(57)【要約】  本発明は、様々な疾患および障害（例えば、過形成、固形腫瘍または造血器悪性腫瘍）の治療に有用な、インターロイキン１５およびプロドラッグの新規融合タンパク質、ならびにそれらの組成物および調製方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質であって、
第１の構造単位：インターロイキン１５受容体（ＩＬ１５Ｒ）のサブユニットまたはそのフラグメント、
第２の構造単位：活性インターロイキン１５（ＩＬ１５）、
第３の構造単位：融合タンパク質のＣ末端に位置する抗体Ｆｃフラグメント、
および、第１、第２および第３の構造単位と共有結合する第１のリンカーセグメントを含み、
ここで、融合タンパク質のＮ末端に第１の構造単位があり、第２の構造単位が第１の構造単位と第３の構造単位との間に位置する、融合タンパク質。
【請求項２】
融合タンパク質であって、
第１の構造単位：インターロイキン１５受容体（ＩＬ１５Ｒ）のサブユニットまたはそのフラグメント、
第２の構造単位：活性ＩＬ１５、
第３の構造単位：融合タンパク質のＣ末端に位置する抗体Ｆｃフラグメント、
および、第１、第２および第３の構造単位と共有結合するリンカーセグメント、Ｌ１を含み、
ここで、融合タンパク質のＮ末端に第２の構造単位があり、第１の構造単位が第２の構造単位と第３の構造単位との間に位置する、融合タンパク質。
【請求項３】
前記ＩＬ１５Ｒのサブユニットがαサブユニット、βサブユニットおよびγサブユニットから選択される、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ＩＬ１５Ｒのサブユニットが、αサブユニットである、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記フラグメントが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を備えたＩＬ１５Ｒのαサブユニットのスシドメインである、請求項１−３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ＩＬ１５がヒトまたはマウスのＩＬ１５である、請求項１−３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ＩＬ１５がマウスＩＬ１５である、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記マウスＩＬ１５が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記抗体ＦｃフラグメントがヒトＦｃフラグメントを含む、請求項１−８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記抗体Ｆｃフラグメントが、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１−Ｆｃを含む、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記リンカーセグメントＬ１が複数のＧＧＧＳを含む、請求項１−１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記第３の構造単位に結合した前記第１のリンカーセグメントが、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１−１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記第１および第２の構造単位を連結するリンカーセグメントＬ１が、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１−１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項１−１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質であって、
融合タンパク質のＮ末端に位置する第４の構造単位：ＩＬ１５受容体βサブユニット（ＲＢ）の細胞外ドメイン、
融合タンパク質の第４の構造単位および残りの構造単位と共有結合するリンカーセグメントＬ２をさらに含み、
ここで、第１の構造単位は、第４の構造単位のＣ末端に共有結合しており、および第２の構造単位は、第１の構造単位と第３の構造単位の間に位置し、
および、リンカーセグメントＬ２は、腫瘍内微小環境中で特異的に発現されるタンパク質分解酵素によって認識および加水分解可能である、融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１−１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質であって、
融合タンパク質のＮ末端に位置する第４の構造単位：ＩＬ１５受容体βサブユニット（ＲＢ）の細胞外ドメイン、
融合タンパク質の第４の構造単位および残りの構造単位と共有結合するリンカーセグメントＬ２をさらに含み、
ここで、第２の構造単位は、第４の構造単位のＣ末端に共有結合しており、および第１の構造単位は、第２の構造単位と第３の構造単位の間に位置し、
および、リンカーセグメントＬ２は、腫瘍内微小環境中で特異的に発現されるタンパク質分解酵素によって認識および加水分解可能である、融合タンパク質。
【請求項１６】
ＲＢのアミノ酸配列が、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１４または１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記腫瘍内微小環境中で特異的に発現されるタンパク質分解酵素がマトリックスメタロプロテイナーゼである、請求項１４−１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
前記マトリックスメタロプロテイナーゼがマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）である、請求項１７に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
前記マトリックスメタロプロテイナーゼがマトリックスメタロプロテイナーゼ１４（ＭＭＰ１４）である、請求項１７に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
前記リンカーセグメントＬ２が、配列番号１０−２３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１４−１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
請求項１−１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、ホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２２】
請求項２０に記載のホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質であって、
ＲＡ−ＩＬ１５−Ｆｃの単量体：ＩＬ１５受容体αサブユニットのスシドメイン、リンカーセグメントＬ１、マウスＩＬ１５、リンカーセグメントＬ２、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃの融合タンパク質を含み、および配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する、ホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２３】
請求項２０に記載のホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質であって、
ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃの単量体：マウスＩＬ１５、リンカーセグメントＬＬ、ＩＬ１５受容体αサブユニットのスシドメイン、リンカーセグメントＬ１、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃの融合タンパク質を含み、および配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する、ホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２４】
請求項２０に記載のホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質であって、
ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃの単量体：ヒトＩＬ１５、リンカーセグメントＬ１、ＩＬ１５受容体αサブユニットのスシドメイン、リンカーセグメントＬ１、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃの融合タンパク質を含み、および配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有する、ホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２５】
請求項２０に記載のホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質であって、
ＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃの単量体：ＩＬ１５受容体βサブユニットの細胞外ドメイン、リンカーセグメントＬ２、マウスＩＬ１５、リンカーセグメントＬ１、ＩＬ１５受容体αサブユニットのスシドメイン、リンカーセグメントＬ１、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃの融合タンパク質を含み、および配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有する、ホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２６】
請求項２０に記載のホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質であって、
ＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃの単量体：ＩＬ１５受容体βサブユニットの細胞外ドメイン、リンカーセグメントＬ２、ヒトＩＬ１５、リンカーセグメントＬ１、ＩＬ１５受容体αサブユニットのスシドメイン、リンカーセグメントＬ１、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃの融合タンパク質を含み、および配列番号２９−４１に記載のアミノ酸配列を有する、ホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２７】
腫瘍内微小環境中で特異的に発現されるタンパク質分解酵素によって加水分解される、請求項２１−２６のいずれかに記載のホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質。
【請求項２８】
請求項１−２７のいずれかに記載の実質的に精製されたタンパク質。
【請求項２９】
請求項１−２８のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３０】
請求項２９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３１】
請求項１−２８のいずれか１項に記載のタンパク質、および薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項３２】
疾患または状態を治療するための方法であって、
請求項１−２８のいずれか１項に記載の治療上有効な量のタンパク質、または請求項３１に記載の医薬組成物を、それらを必要とする患者に投与する工程を含み、
ここで、前記疾患または状態は、過形成、固形腫瘍または造血器悪性腫瘍から選択される方法。
【請求項３３】
対象に化学療法および放射線療法のうちの１つまたは複数を施す工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
化学療法剤を投与する工程を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
放射線療法を施す工程を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
疾患または障害を治療または軽減するための、請求項１−２８のいずれか１項に記載のタンパク質の使用。
【請求項３７】
疾患または障害を治療または軽減するための薬剤の調製における、請求項１−２８のいずれか１項に記載のタンパク質、および薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤の使用。
【請求項３８】
疾患または障害が、頭頸部癌、子宮内膜癌、大腸癌、卵巣癌、乳癌、黒色腫、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、肛門癌、肉腫、リンパ腫、白血病、脳腫瘍、胃癌、精巣癌、膵臓癌、甲状腺癌から選択される、請求項３５または３６の使用。
【請求項３９】
薬剤の調製のための、請求項１−２８のいずれか１項に記載のタンパク質の使用。
【請求項４０】
前記薬剤が抗腫瘍薬である、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
前記抗腫瘍薬がＢ細胞リンパ腫を治療するために、または抗大腸癌のために有効である、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
請求項１−２８のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細胞株。
【請求項４３】
請求項４２に記載の細胞株を培養することを含む、タンパク質を製造するための工程。
【請求項４４】
生成されたタンパク質を精製または単離することをさらに含む、請求項４３に記載の工程。
【請求項４５】
タンパク質を製造するための方法であって、
請求項１−２８のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする発現ベクターを提供する工程、
発現ベクターを宿主細胞に導入する工程、
タンパク質を発現するために十分な条件下で、培地中で宿主細胞を培養する工程、および宿主細胞または培地から前記タンパク質を精製する工程を
含む、タンパク質の製造方法。
【請求項４６】
宿主細胞が２９３Ｆ細胞およびＣＨＯ細胞から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
発現ベクターの導入が一過性トランスフェクションによるものである、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
タンパク質の精製が、プロテインＡ／Ｇのアフィニティークロマトグラフィーまたはサイズ排除法によるものである、請求項４５−４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
請求項４５−４８のいずれか１項に記載の方法によって生成される単離されたタンパク質。
【請求項５０】
実質的に純粋である、請求項４９に記載の単離されたタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張および関連出願
本出願は、２０１８年５月４日に出願された中国出願第２０１８１０４２０７３９．６号に対する利益を主張し、その全内容は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、全体として、新規の融合タンパク質およびその治療的使用に関する。より具体的には、本発明は、インターロイキン１５およびプロドラッグの新規融合タンパク質、ならびに様々な疾患および障害（例えば、過形成、固形腫瘍または造血器悪性腫瘍）の治療に有用である、それらの組成物および調製方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
インターロイキン１５（ＩＬ１５）、１４−１５ｋＤａの糖タンパク質は、１９９４年に最初に発見された可溶性サイトカインである（Ｇｒａｂｓｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：９６５−８）。インターロイキン２と同様に、ＩＬ１５は、４−ヘリックスバンドルサイトカインのファミリーに属している。ヒトＩＬ１５遺伝子は第４染色体ｑ２５−３５領域にマッピングされた。成熟ＩＬ１５は１１２アミノ酸からなり、および３つのＮ−グリコシル化部位を含有する。ＩＬ１５の発現は厳密に調節されている。ＩＬ−１５  ｍＲＮＡは、線維芽細胞、筋肉細胞、ケラチノサイト、腎臓細胞、リンパ球、肥満細胞、および腫瘍細胞を含む、多くの組織や細胞に見られるが、成熟タンパク質は、主に樹状細胞、単球、マクロファージ、間質細胞によって生成され、Ｔ細胞によっては生成されない。ＩＬ−１５の発現は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン、およびｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のアゴニストなどのサイトカインによって刺激される（Ｍａｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ＆Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２２：９９−１０８）。
【０００４】
ＩＬ１５受容体（ＩＬ１５Ｒ）は、造血系のスーパーファミリーに属する。ヘテロ三量体ＩＬ１５Ｒは、α、β（ＣＤ１２２）およびγ（ＣＤ１３２、共通γ鎖、γｃ）サブユニットを含む。βサブユニット（ＩＬ１５Ｒβ）はＩＬ２受容体と共有される。ヒトＩＬ１５ＲαはＩ型膜貫通タンパク質に属する。ＩＬ２ＲαとＩＬ１５Ｒαの両方は、保存性スシドメインを包含する。ＩＬ１５は、Ｔ細胞やＮＫ細胞の増殖を促進するような、ＩＬ２と同様の機能をいくつか有している［３］（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｊ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７７：６０７２−６０８０）。
【０００５】
ＩＬ１５Ｒαは、主に樹状細胞（ＤＣ）および単球で発現される。ほとんどの場合、ＩＬ１５はトランス提示型で受容体に結合する。トランス提示モデルにおいて、ＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒαは同一細胞内で合成される。ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαスシドメインは、細胞質中で高い親和性で互いに結合し、ＩＬ−１５を細胞膜に輸送する。次に、ＩＬ１５ＲαはＩＬ−１５をＴ細胞やＮＫ細胞などの応答細胞にトランス提示することができる。
【０００６】
ＩＬ１５は、恒常性、および自然免疫と適応免疫の両方の活性化において、以下のような多面的な機能を示す。
（１）ＩＬ１５は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化、増殖、および生存において重要な役割を果たし、
（２）ＩＬ１５は、記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および恒常性において重要な役割を果たし、
（３）ＩＬ１５は、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の発生、活性化、および増殖において重要な役割を果たし、
（４）ＩＬ１５は、抗腫瘍抗体の産生において重要な役割を果たし、
（５）ＩＬ１５は、自己分泌モデルによるＤＣの活性化、増殖、および分化において重要な役割を果たし、ＤＣ上でのＭＨＣ  ＩＩおよびＣＤ８０／ＣＤ８６の発現を促進し、およびＣＤ８＋Ｔ細胞へのＤＣの提示を増加させ、
（６）ＩＬ１５は、単球およびマクロファージの活性化において重要な役割を果たし、
（７）ＩＬ１５は、ＡＩＣＤの阻害において重要な役割を果たし、Ｔ細胞をＴｒｅｇによる阻害から保護し、および腫瘍抗原に対する耐性を克服する。
【０００７】
ＩＬ２は、転移性腎細胞癌および悪性黒色腫の治療のためにＦＤＡによって承認されている。しかし、抗癌治療薬としてのＩＬ−２の有効性は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ制御性細胞の維持、および活性化誘導型細胞死（ＡＩＣＤ）におけるその極めて重要な役割のために疑問視されてきた。このプロセスは、刺激されたＴ細胞の排除およびＴ細胞寛容の誘導につながり、それによって治療効果を制限する。
【０００８】
ＩＬ２とは異なり、ＩＬ１５は、活性化誘導型細胞死（ＡＩＣＤ）および制御性Ｔ細胞の維持に関与しない。したがって、ＩＬ１５は、癌の治療においてＩＬ２よりも著しい利点を有し得る。最近の報告は、ＩＬ１５とその可溶性受容体ＩＬ１５Ｒαとのあらかじめ形成された複合体の投与が、ＩＬ１５の半減期を延長させ、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖を向上させることが示されている（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６  Ｊ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７７：６０７２−６０８０）。
【０００９】
重要なことに、フレキシブルペプチドによって連結されたＩＬ１５ＲαスシドメインおよびＩＬ１５の可溶性融合タンパク質は、ＩＬ１５の半減期の延長およびＴ細胞ならびにＮＫ細胞の増殖の向上を示した。マウスＢ１６Ｆ１０およびＤＥＮ誘発ＨＣＣ腫瘍モデルにおいて、この融合タンパク質は腫瘍の成長を阻害、および腫瘍の転移を抑制することができた。その上、ＩＬ１５は、組み合わせ研究において、抗腫瘍効果の増強または腫瘍の成長の抑制を示した。（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４  Ｊ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ６１：１２９７−１３０３；Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１７  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３８：１０−２１．）
【００１０】
様々な副作用がＩＬ１５療法に付随しており、例えば、
（１）ＴＮＦα、ＩＬ１、ＩＬ６、ＧＭ−ＣＳＦおよび炎症誘発性サイトカインを含むサイトカインカスケードの誘導
（２）いくつかの腫瘍細胞の増殖、生存、および転移の促進
（３）自己免疫型Ｔ細胞の活性化および自己免疫疾患の関与
（４）冠状動脈性心臓病の誘発、ならびに
（５）制御分子ＰＤ１／ＰＤＬ１の発現の誘導
である。
【００１１】
例えば、過形成、固形腫瘍または造血器悪性腫瘍のための現在利用可能な治療法および方法は不十分である。そのような疾患および状態を効果的に治療するための新規かつ改善された治療法についての緊急かつ継続的な必要性が依然として存在している。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、新規の融合タンパク質の驚くべき発見、およびその治療的用途に部分的に基づいている。ＩＬ１５およびそのプロドラッグの新規の融合タンパク質、その組成物および調製方法は、様々な疾患および障害、例えば、過形成、固形腫瘍または造血器悪性腫瘍を治療する際に有用であることが、本明細書に開示される。
【００１３】
一態様において、本発明は、全体として、融合タンパク質に関する。融合タンパク質は、第１の構造単位：インターロイキン１５受容体アルファ（ＩＬ１５Ｒα）のサブユニットまたはそのフラグメント、第２の構造単位：活性ＩＬ１５、第３の構造単位：融合タンパク質のＣ末端に位置する抗体Ｆｃフラグメント、および、第１、第２および第３の構造単位と共有結合する第１のリンカーセグメント（Ｌ１）を含み、融合タンパク質のＮ末端に第１の構造単位であり、第２の構造単位が第１の構造単位と第３の構造単位との間に位置する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、全体として、融合タンパク質に関する。融合タンパク質は、第１の構造単位：インターロイキン１５受容体アルファ（ＩＬ１５Ｒα）のサブユニットまたはそのフラグメント、第２の構造単位：活性ＩＬ１５、第３の構造単位：融合タンパク質のＣ末端に位置する抗体Ｆｃフラグメント、および、第１、第２および第３の構造単位と共有結合する第１のリンカーセグメント（Ｌ１）を含み、融合タンパク質のＮ末端は第２の構造単位であり、第１の構造単位が第２の構造単位と第３の構造単位との間に位置する。
【００１５】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、融合タンパク質に関する。融合タンパク質は、第１の構造単位：インターロイキン１５受容体アルファ（ＩＬ１５Ｒα）のサブユニットまたはそのフラグメント、第２の構造単位：活性ＩＬ１５、第３の構造単位：融合タンパク質のＣ末端に位置する抗体Ｆｃフラグメント、第４の構造単位：インターロイキン１５受容体ベータ（ＩＬ１５Ｒβ）のサブユニットまたはそのフラグメント、および、第１、第２、第３および第４の構造単位と共有結合する第１のリンカーセグメント（Ｌ１）を含み、融合タンパク質のＮ末端は第４の構造単位であり、第２の構造単位が第４の構造単位と第１の構造単位との間に位置し、および第１の構造単位が第２の構造単位と第３の構造単位との間に位置する。
【００１６】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、融合タンパク質に関係する。融合タンパク質は、第１の構造単位：インターロイキン１５受容体（ＩＬ１５Ｒ）のサブユニットまたはそのフラグメント、第２の構造単位：活性ＩＬ１５、第３の構造単位：融合タンパク質のＣ末端に位置する抗体Ｆｃフラグメント、第４の構造単位：インターロイキン１５受容体ベータ（ＩＬ１５Ｒβ）のサブユニットまたはそのフラグメント、第１、第２および第３の構造単位と共有結合する第１のリンカーセグメント（Ｌ１）、ならびに第４の構造単位が２の構造単位と共有結合する第２のリンカーセグメント（Ｌ２）を含み、第１の構造単位が第２の構造単位と第３の構造単位との間に位置し、融合タンパク質のＮ末端は第４の構造単位である。
【００１７】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、本明細書に開示される融合タンパク質を含む、ホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質に関する。
【００１８】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、本明細書に開示される融合タンパク質または、フラグメントなどの実質的に精製されたタンパク質に関する。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、本明細書に開示される融合タンパク質、またはそのフラグメントなどのタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００２０】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、本明細書に開示される融合タンパク質、またはそのフラグメントなどのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。
【００２１】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、本明細書に開示される融合タンパク質またはそのフラグメントなどのタンパク質、および薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む医薬組成物に関する。
【００２２】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、本明細書に開示される融合タンパク質またはそのフラグメントなどのタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む医薬組成物に関する。
【００２３】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、疾患または状態を治療するための方法に関する。この方法は、それを必要とする患者に、本明細書に開示される融合タンパク質またはそのフラグメントなどのタンパク質をコードする治療有効量のポリヌクレオチドを投与する工程を含み、疾患または状態は、過形成、固形腫瘍または造血器悪性腫瘍から選択される。
【００２４】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、疾患または障害（例えば、過形成、固形腫瘍または造血器悪性腫瘍）を治療または軽減するための、本明細書に開示される融合タンパク質またはそのフラグメントなどのタンパク質の使用に関する。
【００２５】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、疾患または障害（例えば、過形成、固形腫瘍または造血器悪性腫瘍）を治療または軽減するための、本明細書に開示される融合タンパク質またはそのフラグメントなどのタンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用に関する。
【００２６】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、疾患または障害（例えば、過形成、固形腫瘍または造血器悪性腫瘍）を治療または低減するための薬剤の調製における、本明細書に開示される融合タンパク質またはそのフラグメントなどのタンパク質、および薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤の使用に関する。
【００２７】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、疾患または障害（例えば、過形成、固形腫瘍または造血器悪性腫瘍）を治療または低減するための薬剤の調製における、本明細書に開示される融合タンパク質またはそのフラグメントなどのタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤の使用に関する。
【００２８】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、本明細書に開示される、融合タンパク質またはそのフラグメントなどのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細胞株に関する。
【００２９】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、細胞株を培養することを含む、タンパク質を作製するための工程に関する。特定の実施形態では、この工程は、本明細書に開示される、融合タンパク質またはそのフラグメントなどの生成されたタンパク質を精製または単離する工程をさらに含む。
【００３０】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、タンパク質を作製する方法に関する。この方法は、本明細書に開示される融合タンパク質またはそのフラグメントなどのタンパク質をコードする発現ベクターを提供する工程、発現ベクターを宿主細胞に導入する工程、タンパク質を発現するために十分な条件下で宿主細胞を培地中で培養する工程、および宿主細胞または培地からタンパク質を精製する工程を含む。
【００３１】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、本明細書に開示される工程によって生成される単離されたタンパク質に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、融合タンパク質の構造の概略図を示す。Ａは、ＩＬ１５−Ｆｃの構造の概略図を示す。ＢおよびＣは、２つのＩＬ１５スーパーアゴニスト（両方ともスーパーＩＬ１５と呼ばれる）：ＲＡ−ＩＬ１５−ＦｃおよびＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃの概略図を示し、Ｄは、融合タンパク質ＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃの概略図を示す。
【図２】図２は、３つの融合タンパク質の例示的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図を示す。
【図３】図３は、ＩＬ１５−ＦｃおよびスーパーＩＬ１５によるリンパ球増殖アッセイの例示的な結果を示す。
【図４】図４は、ＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−ＦｃおよびスーパーＩＬ１５によるリンパ球増殖アッセイの例示的な結果を示す。
【図５Ａ】図Ａ５は、Ａ２０腫瘍モデルにおけるスーパーＩＬ１５の治療効果についての例示的な結果を示す。腫瘍内注射を介したスーパーＩＬ１５治療効果の例示的なデータを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、Ａ２０腫瘍モデルにおけるスーパーＩＬ１５の治療効果についての例示的な結果を示す。腫瘍内注射および腹腔内注射後のマウスの生存の例示的なデータを示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、Ａ２０腫瘍モデルにおけるスーパーＩＬ１５の治療効果についての例示的な結果を示す。Ａ２０腫瘍細胞を用いて再チャレンジされた腫瘍治癒マウスについての例示的なデータを示す。
【図６Ａ】図６Ａは、ＭＣ３８腫瘍モデルにおけるスーパーＩＬ１５の治療効果についての例示的な結果を示す。腫瘍内注射および静脈内注射を介したスーパーＩＬ１５治療効果についての例示的なデータを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＭＣ３８腫瘍モデルにおけるスーパーＩＬ１５の治療効果についての例示的な結果を示す。治療後のマウスの生存についての例示的なデータを示す。
【図７】図７は、より低い投与量のＡ２０マウスモデルにおけるスーパーＩＬ１５の治療効果についての例示的なデータを示す。
【図８Ａ】図８Ａは、静脈内注射後のＡ２０腫瘍モデルにおけるＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−ＦｃおよびスーパーＩＬ１５の治療効果の例示的な比較を示す。治療後のマウスの例示的な腫瘍成長曲線を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、静脈内注射後のＡ２０腫瘍モデルにおけるＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−ＦｃおよびスーパーＩＬ１５の治療効果の例示的な比較を示す。治療後の血清中のサイトカインの例示的なレベルを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、腹腔内注射後のマウスＡ２０腫瘍モデルにおけるＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−ＦｃおよびスーパーＩＬ１５の治療効果の例示的な比較を示す。治療後のマウスの例示的な生存を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、腹腔内注射後のマウスＡ２０腫瘍モデルにおけるＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−ＦｃおよびスーパーＩＬ１５の治療効果の例示的な比較を示す。治療後の血清中の例示的なサイトカインのレベルを示す。
【図１０】図１０は、ＭＭＰ１４消化を伴うか、または伴わない精製ヒトＩＬ１５融合タンパク質の例示的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図を示す。ＲＢに取り付けられたリンカーセグメントとしてＬ１またはＬ２のどちらが使用されているかを強調するために、ＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−ＦｃはＲＢ−Ｌ１−ｌ５ＲＡ−ＦｃまたはＲＢ−Ｌ２−ｌ５ＲＡ−Ｆｃとして表示される。ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃは１５ＲＡ−Ｆｃとして表示される。
【図１１】図１１は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ２レポーター細胞アッセイを使用して評価された、ＭＭＰ１４インキュベーションを伴うかまたは伴わないヒトＩＬ１５融合タンパク質活性の例示的な結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。以下の用語は、それらの用語が見出される文脈で述べられた他の指示がない限り、以下の意味を有することが意図されている。
【００３４】
本明細書で商品名が使用される場合、商品名は、文脈によって別の指示がない限り、商品名製品の製品製剤、ジェネリック医薬品、および医薬品有効成分を含める。
【００３５】
本明細書で提供される範囲は、範囲内のすべての値の省略であると理解される。例えば、１から５０の範囲は、任意の数、数の組み合わせ、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群からの下位の範囲を含めると理解される。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「少なくとも」特定の値は、その値およびその値より大きいすべての値であると理解される。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「１より大きい」は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、１００など、またはそれらの間の任意の値として理解される。
【００３８】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他の指示をしない限り、複数形の参照を含む。
【００３９】
本明細書で使用されるように、具体的に述べられていないか、または文脈から明らかでない限り、「約」という用語は、当該技術分野における通常の許容範囲内、例えば、平均の２標準偏差以内であると理解される。約は、規定値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内にあるとして理解される。文脈から他の指示が明らかでない限り、本明細書で提供されるすべての数値は、約という用語によって修飾することができる。
【００４０】
本明細書で使用されるように、具体的に述べられているか、文脈から明らかでない限り、「または」という用語は包括的であると理解される。
【００４１】
組成物および方法を定義するために使用される場合、「含む」という用語は、列挙された要素を含めるが、他の要素を除外しないことを意味することを意図する。組成物および方法を定義するために使用される場合、「本質的にからなる」という用語は、組成物および方法が、列挙された要素を含み、組成物および方法にとって任意の任意の本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものとする。例えば、「本質的にからなる」とは、明示的に列挙された薬理的に活性な薬剤の投与に言及し、明示的に列挙されていない薬理的に活性な薬剤を除外する。本質的にからなるという用語は、薬理学的に不活性または不活発な薬剤、例えば、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を除外しない。「からなる」という用語は、組成物および方法を定義するために使用される場合、他の成分の微量元素および実質的な方法の工程を除外することを意味するものとする。これらの移行した用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「アゴニスト」という用語は、受容体と組み合わせて、細胞応答を生成することができる化合物をいう。アゴニストは、受容体に直接結合するリガンドであり得る。あるいは、アゴニストは、例えば、（ａ）受容体に直接結合する別の分子と複合体を形成すること、または（ｂ）そうでなければ、他の化合物が受容体に直接結合するように別の化合物の修飾をもたらすことによって間接的に受容体と結合し得る。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「アンタゴニスト」という用語は、受容体への結合についてアゴニストまたはインバースアゴニストと競合し、それによって受容体でのアゴニストまたはインバースアゴニストの作用を遮断する化合物をいう。しかし、アゴニストは構成的受容体活性に影響を与えない。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、エピトープまたは抗原決定基に結合可能な分子をいう。この用語は、抗体全体およびその抗原結合性フラグメントを含むことを意味する。この用語は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、Ｆａｂ、Ｆｖ、一本鎖抗体、および一本または複数の免疫グロブリン可変鎖、またはＣＤＲドメイン設計、ならびに二重特異性抗体および多重特異性抗体を包含する。抗体は、任意の動物由来のものであってよい。好ましくは、抗体は、哺乳動物、例えば、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマなど、または他の適切な動物由来であり得る。抗体は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原を認識し得る。この用語は、例えば、免疫グロブリンの抗原結合フラグメント、重鎖の可変領域および／または定常領域、軽鎖の可変領域および／または定常領域、相補性決定領域（ｃｄｒ）、およびフレームワーク領域を含む活性フラグメントを含む。この用語は、ポリクローナル抗体の調製物およびモノクローナル抗体の調製物、ならびにハイブリッド抗体、改変した抗体、キメラ抗体、ハイブリッド抗体分子、Ｆ（ａｂ）２およびＦ（ａｂ）フラグメント；Ｆｖ分子（例えば、非共有ヘテロダイマー）、二量体および三量体抗体フラグメントコンストラクト；低分子化抗体、ヒト化抗体分子、およびそのような分子から得られた特異的結合を保持する任意の機能的フラグメントを含む調製物を含む。
【００４５】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「抗原」という用語は、免疫系が、抗体またはそれに対する特定の細胞性免疫応答を生成する原因となる、任意の物質を意味する。疾患関連抗原は、免疫系が、抗体またはそれに対する特定の細胞性免疫応答を生成する原因となる任意の疾患に関連する、任意の物質である。抗原は、免疫系によって認識されることが可能であり、および／またはＢリンパ球および／またはＴリンパ球の活性化につながる体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘導することが可能である。抗原は、１つ以上のエピトープ（Ｂ細胞および／またはＴ細胞エピトープ）を有することができる。抗原は、好ましくは、高度に選択的な方法で典型的に、その対応する抗体またはＴＣＲと反応し、他の抗原によって引き起され得る他の多数の抗体またはＴＣＲとは反応しない。本明細書で使用される抗原はまた、いくつかの個々の抗原の混合物であってもよい。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「生物学的に活性な」実体、または「生物学的活性」を有する実体という用語は、天然に存在する分子の構造的、調節的、または生化学的機能、または代謝または生理学的プロセスに関するまたは関連する任意の機能を有するものである。生物学的に活性なポリペプチドまたはそのフラグメントは、生物学的プロセスまたは反応に関与することができ、および／または所望の効果を生成することができるものを含む。生物学的活性は、改善された所望の活性、または所望しない活性の減少を含むことができる。例えば、実体は、別の分子との分子相互作用に関与する場合、病状を緩和する治療的価値がある場合、免疫応答を誘発する予防的価値がある場合、または分子の存在を決定する際に診断的価値および／または予後的価値がある場合、生物学的活性を示す。生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドは、天然に存在するか、または既知の要素、例えば、組換え合成または化学合成から合成することができ、および異種の要素を含むことができる。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「癌」および「癌性」という用語は、典型的には無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態をいう、または記載する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、および白血病が含まれるが、これらに限定されない。そのような癌のより詳細な例には、扁平上皮癌、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、および頭頸部癌が含まれる。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、任意の原核細胞、真核生物、初代細胞または不死化細胞株、組織または器官などのそのような細胞の任意の群をいう。好ましくは、細胞は哺乳動物（例えば、ヒト）起源であり、および１つ以上の病原体によって感染させることができる。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「同時投与する」という用語は、血液中に２つの薬物が同時に存在することをいう。２つの薬物は、同時にまたは連続して投与することができる。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「共発現される」という用語は、２つのポリペプチドが宿主細胞または宿主細胞培養培地のいずれかで相互作用または結合、および複合体を形成できるように、２つの異なるポリペプチドが宿主細胞中に同時に発現される。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「疾患」または「障害」という用語は、病状、例えば、健康状態または正常状態から分かれるものとして症状または他の識別因子によって識別され得るものをいう。「疾患」という用語には、障害、症候群、状態、および傷害が含まれる。疾患には、増殖性、炎症性、免疫性、代謝性、感染性、および虚血性の疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
本明細書で使用される場合、活性剤の「有効量」という用語は、所望の生物学的応答を引き出すために十分な量をいう。当業者によって評価されるように、本発明の化合物の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、化合物の薬物動態、治療される疾患、投与の方式、および患者などの要因に応じて変化し得る。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「核酸分子の発現」という用語は、核酸分子に含まれる情報の遺伝子産物への変換をいう。遺伝子産物は、遺伝子（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、またはその他のタイプのＲＮＡ）の直接転写産物、またはｍＲＮＡの翻訳によって生成されるペプチドまたはポリペプチドであり得る。遺伝子産物にはまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集などのプロセスによって修飾されたＲＮＡ；および、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、任意の組換えベクターまたは単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであり得るか、またはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物をいう。宿主細胞には、原核生物、真核生物、哺乳動物、鳥類、昆虫、植物または細菌の細胞が含まれ、トランスフェクト、形質転換、形質導入または感染した任意の起源の細胞であり得、またはそれは、本明細書に記載された核酸を増やすために使用され得る任意の起源の細胞であり得る。宿主細胞は単一の宿主細胞の子孫を含み、および子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な突然変異および／または変化のために、必ずしも元の親細胞と完全に同一であるとは限らない（形態または全ＤＮＡ相補物において）。宿主細胞には、本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドでインビボまたはインビトロでトランスフェクトまたは感染された細胞が含まれる。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ばれ得る。
【００５５】
宿主細胞には、哺乳動物、植物、昆虫、真菌および細菌の細胞が含まれるが、これらに限定されない。細菌細胞には、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、およびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属のようなグラム陽性菌の細胞、およびエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の細胞などのグラム陰性菌の細胞が含まれるが、これらに限定されない。真菌細胞には、好ましくは、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびハンセヌラポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）などの酵母細胞が含まれる。昆虫細胞には、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞およびＳｆ９細胞が含まれるが、これらに限定されない。植物細胞には、とりわけ、穀物、薬用または観賞用植物または球根などの作物からの細胞が含まれる。本発明に適した哺乳動物の細胞には、上皮細胞株（ブタなど）、骨肉腫細胞株（ヒトなど）、神経芽細胞腫細胞株（ヒトなど）、上皮癌（ヒト、など）、グリア細胞（マウスなど）、肝細胞株（サルなど）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１、ＡＴ１０８０、Ａ５４９、２９３またはＰＥＲ．、Ｃ６、ヒトＥＣＣ  ＮＴＥＲＡ−２細胞、ｍＥＳＣ系統のＤ３細胞、ＨＳ２９３およびＢＧＶ０１、ＳＨＥＦ１、ＳＨＥＦ２およびＨＳ１８１などのヒト胚性幹細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、２９３Ｔ細胞、ＲＥＨ細胞およびＭＣＦ−７細胞、およびｈＭＳＣ細胞が含まれる。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ」という用語は、単量体または多量体の形状であるかどうかにかかわらず、抗体全体の非抗原結合フラグメントの配列を含む分子または配列をいう。ネイティブＦｃのオリジナルの免疫グロブリン源は、好ましくはヒト由来であり、および免疫グロブリンのいずれか（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２）であり得る。ネイティブＦｃは、共有結合（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合によって二量体または多量体の形状に連結され得る単量体ポリペプチドで成り立っている。ネイティブＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）またはサブクラス（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡｌ、ＩｇＧＡ２）に応じて１−４の範囲である。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖の「フラグメント結晶化可能」領域をいうことを意味する。一般に、Ｆｃドメインは２番目のＦｃドメインと相互作用して二量体複合体を形成することができる。Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体および／または補体系のタンパク質と呼ばれる細胞表面受容体に結合することができるか、またはこれらの結合活性を低減または増大するように変更され得る。Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、またはＩｇＥ抗体アイソタイプから派生し、およびオプソニン作用、細胞溶解、肥満細胞の脱顆粒現象、好塩基球の脱顆粒現象、好酸球の脱顆粒現象、およびその他のＦｃ受容体依存性プロセス；補体経路の活性化；インビボでのタンパク質の安定性、を含む免疫活性に影響を及ぼす。
【００５８】
「Ｆｃドメイン」は、本明細書で定義されるようなネイティブＦｃ、およびＦｃ変異体分子および配列を包含する。Ｆｃ変異体およびネイティブＦｃと同様に、「Ｆｃドメイン」という用語には、抗体全体から消化されたか、または組換え遺伝子発現または他の手段によって生成されたかにかかわらず、単量体または多量体の形態の分子が含まれる。
【００５９】
Ｆｃ融合タンパク質は、ＩｇＧのＦｃ領域を、様々なサイトカインおよび可溶性受容体などの別のタンパク質のドメインと組み合わせることが報告されている（例えば、Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８９  Ｎａｔｕｒｅ３３７：５２５−５３１；Ｃｈａｍｏｗ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：５２−６０；米国特許第５，１１６，９６４号および同第５，５４１，０８７号）。
【００６０】
Ｆｃ融合物の使用は当該技術分野（例えば、米国特許第７，７５４，８５５号；第５，４８０，９８１号；第５，８０８，０２９号；ＷＯ７／２３６１４；ＷＯ９８／２８４２７，およびそれらに引用されている参考文献）で知られている。Ｆｃ融合タンパク質は、変異型Ｆｃ分子（例えば、米国特許第７、７３２、５７０号に記載されているような）を含むことができる。Ｆｃ融合タンパク質は、血漿に可溶であるか、または特定のＦｃ受容体を有する細胞の細胞表面に結びつくことができる。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ変異体」という用語は、ネイティブＦｃから変更されているが、それでもサルベージ受容体、ＦｃＲｎのための結合部位を含む分子または配列をいう。国際出願ＷＯ９７／３４６３１（１９９７年９月２５日公開）、およびＷＯ９６／３２４７８は、例示的なＦｃ変異体、ならびにサルベージ受容体との相互作用を記載しており、参照により本明細書に組み込まれる。したがって、「Ｆｃ変異体」という用語は、非ヒトネイティブＦｃからヒト化された分子または配列を含む。さらに、ネイティブＦｃは、それらが本発明の融合分子に必要とされない構造的特徴または生物学的活性を提供するので、除去され得る部位を含む。したがって、特定の実施形態では、「Ｆｃ変異体」という用語は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との非互換性（３）選択された宿主細胞における発現時のＮ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、または（７）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を与えるかまたは関わる、１つ以上のネイティブＦｃ部位または残基を欠く、分子または配列を含む。Ｆｃ変異体については、以下でさらに詳しく記載する。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、組換え、化学的または他の適切な方法によって共有結合された（すなわち、「融合された」）異なるまたは異種タンパク質からの２つ以上の領域を含むポリペプチドをいう。必要に応じて、融合分子は、ペプチドまたは他のリンカーセグメントまたは配列を介して１つまたはいくつかの部位で融合することができる。例えば、１つ以上のペプチドリンカーを使用して、融合タンパク質の構築を支援することができる。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「ＧＣ含量」という用語は、デオキシグアノシン（Ｇ）および／またはデオキシシチジン（Ｃ）デオキシリボヌクレオシド、またはグアノシン（Ｇ）および／またはシチジン（Ｃ）リボヌクレオシド残基を含む核酸配列のパーセンテージをいう。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「高用量」という用語は、少なくとも５％（例えば、少なくとも１０％、２０％、５０％、１００％、２００％、さらには３００％）、ヒトの疾患や状態の治療のための特定の化合物の最高基準の推奨用量より多いことを意味する。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「免疫応答」という用語は、免疫細胞が、別個の接着および／または活性化ステップを含む多因子プロセスを経て、血液からリンパ組織ならびに非リンパ組織に、刺激および／または補充されることによるプロセスをいう。活性化条件は、サイトカイン、成長因子、ケモカインおよび他の因子の放出を引き起こし、免疫細胞上の接着および他の活性化分子の発現をアップレギュレートし、組織を介した走化性と共に接着、形態学的変化、および／または血管外遊走を促進し、細胞増殖および細胞毒性活性を高め、抗原提示を刺激し、および記憶細胞タイプの発生を含む他の表現型の変化を提供する。免疫応答は、他の免疫細胞の炎症性または細胞毒性活性を抑制または調節する免疫細胞の活性をいうことも意味する。免疫反応とは、インビボまたはインビトロにおける免疫細胞の活性をいう。
【００６６】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における、「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、同一であるか、または同一の特定のパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチドを有し（すなわち、比較ウィンドウまたは指定された領域での最大の一致のために比較および整列されたとき、指定された領域（例えば、ＩＬ１５またはＩＬ１５Ｒα配列）にわたって、約７０％の同一性、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のより高い同一性）、以下に記載するデフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムの使用、または手動のアライメントおよび目視検査を用いて測定されるような、２つ以上の配列またはサブ配列をいう。そのような配列は、その後、「実質的に同一」であると言われる。この定義は、また、試験配列の相補物を参照し、または適用することもできる。定義には、欠失および／または追加を有する配列、ならびに置換を有する配列も含まれる。以下に記載するように、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを説明することができる。好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約２５、５０、７５、１００、１５０、２００のアミノ酸またはヌクレオチドである領域にわたって存在し、しばしば、長さが２２５、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００のアミノ酸またはヌクレオチドである領域にわたって、または、アミノ酸または核酸配列の全長にわたって、存在する。
【００６７】
配列比較のために、典型的に、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列としてふるまう。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列および参照配列がコンピューターに入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、および配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。好ましくは、デフォルトのプログラムパラメータを使用することができ、または代替パラメータを指定することができる。その後、シーケンス比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【００６８】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために適したアルゴリズムの好ましい例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９７７  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０のそれぞれに記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のワールドワイドウェブ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）上で一般公開されています。デフォルトパラメータまたはその他のデフォルトでないパラメータの両方を使用できる。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列のためには、ＢＬＡＳＴＰプログラムは３のワード長および１０の期待値（Ｅ）、および５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスアラインメント（Ｂ）（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９８９）を参照）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「阻害する」という用語は、任意の生物学的活性の測定可能な減少をいう。したがって、本明細書で使用される場合、「阻害する」または「阻害」は、通常レベルの活性のパーセンテージとして言及され得る。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「インターロイキン１５」または「ＩＬ１５」という用語は、生物学的に活性、つまり突然変異タンパク質（「ムテイン」）が少なくとも１つの機能アッセイにおいてネイティブＩＬ１５タンパク質と同様の機能（７５％以上）を有する、哺乳動物のネイティブＩＬ１５アミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する、ポリペプチドをいう。機能的には、ＩＬ１５はＴ細胞およびナチュラルキラー細胞の活性化と増殖を調節するサイトカインである。
【００７１】
ＩＬ１５およびＩＬ２は、ＣＤ１２２、ＩＬ２β／ＩＬ１５β受容体サブユニットへの結合を含む多くの生物学的活性を共有している。ＣＤ８＋記憶細胞の数は、このＩＬ１５とＩＬ２間のバランスによって制御される。ＩＬ１５は、ＪＡＫキナーゼの活性化、ならびに転写活性化因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、およびＳＴＡＴ６のリン酸化および活性化を誘導する。ＩＬ１５はまた、おそらくＳＴＡＴ６の転写活性化活性を介して、アポトーシス阻害剤ＢＣＬ２Ｌ１／ＢＣＬ−Ｘ（Ｌ）の発現を増加させ、したがってアポトーシスを阻止する。同じ成熟タンパク質をコードするＩＬ１５遺伝子の２つの選択的スプライシング転写変異体が報告されている。
【００７２】
ＩＬ１５ポリペプチドの例示された機能的アッセイは、Ｔ細胞の増殖（例えば、Ｍｏｎｔｅｓ  ｅｌ  ａｌ．  ２００５  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  ｉｍｍｕｎｏｌ  １４２：２９２）、およびＮＫ細胞、マクロファージ、および好中球の活性化を含む。特定の免疫細胞亜集団を単離し、増殖を検出するための方法（すなわち、３Ｈチミジンの取り込み）は、当該技術分野で周知である。細胞媒介性細胞傷害アッセイは、ＮＫ細胞、マクロファージ、および好中球の活性化を測定するために使用できる。同位体（５１Ｃｒ）、染料（例えば、テトラゾリウム、ニュートラルレッド）または酵素の放出を含む細胞媒介性細胞傷害アッセイもまた、市販のキット（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｍ；Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ）とともに、当該技術分野で周知である。ＩＬ１５は、Ｆａｓ媒介アポトーシスを阻害することも示されている（例えば、Ｄｅｍｉｒｃｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １：１２３）。例えば、ＴＵＮＥＬアッセイおよびアネキシンＶアッセイを含むアポトーシスアッセイは、市販のキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）とともに、当該技術分野で周知である（例えば、Ｃｏｌｉｇａ  ｅｔ  ｅｌ．１９９１−２００６  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．）。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「インターロイキン１５受容体アルファ」または「ＩＬ１５Ｒα」という用語は、哺乳動物由来のインターロイキン１５受容体アルファアミノ酸配列をいう。当業者は、インターロイキン−１５受容体アルファ核酸およびアミノ酸配列が遺伝子データベース、例えば、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のワールドワイドウェブ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を介したＧｅｎＢａｎｋ上で一般公開されていることを認識している。例示された哺乳動物のネイティブＩＬ−１５受容体アルファ核酸またはアミノ酸配列は、例えば、ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどに由来し得る。例示的な哺乳動物のネイティブＩＬ−１５核酸配列のアクセッション番号には、ＮＭ＿１７２２００．１（ヒトアイソフォーム２）、およびＮＭ＿００２１８９．２（ヒトアイソフォーム１前駆体）が含まれる。例示的なネイティブ哺乳動物ＩＬ−１５アミノ酸配列のアクセッション番号には、ＮＰ＿７５１９５０．１（ヒトアイソフォーム２）、およびＮＰ＿００２１８０．１（ヒトアイソフォーム１前駆体）が含まれる。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「インターロイキン１５受容体アルファ」または「ＩＬ１５Ｒα」はまた、生物学的に活性であり、少なくとも１つの機能アッセイにおいてネイティブＩＬ１５Ｒαタンパク質と同様の機能（７５％以上）を有する、ネイティブ哺乳動物ＩＬ１５Ｒαアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する、ポリペプチドをいい得る。ＩＬ１５Ｒαは、高い親和性でＩＬ１５に特異的に結合するサイトカイン受容体である。１つの機能アッセイは、ネイティブＩＬ１５タンパク質への特異的結合である。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「単離された」分子（ポリペプチドまたはポリヌクレオチドなど）という用語は、自然界よりも高濃度で存在するように操作されたもの、またはその本来の環境から取り出されたものである。例えば、それが天然には結合していない対象でない抗体材料の少なくとも１０％、または２０％、または４０％、または５０％、または７０％、９０％が除去されたときに、対象の抗体は単離され、精製され、実質的に単離され、または実質的に精製される。例えば、生きている動物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、その天然状態の共存物質から分離された、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されている。さらに、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されたとみなされる。単離されたＲＮＡ分子は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子のインビボまたはインビトロＲＮＡ複製産物を含む。単離された核酸分子は、合成的に生成された分子をさらに含む。加えて、組換え宿主細胞に含まれるベクター分子も単離される。したがって、すべての「単離された」分子が「精製される」必要はない。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「リンカー」または「リンカーセグメント」という用語は、２つの他の分子または基を接続する分子または基をいう。ペプチドリンカーは、接続された分子または基が機能的な配置を獲得することを可能にし得る。リンカーペプチドは、好ましくは、少なくとも２つのアミノ酸、少なくとも３つのアミノ酸、少なくとも５つのアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも６０個のアミノ酸、少なくとも７０個のアミノ酸、少なくとも８０個のアミノ酸、少なくとも９０個のアミノ酸、またはおよそ１００個のアミノ酸を含む。
【００７７】
サイトカインまたは他の生物活性分子、および任意のペプチドリンカーなどの融合タンパク質の要素は、融合タンパク質が意図された機能を有するならば、ほぼすべての様式で組織化することができる。特に、融合タンパク質の各要素は、必要に応じて、少なくとも１つの適切なペプチドリンカーセグメントまたは配列によって別の要素から間隔をあけることができる。加えて、融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質の修飾、同定および／または精製を容易にするためのタグを含み得る。より具体的な融合タンパク質は、以下の実施例に記載されている。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「低用量」という用語は、少なくとも５％（例えば、少なくとも１０％、２０％、５０％、８０％、９０％、または９５％さえ）、任意のヒトの疾患や状態の治療のための所定の投与経路のために処方された特定の化合物の最低基準の推奨用量より少ないことをいう。例えば、吸入による投与のために処方された低用量の薬剤は、経口投与のために処方された同じ薬剤の低用量とは異なるであろう。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」または「培地（ｍｅｄｉａ）」という用語は、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真核生物宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、ＣＨＯ細胞、原核宿主細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主細胞、および細胞内容物を含む任意の宿主細胞を支持または含むことができる任意の培養培地、溶液、固体、半固体、または剛性の支持体を含む。したがって、この用語は、宿主細胞が増殖した培地、例えば、増殖ステップ前または後のいずれかの培地を含む、ポリペプチドが分泌された培地を包含し得る。この用語はまた、ポリペプチドが細胞内で生成され、および宿主細胞が溶解または破壊されてポリペプチドを放出する場合のような、宿主細胞溶解物を含む緩衝液または試薬を包含し得る。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「調整する」という用語は、適切なコントロールと比較したとき、測定された活性における増加または減少、刺激、阻害、干渉、または遮断の直接的または間接的な生成をいう。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「モジュレーター」は、適切なコントロールと比較したとき、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの測定された活性に影響を与える、例えば、増加、減少、刺激、阻害、干渉、または遮断する実態をいう。例えば、「モジュレーター」は、測定可能な親和性で標的に結合および／または活性化または阻害するか、あるいは受容体活性の正常な調節に直接的または間接的に影響を及ぼし得る。
【００８１】
「作動可能に連結された」という用語は、第１の核酸配列および第２の核酸配列が単一の核酸配列に転写されるような、第１の核酸配列と第２の核酸配列との間の機能的な連結をいう。作動可能に連結された核酸配列は、互いに物理的に隣接している必要はない。「作動可能に連結された」という用語はまた、核酸発現制御配列（プロモーター、または転写因子結合部位のアレイなど）と転写可能な核酸配列との間の機能的連結をいい、ここで、発現制御配列は転写可能な配列に対応する核酸の転写を方向付ける。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」賦形剤、担体、または希釈剤という用語は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶剤またはカプセル化材料などの薬学的に許容される材料、組成物または媒体をいい、対象の医薬品をある器官または体の一部から、別の器官または体の一部へ運搬することまたは輸送することに関わる。各担体は、製剤の他の成分と適合性があり、および患者に害を及ぼさないという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容される担体として役立つことができる材料のいくつかの例は、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロース、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースの誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ごま油、オリーブ油、コーン油、および大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；および医薬製剤に使用される他の非毒性の適合性物質を含む。湿潤剤、乳化剤および潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウムおよびポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドコポリマー、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味料および芳香剤、保存料および酸化防止剤もまた、組成物中に存在することができる。
【００８３】
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」は、任意の長さのリボヌクレオチドならびにデオキシリボヌクレオチドを含む、ヌクレオチドの重合体形態を指すために、本明細書では交換可能に使用される。それらは、二重鎖、一本鎖または三重らせん配列の両方を含むことができ、これらには、ウイルス、原核生物および真核細胞源からのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ウイルス（例えば、ＤＮＡウイルスおよびレトロウイルス）または原核生物源からのゲノムＤＮＡ配列；ＲＮＡｉ；ｃＲＮＡ；アンチセンス分子；組換えポリヌクレオチド；リボザイム；および合成ＤＮＡ配列が挙げられるがこれらに限定されない。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの既知の塩基類似体のいずれかを含む配列も捕捉する。ヌクレオチドは、それらの共通に受け入れられた単文字コードによって参照され得る。
【００８４】
ポリヌクレオチドは、それらが天然に現れるままでポリヌクレオチドに限定されず、これはまた、非天然ヌクレオチド類似体およびヌクレオチド間結合が現れるポリヌクレオチドを含む。核酸分子は、修飾された核酸分子（例えば、修飾された塩基、糖、および／またはヌクレオチドリンカー）を含み得る。このタイプの非天然な構造の非限定的な例には、糖がリボースとは異なるポリヌクレオチド、ホスホジエステル結合３’−５’および２’−５’が現れるポリヌクレオチド、逆結合（３’−３’および５’−５’）および分岐構造が現れるポリヌクレオチドが挙げられる。また、本発明のポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、Ｃ１−Ｃ６アルキルホスホトリエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートタイプのＣ１−Ｃ４アルキルホスホネート結合などの非天然ヌクレオチド間結合を含む。いずれの場合でも、本発明のポリヌクレオチドは、天然ポリヌクレオチドと同様の方法で標的核酸とハイブリダイズする能力を維持している。
【００８５】
別段の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列、ならびに明示的に示された配列を暗黙的に包含する。縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成することができる。（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；  Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．１９８５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；  Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８．）
【００８６】
本明細書で使用される場合、用語「予防する」、「予防する」または「予防」という用語は、疾患または状態の発症、発生、重篤度、または再発を排除、遅延、回避、または停止するための方法をいう。例えば、方法は、その方法を受けていない対象と比較して、疾患または状態に感受性である対象において、疾患または症状またはその１つ以上の症状の発症、発生、重篤度、または再発の減少または遅延がある場合に予防とみなされる。
、開示された方法はまた、治療を受ける前の対象の進行と比較して、この方法を受けた後の疾患または状態に感受性である対象における疾患または状態の１つまたは複数の症状の発症、発症、重篤度、または再発の減少または遅延がある場合には、予防とみなされる。
骨粗鬆症の発症、発生、重篤度、または再発の減少または遅延は、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、またはそれらの間の任意の量の減少であり得る。
【００８７】
予防等は、対象が特定の疾患または障害をずっと受けないようにすることを意味するものではない。予防には、複数回の投与が必要になる場合がある。予防には、すべての疾患症状が排除された対象における疾患の再発の予防、または再発寛解型疾患における再発の予防が含まれ得る。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、哺乳動物細胞中でＲＮＡポリメラーゼを結合し、それに作動可能に連結された下流（３’方向）コーディング配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域をいう。プロモーター配列は、バックグラウンドより高いレベルで目的の遺伝子の転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含む。プロモーター配列内には、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が含まれ得る。真核生物プロモーターは、しばしば、常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含むであろう。プロモーターは、核酸分子に自然に隣接しているもの、および核酸分子に自然に隣接していないものを含む。さらに、「プロモーター」という用語は、誘導性プロモーター、ｃｒｅ−ｌｏｘプロモーターなどの条件付き活性プロモーター、構成的プロモーター、および組織特異的プロモーターを含む。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に使用され、最小の長さに限定されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などがこの定義に含まれる。完全長タンパク質とそのフラグメントの両方が定義に含まれる。これらの用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。さらに、ポリペプチドは、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然配列に対する欠失、付加、および置換（一般に本質的に保存的）などの修飾を含むタンパク質を指し得る。これらの変更は、意図的なものか、偶発的なものである可能性がある。アミノ酸は、本明細書では、一般に知られている３文字の記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）が推奨する１文字の記号のいずれかで参照できる。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「精製された」という用語は、その天然に存在する環境、すなわち天然細胞、または組換え生産されたタンパク質の場合には、宿主細胞において見られるように、タンパク質に通常付随するかまたは相互作用する成分を実質的または本質的に含まないタンパク質をいう。細胞物質を実質的に含まない可能性のあるタンパク質は、約３０％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満（乾燥重量で）の夾雑タンパク質の調製物を含む。タンパク質またはその変異体が宿主細胞によって組換え的に産生される場合、タンパク質は、細胞の乾燥重量の約３０％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％以下で存在し得る。タンパク質またはその変異体が宿主細胞によって組換え的に産生される場合、タンパク質は、培養培地中に細胞の乾燥重量の約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、または約１ｍｇ／Ｌ以下で存在し得る。したがって、「実質的に精製された」タンパク質は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、およびキャピラリー電気泳動などの適切な方法によって決定される、少なくとも約８０％の純度レベル、具体的には、少なくとも約８５％の純度レベル、より具体的には、少なくとも約９０％の純度レベル、少なくとも約９５％のレベル、少なくとも約９９％の純度レベル、および９９％以上の純度レベルを有することができる。
【００９１】
本発明のタンパク質およびプロドラッグは、それらの調製に続いて、好ましくは単離および／または精製されて、８０重量％以上の量（「実質的に純粋」）を含む組成物が得られ、これが次に本明細書に記載されるように、使用されるかまたは処方される。特定の実施形態において、本発明の化合物は、９５％を超える純度である。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「受容体」という用語は、リガンドと呼ばれる別の分子と相互作用することができる、糖タンパク質またはそのフラグメントを含むタンパク質を指す。リガンドは、任意のクラスの生化学的または化学的化合物に属し得る。リガンドは通常、細胞外分子であり、受容体に結合すると、通常、シグナル伝達経路の開始などの細胞応答を開始する。受容体は必ずしも膜結合タンパク質である必要はない。
【００９３】
本明細書で使用される場合、核酸分子に関する「組換え」という用語は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルス、半合成、および／または合成起源のポリヌクレオチドを意味し、その起源または操作のために、それが天然に結合しているポリヌクレオチドの一部またはすべてに結合していない。タンパク質またはポリペプチドに関して使用される「組換え」という用語は、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。宿主細胞に関して使用される「組換え」という用語は、組換えポリヌクレオチドが導入された宿主細胞を意味する。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「サンプル」という用語は、ヒト、動物からのサンプル、または研究サンプル、例えば、細胞、組織、器官、液体、ガス、エアロゾル、スラリー、コロイド、または凝固物質をいう。「サンプル」は、例えば、ヒトまたは動物から除去することなく、インビボで試験され得るか、またはそれは、インビトロで試験され得る。サンプルは、例えば、組織学的方法によって、処理後に試験することができる。「サンプル」はまた、例えば、液体または組織サンプルを含む細胞、または液体または組織サンプルから分離された細胞を指す。「サンプル」はまた、ヒトまたは動物から新たに採取された細胞、組織、器官、または液体、あるいは処理または保存された細胞、組織、器官、または液体である。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「可溶性」という用語は、低Ｇ力遠心分離（例えば、標準的な遠心分離機で毎分約３０，０００回転未満）下で水性緩衝液、例えば、細胞培地から容易に沈降しない融合分子、特に融合タンパク質を指す。融合分子は、それが約５〜３７℃を超える温度で、低濃度アニオン性または非イオン性界面活性剤の存在下または非存在下で中性ｐＨまたはその近くで水溶液中に留まる場合、可溶性である。これらの条件下では、可溶性タンパク質の沈降値はしばしば低く、例えば約１０〜５０スヴェドベリ単位未満になる。
【００９６】
本明細書で参照される水溶液は、典型的には、ｐＨを確立するための緩衝化合物を有し、典型的には、約５〜９のｐＨ範囲内であり、イオン強度範囲は、約２ｍＭ〜５００ｍＭである。プロテアーゼ阻害剤または穏やかな非イオン性界面活性剤が加えられることがある。さらに、所望される場合、キャリアタンパク質を添加することができる（例えば、ウシ血清アルブミン）。例示的な水性緩衝液には、標準的なリン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、または他の周知の緩衝液および細胞培地製剤が含まれる。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「可溶性ＩＬ１５受容体アルファ」という用語は、受容体の膜貫通アンカー部分を欠き、したがって原形質膜に固定されることなく細胞から分泌され得るＩＬ１５受容体アルファの形態を指す。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「刺激する」または「刺激すること」という用語は、生理学的活性、例えば免疫応答を増加させる、増幅する、増強する、ブーストすることを指す。刺激はポジティブな変化になる可能性がある。例えば、増加は５％、１０％、２５％、５０％、７５％、さらには９０〜１００％になる可能性がある。他の例示的な増加には、２倍、５倍、１０倍、２０倍、４０倍、または１００倍さえが含まれる。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、生きている動物（ヒトまたは非ヒト）を指す。対象は哺乳動物であり得る。「哺乳動物」または「哺乳類」という用語は、分類学的分類哺乳類内の任意の動物を指す。哺乳動物は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウスであり得る。「対象」という用語は、疾患または状態に関して完全に正常であるか、またはすべての点で正常である個体を排除するものではない。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「抑制する」または「抑制すること」という用語は、生理学的活性、例えば、免疫応答を減少させる、弱める、減ずる、停止させる、または安定化することを指す。抑制はネガティブな変化である可能性がある。例えば、減少は５％、１０％、２５％、５０％、７５％、さらには９０〜１００％さえになる可能性がある。例示的な減少には、２倍、５倍、１０倍、２０倍、４０倍、または１００倍さえが含まれる。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、望ましくない副作用を最小限に抑えるか、または全く伴わずに、意図された治療効果を達成するのに十分な治療剤（単数または複数）の治療剤の用量を指す。治療有効量は、例えば、最初に低用量の薬剤を投与し、次に、望ましくない副作用が最小限または全くない状態で所望の治療効果が達成されるまで用量を漸増することによって、当業者によって容易に決定することができる。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「トランスフェクトされた」という用語は、リポフェクタミンなどの付随する促進剤の使用の有無にかかわらず、導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを保有することを意味する。当該技術分野で知られているトランスフェクションの方法には、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、およびリポフェクションが含まれる。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、疾患または障害の「治療」または「治療すること」という用語は、そのような状態、またはそのような疾患または状態の１つまたは複数の症状を、それが起こる前または後に軽減、遅延、または改善する方法を指す。治療は、疾患および／または根底にある病状の１つまたは複数の影響または症状に向けられ得る。治療は、任意の軽減であり得、そして疾患または疾患の症状の完全な切除であり得るが、これらに限定されない。同等の未処理の対照と比較して、そのような減少または予防の程度は、標準的な手法によって測定されるように、少なくとも５％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、または１００％である。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「腫瘍」という用語は、任意の悪性または新生物細胞を指す。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、遺伝物質を宿主細胞または生物に伝達することができる核酸分子を指す。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかで構成される。ベクターは、独自の複製起点、外来ＤＮＡの挿入に使用できる制限エンドヌクレアーゼのための１つ以上の固有の認識部位、および抗生物質耐性をコードする遺伝子などの通常の選択可能なマーカー、および多くの場合、挿入されたＤＮＡの発現のための認識配列（プロモーターなど）を有している。一般的なベクターには、プラスミドベクターとファージベクターが含まれる。
【０１０６】
本明細書に開示される任意の組成物または方法は、本明細書に提供される他の組成物および方法のいずれか１つまたは複数と組み合わせることができる。
＜発明の詳細な説明＞
【０１０７】
本発明は、新規の融合タンパク質およびその治療的使用を提供する。より具体的には、本発明は、ＩＬ１５およびそのプロドラッグの新規融合タンパク質、その組成物および調製方法を提供し、これらは、様々な疾患および障害、例えば、過形成、固形腫瘍または造血悪性腫瘍を治療中に低減されたオフターゲット毒性および副作用で治療するのに有用である。
【０１０８】
一態様においては、本発明は、全体として、融合タンパク質に関する。融合タンパク質は、第１の構造単位：インターロイキン１５受容体（ＩＬ１５Ｒ）のサブユニットまたはそのフラグメント；第２の構造単位：活性ＩＬ１５；第３の構造単位：融合タンパク質のＣ末端に位置する抗体Ｆｃフラグメント、および第１、第２および第３の構造単位を共有結合する第１のリンカーセグメントを含み、ここで、融合タンパク質のＮ末端に第１の構造単位があり、第２の構造単位が第１の構造単位と第３の構造単位との間に位置する。
【０１０９】
別の態様において、本発明は、全体として、融合タンパク質に関する。融合タンパク質は、第１の構造単位：インターロイキン１５受容体（ＩＬ１５Ｒ）のサブユニットまたはそのフラグメント；第２の構造単位：活性ＩＬ１５；第３の構造単位：融合タンパク質のＣ末端に位置する抗体Ｆｃフラグメント、および、第１、第２および第３の構造単位と共有結合するリンカーセグメントを含み、および第１、第２および第３の構造単位を共有結合する第１のリンカーセグメントをであって、上記融合タンパク質のｎ末端が上記第２の構造単位である場合、上記第１の構造単位は、上記第２の構造単位と上記第３の構造単位との間に位置する。
【０１１０】
融合タンパク質の特定の実施形態では、ＩＬ１５Ｒのサブユニットは、αサブユニット、βサブユニット、およびγサブユニットから選択される。
【０１１１】
融合タンパク質の特定の実施形態では、ＩＬ１５Ｒのサブユニットは、αサブユニットである。
【０１１２】
融合タンパク質の特定の実施形態において、フラグメントは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する、マウスＩＬ１５Ｒのαサブユニットのスシドメインである。
【０１１３】
融合タンパク質の特定の実施形態において、フラグメントは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する、ヒトＩＬ１５Ｒのαサブユニットのスシドメインである。
【０１１４】
融合タンパク質の特定の実施形態において、ＩＬ１５は、ヒトまたはマウスのＩＬ１５である。
【０１１５】
融合タンパク質の特定の実施形態において、ＩＬ１５はマウスＩＬ１５である。融合タンパク質の特定の実施形態において、マウスＩＬ１５は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。
【０１１６】
融合タンパク質の特定の実施形態において、ＩＬ１５はヒトＩＬ１５である。融合タンパク質の特定の実施形態において、ヒトＩＬ１５は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。
【０１１７】
融合タンパク質の特定の実施形態において、抗体Ｆｃフラグメントは、ヒトＦｃフラグメントを含む。
【０１１８】
融合タンパク質の特定の実施形態において、ヒトＦｃフラグメントは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１−Ｆｃを含む。
【０１１９】
融合タンパク質の特定の実施形態において、リンカーセグメントＬ１は、複数のＧＧＧＳを含む。
【０１２０】
融合タンパク質の特定の実施形態において、第１の構造単位を第３の構造単位に連結するリンカーセグメントＬ１は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１２１】
融合タンパク質の特定の実施形態において、第１および第２の構造単位を連結するリンカーセグメントＬ１は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１２２】
特定の実施形態において、融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端に位置する第４の構造単位：ＩＬ１５受容体βサブユニット（Ｒβ）の細胞外ドメイン、および第４の構造単位と融合タンパク質の残りの構造単位とを共有結合するリンカーセグメントＬ２をさらに含み、ここで、第１の構造単位は、第４の構造単位のＣ末端に共有結合し、第２の構造単位は、上記第１の構造単位と上記第３の構造単位との間に位置し、上記リンカーセグメントＬ２は、腫瘍微小環境で特異的に発現するタンパク質分解酵素によって認識および加水分解可能である。
【０１２３】
特定の実施形態において、融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端に位置する第４の構造単位：ＩＬ１５受容体βサブユニット（Ｒβ）の細胞外ドメイン、および第４の構造単位と融合タンパク質の残りの構造単位とを共有結合するリンカーセグメントＬ２をさらに含み、第２の構造単位は第４の構造単位のＣ末端に共有結合しており、上記第１の構造単位は、上記第２の構造単位と上記第３の構造単位との間に位置し、上記リンカーセグメントＬ２は、腫瘍微小環境で特異的に発現するタンパク質分解酵素によって認識および加水分解可能である。
【０１２４】
特定の実施形態において、マウスＲｂのアミノ酸配列は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する。
【０１２５】
特定の実施形態において、ヒトＲｂのアミノ酸配列は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する。
【０１２６】
融合タンパク質の特定の実施形態において、腫瘍微小環境において特異的に発現されるタンパク質分解酵素は、マトリックスメタロプロテイナーゼである。
【０１２７】
融合タンパク質の特定の実施形態において、マトリックスメタロプロテイナーゼは、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）である。
【０１２８】
融合タンパク質の特定の実施形態において、マトリックスメタロプロテイナーゼは、マトリックスメタロプロテイナーゼ１４（ＭＭＰ１４）である。
【０１２９】
融合タンパク質の特定の実施形態において、リンカーセグメントＬ２は、配列番号１０−２３に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１３０】
さらに別の局面において、本発明は、全体として、本明細書に開示される融合タンパク質を含む、ホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質に関する。
【０１３１】
特定の実施形態において、ホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質は、ＲＡ−ＩＬ１５−Ｆｃの単量体：マウスＩＬ１５受容体αサブユニットのスシドメイン、リンカーセグメントＬ１、マウスＩＬ１５、リンカーセグメントＬ１、例えば、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃの融合タンパク質を含む。
【０１３２】
特定の実施形態において、ホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質は、ＲＡ−ＩＬ１５−Ｆｃの単量体：ヒトＩＬ１５受容体αサブユニットのスシドメイン、リンカーセグメントＬ１、ヒトＩＬ１５、リンカーセグメントＬ１、例えば、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃの融合タンパク質を含む。
【０１３３】
特定の実施形態において、ホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質は、ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃの単量体：マウスＩＬ１５、リンカーセグメントＬ１、ＩＬ１５受容体αサブユニットのスシドメイン、リンカーセグメントＬ１、例えば、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃの融合タンパク質を含む。
【０１３４】
特定の実施形態において、ホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質は、ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃの単量体：ヒトＩＬ１５、リンカーセグメントＬ１、ＩＬ１５受容体αサブユニットのスシドメイン、リンカーセグメントＬ１、例えば配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有する、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃの融合タンパク質を含む。
【０１３５】
特定の実施形態において、ホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質は、ＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃの単量体：マウスＩＬ１５受容体βサブユニットの細胞外ドメイン、リンカーセグメントＬ２、マウスＩＬ１５、リンカーセグメントＬ１、ＩＬ１５受容体αサブユニットのスシドメイン、リンカーセグメントＬ１、例えば、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有する、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃの融合タンパク質を含む。
【０１３６】
特定の実施形態において、ホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質は、ＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃの単量体：ヒトＩＬ１５受容体βサブユニットの細胞外ドメイン、リンカーセグメントＬ２、ヒトＩＬ１５、リンカーセグメントＬ１、ＩＬ１５受容体αサブユニットのスシドメイン、リンカーセグメントＬ１、例えば、配列番号２９−４１に記載のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃの融合タンパク質を含む。
【０１３７】
特定の実施形態において、ホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質は、ＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃの単量体：ヒトＩＬ１５受容体βサブユニットの細胞外ドメイン、リンカーセグメントＬ１、ヒトＩＬ１５、リンカーセグメントＬ１、ＩＬ１５受容体αサブユニットのスシドメイン、リンカーセグメントＬ１、例えば、配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃの融合タンパク質を含む。
【０１３８】
特定の実施形態において、ホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質は、腫瘍微小環境において特異的に発現されるタンパク質分解酵素によって加水分解される。
【０１３９】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、本明細書に開示される、融合タンパク質またはフラグメントなどの実質的に精製されたタンパク質に関する。
【０１４０】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、本明細書に開示される、融合タンパク質またはそのフラグメントなどのタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。
【０１４１】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、本明細書に開示される、融合タンパク質またはそのフラグメントなどのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。
【０１４２】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、本明細書に開示される融合タンパク質またはそのフラグメントなどのタンパク質および、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む医薬組成物に関する。
【０１４３】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、本明細書に開示される融合タンパク質またはそのフラグメントなどのタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む医薬組成物に関する。
【０１４４】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、疾患または状態を治療するための方法に関する。この方法は、それを必要とする患者に、本明細書に開示される融合タンパク質またはそのフラグメントなどのタンパク質をコードする治療有効量のポリヌクレオチドを投与することを含み、疾患または状態は、過形成、固形腫瘍または造血器悪性腫瘍から選択される。
【０１４５】
特定の実施形態において、治療されている疾患または状態は、過形成である。
【０１４６】
特定の実施形態において、治療されている疾患または状態は、固形腫瘍である。
【０１４７】
特定の実施形態において、治療されている疾患または状態は、造血器悪性腫瘍である。
【０１４８】
特定の実施形態において、治療される対象は、化学療法、放射線療法、標的療法、免疫療法またはホルモン療法のうちの１つ以上をさらに投与される。
【０１４９】
特定の実施形態では、この方法は、化学療法剤を対象に投与することをさらに含む。
【０１５０】
特定の実施形態では、この方法は、対象に放射線療法を施すことをさらに含む。
【０１５１】
特定の実施形態では、この方法は、対象に標的療法を施すことをさらに含む。
【０１５２】
特定の実施形態では、この方法は、対象に免疫療法を施すことをさらに含む。
【０１５３】
特定の実施形態では、この方法は、対象にホルモン療法を施すことをさらに含む。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、「化学療法剤」という用語は、癌の治療において有用な化合物をいう。化学療法剤の例には、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍ．）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、スーテント（ＳＵ１１２４８、Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）、ノバルティス）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、オキサリプラチン（エロキサチン（登録商標）、サノフィ）、５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）、ロイコボリン、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）、ワイス）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６、グラクソスミスクライン）、ロナファミブ（Ｌｏｎａｆａｍｉｂ）（ＳＣＨ  ６６３３６）、ソラフェニブ（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）（ＢＡＹ４３−９００６、Ｂａｙｅｒ  Ｌａｂｓ）、およびゲフェチニブ（Ｇｅｆｉｔｍｉｂ）（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）、アストラゼネカ）、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ  ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボクオン、メチュレドーパ、ウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチルメラミンを含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類化合物を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似化合物、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロマファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムヌスチンなどのニトロソウレア；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ１およびカリケアマイシンオメガ１（Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（１９９４）３３：１８３−１８６）；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマ���シン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）（ドキソルビシン）、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソニビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗物質；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン等のピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン等のアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン等の抗副腎剤；フォリン酸（ｆｒｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）等の葉酸補充剤；アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジコン；エルフオルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシンおよびアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラエリン；ペントスタチン、フェナメト；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジン；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン、２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン、トリコテセン（特に、Ｔ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；クロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）（パクリタキセル；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（発色団なし）、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、１１１）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（��セタキセル；Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）（ゲムシタビン）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）（ビノレルビン）；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤  ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸等のレチノイド；および上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、および誘導体が挙げられる。
【０１５５】
第２の（または、さらなる）薬剤または治療薬の例には、免疫療法（例えば、ＰＤ−１阻害剤（ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セツキシマブ）、ＰＤ−Ｌ１阻害剤（アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ）、ＣＴＬＡ４拮抗薬、細胞シグナル伝達阻害剤（例えば、イマチニブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、エルロチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ダサチニブ、ボリノスタット、ラパチニブ、テムシロリムス、ニロチニブ、エバーオリムス、パゾパニブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ラニビズマブ、ペガプタニブ、パニツムマブなど）、有糸分裂阻害剤（例えば、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチンなど）、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、シクロホスファミド、クロマブシル、カルムスチンなど）、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、５−ＦＵなど）、インターカレートする抗癌剤（例えば、アクチノマイシン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣなど）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、テニポシドなど）、免疫療法剤（例えば、インターロイキン、インターフェロンなど）および抗ホルモン剤（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェンなど）が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１５６】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、疾患または障害（例えば、過形成、固形腫瘍または造血器悪性腫瘍）を治療または軽減するための、本明細書に開示される融合タンパク質またはそのフラグメントなどのタンパク質の使用に関する。
【０１５７】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、疾患または障害（例えば、過形成、固形腫瘍または造血器悪性腫瘍）を治療または軽減するための、本明細書に開示される融合タンパク質またはそのフラグメントなどのタンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用に関する。
【０１５８】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、疾患または障害（例えば、過形成、固形腫瘍または造血器悪性腫瘍）を治療または軽減するための薬剤の調製における、本明細書に開示される融合タンパク質またはそのフラグメントなどのタンパク質、および薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤の使用に関する。
【０１５９】
さらに別の態様では、本発明は、全体として、疾患または障害（例えば、過形成、固形腫瘍または造血器悪性腫瘍）の治療または軽減するための薬剤の調製において本明細書に開示される融合タンパク質またはそのフラグメントなどのタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤の使用に関する。
【０１６０】
特定の実施形態では、薬剤は抗癌剤である。
【０１６１】
特定の実施形態において、疾患または障害は、頭頸部癌、子宮内膜癌、大腸癌、卵巣癌、乳癌、黒色腫、肺癌、腎癌、肝臓癌、肛門癌、肉腫、リンパ腫、白血病、脳腫瘍、胃癌、精巣癌、膵臓癌、および甲状腺癌から選択される、１種以上である。
【０１６２】
特定の実施形態において、抗癌剤は、Ｂ細胞リンパ腫を治療する、または抗大腸癌に有効である。
【０１６３】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、本明細書に開示される、融合タンパク質またはそのフラグメントなどのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細胞株に関する。
【０１６４】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、細胞株を培養する工程を含む、タンパク質を作製するための方法に関する。特定の実施形態では、この方法は、本明細書に開示される、融合タンパク質またはそのフラグメントなどの生成されたタンパク質を精製または単離する工程をさらに含む。
【０１６５】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、タンパク質を作製するための方法に関し、この方法は、本明細書に開示される融合タンパク質またはそのフラグメントなどのタンパク質をコードする発現ベクターを提供する工程、発現ベクターを宿主細胞に導入する工程、タンパク質を発現するのに十分な条件下で培地中で宿主細胞を培養する工程、および宿主細胞または培地からタンパク質を精製する工程を含む。
【０１６６】
任意の適切な発現ベクターを使用することができる。例示的な発現ベクターは、ｐＥＥ１２．４発現ベクターである。
【０１６７】
任意の適切な宿主細胞、例えば、２９３ＦおよびＣＨＯ細胞を用いることができる。
【０１６８】
発現ベクターの導入は、任意の適切なトランスフェクション法により、および一過性トランスフェクションまたは安定な細胞株を介して、達成することができる。
【０１６９】
任意の適切な精製方法を用いることができる。例示的な精製方法は、プロテインＡ／Ｇのアフィニティークロマトグラフィーまたはサイズ排除法によるものである。
【０１７０】
さらに別の態様において、本発明は、全体として、本明細書に開示される方法によって生成される単離されたタンパク質に関する。
【０１７１】
特定の実施形態において、単離されたタンパク質は、実質的に純粋である。
【０１７２】
本明細書に開示されるように、リンカー配列を使用して、生物学的に活性なポリペプチドの２つ以上のポリペプチドを連結して、所望の機能的活性を有する一本鎖分子を生成することができる。
【０１７３】
任意の適切なリンカーを採用することができる。例示的なペプチドリンカー配列は、約７から２０アミノ酸、例えば、約８から１６アミノ酸を有するものを含む。リンカー配列は、生物学的に活性なポリペプチドまたはエフェクター分子を単一の望ましくないコンフォメーションで保持しないように、好ましくは柔軟（フレキシブル）である。リンカー配列は、例えば、融合した分子から認識部位の間隔をあけるために使用することができる。具体的には、ペプチドリンカー配列は、分子の柔軟性を提供するように配置することができる。リンカーは、好ましくは、柔軟性を提供するために、グリシン、アラニン、およびセリンなどの小さな側鎖を有するアミノ酸を主に含む。
【０１７４】
全体として、本発明の融合タンパク質複合体の調製は、本明細書に開示される手順によって、および例えば、ポリメラーゼ連鎖増幅反応（ＰＣＲ）、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素を用いるＤＮＡの開裂、オリゴヌクレオチドの調製、ＤＮＡのライゲーション、ｍＲＮＡの単離、適切な細胞へのＤＮＡの導入、宿主の形質転換またはトランスフェクション、宿主の培養を含む、認識された組換えＤＮＡ技術によって達成され得る。さらに、融合分子は、カオトロピック剤、および周知の電気泳動、遠心分離、およびクロマトグラフィーの方法を使用して単離および精製することができる。（これらの方法に関連する開示については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．（１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌ、ｅｔ  ａｌ．、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９））
【０１７５】
本発明はさらに、提示する融合タンパク質をコードする核酸配列およびＤＮＡ配列を提供する。ＤＮＡ配列は、ファージ、ウイルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ、またはエピソームなどの染色体外複製に適したベクターによって運ばれ得る。例えば、所望の融合タンパク質をコードするＤＮＡベクターを使用して、本明細書に記載の調製方法を容易にし、およびかなりの量の融合タンパク質またはその成分を得ることができる。ＤＮＡ配列は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳のために必要な要素を含むベクターに、挿入することができる。タンパク質コード配列を発現させるために、様々な宿主ベクターシステムが利用できる。これらには、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母などの微生物、またはバクテリオファージＤＮＡで形質転換された細菌、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡが含まれ得る。利用される宿主−ベクターシステムに応じて、いくつかの適切な転写および翻訳要素のいずれか１つを使用することができる。（これらの方法に関連する開示については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｌ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．  （１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８９））
【０１７６】
ＤＮＡベクターによってコードされる融合タンパク質成分は、カセットフォーマットで提供することができる。「カセット」という用語は、標準的な組換え法によって各成分を別の成分に容易に置き換えることができることを意味する。特に、カセット形式で構成されたＤＮＡベクターは、コード化された融合複合体が、血清型を発現する可能性があるか、または有する可能性がある病原体に対して使用される場合に特に望ましい。
【０１７７】
融合タンパク質複合体をコードするベクターを作製するために、生物学的に活性なポリペプチドをコードする配列は、適切なリガーゼを使用することにより、エフェクターペプチドをコードする配列に連結される。提示プチドをコードするＤＮＡは、適切な細胞株などからの天然資源から、または既知の合成方法、例えばリン酸トリエステル法によってＤＮＡを単離することによって得ることができる。（ＯｌｉｇｏｎｕｃｌＥＯＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ，Ｍ．Ｊ．ＧＡＩＴ，ＥＤ．、１９８４）。合成オリゴヌクレオチドはまた、市販の自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーを使用して調製することができる。いったん単離されると、生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子は、ＰＣＲまたは当該技術分野で知られている他の手段によって増幅することができる。生物学的に活性なポリペプチド遺伝子を増幅するための適切なＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ産物に制限部位を追加し得る。ＰＣＲ産物は、好ましくは、生物学的に活性なポリペプチド−エフェクター融合複合体の適切な発現および分泌に必要なエフェクターペプチドおよびリーダー配列のためのスプライス部位を含む。ＰＣＲ産物は、また、好ましくは、リンカー配列をコードする配列、またはそのような配列の連結のための制限酵素部位も含む。
【０１７８】
本明細書に記載の融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。例えば、生物学的に活性なポリペプチドをコードするＤＮＡ分子が単離されると、配列は、エフェクターポリペプチドをコードする別のＤＮＡ分子に連結され得る。生物学的に活性なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、エフェクターペプチドをコードするＤＮＡ配列に直接結合され得るか、またはより典型的には、本明細書で論じられるリンカー配列をコードするＤＮＡ配列は、生物学的に活性なポリペプチドをコードする配列とエフェクターペプチドをコードする配列の間に挿入され、適切なリガーゼを使用して結合させ得る。得られたハイブリッドＤＮＡ分子を適切な宿主細胞で発現させて、融合タンパク質複合体を生成することができる。ＤＮＡ分子は、連結反応後に、コードされたポリペプチドの翻訳フレームが変更されないように、５’−３’配向で互いに連結される（すなわち、ＤＮＡ分子は、フレーム内で互いに連結される）。得られたＤＮＡ分子は、インフレーム融合タンパク質をコードする。
【０１７９】
他のヌクレオチド配列もまた、遺伝子構築物に含めることができる。例えば、エフェクターペプチドに融合した生物学的に活性なポリペプチドをコードする配列の発現を制御するプロモーター配列、または融合タンパク質を細胞表面または培養培地に方向付けるリーダー配列は、構築物が挿入される発現ベクターに含まれるか、または存在することができる。
【０１８０】
変異体の生物学的に活性なポリペプチド、ＩＬ１５、ＩＬ１５ＲまたはＦｃドメインコード配列を取得する際に、当業者は、生物学的活性の喪失または低下を伴わずに、ポリペプチドが特定のアミノ酸置換、付加、欠失、および翻訳後修飾によって修飾され得ることを認識する。特に、保存的アミノ酸置換、すなわち、あるアミノ酸を同様のサイズ、電荷、極性、およびコンフォメーションの別のアミノ酸に置換することは、タンパク質の機能を著しく変化する可能性が低いことはよく知られている。タンパク質の構成要素である２０の標準アミノ酸は、次のように保存アミノ酸の４つのグループに大まかに分類することができる：非極性（疎水性）グループには、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、およびバリンが含まれ；極性（非荷電、中性）グループには、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、およびチロシンが含まれ；正に帯電した（塩基性）グループには、アルギニン、ヒスチジン、およびリジンが含まれ；負に帯電した（酸性）グループには、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれている。同じグループ内のあるアミノ酸から別のアミノ酸へのタンパク質の置換は、タンパク質の生物学的活性に悪影響を与える可能性は低い。他の例では、タンパク質の生物学的活性を低減または増強するために、アミノ酸位置への修飾を行うことができる。このような変化は、標的残基の既知のまたは推定された構造的または機能的特性に基づいて、ランダムにまたは部位特異的突然変異を介して導入され得る。変異タンパク質の発現に続いて、修飾による生物活性の変化は、結合または機能アッセイを使用して容易に評価することができる。
【０１８１】
ヌクレオチド配列間の相同性は、二本鎖ＤＮＡハイブリッドの安定性が、存在する塩基対形成の程度に依存する、ＤＮＡハイブリダイゼーション分析によって決定することができる。高温および／または低塩含有量の条件は、ハイブリッドの安定性を低下させ、選択された程度未満の相同性を有する配列のアニーリングを防ぐために変化させることができる。例えば、Ｇ−Ｃ含有量が約５５％の配列の場合、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は４０−５０℃、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム緩衝液）および０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）は約６０−７０％の相同性を示し、５０−６５℃、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は約８２−９７％の相同性を示し、５２℃、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は約９９−１００％の相同性を示す。ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を比較する（および相同性の程度を測定する）ための幅広いコンピュータープログラムも利用できる。すぐに利用できる配列比較および複数の配列アラインメントアルゴリズムは、それぞれ、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）およびＣｌｕｓｔａｌＷプログラムである。
【０１８２】
本発明のタンパク質融合複合体を発現させる、多くの戦略を用いることができる。例えば、上記融合タンパク質構築物は、制限酵素を用いて、後に連結反応を続けて構築物の挿入、続いて連結反応を行うためのベクターに切り口を作ることによって、公知の方法により適切なベクターに組み込むことができる。次に、遺伝子構築物を含むベクターを融合タンパク質の発現に適した宿主に導入する。（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ．  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  ｅｄ．  （１９８９）  ｆｏｒ  ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ  ｒｅｌａｔｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅｓｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ．）
【０１８３】
適切なベクターの選択は、クローニングプロトコルに関連する要因に基づいて経験的に行うことができる。例えば、ベクターは、使用されている宿主に対して適切な応答コンを有する必要がある。さらにベクターは、発現される融合タンパク質複合体をコードするＤＮＡ配列を収容できなければならない。好適な宿主細胞は、真核細胞および原核細胞を含み、好ましくは、培養培地において容易に形質転換され、かつ急速な増殖を示すことができる細胞である。具体的には、好ましい宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス・サブティラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）などの原核生物、および動物細胞および酵母株、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの真核生物を含む。哺乳動物細胞は、一般に好ましく、特にＪ５５８、ＮＳＯ、ＳＰ２−ＯまたはＣＨＯである。他の適切な宿主としては、例えば、Ｓｆ９などの昆虫細胞が挙げられる。従来の培養条件が採用される。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出を参照。安定した形質転換またはトランスフェクトされた細胞株を選択することができる。本発明の融合タンパク質複合体を発現する細胞は、公知の手順により決定することができる。例えば、免疫グロブリンに結合した融合タンパク質複合体の発現は、結合免疫グロブリンに特異的なＥＬＩＳＡおよび／または免疫ブロット法によって決定することができる。ＩＬ１２またはＩＬ１２Ｒドメインに結合した生物学的に活性なポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を検出する他の方法が実施例に開示されている。
【０１８４】
宿主細胞は、所望の融合タンパク質またはその成分をコードする核酸を伝播させる調製目的のために使用することができる。宿主細胞は、融合タンパク質の産生が特に意図される原核細胞または真核細胞を含むことができる。したがって、宿主細胞には、特に、酵母、ハエ、ワーム、植物、カエル、哺乳動物細胞および融合物をコードする核酸を伝播することができる器官を含む。使用できる哺乳動物細胞株の非限定的な例には、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｍ，１９８０  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６）、２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．１９７７  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（））またはＳＰ２またはＮＳＯのような骨髄腫細胞（Ｇａｌｆｒｅ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  １９８１  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ，７３（Ｂ）：３）。
【０１８５】
所望の融合タンパク質複合体をコードする核酸を伝播可能な宿主細胞は、同様に非哺乳動物の真核細胞を包含する、昆虫（例えば、Ｓｐ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、これらはＦｌｅｅｒ，Ｒ．，１９９２  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ３（５）：４８６４９６によって一般的に概説されている）を含む。また、大腸菌やバチルスなどの特定の原核生物も意図される。
【０１８６】
所望の融合タンパク質をコードする核酸は、細胞をトランスフェクションするための標準的な技術によって宿主細胞に導入され得る。用語「トランスフェトすること」または「トランスフェクション」は、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ウイルス導入および／または組み込みを含む、宿主細胞に核酸を導入するためのすべての従来の技術を包含することを意図している。
【０１８７】
種々のプロモーター（転写開始調節領域）は、本発明に従って使用され得る。適切なプロモーターの選択は、提案された発現宿主に依存する。異種源からのプロモーターは、選択された宿主において機能している限り使用され得る。
【０１８８】
プロモーターの選択は、ペプチドまたはタンパク質産生の所望の効率およびレベルに依存する。ｔａｃなどの誘導性プロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるタンパク質発現のレベルを劇的に増加させるためにしばしば採用される。タンパク質の過剰発現は宿主細胞に有害である可能性がある。結果として、宿主細胞の増殖が制限され得る。誘導性プロモーター系を使用することで、宿主細胞を遺伝子発現の誘導前に許容可能な密度まで培養することができ、より高い製品収率を容易にする。
【０１８９】
本発明に従って種々のシグナル配列を用いてもよい。生物学的に活性なポリペプチドコード配列に相同性であるシグナル配列を用いてもよい。あるいは、発現宿主内で効率的な分泌およびプロセシングのために選択または設計されたシグナル配列も使用され得る。シグナル配列は、シグナルペプチダーゼ切断部位をコードする配列を通して直接結合してタンパク質コード配列に、または短いヌクレオチドブリッジを介して結合することができる。
【０１９０】
発現構築物は、公知の組換えＤＮＡ技術を採用して組み立てることができる。制限酵素の消化およびライゲーションは、ＤＮＡの２つの断片を結合するために採用される基本的な工程である。ポリリンカーおよびアダプターは、選択した断片の結合を容易にするために使用され得る。発現構築物は、典型的には、大腸菌の制限、ライゲーション、および形質転換のラウンドを採用する段階で組み立てることができる。発現物の構築のために適した多数のクローニングベクターは、当該分野で知られている（λｌＺＡＲ  ａｎｄ  ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＳＫ−ｌ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．，ｐＥＴ，  Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．，ｒＥＥ１２．４，  Ｌｏｎｚａ  ＢｉｏｌｏｇｉｅｓＢａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【０１９１】
発現構築物は、クローニングベクター構築物として宿主に形質転換されてもよいし、線形または円形、またはクローニングベクターから取り出され、または送達ベクターに導入されるように使用することができる。この送達ベクターは、選択された宿主細胞型における発現構造の導入および維持を容易にする。発現構築物は、既知の遺伝子導入システム（例えば、自然能力、化学的に媒介された形質転換、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、バイオリスティック形質転換、トランスフェクション、またはコンジュゲーション）のいずれかによって宿主細胞に導入される。選択される遺伝子導入システムは、使用される宿主細胞およびベクター系に依存する。
【０１９２】
本発明はさらに、目的とする融合タンパク質を単離するための製造プロセスを提供する。その過程において、宿主細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、細菌または動物細胞）に、制御配列に作用的に連結された目的のタンパク質をコードする核酸を導入し、目的の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写を刺激するために培養液中で生産スケールで増殖させる。続いて、目的の融合タンパク質は、採取された宿主細胞から、または培養培地から単離される。標準的なタンパク質精製技術は、培地または採取した細胞から目的のタンパク質を単離するために使用することができる。特に、精製技術は、ローラーボトル、スピナーフラスコ、組織培養プレート、バイオリアクター、または発酵槽を含む様々な実装から、所望の融合タンパク質を大規模（すなわち少なくともミリグラム量）で発現および精製するために使用することができる。
【０１９３】
発現タンパク質融合複合体は、公知の方法により単離および精製することができる。典型的には、培養培地は遠心分離または濾過され、次いで上清がアフィニティーまたは免疫親和性クロマトグラフィーによって精製され、例えばプロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫親和性プロトコルは、連結されたＴＣＲまたは免疫グロブリン領域などの発現融合複合体を結合するモノクローナル抗体の使用を含む。本発明の融合タンパク質は、公知の技術の適切な組み合わせにより分離精製することができる。これらの方法には、例えば、塩沈殿や溶媒沈殿などの溶解性を利用する方法、透析などの分子量の差を利用する方法、超ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法とは、イオン交換カラムクロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの比親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電焦点電気泳動体などの等電点の差を利用する方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．  （１９８９）；ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）ｆｏｒ  ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ  ｒｅｌａｔｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅｓｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ．）を含む。
【０１９４】
本発明の融合タンパク質は実質的に純粋であることが好ましい。すなわち、融合タンパク質が少なくとも８０％または９０％−９５％均質性（ｗ／ｗ）で存在するように自然にそれに伴う細胞置換基から分離されている。少なくとも９８−９９％の均質性（ｗ／ｗ）を有する融合タンパク質は、多くの医薬品、臨床および研究用途に最も好ましい。一旦実質的に精製された融合タンパク質は、治療用途に対する汚染物質を実質的に含むべきでない。いったん部分的にまたは実質的な純度に精製されると、可溶性融合タンパク質は、治療的に、またはインビトロまたはインビボアッセイを実施する際に本明細書に開示される。実質的な純度は、クロマトグラフィーやゲル電気泳動など、様々な標準的な技術によって決定することができる。
【０１９５】
本発明はまた、組成物の治療有効量、融合タンパク質、ポリヌクレオチド、遺伝子構築物、本発明に従うベクターまたは宿主細胞および薬学的に許容される賦形剤または溶媒を含む医薬製剤を提供する。
【０１９６】
本発明で使用する好ましい賦形剤は、糖、デンプン、セルロース、ゴムおよびタンパク質を含む。好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、固体として投与するための医薬形態で処方される（例えば錠剤、カプセル、トローチ、顆粒、坐剤、液体形態等を提供するために再構成することができる結晶性または非晶質無菌性固体、液体（例えば、溶液、懸濁液、乳化剤、エリキシル、ローション、アングエントなど）または半固体（ゲル、軟膏、クリームおよび類似するもの）。本発明の医薬組成物は、任意の経路により投与することができ、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、内流性、心室、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、下皮または直腸経路を含むが、限定されない。有効な原理の管理の異なる形態の改訂、使用する賦形剤とその製造手順は、レミントンの薬学で見つけることができ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．），２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ，  ＵＳＡ（２０００）薬学的に受け入れられる溶媒の例は、技術の状態で知られており、リン酸塩、水、エマルジョンなどの乳剤、異なる種類の加湿剤、滅菌溶液などでバッファーされる生理食塩水溶液が含まれる。前記溶媒を含む組成物は、その技術の状態で知られている従来の手順によって製剤化することができる。
【０１９７】
また、核酸（本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは遺伝子構築物）を含む本発明の医薬組成物の場合、本発明は、前記核酸を投与するための特別に調製された医薬組成物を意図する。医薬組成物は、前記核酸を裸形、すなわち、生物のヌクレアーゼによる分解から核酸を保護する化合物の、トランスフェクションに使用される試薬に関連する毒性を排除する利点を伴う。裸の化合物に対する適切な投与経路としては、血管内、腫瘍内、クレーン内、腹腔内、脾臓、筋肉内、皮下、粘液、局所および経口経路（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，  ２００２  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２１：８５７−８６７）あるいは、核酸を、リポソームの形成部分を投与し、コレステロールにコンジュゲートしたり、ＨＩＶ−１のＴＡＴタンパク質由来のＴＡＴペプチドなどの細胞膜を介して転座を促進することができる化合物にコンジュゲートしたり、Ｄ．メラノガスターのアンテナペディアタンパク質のホメオドメインの第３らせん、単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２タンパク質、アルギニンのオリゴマー、およびＷＯ０７０６９０９０に記載されているものなどのペプチド（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｔｒｅｎｄｓ  ＰｈａｒｍａｃｏｌＳｃｉ  ２１  ：９９−１０３；Ｓｃｈｗａｒｚｅ，  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．  ２１  ：４５−４８；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００３  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：１４３−１５０；およびＳｎｙｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．  ２１  ：３８９−３９３）。あるいは、ポリヌクレオチドは、プラスミジンベクターまたはウイルスベクターの一部を形成する部分、好ましくはアデノウイルスに基づくベクター、アデノ関連ウイルス、またはマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）またはレンチウイルス（ＨＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶ）に基づくウイルスなどのレトロウイルスに投与することができる。
【０１９８】
本発明の組成物は、体重１キログラム当たり１０ｍｇ未満の用量で投与することができ、好ましくは、体重の各ｋｇあたり、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、または０．００００１ｍｇ未満、および２００ｎｍｏｌ未満の薬剤、言い換えれば、体重１ｋｇあたり約４．４×１０１６コピーまたは体重１ｋｇ当たり１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５または０．０７５ｎｍｏｌ未満である。単回用量は、注射、吸入または局所投与によって投与することができる。本発明の二官能性ポリヌクレオチドおよび組成物は、標的ｍＲＮＡが発現される臓器に直接投与することができ、その場合、用量は、臓器あたり０．００００１ｍｇと３ｍｇの間で、または好ましくは、１臓器あたり０．０００１から０．００１ｍｇの間、臓器あたり約０．０３から３．０ｍｇの間、臓器あたり約０．１から３．０ｍｇの間、または１臓器あたり０．３から３．０ｍｇの間で投与される。
【０１９９】
用量は、治療される状態に対する重症度および応答に依存し、数日から数ヶ月の間、または状態が再発するまで変化する可能性がある。最適用量は、患者の生物中の薬剤の濃度を定期的に測定することによって決定することができる。最適用量は、動物モデルにおける以前のインビトロまたはインビボ試験を通じて得られたＥＣ５０値から決定することができる。この単位投与量は、１日１回、または１日１回未満、好ましくは、２、４、８または３０日に１回未満で投与することができる。あるいは、初期用量を投与し、その後に１回または複数回の維持用量を投与することができるが、これは一般的に初期用量よりも少ない量である。維持レジメンは、１日当たり０．０１μｇ−１．４ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量、例えば、体重１ｋｇ当たり１、０．１、０．０１、０．００１、または０．００００１ｍｇ／日で患者を治療することを含んでもよい。維持用量は、好ましくは、５、１０または３０日に最大１回投与される。治療は、患者が受ける変化の種類、その重症度および患者の状態に応じて変化する時間の間、継続しなければならない。治療後、患者の進化は、治療に反応しない疾患の場合に用量を増加させるべきか、または疾患の改善もしくは望ましくない二次効果を観察する場合に用量を減少させるべきかどうかを決定するためにモニターされなければならない。
【０２００】
日々の用量は、特定の状況に応じて、単回用量または２回以上の用量で投与することができる。繰り返し投与または頻繁な投与が必要な場合は、ポンプ、半永久的なカテーテル（静脈内、腹腔内、内膜またはカプセル内）またはリザーバーなどの管理装置を移植することが推奨される。
【０２０１】
本発明の組成物は、当該技術分野の専門家に知られている方法に従って投与され、静脈内、経口、鼻、非経口、局所、経皮、直腸および同様のものを含むが、限定されない。
【０２０２】
以下の例は、本発明の実施を例示し、いかなる場合でも限定しないことを意味する。
【実施例】
【０２０３】
以下の実施例は、開示された発明に従って調製された化合物の特定の例示的な実施形態を説明する。以下の一般的な方法、および当業者に公知である他の方法は、本明細書に開示されるような化合物およびサブクラスおよび種に適用するできることが理解される。
【０２０４】
実施例１．融合タンパク質の構築
Ａ．４つの融合タンパク質の構築
対照タンパク質の構築：ＩＬ１５−Ｆｃ
マウスＩＬ１５は、図１ＡのようにｈＩｇＧ  Ｆｃ（ＩＬ１５−Ｆｃと命名）のＮ末端に融合している。マウスＩＬ１５のアミノ酸配列は、配列番号１であった。ｈＩｇＧ  Ｆｃのアミノ酸配列は、配列番号３であった。
【０２０５】
スーパーＩＬ１５の２つのフォーマット
ＩＬ１５Ｒαスシ−ＩＬ１５−Ｆｃ（ＲＡ−ＩＬ１５−Ｆｃと命名）およびＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒαスシ−Ｆｃ（ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃと命名）の模式図を図１Ｂおよび図１Ｃとして示す。生物学的活性において同様に、両方の構造は、スーパーＩＬ１５と交換可能に呼ばれる。マウスＩＬ１５Ｒαスシのアミノ酸配列は、配列番号４である。ヒトＩＬ１５Ｒαスシのアミノ酸配列は、配列番号５である。ＩＬ１５ＲαスシとＩＬ１５との間のリンカーの配列は、配列番号８である。マウスＲＡ−ＩＬ１５−ＦｃおよびＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃは、配列番号２４および配列番号２６で完全に表される。ヒトＲＡ−ＩＬ１５−ＦｃおよびＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃは、配列番号２５および配列番号２７で完全に表される。
【０２０６】
プロドラッグ
ＩＬ１５ＲβのＥＣＤ（細胞外ドメイン）をＩＬ１５−ＲＡ−ＦｃのＮ末端に融合し、リンカーセグメントＬ２によって連結した。
【０２０７】
ＩＬ１５ＲβＥＣＤ−Ｌ２−ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒαスシ−Ｆｃ（ＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃと命名）の模式図を図１Ｄに示す。マウスＩＬ１５ＲβＥＣＤのアミノ酸配列は配列番号６である。ヒトＩＬ１５ＲβＥＣＤのアミノ酸配列は配列番号７である。リンカーセグメントＬ２は、ＭＭＰ９またはＭＭＰ１４の基質である。ＭＭＰ９基質リンカーのアミノ酸配列は、配列番号１０である。ＭＭＰ１４基質リンカーアミノ酸配列は、配列番号１１−２３である。
【０２０８】
Ｂ．融合タンパク質の構築、トランスフェクション、発現および精製
遺伝子をｐＥＥ１２．４などの発現ベクターにクローニングした。プラスミドは２９３Ｆ細胞に一時的にトランスフェクトした。上清は、トランスフェクションの４−７日後に収集した。プロテインＡセファロースを用いて、融合タンパク質を精製した。全てのタンパク質をＥＬＩＳＡとＳＤＳ−ＰＡＧＥで定量した。
【０２０９】
詳細なプロトコルは次のとおりである。
【０２１０】
融合タンパク質の構築
ＩＬ１５、ＩＬ１５ＲＡおよびＩＬ１５ＲＢ  ＥＣＤを合成し、ｐＥＥ１２．４−ＩｇＧκ−ｈＩｇＧ１  Ｆｃプラスミドにクローン化し、これはマウスＩｇＧκをリード配列およびヒトＩｇＧ１  Ｆｃを含んでいた。標準的な市販のプラスミド抽出キットを用いてプラスミド抽出し、−８０℃で保存した。
【０２１１】
融合タンパク質のトランスフェクション
２９３Ｆ細胞をＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地を用いて培養し、１３５ｒｐｍで振盪しながら３７℃、８％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。トランスフェクションの２日前に０．６−０．８×１０６細胞／ｍＬの密度で、細胞をプレーティングした。細胞を約２．５−３．５×１０６細胞／ｍＬの密度で収集し、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３培地を用いて洗浄し、２００ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３で再懸濁した。ＤＮＡ（６００μｇ）を５ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３で希釈し、０．２２μｍフィルターに通して濾過した。ＰＥＩ（１．８ｍｇ）を５ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３で希釈し、０．２２μｍフィルターに通して濾過した。ＤＮＡおよびＰＥＩを混合し、室温で５分間インキュベートし、フラスコ中で細胞と混合した。フラスコを、８５ｒｐｍで振盪させながら、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターに配置した。１３５ｒｐｍでのトランスフェクションの４時間後に２００ｍＬのＥＸ−ＣＥＦＦ（商標）２９３培地を添加した。トランスフェクションの２０時間後、３．８ｍＭ  ＶＰＡが追加された。細胞生存率が７０％を超える一方で、トランスフェクション後４日目から７日目に上清を回収した。
【０２１２】
融合タンパク質の精製
マニュアル（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に従ってプロテインＡ−セファロースカラムを用いて、融合タンパク質を精製した。
結合緩衝液：２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
溶出緩衝液：０．１Ｍ  グリシン、ｐＨ２．７
再生緩衝液：１Ｍ  ＮａＯＨ
中和緩衝液：１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０
すべての緩衝液は、０．４５μｍフィルターでフィルター濾過した。
（１）サンプルを８０００×ｒｐｍで２時間遠心分離し、細胞を除去し、次いで０．４５μｍのフィルターに通して濾過した。ＮａＮ３を添加し、最終濃度を０．０５％とし、細菌増殖を防止した。
（２）カラムを２０％エタノールを用いて保存した場合、５０から１００ｃｍ／ｈの直線流量、５カラム体積の蒸留水でカラムを洗浄した。
（３）カラムを、溶出緩衝液の５−１０カラム体積で洗浄し、不純物を洗い流した。
（４）５０から１００ｃｍ／ｈｒの直線流量、５−１０カラム体積の結合緩衝液でカラムを平衡化した。
（５）前処理されたサンプルをカラムに適用した。
（６）５−１０カラム体積の結合緩衝液でカラムを洗浄した。
（７）カラムを１．５ｍＬの収集チューブに溶出させた。
【０２１３】
精製融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を図２に示し、ここで、レーンＳ１にＩＬ１５−Ｆｃをロードし、レーンＳ２はスーパーＩＬ１５をロードし、レーンＳ３にはＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃをロードした。
【０２１４】
＜実施例２．スーパーＩＬ１５融合タンパク質の生物学的機能＞
Ａ．リンパ球増殖促進の機能
インターロイキン１５（ＩＬ−１５）は、最初にマウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−２の増殖を刺激する能力によって特徴付けられた。このプロトコルでは、ＣＴＬＬ−２細胞は、マウスＩＬ−１５の連続希釈の存在下で培養され、それらの増殖はＣＣＫ８によって測定される。
【０２１５】
次の手順が使用された。
（１）ＣＴＬＬ２細胞を培養するために１００Ｕ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−２を補充したＣＴＬＬ−２アッセイ培地を使用する。
（２）ＣＴＬＬ−２細胞を継代後２４−４８時間の対数増殖期に収集し、２回洗浄して残留ＩＬ−２を除去する。５−１０ｍＬ  ＣＴＬＬ−２アッセイ培地中の細胞を再懸濁し、細胞を数え、２×１０４細胞／ｍＬの濃度に調整する。
（３）ＣＴＬＬ−２アッセイ培地を使用してサンプルを希釈する。最初のトップ濃度は１０μｇ／ｍＬである。１：１０の連続希釈を７本のチューブ上で行う。
（４）各平底９６ウェルプレート（２×１０３細胞／ウェル）に細胞懸濁液１００μＬを加える。各ウェルに１００μＬのサンプルを加える。陰性対照として２００μＬアッセイ培地のみを含むウェルの列を含める。
（５）プレートに蓋をし、４８−７２時間インキュベートする。
（６）ＣＣＫ８を２０μＬ追加する。２−４時間後、マイクロタイタープレートリーダーを使用して各ウェルのＯＤ４５０およびＯＤ６３０を読み取る。
【０２１６】
結果は図３に示されており、これは、（１）スーパーＩＬ１５の２つの形態の生物学的活性が類似しており、すなわち、融合タンパク質において、最初に、ＩＬ１５フラグメント、またはＩＬ１５αスシフラグメントに関係なく、スーパーＩＬ１５の機能は影響を受けなかったこと、そして（２）スーパーＩＬ１５はＩＬ１５−Ｆｃと比較して生物学的活性が約１００倍増加したことを示している。
【０２１７】
Ｂ．ＩＬ１５ＲβＥＣＤの融合フラグメントは、スーパーＩＬ１５の生物学的機能を遮断することができる
ＣＴＬＬ２に対するマウスＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−ＦｃおよびスーパーＩＬ１５の増殖能力を、ＣＣＫ８アッセイにより調べた。図４に示す結果は、ＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃの生物活性が１００倍低下したことを示す。これは、ＩＬ−１５Ｒβの細胞外ドメインがスーパーＩＬ−１５の生物学的機能を遮断できることを示している。
【０２１８】
Ｃ．異なる腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果および全身毒性
Ａ２０モデル
実験１（２５μｇ）：Ａ２０細胞（３×１０６）を、Ｂａｌｂ／ｃマウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍を有するマウス（６０−８０ｍｍ３）を、１０日目および１３日目に２５μｇのスーパーＩＬ１５を用いて腫瘍内（ｉ．ｔ．）および静脈内（ｉ．ｖ．）で処置した。対照群をＰＢＳで処置した。腫瘍体積＝長さ×幅×高さ／２。腫瘍増殖曲線を記録した。
【０２１９】
結果：（１）腫瘍内処置群において、全マウスからの腫瘍が完全な退行を示した（図５Ａ）。既に完全な腫瘍退行を受けたマウスは、致死量のＡ２０細胞で再チャレンジされた。すべてのマウスは再チャレンジされた腫瘍を拒絶し、強い記憶応答を示した（図５Ｃ）。（２）すべてのマウスは、重度の全身毒性を示す２回目のｉｖ処置で死亡した（図５Ｂ）。
【０２２０】
実験２（１２．５μｇ）：Ａ２０細胞（３×１０６）を、Ｂａｌｂ／ｃマウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍を有するマウス（６０−８０ｍｍ３）を１０日目および１３日目に１２．５μｇのスーパーＩＬ１５を用いて腫瘍内（ｉ．ｔ．）および静脈内（ｉ．ｖ．）で処置した。対照群をＰＢＳで処理した。腫瘍体積は、長さ×幅×高さ／２として定義した。腫瘍増殖曲線を記録した。
【０２２１】
結果（図７）：腫瘍内投与した処置群において、マウスの１００％が完全退行を有していた。対照的に、静脈内処置されたマウスの２０％は完全な退行を有し、残りのマウス腫瘍は部分的に抑えられた。
【０２２２】
ＭＣ３８モデル
実験：ＭＣ３８細胞（５×１０５）をＣ５７マウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍を有するマウス（６０ｍｍ３）を、７日目および１０日目に２５μｇのスーパーＩＬ１５で腫瘍内（ｉ．ｔ．）および静脈内（ｉ．ｖ．）を用いて静脈内治療した。対照群をＰＢＳで処理した。腫瘍体積＝長さ×幅×高さ／２。腫瘍増殖曲線を記録した。
【０２２３】
結果：腫瘍内投与した治療群において、５０％のマウスが完全退行を有し（図６Ａ）、生存率が有意に増加した（図６Ｂ）。対照的に、静脈内投与されたマウスは完全な腫瘍退行を有しておらず（図６Ａ）、マウス生存率はわずかに増加した（図６Ｂ）。
【０２２４】
上記の結果は、スーパーＩＬ１５が腫瘍微小環境（ＴＭＥ）で局所的に機能すると思われることを示している。
【０２２５】
＜実施例３．スーパーＩＬ１５およびＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃの腫瘍治療効果および副作用の比較＞
Ａ２０細胞（３×１０６）を、Ｂａｌｂ／ｃマウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍を有するマウス（６０−８０ｍｍ３）を、１０日目および１３日目に１２．５μｇのスーパーＩＬ１５またはＲβ−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃを用いて腹腔内（ｉ．ｐ．）で処置した。腫瘍の増殖は週２回測定した。血清は２回目の注射の２０時間後で採取した。血清中のサイトカイン濃度をＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）で測定し、腫瘍曲線を記録した。
【０２２６】
次のＣＢＡプロトコルを使用した。
（１）血清を眼静脈から採取し、−８０℃で保存する。
（２）血清中のＩＬ１２ｐ７０、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＭＣＰ１およびＩＬ−１０をＢＤからＣＢＡキットを用いて評価する。
（３）アッセイ希釈液２．０ｍＬで標準を再構成し、次いで、室温で少なくとも１５分間再校正した。標準は、１：２、１：４、１：８、１：１６、１：３２、１：６４、１：１２８、および１：２５６の比率で連続して希釈した。
（４）Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカイン捕捉ビーズを混合した。実験に必要なアッセイチューブ（標準および対照を含む）の数を決定した。各捕捉ビーズ懸濁液は、混合する前に３−５秒間激しくボルテックスした。各捕捉ビーズの２μＬアリコートを、分析するアッセイチューブごとに１本のチューブに追加する。マウスＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７ＰＥ検出試薬の１０μＬアリコートをチューブに添加し、徹底的にボルテックスした。
（５）Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカインアッセイを実行した：混合捕捉ビーズをボルテックスし、２０μＬをすべてのアッセイチューブに追加した。マウスＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカイン標準希釈液の５０μＬを対照チューブに加えた。各未知サンプルの５０μＬを適切に標識されたサンプルアッセイチューブに添加した。アッセイチューブを室温で２時間インキュベートし、光から保護した。
（６）１ｍＬの洗浄緩衝液を各アッセイチューブに加え、３００ｇで５分間遠心分離した。
（７）上清を慎重に吸引し、各アッセイチューブから廃棄した。３００μＬの洗浄緩衝液を各アッセイチューブに添加し、ビーズペレットを再懸濁させた。
（８）サンプルはフローサイトメトリーを介して分析し、サイトカインのレベルを標準に従って計算した。
【０２２７】
この治療効果は図８Ａに示され、静脈内に投与されたＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃの治療効果がスーパーＩＬ１５のそれと類似していることを示す。
【０２２８】
血清炎症性因子レベルの比較の結果は、図８Ｂに示されており、ＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃの毒性副作用がスーパーＩＬ１５と比較して有意に減少していることを示している。
【０２２９】
Ａ２０細胞（３×１０６）を、Ｂａｌｂ／ｃマウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍を有するマウス（６０−８０ｍｍ３）を、１０日目および１３日目に２５μｇのスーパーＩＬ１５またはＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃを用いて腹腔内（ｉ．ｐ．）で処置した。腫瘍の増殖は週２回測定した。血清は２回目の注射の２０時間後に収集した。血清中のサイトカインレベルをＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）で測定し、腫瘍曲線を記録した。
【０２３０】
結果：腫瘍再チャレンジおよびスーパーＩＬ１５を用いる処置の後、腫瘍を有するマウスは重度の体重減少、移動性の低下、しわの寄った毛皮を伴って有意に疾患となり、２回目の処置後１日以内に全て死亡した。対照的に、ＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃで処置されたマウスはいずれも死亡し、どのマウスも不健康に見えなかった。ＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃの生存曲線は、スーパーＩＬ１５よりも有意に長かった。生存曲線を図９Ａに示し、および血清炎症因子レベルを図９Ｂに示す。
【０２３１】
まとめると、ＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃは、スーパーＩＬ１５の毒性副作用を減少させた。
【０２３２】
様々なＩＬ１５融合タンパク質およびプロドラッグの類似のヒトバージョンも生成され、インビトロで試験された。ヒトタンパク質の生成は、マウスタンパク質の生成のために先に説明したクローニング、トランスフェクションおよび精製プロトコルに従って行われた。
【０２３３】
組換えヒトＭＭＰ−１４／ＭＴ１−ＭＭＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を活性化し、およびＩＬ１５融合タンパク質と共に３７℃で２４時間インキュベートし、Ｌ２リンカー部位でのプロドラッグ活性化と切断を確認した。
【０２３４】
ＭＭＰ１４を伴ってまたは伴わずに、インキュベートした精製ヒト融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を３７℃で２４時間用いたものにした結果を図１０に示す。
【０２３５】
ヒトＲＢ−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃの機能は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ２レポーター細胞アッセイ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を用いて測定した。ＩＬ−２刺激の際、ＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＭＩＬ−２細胞はＳＴＡＴ５の活性化とＳＥＡＰのサブシーケンス分泌を引き起こす。ＳＴＡＴ５誘導ＳＥＡＰのレベルは、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）を使用して容易にモニターすることができる。ＩＬ１５は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５受容体β鎖および共通のγ鎖から校正される複合体を介して結合し、シグナルを伝達するため、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−２細胞株はＩＬ１５および／またはｐｒｏ−ＩＬ１５機能活性を測定するためにも使用できる。
【０２３６】
以下のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−２レポーターアッセイを使用した。
（１）ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−２細胞をＰＢＳ中で穏やかに濯ぎ、新鮮な、事前に温められた試験培地（ＤＭＥＭ、４．５ｇ／Ｌグルコース、２ｍＭＬ−グルタミン、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＰＢＳ（５６℃、〜１×１０６細胞／ｍＬで３０分）に懸濁する。
（２）サンプルを平底９６ウェルプレートで連続希釈し、１ウェルあたり５０μＬの細胞懸濁液（〜５０，０００細胞）とともにＣＯ２インキュベーターで２０−２４時間３７℃インキュベートする。
（３）平底９６ウェルプレートのウェルあたり２０μＬの誘導ＨＥＫ−ＢＬＵＥ  ＩＬ−２細胞上清を、１ウェルあたり１００μＬの再懸濁ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）溶液とともに、３７℃のインキュベーター中で１５分間−１時間インキュベートする。
（４）６５０ｎｍの分光光度計を使用してＳＥＡＰレベルを決定する、
【０２３７】
結果：図１１は、リンカーセグメント（Ｌ２）に埋め込まれたＭＭＰ１４基質配列を用いて構築され、ＭＭＰ１４を伴ってインキュベートされたＲＢ−Ｌ２−１５ＲＡ−Ｆｃが、ＭＭＰ１４の有無にかかわらず１５ＲＡ−Ｆｃと同じレベルで機能を示したことを実証する。一致して、ＲＢ−Ｌ１−１５ＲＡ−Ｆｃは、リンカーセグメント（Ｌ１）に埋め込まれたＭＭＰ１４基質配列なしで構築され、ＭＭＰ１４を含まないサンプルと同様に機能した。構築物表記１５ＲＡはＩＬ１５−Ｌ１−ＲＡの略である。
＜配列リスト＞
配列番号１：マウスＩＬ１５
ＮＷＩＤＶＲＹＤＬＥＫＩＥＳＬＩＱＳＩＨＩＤＴＴＬＹＴＤＳＤＦＨＰＳＣＫＶＴＡＭＮＣＦＬＬＥＬＱＶＩＬＨＥＹＳＮＭＴＬＮＥＴＶＲＮＶＬＹＬＡＮＳＴＬＳＳＮＫＮＶＡＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＴＦＴＥＦＬＱＳＦＩＲＩＶＱＭＦＩＮＴＳ
配列番号２：ヒトＩＬ１５
ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ
配列番号３：ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ
ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号４：マウスＲα−スシドメイン
ＧＴＴＣＰＰＰＶＳＩＥＨＡＤＩＲＶＫＮＹＳＶＮＳＲＥＲＹＶＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＴＬＩＥＣＶＩＮＫＮＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＳＬＡＨＹＳＰＶＰＴ
配列番号５：ヒトＲα−スシドメイン
ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ
配列番号６：マウスＲβ細胞外ドメイン
ＡＶＫＮＣＳＨＬＥＣＦＹＮＳＲＡＮＶＳＣＭＷＳＨＥＥＡＬＮＶＴＴＣＨＶＨＡＫＳＮＬＲＨＷＮＫＴＣＥＬＴＬＶＲＱＡＳＷＡＣＮＬＩＬＧＳＦＰＥＳＱＳＬＴＳＶＤＬＬＤＩＮＶＶＣＷＥＥＫＧＷＲＲＶＫＴＣＤＦＨＰＦＤＮＬＲＬＶＡＰＨＳＬＱＶＬＨＩＤＴＱＲＣＮＩＳＷＫＶＳＱＶＳＨＹＩＥＰＹＬＥＦＥＡＲＲＲＬＬＧＨＳＷＥＤＡＳＶＬＳＬＫＱＲＱＱＷＬＦＬＥＭＬＩＰＳＴＳＹＥＶＱＶＲＶＫＡＱＲＮＮＴＧＴＷＳＰＷＳＱＰＬＴＦＲＴＲＰＡＤＰＭＫＥ
配列番号７：ヒトＲβ細胞外ドメイン
ＡＶＮＧＴＳＱＦＴＣＦＹＮＳＲＡＮＩＳＣＶＷＳＱＤＧＡＬＱＤＴＳＣＱＶＨＡＷＰＤＲＲＲＷＮＱＴＣＥＬＬＰＶＳＱＡＳＷＡＣＮＬＩＬＧＡＰＤＳＱＫＬＴＴＶＤＩＶＴＬＲＶＬＣＲＥＧＶＲＷＲＶＭＡＩＱＤＦＫＰＦＥＮＬＲＬＭＡＰＩＳＬＱＶＶＨＶＥＴＨＲＣＮＩＳＷＥＩＳＱＡＳＨＹＦＥＲＨＬＥＦＥＡＲＴＬＳＰＧＨＴＷＥＥＡＰＬＬＴＬＫＱＫＱＥＷＩＣＬＥＴＬＴＰＤＴＱＹＥＦＱＶＲＶＫＰＬＱＧＥＦＴＴＷＳＰＷＳＱＰＬＡＦＲＴＫＰＡＡＬＧＫＤＴ
配列番号８：リンカーセグメント  Ｌ１
ＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＬＱ
配列番号９：リンカーセグメント  Ｌ１
ＧＧＧＧＳ
配列番号１０：リンカーセグメント  Ｌ２（ＭＭＰ９）ＧＧＧＧＳＰＶＧＬＩＧＧＧＧＧＳ
配列番号１１：リンカーセグメント  Ｌ２（ＭＭＰ１４）
ＧＧＧＧＳＳＧＡＲＹＲＷＬＴＡＧＧＧＧＳ
配列番号１２：リンカーセグメント  Ｌ２（ＭＭＰ１４）
ＧＧＧＧＳＳＧＲＩＧＦＬＲＴＡＧＧＧＧＳ
配列番号１３：リンカーセグメント  Ｌ２（ＭＭＰ１４）
ＧＧＧＧＳＳＧＡＩＧＦＬＲＴＡＧＧＧＧＳ
配列番号１４：リンカーセグメント  Ｌ２（ＭＭＰ１４）
ＧＧＧＧＳＳＧＲＡＭＨＭＹＴＡＧＧＧＧＳ
配列番号１５：リンカーセグメント  Ｌ２（ＭＭＰ１４）
ＧＧＧＧＳＳＧＡＡＭＨＭＹＴＡＧＧＧＧＳ
配列番号１６：リンカーセグメント  Ｌ２（ＭＭＰ１４）
ＧＧＧＧＳＳＧＲＳＥＮＩＲＴＡＧＧＧＧＳ
配列番号１７：リンカーセグメント  Ｌ２（ＭＭＰ１４）
ＧＧＧＧＳＳＧＡＳＥＮＩＲＴＡＧＧＧＧＳ
配列番号１８：リンカーセグメント  Ｌ２（ＭＭＰ１４）
ＧＧＧＧＳＳＧＲＰＥＮＩＲＴＡＧＧＧＧＳ
配列番号１９：リンカーセグメント  Ｌ２（ＭＭＰ１４）
ＧＧＧＧＳＳＧＡＰＥＮＩＲＴＡＧＧＧＧＳ
配列番号２０：リンカーセグメント  Ｌ２（ＭＭＰ１４）
ＧＧＧＧＳＳＧＬＩＳＨＳＩＴＡＧＧＧＧＳ
配列番号２１：リンカーセグメント  Ｌ２（ＭＭＰ１４）
ＧＧＧＧＳＳＧＮＬＲＳＫＬＴＡＧＧＧＧＳ
配列番号２２：リンカーセグメント  Ｌ２（ＭＭＰ１４）
ＧＧＧＧＳＳＧＶＦＳＩＰＬＴＡＧＧＧＧＳ
配列番号２３：リンカーセグメント  Ｌ２（ＭＭＰ１４）
ＧＧＧＧＳＳＧＩＫＹＨＳＬＴＡＧＧＧＧＳ
配列番号２４：マウスＲＡ−ＩＬ１５−Ｆｃ
ＧＴＴＣＰＰＰＶＳＩＥＨＡＤＩＲＶＫＮＹＳＶＮＳＲＥＲＹＶＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＴＬＩＥＣＶＩＮＫＮＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＳＬＡＨＹＳＰＶＰＴＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＬＱＮＷＩＤＶＲＹＤＬＥＫＩＥＳＬＩＱＳＩＨＩＤＴＴＬＹＴＤＳＤＦＨＰＳＣＫＶＴＡＭＮＣＦＬＬＥＬＱＶＩＬＨＥＹＳＮＭＴＬＮＥＴＶＲＮＶＬＹＬＡＮＳＴＬＳＳＮＫＮＶＡＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＴＦＴＥＦＬＱＳＦＩＲＩＶＱＭＦＩＮＴＳＧＧＧＧＳＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２５：ヒトＲＡ−ＩＬ１５−Ｆｃ
ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＬＱＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２６：マウスＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃ
ＮＷＩＤＶＲＹＤＬＥＫＩＥＳＬＩＱＳＩＨＩＤＴＴＬＹＴＤＳＤＦＨＰＳＣＫＶＴＡＭＮＣＦＬＬＥＬＱＶＩＬＨＥＹＳＮＭＴＬＮＥＴＶＲＮＶＬＹＬＡＮＳＴＬＳＳＮＫＮＶＡＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＴＦＴＥＦＬＱＳＦＩＲＩＶＱＭＦＩＮＴＳＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＬＱＧＴＴＣＰＰＰＶＳＩＥＨＡＤＩＲＶＫＮＹＳＶＮＳＲＥＲＹＶＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＴＬＩＥＣＶＩＮＫＮＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＳＬＡＨＹＳＰＶＰＴＧＧＧＧＳＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２７：ヒトＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃ
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配列番号２８：マウスＲＢ−Ｌ２−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃ
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配列番号２９：ヒトＲＢ−Ｌ２−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃ
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配列番号３０：ヒトＲＢ−Ｌ２−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃ
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配列番号３１：ヒトＲＢ−Ｌ２−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃ
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配列番号３２：ヒトＲＢ−Ｌ２−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃ
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配列番号３３：ヒトＲＢ−Ｌ２−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃ
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配列番号３４：ヒトＲＢ−Ｌ２−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃ
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配列番号３５：ヒトＲＢ−Ｌ２−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃ
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配列番号３６：ヒトＲＢ−Ｌ２−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃ
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配列番号３７：ヒトＲＢ−Ｌ２−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃ
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配列番号３８：ヒトＲＢ−Ｌ２−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃ
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配列番号３９：ヒトＲＢ−Ｌ２−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃ
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配列番号４０：ヒトＲＢ−Ｌ２−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃ
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配列番号４１：ヒトＲＢ−Ｌ２−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃ
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配列番号４２：ヒトＲＢ−Ｌ１−ＩＬ１５−ＲＡ−Ｆｃ
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【０２３８】
出願の開示は、同一または類似の要素を表す図を参照した好ましい実施形態で本明細書に記載される。本明細書全体を通じて「一実施形態」、「実施形態」、または同様の言語への言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書中の「一実施形態において」、「実施形態において」および同様の言語は、必ずしもそうではないが、すべてが同じ実施形態を指す場合がある。
【０２３９】
出願の開示に記載された特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。本明細書の説明において、本発明の実施形態の完全な理解を提供するために、多くの特定の詳細が記載されている。しかし、関連する技術の当業者は、本出願人の組成および／または方法が、１つ以上の特定の詳細なしで、または他の方法、構成要素、材料などで実施され得ることを認識するであろう。他の例では、他の例では、本開示の態様を不明瞭にすることを避けるために、周知の構造、材料、または操作は、詳細には示されないか、または記載されていない。
【０２４０】
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、当業者が一般的に理解しているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の方法および材料は、本開示の実施または試験においても使用することができるが、好ましい方法および材料が今記載されている。本明細書に記載の方法は、開示された特定の順序に加えて、論理的に可能な任意の順序で実行することができる。
【０２４１】
＜参照による引用＞
本開示では、特許、特許出願、特許刊行物、ジャーナル、本、論文、ウェブコンテンツなどの他の文書への参照および引用がなされている。そのようなすべての文書は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。参照により本明細書に組み込まれると言われているが、本明細書に明示的に記載されている既存の定義、声明、または他の開示資料と矛盾する資料またはその一部は、本明細書に明示的に記載されているように、その組み込まれた材料と本開示の材料との間に矛盾が生じない程度にのみ組み込む。対立が生じた場合、優先開示として本開示を優先して対立を解決する必要がある。
【０２４２】
＜同等物＞
代表的な実施例は、本発明を説明するのを助けることを意図しており、本発明の範囲を制限することを意図しておらず、また、それらを制限することを意図しておらず、そのように解釈されるべきではない。実際、本明細書に示され記載されたものに加えて、本発明およびその多くのさらなる実施形態の様々な修正は、本明細書に含まれる科学文献および特許文献の実施例および参考文献を含む、本文書の全内容から当業者に明らかになるであろう。実施例は、その様々な実施形態およびその同等物における本発明の実施に適合させることができる重要な追加情報、例示およびガイダンスを含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
2021522786.tif 000006
【図５Ｂ】
2021522786.tif 000007
【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
2021522786.tif 000009
【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
2021522786.tif 000014
【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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