(57)【要約】この出願は、国際調査報告が作成されていないため、国際公開公報に要約書が記載されておりません。【特許請求の範囲】
【請求項１】
完全長の配列番号１と少なくとも７０％同一であり、表１．１の１以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項２】
配列番号１と比べて中性ｐＨで正味の電荷を増加させるアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項３】
前記中性ｐＨで前記正味の電荷を増加させる前記アミノ酸置換がリシンまたはアルギニンへの置換を含む、請求項２に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項４】
前記中性ｐＨにて前記正味電荷を増加させる前記アミノ酸置換がアスパラギン酸またはグルタミン酸の中性アミノ酸、リシンまたはアルギニンへの置換を含む、請求項２または３に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項５】
表４．１の１以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項６】
表４の１以上のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項７】
ＤＮＡ結合及びオリゴマー化ドメイン；挿入ドメイン；Ｚｎ−ＢＥＤドメイン；またはそれらの組み合わせにてアミノ酸置換を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項８】
配列番号１と比べて、触媒ドメイン内または触媒ドメインの近傍にて中性ｐＨで正味電荷を増加させるアミノ酸置換を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項９】
配列番号１と比べて中性ｐＨで正味電荷を増加させるアミノ酸置換を含み、前記１以上のアミノ酸が配列番号１に従って番号付けされる場合、Ｄ２２３、Ｄ２８９またはＥ５８９の近傍に位置する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項１０】
前記近傍が約８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５アミノ酸の距離である、請求項８または９に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項１１】
前記近傍が約７０〜８０アミノ酸の距離である、請求項８または９に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項１２】
前記変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゼースの前記アミノ酸配列が完全長の配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項１３】
表２の１以上のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項１４】
表３の１以上のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項１５】
配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、及びＤ１８９Ａをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項１６】
配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｋ５７３Ｅ及びＥ５７８Ｌをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項１７】
配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｋをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項１８】
配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項１９】
配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｖ２９７Ｋをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項２０】
配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｎ８５Ｓをさらに含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項２１】
配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｆ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、及びＤ１８９Ａをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項２２】
配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、及びＤ１８９Ａをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項２３】
配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３Ｅ及びＥ５７８Ｌをさらに含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項２４】
表１の１以上のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項２５】
前記変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼが、アミノ酸配列の配列番号１を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比べて、上昇した転位効率を有する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項２６】
前記変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは前記野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと、レポーターカーゴカセットを含有するＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンとを細胞の集団に導入することと、細胞の前記集団のゲノムにおける前記レポーターカーゴカセットの転位を検出することとを含むアッセイによって前記転位効率が測定される、請求項２５に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項２７】
ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列と１以上の追加の核局在化シグナル配列とを含み、前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が完全長の配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有する、融合トランスポザーゼ。
【請求項２８】
前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が完全長の配列番号１に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する、請求項２７に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項２９】
前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が配列番号１と比べて中性ｐＨで正味の電荷を増加させる１以上のアミノ酸置換を含む、請求項２７または２８に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項３０】
前記１以上のアミノ酸置換が、リシンまたはアルギニンによる置換を含む、請求項２９に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項３１】
前記１以上のアミノ酸置換がアスパラギン酸またはグルタミン酸の中性アミノ酸、リシンまたはアルギニンによる置換を含む、請求項２９または３０に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項３２】
前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が表４、表４．１、または双方の１以上のアミノ酸置換を含む、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項３３】
前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列がＤＮＡ結合及びオリゴマー化ドメイン；挿入ドメイン；Ｚｎ−ＢＥＤドメイン；またはそれらの組み合わせにて１以上のアミノ酸置換を含む、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項３４】
前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が含む表１、表１．１、または双方の１以上のアミノ酸置換を含む、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項３５】
前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列がアミノ酸配列の配列番号１を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比べて高い転位効率を有する、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項３６】
前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列の前記転位効率が、前記融合トランスポザーゼまたは前記野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと、レポーターカーゴカセットを含有するＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンとを細胞の集団に導入することと、細胞の前記集団のゲノムにて前記レポーターカーゴカセットの転位を検出することとを含むアッセイによって測定される、請求項３５に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項３７】
前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が配列番号１と比べて触媒ドメインの内部またはその近傍にて中性ｐＨで正味の電荷を増加させる１以上のアミノ酸置換を含む、請求項２７〜３６のいずれか１項に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項３８】
前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が配列番号１と比べて中性ｐＨで正味の電荷を増加させる１以上のアミノ酸置換を含み、その際、前記１以上のアミノ酸置換が配列番号１に従って番号付けされる場合、Ｄ２２３、Ｄ２８９、またはＥ５８９の近傍に位置する、請求項２７〜３７のいずれか１項に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項３９】
前記近傍が約８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５アミノ酸の距離である、請求項３７または３８に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項４０】
前記近傍が約７０〜８０アミノ酸の距離である、請求項３７または３８に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項４１】
前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が表２の１以上のアミノ酸置換を含む、請求項２７〜４０のいずれか１項に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項４２】
前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が表３の１以上のアミノ酸置換を含む、請求項２７〜４１のいずれか１項に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項４３】
前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、及びＤ１８９Ａを含む、請求項２７〜４２のいずれか１項に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項４４】
前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｋ５７３Ｅ及びＥ５７８Ｌを含む、請求項２７〜４３のいずれか１項に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項４５】
前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｋを含む、請求項２７〜４４のいずれか１項に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項４６】
前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋを含む、請求項２７〜４５のいずれか１項に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項４７】
前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｖ２９７Ｋを含む、請求項２７〜４６のいずれか１項に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項４８】
前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｎ８５Ｓを含む、請求項２７〜４７のいずれか１項に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項４９】
前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｆ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、及びＤ１８９Ａを含む、請求項２７〜４８のいずれか１項に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項５０】
前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、及びＤ１８９Ａを含む、請求項２７〜４９のいずれか１項に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項５１】
前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３Ｅ及びＥ５７８Ｌを含む、請求項２７〜５０のいずれか１項に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項５２】
前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が完全長の配列番号１に対して１００％の同一性を有する、請求項２７〜５１のいずれか１項に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項５３】
ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列とＤＮＡ配列特異的結合ドメインとを含む融合トランスポザーゼであって、前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が請求項１〜２６のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒのアミノ酸配列を有する、前記融合トランスポザーゼ。
【請求項５４】
前記ＤＮＡ配列特異的結合ドメインが、ＴＡＬＥドメイン、ジンクフィンガードメイン、ＡＡＶのＲｅｐ  ＤＮＡ結合ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５３に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項５５】
前記ＤＮＡ配列特異的結合ドメインがＴＡＬＥドメインを含む、請求項５３または５４に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項５６】
前記ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列及びＤＮＡ配列特異的結合ドメインがリンカーによって分離される、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項５７】
前記リンカーが少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも５０のアミノ酸を含む、請求項５６に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項５８】
前記リンカーが配列番号９を含む、請求項５６または５７に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項５９】
完全長の配列番号２０４または２０７と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一または相補性である核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項６０】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６１】
請求項２７〜５８のいずれか１項に記載の融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６２】
前記ポリヌクレオチドが前記変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは前記融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡを含む、請求項５９〜６１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６３】
前記ポリヌクレオチドが前記変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは前記融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、請求項５９〜６２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６４】
前記ｍＲＮＡが化学的に修飾される、請求項６３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６５】
前記ポリヌクレオチドが、前記変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは前記融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、請求項５９〜６４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６６】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡベクターに存在する、請求項５９〜６５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６７】
前記ＤＮＡベクターがミニサークルプラスミドを含む、請求項６６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６８】
前記ポリヌクレオチドがヒト細胞における発現のためにコドンで最適化される、請求項５９〜６７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６９】
完全長の配列番号２０４または２０７と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一または相補性である核酸配列を含む、請求項６０〜６８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７０】
完全長の配列番号２０４または２０７と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一または相補性である核酸配列を含む、請求項６０〜６８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７１】
完全長の配列番号２０４または２０７と少なくとも約９５％同一または相補性である核酸配列を含む、請求項５９〜６８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７２】
完全長の配列番号２０４または２０７と１００％同一または相補性である核酸配列を含む、請求項５９〜６８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７３】
請求項１〜５８のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼを産生する細胞。
【請求項７４】
請求項５９〜７２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有する細胞。
【請求項７５】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと、前記変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンとを細胞に導入することを含む方法。
【請求項７６】
請求項２７〜５８のいずれか１項に記載の融合トランスポザーゼと、前記融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンとを細胞に導入することを含む方法。
【請求項７７】
前記導入することが前記変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは前記融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと前記細胞を接触させることを含む、請求項７５または７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記ポリヌクレオチドが、前記変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは前記融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記ポリヌクレオチドが前記変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは前記融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記ｍＲＮＡが化学的に修飾される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記導入することが前記トランスポゾンを含有するＤＮＡベクターと前記細胞を接触させることを含む、請求項７５〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記ＤＮＡベクターがミニサークルプラスミドを含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記導入することが、前記トランスポゾンと、前記変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは前記融合トランスポザーゼをコードする前記ポリヌクレオチドとの双方を含有するプラスミドベクターと前記細胞を接触させることを含む、請求項７７〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記導入することが、精製タンパク質としての前記変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは前記融合トランスポザーゼと前記細胞を接触させることを含む、請求項７５〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記トランスポゾンが２つの逆向き反復配列の間に位置するカーゴカセットを含む、請求項７５〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記２つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列が配列番号３に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記２つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列が配列番号３を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記２つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列が配列番号４に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項８５〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記２つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列が配列番号４を含む、請求項８５〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記２つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列が配列番号５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９１】
前記２つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列が配列番号５を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９２】
前記２つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列が配列番号６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項８５、９０または９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記２つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列が配列番号６を含む、請求項８５、９０または９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記２つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列が配列番号２０５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９５】
前記２つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列が配列番号２０５を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９６】
前記２つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列が配列番号２０６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項８５、９４または９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記２つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列が配列番号２０６を含む、請求項８５、９４または９５に記載の方法。
【請求項９８】
前記カーゴカセットがＣＭＶ、ＥＦＳ、ＭＮＤ、ＥＦ１α、ＣＡＧＣｓ、ＰＧＫ、ＵＢＣ、Ｕ６、Ｈ１、及びクメートから成る群から選択されるプロモーターを含む、請求項８５〜９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
前記カーゴカセットがＣＭＶプロモーターを含む、請求項８５〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
前記カーゴカセットが順方向で存在する、請求項８５〜９９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記カーゴカセットが逆方向に存在する、請求項８５〜９９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記導入することが、エレクトロポレーション、微量注入、リン酸カルシウム沈殿、カチオン性ポリマー、デンドリマー、リポソーム、微小発射体衝撃、ＦｕＧｅｎｅ、直接音波負荷、細胞圧搾、光学形質移入、プロトプラスト融合、インパレフェクション、マグネトフェクション、ヌクレオフェクション、またはそれらの任意の組み合わせの助けを借りて細胞に形質移入することを含む、請求項７５〜１０１いずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記導入することが前記細胞でエレクトロポレーションを行なうことを含む、請求項７５〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記細胞が、対象から単離された初代細胞である、請求項７５〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記対象がヒトである、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記対象が疾患を持つ患者である、請求項１０４または１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記対象ががんまたは腫瘍と診断されている、請求項１０４〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記細胞が前記対象の血液から単離される、請求項１０４〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記細胞が初代免疫細胞を含む、請求項７５〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記細胞が初代白血球を含む、請求項７５〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記細胞が初代Ｔ細胞を含む、請求項７５〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記初代Ｔ細胞がガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
初代免疫細胞がＣＤ３＋細胞を含む、請求項１０９〜１１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記細胞が幹細胞を含む、請求項７５〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、造血幹細胞、表皮幹細胞、上皮幹細胞、気管支肺胞幹細胞、乳腺幹細胞、間葉幹細胞、腸幹細胞、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成体幹細胞、神経堤幹細胞、精巣細胞、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記幹細胞が人工多能性幹細胞を含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１７】
前記カーゴカセットが導入遺伝子を含む、請求項８５〜１１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記導入遺伝子が、細胞受容体、免疫チェックポイントタンパク質、サイトカイン、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記導入遺伝子が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される細胞受容体をコードする、請求項１１７または１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
治療方法であって、
（ａ）トランスポゾンと、前記トランスポゾンを認識する請求項１〜５８のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼとを細胞に導入し、それによって遺伝子操作された細胞を生成することと；
（ｂ）治療を必要としている患者に前記遺伝子操作された細胞を投与することとを含む、前記方法。
【請求項１２１】
前記遺伝子操作された細胞が前記トランスポゾンによって導入された導入遺伝子を含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記患者ががんまたは腫瘍と診断されている、請求項１２０または１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記投与することが前記遺伝子操作された細胞を前記患者の血管に輸注することを含む、請求項１２０〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２４】
請求項１〜５８のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼと、前記変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは前記融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンとを含む、ゲノム編集のためのシステム。
【請求項１２５】
請求項１〜５８のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと、前記変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは前記融合体によって認識可能なトランスポゾンとを含む、ゲノム編集のためのシステム。
【請求項１２６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２０４または２０７と少なくとも８０％同一または相補性である核酸配列を含む、請求項１２５に記載のシステム。
【請求項１２７】
前記ポリヌクレオチドが前記変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは前記融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡを含む、請求項１２５に記載のシステム。
【請求項１２８】
前記ポリヌクレオチドが前記変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは前記融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、請求項１２５または１２７に記載のシステム。
【請求項１２９】
前記ｍＲＮＡが化学的に修飾される、請求項１２８に記載のシステム。
【請求項１３０】
前記トランスポゾンがＤＮＡベクターに存在する、請求項１２４〜１２９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１３１】
前記ＤＮＡベクターがミニサークルプラスミドを含む、請求項１３０に記載のシステム。
【請求項１３２】
前記ポリヌクレオチド及び前記トランスポゾンが同じプラスミドに存在する、請求項１２５〜１３１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１３３】
前記トランスポゾンが２つの逆向き反復配列の間に配置されたカーゴカセットを含む、請求項１２４〜１３２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１３４】
前記２つの逆向き反復配列の左の逆向き反復配列が配列番号３に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１３３に記載のシステム。
【請求項１３５】
前記２つの逆向き反復配列の左の逆向き反復配列が配列番号３を含む、請求項１３３に記載のシステム。
【請求項１３６】
前記２つの逆向き反復配列のうちの右の逆向き反復配列が配列番号４に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１３３〜１３５に記載のシステム。
【請求項１３７】
前記２つの逆向き反復配列のうちの右の逆向き反復配列が配列番号４を含む、請求項１３３〜１３５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１３８】
前記２つの逆向き反復配列の左の逆向き反復配列が配列番号５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１３３に記載のシステム。
【請求項１３９】
前記２つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列が配列番号５を含む、請求項１３３に記載のシステム。
【請求項１４０】
前記２つの逆向き反復のうち右の逆向き反復配列が配列番号６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１３３、１３８または１３９に記載のシステム。
【請求項１４１】
前記２つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列が配列番号６を含む、請求項１３３、１３８または１３９に記載のシステム。
【請求項１４２】
前記２つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列が配列番号２０５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１３３に記載のシステム。
【請求項１４３】
前記２つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列が配列番号２０５を含む、請求項１３３に記載のシステム。
【請求項１４４】
前記２つの逆向き反復配列のうちの右の逆向き反復配列が配列番号２０６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１３３、１４２、または１４３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１４５】
前記２つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列が配列番号２０６を含む、請求項１３３、１４２、または１４３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１４６】
前記カーゴカセットがＣＭＶ、ＥＦＳ、ＭＮＤ、ＥＦ１α、ＣＡＧＣｓ、ＰＧＫ、ＵＢＣ、Ｕ６、Ｈ１、及びクメートから成る群から選択されるプロモーターを含む、請求項１３３〜１４５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１４７】
前記カーゴカセットがＣＭＶプロモーターを含む、請求項１３３〜１４５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１４８】
前記カーゴカセットが導入遺伝子を含む、請求項１３３〜１４７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１４９】
前記導入遺伝子が細胞受容体、免疫チェックポイントタンパク質、サイトカイン、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１４８に記載のシステム。
【請求項１５０】
前記導入遺伝子がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される細胞受容体をコードする、請求項１４８または１４９に記載のシステム。
【請求項１５１】
前記カーゴカセットが順方向に存在する、請求項１３３〜１５０いずれか１項に記載のシステム。
【請求項１５２】
前記カーゴカセットが逆方向に存在する、請求項１３３〜１５０いずれか１項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
相互参照
本出願は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる２０１８年６月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／６８８，２７８号の利益も主張する。
［背景技術］
【０００２】
トランスポゾンとも呼ばれる転位性の遺伝因子は、単一の細胞内でゲノム１つの位置から別の位置に動くことができるＤＮＡのセグメントである。トランスポゾンは、転位のメカニズムに従って２つの主要な群に分けることができ：転位は、（１）レトロトランスポゾンと呼ばれる要素のＲＮＡ中間体の逆転写を介して、及び（２）ＤＮＡトランスポゾンのための末端逆向き反復配列（ＴＩＲ）が隣接するＤＮＡの直接転位を介して発生することができる。活性があるトランスポゾンは、転位に必要な１以上のタンパク質をコードする。天然の活性ＤＮＡトランスポゾンはトランスポザーゼ酵素遺伝子を内部に持つ。
【０００３】
ｈＡＴファミリーのＤＮＡトランスポゾンは植物や動物に広く分布している。Ｈｅｒｍｅｓトランスポゾン、Ａｃトランスポゾン、ｈｏｂｏトランスポゾン及びＴｏｌ２トランスポゾンを含むが、これらに限定されない活性がある多数のｈＡＴトランスポゾン系が特定され、機能的であることが見いだされている。ｈＡＴファミリーは、トランスポザーゼの一次配列に基づいて、ＡＣサブファミリーとＢｕｓｔｅｒサブファミリーに分類されている２つのファミリーで構成される。ｈＡＴファミリーのメンバーはクラスＩＩの転位因子に属する。クラスＩＩ可動因子は、転位のカットアンドペーストメカニズムを使用する。ｈＡＴ因子は、同様のトランスポザーゼ、短い末端逆向き反復配列、及びゲノム標的の８塩基対重複を共有する。
［発明の概要］
【０００４】
本明細書に記載されているのは、一態様では、完全長の配列番号１と少なくとも７０％同一であり、表１．１の１以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼである。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１と比べて中性ｐＨで正味電荷を増加させるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、中性ｐＨで正味電荷を増加させるアミノ酸置換はリシンまたはアルギニンへの置換を含む。いくつかの実施形態では、中性ｐＨで正味電荷を増加させるアミノ酸置換は、アスパラギン酸またはグルタミン酸の中性アミノ酸、リシンまたはアルギニンへの置換を含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは表４．１の１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは表４の１以上のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、ＤＮＡ結合及びオリゴマー化ドメイン、挿入ドメイン、Ｚｎ−ＢＥＤドメイン、またはそれらの組み合わせにてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは配列番号１と比べて、触媒ドメイン内または触媒ドメインの近傍にて中性ｐＨで正味電荷を増加させるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは配列番号１と比べて中性ｐＨで正味電荷を増加させるアミノ酸置換を含み；その際、配列番号１に従って番号付けされる場合、１以上のアミノ酸はＤ２２３、Ｄ２８９、またはＥ５８９の近傍に位置する。いくつかの実施形態では、近傍は約８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５アミノ酸の距離である。いくつかの実施形態では、近傍は約７０〜８０アミノ酸の距離である。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列は完全長の配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼはさらに表２の１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼはさらに表３の１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１に従って番号付けされる場合、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼはさらにアミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、及びＤ１８９Ａを含む。いくつかの実施形態では、配列番号１に従って番号付けされる場合、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼはさらにアミノ酸置換Ｋ５７３Ｅ及びＥ５７８Ｌを含む。いくつかの実施形態では、配列番号１に従って番号付けされる場合、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼはさらにアミノ酸置換Ｉ４５２Ｋを含む。いくつかの実施形態では、配列番号１に従って番号付けされる場合、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼはさらにアミノ酸置換Ａ３５８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、配列番号１に従って番号付けされる場合、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼはさらにアミノ酸置換Ｖ２９７Ｋを含む。いくつかの実施形態では、配列番号１に従って番号付けされる場合、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼはさらにアミノ酸置換Ｎ８５Ｓを含む。いくつかの実施形態では、配列番号１に従って番号付けされる場合、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼはさらにアミノ酸置換Ｉ４５２Ｆ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、及びＤ１８９Ａを含む。いくつかの実施形態では、配列番号１に従って番号付けされる場合、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼはさらにアミノ酸置換Ａ３５８Ｋ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、及びＤ１８９Ａを含む。いくつかの実施形態では、配列番号１に従って番号が付けされた場合、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼはさらにアミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３Ｅ及びＥ５７８Ｌを含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼはさらに表１の１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸配列の配列番号１を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比べて高い転位効率を有する。いくつかの実施形態では、転位効率は、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼとレポーターカーゴカセットを含有するＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンとを細胞集団に導入し、その細胞集団のゲノムにてレポーターカーゴカセットの転位を検出することを含むアッセイによって測定される。
【０００５】
本明細書に記載されているのは、一態様では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列と１以上の追加の核局在化シグナル配列とを含む融合トランスポザーゼであり、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は完全長の配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、完全長の配列番号１に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、配列番号１と比べて中性ｐＨで正味電荷を増加させる１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、１以上のアミノ酸置換はリシンまたはアルギニンによる置換を含む。いくつかの実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、アスパラギン酸またはグルタミン酸の、中性アミノ酸、リシンまたはアルギニンによる置換を含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は表４、表４．１、またはその双方からの１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、ＤＮＡ結合及びオリゴマー化ドメイン；挿入ドメイン；Ｚｎ−ＢＥＤドメイン；またはそれらの組み合わせにて１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、表１、表１．１、またはその双方からの１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、アミノ酸配列の配列番号１を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比べて高い転位効率を有する。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列の転位効率は、融合ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼとレポーターカーゴカセットを含有するＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンとを細胞集団に導入し、その細胞集団のゲノムにてレポーターカーゴカセットの転位を検出することを含むアッセイによって測定される。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、配列番号１と比べて、触媒ドメイン内またはその近傍にて中性ｐＨで正味電荷を増加させる１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、配列番号１と比べて中性ｐＨで正味電荷を増加させる１以上のアミノ酸置換を含み、１以上のアミノ酸置換は配列番号１に従って番号付けされる場合、Ｄ２２３、Ｄ２８９またはＥ５８９の近傍に位置する。いくつかの実施形態では、近傍は約８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５アミノ酸の距離である。いくつかの実施形態では、近傍は約７０〜８０アミノ酸の距離である。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は表２の１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は表３の１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、及びＤ１８９Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｋ５７３Ｅ及びＥ５７８Ｌを含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｋを含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｖ２９７Ｋを含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｎ８５Ｓを含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｆ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、及びＤ１８９Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ及びＤ１８９Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３Ｅ及びＥ５７８Ｌを含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は完全長の配列番号１に対して１００％の同一性を有する。
【０００６】
本明細書に記載されているのは、一態様では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列とＤＮＡ配列特異的結合ドメインとを含む融合トランスポザーゼであり、その際、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒのアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列特異的結合ドメインはＴＡＬＥドメイン、ジンクフィンガードメイン、ＡＡＶ  Ｒｅｐ  ＤＮＡ結合ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列特異的結合ドメインはＴＡＬＥドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列及びＤＮＡ配列特異的結合ドメインはリンカーによって分離される。いくつかの実施形態では、リンカーは少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも５０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは配列番号９を含む。
【０００７】
本明細書に記載されているのは、一態様では、完全長の配列番号２０４または２０７と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一または相補性である核酸配列を含むポリヌクレオチドである。本明細書に記載されているのは、一態様では、本明細書に記載されている変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドである。本明細書に記載されているのは、本明細書に記載されているのは、一態様では、本明細書に記載されている融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは化学的に修飾される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡベクターに存在する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡベクターはミニサークルプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはヒト細胞での発現のためにコドンが最適化される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは完全長の配列番号２０４または２０７と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一または相補性である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは完全長の配列番号２０４または２０７と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一または相補性である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは完全長の配列番号２０４または２０７と少なくとも約９５％同一または相補性である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは完全長の配列番号２０４または２０７と１００％同一であるまたは相補性である核酸配列を含む。
【０００８】
本開示の一態様は、完全長の配列番号１と少なくとも７０％同一であり、配列番号１と比べて中性ｐＨで正味電荷を増加させる１以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを提供する。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸配列の配列番号１を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比べて高い転位効率を有する。本開示の別の態様は、完全長の配列番号１と少なくとも７０％同一であり、ＤＮＡ結合及びオリゴマー化ドメイン；挿入ドメイン；Ｚｎ−ＢＥＤドメイン；またはそれらの組み合わせにもう１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを提供する。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸配列の配列番号１を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比べて高い転位効率を有する。本開示のさらに別の態様は、全長配列番号１と少なくとも７０％同一であり、表１の１以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを提供する。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１と比べて触媒ドメイン内でまたはその近傍にて中性ｐＨで正味電荷を増加させる１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１と比べて中性ｐＨにて正味電荷を増加させる１以上のアミノ酸置換を含み、１以上のアミノ酸は配列番号１に従って番号付けされる場合、Ｄ２２３、Ｄ２８９、またはＥ５８９の近傍に位置する。いくつかの実施形態では、近傍は約８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５アミノ酸の距離である。いくつかの実施形態では、近傍は約７０〜８０アミノ酸の距離である。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列は、完全長の配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、１以上のアミノ酸置換はリシンまたはアルギニンへの置換を含む。いくつかの実施形態では、１以上のアミノ酸置換はアスパラギン酸またはグルタミン酸の、中性アミノ酸、リシンまたはアルギニンへの置換を含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは表４の１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは表２の１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは表３の１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、及びＤ１８９Ａを含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｋ５７３Ｅ及びＥ５７８Ｌを含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｋを含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｖ２９７Ｋを含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｎ８５Ｓを含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｆ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、及びＤ１８９Ａを含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、及びＤ１８９Ａを含む。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３Ｅ及びＥ５７８Ｌを含む。いくつかの実施形態では、転位効率は、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼとレポーターカーゴカセットを含有するＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンとを細胞集団に導入し、その細胞集団のゲノムにてレポーターカーゴカセットの転位を検出することを含むアッセイによって測定される。
【０００９】
本開示のさらに別の態様は、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列とＤＮＡ配列特異的結合ドメインとを含む融合トランスポザーゼを提供する。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、完全長の配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列特異的結合ドメインは、ＴＡＬＥドメイン、ジンクフィンガードメイン、ＡＡＶ  Ｒｅｐ  ＤＮＡ結合ドメインまたはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列特異的結合ドメインはＴＡＬＥドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、完全長の配列番号１に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、配列番号１と比べて中性ｐＨにて正味電荷を増加させる１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、ＤＮＡ結合及びオリゴマー化ドメイン；挿入ドメイン；Ｚｎ−ＢＥＤドメイン；またはそれらの組み合わせにて１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、表１の１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、アミノ酸配列の配列番号１を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比べて高い転位効率を有する。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、配列番号１と比べて、触媒ドメイン内またはその近傍にて中性ｐＨで正味電荷を増加させる１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、配列番号１と比べて中性ｐＨで正味電荷を増加させる１以上のアミノ酸置換を含み、１以上のアミノ酸置換は配列番号１に従って番号が付けされる場合、Ｄ２２３、Ｄ２８９またはＥ５８９の近傍に位置する。いくつかの実施形態では、近傍は約８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５アミノ酸の距離である。いくつかの実施形態では、近傍は約７０〜８０アミノ酸の距離である。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は表２の１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は表３の１以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、及びＤ１８９Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｋ５７３Ｅ及びＥ５７８Ｌを含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｋを含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、配��番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｖ２９７Ｋを含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｎ８５Ｓを含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｆ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、及びＤ１８９Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、及びＤ１８９Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、配列番号１に従って番号付けされる場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３Ｅ、及びＥ５７８Ｌを含む。いくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は完全長の配列番号１に対して１００％の同一性を有する。融合トランスポザーゼのいくつかの実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列及びＤＮＡ配列特異的結合ドメインはリンカーによって分離される。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも５０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは配列番号９を含む。
【００１０】
本開示のさらに別の態様は、本明細書に記載されているような変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。本開示のさらに別の態様は、本明細書に記載されているような融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは化学的に修飾される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡベクターに存在する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡベクターはミニサークルプラスミドを含む。
【００１１】
本開示のさらに別の態様は、本明細書に記載されているような変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼを産生する細胞を提供する。本開示のさらに別の態様は、本明細書に記載されているようなポリヌクレオチドを含有する細胞を提供する。本開示のさらに別の態様は、本明細書に記載されているような変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンとを細胞に導入することを含む方法を提供する。本開示のさらに別の態様は、本明細書に記載されているような融合トランスポザーゼと融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンとを細胞に導入することを含む方法を提供する。方法のいくつかの実施形態では、導入することは、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと細胞を接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは化学的に修飾される。方法のいくつかの実施形態では、導入することはトランスポゾンを含有するＤＮＡベクターと細胞を接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡベクターはミニサークルプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、導入することは、トランスポゾンと、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドとの双方を含有するプラスミドベクターと細胞を接触させることを含む。いくつかの実施形態では、導入することは精製タンパク質としての変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼと細胞を接触させることを含む。方法のいくつかの実施形態では、トランスポゾンは２つの逆向き反復配列の間に配置されたカーゴカセットを含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復のうち左の逆向き反復配列は、配列番号３に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復配列のうちの左の逆向き反復配列は配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列は配列番号４に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列は配列番号４を含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列は、配列番号５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列は配列番号５を含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列は、配列番号６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列は配列番号６を含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列は配列番号２０５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列は配列番号２０５を含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列は配列番号２０６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列は配列番号２０６を含む。いくつかの実施形態では、カーゴカセットはＣＭＶ、ＥＦＳ、ＭＮＤ、ＥＦ１α、ＣＡＧＣｓ、ＰＧＫ、ＵＢＣ、Ｕ６、Ｈ１、及びクメートから成る群から選択されるプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ベクターはＣＭＶプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、カーゴカセットは順方向で存在する。いくつかの実施形態では、カーゴカセットは逆向きで存在する。いくつかの実施形態では、カーゴカセットは導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、細胞受容体、免疫チェックポイントタンパク質、サイトカイン、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される細胞受容体をコードする。いくつかの実施形態では、導入することは、エレクトロポレーション、微量注入、リン酸カルシウム沈殿、カチオン性ポリマー、デンドリマー、リポソーム、微小発射体衝撃、ＦｕＧｅｎｅ、直接音波負荷、細胞圧搾、光学形質移入、プロトプラスト融合、インパレフェクション、マグネトフェクション、ヌクレオフェクション、またはそれらの任意の組み合わせの助けを借りて細胞に形質移入することを含む。いくつかの実施形態では、導入することは細胞でエレクトロポレーションを行なうことを含む。方法のいくつかの実施形態では、細胞は対象から単離された初代細胞である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつか実施形態では、対象は疾患患者である。いくつかの実施形態では、対象はがんまたは腫瘍であると診断されている。いくつかの実施形態では、細胞は対象の血液から単離される。いくつかの実施形態では、細胞は初代免疫細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞は初代白血球を含む。いくつかの実施形態では、細胞は初代Ｔ細胞���含む。いくつかの実施形態では、初代Ｔ細胞は、ガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、初代免疫細胞はＣＤ３＋細胞を含む。いくつかの実施形態で、細胞は幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞、造血幹細胞、表皮幹細胞、上皮幹細胞、気管支肺胞幹細胞、乳腺幹細胞、間葉系幹細胞、腸幹細胞、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成体幹細胞、神経堤幹細胞、精巣細胞、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。いくつかの実施形態では、幹細胞は人工多能性幹細胞を含む。
【００１２】
本開示の別の態様は、（ａ）トランスポゾンと、トランスポゾンを認識する本明細書に記載されているような変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼとを細胞に導入し、それによって遺伝子操作された細胞を生成することと；（ｂ）治療を必要としている患者に遺伝子操作された細胞を投与することとを含む治療の方法を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞はトランスポゾンによって導入された導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、患者はがんまたは腫瘍であると診断されている。いくつかの実施形態では、投与することは、遺伝子操作された細胞を患者の血管に輸注することを含む。
【００１３】
本開示のさらに別の態様は、本明細書に記載されているような変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼと、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンとを含む、ゲノム編集のためのシステムを提供する。本開示のさらに別の態様は、本明細書に記載されているような変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンとを含む、ゲノム編集のためのシステムを提供する。システムのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは化学的に修飾される。いくつかの実施形態では、トランスポゾンはＤＮＡベクターに存在する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡベクターはミニサークルプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド及びトランスポゾンは同じプラスミドに存在する。いくつかの実施形態では、トランスポゾンは２つの逆向き反復配列の間に配置されたカーゴカセットを含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列は配列番号３に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列は配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列は配列番号４に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列は配列番号４を含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列は配列番号５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列は配列番号５を含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列は配列番号６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列は配列番号６を含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列は配列番号２０５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復配列のうち左の逆向き反復配列は配列番号２０５を含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列は配列番号２０６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、２つの逆向き反復配列のうち右の逆向き反復配列は配列番号２０６を含む。いくつかの実施形態では、カーゴカセットはＣＭＶ、ＥＦＳ、ＭＮＤ、ＥＦ１α、ＣＡＧＣｓ、ＰＧＫ、ＵＢＣ、Ｕ６、Ｈ１、及びクメートから成る群から選択されるプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ベクターはＣＭＶプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、カーゴカセットは導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、細胞受容体、免疫チェックポイントタンパク質、サイトカイン、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される細胞受容体をコードする。いくつかの実施形態では、カーゴカセットは順方向で存在する。いくつかの実施形態では、カーゴカセットは逆向きで存在する。
【００１４】
参照による組込み
本明細書に記述されている刊行物、特許及び特許出願はすべて、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、具体的に且つ個別に参照によって組み込まれるように指示されたかのようなことと同程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。参照によって組み込まれる用語が本明細書で定義される用語と矛盾する範囲内では、本明細書が支配する。
【００１５】
本開示の新規の特徴は、添付のクレームにて詳細に記述されている。本開示に記述されているこれらの特徴及び利点のさらに良好な理解は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を記述している以下の詳細な説明及び添付図面を参照することによって得られるであろう。
［図面の簡単な説明］
【００１６】
［図１］野生型（ＷＴ）ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ及び例示的なＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンで形質移入した細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の比率によって測定された、いくつかの例示的なＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンベクター構築物の転位効率を示す図である。
［図２］例示的なＴｃＢｕｓｔｅｒ  ＩＲ／ＤＲ配列１（それぞれ出現順に配列番号３〜４）及び配列２（それぞれ出現順に配列番号５〜６）のヌクレオチド配列比較を示す図である。
［図３］Ａは例示的なＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンＴｎ−８（ｐｕｒｏ−ｍＣｈｅｒｒｙカセットを含有する；図１に示す）及び野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたはＶ５９６Ａ変異型トランスポザーゼ（Ｖ５９６Ａ置換を含有する）による形質移入の２週間後のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の代表的な明視野画像及び蛍光画像を示す。形質移入された細胞を、形質移入の２日後に１μｇ／ｍＬのピューロマイシンと共に６ウェルプレートに入れ、コロニーの定量のために形質移入の２週間後に固定し、クリスタルバイオレットで染色した。Ｂは形質移入の２週間後の６ウェルプレートにおける形質移入された細胞コロニーの代表的な写真を示す。Ｃは形質移入の２週間後の各形質移入条件ごとのコロニーの定量を示すグラフである。
［図４］ＡＣサブファミリーにおけるいくつかのトランスポザーゼに対比させたＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列の配列比較を示し、アミノ酸保存の領域のみが示されている（それぞれ、出現順に配列番号８９〜１９４）。
［図５］Ｂｕｓｔｅｒサブファミリーにおける多数の他のトランスポザーゼメンバーに対比させたＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列の配列比較を示す図である（それぞれ、出現順に配列番号１９５〜２０３）。特定の例示的なアミノ酸置換をタンパク質配列の上に示し、併せて、配列比較の上に示す比率はＴｃＢｕｓｔｅｒ配列に置換されていると考えられるアミノ酸を含有する他のＢｕｓｔｅｒサブファミリーメンバーの比率であり、下に示す比率はその位置で標準的なＴｃＢｕｓｔｅｒアミノ酸を含有する他のＢｕｓｔｅｒサブファミリーメンバーの比率である。
［図６］ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ変異型を調べるのに使用された例示的な発現ベクターｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０のベクターマップを示す。
［図７］例示的なトランスポザーゼ変異型と共にＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンＴｎ−８（図１に示す）で形質移入したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の比率によって測定される、例示的なＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ変異型の転位効率を定量化するグラフである。
［図８］任意のリンカーによって連結されたＤＮＡ配列特異的結合ドメインとＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列とを含有する１つの例示的な融合トランスポザーゼを示す。
［図９］タグを含有する例示的なトランスポザーゼと共にＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンＴｎ−８（図１に示す）で形質移入したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の割合によって測定したときの、異なるタグを含有する例示的なＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの転位効率を定量化するグラフである。
［図１０］ＡはＧＦＰ陽性細胞の比率によって測定されたときの、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞における例示的なＴｃＢｕｓｔｅｒ転位システムの転位効率を定量化するグラフである。Ｂはフローサイトメトリーによる形質移入の２日後及び７日後の形質移入されたＴ細胞の生存率を定量化するグラフである。データはパルス制御に関連する。
［図１１］特定のアミノ酸に注釈が付けられた野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列を示す（配列番号１）。
［図１２］アミノ酸置換Ｄ１８９Ａ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ（配列番号７８）を含有する変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列を示す。
［図１３］アミノ酸置換Ｄ１８９Ａ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｉ４５２Ｋ（配列番号７９）を含有する変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列を示す。
［図１４］アミノ酸置換Ｄ１８９Ａ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｎ８５Ｓ（配列番号８０）を含有する変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列を示す。
［図１５］アミノ酸置換Ｄ１８９Ａ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ａ３５８Ｋ（配列番号８１）を含有する変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列を示す。
［図１６］アミノ酸置換Ｄ１８９Ａ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｋ５７３Ｅ／Ｅ５７８Ｌ（配列番号１３）を含有する変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列を示す。
［発明を実施するための形態］
【００１７】
概要
【００１８】
ＤＮＡトランスポゾンは、非複製性の「カットアンドペースト」メカニズムを介して転座することができる。これには、触媒酵素、すなわち、その標的を切断し、その結果、そのドナーテンプレートからＤＮＡトランスポゾンを遊離することができるトランスポザーゼによる２つの末端の逆向き反復配列の認識が必要である。切除すると、ＤＮＡトランスポゾンはその後、同じトランスポザーゼによって切断されるアクセプターＤＮＡに組み込まれてもよい。それらの自然な構成のいくつかでは、ＤＮＡトランスポゾンは２つの逆向き反復配列に隣接しており、転位を触媒するトランスポザーゼをコードする遺伝子を含有してもよい。
【００１９】
ＤＮＡトランスポゾンによるゲノム編集の応用については、２つの異なるプラスミドに基づいてバイナリシステムを開発するようにトランスポゾンを設計し、それによってトランスポザーゼは逆向き反復配列に隣接する対象とする遺伝子を含有するトランスポゾンＤＮＡから物理的に分離されることが望ましい。トランスポゾンとトランスポザーゼのプラスミドの標的細胞への同時送達により、従来のカットアンドペーストメカニズムを介した転位が可能になる。
【００２０】
ＴｃＢｕｓｔｅｒはＤＮＡトランスポゾンのｈＡＴファミリーのメンバーである。ファミリーの他のメンバーにはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ及びＰｉｇｇＢａｃが挙げられる。本明細書で議論されるのは、ｈＡＴファミリーのトランスポゾン成分を用いてヒト造血系細胞及び免疫系細胞への遺伝子導入を増強するための相乗的アプローチに関連する種々の装置、システム、及び方法である。本開示は、改良されたｈＡＴトランスポザーゼ、トランスポゾンのベクター配列、トランスポザーゼの送達方法、及びトランスポゾンの送達方法に関する。一実施形態では、本研究は、機能亢進ｈＡＴトランスポザーゼを作製するための特定の普遍的な部位を特定した。別の実施態様では、ゲノム空間を保存する最小サイズのｈＡＴトランスポゾンベクターの逆向き末端反復配列（ＩＴＲ）を作製する方法が記載されている。別の実施態様では、化学的に修飾された試験管内で転写されたｍＲＮＡとしてｈＡＴファミリートランスポザーゼを送達するための改善された方法が記載されている。別の実施態様では、ｈＡＴファミリートランスポゾンベクターをＤＮＡの「ミニチュア」サークルとして送達する方法が記載されており、実質的にすべての原核生物配列が組換え法によって除去されている。別の実施態様では、ｈＡＴトランスポザーゼに融合された転写活性化因子様（ＴＡＬ）ドメインを用いてＤＮＡ配列特異的結合ドメインを融合する方法が記載されている。これらの改善は、個別にまたは組み合わせて、問題の細胞型への予想外に高レベルの遺伝子導入、及び対象とする配列へのトランスポゾンベクターの送達の改善を得ることができる。
【００２１】
変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ
【００２２】
本開示の一態様は変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを提供する。変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ（配列番号１）と比べて１以上のアミノ酸置換を含んでもよい。
【００２３】
変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ（配列番号１）の完全長配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ（配列番号１）の完全長配列に対して少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ（配列番号１）の完全長配列に対して少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または少なくとも９９．９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００２４】
本明細書で使用されるとき「同一性パーセント（％）」という用語は、最大比率の同一性を達成するために配列を並べ、必要に応じてギャップ（すなわち、ギャップは、最適な配列比較のために候補配列及び参照配列の一方または双方に導入することができ、非相同配列は比較の目的で無視することができる）を導入した後の、参照配列のアミノ酸（または核酸）残基と同一である候補配列のアミノ酸（または核酸）残基の比率を指すことができる。同一性パーセントを決定する目的のための配列比較は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて当該技術分野の技量の範囲内にある種々の方法で達成することができる。２つの配列の同一性パーセントは、ＢＬＡＳＴを用いて試験配列を比較配列と共に並べ、比較配列の同じ位置にあるアミノ酸またはヌクレオチドと同一である並べた試験配列内のアミノ酸またはヌクレオチドの数を決定し、同一のアミノ酸またはヌクレオチドの数を比較配列内のアミノ酸またはヌクレオチドの数で割ることによって算出することができる。
【００２５】
本明細書で使用されるとき「相補体（単数）」、「相補体（複数）」、「相補性の」、及び「相補性」という用語は、所与の配列に完全に相補性であり、ハイブリッド形成可能である配列を指すことができる。場合によっては、所与の領域にわたるその塩基の配列がその結合相手の塩基配列を相補性に結合することができるので、例えば、Ａ−Ｔ、Ａ−Ｕ、Ｇ−Ｃ、及びＧ−Ｕの塩基対が形成されるならば、所与の核酸とハイブリッド形成する配列は所与の分子の「相補体」または「逆相補体」と呼ばれる。一般に、第２の配列にハイブリッド形成可能な第１の配列は第２の配列に特異的または選択的にハイブリッド形成可能であるので、第２の配列または第２の配列のセットへのハイブリッド形成（例えば、当該技術分野で一般的に使用されるストリンジェントな条件のような所与の設定の条件下で熱力学的にさらに安定な）はハイブリッド形成反応中の非標的配列とのハイブリッド形成よりも好まれる。通常、ハイブリッド形成可能な配列は、それぞれの長さの全部または一部にわたる配列相補性、例えば、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及び１００％の配列相補性を含む２５％〜１００％の間の相補性の程度を共有する。相補性パーセントを評価する目的のような配列同一性は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌにて利用できる任意で初期設定の設定でのＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅアライナーを参照のこと）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉにて利用できる任意で初期設定の設定でのＢＬＡＳＴ配列比較ツールを参照のこと）、またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌにて利用できる任意で初期設定の設定でのＥＭＢＯＳＳ  Ｗａｔｅｒアライナーを参照のこと）を含むが、これらに限定されない好適な配列比較アルゴリズムによって測定することができる。最適な配列比較は、初期設定のパラメーターを含む、選択したアルゴリズムの適切なパラメーターを用いて評価することができる。
【００２６】
相補性は完全であることができ、または実質的／十分であることができる。２つの核酸間の完全な相補性は、２つの核酸が二本鎖のすべての塩基がワトソン・クリック対合によって相補性塩基に結合する二本鎖を形成することができることを意味する。実質的なまたは十分な相補性は、一方の鎖の配列が反対側の鎖の配列に完全及び／または完璧に相補性ではないが、ハイブリッド形成条件の設定（例えば、塩濃度と温度）で安定したハイブリッド複合体を形成するために２つの鎖の塩基間で十分な結合が生じることを意味することができる。そのような条件は、配列と標準的な数学的計算を用いてハイブリッド形成した鎖のＴｍを予測することによって、または日常の方法を用いてＴｍを経験的に決定することによって予測することができる。
【００２７】
変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの完全長配列（配列番号１）とは異なる少なくとも１つのアミノ酸を有するアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ（配列番号１）の完全長配列とは異なる少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０以上のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ（配列番号１）の完全長配列とは異なる少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、または少なくとも３００のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含むことができる。場合によっては、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ（配列番号１）の完全長配列とは異なる多くても３、多くても６、多くても１２、多くても２５、多くても３５、多くても４５、多くても５５、多くても６５、多くても７５、多くても８５、多くても９５、多くても１５０、多くても２５０、または多くても３５０のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００２８】
図４に示すように、通常、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポサーゼはＮ末端からＣ末端までにて、ＺｎＦ−ＢＥＤドメイン（アミノ酸７６〜９８）、ＤＮＡ結合及びオリゴマー化ドメイン（アミノ酸１１２〜２１３）、第１の触媒ドメイン（アミノ酸２１３〜３１２）、挿入ドメイン（アミノ酸３１２〜５４３）、及び第２の触媒ドメイン（アミノ酸５８３〜６２０）、ならびにこれらの注釈付きドメイン間における少なくとも４つのドメイン間領域を含むと見なすことができる。特に明記しない限り、本明細書で使用されているようなアミノ酸への数的言及はすべて配列番号１に従う。変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、これらのドメインのいずれか１つ、またはそれらの任意の組み合わせにて１以上のアミノ酸置換を含むことができる。場合によっては、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、ＺｎＦ−ＢＥＤドメイン、ＤＮＡ結合及びオリゴマー化ドメイン、第１の触媒ドメイン、挿入ドメイン、またはそれらの組み合わせにて１以上のアミノ酸置換を含むことができる。変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、２つの触媒ドメインの少なくとも一方にて１以上のアミノ酸置換を含むことができる。
【００２９】
例示的な変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、表１または表１．１の１以上のアミノ酸置換を含むことができる。時には、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、表１または表１．１のアミノ酸置換の少なくとも１つを含むことができる。変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、表１または表１．１のアミノ酸置換の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０以上を含むことができる。
【表１】
2021527427.tif 000002
2021527427.tif 000003
2021527427.tif 000004
【表２】
2021527427.tif 000005
2021527427.tif 000006
2021527427.tif 000007
2021527427.tif 000008
【００３０】
例示的な変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは表２の１以上のアミノ酸置換、または置換の組み合わせを含む。場合によっては、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは表２のアミノ酸置換の少なくとも１つまたは置換の組み合わせを含むことができる。変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは表２のアミノ酸置換の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０以上、または置換の組み合わせを含むことができる。
【表３】
2021527427.tif 000009
2021527427.tif 000010
【００３１】
例示的な変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは表３の１以上のアミノ酸置換、または置換の組み合わせを含む。場合によっては、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは表３のアミノ酸置換の少なくとも１つまたは置換の組み合わせを含むことができる。変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは表３のアミノ酸置換の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０以上、または置換の組み合わせを含むことができる。
【表４】
2021527427.tif 000011
【００３２】
機能亢進変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ
【００３３】
本開示の別の態様は機能亢進変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを提供することである。本明細書で使用されるとき「機能亢進」変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸配列の配列番号１を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比べて高い転位効率を有する任意の変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを指すことができる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、機能亢進変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸配列の配列番号１を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比べて、特定の状況下で高い転位効率を有してもよい。例えば、機能亢進変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは特定の種類の逆向き反復配列を有するトランスポゾンの転位を触媒するのに使用される場合、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼよりも良好な転位効率を有してもよい。他の種類の逆向き反復配列を有する他のいくつかのトランスポゾンでは、機能亢進変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比べて高い転位効率を有さない可能性がある。いくつかの他の非限定的な例では、機能亢進変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、特定の形質移入条件下で、アミノ酸配列の配列番号１を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比べて高い転位効率を有してもよい。限定されないで、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較した場合、機能亢進変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは温度が通常の細胞培養温度よりも高ければ、さらに良好な転位効率を有してもよく；機能亢進変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、相対的に酸性または塩基性の水性媒体にてさらに良好な転位効率を有してもよく；機能亢進変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、特定の種類の形質移入技術（例えば、エレクトロポレーション）を実施すれば、さらに良好な転位効率を有してもよい。
【００３５】
転位効率は、宿主細胞の集団に導入されたトランスポゾン及びトランスポザーゼの量によって基準化される、その宿主細胞の集団で発生する成功した転位事象の割合によって測定することができる。多くの場合、２以上のトランスポザーゼの転位効率を比較すると、同じまたは類似の形質移入条件下での宿主細胞の形質移入のために、同じトランスポゾン構築物が２以上のトランスポザーゼのそれぞれと対合する。宿主細胞における転位事象の量は種々のアプローチによって調べることができる。例えば、トランスポゾン構築物は、逆向き反復配列の間に配置されたレポーター遺伝子を含有するように設計されてもよく、レポーター遺伝子について陽性の形質移入された細胞は、転位事象の量の推定値を与えることができる、成功した転位事象が発生する細胞として数えられ得る。別の非限定的な例には、トランスポゾンのカセットカーゴの挿入を調べるための宿主細胞ゲノムの配列決定が挙げられる。いくつかの実施形態では、２以上の異なるトランスポゾンの転位効率を比較する場合、同じまたは類似の形質移入条件下での宿主細胞の形質移入のために、同じトランスポザーゼが異なるトランスポゾンのそれぞれと対合することができる。同様のアプローチは転位効率の測定に利用することができる。当業者に知られている他の方法もまた転位効率の比較のために実施されてもよい。
【００３６】
本明細書で提供されているのはまた、機能亢進変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを取得する方法である。
【００３７】
例示的な方法の１つは、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸を体系的に変異させてアミノ酸配列の正味電荷を増加させることを含むことができる。時には、方法は、体系的なアラニン走査を実施して中性ｐＨで負に荷電しているアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）をアラニン残基に変異させることを含むことができる。方法は、中性ｐＨで正に荷電しているリシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）の残基に対して体系的な変異を実行することを含むことができる。
【００３８】
特定の理論に束縛されることを望まないが、中性ｐＨでのアミノ酸配列の正味電荷の増加はＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの転位効率を増加させてもよい。特に、トランスポザーゼの触媒ドメインの近傍で正味電荷が増加すると、転位効率が増加すると予想される。正に荷電したアミノ酸は、ＤＮＡ標的との接触点を形成し、触媒ドメインがＤＮＡ標的に作用することを可能にすることができると考えることができる。これらの正に荷電したアミノ酸が失われると、トランスポザーゼの切除または組込みの活性のいずれかが低下し得ることも考えられてもよい。
【００３９】
図１１は、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列を示しており、ＤＮＡとの接触点であってもよいアミノ酸を強調している。図１１では、大きな太字の文字は触媒三連構造アミノ酸を示す；ボックスの文字は正に荷電したアミノ酸に置換されると転位を増加させるアミノ酸を示し；イタリック体及び小文字の文字は、異なるアミノ酸に置換すると転位が減少する正に荷電したアミノ酸を示し；太字のイタリック体と下線は、正に荷電したアミノ酸に置換すると転位が増加し、負に荷電したアミノ酸に置換すると転位が減少するアミノ酸を示し；下線が引かれた文字は、Ｂｕｓｔｅｒサブファミリーに対するタンパク質配列の配列比較に基づいて正に荷電したアミノ酸である可能性があるアミノ酸を示す。
【００４０】
変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１と比べて中性ｐＨで正味電荷を増加させる１以上のアミノ酸置換を含むことができる。時には、配列番号１と比べて中性ｐＨで正味電荷を増加させる１以上のアミノ酸置換を含む変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは機能亢進性であることができる。時には、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、例えば、リシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）のような正に荷電したアミノ酸への１以上の置換を含むことができる。変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）のような、しかし、これらに限定されない負に荷電したアミノ酸の、中性アミノ酸または正に荷電したアミノ酸による１以上の置換を含むことができる。
【００４１】
非限定的な例の１つには、配列番号１と比べて触媒ドメイン内でまたは触媒ドメインの近傍で中性ｐＨにて正味電荷を増加させる１以上のアミノ酸置換を含む変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼが挙げられる。触媒ドメインは第１の触媒ドメインまたは第２の触媒ドメインであることができる。触媒ドメインはまたトランスポザーゼの双方の触媒ドメインも含むことができる。
【００４２】
本開示の例示的な方法は、ＤＮＡに近接している、またはＤＮＡと直接接触すると予測されるアミノ酸を変異させることを含むことができる。これらのアミノ酸は、ｈＡＴファミリーの他のメンバー（複数可）（例えば、Ｂｕｓｔｅｒ及び／またはＡｃサブファミリーの他のメンバー）で保存されていると同定された置換アミノ酸であることができる。ＤＮＡに近接している、またはＤＮＡと直接接触すると予測されるアミノ酸は、例えば、結晶構造、予測される構造、変異分析、機能分析、ｈＡＴファミリーの他のメンバーとの配列比較または他の好適な方法を参照することによって同定することができる。
【００４３】
特定の理論に束縛されることを望まないが、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼはｈＡＴトランスポザーゼファミリーの他のメンバーと同様に、トランスポゾンの動きを触媒する活性部位であってもよいＤＤＥモチーフを有する。Ｄ２２３、Ｄ２８９、及びＥ５８９は酸性残基の三連構造である活性部位を構成すると考えられる。ＤＤＥモチーフは二価の金属イオンを配位させてもよく、触媒反応において重要であることができる。いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１と比べて中性ｐＨで正味電荷を増加させる１以上のアミノ酸置換を含むことができ、且つ１以上のアミノ酸は配列番号１に従って番号付けされる場合、Ｄ２２３、Ｄ２８９またはＥ５８９の近傍に位置する。
【００４４】
特定の実施形態では、本明細書で提供されているような変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、触媒三連構造、すなわちＤ２２３、Ｄ２８９、またはＥ５８９の破壊を含まない。変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、Ｄ２２３、Ｄ２８９、またはＥ５８９でのアミノ酸置換を含まなくてもよい。変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、Ｄ２２３、Ｄ２８９、またはＥ５８９でのアミノ酸置換を含んでもよいが、そのような置換は触媒三連構造によってもたらされる触媒活性を破壊しない。
【００４５】
場合によっては、「近傍」という用語は、トランスポザーゼの一次構造における直線距離の測定を指すことができる。例えば、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの一次構造におけるＤ２２３とＤ２８９の間の距離は６６アミノ酸である。特定の実施形態では、近傍は約７０〜８０アミノ酸の距離を指すことができる。多くの場合、近傍は約８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５アミノ酸の距離を指すことができる。
【００４６】
場合によっては、「近傍」という用語は、トランスポザーゼの二次または三次構造における空間的関係の測定、すなわち、トランスポザーゼがその三次元構成に折り畳まれるときを指すことができる。タンパク質の二次構造は、タンパク質の局所セグメントの三次元形態を指すことができる。一般的な二次構造要素には、アルファヘリックス、ベータシート、ベータターン、及びオメガループが挙げられる。二次構造要素は、タンパク質がその三次元三次構造に折り畳む前に中間体として形成されてもよい。タンパク質の三次構造はタンパク質の三次元形状を指すことができる。タンパク質の三次構造は、生理学的条件下または他の条件下で動的な構成変化を示してもよい。三次構造は、１以上のタンパク質二次構造であるタンパク質ドメインを持つ単一のポリペプチド鎖「主鎖」を有するであろう。アミノ酸側鎖は多数の方法で相互作用し、結合してもよい。特定のタンパク質内の側鎖の相互作用及び結合がその三次構造を決定する。多くの実施態様では、近傍は、約１Å、約２Å、約５Å、約８Å、約１０Å、約１５Å、約２０Å、約２５Å、約３０Å、約３５Å、約４０Å、約５０Å、約６０Å、約７０Å、約８０Å、約９０Å、または約１００Åの距離を指すことができる。
【００４７】
中性ｐＨは約７のｐＨ値であることができる。時には、中性ｐＨは、６．９〜７．１、６．８〜７．２、６．７〜７．３、６．６〜７．４、６．５〜７．５、６．４〜７．６、６．３〜７．７、６．２〜７．８、６．１〜７．９、６．０〜８．０、５〜８、またはそれらから派生した範囲のｐＨ値であることができる。
【００４８】
配列番号１と比べて中性ｐＨで正味電荷を増加させる１以上のアミノ酸置換を含む非限定的な例示的変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼには、表４、表４．１、またはその双方のアミノ酸置換の組み合わせの少なくとも１つを含むＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼが挙げられる。変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、表４、表４．１、またはその双方のアミノ酸置換の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０以上を含むことができる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１と比べて非中性ｐＨで正味電荷を増加させる１以上のアミノ酸置換を含むことができる。場合によっては、正味電荷は非中性ｐＨでの触媒ドメイン内またはその近傍で増加する。多くの場合、正味電荷は非中性ｐＨにてＤ２２３、Ｄ２８９、またはＥ５８９の近傍で増加する。非中性ｐＨは、７未満、６．５未満、６未満、５．５未満、５未満、４．５未満、４未満、３．５未満、３未満、２．５未満、２未満、１．５未満、または１未満のｐＨ値であることができる。非中性ｐＨは、７を超える、７．５を超える、８を超える、８．５を超える、９を超える、９．５を超える、または１０を超えるｐＨ値であることができる。
【表５】
2021527427.tif 000012
2021527427.tif 000013
【表６】
2021527427.tif 000014
【００５０】
例示的な一実施形態では、方法はＤＮＡ結合及びオリゴマー化ドメインにてアミノ酸を体系的に変異させることを含むことができる。特定の理論に束縛されることを望まないが、ＤＮＡ結合及びオリゴマー化ドメインにおける変異は、ＤＮＡ標的への結合親和性を高めてもよく、トランスポザーゼのオリゴマー化活性を促進してもよく、その結果、転位効率を促進してもよい。さらに具体的には、方法は、ＤＮＡ結合及びオリゴマー化ドメイン（例えば、アミノ酸１１２〜２１３）内またはその近傍でアミノ酸を１つずつ体系的に変異させることを含むことができる。方法はまた、ＤＮＡ結合及びオリゴマー化ドメイン内またはその近傍で１を超えるアミノ酸を変異させることも含むことができる。方法はまた、ＤＮＡ結合及びオリゴマー化ドメインの外側の１以上のアミノ酸と一緒にＤＮＡ結合及びオリゴマー化ドメイン内でまたはその近傍で１以上のアミノ酸を変異させることも含むことができる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、方法は、他のｈＡＴファミリートランスポザーゼ（Ａｃ、Ｈｅｒｍｅｓ、Ｈｏｂｏ、Ｔａｇ２、Ｔａｍ３、Ｈｅｒｍｅｓ、Ｒｅｓｔｌｅｓｓ及びＴｏｌ２）またはＢｕｓｔｅｒサブファミリーの他のメンバー（例えば、ＡｅＢｕｓｔｅｒ１、ＡｅＢｕｓｔｅｒ２、ＡｅＢｕｓｔｅｒ３、ＢｔＢｕｓｔｅｒ１、ＢｔＢｕｓｔｅｒ２、ＣｆＢｕｓｔｅｒ１、及びＣｆＢｕｓｔｅｒ２）とのＴｃＢｕｓｔｅｒの複数の配列比較に基づいて選択的アミノ酸残基の合理的な置換を行うことを含むことができる。特定の理論に束縛されないで、他のｈＡＴファミリーのトランスポザーゼの間、特に活性があるトランスポザーゼの間での特定のアミノ酸の保存性は、トランスポザーゼの触媒活性についてのそれらの重要性を示してもよい。したがって、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒ配列（配列番号１）の保存されていないアミノ酸を他のｈＡＴファミリーの中で保存されたアミノ酸で置き換えると、機能亢進変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼが得られてもよい。方法は、ＴｃＢｕｓｔｅｒと同様に他のｈＡＴファミリートランスポザーゼの配列を取得することと；配列を整列させ、他のｈＡＴファミリートランスポザーゼの中で異なる保存された対応物でＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸を同定することと；部位特異的変異誘発を実施して、変異（複数可）を内部に含む変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを作り出すこととを含んでもよい。
【００５２】
機能亢進変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、Ｂｕｓｔｅｒサブファミリーの他のメンバーまたはｈＡＴファミリーの他のメンバーに対する配列比較に基づいて１以上のアミノ酸置換を含むことができる。多くの場合、１以上のアミノ酸置換は、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒ配列（配列番号１）での保存されていないアミノ酸についての保存されたアミノ酸の置換であることができる。変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの非限定的な例には、表５、表５．１、またはその双方のアミノ酸置換の少なくとも１つを含むＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼが挙げられる。変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、表５、表５．１、またはその双方のアミノ酸置換の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０以上を含むことができる。
【００５３】
別の例示的な方法は、酸性アミノ酸を塩基性アミノ酸に体系的に変異させ、機能亢進変異トランスポザーゼを同定することを含むことができる。
【００５４】
場合によっては、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、及びＤ１８９Ａを含むことができる。変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼはアミノ酸置換Ｋ５７３Ｅ及びＥ５７８Ｌを含むことができる。変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼはアミノ酸置換Ｉ４５２Ｋを含むことができる。変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼはアミノ酸置換Ａ３５８Ｋを含むことができる。変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼはアミノ酸置換Ｖ２９７Ｋを含むことができる。変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼはアミノ酸置換Ｎ８５Ｓを含むことができる。変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ｎ８５Ｓ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、及びＤ１８９Ａを含むことができる。変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｆ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、及びＤ１８９Ａを含むことができる。変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、及びＤ１８９Ａを含むことができる。変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３Ｅ及びＥ５７８Ｌを含むことができる。
【表７】
2021527427.tif 000015
2021527427.tif 000016
【表８】
2021527427.tif 000017
2021527427.tif 000018
2021527427.tif 000019
【００５５】
核局在化シグナル
【００５６】
本開示の別の態様は、１以上の追加の核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列を持つ融合ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを提供する。野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ（配列番号１）は、２つの推定上の単節型ＮＬＳ配列ＲＫＫＲ及びＫＫＲＫを含有する。本開示のいくつかの実施形態では、本明細書で提供されているような融合ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換を介して作り出された追加の単節型ＮＬＳ配列を含むことができる。場合によっては、追加の単節型ＮＬＳ配列は、配列Ｋ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）を有することができ、その際、Ｘは任意のアミノ酸を表す。場合によっては、本明細書で提供されているような追加の単節型ＮＬＳ配列を含む融合ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、追加の単節型ＮＬＳ配列を有さない他の点では同一のＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比べて、高い転位効率を有することができる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されているような融合ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの追加のＮＬＳ配列を含む。場合によっては、追加のＮＬＳ配列には表６でリストにされているものが含まれる。本明細書で提供されているように、追加のＮＬＳ配列はＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのＮ末端、Ｃ末端、及び／または内部部分に融合することができる。
【００５８】
本明細書で提供されているような双節型ＮＬＳ配列を含む例示的なＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、Ｋ（Ｋ／Ｒ）ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）、Ｋ（Ｋ／Ｒ）ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）、Ｋ（Ｋ／Ｒ）ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）、Ｋ（Ｋ／Ｒ）ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）、Ｋ（Ｋ／Ｒ）ＸＸＸＸＸＸＸＸ（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）、またはＫ（Ｋ／Ｒ）ＸＸＸＸＸＸＸ（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）のようなＮＬＳ配列を有することができ、その際、Ｘは任意のアミノ酸を表す。
【表９】
2021527427.tif 000020
【００５９】
ＤＮＡ結合ドメインを持つ融合トランスポザーゼ
【００６０】
本開示の別の態様は融合トランスポザーゼを提供する。融合トランスポザーゼは、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列とＤＮＡ配列特異的結合ドメインとを含むことができる。
【００６１】
融合トランスポザーゼのＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、本明細書に記載されているような変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのいずれかのアミノ酸配列を含むことができる。融合トランスポザーゼのＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列はまた、アミノ酸配列の配列番号１を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列を含むこともできる。
【００６２】
本明細書に記載されているようなＤＮＡ配列特異的結合ドメインは、特定の配列モチーフを含有する配列領域（「標的配列」）でＤＮＡ分子に結合するように適合させるタンパク質ドメインを指すことができる。例えば、例示的なＤＮＡ配列特異的結合ドメインは配列モチーフＴＡＴＡに選択的に結合してもよい一方で、別の例示的なＤＮＡ配列特異的結合ドメインは異なる配列モチーフＡＴＧＣＮＴＡＧＡＴ（配列番号８２）に選択的に結合してもよい（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ及びＣのいずれか１つを示す）。
【００６３】
本明細書で提供されているような融合トランスポザーゼはトランスポゾンの配列特異的挿入を指示してもよい。例えば、ＤＮＡ配列特異的結合ドメインは、結合ドメインの結合特異性に基づいて融合トランスポザーゼが標的配列に結合するように誘導してもよい。特定の配列領域に結合することまたは限定されることは、融合トランスポザーゼとトランスポゾンとの間の相互作用を空間的に制限し、それによって、触媒される転位を標的配列の近傍の配列領域に制限してもよい。ＤＮＡ結合ドメインのサイズ、三次元構成、及び配列結合親和性、と同様にＤＮＡ結合ドメインとＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列との間の空間的関係、及び２つのドメイン間の接続の柔軟性に応じて、標的配列への実際の転位部位の距離は変化してもよい。融合トランスポザーゼの構成の適切な設計は転位を望ましい標的ゲノム領域に向けることができる。
【００６４】
転位についての標的ゲノム領域は適用の目的に応じて任意の特定のゲノム領域であることができる。例えば、時には、細胞の特定の重要な内在性遺伝子（複数可）の発現レベルにおける望ましくない、または有害でさえある変化を引き起こしてもよい、転位の転写開始部位を回避することが望ましい。融合トランスポザーゼは、宿主ゲノムの安全域に転位を向けることができるＤＮＡ配列特異的結合ドメインを含有してもよい。安全域の非限定的な例には、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ部位（例えば、ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２、ＥＴＣ）、ＣＣＲ５、またはＲｏｓａ２６を挙げることができる。安全域部位は一般に、その使用は、細胞のゲノムの完全性または細胞の健全性と機能にほとんどまたはまったく破壊的な効果を発揮しない、導入遺伝子挿入のための部位を指すことができる。
【００６５】
ＤＮＡ配列特異的結合ドメインは、配列特異性を有する任意のＤＮＡ結合タンパク質に由来してもよく、またはその変異型であってもよい。多くの場合、ＤＮＡ配列特異的結合ドメインは天然に存在する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質と、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでもよい。ＤＮＡ配列特異的結合ドメインは、天然に存在する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含んでもよい。天然に存在する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質の非限定的な例には、種々の起源由来の転写因子、特異的配列ヌクレアーゼ、及びウイルス複製タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。天然に存在する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質はまた種々の起源由来の特異的結合能力を有する他の任意のタンパク質であることもできる。ＤＮＡ結合タンパク質の選択及び予測は、ＤＰ−Ｂｉｎｄ（ｈｔｔｐ：／／ｌｃｇ．ｒｉｔ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／ｄｐ−ｂｉｎｄ／）またはＤＮＡＢＩＮＤ（ｈｔｔｐ：／／ｄｎａｂｉｎｄ．ｓｚｉａｌａｂ．ｏｒｇ／）のようなオンラインで利用可能な計算予測データベースの使用を含むが，これらに限定されない種々のアプローチによって実施することができる。
【００６６】
「転写因子」という用語は、特定のＤＮＡ配列に結合することによって、ＤＮＡからメッセンジャーＤＮＡへの遺伝情報の転写速度を制御するタンパク質を指すことができる。本明細書に記載されている融合トランスポザーゼで使用することができる転写因子は、それが標的ＤＮＡ分子に結合するときに配列特異性を付与する限り、原核生物転写因子または真核生物転写因子に基づくことができる。本開示を適用するための適切な転写因子を選択のためにＤＢＤ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ．ｏｒｇ）のような転写因子予測データベースを用いてもよい。
【００６７】
本明細書で使用されているようなＤＮＡ配列特異的結合ドメインは、天然に存在する転写因子由来の１以上のＤＮＡ結合ドメインを含むことができる。転写因子のＤＮＡ結合ドメインの非限定的な例には、塩基性ヘリックスループヘリックス、塩基性ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）、双節型応答調節因子のＣ末端エフェクタードメイン、ＡＰ２／ＥＲＦ／ＧＣＣボックス、ヘリックスターンヘリックス、ホメオドメインタンパク質、ラムダリプレッサー様、ｓｒｆ様（血清応答因子）、対合ボックス、翼のあるヘリックス、ジンクフィンガー、マルチドメインＣｙｓ２Ｈｉｓ２（Ｃ２Ｈ２）ジンクフィンガー、Ｚｎ２／Ｃｙｓ６、またはＺｎ２／Ｃｙｓ８核受容体ジンクフィンガーのようなファミリーに属するＤＮＡ結合ドメインが挙げられる。
【００６８】
ＤＮＡ配列特異的結合ドメインは、特定のＤＮＡ配列に結合する人工的に操作されたアミノ酸配列であることができる。そのような人工的に設計されたアミノ酸配列の非限定的な例には、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメイン、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）Ｒｅｐタンパク質、及び本明細書に記載されているような他の好適なＤＮＡ結合タンパク質のようなフレームワークに基づいて作り出される配列が挙げられる。
【００６９】
天然のＴＡＬＥは、植物種の感染を助けるＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ細菌によって分泌されるタンパク質である。天然のＴＡＬＥは、特定のＤＮＡ配列に結合し、宿主遺伝子の発現を活性化することによって感染を助けることができる。一般に、ＴＡＬＥタンパク質は中央反復ドメインから成り、それはＤＮＡ標的指向化の特異性を決定するが、新たに迅速に合成され得る。ＴＡＬＥは残基の反復配列を含有するモジュールＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を有する。一部のＴＡＬＥでは、各反復領域は３４のアミノ酸を含有する。本明細書で使用されるとき「ＴＡＬＥドメイン」という用語はＴＡＬＥのモジュールＤＢＤを指すことができる。各反復領域の１２位と１３位にある残基のペアは、ヌクレオチドの特異性を決定することができ、反復可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれる。半反復と呼ばれる最後の反復領域は通常、２０アミノ酸に切り詰められる。これらの反復領域を組み合わせることで、配列特異的な合成ＴＡＬＥを合成することができる。Ｃ末端は通常、ＴＡＬＥを核に向ける核局在化シグナル（ＮＬＳ）と同様に、酸性活性化ドメイン（ＡＤ）のような転写を調節する機能ドメインを含有する。内在性ＮＬＳは、生物固有の局在化シグナルに置き換えることができる。例えば、サルウイルス４０ラージＴ抗原に由来するＮＬＳは哺乳動物細胞で使用することができる。ＲＶＤのＨＤ、ＮＧ、ＮＩ、及びＮＮは、それぞれＣ、Ｔ、Ａ、及びＧ／Ａを標的とする。ヌクレオチドの特定の状況下でのＲＶＤとそれらの結合優先度のリストを表７で見いだすことができる。追加のＴＡＬＥのＲＶＤはカスタム縮重ＴＡＬＥ−ＤＮＡ相互作用にも使用することができる。例えば、ＮＡはＤＮＡの４つの塩基すべてに対して高い親和性を有する。さらに、＊が１３番目の残基が欠失したＲＶＤであるＮ＊は、メチル化シトシンを含むすべてのＤＮＡ文字に対応することができる。また、Ｓ＊は任意のＤＮＡヌクレオチドに結合する能力を有してもよい。
【００７０】
例えば、ＴＡＬＥ−ＮＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｔａｌｅ−ｎｔ．ｃａｃ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／）、Ｍｏｊｏハンド（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｌｅｎｄｅｓｉｇｎ．ｏｒｇ／）のような特定のＤＮＡ配列を標的とするＴＡＬＥを設計するために多数のオンラインツールが利用可能である。市販のキットは、タンパク質のＮ末端とＣ末端の間にＴＡＬＥ反復領域のカスタムアセンブリを作り出すのにも役立ってもよい。これらの方法を用いてカスタムＤＢＤを構築し、次いでそれを機能ドメイン、例えば、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列を含有する発現ベクターにクローニングすることができる。
【表１０】
2021527427.tif 000021
2021527427.tif 000022
【００７１】
ＴＡＬＥは、例えば、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ反応における消化工程及びライゲーション工程をＩＩ型制限酵素と組み合わせることによって実験室で新たに合成することができる。あるいは、ＴＡＬＥは、ライゲーションに依存しないクローニング（ＬＩＣ）、高速ライゲーションに基づく自動化可能な固相ハイスループット（ＦＬＡＳＨ）アセンブリ、反復キャップアセンブリ（ＩＣＡ）を含むが、これらに限定されない、多数のさまざまなアプローチで構築することができる。
【００７２】
ジンクフィンガー（ＺＦ）は、約３ヌクレオチドの限られた組み合わせに結合することができる約３０アミノ酸である。Ｃ２Ｈ２のＺＦドメインは、最も一般的な種類のＺＦであってもよく、真核細胞で最も豊富に発現されるタンパク質の１つであると思われる。ＺＦはその構造にて亜鉛分子と協調する小型の、機能的で、独立して折り畳まれるドメインである。各ＺＦのアミノ酸は特定のヌクレオチドに対して親和性を有することができ、各フィンガーにＤＮＡの３〜４ヌクレオチドを選択的に認識させる。複数のＺＦは縦列アレイに配置され、ＤＮＡ上のヌクレオチドのセットを認識することができる。異なるジンクフィンガーの組み合わせを使用することによって、ゲノム内の独特のＤＮＡ配列を標的とすることができる。種々の長さのさまざまなＺＦＰを生成することができ、それは、考えられる６４のトリプレット亜部位からほぼどんな所望のＤＮＡ配列の認識も可能にする。
【００７３】
本開示に関連して使用されるジンクフィンガーは、Ｂａｒｂａｓ及び共同研究者によって開発されたモジュールアセンブリフィンガードメインのセット、及びＴｏｏｌＧｅｎによるモジュールアセンブリフィンガードメインの別のセットのような確立されたモジュールアセンブリフィンガーを用いて作り出すことができる。ドメインの双方のセットは、３つのｂｐのＧＮＮすべて、ほとんどのＡＮＮ、多くのＣＮＮ、及びいくつかのＴＮＮのトリプレット（Ｎは４つのヌクレオチドのいずれかであることができる）を網羅する。双方は、必要に応じて異なるＺＦモジュールを検索する及びコードするのを可能にする異なるフィンガーセットを有する。コンビナトリアル選択に基づいたオリゴマー化プールの操作（ＯＰＥＮ）戦略を採用して、タンパク質におけるフィンガーの位置と隣接するフィンガーの配列を含むモジュールアセンブリの背景依存性の影響を出来るだけ抑えることもできる。ＯＰＥＮ  ＺＦアレイはジンクフィンガー共同体データベースから公的に利用可能である。
【００７４】
ＡＡＶ  ＲｅｐのＤＮＡ結合ドメインは、本開示の主題に関連して使用することができる別のＤＮＡ配列特異的結合ドメインである。ウイルスのシス作用性逆向き末端反復配列（ＩＴＲ）、及びトランス作用性ウイルスＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ）は、ヘルパーウイルスの非存在下で宿主ゲノムのＡＡＶＳ１部位へのＡＡＶの優先的組込みに介在する因子であると考えられている。ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質はＡＡＶＳ１部位における特定のＤＮＡ配列に結合することができる。したがって、部位特異的ＤＮＡ結合ドメインは本明細書に記載されているようなＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼドメインと一緒に融合させることができる。
【００７５】
本明細書で提供されているような融合トランスポザーゼはＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列及びタグ配列を含むことができる。本明細書で提供されているようなタグ配列は、抗体によって認識され得るレポータータンパク質及び親和性タグのような、しかし、これらに限定されない融合タンパク質の検出タグとして使用され得る任意のタンパク質配列を指すことができる。レポータータンパク質には、蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＹＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。親和性タグの非限定的な例には、ポリヒスチジン（Ｈｉｓタグ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、インテイン−キチン結合ドメイン（インテイン−ＣＢＤ）、ストレプトアビジン／ビオチン系のタグ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｃ−ｍｙｃ、Ｔ７、Ｇｌｕ−Ｇｌｕのようなエピトープタグ、等が挙げられる。
【００７６】
本明細書で提供されているような融合トランスポザーゼは、どんな中間配列も含まずに（例えば、「背中合わせで」）一緒に融合されるＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列と、ＤＮＡ配列特異的結合ドメインまたはタグ配列とを含むことができる。場合によっては、本明細書で提供されているような融合トランスポザーゼは、リンカー配列によって連結されるＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列と、ＤＮＡ配列特異的結合ドメインまたはタグ配列とを含むことができる。図８は、リンカーによって連結されたＤＮＡ配列特異的結合ドメインとＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列とを含む例示的な融合トランスポザーゼの概略図である。例示的な融合トランスポザーゼでは、リンカーは主に、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間のスペーサーとして役立ってもよい。リンカーは、単一のポリペプチドにて複数のドメインを分離するための短いアミノ酸配列であることができる。リンカー配列は、天然のマルチドメインタンパク質に存在するリンカーを含むことができる。場合によっては、リンカー配列は人工的に作り出されたリンカーを含むことができる。リンカー配列の選択は融合トランスポザーゼの適用に基づいてもよい。リンカー配列は、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のアミノ酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも５０のアミノ酸を含んでもよい。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、多くても４、多くても５、多くても７、多くても８、多くても９、多くても１０、多くても１１、多くても１２、多くても１５を含むことができる。多くても２０、多くても３０、多くても４０、多くても５０、または多くても１００のアミノ酸を含むことができる。特定の場合では、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎ＝２〜８）（配列番号８３）、（Ｇｌｙ）８（配列番号８４）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号８５）、（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号８６）のようなＧｌｙとＳｅｒ残基の区間（「ＧＳ」リンカー）のような、しかし、これらに限定されない柔軟なリンカー配列を使用することが望ましくてもよい。（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎ＝２〜７）（配列番号８７）、Ｘが任意のアミノ酸を指定する（ＸＰ）ｎのようなプロリッチ配列のような、しかし、これらに限定されない剛直なリンカー配列を使用することが望ましくてもよい。
【００７７】
本明細書で提供されている例示的な融合トランスポザーゼでは、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列をＤＮＡ配列特異的結合ドメインまたはタグ配列のＮ末端に融合させることができる。あるいは、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列をＤＮＡ配列特異的結合ドメインまたはタグ配列のＣ末端に融合させることができる。いくつかの実施形態では、融合トランスポザーゼの適用に応じて、第３のドメイン配列または複数の他の配列が、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼとＤＮＡ配列特異的結合ドメインまたはタグ配列との間に存在することができる。
【００７８】
ＴｃＢｕｓｔｅｒのヌクレオチド配列
【００７９】
本開示の別の態様は、本明細書で提供されているようなＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されているようなポリヌクレオチドは、その細胞にポリヌクレオチドが送達される生物の翻訳システムによって有利である１以上のコドンを含む。例えば、本明細書で提供されているようなポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドがゲノム編集の目的でヒト細胞に送達される場合、ヒト（例えば、Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓ）翻訳システムによって有利である１以上のコドンを含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されているようなＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドにおける１以上のコドンは、その細胞にポリヌクレオチドが送達される生物にてさらに高い頻度で見いだされるコドンであることができる。特定の理論に束縛されないで、場合によっては、本明細書で提供されているようなＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、それをコードするポリヌクレオチドの形態で標的細胞に送達され、標的細胞における高頻度のコドンは、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼをコードするＤＮＡの天然コドンと比べて、細胞の翻訳システムがさらに効率的に利用することができ、それによって標的細胞におけるＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの高い発現をもたらす。
【００８０】
本明細書で提供されているようなポリヌクレオチドの特定の実施形態は、その細胞にポリヌクレオチドが送達される生物で有利であるコドンによって置き換えられる少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０を含み得る。少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、または少なくとも２００のコドンを含むことができる。ポリヌクレオチドの特定の実施形態は、Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓにおいて高頻度で見いだされる１以上のコドン、例えば、表８に列挙された高い頻度／１０００（または少数部）のものを含むことができる。場合によっては、Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓにおけるその頻度／１０００が少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、または少なくとも３０であれば、表８のコドンが選択される。場合によっては、Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓにおけるその少数部が少なくとも０．１、少なくとも０．１２、少なくとも０．１４、少なくとも０．１６、少なくとも０．１８、少なくとも０．２、少なくとも０．２２、少なくとも０．２４である場合に選択されます。少なくとも０．２６、少なくとも０．２８、少なくとも０．３、少なくとも０．３５、少なくとも０．４、少なくとも０．４５、少なくとも０．５、または少なくとも０．５５であれば、表８のコドンが選択される。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されているポリヌクレオチドは標的種の  細胞、例えば、ヒト細胞における発現のために最適化されたコドンである。ポリヌクレオチドは、例えば、標的種にて高頻度で存在するポリヌクレオチドにおけるコドンの少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％（例えば、標的種における少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、または少なくとも３０の頻度／１０００、または例えば、標的種における少なくとも０．１、少なくとも０．１２、少なくとも０．１４、少なくとも０．１６、少なくとも０．１８、少なくとも０．２、少なくとも０．２２、少なくとも０．２４、少なくとも０．２６、少なくとも０．２８、少なくとも０．３、少なくとも０．３５、少なくとも０．４、少なくとも０．４５、少なくとも０．５、または少なくとも０．５５の少数部）標的種の細胞における発現のためにコドンを最適化することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、標的種にて高頻度で存在するポリヌクレオチドにおけるコドンの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％（例えば、標的種における少なくとも２０、少なくとも２５、または少なくとも３０の頻度／１０００、または標的種における少なくとも０．２、少なくとも０．２２、少なくとも、０．２４、少なくとも０．２６、少なくとも０．２８、少なくとも０．３、少なくとも０．３５、少なくとも０．４、少なくとも０．４５、少なくとも０．５、または少なくとも０．５５の少数部）標的種の細胞における発現のためにコドンが最適化される。
【００８２】
配列番号２０４はヒト細胞での発現のためにコドンが最適化され、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼをコードする例示的なＤＮＡ配列である。配列番号２０７はヒト細胞での発現のためにコドンが最適化され、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼをコードする例示的なｍＲＮＡ配列である。本明細書で提供されているポリヌクレオチドは完全長の配列番号２０４または２０７と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一または相補性であるヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは完全長の配列番号２０４または２０７と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一または相補性であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは完全長の配列番号２０４または２０７と少なくとも約９５％同一である、または相補性であるヌクレオチド配列を有する。
【表１１】
2021527427.tif 000023
2021527427.tif 000024
【００８３】
ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾン
【００８４】
本開示の別の態様は、２つの逆向き反復配列の間に配置されたカセットカーゴを含むＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンを提供する。ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンは、本明細書に記載されているようなＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼによって認識されることができ、例えば、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼはＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンを認識し、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンのＤＮＡ配列への転位を触媒することができる。
【００８５】
本明細書で相互交換可能に使用されるとき「逆向き反復配列」、「末端逆向き反復配列」、「逆向き末端反復配列」という用語は、天然トランスポゾンにおけるトランスポザーゼ遺伝子または人工的に操作されたトランスポゾンにおけるカセットカーゴに隣接する短い配列反復を指すことができる。対応するトランスポザーゼの存在下でのトランスポゾンの動員には、一般に２つの逆向き反復配列が必要である。本明細書に記載されているような逆向き反復配列は、１以上の直接反復（ＤＲ）配列を含有してもよい。これらの配列は通常、因子の末端逆向き反復配列（ＴＩＲ）に埋め込まれている。本明細書で使用されるとき「カーゴカセット」という用語は、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ遺伝子を含有する逆向き反復配列間のネイティブのヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列を指すことができる。カーゴカセットは人工的に操作することができる。
【００８６】
本明細書に記載されているトランスポゾンは、ＩＲ／ＤＲ配列が隣接するカーゴカセットを含有してもよい。いくつかの実施形態では、反復配列の少なくとも１つは少なくとも１つの直接反復配列を含有する。図１及び図２に示すように、トランスポゾンは、ＩＲＤＲ−Ｌ−Ｓｅｑ１（配列番号３）及びＩＲＤＲ−Ｒ−Ｓｅｑ１（配列番号４）が隣接するカーゴカセットを含有してもよい。多くの場合、左の逆向き反復配列は、ＩＲＤＲ−Ｌ−Ｓｅｑ１（配列番号３）と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むことができる。場合によっては、右の逆向き反復配列は、ＩＲＤＲ−Ｒ−Ｓｅｑ１（配列番号４）と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むことができる。他の場合では、右の逆向き反復配列は、ＩＲＤＲ−Ｌ−Ｓｅｑ１（配列番号３）と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むことができる。時には、左の逆向き反復配列はＩＲＤＲ−Ｒ−Ｓｅｑ１（配列番号４）と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むことができる。本明細書で使用されるとき「左」及び「右」という用語は、それぞれ、二本鎖トランスポゾンのセンス鎖上のカーゴカセットの５’側及び３’側を指すことができる。トランスポゾンはＩＲＤＲ−Ｌ−Ｓｅｑ２（配列番号５）及びＩＲＤＲ−Ｒ−Ｓｅｑ２（配列番号６）が隣接するカーゴカセットを含有してもよい可能性もある。多くの場合、左の逆向き反復配列はＩＲＤＲ−Ｌ−Ｓｅｑ２（配列番号５）と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むことができる。場合によっては、右の逆向き反復配列はＩＲＤＲ−Ｒ−Ｓｅｑ２（配列番号６）と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むことができる。他の場合において、右の逆向き反復配列はＩＲＤＲ−Ｌ−Ｓｅｑ２（配列番号５）と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むことができる。時には、左の逆向き反復はＩＲＤＲ−Ｒ−Ｓｅｑ２（配列番号６）と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むことができる。あるいは、トランスポゾンはＩＲＤＲ−Ｌ−Ｓｅｑ３（配列番号２０５）及びＩＲＤＲ−Ｒ−Ｓｅｑ３（配列番号２０６）が隣接するカーゴカセットを含有することができる。多くの場合、左の逆向き反復配列はＩＲＤＲ−Ｌ−Ｓｅｑ３（配列番号２０５）と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むことができる。場合によっては、右の逆向き反復配列はＩＲＤＲ−Ｒ−Ｓｅｑ３（配列番号２０６）と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むことができる。他の場合において、右の逆向き反復配列はＩＲＤＲ−Ｌ−Ｓｅｑ３（配列番号２０５）と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むことができる。時には、左の逆向き反復はＩＲＤＲ−Ｒ−Ｓｅｑ３（配列番号２０６）と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むことができる。トランスポゾンは、図２に与えられたものとは異なるヌクレオチド配列、または当業者に知られているさまざまな配列の組み合わせを有する２つの逆向き反復配列が隣接するカーゴカセットを含有してもよい。本明細書に記載されているトランスポゾンの２つの逆向き反復配列のうちの少なくとも一方は配列番号３〜６のいずれか１つと少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含有してもよい。本明細書に記載されているトランスポゾンの逆向き反復配列の少なくとも一方は、配列番号３または４と少なくとも８０％同一である配列を含有してもよい。本明細書に記載されているトランスポゾンの逆向き反復配列の少なくとも一方は、配列番号５または６と少なくとも８０％同一である配列を含有してもよい。逆向き反復配列の選択は、予想される転位効率、操作される細胞の種類、使用するトランスポザーゼ、及び他の多くの因子に応じて変化してもよい。
【００８７】
多くの実施態様では、ゲノム空間を保存する最小サイズのトランスポゾンベクターの逆向き末端反復配列が使用されてもよい。ｈＡＴファミリートランスポゾンのＩＴＲは、右側と左側のＩＴＲの差異によって大きく異なる。多くの場合、わずか１００〜２００ヌクレオチドから成る小さなＩＴＲは、ｈＡＴトランスポゾンベクターの長いネイティブＩＴＲと同じくらい活性がある。これらの配列は、ｈＡＴファミリーの転位に介在しながら一貫して減らされてもよい。これらの短いＩＴＲは、ｈＡＴトランスポゾンベクター内のゲノム空間を保存することができる。
【００８８】
本明細書で提供されているトランスポゾンの逆向き反復配列は、約５０〜２０００ヌクレオチド、約５０〜１０００ヌクレオチド、約５０〜８００ヌクレオチド、約５０〜６００ヌクレオチド、約５０〜５００ヌクレオチド、約５０〜４００ヌクレオチド、約５０〜３５０ヌクレオチド、約５０〜３００ヌクレオチド、約５０〜２５０ヌクレオチド、約５０〜２００ヌクレオチド、約５０〜１８０ヌクレオチド、約５０〜１６０ヌクレオチド、約５０〜１４０ヌクレオチド、約５０〜１２０ヌクレオチド、約５０〜１１０ヌクレオチド、約５０〜１００ヌクレオチド、約５０〜９０ヌクレオチド、約５０〜８０ヌクレオチド、約５０〜７０ヌクレオチド、約５０〜６０ヌクレオチド、約７５〜７５０ヌクレオチド、約７５〜４５０ヌクレオチド、約７５〜３２５ヌクレオチド、約７５〜２５０ヌクレオチド、約７５〜１５０ヌクレオチド、約７５〜９５ヌクレオチド、約１００〜５００ヌクレオチド、約１００〜４００ヌクレオチド、約１００〜３５０ヌクレオチド、約１００〜３００ヌクレオチド、約１００〜２５０ヌクレオチド、約１００〜２２０ヌクレオチド、約１００〜２００ヌクレオチド、またはそれらに由来する任意の範囲であることができる。
【００８９】
場合によっては、カーゴカセットは、プロモーター、導入遺伝子、またはそれらの組み合わせを含むことができる。プロモーターと導入遺伝子の双方を含むカーゴカセットでは、導入遺伝子の発現はプロモーターによって指示され得る。プロモーターは、当業者が利用できる任意の種類のプロモーターであることができる。ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンで使用することができるプロモーターの非限定的な例にはＥＦＳ、ＣＭＶ、ＭＮＤ、ＥＦ１α、ＣＡＧＧｓ、ＰＧＫ、ＵＢＣ、Ｕ６、Ｈ１、及びクメートが挙げられる。ＴｃＢｕｓｔｅｒ転位で使用されるプロモーターの選択は、プロモーターの発現効率、遺伝子操作される細胞の種類、及び所望の導入遺伝子発現レベルのような、しかし、これらに限定されない多くの因子に依存する。
【００９０】
ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンにおける導入遺伝子は、対象とする任意の遺伝子であることができ、当業者に利用可能である。導入遺伝子は、自然界の遺伝子、もしくはその変異型に由来することができ、または人工的に設計することができる。導入遺伝子は、操作される細胞と同じ種起源のものであることができ、または異なる種のものであることができる。導入遺伝子は、原核生物遺伝子または真核生物遺伝子であることができる。時には、導入遺伝子は非ヒト動物、植物、またはヒトに由来する遺伝子であることができる。導入遺伝子はイントロンを含むことができる。あるいは、導入遺伝子はイントロンが除去されていてもよく、または存在しなくてもよい。
【００９１】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子はタンパク質をコードすることができる。例示的なタンパク質には、細胞受容体、免疫チェックポイントタンパク質、サイトカイン、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。時には、本明細書に記載されているような細胞受容体には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００９２】
本明細書に記載されているようなカーゴカセットは、いかなる種類のタンパク質産物をコードする導入遺伝子を含有しなくてもよいが、それは他の目的に有用である。例えば、例えば、宿主ゲノムの遺伝子のエキソンに挿入される場合、カーゴカセットは挿入部位にフレームシフトを作り出すために使用されてもよい。これは遺伝子産物の切り詰めまたはヌル変異につながってもよい。時には、内在性ゲノム配列を外来性ヌクレオチド配列で置き換え、それによって宿主ゲノムを操作するのにカーゴカセットが使用されてもよい。
【００９３】
本明細書に記載されているトランスポゾンは、順方向または逆向きのいずれかでカーゴカセットを有してもよい。多くの場合、カーゴカセットはその独自の方向性を有する。例えば、導入遺伝子を含有するカーゴカセットは５’から３’のコード配列を有する。プロモーターと遺伝子挿入とを含有するカーゴカセットは、遺伝子挿入の５’部位にプロモーターを有する。本明細書で使用されるとき「順方向」という用語は、カーゴカセットが二本鎖トランスポゾンのセンス鎖上でその方向性を維持する状況を指すことができる。本明細書で使用されるとき「逆方向」という用語は、カーゴカセットが二本鎖トランスポゾンのアンチセンス鎖上でその方向性を維持する状況を指すことができる。
【００９４】
ゲノム編集のためのシステム及び使用方法
【００９５】
本開示の別の態様はゲノム編集のためのシステムを提供する。システムはＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼとＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンとを含むことができる。宿主細胞の内在性ゲノム領域を破壊または修飾し、外来性遺伝子を宿主ゲノムに挿入し、内在性ヌクレオチド配列を外来性ヌクレオチド配列で置き換える、またはそれらの任意の組み合わせがある、宿主細胞のゲノム編集にシステムを使用することができる。
【００９６】
ゲノム編集のためのシステムは、本明細書に記載されているような変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼと、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンとを含むことができる。変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼは精製タンパク質として提供することができる。タンパク質の生産及び精製の技術は当業者に知られている。精製されたタンパク質は、トランスポゾンとは異なる容器に保管することができ、または同じ容器に保管することができる。
【００９７】
多くの場合、ゲノム編集のためのシステムは、本明細書に記載されているような変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンとを含むことができる。時には、システムのポリヌクレオチドは、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡを含むことができる。代わりにまたはさらに、システムのポリヌクレオチドは、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むことができる。ｍＲＮＡは、生体内転写及びＲＮＡ精製、試験管内転写、及びデノボ合成のような、しかし、これらに限定されない、当業者に周知の多数のアプローチによって作り出すことができる。多くの場合、ｍＲＮＡは化学的に修飾することができる。化学的に修飾されたｍＲＮＡは、修飾されていないｍＲＮＡや天然のｍＲＮＡよりも分解に耐性であってもよい、またはさらに迅速に分解してもよい。多くの場合、ｍＲＮＡの化学修飾はｍＲＮＡがさらに効率的に翻訳されようにしてもよい。ｍＲＮＡの化学修飾は、当業者に利用可能な周知の技術によって、または供給業者によって実施することができる。
【００９８】
多くの応用については、安全性はｈＡＴトランスポザーゼ発現の持続時間が安全なトランスポゾン送達に介在するのに十分長いにすぎないことを決定づける。さらに、トランスポゾンベクターのレベルの高さと一致するｈＡＴトランスポザーゼ発現のパルスは最大の遺伝子送達を達成することができる。実施態様は、ＤＮＡプラスミドテンプレートからのＲＮＡ分子の試験管内転写に利用可能な技術を用いて行われる。ＲＮＡ分子は、ＤＮＡコピーからの試験管内（例えば、無細胞）転写のための種々の方法を用いて合成することができる。これを行う方法は説明されており、市販されている。例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを通じて入手可能なｍＭｅｓｓａｇｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ試験管内転写キット。
【００９９】
サービスベースの料金で試験管内転写を実施することができる企業も数多くある。我々はまた、ｈＡＴ発現用に化学的に修飾されたＲＮＡが遺伝子導入に特に都合がいいことも見いだしている。これらの化学的に修飾されたＲＮＡは、細胞性免疫反応を誘導せず、細胞性免疫反応も回避する独自の方法を用いて生成されたＲＮＡである。これらのＲＮＡ調製物は、ＲＮＡ二量体（Ｃｌｅａｎ−Ｃａｐ）を取り除き、細胞反応性（シュードウリシンの取り込み）は、我々に毒性を与えることなく、ヒトＴ細胞でさらに良好な一過性遺伝子発現を生じる（データは示さず）。ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ形質移入について説明されている多くの方法のいずれかを用いて細胞に導入でき、それはふつう、ほとんどの細胞に対して無毒である。これを行う方法は説明されており、市販されている。例えば、Ａｍａｘａヌクレオフェクター、Ｎｅｏｎエレクトロポレーター、Ｍａｘｃｙｔｅプラットフォームである。
【０１００】
本明細書に記載されているようなトランスポゾンは発現ベクターに存在してもよい。多くの場合、発現ベクターはＤＮＡプラスミドであることができる。時には、発現ベクターはミニサークルベクターであることができる。本明細書で使用されるとき「ミニサークルベクター」という用語は、すべてではないにしてもほとんどの原核生物ベクター部分（例えば、原核生物起源の制御配列または非機能的配列）を含まない小さな環状プラスミド誘導体を指すことができる。状況下では、形質移入またはエレクトロポレーションによって作り出された細胞への毒性は、本明細書に記載されているような「ミニサークル」を使用することによって軽減することができる。
【０１０１】
ミニサークルベクターは、利用可能な周知の分子クローニング技術によって調製することができる。先ず、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌における「親プラスミド」（トランスポゾン構築物のような挿入を伴う細菌プラスミド）を生成することができ、その後、部位特異的リコンビナーゼを誘導することができる。次に、これらの工程の後に、挿入物の両端にある２つのリコンビナーゼ標的配列を介して原核生物ベクターの部分を切除し、得られたミニサークルベクターを回収することができる。精製されたミニサークルは、形質移入またはリポフェクションによってレシピエント細胞に移され、例えばジェット注射によって分化した組織に移される。ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンを含有するミニサークルは約１．５ｋｂ、約２ｋｂ、約２．２ｋｂ、約２．４ｋｂ、約２．６ｋｂ、約２．８ｋｂ、約３ｋｂ、約３．２ｋｂ、約３．４ｋｂ、約３．６ｋｂ、約３．８ｋｂ、約４ｋｂ、約４．２ｋｂ、約４．４ｋｂ、約４．６ｋｂ、約４．８ｋｂ、約５ｋｂ、約５．２ｋｂ、約５．４ｋｂ、約５．６ｋｂ、約５．８ｋｂ、約６ｋｂ、約６．５ｋｂ、約７ｋｂ、約８ｋｂ、約９ｋｂ、約１０ｋｂ、約１２ｋｂ、約２５ｋｂ、約５０ｋｂ、またはこれらの数値のいずれか２つの間の値のサイズを有することができる。時には、本明細書で提供されているようなＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンを含有するミニサークルは大きくても２．１ｋｂ、大きくても３．１ｋｂ、大きくても４．１ｋｂ、大きくても４．５ｋｂ、大きくても５．１ｋｂ、大きくても５．５ｋｂ、大きくても６．５ｋｂ、大きくても７．５ｋｂ、大きくても８．５ｋｂ、大きくても９．５ｋｂ、大きくても１１ｋｂ、大きくても１３ｋｂ、大きくても１５ｋｂ、大きくても３０ｋｂ、または大きくても６０ｋｂのサイズを有することができる。
【０１０２】
特定の実施形態では、本明細書に記載されているようなシステムは、本明細書に記載されているような変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと、同じ発現ベクター、例えばプラスミドに存在するトランスポゾンとを含有してもよい。
【０１０３】
本開示のさらに別の態様は遺伝子操作の方法を提供する。遺伝子操作の方法は、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼとＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンとを細胞に導入することを含むことができる。遺伝子操作の方法は無細胞環境でも実施することができる。無細胞環境における遺伝子操作の方法は、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと、トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンと、標的核酸とをウェルまたは試験管のような容器にて合わせることを含むことができる。
【０１０４】
本明細書に記載されている方法は、本明細書で提供されている変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンとを細胞に導入することを含むことができる。ゲノム編集の方法は、本明細書で提供されている融合トランスポザーゼと、融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンとを細胞に導入することを含むことができる。
【０１０５】
変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼは、タンパク質として、または変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼもしくは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドを介して細胞に導入することができる。上記で議論されたように、ポリヌクレオチドは変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡを含むことができる。
【０１０６】
多くの場合、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼはタンパク質として宿主細胞に形質移入することができ、タンパク質の濃度は少なくとも０．０５ｎＭ、少なくとも０．１ｎＭ、少なくとも０．２ｎＭ、少なくとも０．５ｎＭ、少なくとも１ｎＭ、少なくとも２ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも２μＭ、少なくとも５μＭ、少なくとも７．５μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１５μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも２５μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも２００μＭ、少なくとも５００μＭ、または少なくとも１μＭであることができる。時には、タンパク質の濃度はおよそ１μＭ〜およそ５０μＭ、およそ２μＭ〜およそ２５μＭ、およそ５μＭ〜およそ１２．５μＭ、またはおよそ７．５μＭ〜およそ１０μＭであることができる。
【０１０７】
多くの場合、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポサーゼまたは融合トランスポサーゼはポリヌクレオチドを介して宿主細胞に形質移入することができ、ポリヌクレオチドの濃度は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１２０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、１８０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２２０ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、２８０ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、７５０ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、３５０μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、４５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、５５０μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、６５０μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、７５０μｇ／ｍｌ、または８００μｇ／ｍｌであることができる。時には、ポリヌクレオチドの濃度は約５〜２５μｇ／ｍｌ、２５〜５０μｇ／ｍｌ、５０〜１００μｇ／ｍｌ、１００〜１５０μｇ／ｍｌ、１５０〜２００μｇ／ｍｌ、２００〜２５０μｇ／ｍｌ、２５０〜５００μｇ／ｍｌ、５〜８００μｇ／ｍｌ、２００〜８００μｇ／ｍｌ、２５０〜８００μｇ／ｍｌ、４００〜８００μｇ／ｍｌ、５００〜８００μｇ／ｍｌの間、またはそれらから導出可能な任意の範囲であることができる。多くの場合、トランスポゾンはトランスポナーゼとは別の発現ベクターに存在し、トランスポゾンの濃度は少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１２０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、１８０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２２０ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、２８０ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、７５０ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、３５０μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、４５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、５５０μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、６５０μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、７５０μｇ／ｍｌ、または８００μｇ／ｍｌであることができる。時には、トランスポゾンの濃度は、約５〜２５μｇ／ｍｌ、２５〜５０μｇ／ｍｌ、５０〜１００μｇ／ｍｌ、１００〜１５０μｇ／ｍｌ、１５０〜２００μｇ／ｍｌ、２００〜２５０μｇ／ｍｌ、２５０〜５００μｇ／ｍｌ、５〜８００μｇ／ｍｌ、２００〜８００μｇ／ｍｌ、２５０〜８００μｇ／ｍｌ、４００〜８００μｇ／ｍｌ、５００〜８００μｇ／ｍｌの間、またはそれらから導出可能な任意の範囲であることができる。トランスポゾンのトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドに対する比率は大きくても１００００、大きくても５０００、大きくても１０００、大きくても５００、大きくても２００、大きくても１００、大きくても５０、大きくても２０、大きくても１０、大きくても５、大きくても２、大きくても１、大きくても０．１、大きくても０．０５、大きくても０．０１、大きくても０．００１、大きくて���０．０００１、またはそれらの任意の２つの間の任意の数であることが可能である。
【０１０８】
他のいくつかの場合では、トランスポゾン及びトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドは同じ発現ベクターに存在し、トランスポゾン及びトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドの双方を含有する発現ベクターの濃度は少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１２０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、１８０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２２０ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、２８０ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、７５０ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、３５０μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、４５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、５５０μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、６５０μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、７５０μｇ／ｍｌ、または８００μｇ／ｍｌであることができる。時には、トランスポゾン及びトランスポナーゼをコードするポリヌクレオチドの双方を含有する発現ベクターの濃度は約５〜２５μｇ／ｍｌ、２５〜５０μｇ／ｍｌ、５０〜１００μｇ／ｍｌ、１００〜１５０μｇ／ｍｌ、１５０〜２００μｇ／ｍｌ、２００〜２５０μｇ／ｍｌ、２５０〜５００μｇ／ｍｌ、５〜８００μｇ／ｍｌ、２００〜８００μｇ／ｍｌ、２５０〜８００μｇ／ｍｌ、４００〜８００μｇ／ｍｌ、５００〜８００μｇ／ｍｌの間、またはその中で導出可能な任意の範囲であることができる。
【０１０９】
場合によっては、エレクトロポレーションによって細胞に導入されてもよいポリ核酸の量を変化させて、形質移入効率及び／または細胞生存率を最適化してもよい。場合によっては、約１００ｐｇ未満の核酸が各細胞試料（例えば、エレクトロポレーションが行われる１以上の細胞）に加えられてもよい。場合によっては、少なくとも約１００ｐｇ、少なくとも約２００ｐｇ、少なくとも約３００ｐｇ、少なくとも約４００ｐｇ、少なくとも約５００ｐｇ、少なくとも約６００ｐｇ、少なくとも約７００ｐｇ、少なくとも約８００ｐｇ、少なくとも約９００ｐｇ、少なくとも約１マイクログラム、少なくとも約１．５μｇ、少なくとも約２μｇ、少なくとも約２．５μｇ、少なくとも約３μｇ、少なくとも約３．５μｇ、少なくとも約４μｇ、少なくとも約４．５μｇ、少なくとも約５μｇ、少なくとも約５．５μｇ、少なくとも約６μｇ、少なくとも約６．５μｇ、少なくとも約７μｇ、少なくとも約７．５μｇ、少なくとも約８μｇ、少なくとも約８．５μｇ、少なくとも約９μｇ、少なくとも約９．５μｇ、少なくとも約１０μｇ、少なくとも約１１μｇ、少なくとも約１２μｇ、少なくとも約１３μｇ、少なくとも約１４μｇ、少なくとも約１５μｇ、少なくとも約２０μｇ、少なくとも約２５μｇ、少なくとも約３０μｇ、少なくとも約３５μｇ、少なくとも約４０μｇ、少なくとも約４５μｇ、または少なくとも約５０μｇの核酸が各細胞試料（例えば、エレクトロポレーションが行われる１以上の細胞）に加えられてもよい。例えば、エレクトロポレーションのために１マイクログラムのｄｓＤＮＡが各細胞試料に加えられてもよい。場合によっては、最適な形質移入効率及び／または細胞生存率に必要とされるポリ核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）の量は細胞の種類に特有であってもよい。
【０１１０】
本明細書で開示されている主題は広範囲の種々の種類の宿主細胞のゲノム編集において使用されてもよい。好ましい実施形態では、宿主細胞は真核生物に由来してもよい。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物起源に由来してもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト起源に由来してもよい。
【０１１１】
一般に、細胞は不死化細胞株または初代細胞に由来してもよい。
【０１１２】
本明細書で相互交換可能に使用されるとき「細胞株」及び「不死化細胞株」という用語は、通常は無期限に増殖しないが、突然変異のために正常な細胞老化を回避してもよく、代わりに分裂を受け続けることができる生物由来の細胞の集団を指すことができる。本明細書で提供されている主題は、ヒトＢＣ−１細胞、ヒトＢＪＡＢ細胞、ヒトＩＭ−９細胞、ヒトＪｉｙｏｙｅ細胞、ヒトＫ−５６２細胞、ヒトＬＣＬ細胞、マウスＭＰＣ−１１細胞、ヒトＲａｊｉ細胞、ヒトＲａｍｏｓ細胞、マウスＲａｍｏｓ細胞、ヒトＲＰＭＩ８２２６細胞、ヒトＲＳ４−１１細胞、ヒトＳＫＷ６．４細胞、ヒト樹状細胞、マウスＰ８１５細胞、マウスＲＢＬ−２Ｈ３細胞、ヒトＨＬ−６０細胞、ヒトＮＡＭＡＬＷＡ細胞、ヒトマクロファージ細胞、マウスＲＡＷ２６４．７細胞、ヒトＫＧ−１細胞、マウスＭ１細胞、ヒトＰＢＭＣ細胞、マウスＢＷ５１４７（Ｔ２００−Ａ）５．２細胞、ヒトＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞、マウスＥＬ４細胞、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞、ヒトＳＣＩＤ．ａｄｈ細胞、ヒトＵ−９３７細胞、またはそれらの細胞の任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、いろいろな一般的な確立された細胞株で使用されてもよい。
【０１１３】
本明細書で使用されるとき「初代細胞」という用語及びその文法上の同等物は、生物、通常、動物または植物のような多細胞生物の生体組織から直接採取される細胞を指すことができる。多くの場合、初代細胞は試験管内での増殖のために確立されてもよい。場合によっては、初代細胞は生物から取り出されたばかりであり、形質移入の前にまだ試験管内での増殖が確立されていなくてもよい。いくつかの実施形態では、初代細胞はまた、試験管内で増殖させることができ、すなわち、初代細胞はまた、生物から直接採取された細胞の増殖から生成される子孫細胞も含んでもよい。これらの場合、子孫細胞は確立された細胞株における細胞のような無期限の増殖特性を示さない。例えば、宿主細胞はヒト初代Ｔ細胞であってもよい一方で、形質移入に先立って、Ｔ細胞の増殖及び細胞集団の拡大を生じてもよい刺激因子に曝露されている。
【０１１４】
遺伝子操作される細胞は、例えば、脳、肺、肝臓、心臓、脾臓、膵臓、小腸、大腸、骨格筋、平滑筋、皮膚、骨、脂肪組織、毛髪、甲状腺、気管、胆嚢、腎臓、尿管、膀胱、大動脈、静脈、食道、横隔膜、胃、直腸、副腎、気管支、耳、目、網膜、生殖器、視床下部、喉頭、鼻、舌、脊髄、または尿管、子宮、卵巣、精巣、及びそれらの任意の組み合わせのような、しかし、これらに限定されない組織または器官に由来する初代細胞であってもよい。特定の実施形態では、細胞には、血球細胞、毛包、角化細胞、性腺刺激ホルモン産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン分泌細胞、甲状腺刺激ホルモン分泌細胞、体細胞刺激ホルモン分泌細胞、プロラクチン産生細胞、クロム親和性細胞、傍濾胞細胞、グロムス細胞、メラニン細胞、母斑細胞、メルケル細胞、象牙芽細胞、セメント芽細胞、角膜角質細胞、網膜ミュラー細胞、網膜色素上皮細胞、ニューロン、グリア、上衣細胞、松果体細胞、肺細胞、クララ細胞、ゴブレット細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、腸クロム親和性様細胞、胃主細胞、壁細胞、小窩細胞、Ｋ細胞、Ｄ細胞、Ｉ細胞、パネート細胞、腸細胞、小襞細胞、肝細胞、肝星状細胞、胆嚢細胞、中心蝸牛細胞、膵臓星状細胞、膵臓α細胞、膵臓β細胞、膵臓δ細胞、膵臓Ｆ細胞、膵臓ε細胞、甲状腺副甲状腺、好酸球細胞、尿路上皮細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋芽細胞、筋細胞、筋サテライト細胞、腱細胞、心筋細胞、脂肪芽細胞、脂肪細胞、カハール介在細胞、血管芽細胞、内皮細胞、メサンギウム細胞、傍糸球体細胞、緻密斑細胞、間質細胞、間質細胞、間質細胞、単純上皮細胞、有足細胞、腎臓近位尿細管ブラシ境界細胞、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、顆粒膜細胞、ペグ細胞、生殖細胞、精巣卵子、リンパ球、骨髄細胞、内皮前駆細胞、内皮幹細胞、血管芽細胞、中胚葉性血管芽細胞、周皮壁細胞、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられてもよいが、これらに限定されない。多くの場合、操作される細胞は、例えば、胚性幹細胞、造血幹細胞、表皮幹細胞、上皮幹細胞、気管支肺胞幹細胞、乳腺幹細胞、間葉系幹細胞、腸幹細胞、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成体幹細胞、神経堤幹細胞、精巣細胞、及びそれらの任意の組み合わせのような、しかし、これらに限定されない幹細胞であってもよい。時には、細胞は任意の種類の組織に由来する人工多能性幹細胞であることができる。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作される細胞は哺乳動物細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞は免疫細胞であってもよい。細胞の非限定的な例には、Ｂ細胞、好塩基球、樹状細胞、好酸球、ガンマデルタＴ細胞、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、ランゲルハンス細胞、リンパ系細胞、自然リンパ系細胞（ＩＬＣ）、マクロファージ、マスト細胞、巨核球、メモリーＴ細胞、単球、骨髄細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、好中球、前駆細胞、形質細胞、前駆細胞、制御性Ｔ−細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞、それらの任意の分化細胞または脱分化細胞、またはそれらの細胞の任意の混合物または組み合わせを挙げることができる。場合によっては、細胞はＴ細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞は初代Ｔ細胞であってもよい。場合によっては、細胞は抗原提示細胞（ＡＰＣ）であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞は初代ＡＰＣであってもよい。本開示に関連するＡＰＣは樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、他の非プロフェッショナルＡＰＣ、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、細胞はＩＬＣ（自然リンパ系細胞）であってもよく、ＩＬＣは、グループ１のＩＬＣ、グループ２のＩＬＣ、またはグループ３のＩＬＣであることができる。グループ１のＩＬＣは一般に、Ｔ−ｂｅｔ転写因子によって制御され、細胞内病原体に応答してＩＦＮ−γやＴＮＦ−αのような１型サイトカインを分泌する細胞として記載されてもよい。グループ２のＩＬＣは一般に、ＧＡＴＡ−３及びＲＯＲ−アルファ転写因子に依存し、細胞外寄生虫感染に応答して２型サイトカインを産生する細胞として記載されてもよい。グループ３のＩＬＣは一般に、ＲＯＲ−ガンマｔ転写因子によって制御される細胞として記載されてもよく、ＩＬ−１７及び／またはＩＬ−２２を産生する。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、細胞は所与の因子に対して陽性または陰性である細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ３−細胞、ＣＤ５＋細胞、ＣＤ５−細胞、ＣＤ７＋細胞、ＣＤ７−細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ１４−細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ８−細胞、ＣＤ１０３＋、細胞、ＣＤ１０３−細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、ＣＤ１１ｂ−細胞、ＢＤＣＡ１＋細胞、ＢＤＣＡ１−細胞、Ｌ−セレクチン＋細胞、Ｌ−セレクチン−細胞、ＣＤ２５＋、ＣＤ２５−細胞、ＣＤ２７＋、ＣＤ２７−細胞、ＣＤ２８＋細胞、ＣＤ２８−細胞、ＣＤ４４＋細胞、ＣＤ４４−細胞、ＣＤ５６＋細胞、ＣＤ５６−細胞、ＣＤ５７＋細胞、ＣＤ５７−細胞、ＣＤ６２Ｌ＋細胞、ＣＤ６２Ｌ−細胞、ＣＤ６９＋細胞、ＣＤ６９−細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞、ＣＤ４５ＲＯ−細胞、ＣＤ１２７＋細胞、ＣＤ１２７−細胞、ＣＤ１３２＋細胞、ＣＤ１３２−細胞、ＩＬ−７＋細胞、ＩＬ−７−細胞、ＩＬ−１５＋細胞、ＩＬ−１５−細胞、レクチン様受容体Ｇ１陽性細胞、レクチン様受容体Ｇ１陰性細胞、またはそれらの分化細胞または脱分化細胞であってもよい。細胞によって発現される因子の例は、限定することを意図するものではなく、当業者は、細胞が当該技術分野で知られている任意の因子について陽性または陰性であってもよいことを理解するであろう。いくつかの実施形態では、細胞は２以上の因子について陽性であってもよい。例えば、細胞はＣＤ４＋及びＣＤ８＋であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞は２以上の因子について陰性であってもよい。例えば、細胞はＣＤ２５−、ＣＤ４４−、及びＣＤ６９−であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、１以上の因子について陽性であってもよく、且つ１以上の因子について陰性であってもよい。例えば、細胞はＣＤ４＋及びＣＤ８−であってもよい。
【０１１８】
本明細書で開示されている方法のいずれかで使用される細胞は、本明細書で開示されている細胞のいずれかの混合物（例えば、２以上の異なる細胞）であってもよいことが理解されるべきである。例えば、本開示の方法は細胞を含んでもよく、細胞はＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞の混合物である。別の例では、本開示の方法は細胞を含んでもよく、細胞はＣＤ４＋細胞及びナイーブ細胞の混合物である。
【０１１９】
本明細書で提供されているように、トランスポザーゼ及びトランスポゾンは多数のアプローチを介して細胞に導入することができる。本明細書で使用されるとき「形質移入」という用語及びその文法上の同等物は一般に、核酸が真核細胞に導入されるプロセスを指すことができる。主題に関連して使用することができる形質移入法には、エレクトロポレーション、微量注入、リン酸カルシウム沈殿、カチオン性ポリマー、デンドリマー、リポソーム、微小発射体衝撃、ＦｕＧｅｎｅ、直接音波負荷、細胞圧搾、光学形質移入、プロトプラスト融合、インパレフェクション、マグネトフェクション、ヌクレオフェクション、またはそれらの任意の組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。多くの場合、本明細書に記載されているトランスポザーゼ及びトランスポゾンはエレクトロポレーションを介して宿主細胞に形質移入することができる。時には、形質移入はヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）技術としても知られている）のようなエレクトロポレーション法の変形を介して行うこともできる。本明細書で使用されるとき「エレクトロポレーション」という用語及びその文法上の同等物は、細胞膜の透過性を高めるために電場が細胞に印加され、化学物質、薬物、またはＤＮＡが細胞に導入されることを可能にするプロセスを指すことができる。エレクトロポレーションの間、電場は非常に短い期間、例えば、５ミリ秒、１０ミリ秒、及び５０ミリ秒の「パルス」の形態で提供されることが多い。当業者が理解するように、エレクトロポレーションはパルス回転電場を使用することによって細胞の外膜で細孔を一時的に開く。試験管内及び生体内でのエレクトロポレーションに使用される方法及び装置も周知である。エレクトロポレーションが行われる細胞の種類及び細胞によって取り込まれる分子の物理的特性に応じて、例えば、パルス強度、パルス長、パルス数のような種々の電気的パラメーターを選択することができる。
【０１２０】
適用
【０１２１】
本明細書で提供されている主題、例えば、組成物（例えば、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ、融合トランスポザーゼ、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ）、システム及び方法は、現代生活の種々の態様においてゲノム編集に関連する広範囲の用途で使用されてもよい。
【０１２２】
特定の状況下では、本明細書に記載されている主題の利点には、コストの削減、規制上の考慮、低い免疫原性、及び複雑さの軽減が挙げられてもよいが、これらに限定されない。場合によっては、本開示の重要な利点は高い転位効率である。本開示の別の利点は、多くの場合、本明細書で提供されている転位システムが「調整可能」であることができ、例えば、転位は、無作為な挿入ではなく選択されたゲノム領域を標的とするように設計できることである。
【０１２３】
１つの非限定的な例は、研究及び臨床応用のために遺伝子操作された細胞を作り出すことに関連する。例えば、上記で議論したように、遺伝子操作されたＴ細胞は、本明細書で提供されている主題を用いて作り出すことができ、それは、がん及び感染症のような、しかし、これらに限定されない種々の疾患と戦う人々を助けるのに使用されてもよい。
【０１２４】
１つの特定の例には、本明細書で提供されている方法を用いた遺伝子操作された初代白血球の生成、及びそれを必要とする患者に遺伝子操作された初代白血球を投与することが挙げられる。遺伝子操作された初代白血球の生成は、トランスポゾンと、そのトランスポゾンを認識することができる、本明細書に記載されているような変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼとを白血球に導入し、それによって、遺伝子操作された白血球を生成することを含むことができる。多くの場合、トランスポゾンは導入遺伝子を含んでもよい。導入遺伝子は、細胞受容体、免疫チェックポイントタンパク質、サイトカイン、及びそれらの任意の組み合わせであることができる。時には、細胞受容体には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。他のいくつかの場合では、トランスポゾン及びトランスポザーゼは、内在性遺伝子、例えば、サイトカイン、免疫チェックポイントタンパク質、がん遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせを欠失させるまたは修飾するように設計される。初代白血球の遺伝子操作は、患者を病的状態にする感染性病原体またはがん細胞に対する免疫を促進するように設計することができる。
【０１２５】
別の非限定的な例は、農業、食料生産、医学、及び薬剤学のために遺伝子操作した生物を作り出すことに関連する。遺伝子操作することができる種は、植物や動物を含むがこれらに限定されない幅広い範囲に及ぶ。遺伝子操作した作物や家畜のような遺伝子操作した生物はその生理学的特性の特定の態様で改変されてもよい。食用作物の例には、特定の害虫、病気、または環境条件への耐性、腐敗の減少、または化学処理への耐性（例えば、除草剤への耐性）、または作物の栄養プロファイルの改善が挙げられる。非食用作物の例には、医薬品、バイオ燃料、及び他の工業的に有用な商品の生産、と同様にバイオレメディエーションが挙げられる。家畜の例には、特定の寄生虫への耐性、特定の栄養要素の生産、成長率の増加、及び乳生産の増加が挙げられる。
【０１２６】
本明細書で使用されるとき参照数値に関連する「約」という用語及びその文法上の同等物はその値からプラスまたはマイナス１０％の値の範囲を含むことができる。例えば、「約１０」の量には９〜１１の量が含まれる。参照数値に関連する「約」という用語はまた、その値からプラスまたはマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の値の範囲を含むこともできる。
【実施例】
【０１２７】
以下の実施例は、本開示の範囲を限定することなく、記載されている実施形態をさらに説明する。
【０１２８】
実施例１．材料及び方法
【０１２９】
この実施例は、例示的な変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの生成及び評価に利用されるいくつかの方法を記載している。
【０１３０】
ＴｃＢｕｓｔｅｒ変異型調製のための部位特異的変異誘発
【０１３１】
推定上の機能亢進のＴｃＢｕｓｔｅｒ（ＴｃＢ）トランスポザーゼ変異型は、ｈＡＴ及びＢｕｓｔｅｒサブファミリーのヌクレオチド配列及びアミノ酸の配列比較によって同定された。Ｑ５部位特異的突然変異誘発キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）をすべての部位特異的突然変異誘発に使用した。ＰＣＲ変異誘発に続いて、ＰＣＲ産物をＧｅｎｅＪＥＴ  ＰＣＲ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で精製した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、精製ＰＣＲ産物の２０ｕＬライゲーション反応を行なった。５ｕＬのライゲーション反応物をＤＨ１０Ｂｅｔａ細胞での形質転換に使用した。Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈによる直接コロニー配列決定を用いて所望の変異の存在を確認した。確認された変異のＤＮＡは、ＺｙｍｏＰＵＲＥプラスミドミニプレップキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて調製した。
【０１３２】
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の形質移入効率の測定
【０１３３】
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、形質移入の１日前に６ウェルプレートのウェルあたり３００，０００個の細胞でプレートに播いた。細胞は、製造元の指示書（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ）に従って、ＴｒａｎｓＩＴ  Ｘ２試薬を用いて、５００ｎｇのトランスポゾンを運ぶｍＣｈｅｒｒｙ−ピューロマイシンカセットと６２．５ｎｇのＴｃＢトランスポザーゼで細胞に形質移入した。形質移入の２日後、細胞を３，０００個の細胞／ウェルの密度でピューロマイシン（１ｕｇ／ｍＬ）と共に３つ組での６ウェルプレートのＤＭＥＭ完全培地に再び播いた、またはピューロマイシン選択を行わずに再び播いた。導入遺伝子の安定した組込みは、ピューロマイシン処理した細胞のコロニー計数（薬物選択を生き延びた各細胞がコロニーを形成した）またはフローサイトメトリーによって評価した。コロニー計数のために、ピューロマイシン選択の２週間後、ＤＭＥＭ完全＋ピューロマイシンの培地を取り除いた。細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、細胞を１×クリスタルバイオレット溶液で１０分間染色した。プレートをＰＢＳで２回洗浄し、コロニーを数えた。
【０１３４】
フローサイトメトリー分析については、導入遺伝子の安定した組込みを、薬剤選択を行わずに増殖させた細胞でのｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の検出によって評価した。形質移入した細胞を、形質移入後の示された時点で回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、分析のために２００ｕＬのＲＤＦＩＩ緩衝液に再浮遊させた。Ｎｏｖｏｃｙｔｅ（Ａｃｅａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞を分析し、ＰＥ−Ｔｅｘａｓレッドチャネルを用いてｍＣｈｅｒｒｙの発現を評価した。
【０１３５】
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるＴｃＢトランスポザーゼ変異型のスクリーニング
【０１３６】
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、形質移入の１日前に２４ウェルプレートのウェルあたり７５，０００個の細胞でプレートに播いた。ＴｒａｎｓＩＴ  Ｘ２試薬を製造元の指示書（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ）に従って２つ組で用いて５００ｎｇトランスポゾンと１２５ｎｇトランスポザーゼで細胞に形質移入した。導入遺伝子の安定した組込みはｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の検出によって評価した。形質移入の１４日後に細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、２００ｕＬのＲＤＦＩＩ緩衝液に再浮遊させた。Ｎｏｖｏｃｙｔｅ（Ａｃｅａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞を分析し、ＰＥ−Ｔｅｘａｓレッドチャネルを用いてｍＣｈｅｒｒｙの発現を評価した。
【０１３７】
ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンとトランスポザーゼの形質移入
【０１３８】
ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ロイコパック（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から濃縮し、凍結保存した。ＣＤ３＋Ｔ細胞を解凍し、ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、ヒト血清とＩＬ−２、ＩＬ−１５、及びＩＬ−７サイトカインで補完したＸ−Ｖｉｖｏ−１５培地にて２日間活性化した。形質移入に先立って、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを取り除き、細胞を洗浄し、Ｎｅｏｎ形質移入システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾン（ＴｃＢｕｓｔｅｒとＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  ＩＲ／ＤＲ及びＧＦＰのカーゴを運ぶミニサークル）及びＲＮＡ形態でのＴｃＢｕｓｔｅｒまたはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼと共にエレクトロポレーションを行なった。生存率対照として、細胞に対してＤＮＡまたはＲＮＡなしで「パルス」エレクトロポレーションを行なった。エレクトロポレーションを行なった細胞を形質移入後２１日間増殖させ、ＧＦＰカーゴの生存率が安定した組込みをフローサイトメトリーで評価した。生存率をＳＳＣ−Ａ対ＦＳＣ−Ａによって測定し、パルスのみの対照に対して基準化し、ＧＦＰの発現は２、７、１４、及び２１日目にＦＩＴＣチャネルを用いて評価した。
【０１３９】
実施例２．例示的なトランスポゾン構築物
【０１４０】
この試験の目的は、さまざまな例示的なＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾン構築物の転位効率を調べることだった。発明者らは、１０のＴｃＢｕｓｔｅｒ（ＴｃＢ）トランスポゾン（Ｔｎ）の構造（図１Ａ）を比べて、哺乳類細胞におけるその転位効率を調べた。これらの１０のＴｃＢ  Ｔｎは、使用するプロモーター（ＥＦＳとＣＭＶ）、ＩＲ／ＤＲ配列、及びトランスポゾンカーゴの方向が異なった。トランスポゾンはそれぞれ、２Ａによって薬剤耐性遺伝子であるピューロマイシンに連結されたｍＣｈｅｒｒｙをコードする同一のカセットを含有していたので、形質移入された細胞は蛍光及び／またはピューロマイシンによる選択によって同定することができた。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に１０のＴｃＢ  Ｔｎ及びＴｃＢ野生型トランスポザーゼの１つで形質移入した（１つトランスポゾン：１つのトランスポザーゼの比）。導入遺伝子の安定した組込みは、形質移入後１０〜３０日間のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の検出によるフローサイトメトリーによって評価した（図１Ｂ）。
【０１４１】
実験条件下で、導入遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙの安定した発現はＥＦＳと比べてＣＭＶプロモーターを用いて大幅に増強されることが見いだされた。転位は、配列１  ＩＲ／ＤＲが使用された場合にのみ発生すると思われた。逆方向でのカーゴの転写は、順方向と比べてさらに大きな転位活性を促進することも見いだされた。
【０１４２】
ＴｃＢ  Ｔｎ−８は１０の試験Ｔｎの間でフローサイトメトリーによって最大の転位効率を示した。ＴｃＢ  Ｔｎ−８の転位効率を確認するために、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にＷＴトランスポザーゼまたはＶ５９６Ａ変異型トランスポザーゼと共にＴｃＢ  Ｔｎ−８を形質移入した。形質移入の２日後、細胞を３，０００個の細胞／ウェルの密度でピューロマイシン（１ｕｇ／ｍＬ）と共に３つ組の６ウェルプレートのＤＭＥＭ完全培地に再び播いた。２週間の選択後、薬物選択を生き延びた各細胞はコロニーを形成し、ｍＣｈｅｒｒｙ発現についてそれを評価し（図３Ａ）、導入遺伝子の安定した組込みを確認するためにそれを数えた（図３Ｂ〜Ｃ）。ＴｃＢ−Ｔｎ８の転位効率は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙの発現及びピューロマイシン耐性コロニーによって確認された。
【０１４３】
実施例３．例示的なトランスポザーゼ変異型
【０１４４】
この試験の目的は、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ変異型を生成し、それらの転位効率を調べることだった。
【０１４５】
この目的のために、発明者らは、野生型ＴｃＢトランスポザーゼのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を他の同様のトランスポザーゼと比較することによってコンセンサス配列を生成した。比較のために、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙは１３の類似したトランスポザーゼの配列比較によって、及びＳＰＩＮは８つの別々の生物由来のＳＰＩＮ様トランスポザーゼの配列比較によって復帰させた。ＳＰＩＮ及びＴｃＢｕｓｔｅｒは豊富なｈＡＴファミリーのトランスポザーゼの一部である。
【０１４６】
ｈＡＴトランスポゾンファミリーは、ｈａｓ  ｈｏｂｏ、ｈｅｒｍｅｓ、及びＴｏｌ２のようなＡＣと、ＳＰＩＮやＴｃＢｕｓｔｅｒのようなＢｕｓｔｅｒサブファミリーとの２つのサブファミリーから成る。ＴｃＢｕｓｔｅｒのアミノ酸配列を、ＡＣ及びＢｕｓｔｅｒサブファミリーメンバーの双方のアミノ酸配列に対して並べ、機能亢進置換の標的であってもよいＴｃＢｕｓｔｅｒに保存されていない重要なアミノ酸を特定した。ＴｃＢｕｓｔｅｒのＡＣサブファミリーのメンバーであるＨｅｒｍｅｓ、Ｈｏｂｏ、Ｔａｇ２、Ｔａｍ３、Ｈｅｒｖｅｓ、Ｒｅｓｔｌｅｓｓ、及びＴｏｌ２に対する配列比較は、ＴｃＢｕｓｔｅｒで置換され得る高度に保存された領域内のアミノ酸を我々が特定するのを可能にした（図４）。さらに、ＴｃＢｕｓｔｅｒのＢｕｓｔｅｒサブファミリーに対する配列比較は、置換されてもよい多数の候補アミノ酸をもたらした（図５）。候補ＴｃＢトランスポザーゼ変異型は、表９に記載されている部位突然変異を含むオリゴヌクレオチドを用いて生成された。次に、変異型の配列を検証し、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０発現ベクター（図６）にクローニングし、形質移入の前にミニプレップを行なった。
【表１２】
2021527427.tif 000025
2021527427.tif 000026
2021527427.tif 000027
【０１４７】
ＴｃＢトランスポザーゼ変異型の転位効率を調べるために、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に２つ組にてＷＴトランスポザーゼまたはＶ５９６Ａ変異型トランスポザーゼ、または候補トランスポザーゼ変異型と共にＴｃＢ  Ｔｎ−８（ｍＣｈｅｒｒｙ−ピューロマイシンカセット）で形質移入した。細胞をＤＭＥＭ完全培地（薬剤選択なし）で増殖させ、ｍＣｈｅｒｒｙの発現を形質移入後１４日目にフローサイトメトリーで評価した。野生型トランスポザーゼよりも大きな転位効率を有する２０を超えるＴｃＢトランスポザーゼ変異型が同定された（図７）。これらの調べた変異型の中で、３つのアミノ酸置換、Ｄ１８９Ａ、Ｖ３７７Ｔ、及びＥ４６９Ｋの組み合わせを含有する変異型トランスポザーゼ１つは、それぞれの単一置換を含有する変異型と比べて転位活性の実質的な上昇をもたらすことが発見された。高い転位活性を持つ変異型には、とりわけ、Ｋ５７３Ｅ／Ｅ５７８Ｌ、Ｉ４５２Ｆ、Ａ３５８Ｋ、Ｖ２９７Ｋ、Ｎ８５Ｓ、Ｓ４４７Ｅ、Ｅ２４７Ｋ、及びＱ２５８Ｔも含まれた。
【０１４８】
これらの調べた変異型の中で、触媒三連構造アミノ酸（Ｄ２３４、Ｄ２８９、及びＥ５８９）の１つの近傍でのリシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）のような正に荷電したアミノ酸への置換のほとんどは転位を増加させることが発見された。加えて、正電荷の除去、または負電荷の追加は転位を減らした。これらのデータは、特にこれらのアミノ酸が正に荷電したアミノ酸に変異している場合、触媒ドメインに近いアミノ酸がＴｃＢの転位活性を促進するのに役立ってもよいことを示唆している。
【０１４９】
機能亢進ＴｃＢｕｓｔｅｒ変異型Ｄ１８９Ａ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ（配列番号７８）のアミノ酸配列を図１２に示す。この変異型のさらなる変異分析が実施されるであろう。図１３で説明されるように、ＴｃＢｕｓｔｅｒ変異型Ｄ１８９Ａ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｉ４５２Ｆ（配列番号７９）が構築されるであろう。図１４で説明されるように、ＴｃＢｕｓｔｅｒ変異型Ｄ１８９Ａ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｎ８５Ｓ（配列番号８０）が構築されるであろう。図１５で説明されるように、ＴｃＢｕｓｔｅｒ変異型Ｄ１８９Ａ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｓ３５８Ｋ（配列番号８１）が構築されるであろう。図１６で説明されるように、ＴｃＢｕｓｔｅｒ変異型Ｄ１８９Ａ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｋ５７３Ｅ／Ｅ５７８Ｌ（配列番号１３）が構築されるであろう。図１２〜１６のそれぞれにて、ＴｃＢｕｓｔｅｒのドメインは以下：ＺｎＦ−ＢＥＤ（小文字）、ＤＮＡ結合／オリゴ化ドメイン（太字）、触媒ドメイン（下線付き文字）、及び挿入ドメイン（斜体文字）のように示され；コアのＤ１８９Ａ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋの置換は、大きく、太字で、イタリック体で、下線付きの文字で示され；追加の置換は大きな太字で示される。これらの構築物のそれぞれは、すでに記載されたように調べられ、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒと比べて機能亢進を示すことが予想される。
【０１５０】
実施例４．タグを含有する例示的な融合トランスポザーゼ
【０１５１】
この試験の目的は、融合ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを生成してその転位効率を調べることだった。一例として、タンパク質タグ、ＧＳＴまたはＰＥＳＴのドメインをＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのＮ末端に融合させて融合ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを生成した。配列番号１０によってコードされる柔軟なリンカーＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＴＳ（配列番号９）を用いて、ＧＳＴドメイン／ＰＥＳＴドメインをＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼから分離した。この柔軟性リンカーの存在は融合タンパク質における非特異的相互作用を最小限に抑えるので、その活性を高めてもよい。例示的な融合トランスポザーゼは、上記に記載されているようなＴｃＢ  Ｔｎ−８と共に形質移入され、転位効率は、フローサイトメトリーによる１４日目のｍＣｈｅｒｒｙ発現によって測定された。転位効率はＧＦＰドメインまたはＰＥＳＴドメインのタグ付けによって影響を受けなかった（図９）ということは、トランスポザーゼのＤＮＡ結合ドメインをＴｃＢｕｓｔｅｒカーゴの直接組込みに融合して安全域部位のようなゲノム部位を選択することが安全な組込みプロファイルを可能にするＴｃＢｕｓｔｅｒにとって実行可能な選択肢であり得ることを示唆している。
【０１５２】
実施例５．ＴＡＬＥドメインを含む例示的な融合トランスポザーゼ
【０１５３】
この試験の目的は、ＴＡＬＥドメインを含む融合ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを生成し、融合トランスポザーゼの転位活性を調べることである。ＴＡＬＥ配列（配列番号１１）は、ヒトゲノムのヒトＡＡＶＳ１（ｈＡＡＶＳ１）部位を標的とするように設計される。したがって、ＴＡＬＥ配列は、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ（配列番号１）のＮ末端に融合されて融合トランスポザーゼを生成する。配列番号１２によってコードされる柔軟なリンカーＧｌｙ４Ｓｅｒ２（配列番号８８）を用いて、ＴＡＬＥドメインとＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列を分離する。例示的な融合トランスポザーゼは配列番号８のアミノ酸配列を有する。
【０１５４】
例示的な融合トランスポザーゼは、エレクトロポレーションの助けを借りて上記に記載されているようなＴｃＢ  Ｔｎ−８と共にＨｅｌａ細胞に形質移入されるであろう。ＴｃＢ  Ｔｎ−８はレポーター遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙを含む。形質移入効率は、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞を数える形質移入の２日後のフローサイトメトリーによって調べることができる。さらに、ゲノムにおけるｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の挿入部位を評価するために、次世代配列決定が実施されるであろう。設計されたＴＡＬＥ配列は、ｈＡＡＶＳ１部位の近くのゲノム部位でのｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の標的挿入に介在することができると予想される。
【０１５５】
実施例６．初代ヒトＴ細胞における転位効率
【０１５６】
この試験の目的は、初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を操作するＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンシステムを開発することだった。この目的のために、発明者らはＧＦＰ導入遺伝子を運ぶ例示的なＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンをミニサークルプラスミドに組み込んだ。活性化されたＣＤ３＋Ｔ細胞でＴｃＢミニサークルトランスポゾン及び野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのようなＲＮＡトランスポザーゼと共にエレクトロポレーションを行ない、実施例２に記載されているように例示的な変異型を選択した。導入遺伝子の発現をエレクトロポレーション後２１日間フローサイトメトリーによってモニターした。
【０１５７】
ＴｃＢトランスポゾンの転位は、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ及びＶ５９６Ａ変異トランスポザーゼと比べて、形質移入の１４日後に、例示的な変異型Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ及びＶ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｄ１８９Ａを用いてほぼ２倍に改善されることが見いだされた（図１０Ａ）。さらに、機能亢進変異型Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ及びＶ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｄ１８９Ａによる平均転位効率は、ＳＢ１１（平均＝８．４）と比べてそれぞれ２倍（平均＝２０．２）及び３倍（平均＝２４．１）効率的だった。
【０１５８】
次に、ＣＤ３＋Ｔ細胞の生存率をエレクトロポレーションの２日後にミニサークルＴｃＢトランスポゾンとＲＮＡトランスポザーゼで評価した。ＣＤ３＋Ｔ細胞にＴｃＢミニサークルとＲＮＡトランスポザーゼを形質移入すると、生存率が中程度に低下することが見いだされた；しかしながら、細胞は７日目までに生存率を急速に回復した（図１０Ｂ）。これらの実験は、初代Ｔ細胞の細胞工学における本開示のいくつかの実施形態に係るＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンシステムの能力を実証している。
【０１５９】
実施例７．がん患者の治療のためのキメラ抗原受容体修飾Ｔ細胞の生成。
【０１６０】
前述のＴｃＢ  Ｔｎ−８構築物を含有するミニサークルプラスミドは、トランスポゾンの逆向き反復配列の間でキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子を内部に持つように設計することができる。ＣＡＲは、ＣＤ１３７（Ｔ細胞における共刺激受容体［４−１ＢＢ］）及びＣＤ３−ゼータ（Ｔ細胞抗原受容体のシグナル伝達成分）シグナル伝達ドメインと一体となってＢ細胞抗原ＣＤ１９に特異性を有するように設計することができる。
【０１６１】
自己Ｔ細胞は、がん、例えば、白血病の患者の末梢血から得られるであろう。Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を介して遠心分離によって単球を枯渇させることにより単離することができる。ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＤＹＮＡＢＥＡＤ  Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔのような抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８結合ビーズを使用したフローサイトメトリーによって単離することができる。単離されたＴ細胞はＧＭＰガイダンスに従って標準的な条件下で培養されるであろう。
【０１６２】
初代Ｔ細胞の遺伝子操作は、上記に記載されているように、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３Ｅ及びＥ５７８Ｌを含む変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ（配列番号１３）と、ＣＡＲを含むＴｃＢｕｓｔｅｒ  Ｔｎ−８トランスポザーゼとを用いて行われるであろう。Ｔ細胞は、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと、ＣＡＲを含有するＴｎ−８トランスポザーゼとの存在下でエレクトロポレーションが行なわれるであろう。形質移入後、Ｔ細胞は活性化及び増殖のために免疫刺激試薬（例えば、抗ＣＤ３抗体やＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５）で処理されるであろう。形質移入の検証は、形質移入の２週間後に次世代配列決定によって実施されるであろう。形質移入されたＴ細胞における形質移入効率及び導入遺伝子の負荷は、治療計画の設計を支援するように決定することができる。危険な導入遺伝子の挿入部位が配列決定の結果によって明らかにされれば、安全上の懸念を排除するために特定の措置も講じられるであろう。
【０１６３】
キメラ抗原受容体修飾Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）をがん患者に注入して戻すことは、導入遺伝子の挿入と臨床的に望ましいレベルへのＣＡＲ−Ｔ細胞の試験管内増殖との検証後に開始されるであろう。
【０１６４】
注入用量は、がんの病期、患者の治療歴、ＣＢＣ（全血球計算）及び治療当日の患者のバイタルサインを含むが、これらに限定されない多数の因子によって決定されるであろう。注入用量は、疾患の進行、患者の反発反応、及び他の多くの医学的因子に応じて増加してもよいし、または減少してもよい。その間、治療計画中に、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）分析が実行され、血液及び骨髄にてキメラ抗原受容体Ｔ細胞を検出するであろう。ｑＰＣＲ分析は、投与戦略及び他の治療計画に関する医学的決定を下すために利用することができる。
【表１３】
2021527427.tif 000028
2021527427.tif 000029
2021527427.tif 000030
2021527427.tif 000031
2021527427.tif 000032
2021527427.tif 000033
2021527427.tif 000034
2021527427.tif 000035
2021527427.tif 000036
2021527427.tif 000037
2021527427.tif 000038
2021527427.tif 000039
2021527427.tif 000040
2021527427.tif 000041
2021527427.tif 000042
2021527427.tif 000043
2021527427.tif 000044
2021527427.tif 000045
2021527427.tif 000046
2021527427.tif 000047
【０１６５】
本開示の好ましい実施形態を示し、本明細書に記載しているが、そのような実施形態が、例示として提供されるにすぎないことは当業者に明らかである。当業者は、本開示から逸脱せずに、数多くの変形、変更及び置換を思いつくであろう。本明細書で開示されている主題を実践することにおいて、本明細書に記載されている主題の実施形態に対する種々の代替物が採用されてもよいことが理解されるべきである。以下のクレームが本発明の範囲を定義し、これらのクレームの範囲内の方法及び構造、ならびにそれらの等価物がそれによって包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１−１】野生型（ＷＴ）ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ及び例示的なＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンで形質移入した細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の比率によって測定された、いくつかの例示的なＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンベクター構築物の転位効率を示す図である。
【図１−２】図１−１の続き。
【図２】例示的なＴｃＢｕｓｔｅｒ  ＩＲ／ＤＲ配列１（それぞれ出現順に配列番号３〜４）及び配列２（それぞれ出現順に配列番号５〜６）のヌクレオチド配列比較を示す図である。
【図３】Ａは例示的なＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンＴｎ−８（ｐｕｒｏ−ｍＣｈｅｒｒｙカセットを含有する；図１に示す）及び野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたはＶ５９６Ａ変異型トランスポザーゼ（Ｖ５９６Ａ置換を含有する）による形質移入の２週間後のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の代表的な明視野画像及び蛍光画像を示す。形質移入された細胞を、形質移入の２日後に１μｇ／ｍＬのピューロマイシンと共に６ウェルプレートに入れ、コロニーの定量のために形質移入の２週間後に固定し、クリスタルバイオレットで染色した。Ｂは形質移入の２週間後の６ウェルプレートにおける形質移入された細胞コロニーの代表的な写真を示す。Ｃは形質移入の２週間後の各形質移入条件ごとのコロニーの定量を示すグラフである。
【図４】ＡＣサブファミリーにおけるいくつかのトランスポザーゼに対比させたＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列の配列比較を示し、アミノ酸保存の領域のみが示されている（それぞれ、出現順に配列番号８９〜１９４）。
【図５】Ｂｕｓｔｅｒサブファミリーにおける多数の他のトランスポザーゼメンバーに対比させたＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列の配列比較を示す図である（それぞれ、出現順に配列番号１９５〜２０３）。特定の例示的なアミノ酸置換をタンパク質配列の上に示し、併せて、配列比較の上に示す比率はＴｃＢｕｓｔｅｒ配列に置換されていると考えられるアミノ酸を含有する他のＢｕｓｔｅｒサブファミリーメンバーの比率であり、下に示す比率はその位置で標準的なＴｃＢｕｓｔｅｒアミノ酸を含有する他のＢｕｓｔｅｒサブファミリーメンバーの比率である。
【図６】ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ変異型を調べるのに使用された例示的な発現ベクターｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０のベクターマップを示す。
【図７】例示的なトランスポザーゼ変異型と共にＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンＴｎ−８（図１に示す）で形質移入したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の比率によって測定される、例示的なＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ変異型の転位効率を定量化するグラフである。
【図８】任意のリンカーによって連結されたＤＮＡ配列特異的結合ドメインとＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列とを含有する１つの例示的な融合トランスポザーゼを示す。
【図９】タグを含有する例示的なトランスポザーゼと共にＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンＴｎ−８（図１に示す）で形質移入したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の割合によって測定したときの、異なるタグを含有する例示的なＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの転位効率を定量化するグラフである。
【図１０】ＡはＧＦＰ陽性細胞の比率によって測定されたときの、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞における例示的なＴｃＢｕｓｔｅｒ転位システムの転位効率を定量化するグラフである。Ｂはフローサイトメトリーによる形質移入の２日後及び７日後の形質移入されたＴ細胞の生存率を定量化するグラフである。データはパルス制御に関連する。
【図１１】特定のアミノ酸に注釈が付けられた野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列を示す（配列番号１）。
【図１２】アミノ酸置換Ｄ１８９Ａ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ（配列番号７８）を含有する変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列を示す。
【図１３】アミノ酸置換Ｄ１８９Ａ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｉ４５２Ｋ（配列番号７９）を含有する変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列を示す。
【図１４】アミノ酸置換Ｄ１８９Ａ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｎ８５Ｓ（配列番号８０）を含有する変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列を示す。
【図１５】アミノ酸置換Ｄ１８９Ａ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ａ３５８Ｋ（配列番号８１）を含有する変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列を示す。
【図１６】アミノ酸置換Ｄ１８９Ａ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｋ５７３Ｅ／Ｅ５７８Ｌ（配列番号１３）を含有する変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列を示す。
【図１−１】
2021527427.tif 000048
【図１−２】
2021527427.tif 000049
【図２−１】
2021527427.tif 000050
【図２−２】
2021527427.tif 000051
【図３】
2021527427.tif 000052
【図４】
2021527427.tif 000053
【図５】
2021527427.tif 000054
【図６】
2021527427.tif 000055
【図７】
2021527427.tif 000056
【図８】
2021527427.tif 000057
【図９】
2021527427.tif 000058
【図１０】
2021527427.tif 000059
【図１１】
2021527427.tif 000060
【図１２】
2021527427.tif 000061
【図１３】
2021527427.tif 000062
【図１４】
2021527427.tif 000063
【図１５】
2021527427.tif 000064
【図１６】
2021527427.tif 000065
【配列表】
2021527427000001.app