(57)【要約】  本明細書で提供されるのは、とりわけ、生物のゲノムを操作するための組成物および方法である。
2021521788.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素、クルッペル関連ボックスドメイン、およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインを含む、融合タンパク質。
【請求項２】
前記ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素が、ｄＣａｓ９、ｄｄＣｐｆ１、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９バリアント、またはヌクレアーゼ欠損クラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインが、Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメイン、前記ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素、および前記クルッペル関連ボックスドメインを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素が、ｄＣａｓ９であり、前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインが、Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインである、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ｄＣａｓ９が、ペプチドリンカーを介して前記Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインに共有結合しており、前記Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインが、ペプチドリンカーを介して前記クルッペル関連ボックスドメインに共有結合している、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ペプチドリンカーが、ＸＴＥＮリンカーである、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、前記クルッペル関連ボックス、前記ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素、および前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素が、ｄＣａｓ９であり、前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインが、Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインである、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ｄＣａｓ９が、ペプチドリンカーを介して前記Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインに共有結合しており、前記クルッペル関連ボックスドメインが、ペプチドリンカーを介して前記ｄＣａｓ９に共有結合している、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記ペプチドリンカーが、ＸＴＥＮリンカーである、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素が、ペプチドリンカーを介して前記クルッペル関連ボックスドメインに共有結合している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素が、ペプチドリンカーを介して前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインに共有結合している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記クルッペル関連ボックスドメインが、ペプチドリンカーを介して前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインに共有結合している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記ペプチドリンカーが、ＸＴＥＮリンカーである、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記ＸＴＥＮリンカーが、約１６〜８０個のアミノ酸残基を含む、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
核局在化シグナルペプチドをさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
前記融合タンパク質が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
請求項１に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列。
【請求項２０】
前記核酸配列が、メッセンジャーＲＮＡである、請求項１９に記載の核酸配列。
【請求項２１】
複合体であって、（ｉ）請求項１に記載の融合タンパク質と、（ｉｉ）ポリヌクレオチドであって、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列、および（ｂ）前記ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素の結合配列であって、前記ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、前記結合配列を介して前記ポリヌクレオチドに結合している、前記結合配列を含む、ポリヌクレオチドと、を含む、複合体。
【請求項２２】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、遺伝子の一部である、請求項２１に記載の複合体。
【請求項２３】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、転写調節配列の一部である、請求項２１に記載の複合体。
【請求項２４】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、プロモーター、エンハンサー、またはサイレンサーの一部である、請求項２１に記載の複合体。
【請求項２５】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、転写開始部位に隣接する約３０００ｂｐ以内にある、請求項２１に記載の複合体。
【請求項２６】
請求項１９に記載の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項２７】
ポリヌクレオチドをさらに含み、前記ポリヌクレオチドが、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列と、（ｂ）前記ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素の結合配列と、を含む、請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
請求項１に記載の融合タンパク質、請求項１９に記載の核酸、請求項２１に記載の複合体、または請求項２６に記載のベクター、を含む、細胞。
【請求項２９】
前記細胞が、真核細胞である、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３１】
細胞内の標的核酸配列をサイレンシングする方法であって、（ｉ）請求項１に記載の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドを、前記標的核酸を含む細胞に送達することと、（ｉｉ）第２のポリヌクレオチドであって、（ａ）前記標的核酸配列に相補的なＤＮＡ標的化配列および（ｂ）前記ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素の結合配列を含む、前記第２のポリヌクレオチド、を前記細胞に送達することと、を含む、方法。
【請求項３２】
前記融合タンパク質が、前記標的核酸配列を含むクロマチンをメチル化することによって、および／または前記標的核酸配列を含むクロマチンに抑制性クロマチンマークを導入することによって、前記細胞内の前記標的核酸配列をサイレンシングする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１のポリヌクレオチドが、第１のベクター内に含まれる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１のポリヌクレオチドが、第２のベクター内に含まれる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１のベクターおよび前記第２のベクターが同じである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１のベクターが前記第２のベクターとは異なる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記方法が、非標的核酸配列に対する特異性よりも２倍高い特異性を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
細胞内の標的核酸配列をサイレンシングする方法であって、請求項２１に記載の複合体を、前記標的核酸を含む細胞に送達することを含む、方法。
【請求項４０】
前記複合体が、前記標的核酸配列を含むクロマチンをメチル化することによって、および／または前記標的核酸配列を含むクロマチンに抑制性クロマチンマークを導入することによって、前記細胞内の前記標的核酸配列をサイレンシングする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記方法が、非標的核酸配列に対する特異性よりも２倍高い特異性を有する、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月１９日に提出された米国出願第６２／６６０，０２３号の優先権を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府の助成による研究開発において行われた発明に対する権利に関する陳述
本発明は、国防総省国防高等研究計画局によって授与された助成金番号ＨＲ００１１−１７−２−００４３および国立衛生研究所によって授与された助成金番号Ｒ０１ＤＡ０３６８５８の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
病気の治療のための有望な治療アプローチと考えられているが、ゲノム編集は二本鎖切断による遺伝毒性の可能性があるため、固有のリスクを伴う。さらに、ゲノム編集は、多くの場合、標的遺伝子に対するオールオアナッシング効果に関連する（つまり、完全なノックアウトを生成する）。対照的に、標的エピゲノム工学は、ＤＳＢ誘発性の遺伝毒性のリスクを伴わず、さらに、それは遺伝子発現に対してより段階的な効果を生み出す機会を与え、したがって完全なサイレンシングからあまり目立たない効果まで機能する。
【０００４】
本明細書で提供されるのは、当技術分野におけるこれらおよび他のニーズに対する解決策である。
【発明の概要】
【０００５】
一態様では、ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインおよびＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインを含む融合タンパク質が提供される。一態様では、配列番号１〜１５のいずれか１つの融合タンパク質が提供される。
【０００６】
一態様では、実施形態およびその態様を含む、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列が提供される。
【０００７】
一態様では、実施形態およびその態様を含む、本明細書に記載の融合タンパク質と、（１）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列および（２）ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素の結合配列を含むポリヌクレオチドと、を含む複合体であって、ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、この結合配列を介してポリヌクレオチドに結合している、複合体を提供する。
【０００８】
一態様では、実施形態およびその態様を含む、本明細書に記載の融合タンパク質の核酸配列を含むベクターが提供される。
【０００９】
一態様では、実施形態およびその態様を含む本明細書に記載の融合タンパク質を含む細胞、実施形態およびその態様を含む本明細書に記載の核酸、実施形態およびその態様を含む本明細書に記載の複合体、または実施形態およびその態様を含む本明細書に記載のベクターが提供される。
【００１０】
一態様では、細胞内の標的核酸配列をサイレンシングする方法であって、実施形態およびその態様を含む本明細書に記載の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドを、標的核酸を含む細胞に送達することと、（ｉ）標的核酸配列に相補的なＤＮＡ標的配列、および（ｉｉ）ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素の結合配列を含む第２のポリヌクレオチド、をその細胞に送達することと、を含む、方法を提供する。いかなる理論にも拘束されることを意図することなく、融合タンパク質は、標的核酸配列を含むクロマチンをメチル化することによって、および／または標的核酸配列を含むクロマチンに抑制性クロマチンマークを導入することによって、細胞内の標的核酸配列をサイレンシングする、と考えられている。したがって、態様では、融合タンパク質は、標的核酸配列を含むクロマチンをメチル化することによって、および／または標的核酸配列を含むクロマチンに抑制性クロマチンマークを導入することによって、細胞内の標的核酸配列をサイレンシングする。
【００１１】
一態様では、実施形態およびその態様を含む本明細書に記載の複合体を標的核酸を含む細胞に送達することを含む、細胞内の標的核酸配列をサイレンシングする方法が提供され、複合体は、細胞内の標的核酸配列をサイレンシングする。いかなる理論にも拘束されることを意図することなく、複合体は、標的核酸配列を含むクロマチンをメチル化することによって、および／または標的核酸配列を含むクロマチンに抑制性クロマチンマークを導入することによって、細胞内の標的核酸配列をサイレンシングする、と考えられている。したがって、態様では、複合体は、標的核酸配列を含むクロマチンをメチル化することによって、および／または標的核酸配列を含むクロマチンに抑制性クロマチンマークを導入することによって、細胞内の標的核酸配列をサイレンシングする。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】長期遺伝子サイレンシングのためのオールインワンタンパク質のエンジニアリングについて説明する。図１Ａは、ＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１７）リンカーによって隔てられているｄＣａｓ９（配列番号２３）の−Ｎ末端に融合されたＫＲＡＢドメインおよびｄＣａｓ９のＣ末端にＤｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ（ＥＡＳＧＳＧＲＡＳＰＧＩＰＧＳＴＲ（配列番号１９）リンカーによって隔てられている）を有する本開示のオールインワンタンパク質（配列番号１）の概略図である。図１Ｂは、永続的な遺伝子サイレンシングについて試験されたｄＣａｓ９融合エピジェネティックモジュレーターの概略図を提供する。ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）適用に関するＧｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１３から採用される。ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ融合は、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１６から採用される。本発明者らは、ＫＲＡＢドメイン（配列番号１６）、ｄＣａｓ９（Ｄ１０Ａ、Ｈ２０８Ａ）、Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ（配列番号３３、ここで、Ｄｎｍｔ３Ａは配列番号２６でありかつＤｎｍｔ３Ｌは配列番号２８である）を１つのポリペプチドに統合する新規なオールインワンタンパク質を設計した。図１Ｃは、オールインワンタンパク質による長期サイレンシングを評価するために使用されたメチル化感受性ＧＦＰレポーター（Ｓｔｅｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１５から採用）の概略図を示す。図１Ｄ〜１Ｅは、図３に示されるＧＦＰレポーターを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるヒットエンドラン実験ワークフローの図および結果を提供する。図１Ｄは、プラスミドが細胞内にコトランスフェクトされたことを示し、一方はヒットエンドランタンパク質をコードし、もう一方はｓｇＲＮＡをコードするプラスミドである。図１Ｅは、オールインワンプラスミドおよびｓｇＲＮＡプラスミドでコトランスフェクトされた細胞について選別されたヒットエンドランアッセイの結果を示す。図１Ｆは、ＧＦＰレポーターのサイレンシングの結果がｓｇＲＮＡ配列に依存していることを示す。
【図１Ｂ】長期遺伝子サイレンシングのためのオールインワンタンパク質のエンジニアリングについて説明する。図１Ａは、ＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１７）リンカーによって隔てられているｄＣａｓ９（配列番号２３）の−Ｎ末端に融合されたＫＲＡＢドメインおよびｄＣａｓ９のＣ末端にＤｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ（ＥＡＳＧＳＧＲＡＳＰＧＩＰＧＳＴＲ（配列番号１９）リンカーによって隔てられている）を有する本開示のオールインワンタンパク質（配列番号１）の概略図である。図１Ｂは、永続的な遺伝子サイレンシングについて試験されたｄＣａｓ９融合エピジェネティックモジュレーターの概略図を提供する。ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）適用に関するＧｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１３から採用される。ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ融合は、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１６から採用される。本発明者らは、ＫＲＡＢドメイン（配列番号１６）、ｄＣａｓ９（Ｄ１０Ａ、Ｈ２０８Ａ）、Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ（配列番号３３、ここで、Ｄｎｍｔ３Ａは配列番号２６でありかつＤｎｍｔ３Ｌは配列番号２８である）を１つのポリペプチドに統合する新規なオールインワンタンパク質を設計した。図１Ｃは、オールインワンタンパク質による長期サイレンシングを評価するために使用されたメチル化感受性ＧＦＰレポーター（Ｓｔｅｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１５から採用）の概略図を示す。図１Ｄ〜１Ｅは、図３に示されるＧＦＰレポーターを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるヒットエンドラン実験ワークフローの図および結果を提供する。図１Ｄは、プラスミドが細胞内にコトランスフェクトされたことを示し、一方はヒットエンドランタンパク質をコードし、もう一方はｓｇＲＮＡをコードするプラスミドである。図１Ｅは、オールインワンプラスミドおよびｓｇＲＮＡプラスミドでコトランスフェクトされた細胞について選別されたヒットエンドランアッセイの結果を示す。図１Ｆは、ＧＦＰレポーターのサイレンシングの結果がｓｇＲＮＡ配列に依存していることを示す。
【図１Ｃ】長期遺伝子サイレンシングのためのオールインワンタンパク質のエンジニアリングについて説明する。図１Ａは、ＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１７）リンカーによって隔てられているｄＣａｓ９（配列番号２３）の−Ｎ末端に融合されたＫＲＡＢドメインおよびｄＣａｓ９のＣ末端にＤｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ（ＥＡＳＧＳＧＲＡＳＰＧＩＰＧＳＴＲ（配列番号１９）リンカーによって隔てられている）を有する本開示のオールインワンタンパク質（配列番号１）の概略図である。図１Ｂは、永続的な遺伝子サイレンシングについて試験されたｄＣａｓ９融合エピジェネティックモジュレーターの概略図を提供する。ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）適用に関するＧｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１３から採用される。ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ融合は、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１６から採用される。本発明者らは、ＫＲＡＢドメイン（配列番号１６）、ｄＣａｓ９（Ｄ１０Ａ、Ｈ２０８Ａ）、Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ（配列番号３３、ここで、Ｄｎｍｔ３Ａは配列番号２６でありかつＤｎｍｔ３Ｌは配列番号２８である）を１つのポリペプチドに統合する新規なオールインワンタンパク質を設計した。図１Ｃは、オールインワンタンパク質による長期サイレンシングを評価するために使用されたメチル化感受性ＧＦＰレポーター（Ｓｔｅｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１５から採用）の概略図を示す。図１Ｄ〜１Ｅは、図３に示されるＧＦＰレポーターを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるヒットエンドラン実験ワークフローの図および結果を提供する。図１Ｄは、プラスミドが細胞内にコトランスフェクトされたことを示し、一方はヒットエンドランタンパク質をコードし、もう一方はｓｇＲＮＡをコードするプラスミドである。図１Ｅは、オールインワンプラスミドおよびｓｇＲＮＡプラスミドでコトランスフェクトされた細胞について選別されたヒットエンドランアッセイの結果を示す。図１Ｆは、ＧＦＰレポーターのサイレンシングの結果がｓｇＲＮＡ配列に依存していることを示す。
【図１Ｄ】長期遺伝子サイレンシングのためのオールインワンタンパク質のエンジニアリングについて説明する。図１Ａは、ＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１７）リンカーによって隔てられているｄＣａｓ９（配列番号２３）の−Ｎ末端に融合されたＫＲＡＢドメインおよびｄＣａｓ９のＣ末端にＤｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ（ＥＡＳＧＳＧＲＡＳＰＧＩＰＧＳＴＲ（配列番号１９）リンカーによって隔てられている）を有する本開示のオールインワンタンパク質（配列番号１）の概略図である。図１Ｂは、永続的な遺伝子サイレンシングについて試験されたｄＣａｓ９融合エピジェネティックモジュレーターの概略図を提供する。ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）適用に関するＧｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１３から採用される。ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ融合は、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１６から採用される。本発明者らは、ＫＲＡＢドメイン（配列番号１６）、ｄＣａｓ９（Ｄ１０Ａ、Ｈ２０８Ａ）、Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ（配列番号３３、ここで、Ｄｎｍｔ３Ａは配列番号２６でありかつＤｎｍｔ３Ｌは配列番号２８である）を１つのポリペプチドに統合する新規なオールインワンタンパク質を設計した。図１Ｃは、オールインワンタンパク質による長期サイレンシングを評価するために使用されたメチル化感受性ＧＦＰレポーター（Ｓｔｅｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１５から採用）の概略図を示す。図１Ｄ〜１Ｅは、図３に示されるＧＦＰレポーターを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるヒットエンドラン実験ワークフローの図および結果を提供する。図１Ｄは、プラスミドが細胞内にコトランスフェクトされたことを示し、一方はヒットエンドランタンパク質をコードし、もう一方はｓｇＲＮＡをコードするプラスミドである。図１Ｅは、オールインワンプラスミドおよびｓｇＲＮＡプラスミドでコトランスフェクトされた細胞について選別されたヒットエンドランアッセイの結果を示す。図１Ｆは、ＧＦＰレポーターのサイレンシングの結果がｓｇＲＮＡ配列に依存していることを示す。
【図１Ｅ】長期遺伝子サイレンシングのためのオールインワンタンパク質のエンジニアリングについて説明する。図１Ａは、ＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１７）リンカーによって隔てられているｄＣａｓ９（配列番号２３）の−Ｎ末端に融合されたＫＲＡＢドメインおよびｄＣａｓ９のＣ末端にＤｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ（ＥＡＳＧＳＧＲＡＳＰＧＩＰＧＳＴＲ（配列番号１９）リンカーによって隔てられている）を有する本開示のオールインワンタンパク質（配列番号１）の概略図である。図１Ｂは、永続的な遺伝子サイレンシングについて試験されたｄＣａｓ９融合エピジェネティックモジュレーターの概略図を提供する。ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）適用に関するＧｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１３から採用される。ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ融合は、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１６から採用される。本発明者らは、ＫＲＡＢドメイン（配列番号１６）、ｄＣａｓ９（Ｄ１０Ａ、Ｈ２０８Ａ）、Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ（配列番号３３、ここで、Ｄｎｍｔ３Ａは配列番号２６でありかつＤｎｍｔ３Ｌは配列番号２８である）を１つのポリペプチドに統合する新規なオールインワンタンパク質を設計した。図１Ｃは、オールインワンタンパク質による長期サイレンシングを評価するために使用されたメチル化感受性ＧＦＰレポーター（Ｓｔｅｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１５から採用）の概略図を示す。図１Ｄ〜１Ｅは、図３に示されるＧＦＰレポーターを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるヒットエンドラン実験ワークフローの図および結果を提供する。図１Ｄは、プラスミドが細胞内にコトランスフェクトされたことを示し、一方はヒットエンドランタンパク質をコードし、もう一方はｓｇＲＮＡをコードするプラスミドである。図１Ｅは、オールインワンプラスミドおよびｓｇＲＮＡプラスミドでコトランスフェクトされた細胞について選別されたヒットエンドランアッセイの結果を示す。図１Ｆは、ＧＦＰレポーターのサイレンシングの結果がｓｇＲＮＡ配列に依存していることを示す。
【図１Ｆ】長期遺伝子サイレンシングのためのオールインワンタンパク質のエンジニアリングについて説明する。図１Ａは、ＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１７）リンカーによって隔てられているｄＣａｓ９（配列番号２３）の−Ｎ末端に融合されたＫＲＡＢドメインおよびｄＣａｓ９のＣ末端にＤｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ（ＥＡＳＧＳＧＲＡＳＰＧＩＰＧＳＴＲ（配列番号１９）リンカーによって隔てられている）を有する本開示のオールインワンタンパク質（配列番号１）の概略図である。図１Ｂは、永続的な遺伝子サイレンシングについて試験されたｄＣａｓ９融合エピジェネティックモジュレーターの概略図を提供する。ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）適用に関するＧｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１３から採用される。ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ融合は、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１６から採用される。本発明者らは、ＫＲＡＢドメイン（配列番号１６）、ｄＣａｓ９（Ｄ１０Ａ、Ｈ２０８Ａ）、Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ（配列番号３３、ここで、Ｄｎｍｔ３Ａは配列番号２６でありかつＤｎｍｔ３Ｌは配列番号２８である）を１つのポリペプチドに統合する新規なオールインワンタンパク質を設計した。図１Ｃは、オールインワンタンパク質による長期サイレンシングを評価するために使用されたメチル化感受性ＧＦＰレポーター（Ｓｔｅｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１５から採用）の概略図を示す。図１Ｄ〜１Ｅは、図３に示されるＧＦＰレポーターを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるヒットエンドラン実験ワークフローの図および結果を提供する。図１Ｄは、プラスミドが細胞内にコトランスフェクトされたことを示し、一方はヒットエンドランタンパク質をコードし、もう一方はｓｇＲＮＡをコードするプラスミドである。図１Ｅは、オールインワンプラスミドおよびｓｇＲＮＡプラスミドでコトランスフェクトされた細胞について選別されたヒットエンドランアッセイの結果を示す。図１Ｆは、ＧＦＰレポーターのサイレンシングの結果がｓｇＲＮＡ配列に依存していることを示す。
【図２Ａ】内在性遺伝子の長期サイレンシングについて説明する。図２Ａ〜２Ｃは、オールインワンタンパク質を使用する長期サイレンシングのための遺伝子（ＣＤ２９、ＣＤ８１、ＣＤ１５１）標的化に続くトランスフェクションの２２日後に取得された代表的なフローサイトメトリーデータである。象限ＩＶは、遺伝子がオフになっている細胞を表し、遺伝子がオフになっている細胞のパーセンテージ（すなわち、それぞれ４５％、６６％、５３％）で示した。図２Ｄは、３つの異なるｓｇＲＮＡによるＣＤ２９、ＣＤ８１、およびＣＤ１５１のサイレンシングの定量化を提供する。図２Ｅは、異なる遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡの同時送達によってオールインタンパク質が多重化され得ることを示すため、２つまたは３つの遺伝子を同時にサイレンシングすることの定量化を提供する。図２Ｆは、細胞の大部分がＣＬＴＡ遺伝子を安定的にオフにしていることを意味する、オールインワンタンパク質およびＣＬＴＡ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡのトランスフェクションの９ヶ月後に取得された時点を表すプロットを提供する。
【図２Ｂ】内在性遺伝子の長期サイレンシングについて説明する。図２Ａ〜２Ｃは、オールインワンタンパク質を使用する長期サイレンシングのための遺伝子（ＣＤ２９、ＣＤ８１、ＣＤ１５１）標的化に続くトランスフェクションの２２日後に取得された代表的なフローサイトメトリーデータである。象限ＩＶは、遺伝子がオフになっている細胞を表し、遺伝子がオフになっている細胞のパーセンテージ（すなわち、それぞれ４５％、６６％、５３％）で示した。図２Ｄは、３つの異なるｓｇＲＮＡによるＣＤ２９、ＣＤ８１、およびＣＤ１５１のサイレンシングの定量化を提供する。図２Ｅは、異なる遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡの同時送達によってオールインタンパク質が多重化され得ることを示すため、２つまたは３つの遺伝子を同時にサイレンシングすることの定量化を提供する。図２Ｆは、細胞の大部分がＣＬＴＡ遺伝子を安定的にオフにしていることを意味する、オールインワンタンパク質およびＣＬＴＡ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡのトランスフェクションの９ヶ月後に取得された時点を表すプロットを提供する。
【図２Ｃ】内在性遺伝子の長期サイレンシングについて説明する。図２Ａ〜２Ｃは、オールインワンタンパク質を使用する長期サイレンシングのための遺伝子（ＣＤ２９、ＣＤ８１、ＣＤ１５１）標的化に続くトランスフェクションの２２日後に取得された代表的なフローサイトメトリーデータである。象限ＩＶは、遺伝子がオフになっている細胞を表し、遺伝子がオフになっている細胞のパーセンテージ（すなわち、それぞれ４５％、６６％、５３％）で示した。図２Ｄは、３つの異なるｓｇＲＮＡによるＣＤ２９、ＣＤ８１、およびＣＤ１５１のサイレンシングの定量化を提供する。図２Ｅは、異なる遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡの同時送達によってオールインタンパク質が多重化され得ることを示すため、２つまたは３つの遺伝子を同時にサイレンシングすることの定量化を提供する。図２Ｆは、細胞の大部分がＣＬＴＡ遺伝子を安定的にオフにしていることを意味する、オールインワンタンパク質およびＣＬＴＡ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡのトランスフェクションの９ヶ月後に取得された時点を表すプロットを提供する。
【図２Ｄ】内在性遺伝子の長期サイレンシングについて説明する。図２Ａ〜２Ｃは、オールインワンタンパク質を使用する長期サイレンシングのための遺伝子（ＣＤ２９、ＣＤ８１、ＣＤ１５１）標的化に続くトランスフェクションの２２日後に取得された代表的なフローサイトメトリーデータである。象限ＩＶは、遺伝子がオフになっている細胞を表し、遺伝子がオフになっている細胞のパーセンテージ（すなわち、それぞれ４５％、６６％、５３％）で示した。図２Ｄは、３つの異なるｓｇＲＮＡによるＣＤ２９、ＣＤ８１、およびＣＤ１５１のサイレンシングの定量化を提供する。図２Ｅは、異なる遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡの同時送達によってオールインタンパク質が多重化され得ることを示すため、２つまたは３つの遺伝子を同時にサイレンシングすることの定量化を提供する。図２Ｆは、細胞の大部分がＣＬＴＡ遺伝子を安定的にオフにしていることを意味する、オールインワンタンパク質およびＣＬＴＡ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡのトランスフェクションの９ヶ月後に取得された時点を表すプロットを提供する。
【図２Ｅ】内在性遺伝子の長期サイレンシングについて説明する。図２Ａ〜２Ｃは、オールインワンタンパク質を使用する長期サイレンシングのための遺伝子（ＣＤ２９、ＣＤ８１、ＣＤ１５１）標的化に続くトランスフェクションの２２日後に取得された代表的なフローサイトメトリーデータである。象限ＩＶは、遺伝子がオフになっている細胞を表し、遺伝子がオフになっている細胞のパーセンテージ（すなわち、それぞれ４５％、６６％、５３％）で示した。図２Ｄは、３つの異なるｓｇＲＮＡによるＣＤ２９、ＣＤ８１、およびＣＤ１５１のサイレンシングの定量化を提供する。図２Ｅは、異なる遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡの同時送達によってオールインタンパク質が多重化され得ることを示すため、２つまたは３つの遺伝子を同時にサイレンシングすることの定量化を提供する。図２Ｆは、細胞の大部分がＣＬＴＡ遺伝子を安定的にオフにしていることを意味する、オールインワンタンパク質およびＣＬＴＡ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡのトランスフェクションの９ヶ月後に取得された時点を表すプロットを提供する。
【図２Ｆ】内在性遺伝子の長期サイレンシングについて説明する。図２Ａ〜２Ｃは、オールインワンタンパク質を使用する長期サイレンシングのための遺伝子（ＣＤ２９、ＣＤ８１、ＣＤ１５１）標的化に続くトランスフェクションの２２日後に取得された代表的なフローサイトメトリーデータである。象限ＩＶは、遺伝子がオフになっている細胞を表し、遺伝子がオフになっている細胞のパーセンテージ（すなわち、それぞれ４５％、６６％、５３％）で示した。図２Ｄは、３つの異なるｓｇＲＮＡによるＣＤ２９、ＣＤ８１、およびＣＤ１５１のサイレンシングの定量化を提供する。図２Ｅは、異なる遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡの同時送達によってオールインタンパク質が多重化され得ることを示すため、２つまたは３つの遺伝子を同時にサイレンシングすることの定量化を提供する。図２Ｆは、細胞の大部分がＣＬＴＡ遺伝子を安定的にオフにしていることを意味する、オールインワンタンパク質およびＣＬＴＡ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡのトランスフェクションの９ヶ月後に取得された時点を表すプロットを提供する。
【図３Ａ】内在性遺伝子の長期サイレンシングについて説明する。図３Ａ〜３Ｃは、収集された細胞が、それらのＲＮＡ発現プロファイルによって決定されるように、トランスフェクションの３６日後にＣＤ２９（図３Ａ）、ＣＤ８１（図３Ｂ）、およびＣＤ１５１（図３Ｃ）の発現を失ったことを示す。図３Ｄ〜３Ｆは、標的遺伝子ＣＤ２９（図３Ｄ）、ＣＤ８１（図３Ｅ）およびＣＤ１５１（図３Ｆ）が、各実験でノックダウンされた唯一の有意な遺伝子であることを示すボルケーノプロットであり、遺伝子サイレンシングの高い特異性を意味する。図３Ｇ〜３Ｉは、標的遺伝子のそれぞれの９６％を超えるノックダウンを示す、ＣＤ１５１（図３Ｇ）、ＣＤ８１（図３Ｈ）、およびＣＤ２９（図３Ｉ）の転写レベルの定量化を提供する。
【図３Ｂ】内在性遺伝子の長期サイレンシングについて説明する。図３Ａ〜３Ｃは、収集された細胞が、それらのＲＮＡ発現プロファイルによって決定されるように、トランスフェクションの３６日後にＣＤ２９（図３Ａ）、ＣＤ８１（図３Ｂ）、およびＣＤ１５１（図３Ｃ）の発現を失ったことを示す。図３Ｄ〜３Ｆは、標的遺伝子ＣＤ２９（図３Ｄ）、ＣＤ８１（図３Ｅ）およびＣＤ１５１（図３Ｆ）が、各実験でノックダウンされた唯一の有意な遺伝子であることを示すボルケーノプロットであり、遺伝子サイレンシングの高い特異性を意味する。図３Ｇ〜３Ｉは、標的遺伝子のそれぞれの９６％を超えるノックダウンを示す、ＣＤ１５１（図３Ｇ）、ＣＤ８１（図３Ｈ）、およびＣＤ２９（図３Ｉ）の転写レベルの定量化を提供する。
【図３Ｃ】内在性遺伝子の長期サイレンシングについて説明する。図３Ａ〜３Ｃは、収集された細胞が、それらのＲＮＡ発現プロファイルによって決定されるように、トランスフェクションの３６日後にＣＤ２９（図３Ａ）、ＣＤ８１（図３Ｂ）、およびＣＤ１５１（図３Ｃ）の発現を失ったことを示す。図３Ｄ〜３Ｆは、標的遺伝子ＣＤ２９（図３Ｄ）、ＣＤ８１（図３Ｅ）およびＣＤ１５１（図３Ｆ）が、各実験でノックダウンされた唯一の有意な遺伝子であることを示すボルケーノプロットであり、遺伝子サイレンシングの高い特異性を意味する。図３Ｇ〜３Ｉは、標的遺伝子のそれぞれの９６％を超えるノックダウンを示す、ＣＤ１５１（図３Ｇ）、ＣＤ８１（図３Ｈ）、およびＣＤ２９（図３Ｉ）の転写レベルの定量化を提供する。
【図３Ｄ】内在性遺伝子の長期サイレンシングについて説明する。図３Ａ〜３Ｃは、収集された細胞が、それらのＲＮＡ発現プロファイルによって決定されるように、トランスフェクションの３６日後にＣＤ２９（図３Ａ）、ＣＤ８１（図３Ｂ）、およびＣＤ１５１（図３Ｃ）の発現を失ったことを示す。図３Ｄ〜３Ｆは、標的遺伝子ＣＤ２９（図３Ｄ）、ＣＤ８１（図３Ｅ）およびＣＤ１５１（図３Ｆ）が、各実験でノックダウンされた唯一の有意な遺伝子であることを示すボルケーノプロットであり、遺伝子サイレンシングの高い特異性を意味する。図３Ｇ〜３Ｉは、標的遺伝子のそれぞれの９６％を超えるノックダウンを示す、ＣＤ１５１（図３Ｇ）、ＣＤ８１（図３Ｈ）、およびＣＤ２９（図３Ｉ）の転写レベルの定量化を提供する。
【図３Ｅ】内在性遺伝子の長期サイレンシングについて説明する。図３Ａ〜３Ｃは、収集された細胞が、それらのＲＮＡ発現プロファイルによって決定されるように、トランスフェクションの３６日後にＣＤ２９（図３Ａ）、ＣＤ８１（図３Ｂ）、およびＣＤ１５１（図３Ｃ）の発現を失ったことを示す。図３Ｄ〜３Ｆは、標的遺伝子ＣＤ２９（図３Ｄ）、ＣＤ８１（図３Ｅ）およびＣＤ１５１（図３Ｆ）が、各実験でノックダウンされた唯一の有意な遺伝子であることを示すボルケーノプロットであり、遺伝子サイレンシングの高い特異性を意味する。図３Ｇ〜３Ｉは、標的遺伝子のそれぞれの９６％を超えるノックダウンを示す、ＣＤ１５１（図３Ｇ）、ＣＤ８１（図３Ｈ）、およびＣＤ２９（図３Ｉ）の転写レベルの定量化を提供する。
【図３Ｆ】内在性遺伝子の長期サイレンシングについて説明する。図３Ａ〜３Ｃは、収集された細胞が、それらのＲＮＡ発現プロファイルによって決定されるように、トランスフェクションの３６日後にＣＤ２９（図３Ａ）、ＣＤ８１（図３Ｂ）、およびＣＤ１５１（図３Ｃ）の発現を失ったことを示す。図３Ｄ〜３Ｆは、標的遺伝子ＣＤ２９（図３Ｄ）、ＣＤ８１（図３Ｅ）およびＣＤ１５１（図３Ｆ）が、各実験でノックダウンされた唯一の有意な遺伝子であることを示すボルケーノプロットであり、遺伝子サイレンシングの高い特異性を意味する。図３Ｇ〜３Ｉは、標的遺伝子のそれぞれの９６％を超えるノックダウンを示す、ＣＤ１５１（図３Ｇ）、ＣＤ８１（図３Ｈ）、およびＣＤ２９（図３Ｉ）の転写レベルの定量化を提供する。
【図３Ｇ】内在性遺伝子の長期サイレンシングについて説明する。図３Ａ〜３Ｃは、収集された細胞が、それらのＲＮＡ発現プロファイルによって決定されるように、トランスフェクションの３６日後にＣＤ２９（図３Ａ）、ＣＤ８１（図３Ｂ）、およびＣＤ１５１（図３Ｃ）の発現を失ったことを示す。図３Ｄ〜３Ｆは、標的遺伝子ＣＤ２９（図３Ｄ）、ＣＤ８１（図３Ｅ）およびＣＤ１５１（図３Ｆ）が、各実験でノックダウンされた唯一の有意な遺伝子であることを示すボルケーノプロットであり、遺伝子サイレンシングの高い特異性を意味する。図３Ｇ〜３Ｉは、標的遺伝子のそれぞれの９６％を超えるノックダウンを示す、ＣＤ１５１（図３Ｇ）、ＣＤ８１（図３Ｈ）、およびＣＤ２９（図３Ｉ）の転写レベルの定量化を提供する。
【図３Ｈ】内在性遺伝子の長期サイレンシングについて説明する。図３Ａ〜３Ｃは、収集された細胞が、それらのＲＮＡ発現プロファイルによって決定されるように、トランスフェクションの３６日後にＣＤ２９（図３Ａ）、ＣＤ８１（図３Ｂ）、およびＣＤ１５１（図３Ｃ）の発現を失ったことを示す。図３Ｄ〜３Ｆは、標的遺伝子ＣＤ２９（図３Ｄ）、ＣＤ８１（図３Ｅ）およびＣＤ１５１（図３Ｆ）が、各実験でノックダウンされた唯一の有意な遺伝子であることを示すボルケーノプロットであり、遺伝子サイレンシングの高い特異性を意味する。図３Ｇ〜３Ｉは、標的遺伝子のそれぞれの９６％を超えるノックダウンを示す、ＣＤ１５１（図３Ｇ）、ＣＤ８１（図３Ｈ）、およびＣＤ２９（図３Ｉ）の転写レベルの定量化を提供する。
【図３Ｉ】内在性遺伝子の長期サイレンシングについて説明する。図３Ａ〜３Ｃは、収集された細胞が、それらのＲＮＡ発現プロファイルによって決定されるように、トランスフェクションの３６日後にＣＤ２９（図３Ａ）、ＣＤ８１（図３Ｂ）、およびＣＤ１５１（図３Ｃ）の発現を失ったことを示す。図３Ｄ〜３Ｆは、標的遺伝子ＣＤ２９（図３Ｄ）、ＣＤ８１（図３Ｅ）およびＣＤ１５１（図３Ｆ）が、各実験でノックダウンされた唯一の有意な遺伝子であることを示すボルケーノプロットであり、遺伝子サイレンシングの高い特異性を意味する。図３Ｇ〜３Ｉは、標的遺伝子のそれぞれの９６％を超えるノックダウンを示す、ＣＤ１５１（図３Ｇ）、ＣＤ８１（図３Ｈ）、およびＣＤ２９（図３Ｉ）の転写レベルの定量化を提供する。
【図４Ａ】異なる哺乳動物細胞株における長期遺伝子サイレンシングについて説明する。図４Ａ〜４Ｆは、ＨｅＬａ（頸部）（図４Ａ）、Ｕ２ＯＳ（骨）（図４Ｂ）、およびヒト人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）（図４Ｃ）におけるＢＦＰ発現（オールインワンタンパク質に融合）を示すフローサイトメトリープロットである。図４Ｄ〜４Ｆは、それぞれ、図４Ａ〜４Ｃのトランスフェクトされなかった対照である。図４Ｇは、オールインワンタンパク質でのトランスフェクションの１８日後に測定された、ＨｅＬａおよびＵ２ＯＳ細胞における内在性遺伝子の安定したサイレンシングが達成されたことを示している。図４Ａ〜４Ｆでは、ｘ軸はＢＦＰ（オールインワンタンパク質に融合）であり、ｙ軸はｍＣｈｅｒｒｙである。図４Ｈは、Ｐｃｓｋ９、Ｎｐｃ１、Ｓｐｃｓ１、およびＣｄ８１を標的とした場合、ＡＭＬ１２マウス肝細胞株でｑＰＣＲによるトランスフェクションの１４日後に遺伝子サイレンシングが検出されたことを示している。
【図４Ｂ】異なる哺乳動物細胞株における長期遺伝子サイレンシングについて説明する。図４Ａ〜４Ｆは、ＨｅＬａ（頸部）（図４Ａ）、Ｕ２ＯＳ（骨）（図４Ｂ）、およびヒト人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）（図４Ｃ）におけるＢＦＰ発現（オールインワンタンパク質に融合）を示すフローサイトメトリープロットである。図４Ｄ〜４Ｆは、それぞれ、図４Ａ〜４Ｃのトランスフェクトされなかった対照である。図４Ｇは、オールインワンタンパク質でのトランスフェクションの１８日後に測定された、ＨｅＬａおよびＵ２ＯＳ細胞における内在性遺伝子の安定したサイレンシングが達成されたことを示している。図４Ａ〜４Ｆでは、ｘ軸はＢＦＰ（オールインワンタンパク質に融合）であり、ｙ軸はｍＣｈｅｒｒｙである。図４Ｈは、Ｐｃｓｋ９、Ｎｐｃ１、Ｓｐｃｓ１、およびＣｄ８１を標的とした場合、ＡＭＬ１２マウス肝細胞株でｑＰＣＲによるトランスフェクションの１４日後に遺伝子サイレンシングが検出されたことを示している。
【図４Ｃ】異なる哺乳動物細胞株における長期遺伝子サイレンシングについて説明する。図４Ａ〜４Ｆは、ＨｅＬａ（頸部）（図４Ａ）、Ｕ２ＯＳ（骨）（図４Ｂ）、およびヒト人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）（図４Ｃ）におけるＢＦＰ発現（オールインワンタンパク質に融合）を示すフローサイトメトリープロットである。図４Ｄ〜４Ｆは、それぞれ、図４Ａ〜４Ｃのトランスフェクトされなかった対照である。図４Ｇは、オールインワンタンパク質でのトランスフェクションの１８日後に測定された、ＨｅＬａおよびＵ２ＯＳ細胞における内在性遺伝子の安定したサイレンシングが達成されたことを示している。図４Ａ〜４Ｆでは、ｘ軸はＢＦＰ（オールインワンタンパク質に融合）であり、ｙ軸はｍＣｈｅｒｒｙである。図４Ｈは、Ｐｃｓｋ９、Ｎｐｃ１、Ｓｐｃｓ１、およびＣｄ８１を標的とした場合、ＡＭＬ１２マウス肝細胞株でｑＰＣＲによるトランスフェクションの１４日後に遺伝子サイレンシングが検出されたことを示している。
【図４Ｄ】異なる哺乳動物細胞株における長期遺伝子サイレンシングについて説明する。図４Ａ〜４Ｆは、ＨｅＬａ（頸部）（図４Ａ）、Ｕ２ＯＳ（骨）（図４Ｂ）、およびヒト人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）（図４Ｃ）におけるＢＦＰ発現（オールインワンタンパク質に融合）を示すフローサイトメトリープロットである。図４Ｄ〜４Ｆは、それぞれ、図４Ａ〜４Ｃのトランスフェクトされなかった対照である。図４Ｇは、オールインワンタンパク質でのトランスフェクションの１８日後に測定された、ＨｅＬａおよびＵ２ＯＳ細胞における内在性遺伝子の安定したサイレンシングが達成されたことを示している。図４Ａ〜４Ｆでは、ｘ軸はＢＦＰ（オールインワンタンパク質に融合）であり、ｙ軸はｍＣｈｅｒｒｙである。図４Ｈは、Ｐｃｓｋ９、Ｎｐｃ１、Ｓｐｃｓ１、およびＣｄ８１を標的とした場合、ＡＭＬ１２マウス肝細胞株でｑＰＣＲによるトランスフェクションの１４日後に遺伝子サイレンシングが検出されたことを示している。
【図４Ｅ】異なる哺乳動物細胞株における長期遺伝子サイレンシングについて説明する。図４Ａ〜４Ｆは、ＨｅＬａ（頸部）（図４Ａ）、Ｕ２ＯＳ（骨）（図４Ｂ）、およびヒト人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）（図４Ｃ）におけるＢＦＰ発現（オールインワンタンパク質に融合）を示すフローサイトメトリープロットである。図４Ｄ〜４Ｆは、それぞれ、図４Ａ〜４Ｃのトランスフェクトされなかった対照である。図４Ｇは、オールインワンタンパク質でのトランスフェクションの１８日後に測定された、ＨｅＬａおよびＵ２ＯＳ細胞における内在性遺伝子の安定したサイレンシングが達成されたことを示している。図４Ａ〜４Ｆでは、ｘ軸はＢＦＰ（オールインワンタンパク質に融合）であり、ｙ軸はｍＣｈｅｒｒｙである。図４Ｈは、Ｐｃｓｋ９、Ｎｐｃ１、Ｓｐｃｓ１、およびＣｄ８１を標的とした場合、ＡＭＬ１２マウス肝細胞株でｑＰＣＲによるトランスフェクションの１４日後に遺伝子サイレンシングが検出されたことを示している。
【図４Ｆ】異なる哺乳動物細胞株における長期遺伝子サイレンシングについて説明する。図４Ａ〜４Ｆは、ＨｅＬａ（頸部）（図４Ａ）、Ｕ２ＯＳ（骨）（図４Ｂ）、およびヒト人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）（図４Ｃ）におけるＢＦＰ発現（オールインワンタンパク質に融合）を示すフローサイトメトリープロットである。図４Ｄ〜４Ｆは、それぞれ、図４Ａ〜４Ｃのトランスフェクトされなかった対照である。図４Ｇは、オールインワンタンパク質でのトランスフェクションの１８日後に測定された、ＨｅＬａおよびＵ２ＯＳ細胞における内在性遺伝子の安定したサイレンシングが達成されたことを示している。図４Ａ〜４Ｆでは、ｘ軸はＢＦＰ（オールインワンタンパク質に融合）であり、ｙ軸はｍＣｈｅｒｒｙである。図４Ｈは、Ｐｃｓｋ９、Ｎｐｃ１、Ｓｐｃｓ１、およびＣｄ８１を標的とした場合、ＡＭＬ１２マウス肝細胞株でｑＰＣＲによるトランスフェクションの１４日後に遺伝子サイレンシングが検出されたことを示している。
【図４Ｇ】異なる哺乳動物細胞株における長期遺伝子サイレンシングについて説明する。図４Ａ〜４Ｆは、ＨｅＬａ（頸部）（図４Ａ）、Ｕ２ＯＳ（骨）（図４Ｂ）、およびヒト人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）（図４Ｃ）におけるＢＦＰ発現（オールインワンタンパク質に融合）を示すフローサイトメトリープロットである。図４Ｄ〜４Ｆは、それぞれ、図４Ａ〜４Ｃのトランスフェクトされなかった対照である。図４Ｇは、オールインワンタンパク質でのトランスフェクションの１８日後に測定された、ＨｅＬａおよびＵ２ＯＳ細胞における内在性遺伝子の安定したサイレンシングが達成されたことを示している。図４Ａ〜４Ｆでは、ｘ軸はＢＦＰ（オールインワンタンパク質に融合）であり、ｙ軸はｍＣｈｅｒｒｙである。図４Ｈは、Ｐｃｓｋ９、Ｎｐｃ１、Ｓｐｃｓ１、およびＣｄ８１を標的とした場合、ＡＭＬ１２マウス肝細胞株でｑＰＣＲによるトランスフェクションの１４日後に遺伝子サイレンシングが検出されたことを示している。
【図４Ｈ】異なる哺乳動物細胞株における長期遺伝子サイレンシングについて説明する。図４Ａ〜４Ｆは、ＨｅＬａ（頸部）（図４Ａ）、Ｕ２ＯＳ（骨）（図４Ｂ）、およびヒト人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）（図４Ｃ）におけるＢＦＰ発現（オールインワンタンパク質に融合）を示すフローサイトメトリープロットである。図４Ｄ〜４Ｆは、それぞれ、図４Ａ〜４Ｃのトランスフェクトされなかった対照である。図４Ｇは、オールインワンタンパク質でのトランスフェクションの１８日後に測定された、ＨｅＬａおよびＵ２ＯＳ細胞における内在性遺伝子の安定したサイレンシングが達成されたことを示している。図４Ａ〜４Ｆでは、ｘ軸はＢＦＰ（オールインワンタンパク質に融合）であり、ｙ軸はｍＣｈｅｒｒｙである。図４Ｈは、Ｐｃｓｋ９、Ｎｐｃ１、Ｓｐｃｓ１、およびＣｄ８１を標的とした場合、ＡＭＬ１２マウス肝細胞株でｑＰＣＲによるトランスフェクションの１４日後に遺伝子サイレンシングが検出されたことを示している。
【図５】それぞれ、配列番号１〜１５に対応する融合タンパク質ｐ７６、ｐ９０〜ｐ１０２、ｐ１１２の概略図を提供する。
【図６Ａ】オールインワンタンパク質バリアントの遺伝子サイレンシング活性を説明する。図６Ａ〜６Ｂは、ＣＬＴＡ遺伝子の標的サイレンシングのためにＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされた配列番号１〜１５の融合タンパク質のトランスフェクションの１８日後の遺伝子サイレンシングの結果を示す。ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢおよびｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌの設計では、一過性であり、長期的なサイレンシングの効率が低いことが示された。図６Ｃ〜６Ｄは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で安定して発現されるＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ（Ｈ２Ｂ）内在性遺伝子（図６Ｃ）および合成Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーター遺伝子（図６Ｄ）をサイレンシングするための配列番号１（ｐ７６）および配列番号１５（ｐ１１２）の比較を提供する。図６Ｅは、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ（Ｈ２Ｂ）遺伝子をオフにするための５０日の時間経過にわたるｐ７６およびｐ１１２のタンパク質発現（点線）のプロットを提供する。タンパク質レベルは、オールインワンタンパク質と同時発現するＢＦＰのフローサイトメトリー検出によって測定された。
【図６Ｂ】オールインワンタンパク質バリアントの遺伝子サイレンシング活性を説明する。図６Ａ〜６Ｂは、ＣＬＴＡ遺伝子の標的サイレンシングのためにＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされた配列番号１〜１５の融合タンパク質のトランスフェクションの１８日後の遺伝子サイレンシングの結果を示す。ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢおよびｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌの設計では、一過性であり、長期的なサイレンシングの効率が低いことが示された。図６Ｃ〜６Ｄは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で安定して発現されるＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ（Ｈ２Ｂ）内在性遺伝子（図６Ｃ）および合成Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーター遺伝子（図６Ｄ）をサイレンシングするための配列番号１（ｐ７６）および配列番号１５（ｐ１１２）の比較を提供する。図６Ｅは、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ（Ｈ２Ｂ）遺伝子をオフにするための５０日の時間経過にわたるｐ７６およびｐ１１２のタンパク質発現（点線）のプロットを提供する。タンパク質レベルは、オールインワンタンパク質と同時発現するＢＦＰのフローサイトメトリー検出によって測定された。
【図６Ｃ】オールインワンタンパク質バリアントの遺伝子サイレンシング活性を説明する。図６Ａ〜６Ｂは、ＣＬＴＡ遺伝子の標的サイレンシングのためにＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされた配列番号１〜１５の融合タンパク質のトランスフェクションの１８日後の遺伝子サイレンシングの結果を示す。ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢおよびｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌの設計では、一過性であり、長期的なサイレンシングの効率が低いことが示された。図６Ｃ〜６Ｄは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で安定して発現されるＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ（Ｈ２Ｂ）内在性遺伝子（図６Ｃ）および合成Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーター遺伝子（図６Ｄ）をサイレンシングするための配列番号１（ｐ７６）および配列番号１５（ｐ１１２）の比較を提供する。図６Ｅは、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ（Ｈ２Ｂ）遺伝子をオフにするための５０日の時間経過にわたるｐ７６およびｐ１１２のタンパク質発現（点線）のプロットを提供する。タンパク質レベルは、オールインワンタンパク質と同時発現するＢＦＰのフローサイトメトリー検出によって測定された。
【図６Ｄ】オールインワンタンパク質バリアントの遺伝子サイレンシング活性を説明する。図６Ａ〜６Ｂは、ＣＬＴＡ遺伝子の標的サイレンシングのためにＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされた配列番号１〜１５の融合タンパク質のトランスフェクションの１８日後の遺伝子サイレンシングの結果を示す。ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢおよびｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌの設計では、一過性であり、長期的なサイレンシングの効率が低いことが示された。図６Ｃ〜６Ｄは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で安定して発現されるＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ（Ｈ２Ｂ）内在性遺伝子（図６Ｃ）および合成Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーター遺伝子（図６Ｄ）をサイレンシングするための配列番号１（ｐ７６）および配列番号１５（ｐ１１２）の比較を提供する。図６Ｅは、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ（Ｈ２Ｂ）遺伝子をオフにするための５０日の時間経過にわたるｐ７６およびｐ１１２のタンパク質発現（点線）のプロットを提供する。タンパク質レベルは、オールインワンタンパク質と同時発現するＢＦＰのフローサイトメトリー検出によって測定された。
【図６Ｅ】オールインワンタンパク質バリアントの遺伝子サイレンシング活性を説明する。図６Ａ〜６Ｂは、ＣＬＴＡ遺伝子の標的サイレンシングのためにＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされた配列番号１〜１５の融合タンパク質のトランスフェクションの１８日後の遺伝子サイレンシングの結果を示す。ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢおよびｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌの設計では、一過性であり、長期的なサイレンシングの効率が低いことが示された。図６Ｃ〜６Ｄは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で安定して発現されるＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ（Ｈ２Ｂ）内在性遺伝子（図６Ｃ）および合成Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーター遺伝子（図６Ｄ）をサイレンシングするための配列番号１（ｐ７６）および配列番号１５（ｐ１１２）の比較を提供する。図６Ｅは、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ（Ｈ２Ｂ）遺伝子をオフにするための５０日の時間経過にわたるｐ７６およびｐ１１２のタンパク質発現（点線）のプロットを提供する。タンパク質レベルは、オールインワンタンパク質と同時発現するＢＦＰのフローサイトメトリー検出によって測定された。
【図７Ａ】オールインワンタンパク質バリアントのウエスタンブロットを提供する。図７Ａは、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９に対する抗体を使用するオールインワンタンパク質バリアントｐ７６およびｐ９０〜ｐ１０２のウエスタンブロット分析である。上のバンドは完全長のタンパク質を表し、小さいサイズのバンドはオールインワンタンパク質のタンパク質分解を表す。図７Ｂは、融合タンパク質から切断された遊離Ｄｎｍｔ３Ａを検出するためのオールインワンタンパク質バリアントのウエスタンブロット分析である。
【図７Ｂ】オールインワンタンパク質バリアントのウエスタンブロットを提供する。図７Ａは、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９に対する抗体を使用するオールインワンタンパク質バリアントｐ７６およびｐ９０〜ｐ１０２のウエスタンブロット分析である。上のバンドは完全長のタンパク質を表し、小さいサイズのバンドはオールインワンタンパク質のタンパク質分解を表す。図７Ｂは、融合タンパク質から切断された遊離Ｄｎｍｔ３Ａを検出するためのオールインワンタンパク質バリアントのウエスタンブロット分析である。
【図８Ａ】最適なｓｇＲＮＡを決定するためのプールされたスクリーンについて説明する。図８Ａは、長期の遺伝子サイレンシングをもたらす最適なｓｇＲＮＡを決定するためのプールされたスクリーンの概略図である。図８Ｂ〜８Ｅは、トランスフェクションの４週間後に遺伝子サイレンシングを受けている細胞のパーセントのフローサイトメトリーヒストグラムである。ＣＬＴＡ（図８Ｂ）、ＶＩＭ（図８Ｃ）、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ（Ｈ２Ｂ）（図８Ｄ）、およびＲＡＢ１１Ａ（図８Ｅ）を含む、それぞれがＧＦＰタグを有する異なる遺伝子を有する４つのＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を使用した。
【図８Ｂ】最適なｓｇＲＮＡを決定するためのプールされたスクリーンについて説明する。図８Ａは、長期の遺伝子サイレンシングをもたらす最適なｓｇＲＮＡを決定するためのプールされたスクリーンの概略図である。図８Ｂ〜８Ｅは、トランスフェクションの４週間後に遺伝子サイレンシングを受けている細胞のパーセントのフローサイトメトリーヒストグラムである。ＣＬＴＡ（図８Ｂ）、ＶＩＭ（図８Ｃ）、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ（Ｈ２Ｂ）（図８Ｄ）、およびＲＡＢ１１Ａ（図８Ｅ）を含む、それぞれがＧＦＰタグを有する異なる遺伝子を有する４つのＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を使用した。
【図８Ｃ】最適なｓｇＲＮＡを決定するためのプールされたスクリーンについて説明する。図８Ａは、長期の遺伝子サイレンシングをもたらす最適なｓｇＲＮＡを決定するためのプールされたスクリーンの概略図である。図８Ｂ〜８Ｅは、トランスフェクションの４週間後に遺伝子サイレンシングを受けている細胞のパーセントのフローサイトメトリーヒストグラムである。ＣＬＴＡ（図８Ｂ）、ＶＩＭ（図８Ｃ）、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ（Ｈ２Ｂ）（図８Ｄ）、およびＲＡＢ１１Ａ（図８Ｅ）を含む、それぞれがＧＦＰタグを有する異なる遺伝子を有する４つのＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を使用した。
【図８Ｄ】最適なｓｇＲＮＡを決定するためのプールされたスクリーンについて説明する。図８Ａは、長期の遺伝子サイレンシングをもたらす最適なｓｇＲＮＡを決定するためのプールされたスクリーンの概略図である。図８Ｂ〜８Ｅは、トランスフェクションの４週間後に遺伝子サイレンシングを受けている細胞のパーセントのフローサイトメトリーヒストグラムである。ＣＬＴＡ（図８Ｂ）、ＶＩＭ（図８Ｃ）、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ（Ｈ２Ｂ）（図８Ｄ）、およびＲＡＢ１１Ａ（図８Ｅ）を含む、それぞれがＧＦＰタグを有する異なる遺伝子を有する４つのＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を使用した。
【図８Ｅ】最適なｓｇＲＮＡを決定するためのプールされたスクリーンについて説明する。図８Ａは、長期の遺伝子サイレンシングをもたらす最適なｓｇＲＮＡを決定するためのプールされたスクリーンの概略図である。図８Ｂ〜８Ｅは、トランスフェクションの４週間後に遺伝子サイレンシングを受けている細胞のパーセントのフローサイトメトリーヒストグラムである。ＣＬＴＡ（図８Ｂ）、ＶＩＭ（図８Ｃ）、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ（Ｈ２Ｂ）（図８Ｄ）、およびＲＡＢ１１Ａ（図８Ｅ）を含む、それぞれがＧＦＰタグを有する異なる遺伝子を有する４つのＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を使用した。
【図９Ａ】は、ＣＬＴＡ（図９Ａ）、Ｈ２Ｂ（図９Ｂ）、ＲＡＢ１１（図９Ｃ）、およびＶＩＭ（図９Ｄ）を含む、標的遺伝子の転写開始部位にまたがるｓｇＲＮＡ機能性のマップである。転写開始部位（ＴＳＳ）とＣｐＧアイランドは、各プロットの上に注釈が付けられている。各ドットは１つのｓｇＲＮＡを表し、長期遺伝子サイレンシングにおけるその有効性は、ｓｇＲＮＡの存在量のｌｏｇ２倍変化としてプロットされる。ヌクレオソーム占有率（下のプロット）は、ＭＮａｓｅシグナルからプロットされる。
【図９Ｂ】は、ＣＬＴＡ（図９Ａ）、Ｈ２Ｂ（図９Ｂ）、ＲＡＢ１１（図９Ｃ）、およびＶＩＭ（図９Ｄ）を含む、標的遺伝子の転写開始部位にまたがるｓｇＲＮＡ機能性のマップである。転写開始部位（ＴＳＳ）とＣｐＧアイランドは、各プロットの上に注釈が付けられている。各ドットは１つのｓｇＲＮＡを表し、長期遺伝子サイレンシングにおけるその有効性は、ｓｇＲＮＡの存在量のｌｏｇ２倍変化としてプロットされる。ヌクレオソーム占有率（下のプロット）は、ＭＮａｓｅシグナルからプロットされる。
【図９Ｃ】は、ＣＬＴＡ（図９Ａ）、Ｈ２Ｂ（図９Ｂ）、ＲＡＢ１１（図９Ｃ）、およびＶＩＭ（図９Ｄ）を含む、標的遺伝子の転写開始部位にまたがるｓｇＲＮＡ機能性のマップである。転写開始部位（ＴＳＳ）とＣｐＧアイランドは、各プロットの上に注釈が付けられている。各ドットは１つのｓｇＲＮＡを表し、長期遺伝子サイレンシングにおけるその有効性は、ｓｇＲＮＡの存在量のｌｏｇ２倍変化としてプロットされる。ヌクレオソーム占有率（下のプロット）は、ＭＮａｓｅシグナルからプロットされる。
【図９Ｄ】は、ＣＬＴＡ（図９Ａ）、Ｈ２Ｂ（図９Ｂ）、ＲＡＢ１１（図９Ｃ）、およびＶＩＭ（図９Ｄ）を含む、標的遺伝子の転写開始部位にまたがるｓｇＲＮＡ機能性のマップである。転写開始部位（ＴＳＳ）とＣｐＧアイランドは、各プロットの上に注釈が付けられている。各ドットは１つのｓｇＲＮＡを表し、長期遺伝子サイレンシングにおけるその有効性は、ｓｇＲＮＡの存在量のｌｏｇ２倍変化としてプロットされる。ヌクレオソーム占有率（下のプロット）は、ＭＮａｓｅシグナルからプロットされる。
【図１０Ａ】長期遺伝子サイレンシングのための機能的なｓｇＲＮＡについて説明する。図１０Ａは、オールインワンタンパク質の最適なｓｇＲＮＡ標的化位置を決定するためのＨＥＫ２９３Ｔ細胞のプールされたスクリーンのワークフローであり、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢに最適なｓｇＲＮＡを決定するためのＫ５６２細胞での従来のリシンタイリングスクリーンから採用されている（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｈｏｒｌｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１４）。図１０Ｂ〜１０Ｅは、Ｋ５６２細胞の既存のｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ／ＣＲＩＳＰＲｉデータセット（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｈｏｒｌｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１４）からの、ＡＲＬ１（図１０Ｂ）、ＥＩＦ６（図１０Ｃ）、ＳＭＣ３（図１０Ｄ）、ＨＥＡＴＲ１（図１０Ｅ）を含む、４つの遺伝子の増殖表現型を、オールインワンタンパク質（下のプロット）とともに、示す代表的なプロットである。各ドットはｓｇＲＮＡを表す。ＴＳＳおよび注釈付きＣｐＧアイランドが各遺伝子について示される。
【図１０Ｂ】長期遺伝子サイレンシングのための機能的なｓｇＲＮＡについて説明する。図１０Ａは、オールインワンタンパク質の最適なｓｇＲＮＡ標的化位置を決定するためのＨＥＫ２９３Ｔ細胞のプールされたスクリーンのワークフローであり、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢに最適なｓｇＲＮＡを決定するためのＫ５６２細胞での従来のリシンタイリングスクリーンから採用されている（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｈｏｒｌｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１４）。図１０Ｂ〜１０Ｅは、Ｋ５６２細胞の既存のｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ／ＣＲＩＳＰＲｉデータセット（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｈｏｒｌｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１４）からの、ＡＲＬ１（図１０Ｂ）、ＥＩＦ６（図１０Ｃ）、ＳＭＣ３（図１０Ｄ）、ＨＥＡＴＲ１（図１０Ｅ）を含む、４つの遺伝子の増殖表現型を、オールインワンタンパク質（下のプロット）とともに、示す代表的なプロットである。各ドットはｓｇＲＮＡを表す。ＴＳＳおよび注釈付きＣｐＧアイランドが各遺伝子について示される。
【図１０Ｃ】長期遺伝子サイレンシングのための機能的なｓｇＲＮＡについて説明する。図１０Ａは、オールインワンタンパク質の最適なｓｇＲＮＡ標的化位置を決定するためのＨＥＫ２９３Ｔ細胞のプールされたスクリーンのワークフローであり、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢに最適なｓｇＲＮＡを決定するためのＫ５６２細胞での従来のリシンタイリングスクリーンから採用されている（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｈｏｒｌｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１４）。図１０Ｂ〜１０Ｅは、Ｋ５６２細胞の既存のｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ／ＣＲＩＳＰＲｉデータセット（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｈｏｒｌｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１４）からの、ＡＲＬ１（図１０Ｂ）、ＥＩＦ６（図１０Ｃ）、ＳＭＣ３（図１０Ｄ）、ＨＥＡＴＲ１（図１０Ｅ）を含む、４つの遺伝子の増殖表現型を、オールインワンタンパク質（下のプロット）とともに、示す代表的なプロットである。各ドットはｓｇＲＮＡを表す。ＴＳＳおよび注釈付きＣｐＧアイランドが各遺伝子について示される。
【図１０Ｄ】長期遺伝子サイレンシングのための機能的なｓｇＲＮＡについて説明する。図１０Ａは、オールインワンタンパク質の最適なｓｇＲＮＡ標的化位置を決定するためのＨＥＫ２９３Ｔ細胞のプールされたスクリーンのワークフローであり、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢに最適なｓｇＲＮＡを決定するためのＫ５６２細胞での従来のリシンタイリングスクリーンから採用されている（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｈｏｒｌｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１４）。図１０Ｂ〜１０Ｅは、Ｋ５６２細胞の既存のｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ／ＣＲＩＳＰＲｉデータセット（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｈｏｒｌｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１４）からの、ＡＲＬ１（図１０Ｂ）、ＥＩＦ６（図１０Ｃ）、ＳＭＣ３（図１０Ｄ）、ＨＥＡＴＲ１（図１０Ｅ）を含む、４つの遺伝子の増殖表現型を、オールインワンタンパク質（下のプロット）とともに、示す代表的なプロットである。各ドットはｓｇＲＮＡを表す。ＴＳＳおよび注釈付きＣｐＧアイランドが各遺伝子について示される。
【図１０Ｅ】長期遺伝子サイレンシングのための機能的なｓｇＲＮＡについて説明する。図１０Ａは、オールインワンタンパク質の最適なｓｇＲＮＡ標的化位置を決定するためのＨＥＫ２９３Ｔ細胞のプールされたスクリーンのワークフローであり、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢに最適なｓｇＲＮＡを決定するためのＫ５６２細胞での従来のリシンタイリングスクリーンから採用されている（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｈｏｒｌｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１４）。図１０Ｂ〜１０Ｅは、Ｋ５６２細胞の既存のｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ／ＣＲＩＳＰＲｉデータセット（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｈｏｒｌｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１４）からの、ＡＲＬ１（図１０Ｂ）、ＥＩＦ６（図１０Ｃ）、ＳＭＣ３（図１０Ｄ）、ＨＥＡＴＲ１（図１０Ｅ）を含む、４つの遺伝子の増殖表現型を、オールインワンタンパク質（下のプロット）とともに、示す代表的なプロットである。各ドットはｓｇＲＮＡを表す。ＴＳＳおよび注釈付きＣｐＧアイランドが各遺伝子について示される。
【図１１Ａ】ＶＰＳ５３（図１１Ａ）およびＶＰＳ５４（図１１Ｂ）の増殖表現型およびヌクレオソーム配置（ＭＮａｓｅシグナルからの）の比較を提供し、ヌクレオソーム枯渇領域における機能的ｓｇＲＮＡの位置を示す。
【図１１Ｂ】ＶＰＳ５３（図１１Ａ）およびＶＰＳ５４（図１１Ｂ）の増殖表現型およびヌクレオソーム配置（ＭＮａｓｅシグナルからの）の比較を提供し、ヌクレオソーム枯渇領域における機能的ｓｇＲＮＡの位置を示す。
【図１２Ａ】ｍＲＮＡ発現によるオールインワンタンパク質の送達を示す図１２Ａは各設計の完全長合成を示す２つのオールインワンバリアント（ｐ１０２およびｐ１１２）のインビトロ転写を示す。図１２Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのｍＲＮＡのトランスフェクションの１日後のｐ１０２およびｐ１１２の発現を示すフローサイトメトリープロットを提供する。図１２Ｃは、ｐ１０２およびｐ１１２オールインワンバリアントを発現するｍＲＮＡをトランスフェクトした後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣＬＴＡ内在性遺伝子サイレンシングの時間経過を提供する。
【図１２Ｂ】ｍＲＮＡ発現によるオールインワンタンパク質の送達を示す図１２Ａは各設計の完全長合成を示す２つのオールインワンバリアント（ｐ１０２およびｐ１１２）のインビトロ転写を示す。図１２Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのｍＲＮＡのトランスフェクションの１日後のｐ１０２およびｐ１１２の発現を示すフローサイトメトリープロットを提供する。図１２Ｃは、ｐ１０２およびｐ１１２オールインワンバリアントを発現するｍＲＮＡをトランスフェクトした後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣＬＴＡ内在性遺伝子サイレンシングの時間経過を提供する。
【図１２Ｃ】ｍＲＮＡ発現によるオールインワンタンパク質の送達を示す図１２Ａは各設計の完全長合成を示す２つのオールインワンバリアント（ｐ１０２およびｐ１１２）のインビトロ転写を示す。図１２Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのｍＲＮＡのトランスフェクションの１日後のｐ１０２およびｐ１１２の発現を示すフローサイトメトリープロットを提供する。図１２Ｃは、ｐ１０２およびｐ１１２オールインワンバリアントを発現するｍＲＮＡをトランスフェクトした後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣＬＴＡ内在性遺伝子サイレンシングの時間経過を提供する。
【図１３Ａ】ドキシサイクリン誘導によるオールインワンタンパク質の制御された発現を説明する。図１３Ａは、ドキシサイクリン誘導性プロモーター下でオールインワンタンパク質を安定してコードするＫ５６２細胞におけるドキシサイクリンの添加によるオールインワンタンパク質の誘導された発現を示すフローサイトメトリープロットを提供する。点線は、ドキシサイクリン投与なしでのベースライン中央値ＢＦＰ蛍光を表す。図１３Ｂは、ドキシサイクリン処理の前後のオールインワンタンパク質の発現を検出するための細胞のウエスタンブロットを提供する。図１３Ｃ〜１３Ｆは、Ｋ５６２細胞のドキシサイクリン処理の１４日後のＣＤ８１（図１３Ｃ〜１３Ｄ）およびＣＤ１５１（図１３Ｅ〜１３Ｆ）ノックダウンのフローサイトメトリープロットである。図１３Ｇは、ドキシサイクリン処理の１４日後またはドキシサイクリン処理なしのＣＤ８１およびＣＤ１５１ノックダウンの定量化を示す。
【図１３Ｂ】ドキシサイクリン誘導によるオールインワンタンパク質の制御された発現を説明する。図１３Ａは、ドキシサイクリン誘導性プロモーター下でオールインワンタンパク質を安定してコードするＫ５６２細胞におけるドキシサイクリンの添加によるオールインワンタンパク質の誘導された発現を示すフローサイトメトリープロットを提供する。点線は、ドキシサイクリン投与なしでのベースライン中央値ＢＦＰ蛍光を表す。図１３Ｂは、ドキシサイクリン処理の前後のオールインワンタンパク質の発現を検出するための細胞のウエスタンブロットを提供する。図１３Ｃ〜１３Ｆは、Ｋ５６２細胞のドキシサイクリン処理の１４日後のＣＤ８１（図１３Ｃ〜１３Ｄ）およびＣＤ１５１（図１３Ｅ〜１３Ｆ）ノックダウンのフローサイトメトリープロットである。図１３Ｇは、ドキシサイクリン処理の１４日後またはドキシサイクリン処理なしのＣＤ８１およびＣＤ１５１ノックダウンの定量化を示す。
【図１３Ｃ】ドキシサイクリン誘導によるオールインワンタンパク質の制御された発現を説明する。図１３Ａは、ドキシサイクリン誘導性プロモーター下でオールインワンタンパク質を安定してコードするＫ５６２細胞におけるドキシサイクリンの添加によるオールインワンタンパク質の誘導された発現を示すフローサイトメトリープロットを提供する。点線は、ドキシサイクリン投与なしでのベースライン中央値ＢＦＰ蛍光を表す。図１３Ｂは、ドキシサイクリン処理の前後のオールインワンタンパク質の発現を検出するための細胞のウエスタンブロットを提供する。図１３Ｃ〜１３Ｆは、Ｋ５６２細胞のドキシサイクリン処理の１４日後のＣＤ８１（図１３Ｃ〜１３Ｄ）およびＣＤ１５１（図１３Ｅ〜１３Ｆ）ノックダウンのフローサイトメトリープロットである。図１３Ｇは、ドキシサイクリン処理の１４日後またはドキシサイクリン処理なしのＣＤ８１およびＣＤ１５１ノックダウンの定量化を示す。
【図１３Ｄ】ドキシサイクリン誘導によるオールインワンタンパク質の制御された発現を説明する。図１３Ａは、ドキシサイクリン誘導性プロモーター下でオールインワンタンパク質を安定してコードするＫ５６２細胞におけるドキシサイクリンの添加によるオールインワンタンパク質の誘導された発現を示すフローサイトメトリープロットを提供する。点線は、ドキシサイクリン投与なしでのベースライン中央値ＢＦＰ蛍光を表す。図１３Ｂは、ドキシサイクリン処理の前後のオールインワンタンパク質の発現を検出するための細胞のウエスタンブロットを提供する。図１３Ｃ〜１３Ｆは、Ｋ５６２細胞のドキシサイクリン処理の１４日後のＣＤ８１（図１３Ｃ〜１３Ｄ）およびＣＤ１５１（図１３Ｅ〜１３Ｆ）ノックダウンのフローサイトメトリープロットである。図１３Ｇは、ドキシサイクリン処理の１４日後またはドキシサイクリン処理なしのＣＤ８１およびＣＤ１５１ノックダウンの定量化を示す。
【図１３Ｅ】ドキシサイクリン誘導によるオールインワンタンパク質の制御された発現を説明する。図１３Ａは、ドキシサイクリン誘導性プロモーター下でオールインワンタンパク質を安定してコードするＫ５６２細胞におけるドキシサイクリンの添加によるオールインワンタンパク質の誘導された発現を示すフローサイトメトリープロットを提供する。点線は、ドキシサイクリン投与なしでのベースライン中央値ＢＦＰ蛍光を表す。図１３Ｂは、ドキシサイクリン処理の前後のオールインワンタンパク質の発現を検出するための細胞のウエスタンブロットを提供する。図１３Ｃ〜１３Ｆは、Ｋ５６２細胞のドキシサイクリン処理の１４日後のＣＤ８１（図１３Ｃ〜１３Ｄ）およびＣＤ１５１（図１３Ｅ〜１３Ｆ）ノックダウンのフローサイトメトリープロットである。図１３Ｇは、ドキシサイクリン処理の１４日後またはドキシサイクリン処理なしのＣＤ８１およびＣＤ１５１ノックダウンの定量化を示す。
【図１３Ｆ】ドキシサイクリン誘導によるオールインワンタンパク質の制御された発現を説明する。図１３Ａは、ドキシサイクリン誘導性プロモーター下でオールインワンタンパク質を安定してコードするＫ５６２細胞におけるドキシサイクリンの添加によるオールインワンタンパク質の誘導された発現を示すフローサイトメトリープロットを提供する。点線は、ドキシサイクリン投与なしでのベースライン中央値ＢＦＰ蛍光を表す。図１３Ｂは、ドキシサイクリン処理の前後のオールインワンタンパク質の発現を検出するための細胞のウエスタンブロットを提供する。図１３Ｃ〜１３Ｆは、Ｋ５６２細胞のドキシサイクリン処理の１４日後のＣＤ８１（図１３Ｃ〜１３Ｄ）およびＣＤ１５１（図１３Ｅ〜１３Ｆ）ノックダウンのフローサイトメトリープロットである。図１３Ｇは、ドキシサイクリン処理の１４日後またはドキシサイクリン処理なしのＣＤ８１およびＣＤ１５１ノックダウンの定量化を示す。
【図１３Ｇ】ドキシサイクリン誘導によるオールインワンタンパク質の制御された発現を説明する。図１３Ａは、ドキシサイクリン誘導性プロモーター下でオールインワンタンパク質を安定してコードするＫ５６２細胞におけるドキシサイクリンの添加によるオールインワンタンパク質の誘導された発現を示すフローサイトメトリープロットを提供する。点線は、ドキシサイクリン投与なしでのベースライン中央値ＢＦＰ蛍光を表す。図１３Ｂは、ドキシサイクリン処理の前後のオールインワンタンパク質の発現を検出するための細胞のウエスタンブロットを提供する。図１３Ｃ〜１３Ｆは、Ｋ５６２細胞のドキシサイクリン処理の１４日後のＣＤ８１（図１３Ｃ〜１３Ｄ）およびＣＤ１５１（図１３Ｅ〜１３Ｆ）ノックダウンのフローサイトメトリープロットである。図１３Ｇは、ドキシサイクリン処理の１４日後またはドキシサイクリン処理なしのＣＤ８１およびＣＤ１５１ノックダウンの定量化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書に記載の技術は、とりわけ、宿主ゲノムにおいて二本鎖ＤＮＡ切断を生成することなく、哺乳動物細胞における遺伝子の永続的なサイレンシングを可能にする。実施形態では、中心構成要素は、Ｄｎｍｔ３Ａ、Ｄｎｍｔ３Ｌ、およびＫＲＡＢドメイン（本明細書では「オールインワンタンパク質」と呼ばれる）に融合された触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）から構成される一本鎖ポリペプチドである。本明細書で提供されるこの融合タンパク質は、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を使用して哺乳動物ゲノムの特定の部位に向けることができ、その部位にＤＮＡメチル化および／または抑制性クロマチンマークを加えることができる。実施形態では、結果は、その後の細胞分裂にわたって継承可能な遺伝子サイレンシングである。実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質（およびｓｇＲＮＡ）は、永続的なサイレンシングを誘導するためのウイルス送達方法の使用を回避して、一時的にのみ発現される。
【００１４】
実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質は、ゲノム編集ではなくエピゲノム編集による内在性遺伝子発現のロバストな長期のまたは永続的なサイレンシングを提供する。遺伝子の両方の対立遺伝子を標的にすることも、単一の病原性対立遺伝子を選択的に標的にすることもできる。実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質の利点は、エピジェネティック編集が可逆的であり、したがって、ゲノム編集よりも本質的に安全であることである。したがって、実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質は、予防的用途において有用である。例えば、遺伝子サイレンシングは、感染／生物学的毒素からの急性の保護を可能にし、感染または中毒のリスクがなくなった後に元に戻すことができる。したがって、実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質は、長期の器官機能または恒常性に必要とされるタンパク質との相互作用を介して細胞に入るウイルスまたは毒素に有用である。実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質は、ゲノム編集に基づく治療において有用である。
【００１５】
実施形態では、哺乳動物細胞における永続的な遺伝子サイレンシングは、２つの構成要素で達成することができる：３つのエピジェネティックモジュレーターに融合したｄＣａｓ９から構成される一本鎖ポリペプチド、およびタンパク質を宿主ゲノムの特定の部位に向けるシングルガイドＲＮＡ。実施形態では、構成要素は、宿主細胞において一過性にのみ発現され、したがって、毒性およびオフターゲットの事象を低減する。
【００１６】
実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質は、永続的な遺伝子サイレンシングのために宿主細胞においてＤＮＡ切断を誘導しない。実施形態では、目的のゲノム部位に追加されるエピジェネティックマークは可逆的であり、したがって、発生する可能性のあるオフターゲットの事象の除去を可能にする。
【００１７】
定義
本開示の様々な実施形態および態様が本明細書に示され説明されているが、そのような実施形態および態様が例としてのみ提供されていることは当業者には明らかであろう。当業者は、本発明から逸脱することなく、多くの変形、変更、および置換を思いつくであろう。本明細書に記載される実施形態の様々な代替物が使用され得ることが理解されるべきである。
【００１８】
本書で使用されている項目の見出しは、組織化の目的のためであり、記載されている主題を限定するものとして解釈されるべきではない。特許、特許出願、論説、書籍、マニュアル、および論文を含むがこれらに限定されない、本出願で引用されているすべての文書または文書の一部は、参照によりその目的が全て明示的に組み込まれている。
【００１９】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を有する技能の１つを提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）、Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）、Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）、およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用される場合、以下の用語は、特に明記されていない限り、それらに帰する意味を有する。
【００２０】
本開示および以下の特許請求の範囲における単数の不定冠詞または定冠詞（例えば、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）の使用は、特定の事例において、その用語が具体的に唯一のことを意味することを意図していることが文脈から明らかでない限り、「少なくとも１つ」を意味する特許における従来のアプローチに従う。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、追加のアイテム、機能、構成要素などを除外することなく、制限のないものである。本明細書で特定される参照文献は、特に明記しない限り、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる。
【００２１】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含める（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」という用語、およびそれらの派生語は、本明細書では、包括的で制限のない用語として互換的に使用される。例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含める（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」の使用は、動詞を含有する節の主語に包含される要素が、含まれる、有される、または含められる要素だけではないことを意味する。
【００２２】
「核酸」とは、一本鎖、二本鎖、もしくは多本鎖のいずれかの形態のヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）およびそれらのポリマー、あるいはそれらの相補体を指す。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「オリゴ」などの用語は、通常および慣習的な意味で、ヌクレオチドの線状配列を指す。「ヌクレオチド」という用語は、通常のおよび慣習的な意味で、単一のポリヌクレオチド単位、すなわちモノマーを指す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの修飾型であり得る。本明細書で企図されるポリヌクレオチドの例には、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖ＤＮＡとＲＮＡの混合物を有するハイブリッド分子が含まれる。本明細書で企図される核酸、例えばポリヌクレオチドの例には、任意の種類のＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、およびガイドＲＮＡ、ならびに任意の種類のＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、およびミニサークルＤＮＡ、ならびにそれらの任意の断片が含まれるが、これらに限定されない。態様では、核酸はメッセンジャーＲＮＡである。態様では、メッセンジャーＲＮＡはメッセンジャーリボ核タンパク質（ＲＮＰ）である。ポリヌクレオチドの文脈における「二本鎖」という用語は、通常のおよび慣習的な意味で、二本鎖性を指す。核酸は、直鎖または分岐鎖であり得る。例えば、核酸は、ヌクレオチドの直鎖であり得るか、または核酸は、例えば、核酸がヌクレオチドの１つ以上のアームまたは分岐を含むように分岐し得る。任意に、分岐核酸は、繰り返し分岐して、デンドリマーなどの高次構造を形成する。
【００２３】
本明細書で使用され得るように、「核酸」、「核酸分子」、「核酸オリゴマー」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸配列」、「核酸フラグメント」および「ポリヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、様々な長さを有し得る互いに共有結合されたヌクレオチドのポリマー形態、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、またはその類似体、誘導体もしくは修飾物を含むことが意図されているが、これらに限定されない。異なるポリヌクレオチドは、異なる三次元構造を有し得、そして既知または未知の様々な機能を実行し得る。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、遺伝子間ＤＮＡ（異質染色質のＤＮＡを含むがこれらに限定されない）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、配列の単離されたＤＮＡ、配列の単離されたＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー、が含まれる。本開示の方法において有用なポリヌクレオチドは、天然の核酸配列およびそのバリアント、人工の核酸配列、またはそのような配列の組み合わせを含み得る。
【００２４】
ポリヌクレオチドの配列は、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびチミン（Ｔ）（ポリヌクレオチドがＲＮＡの場合、チミンの代わりにウラシル（Ｕ））で構成されている。したがって、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット順の表現である、あるいは、この用語は、ポリヌクレオチド分子自体に適用され得る。このアルファベット順の表現は、中央処理装置を備えたコンピューターのデータベースに入力でき、機能ゲノミクスや相同性検索などのバイオインフォマティクスアプリケーションに使用できる。ポリヌクレオチドは、任意選択で、１つ以上の非標準ヌクレオチド（複数可）、ヌクレオチド類似体（複数可）、および／または修飾ヌクレオチドを含み得る。
【００２５】
例えばホスホチオエート骨格を有する核酸を含む核酸は、１つ以上の反応性部分を含み得る。本明細書で使用される場合、反応性部分という用語は、共有結合、非共有結合、または他の相互作用を介して別の分子、例えば、核酸またはポリペプチドと反応することができる任意の基を含む。例として、核酸は、共有結合、非共有結合、または他の相互作用を介してタンパク質またはポリペプチド上のアミノ酸と反応するアミノ酸反応性部分を含み得る。
【００２６】
この用語はまた、既知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基もしくは結合を含む核酸も包含し、合成、天然に存在する、および天然に存在せず、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと類似の方法で代謝される。そのような類似体の例としては、例えば、ホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、ホスホロチオエート（リン酸中の酸素を二重結合硫黄で置換するホスホチオエートとしても知られる）、ホスホロジチオエート、ホスホノカルボン酸、ホスホノカルボキシレート、ホスホノ酢酸、ホスホノギ酸、メチルホスホネート、ボロンホスホネート、またはＯ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）、ならびに５−メチルシチジンまたはプソイドウリジンなどのヌクレオチド塩基に対する修飾、ならびにペプチド核酸骨格および結合を含むホスホジエステル誘導体が挙げられ、挙げられるが、これらに限定されない。他の類似体核酸としては、米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号、ならびに第６章および第７章、ＡＳＣシンポジウムシリーズ５８０、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓａｎｇｈｕｉ＆Ｃｏｏｋ，ｅｄｓ．に記載されているものを含む、陽性骨格、非イオン性骨格、修飾糖、および非リボース骨格（例えば、当該技術分野において公知のホスホロジアミデートモルホリノオリゴまたはロックド核酸（ＬＮＡ））を有するものが挙げられる。１つ以上の炭素環式糖を含有する核酸もまた、核酸の１つの定義内に含まれる。リボース−ホスフェート骨格の修飾は、例えば、生理学的環境におけるそのような分子の安定性および半減期を増加させるために、またはバイオチップ上のプローブとして、様々な理由で行うことができる。天然に存在する核酸と類似体の混合物が作製され得るか、あるいは、異なる核酸類似体の混合物、および天然に存在する核酸と類似体の混合物が作製され得る。態様では、ＤＮＡ中のヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル、ホスホジエステル誘導体、または両方の組み合わせである。
【００２７】
核酸は、非特異的配列を含み得る。本明細書中で使用される場合、「非特異的配列」という用語は、任意の他の核酸配列に相補的であるか、または部分的にのみ相補的であるように設計されていない一連の残基を含む核酸配列を指す。例として、非特異的核酸配列は、細胞または生物と接触した場合に阻害性核酸として機能しない核酸残基の配列である。
【００２８】
「相補的」または「相補性」という用語は、従来のワトソン−クリック型または他の非従来型のいずれかによって、別の核酸配列と水素結合を形成する核酸の能力を指す。例えば、配列ＡＧＴは配列ＴＣＡに相補的である。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対）を形成できる核酸分子の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０のうち５、６、７、８、９、１０は、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列のすべての隣接する残基が、第２の核酸配列における同じ数の隣接する残基と水素結合することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％である相補性の程度を指すか、ストリンジェントな条件下（すなわち、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下）でハイブリダイズする２つの核酸を指す。
【００２９】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という句は、プローブが、その標的部分配列、典型的には核酸の複合体混合物にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列に依存し、様々な状況によって異なる。より長い配列は、特に高温でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ”（１９９３）に見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度ｐＨでの特定の配列の熱融点（ｔｈｅｒｍａｌ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）（Ｔｍ）よりも約５〜１０°Ｃ低くなるように選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度の下で）である（標的配列が過剰に存在するため、Ｔｍではプローブのうち５０％が平衡状態で占有されている）。ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することで、ストリンジェントな条件を達成することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下のとおりである：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベートするまたは、５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベートし、６５℃で０．２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで洗浄する。
【００３０】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合には、依然として実質的に同一である。これは、例えば、遺伝暗号によって許容されている最大のコドン縮重を使用して核酸のコピーが作成された場合に発生する。そのような場合、核酸は通常、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」には、３７℃での４０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液でのハイブリダイゼーション、および４５℃での１ＸＳＳＣでの洗浄が含まれる。ポジティブハイブリダイゼーションは少なくとも２倍のバックグラウンドである。当業者は、代替のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を利用して、同様のストリンジェンシーの条件を提供できることを容易に認識するであろう。ハイブリダイゼーションパラメータを決定するための追加のガイドラインは、多くの参考文献、例えば、前出のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，に提供される。
【００３１】
「遺伝子」という用語は、タンパク質の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、これには、コーディング領域の前後の領域（リーダーとトレーラー）、および個々のコーディングセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）が含まれる。リーダー、トレーラー、およびイントロンには、遺伝子の転写および翻訳中に必要な調節エレメントが含まれている。さらに、「タンパク質遺伝子産物」は、特定の遺伝子から発現されるタンパク質である。
【００３２】
遺伝子に関して本明細書で使用される「発現」または「発現された」という用語は、その遺伝子の転写および／または翻訳産物を意味する。細胞内のＤＮＡ分子の発現レベルは、細胞内に存在する対応するｍＲＮＡの量、または細胞によって産生されるそのＤＮＡによってコードされるタンパク質の量のいずれかに基づいて決定され得る。非コード核酸分子（例えば、ｓｇＲＮＡ）の発現レベルは、当技術分野で周知の標準的なＰＣＲまたはノーザンブロット法によって検出することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１８．１−１８．８８を参照されたい。
【００３３】
本明細書で提供される「転写調節配列」という用語は、生物内の特定の遺伝子の転写（例えば、発現）を増加または減少させることができるＤＮＡのセグメントを指す。転写調節配列の非限定的な例には、プロモーター、エンハンサー、およびサイレンサーが含まれる。
【００３４】
「転写開始部位（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｓｔａｒｔ  ｓｉｔｅ）」および「転写開始部位（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）」という用語は、本明細書において、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼ）がＲＮＡ転写物の合成を開始する遺伝子配列（例えば、ＤＮＡ配列）の５’末端を指すために交換可能に使用され得る。転写開始部位は、ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ転写物の合成を開始する転写されたＤＮＡ配列の最初のヌクレオチドであり得る。当業者は、例えば、ラン・オフ転写アッセイを実施することによって、またはＦＡＮＴＯＭ５データベースによる定義によって、日常的な実験および分析を介して転写開始部位を決定することができる。
【００３５】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、特定の遺伝子の転写を開始するＤＮＡの領域を指す。プロモーターは通常、遺伝子の転写開始部位の近く、遺伝子の上流、およびＤＮＡの同じ鎖（すなわち、センス鎖の５’）に位置する。プロモーターは、長さが約１００〜約１０００塩基対であり得る。
【００３６】
本明細書で使用される「エンハンサー」という用語は、遺伝子の転写が起こる可能性を高めるためにタンパク質（例えば、転写因子）によって結合され得るＤＮＡの領域を指す。エンハンサーは、長さが約５０〜約１５００塩基対であり得る。エンハンサーは、それが調節する転写開始部位の下流または上流に位置し得、そして転写開始部位から数百塩基対離れていてもよい。
【００３７】
本明細書で使用される「サイレンサー」という用語は、リプレッサーとして知られる転写調節因子に結合することができ、それによって遺伝子の転写に悪影響を与えることができるＤＮＡ配列を指す。サイレンサーＤＮＡ配列は、遺伝子の転写を抑制するように作用する標的遺伝子の上流を含むがこれに限定されない、ＤＮＡ全体の多くの異なる位置に見出され得る（例えば、サイレンサー遺伝子発現）。
【００３８】
本明細書で提供される「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、標的ヌクレオチド配列と十分な相補性を有して、その標的配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への直接配列特異的結合を有する、任意のポリヌクレオチド配列を指す。態様では、ガイド配列とそれに対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインメントされた場合、約５０％以上、約６０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７．５％以上、約９９％以上、またはそれ以上である。
【００３９】
実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、一本鎖リボ核酸である。態様では、ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上の長さの核酸残基である。態様では、ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、１０〜３０の核酸残基の長さである。態様では、ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、２０の核酸残基の長さである。態様では、ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）の長さは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００以上の核酸残基または糖残基の長さであってよい。態様では、ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、５〜５０、１０〜５０、１５〜５０、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、５〜７５、１０〜７５、１５〜７５、２０〜７５、２５〜７５、３０〜７５、３５〜７５、４０〜７５、４５〜７５、５０〜７５、５５〜７５、６０〜７５、６５〜７５、７０〜７５、５〜１００、１０〜１００、１５〜１００、２０〜１００、２５〜１００、３０〜１００、３５〜１００、４０〜１００、４５〜１００、５０〜１００、５５〜１００、６０〜１００、６５〜１００、７０〜１００、７５〜１００、８０〜１００、８５〜１００、９０〜１００、９５〜１００、またはそれ以上の残基の長さである。態様では、ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、１０〜１５、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、または１０〜５０残基の長さである。
【００４０】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコード化されたもの、ならびに例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンなど、後で修飾されるアミノ酸である。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、つまり、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合しているα炭素を有する化合物を指し、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物を指す。「非天然アミノ酸」および「非天然アミノ酸」という用語は、天然には見られないアミノ酸類似体、合成アミノ酸、およびアミノ酸模倣物を指す。
【００４１】
アミノ酸は、本明細書では、それらの一般的に既知である３文字記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される１文字記号のいずれかによって参照され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に認められている一文字コードによって参照され得る。
【００４２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書中で交換可能に使用され、ポリマーは、態様では、アミノ酸から構成されない部分にコンジュゲートされ得る。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに対して適用される。「融合タンパク質」は、単一の部分として組換えにより発現される２つ以上の別々のタンパク質配列をコードするキメラタンパク質を指す。
【００４３】
「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に修飾されたバリアント」は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指す。遺伝コードの縮重のため、多くの核酸配列が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって指定されるすべての位置で、コドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンのいずれかに変更され得る。そのような核酸バリエーションは、保存的に修飾されたバリエーションの一種である「サイレントバリエーション」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、核酸のすべての可能なサイレントバリエーションについて記載する。当業者は、核酸中の各コドン（通常、メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一の分子を生じさせ得ることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションは、記載された各配列に内在している。
【００４４】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列中の単一のアミノ酸または少ないパーセンテージのアミノ酸を変更し、付加し、または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または付加が、変更により、化学的に類似したアミノ酸でのアミノ酸の置換がもたらされる「保存的に修飾されたバリアント」であることを認識する。機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野で周知である。そのような保存的に修飾されたバリアントは、本開示の多型バリアント、種間ホモログ、および対立遺伝子に加えられ、それらを除外しない。以下の８つの群はそれぞれ、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含む：（１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、（７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、および（８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照されたい）。
【００４５】
「配列同一性パーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントされた配列を比較することによって決定され、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置数を決定して、マッチした位置数を出し、そのマッチした位置数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【００４６】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「同一の」または「同一性」パーセントという用語は、下記のデフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、またはマニュアルアラインメントおよび目視検査によって、測定されるように、同一であるか、または同一である特定のパーセンテージ（すなわち、比較ウィンドウまたは指定された領域に関して最大に対応するように比較およびアラインメントを行った場合に、特定の領域について、約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性）のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する、２つ以上の配列または部分配列を指す（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／などを参照されたい）。次いで、そのような配列は、「実質的に同一」であると言われる。この定義はまた、試験配列の相補物を指すか、またはこれに適用することができる。定義はまた、欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有するものを含む。以下に説明するように、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを計算することができる。好ましくは、同一性は、少なくとも約２５アミノ酸長またはヌクレオチド長の領域にわたり、またより好ましくは５０〜１００アミノ酸長またはヌクレオチド長の領域にわたって存在する。
【００４７】
アミノ酸またはヌクレオチド塩基の「位置」は、Ｎ末端（または５’末端）に対するその位置に基づいて、参照配列中の各アミノ酸（またはヌクレオチド塩基）を順次識別する番号によって示される。最適なアラインメントを決定する際に考慮しなければならない欠失、挿入、トランケーション、融合などのために、一般に、Ｎ末端から単純にカウントすることよって決定される試験配列のアミノ酸残基数は必ずしも参照配列内の対応する位置の数と同じではない。例えば、バリアントがアラインメントされた参照配列に対して欠失を有する場合、欠失部位での参照配列中の位置に対応するバリアント中のアミノ酸は存在しないであろう。アラインメントされた参照配列に挿入がある場合、その挿入は参照配列の番号付きアミノ酸位置に対応しない。トランケーションまたは融合の場合、参照配列またはアラインメントされた配列のいずれかに、対応する配列のいずれのアミノ酸にも対応しないアミノ酸のストレッチが存在し得る。
【００４８】
所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈で使用される場合、「参照して番号付けされる」または「対応する」という用語は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較された場合の特定の参照配列の残基の番号付けを指す。
【００４９】
本明細書に記載の特定のタンパク質（例えば、ＫＲＡＢ、ｄＣａｓ９、Ｄｎｍｔ３Ａ、Ｄｎｍｔ３Ｌ）の場合、指定されたタンパク質は、タンパク質の天然に存在する形態、またはタンパク質活性を維持するバリアントまたはホモログのいずれかが含まれる（例えば、天然タンパク質と比較して、少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の活性内）。態様では、バリアントまたはホモログは、天然に存在する形態と比較して、配列の全体または配列の一部（例えば、５０、１００、１５０または２００個の連続したアミノ酸部分）にわたって、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。態様では、タンパク質は、そのＮＣＢＩ配列参照によって同定されるタンパク質である。態様では、タンパク質は、そのＮＣＢＩ配列参照またはその機能的断片またはホモログによって同定されるタンパク質である。
【００５０】
本明細書で提供される「クルッペル関連ボックスドメイン」または「ＫＲＡＢドメイン」という用語は、約４００個のヒトジンクフィンガータンパク質ベースの転写因子に存在する転写抑制ドメインのカテゴリーを指す。ＫＲＡＢドメインは通常、約４５〜約７５個のアミノ酸残基を含む。それらの機能および使用を含むＫＲＡＢドメインの説明は、例えば、Ｅｃｃｏ，Ｇ．，Ｉｍｂｅａｕｌｔ，Ｍ．，Ｔｒｏｎｏ，Ｄ．，ＫＲＡＢ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４４，２０１７、Ｌａｍｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ，Ｃｅｌｌ  １７２，２０１８、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１３）、およびＧｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１４）に見出され得、これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。態様では、ＫＲＡＢドメインは、Ｋｏｘ  １のＫＲＡＢドメインである。態様では、ＫＲＡＢドメインは、配列番号１６によって示される配列を含む。態様では、ＫＲＡＢドメインは、配列番号１６の配列である。態様では、ＫＲＡＢドメインは、配列番号１６に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、ＫＲＡＢドメインは、配列番号１６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、ＫＲＡＢドメインは、配列番号１６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、ＫＲＡＢドメインは、配列番号１６に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、ＫＲＡＢドメインは、配列番号１６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、ＫＲＡＢドメインは、配列番号１６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００５１】
本明細書で提供される「ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ」という用語は、メチル基のＤＮＡへの転移を触媒する酵素を指す。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの非限定的な例には、Ｄｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３Ａ、Ｄｎｍｔ３Ｂ、およびＤｎｍｔ３Ｌが含まれる。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼは、細菌のシトシンメチルトランスフェラーゼおよび／または細菌の非シトシンメチルトランスフェラーゼである。特定のＤＮＡメチルトランスフェラーゼに応じて、ＤＮＡの様々な領域がメチル化された。例えば、Ｄｎｍｔ３Ａは通常、メチル化のためにＣｐＧジヌクレオチドを標的とする。ＤＮＡメチル化により、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼは、ＤＮＡ配列を変更することなく、ＤＮＡセグメントの活性（遺伝子発現など）を改変できる。態様では、ＤＮＡメチル化は、遺伝子転写の抑制および／またはメチル化感受性転写因子もしくはＣＴＣＦの調節をもたらす。本明細書に記載されるように、融合タンパク質は、１つ以上（例えば、２つ）のＤＮＡメチルトランスフェラーゼを含み得る。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼが融合タンパク質の一部として含まれている場合、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼは「ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメイン」と呼ばれることがある。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、１つ以上のＤＮＡメチルトランスフェラーゼを含む。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、２つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼを含む。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインはＤｎｍｔ３Ａである。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を有する。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号２６に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号２６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号２６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号２６に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号２６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号２６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインはＤｎｍｔ３Ｌである。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号２８のアミノ酸配列を有する。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号２８に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号２８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号２８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号２８に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号２８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号２８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、Ｄｎｍｔ３ＡおよびＤｎｍｔ３Ｌを含む。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号３３のアミノ酸配列を有する。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号３３に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号３３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号３３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号３３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号３３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号３３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインの構造と使用法の説明は、例えば、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ＶＥＧＦ−Ａ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｄｎｍｔ３ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２５，２０１３およびＳｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４５，２０１７に見出され得、これらは参照によりその全体およびすべての目的のために本明細書に組み込まれる。
【００５２】
本明細書で言及される「Ｄｎｍｔ３Ａ」、「Ｄｎｍｔ３ａ」、「ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ３Ａ」または「ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ」タンパク質には、Ｄｎｍｔ３Ａ酵素の組換え型または天然に存在する形態またはＤｎｍｔ３Ａ酵素活性を維持するそのバリアントまたはホモログ（例えば、Ｄｎｍｔ３Ａと比較して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の活性内）のいずれかが含まれる。態様では、バリアントまたはホモログは、天然に存在するＤｎｍｔ３Ａタンパク質と比較して、全配列または配列の一部（例えば、５０、１００、１５０、または２００個の連続したアミノ酸部分）にわたる少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ａタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９Ｙ６Ｋ１によって同定されるタンパク質、またはそれに対して実質的な同一性を有するバリアントもしくはホモログと実質的に同一である。態様では、Ｄｎｍｔ３Ａポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照配列受入番号ＮＭ＿０２２５５２によって同定される核酸配列、そのホモログまたは機能的フラグメントによってコードされる。態様では、Ｄｎｍｔ３Ａは、配列番号２６によって示される配列を含む。態様では、Ｄｎｍｔ３Ａは、配列番号２６によって示される配列である。態様では、Ｄｎｍｔ３Ａは、配列番号２６に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号２６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号２６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、配列番号２６に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ａは、配列番号２６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ａは、配列番号２６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００５３】
本明細書で言及される「Ｄｎｍｔ３Ｌ」、「ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ３Ｌ」または「ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３Ｌ」タンパク質は、Ｄｎｍｔ３Ｌ酵素の組換え型または天然に存在する形態、またはＤｎｍｔ３Ｌ酵素を維持するそのバリアントまたはホモログ（例えば、Ｄｎｍｔ３Ｌと比較して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の活性内）のいずれかを含む。態様では、バリアントまたはホモログは、天然に存在するＤｎｍｔ３Ｌタンパク質と比較して、全配列または配列の一部（例えば、５０、１００、１５０、または２００個の連続したアミノ酸部分）にわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９ＣＷＲ８によって同定されるタンパク質、またはそれに対して実質的な同一性を有するバリアントもしくはホモログと実質的に同一である。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９ＣＷＲ８によって同定されるタンパク質と同一である。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９ＣＷＲ８によって同定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９ＣＷＲ８によって同定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９ＣＷＲ８によって同定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９ＣＷＲ８によって同定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【００５４】
態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９ＵＪＷによって同定されるタンパク質、またはそれに対して実質的な同一性を有するバリアントもしくはホモログと実質的に同一である。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９ＵＪＷによって同定されるタンパク質と同一である。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９ＵＪＷによって同定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９ＵＪＷによって同定されるタンパク質に対して少なくとも５５％の配列同一性を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９ＵＪＷによって同定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９ＵＪＷによって同定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％の配列同一性を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９ＵＪＷによって同定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９ＵＪＷによって同定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９ＵＪＷによって同定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９ＵＪＷによって同定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９ＵＪＷによって同定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９ＵＪＷによって同定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照配列受入番号ＮＭ＿００１０８１６９５によって同定される核酸配列、またはそのホモログまたは機能的フラグメントによってコードされる。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌは、配列番号２８によって示される配列を含む。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌは、配列番号２８によって示される配列である。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌは、配列番号２８に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌは、配列番号２８に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌは、配列番号２８に対して少なくとも５５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌは、配列番号２８に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌは、配列番号２８に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌは、配列番号２８に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌは、配列番号２８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌは、配列番号２８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌは、配列番号２８に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌは、配列番号２８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ｌは、配列番号２８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００５５】
「ＲＮＡ誘導型（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ」などの用語は、通常の慣習的な意味で、ＤＮＡポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素を指し、ホスホジエステル結合の認識は、別個のＲＮＡ配列によって促進される（例えば、シングルガイドＲＮＡ）。
【００５６】
「クラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ」という用語は、Ｃａｓ９と同様のエンドヌクレアーゼ活性を持ち、クラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステムに関与するエンドヌクレアーゼを指す。クラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステムの例は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＳＦ３７０のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座で、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃｓｎ１の４つの遺伝子のクラスターと、２つの非コードＲＮＡエレメント、ｔｒａｃｒＲＮＡ、および非反復配列（スペーサー、各約３０ｂｐ）の短いストレッチによって間隔が空けられた反復配列（直接反復）の特徴的なアレイを含有する。Ｃｐｆ１酵素は、推定上のＶ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに属している。ＩＩ型とＶ型の両方のシステムは、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのクラスＩＩに含まれている。
【００５７】
「核局在化配列」または「核局在化シグナル」または「ＮＬＳ」は、タンパク質を核に向けるペプチドである。態様では、ＮＬＳは、５つの基本的な正に帯電したアミノ酸を含む。ＮＬＳはペプチド鎖のどこにでも配置できる。態様では、ＮＬＳは、ＳＶ４０由来のＮＬＳである。態様では、ＮＬＳは、配列番号２５によって示される配列を含む。態様では、ＮＬＳは、配列番号２５によって示される配列である。態様では、ＮＬＳは、配列番号２５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＮＬＳは、配列番号２５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＮＬＳは、配列番号２５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＮＬＳは、配列番号２５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＮＬＳは、配列番号２５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＮＬＳは、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＮＬＳは、配列番号２５のアミノ酸配列を有する。
【００５８】
本明細書で使用される「細胞」は、そのゲノムＤＮＡを保存または複製するのに十分な代謝または他の機能を果たす細胞を指す。細胞は、例えば、無傷の膜の存在、特定の染料による染色、子孫を産生する能力、または配偶子の場合、第２の配偶子と組み合わせて、生存能力のある子孫を生み出す能力を含む、当該技術分野において周知の方法によって同定することができる。細胞には、原核細胞および真核細胞が含まれ得る。原核細胞には、細菌が含まれるが、これに限定されない。真核細胞には、酵母細胞ならびに植物および動物に由来する細胞、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）、およびヒト細胞が含まれるが、これらに限定されない。細胞は、それらが天然に非接着性であるか、または表面に接着しないように（例えば、トリプシン処理によって）処理されている場合に有用であり得る。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントをライゲーションできる線形または円形の二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲーションすることができる。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）において自律複製することができる。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが動作可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。本明細書では、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるため、「プラスミド」および「ベクター」を交換可能に使用することができる。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などのそのような他の形態の発現ベクターを含むことを意図している。さらに、いくつかのウイルスベクターは、特定の細胞型を特異的または非特異的に標的化することができる。複製能力のないウイルスベクターまたは複製欠損ウイルスベクターは、それらの標的細胞に感染し、それらのウイルスペイロードを送達することができるが、細胞溶解および死につながる典型的な溶解経路を継続できないウイルスベクターを指す。
【００６０】
「トランスフェクション」、「形質導入」、「トランスフェクションする」または「形質導入する」という用語は、交換可能に使用することができ、核酸分子および／またはタンパク質を細胞に導入するプロセスとして定義される。非ウイルスのまたはウイルスベースの方法を使用して、核酸を細胞に導入することができる。核酸分子は、完全なタンパク質またはその機能的部分をコードする配列であってよい。典型的には、タンパク質発現に必要な要素（例えば、プロモーター、転写開始部位など）を含む核酸ベクターである。トランスフェクションの非ウイルス方法には、核酸分子を細胞に導入するための送達システムとしてウイルスＤＮＡまたはウイルス粒子を使用しない任意の適切な方法が含まれる。例示的な非ウイルストランスフェクション法には、融合タンパク質をコードする核酸のナノ粒子カプセル化（例えば、脂質ナノ粒子、金ナノ粒子など）、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソームトランスフェクション、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）、ソノポレーション、熱ショックによるトランスフェクション、マグネティフェクション（ｍａｇｎｅｔｉｆｅｃｔｉｏｎ）およびエレクトロポレーション、が含まれる。ウイルスベースの方法の場合、任意の有用なウイルスベクターを本明細書に記載の方法で使用することができる。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。態様では、核酸分子は、当技術分野で周知の標準的な手順に従って、レトロウイルスベクターを使用して細胞に導入される。「トランスフェクション」または「形質導入」という用語はまた、外部環境から細胞にタンパク質を導入することを指す。通常、タンパク質の形質導入またはトランスフェクションは、細胞膜を横断できるペプチドまたはタンパク質の、目的のタンパク質への付着に依存する。例えば、Ｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：１−４およびＰｒｏｃｈｉａｎｔｚ（２００７）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：１１９−２０を参照されたい。
【００６１】
本明細書で提供される「ペプチドリンカー」は、ペプチド部分を含むリンカーである。実施形態では、ペプチドリンカーは２価ペプチド、例えば化合物の残部（例えば、本明細書で提供される融合タンパク質）にＮ末端およびＣ末端で結合されたアミノ酸配列である。ペプチドリンカーは、切断可能なペプチド部分（２価ペプチド部分）であってもよい（例えば、Ｐ２Ａ切断可能なポリペプチド）。本明細書で提供されるペプチドリンカーはまた、交換可能にアミノ酸リンカーとも呼ばれ得る。態様では、ペプチドリンカーは、１〜約８０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、１〜約７０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、１〜約６０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、１〜約５０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、１〜約４０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、１〜約３０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、１〜約２５個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、１〜約２０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２〜約２０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２〜約１９個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２〜約１８個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２〜約１７個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２〜約１６個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２〜約１５個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２〜約１４個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２〜約１３個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２〜約１２個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２〜約１１個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２〜約１０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２〜約９個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２〜約８個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２〜約７個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２〜約６個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２〜約５個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２〜約４個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２〜約３個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約３〜約１９個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約３〜約１８個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約３〜約１７個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約３〜約１６個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約３〜約１５個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約３〜約１４個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約３〜約１３個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約３〜約１２個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約３〜約１１個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約３〜約１０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約３〜約９個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約３〜約８個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約３〜約７個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約３〜約６個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約３〜約５個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約３〜約４個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約１０〜約２０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約１５〜約２０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約３個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約４個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約５個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約６個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約７個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約８個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約９個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約１０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約１１個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約１２個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約１３個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約１４個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約１５個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約１６個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約１７個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約１８個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約１９個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２１個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２２個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２３個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２４個のアミノ酸残基を含む。態様では、ペプチドリンカーは、約２５個のアミノ酸残基を含む。
【００６２】
態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１７によって示される配列を含む。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１７によって示される配列である。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１８によって示される配列を含む。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１８によって示される配列である。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１９によって示される配列を含む。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１９によって示される配列である。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２０によって示される配列を含む。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２０によって示される配列である。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２１によって示される配列を含む。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２１によって示される配列である。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２２によって示される配列を含む。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２２によって示される配列である。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２７によって示される配列を含む。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２７によって示される配列である。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２４によって示される配列を含む。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２４によって示される配列である。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２９によって示される配列を含む。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２９によって示される配列である。態様では、ペプチドリンカーはＸＴＥＮポリペプチドである。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２４、２７、または２９に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２４、２７、または２９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００６３】
態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２４、２７、または２９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号１９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００６４】
本明細書で使用される「ＸＴＥＮ」、「ＸＴＥＮリンカー」、または「ＸＴＥＮポリペプチド」という用語は、疎水性アミノ酸残基を欠く組換えポリペプチド（例えば、構造化されていない組換えペプチド）を指す。ＸＴＥＮの開発および使用は、例えば、Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７，１１８６−１１９０（２００９）に見出され得、これは、その全体およびすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３１によって示される配列を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３１によって示される配列である。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３２によって示される配列を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３２によって示される配列である。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３１に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３２に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００６５】
「検出可能な薬剤」または「検出可能な部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、磁気共鳴画像法、または他の物理的手段などの適切な手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な検出可能な薬剤には、１８Ｆ、３２Ｐ、３３Ｐ、４５Ｔｉ、４７Ｓｃ、５２Ｆｅ、５９Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７７Ａｓ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｓｒ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、９９Ｍｏ、１０５Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５４−１５８１Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７５Ｌｕ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１１Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、Ｃｒ、Ｖ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、３２Ｐ、フルオロフォア（蛍光色素など）、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般的に使用されるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、常磁性分子、常磁性ナノ粒子、超小型超常磁性酸化鉄（「ＵＳＰＩＯ」）ナノ粒子、ＵＳＰＩＯナノ粒子凝集体、超常磁性酸化鉄（「ＳＰＩＯ」）ナノ粒子、ＳＰＩＯナノ粒子凝集体、単結晶酸化鉄ナノ粒子、単結晶酸化鉄、ナノ粒子造影剤、リポソーム、またはガドリニウムキレートを含むその他の送達媒体（「Ｇｄ−キレート」）分子、ガドリニウム、放射性同位元素、放射性核種（例えば、炭素−１１、窒素−１３、酸素−１５、フッ素−１８、ルビジウム−８２）、フルオロデオキシグルコース（例えば、フッ素−１８標識）、任意のガンマ線放出放射性核種、陽電子放出放射性核種、放射性標識グルコース、放射性標識水、放射性標識アンモニア、生体コロイド、マイクロバブル（例えば、アルブミン、ガラクトース、脂質、および／またはポリマーを含むマイクロバブルシェル、空気、重ガス（複数可）、パーフルオロカーボン、窒素、オクタフルオロプロパン、パーフレクサン（ｐｅｒｆｌｅｘａｎｅ）脂質ミクロスフェア、パーフルトレンなどを含むマイクロバブルガスコア）、ヨード造影剤（例、イオヘキソール、イオジキサノール、イオベルソル、イオパミドール、イオキシラン、イオプロミド、ジアトリゾエート、メトリゾエート、イオキサグレート）、硫酸バリウム、二酸化トリウム、金、金ナノ粒子、金ナノ粒子凝集体、フルオロフォア、２光子フルオロフォア、またはハプテンおよびタンパク質、または、例えば、標的ペプチドと特異的に反応するペプチドまたは抗体に放射性標識を組み込むことによって検出可能にすることができる他の実体、が含まれる。
【００６６】
検出可能な部分は、一価の検出可能な薬剤または別の組成物と結合を形成することができる検出可能な薬剤である。態様では、検出可能な薬剤はＨＡタグである。態様では、ＨＡタグは、配列番号２４によって示される配列を含む。態様では、ＨＡタグは、配列番号２４によって示される配列である。態様では、ＨＡタグは、配列番号２４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＨＡタグは、配列番号２４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＨＡタグは、配列番号２４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＨＡタグは、配列番号２４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、検出可能な薬剤は、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）である。態様では、ＢＦＰは、配列番号３０によって示される配列を含む。態様では、ＢＦＰは、配列番号３０によって示される配列である。態様では、ＢＦＰは、配列番号３０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＢＦＰは、配列番号３０に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＢＦＰは、配列番号３０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＢＦＰは、配列番号３０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００６７】
本開示の態様によるイメージングおよび／または標識剤として使用することができる放射性物質（例えば、放射性同位体）は、これらに限定されないが、１８Ｆ、３２Ｐ、３３Ｐ、４５Ｔｉ、４７Ｓｃ、５２Ｆｅ、５９Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７７Ａｓ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｓｒ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、９９Ｍｏ、１０５Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５４−１５８１Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７５Ｌｕ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９４  Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１１Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａおよび２２５Ａｃ、が含まれる。本開示の態様に従って追加の造影剤として使用することができる常磁性イオンには、遷移金属およびランタニド金属（例えば、原子番号が２１〜２９、４２、４３、４４、または５７〜７１である金属）のイオンが含まれるが、これらに限定されない。これらの金属には、Ｃｒ、Ｖ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕのイオンが含まれる。
【００６８】
「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」は、その単純な通常の意味に従って使用され、少なくとも２つの異なる種が、反応するか、相互作用するか、または物理的に接するために十分に近位になることを可能にするプロセスを指す。しかしながら、結果として生じた反応生成物が、添加された試薬間の反応から直接生成され得るか、または反応混合物中に生成され得る添加された試薬のうちの１つ以上由来の中間体から生成され得ることを理解するべきである。
【００６９】
「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」という用語は、２つの種が反応、相互作用、または物理的に接することを可能にすることを含み得、ここで、２つの種は、例えば、本明細書で提供される融合タンパク質および核酸配列（例えば、標的ＤＮＡ配列）であり得る。
【００７０】
本明細書で定義される、「阻害」、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」、「抑制」、「抑制する（ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ）」、「サイレンシングする（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）」、「サイレンシングする（ｓｉｌｅｎｃｅ）」などの用語は、本明細書で提供される組成物（例えば、融合タンパク質、複合体、核酸、ベクター）に関して使用される場合、組成物（例えば、融合タンパク質、複合体、核酸、ベクター）の非存在下での核酸配列の活性（例えば、遺伝子の転写）と比較して、核酸配列の活性（例えば、転写）に負の影響を与える（例えば、減少させる）こと（例えば遺伝子の転写を減少させる）を指す。態様では、阻害とは、疾患または疾患の症状（例えば、癌）の低減を指す。したがって、阻害には、少なくとも部分的に、部分的または完全に活性化（例えば、転写）を遮断すること、または核酸配列の活性化（例えば、転写）を減少、防止、または遅延させることが含まれる。阻害された活性（例えば、転写）は、対照のものと比較して、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、またはそれ以下であってもよい。態様では、対照と比較して阻害は、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、またはそれ以上である。
【００７１】
「対照」試料または値は、試験試料との比較のための基準となる、通常は既知の基準となる試料を指す。例えば、試験試料は、例えば、試験化合物の存在下での試験条件から採取され得、例えば、試験化合物の非存在下（陰性対照）、または既知の化合物の存在下（陽性対照）での既知の条件からの試料と比較され得る。対照は、いくつかの試験または結果から収集された平均値を表すこともできる。当業者は、対照を任意の数のパラメータの評価のために設計し得ることを認識するであろう。例えば、薬理学的データ（例えば、半減期）または治療手段（例えば、副作用の比較）に基づいて治療効果を比較するための対照を考案することができる。当業者は、対照が所与の状況において価値があるかを理解し、対照値との比較に基づいてデータを分析することができるであろう。対照は、データの有意性を判断するためにも役立つ。例えば、所与のパラメータの値が対照において大きく変動する場合、試験試料の変動は有意であるとみなされない。
【００７２】
融合タンパク質
本明細書で提供されるのは、とりわけ、ＣＲＩＳＰＲベースのエピゲノム編集を使用して、哺乳動物細胞において遺伝子を永続的に（例えば、不可逆的に）および可逆的にオフにすることができる融合タンパク質である。実施形態では、融合タンパク質は、細胞において一過性に発現され得る４つのタンパク質（例えば、触媒的に不活性なＣａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９）、ＫＲＡＢドメイン、Ｄｎｍｔ３ＡおよびＤｎｍｔ３Ｌ）の単一ポリペプチド融合を含む。融合タンパク質は、標的核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）に相補的なポリヌクレオチドを使用して哺乳動物ゲノムの特定の部位に向けることができ、それは、融合タンパク質に結合することができる配列（すなわち、結合配列）をさらに含む。適切に配置されると、理論に拘束されることを意図せずに、融合タンパク質は、ＤＮＡメチル化および／または抑制性クロマチンマークを標的核酸に追加し、その後の細胞分裂にわたって継承可能な遺伝子サイレンシングをもたらす。このように、融合タンパク質は、宿主ゲノムにＤＮＡ二本鎖切断を生成する必要性を回避するエピゲノム編集を実行できるため、生物のゲノムを操作する安全で可逆的な方法になる。
【００７３】
実施形態では、融合タンパク質は、ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素、ＫＲＡＢドメイン、およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインを含む。態様では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメイン、ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素、およびＫＲＡＢドメインを含む。態様では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ＫＲＡＢドメイン、ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素、およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインを含む。実施形態では、融合タンパク質は、１つ以上のペプチドリンカーをさらに含む。態様では、融合タンパク質は、１つ以上の検出可能なタグをさらに含む。態様では、融合タンパク質は、１つ以上の核局在化配列をさらに含む。態様では、融合タンパク質は、１つ以上のペプチドリンカー、１つ以上の検出可能なタグ、１つ以上の核局在化配列、または前述の２つ以上の組み合わせをさらに含む。融合タンパク質が１つ以上のペプチドリンカーを含む場合、各ペプチドリンカーは同じであっても異なっていてもよい。融合タンパク質が１つ以上の検出可能なタグを含む場合、各検出可能なタグは同じであっても異なっていてもよい。態様では、融合タンパク質は、１〜１０個の検出可能なタグを含む。態様では、融合タンパク質は、１〜９つの検出可能なタグを含む。態様では、融合タンパク質は、１〜８つの検出可能なタグを含む。態様では、融合タンパク質は、１〜７つの検出可能なタグを含む。態様では、融合タンパク質は、１〜６つの検出可能なタグを含む。態様では、融合タンパク質は、１〜５つの検出可能なタグを含む。態様では、融合タンパク質は、１〜４つの検出可能なタグを含む。態様では、融合タンパク質は、１〜３つの検出可能なタグを含む。態様では、融合タンパク質は、１〜２つの検出可能なタグを含む。態様では、融合タンパク質は、１つの検出可能なタグを含む。態様では、融合タンパク質は、２つの検出可能なタグを含む。態様では、融合タンパク質は、３つの検出可能なタグを含む。態様では、融合タンパク質は、４つの検出可能なタグを含む。態様では、融合タンパク質は、５つの検出可能なタグを含む。
【００７４】
実施形態では、融合タンパク質は、以下の構造：Ａ−Ｂ−Ｃ、またはＢ−Ａ−Ｃ、またはＣ−Ａ−Ｂ、またはＣ−Ｂ−Ａ、またはＢ−Ｃ−Ａ、またはＡ−Ｃ−Ｂを含み、構造中、Ａはヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素を含み、ＢはＫＲＡＢドメインを含み、ＣはＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインを含み、構造中、左側の構成要素はＮ末端であり、右側の構成要素はＣ末端である。態様では、融合タンパク質は、１つ以上のペプチドリンカーおよび１つ以上の検出可能なタグをさらに含む。態様では、Ａ−Ｂ、Ｂ−Ａ、Ｂ−Ｃ、Ｃ−Ｂ、Ａ−Ｃ、およびＣ−Ａはそれぞれ、共有結合、ペプチドリンカー、検出可能なタグ、核局在化配列、またはそれらの２つ以上の組み合わせを介して、独立して連結している。ペプチドリンカーは、当技術分野で知られている任意のものであってよい（例えば、Ｐ２Ａ切断可能ペプチド、ＸＴＥＮリンカーなど）。態様では、融合タンパク質は、検出可能なタグ（例えば、ＨＡタグ、青色蛍光タンパク質など）などの他の構成要素を含む。
【００７５】
実施形態では、融合タンパク質は、以下の構造：Ａ−Ｌ１−Ｂ−Ｌ２−Ｃを含み、構造中、Ａはヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素を含み、ＢはＫＲＡＢドメインを含み、ＣはＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインを含み、Ｌ１は共有結合またはペプチドリンカーであり、Ｌ２は共有結合またはペプチドリンカーであり、構造中、ＡはＮ末端にあり、ＣはＣ末端にある。態様では、Ａは、ペプチドリンカーを介してＢに共有結合している。態様では、Ａは共有結合を介してＢに共有結合している。態様では、Ｂは、ペプチドリンカーを介してＣに共有結合している。態様では、Ｂは、共有結合を介してＣに共有結合している。ペプチドリンカーは、当技術分野で知られている任意のものであってよい（例えば、Ｐ２Ａ切断可能ペプチド、ＸＴＥＮリンカーなど）。態様では、融合タンパク質は、検出可能なタグ、核局在化配列などの他の構成要素を含む。態様では、Ｌ１は、共有結合、ペプチドリンカー、検出可能なタグ、核局在化配列、またはそれらの組み合わせである。態様では、Ｌ２は、共有結合、ペプチドリンカー、検出可能なタグ、核局在化配列、またはそれらの組み合わせである。
【００７６】
実施形態において、融合タンパク質は、以下の構造：Ｂ−Ｌ１−Ａ−Ｌ２−Ｃを含み、構造中、Ａは、ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素を含み、ＢはＫＲＡＢドメインを含み、ＣはＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインを含み、Ｌ１は共有結合またはペプチドリンカーであり、Ｌ２は共有結合またはペプチドリンカーであり、構造中、ＢはＮ末端にあり、ＣはＣ末端にある。態様では、Ｌ１はペプチドリンカーである。態様では、Ｌ１は共有結合である。態様では、Ｌ２はペプチドリンカーである。態様では、Ｌ２は共有結合である。ペプチドリンカーは、当技術分野で知られているか、または本明細書に記載されている任意のものであってよい（例えば、Ｐ２Ａ切断可能ペプチド、ＸＴＥＮリンカーなど）。態様では、融合タンパク質は、検出可能なタグなどの他の構成要素を含む。態様では、Ｌ１は、共有結合、ペプチドリンカー、検出可能なタグ、またはそれらの組み合わせである。態様では、Ｌ２は、共有結合、ペプチドリンカー、検出可能なタグ、またはそれらの組み合わせである。態様では、融合タンパク質は、核局在化配列をさらに含む。構造：Ｂ−Ｌ１−Ａ−Ｌ２−Ｃを含む例示的な融合タンパク質には、ｐ７６、ｐ９０、ｐ９１、ｐ９２、ｐ９３、ｐ９４、ｐ９５、ｐ９６、ｐ９７、ｐ９８、ｐ９９、ｐ１００、ｐ１０１、およびｐ１０２が含まれる（図５）。
【００７７】
実施形態では、融合タンパク質は、以下の構造：Ｂ−Ｌ３−Ａ−Ｌ４−Ｃ−Ｌ５−Ｄを含み、構造中、Ａはヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素を含み、ＢはＫＲＡＢドメインを含み、ＣはＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインを含み、Ｄは存在しないか、またはＤは１つ以上の検出可能なタグを含み、Ｌ３は共有結合、ペプチドリンカー、検出可能なタグ、またはそれらの２つ以上の組み合わせを含み、Ｌ４は共有結合、ペプチドリンカー、検出可能なタグ、またはそれらの２つ以上の組み合わせを含み、Ｌ５は存在しないか、またはＬ５は共有結合またはペプチドリンカーを含み、構造中、ＢはＮ末端にあり、ＤはＣ末端にある。態様では、Ｌ３はペプチドリンカーである。態様では、Ｌ３は共有結合である。態様では、Ｌ３はペプチドリンカーおよび検出可能なタグを含む。態様では、Ｌ３は検出可能なタグを含む。態様では、Ｌ４はペプチドリンカーである。態様では、Ｌ４はペプチドリンカーおよび検出可能なタグを含む。態様では、Ｌ４は共有結合である。態様では、Ｌ４は検出可能なタグを含む。態様では、Ｌ５はペプチドリンカーである。態様では、Ｌ５は共有結合である。態様では、Ｄは１つまたは複数の検出可能なタグを含む。態様では、Ｄは１つの検出可能なタグを含む。態様では、Ｄは２つの検出可能なタグを含む。態様では、Ｄは３つの検出可能なタグを含む。態様では、Ｄは複数の検出可能なタグを含む。Ｄは、当技術分野で知られているおよび／または本明細書に記載されている任意の検出可能なタグ（例えば、ＨＡタグ、青色蛍光タンパク質など）であってよい。一態様では、Ｌ５およびＤは存在しない。Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＤが２つ以上の検出可能なタグを含む場合、各検出可能なタグは同じであるかまたは異なる。ペプチドリンカーは、当技術分野で知られている、および／または本明細書に記載されている任意のものであってよい（例えば、Ｐ２Ａ切断可能ペプチド、ＸＴＥＮリンカーなど）。態様では、融合タンパク質は、核局在化配列をさらに含む。構造：Ｂ−Ｌ３−Ａ−Ｌ４−Ｃ−Ｌ５−Ｄを含む例示的な融合タンパク質には、図５に示すように、ｐ７６、ｐ９０、ｐ９１、ｐ９２、ｐ９３、ｐ９４、ｐ９５、ｐ９６、ｐ９７、ｐ９８、ｐ９９、ｐ１００、ｐ１０１、およびｐ１０２が含まれる。
【００７８】
実施形態において、融合タンパク質は、以下の構造：Ｃ−Ｌ３−Ａ−Ｌ４−Ｂ−Ｌ５−Ｄを含み、構造中、Ａはヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素を含み、ＢはＫＲＡＢドメインを含み、ＣはＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインを含み、Ｄは存在しないか、またはＤは１つ以上の検出可能なタグを含み、Ｌ３は共有結合、ペプチドリンカー、検出可能なタグ、またはそれらの２つ以上の組み合わせを含み、Ｌ４は共有結合、ペプチドリンカー、検出可能なタグ、またはそれらの２つ以上の組み合わせを含み、Ｌ５は存在しないか、またはＬ５は共有結合またはペプチドリンカーを含み、構造中、ＣはＮ末端にあり、ＤはＣ末端にある。態様では、Ｌ３はペプチドリンカーである。態様では、Ｌ３は共有結合である。態様では、Ｌ３は検出可能なタグを含む。態様では、Ｌ３はペプチドリンカーおよび検出可能なタグを含む。態様では、Ｌ４はペプチドリンカーである。態様では、Ｌ４は共有結合である。態様では、Ｌ４は検出可能なタグを含む。態様では、Ｌ４はペプチドリンカーおよび検出可能なタグを含む。態様では、Ｌ５はペプチドリンカーである。態様では、Ｌ５は共有結合である。態様では、Ｄは１つまたは複数の検出可能なタグを含む。態様では、Ｄは１つの検出可能なタグを含む。態様では、Ｄは２つの検出可能なタグを含む。態様では、Ｄは３つの検出可能なタグを含む。態様では、Ｄは複数の検出可能なタグを含む。Ｄは、当技術分野で知られているおよび／または本明細書に記載されている任意の検出可能なタグ（例えば、ＨＡタグ、青色蛍光タンパク質など）であってよい。一態様では、Ｌ５およびＤは存在しない。Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＤが２つ以上の検出可能なタグを含む場合、各検出可能なタグは同じであるかまたは異なる。ペプチドリンカーは、当技術分野で知られている、および／または本明細書に記載されている任意のものであってよい（例えば、Ｐ２Ａ切断可能ペプチド、ＸＴＥＮリンカーなど）。態様では、融合タンパク質は、核局在化配列をさらに含む。構造：Ｃ−Ｌ３−Ａ−Ｌ４−Ｂ−Ｌ５−Ｄを含む例示的な融合タンパク質は、図５に示されるように、ｐ１１２を含む。
【００７９】
「ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素」などの用語は、通常の慣習的な意味で、ＤＮＡポリヌクレオチド内の特定のホスホジエステル結合を標的とするＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、天然に存在するＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼの変異型）を指し、この場合、ホスホジエステル結合の認識は、別個のポリヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ配列（例えば、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ））によって促進されるが、標的ホスホジエステル結合を有意な程度に切断することはできない（例えば、生理学的条件下でのホスホジエステル結合の測定可能な切断はない）。したがって、ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）と複合体を形成したときにＤＮＡ結合能力（例えば、標的配列への特異的結合）を保持するが、有意なエンドヌクレアーゼ活性（例えば、検出可能なエンドヌクレアーゼ活性の量）を欠く。態様では、ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、ｄＣａｓ９、ｄｄＣｐｆ１、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９バリアント、またはヌクレアーゼ欠損クラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼである。
【００８０】
実施形態では、ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、ｄＣａｓ９である。本明細書で言及される「ｄＣａｓ９」または「ｄＣａｓ９タンパク質」という用語は、エンドヌクレアーゼ活性の両方の触媒部位に欠陥があるか、または活性を欠いているＣａｓ９タンパク質である。態様では、ｄＣａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９のＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａに対応する位置に突然変異を有する。態様では、ｄＣａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９の両方のエンドヌクレアーゼ触媒部位（ＲｕｖＣおよびＨＮＨ）での点突然変異のために、エンドヌクレアーゼ活性を欠いている。点突然変異はＤ１０ＡとＨ８４０Ａであり得る。態様では、ｄＣａｓ９は、検出可能なエンドヌクレアーゼ（例えば、エンドデオキシリボヌクレアーゼ）活性を実質的に有さない。態様では、ｄＣａｓ９は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。態様では、ｄＣａｓ９は、配列番号２３のアミノ酸配列を有する。態様では、ｄＣａｓ９は、配列番号２３に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ｄＣａｓ９は、配列番号２３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ｄＣａｓ９は、配列番号２３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ｄＣａｓ９は、配列番号２３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ｄＣａｓ９は、配列番号２３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ｄＣａｓ９は、配列番号２３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００８１】
本明細書で言及される「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９」、「Ｃａｓ９」、「Ｃｓｎ１」または「Ｃａｓ９タンパク質」は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの組換え型または天然型、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ酵素活性を維持するまたはそのバリアントまたはホモログのいずれかを含む（例えば、Ｃａｓ９と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の活性内）。いくつかの態様では、バリアントまたはホモログは、天然に存在するＣａｓ９タンパク質と比較して、全配列または配列の一部（例えば、５０、１００、１５０、または２００個の連続したアミノ酸部分）にわたる少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９９ＺＷ２によって同定されるタンパク質、またはそれに対して実質的な同一性を有するバリアントもしくはホモログと実質的に同一である。態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９９ＺＷ２によって同定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する。態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９９ＺＷ２によって同定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９９ＺＷ２によって同定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９９ＺＷ２によって同定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９９ＺＷ２によって同定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【００８２】
実施形態では、ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、「ｄｄＣｐｆ１」または「ｄｄＣａｓ１２ａ」である。「ＤＮＡｓｅ−ｄｅａｄＣｐｆ１」または「ｄｄＣｐｆ１」という用語は、Ｃｐｆ１ＤＮＡｓｅ活性の不活性化をもたらす変異したＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）を指す。態様では、ｄｄＣｐｆ１は、ＡｓＣｐｆ１のＲｕｖＣドメインにＥ９９３Ａ突然変異を含む。態様では、ｄｄＣｐｆ１は、検出可能なエンドヌクレアーゼ（例えば、エンドデオキシリボヌクレアーゼ）活性を実質的に有さない。態様では、ｄｄＣｐｆ１は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。態様では、ｄｄＣｐｆ１は、配列番号３４のアミノ酸配列を有する。態様では、ｄｄＣｐｆ１は、配列番号３４に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ｄｄＣｐｆ１は、配列番号３４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ｄｄＣｐｆ１は、配列番号３４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ｄｄＣｐｆ１は、配列番号３４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ｄｄＣｐｆ１は、配列番号３４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ｄｄＣｐｆ１は、配列番号３４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００８３】
実施形態では、ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、ｄＬｂＣｐｆ１である。「ｄＬｂＣｐｆ１：という用語は、ＤＮＡｓｅ活性を欠くＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）からの変異したＣｐｆ１を指す。態様では、ｄＬｂＣｐｆ１は、Ｄ８３２Ａ突然変異を含む。態様では、ｄＬｂＣｐｆ１は、検出可能なエンドヌクレアーゼ（例えば、エンドデオキシリボヌクレアーゼ）活性を実質的に有さない。態様では、ｄＬｂＣｐｆ１は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。態様では、ｄＬｂＣｐｆ１は、配列番号３５のアミノ酸配列を有する。態様では、ｄＬｂＣｐｆ１は、配列番号３５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ｄＬｂＣｐｆ１は、配列番号３５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ｄＬｂＣｐｆ１は、配列番号３５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ｄＬｂＣｐｆ１は、配列番号３５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ｄＬｂＣｐｆ１は、配列番号３５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ｄＬｂＣｐｆ１は、配列番号３５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００８４】
実施形態では、ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、ｄＦｎＣｐｆ１である。「ｄＦｎＣｐｆ１」という用語は、ＤＮＡｓｅ活性を欠くＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ  Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）からの変異Ｃｐｆ１を指す。態様では、ｄＦｎＣｐｆ１は、Ｄ９１７Ａ突然変異を含む。態様では、ｄＦｎＣｐｆ１は、検出可能なエンドヌクレアーゼ（例えば、エンドデオキシリボヌクレアーゼ）活性を実質的に有さない。態様では、ｄＦｎＣｐｆ１は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。態様では、ｄＦｎＣｐｆ１は、配列番号３６のアミノ酸配列を有する。態様では、ｄＦｎＣｐｆ１は、配列番号３６に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ｄＦｎＣｐｆ１は、配列番号３６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ｄＦｎＣｐｆ１は、配列番号３６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ｄＦｎＣｐｆ１は、配列番号３６に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ｄＦｎＣｐｆ１は、配列番号３６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ｄＦｎＣｐｆ１は、配列番号３６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００８５】
本明細書で言及される「Ｃｐｆ１」または「Ｃｐｆ１タンパク質」は、Ｃｐｆ１（ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ１からのＣＲＩＳＰＲ）エンドヌクレアーゼの組換えまたは天然に存在する形態またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ酵素活性を維持するそのバリアントまたはホモログ（Ｃｐｆ１と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の活性内）のいずれかが含まれる態様では、バリアントまたはホモログは、天然に存在するＣｐｆ１タンパク質と比較して、全配列または配列の一部（例えば、５０、１００、１５０または２００個の連続したアミノ酸部分）にわたって、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。態様では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｕ２ＵＭＱ６によって同定されるタンパク質、またはそれに対して実質的な同一性を有するバリアントもしくはホモログと実質的に同一である。態様では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｕ２ＵＭＱ６によって同定されるタンパク質と同一である。態様では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｕ２ＵＭＱ６によって同定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する。態様では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｕ２ＵＭＱ６によって同定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。態様では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｕ２ＵＭＱ６によって同定されるタンパク質と同一である。態様では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｕ２ＵＭＱ６によって同定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。態様では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｕ２ＵＭＱ６によって同定されるタンパク質と同一である。態様では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｕ２ＵＭＱ６によって同定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｕ２ＵＭＱ６によって同定されるタンパク質と同一である。態様では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｕ２ＵＭＱ６によって同定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【００８６】
実施形態において、ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９バリアントである。「ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９バリアント」という用語は、野生型Ｃａｓ９と比較してＰＡＭへの結合特異性を高める１つ以上の変異を有し、さらに、タンパク質をエンドヌクレアーゼ活性が不可能にするか、または著しく損なうタンパク質変異を含むＣａｓ９タンパク質を指す。理論に拘束されることを望まないが、標的配列はＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体によって認識される短い配列、と関連しているべきであると考えられている。ＰＡＭの正確な配列と長さの要件は、使用するＣＲＩＳＰＲ酵素によって異なるが、ＰＡＭは通常、プロトスペーサー（すなわち、標的配列）に隣接する２〜５塩基対の配列である。ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９バリアントのＰＡＭへの結合特異性は、当技術分野で知られている任意の方法によって決定することができる。既知のＣａｓ９バリアントの説明と使用法は、例えば、Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５，２０１７およびＣｅｂｒｉａｎ−Ｓｅｒｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅｓ  ａｎｄ  ｖａｒｉａｎｔｓ：ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｏｏｌｓＭａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  ７−８，２０１７に記載されており、これらは参照によりその全体およびすべての目的のために本明細書に組み込まれる。例示的なＣａｓ９バリアントを以下の表４に示す。
【表１】
2021521788.tif 000003
【００８７】
実施形態では、ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、ヌクレアーゼ欠損クラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼである。本明細書で使用される「ヌクレアーゼ欠損クラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ」という用語は、減少した、損なわれた、または不活性なエンドヌクレアーゼ活性をもたらす突然変異を有する任意のクラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを指す。
【００８８】
実施形態において、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインは、Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインである。本明細書で提供される「Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメイン」は、Ｄｎｍｔ３ＡおよびＤｎｍｔ３Ｌの両方を含むタンパク質を指す。態様では、Ｄｎｍｔ３ＡおよびＤｎｍｔ３Ｌは共有結合している。態様では、Ｄｎｍｔ３Ａは、ペプチドリンカーを介してＤｎｍｔ３Ｌに共有結合している。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２７によって示される配列を含む。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２７によって示される配列である。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２７に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ペプチドリンカーは、配列番号２７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインは、配列番号３３によって示される配列を含む。態様では、Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインは、配列番号３３によって示される配列である。態様では、Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインは、配列番号３３に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインは、配列番号３３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインは、配列番号３３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインは、配列番号３３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインは、配列番号３３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインは、配列番号３３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００８９】
実施形態では、ペプチドリンカーはＸＴＥＮリンカーである。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、約１６〜約８０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、約１７〜約８０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、約１８〜約８０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、約１９〜約８０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、約２０〜約８０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、約３０〜約８０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、約４０〜約８０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、約５０〜約８０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、約６０〜約８０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、約７０〜約８０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、約１６〜約７０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、約１６〜約６０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、約１６〜約５０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、約１６〜約４０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、約１６〜約３５個のアミノ酸残基を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、約１６〜約３０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、約１６〜約２５個のアミノ酸残基を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、約１６〜約２０個のアミノ酸残基を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、約１６個のアミノ酸残基を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、約１７個のアミノ酸残基を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、約１８個のアミノ酸残基を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、約１９個のアミノ酸残基を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、約２０個のアミノ酸残基を含む。
【００９０】
実施形態では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３１によって示される配列を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３１によって示される配列である。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３２によって示される配列を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３２によって示される配列である。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３１に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３２に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００９１】
融合タンパク質は、細胞の特定の領域（例えば、細胞質、核）に融合タンパク質を標的化するのに有用なアミノ酸配列を含み得る。したがって、態様では、融合タンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）ペプチドをさらに含む。態様では、ＮＬＳは、配列番号２５によって示される配列を含む。態様では、ＮＬＳは、配列番号２５によって示される配列である。態様では、ＮＬＳは、配列番号２５に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＮＬＳは、配列番号２５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＮＬＳは、配列番号２５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＮＬＳは、配列番号２５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＮＬＳは、配列番号２５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＮＬＳは、配列番号２５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００９２】
実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、ＫＲＡＢドメイン、ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素、およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインを含む。
【００９３】
実施形態では、ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素はｄＣａｓ９であり、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインはＤｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインである。
【００９４】
実施形態では、ｄＣａｓ９は、ペプチドリンカーを介してＫＲＡＢドメインに共有結合され、ここで、ｄＣａｓ９は、ペプチドリンカーを介してＤｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインに共有結合される。
【００９５】
実施形態では、ペプチドリンカーはＸＴＥＮリンカーである。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３１によって示される配列を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３１によって示される配列である。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３２によって示される配列を含む。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３２によって示される配列である。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号３２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００９６】
実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列である。態様では、融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列である。態様では、融合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列である。態様では、融合タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列である。態様では、融合タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列である。態様では、融合タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列である。態様では、融合タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列である。態様では、融合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列である。態様では、融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列である。態様では、融合タンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列である。態様では、融合タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列である。態様では、融合タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列である。態様では、融合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列である。態様では、融合タンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列である。態様では、融合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列である。
【００９７】
実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５に対して、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１に対して、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号２に対して、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号３に対して、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号４に対して、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号５に対して、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号６に対して、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号７に対して、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号８に対して、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号９に対して、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１０に対して、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１１に対して、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１２に対して、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１３に対して、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１４に対して、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１５に対して、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９８】
実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９９】
実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１００】
実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号６に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号７に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号８に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号９に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１０に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０１】
実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０２】
実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、融合タンパク質は、配列番号１５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
複合体
融合タンパク質がエピゲノム編集を実行するために、融合タンパク質は、標的ポリヌクレオチド配列（例えば、編集される標的ＤＮＡ配列）に相補的なポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡ）と相互作用し（例えば、非共有結合的に結合する）、さらに、本明細書に記載の融合タンパク質のヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素が結合することができる配列（すなわち、結合配列）を含む。この複合体を形成することにより、融合タンパク質はエピゲノム編集を実行するために適切に配置される。「複合体」という用語は、２つ以上の構成要素を含み、構成要素が一緒に結合して機能単位を形成する組成物を指す。態様では、本明細書に記載の複合体は、本明細書に記載の融合タンパク質および本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む。したがって、一態様では、実施形態およびその態様を含む、本明細書に記載の融合タンパク質と、ポリヌクレオチドであって、（１）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列、および（２）ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素の結合配列であって、ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素が、結合配列（例えば、ＤＮＡ標的配列に結合可能なアミノ酸配列）を介してポリヌクレオチドに結合している、結合配列を含む、ポリヌクレオチドと、が提供される。
【０１０４】
ＤＮＡ標的化配列とは、標的ポリヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを指す。態様では、ＤＮＡ標的化配列は、「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」を含み得る単一ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）であり得る。態様では、ＤＮＡ標的化配列は、２つのＲＮＡ分子を含む（例えば、結合配列（例えば、ｄＣａｓ９結合配列）でのハイブリダイゼーションを介して一緒に結合される）。態様では、ＤＮＡ標的化配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的である。態様では、ＤＮＡ標的化配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、細胞遺伝子の配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的である。態様では、ＤＮＡ標的化配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、細胞遺伝子の配列に結合する。態様では、ＤＮＡ標的化配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、細胞遺伝子の配列に対して少なくとも７５％相補的である。態様では、ＤＮＡ標的化配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、細胞遺伝子の配列に対して少なくとも８０％相補的である。態様では、ＤＮＡ標的化配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、細胞遺伝子の配列に結合する。態様では、ＤＮＡ標的化配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、細胞遺伝子の配列に対して少なくとも８５％相補的である。態様では、ＤＮＡ標的化配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、細胞遺伝子の配列に結合する。態様では、ＤＮＡ標的化配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、細胞遺伝子の配列に対して少なくとも９０％相補的である。態様では、ＤＮＡ標的化配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、細胞遺伝子の配列に結合する。態様では、ＤＮＡ標的化配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、細胞遺伝子の配列に対して少なくとも９５％相補的である。態様では、ＤＮＡ標的化配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、細胞遺伝子の配列に結合する。
【０１０５】
本明細書で提供される「標的ポリヌクレオチド配列」は、細胞内に存在するか、または細胞によって発現される核酸配列であり、ガイド配列（またはＤＮＡ標的化配列）は、標的配列とガイド配列（またはＤＮＡ標的化配列）間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する相補性を有するように設計される。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ではない。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、外来性核酸配列である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、内在性核酸配列である。
【０１０６】
標的ポリヌクレオチド配列は、エピゲノム編集に適したポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列）の任意の領域であり得る。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は遺伝子の一部である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、転写調節配列の一部である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、プロモーター、エンハンサー、またはサイレンサーの一部である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、プロモーターの一部である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、エンハンサーの一部である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、サイレンサーの一部である。
【０１０７】
実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、低メチル化核酸配列である。「低メチル化核酸配列」は、当技術分野における標準的な意味に従って本明細書で使用され、５−メチルシトシンヌクレオチド上の（例えば、ＣｐＧでの）メチル基の喪失または欠如を指す。メチル基の喪失または欠如は、標準的な対照と比較して起こり得る。低メチル化は、例えば、より若い細胞または非癌細胞と比較して、それぞれ、老化細胞または癌（例えば、新生物の初期段階）で起こり得る。したがって、この複合体は、正常な（例えば、非疾患の非加齢）メチル化レベルを再確立するのに有用であり得る。
【０１０８】
実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、転写開始部位に隣接する約３０００塩基対（ｂｐ）以内にある。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、転写開始部位に隣接する約３０００、２９００、２８００、２７００、２６００、２５００、２４００、２３００、２２００、２１００、２０００、１９００、１８００、１７００、１６００、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、または１００塩基対（ｂｐ）以内にある。
【０１０９】
実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、プロモーター配列に、その近くに、またはその中にある。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣｐＧアイランド内にある。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡ低メチル化を特徴とする疾患または状態に関連することが知られている。
【０１１０】
実施形態では、例示的な標的ポリヌクレオチド配列は、表１および２に記載されるものを含む。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、または９５の配列を含む。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、または９５に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号３７である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号３９である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号４１である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号４３である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号４５である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号４７である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号４９である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号５１である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号５３である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号５５である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号５７である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号５９である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号６１である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号６３である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号６５である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号６７である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号６９である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号７１である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号７３である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号７５である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号７７である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号７９である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号８１である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号８３である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号８５である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号８７である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号８９である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号９１である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号９３である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号９５である。
【０１１１】
態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号３７に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号３９に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号４１に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号４３に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号４５である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号４７に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号４９に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号５１に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号５３に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号５５に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号５７に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号５９に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号６１に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号６３に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号６５に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号６７に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号６９に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号７１に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号７３に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号７５に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号７７に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号７９に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号８１に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号８３に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号８５に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号８７に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号８９に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号９１に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号９３に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号９５に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【０１１２】
態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号３７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号３９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号４１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号４３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号４５である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号４７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号４９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号５１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号５３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号５５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号５７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号５９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号６１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号６３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号６５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号６７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号６９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号７１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号７３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号７５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号７７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号７９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号８１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号８３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号８５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号８７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号８９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号９１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号９３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号９５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【０１１３】
態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号３７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号３９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号４１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号４３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は配列番号４５である。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号４７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号５１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号５３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号５５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号５７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号５９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号６１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号６３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号６５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号６７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号６９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号７１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号７３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号７５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号７７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号７９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号８１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号８３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号８５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号８７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号８９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号９１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号９３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号９５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【０１１４】
実施形態では、複合体は、ポリヌクレオチドの結合配列に結合することによってポリヌクレオチドに結合し、それによってリボ核タンパク質複合体を形成するｄＣａｓ９を含む。態様では、結合配列はヘアピン構造を形成する。態様では、結合配列は、３０〜１００ｎｔ、３５〜５０ｎｔ、３７〜４７ｎｔ、または４２ｎｔの長さである。
【０１１５】
実施形態では、結合配列（例えば、Ｃａｓ９結合配列）は、Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ｄＣａｓ９タンパク質）と相互作用するか、または結合し、そしてそれらは一緒に、ＤＮＡ標的化配列によって認識される標的ポリヌクレオチド配列に結合する。結合配列（例えば、Ｃａｓ９結合配列）は、互いにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成するヌクレオチドの２つの相補的なストレッチを含む。これらのヌクレオチドの２つの相補的ストレッチは、リンカーまたはリンカーヌクレオチドとして知られる介在ヌクレオチド（例えば、単一分子ポリヌクレオチドの場合）によって共有結合され得、そしてハイブリダイズして結合配列（例えば、Ｃａｓ９結合配列）の二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖、または「Ｃａｓ９−結合配列の結合ヘアピン」）を形成し、したがって、ステムループ構造をもたらす。あるいは、いくつかの態様では、ヌクレオチドの２つの相補的ストレッチは共有結合されなくてもよく、代わりに、相補的配列（例えば、２分子ポリヌクレオチド）間のハイブリダイゼーションによって一緒に保持される。
【０１１６】
結合配列（例えば、Ｃａｓ９結合配列）は、１０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチド、例えば、１０ヌクレオチド（ｎｔ）〜２０ｎｔ、２０ｎｔ〜３０ｎｔ、３０ｎｔ〜４０ｎｔ、４０ｎｔ〜５０ｎｔ、５０ｎｔ〜６０ｎｔ、６０ｎｔ〜７０ｎｔ、７０ｎｔ〜８０ｎｔ、８０ｎｔ〜９０ｎｔ、または９０ｎｔ〜１００ｎｔの長さを有することができる。態様では、結合配列は１５ヌクレオチド（ｎｔ）〜８０ｎｔまでの長さを有する。態様では、結合配列は１５ｎｔ〜５０ｎｔの長さを有する。態様では、結合配列は１５ｎｔ〜４０ｎｔの長さを有する。態様では、結合配列は１５ｎｔ〜３０ｎｔの長さを有する。態様では、結合配列は３７ｎｔ〜４７ｎｔ（例えば、４２ｎｔ）の長さを有する。態様では、結合配列は、１５ｎｔ〜２５ｎｔの長さを有する。
【０１１７】
結合配列（例えば、Ｃａｓ９結合配列）のｄｓＲＮＡ二重鎖は、６塩基対（ｂｐ）〜５０ｂｐの長さを有することができる。例えば、結合配列（例えば、Ｃａｓ９結合配列）のｄｓＲＮＡ二重鎖は、６ｂｐ〜４０ｂｐ、６ｂｐ〜３０ｂｐ、６ｂｐ〜２５ｂｐ、６ｂｐ〜２０ｂｐ、６ｂｐ〜１５ｂｐ、８ｂｐ〜４０ｂｐ、８ｂｐ〜３０ｂｐ、８ｂｐ〜２５ｂｐ、８ｂｐ〜２０ｂｐ、または８ｂｐ〜１５ｂｐの長さを有することができる。態様では、結合配列（例えば、Ｃａｓ９結合配列）のｄｓＲＮＡ二重鎖は、８ｂｐ〜１０ｂｐの長さを有する。態様では、結合配列（例えば、Ｃａｓ９結合配列）のｄｓＲＮＡ二重鎖は、１０ｂｐ〜１５ｂｐの長さを有する。態様では、結合配列（例えば、Ｃａｓ９結合配列）のｄｓＲＮＡ二重鎖は、１５ｂｐ〜１８ｂｐの長さを有する。態様では、結合配列（例えば、Ｃａｓ９結合配列）のｄｓＲＮＡ二重鎖は、１８ｂｐ〜２０ｂｐの長さを有する。態様では、結合配列（例えば、Ｃａｓ９結合配列）のｄｓＲＮＡ二重鎖は、２０ｂｐ〜２５ｂｐの長さを有する。態様では、結合配列（例えば、Ｃａｓ９結合配列）のｄｓＲＮＡ二重鎖は、２５ｂｐ〜３０ｂｐの長さを有する。態様では、結合配列（例えば、Ｃａｓ９結合配列）のｄｓＲＮＡ二重鎖は、３０ｂｐ〜３５ｂｐまでの長さを有する。態様では、結合配列（例えば、Ｃａｓ９結合配列）のｄｓＲＮＡ二重鎖は、３５ｂｐ〜４０ｂｐまでの長さを有する。態様では、結合配列（例えば、Ｃａｓ９結合配列）のｄｓＲＮＡ二重鎖は、４０ｂｐ〜５０ｂｐの長さを有する。
【０１１８】
実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成する例示的なポリヌクレオチドには、ｓｇＲＮＡとして表１および２に記載されているものが含まれる。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドには、配列番号３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、もしくは９４の配列またはそれらの対応するＲＮＡ配列が含まれる。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、もしくは９４またはそれらに対応するＲＮＡ配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号３８の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号４０の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号４２の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号４４の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号４６の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号４８の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号５０の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号５２の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号５４の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号５６の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号５８の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号６０の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号６２の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号６４の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号６６の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号６８の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号７０の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号７２の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号７４の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号７６の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号７８の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号８０の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号８２の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号８４の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号８６の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号８８の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号９０の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号９２の配列を含む。態様では、本明細書に記載の融合タンパク質と複合体を形成するポリヌクレオチドは、配列番号９４の配列を含む。
【０１１９】
核酸とベクター
実施形態およびその態様を含む、本明細書に記載の融合タンパク質は、融合タンパク質をコードする核酸配列として提供され得る。したがって、一態様では、実施形態およびその態様を含む、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列が提供される。一態様では、実施形態およびその態様を含む、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列（ＤＮＡ標的化配列を含む）が提供される。態様では、核酸配列は、本明細書に記載の特定の％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する融合タンパク質を含む、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする。態様では、核酸はＲＮＡである。態様では、核酸はメッセンジャーＲＮＡである。態様では、メッセンジャーＲＮＡはメッセンジャーＲＮＰである。態様では、核酸配列は、実施形態およびその態様を含む、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする。態様では、核酸配列は配列番号１の融合タンパク質をコードする。態様では、核酸配列は配列番号２の融合タンパク質をコードする。態様では、核酸配列は配列番号３の融合タンパク質をコードする。態様では、核酸配列は配列番号４の融合タンパク質をコードする。態様では、核酸配列は配列番号５の融合タンパク質をコードする。態様では、核酸配列は配列番号６の融合タンパク質をコードする。態様では、核酸配列は配列番号７の融合タンパク質をコードする。態様では、核酸配列は配列番号８の融合タンパク質をコードする。態様では、核酸配列は配列番号９の融合タンパク質をコードする。態様では、核酸配列は配列番号１０の融合タンパク質をコードする。態様では、核酸配列は配列番号１１の融合タンパク質をコードする。態様では、核酸配列は配列番号１２の融合タンパク質をコードする。態様では、核酸配列は配列番号１３の融合タンパク質をコードする。態様では、核酸配列は配列番号１４の融合タンパク質をコードする。態様では、核酸配列は配列番号１５の融合タンパク質をコードする。
【０１２０】
実施形態およびその態様を含む、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列は、ベクターに含まれ得ることがさらに企図される。したがって、一態様では、実施形態およびその態様を含む、本明細書に記載の核酸配列を含むベクターが提供される。態様では、ベクターは、本明細書に記載の特定の％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する融合タンパク質を含む、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。態様では、核酸はメッセンジャーＲＮＡである。態様では、メッセンジャーＲＮＡはメッセンジャーＲＮＰである。態様では、ベクターは配列番号１の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは配列番号２の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは配列番号３の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは配列番号４の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは配列番号５の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは配列番号６の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは配列番号７の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは配列番号８の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは配列番号９の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは配列番号１０の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは配列番号１１の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは配列番号１２の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは配列番号１３の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは配列番号１４の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは配列番号１５の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。
【０１２１】
実施形態において、ベクターは、ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドは、（１）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列、および（２）ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素の結合配列を含む。したがって、１つ以上のベクターは、エピゲノム編集を実行するために必要なすべての構成要素を含み得る。
【０１２２】
細胞
本明細書に記載の組成物は、細胞に組み込むことができる。細胞内で、実施形態およびその態様を含む、本明細書に記載の組成物は、エピゲノム編集を実行することができる。したがって、一態様では、実施形態およびその態様を含む本明細書に記載の融合タンパク質、実施形態およびその態様を含む本明細書に記載の核酸、実施形態およびその態様を含む本明細書に記載の複合体、または実施形態およびその態様を含む、本明細書に記載のベクター、を含む細胞を提供する。一態様では、実施形態およびその態様を含む、本明細書に記載の融合タンパク質を含む細胞が提供される。一態様では、実施形態およびその態様を含む、本明細書に記載の核酸を含む細胞が提供される。一態様では、実施形態およびその態様を含む、本明細書に記載の複合体を含む細胞が提供される。一態様では、実施形態およびその態様を含む、本明細書に記載のベクターを含む細胞が提供される。態様では、細胞は真核細胞である。態様では、細胞は哺乳動物細胞である。
【０１２３】
方法
本明細書に記載の組成物は、エピゲノム編集、より具体的には、標的核酸配列（例えば、遺伝子）の抑制またはサイレンシングをもたらすエピゲノム編集に使用できることが企図される。いかなる理論にも拘束されることを意図することなく、サイレンシングは、標的核酸配列を含むクロマチン上で、メチル化および／または抑制性クロマチンマーカーの導入（例えば、特定のヒストン（例えば、Ｈ３Ｋ９、Ｈ３Ｋ２７）のモノメチル化、ジメチル化、またはトリメチル化、脱アセチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化）から生じ得る。いかなる理論にも拘束されることを意図することなく、この方法を使用して、例えば、メチル化を介してクロマチンを閉じるか、または標的核酸配列（例えば、遺伝子）を含むクロマチンに抑制性クロマチンマーカーを導入することによって、エピジェネティックな状態を変えることができる。いかなる理論にも拘束されることを意図することなく、Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌ融合はＣｐＧアイランドに見出されるＣＧ  ＤＮＡ部位にメチルマークを追加するように機能し、ＫＲＡＢドメインは抑制性マークを導入することによってヒストンを修飾するエピジェネティック因子を動員すると考えられる。いかなる理論にも拘束されることを意図することなく、ＤＮＡはＣｐＧアイランドに見出されるＣＧ配列のＣヌクレオチドでメチル化される（すなわち、ＣｐＧアイランドに見出されるＣＧ  ＤＮＡ部位のＣヌクレオチドにメチルマークを追加する）。
【０１２４】
一態様では、実施形態およびその態様を含む、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドを標的核酸を含む細胞に送達することと、（ｉ）標的核酸配列に相補的なＤＮＡ標的化配列、および（ｉｉ）ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素の結合配列を含む、第２のポリヌクレオチドをその細胞に送達することと、を含む細胞内の標的核酸配列をサイレンシングする方法が提供される。いかなる理論にも拘束されることを意図することなく、融合タンパク質は、標的核酸配列を含むクロマチンをメチル化することによって、および／または標的核酸配列を含むクロマチンに抑制性クロマチンマークを導入することによって、細胞内の標的核酸配列をサイレンシングする。いかなる理論にも拘束されることを意図することなく、クロマチンをメチル化することは、ＣｐＧアイランドに見出されるＣＧ配列のＣヌクレオチドでＤＮＡがメチル化されることを意味する（すなわち、ＣｐＧアイランドに見出されるＣＧ  ＤＮＡ部位のＣヌクレオチドにメチルマークを追加する）。態様では、標的核酸配列の約３０００塩基対以内にある配列はメチル化されている。態様では、標的核酸配列の、約３０００、２９００、２８００、２７００、２６００、２５００、２４００、２３００、２２００、２１００、２０００、１９００、１８００、１７００、１６００、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、または１００塩基対以内にある配列はメチル化されている。
【０１２５】
本明細書で使用される「抑制性クロマチンマーカー」という用語は、標的核酸配列（例えば、遺伝子）のサイレンシング（例えば、転写の減少または阻害）をもたらすクロマチンに加えられた修飾を指す。抑制性クロマチンマーカーの例には、ヒストン（例えば、Ｈ３Ｋ９、Ｈ３Ｋ２７、Ｈ３Ｋ７９、Ｈ２ＢＫ５）のモノメチル化、ジメチル化、および／またはトリメチル化、アセチル化／脱アセチル化、リン酸化、およびユビキチン化が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２６】
実施形態では、サイレンシングは、転写の完全な抑制を指す。態様では、サイレンシングは、対照の転写のレベルと比較して、転写の有意な減少を指す。
【０１２７】
実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第１のベクター内に含まれる。態様では、第１のポリヌクレオチドは、第２のベクター内に含まれる。態様では、第１のベクターと第２のベクターは同じである。態様では、第１のベクターは第２のベクターとは異なる。
【０１２８】
実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、当技術分野で知られている任意の方法によって、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、または形質導入によって細胞に送達される。
【０１２９】
あるいは、一態様では、実施形態およびその態様を含む、本明細書に記載の複合体を標的核酸を含む細胞に送達することを含む、細胞内の標的核酸配列をサイレンシングする方法が提供される。いかなる理論にも拘束されることを意図することなく、複合体は、標的核酸配列を含むクロマチンをメチル化することによって、および／または標的核酸配列を含むクロマチンに抑制性クロマチンマークを導入することによって、細胞内の標的核酸配列をサイレンシングする。
【０１３０】
実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。
【０１３１】
実施形態では、この方法は、非標的核酸配列に対する特異性よりも２倍高い特異性を有する。態様では、この方法は、非標的核酸配列に対する特異性よりも、少なくとも２倍（例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍）高い特異性を有する。特異性を決定するための方法は当技術分野で周知であり、これらに限定されないが、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）、バイサルファイトシーケンシング、クロマチン免疫沈降、フローサイトメトリー、およびｑＰＣＲが含まれる。したがって、態様では、特異性はＲＮＡシーケンシングによって決定される。態様では、特異性はバイサルファイトシーケンシングによって決定される。態様では、特異性はクロマチン免疫沈降によって決定される。態様では、特異性はフローサイトメトリーによって決定される。態様では、特異性はｑＰＣＲによって決定される。
【０１３２】
態様では、複合体は、当技術分野で知られている任意の方法、例えば、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）送達を介して細胞に送達される。
【０１３３】
実施形態Ｎ１〜Ｎ４１
実施形態Ｎ１．ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素、クルッペル関連ボックスドメイン、およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインを含む、融合タンパク質。
【０１３４】
実施形態Ｎ２．ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素が、ｄＣａｓ９、ｄｄＣｐｆ１、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９バリアント、またはヌクレアーゼ欠損クラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼである、実施形態Ｎ１に記載の融合タンパク質。
【０１３５】
実施形態Ｎ３．ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインが、Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインである、実施形態Ｎ１またはＮ２に記載の融合タンパク質。
【０１３６】
実施形態Ｎ４．融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメイン、ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素、およびクルッペル関連ボックスドメインを含む、実施形態Ｎ１に記載の融合タンパク質。
【０１３７】
実施形態Ｎ５．ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素が、ｄＣａｓ９であり、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインが、Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインである、実施形態Ｎ４に記載の融合タンパク質。
【０１３８】
実施形態Ｎ６．ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素が、ｄＣａｓ９であり、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインが、Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインである、実施形態Ｎ５に記載の融合タンパク質。
【０１３９】
実施形態Ｎ７．ペプチドリンカーが、ＸＴＥＮリンカーである、実施形態Ｎ６に記載の融合タンパク質。
【０１４０】
実施形態Ｎ８．融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、クルッペル関連ボックス、ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素、およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインを含む、実施形態Ｎ１に記載の融合タンパク質。
【０１４１】
実施形態Ｎ９．ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素が、ｄＣａｓ９であり、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインが、Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインである、実施形態Ｎ８に記載の融合タンパク質。
【０１４２】
実施形態Ｎ１０．ｄＣａｓ９が、ペプチドリンカーを介してＤｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインに共有結合しており、クルッペル関連ボックスドメインが、ペプチドリンカーを介してｄＣａｓ９に共有結合している、実施形態Ｎ９に記載の融合タンパク質。
【０１４３】
実施形態Ｎ１１．ペプチドリンカーが、ＸＴＥＮリンカーである、実施形態Ｎ１０に記載の融合タンパク質。
【０１４４】
実施形態Ｎ１２．ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素が、ペプチドリンカーを介してクルッペル関連ボックスドメインに共有結合している、実施形態Ｎ１〜Ｎ３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【０１４５】
実施形態Ｎ１３．ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素が、ペプチドリンカーを介してＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインに共有結合している、実施形態Ｎ１〜Ｎ３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【０１４６】
実施形態Ｎ１４．クルッペル関連ボックスドメインが、ペプチドリンカーを介してＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインに共有結合している、実施形態Ｎ１〜Ｎ３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【０１４７】
実施形態Ｎ１５．ペプチドリンカーが、ＸＴＥＮリンカーである、実施形態Ｎ１２〜Ｎ１４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【０１４８】
実施形態Ｎ１６．ＸＴＥＮリンカーが、約１６〜８０個のアミノ酸残基を含む、実施形態Ｎ１５に記載の融合タンパク質。
【０１４９】
実施形態Ｎ１７．核局在化シグナルペプチドをさらに含む、実施形態Ｎ１〜Ｎ１６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【０１５０】
実施形態Ｎ１８．融合タンパク質が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｎ１に記載の融合タンパク質。
【０１５１】
実施形態Ｎ１９．実施形態Ｎ１〜Ｎ１８のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする核酸配列。
【０１５２】
実施形態Ｎ２０．核酸配列がメッセンジャーＲＮＡである、実施形態Ｎ１９の核酸配列。
【０１５３】
実施形態Ｎ２１．複合体であって、（ｉ）実施形態Ｎ１からＮ１８のいずれか１つに記載の融合タンパク質と、（ｉｉ）ポリヌクレオチドであって、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列、および（ｂ）ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素の結合配列であって、ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、結合配列を介してポリヌクレオチドに結合している、結合配列を含む、ポリヌクレオチドと、を含む、複合体。
【０１５４】
実施形態Ｎ２２．標的ポリヌクレオチド配列が、遺伝子の一部である、実施形態Ｎ２１に記載の複合体。
【０１５５】
実施形態Ｎ２３．標的ポリヌクレオチド配列が、転写調節配列の一部である、実施形態Ｎ２１に記載の複合体。
【０１５６】
実施形態Ｎ２４．標的ポリヌクレオチド配列が、プロモーター、エンハンサー、またはサイレンサーの一部である、実施形態Ｎ２１に記載の複合体。
【０１５７】
実施形態Ｎ２５．標的ポリヌクレオチド配列が、転写開始部位に隣接する約３０００ｂｐ以内にある、実施形態Ｎ２１に記載の複合体。
【０１５８】
実施形態Ｎ２６．実施形態Ｎ１９またはＮ２０に記載の核酸配列を含むベクター。
【０１５９】
実施形態Ｎ２７．ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドが、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列と、（ｂ）ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素の結合配列と、を含む、実施形態Ｎ２６に記載のベクター。
【０１６０】
実施形態Ｎ２８．実施形態Ｎ１〜Ｎ１８のいずれか１つに記載の融合タンパク質、実施形態Ｎ１９もしくはＮ２０に記載の核酸、実施形態Ｎ２１〜Ｎ２５のいずれか１つに記載の複合体、または実施形態Ｎ２６もしくはＮ２７に記載のベクター、を含む、細胞。
【０１６１】
実施形態Ｎ２９．細胞が真核細胞である、実施形態Ｎ２８に記載の細胞。
【０１６２】
実施形態Ｎ３０．細胞が哺乳動物細胞である、実施形態Ｎ２８に記載の細胞。
【０１６３】
実施形態Ｎ３１．細胞内の標的核酸配列をサイレンシングする方法であって、（ｉ）実施形態Ｎ１〜Ｎ１８のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドを、標的核酸を含む細胞に送達することと、（ｉｉ）第２のポリヌクレオチドであって、（ａ）標的核酸配列に相補的なＤＮＡ標的化配列および（ｂ）ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素の結合配列を含む、第２のポリヌクレオチド、を細胞に送達することと、を含む、方法。
【０１６４】
実施形態Ｎ３２．融合タンパク質が、標的核酸配列を含むクロマチンをメチル化することによって、および／または標的核酸配列を含むクロマチンに抑制性クロマチンマークを導入することによって、細胞内の標的核酸配列をサイレンシングする、実施形態Ｎ３１に記載の方法。
【０１６５】
実施形態Ｎ３３．第１のポリヌクレオチドが、第１のベクター内に含まれる、実施形態Ｎ３１またはＮ３２に記載の方法。
【０１６６】
実施形態Ｎ３４．第１のポリヌクレオチドが、第２のベクター内に含まれる、実施形態Ｎ３１〜Ｎ３３のいずれか１つに記載の方法。
【０１６７】
実施形態Ｎ３５．第１のベクターと第２のベクターが同じである、実施形態Ｎ３４に記載の方法。
【０１６８】
実施形態Ｎ３６．第１のベクターが第２のベクターとは異なる、実施形態Ｎ３４に記載の方法。
【０１６９】
実施形態Ｎ３７．細胞が哺乳動物細胞である、実施形態Ｎ３１に記載の方法。
【０１７０】
実施形態Ｎ３８．方法が、非標的核酸配列に対する特異性よりも２倍高い特異性を有する、実施形態Ｎ３１に記載の方法。
【０１７１】
実施形態Ｎ３９．細胞内の標的核酸配列をサイレンシングする方法であって、実施形態Ｎ２１〜Ｎ２５のいずれか１つに記載の複合体を標的核酸を含む細胞に送達することを含む、方法。
【０１７２】
実施形態Ｎ４０．複合体が、標的核酸配列を含むクロマチンをメチル化することによって、および／または標的核酸配列を含むクロマチンに抑制性クロマチンマークを導入することによって、細胞内の標的核酸配列をサイレンシングする、実施形態Ｎ３９に記載の方法。
【０１７３】
実施形態Ｎ４１．細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態Ｎ３９またはＮ４０に記載の方法。
【０１７４】
実施形態Ｎ４２．方法が、非標的核酸配列に対する特異性よりも２倍高い特異性を有する、実施形態Ｎ３９〜Ｎ４１のいずれか１つに記載の方法。
【０１７５】
実施形態１〜３６
実施形態１．ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインを含む、融合タンパク質。
【０１７６】
実施形態２．ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素が、ｄＣａｓ９、ｄｄＣｐｆ１、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９バリアント、またはヌクレアーゼ欠損クラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼである、実施形態１に記載の融合タンパク質。
【０１７７】
実施形態３．ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインが、Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインである、実施形態１または２の融合タンパク質。
【０１７８】
実施形態４．ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素が、ペプチドリンカーを介してＫＲＡＢドメインに共有結合している、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【０１７９】
実施形態５．ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素が、ペプチドリンカーを介してＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインに共有結合している、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【０１８０】
実施形態６．ＫＲＡＢドメインが、ペプチドリンカーを介してＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインに共有結合している、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【０１８１】
実施形態７．ペプチドリンカーが、ＸＴＥＮリンカーである、実施形態４〜６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【０１８２】
実施形態８．ＸＴＥＮリンカーが、約１６〜８０個のアミノ酸残基を含む、実施形態７に記載の融合タンパク質。
【０１８３】
実施形態９．核局在化シグナルペプチドをさらに含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【０１８４】
実施形態１０．融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、ＫＲＡＢドメイン、ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素、およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインを含む、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【０１８５】
実施形態１１．ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素が、ｄＣａｓ９であり、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインが、Ｄｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインである、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【０１８６】
実施形態１２．ｄＣａｓ９が、ペプチドリンカーを介してＫＲＡＢドメインに共有結合しており、ｄＣａｓ９が、ペプチドリンカーを介してＤｎｍｔ３Ａ−３Ｌドメインに共有結合している、実施形態１１に記載の融合タンパク質。
【０１８７】
実施形態１３．ペプチドリンカーが、ＸＴＥＮリンカーである、実施形態１２に記載の融合タンパク質。
【０１８８】
実施形態１４．融合タンパク質が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【０１８９】
実施形態１５．実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする核酸配列。
【０１９０】
実施形態１６．複合体であって、（ｉ）実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の融合タンパク質と、（ｉｉ）ポリヌクレオチドであって、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列、および（ｂ）ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素の結合配列であって、ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素は、結合配列を介してポリヌクレオチドに結合している、結合配列を含む、ポリヌクレオチドと、を含む、複合体。
【０１９１】
実施形態１７．標的ポリヌクレオチド配列が、遺伝子の一部である、実施形態２１に記載の複合体。
【０１９２】
実施形態１８．標的ポリヌクレオチド配列が、転写調節配列の一部である、実施形態２１に記載の複合体。
【０１９３】
実施形態１９．標的ポリヌクレオチド配列が、プロモーター、エンハンサー、またはサイレンサーの一部である、実施形態２１に記載の複合体。
【０１９４】
実施形態２０．標的ポリヌクレオチド配列が、低メチル化核酸配列である、実施形態２１に記載の複合体。
【０１９５】
実施形態２１．標的ポリヌクレオチド配列が、転写開始部位に隣接する約３０００ｂｐ以内にある、実施形態２１に記載の複合体。
【０１９６】
実施形態２２．実施形態１９に記載の核酸配列を含むベクター。
【０１９７】
実施形態２３．ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドが、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ標的化配列と、（ｂ）ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素の結合配列と、を含む、実施形態２６に記載のベクター。
【０１９８】
実施形態２４．実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の融合タンパク質、実施形態１５に記載の核酸、実施形態１６〜２１のいずれか１つに記載の複合体、または実施形態２２もしくは２３に記載のベクター、を含む、細胞。
【０１９９】
実施形態２５．細胞が、真核細胞である、実施形態２８に記載の細胞。
【０２００】
実施形態２６．細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態２８に記載の細胞。
【０２０１】
実施形態２７．細胞内の標的核酸配列をサイレンシングする方法であって、（ｉ）実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドを、標的核酸を含む細胞に送達することと、（ｉｉ）第２のポリヌクレオチドであって、（ａ）標的核酸配列に相補的なＤＮＡ標的化配列および（ｂ）ヌクレアーゼ欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素の結合配列を含む、第２のポリヌクレオチド、を細胞に送達することと、を含み、融合タンパク質が、標的核酸配列を含むクロマチンをメチル化すること、および／または標的核酸配列を含むクロマチンに抑制性クロマチンマークを導入すること、により、細胞内の標的核酸配列をサイレンシングする、方法。
【０２０２】
実施形態２８．第１のポリヌクレオチドが、第１のベクター内に含まれる、実施形態２７に記載の方法。
【０２０３】
実施形態２９．第１のポリヌクレオチドが、第２のベクター内に含まれる、実施形態２７に記載の方法。
【０２０４】
実施形態３０．第１のベクターおよび第２のベクターが同じである、実施形態２８または２９に記載の方法。
【０２０５】
実施形態３１．第１のベクターが、第２のベクターとは異なる、実施形態２８または２９に記載の方法。
【０２０６】
実施形態３２．細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態２７〜３１のいずれか１つに記載の方法。
【０２０７】
実施形態３３．方法が、非標的核酸配列に対する特異性よりも２倍高い特異性を有する、実施形態２７〜３２のいずれか１つに記載の方法。
【０２０８】
実施形態３４．細胞内の標的核酸配列をサイレンシングする方法であって、方法は、実施形態１６〜２０のいずれか１つに記載の複合体を、標的核酸を含む細胞に送達することを含み、複合体が、（ｉ）標的核酸配列を含むクロマチンをメチル化すること、（ｉｉ）標的核酸配列を含むクロマチンに抑制性クロマチンマークを導入すること、または（ｉｉｉ）標的核酸配列を含むクロマチンをメチル化しかつ標的核酸配列を含むクロマチンに抑制性クロマチンマークを導入すること、により、細胞内の標的核酸配列をサイレンシングする、方法。
【０２０９】
実施形態３５．細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態３４に記載の方法。
【０２１０】
実施形態３６．方法が、非標的核酸配列に対する特異性よりも２倍高い特異性を有する、実施形態３４または３５に記載の方法。
【実施例】
【０２１１】
本明細書の実施形態および態様は、以下の実施例によってさらに説明される。実施例は、単に実施形態および態様を説明することを意図しており、本明細書の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０２１２】
実施例１
ｄＣａｓ９融合エピジェネティックモジュレーターを、永続的な遺伝子サイレンシングについて試験した。オールインワンタンパク質（図１Ａ）の初期バージョン（Ｖ１、ｐ７６（配列番号１））は、ＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１７）リンカーで隔てられている、ｄＣａｓ９（配列番号２３）の−Ｎ末端に融合されたＫＲＡＢドメイン、およびｄＣａｓ９のＣ末端にＤｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ（ＥＡＳＧＳＧＲＡＳＰＧＩＰＧＳＴＲ（配列番号１９）リンカーによって隔てられている）を有する。ＫＲＡＢドメイン（配列番号１６）、ｄＣａｓ９（Ｄ１０Ａ、Ｈ２０８Ａ）、Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ（配列番号３３、ここで、配列番号２６はＤｎｍｔ３Ａでありかつ配列番号２８はＤｎｍｔ３Ｌである）を１つのポリペプチドにまとめた別のオールインワンタンパク質（図１Ｂ）。図１Ｂを参照すると、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）適用に関するＧｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１３から採用され、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ融合は、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１６から採用された。
【０２１３】
オールインワンタンパク質による長期サイレンシングを評価するため、ＤＮＡメチル化感受性ＧＦＰレポーター（Ｓｔｅｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１５から採用）を使用して、Ｖ１エピジェネティックエディタの活性をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で試験した（図１Ｃ）。哺乳動物細胞におけるレンチウイルスベクターのバックグラウンドサイレンシングを防ぐために、ＧＡＰＤＨ  ＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）の上流にユビキタスクロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）が追加された。ＧＡＰＤＨ  ＣＧＩがメチル化されると、ｇｆｐ遺伝子はオフになる。Ａ、Ｂ、Ｃは、プロモーターで標的とするシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードした位置を示す。これらの標的配列および対応するｓｇＲＮＡ配列を以下の表１に示す。２つのプラスミドを細胞にコトランスフェクトし、一方はヒットエンドランタンパク質をコードし、もう一方はｓｇＲＮＡをコードするプラスミドであった（図１Ｄ）。トランスフェクションの２日後、ヒットエンドランタンパク質とｓｇＲＮＡ発現ベクターを発現する細胞を選別する。ＧＦＰ蛍光は、フローサイトメトリーによって経時的に評価される。オールインワンタンパク質がｓｇＲＮＡで発現されると、ＧＦＰレポーターの長期サイレンシングを受けている細胞の集団が観察された（図１Ｅ）。長期サイレンシングを受けている細胞の数は、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ（ＫＲＡＢドメインを欠いている）よりも多かった。
【表２】
2021521788.tif 000004
【０２１４】
ＧＦＰレポーターのサイレンシングはｓｇＲＮＡ配列に依存しており、ガイドＣは、試験した３つのｓｇＲＮＡ配列の中で最高レベルのサイレンシングをもたらす。異なる配列をコードするｓｇＲＮＡのプーリングは、遺伝子サイレンシングに有意な変化がなかった。
【０２１５】
実施例２
３つの遺伝子（ＣＤ２９、ＣＤ８１、ＣＤ１５１）を、ヒットエンドラン融合タンパク質を使用して長期サイレンシングの標的とした。３つのタンパク質はすべて細胞表面に局在しており、ノックダウンを細胞の細胞表面抗体染色とそれに続くフローサイトメトリーによって評価した。トランスフェクションの２２日後に取られた代表的なフローサイトメトリーデータを図２Ａ〜２Ｃに示す。象限ＩＶは、遺伝子がオフになっている細胞を表し、遺伝子がオフになっている細胞のパーセンテージで示した。象限ＩおよびＩＩに細胞がないことは、ヒットエンドランタンパク質（ＢＦＰでマークされている）が細胞内に存在しなくなったことを意味する。図２Ｄは、３つの異なるｓｇＲＮＡ配列または３つすべてのｓｇＲＮＡのプールを用いたＣＤ２９、ＣＤ８１およびＣＤ１５１のサイレンシングの定量化を提供する。この実験で使用した標的ＤＮＡ配列とそのｓｇＲＮＡを表２にまとめる。
【表３】
2021521788.tif 000005
【０２１６】
２つまたは３つの遺伝子を同時に標的にして、異なる遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡの同時送達によってオールインタンパク質を多重化できることを示した。ＮＴ  ｓｇＲＮＡは、非標的化ｓｇＲＮＡ対照を指す。結果を図２Ｅに示す。
【０２１７】
単一クローンとして開始された細胞の遺伝子サイレンシングが追跡され、細胞の大部分が標的ＣＬＴＡ遺伝子をオフに維持していることが観察された（３９クローンのうち３７クローン）。図２Ｆのプロットは、オールインワンタンパク質およびＣＬＴＡ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡのトランスフェクションの９ヶ月後にとった時点を表す。
【０２１８】
本明細書に記載のシステムは、哺乳動物ゲノム内の任意の遺伝子、特に遺伝子プロモーターにＣｐＧアイランドを含む遺伝子を標的にすることができる。Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌは、ＣｐＧジヌクレオチドを標準的に標的にする。標的化できる遺伝子の例には、ＣＸＣＲ４、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＰＤ−１、ＣＬＴＡ−４、ＴＧＦＢＲ、ＴＣＲａ、ＴＣＲｂ、Ｂ２Ｍが含まれるが、これらに限定されない。
【０２１９】
実施例３
トランスフェクションの３６日後にＩＴＧＢ１（ＣＤ２９）、ＣＤ８１およびＣＤ１５１の発現を失った細胞を収集し、それらのＲＮＡ発現プロファイルを分析した。図３Ａ〜３Ｃに示されるように、標的遺伝子のノックダウンに成功したことが、非標的化ｓｇＲＮＡ対照と比較して検出された。図３Ｄ〜３Ｆは、標的遺伝子が各実験でノックダウンされた唯一の有意な遺伝子であることを示す、ボルケーノプロットであり、遺伝子サイレンシングの高い特異性を示している。図３Ｇ〜３Ｉは、標的遺伝子の９６％を超えるノックダウンを示す転写物レベルの定量化である。
【０２２０】
実施例４
オールインワンタンパク質は、ＨｅＬａ（頸部）、Ｕ２ＯＳ（骨）、およびヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）でトランスフェクトおよび発現させることができる。図４Ａ〜４Ｆのフローサイトメトリープロットは、タンパク質に融合されたＢＦＰ発現を示している。ＨｅＬａおよびＵ２ＯＳ細胞の３つの内在性遺伝子（すなわち、ＣＤ２９、ＣＤ８１、およびＣＤ１５１）が標的とされた。図４Ｇに示されるように、トランスフェクションの１８日後に測定された安定したサイレンシングが検出された。Ｐｃｓｋ９、Ｎｐｃ１、Ｓｐｃｓ１、およびＣｄ８１を標的とした場合、ＡＭＬ１２マウス肝細胞株の遺伝子サイレンシングが検出された。図４Ｈに示されるように、サイレンシングは、トランスフェクションの１４日後に測定されたｑＰＣＲによって検出された。この実験で使用したｓｇＲＮＡ配列を表３にまとめる。
【表４】
2021521788.tif 000006
【０２２１】
実施例５
図５は、遺伝子サイレンシングのために設計および試験されたオールインワンタンパク質構築物の概略図を提供する。配列番号１の初期設計（ｐ７６、Ｖ１）は、ｄＣａｓ９（配列番号２９）のＮまたはＣ末端のいずれかで、ＸＴＥＮリンカー（例えば、１６アミノ酸（配列番号３１）または８０アミノ酸（配列番号３２））をコードするように改変された。すべてのベクターは、ｄＣａｓ９のＣ末端にＨＡタグ（配列番号２４）を含んでいる。態様では、例えば、構築物ｐ７６、およびｐ９０−１０２、ｐ１１２（Ｖ２）において良好な発現を提供するため、ＣＡＧプロモーターが使用される。図５を参照すると、ｐ９０〜ｐ１０２のタンパク質構築物は、それぞれ、配列番号２〜１４に対応し、タンパク質構築物ｐ１１２は、配列番号１５に対応する。
【０２２２】
実施例６
図５に示されるタンパク質構築物は、トランスフェクション後１８日間のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣＬＴＡ遺伝子のサイレンシングについて試験された（図６Ａ〜６Ｂ）。ｐ９９（配列番号１１）、ｐ１００（配列番号１２）、およびｐ１１２（配列番号１５）などのｐ７６（Ｖ１）設計と比較してより耐久性のある遺伝子サイレンシングを有するバリアントのパネルを含む、可変レベルの遺伝子サイレンシング活性が検出された。図６Ａおよび６Ｂは、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢおよびｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ構築物が、一過性で長期サイレンシングがより低効率であることを示したことを示す。
【０２２３】
ｐ７６（配列番号１）、ｐ１１２（配列番号１５）を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で安定して発現されるＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ（Ｈ２Ｂ）内在性遺伝子および合成Ｓｎｒｐｎ−ＧＦＰレポーター遺伝子のサイレンシングについて試験した（図６Ｃ〜６Ｄ）。トランスフェクション後５０日間細胞を追跡した。ｐ１１２バリアントは、ｐ７６（Ｖ１）設計よりも高効率で遺伝子サイレンシングを維持した。ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３ＬおよびｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ融合タンパク質は、一過性であり、長期サイレンシングがより低効率である。図６Ｅは、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ（Ｈ２Ｂ）遺伝子をオフにするための５０日の時間経過にわたるｐ７６およびｐ１１２のタンパク質発現のプロットを提供する。タンパク質レベルは、オールインワンタンパク質と同時発現するＢＦＰのフローサイトメトリー検出によって測定された。
【０２２４】
実施例７
Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９に対する抗体を使用してオールインワンタンパク質バリアントｐ７６、ｐ９０〜ｐ１０２でウエスタンブロット分析を行った。図７Ａを参照すると、上のバンドは完全長タンパク質を表し、より小さいサイズのバンドはオールインワンタンパク質のタンパク質分解を表す。ｐ９９（配列番号１１）、ｐ１００（配列番号１２）、およびｐ１０２（配列番号１４）など、タンパク質分解をほとんど示さないバリアントは、遺伝子サイレンシングのより高効率を示した。ｐ９６（配列番号８）およびｐ９７（配列番号９）などの高レベルのタンパク質分解を伴うバリアントは、より低効率の持続的な遺伝子サイレンシングにつながった。
【０２２５】
融合タンパク質から切断された遊離Ｄｎｍｔ３Ａを検出するために、オールインワンタンパク質バリアントを用いてウエスタンブロット分析を実施した。図７Ｂに示されるように、ｐ９２（配列番号４）、ｐ１００（配列番号１２）、ｐ１０１（配列番号１３）、およびｐ１０２（配列番号１４）などの、検出可能な遊離Ｄｎｍｔ３をほとんどまたは全く持たないバリアントは、検出可能な切断されたＤｎｍｔ３Ａを有するバリアント、すなわちｐ７６（配列番号１）、ｐ９１（配列番号３）、ｐ９６（配列番号８）およびｐ９８（配列番号１０）と比較して、持続的な遺伝子サイレンシングの効率が高かった。
【０２２６】
実施例８
図８Ａに示されるように、プールされたスクリーンをアッセイして、長期遺伝子サイレンシングをもたらす最適なｓｇＲＮＡを決定した。それぞれがＧＦＰタグ（ＣＬＴＡ、ＶＩＭ、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ（Ｈ２Ｂ）、およびＲＡＢ１１Ａ）を含む異なる遺伝子を有する４つのＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を使用した。各遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）から＋／−２．５ｋｂにおよぶｓｇＲＮＡからなるタイリングライブラリーは、レンチウイルス送達とそれに続くオールインワンタンパク質を発現する一過性発現プラスミドＤＮＡによって細胞内で安定して発現された。トランスフェクションの４週間後、遺伝子サイレンシングを維持している細胞を選別して、ｓｇＲＮＡの同一性を決定した。図８Ｂ〜８Ｅは、トランスフェクションの４週間後に遺伝子サイレンシングを受けている細胞のパーセントを示すフローサイトメトリーヒストグラムである。
【０２２７】
図９Ａ〜９Ｄは、標的遺伝子（ＣＬＴＡ、Ｈ２Ｂ、ＲＡＢ１１、ＶＩＭ）の転写開始部位にまたがるｓｇＲＮＡ機能性のマップである。転写開始部位（ＴＳＳ）とＣｐＧアイランドは、各プロットの上に注釈が付けられている。各ドットは１つのｓｇＲＮＡを表し、長期遺伝子サイレンシングにおけるその有効性は、ｓｇＲＮＡの存在量のｌｏｇ２倍の変化としてプロットされる。ヌクレオソーム占有率（下のプロット）は、ＭＮａｓｅシグナルからプロットされる。
【０２２８】
実施例９
図１０Ａは、オールインワンタンパク質の最適なｓｇＲＮＡ標的位置を決定するためのＨＥＫ２９３Ｔ細胞のプールされたスクリーンのワークフローであり、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢの最適なｓｇＲＮＡを決定するため、Ｋ５６２細胞での従来のリシンタイリングスクリーンから採用されている（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｈｏｒｌｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１４）。ｓｇＲＮＡは、レンチウイルス送達、続いてオールインワンタンパク質をコードするプラスミドの一過性トランスフェクションによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞で最初に安定して発現された（０日目）。オールインワンタンパク質を発現する細胞を選別し（２日目）、さらに３日間増殖させる。細胞は５日目に分割され、そこから半分が最初の時点として収集され、残りの半分は最後の時点でさらに１０日間（１５日目）継代された。増殖表現型（γ）は、ｌｏｇ２  ｓｇＲＮＡエンリッチメントを、Ｔ（初期）とＴ（最終）の間の細胞倍加の数で割ったものとして計算された。
【０２２９】
図１０Ｂ−１０Ｅは、Ｋ５６２細胞の既存のｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ／ＣＲＩＳＰＲｉデータセット（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｈｏｒｌｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）からの４つの遺伝子（ＡＲＬ１、ＥＩＦ６、ＳＭＣ３、ＨＥＡＴＲ１）の増殖表現型を、オールインワンタンパク質（下のプロット）とともに示す、代表的なプロットである。各ドットはｓｇＲＮＡを表す。ＴＳＳと注釈付きＣｐＧアイランドが各遺伝子について示される。オールインワンタンパク質を使用する機能的ｓｇＲＮＡは、その機能的ｓｇＲＮＡよりも広い範囲におよび、より広い範囲で有効な標的化を示す。
【０２３０】
実施例１０
図１１Ａ〜１１Ｂは、ＶＰＳ５３およびＶＰＳ５４の増殖表現型およびヌクレオソーム配置（ＭＮａｓｅシグナルからの）の比較を提供し、ヌクレオソーム枯渇領域における機能的ｓｇＲＮＡの位置を示す。さらに、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ／ＣＲＩＳＰＲｉと比較して、オールインワンタンパク質を使用すると、機能的なｓｇＲＮＡの範囲が広がる。
【０２３１】
実施例１１
２つのオールインワンバリアント（ｐ１０２（配列番号１４）およびｐ１１２（配列番号１５））のインビトロ転写は、各設計の完全長合成を示す（図１２Ａ）。図１２Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのｍＲＮＡのトランスフェクションの１日後のｐ１０２およびｐ１１２の発現を示すフローサイトメトリープロットを提供する。図１２Ｃは、ｐ１０２およびｐ１１２オールインワンバリアントを発現するｍＲＮＡをトランスフェクトした後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣＬＴＡ内在性遺伝子サイレンシングの時間経過を示す。
【０２３２】
実施例１２
図１３Ａは、ドキシサイクリン誘導性プロモーター下でオールインワンタンパク質を安定してコードするＫ５６２細胞におけるドキシサイクリンの添加によるオールインワンタンパク質の誘導された発現を示すフローサイトメトリープロットを提供する。ドキシサイクリン誘導後４日間タンパク質発現を追跡した。図１３Ａのパネルの点線は、ドキシサイクリン投与なしでのベースライン中央値ＢＦＰ蛍光を表す。ドキシサイクリン処理の前後のオールインワンタンパク質の発現を検出するために、細胞のウエスタンブロットを行った（図１３Ｂ）。オールインワンタンパク質の存在は、誘導後９６時間までには検出されない。Ｋ５６２細胞のドキシサイクリン処理の１４日後のＣＤ８１およびＣＤ１５１ノックダウンのフローサイトメトリープロットを図１３Ｃ〜１３Ｆに示す。標的遺伝子がノックダウンされた細胞のパーセントを示す。ＢＦＰ＋象限には細胞が存在しないため、オールインワンタンパク質の検出可能な発現はない。ドキシサイクリン処理の１４日後またはドキシサイクリン処理なしのＣＤ８１およびＣＤ１５１ノックダウンの定量化を図１３Ｇに示す。
【０２３３】
参考文献
Ｅｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４４，２０１７．Ｌａｍｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  １７２，２０１８．Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４２５，２０１３．Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４５，２０１７．Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５，２０１７．Ｃｅｂｒｉａｎ−Ｓｅｒｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  ７−８，２０１７．Ｐｕｌｅｃｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２１，２０１７．
【０２３４】
非公式の配列表
配列番号１（ｐ７６（オールインワンタンパク質配列、バージョン１）：ＫＲＡＢ（太字、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３，２０１４から）、リンカー（下線付き）、ｄＣａｓ９（斜体）、ＨＡタグ（小文字）、ＳＶ４０  ＮＬＳ（小文字斜体）、Ｄｎｍｔ３Ａ（太字斜体、残基６１２−９１２、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、２７アミノ酸リンカー（斜体下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｄｎｍｔ３Ｌ（太字下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｐ２Ａペプチド切断配列（小文字太字）、ＢＦＰ（小文字下線付き））
【化１−１】
2021521788.tif 000007
【化１−２】
2021521788.tif 000008
【０２３５】
配列番号２（ｐ９０（ＫＲＡＢ−ｄＣａｓ９−ＸＴＥＮ１６−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ−Ｐ２Ａ−ＢＦＰ）：ＫＲＡＢ（太字、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３，２０１４から）、リンカー（下線付き）、ｄＣａｓ９（斜体）、ＨＡタグ（小文字）、ＳＶ４０  ＮＬＳ（小文字斜体）、ＸＴＥＮ１６（大文字、１６アミノ酸配列）、Ｄｎｍｔ３Ａ（太字斜体、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、２７アミノ酸リンカー（斜体下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｄｎｍｔ３Ｌ（太字下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｐ２Ａペプチド切断配列（小文字太字）、ＢＦＰ（小文字下線付き））
【化２−１】
2021521788.tif 000009
【化２−２】
2021521788.tif 000010
【０２３６】
配列番号３（ｐ９１（ＫＲＡＢ−ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ−Ｐ２Ａ−Ｐ２Ａ−ＢＦＰ）：ＫＲＡＢ（太字、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３，２０１４から）、リンカー（下線付き）、ｄＣａｓ９（斜体）、ＨＡタグ（小文字）、ＳＶ４０  ＮＬＳ（小文字斜体）、Ｄｎｍｔ３Ａ（太字斜体、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、２７アミノ酸リンカー（斜体下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｄｎｍｔ３Ｌ（太字下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｐ２Ａペプチド切断配列（小文字太字）、ＢＦＰ（小文字下線付き））
【化３−１】
2021521788.tif 000011
【化３−２】
2021521788.tif 000012
【０２３７】
配列番号４（ｐ９２（ＫＲＡＢ−ｄＣａｓ９−ＸＴＥＮ１６−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ−Ｐ２Ａ−Ｐ２Ａ−ＢＦＰ）：ＫＲＡＢ（太字、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３，２０１４から）、リンカー（下線付き）、ｄＣａｓ９（斜体）、ＨＡタグ（小文字）、ＳＶ４０  ＮＬＳ（小文字斜体）、ＸＴＥＮ１６（１６アミノ酸配列）、Ｄｎｍｔ３Ａ（太字斜体、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、２７アミノ酸リンカー（斜体下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｄｎｍｔ３Ｌ（太字下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｐ２Ａペプチド切断配列（小文字太字）、ＢＦＰ（小文字下線付き））
【化４−１】
2021521788.tif 000013
【化４−２】
2021521788.tif 000014
【０２３８】
配列番号５（ｐ９３（ＫＲＡＢ−ｄＣａｓ９−ＸＴＥＮ８０−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ−Ｐ２Ａ−ＢＦＰ）：ＫＲＡＢ（太字、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３，２０１４から）、リンカー（下線付き）、ｄＣａｓ９（斜体）、ＨＡタグ（小文字）、ＳＶ４０  ＮＬＳ（小文字斜体）、ＸＴＥＮ８０（８０アミノ酸配列）、Ｄｎｍｔ３Ａ（太字斜体、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、２７アミノ酸リンカー（斜体下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｄｎｍｔ３Ｌ（太字下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｐ２Ａペプチド切断配列（小文字太字）、ＢＦＰ（小文字下線付き））
【化５−１】
2021521788.tif 000015
【化５−２】
2021521788.tif 000016
【０２３９】
配列番号６（ｐ９４（ＫＲＡＢ−ｄＣａｓ９−ＸＴＥＮ８０−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ−Ｐ２Ａ−Ｐ２Ａ−ＢＦＰ）：ＫＲＡＢ（太字、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３，２０１４から）、リンカー（下線付き）、ｄＣａｓ９（斜体）、ＨＡタグ（小文字）、ＳＶ４０  ＮＬＳ（小文字斜体）、ＸＴＥＮ８０（８０アミノ酸配列）、Ｄｎｍｔ３Ａ（太字斜体、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、２７アミノ酸リンカー（斜体下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｄｎｍｔ３Ｌ（太字下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｐ２Ａペプチド切断配列（小文字太字）、ＢＦＰ（小文字下線付き））
【化６】
2021521788.tif 000017
【０２４０】
配列番号７（ｐ９５（ＫＲＡＢ−ＸＴＥＮ１６−ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ−Ｐ２Ａ−ＢＦＰ）：ＫＲＡＢ（太字、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３，２０１４から）、リンカー（下線付き）、ＸＴＥＮ１６（１６アミノ酸配列）、ｄＣａｓ９（斜体）、ＨＡタグ（小文字）、ＳＶ４０  ＮＬＳ（小文字斜体）、Ｄｎｍｔ３Ａ（太字斜体、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、２７アミノ酸リンカー（斜体下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｄｎｍｔ３Ｌ（太字下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｐ２Ａペプチド切断配列（小文字太字）、ＢＦＰ（小文字下線付き））
【化７】
2021521788.tif 000018
【０２４１】
配列番号８（ｐ９６（ＫＲＡＢ−ＸＴＥＮ１６−ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ−Ｐ２Ａ−Ｐ２Ａ−ＢＦＰ）：ＫＲＡＢ（太字、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３，２０１４から）、リンカー（下線付き）、ＸＴＥＮ１６（１６アミノ酸配列）、ｄＣａｓ９（斜体）、ＨＡタグ（小文字）、ＳＶ４０  ＮＬＳ（小文字斜体）、Ｄｎｍｔ３Ａ（太字斜体、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、２７アミノ酸リンカー（斜体下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｄｎｍｔ３Ｌ（太字下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｐ２Ａペプチド切断配列（小文字太字）、ＢＦＰ（小文字下線付き））
【化８】
2021521788.tif 000019
【０２４２】
配列番号９（ｐ９７（ＫＲＡＢ−ＸＴＥＮ８０−ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ−Ｐ２Ａ−ＢＦＰ）：ＫＲＡＢ（太字、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３，２０１４から）、リンカー（下線付き）、ＸＴＥＮ８０（８０アミノ酸配列）、ｄＣａｓ９（斜体）、ＨＡタグ（小文字）、ＳＶ４０  ＮＬＳ（小文字斜体）、Ｄｎｍｔ３Ａ（太字斜体、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、２７アミノ酸リンカー（斜体下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｄｎｍｔ３Ｌ（太字下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｐ２Ａペプチド切断配列（小文字太字）、ＢＦＰ（小文字下線付き））
【化９−１】
2021521788.tif 000020
【化９−２】
2021521788.tif 000021
【０２４３】
配列番号：１０（ｐ９８（ＫＲＡＢ−ＸＴＥＮ８０−ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ−Ｐ２Ａ−Ｐ２Ａ−ＢＦＰ）：ＫＲＡＢ（太字、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３，２０１４から）、リンカー（下線付き）、ＸＴＥＮ８０（８０アミノ酸配列）、ｄＣａｓ９（斜体）、ＨＡタグ（小文字）、ＳＶ４０  ＮＬＳ（小文字斜体）、Ｄｎｍｔ３Ａ（太字斜体、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、２７アミノ酸リンカー（斜体下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｄｎｍｔ３Ｌ（太字下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｐ２Ａペプチド切断配列（小文字太字）、ＢＦＰ（小文字下線付き））
【化１０−１】
2021521788.tif 000022
【化１０−２】
2021521788.tif 000023
【０２４４】
配列番号１１（ｐ９９（ＫＲＡＢ−ＸＴＥＮ１６−ｄＣａｓ９−ＸＴＥＮ８０−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ−Ｐ２Ａ−ＢＦＰ）：ＫＲＡＢ（太字、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３，２０１４から）、ＸＴＥＮ１６（１６アミノ酸配列）、ｄＣａｓ９（斜体）、ＨＡタグ（小文字）、リンカー（下線付き）、ＳＶ４０  ＮＬＳ（小文字斜体）、ＸＴＥＮ８０（小文字斜体太字、８０アミノ酸配列）、Ｄｎｍｔ３Ａ（太字斜体、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、２７アミノ酸リンカー（斜体下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｄｎｍｔ３Ｌ（太字下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｐ２Ａペプチド切断配列（小文字太字）、ＢＦＰ（小文字下線付き））
【化１１−１】
2021521788.tif 000024
【化１１−２】
2021521788.tif 000025
【０２４５】
配列番号１２（ｐ１００（ＫＲＡＢ−ＸＴＥＮ１６−ｄＣａｓ９−ＸＴＥＮ８０−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ−Ｐ２Ａ−Ｐ２Ａ−ＢＦＰ）：ＫＲＡＢ（太字、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３，２０１４から）、ＸＴＥＮ１６（１６アミノ酸配列）、ｄＣａｓ９（斜体）、ＨＡタグ（小文字）、リンカー（下線付き）、ＳＶ４０  ＮＬＳ（小文字斜体）、ＸＴＥＮ８０（小文字太字斜体、８０アミノ酸配列）、Ｄｎｍｔ３Ａ（太字斜体、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、２７アミノ酸リンカー（斜体下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｄｎｍｔ３Ｌ（太字下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｐ２Ａペプチド切断配列（小文字太字）、ＢＦＰ（小文字下線付き））
【化１２−１】
2021521788.tif 000026
【化１２−２】
2021521788.tif 000027
【０２４６】
配列番号１３（ｐ１０１（ＫＲＡＢ−ＸＴＥＮ８０−ｄＣａｓ９−ＸＴＥＮ１６−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ−Ｐ２Ａ−ＢＦＰ）：ＫＲＡＢ（太字、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３，２０１４から）、リンカー（下線付き）、ＸＴＥＮ８０（小文字太字斜体、８０アミノ酸配列）、ｄＣａｓ９（斜体）、ＨＡタグ（小文字）、ＳＶ４０  ＮＬＳ（小文字斜体）、ＸＴＥＮ１６（１６アミノ酸配列）、Ｄｎｍｔ３Ａ（太字斜体、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、２７アミノ酸リンカー（斜体下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｄｎｍｔ３Ｌ（太字下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｐ２Ａペプチド切断配列（小文字太字）、ＢＦＰ（小文字下線付き））
【化１３−１】
2021521788.tif 000028
【化１３−２】
2021521788.tif 000029
【０２４７】
配列番号１４（ｐ１０２（ＫＲＡＢ−ＸＴＥＮ８０−ｄＣａｓ９−ＸＴＥＮ１６−Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ−Ｐ２Ａ−ＢＦＰ）：ＫＲＡＢ（太字、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３，２０１４から）、リンカー（下線付き）、ＸＴＥＮ８０（小文字太字斜体、８０アミノ酸配列）、ｄＣａｓ９（斜体）、ＨＡタグ（小文字）、ＳＶ４０  ＮＬＳ（小文字斜体）、ＸＴＥＮ１６（１６アミノ酸配列）、Ｄｎｍｔ３Ａ（太字斜体、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、２７アミノ酸リンカー（斜体下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｄｎｍｔ３Ｌ（太字下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｐ２Ａペプチド切断配列（小文字太字）、ＢＦＰ（小文字下線付き））
【化１４−１】
2021521788.tif 000030
【化１４−２】
2021521788.tif 000031
【０２４８】
配列番号１５（ｐ１１２（Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌ−ＸＴＥＮ８０−ｄＣａｓ９−ＢＦＰ−ＫＲＡＢ）；  ＫＲＡＢ（太字、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３，２０１４から）、リンカー（下線付き）、ＸＴＥＮ８０（小文字太字斜体、８０アミノ酸配列）、ｄＣａｓ９（斜体）、ＨＡタグ（小文字）、ＳＶ４０  ＮＬＳ（小文字斜体）、Ｄｎｍｔ３Ａ（太字斜体、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、２７アミノ酸リンカー（斜体下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、Ｄｎｍｔ３Ｌ（太字下線付き、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）、ＢＦＰ（小文字下線付き））
【化１５−１】
2021521788.tif 000032
【化１５−２】
2021521788.tif 000033
【０２４９】
配列番号１６（ＫＲＡＢ、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１３，２０１４から）
DAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEP
【０２５０】
配列番号１７（リンカー）
GGSGGGS
【０２５１】
配列番号１８（リンカー）
SGS
【０２５２】
配列番号１９  （リンカー）
EASGSGRASPGIPGSTR
【０２５３】
配列番号２０（リンカー）
SRAD
【０２５４】
配列番号２１（リンカー）
GSG
【０２５５】
配列番号２２（リンカー
SPG
【０２５６】
配列番号２３（ｄＣａｓ９）
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
【０２５７】
配列番号２４（ＨＡタグ）
YPYDVPDYA
【０２５８】
配列番号２５（ＳＶ４０  ＮＬＳ）
PKKKRKV
【０２５９】
配列番号２６（Ｄｎｍｔ３Ａ、残基６１２−９１２、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）
NHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACV
【０２６０】
配列番号２７（２７アミノ酸リンカー、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）
SSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSH
【０２６１】
配列番号２８（Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｓｉｄｄｉｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２０１３、Ｓｔｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２０１６から）
MGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQNSLPL
【０２６２】
配列番号２９（Ｐ２Ａペプチド切断配列）
ATNFSLLKQAGDVEENPGP
【０２６３】
配列番号３０（ＢＦＰ）
SELIKENMHMKLYMEGTVDNHHFKCTSEGEGKPYEGTQTMRIKVVEGGPLPFAFDILATSFLYGSKTFINHTQGIPDFFKQSFPEGFTWERVTTYEDGGVLTATQDTSLQDGCLIYNVKIRGVNFTSNGPVMQKKTLGWEAFTETLYPADGGLEGRNDMALKLVGGSHLIANIKTTYRSKKPAKNLKMPGVYYVDYRLERIKEANNETYVEQHEVAVARYCDLPSKLGHKLN*
【０２６４】
配列番号３１（ＸＴＥＮ１６（１６アミノ酸配列））
SGSETPGTSESATPES
【０２６５】
配列番号３２（ＸＴＥＮ８０（８０アミノ酸配列））
GGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE
【０２６６】
配列番号３３（Ｄｎｍｔ３Ａ−Ｄｎｍｔ３Ｌドメイン）
NHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACVSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSHMGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQNSLPL
【０２６７】
配列番号３４（ｄｄＡｓＣｆｐ１）
MTQFEGFTNLYQVSKTLRFELIPQGKTLKHIQEQGFIEEDKARNDHYKELKPIIDRIYKTYADQCLQLVQLDWENLSAAIDSYRKEKTEETRNALIEEQATYRNAIHDYFIGRTDNLTDAINKRHAEIYKGLFKAELFNGKVLKQLGTVTTTEHENALLRSFDKFTTYFSGFYENRKNVFSAEDISTAIPHRIVQDNFPKFKENCHIFTRLITAVPSLREHFENVKKAIGIFVSTSIEEVFSFPFYNQLLTQTQIDLYNQLLGGISREAGTEKIKGLNEVLNLAIQKNDETAHIIASLPHRFIPLFKQILSDRNTLSFILEEFKSDEEVIQSFCKYKTLLRNENVLETAEALFNELNSIDLTHIFISHKKLETISSALCDHWDTLRNALYERRISELTGKITKSAKEKVQRSLKHEDINLQEIISAAGKELSEAFKQKTSEILSHAHAALDQPLPTTLKKQEEKEILKSQLDSLLGLYHLLDWFAVDESNEVDPEFSARLTGIKLEMEPSLSFYNKARNYATKKPYSVEKFKLNFQMPTLASGWDVNKEKNNGAILFVKNGLYYLGIMPKQKGRYKALSFEPTEKTSEGFDKMYYDYFPDAAKMIPKCSTQLKAVTAHFQTHTTPILLSNNFIEPLEITKEIYDLNNPEKEPKKFQTAYAKKTGDQKGYREALCKWIDFTRDFLSKYTKTTSIDLSSLRPSSQYKDLGEYYAELNPLLYHISFQRIAEKEIMDAVETGKLYLFQIYNKDFAKGHHGKPNLHTLYWTGLFSPENLAKTSIKLNGQAELFYRPKSRMKRMAHRLGEKMLNKKLKDQKTPIPDTLYQELYDYVNHRLSHDLSDEARALLPNVITKEVSHEIIKDRRFTSDKFFFHVPITLNYQAANSPSKFNQRVNAYLKEHPETPIIGIDRGERNLIYITVIDSTGKILEQRSLNTIQQFDYQKKLDNREKERVAARQAWSVVGTIKDLKQGYLSQVIHEIVDLMIHYQAVVVLANLNFGFKSKRTGIAEKAVYQQFEKMLIDKLNCLVLKDYPAEKVGGVLNPYQLTDQFTSFAKMGTQSGFLFYVPAPYTSKIDPLTGFVDPFVWKTIKNHESRKHFLEGFDFLHYDVKTGDFILHFKMNRNLSFQRGLPGFMPAWDIVFEKNETQFDAKGTPFIAGKRIVPVIENHRFTGRYRDLYPANELIALLEEKGIVFRDGSNILPKLLENDDSHAIDTMVALIRSVLQMRNSNAATGEDYINSPVRDLNGVCFDSRFQNPEWPMDADANGAYHIALKGQLLLNHLKESKDLKLQNGISNQDWLAYIQELRN
【０２６８】
配列番号３５（ｄｄＬｂＣｆｐ１）
MSKLEKFTNCYSLSKTLRFKAIPVGKTQENIDNKRLLVEDEKRAEDYKGVKKLLDRYYLSFINDVLHSIKLKNLNNYISLFRKKTRTEKENKELENLEINLRKEIAKAFKGNEGYKSLFKKDIIETILPEFLDDKDEIALVNSFNGFTTAFTGFFDNRENMFSEEAKSTSIAFRCINENLTRYISNMDIFEKVDAIFDKHEVQEIKEKILNSDYDVEDFFEGEFFNFVLTQEGIDVYNAIIGGFVTESGEKIKGLNEYINLYNQKTKQKLPKFKPLYKQVLSDRESLSFYGEGYTSDEEVLEVFRNTLNKNSEIFSSIKKLEKLFKNFDEYSSAGIFVKNGPAISTISKDIFGEWNVIRDKWNAEYDDIHLKKKAVVTEKYEDDRRKSFKKIGSFSLEQLQEYADADLSVVEKLKEIIIQKVDEIYKVYGSSEKLFDADFVLEKSLKKNDAVVAIMKDLLDSVKSFENYIKAFFGEGKETNRDESFYGDFVLAYDILLKVDHIYDAIRNYVTQKPYSKDKFKLYFQNPQFMGGWDKDKETDYRATILRYGSKYYLAIMDKKYAKCLQKIDKDDVNGNYEKINYKLLPGPNKMLPKVFFSKKWMAYYNPSEDIQKIYKNGTFKKGDMFNLNDCHKLIDFFKDSISRYPKWSNAYDFNFSETEKYKDIAGFYREVEEQGYKVSFESASKKEVDKLVEEGKLYMFQIYNKDFSDKSHGTPNLHTMYFKLLFDENNHGQIRLSGGAELFMRRASLKKEELVVHPANSPIANKNPDNPKKTTTLSYDVYKDKRFSEDQYELHIPIAINKCPKNIFKINTEVRVLLKHDDNPYVIGIARGERNLLYIVVVDGKGNIVEQYSLNEIINNFNGIRIKTDYHSLLDKKEKERFEARQNWTSIENIKELKAGYISQVVHKICELVEKYDAVIALADLNSGFKNSRVKVEKQVYQKFEKMLIDKLNYMVDKKSNPCATGGALKGYQITNKFESFKSMSTQNGFIFYIPAWLTSKIDPSTGFVNLLKTKYTSIADSKKFISSFDRIMYVPEEDLFEFALDYKNFSRTDADYIKKWKLYSYGNRIRIFRNPKKNNVFDWEEVCLTSAYKELFNKYGINYQQGDIRALLCEQSDKAFYSSFMALMSLMLQMRNSITGRTDVDFLISPVKNSDGIFYDSRNYEAQENAILPKNADANGAYNIARKVLWAIGQFKKAEDEKLDKVKIAISNKEWLEYAQTSVKH
【０２６９】
配列番号３６（ｄｄＦｎＣｆｐ１）
MYPYDVPDYASGSGMSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFKGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLANGWDKNKEPDNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYKLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIARGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFEDLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDADANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNN
【図１Ａ】
2021521788.tif 000034
【図１Ｂ】
2021521788.tif 000035
【図１Ｃ】
2021521788.tif 000036
【図１Ｄ】
2021521788.tif 000037
【図１Ｅ】
2021521788.tif 000038
【図１Ｆ】
2021521788.tif 000039
【図２Ａ】
2021521788.tif 000040
【図２Ｂ】
2021521788.tif 000041
【図２Ｃ】
2021521788.tif 000042
【図２Ｄ】
2021521788.tif 000043
【図２Ｅ】
2021521788.tif 000044
【図２Ｆ】
2021521788.tif 000045
【図３Ａ】
2021521788.tif 000046
【図３Ｂ】
2021521788.tif 000047
【図３Ｃ】
2021521788.tif 000048
【図３Ｄ】
2021521788.tif 000049
【図３Ｅ】
2021521788.tif 000050
【図３Ｆ】
2021521788.tif 000051
【図３Ｇ】
2021521788.tif 000052
【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2021521788.tif 000056
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2021521788.tif 000058
【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
2021521788.tif 000060
【図４Ｇ】
2021521788.tif 000061
【図４Ｈ】
2021521788.tif 000062
【図５】
2021521788.tif 000063
【図６Ａ】
2021521788.tif 000064
【図６Ｂ】
2021521788.tif 000065
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
2021521788.tif 000067
【図６Ｅ】
2021521788.tif 000068
【図７Ａ】
2021521788.tif 000069
【図７Ｂ】
2021521788.tif 000070
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
2021521788.tif 000074
【図８Ｅ】
2021521788.tif 000075
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
2021521788.tif 000079
【図１０Ａ】
2021521788.tif 000080
【図１０Ｂ】
2021521788.tif 000081
【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
2021521788.tif 000083
【図１０Ｅ】
2021521788.tif 000084
【図１１Ａ】
2021521788.tif 000085
【図１１Ｂ】
2021521788.tif 000086
【図１２Ａ】
2021521788.tif 000087
【図１２Ｂ】
2021521788.tif 000088
【図１２Ｃ】
2021521788.tif 000089
【図１３Ａ】
2021521788.tif 000090
【図１３Ｂ】
2021521788.tif 000091
【図１３Ｃ】
2021521788.tif 000092
【図１３Ｄ】
2021521788.tif 000093
【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021521788.tif 000098
2021521788.tif 000099
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