(57)【要約】シアリルラクトースを他の炭水化物から精製するための方法を提供し、該方法は、シアリルラクトースを含有する水溶液を、異なる膜、すなわち約３００ドルトン〜約５００ドルトンの分子量カットオフを有する膜と、約６００ドルトン〜約８００ドルトンの分子量カットオフを有する膜とを用いる二つの膜濾過工程に付す工程を含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアリルラクトースを他の炭水化物から精製するための方法であって、該方法は、シアリルラクトースと他の炭水化物を含有する水溶液を異なる膜を用いる二つの膜濾過工程に付す工程を含み、ここで、
−  一つの膜は約３００〜約５００ドルトンの分子量カットオフを有し、そして
−  他の膜は約６００〜約８００ドルトンの分子量カットオフを有する
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
該水溶液が、シアリルラクトースを製造するための発酵又は酵素法から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該水溶液が、発酵ブロスからバイオマスを分離することによって発酵から得られる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
発酵ブロスからのバイオマスの分離が、少なくとも一つの限外濾過工程、好ましくは二つの限外濾過工程、さらに好ましくは約５００ｋＤａの分子量カットオフを有する膜を用いる第一の限外濾過と約１５０ｋＤａの分子量カットオフを有する膜を用いる第二の限外濾過を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
シアリルラクトースを含有する水溶液が、好ましくはＨ＋形の、陽イオン交換樹脂と、好ましくはＣｌ−形の、陰イオン交換樹脂とにより、さらに好ましくは該水溶液を膜濾過工程に付す前に処理される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
方法が、透析、好ましくは電気透析の工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該水溶液中のシアリルラクトースの純度が、精製前に≦７０％、≦６０％、≦５０％、≦４０％、≦３０％、≦２０％、≦１０％又は≦５％であり、及び／又は、該水溶液がシアリルラクトースを精製後に≧８０％、好ましくは≧８５％又はさらに好ましくは≧９０％の純度で含有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
シアリルラクトースが３’−シアリルラクトース又は６’−シアリルラクトースである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シアリルラクトースの精製法に関する。さらに詳しくは、本発明は、シアリルラクトースを、ラクトース（乳糖）及び単糖などの他の炭水化物のほか、前記シアリルラクトースが微生物発酵によって製造される場合、発酵ブロス中に夾雑炭水化物として存在しうるジシアリルラクトースのようなより大きいオリゴ糖から分離するための簡素で経済的な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトミルクは乳児の発育のための最良の食事と見なされている。それは、脂肪、タンパク質、ビタミン、ミネラル、微量元素及び複合オリゴ糖で構成されている。ヒトミルク（ならびにその他の哺乳動物のミルク）は、ラクトースのほか、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）としても知られる様々な構造的に異なるオリゴ糖を含有している（Ｕｓａｓｈｉｍａ  Ｔ．ら（２０１１）ミルクオリゴ糖(Milk Oligosaccharides)，Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｏｏｋｓ，ニューヨーク  ＩＳＢＮ  ９７８−１−６１１２２−８３１−１）。ＨＭＯの中でも、シアル化ＨＭＯ（ＳＨＭＯ）は、腸病原性の細菌及びウィルスに対する抵抗性を支援することが観察されている。興味深いことに、最近の研究ではさらに、早産児に最も一般的な致命的疾患の一つである壊死性腸炎に対する長鎖ＳＨＭＯの保護効果も示されている。さらに、ＳＨＭＯは、乳児の脳の発達とその認知能力を支援するとも考えられている。また、シアル化オリゴ糖は、大腸菌(Escherichia coli)、コレラ菌(Vibrio cholerae)及びサルモネラ菌(Salmonella)を含む様々な病原性微生物の腸毒素を中和することも示されている。さらに、シアル化オリゴ糖は、ヘリコバクター・ピロリ菌(Helicobacter pylori)の消化管コロニー形成を妨害することによって胃潰瘍及び十二指腸潰瘍を予防又は阻害することも見出された。
【０００３】
シアル化オリゴ糖のうち、３’−シアリルラクトース及び６’−シアリルラクトースはヒトミルク中で最も豊富な成分である。
シアル化オリゴ糖は複雑な構造を有しているので、それらの化学合成又は（化学）酵素合成には課題も多く、立体化学の制御、特異的結合の形成、原料の入手性など、広範囲にわたる困難を伴う。その結果、市販のシアル化オリゴ糖は、天然物の量が少ないために非常に高価であった。
【０００４】
そこで、シアル化オリゴ糖を製造するために微生物の代謝工学において努力が重ねられてきた。それは、この手法が工業規模でＨＭＯを製造するための最も有望な手段だからである。微生物発酵によってＳＨＭＯを製造する場合、微生物は典型的には外因性シアル酸の存在下で培養される。
【０００５】
国際特許公開第ＷＯ２００７／１０１８６２  Ａ１号及びＷＯ２０１４／１５３２５２  Ａ１号には、シアル化オリゴ糖を製造するために細菌を工学的に改変するための方法及び組成物が開示されている。しかしながら、６’−シアリルラクトースの発酵製造法は、ジシアリルラクトースなどの他の炭水化物の生合成を伴うことが知られている（Ｄｒｏｕｉｌｌａｒｄ，Ｓ．ら（２０１０） フォトバクテリウム種ＪＴ−ＩＳＨ−２２４由来の多機能性シアリルトランスフェラーゼを発現している代謝工学的改変大腸菌による６’−シアリルラクトース、６，６’−ジシアリルラクトース、及び６’−ＫＤＯ−ラクトースの効率的合成(Efficient synthesis of 6'-sialyllactose, 6,6'-disialyllactose, and 6'-KDO-lactose by metabolically engineered E. coli expressing a multifunctional sialyltransferase from the Photobacterium sp. JT-ISH-224). Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３４５：１３９４−１３９９）。これは、遺伝子工学的改変細菌に発現されているシアリルトランスフェラーゼの活性により、６’−シアリルラクトースから生成する。さらに、炭水化物（例えばラクトース）のオートクレーブ（熱処理）によって、アルドール又はメイラード生成物などの望まざる副産物の形成、又は転位反応（例えばラクトースからラクツロースへの変換）ももたらされる。最終生成物中にそのような夾雑物が特に大量に存在するのは望ましくないか又はさらには容認できない。
【０００６】
さらに、オリゴ糖の製造に遺伝子工学的改変細菌を使用すると、微生物に由来する核酸分子又はポリペプチドなどの組換え材料で発酵ブロスの汚染が引き起こされる。しかしながら、ヒトが消費する製品が組換えＤＮＡ又はタンパク質で汚染されることは、今日、規制当局によっても消費者によっても許されない。従って、組換え微生物に由来するあらゆる核酸及びタンパク質は、目的のヒトミルクオリゴ糖から除去される必要がある。組換えＤＮＡ分子の検出限界は今日では非常に低いため、徹底的な精製スキームが求められる。ＤＮＡのｑＰＣＲベースの検出の場合、サンプル中のわずか単一のＤＮＡ分子でさえも検出可能である。
【０００７】
発酵ブロスから個々のオリゴ糖を精製するための“最先端”の方法は、特に前記オリゴ糖が食品用途での使用を意図される場合、技術的に複雑で非経済的であることが多い。乳清又は糖液のような複雑な混合物から二糖類のラクトース又はスクロースを精製するために、複数の結晶化工程を含む工業規模の方法が開発されている。しかしながら、前記方法は手が込んでいる上に低収率しかもたらさない。また、これらの方法は、乳清及び糖液以外の発酵ブロスがまだ食品でないため、微生物発酵によって得られたオリゴ糖を食品産業での使用に適切なものにするのにはふさわしくない。
【０００８】
しかしながら、限外濾過、精密濾過（マイクロ濾過）及びナノ濾過のような濾過法は、すべての工程パラメーターが分かっていて最適化されていれば、実施するのは技術的に容易である。透析濾過は別の適切な方法で、膜透過性成分を除去するために新鮮水を溶液に添加することを必要とする。限外濾過及び精密濾過は、通常、タンパク質のようなかなり大きい分子又は細胞を発酵ブロス又は水溶液から分離するために使用される。さらに、ナノ濾過による水、ミネラル及び非常に小さい分子の除去も周知であり、酪農業では乳清の濃縮及びミネラル除去のために使用されている。大部分の場合、ナノ濾過及び限外濾過用の膜材料は、ピペラジン、ポリアミド、ポリエーテルスルホン、ポリエチレングリコール及びセラミックなどの材料に基づいている。膜は、例えば、中空糸モジュール、スパイラル型モジュール及び平膜として組み立てる（アセンブルする）ことができ、そのアセンブリは、異なる分離性能をもたらすことができる。一般に、ナノ濾過膜は１５０〜３００ドルトンの範囲の分子量カットオフを有する。４００〜６００ドルトンの範囲の分子量カットオフを有する膜は、特に大規模工業生産では非常に珍しい。このため、オリゴ糖の分離は、バッチ式又は連続式のクロマトグラフィーなどの他の分離技術が必要になるため、依然として複雑なものとなっている。
【０００９】
ゲル濾過クロマトグラフィーは便利な実験室規模の方法にすぎないが、擬似移動床クロマトグラフィーは食品生産に適合する規模で６−ＳＬを精製するための適切な方法の代表である。しかしながら、公表されているすべてのその他の方法は、夾雑炭水化物を所望生成物から効果的に除去できないという問題に悩まされている。
【００１０】
そこで、本発明の目的は、微生物発酵からシアリルラクトースを精製するための簡素で費用効率の高い方法を提供することであり、そこでは組換え微生物に由来する核酸及びポリペプチドを所望のオリゴ糖から前記その他の炭水化物と同様に除去することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際特許公開第ＷＯ２００７／１０１８６２  Ａ１号
【特許文献２】国際特許公開第ＷＯ２０１４／１５３２５２  Ａ１号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｕｓａｓｈｉｍａ  Ｔ．ら（２０１１），Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｏｏｋｓ，ニューヨーク  ＩＳＢＮ  ９７８−１−６１１２２−８３１−１
【非特許文献２】Ｄｒｏｕｉｌｌａｒｄ，Ｓ．ら（２０１０），Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３４５：１３９４−１３９９
【発明の概要】
【００１３】
簡素で費用効率が高く、規模拡大可能なシアリルラクトースの精製法を提供する。このシアリルラクトースの精製法は、前記シアリルラクトースを結晶化するための有機溶媒を使用せずに実施できる。さらに、このシアリルラクトースの精製法は、不連続的なクロマトグラフィー工程なしに実施できる。
【００１４】
シアリルラクトースはヒトミルクオリゴ糖の代表で、乳児用調製粉乳(infant formula)及び病人向け特別食(medical food)へのその配合が非常に望まれる。シアリルラクトースは高コストであるがゆえに、特に乳児用調製粉乳へのその幅広い使用が妨げられている。特に、微生物発酵からの生成物の精製は手が込み、費用がかかることが多い。 また、有機溶媒の使用と不連続的なクロマトグラフィー工程も６’−シアリルラクトース及びその他の中性オリゴ糖を法外に高価なものにしている。また、エタノールの使用は、ある種の宗教的食品基準によっては受け入れられない（例えばハラル）。そこで、本発明は、組換えプロセシングの助けを借りて微生物発酵からシアリルラクトースを精製し、ヒトの消費に適切な、特に乳児用食品及び医療用栄養製品に適切なシアリルラクトース生成物を得るための簡素で費用効果的な方法に関する。
【００１５】
精製法は、濾過の手段によって夾雑炭水化物からシアリルラクトースを精製／分離するための二つの異なる膜の使用に基づき、二つの膜濾過工程を含む。ここで、一つの膜は約３００〜約５００ドルトンの分子量カットオフを有し、他の膜は約６００〜約８００ドルトンの分子量カットオフを有する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
シアリルラクトースを他の炭水化物から精製するための方法を提供し、該方法は、シアリルラクトース及び前記他の炭水化物を含有する水溶液を異なる膜を用いる二つの膜濾過工程に付す工程を含み、ここで、一つの膜は約３００〜約５００ドルトンの分子量カットオフを有し、他の膜は約６００〜約８００ドルトンの分子量カットオフを有する。
【００１７】
約３００〜約５００ドルトンの分子量カットオフを有する膜は、シアリルラクトースより小さい分子量を有する炭水化物のバルクを除去できる。濾過により、ＳＬ及びＳＬより大きい分子量を有する炭水化物が保持液中に保持される。
【００１８】
追加及び／又は代替の態様において、約３００〜約５００ドルトンの分子量カットオフを有する膜は、１〜２ｎｍの孔径を有する。
ＳＬの分子量より小さい分子量カットオフを有する適切な膜は、例えば、ＴｒｉＳｅｐ  ＸＮ−４５（ＴｒｉＳｅｐ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、米国）、Ｄａｉｒｙ  ＤＫ（Ｓｕｅｚ  Ｗａｔｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、旧ＧＥ社）及びＦｉｌｍｔｅｃｈ  ＮＦ２７０（Ｄｏｗ社）である。
【００１９】
約６００〜約８００ドルトンの分子量カットオフを有する膜は、シアリルラクトース及びＳＬより小さい分子量を有する炭水化物に対する透過性を有する。濾過により、ＳＬは濾液中に存在するが、ＳＬより大きい分子量を有する炭水化物は保持液中に残る。
【００２０】
追加及び／又は代替の態様において、約６００〜約８００ドルトンの分子量カットオフを有する膜は、２．５〜３ｎｍの孔径を有する。
６−ＳＬに対する透過性を有し、６−ＳＬより大きい分子量を有する炭水化物を保持液中に保持するための適切な膜は、例えば、ＴａｎｇｅｎＸ  ＳＩＵＳ  ＴＦＦ  ０．６５ｋＤａ膜（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）、Ｚｉｒｋｏｎｉａモジュール  ３ｎｍ（Ｐｅｒｖａｔｅｃｈ  ＢＶ社）及びＳ−ＣＵＴ  ＹＳＮＦ−ＹＳ６００（ＣＵＴ／Ｂｕｒｋｅｒｔ社）である。
【００２１】
当該方法は、高価な不連続クロマトグラフィー工程の使用を回避するほか、有機溶媒を用いる沈殿又は結晶化工程も不要にする。従って、追加及び／又は代替の態様において、当該方法は、一つ又は複数の不連続クロマトグラフィー工程及び／又は有機溶媒の使用による６−ＳＬの沈殿及び／又は結晶化の一つ又は複数の工程を含まない。
【００２２】
追加及び／又は代替の態様において、水溶液は、シアリルラクトースを製造するための発酵又は酵素法から得られる。
本明細書中に記載の方法は、経済的に実現可能であり規模拡大可能であるので、ヒトミルクオリゴ糖の３’−シアリルラクトース又は６’−シアリルラクトースを微生物発酵又は生体触媒反応から数トン量で精製するのに適切である。
【００２３】
追加及び／又は代替の態様において、水溶液は発酵から得られる。すなわちシアリルラクトースを産生できる微生物細胞を、培地（発酵ブロス）中及び微生物細胞がシアリルラクトースを産生可能な条件下で培養することにより、発酵ブロスからバイオマスを分離することによって得られる。好ましくは、発酵ブロスからのバイオマスの分離は、少なくとも一つの限外濾過工程、好ましくは二つの限外濾過工程、さらに好ましくは、約５００ｋＤａの分子量カットオフを有する膜を用いる第一の限外濾過と約１５０ｋＤａの分子量カットオフを有する膜を用いる第二の限外濾過を含む。
【００２４】
追加及び／又は代替の態様において、水溶液は、好ましくはＨ＋形の、陽イオン交換樹脂と、好ましくはＣｌ−形の、陰イオン交換樹脂とで処理される。好ましくは、シアリルラクトース及び他の炭水化物を含有する水溶液は、他の炭水化物を除去するための膜濾過工程に付される前にイオン交換樹脂で処理される。
【００２５】
追加及び／又は代替の態様において、方法はさらに、イオンを除去するために、透析の工程、好ましくは電気透析の工程を含む。好ましくは、シアリルラクトースを含有する水溶液は、前記他の炭水化物が水溶液から除去された後に透析及び／又は電気透析に付される。
【００２６】
生成物は、無菌濃縮液として又は噴霧乾燥製品として供給されるのが最も好都合でありうる。
当該方法は３’−シアリルラクトース又は６’−シアリルラクトースの精製、すなわち他の炭水化物からの３−ＳＬ又は６−ＳＬの分離を可能にする。ここで、水溶液中のシアリルラクトースの純度は精製前に≦７０％、≦６０％、≦５０％、≦４０％、≦３０％、≦２０％、≦１０％又は≦５％であり、及び／又は、該水溶液はシアリルラクトースを精製後に≧８０％、好ましくは≧８５％又はさらに好ましくは≧９０％の純度で含有する。
【００２７】
追加及び／又は代替の態様において、精製は下記工程を含む。
ｉ．）バイオマスを発酵ブロスから分離し；
ii．）荷電物質を除去するために、無細胞発酵ブロスを少なくとも一つのイオン交換樹脂処理、好ましくは陰イオン交換樹脂処理及び陽イオン交換樹脂処理に付し；
iii．）工程ii．で得られた水溶液を、約３００〜約５００ドルトンの分子量カットオフを有する膜を用いる膜濾過工程に付してシアリルラクトースより小さい分子量を有する炭水化物を除去し；
iv．）工程iii．で得られた保持液を、約６００〜約８００ドルトンの分子量カットオフを有する膜を用いる膜濾過工程に付してシアリルラクトースより大きい分子量を有する炭水化物を除去し；そして、任意に
ｖ．）工程iv．の濾液中に存在するシアリルラクトースの濃度を増大させる。
【００２８】
シアリルラクトースの精製に使用される他の方法（手順）はかなり複雑で、従って費用もかかるが、本明細書の上文に記載された方法は、主に二つの膜濾過工程の使用に依拠している。
【００２９】
一定の態様は、一つ又は複数の更なる工程、例えば、透析工程（塩類除去のため）、電気透析（荷電分子除去のため）、活性炭処理（生成物溶液の脱色のため）及び／又はその他の濾過工程（内毒素除去及び／又は滅菌濾過のような）を含む。必要ではないが、方法は、夾雑オリゴ糖の沈殿のため、又は活性炭への吸着後に短鎖アルコール及び水混合物による溶離のため、及び／又はシアリルラクトースの結晶化のために、シアリルラクトースを含有する水溶液を有機溶媒（例えばメタノールのような短鎖アルコール）で処理することを含んでもよい。
【００３０】
当該方法から得られた水溶液は、シアリルラクトースを含有するが、微生物細胞の核酸及びポリペプチドは含有しない。さらに、前記水溶液は、仮にあったとしても単糖類及び／又はジシアリルラクトースをほとんど含有しない。
【００３１】
本発明を、特定の態様に関して説明するが、本発明はそれらに限定されるのではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。さらに、説明文及び特許請求の範囲における第一、第二などの用語は、類似の要素を区別するために使用されているのであって、必ずしも、時間的、空間的、ランキング又は任意のその他の様式における順序を記述しているわけではない。そのように使用された用語は、適切な状況下で交換可能であること、そして本明細書中に記載された発明の態様は本明細書中に記載又は例示されている以外の他の順序で操作可能であることは理解されるはずである。
【００３２】
特許請求の範囲において使用されている“含む(comprising)”という用語は、その後に掲載されている手段に限定されないと解釈されるべきであり；他の要素又は工程を除外しないことに注意する。従って、参照された規定の特徴、整数、工程又は要素の存在を具体化していると解釈されるべきではあるが、一つ又は複数のその他の特徴、整数、工程又は要素、又はそれらのグループの存在又は追加を排除しない。従って、“手段Ａ及びＢを含む装置”という表現の範囲は、要素Ａ及びＢのみからなる装置に限定されるべきではない。それは、本発明に関しては、装置の単なる関連要素がＡ及びＢであることを意味する。
【００３３】
本明細書全体を通じて、“一態様”又は“態様”への参照は、その態様に関連して記載されている特定の特徴(feature)、構造又は特徴(characteristic)が、本発明の少なくとも一つの態様に含まれることを意味する。従って、本明細書全体の様々な場所で、“一態様において”又は“態様において”という語句の出現は、必ずしもすべてが同じ態様を参照しているとは限らないが、参照していることもある。さらに、特定の特徴(feature)、構造又は特徴(characteristic)は、本開示から当業者には明らかなように、一つ又は複数の態様において任意の適切な様式で組み合わせることができる。
【００３４】
同様に、本発明の例示的態様の記載において、本発明の様々な特徴は、開示内容を簡素化するため及び様々な発明的側面の一つ又は複数の理解を助けるために、単一の態様、図面又はその説明にまとめられることもあることは理解されるべきである。しかしながら、この開示の方法は、特許請求されている発明は各請求項に明示されているよりも多くの特徴を必要とするという意図を表していると解釈されるべきでない。むしろ、以下の特許請求の範囲に表されている通り、発明的側面は、前述の開示された単一の態様のすべての特徴よりも少ない特徴にある。従って、詳細な説明に続く特許請求の範囲は、これによって明示的にこの詳細な説明に取り込まれ、各請求項は、本発明の別の態様として独立している。
【００３５】
さらに、本明細書中に記載の一部の態様は、他の態様に含まれる一部の特徴（他の特徴ではない）を含むが、異なる態様の特徴の組合せは、当業者には分かる通り、本発明の範囲内であることを意味し、異なる態様を形成する。例えば、以下の特許請求の範囲において、特許請求されている態様のいずれもが任意の組合せで使用できる。
【００３６】
さらに、実施態様のいくつかは、コンピュータシステムのプロセッサによって又は機能を実施するその他の手段によって実施できる方法又は方法の要素の組合せとして本明細書に記載されている。従って、そのような方法又は方法の要素を実施するために必要な指示を備えたプロセッサは、方法又は方法の要素を実施するための手段を形成する。さらに、装置態様の本明細書中に記載されている要素は、本発明を実施するために、該要素によって実施される機能を実行するための手段の例である。
【００３７】
本明細書中に提供されている説明及び図面には、多数の具体的な詳細が示されている。しかしながら、本発明の態様は、これらの具体的詳細がなくても実施できることは理解されるはずである。他の場合において、周知の方法、構造及び技術は、本説明の理解を曖昧にしないために詳細には示されていない。
【００３８】
次に、本発明を、本発明のいくつかの態様を詳細に記載することによって説明する。本発明の他の態様は、本発明の真の精神又は技術的教示から逸脱することなく、当業者の知識に従って構成することができ、本発明は添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されることは明白である。
【実施例】
【００３９】
実施例１．６’−シアリルラクトースの発酵生産
フォトバクテリウム・レイオグナチ(Photobacterium leiognathi)ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９由来のα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ遺伝子ｐｌｓＴ６を発現している組換え６’−シアリルラクトース合成大腸菌株（大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）  ΔｌａｃＺ）を用いて６’−シアリルラクトースの流加発酵(feed-batch fermentation)を実施した。ＣＭＰ−シアル酸の生合成を増強するために、大腸菌由来グルコサミン−６−リン酸シンターゼＧｌｍＳ、シネコシスティス種(Synechocystis sp.)由来Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼＳｌｒ１９７５、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来グルコサミン６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼＧｎａ１、大腸菌由来ホスホエノールピルビン酸シンターゼＰｐｓＡ、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼＮｅｕＢ、及びＣＭＰ−シアル酸シンターゼＮｅｕＡ（後者二つはカンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)由来）をコードする遺伝子を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主の染色体に組み込んだ。さらに、大腸菌由来ラクトースペルメアーゼＬａｃＹをコードする遺伝子、及び大腸菌由来の遺伝子ｃｓｃＢ（スクロースペルメアーゼ）、ｃｓｃＫ（フルクトキナーゼ）、ｃｓｃＡ（スクロースヒドロラーゼ）、及びｃｓｃＲ（転写調節因子）もＢＬ２１ゲノムに組み込み、組み込まれた遺伝子の転写が、テトラサイクリンプロモーターＰｔｅｔ又はＰＴ５プロモーターいずれかの構成的プロモーターから開始されるようにした。遺伝子ｇａｌＥ（ＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼ）、ｇａｌＴ（ガラクトース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ）、ｇａｌＫ（ガラクトキナーゼ）、及びｇａｌＭ（ガラクトース−１−エピメラーゼ）からなり、発現している機能的ガル（ガラクトース）オペロンを大腸菌Ｋ１２からＢＬ２１株のゲノムに移した。Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸の分解を防止するため、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸デアセチラーゼ（ＮａｇＡ）、グルコサミン−６−リン酸デアミナーゼ（ＮａｇＢ）、及びＮ−アセチルグルコサミン特異的ＰＴＳタンパク質ＩＩＡＢＣ（ＮａｇＥ）を細菌染色体から削除した。さらに、マンノース、グルコース、グルコサミン及びＮ−アセチルグルコサミンのための大腸菌ＰＴＳ系の糖輸送体をコードするオペロンｍａｎＸＹＺのほか、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミン−６−リン酸エピメラーゼ、及びシアル酸輸送体をそれぞれコードする遺伝子ｎａｎＡ、ｎａｎＫ、ｎａｎＥ、及びｎａｎＴも削除した。Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−リン酸デアセチラーゼ（ＡｇａＡ）をコードする遺伝子も削除した。
【００４０】
６’−シアリルラクトース産生大腸菌株を、７ｇ・ｌ−１のＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、７ｇ・ｌ−１のＫ２ＨＰＯ４、２ｇ・ｌ−１のＫＯＨ、０．３ｇ・ｌ−１のクエン酸、５ｇ・ｌ−１のＮＨ４Ｃｌ、１ｍｌ・ｌ−１の消泡剤（Ｓｔｒｕｋｔｏｌ  Ｊ６７３、Ｓｃｈｉｌｌ＋Ｓｅｉｌａｃｈｅｒ社）、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、８ｍＭのＭｇＳＯ４、微量元素及び炭素源として２％スクロースを含む規定の無機塩培地中で増殖させた。微量元素は、０．１０１ｇ・ｌ−１のニトリロ三酢酸（ｐＨ６．５）、０．０５６ｇ・ｌ−１のクエン酸第二鉄アンモニウム、０．０１ｇ・ｌ−１のＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ・ｌ−１のＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ、０．００１ｇ・ｌ−１のＣｕＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ・ｌ−１のホウ酸、０．００９ｇ・ｌ−１のＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．００１ｇ・ｌ−１のＮａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ・ｌ−１のＮａ２ＳｅＯ３、０．００２ｇ・ｌ−１のＮｉＳＯ４×６Ｈ２Ｏからなるものであった。
【００４１】
スクロース供給材料（５００ｇ・ｌ−１）には、８ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、微量元素、及び５ｇ・ｌ−１のＮＨ４Ｃｌを補充した。６’−シアリルラクトース形成のために、２１６ｇ・ｌ−１のラクトース供給材料を使用した。培地のｐＨはアンモニア溶液（２５％ｖ／ｖ）の使用によって制御された。流加発酵は、一定の通気及び撹拌下３０℃で７２時間、開始体積を基準にして５．５〜７ｍｌ・ｌ−１・ｈ−１のスクロース供給速度を適用することによって実施された。発酵開始後７２時間時点で、添加されたラクトースの大部分は６’−シアリルラクトースに変換された。発酵上清中の残留ラクトースを除去するために、β−ガラクトシダーゼを発酵容器に加えた。
【００４２】
実施例２：無細胞発酵ブロスの調製
細胞集団(cell-mass)（発酵ブロスの約１０％）を、限外濾過（０．０５μｍカットオフ）（ＣＵＴ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ドイツ・エルクラート）と、その後の１５０ｋＤａのＭＷＣＯを有するフィルター（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ−Ｎａｄｉｒ社、ドイツ・ヴィースバーデン）を用いるクロスフロー濾過によって培地から分離した。
【００４３】
実施例３：６’−シアリルラクトース含有無細胞発酵ブロスのイオン交換樹脂処理
実施例２から得られた無細胞発酵ブロスは、体積１０００リットル中に６’−シアリルラクトースを（乾燥重量による純度９％で）含有していた。これを、正に帯電した夾雑物質を除去するために、Ｈ＋形の強陽イオン交換樹脂（ドイツのＬａｎｘｅｓｓ社から入手したＬｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ２５６８）に通した（イオン交換体の床体積のサイズは２００Ｌであった）。イオン交換樹脂からの６−ＳＬの溶出は脱イオン水を用いて続けられた。次に、得られた溶液を水酸化ナトリウム溶液の添加によりｐＨ７にセットした。次に（遅滞なく）、該溶液を陰イオン交換体カラムに通した（イオン交換体の床体積は２００Ｌであった）。使用された強陰イオン交換体Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ６３６８Ａ（Ｌａｎｘｅｓｓ社、ドイツ）は塩化物（Ｃｌ−）形であった。６−ＳＬの溶出は脱イオン水を用いて続けられた。得られた溶液を再度ｐＨ７に中和した。
【００４４】
実施例４：より小さい分子／炭水化物を除去するための第一の濾過
実施例３に示されたイオン交換樹脂処理によって得られた溶液を、ＴｒｉＳｅｐ  ＸＮ−４５（ＴｒｉＳｅｐ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、米国）ナノ濾過膜と５００Ｌの脱イオン水を用いて透析濾過した。得られた溶液をさらに、ナノ濾過膜（ＲＥ  ８０４０−ＢＥ、ＣＳＭ−Ｓａｅｈａｎ社）を用いて濃縮した。ここで、純度３１％（乾燥重量による）及び導電率８ｍＳ／ｃｍを有する６’−シアリルラクトース溶液が得られた。
【００４５】
実施例５：より大きい分子／炭水化物を除去するための第二の濾過
発酵生産された副産物のジシアリルラクトースから６’−シアリルラクトースを分離するために第二の膜処理を使用した。濾過のために、公称カットオフ０．６５ｋＤａを有するＴａｎｇｅｎＸ  ＳＩＵＳ  ＴＦＦ膜（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）を使用した。９４．４％の６’−シアリルラクトースと６．６％のジシアリルラクトース（比率１５：１）を含有する溶液を、記載のシステムを用いてクロスフロー濾過し、透過液及び保持液内部の６’−シアリルラクトースとジシアリルラクトースの濃度を決定した。結果は、透過液内部のジシアリルラクトースの量が６．６％から０．２％に著しく減少した（６’−シアリルラクトース対ジシアリルラクトースの比率は５５：１であった）が、保持液内部の６’−シアリルラクトース対ジシアリルラクトースの比率は１４：１であったことを示している。この結果は、追加の濾過工程を使用することによって６’−シアリルラクトースをジシアリルラクトースから分離できることを示している。このような観察結果は、異なる供給業者から入手した類似のカットオフを有する第二の種類の膜を使用することによっても示すことができる。公称カットオフ６００〜８００Ｄａを有するＳ−ＣＵＴ  ＹＳＮＦ−ＹＳ６００−２５４０−Ｍ４６Ｄ−ＡＴＤ膜（ＣＵＴ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＧｍｂＨ社）を用いることによっても６’−シアリルラクトースはクロスフロー濾過によってジシアリルラクトースから分離された。
【００４６】
実施例６：電気透析処理
実施例５で得られた透過液を、ＰＣ−Ｃｅｌｌ  ＥＤ  １０００Ｈ  膜スタックを備えたＰＣ−Ｃｅｌｌ  １５  電気透析装置（ＰＣ−Ｃｅｌｌ、ドイツ・ホイスヴァイラー）を用いて２ｍＳ／ｃｍにまで電気透析した。この膜スタックは下記の膜を備えていた。すなわち、陽イオン交換膜ＣＥＭ：ＰＫ  ＳＫ  及び陰イオン交換膜ＡＥＭ：６０Ｄａのサイズ排除限界を有するＰｃＡｃｉｄ６０。０．０２５Ｍのスルファミン酸（アミドスルホン酸）溶液を電気透析法の電解質として使用した。電気透析後、６’−シアリルラクトースを純度８３％（乾燥重量による）で含有する溶液が得られた。電気透析処理の代わりに透析濾過法を使用することもできた。
【００４７】
実施例７：濃縮及び活性炭処理
逆浸透フィルターと４５℃での回転蒸発を用いて水溶液から多少の水を除去し、２５％（ｍ／ｖ）の６’−シアリルラクトース溶液を得た。次に、得られた水溶液を活性炭（Ｎｏｒｉｔ  ＳＡ２）で処理した。１Ｌの２５％（ｍ／ｖ）６’−シアリルラクトースに対し１２５ｇの活性炭を使用した。
【００４８】
実施例８：滅菌濾過及び内毒素除去
その後、実施例７で得られた溶液を６ｋＤフィルター（Ｐａｌｌ  Ｍｉｃｒｏｚａ  限外濾過中空糸モジュールＳＥＰ−２０１３、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、ドイツ・ドライアイヒ）に通すことにより滅菌濾過に付した。次に、該滅菌溶液を噴霧乾燥までＲＴ（室温）で保管した。
【００４９】
実施例９：６’−シアリルラクトースの噴霧乾燥
このようにして得られた（実施例８）滅菌６’−シアリルラクトースを次に、ＮＵＢＩＬＯＳＡ  ＬＴＣ−ＧＭＰ噴霧乾燥機（ＮＵＢＩＬＯＳＡ社、ドイツ・コンスタンツ）を用いて噴霧乾燥した。６’−シアリルラクトースの噴霧乾燥の場合、溶液を、３．５ｂａｒの加圧下、１３０℃にセットされた噴霧乾燥機ノズルに通し、６７〜６９℃の排気温度を維持するように流量を調整した。これらの設定を用いて、９％未満の水分量を有する噴霧乾燥粉末が得られた。水分含量は、カール・フィッシャー滴定によって決定された。
【００５０】
実施例１０：６’−シアリルラクトースのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
定量のため、質量分析をＭＲＭ（多重反応モニタリング）により、ＬＣトリプル四重極ＭＳ検出システムを用いて実施した。プリカーサイオンは四重極１で選択及び分析し、フラグメンテーションはアルゴンをＣＩＤガスとして用いて衝突室（コリジョンセル）で行い、フラグメントイオンの選択は四重極３で実施する。糖のクロマトグラフィー分離は、ＸＢｒｉｄｇｅ  Ａｍｉｄｅガードカートリッジ（３．５μｍ、２．１×１０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ社、米国）付きＸＢｒｉｄｇｅ  Ａｍｉｄｅ  ＨＰＬＣカラム（３．５μｍ、２．１×５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ社、米国）で実施した。ＨＰＬＣシステムのカラムオーブン温度は５０℃であった。移動相は、１０ｍＭ酢酸アンモニウム入りのアセトニトリル／Ｈ２Ｏで構成されていた。１μｌのサンプルを機器に注入し；運転(run)は流速４００μｌ／分で３．６０分間実施した。６’−シアリルラクトースは、ＭＲＭにより、ＥＳＩポジティブイオン化モードで分析された。質量分析計はユニット分解能で運転された。シアリルラクトースは、ｍ／ｚ６５６．２［Ｍ＋Ｎａ］のイオンを形成する。シアリルラクトースのプリカーサイオンをさらに衝突室でフラグメント化し、フラグメントイオンｍ／ｚ６１２．１５、ｍ／ｚ３６５．１５及びｍ／ｚ３１４．１５にした。衝突エネルギー、Ｑ１及びＱ３のプレバイアス(Pre Bias)は各分析物ごとに個別に最適化された。定量法は市販の標準（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ社、英国コンプトン）を用いて確立された。
【国際調査報告】
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