(57)【要約】  本発明は複合体Ｍｕｎｃ１８−シンタキシン−１の形成に干渉可能であり、従って、ニューロンのエキソサイトーシス障害および／または筋収縮性障害の予防および／または治療、および皮膚の老化および／または表情による徴候の予防、減少および／または排除に有用であるペプチドのファミリーに関する。
2021514940.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３および／または配列番号４と競合することを特徴とする、Ｍｕｎｃ１８−シンタキシン−１複合体相互作用に干渉可能なペプチド、その許容可能な異性体、塩、溶媒和物および／または誘導体および／またはそれらの混合物。
【請求項２】
配列が配列番号３および／または配列番号４であることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
式（Ｉ）：
Ｒ１−ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−ＡＡ５−ＡＡ６−Ｒ２
に記載の配列を有することを特徴とする請求項１に記載のペプチド、その美容的および薬学的に許容可能な異性体、塩、溶媒和物および／または誘導体ならびにそれらの混合物
ここで：
ＡＡ１は、正の電荷を有する側鎖または電荷を有さない極性の側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
ＡＡ２は、非極性の疎水性側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
ＡＡ３は、非極性の疎水性側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
ＡＡ４は、電荷を有する側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
ＡＡ５は、非極性の疎水性側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
ＡＡ６は、Ｗであり；
Ｒ１はＨ、置換されたもしくは非置換の非環式脂肪族、置換されたもしくは非置換のアリシクリル、置換されたもしくは非置換のヘテロシクリル、置換されたもしくは非置換のヘテロアリールアルキル、置換されたもしくは非置換のアリール、置換されたもしくは非置換のアラルキル、およびＲ５−ＣＯ−から選択され、ここでＲ５は置換されたもしくは非置換のＣ１−Ｃ２４アルキルラジカル、置換されたもしくは非置換のＣ２−Ｃ２４アルケニル、置換されたもしくは非置換のＣ２−Ｃ２４アルキニル、置換されたもしくは非置換のＣ３−Ｃ２４シクロアルキル、置換されたもしくは非置換のＣ５−Ｃ２４シクロアルケニル、置換されたもしくは非置換のＣ８−Ｃ２４シクロアルキニル、置換されたもしくは非置換のＣ６−Ｃ３０アリール、置換されたもしくは非置換のＣ７−Ｃ２４アラルキル、置換されたもしくは非置換の３〜１０員のヘテロシクリル環、および２〜２４個の炭素原子と１〜３個の炭素原子以外の原子と１〜６個の炭素原子のアルキル鎖とを有する置換されたまたは非置換のヘテロアリールアルキルによって形成される群から選択され；および、
Ｒ２はＨ、−ＮＲ３Ｒ４−、−ＯＲ３および−ＳＲ３から選択され、ここで、Ｒ３およびＲ４はＨ、置換されたまたは非置換の非環式脂肪族基、置換されたまたは非置換のアリシクリル、置換されたまたは非置換のヘテロシクリル、置換されたまたは非置換のヘテロアリールアルキル、置換されたまたは非置換のアリール、および置換されたまたは非置換のアラルキルから独立して選択される。
【請求項４】
ＡＡ１は、Ｈであり；
ＡＡ２は、非極性の疎水性側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
ＡＡ３は、非極性の疎水性側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
ＡＡ４は、電荷を有する側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
ＡＡ５は、Ｍまたは芳香族側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；および、
ＡＡ６は、Ｔｒｐであることを特徴とする、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
ＡＡ１はＨｉｓであり；
ＡＡ２はＡｌａおよびＩｌｅの群から選択され；
ＡＡ３はＬｅｕおよびＭｅｔの群から選択され；
ＡＡ４はＡｒｇおよびＡｓｐの群から選択され；
ＡＡ５はＭｅｔ、Ｐｈｅ、およびＴｒｐの群からから選択され；および、
ＡＡ６は、Ｔｒｐであることを特徴とする、請求項３または４に記載のペプチド。
【請求項６】
式（Ｉ）のペプチドが、
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号５−Ｒ２）；
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号６−Ｒ２）；
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号７−Ｒ２）；
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号８−Ｒ２）；および／または、
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号９−Ｒ２）であることを特徴とする、請求項３〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
式（Ｉ）のペプチドが、
Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号５−ＮＨ２）；
Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号６−ＮＨ２）；
Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号７−ＮＨ２）；
Ａｃ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号８−ＮＨ２）および／または、
Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号９−ＮＨ２）であることを特徴とする、請求項３〜６のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項８】
式（ＩＩ）：
Ｒ１−ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−Ｒ２
に記載の配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のペプチド、その美容的および薬学的に許容可能な異性体、塩、溶媒和物および／または誘導体ならびにそれらの混合物
ここで：
ＡＡ１は、正に電荷を有する側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
ＡＡ２は、任意のアミノ酸であり；
ＡＡ３は、正の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
ＡＡ４は、芳香族側鎖を有するアミノ酸群から選択され；
Ｒ１はＨｉｓ、置換されたもしくは非置換の非環式脂肪族、置換されたもしくは非置換のアリシクリル、置換されたもしくは非置換のヘテロシクリル、置換されたもしくは非置換のヘテロアリールアルキル、置換されたもしくは非置換のアリール、置換されたもしくは非置換のアラルキル、およびＲ５−ＣＯ−から選択され、ここでＲ５は置換されたもしくは非置換のＣ１−Ｃ２４アルキルラジカル、置換されたもしくは非置換のＣ２−Ｃ２４アルケニル、置換されたもしくは非置換のＣ２−Ｃ２４アルキニル、置換されたもしくは非置換のＣ３−Ｃ２４シクロアルキル、置換されたもしくは非置換のＣ５−Ｃ２４シクロアルケニル、置換されたもしくは非置換のＣ８−Ｃ２４シクロアルキニル、置換されたもしくは非置換のＣ６−Ｃ３０アリール、置換されたもしくは非置換のＣ７−Ｃ２４アラルキル、置換されたもしくは非置換の３〜１０員のヘテロシクリル環、および２〜２４個の炭素原子と１〜３個の炭素原子以外の原子と１〜６個の炭素原子のアルキル鎖とを有する置換されたまたは非置換のヘテロアリールアルキルによって形成される群から選択され；および、
Ｒ２はＨ、−ＮＲ３Ｒ４−、−ＯＲ３および−ＳＲ３から選択され、ここで、Ｒ３およびＲ４はＨ、置換されたまたは非置換の非環式脂肪族基、置換されたまたは非置換のアリシクリル、置換されたまたは非置換のヘテロシクリル、置換されたまたは非置換のヘテロアリールアルキル、置換されたまたは非置換のアリール、および置換されたまたは非置換のアラルキルから独立して選択される。
【請求項９】
ＡＡ１は、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓの群から選択され；
ＡＡ２は、任意のアミノ酸であり；
ＡＡ３は、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓの群から選択され；および、
ＡＡ４は、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐの群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１０】
ＡＡ１は、Ａｒｇの群から選択され；
ＡＡ２は、任意のアミノ酸であり；
ＡＡ３は、Ａｒｇの群から選択され、および、
ＡＡ４は、Ｐｈｅの群から選択されることを特徴とする、請求項８または９に記載のペプチド。
【請求項１１】
式（ＩＩ）のペプチドが、
Ｒ１−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号１０−Ｒ２）；および／または、
Ｒ１−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号１１−Ｒ２）であることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１２】
式（ＩＩ）のペプチドが、
Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号１０−ＮＨ２）；および／または、
Ａｃ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号１１−ＮＨ２）であることを特徴とする、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物。
【請求項１４】
薬剤として使用するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ニューロンのエキソサイトーシス障害および／または筋収縮性障害の予防および／または治療に使用するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
ニューロンのエキソサイトーシス障害および／または筋収縮性障害が、老人性認知症、アルツハイマー関連認知症、エイズ関連認知症、てんかん、筋萎縮性硬化症、多発性／側索硬化症、肥満細胞症、慢性片頭痛、ジストニアおよび／または不安障害であることを特徴とする、請求項１５に記載の使用するためのペプチドまたは組成物。
【請求項１７】
筋収縮性障害が、筋強直症、筋強直性ジストロフィー、先天性筋強直症、パーキンソン病、二次性パーキンソニズム、ハンチントン病、痙縮または遅発性ジスキネジア（ＴＤ）であることを特徴とする、請求項１５に記載の使用するためのペプチドまたは組成物。
【請求項１８】
被験体における皮膚の老化および／または表情による徴候を予防、減少および／または排除するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項１３に記載の組成物の化粧料としての使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は分子生物学の分野に関し、より正確には化粧料および医薬に適用される分子生物学に関し、さらにより正確にはＭｕｎｃ１８とシンタキシン−１との間の結合または相互作用、すなわちＳＮＡＲＥ複合体の結合を調節可能な、ペプチドおよび前記ペプチドを含む組成物に関する。この活性により、本発明のペプチドおよび組成物は、シナプス小胞融合および筋収縮性を調節可能である。従って、前記ペプチドおよび組成物は上述の態様（例えば、筋弛緩）の調節に関連する状態の治療に効果的であり、化粧料（抗しわ活性および多汗症に対する活性）および医薬品（ニューロンの障害および／または筋収縮性障害）の両方に有用である。
【０００２】
特に、ＳＮＡＲＥ複合体およびシナプス小胞融合の異常な調節は、化粧料および医薬品の両方に非常に関連することが知られている、異常な筋収縮−弛緩を発生させる。
【０００３】
一方では、しわ（例えば、顔の表情のしわ）形成の原因またはメカニズムは皮膚を内側に引っ張る筋肉の緊張である。この筋肉の緊張は、対応する筋肉を活性化する神経の過敏の結果である。次に、前記神経過敏は、筋線維を興奮させる神経伝達物質の制御不能かつ過剰な放出によって特徴付けられる。
【０００４】
他方では、筋収縮−弛緩の変化をもたらす神経過敏（既に述べたように、筋線維を興奮させる神経伝達物質の制御不能かつ過剰な放出によって特徴づけられる）はいくつかの既知の疾患、例えば、老人性認知症、アルツハイマー関連認知症、エイズ関連認知症、てんかん、筋萎縮性硬化症または多発性／側索硬化症の原因でもある（Jabbari B, (2018) Botulinum Toxin Treatment in Clinical Medicine A Disease-Oriented Approach, Springer, Cham.; Jankovic J, (2004) Botulinum toxin in clinical practice, J Neurol Neurosurg Psychiatry, 75:951−957）。
【０００５】
前述したのと同様に、ニューロンのエキソサイトーシスの調節異常を引き起こすＳＮＡＲＥ複合体およびシナプス小胞融合の異常は、筋肉だけでなく、例えば腺のような他の構造または器官の過剰な活性化または興奮を引き起こすこともある。従って、前記条件は例えば、多汗症（汗腺の過剰な活性化または興奮）のように、筋収縮に関連しない（本発明のペプチドおよび組成物が有用な）美容的および医学的な変化も引き起こす（Jabbari B, (2018) Botulinum Toxin Treatment in Clinical Medicine A Disease-Oriented Approach, Springer, Cham.; Luvisetto S, Gazerani P, Cianchetti C, Pavone F, (2015) Botulinum Toxin Type A as a Therapeutic Agent against Headache and Related Disorders, Toxins (Basel), Sep; 7(9): 3818−3844.；Molderings GJ, Haenisch B, Brettner S, et. al., (2016) Pharmacological treatment options for mast cell activation disease, Arch Pharmacol. 2016; 389： 671−694.; Basar E, Arici C, (2016), Use of Botulinum Neurotoxin in Ophthalmology, Turk J Ophthalmol. Dec； 46(6)：282−290.; Schlereth T, Dieterich M, Birklein F(2009), Hyperhidrosis-causes and treatment of enhanced sweating, Dtsch Arztebl Int. Jan;106(3)：32−7）。
【０００６】
神経伝達物質の放出はシナプス前小胞の融合によるものである。広く知られているように、前記シナプス前小胞の融合は、異なるタンパク質間の複雑な相互作用によって制御され、当該タンパク質は、神経伝達物質を伴った小胞をシナプス前膜に接近させる、分泌のために前記小胞の位置を決める、分泌のための膜融合を可能にする、および、生成された複合体をその再利用を可能にするために分解する役割を持つ。関与するタンパク質の組み立てと分解を含む、この全ての手順は、あらゆる種類の調節不全が美容への影響および／または健康への影響の両方を伴う変化につながる可能性があるので、厳密に制御される必要がある。
【０００７】
ニューロンのエキソサイトーシスを調節する分子は筋肉の緊張を緩和することに寄与し、従って、しわ（好ましくは、顔面のしわ）を予防、減少および／または排除し、そして／または異常なまたは調節不全のニューロンのエキソサイトーシスに関連する疾患を予防、改善または治癒する。
【０００８】
これに関連して、（神経伝達物質、好ましくはアセチルコリンが含まれた）シナプス前小胞融合は、ＳＮＡＲＥタンパク質（すなわち、ニューロンの膜におけるシンタキシン−１およびＳＮＡＰ−２５；および小胞の膜におけるシナプトブレビンまたはＶＡＭＰ）によって作動または制御されていると従来考えられていた。従って、ＳＮＡＲＥタンパク質複合体は神経分泌を制御するための鍵となる標的を形成すると考えられていた。
【０００９】
これに関連して、ＳＮＡＲＥタンパク質複合体に向けられたいくつかの治療的および美容的アプローチが生み出されてきた。例えば：
ボツリヌス毒素：特に血清型Ａ（ＢＯＴＯＸ（登録商標）Ｃｏｓｍｅｔｉｃ、Ａｌｌｅｒｇａｎ  Ｉｎｃ．）は表情のしわを減少および／または排除する目的で広く使用されてきた。前記ボツリヌス毒素は局所的に注射され、それらの麻痺効果は平均期間６ヶ月の可逆的な効果であり、従って、反復注射が必要となる。ボツリヌス製剤に対する免疫反応を引き起こし、治療効果を失うという危険性が知られている。Ｂ、Ｆ、Ｅのようなボツリヌス毒素の他の血清型もこの問題を克服すると考えられていたが、前記血清型も免疫応答を引き起こす危険性を有する。分子レベルでは、ボツリヌス毒素は、カルシウムイオン活性化エキソサイトーシス機構に関与する、ニューロンタンパク質を分解するプロテアーゼである。例えば、ボツリヌス毒素Ａは、ニューロンＳＮＡＰ−２５タンパク質を切断する。
【００１０】
ＳＮＡＲＥ複合体を形成するタンパク質の配列に由来する特定のペプチドがニューロンのエキソサイトーシスを阻害することも、現在の当技術分野で公知である。特定のペプチドとしては例えば、ＳＮＡＰ−２５のアミノおよびカルボキシルドメインに由来するペプチド（例えば、ＰＣＴ特許出願WO97/34620、欧州特許EP1180524B1および欧州特許EP2123673B1を参照のこと）、およびシナプトブレビンまたはシンタキシンに由来するペプチド（例えば、ＰＣＴ特許出願WO97/34620; Blanes-Mira, C., Clemente, J., Jodas, G., Gil, A., Fernandez-Ballester, G., Ponsati, B., Gutierrez, L., Perez-Paya, E., Ferrer-Montiel, A. A synthetic hexapeptide (Argireline) with antiwrinkle activity. International Journal of Cosmetic Science, (2002), 24, 303-310）等がある。
【００１１】
しかしながら、シナプス神経伝達物質の放出の機構への干渉およびその阻害を可能にし、ニューロンのエキソサイトーシスの阻害を可能にする、従って特に、筋肉の弛緩または腺過敏の減少と、および対応する美容的および薬学的効果とを提供する、追加または代替の分子を見出すことがいまだ必要とされている。
【００１２】
最近の研究から、シナプス神経伝達物質放出のより複雑な調節が示唆されており、ＳＮＡＲＥタンパク質複合体に加えて、Ｍｕｎｃ１３およびＭｕｎｃ１８などの他のタンパク質が、この手順の調節と膜融合を可能にするという点で重要な役割を果たすかもしれない（Rizo, J and Sudhof, T.C. (2012) The Membrane Fusion Enigma: SNAREs, Sec1/Munc18 Proteins, and Their Accomplices − Guilty as Charged?; Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 28:279-308）。この意味で、Ｍｕｎｃ１８（配列番号１）とシンタキシン−１（配列番号２）との間の相互作用は、ＳＮＡＲＥ複合体の生成および膜融合の両方にとって、中心的かつ必須であると記載されている。一方では、Ｍｕｎｃ１８はシンタキシン−１のＨａｂｃドメインと相互作用し、前記Ｍｕｎｃ１８の安定化とその適切な輸送を可能にする。他方では、Ｍｕｎｃ１８とシンタキシン−１のＮペプチドとの相互作用はＭｕｎｃ１８とＳＮＡＲＥ複合体との相互作用、および膜融合にとって必要である（Zhou, P. et.al. (2013) Syntaxin-1 N-peptide and Habc-domain perform distinct essential functions in synaptic vesicle fusion; The EMBO Journal, 32:159-171; Rizo, J and Sudhof, T.C. (2012) The Membrane Fusion Enigma: SNAREs, Sec1/Munc18 Proteins, and Their Accomplices − Guilty as Charged?; Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 28:279-308）。
【００１３】
本発明者らは広範かつ徹底的な調査の後、驚くべきことに、Ｍｕｎｃ１８とシンタキシン−１との間の相互作用面に位置する特異的配列と競合するペプチドが、前記複合体Ｍｕｎｃ１８−シンタキシン−１の干渉または阻害と、従って神経伝達物質放出の阻害（好ましくは、アセチルコリンおよびＣＧＲＰ（カルシトニン遺伝子関連ペプチド））と、筋収縮の阻害（間接的にニューロンのエキソサイトーシスを阻害する手段、および筋細胞内に直接効果を提供することの両方によって）とを可能にすることを見出した。驚くべきことに、Ｍｕｎｃ１８とシンタキシン−１との間の相互作用面に位置する他の配列と競合するペプチドは、前記の効果を提供しないことが見出された。それゆえ、本発明者らは、配列番号３（Ｍｕｎｃ１８の、すなわち配列番号１の４６〜５１位に対応するものである）および／または配列番号４（Ｍｕｎｃ１８の、すなわち配列番号１の６３〜６６位に対応するものである）と競合するペプチド、Ｍｕｎｃ１８の両方が、Ｍｕｎｃ１８とシンタキシン−１との間の相互作用への干渉について、Ｍｕｎｃ１８とシンタキシン−１との間の相互作用面に位置する他の配列よりも有利であることを見出した。前記ペプチド（本発明のペプチド）は、Ｍｕｎｃ１８とシンタキシン−１との間の相互作用への効果的な干渉を示した。さらに、これらのペプチドは筋細胞に直接作用する、すなわち、他のペプチドにも見られるような、筋収縮に関与する遺伝子を調節することおよびカルシウム動員を調節することで、シナプス後側に作用する能力を有することで、直接的な筋弛緩効果を示した（Schagen, S.K. (2017)Topical treatments with effective anti-aging results, Cosmetics, 4, 16; ＰＣＴ特許出願 WO2006047900）。従って、ニューロンにおけるアセチルコリン放出の効果的な阻害と、筋細胞における遺伝子発現の調節およびカルシウム動員の減少とを可能にすることにより、シナプス前側およびシナプス後側の両方で効果を示した。従って、本発明のペプチドは前記の問題を解決し、そして美容的徴候と、およびニューロンのエキソサイトーシスおよび／または筋収縮性の調節不全に関連する疾患との両方の治療に有用である。
【００１４】
本発明者らは、Ｍｕｎｃ１８とシンタキシン−１との間の相互作用に干渉して神経伝達物質放出を阻害する（従って、ニューロンのエキソサイトーシスを阻害する）、および筋収縮性を阻害する分子については、いかなる従来技術も発見していない。
【００１５】
第１の態様において、本発明は、Ｍｕｎｃ１８とシンタキシン−１との間の相互作用面の特定の領域と競合することによって、Ｍｕｎｃ１８−シンタキシン−１複合体相互作用に干渉可能なペプチドに関する。より正確には本発明のペプチドは、配列番号３および／または配列番号４と競合し、両方の配列はＭｕｎｃ１８における、シンタキシン−１との相互作用面に位置する。
【００１６】
第２の態様において、本発明は、本発明のペプチド（本発明のペプチドの１つまたはその組み合わせ）を含む組成物に関する。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は薬物として使用するための、より正確にはニューロンのエキソサイトーシス障害および／または筋収縮性障害の予防、改善および／または治療のために使用するための、さらにより正確にはＳＮＡＲＥ複合体形成の調節不全、横紋筋収縮の調節不全、アセチルコリンおよび／またはＣＧＲＰ放出の調節不全および／またはＣａ２＋チャネル活性化の調節不全に関連する疾患の予防、改善および／または治療において使用するための、組成物またはペプチドに関する。
【００１８】
第４の態様において、本発明はニューロンのエキソサイトーシス障害および／または筋収縮性障害の予防、改善および／または治療のための方法に関し、さらにより正確には、ＳＮＡＲＥ複合体形成の調節不全、横紋筋収縮の調節不全、アセチルコリンおよび／またはＣＧＲＰ放出の調節不全および／またはＣａ２＋チャネル活性化の調節不全に関連する疾患の予防、改善および／または治療のための方法であって、それを必要とする被験体に本発明のペプチドまたは組成物を投与する工程を含む方法に関する。
【００１９】
さらに、本発明は第５の態様において、被験体におけるニューロンのエキソサイトーシスおよび／または筋収縮性の調節不全に関連する美容的徴候、より具体的には皮膚の老化または表情による徴候を予防、減少および／または排除するための、本発明のペプチドまたは組成物の化粧料としての使用に関する。
【００２０】
第６の態様において、本発明は被験体におけるニューロンのエキソサイトーシスおよび／または筋収縮性の調節不全に関連する美容的徴候、より具体的には皮膚の老化または表情による徴候を予防、減少および／または排除するための、本発明のペプチドまたは組成物の化粧料への使用に関する。
【００２１】
第７の態様において、本発明は、本発明のペプチドまたは組成物の使用を含むことを特徴とする、それを必要とする被験体におけるニューロンのエキソサイトーシスおよび／または筋収縮性の調節不全に関連する美容的徴候（より具体的には皮膚の老化または表情による徴候）を予防、減少および／または排除する方法に関する。
【００２２】
用語「非環式脂肪族基」およびその複数形は、本明細書で使用される場合、当該用語に対して当技術分野で与えられる一般的な意味を有する。従って、これらの用語は例えば、直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニルおよびアルキニル基を指すが、これらに限定されない。
【００２３】
用語「アルキル基」およびその複数形は本明細書で使用される場合、１〜２４個、好ましくは１〜１６個、より好ましくは１〜１４個、さらにより好ましくは１〜１２個、さらによりいっそう好ましくは１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有し、かつ、単結合によって分子の残りに結合した飽和直鎖または飽和分岐基を指し、例えば、限定されないが、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、ドデシル、ラウリル、ヘキサデシル、オクタデシル、アミル、２−エチルヘキシル、２−メチルブチル、５−メチルヘキシルなどを含む。アルキル基は、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ−カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つまたは複数の置換基によって任意に置換されていてもよい。
【００２４】
用語「アルケニル基」およびその複数形は本明細書で使用される場合、２〜２４個、好ましくは２〜１６個、より好ましくは２〜１４個、さらにより好ましくは２〜１２個、さらによりいっそう好ましくは２、３、４、５または６個の炭素原子を有し、共役または非共役の１つまたは複数の炭素−炭素二重結合を有し、好ましくは１、２または３個の炭素−炭素二重結合を有し、単結合を介して分子の残りに結合した直鎖または分岐鎖基を指し、例えば、限定されないが、ビニル、オレイル、リノレイルおよび類似の基を含む。アルケニル基は、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ−カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つまたは複数の置換基によって任意に置換されていてもよい。
【００２５】
用語「アルキニル基」およびその複数形は本明細書中で使用される場合、２〜２４個、好ましくは２〜１６個、より好ましくは２〜１４個、さらにより好ましくは２〜１２個、さらによりいっそう好ましくは２、３、４、５または６個の炭素原子を有し、共役または非共役の１つまたは複数の炭素−炭素三重結合、好ましくは１、２または３個の炭素−炭素三重結合を有し、単結合を介して分子の残りに結合した直鎖または分岐基を指し、例えば、これらに限定されないが、エチニル基、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニルのようなペンチニルおよび類似の基を含む。アルキニル基は、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ−カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つまたは複数の置換基によって任意に置換されていてもよい。
【００２６】
用語「脂環式基」およびその複数形は、本明細書中で使用される場合、当該用語に対して当技術分野で与えられる一般的な意味を有する。従って、これらの用語は例えば、シクロアルキルまたはシクロアルケニルまたはシクロアルキニル基を指すために使用されるが、これらに限定されない。
【００２７】
用語「シクロアルキル」およびその複数形は本明細書で使用される場合、３〜２４個、好ましくは３〜１６個、より好ましくは３〜１４個、さらにより好ましくは３〜１２個、さらによりいっそう好ましくは３、４、５または６個の炭素原子を有し、単結合を介して分子の残りに結合した飽和の単環式または多環式の脂肪族基を指し、例えば、これらに限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、メチルシクロヘキシル、ジメチルシクロヘキシル、オクタヒドロインデン、デカヒドロナフタレン、ドデカヒドロ−フェナレン、アダマンチルおよび類似の基を含み、、アルキル、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ−カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つまたは複数の基によって任意に置換され得る。
【００２８】
用語「シクロアルケニル」およびその複数形は本明細書で使用される場合、５〜２４個、好ましくは５〜１６個、より好ましくは５〜１４個、さらにより好ましくは５〜１２個、さらによりいっそう好ましくは５〜６個の炭素原子を有し、共役または非共役の１つまたは複数の炭素−炭素二重結合を有し、好ましくは１、２、または３個の炭素−炭素二重結合を有し、単結合を介して分子の残りに結合した非芳香族の単環式または多環式の脂肪族基を指し、例えば、これらに限定されないが、シクロペント−１−エン−１−イル基および類似の基を含み、アルキル、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ−カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つまたは複数の基によって任意に置換され得る。
【００２９】
用語「シクロアルキニル」およびその複数形は本明細書で使用される場合、８〜２４個、好ましくは８〜１６個、より好ましくは８〜１４個、さらにより好ましくは８〜１２個、さらによりいっそう好ましくは８または９個の炭素原子を有し、共役または非共役の１つまたは複数の炭素−炭素三重結合、好ましくは１、２、または３個の炭素−炭素三重結合を有し、単結合を介して分子の残りに結合した非芳香族の単環式または多環式の脂肪族基を指し、例えば、これらに限定されないが、シクロオクト−２−イン−１−イル基および類似の基を含み、アルキル、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ−カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つまたは複数の基によって任意に置換され得る。
【００３０】
用語「アリール基」およびその複数形は本明細書で使用される場合、６〜３０個、好ましくは６〜１８個、より好ましくは６〜１０個、さらにより好ましくは６または１０個の炭素原子を有する、１、２、３または４個の芳香環を含み、炭素−炭素結合によって結合されるかまたは縮合され、単結合を介して分子の残りに結合された芳香族基を指し、例えば、これらに限定されないが、特にフェニル、ナフチル、ジフェニル、インデニル、フェナントリルまたはアントラニルなどを含む。アリール基は、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ−カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つまたは複数の置換基によって任意に置換されていてもよい。
【００３１】
用語「アラルキル基」およびその複数形は本明細書で使用される場合、７〜２４個の炭素原子を有する芳香族基によって置換されたアルキル基を指し、例えば、これらに限定されないが、−（ＣＨ２）１−６−フェニル、−（ＣＨ２）１−６−（１−ナフチル）、−（ＣＨ２）１−６−（２−ナフチル）、−（ＣＨ２）１−６−ＣＨ（フェニル）２およびその類似を含む。アラルキル基は、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ−カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つまたは複数の置換基によって任意に置換されていてもよい。
【００３２】
用語「複素環基」およびその複数形は本明細書中で使用される場合、３〜１０員のヘテロシクリル環または炭化水素環を指し、環原子の１つまたは複数、好ましくは環原子の１、２または３個が炭素とは異なる原子（例えば、窒素、酸素または硫黄）であり、そして飽和または不飽和であり得る。本発明の目的のために、ヘテロシクリルは縮合環系を含み得る環系、単環系、二環系または三環系であり得、窒素、炭素または硫黄原子は任意に、ヘテロシクリルラジカル中で酸化され得；窒素原子は任意に、四元化され得；ヘテロシクリルラジカルは部分的または完全に飽和され得るか、または芳香族であり得る。好ましくは、複素環という用語が５または６員環に関する。複素環基は、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ−カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つまたは複数の置換基によって任意に置換されていてもよい。
【００３３】
用語「ヘテロアリールアルキル基」およびその複数形は本明細書で使用される場合、置換されたまたは非置換の芳香族ヘテロシクリル基で置換されたアルキル基を指し、アルキル基は１〜６個の炭素原子を有し、芳香族ヘテロシクリル基は２〜２４個の炭素原子および炭素以外の１〜３個の原子を有し、例えば、これらに限定されないが、−（ＣＨ２）１−６−イミダゾリル、−（ＣＨ２）１−６−トリアゾリル、−（ＣＨ２）１−６−チエニル、−（ＣＨ２）１−６−フリル、−（ＣＨ２）１−６−ピロリジニルなどを含む。ヘテロアリールアルキル基は、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボニル、シアノ、アシル、アルコキシ−カルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプトおよびアルコキシチオなどの１つまたは複数の置換基によって任意に置換されていてもよい。
【００３４】
用語「ハロ」または「ハロゲン」は、本明細書中で使用される場合、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を指し、そのアニオンはハロゲン化物と呼ばれる。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「誘導体」およびその複数形は、化粧料の調製に使用可能な対象の化合物由来の、美容的に許容される化合物と、美容的に許容される誘導体の調製に有用であり得る、美容的許容されない誘導体との両方を指す。「誘導体」という用語およびその複数形は、薬剤の調製に使用可能な対象の化合物由来の、薬学的に許容される化合物と、薬学的に許容される誘導体の調製に有用であり得る、薬学的に許容されない誘導体との両方を指す。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「塩」およびその複数形は当技術分野で公知の任意の種類の塩、例えば、ハロゲン化物塩、ヒドロキシ酸塩（オキシ酸塩、酸塩、塩基性塩および二重塩など）、ヒドロキソ塩、混合塩、オキシ塩または他の水和塩を指す。この用語は美容的および／または薬学的に許容される塩、ならびに美容的および／または薬学的に許容されない塩の両方を含むが、これは、後者が美容的および／または薬学的に許容される塩の調製に有用であり得るためである。
【００３７】
本明細書で使用されるように、用語「異性体」およびその複数形は、光学異性体、鏡像異性体、立体異性体またはジアステレオ異性体を指す。個々の鏡像異性体またはジアステレオ異性体、ならびにそれらの混合物は、当技術分野で公知の従来技術によって分離することができる。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「溶媒和物」およびその複数形は極性、無極性または両親媒性溶媒和物のような、当技術分野で公知の任意の溶媒和物を指し、対象の被験体に投与または適用する際に、対象の化合物（本発明のペプチド）を（直接的または間接的に）提供する、任意の美容的に許容される溶媒和物を含む。好ましくは、溶媒和物は、水和物、メタノール、エタノール、プロパノールもしくはイソプロパノールのようなアルコールとの溶媒和物、酢酸エチルなどのエステルとの溶媒和物、メチルエーテル、エチルエーテルもしくはＴＨＦ（テトラヒドロフラン）などのエーテルとの溶媒和物、またはＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）との溶媒和物であり、より好ましくは水和物またはエタノールなどのアルコールとの溶媒和物である。
【００３９】
さらに、本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸」およびその複数形は、天然であるか否かにかかわらず、そしてＤ−およびＬ−アミノ酸であるかどうかにかかわらず、遺伝コードによってコーディングされたアミノ酸、およびコーディングされていないアミノ酸を含む。コーディングされていないアミノ酸の例としては、これらに限定されないが、特にシトルリン、オルニチン、サルコシン、デスモシン、ノルバリン、４−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、２−アミノイソ酪酸、６−アミノヘキサン酸、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、２−アミノ安息香酸、４−アミノ安息香酸、４−クロロフェニルアラニン、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸、シクロセリン、カルニチン、システイン、ペニシラミン、ピログルタミン酸、チエニルアラニン、ヒドロキシプロリン、アロ−イソロイシン、アロ−スレオニン、イソニペコチン酸、イソセリン、フェニルグリシン、スタチン、β−アラニン、ノルロイシン、Ｎ−メチルアミノ酸、α−アミノ酸およびβ−アミノ酸、それらの誘導体などが挙げられる。それにもかかわらず、さらなる非天然アミノ酸は当該分野で公知である（例えば、“Unusual amino acids in peptide synthesis” by D. C. Roberts and F. Vellaccio, The Peptides, Vol. 5 (1983), Chapter VI, Gross E. and Meienhofer J., Eds., Academic Press, New York, USAを参照）。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「表情のしわ」は、顔の皮膚上に顔の表情を引き起こす、顔の筋肉の収縮によって及ぼされる応力から生じるしわである。前記しわは、通常、額、眉の間の空間、口の周り、および／または目の周りに位置する。
【００４１】
前記の通り、第１の態様において、本発明は、配列番号３および／または配列番号４、と競合することを特徴とする、Ｍｕｎｃ１８−シンタキシン−１複合体相互作用に干渉可能なペプチド、その許容可能な異性体、塩、溶媒和物および／または誘導体および／またはそれらの混合物に関する。
【００４２】
本発明のペプチドにおいて使用されるまたは存在するアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはそれらの組み合わせであることが意図される。好ましい実施形態において、本発明のペプチドにおいて使用されるまたは存在するアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸である。
【００４３】
好ましくは、前記の異性体は立体異性体である。前記立体異性体は、鏡像異性体またはジアステレオ異性体であることが意図される。従って、本発明の好ましい実施形態において、ペプチドは、ラセミ混合物、ジアステレオマー混合物、純粋な鏡像異性体または純粋なジアステレオ異性体である。
【００４４】
本発明のペプチドは、そのＮ末端および／またはそのＣ末端に結合した少なくとも１つの部分を含むことが意図される。前記少なくとも１つの部分は当技術分野で公知の任意の手段によって、好ましくは共有結合によって、ペプチドに結合され得る。好ましい実施形態において、ペプチドは、そのＮ末端に共有結合した１つの部分およびそのＣ末端に共有結合した１つの部分を含む。
【００４５】
一実施形態では、少なくとも１つのＮ−末端部分（好ましくは１つのＮ−末端部分）がＨ、置換されたまたは非置換の非環式脂肪族、置換されたまたは非置換のアリシクリル、置換されたまたは非置換のヘテロシクリル、置換されたまたは非置換のヘテロアリールアルキル、置換されたまたは非置換のアリール、置換されたまたは非置換のアラルキルおよびＲ５−ＣＯ−から選択され、Ｒ５は置換されたまたは非置換のＣ１−Ｃ２４アルキルラジカル、置換されたまたは非置換のＣ２−Ｃ２４アルケニル、置換されたまたは非置換のＣ２−Ｃ２４アルキニル、置換されたまたは非置換のＣ３−Ｃ２４シクロアルキル、置換されたまたは非置換のＣ５−Ｃ２４シクロアルケニル、置換されたまたは非置換のＣ８−Ｃ２４シクロアルキニル、置換されたまたは非置換のＣ６−Ｃ３０アリール、置換されたまたは非置換のＣ７−Ｃ２４アラルキル、置換されたまたは非置換の３〜１０員のヘテロシクリル環、および２〜２４個の炭素原子と１〜３個の炭素原子以外の原子と１〜６個の炭素原子のアルキル鎖とを有する置換されたまたは非置換のヘテロアリールアルキルによって形成される群から選択される。より好ましくは、少なくとも１つのＮ末端部分（好ましくは１つのＮ末端部分）がＨまたはＲ５−ＣＯ−から選択され、Ｒ５は置換されたまたは非置換のＣ１−Ｃ２４アルキルラジカル、置換されたまたは非置換のＣ２−Ｃ２４アルケニル、置換されたまたは非置換のＣ２−Ｃ２４アルキニル、置換されたまたは非置換のＣ３−Ｃ２４シクロアルキル、置換されたまたは非置換のＣ５−Ｃ２４シクロアルケニル、置換されたまたは非置換のＣ８−Ｃ２４シクロアルキニル、置換されたまたは非置換のＣ６−Ｃ３０アリール、置換されたまたは非置換のＣ７−Ｃ２４アラルキル、置換されたまたは非置換の３〜１０員のヘテロシクリル環、および２〜２４個の炭素原子と１〜３個の炭素原子以外の原子と１〜６個の炭素原子のアルキル鎖とを有する置換されたまたは非置換のヘテロアリールアルキルによって形成される群から選択される。さらにより好ましくは、少なくとも１つのＮ末端部分（好ましくは１つのＮ末端部分）がＨ、アセチル（以下、Ａｃ）、ｔｅｒｔ−ブタノイル、ヘキサノイル、２−メチルヘキサノイル、シクロヘキサンカルボキシル、オクタノイル、デカノイル、ラウロイルミリストイル、パルミトイル（以下、Ｐａｌ）、ステアロイル、オレオイルおよびリノレオイルから選択される。最も好ましい実施形態において、少なくとも１つのＮ末端部分（好ましくは、１つのＮ末端部分）はＡｃである。
【００４６】
一実施形態において、少なくとも１つのＣ末端部分（好ましくは１つのＣ末端部分）がＨ、−ＮＲ３Ｒ４−、−ＯＲ３および−ＳＲ３から選択され、ここで、Ｒ３およびＲ４はＨ、置換されたまたは非置換の非環式脂肪族基、置換されたまたは非置換のアリシクリル、置換されたまたは非置換のヘテロシクリル、置換されたまたは非置換のヘテロアリールアルキル、置換されたまたは非置換のアリール、および置換されたまたは非置換のアラルキルから独立して選択される。最も好ましい実施形態において、少なくとも１つのＣ末端部分（好ましくは、１つのＣ末端部分）がＮＨ２である。
【００４７】
従って、より好ましくは、本発明のペプチドは、Ｎ末端に結合した１つの部分およびＣ末端に結合した１つの部分を含み、ここで、Ｎ末端に結合した部分はＡｃであり、Ｃ末端に結合した部分はＮＨ２である。
【００４８】
一実施形態において、本発明のペプチドの配列は配列番号３または配列番号４である（前記のように、前記ペプチドはＮ末端に結合した少なくとも１つの部分および／またはそのＣ末端に結合した少なくとも１つの部分を含み得、より好ましくは、Ｎ末端に結合した１つの部分およびＣ末端に結合した１つの部分を含み、ここで、Ｎ末端に結合した部分はＡｃであり、Ｃ末端に結合した部分はＮＨ２である）。本発明のペプチドは、配列番号３または配列番号４と少なくとも７０％の同一性、さらにより好ましくは配列番号３または配列番号４と８０％の同一性、さらにより好ましくは配列番号３または配列番号４と９０％の同一性、さらにより好ましくは配列番号３または配列番号４と９５％の同一性、さらにより好ましくは配列番号３または配列番号４と９９％の同一性を有する配列を有することが意図される。
【００４９】
好ましい実施形態の１つにおいて、本発明に係るペプチド、その美容的および薬学的に許容可能な異性体、塩、溶媒和物および／または誘導体ならびにそれらの混合物は、式（Ｉ）に記載の配列を有する：
Ｒ１−ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−ＡＡ５−ＡＡ６−Ｒ２
（Ｉ）
ここで：
ＡＡ１は、正の電荷を有する側鎖または電荷を有さない極性の側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
ＡＡ２は、非極性の疎水性側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
ＡＡ３は、非極性の疎水性側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
ＡＡ４は、電荷を有する側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
ＡＡ５は、非極性の疎水性側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
ＡＡ６は、Ｔｒｐであり；
Ｒ１はＨ、置換されたもしくは非置換の非環式脂肪族、置換されたもしくは非置換のアリシクリル、置換されたもしくは非置換のヘテロシクリル、置換されたもしくは非置換のヘテロアリールアルキル、置換されたもしくは非置換のアリール、置換されたもしくは非置換のアラルキル、およびＲ５−ＣＯ−から選択され、ここでＲ５は置換されたもしくは非置換のＣ１−Ｃ２４アルキルラジカル、置換されたもしくは非置換のＣ２−Ｃ２４アルケニル、置換されたもしくは非置換のＣ２−Ｃ２４アルキニル、置換されたもしくは非置換のＣ３−Ｃ２４シクロアルキル、置換されたもしくは非置換のＣ５−Ｃ２４シクロアルケニル、置換されたもしくは非置換のＣ８−Ｃ２４シクロアルキニル、置換されたもしくは非置換のＣ６−Ｃ３０アリール、置換されたもしくは非置換のＣ７−Ｃ２４アラルキル、置換されたもしくは非置換の３〜１０員のヘテロシクリル環、および２〜２４個の炭素原子と１〜３個の炭素原子以外の原子と１〜６個の炭素原子のアルキル鎖とを有する置換されたもしくは非置換のヘテロアリールアルキルによって形成された群から選択され；および、
Ｒ２はＨ、−ＮＲ３Ｒ４−、−ＯＲ３および−ＳＲ３から選択され、ここで、Ｒ３およびＲ４はＨ、置換されたまたは非置換の非環式脂肪族基、置換されたまたは非置換のアリシクリル、置換されたまたは非置換のヘテロシクリル、置換されたまたは非置換のヘテロアリールアルキル、置換されたまたは非置換のアリール、および置換されたまたは非置換のアラルキルから独立して選択される。
【００５０】
より好ましくは、この好ましい実施形態において、式（Ｉ）中：
ＡＡ１は、Ｈｉｓであり；
ＡＡ２は、非極性の疎水性側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
ＡＡ３は、非極性の疎水性側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
ＡＡ４は、電荷を有する側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
ＡＡ５は、Ｍｅｔまたは芳香族側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；および、
ＡＡ６は、Ｔｒｐである。
【００５１】
より好ましくは、この好ましい実施形態において、式（Ｉ）中：
ＡＡ１は、Ｈｉｓであり；
ＡＡ２は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅｔおよびＩｌｅの群から選択され；
ＡＡ３は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅｔおよびＩｌｅの群から選択され；
ＡＡ４は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｐおよびＧｌｕの群から選択され；
ＡＡ５は、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐから選択され；および、
ＡＡ６はＴｒｐである。
【００５２】
より好ましくは、この好ましい実施形態において、式（Ｉ）である：
ＡＡ１は、Ｈｉｓであり；
ＡＡ２は、ＡｌａおよびＩｌｅの群から選択され；
ＡＡ３は、ＬｅｕおよびＭｅｔの群から選択され；
ＡＡ４は、ＡｒｇおよびＡｓｐの群から選択され；
ＡＡ５は、Ｍｅｔ、ＰｈｅおよびＴｒｐの群からから選択され；および、
ＡＡ６は、Ｔｒｐである。
【００５３】
さらにより好ましくは、この好ましい実施形態において、本発明に係るペプチドの配列が：
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号５−Ｒ２）；
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号６−Ｒ２）；
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号７−Ｒ２）；
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号８−Ｒ２）；および／または、
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号９−Ｒ２）である。
【００５４】
Ｒ１は好ましくはＨまたはＲ５−ＣＯ−から選択され、ここで、Ｒ５は置換されたもしくは非置換のＣ１−Ｃ２４アルキルラジカル、置換されたもしくは非置換のＣ２−Ｃ２４アルケニル、置換されたもしくは非置換のＣ２−Ｃ２４アルキニル、置換されたもしくは非置換のＣ３−Ｃ２４シクロアルキル、置換されたもしくは非置換のＣ５−Ｃ２４シクロアルケニル、置換されたもしくは非置換のＣ８−Ｃ２４シクロアルキニル、置換されたもしくは非置換のＣ６−Ｃ３０アリール、置換されたもしくは非置換のＣ７−Ｃ２４アラルキル、置換されたもしくは非置換の３〜１０員のヘテロシクリル環、および２〜２４個の炭素原子と１〜３個の炭素原子以外の原子と１〜６個の炭素原子のアルキル鎖とを有する置換されたまたは非置換のヘテロアリールアルキルによって形成された群から選択される。さらにより好ましくは、Ｒ１がＨ、アセチル（以下、Ａｃ）、ｔｅｒｔ−ブタノイル、ヘキサノイル、２−メチルヘキサノイル、シクロヘキサンカルボキシル、オクタノイル、デカノイル、ラウロイルミリストイル、パルミトイル（以下、Ｐａｌ）、ステアロイル、オレオイルおよびリノレオイルから選択される。さらにより好ましくは、Ｒ１はＡｃである。
【００５５】
好ましくは、Ｒ２はＮＨ２である。
【００５６】
従って、より好ましくは、Ｒ１はＡｃであり、Ｒ２はＮＨ２である。
【００５７】
従って、この好ましい実施形態では、好ましくは、本発明に係るペプチドの配列が：
Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号５−ＮＨ２）；
Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号６−ＮＨ２）；
Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号７−ＮＨ２）；
Ａｃ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号８−ＮＨ２）および／または、
Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号９−ＮＨ２）である。
【００５８】
別の好ましい実施形態において、本発明のペプチド、その美容的および薬学的に許容可能な異性体、塩、溶媒和物および／または誘導体ならびにそれらの混合物は、式（ＩＩ）に記載の配列を有する：
Ｒ１−ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−Ｒ２
（ＩＩ）
ここで：
ＡＡ１は、正の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
ＡＡ２は、任意のアミノ酸であり；
ＡＡ３は、正の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
ＡＡ４は、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群から選択され；
Ｒ１はＨ、置換されたもしくは非置換の非環式脂肪族、置換されたもしくは非置換のアリシクリル、置換されたもしくは非置換のヘテロシクリル、置換されたもしくは非置換のヘテロアリールアルキル、置換されたもしくは非置換のアリール、置換されたもしくは非置換のアラルキル、およびＲ５−ＣＯ−から選択され、ここでＲ５は置換されたもしくは非置換のＣ１−Ｃ２４アルキルラジカル、置換されたもしくは非置換のＣ２−Ｃ２４アルケニル、置換されたもしくは非置換のＣ２−Ｃ２４アルキニル、置換されたもしくは非置換のＣ３−Ｃ２４シクロアルキル、置換されたもしくは非置換のＣ５−Ｃ２４シクロアルケニル、置換されたもしくは非置換のＣ８−Ｃ２４シクロアルキニル、置換されたもしくは非置換のＣ６−Ｃ３０アリール、置換されたもしくは非置換のＣ７−Ｃ２４アラルキル、置換されたもしくは非置換の３〜１０員のヘテロシクリル環、および２〜２４個の炭素原子と１〜３個の炭素原子以外の原子と１〜６個の炭素原子のアルキル鎖とを有する置換されたまたは非置換のヘテロアリールアルキルによって形成される群から選択され；および、
Ｒ２はＨ、−ＮＲ３Ｒ４−、−ＯＲ３および−ＳＲ３から選択され、ここで、Ｒ３およびＲ４はＨ、置換されたまたは非置換の非環式脂肪族基、置換されたまたは非置換のアリシクリル、置換されたまたは非置換のヘテロシクリル、置換されたまたは非置換のヘテロアリールアルキル、置換されたまたは非置換のアリール、および置換されたまたは非置換のアラルキルから独立して選択される。
【００５９】
より好ましくは、この好ましい実施形態では、式（ＩＩ）中：
ＡＡ１は、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓの群から選択され；
ＡＡ２は、任意のアミノ酸であり；
ＡＡ３は、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓの群から選択され；および、
ＡＡ４は、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐの群から選択される。
【００６０】
より好ましくは、この好ましい実施形態では、式（ＩＩ）中：
ＡＡ１は、Ａｒｇの群から選択され；
ＡＡ２は、任意のアミノ酸であり；
ＡＡ３は、Ａｒｇの群から選択され；および、
ＡＡ４は、Ｐｈｅの群から選択される。
【００６１】
さらにより好ましくは、この好ましい実施形態において、本発明に係るペプチドの配列は：
Ｒ１−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号１０−Ｒ２）；および／または、
Ｒ１−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｒ２（Ｒ１−配列番号１１−Ｒ２）である。
【００６２】
Ｒ１は好ましくはＨまたはＲ５−ＣＯ−から選択され、ここで、Ｒ５は置換されたもしくは非置換のＣ１−Ｃ２４アルキルラジカル、置換されたもしくは非置換のＣ２−Ｃ２４アルケニル、置換されたもしくは非置換のＣ２−Ｃ２４アルキニル、置換されたもしくは非置換のＣ３−Ｃ２４シクロアルキル、置換されたもしくは非置換のＣ５−Ｃ２４シクロアルケニル、置換されたもしくは非置換のＣ８−Ｃ２４シクロアルキニル、置換されたもしくは非置換のＣ６−Ｃ３０アリール、置換されたもしくは非置換のＣ７−Ｃ２４アラルキル、置換されたもしくは非置換の３〜１０員のヘテロシクリル環、および２〜２４個の炭素原子と１〜３個の炭素原子以外の原子と１〜６個の炭素原子のアルキル鎖とを有する置換されたまたは非置換のヘテロアリールアルキルによって形成された群から選択される。さらにより好ましくは、Ｒ１がＨ、アセチルＡｃ、ｔｅｒｔ−ブタノイル、ヘキサノイル、２−メチルヘキサノイル、シクロヘキサンカルボキシル、オクタノイル、デカノイル、ラウロイルミリストイル、Ｐａｌ、ステアロイル、オレオイルおよびリノレオイルから選択される。さらにより好ましくは、Ｒ１はＡｃである。
【００６３】
好ましくは、Ｒ２はＮＨ２である。
【００６４】
従って、より好ましくは、Ｒ１はＡｃであり、Ｒ２はＮＨ２である。
【００６５】
従って、この好ましい実施形態では、本発明に係るペプチドの配列が：
Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号１０−ＮＨ２）；および／または、
Ａｃ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（Ａｃ−配列番号１１−ＮＨ２）である。
【００６６】
本発明のペプチドは、当技術分野で公知の任意の手段によって合成および産生され得る。例えば、前記ペプチドは、化学合成（好ましくは固相ペプチド合成の手段によって）、細胞培養にて前記ペプチドを発現させる、または植物あるいは動物におけるペプチドの遺伝子組み換え生産の手段によって、合成および生産され得る。さらに、本発明のペプチドは、当技術分野で公知の任意の手段によって精製され得る。
【００６７】
以下に含まれる例から明らかなように、本発明のペプチドはＭｕｎｃ１８とシンタキシン−１との間の相互作用に対する効果的な干渉を提供し、シナプス前の段階で、アセチルコリン放出の阻害、従って、筋収縮の阻害をもたらす。また、以下に含まれる例から誘導され得るように、本発明のペプチドは、筋細胞において筋肉の弛緩を直接誘導することで、シナプス後の段階で直接的な効果を有する。従って、本発明のペプチドは前記の問題を解決し、かつニューロンのエキソサイトーシスおよび／または筋収縮性の調節不全に関連する疾患および／または美的徴候を治療（予防、減少および／または排除）し得る追加のペプチドまたは代替のペプチドを提供する。
【００６８】
第２の態様において、本発明は、本発明に係る少なくとも１つのペプチドを含む組成物に関する。
【００６９】
本発明の組成物は、１種類の本発明のペプチド、または異なる本発明のペプチドの組み合わせまたは混合物を含むことが意図される。
【００７０】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は化粧料組成物である。
【００７１】
本発明の化粧料組成物は、美容的に有効な量の、少なくとも１つの本発明のペプチドを含む。より好ましくは、本発明の化粧料組成物が０．０００１％〜０．０５％（ｍ／ｖ）の少なくとも１つの本発明のペプチド、より好ましくは０．０００５％〜０．００５％（ｍ／ｖ）の少なくとも１つの本発明のペプチド、さらにより好ましくは０．０５％〜０．００１％（ｍ／ｖ）の少なくとも１つの本発明のペプチドを含む。
【００７２】
本発明の化粧料組成物は、本発明のペプチドの活性の結果として、（すなわち、Ｍｕｎｃ１８とシンタキシン−１との間の相互作用の阻害、従って、神経伝達物質の放出の阻害および筋収縮の調節）、皮膚の老化および／または表情による徴候（好ましくはしわ）の予防、減少および／または排除を提供する。より正確には、本発明の化粧料組成物は、顔の表情のしわ、より好ましくは額のしわ、眉の間の空間のしわ、および／または口の周りおよび／または目の周りのしわおよび細い線の予防、減少および／または排除を提供する。
【００７３】
また、本発明の化粧料組成物が少なくとも１つの追加の化粧料成分を含むことを意図する。前記追加の化粧料成分は、少なくとも１つの賦形剤および／または少なくとも１つの追加の化粧料活性成分であり得る。
【００７４】
追加の化粧料成分は例えば、安定剤、可溶化剤、ビタミン、着色剤および香料などの補助剤；担体；および／または他の化粧料活性成分として、当技術分野で通常使用されるものを含む。
【００７５】
前記の追加の化粧料成分は、組成物の他の成分、特に本発明の組成物に含まれる本発明のペプチドと物理的および化学的に適合していなければならない。同様に、前記追加の化粧料成分の性質は、本発明のペプチドおよび組成物の利点を許容できないほど変えてはならない。前記追加の化粧料成分は例えば、植物抽出物などの合成または天然起源のものであってもよく、または生物発酵プロセスに由来するものであってもよい（例えば、CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Eleventh Edition (2006)参照）。
【００７６】
前記の追加の化粧料成分は、皮膚および/または毛髪の洗浄に配慮するための組成物、および／または多汗症を予防するための脱臭剤および／またはクリームにおいて、通常に使用される成分が含まれることが意図される。前記成分としては例えば、メラニン合成阻害剤、ホワイトニング剤または脱色剤、抗老化剤、ＮＯ−シンターゼ阻害剤、抗酸化剤、抗大気汚染剤および／またはフリーラジカル捕捉剤、抗糖化剤、乳化剤、エモリエント剤、有機溶剤、液体噴射剤、スキンコンディショナー（例えば、湿潤剤、保湿物質、α−ヒドロキシ酸、保湿剤、ビタミンなど）、色素または着色剤、染料、ゲル化ポリマー、増粘剤、界面活性剤、柔軟剤、他のしわ防止剤、目の下の隈を減少または排除することができる薬剤、削剥剤、抗菌剤、抗真菌剤、殺菌剤、真皮または表皮における高分子合成を促進する薬剤および/またはその分解を防止または阻害できる薬剤（例えば、コラーゲン合成促進剤、エラスチン合成促進剤、ラミニン合成促進剤、コラーゲン分解阻害剤、エラスチン分解阻害剤、線維芽細胞増殖促進剤、ケラチノサイト増殖促進剤、ケラチノサイト分化促進剤、角質層の成分（セラミド、脂肪酸等）の合成および脂質合成の促進剤など）、皮膚弛緩剤、グリコサミノグリカン合成促進剤、ＤＮＡ修復剤、ＤＮＡ保護剤、プロテオソーム活性促進剤、抗掻痒剤、敏感皮膚治療剤、再形成剤（reaffirming agents）、収斂剤、皮脂産生調節剤、リポリーシス促進剤、抗セルライト剤、鎮静剤、抗炎症剤、毛細血管循環および／または微小循環に作用する薬剤、細胞ミトコンドリアに作用する薬剤、真皮−表皮接合部を強化する薬剤、防腐剤、香料、キレート剤、植物抽出物、エッセンシャルオイル、海洋性抽出物、生物発酵プロセス由来の薬剤、無機塩、細胞抽出物および／または、太陽光フィルター（紫外線ＡおよびＢに対して活性な有機または無機光保護剤）などが挙げられる。
【００７７】
一実施形態において、追加の化粧料成分の少なくとも１つは、本発明のペプチドとして前記に開示されたものと同じ、類似の、相補的な、または異なる化粧料活性を発揮し得る化粧料活性成分または物質である。本発明の化粧料組成物は他の抗しわ剤または抗老化剤を含むことが意図される。他の抗しわ剤または抗老化剤としては例えば、コラーゲン、エラスチン、成長因子、ヒアルロン酸ブースター、保護機能促進剤、照明剤(illuminating agents)、コラーゲンＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよび／またはＶＩ、およびラミニンの発現および／または合成の促進剤；グリコサミノグルカンまたはヒアルロン酸の合成促進剤；エラスチンおよび／または他の弾性線維関連タンパク質の発現および／または合成の促進剤；コラーゲンおよび／または弾性線維の分解阻害剤；ミトコンドリア関連タンパク質（例えば、サーチュインおよびアコニターゼ）の発現および／または合成の促進剤；局所接着タンパク質の発現および／または合成の促進剤；ケラチノサイトおよび／または線維芽細胞の増殖および／または分化の促進剤；抗酸化剤；抗大気汚染剤および／またはフリーラジカル捕捉剤；抗糖化剤；解毒剤；経時的老化、環境老化、および炎症老化の抑制剤；およびメラニン産生抑制剤および／またはチロシナーゼ抑制剤および／または脂質合成および表皮の成分（ケラチン）、より具体的には角質層（ケラチン、セラミド、フィラグリン、ロリクリンおよびＳＰＲＲ１Ｂ）の合成の促進剤が挙げられる。より好ましくは、追加の化粧料成分の少なくとも１つはアルギレリン（登録商標）（アセチルヘキサペプチド−８）、ロイファシル（登録商標）（ペンタペプチド−３）、イニルイン（登録商標）（アセチルヘキサペプチド−３０）、Ｓｙｎ−Ａｋｅ（登録商標）（トリペプチド−３）、またはそれらの組み合わせである。
【００７８】
さらに、本発明の化粧料組成物（または本発明のペプチド）は、当技術分野で通常使用される任意の形態として製剤化されていてよい。例えば、「洗い流さない」および「洗い流す」製剤を含む、溶液、懸濁液、エマルション、ペースト、ゲル、クリーム、粉末、スプレー、ローション、オイル、リニメント剤、美容液、ムース、軟膏、バーまたはペンシルが挙げられる。本発明の化粧料組成物はまた、ウエットティッシュ、ヒドロゲル、粘着性（または非粘着性）パッチまたはフェイスマスクなどの様々な種類の固形部品に、当技術分野で公知の技術によって組み込むこともできる。または、特にコンシーラー、メイク用ファンデーション、ローション、もしくは化粧落としローションなど、様々な種類の化粧製品に組み込むこともできる。
【００７９】
また、本明細書に両方とも開示される、本発明の化粧料組成物または本発明のペプチドは、有効成分をよりよく浸透させるために、化粧料の持続的放出システムおよび/または担体と組み合わせることもできることが意図される。これらの例としては、リポソーム、ミリ粒子、マイクロ粒子およびナノ粒子などに加えて、スポンジ、ベシクル、ミセル、ミリスフィア、ミクロスフィア、ナノスフィア、リポスフィア、ミリカプセル、マイクロカプセル、およびナノカプセルなど、さらには、マイクロエマルション、ナノエマルションが挙げられる。
【００８０】
好ましい実施形態において、本発明の化粧料組成物はイオン導入によって、より好ましくは被験体の顔および／または身体に、より好ましくは被験体の顔、首、手および／または脇の下に、さらにより好ましくは被験体（好ましくはヒト）の顔および／または首に適用するために、適している、または適合される。
【００８１】
別の好ましい実施形態では皮下注射の手段によって、より好ましくは被験体の顔および／または身体に、より好ましくは被験体の顔、首、手および／または脇の下に、さらにより好ましくは被験体（好ましくはヒト）の顔および／または首に適用するために、適している、または適合される。
【００８２】
最も好ましい実施形態では、本発明の化粧料組成物が局所的に（より好ましくはクリーム状で）、より好ましくは被験体の顔および／または身体に、より好ましくは被験体の顔、首、手および／または脇の下に、さらにより好ましくは被験体（好ましくはヒト）の顔および／または首に適用するために、適している、または適合される。
【００８３】
別の好ましい実施形態では、本発明の組成物は薬学的組成物である。
【００８４】
本発明の組成物は、１種類の本発明のペプチド、または異なる本発明のペプチドの組み合わせまたは混合物を含むことが意図される。
【００８５】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量の少なくとも１つの本発明のペプチドを含む。
【００８６】
本発明の薬学的組成物は本発明のペプチドの活性の結果として（すなわち、神経伝達物質の放出の阻害、および筋収縮の調節）、ニューロンのエキソサイトーシス障害および／または筋収縮性障害に関連する疾患の予防および／または治療、より正確にはＳＮＡＲＥ複合体形成の調節不全、横紋筋収縮の調節不全、アセチルコリンおよび／またはＣＧＲＰ放出の調節不全、および／またはＣａ２＋チャネル活性化の調節不全、好ましくは老人性認知症、アルツハイマー関連認知症、エイズ関連認知症、てんかん、筋萎縮性硬化症、多発性／側索硬化症、慢性偏頭痛、肥満細胞症、ジストニアまたは不安障害に関連する疾患の予防および／または治療を提供する。
【００８７】
本発明の薬学的組成物はまた、筋強直症、筋強直性ジストロフィー、先天性筋強直症、パーキンソン病、二次性パーキンソニズム、ハンチントン病、痙縮、遅発性ジスキネジア（ＴＤ）またはジストニア（眼瞼痙攣、マイジュ症候群、手の痙攣、四肢ジストニアまたは斜視）の治療を提供する。
【００８８】
薬学的組成物は、選択された経路に適した、当技術分野で公知の任意の形態であり得る。本発明の薬学的組成物は当技術分野で公知の任意の手段および任意の経路（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、または経口；後者の場合では、例えば、生理食塩水および／または生分解性物質、例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）ポリ乳酸−グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトンおよび／またはコレステロールのポリマー）による投与に適している、または適合されることが意図される。
【００８９】
本発明の薬学的組成物はまた、少なくとも１つの追加の薬学的成分を含むことが意図される。前記追加の薬学的成分は、少なくとも１つの賦形剤および／または少なくとも１つの追加の薬学的活性成分であり得る。前記少なくとも１つの追加の薬学的活性成分は、ベンゾジアゼピン、クロナゼパム、ロラゼパム、ジアゼパム、バクロフェン、抗コリン作用薬、トリヘキシフェニジル、ベンズトロピン、ドーパミン枯渇剤、テトラベンザジン、クロザピン、またはそれらの組み合わせであることが意図される。
【００９０】
前記の通り、第３の態様において、本発明は、医薬において使用するための、本発明に係るペプチドまたは組成物（すなわち、前記の通りである）に関する。
【００９１】
上述のおよび後述の実施例から直接導き出すことができるように、本発明のペプチド（従って、およびそれらを含む組成物）はアセチルコリンの放出および筋収縮を阻害可能であり、それゆえ、前記活性のために、それらは薬剤として有用である。
【００９２】
好ましい実施形態において、本発明のペプチドまたは組成物は、ニューロンのエキソサイトーシス障害および／または筋収縮性障害の予防および／または治療（好ましくは治療）における使用のためのものである。
【００９３】
筋収縮性障害は、好ましくは筋過収縮性（muscle hypercontractility）である。
【００９４】
好ましくは、ニューロンのエキソサイトーシス障害および／または筋収縮性障害がＳＮＡＲＥ複合体形成、横紋筋収縮、アセチルコリンおよび／またはＣＧＲＰ放出、および／またはＣａ２＋チャネル活性化の調節不全に関連する疾患である。
【００９５】
より好ましくは、ニューロンのエキソサイトーシス障害および／または筋収縮性障害が老人性認知症、アルツハイマー関連認知症、エイズ関連認知症、てんかん、筋萎縮性硬化症、多発性／側索硬化症、肥満細胞症、慢性片頭痛、ジストニアまたは不安障害から選択される。
【００９６】
従って、好ましい実施形態では、本発明のペプチドまたは組成物が老人性認知症、アルツハイマー関連認知症、エイズ関連認知症、てんかん、筋萎縮硬化症、多発性／側索硬化症、肥満細胞症、慢性偏頭痛、ジストニアまたは不安障害の予防および／または治療に使用するためのものである。前記疾患に関して、老人性認知症、アルツハイマー関連認知症、エイズ関連認知症、てんかん、筋萎縮性硬化症、多発性／側索硬化症、慢性片頭痛および不安障害はニューロンのエキソサイトーシス障害である。一方、ジストニアは筋収縮性障害である。
【００９７】
好ましくは、ジストニアが眼瞼痙攣、マイジュ症候群、手の痙攣、四肢ジストニアまたは斜視から選択される。
【００９８】
別の好ましい実施形態では、本発明のペプチドまたは組成物が筋強直症、筋強直性ジストロフィー、先天性筋強直症、パーキンソン病、二次性パーキンソニズム、ハンチントン病、痙縮または遅発性ジスキネジア（ＴＤ）の予防および／または治療に使用するためのものである。前記疾患は、筋収縮性障害である。
【００９９】
好ましくは、本発明のペプチドまたは組成物は、治療に有効な量にて使用される。
【０１００】
好ましい実施形態において、本発明のペプチドおよび組成物は、哺乳類、より好ましくはヒトに使用するためのものである。
【０１０１】
好ましい実施形態において、組成物は、前記の通りの薬学的組成物である。
【０１０２】
本発明のペプチドまたは組成物は、当技術分野で公知の任意の手段によって、または任意の経路を介して使用することができる。いずれの場合でも、ペプチドまたは組成物は選択された手段および／または経路（例えば、皮下、筋肉内、静脈内または経口；後者の場合、例えば、生理食塩水および／または生分解性物質、例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）ポリ乳酸−グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトンおよび／またはコレステロールのポリマーの形態で）に適合される。
【０１０３】
第４の態様において、本発明はニューロンのエキソサイトーシス障害および／または筋収縮性障害の予防および／または治療（好ましくは治療）のための方法に関し、これは、本発明のペプチドまたは組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む。
【０１０４】
筋収縮性障害は、好ましくは筋過収縮性である。
【０１０５】
好ましくは、ニューロンのエキソサイトーシス障害および／または筋収縮性障害がＳＮＡＲＥ複合体形成の調節不全、横紋筋収縮の調節不全、アセチルコリンおよび／またはＣＧＲＰ放出の調節不全および／またはＣａ２＋チャネル活性化の調節不全に関連する疾患である。
【０１０６】
より好ましくは、ニューロンのエキソサイトーシス障害および／または筋収縮性障害が老人性認知症、アルツハイマー関連認知症、エイズ関連認知症、てんかん、筋萎縮性硬化症、多発性／側索硬化症、肥満細胞症、慢性片頭痛、ジストニアまたは不安障害から選択される。
【０１０７】
前記疾患に関して、老人性認知症、アルツハイマー関連認知症、エイズ関連認知症、てんかん、筋萎縮性硬化症、多発性／側索硬化症、慢性片頭痛および不安障害はニューロンのエキソサイトーシス障害である。一方、ジストニアは筋収縮性障害である。
【０１０８】
好ましくは、ジストニアが眼瞼痙攣、マイジュ症候群、手の痙攣、四肢ジストニアまたは斜視から選択される。
【０１０９】
別の好ましい実施形態では、ニューロンのエキソサイトーシス障害および／または筋収縮性障害が筋強直症、筋強直性ジストロフィー、先天性筋強直症、パーキンソン病、二次性パーキンソニズム、ハンチントン病、痙縮または遅発性ジスキネジア（ＴＤ）から選択される筋収縮性障害である。
【０１１０】
好ましくは、本発明のペプチドまたは組成物が治療に有効な量にて使用される。
【０１１１】
好ましい実施形態において、本発明の治療方法を必要とする被験体は、哺乳類、より好ましくはヒトである。
【０１１２】
好ましい実施形態において、組成物は、前記の通りの薬学的組成物である。
【０１１３】
本発明のペプチドまたは組成物は、当技術分野で公知の任意の手段によって、または任意の経路を介して使用することができる。いずれにせよ、ペプチドまたは組成物は選択された手段および／または経路（例えば、皮下、筋肉内、静脈内または経口；後者の場合、例えば、生理食塩水および／または生分解性物質、例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）ポリ乳酸−グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトンおよび／またはコレステロールのポリマーの形態で）に適合される。
【０１１４】
既に上述したように、第５の態様では、本発明は、被験体におけるニューロンのエキソサイトーシスおよび／または筋収縮性の調節不全に関連する徴候を予防、減少および／または排除するための、本発明のペプチドまたは化粧料組成物の化粧料としての使用に関する。
【０１１５】
明らかなように、前記の徴候は美容的徴候である。
【０１１６】
筋収縮性の調節障害は、筋過収縮性であることが望ましい。
【０１１７】
好ましくは、ニューロンのエキソサイトーシスおよび／または筋過収縮性の調節不全に関連する美容的徴候が皮膚の老化および／または表情による徴候である。
【０１１８】
皮膚の老化の美容的徴候は、好ましくはしわである。
【０１１９】
最も好ましい実施形態では、皮膚の老化および／または表情による徴候が顔のしわ（好ましくは表情による徴候）および／または顔の非対称性である。
【０１２０】
好ましい実施形態において、本発明のペプチドまたは化粧料組成物はイオン導入によって、より好ましくは被験体の顔および／または身体に、より好ましくは被験体の顔、首、手および／または脇の下に、さらにより好ましくは被験体（好ましくはヒト）の顔および／または首に適用される。
【０１２１】
別の好ましい実施形態において、本発明のペプチドまたは化粧料組成物は皮下注射によって、より好ましくは被験体の顔および／または身体に、より好ましくは被験体の顔、首、手および／または脇の下に、さらにより好ましくは被験体（好ましくはヒト）の顔および／または首に適用される。
【０１２２】
最も好ましい実施形態では、本発明のペプチドまたは化粧料組成物は局所的に（より好ましくはクリームの形態で）、より好ましくは被験体の顔および／または身体に、より好ましくは被験体の顔、首、手および／または脇の下に、さらにより好ましくは被験体（好ましくはヒト）の顔および／または首に適用される。
【０１２３】
好ましくは、被験体は哺乳類、さらにより好ましくはヒトである。
【０１２４】
また、本発明の化粧料としての使用において、本発明のペプチドまたは化粧料組成物は、美容的に有効な量で使用される。より好ましくは、本発明のペプチドが０．０００１％〜０．０５％（ｍ／ｖ）、より好ましくは０．０００５％〜０．００５％（ｍ／ｖ）、さらにより好ましくは０．０５％〜０．００１％（ｍ／ｖ）の濃度で使用される。
【０１２５】
既に上述したように、本発明の化粧料組成物はまた、少なくとも１つの追加の化粧料成分を含むことが意図される。前記追加の化粧料成分は少なくとも１つの賦形剤および／または少なくとも１つの追加の化粧料活性成分であり得、これは前記で説明されたとおりであり得る。また、本発明のペプチドは、前記の通りの少なくとも１つの追加の化粧料成分と組み合わせて使用されることが意図される。
【０１２６】
さらに、本発明のペプチドおよび本発明の化粧料組成物は、当技術分野で通常使用される任意の形態として製剤化されていてよい。例えば、「洗い流さない」および「洗い流す」製剤を含む、溶液、懸濁液、エマルション、ペースト、ゲル、クリーム、粉末、スプレー、ローション、オイル、リニメント剤、美容液、ムース、軟膏、バーまたはペンシルが挙げられる。本発明の化粧料組成物はまた、ウエットティッシュ、ヒドロゲル、粘着性（または非粘着性）パッチまたはフェイスマスクなどの様々な種類の固形部品に、当技術分野で公知の技術によって組み込むこともできる。または、特にコンシーラー、メイク用ファンデーション、ローション、化粧落としローションなど、様々な種類の化粧製品に組み込むこともできる。
【０１２７】
また、本明細書に両方とも開示される、本発明の化粧料組成物または本発明のペプチドは、有効成分をよりよく浸透させるために、化粧料の持続的放出システムおよび/または担体と組み合わせることもできることが意図される。これらの例としては、リポソーム、ミリ粒子、マイクロ粒子およびナノ粒子などに加えて、スポンジ、ベシクル、ミセル、ミリスフィア、ミクロスフィア、ナノスフィア、リポスフィア、ミリカプセル、マイクロカプセル、およびナノカプセルなど、さらには、マイクロエマルション、ナノエマルションが挙げられる。
【０１２８】
第６の態様において、本発明は（すなわち、前記で説明されるように）被験体におけるニューロンのエキソサイトーシスおよび／または筋収縮性の調節不全に関連する徴候を予防、減少および／または排除するための、本発明のペプチドまたは化粧料組成物の化粧料としての使用に関する。
【０１２９】
前記の徴候は美容的徴候である。
【０１３０】
筋収縮性の調節不全は、好ましくは筋過収縮性である。
【０１３１】
好ましくは、ニューロンのエキソサイトーシスおよび／または筋過収縮性の調節不全に関連する美容的徴候が皮膚の老化および／または表情による徴候である。
【０１３２】
皮膚の老化の美容的徴候は、好ましくはしわである。
【０１３３】
最も好ましい実施形態では、皮膚の老化および／または表情による徴候が顔のしわ（好ましくは表情のしわ）および／または顔の非対称性である。
【０１３４】
好ましい実施形態において、本発明のペプチドまたは化粧料組成物はイオン導入によって、より好ましくは被験体の顔および／または身体に、より好ましくは被験体の顔、首、手および／または脇の下に、さらにより好ましくは被験体の顔および／または首に適用される。
【０１３５】
別の好ましい実施形態において、本発明のペプチドまたは化粧料組成物は皮下注射の手段によって、より好ましくは被験体の顔および／または身体に、より好ましくは被験体の顔、首、手および／または脇の下に、さらにより好ましくは被験体の顔および／または首に適用される。
【０１３６】
最も好ましい実施形態において、本発明のペプチドまたは化粧料組成物は局所的に（より好ましくはクリームの形態で）、より好ましくは被験体の顔および／または身体に、より好ましくは被験体の顔、首、手および／または脇の下に、さらにより好ましくは被験体（好ましくはヒト）の顔および／または首に適用される。
【０１３７】
好ましくは、被験体は哺乳動物であり、さらにより好ましくはヒトである。
【０１３８】
また、本発明の化粧料としての使用において、本発明のペプチドまたは化粧料組成物は、美容的に有効な量で使用される。より好ましくは、本発明のペプチドが０．０００１％〜０．０５％（ｍ／ｖ）、より好ましくは０．０００５％〜０．００５％（ｍ／ｖ）、さらにより好ましくは０．０５％〜０．００１％（ｍ／ｖ）の濃度で使用される。
【０１３９】
既に上述したように、本発明の化粧料組成物はまた、少なくとも１つの追加の化粧料成分を含むことが意図される。前記追加の化粧料成分は少なくとも１つの賦形剤および／または少なくとも１つの追加の化粧料活性成分であり得、これは前記で説明されたとおりであり得る。また、本発明のペプチドは、前記の通りの少なくとも１つの追加の化粧料成分と組み合わせて使用されることが意図される。
【０１４０】
さらに、本発明のペプチドおよび本発明の化粧料組成物は、当技術分野で通常使用される任意の形態として製剤化されていてよい。例えば、「洗い流さない」および「洗い流す」製剤を含む、溶液、懸濁液、エマルション、ペースト、ゲル、クリーム、粉末、スプレー、ローション、オイル、リニメント剤、美容液、ムース、軟膏、バーまたはペンシルが挙げられる。本発明の化粧料組成物はまた、ウエットティッシュ、ヒドロゲル、粘着性（または非粘着性）パッチまたはフェイスマスクなどの様々な種類の固形部品に、当技術分野で公知の技術によって組み込むこともできる。または、コンシーラー、メイク用ファンデーション、ローション、化粧落としローションなど、様々な種類の化粧製品に組み込むこともできる。
【０１４１】
また、本明細書に開示される、本発明の化粧料組成物または本発明のペプチドは、有効成分をよりよく浸透させるために、化粧料の持続的放出システムおよび/または担体と組み合わせることもできることが意図される。これらの例としては、リポソーム、ミリ粒子、マイクロ粒子およびナノ粒子などに加えて、スポンジ、ベシクル、ミセル、ミリスフィア、ミクロスフィア、ナノスフィア、リポスフィア、ミリカプセル、マイクロカプセル、およびナノカプセルなど、さらには、マイクロエマルション、ナノエマルションが挙げられる。
【０１４２】
前記のように、第７の態様において、本発明は、本発明に係るペプチドまたは化粧料組成物を使用することを含む、それらを必要とする被験体におけるニューロンのエキソサイトーシスおよび／または筋収縮性の調節不全に関連する徴候を予防および／または減少させる方法に関する。
【０１４３】
前記の通り、徴候は美容的徴候である。
【０１４４】
筋収縮性の調節不全は、好ましくは筋過収縮性である。
【０１４５】
好ましくは、ニューロンのエキソサイトーシスおよび／または筋過収縮性の調節不全に関連する美容的徴候が皮膚の老化および／または表情による徴候である。
【０１４６】
好ましくは、皮膚の老化の美容的徴候はしわである。
【０１４７】
最も好ましい実施形態では、皮膚の老化および／または表情による徴候が顔のしわ（好ましくは表情のしわ）および／または顔の非対称性である。
【０１４８】
好ましい実施形態において、本発明のペプチドまたは化粧料組成物はイオン導入によって、より好ましくは被験体の顔および／または身体に、より好ましくは被験体の顔、首、手および／または脇の下に、さらにより好ましくは被験体（好ましくはヒト）の顔および／または首に適用される。
【０１４９】
別の好ましい実施形態において、本発明のペプチドまたは化粧料組成物は皮下注射の手段によって、より好ましくは被験体の顔および／または身体に、より好ましくは被験体の顔、首、手および／または脇の下に、さらにより好ましくは被験体（好ましくはヒト）の顔および／または首に適用される。
【０１５０】
最も好ましい実施形態において、本発明のペプチドまたは化粧料組成物は局所的に（より好ましくはクリームの形態で）、より好ましくは被験体の顔および／または身体に、より好ましくは被験体の顔、首、手および／または脇の下に、さらにより好ましくは被験体（好ましくはヒト）の顔および／または首に適用される。
【０１５１】
好ましくは、被験体は哺乳動物であり、さらにより好ましくはヒトである。
【０１５２】
また、本発明の方法において、本発明のペプチドまたは化粧料組成物は、美容的に有効な量で使用される。より好ましくは、本発明のペプチドが０．０００１％〜０．０５％（ｍ／ｖ）、より好ましくは０．０００５％〜０．００５％（ｍ／ｖ）、さらにより好ましくは０．０５％〜０．００１％（ｍ／ｖ）の濃度で使用される。
【０１５３】
既に上述したように、本発明の化粧料組成物はまた、少なくとも１つの追加の化粧料成分を含むことが意図される。前記追加の化粧料成分は少なくとも１つの賦形剤および／または少なくとも１つの追加の化粧料活性成分であり得、これは前記で説明されたとおりであり得る。また、本発明のペプチドは、前記の通りの少なくとも１つの追加の化粧料成分と組み合わせて使用されることが意図される。
【０１５４】
さらに、本発明のペプチドおよび本発明の化粧料組成物は、当技術分野で通常使用される任意の形態として製剤化されていてよい。例えば、「洗い流さない」および「洗い流す」製剤を含む、溶液、懸濁液、エマルション、ペースト、ゲル、クリーム、粉末、スプレー、ローション、オイル、リニメント剤、美容液、ムース、軟膏、バーまたはペンシルが挙げられる。本発明のペプチドおよび化粧料組成物はまた、ウエットティッシュ、ヒドロゲル、粘着性（または非粘着性）パッチまたはフェイスマスクなどの様々な種類の固形部品に、当技術分野で公知の技術によって組み込むこともできる。または、特にコンシーラー、メイク用ファンデーション、ローション、化粧落としローションなど、様々な種類の化粧製品に組み込むこともできる。
【０１５５】
また、本明細書に両方とも開示される、本発明の化粧料組成物または本発明のペプチドは、有効成分をよりよく浸透させるために、化粧料の持続的放出システムおよび/または担体と組み合わせることもできることが意図される。これらの例としては、リポソーム、ミリ粒子、マイクロ粒子およびナノ粒子などに加えて、スポンジ、ベシクル、ミセル、ミリスフィア、ミクロスフィア、ナノスフィア、リポスフィア、ミリカプセル、マイクロカプセル、およびナノカプセルなど、さらには、マイクロエマルション、ナノエマルションが挙げられる。
【０１５６】
より良い理解を可能にするために、例として提示される添付の図面および例示的かつ非限定的な例を参照して、以下に本発明を詳細に説明する。
【０１５７】
図１は、分析されたペプチドで処理されたＬＡＮ細胞によるインビトロでのアセチルコリン放出の割合を、ポジティブコントロールと比較して示す（すなわち、ポジティブコントロール試料のアセチルコリン放出の割合を１００％として、次いで残りの試料との比較を行う）。図１は、得られたペプチドの結果を示す：Ａｃ−配列番号５−ＮＨ２（Ａ）、Ａｃ−配列番号６−ＮＨ２（Ｂ）、Ａｃ−配列番号７−ＮＨ２（Ｃ）、Ａｃ−配列番号８−ＮＨ２（Ｄ）、Ａｃ−配列番号９−ＮＨ２（Ｅ）、Ａｃ−配列番号１０−ＮＨ２（Ｆ）、Ａｃ−配列番号１１−ＮＨ２（Ｇ）、Ａｃ−配列番号１３−ＮＨ２（Ｈ）およびＡｃ−配列番号１４−ＮＨ２（Ｉ）。Ａｃ−配列番号８−ＮＨ２（Ｄ）を除くすべてのペプチドを、０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬおよび０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度で試験し、ペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２（Ｄ）は、０．００５ｍｇ／ｍＬおよび０．０５ｍｇ／ｍＬで試験した。図１（Ｄ）のｘ軸の縦列は左から右に、基底状態（無処理の細胞）、ポジティブコントロール（５０ｍＭのＫＣｌで処理した細胞）、１００ｍＭの毒（Ibanez C., Blanes-Mira C., Fernandez-Ballester G., Planells-Cases R., and Ferrer-Montiel A., （2004） Modulation of botulinum neurotoxin A catalytic domain stability by tyrosine phosphorylation, FEBS Letters 578, 121−127に記載の方法で生産したボツリヌス神経毒Ａ軽鎖（ＢｏＮＴ  Ａ  ＬＣ））で処理した細胞、０．１μＭパルミトイル−アルギレリン（登録商標）（パルミトイル−アセチルヘキサペプチド−８（登録商標））で処理した細胞、ならびに０．００５ｍｇ／ｍＬおよび０．０５ｍｇ／ｍＬの対応するペプチドで処理した細胞に対応する。その側で、図１（Ａ）〜１（Ｃ）および１（Ｅ）〜１（Ｉ）について、ｘ軸の縦列は左から右に、基底状態（無処理の細胞）、ポジティブコントロール（５０ｍＭのＫＣｌで処理した細胞）、１００ｎＭの毒素（ＢｏＮＴ  Ａ  ＬＣ）で処理した細胞、ならびに０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬおよび０．０１ｍｇ／ｍＬの対応するペプチドで処理した細胞に対応する。図１（Ａ）〜１（Ｉ）について、ｙ軸は、（ポジティブコントロールに対する）アセチルコリン放出の割合を示す。
【０１５８】
図２は、コントロール（処理なし）に対する複合体Ｍｕｎｃ１８−シンタキシン−１の結合の割合を示し、コントロールは１００％の結合を表す。図２において、ペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２（Ａ）およびＡｃ−配列番号５−ＮＨ２（Ｂ）の、複合体Ｍｕｎｃ１８−シンタキシン−１の形成を阻害する能力を観察することができる。図２（Ａ）および２（Ｂ）の両方のｘ軸の縦列は左から右に、第１の縦列群（縦列の左群）がＭｕｎｃ１８およびシンタキシン−１の比１００ｎＭ：１０ｎＭである対応するペプチドのコントロールおよび濃度０．１、０．５および１ｍＭに相当し、第２の縦列群（縦列の右群）がＭｕｎｃ１８およびシンタキシン−１の比１００ｎＭ：５ｎＭである対応するペプチドのコントロールおよび濃度０．１、０．５および１ｍＭに相当する。両方の図について、ｙ軸は複合体の形成の割合を示し、これは、いかなる処理も行わない場合、１００％のシグナルとなる。
【０１５９】
図３は、本発明のペプチドによる処理によって誘導されたヒト骨格ミオサイトの遺伝子発現プロファイルの調整を示す。図３（Ａ）はＡｃ−配列番号８−ＮＨ２を用いた処理（濃度０．０５および０．５ｍｇ／ｍＬ、６時間）によって得られた結果を示し、バーは上から下へ、以下の遺伝子を指す：ＳＣＮ３Ａ（ナトリウム電位ゲートチャネルアルファサブユニット３）、ＵＴＲＮ（ウトロフィン）、ＡＣＴＡ１（アクチンアルファ１）、ＴＮＮＣ１（トロポニンＣ１）、ＣＡＬＭ３（カルモジュリン３）、ＣＡＶ１（カベオリン１）、ＣＡＣＮＢ１（カルシウム電位ゲートチャネル補助サブユニットベータ１）、ＬＲＰ４（ＬＤＬ受容体関連タンパク質４）、およびＭＹＨ１（ミオシン重鎖１）。図３（Ａ）において、示された結果のうち、遺伝子ＭＨＹ１、ＬＲＰ４、ＣＡＣＮＢ１およびＵＴＲＮに関するものは、０．０５ｍｇ／ｍＬでの処理に相当し、残りは０．５ｍｇ／ｍＬでの処理に相当する。図３（Ｂ）はＡｃ−配列番号８−ＮＨ２を用いた、濃度０．５ｍｇ／ｍＬ、２４時間の処理によって得られた結果を示し、バーは上から下へ、以下の遺伝子を指す：ＲＡＰＳＮ（シナプスの受容体関連タンパク質）およびＡＴＰ２Ａ（ＡＴＰａｓｅ  Ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ／Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  Ｃａ２＋Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ）。図３（Ｃ）はＡｃ−配列番号５−ＮＨ２を用いた処理（濃度０．０５ｍｇ／ｍＬおよび２４時間）によって得られた結果を示し、バーは上から下へ、以下の遺伝子を指す：ＵＴＲＮ（ウトロフィン）、ＡＣＴＡ１（アクチンα１）、ＴＮＮＣ１（トロポニンＣ１）、ＲＡＰＳＮ（シナプスの受容体関連タンパク質）、ＳＣＮ３Ａ（ナトリウム電位ゲートチャネルアルファサブユニット３）およびＭＹＨ１。図３（Ｄ）はＡｃ−配列番号１０−ＮＨ２を用いた処理（濃度０．１ｍｇ／ｍＬおよび２４時間）によって得られた結果を示し、バーは上から下へ、以下の遺伝子を指す：ＵＴＲＮ（ウトロフィン）、ＴＮＮＣ１（トロポニンＣ１）、ＳＣＮ３Ａ（ナトリウム電位ゲートチャネルアルファサブユニット３）、ＣＨＲＮＡ１（コリン作動性受容体ニコチンアルファ１サブユニット）およびＣＡＣＮＢ１（カルシウム電位ゲートチャネル補助サブユニットベータ１）。前記図３（Ａ）〜（Ｄ）の４つの場合において、ｘ軸は、基底状態に対する倍率変化を示す。負の倍率変化とは遺伝子発現の下方調節を指し、正の倍率変化とは上方調節を指す。
【０１６０】
図４は、ペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２で処理し、６０ｍＭ  ＫＣｌで刺激した後、コントロール（６０ｍＭ  ＫＣｌで刺激された非処理試料）を１００％として規定した、ヒト骨格筋ミオサイトへのカルシウム流入が低下したことを示す。ｘ軸の縦列は左から右に、コントロール、ならびに０．０１、０．０５および０．１ｍｇ／ｍＬのペプチド濃度に相当する。ｙ軸は、コントロールを１００％のシグナルとして規定した、カルシウムシグナルの低下の割合を示す。
【０１６１】
図５は、非処理の初代ヒト骨格筋細胞（図５（Ａ））および０．０５ｍｇ／ｍＬのペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２を用いて処理された、初代ヒト骨格筋細胞（図５（Ｂ））上の、ミオシン重鎖タンパク質の発現レベルの代表的な画像を示す。非処理の細胞に対して、０．０５ｍｇ／ｍＬのペプチドで処理された初代ヒト骨格筋細胞において、ミオシン重鎖タンパク質レベルの減少が観察され、これは図５（Ａ）と比較して、図５Ｂにおいて染色またはシグナルの減少として見ることができる。
【０１６２】
図６は、ペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２で処理した後の初代ヒト骨格筋細胞において、基礎コントロール（非処理細胞）を１００％として規定した、ミオシン重鎖タンパク質レベルが低下したことを示す。Ｘ軸の縦列は左から右に、非処理細胞、ならびに０．０５および０．５ｍｇ／ｍｌのペプチド濃度に相当する。Ｙ軸は基礎コントロールを１００％シグナルとして規定した、（細胞蛍光の平均によって測定された、各処理群におけるミオシン重鎖タンパク質において観察された蛍光シグナルに基づく）ミオシン重鎖タンパク質のレベルを示す。
【０１６３】
図７は、基準コントロールであるペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２、アセチルヘキサペプチド−８、または阻害のポジティブコントロールであるα−ブンガロトキシンのいずれかで処理した後のヒト運動ニューロンおよびヒト骨格ミオサイト共培養物において観察された、基礎コントロール（非処理細胞）を１００％として規定した、収縮頻度の調整を示す。四角印の線は、非処理細胞（基礎コントロール）の収縮頻度を表す。×印の線は収縮阻害のポジティブコントロールである、α‐ブンガロトキシンによる収縮頻度を表す。菱形印の線は、基準である０．５ｍｇ／ｍｌアセチルヘキサペプチド−８による収縮頻度を表す。丸印の線は０．１ｍｇ／ｍｌのペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２による収縮頻度を表し、三角印の線は、０．０５ｍｇ／ｍｌのペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２による収縮頻度を表す。Ｘ軸は異なる活性物質による処理の長さに相当し、Ｔ０、Ｔ３０ｍｉｎ、Ｔ２ｈ、Ｔ２４ｈおよびリカバリーの各点は異なる時間の点を示す。Ｔ０は前記化合物による処理前の収縮状態に相当し；Ｔ３０ｍｉｎは３０分の処理に相当し；Ｔ２ｈは２時間の処理に相当し；Ｔ２４時間は２４ｈの処理に相当し；リカバリーは、全ての化合物を除去した後の２４時間培養に相当する。Ｙ軸は、基礎コントロール（非処理細胞）を１００％のシグナルとして規定した、収縮頻度の割合を示す。
【０１６４】
図８は、ペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２または基準のアセチルヘキサペプチド−８で処理した後のヒト神経芽細胞腫細胞系において、非処理細胞である基礎コントロールを１００％として規定した、エキソサイトーシスの低下を示す。Ｘ軸の縦軸は左から右に、非処理細胞、１ｍｇ／ｍｌのアセチルヘキサペプチド−８で処理した細胞、および０．０１ｍｇ／ｍｌのペプチドＡｃ−配塔番号８−ＮＨ２で処理した細胞に相当する。Ｙ軸は、基礎コントロールを１００％レベルとして規定した、エキソサイトーシスのレベルに相当する、蛍光シグナルの割合を示す。
【０１６５】
図９は、ペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２または基準のアセチルヘキサペプチド−８で処理した後のヒト神経芽細胞腫細胞系における、非処理細胞の基礎コントロールを１００％として規定した、エキソサイトーシスの時間における遅延を示す。Ｘ軸の縦軸は左から右に、非処理細胞、１ｍｇ／ｍｌのアセチルヘキサペプチド−８および０．０１ｍｇ／ｍｌのペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２に相当する。Ｙ軸は、基礎コントロールを１００％レベルとして規定した、エキソサイトーシスの遅延に対応する応答時間の割合を示す。
【０１６６】
図１０は、処理の開始後２４時間（図１０（Ａ））および処理の開始後４８時間（図１０（Ｂ））に、Ａｃ−配列番号８−ＮＨ２で処理した後の初代ヒト皮膚線維芽細胞による、基礎コントロール（非処理細胞）を１００％として規定した、Ｉ型コラーゲン産生を示す。Ｘ軸の縦軸は左から右に、それぞれ、基礎コントロール（非処理細胞）および０．０１、０．０５または０．１ｍｇ／ｍｌのペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２で処理した細胞に相当する。Ｙ軸は、コントロールを１００％レベルとして規定した、Ｉ型コラーゲンタンパク質合成の増加の割合を示す。
【０１６７】
〔実施例〕
省略形：
アミノ酸に使用される略語は、1983 IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature recommendations outlined in Eur. J. Biochem. （1984） 138:937に従う。
【０１６８】
Ａｃ、アセチル；Ａｌａ、アラニン；Ａｒｇ、アルギニン；Ａｓｎ、アスパラギン；Ａｓｐ、アスパラギン酸；Ｂｏｃ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル；Ｃ末端、カルボキシ−末端；ＤＣＭ、ジクロロメタン；ＤＩＥＡ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン；ＤＩＰＣＤＩ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド；ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ｅｑｕｉｖ、当量；ＥＳＩ−ＭＳ、エレクトロスプレーイオン化質量分析；Ｆｍｏｃ、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル；Ｇｌｕ、グルタミン酸；ｈｉＰＳＣ、ヒト誘導多能性幹細胞；Ｈｉｓ、ヒスチジン；ＨＯＢｔ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール；ＨＰＬＣ、高速液体クロマトグラフィー；ＨＲＰ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ；Ｉｌｅ、イソロイシン；ＩＮＣＩ、化粧料成分の国際命名法；ＭＢＨＡ、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン；Ｌｅｕ、ロイシン；Ｌｙｓ、リジン；Ｍｅ、メチル；ＭｅＣＮ、アセトニトリル；ＭｅＯＨ、メタノール；Ｍｅｔ、メチオニン；Ｎ−末端、アミノ−末端；Ｐａｌｍ、パルミトイル；Ｐｂｆ、２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル；ＰＦＡ、パラホルムアルデヒド；ＰＭＡ、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート；Ｐｈｅ、フェニルアラニン；ＰＭＳＦ、フェニルメタンスルホニル；ＲＴ、室温；ｔＢｕ、ｔｅｒｔ−ブチル；Ｔｈｒ、スレオニン；ＴＦＡ、トリフルオロ酢酸；ＴＩＳ、トリイソプロピルシラン；ＴＭＢ、テトラメチルベンジジン；Ｔｒｔ、トリフェニルメチルまたはトリチル；Ｔｒｐ、トリプトファン；Ｔｙｒ、チロシン。
【０１６９】
実施例に含まれる化学合成手順に関して、すべての合成プロセスは、多孔質ポリエチレンディスクを取り付けたポリプロピレンシリンジまたは多孔質プレートを取り付けたＰｙｒｅｘ（登録商標）リアクター中で実施したことに留意されたい。全ての試薬および溶媒は合成品質であり、いかなる追加の処理も行わずに使用した。溶媒および可溶性試薬は、吸引により除去した。Ｆｍｏｃ基は、ピペリジン−ＤＭＦ（２：８、ｖ／ｖ）（最低１×１分，２×１０分，５ｍｌ／ｇ樹脂）により除去した（Lloyd Williams P. et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC, 1997, Boca Raton （Fla., USA））。脱保護、カップリング、および再度の脱保護の段階の間の洗浄は、１０ｍｌ溶媒／ｇ樹脂を毎回使用して、ＤＭＦ（３×１分）およびＤＣＭ（３×１分）で行った。カップリング反応は、３ｍｌ溶媒／ｇ樹脂で行った。カップリングの制御は、ニンヒドリン試験（Kaiser E. et al., Anal. Biochem., 1970, 34: 595598）を実施することによって行った。全ての合成反応および洗浄は、室温で行った。
【０１７０】
実施例１．Ｍｙｎｃ１８−シンタキシン−１の相互作用に干渉するペプチドのインシリコ測定
この実験における目的は、Ｍｕｎｃ１８およびシンタキシン−１の相互作用領域に対して親和性および／または特異性を有し、したがって、前記２つのタンパク質間の相互作用および／または結合に対して競合、干渉および妨害可能であるインシリコペプチドを生成することであった。
【０１７１】
Ｍｕｎｃ１８−シンタキシン−１複合体の構造は既知であり、２．６Ａの分解能（タンパク質データバンク参照、番号３Ｃ９８）が使用可能であったので、この相互作用の三次元構造モデルを作製し、表１に含まれるＭｕｎｃ１８の相互作用断片を選択した。
【０１７２】
【表１】
2021514940.tif 000003
【０１７３】
設計の第一段階として、前記標的断片に基づき、野生型ペプチド（１００％結合ペプチドとして考えられる）をポリ−Ａｌａ（０％非結合ペプチドとして考えられる）に変異させ、全ての部位を独立として処理した。独立部位をそれぞれ２０個の天然アミノ酸に変異させたが、他の部位はＡｌａとして残した。断片と複合体の残りの部位との間の理論上の結合エネルギーは、異なる部位における突然変異誘発との相互作用の向上を評価することで決定した。表を作成および結合エネルギーを正規化して、アミノ酸残基がペプチドの所望の位置にどれほど良好に適合するかを示す数値マトリクスを生成した。これらのマトリクスを用いて、Ｍｕｎｃ１８−シンタキシン−１複合体形成を阻害すると推定されるペプチドを、順位付けしたリストを提案し、構築した。
【０１７４】
実験の第２段階ではペプチドのリストを複合体上でモデル化したが、同時にペプチド中のすべての部位を変異させた。この方法では、ペプチド中の隣接する部位間の相互作用または不適合性を確実に考慮した。ペプチド−複合体の相互作用の結合エネルギーを再び評価し、当該エネルギーに従ってペプチドを再び順位付けした。次いで、１００％より高いかまたは０％より低い結合エネルギーを、１００％バインダー（野生型）および０％バインダー（ポリＡｌａペプチド）と比較した。最良のペプチドを、さらなる研究および検証のために選択し、提案した（表２参照）。
【０１７５】
【表２】
2021514940.tif 000004
【０１７６】
実施例２．ペプチドの合成および調製
Ｆｍｏｃ−ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−ＡＡ５−ＡＡ６−Ｒｉｎｋ−ＭＢＨＡ−樹脂の取得。式中、ＡＡ１がＬ−Ｈｉｓであり、ＡＡ２がＬ−ＩｌｅまたはＬ−Ａｌａであり、ＡＡ３がＬ−ＬｅｕまたはＬ−Ｍｅｔであり、ＡＡ４がＬ−ＡｓｐまたはＬ−Ａｒｇであり、ＡＡ５がＬ−Ｍｅｔ、Ｌ−ＴｒｐまたはＬ−Ｐｈｅであり、およびＡＡ６がＬ−Ｔｒｐである。
【０１７７】
重量を正規化した。Ｆｍｏｃ基を除去するために、０．５２ｍｍｏｌ／ｇの官能基を有する４．８ｇ（２．５ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−ＭＢＨＡ樹脂を、当技術分野で公知の開示された一般的なプロトコルに従ってピペリジン−ＤＭＦで処理した。ＤＩＰＣＤＩ（１．１７ｍＬ；７．５ｍｍｏｌ；３当量）およびＨＯＢｔ（１．０１ｇ；７．５ｍｍｏｌ；３当量）の存在下で、ＤＭＦを溶媒として用い、１時間かけて、３．９４ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）を、脱保護された樹脂上に組み込んだ。
【０１７８】
次いで、当技術分野で公知の一般的な方法に開示された通りに樹脂を洗浄し、Ｆｍｏｃ基の脱保護処理を繰り返し、次のアミノ酸のカップリングを行った。以前に開示されたプロトコルに従って、２．９０ｇのＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、２．７８ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ−ＯＨまたは３．９４ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）；続いて４．８６ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨまたは３．０８ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）；続いて２．６５ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨまたは２．７８ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）；続いて２．３３ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨまたは２．６５ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）、および続いて４．６４ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）を順番にカップリングさせた。各カップリングは、１．０１ｇのＨＯＢｔ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）および１．１７ｍＬのＤＩＰＣＤＩ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）の存在下で行った。既に上述した通り、各アミノ酸付加工程の間に、Ｆｍｏｃ基の脱保護処理を行った。
【０１７９】
合成後、ペプチド樹脂をＤＣＭで洗浄し（それぞれ３分間、５回）、真空下で乾燥させた。
【０１８０】
Ｆｍｏｃ−ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−Ｒｉｎｋ−ＭＢＨＡ−樹脂の取得。式中、ＡＡ１がＬ−Ａｒｇ、ＡＡ２がＬ−ＡｒｇまたはＬ−Ｍｅｔ、ＡＡ３がＬ−ＡｒｇおよびＡＡ４がＬ−Ｐｈｅである。
【０１８１】
重量を正規化した。０．５２ｍｍｏｌ／ｇの官能基を有する４．８ｇ（２．５ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−ＭＢＨＡ樹脂を、Ｆｍｏｃ基を除去するために、当技術分野で公知の開示された一般的なプロトコルに従ってピペリジン−ＤＭＦで処理した。ＤＩＰＣＤＩ（１．１７ｍＬ；７．５ｍｍｏｌ；３当量）およびＨＯＢｔ（１．０１ｇ；７．５ｍｍｏｌ；３当量）の存在下で、ＤＭＦを溶媒として用い、１時間かけて、２．９０ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）を、脱保護された樹脂上に組み込んだ。
【０１８２】
次いで、当技術分野で公知の一般的な方法に開示された通りに樹脂を洗浄し、Ｆｍｏｃ基の脱保護処理を繰り返し、次のアミノ酸のカップリングを行った。以前に開示されたプロトコルに従って、４．８６ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）；続いて４．８６ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨまたは２．７８ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）、および続いて４．８６ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）を順番にカップリングした。各カップリングは、１．０１ｇのＨＯＢｔ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）および１．１７ｍＬのＤＩＰＣＤＩ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）の存在下で行った。既に上述した通り、各アミノ酸付加工程の間に、Ｆｍｏｃ基の脱保護処理を行った。
【０１８３】
合成後、ペプチド樹脂をＤＣＭで洗浄し（それぞれ３分間、５回）、真空下で乾燥させた。
【０１８４】
Ｆｍｏｃ−ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−ＡＡ５−ＡＡ６−ＡＡ７−ＡＡ８−Ｒｉｎｋ−ＭＢＨＡ−樹脂の取得。式中、ＡＡ１がＬ−Ｇｌｕ；ＡＡ２がＬ−Ａｒｇ；ＡＡ３がＬ−Ｉｌｅ；ＡＡ４がＬ−Ａｓｎ；ＡＡ５がＬ−Ｌｙｓ；ＡＡ６がＬ−ＡｒｇまたはＬ−Ｍｅｔ；ＡＡ７がＬ−ＡｒｇおよびＡＡ８がＬ−ＴｒｐまたはＬ−Ｔｙｒである。
【０１８５】
重量を正規化した。Ｆｍｏｃ基を除去するために、０．５２ｍｍｏｌ／ｇの官能基を有する４．８ｇ（２．５ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−ＭＢＨＡ樹脂を、当技術分野で公知の開示された一般的なプロトコルに従ってピペリジン−ＤＭＦで処理した。ＤＩＰＣＤＩ（１．１７ｍＬ；７．５ｍｍｏｌ；３当量）およびＨＯＢｔ（１．０１ｇ；７．５ｍｍｏｌ；３当量）の存在下で、ＤＭＦを溶媒として用い、１時間かけて、３．９４ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨまたは３．４４ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）を、脱保護された樹脂上に組み込んだ。
【０１８６】
次いで、一般的な方法に開示された通りに樹脂を洗浄し、Ｆｍｏｃ基の脱保護処理を繰り返し、次のアミノ酸のカップリングを行った。以前に開示されたプロトコルに従って、４．８６ｇのＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）；続いて４．８６ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨまたは２．７８ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）；続いて３．５１ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）；続いて４．４５ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）；続いて２．６５ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＨ；続いて４．８６ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、および続いて３．１９ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）のカップリングを順番に行った。各カップリングは、１．０１ｇのＨＯＢｔ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）および１．１７ｍＬのＤＩＰＣＤＩ（７．５ｍｍｏｌ；３当量）の存在下で行った。既に上述したように、各アミノ酸付加工程の間に、Ｆｍｏｃ基の脱保護処理を行った。
【０１８７】
合成後、ペプチド樹脂をＤＣＭで洗浄し（それぞれ３分間、５回）、真空下で乾燥させた。
【０１８８】
必要なアミノ酸の選択とともに前記の合成手順を使用して、以下の配列を合成した：
Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ（配列番号５）；
Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ（配列番号６）；
Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ（配列番号７）；
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ（配列番号８）；
Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ（配列番号９）；
Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ（配列番号１０）；
Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ（配列番号１１）；
Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ（配列番号１３）；および、
Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ（配列番号１４）。
【０１８９】
実施例３．実施例２に従って合成したペプチドのＦｍｏｃＮ末端保護基の除去。
【０１９０】
ペプチジル樹脂のＮ末端Ｆｍｏｃ基を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン（１×１分＋２×１０分）で脱保護した（Lloyd Williams P. et al. （1997） “Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins” CRC, Boca Raton （Fla., USA））。ペプチジル樹脂をＤＭＦ（５×１分）、ＤＣＭ（４×１分）で洗浄し、次いで真空下で乾燥させた。
【０１９１】
実施例４．実施例３に従って得られたペプチジル樹脂上にＲ１アセチル基を導入するプロセス。
【０１９２】
実施例２に従って得られたペプチジル樹脂１ｍｍｏｌ（１当量）を、溶媒として５ｍＬのＤＭＦを使用して、２５当量のＤＩＥＡの存在下、２５当量の無水酢酸で処理した。前記樹脂を３０分間反応させた後、ペプチジル樹脂をＤＭＦ（５×１分）、ＤＣＭ（４×１分）で洗浄し、次いで真空下で乾燥させた。
【０１９３】
実施例５．実施例３および４に従って得られたペプチジル樹脂のポリマー支持体からの切断プロセス。
【０１９４】
重量を正規化した。実施例２、３または４のいずれかで得られた乾燥ペプチジル樹脂２００ｍｇを、撹拌しながら、５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ（９０：５：５）を用いて室温で２時間処理した。濾液を集め、５０ｍＬ（８〜１０倍）の冷却ジエチルエーテルを用いて沈殿させた。エーテル溶液を減圧および室温で蒸発乾固乾燥させ、沈殿物をＨ２Ｏ中の５０％ＭｅＣＮに再溶解し、凍結乾燥した。
【０１９５】
実施例６．実施例５において合成および調製したペプチドの特性の決定。
【０１９６】
実施例５に従って得られたペプチドのＨＰＬＣを、逆相カラム（１５０×４．６ｍｍ、ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＢＥＨ  Ｃ１８、３．５μｍ、Ｗａｔｅｒｓ、ＵＳＡ）を用いて、Ｈ２Ｏ（＋０．０４５％ＴＦＡ）中のＭｅＣＮ（＋０．０３６％ＴＦＡ）勾配中、流量１．２５ｍＬ／分で、島津機器（京都、日本）を用いて行い、２２０ｎｍで検出を行った。全てのペプチドは、８０％を超える純度を示した。移動相として流速０．２ｍＬ／分のＭｅＯＨを使用し、Ｗａｔｅｒ  ＺＱ  ４０００検出器中のＥＳＩ−ＭＳによって、得られたペプチドの同一性を確認した。得られた結果は、表３に含まれるペプチドが効果的に合成されたことを示した。
【０１９７】
【表３】
2021514940.tif 000005
【０１９８】
実施例７．アセチルコリン放出の測定。
【０１９９】
前記表３に含まれるペプチドは、実施例２〜６に従って合成した。
【０２００】
前記ペプチドの、アセチルコリン放出を調節する能力についてインビトロで試験した。そのために、ＬＡＮ細胞を４８ウェル培養プレート上に播種し、制御された条件下（３７℃、５％ＣＯ２）で適切なコンフルエンス（confluence）にまで到達させた後、Ｎ−２補充物、ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ、コリンクロライドおよび白血病抑制因子（ＧＩＢＣＯ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）を補ったＮｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）Ａ培地を培養培地とすることで、分化を誘導した。細胞がその分化形態を獲得した時点で、細胞を、以下の濃度の前記ペプチドによって１時間処理した：Ａｃ−配列番号８−ＮＨ２を除くすべてのペプチドは０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬおよび０．０１ｍｇ／ｍＬ；ならびにペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２は０．００５ｍｇ／ｍＬおよび０．０５ｍｇ／ｍＬ。次いで、細胞をＨＥＰＥＳで洗浄した後、５０ｍＭ  ＫＣｌ溶液によって外部から、脱分極によるアセチルコリン放出の刺激を行った。非刺激細胞は、非脱分極４ｍＭ  ＫＣｌ溶液と共に培養した。対応する脱分極または非脱分極ＫＣｌ溶液と共に３０分間培養した後、細胞上清を回収し、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ  Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いてアセチルコリンレベルを測定した。細胞ペレットを用いて、ＢＣＡタンパク質試験アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、ＵＳＡ）（データ正規化目的のため）によってタンパク質含量を決定した。
【０２０１】
アセチルコリン放出阻害の割合を、ポジティブコントロール（ＫＣｌ細胞で刺激された非処理細胞）が１００％の放出をしたと考え、計算した。
【０２０２】
得られた結果を表４にまとめて示す：
【０２０３】
【表４】
2021514940.tif 000006
【０２０４】
この実験の結果は、図１（Ａ）〜（Ｉ）にも要約されている。前記図から直接導き出すことができる通り、表４においてアセチルコリンの調整において活性を有するとマークされたペプチドは、試験した全ての濃度においてアセチルコリンの放出の有意な減少を示す。一方では、表４において活性を有さないとマークされたペプチドは最低濃度において中〜低度の阻害を示し、最高濃度において完全に阻害の喪失を示した。前記ペプチドは、試験した濃度のいずれにおいてもアセチルコリンの放出の統計的な減少を示さなかった。低濃度におけるわずかな阻害が観察されたのは、このタイプの細胞の技術的な問題、および試験固有の変動性によるものだと予想されたが、最高濃度において活性が完全に喪失したことは、これらのペプチド（Ａｃ−配列番号１３−ＮＨ２およびＡｃ−配列番号１４−ＮＨ２）がアセチルコリンの放出を阻害できなかったことを明らかに示している。
【０２０５】
先行技術（Blanes-Mira C., Clemente J., Jodas G., et.al. （2002）, A synthetic hexapeptide （Argireline） with antiwrinkle activity, International Journal of Cosmetic Science, 24, 303-310）から分かるように、透過性クロム親和性細胞からのエキソサイトーシス阻害は、ＢｏＮＴ  Ａを使用した場合には５０％、またはＡｒｇｉｒｅｌｉｎｅ（登録商標）を使用した場合には４０％の最高値に達した。従って、この実験で得られた結果は、ＬＡＮ細胞上でアセチルコリン放出の阻害を直接試験したときのように本発明のペプチドの高い活性を証明し、透過させていなくても、２０〜３０％の阻害値が得られた。
【０２０６】
実施例８：結合アッセイ
以下のペプチドを、実施例１のインシリコ研究および、実施例２〜６に従って合成した：
Ａｃ−配列番号５−ＮＨ２
Ａｃ−配列番号８−ＮＨ２
ＳＮＡＲＥ複合体タンパク質であるシンタキシン‐１と、Ｍｕｎｃ１８とのタンパク質‐タンパク質相互作用を阻害するペプチドの能力を、ＥＬＩＳＡ−ベースインビトロＭｕｎｃ１８／シンタキシン‐１結合アッセイによって機能的に評価した。簡潔に述べると、０．１、０．５および１ｍＭの前記ペプチドを、当該ペプチドの標的タンパク質である１０および５ｎＭのシンタキシン−１（ＧＳＴタグ化）と共に、バッファ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００および０．５％脱脂乳）中で、室温で３時間、前培養した。一方、１００ｎＭのＨｉｓ標識Ｍｕｎｃ１８をニッケル被覆９６ウェルプレートに結合させ、室温で１．５時間培養した。続いて、非結合タンパク質を洗浄除去した後、洗浄バッファ（ＰＢＳ＋０．０２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）中の脱脂乳でウェルをさらに３０分間ブロックした。次いで、ペプチドと前培養した１０および５ｎＭのＧＳＴタグ付きシンタキシン−１をプレートに添加し、室温で２時間培養した。ウェルを洗浄バッファで３回洗浄した後、一次抗体（ＧＳＴタグポリクローナル抗体−Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）と共に４５分間培養した。最後に、再び洗浄した後、ＨＲＰ共役二次抗体（Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ−ＩｇＧ−ＨＲＰ−Ｓｉｇｍａ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）を添加し、室温で培養した。ＴＭＢ基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）を用いてシグナルを発現させた。停止試薬を添加して、反応を停止させた。シンタキシン−１タンパク質のＭｕｎｃ１８タンパク質への結合量を、４５０ｎｍにおける吸光度の測定によって分析した。
【０２０７】
この実験で得られた結果は図２に要約されている。図２は試験した両方のペプチドが（Ａｃ−配列番号５−ＮＨ２がさらに驚くほど高度であった）Ｍｕｎｃ１８とシンタキシン−１との間のタンパク質−タンパク質相互作用を有意にブロック可能であり、用量応答様式をさらに示すことを証明する。阻害の最大値は、Ａｃ−配列番号８−ＮＨ２およびＡｃ−配列番号５−ＮＨ２ペプチドについてそれぞれ３７％および６７％に達した。これらの結果に基づいて、本発明のペプチドは、調節されたエキソサイトーシス、およびその結果として生じる神経伝達物質放出に必要な、タンパク質−タンパク質相互作用を妨害可能であることが分かる。
【０２０８】
実施例９．ヒト骨格筋ミオサイトにおける遺伝子発現調節。
【０２０９】
以下のペプチドを、実施例１のインシリコ研究、および実施例２〜６に従って合成した：
Ａｃ−配列番号５−ＮＨ２
Ａｃ−配列番号８−ＮＨ２
Ａｃ−配列番号１０−ＮＨ２
ヒト骨格筋ミオサイトにおける筋収縮および弛緩に関連するいくつかの遺伝子の発現を調節する能力を評価するために、前記ペプチドを試験した（Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al. （2000）, Molecular Cell Biology, 4th edition; Section 18.3 Myosin: The Actin Motor Protein, Nueva York, W. H. Freeman; Kuo, IY, & Ehrlich, BE （2015）, Signaling in Muscle Contraction, Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 7（2）; RAPSN receptor associated protein of the synapse [ Homo sapiens （human） ], Gene ID in NCBI 5913; Blake DJ, Tinsley JM, Davies KE （1996）, Utrophin: a structural and functional comparison to dystrophin, Brain Pathol., 6（1）:37-47; Barik A, Lu Y, Sathyamurthy A, et.al. （2014）, LRP4 Is Critical for Neuromuscular Junction Maintenance, The Journal of Neuroscience, 34（42）, 13892−13905; Kim N, Stiegler AL, Cameron TO, Hallock PT, et.al. （2008）, Lrp4 is a Receptor for Agrin and Forms a Complex with MuSK, Cell, 135（2）, 334−342; Mahavadi S, Nalli A, Kumar D, et.al. （2014）, Increased expression of caveolin-1 is associated with upregulation of the RhoA/Rho kinase pathway and smooth muscle contraction in diabetes （1110.11）, The FASEB Journal, 28:1_supplement）。そのために、収縮スマートデータ遺伝子パネルを設計した。前記収縮スマートデータ遺伝子パネルは、表５に含まれる筋収縮および弛緩に関連する遺伝子の発現を分析する。
【０２１０】
【表５】
2021514940.tif 000007
【０２１１】
簡潔に述べると、ヒト骨格筋肉芽細胞を、１２ウェル培養プレート中に１×１０５細胞／ウェルの密度で、２回播種し、そして４８〜７２時間、標準的な培養条件下（３７℃、９５％湿度、５％ＣＯ２）で培養した。次にミオサイトへの筋芽細胞の分化を特異的分化培地（ＳＫＭ‐Ｄ培地＋１％抗生物質‐抗真菌薬）で誘導し、さらに７日間モニターした。分化した細胞を、０．０５ｍｇ／ｍＬのペプチドＡｃ−配列番号５−ＮＨ２；または０．１ｍｇ／ｍＬのペプチドＡｃ−配列番号１０−ＮＨ２で２４時間；または０．０５および０．５ｍｇ／ｍＬのペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２で６時間；または０．５ｍｇ／ｍＬのペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２で２４時間処理した。非処理細胞を基礎コントロールとして使用した。次いで、細胞を、製造業者の説明書に従って、市販のＲＮＡ精製キット（ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いてＲＮＡを抽出するために溶解した。次いで、ＲＮＡをナノドロップによって定量し、濃度を調整し、市販のキット（Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡへの逆転写を行うために処理した。得られたｃＤＮＡを用いて、ｔａｑｍａｎ技術および表４に挙げた筋収縮性に関連する特定の遺伝子を標的とするように設計されたプローブのパネルを用いた、ＲＴｑＰＣＲ（Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施した。
【０２１２】
この実験の結果を図３（Ａ）〜（Ｄ）に要約して示す。前記図において、ヒトミオサイトをペプチドＡｃ−配列番号５−ＮＨ２で処理した場合、ＵＴＲＮ、ＡＣＴＡ１、ＴＮＮＣ１、ＲＡＰＳＮ、ＳＣＮ３ＡおよびＭＹＨ１の下方調節が観察されたことが分かる。ペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２でミオサイトを処理すると、６時間の処理でＳＣＮ３Ａ、ＵＴＲＮ、ＡＣＴＡ１、ＴＮＮＣ１、ＣＡＬＭ３、ＣＡＶ１、ＣＡＣＮＢ１、ＬＲＰ４およびＭＹＨ１が下方調節され、２４時間処理でＲＡＰＳＮが下方調節され、ＡＴＰ２Ａが上方調節された。最後に、ペプチドＡｃ−配列番号１０−ＮＨ２によるミオサイトの処理は、ＵＴＲＮ、ＴＮＮＣ１、ＳＣＮ３Ａ、ＣＨＲＮＡ１およびＣＡＣＮＢ１の下方調節をもたらした。
【０２１３】
前記遺伝子の下方調節は様々な経路で正常な筋収縮機能に影響を及ぼす可能性がある：筋細胞表面のアセチルコリンの結合に必要なＲＡＰＳＮ、ＣＨＲＮＡ１、ＵＴＲＮおよびＬＲＰ４は、神経伝達物質が誘導する膜脱分極および細胞骨格の安定性に影響を及ぼす可能性がある；電位依存性チャネルとしてＳＣＮ３ＡおよびＣＡＣＮＢ１が、膜電位の興奮伝達に影響を及ぼす可能性がある；Ｃａ２＋輸送に関与するＳＬＮは細胞内カルシウム蓄積に影響を及ぼす可能性がある；ＭＹＨ１、ＴＮＮＣ１およびＡＣＴＡ１は細胞骨格の完全性、および収縮を作動させるパワーストライク（power strike）に影響を及ぼす可能性がある。したがって、この実施例で得られた、図３に示す結果は本発明のペプチドが筋肉の収縮−弛緩を調節する能力と、筋肉の弛緩の増加に寄与することを示す。
【０２１４】
実施例１０．カルシウム動員アッセイ
ペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２を、実施例２〜６に従って合成した。
【０２１５】
ヒト骨格筋細胞上のカルシウム動員を減少させる、前記ペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２の能力を、Ｆｌｕｏ−４  ＮＷカルシウムアッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ  ＵＳＡ）を用いてインビトロで評価した。簡単に述べると、ヒト骨格筋芽細胞を、１×１０４細胞／ウェルの密度で、ブラック９６ウェルプレート、透明な底部に５回播種し、そして４８〜７２時間、標準的な培養条件下（３７℃、９５％湿度、５％ＣＯ２）で培養した。次いで、ミオサイトへの筋芽細胞の分化を特異的分化培地（ＳＫＭ−Ｄ培地＋１％  ａ／ａ）で誘導し、さらに７日間モニターした。分化した細胞を、細胞毒性を有さない濃度のペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２（０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬおよび０．１ｍｇ／ｍＬ）でさらに４８時間処理した。
【０２１６】
培養が終了した時点で、細胞培養培地を１００μｌの色素ローディング溶液と入れ換え、プレートを培養器上に３０分間保持した。次に、色素溶液をアッセイバッファと入れ替え、ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａ測定器（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてカルシウム測定を行った。動力学的測定を適切に行うために、基準線のシグナルを決定する目的で、１０秒間の刺激前の段階を設定した後、６０ｍＭ  ＫＣｌの添加によるカルシウム流入を誘導した。刺激後の段階を９０秒に設定し、４９４／５１６ｎｍ（励起／発光）で０．１秒毎に読み取った。
【０２１７】
データを分析するために、以下の工程を行った：１）各条件における平均動力学曲線の計算；２）ＫＣｌによる刺激後の各曲線における最大蛍光シグナルの決定；３）基準線に対する倍率変化による増加の計算；４）各条件（各ペプチド濃度）において得られた結果対コントロール（非処理細胞）において得られた結果の正規化。
【０２１８】
この実験で得られた結果は図４に要約されており、（Ａｃ−配列番号８−ＮＨ２によって例示されるように）カルシウム流入を用量依存様式で減少させる本発明のペプチドの能力を反映している（０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬおよび０．１ｍｇ／ｍＬでそれぞれ−６％、−２０％および−３０％）。このカルシウム流入の減少は、筋弛緩を促進する細胞収縮性に影響を及ぼす。
【０２１９】
前記の実施例から直接導き出すことができるように、本発明のペプチドは複合体Ｍｕｎｃ１８−シンタキシン−１の形成を効果的に干渉または阻害し、したがって、ニューロンのエキソサイトーシスの調節（阻害）を可能にする。さらに、前記ペプチドは、筋細胞の弛緩（筋弛緩）を誘導またはそれに寄与することで、筋細胞に直接的な効果を提供する。したがって、本発明のペプチドは、当技術分野に存在する前記の問題を解決する。
【０２２０】
実施例１１．ミオシン重鎖タンパク質の減少
ヒト骨格筋細胞におけるミオシン重鎖タンパク質の発現を低下させる前記ペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２の能力を、このタンパク質に対する特異的抗体（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ、ＵＳＡ）、続いて二次蛍光抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ）を用いた免疫蛍光によって、インビトロで評価した。簡潔に述べると、ヒト骨格筋芽細胞を、３×１０４細胞／ｃｍ２の濃度でＳＫＭ−Ｍ培地（Ｔｅｂｕ−Ｂｉｏ、Ｆｒａｎｃｅ）中のカバーガラス上に播種し、標準的な培養条件下（３７℃、９５％湿度、５％  ＣＯ２）で一晩培養した。次にミオサイトへの筋芽細胞の分化を特異的分化培地（Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＳＫＭ−Ｄ培地）で誘導し、さらに７日間モニターした。分化した細胞を、細胞毒性を有さない濃度のペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２（０．０５ｍｇ／ｍＬおよび０．５ｍｇ／ｍＬ）でさらに４８時間処理した。
【０２２１】
培養が終了した時点で、細胞を４％ＰＦＡで固定し、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を用いて透過処理した。次いで、ミオシンを、０．５ｍｇ／ｍｌのミオシン重鎖抗体で、２時間室温で染色した。適切に洗浄した後、アクチンタンパク質を５０μｇ／ｍｌファロイジン（赤色）（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）で１時間標識し、洗浄後、細胞を４μｇ／ｍｌの二次抗体ヤギ抗マウスｉｇＧで１時間染色した。最後に、核を３．５μｇ／ｍｌのＨｏｅｓｃｈｔマーカーで１０分間染色した（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）。
【０２２２】
顕微鏡画像は、５×および１０×の対物レンズを用いて取得した。各状態について３つの複製を使用し、各カバーガラスにおける３〜４箇所の視野の画像を、同じ設定を使用して取得した。
【０２２３】
画像は、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いて分析した。簡単に閾値を調節してミオシンを選択し、平均蛍光を測定した。陽性細胞の数は、ＤＡＰＩ染色を用いて計数した。ミオシンの平均蛍光強度をミオシン陽性細胞数で除した。最後に、全てのデータを以下の通り正規化して、非処理細胞と比較したミオシンの％を得た：％対コントロール＝（処理ウェル中の細胞あたりの蛍光／非処理ウェル中の細胞あたりの蛍光）×１００。
【０２２４】
この実験で得られた結果は図５（Ａ）、５（Ｂ）および６に要約されており、（Ａｃ−配列番号８−ＮＨ２によって例示されるように）ミオシン重鎖タンパク質レベルを用量依存様式で減少させる本発明のペプチドの能力を反映している（図６における０．０５ｍｇ／ｍＬおよび０．５ｍｇ／ｍＬで、それぞれ−２６％および−３８％）。このミオシン重鎖タンパク質レベルの低下は、筋弛緩を促進する細胞収縮性に影響を及ぼす。
【０２２５】
前記の実施例から直接導き出すことができるように、本発明のペプチドは、筋細胞の弛緩（筋弛緩）を誘導またはそれに寄与することで、筋細胞に直接的な効果を提供する。
【０２２６】
実施例１２．収縮頻度
収縮頻度を調節する前記ペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２の能力を、ヒト筋細胞およびｈｉＰＳＣ共培養由来の運動ニューロンを用いて、６０秒間、処理の前と後（処理後は、それぞれ規定された時点）におけるＩｎＣｅｌｌ  ２２００自動顕微鏡で記録された局在化収縮筋線維のライブイメージングビデオによってインビトロで評価した。
【０２２７】
ヒト筋細胞を、Ｔ７５ｃｍ２フラスコ中で１×１０６細胞の密度で培養し、次いで、分化させるために９６ウェルプレートに移した。ｈｉＰＳＣ由来の運動ニューロンを、分化培地中の筋細胞を含む９６ウェルプレート上に移した。１０日間共培養を続け、筋線維を備えたニューロン接合部を作製した。５日以内に自然収縮が観察された。
【０２２８】
次いで、共培養物を、コントロール培地（基礎）、１μＭのα−ブンガロトキシン、参考基準として０．５ｍｇ／ｍＬのアセチルヘキサペプチド−８、および０．０５または０．１ｍｇ／ｍＬのペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２で処理した。共培養の動画を、処理前に６０秒間記録し、培養の３０分後、再び動画を６０秒間記録した。培養プレートを化合物と共に、再び１時間３０分培養し（培養は計２時間）、共培養の動画を再び６０秒間記録した。培養プレートを化合物と共に合計２４時間再び培養し、培養の終わりに、動画を再び６０秒間記録した。最後に、化合物を洗い流し、当該化合物の洗い流しから２４時間後の最後の記録を行って、筋収縮の最終的な回復（リカバリー）を評価した。
【０２２９】
収縮の頻度を、各培養の前後で計算した。各培養条件について、６ウェルを分析した。
【０２３０】
この実験で得られた結果は、図７に要約されており、（Ａｃ−配列番号８−ＮＨ２によって例示されるように）わずか３０分後から筋収縮頻度の重要な用量依存的な低下を誘導し（基礎非処理細胞に対して、０．０５および０．１ｍｇ／ｍＬで、筋収縮頻度がそれぞれ２５％および１８％）、２４時間の培養期間に、筋収縮頻度の低下を維持する（０．０５および０．１ｍｇ／ｍＬで、それぞれ２３％および１０％）本発明のペプチドの能力を反映している。この化合物の洗い流しは、０．０５ｍｇ／ｍＬ濃度でより良好な筋収縮頻度の部分的回復を可能にする（０．０５および０．１ｍｇ／ｍＬでそれぞれ６５％および３５％）。
【０２３１】
０．５ｍｇ／ｍＬで使用した基準（アセチルヘキサペプチド‐８）は３０分後に筋収縮頻度の部分的な阻害（筋収縮頻度１８％）を誘導したが、この効果はより長い培養で弱まり（２４時間後で４５％）、洗い流し後、頻度は完全に回復した（１００％）。
【０２３２】
前記の実施例から直接導き出すことができるように、本発明のペプチドは、筋線維の弛緩（筋弛緩）に寄与し、筋線維を備えたニューロン接合部を形成している間、筋収縮に対する直接的な効果を効果的に提供する。
【０２３３】
実施例１３．エキソサイトーシスレベルと遅延
神経芽細胞腫細胞株由来の神経伝達物質を含む小胞のエキソサイトーシスを調節する、前記ペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２の能力を、２０ｘ対物レンズおよびキセノンランプを備えたＺｅｉｓｓ  ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００倒立落射蛍光顕微鏡を用いた蛍光イメージングによって、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を用いてインビトロで評価した。
【０２３４】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を、Ｔ２５フラスコ中の補充培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）にて培養した。コンフルエンスが９０％を超えたところで、細胞を１ｍｌの０．５％（ｖ／ｖ）トリプシン−ＥＤＴＡでトリプシン処理した。次に、５ｍＬの前記補充培地を添加し、細胞濃度を測定した。細胞を、補充培地（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）中、２４ウェルプレート中のポリリジン被覆１２ｍｍ−処理カバーガラス上に１５×１０４細胞／ウェル播種し、制御された条件（３７℃、５％ＣＯ２）下で培養した。細胞播種から２４時間後、細胞を製造業者の説明書に従って、リポフェクタミンＴＭ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用して、エキソサイトーシスレポーターによって形質転換した。レポーター構築物は、管腔内特異的タンパク質およびｐＨ感受性蛍光タンパク質から構成される融合タンパク質を含有した。
【０２３５】
エキソサイトーシスをモニターするために、タンパク質発現の４８時間後、細胞を０．０１ｍｇ／ｍＬのＡｃ−配列番号８−ＮＨ２ペプチドまたは１ｍｇ／ｍＬの規準のアセチルヘキサペプチド−８と共に３７℃および５％ＣＯ２で１時間培養した。非処理細胞を基礎コントロールとして使用した。次に、細胞を１００ｎＭ  ＰＭＡで１５分間前処理し、ＰＭＡ（１００ｎＭ）と共に１２．５μＭイオノマイシンで５分間刺激した（刺激は計２０分間）。蛍光イメージングを刺激プロトコルの最後の１０分間において行った。エキソサイトーシスレポーターの蛍光シグナルを、４８３〜５１２ｎｍ励起フィルターおよび５２５〜５３０ｎｍ発光フィルターを用いてモニターした。画像はＡｑｕａｃｏｓｍｏｓソフトウェアを用いて５秒毎に１０分間ＯＲＣＡ−ＥＲ  ＣＣＤカメラで撮影した。
【０２３６】
ｎ＝１６のカバーガラスを用いたＮ＝４の独立した実験で非処理細胞のアッセイを行い（４８３細胞を測定）、ｎ＝１０のカバーガラスを用いたＮ＝３の独立した実験でアセチルヘキサペプチド−８処理細胞のアッセイを行い（３２８細胞を測定）、およびｎ＝８のカバーガラスを用いたＮ＝３の独立した実験でＡｃ−配列番号８−ＮＨ２処理細胞のアッセイを行った（２４０細胞を測定）。細胞を選択して、蛍光強度および時間経過を個々にモニターした。イオノマイシン添加によって誘発された蛍光ピークを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することによってエキソサイトーシスを定量した。２つのパラメータを定義し、分析した：
エキソサイトーシスレベル：個々の細胞について、ＡＵＣ分析から総ピーク面積を得て、イオノマイシンを注射する前の３サイクルにおける蛍光強度として定義される基準線によって正規化した。
【０２３７】
エキソサイトーシス遅延：個々の細胞について、応答時間（分）を、イオノマイシン注入（Ｙ）とピークの開始（ｆｉｒｓｔＸ）との間の時間枠としてＡＵＣ分析から得た。
【０２３８】
蛍光値はさらに、各実験における、非処理細胞に対する割合変化として正規化した：（処理細胞のエキソサイトーシスレベル／非処理細胞のエキソサイトーシスレベル）×１００および（処理細胞の応答時間／非処理細胞の応答時間）×１００。
【０２３９】
エキソサイトーシスモニターパラメータの分析：データは、非処理細胞に対する、エキソサイトーシスレベルおよびエキソサイトーシス遅延について、正規化された割合を表す。データは、平均±ＳＥＭとして表される；データは、非処理細胞についてはｎ＝１６の複製、Ｎ＝４の独立した実験（４８３細胞を測定）から得られ；アセチル−ヘキサペプチド−８については、ｎ＝１０の複製、Ｎ＝３の独立した実験（３２８細胞を測定）から得られ；Ａｃ−配列番号８−ＮＨ２についてはｎ＝８の複製、Ｎ＝３の独立した実験（２４０細胞を測定）から得られた。
【０２４０】
この実験で得られた結果は図８および９に要約されており、（Ａｃ−配列番号８−ＮＨ２によって例示されるように）特定のアセチルコリン受容体を介して筋収縮を活性化するニューロンによって放出されるアセチルコリンを含む、小胞のエキソサイトーシスを減少（図８）、および遅延（図９）させる本発明のペプチドの能力を反映している。
【０２４１】
ヒト神経芽細胞腫細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙにおいて、Ａｃ−配列番号８−ＮＨ２を０．０１ｍｇ／ｍＬで１時間培養すると、エキソサイトーシス応答時間が有意に遅延し（２４％遅延）、エキソサイトーシスレベルが低下した（−１４％）一方で、アセチルヘキサペプチド−８を１ｍｇ／ｍＬで１時間培養すると、エキソサイトーシスレベルを変化させることなく（７％）、エキソサイトーシス応答が有意に遅延した（６７％遅延）。
【０２４２】
前記の実施例から直接導き出すことができるように、本発明のペプチドは、筋収縮のためにニューロンによってシナプス間隙に放出されるアセチルコリン小胞のレベルを減少させ、前記エキソサイトーシスを遅延させることによって、筋収縮に対する間接的な効果を効果的に提供する。
【０２４３】
実施例１４．コラーゲン産生
皮膚硬化の潜在的な改善剤としてのＩ型コラーゲンの産生を調節する、前記ペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２の能力を、ヒト皮膚線維芽細胞を用いてインビトロで評価した。
【０２４４】
細胞を９６ウェルプレートに１×１０４細胞／ウェルで播種し、標準的な培養条件下（３７℃、９５％湿度、５％ＣＯ２）で２４時間培養した。２４時間培養した後、培地を除去し、ペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２を０．０１、０．０５または０．１ｍｇ／ｍＬで含む新しい培地をウェルの濃縮物に添加した。処理は２４時間または４８時間継続させ、アッセイの最後に細胞培養培地を回収した。培養培地のみで処理した細胞を基礎コントロール（非処理細胞）として使用した。
【０２４５】
２４時間および４８時間の処理後、細胞によって産生および放出されたＩ型コラーゲンの量（新たに合成されたＩ型コラーゲン）を、ＥＬＩＳＡアッセイによって細胞培養培地中で測定した。試験物質の結果を基礎コントロールの条件（非処理細胞）と比較した。処理は、３つの異なる実験セッションで３回行った。
【０２４６】
Ｉ型コラーゲン合成の定量は、競合ＥＬＩＳＡ方法により行った。抗体で予めコーティングした酵素ウェルに試料を添加し、次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した認識抗原を添加した；３７℃で１時間培養した後、両者は固相の抗原と競合し、免疫複合体を形成した。リン酸緩衝液で洗浄した後、結合したＨＲＰは触媒作用によってテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を青色に変化させ、酸の作用によって黄色に変化した；ＴＭＢは４５０ｎｍ波長下に吸収ピークを有し、その吸光度は試料の抗原密度に対し負の相関を有する。プレートはマイクロプレートリーダーで読み取った。
【０２４７】
定量には、Ｉ型標準コラーゲンの既知濃度と増殖濃度からなる検量線を用いた。結果を細胞培養液５０μＬ中のＩ型コラーゲン濃度（μｇ／ｍｌ）として表す。
【０２４８】
３つの異なる実験セッションにおける各測定について、３回の試験を行った。ネガティブコントロールと試料との間のＩ型コラーゲン含量の％変動を計算し、コラーゲンＩの合成を増加させるペプチドの有効度の直接的な指標を得た。
【０２４９】
この実験で得られた結果は図１０（Ａ）および１０（Ｂ）に要約されており、（Ａｃ−配列番号８−ＮＨ２によって例示される）ヒト皮膚線維芽細胞によるＩ型コラーゲンの産生を誘導する本発明のペプチドの能力を反映している。
【０２５０】
Ａｃ−配列番号８−ＮＨ２ペプチドは０．０１、０．０５および０．１ｍｇ／ｍＬでそれぞれ２４時間後に線維芽細胞によるＩ型コラーゲン産生を９％、３１％および３７．５％有意に増強し、０．０１、０．０５および０．１ｍｇ／ｍＬでそれぞれ４８時間後に１６％、２９．５％および５６．５％有意に増強した。
【０２５１】
前記の実施例から直接導き出すことができるように、本発明のペプチドは強力な効果を効果的に提供し、皮膚の硬度および質を改善する。
【図面の簡単な説明】
【０２５２】
【図１】図１は、分析されたペプチドで処理されたＬＡＮ細胞によるインビトロでのアセチルコリン放出の割合を、ポジティブコントロールと比較して示す（すなわち、ポジティブコントロール試料のアセチルコリン放出の割合を１００％として、次いで残りの試料との比較を行う）。図１は、得られたペプチドの結果を示す：Ａｃ−配列番号５−ＮＨ２（Ａ）、Ａｃ−配列番号６−ＮＨ２（Ｂ）、Ａｃ−配列番号７−ＮＨ２（Ｃ）、Ａｃ−配列番号８−ＮＨ２（Ｄ）、Ａｃ−配列番号９−ＮＨ２（Ｅ）、Ａｃ−配列番号１０−ＮＨ２（Ｆ）、Ａｃ−配列番号１１−ＮＨ２（Ｇ）、Ａｃ−配列番号１３−ＮＨ２（Ｈ）およびＡｃ−配列番号１４−ＮＨ２（Ｉ）。Ａｃ−配列番号８−ＮＨ２（Ｄ）を除くすべてのペプチドを、０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬおよび０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度で試験し、ペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２（Ｄ）は、０．００５ｍｇ／ｍＬおよび０．０５ｍｇ／ｍＬで試験した。図１（Ｄ）のｘ軸の縦列は左から右に、基底状態（無処理の細胞）、ポジティブコントロール（５０ｍＭのＫＣｌで処理した細胞）、１００ｍＭの毒（Ibanez C., Blanes-Mira C., Fernandez-Ballester G., Planells-Cases R., and Ferrer-Montiel A., （2004） Modulation of botulinum neurotoxin A catalytic domain stability by tyrosine phosphorylation, FEBS Letters 578, 121−127に記載の方法で生産したボツリヌス神経毒Ａ軽鎖（ＢｏＮＴ  Ａ  ＬＣ））で処理した細胞、０．１μＭパルミトイル−アルギレリン（登録商標）（パルミトイル−アセチルヘキサペプチド−８（登録商標））で処理した細胞、ならびに０．００５ｍｇ／ｍＬおよび０．０５ｍｇ／ｍＬの対応するペプチドで処理した細胞に対応する。その側で、図１（Ａ）〜１（Ｃ）および１（Ｅ）〜１（Ｉ）について、ｘ軸の縦列は左から右に、基底状態（無処理の細胞）、ポジティブコントロール（５０ｍＭのＫＣｌで処理した細胞）、１００ｎＭの毒素（ＢｏＮＴ  Ａ  ＬＣ）で処理した細胞、ならびに０．００１ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬおよび０．０１ｍｇ／ｍＬの対応するペプチドで処理した細胞に対応する。図１（Ａ）〜１（Ｉ）について、ｙ軸は、（ポジティブコントロールに対する）アセチルコリン放出の割合を示す。
【図２】図２はコントロール（処理なし）に対するＭｕｎｃ１８−シンタキシン−１複合体の結合の割合を示し、コントロールは１００％の結合を表す。図２において、ペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２（Ａ）およびＡｃ−配列番号５−ＮＨ２（Ｂ）の、Ｍｕｎｃ１８−シンタキシン−１複合体の形成を阻害する能力を観察することができる。図２（Ａ）および２（Ｂ）の両方のｘ軸の縦列は左から右に：第１の縦列群（縦列の左群）がＭｕｎｃ１８およびシンタキシン−１の比が１００ｎＭ：１０ｎＭであるペプチドのコントロールおよび濃度０．１、０．５および１ｍＭに相当し、第２の縦列群（縦列の右群）がＭｕｎｃ１８およびシンタキシン−１の比が１００ｎＭ：５ｎＭであるペプチドのコントロールおよび濃度０．１、０．５および１ｍＭに相当する。両方の図について、ｙ軸は複合体の形成の割合を示し、これは、いかなる治療も行わない場合、１００％のシグナルとなる。
【図３】図３は、本発明のペプチドによる処理によって誘導されたヒト骨格ミオサイトの遺伝子発現プロファイルの調整を示す。図３（Ａ）はＡｃ−配列番号８−ＮＨ２を用いた処理（濃度０．０５および０．５ｍｇ／ｍＬ、６時間）によって得られた結果を示し、バーは上から下へ、以下の遺伝子を指す：ＳＣＮ３Ａ（ナトリウム電位ゲートチャネルアルファサブユニット３）、ＵＴＲＮ（ウトロフィン）、ＡＣＴＡ１（アクチンアルファ１）、ＴＮＮＣ１（トロポニンＣ１）、ＣＡＬＭ３（カルモジュリン３）、ＣＡＶ１（カベオリン１）、ＣＡＣＮＢ１（カルシウム電位ゲートチャネル補助サブユニットベータ１）、ＬＲＰ４（ＬＤＬ受容体関連タンパク質４）、およびＭＹＨ１（ミオシン重鎖１）。図３（Ａ）において、示された結果のうち、遺伝子ＭＨＹ１、ＬＲＰ４、ＣＡＣＮＢ１およびＵＴＲＮに関するものは、０．０５ｍｇ／ｍＬでの処理に相当し、残りは０．５ｍｇ／ｍＬでの処理に相当する。図３（Ｂ）はＡｃ−配列番号８−ＮＨ２を用いた、濃度０．５ｍｇ／ｍＬ、２４時間の処理によって得られた結果を示し、バーは上から下へ、以下の遺伝子を指す：ＲＡＰＳＮ（シナプスの受容体関連タンパク質）およびＡＴＰ２Ａ（ＡＴＰａｓｅ  Ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ／Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  Ｃａ２＋Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ）。図３（Ｃ）はＡｃ−配列番号５−ＮＨ２を用いた処理（濃度０．０５ｍｇ／ｍＬおよび２４時間）によって得られた結果を示し、バーは上から下へ、以下の遺伝子を指す：ＵＴＲＮ（ウトロフィン）、ＡＣＴＡ１（アクチンα１）、ＴＮＮＣ１（トロポニンＣ１）、ＲＡＰＳＮ（シナプスの受容体関連タンパク質）、ＳＣＮ３Ａ（ナトリウム電位ゲートチャネルアルファサブユニット３）およびＭＹＨ１。図３（Ｄ）はＡｃ−配列番号１０−ＮＨ２を用いた処理（濃度０．１ｍｇ／ｍＬおよび２４時間）によって得られた結果を示し、バーは上から下へ、以下の遺伝子を指す：ＵＴＲＮ（ウトロフィン）、ＴＮＮＣ１（トロポニンＣ１）、ＳＣＮ３Ａ（ナトリウム電位ゲートチャネルアルファサブユニット３）、ＣＨＲＮＡ１（コリン作動性受容体ニコチンアルファ１サブユニット）およびＣＡＣＮＢ１（カルシウム電位ゲートチャネル補助サブユニットベータ１）。前記図３（Ａ）〜（Ｄ）の４つの場合において、ｘ軸は、基底状態に対する倍率変化を示す。負の倍率変化とは遺伝子発現の下方調節を指し、正の倍率変化とは上方調節を指す。
【図４】図４は、ペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２で処理し、６０ｍＭ  ＫＣｌで刺激した後、コントロール（６０ｍＭ  ＫＣｌで刺激された非処理試料）を１００％として規定した、ヒト骨格筋ミオサイトへのカルシウム流入が低下したことを示す。ｘ軸の縦列は左から右に、コントロール、ならびに０．０１、０．０５および０．１ｍｇ／ｍＬのペプチド濃度に相当する。ｙ軸は、コントロールを１００％のシグナルとして規定した、カルシウムシグナルの低下の割合を示す。
【図５】図５は、非処理の初代ヒト骨格筋細胞（図５（Ａ））および０．０５ｍｇ／ｍＬのペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２を用いて処理された、初代ヒト骨格筋細胞（図５（Ｂ））上の、ミオシン重鎖タンパク質の発現レベルの代表的な画像を示す。非処理の細胞に対して、０．０５ｍｇ／ｍＬのペプチドで処理された初代ヒト骨格筋細胞において、ミオシン重鎖タンパク質レベルの減少が観察され、これは図５（Ａ）と比較して、図５Ｂにおいて染色またはシグナルの減少として見ることができる。
【図６】図６は、ペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２で処理した後の初代ヒト骨格筋細胞において、基礎コントロール（非処理細胞）を１００％として規定した、ミオシン重鎖タンパク質レベルが低下したことを示す。Ｘ軸の縦列は左から右に、非処理細胞、ならびに０．０５および０．５ｍｇ／ｍｌのペプチド濃度に相当する。Ｙ軸は基礎コントロールを１００％シグナルとして規定した、（細胞蛍光の平均によって測定された、各処理群におけるミオシン重鎖タンパク質において観察された蛍光シグナルに基づく）ミオシン重鎖タンパク質のレベルを示す。
【図７】図７は、基準コントロールであるペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２、アセチルヘキサペプチド−８、または阻害のポジティブコントロールであるα−ブンガロトキシンのいずれかで処理した後のヒト運動ニューロンおよびヒト骨格ミオサイト共培養物において観察された、基礎コントロール（非処理細胞）を１００％として規定した、収縮頻度の調整を示す。四角印の線は、非処理細胞（基礎コントロール）の収縮頻度を表す。×印の線は収縮阻害のポジティブコントロールである、α‐ブンガロトキシンによる収縮頻度を表す。菱形印の線は、基準である０．５ｍｇ／ｍｌアセチルヘキサペプチド−８による収縮頻度を表す。丸印の線は０．１ｍｇ／ｍｌのペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２による収縮頻度を表し、三角印の線は、０．０５ｍｇ／ｍｌのペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２による収縮頻度を表す。Ｘ軸は異なる活性物質による処理の長さに相当し、Ｔ０、Ｔ３０ｍｉｎ、Ｔ２ｈ、Ｔ２４ｈおよびリカバリーの各点は異なる時間の点を示す。Ｔ０は前記化合物による処理前の収縮状態に相当し；Ｔ３０ｍｉｎは３０分の処理に相当し；Ｔ２ｈは２時間の処理に相当し；Ｔ２４時間は２４ｈの処理に相当し；リカバリーは、全ての化合物を除去した後の２４時間培養に相当する。Ｙ軸は、基礎コントロール（非処理細胞）を１００％のシグナルとして規定した、収縮頻度の割合を示す。
【図８】図８は、ペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２または基準のアセチルヘキサペプチド−８で処理した後のヒト神経芽細胞腫細胞系において、非処理細胞である基礎コントロールを１００％として規定した、エキソサイトーシスの低下を示す。Ｘ軸の縦軸は左から右に、非処理細胞、１ｍｇ／ｍｌのアセチルヘキサペプチド−８で処理した細胞、および０．０１ｍｇ／ｍｌのペプチドＡｃ−配塔番号８−ＮＨ２で処理した細胞に相当する。Ｙ軸は、基礎コントロールを１００％レベルとして規定した、エキソサイトーシスのレベルに相当する、蛍光シグナルの割合を示す。
【図９】図９は、ペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２または基準のアセチルヘキサペプチド−８で処理した後のヒト神経芽細胞腫細胞系における、非処理細胞の基礎コントロールを１００％として規定した、エキソサイトーシスの時間における遅延を示す。Ｘ軸の縦軸は左から右に、非処理細胞、１ｍｇ／ｍｌのアセチルヘキサペプチド−８および０．０１ｍｇ／ｍｌのペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２に相当する。Ｙ軸は、基礎コントロールを１００％レベルとして規定した、エキソサイトーシスの遅延に対応する応答時間の割合を示す。
【図１０】図１０は、処理の開始後２４時間（図１０（Ａ））および処理の開始後４８時間（図１０（Ｂ））に、Ａｃ−配列番号８−ＮＨ２で処理した後の初代ヒト皮膚線維芽細胞による、基礎コントロール（非処理細胞）を１００％として規定した、Ｉ型コラーゲン産生を示す。Ｘ軸の縦軸は左から右に、それぞれ、基礎コントロール（非処理細胞）および０．０１、０．０５または０．１ｍｇ／ｍｌのペプチドＡｃ−配列番号８−ＮＨ２で処理した細胞に相当する。Ｙ軸は、コントロールを１００％レベルとして規定した、Ｉ型コラーゲンタンパク質合成の増加の割合を示す。
【図１Ａ】
2021514940.tif 000008
【図１Ｂ】
2021514940.tif 000009
【図１Ｃ】
2021514940.tif 000010
【図１Ｄ】
2021514940.tif 000011
【図１Ｅ】
2021514940.tif 000012
【図１Ｆ】
2021514940.tif 000013
【図１Ｇ】
2021514940.tif 000014
【図１Ｈ】
2021514940.tif 000015
【図１Ｉ】
2021514940.tif 000016
【図２Ａ】
2021514940.tif 000017
【図２Ｂ】
2021514940.tif 000018
【図３Ａ】
2021514940.tif 000019
【図３Ｂ】
2021514940.tif 000020
【図３Ｃ】
2021514940.tif 000021
【図３Ｄ】
2021514940.tif 000022
【図４】
2021514940.tif 000023
【図５Ａ】
2021514940.tif 000024
【図５Ｂ】
2021514940.tif 000025
【図６】
2021514940.tif 000026
【図７】
2021514940.tif 000027
【図８】
2021514940.tif 000028
【図９】
2021514940.tif 000029
【図１０Ａ】
2021514940.tif 000030
【図１０Ｂ】
2021514940.tif 000031
【配列表】
2021514940000001.app
【国際調査報告】
2021514940.tif 000032
2021514940.tif 000033
2021514940.tif 000034