(57)【要約】老化、疾患、または他の状態に関連する標的細胞、とりわけ、老化細胞または癌細胞である標的細胞を含む、標的細胞内の、アポトーシス促進性タンパク質などの治療用タンパク質の標的細胞に特異的な産生のための核酸ベースの発現構築物が提供される。核酸ベースの発現構築物の送達のための、融合性脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤および系を含む製剤および系、ならびに、老化、疾患、または他の状態に関連する老化細胞および／または癌細胞などの細胞の成長および／または生存を減少させ、予防し、および／または排除するためにそのような核酸ベースの発現構築物、組成物、および系を製造および使用するための方法、さらに、老化、疾患、または他の状態に関連する標的細胞、とりわけ、老化細胞または癌細胞である標的細胞において、アポトーシス促進性タンパク質などの治療用タンパク質の標的細胞に特異的な産生のための発現構築物を含む融合性ＬＮＰ製剤などの製剤のインビボ投与を介する、老化、疾患、または他の状態の処置のための方法も提供される。【選択図】図１
2021526505.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞内の治療用タンパク質の標的化産生のための脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤であって、
ＬＮＰ製剤は：
ａ．両方の標的細胞または非標的細胞を含む哺乳動物細胞への核酸の非特異的な送達のための脂質ナノ粒子ベクターであって、前記脂質ナノ粒子が１つ以上の脂質と１つ以上の融合性タンパク質を含む、脂質ナノ粒子ベクターと、
ｂ．標的細胞内での治療用タンパク質の優先的な産生のための発現構築物を含み、
前記発現構築物は：
ｉ．前記非標的細胞と比較して、前記標的細胞内で優先的に産生される１つ以上の因子に応答して活性化される転写プロモーターと、
ｉｉ．前記転写プロモーターに動作可能に連結され、かつ、前記転写プロモーターの調節制御下にある核酸であって、前記核酸は、標的細胞と非標的細胞の両方を含む、哺乳動物細胞の成長および／または生存を減少させ、予防し、および／または排除することができる治療用タンパク質をコードし、ならびに、前記治療用タンパク質は前記標的細胞内で産生されるが、前記非標的細胞内では産生されない、核酸とを含む、
ＬＮＰ製剤。
【請求項２】
前記１つ以上の脂質は、１ｍＭから１００ｍＭの範囲の濃度で前記ＬＮＰ製剤中に存在する、請求項１に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項３】
前記１つ以上の脂質は、５ｍＭから５０ｍＭの範囲の濃度で前記ＬＮＰ製剤中に存在する、請求項２に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項４】
前記１つ以上の脂質は、１０ｍＭから３０ｍＭの範囲の濃度で前記ＬＮＰ製剤中に存在する、請求項３に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項５】
前記１つ以上の脂質は、１５ｍＭから２５ｍＭの範囲の濃度で前記ＬＮＰ製剤中に存在する、請求項４に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項６】
前記１つ以上の脂質は、約２０ｍＭの濃度で前記ＬＮＰ製剤中に存在する、請求項５に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項７】
前記１つ以上の脂質は、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール、および１，２−ジミリストイル−ｒａｃ−グリセロ−３−メトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ−ＰＥＧ）からなる群から選択される、請求項１に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項８】
前記脂質は、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧからなる群から選択される２以上の脂質を含む、請求項７に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項９】
前記脂質は、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧを含む、請求項８に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項１０】
前記ＤＯＤＡＰ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧは、３５−５５モル％のＤＯＤＡＰ：１０−２０モル％のＤＯＴＡＰ：２２．５−３７．５モル％のＤＯＰＥ：４−８モル％のコレステロール：３−５モル％のＤＭＧ−ＰＥＧのモル比で前記ＬＮＰ製剤中に存在する、請求項９に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項１１】
前記ＤＯＤＡＰ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧは、約４５モル％のＤＯＤＡＰ：約１５モル％のＤＯＴＡＰ：約３０モル％のＤＯＰＥ：約６モル％のコレステロール：および、約４モル％のＤＭＧ−ＰＥＧのモル比で前記ＬＮＰ製剤中に存在する、請求項１０に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項１２】
前記ＤＯＤＡＰ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧは、４５モル％のＤＯＤＡＰ：１５モル％のＤＯＴＡＰ：３０モル％のＤＯＰＥ：６モル％のコレステロール：４モル％のＤＭＧ−ＰＥＧのモル比で前記ＬＮＰ製剤中に存在する、請求項１１に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項１３】
前記１つ以上の融合性タンパク質は、０．５μＭから２０μＭの範囲の濃度で前記ＬＮＰ製剤中に存在する、請求項１に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項１４】
前記１つ以上の融合性タンパク質は、１μＭから１０μＭの範囲の濃度で前記ＬＮＰ製剤中に存在する、請求項１３に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項１５】
前記１つ以上の融合性タンパク質は、３μＭから４μＭの範囲の濃度で前記ＬＮＰ製剤中に存在する、請求項１４に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項１６】
前記１つ以上の融合性タンパク質は、３．５μＭの濃度で前記ＬＮＰ製剤中に存在する、請求項１５に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項１７】
前記融合性タンパク質の１つ以上は、ｐ１４融合性タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）とｐ１４ｅ１５融合性タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）からなる群から選択される、請求項１に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項１８】
前記融合性タンパク質は、ｐ１４融合性タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）である、請求項１に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項１９】
前記融合性タンパク質は、ｐ１４ｅ１５融合性タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）である、請求項１に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項２０】
前記発現構築物は、２０μｇ／ｍＬから１．５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で前記ＬＮＰ製剤中に存在する、請求項１に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項２１】
前記発現構築物は、１００μｇ／ｍＬから５００μｇ／ｍＬの範囲の濃度で前記ＬＮＰ製剤中に存在する、請求項２０に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項２２】
前記発現構築物は、２５０μｇ／ｍＬの濃度で前記ＬＮＰ製剤中に存在する、請求項２１に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項２３】
前記発現構築物は、２５０μｇ／ｍＬの濃度で前記ＬＮＰ製剤中に存在する、請求項２１に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項２４】
前記転写プロモーターは、ｐ１６転写プロモーター、ｐ２１転写プロモーター、およびｐ５３転写プロモーターからなる群から選択される、請求項１に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項２５】
前記転写プロモーターは、ＳＰ１、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、およびｐ５３／ＴＰ５３からなる群から選択された因子に応答する、請求項２４に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項２６】
前記転写プロモーターは、ｐ１６ＩＮＫ４ａ／ＣＤＫＮ２Ａ転写プロモーターとｐ２１／ＣＤＫＮ１Ａ転写プロモーターから選択される、請求項２４に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項２７】
前記転写プロモーターは、ＥＢＦ３、Ｏ／Ｅ−１、Ｐａｘ−５、Ｅ２Ａ、ｐ５３、ＶＰ１６、ＭＬＬ、ＨＳＦ１、ＮＦ−ＩＬ６、ＮＦＡＴ１、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＨＯＸ、Ｅ２Ｆ３、および／またはＮＦ−κＢの転写因子からなる群から選択された因子に応答する、請求項２４に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項２８】
前記転写プロモーターは、ｐ２１ｃｉｐ１／ｗａｆ１プロモーター、ｐ２７ｋｉｐ１プロモーター、ｐ５７ｋｉｐ２プロモーター、ＴｄＴプロモーター、Ｒａｇ−１プロモーター、Ｂ２９プロモーター、Ｂｌｋプロモーター、ＣＤ１９プロモーター、ＢＬＮＫプロモーター、および出るＰλ５プロモーターからなる群から選択される、請求項２７に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項２９】
前記核酸は、カスパーゼ（Ｃａｓｐ）、誘導性カスパーゼ（ｉＣａｓｐ）、自己活性化カスパーゼ（ｓａＣａｓｐ）、ＢＡＸ、ＤＦＦ４０、ＨＳＶ−ＴＫ、およびシトシンデアミナーゼからなる群から選択された治療用タンパク質をコードする、請求項１に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項３０】
前記核酸は、Ｃａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、およびＣａｓｐ９からなる群から選択されたカスパーゼをコードする、請求項２９に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項３１】
前記核酸はＣａｓｐ９をコードする、請求項３０に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項３２】
前記核酸は誘導性Ｃａｓｐ９（ｉＣａｓｐ９）をコードする、請求項３１に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項３３】
前記核酸は自己活性化Ｃａｓｐ９（ｓａＣａｓｐ９）をコードする、請求項３１に記載のＬＮＰ製剤。
【請求項３４】
標的細胞の成長を減少させ、予防し、および／または排除するための方法であって、
前記方法は、標的細胞をＬＮＰ製剤に接触させる工程を含み、
前記ＬＮＰ製剤は：
ａ．両方の標的細胞または非標的細胞を含む哺乳動物細胞への核酸の非特異的な送達のための脂質ナノ粒子ベクターであって、前記脂質ナノ粒子が１つ以上の脂質と１つ以上の融合性タンパク質を含む、脂質ナノ粒子ベクターと、
ｂ．標的細胞内での治療用タンパク質の優先的な産生のための発現構築物を含み、
前記発現構築物は：
ｉ．前記非標的細胞と比較して、前記標的細胞内で優先的に産生される１つ以上の因子に応答して活性化される転写プロモーターと、
ｉｉ．前記転写プロモーターに動作可能に連結され、かつ、前記転写プロモーターの調節制御下にある核酸であって、前記核酸は、標的細胞と非標的細胞の両方を含む、哺乳動物細胞の成長および／または生存を減少させ、予防し、および／または排除することができる治療用タンパク質をコードし、ならびに、前記治療用タンパク質は前記標的細胞内で産生されるが、前記非標的細胞内では産生されない、核酸とを含む、
方法。
【請求項３５】
標的細胞を有する患者の疾患または疾病の処置のための方法であって、
前記方法は：
ＬＮＰ製剤を前記患者に投与する工程を含み、
前記ＬＮＰ製剤は：
ａ．両方の標的細胞または非標的細胞を含む哺乳動物細胞への核酸の非特異的な送達のための脂質ナノ粒子ベクターであって、前記脂質ナノ粒子が１つ以上の脂質と１つ以上の融合性タンパク質を含む、脂質ナノ粒子ベクターと、
ｂ．標的細胞内での治療用タンパク質の優先的な産生のための発現構築物を含み、
前記発現構築物は：
ｉ．前記非標的細胞と比較して、前記標的細胞内で優先的に産生される１つ以上の因子に応答して活性化される転写プロモーターと、
ｉｉ．前記転写プロモーターに動作可能に連結され、かつ、前記転写プロモーターの調節制御下にある核酸であって、前記核酸は、標的細胞と非標的細胞の両方を含む哺乳動物細胞の成長および／または生存を減少させ、予防し、および／または排除することができる治療用タンパク質をコードし、および、前記治療用タンパク質は前記標的細胞内で産生されるが、前記非標的細胞内では産生されない、核酸とを含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
このＰＣＴ特許出願は２０１９年４月１８日に出願され、２０１８年４月１８日に出願された米国仮特許出願６２／６５９，６７６号と２０１９年３月２０日に出願された米国仮特許出願６２／８２１，０８４号の利点を主張する。第６２／６５９，６７６号と第６２／８２１，０８４号の仮特許出願の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、２０１９年４月１８日に作成され、６８，８３１バイトのサイズを有する、「ＯＳＩＮ−０１−０３０４ＷＯ０１＿２０１９−０４−１８＿ＳＥＱＬＩＳＴ＿ＳＴ２５」という表題のｔｘｔファイルとしての電子フォーマットの配列表を含む。本出願はさらに、２０１９年４月１８日に作成された「ＯＳＩＮ−０１−０３０４ＷＯ０１＿２０１９−０４−１８＿ＳＥＱＬＩＳＴ＿ＳＴ２５」という表題のＰＤＦファイルとしての配列表を含む。「ＯＳＩＮ−０１−０３０４ＷＯ０１＿２０１９−０４−１８＿ＳＥＱＬＩＳＴ＿ＳＴ２５」という表題のｔｘｔとＰＤＦのファイルの内容は同一であり、参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
本開示は一般に、疾患の処置、長寿の促進、老化防止、および健康増進を含む医学の分野に関する。具体的には、本開示は、老化、病気、および他の疾病に関連する細胞の成長および／または生存を抑制するための組成物および方法と関係する。治療用タンパク質の標的細胞に特異的な発現のための発現構築物が提供され、上記発現構築物は、標的細胞内には存在するが、正常な非標的細胞には存在しないか、大幅に減少している、転写調節機能を含む固有の細胞内の機能を利用する。そのような発現構築物は、標的細胞への核酸の送達のためのベクターを含む系で使用され、ベクターは、必ずしも必要とするわけではないが、融合性脂質ナノ粒子、および、随意に、標的細胞への発現構築物の送達を増強するための標的化部分を含み得る。
【０００４】
関連技術の詳細
癌細胞、老化細胞、および望ましくない表現型を有する他の細胞は、人の一生の間に蓄積され得、適切な治療がなければ、こうした細胞は、人の罹患率と、最終的には死亡率に寄与するか、あるいはその原因となり得る。
【０００５】
疾患における老化細胞の役割と老化細胞を除去することの潜在的な利益は、Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７９：２３２−６（２０１１）などの科学出版物で議論されてきた。老化細胞の蓄積の問題に対処することを目的とする系と方法が記載されてきた。例えば、ＧｒｉｇｇｇのＰＣＴ特許公開第ＷＯ１９９２／００９２９８号は、カルノシンに類似する化学化合物を用いて細胞の老化を防止または逆転させるための系について記載しており、Ｇｒｕｂｅｒの米国特許出願公開第２０１２／０１８３５３４号は、放射線、超音波、毒素、抗体、および抗体−毒素複合体を用いて老化細胞を殺すための系について記載しており、これらの系は、治療分子の標的化に使用するための老化細胞表面タンパク質を含んでいる。
【０００６】
老化細胞の選択的死滅は、遺伝子組み換え実験動物以外の哺乳動物では非現実的であることが証明されている。現在利用可能な系および方法は、かなりの全身毒性を呈しており、目的とする細胞の標的化が不十分であり、十分な安全性に欠けている。このような技術的な欠点が、特定の癌の治療や老化の影響を遅らせるための安全で効果的な治療法の開発を妨げている。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、老化、疾患、および／または別の疾病に関連する細胞などの細胞（まとめて「標的細胞」）が、標的細胞への治療剤の標的送達を必要とすることなく、標的細胞に特異的な方法で選択的に死滅され得るという発見に基づくものである。本明細書に記載される発現構築物、系、および方法は、患者に対して限定的な治療上の利点を与えるものであった、治療剤の標的送達を採用する既存技術に関連する安全性および有効性の懸念を克服するものである。
【０００８】
本明細書に記載されているように、本開示は、細胞内で産生されると、老化、疾患、および／または他の状態に関連する細胞などの細胞の成長および／または生存を抑制または排除するタンパク質をコードする核酸の発現を、標的細胞に特異的な方法で誘導するための発現カセット、系、および方法を提供する。
【０００９】
本明細書に記載される発現カセット、系、および方法は、老化（老化細胞など）、疾患（癌、感染症、細菌性疾患など）、および／または他の疾病に関連する特定の細胞に内在する固有の転写調節機構を利用し、転写調節機構は、老化、疾患、または他の状態に関連しない正常な細胞（すなわち、「非標的細胞」）においては、作動しないか、または著しく減少した活性を呈する。
【００１０】
本開示の発現カセット、系、および方法は、標的細胞によって提供され、かつ標的細胞に固有の細胞内機能性の結果として、標的細胞特異性の高いレベルを達成し、細胞内機能性は正常な非標的細胞では提供されないか、または著しく減少している。したがって、本開示の系および方法は、核酸が送達される細胞型に関して非特異的である核酸送達ベクターを採用し、実際に、本明細書に記載されたベクターは、標的細胞特異性、およびその結果として、標的細胞の成長および／または生存の治療上効果的な減少、予防、および／または排除を達成するために、核酸（例えば、発現カセット）の標的細胞に特異的送達のために構成される必要はない。
【００１１】
特定の実施形態内では、本開示は、老化、疾患、および／または別の状態に関連する細胞などの標的細胞内での治療用タンパク質の標的化生成のための発現構築物を提供する。本明細書で開示される発現構築物は：（１）それぞれ標的細胞内で産生される１つ以上の因子に応答して活性化される転写プロモーター、および（２）転写プロモーターに動作可能に連結され、かつ転写プロモーターの調節制御下にある核酸を含み、ここで、核酸は、標的細胞を含む細胞の成長および／または生存を減少させ、予防し、および／または除去することができる治療用タンパク質をコードする。
【００１２】
これらの実施形態の特定の態様内では、転写プロモーターは、疾患、状態、または老化に関連する標的細胞において活性化されるが、疾患、状態、または老化に関連しない正常な哺乳動物細胞においては活性化されない。標的細胞に特異的な転写活性化は、標的細胞では産生されるが、正常な哺乳動物細胞、例えば、正常な骨格筋芽細胞、正常な脂肪細胞、正常な目の細胞、正常な脳細胞、正常な肝臓細胞、正常な結腸細胞、正常な肺細胞、正常な膵臓細胞、および／または正常な心臓細胞などの正常なヒト細胞であって、これらの正常な細胞が疾患、状態、または老化に関連していない細胞では産生されない１つ以上の因子の作用によって達成される。
【００１３】
これらの実施形態の他の態様内では、標的細胞は、哺乳動物細胞または細菌細胞であり得る。標的哺乳動物細胞は、老化細胞、癌細胞、前癌細胞、異形成細胞、および感染因子に感染している細胞などのヒト細胞を含むことができる。
【００１４】
ヒト標的細胞が老化細胞であるこれらの実施形態の特定の態様において、転写プロモーターは、ＳＰ１、ＥＴＳ１、および／またはＥＴＳ２などの転写因子による活性化に応答するｐ１６ＩＮＫ４ａ／ＣＤＫＮ２Ａ転写プロモーターなどの転写プロモーターを含み得る。ヒト標的細胞が老化細胞であるこれらの実施形態の他の態様において、転写プロモーターは、ｐ５３／ＴＰ５３に応答する、ｐ２１／ＣＤＫＮ１Ａ転写プロモーターなどの転写プロモーターを含み得る。
【００１５】
老化細胞などの標的細胞において、転写プロモーターは、例えば、Ｃａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９、ＢＡＸ、ＤＦＦ４０、ＨＳＶ−ＴＫ、およびシトシンデアミナーゼなどの治療用タンパク質をコードする核酸、ならびにＣａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９、ＢＡＸ、ＤＦＦ４０、ＨＳＶ−ＴＫ、およびシトシンデアミナーゼの誘導可能および自己活性化変異体の発現を誘導し、治療用タンパク質は、例えば、アポトーシスを含む細胞プロセスを介して老化細胞における細胞死を誘導することなどによって老化細胞の成長および／または生存を減少させ、予防し、および／または排除する。壊死／ネクロプトーシス、オートファジー細胞死、小胞体ストレスに関連する細胞毒性、小胞体ストレスに関連する細胞毒性、有糸分裂カタストロフィー、パラプトーシス、ピロネクローシス、ピロネクローシス、およびエントシフを含む細胞プロセスを介して細胞死を誘導することにより、例えば、有糸分裂細胞の増殖および／または生存を減少させ、防止し、および／または排除する他の治療用タンパク質が採用され得る。
【００１６】
ヒト標的細胞が脳癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、乳癌細胞、肝臓癌細胞、血液癌細胞、および骨癌細胞などの癌細胞であるこれらの実施形態の他の態様では、転写プロモーターは、ｐ２１ｃｉｐ１／ｗａｆ１プロモーター、ｐ２７ｋｉｐ１プロモーター、ｐ５７ｋｉｐ２プロモーター、ＴｄＴプロモーター、Ｒａｇ−１プロモーター、Ｂ２９プロモーター、Ｂｌｋプロモーター、ＣＤ１９プロモーター、ＢＬＮＫプロモーター、および／または、λ５プロモーターを含み得、転写プロモーターは、ＥＢＦ３、Ｏ／Ｅ−１、Ｐａｘ−５、Ｅ２Ａ、ｐ５３、ＶＰ１６、ＭＬＬ、ＨＳＦ１、ＮＦ−ＩＬ６、ＮＦＡＴ１、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＨＯＸ、Ｅ２Ｆ３、および／またはＮＦ−κＢ転写因子などの１つ以上の転写因子による活性化に応答し、転写活性化は、例えば、Ｃａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９、ＢＡＸ、ＤＦＦ４０、ＨＳＶ−ＴＫ、およびシトシンデアミナーゼなどの治療用タンパク質をコードする核酸、ならびにＣａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９、ＢＡＸ、ＤＦＦ４０、ＨＳＶ−ＴＫ、およびシトシンデアミナーゼの誘導可能なおよび自己活性化変異体の発現を誘導し、治療用タンパク質は、例えば、アポトーシスを含む細胞プロセスを介して老化細胞における細胞死を誘導することによって、老化細胞の増殖および／または生存を減少させ、防止し、および／または排除する。壊死／ネクロプトーシス、オートファジー細胞死、小胞体ストレスに関連する細胞毒性、小胞体ストレスに関連する細胞毒性、有糸分裂カタストロフィー、パラプトーシス、ピロネクローシス、ピロネクローシス、およびエントシフを含む細胞プロセスを介して細胞死を誘導することにより、例えば、有糸分裂細胞の増殖および／または生存を減少させ、防止し、および／または排除する他の治療用タンパク質が採用され得る。
【００１７】
標的細胞が、例えば、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、肝炎ウイルス、レトロウイルスウイルス、インフルエンザウイルス、およびサイノウイルスを含むウイルスなどの感染因子に感染しているヒト細胞であるか、または標的細胞が細菌細胞であるこれらの実施形態のさらなる態様において、転写プロモーターは、感染因子または細菌細胞によって発現される因子によって活性化され得、転写活性化は、例えば、Ｃａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９、ＢＡＸ、ＤＦＦ４０、ＨＳＶ−ＴＫ、およびシトシンデアミナーゼなどの治療用タンパク質をコードする核酸、ならびにＣａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９、ＢＡＸ、ＤＦＦ４０、ＨＳＶ−ＴＫ、およびシトシンデアミナーゼの誘導可能なおよび自己活性化変異体の発現を誘導し、治療用タンパク質は、例えば、アポトーシスを含む細胞プロセスを介して老化細胞における細胞死を誘導することによって、老化細胞の増殖および／または生存を減少させ、防止し、および／または排除する。壊死／ネクロプトーシス、オートファジー細胞死、小胞体ストレスに関連する細胞毒性、小胞体ストレスに関連する細胞毒性、有糸分裂カタストロフィー、パラプトーシス、ピロネクローシス、ピロネクローシス、およびエントシフを含む細胞プロセスを介して細胞死を誘導することにより、例えば、有糸分裂細胞の増殖および／または生存を減少させ、防止し、および／または排除する他の治療用タンパク質が採用され得る。
【００１８】
他の実施形態において、本開示は、標的細胞内での治療用タンパク質の標的産生のための系を提供する。これらの系は、標的細胞および非標的細胞を含む細胞に核酸を送達することができるベクターであって、ベクターが、非標的細胞内ではなく、標的細胞（例えば、老化、疾患、または他の状態に関連する細胞）内での治療用タンパク質の標的産生のための発現構築物を含み、発現構築物が、前記標的細胞内でそれぞれ産生される１つ以上の因子に応答して活性化される転写プロモーターを含む、ベクターと；転写プロモーターに動作可能に連結され、かつ、転写プロモーターの調節制御下にある核酸であって、核酸が、標的細胞を含む、産生される細胞の成長および／または生存を減少させ、予防し、および／または排除することができる治療用タンパク質をコードする、核酸とを含む。
【００１９】
これらの実施形態の特定の態様内では、製剤および系は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤および系を含み、ＬＰＮは、カスパーゼタンパク質などのアポトーシス促進性タンパク質のためのコード領域を含むポリヌクレオチド構築物（例えば、プラスミドＤＮＡ）をカプセル化し、コード領域は、例えば、老化細胞に特異的な転写プロモーターまたは癌細胞に特異的な転写プロモーターなどの標的細胞に特異的な転写プロモーターの調節制御下にある。例示的な細胞に特異的な転写プロモーターは、ｐ１６、ｐ２２、ｐ５３を含む。アポトーシス促進性のタンパク質用の例示的なコード領域は、Ｃａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９、ＢＡＸ、ＤＦＦ４０、ＨＳＶ−ＴＫ、およびシトシンデアミナーゼタンパク質のためのコード領域を含む。アポトーシス促進性のタンパク質は、誘導可能なＣａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９、ＢＡＸ、ＤＦＦ４０、ＨＳＶ−ＴＫ、およびシトシンデアミナーゼタンパク質、ならびに、自己活性化Ｃａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９、ＢＡＸ、ＤＦＦ４０、ＨＳＶ−ＴＫ、およびシトシンデアミナーゼタンパク質を含み、これらは誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）あるいは自己活性化カスパーゼ９（ｓａＣａｓｐ９）によって本明細書で例証される。
【００２０】
ｉＣａｓｐ９タンパク質を含む誘導可能なアポトーシス促進性のタンパク質は、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７などの化学的二量体化誘導剤（ＣＩＤ）に結合する、ＦＫＢＰまたはＦＫ５０６結合タンパク質ドメインなどの二量体化ドメインを含み得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９５：１０４３７−１０４４２（１９９８）．誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９；Ａｒｉａｄ，Ｅｒｉｅ，ＰＡ）は、ＡＰ１９０３の存在下で活性化され得る。米国特許第５，８６９，３３７号およびＳｔｒａａｔｈｏｆ，Ｂｌｏｏｄ  １０５：４２４７−４２５４（２００５）。ＦＫＢＰドメインをコードする例示的なヒト遺伝子としては、ＡＩＰ、ＡＩＰＬ１、ＦＫＢＰ１Ａ、ＦＫＢＰ１Ｂ、ＦＫＢＰ２、ＦＫＢＰ３、ＦＨＢＰ５、ＦＫＢＰ６、ＦＫＢＰ７、ＦＫＢＰ８、ＦＫＢＰ８、ＦＫＢＰ９Ｌ、ＦＫＢＰ１０、ＦＫＢＰ１１、ＦＫＢＰ１４、ＦＫＢＰ１５、ＦＫＢＰ５２、およびＬＯＣ５４１４７３が挙げられる。
【００２１】
これらの実施形態の他の態様内では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ＬＮＰと標的細胞原形質膜との間の脂質混合を触媒するために、例えば、爬虫類レウイルス由来の融合性ｐ１４  ＦＡＳＴ融合タンパク質などの融合性タンパク質を含む融合性脂質ナノ粒子である。適切な融合性タンパク質は、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１２／０４０８２５Ａ１およびＷＯ２００２／０４４２０６Ａ２、Ｌａｕ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．８６：２７２（２００４），Ｎｅｓｂｉｔｔ，Ｍａｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｈｅｓｉｓ（２０１２），Ｚｉｊｌｓｔｒａ，ＡＡＣＲ（２０１７），Ｍｒｌｏｕａｈ，ＰＡＡＣＲＡＭ  ７７（１３Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔ  ５１４３（２０１７），Ｋｒａｂｂｅ，Ｃａｎｃｅｒｓ  １０：２１６（２０１８），Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｇａｒｃｉａ，ＣｈｅｍＣｏｍｍ  ５３：４５６５（２０１７），Ｃｌａｎｃｙ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８３（７）：２９４１（２００９），Ｓｕｄｏ，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２５５：１（２０１７），Ｗｏｎｇ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２３：３５５（２０１６），および、Ｃｏｒｃｏｒａｎ，ＪＢＣ  ２８１（４２）：３１７７８（２００６）に記載され、表１で提示されるアミノ酸配列を有するＰ１４とＰ１４ｅ１５タンパク質によって例証される。
【００２２】
【表１】
2021526505.tif 000003
【００２３】
ｉＣａｓｐ９タンパク質を発現する細胞を、ＣＩＤに接触させると、ｉＣａｓｐ９タンパク質の二量体化が促進され、これが標的細胞のアポトーシスを誘発する。ＡＰ１９０３はヒトで複数回使用されたことがあり、静脈内での安全性が確認され、薬物動態が決定されている。Ｉｕｌｉｕｃｃｉ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４１（８）：８７０−９（２００１）およびＤｉ  Ｓｔａｓｉ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６５：１６７３−８３（２０１１）．ｉＣａｓｐ９  ＋  ＡＰ１９０３は、同種Ｔ細胞移植後のＧｖＨＤを処置するためにヒトでの使用に成功した。Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６５：１６７３−８３（２０１１）．
【００２４】
特定の実施形態内では、自己活性化カスパーゼ９（ｓａＣａｓｐ９）などの自己活性化カスパーゼをコードするポリヌクレオチドが採用されても得、ここで、カスパーゼポリヌクレオチドの発現は、老化細胞集団または癌細胞集団などの標的細胞集団において活性である因子の調節制御下にある。自己活性化カスパーゼは、化学的二量体化誘導剤（ＣＩＤ）の不在下で活性化する。ｓａＣａｓｐ９などの自己活性化カスパーゼを発現する細胞は、ほぼ即座にアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｅ）する。こうした自己活性化カスパーゼは、誘導性カスパーゼタンパク質がＣＩＤの投与前に希釈されることになる、急速に分裂する腫瘍細胞などの急速に分裂する細胞においてアポトーシスの誘導に有利に採用され得ることは、当業者であれば理解されるであろう。さらに、自己活性化カスパーゼによる細胞死は、誘導性カスパーゼと比較してより長い期間にわたって起こるため、腫瘍溶解症候群のリスクは自己活性化カスパーゼにより低減する。
【００２５】
ＬＮＰ製剤でカプセル化されたプラスミドＤＮＡを含む製剤は、１５  ｍｇ／ｋｇを超える用量で動物には無毒で免疫原性がなく、中性脂質製剤で達成可能な効率の８０倍以上、および、カチオン性脂質製剤で達成可能な効率の２〜５倍以上の効率を示す。ＬＮＰカーゴは細胞質に直接沈着し、それによって内細胞経路を迂回する。
【００２６】
これらの実施形態のさらなる態様内では、上記系は、例えば、細胞内因子に加えて、発現構築物内のプロモーターの転写活性化を促進するか、または、Ｃａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９、ＢＡＸ、ＤＦＦ４０、ＨＳＶ−ＴＫ、およびシトシンデアミナーゼの誘導性変異体の二量体化も促進することなどにより治療用タンパク質の機能性を促進する化学的または生物学的化合物に、標的細胞を接触させることを要求することなどによって、発現構築物内での核酸の発現、または核酸によってコードされる治療用タンパク質の機能性に対する追加的な制御を可能にする１つ以上の安全性の特徴をさらに含む。
【００２７】
本開示の発現構築物および系で採用され得るさらなる安全性の要素は、哺乳動物発現のためにｐＤＥＳＴ２６プラスミドを採用するＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｇａｔｅｗａｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍを使用するタモキシフェン誘導性Ｃｒｅ構築物を含む。例えば、Ｃｒｅとエストロゲン受容体との融合タンパク質を構成的に発現させ、タモキシフェンの添加に応じて誘導させることができ、これにより、活性化されたＣｒｅが転写プロモーターを再配向させ、それにより治療用タンパク質を発現させることができる。
【００２８】
これらの実施形態のさらに他の態様では、上記系は、検出可能なマーカー、例えば、生物発光マーカーをコードする核酸をさらに含み、それにより、治療用タンパク質を発現する細胞や、および、誘導性のＣａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９などの誘導性の治療用タンパク質の場合には、誘導性のＣａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９の二量体化を誘導することなどによって治療用タンパク質の活性を促進する化合物の投与によって死滅する細胞の同定を可能にする。
【００２９】
さらなる実施形態内では、本開示は、標的細胞の成長を減少させ、予防し、および／または排除するための方法を提供し、上記方法は、標的細胞を、標的細胞内での治療用タンパク質の標的化産生のための系に接触させる工程を含み、ここで、上記系は、核酸を細胞に送達することができるベクターを含み、ベクターは、非標的細胞内ではなく、標的細胞（例えば、老化、疾患、または他の状態に関連する細胞）内での治療用タンパク質の標的産生のための発現構築物を含み、ここで、発現構築物は、（ａ）それぞれ標的細胞内で産生される１つ以上の因子に応答して活性化される転写プロモーター、および（ｂ）転写プロモーターに動作可能に連結され、かつ転写プロモーターの調節制御下にある核酸を含み、ここで、核酸は核酸の発現時に産生される治療用タンパク質をコードし、および、標的細胞（つまり、老化、疾患、または他の状態に関連する細胞）の治療用タンパク質の産生は、標的細胞の成長および／または生存を減少させ、予防し、および／または排除する。
【００３０】
さらなる実施形態内では、本開示は、年老いたヒト、または疾患あるいは別の状態に悩まされているヒトを処置するための方法を提供し、ここで、老化、疾患、または他の状態は、ヒト内の標的細胞に関連しており、上記方法は、標的細胞内での治療用タンパク質の標的産生のための系をヒトに施す工程を含み、ここで、上記系は、核酸を細胞に送達することができるベクターを含み、ベクターは、非標的細胞内ではなく、標的細胞（例えば、老化、疾患、または他の状態に関連する細胞）内での治療用タンパク質の標的産生のための発現構築物を含み、ここで、発現構築物は、（ａ）それぞれ標的細胞内で産生される１つ以上の因子に応答して活性化される転写プロモーター、および（ｂ）転写プロモーターに動作可能に連結され、かつ転写プロモーターの調節制御下にある核酸を含み、ここで、核酸は核酸の発現時に産生される治療用タンパク質をコードし、および、標的細胞（つまり、老化、疾患、または他の状態に関連する細胞）の治療用タンパク質の産生は、標的細胞の成長および／または生存を減少させ、予防し、および／または排除し、それによって、ヒトの老化を遅らせ、および／または、ヒトの疾患または状態を無効にし、および／または除去する。
【００３１】
さらなる実施形態内では、本開示は、標的細胞内での治療用タンパク質の標的産生のための脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を提供し、ＬＮＰ製剤は：（ａ）標的細胞または非標的細胞の両方を含む哺乳動物細胞への核酸の非特異的な送達のための脂質ナノ粒子ベクターであって、前記脂質ナノ粒子が１つ以上の脂質と１つ以上の融合性タンパク質を含む、脂質ナノ粒子ベクターと、（ｂ）標的細胞内での治療用タンパク質の優先的な産生のための発現構築物とを含む。
【００３２】
これらの実施形態の特定の態様に従ったＬＮＰ製剤は、１ｍＭから１００ｍＭ、または５ｍＭから５０ｍＭ、または１０ｍＭから３０ｍＭ、または１５ｍＭから２５ｍＭの範囲の濃度の１つ以上の脂質を含む。本明細書で例示されるＬＮＰ製剤は、約２０ｍＭの濃度の１つまたは複数の脂質を含む。
【００３３】
本明細書で例示される特定のＬＮＰ製剤内では、１つ以上の脂質は、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール、および１，２−ジミリストイル−ｒａｃ−グリセロ−３−メトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ−ＰＥＧ）から選択される。ＬＮＰ製剤は、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧからなる群から選択される２以上の脂質を含んでもよい。
【００３４】
３５−５５モル％のＤＯＤＡＰ：１０−２０モル％のＤＯＴＡＰ：２２．５−３７．５モル％のＤＯＰＥ：４−８モル％のコレステロール：３−５モル％のＤＭＧ−ＰＥＧのモル比で；または、約４５モル％のＤＯＤＡＰ：約１５モル％のＤＯＴＡＰ：約３０モル％のＤＯＰＥ：約６モル％のコレステロール：約４モル％のＤＭＧ−ＰＥＧのモル比で、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧを含むＬＮＰ製剤が本明細書で例示される。特定の態様内では、ＬＮＰ製剤は、４５モル％のＤＯＤＡＰ：１５モル％のＤＯＴＡＰ：３０モル％のＤＯＰＥ：６モル％のコレステロール：４モル％のＤＭＧ−ＰＥＧのモル比で、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧを含む。
【００３５】
これらの実施形態の他の態様に係るＬＮＰ製剤は、０．５μＭから２０μＭ、または１μＭから１０μＭ、または３μＭから４μＭの濃度範囲の１つ以上の融合性タンパク質を含む。融合性タンパク質が３．５μＭの濃度で存在するＬＮＰ製剤が本明細書で例証される。例示的で適切な融合性タンパク質は、ｐ１４融合性タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）とｐ１４ｅ１５融合性タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）を含む。
【００３６】
これらの実施形態のさらなる態様内では、ＬＮＰ製剤は、（ｉ）前記非標的細胞と比較して、前記標的細胞内で優先的に産生される１つ以上の因子に応答して活性化される転写プロモーターと、（ｉｉ）前記転写プロモーターに動作可能に連結され、かつ前記転写プロモーターの調節制御下にある核酸を含み、ここで、前記核酸は、標的細胞と非標的細胞の両方を含む、哺乳動物細胞の成長および／または生存を減少させ、予防し、および／または排除することができる治療用タンパク質をコードし、および、前記治療用タンパク質は前記標的細胞内で産生されるが、前記非標的細胞内では産生されない。
【００３７】
２０μｇ／ｍＬから１．５ｍｇ／ｍＬ、または１００μｇ／ｍＬから５００μｇ／ｍＬ範囲の濃度で、または２５０μｇ／ｍＬの濃度の発現構築物を含むＬＮＰ製剤が本明細書に例証される。
【００３８】
適切な例示的なＬＮＰ製剤は以下を含む：各１ｍＬのＬＮＰについては、脂質濃度は２０ｍＭであり、ＤＮＡ含量は２５０μｇであり、および融合性タンパク質（例えば、ｐ１４またはｐ１４ｅ１５）は３．５μＭであり、ここで、脂質製剤は、それぞれ４５：１５：３０：６：４のモル％比率でＤＯＤＡＰ：ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ−ＰＥＧを含む。
【００３９】
これらの実施形態のさらなる態様内では、ＬＮＰ製剤は、ｐ１６転写プロモーター、ｐ２１転写プロモーター、およびｐ５３転写プロモーターから選択される転写プロモーターを有する発現構築物を含み、ならびに、ＳＰ１、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、およびｐ５３／ＴＰ５３から選択される因子に応答する転写プロモーターを含む。前記転写プロモーターがｐ１６ＩＮＫ４ａ／ＣＤＫＮ２Ａ転写プロモーターまたはｐ２１／ＣＤＫＮ１Ａ転写プロモーターであるＬＮＰ製剤が本明細書で例示される。
【００４０】
これらの実施形態の関連する態様内では、ＬＮＰ製剤は、ＥＢＦ３、Ｏ／Ｅ−１、Ｐａｘ−５、Ｅ２Ａ、ｐ５３、ＶＰ１６、ＭＬＬ、ＨＳＦ１、ＮＦ−ＩＬ６、ＮＦＡＴ１、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＨＯＸ、Ｅ２Ｆ３、および／またはＮＦ−κＢから選択される因子に応答する転写プロモーターを有する発現構築物を含む。前記転写プロモーターがｐ２１ｃｉｐ１／ｗａｆ１プロモーター、ｐ２７ｋｉｐ１プロモーター、ｐ５７ｋｉｐ２プロモーター、ＴｄＴプロモーター、Ｒａｇ−１プロモーター、Ｂ２９プロモーター、Ｂｌｋプロモーター、ＣＤ１９プロモーター、ＢＬＮＫプロモーター、およびλ５プロモーターであるＬＮＰ製剤が、本明細書で例示される。
【００４１】
これらの実施形態の他の関連する態様内では、ＬＮＰ製剤は、例えば、カスパーゼ（Ｃａｓｐ）、誘導性カスパーゼ（ｉＣａｓｐ）、自己活性化カスパーゼ（ｓａＣａｓｐ）、ＢＡＸ、ＤＦＦ４０、ＨＳＶ−ＴＫ、およびシトシンデアミナーゼから選択される治療用タンパク質などの治療用タンパク質をコードする核酸を有する発現構築物を含む。例えば、誘導性Ｃａｓｐ９（ｉＣａｓｐ９）または自己活性化Ｃａｓｐ９（ｓａＣａｓｐ９）を含む、Ｃａｓｐ９をコードする核酸を有する発現構築物を含むＬＮＰ製剤が本明細書で例示される。
【００４２】
本開示の他の実施形態は、標的細胞の成長を減少させ、予防し、および／または排除するための方法を提供し、上記方法は、（ａ）標的細胞または非標的細胞の両方を含む哺乳動物細胞への核酸の非特異的な送達のための脂質ナノ粒子ベクターであって、前記脂質ナノ粒子が１つ以上の脂質と１つ以上の融合性タンパク質を含む、脂質ナノ粒子ベクターと、（ｂ）標的細胞内での治療用タンパク質の優先的な産生のための発現構築物とを含むＬＮＰ製剤に、標的細胞を接触させる工程を含む。
【００４３】
これらの実施形態の特定の態様内では、上記方法は、（ｉ）前記非標的細胞と比較して、標的細胞内で優先的に産生される１つ以上の因子に応答して活性化される転写プロモーターと、（ｉｉ）転写プロモーターに動作可能に連結され、かつ前記転写プロモーターの調節制御下にある核酸を含むＬＮＰ製剤を利用し、ここで、核酸は、標的細胞と非標的細胞の両方を含む、哺乳動物細胞の成長および／または生存を減少させ、予防し、および／または排除することができる治療用タンパク質をコードし、および、前記治療用タンパク質は標的細胞内では産生されるが、非標的細胞内では産生されない。
【００４４】
本開示の他の実施形態は、標的細胞を有するヒト患者を含む患者における疾患または状態の処置のための方法を提供し、ここで、上記方法は、（ａ）標的細胞または非標的細胞の両方を含む哺乳動物細胞への核酸の非特異的な送達のための脂質ナノ粒子ベクターであって、脂質ナノ粒子が、１つ以上の脂質および１つ以上の融合性タンパク質を含む、脂質ナノ粒子ベクターと、（ｂ）標的細胞内での治療用タンパク質を優先的に産生するための発現構築物とを含む、脂質ナノ粒子を有するＬＮＰ製剤を患者に投与する工程を含む。
【００４５】
これらの実施形態の特定の態様内では、上記方法は、（ｉ）非標的細胞と比較して、標的細胞内で優先的に産生される１つ以上の因子に応答して活性化される転写プロモーターと、（ｉｉ）転写プロモーターに動作可能に連結され、かつ転写プロモーターの調節制御下にある核酸とを含むＬＮＰ製剤を利用し、核酸は、標的細胞と非標的細胞の両方を含む、哺乳動物細胞の成長および／または生存を減少させ、予防し、および／または排除することができる治療用タンパク質をコードし、および、前記治療用タンパク質は標的細胞内では産生されるが、非標的細胞内では産生されない。
【００４６】
本開示のこれらおよび他の関連する態様は、様々な実施形態の特定の態様を例示する、以下の図面と詳細な記載を考慮してさらに良く理解される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本開示の特定の態様に従って、ＩｎｎｏｖａｓｃｒｅｅｎのＦｕｓｏｇｅｎｉｘ（商標）プラットフォームを採用する脂質ナノ粒子を含む、ステルス融合性リポソームを含む融合性リポソームと従来のリポソームの概略図である。爬虫類レオウイルス由来のｐ１４  ＦＡＳＴ融合タンパク質を利用し、かつ、老化細胞集団または癌標的細胞集団などの標的細胞集団において活性なプロモーター下で誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）をコードするプラスミドベクターを含む、Ｆｕｓｏｇｅｎｉｘ（商標）脂質ナノ粒子が示されている。この概略図では、に例示されている、ＡＰ１９０３などの小分子二量体化剤（ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）を介して活性化されるＣａｓｐ９融合ペプチドである。
【図２】本開示の特定の態様に係る標的細胞の細胞質へのリポソーム送達の概略図である。ｐ１６をコードする標的老化細胞またはｐ５３をコードする標的癌細胞などの標的細胞に特異的な転写プロモーターの調節制御下において、カスパーゼ９などのアポトーシス促進性タンパク質をコードする核酸などの核酸の送達のために構成されたＦｕｓｏｇｅｎｉｘ（商標）脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が示されている。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と標的細胞原形質膜との間の迅速な脂質混合を触媒するためのｐ１４  ＦＡＳＴタンパク質を含むＦｕｓｏｇｅｎｉｘ（商標）脂質ナノ粒子が例示されている。このようなＦｕｓｏｇｅｎｉｘ（商標）脂質ナノ粒子は、（ｉ）  細胞質にカーゴ核酸を直接送達し、それによって、内分泌経路を迂回し、（ｉｉ）１５ｍｇ／ｋｇ以上の用量で動物に無毒（非免疫原性）であり、（ｉｉｉ）中性脂質製剤よりも８０倍以上効率的であり、（ｉｖ）カチオン性脂質製剤よりも２〜５倍効率的であり、および、（ｉｖ）大規模に製造可能である。
【図３】臨床段階の脂質ベースのインビボの送達技術について報告された最大許容用量（ＭＴＤ）を比較する表である。本開示の融合性脂質ナノ粒子について＞１５ｍｇ／ｋｇのＭＴＤが、ラット毒性データから推定された。
【図４Ａ】誘導性カスパーゼ９ホモ二量体（ｉＣａｓｐ９）の誘導の概略図であり、ｉＣａｓｐ９は、化学的二量体化誘導剤（ＣＩＤ）に結合するための薬剤結合ドメインとカスパーゼ９の活性部分とを含む融合タンパク質である。ＡＰ１９０３やＡＰ２０１８７と指定されるＣＩＤによって例示されるように、ＣＩＤは、ｉＣａｓｐ９融合タンパク質の薬剤結合ドメインに結合して二量体化し、それによってｉＣａｓｐ９を活性化し、これが、アポトーシス促進性分子の細胞内活性化と標的細胞内でのアポトーシスの誘導を引き起こす。
【図４Ｂ】本開示の特定の態様に係る例示的なアポトソームの概略図である。
【図５】例示的な化学的二量体化誘導剤（ＣＩＤ）の化学構造を示しており、これは、本明細書においてＡＰ１９０３（ＡＰＥｘＢＩＯ、ヒューストン、テキサス州）として指定されるホモ二量体化剤であり、誘導性カスパーゼタンパク質（例えば、ｉＣａｓｐ９）などの誘導性アポトーシス促進性タンパク質の活性を誘導するために、本開示の様々な実施形態において採用され得る。
【図６】例示的な化学的二量体化誘導剤（ＣＩＤ）の化学構造を示しており、これは、本明細書においてＡＰ２０１８７（ＡＰＥｘＢＩＯ、ヒューストン、テキサス州）として指定されるホモ二量体化剤であり、誘導性カスパーゼタンパク質（例えば、ｉＣａｓｐ９）などの誘導性アポトーシス促進性タンパク質の活性を誘導するために、本開示の様々な実施形態において採用され得る。
【図７】６４Ｃｕ−ＮＯＴＡ［１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸］で標識したＦｕｓｏｇｅｎｉｘ脂質ナノ粒子を静脈内投与したマウスで得られたデータを示す。図７は、静脈内に投与されたマウスを得られたデータを提示する、６４Ｃｕ−ＮＯＴＡ［１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸を用いる標識されたＦｕｓｏｇｅｎｉｘ脂質ナノ粒子］。Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，ＥＪＮＭＭＩ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２：８（２０１２）を参照。６４Ｃｕは陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）で検出された。Ａは、タンパク質を含まない６４Ｃｕ−ＮＯＴＡリポソームを投与されたマウスから得られたＰＥＴデータを示す。Ｂは、６４Ｃｕ−ＮＯＴＡ−リポソーム−ｐ１４を投与されたマウスから得られたＰＥＴデータを示す。
【図８】タンパク質を含まない６４Ｃｕ−ＮＯＴＡ−リポソームと６４Ｃｕ−ＮＯＴＡ−リポソーム−ｐ１４について２４時間、ＳＵＶｍｅａｎを比較してＦｕｓｏｇｅｎｉｘ脂質ナノ粒子で得られたデータの棒グラフである。図７と図８に示されたデータは、競合する製剤と比較して、前立腺腫瘍への遺伝子／ｓｉＲＮＡ送達における５０％の増加を示している。
【図９】実施例１で議論されるように、２４時間後に発現されたヌードマウス中の標識されたペグ化リポソームの生物分散の棒グラフである。
【図１０】濃度（μｇ／ｍｌ；図１０）および抗ｐ１４と抗ＬＮＰの抗体応答（図１１）に応じた４０５ｎｍでの光学濃度のグラフであり、爬虫類のレオウイルスｐ１４  ＦＡＳＴ融合タンパク質（Ｆｕｓｏｇｅｎｉｘ（商標））を利用して、例示的な融合性脂質ナノ粒子の安全性と耐容性を実証する。示されるように、（アジュバントを用いた、および用いない）免疫適格マウスでは、事実上いかなる抗体応答も観察されなかった。
【図１１】濃度（μｇ／ｍｌ；図１０）および抗ｐ１４と抗ＬＮＰの抗体応答（図１１）に応じた４０５ｎｍでの光学濃度のグラフであり、爬虫類のレオウイルスｐ１４  ＦＡＳＴ融合タンパク質（Ｆｕｓｏｇｅｎｉｘ（商標））を利用して、例示的な融合性脂質ナノ粒子の安全性と耐容性を実証する。示されるように、（アジュバントを用いた、および用いない）免疫適格マウスでは、事実上いかなる抗体応答も観察されなかった。
【図１２】Ｓｚｅｂｅｎｉ，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６１（２）：１６３−７３  （２０１４）に記載されるようなＣ４ｄおよびｉＣ３ｂ補体ＥＬＩＳＡアッセイを使用して補体活性化関連偽アレルギー（ｐｓｕｅｄｏａｌｌｅｒｇｙ）（ＣＡＲＰＡ）について試験した１０個のヒトサンプルのうち８個のヒトサンプルにおいて、Ｄｏｘｉｌと比較して、本開示に係る脂質ナノ粒子製剤がＣ４ｄには反応せず（図１２）、ｉＣ３ｂとの反応性が低い（図１３）ことを示している。
【図１３】Ｓｚｅｂｅｎｉ，  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６１（２）：１６３−７３（２０１４）に記載されるようなＣ４ｄおよびｉＣ３ｂ補体ＥＬＩＳＡアッセイを使用して補体活性化関連偽アレルギー（ｐｓｕｅｄｏａｌｌｅｒｇｙ）（ＣＡＲＰＡ）について試験した１０個のヒトサンプルのうち８個のヒトサンプルにおいて、Ｄｏｘｉｌと比較して、本開示に係る脂質ナノ粒子製剤がＣ４ｄには反応せず（図１２）、ｉＣ３ｂとの反応性が低い（図１３）ことを示している。
【図１４】カスパーゼ９などのカスパーゼタンパク質を含むアポトーシス促進性タンパク質などや、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）および自己活性化カスパーゼ９（ｓａＣａｓｐ９）などのカスパーゼタンパク質の誘導性および自己活性化変異体を含む、アポトーシス促進性タンパク質の誘導性および自己活性化変異体などの、治療用タンパク質の標的細胞に特異的な産生のための本開示の発現構築物、系、製剤、および方法の特定の態様で採用されるプラスミドベクターｐＶＡＸ１（商標）の制限地図である。特定の実施形態では、発現構築物および製剤は、さらに、タモキシフェン誘導性のＣｒｅ構築物（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｇａｔｅｗａｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）などの安全要素を含み得る。Ｃｒｅとエストロゲン受容体の融合タンパク質は構成的に発現され、タモキシフェンの添加時に誘導され、これにより、活性化したＣｒｅがｐ１６−プロモーターを再配向することを可能にし、それによってカスパーゼ９またはその誘導性の／自己活性化変異体を発現させる。ｐＶＡＸ１はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から市販されている。
【図１５】老齢化および／または老化に関連する標的細胞など、ｐ１６を発現する標的細胞における誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）または自己活性化カスパーゼ９（ｓａＣａｓｐ９）タンパク質の標的細胞に特異的な発現のための例示的なｐ１６標的化構築物の概略図であり、このｐ１６標的化構築物は、ｉＣａｓｐ９またはｓａＣａｓｐ９に動作可能に接続されたｐ１６ｓ転写プロモーターを含む。例示的なｐ１６転写プロモーターはＢａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７９（７３７２）：２３２−６７（２０１１）に記載されている。
【図１６】老齢化および／または老化に関連する標的細胞などのｐ１６を発現する標的細胞における誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）タンパク質の標的細胞に特異的な発現のための例示的なｐ１６標的化構築物を含む、プラスミドベクターｐＶＡＸ１−１６ｓ−ｉＣａｓｐ９−ＭＸ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の制限地図であり、これは、ｐ１６標的化構築物は、ｉＣａｓｐ９に動作可能に接続されたｐ１６ｓ転写プロモーターを含む。
【図１７】老齢化および／または老化に関連する標的細胞などのｐ１６を発現する標的細胞における誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）タンパク質の標的細胞に特異的な発現のための例示的なｐ１６標的化構築物を含む、ベクターｐ１０−ｐ１６−ｓ−ｉＣａｓｐ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）のプラスミドマップであり、ｐ１６標的化構築物は、ｉＣａｓｐ９に動作可能に接続されたｐ１６ｅ転写プロモーターを含む。
【図１８】老齢化および／または老化に関連する標的細胞などのｐ１６を発現する標的細胞における自己活性化カスパーゼ９（ｓａＣａｓｐ９）タンパク質の標的細胞に特異的な発現のための例示的なｐ１６標的化構築物を含む、ベクターｐ１０−ｐ１６−ｓａＣａｓｐ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）のプラスミドマップであり、ｐ１６標的化構築物は、ｓａＣａｓｐ９に動作可能に接続されたｐ１６ｅ転写プロモーターを含む。
【図１９】老化用のマウスモデル系における例示的なｐ１６標的化構築物のインビボの投与の概略図であり、ここで、老化マウスモデルは、（ｐ１６＋細胞の存在によって定義されるような）老化細胞負荷、および老衰に関連する分泌表現型（ＳＡＳＰ；ｖａｎ  Ｄｅｕｒｓｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ５０９（７５０１）：４３９−４４６（２０１４））に関連する因子の分泌を示す。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ベクター、例えば、ｐ１６−Ｃａｓｐ９発現構築物、例えば、ｐＶＡＸ１−１６ｓ−ｉＣａｓｐ９、ｐ１０−ｐ１６ｅ−ｉＣａｓｐ９、ｐ１０−ｐ１６ｅ−ｓａＣａｓｐ９、またはその変異体を包含する、ｐ１４  ＦＡＳＴなどの融合性タンパク質を含む融合性ＬＮＰなどのベクターおよび発現構築物を含む製剤は、尾静脈への注入を介して老化マウスにインビボで投与され、ＬＮＰ＋発現構築物は、特異性なく標的細胞と非標的細胞をトランスフェクトする。ＡＰ２０１８７などの化学的二量体化誘導剤（ＣＩＤ）のその後のインビボ投与時に、ｉＣａｓｐ９タンパク質を発現するｐ１６＋標的細胞（例えば、老化細胞）は、アポトーシスを経験し、ＳＡＳＰレベルが低下するが、ｐ１６−細胞は生存可能なままである。
【図２０Ａ】脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ベクター、例えば、ｐ１６−Ｃａｓｐ９発現構築物、例えば、ｐＶＡＸ１−１６ｓ−ｉＣａｓｐ９、ｐ１０−ｐ１６ｅ−ｉＣａｓｐ９、ｐ１０−ｐ１６ｅ−ｓａＣａｓｐ９、またはその変異体を包含する、ｐ１４  ＦＡＳＴなどの融合性タンパク質を含む融合性ＬＮＰなどのベクターおよび発現構築物を含む、β−ｇａｌについて染色された老化マウスと腎臓細胞にインビボで投与される製剤のインビボ投与（８０週齢の１６匹）後の、未処理（上のパネル）または処理済（低用量−中央のパネルおよび高用量−下のパネル）のインビボ老化マウスモデルからの腎臓細胞における老化関連β−ｇａｌの組織学的染色のフォトマイクログラフである。これらのデータは、ｐ１６＋老化腎臓細胞の用量依存的な減少を実証した。
【図２０Ｂ】脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ベクター、例えば、ｐ１６−Ｃａｓｐ９発現構築物、例えば、ｐＶＡＸ１−１６ｓ−ｉＣａｓｐ９、ｐ１０−ｐ１６ｅ−ｉＣａｓｐ９、ｐ１０−ｐ１６ｅ−ｓａＣａｓｐ９、またはその変異体を包含する、ｐ１４  ＦＡＳＴなどの融合性タンパク質を含む融合性ＬＮＰなどのベクターおよび発現構築物を含む、β−ｇａｌについて染色された老化マウスと腎臓細胞にインビボで投与される製剤のインビボ投与（８０週齢の１６匹）後の、未処理（上のパネル）または処理済（低用量−中央のパネルおよび高用量−下のパネル）のインビボ老化マウスモデルからの腎臓細胞における老化関連β−ｇａｌの組織学的染色のフォトマイクログラフである。これらのデータは、ｐ１６＋老化腎臓細胞の用量依存的な減少を実証した。
【図２０Ｃ】脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ベクター、例えば、ｐ１６−Ｃａｓｐ９発現構築物、例えば、ｐＶＡＸ１−１６ｓ−ｉＣａｓｐ９、ｐ１０−ｐ１６ｅ−ｉＣａｓｐ９、ｐ１０−ｐ１６ｅ−ｓａＣａｓｐ９、またはその変異体を包含する、ｐ１４  ＦＡＳＴなどの融合性タンパク質を含む融合性ＬＮＰなどのベクターおよび発現構築物を含む、β−ｇａｌについて染色された老化マウスと腎臓細胞にインビボで投与される製剤のインビボ投与（８０週齢の１６匹）後の、未処理（上のパネル）または処理済（低用量−中央のパネルおよび高用量−下のパネル）のインビボ老化マウスモデルからの腎臓細胞における老化関連β−ｇａｌの組織学的染色のフォトマイクログラフである。これらのデータは、ｐ１６＋老化腎臓細胞の用量依存的な減少を実証した。
【図２０Ｄ】脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ベクター、例えば、ｐ１６−Ｃａｓｐ９発現構築物、例えば、ｐＶＡＸ１−１６ｓ−ｉＣａｓｐ９、ｐ１０−ｐ１６ｅ−ｉＣａｓｐ９、ｐ１０−ｐ１６ｅ−ｓａＣａｓｐ９、またはその変異体を包含する、ｐ１４  ＦＡＳＴなどの融合性タンパク質を含む融合性ＬＮＰなどのベクターおよび発現構築物を含む、β−ｇａｌについて染色された老化マウスと腎臓細胞にインビボで投与される製剤のインビボ投与（８０週齢の１６匹）後の、未処理（上のパネル）または処理済（低用量−中央のパネルおよび高用量−下のパネル）のインビボ老化マウスモデルからの腎臓細胞における老化関連β−ｇａｌの組織学的染色のフォトマイクログラフである。これらのデータは、ｐ１６＋老化腎臓細胞の用量依存的な減少を実証した。
【図２０Ｅ】脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ベクター、例えば、ｐ１６−ｉＣａｓｐ９発現構築物、例えば、ｐＶＡＸ１−１６ｓ−ｉＣａｓｐ９、ｐ１０−ｐ１６ｅ−ｉＣａｓｐ９、ｐ１０−ｐ１６ｅ−ｓａＣａｓｐ９、またはその変異体を包含する、ｐ１４  ＦＡＳＴなどの融合性タンパク質を含む融合性ＬＮＰなどのベクターおよび発現構築物を含む、β−ｇａｌについて染色された老化マウスと精嚢細胞にインビボで投与される製剤のインビボ投与（８０週齢の１６匹）後の、未処理（上のパネル）または処理済（低用量−中央のパネルおよび高用量−下のパネル）のインビボ老化マウスモデルからの精嚢細胞における老化関連β−ｇａｌの組織学的染色のフォトマイクログラフである。これらのデータは、ｐ１６＋老化精嚢細胞の用量依存的な減少を実証した。
【図２０Ｆ】脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ベクター、例えば、ｐ１６−ｉＣａｓｐ９発現構築物、例えば、ｐＶＡＸ１−１６ｓ−ｉＣａｓｐ９、ｐ１０−ｐ１６ｅ−ｉＣａｓｐ９、ｐ１０−ｐ１６ｅ−ｓａＣａｓｐ９、またはその変異体を包含する、ｐ１４  ＦＡＳＴなどの融合性タンパク質を含む融合性ＬＮＰなどのベクターおよび発現構築物を含む、β−ｇａｌについて染色された老化マウスと精嚢細胞にインビボで投与される製剤のインビボ投与（８０週齢の１６匹）後の、未処理（上のパネル）または処理済（低用量−中央のパネルおよび高用量−下のパネル）のインビボ老化マウスモデルからの精嚢細胞における老化関連β−ｇａｌの組織学的染色のフォトマイクログラフである。これらのデータは、ｐ１６＋老化精嚢細胞の用量依存的な減少を実証した。
【図２０Ｇ】脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ベクター、例えば、ｐ１６−ｉＣａｓｐ９発現構築物、例えば、ｐＶＡＸ１−１６ｓ−ｉＣａｓｐ９、ｐ１０−ｐ１６ｅ−ｉＣａｓｐ９、ｐ１０−ｐ１６ｅ−ｓａＣａｓｐ９、またはその変異体を包含する、ｐ１４  ＦＡＳＴなどの融合性タンパク質を含む融合性ＬＮＰなどのベクターおよび発現構築物を含む、β−ｇａｌについて染色された老化マウスと精嚢細胞にインビボで投与される製剤のインビボ投与（８０週齢の１６匹）後の、未処理（上のパネル）または処理済（低用量−中央のパネルおよび高用量−下のパネル）のインビボ老化マウスモデルからの精嚢細胞における老化関連β−ｇａｌの組織学的染色のフォトマイクログラフである。これらのデータは、ｐ１６＋老化精嚢細胞の用量依存的な減少を実証した。
【図２０Ｈ】脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ベクター、例えば、ｐ１６−ｉＣａｓｐ９発現構築物、例えば、ｐＶＡＸ１−１６ｓ−ｉＣａｓｐ９、ｐ１０−ｐ１６ｅ−ｉＣａｓｐ９、ｐ１０−ｐ１６ｅ−ｓａＣａｓｐ９、またはその変異体を包含する、ｐ１４  ＦＡＳＴなどの融合性タンパク質を含む融合性ＬＮＰなどのベクターおよび発現構築物を含む、β−ｇａｌについて染色された老化マウスと精嚢細胞にインビボで投与される製剤のインビボ投与（８０週齢の１６匹）後の、未処理（上のパネル）または処理済（低用量−中央のパネルおよび高用量−下のパネル）のインビボ老化マウスモデルからの精嚢細胞における老化関連β−ｇａｌの組織学的染色のフォトマイクログラフである。これらのデータは、ｐ１６＋老化精嚢細胞の用量依存的な減少を実証した。
【図２１】ｐＶＡＸ１−ｐ１６発現構築物を含む融合性脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤のインビボ投与後の自然に老化したマウス中のｐ１６＋腎臓細胞の用量依存的な標的化を実証する棒グラフである。腎臓細胞はｐ１６ｌｎｋ４ａ転写産物を検出するためにｑＲＴ−ＰＣＲ反応にさらされた。相対的な発現は２ΔΔＣｔを使用して計算された（Ｌｉｖａｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：４０２−４０８（２００１））。
【図２２】ｐＶＡＸ１−ｐ１６発現構築物を含む融合性脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤のインビボ投与後の自然老化マウスにおけるｐ１６＋脾臓細胞の用量依存性標的化を実証する棒グラフである。脾臓細胞はｐ１６ｌｎｋ４ａ転写産物を検出するためにｑＲＴ−ＰＣＲ反応にさらされた。相対的な発現は２ΔΔＣｔを使用して計算された（Ｌｉｖａｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：４０２−４０８（２００１））。
【図２３】ｐＶＡＸ１−ｐ１６発現構築物を含む融合性脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤のインビボ投与後の自然老化マウスにおけるｐ１６＋精嚢細胞の用量依存性標的化を実証する棒グラフである。精嚢細胞はｐ１６ｌｎｋ４ａ転写産物を検出するためにｑＲＴ−ＰＣＲ反応にさらされた。相対的な発現は２ΔΔＣｔを使用して計算された（Ｌｉｖａｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：４０２−４０８（２００１））。
【図２４】ｐＶＡＸ１−ｐ１６発現構築物を含む融合性脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤のインビボ投与後の自然老化マウスにおけるｐ１６＋鼠径部の脂肪細胞の用量依存性標的化を実証する棒グラフである。鼠径部の脂肪細胞は、ｐ１６ｌｎｋ４ａ転写産物を検出するためにｑＲＴ−ＰＣＲ反応にさらされた。相対的な発現は２ΔΔＣｔを使用して計算された（Ｌｉｖａｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：４０２−４０８（２００１））。
【図２５】ｐＶＡＸ１−ｐ１６発現構築物を含む融合性脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤のインビボ投与後の自然老化マウスにおけるｐ１６＋肺細胞の用量依存性標的化を実証する棒グラフである。肺細胞はｐ１６ｌｎｋ４ａ転写産物を検出するためにｑＲＴ−ＰＣＲ反応にさらされた。相対的な発現は２ΔΔＣｔを使用して計算された（Ｌｉｖａｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：４０２−４０８（２００１））。
【図２６】化学療法で誘導された損傷（ドキソルビシンを用いる処置後に損傷を受けた細胞（つまり、老化細胞）の排除によって決定されるような）の改善を実証するデータの棒グラフである。老衰はドキソルビシンを用いてＢ６マウスで引き起こされた。動物は、マウスのｐ５３−ｉＣａｓｐ９、および、二量体化剤または対照（二量体化剤のみおよびＬＮＰのみ）を用いる処置され、屠殺された。組織を室温−ＰＣＲによってｐ５３発現についてアッセイした。
【図２７】本開示の特定の実施形態に従って腫瘍細胞の選択的な死滅による癌（腫瘍内科学）の処置で使用される例示的なｐ５３標的化カセットの概略図である。ｐ５３標的化カセットはｐ５３転写プロモーターを含み、これは誘導性カスパーゼ９タンパク質（ｉＣａｓｐ９）または自己活性化カスパーゼ９タンパク質（ｓａＣａｓｐ９）の発現を駆り立てる。
【図２８】図２７に描かれるようなｐ５３標的化カセットを含むプラスミド（ｐＶＡＸ１−ｐ５３−ｉＣａｓｐ９−ＭＸ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）の制限地図である。誘導性Ｃａｓｐ９タンパク質をコードするｉＣａｓｐ９核酸の発現は、ｐ５３転写プロモーターによって調節される。
【図２９】ｐ５３標的化カセットを含むプラスミド（ｐＶＡＸ１−ｐ５３−ｓａＣａｓｐ９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）の制限地図である。自己活性化カスパーゼ９（ｓａＣａｓｐ９）タンパク質をコードする核酸の発現は、ｐ５３転写プロモーターによって調節される。
【図３０】図２７に描かれるようなｐ５３標的化カセットを含むプラスミド（ｐＶＡＸ１−ｐ５３−ｉＣａｓｐ９−ＯＶＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）の制限地図である。誘導性Ｃａｓｐ９タンパク質をコードする核酸の発現は、ｐ５３転写プロモーターによって調節される。
【図３１】図２７に描かれるようなｐ５３標的化カセットを含むプラスミド（ｐＶＡＸ１−ｐ５３−ｉＣａｓｐ９−Ｇ−Ｏ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の制限地図である。誘導性Ｃａｓｐ９タンパク質をコードするｉＣａｓｐ９核酸の発現は、ｐ５３転写プロモーターによって調節される。
【図３２】図２７に描かれるようなｐ５３標的化カセットを含むプラスミド（ｐＶＡＸ１−ｐ５３−ｉＣａｓｐ９−ｈｕＣＤ４０Ｌ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）の制限地図である。誘導性Ｃａｓｐ９タンパク質をコードするｉＣａｓｐ９核酸の発現は、ｐ５３転写プロモーターによって調節される。本明細書に開示されているように、追加の標的化カセットおよびプラスミド構築物が、高度な腫瘍学的応用のために開発されており、これらの構築物は、例えば、１つ以上の免疫刺激性サイトカイン（例えば、図３２に示されているようなｈｕＣＤ４０Ｌ、ならびにＧＭＣＳＦおよびＩＬ１２）、および／または１つ以上の抗原（例えば、図３０に示されているようなトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ならびにＮｔ１、破傷風抗原、およびインフルエンザ抗原）をコードする核酸を採用している。
【図３３】図２７に描かれるようなｐ５３標的化カセットを含むプラスミド（ｐ１０−ｐ５３ｅ−ｉＣａｓｐ９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）の地図である。誘導性Ｃａｓｐ９タンパク質をコードするｉＣａｓｐ９核酸の発現は、ｐ５３転写プロモーターによって調節される。本明細書に開示されているように、追加の標的化カセットおよびプラスミド構築物が、高度な腫瘍学的応用のために開発されており、これらの構築物は、例えば、１つ以上の免疫刺激性サイトカイン（例えば、図３２に示されているようなｈｕＣＤ４０Ｌ、ならびにＧＭＣＳＦおよびＩＬ１２）、および／または１つ以上の抗原（例えば、図３０に示されているようなトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ならびにＮｔ１、破傷風抗原、およびインフルエンザ抗原）をコードする核酸を採用している。
【図３４】図２７に描かれるようなｐ５３標的化カセットを含むプラスミド（ｐ１０−ｐ５３ｅ−ｓａＣａｓｐ９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）の地図である。自己活性化Ｃａｓｐ９タンパク質をコードするｓａＣａｓｐ９核酸の発現は、ｐ５３転写プロモーターによって調節される。本明細書に開示されているように、追加の標的化カセットおよびプラスミド構築物が、高度な腫瘍学的応用のために開発されており、これらの構築物は、例えば、１つ以上の免疫刺激性サイトカイン（例えば、図３２に示されているようなｈｕＣＤ４０Ｌ、ならびにＧＭＣＳＦおよびＩＬ１２）、および／または１つ以上の抗原（例えば、図３０に示されているようなトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ならびにＮｔ１、破傷風抗原、およびインフルエンザ抗原）をコードする核酸を採用している。
【図３５】カスパーゼタンパク質、例えば、カスパーゼ９タンパク質などのアポトーシス促進性タンパク質と組み合わせて動作可能なｐ５３プロモーターを含む発現構築物を用いてｐ５３＋腫瘍を標的とするための論理的根拠を示す図である。癌細胞はしばしばそれを変異させるか欠失させるため、癌細胞は制御不能に増大することがある。しかしながら、ｐ５３遺伝子が変異するときでさえ、それに結合する転写因子はほとんど常に活性のままである。
【図３６】ｐ５３発現細胞（ｐＶａｘ−ｐ５３）と対照細胞（ｐｃＤＮＡ３−ＧＦＰ）を用いて得られたｉＣａｓｐ９とＣａｓｐ９タンパク質レベルのウェスタンブロットである。ヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞は、（ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７０の存在下と不在下において）ｐＶａｘ−ｐ５３−ｉＣａｓｐ９−ｌｕｃ（ルシフェリン）プラスミドを保有するＦｕｓｏｇｅｎｉｘ脂質ナノ粒子で処理され、ｉＣａｓｐ９発現について評価された。これらのデータは、化学的二量体化誘導剤（ＣＩＤ；例えば、ＡＰ２０１８７とＡＰ１９０３）の添加が、ｉＣａｓｐ９またはルシフェラーゼを発現するために操作されたｐ５３発現細胞中のｉＣａｓｐ９およびルシフェラーゼの発現を消失させることを実証する。
【図３７Ａ】ｐＶａｘ−ｐ５３−ｉＣａｓｐ９−ｌｕｃプラスミドを保有するＦｕｓｏｇｅｎｉｘ脂質ナノ粒子を用いて処置され、ウェスタンブロットと発光のアッセイによってｉＣａｓｐ９発現について評価された、ヒト前立腺癌（ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５、ＰＣ−３）または正常上皮（ＲＷＰＥ）細胞の微視的な画像である。
【図３７Ｂ】ｐＶａｘ−ｐ５３−ｉＣａｓｐ９−ｌｕｃプラスミドを保有するＦｕｓｏｇｅｎｉｘ脂質ナノ粒子を用いて処置され、ウェスタンブロットと発光のアッセイによってｉＣａｓｐ９発現について評価された、ヒト前立腺癌（ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５、ＰＣ−３）または正常上皮（ＲＷＰＥ）細胞の微視的な画像である。
【図３７Ｃ】ｐＶａｘ−ｐ５３−ｉＣａｓｐ９−ｌｕｃプラスミドを保有するＦｕｓｏｇｅｎｉｘ脂質ナノ粒子を用いて処置され、ウェスタンブロットと発光のアッセイによってｉＣａｓｐ９発現について評価された、ヒト前立腺癌（ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５、ＰＣ−３）または正常上皮（ＲＷＰＥ）細胞の微視的な画像である。
【図３７Ｄ】ｐＶａｘ−ｐ５３−ｉＣａｓｐ９−ｌｕｃプラスミドを保有するＦｕｓｏｇｅｎｉｘ脂質ナノ粒子を用いて処置され、ウェスタンブロットと発光のアッセイによってｉＣａｓｐ９発現について評価された、ヒト前立腺癌（ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５、ＰＣ−３）または正常上皮（ＲＷＰＥ）細胞の微視的な画像である。
【図３８】図３７Ａ−図３７Ｄに提示されたｐ５３発現細胞を用いて得られたデータの棒グラフである。ヒト前立腺癌（ＬＮＣａＰ（図３８）、ＤＵ１４５（図３９）、ＰＣ−３（図４０）、または正常上皮（ＲＷＰＥ（図４１））の細胞は、ｐＶａｘ−ｐ５３−ｉＣａｓｐ９−ｌｕｃプラスミドを保有するＦｕｓｏｇｅｎｉｘ脂質ナノ粒子を用いて処置され、ウェスタンブロットと発光のアッセイによってｉＣａｓｐ９発現について評価された。これらのデータは、化学的二量体化誘導剤（ＣＩＤ；例えば、ＡＰ２０１８７とＡＰ１９０３）の添加が、ｉＣａｓｐ９またはルシフェラーゼを発現するために操作されたｐ５３発現細胞中のｉＣａｓｐ９およびルシフェラーゼの発現を消失させることを実証する。
【図３９】図３７Ａ−図３７Ｄに提示されたｐ５３発現細胞を用いて得られたデータの棒グラフである。ヒト前立腺癌（ＬＮＣａＰ（図３８）、ＤＵ１４５（図３９）、ＰＣ−３（図４０）、または正常上皮（ＲＷＰＥ（図４１））の細胞は、ｐＶａｘ−ｐ５３−ｉＣａｓｐ９−ｌｕｃプラスミドを保有するＦｕｓｏｇｅｎｉｘ脂質ナノ粒子を用いて処置され、ウェスタンブロットと発光のアッセイによってｉＣａｓｐ９発現について評価された。これらのデータは、化学的二量体化誘導剤（ＣＩＤ；例えば、ＡＰ２０１８７とＡＰ１９０３）の添加が、ｉＣａｓｐ９またはルシフェラーゼを発現するために操作されたｐ５３発現細胞中のｉＣａｓｐ９およびルシフェラーゼの発現を消失させることを実証する。
【図４０】図３７Ａ−図３７Ｄに提示されたｐ５３発現細胞を用いて得られたデータの棒グラフである。ヒト前立腺癌（ＬＮＣａＰ（図３８）、ＤＵ１４５（図３９）、ＰＣ−３（図４０）、または正常上皮（ＲＷＰＥ（図４１））の細胞は、ｐＶａｘ−ｐ５３−ｉＣａｓｐ９−ｌｕｃプラスミドを保有するＦｕｓｏｇｅｎｉｘ脂質ナノ粒子を用いて処置され、ウェスタンブロットと発光のアッセイによってｉＣａｓｐ９発現について評価された。これらのデータは、化学的二量体化誘導剤（ＣＩＤ；例えば、ＡＰ２０１８７とＡＰ１９０３）の添加が、ｉＣａｓｐ９またはルシフェラーゼを発現するために操作されたｐ５３発現細胞中のｉＣａｓｐ９およびルシフェラーゼの発現を消失させることを実証する。
【図４１】図３７Ａ−図３７Ｄに提示されたｐ５３発現細胞を用いて得られたデータの棒グラフである。ヒト前立腺癌（ＬＮＣａＰ（図３８）、ＤＵ１４５（図３９）、ＰＣ−３（図４０）、または正常上皮（ＲＷＰＥ（図４１））の細胞は、ｐＶａｘ−ｐ５３−ｉＣａｓｐ９−ｌｕｃプラスミドを保有するＦｕｓｏｇｅｎｉｘ脂質ナノ粒子を用いて処置され、ウェスタンブロットと発光のアッセイによってｉＣａｓｐ９発現について評価された。これらのデータは、化学的二量体化誘導剤（ＣＩＤ；例えば、ＡＰ２０１８７とＡＰ１９０３）の添加が、ｉＣａｓｐ９またはルシフェラーゼを発現するために操作されたｐ５３発現細胞中のｉＣａｓｐ９およびルシフェラーゼの発現を消失させることを実証する。
【図４２】図３６で提示されたｐ５３発現細胞（ｐＶａｘ−ｐ５３）と対照細胞（ｐｃＤＮＡ３−ＧＦＰ）で得られたＣａｓｐ９とｉＣａｓｐ９タンパク質レベルの発光アッセイからのデータの棒グラフである。ヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞は、（ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７の存在下と不在下において）ｐＶａｘ−ｐ５３−ｉＣａｓｐ９−ｌｕｃ（ルシフェリン）プラスミドを保有するＦｕｓｏｇｅｎｉｘ脂質ナノ粒子で処理され、ｉＣａｓｐ９発現について評価された。これらのデータは、化学的二量体化誘導剤（ＣＩＤ；例えば、ＡＰ２０１８７とＡＰ１９０３）の添加が、ｉＣａｓｐ９またはルシフェラーゼを発現するために操作されたｐ５３発現細胞中のｉＣａｓｐ９およびルシフェラーゼの発現を消失させることを実証する。
【図４３】（ＡＰ２０１８７、図４３のＡとＢ、および、図４４のＡとＢそれぞれの存在下と不在下において）ｐＶａｘ−ｐ５３  Ｆｕｓｏｇｅｎｉｘ脂質ナノ粒子を用いて処置されたヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞のフローサイトメトリーアポトーシスデータ（アネキシンＶ）である。
【図４４】（ＡＰ２０１８７、図４３のＡとＢ、および、図４４のＡとＢそれぞれの存在下と不在下において）ｐＶａｘ−ｐ５３  Ｆｕｓｏｇｅｎｉｘ脂質ナノ粒子を用いて処置されたヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞のフローサイトメトリーアポトーシスデータ（アネキシンＶ）である。これらの図で提示されたデータは、自殺遺伝子治療が、アポトーシス（ルシフェラーゼ−アネキシンＶフローサイトメトリー）を誘導することによって、培養物中でｐ５３発現ヒト前立腺癌細胞を選択的に死滅させることを実証する。
【図４５】ヒト前立腺腫瘍細胞が移植された３０ｘ  ＮＳＧマウスを用いる、本開示の前臨床腫瘍内科学試験を描くフロー図である。
【図４６】図３３で描かれた前臨床腫瘍内科学試験からの腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフであり、皮下ヒト前立腺ＰＣ−３腫瘍を有するＮＳＧマウスに、１００μｇのＦｕｓｏｇｅｎｉｘ  ｐＶａｘ−ｐ５３製剤を腫瘍内（ＩＴ）に注入し、９６時間後に２ｍｇ／ｋｇのホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７を静脈内（ＩＶ）投与した。
【図４７】Ａ−Ｃは、図４６のＩＴ注射腫瘍内科学試験からの腫瘍の写真であり、皮下ヒト前立腺ＰＣ−３腫瘍を有するＮＳＧマウスに、１００μｇのＦｕｓｏｇｅｎｉｘ  ｐＶａｘ−ｐ５３製剤を腫瘍内に注入し、９６時間後に２ｍｇ／ｋｇのＡＰ２０１８７  ＩＶ投与した。
【図４８】皮下ヒト前立腺癌ＰＣ−３腫瘍を有する４匹のＮＳＧマウスの第１のＮＳＧマウスのグラフであり、それらのマウスに４ｘ１００μｇ投与量のＦｕｓｏｇｅｎｉｘ  ｐＶａｘ−ｐ５３製剤を静脈内（ＩＶ）に注入し、２４時間後に２ｍｇ／ｋｇのＡＰ２０１８７をＩＶ投与した。
【図４９】皮下ヒト前立腺癌ＰＣ−３腫瘍を有する４匹のＮＳＧマウスの第２のＮＳＧマウスのグラフであり、それらのマウスに４ｘ１００μｇ投与量のＦｕｓｏｇｅｎｉｘ  ｐＶａｘ−ｐ５３製剤を静脈内（ＩＶ）に注入し、２４時間後に２ｍｇ／ｋｇのＡＰ２０１８７をＩＶ投与した。
【図５０】皮下ヒト前立腺癌ＰＣ−３腫瘍を有する４匹のＮＳＧマウスの第３のＮＳＧマウスのグラフであり、それらのマウスに４ｘ１００μｇ投与量のＦｕｓｏｇｅｎｉｘ  ｐＶａｘ−ｐ５３製剤を静脈内（ＩＶ）に注入し、２４時間後に２ｍｇ／ｋｇのＡＰ２０１８７をＩＶ投与した。
【図５１】皮下ヒト前立腺癌ＰＣ−３腫瘍を有する４匹のＮＳＧマウスの第４のＮＳＧマウスのグラフであり、それらのマウスに、４ｘ１００μｇの投与量のＦｕｓｏｇｅｎｉｘ  ｐＶａｘ−ｐ５３製剤を静脈内（ＩＶ）に注射し、２４時間後に２ｍｇ／ｋｇのＡＰ２０１８７をＩＶ注射した。
【図５２】静脈内ｐ１４  ＬＮＰ  ｐＶＡＸで処置された前立腺腫瘍を有するＮＳＧマウス（すべての群でＮ＝６）における、二量体形成（ＣＩＤ）の化学的誘導物質のインビボでの投与後の時間に応じて、腫瘍体積中の変化率を示すグラフである。
【図５３】静脈内ｐ１４  ＬＮＰ  ｐＶＡＸで処置された前立腺腫瘍を有するＮＳＧマウス（すべての群でＮ＝６）における、二量体形成（ＣＩＤ）の化学的誘導物質のインビボでの投与後の時間に応じて、生存率を示す生存曲線である。
【図５４】１００μｇ、４００μｇ、および１０００μｇの静脈内ｐ１４  ＬＮＰ  ｐＶＡＸで処置された前立腺腫瘍を有するＮＯＤスキッドマウス（すべての群でＮ＝６）における、二量体形成（ＣＩＤ）の化学的誘導物質のインビボでの投与後の時間に応じた腫瘍体積の変化率を示す、用量漸増データのグラフである。５００，０００のＰＣ−３細胞をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの皮下に移植し、それらの腫瘍が２００ｍｍ３（すべての群でＮ＝２）に達すると、処置群へと無作為化した。動物に、割り当てられた投与量のｐ５３−ｉＣａｓｐ９  ＬＮＰを２回静脈内注射し、その後、２ｍｇ／ｋｇの二量体化剤を注射した。腫瘍は２４時間ごとに直接測定された。
【図５５】二量体形成（ＣＩＤ）の化学的誘導物質を含む、あるいはその誘導物質を含まないｐ５３−ｉＣａｓｐ９  ＬＮＰでの処置を繰り返すことにより、転移性腫瘍増殖を抑制することを示すグラフである。０日目に、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ  マウスに５００，０００のＰＣ−３Ｍルシフェラーゼ細胞が注射され、２２日目に、ＬＮＰ投与が１５０μｇのｐ５３−ｉＣａｓｐ９  ＬＮＰを用いて開始された。二量体化剤の投与が２ｍｇ／ｋｇで２４日目に開始された。全体の動物発光を検知するために、マウスを２４−４８時間ごとに画像化した。
【図５６】同質遺伝子Ｃ５７Ｂ６マウスにおける二量体形成（ＣＩＤ）の化学的誘導物質のインビボでの投与後の時間に応じて、腫瘍体積の変化率（図５６）と生存率（図５７）を示すグラフであり、その同質遺伝子Ｃ５７Ｂ６マウスは、マウスｐ５３プロモーターの制御下でｉＣａｓｐ９およびマウスＣＤ４０Ｌをコードする構築物を含有するＬＮＰで処置されたＢ１６マウスメラノーマ細胞が移植されている。Ｂ１６細胞の急速な（１０時間）倍加時間により、それらの大部分がｉＣａｓｐ９誘導アポトーシスに対して抵抗性になったが、腫瘍の成長を効果的に停止させるのに十分なＣＤ４０Ｌを依然として分泌した。ＧＭＣＳＦ＋ＯＶＡ抗原をコードする構築物も試験され、ｉＣａｓｐ９単独と比べてより効果的であると決定されたが、ＣＤ４０Ｌバージョンほど効果的ではなかった。両方の群でＮ＝３。
【図５７】同質遺伝子Ｃ５７Ｂ６マウスにおける二量体形成（ＣＩＤ）の化学的誘導物質のインビボでの投与後の時間に応じて、腫瘍体積の変化率（図５６）と生存率（図５７）を示すグラフであり、その同質遺伝子Ｃ５７Ｂ６マウスは、マウスｐ５３プロモーターの制御下でｉＣａｓｐ９およびマウスＣＤ４０Ｌをコードする構築物を含有するＬＮＰで処置されたＢ１６マウスメラノーマ細胞が移植されている。Ｂ１６細胞の急速な（１０時間）倍加時間により、それらの大部分がｉＣａｓｐ９誘導アポトーシスに対して抵抗性になったが、腫瘍の成長を効果的に停止させるのに十分なＣＤ４０Ｌを依然として分泌した。ＧＭＣＳＦ＋ＯＶＡ抗原をコードする構築物も試験され、ｉＣａｓｐ９単独と比べてより効果的であると決定されたが、ＣＤ４０Ｌバージョンほど効果的ではなかった。両方の群でＮ＝３。
【図５８Ａ】７５，０００のＢ１６Ｆ１０細胞の静脈内注射の３、６、９、および１２日後に、１００μｇの対照ＬＮＰあるいはｐ５３−ｉＣａｓｐ９  ＬＮＰが静脈内に投与された、Ｂ１５Ｆ１０肺転移モデルデータのそれぞれ写真と棒グラフである。５、８、１１、および１３日に、二量体形成（ＣＩＤ）の化学的誘導物質が腹腔内に投与された。動物は１４日目に屠殺され、肺転移が定量化された。
【図５８Ｂ】７５，０００のＢ１６Ｆ１０細胞の静脈内注射の３、６、９、および１２日後に、１００μｇの対照ＬＮＰあるいはｐ５３−ｉＣａｓｐ９  ＬＮＰが静脈内に投与された、Ｂ１５Ｆ１０肺転移モデルデータのそれぞれ写真と棒グラフである。５、８、１１、および１３日に、二量体形成（ＣＩＤ）の化学的誘導物質が腹腔内に投与された。動物は１４日目に屠殺され、肺転移が定量化された。
【図５８Ｃ】７５，０００のＢ１６Ｆ１０細胞の静脈内注射の３、６、９、および１２日後に、１００μｇの対照ＬＮＰあるいはｐ５３−ｉＣａｓｐ９  ＬＮＰが静脈内に投与された、Ｂ１５Ｆ１０肺転移モデルデータのそれぞれ写真と棒グラフである。５、８、１１、および１３日に、二量体形成（ＣＩＤ）の化学的誘導物質が腹腔内に投与された。動物は１４日目に屠殺され、肺転移が定量化された。
【図５８Ｄ】７５，０００のＢ１６Ｆ１０細胞の静脈内注射の３、６、９、および１２日後に、１００μｇの対照ＬＮＰあるいはｐ５３−ｉＣａｓｐ９  ＬＮＰが静脈内に投与された、Ｂ１５Ｆ１０肺転移モデルデータのそれぞれ写真と棒グラフである。５、８、１１、および１３日に、二量体形成（ＣＩＤ）の化学的誘導物質が腹腔内に投与された。動物は１４日目に屠殺され、肺転移が定量化された。
【図５９】７５，０００のＢ１６Ｆ１０細胞の静脈内注射の３、６、９、および１２日後に、１００μｇの対照ＬＮＰあるいはｐ５３−ｉＣａｓｐ９  ＬＮＰが静脈内に投与された、Ｂ１５Ｆ１０肺転移モデルデータのそれぞれ写真と棒グラフである。５、８、１１、および１３日に、二量体形成（ＣＩＤ）の化学的誘導物質が腹腔内に投与された。動物は１４日目に屠殺され、肺転移が定量化された。
【図６０】ｐ１６、ｐ５３、あるいはそれらの組み合わせ（ｐ１６＋ｐ５３）（すべての群でＮ＝１０）を標的とするＬＮＰ製剤のインビボでの投与後に、毎月実施されたＤＥＸＡスキャンである。マウスは、７２８日（１０４週）の年齢から毎月処置された。
【図６１】ｐ１６、ｐ５３、あるいはそれらの組み合わせ（ｐ１６＋ｐ５３）（すべての群でＮ＝１０）を標的とするＬＮＰ製剤のインビボでの投与後に、毎月実施されたＤＥＸＡスキャンである。マウスは、７２８日（１０４週）の年齢から毎月処置された。
【図６２】ｐ１６、ｐ５３あるいはそれらの組み合わせ（ｐ１６＋ｐ５３）（すべての群でＮ＝１０）を標的とするＬＮＰ製剤のインビボでの投与後の、自然に老化したマウスのオス（図６２）とメス（図６３）の骨密度の変化を示すグラフである。マウスは、７２８日（１０４週）の年齢から毎月処置された（矢印）。８９６日（１２８週）目に、処置されたマウスの骨密度利点の増大が、オスのマウスにおいて明らかである。
【図６３】ｐ１６、ｐ５３あるいはそれらの組み合わせ（ｐ１６＋ｐ５３）（すべての群でＮ＝１０）を標的とするＬＮＰ製剤のインビボでの投与後の、自然に老化したマウスのオス（図６２）とメス（図６３）の骨密度の変化を示すグラフである。マウスは、７２８日（１０４週）の年齢から毎月処置された（矢印）。８９６日（１２８週）目に、処置されたマウスの骨密度利点の増大が、オスのマウスにおいて明らかである。
【図６４】ｐ１６、ｐ５３あるいはそれらの組み合わせ（ｐ１６＋ｐ５３）（すべての群でＮ＝１０）を標的とするＬＮＰ製剤のインビボでの投与後の時間に応じて、生存率を示す生存曲線である。マウスは、７２８日（１０４週）の年齢から毎月処置された（矢印）。９３１日（１３３週）目で、処置されたマウスの延命効果が明らかである（併用療法と対照の間の＞５０％の生存差）。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本開示は、老化、疾患、あるいは他の状態に関連する細胞（総称して「標的細胞」）の成長および／または生存を選択的に減少し、防ぎ、および／または排除するための発現カセット、系、および方法を提供する。その発現カセット、系、および方法は、治療用化合物の標的化された送達に依存し、ならびに、例えば、非効率的な標的細胞の送達および／またはオフターゲット効果の結果として、治療効果を制限している既存の技術に関連する安全性と有効性の問題を克服している。
【００４９】
より具体的には、本明細書に開示される発現カセット、系、および方法は、標的細胞に備わっている細胞特異的な転写制御機構を利用し、それにより、治療用化合物の標的化−送達を必要とせずに、標的細胞に特異的な治療効果を達成する。これらの発現カセット、系、および方法は、治療用タンパク質をコードする核酸の発現の標的細胞に特異的な誘導を可能にし、そのタンパク質は、産生される細胞の成長および／または生存を減少させ、防ぎ、および／または、排除することができる。
【００５０】
したがって、本開示によって提供される様々な実施形態は以下のものを含む：
１．老化、疾患、および／または他の状態に関連する細胞などの、標的細胞内の治療用タンパク質の標的化された産生のための発現構築物であって、上記発現構築物は：
ａ．１つ以上の因子に応答して活性化される転写プロモーターであって、その各々が標的細胞内で生産される転写プロモーターと、
ｂ．転写プロモーターに動作可能に連結され、かつ転写プロモーターの調節制御下にある核酸であって、ここで、上記核酸は、標的細胞を含む細胞の成長および／または生存を減少させ、防ぎ、および／または排除することができる治療用タンパク質をコードする、核酸と、を含む発現構築物。
２．標的細胞内の治療用タンパク質の標的化された産生のための系であって、上記系は、標的細胞ならびに非標的細胞を含む細胞に核酸を送達するためのベクターを含み、
ここで、上記ベクターは、非標的細胞内ではなく、標的細胞（例えば、老化、癌、および／または、他の疾患および／または疾病に関連する細胞）内での治療用タンパク質の標的化された産生のための発現構築物を含み、
ここで、発現構築物は、（ｉ）１つ以上の因子に応答して活性化される転写プロモーターであって、その各々は標的細胞内で産生される、転写プロモーターと、（ｉｉ）転写プロモーターに動作可能に連結され、かつ転写プロモーター調節制御下にある核酸であって、
ここで、核酸は、標的細胞を含む産生される細胞の成長および／または生存を減少させ、防ぎ、および／または排除する治療用タンパク質をコードする、核酸とを含む、系。
３．標的細胞の増殖を減少させ、防ぎ、および／または排除するための方法であって、ここで、上記方法は、標的細胞内の治療用タンパク質の標的化された産生のための系を、標的細胞と接触させる工程を含み、
ここで、上記系は、細胞への核酸の送達のためのベクターを含み、
ここで、上記ベクターは、非標的細胞内ではなく、標的細胞（例えば、老化、疾患、あるいは他の状態に関連する細胞）内の治療用タンパク質の標的化された産生のための発現構築物を含み、
ここで、上記発現構築物は、（ｉ）１つ以上の因子に応答して活性化される転写プロモーターであって、その因子の各々は標的細胞内で産生される、転写プロモーターと、（ｉｉ）上記転写プロモーターに動作可能に連結され、かつ転写プロモーター調節制御下にある核酸であって、
ここで、上記核酸は、核酸の発現時に産生される治療用タンパク質をコードし、および
ここで、標的細胞（例えば、老化、疾患、あるいは他の状態に関連する細胞）中の治療用タンパク質の産生は、標的細胞の成長および／または生存を、減少し、防ぎ、および／または排除する核酸と、を含む方法。
４．ヒトの老化、疾患、あるいは他の状態の処置のための方法であって、ここで、老化、疾患、あるいは他の状態は標的細胞と関連し、上記方法は、標的細胞内の治療用タンパク質の標的化された産生のための系をヒトに投与する工程を含み、
ここで、上記系は、細胞に核酸を送達することができるベクターを含み、
ここで、上記ベクターは、非標的細胞内ではなく、標的細胞（例えば、老化、疾患、あるいは他の状態に関連する細胞）内の治療用タンパク質の標的化された産生のための発現構築物を含み、
ここで、上記発現構築物は、（ｉ）１つ以上の因子に応答して活性化される転写プロモーターであって、その因子の各々は標的細胞内で産生される、転写プロモーターと、（ｉｉ）転写プロモーターに動作可能に連結され、かつ転写プロモーターの調節制御下にある核酸であって、
ここで、上記核酸は、核酸の発現時に治療用タンパク質をコードする、核酸と、および
ここで、標的細胞（例えば、老化、疾患、あるいは他の状態に関連する細胞）中の治療用タンパク質の産生は、標的細胞の成長および／または生存を減少させ、防ぎ、および／または排除し、それにより、ヒトの老化を遅らせ、および／または、ヒトの疾患あるいは疾病を遅らせ、回復させ、および／または排除する、方法。
【００５１】
定義
本開示のこれらの態様および他の態様は、以下の非制限的な定義を参照することにより、より良く理解することができる。
【００５２】
本明細書で使用されるように、「転写プロモーター」という用語は、特定の遺伝子の転写を開始するＤＮＡの部位を指す。プロモーターは、遺伝子の転写開始部位の近く、同じ鎖上、あるいはＤＮＡの上流（鋳型鎖および非コード鎖とも呼ばれるアンチセンス鎖の３’領域に向かって）にある。プロモーターは、約１００−１０００の塩基対の長さであり得る。転写が起こるためには、ＲＮＡポリメラーゼとしても知られているＲＮＡを合成する酵素は、遺伝子の近くのＤＮＡに結合しなければならない。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼのための、およびＲＮＡポリメラーゼを動員する転写因子と呼ばれるタンパク質のための安全な初期結合部位をもたらす、特異的ＤＮＡ配列および応答エレメントを含有している。これらの転写因子には、特定のプロモーターに結合し、遺伝子発現を調節する、対応するヌクレオチドの特定のアクチベーターまたはリプレッサー配列がある。そのプロセスはより複雑であり、ＲＮＡポリメラーゼＩＩをプロモーターに結合するのに、少なくとも７つの様々な因子が必要である。プロモーターは、他の制御領域（エンハンサー、サイレンサー、境界領域／インスレーター）と連携して働いて、所与の遺伝子の転写のレベルを指図することができる重要な要素を表す。
【００５３】
真核転写プロモーターは多くの必須エレメントを含み、その必須エレメントは、コアプロモーター（つまり、転写を開始するのに必要なプロモーターの最小部分）を集合的に構成する。それらのエレメントは、（１）転写開始部位（ＴＳＳ）、（２）ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（特に、メッセンジャーＲＮＡをコードする遺伝子のプロモーターにおけるＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合部位）、（３）基本転写因子結合部位（例えば、コンセンサス配列ＴＡＴＡＡＡを有するＴＡＴＡボックスであり、これはＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）の結合部位である）、（４）Ｂ認識エレメント（ＢＲＥ）、（５）調節エレメントを含有するおよそ２５０ｂｐの近位プロモーター、（６）転写因子結合部位（例えば、配列ＣＡＣＧＴＦを有するＥボックスであり、これは、ＢＭＡＬ１１−Ｃｌｏｃｋ  ｎａｄ  ｃＭｙｃを含む塩基性ヘリックスループヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子の結合部位である）、および（７）さらなる調節エレメントを含有する遠位プロモーターを含む。本明細書で使用されるように、用語「転写プロモーター」は、転写開始部位から遠く離れている調節エレメントを指す用語である「エンハンサー」とは異なる。
【００５４】
真核プロモーターはしばしば、以下のクラスに従って分類される：（１）ＡＴベースのクラス、（２）ＣＧベースのクラス、（３）ＡＴＣＧコンパクトクラス、（４）ＡＴＣＧのバランスのとれたクラス、（５）ＡＴＣＧミドルクラス、（６）ＡＴＣＧが少ないクラス、（７）ＡＴが少ないクラス、（８）ＣＧスパイククラス、（９）ＣＧが少ないクラス、および（１０）ＡＴスパイククラス。Ｇａｇｎｉｕｃ  ａｎｄ  Ｉｏｎｅｓｃｕ−Ｔｉｒｇｏｖｉｓｔｅ，  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３：５１２（２０１２）を参照。真核プロモーターは「一方向性」または「双方向性」である。一方向性プロモーターは、単一の遺伝子の転写を調節し、ＴＡＴＡボックスの存在によって特徴付けられる。双方向性プロモーターは、双方向性遺伝子対（つまり、互いの方を向いた５’末端を有する対向し合う鎖上でコードされた、２つの隣接遺伝子）中の遺伝子の５’末端間のＤＮＡの短い（＜１ｋｂｐ）遺伝子間領域である。双方向性遺伝子はしばしば機能的に関連付けられ、および、それらが単一のプロモーターを共有するので、同時制御され、同時発現され得る。一方向性プロモーターとは異なり、双方向性プロモーターはＴＡＴＡボックスを含有していないが、ＧｐＣアイランドを含有しており、かつ、一方の側の優勢なＣとＡおよび他方側のＧとＴの中点周りの対称性を示す。ＣＣＡＡＴボックスは双方向性プロモーターにおいて共通であり、ＮＲＦ−１、ＧＡＢＰＡ、ＹＹ１、およびＡＣＴＡＣＡｎｎＴＣＣＣモチーフも同様である。
【００５５】
転写プロモーターは、しばしば２つ以上の転写因子結合部位を含有している。したがって、複数の転写因子結合部位を有するプロモーターの下流にある核酸の効率的な発現は、典型的に、複数の転写因子の協調作用を必要とする。それゆえ、転写制御の特異性、したがって関連する核酸の発現は、２つ以上の転写因子結合部位を有する転写プロモーターの利用により、増大させることができる。
【００５６】
本明細書で使用されるように、用語「転写因子」は、転写プロモーター内の特異的配列に結合し、それによって、プロモーターの操作可能な近接（ｏｐｅｒａｂｌｅ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）およびプロモーターの下流にある核酸の転写を制御する配列特異的ＤＮＡ結合因子を指す。転写因子はアクチベーター（転写を促進する）および抑制因子（補充を防ぐまたはＲＮＡポリメラーゼの動員または結合を防ぐことにより転写を阻止する）を含む。転写因子は、典型的には、（１）転写プロモーター内に同族の転写因子結合部位（応答エレメントとしても知られる）への配列特異的結合を促進する、１つ以上のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と；（２）外部シグナルに対して反応性のリガンド結合ドメインを含む、１つ以上のシグナル検知ドメイン（ＳＳＤ）と；（３）転写共調節因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｃｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）を含む他のタンパク質の結合部位を含有している、１つ以上のトランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）とを含む。
【００５７】
本明細書で使用されるように、用語「転写因子」は、もっぱら１つ以上のＤＢＤを有する因子を指し、ＤＢＤを含有していない他の制御タンパク質、例えば、コアクチベーター、クロマチンリモデラー（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｒｅｍｏｄｅｌｅｒｓ）、ヒストンアセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、およびメチラーゼを含むようには意図されない。
【００５８】
ＤＮＡ結合ドメインを含有しているおよそ２，６００のヒトタンパク質のうち、その大多数は転写因子であると考えられる。転写因子は、ＤＮＡ結合ドメインの構造的特徴に従って分類され、その構造的特徴には、塩基性ヘリックスループヘリックスドメイン、塩基性ロイシンジッパー転写因子（ｂＺＩＰドメイン）、二分応答制御因子（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）の末端エフェクタードメイン、ＧＣＣボックスドメイン、ヘリックスターンヘリックスドメイン、ホメオドメイン、ラムダリプレッサー様ドメイン、  血清応答因子様（ｓｒｆ−様）ドメイン、ペアードボックスドメイン、ウィングドヘリックスドメイン、ジンクフィンガードメイン、マルチＣｙｓ２Ｈｉｓ２ジンクフィンガードメイン、Ｚｎ２Ｃｙｓ６ドメイン、およびＺｎ２Ｃｙｓ８の核内受容体ジンクフィンガードメインが含まれる。
【００５９】
多くの転写因子は腫瘍抑制因子または癌遺伝子のいずれかであり、したがって、そのような転写因子内の突然変異およびそのような転写因子の異常な発現は、いくつかの癌および他の疾患ならびに疾病に関連する。例えば、（１）ＮＦ−κＢファミリー、（２）ＡＰ−１ファミリー、（３）ＳＴＡＴファミリー、および（４）ステロイド受容体ファミリー内の転写因子は、神経発達障害レット症候群（ＭＥＣＰ２転写因子）、糖尿病（肝細胞核因子（ＨＮＦ）およびインスリンプロモーター因子−１（ＩＰＦ１／Ｐｄｘ１））、発達性言語協調障害（ＦＯＸＰ２転写因子）、自己免疫疾患（ＦＯＸＰ３転写因子）、リー・フラウメニ症候群（ｐ５３腫瘍抑制因子）、および多発癌（転写因子のＳＴＡＴとＨＯＸのファミリー）に関連付けられる。Ｃｌｅｖｅｎｇｅｒ，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １６５（５）：１４４９−６０（２００４）；Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６６（１）：１８５−１９６（２００５）；Ｈｅｒｒｅｒｏｓ−Ｖｉｌｌａｎｕｅｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２０（９）：２２４７−２２５４（２０１４）；およびＣａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５８（１）：２５−３２（２００１）。Ｏｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２６（７）：１０２８−３７（２００７）には、ヒトの膀胱癌および前立腺癌における細胞周期の主要制御因子である、転写因子Ｅ２Ｆ３のアップレギュレーションが記載されている。Ｃａｎｔｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １８（３２）：４８７２−８４（２０１１）には、泌尿生殖器癌におけるＨＯＸ遺伝子のアップレギュレーションが記載されており；Ｃｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  １２９（１１）：２５７７−８７（２０１１）には、肝細胞癌におけるＨＯＸ遺伝子のアップレギュレーションが記載されており；Ｃａｎｔｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  １２５（７）：１５３２−４１（２００９）  には、７９の腫瘍組織タイプにわたるＨＯＸ  Ｄ１３発現が記載されており；Ｃａｎｔｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２０５（２）：２０２−１０（２００５）には、前立腺癌におけるＨＯＸ  Ｄ発現のアップレギュレーションが記載されており；Ｃａｎｔｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２（４１）：６４６２−８（２００３）には、ヒト膀胱移行細胞癌のＨＯＸネットワークにおける遺伝子座Ｃ遺伝子の過剰発現が記載されており；Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  １４：１５（２０１４）には、前立腺癌の標的としてのＨＯＸ転写因子が記載されており；および、Ａｌｈａｒｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２７（５）：１０００−８（２０１３）には、造血と急性白血病におけるＨＯＸＣ遺伝子の役割が記載されている。
【００６０】
ＡＰ−２ファミリーは、抑制因子とアクチベーターの両方として機能することができる、５つの転写因子を含む。ＡＰ−２γは、ｐ２１ＣＩＰ遺伝子のｐ５３活性化を阻止することにより癌細胞生存を制御する。高レベルのＡＰ−２γは、乳癌中の予後不良と関連している。Ｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２１７（１）：３２−４１（２００９）およびＷｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ  ２８（２２）：３５９１−６０１（２００９）。細胞生存を促進するさらなる転写因子は、フォークヘッド転写因子（ＦＯＸ）であり、これは、薬剤耐性に関与するタンパク質の発現を促進し、およびプログラム細胞死を阻止することができ、したがって、化学療法剤から癌細胞を保護することができる。Ｇｏｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｉｎ  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ３２（７）：３６５−７０（２０１３）には、発癌と薬物耐性におけるＦＯＸＯ３ａおよびＦＯＸＭ１の役割が記載されている。
【００６１】
転写因子は、プロモーターおよびエンハンサーに結合することができる。本開示で使用されるように、転写因子という用語は、プロモーター内の転写因子結合部位に結合する転写因子の部分集合を指し、エンハンサー配列に結合するこれらの因子を除外する。転写因子は、関連する核酸の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることもできる。本開示は、発現を阻害するのではなく促進し、したがって、関連する核酸の発現におけるアップレギュレーションを引き起こす、転写因子の転写因子結合部位を有する転写プロモーターを利用する。核酸発現をアップレギュレートする上記転写因子としては、例えば、限定されないが、（１）同族の結合部位に結合するＲＮＡポリメラーゼを安定化させ、（２）転写因子ＤＮＡ複合体にコアクチベーターあるいはコリプレッサーのタンパク質を動員し、および／または（３）ヒストンタンパク質のアセチル化を触媒する（あるいは、ヒストンタンパク質のアセチル化を触媒する１つ以上の他のタンパク質を動員する）、転写因子が挙げられる。そのようなヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）活性により、ＤＮＡに結合するヒストンの親和性が低下し、それにより、ＤＮＡを転写に利用しやすくなる。
【００６２】
本明細書で使用されるように、用語「ネクローシス」は、毒物、肉体的損傷、感染、または失血などの外力によって、細胞が損傷を受けた際に生じる細胞死へとつながるプロセスを指す。ネクローシスの細胞死は炎症を引き起こし、身体内の一層の苦痛または損傷を結果としてもたらす。本明細書で使用されるように、用語「アポトーシス」は、事象のプログラムされた配列が有害物質を放出することなく細胞の排除を引き起こす、細胞死につながるプロセスを指す。アポトーシスは、古い細胞、不必要な細胞、および不健康な細胞の除去により、身体の健康を発達させ、維持する際に重要な役割を果たす。アポトーシスは、カスパーゼタンパク質を含む、自殺遺伝子によって産生されたタンパク質によって媒介され、それは、生存に必要な細胞の成分を分解し、ＤＮＡｓｅｓの産生を誘導することで、核ＤＮＡを破壊する。
【００６３】
本明細書で使用されるように、用語「自殺遺伝子」は、ｐ５３媒介アポトーシスの細胞の死滅を引き起こすタンパク質を産生する遺伝子のクラスを指す。本開示の発現構築物および系で利用することができる自殺遺伝子は、カスパーゼ、Ｃａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９、ＢＡＸ、ＤＦＦ４０、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、ならびにシトシンデアミナーゼ、および、Ｃａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９、ＢＡＸ、ＤＦＦ４０、ヘルペスＨＳＶ−ＴＫ、ならびにシトシンデアミナーゼの誘導性変異体を含む。
【００６４】
ここに開示されている発現構築物および系は、老化、癌感染症、細菌感染、および／または他の疾病の処置のための方法と、老化、癌、感染症、細菌感染、および／または他の疾病に関連する細胞の死滅のための方法で使用され、かつ、標的細胞の成長および／または増殖を減少させる治療用タンパク質を使用する。ある実施形態では、治療用タンパク質は自殺遺伝子によって発現することができ、その自殺遺伝子は、Ｃａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９、ＢＡＸ、ＤＦＦ４０、ＨＳＶ−ＴＫ、あるいはシトシンデアミナーゼ、および、Ｃａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９、ＢＡＸ、ＤＦＦ４０、ＨＳＶ−ＴＫ、あるいはシトシンデアミナーゼの誘導性変異体をコードする。発現カセットおよび系は、従来の化学療法と共に使用して、老化、癌、感染症、細菌感染、および他の疾患ならびに疾病の処置のための治療レジメンの有効性を高めることができる。
【００６５】
本開示のある態様内では、発現構築物は、標的細胞に特異的プロモーター、例えば、老化細胞に特異的なプロモーターあるいは癌細胞に特異的なプロモーターの調節制御下でアポトーシス促進タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、ｐＶＡＸ１（図１４）プラスミド発現構築物である。
【００６６】
例示的なｐＶＡＸ１（商標）プラスミド発現構築物は、ｐ１６ｓプロモーターの調節制御下での誘導性カスパーゼ９タンパク質（ｉＣａｓｐ９）の標的細胞に特異的な発現のための、ｐＶＡＸ−１６ｓ−ｉＣａｓｐ９−ＭＸ（図１６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ｐ５３プロモーターの調節制御下での誘導性カスパーゼ９タンパク質（ｉＣａｓｐ９）の標的細胞に特異的な発現のための、ｐＶＡＸ１−５３−ｉＣａｓｐ９−ＭＸ（図２６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ｐ５３プロモーターの調節制御下での自己活性化カスパーゼ９タンパク質（ｓａＣＡＳＰ９）の標的細胞に特異的な発現のための、ｐＶａｘ１−ｐ５３−ｓａＣａｓｐ９−５（図２７；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ｐ５３プロモーターの調節制御下での誘導性カスパーゼ９タンパク質（ｉＣａｓｐ９）およびオボアルブミンタンパク質の標的細胞に特異的な発現のための、ｐＶａｘ１−ｐ５３−ｉＣａｓｐ９−ＯＶＡ（図２８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ｐ５３プロモーターの調節制御下での誘導性カスパーゼ９タンパク質（ｉＣａｓｐ９）およびオボアルブミンタンパク質の標的細胞に特異的な発現のための、ｐＶａｘ１−ｐ５３−ｉＣａｓｐ９−Ｇ−Ｏ（図２９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ｐ５３プロモーターの調節制御下での誘導性カスパーゼ９タンパク質（ｉＣａｓｐ９）およびＣＤ４０リガンドタンパク質（ＣＤ４０Ｌ）の標的細胞に特異的な発現のための、ｐＶａｘ１−ｐ５３−ｉＣａｓｐ９−ｈｕＣＤ４０Ｌ（図３０；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）を含む。
【００６７】
例示的なｐ１０プラスミド発現構築物は、ｐ１６ｅプロモーターの調節制御下の誘導性カスパーゼ９タンパク質（ｉＣａｓｐ９）の標的細胞に特異的な発現のための、ｐ１０−ｐ１６ｅ−ｉＣａｓｐ９（図１７；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、ｐ１６ｅプロモーターの調節制御下の自己活性化カスパーゼ９タンパク質（ｓａＣａｓｐ９）の標的細胞に特異的な発現のための、ｐ１０−ｐ１６ｅ−ｓａＣａｓｐ９（図１８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、ｐ５３プロモーターの調節制御下の誘導性カスパーゼ９タンパク質（ｉＣａｓｐ９）の標的細胞に特異的な発現のための、ｐ１０−ｐ５３−ｉＣａｓｐ９（図３３；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、および、ｐ５３プロモーターの調節制御下の自己活性化カスパーゼ９タンパク質（ｓａＣａｓｐ９）の標的細胞に特異的な発現のための、ｐ１０−ｐ５３−ｓａＣａｓｐ９（図３４；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を含む。
【００６８】
本開示の他の態様内では、発現構築物は、ＮＴＣ８３８５、ＮＴＣ８６８５、およびＮＴＣ９３８５プラスミド発現構築物を含む、ＮＴＣベースのプラスミド発現構築物であり、これは、標的細胞に特異的なプロモーター、例えば、老化細胞に特異的なプロモーターあるいは癌細胞特異的なプロモーターの調節制御下で、アポトーシス促進タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００６９】
本開示のさらなる態様内では、発現構築物は、ｇＷｉｚベースのプラスミド発現構築物であり、これは、標的細胞に特異的なプロモーター、例えば、老化細胞に特異的なプロモーターあるいは癌細胞に特異的なプロモーターの調節制御下で、アポトーシス促進タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００７０】
本開示の実施は、特に反対のことが示されていない限り、ウイルス学、腫瘍学、免疫学、微生物学、分子生物学、および組換えＤＮＡの分野で一般的に使用される従来の方法および技術を使用し、その方法論および技術は、当業者に周知であり、容易に利用可能である。そのような方法論および技術は、試験所マニュアル、ならびに科学文献および特許文献中で十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（１９８２）；“ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ｖｏｌ．  Ｉ  ＆  ＩＩ”（Ｇｌｏｖｅｒ，  ｅｄ．）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｇａｉｔ，  ｅｄ．，  １９８４）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”（Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  ｅｄｓ．，  １９８５）；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”（Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  ｅｄｓ．，  １９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  ｅｄ．，  １９８６）；およびＰｅｒｂａｌ，  “Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８４）を参照。上記または下記に関わらず本明細書で引用される、全ての出版物、特許および特許出願は、参照によって全体として本明細書に組み入れられる。
【００７１】
標的細胞の成長および／または生存を減少させ、防ぎ、および／または排除するための系および発現構築物
ある実施形態内では、本開示は、発現構築物と、標的細胞の成長および／または生存を標的細胞に特異的に減少させ、防ぎ、および／または排除することを達成するための１つの送達ベクターおよび１つの発現構築物を含む系を提供する。
【００７２】
系
本開示の系は、（１）細胞が標的細胞あるいは非標的細胞であるかに関わらず、その細胞への核酸の非特異的な送達が可能なベクター、および（ｂ）標的細胞に特異的な転写プロモーターと、治療用タンパク質をコードする核酸とを含む発現構築物を含み、この発現構築物は、治療用タンパク質の標的細胞に特異的な産生を達成する。本明細書に開示される系は、老化、疾患、あるいは別の状態に関連する細胞などの標的細胞の成長または生存の特性をもたらすが、同時に、正常な、老化、疾患、あるいは別の状態に関連しない非標的細胞の成長または生存の特性をもたらさないことが望ましい広範囲の治療適用に有用である。
【００７３】
本開示は、老化、疾患、あるいは他の状態に関連する細胞の広範囲の成長および／または生存をもたらすための系を提供し、その系は、同様に、（１）非特異的核酸送達ベクター、および（２）（ａ）標的細胞に特異的な転写プロモーターと（ｂ）治療用タンパク質をコードする核酸とを含む発現構築物を含む。ここに開示される系のこれらの態様の各々は、本明細書においてより詳細に記載されている。
【００７４】
ある実施形態内では、標的細胞の成長および／または生存をもたらすための系が本明細書に提供され、その系は：（１）非特異的核酸送達ベクターおよび（２）発現構築物を含み、上記発現構築物は：（ａ）標的細胞において活性化されるが、正常な非標的細胞では活性化されない転写プロモーター、および（ｂ）転写プロモーターの制御下である核酸であって、例えば、産生される細胞におけるプログラム細胞死の機構を誘導することによって、標的細胞の成長および／または生存を減少させ、防ぎ、および／または排除することができる治療用タンパク質をコードする、核酸を含む。したがって、これらの系は、毒素を使用することなく、および発現構築物の標的細胞に特異的な送達がない状況で、標的細胞内で生成される、かつ標的細胞に備わっている転写機構を利用することより、標的細胞の選択的な死滅を達成する。
【００７５】
ヒト標的細胞が老化細胞であるこれらの実施形態のある態様では、転写プロモーターは、少なくとも、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６（５２）：４８６５５−６１（２００１）に記載されるｐ１６ＩＮＫ４ａ／ＣＤＫＮ２Ａの転写因子結合部位（つまり、応答エレメント）を有することができ、この転写プロモーターは、ＳＰ１、ＥＴＳ１、およびＥＴＳ２などの因子による活性化に反応性である。転写プロモーターは、少なくともｐ２１／ＣＤＫＮ１Ａの転写因子結合部位（つまり、応答エレメント）も含むことができ、この転写プロモーターは、ｐ５３／ＴＰ５３などの因子による活性化に反応性である。転写活性化は、治療用タンパク質、例えば、Ｃａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９、ＤＦＦ４０、ＢＡＸ、ＨＳＶ−ＴＫ、あるいは炭酸脱水酵素、または、Ｃａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９、ＢＡＸ、ＤＦＦ４０、ＨＳＶ−ＴＫ、あるいはシトシンデアミナーゼの誘導性変異体をコードする核酸の発現を誘導する。
【００７６】
ヒト標的細胞が癌細胞、例えば、脳癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、乳癌細胞、肝臓癌細胞、血液癌細胞、および骨癌細胞であるこれらの実施形態の他の態様では  転写プロモーターは、少なくともｐ２１ｃｉｐ１／ｗａｆ１プロモーター、ｐ２７ｋｉｐ１プロモーター、ｐ５７ｋｉｐ２プロモーター、ＴｄＴプロモーター、Ｒａｇ−１プロモーター、Ｂ２９プロモーター、Ｂｌｋプロモーター、ＣＤ１９プロモーター、ＢＬＮＫプロモーター、および／または、λ５プロモーターの転写因子結合部位（つまり、応答エレメント）を含むことができ、この転写プロモーターは、１つ以上の転写因子、例えば、ＥＢＦ３、Ｏ／Ｅ−１、Ｐａｘ−５、Ｅ２Ａ、ｐ５３、ＶＰ１６、ＭＬＬ、ＨＳＦ１、ＮＦ−ＩＬ６、ＮＦＡＴ１、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＨＯＸ、Ｅ２Ｆ３、および／またはＮＦ−κＢ転写因子による活性化に反応性であり、および、その転写活性化は、治療用タンパク質、例えば、Ｃａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９、ＢＡＸ、ＤＦＦ４０、ＨＳＶ−ＴＫ、あるいはシトシンデアミナーゼ、または、Ｃａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９、ＢＡＸ、ＤＦＦ４０、ＨＳＶ−ＴＫ、あるいはシトシンデアミナーゼの誘導性変異体をコードする核酸の発現を誘導し、その治療用タンパク質は、例えば、アポトーシスを含む細胞プロセスを介して老化細胞の細胞死を誘導することによって、癌細胞の成長および／または生存を減少させ、防ぎ、および／または排除する。例えば、ネクローシス／ネクロトーシス、オートファジー細胞死、小胞体ストレス関連細胞毒性、分裂死、パラトーシス（ｐａｒａｐｔｏｓｉｓ）、パイロトーシス（ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓ）、ピロネクローシス（ｐｙｒｏｎｅｃｒｏｓｉｓ）、およびｅｎｔｏｓｉｆｓを含む、細胞プロセスによって細胞死を誘導することによって、癌細胞の成長および／または生存を減少させ、防ぎ、および／または排除する他の治療用タンパク質が利用されてもよい。標的細胞が、例えば、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、肝炎ウイルス、レトロウイルス、インフルエンザウイルス、およびライノウイルスを含むウイルスなどの感染因子に感染しているヒト細胞であるか、または標的細胞が細菌細胞である、これらの実施形態のさらなる態様では、転写プロモーターは、感染因子または細菌細胞によって発現される因子によって活性化することができ、その転写活性化は、治療用タンパク質、例えば、Ｃａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９、ＢＡＸ、ＤＦＦ４０、ＨＳＶ−ＴＫ、あるいはシトシンデアミナーゼ、または、Ｃａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９、ＢＡＸ、ＤＦＦ４０、ＨＳＶ−ＴＫ、あるいはシトシンデアミナーゼの誘導性変異体をコードする核酸の発現を誘導し、その治療用タンパク質は、例えば、アポトーシスを含む細胞プロセスによる老化細胞の細胞死を誘導することによって、老化細胞の成長および／または生存を減少させ、防ぎ、および／または排除する。例えば、ネクローシス／ネクロトーシス、オートファジー細胞死、小胞体ストレス関連細胞毒性、分裂死、パラトーシス（ｐａｒａｐｔｏｓｉｓ）、パイロトーシス（ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓ）、ピロネクローシス（ｐｙｒｏｎｅｃｒｏｓｉｓ）、およびｅｎｔｏｓｉｆｓを含む、細胞プロセスによって細胞死を誘導することによって、老化細胞の成長および／または生存を減少させ、防ぎ、および／または排除する他の治療用タンパク質が使用されてもよい。
【００７７】
ここに開示される系のこれらの態様の各々は、本明細書において、より詳細に記載されている。
【００７８】
１．非特異的核酸送達ベクター
本開示の系は、標的細胞に固有の転写機構を利用することにより、標的細胞特異性を達成する。したがって、本明細書に記載される系は、標的細胞を含むが、これに限定されない細胞への発現構築物の非特異的送達に容易に適合し得る核酸送達ベクターを利用する。
【００７９】
種々様々な非ウイルスとウイルスの両方の核酸送達ベクターは、当技術分野において周知であり、かつ容易に利用可能であり、および、本明細書に開示される発現構築物の非特異的細胞送達ための使用に適合し得る。例えば、ウイルスの核酸送達方法論の概要については、Ｅｌｓａｂａｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ８（３）：２３５−２４４（２０１１）を参照。哺乳動物細胞への核酸の成功した送達は、効率的な送達ベクターの使用に依存する。ウイルスベクターは、望ましいレベルの送達効率を示すが、しばしば、好ましくない免疫原性、炎症反応、およびスケールアップに関連する問題も示し、これらのすべては臨床使用を制限する可能性がある。核酸の送達のための理想的なベクターは、安全であるが、核酸安定性および適切な細胞内コンパートメントへの核酸の効率的な移動を確実にする。
【００８０】
非ウイルスとウイルスの核酸送達ベクターの非限定的な例は、本明細書に記載され、かつ科学文献および特許文献において開示される。より具体的には、ここに開示される系は、１つ以上のリポソームベクター、ウイルスベクター、ナノ粒子、ポリプレックス（ｐｏｌｙｐｌｅｘｅｓｍ）デンドリマーを使用してもよく、それらの各々は、核酸の非特異的送達のために開発されており、本明細書に記載される発現構築物の非特異的送達に適合することができ、および、上記系は、対象の標的細胞への系の標的化された送達を促進するための１つ以上の薬剤を取り込むように修飾されることで、ここに開示される系の標的細胞特異性を増強することができる。
【００８１】
２．リポソームベクターおよびナノ粒子
発現カセットは、例えば、リポソーム、小胞、ミセルおよび／または、マイクロスフェアなどの、脂質膜、脂質二重層、および／または脂質複合体内に取り込まれる、および／または、脂質膜、脂質二重層、および／または脂質複合体に関連し得る。本開示の発現構築物とともに利用され得る脂質ベース送達系を調製するための適切な方法は、Ｍｅｔｓｅｌａａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２（４）：３１９−２９（２００２）；Ｏ’Ｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２（２）：２６９−８３（２００３）；Ｏ’Ｈａｇａｎ，  Ｃｕｒｒ．  Ｄｕｒｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓｏｒｄ．  １（３）：２７３−８６（２００１）；Ｚｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ２２（２）：３５５−６９（２００２）；Ｃｈｉｋｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ２２（２）：３３９−５３（２００２）；Ｂｕｎｇｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｒｅｐ．  ２２（２）：３２３−３８（２００２）；Ｐａｒｋ，  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ２２（２）：２６７−８１（２００２）；Ｕｌｒｉｃｈ，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｒｅｐ．  ２２（２）：１２９−５０；Ｌｏｆｔｈｏｕｓｅ，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  ５４（６）：８６３−７０（２００２）；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２５（４）：２８９−３０３（２００２）；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．  １９（６）：７１５−２８（２００２）；Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ８（９）：１１２３−３６（２００１）；および、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４（３）：２２９−３５（１９９４）に記載されている。Ｍｉｄｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １５７：１６６−１７８（２００９）には、ポリマー、ペプチド、および脂質を含む核酸の送達のための化学的ベクターが記載されている。Ｓｉｏｕｄ  ａｎｄ  Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３１２（４）：１２２０−５（２００３）には、核酸の送達のためのカチオン性リポソームが記載されている。
【００８２】
それらの電荷が正であるので、負に帯電したＤＮＡ分子を濃縮するために、および、リポソーム中へのＤＮＡの封入を容易にするために、カチオン性脂質が使用されている。カチオン性脂質はさらに、リポソームに高度な安定性を提供する。カチオン性リポソームは、細胞膜と相互作用し、エンドサイトーシスのプロセスを介して細胞によって取り入れられる。エンドサイトーシスの結果として形成されたエンドソームは、細胞質中で分解され、それにより、カーゴ核酸を放出する。しかしながら、カチオン性リポソームの固有の安定性ゆえに、トランスフェクション効率は、カーゴ核酸のリソソーム分解の結果として低くなり得る。
【００８３】
ヘルパー脂質（電気的中性脂質（ｅｌｅｃｔｒｏｎｅｕｔｒａｌ  ｌｉｐｉｄ）ＤＯＰＥおよびＬ−ａ−ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）など）は、カチオン性脂質と組み合わせて使用すると、安定性が低下したリポソームを形成し、したがって、トランスフェクション効率の向上を示す。これらの電気的中性脂質は融合性脂質（Ｆｕｓｏｇｅｎｉｘ  ｌｉｐｉｄｓ）と呼ばれる。Ｇｒｕｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７（８）：２８５３−６６（１９８８）およびＦａｒｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２３５（２）：２８９−９５（１９９５）を参照。ＤＯＰＥはＨＩＩ相構造を形成し、５°Ｃ〜１０°Ｃより高い温度で、脂質二重層の融合につながる超分子の構成を引き起こす。リポソーム中へのＤＯＰＥの取り込みはさらに、エンドソーム膜を不安定にするＨＩＩ相の形成を支援する。
【００８４】
コレステロールは、リポソームベクターが静脈内に投与される用途のために、ＤＯＰＥリポソームと組み合わせて使用することができる。Ｓａｋｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ  ５２（２）：１６５−７２（２００１）。ＤＯＰＥのアシル鎖中の１つの不飽和の存在は、膜融合活性の決定因子である。Ｔａｌｂｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６（１９）：５８２７−３６（１９９７）。
【００８５】
飽和鎖を有するフッ素化ヘルパー脂質、例えば、ＤＦ４Ｃ１１ＰＥ（ｒａｃ−２，３−ジ［１１−（Ｆ−ブチル）ウンデカノイル）グリセロ−１−ホスホエタノールアミンは、リポポリアミン（ｌｉｐｏｐｏｌｙａｍｉｎｅ）リポソームのトランスフェクション効率も高める。Ｂｏｕｓｓｉｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ３（２）：１０９−１４（２００１）；Ｇａｕｃｈｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ  １２（６）：９４９−６３（２００１）；および、Ｇａｕｃｈｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ３（４）：３３８−４４（２００１）。
【００８６】
ヘルパー脂質１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）は、ＤＯＰＥ  リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘｅｓ）と比べて、インビトロの細胞トランスフェクションの効率を高める。Ｐｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ  １３：１５６６−８（２００８）。ＤＯＰＥのオレイン酸鎖の二重結合を、Ｄｉｓｔｅａｒ−４−イノイルＬ−ａ−ホスファチジルエタノールアミン［ＤＳ（９−イン）ＰＥ］などの三重結合と交換することにより、安定したリポプレックスを産生すると示されている。Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｒｇ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｃｈｅｍ  ４（２）：１９６−９（２００６）。
【００８７】
インフルエンザウイルスの血球凝集素のＨＡ−２サブユニットのＮ末端セグメントに由来する両親媒性のアニオン性ペプチド、例えば、ＩＦＮ７（ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥ  ＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷ  ＹＧ）とＥ５ＣＡ（ＧＬＦＥＡＩＡＥＦＩ  ＥＧＧＷＥＧＬＩＥＧ  ＣＡ）のペプチドを使用して、リポソームのトランスフェクション効率を桁違いに高めることができる。Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８９（１７）：７９３４−８（１９９２）；Ｍｉｄｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１（４）：８７１−８（１９９３）；Ｋｉｃｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ８（２）：２１３−２１（１９９７）；Ｗａｇｎｅｒ，  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ３８（３）：２７９−２８９（１９９９）；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ３（６）：５６０−８（２００１）。ＧＡＬＡなどのいくつかの人工ペプチドも、融合ペプチドとして使用された。例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５６（７）：９６７−８５（２００４）およびＳａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ３９１（８）：２７１７−２７（２００８）を参照。単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｈからの融合ペプチドは、ヒト細胞におけるＤＮＡ／リポフェクタミンリポプレックスおよび導入遺伝子発現のエンドソーム放出（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｒｅｌｅａｓｅ）を改善する（Ｔｕ  ａｎｄ  Ｋｉｍ，  Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  １０（６）：６４６−５４（２００８）。
【００８８】
ＰＣＴ特許公報ＷＯ１９９９０２４５８２Ａ１号およびＷＯ２００２／０４４２０６号には、膜融合を促進するレオウイルス科に由来するタンパク質のクラスが記載されている。これらのタンパク質は、爬虫類レオウイルスのｐ１４タンパク質およびアクアレオウイルスのｐ１６タンパク質によって例証される。ＰＣＴ特許公報ＷＯ２０１２／０４０８２５には、膜融合を促進するための組み換えポリペプチドが記載されており、そのポリペプチドは、ｐ１４融合関連小さな膜貫通（ｆｕｓｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｍａｌｌ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）（ＦＡＳＴ）タンパク質の外部ドメインとの少なくとも８０％の配列同一性を有し、また機能性のリストイル化モチーフ、ＦＡＳＴタンパク質からの膜貫通ドメインおよびｐ１５  ＦＡＳＴタンパク質の外部ドメインとの少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有する。’８２５のＰＣＴには、選択的融合のための組み換えポリペプチドへの標的化リガンドの添加がさらに記載されている。’８２５のＰＣＴで提示された組み換えポリペプチドは、核酸の送達を促進するリポソームの膜内に取り込まれ得る。核酸を含む治療用化合物を哺乳動物細胞の細胞質に送達するためのＦｕｓｏｇｅｎｉｘリポソームは、リポソームの破壊ならびにその結果として生じるカーゴ核酸の全身性の分散、および／または、エンドソームを取り込みならびにその結果として生じる核酸破壊を減少させるものであり、Ｉｎｎｏｖａｓｃｒｅｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｈａｌｉｆａｘ，  Ｎｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａ，  ＣＡ）から商業上入手可能である。
【００８９】
金、シリカ、酸化鉄、チタン、ヒドロゲル、およびリン酸カルシウムを含む種々様々な無機ナノ粒子は、核酸の送達について記載されているが、本明細書に記載される発現構築物の送達に適合し得る。例えば、Ｗａｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｂｈａｄｕｒｉ，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １８（１）：１−１４（２０１２）（核酸配列の送達のための無機ナノ粒子の説明）；Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ｅ−ｐｕｂ（２０１４）（核酸送達のための金ナノ粒子の説明）；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ３０（３）：８３９−４５（２０１４）（ＤＮＡオリゴヌクレオチドの送達のための二酸化チタンナノ粒子の説明）；Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４（１０）：９１８−２５（２０１４）（遺伝子送達のための生物分解性のリン酸カルシウムナノ粒子の説明）；Ｓｉｚｏｖｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３６（１）：２３４−４０（２０１４）（サブ−３０単分散のオリゴヌクレオチドナノ粒子の説明）を参照。
【００９０】
無機ベクターの利点は、貯蔵安定性、低い免疫原性、および微生物抵抗性である。１００ｎｍ未満のナノ粒子は、核酸を効率的に捕捉し、分解せずにエンドソームからの逃避を可能にする。無機ナノ粒子は、培養皿の底部上の高密度および優先的位置により、付着細胞株の改善されたインビトロのトランスフェクションを示す。核酸送達と安定した蛍光マーカーの結合を可能にする量子ドットが記載されている。
【００９１】
定義された次元のヒドロゲルナノ粒子および組成物は、ＰＲＩＮＴ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｏｎ−ｗｅｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ）と呼ばれる粒子形成プロセスによって調製することができ、送達ベクターとして本明細書に開示される発現構築物に使用することができる。核酸は、静電会合（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）および物理的捕捉によって粒子に封入され得る。全身投与した後にナノ粒子からカーゴ核酸が分離するのを防ぐために、分解可能なジスフィルド結合を有する重合可能な結合（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｂｌｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を利用することができる。
【００９２】
ＰＲＩＮＴ技術は、標的細胞に対する発現カセットの標的化を強化するためのサイズ、形、係数、化学組成物、および表面機能性を含む、正確に制御された特性を有する設計されたナノ粒子の生成を可能にする。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３２：１１３０６−１１３１３（２０１０）；Ｅｎｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  １１：８０８−８１３（２０１１）；Ｇｒａｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５：１１６１３−１１６１８（２００８）；Ｋｅｌｌｙ，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３０：５４３８−５４３９（２００８）；Ｍｅｒｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８：５８６−５９１（２０１１）を参照。さらに、ＰＲＩＮＴは、優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）条件下での粒子製造のスケールアップを可能にする、連続的なロールツーロール製造技術に適している。
【００９３】
ナノ粒子は、経口バイオアベイラビリティを改善し、酵素学的分解を最小限に抑えて、血液脳関門を通過するために、脂質コーティング用いてカプセル化することができる。ナノ粒子の表面は、水溶性、インビボでの循環、およびステルス特性を改善するためにペグ化されてもよい。
【００９４】
３．ウイルスベクター
例えば、単純ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスを含む、種々様々のウイルスベクターは、当業者に周知で、かつ容易に利用可能であり、上記ウイルスベクターは、核酸（特に、治療用タンパク質の標的細胞に特異的な発現のための発現カセットを含む核酸）の送達のために本明細書に開示される系での使用に適合し得る。
【００９５】
特定の受容体への天然のウイルスあるいは操作されたウイルスの指向性は、核酸の送達のためのウイルスベクターを構築するための基礎である。標的細胞へのこれらのベクターの結合は、ウイルスベクター上のリガンドによる細胞表面上の特定の受容体の認識に左右される。表面上に非常に特異的なリガンドを提示するウイルスは、細胞上の特定の受容体上に固定される。ウイルスは、対象の標的細胞の表面上で提示された受容体のためのリガンドを表示するために操作され得る。細胞受容体とウイルスリガンドとの相互作用は、Ｔｏｌｌ様受容体によりインビボで調節される。
【００９６】
細胞へのウイルスベクターの侵入には、受容体依存性エンドサイトーシスであるか膜融合であるかに関わらず、エンドソームおよび／またはリソソームの経路からのウイルスベクターの逃避を可能にする、特定のセットのドメインが必要である。他のドメインは、視交叉上核への侵入を促進する。複製、組立、潜伏は、ベクターと細胞の相互作用の動力学を決定し、ウイルスベクターの選択の際に、ならびに、治療用のカーゴ保有細胞（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｃａｒｇｏ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）を操作する際に、癌自殺遺伝子治療を設計する際に重要な考慮事項となる。
【００９７】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、ヘルペスウイルス科のファミリーに属し、エンベロープＤＮＡウイルスである。ＨＳＶは、３つの主要なリガンド糖タンパク質（ｇＢ、ｇＨ、ならびにｇＬ）のオーソログを介して細胞受容体に結合し、時に、アクセサリータンパク質を使用する。これらのリガンドは、病気の経口、眼、および生殖器の形態にウイルスが侵入する主要経路において決定的役割を果たす。ＨＳＶは、神経系の細胞受容体への高い指向性を保有し、および、老化細胞、癌細胞、ならびに感染因子に感染した細胞を含む標的細胞に発現カセットを送達するために、組み換えウイルスを操作するのに利用され得る。治療用の傍観者効果は、構築物中にコネキシンをコードする配列を含めることによって増強される。標的細胞への核酸の送達のための単純ヘルペスウイルスベクターは、Ａｎｅｓｔｉ  ａｎｄ  Ｃｏｆｆｉｎ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １０（１）：８９−１０３（２０１０）；Ｍａｒｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ６５５：１１８−４４（２００９）；および、Ｋａｓａｉ  ａｎｄ  Ｓａｅｋｉ，  Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ６（３）：３０３−１４（２００６）で説明されている。
【００９８】
レンチウイルスは、レトロウイルス科のファミリーに属し、エンベロープ一本鎖ＲＮＡレトロウイルスであり、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含む。ＨＩＶエンベロープタンパク質はＣＤ４に結合し、ＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ、および樹状細胞などのヒト免疫系の細胞上に存在する。細胞への侵入時に、ウイルスＲＮＡゲノムは二本鎖ＤＮＡに逆転写され、それは、細胞核内へと移入され、細胞ＤＮＡに統合される。ＨＩＶベクターは、治療用遺伝子を白血病細胞に送達するために使用された。組み換えレンチウイルスは、正常細胞への実質的な非特異的送達なしに、膵癌細胞内への、卵巣上皮癌への、および神経膠腫細胞への核酸のムチン媒介送達について記載されている。標的細胞への核酸の送達のためのレンチウイルスベクターは、Ｐｒｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２１（３）：１６２−７０（２０１２）；Ｓｔａｕｎｓｔｒｕｐ  ａｎｄ  Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，  Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １１（５）：３５０−６２（２０１１）；および、Ｄｒｅｙｅｒ，  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ４７（２）：１６９−８７（２０１１）に説明されている。
【００９９】
アデノウイルスは、二本鎖の直鎖ＤＮＡゲノムおよびカプシドからなる、非エンベロープウイルスである。当然、アデノウイルスはアデノイド中に存在し、上気道感染症の原因となる可能性がある。アデノウイルスは、細胞の鼻、気管、および肺の上皮への侵入のために、アデノウイルスの繊維タンパク質のコクサッキーウィルスとアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）を利用する。ＣＡＲは、老化細胞および癌細胞上に低レベルで発現される。核酸を標的細胞に送達することができる組み換えアデノウイルスが生成され得る。複製可能なアデノウイルス媒介自殺遺伝子治療（ＲｅＣＡＰ）は、新しく診断された前立腺癌のために臨床試験中である。標的細胞への核酸の送達のためのアデノウイルスのベクターは、Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｋａｍｉｈｉｒａ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ．  ３１（２）：２０８−２３（２０１３）；Ａｌｅｍａｎｙ，  Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１５：９３−１１４（２０１２）；Ｋａｕｆｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｎｅｔｔｅｌｂｅｃｋ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １８（７）：３６５−７６（２０１２）；および、Ｍｏｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  ７（１２）：１３７３−８５（２０１０）に説明されている。
【０１００】
アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）は、ヒトおよび他の一部の霊長類種に感染する、小さなウイルスである。ＡＡＶは、疾患を引き起こすことが現在知られておらず、結果的に、ウイルスは非常に軽度の免疫応答を引き起こす。ＡＡＶを使用するベクターは、分裂細胞および静止細胞の両方に感染し、宿主細胞のゲノム中統合することなく、染色体外の状態を存続することができる。これらの特徴により、ＡＡＶは、本開示の系で使用されるウイルスベクターを作製するための非常に魅力的な候補になる。標的細胞への核酸の送達のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １７２（２）：５８９−６００（２０１３）；Ｈａｊｉｔｏｕ，  Ａｄｖ  Ｇｅｎｅｔ  ６９：６５−８２（２０１０）；ＭｃＣａｒｔｙ，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １６（１０）：１６４８−５６（２００８）；および、Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３９２：３８１−４０５（２００５）に説明されている。
【０１０１】
４．ポリプレックス
ポリプレックスはＤＮＡとポリマーの複合体である。ポリプレックスは、カチオンポリマーからなり、それらの製作はイオン相互作用による自己組織化に基づく。ポリプレックスと、リポソームおよびリポプレックスの作用方法の間の１つの重要な違いは、ポリプレックスが、核酸カーゴを標的細胞の細胞質に直接放出することができないということである。その結果、不活性化アデノウイルスなどのエンドソーム溶解剤との同時トランスフェクションは、粒子取り込み中に作られた細胞内小胞からの逃避を容易にするために必要となる。ＤＮＡがエンドリソソームの経路（つまり、プロトンスポンジ効果）から逃れることができる機構のより良い理解は、ポリマー骨格におけるプロトン化可能な残基の取り込みなどの新規ポリマー合成方策のきっかけとなり、またポリカチオンベースの系についての研究を活性化している。例えば、Ｐａｒｈａｍｉｆａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｅ−ｐｕｂ  （２０１４）；Ｒｙｃｈｇａｋ  ａｎｄ  Ｋｉｌｂａｎｏｖ，  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ｅ−ｐｕｂ  （２０１４）；Ｊａｆａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １９（２）：１９７−２０８（２０１２）を参照。
【０１０２】
ポリカチオンのナノキャリアは、その低毒性、高い付加能力、および製作の容易さにより、ウイルスベクターに対する実質的な利点を示し、高い免疫原性、および潜在的発癌性、および用量依存的な毒性を引き起こす脂質ベースのベクターを示す。ポリエチレンイミン、キトサン、ポリ（β−アミノエステル）、およびホスホロアミド酸が核酸の送達について記載されている。例えば、Ｂｕｓｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ６５（９）：１２３４−７０  （２０１３）を参照。これらのポリマーナノキャリアのサイズ、形、および界面化学は、容易に操作することができる。
【０１０３】
５．デンドリマー
デンドリマーは、球形の高度に分岐したポリマーである。デンドリマー粒子の表面は、例えば、正の表面電荷（カチオン性デンドリマー）などを用いて、機能化される場合があり、それは、核酸の送達に使用され得る。デンドリマー−核酸の複合体は、エンドサイトーシスによって細胞中に取り込まれる。デンドリマーは、堅牢な共有結合構造および分子の構造およびサイズに対する極端な制御を提供する。デンドリマーは、動力学的駆動化学（ｋｉｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｄｒｉｖｅｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を使用して、デンドリマーを産生するＤｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．から商業上利用可能であり、そのデンドリマーは、核酸の送達に適合することができ、低毒性、高効率で細胞をトランスフェクトすることができる。
【０１０４】
発現構築物の標的化された送達は本開示の系によって必要とされない一方、標的細胞の成長および／または生存の標的化された減少、防止、および／または排除は、標的細胞に固有の標的細胞の細胞内転写機構を利用することによって達成することができるということが理解され、企図された正確な適用に応じて、細胞のサブセットへの標的化された送達を容易にする１つ以上の成分を、他の非特異的送達ベクターに組み込むことが望ましい場合があり、その細胞の少なくとも一部は、本開示の発現構築物による成長および／または生存阻害に影響されやすい標的細胞を含む。
【０１０５】
リポソーム、ナノ粒子、ウイルス、および本明細書に記載される他のベクターによる核酸の標的化された送達は、科学的文献および特許文献に記載されており、当業者に周知で、かつ容易に利用可能である。したがって、そのような標的化された送達技術は、標的細胞内で達成される成長および／または生存の減少、防止、および／または排除の特異性を高めるために、本開示の発現構築物の伝達を標的化するために適切に適合され得る。標的化された送達技術の以下の例は、限定するためではなく、本開示の系を達成するのに適合され得る標的化された送達ベクターを例証するために、本明細書で提供される。
【０１０６】
発現構築物
本開示の発現構築物は、（ａ）標的細胞に産生される因子に反応する転写プロモーターであって、そのうち１つ以上が産生されず、実質的に低レベルで産生され、不活性であり、および／または非標的細胞中で実質的に低活性を示す、転写プロモーターと、（ｂ）前記転写プロモーターに動作可能に連結され、かつ前記転写プロモーターの調節制御下にある核酸であって、該核酸が、標的細胞を含む細胞の成長および／または生存を減らし、妨げ、および／または排除することが可能なタンパク質をコードし、前記細胞中で前記タンパク質が産生される、核酸とを含む。
【０１０７】
１．  標的細胞の特異的な転写プロモーター
本開示は、核酸を細胞に送達するためのベクターを含む系を提供し、該核酸はプロモーターの転写制御下にあり、該プロモーターは、標的細胞中で活発化または活性化されるが、正常細胞、すなわち非標的細胞中では不活発化（ｒｅｐｒｅｐｒｅｓｓｅｄ）または不活性化される。
【０１０８】
それゆえ、前記細胞が標的細胞であるかどうかに関係なく、細胞の成長および／または生存を低下し、妨げ、および／または排除するタンパク質をコードする核酸の標的細胞に特異的な転写活性化を介して、標的細胞を対象とする本開示の系の特異性が達成されることが理解される。ゆえに、本開示の系の標的細胞特異性は、標的細胞により提供されかつそれに固有の転写調節機構と協働して、発現カセット内で核酸の発現を調節する転写プロモーターに由来する。
【０１０９】
ゆえに、本開示の発現構築物、系、および方法に適宜利用可能な転写プロモーターは、標的細胞（すなわち、老齢化、疾患、または他の疾病に関連する細胞）中の核酸の発現の促進することはできるが、非標的細胞中の核酸の発現を促進することはできず、またはその能力が実質的に低下している、転写プロモーターを含む。
【０１１０】
本明細書には、発現構築物、および発現構築物を含む系が例証され、その中で転写プロモーターは、老齢化、疾患、または別の疾病に関係する標的細胞中で活性化される。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本開示は、老齢化に関連する老化細胞などの細胞の成長および／または生存を低下し、妨げ、および／または排除する、老齢化を処置する方法に利用可能な発現構築物、ならびに系を提供する。それら実施形態のある態様では、発現構築物は、老化細胞などの標的細胞内で産生されるが非標的細胞内では産生されない１つ以上の因子に反応する転写プロモーターを利用するものであり、それら１つ以上の因子は、前記転写プロモーターを活発化および／または活性化させ、その結果として、老化細胞を含む、老齢化に関連する細胞の成長および／または生存を低下し、妨げ、および／または排除する治療タンパク質をコードする核酸の発現を促進する。
【０１１２】
前記転写プロモーター自体は主要な機構であり、これによって老化細胞は本開示に記載される系により優先的に標的とされる。本開示中の系と共に使用するための標的特異的転写プロモーターの原型例は、老化細胞中で唯一活性な、または大半が活性なプロモーターである。老化細胞中で活性であると当業者に知られる多くのプロモーターが、この系と共に使用されてもよい。
【０１１３】
ヒト標的細胞が老化細胞であるこれら実施形態のある態様では、前記転写プロモーターは、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６（５２）：４８６５５−６１（２００１）に記載されるようなｐ１６ＩＮＫ４ａ／ＣＤＫＮ２Ａのプロモーター領域を含む場合があり、その中で転写プロモーターは、ＳＰ１、ＥＴＳ１、およびＥＴＳ２などの因子による活性化に反応する。前記転写プロモーターはｐ２１／ＣＤＫＮ１Ａのプロモーター領域も含む場合があり、その中で転写プロモーターはｐ５３／ＴＰ５３などの因子による活性化に反応する。
【０１１４】
前記ヒト標的細胞が、脳癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、乳癌細胞、肝臓癌細胞、血液癌細胞、および骨癌細胞などの癌細胞である、これら実施形態の他の態様では、前記転写プロモーターは、ｐ２１ｃｉｐ１／ｗａｆ１プロモーター、ｐ２７ｋｉｐ１プロモーター、ｐ５７ｋｉｐ２プロモーター、ＴｄＴプロモーター、Ｒａｇ−１プロモーター、Ｂ２９プロモーター、Ｂｌｋプロモーター、ＣＤ１９プロモーター、ＢＬＮＫプロモーター、および／またはλ５プロモーターを含む場合があり、その中で転写プロモーターは、ＥＢＦ３、Ｏ／Ｅ−１、Ｐａｘ−５、Ｅ２Ａ、ｐ５３、ＶＰ１６、ＭＬＬ、ＨＳＦ１、ＮＦ−ＩＬ６、ＮＦＡＴ１、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＨＯＸ、Ｅ２Ｆ３、および／またはＮＦ−κＢ転写因子などの１つ以上の転写因子による活性化に反応し、転写活性化は治療タンパク質をコードする核酸の発現を誘導する。
【０１１５】
標的細胞が、例えばヘルペスウイルス、ポリオウイルス、肝炎ウイルス、レトロウイルス、インフルエンザウイルス、およびライノウイルスを含むウイルスなどの感染因子に感染し、または、標的細胞が細菌細胞である、これら実施形態のまたさらなる態様では、転写プロモーターは、感染因子または細菌細胞により発現される因子により活性化される場合があり、転写活性化は治療タンパク質をコードする核酸の発現を誘導する。
【０１１６】
２．  ｐ１６転写プロモーター
一実施形態では、自殺遺伝子は、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ遺伝子プロモーターなどのｐ１６プロモーターの制御下に置くことができる。ｐ１６プロモーターは、非老化細胞ではなく老化細胞中で転写的に活性である。
【０１１７】
ヒトでは、ｐ１６はＣＤＫＮ２Ａ遺伝子によりコードされる。この遺伝子は、広範な腫瘍中で突然変異するか、または欠失することが多い。ｐ１６はＣＤＫ４およびＣＤＫ６などのサイクリン依存性キナーゼの阻害剤であり、該阻害剤は、網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲＢ）をリン酸化することで、Ｇ１相からＳ相へと進行させる。ｐ１６は、細胞がＧ１相からＳ相に進行する速度を遅くすることにより細胞周期調節に重要な役割を果たすものであり、これにより、例えば黒色腫、中咽頭扁平細胞腫、および食道癌を含む癌の予防に関与する腫瘍抑制因子として作用する。ｐ１６Ｉｎｋ４Ａの指定は、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子のスプライス変異体のうち１つによりコードされたタンパク質の分子量（１５，８４５）、およびＣＤＫ４の阻害におけるその役割を指す。
【０１１８】
ヒトでは、ｐ１６は染色体９（９ｐ２１．３）に位置するＣＤＫＮ２Ａ遺伝子によりコードされる。この遺伝子は、それらの第１のエクソン中で異なる様々な転写変異体を生成する。別個のタンパク質をコードする少なくとも３つの代替的にスプライシングされた変異体が報告されており、そのうち２つは、ＣＤＫ４の阻害剤として機能と知られる構造上関連するアイソフォームをコードする。残る転写産物は、遺伝子の残部の２０ｋｂ上流に位置する代替的なエクソン１を含む。この転写産物は、他の変異体の生成物とは構造上無関係のタンパク質を特定する代替的なオープンリーディングフレーム（ＡＲＦ）を含んでいる。ＡＲＦ生成物は、ＭＤＭ２、すなわちｐ５３の分解の原因であるタンパク質と相互に作用し、かつそれを捕捉できることから、腫瘍抑制因子タンパク質ｐ５３の安定化剤として機能する。構造上と機能上の差異にもかかわらず、この遺伝子によりコードされるＣＤＫ阻害剤アイソフォームとＡＲＦ生成物は、細胞周期Ｇ１進行におけるＣＤＫ４とｐ５３の調節上の役割を介して、細胞周期のＧ１相の制御下で共通の機能を共有する。この遺伝子は、広範な腫瘍中で変異または欠失されることが多く、重要な腫瘍抑制遺伝子であると知られている。
【０１１９】
ｐ１６ＩＮＫ４ａの濃縮により組織年齢が劇的に増大する。Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  ８（４）：４３９−４８（２００９）  ａｎｄ  Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４４３（７１１０）：４５３−７（２００６）。老齢化を伴うｐ１６遺伝子の発現増加により幹細胞の増殖が減少し、これによりヒトの細胞老化関連の健康リスクが増大してしまう。
【０１２０】
ｐ１６は、Ｇ１相からＳ相への進行を妨げることにより細胞周期を遅くするサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤である。通常、ＣＤＫ４／６はサイクリンＤに結合して、網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲＢ）をリン酸化する活性タンパク質複合体を形成する。一旦リン酸化されると、ｐＲＢは転写因子Ｅ２Ｆ１から切り離されて、Ｅ２Ｆ１をその細胞質結合状態から解放し、Ｅ２Ｆ１が核に進入するのを可能にする。一旦核に存在すると、Ｅ２Ｆ１は、Ｇ１相からＳ相への遷移に必須の標的遺伝子の転写を促進する。
【０１２１】
ｐ１６は、ＣＤＫ４／６に結合し、かつサイクリンＤとの相互作用を妨げることにより腫瘍抑制因子として作用する。この相互作用は最終的に、Ｅ２Ｆ１などの転写因子の下流活性を阻害して、細胞増殖を阻止する。この経路は腫瘍の形成と老化のプロセスに関連し、これらプロセスをスペクトルの両端に固定する。
【０１２２】
一端では、ｐ１６の過剰メチル化、突然変異、または欠失が遺伝子のダウンレギュレーションを引き起こし、かつ細胞周期進行の調節異常を介して癌を引き起こす場合がある。反対に、ＲＯＳ経路、ＤＮＡ損傷、または老化によるｐ１６の活性化は、組織にｐ１６を構築し、細胞の老化に関与する。
【０１２３】
ｐ１６の調節は複雑であり、様々な転写因子の相互作用ほか、プロモーター領域のメチル化および抑圧を介した後成的修飾に関与する様々なタンパク質の相互作用にも関与している。ＰＲＣ１とＰＲＣ２は、ｐ１６の転写を抑制可能なメチル化パターンを実行する様々な転写因子の相互作用によりｐ１６の発現を修飾する、２つのタンパク質複合体である。これら経路は、老化を減少するために細胞応答において活性化される。
【０１２４】
３．  ｐ２１転写プロモーター
治療タンパク質をコードする核酸は、老化細胞、および癌細胞または前癌細胞中で転写的に活性なことが多いｐ２１／ＣＤＫＮ１Ａ転写プロモーターの制御下に置くことができる。ｐ５３／ＴＰ５３は、損傷を受けたときにｐ２１の調節、およびこれにより細胞の成長停止において中心的な役割を果たす。ｐ２１タンパク質は、細胞周期を駆動し、かつそれらのキナーゼ活性を阻害することで細胞周期阻止を修復させる、サイクリンＣＤＫ複合体に直接結合する。ｐ２１はまた、分化に関連する成長停止、および細胞老化に関連する恒久的な成長阻止を媒介する。ｐ２１遺伝子は、ｐ５３タンパク質の直接結合を媒介する様々なｐ５３反応要素を含んでおり、その結果、ｐ２１タンパク質をコードする遺伝子の転写活性化が生じる。細胞老化におけるｐ５３遺伝子調節の役割は、Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７０（９）：３５６６−７５．（２０１０）に記載されている。
【０１２５】
核酸、およびそれによりコードされる治療タンパク質
本開示の発現構築物、系、および方法に適宜利用可能な核酸は、標的細胞を含む細胞の成長および／または生存を低下し、妨げ、および／または排除することが可能なタンパク質をコードするものであり、前記細胞内ではタンパク質が産生される。ゆえに、本開示の発現構築物および系の標的細胞特異性は、治療タンパク質をコードする核酸の、非標的細胞ではなく標的細胞内での発現により達成される。
【０１２６】
本開示の発現構築物および系に利用可能な治療タンパク質をコードする核酸として、タンパク質が産生される細胞中でアポトーシスを誘発する１つ以上のタンパク質をコードする核酸が挙げられる。本明細書には、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、シトシンデアミナーゼ、Ｃａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９、ＢＡＸ、ＤＦＦ４０、またはシトシンデアミナーゼをコードする核酸、または、細胞のアポトーシスを誘発可能なタンパク質をコードする核酸などの、１つ以上の「自殺遺伝子」を含む発現構築物および系が例証される。
【０１２７】
アポトーシス、すなわちプログラム細胞死（ＰＣＤ）は、後生動物すべてに共通する進化的に保存された特性である。多くの生物プロセスでは、アポトーシスには、過剰または危険な細胞（前癌細胞など）を排除し、かつ正常な進行を促進することが必要となる。それゆえ、アポトーシスの調節異常は、癌、自己免疫障害、および神経変性障害を含む多くの主要な疾患の進行の一因となる場合がある。大半の場合、カスパーゼファミリーのタンパク質は細胞死を引き起こす遺伝学的プログラムを実行する。
【０１２８】
アポトーシスは、カスパーゼタンパク質、特にカスパーゼタンパク質ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ８、およびＣＡＳＰ９の活性化を介して、哺乳動物細胞、特にヒト細胞中で引き起こされる。例えば、Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１（１８）：１８６−９１（２００１）、Ｃａｒｌｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １２（７）：６２７−３９（２００５）、Ｌｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８（１８）：１３６３−７１（２００１）、およびＳｈａｒｉａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１（６）：２５６２−７１（２００１）を参照。
【０１２９】
ＤＮＡ断片形成因子（ＤＦＦ）は、ＤＮａｓｅ  ＤＦＦ４０（ＣＡＤ）とそのシャペロン／阻害剤ＤＦＦ４５（ＩＣＡＤ−Ｌ）との複合体である。その不活性形態では、ＤＦＦは、４５ｋＤａシャペロン阻害剤サブユニット（ＤＦＦ４５またはＩＣＡＤ）、および４０ｋＤａ潜在性エンドヌクレアーゼサブユニット（ＤＦＦ４０またはＣＡＤ）で構成されたヘテロ二量体である。ＤＦＦ４５のカスパーゼ−３開裂に際して、ＤＦＦ４０は活性エンドヌクレアーゼホモオリゴマーを形成する。これはアポトーシス中に活性化されることでＤＮＡ断片形成を誘導する。ＤＦＦによるＤＮＡ結合はヌクレアーゼサブユニットにより媒介される。このサブユニットはＤＦＦからの放出後に安定したＤＮＡ複合体も形成することができる。ヌクレアーゼサブユニットは、ＤＮＡ結合ではなくＤＮＡ開裂において阻害される。ＤＦＦ４５も、カスパーゼ−６およびカスパーゼ−８ではなくカスパーゼ−７により切断かつ不活性化される場合がある。切断ＤＦＦ４５フラグメントはＤＦＦ４０から切り離されることで、ＤＦＦ４０をオリゴマー形成し（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｓｅ）、二本鎖破壊の導入によりＤＮＡを切断する大きな複合体を形成することができる。ヒストンＨ１はＤＦＦにＤＮＡ結合能力を与えて、ＤＦＦ４０のヌクレアーゼ活性を刺激する。アポトーシスエンドヌクレアーゼＤＦＦ−４０の活性化は、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４（２０）：１３８３６−４０（１９９９）に記載される。
【０１３０】
チミジンキナーゼ（ＴＫ）は、生細胞のほか、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）を含むある種のウイルスにも存在する、ＡＴＰ−チミジン５’−ホスホトランスフェラーゼである。チミジンキナーゼはデオキシチミジンをデオキシチミジン５’−モノホスフェート（ＴＭＰ）に変換する。デオキシチミジン５’−モノホスフェート（ＴＭＰ）は、チミジル酸キナーゼおよびヌクレオシド２リン酸キナーゼによりそれぞれデオキシチミジン二リン酸およびデオキシチミジン三リン酸にリン酸化される。デオキシチミジントリホスファーゼ（Ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｓｅ）は、ＤＮＡポリメラーゼおよびウイルス逆転写酵素により細胞内ＤＮＡに組み込まれる。
【０１３１】
ＤＮＡに組み込まれると、２’−デオキシ−グアノシンの合成アナログ（例えばガンシクロビル）などのあるｄＮＴＰアナログはＤＮＡ合成の早期終止を引き起こし、これにより細胞のアポトーシスが誘発される。
【０１３２】
ある実施形態では、本開示の発現カセットおよび系は、ＨＳＶ−ＴＫをコードする核酸を利用する。ＨＳＶ−ＴＫをコードする核酸を利用する系をヒトに適用した後、２’−デオキシ−グアノシンなどの２’−デオキシ−ヌクレオチドのアナログがヒトに投与される。ＨＳＶ−ＴＫは２’−デオキシヌクレオチドアナログをｄＮＴＰアナログへと効率的に変換する。ｄＮＴＰアナログはＤＮＡに組み込まれると標的細胞にアポトーシスを誘発する。
【０１３３】
シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）は、シトシンのＤＮＡ中でウラシルおよびアンモニアへの加水分解変換を触媒する。ＣＤ修飾部位がエンドヌクレアーゼにより認識される場合、リン酸ジエステル結合は切断され、正常細胞中で新たなシトシンを組み込むことにより修復される。５−フルオロサイトシン（５−ＦＣ）の存在下では、シトシンデアミナーゼは５−ＦＣを５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に変換する。５−ＦＵは標的細胞成長を阻害することができる。それゆえ標的細胞中のＣＤのトランスジェニック発現は標的細胞の成長および／または生存を低下させる。
【０１３４】
本開示は、治療タンパク質をコードする核酸の発現が所望の期間にわたり、および／または特定のレベルにアップレギュレートされるのを確かなものにする１つ以上の安全機能をさらに含む、発現構築物および系を提供する。
【０１３５】
１つのそのような実施形態では、本開示の発現構築物および系は、例えばＣａｓｐ３、Ｃａｓｐ８、Ｃａｓｐ９の誘導性変異体を含む、治療タンパク質の誘導性変異体をコードする核酸を利用する。この誘導性変異体には、治療タンパク質を活性化する化学化合物または生物化合物を細胞とさらに接触させること、またはそれらをヒトに投与することが必要になる。
【０１３６】
誘導性自殺遺伝子系は周知のものであり、当該技術分野で容易に利用可能であり、例えばＭｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．のＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２００８／１５４６４４、およびＢｒｅｎｎｅｒの米国特許出願公報２０１１／０２８６９８０に記載されている。加えて、Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ  ４５（４）：１０４−１９９（２００７）には、ＲＵ４８６および化学的二量体化誘導剤（ＣＩＤ）を利用するカスパーゼ３と９に対する二重の誘導性系が記載されている。Ｓｔｒａａｔｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０５（１１）：４２４７−４２５４（２００５）には誘致可能カスパーゼ９系が記載されており、その中ではカスパーゼ９はヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）に縮合されることで、ＦＫ５０６の非毒性合成アナログである小分子ＡＰ２０１８７（ＡＲＩＡＤ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用した条件的な二量体化を可能にする。Ｃａｒｌｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １２（７）：６２７−３９（２００５）には、ＡＲＩＡＤ（商標）ホモ二量体化系（ＦＫＣ８；ＡＲＩＡＤ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）の利用により誘導性カスパーゼ８系が記載されている。
【０１３７】
完全長の誘導性カスパーゼ９（Ｆ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９．Ｉ．ＧＦＰ）は、２つの１２ｋＤａヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２；ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＨ００２  ８１８）に連結されたそのカスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ００１  ２２９）を含む完全長のカスパーゼ９を含んでいる。２つの１２ｋＤａヒトＦＫ５０６結合タンパク質は、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１０４３７−１０４４２（１９９８）に記載されるようなＦ３６Ｖ突然変異を含んでおり、かつ、ＦＫＢＰおよびカスパーゼ９に接続することで柔軟性を向上させるＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーにより接続される。
【０１３８】
さらなる実施形態では、誘導性自殺遺伝子は、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質などの検出可能なバイオマーカーに対して核酸配列に連結することで、化合物を投与して誘導性治療タンパク質を活性化する前に標的細胞の検出を可能にすることができる。
【０１３９】
ベクターおよび発現カセットを含む系の組成と製剤
本開示は、ベクターと発現カセットとを含む系を提供し、前記発現カセットは、標的細胞中および治療タンパク質をコードする核酸中で発現される１つ以上の転写因子に反応する転写プロモーターを含む。系は、それ自体で、または、本明細書に記載されるような疾患または疾病を処置あるいは改善する投与量の適切な担体あるいは賦形剤と共に混合された医薬組成物の中で、ヒト患者に投与することができる。これら系の混合物も、単一の混合物として、または医薬組成物の中で患者に投与することができる。
【０１４０】
本開示の範囲内の組成物は、治療薬が、老化細胞、癌細胞、感染因子に感染した細胞、細菌細胞、または別の疾患あるいは疾病に関連する細胞の成長および／または生存を低下または排除するのに有効な量のベクターと発現カセットとを含む系である組成物を含む。各成分の有効量の最適範囲の決定は、当業者の技術範囲内で行われる。有効投与量は、特定の系、組成物内に存在するか前記系と同時に提供される１つ以上の他の治療薬の存在、処置の頻度、患者の臨床状態、年齢、健康、および体重を含む多くの要素に左右される。
【０１４１】
系を含む組成物は非経口投与されてもよい。本明細書では、用語「非経口投与」は、通常は注入による、腸内投与と局所投与以外の投与形態を指すものであり、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、および胸骨下の注射と注入が挙げられるが、これらに限定されない。代替的に、または同時に、投与は経口で行われてもよい。
【０１４２】
系を含む組成物は、例えば静注または静脈内ボーラスにより静脈投与されてもよい。代替的に、系を含む組成物は静脈注射により投与されてもよい。
【０１４３】
組成物は、治療上有効な量の系と、薬学的に許容可能な担体とを含む。本明細書では、用語「薬学的に許容可能な」とは、連邦またはた州政府の規制当局の承認を受けたもの、または、米国薬局方もしくは哺乳動物、より具体的にはヒトへの使用に一般に認められている他の薬局方に列記されているものを意味する。用語「担体」は、治療薬が共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような医薬品担体は、水、ならびに動物、植物、および合成由来のものを含む油、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などといった滅菌液体でもよい。医薬組成物が静脈内投与されると、水が好ましい担体である。生理食塩水、デキストロース水溶液、およびグリセリン水溶液も、特に注射液用の液体担体として利用できる。適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。前記組成物は、望まれる場合、少量の湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含むことができる。
【０１４４】
これら組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、徐放製剤などの形態を呈することができる。前記組成物は、従来の結合剤、およびトリグリセリドなどの担体を含む坐薬として製剤することができる。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準の担体を含むことができる。このような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するように適量の担体と共に、好ましくは精製形態で治療上有効な量の阻害剤を含有する。この製剤は投与の様式に合わせたものでなければならない。
【０１４５】
医薬組成物がヒトへの静脈内投与に適しているため、組成物は慣例手順に従って製剤することができる。通常、静脈内投与用組成物は滅菌等張水性バッファーの溶液である。必要に応じて、前記組成物はさらに、可溶化剤、注入部位の疼痛を緩和するためにリグノカインなどの局所麻酔薬を含んでもよい。一般に、この成分は別々に供給されるか、または、単位剤形、例えば活性薬剤の量を示すアンプルあるいは小袋などの密封容器中の凍結乾燥粉末、あるいは水を含まない濃縮物として一体的に混合される。前記組成物が注入により投与される場合、組成物は医薬品等級の滅菌水または滅菌生理食塩水を含む注入瓶により分注可能である。前記組成物が注入により投与される場合、成分が投与前に混合されてもよいように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０１４６】
本明細書に開示される系は、中性または塩形態として製剤することができる。薬学的に許容可能な塩は、塩化水素酸、リン酸、酢酸、蓚酸、酒石酸などに由来する陰イオンで形成される塩、および、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する陽イオンで形成される塩を含む。
【０１４７】
老齢化、癌、感染症、細菌感染症、および／または他の疾患あるいは疾病に関連する細胞に関連する疾患または疾病を処置する方法、ならびに、前記細胞の成長および／または生存を低下し、阻害し、および／または妨げるための方法
本開示は、老齢化、癌、感染症、細菌感染症、および／または他の疾患あるいは疾病に関連する細胞の成長および／または生存を低下し、阻害し、および／または妨げるための方法を提供する。該方法は、本明細書に記載されるような系に標的細胞または標的細胞を含む細胞の集団を接触させる工程を含み、前記系はベクターと発現構築物とを含み、該発現構築物は転写プロモーターと核酸とを含む。
【０１４８】
本開示はまた、患者の老齢化、癌、感染症、細菌感染症、および／または他の疾患あるいは疾病を措置する方法を提供する。該方法は本明細書に記載されるような系の投与を含み、前記系はベクターと発現構築物とを含み、該発現構築物は転写プロモーターと核酸とを含む。
【０１４９】
本件治療方法は、老化、癌、感染症、細菌感染症、または別の疾患あるいは疾病に関連する細胞の成長および／または生存を低下および／または排除するために、ベクターと発現カセットとを含む１つ以上の系を含む組成物に標的細胞を接触させる工程、または、前記組成物をヒト患者に投与する工程を含む。
【０１５０】
１つ以上の転写因子の発現上昇に関連する老齢化、癌、感染症、細菌感染症、または他の疾患あるいは疾病の処置、阻害、および／または予防に有効な系の量は、通常の臨床技術により決定することができる。インビボアッセイは、最適な投与量範囲の特定を補助するために随意に使用されてもよい。製剤に利用される正確な投与量も、投与経路、および疾患または障害の重症度に左右される。有効な投与量は、インビトロまたは動物モデルの試験系に由来する用量反応曲線から推定されてもよい。
【０１５１】
本開示の系または医薬組成物は、ヒトに使用する前に所望の治療活性または予防活性を調べるためにインビトロで検査し、次いでインビボで検査することができる。例えば、化合物または医薬組成物の治療有効性か予防有用性を実証するインビトロアッセイは、細胞株または患者組織サンプルに対する系の効果を含む。細胞株および／もしくは組織サンプルに対する系またはその医薬組成物の効果は、増殖およびアポトーシスのアッセイを含むがこれらに限定されない、当業者に既知の技術を利用して決定することができる。本開示に従い、特定化合物の投与が示されるかどうかを定めるために使用可能なインビトロアッセイはインビトロ細胞培養アッセイを含み、該アッセイにおいて患者組織サンプルは、培養され、化合物にさらされ、またはその他の方法により前記化合物を投与され、組織サンプルに対する前記化合物の効果が観察される。
【０１５２】
本開示は、本明細書に記載されるような有効な量の系またはその医薬組成物を被験体に投与することによる処置、ならびに成長および／または生存阻害の方法を提供する。一態様では、前記系は、その効果を制限するか、または望ましくない副作用を生み出す物質を実質的に含まないように、実質的に精製される。
【０１５３】
投与の方法として、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路、および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。前記系またはその組成物は、都合の良い任意の経路、例えば注入もしくはボーラス注入、上皮もしくは粘膜皮膚の内膜（例えば口腔粘膜、直腸、腸管粘膜など）を介した吸収により投与されてもよく、かつ他の生理的に活性な物質と共に投与されてもよい。投与は全身投与でも局所投与でもよい。加えて、脳室内注射および髄腔内注射を含む任意の適切な経路により、阻害剤または組成物を中枢神経系に導入することが望ましい場合もある。脳室内注射は、例えばＯｍｍａｙａリザーバーなどのリザーバーに取り付けられる脳室内カテーテルにより容易にされてもよい。例えば吸入器またはネブライザーの使用、およびエアロゾル化薬剤を含む製剤により、経肺投与も利用することができる。
【０１５４】
処置を必要とする領域に系またはその組成物を局所投与することが望ましい場合もある。この投与は、例えば手術中の局所注入、局所適用、注射、カテーテル、坐薬、またはインプラントにより達成されてもよく、前記インプラントは、シラスティック膜または繊維などの多孔性、非多孔性、またはゼラチン状の材料で構成されている。
【０１５５】
前記系は、治療標的に近づいて配される制御放出系なかで送達することができ、したがって全身投与の分画しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２：１１５−１３８（１９８４）を参照）。
【０１５６】
系を含む組成物の静脈注射は、少なくとも約１日、少なくとも約３日、少なくとも約７日、少なくとも約１４日、少なくとも約２１日、少なくとも約２８日、少なくとも約４２日、少なくとも約５６日、少なくとも約８４日、または少なくとも約１１２日の期間にわたり連続して行われてもよい。
【０１５７】
系を含む組成物の連続点滴静注は、特定の期間、その後に残りを別の期間にわたって行われてもよい。例えば、連続注入の期間は、約１日〜約７日、約１４日、約２１日、約２８日、約４２日、約５６日、約８４日、または約１１２日にであってもよい。その後連続注入は、残りを約１日〜約２日、約３日、約７日に、約１４日、または約２８日間にわたり行われてもよい。その後連続注入は、上述のように、かつ残りを別の期間にわたり繰り返してもよい。
【０１５８】
適合された正確な注入プロトコルにかかわらず、系を含む組成物の連続注入は、所望の効果が達成されるか、または承諾しがたいレベルの毒性が明白となるまで連続して行われることを理解されたい。
【０１５９】
特にそれとは反対の指示がない限り、用語は、「オープン」ターム（“ｏｐｅｎ”ｔｅｒｍｓ）として意図されることを理解されたい（例えば、用語「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は「〜を含むがこれらに限定されない」として解釈され、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」は「少なくとも〜を有する」と解釈され、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」は「〜などを含むがこれらに限定されないとして解釈されねばならない）。「少なくとも１つ」および「１つ以上」といった句、ならびに「ａ」または「ａｎ」などの用語は、単数形と複数形の両方を含む。
【０１６０】
本開示の特徴と態様がマーカッシュ群の観点から記載されている場合、本開示は、マーカッシュ群の個々の員または員のサブグループの観点からも記載されることを意図していることを、さらに理解されたい。同様に、本明細書に開示される範囲はすべて、可能なサブ範囲すべて、およびサブ範囲の組み合わせを包含しており、「間」、「最大」、「少なくとも」、「より多く」、「未満」などの語句は、範囲内に列挙された数を含み、かつ個々の員それぞれを含む。
【０１６１】
上記のものまたは下記のものに関わらず、米国、ＰＣＴ、またはその他外国の特許、特許出願、および特許公報、ならびに技術公報および／または科学公報のすべてを含むがこれらに限定されない、本明細書で引用される引用文献はすべて、その全体を参照することで本明細書に引用される。
【実施例】
【０１６２】
様々な実施形態が本明細書に開示されているが、他の実施形態も当業者に明白であろう。本明細書に開示される様々な実施形態は例示を目的とするものであり、特許請求の範囲に示されている真の範囲と趣旨に制限されるようには意図されていない。本開示は以下の実施例を参照してさらに記述される。これら実施例はある実施形態を例示するために提供されるものであり、本開示の範囲、または請求される発明特定事項を制限するようには意図されていない。
【０１６３】
実施例１：ｐ１４  ＦＡＳＴ融合性脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）による腫瘍への遺伝子送達の向上
この実施例で実証されるのは、爬虫類レオウイルスのｐ１４  ＦＡＳＴ融合を利用するＦｕｓｏｇｅｎｉｘ（商標）（Ｉｎｎｏｖａｓｃｒｅｅｎ，Ｈａｌｉｆａｘ，Ｎｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａ，Ｃａｎａｄａ）脂質ナノ粒子が標的腫瘍へのプラスミドＤＮＡ構築物の送達に有効であることである。
【０１６４】
ｐ１４  ＦＡＳＴ融合タンパク質（ＰＣＴ特許出願公報ＷＯ２００２０４４２０６Ａ２およびＷＯ２０１２０４０８２５Ａ１に記載）の有無にかかわらず、６４Ｃｕ（６４Ｃｕ  ＮＯＴＡリポソーム）で標識された融合性脂質ナノ粒子をＭ１６マウスモデル系に静脈内投与し、前立腺癌（ＰＣ３細胞）を調べた。Ｓｅｏ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １９（１２）：２５７７−２５８５（２００９）およびＲｅｅｖｅｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １３６（７）：１７３１−１７４０（２０１４）を参照。免疫化を行い２４時間後、陽電子射出断層撮影法（ＰＥＴ）を使用してＰＣ３腫瘍を可視化した。図７のＡとＢを参照。
【０１６５】
図８に示すデータから実証されるのは、ｐ１４  ＦＡＳＴ融合タンパク質を含む６４Ｃｕ  ＮＯＴＡリポソームのＰＣ３前立腺腫瘍の取り込みが、ｐ１４  ＦＡＳＴ融合タンパク質を含まない６４Ｃｕ  ＮＯＴＡリポソームに比べて５０％増加したことである。２４時間後に発現されたヌードマウスの標識化したペグ化リポソームの生物分布を図９に示す。
【０１６６】
実施例２：インビボで投与されたｐ１４  ＦＡＳＴ融合性脂質ナノ粒子は非毒性であり、耐用性が優れている
この実施例から実証されるのは、爬虫類レオウイルスのｐ１４  ＦＡＳＴ融合を利用するＦｕｓｏｇｅｎｉｘ（商標）（Ｉｎｎｏｖａｓｃｒｅｅｎ，Ｈａｌｉｆａｘ，Ｎｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａ，Ｃａｎａｄａ）脂質ナノ粒子が、スプラーグドーリーラットにインビボ投与されたときに調べられる主要な哺乳動物器官系のいずれにも有害な副作用を示さないことである。このナノ粒子は標的腫瘍へのプラスミドＤＮＡ構築物の送達で有効である。
【０１６７】
本明細書には、（ｉ）ＬＮＰ（ＰＢＳ）なし、（ｉｉ）ｐ１４を含まないＬＮＰ、または（ｉｉｉ）ｐ１４含有融合性脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）のいずれかで処置したＮ＝２０のオスのラットに対して行われた比較試験を示す。各動物の尾部に、４日間にわたり１５ｍｇ／ｋｇを計３回注射した。ｐ１４含有ＬＮＰで動物を処置した結果、動物行動に任意の急激な変化が生じ、動物成長は、ｐ１４含有ＬＮＰでの処置による影響を受けなかった。ｐ１４含有ＬＮＰで処置した動物の器官重量は、研究した他の動物群すべてと同様であった。
【０１６８】
ｐ１４含有ＬＮＰでの処置は、主要な器官系の組織の微視的外観に影響を及ぼさなかった。肺、脳、心臓、腎臓、肝臓、生殖器、腸、内分泌系、リンパ節、脾臓、膵臓、膀胱、および尾部の組織をすべて独立して検査し、ｐ１４は視認可能な毒性徴候を引き起こさなかった。重要なのは、肝臓の外観がｐ１４への曝露による影響を受けなかったことである。さらに、ｐ１４で処置した動物組織と対照群組織との間に差異は特定されなかった。
【０１６９】
多くの血液化学値を測定して、生理機能および炎症に対するｐ１４の影響を求めた。急性肝機能を意味するＡＬＴおよびＡＳＴなどのパラメータはすべて正常範囲内であった。ｐ１４を含有するＦｕｓｏｇｅｎｉｘ  ＬＮＰは、検査される主要な哺乳動物器官系のいずれにも何の有害な副作用も示さない。組織の組織学的外観も正常であった。
【０１７０】
フロインドアジュバントと混合した精製を１０日間隔で３回、マウスに注射した。第１の投与量にはＣＦＡ（完全フロインドアジュバント）、第２と第３の投与量にはＩＦＡ（不完全フロインドアジュバント）が含まれていた。各注射でｐ１４を５０μｇ注射した。３０日後にマウスを屠殺し、血清を分析して抗ｐ１４抗体を調べた。ｐ１４脂質ナノ粒子も、ｐ１４を２４０μｇ含むｐ５３−ｉＣａｓｐ９  Ｆｕｓｏｇｅｎｉｘ脂質ナノ粒子４００μｇを静脈内注射することで２匹のマウスにて試験した。注射の３０日後にマウスを屠殺し、血清を分析して抗ｐ１４抗体を調べた。陽性対照は、２５０ｎｇ／ｍｌの高用量および５０ｎｇ／ｍｌの低用量で血清においてスパイクされた（ｓｐｉｋｅｄ）精製抗体を含んでいた。図１０と１１に示すデータから実証されるのは、爬虫類レオウイルスｐ１４  ＦＡＳＴ融合タンパク質を利用するＦｕｓｏｇｅｎｉｘ（商標）脂質ナノ粒子の安全性と耐容性である。抗ｐ１４抗体と抗ＬＮＰ抗体のアッセイから実証されるのは、免疫適格マウス（アジュバントの有無にかかわらず）には抗体反応が実質的に観察されないことである。
【０１７１】
Ｓｚｅｂｅｎｉ，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６１（２）：１６３−７３（２０１４）に記載されるようにＣ４ｄおよびｉＣ３ｂ補足ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、１０個のヒト血清サンプルを活性化関連仮性アレルギー（ＣＡＲＰＡ）について検査した。図１２と１３に示すデータから実証されるのは、本開示に係るＬＮＰ製剤が、１０個のヒトサンプルのうち８個のサンプル中のＤｏｘｉｌと比較して、Ｃ４ｄには反応せず（図１２）、ｉＣ３ｂにはあまり反応しなかった（図１３）ことである（ヒトの約５〜１０％はＤｏｘｉｌなどのナノ医療に対するＣＡＲＰＡ反応を示す）。
【０１７２】
インビトロの抗ｐ１４抗体および抗ＬＮＰ抗体の中和アッセイにより、ベクター中和には非常に高い抗体濃度が必要であることが明らかとなった。さらに、ｐ１４−ＬＮＰのワクチン接種または前処置の結果、治療効果の低下はなく、インビボ投薬の繰り返しは有効であり、十分に耐容性があった。対照のペグ化リポソームドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ）と比較して、Ｆｕｓｏｇｅｎｉｘ（商標）ｐ１４  ＦＡＳＴ脂質ナノ粒子でのＣＡＲＰＡアッセイは補体活性をあまり引き起こさない。
【０１７３】
実施例３：老齢化したマウスのｐ１６−陽性老化細胞負荷のインビボ抑制
この実施例で実証されるのは、老齢化に対してマウスモデル系の例示的なｐ１６標的化構築物のインビボ投与後のｐ１６−陽性老化細胞負荷における標的細胞に特異的な抑制である。
【０１７４】
老齢化マウスモデルは、老化細胞負荷（ｐ１６＋細胞の存在により規定されるような）、および老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ；  ｖａｎ  Ｄｅｕｒｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ５０９（７５０１）：４３９−４４６（２０１４））に関連する因子の分泌を示す。
【０１７５】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ベクター、例えば、老齢化および／または老化に関連する標的細胞などのｐ１６を発現する標的細胞中の誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）タンパク質の標的細胞に特異的な発現のための典型的なｐ１６標的化構築物を含むｐ１６−ｉＣａｓｐ９発現構築物（ｐＶＡＸ１−１６ｓ−ｉＣａｓｐ９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０６；図１６）を含むｐ１４  ＦＡＳＴなどの融合性タンパク質を含む融合性ＬＮＰなどの、ベクターと発現構築物とを含む製剤（ｐ１６標的化構築物は、（視覚化のために）ルシフェラーゼを発現するｉＣａｓｐ９またはその変異体へ動作可能に接続したｐ１６ｓ転写プロモーターを含む）を、注射により老齢化マウスの尾静脈にインビボ投与すると、ＬＮＰ＋発現構築物は特異性のない標的細胞および非特異性細胞をトランスフェクトした。図１９を参照。二量化の化学誘導物質（ＣＩＤ）のインビボ投与後、ＡＰ２０１８７、ｐ１６＋標的細胞（例えば老化細胞）はアポトーシスを受け、その結果、ＳＡＳＰレベルは低下したが、ｐ１６−細胞は依然として生存可能であった。
【０１７６】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ベクター、例えば、ｐ１６−Ｃａｓｐ９発現構築物、例えば、ｐＶＡＸ１−１６ｓ−ｉＣａｓｐ９、またはその変異体を包含する、ｐ１４  ＦＡＳＴなどの融合性タンパク質を含む融合性ＬＮＰなどのベクターおよび発現構築物を含む、β−ｇａｌについて染色された老齢化マウスと腎臓細胞にインビボで投与される製剤のインビボ投与（８０週齢の１６匹）後の、未処理（左上のパネル）または処理済（右上のパネル）のインビボ老齢化マウスモデルからの腎臓細胞における老化関連β−ｇａｌの組織学的染色である。図２０Ａ〜Ｄを参照。下方のパネルは、正常なマウスの４か月齢の腎臓細胞における老化関連β−ｇａｌの組織学的（ｈｉｓｔｉｏｌｏｇｉｃａｌ）染色の顕微鏡写真である。これらデータから、ｐ１６＋老化腎臓細胞の用量依存性減少が実証された。
【０１７７】
ｐ１６＋腎臓細胞（図２１）、脾臓細胞（図２２）、精嚢細胞（図２３）、鼠蹊部脂肪細胞（図２４）、および肺細胞（図２５）の用量依存性標的化は、ｐＶＡＸ１−ｐ１６発現構築物を含む融合性脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤のインビボ投与後に自然に老齢化したマウスにおいて実証された。腎臓細胞をｑＲＴ−ＰＣＲ反応にさらして、ｐ１６ｌｎｋ４ａ転写産物を検出した。２ΔΔＣｔ（Ｌｉｖａｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：４０２−４０８（２００１）を使用して相対発現を算出した。
【０１７８】
実施例４：ヒト前立腺腫瘍を移植したＮＳＧマウスでのインビボ腫瘍内科学試験
この実施例で実証されるのは、ヒト前立腺腫瘍（すなわちＰＣ−３異種移植片）を移植したＮＳＧマウスのｐ５３発現前立腺癌細胞の標的細胞に特異的な抑制である。
【０１７９】
ヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞を、ｐＶａｘ−ｐ５３−ｉＣａｓｐ９−ｌｕｃ（ルシフェリン）プラスミド（ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７０の存在下および不在下）を保有するＦｕｓｏｇｅｎｉｘ脂質ナノ粒子で処置して、ｉＣａｓｐ９発現を評価し、ｐ５３発現細胞（ｐＶａｘ−ｐ５３）および対照細胞（ｐｃＤＮＡ３−ＧＦＰ）で得られたｉＣａｓｐ９とＣａｓｐ９タンパク質のレベルのウェスタンブロット解析にかけた。図３６を参照。これらデータから実証されるのは、化学的二量体化誘導剤（ＣＩＤ；例えばＡＰ２０１８７およびＡＰ１９０３）の添加により、ｉＣａｓｐ９またはルシフェラーゼを発現するように操作されたｐ５３発現細胞中のｉＣａｓｐ９およびルシフェラーゼの発現が消失したことである。
【０１８０】
ヒト前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ（図３８）、ＤＵ１４５（図３９）、およびＰＣ−３（図４０））ならびに正常上皮細胞（ＲＷＰＥ（図４１））を、ｐＶａｘ−ｐ５３−ｉＣａｓｐ９−ｌｕｃプラスミドを運ぶＦｕｓｏｇｅｎｉｘ脂質ナノ粒子で処置して、ウェスタンブロットおよび発光アッセイによりｉＣａｓｐ９発現を評価した。これらデータから実証されるのは、化学的二量体化誘導剤（ＣＩＤ；例えばＡＰ２０１８７およびＡＰ１９０３）の添加により、ｉＣａｓｐ９またはルシフェラーゼを発現するように操作されたｐ５３発現細胞中のｉＣａｓｐ９およびルシフェラーゼの発現が消失したことである。
【０１８１】
ヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞を、ｐＶａｘ−ｐ５３−ｉＣａｓｐ９−ｌｕｃ（ルシフェリン）プラスミド（ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７の存在下および不在下）を運ぶＦｕｓｏｇｅｎｉｘ脂質ナノ粒子で処置して、ｉＣａｓｐ９発現を評価した。図４２に示すデータから実証されるのは、化学的二量体化誘導剤（ＣＩＤ；例えばＡＰ２０１８７およびＡＰ１９０３）の添加により、ｉＣａｓｐ９またはルシフェラーゼを発現するように操作されたｐ５３発現細胞中のｉＣａｓｐ９およびルシフェラーゼの発現が消失したことである。
【０１８２】
ｐＶａｘ−ｐ５３  Ｆｕｓｏｇｅｎｉｘ脂質ナノ粒子（ＡＰ２０１８７の存在下および不在下、それぞれ図４３のＡ、４４のＡ、４３のＢ、４４のＢ）で処置したヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞からのフローサイトメトリーのアポトーシスデータ（アネキシンＶ）から実証されるのは、自殺遺伝子治療では、アポトーシス（ルシフェラーゼ−アネキシンＶのフローサイトメトリー）の誘導により培養物中でｐ５３発現ヒト前立腺癌細胞が選択的に死滅したことである。
【０１８３】
本開示に係る前臨床的腫瘍内科学試験を、ヒト前立腺腫瘍細胞を移植した３０ｘＮＳＧマウスで行った。図４５を参照。皮下ヒト前立腺ＰＣ−３腫瘍を持つＮＳＧマウスに、１００μｇのＦｕｓｏｇｅｎｉｘ  ｐＶａｘ−ｐ５３製剤を腫瘍内（ＩＴ）注入し、９６時間後に２ｍｇ／ｋｇのホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７を静脈内（ＩＶ）投与で注入した。図４６を参照。１００μｇのＦｕｓｏｇｅｎｉｘ  ｐＶａｘ−ｐ５３製剤を腫瘍内注入し、その９６時間後に２ｍｇ／ｋｇのＡＰ２０１８７をＩＶ注入した皮下ヒト前立腺ＰＣ−３腫瘍を持つＮＳＧマウスの腫瘍を撮影した（図４７のＡ〜Ｃ）。
【０１８４】
皮下ヒト前立腺癌ＰＣ−３腫瘍を持つ４匹のＮＳＧマウスに、１００μｇ投与量のＦｕｓｏｇｅｎｉｘ  ｐＶａｘ−ｐ５３製剤の静脈内（ＩＶ）注入、その２４時間後に２ｍｇ／ｋｇのＡＰ２０１８７のＩＶ注入を４回行った。腫瘍体積を測定し、ＩＶ注射後の時間関数としてプロットした。図４８〜５１を参照。
【０１８５】
腫瘍体積の変化率を求めて、ｐ１４  ＬＮＰ  ｐＶＡＸの静脈内投与で処置した前立腺腫瘍を持つＮＳＧマウス（全群に対しＮ＝６）に対して化学的二量体化誘導剤（ＣＩＤ）のインビボ投与を行った後の時間の関数としてプロットした。図５２を参照。生存率を求めて、ｐ１４  ＬＮＰ  ｐＶＡＸの静脈内投与で処置した前立腺腫瘍を持つＮＳＧマウス（全群に対しＮ＝６）に対して化学的二量体化誘導剤（ＣＩＤ）のインビボ投与を行った後の時間の関数としてプロットした。図５３を参照。
【０１８６】
用量漸増設計を実行した。そこでは腫瘍体積の変化率を、１００μｇ、４００μｇ、および１０００μｇのｐ１４  ＬＮＰ  ｐＶＡＸの静脈内投与で処置した前立腺腫瘍を持つＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（全群に対しＮ＝６）に対して化学的二量体化誘導剤（ＣＩＤ）のインビボ投与を行った後の時間の関数としてプロットした。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに５００，０００のＰＣ−３細胞を皮下移植し、腫瘍が２００ｍｍ３に達したときに処置群へと無作為化した（全群に対しＮ＝２）。動物にｐ５３−ｉＣａｓｐ９  ＬＮＰの割当投与量を２回ＩＶ注入し、その後に二量体化剤２ｍｇ／ｋｇを注入した。腫瘍を２４時間ごとに直接測定した。図５４を参照。
【０１８７】
総体的に、本明細書に示すデータから実証されるのは、ｐ５３−ｉＣａｓｐ９発現構築物を含む融合性脂質ナノ粒子製剤の静脈内投与によりｐ５３＋前立腺癌細胞に特異的な様式で、アポトーシスを確実に誘導することができることである。
【０１８８】
実施例５：転移性腫瘍を移植したＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおける転移のインビボ抑制
化学的二量体化誘導剤（ＣＩＤ）を用いる、または用いないｐ５３−ｉＣａｓｐ９  ＬＮＰの反復処置による転移性腫瘍増殖の抑制を、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスモデル系で実証した。
【０１８９】
０日目にＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに５００，０００のＰＣ−３Ｍルシフェラーゼ細胞を注入し、ＬＮＰ投与を２２日目に１５０μｇのｐ５３−ｉＣａｓｐ９  ＬＮＰで開始した。二量体化剤の投与を２４日目に２ｍｇ／ｋｇで開始した。マウスを２４〜４８時間ごとに撮像して、動物発光全体を検出した。図５５を参照。
【０１９０】
実施例６：Ｂ１６マウス黒色腫細胞を移植した同質遺伝子型Ｃ５７Ｂ６マウスの黒色腫のインビボ抑制
Ｂ１６マウス黒色腫細胞を移植した同質遺伝子型Ｃ５７Ｂ６マウスを、マウスｐ５３プロモーターの制御下でｉＣａｓｐ９およびマウスＣＤ４０Ｌをコードする構築物を含有するＬＮＰ、その後にＡＰ２０１８７二量体化剤で処置した。
【０１９１】
マウスｐ５３プロモーターの制御下でｉＣａｓｐ９およびマウスＣＤ４０Ｌをコードする構築物を含むＬＮＰで処置した２５０，０００のＢ１６マウス黒色腫細胞（４００ｍｍ３に成長）を皮下注射により移植した同質遺伝子型Ｃ５７Ｂ６マウスの化学的二量体化誘導剤（ＣＩＤ）をインビボで投与した後の時間の関数として、腫瘍体積の変化率（図５６）と生存率（図５７）を測定した。
【０１９２】
これらデータから実証されるのは、Ｂ１６細胞の倍の速さ（１０時間）により細胞の大部分がｉＣａｓｐ９誘導アポトーシスに耐性を持つものの、それらは依然として腫瘍成長を効率的に止めるのに十分なＣＤ４０Ｌを分泌したことである。ＧＭＣＳＦ＋ＯＶＡ抗原をコードする構築物も検査すると、ｉＣａｓｐ９単独よりも有効であったが、ＣＤ４０Ｌ版ほど有効ではなかったことを突き止めた。両群に対してＮ＝３。
【０１９３】
実施例７：Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞を移植したマウスの肺癌転移のインビボ抑制
この実施例で実証されるのは、肺転移マウスモデル系に移植したマウスｐ５３＋Ｂ１６Ｆ１０黒色腫標的細胞のインビボでのｐ５３＋標的細胞抑制である。
【０１９４】
Ｂ１６Ｆ１０肺転移モデル系を利用した。そこでは、７５，０００のＢ１６Ｆ１０細胞の静脈内注射後３、６、９、および１２日目に対照ＬＮＰまたはｐ５３−ｉＣａｓｐ９  ＬＮＰ１００μｇが静脈内投与されている。５、８、１１、および１３日目に、二量体化の科学誘導物質（ＣＩＤ）を腹腔内投与した。１４日目に動物を屠殺し、肺転移を定量した。図５８Ａ〜５８Ｄ、および図５９を参照。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ】
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【図２０Ｈ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３７Ｄ】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８Ａ】
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【図５８Ｂ】
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【図５８Ｃ】
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【図５８Ｄ】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
2021526505.tif 000078
【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【配列表】
2021526505000001.app
【国際調査報告】
2021526505.tif 000082
2021526505.tif 000083
2021526505.tif 000084