(57)【要約】  複数のペイロードを伴う送達媒体を使用するゲノム編集の方法及び組成物が提供される。一部の態様では、送達媒体は、（ａ）ゲノムを切断する１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ又はこれをコードする１つ以上の核酸、（ｂ）ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列の挿入がゲノム内の挿入部位において部位特異的リコンビナーゼのための標的配列（例．ａｔｔＰ部位）をもたらす第１のドナーＤＮＡ；（ｃ）部位特異的リコンビナーゼ（例．ΦＣ３１、ΦＣ３１ ＲＤＦ、Ｃｒｅ、ＦＬＰ）（又はこれをコードする核酸）であって、前記標的配列を認識する部位特異的リコンビナーゼ；及び（ｄ）部位特異的リコンビナーゼによる前記標的配列の認識の結果としてゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含む第２のドナーＤＮＡを含むペイロードを含む。
2021521825.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドナー配列を細胞のゲノムに挿入する方法であって、
（ａ）１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ又は前記１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼをコードする１つ以上の核酸を含み、前記１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼが前記ゲノムを切断する、ヌクレアーゼ組成物；
（ｂ）前記ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含む第１のドナーＤＮＡを含み、前記ヌクレオチド配列の挿入が前記ゲノム内の挿入部位において部位特異的リコンビナーゼのための標的配列をもたらす、標的ドナー組成物；
（ｃ）前記部位特異的リコンビナーゼ又は前記部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸を含み、前記部位特異的リコンビナーゼが前記標的配列を認識する、リコンビナーゼ組成物；及び
（ｄ）前記部位特異的リコンビナーゼによる前記標的配列の認識の結果として前記ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含む第２のドナーＤＮＡを含むインサートドナー組成物
を含むペイロードを伴う送達媒体を細胞に導入することを含む方法。
【請求項２】
前記標的ドナー組成物の前記第１のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列の挿入が、前記ゲノム内の第１の部位において前記部位特異的リコンビナーゼのための第１の標的配列をもたらし、前記ゲノム内の第２の部位において前記部位特異的リコンビナーゼのための第２の標的配列をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヌクレアーゼ組成物が２か所で前記ゲノムを切断し、前記標的ドナー組成物が前記第１のドナーＤＮＡのうちの２つを含み、それらの各々が前記ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含み、これにより、前記ゲノム内の第１の部位において前記部位特異的リコンビナーゼのための第１の標的配列をもたらし、前記ゲノム内の第２の部位において前記部位特異的リコンビナーゼのための第２の標的配列をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ゲノム内の前記第１の部位及び第２の部位の間隔が１，０００，０００塩基対以下である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記ゲノム内の前記第１の部位及び第２の部位の間隔が１００，０００塩基対以下である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６】
前記ゲノムに挿入される前記インサートドナー組成物の前記ヌクレオチド配列の長さが、１０塩基対（ｂｐ）〜１００キロ塩基対（ｋｂｐ）である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項７】
前記第２のドナーＤＮＡが前記部位特異的リコンビナーゼのための２つの標的配列を含み、前記２つの標的配列が前記ゲノムに挿入される前記ヌクレオチド配列を挟む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記部位特異的リコンビナーゼのための前記標的配列が、ａｔｔＢ部位、ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位、ａｔｔＲ部位、ｌｏｘＰ部位及びＦＲＴ部位から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記部位特異的リコンビナーゼが、ΦＣ３１、ΦＣ３１ ＲＤＦ、Ｃｒｅ及びＦＬＰから選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼのうちの少なくとも１つが、メガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼのうちの少なくとも１つがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質クラス２である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質クラス２がＣａｓ９及びｃｐｆ１から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヌクレアーゼ組成物が、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓガイド核酸又は前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓガイド核酸をコードする１つ以上の核酸を含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記送達媒体が非ウイルス性である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記送達媒体がナノ粒子である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ナノ粒子が、前記ペイロードに加えて、アニオン性ポリマー組成物、カチオン性ポリマー組成物及びカチオン性ポリペプチド組成物を含むコアを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アニオン性ポリマー組成物が、ポリ（グルタミン酸）及びポリ（アスパラギン酸）から選択されるアニオン性ポリマーを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記カチオン性ポリマー組成物が、ポリ（アルギニン）、ポリ（リシン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（オルニチン）及びポリ（シトルリン）から選択されるカチオン性ポリマーを含む、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
ナノ粒子が前記コアを封入する脱落層をさらに含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記脱落層がアニオン性コート又はカチオン性コートである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記脱落層が、シリカ、ペプトイド、ポリシステイン、カルシウム、酸化カルシウム、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、マンガン、酸化マンガン、リン酸マンガン、硫酸マンガン、マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、鉄、酸化鉄、リン酸鉄及び硫酸鉄のうちの１つ以上を含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ナノ粒子が前記脱落層を取り囲む表面コートをさらに含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記表面コートが、前記脱落層と静電相互作用するカチオン性又はアニオン性のアンカードメインを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記表面コートが１つ以上のターゲティングリガンドを含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記１つ以上のターゲティングリガンドが、ペプチド、ＳｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、核酸アプタマー又はペプトイドから選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記表面コートが、狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）断片、ＡｐｏＥ−トランスフェリン、ラクトフェリン、メラノフェリチン、オボトランスフェリチン、L-セレクチン、E-セレクチン、P-セレクチン、シアル化ペプチド、ポリシアル化Ｏ結合型ペプチド、ＴＰＯ、ＥＰＯ、ＰＳＧＬ−１、ＥＳＬ−１、ＣＤ４４、死受容体３（ＤＲ３）、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、Ｍａｃ２−ＢＰ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＣＤ７０、ＳＨ２ドメイン含有タンパク質１Ａ（ＳＨ２Ｄ１Ａ）、エキセンディン４、ＧＬＰ１、ＲＧＤ、トランスフェリンリガンド、ＦＧＦ断片、コハク酸、ビスホスホネート、造血幹細胞走化性脂質、スフィンゴシン、セラミド、スフィンゴシン-1-リン酸、セラミド-1-リン酸、ＩＬ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８ε、ペプチド−ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、及びこれらの活性ターゲティング断片からなる群から選択される１つ以上のターゲティングリガンドを含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記表面コートが、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ９０、ＣＤ４５ｆ、ＣＤ３４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４７、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ；ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ及び／又はＴＣＲδの定常領域；４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ６２Ｌ、ＡＲＰ５、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＤ９４／ＮＫＧ２、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｈ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＤＮＡＭ、ＸＣＲ１、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＩＬＴ、ＬＩＲ、Ｌｙ４９、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ１０Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、ＩＬ１８Ｒ、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＴＧＦ−β及びα５β１から選択される標的との結合をもたらす１つ以上のターゲティングリガンドを含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記表面コートが、骨髄細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄系前駆細胞、リンパ系前駆細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、赤血球、巨核細胞、マスト細胞、好塩基球、好酸球、好中球、マクロファージ、赤血球系前駆細胞、巨核細胞−赤血球系前駆細胞（ＭＥＰ）、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）、複能性前駆細胞（ＭＰＰ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、短期ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ）、ＩＴ−ＨＳＣ、長期ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）、内皮細胞、ニューロン、星状細胞、膵細胞、膵島β細胞、肝臓細胞、筋肉細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、肝細胞、脂肪細胞、腸細胞、結腸細胞及び胃細胞から選択される標的細胞との結合をもたらす１つ以上のターゲティングリガンドを含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記送達媒体が前記ペイロードとコンジュゲートしたターゲティングリガンドであり、前記ターゲティングリガンドが細胞表面タンパク質との結合をもたらす、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記送達媒体が帯電ポリマーであるポリペプチドドメインとコンジュゲートしたターゲティングリガンドであり、前記ターゲティングリガンドが細胞表面タンパク質との結合をもたらし、前記帯電ポリマーであるポリペプチドドメインが核酸ペイロードと共に凝縮され及び／又はタンパク質ペイロードと静電相互作用している、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ターゲティングリガンドが、ペプチド、ＳｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、核酸アプタマー又はペプトイドである、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記帯電ポリマーであるポリペプチドドメインのアミノ酸長が３〜３０である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記送達媒体が、前記ペイロード及び前記帯電ポリマーであるポリペプチドドメインと相互作用するアニオン性ポリマーをさらに含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記アニオン性ポリマーが、ポリ（グルタミン酸）及びポリ（アスパラギン酸）から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ターゲティングリガンドのアミノ酸長が５〜５０である、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ターゲティングリガンドが、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーＢ、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、細胞表面糖タンパク質及び細胞間接着分子から選択される細胞表面タンパク質との結合をもたらす、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ターゲティングリガンドが、狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）断片、ＡｐｏＥ−トランスフェリン、ラクトフェリン、メラノフェリチン、オボトランスフェリチン、L-セレクチン、E-セレクチン、P-セレクチン、シアル化ペプチド、ポリシアル化Ｏ結合型ペプチド、ＴＰＯ、ＥＰＯ、ＰＳＧＬ−１、ＥＳＬ−１、ＣＤ４４、死受容体３（ＤＲ３）、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、Ｍａｃ２−ＢＰ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＣＤ７０、ＳＨ２ドメイン含有タンパク質１Ａ（ＳＨ２Ｄ１Ａ）、エキセンディン、エキセンディン−Ｓ１１Ｃ、ＧＬＰ１、ＲＧＤ、トランスフェリンリガンド、ＦＧＦ断片、α５β１リガンド、ＩＬ２、Ｃｄｅ３ε、ペプチド−ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、コハク酸、ビスホスホネート、造血幹細胞走化性脂質、スフィンゴシン、セラミド、スフィンゴシン-1-リン酸、セラミド-1-リン酸、及びこれらの活性ターゲティング断片からなる群から選択される、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ターゲティングリガンドが、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ９０、ＣＤ４５ｆ、ＣＤ３４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４７、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ；ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ及び／又はＴＣＲδの定常領域；４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ６２Ｌ、ＡＲＰ５、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＤ９４／ＮＫＧ２、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｈ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＤＮＡＭ、ＸＣＲ１、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＩＬＴ、ＬＩＲ、Ｌｙ４９、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＴＧＦ−β及びα５β１から選択される標的との結合をもたらす、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ターゲティングリガンドが、骨髄細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、長期ＨＳＣ、短期ＨＳＣ、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄系前駆細胞、リンパ系前駆細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、赤血球、巨核細胞、マスト細胞、好塩基球、好酸球、好中球、マクロファージ、赤血球系前駆細胞（例．ＨＵＤＥＰ細胞）、巨核細胞−赤血球系前駆細胞（ＭＥＰ）、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）、複能性前駆細胞（ＭＰＰ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、短期ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ）、ＩＴ−ＨＳＣ、長期ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）、内皮細胞、ニューロン、星状細胞、膵細胞、膵島β細胞、筋肉細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、肝細胞、脂肪細胞、腸細胞、結腸細胞及び胃細胞からなる群から選択される細胞への結合をもたらす、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列の前記ゲノムへの挿入が、挿入された配列の内因性プロモーターとの作動可能な連結をもたらす、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記内因性プロモーターが、（ｉ）Ｔ細胞特異的プロモーター；（ｉｉ）ＣＤ３プロモーター；（ｉｉｉ）ＣＤ２８プロモーター；（ｉｖ）幹細胞特異的プロモーター；（ｖ）体細胞特異的プロモーター；（ｖｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α、β、γ又はδのプロモーター；（ｖ）Ｂ細胞特異的プロモーター；（ｖｉ）ＣＤ１９プロモーター；（ｖｉｉ）ＣＤ２０プロモーター；（ｖｉｉｉ）ＣＤ２２プロモーター；（ｉｘ）Ｂ２９プロモーター；及び（ｘ）Ｔ細胞又はＢ細胞のＶ（Ｄ）Ｊ特異的プロモーターからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
挿入される前記インサートドナー組成物の前記ヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結するタンパク質をコードする配列を含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記プロモーターが、（ｉ）Ｔ細胞特異的プロモーター；（ｉｉ）ＣＤ３プロモーター；（ｉｉｉ）ＣＤ２８プロモーター；（ｉｖ）幹細胞特異的プロモーター；（ｖ）体細胞特異的プロモーター；（ｖｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α、β、γ又はδのプロモーター；（ｖ）Ｂ細胞特異的プロモーター；（ｖｉ）ＣＤ１９プロモーター；（ｖｉｉ）ＣＤ２０プロモーター；（ｖｉｉｉ）ＣＤ２２プロモーター；（ｉｘ）Ｂ２９プロモーター；及び（ｘ）Ｔ細胞又はＢ細胞のＶ（Ｄ）Ｊ特異的プロモーターからなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ゲノムに挿入される前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、（ｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質；（ｉｉ）ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭタンパク質；又は（ｉｉｉ）ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭタンパク質のκ若しくはλ鎖をコードする、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ゲノムに挿入される前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質のＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３領域をコードする、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ゲノムに挿入される前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＣＡＲをコードする前記ヌクレオチド配列の挿入が、前記ＣＡＲをコードする前記ヌクレオチド配列の内因性Ｔ細胞特異的プロモーターとの作動可能な連結をもたらす、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ゲノムに挿入される前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、多価表面受容体をコードする、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞がＴ細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記多価表面受容体が、二特異性又は三特異性のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、請求項４８又は４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ゲノムに挿入される前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、膜に結合し細胞外に提示される細胞特異的ターゲティングリガンドをコードする、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ゲノムに挿入される前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、レポータータンパク質をコードする、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記レポータータンパク質が蛍光タンパク質である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記レポータータンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、細胞特異的又は組織特異的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項５２又は５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記レポータータンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、構成的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項５２又は５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記ゲノムに挿入される前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、イントロンを有さないタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
イントロンを有さない前記ヌクレオチド配列が、ＴＣＲタンパク質又は免疫グロブリンの全体又は一部分をコードする、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記方法が、前記送達媒体のうちの第１及び第２のものを前記細胞に導入することを含み、
（１）前記ゲノムに挿入される前記第１の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α若しくはδサブユニットをコードし、前記ゲノムに挿入される前記第２の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、ＴＣＲβ若しくはγサブユニットをコードする；又は
（２）前記ゲノムに挿入される前記第１の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α若しくはγサブユニットをコードし、前記ゲノムに挿入される前記第２の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、ＴＣＲβ若しくはδサブユニットをコードする；又は
（３）前記ゲノムに挿入される前記第１の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭタンパク質のκ鎖をコードし、前記ゲノムに挿入される前記第２の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭタンパク質のλ鎖をコードする、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記方法が、前記送達媒体のうちの第１及び第２のものを前記細胞に導入することを含み、
前記ゲノムに挿入される前記第１の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α又はδサブユニットの定常領域をコードし、
前記ゲノムに挿入される前記第２の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、ＴＣＲβ又はγサブユニットの定常領域をコードする、
請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記方法が、前記送達媒体のうちの第１及び第２のものを前記細胞に導入することを含み、
（１）前記第１の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α若しくはδサブユニットのプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内に挿入され、前記第２の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、ＴＣＲβ若しくはγサブユニットのプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内に挿入されるか；又は
（２）前記第１の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α若しくはγサブユニットのプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内に挿入され、前記第２の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、ＴＣＲβ若しくはδサブユニットのプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内に挿入されるか；又は
（３）前記第１の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭタンパク質のκ鎖のプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内に挿入され、前記第２の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭタンパク質のλ鎖のプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内に挿入される、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
（ａ）１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ又は前記１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼをコードする１つ以上の核酸を含む、ヌクレアーゼ組成物；
（ｂ）部位特異的リコンビナーゼのための標的配列を含む第１のドナーＤＮＡを含む、標的ドナー組成物；
（ｃ）前記部位特異的リコンビナーゼ又は前記部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸を含み、前記部位特異的リコンビナーゼが前記標的配列を認識する、リコンビナーゼ組成物；及び
（ｄ）標的細胞のゲノムへの挿入のための目的のヌクレオチド配列を含む第２のドナーＤＮＡを含む、インサートドナー組成物
を含み；
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）が、同じ送達媒体の一部としてのペイロードである、
組成物。
【請求項６４】
前記送達媒体がナノ粒子である、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記ナノ粒子が、（ａ）、（ｂ）、アニオン性ポリマー組成物、カチオン性ポリマー組成物及びカチオン性ポリペプチド組成物を含むコアを含む、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
前記ナノ粒子が、前記ナノ粒子を細胞表面タンパク質と結合させるターゲティングリガンドを含む、請求項６４又は６５に記載の組成物。
【請求項６７】
前記細胞表面タンパク質がＣＤ４７である、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記ターゲティングリガンドがＳＩＲＰαタンパク質模倣体である、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
前記ナノ粒子がエンドサイトーシス誘発リガンドをさらに含む、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
前記ペイロードが、１つ以上のデオキシリボヌクレオタンパク質複合体又は１つ以上のリボ−デオキシリボヌクレオタンパク質複合体を形成する、請求項６３〜６９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７１】
前記送達媒体が帯電ポリマーであるポリペプチドドメインと結合したターゲティングリガンドであり、前記ターゲティングリガンドが細胞表面タンパク質との結合をもたらし、前記帯電ポリマーであるポリペプチドドメインが１つ以上の前記ペイロードと静電相互作用している、請求項６３〜７０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７２】
前記送達媒体が、１つ以上の前記ペイロード及び前記帯電ポリマーであるポリペプチドドメインと相互作用するアニオン性ポリマーをさらに含む、請求項７１に記載の組成物。
【請求項７３】
前記送達媒体が前記ペイロードのうちの１つ以上と結合したターゲティングリガンドであり、前記ターゲティングリガンドが細胞表面タンパク質との結合をもたらす、請求項６３〜７０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７４】
前記送達媒体が、水中油中水エマルジョン粒子、水中油エマルジョンミセル粒子、多重膜型水中油中水エマルジョン粒子、多層型粒子、又はＤＮＡオリガミナノボットを被うターゲティングリガンドを含む、請求項６３〜７０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７５】
前記ターゲティングリガンドが、ペプチド、ＳｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、核酸アプタマー又はペプトイドである、請求項６６〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記送達媒体が非ウイルス性である、請求項６３〜７０のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、2018年4月24日に出願された米国特許仮出願第62/661,992号、2018年6月14日に出願された米国特許仮出願第62/685,240号の利益を主張し、これらの出願は、参照によりその全体がここに組み込まれる。
【０００２】
序説
ゲノム編集は、多くの状況で、依然として非効率的な方法である。部位特異的な遺伝子編集を行う多くの方法があるが、治療への橋渡しは、特に、in vivoへの送達を考慮した場合、送達技術が十分ではないことにより妨げられている。効率的なゲノム編集のための組成物及び方法に対する解決されていない重要な要求がある。
【発明の概要】
【０００３】
複数のペイロードを伴う送達媒体を使用するゲノム編集のための組成物及び方法が提供される。一部の態様では、本発明の方法は送達媒体を細胞に導入することを含み、ここで、送達媒体は、（ａ）ゲノムを切断する１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ（例えば、メガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、Ｉ型又はＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ切断複合体、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質クラス２（ＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチド（例．Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）、Ｃａｓ１３、ＭＡＤ７など））、又は１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼをコードする１つ以上の核酸［本明細書では（ａ）はヌクレアーゼ組成物という］；（ｂ）ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列の挿入がゲノム内の挿入部位において部位特異的リコンビナーゼのための標的配列（例．ａｔｔＰ部位）をもたらす第１のドナーＤＮＡ［本明細書では（ｂ）は標的ドナー組成物という］；（ｃ）部位特異的リコンビナーゼ（例．ΦＣ３１、ΦＣ３１ ＲＤＦ、Ｃｒｅ、ＦＬＰ）（又はこれをコードする核酸）であって、前記標的配列を認識する部位特異的リコンビナーゼ［本明細書では（ｃ）はリコンビナーゼ組成物という］；及び（ｄ）部位特異的リコンビナーゼによる前記標的配列の認識の結果としてゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含む第２のドナーＤＮＡ［本明細書ではｄ）はインサートドナー組成物という］を含むペイロードを含む。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を含む送達媒体は、部位特異的リコンビナーゼのための１つ以上の標的部位の挿入による大型の配列のゲノムへの挿入と、その後の目的のヌクレオチド配列のリコンビナーゼ媒介型挿入を容易とする。一部の場合、挿入される（インサートドナー組成物から）目的のヌクレオチド配列は、１０キロ塩基対（ｋｂｐ）以上（例えば、１５ｋｂｐ〜１００ｋｂｐ、３０ｋｂｐ〜１００ｋｂｐ又は５０ｋｂｐ〜１００ｋｂｐ）である。
【０００４】
一部の場合、第１のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列の挿入は、ゲノム内の第１の部位において部位特異的リコンビナーゼのための第１の標的配列をもたらし、ゲノム内の第２の部位において部位特異的リコンビナーゼのための第２の標的配列（例えば、２つのａｔｔＰ部位の挿入）をもたらす。一部の場合、ヌクレアーゼ組成物は２か所でゲノムを切断し、標的ドナー組成物は第１のドナーＤＮＡのうちの２つを含み、それらの各々がゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含み、これにより、ゲノム内の第１の部位において部位特異的リコンビナーゼのための第１の標的配列をもたらし、ゲノム内の第２の部位において部位特異的リコンビナーゼのための第２の標的配列をもたらす（例．２つのａｔｔＰ部位の挿入）。一部の場合、第２のドナーＤＮＡは部位特異的リコンビナーゼのための２つの標的配列（例．ａｔｔＢ部位）を含み、ここで、２つの標的配列はゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を挟む。
【０００５】
送達媒体は、in vitro、ex vivo又はin vivoで、細胞に導入されうる／細胞へと送達されうる。複数のペイロードを同じ送達媒体（例．ナノ粒子）の一部として送達することの１つの利点は、各ペイロードの効率が低下しないことである。例として、ペイロードＡ及びペイロードＢが２つの別個のパッケージ／媒体（それぞれパッケージＡ及びパッケージＢ）により送達される場合、効率は乗算的で、例えば、パッケージＡ及びパッケージＢが各々１％のトランスフェクション効率を有する場合、ペイロードＡ及びペイロードＢを同じ細胞へと送達する見込みは０．０１％（１％×１％）である。しかし、ペイロードＡ及びペイロードＢがいずれも同じ送達媒体の一部として送達される場合、ペイロードＡ及びペイロードＢを同じ細胞へと送達する見込みは１％で、０．０１％に対して１００倍の改善である。
【０００６】
送達媒体は、非ウイルス性媒体、ウイルス性媒体、ナノ粒子（例．ターゲティングリガンド、並びに／又はアニオン性ポリマー組成物、カチオン性ポリマー組成物及びカチオン性ポリペプチド組成物を含むコア、を含むナノ粒子）、リポソーム、ミセル、水中油中水エマルジョン粒子、水中油エマルジョンミセル粒子、多重膜型水中油中水エマルジョン粒子、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインと結合したターゲティングリガンド（例．ペプチドのターゲティングリガンド。ここで、ターゲティングリガンドは細胞表面タンパク質と結合し、そして、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインは、核酸ペイロードと凝縮する及び／又はタンパク質ペイロードと静電相互作用している）、ペイロードと結合したターゲティングリガンド（例．ペプチドであるターゲティングリガンド。ここで、ターゲティングリガンドは細胞表面タンパク質と結合する）などを含みうるが、これらに限定されるものではない。一部の場合、ペイロードは、デオキシリボヌクレオタンパク質複合体及び／又はリボ−デオキシリボヌクレオタンパク質複合体として細胞に導入される。
【０００７】
提供される組成物及び方法は、任意の細胞内の任意の座位におけるゲノム編集のために（例えばin vivoにおいて、例えばＴ細胞を操作するのに）使用されうる。例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞集団又はＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔ細胞の混合物は、抗原認識のために、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３ドメインの適切なＴＣＲα／ＴＣＲβ対を一過性又は恒久的に発現するようにプログラム化されうる。
【０００８】
本発明は、添付した図面を参照する場合に、以下の発明の詳細な説明を最も良く理解することができる。一般的な慣行に従い、図面は必ずしも縮尺どおりではないことが強調される。対照的に、図面は、明確さのために任意に拡大又は縮小することができる。図面には以下の図が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の方法を例示する概略図である。この例では、配列特異的ヌクレアーゼによるゲノムの切断の後に、（標的ドナー組成物のドナーＤＮＡを使用して）２つの標的配列（例．ａｔｔＰ部位）をゲノムに挿入する。２つの標的配列（例．ａｔｔＢ部位）はインサートドナー組成物のドナーＤＮＡ上に存在しており、部位特異的リコンビナーゼ（例．ΦＣ３１）を使用して（インサートドナー組成物の）ドナーＤＮＡの配列を挿入した後も、２つの残留部位（例．ａｔｔＲ部位）はゲノム内に存在している。
【図２】図２は、送達媒体（この例では、ある種のナノ粒子）を例示する概略図である。
【図３】図３は、送達媒体（この例では、ある種のナノ粒子）を例示する概略図である。この場合、ナノ粒子は、外側から順に、表面コート（外殻を含む）層、第２の脱落層、中間層（追加のペイロードを含む）及び第１の脱落層により取り囲まれたコア（第１のペイロードを含む）を有する、多層型である。
【図４】図４（パネルＡ〜Ｂ）は、本発明のナノ粒子の表面コートにおけるターゲティングリガンドの構成例を示す概略図である。図示された送達分子は、ナノ粒子の脱落層と静電相互作用しているアンカードメインとコンジュゲートしたターゲティングリガンドを含む。ターゲティングリガンドは、Ｎ末端又はＣ末端でコンジュゲートする場合（各パネルの左側）も、内部でコンジュゲートする場合（各パネルの右側）もあることに留意されたい。パネルＡではリンカーを含んでいるが、パネルＢはリンカーを含まない。
【図５Ａ】図５Ａは、送達媒体（本発明の送達分子を構成する例）を例示する概略図である。ターゲティングリガンドは、Ｎ末端又はＣ末端でコンジュゲートする場合（各パネルの左側）も、内部でコンジュゲートする場合（各パネルの右側）もある。この図は、リンカーのほかにペイロードと結合したターゲティングリガンドを含む送達分子を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、送達媒体（本発明の送達分子を構成する例）を例示する概略図である。ターゲティングリガンドは、Ｎ末端又はＣ末端でコンジュゲートする場合（各パネルの左側）も、内部でコンジュゲートする場合（各パネルの右側）もある。この図は、リンカーを有さないがペイロードと結合したターゲティングリガンドを有する送達分子を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、送達媒体（本発明の送達分子を構成する例）を例示する概略図である。ターゲティングリガンドは、Ｎ末端又はＣ末端でコンジュゲートする場合（各パネルの左側）も、内部でコンジュゲートする場合（各パネルの右側）もある。この図は、核酸ペイロードと凝縮した（及び／又はタンパク質ペイロードと例えば静電的に相互作用している）帯電ポリマーであるポリペプチドドメインと結合した、リンカー及びターゲティングリガンドを含む送達分子を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、送達媒体（本発明の送達分子を構成する例）を例示する概略図である。ターゲティングリガンドは、Ｎ末端又はＣ末端でコンジュゲートする場合（各パネルの左側）も、内部でコンジュゲートする場合（各パネルの右側）もある。この図は、リンカーは有さないが、核酸ペイロードと凝縮した（及び／又はタンパク質ペイロードと例えば静電的に相互作用している）帯電ポリマーであるポリペプチドドメインと結合したターゲティングリガンドを含む送達分子を示す。
【図６】図６は、使用可能な（例えばナノ粒子の一部として、例えば核局在化シグナル（ＮＬＳ）含有ペプチドとして；ＮＬＳ含有ペプチド、アニオン性ポリマー、カチオン性ポリマー及び／又はカチオン性ポリペプチドなどの一部として／これらにコンジュゲート可能な）ＮＬＳの例を示す。図は、Kosugi et al., J Biol Chem. 2009 Jan 2;284(1):478-85からの転載である［クラス１、上から順に配列番号２０１から配列番号２２１；クラス２、上から順に配列番号２２２から配列番号２２４；クラス４、上から順に配列番号２２５から配列番号２３０；クラス３、上から順に配列番号２３１から配列番号２４５；クラス５、上から順に配列番号２４６から配列番号２６４］。
【図７】図７は、マウス造血細胞系統と当該系統内の多様な細胞で同定されたマーカーを示す概略図である。
【図８】図８は、ヒト造血細胞系統と当該系統内の多様な細胞で同定されたマーカーを示す概略図である。
【図９】図９は、細胞の分化及び／又は増殖に影響を及ぼすのに使用可能なｍｉＲＮＡを示す概略図である。
【図１０】図１０は、細胞の分化及び／又は増殖に影響を及ぼすのに使用可能なタンパク質を示す概略図である。
【図１１】図１１は、研究Ａの組成物に関して、ナノ粒子の平均粒子サイズを示す。
【図１２】図１２は、研究Ａの組成物に関して、ナノ粒子のゼータ電位を示す。
【図１３】図１３は、研究Ａの組成物に関して、ナノ粒子の多分散性指数を示す。
【図１４】図１４は、研究Ｂの組成物に関して、ナノ粒子の多分散性指数及び安定性を説明する図を示す。
【図１５】図１５は、研究Ｂの組成物に関して、ナノ粒子の平均粒子サイズを示す。
【図１６】図１６は、研究Ｂの組成物に関して、ナノ粒子のゼータ電位を示す。
【図１７】図１７は、研究Ｂの組成物に関して、ナノ粒子の多分散性指数を示す。
【図１８】図１８は、研究Ｂの組成物に関して、ナノ粒子の多分散性指数及び安定性を説明する図を示す。
【図１９】図１９は、研究Ｃの組成物に関して、ナノ粒子の粒子サイズ分布を示す。
【図２０】図２０は、研究Ｃの組成物に関して、ナノ粒子のゼータ電位を示す。
【図２１】図２１は、研究Ｃの組成物に関して、ナノ粒子の多分散性指数を示す。
【図２２】図２２は、研究Ｃの組成物に関して、ナノ粒子の多分散性指数及び安定性を示す。
【図２３】図２３は、研究Ｃの組成物に関して、ナノ粒子のSYBR GOLD組入れアッセイで得た蛍光値を示す。
【図２４】図２４は、ＲＮＰ−Ｈ２Ｂ（ミニコア）粒子についての特徴付けを示す。
【図２５】図２５は、ＲＮＰ−Ｈ２Ｂ−ＰＬＥ２０：ＰＤＥ２０（コア）粒子についての特徴付けを示す。
【図２６】図２６は、ＲＮＰ−Ｈ２Ｂ−ＰＬＥ２０：ＰＤＥ２０（コア）粒子の血清安定性を示す。
【図２７】図２７は、１日後のリガンド修飾粒子についての多分散性の評価を示す。
【図２８】図２８は、７２時間後又は７日後のリガンド修飾粒子についての多分散性の評価を示す。
【図２９】図２９は、自動式パイプラインサンプリングで測定される細胞、核及びナノ粒子を示す。
【図３０】図３０は、さまざまな処理の１４．５時間後までの細胞内の粒子の共局在の変化を示す。
【図３１】図３１は、さまざまな処理の１４．５時間後までのＣａｓ９−ｅＧＦＰ細胞の割合を示す。
【図３２】図３２は、さまざまな処理の１４．５時間後までの核への粒子の組込みを示す。
【図３３】図３３は、さまざまな処理の１４．５時間後までのＣａｓ９−ｅＧＦＰ細胞の割合を示す。
【図３４Ａ】図３４Ａは、非処理試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
【図３４Ｂ】図３４Ｂは、図３４Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
【図３４Ｃ】図３４Ｃは、図３４Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
【図３５Ａ】図３５Ａは、コア粒子中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
【図３５Ｂ】図３５Ｂは、図３５Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
【図３５Ｃ】図３５Ｃは、図３５Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
【図３６Ａ】図３６Ａは、リガンドであるポリ（L-アルギニン）で処理された試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
【図３６Ｂ】図３６Ｂは、図３６Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
【図３６Ｃ】図３６Ｃは、図３６Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
【図３７Ａ】図３７Ａは、リガンドＣＤ３＿ＣＤ３ｅ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ＿１による、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
【図３７Ｂ】図３７Ｂは、図３７Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
【図３７Ｃ】図３７Ｃは、図３７Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
【図３８Ａ】図３８Ａは、リガンドＣＤ８＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎによる、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
【図３８Ｂ】図３８Ｂは、図３８Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
【図３８Ｃ】図３８Ｃは、図３８Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
【図３９Ａ】図３９Ａは、リガンドＣＤ２８＿ｍＣＤ８０＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎによる、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
【図３９Ｂ】図３９Ｂは、図３９Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
【図３９Ｃ】図３９Ｃは、図３９Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
【図４０Ａ】図４０Ａは、リガンドＣＤ２８＿ｍＣＤ８６＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎによる、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
【図４０Ｂ】図４０Ｂは、図４０Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
【図４０Ｃ】図４０Ｃは、図４０Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
【図４１Ａ】図４１Ａは、リガンドＩＬ２Ｒ＿ｍＩＬ２＿４ＧＳ＿２＿９Ｒ＿Ｎ＿１による、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
【図４１Ｂ】図４１Ｂは、図４１Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
【図４１Ｃ】図４１Ｃは、図４１Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
【図４２Ａ】図４２Ａは、リガンドＣＤ３＿ＣＤ３ｅ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ＿１及びＣＤ８＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎによる、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
【図４２Ｂ】図４２Ｂは、図４２Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
【図４２Ｃ】図４２Ｃは、図４２Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
【図４３Ａ】図４３Ａは、リガンドＣＤ３＿ＣＤ３ｅ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ＿１及びＣＤ２８＿ｍＣＤ８０＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎによる、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
【図４３Ｂ】図４３Ｂは、図４３Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
【図４３Ｃ】図４３Ｃは、図４３Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
【図４４Ａ】図４４Ａは、リガンドＣＤ３＿ＣＤ３ｅ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ＿１及びＣＤ２８＿ｍＣＤ８６＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎによる、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
【図４４Ｂ】図４４Ｂは、図４４Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
【図４４Ｃ】図４４Ｃは、図４４Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
【図４５Ａ】図４５Ａは、リガンドＣＤ３＿ＣＤ３ｅ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ＿１及びＩＬ２Ｒ＿ｍＩＬ２＿４ＧＳ＿２＿９Ｒ＿Ｎ＿１による、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
【図４５Ｂ】図４５Ｂは、図４５Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
【図４５Ｃ】図４５Ｃは、図４５Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
【図４６Ａ】図４６Ａは、リガンドＣＤ３＿ＣＤ３ｅ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ＿１及びポリ（L-アルギニン）；ｎ＝１０による、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
【図４６Ｂ】図４６Ｂは、図４６Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
【図４６Ｃ】図４６Ｃは、図４６Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
【図４７Ａ】図４７Ａは、リガンドＣＤ２８＿ｍＣＤ８０＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ及びＣＤ２８＿ｍＣＤ８６＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎによる、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
【図４７Ｂ】図４７Ｂは、図４７Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
【図４７Ｃ】図４７Ｃは、図４７Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
【図４８Ａ】図４８Ａは、リガンドＣＤ３＿ＣＤ３ｅ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ＿１、ＣＤ２８＿ｍＣＤ８６＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ及びＣＤ８＿４ＧＳ＿２＿９Ｒ＿Ｎ＿１による、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
【図４８Ｂ】図４８Ｂは、図４８Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
【図４８Ｃ】図４８Ｃは、図４８Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
【図４９Ａ】図４９Ａは、リガンドＣＤ３＿ＣＤ３ｅ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ＿１、ＣＤ８＿４ＧＳ＿２＿９Ｒ＿Ｎ＿１及びＩＬ２Ｒ＿ｍＩＬ２＿４ＧＳ＿２＿９Ｒ＿Ｎ＿１による、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
【図４９Ｂ】図４９Ｂは、図４９Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
【図４９Ｃ】図４９Ｃは、図４９Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
【図５０Ａ】図５０Ａは、リガンドＣＤ３＿ＣＤ３ｅ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ＿１、ＣＤ２８＿ｍＣＤ８０＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ及びＣＤ８＿４ＧＳ＿２＿９Ｒ＿Ｎ＿１による、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
【図５０Ｂ】図５０Ｂは、図５０Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
【図５０Ｃ】図５０Ｃは、図５０Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
【図５１Ａ】図５１Ａは、ＣＤ３＿ＣＤ３ｅ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ＿１、ＣＤ２８＿ｍＣＤ８６＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ及びＣＤ２８＿ｍＣＤ８０＿（４ＧＳ＿）２＿９Ｒ＿Ｎ＿１による、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
【図５１Ｂ】図５１Ｂは、図５１Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
【図５１Ｃ】図５１Ｃは、図５１Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
【図５２Ａ】図５２Ａは、リガンドＣＤ８＿４ＧＳ＿２＿９Ｒ＿Ｎ＿１、ＣＤ２８＿ｍＣＤ８０＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ及びＣＤ２８＿ｍＣＤ８６＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎによる、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
【図５２Ｂ】図５２Ｂは、図５２Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
【図５２Ｃ】図５２Ｃは、図５２Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
【図５３Ａ】図５３Ａは、リガンドＣＤ８＿４ＧＳ＿２＿９Ｒ＿Ｎ＿１、ＣＤ２８＿ｍＣＤ８０＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ及びＩＬ２Ｒ＿ｍＩＬ２＿４ＧＳ＿２＿９Ｒ＿Ｎ＿１による、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
【図５３Ｂ】図５３Ｂは、図５３Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
【図５３Ｃ】図５３Ｃは、図５３Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
【図５４Ａ】図５４Ａは、リガンドＣＤ８＿４ＧＳ＿２＿９Ｒ＿Ｎ＿１、ＣＤ２８＿ｍＣＤ８６＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ、ＩＬ２Ｒ＿ｍＩＬ２＿４ＧＳ＿２＿９Ｒ＿Ｎ＿１による、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
【図５４Ｂ】図５４Ｂは、図５４Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
【図５４Ｃ】図５４Ｃは、図５４Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
【図５５】図５５は、異なるリガンドによる試料の画像解析、汎Ｔ細胞フロー解析及びＰＢＭＣフロー解析を示す。
【図５６】図５６は、図５５のリガンドセットと異なるリガンドセットによる試料についての画像解析、汎Ｔ細胞フロー解析及びＰＢＭＣフロー解析を示す。
【図５７】図５７は、ナノ粒子の合成の一般的な概略を示す。これは、ペイロード、カチオン性／アニオン性ペプチド及びリガンドの添加を含み、添加の順序は自由である。ペプチド、ペイロード及びリガンドの例も示し、これらは、その塩基数が異なり、また、Ｄ／Ｌ異性体を含んでもよい。
【図５８Ａ】図５８Ａは、各ナノ粒子に段階的に添加されるＰＬＲ５０、緩衝液及びＲＮＰの量を示す。
【図５８Ｂ】図５８Ｂは、各ナノ粒子に段階的に添加されるＰＬＲ５０、緩衝液及びＲＮＰの量（続き）を示す。
【図５８Ｃ】図５８Ｃは、各ナノ粒子に段階的に添加されるＤＮＡ、ＰＬＲ５０及び緩衝液の量を示す。
【図５８Ｄ】図５８Ｄは、各ナノ粒子に段階的に添加されるＤＮＡ、ＰＬＲ５０及び緩衝液の量（続き）を示す。
【図５８Ｅ】図５８Ｅは、ナノ粒子ウェルＩＤ（ナノ粒子を合成し、サイズ、ゼータ電位及びSYBR蛍光を測定する９６ウェルプレート内の場所）と、図６１Ｉに示したナノ粒子ＩＤ（９６ウェル細胞トランスフェクションプレート）への、その変換を示す。
【図５９Ａ】図５９Ａは、２Ｃ．１．１．１で合成されたナノ粒子の粒子サイズを示す。粒子のサイズはWyatt Mobius Zeta Potential and DLS Detectorで３回測定した。サイズは、ナノ粒子９６ウェルＩＤに関連するヒートマップにおいて、平均流体力学直径（ｎｍ）±標準偏差として示す。
【図５９Ｂ】図５９Ｂは、２Ｃ．１．１．１で合成されたナノ粒子のゼータ電位を示す。粒子のゼータ電位はWyatt Mobius Zeta Potential and DLS Detectorで３回測定した。ゼータ電位は、ナノ粒子９６ウェルＩＤに関連するヒートマップにおいて、平均ゼータ電位（ｍＶ）±標準偏差として示す。
【図５９Ｃ】図５９Ｃは、SYBR蛍光アッセイによる各粒子の凝縮指数の（一晩の）平均を示す。凝縮指数は、［（対象ウェルの蛍光−遊離ＤＮＡの蛍光）／遊離ＤＮＡの蛍光］×１００により計算され、ナノ粒子９６ウェルＩＤに関連するヒートマップにおいて、平均凝縮指数±標準偏差として示す。十分に凝縮したナノ粒子は遮蔽が高度で蛍光が弱く、したがって凝縮指数は負の値である。
【図６０Ａ】図６０Ａは、ＨＥＫ２９３−ＧＦＰ細胞へのトランスフェクションのプレートレイアウトを示す。ナノ粒子は、二連プレート上、２０ｕＬ及び１０ｕＬで投与した。Ｂ行（金の強調）は層１の電荷比を示し、Ｃ行（オレンジの強調）は外層の電荷比を示し、緑の強調はCRISPRMAXトランスフェクション対照を示し、グレーの強調はリポフェクタミン3000トランスフェクション対照を示す。ＤＮＡミックスは、一本鎖デオキシオリゴヌクレオチド及びφＣ３１発現及びドナープラスミドを含む。
【図６０Ｂ】図６０Ｂは、ＧＦＰ及びAlexa647（ナノ粒子）の蛍光の測定による、トランスフェクション後５日目のフロー解析の結果を示す。ＦＳＣ／ＳＳＣ散乱に基づき生細胞にゲートをかけ、生細胞ゲートについて、ＧＦＰ−の割合（％）及びナノ粒子＋の割合（％）を示す。リポフェクション対照はロバストな結果となるが、ナノ粒子ウェルでは著しいＧＦＰノックダウンは観察されない。用量２０ｕＬのナノ粒子は５日目に著しいナノ粒子シグナルが生じるが、用量１０ｕＬではこれは生じない。ＲＦＰ発現は、タグ−ＲＦＰプラスミドを伴うリポフェクション対照のみで観察された：生細胞のうちの２０％のＲＦＰ＋、ウェルＣ１１（データは示さない）。トランスフェクション後１０日目及び１４日目におけるフロー解析では、ナノ粒子群はもはやナノ粒子のＡｌｅｘａ−６４７シグナルを示さず、ＧＦＰのノックダウンを示さず、ＲＦＰの発現を示さなかった。プラスミドのリポフェクション対照では、時間が経過するにつれＲＦＰの発現が低下した（１０日目に７％のＲＦＰ＋、１４日目に２％のＲＦＰ＋）が、CRISPRMAX対照（Ｂ１０、Ｃ１０）のＧＦＰのノックダウンが一定を維持したことは、遺伝子編集の遺伝性と符合する。
【図６０Ｃ】図６０Ｃは、サンガーシーケンシングデータのSynthego製ＩＣＥノックイン解析を使用する、ＧＦＰ座位の編集（２５％ノックダウン）及びａｔｔＰ一本鎖デオキシオリゴヌクレオチドによる相同性指向修復（ノックイン）（６％）を示すＲＮＰ＋ＤＮＡミックスのリポフェクション対照（ウェルＣ１０）についての、トランスフェクション後５日目のゲノム解析の結果を示す。
【図６１Ａ】図６１Ａは、各ナノ粒子に段階的に添加されるＰＬＲ５０、緩衝液及びＲＮＰの量を示す。
【図６１Ｂ】図６１Ｂは、各ナノ粒子に段階的に添加されるＰＬＲ５０、緩衝液及びＲＮＰの量（続き）を示す。
【図６１Ｃ】図６１Ｃは、各ナノ粒子に段階的に添加されるＤＮＡ、リガンドミックス、ＡＬＥＸＡ−６４７ナノ粒子標識及び緩衝液の量を示す。
【図６１Ｄ】図６１Ｄは、各ナノ粒子に段階的に添加されるＰＬＲ５０、緩衝液及びＲＮＰの量（続き）を示す。
【図６１Ｅ】図６１Ｅは、ナノ粒子ウェルＩＤ（ナノ粒子が合成され、サイズ、ゼータ電位及びSYBR蛍光を測定する９６ウェルプレート内の場所）と、図６１Ｉに示したナノ粒子ＩＤ（９６ウェル細胞トランスフェクションプレート）へのその変換を示す。
【図６１Ｆ】図６１Ｆは、２Ｃ．２．１．１で合成されたナノ粒子の粒子サイズを示す。粒子のサイズはWyatt Mobius Zeta Potential and DLS Detectorで３回測定した。サイズは、ナノ粒子９６ウェルＩＤに関連するヒートマップにおいて、平均流体力学直径（ｎｍ）±標準偏差として示す。
【図６１Ｇ】図６１Ｇは、２Ｃ．２．１．１で合成されたナノ粒子のゼータ電位を示す。粒子のゼータ電位はWyatt Mobius Zeta Potential and DLS Detectorで３回測定した。ゼータ電位は、ナノ粒子９６ウェルＩＤに関連するヒートマップにおいて、平均ゼータ電位（ｍＶ）±標準偏差として示す。
【図６１Ｈ】図６１Ｈは、SYBR蛍光アッセイによる各粒子の凝縮指数の（一晩の）平均を示す。凝縮指数は、［（対象ウェルの蛍光−遊離ＤＮＡの蛍光）／遊離ＤＮＡの蛍光］×１００として計算され、ナノ粒子９６ウェルＩＤに関連するヒートマップにおいて、平均凝縮指数±標準偏差として示す。十分に凝縮したナノ粒子は遮蔽が高度で蛍光が弱く、したがって、凝縮指数は負の値である。
【図６１Ｉ】図６１Ｉは、刺激されたＰＢＭＣへのトランスフェクションのプレートレイアウトを示す。ナノ粒子は、６０，０００の刺激されたＰＢＭＣを有するウェル１つ当たり１０ｕＬ投与した。Ｂ行（金の強調）は層１の電荷比を示し、Ｃ行（オレンジの強調）は外層の電荷比を示す。緑で強調されたウェル（Ｂ１２（Ｇ）１２及びＧ１１）は、ヌクレオフェクション対照である。ＮＰ１８、ＮＰ３９及びＮＰ２５は、遺伝子編集効率（それぞれ、ＴＣＲノックダウン；６％、５％、及びサンガーシーケンシング効率；５％）に関して最高性能のナノ粒子群であった。太字の試料は、サンガーシーケンシングにより決定されたＴＣＲ座位の切断値が＞１％であることを示す。
【図６１Ｊ】図６１Ｊは、フローサイトメトリーで測定したトランスフェクト細胞の細胞生存率（％生細胞）を示す。一晩トランスフェクションしたナノ粒子をＰＢＳで洗浄後、刺激されたＰＢＭＣを１日目のフロー解析のために回収した。細胞生存率はAnnexin V染色によりアッセイした。ウェルＥ６は誤差を有した。
【図６１Ｋ】図６１Ｋは、フローサイトメトリーで測定したトランスフェクト細胞の細胞生存率（％死／アポトーシス細胞）を示す。一晩トランスフェクションしたナノ粒子をＰＢＳで洗浄後、刺激されたＰＢＭＣを１日目のフロー解析のために回収した。細胞生存率はAnnexin V染色によりアッセイした。ウェルＥ６は、アポトーシス細胞及び死細胞を有した。ウェルＥ６は誤差を有した。
【図６１Ｌ】図６１Ｌは、様々なナノ粒子製剤の細胞への取込み（ＡＦ６４７−／ナノ粒子＋及びＥＧＦＰ−／Ｃａｓ９＋）を示す。一晩トランスフェクションしたナノ粒子をＰＢＳで洗浄後、刺激されたＰＢＭＣを１日目のフロー解析のために回収した。ＧＦＰ（Ｃａｓ９−ＧＦＰ）及びAlexa647（ナノ粒子）の蛍光について、生細胞ゲート（Annexin V陰性）のＧＦＰ＋の割合（％）及びナノ粒子＋の割合（％）を示す。ＨＥＫ−２９３細胞と比較してＴ細胞のナノ粒子シグナル（Alexa647）は極めて低かったので、ＡＦ６４７が結合したエンドソーム脱出ペプチドの急速な分解が、最も効率的な細胞内Ｃａｓ９ ＲＮＰ送達をもたらすことが示唆される。ほぼ全ての痕跡量のナノ粒子＋（１〜２％）は、最高値のＣａｓ９−ＧＦＰシグナルと一致する。細胞のうちの＞９５％がＣＤ３染色で陽性であり（図示しない）、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激がＴ細胞の選択的増殖をもたらしたことを示す。
【図６１Ｍ】図６１Ｍは、トランスフェクション後４日目におけるＴＣＲ発現のフロー解析を示す。ＲＮＰ±一本鎖デオキシオリゴヌクレオチドを伴うヌクレオフェクションウェルはロバストなＴＣＲノックダウンを有するが、全ての構成要素のヌクレオフェクション（Ｆ１２）及びナノ粒子ウェルはこれを有さない。ナノ粒子シグナル（Alexa647又はＣａｓ９−ＧＦＰ）は観察されず、ＲＦＰによるプラスミドのヌクレオフェクション対照ウェル（Ｇ１２）だけが生細胞のうちの１０％においてＲＦＰの発現を示す（データは示さない）。
【図６１Ｎ】図６１Ｎは、トランスフェクション後１４日目におけるＴＣＲ発現のフロー解析を示す。ナノ粒子シグナル（Alexa647又はＣａｓ９−ＧＦＰ）又はＲＦＰの発現は、プラスミドのヌクレオフェクション対照からのものすら観察されなかった。
【図６１Ｏ】図６１Ｏは、ＴＲＡＣ座位の１４日目におけるサンガーシーケンシングデータによるＩＣＥスコアを示す。高ＩＣＥスコアは、フロー解析によるＴＣＲノックダウンと同様にヌクレオフェクション試料中のロバストな編集を示す。３つのナノ粒子（枠囲い）は、Synthego製ＩＣＥプラットフォームで低度のＴＣＲ編集を示した。どの試料も、ａｔｔＰ一本鎖デオキシオリゴヌクレオチドによる相同性指向修復（ノックイン）を示さなかった。
【図６１Ｐ】図６１Ｐはサンガーシーケンシングの結果を示す。実験２Ｃ．１．２．１の前に行われた研究において、高度のナノ粒子の取込み効率及び細胞内の放出動態をもたらすようにコアがさらに最適化された。実験２Ｃ．１．２．１では、様々な比率のヒストン断片、ＰＬＲ１０、ＰＬＲ５０、ＮＬＳ修飾ヒストン、及び／又はエンドソーム脱出−ＮＬＳペプチドと共に、ＰＬＥ対ＰＤＥの比の様々な値をさらに含んだ。ターゲティングリガンドにおける装飾の前に、ナノ粒子のコアを細胞内の急速な放出対細胞内徐放について最適化することを意図する初期のスクリーンセットにおいて、多様なナノ粒子のコアをそれらの生物学的性能（細胞への取込み、時間経過にわたる細胞内貯留、生存率及び遺伝子編集）について評価した。
【図６１Ｑ】図６１Ｑは、トランスフェクション後１４日目のサンガーシーケンシングの結果を示す。実験２Ｃ．１．２．１の前に行われた研究において、高度のナノ粒子の取込み効率及び細胞内の放出動態をもたらすようにコアがさらに最適化された。ターゲティングリガンドにおける装飾の前に、ナノ粒子のコアを細胞内の急速な放出対細胞内徐放について最適化することを意図する初期のスクリーンセットにおいて、多様なナノ粒子のコアを、それらの生物学的性能（細胞への取込み、時間経過にわたる細胞内貯留、生存率及び遺伝子編集）について評価した。
【図６２Ａ】図６２Ａは、各ナノ粒子に工程１で添加されるカチオン性ペプチド及び緩衝液の量を示す。
【図６２Ｂ】図６２Ｂは、各ナノ粒子に工程２で添加されるＲＮＰ、ＤＮＡ又はＤＮＡ＋ＰＬＥ／ＰＤＥの量を示す。この段階でナノ粒子を１０分間インキュベートした。
【図６２Ｃ】図６２Ｃは、各ナノ粒子に工程３で添加されるＲＮＰ、ＤＮＡ、又はＤＮＡ＋ＰＬＥ／ＰＤＥの量を示す。この段階でナノ粒子をさらに１０分間インキュベートした。
【図６２Ｄ】図６２Ｄは、各ナノ粒子に工程３で添加されるカチオン性ペプチド、ナノ粒子ＡＬＥＸＡ−６４７標識及び緩衝液の量を示す。この段階でナノ粒子をさらに１０分間インキュベートした。
【図６２Ｅ】図６２Ｅは、ナノ粒子ウェルＩＤ（ナノ粒子が合成され、サイズ、ゼータ電位及びSYBR蛍光を測定する９６ウェルプレート内の場所）と、図６１Ｉに示したナノ粒子ＩＤ（９６ウェル細胞トランスフェクションプレート）への、その変換を示す。
【図６２Ｆ】図６２Ｆは、０．１％の原液から電荷比１０を達成するために必要なカチオン性ポリペプチドの体積の計算の例を示す。
【図６２Ｇ】図６２Ｇは、０．１％の原液から電荷比４を達成するために必要なカチオン性ポリペプチドの体積の計算の例を示す。
【図６２Ｈ】図６２Ｈは、２Ｃ．１．２．１で合成されたナノ粒子の粒子サイズを示す。粒子のサイズはWyatt Mobius Zeta Potential and DLS Detectorで３回測定した。サイズは、ナノ粒子９６ウェルＩＤに関連するヒートマップにおいて、平均流体力学直径（ｎｍ）±標準偏差として示す。
【図６２Ｉ】図６２Ｉは、２Ｃ．１．２．１で合成されたナノ粒子のゼータ電位を示す。粒子のゼータ電位はWyatt Mobius Zeta Potential and DLS Detectorで３回測定した。ゼータ電位は、ナノ粒子９６ウェルＩＤに関連するヒートマップにおいて、平均ゼータ電位（ｍＶ）±標準偏差として示す。
【図６２Ｊ】図６２Ｊは、SYBR蛍光アッセイによる各粒子の凝縮指数の（一晩の）平均を示す。凝縮指数は、［（対象ウェルの蛍光−遊離ＤＮＡの蛍光）／遊離ＤＮＡの蛍光］×１００により計算され、ナノ粒子９６ウェルＩＤに関連するヒートマップにおいて、平均凝縮指数±標準偏差として示す。十分に凝縮したナノ粒子は遮蔽が高度で蛍光が弱く、したがって凝縮指数は負の値である。
【図６２Ｋ】図６２Ｋは、ＨＥＫ２９３−ＧＦＰ細胞へのナノ粒子トランスフェクションレイアウトを示す。黄で強調した群は図６２Ａ〜６２Ｅに示された対応するナノ粒子の１回量（１０ｕｌ）で、青で強調した群は図６２Ａ〜６２Ｅに示された対応するナノ粒子の２回量（２０ｕｌ）である。緑の強調はCRISPRMAXトランスフェクション対照を示し、グレーの強調はリポフェクタミン3000トランスフェクション対照を示す。ＤＮＡミックスは、一本鎖デオキシオリゴヌクレオチド、φＣ３１発現及びドナープラスミドを含む。
【図６２Ｌ】図６２Ｌは、Alexa647の蛍光（ナノ粒子シグナル）の測定による、トランスフェクション後３日目のフロー解析の結果を示す。ＦＳＣ／ＳＳＣ散乱に基づき生細胞にゲートをかけ、生細胞ゲートのナノ粒子＋の割合（％）を示す。
【図６２Ｍ】図６２Ｍは、ＧＦＰの蛍光の測定による、トランスフェクション後３日目のフロー解析の結果を示す。ＦＳＣ／ＳＳＣ散乱に基づき生細胞にゲートをかけ、生細胞ゲートのＧＦＰ−の割合（％）を示す。ＲＦＰ発現は、タグ−ＲＦＰプラスミドを伴うリポフェクション対照のみで観察された：ウェルＢ６における生細胞のうちの５１％のＲＦＰ＋（データは示さない）。
【図６２Ｎ】図６２Ｎは、図６２ＦでＧＦＰのノックダウンを示す、２Ｃ．１．２．１（ＨＥＫ２９３−ＧＦＰ）から選択したナノ粒子トランスフェクト試料の、３日目におけるＧＦＰ及びAlexa647（ナノ粒子）のフロー解析のプロットを示す。生細胞ゲート（ＦＳＣ／ＳＳＣに基づく）を示す。ナノ粒子シグナルを伴う場合も伴わない場合もＧＦＰの発現の低減が見られることから、ナノ粒子ペプチドシェルの急速な分解及びＲＮＰペイロードの放出が示唆される。
【図６２Ｏ】図６２Ｏは、ＧＦＰの蛍光及びAlexa647の蛍光（ナノ粒子シグナル）の測定による、トランスフェクション後３日目のフロー解析の結果を示す。ＦＳＣ／ＳＳＣ散乱に基づき生細胞にゲートをかけ、割合（％）を生細胞ゲートについて示す。緑で強調されたウェルは（６２Ｆに示した）ＧＦＰ−の割合（％）の上位ヒットで、ピンクで強調されたウェルは（６２Ｅに示した）ナノ粒子＋の割合（％）の上位ヒットである。
【図６２Ｐ】図６２Ｐは、２Ｃ．１．２．１のウェルＥ５に対応する、ＨＥＫ２９３−ＧＦＰ細胞にトランスフェクトされたＡＦ６４７標識ナノ粒子のコントラスト増強画像（左上、左下；ImageJ Script参照）、及び関連する閾値マップ（右上、右下）を示す。明るい緑の領域は高度のナノ粒子誘導蛍光を有するＧＦＰ−領域を表し、赤の領域はナノ粒子誘導蛍光が存在しないＧＦＰ＋領域を示す。ナノ粒子の蛍光は、BioTek Cytation 5 Texas Red Filter Cube（型番：1225102）で検出し、これによる共局在研究、及びＡＦ６４７（Ｃｙ５チャネル）を用いたフローサイトメトリーの結果との比較は、ナノ粒子＋ピクセルが、ＲＦＰ＋ピクセルと識別できないことを示した。これらの閾値マップを用い、各ウェル位置におけるピアソン係数、Ｍ１及びＭ２係数、並びにオーバーラップ係数を求めた。
【図６２Ｑ】図６２Ｑは、トランスフェクション後６日目に作成されたウェルＥ５に対応し図６２Ｐに対応する、ＨＥＫ２９３−ＧＦＰ細胞にトランスフェクトされたＡＦ６４７標識ナノ粒子に適用されたCostesの閾値マップを示す。明るい緑の領域は高度のナノ粒子誘導蛍光を有するＧＦＰ−領域を表し、赤の領域はナノ粒子誘導蛍光が存在しないＧＦＰ＋領域を指し示す。
【図６２Ｒ】図６２Ｒは、トランスフェクション後６日目に作成されたウェルＥ５の、セグメント化及びCostesの閾値マップに対応する代表的なデータ、並びに、イメージングスクリプトによる自動閾値処理を示す。これらの閾値マップを用い、各ウェル位置におけるピアソン係数、Ｍ１及びＭ２係数、並びにオーバーラップ係数を求めた。
【図６２Ｓ】図６２Ｓは、ウェルＢ６（ＲＦＰプラスミドのみの陽性対照）の閾値マップの自動生成に対応する代表的なデータ、及び、イメージングスクリプトによる自動閾値処理を示す。これらの閾値マップを用い、他のウェルの各位置の、ピアソン係数、Ｍ１及びＭ２係数、並びにオーバーラップ係数を求めた。Ｃｙ５チャネル（ナノ粒子−）の非存在下でのTexas Redチャネル（ＲＦＰ＋）の確認、及びナノ粒子＋指標としてのＲＦＰ＋の目視可能性を、他のウェルを比較する場合の閾値の設定に使用した。
【図６２Ｔ】図６２Ｔは、ＲＦＰとＤＡＰＩのオーバーラップ画像を示す。ウェルＢ５は、（Ｂ６におけるＲＦＰプラスミドのリポフェクタミン対照で見られる）ＲＦＰインサートがなくTexas Redチャネルを示さない。ウェルＥ８、Ｅ９及びＦ９（ナノ粒子群）は、高度に目視可能な高度のナノ粒子取込みを示し、ある特定のウェル（例．Ｅ５）は、Ｍ１＝０．０１（ナノ粒子＋と重複するＧＦＰ＋の画分）対Ｍ２＝０．９０７（ＧＦＰ＋と重複するナノ粒子＋の画分）のマンダー係数を示す。これは、粒子の取込みとＧＦＰ発現の欠如の間に強力な関係があることを示す。
【図６２Ｕ】図６２Ｕは、２Ｃ．１．２．１の３日目におけるナノ粒子の取込み及びＧＦＰのノックダウンを示し、この図では、試料は、ＧＦＰ−の割合（Ｂ４〜Ｅ４で値の降順）及びナノ粒子＋の割合（Ｅ７〜Ｆ５で値の昇順）の二つの順で並びかえて示している。注目すべきことに、最高性能のナノ粒子取込み群において、ナノ粒子＋生細胞の比率は、３日目と６日目とで同様である。これは、粒子のさまざまな構成要素は細胞に効率的に侵入するが、それらのペイロードを効率的に放出したり、適切なコンパートメントに到達したりせず、また、これらのナノ粒子は徐放動態を有しうることを示唆する。３日目で上位性能のＧＦＰノックダウン粒子は、６日目には相対ノックダウン効率が低下した。粒子の分解は、Δ（３日目におけるナノ粒子＋の割合（％）−６日目におけるナノ粒子＋の割合（％））によりモデル化される。ナノ粒子＋編集細胞の毒性を説明する遺伝子編集効率は、Δ（６日目におけるＧＦＰ−の割合（％）−３日目におけるＧＦＰ−の割合（％））によりモデル化される。これらの２つの比の比較は、その後のターゲティングリガンドによるコーティングに最適の「コアナノ粒子」の確立を可能とするが、ここで、３日目におけるナノ粒子＋細胞の割合（％）と、６日目におけるＧＦＰ−細胞の割合（％）とのバランスが求められる。これらの選択基準によれば、ＮＰ１３、ＮＰ１５、ＮＰ０６及びＮＰ１４（黒四角）が、さらなるリガンドターゲティング層形成及び細胞内ターゲティング対細胞内放出効率の最適化のための上位候補のナノ粒子である。図３５Ａでは、「コア粒子」（同じ定義によれば、例えば、リガンドを伴わない、アニオン性及び／又はカチオン性ポリペプチドのみを含む）は、２Ｃ．１．２．１及び２Ｃ．２．１．１における最低性能と同等な取込み効率を達成することが示され、ここで、さまざまなターゲティングリガンドの装飾は、細胞への取込み及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ＲＮＰによる送達を１０倍を超える効率で増大させる（図３０〜５６）。
【図６２Ｖ】図６２Ｖは、２Ｃ．１．２．１の６日目におけるナノ粒子の取込み及びＧＦＰのノックダウンを示し、この図では、試料は、ＧＦＰ−の割合（Ｂ４〜Ｅ４で値の降順）及びナノ粒子＋の割合（Ｅ７〜Ｆ５で値の昇順）の二つの順で並びかえて示している。注目すべきことに、最高性能のナノ粒子取込み群において、ナノ粒子＋生細胞の比率は、３日目と６日目とで同様である。これは、粒子のさまざまな構成要素は細胞に効率的に侵入するが、それらのペイロードを効率的に放出したり、適切なコンパートメントに到達したりせず、また、これらのナノ粒子は徐放動態を有しうることを示唆する。３日目で上位性能のＧＦＰノックダウン粒子は、６日目には相対ノックダウン効率が低下した。粒子の分解は、Δ（３日目におけるナノ粒子＋の割合（％）−６日目におけるナノ粒子＋の割合（％））によりモデル化される。ナノ粒子＋編集細胞の毒性を説明する遺伝子編集効率は、Δ（６日目におけるＧＦＰ−の割合（％）−３日目におけるＧＦＰ−の割合（％））によりモデル化される。これらの２つの比の比較は、その後のターゲティングリガンドによるコーティングに最適の「コアナノ粒子」の確立を可能とするが、ここで、３日目におけるナノ粒子＋細胞の割合（％）と、６日目におけるＧＦＰ−細胞の割合（％）とのバランスが求められる。これらの選択基準によれば、ＮＰ１３、ＮＰ１５、ＮＰ０６及びＮＰ１４（黒四角）が、さらなるリガンドターゲティング層形成及び細胞内ターゲティング対細胞内放出効率の最適化のための上位候補のナノ粒子である。図３５Ａでは、「コア粒子」（同じ定義によれば、例えば、リガンドを伴わない、アニオン性及び／又はカチオン性ポリペプチドのみを含む）は、２Ｃ．１．２．１及び２Ｃ．２．１．１における最低性能と同等な取込み効率を達成することが示され、ここで、さまざまなターゲティングリガンドの装飾は、細胞への取込み及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ＲＮＰによる送達を１０倍を超える効率で増大させる（図３０〜５６）。
【図６２Ｗ】図６２Ｗは、３日目における上位性能のＧＦＰのノックダウン粒子と、６日目における上位性能の取込み粒子を示す。注目すべきことに、最高性能のナノ粒子取込み群において、ナノ粒子＋生細胞の比率は３日目と６日目とで同様であり、かつ、ＧＦＰ−細胞は急速なナノ粒子代謝に依拠するようであるのに対して、低度の毒性及び高度の取込み率を示すナノ粒子は低度のペイロード活性を示す。これは、粒子のさまざまな構成要素は細胞に効率的に侵入するが、それらのペイロードを効率的に放出したり、適切なコンパートメントに到達したりせず、また、これらのナノ粒子は、毒性が制限された徐放動態を有しうることを示唆する。ある特定の添加及び製剤化の順序も、強力な静電相互作用のためにｇＲＮＡ−Ｃａｓ９活性を破壊しうる。３日目において、上位性能のＧＦＰノックダウン粒子は、６日目までに、相対ノックダウン効率が低下した。試料Ｅ７、Ｅ４、Ｆ７及びＥ５（黒四角）は、３日目から６日目で遺伝子編集効率が増大し、２Ｃ．１．２．１の研究の全ての製剤の中で編集細胞対ナノ粒子＋細胞の最高比を有した。
【図６２Ｘ】図６２Ｘは、３日目及び６日目におけるナノ粒子＋の生細胞（ナノ粒子を含有する全生細胞の割合（％））を示す。組入れの順序、ＰＤＥ／ＰＬＥ、ＰＬＲ１０、ＰＬＲ５０及び／又はヒストン由来断片の添加並びに４／５構成要素型ナノ粒子のトランスフェクション効率について、さまざまな製剤を示す。Ｅ８のＮＰ１７は、Ｇ８のＮＰ１７のＧ８の５０％用量で高いトランスフェクション効率を達成しており、細胞内トラフィッキングの最適化がナノ粒子＋細胞数を増大させうることを示唆する。ナノ粒子＋生細胞対ＧＦＰ−編集生細胞比（図６２Ｂ〜６２Ｃ）及びＲＮＰのみの送達システムについてのさらなる製剤研究（図１１〜５６）において、グローバルの最大凝縮指数を約１０％下回る製剤が最高の性能を示すことにより証明されているように、凝縮指数、ゼータ電位及びリガンドコーティングのさらなる最適化は、細胞特異性及び細胞内放出効率の改善をもたらす。図３５Ａでは、「コア粒子」（例えば、リガンドを伴わない、アニオン性及び／又はカチオン性ポリペプチドのみを含む）は、２Ｃ．１．２．１及び２Ｃ．２．１．１における最低性能と同等な取込み効率を達成することが示され、ここで、さまざまなターゲティングリガンドの装飾は、細胞への取込み及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ＲＮＰによる送達を１０倍を超える効率で増大させる（図３０〜５６）。複数の比にわたるヒストン由来配列並びにＰＬＥ及び／又はＰＤＥを含む、グローバルの最大凝縮指数を十分に下回るナノ粒子の創出は、細胞内トラフィッキング及び放出能のバランスがよいターゲティングリガンド及びナノ粒子表面化学反応の最適化された合理的選択を可能とする。
【図６２Ｙ】図６２Ｙは、図６２Ｍ〜６２Ｏにおいて黒四角により規定される３日目及び６日目におけるナノ粒子＋の生細胞（ナノ粒子を含有するか、ＧＦＰ−であるか、又はこれらの両者である全生細胞の割合（％））の比較を示す。これらの粒子は、２つの時点を比較した場合、トランスフェクション後にＧＦＰ−生細胞が増大しており、ナノ粒子ペイロードの放出の遅延または延長が示唆される。加えて、ＧＦＰ−生細胞の頻度はトランスフェクション効率と同様であり、効率的な細胞内放出、ナノ粒子＋ＡＦ６４７フルオロフォアの分解及びその後のペイロード活性が示唆される。これらのナノ粒子のコアは、図３０〜５６で示されるようにターゲティングリガンドのさらなる積層のための理想的な鋳型である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
上記にまとめたとおり、複数のペイロードを伴う送達媒体を使用するゲノム編集のための組成物及び方法が提供される。一部の態様では、本発明の方法は送達媒体を細胞に導入することを含み、ここで、送達媒体は、（ａ）ゲノムを切断する１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ（例えば、メガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、Ｉ型又はＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ切断複合体、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質クラス２（ＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチド（例．Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）、Ｃａｓ１３、ＭＡＤ７など））、又は１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼをコードする１つ以上の核酸［本明細書では（ａ）はヌクレアーゼ組成物という］；（ｂ）ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列の挿入がゲノム内の挿入部位において部位特異的リコンビナーゼのための標的配列（例．ａｔｔＰ部位）をもたらす第１のドナーＤＮＡ［本明細書では（ｂ）は標的ドナー組成物という］；（ｃ）部位特異的リコンビナーゼ（例．ΦＣ３１、ΦＣ３１ ＲＤＦ、Ｃｒｅ、ＦＬＰ）（又はこれをコードする核酸）であって、前記標的配列を認識する部位特異的リコンビナーゼ［本明細書では（ｃ）はリコンビナーゼ組成物という］；及び（ｄ）部位特異的リコンビナーゼによる前記標的配列の認識の結果としてゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含む第２のドナーＤＮＡ［本明細書では（ｄ）はインサートドナー組成物という］を含むペイロードを含む。
【００１１】
本発明の方法及び組成物について説明する前に、本発明は、明細書に記載された特定の方法又は組成物に限定されず、もちろん変化してもよいことを理解すべきである。本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるのであり、本明細書で使用される用語は、特定の態様のみを説明することを目的し、限定することを意図しているものではないことも理解されたい。
【００１２】
値の範囲が提示される場合は、その範囲の上限と下限との間の、文脈によりそうでないことが明確に指示されない限りにおいて、下限の単位の１０分の１までの各中間値もまた、具体的に開示されることが理解される。任意の言明された値の間の各小範囲、又は言明された範囲内の中間値、及びこの言明された範囲内の他の任意の言明された値又は中間値が、本発明に包含される。これらの小範囲の上限及び下限は、範囲内に独立に含まれてもよく、範囲から独立に除外されてもよく、一方の限界が小範囲に含まれるか、いずれの限界も小範囲に含まれないか、又は両方の限界が小範囲に含まれる各範囲もまた、本発明内に包含され、言明された範囲内の任意の具体的に除外された限界に従う。言明された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、これらの含まれた限界の一方又は両方を除外する範囲もまた本発明に含まれる。
【００１３】
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者において一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と同様又は同等である任意の方法及び材料が、本発明の実施又は試行において使用されうるが、一部の可能かつ好ましい方法及び材料が、本明細書では記載される。本明細書で言明される全ての刊行物は、それらとの関連で刊行物が引用される方法及び／又は材料について開示及び記載するように、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾が存在する場合、本開示は、組み込まれた刊行物のいかなる開示にも優先されることが理解される。
【００１４】
本明細書を読んだ当業者には明らかなように、本明細書に記載及び例示される個々の態様の各々は、本発明の精神又は範囲から逸脱しない限りにおいて、他のいくつかの態様のうちのいずれかの特色からたやすく分離されてもよく、また、これらとたやすく組み合わされもよい個別の構成要素及び特色を有する。列挙された任意の方法は、列挙された事象の順序で行われる場合もあり、論理的に可能な他の任意の順序で行われる場合もある。
【００１５】
文脈によりそうでないことが明らかに指示されるのでない限り、この明細書及び特許請求の範囲で使用される単数形の「ある（a）」、「ある（an）」及び「その」は、複数の指示対象を含むことに注意されたい。したがって、例えば、「ある細胞」への言及は複数のこのような細胞を含み、「あるエンドヌクレアーゼ」に対する言及は１つ以上のエンドヌクレアーゼ及び当業者に公知のこれらの同等物を含むなどである。特許請求の範囲は、任意の要素、例えば任意の随意的要素を除外するように起草されてもよいことにさらに注意されたい。したがって、この言明は、請求項要素の列挙に関する、例えば、「単に」、「だけ」といった除外的用語法の使用、又は「否定的」限定の使用のための先行詞として用いられるように意図される。
【００１６】
本明細書で引用される刊行物は、本出願の出願日の前におけるそれらの開示のためだけに提示される。本明細書におけるいかなることがらも、本発明がこのような刊行物に先行する権利が与えられていないことの容認とみなされるべきではない。さらに、提示される刊行日は、独立に確認される必要があってもよい実際の刊行日と異なってもよい。
【００１７】
方法及び組成物
効率的なゲノム編集の方法及び組成物が提供される。一部の態様では、本発明の方法は、細胞に、（ａ）ゲノムを切断する１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ（又は１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼをコードする１つ以上の核酸［本明細書ではヌクレアーゼ組成物という］；（ｂ）ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列の挿入がゲノム内の挿入部位において部位特異的リコンビナーゼのための標的配列（標的部位、例．ａｔｔＰ部位）をもたらす第１のドナーＤＮＡ［本明細書では標的ドナー組成物という］；（ｃ）部位特異的リコンビナーゼ（又はこれをコードする核酸）であって、前記標的配列を認識する部位特異的リコンビナーゼ［本明細書ではリコンビナーゼ組成物という］；及び（ｄ）部位特異的リコンビナーゼによる前記標的配列の認識の結果としてゲノムに挿入される目的のヌクレオチド配列を含む第２のドナーＤＮＡ［本明細書ではインサートドナー組成物という］を含むペイロードを伴う送達媒体を導入することを含む。
【００１８】
（ａ）部位特異的ヌクレアーゼ（本明細書では配列特異的ヌクレアーゼともいう）又は（ｂ）部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸は、目的の核酸であってもよく、例えば、送達媒体の核酸ペイロードとして、核酸は、直鎖状の場合もあり、環状の場合もあり、プラスミド、ウイルスゲノム、ＲＮＡなどであってもよい。「核酸」という用語は修飾核酸を包含する。一部の場合、核酸分子は模倣体であってもよく、修飾糖骨格、１つ以上の修飾ヌクレオシド間連結（例．１つ以上のホスホロチオエート連結及び／又はヘテロ原子によるヌクレオシド間連結）、１つ以上の修飾塩基などを含みうる（核酸がタンパク質に転写及び／又は翻訳されうる限りにおいて）。
【００１９】
Ｉ．ヌクレアーゼ組成物（配列特異的ヌクレアーゼ）
本発明のヌクレアーゼ組成物は、１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ（本明細書では部位特異的ヌクレアーゼともいう）又は１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼをコードする１つ以上の核酸を含む。本発明の部位特異的ヌクレアーゼは、ゲノムＤＮＡ内に切断（二本鎖又は一本鎖）を配列特異的に導入しうる部位特異的ヌクレアーゼである。一部の部位特異的ヌクレアーゼは、操作タンパク質（例．亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ））であり、一部の場合、このようなタンパク質は、ニック（一本鎖切断）を生成するのに使用されるか又は平滑若しくは付着末端を生成するタンパク質対として使用される。一部の場合、部位特異的ヌクレアーゼは、平滑二本鎖切断を生成する部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質クラス２（例．Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３など））である。一部の場合、部位特異的ヌクレアーゼは、平滑一本鎖切断を天然で生成する部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質クラス２（例．Ｃａｓ９））であるが、タンパク質がニカーゼ（ＤＮＡの１つの鎖だけを切断する）であるように突然変異を導入されている。ニカーゼタンパク質、例えば突然変異ニカーゼＣａｓ９は、一本鎖切断を生成するか又は標的ＤＮＡの向かい合う鎖をターゲティングする、２つのガイドＲＮＡを使用することにより、付着末端を生成するのに使用されうる。したがって、一部の場合、本発明の方法は、配列特異的ニカーゼ（例えば、ニカーゼであるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質クラス２（例．ニカーゼであるＣａｓ９））を２つのガイドＲＮＡと共に使用し、２つのゲノム部位のうちの（少なくとも）１つにおいて付着型切断を生成することを含む。一部の場合、本発明の方法は、配列特異的ニカーゼ（例えば、ニカーゼであるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質クラス２（例．ニカーゼであるＣａｓ９））を４つのガイドＲＮＡと共に使用し、２つのゲノム部位において２つの付着型切断を生成することを含む。
【００２０】
任意の好都合な部位特異的ヌクレアーゼ（例えば遺伝子編集タンパク質（例．任意の好都合なプログラム型遺伝子編集タンパク質））が使用されうる。適切なプログラム型遺伝子編集タンパク質の例は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｉ型又はＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ポリペプチド（エフェクター）クラス２（例．Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３、ＭＡＤ７など））を含むが、これらに限定されるものではない。使用されうる部位特異的ヌクレアーゼの例は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）；亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）；Ｉ型又はＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ポリペプチド（エフェクタータンパク質）、例えば、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３、ＭＡＤ７など）；メガヌクレアーゼ（例．Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＦｌｍｕＩ、Ｉ−ＦｌｍｕＩＩ、Ｉ−Ａｎｉｌ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＰａｎＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧＺｅＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ＰＩ−ＭｌｅＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｔｌｉ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｌｉ  ＩＩ、ＰＩ−ＳｃｅＶなど）；並びにホーミングエンドヌクレアーゼを含むが、これらに限定されるものではない。部位特異的ヌクレアーゼは、タンパク質として又はタンパク質をコードする核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）として（送達媒体の一部として）細胞に送達されうる。
【００２１】
一部の場合、送達媒体は、遺伝子編集ツール（すなわち、遺伝子編集システム、例えば、部位特異的切断システム（例．プログラム型遺伝子編集システムの構成要素））をコードする核酸を送達するのに使用される。例えば、核酸ペイロードは、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、（ｉｉｉ）プログラム型遺伝子編集タンパク質、例えば、亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）（例．亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ））、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質（例．ヌクレアーゼへと融合させた（ＴＡＬＥＮ））、Ｉ型若しくはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ及び／若しくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ポリペプチド（例．Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３、ＭＡＤ７など）、をコードするＤＮＡ並びに／又はＲＮＡ；（ｉｖ）メガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡ；（ｖ）ホーミングエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡ；並びに（ｉｖ）ドナーＤＮＡ分子（第１及び／又は第２の本発明のドナーＤＮＡ）のうちの１つ以上を含みうる。
【００２２】
一部の場合、本発明の送達媒体は、タンパク質ペイロード、例えばタンパク質、例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、Ｉ型又はＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ及び／又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ポリペプチド（例．Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３、ＭＡＤ７など）、メガヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼを送達するのに使用される。
【００２３】
システムの性質及び所望の帰結に応じて、遺伝子編集システム（例えば、部位特異的遺伝子編集システム、例えば、プログラム型遺伝子編集システム）は、単一の構成要素（例えば、ＺＦＰ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼなど）を含む場合もあり、複数の構成要素を含む場合もある。一部の場合、遺伝子編集システムは、少なくとも２つの構成要素を含む。例えば一部の場合、遺伝子編集システム（例．プログラム型遺伝子編集システム）は、（ｉ）ドナーＤＮＡ分子の核酸；及び（ｉｉ）遺伝子編集タンパク質（例えば、プログラム型遺伝子編集タンパク質、例えば、ＺＦＰ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥ、ＴＡＬＥＮ、ＤＮＡ誘導型ポリペプチド、例えば、高度好塩菌（Natronobacterium gregoryi）のArgonaute（ＮｇＡｇｏ）、Ｉ型又はＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ及び／又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ポリペプチド（例．Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３、ＭＡＤ７など）、又は遺伝子編集タンパク質をコードする核酸分子（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ、例えばプラスミド又はｍＲＮＡ）を含む。別の例として述べると、一部の場合、遺伝子編集システム（例．プログラム型遺伝子編集システム）は、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ又はＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ；及び（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ  ＲＮＡ誘導型ポリペプチド（例．Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３、ＭＡＤ７など）又はＲＮＡ誘導型ポリペプチドをコードする核酸分子（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ、例えばプラスミド又はｍＲＮＡ）を含む。別の例として述べると、一部の場合、遺伝子編集システム（例．プログラム型遺伝子編集システム）は、（ｉ）ＮｇＡｇｏ様ガイドＤＮＡ；及び（ｉｉ）ＤＮＡ誘導型ポリペプチド（例．ＮｇＡｇｏ）又はＤＮＡ誘導型ポリペプチドをコードする核酸分子（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ、例えばプラスミド又はｍＲＮＡ）を含む。一部の場合、遺伝子編集システム（例．プログラム型遺伝子編集システム）は、少なくとも３つの構成要素：（ｉ）ドナーＤＮＡ分子；（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ又はＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ；及び（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ポリペプチド（例．Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、又はＣｐｆ１）又はＲＮＡ誘導型ポリペプチドをコードする核酸分子（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ、例えばプラスミド又はｍＲＮＡ）を含む。一部の場合、遺伝子編集システム（例．プログラム型遺伝子編集システム）は、少なくとも３つの構成要素：（ｉ）ドナーＤＮＡ分子；（ｉｉ）ＮｇＡｇｏ様ガイドＤＮＡ又はＮｇＡｇｏ様ガイドＤＮＡをコードするＤＮＡ；及び（ｉｉｉ）ＤＮＡ誘導型ポリペプチド（例．ＮｇＡｇｏ）又はＤＮＡ誘導型ポリペプチドをコードする核酸分子（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ、例えばプラスミド又はｍＲＮＡ）を含む。
【００２４】
一部の態様では、送達媒体のペイロードは、１つ以上の遺伝子編集ツールを含む。ここでは、「遺伝子編集ツール」という用語は、遺伝子編集システムの１つ以上の構成要素を指すように使用される。したがって、一部の場合、ペイロードは遺伝子編集システムを含み、一部の場合、ペイロードは遺伝子編集システムの１つ以上の構成要素（すなわち、１つ以上の遺伝子編集ツール）を含む。例えば、標的細胞は遺伝子編集システムの構成要素のうちの１つを既に含んでいてもよく、使用者は残りの構成要素だけを必要とする。このような場合には、本発明のナノ粒子のペイロードは、所与の遺伝子編集システムの構成要素の全てを必ずしも含まない。このように、一部の場合、ペイロードは１つ以上の遺伝子編集ツールを含む。
【００２５】
例として述べると、標的細胞は、遺伝子編集タンパク質、例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＤＮＡ誘導型ポリペプチド（例．ＮｇＡｇｏ）、Ｉ型又はＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、及び／又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ポリペプチド、（例えば、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３、ＭＡＤ７など、及び／又はタンパク質をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡを既に含んでいてもよい場合があり、したがって、ペイロードは、（ｉ）ドナーＤＮＡ分子；及び（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、若しくはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ；又はＮｇＡｇｏ様ガイドＤＮＡのうちの１つ以上を含みうる。同様に、標的細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、及び／若しくはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、又はＮｇＡｇｏ様ガイドＤＮＡを既に含んでいてもよく、ペイロードは、（ｉ）ドナーＤＮＡ分子；及び（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ポリペプチド（例．Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３、ＭＡＤ７など）、若しくはＲＮＡ誘導型ポリペプチドをコードする核酸分子（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ、例えばプラスミド又はｍＲＮＡ）；又はＤＮＡ誘導型ポリペプチド（例．ＮｇＡｇｏ）、若しくはＤＮＡ誘導型ポリペプチドをコードする核酸分子のうちの１つ以上を含みうる。
【００２６】
プログラム型遺伝子編集ツール（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型タンパク質、例えば、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）、及びＣａｓ１３、亜鉛フィンガータンパク質、例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥタンパク質、例えば、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡなど）に関するさらなる情報については、例えば、Dreier, et al., (2001) J Biol Chem 276:29466-78；Dreier, et al., (2000) J Mol Biol 303:489-502；Liu, et al., (2002) J Biol Chem 277:3850-6)；Dreier, et al., (2005) J Biol Chem 280:35588-97；Jamieson, et al., (2003) Nature Rev Drug Discov 2:361-8；Durai, et al., (2005) Nucleic Acids Res 33:5978-90；Segal, (2002) Methods 26:76-83；Porteus and Carroll, (2005) Nat Biotechnol 23:967-73；Pabo, et al., (2001) Ann Rev Biochem 70:313-40；Wolfe, et al., (2000) Ann Rev Biophys Biomol Struct 29:183-212；Segal and Barbas, (2001) Curr Opin Biotechnol 12:632-7；Segal, et al., (2003) Biochemistry 42:2137-48；Beerli and Barbas, (2002) Nat Biotechnol 20:135-41；Carroll, et al., (2006) Nature Protocols 1:1329；Ordiz, et al., (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:13290-5；Guan, et al., (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:13296-301；Sanjana et al., Nature Protocols, 7:171-192 (2012)；Zetsche et al, Cell. 2015 Oct 22;163(3):759-71；Makarova et al, Nat Rev Microbiol. 2015 Nov;13(11):722-36；Shmakov et al., Mol Cell. 2015 Nov 5;60(3):385-97；Jinek et al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21；Chylinski et al., RNA Biol. 2013 May;10(5):726-37；Ma et al., Biomed Res Int. 2013;2013:270805；Hou et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24;110(39):15644-9；Jinek et al., Elife. 2013;2:e00471；Pattanayak et al., Nat Biotechnol. 2013 Sep;31(9):839-43；Qi et al, Cell. 2013 Feb 28;152(5):1173-83；Wang et al., Cell. 2013 May 9;153(4):910-8；Auer et. al., Genome Res. 2013 Oct 31；Chen et. al., Nucleic Acids Res. 2013 Nov 1;41(20):e19；Cheng et. al., Cell Res. 2013 Oct;23(10):1163-71；Cho et. al., Genetics. 2013 Nov;195(3):1177-80；DiCarlo et al., Nucleic Acids Res. 2013 Apr;41(7):4336-43；Dickinson et. al., Nat Methods. 2013 Oct;10(10):1028-34；Ebina et. al., Sci Rep. 2013;3:2510；Fujii et. al, Nucleic Acids Res. 2013 Nov 1;41(20):e187；Hu et. al., Cell Res. 2013 Nov;23(11):1322-5；Jiang et. al., Nucleic Acids Res. 2013 Nov 1;41(20):e188；Larson et. al., Nat Protoc. 2013 Nov;8(11):2180-96；Mali et. at., Nat Methods. 2013 Oct;10(10):957-63；Nakayama et. al., Genesis. 2013 Dec;51(12):835-43；Ran et. al., Nat Protoc. 2013 Nov;8(11):2281-308；Ran et. al., Cell. 2013 Sep 12;154(6):1380-9；Upadhyay et. al., G3 (Bethesda). 2013 Dec 9;3(12):2233-8；Walsh et. al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24;110(39):15514-5；Xie et. al., Mol Plant. 2013 Oct 9；Yang et. al., Cell. 2013 Sep 12;154(6):1370-9；Briner et al., Mol Cell. 2014 Oct 23;56(2):333-9；Burstein et al., Nature. 2016 Dec 22 - Epub ahead of print；Gao et al., Nat Biotechnol. 2016 Jul 34(7):768-73及びShmakov et al., Nat Rev Microbiol. 2017 Mar;15(3):169-182；並びに国際特許出願WO2002099084；WO00/42219；WO02/42459；WO2003062455；WO03/080809；WO05/014791；WO05/084190；WO08/021207；WO09/042186；WO09/054985及びWO10/065123；米国特許出願公開番号、20030059767；20030108880；20140068797；20140170753；20140179006；20140179770；20140186843；20140186919；20140186958；20140189896；20140227787；20140234972；20140242664；20140242699；20140242700；20140242702；20140248702；20140256046；20140273037；20140273226；20140273230；20140273231；20140273232；20140273233；20140273234；20140273235；20140287938；20140295556；20140295557；20140298547；20140304853；20140309487；20140310828；20140310830；20140315985；20140335063；20140335620；20140342456；20140342457；20140342458；20140349400；20140349405；20140356867；20140356956；20140356958；20140356959；20140357523；20140357530；20140364333；20140377868���20150166983及び20160208243；並びに米国特許番号、6,140,466；6,511,808；6,453,242；8,685,737；8,906,616；8,895,308；8,889,418；8,889,356；8,871,445；8,865,406；8,795,965；8,771,945及び8,697,359を参照されたい；これらの全ては、参照によりそれらの全体において、ここに組み込まれる。
【００２７】
ＩＩ．標的ドナー組成物（第１のドナーＤＮＡ）
本発明の標的ドナー組成物は第１のドナーＤＮＡを含む。第１のドナーＤＮＡは、直鎖状の場合もあり、環状の場合もあり、任意の、好都合なフォーマット（例えば、プラスミド、ミニサークル、直鎖状など）でありうる。標的ドナー組成物のドナーＤＮＡは、ゲノムに挿入され、次いで、部位特異的リコンビナーゼにより認識（及び利用）される、１つ以上の標的配列（標的部位）を含みうる。一部の場合、標的ドナー組成物のドナーＤＮＡは、標的部位を含まないが、ドナーＤＮＡの挿入は、ゲノム内に存在する、このような標的部位（例えば、標的部位が、例えば一部の場合、ドナー及びゲノムが、粘着末端を有する、ドナーのインサート配列と、ゲノムとの接合部において生成されうる）をもたらす。
【００２８】
標的ドナー組成物のドナーＤＮＡ（第１のドナーＤＮＡ）は、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もある。
【００２９】
一部の場合、第２のドナーＤＮＡ（インサートドナー組成物のドナーＤＮＡ）の塩基対は、１０（ｂｐ）以上（例えば、２０ｂｐ以上、３０ｂｐ以上、５０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、２００ｂｐ以上、５００ｂｐ以上、１，０００ｂｐ以上、５，０００ｂｐ以上、１０，０００ｂｐ以上、５０，０００ｂｐ以上又は７５，０００ｂｐ以上）である（合計これらの塩基対を有する）。言い換えれば、一部の場合、本発明のドナーＤＮＡは、１０ｂｐ以上（例えば、２０ｂｐ以上、３０ｂｐ以上、５０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、２００ｂｐ以上、５００ｂｐ以上、１，０００ｂｐ以上、５，０００ｂｐ以上、１０，０００ｂｐ以上、５０，０００ｂｐ以上、又は７５，０００ｂｐ以上）を有する。
【００３０】
一部の場合、本発明の第２のドナーＤＮＡ（インサートドナー組成物のドナーＤＮＡ）の塩基対（ｂｐ）は、合計１０ｂｐ〜１５０キロ塩基対（ｋｂｐ）［一本鎖の場合は、「ｂｐ」ではなく、ヌクレオチド（ｎｔ）単位で］（例えば、１０ｂｐ〜１００ｋｂｐ、７０ｋｂｐ、１０ｂｐ〜５０ｋｂｐ、１０ｂｐ〜４０ｋｂｐ、１０ｂｐ〜２５ｋｂｐ、１０ｂｐ〜１５ｋｂｐ、１０ｂｐ〜１０ｋｂｐ、１０ｂｐ〜１ｋｂｐ、１０ｂｐ〜７５０ｂｐ、１０ｂｐ〜５００ｂｐ、１０ｂｐ〜２５０ｂｐ、１０ｂｐ〜１５０ｂｐ、１０ｂｐ〜１００ｂｐ、１０ｂｐ〜５０ｂｐ、１８ｂｐ〜１５０ｋｂｐ、１８ｂｐ〜１００ｋｂｐ、１８ｂｐ〜７０ｋｂｐ、１８ｂｐ〜５０ｋｂｐ、１８ｂｐ〜４０ｋｂｐ、１８ｂｐ〜２５ｋｂｐ、１８ｂｐ〜１５ｋｂｐ、１８ｂｐ〜１０ｋｂｐ、１８ｂｐ〜１ｋｂｐ、１８ｂｐ〜７５０ｂｐ、１８ｂｐ〜５００ｂｐ、１８ｂｐ〜２５０ｂｐ、１８ｂｐ〜１５０ｂｐ、２５ｂｐ〜１５０ｋｂｐ、２５ｂｐ〜１００ｋｂｐ、２５ｂｐ〜７０ｋｂｐ、２５ｂｐ〜５０ｋｂｐ、２５ｂｐ〜４０ｋｂｐ、２５ｂｐ〜２５ｋｂｐ、２５ｂｐ〜１５ｋｂｐ、２５ｂｐ〜１０ｋｂｐ、２５ｂｐ〜１ｋｂｐ、２５ｂｐ〜７５０ｂｐ、２５ｂｐ〜５００ｂｐ、２５ｂｐ〜２５０ｂｐ、２５ｂｐ〜１５０ｂｐ、５０ｂｐ〜１５０ｋｂｐ、５０ｂｐ〜１００ｋｂｐ、５０ｂｐ〜７０ｋｂｐ、５０ｂｐ〜５０ｋｂｐ、５０ｂｐ〜４０ｋｂｐ、５０ｂｐ〜２５ｋｂｐ、５０ｂｐ〜１５ｋｂｐ、５０ｂｐ〜１０ｋｂｐ、５０ｂｐ〜１ｋｂｐ、５０ｂｐ〜７５０ｂｐ、５０ｂｐ〜５００ｂｐ、５０ｂｐ〜２５０ｂｐ、５０ｂｐ〜１５０ｂｐ、１００ｂｐ〜１５０ｋｂｐ、１００ｂｐ〜１００ｋｂｐ、１００ｂｐ〜７０ｋｂｐ、１００ｂｐ〜５０ｋｂｐ、１００ｂｐ〜４０ｋｂｐ、１００ｂｐ〜２５ｋｂｐ、１００ｂｐ〜１５ｋｂｐ、１００ｂｐ〜１０ｋｂｐ、１００ｂｐ〜１ｋｂｐ、１００ｂｐ〜７５０ｂｐ、１００ｂｐ〜５００ｂｐ、１００ｂｐ〜２５０ｂｐ、２００ｂｐ〜１５０ｋｂｐ、２００ｂｐ〜１００ｋｂｐ、２００ｂｐ〜７０ｋｂｐ、２００ｂｐ〜５０ｋｂｐ、２００ｂｐ〜４０ｋｂｐ、２００ｂｐ〜２５ｋｂｐ、２００ｂｐ〜１５ｋｂｐ、２００ｂｐ〜１０ｋｂｐ、２００ｂｐ〜１ｋｂｐ、２００ｂｐ〜７５０ｂｐ、２００ｂｐ〜５００ｂｐ、１０ｋｂｐ〜１５０ｋｂｐ、１０ｋｂｐ〜１００ｋｂｐ、１０ｋｂｐ〜７０ｋｂｐ、１０ｋｂｐ〜５０ｋｂｐ、１０ｋｂｐ〜４０ｋｂｐ、１０ｋｂｐ〜２５ｋｂｐ、５０ｋｂｐ〜１５０ｋｂｐ、５０ｋｂｐ〜１００ｋｂｐ、５０ｋｂｐ〜７０ｋｂｐ、７０ｋｂｐ〜１５０ｋｂｐ又は７０ｋｂｐ〜１００ｋｂｐ）である（これらの長さを有する）。一部の場合、本発明の第１のドナーＤＮＡ（標的ドナー組成物のドナーＤＮＡ）は、合計１０ｂｐ〜５０ｋｂｐを有する。一部の場合、本発明の第１のドナーＤＮＡ（標的ドナー組成物のドナーＤＮＡ）は、合計１０ｂｐ〜１０ｋｂｐを有する。一部の場合、本発明の第１のドナーＤＮＡ（標的ドナー組成物のドナーＤＮＡ）は、合計５０ｋｂｐ〜１００ｋｂｐを有する。一部の場合、本発明の第１のドナーＤＮＡ（標的ドナー組成物のドナーＤＮＡ）は、合計１０ｂｐ〜１０ｋｂｐを有する。一部の場合、本発明の第１のドナーＤＮＡ（標的ドナー組成物のドナーＤＮＡ）は、合計１０ｂｐ〜１ｋｂｐを有する。一部の場合、本発明の第１のドナーＤＮＡ（標的ドナー組成物のドナーＤＮＡ）は、合計２０ｂｐ〜５０ｋｂｐを有する。一部の場合、本発明の第１のドナーＤＮＡ（標的ドナー組成物のドナーＤＮＡ）は、合計２０ｂｐ〜１０ｋｂｐを有する。一部の場合、本発明の第１のドナーＤＮＡ（標的ドナー組成物のドナーＤＮＡ）は、合計２０ｂｐ〜１ｋｂｐを有する。
【００３１】
一部の場合、ドナーＤＮＡは、模倣体、修飾糖骨格、非天然ヌクレオシド間連結（例えば１つ以上のホスホロチオエート及び／又はヘテロ原子ヌクレオシド間連結）、修飾塩基などのうちの１つ以上を含む。
【００３２】
ゲノムに挿入される標的ドナー組成物のドナーＤＮＡ（第１のドナーＤＮＡ）のヌクレオチド配列は、任意の好都合な長さを有しうる。例えば一部の場合、配列は、１０塩基対（ｂｐ）以上（例．２０ｂｐ以上、３０ｂｐ以上、５０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、２００ｂｐ以上、５００ｂｐ以上、１，０００ｂｐ以上、５，０００ｂｐ以上、１０，０００ｂｐ以上、５０，０００ｂｐ以上又は７５，０００ｂｐ以上）の長さである（合計これらの塩基対を有する）。言い換えれば、一部の場合、ゲノムに挿入される標的ドナー組成物のドナーＤＮＡ（第１のドナーＤＮＡ）のヌクレオチド配列の長さは、１０ｂｐ以上（例．２０ｂｐ以上、３０ｂｐ以上、５０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、２００ｂｐ以上、５００ｂｐ以上、１，０００ｂｐ以上、５，０００ｂｐ以上、１０，０００ｂｐ以上、５０，０００ｂｐ以上又は７５，０００ｂｐ以上）である。
【００３３】
一部の場合、ゲノムに挿入される標的ドナー組成物のドナーＤＮＡ（第１のドナーＤＮＡ）のヌクレオチド配列は、合計１０塩基対（ｂｐ）〜１５０キロ塩基対（ｋｂｐ）［一本鎖の場合は、「ｂｐ」ではなく、ヌクレオチド（ｎｔ）単位で］（例えば、１０ｂｐ〜１００ｋｂｐ、７０ｋｂｐ、１０ｂｐ〜５０ｋｂｐ、１０ｂｐ〜４０ｋｂｐ、１０ｂｐ〜２５ｋｂｐ、１０ｂｐ〜１５ｋｂｐ、１０ｂｐ〜１０ｋｂｐ、１０ｂｐ〜１ｋｂｐ、１０ｂｐ〜７５０ｂｐ、１０ｂｐ〜５００ｂｐ、１０ｂｐ〜２５０ｂｐ、１０ｂｐ〜１５０ｂｐ、１０ｂｐ〜１００ｂｐ、１０ｂｐ〜５０ｂｐ、１８ｂｐ〜１５０ｋｂｐ、１８ｂｐ〜１００ｋｂｐ、１８ｂｐ〜７０ｋｂｐ、１８ｂｐ〜５０ｋｂｐ、１８ｂｐ〜４０ｋｂｐ、１８ｂｐ〜２５ｋｂｐ、１８ｂｐ〜１５ｋｂｐ、１８ｂｐ〜１０ｋｂｐ、１８ｂｐ〜１ｋｂｐ、１８ｂｐ〜７５０ｂｐ、１８ｂｐ〜５００ｂｐ、１８ｂｐ〜２５０ｂｐ、１８ｂｐ〜１５０ｂｐ、２５ｂｐ〜１５０ｋｂｐ、２５ｂｐ〜１００ｋｂｐ、２５ｂｐ〜７０ｋｂｐ、２５ｂｐ〜５０ｋｂｐ、２５ｂｐ〜４０ｋｂｐ、２５ｂｐ〜２５ｋｂｐ、２５ｂｐ〜１５ｋｂｐ、２５ｂｐ〜１０ｋｂｐ、２５ｂｐ〜１ｋｂｐ、２５ｂｐ〜７５０ｂｐ、２５ｂｐ〜５００ｂｐ、２５ｂｐ〜２５０ｂｐ、２５ｂｐ〜１５０ｂｐ、５０ｂｐ〜１５０ｋｂｐ、５０ｂｐ〜１００ｋｂｐ、５０ｂｐ〜７０ｋｂｐ、５０ｂｐ〜５０ｋｂｐ、５０ｂｐ〜４０ｋｂｐ、５０ｂｐ〜２５ｋｂｐ、５０ｂｐ〜１５ｋｂｐ、５０ｂｐ〜１０ｋｂｐ、５０ｂｐ〜１ｋｂｐ、５０ｂｐ〜７５０ｂｐ、５０ｂｐ〜５００ｂｐ、５０ｂｐ〜２５０ｂｐ、５０ｂｐ〜１５０ｂｐ、１００ｂｐ〜１５０ｋｂｐ、１００ｂｐ〜１００ｋｂｐ、１００ｂｐ〜７０ｋｂｐ、１００ｂｐ〜５０ｋｂｐ、１００ｂｐ〜４０ｋｂｐ、１００ｂｐ〜２５ｋｂｐ、１００ｂｐ〜１５ｋｂｐ、１００ｂｐ〜１０ｋｂｐ、１００ｂｐ〜１ｋｂｐ、１００ｂｐ〜７５０ｂｐ、１００ｂｐ〜５００ｂｐ、１００ｂｐ〜２５０ｂｐ、２００ｂｐ〜１５０ｋｂｐ、２００ｂｐ〜１００ｋｂｐ、２００ｂｐ〜７０ｋｂｐ、２００ｂｐ〜５０ｋｂｐ、２００ｂｐ〜４０ｋｂｐ、２００ｂｐ〜２５ｋｂｐ、２００ｂｐ〜１５ｋｂｐ、２００ｂｐ〜１０ｋｂｐ、２００ｂｐ〜１ｋｂｐ、２００ｂｐ〜７５０ｂｐ、２００ｂｐ〜５００ｂｐ、１０ｋｂｐ〜１５０ｋｂｐ、１０ｋｂｐ〜１００ｋｂｐ、１０ｋｂｐ〜７０ｋｂｐ、１０ｋｂｐ〜５０ｋｂｐ、１０ｋｂｐ〜４０ｋｂｐ、１０ｋｂｐ〜２５ｋｂｐ、５０ｋｂｐ〜１５０ｋｂｐ、５０ｋｂｐ〜１００ｋｂｐ、５０ｋｂｐ〜７０ｋｂｐ、７０ｋｂｐ〜１５０ｋｂｐ又は７０ｋｂｐ〜１００ｋｂｐ）である（これらの長さを有する）。一部の場合、ゲノムに挿入される標的ドナー組成物のドナーＤＮＡ（第１のドナーＤＮＡ）のヌクレオチド配列の長さは、合計１０ｂｐ〜５０ｋｂｐである。一部の場合、ゲノムに挿入される標的ドナー組成物のドナーＤＮＡ（第１のドナーＤＮＡ）のヌクレオチド配列の長さは、合計１０ｂｐ〜１０ｋｂｐである。一部の場合、ゲノムに挿入される標的ドナー組成物のドナーＤＮＡ（第１のドナーＤＮＡ）のヌクレオチド配列の長さは、合計５０ｋｂｐ〜１００ｋｂｐである。一部の場合、ゲノムに挿入される標的ドナー組成物のドナーＤＮＡ（第１のドナーＤＮＡ）のヌクレオチド配列の長さは、合計１０ｂｐ〜１０ｋｂｐである。一部の場合、ゲノムに挿入される標的ドナー組成物のドナーＤＮＡ（第１のドナーＤＮＡ）のヌクレオチド配列の長さは、合計１０ｂｐ〜１ｋｂｐである。一部の場合、ゲノムに挿入される標的ドナー組成物のドナーＤＮＡ（第１のドナーＤＮＡ）のヌクレオチド配列の長さは、合計２０ｂｐ〜５０ｋｂｐである。一部の場合、ゲノムに挿入される標的ドナー組成物のドナーＤＮＡ（第１のドナーＤＮＡ）のヌクレオチド配列は、合計２０ｂｐ〜１０ｋｂｐである。一部の場合、ゲノムに挿入される標的ドナー組成物のドナーＤＮＡ（第１のドナーＤＮＡ）のヌクレオチド配列の長さは、合計２０ｂｐ〜１０ｋｂｐである。
【００３４】
一部の態様では、２つの標的部位は、ゲノムに挿入される（以下により詳細に説明する、第２のドナーＤＮＡ（インサートドナー組成物）からの、単一の目的のヌクレオチド配列の挿入に対応するために）。言い換えれば、一部の態様では、標的ドナー組成物の、第１のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列の挿入は、ゲノム内の第１の部位において部位特異的リコンビナーゼのための第１の標的配列をもたらし、ゲノム内の第２の部位において部位特異的リコンビナーゼのための第２の標的配列をもたらし、これは、任意の好都合な手法を使用して達せられうる。例えば一部の場合、２つの標的部位は同じ第１のドナーＤＮＡ上に存在しうる。一部の場合、２つの標的部位の各々は、ゲノム内の別個の第１のドナーＤＮＡへと挿入され、したがって、一部の場合、本発明の送達媒体のペイロードは、２つの異なる第１のドナーＤＮＡを含みうる（例えば一部の場合、これは、例えば、２つの異なる部位特異的ヌクレアーゼ又はヌクレアーゼ組成物の一部として含まれうる少なくとも２つの異なるガイドＲＮＡを伴う単一のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質を使用する２つ異なる部位におけるゲノムの切断を要求するであろう）。
【００３５】
２つの標的部位が、ゲノムに作製／挿入（例えば、１つ又は２つの第１のドナーＤＮＡ及び１つ以上の部位特異的ヌクレアーゼ（又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質を有する１つ以上のガイドＲＮＡ）を使用して）された後の２つの標的部位の間隔は、１，０００，０００塩基対（ｂｐ）以下（例えば、５００，０００ｂｐ以下、１００，０００ｂｐ以下、５０，０００ｂｐ以下、１０，０００ｂｐ以下、１，０００ｂｐ以下、７５０ｂｐ以下、又は５００ｂｐ以下）であってもよい。一部の場合、２つの標的部位の間隔は１００，０００ｂｐ以下である。一部の場合、２つの部位の間隔は５０，０００ｂｐ以下である。一部の態様では、２つの標的部位の間隔は、５〜１，０００，０００塩基対（ｂｐ）（例えば、５〜５００，０００、５〜１００，０００、５〜５０，０００、５〜１０，０００、５〜５，０００、５〜１，０００、５〜５００、１０〜１，０００，０００、１０〜５００，０００、１０〜１００，０００、１０〜５０，０００、１０〜１０，０００、１０〜５，０００、１０〜１，０００、１０〜５００、５０〜１，０００，０００、５０〜５００，０００、５０〜１００，０００、５０〜５０，０００、５０〜１０，０００、５０〜５，０００、５０〜１，０００、５０〜５００、１００〜１，０００，０００、１００〜５００，０００、１００〜１００，０００、１００〜５０，０００、１００〜１０，０００、１００〜５，０００、１００〜１，０００、１００〜５００、３００〜１，０００，０００、３００〜５００，０００、３００〜１００，０００、３００〜５０，０００、３００〜１０，０００、３００〜５，０００、３００〜１，０００、３００〜５００、５００〜１，０００，０００、５００〜５００，０００、５００〜１００，０００、５００〜５０，０００、５００〜１０，０００、５００〜５，０００、５００〜１，０００、１，０００〜１，０００，０００、１，０００〜５００，０００、１，０００〜１００，０００、１，０００〜５０，０００、１，０００〜１０，０００、又は１，０００〜５，０００ｂｐ）である。
【００３６】
一部の場合、２つの標的部位の間隔は２０〜１，０００，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は２０〜５００，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は２０〜１５０，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は２０〜５０，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は２０〜２０，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は２０〜１５，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は２０〜１０，０００ｂｐである。
【００３７】
一部の場合、２つの標的部位の間隔は５００〜１，０００，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は５００〜５００，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は５００〜１５０，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は５００〜５０，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は５００〜２０，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は５００〜１５，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は５００〜１０，０００ｂｐである。
【００３８】
一部の場合、２つの標的部位の間隔は１，０００〜１，０００，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は１，０００〜５００，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は１，０００〜１５０，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は１，０００〜５０，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は１，０００〜２０，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は１，０００〜１５，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は１，０００〜１０，０００ｂｐである。
【００３９】
一部の場合、２つの標的部位の間隔は５，０００〜１，０００，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は５，０００〜５００，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は５，０００〜１５０，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は５，０００〜５０，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は５，０００〜２０，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は５，０００〜１５，０００ｂｐである。一部の場合、２つの標的部位の間隔は５，０００〜１０，０００ｂｐである。
【００４０】
第１のドナーＤＮＡが二本鎖である場合、ドナーＤＮＡの各末端は、独立して、５’又は３’の一本鎖突出を有する場合もあり、平滑末端の場合もある。例えば一部の場合、ドナーＤＮＡの両方の末端は５’突出を有する。一部の場合、ドナーＤＮＡの両方の末端は３’突出を有する。一部の場合、ドナーＤＮＡの１つの末端は５’突出を有するが、他の末端は３’突出を有する。各突出は、任意の好都合な長さでありうる。一部の場合、各突出の長さは、独立に、２〜２００ヌクレオチド（ｎｔ）の長さ（例えば、２〜１５０、２〜１００、２〜５０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１２、２〜１０、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、３〜１５０、３〜１００、３〜５０、３〜２５、３〜２０、３〜１５、３〜１２、３〜１０、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、４〜１５０、４〜１００、４〜５０、４〜２５、４〜２０、４〜１５、４〜１２、４〜１０、４〜８、４〜７、４〜６、５〜１５０、５〜１００、５〜５０、５〜２５、５〜２０、５〜１５、５〜１２、５〜１０、５〜８、又は５〜７ヌクレオチドを参照されたい）でありうる。一部の場合、各突出の長さは、独立に、２〜２０ヌクレオチドの長さでありうる。一部の場合、各突出の長さは、独立に、２〜１５ヌクレオチドの長さでありうる。一部の場合、各突出の長さは、独立に、２〜１０ヌクレオチドの長さでありうる。一部の場合、各突出の長さは、独立に、２〜７ヌクレオチドの長さでありうる。
【００４１】
一部の態様では、ドナーＤＮＡは少なくとも１つのアデニル化３’末端を有する。
【００４２】
任意の好都合な標的部位が使用されうる（例えばこれは、ゲノムに挿入される第１のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列内に含まれうる）。一部の場合、標的部位は、１５ｂｐ（又はｎｔ）（例えば、１８ｂｐ以上、２０ｂｐ以上、２５ｂｐ以上又は３０ｂｐ以上）の長さである。一部の場合、標的部位は、１５〜５０ｂｐ（又はｎｔ）（例えば、１５〜４５、１５〜４０、１５〜３５、１８〜５０、１８〜４５、１８〜４０、１８〜３５、２０〜５０、２０〜４５、２０〜４０、２０〜３５、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、３０〜５０、３０〜４５、３０〜４０、３０〜３５）の長さである。標的部位の例は、ＬｏｘＰ（Ｃｒｅが認識）、ＬｏｘＰ２７２２（Ｃｒｅが認識）、ａｔｔ［例．ａｔｔＢ（ΦＣ３１）、ａｔｔＰ（ΦＣ３１）、ａｔｔＬ（ΦＣ３１ ＲＤＦ）、ａｔｔＲ（ΦＣ３１ ＲＤＦ）、ＲＳ（Ｒは認識）、ｇｉｘ（Ｇｉｎが認識）］を含むがこれらに限定されず、例えば、米国特許第9,902,970号；第9,783,822号；第9,233,174号；第8,546,135号；第8,399,254号；第8,058,506号；第7,670,823号及び第5,888,732号を参照されたい；これらの全ては、標的部位及び／又は対応する部位特異的リコンビナーゼに関するそれらの教示について、参照によりここに組み込まれる。
【００４３】
ＩＩＩ．リコンビナーゼ組成物（部位特異的リコンビナーゼ）
本発明のリコンビナーゼ組成物は、１つ以上の配列特異的リコンビナーゼ（本明細書では部位特異的リコンビナーゼアーゼともいう）、又は１つ以上の配列特異的リコンビナーゼをコードする１つ以上の核酸を含む。本発明の部位特異的リコンビナーゼは、（第１のドナーＤＮＡからの配列の挿入の後の）ゲノムの１つ以上の標的部位（上記を参照）、及び、第２のドナーＤＮＡ（インサートドナー組成物のドナーＤＮＡ）の１つ以上の標的部位を認識することが可能で、かつ、第２のドナーＤＮＡからの目的の配列のゲノムへの挿入を触媒する、部位特異的リコンビナーゼである。当技術分野ではいくつかの部位特異的リコンビナーゼが公知で、任意の好都合な部位特異的リコンビナーゼが使用されうる。部位特異的リコンビナーゼの例には、ΦＣ３１、ΦＣ３１ ＲＤＦ、Ｃｒｅ及びＦＬＰが含まれるが、これらに限定されるものではない。加えて、代表的な部位特異的リコンビナーゼは、ΦＣ３１、Ｒ４、ＴＰ９０１−１、ΦＢＴ１、Ｂｘｂ１、ＲＶ−１、ＡＡ１１８、Ｕ１５３、及びΦＦＣ１のインテグラーゼを含みうるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
ＩＶ．インサートドナー組成物（第２のドナーＤＮＡ）
本発明のインサートドナー組成物は第２のドナーＤＮＡを含む。第２のドナーＤＮＡは、直鎖状の場合もあり、環状の場合もあり、任意の好都合なフォーマット（例えば、プラスミド、ミニサークル、直鎖状など）でありうる。インサートドナー組成物のドナーＤＮＡは、部位特異的リコンビナーゼによりゲノムに挿入される目的のヌクレオチド配列を含む。インサートドナー組成物のドナーＤＮＡは、部位特異的リコンビナーゼが第１のドナーＤＮＡ（標的ドナー組成物の）の配列の挿入時に作製された標的部位を使用して配列の挿入を触媒しうる限りにおいて一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もある。このように、第２のドナーＤＮＡは、目的の配列のゲノムへの挿入を容易とするために、通常、部位特異的リコンビナーゼが認識する１つ以上の標的部位（例えば、第１のドナーＤＮＡに関して、上述した標的部位を参照されたい）を含むであろう。当業者に知られているように、一部の場合、第２のドナーＤＮＡの挿入により、残留配列がゲノム内に残る可能性がある。例えば、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ標的部位が使用される場合、挿入が完了した後で、ａｔｔＬ及び／又はａｔｔＲ配列がゲノム内に残りうる。
【００４５】
一部の場合、第２のドナーＤＮＡ（インサートドナー組成物のドナーＤＮＡ）は、１つの標的部位を含む。一部の場合、第２のドナーＤＮＡ（インサートドナー組成物のドナーＤＮＡ）は、１つ以上の標的部位（例えば、２つ以上の標的部位）を含む。一部の場合、第２のドナーＤＮＡ（インサートドナー組成物のドナーＤＮＡ）は、２つの標的部位を含む。一部の場合、目的のヌクレオチド配列（ゲノムに挿入される配列）は、２つの標的部位により挟まれる（かつ、一部の場合、２つの標的部位は同じである、すなわち、目的のヌクレオチド配列は同じ標的部位の２つのコピーにより挟まれる）。
【００４６】
一部の場合、第２のドナーＤＮＡ（インサートドナー組成物のドナーＤＮＡ）は、１０塩基対（ｂｐ）以上（例えば、２０ｂｐ以上、３０ｂｐ以上、５０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、２００ｂｐ以上、５００ｂｐ以上、１，０００ｂｐ以上、５，０００ｂｐ以上、１０，０００ｂｐ以上、５０，０００ｂｐ以上又は７５，０００ｂｐ以上）の長さである（合計これらの塩基対を有する）。言い換えれば、一部の場合、本発明のドナーＤＮＡは、１０ｂｐ以上（例えば、２０ｂｐ以上、３０ｂｐ以上、５０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、２００ｂｐ以上、５００ｂｐ以上、１，０００ｂｐ以上、５，０００ｂｐ以上、１０，０００ｂｐ以上、５０，０００ｂｐ以上又は７５，０００ｂｐ以上）を有する。
【００４７】
一部の場合、本発明の第２のドナーＤＮＡ（インサートドナー組成物のドナーＤＮＡ）は、合計１０塩基対（ｂｐ）〜１５０キロ塩基対（ｋｂｐ）［一本鎖の場合は、「ｂｐ」ではなく、ヌクレオチド（ｎｔ）単位で］（例えば、１０ｂｐ〜１００ｋｂｐ、７０ｋｂｐ、１０ｂｐ〜５０ｋｂｐ、１０ｂｐ〜４０ｋｂｐ、１０ｂｐ〜２５ｋｂｐ、１０ｂｐ〜１５ｋｂｐ、１０ｂｐ〜１０ｋｂｐ、１０ｂｐ〜１ｋｂｐ、１０ｂｐ〜７５０ｂｐ、１０ｂｐ〜５００ｂｐ、１０ｂｐ〜２５０ｂｐ、１０ｂｐ〜１５０ｂｐ、１０ｂｐ〜１００ｂｐ、１０ｂｐ〜５０ｂｐ、１８ｂｐ〜１５０ｋｂｐ、１８ｂｐ〜１００ｋｂｐ、１８ｂｐ〜７０ｋｂｐ、１８ｂｐ〜５０ｋｂｐ、１８ｂｐ〜４０ｋｂｐ、１８ｂｐ〜２５ｋｂｐ、１８ｂｐ〜１５ｋｂｐ、１８ｂｐ〜１０ｋｂｐ、１８ｂｐ〜１ｋｂｐ、１８ｂｐ〜７５０ｂｐ、１８ｂｐ〜５００ｂｐ、１８ｂｐ〜２５０ｂｐ、１８ｂｐ〜１５０ｂｐ、２５ｂｐ〜１５０ｋｂｐ、２５ｂｐ〜１００ｋｂｐ、２５ｂｐ〜７０ｋｂｐ、２５ｂｐ〜５０ｋｂｐ、２５ｂｐ〜４０ｋｂｐ、２５ｂｐ〜２５ｋｂｐ、２５ｂｐ〜１５ｋｂｐ、２５ｂｐ〜１０ｋｂｐ、２５ｂｐ〜１ｋｂｐ、２５ｂｐ〜７５０ｂｐ、２５ｂｐ〜５００ｂｐ、２５ｂｐ〜２５０ｂｐ、２５ｂｐ〜１５０ｂｐ、５０ｂｐ〜１５０ｋｂｐ、５０ｂｐ〜１００ｋｂｐ、５０ｂｐ〜７０ｋｂｐ、５０ｂｐ〜５０ｋｂｐ、５０ｂｐ〜４０ｋｂｐ、５０ｂｐ〜２５ｋｂｐ、５０ｂｐ〜１５ｋｂｐ、５０ｂｐ〜１０ｋｂｐ、５０ｂｐ〜１ｋｂｐ、５０ｂｐ〜７５０ｂｐ、５０ｂｐ〜５００ｂｐ、５０ｂｐ〜２５０ｂｐ、５０ｂｐ〜１５０ｂｐ、１００ｂｐ〜１５０ｋｂｐ、１００ｂｐ〜１００ｋｂｐ、１００ｂｐ〜７０ｋｂｐ、１００ｂｐ〜５０ｋｂｐ、１００ｂｐ〜４０ｋｂｐ、１００ｂｐ〜２５ｋｂｐ、１００ｂｐ〜１５ｋｂｐ、１００ｂｐ〜１０ｋｂｐ、１００ｂｐ〜１ｋｂｐ、１００ｂｐ〜７５０ｂｐ、１００ｂｐ〜５００ｂｐ、１００ｂｐ〜２５０ｂｐ、２００ｂｐ〜１５０ｋｂｐ、２００ｂｐ〜１００ｋｂｐ、２００ｂｐ〜７０ｋｂｐ、２００ｂｐ〜５０ｋｂｐ、２００ｂｐ〜４０ｋｂｐ、２００ｂｐ〜２５ｋｂｐ、２００ｂｐ〜１５ｋｂｐ、２００ｂｐ〜１０ｋｂｐ、２００ｂｐ〜１ｋｂｐ、２００ｂｐ〜７５０ｂｐ、２００ｂｐ〜５００ｂｐ、１０ｋｂｐ〜１５０ｋｂｐ、１０ｋｂｐ〜１００ｋｂｐ、１０ｋｂｐ〜７０ｋｂｐ、１０ｋｂｐ〜５０ｋｂｐ、１０ｋｂｐ〜４０ｋｂｐ、１０ｋｂｐ〜２５ｋｂｐ、５０ｋｂｐ〜１５０ｋｂｐ、５０ｋｂｐ〜１００ｋｂｐ、５０ｋｂｐ〜７０ｋｂｐ、７０ｋｂｐ〜１５０ｋｂｐ又は７０ｋｂｐ〜１００ｋｂｐ）である（これらの長さを有する）。一部の場合、本発明の第２のドナーＤＮＡ（インサートドナー組成物のドナーＤＮＡ）は、合計１０ｂｐ〜５０ｋｂｐを有する。一部の場合、本発明の第２のドナーＤＮＡ（インサートドナー組成物のドナーＤＮＡ）は、合計１０ｂｐ〜１０ｋｂｐを有する。一部の場合、本発明の第２のドナーＤＮＡ（インサートドナー組成物のドナーＤＮＡ）は、合計５０ｋｂｐ〜１００ｋｂｐを有する。一部の場合、本発明の第２のドナーＤＮＡ（インサートドナー組成物のドナーＤＮＡ）は、合計１０ｂｐ〜１０ｋｂｐを有する。一部の場合、本発明の第２のドナーＤＮＡ（インサートドナー組成物のドナーＤＮＡ）は、合計１０ｂｐ〜１ｋｂｐを有する。一部の場合、本発明の第２のドナーＤＮＡ（インサートドナー組成物のドナーＤＮＡ）は、合計２０ｂｐ〜５０ｋｂｐを有する。一部の場合、本発明の第２のドナーＤＮＡ（インサートドナー組成物のドナーＤＮＡ）は、合計２０ｂｐ〜１０ｋｂｐを有する。一部の場合、本発明の第２のドナーＤＮＡ（インサートドナー組成物のドナーＤＮＡ）は、合計２０ｂｐ〜１ｋｂｐを有する。
【００４８】
一部の場合、ドナーＤＮＡは、模倣体、修飾糖骨格、非天然ヌクレオシド間連結（例えば、１つ以上のホスホロチオエート及び／又はヘテロ原子ヌクレオシド間連結）、修飾塩基などのうちの１つ以上を含む。
【００４９】
ゲノムに挿入されるインサートドナー組成物のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列（第２のドナーＤＮＡ）は、任意の好都合な長さを有しうる。例えば一部の場合、配列は、１０塩基対（ｂｐ）以上（例えば、２０ｂｐ以上、３０ｂｐ以上、５０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、２００ｂｐ以上、５００ｂｐ以上、１，０００ｂｐ以上、５，０００ｂｐ以上、１０，０００ｂｐ以上、５０，０００ｂｐ以上又は７５，０００ｂｐ以上）の長さである（合計これらの塩基対を有する）。言い換えれば、一部の場合、ゲノムに挿入されるインサートドナー組成物のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列（第２のドナーＤＮＡ）は、１０ｂｐ以上（例えば、２０ｂｐ以上、３０ｂｐ以上、５０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、２００ｂｐ以上、５００ｂｐ以上、１，０００ｂｐ以上、５，０００ｂｐ以上、１０，０００ｂｐ以上、５０，０００ｂｐ以上又は７５，０００ｂｐ以上）である。
【００５０】
一部の場合、ゲノムに挿入されるインサートドナー組成物のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列（第２のドナーＤＮＡ）の長さは、合計１０塩基対（ｂｐ）〜１５０キロ塩基対（ｋｂｐ）［一本鎖の場合は、「ｂｐ」ではなく、ヌクレオチド（ｎｔ）単位で］（例えば、１０ｂｐ〜１００ｋｂｐ、７０ｋｂｐ、１０ｂｐ〜５０ｋｂｐ、１０ｂｐ〜４０ｋｂｐ、１０ｂｐ〜２５ｋｂｐ、１０ｂｐ〜１５ｋｂｐ、１０ｂｐ〜１０ｋｂｐ、１０ｂｐ〜１ｋｂｐ、１０ｂｐ〜７５０ｂｐ、１０ｂｐ〜５００ｂｐ、１０ｂｐ〜２５０ｂｐ、１０ｂｐ〜１５０ｂｐ、１０ｂｐ〜１００ｂｐ、１０ｂｐ〜５０ｂｐ、１８ｂｐ〜１５０ｋｂｐ、１８ｂｐ〜１００ｋｂｐ、１８ｂｐ〜７０ｋｂｐ、１８ｂｐ〜５０ｋｂｐ、１８ｂｐ〜４０ｋｂｐ、１８ｂｐ〜２５ｋｂｐ、１８ｂｐ〜１５ｋｂｐ、１８ｂｐ〜１０ｋｂｐ、１８ｂｐ〜１ｋｂｐ、１８ｂｐ〜７５０ｂｐ、１８ｂｐ〜５００ｂｐ、１８ｂｐ〜２５０ｂｐ、１８ｂｐ〜１５０ｂｐ、２５ｂｐ〜１５０ｋｂｐ、２５ｂｐ〜１００ｋｂｐ、２５ｂｐ〜７０ｋｂｐ、２５ｂｐ〜５０ｋｂｐ、２５ｂｐ〜４０ｋｂｐ、２５ｂｐ〜２５ｋｂｐ、２５ｂｐ〜１５ｋｂｐ、２５ｂｐ〜１０ｋｂｐ、２５ｂｐ〜１ｋｂｐ、２５ｂｐ〜７５０ｂｐ、２５ｂｐ〜５００ｂｐ、２５ｂｐ〜２５０ｂｐ、２５ｂｐ〜１５０ｂｐ、５０ｂｐ〜１５０ｋｂｐ、５０ｂｐ〜１００ｋｂｐ、５０ｂｐ〜７０ｋｂｐ、５０ｂｐ〜５０ｋｂｐ、５０ｂｐ〜４０ｋｂｐ、５０ｂｐ〜２５ｋｂｐ、５０ｂｐ〜１５ｋｂｐ、５０ｂｐ〜１０ｋｂｐ、５０ｂｐ〜１ｋｂｐ、５０ｂｐ〜７５０ｂｐ、５０ｂｐ〜５００ｂｐ、５０ｂｐ〜２５０ｂｐ、５０ｂｐ〜１５０ｂｐ、１００ｂｐ〜１５０ｋｂｐ、１００ｂｐ〜１００ｋｂｐ、１００ｂｐ〜７０ｋｂｐ、１００ｂｐ〜５０ｋｂｐ、１００ｂｐ〜４０ｋｂｐ、１００ｂｐ〜２５ｋｂｐ、１００ｂｐ〜１５ｋｂｐ、１００ｂｐ〜１０ｋｂｐ、１００ｂｐ〜１ｋｂｐ、１００ｂｐ〜７５０ｂｐ、１００ｂｐ〜５００ｂｐ、１００ｂｐ〜２５０ｂｐ、２００ｂｐ〜１５０ｋｂｐ、２００ｂｐ〜１００ｋｂｐ、２００ｂｐ〜７０ｋｂｐ、２００ｂｐ〜５０ｋｂｐ、２００ｂｐ〜４０ｋｂｐ、２００ｂｐ〜２５ｋｂｐ、２００ｂｐ〜１５ｋｂｐ、２００ｂｐ〜１０ｋｂｐ、２００ｂｐ〜１ｋｂｐ、２００ｂｐ〜７５０ｂｐ、２００ｂｐ〜５００ｂｐ、１０ｋｂｐ〜１５０ｋｂｐ、１０ｋｂｐ〜１００ｋｂｐ、１０ｋｂｐ〜７０ｋｂｐ、１０ｋｂｐ〜５０ｋｂｐ、１０ｋｂｐ〜４０ｋｂｐ、１０ｋｂｐ〜２５ｋｂｐ、５０ｋｂｐ〜１５０ｋｂｐ、５０ｋｂｐ〜１００ｋｂｐ、５０ｋｂｐ〜７０ｋｂｐ、７０ｋｂｐ〜１５０ｋｂｐ又は７０ｋｂｐ〜１００ｋｂｐ）である（これらの長さを有する）。一部の場合、ゲノムに挿入されるインサートドナー組成物のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列（第２のドナーＤＮＡ）の長さは、合計１０ｂｐ〜５０ｋｂｐである。一部の場合、ゲノムに挿入されるインサートドナー組成物のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列（第２のドナーＤＮＡ）の長さは、合計１０ｂｐ〜１０ｋｂｐである。一部の場合、ゲノムに挿入されるインサートドナー組成物のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列（第２のドナーＤＮＡ）の長さは、合計５０ｋｂｐ〜１００ｋｂｐである。一部の場合、ゲノムに挿入されるインサートドナー組成物のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列（第２のドナーＤＮＡ）の長さは、合計１０ｂｐ〜１０ｋｂｐである。一部の場合、ゲノムに挿入されるインサートドナー組成物のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列（第２のドナーＤＮＡ）の長さは、合計１０ｂｐ〜１ｋｂｐである。一部の場合、ゲノムに挿入されるインサートドナー組成物のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列（第２のドナーＤＮＡ）の長さは、合計２０ｂｐ〜５０ｋｂｐである。一部の場合、ゲノムに挿入されるインサートドナー組成物のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列（第２のドナーＤＮＡ）の長さは、合計２０ｂｐ〜１０ｋｂｐである。一部の場合、ゲノムに挿入されるインサートドナー組成物のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列（第２のドナーＤＮＡ）の長さは、合計２０ｂｐ〜１ｋｂｐである。
【００５１】
一部の態様では、ドナーＤＮＡは少なくとも１つのアデニル化３’末端を有する。
【００５２】
一部の態様では、第２のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列のゲノムへの挿入は、挿入された配列の内因性プロモーター（例えば、（ｉ）Ｔ細胞特異的プロモーター；（ｉｉ）ＣＤ３プロモーター；（ｉｉｉ）ＣＤ２８プロモーター；（ｉｖ）幹細胞特異的プロモーター；（ｖ）体細胞特異的プロモーター；及び（ｖｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α、β、γ又はδのプロモーター）との作動可能な連結をもたらす。一部の場合、挿入される、インサートドナー組成物のヌクレオチド配列は、プロモーター（例えば、（ｉ）Ｔ細胞特異的プロモーター；（ｉｉ）ＣＤ３プロモーター；（ｉｉｉ）ＣＤ２８プロモーター；（ｉｖ）幹細胞特異的プロモーター；（ｖ）体細胞特異的プロモーター；及び（ｖｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α、β、γ又はδのプロモーター）に作動可能に連結するタンパク質をコードする配列を含む。
【００５３】
一部の態様では、（第２のドナーＤＮＡの）ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列は、タンパク質をコードする。任意の好都合なタンパク質がコードされうる（例は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質；Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質のＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３領域；キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；膜に結合し細胞外に提示される細胞特異的ターゲティングリガンド；レポータータンパク質（例えば、蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、及び遠赤色蛍光発光、近赤外蛍光発光する蛍光タンパク質など）を含むが、これらに限定されるものではない）。一部の態様では、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列（第２のドナーＤＮＡの）は、多価（例えばヘテロ多価）表面受容体（例えば一部の場合、Ｔ細胞が標的細胞である場合）をコードする。任意の好都合な多価受容体が使用される場合があり、非限定的な例は、二特異性若しくは三特異性のＣＡＲ及び／若しくはＴＣＲ、又は免疫細胞上の他のアフィニティータグを含む。このような挿入は、ターゲティングされた細胞に、受容体を発現させるであろう。一部の場合、多価性は、個別の受容体を挿入することにより達成され、この場合、挿入された受容体は、ＯＲゲート（一方又は他方が、活性化を誘発する）、又はＡＮＤゲート（受容体によるシグナル伝達は、共刺激性であり、ホモバレントの結合は、細胞、例えば、ターゲティングされたＴ細胞を活性化させない／刺激しないであろう）として機能する。挿入されたＤＮＡによりコードされるタンパク質（例えば、ＣＡＲ、ＴＣＲ、多価表面受容体）は、それが、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ９０、ＣＤ４５ｆ、ＣＤ３４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ；ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ及び／又はＴＣＲδの定常領域；４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ６２Ｌ、ＡＲＰ５、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＤ９４／ＮＫＧ２、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｈ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＤＮＡＭ、ＸＣＲ１、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＩＬＴ、ＬＩＲ、Ｌｙ４９、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＴＧＦ−β及びα５β１から選択される１つ以上の標的に結合する（例えば細胞（例．Ｔ細胞）をこれらへとターゲティングするように機能する）ように選択されうる。
【００５４】
一部の場合、挿入されるヌクレオチド配列は、受容体によりターゲティングされる（受容体が結合する）標的が個体の疾患（例えば、がん／腫瘍）に特異的である受容体をコードする。一部の場合、挿入されるヌクレオチド配列は、ヘテロ多価受容体によりターゲティングされる標的の組合せが個体の疾患（例えば、がん／腫瘍）に特異的であるヘテロ多価受容体をコードする。１つの例としては、個体のがん（例．腫瘍、例えば生検による）をシーケンシングし（核酸配列、プロテオミクス、メタボロミクスなど）、標的でありうる罹患細胞の抗原（例えば、個体の対照細胞と比べ腫瘍で過剰発現するか又はこれに固有である抗原）を同定し、免疫細胞が個体の罹患細胞（例．腫瘍細胞）を特異的にターゲティングするように、これらの標的のうちの１つ以上（例．２以上、３以上、５以上、１０以上、１５以上又は約２０）に結合する受容体（例．ヘテロ多価受容体）をコードするヌクレオチド配列を、免疫細胞（例えば、ＣＡＲ又はＴＣＲを使用する、例えば、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞）に挿入することができる。このように、（第２のドナーＤＮＡの）挿入されるヌクレオチド配列は（（例えば、シーケンシングなどを介して）患者のプロテオミクス、ゲノミクス又はメタボロミクスに関するユニークな洞察を受け取った後で、コードされる受容体（例．ヘテロ多価受容体）がデザインされうるという意味で）診断応答的で、これにより、アビディティーが大きく特異的な免疫系の応答を生じるようにデザインされうる。このようにして、免疫細胞（例．ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞など）は、個体の固有の疾患（例．がん）に対して、効果的であるようにデザインされた受容体、例えば、ＣＡＲ及び／又はＴＣＲタンパク質（例．ヘテロ多価形）を発現するようにゲノム編集されうる。一部の場合、診断応答医療の後では、自己免疫に罹患した組織に対する同様のアビディティーが調節的Ｔ細胞に与えられうる。
【００５５】
一部の場合、ゲノムに挿入される第２のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列は、イントロンを有さないタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。一部の場合、イントロンを有さないヌクレオチド配列は、ＴＣＲタンパク質の全体又は一部分をコードする。
【００５６】
一部の態様では、１つを超える送達媒体が標的細胞に導入されうる。例えば一部の場合、本発明の方法は、前記送達媒体のうちの第１及び第２の送達媒体を細胞に導入することを含み、ここで、ゲノムに挿入される第１の送達媒体の第２のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α又はδサブユニットをコードし、ゲノムに挿入される第２の送達媒体の第２のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＴＣＲβ又はγサブユニットをコードする。一部の場合、本発明の方法は、前記送達媒体のうちの第１及び第２の送達媒体を細胞に導入することを含み、ここで、ゲノムに挿入される第１の送達媒体の第２のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α又はδサブユニットの定常領域をコードし、ゲノムに挿入される第２の送達媒体の第２のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＴＣＲβ又はγサブユニットの定常領域をコードする。
【００５７】
一部の場合、本発明の方法は、前記送達媒体のうちの第１及び第２の送達媒体を細胞に導入することを含み、この場合、第１の送達媒体の第２のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α又はδサブユニットのプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内に挿入され、第２の送達媒体の第２のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＴＣＲβ又はγサブユニットのプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内に挿入される。ＴＣＲタンパク質及びＣＤＲに関するさらなる情報は、例えば、Dash et al., Nature. 2017 Jul 6;547(7661):89-93. Epub 2017 Jun 21及びGlanville et al., Nature. 2017 Jul 6;547(7661):94-98. Epub 2017 Jun 21.を参照されたい。
【００５８】
一部の場合、本発明の方法は、前記送達媒体のうちの第１及び第２の送達媒体を細胞に導入することを含み、ここで、ゲノムに挿入される第１の送達媒体の第２のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α又はγサブユニットをコードし、ゲノムに挿入される第２の送達媒体の第２のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＴＣＲβ又はδサブユニットをコードする。一部の場合、本発明の方法は、前記送達媒体のうちの第１及び第２の送達媒体を細胞に導入することを含み、ここで、ゲノムに挿入される第１の送達媒体の第２のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α又はδサブユニットの定常領域をコードし、ゲノムに挿入される第２の送達媒体の第２のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＴＣＲβ又はγサブユニットの定常領域をコードする。一部の場合、本発明の方法は、前記送達媒体のうちの第１及び第２の送達媒体を細胞に導入することを含み、この場合、第１の送達媒体の第２のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α又はγサブユニットのプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内に挿入され、第２の送達媒体の第２のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＴＣＲβ又はδサブユニットのプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内に挿入される。ＴＣＲタンパク質及びＣＤＲに関するさらなる情報は、例えば、Dash et al., Nature. 2017 Jul 6;547(7661):89-93. Epub 2017 Jun 21及びGlanville et al., Nature. 2017 Jul 6;547(7661):94-98. Epub 2017 Jun 21.を参照されたい。
【００５９】
送達媒体／ペイロード
一部の態様では、本発明の組成物（ヌクレアーゼ組成物、標的ドナー組成物、リコンビナーゼ組成物及び／又はインサートドナー組成物）は、同じ送達媒体のペイロードとして細胞に送達される。例えば一部の場合、（ｉ）本発明の第１のドナーＤＮＡ；（ｉｉ）１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ（例．メガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質）（又は１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼをコードするさらなる核酸）；（ｉｉｉ）部位特異的リコンビナーゼ；及び（ｉｖ）第２のドナーＤＮＡは、同じ送達媒体のペイロードである。一部のこのような場合には、ペイロードは一体に結合し、１つ以上の：リボ核タンパク質複合体（例えば、タンパク質及びＲＮＡ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質及びガイドＲＮＡを含む複合体）、デオキシリボヌクレオタンパク質複合体（例えば、ＤＮＡ及びタンパク質を含む複合体）、及び／又はリボ−デオキシリボヌクレオタンパク質複合体（例えば、タンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む複合体）を形成する。
【００６０】
送達媒体は、非ウイルス性媒体、ウイルス性媒体、ナノ粒子（例えば、ターゲティングリガンド、並びに／又は、アニオン性ポリマー組成物、カチオン性ポリマー組成物及びカチオン性ポリペプチド組成物を含むコア、を含むナノ粒子）、リポソーム、ミセル、水中油中水エマルジョン粒子、水中油エマルジョンミセル粒子、多重膜型水中油中水エマルジョン粒子、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインと結合したターゲティングリガンド（例．ペプチドのターゲティングリガンド。ここで、ターゲティングリガンドは細胞表面タンパク質と結合し、そして、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインは、核酸ペイロードと凝縮する及び／又はタンパク質ペイロードと静電相互作用している）、ペイロードと結合したターゲティングリガンド（例．ペプチドであるターゲティングリガンド）（ここで、ターゲティングリガンドは細胞表面タンパク質と結合する）を含みうるが、これらに限定されるものではない。
【００６１】
一部の場合、送達媒体は、水中油中水エマルジョン粒子である。一部の場合、送達媒体は水中油エマルジョンミセル粒子である。一部の場合、送達媒体は多重膜型水中油中水エマルジョン粒子である。一部の場合、送達媒体は多層型粒子である。一部の場合、送達媒体はＤＮＡオリガミナノボットである。上記のいずれの場合も、ペイロード（核酸及び／又はタンパク質）は、共有結合により、核酸相補対として結合して、又は粒子の水相内にあることで、粒子の内部にありうる。一部の場合、送達媒体は、ターゲティングリガンド、例えば一部の場合、水中油中水エマルジョン粒子、水中油エマルジョンミセル粒子、多重膜型水中油中水エマルジョン粒子、多層型粒子又はＤＮＡオリガミナノボットでコーティングされたターゲティングリガンド（明細書の別の部分で詳細に説明する）を含む。一部の場合、送達媒体は金属粒子のコアを有し、ペイロード（例．ドナーＤＮＡ及び／又は部位特異的ヌクレアーゼ（又はこれをコードする核酸））は金属コアへとコンジュゲートされていても（共有結合的に結合していても）よい。
【００６２】
ナノ粒子
本発明のナノ粒子は、核酸及び／又はタンパク質から作られうるペイロードを含む。例えば一部の場合、本発明のナノ粒子は核酸ペイロード（例．ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を送達するのに使用される。一部の場合、ナノ粒子のコアはペイロードを含む。一部のこのような場合、ナノ粒子のコアはまた、アニオン性ポリマー組成物、カチオン性ポリマー組成物及びカチオン性ポリペプチド組成物も含みうる。一部の場合、ナノ粒子は金属粒子のコアを有し、ペイロードはコアと会合する（一部の場合にこれと、例えばこの外部とコンジュゲートする）。一部の態様では、ペイロードはナノ粒子のコアの一部である。したがって、本発明のナノ粒子のコアは、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含みうる。したがって一部の場合、本発明のナノ粒子は核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）及びタンパク質を含む。一部の場合、本発明のナノ粒子のコアはリボ核タンパク質（ＲＮＡ及びタンパク質の）複合体を含む。一部の場合、本発明のナノ粒子のコアはデオキシリボヌクレオタンパク質（ＤＮＡ及びタンパク質（例．ドナーＤＮＡ及びＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質））複合体を含む。一部の場合、本発明のナノ粒子のコアは、リボ−デオキシリボヌクレオタンパク質（ＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質（例．ガイドＲＮＡ、ドナーＤＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質））複合体を含む。一部の場合、本発明のナノ粒子のコアはＰＮＡを含む。一部の場合、本発明のコアはＰＮＡ及びＤＮＡを含む。
【００６３】
本発明の核酸ペイロードはモルホリノ骨格構造を含みうる。一部の場合、本発明の核酸ペイロード（例．ドナーＤＮＡ、配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸及び／又はリコンビナーゼをコードする核酸）は、１つ以上のロックト核酸（ＬＮＡ）を有しうる。適切な糖置換基は、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ３）、アミノプロポキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、−Ｏ−アリル（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）及びフルオロ（Ｆ）を含む。2’-糖置換基は、アラビノ位（上）にあってもよく、リボ位（下）にあってもよい。適切な塩基修飾は、5-メチルシトシン（5-me-Ｃ）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6-メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2-プロピル及び他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン、2-チオシトシン、5-ハロウラシル及びシトシン、5-プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシン、ピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6-アゾウラシル、シトシン、及びチミン、5-ウラシル（シュードウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル及び他の8-置換アデニン及びグアニン、5-ハロ、特に、5-ブロモ、5-トリフルオロメチル、及び他の5-置換ウラシル及びシトシン、7-メチルグアニン、7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノ-アデニン、8-アザグアニン、8-アザアデニン、7-デアザグアニン、7-デアザアデニン、3-デアザグアニン並びに3-デアザアデニンのような、合成及び天然ヌクレオ塩基を含む。さらなる修飾ヌクレオ塩基は、フェノキサジンシチジン（1H-ピリミド(5,4-b)(1,4)ベンゾキサジン-2(3H)-オン）、フェノチアジンシチジン（1H-ピリミド(5,4-b)(1,4)ベンゾチアジン-2(3H)-オン）、置換フェノキサジンシチジン（例．9-(2-アミノエトキシ)-H-ピリミド(5,4-(b)(1,4)ベンゾキサジン-2(3H)-オン）のようなＧクランプ、カルバゾールシチジン（2H-ピリミド(4,5-b)インドール-2-オン）、ピリドインドールシチジン（H-ピリド(3’,2’:4,5)ピロロ(2,3-d)ピリミジン-2-オン）といった三環式ピリミジンを含む。
【００６４】
一部の場合、核酸ペイロードはコンジュゲート部分（例えば、核酸ペイロードの活性、安定性、細胞内分布又は細胞内取込みを増強する部分）を含みうる。これらの部分又はコンジュゲートは、官能基、例えば、一級又は二級ヒドロキシル基へと共有結合したコンジュゲート基を含みうる。コンジュゲート基は、挿入剤、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学特性を増強する基及びオリゴマーの薬物動態特性を増強する基を含むが、これらに限定されない。適切なコンジュゲート基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン及び染料を含むが、これらに限定されない。薬力学特性を増強する基は、取込みを改善し、分解への抵抗性を増強し、及び／又は標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。薬物動態特性を増強する基は、本発明の核酸の取込み、分布、代謝又は排出を改善する基を含む。
【００６５】
任意の好都合なポリヌクレオチドは、ドナーＤＮＡではない（例えば、部位特異的ヌクレアーゼ及び／又は部位特異的リコンビナーゼを送達するための）本発明の核酸ペイロードとして使用されうる。ｍＲＮＡ、ｍ１Ａ修飾ｍＲＮＡ（アデノシンの１位においてモノメチル化された）、モルホリノＲＮＡ、ペプトイド及びペプチド核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡオリガミ、合成ヌクレオチドを伴うＤＮＡ及びＲＮＡ、所定の二次構造を伴うＤＮＡ及びＲＮＡ、並びに前出の分子種のマルチマー及びオリゴマーを含む、ＲＮＡ及びＤＮＡの分子種が例として挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
上述のとおり、１つを超えるペイロードは、同じパッケージ（送達媒体）（例．ナノ粒子）の一部として送達され、例えば一部の場合、異なるペイロードは異なるコアの部分である。複数のペイロードを同じ送達媒体（例．ナノ粒子）の一部として送達することの１つの利点は、各ペイロードの効率が低下しないことである。例としては、ペイロードＡ及びペイロードＢが２つの別個のパッケージ／媒体（それぞれ、パッケージＡ及びパッケージＢ）により送達される場合、効率は乗算的で、例えば、パッケージＡ及びパッケージＢが各々１％のトランスフェクション効率を有する場合、ペイロードＡ及びペイロードＢを同じ細胞へと送達する見込みは０．０１％（１％×１％）である。しかし、ペイロードＡ及びペイロードＢがいずれも同じ送達媒体の一部として送達される場合、ペイロードＡ及びペイロードＢを同じ細胞へと送達する見込みは１％で、０．０１％に対して１００倍の改善である。
【００６７】
同様に、パッケージＡ及びパッケージＢが各々０．１％のトランスフェクション効率を有する状況では、ペイロードＡ及びペイロードＢを同じ細胞へと送達する見込みは０．０００１％（０．１％×０．１％）である。しかし、この状況では、ペイロードＡ及びペイロードＢがいずれも同じパッケージ（例えば、同じナノ粒子の一部（パッケージＡ）の一部）として送達される場合、ペイロードＡ及びペイロードＢを同じ細胞へと送達する見込みは０．１％で、０．０００１％に対して１０００倍の改善である。
【００６８】
このように、一部の態様では、（例えば上述した）１つ以上の遺伝子編集ツール及びドナーＤＮＡは、タンパク質（及び／又はこれをコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ）、並びに／又はゲノム編集効率を増大させる非コードＲＮＡと組み合わせて（例えば、同じナノ粒子の一部として）送達される。一部の場合、（例えば上述した）１つ以上の遺伝子編集ツール及びドナーＤＮＡは、タンパク質（及び／又はこれをコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ）、並びに／又は細胞の分裂及び／若しくは分化を制御する非コードＲＮＡと組み合わせて（例えば、同じナノ粒子の一部として）送達される。
【００６９】
上記の非限定的な例として述べると、一部の態様では、１つ以上の遺伝子編集ツール及びドナーＤＮＡは、ＳＣＦ（及び／又はＳＣＦをコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ）、ＨｏｘＢ４（及び／又はＨｏｘＢ４をコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ）、ＢＣＬ−ＸＬ（及び／又はＢＣＬ−ＸＬをコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ）、ＳＩＲＴ６（及び／又はＳＩＲＴ６をコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ）、ｍｉＲ−１５５を抑制する核酸分子（例．ｓｉＲＮＡ及び／又はＬＮＡ）、ｋｕ７０の発現を低減する核酸分子（例．ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）、及びｋｕ８０の発現を低減する核酸分子（例．ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）のうちの１つ以上と組み合わせて送達されうる。
【００７０】
一体で送達できるマイクロＲＮＡ（ＲＮＡとして又はＲＮＡをコードするＤＮＡとして送達される）の例については、図９を参照。例えば、以下のマイクロＲＮＡは、以下の目的で使用されうる：多能性幹細胞の外胚葉系統への分化を遮断する目的で：ｍｉＲ−４３０／４２７／３０２（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000738、MI0000772、MI0000773、MI0000774、MI0006417、MI0006418、MI0000402、MI0003716、MI0003717及びMI0003718）；多能性幹細胞の内胚葉系統への分化を遮断する目的で：ｍｉＲ−１０９及び／又はｍｉＲ−２４（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000080、MI0000081、MI0000231及びMI0000572）；多能性幹細胞の内胚葉系統への分化を駆動する目的で：ｍｉＲ−１２２（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000442及びMI0000256）及び／又はｍｉＲ−１９２（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000234及びMI0000551）；外胚葉前駆細胞の角化細胞運命への分化を駆動する目的で：ｍｉＲ−２０３（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000283、MI0017343及びMI0000246）；神経堤幹細胞の平滑筋運命への分化を駆動する目的で：ｍｉＲ−１４５（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000461、MI0000169及びMI0021890）；神経幹細胞のグリア細胞運命及び／又はニューロン運命への分化を駆動する目的で：ｍｉＲ−９（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000466、MI0000467、MI0000468、MI0000157、MI0000720及びMI0000721）及び／又はｍｉＲ−１２４ａ（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000443、MI0000444、MI0000445、MI0000150、MI0000716及びMI0000717）；中胚葉前駆細胞の軟骨細胞運命への分化を遮断する目的で：ｍｉＲ−１９９ａ（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000242、MI0000281、MI0000241及びMI0000713）；中胚葉前駆細胞の骨芽細胞運命への分化を駆動する目的で：ｍｉＲ−２９６（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000747及びMI0000394）及び／又はｍｉＲ−２８６１（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0013006及びMI0013007）；中胚葉前駆細胞の心筋運命への分化を駆動する目的で：ｍｉＲ−１（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000437、MI0000651、MI0000139、MI0000652、MI0006283）；中胚葉前駆細胞の心筋運命への分化を遮断する目的で：ｍｉＲ−１３３（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000450、MI0000451、MI0000822、MI0000159、MI0000820、MI0000821及びMI0021863）；中胚葉前駆細胞の骨格筋運命への分化を駆動する目的で：ｍｉＲ−２１４（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000290及びMI0000698）、ｍｉＲ−２０６（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000490及びMI0000249）、ｍｉＲ−１及び／又はｍｉＲ−２６ａ（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000083、MI0000750、MI0000573及びMI0000706）；中胚葉前駆細胞の骨格筋運命への分化を遮断する目的で：ｍｉＲ−１３３（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000450、MI0000451、MI0000822、MI0000159、MI0000820、MI0000821及びMI0021863）、ｍｉＲ−２２１（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000298及びMI0000709）、及び／又はｍｉＲ−２２２（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000299及びMI0000710）；造血前駆細胞の分化を駆動する目的で：ｍｉＲ−２２３（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000300及びMI0000703）；造血前駆細胞の分化を遮断する目的で：ｍｉＲ−１２８ａ（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000447及びMI0000155）及び／又はｍｉＲ−１８１ａ（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000269、MI0000289、MI0000223、及びMI0000697）；造血前駆細胞のリンパ系前駆細胞への分化を駆動する目的で：ｍｉＲ−１８１（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000269、MI0000270、MI0000271、MI0000289、MI0000683、MI0003139、MI0000223、MI0000723、MI0000697、MI0000724、MI0000823及びMI0005450）；造血前駆細胞のリンパ系前駆細胞への分化を遮断する目的で：ｍｉＲ−１４６（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000477、MI0003129、MI0003782、MI0000170及びMI0004665）；造血前駆細胞の骨髄系前駆細胞への分化を遮断する目的で：ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２４ａ、及び／又はｍｉＲ−１７（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000071及びMI0000687）；リンパ系前駆細胞のＴ細胞運命への分化を駆動する目的で：ｍｉＲ−１５０（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000479及びMI0000172）；骨髄系前駆細胞の顆粒球運命への分化を遮断する目的で：ｍｉＲ−２２３（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000300及びMI0000703）；骨髄系前駆細胞の単球運命への分化を遮断する目的で：ｍｉＲ−１７−５ｐ（例．ＭｉＲベース受託番号：MIMAT0000070及びMIMAT0000649）、ｍｉＲ−２０ａ（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000076及びMI0000568）、及び／又はｍｉＲ−１０６ａ（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000113及びMI0000406）；骨髄系前駆細胞の赤血球運命への分化を遮断する目的で：ｍｉＲ−１５０（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000479及びMI0000172）、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２２１（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000298及びMI0000709）、及び／又はｍｉＲ−２２２（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000299及びMI0000710）；かつ骨髄系前駆細胞の赤血球運命への分化を駆動する目的で：ｍｉＲ−４５１（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0001729、MI0017360、MI0001730及びMI0021960）及び／又はｍｉＲ−１６（例．ＭｉＲベース受託番号：MI0000070、MI0000115、MI0000565及びMI0000566）。
【００７１】
遺伝子編集ツール、第１及び第２のドナーＤＮＡ、及びリコンビナーゼ（又はこれをコードする核酸）と組み合わせて送達されうる（例えば、タンパク質又はタンパク質をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡとして）、シグナル伝達タンパク質（例．細胞外シグナル伝達タンパク質）の例については、図１０を参照。同じタンパク質は、例えばナノ粒子を受け取る標的細胞における分化にバイアスをかける目的で、ターゲティングリガンドと同様に本発明のナノ粒子の外殻の一部としても使用されうる。例えば、以下のシグナル伝達タンパク質（例．細胞外シグナル伝達タンパク質）は、以下の目的で使用されうる：造血幹細胞のリンパ系共通前駆細胞系統への分化を駆動する目的で：ＩＬ−７（例．NCBI Gene ID：3574）；造血幹細胞の骨髄系共通前駆細胞系統への分化を駆動する目的で：ＩＬ−３（例．NCBI Gene ID：3562）、ＧＭ−ＣＳＦ（例．NCBI Gene ID：1437）及び／又はＭ−ＣＳＦ（例．NCBI Gene ID：1435）；リンパ系共通前駆細胞のＢ細胞運命への分化を駆動する目的で：ＩＬ−３、ＩＬ−４（例．NCBI Gene ID：3565）及び／又はＩＬ−７；リンパ系共通前駆細胞のナチュラルキラー細胞運命への分化を駆動する目的で：ＩＬ−１５（例．NCBI Gene ID：3600）；リンパ系共通前駆細胞のＴ細胞運命への分化を駆動する目的で：ＩＬ−２（例．NCBI Gene ID：3558）、ＩＬ−７及び／又はＮｏｔｃｈ（例．NCBI Gene ID：4851、4853、4854、4855）；リンパ系共通前駆細胞の樹状細胞運命への分化を駆動する目的で：Ｆｌｔ−３リガンド（例．NCBI Gene ID：2323）；骨髄系共通前駆細胞の樹状細胞運命への分化を駆動する目的で：Ｆｌｔ−３リガンド、ＧＭ−ＣＳＦ及び／又はＴＮＦα（例．NCBI Gene ID：7124）；骨髄系共通前駆細胞の顆粒球マクロファージ前駆細胞系統への分化を駆動する目的で：ＧＭ−ＣＳＦ；骨髄系共通前駆細胞の巨核細胞−赤血球系前駆細胞系統への分化を駆動する目的で：ＩＬ−３、ＳＣＦ（例．NCBI Gene ID：4254）及び／又はＴｐｏ（例．NCBI Gene ID：7173）；巨核細胞−赤血球系前駆細胞の巨核細胞運命への分化を駆動する目的で：ＩＬ−３、ＩＬ−６（例．NCBI Gene ID：3569）、ＳＣＦ及び／又はＴｐｏ；巨核細胞−赤血球系前駆細胞の赤血球運命への分化を駆動する目的で：エリスロポエチン（例．NCBI Gene ID：2056）；巨核細胞の血小板運命への分化を駆動する目的で：ＩＬ−１１（例．NCBI Gene ID：3589）及び／又はＴｐｏ；顆粒球マクロファージ前駆細胞の単球系統への分化を駆動する目的で：ＧＭ−ＣＳＦ及び／又はＭ−ＣＳＦ；顆粒球マクロファージ前駆細胞の骨芽細胞系統への分化を駆動する目的で：ＧＭ−ＣＳＦ；単球の単球由来樹状細胞運命への分化を駆動する目的で：Ｆｌｔ−３リガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα（例．NCBI Gene ID：3439）及び／又はＩＬ−４；単球のマクロファージ運命への分化を駆動する目的で：ＩＦＮγ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０（例．NCBI Gene ID：3586）及び／又はＭ−ＣＳＦ；骨芽細胞の好中球運命への分化を駆動する目的で：Ｇ−ＣＳＦ（例．NCBI Gene ID：1440）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６及び／又はＳＣＦ；骨芽細胞の好酸球運命への分化を駆動する目的で：ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、及び／又はＩＬ−５（例．NCBI Gene ID：3567）；かつ骨芽細胞の好塩基球運命への分化を駆動する目的で：Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ��び／又はＩＬ−３。
【００７２】
ここで記載される（例えば、タンパク質及び／又はタンパク質をコードする核酸、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡとして）他のペイロードと組み合わせて送達されうるタンパク質の例は、ＳＯＸ１７、ＨＥＸ、ＯＳＫＭ（Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２／Ｋｌｆ４／ｃ−ｍｙｃ）、及び／又はｂＦＧＦ（例えば、肝幹細胞系統への分化を駆動する）；ＨＮＦ４ａ（例えば、肝細胞運命への分化を駆動する）；Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ＢＭＰ−４、ｂＦＧＦ、及び／又は８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（例えば、内皮幹細胞／前駆細胞系統への分化を駆動する）；ＶＥＧＦ（例えば、動脈内皮運命への分化を駆動する）；Ｓｏｘ−２、Ｂｒｎ４、Ｍｙｔ１ｌ、Ｎｅｕｒｏｄ２、Ａｓｃｌ１（例えば、神経幹細胞／前駆細胞系統への分化を駆動する）；並びにＢＤＮＦ、ＦＣＳ、フォルスコリン、及び／又はＳＨＨ（例えば、ニューロン、星状細胞、及び／又は希突起膠細胞運命への分化を駆動する）を含むが、これらに限定されるものではない。
【００７３】
ここで記載される（例えば、タンパク質及び／又はタンパク質をコードする核酸、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡとして）他のペイロードと共に送達されうるシグナル伝達タンパク質（例．細胞外シグナル伝達タンパク質）の例は、サイトカイン（例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を活性化させるための、例えば、ＩＬ−及び／又はＩＬ−１５）；Ｎｏｔｃｈ、Ｗｎｔ、及び／又はＳｍａｄシグナル伝達経路のうちの１つ以上をモジュレートするリガンド及び／又はシグナル伝達タンパク質；ＳＣＦ；幹細胞分化因子（例えば、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃなど）；並びにその後の単離／精製／濃縮のための一時的表面マーカー「タグ」及び／又は蛍光レポーターを含むが、これらに限定されない。例えば、線維芽細胞はＳｏｘ２の送達を介して神経幹細胞へと転換されうるが、Ｏｃｔ３／４及び低分子である「後成的リセット因子」の存在下では心筋細胞へとなるであろう。ハンチントン病又はＣＸＣＲ４突然変異を伴う患者では、これらの線維芽細胞は、それぞれ、ニューロン及び心臓細胞と関連する罹患表現型形質をコードしうる。遺伝子編集補正及びこれらの因子を単一のパッケージ内で送達することにより、導入される因子／ペイロードの全てではないが、これらの１つ以上に起因する有害作用の危険性が著明に低減されうる。
【００７４】
ペイロード放出のタイミング及び／又は場所は制御されうる（本明細書の別の箇所でより詳細に説明する）ため、複数のペイロードの同じパッケージ（例えば、同じナノ粒子）内のパッケージングは、異なるペイロードについて異なる放出時間／速度及び／又は場所を達成することを妨げない。例えば上記のタンパク質（及び／又はこれらをコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ）及び／又は非コードＲＮＡの放出は、同じパッケージの一部である１つ以上の遺伝子編集ツールの放出と別個に制御されうる。例えば細胞の増殖及び／又は分化を制御するタンパク質及び／又は核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）は、１つ以上の遺伝子編集ツールより早く放出される場合もあり、１つ以上の遺伝子編集ツールより遅く放出される場合もある。これは、例えば１つを超える脱落層を使用することにより達成される場合もあり、及び／又は１つを超えるコア（例えば、１つのコアが、他のコアと異なる放出プロファイルを有する場合、例えば、異なるD-異性体対L-異性体の比を使用する場合、異なるＥＳＰ：ＥＮＰ：ＥＰＰプロファイルを使用する場合など）を使用することにより達成される場合もある。このようにして、ドナー及びヌクレアーゼは、最適の編集及び挿入効率を可能とする段階的な方式で、放出されうる。同様に、一部の場合、リコンビナーゼ（又はこれをコードする核酸）及び第２のドナーＤＮＡを放出する前に、第１のドナーＤＮＡ及びヌクレアーゼ（又はこれをコードする核酸）を放出することが所望されてもよい。
【００７５】
ナノ粒子のコア
本発明のナノ粒子のコアは、アニオン性ポリマー組成物（例えば、ポリ（グルタミン酸））、カチオン性ポリマー組成物（例えば、ポリ（アルギニン）、カチオン性ポリペプチド組成物（例．ヒストンテールペプチド）、及びペイロード（例えば、核酸及び／又はタンパク質のペイロード（例．第１及び第２のドナーＤＮＡのうちの１つ以上、部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸、並びに部位特異的リコンビナーゼ又はこれらをコードする核酸））を含みうる。一部の場合、コアは、アニオン性アミノ酸ポリマーの存在下における（かつ、一部の場合、カチオン性ポリペプチド組成物のカチオン性ポリペプチドの存在下における）カチオン性アミノ酸ポリマー及びペイロードの凝縮により生成される。一部の態様では、コアを構成する構成要素の凝縮は、カチオン性ポリマー、ペイロードとのコンジュゲートと比較した、トランスフェクション効率の増大を媒介しうる。アニオン性ポリマーのナノ粒子のコアへの組入れは、細胞内のナノ粒子の滞留及びペイロード放出の持続時間を延長しうる。
【００７６】
コアのカチオン性及びアニオン性ポリマー組成物について、ペイロードの徐放を制御するためにD-異性体ポリマー対L-異性体ポリマーの比が制御されうるが、ここで、D-異性体ポリマー対L-異性体ポリマーの比の増大は安定性の増大（ペイロード放出速度の低減）をもたらし、これは、例えば、本発明のナノ粒子により送達されるペイロードからの長時間持続型の遺伝子発現を可能としうる。一部の場合、ナノ粒子のコア内のD-異性体ポリペプチド対L-異性体ポリペプチドの比の改変は、遺伝子発現プロファイル（例．ペイロード分子によりコードされるタンパク質の発現）が、１〜９０日間（例．１〜８０、１〜７０、１〜６０、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０、３〜９０、３〜８０、３〜７０、３〜６０、３〜５０、３〜４０、３〜３０、３〜２５、３〜２０、３〜１５、３〜１０、５〜９０、５〜８０、５〜７０、５〜６０、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１５又は５〜１０日間）のオーダーにあるように仕向けうる。（例えば、遺伝子編集ツールを送達する場合の）ペイロード放出の制御は、例えば相同性指向修復が所望される場合、ゲノム編集を実施するために特に効果的でありうる。
【００７７】
一部の態様では、ナノ粒子は、コア及びコアを封入する脱落層を含み、ここで、コアは、（ａ）アニオン性ポリマー組成物；（ｂ）カチオン性ポリマー組成物；（ｃ）カチオン性ポリペプチド組成物；並びに（ｄ）核酸及び／又はタンパク質のペイロードを含み、ここで、（ａ）及び（ｂ）のうちの一方は、アミノ酸のD-異性体ポリマーを含み、（ａ）及び（ｂ）のうちの他方は、アミノ酸のL-異性体ポリマーを含み、ここで、D-異性体ポリマー対L-異性体ポリマーの比は、１０：１〜１．５：１（例えば、８：１〜１．５：１、６：１〜１．５：１、５：１〜１．５：１、４：１〜１．５：１、３：１〜１．５：１、２：１〜１．５：１、１０：１〜２：１；８：１〜２：１、６：１〜２：１、５：１〜２：１、１０：１〜３：１；８：１〜３：１、６：１〜３：１、５：１〜３：１、１０：１〜４：１；４：１〜２：１、６：１〜４：１、又は１０：１〜５：１）、又は１：１．５〜１：１０（例えば、１：１．５〜１：８、１：１．５〜１：６、１：１．５〜１：５、１：１．５〜１：４、１：１．５〜１：３、１：１．５〜１：２、１：２〜１：１０、１：２〜１：８、１：２〜１：６、１：２〜１：５、１：２〜１：４、１：２〜１：３、１：３〜１：１０、１：３〜１：８、１：３〜１：６、１：３〜１：５、１：４〜１：１０、１：４〜１：８、１：４〜１：６、又は１：５〜１：１０）の範囲にある。一部のこのような場合には、D-異性体ポリマー対L-異性体ポリマーの比は１：１ではない。一部のこのような場合には、アニオン性ポリマー組成物は、ポリ（D-グルタミン酸）（ＰＤＥＡ）及びポリ（D-アスパラギン酸）（ＰＤＤＡ）から選択されるアニオン性ポリマーを含み、ここで（任意に）、カチオン性ポリマー組成物は、ポリ（L-アルギニン）、ポリ（L-リシン）、ポリ（L-ヒスチジン）、ポリ（L-オルニチン）及びポリ（L-シトルリン）から選択されるカチオン性ポリマーを含みうる。一部の場合、カチオン性ポリマー組成物は、ポリ（D-アルギニン）、ポリ（D-リシン）、ポリ（D-ヒスチジン）、ポリ（D-オルニチン）及びポリ（D-シトルリン）から選択されるカチオン性ポリマーを含み、ここで（任意に）、アニオン性ポリマー組成物は、ポリ（L-グルタミン酸）（ＰＬＥＡ）及びポリ（L-アスパラギン酸）（ＰＬＤＡ）から選択されるアニオン性ポリマーを含みうる。
【００７８】
一部の態様では、ナノ粒子は、コア及びコアを封入する脱落層を含み、ここで、コアは、（ｉ）アニオン性ポリマー組成物；（ｉｉ）カチオン性ポリマー組成物；（ｉｉｉ）カチオン性ポリペプチド組成物；並びに（ｉｖ）核酸及び／又はタンパク質のペイロードを含み、この場合、（ａ）前記アニオン性ポリマー組成物は、アニオン性アミノ酸のD-異性体のポリマー、及びアニオン性アミノ酸のL-異性体のポリマーを含み；及び／又は（ｂ）前記カチオン性ポリマー組成物は、カチオン性アミノ酸のD-異性体のポリマー、及びカチオン性アミノ酸のL-異性体のポリマーを含む。一部のこのような場合には、アニオン性ポリマー組成物は、ポリ（D-グルタミン酸）（ＰＤＥＡ）及びポリ（D-アスパラギン酸）（ＰＤＤＡ）から選択される、第１のアニオン性ポリマーを含み；ポリ（L-グルタミン酸）（ＰＬＥＡ）及びポリ（L-アスパラギン酸）（ＰＬＤＡ）から選択される第２のアニオン性ポリマーを含む。一部の場合、カチオン性ポリマー組成物は、ポリ（D-アルギニン）、ポリ（D-リシン）、ポリ（D-ヒスチジン）、ポリ（D-オルニチン）及びポリ（D-シトルリン）から選択される第１のカチオン性ポリマーを含み；ポリ（L-アルギニン）、ポリ（L-リシン）、ポリ（L-ヒスチジン）、ポリ（L-オルニチン）及びポリ（L-シトルリン）から選択される第２のカチオン性ポリマーを含む。一部の場合、アニオン性アミノ酸のD-異性体のポリマーは、アニオン性アミノ酸の前記L-異性体のポリマーと比べて１０：１〜１：１０の範囲内の比で存在する。一部の場合、カチオン性アミノ酸のD-異性体のポリマーは、カチオン性アミノ酸の前記L-異性体のポリマーと比べて１０：１〜１：１０の範囲内の比で存在する。
【００７９】
ナノ粒子の構成要素（タイミング）
一部の態様では、ペイロード放出のタイミングは、特定の種類のタンパク質を、例えば、コアの一部（例えば、カチオン性ポリペプチド組成物の一部、カチオン性ポリマー組成物の一部、及び／又はアニオン性ポリマー組成物の一部）として選択することにより制御されうる。例えば、ペイロードの放出を、特定の時間、又はペイロードが特定の細胞内の場所（例えば、細胞質ゾル、核、リソソーム、エンドソーム）に若しくは特定の条件下（例えば、低ｐＨ、高ｐＨなど）で存在するまで遅らせることが所望されてもよい。このように、一部の場合、特異的タンパク質活性（例．酵素活性）に対して感受性である、例えば特異的タンパク質活性（例えば、酵素活性）に対する基質であるタンパク質が（例えばコアの一部として）使用されるが、これは、一般的な遍在的細胞内機構、例えば、一般的な分解機構に対して感受性であることと対照的である。本明細書では、特異的タンパク質活性に対して感受性であるタンパク質は「酵素感受性タンパク質」（ＥＳＰ）という。ＥＳＰの例は、（ｉ）マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）活性（細胞外活性の例）に対する基質であるタンパク質、例えば、ＭＭＰが認識するモチーフを含むタンパク質；（ｉｉ）カテプシン活性（細胞内エンドソーム活性の例）に対する基質であるタンパク質、例えば、カテプシンが認識するモチーフを含むタンパク質；並びに（ｉｉｉ）メチルトランスフェラーゼ及び／又はアセチルトランスフェラーゼ活性（細胞内核活性の例）に対する基質であるタンパク質、例えば、ヒストンテールペプチド（ＨＴＰ）、例えば、酵素的にメチル化／脱メチル化されうるモチーフ、及び／又は酵素的にアセチル化／脱アセチル化されうるモチーフを含むタンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。例えば一部の場合、核酸ペイロードは、アセチルトランスフェラーゼ活性に対する基質であるタンパク質（例．ヒストンテールペプチド）と共に凝縮され、タンパク質のアセチル化は、タンパク質にペイロードを放出させる（このように、アセチル化に対する感受性が大きいか又は小さいタンパク質の使用を選び出すことにより、ペイロード放出に対して制御することができる）。
【００８０】
一部の場合、本発明のナノ粒子のコアは、ポリペプチドホモポリマー（すなわち、リピート配列を有するタンパク質）である酵素中性ポリペプチド（ＥＮＰ）を含み、この場合、ポリペプチドは、特定の活性を有さず、中性である。例えば、いずれも、特定の活性を有するＮＬＳ配列及びＨＴＰと異なり、ＥＮＰは、特定の活性を有さない。
【００８１】
一部の場合、本発明のナノ粒子のコアは、酵素活性に対して抵抗性であるタンパク質である酵素保護ポリペプチド（ＥＰＰ）を含む。ＥＰＰの例は、（ｉ）タンパク質分解に抵抗しうる、D-異性体アミノ酸（例えば、D-異性体ポリマー）を含むポリペプチド；及び（ｉｉ）セルフシェルタリングドメイン、例えば、ポリグルタミンリピートドメイン（例えば、ＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱ）（配列番号１７０）を含むが、これらに限定されるものではない。
【００８２】
本発明のナノ粒子の一部（例えば、ナノ粒子のコアの一部）である感受性タンパク質（ＥＳＰ）、中性タンパク質（ＥＮＰ）、及び保護タンパク質（ＥＰＰ）の相対量を制御することにより、ペイロードの放出を制御しうる。例えば、多くのＥＳＰの使用は、一般に、多くのＥＰＰの使用より迅速なペイロードの放出をもたらしうる。加えて、多くのＥＳＰの使用は、一般に、特定の条件／状況のセット、例えば、ＥＳＰが感受性であるタンパク質（例えば、酵素）の活性をもたらす状態／状況に依存するペイロードの放出をもたらす。
【００８３】
ナノ粒子のアニオン性ポリマー組成物
アニオン性ポリマー組成物は、１つ以上のアニオン性アミノ酸ポリマーを含みうる。例えば一部の場合、本発明のアニオン性ポリマー組成物は、ポリ（グルタミン酸）（ＰＥＡ）、ポリ（アスパラギン酸）（ＰＤＡ）及びこれらの組合せから選択されるポリマーを含む。一部の場合、所与のアニオン性アミノ酸ポリマーは、アスパラギン酸残基とグルタミン酸残基のミックスを含みうる。各ポリマーは、組成物中でL-異性体のポリマーとして存在する場合もあり、D-異性体のポリマーとして存在する場合もあり、ここで、D-異性体は分解に長くかかるため、標的細胞内でより安定である。したがって、D-異性体のポリ（アミノ酸）のナノ粒子のコアへの組入れは、コアの分解及びその後のペイロード放出を遅らせる。したがって、ペイロード放出速度は制御される場合があり、D-異性体のポリマー対L-異性体のポリマーの比に比例し、ここで、D-異性体対L-異性体の比はペイロード放出の持続時間を増大させる（すなわち、放出速度を減少させる）。言い換えれば、D-異性体とL-異性体との相対量は、ナノ粒子のコアの徐放動態並びに分解への酵素感受性及びペイロード放出をモジュレートしうる。
【００８４】
一部の場合、本発明のナノ粒子のアニオン性ポリマー組成物は、アニオン性アミノ酸ポリマーのD-異性体のポリマー及びL-異性体のポリマー（例えば、ポリ（グルタミン酸）（ＰＥＡ）及びポリ（アスパラギン酸）（ＰＤＡ））を含む。一部の場合、D-異性体対L-異性体の比は、１０：１〜１：１０（例えば、８：１〜１：１０、６：１〜１：１０、４：１〜１：１０、３：１〜１：１０、２：１〜１：１０、１：１〜１：１０、１０：１〜１：８、８：１〜１：８、６：１〜１：８、４：１〜１：８、３：１〜１：８、２：１〜１：８、１：１〜１：８、１０：１〜１：６、８：１〜１：６、６：１〜１：６、４：１〜１：６、３：１〜１：６、２：１〜１：６、１：１〜１：６、１０：１〜１：４、８：１〜１：４、６：１〜１：４、４：１〜１：４、３：１〜１：４、２：１〜１：４、１：１〜１：４、１０：１〜１：３、８：１〜１：３、６：１〜１：３、４：１〜１：３、３：１〜１：３、２：１〜１：３、１：１〜１：３、１０：１〜１：２、８：１〜１：２、６：１〜１：２、４：１〜１：２、３：１〜１：２、２：１〜１：２、１：１〜１：２、１０：１〜１：１、８：１〜１：１、６：１〜１：１、４：１〜１：１、３：１〜１：１又は２：１〜１：１）である。
【００８５】
したがって、一部の場合、アニオン性ポリマー組成物は、D-異性体（例えば、ポリ（D-グルタミン酸）（ＰＤＥＡ）及びポリ（D-アスパラギン酸）（ＰＤＤＡ）から選択される）のポリマーである第１のアニオン性ポリマー（例．アミノ酸ポリマー）を含み；L-異性体（例えば、ポリ（L-グルタミン酸）（ＰＬＥＡ）及びポリ（L-アスパラギン酸）（ＰＬＤＡ）から選択される）のポリマーである第２のアニオン性ポリマー（例．アミノ酸ポリマー）を含む。一部の場合、第１のアニオン性ポリマー（D-異性体）対第２のアニオン性ポリマー（L-異性体）の比は、１０：１〜１：１０（例えば、８：１〜１：１０、６：１〜１：１０、４：１〜１：１０、３：１〜１：１０、２：１〜１：１０、１：１〜１：１０、１０：１〜１：８、８：１〜１：８、６：１〜１：８、４：１〜１：８、３：１〜１：８、２：１〜１：８、１：１〜１：８、１０：１〜１：６、８：１〜１：６、６：１〜１：６、４：１〜１：６、３：１〜１：６、２：１〜１：６、１：１〜１：６、１０：１〜１：４、８：１〜１：４、６：１〜１：４、４：１〜１：４、３：１〜１：４、２：１〜１：４、１：１〜１：４、１０：１〜１：３、８：１〜１：３、６：１〜１：３、４：１〜１：３、３：１〜１：３、２：１〜１：３、１：１〜１：３、１０：１〜１：２、８：１〜１：２、６：１〜１：２、４：１〜１：２、３：１〜１：２、２：１〜１：２、１：１〜１：２、１０：１〜１：１、８：１〜１：１、６：１〜１：１、４：１〜１：１、３：１〜１：１、又は２：１〜１：１）である。
【００８６】
一部の態様では、本発明のナノ粒子のコアのアニオン性ポリマー組成物は、グリコサミノグリカン、糖タンパク質、多糖、ポリ（マヌロン酸）、ポリ（グルクロン酸）、ヘパリン、硫酸ヘパリン、コンドロイチン、硫酸コンドロイチン、ケラタン、硫酸ケラタン、アグレカン、ポリ（グルコサミン）又はこれらの任意の組合せを含むアニオン性ポリマーを含む（例えば、アニオン性ポリマーの前出の例のうちのいずれかに加えて、又はこの代わりに）。
【００８７】
一部の態様では、コア内のアニオン性ポリマーは、１〜２００ｋＤａ（例えば、１〜１５０、１〜１００、１〜５０、５〜２００、５〜１５０、５〜１００、５〜５０、１０〜２００、１０〜１５０、１０〜１００、１０〜５０、１５〜２００、１５〜１５０、１５〜１００、又は１５〜５０ｋＤａ）の分子量を有しうる。例として述べると、一部の場合、アニオン性ポリマーは分子量を約１５ｋＤａのポリ（グルタミン酸）を含む。
【００８８】
一部の場合、アニオン性アミノ酸ポリマーは、例えば、リンカー、ＮＬＳ及び／又はカチオン性ポリペプチド（例．ヒストン又はＨＴＰ）との結合を促進するシステイン残基を含む。例えば、システイン残基は、スルフヒドリル化学反応（例．ジスルフィド結合）及び／又はアミン反応性化学反応を介する架橋（コンジュゲーション）のために使用されうる。したがって、一部の態様では、アニオン性ポリマー組成物のアニオン性アミノ酸ポリマー（例．ポリ（グルタミン酸）（ＰＥＡ）、ポリ（アスパラギン酸）（ＰＤＡ）、ポリ（D-グルタミン酸）（ＰＤＥＡ）、ポリ（D-アスパラギン酸）（ＰＤＤＡ）、ポリ（L-グルタミン酸）（ＰＬＥＡ）、ポリ（L-アスパラギン酸）（ＰＬＤＡ））は、システイン残基を含む。一部の場合、アニオン性アミノ酸ポリマーは、Ｎ及び／又はＣ末端においてシステイン残基を含む。一部の場合、アニオン性アミノ酸ポリマーは内部システイン残基を含む。
【００８９】
一部の場合、アニオン性アミノ酸ポリマーは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）（以下により詳細に説明する）を含む（及び／又はこれとコンジュゲートする）。したがって、一部の態様では、アニオン性ポリマー組成物のアニオン性アミノ酸ポリマー（例．ポリ（グルタミン酸）（ＰＥＡ）、ポリ（アスパラギン酸）（ＰＤＡ）、ポリ（D-グルタミン酸）（ＰＤＥＡ）、ポリ（D-アスパラギン酸）（ＰＤＤＡ）、ポリ（L-グルタミン酸）（ＰＬＥＡ）、ポリ（L-アスパラギン酸）（ＰＬＤＡ））は、１つ以上（例．２つ以上、３つ以上又は４つ以上）のＮＬＳを含む（及び／又はこれとコンジュゲートする）。一部の場合、アニオン性アミノ酸ポリマーは、Ｎ及び／又はＣ末端においてＮＬＳを含む。一部の場合、アニオン性アミノ酸ポリマーは内部ＮＬＳを含む。
【００９０】
一部の場合、アニオン性ポリマーは、本発明のナノ粒子のコアを生成する場合にカチオン性ポリマーの前に添加される。
【００９１】
ナノ粒子のカチオン性ポリマー組成物
カチオン性ポリマー組成物は、１つ以上のカチオン性アミノ酸ポリマーを含みうる。例えば一部の場合、本発明のカチオン性ポリマー組成物は、ポリ（アルギニン）（ＰＲ）、ポリ（リシン）（ＰＫ）、ポリ（ヒスチジン）（ＰＨ）、ポリ（オルニチン）、ポリ（シトルリン）及びこれらの組合せから選択されるポリマーを含む。一部の場合、所与のカチオン性アミノ酸ポリマーは、アルギニン、リシン、ヒスチジン、オルニチン及びシトルリン残基（任意の好都合な組合せにおける）のミックスを含みうる。各ポリマーは、組成物中でL-異性体のポリマーとして存在する場合もあり、D-異性体のポリマーとして存在する場合もあり、ここで、D-異性体は分解に長くかかるため、標的細胞内でより安定である。したがって、D-異性体のポリ（アミノ酸）のナノ粒子のコアへの組入れは、コアの分解及びその後のペイロード放出を遅らせる。したがって、ペイロード放出速度は制御される場合があり、D-異性体のポリマー対L-異性体のポリマーの比に比例し、ここで、D-異性体対L-異性体の比は、ペイロード放出の持続時間を増大させる（すなわち放出速度を減少させる）。言い換えれば、D-異性体とL-異性体との相対量は、ナノ粒子のコアの徐放動態並びに分解への酵素感受性及びペイロード放出をモジュレートしうる。
【００９２】
一部の場合、本発明のナノ粒子のカチオン性ポリマー組成物は、カチオン性アミノ酸ポリマーのD-異性体のポリマー及びL-異性体のポリマー（例．ポリ（アルギニン）（ＰＲ）、ポリ（リシン）（ＰＫ）、ポリ（ヒスチジン）（ＰＨ）、ポリ（オルニチン）、ポリ（シトルリン））を含む。一部の場合、D-異性体対L-異性体の比は、１０：１〜１：１０（例えば、８：１〜１：１０、６：１〜１：１０、４：１〜１：１０、３：１〜１：１０、２：１〜１：１０、１：１〜１：１０、１０：１〜１：８、８：１〜１：８、６：１〜１：８、４：１〜１：８、３：１〜１：８、２：１〜１：８、１：１〜１：８、１０：１〜１：６、８：１〜１：６、６：１〜１：６、４：１〜１：６、３：１〜１：６、２：１〜１：６、１：１〜１：６、１０：１〜１：４、８：１〜１：４、６：１〜１：４、４：１〜１：４、３：１〜１：４、２：１〜１：４、１：１〜１：４、１０：１〜１：３、８：１〜１：３、６：１〜１：３、４：１〜１：３、３：１〜１：３、２：１〜１：３、１：１〜１：３、１０：１〜１：２、８：１〜１：２、６：１〜１：２、４：１〜１：２、３：１〜１：２、２：１〜１：２、１：１〜１：２、１０：１〜１：１、８：１〜１：１、６：１〜１：１、４：１〜１：１、３：１〜１：１、又は２：１〜１：１）である。
【００９３】
したがって、一部の場合、カチオン性ポリマー組成物は、D-異性体（例えば、ポリ（D-アルギニン）、ポリ（D-リシン）、ポリ（D-ヒスチジン）、ポリ（D-オルニチン）及びポリ（D-シトルリン）から選択される）のポリマーである第１のカチオン性ポリマー（例．アミノ酸ポリマー）を含み；L-異性体（例えば、ポリ（L-アルギニン）、ポリ（L-リシン）、ポリ（L-ヒスチジン）、ポリ（L-オルニチン）及びポリ（L-シトルリン）から選択される）のポリマーである第２のカチオン性ポリマー（例．アミノ酸ポリマー）を含む。一部の場合、第１のカチオン性ポリマー（D-異性体）対第２のカチオン性ポリマー（L-異性体）の比は、１０：１〜１：１０（例えば、８：１〜１：１０、６：１〜１：１０、４：１〜１：１０、３：１〜１：１０、２：１〜１：１０、１：１〜１：１０、１０：１〜１：８、８：１〜１：８、６：１〜１：８、４：１〜１：８、３：１〜１：８、２：１〜１：８、１：１〜１：８、１０：１〜１：６、８：１〜１：６、６：１〜１：６、４：１〜１：６、３：１〜１：６、２：１〜１：６、１：１〜１：６、１０：１〜１：４、８：１〜１：４、６：１〜１：４、４：１〜１：４、３：１〜１：４、２：１〜１：４、１：１〜１：４、１０：１〜１：３、８：１〜１：３、６：１〜１：３、４：１〜１：３、３：１〜１：３、２：１〜１：３、１：１〜１：３、１０：１〜１：２、８：１〜１：２、６：１〜１：２、４：１〜１：２、３：１〜１：２、２：１〜１：２、１：１〜１：２、１０：１〜１：１、８：１〜１：１、６：１〜１：１、４：１〜１：１、３：１〜１：１又は２：１〜１：１）である。
【００９４】
一部の態様では、本発明のナノ粒子のコアのカチオン性ポリマー組成物は、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（アスパルタミド）、（例えば、コア凝縮のために「スパイダーウェブ」様分枝を形成するための）ポリペプトイド、電荷官能化ポリエステル、カチオン性多糖、アセチル化されたアミノ糖、キトサン、又はこれらの任意の組合せを含む（例えば、直鎖形態又は分枝形態の）カチオン性ポリマーを含む（例えば、カチオン性ポリマーの前出の例のうちのいずれかに加えて、又はこの代わりに）。
【００９５】
一部の態様では、コア内のカチオン性ポリマーは、１〜２００ｋＤａ（例えば、１〜１５０、１〜１００、１〜５０、５〜２００、５〜１５０、５〜１００、５〜５０、１０〜２００、１０〜１５０、１０〜１００、１０〜５０、１５〜２００、１５〜１５０、１５〜１００、又は１５〜５０ｋＤａ）の分子量を有しうる。例として述べると、一部の場合、カチオン性ポリマーは、例えば分子量約２９ｋＤａのポリ（L-アルギニン）を含む。別の例として述べると、一部の場合、カチオン性ポリマーは分子量を約２５ｋＤａの直鎖状ポリ（エチレンイミン）を含む。別の例として述べると、一部の場合、カチオン性ポリマーは分子量約１０ｋＤａの分枝状ポリ（エチレンイミン）を含む。別の例として述べると、一部の場合、カチオン性ポリマーは分子量約７０ｋＤａの分枝状ポリ（エチレンイミン）を含む。一部の場合、カチオン性ポリマーはＰＡＭＡＭを含む。
【００９６】
一部の場合、カチオン性アミノ酸ポリマーは、例えば、リンカー、ＮＬＳ、及び／又はカチオン性ポリペプチド（例．ヒストン又はＨＴＰ）との結合を促進するシステイン残基を含む。例えば、システイン残基は、スルフヒドリル化学反応（例．ジスルフィド結合）及び／又はアミン反応性化学反応を介する架橋（コンジュゲーション）のために使用されうる。したがって、一部の態様では、カチオン性ポリマー組成物のカチオン性アミノ酸ポリマー（例えば、ポリ（アルギニン）（ＰＲ）、ポリ（リシン）（ＰＫ）、ポリ（ヒスチジン）（ＰＨ）、ポリ（オルニチン）、及びポリ（シトルリン）、ポリ（D-アルギニン）（ＰＤＲ）、ポリ（D-リシン）（ＰＤＫ）、ポリ（D-ヒスチジン）（ＰＤＨ）、ポリ（D-オルニチン）、及びポリ（D-シトルリン）、ポリ（L-アルギニン）（ＰＬＲ）、ポリ（L-リシン）（ＰＬＫ）、ポリ（L-ヒスチジン）（ＰＬＨ）、ポリ（L-オルニチン）及びポリ（L-シトルリン））は、システイン残基を含む。一部の場合、カチオン性アミノ酸ポリマーはＮ及び／又はＣ末端においてシステイン残基を含む。一部の場合、カチオン性アミノ酸ポリマーは内部システイン残基を含む。
【００９７】
一部の場合、カチオン性アミノ酸ポリマーは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）（以下により詳細に説明する）を含む（及び／又はこれとコンジュゲートする）。したがって、一部の態様では、カチオン性ポリマー組成物のカチオン性アミノ酸ポリマー（例えば、ポリ（アルギニン）（ＰＲ）、ポリ（リシン）（ＰＫ）、ポリ（ヒスチジン）（ＰＨ）、ポリ（オルニチン）、及びポリ（シトルリン）、ポリ（D-アルギニン）（ＰＤＲ）、ポリ（D-リシン）（ＰＤＫ）、ポリ（D-ヒスチジン）（ＰＤＨ）、ポリ（D-オルニチン）、及びポリ（D-シトルリン）、ポリ（L-アルギニン）（ＰＬＲ）、ポリ（L-リシン）（ＰＬＫ）、ポリ（L-ヒスチジン）（ＰＬＨ）、ポリ（L-オルニチン）、及びポリ（L-シトルリン））は、１つ以上（例．２つ以上、３つ以上又は４つ以上）のＮＬＳを含む（及び／又はこれとコンジュゲートする）。一部の場合、カチオン性アミノ酸ポリマーはＮ及び／又はＣ末端においてＮＬＳを含む。一部の場合、カチオン性アミノ酸ポリマーは内部ＮＬＳを含む。
【００９８】
ナノ粒子のカチオン性ポリペプチド組成物
一部の態様では、ナノ粒子のカチオン性ポリペプチド組成物は、安定性、細胞内コンパートメント化及び／又はペイロードの放出を媒介しうる。１つの例として述べると、本発明のナノ粒子のコア内の一般にヒストンテールペプチドと呼ばれるヒストンタンパク質のＮ末端の断片は、一部の場合には、例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ媒介型アセチル化の際のさまざまヒストン修飾により、脱プロトン化されうるだけでなく、また、ナノ粒子のコアの構成要素（例えば、ペイロード）の、効果的な核特異的アンパッキングも媒介しうる。一部の場合、カチオン性ポリペプチド組成物は、ヒストン及び／又はヒストンテールペプチド（例えば、カチオン性ポリペプチドは、ヒストン及び／又はヒストンテールペプチドでありうる）を含む。一部の場合、カチオン性ポリペプチド組成物は、ＮＬＳ含有ペプチド（例えば、カチオン性ポリペプチドは、ＮＬＳ含有ペプチドでありうる）を含む。一部の場合、カチオン性ポリペプチド組成物は、架橋を容易とするように、システイン残基により隔てられた、１つ以上のＮＬＳ含有ペプチドを含む。一部の場合、カチオン性ポリペプチド組成物は、ミトコンドリア局在化シグナルを含むペプチド（例えば、カチオン性ポリペプチドは、ミトコンドリア局在化シグナルを含むペプチドでありうる）を含む。
【００９９】
ナノ粒子の脱落層（脱落性コート）
一部の態様では、本発明のナノ粒子は、コアを取り囲む（これを封入する）脱落層（本明細書では「一過性安定化層」ともいう）を含む。一部の場合、本発明の脱落層は、初期の細胞への取込みの前及び取込み時にペイロードを保護しうる。例えば、脱落層を伴わなければ、ペイロードの大半は細胞内移行時に失われる。細胞内環境に入ると、脱落層は、「脱落」し（例えば、層は、ｐＨ（及び／又はグルタチオン）感受性でありうる）、コアの構成要素を露出させる。
【０１００】
一部の場合、本発明の脱落層はシリカを含む。一部の場合、本発明のナノ粒子が、脱落層（例えば、シリカによる）を含む場合、細胞への取込みの確率の低下にもかかわらず、大きな細胞送達効率が観察されうる。特定の理論に束縛されることを望まずに述べると、ナノ粒子のコアの脱落層（例えば、シリカコーティング）によるコーティングは、コアをシーリングすることが可能で、ペイロードの放出（例えば、意図された細胞内コンパートメント内のプロセシング時における）をもたらす層の脱落まで、コアを安定化させる。受容体媒介型エンドサイトーシスを介する細胞への侵入の後、ナノ粒子は、その最も外側の層を脱落させ、脱落層はエンドソームの酸性化環境又は細胞質ゾルの還元性環境において分解し、一部の場合、局在化シグナル、例えば、核局在化シグナル（ＮＬＳ）及び／又はミトコンドリア局在化シグナルを顕示するコアを露出させる。さらに、脱落層により封入されたナノ粒子のコアは、血清中で安定であることが可能であり、in vivoにおける投与に適しうる。
【０１０１】
任意の、所望の脱落層が使用される場合があり、当業者は、標的細胞内のどこで（例えば、どのような条件下で、例えば、低ｐＨ下で）（例えば、エンドソーム、細胞質ゾル、核、リソソームなど）ペイロードが放出されることを所望するのかについて考慮することができる。いつ、どこで、及び／又はどのような条件下で、脱落性コートが脱落する（かつ、これにより、ペイロードを放出する）ことが所望であるのかに応じて、異なる脱落層がより所望されうる。例えば、脱落層は、酸不安定性でありうる。一部の場合、脱落層は、アニオン性脱落層（アニオン性コート）である。一部の場合、脱落層は、シリカ、ペプトイド、ポリシステイン、及び／又はセラミック（例えば、バイオセラミック）を含む。一部の場合、脱落剤は、カルシウム、マンガン、マグネシウム、鉄（例えば、脱落層は、磁性層、例えば、Ｆｅ３ＭｎＯ２でありうる）、及びリチウムのうちの１つ以上を含む。これらの各々は、リン酸塩を含む場合もあり、硫酸塩を含む場合もある。このように、一部の場合、脱落剤は、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸マンガン、硫酸マンガン、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、リン酸鉄、硫酸鉄、リン酸リチウム、及び硫酸リチウムのうちの１つ以上を含み；これらの各々は、どのようにして、及び／又はどのような条件下で、脱落層が「脱落する」のかに対して、特定の効果を及ぼしうる。したがって、一部の場合、脱落層は、シリカ、ペプトイド、ポリシステイン、セラミック（例えば、バイオセラミック）、カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、酸化カルシウム、ヒドロキシアパタイト、マンガン、リン酸マンガン、硫酸マンガン、酸化マンガン、マグネシウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、鉄、リン酸鉄、硫酸鉄、酸化鉄、リチウム、リン酸リチウム、及び硫酸リチウム（これらの任意の組合せにおける）のうちの１つ以上を含む（例えば、脱落層は、シリカ、ペプトイド、ポリシステイン、セラミック（例えば、バイオセラミック）、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸マンガン、硫酸マンガン、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、リン酸鉄、硫酸鉄、リン酸リチウム、硫酸リチウム、又はこれらの組合せによるコーティングでありうる）。一部の場合、脱落層は、シリカを含む（例えば、脱落層は、シリカコートでありうる）。一部の場合、脱落層は、アルギン酸ゲルを含む。
【０１０２】
一部の場合、異なるペイロードに対する、異なる放出時間が所望される。例えば一部の場合、ペイロードを、早く（例えば、標的細胞に接触してから０．５〜７日以内に）放出することが所望され、一部の場合、ペイロードを、遅く（例えば標的細胞に接触してから６〜３０日以内に）放出することが所望される。例えば一部の場合、標的細胞に接触してから０．５〜７日以内に（例えば、標的細胞に接触してから０．５〜５日、０．５〜３日、１〜７日、１〜５日、又は１〜３日以内に）、ペイロード（例えば、第１のドナーＤＮＡ及び遺伝子編集ツール、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、前記ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ポリペプチド、及び／又は前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ポリペプチドをコードする核酸分子）を放出することが所望されてもよい。一部の場合、標的細胞に接触してから６〜４０日以内に（例えば、標的細胞に接触してから６〜３０、６〜２０、６〜１５、７〜４０、７〜３０、７〜２０、７〜１５、９〜４０、９〜３０、９〜２０、又は９〜１５日以内に）、ペイロード（例えば、第２のドナーＤＮＡ分子及びリコンビナーゼ又はこれらをコードする核酸）を放出することが所望されてもよい。一部の場合、放出時間は、異なるペイロードを有するナノ粒子を、異なる時点において送達することにより制御されうる。一部の場合、放出時間は、ナノ粒子を、同じ時点において送達することにより（異なる製剤の一部として、又は同じ製剤の一部として）制御されうるが、この場合、ナノ粒子の構成要素は、所望の放出時間を達成するようにデザインされる。例えば、速く又は遅く分解する脱落層、分解に対する抵抗性が大きいか、又は小さいコア構成要素、脱凝縮を受けやすいか、又は受けやすくないコア構成要素などを使用してもよい（かつ、構成要素のうちのいずれか又は全ては、所望のタイミングを達成するように、任意の好都合な組合せで選択されうる）。
【０１０３】
一部の場合、ペイロードは、異なる時点において放出されることが所望される。これは、多数の、異なる方式で達成されうる。例えば、ナノ粒子は、１つを超えるコアを有する場合があり、この場合、１つのコアは、ペイロード（例えば、第１のドナーＤＮＡ及び／又はゲノム編集ツール、例えば、ＺＦＰ又はＺＦＰをコードする核酸、ＴＡＬＥ又はＴＡＬＥをコードする核酸、ＺＦＮ又はＺＦＮをコードする核酸、ＴＡＬＥＮ又はＴＡＬＥＮをコードする核酸、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ又はＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ポリペプチド又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ポリペプチドをコードする核酸分子など）を、早く（例えば、標的細胞に接触してから０．５〜７日以内に、例えば、標的細胞に接触してから０．５〜５日、０．５〜３日、１〜７日、１〜５日、又は１〜３日以内に）放出しうる構成要素と共に作られ、他のコアは、ペイロード（例えば、第２のドナーＤＮＡ分子及び／又はリコンビナーゼ（又はこれらをコードする核酸））を、遅く（例えば、標的細胞に接触してから６〜４０日以内に、例えば、標的細胞に接触してから６〜３０、６〜２０、６〜１５、７〜４０、７〜３０、７〜２０、７〜１５、９〜４０、９〜３０、９〜２０、又は９〜１５日以内に）放出しうる構成要素と共に作られる。
【０１０４】
別の例として述べると、ナノ粒子は、１つを超える脱落層を含むことが可能であり、この場合、外側の脱落層は、内側の脱落層が脱落する（別のペイロードを放出する）前に、脱落する（ペイロードを放出する）。一部の場合、内側のペイロードは、第１のドナーＤＮＡ分子、及び１つ以上の遺伝子編集ツール（例えば、ＺＦＮ又はＺＦＮをコードする核酸、ＴＡＬＥＮ又はＴＡＬＥＮをコードする核酸、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ又はＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ポリペプチド又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ポリペプチドをコードする核酸分子など）であり、外側のペイロードは、第２のドナーＤＮＡ及び配列特異的リコンビナーゼ（又はこれらをコードする核酸）である。内側及び外側のペイロードは、任意の、所望のペイロードで有ることが可能であり、これらの一方又は両方は、例えば、１つ以上のｓｉＲＮＡ及び／又は１つ以上のｍＲＮＡを含みうる。このように、一部の場合、ナノ粒子は、１つを超える脱落層を有することが可能であり、１つのペイロード（例えば、ドナーＤＮＡ及び／又はゲノム編集ツール、例えば、ＺＦＰ又はＺＦＰをコードする核酸、ＴＡＬＥ又はＴＡＬＥをコードする核酸、ＺＦＮ又はＺＦＮをコードする核酸、ＴＡＬＥＮ又はＴＡＬＥＮをコードする核酸、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ又はＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ポリペプチド又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ポリペプチドをコードする核酸分子など）を、早く（例えば、標的細胞に接触してから０．５〜７日以内に、例えば、標的細胞に接触してから０．５〜５日、０．５〜３日、１〜７日、１〜５日、又は１〜３日以内に）放出し、別のペイロード（例えば、第２のドナーＤＮＡ分子及び／又はリコンビナーゼ）を、遅く（例えば、標的細胞に接触してから６〜４０日以内に、例えば、標的細胞に接触してから６〜３０、６〜２０、６〜１５、７〜４０、７〜３０、７〜２０、７〜１５、９〜４０、９〜３０、９〜２０、又は９〜１５日以内に）放出するようにデザインされうる。
【０１０５】
一部の態様（例えば上述した態様）では、変更された遺伝子発現の時点は、ペイロード放出時点の代用物として使用されうる。例として、ペイロードが１２日目までに放出されたのかどうかを決定することを所望する場合、１２日目にナノ粒子送達の所望の結果についてアッセイすることができる。例えば、所望の結果が目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を挿入することにより目的のタンパク質を発現させることであった場合、ペイロードが放出されたのかどうかを決定するの、目的のタンパク質の発現をアッセイ／モニタリングしてもよい。さらに別の例として述べると、所望の結果がゲノムＤＮＡの切断及び／又はドナーＤＮＡ分子の配列の挿入を介して標的細胞のゲノムを変更することであった場合、ペイロードが放出されたのかどうかを決定するのに、ターゲティングされた座位からの発現及び／又はゲノムの変更の存在をアッセイ／モニタリングしてもよい。
【０１０６】
このように、一部の場合、脱落層は、ナノ粒子構成要素の段階的放出をもたらす。例えば一部の場合、ナノ粒子は、１つを超える（例えば、２つ、３つ、又は４つの）脱落層を有する。例えば、２つの脱落層を伴うナノ粒子では、このようなナノ粒子は、最も内側から、最も外側へと、例えば、第１のペイロードを伴うコア；第１の脱落層、例えば、第２のペイロードを伴う中間層；及び中間層を取り囲む、第２の脱落層を有しうる（例．図３）。このような立体構成（複数の脱落層）は、多様な所望のペイロードの段階的放出を容易とする。別の例としては、２つの脱落層を伴う（上述した）ナノ粒子は、ドナーＤＮＡ及び／又はコア内の１つ以上の所望の遺伝子編集ツール（例えば、ドナーＤＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡをコードするＤＮＡなどのうちの１つ以上）、及び中間層内の、別の所望の遺伝子編集ツール（例えば、第２のドナーＤＮＡ及びリコンビナーゼ又はこれらをコードする核酸）（任意の、所望の組合せにおける）を含みうる。
【０１０７】
代替的なパッケージング（例．脂質製剤）
一部の態様では、（例えば上述した構成要素及び／又は構成の任意の組合せを含む）本発明のコアは、脂質ベースの送達システム、例えば、カチオン性脂質送達システム（例えば、Chesnoy and Huang, Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2000, 29:27-47；Hirko et al., Curr Med Chem. 2003 Jul 10(14):1185-93及びLiu et al., Curr Med Chem. 2003 Jul 10(14):1307-15を参照されたい）の一部である。一部の場合、（例えば上述した構成要素及び／又は構成の任意の組合せを含む）本発明のコアは、脱落層に取り囲まれていない。上述のとおり、コアは、アニオン性ポリマー組成物（例．ポリ（グルタミン酸））、カチオン性ポリマー組成物（例．ポリ（アルギニン）、カチオン性ポリペプチド組成物（例．ヒストンテールペプチド）及びペイロード（例．核酸及び／又はタンパク質のペイロード）を含みうる。
【０１０８】
コアが脂質ベースの送達システムの一部である場合には、徐放及び／又はポジショナルリリース（例えば、環境特異的放出）を伴うコアがデザインされる。例えば一部の場合、コアは、ＥＳＰ、ＥＮＰ及び／又はＥＰＰを含み、このような場合に、これらの構成要素は、所望の条件（例えば、細胞内の場所、細胞内の状態、例えば、ｐＨ、特定の酵素の存在など）に（例えば上述した）コアが遭遇するまで、ペイロードの放出が遅らせられるような比で存在することがある。このような態様の一部では、コアは、アニオン性アミノ酸のD-異性体のポリマー及びアニオン性アミノ酸のL-異性体のポリマーを含み、一部の場合、D-異性体及びL-異性体のポリマーは、（例えば上述した）特定の範囲の比で存在する。一部の場合、コアは、カチオン性アミノ酸のD-異性体のポリマー及びカチオン性アミノ酸のL-異性体のポリマーを含み、一部の場合、D-異性体及びL-異性体のポリマーは、（例えば上述した）特定の範囲の比で存在する。一部の場合、コアは、アニオン性アミノ酸のD-異性体のポリマー及びカチオン性アミノ酸のL-異性体のポリマーを含み、一部の場合、D-異性体及びL-異性体のポリマーは、（例えば上述した）特定の範囲の比で存在する。一部の場合、コアは、アニオン性アミノ酸のL-異性体のポリマー及びカチオン性アミノ酸のD-異性体のポリマーを含み、一部の場合、D-異性体及びL-異性体のポリマーは、（例えば本明細書の別の箇所で説明する）特定の範囲の比で存在する。一部の場合、コアは、（例えば本明細書の別の箇所で説明する）ＮＬＳを含むタンパク質を含む。一部の場合、コアは、（例えば本明細書の別の箇所で説明する）ＨＴＰを含む。
【０１０９】
カチオン性脂質は、遺伝子送達に使用されうる非ウイルス性ベクターであり、プラスミドＤＮＡを凝縮する能力を有する。リポフェクションのための、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウムの合成の後、ヘッド基、リンカー、及び疎水性ドメインの修飾を含む、カチオン性脂質の分子構造の改良が、活発な領域となっている。修飾は、表面電荷密度の増強、及び毒性を制限しうる、ステロールベースの疎水性基、例えば、3B-[N-(N’,N’-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]コレステロールの使用を介して、ＤＮＡへの結合及び送達を改善しうる、多価ポリアミンの使用を含んだ。ヘルパー脂質、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）は、リポソームの疎水性の増強及び六方晶逆相転移を介して、トランス遺伝子の発現を改善して、エンドソーム脱出を容易とするのに使用されうる。一部の場合、脂質製剤は、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、コレステロール、ＰＥＧ−脂質、リピドポリアミン；デキサメタゾン−スペルミン（ＤＳ）；及び二置換スペルミン（Ｄ２Ｓ）（例えば、デキサメタゾンとポリアミンスペルミンのコンジュゲーションにより得られる）のうちの１つ以上を含む。ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、及びＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡは、当技術分野で概括された方法により合成されうる（例えば、Heyes et. al, J. Control Release, 2005, 107, 276-287；Semple et. al, Nature Biotechnology, 2010, 28, 172-176；Akinc et. al, Nature Biotechnology, 2008, 26, 561-569；Love et. al, PNAS, 2010, 107, 1864-1869；国際公開第2010/054401号を参照されたい；これらの全ては、参照によりそれらの全体において、ここに組み込まれる）。
【０１１０】
多様な、脂質ベースの送達システムの例は、以下の刊行物：国際公開第2016/081029号；米国特許出願公開第2016/0263047号及び第2016/0237455号；並びに米国特許第9,533,047号；第9,504,747号；第9,504,651号；第9,486,538号；第9,393,200号；第9,326,940号；第9,315,828号；及び第9,308,267号に記載された送達システムを含むがこれらに限定されず；これらの全ては、参照によりそれらの全体において、ここに組み込まれる。
【０１１１】
このように、一部の場合、本発明のコアは、脂質（例えば、カチオン性脂質、例えば、LIPOFECTAMINEトランスフェクション試薬）により取り囲まれている。一部の場合、本発明のコアは、脂質製剤（例えば、脂質ナノ粒子製剤）中に存在する。脂質製剤は、リポソーム及び／又はリポプレックスを含みうる。脂質製剤は、Spontaneous Vesicle Formation by Ethanol Dilution（ＳＮＡＬＰ）リポソーム（例えば、カチオン性脂質を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び／又はプロタミンでコーティングされうる、中性ヘルパー脂質と併せて含む脂質製剤）を含みうる。
【０１１２】
脂質製剤は、リピドイドベースの製剤でありうる。リピドイドの合成については、広範に記載されており、これらの化合物を含有する製剤は、本発明の脂質製剤中に含まれる（例えば、Mahon et al., Bioconjug Chem. 2010 21:1448-1454；Schroeder et al., J Intern Med. 2010 267:9-21；Akinc et al., Nat Biotechnol. 2008 26:561-569；Love et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2010 107:1864-1869及びSiegwart et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2011 108:12996-3001を参照されたい；これらの全ては、参照によりそれらの全体において、ここに組み込まれる）。一部の場合、本発明の脂質製剤は、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）；1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；1,2-ジオレオイルオキシ-3-トリメチルアンモニウム-プロパン（ＤＯＴＡＰ）；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）；N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(ドデシルオキシ)-1（ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ）；プロパンアミニウムブロミド；セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）；6-ラウロキシヘキシルオルニチネート（ＬＨＯＮ）；1-(2,3-ジオレオイルオキシプロピル)-2,4,6-トリメチルピリジニウム（２Ｏｃ）；2,3-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミンカルボキサミド-エチル]-N,N-ジメチル−１（ＤＯＳＰＡ）；プロパンアミニウムトリフルオロアセテート；1,2-ジオレイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン（ＤＯＰＡ）；N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1（ＭＤＲＩＥ）；プロパンアミニウムブロミド；ジミリストキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩ）；3β-[N-(N’,N’-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル］コレステロールである、ＤＣ−Ｃｈｏｌ；ビス-グアニジウム-tren-コレステロール（ＢＧＴＣ）；1,3-ジオデオキシ-2-(6-カルボキシ-スペルミル)-プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）；ジメチルオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＳＬ）；rac-[(2,3-ジオクタデシルオキシプロピル)(2-ヒドロキシエチル)]-ジメチルアンモニウム（ＣＬＩＰ−１）；クロリドrac-[2(2,3-ジヘキサデシルオキシプロピルオキシメチルオキシ)エチル]トリメチルアンモニウムブロミド（ＣＬＩＰ−６）；エチルジミリストイルホスファチジルコリン（ＥＤＭＰＣ）；1,2-ジステアリルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）；1,2-ジミリストイル-トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）；O,O’-ジミリスチル-N-リシルアスパラギン酸（ＤＭＫＥ）；1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（ＤＳＥＰＣ）；N-パルミトイルD-エリスロ-スフィンゴシルカルバモイル-スペルミン（ＣＣＳ）；N-t-ブチル-N0-テトラデシル-3-テトラデシルアミノプロピオンアミジン；ジC14-アミジン；オクタデセノイルオキシ[エチル-2-ヘプタデセニル-3ヒドロキシエチル］イミダゾリニウム（ＤＯＴＩＭ）；クロリドN1-コレステリルオキシカルボニル-3,7-ジアザノナン-1,9-ジアミン（ＣＤＡＮ）；2-[3-[ビス(3-アミノプロピル)アミノ]プロピルアミノ]-N-[2-[ジ(テトラデシル)アミノ]-2-オキソエチル]アセトアミド（ＲＰＲ２０９１２０）；ジテトラデシルカルバモ��ルメチルアセトアミド；1,2-ジリノレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）；2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン；ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ；ジリノレイル-メチル-4-ジメチルアミノブチレート；ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ；ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ；９８Ｎ１２−５；Ｃ１２−２００；コレステロール；ＰＥＧ−脂質；リピドポリアミン；デキサメタゾン−スペルミン（ＤＳ）；及び二置換スペルミン（Ｄ２Ｓ）のうちの１つ以上（任意の、所望の組合せにおける）を含みうる。
【０１１３】
ナノ粒子の表面コート（外殻）
一部の場合、脱落層（コート）は、それ自体も、本明細書において「外殻」、「外側のコート」又は「表面コート」というさらなる層によりコーティングされる。表面コートは、複数の異なる機能を果たしうる。例えば、表面コートは、送達効率を増大させる場合もあり、及び／又は、本発明のナノ粒子を特定の細胞にターゲティングする場合もある。表面コートは、ペプチド、ポリマー又はリガンド−ポリマーコンジュゲートを含みうる。表面コートはターゲティングリガンドを含みうる。例えば、１つ以上のターゲティングリガンド（リンカードメインを伴うか、又は伴わない）の水溶液を、コーティングされたナノ粒子懸濁液（脱落層でコーティングされたナノ粒子の懸濁液）へと添加する。例えば一部の場合、プロトン化アンカリング残基（アンカードメインの）の最終濃度は、２５〜３００μＭの間である。一部の場合、表面コートを添加する工程は、平均値粒子サイズを５０〜１５０ｎｍの間とし、ゼータ電位を０〜−１０ｍＶの間とする粒子の単分散懸濁液をもたらす。
【０１１４】
一部の場合、表面コートは、最も外側の脱落層と静電相互作用する。例えば一部の場合、ナノ粒子は、２つの脱落層（例えば、最も内側から、最も外側へと、例えば、第１のペイロードを伴うコア；第１の脱落層、例えば、第２のペイロードを伴う中間層；及び中間層を取り囲む、第２の脱落層）を有し、外殻（表面コート）は、第２の脱落層と相互作用しうる（例えば、静電的に）。一部の場合、ナノ粒子は、１つの脱落層だけ（例えば、アニオン性シリカ層）を有し、一部の場合、外殻は、脱落層と静電相互作用しうる。
【０１１５】
したがって、脱落層（例えば、最も外側の脱落層）が、アニオン性である（例えば一部の場合、脱落層が、シリカコートである）場合、表面コートは、表面コートが、カチオン性構成要素を含む場合、脱落層と静電相互作用しうる。例えば一部の場合、表面コートは、送達分子を含み、この場合、ターゲティングリガンドは、カチオン性アンカードメインへとコンジュゲートされる。カチオン性アンカードメインは、脱落層と静電相互作用し、送達分子を、ナノ粒子へとアンカリングする。同様に、脱落層（例えば、最も外側の脱落層）が、カチオン性である場合、表面コートは、表面コートが、アニオン性構成要素を含む場合、脱落層と静電相互作用しうる。
【０１１６】
一部の態様では、表面コートは、細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）を含む。一部の場合、カチオン性アミノ酸のポリマーは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、又は小胞膜の横断を容易とするポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、又は有機若しくは無機化合物を指すのに使用される用語であるＣＰＰ（「タンパク質導入ドメイン」（ＰＴＤ）ともいう）として機能しうる。小型の極性分子〜大型の高分子及び／又はナノ粒子の範囲にわたりうる、別の分子（例えば、本発明のナノ粒子内に埋め込まれ、及び／又はこの脱落層と相互作用する）へと接合されたＰＴＤは、分子の膜の横断、例えば、細胞外空間から細胞内空間へ、又は細胞質ゾルから細胞小器官（例えば、核）内への横断を容易とする。
【０１１７】
ＣＰＰの例は、最小限のウンデカペプチドによるタンパク質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１６０）を含む、ＨＩＶ−１ ＴＡＴの残基４７〜５７に対応する）；細胞への直接的な侵入に十分な、多数のアルギニン（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又は１０〜５０のアルギニン）を含むポリアルギニン配列；ＶＰ２２ドメイン（Zender et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9(6):489-96）；ショウジョウバエ（Drosophila）属Antennapediaタンパク質導入ドメイン（Noguchi et al. (2003) Diabetes 52(7):1732-1737）；切断型ヒトカルシトニンペプチド（Trehin et al. (2004) Pharm. Research 21:1248-1256）；ポリリシン（Wender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13003-13008）；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号１６１）；トランスポルタンであるＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号１６２）；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号１６３）；及びＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１６４）を含むが、これらに限定されるものではない。代表的なＣＰＰは、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１６０）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１６５）、３アルギニン残基〜５０アルギニン残基のアルギニンホモポリマー、ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号１６６）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号１６７）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号１６８）、及びＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号１６９）を含むが、これらに限定されるものではない。一部の態様では、ＣＰＰは、活性化型ＣＰＰ（ＡＣＰＰ）（Aguilera et al. (2009) Integr Biol (Camb) June; 1(5-6): 371-381）である。ＡＣＰＰは、切断性リンカーを介して、マッチするポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９又は「Ｅ９」）と接続された、ポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９又は「Ｒ９」）を含み、これにより、正味の電荷を、ゼロ近くまで低減し、これにより、細胞への接着及び取込みを阻害する。リンカーが切断されると、ポリアニオンが放出され、ポリアルギニン及びその固有の接着性の遮蔽を局所的に解除し、これにより、ＡＣＰＰ「を活性化させ」て、膜を横断させる。
【０１１８】
一部の場合、ＣＰＰは、コーティングされたコア（脱落層により取り囲まれたコア）を、ＣＰＰを含む組成物（例えば、溶液）と接触させることにより、ナノ粒子に添加してもよい。次いで、ＣＰＰは、脱落層と（例えば、静電的に）相互作用してもよい。
【０１１９】
一部の場合、表面コートは、カチオン性アミノ酸のポリマー（例えば、ポリ（アルギニン）、例えば、ポリ（L-アルギニン）及び／又はポリ（D-アルギニン）、ポリ（リシン）、例えば、ポリ（L-リシン）及び／又はポリ（D-リシン）、ポリ（ヒスチジン）、例えば、ポリ（L-ヒスチジン）及び／又はポリ（D-ヒスチジン）、ポリ（オルニチン）、例えば、ポリ（L-オルニチン）及び／又はポリ（D-オルニチン）、ポリ（シトルリン）、例えば、ポリ（L-シトルリン）及び／又はポリ（D-シトルリン）など）を含む。このように、一部の場合、表面コートは、ポリ（アルギニン）、例えば、ポリ（L-アルギニン）を含む。
【０１２０】
一部の態様では、表面コートは、ヘプタペプチド、例えば、セランク（ＴＫＰＲＰＧＰ：配列番号１４７）（例えば、N-アセチルセランク）及び／又はセマックス（ＭＥＨＦＰＧＰ：配列番号１４８）（例えば、N-アセチルセマックス）を含む。このように、一部の場合、表面コートは、セランク（例えば、N-アセチルセランク）を含む。一部の場合、表面コートは、セマックス（例えば、N-アセチルセマックス）を含む。
【０１２１】
一部の態様では、表面コートは、送達分子を含む。送達分子は、ターゲティングリガンドを含み、一部の場合、ターゲティングリガンドは、アンカードメイン（例えば、カチオン性アンカードメイン又はアニオン性アンカードメイン）へとコンジュゲートされる。一部の場合、ターゲティングリガンドは、介在リンカーを介して、アンカードメイン（例えば、カチオン性アンカードメイン又はアニオン性アンカードメイン）へとコンジュゲートされる。
【０１２２】
多価表面コート
一部の場合、表面コートは、（ｉ）上記に記載されたポリマーのうちの１つ以上、（ｉｉ）１つ以上のターゲティングリガンド、１つ以上のＣＰＰ、及び１つ以上のヘプタペプチドのうちのいずれか１つ以上（任意の、所望の組合せにおける）を含む。例えば一部の場合、表面コートは、１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上）のターゲティングリガンドを含みうるが、また、上記に記載されたカチオン性ポリマーのうちの１つ以上も含みうる。一部の場合、表面コートは、１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上）のターゲティングリガンドを含みうるが、また、１つ以上のＣＰＰも含みうる。さらに、表面コートは、ステルスの機能性を促進する、すなわち、血清タンパク質の吸着及び補体活性を防止する、糖ペプチドの任意の組合せを含みうる。これは、プロパルギル修飾残基を含有するペプチドを、シアル酸、ノイラミニン酸などの、アジド含有誘導体へとカップリングさせる、アジド−アルキンクリック化学反応を介して達せられうる。
【０１２３】
一部の場合、表面コートは、ＣＤ３４及びヘパリン硫酸プロテオグリカンと結合するターゲティングリガンドの組合せを含む。例えば、ポリ（L-アルギニン）は、ヘパリン硫酸プロテオグリカンと結合するように、表面コートの一部として使用されうる。このように、一部の場合、ナノ粒子を、カチオン性ポリマー（例えば、ポリ（L-アルギニン））で表面コーティングした後で、コーティングされたナノ粒子を、ヒアルロン酸と共にインキュベートし、これにより、両性イオン性であり、かつ、多価である表面を形成する。
【０１２４】
一部の態様では、表面コートは、多価である。多価表面コートは、２つ以上のターゲティングリガンド（例えば、異なるリガンドを含む、２つ以上の送達分子）を含む表面コートである。多量体の（この場合、三量体の）表面コート（外殻）の例は、ターゲティングリガンドである幹細胞因子（ＳＣＦ）（また、ＣＤ１１７としても公知のｃ−Ｋｉｔ受容体をターゲティングする）、ＣＤ７０（ＣＤ２７をターゲティングする）、及びＳＨ２ドメイン含有タンパク質１Ａ（ＳＨ２Ｄ１Ａ）（ＣＤ１５０をターゲティングする）を含む表面コートである。例えば一部の場合、造血幹細胞（ＨＳＣ）［ＫＬＳ（ｃ−Ｋｉｔ＋Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋）及びＣＤ２７＋／ＩＬ−７Ｒａ−／ＣＤ１５０＋／ＣＤ３４−］をターゲティングするために、本発明のナノ粒子は、それぞれ、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ２７、及びＣＤ１５０をターゲティングする、ターゲティングリガンドであるＳＣＦ、ＣＤ７０、及びＳＨ２ドメイン含有タンパク質１Ａ（ＳＨ２Ｄ１Ａ）の組合せ（例えば、表１を参照されたい）を含む表面コートを含む。一部の場合、このような表面コートは、他のリンパ系及び骨髄系の前駆細胞にもまして、ＨＳＰＣ及び長期ＨＳＣ（ｃ−Ｋｉｔ＋／Ｌｉｎ−／Ｓｃａ−１＋／ＣＤ２７＋／ＩＬ−７Ｒａ−／ＣＤ１５０＋／ＣＤ３４−）を、選択的ターゲティングしうる。
【０１２５】
一部の代表的な態様では、３つのターゲティングリガンド全て（ＳＣＦ、ＣＤ７０及びＳＨ２Ｄ１Ａ）は、カチオン性アンカードメイン（例えば、６Ｈのようなポリヒスチジン、９Ｒのようなポリアルギニンなど）への融合を介してナノ粒子にアンカリングされる。例えば、（１）ターゲティングポリペプチドであるＳＣＦ（ｃ−Ｋｉｔ受容体をターゲティング）は、
【０１２６】
【化１】
2021521825.tif 000003
【０１２７】
［配列中、Ｘはカチオン性アンカードメイン（例えば、６Ｈのようなポリヒスチジン、９Ｒのようなポリアルギニンなど）で、場合によっては、Ｎ末端及び／又はＣ末端に存在し、また、ポリペプチド配列内に包埋される］を含んでもよく；（２）ターゲティングポリペプチドであるＣＤ７０（ＣＤ２７をターゲティング）は、
【０１２８】
【化２】
2021521825.tif 000004
【０１２９】
［配列中、Ｘはカチオン性アンカードメイン（例えば、６Ｈのようなポリヒスチジン、９Ｒのようなポリアルギニンなど）で、場合によっては、Ｎ末端及び／又はＣ末端に存在し、また、ポリペプチド配列内に包埋される］を含んでもよく；（３）ターゲティングポリペプチドであるＳＨ２Ｄ１Ａ（ＣＤ１５０をターゲティング）は、
【０１３０】
【化３】
2021521825.tif 000005
【０１３１】
［配列中、Ｘは、例えば一部の場合、Ｎ及び／又はＣ末端に存在する場合もあり、ポリペプチド配列内に包埋される場合もある、カチオン性アンカードメイン（例えば、ポリヒスチジン、例えば、６Ｈ、ポリアルギニン、例えば、９Ｒなど）である］（例えば、
【０１３２】
【化４】
2021521825.tif 000006
【０１３３】
）を含みうる。
【０１３４】
上述のとおり、本開示のナノ粒子は、所望の細胞をターゲティングするために、又は所望の細胞の組合せをターゲティングするために、複数のターゲティングリガンド（表面コートの一部としての）を含みうる。マウス及びヒトの造血細胞系統内の、目的の細胞の例は、これらの細胞について同定されているマーカーと共に、図７〜８に示される。例えば、目的の細胞表面マーカーの多様な組合せは、［マウス］（ｉ）ＣＤ１５０；（ｉｉ）Ｓｃａ１、ｃＫｉｔ、ＣＤ１５０；（ｉｉｉ）ＣＤ１５０及びＣＤ４９ｂ；（ｉｖ）Ｓｃａ１、ｃＫｉｔ、ＣＤ１５０、及びＣＤ４９ｂ；（ｖ）ＣＤ１５０及びＦｌｔ３；（ｖｉ）Ｓｃａ１、ｃＫｉｔ、ＣＤ１５０、及びＦｌｔ３；（ｖｉｉ）Ｆｌｔ３及びＣＤ３４；（ｖｉｉｉ）Ｆｌｔ３、ＣＤ３４、Ｓｃａ１、及びｃＫｉｔ；（ｉｘ）Ｆｌｔ３及びＣＤ１２７；（ｘ）Ｓｃａ１、ｃＫｉｔ、Ｆｌｔ３、及びＣＤ１２７；（ｘｉ）ＣＤ３４；（ｘｉｉ）ｃＫｉｔ及びＣＤ３４；（ｘｉｉｉ）ＣＤ１６／３２及びＣＤ３４；（ｘｉｖ）ｃＫｉｔ、ＣＤ１６／３２、及びＣＤ３４；及び（ｘｖ）ｃＫｉｔ；及び［ヒト］（ｉ）ＣＤ９０及びＣＤ４９ｆ；（ｉｉ）ＣＤ３４、ＣＤ９０、及びＣＤ４９ｆ；（ｉｉｉ）ＣＤ３４；（ｉｖ）ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ１０；（ｖ）ＣＤ３４、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＤ１０；（ｖｉ）ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ１３５；（ｖｉｉ）ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＤ１３５；（ｖｉｉｉ）ＣＤ１３５；（ｉｘ）ＣＤ３４、ＣＤ３８、及びＣＤ１３５；及び（ｘ）ＣＤ３４及びＣＤ３８を含むが、これらに限定されるものではない。したがって、一部の場合、表面コートは、［マウス］（ｉ）ＣＤ１５０；（ｉｉ）Ｓｃａ１、ｃＫｉｔ、ＣＤ１５０；（ｉｉｉ）ＣＤ１５０及びＣＤ４９ｂ；（ｉｖ）Ｓｃａ１、ｃＫｉｔ、ＣＤ１５０、及びＣＤ４９ｂ；（ｖ）ＣＤ１５０及びＦｌｔ３；（ｖｉ）Ｓｃａ１、ｃＫｉｔ、ＣＤ１５０、及びＦｌｔ３；（ｖｉｉ）Ｆｌｔ３及びＣＤ３４；（ｖｉｉｉ）Ｆｌｔ３、ＣＤ３４、Ｓｃａ１、及びｃＫｉｔ；（ｉｘ）Ｆｌｔ３及びＣＤ１２７；（ｘ）Ｓｃａ１、ｃＫｉｔ、Ｆｌｔ３、及びＣＤ１２７；（ｘｉ）ＣＤ３４；（ｘｉｉ）ｃＫｉｔ及びＣＤ３４；（ｘｉｉｉ）ＣＤ１６／３２及びＣＤ３４；（ｘｉｖ）ｃＫｉｔ、ＣＤ１６／３２、及びＣＤ３４；及び（ｘｖ）ｃＫｉｔ；及び［ヒト］（ｉ）ＣＤ９０及びＣＤ４９ｆ；（ｉｉ）ＣＤ３４、ＣＤ９０、及びＣＤ４９ｆ；（ｉｉｉ）ＣＤ３４；（ｉｖ）ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ１０；（ｖ）ＣＤ３４、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＤ１０；（ｖｉ）ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ１３５；（ｖｉｉ）ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＤ１３５；（ｖｉｉｉ）ＣＤ１３５；（ｉｘ）ＣＤ３４、ＣＤ３８、及びＣＤ１３５；及び（ｘ）ＣＤ３４及びＣＤ３８から選択される表面タンパク質又は表面タンパク質の組合せとの結合をもたらす１つ以上のターゲティングリガンドを含む。本発明のナノ粒子は、１つを超えるターゲティングリガンドを含むことが可能であり、一部の細胞は、マーカーの重複を含むため、複数の異なる細胞は、表面コートの組合せを使用してターゲティングされる場合があり、例えば、ある場合には、表面コートは、１つの特定の細胞をターゲティングしうるが、他の場合には、表面コートは、１つを超える特定の細胞（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上の細胞）をターゲティングしうる。例えば、造血系統内の細胞の、任意の組合せがターゲティングされうる。例としては、（ＣＤ３４と結合するターゲティングリガンドを使用する）ＣＤ３４へのターゲティングは、ナノ粒子によるペイロードの造血系統内のいくつかの異なる細胞への送達をもたらしうる（例．図７〜８）。
【０１３５】
送達分子
（ｉ）タンパク質若しくは核酸のペイロード、又は（ｉｉ）帯電ポリマーであるポリペプチドドメインと結合したターゲティングリガンド（ペプチド）を含む送達分子が提供される。ターゲティングリガンドは、（ｉ）細胞表面タンパク質への、ターゲティングされた結合と、一部の場合、（ｉｉ）長期エンドソームリサイクリング経路への関与とをもたらす。一部の場合、ターゲティングリガンドが、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインへとコンジュゲートされると、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインは、核酸ペイロード及び／又はタンパク質ペイロードと相互作用する（例えば、これと共に凝縮される）。一部の場合、ターゲティングリガンドは、介在リンカーを介してコンジュゲートされる。異なる、可能なコンジュゲーション戦略（すなわち、本発明の送達分子の構成要素の、異なる、可能な配置）の例については、図５Ａ〜Ｄを参照されたい。一部の場合、ターゲティングリガンドは細胞表面タンパク質と結合するが、長期エンドソームリサイクリング経路への関与は必ずしももたらさない。したがって、また、タンパク質若しくは核酸のペイロードと結合するか、又は帯電ポリマーであるポリペプチドドメインと結合したターゲティングリガンド（例．ペプチドであるターゲティングリガンド）であって、細胞表面タンパク質と結合する（が、長期エンドソームリサイクリング経路への関与は、必ずしももたらさない）ターゲティングリガンドを含む送達分子も提供される。
【０１３６】
一部の場合、ここで開示される送達分子は、核酸又はタンパク質ペイロードが、その細胞外標的に到達し（例えば、細胞表面タンパク質と結合することにより）、優先的に、リソソーム内で破壊されたり、又は「短期」エンドソームリサイクリング型エンドソームへと隔離されたりすることがないようにデザインされる。代わりに、本開示の送達分子は、エンドソーム脱出、及び／又はエンドソームの細胞小器官との融合を可能としうる、「長期」（間接的／緩徐）エンドソームリサイクリング経路の関与をもたらしうる。
【０１３７】
例えば一部の場合、β−アレスチンは、７回膜貫通型ＧＰＣＲ（McGovern et al., Handb Exp Pharmacol. 2014;219:341-59；Goodman et al., Nature. 1996 Oct 3;383(6599):447-50；Zhang et al., J Biol Chem. 1997 Oct 24;272(43):27005-14、及び／又は１回膜貫通型受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の、アクチン細胞骨格（例えば、エンドサイトーシス時における）からの切断を媒介し、所望のエンドソーム分取経路を誘発することに関与する。したがって、一部の態様では、本開示の送達分子のターゲティングリガンドは、細胞表面タンパク質への結合時のβ−アレスチンの関与（例えば、シグナル伝達にバイアスをもたらし、オーソステリックの結合後におけるエンドサイトーシスを介して、細胞内移行を促進する）をもたらす。
【０１３８】
帯電ポリマーであるポリペプチドドメイン
一部の場合、ターゲティングリガンド（例えば、本発明の送達分子の）は、帯電ポリマーであるポリペプチドドメイン（アンカードメイン、例えば、カチオン性アンカードメイン又はアニオン性アンカードメイン）（例えば、図４及び図５Ａ〜Ｄを参照されたい）へとコンジュゲートされる。帯電ポリマーであるポリペプチドドメインは、反復残基（例えば、カチオン性残基、例えば、アルギニン、リシン、ヒスチジン）を含みうる。一部の場合、帯電ポリマーであるポリペプチドドメイン（アンカードメイン）のアミノ酸長は、３〜３０（例えば、３〜２８、３〜２５、３〜２４、３〜２０、４〜３０、４〜２８、４〜２５、４〜２４又は４〜２０；又は例えば、４〜１５、４〜１２、５〜３０、５〜２８、５〜２５、５〜２０、５〜１５、５〜１２）である。一部の場合、帯電ポリマーであるポリペプチドドメイン（アンカードメイン）のアミノ酸長は４〜２４である。一部の場合、帯電ポリマーであるポリペプチドドメイン（アンカードメイン）のアミノ酸長は５〜１０である。帯電ポリマーであるポリペプチドドメインの適切な例は、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（９Ｒ）（配列番号１５）及びＨＨＨＨＨＨ（６Ｈ）（配列番号１６）を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１３９】
帯電ポリマーであるポリペプチドドメイン（カチオン性アンカードメイン、アニオン性アンカードメイン）は、任意の好都合な帯電ドメイン（例えば、カチオン性帯電ドメイン）でありうる。例えば、このようなドメインは、ヒストンテールペプチド（ＨＴＰ）（本明細書の別の箇所でより詳細に説明する）でありうる。一部の場合、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインは、ヒストン及び／又はヒストンテールペプチド（例えば、カチオン性ポリペプチドは、ヒストン及び／又はヒストンテールペプチドでありうる）を含む。一部の場合、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインは、ＮＬＳ含有ペプチド（例えば、カチオン性ポリペプチドは、ＮＬＳ含有ペプチドでありうる）を含む。一部の場合、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインは、ミトコンドリア局在化シグナルを含むペプチド（例えば、カチオン性ポリペプチドは、ミトコンドリア局在化シグナルを含むペプチドでありうる）を含む。
【０１４０】
一部の場合、本発明の送達分子の、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインは、送達分子が、ペイロード（例えば、核酸ペイロード及び／又はタンパク質ペイロード）と相互作用する（例えば凝縮のために、例えば静電相互作用する）ための方途として使用される。
【０１４１】
一部の場合、本発明の送達分子の、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインは、例えば、ターゲティングリガンドが、ナノ粒子を、所望の細胞／細胞表面タンパク質へとターゲティングする（例えば、図４を参照されたい）のに使用されるように、送達分子を伴うナノ粒子のコート表面へのアンカーとして使用される。したがって、一部の場合、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインは、ナノ粒子の帯電安定化層と静電相互作用する。例えば一部の場合、ナノ粒子は、安定化層（例えば、シリカ、ペプトイド、ポリシステイン、又はリン酸カルシウムコーティング）により取り囲まれたコア（例えば、核酸、タンパク質、及び／又はリボ核タンパク質の複合体であるペイロードを含む）を含む。一部の場合、安定化層は、負の電荷を有し、したがって、正に帯電したポリマーであるポリペプチドドメインは、安定化層と相互作用し、送達分子を、ナノ粒子へと、効果的にアンカリングし、ナノ粒子表面を、本発明のターゲティングリガンドでコーティングしうる（例えば、図４を参照されたい）。一部の場合、安定化層は、正の電荷を有し、したがって、負に帯電したポリマーであるポリペプチドドメインは、安定化層と相互作用し、送達分子を、ナノ粒子へと、効果的にアンカリングし、ナノ粒子表面を、本発明のターゲティングリガンドでコーティングしうる。コンジュゲーションは、任意の好都合な技法により達せられる場合があり、当業者には、多くの異なるコンジュゲーション化学反応が公知であろう。一部の場合、コンジュゲーションは、スルフヒドリル化学反応（例．ジスルフィド結合）を介する。一部の場合、コンジュゲーションは、アミン反応性化学反応を使用して達せられる。一部の場合、ターゲティングリガンドと、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインとは、同じポリペプチドの一部であることによりコンジュゲートされる。
【０１４２】
一部の場合、帯電ポリマーであるポリペプチドドメイン（カチオン性）は、ポリ（アルギニン）（ＰＲ）、ポリ（リシン）（ＰＫ）、ポリ（ヒスチジン）（ＰＨ）、ポリ（オルニチン）、ポリ（シトルリン）及びこれらの組合せから選択されるポリマーを含みうる。一部の場合、所与のカチオン性アミノ酸ポリマーは、アルギニン、リシン、ヒスチジン、オルニチン及びシトルリン残基（任意の好都合な組合せにおける）のミックスを含みうる。ポリマーは、L-異性体のポリマーとして存在する場合もあり、D-異性体のポリマーとして存在する場合もあり、ここで、D-異性体は分解に長くかかるため、標的細胞内でより安定である。したがって、D-異性体のポリ（アミノ酸）の組入れは分解（及びその後のペイロードの放出）を遅らせる。したがって、ペイロード放出速度は制御される場合があり、D-異性体のポリマー対L-異性体のポリマーの比に比例し、ここで、D-異性体対L-異性体の比はペイロード放出の持続時間を増大させる（すなわち放出速度を減少させる）。言い換えれば、D-異性体とL-異性体との相対量は、ナノ粒子のコアの徐放動態並びに分解への酵素感受性及びペイロード放出をモジュレートしうる。
【０１４３】
一部の場合、カチオン性ポリマーは、カチオン性アミノ酸ポリマーのD-異性体及びL-異性体（例えば、ポリ（アルギニン）（ＰＲ）、ポリ（リシン）（ＰＫ）、ポリ（ヒスチジン）（ＰＨ）、ポリ（オルニチン）、ポリ（シトルリン））を含む。一部の場合、D-異性体対L-異性体の比は、１０：１〜１：１０（例えば、８：１〜１：１０、６：１〜１：１０、４：１〜１：１０、３：１〜１：１０、２：１〜１：１０、１：１〜１：１０、１０：１〜１：８、８：１〜１：８、６：１〜１：８、４：１〜１：８、３：１〜１：８、２：１〜１：８、１：１〜１：８、１０：１〜１：６、８：１〜１：６、６：１〜１：６、４：１〜１：６、３：１〜１：６、２：１〜１：６、１：１〜１：６、１０：１〜１：４、８：１〜１：４、６：１〜１：４、４：１〜１：４、３：１〜１：４、２：１〜１：４、１：１〜１：４、１０：１〜１：３、８：１〜１：３、６：１〜１：３、４：１〜１：３、３：１〜１：３、２：１〜１：３、１：１〜１：３、１０：１〜１：２、８：１〜１：２、６：１〜１：２、４：１〜１：２、３：１〜１：２、２：１〜１：２、１：１〜１：２、１０：１〜１：１、８：１〜１：１、６：１〜１：１、４：１〜１：１、３：１〜１：１、又は２：１〜１：１）の範囲にある。
【０１４４】
したがって、一部の場合、カチオン性ポリマーは、D-異性体（例えば、ポリ（D-アルギニン）、ポリ（D-リシン）、ポリ（D-ヒスチジン）、ポリ（D-オルニチン）、及びポリ（D-シトルリン）から選択される）のポリマーである第１のカチオン性ポリマー（例．アミノ酸ポリマー）を含み；L-異性体（例えば、ポリ（L-アルギニン）、ポリ（L-リシン）、ポリ（L-ヒスチジン）、ポリ（L-オルニチン）、及びポリ（L-シトルリン）から選択される）のポリマーである第２のカチオン性ポリマー（例．アミノ酸ポリマー）を含む。一部の場合、第１のカチオン性ポリマー（D-異性体）対第２のカチオン性ポリマー（L-異性体）の比は、１０：１〜１：１０（例えば、８：１〜１：１０、６：１〜１：１０、４：１〜１：１０、３：１〜１：１０、２：１〜１：１０、１：１〜１：１０、１０：１〜１：８、８：１〜１：８、６：１〜１：１０、４：１〜１：１０、３：１〜１：１０、２：１〜１：１０、１：１〜１：１０、１０：１〜１：８、８：１〜１：８、６：１〜１：８、４：１〜１：８、３：１〜１：８、２：１〜１：８、１：１〜１：８、１０：１〜１：６、８：１〜１：６、６：１〜１：６、４：１〜１：６、３：１〜１：６、２：１〜１：６、１：１〜１：６、１０：１〜１：４、８：１〜１：４、６：１〜１：４、４：１〜１：４、３：１〜１：４、２：１〜１：４、１：１〜１：４、１０：１〜１：３、８：１〜１：３、６：１〜１：３、４：１〜１：３、３：１〜１：３、２：１〜１：３、１：１〜１：３、１０：１〜１：２、８：１〜１：２、６：１〜１：２、４：１〜１：２、３：１〜１：２、２：１〜１：２、１：１〜１：２、１０：１〜１：１、８：１〜１：１、６：１〜１：１、４：１〜１：１、３：１〜１：１、又は２：１〜１：１）の範囲にある。
【０１４５】
一部の態様では、カチオン性ポリマーは、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（アスパルタミド）、ポリペプトイド（例えば、コア凝縮のために「スパイダーウェブ」様分枝を形成するための）ポリペプトイド、電荷官能化ポリエステル、カチオン性多糖、アセチル化されたアミノ糖、キトサン、又はこれらの任意の組合せを含む（例えば、直鎖形態又は分枝形態の）カチオン性ポリマーを含む（例えば、カチオン性ポリマーの前出の例のうちのいずれかに加えて、又はこの代わりに）。
【０１４６】
一部の態様では、カチオン性ポリマーは、１〜２００ｋＤａ（例えば、１〜１５０、１〜１００、１〜５０、５〜２００、５〜１５０、５〜１００、５〜５０、１０〜２００、１０〜１５０、１０〜１００、１０〜５０、１５〜２００、１５〜１５０、１５〜１００、又は１５〜５０ｋＤａ）の分子量を有しうる。例として述べると、一部の場合、カチオン性ポリマーは、例えば、分子量約２９ｋＤａのポリ（L-アルギニン）を含む。別の例として述べると、一部の場合、カチオン性ポリマーは分子量約２５ｋＤａ（ＰＥＩ）の直鎖状ポリ（エチレンイミン）を含む。別の例として述べると、一部の場合、カチオン性ポリマーは分子量約１０ｋＤａの分枝状ポリ（エチレンイミン）を含む。別の例として述べると、一部の場合、カチオン性ポリマーは分子量約７０ｋＤａの分枝状ポリ（エチレンイミン）を含む。一部の場合、カチオン性ポリマーは、ＰＡＭＡＭを含む。
【０１４７】
一部の場合、カチオン性アミノ酸ポリマーは、例えば、リンカー、ＮＬＳ、及び／又はカチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストン又はＨＴＰ）との結合を促進するシステイン残基を含む。例えば、システイン残基は、スルフヒドリル化学反応（例．ジスルフィド結合）及び／又はアミン反応性化学反応を介する架橋（コンジュゲーション）のために使用されうる。したがって、一部の態様では、カチオン性ポリマー組成物のカチオン性アミノ酸ポリマー（例えば、ポリ（アルギニン）（ＰＲ）、ポリ（リシン）（ＰＫ）、ポリ（ヒスチジン）（ＰＨ）、ポリ（オルニチン）、及びポリ（シトルリン）、ポリ（D-アルギニン）（ＰＤＲ）、ポリ（D-リシン）（ＰＤＫ）、ポリ（D-ヒスチジン）（ＰＤＨ）、ポリ（D-オルニチン）、及びポリ（D-シトルリン）、ポリ（L-アルギニン）（ＰＬＲ）、ポリ（L-リシン）（ＰＬＫ）、ポリ（L-ヒスチジン）（ＰＬＨ）、ポリ（L-オルニチン）、及びポリ（L-シトルリン））は、システイン残基を含む。一部の場合、カチオン性アミノ酸ポリマーは、Ｎ及び／又はＣ末端において、システイン残基を含む。一部の場合、カチオン性アミノ酸ポリマーは、内部システイン残基を含む。
【０１４８】
一部の場合、カチオン性アミノ酸ポリマーは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）（以下により詳細に説明する）を含む（及び／又はこれとコンジュゲートする）。したがって、一部の態様では、カチオン性アミノ酸ポリマー（例えば、ポリ（アルギニン）（ＰＲ）、ポリ（リシン）（ＰＫ）、ポリ（ヒスチジン）（ＰＨ）、ポリ（オルニチン）、及びポリ（シトルリン）、ポリ（D-アルギニン）（ＰＤＲ）、ポリ（D-リシン）（ＰＤＫ）、ポリ（D-ヒスチジン）（ＰＤＨ）、ポリ（D-オルニチン）、及びポリ（D-シトルリン）、ポリ（L-アルギニン）（ＰＬＲ）、ポリ（L-リシン）（ＰＬＫ）、ポリ（L-ヒスチジン）（ＰＬＨ）、ポリ（L-オルニチン）、及びポリ（L-シトルリン））は、１つ以上（例．２つ以上、３つ以上又は４つ以上）のＮＬＳを含む。一部の場合、カチオン性アミノ酸ポリマーは、Ｎ及び／又はＣ末端において、ＮＬＳを含む。一部の場合、カチオン性アミノ酸ポリマーは、内部ＮＬＳを含む。
【０１４９】
一部の場合、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインは、核酸ペイロード及び／又はタンパク質ペイロードと共に凝縮される（例えば、図５Ａ〜Ｄを参照されたい）。一部の場合、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインは、タンパク質ペイロードと静電相互作用する。一部の場合、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインは、シリカ、塩、及び／又はアニオン性ポリマーと共に共凝縮され、エンドソーム緩衝能、安定性、及び、例えば、任意の徐放を付加される。一部の場合、本発明の送達分子の、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインは、例えば、約４〜２５アミノ酸の長さ又は４〜１５アミノ酸の長さの、反復するカチオン性残基（例えば、アルギニン、リシン、及び／又はヒスチジン）の連なりである。このようなドメインは、送達分子が、アニオン性脱落性マトリックス（例えば、共凝縮されたアニオン性ポリマー）と静電相互作用することを可能としうる。したがって、一部の場合、本発明の送達分子の帯電ポリマーであるポリペプチドドメインは、アニオン性脱落性マトリックス、並びに核酸及び／又はタンパク質のペイロードと（例えば、静電）相互作用する、反復するカチオン性残基の連なりである。したがって、一部の場合、本発明の送達分子は、ペイロード（例えば、核酸及び／又はタンパク質）と相互作用し、アニオン性ポリマーを伴う組成物の一部として存在する（例えば、ペイロード及びアニオン性ポリマーと共に、共凝縮される）。
【０１５０】
アニオン性脱落性マトリックスのアニオン性ポリマー（すなわち、本発明の送達分子の、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインと相互作用するアニオン性ポリマー）は、任意の好都合なアニオン性ポリマー／ポリマー組成物でありうる。例は、ポリ（グルタミン酸）（例えば、ポリ（D-グルタミン酸）（ＰＤＥ）、ポリ（L-グルタミン酸）（ＰＬＥ）、さまざまな所望の比のＰＤＥとＰＬＥの両者など）を含むが、これらに限定されるものではない。一部の場合、ＰＤＥは、アニオン性脱落性マトリックスとして使用される。一部の場合、ＰＬＥは、アニオン性脱落性マトリックス（アニオン性ポリマー）として使用される。一部の場合、ＰＤＥは、アニオン性脱落性マトリックス（アニオン性ポリマー）として使用される。一部の場合、ＰＤＥとＰＬＥの両方は、例えば、１：１の比（５０％のＰＤＥ、５０％のＰＬＥ）で、アニオン性脱落性マトリックス（アニオン性ポリマー）として使用される。
【０１５１】
アニオン性ポリマー
アニオン性ポリマーは、１つ以上のアニオン性アミノ酸ポリマーを含みうる。例えば一部の場合、本発明のアニオン性ポリマー組成物は、ポリ（グルタミン酸）（ＰＥＡ）、ポリ（アスパラギン酸）（ＰＤＡ）及びこれらの組合せから選択されるポリマーを含む。一部の場合、所与のアニオン性アミノ酸ポリマーは、アスパラギン酸残基とグルタミン酸残基のミックスを含みうる。各ポリマーは、組成物中でL-異性体のポリマーとして存在する場合もあり、D-異性体のポリマーとして存在する場合もあり、ここで、D-異性体は分解に長くかかるため、標的細胞内でより安定である。したがって、D-異性体のポリ（アミノ酸）の組入れは、分解（及びその後のペイロードの放出）を遅らせうる。したがって、ペイロード放出速度は制御される場合があり、D-異性体のポリマー対L-異性体のポリマーの比に比例し、ここで、D-異性体対L-異性体の比は、ペイロード放出の持続時間を増大させる（すなわち放出速度を減少させる）。言い換えれば、D-異性体とL-異性体との相対量は、ナノ粒子のコアの徐放動態並びに分解への酵素感受性及びペイロード放出をモジュレートしうる。
【０１５２】
一部の場合、アニオン性ポリマー組成物は、アニオン性アミノ酸ポリマーのD-異性体のポリマー及びL-異性体のポリマー（例えば、ポリ（グルタミン酸）（ＰＥＡ）及びポリ（アスパラギン酸）（ＰＤＡ））を含む。一部の場合、D-異性体対L-異性体の比は、１０：１〜１：１０（例えば、８：１〜１：１０、６：１〜１：１０、４：１〜１：１０、３：１〜１：１０、２：１〜１：１０、１：１〜１：１０、１０：１〜１：８、８：１〜１：８、６：１〜１：８、４：１〜１：８、３：１〜１：８、２：１〜１：８、１：１〜１：８、１０：１〜１：６、８：１〜１：６、６：１〜１：６、４：１〜１：６、３：１〜１：６、２：１〜１：６、１：１〜１：６、１０：１〜１：４、８：１〜１：４、６：１〜１：４、４：１〜１：４、３：１〜１：４、２：１〜１：４、１：１〜１：４、１０：１〜１：３、８：１〜１：３、６：１〜１：３、４：１〜１：３、３：１〜１：３、２：１〜１：３、１：１〜１：３、１０：１〜１：２、８：１〜１：２、６：１〜１：２、４：１〜１：２、３：１〜１：２、２：１〜１：２、１：１〜１：２、１０：１〜１：１、８：１〜１：１、６：１〜１：１、４：１〜１：１、３：１〜１：１、又は２：１〜１：１）の範囲にある。
【０１５３】
したがって、一部の場合、アニオン性ポリマー組成物は、D-異性体（例えば、ポリ（D-グルタミン酸）（ＰＤＥＡ）及びポリ（D-アスパラギン酸）（ＰＤＤＡ）から選択される）のポリマーである第１のアニオン性ポリマー（例．アミノ酸ポリマー）を含み；L-異性体（例えば、ポリ（L-グルタミン酸）（ＰＬＥＡ）及びポリ（L-アスパラギン酸）（ＰＬＤＡ）から選択される）のポリマーである第２のアニオン性ポリマー（例．アミノ酸ポリマー）を含む。一部の場合、第１のアニオン性ポリマー（D-異性体）対、第２のアニオン性ポリマー（L-異性体）の比は、１０：１〜１：１０（例えば、８：１〜１：１０、６：１〜１：１０、４：１〜１：１０、３：１〜１：１０、２：１〜１：１０、１：１〜１：１０、１０：１〜１：８、８：１〜１：８、６：１〜１：８、４：１〜１：８、３：１〜１：８、２：１〜１：８、１：１〜１：８、１０：１〜１：６、８：１〜１：６、６：１〜１：６、４：１〜１：６、３：１〜１：６、２：１〜１：６、１：１〜１：６、１０：１〜１：４、８：１〜１：４、６：１〜１：４、４：１〜１：４、３：１〜１：４、２：１〜１：４、１：１〜１：４、１０：１〜１：３、８：１〜１：３、６：１〜１：３、４：１〜１：３、３：１〜１：３、２：１〜１：３、１：１〜１：３、１０：１〜１：２、８：１〜１：２、６：１〜１：２、４：１〜１：２、３：１〜１：２、２：１〜１：２、１：１〜１：２、１０：１〜１：１、８：１〜１：１、６：１〜１：１、４：１〜１：１、又は２：１〜１：１）の範囲にある。
【０１５４】
一部の態様では、アニオン性ポリマー組成物は、グリコサミノグリカン、糖タンパク質、多糖、ポリ（マヌロン酸）、ポリ（グルクロン酸）、ヘパリン、硫酸ヘパリン、コンドロイチン、硫酸コンドロイチン、ケラタン、硫酸ケラタン、アグレカン、ポリ（グルコサミン）、又はこれらの任意の組合せを含むアニオン性ポリマーを含む（例えば、アニオン性ポリマーの前出の例のうちのいずれかに加えて、又はこの代わりに）。
【０１５５】
一部の態様では、アニオン性ポリマーは、１〜２００ｋＤａ（例えば、１〜１５０、１〜１００、１〜５０、５〜２００、５〜１５０、５〜１００、５〜５０、１０〜２００、１０〜１５０、１０〜１００、１０〜５０、１５〜２００、１５〜１５０、１５〜１００、又は１５〜５０ｋＤａ）の範囲内の分子量を有しうる。例として述べると、一部の場合、アニオン性ポリマーは、分子量を約１５ｋＤａとするポリ（グルタミン酸）を含む。
【０１５６】
一部の場合、アニオン性アミノ酸ポリマーは、例えば、リンカー、ＮＬＳ、及び／又はカチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストン又はＨＴＰ）との結合を促進するシステイン残基を含む。例えば、システイン残基は、スルフヒドリル化学反応（例．ジスルフィド結合）及び／又はアミン反応性化学反応を介する架橋（コンジュゲーション）のために使用されうる。したがって、一部の態様では、アニオン性ポリマー組成物のアニオン性アミノ酸ポリマー（例えば、ポリ（グルタミン酸）（ＰＥＡ）、ポリ（アスパラギン酸）（ＰＤＡ）、ポリ（D-グルタミン酸）（ＰＤＥＡ）、ポリ（D-アスパラギン酸）（ＰＤＤＡ）、ポリ（L-グルタミン酸）（ＰＬＥＡ）、ポリ（L-アスパラギン酸）（ＰＬＤＡ））は、システイン残基を含む。一部の場合、アニオン性アミノ酸ポリマーは、Ｎ及び／又はＣ末端において、システイン残基を含む。一部の場合、アニオン性アミノ酸ポリマーは、内部システイン残基を含む。
【０１５７】
一部の場合、アニオン性アミノ酸ポリマーは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）（以下により詳細に説明する）を含む（及び／又はこれとコンジュゲートする）。したがって、一部の態様では、アニオン性ポリマー組成物のアニオン性アミノ酸ポリマー（例えば、ポリ（グルタミン酸）（ＰＥＡ）、ポリ（アスパラギン酸）（ＰＤＡ）、ポリ（D-グルタミン酸）（ＰＤＥＡ）、ポリ（D-アスパラギン酸）（ＰＤＤＡ）、ポリ（L-グルタミン酸）（ＰＬＥＡ）、ポリ（L-アスパラギン酸）（ＰＬＤＡ））は、１つ以上（例．２つ以上、３つ以上又は４つ以上）のＮＬＳを含む（及び／又はこれとコンジュゲートする）。一部の場合、アニオン性アミノ酸ポリマーは、Ｎ及び／又はＣ末端において、ＮＬＳを含む。一部の場合、アニオン性アミノ酸ポリマーは、内部ＮＬＳを含む。
【０１５８】
一部の場合、アニオン性ポリマーは、ターゲティングリガンドへとコンジュゲートされる。
【０１５９】
リンカー
一部の態様では、ターゲティングリガンドは、介在リンカーを介して、アンカードメイン（例えば、カチオン性アンカードメイン、アニオン性アンカードメイン）又はペイロードへとコンジュゲートされる。リンカーは、タンパク質リンカーの場合もあり、非タンパク質リンカーの場合もある。リンカーは、一部の場合、安定性の一助となる場合もあり、補体の活性化を防止する場合もあり、及び／又はアンカードメインと比べて、リガンドに可撓性をもたらす場合もある。
【０１６０】
ターゲティングリガンドの、リンカーへのコンジュゲーション、又はリンカーの、アンカードメインへのコンジュゲーションは、多数の、異なる方式で達せられうる。一部の場合、コンジュゲーションは、スルフヒドリル化学反応（例えば、２つのシステイン残基の間の、例えば、ジスルフィド結合）を介する。一部の場合、コンジュゲーションは、アミン反応性化学反応を使用して達せられる。一部の場合、ターゲティングリガンドは、システイン残基を含み、システイン残基を介して、リンカーへとコンジュゲートされ；及び／又はアンカードメインは、システイン残基を含み、システイン残基を介して、リンカーへとコンジュゲートされる。一部の場合、リンカーは、ペプチドリンカーであり、システイン残基を含む。一部の場合、ターゲティングリガンドと、ペプチドリンカーとは、同じポリペプチドの一部であることによりコンジュゲートされ；及び／又はアンカードメインと、ペプチドリンカーとは、同じポリペプチドの一部であることによりコンジュゲートされる。
【０１６１】
一部の場合、本発明のリンカーはポリペプチドであり、ポリペプチドリンカーということができる。ポリペプチドリンカーが想定されるが、一部の場合、非ポリペプチドリンカー（化学リンカー）も使用されることが理解されるものとする。例えば、一部の態様では、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーである。適切なタンパク質リンカーは、４アミノ酸〜６０アミノ酸の間の長さ（例えば、４〜５０、４〜４０、４〜３０、４〜２５、４〜２０、４〜１５、４〜１０、６〜６０、６〜５０、６〜４０、６〜３０、６〜２５、６〜２０、６〜１５、６〜１０、８〜６０、８〜５０、８〜４０、８〜３０、８〜２５、８〜２０、又は８〜１５アミノ酸の長さ）のポリペプチドを含む。
【０１６２】
一部の態様では、本発明のリンカーは非可撓性（例えば、１つ以上のプロリン残基を含むリンカー）である。非可撓性リンカーの１つの非限定的な例はＧＡＰＧＡＰＧＡＰ（配列番号１７）である。一部の場合、ポリペプチドリンカーはＮ又はＣ末端においてＣ残基を含む。したがって、一部の場合は、非可撓性リンカーはＧＡＰＧＡＰＧＡＰＣ（配列番号１８）及びＣＧＡＰＧＡＰＧＡＰ（配列番号１９）から選択される。
【０１６３】
ある程度の可撓性を伴うペプチドリンカーが使用されうる。したがって、一部の場合、本発明のリンカーは、可撓性である。連結ペプチドは、可撓性リンカーは、一般に、可撓性ペプチドをもたらす配列を有することを念頭に置きながら、事実上、任意のアミノ酸配列を有しうる。小型のアミノ酸、例えば、グリシン及びアラニンの使用は、可撓性ペプチドの創出において有用である。このような配列の創出は、当業者に規定である。様々な、異なるリンカーが市販されており、使用に適すると考えられる。代表的なリンカーポリペプチドは、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）、ＧＳＧＧＳｎ（配列番号２０を含む）、ＧＧＳＧＧＳｎ（配列番号２１）、及びＧＧＧＳｎ（配列番号２２）［配列中、ｎは、１以上の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマーを含む。代表的なリンカーは、ＧＧＳＧ（配列番号２３）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２４）、ＧＳＧＳＧ（配列番号２５）、ＧＳＧＧＧ（配列番号２６）、ＧＧＧＳＧ（配列番号２７）、ＧＳＳＳＧ（配列番号２８）などを含むが、これらに限定されるものではないアミノ酸配列を含みうる。当業者は、リンカーが、可撓性リンカーが、可撓性の小さな構造を付与する、１つ以上の部分を含みうるように、上記任意の要素へとコンジュゲートされるペプチドのデザインが、全体的又は部分的に可撓性であるリンカーを含みうることを認識するであろう。可撓性リンカーのさらなる例は、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧ（配列番号２９）及びＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０）を含むが、これらに限定されるものではない。上述のとおり、一部の場合、ポリペプチドリンカーは、Ｎ又はＣ末端において、Ｃ残基を含む。したがって、一部の場合、可撓性リンカーは、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＣ（配列番号３１）、ＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧ（配列番号３２）、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣ（配列番号３３）、及びＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３４）から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１６４】
一部の場合、本発明のポリペプチドリンカーは、エンドソーム溶解性である。エンドソーム溶解性ポリペプチドリンカーは、ＫＡＬＡ（配列番号３５）及びＧＡＬＡ（配列番号３６）を含むが、これらに限定されるものではない。上述のとおり、一部の場合、ポリペプチドリンカーは、Ｎ又はＣ末端において、Ｃ残基を含む。したがって、一部の場合、本発明のリンカーは、ＣＫＡＬＡ（配列番号３７）、ＫＡＬＡＣ（配列番号３８）、ＣＧＡＬＡ（配列番号３９）、及びＧＡＬＡＣ（配列番号４０）から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１６５】
スルフヒドリルカップリング反応の例
（例えば、システイン残基を使用する、例えば、スルフヒドリル化学反応を介するコンジュゲーションのための反応）
（例えば、ターゲティングリガンド又は糖ペプチドを、リンカーへとコンジュゲートするため、ターゲティングリガンド又は糖ペプチドを、アンカードメイン（例えば、カチオン性アンカードメイン）へとコンジュゲートするため、リンカーを、アンカードメイン（例えば、カチオン性アンカードメイン）へとコンジュゲートするためなどの反応）
【０１６６】
ジスルフィド結合
遊離スルフヒドリル基を含有する、還元状態下のシステイン残基は、典型的なジスルフィド交換反応において、保護されたチオールとのジスルフィド結合を、たやすく形成する。
【０１６７】
【化５】
2021521825.tif 000007
【０１６８】
チオエーテル／チオエステル結合
システインのスルフヒドリル基は、マレイミド及びハロゲン化アシル基と反応し、それぞれ、安定的なチオエーテル及びチオエステル結合を形成する。
【０１６９】
【化６】
2021521825.tif 000008
【０１７０】
【化７】
2021521825.tif 000009
【０１７１】
アジド−アルキン環化付加
このコンジュゲーションは、アルキン結合を含有するための、システイン残基の化学修飾により、又は合成ペプチド調製（例えば、固相合成）におけるL-プロパルギルアミノ酸誘導体（例えば、L-プロパルギルシステイン（下記に図解される））の使用により容易とされる。次いで、カップリングは、Ｃｕ促進型クリック化学反応により達成される。
【０１７２】
【化８】
2021521825.tif 000010
【０１７３】
ターゲティングリガンドの例
ターゲティングリガンドの例には、以下のアミノ酸配列：
ＳＣＦ（標的：ｃ−Ｋｉｔ受容体）
ＥＧＩＣＲＮＲＶＴＮＮＶＫＤＶＴＫＬＶＡＮＬＰＫＤＹＭＩＴＬＫＹＶＰＧＭＤＶＬＰＳＨＣＷＩＳＥＭＶＶＱＬＳＤＳＬＴＤＬＬＤＫＦＳＮＩＳＥＧＬＳＮＹＳＩＩＤＫＬＶＮＩＶＤＤＬＶＥＣＶＫＥＮＳＳＫＤＬＫＫＳＦＫＳＰＥＰＲＬＦＴＰＥＥＦＦＲＩＦＮＲＳＩＤＡＦＫＤＦＶＶＡＳＥＴＳＤＣＶＶＳＳＴＬＳＰＥＫＤＳＲＶＳＶＴＫＰＦＭＬＰＰＶＡ（配列番号１８４）；
ＣＤ７０（標的：ＣＤ２７）
ＰＥＥＧＳＧＣＳＶＲＲＲＰＹＧＣＶＬＲＡＡＬＶＰＬＶＡＧＬＶＩＣＬＶＶＣＩＱＲＦＡＱＡＱＱＱＬＰＬＥＳＬＧＷＤＶＡＥＬＱＬＮＨＴＧＰＱＱＤＰＲＬＹＷＱＧＧＰＡＬＧＲＳＦＬＨＧＰＥＬＤＫＧＱＬＲＩＨＲＤＧＩＹＭＶＨＩＱＶＴＬＡＩＣＳＳＴＴＡＳＲＨＨＰＴＴＬＡＶＧＩＣＳＰＡＳＲＳＩＳＬＬＲＬＳＦＨＱＧＣＴＩＡＳＱＲＬＴＰＬＡＲＧＤＴＬＣＴＮＬＴＧＴＬＬＰＳＲＮＴＤＥＴＦＦＧＶＱＷＶＲＰ（配列番号１８５）；及び
ＳＨ２ドメイン含有タンパク質１Ａ（ＳＨ２Ｄ１Ａ）（標的：ＣＤ１５０）
ＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭＤＡＶＡＶＹＨＧＫＩＳＲＥＴＧＥＫＬＬＬＡＴＧＬＤＧＳＹＬＬＲＤＳＥＳＶＰＧＶＹＣＬＣＶＬＹＨＧＹＩＹＴＹＲＶＳＱＴＥＴＧＳＷＳＡＥＴＡＰＧＶＨＫＲＹＦＲＫＩＫＮＬＩＳＡＦＱＫＰＤＱＧＩＶＩＰＬＱＹＰＶＥＫＫＳＳＡＲＳＴＱＧＴＴＧＩＲＥＤＰＤＶＣＬＫＡＰ（配列番号１８６）
を含むポリペプチドが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１７４】
したがって、（単独で又は他のターゲッテングリガンドと組み合わせて使用することができる）ターゲッテングリガンドの非限定的な例には、
【０１７５】
【化９】
2021521825.tif 000011
【０１７６】
が含まれる。
【０１７７】
送達分子及び構成要素の実例
（０ａ）システインコンジュゲーションアンカー１（ＣＣＡ１）
［アンカードメイン（例．カチオン性アンカードメイン）−リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）−システイン］
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ  ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ  Ｃ（配列番号４１）
（０ｂ）システインコンジュゲーションアンカー２（ＣＣＡ２）
［システイン−リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）−アンカードメイン（例．カチオン性アンカードメイン）］
Ｃ  ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ  ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号４２）
【０１７８】
（１ａ）α５β１リガンド
［アンカードメイン（例．カチオン性アンカードメイン）−リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）−ターゲティングリガンド］
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ  ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ  ＲＲＥＴＡＷＡ（配列番号４５）
（１ｂ）α５β１リガンド
［ターゲティングリガンド−リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）−アンカードメイン（例．カチオン性アンカードメイン）］
ＲＲＥＴＡＷＡ  ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ  ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号４６）
（１ｃ）α５β１リガンド（左Ｃｙｓ）
ＣＧＡＰＧＡＰＧＡＰ（配列番号１９）
注：これは、スルフヒドリル化学反応（例．ジスルフィド結合）又はアミン反応性化学によりＣＣＡ１（上記参照）とコンジュゲートできる。
（１ｄ）α５β１リガンド（右Ｃｙｓ）
ＧＡＰＧＡＰＧＡＰＣ（配列番号１８）
注：これは、スルフヒドリル化学反応（例．ジスルフィド結合）又はアミン反応性化学をによりＣＣＡ２（上記参照）とコンジュゲートできる。
【０１７９】
（２ａ）ＲＧＤ α５β１リガンド
［アンカードメイン（例．カチオン性アンカードメイン）−リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）−ターゲティングリガンド］
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ  ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ  ＲＧＤ（配列番号４７）
（２ｂ）ＲＧＤ ａ５ｂ１リガンド
［ターゲティングリガンド−リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）−アンカードメイン（例．カチオン性アンカードメイン）］
ＲＧＤ  ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ  ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号４８）
（２ｃ）ＲＧＤリガンド（左Ｃｙｓ）
ＣＲＧＤ（配列番号４９）
注：これは、スルフヒドリル化学反応（例．ジスルフィド結合）又はアミン反応性化学によりＣＣＡ１（上記参照）とコンジュゲートできる。
（２ｄ）ＲＧＤリガンド（右Ｃｙｓ）
ＲＧＤＣ（配列番号５０）
注：これは、スルフヒドリル化学反応（例．ジスルフィド結合）又はアミン反応性化学によりＣＣＡ２（上記参照）とコンジュゲートできる。
【０１８０】
（３ａ）トランスフェリンリガンド
［アンカードメイン（例．カチオン性アンカードメイン）−リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）−ターゲティングリガンド］
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ  ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ  ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号５１）
（３ｂ）トランスフェリンリガンド
［ターゲティングリガンド−リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）−アンカードメイン（例．カチオン性アンカードメイン）］
ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ  ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ  ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号５２）
（３ｃ）トランスフェリンリガンド（左Ｃｙｓ）
ＣＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号５３）
ＣＰＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号５４）
注：これは、スルフヒドリル化学反応（例．ジスルフィド結合）又はアミン反応性化学によりＣＣＡ１（上記参照）とコンジュゲートできる。
（３ｄ）トランスフェリンリガンド（右Ｃｙｓ）
ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰＣ（配列番号５５）
注：これは、スルフヒドリル化学反応（例．ジスルフィド結合）又はアミン反応性化学によりＣＣＡ２（上記参照）とコンジュゲートできる。
【０１８１】
（４ａ）E-セレクチンリガンド［１〜２１］
［アンカードメイン（例．カチオン性アンカードメイン）−リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）−ターゲティングリガンド］
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ  ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ  ＭＩＡＳＱＦＬＳＡＬＴＬＶＬＬＩＫＥＳＧＡ（配列番号５６）
（４ｂ）E-セレクチンリガンド［１〜２１］
［ターゲティングリガンド−リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）−アンカードメイン（例．カチオン性アンカードメイン）］
ＭＩＡＳＱＦＬＳＡＬＴＬＶＬＬＩＫＥＳＧＡ  ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ  ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号５７）
（４ｃ）E-セレクチンリガンド［１〜２１］（左Ｃｙｓ）
ＣＭＩＡＳＱＦＬＳＡＬＴＬＶＬＬＩＫＥＳＧＡ（配列番号５８）
注：これは、スルフヒドリル化学反応（例．ジスルフィド結合）又はアミン反応性化学によりＣＣＡ１（上記参照）とコンジュゲートできる。
（４ｄ）E-セレクチンリガンド［１〜２１］（右Ｃｙｓ）
ＭＩＡＳＱＦＬＳＡＬＴＬＶＬＬＩＫＥＳＧＡＣ（配列番号５９）
注：これは、スルフヒドリル化学反応（例．ジスルフィド結合）又はアミン反応性化学によりＣＣＡ２（上記参照）とコンジュゲートできる。
【０１８２】
（５ａ）ＦＧＦ断片［２６〜４７］
［アンカードメイン（例．カチオン性アンカードメイン）−リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）−ターゲティングリガンド］
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ  ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ  ＫＮＧＧＦＦＬＲＩＨＰＤＧＲＶＤＧＶＲＥＫＳ（配列番号６０）
注：これは、スルフヒドリル化学反応（例．ジスルフィド結合）又はアミン反応性化学によりＣＣＡ１（上記参照）とコンジュゲートできる。
（５ｂ）ＦＧＦ断片［２６〜４７］
［ターゲティングリガンド−リンカー（ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ）−アンカードメイン（例．カチオン性アンカードメイン）］
ＫＮＧＧＦＦＬＲＩＨＰＤＧＲＶＤＧＶＲＥＫＳ  ＧＡＰＧＡＰＧＡＰ  ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号６１）
注：これは、スルフヒドリル化学反応（例．ジスルフィド結合）又はアミン反応性化学により、ＣＣＡ１（上記参照）とコンジュゲートできる。
（５ｃ）ＦＧＦ断片［２５〜４７］（左Ｃｙｓが天然）
ＣＫＮＧＧＦＦＬＲＩＨＰＤＧＲＶＤＧＶＲＥＫＳ（配列番号４３）
注：これは、スルフヒドリル化学反応（例．ジスルフィド結合）又はアミン反応性化学によりＣＣＡ１（上記参照）とコンジュゲートできる。
（５ｄ）ＦＧＦ断片［２６〜４７］（右Ｃｙｓ）
ＫＮＧＧＦＦＬＲＩＨＰＤＧＲＶＤＧＶＲＥＫＳＣ（配列番号４４）
注：これは、スルフヒドリル化学反応（例．ジスルフィド結合）又はアミン反応性化学により介してＣＣＡ２（上記参照）とコンジュゲートできる。
【０１８３】
（６ａ）エキセンディン（Ｓ１１Ｃ）［１〜３９］
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＣＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号２）
注：これは、スルフヒドリル化学反応（例．ジスルフィド結合）又はアミン反応性化学によりＣＣＡ１（上記参照）とコンジュゲートできる。
【０１８４】
ターゲティングリガンド
様々なターゲティングリガンド（例えば、本発明の送達分子の一部としての、例えば、ナノ粒子の一部としての）が使用される可能性があり、多数の異なるターゲティングリガンドが想定される。一部の態様では、ターゲティングリガンドは、野生型タンパク質の断片（例えば、結合性ドメイン）である。例えば一部の場合、本発明の送達分子の、ペプチドであるターゲティングリガンドは、４〜５０アミノ酸（例えば、４〜４０、４〜３５、４〜３０、４〜２５、４〜２０、４〜１５、５〜５０、５〜４０、５〜３５、５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１５、７〜５０、７〜４０、７〜３５、７〜３０、７〜２５、７〜２０、７〜１５、８〜５０、８〜４０、８〜３５、８〜３０、８〜２５、８〜２０、又は８〜１５アミノ酸）の長さを有しうる。ターゲティングリガンドは、野生型タンパク質の断片でありうるが、一部の場合、野生型アミノ酸配列と比べた突然変異（例えば、挿入、欠失、置換）（すなわち、対応する野生型タンパク質配列と比べた突然変異）を有する。例えば、ターゲティングリガンドは、標的細胞の表面タンパク質に対する結合アフィニティーを増大又は減少させる突然変異を含みうる。
【０１８５】
一部の場合、ターゲティングリガンドは、抗体（Ｆ（ａｂ））の抗原結合性領域である。一部の場合、ターゲティングリガンドは、ＳｃＦｖである。「Ｆｖ」とは、完全な抗原認識／結合性部位を含有する、最小の抗体断片である。二本鎖Ｆｖ分子種では、この領域は、緊密な非共有結合的会合下にある１つの重鎖／１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。単鎖Ｆｖ分子種（ｓｃＦｖ）では、軽鎖と重鎖が、二本鎖Ｆｖ分子種内の「二量体」構造と類似の「二量体」構造下で会合しうるように、１つの重鎖／１つの軽鎖可変ドメインは、可撓性ペプチドリンカーにより、共有結合的に連結されうる。ｓｃＦｖの総説については、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい。
【０１８６】
一部の場合、ターゲティングリガンドは、一部の場合、遍在的な表面マーカー、例えば、ヘパリン硫酸プロテオグリカンに結合し、膜波打ち関連過程を介して、一部の細胞集団内で、ミクロピノサイトーシス（及び／又はマクロピノサイトーシス）を誘導しうる、ウイルス性糖タンパク質を含む。ポリ（L-アルギニン）は、これもまた、表面マーカー、例えば、ヘパリン硫酸プロテオグリカンへの結合に使用されうる、別の代表的なターゲティングリガンドである。
【０１８７】
一部の場合、静電的に、又は粒子表面への共有結合的修飾、若しくは粒子表面上の、１つ以上のポリマーを利用して、粒子表面（例えば、ナノ粒子表面）は、ターゲティングリガンドでコーティングされる。一部の場合、ターゲティングリガンドは、リンカー及び／又はアンカードメイン（例えば、カチオン性アンカードメイン）との結合を促進するシステイン残基を付加する突然変異を含みうる。例えば、システインは、スルフヒドリル化学反応（例．ジスルフィド結合）及び／又はアミン反応性化学反応を介する架橋（コンジュゲーション）のために使用されうる。
【０１８８】
一部の場合、ターゲティングリガンドは、内部システイン残基を含む。一部の場合、ターゲティングリガンドは、Ｎ及び／又はＣ末端において、システイン残基を含む。一部の場合、システイン残基を含むために、ターゲティングリガンドは、例えば、対応する野生型配列と比べて、突然変異（例えば、挿入又は置換）を導入される。このように、ここで記載されるターゲティングリガンドのうちのいずれかは、システイン残基を挿入すること、及び／又はこれで置換すること（例えば、内部、Ｎ末端、Ｃ末端でのシステイン残基の挿入又はこれによる置換）により修飾されうる。
【０１８９】
「対応する」野生型配列とは、対象配列が由来したか、又は由来した可能性がある野生型配列（例えば、目的の配列に対する、高度の配列同一性を有する野生型タンパク質配列）を意味する。一部の場合、「対応する」野生型配列とは、目的のアミノ酸と８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上又は１００％の配列同一性）を有する野生型配列である。例えば、１つ以上の突然変異（例えば、置換、挿入）を有するが、野生型配列と、他の形で高度に類似するターゲティングリガンドに対して、最も類似するアミノ酸配列は、対応する野生型アミノ酸配列であると考えられてもよい。
【０１９０】
対応する野生型タンパク質／配列は、１００％同一である（例えば、８５％以上同一、９０％以上同一、９５％以上同一、９８％以上同一、９９％以上同一などでありうる）（修飾される位置以外で）必要はないが、ターゲティングリガンド、及び対応する野生型タンパク質（例えば、野生型タンパク質の断片）は、意図される細胞表面タンパク質に結合することが可能であり、それらが相同であると考えられるのに十分な配列同一性（修飾される領域外における）を保持しうる。「対応する」野生型タンパク質配列のアミノ酸配列は、任意の好都合な方法を使用して（例えば、任意の好都合な配列比較／アライメントソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＭＵＳＣＬＥ、Ｔ−ＣＯＦＦＥＥなどを使用して）同定／査定されうる。
【０１９１】
表面コートの一部として（例えば、表面コートの送達分子の一部として）使用されうるターゲティングリガンドの例は、表１に列挙されたターゲティングリガンドを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の送達分子の一部として使用されうるターゲティングリガンドの例は、表３に列挙されたターゲティングリガンド（表３に列挙された配列の多くは、例えば、リンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を介して、カチオン性ポリペプチドドメイン、例えば、９Ｒ、６Ｒと結合したターゲティングリガンド（例えば、２行目のＳＮＲＷＬＤＶＫ）を含む）を含むが、これらに限定されるものではない。ターゲティングリガンド内に含まれうるアミノ酸配列の例は、ＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹ（配列番号ｘｘ）（ＩＬ２）、ＴＳＶＧＫＹＰＮＴＧＹＹＧＤ（配列番号ｘｘ）（ＣＤ３）、ＳＮＲＷＬＤＶＫ（Ｓｉｇｌｅｃ）、ＥＫＦＩＬＫＶＲＰＡＦＫＡＶ（配列番号ｘｘ）（ＳＣＦ）；ＥＫＦＩＬＫＶＲＰＡＦＫＡＶ（配列番号ｘｘ）（ＳＣＦ）、ＥＫＦＩＬＫＶＲＰＡＦＫＡＶ（配列番号ｘｘ）（ＳＣＦ）、ＳＮＹＳＩＩＤＫＬＶＮＩＶＤＤＬＶＥＣＶＫＥＮＳ（配列番号ｘｘ）（ｃＫｉｔ）、及びＡｃ−ＳＮＹＳＡｉｂＡＤＫＡｉｂＡＮＡｉｂＡＤＤＡｉｂＡＥＡｉｂＡＫＥＮＳ（配列番号ｘｘ）（ｃＫｉｔ）を含むが、これらに限定されるものではない。したがって、一部の場合、ターゲティングリガンドは、ＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹ（配列番号ｘｘ）（ＩＬ２）、ＴＳＶＧＫＹＰＮＴＧＹＹＧＤ（配列番号ｘｘ）（ＣＤ３）、ＳＮＲＷＬＤＶＫ（Ｓｉｇｌｅｃ）、ＥＫＦＩＬＫＶＲＰＡＦＫＡＶ（配列番号ｘｘ）（ＳＣＦ）；ＥＫＦＩＬＫＶＲＰＡＦＫＡＶ（配列番号ｘｘ）（ＳＣＦ）、ＥＫＦＩＬＫＶＲＰＡＦＫＡＶ（配列番号ｘｘ）（ＳＣＦ）、又はＳＮＹＳＩＩＤＫＬＶＮＩＶＤＤＬＶＥＣＶＫＥＮＳ（配列番号ｘｘ）（ｃＫｉｔ）との、８５％以上（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１９２】
【表１−１】
2021521825.tif 000012
【０１９３】
【表１−２】
2021521825.tif 000013
【０１９４】
【表１−３】
2021521825.tif 000014
【０１９５】
【表１−４】
2021521825.tif 000015
【０１９６】
【表１−５】
2021521825.tif 000016
【０１９７】
ターゲティングリガンド（例えば、送達分子の）は、アミノ酸配列ＲＧＤ、及び／又は配列番号１〜１２のうちのいずれか１つに明示されたアミノ酸配列との、８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含みうる。一部の場合、ターゲティングリガンドは、アミノ酸配列ＲＧＤ、及び／又は配列番号１〜１２のうちのいずれか１つに明示されたアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ターゲティングリガンドは、システイン（内部、Ｃ末端、又はＮ末端の）を含むことが可能であり、また、アミノ酸配列ＲＧＤ、及び／又は配列番号１〜１２のうちのいずれか１つに明示されたアミノ酸配列との、８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列も含みうる。
【０１９８】
ターゲティングリガンド（例えば、送達分子の）は、アミノ酸配列ＲＧＤ、及び／又は配列番号１〜１２及び１８１〜１８７のうちのいずれか１つに明示されたアミノ酸配列との、８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含みうる。一部の場合、ターゲティングリガンドは、アミノ酸配列ＲＧＤ、及び／又は配列番号１〜１２及び１８１〜１８７のうちのいずれか１つに明示されたアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ターゲティングリガンドは、システイン（内部、Ｃ末端、又はＮ末端の）を含むことが可能であり、また、アミノ酸配列ＲＧＤ、及び／又は配列番号１〜１２及び１８１〜１８７のうちのいずれか１つに明示されたアミノ酸配列との、８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列も含みうる。
【０１９９】
ターゲティングリガンド（例えば、送達分子の）は、アミノ酸配列ＲＧＤ、及び／又は配列番号１〜１２、１８１〜１８７、及び２７１〜２７７のうちのいずれか１つに明示されたアミノ酸配列との、８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含みうる。一部の場合、ターゲティングリガンドは、アミノ酸配列ＲＧＤ、及び／又は配列番号１〜１２、１８１〜１８７、及び２７１〜２７７のうちのいずれか１つに明示されたアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ターゲティングリガンドは、システイン（内部、Ｃ末端、又はＮ末端の）を含むことが可能であり、また、アミノ酸配列ＲＧＤ、及び／又は配列番号１〜１２、１８１〜１８７、及び２７１〜２７７のうちのいずれか１つに明示されたアミノ酸配列との、８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列も含みうる。
【０２００】
一部の場合、ターゲティングリガンド（例えば、送達分子の）は、配列番号１８１〜１８７及び２７１〜２７７のうちのいずれか１つに明示されたアミノ酸配列との、８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含みうる。一部の場合、ターゲティングリガンドは、配列番号１８１〜１８７及び２７１〜２７７のうちのいずれか１つに明示されたアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ターゲティングリガンドは、システイン（内部、Ｃ末端、又はＮ末端の）を含むことが可能であり、また、配列番号１８１〜１８７及び２７１〜２７７のうちのいずれか１つに明示されたアミノ酸配列との、８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列も含みうる。
【０２０１】
一部の場合、ターゲティングリガンド（例えば、送達分子の）は、配列番号１８１〜１８７のうちのいずれか１つに明示されたアミノ酸配列との、８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含みうる。一部の場合、ターゲティングリガンドは、配列番号１８１〜１８７のうちのいずれか１つに明示されたアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ターゲティングリガンドは、システイン（内部、Ｃ末端、又はＮ末端の）を含むことが可能であり、また、配列番号１８１〜１８７のうちのいずれか１つに明示されたアミノ酸配列との、８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列も含みうる。
【０２０２】
一部の場合、ターゲティングリガンド（例えば、送達分子の）は、配列番号２７１〜２７７のうちのいずれか１つに明示されたアミノ酸配列との、８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含みうる。一部の場合、ターゲティングリガンドは、配列番号２７１〜２７７のうちのいずれか１つに明示されたアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ターゲティングリガンドは、システイン（内部、Ｃ末端、又はＮ末端の）を含むことが可能であり、また、配列番号２７１〜２７７のうちのいずれか１つに明示されたアミノ酸配列との、８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列も含みうる。
【０２０３】
ここでは、「〜をターゲティングする」及び「ターゲティングされた結合」は、特異的結合を指すように使用される。「特異的に結合すること」、「〜に特異的に結合する」などの用語は、溶液又は反応混合物中の、他の分子又は部分と比べた、分子への、非共有結合的又は共有結合的な、優先的結合を指す（例えば、抗体は、他の結合可能なポリペプチドと比べて、特定のポリペプチド又はエピトープに特異的に結合し、リガンドは、他の結合可能な受容体と比べて、特定の受容体に特異的に結合する）。一部の態様では、１つの分子の、それが特異的に結合する、別の分子に対するアフィニティーは、１０−５Ｍ以下（例えば、１０−６Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、１０−１２Ｍ以下、１０−１３Ｍ以下、１０−１４Ｍ以下、１０−１５Ｍ以下、又は１０−１６Ｍ以下）のＫｄ（解離定数）により特徴付けられる。「アフィニティー」とは、結合の強度を指し、結合アフィニティーの増大は、低Ｋｄと相関する。
【０２０４】
一部の場合、ターゲティングリガンドは、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーＢ、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、細胞表面糖タンパク質及び細胞間接着分子から選択される細胞表面タンパク質と結合する。受容体へのドッキング時のリガンドの空間的配置についての検討は、例えば、ターゲティングリガンドの、ペイロード又はアンカードメイン（例えば、カチオン性アンカードメイン）へのコンジュゲーションのために、リガンドと標的との構造機能関係が破壊されないように、所望の機能的選択性及びエンドソーム分取バイアスを達するのに使用されうる。例えば、核酸、タンパク質、リボ核タンパク質、又はアンカードメイン（例えば、カチオン性アンカードメイン）へのコンジュゲーションは、クレフトへの結合に、潜在的に干渉しうるであろう。
【０２０５】
したがって、一部の場合、そのリガンドに結合した、所望の標的（細胞表面タンパク質）の結晶構造が入手可能である場合（又はこのような構造が、類縁のタンパク質について入手可能である場合）、３Ｄ構造モデリング及び配列スレッディングを使用して、リガンドと標的との相互作用部位を可視化することができる。これは、例えば、置換及び／又は挿入（例えば、システイン残基の）する内部部位の選択を容易としうる。
【０２０６】
例として述べると、一部の場合、ターゲティングリガンドは、ファミリーＢのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）（また、「セクレチンファミリー」としても公知である）への結合をもたらす。一部の場合、ターゲティングリガンドは、それぞれ、ターゲティングされた結合及び長期エンドソームリサイクリング経路の関与をもたらす、ファミリーＢのＧＰＣＲの、アロステリックアフィニティードメイン及びオーソステリックドメインの両方への結合をもたらす。
【０２０７】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、共通の分子アーキテクチャー（推定の７回膜貫通セグメント）と、それらが、Ｇタンパク質（ヘテロ三量体のＧＴＰアーゼ）と相互作用して、細胞内の二次的メッセンジャー、例えば、サイクリックＡＭＰ、イノシトールリン酸、ジアシルグリセロール、及びカルシウムイオンの合成を調節するという意味において、共通のシグナル伝達機構とを共有する。ＧＰＣＲのファミリーＢ（セクレチン受容体ファミリー又は「ファミリー２」）は、ポリペプチドホルモン、及び細胞膜における細胞間相互作用を媒介すると考えられる分子に対する受容体を含む、小さいが、構造的かつ機能的に多様なタンパク質群である（例えば、Harmar et al., Genome Biol. 2001;2(12):REVIEWS3013を参照されたい）。セクレチン受容体ファミリーのメンバーに関する構造生物学では、リガンドの結合を伴うか、又は伴わない、それらのＮ末端の、いくつかの結晶構造の公開を含む、重要な進歩があった。これらの業績は、リガンドの結合についての理解を拡張しており、構造ベースのリガンドデザインに有用なプラットフォームを提供する（例えば、Poyner et al., Br J Pharmacol. 2012 May;166(1):1-3を参照されたい）。
【０２０８】
例えば、エキセンディン４リガンド又はこの誘導体（例えば、システインで置換されたエキセンディン４ターゲティングリガンド、例えば、配列番号２として提示されたターゲティングリガンド）を使用して、膵細胞表面タンパク質ＧＬＰ１Ｒ（例えば、膵島β細胞をターゲティングする）をターゲティングするように、本発明の送達分子を使用することを所望してもよい。ＧＬＰ１Ｒは、脳及び膵臓内に多く存在するため、ＧＬＰ１Ｒへの結合のターゲティングをもたらすターゲティングリガンドは、脳及び膵臓をターゲティングするのに使用されうる。したがって、ＧＬＰ１Ｒのターゲティングは、疾患（例えば、１つ以上の遺伝子編集ツールの送達を介する）、例えば、ハンチントン病（ＣＡＧリピート拡大突然変異）、パーキンソン病（ＬＲＲＫ２突然変異）、ＡＬＳ（ＳＯＤ１突然変異）、及び他のＣＮＳ疾患の治療に焦点を絞った方法（例えば、治療法）を容易とする。ＧＬＰ１Ｒのターゲティングはまた、疾患、例えば、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、及び膵臓がんの治療（例えば、１つ以上の遺伝子編集ツールの送達を介する）のために、ペイロードを、膵島β細胞へと送達することに焦点を絞った方法（例えば、治療法）も容易とする。
【０２０９】
エキセンディン４の修飾形を使用して、ＧＬＰ１Ｒをターゲティングする場合、システイン置換及び／又は挿入のためのアミノ酸（例えば、核酸ペイロードへのコンジュゲーションのための）は、２つの結合クレフトを破壊しないために、架橋された複合体が向かなければならない方向を予測するために、３Ｄ空間内で回転させてもよい、ＰＤＢによる三次元レンダリングを使用して、ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１）で示されるエキセンディン４のアミノ酸配列を、グルカゴン−ＧＣＧＲ（４ＥＲＳ）、及びＧＬＰ１−ＧＬＰ１Ｒ−ＥＣＤ複合体（ＰＤＢ：３ＩＯＬ）の結晶構造に照らしてアライメントすることにより同定されうる。ターゲティングリガンド（ファミリーＢのＧＰＣＲをターゲティングする）の、所望の架橋部位（例えば、システイン残基の置換／挿入のための部位）が、対応する受容体の、２つの結合クレフトに対して、十分に直交する（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）場合、高アフィニティーの結合のほか、共時的な、長期エンドソームリサイクリング経路への隔離（例えば、最適のペイロード放出のための）が生じうる。配列番号１のアミノ酸位置１０、１１、及び／又は１２におけるシステイン置換は、二相性結合及びＧｓにバイアスのかかったシグナル伝達カスケードの特異的誘発、βアレスチンの関与、並びに受容体の、アクチン細胞骨格からの解離を付与する。一部の場合、このターゲティングリガンドは、共時的なオーソステリック部位の関与を伴わないＧＰＣＲのＮ末端ドメインへの結合のみ（アフィニティー鎖であるエキセンディン４［３１〜３９］の結合のみの場合と同様に）が関与するものではない機構受容体媒介型エンドサイトーシスを介して、ナノ粒子の細胞内移行を誘発する。
【０２１０】
一部の場合、本発明のターゲティングリガンドは、エキセンディン４のアミノ酸配列（配列番号１）との、８５％以上（例えば、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部のこのような場合には、ターゲティングリガンドは、配列番号１に明示されたアミノ酸配列の、Ｌ１０、Ｓ１１、及びＫ１２に対応する位置のうちの１つ以上におけるシステインの置換又は挿入を含む。一部の場合、ターゲティングリガンドは、配列番号１に明示されたアミノ酸配列のＳ１１に対応する位置におけるシステインの置換又は挿入を含む。一部の場合、本発明のターゲティングリガンドは、エキセンディン４のアミノ酸配列（配列番号１）を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合、ターゲティングリガンドは、アンカードメイン（例えば、カチオン性アンカードメイン）へとコンジュゲートされる（リンカーを伴うか、又は伴わずに）。
【０２１１】
別の例として述べると、一部の場合、本発明のターゲティングリガンドは、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体（ＦＧＦＲ）への結合をもたらす。したがって、一部の場合、ターゲティングリガンドは、ＦＧＦの断片である（すなわち、ＦＧＦのアミノ酸配列を含む）。一部の場合、ターゲティングリガンドは、オーソステリックの結合時に占有される、ＲＴＫのセグメント（例えば、以下の実施例を参照されたい）に結合する。一部の場合、ターゲティングリガンドは、ＲＴＫのヘパリンアフィニティードメインに結合する。一部の場合、ターゲティングリガンドは、ＦＧＦ受容体との結合をもたらし、アミノ酸配列ＫＮＧＧＦＦＬＲＩＨＰＤＧＲＶＤＧＶＲＥＫＳ（配列番号４）との、８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合、ターゲティングリガンドは、ＦＧＦ受容体との結合をもたらし、配列番号４として明示されたアミノ酸配列を含む。
【０２１２】
一部の場合、ＲＴＫのオーソステリック部位を占有する、小型のドメイン（例えば、５〜４０アミノ酸の長さ）は、天然の増殖因子リガンドに特有でありうる、細胞増殖性であり、かつ、がん原性であるシグナル伝達カスケードの関与を伴わずに、ＲＴＫ（例えば、ＦＧＦＲ）の核内分取に関するエンドサイトーシス経路に関与するのに使用されうる。例えば、切断型ｂＦＧＦ（ｔｂＦＧＦ）ペプチド（３０〜１１５アミノ酸）は、ｂＦＧＦ受容体結合性部位及びヘパリン結合性部位の一部を含有し、このペプチドは、細胞増殖を刺激せずに、細胞表面上のＦＧＦＲに、効果的に結合しうる。ｔｂＦＧＦの配列は、ＫＲＬＹＣＫＮＧＧＦＦＬＲＩＨＰＤＧＲＶＤＧＶＲＥＫＳＤＰＨＩＫＬＱＬＱＡＥＥＲＧＶＶＳＩＫＧＶＣＡＮＲＹＬＡＭＫＥＤＧＲＬＬＡＳＫＣＶＴＤＥＣＦＦＦＥＲＬＥＳＮＮＹＮＴＹ（配列番号１３）（例えば、Cai et al., Int J Pharm. 2011 Apr 15;408(1-2):173-82を参照されたい）である。
【０２１３】
一部の場合、ターゲティングリガンドは、ＦＧＦ受容体との結合をもたらし、アミノ酸配列ＨＦＫＤＰＫ（配列番号５）（例えば、下記の実施例節を参照されたい）を含む。一部の場合、ターゲティングリガンドは、ＦＧＦ受容体との結合をもたらし、アミノ酸配列ＬＥＳＮＮＹＮＴ（配列番号６）（例えば、下記の実施例節を参照されたい）を含む。
【０２１４】
一部の場合、本発明のターゲティングリガンドは細胞表面糖タンパク質と結合する。一部の場合、ターゲティングリガンドは細胞間接着分子と結合する。例えば一部の場合、ターゲティングリガンドは、細胞間接着因子として機能する細胞表面糖タンパク質で、造血幹細胞（例えば、骨髄）上で見出されるタンパク質ＣＤ３４と結合する。一部の場合、ターゲティングリガンドは、セレクチン、例えば、E-セレクチン、L-セレクチン又はP-セレクチン（例えば、セレクチンの、最初の４０アミノ酸の中に見出されるシグナルペプチド）の断片である。一部の場合、本発明のターゲティングリガンドは、セレクチン（例えば、E-セレクチン、L-セレクチン、P-セレクチン）のスシドメインを含む。
【０２１５】
一部の場合、ターゲティングリガンドは、アミノ酸配列ＭＩＡＳＱＦＬＳＡＬＴＬＶＬＬＩＫＥＳＧＡ（配列番号７）との、８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合、ターゲティングリガンドは、配列番号７として明示されたアミノ酸配列を含む。一部の場合、ターゲティングリガンドは、アミノ酸配列ＭＶＦＰＷＲＣＥＧＴＹＷＧＳＲＮＩＬＫＬＷＶＷＴＬＬＣＣＤＦＬＩＨＨＧＴＨＣ（配列番号８）との、８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合、ターゲティングリガンドは、配列番号８として明示されたアミノ酸配列を含む。一部の場合、ターゲティングリガンドは、アミノ酸配列ＭＩＦＰＷＫＣＱＳＴＱＲＤＬＷＮＩＦＫＬＷＧＷＴＭＬＣＣＤＦＬＡＨＨＧＴＤＣ（配列番号９）との、８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合、ターゲティングリガンドは、配列番号９として明示されたアミノ酸配列を含む。一部の場合、ターゲティングリガンドは、アミノ酸配列ＭＩＦＰＷＫＣＱＳＴＱＲＤＬＷＮＩＦＫＬＷＧＷＴＭＬＣＣ（配列番号１０）との、８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合、ターゲティングリガンドは、配列番号１０として明示されたアミノ酸配列を含む。
【０２１６】
一部の場合、本発明のターゲティングリガンドとして使用されうるセレクチンの断片（例えば、セレクチンの、最初の４０アミノ酸の中に見出されるシグナルペプチド）は、特異的に修飾されたシアロムチンへの、強力な結合を達することが可能であり、例えば、細胞外ＣＤ３４の、多様なシアリルLewisｘ修飾／O-シアル化は、P-セレクチン、L-セレクチン、及びE-セレクチンについて、骨髄、リンパ、脾臓、及び扁桃コンパートメントに対する、示差的なアフィニティーをもたらしうる。一部の場合、逆に、ターゲティングリガンドは、ＣＤ３４の細胞外部分でありうる。一部のこのような場合には、リガンドのシアル化の修飾が、ターゲティングリガンドを、多様なセレクチンへと、示差的にターゲティングするのに利用されうる。
【０２１７】
一部の場合、本発明のターゲティングリガンドはE-セレクチンと結合する。E-セレクチンは、腫瘍細胞の内皮細胞への接着を媒介することが可能であり、E-セレクチンに対するリガンドは、がん転移において役割を果たしうる。例として述べると、P-セレクチン糖タンパク質１（ＰＳＧＬ−１）（例えば、ヒト好中球に由来する）は、E-セレクチン（例えば、内皮により発現される）に対する、高効率のリガンドとして機能することが可能であり、したがって、本発明のターゲティングリガンドは、一部の場合、ＰＳＧＬ−１のアミノ酸配列（又はE-セレクチンに結合する、この断片）を含みうる。別の例として述べると、E-セレクチンリガンド１（ＥＳＬ−１）は、E-セレクチンに結合することが可能であり、したがって、本発明のターゲティングリガンドは、一部の場合、ＥＳＬ−１のアミノ酸配列（又はE-セレクチンに結合する、この断片）を含みうる。一部の場合、ＰＳＧＬ−１及び／又はＥＳＬ−１のアミノ酸配列（又はE-セレクチンに結合する、これらの断片）を伴うターゲティングリガンドは、E-セレクチンに結合するために、１つ以上のシアリルLewis修飾を保有する。別の例として述べると、一部の場合、ＣＤ４４、死受容体３（ＤＲ３）、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、及びＭａｃ２−ＢＰは、E-セレクチンに結合することが可能であり、したがって、本発明のターゲティングリガンドは、一部の場合、ＣＤ４４、死受容体３（ＤＲ３）、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、及びＭａｃ２−ＢＰのうちのいずれか１つのアミノ酸配列（又はE-セレクチンに結合する、この断片）を含みうる。
【０２１８】
一部の場合、本発明のターゲティングリガンドは、P-セレクチンと結合する。一部の場合、ＰＳＧＬ−１は、このようなターゲティングされた結合をもたらしうる。したがって、一部の場合、本発明のターゲティングリガンドは、一部の場合、ＰＳＧＬ−１のアミノ酸配列（又はP-セレクチンに結合する、この断片）を含みうる。一部の場合、ＰＳＧＬ−１のアミノ酸配列（又はP-セレクチンに結合する、この断片）を伴うターゲティングリガンドは、P-セレクチンに結合するために、１つ以上のシアリルLewis修飾を保有する。
【０２１９】
一部の場合、本発明のターゲティングリガンドは、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ９０、ＣＤ４５ｆ、ＣＤ３４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４７、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ；ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ及び／又はＴＣＲδの定常領域；４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ６２Ｌ、ＡＲＰ５、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＤ９４／ＮＫＧ２、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｈ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＤＮＡＭ、ＸＣＲ１、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＩＬＴ、ＬＩＲ、Ｌｙ４９、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＴＧＦ−β及びα５β１から選択される標的との結合をもたらす。
【０２２０】
一部の場合、本発明のターゲティングリガンドは、トランスフェリン受容体と結合する。一部のこのような場合には、ターゲティングリガンドは、アミノ酸配列ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号１１）との、８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合、ターゲティングリガンドは、配列番号１１として明示されたアミノ酸配列を含む。
【０２２１】
一部の場合、本発明のターゲティングリガンドは、インテグリン（例えば、α５β１インテグリン）と結合する。一部のこのような場合には、ターゲティングリガンドは、アミノ酸配列ＲＲＥＴＡＷＡ（配列番号１２）との、８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合、ターゲティングリガンドは、配列番号１２として明示されたアミノ酸配列を含む。一部の場合、ターゲティングリガンドは、アミノ酸配列ＲＧＤＧＷ（配列番号１８１）との、８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合、ターゲティングリガンドは、配列番号１８１として明示されたアミノ酸配列を含む。一部の場合、ターゲティングリガンドは、アミノ酸配列ＲＧＤを含む。
【０２２２】
一部の場合、本発明のターゲティングリガンドは、インテグリンと結合する。一部のこのような場合には、ターゲティングリガンドは、アミノ酸配列ＧＣＧＹＧＲＧＤＳＰＧ（配列番号１８２）との、８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合、ターゲティングリガンドは、配列番号１８２として明示されたアミノ酸配列を含む。一部の場合、このようなターゲティングリガンドは、Ｎ末端において、アセチル化されており、及び／又はＣ末端において、アミド（ＮＨ２）化されている。
【０２２３】
一部の場合、本発明のターゲティングリガンドは、インテグリン（例えば、α５β３インテグリン）と結合する。一部のこのような場合には、ターゲティングリガンドは、アミノ酸配列ＤＧＡＲＹＣＲＧＤＣＦＤＧ（配列番号１８７）と８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合、ターゲティングリガンドは、配列番号１８７として明示されたアミノ酸配列を含む。
【０２２４】
一部の態様では、脳をターゲティングするのに使用されるターゲティングリガンドは、狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）に由来するアミノ酸配列（例えば、ＹＴＩＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧＧＧＧ（配列番号１８３））を含む。一部のこのような場合には、ターゲティングリガンドは、配列番号１８３と８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列として明示されたアミノ酸配列を含む。ターゲティングリガンド（本明細書の別の箇所で説明する）のいずれについてとも同様に、ＲＶＧは、アンカードメイン（例えば、９Ｒペプチド配列）へとコンジュゲートされ、及び／又は融合されうる。例えば、本発明のナノ粒子の表面コートの一部として使用される、本発明の送達分子は、配列ＹＴＩＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧＧＧＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号１８０）を含みうる。
【０２２５】
一部の場合、本発明のターゲティングリガンドは、ｃ−Ｋｉｔ受容体と結合する。一部のこのような場合には、ターゲティングリガンドは、配列番号１８４と８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列として明示されたアミノ酸配列を含む。一部の場合、ターゲティングリガンドは、配列番号１８４として明示されたアミノ酸配列を含む。
【０２２６】
一部の場合、本発明のターゲティングリガンドは、ＣＤ２７と結合する。一部のこのような場合には、ターゲティングリガンドは、配列番号１８５と８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列として明示されたアミノ酸配列を含む。一部の場合、ターゲティングリガンドは、配列番号１８５として明示されたアミノ酸配列を含む。
【０２２７】
一部の場合、本発明のターゲティングリガンドは、ＣＤ１５０と結合する。一部のこのような場合には、ターゲティングリガンドは、配列番号１８６と８５％以上の配列同一性（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列として明示されたアミノ酸配列を含む。一部の場合、ターゲティングリガンドは、配列番号１８６として明示されたアミノ酸配列を含む。
【０２２８】
一部の態様では、ターゲティングリガンドは、ＫＬＳ ＣＤ２７＋／ＩＬ−７Ｒａ−／ＣＤ１５０＋／ＣＤ３４−造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）と結合する。例えば、遺伝子編集ツール（本明細書の別の箇所で説明する）は、ＢＣＬ１１ａ転写因子の発現を破壊し、この帰結として、胎児ヘモグロビンを発生させるために導入されうる。別の例として述べると、β−グロビン（ＨＢＢ）遺伝子は、変更されたＥ７Ｖ置換を、対応する、相同性指向修復用のドナーＤＮＡ分子で補正するように直接ターゲティングされてもよい。一例としてと、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１）は、それが、ＨＢＢ遺伝子内の座位に結合し、ゲノム内に、二本鎖又は一本鎖切断を創出し、ゲノム修復を誘発するように、適切なガイドＲＮＡと共に送達されうる。一部の場合、ドナーＤＮＡ分子（一本鎖又は二本鎖）が導入される（ペイロードの一部として）場合もあり、これが１４〜３０日間放出される一方で、ガイドＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質複合体（リボ核タンパク質複合体）は１〜７日間放出されうる。
【０２２９】
一部の態様では、ターゲティングリガンドは、Ｔ細胞受容体を修飾するために、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋ Ｔ細胞、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と結合する。例えば、遺伝子編集ツール（本明細書の別の箇所で説明する）は、Ｔ細胞受容体を修飾するために、導入されうる。Ｔ細胞受容体は、直接ターゲティングされ、新規のＴ細胞受容体のための対応するドナーＤＮＡ分子で置換されてもよい。１つの例として述べると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１）は、それが、ＴＣＲ遺伝子内の座位に結合し、ゲノム内に、二本鎖又は一本鎖切断を創出し、第１のドナーＤＮＡ（配列特異的リコンビナーゼのための１つ以上の標的配列を有する）の挿入を誘発し、目的のヌクレオチド配列が、第１のドナーＤＮＡにより挿入された標的配列を認識するリコンビナーゼにより第２のドナーＤＮＡから挿入されるように、適切なガイドＲＮＡと共に送達されうる。一部の場合、ドナーＤＮＡ分子（一本鎖又は二本鎖）が、導入される（ペイロードの一部として）。本開示に従い、β-グロビン、ＣＣＲ５、Ｔ細胞受容体若しくは他の目的遺伝子をターゲティングする、他のＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ及びドナー配列、並びに／又は他の発現ベクターを使用してもよいことは当業者に明らかである。
【０２３０】
一部の態様では、ターゲティングリガンドは、核酸アプタマーである。一部の態様では、ターゲティングリガンドは、ペプトイドである。
【０２３１】
また、併せて、ターゲティングリガンドを構成する、２つの異なるペプチド配列を伴う送達分子も提供される。例えば一部の場合、ターゲティングリガンドは、二価（例えば、ヘテロ二価）である。一部の場合、細胞膜透過ペプチド及び／又はヘパリン硫酸プロテオグリカン結合性リガンドが、本開示のターゲティングリガンドのうちのいずれかと共に、ヘテロ二価のエンドサイトーシス誘因として使用される。ヘテロ二価のターゲティングリガンドは、ターゲティングリガンドのうちの１つに由来するアフィニティー配列と、異なるターゲティングリガンドに由来する、オーソステリック結合配列（例えば、所望のエンドサイトーシストラフィッキング経路に関与することが公知のオーソステリック結合配列）とを含みうる。
【０２３２】
アンカードメイン
一部の態様では、送達分子は、アンカードメイン（例えば、カチオン性アンカードメイン、アニオン性アンカードメイン）と結合したターゲティングリガンドを含む。一部の場合、本発明の送達媒体は、アンカードメインと共に凝縮され、及び／又はこれと静電相互作用するペイロードを含む（例えば、送達分子は、ペイロードを送達するのに使用される送達媒体でありうる）。一部の場合、ナノ粒子の表面コートは、アンカードメインを伴うこのような送達分子を含み、一部のこのような場合、ペイロードはこのようなナノ粒子のコア内にある（コアと相互作用する）。アンカードメインに関するさらなる詳細は、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインについて記載する上記の節を参照されたい。
【０２３３】
ヒストンテールペプチド（ＨＴＰ）
一部の態様では、本発明のナノ粒子のカチオン性ポリペプチド組成物は、ヒストンペプチド又はヒストンペプチドの断片、例えば、Ｎ末端のヒストンテール（例えば、Ｈ１、Ｈ２（例えば、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＡＸ、Ｈ２Ｂ）、Ｈ３、又はＨ４ヒストンタンパク質のヒストンテール）を含む。本明細書では、ヒストンタンパク質のテール断片はヒストンテールペプチド（ＨＴＰ）という。このようなタンパク質（ヒストン及び／又はＨＴＰ）は、本発明のナノ粒子のコアの一部として核酸ペイロードと共に凝縮しうるため、本明細書では、１つ以上のヒストン又はＨＴＰ（例えば、カチオン性ポリペプチド組成物の一部として）を含むコアはヌクレオソーム模倣体コアともいう。ヒストン及び／又はＨＴＰは、単量体として組み入れられうるが、一部の場合、核酸ペイロードを、ナノ粒子のコアへと凝縮する場合に、二量体、三量体、四量体、及び／又は八量体を形成しうる。一部の場合、ＨＴＰは、例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ媒介型アセチル化の場合における多様なヒストン修飾により、脱プロトン化されうるだけでなく、また、コアの構成要素の効果的な核特異的アンパッキング（例えば、ペイロードの放出）も媒介しうる。ヒストン及び／又はＨＴＰを含むコアのトラフィッキングは、ゴルジ体及び小胞体を介する逆行輸送を利用する、代替的なエンドサイトーシス経路に依拠してもよい。さらに、一部のヒストンは、内因性の核局在化配列を含み、ＮＬＳのコアへの組入れは、コア（ペイロードを含む）を、標的細胞の核へと方向付けうる。
【０２３４】
一部の態様では、本発明のカチオン性ポリペプチド組成物は、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＡＸ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、又はＨ４タンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。一部の場合、本発明のカチオン性ポリペプチド組成物は、ヒストンタンパク質のＮ末端領域に対応するアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。例えば、断片（ＨＴＰ）は、ヒストンタンパク質の最初の５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０のＮ末端アミノ酸を含みうる。一部の場合、本発明のＨＴＰは、ヒストンタンパク質のＮ末端領域に由来する、５〜５０アミノ酸（例えば、５〜４５、５〜４０、５〜３５、５〜３０、５〜２５、５〜２０、８〜５０、８〜４５、８〜４０、８〜３５、８〜３０、１０〜５０、１０〜４５、１０〜４０、１０〜３５、又は１０〜３０アミノ酸）を含む。一部の場合、本発明のカチオン性ポリペプチドは、５〜１５０アミノ酸（例えば、５〜１００、５〜５０、５〜３５、５〜３０、５〜２５、５〜２０、８〜１５０、８〜１００、８〜５０、８〜４０、８〜３５、８〜３０、１０〜１５０、１０〜１００、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３５、又は１０〜３０アミノ酸）を含む。
【０２３５】
一部の場合、カチオン性ポリペプチド組成物のカチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストン又はＨＴＰ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＡＸ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、又はＨ４）は、翻訳後修飾（例えば一部の場合、１つ以上のヒスチジン、リシン、アルギニン、又は他の相補性残基における）を含む。例えば一部の場合、カチオン性ポリペプチドは、メチル化される（及び／又はメチル化／脱メチル化を受けやすい）か、アセチル化される（及び／又はアセチル化／脱アセチル化を受けやすい）か、クロトニル化される（及び／又はクロトニル化／脱クロトニル化を受けやすい）か、ユビキチニル化される（及び／又はユビキチン化／脱ユビキチン化を受けやすい）か、リン酸化される（及び／又はリン酸化／脱リン酸化を受けやすい）か、ＳＵＭＯ化される（及び／又はＳＵＭＯ化／脱ＳＵＭＯ化を受けやすい）か、ファルネシル化される（及び／又はファルネシル化／脱ファルネシル化を受けやすい）か、硫酸化される（及び／又は硫酸化／脱硫酸化を受けやすい）か、又は他の形で翻訳後修飾される。一部の場合、カチオン性ポリペプチド組成物のカチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストン又はＨＴＰ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＡＸ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、又はＨ４）は、ｐ３００／ＣＢＰの基質（例えば、下記の代表的なＨＴＰ、例えば、配列番号１２９〜１３０を参照されたい）である。一部の場合、カチオン性ポリペプチド組成物のカチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストン又はＨＴＰ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＡＸ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、又はＨ４）は、硫酸化されるか、又は硫酸化を受けやすい（例えば、チオ硫酸スルフルトランスフェラーゼの基質として）、１つ以上のチオール残基（例えば、システイン及び／又はメチオニン残基を含みうる）を含む。一部の場合、カチオン性ポリペプチド組成物のカチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストン又はＨＴＰ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＡＸ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、又はＨ４）は、Ｃ末端においてアミド化される。ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４（及び／又はＨＴＰ）は、転写活性を促進又は抑制し、核特異的放出動態を変更するように、それらのリシンのうちのいずれかにおいて、モノメチル化されてもよく、ジメチル化されてもよく、トリメチル化されてもよい。
【０２３６】
カチオン性ポリペプチドは、所望の修飾により合成される場合もあり、in vitro反応により修飾される場合もある。代替的に、カチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストン又はＨＴＰ）は、細胞集団内で発現される場合があり、所望の修飾タンパク質は、単離／精製されうる。一部の場合、本発明のナノ粒子のカチオン性ポリペプチド組成物は、メチル化ＨＴＰを含む、例えば、Ｈ３Ｋ４（Ｍｅ３）のＨＴＰ配列を含む（配列番号７５又は８８として明示されたアミノ酸配列を含む）。一部の場合、カチオン性ポリペプチド組成物のカチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストン又はＨＴＰ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＡＸ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、又はＨ４）は、Ｃ末端のアミドを含む。
【０２３７】
ヒストン及びＨＴＰの例
例は、以下の配列：
Ｈ２Ａ
ＳＧＲＧＫＱＧＧＫＡＲＡＫＡＫＴＲＳＳＲ（配列番号６２）［１〜２０］
ＳＧＲＧＫＱＧＧＫＡＲＡＫＡＫＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫＧＧＧ（配列番号６３）［１〜３９］
ＭＳＧＲＧＫＱＧＧＫＡＲＡＫＡＫＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫＧＮＹＡＥＲＶＧＡＧＡＰＶＹＬＡＡＶＬＥＹＬＴＡＥＩＬＥＬＡＧＮＡＡＲＤＮＫＫＴＲＩＩＰＲＨＬＱＬＡＩＲＮＤＥＥＬＮＫＬＬＧＫＶＴＩＡＱＧＧＶＬＰＮＩＱＡＶＬＬＰＫＫＴＥＳＨＨＫＡＫＧＫ（配列番号６４）［１〜１３０］
Ｈ２ＡＸ
ＣＫＡＴＱＡＳＱＥＹ（配列番号６５）［１３４〜１４３］
ＫＫＴＳＡＴＶＧＰＫＡＰＳＧＧＫＫＡＴＱＡＳＱＥＹ（配列番号６６）［ＫＫ  １２０〜１２９］
ＭＳＧＲＧＫＴＧＧＫＡＲＡＫＡＫＳＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫＧＨＹＡＥＲＶＧＡＧＡＰＶＹＬＡＡＶＬＥＹＬＴＡＥＩＬＥＬＡＧＮＡＡＲＤＮＫＫＴＲＩＩＰＲＨＬＱＬＡＩＲＮＤＥＥＬＮＫＬＬＧＧＶＴＩＡＱＧＧＶＬＰＮＩＱＡＶＬＬＰＫＫＴＳＡＴＶＧＰＫＡＰＳＧＧＫＫＡＴＱＡＳＱＥＹ（配列番号６７）［１〜１４３］
Ｈ２Ｂ
ＰＥＰＡ−Ｋ（ｃｒ）−ＳＡＰＡＰＫ（配列番号６８）［１〜１１  Ｈ２ＢＫ５（ｃｒ）］
［ｃｒ：クロトニル化］
ＰＥＰＡＫＳＡＰＡＰＫ（配列番号６９）［１〜１１］
ＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥ（配列番号７０）［２１〜３５］
ＭＰＥＰＡＫＳＡＰＡＰＫＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＩＹＶＹＫＶＬＫＱＶＨＰＤＴＧＩＳＳＫＡＭＧＩＭＮＳＦＶＮＤＩＦＥＲＩＡＧＥＡＳＲＬＡＨＹＮＫＲＳＴＩＴＳＲＥＩＱＴＡＶＲＬＬＬＰＧＥＬＡＫＨＡＶＳＥＧＴＫＡＶＴＫＹＴＳＳＫ（配列番号７１）［１〜１２６］
【０２３８】
Ｈ３
ＡＲＴＫＱＴＡＲ（配列番号７２）［１〜８］
ＡＲＴ−Ｋ（Ｍｅ１）−ＱＴＡＲＫＳ（配列番号７３）［１〜８  Ｈ３Ｋ４（Ｍｅ１）］
ＡＲＴ−Ｋ（Ｍｅ２）−ＱＴＡＲＫＳ（配列番号７４）［１〜８  Ｈ３Ｋ４（Ｍｅ２）］
ＡＲＴ−Ｋ（Ｍｅ３）−ＱＴＡＲＫＳ（配列番号７５）［１〜８  Ｈ３Ｋ４（Ｍｅ３）］
ＡＲＴＫＱＴＡＲＫ−ｐＳ−ＴＧＧＫＡ（配列番号７６）［１〜１５  Ｈ３ｐＳ１０］
ＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＷＣ−ＮＨ２（配列番号７７）［１〜１８  ＷＣ、アミド］
ＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧ−Ｋ（Ａｃ）−ＡＰＲＫＱ（配列番号７８）［１〜１９  Ｈ３Ｋ１４（Ａｃ）］
ＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬ（配列番号７９）［１〜２０］
ＡＲＴＫＱＴＡＲ−Ｋ（Ａｃ）−ＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬ（配列番号８０）［１〜２０  Ｈ３Ｋ９（Ａｃ）］
ＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ（配列番号８１）［１〜２１］
ＡＲＴＫＱＴＡＲ−Ｋ（Ａｃ）−ＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ（配列番号８２）［１〜２１  Ｈ３Ｋ９（Ａｃ）］
ＡＲＴＫＱＴＡＲ−Ｋ（Ｍｅ２）−ＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ（配列番号８３）［１〜２１  Ｈ３Ｋ９（Ｍｅ１）］
ＡＲＴＫＱＴＡＲ−Ｋ（Ｍｅ２）−ＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ（配列番号８４）［１〜２１  Ｈ３Ｋ９（Ｍｅ２）］
ＡＲＴＫＱＴＡＲ−Ｋ（Ｍｅ２）−ＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ（配列番号８５）［１〜２１  Ｈ３Ｋ９（Ｍｅ３）］
ＡＲＴ−Ｋ（Ｍｅ１）−ＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ（配列番号８６）［１〜２１  Ｈ３Ｋ４（Ｍｅ１）］
ＡＲＴ−Ｋ（Ｍｅ２）−ＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ（配列番号８７）［１〜２１  Ｈ３Ｋ４（Ｍｅ２）］
ＡＲＴ−Ｋ（Ｍｅ３）−ＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ（配列番号８８）［１〜２１  Ｈ３Ｋ４（Ｍｅ３）］
ＡＲＴＫＱＴＡＲ−Ｋ（Ａｃ）−ｐＳ−ＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ（配列番号８９）［１〜２１  Ｈ３Ｋ９（Ａｃ）、ｐＳ１０］
ＡＲＴ−Ｋ（Ｍｅ３）−ＱＴＡＲ−Ｋ（Ａｃ）−ｐＳ−ＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ（配列番号９０）［１〜２１  Ｈ３Ｋ４（Ｍｅ３）、Ｋ９（Ａｃ）、ｐＳ１０］
ＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡＣ（配列番号９１）［１〜２１  Ｃｙｓ］
ＡＲＴＫＱＴＡＲ−Ｋ（Ａｃ）−ＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡＴＫＡ（配列番号９２）［１〜２４  Ｈ３Ｋ９（Ａｃ）］
ＡＲＴＫＱＴＡＲ−Ｋ（Ｍｅ３）−ＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡＴＫＡ（配列番号９３）［１〜２４  Ｈ３Ｋ９（Ｍｅ３）］
ＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡＴＫＡＡ（配列番号９４）［１〜２５］
ＡＲＴ−Ｋ（Ｍｅ３）−ＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡＴＫＡＡ（配列番号９５）［１〜２５  Ｈ３Ｋ４（Ｍｅ３）］
ＴＫＱＴＡＲ−Ｋ（Ｍｅ１）−ＳＴＧＧＫＡＰＲ（配列番号９６）［３〜１７  Ｈ３Ｋ９（Ｍｅ１）］
ＴＫＱＴＡＲ−Ｋ（Ｍｅ２）−ＳＴＧＧＫＡＰＲ（配列番号９７）［３〜１７  Ｈ３Ｋ９（Ｍｅ２）］
ＴＫＱＴＡＲ−Ｋ（Ｍｅ３）−ＳＴＧＧＫＡＰＲ（配列番号９８）［３〜１７  Ｈ３Ｋ９（Ｍｅ３）］
ＫＳＴＧＧ−Ｋ（Ａｃ）−ＡＰＲＫＱ（配列番号９９）［９〜１９  Ｈ３Ｋ１４（Ａｃ）］
ＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡＳＫ（配列番号１００）［５〜２３］
ＡＰＲＫＱＬＡＴＫＡＡＲＫＳＡＰＡＴＧＧＶＫＫＰＨ（配列番号１０１）［１５〜３９］
ＡＴＫＡＡＲＫＳＡＰＡＴＧＧＶＫＫＰＨＲＹＲＰＧ（配列番号１０２）［２１〜４４］
ＫＡＡＲＫＳＡＰＡ（配列番号１０３）［２３〜３１］
ＫＡＡＲＫＳＡＰＡＴＧＧ（配列番号１０４）［２３〜３４］
ＫＡＡＲＫＳＡＰＡＴＧＧＣ（配列番号１０５）［２３〜３４  Ｃｙｓ］
ＫＡＡＲ−Ｋ（Ａｃ）−ＳＡＰＡＴＧＧ（配列番号１０６）［Ｈ３Ｋ２７（Ａｃ）］
ＫＡＡＲ−Ｋ（Ｍｅ１）−ＳＡＰＡＴＧＧ（配列番号１０７）Ｈ３Ｋ２７（Ｍｅ１）］
ＫＡＡＲ−Ｋ（Ｍｅ２）−ＳＡＰＡＴＧＧ（配列番号１０８）［Ｈ３Ｋ２７（Ｍｅ２）］
ＫＡＡＲ−Ｋ（Ｍｅ３）−ＳＡＰＡＴＧＧ（配列番号１０９）［Ｈ３Ｋ２７（Ｍｅ３）］
ＡＴ−Ｋ（Ａｃ）−ＡＡＲＫＳＡＰＳＴＧＧＶＫＫＰＨＲＹＲＰＧ（配列番号１１０）［２１〜４４  Ｈ３Ｋ２３（Ａｃ）］
ＡＴＫＡＡＲＫ−ｐＳ−ＡＰＡＴＧＧＶＫＫＰＨＲＹＲＰＧ（配列番号１１１）［２１〜４４  ｐＳ２８］
ＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡＴＫＡＡＲＫＳＡＰＡＴＧＧＶ（配列番号１１２）［１〜３５］
ＳＴＧＧＶ−Ｋ（Ｍｅ１）−ＫＰＨＲＹ（配列番号１１３）［３１〜４１  Ｈ３Ｋ３６（Ｍｅ１）］
ＳＴＧＧＶ−Ｋ（Ｍｅ２）−ＫＰＨＲＹ（配列番号１１４）［３１〜４１  Ｈ３Ｋ３６（Ｍｅ２）］
ＳＴＧＧＶ−Ｋ（Ｍｅ３）−ＫＰＨＲＹ（配列番号１１５）［３１〜４１  Ｈ３Ｋ３６（Ｍｅ３）］
ＧＴＶＡＬＲＥＩＲＲＹＱ−Ｋ（Ａｃ）−ＳＴＥＬＬＩＲ（配列番号１１６）［４４〜６３  Ｈ３Ｋ５６（Ａｃ）］
ＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡＴＫＡＡＲＫＳＡＰＡＴＧＧＶＫＫＰＨＲＹＲＰＧＴＶＡＬＲＥ（配列番号１１７）［１〜５０］
ＴＥＬＬＩＲＫＬＰＦＱＲＬＶＲＥＩＡＱＤＦ−Ｋ（Ｍｅ１）−ＴＤＬＲＦＱＳＡＡＩ（配列番号１１８）［Ｈ３Ｋ７９（Ｍｅ１）］
ＥＩＡＱＤＦＫＴＤＬＲ（配列番号１１９）［７３〜８３］
ＥＩＡＱＤＦ−Ｋ（Ａｃ）−ＴＤＬＲ（配列番号１２０）［７３〜８３  Ｈ３Ｋ７９（Ａｃ）］
ＥＩＡＱＤＦ−Ｋ（Ｍｅ３）−ＴＤＬＲ（配列番号１２１）［７３〜８３  Ｈ３Ｋ７９（Ｍｅ３）］
ＲＬＶＲＥＩＡＱＤＦＫＴＤＬＲＦＱＳＳＡＶ（配列番号１２２）［６９〜８９］
ＲＬＶＲＥＩＡＱＤＦＫ−（Ｍｅ１）−ＴＤＬＲＦＱＳＳＡＶ（配列番号１２３）［６９〜８９  Ｈ３Ｋ７９（Ｍｅ１）、アミド］
ＲＬＶＲＥＩＡＱＤＦＫ−（Ｍｅ２）−ＴＤＬＲＦＱＳＳＡＶ（配列番号１２４）［６９〜８９  Ｈ３Ｋ７９（Ｍｅ２）、アミド］
ＲＬＶＲＥＩＡＱＤＦＫ−（Ｍｅ３）−ＴＤＬＲＦＱＳＳＡＶ（配列番号１２５）［６９〜８９  Ｈ３Ｋ７９（Ｍｅ３）、アミド］
ＫＲＶＴＩＭＰＫＤＩＱＬＡＲＲＩＲＧＥＲＡ（配列番号１２６）［１１６〜１３６］
ＭＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡＴＫＶＡＲＫＳＡＰＡＴＧＧＶＫＫＰＨＲＹＲＰＧＴＶＡＬＲＥＩＲＲＹＱＫＳＴＥＬＬＩＲＫＬＰＦＱＲＬＭＲＥＩＡＱＤＦＫＴＤＬＲＦＱＳＳＡＶＭＡＬＱＥＡＣＥＳＹＬＶＧＬＦＥＤＴＮＬＣＶＩＨＡＫＲＶＴＩＭＰＫＤＩＱＬＡＲＲＩＲＧＥＲＡ（配列番号１２７）［１〜１３６］
【０２３９】
Ｈ４
ＳＧＲＧＫＧＧ（配列番号１２８）［１〜７］
ＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＡ（配列番号１２９）［４〜１２］
ＳＧＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫＶ（配列番号１３０）［１〜２１］
ＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫＶＬＲＤＮＷＣ−ＮＨ２（配列番号１３１）［８〜２５  ＷＣ、アミド］
ＳＧＲＧ−Ｋ（Ａｃ）−ＧＧ−Ｋ（Ａｃ）−ＧＬＧ−Ｋ（Ａｃ）−ＧＧＡ−Ｋ（Ａｃ）−ＲＨＲＫＶＬＲＤＮＧＳＧＳＫ（配列番号１３２）［１〜２５  Ｈ４Ｋ５，８，１２，１６（Ａｃ）］
ＳＧＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ−ＮＨ２（配列番号１３３）［１〜２０  Ｈ４  ＰＲＭＴ７（タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ７）基質、Ｍ１］
ＳＧＲＧ−Ｋ（Ａｃ）−ＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号１３４）［１〜２０  Ｈ４Ｋ５（Ａｃ）］
ＳＧＲＧＫＧＧ−Ｋ（Ａｃ）−ＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号１３５）［１〜２０  Ｈ４Ｋ８（Ａｃ）］
ＳＧＲＧＫＧＧＫＧＬＧ−Ｋ（Ａｃ）−ＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号１３６）［１〜２０  Ｈ４Ｋ１２（Ａｃ）］
ＳＧＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡ−Ｋ（Ａｃ）−ＲＨＲＫ（配列番号１３７）［１〜２０  Ｈ４Ｋ１６（Ａｃ）］
ＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫＶＬＲＤＮＷＣ−ＮＨ２（配列番号１３８）［１〜２５  ＷＣ、アミド］
ＭＳＧＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫＶＬＲＤＮＩＱＧＩＴＫＰＡＩＲＲＬＡＲＲＧＧＶＫＲＩＳＧＬＩＹＥＥＴＲＧＶＬＫＶＦＬＥＮＶＩＲＤＡＶＴＹＴＥＨＡＫＲＫＴＶＴＡＭＤＶＶＹＡＬＫＲＱＧＲＴＬＹＧＦＧＧ（配列番号１３９）［１〜１０３］
を含むが、これらに限定されるものではない。
【０２４０】
このように、本発明のカチオン性ポリペプチド組成物のカチオン性ポリペプチドは、配列番号６２〜１３９のうちのいずれかに明示されたアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含みうる。一部の場合、本発明のカチオン性ポリペプチド組成物のカチオン性ポリペプチドは、配列番号６２〜１３９のうちのいずれかに明示されたアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合、本発明のカチオン性ポリペプチド組成物のカチオン性ポリペプチドは、配列番号６２〜１３９のうちのいずれかに明示されたアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。カチオン性ポリペプチドは、任意の好都合な修飾を含むことが可能であり、多数のこのような、想定された修飾、例えば、メチル化、アセチル化、クロトニル化、ユビキチニル化、リン酸化、ＳＵＭＯ化、ファルネシル化、硫酸化などについては、上記で論じられている。
【０２４１】
一部の場合、カチオン性ポリペプチド組成物のカチオン性ポリペプチドは、配列番号９４に明示されたアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合、カチオン性ポリペプチド組成物のカチオン性ポリペプチドは、配列番号９４に明示されたアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性（例えば、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合、カチオン性ポリペプチド組成物のカチオン性ポリペプチドは、配列番号９４に明示されたアミノ酸配列を含む。一部の場合、カチオン性ポリペプチド組成物のカチオン性ポリペプチドは、ヒトヒストン３タンパク質の最初の２５アミノ酸を含み、リシン４においてトリメチル化された（例えば一部の場合、Ｃ末端においてアミド化された）、Ｈ３Ｋ４（Ｍｅ３）（配列番号９５）により表される配列を含む。
【０２４２】
一部の態様では、カチオン性ポリペプチド組成物のカチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストン又はＨＴＰ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＡＸ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、又はＨ４）は、カチオン性（又は一部の場合、アニオン性）アミノ酸ポリマー、リンカー、ＮＬＳ、及び／又は他のカチオン性ポリペプチドへのコンジュゲーション（例えば一部の場合、分枝状ヒストン構造を形成する）を容易としうるシステイン残基を含む。例えば、システイン残基は、スルフヒドリル化学反応（例．ジスルフィド結合）及び／又はアミン反応性化学反応を介する架橋（コンジュゲーション）のために使用されうる。一部の場合、システイン残基は、内部システイン残基である。一部の場合、システイン残基は、Ｎ末端及び／又はＣ末端に位置する。一部の場合、カチオン性ポリペプチド組成物のカチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストン又はＨＴＰ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＡＸ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、又はＨ４）は、システイン残基を付加する突然変異（例えば、挿入又は置換）を含む。システインを含むＨＴＰの例は、
ＣＫＡＴＱＡＳＱＥＹ（配列番号１４０）−Ｈ２ＡＸから
ＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡＣ（配列番号１４１）−Ｈ３から
ＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＷＣ（配列番号１４２）
ＫＡＡＲＫＳＡＰＡＴＧＧＣ（配列番号１４３）Ｈ３から
ＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫＶＬＲＤＮＷＣ（配列番号１４４）Ｈ４から
ＭＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡＴＫＶＡＲＫＳＡＰＡＴＧＧＶＫＫＰＨＲＹＲＰＧＴＶＡＬＲＥＩＲＲＹＱＫＳＴＥＬＬＩＲＫＬＰＦＱＲＬＭＲＥＩＡＱＤＦＫＴＤＬＲＦＱＳＳＡＶＭＡＬＱＥＡＣＥＳＹＬＶＧＬＦＥＤＴＮＬＣＶＩＨＡＫＲＶＴＩＭＰＫＤＩＱＬＡＲＲＩＲＧＥＲＡ（配列番号１４５）Ｈ３から
を含むが、これらに限定されるものではない。
【０２４３】
一部の態様では、カチオン性ポリペプチド組成物のカチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストン又はＨＴＰ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＡＸ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、又はＨ４）は、本発明のナノ粒子のコアのカチオン性（及び／又はアニオン性）アミノ酸ポリマーへとコンジュゲートされる。例として述べると、ヒストン又はＨＴＰは、例えば、ポリマーのリシンのピリジルジスルフィド基が、ヒストン又はＨＴＰのシステインへのジスルフィド結合で置換されたシステイン残基を介して、カチオン性アミノ酸ポリマー（例えば、ポリ（リシン）を含むカチオン性アミノ酸ポリマー）へとコンジュゲートされうる。
【０２４４】
修飾／分枝構造
一部の態様では、本発明のカチオン性ポリペプチド組成物のカチオン性ポリペプチドは、直鎖構造を有する。一部の態様では、本発明のカチオン性ポリペプチド組成物のカチオン性ポリペプチドは、分枝構造を有する。
【０２４５】
例えば一部の場合、カチオン性ポリペプチド（例えば、ＨＴＰ、例えば、システイン残基を伴うＨＴＰ）は、カチオン性ポリマー（例えば、ポリ（L-アルギニン）、ポリ（D-リシン）、ポリ（L-リシン）、ポリ（D-リシン））の末端へとコンジュゲートされ（例えば、そのＣ末端において）、これにより、拡張型直鎖状ポリペプチドを形成する。一部の場合、１つ以上（２つ以上、３つ以上など）のカチオン性ポリペプチド（例えば、ＨＴＰ、例えば、システイン残基を伴うＨＴＰ）は、カチオン性ポリマー（例えば、ポリ（L-アルギニン）、ポリ（D-リシン）、ポリ（L-リシン）、ポリ（D-リシン））の末端へとコンジュゲートされ（例えば、それらのＣ末端において）、これにより、拡張型直鎖状ポリペプチドを形成する。一部の場合、カチオン性ポリマーは、４，５００〜１５０，０００Ｄａの範囲内の分子量を有する。
【０２４６】
別の例として述べると、一部の場合、１つ以上（２つ以上、３つ以上など）のカチオン性ポリペプチド（例えば、ＨＴＰ、例えば、システイン残基を伴うＨＴＰ）は、カチオン性ポリマー（例えば、ポリ（L-アルギニン）、ポリ（D-リシン）、ポリ（L-リシン）、ポリ（D-リシン））の側鎖へとコンジュゲートされ（例えば、それらのＣ末端において）、これにより、分枝構造（分枝状ポリペプチド）を形成する。ナノ粒子のコアの構成要素（例えば、本発明のカチオン性ポリペプチド組成物の構成要素）による分枝構造の形成は、一部の場合、達成されうるコアの凝縮（例えば、核酸ペイロードの凝縮）の量を増大させうる。したがって、一部の場合、分枝構造を形成する構成要素を使用することが所望される。多様な種類の分枝構造が、目的の分枝構造であり、生成されうる（例えば、本発明のカチオン性ポリペプチド、例えば、ＨＴＰ、例えば、システイン残基を伴うＨＴＰ；ペプトイド、ポリアミドなどを使用して）分枝構造の例は、ブラシポリマー、ウェブ（例えば、スパイダーウェブ）、グラフトポリマー、星形ポリマー、櫛形ポリマー、ポリマーネットワーク、デンドリマーなどを含むが、これらに限定されるものではない。
【０２４７】
一部の場合、分枝構造は、２〜３０のカチオン性ポリペプチド（例えば、ＨＴＰ）（例えば、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、４〜３０、４〜２５、４〜２０、４〜１５、又は４〜１０のカチオン性ポリペプチド）を含み、ここで、各カチオン性ポリペプチドは、分枝構造の他のカチオン性ポリペプチドと同じ場合もあり、異なる場合もある。一部の場合、カチオン性ポリマーは、４，５００〜１５０，０００Ｄａの範囲内の分子量を有する。一部の場合、カチオン性ポリマー（例えば、ポリ（L-アルギニン）、ポリ（D-リシン）、ポリ（L-リシン）、ポリ（D-リシン））の側鎖のうちの５％以上（例．１０％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上）は、本発明のカチオン性ポリペプチド（例えば、ＨＴＰ、例えば、システイン残基を伴うＨＴＰ）へとコンジュゲートされる。一部の場合、カチオン性ポリマー（例えば、ポリ（L-アルギニン）、ポリ（D-リシン）、ポリ（L-リシン）、ポリ（D-リシン））の側鎖のうちの５０％以下（例．４０％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下又は５％以下）は、本発明のカチオン性ポリペプチド（例えば、ＨＴＰ、例えば、システイン残基を伴うＨＴＰ）へとコンジュゲートされる。したがって、ＨＴＰは、ポリマー、例えば、カチオン性アミノ酸ポリマーの骨格から分枝していることがある。
【０２４８】
一部の場合、分枝構造の形成は、構成要素、例えば、ペプトイド（ポリペプトイド）、ポリアミド、デンドリマーなどを使用して容易とされうる。例えば一部の場合、ペプトイド（例．ポリペプトイド）は、ナノ粒子のコアの凝縮を容易としうるウェブ（例．スパイダーウェブ）構造を生成するために、ナノ粒子のコアの構成要素として使用される。
【０２４９】
ここにおける天然又は修飾ポリペプチド配列のうちの１つ以上は、末端の、又は間欠的なアルギニン、リシン、又はヒスチジン配列で修飾されてもよい。一態様では、各ポリペプチドは、ナノ粒子のコア内に、等しいアミンモル濃度で組み入れられる。この態様では、各ポリペプチドのＣ末端は５Ｒ（５つのアルギニン）で修飾されうる。一部の態様では、各ポリペプチドのＣ末端は９Ｒ（９つのアルギニン）で修飾されうる。一部の態様では、各ポリペプチドのＮ末端は５Ｒ（５つのアルギニン）で修飾されうる。一部の態様では、各ポリペプチドのＮ末端は９Ｒ（９つのアルギニン）で修飾されうる。一部の場合、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、及び／又はＨ４のヒストン断片（例えば、ＨＴＰ）は、各々、ＦＫＦＬであるカテプシンＢタンパク質分解性切断ドメイン、又はＲＧＦＦＰであるカテプシンＤタンパク質分解性切断ドメインと直列に架橋される。一部の場合、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、及び／又はＨ４のヒストン断片（例えば、ＨＴＰ）は、５Ｒ（５つのアルギニン）、９Ｒ（９つのアルギニン）、５Ｋ（５つのリシン）、９Ｋ（９つのリシン）、５Ｈ（５つのヒスチジン）、又は９Ｈ（９つのヒスチジン）のカチオン性スペーサードメインにより、直列に架橋されうる。一部の場合、１つ以上のＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、及び／又はＨ４のヒストン断片（例えば、ＨＴＰ）は、それらのＮ末端において、プロタミンへとジスルフィド架橋される。
【０２５０】
分枝状ヒストン構造を、どのように生成するのかを例示するために、代表的な調製法が提示される。このような方法の１つの例は、以下を含む：等モル比のヒストンＨ２ＡＸ［１３４〜１４３］、ヒストンＨ３［１〜２１のＣｙｓ］、ヒストンＨ３［２３〜３４のＣｙｓ］、ヒストンＨ４［８〜２５のＷＣ］、及びＳＶ４０  Ｔ−Ａｇ抗原由来ＮＬＳの共有結合的修飾は、１０％のピリジルジスルフィドで修飾されたポリ（L-リシン）［ＭＷ＝５４００、１８０００、又は４５０００Ｄａ；ｎ＝３０、１００、又は２５０］を伴う反応において実施することができる。典型的な反応では、７００μＭのＣｙｓ修飾ヒストン／ＮＬＳ（２０ナノモル）の２９μＬ水溶液を、０．２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）５７μＬへと添加することができる。次いで、第２に、１００μＭのピリジルジスルフィド保護ポリ（リシン）溶液１４μＬを、ヒストン溶液へと添加し、ピリジルジスルフィド基対システイン残基の比を１：２として、最終容量を、１００μＬへとすることができる。この反応は、室温で３時間行うことができる。反応を４回繰り返すことができ、ピリジン-2-チオンの３４３ｎｍの吸光度を介して、コンジュゲーション度を決定することができる。
【０２５１】
別の例として述べると、０：１、１：４、１：３、１：２、１：１、１：２、１：３、１：４、又は１：０のモル比のヒストンＨ３［１〜２１のＣｙｓ］ペプチド及びヒストンＨ３［２３〜３４のＣｙｓ］ペプチドの共有結合的修飾を、１０％のピリジルジスルフィドで修飾されたポリ（L-リシン）又はポリ（L-アルギニン）［ＭＷ＝５４００、１８０００、又は４５０００Ｄａ；ｎ＝３０、１００、又は２５０］を伴う反応において実施することができる。典型的な反応では、７００μＭのＣｙｓ修飾ヒストン（２０ナノモル）の２９μＬ水溶液を、０．２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）５７μＬへと添加することができる。次いで、第２に、１００μＭのピリジルジスルフィド保護ポリ（リシン）溶液１４μＬを、ヒストン溶液へと添加し、ピリジルジスルフィド基対システイン残基の比を１：２として、最終容量を、１００μＬへとすることができる。この反応は、室温で３時間行うことができる。反応を４回繰り返すことができ、ピリジン-2-チオンの３４３ｎｍの吸光度を介して、コンジュゲーション度を決定することができる。
【０２５２】
一部の場合、アニオン性ポリマーは、ターゲティングリガンドへとコンジュゲートされる。
【０２５３】
核局在化配列（ＮＬＳ）
一部の態様では、カチオン性ポリペプチド組成物のカチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストン又はＨＴＰ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＡＸ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、又はＨ４）は、１つ以上（例．２つ以上、３つ以上又は４つ以上）の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む（及び／又はこれとコンジュゲートする）。したがって、一部の場合、本発明のナノ粒子のカチオン性ポリペプチド組成物は、ＮＬＳを含むペプチドを含む。一部の場合、本発明のナノ粒子のヒストンタンパク質（又はＨＴＰ）は、１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上）の天然の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。一部の場合、本発明のナノ粒子のヒストンタンパク質（又はＨＴＰ）は、ヒストンタンパク質に対して異種である１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上）のＮＬＳを含む（すなわち、天然では、ヒストン／ＨＴＰの一部として生じないＮＬＳであり、例えば、ＮＬＳは、ヒトにより付加されうる）。一部の場合、ＨＴＰは、Ｎ及び／又はＣ末端において、ＮＬＳを含む。
【０２５４】
一部の態様では、カチオン性ポリマー組成物のカチオン性アミノ酸ポリマー（例えば、ポリ（アルギニン）（ＰＲ）、ポリ（リシン）（ＰＫ）、ポリ（ヒスチジン）（ＰＨ）、ポリ（オルニチン）、ポリ（シトルリン）、ポリ（D-アルギニン）（ＰＤＲ）、ポリ（D-リシン）（ＰＤＫ）、ポリ（D-ヒスチジン）（ＰＤＨ）、ポリ（D-オルニチン）、ポリ（D-シトルリン）、ポリ（L-アルギニン）（ＰＬＲ）、ポリ（L-リシン）（ＰＬＫ）、ポリ（L-ヒスチジン）（ＰＬＨ）、ポリ（L-オルニチン）、又はポリ（L-シトルリン））は、１つ以上（例．２つ以上、３つ以上又は４つ以上）のＮＬＳを含む（及び／又はこれとコンジュゲートする）。一部の場合、カチオン性アミノ酸ポリマーは、Ｎ及び／又はＣ末端において、ＮＬＳを含む。一部の場合、カチオン性アミノ酸ポリマーは、内部ＮＬＳを含む。
【０２５５】
一部の態様では、アニオン性ポリマー組成物のアニオン性アミノ酸ポリマー（例えば、ポリ（グルタミン酸）（ＰＥＡ）、ポリ（アスパラギン酸）（ＰＤＡ）、ポリ（D-グルタミン酸）（ＰＤＥＡ）、ポリ（D-アスパラギン酸）（ＰＤＤＡ）、ポリ（L-グルタミン酸）（ＰＬＥＡ）、又はポリ（L-アスパラギン酸）（ＰＬＤＡ））は、１つ以上（例．２つ以上、３つ以上又は４つ以上）のＮＬＳを含む（及び／又はこれとコンジュゲートする）。一部の場合、アニオン性アミノ酸ポリマーは、Ｎ及び／又はＣ末端において、ＮＬＳを含む。一部の場合、アニオン性アミノ酸ポリマーは、内部ＮＬＳを含む。
【０２５６】
任意の好都合な（例えば、ヒストン、ＨＴＰ、カチオン性アミノ酸ポリマー、アニオン性アミノ酸ポリマーなどと結合可能である）ＮＬＳが使用されうる。例は、クラス１及びクラス２の「単節型ＮＬＳ」のほか、クラス３〜５のＮＬＳ（例えば、Kosugi et al., J Biol Chem. 2009 Jan 2;284(1):478-85から転載された図６を参照されたい）を含むが、これらに限定されるものではない。一部の場合、ＮＬＳは、式：（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）Ｘ１０−１２（Ｋ／Ｒ）３−５を有する。一部の場合、ＮＬＳは、式：Ｋ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）を有する。
【０２５７】
一部の態様では、カチオン性ポリペプチド組成物のカチオン性ポリペプチドは、１つ以上（例．２つ以上、３つ以上又は４つ以上）のＮＬＳを含む。一部の場合、カチオン性ポリペプチドは、ヒストンタンパク質又はヒストン断片ではない（例えば、ＨＴＰではない）。したがって、一部の場合、カチオン性ポリペプチド組成物のカチオン性ポリペプチドは、ＮＬＳ含有ペプチドである。
【０２５８】
一部の場合、ＮＬＳ含有ペプチドは、カチオン性（又は一部の場合アニオン性）アミノ酸ポリマー、リンカー、ＨＴＰの場合のヒストンタンパク質、及び／又は他のカチオン性ポリペプチド（例えば一部の場合、分枝状ヒストン構造の一部としての）との結合を促進するシステイン残基を含む。例えば、システイン残基は、スルフヒドリル化学反応（例．ジスルフィド結合）及び／又はアミン反応性化学反応を介する架橋（コンジュゲーション）のために使用されうる。一部の場合、システイン残基は、システイン残基である。一部の場合、システイン残基は、Ｎ末端及び／又はＣ末端に位置する。一部の場合、カチオン性ポリペプチド組成物のＮＬＳ含有ペプチドは、システイン残基を付加する突然変異（例えば、挿入又は置換）（例えば、野生型アミノ酸配列と比べた）を含む。
【０２５９】
ＮＬＳ含有ペプチド（又は任意の好都合なカチオン性ポリペプチド、例えば、ＨＴＰ又はカチオン性ポリマー又はカチオン性アミノ酸ポリマー又はアニオン性アミノ酸ポリマーと結合したＮＬＳ）として使用されうるＮＬＳの例は、
ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１５１）（Ｔ−ａｇ ＮＬＳ）
ＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＹＣ（配列番号１５２）−ＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ−由来ＮＬＳ
ＰＫＫＫＲＫＶＧＰＫＫＫＲＫＶＧＰＫＫＫＲＫＶＧＰＫＫＫＲＫＶＧＣ（配列番号１５３）（ＮＬＳ ＳＶ４０）
ＣＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１５４）−システインＴＡＴのＮ末端システイン
ＣＳＩＰＰＥＶＫＦＮＫＰＦＶＹＬＩ（配列番号１５５）
ＤＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１５６）
ＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＹＣ（配列番号１５７）−ＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ−由来ＮＬＳのＣ末端システイン
ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ  （配列番号１５８）  ［ｃＭｙｃ ＮＬＳ］
を含むが、これらに限定されるものではない（これらの一部が、システイン残基を含む）。
【０２６０】
使用されうるＮＬＳの非限定的な例については、例えば、Kosugi et al., J Biol Chem. 2009 Jan 2;284(1):478-85を参照し、例えば、本開示の図６を参照されたい。
【０２６１】
ミトコンドリア局在化シグナル
一部の態様では、本発明のナノ粒子のカチオン性ポリペプチド（例えば、ヒストン又はＨＴＰ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ２Ａ、Ｈ２ＡＸ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、又はＨ４）、アニオン性ポリマー、及び／又はカチオン性ポリマーは、１つ以上（例．２つ以上、３つ以上又は４つ以上）のミトコンドリア局在化配列を含む（及び／又はこれとコンジュゲートする）。任意の好都合なミトコンドリア局在化配列が使用されうる。ミトコンドリア局在化配列の例は、ＰＥＤＥＩＷＬＰＥＰＥＳＶＤＶＰＡＫＰＩＳＴＳＳＭＭＭＰ（配列番号１４９）、ＳＤＨＢのミトコンドリア局在化配列、モノ／ジ／トリフェニルホスホニウム、又は他のホスホニウム、ＶＡＭＰ  １Ａ、ＶＡＭＰ  １Ｂ、ＤＧＡＴ２のＮ末端の６７アミノ酸、及びＢａｘのＮ末端の２０アミノ酸を含むが、これらに限定されるものではない。
【０２６２】
送達
上述のとおり、一部の態様では、本発明の方法は、送達媒体（例えば、ナノ粒子、送達分子など）を標的細胞に導入することを含み、これは、一部の場合、標的細胞を、送達媒体と接触させることにより達せられうる。標的細胞が、in vivoにおいて存在する場合、導入することは、送達媒体を、個体へと投与することにより達せられうる。本発明の送達媒体（例えば、ナノ粒子、送達分子など）は、任意の、所望の標的細胞、例えば、任意の所望の真核細胞へと送達されうる。
【０２６３】
一部の場合、標的細胞は、in vitro細胞である（例えば、細胞は、培養物中にある）、例えば、細胞は、確立された組織培養物細胞系の細胞でありうる。一部の場合、標的細胞は、ex vivo細胞である（例えば、細胞は、個体、例えば、患者から単離された初代細胞（又は継代数の若い子孫細胞）である）。一部の場合、標的細胞は、in vivoであり、したがって、生物の内部にある（生物の一部である）。
【０２６４】
例えば、送達媒体のペイロードとして明細書に記載される構成要素は、任意の好都合な経路（例は、全身、局所、非経口、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、頭蓋内（ｉ．ｃ．）、脊髄内、眼内、皮内（ｉ．ｄ．）、筋内（ｉ．ｍ．）、リンパ内（ｉ．ｌ．）、又は脊髄液内を含むが、これらに限定されるものではない）を介して、対象へと導入されうる（すなわち、個体へと投与される）。構成要素／送達媒体は、注入（例えば、全身注入、直接的な局所注入、腫瘍及び／若しくは腫瘍切除部位、又はこれらの近傍への局所注射など）、カテーテルなどにより導入されてもよい。局所送達（例えば、腫瘍及び／又はがんの部位への送達）のための方法の例は、例えば、シリンジによる、例えば、関節、腫瘍、若しくは臓器、又は関節、腫瘍、若しくは臓器の近傍への、例えば、ボーラス注入（injection）により；例えば、対流を伴う、例えば、カニューレ留置による、例えば、連続注入（infusion）による送達を含む（例えば、参照によりここに組み込まれる、米国特許出願公開第2007/0254842号を参照されたい）。
【０２６５】
対象への治療の投与回数は、変動してもよい。送達媒体を、個体へと導入することは、１回のイベントでありうるが；ある特定の状況では、このような治療は、限定的な期間、改善を誘発し、反復的な治療のシリーズの続行を要求してもよい。他の状況では、効果が観察される前に、送達媒体の複数回の投与が要求されうる。当業者がたやすく理解するように、正確なプロトコールは、疾患又は状態、病期、及び治療される個体についてのパラメータに依存する。
【０２６６】
「治療有効量」又は「治療用量」とは、所望の治療結果（すなわち、治療的効能を達成する）をもたらすのに十分な量である。治療有効量は、１回以上の投与で投与されうる。送達媒体の治療有効量は、個体に投与した場合に、本発明の目的において、疾患状態／障害を緩和する、改善する、安定化させる、抑制する、防止する、進行を緩徐にする、又は遅らせるのに十分な量である。
【０２６７】
代表的な治療介入は、宿主ゲノムへと組み込まれた、任意のレトロウイルスＤＮＡの除去に加えて、ＨＩＶ感染に対する抵抗性を創出する治療介入である。Ｔ細胞は、ＨＩＶの影響を直接に受けるので、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋細胞に対する、ハイブリッドの血液ターゲティング戦略が探索されてもよい。例えば、効果的な治療介入は、ＨＳＣ及びＴ細胞を同時にターゲティングし、複数の誘導型ヌクレアーゼ（例えば、単一の粒子内で）を介して、ＣＣＲ５−Δ３２及びｇａｇ／ｒｅｖ／ｐｏｌ遺伝子に対して、除去する（及び置きかえ配列を送達する）ことを含みうる。
【０２６８】
一部の場合、標的細胞は、哺乳動物細胞（例えば、齧歯動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、有蹄動物細胞、ウシ細胞、ヒツジ細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ラクダ細胞、ウサギ細胞、イヌ科動物（イヌ）細胞、ネコ科動物（ネコ）細胞、霊長動物細胞、非ヒト霊長動物細胞、ヒト細胞）である。任意の細胞がターゲティングされる場合があり、一部の場合、特定の細胞の特異的ターゲティングは、ターゲティングリガンド（例えば、ナノ粒子の表面コートの一部としての、送達分子の一部としての）の存在に依存し、この場合、ターゲティングリガンドは特定の細胞への結合のターゲティングをもたらす。例えば、ターゲティングされうる細胞は、骨髄細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、長期ＨＳＣ、短期ＨＳＣ、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄系前駆細胞、リンパ系前駆細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２のターゲティングを介する）、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、赤血球、巨核細胞、マスト細胞、好塩基球、好酸球、好中球、マクロファージ（例えば、ＳＩＲＰα−模倣体ペプチドを介する、ＣＤ４７のターゲティングを介する）、赤血球系前駆細胞（例．ＨＵＤＥＰ細胞）、巨核細胞−赤血球系前駆細胞（ＭＥＰ）、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）、複能性前駆細胞（ＭＰＰ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、短期ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ）、ＩＴ−ＨＳＣ、長期ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）、内皮細胞、ニューロン、星状細胞、膵細胞、膵島β細胞、筋肉細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、肝細胞、脂肪細胞、腸細胞、結腸細胞及び胃細胞を含むが、これらに限定されるものではない。
【０２６９】
多様な適用（例えば、ニューロン、膵臓細胞、造血幹細胞、及び複能性前駆細胞などをターゲティングするための）の例については、例えば、ターゲティングリガンドの文脈において、上記で論じられている。例えば、造血幹細胞及び複能性前駆細胞は、in vivoにおける遺伝子編集（例えば、挿入）のためにターゲティングされうる。in vivoにおける骨髄細胞のうちの１％（細胞約１５０億個）の編集であってもなお、ex vivo療法より多くの細胞（細胞約１００億個）をターゲティングすることになろう。別の例として述べると、膵臓細胞（例えば、膵島β細胞）は、例えば、膵臓がんを治療し、糖尿病などを治療するのにターゲティングされうる。別の例として述べると、脳内の体細胞、例えば、ニューロンがターゲティングされうる（例えば、適応症、例えば、ハンチントン病、パーキンソン病（例えば、ＬＲＲＫ２突然変異）、及びＡＬＳ（例えば、ＳＯＤ１突然変異）を治療するのに）。一部の場合、これは、直接的な頭蓋内注入を介して達成されうる。
【０２７０】
別の例として述べると、内皮細胞及び造血系の細胞（例えば、巨核細胞及び／又は巨核細胞の祖型である任意の前駆細胞、例えば、巨核細胞−赤血球系前駆細胞（ＭＥＰ）、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）、複能性前駆細胞（ＭＰＰ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、短期ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ）、ＩＴ−ＨＳＣ、長期ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）（例えば、図７〜８を参照されたい））は、フォンウィレブラント病を治療するのに、本発明のナノ粒子（又は本発明のウイルス性又は非ウイルス性の送達媒体）によりターゲティングされうる。例えば、フォンウィレブラント因子（ＶＷＦ）をコードする遺伝子内に突然変異を保有する細胞（例えば、内皮細胞、巨核細胞及び／又は巨核細胞の祖型である任意の前駆細胞、例えば、ＭＥＰ、ＣＭＰ、ＭＰＰ、ＨＳＣ、例えば、ＳＴ−ＨＳＣ、ＩＴ−ＨＳＣ、及び／又はＬＴ−ＨＳＣ）は、例えば、置きかえ配列を導入する（例えば、ドナーＤＮＡの送達を介する）ことにより、突然変異を導入された遺伝子を編集する（かつ、これを補正する）ために（in vitro、ex vivo、in vivoにおいて）ターゲティングされうる。上記の場合のうちの一部において（例えば、フォンウィレブラント病の治療に関する場合、ＶＷＦをコードする遺伝子内に突然変異を保有する細胞のターゲティングに関する場合に）、本発明のターゲティングリガンドは、E-セレクチンと結合する。
【０２７１】
本発明の方法及び組成物は、ゲノム内の突然変異のような既知の突然変異に連関する任意の数の疾患を治療するのに使用することができる。例えば、本発明の方法及び組成物は、鎌状赤血球病、βサラセミア、ＨＩＶ、骨髄異形成症候群、ＪＡＫ２媒介性真性多血症、ＪＡＫ２媒介性原発性骨髄線維症、ＪＡＫ２媒介性白血病及び様々な血液障害の治療に使用することができる。また、他の例としては、本発明の方法及び組成物は、Ｂ細胞抗体の生成、免疫療法（例えば、チェックポイント遮断剤の送達）及び幹細胞の分化にも使用することができる。
【０２７２】
一部の態様では、ターゲティングリガンドは、ＫＬＳ ＣＤ２７＋／ＩＬ−７Ｒａ−／ＣＤ１５０＋／ＣＤ３４−造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）との結合をもたらす。例えば、β−グロビン（ＨＢＢ）遺伝子は、変更されたＥ７Ｖ置換を、適切なドナーＤＮＡ分子（インサートドナー組成物の）で補正するように直接ターゲティングされてもよい。一例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１）は、それが、ＨＢＢ遺伝子内の座位に結合し、ゲノム内に切断を創出し、導入された第１のドナーＤＮＡ（標的ドナー組成物）からの配列の挿入を誘発するように、適切なガイドＲＮＡと共に送達されうる。前記挿入により生じる標的部位は、第２のドナーＤＮＡからの目的のヌクレオチド配列の挿入を触媒する部位特異的リコンビナーゼのための標的をもたらす。一部の場合、ドナーＤＮＡ分子（一本鎖又は二本鎖）が導入される（ペイロードの一部として）場合もあり、これが１４〜３０日間放出される一方で、ガイドＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質複合体（リボ核タンパク質複合体）は、１〜７日間放出されうる。
【０２７３】
一部の態様では、ターゲティングリガンドは、Ｔ細胞受容体を修飾するために、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋ Ｔ細胞、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と結合する。例えば、遺伝子編集ツール（本明細書の別の箇所で説明する）は、Ｔ細胞受容体を修飾するために、導入されうる。Ｔ細胞受容体は、直接ターゲティングされ、新規のＴ細胞受容体のための対応する相同性指向修復用のドナーＤＮＡ分子で置換されてもよい。１つの例として述べると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１）は、それが、ＨＢＢ遺伝子内の座位に結合し、ゲノム内に切断を創出し、導入された第１のドナーＤＮＡ（標的ドナー組成物）からの配列の挿入を誘発するように、適切なガイドＲＮＡと共に送達されうる。前記挿入により生じる標的部位は、第２のドナーＤＮＡからの目的のヌクレオチド配列の挿入を触媒する部位特異的リコンビナーゼのための標的をもたらす。本開示に従い、β-グロビン、ＣＣＲ５、Ｔ細胞受容体若しくは他の目的遺伝子をターゲティングする、他のＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ及びドナー配列、並びに／又は他の発現ベクターを使用してもよいことは当業者に明らかである。
【０２７４】
一部の場合、本発明の方法は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードし、一部の場合、約１００のドメインと定常領域がＶ（Ｄ）Ｊ領域から約１００，０００塩基対以上隔てられた１，０００，０００もの塩基対を有する座位をターゲティングするのに使用される。一部の場合、ドナーＤＮＡの挿入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列内で生じる。一部のこのような場合には、ゲノムに挿入される、ドナーＤＮＡの配列（インサートドナー組成物の）は、ＴＣＲタンパク質のＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３領域のアミノ酸をコードする。例えば、Dash et al., Nature. 2017 Jul 6;547(7661):89-93. Epub 2017 Jun 21及びGlanville et al., Nature. 2017 Jul 6;547(7661):94-98. Epub 2017 Jun 21を参照されたい。
【０２７５】
一部の場合、本発明の方法は、遺伝子を、それらが、ゲノム操作に対するフェイルセーフとしての特異的エンハンサーの制御下（これとの作動可能な連結下）に置かれるように挿入するのに使用される。挿入が失敗しても、後続の遺伝子をもたらすエンハンサーが破壊され、任意の可能なインデルが発現する可能性は低い。遺伝子の挿入が成功すれば、その末端に終止コドンを伴い、特に、マルチパートの遺伝子、例えば、ＴＣＲ座位に有用な、新たな遺伝子が挿入されうる。一部の場合、本発明の方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は他の構築物を、Ｔ細胞へと挿入するか、又はＢ細胞に特異的抗体又は抗体への代替物（例えば、ナノボディー、サメ抗体など）を創出させるのに使用されうる。
【０２７６】
一部の場合、ゲノムに挿入されるドナーＤＮＡの配列（インサートドナー組成物の）は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。一部のこのような場合には、ドナーＤＮＡの挿入は、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列の内因性Ｔ細胞プロモーターへの作動可能な連結をもたらす（すなわち、ＣＡＲの発現は、内因性プロモーターの制御下に置かれる）。一部の場合、ゲノムに挿入されるドナーＤＮＡの配列（インサートドナー組成物の）は、プロモーターに作動可能に連結するヌクレオチド配列を含み、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする（かつ、これにより、挿入されたＣＡＲはドナーＤＮＡ上に存在したプロモーターの制御下に置かれる）。
【０２７７】
一部の場合、ゲノムに挿入されるドナーＤＮＡの配列（インサートドナー組成物の）は、膜に結合し細胞外に提示される細胞特異的ターゲティングリガンドをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の場合、前記ドナーＤＮＡの挿入は、細胞特異的ターゲティングリガンドをコードするヌクレオチド配列の内因性プロモーターへの作動可能な連結をもたらす。一部の場合、ゲノムに挿入されるドナーＤＮＡの配列（インサートドナー組成物の）は、膜に結合し細胞外に提示される細胞特異的ターゲティングリガンドをコードする配列に作動可能に連結するプロモーターを含む（かつ、これにより、配列の挿入の後で、膜に結合したターゲティングリガンドの発現はドナーＤＮＡ上に存在したプロモーターの制御下に置かれる）。
【０２７８】
一部の態様では、ドナーＤＮＡの配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α又はδサブユニットをコードするヌクレオチド配列内で生じる。一部の場合、ドナーＤＮＡの配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、ＴＣＲβ又はγサブユニットをコードするヌクレオチド配列内で生じる。一部の場合、本発明の方法及び／又は組成物は、２つのドナーＤＮＡを含む。一部のこのような場合には、ドナーＤＮＡの１つの配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α又はδサブユニットをコードするヌクレオチド配列内で生じ、ドナーＤＮＡの他の配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）β又はγサブユニットをコードするヌクレオチド配列内で生じる。
【０２７９】
一部の態様では、ドナーＤＮＡの配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α又はδサブユニットの定常領域をコードするヌクレオチド配列内で生じる。一部の場合、ドナーＤＮＡの配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）β又はγサブユニットの定常領域をコードするヌクレオチド配列内で生じる。一部の場合、本発明の方法及び／又は組成物は、２つのドナーＤＮＡを含む。一部のこのような場合には、ドナーＤＮＡの１つの配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α又はδサブユニットの定常領域をコードするヌクレオチド配列内で生じ、ドナーＤＮＡの他の配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）β又はγサブユニットの定常領域をコードするヌクレオチド配列内で生じる。
【０２８０】
一部の態様では、ドナーＤＮＡの配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α又はδサブユニットのプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内で生じる。一部の場合、ドナーＤＮＡの配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）β又はγサブユニットのプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内で生じる。一部の場合、本発明の方法及び／又は組成物は、２つのドナーＤＮＡを含む。一部のこのような場合には、ドナーＤＮＡの１つの配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α又はδサブユニットのプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内で生じ、ドナーＤＮＡの他の配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）β又はγサブユニットのプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内で生じる。
【０２８１】
一部の態様では、ドナーＤＮＡの配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α又はγサブユニットをコードするヌクレオチド配列内で生じる。一部の場合、ドナーＤＮＡの配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、ＴＣＲβ又はδサブユニットをコードするヌクレオチド配列内で生じる。一部の場合、本発明の方法及び／又は組成物は、２つのドナーＤＮＡを含む。一部のこのような場合には、ドナーＤＮＡの１つの配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α又はγサブユニットをコードするヌクレオチド配列内で生じ、ドナーＤＮＡの他の配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）β又はδサブユニットをコードするヌクレオチド配列内で生じる。
【０２８２】
一部の態様では、ドナーＤＮＡの配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α又はγサブユニットの定常領域をコードするヌクレオチド配列内で生じる。一部の場合、ドナーＤＮＡの配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）β又はδサブユニットの定常領域をコードするヌクレオチド配列内で生じる。一部の場合、本発明の方法及び／又は組成物は、２つのドナーＤＮＡを含む。一部のこのような場合には、ドナーＤＮＡの１つの配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α又はγサブユニットの定常領域をコードするヌクレオチド配列内で生じ、ドナーＤＮＡの他の配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）β又はδサブユニットの定常領域をコードするヌクレオチド配列内で生じる。
【０２８３】
一部の態様では、ドナーＤＮＡの配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α又はγサブユニットのプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内で生じる。一部の場合、ドナーＤＮＡの配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）β又はδサブユニットのプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内で生じる。一部の場合、本発明の方法及び／又は組成物は、２つのドナーＤＮＡを含む。一部のこのような場合には、ドナーＤＮＡの１つの配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α又はγサブユニットのプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内で生じ、ドナーＤＮＡの他の配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）β又はδサブユニットのプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内で生じる。
【０２８４】
一部の態様では、ドナーＤＮＡの配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、挿入された配列のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α、β、の内因性プロモーターとの作動可能な連結をもたらす。一部の場合、挿入された配列は、挿入の後で、タンパク質をコードする配列がドナーＤＮＡ内に存在するプロモーターへの作動可能な連結を維持する（依然としてこの制御下にあり続ける）ように、ＴＣＲα、β、γ又はδのプロモーターに作動可能に連結するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。一部の場合、前記配列の挿入は、挿入された配列（例えば、タンパク質をコードするヌクレオチド配列、例えば、ＣＡＲ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、又はＴＣＲδの配列）の、ＣＤ３又はＣＤ２８プロモーターとの作動可能な連結をもたらす。一部の場合、挿入された、ドナーＤＮＡの配列（インサートドナー組成物の）は、プロモーター（例えば、Ｔ細胞特異的プロモーター）に作動可能に連結するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。一部の場合、ドナーＤＮＡの配列（インサートドナー組成物の）の挿入は、挿入された配列の内因性プロモーター（例えば、幹細胞特異的であるか、又は体細胞特異的な内因性プロモーター）との作動可能な連結をもたらす。一部の場合、挿入された、ドナーＤＮＡの配列（インサートドナー組成物の）は、レポータータンパク質（例えば、遺伝子編集効率を査定するための蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、近赤外及び／又は遠赤色のレポータータンパク質など）をコードするヌクレオチド配列を含む。一部の場合、挿入された配列は、イントロンを有さないタンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＴＣＲタンパク質の全体又は一部分をコードするヌクレオチド配列）を含む。
【０２８５】
一部の場合、本発明の方法（及び／又は本発明の組成物）は、適用のための配列の挿入、例えば、蛍光レポーター（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）／赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）／近赤外／遠赤色蛍光タンパク質など）の、例えば、任意の、コードされる、目的のタンパク質、例えば、膜貫通タンパク質のＣ及び／又はＮ末端への挿入のために使用されうる。
【０２８６】
共送達（本発明のナノ粒子には限定されない）
上述のとおり、複数のペイロードを、同じパッケージ（送達媒体）の一部として送達することの１つの利点は、各ペイロードの効率が低下しないことである。一部の態様では、第１のドナーＤＮＡ、１つ以上の部位特異的ヌクレアーゼ（又はこれをコードする１つ以上の核酸）、第２のドナーＤＮＡ、及び部位特異的リコンビナーゼ（又はこれをコードする核酸）は、同じ送達媒体のペイロードである。一部の態様では、ドナーＤＮＡ及び／又は１つ以上の遺伝子編集ツール（例えば、本明細書の別の箇所で説明する）は、タンパク質（及び／又はこれをコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ）、及び／又はゲノム編集効率を増大させる非コードＲＮＡと組み合わせて送達される（例えば、同じパッケージ／送達媒体の一部として送達される場合があり、ここで、送達媒体は、本開示のナノ粒子である必要はない）。一部の態様では、１つ以上の遺伝子編集ツールは、タンパク質（及び／又はこれをコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ）、並びに／又は細胞の分裂及び／若しくは分化を制御する非コードＲＮＡと組み合わせて送達される（例えば、同じパッケージ／送達媒体の一部として送達される場合があり、ここで、送達媒体は、本開示のナノ粒子である必要はない）。例えば一部の場合、１つ以上の遺伝子編集ツールは、タンパク質（及び／又はこれをコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ）、及び／又は細胞分裂を制御する非コードＲＮＡと組み合わせて送達される（例えば、同じパッケージ／送達媒体の一部として送達される場合があり、ここで、送達媒体は、本開示のナノ粒子である必要はない）。一部の場合、１つ以上の遺伝子編集ツールは、タンパク質（及び／又はこれをコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ）、及び／又は分化を制御する非コードＲＮＡと組み合わせて送達される（例えば、同じパッケージ／送達媒体の一部として送達される場合があり、ここで、送達媒体は、本開示のナノ粒子である必要はない）。一部の場合、１つ以上の遺伝子編集ツールは、タンパク質（及び／又はこれをコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ）、及び／又は細胞ＤＮＡ修復機構にバイアスをかける非コードＲＮＡと組み合わせて送達される（例えば、同じパッケージ／送達媒体の一部として送達される場合があり、ここで、送達媒体は、本開示のナノ粒子である必要はない）。
【０２８７】
上述のとおり、一部の場合、送達媒体は、本開示のナノ粒子である必要がない。例えば一部の場合、送達媒体は、ウイルス性であり、一部の場合、送達媒体は、非ウイルス性である。非ウイルス性送達システムの例は、複数の核酸ペイロード、又はタンパク質と核酸のペイロードの組合せを共凝縮させるのに使用されうる材料を含む。例は、（１）脂質ベースの粒子、例えば、両性イオン又はカチオン性脂質、及びエクソソーム又はエクソソーム由来の小胞；（２）無機／ハイブリッドの複合粒子、例えば、核酸及び／又はタンパク質のペイロードと共に、共凝縮されたイオン性複合体、並びにＣａ、Ｍｇ、Ｓｉ、Ｆｅのカチオン性イオン性状態、及び生理学的アニオン、例えば、Ｏ２−、ＯＨ、ＰＯ４３−、ＳＯ４２−から凝縮されうる複合体を含む、無機／ハイブリッドの複合粒子；（３）炭水化物送達媒体、例えば、シクロデキストリン及び／又はアルギネート；（４）ポリマー性及び／又は共ポリマー性の複合体、例えば、ポリ（アミノ酸）ベースの静電複合体、ポリ（アミド−アミン）、及びカチオン性ポリ（Ｂ−アミノエステル）；並びに（５）ウイルス様粒子（例えば、タンパク質及び核酸ベースの）を含むが、これらに限定されるものではない。ウイルス性送達システムの例は、ＡＡＶ、アデノウイルス性、レトロウイルス性、及びレンチウイルス性送達システムを含むが、これらに限定されるものではない。
【０２８８】
共送達のためのペイロードの例
一部の態様では、ここで記載されるペイロード構成要素は、ＳＣＦ（及び／又はＳＣＦをコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ）、ＨｏｘＢ４（及び／又はＨｏｘＢ４をコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ）、ＢＣＬ−ＸＬ（及び／又はＢＣＬ−ＸＬをコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ）、ＳＩＲＴ６（及び／又はＳＩＲＴ６をコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ）、ｍｉＲ−１５５を抑制する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ及び／又はＬＮＡ）、ｋｕ７０の発現を低減する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）、及びｋｕ８０の発現を低減する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）のうちの１つ以上と組み合わせて送達されうる（例えば、同じパッケージの部分／送達媒体として送達され、ここで、送達媒体は、本開示のナノ粒子である必要がない）。
【０２８９】
一体で送達できるマイクロＲＮＡ（ＲＮＡとして、又はＲＮＡをコードするＤＮＡとして送達される）の例については、図９を参照されたい。例えば、以下のマイクロＲＮＡは、以下の目的で使用されうる：多能性幹細胞の外胚葉系統への分化を遮断する目的で：ｍｉＲ−４３０／４２７／３０２；多能性幹細胞の内胚葉系統への分化を遮断する目的で：ｍｉＲ−１０９及び／又はｍｉＲ−２４；多能性幹細胞の内胚葉系統への分化を駆動する目的で：ｍｉＲ−１２２及び／又はｍｉＲ−１９２；外胚葉前駆細胞の角化細胞運命への分化を駆動する目的で：ｍｉＲ−２０３；神経堤幹細胞の平滑筋運命への分化を駆動する目的で：ｍｉＲ−１４５；神経幹細胞のグリア細胞運命及び／又はニューロン運命への分化を駆動する目的で：ｍｉＲ−９及び／又はｍｉＲ−１２４ａ；中胚葉前駆細胞の軟骨細胞運命への分化を遮断する目的で：ｍｉＲ−１９９ａ；中胚葉前駆細胞の骨芽細胞運命への分化を駆動する目的で：ｍｉＲ−２９６及び／又はｍｉＲ−２８６１；中胚葉前駆細胞の心筋運命への分化を駆動する目的で：ｍｉＲ−１；中胚葉前駆細胞の心筋運命への分化を遮断する目的で：ｍｉＲ−１３３；中胚葉前駆細胞の骨格筋運命への分化を駆動する目的で：ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−１及び／又はｍｉＲ−２６ａ；中胚葉前駆細胞の骨格筋運命への分化を遮断する目的で：ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２２１、及び／又はｍｉＲ−２２２；造血前駆細胞の分化への分化を駆動する目的で：ｍｉＲ−２２３；造血前駆細胞の分化への分化を遮断する目的で：ｍｉＲ−１２８ａ及び／又はｍｉＲ−１８１ａ；造血前駆細胞のリンパ系前駆細胞への分化を駆動する目的で：ｍｉＲ−１８１；造血前駆細胞のリンパ系前駆細胞への分化を遮断する目的で：ｍｉＲ−１４６；造血前駆細胞の骨髄系前駆細胞への分化を遮断する目的で：ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２４ａ、及び／又はｍｉＲ−１７；リンパ系前駆細胞のＴ細胞運命への分化を駆動する目的で：ｍｉＲ−１５０；骨髄系前駆細胞の顆粒球運命への分化を遮断する目的で：ｍｉＲ−２２３；骨髄系前駆細胞の単球運命への分化を遮断する目的で：ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ、及び／又はｍｉＲ−１０６ａ；骨髄系前駆細胞の赤血球運命への分化を遮断する目的で：ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２２１、及び／又はｍｉＲ−２２２；かつ骨髄系前駆細胞の赤血球運命への分化を駆動する目的で：ｍｉＲ−４５１及び／又はｍｉＲ−１６。
【０２９０】
ここで記載される構成要素（例えば、第１及び第２のドナーＤＮＡ、１つ以上の遺伝子編集ツール（例えば、本明細書の別の箇所で説明する）、並びに配列特異的リコンビナーゼ（又はこれらをコードする核酸））と併せて送達されうる、シグナル伝達タンパク質（例．細胞外シグナル伝達タンパク質）の例については、図１０を参照されたい。例えば、以下のシグナル伝達タンパク質（例．細胞外シグナル伝達タンパク質）（例えば、タンパク質として、又はタンパク質をコードする核酸、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡとして送達される）は、以下の目的で使用されうる：造血幹細胞のリンパ系共通前駆細胞系統への分化を駆動する目的で：ＩＬ−７；造血幹細胞の骨髄系共通前駆細胞系統への分化を駆動する目的で：ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、及び／又はＭ−ＣＳＦ；リンパ系共通前駆細胞のＢ細胞運命への分化を駆動する目的で：ＩＬ−３、ＩＬ−４、及び／又はＩＬ−７；リンパ系共通前駆細胞のナチュラルキラー細胞運命への分化を駆動する目的で：ＩＬ−１５；リンパ系共通前駆細胞のＴ細胞運命への分化を駆動する目的で：ＩＬ−２、ＩＬ−７、及び／又はＮｏｔｃｈ；リンパ系共通前駆細胞の樹状細胞運命への分化を駆動する目的で：Ｆｌｔ−３リガンド；骨髄系共通前駆細胞の樹状細胞運命への分化を駆動する目的で：Ｆｌｔ−３リガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、及び／又はＴＮＦα；骨髄系共通前駆細胞の顆粒球マクロファージ前駆細胞系統への分化を駆動する目的で：ＧＭ−ＣＳＦ；骨髄系共通前駆細胞の巨核細胞−赤血球系前駆細胞系統への分化を駆動する目的で：ＩＬ−３、ＳＣＦ、及び／又はＴｐｏ；巨核細胞−赤血球系前駆細胞の巨核細胞運命への分化を駆動する目的で：ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦ、及び／又はＴｐｏ；巨核細胞−赤血球系前駆細胞の赤血球運命への分化を駆動する目的で：エリスロポエチン；巨核細胞の血小板運命への分化を駆動する目的で：ＩＬ−１１及び／又はＴｐｏ；顆粒球マクロファージ前駆細胞の単球系統への分化を駆動する目的で：ＧＭ−ＣＳＦ及び／又はＭ−ＣＳＦ；顆粒球マクロファージ前駆細胞の骨芽細胞系統への分化を駆動する目的で：ＧＭ−ＣＳＦ；単球の単球由来樹状細胞運命への分化を駆動する目的で：Ｆｌｔ−３リガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα、及び／又はＩＬ−４；単球のマクロファージ運命への分化を駆動する目的で：ＩＦＮγ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、及び／又はＭ−ＣＳＦ；骨芽細胞の好中球運命への分化を駆動する目的で：Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、及び／又はＳＣＦ；骨芽細胞の好酸球運命への分化を駆動する目的で：ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、及び／又はＩＬ−５；かつ骨芽細胞の好塩基球運命への分化を駆動する目的で：Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及び／又はＩＬ−３。
【０２９１】
ここで記載される構成要素と併せて送達されうる（例えば、タンパク質及び／又はタンパク質をコードする核酸、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡとして）タンパク質の例は、ＳＯＸ１７、ＨＥＸ、ＯＳＫＭ（Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２／Ｋｌｆ４／ｃ−ｍｙｃ）、及び／又はｂＦＧＦ（例えば、肝幹細胞系統への分化を駆動する）；ＨＮＦ４ａ（例えば、肝細胞運命への分化を駆動する）；Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ＢＭＰ−４、ｂＦＧＦ、及び／又は８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（例えば、内皮幹細胞／前駆細胞系統への分化を駆動する）；ＶＥＧＦ（例えば、動脈内皮運命への分化を駆動する）；Ｓｏｘ−２、Ｂｒｎ４、Ｍｙｔ１ｌ、Ｎｅｕｒｏｄ２、Ａｓｃｌ１（例えば、神経幹細胞／前駆細胞系統への分化を駆動する）；並びにＢＤＮＦ、ＦＣＳ、フォルスコリン、及び／又はＳＨＨ（例えば、ニューロン、星状細胞、及び／又は希突起膠細胞運命への分化を駆動する）を含むが、これらに限定されるものではない。
【０２９２】
ここで記載される（例えば、タンパク質及び／又はタンパク質をコードする核酸、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡとして）構成要素と併せて送達されうるシグナル伝達タンパク質（例．細胞外シグナル伝達タンパク質）の例は、サイトカイン（例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を活性化させるための、例えば、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１５）；Ｎｏｔｃｈ、Ｗｎｔ、及び／又はＳｍａｄシグナル伝達経路のうちの１つ以上をモジュレートするリガンド及び／又はシグナル伝達タンパク質；ＳＣＦ；幹細胞プログラム化因子（例えば、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃなど）；並びにその後の単離／精製／濃縮のための、一時的表面マーカー「タグ」及び／又は蛍光レポーターを含むが、これらに限定されるものではない。例えば、線維芽細胞はＳｏｘ２の送達を介して神経幹細胞へと転換されうるが、Ｏｃｔ３／４及び低分子である「後成的リセット因子」の存在下では心筋細胞へとなるであろう。ハンチントン病又はＣＸＣＲ４突然変異を伴う患者では、これらの線維芽細胞は、それぞれ、ニューロン及び心臓細胞と関連する罹患表現型形質をコードしうる。遺伝子編集補正及びこれらの因子を単一のパッケージ内で送達することにより、導入される因子／ペイロードの全てではないが、これらの１つ以上に起因する有害作用の危険性が著明に低減されうる。
【０２９３】
適用は、細胞死のキューが、不成功の遺伝子編集を条件としてもよく、細胞の分化／増殖／活性化が、組織／臓器特異的プロモーター及び／又は外因性因子と関係づけられた、in vivo法を含む。遺伝子編集を施される罹患細胞は、活性化し、増殖してもよいが、別のプロモーター駆動型発現カセット（例えば、腫瘍抑制因子、例えば、ｐ２１又はｐ５３の非存在と関係づけられた発現カセット）の存在によって、これらの細胞は、その後、消失するであろう。他方、所望の特徴を発現する細胞は、所望の後代系統へと、さらに分化するように誘発されてもよい。
【０２９４】
キット
キットもまた、本開示の範囲内にある。例えば一部の場合、本発明のキットは、（ｉ）第１のドナーＤＮＡ（本明細書の別の箇所で説明）；（ｉｉ）１つ以上の部位特異的ヌクレアーゼ（又はこれをコードする１つ以上の核酸）、例えば、ＺＦＮ対、ＴＡＬＥＮ対、ニカーゼであるＣａ９、Ｃｐｆ１など；（ｉｉｉ）第２のドナーＤＮＡ（本明細書の別の箇所で説明）；（ｉｖ）配列特異的リコンビナーゼ（又はこれをコードする核酸）；（ｖ）ターゲティングリガンド、（ｖｉ）リンカー、（ｖｉｉ）リンカーと結合したターゲティングリガンド、（ｖｉｉｉ）アンカードメイン（例えば、リンカーを伴うか、又は伴わない）と結合したターゲティングリガンド、（ｉｘ）脱落層としての使用のための薬剤（例えば、シリカ）、（ｘ）さらなるペイロード、例えば、ｓｉＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡのための転写鋳型；遺伝子編集ツールなど、（ｘｉ）カチオン性ポリマーとして使用されうるポリマー、（ｘｉｉ）アニオン性ポリマーとして使用されうるポリマー、（ｘｉｉｉ）カチオン性ポリペプチドとして使用されうるポリペプチド、例えば、１つ以上のＨＴＰ、及び（ｘｉｖ）本発明のウイルス性又は非ウイルス性の送達媒体のうちの１つ以上（任意に組み合わされた）を含みうる。
一部の場合、本発明のキットは使用のための指示書を含みうる。キットは、キットの内容物の、意図された使用を指し示す表示を典型的に含む。「表示」という用語は、キット上若しくはキットと共に備えられるか、又は、他の形でキットに付随する、任意の、書かれるか、又は記録された材料、例えば、コンピュータ読取り型メディアを含む。
【０２９５】
ナノ粒子合成の第一の例
これらの操作は、滅菌の無粉塵環境（ＢＳＬ−ＩＩフード）内で実施した。気密性シリンジを７０％エタノールで滅菌処理してから、ヌクレアーゼ非含有水で３回すすぎ、使用する迄４℃で保管した。使用の前に表面をＲＮアーゼ阻害剤で処理した。
【０２９６】
ナノ粒子のコア
適量のペイロード（この場合、プラスミドＤＮＡ（ＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミド））を、ポリ（D-グルタミン酸）とポリ（L-グルタミン酸）の水性混合物（「アニオン性ポリマー組成物」）と組み合わせることにより、第１の溶液（アニオン性溶液）を調製した。この溶液をｐＨ８．５の１０ｍＭのトリス−ＨＣｌで適正な容量に希釈した。「カチオン性ポリマー組成物」と「カチオン性ポリペプチド組成物」の組合せである第２の溶液（カチオン性溶液）は、適量の凝縮剤を含有する濃縮溶液をｐＨ５．５の６０ｍＭのＨＥＰＥＳで適正な容量へと希釈することにより調製した。この場合、「カチオン性ポリマー組成物」はポリ（L-アルギニン）で、「カチオン性ポリペプチド組成物」は１６μｇのＨ３Ｋ４（ｍｅ３）（Ｋ４においてトリメチル化されたヒストンＨ３のテール）であった。
【０２９７】
２００μｌ未満のバッチにおけるナノ粒子コアの沈殿を、凝縮溶液のガラスバイアル又は低タンパク質結合性遠心管内のペイロード溶液への滴下による添加により行った後、４℃で３０分間インキュベーションした。２００μｌを超えるバッチについては、（例えば、標準的な混合チップ（例えば、Dolomite Micromixer）又は流体力学的フローフォーカシングチップを使用して）２つの溶液をマイクロ流体フォーマットで組み合わせることができる。最適のインプット流量は、得られたナノ粒子コアの懸濁液が単分散性で、１００ｎｍを下回る平均値粒子サイズを呈するように決定することができる。
【０２９８】
この場合、混合のために、上記２つの等容量溶液（カチオン性凝縮剤の溶液及びアニオン性凝縮剤の溶液）を調製した。カチオン性凝縮剤の溶液のために、ポリマー／ペプチド溶液を１つのタンパク質低結合性チューブ（エッペンドルフ管）に添加し、次いで６０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ５．５）で総容量１００μｌに希釈した（上述のとおり）。アニオン性溶液を調製する間、この溶液を室温で保存した。アニオン性凝縮剤の溶液のために、アニオン性溶液を光への曝露を最小限とする氷上で冷却した。水溶液中に１０μｇの核酸（約１μｇ／μｌ）及び７μｇの水性ポリ（D-グルタミン酸）［０．１％］を、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で総容量１００μｌに希釈した（上述のとおり）。
【０２９９】
０．２ミクロンのシリンジフィルターを使用して２つの溶液の各々を濾過し、元のHamilton製の１ｍｌ気密性シリンジ（ガラス（製品番号を挿入する））に移した。各シリンジをHarvard Pump 11 Elite Dual Syringe Pumpに取り付けた。チューブを使用して、シリンジをDolomite Micro Mixerチップの適切な注入口へと接続し、シリンジポンプを１２０μｌ／分で１００μｌの総容量にわたり作動させた。得られた溶液は、コア組成物（ここでは、核酸ペイロード、アニオン性構成要素及びカチオン性構成要素を含む）を含んだ。
【０３００】
コアの安定化（脱落層の追加）
コアを脱落層でコーティングするために、得られたナノ粒子コアの懸濁液を１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．５、１０〜５００ｍＭ）中のケイ酸ナトリウム、又は１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ８．５、１０〜５００ｍＭ）中の塩化カルシウムの希釈液と組み合わせ、室温で１〜２分間インキュベートした。この場合、コア組成物を希釈ケイ酸ナトリウム溶液に添加し、コアをポリマー性シリカの酸不安定性コーティング（脱落層の例）でコーティングした。このようにするために、原液のケイ酸ナトリウム（Sigma）１０μｌを、まずトリス緩衝液（１０ｍＭのトリスｐＨ＝８．５、１：２００希釈率）１．９９ｍｌ中で溶解させ、完全に混合した。滅菌０．１ミクロンシリンジフィルターを使用してケイ酸塩溶液を濾過し、Hamilton製の滅菌気密性シリンジに移し、これをシリンジポンプに取り付けた。上記によるコア組成物もまたHamilton製の滅菌気密性シリンジに移し、これもシリンジポンプに取り付けた。ＰＴＦＥチューブを使用してシリンジをDolomite Micro Mixerチップの適切な注入口へと接続し、シリンジポンプを１２０μｌ／分で作動させた。
【０３０１】
安定化させた（コーティングされた）コアは、標準的な遠心濾過デバイス（１００ｋＤａ Amicon Ultra、Millipore）又は高分子量カットオフ膜を使用して、３０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中で透析により精製することができる。この場合、安定化させた（コーティングされた）コアは遠心濾過デバイスを使用して精製した。回収されたコーティングナノ粒子（ナノ粒子溶液）を希釈ＰＢＳ（１：８００）又はＨＥＰＥＳで洗浄し、再度濾過した（溶液は、保管のために５００μｌの滅菌分散緩衝液又はヌクレアーゼ非含有水中に再懸濁させることができる）。効果的なシリカコーティングが裏付けられた。安定化させたコアは、１１０．６ｎｍのサイズ及び−４２．１ｍＶ（９５％）のゼータ電位を有した。
【０３０２】
表面コート（外殻）
場合によって「表面官能化」と呼ばれる表面コート（外殻とも呼ばれる）の追加は、リガンド分子種（この場合、カチオン性アンカードメインとしての９−Ａｒｇペプチド配列へと融合させた、狂犬病ウイルス糖タンパク質（「ＲＶＧ９Ｒ」））を安定化させた（この場合、シリカコーティングされた）ナノ粒子の負に帯電した表面へと、静電的にグラフトすることにより達成した。濾過され、緩衝液又は水中に再懸濁されたシリカコーティングナノ粒子から始めて、プロトン化アミン基の最終濃度が少なくとも７５ｕＭとなるように、添加すべきポリマー又はペプチドの量及び各ナノ粒子分散液の最終容量を決定した。所望の表面成分を添加し、溶液を２０〜３０秒間超音波処理してから、１時間インキュベートした。遠心濾過は３００ｋＤａで実施し（最終産物は、標準的な遠心濾過デバイス、例えばAmicon Ultra Milliporeの３００〜５００ｋＤａ型デバイス、又は、例えば高分子量カットオフ膜を使用する３０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中の透析を使用して精製することができる）、最終的な再懸濁は、細胞培養培地又は分散緩衝液中の再懸濁であった。一部の場合、最適の外殻の追加は、平均値粒子サイズを５０〜１５０ｎｍの間とし、ゼータ電位を０〜−１０ｍＶの間とする粒子の単分散懸濁液をもたらす。この場合、外殻を伴うナノ粒子は、１１５．８ｎｍのサイズ及び−３．１ｍＶ（１００％）のゼータ電位を有した。
【０３０３】
ナノ粒子合成の第二の例
ナノ粒子は、室温で、３７℃で、又はカチオン性及びアニオン性構成要素の間で３７℃と室温の差をつけて合成した。溶液は、カチオン性及びアニオン性構成要素の混合時における天然の静電相互作用を利用して、水性緩衝液中で調製した。開始時に、アニオン性構成要素をトリス緩衝液（３０ｍＭ〜６０ｍＭ；ｐＨ＝７．４〜９）又はＨＥＰＥＳ緩衝液（３０ｍＭ、ｐＨ＝５．５）中に溶解させる一方で、カチオン性構成要素をＨＥＰＥＳ緩衝液（３０ｍＭ〜６０ｍＭ、ｐＨ＝５〜６．５）中に溶解させた。
【０３０４】
具体的には、ペイロード（例．遺伝子素材（ＲＮＡ又はＤＮＡ）、遺伝子素材−タンパク質−核局在化シグナルポリペプチド複合体（リボ核タンパク質）又はポリペプチド）を、塩基性、中性又は酸性緩衝液中で復元した。解析を目的として、ペイロードをフルオロフォアで共有結合的にタグ付けされるか又はフルオロフォアを遺伝子コードするように製造した。ｐＤＮＡのペイロードでは、ＡＧＡＧＡＧタンデムリピートに特異的なＣｙ５タグ付けペプチド核酸（ＰＮＡ）を蛍光レポーターベクター及び蛍光レポーター−治療用遺伝子ベクターを蛍光タグ付けするのに使用した。負に帯電した凝縮分子種（例．ポリ（グルタミン酸））としても用いられる徐放型構成要素もまた、塩基性、中性又は酸性緩衝液中で復元した。リンカー−アンカー配列へとコンジュゲートした、野生型に由来するか又は野生型から突然変異させたターゲティングペプチドを伴うターゲティングリガンドを、酸性緩衝液中で復元した。さらなる凝縮分子種又は核局在化シグナルペプチドをナノ粒子内に組み入れる場合は、これらもまた、カチオン性分子種には０．０３％ｗ／ｖであり、アニオン性分子種には０．０１５％ｗ／ｖである作業溶液としての緩衝液中で復元した。実験は、カチオン性分子種に０．１％ｗ／ｖであり、アニオン性分子種に０．１％ｗ／ｖである作業溶液によっても行った。遺伝子素材と複合体化するポリペプチドを除き、全てのポリペプチドを１０分間超音波処理し、可溶性を改善した。
【０３０５】
本発明の代表的な非限定的側面
上記本対象物の態様を含む側面は、単独で有益であってもよく、１つ以上の他の側面又は態様と組み合わせて有益であってもよい。前出の記載を限定せずに述べると、本開示のある特定の非限定的な側面は、下記のセットＡ及びセットＢに提示される。本明細書を読んだ当業者には明らかなように、個別に番号付けされた側面の各々は、先行又は後続する個別に番号付けされた側面のうちのいずれかと共に使用されるか又は組み合わされてもよい。これは、側面の全てのこのような組合せに裏付けを与えるように意図されるものであり、下記に明示的に提示される側面の組合せに限定するように意図されるものではない。当業者には、本発明の精神又は範囲から逸脱しない限りにおいて、多様な変化及び改変がなされうることが明らかであろう。
【０３０６】
セットＡ
１．ドナー配列を細胞のゲノムに挿入するの方法であって、
細胞へと、
（ａ）１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ又は前記１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼをコードする１つ以上の核酸を含み、前記１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼが前記ゲノムを切断する、ヌクレアーゼ組成物；
（ｂ）前記ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含む第１のドナーＤＮＡを含み、前記ヌクレオチド配列の挿入が前記ゲノム内の挿入部位において部位特異的リコンビナーゼのための標的配列をもたらす、標的ドナー組成物；
（ｃ）前記部位特異的リコンビナーゼ又は前記部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸を含み、前記部位特異的リコンビナーゼが前記標的配列を認識する、リコンビナーゼ組成物；及び
（ｄ）前記部位特異的リコンビナーゼによる前記標的配列の認識の結果として前記ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含む第２のドナーＤＮＡを含むインサートドナー組成物
を含むペイロードを伴う送達媒体を導入することを含む方法。
２．前記標的ドナー組成物の前記第１のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列の挿入が、前記ゲノム内の第１の部位において前記部位特異的リコンビナーゼのための第１の標的配列をもたらし、前記ゲノム内の第２の部位において前記部位特異的リコンビナーゼのための第２の標的配列をもたらす、１に記載の方法。
３．前記ヌクレアーゼ組成物が２か所で前記ゲノムを切断し、前記標的ドナー組成物が前記第１のドナーＤＮＡのうちの２つを含み、それらの各々が前記ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含み、これにより、前記ゲノム内の第１の部位において前記部位特異的リコンビナーゼのための第１の標的配列をもたらし、前記ゲノム内の第２の部位において前記部位特異的リコンビナーゼのための第２の標的配列をもたらす、１に記載の方法。
４．前記ゲノム内の第１の部位及び第２の部位の間隔が、１，０００，０００塩基対以下である、２又は３に記載の方法。
５．前記ゲノム内の第１の部位及び第２の部位の間隔が、１００，０００塩基対以下である、２又は３に記載の方法。
６．前記ゲノムに挿入される前記インサートドナー組成物の前記ヌクレオチド配列の長さが、１０塩基対（ｂｐ）〜１００キロ塩基対（ｋｂｐ）である、２又は３に記載の方法。
７．前記第２のドナーＤＮＡが前記部位特異的リコンビナーゼのための２つの標的配列を含み、前記２つの標的配列が前記ゲノムに挿入される前記ヌクレオチド配列を挟む、１から６のいずれか一項に記載の方法。
８．前記部位特異的リコンビナーゼのための前記標的配列が、ａｔｔＢ部位、ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位、ａｔｔＲ部位、ｌｏｘＰ部位及びＦＲＴ部位から選択される、１から７のいずれか一項に記載の方法。
９．前記部位特異的リコンビナーゼが、ΦＣ３１、ΦＣ３１ ＲＤＦ、Ｃｒｅ及びＦＬＰから選択される、１から８のいずれか一項に記載の方法。
１０．前記１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼのうちの少なくとも１つが、メガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択される、１から９のいずれか一項に記載の方法。
【０３０７】
１１．前記１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼのうちの少なくとも１つが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質クラス２である、１から９のいずれか一項に記載の方法。
１２．前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質クラス２が、Ｃａｓ９及びｃｐｆ１から選択される、１１に記載の方法。
１３．前記ヌクレアーゼ組成物が、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓガイド核酸又は前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓガイド核酸をコードする１つ以上の核酸を含む、１１又は１２に記載の方法。
１４．送達媒体が、非ウイルス性である、１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
１５．送達媒体が、ナノ粒子である、１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
１６．ナノ粒子が、ペイロードに加えて、アニオン性ポリマー組成物、カチオン性ポリマー組成物及びカチオン性ポリペプチド組成物を含むコアを含む、１５に記載の方法。
１７．前記アニオン性ポリマー組成物が、ポリ（グルタミン酸）及びポリ（アスパラギン酸）から選択されるアニオン性ポリマーを含む、１６に記載の方法。
１８．前記カチオン性ポリマー組成物が、ポリ（アルギニン）、ポリ（リシン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（オルニチン）及びポリ（シトルリン）から選択されるカチオン性ポリマーを含む、１６又は１７に記載の方法。
１９．ナノ粒子が、コアを封入する脱落層をさらに含む、１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
２０．脱落層が、アニオン性コート又はカチオン性コートである、１９に記載の方法。
【０３０８】
２１．脱落層が、シリカ、ペプトイド、ポリシステイン、カルシウム、酸化カルシウム、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、マンガン、酸化マンガン、リン酸マンガン、硫酸マンガン、マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、鉄、酸化鉄、リン酸鉄及び硫酸鉄のうちの１つ以上を含む、１９又は２０に記載の方法。
２２．ナノ粒子が、脱落層を取り囲む表面コートをさらに含む、１９から２１のいずれか一項に記載の方法。
２３．表面コートが、脱落層と静電相互作用するカチオン性又はアニオン性のアンカードメインを含む、２２に記載の方法。
２４．表面コートが、１つ以上のターゲティングリガンドを含む、２２又は２３に記載の方法。
２５．前記１つ以上のターゲティングリガンドが、ペプチド、ＳｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、核酸アプタマー又はペプトイドから選択される、２４に記載の方法。
２６．表面コートが、狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）断片、ＡｐｏＥ−トランスフェリン、ラクトフェリン、メラノフェリチン、オボトランスフェリチン、L-セレクチン、E-セレクチン、P-セレクチン、シアル化ペプチド、ポリシアル化Ｏ結合型ペプチド、ＴＰＯ、ＥＰＯ、ＰＳＧＬ−１、ＥＳＬ−１、ＣＤ４４、死受容体３（ＤＲ３）、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、Ｍａｃ２−ＢＰ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＣＤ７０、ＳＨ２ドメイン含有タンパク質１Ａ（ＳＨ２Ｄ１Ａ）、エキセンディン−４、ＧＬＰ１、ＲＧＤ、トランスフェリンリガンド、ＦＧＦ断片、コハク酸、ビスホスホネート、造血幹細胞走化性脂質、スフィンゴシン、セラミド、スフィンゴシン-1-リン酸、セラミド-1-リン酸、及びこれらの活性ターゲティング断片からなる群から選択される１つ以上のターゲティングリガンドを含む、２２又は２３に記載の方法。
２７．表面コートが、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ９０、ＣＤ４５ｆ、ＣＤ３４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ；ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ及び／又はＴＣＲδの定常領域；４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ６２Ｌ、ＡＲＰ５、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＤ９４／ＮＫＧ２、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｈ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＤＮＡＭ、ＸＣＲ１、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＩＬＴ、ＬＩＲ、Ｌｙ４９、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＴＧＦ−β及びα５β１から選択される標的との結合をもたらす１つ以上のターゲティングリガンドを含む、２２又は２３に記載の方法。
２８．表面コートが、骨髄細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄系前駆細胞、リンパ系前駆細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、赤血球、巨核細胞、マスト細胞、好塩基球、好酸球、好中球、マクロファージ、赤血球系前駆細胞、巨核細胞−赤血球系前駆細胞（ＭＥＰ）、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）、複能性前駆細胞（ＭＰＰ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、短期ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ）、ＩＴ−ＨＳＣ、長期ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）、内皮細胞、ニューロン、星状細胞、膵細胞、膵島β細胞、肝臓細胞、筋肉細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、肝細胞、脂肪細胞、腸細胞、結腸細胞及び胃細胞から選択される標的細胞との結合をもたらす１つ以上のターゲティングリガンドを含む、２２又は２３に記載の方法。
２９．送達媒体がペイロードと結合したターゲティングリガンドであり、ターゲティングリガンドが細胞表面タンパク質と結合する、１から１４のいずれか一項に記載の方法。
３０．送達媒体が帯電ポリマーであるポリペプチドドメインと結合したターゲティングリガンドであり、ターゲティングリガンドが細胞表面タンパク質との結合をもたらし、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインが核酸ペイロードと共に凝縮され及び／又はタンパク質ペイロードと静電相互作用する、１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【０３０９】
３１．ターゲティングリガンドが、ペプチド、ＳｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、核酸アプタマー又はペプトイドである、２９又は３０に記載の方法。
３２．帯電ポリマーであるポリペプチドドメインのアミノ酸長が３〜３０である、３０に記載の方法。
３３．送達媒体が、ペイロード、及び帯電ポリマーであるポリペプチドドメインと相互作用するアニオン性ポリマーをさらに含む、３０から３２のいずれか一項に記載の方法。
３４．アニオン性ポリマーが、ポリ（グルタミン酸）及びポリ（アスパラギン酸）から選択される、３３に記載の方法。
３５．ターゲティングリガンドのアミノ酸長が５〜５０である、２９から３４のいずれか一項に記載の方法。
３６．ターゲティングリガンドが、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーＢ、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、細胞表面糖タンパク質及び細胞間接着分子から選択される細胞表面タンパク質と結合する、２９から３５のいずれか一項に記載の方法。
３７．ターゲティングリガンドが、狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）断片、ＡｐｏＥ−トランスフェリン、ラクトフェリン、メラノフェリチン、オボトランスフェリチン、L-セレクチン、E-セレクチン、P-セレクチン、シアル化ペプチド、ポリシアル化Ｏ結合型ペプチド、ＴＰＯ、ＥＰＯ、ＰＳＧＬ−１、ＥＳＬ−１、ＣＤ４４、死受容体３（ＤＲ３）、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、Ｍａｃ２−ＢＰ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＣＤ７０、ＳＨ２ドメイン含有タンパク質１Ａ（ＳＨ２Ｄ１Ａ）、エキセンディン−４、ＧＬＰ１、ＲＧＤ、トランスフェリンリガンド、ＦＧＦ断片、コハク酸、ビスホスホネート、造血幹細胞走化性脂質、スフィンゴシン、セラミド、スフィンゴシン-1-リン酸、セラミド-1-リン酸、及びこれらの活性ターゲティング断片からなる群から選択される、２９から３５のいずれか一項に記載の方法。
３８．ターゲティングリガンドが、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ９０、ＣＤ４５ｆ、ＣＤ３４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ；ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ及び／又はＴＣＲδの定常領域；４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ６２Ｌ、ＡＲＰ５、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＤ９４／ＮＫＧ２、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｈ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＤＮＡＭ、ＸＣＲ１、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＩＬＴ、ＬＩＲ、Ｌｙ４９、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＴＧＦ−β及びα５β１から選択される標的との結合をもたらす、２９から３５のいずれか一項に記載の方法。
３９．ターゲティングリガンドが、骨髄細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、長期ＨＳＣ、短期ＨＳＣ、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄系前駆細胞、リンパ系前駆細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、赤血球、巨核細胞、マスト細胞、好塩基球、好酸球、好中球、マクロファージ、赤血球系前駆細胞（例．ＨＵＤＥＰ細胞）、巨核細胞−赤血球系前駆細胞（ＭＥＰ）、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）、複能性前駆細胞（ＭＰＰ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、短期ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ）、ＩＴ−ＨＳＣ、長期ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）、内皮細胞、ニューロン、星状細胞、膵細胞、膵島β細胞、筋肉細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、肝細胞、脂肪細胞、腸細胞、結腸細胞及び胃細胞からなる群から選択される細胞への結合をもたらす、２９から３５のいずれか一項に記載の方法。
４０．第２のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列の前記ゲノムへの挿入が、挿入された配列の、内因性プロモーターとの作動可能な連結をもたらす、１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【０３１０】
４１．内因性プロモーターが、（ｉ）Ｔ細胞特異的プロモーター；（ｉｉ）ＣＤ３プロモーター；（ｉｉｉ）ＣＤ２８プロモーター；（ｉｖ）幹細胞特異的プロモーター；（ｖ）体細胞特異的プロモーター；及び（ｖｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α、β、γ又はδのプロモーターからなる群から選択される、４０に記載の方法。
４２．挿入されるインサートドナー組成物のヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結するタンパク質をコードする配列を含む、１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
４３．プロモーターが、（ｉ）Ｔ細胞特異的プロモーター；（ｉｉ）ＣＤ３プロモーター；（ｉｉｉ）ＣＤ２８プロモーター；（ｉｖ）幹細胞特異的プロモーター；（ｖ）体細胞特異的プロモーター；及び（ｖｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α、β、γ又はδのプロモーターからなる群から選択される、４２に記載の方法。
４４．前記ゲノムに挿入される第２のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質をコードする、１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
４５．前記ゲノムに挿入される前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質のＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３領域をコードする、１から４３のいずれか一項に記載の方法。
４６．前記ゲノムに挿入される前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、１から４３のいずれか一項に記載の方法。
４７．前記ＣＡＲをコードする前記ヌクレオチド配列の挿入が、前記ＣＡＲをコードする前記ヌクレオチド配列の内因性Ｔ細胞特異的プロモーターとの作動可能な連結をもたらす、４６に記載の方法。
４８．前記ゲノムに挿入される前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、多価表面受容体をコードする、１から４３のいずれか一項に記載の方法。
４９．前記細胞が、Ｔ細胞である、４８に記載の方法。
５０．前記多価表面受容体が、二特異性又は三特異性のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、４８又は４９に記載の方法。
【０３１１】
５１．前記ゲノムに挿入される前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、膜に結合し細胞外に提示される細胞特異的ターゲティングリガンドをコードする、１から４３のいずれか一項に記載の方法。
２．前記ゲノムに挿入される前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、レポータータンパク質をコードする、１から４３のいずれか一項に記載の方法。
５３．前記レポータータンパク質が、蛍光タンパク質である、５２に記載の方法。
５４．前記レポータータンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、細胞特異的又は組織特異的プロモーターに作動可能に連結されている、５２又は５３に記載の方法。
５５．前記レポータータンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、構成的プロモーターに作動可能に連結されている、５２又は５３に記載の方法。
５６．前記ゲノムに挿入される前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、イントロンを有さないタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、１から５５のいずれか一項に記載の方法。
５７．イントロンを有さない前記ヌクレオチド配列が、ＴＣＲタンパク質の、全体又は一部分をコードする、５６に記載の方法。
５８．方法が、前記送達媒体のうちの第１及び第２のものを細胞に導入することを含み、
前記ゲノムに挿入される第１の送達媒体の第２のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α又はδサブユニットをコードし、
前記ゲノムに挿入される第２の送達媒体の第２のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列が、ＴＣＲβ又はγサブユニットをコードする、
１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
５９．前記方法が、前記送達媒体のうちの第１及び第２のものを前記細胞に導入することを含み、
前記ゲノムに挿入される前記第１の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α又はδサブユニットの定常領域をコードし、
前記ゲノムに挿入される前記第２の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、ＴＣＲβ又はγサブユニットの定常領域をコードする、
１から５７のいずれか一項に記載の方法。
６０．方法が、前記送達媒体のうちの第１及び第２のものを細胞に導入することを含み、
第１の送達媒体の第２のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α又はδサブユニットのプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内に挿入され、
第２の送達媒体の第２のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列が、ＴＣＲβ又はγサブユニットのプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内に挿入される、
１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【０３１２】
６１．細胞が、哺乳動物細胞である、１から６０のいずれか一項に記載の方法。
６２．細胞が、ヒト細胞である、１から６１のいずれか一項に記載の方法。
６３．（ａ）１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ又は前記１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼをコードする１つ以上の核酸を含むヌクレアーゼ組成物；
（ｂ）部位特異的リコンビナーゼのための標的配列を含む第１のドナーＤＮＡを含む標的ドナー組成物；
（ｃ）前記部位特異的リコンビナーゼ又は前記部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸を含み、前記部位特異的リコンビナーゼが前記標的配列を認識する、リコンビナーゼ組成物；及び
（ｄ）標的細胞のゲノムへの挿入のための目的のヌクレオチド配列を含む第２のドナーＤＮＡを含むインサートドナー組成物
を含み；
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）が、同じ送達媒体の一部としてのペイロードである、
組成物。
６４．送達媒体が、ナノ粒子である、６３に記載の組成物。
６５．ナノ粒子が、（ａ）、（ｂ）、アニオン性ポリマー組成物、カチオン性ポリマー組成物、及びカチオン性ポリペプチド組成物を含むコアを含む、６４に記載の組成物。
６６．ナノ粒子が、ナノ粒子を細胞表面タンパク質と結合させるターゲティングリガンドを含む、６４又は６５に記載の組成物。
６７．前記ペイロードが、１つ以上のデオキシリボヌクレオタンパク質複合体又は１つ以上のリボ−デオキシリボヌクレオタンパク質複合体を形成する、６３から６６のいずれか一項に記載の組成物。
６８．送達媒体が帯電ポリマーであるポリペプチドドメインと結合したターゲティングリガンドであり、ターゲティングリガンドが細胞表面タンパク質との結合をもたらし、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインが１つ以上のペイロードと静電相互作用している、６３から６７のいずれか一項に記載の組成物。
６９．送達媒体が、１つ以上のペイロード、及び帯電ポリマーであるポリペプチドドメインと相互作用するアニオン性ポリマーをさらに含む、６８に記載の組成物。
７０．送達媒体が１つ以上のペイロードと結合したターゲティングリガンドであり、ターゲティングリガンドが細胞表面タンパク質と結合する、６３から６７のいずれか一項に記載の組成物。
【０３１３】
７１．前記送達媒体が、水中油中水エマルジョン粒子、水中油エマルジョンミセル粒子、多重膜型水中油中水エマルジョン粒子、多層型粒子又はＤＮＡオリガミナノボットをコーティングするターゲティングリガンドを含む、６３から６７のいずれか一項に記載の組成物。
７２．ターゲティングリガンドが、ペプチド、ＳｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、核酸アプタマー又はペプトイドである、６６から７１のいずれか一項に記載の方法。
７３．送達媒体が、非ウイルス性である、６３から６７のいずれか一項に記載の組成物。
【０３１４】
セットＢ
１．ドナー配列を細胞のゲノムに挿入する方法であって、
細胞へと、
（ａ）１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ又は前記１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼをコードする１つ以上の核酸を含み、前記１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼが前記ゲノムを切断する、ヌクレアーゼ組成物；
（ｂ）前記ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含む第１のドナーＤＮＡを含み、前記ヌクレオチド配列の挿入が前記ゲノム内の挿入部位において部位特異的リコンビナーゼのための標的配列をもたらす、標的ドナー組成物；
（ｃ）前記部位特異的リコンビナーゼ又は前記部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸を含み、前記部位特異的リコンビナーゼが前記標的配列を認識する、リコンビナーゼ組成物；及び
（ｄ）前記部位特異的リコンビナーゼによる前記標的配列の認識の結果として前記ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含む第２のドナーＤＮＡを含むインサートドナー組成物
を含むペイロードを伴う送達媒体を導入することを含む方法。
２．前記標的ドナー組成物の前記第１のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列の挿入が、前記ゲノム内の第１の部位において前記部位特異的リコンビナーゼのための第１の標的配列をもたらし、前記ゲノム内の第２の部位において、前記部位特異的リコンビナーゼのための第２の標的配列をもたらす、１に記載の方法。
３．前記ヌクレアーゼ組成物が２か所で前記ゲノムを切断し、前記標的ドナー組成物が前記第１のドナーＤＮＡのうちの２つを含み、それらの各々が前記ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含み、これにより、前記ゲノム内の第１の部位において前記部位特異的リコンビナーゼのための第１の標的配列をもたらし、前記ゲノム内の第２の部位において前記部位特異的リコンビナーゼのための第２の標的配列をもたらす、１に記載の方法。
４．前記ゲノム内の第１の部位及び第２の部位の間隔が、１，０００，０００塩基対以下である、請求項２又は３に記載の方法。
５．前記ゲノム内の第１の部位及び第２の部位の間隔が、１００，０００塩基対以下である、請求項２又は３に記載の方法。
６．前記ゲノムに挿入される前記インサートドナー組成物の前記ヌクレオチド配列の長さが、１０塩基対（ｂｐ）〜１００キロ塩基対（ｋｂｐ）である、２又は３に記載の方法。
７．前記第２のドナーＤＮＡが前記部位特異的リコンビナーゼのための２つの標的配列を含み、前記２つの標的配列が前記ゲノムに挿入される前記ヌクレオチド配列を挟む、１から６のいずれか一項に記載の方法。
８．前記部位特異的リコンビナーゼのための前記標的配列が、ａｔｔＢ部位、ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位、ａｔｔＲ部位、ｌｏｘＰ部位及びＦＲＴ部位から選択される、１から７のいずれか一項に記載の方法。
９．前記部位特異的リコンビナーゼが、ΦＣ３１、ΦＣ３１ ＲＤＦ、Ｃｒｅ及びＦＬＰから選択される、１から８のいずれか一項に記載の方法。
１０．前記１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼのうちの少なくとも１つが、メガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択される、１から９のいずれか一項に記載の方法。
【０３１５】
１１．前記１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼのうちの少なくとも１つが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質クラス２である、１から９のいずれか一項に記載の方法。
１２．前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質クラス２が、Ｃａｓ９及びｃｐｆ１から選択される、１１に記載の方法。
１３．前記ヌクレアーゼ組成物が、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓガイド核酸又は前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓガイド核酸をコードする１つ以上の核酸を含む、１１又は１２に記載の方法。
１４．前記送達媒体が、非ウイルス性である、１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
１５．前記送達媒体が、ナノ粒子である、１から１４のいずれか一項に記載の方法。
１６．前記ナノ粒子が、前記ペイロードに加えて、アニオン性ポリマー組成物、カチオン性ポリマー組成物及びカチオン性ポリペプチド組成物を含むコアを含む、１５に記載の方法。
１７．前記アニオン性ポリマー組成物が、ポリ（グルタミン酸）及びポリ（アスパラギン酸）から選択されるアニオン性ポリマーを含む、１６に記載の方法。
１８．前記カチオン性ポリマー組成物が、ポリ（アルギニン）、ポリ（リシン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（オルニチン）及びポリ（シトルリン）から選択されるカチオン性ポリマーを含む、１６又は１７に記載の方法。
１９．ナノ粒子が、コアを封入する脱落層をさらに含む、１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
２０．脱落層が、アニオン性コート又はカチオン性コートである、１９に記載の方法。
【０３１６】
２１．脱落層が、シリカ、ペプトイド、ポリシステイン、カルシウム、酸化カルシウム、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、マンガン、酸化マンガン、リン酸マンガン、硫酸マンガン、マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、鉄、酸化鉄、リン酸鉄及び硫酸鉄のうちの１つ以上を含む、１９又は２０に記載の方法。
２２．ナノ粒子が、脱落層を取り囲む表面コートをさらに含む、１９から２１のいずれか一項に記載の方法。
２３．表面コートが、脱落層と静電相互作用するカチオン性又はアニオン性のアンカードメインを含む、２２に記載の方法。
２４．表面コートが、１つ以上のターゲティングリガンドを含む、２２又は２３に記載の方法。
２５．前記１つ以上のターゲティングリガンドが、ペプチド、ＳｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、核酸アプタマー又はペプトイドから選択される、２４に記載の方法。
２６．前記表面コートが、狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）断片、ＡｐｏＥ−トランスフェリン、ラクトフェリン、メラノフェリチン、オボトランスフェリチン、L-セレクチン、E-セレクチン、P-セレクチン、シアル化ペプチド、ポリシアル化Ｏ結合型ペプチド、ＴＰＯ、ＥＰＯ、ＰＳＧＬ−１、ＥＳＬ−１、ＣＤ４４、死受容体３（ＤＲ３）、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、Ｍａｃ２−ＢＰ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＣＤ７０、ＳＨ２ドメイン含有タンパク質１Ａ（ＳＨ２Ｄ１Ａ）、エキセンディン４、ＧＬＰ１、ＲＧＤ、トランスフェリンリガンド、ＦＧＦ断片、コハク酸、ビスホスホネート、造血幹細胞走化性脂質、スフィンゴシン、セラミド、スフィンゴシン-1-リン酸、セラミド-1-リン酸、ＩＬ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８ε、ペプチド−ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、及びこれらの活性ターゲティング断片からなる群から選択される１つ以上のターゲティングリガンドを含む、２２又は２３に記載の方法。
２７．表面コートが、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ９０、ＣＤ４５ｆ、ＣＤ３４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４７、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ；ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ及び／又はＴＣＲδの定常領域；４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ６２Ｌ、ＡＲＰ５、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＤ９４／ＮＫＧ２、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｈ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＤＮＡＭ、ＸＣＲ１、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＩＬＴ、ＬＩＲ、Ｌｙ４９、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ１０Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、ＩＬ１８Ｒ、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＴＧＦ−β及びα５β１から選択される標的との結合をもたらす１つ以上のターゲティングリガンドを含む、２２又は２３に記載の方法。
２８．表面コートが、骨髄細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄系前駆細胞、リンパ系前駆細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、赤血球、巨核細胞、マスト細胞、好塩基球、好酸球、好中球、マクロファージ、赤血球系前駆細胞、巨核細胞−赤血球系前駆細胞（ＭＥＰ）、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）、複能性前駆細胞（ＭＰＰ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、短期ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ）、ＩＴ−ＨＳＣ、長期ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）、内皮細胞、ニューロン、星状細胞、膵細胞、膵島β細胞、肝臓細胞、筋肉細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、肝細胞、脂肪細胞、腸細胞、結腸細胞及び胃細胞から選択される標的細胞との結合をもたらす１つ以上のターゲティングリガンドを含む、２２又は２３に記載の方法。
２９．送達媒体がペイロードと結合したターゲティングリガンドであり、ターゲティングリガンドが細胞表面タンパク質と結合する、１から１４のいずれか一項に記載の方法。
３０．送達媒体が帯電ポリマーであるポリペプチドドメインと結合したターゲティングリガンドであり、ターゲティングリガンドが細胞表面タンパク質との結合をもたらし、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインが核酸ペイロードと共に凝縮され及び／又はタンパク質ペイロードと静電相互作用する、１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【０３１７】
３１．ターゲティングリガンドが、ペプチド、ＳｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、核酸アプタマー又はペプトイドである、２９又は３０に記載の方法。
３２．帯電ポリマーであるポリペプチドドメインのアミノ酸長が３〜３０である、３０に記載の方法。
３３．送達媒体が、ペイロード、及び帯電ポリマーであるポリペプチドドメインと相互作用するアニオン性ポリマーをさらに含む、３０から３２のいずれか一項に記載の方法。
３４．アニオン性ポリマーが、ポリ（グルタミン酸）及びポリ（アスパラギン酸）から選択される、３３に記載の方法。
３５．ターゲティングリガンドのアミノ酸長が５〜５０である、２９から３４のいずれか一項に記載の方法。
３６．ターゲティングリガンドが、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーＢ、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、細胞表面糖タンパク質及び細胞間接着分子から選択される細胞表面タンパク質と結合する、２９から３５のいずれか一項に記載の方法。
３７．ターゲティングリガンドが、狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）断片、ＡｐｏＥ−トランスフェリン、ラクトフェリン、メラノフェリチン、オボトランスフェリチン、L-セレクチン、E-セレクチン、P-セレクチン、シアル化ペプチド、ポリシアル化Ｏ結合型ペプチド、ＴＰＯ、ＥＰＯ、ＰＳＧＬ−１、ＥＳＬ−１、ＣＤ４４、死受容体３（ＤＲ３）、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、Ｍａｃ２−ＢＰ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＣＤ７０、ＳＨ２ドメイン含有タンパク質１Ａ（ＳＨ２Ｄ１Ａ）、エキセンディン、エキセンディン−Ｓ１１Ｃ、ＧＬＰ１、ＲＧＤ、トランスフェリンリガンド、ＦＧＦ断片、α５β１リガンド、ＩＬ２、Ｃｄｅ３ε、ペプチド−ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、コハク酸、ビスホスホネート、造血幹細胞走化性脂質、スフィンゴシン、セラミド、スフィンゴシン-1-リン酸、セラミド-1-リン酸、及びこれらの活性ターゲティング断片からなる群から選択される、２９から３５のいずれか一項に記載の方法。
３８．ターゲティングリガンドが、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ９０、ＣＤ４５ｆ、ＣＤ３４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４７、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ；ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ及び／又はＴＣＲδの定常領域；４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ６２Ｌ、ＡＲＰ５、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＤ９４／ＮＫＧ２、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｈ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＤＮＡＭ、ＸＣＲ１、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＩＬＴ、ＬＩＲ、Ｌｙ４９、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＴＧＦ−β、及びα５β１から選択される標的との結合をもたらす、２９から３５のいずれか一項に記載の方法。
３９．ターゲティングリガンドが、骨髄細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、長期ＨＳＣ、短期ＨＳＣ、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄系前駆細胞、リンパ系前駆細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、赤血球、巨核細胞、マスト細胞、好塩基球、好酸球、好中球、マクロファージ、赤血球系前駆細胞（例．ＨＵＤＥＰ細胞）、巨核細胞−赤血球系前駆細胞（ＭＥＰ）、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）、複能性前駆細胞（ＭＰＰ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、短期ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ）、ＩＴ−ＨＳＣ、長期ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）、内皮細胞、ニューロン、星状細胞、膵細胞、膵島β細胞、筋肉細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、肝細胞、脂肪細胞、腸細胞、結腸細胞及び胃細胞からなる群から選択される細胞への結合をもたらす、２９から３５のいずれか一項に記載の方法。
４０．前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列の前記ゲノムへの挿入が、挿入された配列の内因性プロモーターとの作動可能な連結をもたらす、１から３９のいずれか一項に記載の方法。
【０３１８】
４１．前記内因性プロモーターが、（ｉ）Ｔ細胞特異的プロモーター；（ｉｉ）ＣＤ３プロモーター；（ｉｉｉ）ＣＤ２８プロモーター；（ｉｖ）幹細胞特異的プロモーター；（ｖ）体細胞特異的プロモーター；（ｖｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α、β、γ又はδのプロモーター；（ｖ）Ｂ細胞特異的プロモーター；（ｖｉ）ＣＤ１９プロモーター；（ｖｉｉ）ＣＤ２０プロモーター；（ｖｉｉｉ）ＣＤ２２プロモーター；（ｉｘ）Ｂ２９プロモーター；及び（ｘ）Ｔ細胞又はＢ細胞のＶ（Ｄ）Ｊ特異的プロモーターからなる群から選択される、４０に記載の方法。
４２．挿入される前記インサートドナー組成物の前記ヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結するタンパク質をコードする配列を含む、１から３９のいずれか一項に記載の方法。
４３．前記プロモーターが、（ｉ）Ｔ細胞特異的プロモーター；（ｉｉ）ＣＤ３プロモーター；（ｉｉｉ）ＣＤ２８プロモーター；（ｉｖ）幹細胞特異的プロモーター；（ｖ）体細胞特異的プロモーター；（ｖｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α、β、γ又はδのプロモーター；（ｖ）Ｂ細胞特異的プロモーター；（ｖｉ）ＣＤ１９プロモーター；（ｖｉｉ）ＣＤ２０プロモーター；（ｖｉｉｉ）ＣＤ２２プロモーター；（ｉｘ）Ｂ２９プロモーター；及び（ｘ）Ｔ細胞又はＢ細胞のＶ（Ｄ）Ｊ特異的プロモーターからなる群から選択される、４２に記載の方法。
４４．前記ゲノムに挿入される前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、（ｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質；（ｉｉ）ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭタンパク質；又は（ｉｉｉ）ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭタンパク質のκ若しくはλ鎖をコードする、１から４３のいずれか一項に記載の方法。
４５．前記ゲノムに挿入される前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質のＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３領域をコードする、１から４３のいずれか一項に記載の方法。
４６．前記ゲノムに挿入される前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、１から４３のいずれか一項に記載の方法。
４７．前記ＣＡＲをコードする前記ヌクレオチド配列の挿入が、前記ＣＡＲをコードする前記ヌクレオチド配列の内因性Ｔ細胞特異的プロモーターとの作動可能な連結をもたらす、４６に記載の方法。
４８．前記ゲノムに挿入される前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、多価表面受容体をコードする、１から４３のいずれか一項に記載の方法。
４９．前記細胞が、Ｔ細胞である、４８に記載の方法。
５０．前記多価表面受容体が、二特異性又は三特異性のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、４８又は４９に記載の方法。
【０３１９】
５１．前記ゲノムに挿入される前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、膜に結合し細胞外に提示される細胞特異的ターゲティングリガンドをコードする、１から４３のいずれか一項に記載の方法。
５２．前記ゲノムに挿入される前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、レポータータンパク質をコードする、１から４３のいずれか一項に記載の方法。
５３．前記レポータータンパク質が、蛍光タンパク質である、５２に記載の方法。
５４．前記レポータータンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、細胞特異的又は組織特異的プロモーターに作動可能に連結されている、５２又は５３に記載の方法。
５５．前記レポータータンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、構成的プロモーターに作動可能に連結されている、５２又は５３に記載の方法。
５６．前記ゲノムに挿入される前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、イントロンを有さないタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、１から５５のいずれか一項に記載の方法。
５７．イントロンを有さない前記ヌクレオチド配列が、ＴＣＲタンパク質又は免疫グロブリンの全体又は一部分をコードする、５６に記載の方法。
５８．前記方法が、前記送達媒体のうちの第１及び第２のものを前記細胞に導入することを含み、
（１）前記ゲノムに挿入される前記第１の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α若しくはδサブユニットをコードし、前記ゲノムに挿入される前記第２の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、ＴＣＲβ若しくはγサブユニットをコードするか；又は
（２）前記ゲノムに挿入される前記第１の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α若しくはγサブユニットをコードし、前記ゲノムに挿入される前記第２の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、ＴＣＲβ若しくはδサブユニットをコードするか；又は
（３）前記ゲノムに挿入される前記第１の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭタンパク質のκ鎖をコードし、前記ゲノムに挿入される前記第２の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭタンパク質のλ鎖をコードする、１から５７のいずれか一項に記載の方法。
５９．前記方法が、前記送達媒体のうちの第１及び第２のものを前記細胞に導入することを含み、
前記ゲノムに挿入される前記第１の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α又はδサブユニットの定常領域をコードし、
前記ゲノムに挿入される前記第２の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、ＴＣＲβ又はγサブユニットの定常領域をコードする、
１から５７のいずれか一項に記載の方法。
６０．前記方法が、前記送達媒体のうちの第１及び第２のものを前記細胞に導入することを含み、
（１）前記第１の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α若しくはδサブユニットのプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内に挿入され、前記第２の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、ＴＣＲβ若しくはγサブユニットのプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内に挿入されるか；又は
（２）前記第１の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α若しくはγサブユニットのプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内に挿入され、前記第２の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、ＴＣＲβ若しくはδサブユニットのプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内に挿入されるか；又は
（３）前記第１の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭタンパク質のκ鎖のプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内に挿入され、前記第２の送達媒体の前記第２のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭタンパク質のλ鎖のプロモーターとして機能するヌクレオチド配列内に挿入される、１から５７のいずれか一項に記載の方法。
【０３２０】
６１．前記細胞が、哺乳動物細胞である、１から６０のいずれか一項に記載の方法。
６２．前記細胞が、ヒト細胞である、１から６１のいずれか一項に記載の方法。
６３．（ａ）１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ又は前記１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼをコードする１つ以上の核酸を含むヌクレアーゼ組成物；
（ｂ）部位特異的リコンビナーゼのための標的配列を含む第１のドナーＤＮＡを含む標的ドナー組成物；
（ｃ）前記部位特異的リコンビナーゼ又は前記部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸を含み、前記部位特異的リコンビナーゼが前記標的配列を認識する、リコンビナーゼ組成物；及び
（ｄ）標的細胞のゲノムへの挿入のための目的のヌクレオチド配列を含む第２のドナーＤＮＡを含むインサートドナー組成物
を含み；
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）が、同じ送達媒体の一部としてのペイロードである、
組成物。
６４．送達媒体が、ナノ粒子である、６３に記載の組成物。
６５．ナノ粒子が、（ａ）、（ｂ）、アニオン性ポリマー組成物、カチオン性ポリマー組成物、及びカチオン性ポリペプチド組成物を含むコアを含む、６４に記載の組成物。
６６．ナノ粒子が、ナノ粒子を細胞表面タンパク質と結合させるターゲティングリガンドを含む、６４又は６５に記載の組成物。
６７．細胞表面タンパク質が、ＣＤ４７である、６６に記載の組成物。
６８．ターゲティングリガンドが、ＳＩＲＰαタンパク質模倣体（マクロファージへの取込みを防止する）（例えば、ＳＩＲＰαの外部断片）である、６７に記載の組成物。
６９．前記ナノ粒子が、エンドサイトーシス誘発リガンドをさらに含む、６８に記載の組成物。
７０．前記ペイロードが、１つ以上のデオキシリボヌクレオタンパク質複合体又は１つ以上のリボ−デオキシリボヌクレオタンパク質複合体を形成する、６３から６９のいずれか一項に記載の組成物。
【０３２１】
７１．送達媒体が帯電ポリマーであるポリペプチドドメインと結合したターゲティングリガンドであり、ターゲティングリガンドが細胞表面タンパク質との結合をもたらし、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインが１つ以上のペイロードと静電相互作用している、６３から７０のいずれか一項に記載の組成物。
７２．送達媒体が、１つ以上のペイロード、及び帯電ポリマーであるポリペプチドドメインと相互作用するアニオン性ポリマーをさらに含む、７１に記載の組成物。
７３．前記送達媒体が前記ペイロードのうちの１つ以上と結合したターゲティングリガンドであり、前記ターゲティングリガンドが細胞表面タンパク質との結合をもたらす、６３から７０のいずれか一項に記載の組成物。
７４．前記送達媒体が、水中油中水エマルジョン粒子、水中油エマルジョンミセル粒子、多重膜型水中油中水エマルジョン粒子、多層型粒子又はＤＮＡオリガミナノボットをコーティングするターゲティングリガンドを含む、６３から７０のいずれか一項に記載の組成物。
７５．ターゲティングリガンドが、ペプチド、ＳｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、核酸アプタマー又はペプトイドである、６６から７１のいずれか一項に記載の方法。
７６．送達媒体が、非ウイルス性である、６３から７０のいずれか一項に記載の組成物。
【実施例】
【０３２２】
実験
以下の例は、当業者に、本発明を、どのようにして作り、使用するのかについての完全な開示及び記載をもたらすように明示されるものであり、本発明の範囲を限定するように意図されるものでも、下記の実験が、全ての実験であるか、又は実施された実験だけを表すように意図されるものでもない。使用される数（例えば、量、温度など）に関しては、精度を確保するように努力が払われたが、一部の実験の誤差及び偏差については、考慮に入れるべきである。そうでないことが指し示されない限りにおいて、部分は、重量による部分であり、分子量は、重量による平均分子量であり、温度は、摂氏度であり、圧力は、大気圧であるか、又はこの近傍である。
【０３２３】
本明細書で引用される、全ての刊行物及び特許出願は、各個別の刊行物又は特許出願が参照により組み込まれるように、具体的かつ個別に指し示された場合と同様に、参照によりここに組み込まれる。
【０３２４】
本発明は、本発明を実施するのに好ましい方式を含むことが見出されるか、又は提起される、特定の態様との関係で記載されている。意図される、本発明範囲から逸脱しない限りにおいて、例示される特定の態様では、本開示に照らして、多数の改変及び変化がなされうることが、当業者により理解されるであろう。例えば、コドンの冗長性のために、タンパク質配列に影響を及ぼさずに、根底をなすＤＮＡ配列内に変化が施されうる。さらに、生物学的な機能的同等性を考慮するために、種類又は量において、生物学的作用に影響を及ぼさずに、タンパク質構造に変化が施されうる。全てのこのような改変は、付属の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【０３２５】
実施例１
フローサイトメトリー及び高含量スクリーニングにより、細胞への取込み及び表現型を特徴付け、さまざまな細胞で送達効率及び遺伝子編集を定量した。
【０３２６】
これらの実験では、非刺激ヒト初代汎Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の混合物）及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）にフラッシュトランスフェクト（ナノ粒子と共に３０分間インキュベーション）し、１０ｕｇ／ｍｌの硫酸ヘパランを含有するＰＢＳで２回洗浄し、２４時間後にAttune NxTフローサイトメーター上で解析した。細胞をＣＤ４及びＣＤ８に特異的抗体で染色し、ＥＧＦＰタグ付けＣａｓ９の導入を各細胞で定量した。
【０３２７】
この実施例で得られた代表的なデータを、図３４Ａ〜５４Ｃに示す。
【０３２８】
実施例２
マルチモードのデータセット
フローサイトメトリー及び高含量スクリーニングにより、細胞への取込み及び表現型を特徴付け、さまざまな細胞で送達効率及び遺伝子編集を定量した。
【０３２９】
これらの実験では、非刺激ヒト初代汎Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の混合物）及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）にフラッシュトランスフェクト（ナノ粒子と共に３０分間インキュベーション）し、１０ｕｇ／ｍｌの硫酸ヘパランを含有するＰＢＳで２回洗浄し、２４時間後にAttune NxTフローサイトメーター上で解析した。細胞をＣＤ４及びＣＤ８に特異的抗体で染色し、ＥＧＦＰタグ付けＣａｓ９の導入を各細胞で定量した。以下の表は、トランスフェクションの１時間後に得た４０倍の対物レンズ付きBioTek Cytation 5 Imaging Readerによる画像の、２４時間後のフローサイトメトリーデータとの比較を示す。本発明者らは、２４時間以上後に細胞への内在化が決まるのに対し、初期では、細胞との親和性が決まると考えられる。細胞との親和性を１時間後の画像から決定するために、教師なし学習を用い、画像データをフローサイトメトリーで評価した２４時間後の細胞への取込みと比較した。
【０３３０】
この実施例で得られた代表的なデータを、図５５〜５６に示す。
【０３３１】
実施例３
４／５構成要素型送達のためのナノ粒子のコアの最適化
以下の実験では、３回のスクリーニングにより、ＧＦＰ又はＴＣＲ座位をターゲティングするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ＲＮＰ、ａｔｔＰのランディング部位を挿入するためのｓｓＤＮＡ、リコンビナをコードするプラスミド、及びａｔｔＰ標的座位へのＲＦＰインサートのためのａｔｔＢ部位を保有するプラスミドの共送達に最適のコア製剤セットを決定した。これらの実験は、実施例２のＣＲＩＳＰＲ−ＥＧＦＰ ＲＮＰ送達のみの場合で詳述したターゲティングリガンド密度の最適化の前に実施する。
【０３３２】
この実施例で得らた代表的なデータを図５７〜６２Ｙに示す。
【０３３３】
物理化学的研究、すなわち、ＳＹＢＲアッセイは、ペイロードの凝縮指数の決定を可能とし、共送達製剤の合成後にナノ粒子に凝縮された遺伝子素材の相対的な割合の理解を可能とする。加えて、さまざまな粒子は、それらの静電鎖全体のシステイン修飾のため架橋ペプチドとして用いることが可能であり、ヒストン修飾酵素及びアセチルＣｏＡのための「転写的に活性な」基質となる可能性がある、ヒストンに由来しＮＬＳで装飾された配列を含む。多くの場合、最も好適なペイロード凝縮指数は、＜２００ｎｍの粒子サイズ、安定的なゼータ電位のほか、高度の粒子取込み、及び／又は遺伝子編集と緊密に相関する。
【０３３４】
これらの例では、ターゲティングリガンドを伴わないさまざまな静電ペプチドのスクリーニングが、機能的な遺伝子編集を実現するためのナノ粒子の「コア」の最適化を可能にして、全てのペイロードをナノ粒子に含め（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ＲＮＰ、ｓｓＤＮＡ  ＯＤＮ及び２つのプラスミドを有する５構成要素型ナノ粒子の効率的なSYBR凝縮指数）、最大５８．９％のトランスフェクション効率（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰによる３．５２％のＧＦＰノックダウンに対応）並びに１９．８％及び１９．６％の効率的なＧＦＰノックダウン効率（それぞれ１８．６％及び１４．６％の粒子取込みに対応）となることを示すために、３つの反復サイクル（図５８Ａ〜６２Ｙ）が実施された。これらの研究における粒子は極めて安定的で、核酸カーゴを効率的に遮蔽し、可変的な細胞内放出及び機能的な編集効率を伴う効率的な細胞内ターゲティングをもたらす。３日目と６日目の（２つのイメージング時点）の間のナノ粒子＋細胞である生細胞の割合（％）の変化も明らかであり、これにより、ポリ（L-グルタミン酸）対ポリ（D-グルタミン酸）の変化、ヒストン断片（ＮＬＳ修飾ヒストン断片並びにＨ２Ａ及びＨ２Ｂ）の割合の変化、エンドソーム溶解性のＡＦ６４７で標識化した機能的ペプチドが、さまざまな、１）細胞内放出効率（ナノ粒子＋細胞対編集細胞）、及び／又は２）徐放対「急速放出」における細胞内環境内のナノ粒子の滞留（６日間を超える）（図６２Ｕ〜６２Ｙ）を生じる。
【０３３５】
図６０Ｉから理解できるように、多くの細胞はＧＦＰ−／ナノ粒子＋であり、代表的な群のＧＦＰ−細胞の割合（フロー解析プロットの下半分：ｙ軸はＧＦＰ強度を表し、ｘ軸はナノ粒子−Alexa647強度を表す）は、おそらく、ａ）所与の静電ポリマーの変動する凝縮効率、ｂ）静電ポリマーの変動する細胞内トラフィッキング効率、ｃ）静電ポリマー結合ペイロードの変動するコンパートメント特異的核外放出、及び／又はｄ）所与の製剤の機能的なゲノム編集可能性の可変性をもたらす所与の「層」と関連する変動する徐放プロファイルのために、ＧＦＰ＋／ナノ粒子＋の細胞、ＧＦＰ＋／ナノ粒子−の細胞とは大幅に異なる。
【０３３６】
１．ナノ粒子の合成
ペプチドは、標準的なＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して合成した。配列はＣからＮ方向に合成した。まず、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロリン酸（ＨＡＴＵ）をN-メチルモルホリン（ＮＭＭ）と共に使用して、Ｆｍｏｃで保護したアミノ酸をNovaPeg Rinkアミド樹脂（Millipore Sigma）にカップリングした。２０％の4-メチルピペリジン（４ＰＩＰ）を含むＤＭＦ溶液でＦｍｏｃ保護基を除去した。その後のカップリング及び脱保護は、ペプチドポリマー内の各アミノ酸について実施した。完成したペプチドは樹脂から切断し、切断カクテル５ｍＬ（４．５ｍＬのトリフルオロ酢酸：２５０ｕＬの水：２５０ｕＬのトリイソプロピルシラン）を使用して全体的に脱保護し、９０分間混合した。切断されたペプチドは、フリットを装備するディスポーザブルカラムに樹脂及びカクテル溶液を通過させることで回収した。ペプチドは、５０ｍＬの低温ジエチルエーテル（４℃）を使用してＴＦＡ溶液から沈殿し。ジエチルエーテルを除去し、粗ペプチドを低温エーテル（５０ｍＬ）で（２回）洗浄し、窒素ガス流の下で乾燥させた。粗ペプチドを２０％のアセトニトリル（ＡＣＮ）を含む水（約５ｍＬ）に溶解し、逆相クロマトグラフィーで分画した。精製画分を組み合わせ、凍結乾燥し粉末の精製ペプチドを得た。
【０３３７】
以下の材料は購入した。
ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＧＦＰ（Genscript Z03393）
ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ（Aldevron 9212）
ＬＬ２８５（Synthego）−ガイド配列：ＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡ（ref. Glaser et al. 2016）
ＬＬ２９５  ＩＤＴ−
ｇｃｇａｔｇｃｃａｃｃｔａｃｇｇｃａａｇｃｔｇａｃｃｃｔｇａａｇｔｔｃａｔｃｔｇｃａｃｃａｃｃｇｇｃａａｇｃｔｇｃｃｃｇｔｇｃｃｃｔｇｇｃｃｃａｃｃｃｔｃｇｔｇａｃｃａｃｃｃｔｇａｃＣＣＣＣＡＡＣＴＧＧＧＧＴＡＡＣＣＴＴＴＧＡＧＴＴＣＴＣＴＣＡＧＴＴＧＧＧＧＧｃｔａｃｇｇｃｇｔｇｃａｇｔｇｃｔｔｃａｇｃｃｇｃｔａｃｃｃｃｇａｃｃａ
ＬＬ２２４  （Synthego）  ガイド配列：ＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ（ref. Roth et al. 2018）
ＬＬ２９４  ＩＤＴ−
ＧＴＣＣＣＡＣＡＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＡＣＴＧＧＧＧＴＡＡＣＣＴＴＴＧＡＧＴＴＣＴＣＴＣＡＧＴＴＧＧＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＡＣＴＣＴＡＡＡＴＣＣＡＧＴＧＡＣＡＡＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＡＴＴＣＡＣＣＧＡＴＴＴＴＧＡＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＡＡＴＧＴＧＴＣＡＣＡＡＡＧＴＡＡＧＧＡＴＴＣ
ｐＬＬ３１２  System Biosciences FC200-PA1
ｐＬＬ３１３  System Biosciences FC550A-1
ｐＴａｇＲＦＰ−Ｎ  Evrogen FP142
【０３３８】
【表２−１】
2021521825.tif 000017
【０３３９】
【表２−２】
2021521825.tif 000018
【０３４０】
【表２−３】
2021521825.tif 000019
【０３４１】
リガンド（ｃｌｌ１１、ｃｌｌ２５）は９アルギニンのアンカーを含む。ヒストン断片（ｃｐｐ１０、ｃｐｐ１２、ｃｐｐ１３）は、システイン基で修飾し架橋メッシュ形成の一助とした。ｃｐｐ１３は核局在化シグナルでも修飾する。
【０３４２】
概観：
この実験は３つの部分に分かれ、これを繰り返し行った。２Ｃ．１．１．１及び２Ｃ．１．２．１と題する実験は、４構成要素型ペイロードナノ粒子の安定的なＨＥＫ２９３−ＧＦＰ細胞へのトランスフェクションを伴う。ペイロードは、ＧＦＰ座位をターゲティングするｓｇＲＮＡを伴うＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳリボ核タンパク質、非対称性の相同性アームを伴うａｔｔＰをコードする一本鎖デオキシオリゴヌクレオチド、φＣ３１インテグラーゼ発現プラスミド、及びＥＦ１ａプロモーター下にあるＲＦＰ−Ｔ２Ａ−PuromycinＲをコードするａｔｔＢドナープラスミドから構成される。２Ｃ．２．１．１と題する実験は、４／５構成要素型ペイロードナノ粒子のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）へのトランスフェクションを伴う。ペイロードは、ＴＲＡＣ座位をターゲティングするｓｇＲＮＡを伴うＧＦＰ−Ｃａｓ９−ＮＬＳリボ核タンパク質、非対称性の相同性アームを伴うａｔｔＰをコードする一本鎖デオキシオリゴヌクレオチド、φＣ３１インテグラーゼ発現プラスミド、及びＥＦ１ａプロモーター下にあるＲＦＰ−Ｔ２Ａ−PuromycinＲをコードするａｔｔＢドナープラスミドから構成される。
【０３４３】
２Ｃ．１．１．１：
２：１のｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９比を使用してＣａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を構成し、室温で３０分間インキュベートした。凍結乾燥状態のＬＬ２８５及びＬＬ２９５を超純水（ｍｉｌｉ−Ｑ水）で０．１％ｗ／ｖに水和した。ｐＬＬ３１２及びｐＬＬ３１３を水で０．０５％ｗ／ｖに希釈し、ｐＬＬ３１３：ｐＬＬ３１２を１：５０とする原液をプラスミド原液として得た。０．１Ｍのビス−トリスｐＨ８．５を使用し、ペプチドを０．１％ｗ／ｖに希釈した。４８のナノ粒子を、最終容量を１００ｕｌとし、以下の添加順序：
１．ＰＬＲ５０
２．ＲＮＰ
３．ＤＮＡミックス（ｓｓＤＮＡ＋プラスミド原液）
４．ＰＬＲ５０
５．緩衝液
で、ＰＬＲ５０（分子１個当たり＋５０の総電荷）とＲＮＰ（分子１個当たり−１５１の総電荷）との間の電荷比（分子Ａ対分子Ｂの総電荷比）を変動させるように、５０マーのポリL-アルギニン（ＰＬＲ５０）の量を変動させて形成した。
【０３４４】
層１及び２を組み合わせて、１０分間インキュベートし、次いで、層３を層１及び２に添加し、さらに１０分間インキュベートした。次いで層４を添加してインキュベートした。最後に緩衝液を各製剤に添加し、総容量を１００ｕＬとした。層１（ＰＬＲ５０：ＲＮＰ）の電荷比は６〜３５であり、層４（ＰＬＲ５０：ＲＮＰ）の電荷比は４〜４０であった。
【０３４５】
各製剤は２５００ｎｇのｓｓＤＮＡ及び８００ｎｇのｐＤＮＡを有したことから、投与１回ごとの用量（１０ｕｌ）は２５０ｎｇのｓｓＤＮＡ及び８０ｎｇのｐＤＮＡの送達であったことが示唆される。各製剤は１０ｐｍｏｌのＣａｓ９を有したことから、投与１回ごとの用量（１０ｕｌ）は１ｐｍｏｌのＣａｓ９の送達であったことが示唆される。この実験では、２枚のプレートのＨＥＫ２９３−ＧＦＰ  ４０，０００個にトランスフェクトし、ウェル１つ当たり１０ｕＬ及び２０ｕＬのナノ粒子を投与した。
【０３４６】
２Ｃ．１．２．１：
２：１のｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９比を使用してＣａｓ９ ＲＮＰを構成し、室温で３０分間インキュベートした。凍結乾燥状態のＬＬ２８５及びＬＬ２９５を超純水（ｍｉｌｉ−Ｑ水）で０．１％ｗ／ｖに水和した。ｐＬＬ３１２及びｐＬＬ３１３を水で０．０５％ｗ／ｖに希釈し、ｐＬＬ３１３：ｐＬＬ３１２を１：５０とする原液をプラスミド原液として得た。０．１Ｍのビス−トリスｐＨ８．５を使用し、ペプチドを０．１％ｗ／ｖに希釈した。２０のナノ粒子を、以下の構成要素及び順序を使用して、添加順序を変動させ、最終容量を１００ｕｌとして形成した。
【０３４７】
【表３】
2021521825.tif 000020
【０３４８】
各層は、次の層を添加する前に１０分間インキュベートした。各製剤は２５００ｎｇのｓｓＤＮＡ及び８００ｎｇのｐＤＮＡを有したことから、投与１回ごとの用量（１０ｕｌ）は、２５０ｎｇのｓｓＤＮＡ及び８０ｎｇのｐＤＮＡの送達であったことが示唆される。各製剤は１５ｐｍｏｌのＣａｓ９を有したことから、投与１回ごとの用量（１０ｕｌ）は１．５ｐｍｏｌのＣａｓ９の送達であったことが示唆される。初期層と最終層のカチオン性ペプチド：ＲＮＰの電荷比は、それぞれ１０及び４で一定であった。詳細な概観は図６１Ｆ及び６１Ｇに含まれる。
【０３４９】
形成の後、ナノ粒子をOpti-Mem Reduced Serum Mediaで２つの濃度（１０ｕｌのナノ粒子＋９０ｕｌの培地又は２０ｕｌのナノ粒子＋８０ｕｌの培地）に希釈した。ウェル１つ当たり２０，０００個の密度で播種した細胞をナノ粒子の希釈溶液１００ｕｌで処理し、一晩放置した。
【０３５０】
２Ｃ．２．１．１：
２：１のｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９比を使用してＣａｓ９ ＲＮＰを構成し、室温で３０分間インキュベートした。凍結乾燥状態のＬＬ２２４及びＬＬ２９４を超純水（ｍｉｌｉ−Ｑ水）で０．１％ｗ／ｖに水和した。ｐＬＬ３１２及びｐＬＬ３１３を水で０．０５％ｗ／ｖに希釈し、ｐＬＬ３１３：ｐＬＬ３１２を１：５０とする原液をプラスミド原液として得た。０．１Ｍのビス−トリスｐＨ８．５を使用して、ペプチドを０．１％ｗ／ｖに希釈した。４８のナノ粒子を、最終容量を１００ｕｌとして、以下の添加順序：
１．ＰＬＲ５０
２．ＲＮＰ
３．ＤＮＡミックス（ｓｓＤＮＡ＋プラスミド原液）
４．リガンドミックス（ＣＤ３、ＣＤ４）
５．緩衝液
で、ＰＬＲ５０（分子１個当たり＋５０の総電荷）とＲＮＰ（分子１個当たり−１５１の総電荷）及びリガンドミックス（分子１個当たり＋９．５の総電荷）とＲＮＰとの間の電荷比（分子Ａ対分子Ｂの総電荷比）を変動させるように、５０マーのポリL-アルギニン（ＰＬＲ５０）及びリガンドミックスの量を変動させて形成した。
【０３５１】
層１及び２を組み合わせ、１０分間インキュベートし、次いで、層３を層１及び２に添加し、さらに１０分間インキュベートした。次いで、リガンドミックスを添加し、１０分間インキュベートした。最後に、緩衝液を各製剤に添加して、総容量を１００ｕＬとした。層１のＰＬＲ５０：ＲＮＰの電荷比は２．６〜１６で、層３のリガンドミックス：ＲＮＰの電荷比は２〜１０であった。各製剤は２５００ｎｇのｓｓＤＮＡ及び８００ｎｇのｐＤＮＡを有したことから、投与１回ごとの用量（１０ｕｌ）は２５０ｎｇのｓｓＤＮＡ及び８０ｎｇのｐＤＮＡの送達であったことが示唆される。各製剤は１５ｐｍｏｌのＣａｓ９を有したことから、投与１回ごとの用量（１０ｕｌ）は１．５ｐｍｏｌのＣａｓ９の送達であったことが示唆される。
【０３５２】
形成の後、ナノ粒子をOpti-Mem Reduced Serum Media（１０ｕｌのナノ粒子＋９０ｕｌの培地）で希釈した。刺激時間に基づき２枚のプレートに播種した細胞をナノ粒子の希釈溶液１００ｕｌで処理し、一晩放置した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、新鮮な培地を添加した。
【０３５３】
２．ＳＹＢＲ組入れアッセイ
Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Plate Readerを使用して、SYBR組入れアッセイの蛍光測定を行った。SYBR（登録商標）Gold Nucleic Acid蛍光染料（ThermoFisher Scientific）は、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子に極めて強力に結合し、結合時に１０００倍を超えるシグナルの増強をもたらす。SYBR GOLD染料を、ナノ粒子内の核酸ペイロードの凝縮についての指標、及び非封入／遊離ペイロードの量についての推定値として使用した。それらのペイロードの封入について、その他のナノ粒子（高度の蛍光により指し示される）と比較して有望な候補ナノ粒子（低度のSYBR蛍光により指し示される）をスクリーニングした。一晩にわたる動態測定を各ナノ粒子試料（Ｎ＝１）で記録し、その間のナノ粒子のパッケージングの安定性について推定した。完成したナノ粒子生成物２０ｕＬをSYBR GOLD作業溶液（ＴＥ緩衝液ｐＨ７．８〜８．０中のSYBRの１０，００倍希釈液）と混合し、総容量を１００ｕＬとして測定した。ネイキッド／遊離のＤＮＡ及びＲＮＡペイロードを、対照（Ｎ＝３）として使用して、ベースラインの蛍光を確立した。バックグラウンドの減算は、SYBR作業溶液中の製剤緩衝液の蛍光を測定することにより実施した。全ての測定は、励起波長：４８５ｎｍ／発光波長：５２８ｎｍで記録した。凝縮指数を［（目的のウェル蛍光−遊離ＤＮＡの蛍光）／遊離ＤＮＡの蛍光］×１００として計算し、ナノ粒子９６ウェルＩＤに関連するヒートマップで、平均凝縮指数±標準偏差として示す。十分に凝縮されたナノ粒子は遮蔽が高度で蛍光が弱く、したがって負の凝縮指数を有するであろう。
【０３５４】
３．粒子サイズ及びゼータ電位の決定：Wyatt Technology製のMobiusを使用して、動的光散乱及び電気泳動移動度により、ナノ粒子の流体力学直径及びゼータ電位を測定した。秒間の収集時間、測定１回当たり２０点の収集、２Ｖの振幅電圧、１０Ｈｚの電界、及び１５秒間のＰＡＬＳ回収時間で、１試料当たり合計３回測定した。
【０３５５】
４．細胞の培養：ＨＥＫ２９３／ＥＧＦＰ−ＡＡＶＳ１ Ｓｔａｂｌｅ細胞系（SL573、GeneCopoeia, Inc., Rockville, MD）を、１０％のＦＢＳ及び０．５ｕｇ／ｍＬピューロマイシン（GibcoA1113802）を補充したＤＭＥＭ中で培養し、製造元の指示書に従い、０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Sigma：59428C）により継代した。StemCell Technologies（70025.2）製の低温保存されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、１０％のＦＢＳ、５０Ｉ．Ｕ．／ｍＬのｒＩＬ−２（PeproTech：200-02）を補充したＲＰＭＩ中で融解した。融解の１日後、細胞を、１０％のＦＢＳ、５０Ｉ．Ｕ．／ｍＬのｒＩＬ−２、５ｎｇ／ｍＬのｒＩＬ−７（Gibco：PHC0075）、５ｎｇ／ｍＬのｒＩＬ−１５（Gibco：PHC9154）を補充したＲＰＭＩ中、１ｍＬ当たりの細胞１×１０６個で、ＣＤ３／ＣＤ２８ Dynabeads（ThermoFisher：11131D）により刺激した。２日間にわたる刺激の後、Dynabeadsを磁気的に除去し、刺激されたＴ細胞を１０％のＦＢＳ及び１２５Ｉ．Ｕ．／ｍＬのｒＩＬ−２を補充したＲＰＭＩ中で培養した。トランスフェクションは、Dynabeads除去の少なくとも１日後に実施した。全ての細胞を、１００Ｕ／ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（ThermoFisher：15-140-122）中で維持した。
【０３５６】
５．細胞のトランスフェクション：ウェル１つ当たりのナノ粒子ミックスの用量１０ｕＬ又は２０ｕＬ（合計１００ｕＬ）のために、ナノ粒子を、無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ThermoFisher：11058021）中で１：１０又は２：１０に希釈した。ＨＥＫ２９３−ＧＦＰをウェル１つ当たりの細胞２０〜４０，０００個で播種し、刺激Ｔ細胞をウェル１つ当たりの細胞６０，０００個で播種した。細胞をナノ粒子中で一晩インキュベートし、次いで、ＰＢＳ中で洗浄し、通常のように培養した。ＤＮＡのためのリポフェクタミン3000（ThermoFisher：L3000008）、及びＤＮＡを伴う又は伴わないＲＮＰのためのCRISPRMAX（ThermoFisher：CMAX00008）によるＨＥＫ２９３−ＧＦＰへのリポフェクションを、製造元の指示書に従い行った。刺激Ｔ細胞へのヌクレオフェクションは、Lonza 4D-Nucleofector及びＰ３初代細胞キットにより実施した。２０ｕＬのキュベット内の細胞１×１０６個に、ナノ粒子のトランスフェクションと等用量の（計量された）ＲＮＰ及びＤＮＡを電気穿孔した。ＲＮＰの場合のみパルスＥＨ−１１５を使用したが、ペイロードを含有するＤＮＡはパルスＥＯ−１１５を使用した。
【０３５７】
６．顕微鏡法：細胞をリシンコーティングプレートに播種し、Hoechst 33342（ThermoFisher：H3570）で標識し、画像をBioTek Cytation 5上で毎日収集し、細胞生存率、ナノ粒子（Alexa647）、並びにＧＦＰ及びＲＦＰの発現を観察した。各試料に対して、Fiji（ImageJ）における以下のスクリプトを用いて画像解析を実施し、ピアソン係数、重複係数を決定し、以下のスクリプト及び関連する出力を用いて、Costesによるチャネル間共局在マップを作成した。代表的な閾値設定、Costesによるマスク及び共局在スクリプトの出力を、図６０Ｋ〜６０Ｎに示す。上位性能のナノ粒子群では、ナノ粒子の取込みがＧＦＰ−ピクセルに高度に対応することを見出した。
【０３５８】
【数１−１】
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【０３５９】
【数１−２】
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【０３６０】
【数２】
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【０３６１】
７．フローサイトメトリー：フローサイトメトリーは、Attune NxT（ThermoFisher：A24858）で実施し、データはFlowJoで解析した。直接的な蛍光を、ＧＦＰ、ＲＦＰ及びAlexa647（ナノ粒子の標識）について測定した。細胞生存率アッセイには、Zombie NIR Fixable Viabilityキット（Biolegend：423106）、Annexin V Pacific Blue（ThermoFisher：A35122）が含まれていた。ＰＢＭＣには、以下の抗体：ＴＣＲα／β−ＰＥ−Ｃｙ７（ＩＰ２６）１：１００（ThermoFisher：25-9986-42）、ＣＤ８ａ−Super Bright 600（ＲＰＡ−Ｔ８）１：３３（ThermoFisher：63-0088-42）、ＣＤ４−ＰＥ（ＲＰＡ−Ｔ４）１：１００（ThermoFisher：12-0049-42）、ＣＤ４−APC-eFluor780（ＲＰＡ−Ｔ４）１：２００（ThermoFisher：47-0049-42）、ＣＤ３ APC-eFluor780（ＯＫＴ３）１：１００（ThermoFisher：47-0037-41）を使用した。
【０３６２】
８．ＰＣＲ：細胞をＰＢＳで洗浄し、Quick Extract（Lucigen：QE09050）を使用し、ゲノムＤＮＡを製造元の指示書に従って採取した。ＰＣＲは、一本鎖デオキシオリゴヌクレオチド相同性アームの外側で、ｓｇＲＮＡ切断配列を挟むプライマー：ＧＦＰフォワード：５’−ａｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇｇ；ＧＦＰリバース：５’−ｃａｃｇａａｃｔｃｃａｇｃａｇｇａｃｃａｔｇ；ＴＲＡＣフォワード：５’−ＣＣＡＧＣＣＴＡＡＧＴＴＧＧＧＧＡＧＡＣ；ＴＲＡＣリバース：５’−ＧＴＧＡＣＴＧＣＧＴＧＡＧＡＣＴＧＡＣＴを使用して実施した。シーケンシング（ＰＣＲ）産物はＥ−ｇｅｌ（Thermo fisher scientific：G401001）により検証し、ｓｇＲＮＡの標的配列の上流におけるプライマー：ＧＦＰ：５’−ｇａｇｃｔｇｔｔｃａｃｃｇｇｇｇｔｇｇｔ；ＴＲＡＣ：５’−ＣＴＧＡＧＴＣＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＡＣＧＡを使用するサンガーシーケンシングのために、Genewizに送付した。サンガーシーケンシングのクロマトグラムは、Synthego製のInference of CRISPR Edits（ＩＣＥ）及びＩＣＥノックインプログラムを使用して解析した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2021521825.tif 000026
【図４】
2021521825.tif 000027
【図５Ａ】
2021521825.tif 000028
【図５Ｂ】
2021521825.tif 000029
【図５Ｃ】
2021521825.tif 000030
【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
2021521825.tif 000033
【図８】
2021521825.tif 000034
【図９】
2021521825.tif 000035
【図１０】
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【図１１】
2021521825.tif 000037
【図１２】
2021521825.tif 000038
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３５Ａ】
2021521825.tif 000063
【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
2021521825.tif 000070
【図３７Ｃ】
2021521825.tif 000071
【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４５Ｃ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４７Ｃ】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４８Ｃ】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図４９Ｃ】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５０Ｃ】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５１Ｃ】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５２Ｃ】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５３Ｃ】
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【図５４Ａ】
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【図５４Ｂ】
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【図５４Ｃ】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８Ａ】
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【図５８Ｂ】
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【図５８Ｃ】
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【図５８Ｄ】
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【図５８Ｅ】
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【図５９Ａ】
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【図５９Ｂ】
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【図５９Ｃ】
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【図６０Ａ】
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【図６０Ｂ】
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【図６０Ｃ】
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【図６１Ａ】
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【図６１Ｂ】
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【図６１Ｃ】
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【図６１Ｄ】
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【図６１Ｅ】
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【図６１Ｆ】
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【図６１Ｇ】
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【図６１Ｈ】
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【図６１Ｉ】
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【図６１Ｊ】
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【図６１Ｋ】
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【図６１Ｌ】
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【図６１Ｍ】
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【図６１Ｎ】
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【図６１Ｏ】
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【図６１Ｐ】
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【図６１Ｑ】
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【図６２Ａ】
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【図６２Ｂ】
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【図６２Ｃ】
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【図６２Ｄ】
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【図６２Ｅ】
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【図６２Ｆ】
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【図６２Ｇ】
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【図６２Ｈ】
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【図６２Ｉ】
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【図６２Ｊ】
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【図６２Ｋ】
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【図６２Ｌ】
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【図６２Ｍ】
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【図６２Ｎ】
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【図６２Ｏ】
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【図６２Ｐ】
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【図６２Ｑ】
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【図６２Ｒ】
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【図６２Ｓ】
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【図６２Ｔ】
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【図６２Ｕ】
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【図６２Ｖ】
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【図６２Ｗ】
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【図６２Ｘ】
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【図６２Ｙ】
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【配列表】
2021521825000001.app
【国際調査報告】
2021521825.tif 000179
2021521825.tif 000180
2021521825.tif 000181