(57)【要約】本開示は、腫瘍関連糖タンパク質−７２（ＴＡＧ−７２）を標的化することによる、Ｔ細胞疾患、特に、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）（特に、セザリー症候群（ＳＳ）および菌状息肉腫（ＭＦ）のような皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）を含む）の処置に関する。一局面において、本開示は、患者においてＴＣＬ（特にＣＴＣＬを含む）を処置する方法であって、ＴＡＧ−７２を標的化する薬剤を上記患者に投与する工程を包含する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞関連疾患を処置する方法であって、ここで前記疾患は、ＴＡＧ−７２を発現するＴ細胞が関わり、前記方法は、患者にＴＡＧ−７２を標的化する薬剤を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記Ｔ細胞関連疾患はＴ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記薬剤は、ＴＡＧ−７２に対して特異的なＣＡＲを発現する細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞は、γδ  ＴＣＲ  Ｔ細胞、αβ  ＴＣＲ  Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＭＡＩＴ（粘膜関連インバリアントＴ）細胞のようなＴ細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞は、ＮＫ細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＡＲは、
（ｉ）配列番号１２〜１７に示される６個のＣＤＲ；
（ｉｉ）配列番号２のＱ１〜Ｓ１１５もしくは配列番号２のＱ１〜Ｓ１１５と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ；および配列番号２のＤ１３１〜Ｒ２４４もしくは配列番号２のＤ１３１〜Ｒ２４４と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ；または
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列、
を含むｓｃＦｖを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＡＲは、ＣＤ３−ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＡＲは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、またはＣＤ２の細胞内共刺激ドメインをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記薬剤は、ＴＡＧ−７２に対して特異的な抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体または抗原結合フラグメントは、細胞傷害性薬剤に結合体化される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞傷害性薬剤は、低分子化合物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体は、増強されたＡＤＣＣ活性と関連する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体は、二重特異的抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記二重特異的抗体は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＭＡＩＴ細胞、またはマクロファージ上のレセプターに結合する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴＣＬは、Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病、末梢Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、血管免疫芽球Ｔ細胞性リンパ腫、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（鼻型）、腸管症型Ｔ細胞リンパ腫（ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）（ＥＡＴＬ）、セザリー症候群、未分化大細胞リンパ腫、紅皮症菌状息肉腫または濾胞性菌状息肉腫である、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記患者は、前記処置の前に、ＴＡＧ−７２発現Ｔ細胞の増大したレベルを有するとして同定されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１７】
ＴＣＬの処置における使用のための、ＴＡＧ−７２標的化薬剤。
【請求項１８】
Ｔ細胞関連疾患を有する患者を診断または特徴づける方法であって、前記方法は、前記患者の血液中のＴＡＧ−７２発現Ｔ細胞のレベルまたは可溶性ＴＡＧ−７２のレベルを検出する工程、およびコントロールレベルと比較する工程を包含する、方法。
【請求項１９】
ＴＣＬ患者を診断または特徴づける方法であって、前記方法は、前記患者の血液中のＴＡＧ−７２発現Ｔ細胞のレベルまたは可溶性ＴＡＧ−７２のレベルを検出する工程、およびコントロールレベルと比較する工程を包含する、方法。
【請求項２０】
前記ＴＡＧ−７２発現Ｔ細胞のレベルは、Ｔ細胞を前記患者の血液から単離し、単離された前記Ｔ細胞をＴＡＧ−７２発現に関して評価することによって決定される、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＴＡＧ−７２発現は、ＴＡＧ−７２に対して指向される抗体を使用することによって評価される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｔ細胞は、ＣＤ３の発現に基づいて前記患者の血液から単離される、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本出願は、２０１８年２月２３日出願の米国仮特許出願第６２／６３４，３６６号（その内容全体は、本明細書に参考として援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
開示の分野
本開示は、腫瘍関連糖タンパク質−７２（ＴＡＧ−７２）を標的化することによる、Ｔ細胞疾患、特に、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）（特に、セザリー症候群（ＳＳ）および菌状息肉腫（ＭＦ）のような皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）を含む）の処置に関する。
【０００３】
配列表の援用の表示
ＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表（ファイル名：３５４７８ＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ（１０ＫＢ）、作成日：２０１９年２月１１日）は、本明細書に参考として援用される。
【背景技術】
【０００４】
背景技術
Ｔ細胞リンパ腫および白血病は、希な血液疾患である。ＴＣＬは、Ｔ細胞変異によって引き起こされる非ホジキンリンパ腫の１クラスである。それは、Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病および末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）を含み、これらは、胸腺から離れて発生する。ＰＴＣＬは、多くのサブタイプを含み、そのうちのいくつかは、より攻撃的であり（より早く増殖する）、他のものは緩慢である（ゆっくりと増殖する）。ＣＴＣＬ（これは、皮膚に端を発する）は、ＰＴＣＬの概して緩慢な（ゆっくりと増殖する）形態である。ＣＴＣＬでは、そのがん性Ｔ細胞は、身体の他の部分へと拡がる前に、皮膚病変を形成する。ＳＳは、そのＴ細胞が病的なレベルのムコ多糖を運ぶＣＴＣＬの特定の形態である。ＳＳの主な症状発現は皮膚にある。ＣＴＣＬの処置選択肢は、現行では、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）インヒビター、光線療法および化学療法に制限される。寛解率はおよそ３０％であるが、寛解は永続的なものではない。新たな処置選択肢の大きな必要性がある。免疫療法（例えば、モノクローナル抗体、抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）およびＣＡＲ−Ｔ細胞）における近年の革新は、ＴＣＬの処置に、潜在的な新しいアプローチを開いた。しかし、このような処置の開発は、正常な細胞上には（本質的に）存在しないＴＣＬ細胞上の特異的マーカーを同定できるかに依存する。
ＴＡＧ−７２は、腺癌のマーカーとして確立されており、ある種の固形腫瘍においてもＣＡＲ−Ｔ細胞の潜在的標的として同定されている（Ｄｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２５７：１−３５  （２０１４））。ＴＡＧ−７２標的化ＣＡＲ−Ｔ細胞を使用する臨床試験は、結腸直腸がんを有する患者において行われた（Ｈｅｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ５：２２  （２０１７））。血液悪性疾患（これはＣＴＣＬを含む）におけるＣＡＲ−Ｔ細胞の潜在的標的はまた、同定されている（Ｄｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  前出）。ＴＡＧ−７２は、血液悪性疾患の潜在的な標的とは考えられてこなかった（Ｄｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  前出）。なぜならその発現が、このような悪性疾患において報告されてこなかったからである。例えば、多数の細胞タイプに対する研究では、ＴＡＧ−７２は、１０／１０のリンパ腫サンプルにおいて検出できなかった（Ｒｕｔｔｅｒ，  Ｆｌｅｕｒｅｎ  ａｎｄ  Ｗａｒｎａａｒ  （編），  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  Ｍａｒｔｉｎｕｓ  Ｎｉｇｈｏｆｆ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  （１９８７））。リンパ腫の大部分はＢ細胞リンパ腫であることから、おそらくは、この研究で使用されたそのリンパ腫サンプルの大部分は、Ｂ細胞リンパ腫であった。ＴＡＧ−７２は、いくつかの造血細胞株（例えば、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株）上で発現されることが報告されている（Ｎｉｃｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ  １８：３５６−３６６  （１９９７））。しかし、細胞株における腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現は、必ずしもその親腫瘍を反映せず、ＴＡＧ−７２が、血液ベースのがんを有する患者から単離された腫瘍細胞上で、または任意の血液腫瘍と関連して検出されているという報告は全くない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｄｏｔｔｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ（２０１４）２５７：１〜３５
【非特許文献２】Ｈｅｇｅら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ（２０１７）５：２２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
開示の要旨
一局面において、本開示は、患者においてＴＣＬ（特にＣＴＣＬを含む）を処置する方法であって、ＴＡＧ−７２を標的化する薬剤を上記患者に投与する工程を包含する方法を提供する。
【０００７】
種々の実施形態において、ＴＡＧ−７２を標的化する薬剤は、ＴＡＧ−７２に対して特異的なＣＡＲを発現する細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記細胞は、Ｔ細胞（例えば、γδ  ＴＣＲ  Ｔ細胞、αβ  ＴＣＲ  Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＭＡＩＴ（粘膜関連インバリアントＴ）細胞）である；そして他の実施形態においては、上記細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、上記ＣＡＲは、ＴＡＧ−７２認識部分（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態において、上記ＣＡＲは、ＣＤ３−ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含むシグナル伝達ドメインを含む；そして具体的実施形態において、上記シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、４−１  ＢＢ、またはＣＤ２の細胞内共刺激ドメインをさらに含む。本明細書でさらに記載されるように、上記ＴＡＧ−７２認識部分は、ヒンジおよび膜貫通ドメインを通じて、上記シグナル伝達ドメインへと連結され得る。
【０００８】
いくつかの実施形態において、ＴＡＧ−７２を標的化する薬剤は、ＴＡＧ−７２に対して特異的な抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、上記抗体または抗原結合フラグメントは、細胞傷害性薬剤に結合体化される。いくつかの実施形態において、上記細胞傷害性薬剤は低分子化合物である。いくつかの実施形態において、上記抗体は、増強されたＡＤＣＣ活性と関連する。いくつかの実施形態において、上記抗体は、二重特異的抗体；例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージ上のレセプターに結合する二重特異的抗体である。
【０００９】
いくつかの実施形態において、上記ＣＴＣＬは、セザリー症候群（「ＳＳ」）である。いくつかの実施形態において、上記ＣＴＣＬは、非ＳＳ形態（例えば、未分化大細胞リンパ腫、紅皮症菌状息肉腫（ｅｒｙｔｈｒｏｄｅｒｍｉｃ  ｍｙｃｏｓｉｓ  ｆｕｎｇｏｉｄｅｓ）および濾胞性菌状息肉腫（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｔｒｏｐｈｉｃ  ｍｙｃｏｓｉｓ  ｆｕｎｇｏｉｄｅｓ））である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される処置方法は、上記処置の前に、コントロールと比較して、血液中でのＴＡＧ−７２発現Ｔ細胞の増大したレベルまたは血液中での可溶性ＴＡＧ−７２の増大したレベルを有すると同定されている患者に与えられる。
【００１１】
別の局面において、本開示は、ＴＣＬ（特に、ＣＴＣＬを含む）の処置における使用のためのＴＡＧ−７２標的化薬剤に関する。
【００１２】
さらなる局面において、本開示は、ＴＣＬ患者を診断または特徴づける方法であって、上記患者の血液中でＴＡＧ−７２発現Ｔ細胞のレベルまたは可溶性ＴＡＧ−７２のレベルを検出する工程、およびコントロールレベルと比較する工程を包含する方法を提供する。いくつかの実施形態において、患者におけるＴＡＧ−７２発現Ｔ細胞のレベルは、上記患者の血液からＴ細胞を単離し、上記単離されたＴ細胞をＴＡＧ−７２発現に関して評価することによって決定される。いくつかの実施形態において、上記ＴＡＧ−７２発現は、ＴＡＧ−７２に対して指向される抗体を使用することによって評価される。いくつかの実施形態において、上記Ｔ細胞は、それらのＣＤ３の発現に基づいて、上記患者の血液から単離される。他の実施形態において、さらなるマーカー（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、およびＣＤ５＋）は、上記血液からＴ細胞を単離するにあたって含められ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｍ。セザリー症候群のＰＢＭＣは、フローサイトメトリーによって示されるように、腫瘍関連抗原ＴＡＧ−７２を発現する。ＴＡＧ−７２は、健常ドナー細胞（Ｊ〜Ｍ）と比較して、分析された全ての患者サンプル（Ａ〜Ｉ）において過剰発現された。数字は、別段述べられなければ、分析した全事象のパーセント（％Ｔ）としての集団頻度を表す。細胞デブリを、ＴＡＧ−７２発現に関して最終的に分析した生存するＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ５＋細胞のゲーティングの前に、分析から電子的に排除した。
【図１−２】図１Ａ〜１Ｍ。セザリー症候群のＰＢＭＣは、フローサイトメトリーによって示されるように、腫瘍関連抗原ＴＡＧ−７２を発現する。ＴＡＧ−７２は、健常ドナー細胞（Ｊ〜Ｍ）と比較して、分析された全ての患者サンプル（Ａ〜Ｉ）において過剰発現された。数字は、別段述べられなければ、分析した全事象のパーセント（％Ｔ）としての集団頻度を表す。細胞デブリを、ＴＡＧ−７２発現に関して最終的に分析した生存するＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ５＋細胞のゲーティングの前に、分析から電子的に排除した。
【図１−３】図１Ａ〜１Ｍ。セザリー症候群のＰＢＭＣは、フローサイトメトリーによって示されるように、腫瘍関連抗原ＴＡＧ−７２を発現する。ＴＡＧ−７２は、健常ドナー細胞（Ｊ〜Ｍ）と比較して、分析された全ての患者サンプル（Ａ〜Ｉ）において過剰発現された。数字は、別段述べられなければ、分析した全事象のパーセント（％Ｔ）としての集団頻度を表す。細胞デブリを、ＴＡＧ−７２発現に関して最終的に分析した生存するＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ５＋細胞のゲーティングの前に、分析から電子的に排除した。
【図１−４】図１Ａ〜１Ｍ。セザリー症候群のＰＢＭＣは、フローサイトメトリーによって示されるように、腫瘍関連抗原ＴＡＧ−７２を発現する。ＴＡＧ−７２は、健常ドナー細胞（Ｊ〜Ｍ）と比較して、分析された全ての患者サンプル（Ａ〜Ｉ）において過剰発現された。数字は、別段述べられなければ、分析した全事象のパーセント（％Ｔ）としての集団頻度を表す。細胞デブリを、ＴＡＧ−７２発現に関して最終的に分析した生存するＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ５＋細胞のゲーティングの前に、分析から電子的に排除した。
【図１−５】図１Ａ〜１Ｍ。セザリー症候群のＰＢＭＣは、フローサイトメトリーによって示されるように、腫瘍関連抗原ＴＡＧ−７２を発現する。ＴＡＧ−７２は、健常ドナー細胞（Ｊ〜Ｍ）と比較して、分析された全ての患者サンプル（Ａ〜Ｉ）において過剰発現された。数字は、別段述べられなければ、分析した全事象のパーセント（％Ｔ）としての集団頻度を表す。細胞デブリを、ＴＡＧ−７２発現に関して最終的に分析した生存するＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ５＋細胞のゲーティングの前に、分析から電子的に排除した。
【００１４】
【図１−６】図１Ｎ〜１Ｖ。Ｔ−ＡＬＬおよびＢ−ＡＬＬのサンプルは、フローサイトメトリーによって示されるように、腫瘍関連抗原ＴＡＧ−７２を発現しない。ＴＡＧ−７２レベルは、Ｔ−ＡＬＬ（Ｎ〜Ｒ）またはＢ−ＡＬＬ（Ｓ〜Ｖ）の患者サンプルにおいてベースラインを超えなかった。数字は、別段述べられなければ、分析した生存事象のパーセントとしての集団頻度を表す。細胞デブリを、ＴＡＧ−７２と、ＣＤ３（Ｔ−ＡＬＬ）またはＣＤ１９（Ｂ−ＡＬＬ）のいずれかとの共発現に関して最終的に分析した単一の生存細胞のゲーティングの前に、分析から電子的に排除した。
【図１−７】図１Ｎ〜１Ｖ。Ｔ−ＡＬＬおよびＢ−ＡＬＬのサンプルは、フローサイトメトリーによって示されるように、腫瘍関連抗原ＴＡＧ−７２を発現しない。ＴＡＧ−７２レベルは、Ｔ−ＡＬＬ（Ｎ〜Ｒ）またはＢ−ＡＬＬ（Ｓ〜Ｖ）の患者サンプルにおいてベースラインを超えなかった。数字は、別段述べられなければ、分析した生存事象のパーセントとしての集団頻度を表す。細胞デブリを、ＴＡＧ−７２と、ＣＤ３（Ｔ−ＡＬＬ）またはＣＤ１９（Ｂ−ＡＬＬ）のいずれかとの共発現に関して最終的に分析した単一の生存細胞のゲーティングの前に、分析から電子的に排除した。
【図１−８】図１Ｎ〜１Ｖ。Ｔ−ＡＬＬおよびＢ−ＡＬＬのサンプルは、フローサイトメトリーによって示されるように、腫瘍関連抗原ＴＡＧ−７２を発現しない。ＴＡＧ−７２レベルは、Ｔ−ＡＬＬ（Ｎ〜Ｒ）またはＢ−ＡＬＬ（Ｓ〜Ｖ）の患者サンプルにおいてベースラインを超えなかった。数字は、別段述べられなければ、分析した生存事象のパーセントとしての集団頻度を表す。細胞デブリを、ＴＡＧ−７２と、ＣＤ３（Ｔ−ＡＬＬ）またはＣＤ１９（Ｂ−ＡＬＬ）のいずれかとの共発現に関して最終的に分析した単一の生存細胞のゲーティングの前に、分析から電子的に排除した。
【図１−９】図１Ｎ〜１Ｖ。Ｔ−ＡＬＬおよびＢ−ＡＬＬのサンプルは、フローサイトメトリーによって示されるように、腫瘍関連抗原ＴＡＧ−７２を発現しない。ＴＡＧ−７２レベルは、Ｔ−ＡＬＬ（Ｎ〜Ｒ）またはＢ−ＡＬＬ（Ｓ〜Ｖ）の患者サンプルにおいてベースラインを超えなかった。数字は、別段述べられなければ、分析した生存事象のパーセントとしての集団頻度を表す。細胞デブリを、ＴＡＧ−７２と、ＣＤ３（Ｔ−ＡＬＬ）またはＣＤ１９（Ｂ−ＡＬＬ）のいずれかとの共発現に関して最終的に分析した単一の生存細胞のゲーティングの前に、分析から電子的に排除した。
【図１−１０】図１Ｎ〜１Ｖ。Ｔ−ＡＬＬおよびＢ−ＡＬＬのサンプルは、フローサイトメトリーによって示されるように、腫瘍関連抗原ＴＡＧ−７２を発現しない。ＴＡＧ−７２レベルは、Ｔ−ＡＬＬ（Ｎ〜Ｒ）またはＢ−ＡＬＬ（Ｓ〜Ｖ）の患者サンプルにおいてベースラインを超えなかった。数字は、別段述べられなければ、分析した生存事象のパーセントとしての集団頻度を表す。細胞デブリを、ＴＡＧ−７２と、ＣＤ３（Ｔ−ＡＬＬ）またはＣＤ１９（Ｂ−ＡＬＬ）のいずれかとの共発現に関して最終的に分析した単一の生存細胞のゲーティングの前に、分析から電子的に排除した。
【００１５】
【図２】図２。ＴＣＬの異なる形態を有する患者は、正常な個体と比較して、ＴＡＧ−７２＋Ｔ細胞の増大した頻度を示す。ＰＢＭＣを、合計で、１５名の健常ドナー（ＨＤ）、２１名のセザリー症候群（ＳＳ）患者、１８名の菌状息肉腫（ＭＦ）患者、および８名の他の形態のＴＣＬ（未分化大細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、および濾胞性菌状息肉腫を含む）を有する患者から得た。ＴＡＧ−７２は、フローサイトメトリーによって示されるように、健常ドナー細胞（青色）と比較して、ＳＳ（赤色）、ＭＦ（緑色）、および他の形態のＴＣＬ（紫色）のＰＢＭＣ中のＣＤ３＋Ｔ細胞サブセットで有意により高度に発現される（ｐ＜０．０５）。数字は、分析した全事象のパーセント（％Ｔ）±ＳＥＭとしての集団頻度を表す。実行したゲーティングストラテジーは、細胞デブリを電子的に排除し、単一の生存細胞について選択した。ＣＤ３＋細胞をその後、ＴＡＧ−７２の共発現に関して分析した。
【００１６】
【図３】図３Ａ〜３Ｂ。ＣＴＣＬ患者は、彼らの血漿中での可溶性ＴＡＧ−７２の、健常ドナーより有意に高いレベルを有する。２９名のＣＴＣＬ患者および１４名の健常ドナーの血漿サンプルを、可溶性ＴＡＧ−７２に関してＥＬＩＳＡによって評価した。個々の患者およびドナーの結果は、棒グラフ（Ａ）および散布図（Ｂ）として示される。ＣＴＣＬ患者におけるＴＡＧ−７２の平均レベルは、健常ドナーにおけるレベルより有意に高い（Ｐ＜０．０５）。破線は、正常なヒトＡＢ血清中で検出されるＴＡＧ−７２のレベルを示す。
【００１７】
【図４−１】図４Ａ。いくらかのＣＴＣＬ患者からの皮膚生検は、ＴＡＧ−７２陽性細胞の存在を示す。病変部の罹患した皮膚のパンチ生検を、ＳＳ、ＭＦまたは未分化Ｔ細胞リンパ腫と診断された１１名の個体から得た。薄い切片を調製し、Ｈ＆Ｅによって、および標準的技術を使用してＴＡＧ−７２またはＣＤ３の発現に関して染色した。各切片および染色に関して目的の代表的領域を、ＴＡＧ−７２およびＣＤ３染色切片の陽性コントロールとともに、図４Ａに示す。スケールバーは、５０μｍを表す。
【図４−２】図４Ａ。いくらかのＣＴＣＬ患者からの皮膚生検は、ＴＡＧ−７２陽性細胞の存在を示す。病変部の罹患した皮膚のパンチ生検を、ＳＳ、ＭＦまたは未分化Ｔ細胞リンパ腫と診断された１１名の個体から得た。薄い切片を調製し、Ｈ＆Ｅによって、および標準的技術を使用してＴＡＧ−７２またはＣＤ３の発現に関して染色した。各切片および染色に関して目的の代表的領域を、ＴＡＧ−７２およびＣＤ３染色切片の陽性コントロールとともに、図４Ａに示す。スケールバーは、５０μｍを表す。
【００１８】
【図４−３】図４Ｂ。ＴＡＧ−７２は、ＴＣＬ患者において循環および／または皮膚浸潤細胞において発現され得る。循環Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析または皮膚生検の免疫組織化学を、以前に記載されるように行った。図４Ａの患者の比較上の発現レベルを、図４Ｂにおいてまとめる。
【００１９】
【図５】図５Ａ。ＴＡＧ−７２に対して特異的なｓｃＦｖに連結されたヒンジ、膜貫通（ＴＭ）およびシグナル伝達ドメインの種々の組み合わせを示す３種のＴＡＧ−７２特異的ＣＡＲ−Ｔ構築物の模式図。実施例で記載される研究は、ＴＡＧ−７２（１）およびＴＡＧ−７２（３）と称されるこれら構築物のうちの２種のいずれかを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞を利用した。図５Ｂ。ＴＡＧ−７２特異的ＣＡＲ構築物であるＴＡＧ−７２（１）およびＴＡＧ−７２（３）に組み込まれたｓｃＦｖドメインのヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）。そのＴＡＧ−７２特異的ｓｃＦＶドメインの構成要素はまた、以下に示される：  ＴＡＧ−７２  ＶＨ（重鎖可変領域）、ＧＳリンカー（太字斜体）、およびＴＡＧ−７２  ＶＬ（軽鎖可変領域）。
【００２０】
【図６−１】図６Ａ〜６Ｂ。ＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（１）Ｔ細胞は、ＴＡＧ−７２ｈｉ発現標的がん細胞（Ｏｖｃａｒ  ３）の極力な細胞殺滅を媒介する（Ａ）が、ＴＡＧ−７２−ｖｅ／ｌｏｗがん標的細胞（ＭＥＳｏｖ）では媒介しない（Ｂ）。標的細胞を、Ｅ：Ｔ比  ５：１（赤色）、１：１（緑色）または１：５（紫色）でのエフェクター細胞の添加（↓）の前に、４時間にわたってＲＴＣＡプレートに接着させた。細胞インピーダンス（ここでは正規化した細胞指数として表される）を、７５時間にわたってモニターした。正常な増殖条件下での標的細胞増殖（青色）をまた、全体にわたってモニターした。
【００２１】
【図６−２】図６Ｃ〜６Ｄ。ＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（３）Ｔ細胞は、ＴＡＧ−７２ｈｉ発現標的細胞（Ｏｖｃａｒ３）の強力な細胞殺滅を媒介する（Ｃ）が、ＴＡＧ−７２−ｖｅ／ｌｏｗがん標的細胞（ＭＥＳｏｖ）では媒介しない（Ｄ）。標的細胞を、Ｅ：Ｔ比  ５：１でのＮＴ  Ｔ細胞（赤色）またはＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（３）（緑色）の添加の前に、４〜６時間にわたってＲＴＣＡプレートに接着させた。細胞インピーダンス（正規化した細胞指数として表される）を、２０時間にわたってモニターした。正常な増殖条件下での標的細胞増殖（青色）をまた、全体にわたってモニターした。
【００２２】
【図７−１】図７Ａ〜７Ｅ。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、インビトロで、懸濁培養物中でＴＡＧ−７２特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞によって殺滅し得る。そのＪｕｒｋａｔ細胞株を、インビトロで使用する前に、アイソタイプコントロール（青色）と比較して、ＴＡＧ−７２発現（Ａ；赤色）に関して特徴づけた。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、４８時間にわたって、正常な培養条件下で維持した（Ｂ）か、非形質導入Ｔ細胞と共培養した（Ｃ）か、ＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（１）Ｔ細胞と共培養した（Ｄ）か、またはＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（３）Ｔ細胞と共培養した（Ｅ）。この時点で、その培養物内に残っている生存ＴＡＧ−７２＋細胞の分析を、フローサイトメトリーによって決定した。データを、ＴＡＧ−７２を発現する、培養物中に残っている生存細胞のパーセントとして表す。
【図７−２】図７Ａ〜７Ｅ。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、インビトロで、懸濁培養物中でＴＡＧ−７２特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞によって殺滅し得る。そのＪｕｒｋａｔ細胞株を、インビトロで使用する前に、アイソタイプコントロール（青色）と比較して、ＴＡＧ−７２発現（Ａ；赤色）に関して特徴づけた。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、４８時間にわたって、正常な培養条件下で維持した（Ｂ）か、非形質導入Ｔ細胞と共培養した（Ｃ）か、ＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（１）Ｔ細胞と共培養した（Ｄ）か、またはＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（３）Ｔ細胞と共培養した（Ｅ）。この時点で、その培養物内に残っている生存ＴＡＧ−７２＋細胞の分析を、フローサイトメトリーによって決定した。データを、ＴＡＧ−７２を発現する、培養物中に残っている生存細胞のパーセントとして表す。
【図７−３】図７Ａ〜７Ｅ。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、インビトロで、懸濁培養物中でＴＡＧ−７２特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞によって殺滅し得る。そのＪｕｒｋａｔ細胞株を、インビトロで使用する前に、アイソタイプコントロール（青色）と比較して、ＴＡＧ−７２発現（Ａ；赤色）に関して特徴づけた。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、４８時間にわたって、正常な培養条件下で維持した（Ｂ）か、非形質導入Ｔ細胞と共培養した（Ｃ）か、ＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（１）Ｔ細胞と共培養した（Ｄ）か、またはＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（３）Ｔ細胞と共培養した（Ｅ）。この時点で、その培養物内に残っている生存ＴＡＧ−７２＋細胞の分析を、フローサイトメトリーによって決定した。データを、ＴＡＧ−７２を発現する、培養物中に残っている生存細胞のパーセントとして表す。
【００２３】
【図８−１】図８Ａ〜８Ｅ。ＳＳ患者のＰＢＭＣのリンパ球集団内のＴＡＧ−７２＋細胞は、インビトロでのＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（１）Ｔ細胞への４８時間の曝露後に低減される。パネルＡ〜Ｄは、１名のＳＳ患者からの結果を表す。例示的なゲーティングストラテジーは、ＴＡＧ−７２発現（Ｂ〜Ｄ）を分析する前に、リンパ球集団（Ａ）に関してゲーティングすることによって、デブリが分析から排除されたことを示す。Ｅ。図２からの９名のＳＳ患者および４名の正常被験体のプールしたデータは、正常な拡大条件下で維持した場合のインビトロでのＳＳ患者のＰＢＭＣ（青色）上でのＴＡＧ−７２発現の持続を示す。わずかな低減が、患者／ＮＴ  ＰＢＭＣ培養物（赤色）において観察可能であるが、これは、有意には達しなかった。その最大の変化は、患者のＰＢＭＣをＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（１）Ｔ細胞と共培養した場合に観察される（緑色）。ｎ．ｓ．＝有意でない；  ＊はｔ検定においてｐ＜０．０５を表す。
【図８−２】図８Ａ〜８Ｅ。ＳＳ患者のＰＢＭＣのリンパ球集団内のＴＡＧ−７２＋細胞は、インビトロでのＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（１）Ｔ細胞への４８時間の曝露後に低減される。パネルＡ〜Ｄは、１名のＳＳ患者からの結果を表す。例示的なゲーティングストラテジーは、ＴＡＧ−７２発現（Ｂ〜Ｄ）を分析する前に、リンパ球集団（Ａ）に関してゲーティングすることによって、デブリが分析から排除されたことを示す。Ｅ。図２からの９名のＳＳ患者および４名の正常被験体のプールしたデータは、正常な拡大条件下で維持した場合のインビトロでのＳＳ患者のＰＢＭＣ（青色）上でのＴＡＧ−７２発現の持続を示す。わずかな低減が、患者／ＮＴ  ＰＢＭＣ培養物（赤色）において観察可能であるが、これは、有意には達しなかった。その最大の変化は、患者のＰＢＭＣをＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（１）Ｔ細胞と共培養した場合に観察される（緑色）。ｎ．ｓ．＝有意でない；  ＊はｔ検定においてｐ＜０．０５を表す。
【図８−３】図８Ａ〜８Ｅ。ＳＳ患者のＰＢＭＣのリンパ球集団内のＴＡＧ−７２＋細胞は、インビトロでのＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（１）Ｔ細胞への４８時間の曝露後に低減される。パネルＡ〜Ｄは、１名のＳＳ患者からの結果を表す。例示的なゲーティングストラテジーは、ＴＡＧ−７２発現（Ｂ〜Ｄ）を分析する前に、リンパ球集団（Ａ）に関してゲーティングすることによって、デブリが分析から排除されたことを示す。Ｅ。図２からの９名のＳＳ患者および４名の正常被験体のプールしたデータは、正常な拡大条件下で維持した場合のインビトロでのＳＳ患者のＰＢＭＣ（青色）上でのＴＡＧ−７２発現の持続を示す。わずかな低減が、患者／ＮＴ  ＰＢＭＣ培養物（赤色）において観察可能であるが、これは、有意には達しなかった。その最大の変化は、患者のＰＢＭＣをＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（１）Ｔ細胞と共培養した場合に観察される（緑色）。ｎ．ｓ．＝有意でない；  ＊はｔ検定においてｐ＜０．０５を表す。
【００２４】
【図９−１】図９Ａ〜９Ｈ。ＴＣＬのＰＢＭＣ（以降、疾患ＰＢＭＣと称される）におけるＣＤ３＋／ＴＡＧ−７２＋の頻度は、形質導入されていない（ＮＴ）Ｔ細胞との共培養（青色）と比較して、ＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（３）Ｔ細胞との２４時間の共培養（赤色、Ｂ、Ｄ、Ｆ）後に有意に低減される。並行した共培養を健常ドナー（ＨＤ）のＰＢＭＣ（Ａ、Ｃ、Ｅ）で行ったところ、ＣＤ３／ＴＡＧ−７２＋細胞の低減は、試験条件でも少ない程度ではあるが、観察された（赤色）。全ての培養物を、５：１のＥ：Ｔを使用して調製した。各標的細胞タイプ（疾患被験体もしくは健常被験体のいずれか、またはＪｕｒｋａｔ細胞株）を、少なくとも２名の異なるドナーから単離したＴ細胞から生成したＣＡＲ−Ｔ細胞と共培養した。図９Ｇおよび９Ｈでは、図２の３６名の疾患患者（Ｇ）および１０名の健常個体（Ｈ）からデータをプールする。ｎ．ｓ．＝有意でない；対応のあるｔ検定において、＊＊はｐ＜０．０１を表し；＊＊＊はｐ＜０．００１を表し、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を表す。
【図９−２】図９Ａ〜９Ｈ。ＴＣＬのＰＢＭＣ（以降、疾患ＰＢＭＣと称される）におけるＣＤ３＋／ＴＡＧ−７２＋の頻度は、形質導入されていない（ＮＴ）Ｔ細胞との共培養（青色）と比較して、ＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（３）Ｔ細胞との２４時間の共培養（赤色、Ｂ、Ｄ、Ｆ）後に有意に低減される。並行した共培養を健常ドナー（ＨＤ）のＰＢＭＣ（Ａ、Ｃ、Ｅ）で行ったところ、ＣＤ３／ＴＡＧ−７２＋細胞の低減は、試験条件でも少ない程度ではあるが、観察された（赤色）。全ての培養物を、５：１のＥ：Ｔを使用して調製した。各標的細胞タイプ（疾患被験体もしくは健常被験体のいずれか、またはＪｕｒｋａｔ細胞株）を、少なくとも２名の異なるドナーから単離したＴ細胞から生成したＣＡＲ−Ｔ細胞と共培養した。図９Ｇおよび９Ｈでは、図２の３６名の疾患患者（Ｇ）および１０名の健常個体（Ｈ）からデータをプールする。ｎ．ｓ．＝有意でない；対応のあるｔ検定において、＊＊はｐ＜０．０１を表し；＊＊＊はｐ＜０．００１を表し、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を表す。
【００２５】
【図１０−１】図１０Ａ〜１０Ｅ。抗ＴＡＧ−７２抗体−薬物結合体を使用するＴＡＧ−７２＋細胞の殺滅。ＴＡＧ−７２を発現するセザリー症候群患者のＰＢＭＣは、その抗ＴＡＧ−７２抗体−薬物結合体ＣＣ４９−ＤＭ１への曝露後に減少した。ＣＣ４９−ＤＭ１に４８時間にわたって曝露した４名のＳＳ患者のＰＢＭＣからプールしたデータは、正常な培養条件下で維持したＳＳ患者のＰＢＭＣ（青色）と比較して、ＴＡＧ−７２を発現する細胞の全パーセントの減少を示した（Ａ；赤色）。この抗体−薬物結合体への曝露はまた、Ｊｕｒｋａｔ培養物中のＴＡＧ−７２発現細胞の頻度を低減した（Ｂ）が、健常ドナーのＰＢＭＣでは減少しなかった（Ｃ）。例示的なＦＡＣＳドットプロットは、抗体−薬物結合体の非存在下（Ｄ）および存在下（Ｅ）で、ＳＳ患者のＰＢＭＣにおけるこの細胞亜集団において変化をさらに示す。
【図１０−２】図１０Ａ〜１０Ｅ。抗ＴＡＧ−７２抗体−薬物結合体を使用するＴＡＧ−７２＋細胞の殺滅。ＴＡＧ−７２を発現するセザリー症候群患者のＰＢＭＣは、その抗ＴＡＧ−７２抗体−薬物結合体ＣＣ４９−ＤＭ１への曝露後に減少した。ＣＣ４９−ＤＭ１に４８時間にわたって曝露した４名のＳＳ患者のＰＢＭＣからプールしたデータは、正常な培養条件下で維持したＳＳ患者のＰＢＭＣ（青色）と比較して、ＴＡＧ−７２を発現する細胞の全パーセントの減少を示した（Ａ；赤色）。この抗体−薬物結合体への曝露はまた、Ｊｕｒｋａｔ培養物中のＴＡＧ−７２発現細胞の頻度を低減した（Ｂ）が、健常ドナーのＰＢＭＣでは減少しなかった（Ｃ）。例示的なＦＡＣＳドットプロットは、抗体−薬物結合体の非存在下（Ｄ）および存在下（Ｅ）で、ＳＳ患者のＰＢＭＣにおけるこの細胞亜集団において変化をさらに示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
詳細な説明
本発明によれば、ＴＡＧ−７２は、ＴＣＬ、特にＣＴＣＬサブタイプ（例えば、セザリー症候群（ＳＳ）および菌状息肉腫（ＭＦ））における細胞によって発現されることが同定された。ＴＡＧ−７２を標的化するＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＴＣＬ  Ｔ細胞をインビトロで特異的に殺滅し、ＴＡＧ−７２抗体−薬物結合体が、ＳＳ患者のＰＢＭＣ中のＴＡＧ−７２＋細胞のパーセンテージを実質的に低減することは、本明細書で示された。よって、ＴＡＧ−７２標的化薬剤の投与によって、ＴＣＬ（例えば、ＳＳおよびＭＦ）を処置する方法が本明細書で開示される。
【００２７】
ＴＣＬ、ＣＴＣＬおよびＳＳ
本明細書で開示される治療方法は、ＴＣＬの全ての形態（例えば、ＳＳ、未分化大細胞リンパ腫、紅皮症菌状息肉腫、および濾胞性菌状息肉腫を含むＣＴＣＬサブタイプを含む）を処置するために有効である。
【００２８】
ＴＣＬは、Ｔ細胞変異によって引き起こされる非ホジキンリンパ腫の１クラスである。末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）は、胸腺から離れて発生する。１つの特定の形態、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）は、皮膚が関わるＴ細胞リンパ腫に言及する。その皮膚Ｔ細胞は、身体の他の部分へと拡がる前に、皮膚病変を形成する。ＣＴＣＬはまた、血液、リンパ節、および他の内部器官が関わり得る。症状としては、皮膚の乾燥、そう痒、赤い発疹、およびリンパ節の肥大が挙げられ得る。ＣＴＣＬを有する大部分の患者は、重篤な合併症なしの皮膚症状のみを経験する；しかし、後期のステージに進んだ患者のうちのおよそ１０パーセントは、重篤な合併症を発生させる。
【００２９】
ＣＴＣＬの２つの最も一般的なタイプは、菌状息肉腫およびＳＳである。菌状息肉腫はＣＴＣＬの最も一般的なタイプであり、皮膚症状は、斑（ｐａｔｃｈ）、局面（ｐｌａｑｕｅ）、または腫瘍として出現し得る。ＳＳは、菌状息肉腫の進行した変型であり、血液中のリンパ腫細胞（ある範囲の表面マーカーによって特徴づけられ、病的なレベルのムコ多糖を運ぶＴ細胞）の存在によって特徴づけられる。ＳＳの主な症状発現は、皮膚にあり、代表的には身体のおよそ８０％を覆う、広範囲にわたる薄く赤いそう痒のある発疹を伴う。
【００３０】
ＴＡＧ−７２
ＴＡＧ−７２は、モノクローナル抗体Ｂ７２．３（このモノクローナル抗体は、正常組織に対して種々の癌腫へのその反応性の範囲に関して広範囲に特徴づけられた）に対して反応性であると最初に同定された（Ｓｈｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４８，  ６８１１−６８１８，  １９８８）。さらなる特徴付けによって、ＴＡＧ−７２は、シアリル−Ｔｎ抗原としても公知の、ＧａｌＮＡｃ  α−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒにα−２，６結合したシアル酸を含むムチン関連短縮化Ｏ−グリカンとして確立された（Ｍｕｎｃｋｌｅｙ，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｓｃｉ．  ２０１６，  １７，  ２７５）。
【００３１】
ＴＡＧ−７２を標的化する薬剤
「ＴＡＧ−７２を標的化する薬剤」とは、がん性細胞の表面で発現されるＴＡＧ−７２に対して特異的に結合し、そのがん性細胞の殺滅をもたらす薬剤を意味する。
【００３２】
抗原認識部分
本明細書で開示されるＴＡＧ−７２を標的化する薬剤は、ＴＡＧ−７２を特異的に認識しかつ結合する抗原認識部分を含む。ＴＡＧ−７２認識部分の特異性は、少なくともマイクロモル濃度範囲にある解離定数（ＫＤ）、好ましくはナノモル濃度範囲またはピコモル濃度範囲にあるＫＤによって反映され得る。
【００３３】
種々の実施形態において、抗原認識部分は、ＴＡＧ−７２に対して特異的に結合する抗体の抗原結合フラグメントから構成される。
【００３４】
用語「抗体」とは、本明細書で使用される場合、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、多重特異的抗体、および単鎖抗体を含む。代表的なＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合によって接続される２本の同一な重鎖および２本の同一な軽鎖から構成される。その重鎖および軽鎖の各々は、定常領域および可変領域を含む。各可変領域は、抗原のエピトープの結合を主に担う３個の「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）を含む。用語「ＶＨ」とは、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域をいい、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２フラグメントの重鎖を含む。用語「ＶＬ」とは、抗体の免疫グロブリン軽鎖の可変領域をいい、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２フラグメントの軽鎖を含む。その可変領域のより高度に保存された部分は、「フレームワーク領域」といわれる。
【００３５】
用語「キメラ抗体」とは、本明細書で使用される場合、その定常領域またはその一部およびその可変領域が異なる起源のものである抗体に言及する。例えば、マウスモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡセグメントは、クローニングされ得、それぞれ、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の定常領域をコードするＤＮＡセグメントに接続されて、マウス−ヒトキメラ免疫グロブリンコード遺伝子を生成する。
【００３６】
用語「ヒト化抗体」とは、本明細書で使用される場合、非ヒト免疫グロブリンに由来する抗体であって、ここでその非ヒト免疫グロブリンのある種のアミノ酸が、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸によって置き換えられている抗体に言及する。ヒト化の目的は、ヒトレシピエントに導入するために、異種抗体（例えば、マウス抗体）の免疫原性を低減し、それと同時にその抗体の完全な抗原結合特異性を維持することである。非ヒト抗体のヒト化は、当該分野で周知の技術（例えば、ＣＤＲグラフト化（非ヒト免疫グロブリンの相補性決定領域をヒト免疫グロブリンフレームワークドメインへとグラフト化する；例えば、ＷＯ  ９２／２２６５３、ＥＰ  ０  ２３９  ４００、ＷＯ  ９１／０９９６７、米国特許第５，５３０，１０１号、および米国特許第５，５８５，０８９号を参照のこと）、リサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（公知のヒト抗体の表面に似せるために、分子モデリング、統計分析および変異誘発の組み合わせに基づいて、抗体可変領域の非ＣＤＲ表面を変化させる；例えば、ＥＰ  ０  ５９２  １０６、ＥＰ  ０  ５１９  ５９６を参照のこと）、および鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）が挙げられる）を使用して行われ得る。
【００３７】
用語「多重特異的抗体（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、２個もしくはこれより多くのエピトープ（２種の異なる分子（例えば、抗原）上のまたは同じ分子上の（例えば、同じ抗原上の）いずれかにある）に選択的に結合し得るかまたはそれらエピトープに対して特異性を有し得る抗体に言及する。例えば、多重特異的抗体の例は、２個もしくはこれより多くのエピトープに選択的に結合し得る二重特異的抗体である。二重特異的抗体の生成は、当該分野で十分に記録されている。
【００３８】
用語「抗体フラグメント」とは、本明細書で使用される場合、全長抗体によって認識されるエピトープに結合する濃緑を保持する抗体の任意の部分を含む。抗体フラグメントの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド連結されたＦｖ（ｄｓＦｖ）、ならびにＶＬまたはＶＨ領域のいずれかを含むフラグメント。抗体の抗原結合フラグメントは、その可変領域を単独で、またはヒンジ領域の一部、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、もしくはこれらの組み合わせとの組み合わせにおいて含み得る。好ましくは、その抗体フラグメントは、抗体全体の全６個のＣＤＲを含むが、全６個より少ないＣＤＲを含むフラグメントも、機能的であり得る。
【００３９】
「単鎖ＦＶ」（「ｓｃＦｖ」）とは、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）に連結された抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）を単一のポリペプチドの中に含むが、その抗体の定常ドメインのうちのいくらかまたは全てを欠く抗原結合フラグメントである。そのＶＨとＶＬとの間の連結は、そのＶＬおよびＶＨ領域の適切な三次元折りたたみが起こって、その抗体全体（その抗体からｓｃＦｖが由来する）の標的分子結合特異性を維持することを確実にするために選択される、短い可撓性のペプチドを通じて達成され得る。ｓｃＦｖは、抗体の定常ドメインのうちのいくらかまたは全てを欠いている。
【００４０】
本開示のＴＡＧ−７２標的化薬剤の抗原認識部分に関して、ＴＡＧ−７２に対して指向される抗体は、当該分野で入手可能であり、公知の技術を使用しても作製され得る。多数の第２世代マウスモノクローナル抗体は、ＴＡＧ−７２に対して開発された（とりわけ、ＣＣ４９およびＣＣ１１２が挙げられる（Ｍｏｌｉｎｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９０；  ５０（４）：  １２９１−１２９８））。このようなモノクローナル抗体、およびそのキメラ形態またはヒト化形態は、ＴＡＧ−７２を標的化する薬剤の抗原認識部分を提供するために使用され得る。マウスＣＣ４９抗体（ｍｕＣＣ４９）に由来するヒト化ＴＡＧ−７２抗体（ｈｕＣＣ４９）は、米国特許第８，８３５，１６７  Ｂ２号に記載されている。
【００４１】
具体的実施形態において、その抗原認識部分は、そのマウスモノクローナル抗体ＣＣ４９の６個のＣＤＲを含む。
【００４２】
いくつかの実施形態において、その抗原認識部分は、配列番号１２〜１７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高い同一性を有するアミノ酸配列を有する６個のＣＤＲを含む。具体的実施形態において、その抗原認識部分は、配列番号１２〜１７に示されるアミノ酸配列を有する６個のＣＤＲを含む。
【００４３】
いくつかの実施形態において、その抗原認識部分は、配列番号２のアミノ酸Ｑ１〜Ｓ１１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高い同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、その抗原認識部分は、配列番号２のアミノ酸Ｄ１３１〜Ｒ２４４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高い同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態において、その抗原認識部分は、（ｉ）配列番号２のアミノ酸Ｑ１〜Ｓ１１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高い同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸Ｄ１３１〜Ｒ２４４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれより高い同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み；ここでそのＶＨおよびＶＬ領域は、配列番号１２〜１７に示されるアミノ酸配列を有する６個のＣＤＲを含む。
【００４６】
具体的実施形態において、その抗原認識部分は、配列番号２のアミノ酸Ｑ１〜Ｓ１１５から構成される重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号２のアミノ酸Ｄ１３１〜Ｒ２４４から構成される軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【００４７】
本開示によれば、そのＴＡＧ−７２を標的化する薬剤は、ＴＡＧ−７２発現がん性細胞へのその薬剤の結合後に、このようながん性細胞の殺滅を達成する。その殺滅は、ＴＡＧ−７２標的化薬剤の形態（これらとしては、薬物結合体化抗体または抗原結合フラグメント、増大した細胞傷害性エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ））を有する抗体、二重特異的抗体、およびキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現する細胞が挙げられ得る）に依存して、種々の方法において達成される。
【００４８】
薬物結合体化抗体または抗原結合フラグメント
いくつかの実施形態において、その薬剤は、細胞傷害性薬剤に結合体化した（例えば、共有結合した）抗ＴＡＧ−７２抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【００４９】
抗ＴＡＧ−７２抗体または抗原結合フラグメントへの結合体化に使用される細胞傷害性薬剤は、細胞死を生じるかもしくは細胞死を誘導する、またはある様式で細胞生存度を減少させる、任意の化合物であり得る。いくつかの実施形態において、その細胞傷害性薬剤は、低分子化合物（特に、抗がん特性を有する低分子化合物が挙げられる）である。用語「低分子化合物（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」とは、単純かつ十分に規定された化学構造を有する、低分子量の化合物（１５００ダルトン未満、１２００ダルトン未満、１０００ダルトン未満、８００ダルトン未満、またはさらに６００ダルトン未満）を含む。例としては、タキソイド、メイタンシノイド（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、トメイマイシ誘導体（ｔｏｍａｙｍｙｃｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、レプトマイシン誘導体（ｌｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）（例えば、ＣＣ−１０６５）またはそのアナログ、オーリスタチン（Ａｕｒｏｓｔａｔｉｎ）およびピロロベンゾジアゼピンダイマーが挙げられる。さらなる薬物（例えば、メトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、カリケアマイシン、ツブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）およびツブリシンアナログ、ドラスタチンおよびドラスタチンアナログ）はまた、結合体の調製において本明細書での使用に適している。
【００５０】
細胞傷害性薬剤は、その抗体またはその抗原結合フラグメントに、直接的にまたはリンカーを介して、共有結合され得る。適切なリンカーは、当該分野で周知であり、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸に不安定な基、光に不安定な基、ペプチダーゼに不安定な基およびエステラーゼに不安定な基を含む。例えば、結合体は、ジスルフィド交換反応を使用して、またはその抗体と低分子化合物との間でチオエーテル結合を形成することによって、構築され得る。その低分子はまた、中間のキャリア分子（例えば、血清アルブミン）を通じてその抗体分子に連結され得る。
【００５１】
改善されたＡＤＣＣ活性を有するＴＡＧ−７２特異的抗体
いくつかの実施形態において、ＴＡＧ−７２標的化薬剤は、細胞の細胞傷害性エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ））を媒介する増強された能力を有する抗ＴＡＧ−７２抗体である。このような抗体は、抗体の定常フレームワーク領域に１個またはこれより多くのアミノ酸置換を作製し、従って、その抗体と、細胞傷害性エフェクター細胞上のＦｃレセプターとの相互作用を変化させることによって得られ得る。例えば、Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  １０３（１１）：  ４００５−４０１０，  ２００６）を参照のこと。
【００５２】
他の実施形態において、ＴＡＧ−７２標的化薬剤は、ＴＡＧ−７２および細胞傷害性エフェクター細胞上に存在するレセプター（例えば、ＮＫ細胞上に存在するＣＤ１６）に対して特異的である二重特異的抗体である。このような二重特異的抗体は、細胞傷害性エフェクター細胞を、ＴＡＧ−７２発現がん細胞の近位にすることができ、その細胞傷害性エフェクター細胞によるそのがん性細胞のより有効な殺滅を生じ得る。腫瘍抗原およびＮＫ細胞レセプターに対して指向される二重特異的抗体は、記載されている（例えば、Ｓｃｈｍｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２４（７）：１３１２−２２，  ２０１６を参照のこと）。ＴＡＧ−７２に対する特異性を付与する二重特異的抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域は、本明細書中上記で記載されるＴＡＧ−７２に対して特異的なＶＨ領域またはＶＬ領域のうちのいずれかであり得る。
【００５３】
ＣＡＲ発現細胞
他の実施形態において、その薬剤は、ＴＡＧ−７２に対して特異的な抗原認識部分を含むキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現する細胞である。
【００５４】
用語「キメラ抗原レセプター」（「人工Ｔ細胞レセプター」、「キメラＴ細胞レセプター」および「キメライムノレセプター」としても公知）は、免疫エフェクター細胞上に抗原結合部分をグラフト化する操作されたレセプターに言及する。これらのレセプターは、モノクローナル抗体のＴＡＧ−７２特異性を、Ｔ細胞またはＮＫ細胞上にグラフト化するために本明細書で使用される。概して、ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞がこのようなＣＡＲを発現する場合に、それらがＴＡＧ−７２を発現する標的細胞を認識および殺滅するように、互いに作動可能に連結される、ＴＡＧ−７２に対して特異的な抗原認識部分、膜貫通ドメイン、および免疫エフェクター細胞上で天然に発現されるレセプターの細胞内／細胞質シグナル伝達ドメイン（エンドドメインともいわれる）から構成される。「作動可能に連結される」とは、その個々のドメインが、ＴＡＧ−７２へのその抗原認識部分の結合の際に、シグナルがその細胞内シグナル伝達ドメインを介して誘導されて、そのＣＡＲを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を活性化しそのエフェクター機能が活性化されることを可能にするように互いに連結されることを意味する。
【００５５】
抗原認識部分  −  ＣＡＲの抗原認識部分は、その標的抗原（すなわち、本明細書ではＴＡＧ−７２）のエピトープを認識し、これに結合するレセプターの細胞外部分である。その抗原認識部分は、通常はｓｃＦｖであり、これは、可撓性リンカーによって互いに融合される抗ＴＡＧ−７２モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有することによって形成される。いくつかの実施形態において、そのＣＡＲは、その抗原認識部分のＮ末端においてシグナルペプチドを有するように操作される。任意の真核生物シグナルペプチド配列が、使用され得る。一般に、アミノ末端に天然に結合されるシグナルペプチドが、使用される（例えば、軽鎖−リンカー−重鎖の配向を有するｓｃＦｖでは、その軽鎖の天然のシグナルが使用される）。
【００５６】
細胞内シグナル伝達ドメイン（または「エンドドメイン」−その抗原認識部分は、抗原認識および結合の際に、細胞（Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の細胞内部分にシグナルを伝達して、その活性化およびエフェクター機構の誘導を可能にする細胞内シグナル伝達ドメインに作動可能に連結される。その抗原認識部分は、天然のＴＣＲのサブユニットのうちの１つに、または人工レセプター（例えば、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ））に作動可能に連結され得る。Ｔ細胞活性化は、細胞質シグナル伝達配列の２つの異なるクラス：ＴＣＲを通じて抗原依存性一次活性化を開始し得るもの（一次細胞質シグナル伝達配列）および抗原非依存性様式で作用して、二次または共刺激シグナルを提供するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）を提供するもの、によって媒介されるといわれ得る。一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激性の様式または阻害性の様式のいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激性様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含み得る。特に有用な一次細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲ  ζ、ＦｃＲ  γ、ＦｃＲ  β、ＣＤ３  γ、ＣＤ３  δ、ＣＤ３  ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ζに由来する細胞質シグナル伝達配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ζの細胞内ドメインを含むか、または天然のドメインに存在するその３個のＩＴＡＭを含むＣＤ３−ζの細胞内ドメインの一部を含む。通常は、天然のレセプターの細胞内シグナル伝達ドメイン全体が使用され得るが、多くの場合には、必ずしもそのドメイン全体を使用しない。天然の細胞内シグナル伝達ドメインの短縮化した部分が使用される程度まで、そのような短縮化した部分は、これがそのエフェクター機能シグナルを伝達する限りにおいて、その無傷のドメインの代わりに使用され得る。場合によっては、ＣＤ３−ζは、十分に能力のある活性化シグナルを提供しなくてもよく、さらなる共刺激シグナル伝達が望ましい。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達領域との組み合わせにおいてＣＤ３  ζ鎖部分を含み得る。その共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメイン（またはその機能的部分）を含み得る。適切な共刺激分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３などが挙げられる。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメイン内の細胞質シグナル伝達配列（例えば、ＣＤ３  ζ鎖部分、および共刺激シグナル伝達領域）は、ランダムなまたは特定の順序で、互いに連結され得る。必要に応じて、短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカー（好ましくは２〜１０アミノ酸の間の長さ）が、連結を形成し得る。グリシ��−セリンダブレットは、特に適切なリンカーを提供する。一実施形態において、その細胞質ドメインは、ＣＤ３−ζのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むようにデザインされる。
【００５７】
膜貫通ドメイン  −  ＣＡＲの膜貫通ドメインは概して、膜にまたがる代表的な疎水性αヘリックスである。いくつかの実施形態において、そのＣＡＲにおけるドメインのうちの１つと天然に会合する膜貫通ドメインが使用される（例えば、その細胞へと突き出し、所望のシグナルを伝達するシグナル伝達エンドドメインの本来の分子）。場合によっては、その膜貫通ドメインは選択され得るか、または同じもしくは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのこのようなドメインの結合を回避して、そのレセプター複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするためにアミノ酸置換によって改変され得る。その膜貫通ドメインは、天然由来または合成供給源由来のいずれであってもよい。その供給源が天然である場合、そのドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。例えば、膜貫通領域は、Ｔ細胞レセプターのα、βもしくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３  ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４に、または免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ４）に由来し得る。あるいは、その膜貫通ドメインは合成でもよく、その場合には、その膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリンのような主に疎水性の残基を含む。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見出される。必要に応じて、短いオリゴまたはポリペプチドリンカー（好ましくは２〜１０アミノ酸の間の長さ）が、その膜貫通ドメインとＣＡＲの細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成し得る。グリシン−セリンダブレットは、特に適切なリンカーを提供する。
【００５８】
スペーサー  −  用語「スペーサー」とは、膜貫通ドメインを、ポリペプチド鎖の中の細胞外ドメインまたは細胞質ドメインのいずれかに連結する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドに言及する。そのスペーサーは、抗原認識部分が、異なる方向に配向して、抗原認識および結合を容易にすることを可能にするために十分可撓性であるべきである。スペーサー領域の１つの単純な形態は、ＩｇＧ１のヒンジ領域である。代替手段としては、免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域およびＣＤ３の一部が挙げられる。大部分のｓｃＦｖベースのＣＡＲに関しては、ＩｇＧ１ヒンジが十分である。スペーサードメインは、３００個までのアミノ酸、好ましくは１０〜１００個のアミノ酸、および最も好ましくは２５〜５０個のアミノ酸を含み得る。なお別の例では、その長さを変化させるためにヒンジ領域が改変され得、それによってさらなる機能的利益が達成され得る。例えば、ＣＤ８またはＣＤ２８ヒンジを含む旧来のＣＡＲでは、１個のシステイン（Ｃｙｓ）が、そのヒンジの中に残されて、Ｔ細胞表面上のダイマー化を安定化し得る。従って、２個のｓｃＦｖが通常はディスプレイされる（二価）。別の例では、その安定化するジスルフィド結合が形成できず、それによって、ダイマー化、従って、未熟な活性化を防止するように、そのＣｙｓを（Ｓｅｒの代わりに）使用し得る。そのＣｙｓはまた、完全に除去され得る。別のデザインは、１つのＣＡＲ上にＶＨドメインのみを、および別のＣＡＲ上にＶＬドメインをディスプレイすることであり、従ってそのＣｙｓ対形成は、そのＶＨ／ＶＬを整列させて、目的の抗原を標的化する機能的な一価Ｆｖを形成する。
【００５９】
ＴＡＧ−７２を標的化するＣＡＲをコードする核酸構築物の例は図４Ａに示され、ＣＡＲおよびＣＡＲにおける使用に適した種々のドメインの例示的配列は、配列番号１〜１１に提供される。
【００６０】
【表１−１】
2021514360.tif 000002
【００６１】
発現ベクター／構築物  −  レシピエント細胞においてＣＡＲを発現するための構築物またはベクターは、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む１またはこれより多くのＤＮＡ領域、および、必要に応じて、選択マーカーをコードする第２のＤＮＡ領域を含み得る。そのプロモーターは、誘導性または構成性であり得る。適切な構成性プロモーターの例としては、例えば、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、伸長増殖因子−１ａ（ＥＦ−１ａ）遺伝子プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター。マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタインバーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター（アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
その発現構築物は、組換えまたは合成技術を含む任意の適切な方法によって、当該分野で公知かつ利用可能なある範囲のベクター（例えば、とりわけプラスミド、バクテリオファージ、バキュロウイルス、哺乳動物ウイルス、人工染色体）を利用して、生成され得る。その発現構築物は、環状または直線状であり得、複製および真核生物への組み込みに適しているべきである。ウイルス（これは、ベクターとして有用である）としては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。多くのウイルスベースのシステムが、哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムに都合の良いプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当該分野で公知の技術を使用して、ベクターへと挿入され得、レトロウイルス粒子中にパッケージされ得る。次いで、その組換えウイルスは単離され得、主題の幹細胞へと送達され得る。多くのレトロウイルスシステムは、当該分野で公知である。
【００６３】
ＣＡＲ発現細胞  −  ＣＡＲをコードする発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段によって、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）へと容易に導入され得る。ポリヌクレオチドを宿主細胞へと導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ウイルスベクターを宿主哺乳動物細胞へと導入するための生物学的方法が、広く使用される。ポリヌクレオチドを宿主細胞へと導入するための化学的手段としては、コロイド分散システム（例えば、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および脂質ベースのシステム（水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームが挙げられる）が挙げられる。送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイドシステムは、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。本明細書で使用される細胞、例えば、Ｔ細胞およびＮＫ細胞は、ヒト被験体（正常な健常個体または処置されるべき個体のいずれか）から、公知の方法を使用して得られ得る。本明細書で使用される細胞、例えば、Ｔ細胞およびＮＫ細胞はまた、幹細胞、例えば、ドナー個体から得られる細胞を再プログラムすることによって得られる人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）の分化によって生成され得る。ＣＡＲをコードする発現ポリヌクレオチドを有するその得られた細胞は、臨床使用の前に評価され得る（例えば、ＣＡＲの発現、インビトロでのＴＡＧ−７２発現標的細胞の認識および殺滅に関する評価）。
【００６４】
処置および投与
本開示によれば、本明細書で開示されるＴＡＧ−７２標的化薬剤は、がん性状態を処置するために、ＴＣＬ（特に、ＣＴＣＬ（例えば、ＳＳ））に罹患している患者に投与され得る。
【００６５】
用語「処置」とは、がんの増殖および／または転移の有効な阻害（例えば、遅らせることまたは排除すること）に言及する、
【００６６】
本明細書で開示されるＴＡＧ−７２標的化薬剤は、全身に（例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下または筋肉内の経路のような非経口経路を介して）、または皮膚病変への直接注射を介して投与され得る。投与されるべき薬剤の投与量は、その薬剤の性質、がんのステージ、および他の臨床因子（例えば、その被験体の体重および状態、製剤のタイプおよび投与経路）に依存する。治療上有効でありかつ有害でない正確な投与量は、当業者によって決定され得る。
【００６７】
いくつかの実施形態において、その処置は、血液中でのＴＡＧ−７２発現Ｔ細胞の増大したレベルまたは割合を有すると同定されているＴＣＬ患者に指向される。「増大したレベル」とは、患者におけるＴＡＧ−７２発現Ｔ細胞のレベルが、健常個体におけるレベル（すなわち、コントロールレベル）より有意に、例えば、少なくとも５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、またはこれより高いことを意味する。そのレベルは、ＴＡＧ−７２陽性である血液中のＴ細胞（これは、例えば、Ｔ細胞マーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、もしくはＣＤ４５ＲＯ、またはこれらの組み合わせ）に関する表面抗原染色およびＴＡＧ−７２に関する染色を使用するＦＡＣＳ分析によって同定され得る）のパーセンテージに基づいて決定され得る。あるいは、ＣＴＣＬ患者の血漿または血清中の可溶性ＴＡＧ−７２は、標準的技術（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって検出され得る。
【００６８】
よって、患者血液中のＴＡＧ−７２発現Ｔ細胞のレベルおよび／または血漿もしくは血清中の可溶性ＴＡＧ−７２の存在を決定することによって、ＴＣＬ患者を分類またはサブタイプに分ける方法がまた、本明細書で開示される。血液中のＴＡＧ−７２発現Ｔ細胞の増大したレベルまたは可溶性ＴＡＧ−７２の増大したレベルを有する患者は、本明細書で開示されるＴＡＧ−７２標的化薬剤に基づく処置に応答すると考えられる。
【００６９】
本明細書で開示されるＴＡＧ−７２特異的処置は、ＴＣＬ、および特に、ＣＴＣＬの他の処置と組み合わされ得る。ＣＴＣＬの現行の処置選択は、代表的には、皮膚が関わる程度、皮膚病変のタイプ、およびそのがんがリンパ節または他の内部器官に拡がっているか否かに依存し、皮膚または全身のどちらかに指向され得る。既存の皮膚指向性の治療は、斑および制限された局面の疾患に有用であり、コルチコステロイド、レチノイド、またはイミキモド（これは、免疫細胞を活性化する）、メクロレタミンゲル（Ｖａｌｃｈｌｏｒ）、局所的化学療法、局所照射、メトトレキサート、フォトフェレシス、紫外線（光線療法）のような局所的処置が挙げられる。メクロレタミンはまた、静脈内処置として承認されている。
【００７０】
本説明は、以下の実施例によってさらに例証される。その実施例は、限定としては如何様にも解釈されるべきでない。全ての引用参考文献（本出願全体を通じて引用されているとおりの参考文献、発行された特許、および公開特許出願を含む）の内容は、明示的に参考として援用される。
【実施例】
【００７１】
実施例１  −  ＳＳを有する患者の血液中でのＴＡＧ−７２＋Ｔ細胞のＦＡＣＳによる同定
ＳＳと診断されたドナーの全血を、静脈穿刺によって得、クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）チューブに集めた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ密度遠心分離によって分離し、得られた細胞を直ぐに特徴づけたかまたは低温保存した。
【００７２】
簡潔には、単離された患者のＰＢＭＣを、遮光して８色抗体カクテルとともに４℃で１５分間インキュベートした（１×１０７細胞／１００μＬ）。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、その後、最終容積２００μＬに再懸濁した。フローサイトメトリー分析を、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ分析器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で行った。データ分析を、ＦｌｏｗＬｏｇｉｃソフトウェアを使用して行った。
【００７３】
Ｔ細胞を、ＴＡＧ−７２発現の分析とともに、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、およびＣＤ４５ＲＯに関して、またはＣＤ３単独に関して、表面抗原染色を使用してＦＡＣＳ分析によって分析した（図１Ａ〜１Ｍおよび図２）。さらなる表面抗原（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３０、ＣＤ１５８ｋ、ＣＬＡおよびＣＣＲ４）の分析をまた、ＳＳ表現型の特徴付けにおいて実施し得る。
【００７４】
図２の結果を表１にまとめる。
【００７５】
【表１−２】
2021514360.tif 000003
【００７６】
健常ドナーとＴＣＬドナーとの間のＴＡＧ−７２＋Ｔ細胞の頻度には重なり合いがあるが、その頻度はＴＣＬ患者において上昇する。表２は、健常ドナーとＴＣＬドナーとの間のカットオフレベルとしての頻度１０％を使用して表１からのデータの分析を示す。
【００７７】
【表２】
2021514360.tif 000004
【００７８】
２群間の差異は、統計的に有意である［χ２＝７．２９１１，  ｐ＝０．００６９３］。
【００７９】
ＴＡＧ−７２が白血病患者の細胞で検出され得るか否かを決定するために、Ｔ−ＡＬＬ患者（ｎ＝５）およびＢ−ＡＬＬ患者（ｎ＝４）から全血または骨髄（ＢＭ）を得た。ここで目的の細胞を、先に記載されるように、Ｆｉｃｏｌｌ密度遠心分離を使用して単離した。特徴付けに使用される得られた細胞を、低温保存した。単離された患者のＰＢＭＣまたはＢＭ細胞（２×１０５細胞／試験）を、ＣＤ３、ＣＤ１９およびＴＡＧ−７２の蛍光結合体化抗体の組み合わせとともに、遮光して４℃で１０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、その後、最終容積２００μＬに懸濁した。フローサイトメトリー分析を、ＢＤ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙ分析器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った。データ分析を、ＦｌｏｗＬｏｇｉｃソフトウェアを使用して行った。
【００８０】
図１Ｎ〜１Ｖに示されるように、ＴＡＧ−７２レベルは、Ｔ−ＡＬＬ（Ｎ〜Ｒ）またはＢ−ＡＬＬ（Ｓ〜Ｖ）の患者サンプルにおいてベースラインを超えなかった。これは、異常なＴＡＧ−７２がＴＣＬのＴ細胞としか関連しないようであることを示唆する。
【００８１】
実施例２  −  ＴＣＬの多数の形態におけるＴＡＧ−７２発現の実証
ＴＣＬ患者（ＳＳ、非ＳＳ  ＣＴＣＬおよびＰＴＣＬを含む）のＰＢＭＣおよびＨＤ  ＰＢＭＣを、フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ３およびＴＡＧ−７２発現に関して分析した。ＰＢＭＣを、先に記載されるように、Ｆｉｃｏｌｌ密度遠心分離を使用して全血から単離した。得られたＰＢＭＣを定量し、各ドナーにつき同数の細胞（２×１０５細胞／１００μＬ）を、遮光して、抗ＣＤ３および抗ＴＡＧ−７２のフルオロフォア結合体化抗体とともに、１５分間、４℃においてインキュベートした。細胞を、冷ＰＢＳで２回洗浄し、その後、最終容積２００μＬに再懸濁した。ヨウ化プロピジウムを、分析直前にサンプルに添加した。ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してサンプルを分析した。データ分析を、ＦｌｏｗＬｏｇｉｃソフトウェアを使用して行った。
【００８２】
図２は、ＳＳ、非ＳＳ  ＣＴＣＬおよびＰＣＴＬのＣＤ３＋Ｔ細胞が、ＨＤ  ＣＤ３＋Ｔ細胞より有意に高い頻度でＴＡＧ−７２を発現することを示す。
【００８３】
実施例３  −  ＣＴＣＬ患者の血漿中での可溶性ＴＡＧ−７２の実証
血漿サンプルを、２９名のＣＴＣＬ患者（２４名のＳＳおよび５名の菌状息肉腫）および１４名の健常ドナーから得た。そのサンプルを、可溶性ＴＡＧ−７２のレベルに関して、市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、その製造業者の製品説明シート（ＩＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  ＣＡ  ７２−４  ＥＬＩＳＡ，  ＲＥ５４１１１）に従って操作してアッセイした。正常ヒトＡＢ血清を、さらなる正常コントロールとして含めた。
【００８４】
図３Ａ〜３Ｂは、ＣＴＣＬ患者の血漿中の可溶性ＴＡＧ−７２のレベルが、健常ドナーの血清中の可溶性ＴＡＧ−７２のレベルより有意に高かったことを示す。
【００８５】
実施例４  −  ＣＴＣＬ患者の皮膚生検におけるＴＡＧ−７２を有する細胞の検出
皮膚生検を、１１名の患者  −  ５名のＳＳ、３名のＭＦ、１名の未分化Ｔ細胞リンパ腫および２名の暫定的に診断されたＭＦ患者  −から得、直ぐにホルマリン固定した。４μｍ切片を、その生検から切り出し、次いで、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）によって、またはＴＡＧ−７２もしくはＣＤ３（Ｔ細胞マーカー）の発現に関して、標準的な免疫組織化学技術を使用して染色した。スライドを、熟練の組織学者によって（そのサンプルが何であるかについては盲検にして）、ＴＡＧ−７２またはＣＤ３に関して陽性かまたは陰性かのいずれかとしてスコア付けした。
【００８６】
図４Ａは、切片の各々についてのサンプル顕微鏡視野（×４０倍率で）を示す。その患者サンプルのうちの４つを、ＴＡＧ−７２に関して陽性とスコア付けした（患者１、２、１０および１１）が、その１１個のサンプルのうちの全１０個は、ＣＤ３に関して陽性とスコア付けした（１個のサンプルは利用可能でなかった）。ＣＴＣＬ患者の皮膚におけるＴ細胞の存在は、周知である。ＴＡＧ−７２陽性細胞の存在（ＣＤ３と、従って、おそらくＴＡＧ−７２陽性Ｔ細胞と共局在する）は、以前は知られていなかった。ＣＴＣＬ患者の皮膚におけるＴＡＧ−７２陽性Ｔ細胞の検出頻度（３６％）は、表２に示されるように、比較的小さいサンプル数という制限内ではあるが、ＴＣＬ患者におけるＴＡＧ−７２陽性Ｔ細胞の上昇したレベルの頻度（４５％）と十分に相関する。
【００８７】
図４Ｂは、利用可能な場合にマッチしたドナーからの浸潤Ｔ細胞および循環Ｔ細胞上のＴＡＧ−７２の発現をまとめる。ＴＡＧ−７２発現は、循環Ｔ細胞および浸潤Ｔ細胞の両方が、２／１１サンプルにおいてＴＡＧ−７２＋と認識される（ここでは４個のサンプルは利用可能でなかった）ので、疾患表現型の１局面に限定されない。
【００８８】
実施例５  −  ＴＡＧ−７２を標的化するＣＡＲ−Ｔ細胞の作製
ＴＡＧ−７２を標的化するＣＡＲ構築物を生成した。これを、図５Ａに図示する。そのＣＡＲは各々、図５Ｂに示されるアミノ酸配列を有するＴＡＧ−７２に対して特異的な単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）から構成される。これらＣＡＲ構築物を、Ｔ細胞の形質導入のために使用されるレンチウイルスベクターにクローニングした。その後の実施例に示される結果は、それぞれ、ＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（１）Ｔ細胞またはＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（３）Ｔ細胞を生成するために、ドナー由来Ｔ細胞へと形質導入されるＴＡＧ−７２（１）構築物またはＴＡＧ−７２（３）構築物のいずれかを利用した。その２つの構築物は、同じＴＡＧ−７２  ｓｃＦｖ（配列番号２）を有するが、図５Ａに示されるように、それらのヒンジ、膜貫通およびシグナル伝達ドメイン配列において異なる。
【００８９】
レンチウイルスを作製するために、２９３Ｔ細胞を、ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ）被覆した１７５ｃｍ２  フラスコ上にプレートした。トランスフェクション前の２時間、培地を１０％  ＦＣＳを補充したＤＭＥＭに交換した。そのレンチウイルス移入ベクターＤＮＡを、パッケージングおよびエンベローププラスミドＤＮＡと一緒に合わせ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００と混合した。その溶液を短時間ボルテックスにかけて、室温で３０分間インキュベートした。この後、その溶液を再び混合し、次いで、細胞に滴下して添加した。フラスコをインキュベーターに戻した。６時間後、新鮮な増殖培地を添加した。ウイルス上清を４８時間後に集め、４℃において１５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって清澄にし、次いで、０．４５μｍ孔のＰＶＤＦ  Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＶフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通した。超遠心分離を使用するレンチウイルスの濃縮を、Ｓｏｒｖａｌ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １００  ＳＥ遠心分離機でＡＨ−６２９ローターを使用して行った。３０ｍＬの濾過したウイルス上清を、３６ｍＬ  ポリアロマーコニカルチューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ）に添加した。９０分間、２０，０００ｇにおいて遠心分離を行った。上清を完全に除去し、ウイルスペレットを、３００μＬ  ＰＢＳに再懸濁し、使用時まで−８０℃で貯蔵した。
【００９０】
Ｔ細胞の最適なレンチウイルス形質導入は、ＴＣＲおよび共刺激レセプターでのそれらの活性化を含む。よって、０日目に、新鮮なＰＢＭＣを、健常ドナーからのアフェレーシスによって集め、常磁性ビーズに結合した抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣｌｉｎＥｘＶｉｖｏ  ＣＤ３／ＣＤ２８，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を３：１（ビーズ：細胞）の比で使用して、活性化Ｔ細胞を富化した。その細胞およびビーズを、１時間、室温で共にインキュベートし、ＣＤ３＋細胞富化を、磁石（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。そのＣＤ３＋画分中の細胞を、１００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を有するＴ細胞拡大培地中の１×１０６細胞／ｍｌの濃度で、開始培地に再懸濁した。１日目に、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎを使用して、ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍＬの溶液において、２ｍｇ／ｃｍ２の濃度で細胞培養ディッシュを、一晩４℃で被覆した。２日目に、そのＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ溶液を吸引し、その同じ容積のブロッキング溶液（ＰＢＳ中０．５％  ヒト血清アルブミンからなる）を、各ディッシュに添加し、室温において３０分間インキュベートした。そのブロッキング溶液を吸引し、各ディッシュをＰＢＳで洗浄した。レンチウイルス上清を急速解凍し、各ディッシュに３００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を有するＴ細胞拡大培地とともに添加した。その培養物をインキュベーターの中に戻し、少なくとも２４時間静置した。４日目に、形質導入を停止した；細胞を、０．５〜１×１０６細胞／ｍＬの濃度で新鮮なＴ細胞拡大培地中に再懸濁した。その培養物を１４日目まで維持し、１日おきに新鮮な拡大培地を与えて、１×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度を維持した。
【００９１】
実施例６  −  インビトロでのＴＡＧ−７２標的化ＣＡＲ−Ｔ細胞を使用するＴＡＧ−７２＋接着性細胞株の特異的殺滅
リアルタイム細胞モニタリングシステム（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ）を使用して、インビトロでＣＡＲ−Ｔ細胞の殺滅効率を決定した。１０，０００  標的細胞／１００μＬ（例えば、卵巣がん細胞株Ｏｖｃａｒ３）を、１０％〜２０％  ウシ胎仔血清を補充した培養培地（例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地）に再懸濁し、ＲＴＣＡプレートに沈着させた。標的細胞を３７℃、５％  ＣＯ２において３〜２０時間維持して、細胞付着を可能にした。標的細胞の付着の後、実施例３のＴＡＧ−７２特異的ＣＡＲ−Ｔエフェクター細胞を、１：５〜５：１の範囲で変わるエフェクター：標的比で添加した。場合によっては、エフェクター細胞を、使用前にＦＡＣＳを介してＧＦＰまたはＦＬＡＧ発現に基づいて単離した。共培養を、最適な増殖条件において少なくとも１２時間維持した。全体を通じて、細胞インピーダンスをモニターした；インピーダンスの減少は、細胞解離および最終的には細胞死を示す。
【００９２】
ＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（１）およびＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（３）Ｔ細胞は、ＴＡＧ−７２ｈｉ発現標的がん細胞（Ｏｖｃａｒ  ３）の強力な細胞殺滅を媒介したが、ＴＡＧ−７２−ｖｅ／ｌｏｗがん標的細胞（ＭＥＳｏｖ）では媒介しなかった（図６Ａ〜６Ｄ）。
【００９３】
実施例７  −  インビトロでのＴＡＧ−７２標的化ＣＡＲ−Ｔ細胞を使用するＴＡＧ−７２＋非接着性Ｊｕｒｋａｔ細胞の特異的殺滅
Ｔ細胞白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔを、フローサイトメトリーを使用して、ＴＡＧ−７２発現細胞株として確認した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は非接着性であるので、ＳＳ患者の細胞を試験するための良好なモデルの代表である。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＴＡＧ−７２  ＣＡＲ−Ｔ（１）、ＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（３）または同じドナーの非形質導入（ＮＴ）ＰＢＭＣとともに、エフェクター：標的比  ５：１で共培養した。場合によっては、エフェクター細胞を、使用前にＦＡＣＳを介して、ＧＦＰまたはＦＬＡＧ発現に基づいて単離した。培養物を、３７℃、５％  ＣＯ２において４８時間維持した。この時点で、共培養物を、ＴＡＧ−７２発現に関するフローサイトメトリーによって再び分析した。さらに、ＡｎｎｅｘｉｎおよびＰＩ染色を行って、その共培養物において死細胞を早期アポトーシス細胞から区別した。ＣＡＲ−Ｔ細胞がＴＡＧ−７２を発現しないと考えれば、ＦＡＣＳ分析において、標的細胞の死とエフェクター細胞の死とを区別することは可能であった。
【００９４】
図７Ａ〜７Ｅは、Ｊｕｒｋａｔ細胞が、ＴＡＧ−７２を発現し、ＴＡＧ−７２を標的化するＣＡＲ−Ｔ細胞によってインビトロで、懸濁培養物中で殺滅され得ることを示す。
【００９５】
実施例８  −  インビトロでのＴＡＧ−７２標的化ＣＡＲ−Ｔ細胞を使用するセザリー疾患を有する患者のＴ細胞の殺滅
ＳＳ患者のＰＢＭＣを、全血からの単離直後に使用したか、または使用する日に凍結したストックから解凍した。ＴＡＧ−７２  ＣＡＲ−Ｔ（１）エフェクター細胞を、エフェクター：標的比  ５：１でマルチウェルプレートにおいて、患者のＰＢＭＣに添加した。場合によっては、エフェクター細胞を、使用前にＦＡＣＳを介して、ＧＦＰまたはＦＬＡＧ発現に基づいて単離した。細胞懸濁物を、ヒト血清を補充したＴ細胞拡大培地中で、３７℃、５％  ＣＯ２において４８時間維持し、その時点で、表現型分析を行った。ＴＡＧ−７２に関する染色を４℃で１５分間（１×１０７細胞／１００μＬ）、遮光して行った。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、その後、最終容積２００μＬに再懸濁した。フローサイトメトリー分析を、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で行った。データ分析を、ＦｌｏｗＬｏｇｉｃソフトウェアを使用して行った。健常ドナーのＰＢＭＣを維持し、並行して分析した。
【００９６】
図８Ａ〜８Ｅは、ＳＳ患者のＰＢＭＣのリンパ球集団内のＴＡＧ−７２＋細胞のパーセンテージが、インビトロでのＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（１）Ｔ細胞への４８時間の曝露後に有意に低減されることを示す。
【００９７】
実施例９  −  インビトロでのＴＡＧ−７２  ＣＡＲ（３）Ｔ細胞を使用するＣＴＣＬを有する患者のＴ細胞の殺滅
ＳＳ患者のＰＢＭＣを、全血からの単離直後に使用したか、または使用する日に凍結したストックから解凍した。ＴＡＧ−７２（３）ＣＡＲ−Ｔエフェクター細胞（４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ＧＦＰレポーターなしのＣＡＲ−Ｔ細胞）を、エフェクター：標的比  ５：１でマルチウェルプレートにおいて、患者のＰＢＭＣに添加した。細胞懸濁物を、ヒト血清を補充したＴ細胞培地中で、３７℃、５％  ＣＯ２において２４時間維持し、その時点で、表現型分析を行った。ＴＡＧ−７２およびＣＤ３に関する染色を４℃で１５分間（２×１０５細胞／試験）、遮光して行った。細胞を２回洗浄し、その後、最終容積２００μＬに再懸濁した。フローサイトメトリー分析を、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して行った。データ分析を、ＦｌｏｗＬｏｇｉｃを使用して行った。健常ドナーのＰＢＭＣを維持し、並行して分析した。３名の独立した健常ドナーから得たＴ細胞から生成したＣＡＲ−Ｔ細胞を使用した。これは、そのＣＡＲ−Ｔ細胞の殺滅能力がドナー依存性ではなかったことを示す。
【００９８】
図９Ａ〜９Ｈは、ＴＡＧ−７２＋Ｔ細胞の頻度が、インビトロでのＴＡＧ−７２（３）Ｔ細胞への２４時間の曝露後に低減されることを示す。
【００９９】
実施例１０  −  抗ＴＡＧ−７２抗体−薬物結合体を使用するＴＡＧ−７２＋細胞の殺滅
ＳＳ患者および正常コントロールドナーのＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ密度遠心分離を使用して全血から分離した。得られた細胞を直ぐに使用したか、または使用する日に凍結したストックから解凍した。細胞懸濁物を、５％  ヒトＡＢ血清および２０Ｕ  ＩＬ−２を補充したＴ細胞拡大培地中で、３７℃、５％  ＣＯ２において維持した。細胞を、抗ＴＡＧ−７２抗体−薬物結合体ＣＣ４９−ＤＭ１に４８時間曝し、その時点で表現型分析を行って、非処置コントロールと比べた、ＳＳ亜集団（ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ７ｎｅｇ／ＣＤ４５ＲＯ＋）および正常なＰＢＭＣ内に残っているＴＡＧ−７２＋細胞のレベルを決定した。そのＴＡＧ−７２発現Ｔ細胞白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔを、並行して分析した。ここで全生存ＴＡＧ−７２＋細胞における変化をモニターした。
【０１００】
図１０Ａ〜１０Ｅは、そのＴＡＧ−７２抗体−薬物結合体が、ＳＳ患者のＰＢＭＣ中の、および培養したＪｕｒｋａｔ細胞中のＴＡＧ−７２＋細胞のパーセンテージを実質的に低減し得たことを示す。健常ドナーのＰＢＭＣに対する効果は何ら認められなかった。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図７Ｃ−７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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