(57)【要約】  それを必要とする対象において、Ｍ２／Ｍマクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療する方法が提供される。該方法は、（ａ）ＩＬ３３及び／又はＧＭ−ＳＣＦの存在下で好塩基球を培養すること；並びに（ｂ）培養後に治療有効量の好塩基球を対象に投与し、それにより、対象のＭ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療すること、を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象において、Ｍ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療する方法であって、
（ａ）ＩＬ３３及び／又はＧＭ−ＳＣＦの存在下で好塩基球を培養すること、並びに
（ｂ）前記培養後、治療有効量の前記好塩基球を前記対象に投与し、
それにより、前記対象においてＭ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる前記疾患又は障害を治療すること、を含む、方法。
【請求項２】
それを必要とする対象において、Ｍ２／Ｍ１マクロファージ比を増加することから利益を得ることができる疾患又は障害の治療において使用するための、ＩＬ３３及び／又はＧＭ−ＳＣＦの存在下で培養することによって生成された治療有効量の好塩基球。
【請求項３】
前記好塩基球が血液循環好塩基球であるか、又は骨髄に由来する、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量の好塩基球。
【請求項４】
（ａ）の前に、
（ｉ）前記好塩基球を骨髄又は末梢血から単離すること；
（ｉｉ）分化した培養物を得るために、ＩＬ−３の存在下で前記好塩基球を前記骨髄又は末梢血から分化させること；
（ｉｉｉ）前記分化した培養物からｃＫＩＴ集団を単離すること、を更に含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量の好塩基球。
【請求項５】
前記（ｉｉ）が培養物中で８〜１０日間行われる、請求項４に記載の方法又は治療有効量の好塩基球。
【請求項６】
前記（ａ）が最大４８時間行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量の好塩基球。
【請求項７】
肺好塩基球表現型を達成するように前記培養が行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量の好塩基球。
【請求項８】
前記肺好塩基球表現型が、Ｃｓｆ１、Ｉｌ６、Ｉｌ１３、Ｌ１ｃａｍ、Ｉｌ４、Ｃｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ６、Ｃｃｌ９及びＨｇｆからなる群から選択される成長因子及びサイトカインの発現を含み、前記発現が血液循環好塩基球よりも高い、請求項７に記載の方法又は治療有効量の好塩基球。
【請求項９】
前記肺好塩基球表現型が、Ｉｌ６、Ｉｌ１３、Ｃｘｃｌ２、Ｔｎｆ、Ｏｓｍ及びＣｃｌ４の発現シグネチャーを含む、請求項７又は８に記載の方法又は治療有効量の好塩基球。
【請求項１０】
前記肺好塩基球表現型が、Ｆｃｅｒａ１＋、Ｉｌ３ｒａ＋（Ｃｄ１２３）、Ｉｔｇａ２＋（Ｃｄ４９ｂ）、Ｃｄ６９＋、Ｃｄ２４４＋（２Ｂ４）、Ｉｔｇａｍ＋（Ｃｄ１１ｂ）、Ｃｄ６３＋、Ｃｄ２４ａ＋、Ｃｄ２００ｒ３＋、Ｉｌ２ｒａ＋、Ｉｌ１８ｒａｐ＋及びＣ３ａｒ１＋の発現シグネチャーを含む、請求項７又は８に記載の方法又は治療有効量の好塩基球。
【請求項１１】
前記好塩基球がヒトである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量の好塩基球。
【請求項１２】
前記好塩基球が、Ｆｃｅｒ１、Ｉｌ１３ｒａ１、Ｉｔｇａ２、Ｃｄ６９、Ｃｄ２４４、Ｉｔｇａｍ、Ｃｄ６３、Ｃｄ２４、Ｉｌ２ｒａ、Ｉｌ１８ｒａｐ及びＣ３ａｒ１の発現シグネチャーを含む、請求項１１に記載の方法又は治療有効量の好塩基球。
【請求項１３】
前記好塩基球が前記対象に対して自家である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量の好塩基球。
【請求項１４】
それを必要とする対象において、Ｍ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療する方法であって、ＩＬ６、ＩＬ１３、及びＨＧＦからなる群から選択される治療有効量のシグナル伝達分子を前記対象に投与し、それにより、対象のＭ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる前記疾患又は障害を治療すること、を含む、方法。
【請求項１５】
対象においてＭ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害の治療に使用するための、ＩＬ６、ＩＬ１３及びＨＧＦからなる群から選択される治療有効量のシグナル伝達分子。
【請求項１６】
前記治療有効量が、前記Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量のシグナル伝達分子。
【請求項１７】
前記対象がヒト対象である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量のシグナル伝達分子。
【請求項１８】
前記投与が局所投与経路のものである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量のシグナル伝達分子。
【請求項１９】
前記投与が肺に対するものである、請求項１８に記載の方法又は治療有効量のシグナル伝達分子。
【請求項２０】
Ｍ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる前記疾患又は障害が炎症性疾患である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量のシグナル伝達分子。
【請求項２１】
前記炎症性疾患が、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、肺炎、敗血症性ショック、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷、誤嚥性肺炎（ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ｐｎｅｕｍａｎｉｔｉｓ）、感染症、膵炎、細菌血症、腹膜炎、腹部膿瘍、外傷による炎症、手術による炎症、慢性炎症性疾患、虚血、臓器又は組織の虚血再灌流障害、疾患による組織損傷、化学療法又は放射線療法による組織損傷、及び摂取、吸入、注入、注射又は送達された物質に対する反応、糸球体腎炎、腸感染症、日和見感染症、並びに大規模な手術又は透析を受けている対象、免疫不全の対象、免疫抑制剤を摂取している対象、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの対象、心内膜炎が疑われる対象、発熱のある対象、原因不明の発熱のある対象、嚢胞性線維症、糖尿病の対象、慢性腎不全の対象、気管支拡張症の対象、慢性閉塞性肺疾患の対象、慢性気管支炎、気腫又は喘息の対象、熱性好中球減少症の対象、髄膜炎の対象、敗血症性関節炎の対象、尿路感染症の対象、壊死性筋膜炎の対象、他のグループＡ連鎖球菌感染症の疑いのある対象、脾臓切除術を受けた対象、再発性又は腸球菌感染症の疑いのある対象、感染リスクの増加に関連する他の医学的及び外科的状態、グラム陽性敗血症、グラム陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌性敗血症、髄膜炎菌血症、ポンプ後症候群（ｐｏｓｔ−ｐｕｍｐ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心臓スタン症候群、脳卒中、うっ血性心不全、肝炎、喉頭蓋炎（ｅｐｉｇｌｏｔｉｔｔｉｓ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ０１５７：Ｈ７、マラリア、ガス壊疽、毒素性ショック症候群、子癇前症、子癇、ＨＥＬＰ症候群、マイコバクテリアによる結核（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、カリニ性肺炎（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｃ  ｃａｒｉｎｉｉ）、肺炎、リーシュマニア症、溶血性尿毒症症候群／血栓性血小板減少性紫斑病、デング出血熱、骨盤炎症性疾患、レジオネラ、ライム病、インフルエンザＡ、エプスタイン−バーウイルス（ｐｅｌｖｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）、脳炎、炎症性疾患及び自己免疫疾患（関節リウマチ、骨関節炎、進行性全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、特発性肺線維症、サルコイドーシス、過敏性肺炎、全身性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、心臓、肝臓、肺腎臓骨髄を含む移植、移植片対宿主病、移植片拒絶、鎌状赤血球貧血、ネフローゼ症候群、ＯＫＴ３等の薬剤の毒性、サイトカイン療法、クリオピリン関連周期熱症候群及び肝硬変を含む）からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法又は治療有効量のシグナル伝達分子。
【請求項２２】
Ｍ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる前記疾患又は障害が自己免疫疾患である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量のシグナル伝達分子。
【請求項２３】
前記自己免疫疾患が、アディソン病、アレルギー、円形脱毛症、アルツハイマー病、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群（ヒューズ症候群）、関節炎、喘息、粥状動脈硬化、動脈硬化巣、自己免疫疾患（例えば、ループス、ＲＡ、ＭＳ、グレイブス病等）、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、無精子症、ベーチェット病、バーガー病、水疱性類天疱瘡、心筋症、心血管疾患、セリアック病／コアリアック病、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＰＤ）、慢性再発性多発ニューロパチー（ギラン−バレ症候群）、チャーグ−ストラウス症候群（ＣＳＳ）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症（ＣＡＤ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、皮膚炎、ヘルペス、皮膚筋炎、糖尿病、円盤状ループス、湿疹後天性表皮水疱症、本態性混合型クリオグロブリン血症、エヴァン症候群、眼球突出（Ｅｘｏｐｔｈａｌｍｏｓ）、線維筋痛症、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、免疫増殖性疾患又は障害（例えば、乾癬）、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、間質性肺疾患、若年性糖尿病、若年性関節炎、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、川崎病、ランバート−イートン筋無力症候群、扁平苔癬、ループス、ループス腎炎、リンパ球性下垂体炎（Ｌｙｍｐｈｏｓｃｙｔｉｃ  Ｌｙｐｏｐｈｉｓｉｔｉｓ）、メニエール病／急性播種性脳脊髄神経根障害、混合性結合組織病、多発性硬化症（ＭＳ）、筋肉リウマチ、筋痛性脳脊髄炎（ＭＥ）、重症筋無力症、
眼の炎症、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発軟骨炎、多腺性症候群（Ｐｏｌｙｇｌａｎｄｕｌａｒ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）（ウィタカー症候群）、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変／自己免疫性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群／反応性関節炎、再狭窄、リウマチ熱、リウマチ性疾患、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強皮症、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ’ｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、スティフ・マン症候群、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、全身性硬化症、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、甲状腺炎、１型糖尿病、２型糖尿病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、及びウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法又は治療有効量のシグナル伝達分子。
【請求項２４】
Ｍ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる前記疾患又は障害が肺疾患である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量のシグナル伝達分子。
【請求項２５】
前記Ｍ２／Ｍ１マクロファージが肺胞マクロファージを含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量のシグナル伝達分子。
【請求項２６】
Ｍ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる前記疾患又は障害が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法又は治療有効量のシグナル伝達分子。
【請求項２７】
それを必要とする対象においてＭ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療する方法であって、前記障害が好塩基球に関連せず、前記対象において好塩基球又は前記好塩基球の活性を枯渇させることを含み、それにより、対象のＭ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる前記疾患又は障害を治療することを含む、方法。
【請求項２８】
前記枯渇が、前記好塩基球又は前記好塩基球の前記活性を枯渇させる薬剤による、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
それを必要とする対象においてＭ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害の治療に使用するために、好塩基球又は前記好塩基球の活性を枯渇させる薬剤。
【請求項３０】
前記薬剤が少なくとも１つの好塩基球マーカーに向けられている、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法又は薬剤。
【請求項３１】
前記薬剤がＦｃｅＲ１ａ、ＩＬ３３Ｒ及び／又はＣＳＦ２Ｒｂを標的とする、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法又は薬剤。
【請求項３２】
前記薬剤がＧＭ−ＣＳＦ及び／又はＩＬ３３を標的とする、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法又は薬剤。
【請求項３３】
前記枯渇がｅｘ−ｖｉｖｏで行われる、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法又は薬剤。
【請求項３４】
前記枯渇がｉｎ−ｖｉｔｒｏで行われる、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法又は薬剤。
【請求項３５】
前記好塩基球が血液循環好塩基球である、請求項２７〜３４のいずれか一項に記載の方法又は薬剤。
【請求項３６】
前記好塩基球が肺に存在する好塩基球である、請求項２７〜３４のいずれか一項に記載の方法又は薬剤。
【請求項３７】
前記枯渇が局所的な方法で行われる、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法又は薬剤。
【請求項３８】
Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる前記疾患又は障害が癌である、請求項２７〜３７のいずれか一項に記載の方法又は薬剤。
【請求項３９】
Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる前記疾患又は障害が黒色腫である、請求項３８に記載の方法又は薬剤。
【請求項４０】
Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる前記疾患又は障害が肺線維症である、請求項２７〜３４のいずれか一項に記載の方法又は薬剤。
【請求項４１】
Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる前記疾患又は障害が、癌、線維性疾患からなる群から選択される、請求項２７〜３７のいずれか一項に記載の方法又は薬剤。
【請求項４２】
Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させる方法であって、マクロファージの近傍から肺好塩基球表現型を有する好塩基球を枯渇させること、又は前記好塩基球の活性を枯渇させることにより、Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させる方法。
【請求項４３】
Ｍ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させる方法であって、マクロファージの近傍に肺好塩基球表現型を有する好塩基球又は前記好塩基球のエフェクターを濃縮することを含み、それによりＭ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させる、方法。
【請求項４４】
前記濃縮がＧＭ−ＣＳＦ及び／又はＩＬ３３によるものである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記エフェクターが、ＩＬ６、ＩＬ１３及びＨＧＦからなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
ｅｘ−ｖｉｖｏで実施される、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ｉｎ−ｖｉｖｏで実施される、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
この出願は、２０１８年８月２４日に出願された米国特許出願第６２／７２２，１９６号からの優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、Ｍ２マクロファージ極性化を調節する方法、及び治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
哺乳動物の組織は、線維芽細胞、上皮、内皮、及び免疫系統を含む多様な細胞型からなる。胚発生中の組織形成には、特定の環境状況において、異なる細胞型間の協調機能及びクロストークが必要である。肺の特殊な確約された細胞型への発生は、独自の経路及び機能特性を特徴とする高度に調節されたプロセスである。並行して、免疫系の細胞は、間質細胞と相互作用し、組織の分化、成長、及び機能に影響を与える活性な免疫コンパートメントを確立するために、造血部位から肺へと遊走する。
【０００４】
哺乳動物の肺は中枢呼吸器であり、特殊な細胞型の多様なセットを特徴としている。肺のガス交換は、特殊な上皮細胞で構成される肺胞で発生し、１型肺胞（ＡＴ）細胞はガス交換を仲介し、ＡＴ２細胞はサーファクタントを分泌して肺の表面張力を維持する（Ｗｈｉｔｓｅｔｔ  ａｎｄ  Ａｌｅｎｇｈａｔ，２０１５）。肺胞上皮細胞は、小管期（Ｅ１６．５）と球形嚢期（Ｅ１８．５）の間で相互の前駆細胞から分岐し、形態及び遺伝子発現に劇的な変化をもたらす（Ｔｒｅｕｔｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。もう１つの主要な細胞型は肺胞マクロファージ（ＡＭ）であり、肺胞腔からサーファクタントを取り除き、重要な免疫調節物質として作用し、肺の不要な免疫反応を抑制する（Ｈｕｓｓｅｌｌ  ａｎｄ  Ｂｅｌｌ，２０１４）。ＡＭは胎児の肝臓胚前駆細胞に由来し、自己維持型であり、成人の骨髄からの寄与がない（Ｅｐｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。肺マクロファージの第１の波は胚の１２．５日（Ｅ１２．５）に現れ、続いて胎児肝臓由来の単球に由来する第２の波が現れ、肺胞マクロファージから成熟ＡＭへの分化軸を継続する（Ｇｉｎｈｏｕｘ，２０１４；Ｇｉｎｈｏｕｘ  ａｎｄ  Ｊｕｎｇ，２０１４；Ｈｏｅｆｆｅｌ  ａｎｄ  Ｇｉｎｈｏｕｘ，２０１８；Ｋｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｔａｎ  ａｎｄ  Ｋｒａｓｎｏｗ，２０１６）。
【０００５】
異常な免疫活性化は、慢性炎症、線維症、及び自己免疫反応を含む組織損傷及び病状を引き起こす可能性があるため、各組織、特に肺における免疫反応は、厳密に調節され、その要件に適合させる必要がある。したがって、各組織は、免疫コンパートメントと相互作用し、細胞の遺伝子発現及びクロマチンランドスケープを形成する独自のシグナル伝達環境を備えている（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｃｉｐｏｌｌｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｇｒｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｈｕｓｓｅｌｌ  ａｎｄ  Ｂｅｌｌ，２０１４；Ｌａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｏｋａｂｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，２０１４；Ｐａｎｄｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。肺の状況では、ＡＭは組織特異的な表現型を示し、遺伝子の発現及び機能から明らかである（Ｇａｕｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｇｕｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３ｂ；Ｋｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｌａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ｅｘ  ｖｉｖｏでＡＭを成長させる試みは成功していないため、肺胞形成プロセス中の動的シグナル伝達の理解には大きな隔たりがある（Ｆｅｊｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。肺マクロファージの発達及び成熟は、上皮細胞（主にＡＴ２）、先天性リンパ球（ＩＬＣ）、及びＡＭ自体から伝達される様々な成長及び分化の手がかりに依存することが示された（ｄｅ  Ｋｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｇｕｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３ａ；Ｓａｌｕｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。ましてや、肺における他の肺に存在する免疫及び非免疫細胞型の機能及びクロストークは、現在、ほとんど理解されていない。
【０００６】
好塩基球は、細胞質に小葉状の核及び分泌顆粒が存在することを特徴とする、短命の顆粒球細胞であると考えられている。好塩基球は、血流に入って巡回する前に、骨髄で成熟を完了する。寄生虫感染及びアレルギー性疾患等の病的状態では、好塩基球が動員されて組織実質に侵入し（Ｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｍｕｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、それらの主な機能は、アレルギーにおけるＴｈ２応答の誘導、及び蠕虫感染後のＩＬ−４分泌の主な原因とされている（Ｍａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｓｏｋｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ａｎｄ  Ｌｏｃｋｓｌｅｙ，２００９；Ｔｓｃｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｔｓｕｊｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０００７】
したがって、マクロファージ極性化の能動的調節は、抗炎症及び抗癌療法の開発におけるアプローチである。
【０００８】
追加の関連する背景技術：
国際公開第２０１６１８５０２６号公報
欧州特許第３０７２５２５号公報Ａ１
国際公開第２０１７０９７８７６号公報
Ｗｙｎｎ  ＴＡ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５  Ｍａｙ；１５（５）：２７１−８２．
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｗｈｉｔｓｅｔｔ  ａｎｄ  Ａｌｅｎｇｈａｔ，２０１５
【非特許文献２】Ｔｒｅｕｔｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４
【非特許文献３】Ｈｕｓｓｅｌｌ  ａｎｄ  Ｂｅｌｌ，２０１４
【非特許文献４】Ｅｐｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４
【非特許文献５】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３
【非特許文献６】Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８
【非特許文献７】Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１
【非特許文献８】Ｇｉｎｈｏｕｘ，２０１４
【非特許文献９】Ｇｉｎｈｏｕｘ  ａｎｄ  Ｊｕｎｇ，２０１４
【非特許文献１０】Ｈｏｅｆｆｅｌ  ａｎｄ  Ｇｉｎｈｏｕｘ，２０１８
【非特許文献１１】Ｋｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５
【非特許文献１２】Ｔａｎ  ａｎｄ  Ｋｒａｓｎｏｗ，２０１６
【非特許文献１３】Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４
【非特許文献１４】Ｃｉｐｏｌｌｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５
【非特許文献１５】Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４
【非特許文献１６】Ｇｒｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２
【非特許文献１７】Ｌａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４
【非特許文献１８】Ｏｋａｂｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，２０１４
【非特許文献１９】Ｐａｎｄｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６
【非特許文献２０】Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７
【非特許文献２１】Ｇａｕｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２
【非特許文献２２】Ｇｕｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３ｂ
【非特許文献２３】Ｆｅｊｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３
【非特許文献２４】ｄｅ  Ｋｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６
【非特許文献２５】Ｇｕｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３ａ
【非特許文献２６】Ｓａｌｕｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７
【非特許文献２７】Ｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４
【非特許文献２８】Ｍｕｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５
【非特許文献２９】Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００７
【発明の概要】
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、それを必要とする対象において、Ｍ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療する方法が提供され、該方法は、
（ａ）ＩＬ３３及び／又はＧＭ−ＳＣＦの存在下で好塩基球を培養すること、並びに
（ｂ）培養後、治療有効量の好塩基球を対象に投与し、
それにより、対象においてＭ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療すること、を含む。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、それを必要とする対象において、Ｍ２／Ｍ１マクロファージ比を増加することから利益を得ることができる疾患又は障害の治療において使用するための、ＩＬ３３及び／又はＧＭ−ＳＣＦの存在下で培養することによって生成された治療有効量の好塩基球が提供される。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、好塩基球は、血液循環好塩基球であるか、又は骨髄に由来する。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、該方法は、（ａ）の前にさらに、
（ｉ）骨髄又は末梢血から好塩基球を分離すること、
（ｉｉ）ＩＬ−３の存在下で好塩基球を骨髄又は末梢血から分化させて、分化した培養物を得ること、
（ｉｉｉ）分化した培養物からｃＫＩＴ−集団を分離すること、を含む。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、（ｉｉ）は、培養において８〜１０日間行われる。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、（ａ）は最大４８時間実施される。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養は、肺の好塩基球表現型を達成するように行われる。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、肺好塩基球表現型は、Ｃｓｆ１、Ｉｌ６、Ｉｌ１３、Ｌ１ｃａｍ、Ｉｌ４、Ｃｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ６、Ｃｃｌ９及びＨｇｆからなる群から選択される成長因子及びサイトカインの発現を含み、血液循環好塩基球で発現はより高い。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、肺好塩基球表現型は、Ｉｌ６、Ｉｌ１３、Ｃｘｃｌ２、Ｔｎｆ、Ｏｓｍ及びＣｃｌ４の発現シグネチャーを含む。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、肺好塩基球表現型は、Ｆｃｅｒａ１＋、Ｉｌ３ｒａ＋（Ｃｄ１２３）、Ｉｔｇａ２＋（Ｃｄ４９ｂ）、Ｃｄ６９＋、Ｃｄ２４４＋（２Ｂ４）、Ｉｔｇａｍ＋（Ｃｄ１１ｂ）、Ｃｄ６３＋、Ｃｄ２４ａ＋、Ｃｄ２００ｒ３＋、Ｉｌ２ｒａ＋、Ｉｌ１８ｒａｐ＋及びＣ３ａｒ１＋の発現シグネチャーを含む。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、好塩基球はヒトである。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、好塩基球は、Ｆｃｅｒ１、Ｉｌ１３ｒａ１、Ｉｔｇａ２、Ｃｄ６９、Ｃｄ２４４、Ｉｔｇａｍ、Ｃｄ６３、Ｃｄ２４、Ｉｌ２ｒａ、Ｉｌ１８ｒａｐ及びＣ３ａｒ１の発現シグネチャーを含む。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、好塩基球は対象に対して自家である。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、それを必要とする対象において、Ｍ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療する方法が提供され、該方法は、ＩＬ６、ＩＬ１３、及びＨＧＦからなる群から選択される治療有効量のシグナル伝達分子を対象に投与し、それにより、対象のＭ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療すること、を含む。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、対象においてＭ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害の治療に使用するためのＩＬ６、ＩＬ１３及びＨＧＦからなる群から選択される治療有効量のシグナル伝達分子が提供される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、治療有効量は、Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させる。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、対象はヒト対象である。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、投与は局所投与経路のものである。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、投与は肺に対するものである。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｍ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害は、炎症性疾患である。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、炎症性疾患は、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、肺炎、敗血症性ショック、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷、誤嚥性肺炎（ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ｐｎｅｕｍａｎｉｔｉｓ）、感染症、膵炎、細菌血症、腹膜炎、腹部膿瘍、外傷による炎症、手術による炎症、慢性炎症性疾患、虚血、臓器又は組織の虚血再灌流障害、疾患による組織損傷、化学療法又は放射線療法による組織損傷、及び摂取、吸入、注入、注射又は送達された物質に対する反応、糸球体腎炎、腸感染症、日和見感染症、並びに大規模な手術又は透析を受けている対象、免疫不全の対象、免疫抑制剤を摂取している対象、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの対象、心内膜炎が疑われる対象、発熱のある対象、原因不明の発熱のある対象、嚢胞性線維症、糖尿病の対象、慢性腎不全の対象、気管支拡張症の対象、慢性閉塞性肺疾患の対象、慢性気管支炎、気腫又は喘息の対象、熱性好中球減少症の対象、髄膜炎の対象、敗血症性関節炎の対象、尿路感染症の対象、壊死性筋膜炎の対象、他のグループＡ連鎖球菌感染症の疑いのある対象、脾臓切除術を受けた対象、再発性又は腸球菌感染症の疑いのある対象、感染リスクの増加に関連する他の医学的及び外科的状態、グラム陽性敗血症、グラム陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌性敗血症、髄膜炎菌血症、ポンプ後症候群（ｐｏｓｔ−ｐｕｍｐ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心臓スタン症候群、脳卒中、うっ血性心不全、肝炎、喉頭蓋炎（ｅｐｉｇｌｏｔｉｔｔｉｓ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ０１５７：Ｈ７、マラリア、ガス壊疽、毒素性ショック症候群、子癇前症、子癇、ＨＥＬＰ症候群、マイコバクテリアによる結核（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、カリニ性肺炎（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｃ  ｃａｒｉｎｉｉ）、肺炎、リーシュマニア症、溶血性尿毒症症候群／血栓性血小板減少性紫斑病、デング出血熱、骨盤炎症性疾患、レジオネラ、ライム病、インフルエンザＡ、エプスタイン−バーウイルス（ｐｅｌｖｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）、脳炎、炎症性疾患及び自己免疫疾患（関節リウマチ、骨関節炎、進行性全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、特発性肺線維症、サルコイドーシス、過敏性肺炎、全身性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、心臓、肝臓、肺腎臓骨髄を含む移植、移植片対宿主病、移植片拒絶、鎌状赤血球貧血、ネフローゼ症候群、ＯＫＴ３等の薬剤の毒性、サイトカイン療法、クリオピリン関連周期熱症候群及び肝硬変を含む）からなる群から選択される。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｍ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害は、自己免疫疾患である。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、自己免疫疾患は、アディソン病、アレルギー、円形脱毛症、アルツハイマー病、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群（ヒューズ症候群）、関節炎、喘息、粥状動脈硬化、動脈硬化巣、自己免疫疾患（例えば、ループス、ＲＡ、ＭＳ、グレイブス病等）、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、無精子症、ベーチェット病、バーガー病、水疱性類天疱瘡、心筋症、心血管疾患、セリアック病／コアリアック病、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＰＤ）、慢性再発性多発ニューロパチー（ギラン−バレ症候群）、チャーグ−ストラウス症候群（ＣＳＳ）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症（ＣＡＤ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、皮膚炎、ヘルペス、皮膚筋炎、糖尿病、円盤状ループス、湿疹後天性表皮水疱症、本態性混合型クリオグロブリン血症、エヴァン症候群、眼球突出（Ｅｘｏｐｔｈａｌｍｏｓ）、線維筋痛症、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、免疫増殖性疾患又は障害（例えば、乾癬）、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、間質性肺疾患、若年性糖尿病、若年性関節炎、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、川崎病、ランバート−イートン筋無力症候群、扁平苔癬、ループス、ループス腎炎、リンパ球性下垂体炎（Ｌｙｍｐｈｏｓｃｙｔｉｃ  Ｌｙｐｏｐｈｉｓｉｔｉｓ）、メニエール病／急性播種性脳脊髄神経根障害、混合性結合組織病、多発性硬化症（ＭＳ）、筋肉リウマチ、筋痛性脳脊髄炎（ＭＥ）、重症筋無力症、
眼の炎症、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発軟骨炎、多腺性症候群（Ｐｏｌｙｇｌａｎｄｕｌａｒ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）（ウィタカー症候群）、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変／自己免疫性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群／反応性関節炎、再狭窄、リウマチ
熱、
リウマチ性疾患、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強皮症、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ’ｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、スティフ・マン症候群、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、全身性硬化症、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、甲状腺炎、１型糖尿病、２型糖尿病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、及びウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｍ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害は、肺疾患である。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｍ２／Ｍ１マクロファージは、肺胞マクロファージを含む。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｍ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、それを必要とする対象においてＭ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療する方法であって、障害が好塩基球に関連せず、対象において好塩基球又は好塩基球の活性を枯渇させることを含み、それにより、対象のＭ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療することを含む、方法が提供される。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、枯渇は、好塩基球又は好塩基球の活性を枯渇させる薬剤によるものである。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、それを必要とする対象においてＭ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害の治療に使用するための好塩基球又は好塩基球の活性を枯渇させる薬剤が提供される。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、薬剤は、少なくとも１つの好塩基球マーカーに向けられる。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、薬剤は、ＦｃｅＲ１ａ、ＩＬ３３Ｒ及び／又はＣＳＦ２Ｒｂを標的とする。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、薬剤は、ＧＭ−ＣＳＦ及び／又はＩＬ３３を標的とする。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、枯渇はｅｘ−ｖｉｖｏで行われる。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、枯渇はｉｎ−ｖｉｔｒｏで行われる。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、好塩基球は、血液循環好塩基球である。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、好塩基球は、肺に存在する好塩基球である。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、枯渇は局所的な方法で行われる。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害は癌である。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害は黒色腫である。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害は、肺線維症である。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる補助疾患又は障害は、癌、線維性疾患からなる群から選択される。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させる方法が提供され、該方法は、マクロファージの近傍から肺好塩基球表現型を有する好塩基球を枯渇させるか、又は好塩基球の活性を枯渇させ、それによってＭ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させる。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、Ｍ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させる方法が提供され、該方法は、マクロファージ又は好塩基球のエフェクターの近傍に肺好塩基球表現型を有する好塩基球を濃縮することを含み、それによってＭ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させる。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、濃縮は、ＧＭ−ＣＳＦ及び／又はＩＬ３３によるものである。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、エフェクターは、ＩＬ６、ＩＬ１３及びＨＧＦからなる群から選択される。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、該方法はｅｘ−ｖｉｖｏで行われる。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、該方法はｉｎ−ｖｉｖｏで行われる。
【００５７】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び／又は科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同様又は同等の方法及び材料を本発明の実施形態の実施又は試験に使用することができるが、例示的な方法及び／又は材料を以下に説明する。矛盾する場合は、定義を含む特許明細書が優先される。さらに、材料、方法、及び例は例示にすぎず、必ずしも限定することを意図するものではない。
【００５８】
添付の図面を参照して、本発明のいくつかの実施形態を例としてのみ本明細書に記載する。ここで詳細に図面を具体的に参照すると、示される詳細は、例として、本発明の実施形態の例示的な議論を目的とすることが強調される。これに関して、図面と共に考慮される説明によれば、本発明の実施形態がどのように実施され得るかは当業者に明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、発生中の肺細胞の単一細胞マップを示している。
【図１Ａ】実験計画。単一細胞を、肺の発生に沿って様々な時点から収集した。
【図１Ｂ】免疫非免疫コンパートメントに由来する単一細胞ＲＮＡ配列データをＭｅｔａＣｅｌｌパッケージ（図示していない）によって分析及びクラスター化し、グラフ表示で単一細胞の２次元投影を行った。全ての時点の１７匹のマウスに由来する２０，９３１個の単一細胞を分析した。２６０個のメタセルを２２個の細胞型及び状態に関連付け、カラーコードによって注釈及びマークを付けた。
【図１Ｃ】肺発達の２Ｄマップの上にある主要な細胞型固有のマーカー遺伝子のクオンタイル。棒グラフは、全ての細胞型に対するマーカー遺伝子のＵＭＩ分布を示し、同じ細胞数に対し低解像度処理されている。
【図２】図２Ａ〜Ｇは、肺の発生中の細胞組成及び遺伝子発現の動的変化を示す。
【図２Ａ】２Ｄマップ上のさまざまな時点からの細胞の投影図である。
【図２Ｂ】ある時点にわたる免疫（ＣＤ４５＋）コンパートメントの細胞型分布である。
【図２Ｃ】ある時点にわたる非免疫（ＣＤ４５−）コンパートメントの細胞型分布である。図２Ａ〜Ｃの時点は、近い時間間隔でいくつかの相関する生物学的複製に対してプールされている（図示していない）。
【図２Ｄ】出生前後（時間；ｔ０＝出生）にプロットされたマクロファージコンパートメント組成の動的変化。ドットは生物学的サンプルを表す（ｎ＝１５）。トレンドラインを局所回帰によって計算する（Ｌｏｅｓｓ）。
【図２Ｅ】２Ｄマップ上の単球からマクロファージＩＩ〜ＩＩＩまでの推奨軌道。
【図２Ｆ】Ｓｌｉｎｇｓｈｏｔ疑似時間軌道（方法）に従って順序付けられた単球及びマクロファージＩＩ〜ＩＩＩ細胞の遺伝子発現プロファイル。下部のカラーバーは、細胞型（中央）及び起点（下）による注釈を示す。
【図２Ｇ】メタセルに対する特徴的な単球及びマクロファージ遺伝子の発現。メタセルを、メジアン疑似時間で並べ替え、左端の５つのメタセルはマクロファージＩである。
【図３】図３Ａ〜Ｉは、肺に存在する好塩基球が免疫及び他のコンパートメントと広く相互作用することを示している。
【図３Ａ】リガンド受容体マップ分析の図である。各ノードはリガンド又は受容体であり、線は相互作用を表す。
【図３Ｂ】すべての時点でプールされた肺発生のリガンド−受容体マップ。遺伝子（リガンド及び受容体）を相関構造（方法）に基づいて２Ｄマップに投影した。特定の細胞に関連する遺伝子を、図１Ａ〜Ｃに従って、固有の色でマークした。
【図３Ｃ】免疫（緑色）及び非免疫（赤色）コンパートメントで活性化された遺伝子の投影。黒丸及び白丸は、それぞれリガンド及び受容体を表す。灰色の円は、１つのコンパートメントに非特異的なリガンド／受容体を表す。
【図３Ｄ−Ｅ】リガンドを、ＧＯ濃縮（方法）によって機能群に分類した。
【図３Ｄ】免疫及び非免疫コンパートメントにおけるリガンドの機能グループの濃縮。
【図３Ｅ】リガンドが免疫コンパートメント及び非免疫コンパートメントにおける異なる機能的グループに由来する受容体の濃縮。ＦＤＲ補正フィッシャーの正確確率検定；ｐ＜０．０５
【図３Ｆ】平滑筋線維芽細胞のＬＲ相互作用マップ、
【図３Ｇ】ＡＴ２細胞のＬＲ相互作用マップ、
【図３Ｈ】ＩＬＣのＬＲ相互作用マップ及び
【図３Ｉ】好塩基球のＬＲ相互作用マップ。色付きのノードは、細胞型においてアップレギュレートされた遺伝子を表し（２倍超の変化）、灰色のノードは相互作用するパートナーを表す。黒丸及び白丸は、それぞれリガンド及び受容体を表。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５。
【図４】図４Ａ〜Ｇは、肺好塩基球の空間的及びトランスクリプトーム特性を示している。
【図４Ａ】ＴｉｓｓｕｅＦＡＸＳによるＭｃｐｔ８ＹＦＰ／＋マウスの全葉切片における肺胞、核、及び好塩基球の検出。インレット：赤い矢印はＹＦＰ＋好塩基球を指す。下部：肺胞（白）、核（灰色）及び好塩基球（黄色）を示す計算解析の出力。熱色は、最も近い肺胞からの距離を示している（方法）。スケールバー＝１ｍｍ（葉全体）及び２０μｍ（代表的な切片）
【図４Ｂ】８．５日ＰＮ及び８週齢の成体マウスにおける他のすべての核（灰色）と比較した肺胞からの好塩基球（黄色）の距離の定量化。距離は、すべての核の中央値に正規化された。Ｐ値を、並べ替え検定（方法）によって計算した。ｎ＝４〜５マウス／群。
【図４Ｃ】３０時間ＰＮ、６．５日ＰＮ及び８週齢の成体マウスに由来する透徹した肺におけるＭｃｐｔ８＋好塩基球（緑色）の代表的な画像。スケールバー＝２ｍｍ
【図４Ｄ】フローサイトメトリーによる異なる発生時点における全肺の肺好塩基球数の定量化。１群あたりのマウスｎ＝３〜４。一元配置分散分析（両側）。ＰＮの８週目〜６．５日及びＰＮの８週目〜３０時間のスチューデントのｔ検定（両側）。
【図４Ｅ】３０時間ＰＮでの肺（ｙ軸）及び末梢血（ｘ軸）に由来する好塩基球の差次的遺伝子発現。
【図４Ｆ】Ｅ１６．５、３０時間ＰＮ、及び８週齢での血液及び肺好塩基球にわたる肺好塩基球に特異的なリガンドの発現。図４Ｅ〜Ｆの値は、細胞数にスケーリングされた１，０００  ＵＭＩあたりの正規化された発現を示す。
【図４Ｇ】時間一致発生時点からの血液及び肺好塩基球全体の肺好塩基球特異的シグネチャーの分布（図７Ｇ）。箱ひげ図は、メジアンバー、１〜３分位ボックス、及び５〜９５パーセンタイルウィスカーを表示する。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図５】図５Ａ〜Ｌは、肺に存在する好塩基球がＩＬ３３及びＧＭ−ＣＳＦによって刺激されることを示す。
【図５Ａ】図１からの単一細胞マップ上でのリガンドＣｓｆ２（緑色）及びその固有の受容体Ｃｓｆ２ｒｂ（赤色）の二重投影。色は発現量を示す。棒グラフは、細胞型全体の１，０００  ＵＭＩあたりのリガンド及び受容体の正規化された発現を示す。
【図５Ｂ】フローサイトメトリーによる３０時間ＰＮでの肥満細胞及び総ＣＤ４５＋細胞と比較したＣＳＦ２Ｒｂ＋肺好塩基球の定量化。１群あたりマウスｎ＝２。一元配置分散分析：好塩基球及び肥満細胞間のスチューデントのｔ検定（両側）。
【図５Ｃ】図５Ａ同じであるが、リガンドＩｌ３３（緑色）及びその固有の受容体Ｉｌ１ｒｌ１（赤）に関するものである。
【図５Ｄ】図５Ｂと同じであるが、ＩＬ１ＲＬ１＋肺好塩基球用である。ｎ＝３マウス／群。
【図５Ｅ】８日ＰＮに由来する肺組織における、細胞核をマークするためのＤＡＰＩ染色（青色）と共に、好塩基球のマーカーであるＭｃｐｔ８（赤色）、ＡＴ２細胞によって発現されるリガンドであるＩｌ３３（緑色）、及び好塩基球によって発現される対応する受容体であるＩｌ１ｒｌ１（白色）のｍＲＮＡ分子の代表的なｓｍＦＩＳＨ画像。スケールバー＝５μｍ。
【図５Ｆ】互いの及び肺胞への空間的近接性を示す、細胞核検出用のメチルグリーン染色（緑色）と共に、成体マウス（８週齢）由来の肺切片における、Ｍｃｐｔ８＋好塩基球（茶色）及びプロＳＰＣ＋ＡＴ２細胞（紫色）の代表的なＩＨＣ画像。スケールバー＝２５μｍ。
【図５Ｇ】Ｉｌ１ｒｌ１（ＳＴ２）ノックアウト（ｙ軸）対同腹仔対照（ｘ軸）からの３０時間ＰＮ肺好塩基球間の差次的遺伝子発現。１，０００ＵＭＩ／細胞あたりのｌｏｇ２正規化発現。
【図５Ｈ】Ｉｌ１ｒｌ１ノックアウト及び同腹仔対照における肺好塩基球特異的シグネチャーの分布（図７Ｇ）。箱ひげ図は、メジアンバー、１分位〜３分位のボックス、及び５〜９５パーセンタイルのウィスカーを表示する。
【図５Ｉ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の実験パラダイムの説明。ＢＭ由来細胞をＩＬ３で増殖させて好塩基球を１０日間誘導した後、ｃＫｉｔ−細胞を選別して播種した（図７Ｊ）。好塩基球をＩＬ３のみ（ａ）、ＩＬ３及びＧＭ−ＣＳＦ（ｂ）、ＩＬ３及びＩＬ３３（ｃ）、並びにＩＬ３、ＩＬ３３及びＧＭ−ＣＳＦの組み合わせ（ｄ）と共に１６時間播種した。単一細胞選別を行った好塩基球の遺伝子発現をＭＡＲＳ−ｓｅｑによって評価した。
【図５Ｊ】４つの条件に対する重要な遺伝子の発現値。値は、１，０００ＵＭＩ／細胞あたりの正規化された発現を示す。
【図５Ｋ】ＩＬ３３誘導プログラム（ｙ軸）及びＧＭ−ＣＳＦ誘導プログラム（ｘ軸：図７Ｌ）のそれらの発現に関する４つの条件からのメタセルのスコアリング。メタセルの同一性を大多数の細胞によって決定する。
【図５Ｌ】図５Ｋに記載されている遺伝子発現プログラムに投影された、３０時間ＰＮの肺（赤丸）及び血液循環（赤色の空円）好塩基球、並びに成体（８週齢）の肺（茶色の丸）及び血液循環（茶色の空円）好塩基球からのメタセルのスコアリング。図５Ｊ〜Ｌ。サンプルは３重に調製され、結果は３つの独立した実験を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。データは平均±ＳＥＭとして表される。
【図６】図６Ａ〜Ｐは、肺好塩基球はＡＭの転写及び機能発達に不可欠である。
【図６Ａ】図１Ａ〜Ｃからの単一細胞マップ上でのリガンドＩｌ１６（緑色）及びその固有の受容体Ｉｌ６ｒａ（赤色）の二重投影。色は発現量を示す。棒グラフは、細胞型全体の１，０００ＵＭＩあたりのリガンド及び受容体の正規化された発現を示す。
【図６Ｂ】フローサイトメトリーによる３０時間ＰＮでの肺好塩基球、肥満細胞、及び総ＣＤ４５＋細胞内での、アイソタイプ対照と比較したＩＬ−６の細胞内染色のヒストグラム及び定量化。ｎ＝６マウス／群。
【図６Ｃ】図６Ａと同様であるが、Ｉｌ１３（緑色）及びその受容体Ｉｌ１３ｒａ１（赤色）に関するものである。
【図６Ｄ】図６Ｂと同様であるが、ＩＬ−１３に関するものである。ｎ＝６マウス／群。図６Ａ〜Ｄ。一元配置分散分析；好塩基球と肥満細胞の間のスチューデントのｔ検定（両側）。
【図６Ｅ】８日ＰＮマウに由来する肺切片のヘマトキシリン染色（薄紫色）に対する、Ｍｃｐｔ８＋好塩基球（濃い紫色）及びＦ４／８０＋マクロファージ（茶色）の代表的なＩＨＣ画像であり、空間的近接性を示す。スケールバー＝４０μｍ。
【図６】図６Ｆ〜Ｉ。好塩基球枯渇用の抗Ｆｃεｒ１α抗体又はアイソタイプ対照を、新生マウスに鼻腔内注射し、生存可能なＣＤ４５＋細胞をＭＡＲＳ−ｓｅｑプロセッシング及び３０時間ＰＮでの分析のために選別した。各サンプルを３つの肺からプールし、結果は２つの独立した実験における３つの複製を表す。
【図６Ｆ】ＦＡＣＳによって決定された、抗Ｆｃεｒ１α及びアイソタイプ対照を注射したマウスに由来する肺の全ＣＤ４５＋細胞からの好塩基球（Ｆｃεｒ１α＋ｃＫｉｔ−）の割合。肺好塩基球の割合に対するスチューデントのｔ検定（両側）。ｎ＝３。
【図６Ｇ】抗Ｆｃεｒ１α及びアイソタイプ対照を注射したマウスに由来する肺の全マクロファージからのマクロファージＩＩＩの割合。実験間の対照レベルに一致するように数値をスケーリングした。ＡＭのパーセントに対するスチューデントｔ検定（両側）。
【図６Ｈ】抗Ｆｃεｒ１α（ｙ軸）及びアイソタイプ対照（ｘ軸）で処理したマウスにおけるマクロファージＩＩ（薄緑色）細胞とマクロファージＩＩＩ（暗緑色）細胞の間で差次的に発現する遺伝子の発現。値は、１，０００ＵＭＩ／細胞あたりの正規化された発現を示す。
【図６Ｉ】抗Ｆｃεｒ１α対アイソタイプ対照処理マウスにおける特徴的なＡＭ及びマクロファージＩＩ（Ｆ１３ａ１）遺伝子のメジアン発現。図６Ｊ〜Ｋ。Ｍｃｐｔ８ノックアウト、及びそれらの同腹仔対照のＢＡＬＦに由来するＡＭを、８〜１２週齢の成体マウスから精製した。結果は４つの独立した実験からのものである。それらのそれぞれは少なくとも４つの複製で構成されている。
【図６Ｊ】Ｍｃｐｔ８ノックアウト及びその同腹仔対照マウスのＢＡＬＦ細胞数。ＡＭのパーセントに対するスチューデントのｔ検定。
【図６Ｋ】Ｍｃｐｔ８ノックアウト対同腹仔対照マウスのＢＡＬＦに由来するＡＭの貪食能。結果を、平均化された対照と比較した食作用指数の倍率変化として示す。ＡＭのパーセントに対するスチューデントｔ検定。図６Ｌ〜Ｐ。ＢＭ−ＭΦ及びＢＭ由来の好塩基球の共培養実験。ＢＭ由来の細胞を分割し、好塩基球（ＩＬ３）に１０日間、及びマクロファージ（Ｍ−ＣＳＦ）に８日間増殖させた。その後、マクロファージを（ａ）Ｍ−ＣＳＦ＋ＩＬ３、（ｂ）ＩＬ３３及びＧＭ−ＣＳＦ、（ｃ）ナイーブ好塩基球、並びに（ｄ）ＩＬ３３及びＧＭ−ＣＳＦの存在下での肺環境で刺激された好塩基球と共に共培養した。
【図６Ｌ】４つの条件からの共培養マクロファージのメタセル分析の２次元表示。右図−２Ｄ投影に対する選択されたＡＭ関連遺伝子の発現クオンタイル。
【図６Ｍ】共培養されたマクロファージにおける肺環境で刺激された好塩基球誘導プログラムは、ＡＭ及び免疫抑制へのマクロファージプライミングと関連する。生物学的複製を示す。
【図６Ｎ】発生中のマクロファージＩＩＩとＩＩの間のＭにおける遺伝子の差次的発現（ｌｏｇ２倍率変化）。
【図６Ｏ】図６Ｍと同じ条件下で増殖させた３０時間ＰＮ肺に由来するＣＤ４５＋ＣＤ１１５＋骨髄細胞全体のＭにおける遺伝子の発現。生物学的複製物を示す。
【図６Ｐ】抗Ｆｃεｒ１α及びアイソタイプ対照が注射された肺に由来するマクロファージ間のＭにおける遺伝子の差次的発現（ｌｏｇ２倍率変化）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。データは平均±ＳＥＭとして表される。
【図７】図７Ａ〜Ｉは、肺好塩基球の空間的及びトランスクリプトームの特性に関連する追加データを提供する。
【図７Ａ】各時点でｎ＝３〜５のＥ１６．５、３０時間ＰＮ、８．５日ＰＮ及び８週齢の成体のマウスに由来する肺切片におけるヘマトキシリンバックグラウンドを含む、Ｍｃｐｔ８＋好塩基球（茶色；赤色矢印）代表的なＩＨＣ画像。
【図７Ｂ】２日ＰＮマウスに由来する肺細胞は、特異的細胞表面マーカーに従って単一細胞ソーティングにより、好塩基球について濃縮した。ＣＤ４５＋細胞のｃＫｉｔ及びＦｃεｒ１αのタンパク質レベル細胞をＦＡＣＳインデックスソーティングによって決定した。図１Ａ〜Ｃのように、転写類似性（方法）によって、細胞型への関連付けによって細胞を色分けする。
【図７Ｃ】図７Ｂと同様のｃＫｉｔ＋、Ｆｃεｒ１α＋、及び二重陰性（ＤＮ）ゲートの細胞型分布。
【図７Ｄ】肥満細胞（ＣＤ４５＋ｃＫｉｔ＋）及びＣＤ４５＋コンパートメントと比較した、３０時間ＰＮでのＭｃｐｔ８ＹＦＰ／＋トランスジェニック新生仔に由来し、好塩基球（ＣＤ４５＋ｃＫｉｔ−Ｆｃεｒ１α＋）が濃縮された肺細胞におけるＹＦＰ＋画分の定量化；ｎ＝６。スチューデントのｔ検定（両側）：＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図７Ｅ】フローサイトメトリーによる３０時間ＰＮでの肥満細胞及び総ＣＤ４５＋細胞と比較したＣＤ４９ｂ＋肺好塩基球の定量化。ｎ＝６。一元配置分散分析：＊＊＊Ｐ＜０．００１。好塩基球及び肥満細胞間のスチューデントのｔ検定（両側）。＊＊＊ｐ＜０．００１。データを平均±ＳＥＭとして表す。
【図７Ｆ】Ｆｃεｒ１α＋ｃＫｉｔ−発現による、Ｅ１６．５、３０時間ＰＮ及び８週齢のマウスでの血液循環（下のパネル）及び肺実質（上のパネル）に由来する好塩基球のゲーティング戦略。
【図７Ｇ】３０時間ＰＮ（ｙ軸）及び成体（８週間、ｘ軸）マウスにおける肺及び血液好塩基球間の差次的遺伝子発現。インレットは、各四分位で差次的に発現する遺伝子（倍率変化１超）のパーセンテージを表示する。赤色の遺伝子を肺好塩基球シグネチャーの定義に対して選択した（図４Ａ−Ｇ−５Ａ−Ｌ）。
【図７Ｈ】すべての肺細胞型にわたる好塩基球発現リガンドの特異性発現閾値は２倍の変化である（図示していない）。図１Ａ〜Ｃのように、色は細胞型を表す。
【図７Ｉ】すべての細胞型と比較した好塩基球によってのみ発現されるリガンドの発現。＊＊＊ｐ＜０．００１。データは平均±ＳＥＭとして表される。
【図８】図８Ａ〜Ｇは、ＩＬ３３及びＧＭ−ＣＳＦによって刺激された肺に存在する好塩基球に関連する追加データを提供する。
【図８Ａ】３０時間ＰＮのマウス由来の血液好塩基球との、Ｉｌ１ｒｌ１ノックアウト又はその同腹子対照の肺好塩基球の遺伝子発現の類似性。各Ｉｌ１ｒｌ１  ＫＯ細胞を、ｋ個の最も近い隣接多数の得票によって血液又は肺のいずれかに割り当てた（方法）。図８Ｂ〜Ｅ。ＢＭ由来細胞をＩＬ３で増殖させて好塩基球を１０日間誘導した後、ｃＫＩＴ−細胞を選別して播種した。好塩基球をＩＬ３のみ（ａ）、ＩＬ３及びＧＭ−ＣＳＦ（ｂ）、ＩＬ３及びＩＬ３３（ｃ）、並びにＩＬ３、ＩＬ３３及びＧＭ−ＣＳＦの組み合わせ（ｄ）と共に１６時間播種した。
【図８Ｂ】ＢＭ由来の細胞を、ｃＫｉｔビーズを使用したネガティブセレクションによってＢＭ好塩基球について濃縮した。全ＢＭ細胞に占める純粋なＢＭ好塩基球集団の割合をＦＡＣＳで評価した。
【図８Ｃ】ヒートマップは、サイトカインのさまざまな組み合わせで増殖させた好塩基球の遺伝子発現プロファイルを表す。カラーバーは、ａ〜ｄのサイトカインの組み合わせを示す。
【図８Ｄ】１つのサイトカイン（ｘ軸−ＧＭ−ＣＳＦ；ｙ軸−ＩＬ３３）及びナイーブ好塩基球（ＩＬ３のみで増殖）で増殖させた好塩基球間の差次的遺伝子発現。水平及び垂直切片は、それぞれＩＬ３３及びＧＭ−ＣＳＦ誘導遺伝子プログラムの閾値を示す。
【図８Ｅ】４つの条件下で増殖させたＢＭ由来好塩基球における肺好塩基球特異的シグネチャーの分布（図７Ｇ）。箱ひげ図は、メジアンバー、１分位〜３分位のボックス、５〜９５パーセンタイルのウィスカーを表示する。＊＊Ｐ＝０．００９；コルモゴロフ−スミルノフ検定。
【図８Ｆ】ＩＬ３３誘導プログラム（ｙ軸）及びＧＭ−ＣＳＦ誘導プログラム（ｘ軸）の発現について、ａ〜ｄのサイトカイン条件からの生物学的複製のスコアリング。条件ａ及びｄは３つの独立した実験によるものである。
【図８Ｇ】ＩＬ３３誘導プログラム（ｙ軸）及びＧＭ−ＣＳＦ誘導プログラム（ｘ軸）の発現について、３０時間ＰＮでのＩｌ１ｒｌ１ノックアウト肺好塩基球及びそれらの同腹仔対照からのメタセルのスコアリング。
【図９】図９Ａ〜Ｎは、肺好塩基球がＡＭの転写及び機能発達に不可欠であることに関する更なるデータを提供する。
【図９Ａ】図１Ａ〜Ｃからの単一細胞マップ上でのリガンドＣｓｆ１（緑色）及びその固有の受容体Ｃｓｆ１ｒ（赤色）の二重投影。色は発現量を示す。棒グラフは、細胞型全体の１，０００  ＵＭＩあたりのリガンド及び受容体の正規化された発現を示す。
【図９Ｂ】好塩基球枯渇実験の図。新生マウスに好塩基球枯渇用の抗Ｆｃεｒ１α抗体又はアイソタイプ対照を１２時間及び１６時間ＰＮで２回鼻腔内注射し、生存可能なＣＤ４５＋細胞をＭＡＲＳ−ｓｅｑプロセッシング及び３０時間ＰＮでの分析のために選別した。
【図９Ｃ】抗Ｆｃεｒ１α又はアイソタイプ対照を注射した新生仔に由来するＣＤ４５＋Ｆｃεｒ１α＋ｃＫｉｔ−肺好塩基球のゲーティング戦略。
【図９Ｄ】単一細胞を肺モデルにマッピングすることによって決定された、抗Ｆｃεｒ１α及びアイソタイプ対照を注射したマウスに由来する肺における総ＣＤ４５＋細胞からの異なる細胞型の存在比率（図１、方法）。数値は、実験間の対照レベルに一致するようにスケーリングした。スチューデントのｔ検定（両側）：＊ｐ＝０．０２；ｎ＝３。
【図９Ｅ】抗Ｆｃεｒ１α由来の肺マクロファージとアイソタイプ対照を注射したマウスを比較した場合の、マクロファージサブセットＩＩ（薄緑色）とＩＩＩ（暗緑色）の間で最も差次的に発現する遺伝子の発現差。両側の上位１５個の差次的に発現する遺伝子を示す。値はｌｏｇ２倍率変化を表す。
【図９Ｆ】抗Ｆｃεｒ１α及びアイソタイプ対照を注射したマウスに由来するマクロファージ全体のマクロファージＩＩＩ特異的遺伝子発現の分布。発現レベルを実験間の対照レベルと一致するようにスケーリングした。コルモゴロフ−スミルノフ検定。＊＊＊ｐ＜１０−４。
【図９Ｇ】８〜１２週齢の成体マウスにおけるＭｃｐｔ８ノックアウト及びそれらの同腹仔対照のＢＡＬＦに由来するＣＤ４５＋細胞からのＡＭのパーセンテージ。
【図９Ｈ】ＢＭ由来の細胞を分割し、好塩基球（ＩＬ３）へと１０日間、マクロファージ（Ｍ−ＣＳＦ）へと８日間増殖させた。マクロファージを（ａ）Ｍ−ＣＳＦ＋ＩＬ３、（ｂ）ＩＬ３３及びＧＭ−ＣＳＦ、（ｃ）ＢＭ由来好塩基球、並びに（ｄ）肺環境で刺激された好塩基球（ＩＬ３３及びＧＭ−ＣＳＦの存在下）と共培養した。
【図９Ｉ】ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ３３で増殖した好塩基球とナイーブ好塩基球との間の差次的遺伝子発現。好塩基球は単独（ｘ軸）、又はマクロファージの存在下（ｙ軸）で増殖した。入口には、各四分位で差次的に発現する遺伝子の割合（倍数変化＞１）が表示される。
【図９Ｊ】ヒートマップは、図６Ｌのように好塩基球の有無にかかわらず増殖させたＢＭ−ＭΦの遺伝子発現プロファイルを表す。カラーバーはａ〜ｄの増殖条件を示す。
【図９Ｋ】肺好塩基球の有無にかかわらず増殖させたマクロファージ間の差次的遺伝子発現（条件ａ及びｄ）。軸は、２つの独立した実験を示す。インレットは、各四分位数で差次的に発現する遺伝子の割合（倍率変化１超）を表示する。
【図９Ｌ】肺の発生におけるマクロファージＩＩ及びＩＩＩ全体の肺に存在する好塩基球によって誘導される免疫調節特異的遺伝子発現の分布。コルモゴロフ−スミルノフ検定。＊＊＊ｐ＜１０−１０。図９Ｍ〜Ｎ。さまざまな組織に由来する好塩基球遺伝子発現の比較。
【図９Ｍ】８週齢のマウスの肺、腫瘍微小環境、血液、脾臓及び肝臓から収集した好塩基球全体の、好塩基球に特徴的な遺伝子（Ｍｃｐｔ８、Ｃｐａ３、Ｃｄ２００ｒ３）、並びに組織特異的遺伝子（Ｉｌ６、Ｃｃｌ３）の遺伝子発現。非好塩基球は、異常値として収集及びフィルタリングされた細胞を示す。
【図９Ｎ】異なる組織に由来する好塩基球全体にわたる肺好塩基球の遺伝子発現シグネチャーの分布（図７Ｇ）。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、Ｍ２マクロファージ極性化を調節する方法、及び治療におけるその使用に関する。
【００６１】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の説明に記載されるか、又は実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であるか、又は様々な方法で実施又は実行され得る。
【００６２】
単球前駆細胞に由来するマクロファージは、局所組織環境に応じて特定の分化を起こす。さまざまなマクロファージ機能は、マクロファージ上の受容体相互作用のタイプ及びサイトカインの存在に関連している。Ｔヘルパータイプ１及びＴヘルパータイプ２（ＴＨ１−ＴＨ２）極性化と同様に、マクロファージの極性化活性化の２つの異なる状態、古典的に活性化された（Ｍ１）マクロファージ表現型及び代替的に活性化された（Ｍ２）マクロファージ表現型が定義されている。Ｔ細胞と同様に、いくつかの活性化マクロファージといくつかの抑制性マクロファージがあるため、マクロファージをそれらの特定の機能的活動に基づいて定義する必要がある。古典的に活性化された（Ｍ１）マクロファージは、ＴＨ１細胞性免疫応答におけるエフェクター細胞の役割を果たす。代替的に活性化された（Ｍ２）マクロファージは、免疫抑制及び組織修復に関与しているようである。これらの理由から、Ｍ１／Ｍ２の比率を調整することは、一方では炎症及び自己免疫、他方では癌の治療に関連するアプローチと見なされてきた。
【００６３】
本発明を実践に還元する一方で、本発明者らは、肺胞に近接して存在する好塩基球の肺常在集団を特定した。これらの好塩基球は、独特の遺伝子発現表現型及びサイトカイン／成長因子分泌を特徴とする。それらは、肺の肺胞マクロファージの成熟及び機能を導く上で重要な役割を果たす。肺に存在する好塩基球表現型は、肺に限定されない病状の特徴でもあることが示唆されており、Ｍ１／Ｍ２の調節から利益を得ることができる病状の治療に有益である可能性があることを示唆している。
【００６４】
具体的には、本発明者らは、肺発生の主要な時点に沿った５０，７７０個の細胞の単一細胞ＲＮＡ配列決定による免疫及び非免疫肺細胞の広範なプロファイリングを報告する。非常に多様な細胞型及び状態のセットが観察され、原始細胞から成熟ＡＭまでのマクロファージタイプの３つの波を含む発生軌道の複雑な動態が特定された。相互作用するリガンド及び受容体の分析により、相互作用の高度に接続されたネットワークが明らかになり、肺で主要な成長因子及びサイトカインシグナル伝達を発現する細胞として好塩基球が強調された。肺の好塩基球は肺胞に近接して存在し、末梢循環好塩基球とは大きく異なる肺特異的表現型を示す。Ｉｌ１ｒｌ１（ＩＬ−３３受容体）ノックアウトマウス及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養を使用して、本発明者らは、肺好塩基球の教育が、肺環境からのＧＭ−ＣＳＦ（Ｃｓｆ２）及びＩＬ−３３のコンビナトリアルな刷り込みによって媒介され、これらのサイトカインを導入することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで系統発生を繰り返せることを発見した。抗体枯渇戦略、好塩基球のジフテリア毒素媒介選択的枯渇、及びｉｎ−ｖｉｔｒｏ共培養実験を使用して、本発明者らは、好塩基球が肺における肺胞マクロファージ（ＡＭ）の成熟及び機能を導く上で重要な役割を果たすことを実証する。これらの知見は、マクロファージ操作及び好塩基球ベースの治療法への新しい臨床戦略を開く。
【００６５】
したがって、本発明の一態様によれば、Ｍ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させる方法が提供される。この方法は、マクロファージ又は当該好塩基球のエフェクターの近傍に肺好塩基球表現型を有する好塩基球を濃縮し、それによってＭ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることを含む。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「Ｍ１マクロファージ」は、炎症誘発性遺伝子の発現を特徴とするマクロファージを指し、典型的には、ＴＨ１細胞性免疫応答におけるエフェクター機能を備えている。本発明のいくつかの実施形態によるＭ１マクロファージは、ＦＡＣＳを使用することによって、又はそれらのサイトカイン分泌プロファイル（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ１ｂ）によって同定することができ、例えばＥＬＩＳＡによって、又はＲＴ−ＰＣＲを使用すること等によってＲＮＡレベルで定量することができる。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「Ｍ２マクロファージ」は、免疫抑制活性及び組織修復を備えたマクロファージを指す。本発明のいくつかの実施形態によるＭ２マクロファージは、ＦＡＣＳを使用する等の特定のマーカー（例えば、ＭＲＣ１、ＡＲＧ１）を使用する細胞数によって、又はそれらのサイトカイン分泌プロファイル（例えば、ＩＬ−１０、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２）によって定量化することができ、また例えばＥＬＩＳＡによって、又はＲＴ−ＰＣＲを使用する等のＲＮＡレベルで定量化することができる。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「肺胞マクロファージ」又は「ＡＭ」は、肺胞に見られるマクロファージのタイプを指す。ＡＭは胎児の肝臓胚前駆細胞に由来し、自己維持型であり、成人の骨髄からの寄与がない。
【００６９】
マウスＡＭは、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ１１ｃ、抗Ｆ４／８０、及び／又は抗ＳＩＧＬＥＣ−Ｆを使用して識別され得る。
【００７０】
ヒトＡＭは、抗ＣＤ４５及び／又は抗ＣＤ１１ｃを使用して識別され得る。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「増加する」とは、当技術分野で周知の方法（以下の実施例の欄を参照）によってアッセイした場合に、上記濃縮がない場合（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ３３、ＩＬ６及び／又はＩＬ１３）と比較したＭ２／Ｍ１比（Ｍ２極性化）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、さらには９５％の増加を指す。
【００７２】
Ｍ２／Ｍ１マクロファージ比の増加は、Ｍ２極性化を意味する。
【００７３】
前述のように、本発明のこの態様の方法は、肺の好塩基球表現型を有する好塩基球を濃縮することによって実施される。
【００７４】
本発明者らは、肺好塩基球表現型がｉｎ  ｖｉｔｒｏで獲得され得ることを示した（以下の実施例の欄を参照）。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「肺好塩基球表現型」は、構造的及び／又は機能的表現型を指す。
【００７６】
特定の実施形態によれば、構造的表現型は、ヒト細胞の場合、Ｆｃｅｒａ１＋、Ｉｌ３ｒａ＋（Ｃｄ１２３）、Ｉｔｇａ２＋（Ｃｄ４９ｂ）、Ｃｄ６９＋、Ｃｄ２４４＋（２Ｂ４）、Ｉｔｇａｍ＋（Ｃｄ１１ｂ）、Ｃｄ６３＋、Ｃｄ２４ａ＋、Ｃｄ２００ｒ３＋、Ｉｌ２ｒａ＋、Ｉｌ１８ｒａｐ＋及びＣ３ａｒ１＋；又はＦｃｅｒ１＋、Ｉｌ１３ｒａ１＋、Ｉｔｇａ２＋、Ｃｄ６９＋、Ｃｄ２４４＋、Ｉｔｇａｍ＋、Ｃｄ６３＋、Ｃｄ２４＋、Ｉｌ２ｒａ＋、Ｉｌ１８ｒａｐ＋及びＣ３ａｒ１＋を含む。
【００７７】
追加又は代替の実施形態によれば、構造表現型は、Ｃｓｆ１、Ｉｌ６、Ｉｌ１３、Ｌ１ｃａｍ、Ｉｌ４、Ｃｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ６、Ｃｃｌ９及びＨｇｆ等の重要なサイトカイン及び成長因子の発現を含む。
【００７８】
追加の又は代替の実施形態によれば、構造的表現型は、重要なサイトカイン及び成長因子Ｉｌ６、Ｉｌ１３、及びＨｇｆの発現を含む。
【００７９】
追加又は代替の実施形態によれば、構造的表現型は、Ｉｌ６、Ｉｌ１３、Ｃｘｃｌ２、Ｔｎｆ、Ｏｓｍ、及びＣｃｌ４の発現を含む独自の遺伝子シグネチャーを特徴とする血液循環好塩基球の別個の遺伝子発現プロファイルを含む。
【００８０】
「機能的表現型」とは、マクロファージに対するＭ２極性化の影響を指す。
【００８１】
特定の実施形態によれば、好塩基球は哺乳動物の好塩基球である。
【００８２】
特定の実施形態によれば、好塩基球はヒト好塩基球である。
【００８３】
一実施形態によれば、濃縮は、ＧＭ−ＣＳＦ及び／又はＩＬ３３と接触することによるものである。
【００８４】
一実施形態によれば、濃縮は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ３３と接触することによるものである。
【００８５】
本明細書で使用される場合、本明細書に記載の「接触」又は方法は、ｉｎ−ｖｉｖｏ、ｅｘ−ｖｉｖｏ、又はｉｎ−ｖｉｔｒｏで実施することができる。
【００８６】
特定の実施形態によれば、濃縮は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。
【００８７】
本明細書で使用される「好塩基球」は、顆粒球と呼ばれる特定のタイプの白血球を指し、これは、塩基性色素及び二葉核（ｂｉ−ｌｏｂｅｄ  ｎｕｃｌｅｕｓ）によって染色され得る大きな細胞質顆粒を特徴とし、外観が別のタイプの顆粒球である肥満細胞に類似している。好塩基球は最も一般的でない顆粒球であり、循環血液白血球のわずか０．５％を占め、寿命はわずか２〜３日（ｉｎ  ｖｉｖｏ）と短い。好塩基球は、骨髄中の顆粒球−単球前駆細胞に由来し、ここで、好塩基球前駆細胞及び肥満細胞前駆細胞は、中間の二能性好塩基球−肥満細胞前駆細胞から生じる（Ａｒｉｎｏｂｕ  ｅｔ  ａｌ．２００５  ａｎｄ  Ａｒｉｎｏｂｕ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。表１は、さまざまな系統の細胞型に関連するマーカーを示している。
【００８８】
【表１】
2021535100.tif 000002
Ｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５，１９２−１９７．からのデータ。
【００８９】
好塩基球は、ヒトとマウスの間で一貫している特定のマーカーの発現によって識別することができる。表２を参照されたい。
【００９０】
【表２】
2021535100.tif 000003
【００９１】
Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ２００９  Ａｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１，１２３−１６１、Ｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ  ２００９  Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０，２１４−２２２、及びＨｅｎｅｂｅｒｇ  ２０１１  Ｃｕ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓｉｇｎ  １７，３７５３−３７７１からのデータ。
【００９２】
特定の実施形態によれば、好塩基球は、骨髄又は末梢血から単離される。
【００９３】
特定の実施形態によれば、好塩基球は以下のように生成される：
（ｉ）好塩基球を骨髄から分離する。
（ｉｉ）ＩＬ−３の存在下で好塩基球を末梢血から分化させて、分化した培養物を得る；
（ｉｉｉ）分化した培養物からｃＫＩＴ−集団を分離する。
【００９４】
例示的なプロトコルによれば、骨髄（ＢＭ）前駆細胞は、所定の濃度、例えば、０．１×１０６〜１ｘ１０６細胞／ｍｌで採取及び培養される。ＢＭ由来マクロファージ（ＭΦ）の分化のために、ＢＭ細胞をＭ−ＣＳＦの存在下で６〜１０日間、例えば８日間培養する。次いで、細胞をこすり取る。ＢＭ由来好塩基球の分化のために、ＢＭ細胞をＩＬ−３の存在下で７〜１０日間（例えば、９〜１０日）培養する。続いて、好塩基球をＣＤ１１７−集団（ｃＫｉｔ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）の磁気活性化セルソーティングによって濃縮し、１６時間再播種する。分化中、培養物を標準培地に入れることができる。
【００９５】
ｅｘ−ｖｉｖｏ法は、組織培養で、又は可能であればアフェレーシス等の閉鎖系で行うことができる。
【００９６】
骨髄培養物又は循環好塩基球（末梢血）培養物を、分化因子で処理する。細胞の生存のために、ＩＬ−３（５〜２０ｎｇ／ｍｌ、例えば１０ｎｇ／ｍｌ）及びＭ−ＣＳＦ（５〜２０ｎｇ／ｍｌ、例えば１０ｎｇ／ｍｌ）；並びに／又はマクロファージのＭ２極性化を調節できる好塩基球に対する細胞活性化のために、ＩＬ３３（３０〜７０ｎｇ／ｍｌ、例えば５０ｎｇ／ｍｌ）及び／若しくはＧＭ−ＣＳＦ（３０〜７０ｎｇ／ｍｌ、例えば５０ｎｇ／ｍｌ）を添加しながら培養を行うことができる。典型的には、細胞活性化は、４８時間以下、例えば、６〜４８時間、１２〜４８時間、２４〜４８時間、１２〜３６時間、１８〜２４時間、例えば、２４時間（例えば、ＩＬ３３＋ＧＭ−ＣＳＦ）で行われる。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「マクロファージの近傍で」は、好塩基球とマクロファージの共培養を指す場合がある。あるいは、「マクロファージの近傍」は、ｉｎ  ｖｉｖｏで肺好塩基球表現型を有する有効量の好塩基球、又はＭ２マクロファージへの極性化を可能にするための当該好塩基球の有効量のエフェクターが存在するように濃縮することを指す場合がある。
【００９８】
肺好塩基球表現型を有する好塩基球のエフェクターには、ＩＬ６、ＩＬ１３及び／又はＨＧＦ（肝細胞成長因子）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９９】
別の態様によれば、Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させる方法、マクロファージの近傍から肺好塩基球表現型を有する好塩基球を枯渇させること、又は当該好塩基球の活性を枯渇させ、それによってＭ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させる方法が提供される。
【０１００】
Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比の増加は、Ｍ１極性化も指す。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「増加する」とは、当技術分野で周知の方法（以下の実施例の欄を参照）によってアッセイした場合に、上記枯渇がない場合と比較したＭ１／Ｍ２比（Ｍ１極性化）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、さらには９５％の増加を指す。
【０１０２】
肺好塩基球表現型を有する好塩基球を枯渇することは、当技術分野で知られている任意の方法によって実施することができ、いくつかは以下に記載されている。
【０１０３】
一実施形態によれば、枯渇は、好塩基球マーカーを標的とする薬剤によってもたらされ得る。
【０１０４】
そのようなマーカーは、上に記載されており、例えば、Ｆｃｅｒａ１＋、Ｉｌ３ｒａ＋（Ｃｄ１２３）、Ｉｔｇａ２＋（Ｃｄ４９ｂ）、Ｃｄ６９＋、Ｃｄ２４４＋（２Ｂ４）、Ｉｔｇａｍ＋（Ｃｄ１１ｂ）、Ｃｄ６３＋、Ｃｄ２４ａ＋、Ｃｄ２００ｒ３＋、Ｉｌ２ｒａ＋、Ｉｌ１８ｒａｐ＋及びＣ３ａｒ１＋；又はＦｃｅｒ１＋、Ｉｌ１３ｒａ１＋、Ｉｔｇａ２＋、Ｃｄ６９＋、Ｃｄ２４４＋、Ｉｔｇａｍ＋、Ｃｄ６３＋、Ｃｄ２４＋、Ｉｌ２ｒａ＋、Ｉｌ１８ｒａｐ＋及びＣ３ａｒ１＋、又は表２に列挙される通りである。
【０１０５】
特定の実施形態によれば、枯渇は、肺好塩基球表現型を有し、他の細胞集団ではない好塩基球を特異的に排除するように実施される（他の細胞集団の枯渇は、２０％、１５％、１０％、５％、１％を超えて影響を受けず、各値は異なる実施形態と見なされる）。
【０１０６】
特定の実施形態によれば、そのような薬剤は、抗Ｆｃｅｒａ１＋抗体等の抗体であり得る。
【０１０７】
抗体の種類の選択は、抗体が誘発するように設計されている免疫エフェクター機能に依存する。
【０１０８】
特定の実施形態によれば、抗体はＦｃドメインを含む。
【０１０９】
特定の実施形態によれば、抗体はネイキッド抗体である。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「ネイキッド抗体」という用語は、異種エフェクター部分、例えば治療部分を含まない抗体を指す。
【０１１１】
特定の実施形態によれば、抗体は、典型的には好塩基球を死滅させ、それによってＭ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させるための異種エフェクター部分を含む。エフェクター部分は、タンパク性又は非タンパク性であり得て、後者は通常、抗体及びコンジュゲートパートナーの官能基を使用して生成される。エフェクター部分は、小分子化学化合物及びポリペプチドを含む任意の分子であり得る。エフェクター部分の非限定的な例としては、限定されるものではないが、サイトカイン、細胞傷害性抗体、毒素、放射性同位体、化学療法抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、及び他の治療的に活性な抗体が挙げられる。異種治療部分に関する追加の説明を、以下にさらに提供する。
【０１１２】
抗体は、単一特異性（１つのエピトープ又はタンパク質を認識できる）、二重特異性（２つのエピトープ又はタンパク質に結合できる）、又は多重特異性（複数のエピトープ又はタンパク質を認識できる）の場合がある。
【０１１３】
特定の実施形態によれば、抗体は単一特異性抗体である。
【０１１４】
特定の実施形態によれば、抗体は二重特異性抗体である。
【０１１５】
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープを特異的に認識して結合することができる抗体である。異なるエピトープは、同じ分子内又は異なる分子上にあり得、その結果、二重特異性抗体は、単一のＲＴＮ４ポリペプチドと並んで２つの異なるポリペプチド上の２つの異なるエピトープを特異的に認識及び結合することができる。あるいは、二重特異性抗体は、例えば、ＲＴＮ４、及び限定されるものではないが、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ１６等の別のエフェクター分子に結合することができる。二重特異性抗体を産生する方法は当技術分野で知られており、例えば、米国特許第４，４７４，８９３号、同第５，９５９，０８４号、及び同第７，２３５，６４１号、同第７，１８３，０７６号、米国特許出願公開第２００８０２１９９８０号及び国際公開第２０１０／１１５５８９号、同第２０１３１５００４３号及び同第２０１２１１８９０３号に開示されており、いずれも本明細書に完全に組み込まれ、そして、例えば、化学的架橋（Ｂｒｅｎｎａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９，８１（１９８５）；Ｒａｓｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＢｉｏＩ．Ｃｈｅｒｎ．２７２，２７６２３（１９９７））、ジスルフィド交換、ハイブリッド−ハイブリドーマの産生（クアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａｓ））、転写及び翻訳によって二重特異性抗体を具体化する単一のポリペプチド鎖を生成するもの、又は転写及び翻訳によって共有結合して二重特異性抗体を生成することができる複数のポリペプチド鎖を生成するものが挙げられる。企図される二重特異性抗体はまた、完全に化学合成によって作製することができる。
【０１１６】
２つ以上の原子価を有する抗体もまた企図される。
【０１１７】
他の特定の実施形態によれば、抗体は多重特異性抗体である。
【０１１８】
特定の実施形態によれば、抗体は、コンジュゲート抗体（すなわち、２つの共有結合した抗体から構成される抗体）である。
【０１１９】
抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり得る。
【０１２０】
特定の実施形態によれば、抗体はモノクローナル抗体である。
【０１２１】
特定の実施形態によれば、抗体はポリクローナル抗体である。
【０１２２】
ポリクローナル及びモノクローナル抗体、並びにそれらのフラグメントを産生する方法は、当技術分野で周知である（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８を参照されたい）。
【０１２３】
本発明のいくつかの実施形態による抗体フラグメントは、抗体のタンパク質分解加水分解によって、又はフラグメントをコードするＤＮＡのＥ．ｃｏｌｉ若しくは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養又は他のタンパク質発現系）での発現によって調製することができる。抗体フラグメントは、従来の方法による抗体全体のペプシン又はパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体フラグメントは、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって生成されて、Ｆ（ａｂ’）２で示される５Ｓフラグメントを提供することができる。このフラグメントは、チオール還元剤、及び任意にジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基のブロッキング基を使用してさらに切断され、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価フラグメントを生成することができる。あるいは、ペプシンを使用した酵素的切断により、２つの一価Ｆａｂ’フラグメント及びＦｃフラグメントが直接生成される。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４，０３６，９４５号及び同第４，３３１，６４７号、並びにそこに含まれる参考文献によって記載されており、これらの特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９−１２６（１９５９）］も参照されたい。一価の軽重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、又は他の酵素的、化学的若しくは遺伝的技術等の抗体を切断する他の方法も、無傷の抗体によって認識されるフラグメントが抗原に結合する限り、使用され得る。
【０１２４】
Ｆｖフラグメントは、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖の会合を含む。Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９−６２（１９７２０］に記載されているように、この会合は非共有的であり得る。あるいは、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合によって連結されるか、又はグルタルアルデヒド等の化学物質によって架橋され得る。好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによって接続されたＶＨ及びＶＬ鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって接続されたＶＨ及びＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、その後、Ｅ．ｃｏｌｉ等の宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを含む単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを生成するための方法は、例えば、［Ｗｈｉｔｌｏｗ  ａｎｄ  Ｆｉｌｐｕｌａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２：９７−１０５（１９９１）；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）；Ｐａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１−７７（１９９３）；及び米国特許第４，９４６，７７８号によって記載され、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２５】
抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識ユニット」）は、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって取得できる。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｆｒｙ［Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：１０６−１０（１９９１）］を参照されたい。
【０１２６】
ヒトの治療又は診断のために、ヒト化抗体が好ましく使用されることが理解されるであろう。
【０１２７】
特定の実施形態によれば、抗体はヒト化抗体である。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、免疫グロブリンのキメラ分子、免疫グロブリン鎖、又は非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むそれらのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２、又は抗体の他の抗原結合サブシーケンス等）である。ヒト化抗体には、残基がレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成するヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれ、これが所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、又はウサギ等の非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置き換えられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が対応する非ヒト残基に置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、インポートされたＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここで、ＣＤＲ領域のすべて又は実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンの領域及びＦＲ領域のすべて又は実質的にすべてに対応し、これらは、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部を含むであろう［Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）］．
【０１２８】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野でよく知られている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしばインポート残基と呼ばれ、通常、インポート可変ドメインから取得される。ヒト化は、基本的には、げっ歯類のＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置き換えることによる、Ｗｉｎｔｅｒらの方法に従って実行することができる［Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］。したがって、そのようなヒト化抗体はキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、無傷のヒト可変ドメインよりも実質的に少ないものが、非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は通常、いくつかのＣＤＲ残基及びおそらくいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体の類似部位からの残基で置換されているヒト抗体である。
【０１２９】
別の実施形態によれば、枯渇は、マクロファージとのシグナル通信を防ぐために、好塩基球の活性を枯渇させることによってもたらされる。
【０１３０】
特定の実施形態によれば、そのような活性は、ＩＬ６、ＩＬ１３及び／又はＨＧＦのものである。
【０１３１】
これらの分子のいずれかの活性の阻害は、これらのリガンドに対する抗体、又はこれらのリガンドに結合してそれらの機能を妨げる「デコイ」とも呼ばれる可溶性受容体を使用して行うことができる。
【０１３２】
典型的には、そのような可溶性受容体は、受容体分子の細胞外部分を含み、膜貫通ドメイン（複数の場合がある）及び細胞質ドメイン（複数の場合がある）を欠いている。
【０１３３】
ＨＧＦの受容体はｃ−Ｍｅｔ受容体である。
【０１３４】
ＩＬ６の受容体は、ＣＤ１２６としても知られるインターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）である。
【０１３５】
ＩＬ１３の受容体はインターロイキン１３受容体である。
【０１３６】
ｃ−ＭＥＴ、ＩＬ６Ｒ及びＩＬ１３Ｒの小分子阻害剤は当技術分野で周知であり、いくつかはすでに臨床使用されている。ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の例には、クラスＩ及びクラスＩＩのＡＴＰ競合性小分子ｃ−Ｍｅｔ阻害剤、例えば、ＪＮＪ−３８８７７６０５、ＰＦ−０４２１７９０３、ＸＬ８８０、フォレチニブ及びＡＭＧ４５８と並んで、チバンチニブ（ＡＲＱ１９７）等のＡＴＰ−非競合的小分子ｃ−Ｍｅｔ阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。ＩＬ６Ｒ阻害剤（例えば、抗体、トシリズマブ、サリルマブ）、ＩＬ６の小分子阻害剤の例は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３０１９６９０号に教示されている。ＩＬ１３Ｒ阻害剤の例はＡＳＬＡＮ００４である。
【０１３７】
特定の組織への特異性を確保するために（必要な場合）、薬剤は、例えば組織マーカーに向けられるか、又は例えば肺活動のために、例えば鼻腔内投与のために局所的に投与される特定の送達ビヒクルを伴うことができる。投与方法は以下に記載されている。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「枯渇」は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上、さらには所望の細胞のＦＡＣＳによって決定される完全な除去を指し、それらの細胞は肺表現型の好塩基球又はＭ２マクロファージである。
ＲＮＡの発現レベルを検出する方法
【０１３９】
本発明のいくつかの実施形態の細胞におけるＲＮＡの発現レベルは、当技術分野で知られている方法を使用して決定することができる。
【０１４０】
ノーザンブロット分析：この方法は、ＲＮＡ混合物中の特定のＲＮＡを検出することを含む。ＲＮＡサンプルは、塩基対間の水素結合を防ぐ薬剤（ホルムアルデヒド等）で処理することにより変性され、すべてのＲＮＡ分子が折りたたまれていない線形コンフォメーションを持つようにする。次に、個々のＲＮＡ分子を、ゲル電気泳動によってサイズに応じて分離し、変性ＲＮＡが付着するニトロセルロース又はナイロンベースのメンブレンに転写する。次に、メンブレンを標識ＤＮＡプローブに曝露する。プローブは、放射性同位元素又は酵素結合ヌクレオチドを使用して標識することができる。検出には、オートラジオグラフィー、比色反応、又は化学発光を使用できる。この方法により、特定のＲＮＡ分子の量の定量、及び電気泳動中のゲル内の移動距離を示す膜上の相対位置によるその同一性の決定の両方が可能になる。
【０１４１】
ＲＴ−ＰＣＲ分析：この方法では、比較的まれなＲＮＡ分子のＰＣＲ増幅を使用する。まず、ＲＮＡ分子を細胞から精製し、逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ等）、及びオリゴｄＴ、ランダムヘキサマー又は遺伝子特異的プライマー等のプライマーを使用して相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換する。次に、遺伝子特異的プライマー及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを適用することにより、ＰＣＲ増幅反応がＰＣＲ機器で実行される。当業者は、特定のＲＮＡ分子を検出するのに適した遺伝子特異的プライマーの長さ及び配列、並びにＰＣＲ条件（すなわち、アニーリング温度、サイクル数等）を選択することができる。ＰＣＲサイクルの数を調整し、増幅産物を既知の対照と比較することにより、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応を使用できることが理解されよう。
【０１４２】
ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション染色：この方法では、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブが細胞内に存在するＲＮＡ分子に付着する。一般に、細胞を最初に顕微鏡スライドに固定して細胞構造を維持し、ＲＮＡ分子が分解されるのを防ぎ、次に標識プローブを含むハイブリダイゼーションバッファーに供される。ハイブリダイゼーションバッファーは、プローブの非特異的結合を回避しながら、ｉｎ  ｓｉｔｕでそれらの標的ｍＲＮＡ分子とのＤＮＡ又はＲＮＡプローブの特異的ハイブリダイゼーションを可能にするホルムアミド及び塩（例えば、塩化ナトリウム及びクエン酸ナトリウム）等の試薬を含む。当業者は、特定のプローブ及び細胞のタイプに合わせて、ハイブリダイゼーション条件（すなわち、温度、塩及びホルムアミドの濃度等）を調整することができる。ハイブリダイゼーションに続いて、結合していないプローブを洗い流し、結合したプローブを既知の方法を使用して検出する。例えば、放射性標識プローブが使用される場合であれば、スライドは、放射性標識プローブを使用して生成されたシグナルを明らかにする写真乳剤に供される。プローブが酵素で標識されている場合であれば、比色反応を形成するために酵素特異的基質が追加される。プローブが蛍光標識を使用して標識されている場合であれば、結合したプローブは蛍光顕微鏡を使用して明らかにされる。プローブがタグ（例えば、ジゴキシゲニン、ビオチン等）を使用して標識されている場合であれば、結合したプローブは、既知の方法を使用して検出できるタグ特異的抗体との相互作用に続いて検出することができる。
【０１４３】
Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ染色：この方法は、Ｎｕｏｖｏ  ＧＪ，ｅｔ  ａｌ．［Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｃＤＮＡ．Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９３，１７：６８３−９０］、及びＫｏｍｍｉｎｏｔｈ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．［Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｒｃｈｉｖａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｂｉｏｐｓｉｅｓ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）ａｎｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ．Ｐａｔｈｏｌ  Ｒｅｓ  Ｐｒａｃｔ．１９９４，１９０：１０１７−２５］に記載されている。簡単に説明すると、ＲＴ−ＰＣＲ反応は、標識ヌクレオチドをＰＣＲ反応に組み込むことにより、固定した細胞に対して実施される。反応は、Ａｒｃｔｕｒｕｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（カリフォルニア州マウンテンビュー）から入手可能なレーザーキャプチャーマイクロダイセクションＰｉｘＣｅｌｌ  Ｉ  ＬＣＭシステム等の特定のｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ装置を使用して行われる。
タンパク質の発現及び／又は活性を検出する方法
【０１４４】
本発明のいくつかの実施形態の培養物の細胞において発現されるタンパク質の発現及び／又は活性レベルは、当技術分野で知られている方法を使用して決定され得る。
【０１４５】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）：この方法は、タンパク質基質を含むサンプル（固定細胞やタンパク質溶液等）をマイクロタイタープレートのウェル等の表面に固定することを含む。酵素に結合した基質特異的抗体が適用され、基質に結合することができる。次に、抗体の存在は、抗体に結合した酵素を使用する比色反応によって検出及び定量化される。この方法で一般的に使用される酵素には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼが含まれる。適切に較正され、応答の線形範囲内にある場合、サンプルに存在する基質の量は、生成される色の量に比例する。基質標準は、一般的に定量精度を向上させるために使用される。
【０１４６】
ウエスタンブロット：この方法は、アクリルアミドゲルを使用して基質を他のタンパク質から分離した後、基質をメンブレン（ナイロン又はＰＶＤＦ等）に転写することを含む。次に、基質の存在を、基質に特異的な抗体によって検出し、次いで抗体結合試薬によって検出する。抗体結合試薬は、例えば、プロテインＡ又は他の抗体であり得る。抗体結合試薬は、上記のように放射性標識又は酵素結合され得る。検出は、オートラジオグラフィー、比色反応、又は化学発光によるものであり得る。この方法により、基質の定量、及び電気泳動中のゲル内の移動距離を示す膜上の相対位置によるその同一性の決定の両方が可能になる。
【０１４７】
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）：あるバージョンでは、この方法は、アガロースビーズ等の沈殿可能な担体上に固定化された特異的抗体及び放射性標識抗体結合タンパク質（例えば、Ｉ１２５で標識されたプロテインＡ）を用いて、目的のタンパク質（すなわち、基質）を沈殿させることを含む。沈殿したペレットのカウント数は、基質の量に比例する。
【０１４８】
ＲＩＡの代替バージョンでは、標識された基質及び標識されていない抗体結合タンパク質が使用される。未知の量の基質を含むサンプルがさまざまな量で追加される。標識された基質からの沈殿数の減少は、添加されたサンプル中の基質の量に比例する。
【０１４９】
蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）：この方法は、基質特異的抗体による細胞内での基質のｉｎ  ｓｉｔｕ検出を含む。基質特異的抗体はフルオロフォアに結合している。検出は、各細胞が光線を通過するときに放出される光の波長を読み取る細胞選別機によって行われる。この方法は、２つ以上の抗体を同時に使用することができる。
【０１５０】
免疫組織化学的分析：この方法は、基質特異的抗体による固定細胞における基質のｉｎ  ｓｉｔｕ検出を含む。基質特異的抗体は、酵素結合又はフルオロフォアに結合され得る。検出を、顕微鏡検査、及び主観的な又は自動の評価によって行う。酵素結合抗体を使用する場合は、比色反応が必要になる場合がある。免疫組織化学の後に、例えばヘマトキシリン又はギムザ染色を使用した細胞核の対比染色がしばしば続くことが理解されよう。
【０１５１】
本明細書に記載の方法のいずれかによって得られるｅｘ−ｖｉｖｏ又はｉｎ−ｖｉｔｒｏの細胞又は細胞集団もまた、本発明のいくつかの実施形態により企図される。本発明のいくつかの実施形態に従って得られた細胞集団は、生理学的環境で見られるものよりも高い純度のレベルを特徴とする（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の細胞が、例えば好塩基球、又はそこから分化した細胞若しくはマクロファージ等の目的の細胞である）。
【０１５２】
述べたように、記載された方法のいずれも、ｅｘ−ｖｉｖｏ又はｉｎ−ｖｉｖｏで実施することができる。
【０１５３】
Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージのバランスを調整する能力により、本発明の教示を治療に活かすことができる。
【０１５４】
したがって、本発明の一態様によれば、それを必要とする対象において、Ｍ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療する方法が提供され、該方法は、
（ａ）ＩＬ３３及び／又はＧＭ−ＳＣＦの存在下で好塩基球を培養すること、並びに
（ｂ）培養後、治療有効量の好塩基球を対象に投与し、
それにより、対象においてＭ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療すること、を含む。
【０１５５】
別の態様によれれば、それを必要としている対象において、Ｍ２／Ｍ１マクロファージ比を増加することから利益を得ることができる疾患又は障害の治療において使用するための、ＩＬ３３及び／又はＧＭ−ＳＣＦの存在下で培養することによって生成された治療有効量の好塩基球が提供される。
【０１５６】
別の態様によれば、それを必要とする対象において、Ｍ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療する方法であって、ＩＬ６、ＩＬ１３、及びＨＧＦからなる群から選択される治療有効量のシグナル伝達分子を対象に投与し、それにより、対象のＭ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害を治療すること、を含む、方法が提供される。
【０１５７】
別の態様によれば、対象においてＭ２／Ｍ１マクロファージ比を増加させることから利益を得ることができる疾患又は障害の治療に使用するための、ＩＬ６、ＩＬ１３及びＨＧＦからなる群から選択される治療有効量のシグナル伝達分子が提供される。
【０１５８】
本明細書で使用される場合、「対象」は、Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比の増加から利益を得ることができる疾患若しくは障害、又はＭ２／Ｍ１マクロファージ比の増加から利益を得ることができる疾患若しくは障害に苦しむ対象を指す。あるいは、対象はそのような疾患又は障害を発症するリスクがある。
【０１５９】
好塩基球を投与する場合、細胞は自家、非自家、同種、同系、又は異種（必要に応じて適切な免疫抑制を伴う）であり得る。
【０１６０】
本明細書で使用される「Ｍ２／Ｍ１マクロファージ比の増加から利益を得ることができる疾患又は障害」は、炎症誘発性サイトカインの分泌によって証明されるような免疫系を抑制することによって改善することができる疾患又は障害（全体としての病状）を指す。
【０１６１】
これには通常、炎症、自己免疫、又は傷害が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６２】
本明細書で使用される「炎症性疾患」という用語は、サイトカイン、ケモカイン又は炎症性細胞（例えばマクロファージ）の活性によって部分的に媒介される、病原体、損傷細胞、身体的損傷又は刺激物等の有害な刺激に対する急性又は慢性の限局性又は全身性応答を指し、ほとんどの場合、痛み、発赤、腫れ、及び組織機能の障害を特徴とする。炎症性疾患は、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、肺炎、敗血症性ショック、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷、誤嚥性肺炎、感染症、膵炎、細菌血症、腹膜炎、腹部膿瘍、外傷による炎症、手術による炎症、慢性炎症性疾患、虚血、臓器又は組織の虚血再灌流障害、疾患による組織損傷、化学療法又は放射線療法による組織損傷、及び摂取、吸入、注入、注射又は送達された物質に対する反応、糸球体腎炎、腸感染症、日和見感染症、並びに大規模な手術又は透析を受けている対象、免疫不全の対象、免疫抑制剤を摂取している対象、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの対象、心内膜炎が疑われる対象、発熱のある対象、原因不明の発熱のある対象、嚢胞性線維症、糖尿病の対象、慢性腎不全の対象、気管支拡張症の対象、慢性閉塞性肺疾患の対象、慢性気管支炎、気腫又は喘息の対象、熱性好中球減少症の対象、髄膜炎の対象、敗血症性関節炎の対象、尿路感染症の対象、壊死性筋膜炎の対象、他のグループＡ連鎖球菌感染症の疑いのある対象、脾臓切除術を受けた対象、再発性又は腸球菌感染症の疑いのある対象、感染リスクの増加に関連する他の医学的及び外科的状態、グラム陽性敗血症、グラム陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌性敗血症、髄膜炎菌血症、ポンプ後症候群（ｐｏｓｔ−ｐｕｍｐ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心臓スタン症候群、脳卒中、うっ血性心不全、肝炎、喉頭蓋炎（ｅｐｉｇｌｏｔｉｔｔｉｓ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ０１５７：Ｈ７、マラリア、ガス壊疽、毒素性ショック症候群、子癇前症、子癇、ＨＥＬＰ症候群、マイコバクテリアによる結核（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、カリニ性肺炎（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｃ  ｃａｒｉｎｉｉ）、肺炎、リーシュマニア症、溶血性尿毒症症候群／血栓性血小板減少性紫斑病、デング出血熱、骨盤炎症性疾患、レジオネラ、ライム病、インフルエンザＡ、エプスタイン−バーウイルス（ｐｅｌｖｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）、脳炎、炎症性疾患及び自己免疫疾患（関節リウマチ、骨関節炎、進行性全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、特発性肺線維症、サルコイドーシス、過敏性肺炎、全身性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、心臓、肝臓、肺腎臓骨髄を含む移植、移植片対宿主病、移植片拒絶、鎌状赤血球貧血、ネフローゼ症候群、ＯＫＴ３等の薬剤の毒性、サイトカイン療法、クリオピリン関連周期熱症候群及び肝硬変を含む）からなる群から選択され得る。
【０１６３】
本明細書で使用される場合、「自己免疫疾患」は、個体自身の組織から生じ、それを対象とする疾患又は障害である。自己免疫疾患の例としては、限定されるものではないが、アディソン病、アレルギー、円形脱毛症、アルツハイマー病、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群（ヒューズ症候群）、関節炎、喘息、粥状動脈硬化、動脈硬化巣、自己免疫疾患（例えば、ループス、ＲＡ、ＭＳ、グレイブス病等）、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、無精子症、ベーチェット病、バーガー病、水疱性類天疱瘡、心筋症、心血管疾患、セリアック病／コアリアック病、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＰＤ）、慢性再発性多発ニューロパチー（ギラン−バレ症候群）、チャーグ−ストラウス症候群（ＣＳＳ）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症（ＣＡＤ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、皮膚炎、ヘルペス、皮膚筋炎、糖尿病、円盤状ループス、湿疹後天性表皮水疱症、本態性混合型クリオグロブリン血症、エヴァン症候群、眼球突出（Ｅｘｏｐｔｈａｌｍｏｓ）、線維筋痛症、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、免疫増殖性疾患又は障害（例えば、乾癬）、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、間質性肺疾患、若年性糖尿病、若年性関節炎、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、川崎病、ランバート−イートン筋無力症候群、扁平苔癬、ループス、ループス腎炎、リンパ球性下垂体炎（Ｌｙｍｐｈｏｓｃｙｔｉｃ  Ｌｙｐｏｐｈｉｓｉｔｉｓ）、メニエール病／急性播種性脳脊髄神経根障害、混合性結合組織病、多発性硬化症（ＭＳ）、筋肉リウマチ、筋痛性脳脊髄炎（ＭＥ）、重症筋無力症、
眼の炎症、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発軟骨炎、多腺性症候群（Ｐｏｌｙｇｌａｎｄｕｌａｒ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）（ウィタカー症候群）、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変／自己免疫性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群／反応性関節炎、再狭窄、リウマチ熱、リウマチ性疾患、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強皮症、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ’ｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、スティフ・マン症候群、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、全身性硬化症、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、甲状腺炎、１型糖尿病、２型糖尿病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、及びウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０１６４】
本明細書で使用される「Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比の増加から利益を得ることができる疾患又は障害」は、炎症誘発性サイトカインの分泌によって証明されるような免疫系を活性化することによって改善することができる疾患又は障害（全体としての病状）を指す。
【０１６５】
そのようなものは、典型的には、癌、例えば、転移性癌、例えば特発性肺線維症（ＩＰＦ）等の進行性線維性疾患、肝線維症、全身性硬化症、アレルギー及び喘息、アテローム性動脈硬化症及びアルツハイマー病、肺線維症、肝臓線維症が挙げられるが、これらに限定されない。特に、本発明の方法は、癌の治療に特に適している。本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、当技術分野でその一般的な意味を有し、固形腫瘍及び血液腫瘍（ｂｌｏｏｄ−ｂｏｒｎｅ  ｔｕｍｏｒｓ）を含むが、これらに限定されない。癌という用語には、皮膚、組織、臓器、骨、軟骨、血液及び血管の疾患が含まれる。「癌」という用語は、原発性癌及び転移性癌の両方をさらに包含する。本発明の方法及び組成物によって治療され得る癌の例としては、限定されるものではないが、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸管、歯茎、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、又は子宮に由来する癌細胞が挙げられる。加えて、癌は、これらに限定されるものではないが、具体的には以下の組織型であり得る：新生物、悪性；癌腫；癌腫、未分化；巨細胞及び紡錘細胞の癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛母癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌；肝細胞癌；肝細胞癌と胆管癌の混合型；小柱腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープにおける腺癌；腺癌、家族性大腸腺腫症；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞上皮腺癌；乳頭腺癌；色素嫌性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基球癌；明細胞腺癌；顆粒細胞がん；濾胞腺癌；乳頭状及び濾胞性腺癌；非被包性硬化性；副腎皮質癌；子宮内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢；腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤性導管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を伴う腺癌；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；アンドロブラストーマ、悪性；セルトリ細胞腫；ライディッヒ細胞腫、悪性；脂質細胞腫瘍（ｌｉｐｉｄ  ｃｅｌｌ  ｔｕｍｏｒ）、悪性；パラガングリオーマ、悪性；乳房外パラガングリオーマ（ｅｘｔｒａ−ｍａｍｍａｒｙ  ｐａｒａｇａｎｇｌｉｏｍａ）、悪性；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性黒色腫；無色素性メラノーマ；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑における悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胚性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質性肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚性癌腫；テラトーマ、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管周囲細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル���皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質星状細胞腫；原線維性星細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起膠芽細胞腫；原始神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅覚神経腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉症；その他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；及び有毛細胞白血病。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、骨への転移性癌の治療に特に適しており、転移性癌は、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、白血病及びリンパ腫を含む血球悪性腫瘍；頭頸部癌；食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管又は胆嚢の癌を含む消化管癌；卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌、及び子宮頸癌を含む女性生殖器の悪性腫瘍；膀胱癌；神経芽細胞腫を含む脳腫瘍；肉腫、骨肉腫；並びに悪性黒色腫又は扁平上皮癌を含む皮膚癌である。
【０１６６】
本発明のいくつかの実施形態の細胞又は薬剤（例えば、サイトカイン、成長因子、抗体）は、生物自体に、又は適切な担体又は賦形剤と混合される医薬組成物で投与することができる。
【０１６７】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、生理学的に適切な担体及び賦形剤等の他の化学成分を用いた、本明細書に記載の活性成分の１つ以上の調製物を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
【０１６８】
本明細書において、「有効成分」という用語は、生物学的効果に関与する細胞又は薬剤（例えば、サイトカイン、成長因子、抗体）を指す。
【０１６９】
以下、同じ意味で使用され得る「生理学的に許容可能な担体」及び「薬学的に許容可能な担体」という句は、生物に重大な刺激を引き起こさず、投与された化合物の生物学的活性及び特性を無効にしない担体又は希釈剤を指す。これらの句にはアジュバントが含まれる。
【０１７０】
本明細書では、「賦形剤」という用語は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の例としては、限定されるものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖及び様々な種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、並びにポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１７１】
薬物の処方及び投与のための技術は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡの最新版に見出すことができ、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７２】
適切な投与経路は、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に経鼻、腸、又は筋肉内、皮下及び髄内注射を含む、非経口送達と並んで、くも膜下腔内、直接心室内、心臓内、例えば、右心室若しくは左心室腔、一般的な冠状動脈内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、又は眼内の注射を含み得る。
【０１７３】
中枢神経系（ＣＮＳ）への薬物送達のための従来のアプローチとしては以下が挙げられる：脳神経外科戦略（例えば、脳内注射又は脳室内注入）；ＢＢＢの内因性輸送経路の１つを利用する試みにおける、薬剤の分子操作（例えば、それ自体がＢＢＢを通過することができない薬剤と組み合わせて内皮細胞表面分子に親和性を有する輸送ペプチドを含むキメラ融合タンパク質の産生）；薬剤の脂溶性を高めるように設計された薬理学的戦略（例えば、水溶性薬剤の脂質又はコレステロール担体への複合化）；及び高浸透圧破壊によるＢＢＢの完全性の一時的な破壊（頸動脈へのマンニトール溶液の注入又はアンギオテンシンペプチド等の生物学的に活性な薬剤の使用に起因する）。しかしながら、これらの戦略のそれぞれには、侵襲的外科手術に関連する固有のリスク、内因性輸送システムに固有の制限によって課されるサイズ制限、中枢神経系の外側で活動する可能性のあるキャリアモチーフで構成されるキメラ分子の全身投与に関連する潜在的に望ましくない生物学的副作用、及びＢＢＢが破壊されている脳の領域内での脳損傷のリスクの可能性等の制限があり、これらは最適ではない送達方法となる。
【０１７４】
あるいは、例えば、医薬組成物を患者の組織領域に直接注射することにより、全身的ではなく局所的な方法で医薬組成物を投与することができる。特定の実施形態によれば、局所治療は、鼻腔内投与等による肺への治療である。
【０１７５】
本明細書に記載の肺投与細胞又は薬剤。
【０１７６】
肺投与は、当業者に知られている適切な手段によって達成することができる。典型的には、肺投与は、吸入中に、送達デバイスから対象の口腔への生物学的活性物質の分配を必要とする。例えば、細胞又は薬剤を含む組成物は、使用される送達デバイスに応じて、医薬組成物の水性若しくは非水溶液又は懸濁液形態、あるいは固体又は乾燥粉末形態から得られるエアロゾル又は他の適切な調製物の吸入を介して投与される。そのような送達デバイスは当技術分野で周知であり、ネブライザー、定量吸入器、及び乾燥粉末吸入器、あるいは懸濁液又は固体若しくは乾燥粉末の形として医薬組成物を水溶液又は非水溶液として分配することを可能にする任意の他の適切な送達機構を含むが、これらに限定されない。中枢及び／又は末梢肺領域への直接送達を含む、肺投与を介して対象に細胞又は薬剤を送達するための方法には、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、定量吸入器（ＭＤＩ）デバイス、及びネブライザーが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７７】
「組織」という用語は、１つ以上の機能を実施するように設計された細胞からなる生物の一部を指す。例としては、限定されるものではないが、脳組織、網膜、皮膚組織、肝組織、膵臓組織、骨、軟骨、結合組織、血液組織、筋肉組織、心臓組織、脳組織、血管組織、腎組織、肺組織、性腺組織、造血組織が挙げられる。
【０１７８】
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物は、当技術分野で周知のプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠形成、研和（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥のプロセスによって製造され得る。
【０１７９】
そのため、本発明のいくつかの実施形態に従って使用するための医薬組成物は、有効成分を薬学的に使用できる調製物に加工することを容易にする賦形剤及び助剤を含む１つ以上の生理学的に許容可能な担体を使用して従来の方法で製剤化され得る。適切な製剤は、選択される投与経路によって異なる。
【０１８０】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水等の生理学的に適合性のあるバッファーにおいて製剤化され得る。経粘膜投与では、浸透するバリアに適した浸透剤を製剤化において使用する。そのような浸透剤は、当技術分野で一般的に知られている。
【０１８１】
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物を当技術分野で周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって容易に製剤化され得る。そのような担体は、患者による経口摂取のために、医薬組成物を錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として処方することを可能にする。経口使用のための薬理学的調製物は、固体賦形剤を使用して作製でき、任意に、得られた混合物を粉砕し、必要に応じて適切な助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して、錠剤又は糖衣錠コアを得ることができる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖；例えば、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、馬鈴薯澱粉、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロース等のセルロース調製物；及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の生理学的に許容可能なポリマー等の充填剤である。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、若しくはアルギン酸等の崩壊剤、又はアルギン酸ナトリウム等のそれらの塩を添加することができる。
【０１８２】
糖衣錠コアには適切なコーティングが施されている。この目的のために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、及び適切な有機溶媒又は溶媒混合物を任意に含み得る濃縮糖溶液を使用することができる。染料又は顔料は、識別のために、又は活性化合物の用量の異なる組み合わせを特徴づけるために、錠剤又は糖衣錠コーティングに添加され得る。
【０１８３】
経口的に使用できる医薬組成物には、ゼラチンで作られたプッシュフィットカプセルと並んで、ゼラチン、及びグリセロール又はソルビトール等の可塑剤で作られた柔らかく密封されたカプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、ラクトース等の充填剤、デンプン等の結合剤、タルク又はステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、及び任意に安定剤と混合した有効成分を含み得る。ソフトカプセルでは、有効成分は、脂肪油、流動パラフィン、又は液体ポリエチレングリコール等の適切な液体に溶解又は懸濁され得る。さらに、安定剤を加えることができる。経口投与用のすべての製剤は、選択した投与経路に適した投与量でなければならない。
【０１８４】
頬側投与の場合、組成物は、従来の方法で処方された錠剤又はトローチの形態をとることができる。
【０１８５】
経鼻吸入による投与の場合、本発明のいくつかの実施形態による使用のための有効成分は、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン又は二酸化炭素を使用した、加圧パック又はネブライザーからのエアロゾルスプレー提示の形態で簡便に送達される。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定することができる。ディスペンサーで使用するための例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジは、化合物の粉末混合物、及びラクトース又はデンプン等の適切な粉末ベースを含むように処方することができる。
【０１８６】
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、ボーラス注射又は連続注入による非経口投与用に処方することができる。注射用製剤は、単位剤形で、例えば、アンプルで、又は任意に防腐剤を添加した複数回投与容器で提示することができる。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又は乳濁液であり得、そして懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤等の配合剤を含み得る。
【０１８７】
非経口投与用の医薬組成物には、水溶性形態の活性製剤の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁液は、適切な油性又は水ベースの注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油等の脂肪油、又はオレイン酸エチル、トリグリセリド若しくはリポソーム等の合成脂肪酸エステルが含まれる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストラン等の懸濁液の粘度を増加させる物質を含み得る。必要に応じて、懸濁液はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために有効成分の溶解度を増加させる適切な安定剤又は薬剤を含み得る。
【０１８８】
あるいは、有効成分は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、無菌のパイロジェンフリーの水ベースの溶液により構成するための粉末形態であり得る。
【０１８９】
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物はまた、例えば、カカオバター又は他のグリセリド等の従来の坐剤ベースを使用して、坐剤又は保持浣腸等の直腸組成物に処方され得る。
【０１９０】
本発明のいくつかの実施形態の文脈での使用に適した医薬組成物には、有効成分が意図された目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物が含まれる。より具体的には、治療有効量とは、障害の症状を予防、緩和若しくは改善する（例えば、上記のように）、又は治療されている対象の生存を延長するのに有効な有効成分（細胞又は薬剤（例えば、サイトカイン、成長因子、抗体））の量を意味する。
【０１９１】
治療有効量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示に照らして、当業者の能力の範囲内である。
【０１９２】
本発明の方法で使用される任意の調製物について、治療有効量又は用量は、最初にｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、用量は、所望の濃度又は力価を達成するために動物モデルで処方することができる。このような情報をヒトの有用な用量をより正確に決定するために使用できる。
【０１９３】
本明細書に記載の有効成分の毒性及び治療効果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、細胞培養又は実験動物における標準的な製薬手順によって決定することができる。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び細胞培養アッセイ、並びに動物実験から得られたデータは、ヒトで使用するための投与量の範囲を策定する際に使用することができる。投与量は、使用される剤形及び利用される投与経路に応じて変化し得る。正確な処方、投与経路、及び投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる。（例えば、“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，第１章第１頁のＦｉｎｇｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９７５を参照）。
【０１９４】
投与量及び間隔は、有効成分の有効（例えば、肺組織）レベルが生物学的効果（最小有効濃度、ＭＥＣ）を誘導又は抑制するのに十分であるように個別に調整され得る。ＭＥＣは調製ごとに異なるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータから推定できる。ＭＥＣするために必要な投与量は、個々の特性及び経路によって異なる。血漿濃度を決定するために検出アッセイを使用することができる。
【０１９５】
治療される状態の重症度及び応答性に応じて、投薬は、単回又は複数回の投与であり得、治療の過程は、数日から数週間、又は治癒がもたらされるか、若しくは病状の減少が達成されるまで続く。
【０１９６】
投与される組成物の量は、もちろん、治療される対象、苦痛の重症度、投与の方法、処方する医師の判断等に依存するであろう。
【０１９７】
本発明のいくつかの実施形態の組成物は、必要に応じて、有効成分を含む１つ以上の単位剤形を含み得る、ＦＤＡ承認キット等のパック又はディスペンサーデバイスで提示され得る。パックは、例えば、ブリスターパック等の金属又はプラスチック箔を含み得る。パック又はディスペンサーデバイスには、投与手順が添付されている場合がある。パック又はディスペンサーは、医薬品の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の容器に関連する通知によって適応させることもでき、この通知は、組成物、又はヒト若しくは動物用の投与の形態の機関による承認を反映している。このような通知は、例えば、処方薬について米国食品医薬品局によって承認されたラベル、又は承認された製品挿入物に関するものである可能性がある。適合性のある薬学的担体に処方された本発明の調製物を含む組成物もまた、調製され、適切な容器に入れられ、そして上でさらに詳述されるように、指定の状態の治療用に標識され得る。
【０１９８】
「治療する」という用語は、病状（疾患、障害又は状態）の発症を阻害、予防若しくは阻止すること、及び／又は病状の軽減、寛解若しくは退行を引き起こすことを指す。当業者は、様々な方法論及びアッセイを使用して病状の進展を評価することができ、同様に、様々な方法論及びアッセイを使用して、病状の減少、寛解又は退行を評価できることを理解するであろう。
【０１９９】
本明細書で使用される場合、「予防する」という用語は、疾患のリスクがある可能性があるが、まだ疾患を有すると診断されていない対象において、疾患、障害又は状態が発生しないようにすることを指す。
【０２００】
本明細書で使用される場合、「治療レジメン」という句は、治療のタイプ、投与量、スケジュール、及び／又はそれを必要とする対象（例えば、病態を診断された対象）に提供される治療の期間を指定する治療計画を指す。選択される治療レジメンは、最良の臨床転帰（例えば、病状の完全な治癒）をもたらすと予想される積極的なもの、又は病状の症状を軽減するが病状の不完全な治癒をもたらす可能性があるより穏やかなものであり得る。特定の場合において、より積極的な治療レジメンは、対象へのいくらかの不快感又は有害な副作用（例えば、健康な細胞又は組織への損傷）と関連し得ることが理解されるであろう。治療の種類には、外科的介入（例えば、病変、病変細胞、組織、又は臓器の除去）、細胞補充療法、局所モード又は全身モードの治療薬（例えば、受容体アゴニスト、アンタゴニスト、ホルモン、化学療法剤）の投与、外部ソース（例えば、外部ビーム）及び／又は内部ソース（例えば、密封小線源治療）及び／又はそれらの任意の組み合わせを使用する放射線療法への曝露が含まれ得る。治療の投与量、スケジュール及び期間は、病状の重症度及び選択された治療のタイプに応じて変化し得、当業者は、治療の投与量、スケジュール及び期間で治療のタイプを調整することができる。
【０２０１】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、±１０％を指す。
【０２０２】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語及びそれらの複合体は、「含むがこれらに限定されない」を意味する。
【０２０３】
「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、「含む、及び限定される」ことを意味する。
【０２０４】
「本質的にからなる」という用語は、組成物、方法又は構造が追加の成分、工程及び／又は部品を含み得るが、追加の成分、工程及び／又は部品が特許請求の範囲の組成物、方法、若しくは構造の基本的及び新規の特性を実質的に変更しない場合に限り、を意味する。
【０２０５】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の参照を含む。例えば、「化合物」又は「少なくとも１つの化合物」という用語は、それらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。
【０２０６】
本出願を通して、本発明の様々な実施形態は、範囲形式で提示され得る。範囲形式での説明は、単に便宜上及び簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく、すべての可能なサブレンジを具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、１〜６等の範囲の記述は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等と並んで、その範囲内の個々の番号、例えば１、２、３、４、５、及び６等のサブレンジを具体的に開示していると見なされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【０２０７】
本明細書で数値範囲が示されるときはいつでも、示された範囲内の引用された数字（分数又は整数）を含むことを意味する。第１の表示番号と第２の表示番号との間の「範囲／その間の範囲」及び第１の表示番号から第２の表示番号までの「範囲／その範囲」という句は、本明細書では同じ意味で使用され、第１及び第２の表示番号、並びにそれらの間のすべての分数及び整数を含むことを意味する。
【０２０８】
本明細書で使用される場合、「方法」という用語は、所与のタスクを達成するための様式、手段、手法及び手順を指し、限定されるものではないが、化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の専門家に知られているか、又は彼らによって既知の様式、手段、手法及び手順から容易に開発されるそれらの様式、手段、手法及び手順を含む。
【０２０９】
本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、状態の進行を無効にする、実質的に阻害する、遅らせる若しくは逆転させる、状態の臨床的若しくは審美的症状を実質的に改善する、又は状態の臨床的若しくは審美的症状の出現を実質的に防止することを含む。
【０２１０】
特定の配列表を参照する場合、そのような参照は、例えば、配列決定エラー、クローニングエラー、又は塩基置換、塩基欠失若しくは塩基付加をもたらす他の変更に起因するマイナーな配列変異を含むものとして、その相補的配列に実質的に対応する配列も包含すると理解されるものとするが、ただし、そのような変異の頻度は、５０ヌクレオチドに１未満、あるいは１００ヌクレオチドに１未満、あるいは２００ヌクレオチドに１未満、あるいは５００ヌクレオチドに１未満、あるいは、１０００ヌクレオチドに１未満、あるいは５，０００ヌクレオチドに１未満、あるいは１０，０００ヌクレオチドに１未満である。
【０２１１】
明確にするために、別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴もまた、単一の実施形態で組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明される本発明の様々な特徴はまた、別個に、又は任意の適切なサブコンビネーションで、又は本発明の他の任意の説明された実施形態に適したものとして提供され得る。様々な実施形態の文脈で説明される特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしでは動作しない場合を除いて、それらの実施形態の本質的な特徴と見なされるべきではない。
【０２１２】
上記に描写され、以下の特許請求の範囲に記載されている本発明の様々な実施形態及び態様は、以下の実施例において実験的裏付けを見出す。
【実施例】
【０２１３】
ここで、以下の実施例を参照すれば、これらの実施例は、上記の説明と共に、本発明のいくつかの実施形態を非限定的な方法で示している。
【０２１４】
一般に、本明細書で使用される命名法及び本発明で利用される実験手順には、分子的、生化学的、微生物学的及び組換えＤＮＡ技術が含まれる。このような手法は、文献で詳しく説明されている。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）“Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、及び同第５，２７２，０５７号に記載される方法論；“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；“Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”ｂｙ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ“Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），”Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ“（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；利用可能な免疫アッセイは、特許及び科学文献に広範に記載さており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号、同第３，８３９，１５３号、同第３，８５０，７５２号、同第３，８５０，５７８号、同第３，８５３，９８７号、同第３，８６７，５１７号、同第３，８７９，２６２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、同第４，０９８，８７６号、同第４，８７９，２１９号、同第５，０１１，７７１号、及び同第５，２８１，５２１号；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔ��ｅｓｉｓ”Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；”Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ“ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ“Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）ａｎｄ“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ“ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい。これらはすべて本明細書に完全に記載されているかのように参照することによって組み込まれる。その他の一般的な参照が、この文書全体で提供されている。その中の手順は当技術分野でよく知られていると考えられており、読者の便宜のために提供されている。そこに含まれるすべての情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１５】
材料及び方法
マウス
性別及び年齢を一致させたＭｃｐｔ８−Ｃｒｅ＋／−ＤＴＡｆｌ／＋及びＭｃｐｔ８−Ｃｒｅ＋／−ＤＴＡ＋／＋同腹仔対照を使用した。ＹＦＰを発現するＭｃｐｔ８−Ｃｒｅ（Ｂ６．１２９−Ｍｃｐｔ８ｔｍ１（Ｃｒｅ）Ｌｋｓｙ／Ｊ）（Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１））及びＤＴＡ（Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１（ＤＴＡ）Ｌｋｙ／Ｊ）（Ｖｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）マウスはスタンフォード大学のＳｔｅｐｈｅｎ  Ｇａｌｌｉから提供され、元々はジャクソン研究所から入手されたものであった。Ｉｌ１ｒｌ１−／−（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）マウスは、ケンブリッジＭＲＣ分子生物学研究所のＡｎｄｒｅｗ  ＭｃＫｅｎｚｉｅから提供された。これらのマウスはすべて、特定病原体除去条件下でウィーン医科大学の動物施設で飼育及び維持された。すべての実験はオーストリアの法律に従って実施され、オーストリア連邦科学研究省（ＢＭＷＦＷ−６６．００９／０１４６−ＷＦ／Ｖ／３ｂ／２０１５）によって承認された。Ｃ５７ＢＬ／６  ＷＴ妊娠、新生仔、成体マウスをＨａｒｌａｎから入手した。マウスをワイツマン科学研究所の動物繁殖センターにおいて特定病原体除去条件下で飼育した。すべての動物は、施設内動物管理使用委員会によって策定された規則に従って取り扱われた。
【０２１６】
腫瘍細胞株
Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞を、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１ｍＭ  ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を添加したＤＭＥＭで維持した。細胞を、加湿した５％ＣＯ２雰囲気で３７℃で培養した。
【０２１７】
方法の詳細
肺の解離及び単一細胞ソーティング
単一細胞実験を、Ｅ１２．５、Ｅ１６．５、Ｅ１８．５、及びＥ１９．５のマウス胎児肺、並びにＰＮの１、６、７、１０、１６、３０時間、２日及び７日の新生仔肺、また成体マウスの肺（８〜１２週齢）に対して実施した。一般に、胚実験は１匹の同腹児のプールされた兄弟肺で行われた（Ｅ１２．５では６つの肺がプールされ、Ｅ１６．５、Ｅ１８．５、Ｅ１９．５では３つの肺がプールされ、ＰＮ時点では２つの肺がプールされ、成人の肺の場合、サンプルはプールされなかった）。胚は凍結した表面に置くことによって安楽死させたが、ＰＮ及び成体マウスは麻酔の過剰摂取によって犠牲にした。Ｅ１２．５を除くすべての時点で、肺を解剖する前に、右心室から冷ＰＢＳを注射してマウスを灌流した。肺組織をマウスから解剖し、肺解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して半分の組織をホモジナイズし、単一細胞プロトコルに適合させたため、酵素インキュベーションを１５分間持続させた（８週間の成体マウスの場合、酵素消化は２０分間持続させた）。以前に考証されているように（Ｔｒｅｕｔｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、肺の残りの半分を解離し、エラスターゼ（３Ｕ／ｍｌ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）及びＤＮａｓｅ（０．３３Ｕ／ｍｌ／Ｓｉｇｍａ−Ａｄｒｉｃｈ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を細胞に短時間添加し、３７℃で１５分間頻繁に攪拌しながらインキュベートした。次に、１０％ＦＢＳ、１Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１Ｕｍｌストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を添加した等量のＤＭＥＭ／Ｆ１２を単細胞懸濁液に添加した。解離後、同じ肺の単細胞懸濁液をあわせ、４００ｇ、５分、４℃で遠心分離した。すべてのサンプルを７０μｍナイロンメッシュフィルターで濾過し、氷冷ソーティングバッファー（０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８及び０．５％ＢＳＡを添加したＰＢＳ）に入れた。
【０２１８】
肺解離プロトコルの較正のために、成体マウスの肺に由来する細胞に以下を添加した。１）リベラーゼ（５０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＤＮａｓｅ（１μｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ）を含むＤＭＥＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）；２）コラゲナーゼＩＶ（１ｍｇ／ｍｌ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）及びディスパーゼ（２．４Ｕ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳ  Ｃａ＋Ｍｇ＋（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）；３）上記のように、エラスターゼ及びＤＮａｓｅを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；及び４）上記のように、肺解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ｂｉｏｔｅｃ）に由来する酵素。３７℃で２０分間頻繁に攪拌しながら酵素消化した後、１０％ＦＢＳ、１Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１Ｕｍｌストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を添加した等量のＤＭＥＭ、又はソーティングバッファーを、リベラーゼ及びコラゲナーゼ−ディスパーゼ処理からの単一細胞懸濁液にそれぞれ添加した。ＭＡＲＳ−ｓｅｑ分析のために、ダブレット及び赤血球を除外した後、すべての生細胞を選別した。各解離技術によって抽出された細胞の単一細胞分析は、細胞型の異なる分布を示した（図示していない）。次に、本発明者らは、解離酵素に由来する特定の細胞型を優先することなく、免疫及び非免疫コンパートメントから広範囲の細胞集団を抽出する研究のために解離プロトコルを選択した。したがって、研究に沿った肺消化は、上皮細胞及びＡＭの抽出につながるエラスターゼ消化と、免疫コンパートメントからのさまざまな細胞集団の抽出につながるｍｉｌｔｅｎｙｉキットプロトコルの組み合わせであった。重要なことに、これらの消化は、コラゲナーゼ−−ディスパーゼ及びリベラーゼ処理後に本発明者らが見出した内皮優勢のような、どの細胞型の優先度でも特徴づけられなかったが（図示していない）、単一細胞マップで観察される細胞のパーセンテージは、さまざまな肺解離法に依存している（図１Ｂ、２Ｂ〜Ｃ）。
【０２１９】
末梢血細胞の単離
末梢血細胞を２０μｌのヘパリンで懸濁し、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８及び０．５％ＢＳＡを添加したＰＢＳで洗浄した。細胞をｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（ＰＢＳと１：１の比率、Ｓｉｇｍａ−Ａｄｒｉｃｈ）で懸濁し、破壊も加速もせずに４６０ｇ、２０分、１０℃で遠心分離した。単核細胞のリング状の層を新しいチューブに移し、冷ＰＢＳで２回洗浄し、４００ｇ、５分、４℃で遠心分離し、４０μｍメッシュフィルターを通過させた後、氷冷ソーティングバッファーに懸濁した。
【０２２０】
腫瘍微小環境の解離
腫瘍微小環境から好塩基球を精製するために、１×１０６個の細胞を１００μｌのＰＢＳに懸濁し、８週間のマウスに皮下（ｓ．ｃ．）注射した。固形腫瘍を注射の１０日後に採取し、小片に切断し、ＤＮａｓｅ（１２．５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｄｒｉｃｈ）及びコラゲナーゼＩＶ（１ｍｇ／ｍｌ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０で懸濁した。ＧｅｎｔｌｅＭａｃｓ組織ホモジナイザー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で組織をホモジナイズし、３７℃で１０分間インキュベートした。機械的及び酵素的解離を２回行った後、細胞を洗浄し、赤血球溶解バッファー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＤＮａｓｅ（０．３３Ｕ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｄｒｉｃｈ）に懸濁し、室温で５分間インキュベートし、冷ＰＢＳで２回洗浄し、４０μｍメッシュフィルターを通過させ、４００ｇ、５分、４℃で遠心分離した後、氷冷ソーティングバッファーに再懸濁した。
【０２２１】
脾臓の解離
組織を８週齢の雌から採取し、アキュターゼ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｄｒｉｃｈ）で懸濁し、ＧｅｎｔｌｅＭａｃｓ組織ホモジナイザー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）でホモジナイズし、３７℃で１０分間頻繁に攪拌しながらインキュベートした。細胞を洗浄し、赤血球溶解バッファー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＤＮａｓｅ（０．３３Ｕ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｄｒｉｃｈ）に懸濁し、室温で３分間インキュベートし、冷ＰＢＳで２回洗浄し、４０μｍメッシュフィルターを通過させ、４００ｇ、５分、４℃で遠心分離した後、氷冷ソーティングバッファーに再懸濁した。
【０２２２】
肝臓の解離
肝臓からの好塩基球を、Ｓｅｇｌｅｎ（Ｓｅｇｌｅｎ，１９７３）の２段階コラゲナーゼ灌流法を修正して単離した。消化工程を、製造業者の指示に従って、Ｌｉｂｅｒａｓｅ（２０μｇ／ｍｌ；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して実行した。肝臓を細かく刻み、ＰＢＳで懸濁し、３０ｇ、５分、４℃で遠心分離した。上清を新しいチューブに集め（肝細胞を除去するため）、ＰＢＳで懸濁し、３０ｇ、５分、４℃で遠心分離した（この工程を２回繰り返した）。２回目の洗浄後、上清を新しいチューブに回収し、５００ｇ、５分、４℃で遠心分離し、氷冷ソーティングバッファーに再懸濁した。
【０２２３】
フローサイトメトリー及びソーティング
細胞集団を、ＳＯＲＰ−ａｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）又はＡｒｉａＦｕｓｉｏｎ装置（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）により選別した。以下の抗体を使用してサンプルを染色した：ｅＦ７８０コンジュゲート固定可能生存性色素、ｅＦｌｕｏｒ４５０コンジュゲートＴＥＲ−１１９、ＡＰＣコンジュゲートＣＤ４５、ＦＩＴＣコンジュゲートＣＤ１１７（ｃＫｉｔ）、及びＰｅｒＣＰＣｙ５．５コンジュゲートＦ４／８０はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入し、ＰｅｒＣＰ  Ｃｙ５．５コンジュゲートＦＣεＲａ１（ＭＡＲ１）、ＡＰＣ−Ｃｙ７コンジュゲートＬｙ６Ｇ、ＦＩＴＣコンジュゲートＣＤ３、ＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲートＣＤ１９、ＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲートＣＤ３１、ＡＰＣ−Ｃｙ７コンジュゲートＣＤ３２６、ＡＰＣ／Ｃｙ７コンジュゲートＴＥＲ−１１９、ＡＦ７００コンジュゲートＣＤ４５、パシフィックブルーコンジュゲートＣＤ４９ｂ、ＰＥコンジュゲートＦｃｅｒ１ａ、ＰＥ／Ｃｙ７コンジュゲートＣＤ１１７、ＦＩＴＣコンジュゲートＬｙ６Ｃ、ＰＥコンジュゲートＣＤ１１ｃ、ＢＶ６０５コンジュゲートＣＤ１１ｂ及びＢＶ６０５コンジュゲートＬｙ−６ＣはＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入し、ＦＩＴＣコンジュゲートＣＤ１１ＣはＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した。
【０２２４】
選別する前に、生／死細胞を評価するため細胞をＤＡＰＩ又は固定可能な生存性色素で染色し、４０μｍメッシュで濾過した。全免疫細胞集団の選別では、サンプルはＣＤ４５＋でゲートされ、全間質細胞の選別ではＣＤ４５−でゲートされ、好塩基球の分離では、ダブレット、死細胞と赤血球を除外した後、サンプルはＣＤ４５＋ＦＣεＲ１α＋ｃＫｉｔ−でゲートされた。各単一細胞のマーカーレベルを記録するために、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ  ７の「インデックスソーティング」機能を単一細胞ソーティング中にアクティブ化した。単一細胞の配列決定及び分析に続いて、各表面マーカーをゲノムワイド発現プロファイルにリンクした。ゲーティング戦略を最適化するためにこの方法論を使用した。単離された生細胞を、２μＬの溶解溶液及び単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑ用のバーコード付きポリ（Ｔ）逆転写（ＲＴ）プライマーを含む３８４ウェル細胞捕捉プレートに単一細胞ソーティングした（Ｊａｉｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。データ分析中、無細胞対照として、４つの空のウェルを各３８４ウェルプレートに保持した。選別後すぐに、各プレートをスピンダウンして細胞が溶解溶液に確実に浸るようにし、処理されるまで−８０℃で保存した。
【０２２５】
肺好塩基球によって発現される受容体のタンパク質レベルを評価するために、本発明者らは、ＰＥコンジュゲートＣＤ１３１（ＣＳＦ２Ｒｂ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、ＰＥ／Ｃｙ７コンジュゲートＩＬ−３３Ｒ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及びＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅコンジュゲートＣＤ４９ｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の細胞表面染色を行った。肺好塩基球によって発現されるリガンドの細胞内タンパク質レベルを評価するために、細胞を、１０％ＦＣＳ、１ｍＭ  ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、及びＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（１：１０００；ＩＬ−１３の場合、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州サンノゼ）又はＢｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ溶液（１：１０００、ＩＬ−６の場合、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０と共に、３７℃で２時間インキュベートして、細胞内サイトカインの発現を可能にし、細胞外分泌を防止した。Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキットを製造業者の指示（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州サンノゼ）に従って使用して、細胞を洗浄、固定、透過処理し、表面及び細胞内タンパク質を染色した。細胞内実験では、次の抗体を使用した：ＰＥコンジュゲートＩＬ−６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥコンジュゲートＩＬ−１３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、及び対応するアイソタイプ対照ＰＥコンジュゲートラットＩｇＧ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。ＢＤ  ＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）を使用して細胞を分析した。
【０２２６】
ＢＭ由来細胞の培養
ＢＭ前駆細胞を８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスから採取し、０．５×１０６細胞／ｍｌの濃度で培養した。ＢＭ−ＭΦ分化のために、ＢＭ培養物をＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下で８日間培養した。８日目に、細胞を冷ＰＢＳでこすり取り、９６ウェル平底組織培養プレートに１６時間再播種した。ＢＭ由来の好塩基球を分化させるために、ＢＭ培養物をＩＬ−３（３０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下で１０日間培養した。好塩基球を、ＣＤ１１７−集団（ｃＫｉｔ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）の磁気活性化細胞ソーティングによって濃縮し、９６ウェル平底組織培養プレートに１６時間再播種した。すべてのＢＭ培養を、１０％ＦＣＳ、１ｍＭ  ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００  ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を添加した標準培地ＲＰＭＩ−１６４０で行った。４日ごとにＢＭ培養物を分化因子Ｍ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）又はＩＬ−３（３０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。ＢＭ由来細胞の再播種後、共培養及び単培養細胞を０．５×１０６細胞／ｍｌ（共培養では１：１の比率）の濃度で播種し、ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）及び細胞生存のためのＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、細胞活性化のためのＩＬ３３（５０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）又はＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加した。
【０２２７】
ＢＭ好塩基球と、肺由来の単球及び未分化マクロファージとの共培養では、本発明者らは、３０時間ＰＮ肺からＣＤ４５＋ＣＤ１１５＋骨髄細胞を選別し、上記のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を行った。
【０２２８】
ＭＡＲＳ−ｓｅｑライブラリーの調製
単一細胞ライブラリーを以前に記載されたように調製した（Ｊａｉｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。簡単に説明すると、細胞捕捉プレートに分類された細胞に由来するｍＲＮＡにバーコードを付け、ｃＤＮＡに変換し、自動パイプラインを使用してプールした。次に、プールされたサンプルをＴ７  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって直線的に増幅し、ライゲーション、ＲＴ及びＰＣＲ中にサンプルにプールバーコード及びｉｌｌｕｍｉｎａ配列をタグ付けすることにより、得られたＲＮＡが断片化され、シーケンシング対応ライブラリーに変換される。細胞の各プールをライブラリーの品質について試験紙、濃度を前述のように評価する（Ｊａｉｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０２２９】
肺に存在する好塩基球の枯渇
新生仔の肺における好塩基球の枯渇については、本発明者らは、以前の研究（Ｄｅｎｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｇｕｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）に基づいてプロトコルを較正した。マウスに７μｌの１００μｇ抗Ｆｃεｒ１α（ＭＡＲ１；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）又はＩｇＧアイソタイプ対照（アルメニアハムスター、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、生後１０時間及び１５時間の２回注射した。肺を、出生後３０時間で注射された新生仔から精製し、ＣＤ４５＋細胞をＲＮＡ−ｓｅｑ分析のために選別した。
【０２３０】
食作用アッセイ
食作用アッセイを、以前に記載されたように実施した（Ｓｈａｒｉｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＡＭを気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）によって分離した。簡単に説明すると、マウスの気管を露出させ、滅菌１８ゲージベンフロン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でカニューレを挿入し、１０ｍｌの滅菌生理食塩水を０．５ｍｌステップで注入した。回収されたＢＡＬ液（９５％超ＡＭを含む）の総細胞数を、Ｎｅｕｂａｕｅｒチャンバーを使用して数えた。細菌の食作用を評価するために、１〜２．５×１０５のＡＭを播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１％ペニシリン及び１％ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩに３時間付着させた。次に、ＡＭをＦＩＴＣ標識熱不活化肺炎球菌（ＭＯＩ  １００）と共に３７℃又は４℃で４５分間インキュベートした（陰性対照として）。細胞を洗浄し、プロテイナーゼＫ（５０μｇ／ｍｌ）と共に氷上で１０分間インキュベートして、付着した細菌を除去した。細菌の取り込みをフローサイトメトリーによって評価し、食作用指数を（ＭＦＩ×３７℃での陽性細胞％）マイナス（ＭＦＩ×４℃での陽性細胞％）として計算した。
【０２３１】
一分子蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｓｍＦＩＳＨ）
７日齢の新生仔をＰＢＳで灌流した。肺組織を採取し、４％パラホルムアルデヒド中４℃で３時間固定し、２％パラホルムアルデヒド中の３０％スクロースで４℃で一晩インキュベートし、ＯＣＴに包埋した。ハイブリダイゼーションには凍結切片（６μｍ）を使用した。プローブライブラリーを、前述のように設計及び構築した（Ｉｔｚｋｏｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｓｔｅｌｌａｒｉｓ  Ｆｉｓｈ  Ｐｒｏｂｅｓ番号ＳＭＦ−１０８２−５、ＳＭＦ−１０６３−５、ＳＭＦ  １０６５−５）。一分子ＦＩＳＨプローブライブラリーは、長さ２０ｂｐｓの４８個のプローブで構成されていた。Ｉｌ１ｒｌ１、Ｉｌ３３、及びＭｃｐｔ８プローブのｓｍＦＩＳＨプローブライブラリーは、それぞれＣｙ３、ＡＦ５９４、及びｃｙ５に連結された。ハイブリダイゼーションを３０℃で一晩行った。核染色用のＤＡＰＩ色素を洗浄中に追加した。画像を６０倍及び１００倍の油浸対物レンズを備えたＮｉｋｏｎ  Ｔｉ−Ｅ倒立蛍光顕微鏡、並びにＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ペンシルベニア州ダウニントン）を使用するＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｐｉｘｉｓ  １０２４  ＣＣＤカメラで撮影した。ｓｍＦＩＳＨ分子を、細胞のＤＡＰＩ染色内でのみ数えた。
【０２３２】
組織学及び免疫組織化学
組織学的検査のために、パラフィン包埋肺切片を指定の時点で採取した。ｐｒｏＳＰ−Ｃを染色するために、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチし、抗原を抗原アンマスキング溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈ−３３００）で回収した。ロバ血清でブロッキングを行い、スライドを抗ｐｒｏＳＰ−Ｃ（Ａｂｃａｍ）で染色した後、二次ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染色し、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＥＬＩＴＥキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用してシグナル増幅を行った。Ｆ４／８０染色では、プロテアーゼタイプＸＩＶ（ＳＩＧＭＡ）を使用して抗原を回収した後、ウサギ血清でブロッキングし、ラット抗マウスＦ４／８０  ｍＡｂ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）で染色した。二次ウサギ抗ラットＩｇＧ  Ａｂ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を適用し、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＥＬＩＴＥキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でシグナルを増幅した。Ｍｃｐｔ８染色では、抗ＧＦＰ  Ａｂ（Ａｂｃａｍ）を使用し、続いて二次ビオチン化ウサギ−抗ヤギＩｇＧ  Ａｂ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。検出には、ペルオキシダーゼ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ）又はＶｅｃｔｏｒ  ＶＩＰペルオキシダーゼキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を適用した。細胞構造をヘマトキシリン又はメチルグリーンで対比染色し、オリンパスＦＳＸ１００顕微鏡で写真を撮影した。
【０２３３】
全肺葉分析のために、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ．Ｚ１顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｉｎｃ．、ドイツ国イエナ）を備えたＴｉｓｓｕｅＦＡＸＳイメージングシステム（ＴｉｓｓｕｅＧｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）を使用してスライドをスキャンした。画像をＰＣＯ  ＰｉｘｅｌＦｌｙカメラ（Ｚｅｉｓｓ）を使用して撮影した。
【０２３４】
組織透徹
組織透徹プロトコルを、前述のように実施した（Ｆｕｚｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。要するに、指定の時点での肺を、ＰＢＳで１回灌流し、その後、ＰＢＳ中の７．５％ホルムアルデヒドで灌流した。肺葉をＰＢＳ中の７．５％ホルムアルデヒドで室温で一晩固定した。ＣＵＢＩＣ試薬１（２５重量％尿素、２５重量％Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ヒドロキシプロピル）エチレンジアミン及び１５重量％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を使用して４日間（３０時間ＰＮ、８．５日目）又は３７℃で７日（８週齢）を用いて、肺葉を透徹した。ＰＢＳで繰り返し洗浄した後、肺葉をブロッキング溶液（ＰＢＳ、２．５％ＢＳＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、３％正常ロバ血清）でインキュベートし、その後、一次抗体溶液（１：１００；ヤギ抗マウスＧＦＰ、ａｂｃａｍ）に３７℃で４日間（３０時間ＰＮ、８．５日目）又は５日間（８週齢）入れた。洗浄した後、二次抗体溶液（１：５００；ロバ抗ヤギＡＦ５５５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３７℃で４日間（３０時間ＰＮ、８．５日）又は５日間（８週齢）加えた。ＰＢＳで再洗浄し、７．５％ホルムアルデヒド中、室温で２時間固定した後、洗浄工程を繰り返し、肺葉をＣＵＢＩＣ試薬２（５０重量％スクロース、２５重量％尿素、１０重量％２，２０，２０’−ニトリロトリエタノール及び０．１％体積／体積％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）においてさらに４日間（３０時間ＰＮ、８．５日目）又は７日間（８週齢）インキュベートした。Ｚｅｉｓｓ  Ｚ１ライトシート顕微鏡を使用して、５倍の検出対物レンズ、５６１のレーザー励起波長で５倍の照明光学系、及び０．５６倍のズームにより、測定された屈折率１．４５のＣＵＢＩＣ試薬２において透徹した肺葉を画像化した。Ｚスタックを、マルチビュータイルスキャンモードで、ライトシートの厚さが８．４２μｍ、露光量が４４１．９ｍｓの両面照明によって取得した。ステッチング、３Ｄ再構成、視覚化、及びレンダリングを、Ａｒｉｖｉｓ  Ｖｉｓｉｏｎ４Ｄ  Ｚｅｉｓｓ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（ｖ．２．１２）を使用して実行した。
【０２３５】
定量化と統計分析
低レベルの処理及びフィルタリング
すべてのＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー（等モル濃度でプール）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００を使用して、単一細胞あたり５８，５８５リードのメジアンシーケンシング深度で配列決定した。配列をマウスゲノム（ｍｍ９）にマッピングし、逆多重化し、前述のようにフィルタリングし（Ｊａｉｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、さらなる処理のために単一細胞内の異なる転写産物を定義する固有分子識別子（ＵＭＩ）のセットを抽出した。本発明者らは、空のＭＡＲＳ−ｓｅｑウェルの統計を使用して、データ内のスプリアスＵＭＩのレベルを推定した（ノイズのメジアン２．７％、図示されていない）。読み取りのマッピングを、ＨＩＳＡＴ（バージョン０．１．６）を使用して行い（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、複数のマッピング位置を持つ読み取りを除外した。読み取りは、参照用にＵＣＳＣゲノムブラウザーを使用して、エクソンにマッピングされている場合は遺伝子に関連付けられていた。同じ鎖上のゲノム位置を共有する異なる遺伝子のエクソンを、連結された遺伝子記号を持つ単一の遺伝子と見みなした。ＵＭＩが５００未満の細胞を、分析から除外した。フィルタリング後、細胞には細胞あたり２，４８３個の固有の分子のメジアンが含まれていた。すべてのダウンストリーム分析をＲで実施した。
【０２３６】
データ処理及びクラスタリング
メタセルパイプライン（Ｇｉｌａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）を使用して、有益な遺伝子を導き出し、細胞−細胞間の類似性を計算し、Ｋ−ｎｎグラフカバーを計算し、細胞の凝集グループ（又はメタセル）におけるＲＮＡの分布を導き出し、ブートストラップ分析及びリサンプリングされたデータのグラフカバーの計算を使用して、強く分離されたクラスターを導出する。方法及びダウンストリーム分析の完全な説明を図に示す。特に明記されていない限り、デフォルトのパラメーターを使用した。
【０２３７】
肺の発達のクラスタリングを、免疫（ＣＤ４５＋）コンパートメントと非免疫（ＣＤ４５−）コンパートメントを組み合わせて実施した。ヘモグロビン遺伝子の高い（６４超）複合発現を伴う細胞を廃棄した（Ｈｂａ−ａ２、Ａｌａｓ２、Ｈｂａ−ａ１、Ｈｂｂ−ｂ２、Ｈｂａ−ｘ、Ｈｂｂ−ｂ１）。本発明者らは、ブートストラップを使用して、堅牢なクラスタリングを導出した（５００回の反復、各反復で細胞の７０％をリサンプリングし、最小クラスターサイズを２０に設定してコクラスターマトリックスをクラスタリングする）。メタセルでは、それ以上のフィルタリング又はクラスター分割は実行されなかった。
【０２３８】
得られたメタセルにセルタイプに注釈を付けるために、本発明者らは、メトリックＦＰｇｅｎｅ，ｍｃ（図示していない）を使用し、これは、各遺伝子とメタセルについて、メタセル内のこの遺伝子の幾何平均及びすべてのメタセルにわたる幾何平均のメジアンの間の倍率変化を表す。ＦＰメトリックは、バックグラウンドと比較して、その中で強く過剰発現している各メタセル遺伝子を強調する。本発明者らは、次に、このメトリックを使用して、Ｃｌｉｃ５（ＡＴ１）、Ｅａｒ２（マクロファージ）、Ｃｄ７９ｂ（Ｂ細胞）等の系統特異的遺伝子の発現のためにメタセルを「着色」した。各遺伝子には、Ｃｌｉｃ５によるＡＴ１の着色は、Ｅｐｃａｍによる一般的な上皮の着色よりも優先されるように、ＦＰしきい値及び優先度インデックスが与えられた。選択した遺伝子、優先度、及び倍率変化のしきい値パラメーターは次のとおりである。
【０２３９】
【表３】
2021535100.tif 000004
【０２４０】
軌道の発見
軌道を推測し、発生の疑似時間に沿って細胞を整列させるために、本発明者らは、公開されたパッケージであるＳｌｉｎｇｓｈｏｔを使用した（Ｓｔｒｅｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。つまり、Ｓｌｉｎｇｓｈｏｔは、既存のクラスターを使用して系統階層（最小スパニングツリー、ＭＳＴに基づく）を推測し、各クラスターの細胞を疑似時間軌道に揃えるツールである。本発明者らのデータは複雑で、多くの連結成分及び時点が含まれているため、本発明者らは、相互接続された細胞型のサブセット、つまりＥ１６．５単球とマクロファージＩＩ及びＩＩＩ（データセットａ）、並びに線維芽細胞系統（データセットｂ）にＳｌｉｎｇｓｈｏｔを適用することを選択した。
【０２４１】
データセットａについては、本発明者らは、すべてのマクロファージＩＩ〜ＩＩＩと、Ｌｙ６ｃ２の相対的発現が低い単球メタセル（分化した単球を除き、Ｅ１６．５単球を保持）に対してＳｌｉｎｇｓｈｏｔを実施した。各データセットについて、本発明者らは、細胞型間で異なる遺伝子のセットを選択した（ＦＤＲ補正カイ２乗検定、ｑ＜１０−３、倍率変化２超）。本発明者らは、細胞サイズに正規化された対数変換されたＵＭＩに対してＰＣＡを実施した。本発明者らは、単球及び初期線維芽細胞を開始クラスターとして、７つの上位主成分でＳｌｉｎｇｓｈｏｔを実行した。
【０２４２】
本発明者らは、最初に、Ｅ１８．５日目に強いＡＴ１及びＡＴ２シグネチャーを観察する。これは、前駆上皮細胞の消失と平行している。このことから、本発明者らは、本発明者らの発生コホートでは正確な分岐点が高い時間分解能でサンプリングされておらず、この特定のケースではＳｌｉｎｇｓｈｏｔが非効率的であると仮定した。代わりに、本発明者らは、Ｅ１６．５日目の前駆上皮細胞がすでにＡＴ１又はＡＴ２のいずれかへと刺激されているかどうかを調べた。上皮前駆細胞におけるＡＴ１ＡＴ２プライミングを検出するために、本発明者らは、ＡＴ１及びＡＴ２の公開された遺伝子リスト（Ｔｒｅｕｔｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）を使用し、次の用語で２つのスコアを計算した。
2021535100.tif 000005
次に、本発明者らは、上皮前駆細胞のスコア分布を調べた。
【０２４３】
相互作用マップ
すべての肺の相互作用を視覚化するために、本発明者らは、公開されているリガンドと受容体のペアのデータセットを使用した（Ｒａｍｉｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。本発明者らは、少なくとも１つのメタセル（メタセルサイズに正規化）に１３を超えるＵＭＩを持つすべてのＬＲを含む、寛大なフィルタリング（ｌｅｎｉｅｎｔ  ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）を適用した。本発明者らは、対数変換されたＵＭＩ（１０００ＵＭＩにダウンサンプリング）間のスピアマン相関を計算し、階層的クラスタリングを使用してＬＲモジュール（Ｋ＝１５のｃｕｔｒｅｅ）を識別した。本発明者らは、ＬＲモジュール間のスピアマン相関を計算し、ρ＞０．４のモジュール間のエッジを接続して、相互作用グラフのスキャフォルドを作成し、Ｒｇｒａｐｈｖｉｚパッケージでグラフを生成した。本発明者らは、ρ＞０．０５のすべてのＬＲにわたる平均ｘ、ｙ座標を計算することにより、グラフスキャフォルドに単一のＬＲを投影した（図３Ｂ）。
【０２４４】
間質−間質及び免疫−免疫相互作用の濃縮を決定するために、本発明者らは、各ＬＲについて、主に間質又は免疫コンパートメントで発現しているかどうかを決定した（ｌｏｇ２倍率変化１超、図示していない）。本発明者らは、Ｓ−ＳとＩ−Ｉの相互作用の数を計算し、無作為に生成された１０，０００個のグラフと比較した。重要なのは、相互作用グラフが規則的ではないため、本発明者らは、無作為に生成されたグラフごとにノードの度数を保持したことである。リガンド機能グループを、Ｄａｖｉｄ  ＧＯアノテーションツール（Ｈｕａｎｇ  ｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）から抽出し、手動でキュレーション（ｃｕｒａｔｅｄ）した。
【０２４５】
図３Ｅ〜Ｈにおける投影では、ＬＲを発現する細胞型を、その発現が他のすべての細胞より２倍以上高い場合に決定した。
【０２４６】
細胞の肺クラスターモデルへのマッピング
既存の参照単一細胞データセット及びクラスターモデル、並びに単一細胞プロファイルの新しいセットを前提として、本発明者らは、上記のように、変換されたマーカー遺伝子ＵＭＩでピアソン相関が最も高いＫ（Ｋ＝１０）参照細胞を新しい細胞ごとに抽出する。これらのＫ近傍でのクラスターメンバーシップの分布を使用して、新しいセル参照クラスターを定義した（過半数の得票による）。
【０２４７】
好塩基球プロファイリング、ｅｘ  ｖｉｖｏ及び共培養分析
本発明者らは、メタセルパイプラインを使用して、次のデータセットを分析及びフィルタリングした：（ａ）肺及び血液由来の好塩基球（図４Ｅ〜Ｇ）；（ｂ）Ｉｌ１ｒｌ１ノックアウト及び対照（図５Ｇ〜Ｈ）；（ｃ）ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖した好塩基球（図５Ｊ〜Ｌ、Ｓ５Ｄ）；（ｄ）並びにマクロファージ及び好塩基球のｅｘ  ｖｉｖｏ共培養（図６Ｌ〜Ｍ、Ｓ６Ｊ）。メタセル分析をデフォルト設定で実施した。各データセットにおいて、本発明者らは、メジアンに対してＭｃｐｔ８の平均発現が増加したメタセルを選択することにより、好塩基球と濾過された汚染物質を特定した。共培養実験（ｄ）では、Ｃｓｆ１ｒの平均発現の増加によりメタセルがマクロファージとして決定された。
【０２４８】
単一細胞における遺伝子の複合発現を計算するために（図８Ｅ、Ｋ）、本発明者らは、次の項を計算した。
2021535100.tif 000006
これにより、さまざまな発現レベルで遺伝子をプールすることができる。
ＴｉｓｓｕｅＦＡＸＳの定量化
【０２４９】
ＴｉｓｓｕｅＦＡＸＳ画像をＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（Ｒ２０１４ｂ）によって処理した肺胞のセグメンテーションを、カスタムメイドのパイプラインによって実施した。画像をグレースケールに変換し、１５ピクセルのディスクサイズで拡張、開閉した。肺胞を２００の強度しきい値によって決定した。３００，０００ピクセルを超える領域は破棄した。核のセグメンテーションを、同様のパイプライン（ディスクサイズ＝５ピクセル）によって実施し、その後、ウォーターシェッドアルゴリズムを適用し、極小値を検出した。画像をＬ＊Ａ＊Ｂ色空間に変換し、各核の平均値を収集した。切片の端にある核は廃棄した。面積＜Ｔａｒｅａ、平均輝度＞Ｔｌ又は高い真円度スコア（＞Ｔｃｉｒｃ）の核は廃棄した。肺胞までの核の距離（ピクセル単位）をｂｗｄｉｓｔ法を使用して計算した。好塩基球（ＹＦＰ＋）は、暗褐色がかった色相によって他の核と区別される（図４Ａ）。したがって、本発明者らは、平均輝度が低く、平均ｂカラーチャネルが高い（平均（ｂ）−平均（ｌ）＞Ｔｂａｓｏ）ことにより、好塩基球を特定した。ＰＮの８．５日目の肺葉では、本発明者らは、次のパラメーターを使用した：Ｔａｒｅａ＝５０；Ｔｌ＝６０；Ｔｃｉｒｃ＝５；Ｔｂａｓｏ＝−４０。８週齢の肺葉では、本発明者らは、次のパラメーターを使用した：Ｔａｒｅａ＝２０；Ｔｌ＝６０；Ｔｃｉｒｃ＝５；Ｔｂａｓｏ＝−４０。結果が低品質の切片の影響を受けないことを検証するために、本発明者らは、各ＴｉｓｓｕｅＦＡＸＳの肺葉からランダムに小切片（ｓｕｂｓｅｃｔｉｏｎ）を選択し、画像の鮮明さを手動で検査した。本発明者らは、肺葉ごとに少なくとも２００の好塩基球が得られるまで、又は肺葉に好塩基球が存在しなくなるまで繰り返した。本発明者らは、肺胞までの距離の有意性を次のように試験した：各肺葉について、すべての核の距離を個別にランク変換した。次に、本発明者らは、各肺葉から無作為にＮｂａｓｏ核を選択し（Ｎｂａｓｏはその肺葉内の好塩基球の数を表す）、ランク付けされた距離のメジアンを計算した。本発明者らは、この順列プロセスを各時点で１０５回繰り返し、観測されたランク付けされた距離のメジアンと比較した。
データ及びソフトウェアの可用性
【０２５０】
報告されたすべてのデータは、ＧＥＯ、アクセッション番号ＧＳＥ１１９２２８にアップロード及び保存される。ソフトウェア及びカスタムコードはリクエストに応じて利用できる。
【０２５１】
（実施例１）
発生中の肺細胞型の包括的なマップ
肺の発生及び恒常性に対するさまざまな免疫細胞及び非免疫細胞のタイプと状態の寄与を理解するために、本発明者らは、肺の発生の重要な時点に沿って単一細胞プロファイルを収集した。細胞表面マーカー又は選択的組織解離手順に起因するバイアスを回避するために、本発明者らは、広範なゲーティング戦略と許容組織解離プロトコルを組み合わせて、肺にある免疫細胞及び非免疫細胞の包括的なレパートリーを作成した（図示していない；方法）。本発明者らは、肺胚及び出生後の発達の複数の時点から細胞を高密度にサンプリングし、インデックスソーティング（ＭＡＲＳ−ｓｅｑ）と組み合わせた大規模並行単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑを実行した（Ｊａｉｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）（図１Ａ；図示せず）。本発明者らは、主要な胚発生段階：初期形態形成（Ｅ１２．５）、小管期（Ｅ１６．５）及び球形嚢期（Ｅ１８．５〜Ｅ１９．５；後期Ｅ）から細胞を収集した。本発明者らは、さらに、出生直後（出生後１、６、７、１０時間、ＰＮ初期）、出生後１６時間、３０時間（ＰＮ中期）と並んで、出生後２日及び７日で、肺胞形成の出生後の段階から細胞を収集した（図１Ａ）。肺細胞マップを構築するために、本発明者らは、１７匹のマウスから１０，１９６個のＣＤ４５−（非免疫）及び１０，９０４個のＣＤ４５＋（免疫）単一細胞をプロファイリングし、メタセルアルゴリズムを使用して均一で堅牢な細胞グループを特定し（「メタセル」；方法）（Ｇｉｌａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）、２６０の最も転写的に異なる亜集団の詳細なマップを得た（図示していない）。免疫及び非免疫の単一細胞の２次元表現は、細胞が多様な系統に分離していることを明らかにした（図１Ｂ）。免疫コンパートメントでは、ＮＫ細胞（Ｃｃｌ５の高発現を特徴とする）、ＩＬＣサブセット２（Ｉｌ７ｒ及びＲｏｒａ）、Ｔ細胞（Ｔｒｂｃ２）及びＢ細胞（Ｃｄ１９）（図１Ｃ）を含むリンパ系統が検出されたが、単球及び骨髄性細胞は、好中球（Ｒｅｔｎｌｇ）、好塩基球（Ｍｃｐｔ８）、肥満細胞（Ｍｃｐｔ４）、ＤＣ（Ｓｉｇｌｅｃｈ）、単球（Ｆ１３ａ１）、及びマクロファージの３つの異なるサブセット（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｉ−ＩＩＩ；Ｅａｒ２）に分離された。遺伝子発現による注釈は、従来のＦＡＣＳインデックスによってさらに裏付けられた（図示していない）。その広大な不均一性にもかかわらず、非免疫コンパートメント（ＣＤ４５−）のクラスター化により、上皮（Ｅｐｃａｍ発現でマークした）、内皮（Ｃｄｈ５）及び線維芽細胞（Ｃｏｌ１ａ２）の３つの主要な系統が明らかになった。肺の発生に関する以前の特徴（Ｔｒｅｕｔｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）と一致して、上皮細胞は、上皮前駆細胞（高Ｅｐｃａｍ）、ＡＴ１細胞（Ａｋａｐ５）、ＡＴ２細胞（Ｌａｍｐ３）、クラブ細胞（Ｓｃｇｂ３ａ２）及び繊毛細胞（Ｆｏｘｊ１）の亜集団に分類され、一方、線維芽細胞サブセットには、線維芽細胞の前駆細胞、平滑筋細胞（Ｅｎｐｐ２）、マトリックス線維芽細胞（Ｍｆａｐ４）、及び周皮細胞（Ｇｕｃｙ１ａ３）が含まれていた（図１Ｂ〜Ｃ）。全体として、これらのデータは、発達の重要な期間中の豊富な肺細胞型と非常にまれな肺細胞型（すべての細胞の０．１％���）の両方の詳細なマップを提供し、これを肺の分化、成熟、及び細胞動態を研究するためにさらに使用することができる。
【０２５２】
（実施例２）
肺の区画化は、細胞のダイナミクスの波によって形作られる。
胚発生中及び出生直後、肺はその成熟及び空気中の酸素への突然の曝露による劇的な環境変化を起こす。したがって、本発明者らの分析は、メタセルの組成がこれらの時点で大きく変化することを示している（図２Ａ）。細胞型レベルでは、免疫及び非免疫組成物の最も顕著な細胞動態が妊娠中に観察された（図２Ｂ〜Ｃ）。特に、組織解離プロトコルは細胞型の存在量に影響を与える可能性があるため、相対量としてのみ見なすことができる（図示していない）。初期の時点（Ｅ１２．５）では、免疫コンパートメントは主にマクロファージ（５１％のＣＤ４５＋細胞）で構成され、特にサブセットＩ、単球（１０％）及び肥満細胞（１１％）に関連していたが、小管期（Ｅ１６．５）では単球、マクロファージ（サブセットＩＩ）、好中球及び好塩基球が優勢で（それぞれ、５８％、１３％、７％、４％）、マクロファージＩサブセットはほとんど減少していた。妊娠後期から始まって、すべての主要な免疫細胞集団が存在し、その後の動態は、リンパ系細胞コンパートメント（Ｂ及びＴ細胞）の着実な増加を示し、ＰＮの７日目で免疫集団の最大３２％に達し、マクロファージ集団の組成を変更する（図２Ｂ）。免疫コンパートメントと同様に、非免疫細胞組成の動態は妊娠中に最も顕著であり（図２Ｃ）、Ｅ１２．５は、主に未分化線維芽細胞（８３％）及び前駆上皮細胞（１０％）で構成されていた。Ｅ１６．５では、周皮細胞の出現、内皮の増加、及びマトリックス線維芽細胞の出現と並行して、前駆上皮サブセットが増加し続け（３０％）、クララ細胞の新しい上皮細胞サブセット（５％）が出現した。細胞組成は妊娠後期以降安定し、平滑筋線維芽細胞が出現し、上皮がＡＴ１細胞及びＡＴ２Ａ細胞に分岐した（図２Ｃ）。これらの細胞動態は、生物学的複製全体で一貫していた（図示していない）。
【０２５３】
以前の研究（Ｋｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｔａｎ  ａｎｄ  Ｋｒａｓｎｏｗ，２０１６）に従って、本発明者らは、マクロファージＩ〜ＩＩＩと呼ばれる３つの異なるマクロファージサブセットを特定した。これらのサブセットは発生の間、波状に現れ、マクロファージＩは妊娠初期に優勢であり、マクロファージＩＩは出生前後に頂点に達し、マクロファージＩＩＩは妊娠後期から着実に増加し、ＰＮの７日目で過半数になった（図２Ｄ）。マクロファージＩ細胞は、マクロファージサブセットＩＩ〜ＩＩＩとは転写的に異なる。特に、マクロファージサブセットＩＩ〜ＩＩＩはＥ１６．５単球と連続的な転写スペクトルを形成し（図２Ｅ）、マクロファージＩＩ及びＩＩＩは、卵黄嚢起源の可能性があるマクロファージサブセットＩではなく、胎児肝臓単球から分化することを示唆している（Ｇｉｎｈｏｕｘ，２０１４；Ｔａｎ  ａｎｄ  Ｋｒａｓｎｏｗ，２０１６）（図２Ｅ）。単球及びマクロファージサブセットの最も可能性の高い分化軌道を推論するために、本発明者らは、疑似時間推論にＳｌｉｎｇｓｈｏｔを使用し（Ｓｔｒｅｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）、Ｅ１８．５以降のマクロファージ遺伝子の段階的な取得を特徴づけた（後期Ｅ、図２Ｆ）。Ｓｌｉｎｇｓｈｏｔ軌跡は、発生時点に沿ったマクロファージサブセットの線形遷移を示唆する。転写的に、マクロファージＩ細胞は高レベルのＣｘ３ｃｒ１及び補体遺伝子（Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ）を発現した（図２Ｇ）。マクロファージＩＩは、分子的に単球を連想させ、Ｃｃｒ２、Ｆ１３ａ１、Ｉｌ１ｂ、及び中間レベルの肺胞マクロファージ（ＡＭ）に特徴的な遺伝子Ｉｌ１ｒｎ、Ｌｐｌ、Ｐｐａｒｇ及びＣｌｅｃ７ａ等を発現していた（Ｋｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）（図２Ｇ）。マクロファージＩＩＩは、Ｐｐａｒｇ、Ｆａｂｐ４、Ｆａｂｐ５、Ｉｌ１ｒｎ、Ｃａｒ４、Ｌｐｌ、Ｃｌｅｃ７ａ、及びＩｔｇａｘを含むＡＭの特徴的な遺伝子の独自のセットを発現した（Ｇａｕｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｌａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）（図２Ｆ〜Ｇ）。本発明者らは、同様に、線維芽細胞及び上皮系統の分化の波を再構築し、平滑筋及びマトリックス線維芽細胞の分岐に関連する主な遺伝子（図示していない）、並びに上皮前駆細胞のＡＴ１細胞及びＡＴ２細胞へのプライミング（図示していない）を強調した。まとめると、本発明者らのデータは、肺の発達に沿った細胞型組成及び遺伝子発現プログラムの両方で厳密に規制された動的変化を明らかにする。異なる細胞型にわたるこれらの細胞及び分子の動態は、これらのプログラムが細胞クロストークの複雑なネットワークによって調整されていることを示唆している。
【０２５４】
（実施例３）
肺の好塩基球は、免疫及び非免疫コンパートメントと広く相互作用する。
多細胞生物では、不均一な細胞型が複雑な通信ネットワークを形成し、主にリガンドと受容体（ＬＲ）間の相互作用によって媒介されるため、組織機能が出現する（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）。単一細胞マップでＬＲペアを調べると、組織の運命を形作る中心的な細胞成分が明らかになる可能性がある（Ｃａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）。細胞間の細胞相互作用を体系的にマッピングし、発達を制御する潜在的なコミュニケーション因子を明らかにするために、本発明者らは、すべての肺細胞型間のＬＲペアを特徴づけた（図３Ａ）。簡単に説明すると、本発明者らは、リガンドを受容体にリンクする公開データセットを使用して、少なくとも１つのメタセルで発現するすべてのＬＲをフィルタリングし、各リガンド又は受容体をすべての細胞全体及び発生時点に沿ったその発現プロファイルに関連付けた（方法）（Ｒａｍｉｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【０２５５】
発生中の肺では、ＬＲのモジュールは主に細胞型によってクラスター化されている（図示していない）。ただし、一部のＬＲでは、本発明者らは、発生中に同じ細胞型で発現レベルの有意な変化を特定することができた（図示していない）。本発明者らは、リガンド及び受容体をそれらの相関構造に基づいて予測し、すべてのＬＲ及びそれらの相互作用をグラフで表現し、それらの細胞型関連モジュールへの分離を強調した（図３Ｂ、方法）。肺のＬＲマップは、免疫コンパートメント（Ｉ）とそれ自体の間、及び非免疫コンパートメント（ＮＩ）とそれ自体の間のＬＲ相互作用の濃縮、並びにコンパートメント間の相互作用の枯渇（Ｉ−Ｉ及びＮＩ−ＮＩ相互作用、ｐ＜１０−４、図示していない）を特徴とする、免疫コンパートメントと非免疫コンパートメントのコミュニケーションパターン間の明確な分離を示した（図３Ｃ）。特に、クロストークの大部分は各コンパートメント内で発生するが、散発的なＩ−ＮＩ及びＮＩ−Ｉの相互作用には、組織の発生及び恒常性のための重要なシグナル伝達経路が含まれる可能性がある。次に、本発明者らは、特定のリガンドファミリー及び経路を機能グループに分類した（方法）。予想通り、サイトカイン及び補体系の構成要素は、主に免疫コンパートメント、及びそれらを認識する受容体に見られた（図３Ｄ−Ｅ）。補完的に、非免疫コンパートメントは、成長因子、マトリックスシグナル伝達、細胞接着リガンド及び受容体が豊富であった（図３Ｄ−Ｅ）。
【０２５６】
コンパートメント間及びコンパートメント内の多数の相互作用に関与する重要な細胞通信ハブを特定するために、本発明者らは、さまざまな細胞型でＬＲ発現パターンを調べた（図示していない）。非免疫コンパートメントより、Ｔｇｆｂ３及びＷｎｔリガンドであるＷｎｔ５ａを発現する平滑筋線維芽細胞（Ｎａｂｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）、並びにインターロイキン３３（Ｉｌ３３）及びサーファクタントタンパク質（Ｓｆｐｔａ１）の排他的発現を特徴とするＡＴ２細胞が、複雑なＮＩ−ＮＩ及びＮＩ−Ｉシグナル伝達に関与していた（図３Ｆ〜Ｇ）（Ｓａｌｕｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。免疫コンパートメント内で、本発明者らは、単球及びマクロファージにおけるＣｓｆ２ｒｂ及びＣｓｆ１ｒ等の独自の細胞サブセットの分化及び成熟に重要な特徴的な受容体の発現を観察した（Ｇｉｎｈｏｕｘ，２０１４；Ｇｕｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）（図示していない）。ここで、以前はＡＭの分化に重要な役割を果たすとされていたＩＬＣ（ｄｅ  Ｋｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｓａｌｕｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）が、Ｃｓｆ２を発現する主要な細胞として見られた（ＧＭ−ＣＳＦ、図３Ｈ）。驚くべきことに、免疫コンパートメントのまれな集団（１．５％）を含む好塩基球は、免疫コンパートメントと非免疫コンパートメントの両方と相互作用する、豊富で複雑なＬＲプロファイルを示した。相互作用マップは、Ｃｓｆ１、Ｉｌ６、Ｉｌ１３及びＨｇｆ等の多くの主要なサイトカイン及び成長因子の主な供給源として好塩基球を強調し（図３Ｉ）、それらの対応する受容体は固有の肺に存在する肺細胞によって発現された。全体として、本発明者らの分析は、肺の免疫細胞型と非免疫細胞型の間及びそれらの内部の潜在的な新規クロストーク回路を発見しながら、肺の発生過程における重要で確立されたＬＲ相互作用を確認する。
【０２５７】
（実施例４）
肺の好塩基球は、明確な空間的局在及び遺伝子シグネチャーを特徴とする。
好塩基球の豊富な相互作用プロファイル（図３Ｉ）に照らして、本発明者らは、これらの細胞が、肺の合図に応答することと、微小環境を変更することの両方によって、肺内の細胞コミュニケーションにおいて中心的な役割を果たしている可能性があると仮定した。肺好塩基球の空間的局在を特定するために、本発明者らは、Ｍｃｐｔ８ＹＦＰ／＋トランスジェニックマウスモデルを実施し、肺実質内のＹＦＰ＋好塩基球が、３０時間ＰＮ、８．５日ＰＮ、及び８週齢のマウスで肺胞に近接して局在することを観察した（図７Ａ）。本発明者らは、肺葉全体の切片のＴｉｓｓｕｅＦＡＸＳ画像を半自動計算分析と組み合わせて、好塩基球を正確に識別し、肺におけるそれらの空間的局在を定量化した（方法）。本発明者らは、好塩基球は、ＰＮの８．５日目に無作為に選択された細胞よりも肺胞の近くに存在する可能性が高く、８週齢の成体マウスではそれほど存在しないことを観察した（図４Ａ〜Ｂ、方法）。肺実質の好塩基球の空間構成をさらに測定するために、本発明者らは、組織の透徹を行った後、さまざまな時点でＭｃｐｔ８ＹＦＰ／＋マウスの左肺葉を画像化した。抗ＧＦＰ抗体染色により、好塩基球が肺葉全体に分布していることがさらに確認された（図４Ｃ）。
【０２５８】
肺の好塩基球を分子的に特徴づけるために、本発明者らは、フローサイトメトリーによってそれらを広範囲に分離しようとした。本発明者らは、データで特定された好塩基球特異的マーカー（ＣＤ４５＋ＦｃｅＲ１α＋ｃＫｉｔ−）をゲートし、ＭＡＲＳ−ｓｅｑ分析を使用してソーティング戦略を検証した（図７Ｂ〜Ｃ）。Ｍｃｐｔ８ＹＦＰ／＋トランスジェニックマウスの分析は、ＣＤ４５＋ＦｃｅＲ１α＋ｃＫｉｔ−細胞の８４％がＹＦＰ＋細胞であり、９８％が好塩基球マーカーＣＤ４９ｂを発現することを示した（図７４Ｄ〜Ｅ）。全肺組織あたりの好塩基球の定量化は、組織の発生に沿ってこの集団の漸進的な蓄積を示し（図４Ｄ）、免疫集団（ＣＤ４５＋）内のそのパーセンテージは安定したままであった（図７Ｆ）。肺の好塩基球が循環で観察されない独特の常在性発現プログラムを持っているかどうかを調べるために、本発明者らは、ＭＡＲＳ−ｓｅｑ分析用に肺及び末梢血から時点が一致する好塩基球を選別した（図７Ｆ）。肺好塩基球の遺伝子発現プロファイルは、Ｉｌ６、Ｉｌ１３、Ｃｘｃｌ２、Ｔｎｆ、Ｏｓｍ、及びＣｃｌ４の発現を含む独自の遺伝子シグネチャーを特徴とする血液循環好塩基球とは異なっていた（図４Ｅ〜Ｆ）。この独自の遺伝子シグネチャーは、成体の肺に存在する好塩基球において持続した（図４Ｆ〜Ｇ、７Ｇ、表４）。
【０２５９】
【表４】
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【０２６０】
特に、リガンドＩｌ６、Ｈｇｆ、及びＬ１ｃａｍは、他の肺免疫細胞及び非免疫細胞と比較して、肺好塩基球によってのみ発現される（図７Ｈ〜Ｉ）。一緒に、本発明者らは、肺に存在する好塩基球が組織実質内に存在し、肺胞の近くに特異的に局在し、循環する対応物と比較して、明確で持続的な肺に特徴的なシグナル伝達及び遺伝子プログラムを獲得することを示す。
【０２６１】
（実施例５）
ＩＬ３３及びＧＭ−ＣＳＦは、肺胞好塩基球の転写アイデンティティを刷り込む。
肺に存在する好塩基球は独特の遺伝子発現シグネチャーを示したため、本発明者らは、肺の好塩基球受容体の分化の手がかりとして役立つ可能性のある肺特異的シグナルのデータを分析した（図示していない）。Ｃｓｆ２（ＧＭ−ＣＳＦ）は造血成長因子であり、肺の微小環境、特にＡＭの形成におけるその役割が、長い間確立されてきた（Ｇｉｎｈｏｕｘ，２０１４；Ｇｕｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。興味深いことに、本発明者らは、肺におけるＣｓｆ２発現の主な原因は、ＩＬＣ及び好塩基球自体に由来し、ＡＴ２細胞からの寄与はごくわずかであることを見出した。すべての肺細胞の中で、好塩基球は、Ｃｓｆ２の主要な受容体であるＣｓｆ２ｒｂの最も高いＲＮＡ及びタンパク質レベルを発現した（図５Ａ〜Ｂ）。さらに、好塩基球及び肥満細胞は、Ｉｌ３３に特異的に結合する受容体Ｉｌ１ｒｌ１（ＩＬ３３Ｒ／ＳＴ２）の最も高いＲＮＡ及びタンパク質レベルを発現した（図５Ｃ〜Ｄ）。以前の報告では、主にＡＴ２細胞によって発現される、細胞分化及び肺成熟の主要な駆動物質としてＩＬ−３３が特定された。具体的には、肺ＩＬＣ−２は、その機能をＩＬ３３−ＳＴ２シグナル伝達に依存することが以前に報告されている（ｄｅ  Ｋｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｓａｌｕｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。Ｉｌ１ｒｌ１及びＩｌ３３遺伝子の出生後肺組織の一分子蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｓｍＦＩＳＨ）染色は、好塩基球マーカーＭｃｐｔ８と共に、これらの遺伝子の隣接細胞での共発現を示し、好塩基球及びＡＴ２細胞が肺組織の空間的近接して存在すること示唆している（図５Ｅ）。成体の肺組織でのＡＴ２及び好塩基球の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色により、これらの結果が確認され、このシグナル伝達を肺胞ニッチに局在化した（図５Ｆ）。肺好塩基球遺伝子発現プロファイルに対するＩＬ−３３シグナル伝達の影響を機能的に検証するために、本発明者らは、ＭＡＲＳ−ｓｅｑ分析のためにＩｌ１ｒｌ１（ＩＬ３３Ｒ）ノックアウトマウスの肺から好塩基球を精製した。本発明者らは、Ｉｌ１ｒｌ１欠損肺好塩基球は、肺に存在する好塩基球に特異的な遺伝子の多くの発現を欠いており、血液循環好塩基球と高い類似性を示すことを見出し（図５Ｇ〜Ｈ、８Ａ）、これは、ＩＬ−３３シグナル伝達が肺好塩基球の特定の遺伝子シグネチャーの大部分を媒介していることを示唆している。
【０２６２】
肺の環境シグナルであるＩＬ−３３及びＧＭ−ＣＳＦが肺の好塩基球表現型の誘導に直接関与しているかどうかを試験するために、本発明者らは、これらのサイトカインを添加した培地で骨髄（ＢＭ）由来の好塩基球を培養するｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムを使用した。本発明者らは、ＢＭ由来細胞をＩＬ３添加培地で分化させ、ｃＫｉｔのネガティブセレクションにより好塩基球を単離し（ＢＭ好塩基球）、増殖培地のみ（ＩＬ３）の存在下、又は肺サイトカイン環境のさまざまな組み合わせ、すなわちＧＭ−ＣＳＦ及び／又はＩＬ−３３と共に培養した（図５Ｉ、８Ｂ〜Ｃ）。本発明者らは、ＩＬ−３３及びＧＭ−ＣＳＦはそれぞれ特定の転写プログラムを誘導することがわった（図８Ｄ）。ＩＬ−３３は、リガンドＩｌ６、Ｉｌ１３、Ｉｌ１ｂ、Ｔｎｆ、Ｃｘｃｌ２及びＣｓｆ２と並んで、転写因子Ｐｏｕ２ｆ２（図５Ｊ、８Ｅ）を含む肺好塩基球遺伝子シグネチャーの大部分を誘導したが、ＧＭ−ＣＳＦは肺好塩基球遺伝子プログラムのより小さなセットを誘導した。興味深いことに、本発明者らは、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３３の両方と共に培養された細胞が両方のプログラムを活性化することを見出し、これはＢＭ好塩基球シグネチャーに対する両方のサイトカインのコンビナトリアル効果を示唆している（図５Ｋ、８Ｆ）。さらに、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３３分化プログラムに遺伝子発現プロファイルを投影することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏの肺及び血液好塩基球を再検討すると、循環からの好塩基球と比較して、肺に存在する好塩基球における両方の発現プログラムの時点に依存しないアップレギュレーションが明らかになった（図５Ｌ）。２つの独立したシグナル伝達プログラムのさらなる裏付けは、Ｉｌ１ｒｌ１ノックアウトマウスから得られ、これは、Ｉｌ１ｒｌ１ノックアウト好塩基球がＧＭ−ＣＳＦ誘導遺伝子の発現を変化させることなくＩＬ−３３プログラムを混乱させることを示した（図８Ｇ）。一緒に、ノックアウトデータ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの組み合わせは、肺環境が好塩基球に強力な転写プログラムを刻印することを示し、これは、ＩＬ−３３が優勢で、ＧＭ−ＣＳＦの寄与が少ない、少なくとも２つの独立したシグナル伝達経路によって媒介される。
【０２６３】
（実施例６）
肺好塩基球は、肺胞マクロファージ表現型をナイーブマクロファージに刷り込む。
好塩基球による重要な肺シグナル伝達分子の発現は、それらのシグナル伝達活性、及び他の肺に存在する細胞の独特の表現型の形成における貢献を探求することを本発明者らに促した。肺に存在する好塩基球は、３つの重要な骨髄成長因子であるＩｌ６、Ｉｌ１３、及びＣｓｆ１を高度に発現するため、本発明者らは、Ｉｌ６ｒａ、Ｉｌ１３ｒａ、及びＣｓｆ１ｒを介して他の骨髄細胞、特にマクロファージと相互作用する可能性があると仮定した（図３Ａ〜Ｉ、６Ａ〜Ｄ、９Ａ）。好塩基球（Ｍｃｐｔ８）及びマクロファージ（Ｆ４／８０）のＩＨＣは、肺胞形成プロセス中に肺実質内でそれらの空間的近接性を示した（図６Ｅ）。マクロファージの分化に対する好塩基球の影響を評価するために、本発明者らは、肺骨髄細胞の成熟に対する肺好塩基球の枯渇の影響を試験した。この目的のために、本発明者らは、抗Ｆｃεｒ１α（ＭＡＲ１）抗体又はアイソタイプ対照を新生仔マウスに鼻腔内投与して好塩基球の局所枯渇を誘発し（１２時間及び１６時間ＰＮで２回注射；方法）、ＭＡＲＳ−ｓｅｑ分析のために肺ＣＤ４５＋細胞を３０時間ＰＮで収集した。（図９Ｂ）。抗Ｆｃεｒ１α抗体は、ＦＡＣＳとＭＡＲＳ−ｓｅｑの両方で測定された他の免疫細胞の存在比率を乱すことなく、肺の好塩基球を効率的かつ特異的に枯渇させた（図６Ｆ、９Ｃ〜Ｄ）。肺の好塩基球の枯渇は、マクロファージコンパートメント内のＡＭ画分（マクロファージＩＩＩ）の減少と結びついていた（図６Ｇ）。さらに、好塩基球が枯渇した肺に由来するマクロファージは、抗炎症（Ｍ２）モジュール（Ｃｌｅｃ７ａ、Ｃｃｌ１７）を含む成熟ＡＭを連想させる遺伝子の発現の減少、及びマクロファージＩＩに関連する遺伝子の増加を示した（ｐ＝１０−４；図６Ｈ、９Ｅ〜Ｆ）。具体的には、本発明者らは、ＡＭの特徴的な遺伝子であるＩｌ１ｒｎ、Ｅａｒ１、Ｌｐｌ、Ｃｌｅｃ７ａ、及びＳｉｇｌｅｃ５のレベルのダウンレギュレーションを、マクロファージＩＩ及び単球で共有される遺伝子であるＦ１３ａ１の誘導と同時に観察した（図６Ｉ）。適切なＡＭ成熟プロセスは、肺免疫調節及び食細胞としての役割にとって重要であるため、本発明者らは、成体のＡＭ機能に対する構成的好塩基球枯渇の影響をさらに特性評価した。このために、本発明者らは、特に好塩基球が枯渇した成体Ｍｃｐｔ８ｃｒｅ／＋ＤＴＡｆｌ／＋マウスの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）に由来する細胞を同腹仔対照と比較した。どちらの条件でも、ＢＡＬＦ細胞は９８％ＡＭで構成されていた（図９Ｇ）。ただし、Ｍｃｐｔ８ｃｒｅ／＋ＤＴＡｆｌ／＋ＢＡＬＦは、対照同腹仔と比較して全体的に細胞数が少なかった（図６Ｊ）。重要なことに、Ｍｃｐｔ８ｃｒｅ／＋ＤＴＡｆｌ／＋由来のＡＭは、対照と比較して、不活化細菌の貪食作用が損なわれていた（図６Ｋ）。一緒に、本発明者らのデータは、肺好塩基球のＡＭニッチがＡＭの分化、区画化及び貪食特性にとって重要であることを示している。
【０２６４】
本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＭ成熟に対する肺好塩基球の影響により、肺好塩基球が単球又はナイーブマクロファージのＡＭシグネチャーへの移行を直接促進できるかどうか尋ねた。この仮説のため、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ共培養アッセイを実施した。ナイーブＢＭ由来マクロファージ（ＢＭ−ＭΦ）を、好塩基球を肺好塩基球表現型へと刺激する環境シグナル伝達である、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３３の組み合わせの有無にかかわらず、単独で培養するか、両方の細胞型（それぞれ、Ｍ−ＣＳＦ及びＩＬ−３）を支持する増殖培地でＢＭ好塩基球と共培養した（図９Ｈ、方法）。ＢＭ好塩基球とＢＭ−ＭΦの共培養は、どの条件でも以前に特徴づけられた好塩基球表現型を変化させなかった（図９Ｉ）。ただし、メタセル分析は、好塩基球の有無にかかわらず培養されたＢＭ−ＭΦの間の明確な区別を示した（図６Ｌ）。重要なことに、肺環境で刺激された（ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ３３）好塩基球の存在下で増殖したＢＭ−ＭΦのみが、抗炎症（Ｍ２）モジュール（Ｃｃ１７、Ｃｌｅｃ７ａ、Ａｒｇ１、及びＩｔｇａｘ；図６Ｌ〜Ｍ、９Ｊ））を含むＡＭに関連する遺伝子をアップレギュレートした。特に、ＢＭ−ＭΦ極性化に対するこの効果は、マクロファージが肺環境サイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−３３）のみを添加した培地で培養された場合には見られず、これらのサイトカインが好塩基球を介したシグナル伝達効果を媒介することを示している（図６Ｌ〜Ｍ）。本発明者らは、以前に代替の抗炎症（Ｍ２）極性化表現型と関連づけられているマクロファージサブセットＩＩＩ（成熟ＡＭ）とＩＩの間で差次的に発現される多くの遺伝子に影響を及ぼす、他のすべての条件と比較して、肺環境で刺激された好塩基球と共培養されたＢＭ−ＭΦの遺伝子発現の大きく再現性のある変化を特徴づけた（ｐ＜１０−１０；図６Ｍ〜Ｎ、９Ｋ〜Ｌ）（Ｇｏｒｄｏｎ，２００３）。ＡＭ成熟に対する肺環境刺激好塩基球の直接効果をさらに調べるために、本発明者らは、次に、主に単球及び未分化ＡＭを含むＣＤ４５＋ＣＤ１１５＋骨髄細胞を３０時間ＰＮ肺から精製し、共培養実験を行った（図９Ｇ）。重要なことに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてナイーブＢＭ−ＭΦで誘導された同じ肺好塩基球プログラム（図６Ｍ）はまた、肺環境で刺激された好塩基球（ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−３３）で培養された単球及び未分化ＡＭでもアップレギュレートされたのに対し（図６Ｏ）、好塩基球が枯渇した肺に由来するマクロファージではダウンレギュレートされていた（図６Ｐ）。これらのデータは、好塩基球表現型が組織の環境的な合図によって刷り込まれている可能性があり、その結果、それらが、組織の骨髄細胞における免疫調節活性を媒介していることを示唆している。したがって、本発明者らは、８週齢のマウスの肺に由来する好塩基球の遺伝子発現プロファイルを、Ｂ１６黒色腫細胞株を注射したマウスの腫瘍微小環境から、並びに８週齢のマウスの脾臓及び肝臓から単離した好塩基球と比較した（図９Ｍ）。すべての組織の好塩基球は好塩基球マーカー遺伝子（Ｍｃｐｔ８、Ｃｐａ３、Ｃｄ２００ｒ３、Ｆｃｅｒ１α等）を高度に発現したが、肺シグネチャーは排他的であり、主にＩｌ４、Ｉｌ６、Ｏｓｍ及びＩ��１３等の免疫抑制遺伝子の発現において腫瘍由来の好塩基球との類似性がより高かった（図９Ｍ〜Ｎ）。まとめると、本発明者らのデータは、肺環境からの指令的なシグナルが好塩基球にサイトカイン及び成長因子の独自の特徴を刷り込み、その後、食細胞及び抗炎症マクロファージへのＡＭの極性化を含む重要なシグナルを他の肺に存在する細胞に伝播することを示している。
【０２６５】
本発明は、その特定の実施形態と併せて説明されてきたが、多くの代替、修正、及び変形が当業者には明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲に含まれるそのようなすべての代替案、修正及び変形を包含することが意図されている。
【０２６６】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許又は特許出願が参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本出願における参考文献の引用又は識別は、そのような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものと解釈されるべきではない。欄の見出しが使用されている限り、それらは必ずしも限定的であると解釈されるべきではない。
【０２６７】
さらに、本出願の優先権書類は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
REFERENCES
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ−Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図５Ｌ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図６Ｌ】
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【図６Ｍ】
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【図６Ｎ】
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【図６Ｏ】
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【図６Ｐ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【図９Ｋ】
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【図９Ｍ】
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【図９Ｎ】
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【国際調査報告】
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