(57)【要約】本明細書では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）及びＴＣＲ定常ドメインをコードする組換え核酸、コードされた分子を発現する改変Ｔ細胞、及びがんを含む疾患の治療のためのその使用方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え核酸であって、
（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする配列であって、
（ｉ）以下：
（１）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、
（２）膜貫通ドメイン、及び
（３）ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＴＣＲアルファ、またはＴＣＲベータの細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含む細胞内ドメイン
を含むＴＣＲサブユニットと
（ｉｉ）抗原結合ドメインを含むヒト抗体またはヒト化抗体と
を含む前記配列と、
（ｂ）ＴＣＲ定常ドメインをコードする配列であって、前記ＴＣＲ定常ドメインが、ＴＣＲアルファ定常ドメイン、ＴＣＲベータ定常ドメイン、またはＴＣＲアルファ定常ドメインとＴＣＲベータ定常ドメインである、前記配列とを含み、
前記ＴＣＲサブユニット及び前記抗体が機能的に連結されており、
かつ
内因性ＴＣＲの機能的破壊を含む改変Ｔ細胞で発現すると前記ＴＦＰがＴＣＲ複合体に機能的に組み込まれる、
組換え核酸。
【請求項２】
組換え核酸であって、
（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする配列であって、
（ｉ）以下：
（１）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、
（２）膜貫通ドメイン、及び
（３）ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＴＣＲアルファ、またはＴＣＲベータの細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含む細胞内ドメイン
を含むＴＣＲサブユニットと
（ｉｉ）抗体またはその断片に結合できる結合リガンドまたはその断片と
を含む前記配列と、
（ｂ）ＴＣＲ定常ドメインをコードする配列であって、前記ＴＣＲ定常ドメインが、ＴＣＲアルファ定常ドメイン、ＴＣＲベータ定常ドメイン、またはＴＣＲアルファ定常ドメインとＴＣＲベータ定常ドメインである、前記配列とを含み、
前記ＴＣＲサブユニット及び結合リガンドまたはその断片は機能的に連結されており、かつ
内因性ＴＣＲの機能的破壊を含む改変Ｔ細胞で発現すると前記ＴＦＰがＴＣＲ複合体に機能的に組み込まれる、組換え核酸。
【請求項３】
前記結合リガンドが、前記抗体のＦｃドメインと結合できる、請求項２に記載の組換え核酸。
【請求項４】
前記結合リガンドが、ＩｇＧ１抗体と選択的に結合できる、請求項２に記載の組換え核酸。
【請求項５】
前記結合リガンドが、ＩｇＧ４抗体と特異的に結合できる、請求項２に記載の組換え核酸。
【請求項６】
前記抗体またはその断片が細胞表面抗原に結合する、請求項２に記載の組換え核酸。
【請求項７】
前記抗体またはその断片が腫瘍細胞の表面にある細胞表面抗原に結合する、請求項２に記載の組換え核酸。
【請求項８】
前記結合リガンドが、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、または十量体を含む、請求項２に記載の組換え核酸。
【請求項９】
前記結合リガンドが抗体またはその断片を含まない、請求項２に記載の組換え核酸。
【請求項１０】
前記結合リガンドがＣＤ１６ポリペプチドまたはその断片を含む、請求項９に記載の組換え核酸。
【請求項１１】
前記結合リガンドがＣＤ１６結合ポリペプチドを含む、請求項１０に記載の組換え核酸。
【請求項１２】
前記結合リガンドがヒトのものであるか、またはヒト化されている、請求項２に記載の組換え核酸。
【請求項１３】
前記結合リガンドが結合できる抗体またはその断片をコードする核酸配列をさらに含む、請求項２に記載の組換え核酸。
【請求項１４】
前記抗体またはその断片が細胞から分泌できる、請求項１３に記載の組換え核酸。
【請求項１５】
組換え核酸であって、
（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする配列であって、
（ｉ）以下：
（１）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、
（２）膜貫通ドメイン、及び
（３）ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＴＣＲアルファ、またはＴＣＲベータの細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含む細胞内ドメイン
を含むＴＣＲサブユニットと
（ｉｉ）細胞の表面に発現する受容体またはポリペプチドに結合するリガンドまたはその断片を含む抗原ドメインと
を含む前記配列と、
（ｂ）ＴＣＲ定常ドメインをコードする配列であって、前記ＴＣＲ定常ドメインが、ＴＣＲアルファ定常ドメイン、ＴＣＲベータ定常ドメイン、またはＴＣＲアルファ定常ドメインとＴＣＲベータ定常ドメインである、前記配列とを含み、
前記ＴＣＲサブユニット及び前記抗原ドメインは機能的に連結されており、
かつ
内因性ＴＣＲの機能的破壊を含む改変Ｔ細胞で発現すると前記ＴＦＰがＴＣＲ複合体に機能的に組み込まれる、組換え核酸。
【請求項１６】
前記抗原ドメインがリガンドを含む、請求項１５に記載の組換え核酸。
【請求項１７】
前記リガンドが細胞の受容体に結合する、請求項１５に記載の組換え核酸。
【請求項１８】
前記リガンドが細胞の表面に発現するポリペプチドに結合する、請求項１５に記載の組換え核酸。
【請求項１９】
細胞の表面に発現する前記受容体またはポリペプチドが、ストレス応答受容体またはポリペプチドを含む、請求項１５に記載の組換え核酸。
【請求項２０】
細胞の表面に発現する前記受容体またはポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩ関連糖タンパク質である、請求項１５に記載の組換え核酸。
【請求項２１】
前記ＭＨＣクラスＩ関連糖タンパク質が、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２０に記載の組換え核酸。
【請求項２２】
前記抗原ドメインが、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、または十量体を含む、請求項１５に記載の組換え核酸。
【請求項２３】
前記抗原ドメインが、前記リガンドまたはその断片の単量体または二量体を含む、請求項２２に記載の組換え核酸。
【請求項２４】
前記リガンドまたはその断片が、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、または十量体である、請求項１５に記載の組換え核酸。
【請求項２５】
前記リガンドまたはその断片が単量体または二量体である、請求項２４に記載の組換え核酸。
【請求項２６】
前記抗原ドメインが抗体またはその断片を含まない、請求項１５に記載の組換え核酸。
【請求項２７】
前記抗原ドメインが可変領域を含まない、請求項１５に記載の組換え核酸。
【請求項２８】
前記抗原ドメインがＣＤＲを含まない、請求項１５に記載の組換え核酸。
【請求項２９】
前記リガンドまたはその断片が、ナチュラルキラーグループ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンドまたはその断片である、請求項１５に記載の組換え核酸。
【請求項３０】
Ｔ細胞で発現すると、前記ＴＣＲ定常ドメインが機能的ＴＣＲ複合体に組み込まれる、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項３１】
前記ＴＣＲ定常ドメインが、Ｔ細胞で発現すると、前記ＴＦＰを組み込む前記機能的ＴＣＲ複合体と同じ機能的ＴＣＲ複合体に組み込まれる、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項３２】
前記ＴＦＰをコードする配列と前記ＴＣＲ定常ドメインをコードする配列が、同じ核酸分子内に含まれている、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項３３】
前記ＴＦＰをコードする配列と前記ＴＣＲ定常ドメインをコードする配列が、異なる核酸分子内に含まれている、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項３４】
前記ＴＣＲサブユニットと、前記抗体ドメイン、前記抗原ドメイン、もしくは前記結合リガンド、またはそれらの断片とが、リンカー配列によって機能的に連結されている、請求項１〜３３に記載の組換え核酸。
【請求項３５】
前記リンカー配列が（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む、請求項３４に記載の組換え核酸。
【請求項３６】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＴＣＲアルファ、またはＴＣＲベータからのＴＣＲ膜貫通ドメインである、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項３７】
前記細胞内ドメインが、ＣＤ３イプシロンのみ、ＣＤ３ガンマのみ、ＣＤ３デルタのみ、ＴＣＲアルファのみ、またはＴＣＲベータのみに由来する、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項３８】
前記ＴＣＲサブユニットが、（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＴＣＲ細胞内ドメインを含み、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）のうち少なくとも２つは同じＴＣＲサブユニット由来である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項３９】
前記ＴＣＲ細胞外ドメインが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、それらの機能的断片、及び少なくとも１つだが２０以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択される、タンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項４０】
前記ＴＣＲサブユニットが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、それらの機能的断片、及び少なくとも１つだが２０以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択される、タンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項４１】
前記ＴＣＲサブユニットが、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメインから選択されるタンパク質の刺激ドメイン、またはそれらに対して少なくとも１つの修飾を有するアミノ酸配列を含むＴＣＲ細胞内ドメインを含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項４２】
前記ＴＣＲサブユニットが、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメイン及び／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインから選択されるタンパク質の刺激ドメイン、またはそれらに対して少なくとも１つの修飾を有するアミノ酸配列を含む細胞内ドメインを含む、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項４３】
共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項４４】
前記共刺激ドメインが、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ならびに少なくとも１つだが２０以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択される、タンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項４３に記載の組換え核酸。
【請求項４５】
前記ＴＣＲサブユニットが、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＴＣＲゼータ鎖、Ｆｃイプシロン受容体１鎖、Ｆｃイプシロン受容体２鎖、Ｆｃガンマ受容体１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ２鎖、Ｆｃガンマ受容体３ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体３ｂ鎖、Ｆｃベータ受容体１鎖、ＴＹＲＯＢＰ（ＤＡＰ１２）、ＣＤ５、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８９、ＣＤ２７８、ＣＤ６６ｄ、それらの機能的断片、及び少なくとも１つだが２０以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択される、タンパク質の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）またはその一部を含む、ＴＣＲサブユニットＩＴＡＭを含む、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項４６】
前記ＩＴＡＭが、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはＣＤ３イプシロンのＩＴＡＭを置換する、請求項４５に記載の組換え核酸。
【請求項４７】
前記ＩＴＡＭが、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択され、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択される別のＩＴＡＭを置換する、請求項４５に記載の組換え核酸。
【請求項４８】
前記ＴＦＰ、前記ＴＣＲアルファ定常ドメイン、前記ＴＣＲベータ定常ドメイン、及びそれらの任意の組み合わせが、内因性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用できる、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項４９】
（ａ）前記ＴＣＲ定常ドメインはＴＣＲアルファ定常ドメインであり、前記ＴＦＰがＴＣＲベータ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはそれらの組み合わせの内因性サブユニットを含むＴＣＲ複合体に機能的に統合されるか、
（ｂ）前記ＴＣＲ定常ドメインはＴＣＲベータ定常ドメインであり、前記ＴＦＰがＴＣＲアルファ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはそれらの組み合わせの内因性サブユニットを含むＴＣＲ複合体に機能的に統合されるか、あるいは
（ｃ）前記ＴＣＲ定常ドメインはＴＣＲアルファ定常ドメイン及びＴＣＲベータ定常ドメインであり、前記ＴＦＰが、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはそれらの組み合わせの内因性サブユニットを含むＴＣＲ複合体に機能的に統合される、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項５０】
前記少なくとも１つだが２０以下の修飾が、細胞シグナル伝達を媒介するアミノ酸の修飾、またはＴＦＰへのリガンド結合に応答してリン酸化されるアミノ酸の修飾を含む、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項５１】
前記ヒト抗体またはヒト化抗体が抗体断片である、請求項１及び３４〜５０のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項５２】
前記抗体断片が、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体ドメイン、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインである、請求項５１に記載の組換え核酸。
【請求項５３】
抗原結合ドメインが、抗ＣＤ１９結合ドメイン、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合ドメイン、抗メソテリン（ＭＳＬＮ）結合ドメイン、抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメイン、抗ＭＵＣ１６結合ドメイン、抗ＣＤ２２結合ドメイン、抗ＰＤ−１結合ドメイン、抗ＢＡＦＦまたはＢＡＦＦ受容体結合ドメイン、及び抗ＲＯＲ−１結合ドメインからなる群から選択される、請求項１及び３４〜５２のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項５４】
前記核酸が、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選択される、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項５５】
前記核酸がｍＲＮＡである、請求項１〜５４のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項５６】
前記組換え核酸が核酸類似体を含み、前記核酸類似体は前記組換え核酸のコード配列にはない、請求項１〜５５のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項５７】
前記核酸類似体が、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホン酸ヌクレオチド、チオールホスホン酸ヌクレオチド、及び２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホロアミダイトからなる群から選択される、請求項５６に記載の組換え核酸。
【請求項５８】
リーダー配列をさらに含む、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項５９】
プロモーター配列をさらに含む、請求項１〜５８のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項６０】
ポリ（Ａ）尾部をコードする配列をさらに含む、請求項１〜５９のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項６１】
３’ＵＴＲ配列をさらに含む、請求項１〜６０のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項６２】
前記核酸が、単離された核酸または天然に存在しない核酸である、請求項１〜６１のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項６３】
前記核酸がｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写した核酸である、請求項１〜６２のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項６４】
ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインをコードする配列をさらに含む、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項６５】
ＴＣＲベータ膜貫通ドメインをコードする配列をさらに含む、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
【請求項６６】
ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインをコードする配列及びＴＣＲベータ膜貫通ドメインをコードする配列をさらに含む、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の組換え核酸。
【請求項６７】
請求項１〜６６のいずれか１項に記載の組換え核酸を含むベクター。
【請求項６８】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項６７に記載のベクター。
【請求項６９】
ＡＡＶ６ベクターである、請求項６７または６８に記載のベクター。
【請求項７０】
プロモーターをさらに含む、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項７１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写したベクターである、請求項６７〜７０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項７２】
請求項１〜６６のいずれか１項に記載の組換え核酸または請求項６７〜７１のいずれか１項に記載のベクターを含む改変Ｔ細胞であって、内因性ＴＣＲの機能的破壊を含む、改変Ｔ細胞。
【請求項７３】
請求項１〜６６のいずれか１項に記載の核酸のＴＦＰをコードする配列、またはＴＦＰをコードする請求項１〜６６のいずれか１項に記載の核酸の配列によってコードされるＴＦＰを含む改変Ｔ細胞であって、内因性ＴＣＲの機能破壊を含む、改変Ｔ細胞。
【請求項７４】
請求項１〜６６のいずれか１項に記載のＴＦＰをコードする配列、またはＴＦＰをコードする請求項１〜６６のいずれか１項に記載の核酸の配列によってコードされるＴＦＰを含む、改変同種Ｔ細胞。
【請求項７５】
ＴＣＲ定常ドメインをコードする異種配列をさらに含み、前記ＴＣＲ定常ドメインは、ＴＣＲアルファ定常ドメイン、ＴＣＲベータ定常ドメイン、またはＴＣＲアルファ定常ドメインとＴＣＲベータ定常ドメインである、請求項７２〜７４のいずれか１項に記載の改変Ｔ細胞。
【請求項７６】
前記機能的に破壊される内因性ＴＣＲが、内因性ＴＣＲアルファ鎖、内因性ＴＣＲベータ鎖、または内因性ＴＣＲアルファ鎖と内因性ＴＣＲベータ鎖である、請求項７２〜７５のいずれか１項に記載の改変Ｔ細胞。
【請求項７７】
前記機能的に破壊された内因性ＴＣＲが、未改変の対照Ｔ細胞のものと比較して、ＭＨＣペプチド複合体への結合が減少する、請求項７２〜７６のいずれか１項に記載の改変Ｔ細胞。
【請求項７８】
前記機能的破壊が、前記内因性ＴＣＲをコードする遺伝子の破壊である、請求項７２〜７７のいずれか１項に記載の改変Ｔ細胞。
【請求項７９】
前記内因性ＴＣＲをコードする遺伝子の前記破壊が、Ｔ細胞のゲノム由来の前記内因性ＴＣＲをコードする前記遺伝子の配列の除去である、請求項７８に記載の改変Ｔ細胞。
【請求項８０】
ＣＤ４細胞、ＣＤ８細胞、ナイーブＴ細胞、メモリー幹Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、二重陰性Ｔ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、Ｔｈ０細胞、Ｔｃ０細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｃ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｃ２細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、ガンマ／デルタＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、造血幹細胞、及び多能性幹細胞から選択されるヒトＴ細胞である、請求項７２〜７９のいずれか１項に記載の改変Ｔ細胞。
【請求項８１】
ＣＤ８＋  Ｔ細胞またはＣＤ４＋  Ｔ細胞である、請求項７２〜８０のいずれか１項に記載の改変Ｔ細胞。
【請求項８２】
同種Ｔ細胞である、請求項７２〜８１のいずれか１項に記載の改変Ｔ細胞。
【請求項８３】
抑制分子の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸を、細胞内シグナル伝達ドメインからの陽性シグナルを含む第２のポリペプチドと会合してさらに含む、請求項７２〜８２のいずれか１項に記載の改変Ｔ細胞。
【請求項８４】
前記抑制分子が、ＰＤ１の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドとを含む、請求項８３に記載の改変Ｔ細胞。
【請求項８５】
（ａ）請求項７２〜８４のいずれか１項に記載の改変Ｔ細胞と、
（ｂ）薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項８６】
請求項７２〜８４のいずれか１項に記載の改変Ｔ細胞を作製する方法であって、
（ａ）ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、またはＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖をコードする内因性ＴＣＲ遺伝子を破壊し、それにより内因性ＴＣＲ遺伝子の機能的破壊を含んだＴ細胞を作製することと、
（ｂ）内因性ＴＣＲ遺伝子の機能的破壊を含んだＴ細胞に、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の組換え核酸または請求項６７〜７１のいずれか１項に記載のベクターを形質導入することを含む、方法。
【請求項８７】
前記破壊が、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、またはＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖をコードする内因性遺伝子を標的とするヌクレアーゼタンパク質、またはヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸配列をＴ細胞に形質導入することを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
請求項７２〜８４のいずれか１項に記載の改変Ｔ細胞を作製する方法であって、内因性ＴＣＲ遺伝子の機能的破壊を含んだＴ細胞に、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の組換え核酸または請求項６７〜７１のいずれか１項に記載のベクターを形質導入することを含む、方法。
【請求項８９】
内因性ＴＣＲ遺伝子の機能的破壊を含んだ前記Ｔ細胞が、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、またはＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖をコードする内因性ＴＣＲ遺伝子の機能的破壊を含んだＴ細胞である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記Ｔ細胞がヒトＴ細胞である、請求項８６〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
内因性ＴＣＲ遺伝子の機能的破壊を含んだ前記Ｔ細胞が、未改変の対照Ｔ細胞のものと比較して、ＭＨＣ−ペプチド複合体への結合が減少する、請求項８６〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、またはｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼである、請求項８６〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記組換え核酸または前記ベクターに含まれる前記配列が、切断部位で前記内因性ＴＣＲサブユニット遺伝子に挿入され、前記内因性ＴＣＲサブユニット遺伝子への前記配列の前記挿入により前記内因性ＴＣＲサブユニットが機能的に破壊される、請求項８６〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記ヌクレアーゼがメガヌクレアーゼである、請求項８６〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
前記メガヌクレアーゼが第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、前記第１のサブユニットは前記認識配列の第１の認識半部位に結合し、前記第２のサブユニットは前記認識配列の第２の認識半部位に結合する、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記メガヌクレアーゼが、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、前記リンカーは前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットとを共有結合する、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
治療を必要とする対象におけるがんの治療方法であって、請求項８５に記載の治療有効量の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項９８】
治療を必要とする対象におけるがんの治療方法であって、（ａ）請求項８６〜９６のいずれか１項に記載の方法に従って作製される改変Ｔ細胞と、（ｂ）薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項９９】
治療を必要とする対象におけるがんの治療方法であって、（ａ）請求項８８〜９６のいずれか１項に記載の方法に従って作製される改変Ｔ細胞と、（ｂ）薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１００】
前記改変Ｔ細胞が同種異系Ｔ細胞である、請求項９７〜９９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
有効量の未改変の対照Ｔ細胞を投与した対象と比較して、前記対象において放出されるサイトカインが少ない、請求項９７〜１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
請求項１〜６６のいずれか１項に記載の組換え核酸または請求項６７〜７１のいずれか１項に記載のベクターを含む有効量の改変Ｔ細胞を投与した対象と比較して、前記対象において放出されるサイトカインが少ない、請求項９７〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記方法が、前記医薬組成物の有効性を増加させる薬剤と組み合わせて前記医薬組成物を投与することを含む、請求項９７〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記方法が、前記医薬組成物に付随する１つ以上の副作用を改善する薬剤と組み合わせて前記医薬組成物を投与することを含む、請求項９７〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記がんが固形癌、リンパ腫、または白血病である、請求項９７〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記がんが、腎細胞癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、及び胃癌からなる群から選択される、請求項９７〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
医薬品としてまたは医薬品の調製に使用するための、請求項１〜６６のいずれか１項に記載の組換え核酸、請求項６７〜７１のいずれか１項に記載のベクター、請求項７２〜８４のいずれか１項に記載の改変Ｔ細胞、または請求項８５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年３月９日出願の米国仮出願第６２／６４１，１５９号の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
血液悪性腫瘍または末期固形腫瘍を有する患者のほとんどは、標準治療では治癒不可能である。加えて、従来の治療法の選択肢は、多くの場合、重篤な副作用がある。がん細胞を拒絶するために患者の免疫系を誘導する数多くの試み、すなわちがん免疫療法と総称される方法が実施されてきた。しかしながら、いくつかの障害が、臨床効果の達成をかなり困難なものにしている。いわゆる腫瘍抗原が何百と特定されているが、これらは多くの場合、自己由来であるため、健康な組織に対してがん免疫療法を向ける可能性があるか、または免疫原性に乏しい。さらに、がん細胞は複数のメカニズムを用いて、がん細胞自体を不可視にするか、またはがん免疫療法による免疫攻撃の開始及び伝播に対抗する。
【０００３】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改変自己Ｔ細胞療法は、遺伝子操作したＴ細胞をがん細胞の適切な細胞表面分子へ誘導する方法を利用しているが、この療法を用いた最近の開発は、免疫系の作用を利用したＢ細胞悪性腫瘍治療において有望な結果を示している（例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ３：３８８−３９８（２０１３）を参照）。ＣＤ１９特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＴＬ０１９と称する）での臨床結果は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）ならびに小児急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）に罹患した患者において完全寛解を示した（例えば、Ｋａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ３：９５ｒａ７３（２０１１）、Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＥＪＭ  ３６５：７２５−７３３（２０１１）、Ｇｒｕｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＥＪＭ  ３６８：１５０９−１５１８（２０１３）を参照）。これに代わる手法は、自己Ｔ細胞を遺伝子操作するために、腫瘍関連ペプチド抗原に合わせて選択されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖及びベータ鎖を使用することである。これらのＴＣＲ鎖は完全なＴＣＲ複合体を形成し、第２の定められた特異性のためにＴＣＲをＴ細胞に提供する。ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＴＣＲアルファ鎖及びベータ鎖を発現する改変自己Ｔ細胞によって滑膜癌の患者で有望な結果が得られた。
【０００４】
改変Ｔ細胞による患者の治療を奏功させるには、ＣＡＲまたは第２のＴＣＲを発現する遺伝子改変Ｔ細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏでそれぞれの標的細胞を認識して破壊する能力以外に、強力な活性化、増殖、経時的な持続性が可能であること、及び再発性疾患の場合には「メモリー」応答を可能にすることが当該Ｔ細胞に必要とされる。ＣＡＲ  Ｔ細胞の高度かつ操作可能な臨床有効性は、現在のところ、ＣＤ  １９陽性Ｂ細胞悪性腫瘍と、ＨＬＡ−Ａ２表現型の、ＮＹ−ＥＳＯ−１−ペプチドを発現する滑膜肉腫患者に限定されている。
【発明の概要】
【０００５】
種々のヒト悪性腫瘍に対して幅広く作用させるため、遺伝子操作Ｔ細胞の改善が必要とされていることは明らかである。
【０００６】
本明細書では、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＴＣＲアルファ鎖、及びＴＣＲベータ鎖を含むＴＣＲサブユニットと細胞表面抗原に特異的な結合ドメインとの融合タンパク質を含み、既存の手法の限界を克服する可能性を有する改変Ｔ細胞について記載する。加えて、この改変Ｔ細胞は、内因性ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲアルファ、ベータ、またはその両方）を機能的に破壊させることができる。この改変Ｔ細胞は、ＣＡＲよりも効率的に標的細胞を殺傷する能力を有し得るが、ＣＡＲと同等またはそれよりも低レベルの炎症性サイトカインを放出し得る。そのようなサイトカインのレベル上昇は養子ＣＡＲ−Ｔ療法の用量制限毒性を伴っているので、この改変Ｔ細胞及びその使用方法は、ＣＡＲと比較した場合の当該細胞の優位性を表し得る。
【０００７】
本明細書では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）及びＴＣＲ定常ドメインを含む改変Ｔ細胞、改変Ｔ細胞の作製方法、及び疾患の治療のためのその使用方法を提供する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、（ａ）（ｉ）（１）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、（２）膜貫通ドメイン、及び（３）ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＴＣＲガンマ、ＴＣＲデルタ、ＴＣＲアルファ、またはＴＣＲベータの細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含むＴＣＲサブユニットと、（ｉｉ）抗原結合ドメインを含むヒト抗体またはヒト化抗体とを含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする配列と；（ｂ）ＴＣＲ定常ドメインをコードする配列とを含み、ＴＣＲ定常ドメインは、ＴＣＲアルファ定常ドメイン、ＴＣＲベータ定常ドメイン、ＴＣＲアルファ定常ドメインとＴＣＲベータ定常ドメイン、ＴＣＲガンマ定常ドメイン、ＴＣＲデルタ定常ドメイン、またはＴＣＲガンマ定常ドメインとＴＣＲデルタ定常ドメインであり；ＴＣＲサブユニット及び抗体は機能的に連結されており、かつＴ細胞で発現するとＴＦＰがＴＣＲ複合体に機能的に組み込まれる、組換え核酸である。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、（ａ）（ｉ）（１）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、（２）膜貫通ドメイン、及び（３）ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＴＣＲアルファ、またはＴＣＲベータの細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含むＴＣＲサブユニットと、（ｉｉ）抗体またはその断片に結合できる結合リガンドまたはその断片とを含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする配列と；（ｂ）ＴＣＲ定常ドメインをコードする配列とを含み、ＴＣＲ定常ドメインは、ＴＣＲアルファ定常ドメイン、ＴＣＲベータ定常ドメイン、またはＴＣＲアルファ定常ドメインとＴＣＲベータ定常ドメインであり；ＴＣＲサブユニット及び結合リガンドまたはその断片は機能的に連結されており、かつ内因性ＴＣＲの機能的破壊を含むＴ細胞で発現するとＴＦＰがＴＣＲ複合体に機能的に組み込まれる、組換え核酸である。場合によっては、結合リガンドは、抗体のＦｃドメインに結合できる。場合によっては、結合リガンドは、ＩｇＧ１抗体と選択的に結合できる。場合によっては、結合リガンドは、ＩｇＧ１抗体と特異的に結合できる。場合によっては、抗体またはその断片は細胞表面抗原に結合する。場合によっては、抗体またはその断片は腫瘍細胞の表面にある細胞表面抗原に結合する。場合によっては、結合リガンドは、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、または十量体を含む。場合によっては、結合リガンドは抗体またはその断片を含まない。場合によっては、結合リガンドはＣＤ１６ポリペプチドまたはその断片を含む。場合によっては、結合リガンドはＣＤ１６結合ポリペプチドを含む。場合によっては、結合リガンドはヒトのものであるか、またはヒト化されている。場合によっては、組換え核酸は、結合リガンドが結合できる抗体またはその断片をコードする核酸配列をさらに含む。場合によっては、抗体またはその断片は細胞から分泌可能である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、（ａ）（ｉ）（１）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、（２）膜貫通ドメイン、及び（３）ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＴＣＲアルファ、またはＴＣＲベータの細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含むＴＣＲサブユニットと、（ｉｉ）細胞の表面に発現する受容体またはポリペプチドに結合するリガンドまたはその断片を含む抗原ドメインとを含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする配列と；（ｂ）ＴＣＲ定常ドメインをコードする配列とを含み、ＴＣＲ定常ドメインは、ＴＣＲアルファ定常ドメイン、ＴＣＲベータ定常ドメイン、またはＴＣＲアルファ定常ドメインとＴＣＲベータ定常ドメインであり；ＴＣＲサブユニット及び抗原ドメインは機能的に連結されており、かつ内因性ＴＣＲの機能的破壊を含むＴ細胞で発現するとＴＦＰがＴＣＲ複合体に機能的に組み込まれる、組換え核酸である。場合によっては、抗原ドメインはリガンドを含む。場合によっては、リガンドは細胞の受容体に結合する。場合によっては、リガンドは、細胞の表面に発現するポリペプチドに結合する。場合によっては、細胞の表面に発現する受容体またはポリペプチドは、ストレス応答受容体またはポリペプチドを含む。場合によっては、細胞の表面に発現する受容体またはポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ関連糖タンパク質である。場合によっては、ＭＨＣクラスＩ関連糖タンパク質は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。場合によっては、抗原ドメインは、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、または十量体を含む。場合によっては、抗原ドメインは、リガンドまたはその断片の単量体または二量体を含む。場合によっては、リガンドまたはその断片は、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、または十量体を含む。場合によっては、リガンドまたはその断片は単量体または二量体である。場合によっては、抗原ドメインは抗体またはその断片を含まない。場合によっては、抗原ドメインは可変領域を含まない。場合によっては、抗原ドメインはＣＤＲを含まない。場合によっては、リガンドまたはその断片は、ナチュラルキラーグループ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンドまたはその断片である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、上記に開示される組換え核酸に関して、ＴＣＲ定常ドメインはＴ細胞で発現すると機能的ＴＣＲ複合体に組み込まれる。場合によっては、ＴＣＲ定常ドメインは、Ｔ細胞で発現するとＴＦＰを組み込む機能的ＴＣＲ複合体と同じ機能的ＴＣＲ複合体に組み込まれる。場合によっては、ＴＦＰをコードする配列とＴＣＲ定常ドメインをコードする配列とは、同じ核酸分子内に含まれている。場合によっては、ＴＦＰをコードする配列とＴＣＲ定常ドメインをコードする配列とは、異なる核酸分子内に含まれている。場合によっては、ＴＣＲサブユニットと、抗体ドメイン、抗原ドメイン、または結合リガンドもしくはそれらの断片とは、リンカー配列によって機能的に連結されている。場合によっては、リンカー配列は（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む。場合によっては、膜貫通ドメインは、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＴＣＲアルファ、またはＴＣＲベータからのＴＣＲ膜貫通ドメインである。場合によっては、細胞内ドメインは、ＣＤ３イプシロンのみ、ＣＤ３ガンマのみ、ＣＤ３デルタのみ、ＴＣＲアルファのみ、またはＴＣＲベータのみに由来する。場合によっては、ＴＣＲサブユニットは、（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＴＣＲ細胞内ドメインを含み、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）のうち少なくとも２つは同じＴＣＲサブユニット由来である。場合によっては、ＴＣＲ細胞外ドメインは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、それらの機能的断片、及び少なくとも１つだが２０以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択される、タンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む。場合によっては、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、それらの機能的断片、及び少なくとも１つだが２０以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択される、タンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。場合によっては、ＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメインから選択されるタンパク質の刺激ドメイン、またはそれらに対して少なくとも１つの修飾を有するアミノ酸配列を含むＴＣＲ細胞内ドメインを含む。場合によっては、ＴＣＲサブユニットは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメイン及び／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインから選択されるタンパク質の刺激ドメイン、またはそれらに対して少なくとも１つの修飾を有するアミノ酸配列を含む細胞内ドメインを含む。場合によっては、組換え核酸は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。場合によっては、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ならびに少なくとも１つだが２０以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択される、タンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。場合によっては、ＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＴＣＲゼータ鎖、Ｆｃイプシロン受容体１鎖、Ｆｃイプシロン受容体２鎖、Ｆｃガンマ受容体１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ２鎖、Ｆｃガンマ受容体３ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体３ｂ鎖、Ｆｃベータ受容体１鎖、ＴＹＲＯＢＰ（ＤＡＰ１２）、ＣＤ５、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８９、ＣＤ２７８、ＣＤ６６ｄ、それらの機能的断片、及び少なくとも１つだが２０以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択される、タンパク質の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）またはその一部を含む、ＴＣＲサブユニットのＩＴＡＭを含む。場合によっては、ＩＴＡＭは、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはＣＤ３イプシロンのＩＴＡＭを置換する。場合によっては、ＩＴＡＭは、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択され、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択される別のＩＴＡＭを置換する。場合によっては、ＴＦＰ、ＴＣＲアルファ定常ドメイン、ＴＣＲベータ定常ドメイン、及びそれらの任意の組み合わせは、内因性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することが可能である。場合によっては、（ａ）ＴＣＲ定常ドメインがＴＣＲアルファ定常ドメインであり、ＴＣＲベータ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはそれらの組み合わせの内因性サブユニットを含むＴＣＲ複合体にＴＦＰが機能的に統合されるか；（ｂ）ＴＣＲ定常ドメインがＴＣＲベータ定常ドメインであり、ＴＣＲアルファ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはそれらの組み合わせの内因性サブユニットを含むＴＣＲ複合体にＴＦＰが機能的に統合されるか；あるいは（ｃ）ＴＣＲ定常ドメインがＴＣＲアルファ定常ドメインおよびＴＣＲベータ定常ドメインであり、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはそれらの組み合わせの内因性サブユニットを含むＴＣＲ複合体にＴＦＰが機能的に統合される。場合によっては、それに対して少なくとも１つだが２０以下の修飾は、細胞シグナル伝達を媒介するアミノ酸の修飾、またはＴＦＰへのリガンド結合に応答してリン酸化されるアミノ酸の修飾を含む。場合によっては、ヒト抗体またはヒト化抗体は抗体断片である。場合によっては、抗体断片は、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体ドメイン、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインである。場合によっては、抗原結合ドメインを含むヒト抗体またはヒト化抗体は、抗ＣＤ１９結合ドメイン、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合ドメイン、抗メソテリン（ＭＳＬＮ）結合ドメイン、抗ＩＬ１３Ｒα２結合ドメイン、抗ＭＵＣ１６結合ドメイン、抗ＣＤ２２結合ドメイン、抗ＰＤ−１結合ドメイン、抗ＢＡＦＦまたはＢＡＦＦ受容体結合ドメイン、及び抗ＲＯＲ−１結合ドメインからなる群から選択される。場合によっては、核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選択される。場合によっては、核酸はｍＲＮＡである。場合によっては、組換え核酸は核酸類似体を含み、この核酸類似体は組換え核酸のコード配列にはない。場合によっては、核酸類似体は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホン酸ヌクレオチド、チオールホスホン酸ヌクレオチド、及び２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホロアミダイトからなる群から選択される。場合によっては、組換え核酸はリーダー配列をさらに含む。場合によっては、組換え核酸はプロモーター配列をさらに含む。場合によっては、組換え核酸はポリ（Ａ）尾部をコードする配列をさらに含む。場合によっては、組換え核酸は３’ＵＴＲ配列をさらに含む。場合によっては、核酸は、単離された核酸または天然に存在しない核酸である。場合によっては、核酸はｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写した核酸である。場合によっては、組換え核酸は、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインをコードする配列をさらに含む。場合によっては、組換え核酸は、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインをコードする配列をさらに含む。場合によっては、組換え核酸は、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインをコードする配列及びＴＣＲベータ膜貫通ドメインをコードする配列をさらに含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される組換え核酸を含むベクターである。場合によっては、ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。場合によっては、ベクターはＡＡＶ６ベクターである。場合によっては、ベクターはプロモーターをさらに含む。場合によっては、ベクターはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写したベクターである。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、上記に開示される組換え核酸または上記に開示されるベクターを含む改変Ｔ細胞であり、当該改変Ｔ細胞は内因性ＴＣＲの機能的破壊を含む。いくつかの実施形態において、本明細書にさらに開示されるのは、上記に開示される核酸のＴＦＰをコードする配列、またはＴＦＰをコードする上記に開示される核酸の配列によってコードされるＴＦＰを含む改変Ｔ細胞であり、当該改変Ｔ細胞は内因性ＴＣＲの機能的破壊を含む。また本明細書では、上記に開示されるＴＦＰをコードする配列、またはＴＦＰをコードする上記に開示される核酸の配列によってコードされるＴＦＰを含む改変同種Ｔ細胞も開示される。場合によっては、Ｔ細胞はＴＣＲ定常ドメインをコードする異種配列をさらに含み、当該ＴＣＲ定常ドメインは、ＴＣＲアルファ定常ドメイン、ＴＣＲベータ定常ドメイン、またはＴＣＲアルファ定常ドメインとＴＣＲベータ定常ドメインである。場合によっては、機能的に破壊される内因性ＴＣＲは、内因性ＴＣＲアルファ鎖、内因性ＴＣＲベータ鎖、または内因性ＴＣＲアルファ鎖と内因性ＴＣＲベータ鎖である。場合によっては、機能的に破壊された内因性ＴＣＲは、未改変の対照Ｔ細胞のものと比較して、ＭＨＣペプチド複合体への結合が減少する。場合によっては、機能的破壊は、内因性ＴＣＲをコードする遺伝子の破壊である。場合によっては、内因性ＴＣＲをコードする遺伝子の破壊とは、内因性ＴＣＲをコードする遺伝子の配列のＴ細胞のゲノムからの除去である。場合によっては、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。場合によっては、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリー幹Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、二重陰性Ｔ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、Ｔｈ０細胞、Ｔｃ０細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｃ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｃ２細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、造血幹細胞、または多能性幹細胞である。場合によっては、Ｔ細胞はＣＤ８＋  Ｔ細胞またはＣＤ４＋  Ｔ細胞である。場合によっては、Ｔ細胞は同種Ｔ細胞である。場合によっては、改変Ｔ細胞は、細胞内シグナル伝達ドメインからの陽性シグナルを含む第２のポリペプチドと会合した、抑制分子の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸をさらに含む。場合によっては、抑制分子は、ＰＤ１の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドとを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、（ａ）本開示の改変Ｔ細胞；及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、本開示の改変Ｔ細胞を作製する方法であり、この方法は、（ａ）ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、またはＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖をコードする内因性ＴＣＲ遺伝子を破壊し、それにより内因性ＴＣＲ遺伝子の機能的破壊を含んだＴ細胞を作製することと；（ｂ）内因性ＴＣＲ遺伝子の機能的破壊を含んだＴ細胞に、本明細書に開示される組換え核酸またはベクターを形質導入することとを含む。場合によっては、破壊は、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、またはＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖をコードする内因性遺伝子を標的とするヌクレアーゼタンパク質、またはヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸配列をＴ細胞に形質導入することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書にさらに開示されるのは、本開示の改変Ｔ細胞を作製する方法であり、この方法は、内因性ＴＣＲ遺伝子の機能的破壊を含んだＴ細胞に、本明細書に開示される組換え核酸またはベクターを形質導入することを含む。場合によっては、内因性ＴＣＲ遺伝子の機能的破壊を含んだＴ細胞は、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、またはＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖をコードする内因性ＴＣＲ遺伝子の機能的破壊を含んだＴ細胞である。場合によっては、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。場合によっては、内因性ＴＣＲ遺伝子の機能的破壊を含んだＴ細胞は、未改変の対照Ｔ細胞のものと比較して、ＭＨＣ−ペプチド複合体への結合が減少する。場合によっては、ヌクレアーゼはメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、またはｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼである。場合によっては、組換え核酸またはベクターに含まれる配列は、切断部位で内因性ＴＣＲサブユニット遺伝子に挿入され、この内因性ＴＣＲサブユニット遺伝子への配列の挿入により内因性ＴＣＲサブユニットが機能的に破壊される。場合によっては、ヌクレアーゼはメガヌクレアーゼである。場合によっては、メガヌクレアーゼは、第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットは認識配列の第１の認識半部位に結合し、第２のサブユニットは認識配列の第２の認識半部位に結合する。場合によっては、メガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、このリンカーは第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、治療を必要とする対象におけるがんの治療方法であり、この方法は、本明細書に開示される、治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのはまた、治療を必要とする対象におけるがんの治療方法であり、この方法は、（ａ）本明細書に開示される方法に従って作製される改変Ｔ細胞、及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。場合によっては、改変Ｔ細胞は同種異系Ｔ細胞である。場合によっては、有効量の未改変の対照Ｔ細胞を投与した対象と比較して、対象において放出されるサイトカインが少ない。場合によっては、本明細書に開示される組換え核酸または本明細書に開示されるベクターを含む有効量の改変Ｔ細胞を投与した対象と比較して、対象において放出されるサイトカインが少ない。場合によっては、この方法は、医薬組成物の有効性を増加させる薬剤と組み合わせて医薬組成物を投与することを含む。場合によっては、この方法は、医薬組成物に付随する１つ以上の副作用を改善する薬剤と組み合わせて医薬組成物を投与することを含む。場合によっては、がんは固形癌、リンパ腫、または白血病である。場合によっては、がんは、腎細胞癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、及び胃癌からなる群から選択される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、医薬品としてまたは医薬品の調製に使用するための、本明細書に開示される組換え核酸、ベクター、改変Ｔ細胞、または医薬組成物である。
【００１８】
参照による組み込み
本明細書で言及される刊行物、特許、及び特許出願はすべて、個別の刊行物、特許、または特許出願がそれぞれ具体的かつ個別に参照により本明細書に組み込まれた場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＴＲＢＣ１とＴＲＢＣ２との間の配列アラインメントである。選択したｃｒＲＮＡを、ＴＲＢＣ１配列上方の矢印で表す。
【図２】Ａ〜Ｂは、ＴＲＡ編集細胞（Ａ）及びＴＲＢ編集細胞（Ｂ）におけるＣＤ３（ＳＫ７）対ＴＣＲαβ（ＩＰ２６）の表面発現を示す例示的なグラフを図示したものである。ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子のいずれかで野生型Ｊｕｒｋａｔ細胞を編集し、ＴＲＡまたはＴＲＢの表面発現を妨げた。ＣＤ３及びＴＣＲαβに対して陰性の細胞を、磁気細胞分離法を使用して精製した。ＣＤ３及びＴＣＲαβが陰性−陰性の細胞集団を視覚化するゲートがプロットに描かれ、各四分区間にある細胞の比率が４隅に示されている。
【図３】Ａ〜Ｅは、精製前後の野生型細胞対編集（ＴＲＡ／Ｂ破壊）細胞におけるＣＤ３対ＴＣＲαβの表面発現を示すグラフの例を図示したものである。ＴＲＡＣ（ＢまたはＤ）またはＴＲＢＣ（ＣまたはＥ）遺伝子のいずれかで野生型ドナー１Ｔ細胞（Ａ）を編集し、ＴＲＡまたはＴＲＢの表面発現を妨げた。Ｂ及びＣは、編集直後のＣＤ３対ＴＣＲαβ表面マーカーの状態を示し、それに対してＤ及びＥは、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）を使用した陰性選択後のこれらの表面マーカーの状態を示す。ＣＤ３及びＴＣＲαβが陰性−陰性の細胞集団を視覚化するゲートがプロットに描かれ、各四分区間にある細胞の比率が４隅に示されている。
【図４】増殖率を観察することによりＴＣＲ陰性Ｔ細胞の同種性を測定するグラフの例を図示する。ＴＣＲ陰性Ｔ細胞は、細胞分裂により濃度が半分になるＣＳＦＥ色素で恒久的に標識した。Ｘ軸方向の濃灰色のピークは、陰性対照である非標識細胞のＣＳＦＥシグナルを示す。灰色線は、何も刺激していない２４時間後の細胞でのＣＳＦＥ量を示し、黒線は５日間の共培養後（刺激あり）のＣＳＦＥ量を示す。Ｙ軸は細胞の比率（％）を示す。ＴＲＡ陰性Ｔ細胞を上部４つのプロットに示し、対するＴＲＢ陰性Ｔ細胞を下部４つのプロットに示す。同種反応は、ＴＲＡ  ＫＯドナー２  Ｔ細胞が異なるハプロタイプのドナー（ドナー１）からのＰＢＭＣと混合されたことを示し、自己反応は、同じドナーのＴ細胞とＰＢＭＣが共培養されたことを示す。ＴＣＲに依存しない刺激に対する陽性対照は、ＰＭＡ及びイオノマイシンのパネルに示した。
【図５】同種異系ＴＦＰ  Ｔ細胞を産生するための戦略例を図示する。以下の番号は、図５の各図に付された番号に対応している。（１）は、抗原提示細胞及び抗原上のＭＨＣＩと相互作用するＴ細胞の内因性ＴＣＲαβを示す。（２）は、ＴＲＡ−／−またはＴＲＢ−／−細胞における、ＴＲＢＣと、ＴＦＰ結合因子に融合したＴＲＡＣとの共発現を示す。（３）は、ＴＲＡ−／−またはＴＲＢ−／−細胞における、マウスＴＲＢＣと、ＴＦＰ結合因子に融合したマウスＴＲＡＣとの共発現を示す。（４）は、ＴＲＡ−／−またはＴＲＢ−／−細胞における、マウス化ＴＲＢＣと、ＴＦＰ結合因子に融合したマウス化ＴＲＡＣとの共発現を示す。（５）は、ＴＲＡ−／−細胞において、ＴＣＲβに対する強い親和性をもつ増強されたＴＲＡＣタンパク質が保持するＴＦＰ結合因子を示す。（６）は、ＴＲＡＣとＴＲＢＣとの間の相互作用を増強するために、ＩｇＧ定常ドメインを各ＴＣＲ定常ドメインのＣ末端に融合する戦略を示す。ＴＲＡ−／−またはＴＲＢ−／−細胞において、ＴＦＰ結合因子はＩｇＧ定常ドメインのＣ末端に融合される。（７）は、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣのＮ末端部分を、それぞれＴＣＲγ及びＴＣＲδのそれらのホモログ部分で置換する戦略を示す。ＴＲＡ−／−またはＴＲＢ−／−細胞において、ＴＦＰ結合因子はＴＲＡＣ及び／またはＴＲＢＣが保持する。
【図６】同種異系ＴＦＰ  Ｔ細胞の産生を可能にするＴ２Ａ自己切断型配列のノックイン戦略を示す例示的な模式図を図示する。
【図７】実施例６に記載されるようなＬｕｃ−Ｃｙｔｏアッセイによって決定される、ＴＣＲαβ及びＣＤ３ε（ヒト）またはマウスＴＣＲβの表面発現を示す例示的なグラフを図示する。
【図８】３対１、１対１、または１対３比で腫瘍標的細胞（上部パネルにＮａｌｍ  ６細胞、下部パネルにＫ５６２細胞）と培養したＴエフェクター細胞のＬｕｃ−Ｃｙｔｏ分析を示す例示的なグラフを図示する。標的（ＣＤ１９陽性）細胞を左側のパネルに示す。ｘ軸は腫瘍細胞溶解の比率（％）を表す。
【図９】Ａ〜Ｃは、野生型細胞（Ａ）、形質導入を伴わないＴＲＢ  ＫＯ細胞（Ｂ）、ＴＣＲβ全長（ＦＬ）ＴＦＰの形質導入を伴うＴＲＢ  ＫＯ細胞（Ｃ）におけるＣＤ３対ＴＣＲαβの表面発現を示す例示的なグラフを図示したものである。ＣＤ３及びＴＣＲαβが陰性−陰性の細胞集団を視覚化するゲートがプロットに描かれ、各四分区間にある細胞の比率（％）が４隅に示されている。
【図１０】Ａ〜Ｂは、ヒトＴＲＢＣ遺伝子（Ａ）及びマウスＴＲＡＣ−Ｔ２Ａ−ＴＲＢＣ遺伝子（Ｂ）を形質導入したＴＲＢノックアウト細胞におけるＣＤ３対ＴＣＲαβの表面発現を示す例示的なグラフを図示したものである。ＣＤ３及びＴＣＲαβが陰性−陰性の細胞集団を視覚化するゲートがプロットに描かれ、各四分区間にある細胞の比率（％）が４隅に示されている。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、（ａ）（ｉ）（１）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、（２）膜貫通ドメイン、及び（３）ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＴＣＲガンマ、またはＴＣＲデルタの細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含むＴＣＲサブユニットと、（ｉｉ）抗原結合ドメインを含むヒト抗体またはヒト化抗体とを含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする配列と、（ｂ）ＴＣＲ定常ドメインをコードする配列とを含み、ＴＣＲ定常ドメインは、ＴＣＲアルファ定常ドメイン、ＴＣＲベータ定常ドメイン、またはＴＣＲアルファ定常ドメインとＴＣＲベータ定常ドメインであり、ＴＣＲサブユニット及び抗体は機能的に連結されており、かつＴ細胞で発現するとＴＦＰがＴＣＲ複合体に機能的に組み込まれる、組換え核酸である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、（ａ）（ｉ）（１）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、（２）膜貫通ドメイン、及び（３）ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＴＣＲアルファ、またはＴＣＲベータの細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含むＴＣＲサブユニットと、（ｉｉ）抗体またはその断片に結合できる結合リガンドまたはその断片とを含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする配列と、（ｂ）ＴＣＲ定常ドメインをコードする配列とを含み、ＴＣＲ定常ドメインは、ＴＣＲアルファ定常ドメイン、ＴＣＲベータ定常ドメイン、またはＴＣＲアルファ定常ドメインとＴＣＲベータ定常ドメインであり、ＴＣＲサブユニット及び結合リガンドまたはその断片が機能的に連結されており、かつＴ細胞で発現するとＴＦＰがＴＣＲ複合体に機能的に組み込まれる、組換え核酸である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、（ａ）（ｉ）（１）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、（２）膜貫通ドメイン、及び（３）ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＴＣＲアルファ、またはＴＣＲベータの細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含むＴＣＲサブユニットと、（ｉｉ）細胞の表面に発現する受容体またはポリペプチドに結合するリガンドまたはその断片を含む抗原ドメインとを含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする配列と、（ｂ）ＴＣＲ定常ドメインをコードする配列とを含み、ＴＣＲ定常ドメインは、ＴＣＲアルファ定常ドメイン、ＴＣＲベータ定常ドメイン、またはＴＣＲアルファ定常ドメインとＴＣＲベータ定常ドメインであり、ＴＣＲサブユニット及び抗原ドメインは機能的に連結されており、かつＴ細胞で発現するとＴＦＰがＴＣＲ複合体に機能的に組み込まれる、組換え核酸である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される組換え核酸を含むベクターである。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される組換え核酸または本明細書に開示されるベクターを含む改変Ｔ細胞であり、当該改変Ｔ細胞は内因性ＴＣＲの機能的破壊を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される核酸のＴＦＰをコードする配列、または本明細書に開示される核酸の配列によってコードされるＴＦＰを含む改変Ｔ細胞であり、当該改変Ｔ細胞は内因性ＴＣＲの機能的破壊を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示されるＴＦＰをコードする配列、または本明細書に開示される核酸の配列によってコードされるＴＦＰを含む改変同種Ｔ細胞である。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、（ａ）本開示の改変Ｔ細胞、及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、本開示の改変Ｔ細胞を作製する方法であり、この方法は、（ａ）ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、またはＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖をコードする内因性ＴＣＲ遺伝子を破壊し、それにより内因性ＴＣＲ遺伝子の機能的破壊を含んだＴ細胞を作製することと、（ｂ）内因性ＴＣＲ遺伝子の機能的破壊を含んだＴ細胞に、本開示の組換え核酸または本明細書に開示されるベクターを形質導入することを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、本開示の改変Ｔ細胞を作製する方法であり、この方法は、内因性ＴＣＲ遺伝子の機能的破壊を含んだＴ細胞に、本明細書に開示される組換え核酸または本明細書に開示されるベクターを形質導入することを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、治療を必要とする対象におけるがんの治療方法であり、この方法は、本明細書に開示される、治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、治療を必要とする対象におけるがんの治療方法であり、この方法は、（ａ）本明細書に開示される方法に従って作製される改変Ｔ細胞、及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００３２】
特定用語
特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に共通して理解されているものと同じ意味を有する。
【００３３】
「ａ」及び「ａｎ」は、その冠詞の文法上の目的語の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例として、「要素」は１つの要素または複数の要素を意味する。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「約」は、状況、及び当業者に既知であるかまたは知り得ることに応じて、１パーセント未満、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、または３０パーセント超の増減を意味することができる。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「対象」（単数または複数）または「個体」は、哺乳動物、例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば家畜、農業用動物または野生動物、ならびに鳥類及び水生動物などを含み得るが、これらに限定されない。「患者」は、疾患、障害、または病態に罹患しているか、その発症リスクがある対象、あるいは別様に本明細書で提供する組成物及び方法を必要とする対象である。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「治療すること」または「治療」とは、疾患または病態の治療または改善に関する何らかの奏功の兆候を指す。治療することは、例えば、疾患または病態の１つ以上の症状の重症度を低下、遅延、または軽減することを含む場合もあれば、あるいは疾患、不全、障害、または有害な病態などの症状が患者に現れる頻度を低減することを含む場合もある。本明細書で使用される場合、「治療または予防する」は、疾患または病態のある程度の治療または改善をもたらす方法を指すものとして本明細書で使用される場合もあり、病態の完全な予防を含むがそれに限定されない、その目的に対する範囲の結果を企図している。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「予防する」とは、患者における疾患または病態、例えば腫瘍形成の予防を指す。例えば、腫瘍またはその他の形態のがんの発症リスクがある個体が本開示の方法で治療され、それ以降、腫瘍またはその他の形態のがんを発症しない場合、その個体において当該疾患は少なくともある期間にわたって予防されている。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、組成物を投与する個体に対して有益な効果を与えるか、別様に有害な有益でない事象を低減するのに十分な組成物またはその活性成分の量である。本明細書で「治療有効用量」とは、１つ以上の所望のまたは望ましい（例えば有益な）効果を生み出すために投与される用量のことを意味し、そのような投与は所与の期間にわたり１回以上行われる。正確な用量は治療の目的に依存し、当業者は公知の技術を使用して確認することができる（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１−３，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）、及びＰｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）を参照）。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質」または「ＴＦＰ」は、ＴＣＲを含む様々なポリペプチド由来の組換えポリペプチドを含み、当該ＴＣＲは概して、ｉ）標的細胞の表面抗原に結合すること、及びｉｉ）通常はＴ細胞内またはその表面に共存する場合、インタクトなＴＣＲ複合体の他のポリペプチド成分と相互作用することができる。
【００４０】
「刺激」という用語は、刺激ドメインまたは刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）が、その同種リガンドと結合し、それによりシグナル伝達事象を媒介することで誘導される一次応答を指し、このシグナル伝達事象として、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達などがあるが、これらに限定されない。刺激は、ある特定の分子の発現の変化、及び／または細胞骨格構造の再構成などを媒介することができる。
【００４１】
「刺激分子」または「刺激ドメイン」という用語は、Ｔ細胞のシグナル伝達経路の少なくともいくつかの側面に対して、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激的に調節する一次細胞質シグナル伝達配列（複数可）を提供する、Ｔ細胞によって発現される分子またはその一部を指す。一態様では、一次シグナルは、例えばペプチドが負荷されたＭＨＣ分子とＴＣＲ／ＣＤ３複合体との結合によって開始され、増殖、活性化、分化などを含むがこれらに限定されないＴ細胞応答の媒介をもたらす。刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン」とも称する）は、免疫受容体チロシン活性化モチーフ、すなわち「ＩＴＡＭ」として知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明で特に有用な、ＩＴＡＭを含んだ一次細胞質シグナル伝達配列の例としては、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」とも称する）、及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
「抗原提示細胞」すなわち「ＡＰＣ」という用語は、その表面で主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と複合化された外来抗原を提示する補助細胞（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など）のような免疫系細胞を指す。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用してこれらの複合体を認識し得る。ＡＰＣは抗原を処理し、それをＴ細胞に提示する。
【００４３】
「主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子は典型的には、ペプチド：ＭＨＣ複合体の一部としてＴＣＲによって結合される。ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子であり得る。複合体は、樹状細胞もしくはＢ細胞などの抗原提示細胞、またはがん細胞を含む任意の他の細胞の表面に存在する場合もあれば、例えばビーズまたはプレート上に被覆することによって固定化されている場合もある。
【００４４】
ヒト白血球抗原系（ＨＬＡ）は、ヒトの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）をコードし、ＨＬＡクラスＩ抗原（Ａ、Ｂ、及びＣ）及びＨＬＡクラスＩＩ抗原（ＤＰ、ＤＱ、及びＤＲ）を含む遺伝子複合体の名称である。ＨＬＡ対立遺伝子Ａ、Ｂ、及びＣは、主に細胞内タンパク質、例えば細胞内に発現するタンパク質に由来するペプチドを提示する。
【００４５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞発現時に、Ｔ細胞は、自己ＭＨＣを確実に認識する正の選択ステップを受け、続いて自己抗原を提示するＭＨＣとの結合が強すぎるＴ細胞を除去する負のステップを受ける。結果として、ある特定のＴ細胞とそれが発現するＴＣＲは、ある特定の種類のＭＨＣ分子、すなわち特定のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるものによって提示されるペプチドのみを認識する。これはＨＬＡ制約として知られている。
【００４６】
対象となる１つのＨＬＡ対立遺伝子は、白人集団の大多数（５０％超）において発現するＨＬＡ−Ａ＊０２０１である。したがって、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１によってコードされる（すなわち、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に制約される）ＭＨＣによって提示されるＷＴ１ペプチドに結合するＴＣＲは、そのようなＴＣＲを利用する免疫療法が白人集団の大部分の治療に適しているため有利である。
【００４７】
対象となる他のＨＬＡ−Ａ対立遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ＊０１０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、及びＨＬＡ−Ａ＊０３０１である。
【００４８】
対象となる広範囲に発現するＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子は、ＨＬＡ−Ｂ＊３５０１、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２、及びＨＬＡ−Ｂ＊３５０２である。
【００４９】
本明細書で使用される「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＦＰ含有細胞、例えば改変Ｔ−Ｔ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えば改変Ｔ−Ｔ細胞における免疫エフェクター機能の例として、細胞溶解活性、及びサイトカインの分泌を含めたＴヘルパー細胞活性が挙げられる。ある実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインとして、一次刺激または抗原依存性刺激に関与する分子に由来するものが挙げられる。ある実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激細胞内ドメインを含み得る。例示的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインとして、共刺激シグナルまたは抗原非依存性刺激に関与する分子に由来するものが挙げられる。
【００５０】
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭ（「免疫受容体チロシン活性化モチーフ」）を含み得る。ＩＴＡＭを含んだ一次細胞質シグナル伝達配列の例として、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ならびにＣＤ６６ｄ  ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、例えばＴ細胞による増殖などであるがこれに限定されない共刺激反応を媒介する、Ｔ細胞での同種結合パートナーを指す。共刺激分子とは、効率的な免疫応答に必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子として、ＭＨＣクラス１分子、ＢＴＬＡ、及びＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）が挙げられるが、これらに限定されない。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、以下のタンパク質ファミリー、すなわちＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、及び活性化ＮＫ細胞受容体に現れる可能性がある。そのような分子の例として、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３などと特異的に結合するリガンドが挙げられる。細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体または天然細胞内全体のシグナル伝達ドメイン、またはそれらの機能的断片を含み得る。「４−１ＢＢ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ６２４７８．２が付与されたアミノ酸配列、または非ヒト種、例えばマウス、齧歯類、サル、類人猿などに由来する同等の残基のＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーを指し、また「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４〜２５５、または非ヒト種、例えばマウス、齧歯類、サル、類人猿などに由来する同等の残基として定義される。
【００５２】
本発明で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質またはポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル起源のインタクトな免疫グロブリン、またはそれらの断片であってよく、天然源または組換え源に由来するものであってよい。
【００５３】
「抗体断片」という用語は、抗体の少なくとも一部、またはその組換え変異体を指し、これは抗原結合ドメイン、すなわちインタクトな抗体の抗原決定可変領域を含み、標的、例えば抗原及びその定められたエピトープに対する抗体断片の認識及び特異的結合を付与するのに十分なものである。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、一本鎖（ｓｃ）Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）抗体断片、線状抗体、ｓｄＡｂなどの単一ドメイン抗体（ＶＬまたはＶＨのいずれか）、ラクダ科ＶＨＨドメイン、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
「ｓｃＦｖ」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片と、重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片とを含む融合タンパク質を指し、この軽鎖及び重鎖の可変領域は、短い可撓性ポリペプチドリンカーを介して隣接して連結されており、単一のポリペプチド鎖として発現でき、ｓｃＦｖは、それが由来するインタクトな抗体の特異性を保持する。
【００５５】
抗体に関する「重鎖可変領域」または「ＶＨ」とは、フレームワーク領域として知られる隣接ストレッチの間に置かれる３つのＣＤＲを含む重鎖の断片を指し、このフレームワーク領域は一般に、ＣＤＲよりも高度に保存されており、ＣＤＲを支持する骨格を形成する。ラクダ科「ＶＨＨ」ドメインは、単一の可変抗体ドメインを含む重鎖である。
【００５６】
特に指定のない限り、本明細書で使用される場合、ｓｃＦｖは、例えばポリペプチドのＮ末端及びＣ末端を基準にしていずれの順序でＶＬ及びＶＨの可変領域を有してもよく、ｓｃＦｖは、ＶＬ−リンカー−ＶＨを含んでもよく、またはＶＨ−リンカー−ＶＬを含んでもよい。
【００５７】
抗体またはその抗体断片を含む本開示のＴＦＰ組成物の一部は、様々な形態で存在してよく、抗原結合ドメインは、例えば単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、マウス、ヒト化、またはヒト抗体に由来する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む、連続ポリペプチド鎖の一部として発現する（Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｉｎ：Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）。ある態様では、本開示のＴＦＰ組成物の抗原結合ドメインは抗体断片を含む。さらなる態様では、ＴＦＰは、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂを含む抗体断片を含む。
【００５８】
「組換え抗体」という用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて作製される抗体、例えばバクテリオファージまたは酵母の発現系によって発現される抗体などを指す。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって作製される抗体であって、そのＤＮＡ分子が抗体タンパク質またはその抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、そのＤＮＡまたはアミノ酸配列が、当技術分野において利用可能であり、かつ周知である組換えＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を用いて得られる抗体を意味すると解釈されるべきである。
【００５９】
「抗原」または「Ａｇ」という用語は、抗体によって特異的に結合できるか、それ以外の方法で免疫応答を誘発する分子を指す。この免疫応答は、抗体産生、もしくは免疫学的にコンピテントな特異的細胞の活性化のいずれか、または両方に関与し得る。
【００６０】
当業者であれば、実質的にすべてのタンパク質またはペプチドを含めたあらゆる巨大分子が抗原の役割を果たし得ることを理解されよう。さらに抗原は、組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから誘導することができる。したがって、当業者であれば、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的なヌクレオチド配列を含むあらゆるＤＮＡが、本明細書で使用される用語での「抗原」をコードすることを理解されよう。さらに、当業者であれば、遺伝子の全長ヌクレオチド配列のみによって抗原がコードされている必要がないことを理解されよう。本開示は、複数の遺伝子の部分的なヌクレオチド配列の使用を含むが、これに限定されず、これらのヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードする様々な組み合わせで配置されていることは自明である。さらに、当業者であれば、抗原は「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解されよう。抗原は、合成されて作製されてもよく、または生体試料由来であってもよく、またはポリペプチド以外の巨大分子であってもよいことは自明である。そのような生体試料は、組織試料、腫瘍試料、細胞、またはその他の生物学的成分を含む液体を含み得るが、これらに限定されない。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ１９」という用語は、Ｂ細胞白血病前駆細胞、他の悪性Ｂ細胞、及び正常なＢ細胞系統のほとんどの細胞で検出可能な抗原決定基である分化群１９タンパク質を指す。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「ＢＣＭＡ」という用語は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７）としても知られるＢ細胞成熟抗原を指し、分化群２６９タンパク質（ＣＤ２６９）は、ヒトにおいてＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＴＮＦＲＳＦ１７は、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）を認識するＴＮＦ受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体である（例えば、Ｌａａｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  １１（１１）：３８９７−９０４（１９９２）を参照）。この受容体は成熟Ｂリンパ球に発現しており、Ｂ細胞の発生と自己免疫応答に重要であり得る。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ１６」（ＦｃγＲＩＩＩとしても知られる）という用語は、ナチュラルキラー細胞、好中球多形核白血球、単球、及びマクロファージの表面に見られる分化群分子を指す。ＣＤ１６は、シグナル伝達に関与するＦｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）及びＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）であると同定されている。ＣＤ１６は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）の分子である。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「ＮＫＧ２Ｄ」とは、Ｃ型レクチン様受容体のＣＤ９４／ＮＫＧ２ファミリーに属する膜貫通タンパク質を指す。ヒトでは、ＮＫＧ２ＤはＮＫ細胞、γδ  Ｔ細胞、及びＣＤ８＋αβ  Ｔ細胞によって発現される。ＮＫＧ２Ｄは、ストレス細胞、悪性に形質転換された細胞、及び感染細胞の表面に出現するＭＩＣ及びＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰファミリーの誘導性自己タンパク質を認識する。
【００６５】
メソテリン（ＭＳＬＮ）とは、胸膜、腹膜、及び心膜の内側を覆う中皮細胞に通常存在する腫瘍分化抗原を指す。メソテリンは、中皮腫、卵巣腺癌、及び膵臓腺癌を含むいくつかのヒト腫瘍で過剰発現する。
【００６６】
神経栄養チロシンキナーゼ受容体関連１（ＮＴＲＫＲ１）としても知られるチロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体ＲＯＲ１は、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体（ＲＯＲ）ファミリーのメンバーである。これはがんの転移に関与している。
【００６７】
「ムチン１６、細胞表面関連」または「卵巣癌関連腫瘍マーカーＣＡ１２５」としても知られる「ＭＵＣ１６」という用語は、アミノ末端側に細胞外ドメイン、大きなタンデムリピートドメイン、及び短い細胞質ドメインをもつ膜貫通ドメインを含む膜係留ムチンである。この遺伝子の産物は種々のがんのマーカーとして使用されており、発現レベルの上昇に伴って転帰が悪化する。
【００６８】
シアル酸結合Ｉｇ様レクチン２、ＳＩＧＬＥＣ−２、Ｔ細胞表面抗原ｌｅｕ−１４、及びＢ細胞受容体ＣＤ２２としても知られる「ＣＤ２２」という用語は、Ｂ細胞／Ｂ細胞相互作用を媒介するタンパク質であり、リンパ組織内でのＢ細胞の局在に関与していると考えられており、難治性血液癌及び有毛細胞白血病を含む疾患に関連している。本明細書に開示される方法での使用に適した完全ヒト抗ＣＤ２２モノクローナル抗体（「Ｍ９７１」）は、例えばＸｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ．２００９  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；１（３）：２９７−３０３に記載されている。
【００６９】
「ＣＤ７９α」及び「ＣＤ７９β」遺伝子は、Ｂリンパ球抗原受容体を構成するタンパク質、すなわち抗原特異的成分、表面免疫グロブリン（Ｉｇ）を含む多量体複合体をコードする。表面Ｉｇは、Ｂ細胞抗原受容体の発現と機能に必要な、他の２つのタンパク質であるＩｇ−アルファ及びＩｇ−ベータ（それぞれＣＤ７９αとそのパラログＣＤ７９βによってコードされる）と非共有結合する。この複合体の機能的破壊は、例えばヒトＢ細胞慢性リンパ性白血病を引き起こし得る。
【００７０】
Ｂ細胞活性化因子、すなわち「ＢＡＦＦ」は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドファミリーに属するサイトカインである。このサイトカインは、受容体ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ／ＴＡＣＩ、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、及びＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ／ＢＡＦＦ−Ｒのリガンドである。このサイトカインはＢ細胞系統細胞で発現し、強力なＢ細胞活性化因子として機能する。また、Ｂ細胞の増殖と分化に重要な役割を果たすことも示されている。
【００７１】
「抗腫瘍効果」という用語は、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、期待余命の延長、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞生存率の低下、またはがん病態に付随する種々の生理学的症状の改善を含むがこれらに限定されない種々の方法によって現われ得る生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、本開示のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、及び抗体が、腫瘍のそもそもの発生を予防する能力によっても現われ得る。
【００７２】
「自己由来」という用語は、同一の個体に由来する任意の物質が、後にその個体へ再導入されることを指す。
【００７３】
「同種異系」またはそれに代わる「同種」という用語は、物質が導入される個体と同じ種の異なる動物または異なる患者に由来する任意の物質を指す。１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合に、２つ以上の個体は互いに同種異系であるといわれる。いくつかの態様では、同じ種の個体からの同種異系の物質は、抗原的に相互作用するには十分に遺伝的に異なり得る。
【００７４】
「異種」という用語は、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
【００７５】
「がん」という用語は、異常細胞の急速かつ制御不能な増殖を特徴とする疾患を指す。がん細胞は、局所的に分布することもあれば、血流及びリンパ系を介して身体の他の部分へと拡散することもある。種々のがんの例が本明細書に記載されており、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌、膵臓癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、悪性脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
「コードする」という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどの、ポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列固有の特性が、生物学的過程での他のポリマー及び巨大分子の合成において、定義したヌクレオチド配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）または定義したアミノ酸配列のいずれか、及びそれに起因する生物学的特性を有する鋳型として機能することを指す。したがって、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳によって、細胞または他の生体系にタンパク質が産生される場合、タンパク質をコードしている。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に示されているコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写用鋳型として用いられる非コード鎖の双方を、タンパク質またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードすると称することができる。
【００７７】
特に指定のない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いの縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードする、すべてのヌクレオチド配列が含まれる。また、タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という表現は、このタンパク質をコードするヌクレオチド配列が一部の型において１つ以上のイントロンを含み得る限りにおいてイントロンを含み得る。
【００７８】
「有効量」または「治療有効量」という用語は、本明細書では同義に使用されており、特定の生物学的または治療上の効果を達成するのに有効である、本明細書に記載の化合物、製剤、材料、または組成物の量を指す。
【００７９】
「内因性」という用語は、生物、細胞、組織、もしくは系に由来するか、またはその内部で産生される任意の物質を指す。
【００８０】
「外因性」という用語は、生物、細胞、組織、もしくは系の外部から導入されるか、または産生される任意の物質を指す。
【００８１】
「発現」という用語は、プロモーターによって誘導される特定のヌクレオチド配列の転写及び／または翻訳を指す。
【００８２】
「機能的破壊」という用語は、細胞内での正常な発現及び／または挙動を妨げる、特定の（例えば、標的）核酸に対する（例えば、遺伝子、ＲＮＡ転写物に対しての、それによってコードされるタンパク質の）物理的または生化学的変化を指す。一実施形態では、機能的破壊とは、遺伝子編集法による遺伝子の修飾を指す。一実施形態では、機能的破壊は、標的遺伝子（例えば内因性遺伝子）の発現を妨げる。
【００８３】
「転写ベクター」という用語は、単離された核酸を含み、かつその単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用できる組成物である。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含むが、これに限定されない数多くのベクターが、当技術分野において公知である。したがって、「転写ベクター」という用語は、自己複製プラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、例えばポリリジン化合物、リポソームなどのような、細胞内への核酸の移入を容易にする非プラスミド性及び非ウイルス性の化合物をさらに含むと解釈されるべきである。ウイルス性転写ベクターの例として、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
「発現ベクター」という用語は、発現させようとするヌクレオチド配列と機能的に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系で供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込んだ、コスミド、プラスミド（例えば、裸のプラスミド、またはリポソーム中に含まれるもの）、及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）を含め、当技術分野で公知のものすべてが含まれる。
【００８５】
「レンチウイルス」という用語は、レトロウイルス科の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染可能であるという点で、レトロウイルスの中でも独特であり、相当な量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡ中に送達することができるため、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、及びＦＩＶはすべて、レンチウイルスの例である。
【００８６】
「レンチウイルスベクター」という用語は、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指し、これには特に、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３−１４６４（２００９）に示される自己不活性化レンチウイルスベクターが含まれる。臨床に使用できるレンチウイルスベクターの他の例として、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａ製のＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（商標）遺伝子送達技術、Ｌｅｎｔｉｇｅｎ製のＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクターシステムなどが挙げられるが、これらに限定されない。非臨床型のレンチウイルスベクターもまた利用可能であり、当業者に公知である。
【００８７】
「相同」または「同一性」という用語は、２つのポリマー分子間、例えば２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子などの２つの核酸分子間、または２つのポリペプチド分子間でのサブユニット配列の同一性を指す。２つの配列双方のサブユニット位置を同じ単量体サブユニットが占めている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置をアデニンが占めている場合には、それらの分子はその位置で相同または同一である。２配列間の相同性は、一致位置または相同位置の数の直接の関数であり、例えば、２配列の位置の半数（例えば、１０サブユニット長のポリマーの５箇所）が相同である場合、この２配列は、５０％相同であり、位置の９０％（例えば、１０のうち９）が一致するまたは相同である場合、この２配列は９０％相同である。
【００８８】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、最小限の非ヒト免疫グロブリン由来の配列を有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体のその他の抗原結合部分配列）である。主としてヒト化抗体及びその抗体断片は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、望ましい特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えばマウス、ラット、またはウサギのＣＤＲ由来の残基で置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体または抗体断片）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体／抗体断片は、レシピエント抗体にも、取り込まれたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。このような改変は、抗体または抗体断片の性能をさらに改良し、最適化することができる。一般に、ヒト化抗体またはその抗体断片は、少なくとも１つ、及び通常は２つの可変ドメインを実質的にすべて含み、その可変ドメインにおいて、すべてまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべての部分または相当な部分が、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体または抗体断片はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、通常はヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含み得る。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５，１９８６；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９，１９８８；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６，１９９２を参照のこと。
【００８９】
「ヒト」または「完全ヒト」とは、分子全体がヒト起源のものであるか、またはヒト型の抗体もしくは免疫グロブリンと同一であるアミノ酸配列からなる、抗体または抗体断片などの免疫グロブリンを指す。
【００９０】
「単離された」という用語は、天然の状態から変更または除去されたことを意味する。例えば、生きた動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態で共存する物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離された」ものである。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態のまま存在することも、または例えば宿主細胞などの非天然環境で存在することもできる。
【００９１】
本開示の文脈において、一般的に存在する核酸塩基に関しては以下の略語を使用する。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、「Ｕ」はウリジンを指す。
【００９２】
「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体または抗体断片の結合特性に著しく影響しないかまたは結合特性を著しく変化させないアミノ酸修飾を指す。そのような保存的修飾には、アミノ酸の置換、付加、及び欠失が含まれる。修飾は、当技術分野において公知の標準技術、例えば部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発によって、本開示の抗体または抗体断片に導入することができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、類似する側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野で定義されている。これらのファミリーとして、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）をもつアミノ酸が挙げられる。したがって、本開示のＴＦＰ内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置換することができ、変更されたＴＦＰは、本明細書に記載の機能アッセイを用いて試験することができる。
【００９３】
「機能的に連結された」または「転写制御」という用語は、調節配列と異種核酸配列との間にあって、異種核酸配列の発現をもたらす機能的連結を指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係にある場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と機能的に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列と機能的に連結されている。機能的に連結されたＤＮＡ配列は互い‘に隣接してもよく、例えば２つのタンパク質コード領域の結合に必要とされる場合には、同一のリーディングフレーム内にある。
【００９４】
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、もしくは胸骨内の注射、腫瘍内、または輸注法を含む。
【００９５】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖いずれかの形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）及びそれらのポリマーを指す。特に制限のない限り、この用語は、参照核酸と類似する結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似する方法で代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含する。特に指定のない限り、特定の核酸配列には、明示された配列と同様に、その保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換体）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補的配列も暗黙裡に包含する。具体的には、縮重コドン置換体は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって得ることができる（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）、Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）、及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【００９６】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は同義に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなくてはならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって互いに結合した２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含まれる。本明細書で使用される場合、この用語は、例えば、当技術分野で一般にペプチド、オリゴペプチド、及びオリゴマーとも称される短鎖と、当技術分野で一般にタンパク質と称され、多くの種類がある長鎖の双方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、生物学的活性断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が特に含まれる。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、またはそれらの組み合わせを含む。
【００９７】
「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるために必要とされる、細胞の転写機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。
【００９８】
「プロモーター／調節配列」という用語は、そのプロモーター／調節配列に機能的に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を指す。場合によっては、この配列はコアプロモーター配列であってよく、また別の場合には、この配列が、遺伝子産物の発現に必要とされるエンハンサー配列及び他の調節エレメントを含んでもよい。プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的に遺伝子産物を発現させるものであってもよい。
【００９９】
「構成的」プロモーターという用語は、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、細胞のほとんどまたはすべての生理的条件下で、その遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０１００】
「誘導性」プロモーターという用語は、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、そのプロモーターに対応する誘導物質が細胞内に存在する場合のみ、実質的にその遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０１０１】
「組織特異的」プロモーターという用語は、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、細胞がそのプロモーターに対応する組織型の細胞である場合のみ、実質的にその遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０１０２】
ｓｃＦｖの文脈において使用される「リンカー」及び「可撓性ポリペプチドリンカー」という用語は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を共に連結するために単独でまたは組み合わせて使用されるグリシン残基及び／またはセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。一実施形態では、可撓性ポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎを含み、式中、ｎは１以上の正の整数である。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５、ｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９、及びｎ＝１０である。一実施形態では、可撓性ポリペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含むが、これらに限定されない。別の実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）、（ＧｌｙＳｅｒ）、または（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）の多重反復を含む。また、本開示の範囲には、ＷＯ２０１２／１３８４７５（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のリンカーが含まれる。場合によっては、リンカー配列は長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。場合によっては、長いリンカー配列は（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４）を含む。場合によっては、リンカー配列は短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。場合によっては、短いリンカー配列は（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３）を含む。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ７−メチルグアノシンキャップ、またはＲＮＡ  ｍ７Ｇキャップとも称する）とは、転写開始直後に真核生物のメッセンジャーＲＮＡの「先頭」または５’末端に付加される修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、最初に転写されるヌクレオチドに連結された末端基からなる。リボソームによる認識、及びＲＮａｓｅからの保護にとって、その存在が不可欠である。キャップの付加は転写と連動しており、それぞれが互いに影響し合うように同時転写的に発生する。転写開始後まもなく、合成されるｍＲＮＡの５’末端に、ＲＮＡポリメラーゼと会合したキャップ合成複合体が結合する。この酵素複合体は、ｍＲＮＡのキャップに必要とされる化学反応を触媒する。合成は多段階の生化学反応として進行する。キャップ部分を修飾して、翻訳の安定性または効率などのｍＲＮＡの機能を調節することができる。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写したＲＮＡ」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。概して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写したＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ベクターから生成される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写したＲＮＡを生成するために使用される鋳型を含む。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「ポリ（Ａ）」は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡに結合した一連のアデノシンである。一過性発現のための構築物の好ましい実施形態では、ポリＡは５０〜５０００、好ましくは６４超、より好ましくは１００超、最も好ましくは３００超または４００超である。ポリ（Ａ）配列を化学的または酵素的に修飾して、翻訳の局在化、安定性、または効率などのｍＲＮＡ機能を調節することができる。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「ポリアデニル化」とは、メッセンジャーＲＮＡ分子へのポリアデニリル部分またはその修飾変異体の共有結合を指す。真核生物では、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子が３’末端でポリアデニル化されている。３’ポリ（Ａ）尾部は、酵素であるポリアデニル酸ポリメラーゼの作用によってｍＲＮＡ前駆体に付加されるアデニンヌクレオチド（多くの場合、数百）の長い配列である。高等真核生物では、特定の配列、すなわちポリアデニル化シグナルを含んだ転写物にポリ（Ａ）尾部が付加される。ポリ（Ａ）尾部とそれに結合したタンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からｍＲＮＡを保護するのに役立つ。ポリアデニル化はまた、転写終結、ｍＲＮＡの核外輸送、及び翻訳にとって重要である。ポリアデニル化は、ＲＮＡへのＤＮＡの転写の直後に核内で起こるが、後に細胞質内でもさらに起こり得る。転写が終結した後、ＲＮＡポリメラーゼと会合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用によってｍＲＮＡ鎖が切断される。通常、切断部位は、切断部位近傍に塩基配列ＡＡＵＡＡＡが存在することを特徴とする。ｍＲＮＡが切断された後、アデノシン残基が切断部位の解放３’末端に付加される。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「一過性」とは、非組み込み型導入遺伝子の発現が数時間、数日間、または数週間であることを指し、その発現の期間は、遺伝子がゲノムに組み込まれる場合、または宿主細胞の安定なプラスミドレプリコン内に収容される場合の遺伝子の発現期間よりも短い。
【０１０８】
「シグナル伝達経路」という用語は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を担う種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。「細胞表面受容体」という表現は、シグナルを受け取り、細胞膜を越えてシグナルを伝達することができる分子及び分子の複合体を含む。
【０１０９】
「対象」という用語は、免疫応答を誘発することができる生物（例えば、哺乳動物、ヒト）を包含することを意図する。
【０１１０】
「実質的に精製された」細胞という用語は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。また、実質的に精製された細胞とは、天然に存在する状態で通常付随する他の細胞型から分離された細胞も指す。場合によっては、実質的に精製された細胞の集団とは、均一な細胞集団を指す。別の場合には、この用語は、単に、天然の状態において本来付随する細胞から分離された細胞を指す。いくつかの態様では、細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される。他の態様では、細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏでは培養されない。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「治療的」という用語は治療を意味する。治療効果は、病状の軽減、抑制、寛解、または根絶によって得られる。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「予防」という用語は、疾患または病状の予防または保護的処置を意味する。
【０１１３】
本開示の文脈において、「腫瘍抗原」または「過剰増殖性疾患抗原」または「過剰増殖性疾患に関連する抗原」とは、特定の過剰増殖性疾患に共通する抗原を指す。ある特定の態様では、本開示の過剰増殖性疾患抗原は、原発性または転移性の黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、ＮＨＬ、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌、ならびに乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌のような腺癌などを含むがこれらに限定されないがんに由来する。
【０１１４】
「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞内に移入または導入される過程を指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞とは、外因性核酸をトランスフェクト、形質転換、または形質導入された細胞である。この細胞は初代対象細胞とその継代を含む。
【０１１５】
「特異的に結合する」という用語は、試料中に存在する同種の結合パートナー（例えばＣＤ１９）を認識して、それと結合するが、試料中の他の分子は必ずしも実質的に認識せず、結合しない抗体、抗体断片、または特異的リガンドを指す。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「メガヌクレアーゼ」という用語は、認識配列が１２塩基対より大きい、二本鎖ＤＮＡと結合するエンドヌクレアーゼを指す。好ましくは、本開示のメガヌクレアーゼの認識配列は２２塩基対である。メガヌクレアーゼは、Ｉ−Ｃｒｅｌに由来するエンドヌクレアーゼであってよく、天然のＩ−Ｃｒｅｌと比較して、例えばＤＮＡ結合特異性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ結合親和性、または二量体化特性に関して改変されたＩ−Ｃｒｅｌの改変バリアントを指す場合もある。Ｉ−Ｃｒｅｌのそのような改変バリアントの作製方法は、当技術分野において公知である（例えば、ＷＯ２００７／０４７８５９）。本明細書で使用されるメガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体として、またはペプチドリンカーを使用して、ＤＮＡ結合ドメインの対が単一のポリペプチドに結合されている「一本鎖メガヌクレアーゼ」として二本鎖ＤＮＡに結合する。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」という用語は、「メガヌクレアーゼ」という用語と同義である。本開示のメガヌクレアーゼは、細胞を３７℃でトランスフェクトして維持できるように、細胞、特にヒトＴ細胞で発現されたとき実質的に無毒であり、本明細書に記載の方法を使用して測定した場合に、細胞生存性への有害な影響またはメガヌクレアーゼ切断活性の著しい低下を認めない。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「一本鎖メガヌクレアーゼ」という用語は、リンカーによって連結されたヌクレアーゼサブユニットの対を含むポリペプチドを指す。一本鎖メガヌクレアーゼの構成はＮ末端サブユニット−リンカー−Ｃ末端サブユニットである。これらの２つのメガヌクレアーゼサブユニットは概してアミノ酸配列が同一ではなく、同一でないＤＮＡ配列を認識する。したがって、一本鎖メガヌクレアーゼは通常、偽パリンドローム認識配列または非パリンドローム認識配列を切断する。一本鎖メガヌクレアーゼは、実際には二量体ではないが、「一本鎖ヘテロ二量体」または「一本鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」と称する場合もある。明確には、特に指定のない限り、「メガヌクレアーゼ」という用語は、二量体メガヌクレアーゼを指すことも、一本鎖メガヌクレアーゼを指すこともある。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「ＴＡＬＥＮ」という用語は、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼドメインの任意の部分に融合された１６〜２２個のＴＡＬドメインリピートを含む、ＤＮＡ結合ドメインを含むエンドヌクレアーゼを指す。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「小型ＴＡＬＥＮ」という用語は、Ｉ−Ｔｅｖ１ホーミングエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインの任意の触媒活性部分に任意の向きで融合された１６〜２２個のＴＡＬドメインリピートをもつＤＮＡ結合ドメインを含むエンドヌクレアーゼを指す。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ」という用語は、Ｃａｓ９などのカスパーゼと、ゲノムＤＮＡの認識部位にハイブリダイズすることによりカスパーゼのＤＮＡ切断を指示するガイドＲＮＡとを含む、カスパーゼ系のエンドヌクレアーゼを指す。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「ｍｅｇａＴＡＬ」という用語は、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインと、改変された配列特異的ホーミングエンドヌクレアーゼとを含む一本鎖ヌクレアーゼを指す。
【０１２２】
範囲：本開示を通して、本開示の様々な態様を範囲形式で示す場合がある。範囲形式による記載は、単に便宜上かつ簡潔さのためであって、本開示の範囲に対する不変の限定と解釈されるべきではないものと理解されるべきである。したがって、ある範囲の記載は、その範囲内におけるすべての可能な部分範囲のほか、個々の数値も明確に開示されているとみなされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分範囲のほか、その範囲内の個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６も明確に開示されているとみなされるべきである。別の例として、９５〜９９％の同一性などの範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性であるものを含み、かつ９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％、及び９８〜９９％の同一性などの部分範囲を含む。これは範囲の幅とは関係なく適用される。
【０１２３】
説明
本明細書では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）及びＴＣＲ定常ドメインを含む改変Ｔ細胞であって、機能的に破壊された内因性ＴＣＲサブユニットも有する改変Ｔ細胞を使用した、がんなどの疾患を治療するための組成物及び使用方法を提供する。本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質」または「ＴＦＰ」は、ＴＣＲを含む様々なポリペプチド由来の組換えポリペプチドを含み、当該ＴＣＲは概して、ｉ）標的細胞の表面抗原に結合すること、及びｉｉ）通常はＴ細胞内またはその表面に共存する場合、インタクトなＴＣＲ複合体の他のポリペプチド成分と相互作用することができる。本明細書に示すように、ＴＦＰはキメラ抗原受容体と比較して大幅な利点を与える。「キメラ抗原受容体」またはそれに代わる「ＣＡＲ」という用語は、ｓｃＦｖの形態の細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び以下に定義する刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称する）を含む組換えポリペプチドを指す。概して、ＣＡＲの中央の細胞内シグナル伝達ドメインは、通常はＴＣＲ複合体と会合して存在するＣＤ３ゼータ鎖由来である。このＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ（すなわちＣＤ１３７）、ＣＤ２７、及び／またはＣＤ２８などの少なくとも１つの共刺激分子由来の１つ以上の機能的シグナル伝達ドメインと融合することができる。
【０１２４】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）
本開示は、ＴＦＰをコードする組換えＤＮＡ構築物であって、当該ＴＦＰが、ＣＤ１９、例えばヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体断片を含み、当該抗体断片の配列が、ＴＣＲサブユニットまたはその一部をコードする核酸配列と隣接し、かつ同一のリーディングフレーム内にある構築物を包含する。本開示は、ＴＦＰをコードする組換えＤＮＡ構築物であって、当該ＴＦＰが、ＢＣＭＡ、例えばヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体断片を含み、当該抗体断片の配列が、ＴＣＲサブユニットまたはその一部をコードする核酸配列と隣接し、かつ同一のリーディングフレーム内にある構築物を包含する。本開示は、ＴＦＰをコードする組換えＤＮＡ構築物であって、当該ＴＦＰが、ＲＯＲ１、例えばヒトＲＯＲ１に特異的に結合する抗体断片を含み、当該抗体断片の配列が、ＴＣＲサブユニットまたはその一部をコードする核酸配列と隣接し、かつ同一のリーディングフレーム内にある構築物を包含する。本開示は、ＴＦＰをコードする組換えＤＮＡ構築物であって、当該ＴＦＰが、ＣＤ２２、例えばヒトＣＤ２２に特異的に結合する抗体断片を含み、当該抗体断片の配列が、ＴＣＲサブユニットまたはその一部をコードする核酸配列と隣接し、かつ同一のリーディングフレーム内にある構築物を包含する。本明細書で提供するＴＦＰは、１つ以上の内因性（または代わりに、１つ以上の外因性、または内因性と外因性の組み合わせ）のＴＣＲサブユニットと会合して、機能的ＴＣＲ複合体を形成することができる。
【０１２５】
一態様では、本開示のＴＦＰは、別の状況では抗原結合ドメインと称される標的特異的結合要素を含む。部分の選択は、標的細胞の表面を決定する標的抗原の型及び数に応じて異なる。例えば、抗原結合ドメインは、特定の病状と関連する標的細胞の細胞表面マーカーとして作用する標的抗原を認識するように選択することができる。したがって、本開示のＴＦＰの抗原結合ドメインに対する標的抗原として作用し得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス、細菌、及び寄生虫の感染症、自己免疫疾患、及びがん疾患（例えば悪性腫瘍疾患）に関連するものが挙げられる。
【０１２６】
一態様では、抗原結合ドメインを操作して所望の抗原に特異的に結合するＴＦＰにすることによって、ＴＦＰ介在型Ｔ細胞応答を、対象となる抗原に誘導することができる。
【０１２７】
一態様では、抗原結合ドメインを含むＴＦＰ部分は、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインを含む。一態様では、抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ１９を標的とする。一態様では、抗原結合ドメインを含むＴＦＰ部分は、ＢＣＭＡを標的とする抗原結合ドメインを含む。一態様では、抗原結合ドメインは、ヒトＢＣＭＡを標的とする。
【０１２８】
抗原結合ドメインは、限定されないものの、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ならびに重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及びラクダ科由来ナノボディの重鎖可変ドメイン（ＶＨＨ）などの単一ドメイン抗体を含むがこれに限定されないそれらの機能的断片を含む抗原と結合するあらゆるドメイン、ならびに当技術分野において抗原結合ドメインとして機能することが公知である代替骨格、例えば組換えフィブロネクチンドメイン、アンチカリン、ＤＡＲＰＩＮなどと結合するあらゆるドメインであり得る。同様に、標的抗原を特異的に認識し、それと結合する天然または合成のリガンドを、ＴＦＰに対する抗原結合ドメインとして使用することができる。場合によっては、最終的にＴＦＰが使用されるものと同じ種に由来する抗原結合ドメインが有益である。例えば、ヒトに使用する場合、ＴＦＰの抗原結合ドメインが、抗体または抗体断片の抗原結合ドメインに対するヒト残基またはヒト化残基を含むことが有益であり得る。
【０１２９】
したがって、一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体もしくはヒト抗体、もしくは抗体断片、またはマウス抗体もしくは抗体断片を含む。一実施形態では、ヒト化またはヒトの抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化またはヒトの抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ結合ドメインの軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）のうちの１つ以上（例えば、３つすべて）、及び／または本明細書に記載のヒト化またはヒトの抗ＣＤ１９結合ドメインの重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上（例えば、３つすべて）を含み、例えば、１つ以上、例えば３つすべてのＬＣ  ＣＤＲと、１つ以上、例えば３つすべてのＨＣ  ＣＤＲを含むヒト化またはヒトの抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ結合ドメインである。一実施形態では、ヒト化またはヒトの抗ＣＤ１９結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化またはヒトの抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ結合ドメインの重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）の１つ以上（例えば、３つすべて）を含み、例えば、ヒト化またはヒトの抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、それぞれが本明細書に記載のＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、及びＨＣ  ＣＤＲ３を含む２つの可変重鎖領域を有する。一実施形態では、ヒト化またはヒトの抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化もしくはヒトの軽鎖可変領域及び／または本明細書に記載のヒト化もしくはヒトの重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化またはヒトの抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化重鎖可変領域、例えば本明細書に記載の少なくとも２つのヒト化またはヒトの重鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、本明細書で提供するアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖を含むｓｃＦｖである。ある実施形態では、抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、本明細書で提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾（例えば置換）、ただし３０、２０、または１０個以下の修飾（例えば置換）を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供するアミノ酸配列に対して９５〜９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域、及び／または本明細書で提供する重鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾（例えば置換）、ただし３０、２０、または１０個以下の修飾（例えば置換）を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供するアミノ酸配列に対して９５〜９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化またはヒトの抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ結合ドメインはｓｃＦｖであり、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が、リンカー、例えば本明細書に記載のリンカーを介して、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に結合されている。一実施形態では、ヒト化抗��Ｄ１９または抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカーを含み、式中、ｎは１、２、３、４、５、または６、好ましくは３または４である。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域、または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域のいずれの配置であってもよい。場合によっては、リンカー配列は長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。場合によっては、長いリンカー配列は（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４）を含む。場合によっては、リンカー配列は短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。場合によっては、短いリンカー配列は（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３）を含む。
【０１３０】
いくつかの態様では、非ヒト抗体がヒト化されており、その場合、抗体の特定の配列または領域が、ヒトにおいて天然に産生される抗体またはその断片との類似性を高めるように修飾されている。一態様では、抗原結合ドメインはヒト化されている。
【０１３１】
ヒト化抗体は、当技術分野において公知である種々の技術を使用して作製することができ、このような技術として、ＣＤＲ移植（例えば、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、欧州特許第ＥＰ２３９，４００号、国際公開第ＷＯ９１／０９９６７号、及び米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、及び同第５，５８５，０８９号を参照）、ベニアリングまたはリサーフェイス（例えば、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、欧州特許第ＥＰ５９２，１０６号及び同第ＥＰ５１９，５９６号、Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８（４／５）：４８９−４９８、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５−８１４、ならびにＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＰＮＡＳ，９１：９６９−９７３を参照）、鎖シャッフル（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５６５，３３２号を参照）、例えば、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００４２６６４号、米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００４８６１７号、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、国際公開第ＷＯ９３１７１０５号、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９：１１１９−２５（２００２）、Ｃａｌｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１３（５）：３５３−６０（２０００）、Ｍｏｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０（３）：２６７−７９（２０００）、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（１６）：１０６７８−８４（１９９７）、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，９（１０）：８９５−９０４（１９９６）、Ｃｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（２３  Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ−５９７７ｓ（１９９５）、Ｃｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（８）：１７１７−２２（１９９５）、Ｓａｎｄｈｕ  Ｊ  Ｓ，Ｇｅｎｅ，１５０（２）：４０９−１０（１９９４）、及びＰｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３５（３）：９５９−７３（１９９４）に開示された技術が挙げられるが、これらに限定されない。多くの場合、フレームワーク領域内のフレームワーク残基を、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換して、抗原結合を変更、例えば改善する。このようなフレームワーク置換は、当技術分野において周知の方法によって同定され、例えば、ＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用をモデル化して、抗原結合及び配列比較にとって重要なフレームワーク残基を同定し、特定の位置での特異なフレームワーク残基を同定することによる（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５８５，０８９号、及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３を参照）。
【０１３２】
ヒト化抗体または抗体断片は、非ヒトである供給源からの残存する１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と呼ばれることが多く、通常は「移入」可変ドメインから取得される。本明細書で提供されるように、ヒト化抗体または抗体断片は、非ヒト免疫グロブリン分子からの１つ以上のＣＤＲとフレームワーク領域とを含み、フレームワークを含むアミノ酸残基は完全にまたはほとんどヒト生殖細胞系列に由来する。抗体または抗体断片のヒト化に関する多くの技術が当技術分野において周知されており、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従って、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列の代わりに用いること、すなわちＣＤＲ移植（内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＥＰ２３９，４００、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０９９６７号、及び米国特許第４，８１６，５６７号、同第６，３３１，４１５号、同第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第６，５４８，６４０号）により基本的に行うことができる。そのようなヒト化抗体及び抗体断片において、非ヒト種由来の対応配列による置換は、インタクトなヒト可変ドメインより大幅に少ない。ヒト化抗体は多くの場合、いくつかのＣＤＲ残基及び場合によってはいくつかのフレームワーク（ＦＲ）残基が、齧歯類抗体の類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。抗体及び抗体断片のヒト化は、ベニアリングまたはリサーフェイス（ＥＰ５９２，１０６、ＥＰ５１９，５９６、Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５−８１４；及びＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９１：９６９−９７３（１９９４））、及び鎖シャッフル（米国特許第５，５６５，３３２号）でも達成することができ、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
ヒト化抗体の作製に使用するヒト可変ドメイン（軽鎖及び重鎖の両方）の選択は、抗原性を低下させるためである。いわゆる「最良適合」法に従って、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対して、齧歯類抗体の可変ドメインの配列をスクリーニングする。その後、齧歯類のものに最も近似するヒト配列が、ヒト化抗体用のヒトフレームワーク（ＦＲ）として認められる（内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体に使用してもよい（例えば、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６−１７）：１１５７−１１６５（１９９７）、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照）。いくつかの実施形態では、フレームワーク領域、例えば重鎖可変領域の４つすべてのフレームワーク領域が、ＶＨ４−４−５９生殖細胞系列配列に由来する。一実施形態では、フレームワーク領域は、例えば対応するマウス配列でのアミノ酸からの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの修飾、例えば置換を含み得る。一実施形態では、フレームワーク領域、例えば軽鎖可変領域の４つすべてのフレームワーク領域が、ＶＫ３−１．２５生殖細胞系列配列に由来する。一実施形態では、フレームワーク領域は、例えば対応するマウス配列でのアミノ酸からの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの修飾、例えば置換を含み得る。
【０１３４】
いくつかの態様では、抗体断片を含む本開示のＴＦＰ組成物の一部が、標的抗原に対する高親和性及び他の有利な生物学的特性を保持したままヒト化される。本開示の一態様によれば、ヒト化抗体及び抗体断片は、親配列及びヒト化配列の３次元モデルを使用した、親配列及び種々の概念的ヒト化産物の分析過程により作製される。３次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者に周知のものである。選択した候補の免疫グロブリン配列の有望な３次元立体構造を例示及び表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示を精査すると、候補の免疫グロブリン配列の機能性に見込まれる残基の役割の分析、例えば、候補の免疫グロブリンが標的抗原と結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能である。このように、所望の抗体または抗体断片の特性、例えば標的抗原に対する親和性の増加が達成されるように、レシピエント及び移入配列からのＦＲ残基を選択して組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基が、抗原結合への影響に対して、直接的及び最も大きく関与している。
【０１３５】
ヒト化抗体または抗体断片は、元の抗体と類似する抗原特異性、例えば本開示では、ヒトＣＤ１９との結合能を保持することができる。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体または抗体断片は、ヒトＣＤ１９またはヒトＢＣＭＡに対する結合の親和性及び／または特異性を改善することができる。
【０１３６】
一態様では、抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、抗体または抗体断片の特定の機能的特徴または特性によって特徴づけられる。例えば、一態様では、抗原結合ドメインを含む本開示のＴＦＰ組成物の一部が、ヒトＣＤ１９またはヒトＢＣＭＡと特異的に結合する。一態様では、抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ１９に対して、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６−１７）：１１５７−１１６５（１９９７）に記載のＦＭＣ６３  ｓｃＦｖと同じかまたは類似する結合特異性を有する。一態様では、本開示は、抗体または抗体断片を含む抗原結合ドメインに関し、当該抗体結合ドメインは、ＣＤ１９もしくはＢＣＭＡタンパク質またはそれらの断片に特異的に結合し、当該抗体または抗体断片は、本明細書で提供されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び／または可変重鎖を含む。ある特定の態様では、ｓｃＦｖは、リーダー配列と隣接し、かつ同一のリーディングフレーム内にある。
【０１３７】
一態様では、抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、断片、例えば一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。一態様では、抗ＣＤ１９結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、または二重機能性（例えば二重特異性）ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５（１９８７））である。一態様では、本開示の抗体及びその断片は、野生型のまたは増強された親和性でＣＤ１９タンパク質と結合する。
【０１３８】
また、標的抗原（例えば、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、または融合部分結合ドメインの標的について本明細書の他の箇所に記載した任意の標的抗原）に特異的な抗体抗原結合ドメインを得るための方法を本明細書で提供し、当該方法は、本明細書で述べるＶＨドメインのアミノ酸配列での１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入により、ＶＨドメインのアミノ酸配列バリアントであるＶＨドメインを提供すること、場合により、そのように提供されたＶＨドメインを１つ以上のＶＬドメインと組み合わせること、ならびにこのＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬの１種または複数種の組み合わせを試験し、特異的結合メンバー、または対象となる標的抗原（例えば、ＣＤ１９またはＢＣＭＡ）に特異的であり、場合により１つ以上の所望の特性を有する抗体抗原結合ドメインを同定することを含む。
【０１３９】
場合によっては、ＶＨドメイン及びｓｃＦｖは、当技術分野において公知の方法に従って作製することができる（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照）。ｓｃＦｖ分子は、ＶＨ及びＶＬ領域を、可撓性ポリペプチドリンカーを用いて連結させることにより作製することができる。ｓｃＦｖ分子は、長さ及び／またはアミノ酸組成が最適化されたリンカー（例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー）を含む。このリンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変領域がどのようにフォールディングされ相互作用するかに大きく影響し得る。実際、短いポリペプチドリンカーを使用する場合（例えば５〜１０アミノ酸）、鎖内のフォールディングが妨げられる。また、２つの可変領域をひとつにして機能的エピトープ結合部位を形成するには、鎖間フォールディングが必要となる。場合によっては、リンカー配列は長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。場合によっては、長いリンカー配列は（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４）を含む。場合によっては、リンカー配列は短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。場合によっては、短いリンカー配列は（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３）を含む。リンカーの配置及び大きさの例については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−６４４８、米国特許出願公開第２００５／０１００５４３号、同第２００５／０１７５６０６号、同第２００７／００１４７９４号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０２０２５８号及び同第ＷＯ２００７／０２４７１５号を参照のこと。
【０１４０】
ｓｃＦｖは、そのＶＬ及びＶＨ領域間に、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１５超の残基のリンカーを含み得る。リンカー配列は、任意の天然に存在するアミノ酸を含んでもよい。いくつかの実施形態では、リンカー配列はアミノ酸のグリシン及びセリンを含む。別の実施形態では、リンカー配列は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは１以上の正の整数である）などのグリシンとセリンのセットのリピートを含む。一実施形態では、リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３であり得る。リンカー長の変動により、活性を保持または増強させ、活性試験において優れた有効性を生じさせることができる。場合によっては、リンカー配列は長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。場合によっては、長いリンカー配列は（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４）を含む。場合によっては、リンカー配列は短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。場合によっては、短いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３）を含む。
【０１４１】
安定性と変異
抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、例えばｓｃＦｖ分子（例えば、可溶性ｓｃＦｖ）の安定性は、従来の対照ｓｃＦｖ分子または全長抗体の生物物理学的特性（例えば、熱安定性）を基準にして評価することができる。一実施形態では、ヒト化またはヒトｓｃＦｖは、記載されるアッセイにおいて、親ｓｃＦｖよりも、約０．１℃、約０．２５℃、約０．５℃、約０．７５℃、約１℃、約１．２５℃、約１．５℃、約１．７５℃、約２℃、約２．５℃、約３℃、約３．５℃、約４℃、約４．５℃、約５℃、約５．５℃、約６℃、約６．５℃、約７℃、約７．５℃、約８℃、約８．５℃、約９℃、約９．５℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、または約１５℃高い熱安定性を有する。
【０１４２】
抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、例えばｓｃＦｖの改善された熱安定性は、引き続きＣＤ１９−ＴＦＰ構築物全体に付与され、抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰ構築物の治療的特性の改善につながる。抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、例えばｓｃＦｖの熱安定性を、従来の抗体と比較して、少なくとも約２℃または３℃改善することができる。一実施形態では、抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、従来の抗体と比較して熱安定性が１℃改善している。別の実施形態では、抗ＣＤ１９結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、従来の抗体と比較して熱安定性が２℃改善している。別の実施形態では、ｓｃＦｖは、従来の抗体と比較して熱安定性が４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、または１５℃改善している。比較は、例えば、本明細書に開示されるｓｃＦｖ分子と、ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬが由来する抗体のｓｃＦｖ分子またはＦａｂ断片との間で行うことができる。熱安定性は当技術分野において公知の方法を使用して測定することができる。例えば、一実施形態ではＴＭを測定することができる。ＴＭの測定方法及びタンパク質の安定性を決定する他の方法を以下に詳述する。
【０１４３】
ｓｃＦｖの変異（可溶性ｓｃＦｖのヒト化または直接変異誘発を介して生じる）は、ｓｃＦｖの安定性を変化させ、かつｓｃＦｖ及び抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰ構築物の全体的な安定性を改善する。ＴＭ、温度変性、及び温度凝集などの測定値を用いて、ヒト化ｓｃＦｖの安定性をマウスｓｃＦｖと比較する。一実施形態では、抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、ヒト化過程から生じる少なくとも１つの変異を含み、それによって変異型ｓｃＦｖは抗ＣＤ１９  ＴＦＰ構築物に改善された安定性を付与する。別の実施形態では、抗ＣＤ１９結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、ヒト化過程から生じる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の変異を含み、それによって変異型ｓｃＦｖはＣＤ１９  ＴＦＰまたはＢＣＭＡ  ＴＦＰ構築物に改善された安定性を付与する。
【０１４４】
一態様では、ＴＦＰの抗原結合ドメインは、本明細書に記載の抗原結合ドメインのアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含み、抗原結合ドメインは、本明細書に記載の抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ抗体断片の所望の機能特性を保持する。具体的な一態様では、本開示のＴＦＰ組成物は抗体断片を含む。さらなる態様では、抗体断片はｓｃＦｖを含む。
【０１４５】
様々な態様において、ＴＦＰの抗原結合ドメインは、一方または双方の可変領域（例えば、ＶＨ及び／またはＶＬ）内、例えば１つ以上のＣＤＲ領域内、及び／または１つ以上のフレームワーク領域内の１つ以上のアミノ酸を修飾することにより改変される。具体的な一態様では、本開示のＴＦＰ組成物は抗体断片を含む。さらなる態様では、抗体断片はｓｃＦｖを含む。
【０１４６】
アミノ酸配列に関して（例えば、野生型とは）異なるが、所望の活性に関しては変化しないように、本開示の抗体または抗体断片をさらに修飾できることは当業者に理解されている。例えば、「非必須」アミノ酸残基にアミノ酸置換をもたらす追加のヌクレオチド置換をタンパク質に行うことができる。例えば、分子内の非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換することができる。別の実施形態では、アミノ酸の鎖が、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／または組成が異なる構造的に類似した鎖で置換されていてもよい。例えば、アミノ酸残基が、類似する側鎖を有するアミノ酸残基で置換される保存的置換を行うことができる。
【０１４７】
類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野で定義されており、これには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【０１４８】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関する文脈において、同一性パーセントとは、２つ以上の配列が同一であることを指す。以下の配列比較アルゴリズムのいずれかを使用して、または手作業でのアラインメント及び目視検査を用いて測定されるような、比較域または指定された領域にわたる最大一致を比較及びアラインメントしたとき、２つの配列が、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定の比率（例えば、指定された領域にわたって、または指定されていない場合には配列全体にわたって、６０％の同一性、場合により、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）で有する場合、２つの配列は「実質的に同一」である。場合により、少なくとも約５０のヌクレオチド（または１０アミノ酸）長である領域にわたって、またはより好ましくは、１００〜５００もしくは１０００以上のヌクレオチド（または２０、５０、２００、もしくはそれ以上のアミノ酸）長である領域にわたって同一性が存在する。
【０１４９】
配列を比較するには、通常１つの配列を参照配列として利用し、試験配列をその参照配列と比較する。配列比較アルゴリズムを利用する場合には、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じて部分座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。デフォルトのプログラムパラメーターを使用することも、別のパラメーターを指定することもできる。その後、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントが算出される。比較のための配列アラインメント方法は当技術分野において周知である。配列比較に最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、または手作業アラインメント及び目視検査（例えば、Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照）によって実施することができる。配列同一性パーセント及び配列類似性の決定に適したアルゴリズムの２つの例が、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより公開されている。
【０１５０】
一態様では、本開示は、機能的に等価な分子を生成する出発抗体または断片（例えばｓｃＦｖ）のアミノ酸配列の修飾を企図する。例えば、ＴＦＰに含まれる抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、例えばｓｃＦｖのＶＨまたはＶＬは、抗ＣＤ１９結合ドメイン、例えばｓｃＦｖの出発ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域の少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を保持するように修飾することができる。本開示は、ＴＦＰ構築物全体の修飾、例えば機能的に等価な分子を生成するための、ＴＦＰ構築物の種々のドメインのうち１つ以上のアミノ酸配列の修飾を企図する。ＴＦＰ構築物は、出発ＴＦＰ構築物の少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を保持するように修飾することができる。
【０１５１】
細胞外ドメイン
細胞外ドメインは、天然源または組換え源のいずれに由来してもよい。供給源が天然である場合、このドメインは、どのタンパク質に由来してもよいが、特に膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質以外のドメインである。一態様では、細胞外ドメインは膜貫通ドメインと会合することができる。本開示で特に使用される細胞外ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、もしくはゼータ鎖、またはＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、もしくはＣＤ３デルタ、あるいは別の実施形態では、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の細胞外領域（複数可）を少なくとも含み得る。
【０１５２】
膜貫通ドメイン
一般的に、ＴＦＰ配列には、単一のゲノム配列がコードする細胞外ドメインと膜貫通ドメインとが含まれる。代替的実施形態では、ＴＦＰは、ＴＦＰの細胞外ドメインとは異種の膜貫通ドメインを含むように設計することができる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接する１つ以上の付加アミノ酸、例えば、膜貫通が由来したタンパク質の細胞外領域に会合した１つ以上のアミノ酸（例えば、細胞外領域の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のアミノ酸）、及び／または膜貫通が由来したタンパク質の細胞内領域に会合した１つ以上の付加アミノ酸（例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のアミノ酸）を含み得る。場合によっては、膜貫通ドメインは、細胞外領域の少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、またはそれ以上のアミノ酸を含み得る。場合によっては、膜貫通ドメインは、細胞内領域の少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、またはそれ以上のアミノ酸を含み得る。一態様では、膜貫通ドメインは、使用されるＴＦＰの他のドメインの１つと会合するものである。場合によっては、膜貫通ドメインを選択する、またはアミノ酸置換により修飾することにより、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに対するそのようなドメインの結合を回避することで、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えことができる。一態様では、膜貫通ドメインは、ＴＦＰ−Ｔ細胞表面の別のＴＦＰとのホモ二量化が可能である。異なる態様では、同じＴＦＰに存在する天然の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小限にするように膜貫通ドメインのアミノ酸配列を修飾または置換することができる。
【０１５３】
膜貫通ドメインは、天然源または組換え源のいずれに由来してもよい。供給源が天然である場合、ドメインは何らかの膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。一態様では、ＴＦＰが標的に結合している場合はいつでも、膜貫通ドメインは細胞内ドメイン（複数可）へシグナル伝達ができる。本開示で特に使用される膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、ガンマ鎖、デルタ鎖、もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通領域（複数可）を少なくとも含み得る。
【０１５４】
場合によっては、膜貫通ドメインは、ＴＦＰの細胞外領域、例えばＴＦＰの抗原結合ドメインに、ヒンジ、例えばヒトタンパク質由来のヒンジを介して結合させることができる。例えば、一実施形態では、ヒンジは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ、例えばＩｇＧ４ヒンジ、またはＣＤ８ａヒンジであり得る。
【０１５５】
リンカー
場合により、長さが２〜１０アミノ酸である短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーによって、ＴＦＰの膜貫通ドメインと細胞質領域との間に結合が形成されていてもよい。場合によっては、リンカーは少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の長さであり得る。グリシン−セリンのダブレットは特に適したリンカーとなる。例えば、一態様では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーはＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣ（配列番号４）のヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１５６】
細胞質ドメイン
ＴＦＰにＣＤ３ガンマ、デルタ、またはイプシロンポリペプチドが含まれている場合、ＴＦＰの細胞質ドメインが細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。ＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータサブユニットは概してシグナル伝達ドメインを含まない。細胞内シグナル伝達ドメインは概して、ＴＦＰが導入されている免疫細胞の少なくとも１つの正常なエフェクター機能の活性化に関与する。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特別な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達して、特別な機能を実行するように細胞を誘導するタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を利用できるが、多くの場合、その鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分を使用する場合には、そのような短縮部分がエフェクター機能シグナルを伝達する限り、それをインタクトな鎖の代わりに使用してもよい。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含むものとする。
【０１５７】
本開示のＴＦＰに使用される細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、抗原受容体結合後にシグナル伝達を開始するために協調して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と共受容体の細胞質配列、ならびにその配列の任意の誘導体またはバリアント、及び同じ機能的能力を有する任意の組換え配列が挙げられる。
【０１５８】
ＴＣＲ単独で生成されたシグナルは、ナイーブＴ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次的及び／または共刺激的なシグナルを必要とすることが知られている。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つのクラスの異なる細胞質シグナル伝達配列、すなわちＴＣＲを介して抗原依存性の一次活性化を開始するもの（一次細胞内シグナル伝達配列）と、抗原に依存せずに作用して、二次的または共刺激的なシグナルをもたらすもの（二次細胞質ドメイン、例えば共刺激ドメイン）によって媒介されるといってよい。
【０１５９】
一次シグナル伝達ドメインは、刺激的方法または阻害的方法のいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激的方法で作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
【０１６０】
本開示で特に有用な、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＩＴＡＭの例としては、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄのものが挙げられる。一実施形態では、本開示のＴＦＰは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３イプシロンの一次シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、改変ＩＴＡＭドメイン、例えば天然のＩＴＡＭドメインと比較して、活性が変化（例えば、増加または減少）している変異型ＩＴＡＭドメインを含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、改変ＩＴＡＭを含む一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化及び／または短縮されたＩＴＡＭを含む一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれより多いＩＴＡＭモチーフを含む。
【０１６１】
ＴＦＰの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを単独で含んでも、または本開示のＴＦＰの文脈において有用である任意の他の望ましい細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）と組み合わせてもよい。例えば、ＴＦＰの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３イプシロン鎖部分及び共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインとは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＴＦＰの一部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例として、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。例えば、ＣＤ２７共刺激は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒトＴＦＰ−Ｔ細胞の増殖、エフェクター機能、及び生存性を増強すること、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒトＴ細胞の持続性と抗腫瘍活性を増大することが実証されている（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（３）：６９６−７０６）。
【０１６２】
本開示のＴＦＰの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列は、ランダムな順序または指定された順序で互いに連結することができる。場合により、例えば、長さが２〜１０アミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸）である短いオリゴリンカーまたはポリペプチドリンカーによって、細胞内シグナル伝達配列間の結合が形成されてもよい。
【０１６３】
一実施形態では、適切なリンカーとしてグリシン−セリンダブレットを使用することができる。一実施形態では、適切なリンカーとして単一のアミノ酸、例えばアラニン、グリシンを使用することができる。
【０１６４】
一態様では、本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞は、例えば同じ標的（ＣＤ１９またはＢＣＭＡ）または異なる標的（例えばＣＤ１２３）に対する第２のＴＦＰ、例えば異なる抗原結合ドメインを含む第２のＴＦＰをさらに含み得る。一実施形態では、ＴＦＰ発現細胞が２つ以上の異なるＴＦＰを含む場合、異なるＴＦＰの抗原結合ドメインは、各抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものであり得る。例えば、第１及び第２のＴＦＰを発現する細胞は、第１のＴＦＰの抗原結合ドメインを、例えば、第２のＴＦＰの抗原結合ドメインと会合を形成しない断片、例えばｓｃＦｖとして有することができ、例えば第２のＴＦＰの抗原結合ドメインはＶＨＨである。
【０１６５】
別の態様では、本明細書に記載のＴＦＰ発現細胞は、別の作用物質、例えば改変Ｔ細胞の活性を増強する作用物質をさらに発現することができる。例えば、一実施形態では、作用物質は抑制分子を阻害する作用物質であり得る。抑制分子、例えばＰＤ１は、いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞が免疫エフェクター応答を高める能力を低下させることができる。抑制分子の例として、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及びＴＧＦＲベータが挙げられる。一実施形態では、抑制分子を阻害する作用物質は、陽性シグナルを細胞、例えば本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインに供給する第２のポリペプチドに会合した第１のポリペプチド、例えば抑制分子を含む。一実施形態では、作用物質は、第１のポリペプチド、例えば、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ３、２Ｂ４、及びＴＩＧＩＴなどの抑制分子、またはそれらのいずれかの断片（例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部）のものと、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメイン（例えば、本明細書に記載の４−１ＢＢ、ＣＤ２７、またはＣＤ２８）及び／または、一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）を含む）である第２のポリペプチドとを含む。一実施形態では、作用物質は、ＰＤ１の第１のポリペプチドまたはその断片（例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部）と、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、及び／または本明細書に記載のＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）である第２のポリペプチドとを含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、及びＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの抑制性メンバーである。ＰＤ−１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び骨髄細胞に発現する（Ａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８：７６５−７５）。ＰＤ１に対する２つのリガンドであるＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ１への結合時、Ｔ細胞の活性化を下方制御することが示されている（Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：１０２７−３４、Ｌａｔｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２６１−８、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：６３４−４３）。ＰＤ−Ｌ１は、ヒトがんにおいて豊富である（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ８１：２８１−７、Ｂｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５４：３０７−３１４、Ｋｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：５０９４）。ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１との局所的相互作用を阻害することによって免疫抑制を逆転することができる。
【０１６６】
一実施形態では、作用物質は抑制分子の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、例えばプログラム死１（ＰＤ１）を、膜貫通ドメイン及び場合により４１ＢＢ及びＣＤ３ゼータなどの細胞内シグナル伝達ドメインと融合することができる（本明細書ではＰＤ１  ＴＦＰとも称する）。一実施形態では、ＰＤ１  ＴＦＰは、本明細書に記載の抗ＣＤ１９  ＴＦＰと組み合わせて使用すると、Ｔ細胞の持続性が改善する。一実施形態では、ＴＦＰは、ＰＤ１の細胞外ドメインを含むＰＤ１  ＴＦＰである。あるいは、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）またはプログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）に特異的に結合するｓｃＦｖなどの抗体または抗体断片を含むＴＦＰを提供する。
【０１６７】
別の態様では、本開示は、ＴＦＰ発現Ｔ細胞、例えばＴＦＰ−Ｔ細胞の集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＦＰ発現Ｔ細胞の集団は、異なるＴＦＰを発現する細胞の混合物を含む。例えば、一実施形態では、ＴＦＰ−Ｔ細胞の集団は、本明細書に記載の抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ結合ドメインを有するＴＦＰを発現する第１の細胞と、異なる抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ結合ドメイン、例えば第１の細胞によって発現されるＴＦＰ内の抗ＣＤ１９結合ドメインとは異なる本明細書に記載の抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ結合ドメインを有するＴＦＰを発現する第２の細胞とを含み得る。別の例として、ＴＦＰ発現細胞の集団は、例えば本明細書に記載されるような抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ結合ドメインを含むＴＦＰを発現する第１の細胞と、ＣＤ１９またはＢＣＭＡ以外の標的（例えば、別の腫瘍関連抗原）に対する抗原結合ドメインを含むＴＦＰを発現する第２の細胞とを含み得る。
【０１６８】
別の態様では、本開示は、集団内の少なくとも１つの細胞が本明細書に記載の抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡドメインを有するＴＦＰを発現する細胞の集団と、別の作用物質、例えば改変Ｔ細胞の活性を増強する作用物質を発現する第２の細胞とを提供する。例えば、一実施形態では、作用物質は抑制分子を阻害する作用物質であり得る。抑制分子、例えば、いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞が免疫エフェクター応答を高める能力を低下させることができる。抑制分子の例として、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及びＴＧＦＲベータが挙げられる。一実施形態では、抑制分子を阻害する作用物質は、第１のポリペプチド、例えば抑制分子を、陽性シグナルを細胞、例えば本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインに供給する第２のポリペプチドに会合して含む。
【０１６９】
本明細書では、ＴＦＰをコードする、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写したＲＮＡの作製方法を開示する。また、本開示は、細胞に直接トランスフェクトすることができる、ＴＦＰをコードするＲＮＡ構築物も含む。トランスフェクションに用いるｍＲＮＡの作製方法には、特別に設計したプライマーによる鋳型のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）と、それに続くポリＡの付加を伴い、３’及び５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）、５’キャップ、及び／または配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現される核酸、ならびに典型的には５０〜２０００塩基長のポリＡ尾部を含む構築物を産生することができる。そのようにして産生されたＲＮＡは、異なる種類の細胞を効率的にトランスフェクトすることができる。一態様では、鋳型はＴＦＰに対する配列を含む。
【０１７０】
一態様では、抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によってコードされる。一態様では、抗ＣＤ１９または抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰをコードするｍＲＮＡは、Ｔ細胞に導入されて、ＴＦＰ−Ｔ細胞を産生する。一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写したＲＮＡ  ＴＦＰは、一過性トランスフェクションの形態で細胞に導入することができる。ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成鋳型を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって産生される。任意の供給源からの対象となるＤＮＡをＰＣＲによって鋳型に直接変換し、適切なプライマー及びＲＮＡポリメラーゼを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍＲＮＡ合成を行うことができる。ＤＮＡ源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列、または任意の他の適切なＤＮＡ源であり得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用の望ましい鋳型は、本開示のＴＦＰである。一実施形態では、ＰＣＲに使用されるＤＮＡはオープンリーディングフレームを含む。このＤＮＡは、生物のゲノム由来の天然に存在するＤＮＡ配列由来であってもよい。一実施形態では、核酸は、５’及び／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の一部またはすべてを含み得る。核酸は、エキソン及びイントロンを含み得る。一実施形態では、ＰＣＲに使用されるＤＮＡはヒト核酸配列である。別の実施形態では、ＰＣＲに使用されるＤＮＡは、５’及び３’ＵＴＲを含むヒト核酸配列である。あるいは、ＤＮＡは、天然に存在する生物では通常発現しない人工ＤＮＡ配列であってもよい。例示的な人工ＤＮＡ配列は、ひとつにライゲーションされて、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成する遺伝子部分を含むものである。ひとつにライゲーションされるＤＮＡの部分は、単一の生物または複数の生物由来であり得る。
【０１７１】
ＰＣＲは、トランスフェクションに使用される、ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用の鋳型を作製するために使用される。ＰＣＲの実施方法は、当技術分野において周知である。ＰＣＲに使用されるプライマーは、ＰＣＲ用の鋳型として使用されるＤＮＡの領域に対して実質的に相補的である領域を有するように設計される。本明細書で使用される場合、「実質的に相補的」とは、プライマー配列中の塩基の大半もしくはすべてが相補的であるか、または１つ以上の塩基が非相補的もしくは不一致である、ヌクレオチドの配列を指す。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲに使用されるアニール条件下で、意図したＤＮＡ標的とアニールまたはハイブリダイズすることができる。プライマーは、ＤＮＡ鋳型の任意の部分に対して実質的に相補的であるように設計することができる。例えば、５’及び３’ＵＴＲを含む、細胞内で通常転写される核酸の一部分（オープンリーディングフレーム）を増幅するようにプライマーを設計することができる。また、対象となる特定のドメインをコードする核酸の一部分を増幅するようにプライマーを設計することもできる。一実施形態では、プライマーは、５’及び３’ＵＴＲの全体または一部分を含む、ヒトｃＤＮＡのコード領域を増幅するように設計される。ＰＣＲに有用なプライマーは、当技術分野において周知である合成法によって作製することができる。「フォワードプライマー」とは、増幅させようとするＤＮＡ配列の上流である、ＤＮＡ鋳型上のヌクレオチドに対して実質的に相補的であるヌクレオチドの領域を含むプライマーである。本明細書で使用される「上流」とは、コード鎖に対して、増幅させようとするＤＮＡ配列の５'位を指す。「リバースプライマー」とは、増幅させようとするＤＮＡ配列の下流である、二本鎖ＤＮＡ鋳型に対して実質的に相補的であるヌクレオチドの領域を含むプライマーである。本明細書で使用される「下流」とは、コード鎖と相対して増幅されるＤＮＡ配列の３’位を指す。
【０１７２】
ＰＣＲに有用なＤＮＡポリメラーゼのいずれをも、本明細書で開示される方法に使用することができる。試薬及びポリメラーゼは、いくつかの供給元から市販されている。
【０１７３】
安定性及び／または翻訳効率を高める能力を有する化学構造体を使用することもできる。ＲＮＡは５’及び３’ＵＴＲを有することが好ましい。一実施形態では、５’ＵＴＲは１〜３０００ヌクレオチド長である。コード領域に付加される５’及び３’ＵＴＲ配列の長さは、様々な方法によって変化させることができ、この方法には、ＵＴＲの別の領域とアニールするＰＣＲ用プライマーの設計を含むが、これに限定されない。この手法を用いて、当業者は、転写ＲＮＡのトランスフェクト後に最適な翻訳効率を達成するために必要とされる５’及び３’ＵＴＲの長さを変更することができる。
【０１７４】
５’及び３’ＵＴＲは、対象となる核酸の天然に存在する内因性５’及び３’ＵＴＲであり得る。あるいは、ＵＴＲ配列をフォワードプライマー及びリバースプライマーに組み込むことによって、または鋳型の他の何らかの改変によって、対象となる核酸に内在しないＵＴＲ配列を付加することができる。対象となる核酸に内在しないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性及び／または翻訳効率の変更に有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列中のＡＵリッチエレメントはｍＲＮＡの安定性を低下させ得ることが知られている。したがって、当技術分野において周知であるＵＴＲの特性に基づいて、転写ＲＮＡの安定性を高めるように３’ＵＴＲを選択または設計することができる。
【０１７５】
一実施形態では、５’ＵＴＲは内因性核酸のコザック配列を含み得る。あるいは、対象となる核酸に内在しない５’ＵＴＲを上記のようにＰＣＲによって付加すると、５’ＵＴＲ配列の付加によりコンセンサスコザック配列を再設計することができる。コザック配列は、いくつかのＲＮＡ転写物の翻訳効率を高めることができるが、効率的な翻訳を可能にするためにＲＮＡすべてに必要であるとは思われない。多くのｍＲＮＡにコザック配列が必要であることは、当技術分野において公知である。他の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞内で安定であるＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲである。他の実施形態では、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨げるために、様々なヌクレオチド類似体を３’または５’ＵＴＲに使用することができる。
【０１７６】
遺伝子クローニングを必要とせずにＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を可能にするには、転写される配列の上流でＤＮＡ鋳型に転写プロモーターが結合される必要がある。ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーターとして機能する配列をフォワードプライマーの５’末端に付加すると、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、転写させようとするオープンリーディングフレームの上流でＰＣＲ産物に組み込まれるようになる。好ましい一実施形態では、プロモーターは、本明細書の他の箇所に記載したようなＴ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターとしては、Ｔ３及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は当技術分野において公知である。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは５’末端のキャップ及び３’ポリ（Ａ）尾部の両方を有し、これらがリボソーム結合、翻訳の開始、及び細胞でのｍＲＮＡ安定性を決定する。環状ＤＮＡ鋳型、例えばプラスミドＤＮＡ上では、ＲＮＡポリメラーゼは、真核細胞での発現に適さない長いコンカテマー産物を産生する。３’ＵＴＲの末端での線状プラスミドＤＮＡの転写では、通常サイズのｍＲＮＡが得られるが、これは転写後にポリアデニル化されても、真核生物のトランスフェクションに有効ではない。
【０１７８】
線状ＤＮＡ鋳型では、ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型の最終塩基を越えて転写物の３’末端を伸長させることができる（Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ  ａｎｄ  Ｍｉｅｒｅｎｄｏｒｆ，Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：６２２３−３６（１９８５）、Ｎａｃｈｅｖａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｚａｌ−Ｈｅｒｒａｎｚ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：１４８５−６５（２００３）。
【０１７９】
ＤＮＡ鋳型にポリＡ／Ｔストレッチを組み込む従来の方法は分子クローニングである。しかしながら、プラスミドＤＮＡに組み込まれたポリＡ／Ｔ配列はプラスミドの不安定化を引き起こす恐れがあり、このことが、細菌細胞から得たプラスミドＤＮＡ鋳型に欠失及び他の異常がしばしば高頻度で混入する理由となっている。そのため、クローニング手順が面倒で時間がかかるだけでなく、信頼性も損なわれる場合が多い。このような理由から、ポリＡ／Ｔ  ３’ストレッチを有するＤＮＡ鋳型の構築をクローニングなしで可能にする方法が待望されている。
【０１８０】
転写ＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、ＰＣＲ時にポリＴ尾部、例えば１００Ｔの尾部（サイズは５０〜５０００Ｔであり得る）などを含むリバースプライマーを使用することによって、またはＰＣＲ後に、ＤＮＡライゲーションもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えを含むが、これらに限定されない他の任意の方法によって産生することができる。ポリ（Ａ）尾部はまた、ＲＮＡに安定性をもたらし、その分解も低下させる。一般に、ポリ（Ａ）尾部の長さは、転写ＲＮＡの安定性と正の相関関係にある。一実施形態では、ポリ（Ａ）尾部は１００〜５０００個のアデノシンである。
【０１８１】
ＲＮＡのポリ（Ａ）尾部は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写後に、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、例えばＥ．ｃｏｌｉポリＡポリメラーゼ（Ｅ−ＰＡＰ）などの使用により、さらに伸長させることができる。一実施形態では、ポリ（Ａ）尾部の長さを１００ヌクレオチドから３００〜４００ヌクレオチドへと増やすことにより、ＲＮＡの翻訳効率が約２倍増加する。さらに、異なる化学基を３’末端に結合して、ｍＲＮＡの安定性を高めることができる。このような結合部は、修飾／人工ヌクレオチド、アプタマー、及び他の化合物を含み得る。例えば、ＡＴＰ類似体をポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてポリ（Ａ）尾部に組み込むことができる。ＡＴＰ類似体は、ＲＮＡの安定性をさらに高めることができる。
【０１８２】
５’キャップもまた、ＲＮＡ分子に安定性を与える。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法により産生されるＲＮＡは５’キャップを含む。５’キャップは、当技術分野において公知であって本明細書に記載される技術を使用して付与される（Ｃｏｕｇｏｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２９：４３６−４４４（２００１）、Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，７：１４６８−９５（２００１）、Ｅｌａｎｇｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３０：９５８−９６６（２００５））。
【０１８３】
本明細書に開示される方法により産生されるＲＮＡはまた、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列も含み得る。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡに対するキャップ非依存的なリボソーム結合を開始させて、翻訳開始を容易にする、任意のウイルス配列、染色体配列、または人工的に設計された配列であってよい。細胞透過性及び生存可能性を促進する因子、例えば糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤、及び界面活性剤などを含有し得る、細胞エレクトロポレーションに適した任意の溶質を含んでもよい。
【０１８４】
ＲＮＡは、いくつかの様々な方法のいずれか、例えば、エレクトロポレーション（Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）−ＩＩ（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ））、ＥＣＭ  ８３０（ＢＴＸ）（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）、またはＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ，Ｄｅｎｖｅｒ，Ｃｏｌｏ．）、Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（登録商標）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｔ，Ｈａｍｂｕｒｇ  Ｇｅｒｍａｎｙ）、リポフェクションを用いるカチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション、ポリマーカプセル封入、ペプチド媒介性トランスフェクション、または「遺伝子銃」などのバイオリスティック粒子送達システムを含むが、これらに限定されない市販の方法を用いて、標的細胞に導入することができる（例えば、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１２（８）：８６１−７０（２００１を参照）。
【０１８５】
ＴＦＰ及びＴＣＲ定常ドメインをコードする組換え核酸
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、（ａ）（ｉ）（１）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、（２）膜貫通ドメイン、及び（３）ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＴＣＲアルファ、またはＴＣＲベータの細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含むＴＣＲサブユニットと、（ｉｉ）抗原結合ドメインを含むヒト抗体またはヒト化抗体とを含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする配列と、（ｂ）ＴＣＲ定常ドメインをコードする配列とを含み、ＴＣＲ定常ドメインは、ＴＣＲアルファ定常ドメイン、ＴＣＲベータ定常ドメイン、またはＴＣＲアルファ定常ドメインとＴＣＲベータ定常ドメインであり、ＴＣＲサブユニット及び抗体は機能的に連結されており、かつＴ細胞で発現するとＴＦＰがＴＣＲ複合体に機能的に組み込まれる、組換え核酸である。
【０１８６】
場合によっては、Ｔ細胞で発現すると、ＴＣＲ定常ドメインは機能的ＴＣＲ複合体に組み込まれる。場合によっては、ＴＣＲ定常ドメインは、Ｔ細胞で発現するとＴＦＰを組み込む機能的ＴＣＲ複合体と同じ機能的ＴＣＲ複合体に組み込まれる。場合によっては、ＴＦＰをコードする配列とＴＣＲ定常ドメインをコードする配列とは、同じ核酸分子内に含まれている。場合によっては、ＴＦＰをコードする配列とＴＣＲ定常ドメインをコードする配列とは、異なる核酸分子内に含まれている。
【０１８７】
場合によっては、ＴＣＲサブユニットと、抗体ドメイン、抗原ドメイン、もしくは結合リガンド、またはそれらの断片とは、リンカー配列によって機能的に連結されている。場合によっては、リンカー配列は（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む。
【０１８８】
場合によっては、膜貫通ドメインは、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＴＣＲアルファ、またはＴＣＲベータからのＴＣＲ膜貫通ドメインである。場合によっては、細胞内ドメインは、ＣＤ３イプシロンのみ、ＣＤ３ガンマのみ、ＣＤ３デルタのみ、ＴＣＲアルファのみ、またはＴＣＲベータのみに由来する。
【０１８９】
場合によっては、ＴＣＲサブユニットは、（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＴＣＲ細胞内ドメインを含み、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）のうち少なくとも２つは同じＴＣＲサブユニット由来である。
【０１９０】
場合によっては、ＴＣＲ細胞外ドメインは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、それらの機能的断片、及び少なくとも１つだが２０以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択される、タンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む。
【０１９１】
場合によっては、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、それらの機能的断片、及び少なくとも１つだが２０以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択される、タンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。
【０１９２】
場合によっては、ＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメインから選択されるタンパク質の刺激ドメイン、またはそれらに対して少なくとも１つの修飾を有するアミノ酸配列を含むＴＣＲ細胞内ドメインを含む。
【０１９３】
場合によっては、ＴＣＲサブユニットは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメイン及び／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインから選択されるタンパク質の刺激ドメイン、またはそれらに対して少なくとも１つの修飾を有するアミノ酸配列を含む細胞内ドメインを含む。
【０１９４】
場合によっては、組換え核酸は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。場合によっては、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ならびに少なくとも１つだが２０以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択される、タンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。
【０１９５】
場合によっては、ＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＴＣＲゼータ鎖、Ｆｃイプシロン受容体１鎖、Ｆｃイプシロン受容体２鎖、Ｆｃガンマ受容体１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ２鎖、Ｆｃガンマ受容体３ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体３ｂ鎖、Ｆｃベータ受容体１鎖、ＴＹＲＯＢＰ（ＤＡＰ１２）、ＣＤ５、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８９、ＣＤ２７８、ＣＤ６６ｄ、それらの機能的断片、及び少なくとも１つだが２０以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択される、タンパク質の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴ  ＡＭ）またはその一部を含む、ＴＣＲサブユニットＩＴ  ＡＭを含む。場合によっては、ＩＴＡＭは、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはＣＤ３イプシロンのＩＴＡＭを置換する。場合によっては、ＩＴＡＭは、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択され、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択される別のＩＴＡＭを置換する。
【０１９６】
場合によっては、ＴＦＰ、ＴＣＲアルファ定常ドメイン、ＴＣＲベータ定常ドメイン、及びそれらの任意の組み合わせは、内因性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することができる。場合によっては、（ａ）ＴＣＲ定常ドメインがＴＣＲアルファ定常ドメインであり、ＴＣＲベータ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはそれらの組み合わせの内因性サブユニットを含むＴＣＲ複合体にＴＦＰが機能的に統合されるか、（ｂ）ＴＣＲ定常ドメインがＴＣＲベータ定常ドメインであり、ＴＣＲアルファ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはそれらの組み合わせの内因性サブユニットを含むＴＣＲ複合体にＴＦＰが機能的に統合されるか、あるいは（ｃ）ＴＣＲ定常ドメインがＴＣＲアルファ定常ドメインであり、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはそれらの組み合わせの内因性サブユニットを含むＴＣＲ複合体にＴＦＰが機能的に統合される。
【０１９７】
場合によっては、上記の、それに対して少なくとも１つだが２０以下の修飾は、細胞シグナル伝達を媒介するアミノ酸の修飾、またはＴＦＰへのリガンド結合に応答してリン酸化されるアミノ酸の修飾を含む。
【０１９８】
場合によっては、ヒト抗体またはヒト化抗体は抗体断片である。場合によっては、抗体断片は、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体ドメイン、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインである。場合によっては、抗原結合ドメインを含むヒト抗体またはヒト化抗体は、抗ＣＤ１９結合ドメイン、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合ドメイン、抗メソテリン（ＭＳＬＮ）結合ドメイン、抗ＣＤ２２結合ドメイン、抗ＰＤ−１結合ドメイン、抗ＢＡＦＦまたはＢＡＦＦ受容体結合ドメイン、及び抗ＲＯＲ−１結合ドメインからなる群から選択される。
【０１９９】
場合によっては、核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選択される。場合によっては、核酸はｍＲＮＡである。場合によっては、組換え核酸は核酸類似体を含み、この核酸類似体は組換え核酸のコード配列にはない。場合によっては、核酸類似体は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホン酸ヌクレオチド、チオールホスホン酸ヌクレオチド、及び２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホロアミダイトからなる群から選択される。
【０２００】
場合によっては、組換え核酸はリーダー配列をさらに含む。場合によっては、組換え核酸はプロモーター配列をさらに含む。場合によっては、組換え核酸はポリ（Ａ）尾部をコードする配列をさらに含む。場合によっては、組換え核酸は３’ＵＴＲ配列をさらに含む。場合によっては、核酸は、単離された核酸または天然に存在しない核酸である。場合によっては、核酸はｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写した核酸である。
【０２０１】
場合によっては、組換え核酸は、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインをコードする配列をさらに含む。場合によっては、組換え核酸は、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインをコードする配列をさらに含む。場合によっては、組換え核酸は、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインをコードする配列及びＴＣＲベータ膜貫通ドメインをコードする配列をさらに含む。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、（ａ）（ｉ）（１）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、（２）膜貫通ドメイン、及び（３）ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＴＣＲアルファ、またはＴＣＲベータの細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含むＴＣＲサブユニットと、（ｉｉ）抗体またはその断片に結合できる結合リガンドまたはその断片とを含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする配列と、（ｂ）ＴＣＲ定常ドメインをコードする配列とを含み、ＴＣＲ定常ドメインは、ＴＣＲアルファ定常ドメイン、ＴＣＲベータ定常ドメイン、またはＴＣＲアルファ定常ドメインとＴＣＲベータ定常ドメインであり、ＴＣＲサブユニット及び結合リガンドまたはその断片が機能的に連結されており、かつＴ細胞で発現するとＴＦＰがＴＣＲ複合体に機能的に組み込まれる、組換え核酸である。場合によっては、結合リガンドは、抗体のＦｃドメインと結合できる。場合によっては、結合リガンドは、ＩｇＧ１抗体と選択的に結合できる。場合によっては、結合リガンドは、ＩｇＧ１抗体と特異的に結合できる。場合によっては、抗体またはその断片は細胞表面抗原に結合する。場合によっては、抗体またはその断片は腫瘍細胞の表面にある細胞表面抗原に結合する。場合によっては、結合リガンドは、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、または十量体を含む。場合によっては、結合リガンドは抗体またはその断片を含まない。場合によっては、結合リガンドはＣＤ１６ポリペプチドまたはその断片を含む。場合によっては、結合リガンドはＣＤ１６結合ポリペプチドを含む。場合によっては、結合リガンドはヒトのものであるか、またはヒト化されている。場合によっては、組換え核酸は、結合リガンドが結合できる抗体またはその断片をコードする核酸配列をさらに含む。場合によっては、抗体またはその断片は細胞から分泌できる。
【０２０３】
場合によっては、ＴＣＲ定常ドメインは、Ｔ細胞で発現すると、機能的ＴＣＲ複合体に組み込まれる。場合によっては、ＴＣＲ定常ドメインは、Ｔ細胞で発現するとＴＦＰを組み込む機能的ＴＣＲ複合体と同じ機能的ＴＣＲ複合体に組み込まれる。場合によっては、ＴＦＰをコードする配列とＴＣＲ定常ドメインをコードする配列とは、同じ核酸分子内に含まれている。場合によっては、ＴＦＰをコードする配列とＴＣＲ定常ドメインをコードする配列とは、異なる核酸分子内に含まれている。
【０２０４】
場合によっては、ＴＣＲサブユニットと、抗体ドメイン、抗原ドメイン、もしくは結合リガンド、またはそれらの断片は、リンカー配列によって機能的に連結されている。場合によっては、リンカー配列は（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む。
【０２０５】
場合によっては、膜貫通ドメインは、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＴＣＲアルファ、またはＴＣＲベータからのＴＣＲ膜貫通ドメインである。場合によっては、細胞内ドメインは、ＣＤ３イプシロンのみ、ＣＤ３ガンマのみ、ＣＤ３デルタのみ、ＴＣＲアルファのみ、またはＴＣＲベータのみに由来する。
【０２０６】
場合によっては、ＴＣＲサブユニットは、（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＴＣＲ細胞内ドメインを含み、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）のうち少なくとも２つは同じＴＣＲサブユニット由来である。
【０２０７】
場合によっては、ＴＣＲ細胞外ドメインは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、それらの機能的断片、及び少なくとも１つだが２０以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択される、タンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む。
【０２０８】
場合によっては、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、それらの機能的断片、及び少なくとも１つだが２０以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択される、タンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。
【０２０９】
場合によっては、ＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメインから選択されるタンパク質の刺激ドメイン、またはそれらに対して少なくとも１つの修飾を有するアミノ酸配列を含むＴＣＲ細胞内ドメインを含む。
【０２１０】
場合によっては、ＴＣＲサブユニットは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメイン及び／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインから選択されるタンパク質の刺激ドメイン、またはそれらに対して少なくとも１つの修飾を有するアミノ酸配列を含む細胞内ドメインを含む。
【０２１１】
場合によっては、組換え核酸は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。場合によっては、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ならびに少なくとも１つだが２０以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択される、タンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。
【０２１２】
場合によっては、ＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＴＣＲゼータ鎖、Ｆｃイプシロン受容体１鎖、Ｆｃイプシロン受容体２鎖、Ｆｃガンマ受容体１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ２鎖、Ｆｃガンマ受容体３ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体３ｂ鎖、Ｆｃベータ受容体１鎖、ＴＹＲＯＢＰ（ＤＡＰ１２）、ＣＤ５、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８９、ＣＤ２７８、ＣＤ６６ｄ、それらの機能的断片、及び少なくとも１つだが２０以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択される、タンパク質の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）またはその一部を含む、ＴＣＲサブユニットのＩＴＡＭを含む。場合によっては、ＩＴＡＭは、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはＣＤ３イプシロンのＩＴＡＭを置換する。場合によっては、ＩＴＡＭは、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択され、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択される別のＩＴＡＭを置換する。
【０２１３】
場合によっては、ＴＦＰ、ＴＣＲアルファ定常ドメイン、ＴＣＲベータ定常ドメイン、及びそれらの任意の組み合わせは、内因性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することができる。場合によっては、（ａ）ＴＣＲ定常ドメインがＴＣＲアルファ定常ドメインであり、ＴＣＲベータ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはそれらの組み合わせの内因性サブユニットを含むＴＣＲ複合体にＴＦＰが機能的に統合されるか、（ｂ）ＴＣＲ定常ドメインがＴＣＲベータ定常ドメインであり、ＴＣＲアルファ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはそれらの組み合わせの内因性サブユニットを含むＴＣＲ複合体にＴＦＰが機能的に統合されるか、あるいは（ｃ）ＴＣＲ定常ドメインがＴＣＲアルファ定常ドメイン及びＴＣＲベータ定常ドメインであり、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはそれらの組み合わせの内因性サブユニットを含むＴＣＲ複合体にＴＦＰが機能的に統合される。
【０２１４】
場合によっては、上記の、それに対して少なくとも１つだが２０以下の修飾は、細胞シグナル伝達を媒介するアミノ酸の修飾、またはＴＦＰへのリガンド結合に応答してリン酸化されるアミノ酸の修飾を含む。
【０２１５】
場合によっては、ヒト抗体またはヒト化抗体は抗体断片である。場合によっては、抗体断片は、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体ドメイン、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインである。場合によっては、抗原結合ドメインを含むヒト抗体またはヒト化抗体は、抗ＣＤ１９結合ドメイン、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合ドメイン、抗メソテリン（ＭＳＬＮ）結合ドメイン、抗ＣＤ２２結合ドメイン、抗ＰＤ−１結合ドメイン、抗ＢＡＦＦ結合ドメイン、及び抗ＲＯＲ−１結合ドメインからなる群から選択される。
【０２１６】
場合によっては、核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選択される。場合によっては、核酸はｍＲＮＡである。場合によっては、組換え核酸は核酸類似体を含み、この核酸類似体は組換え核酸のコード配列にはない。場合によっては、核酸類似体は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホン酸ヌクレオチド、チオールホスホン酸ヌクレオチド、及び２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホロアミダイトからなる群から選択される。
【０２１７】
場合によっては、組換え核酸はリーダー配列をさらに含む。場合によっては、組換え核酸はプロモーター配列をさらに含む。場合によっては、組換え核酸はポリ（Ａ）尾部をコードする配列をさらに含む。場合によっては、組換え核酸は３’ＵＴＲ配列をさらに含む。場合によっては、核酸は、単離された核酸または天然に存在しない核酸である。場合によっては、核酸はｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写した核酸である。
【０２１８】
場合によっては、組換え核酸は、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインをコードする配列をさらに含む。場合によっては、組換え核酸は、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインをコードする配列をさらに含む。場合によっては、組換え核酸は、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインをコードする配列及びＴＣＲベータ膜貫通ドメインをコードする配列をさらに含む。あるいは、組換え核酸は、ＴＣＲガンマドメインまたはＴＣＲデルタドメイン、例えば膜貫通ドメインをコードする配列を含む。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、（ａ）（ｉ）（１）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、（２）膜貫通ドメイン、及び（３）ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＴＣＲアルファ、またはＴＣＲベータの細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含むＴＣＲサブユニットと、（ｉｉ）細胞の表面に発現する受容体またはポリペプチドに結合するリガンドまたはその断片を含む抗原ドメインとを含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする配列と、（ｂ）ＴＣＲ定常ドメインをコードする配列とを含み、ＴＣＲ定常ドメインは、ＴＣＲアルファ定常ドメイン、ＴＣＲベータ定常ドメイン、またはＴＣＲアルファ定常ドメインとＴＣＲベータ定常ドメインであり、ＴＣＲサブユニット及び抗原ドメインは機能的に連結されており、かつＴ細胞で発現するとＴＦＰがＴＣＲ複合体に機能的に組み込まれる、組換え核酸である。場合によっては、抗原ドメインはリガンドを含む。場合によっては、リガンドは細胞の受容体に結合する。場合によっては、リガンドは、細胞の表面に発現するポリペプチドに結合する。場合によっては、細胞の表面に発現する受容体またはポリペプチドは、ストレス応答受容体またはポリペプチドを含む。場合によっては、細胞の表面に発現する受容体またはポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ関連糖タンパク質である。場合によっては、ＭＨＣクラスＩ関連糖タンパク質は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。場合によっては、抗原ドメインは、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、または十量体を含む。場合によっては、抗原ドメインは、リガンドまたはその断片の単量体または二量体を含む。場合によっては、リガンドまたはその断片は、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、または十量体を含む。場合によっては、リガンドまたはその断片は単量体または二量体である。場合によっては、抗原ドメインは抗体またはその断片を含まない。場合によっては、抗原ドメインは可変領域を含まない。場合によっては、抗原ドメインはＣＤＲを含まない。場合によっては、リガンドまたはその断片は、ナチュラルキラーグループ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンドまたはその断片である。
【０２２０】
場合によっては、ＴＣＲ定常ドメインは、Ｔ細胞で発現すると、機能的ＴＣＲ複合体に組み込まれる。場合によっては、ＴＣＲ定常ドメインは、Ｔ細胞で発現するとＴＦＰを組み込む機能的ＴＣＲ複合体と同じ機能的ＴＣＲ複合体に組み込まれる。場合によっては、ＴＦＰをコードする配列とＴＣＲ定常ドメインをコードする配列とは、同じ核酸分子内に含まれている。場合によっては、ＴＦＰをコードする配列とＴＣＲ定常ドメインをコードする配列とは、異なる核酸分子内に含まれている。
【０２２１】
場合によっては、ＴＣＲサブユニットと、抗体ドメイン、抗原ドメイン、もしくは結合リガンド、またはそれらの断片は、リンカー配列によって機能的に連結されている。場合によっては、リンカー配列は（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む。
【０２２２】
場合によっては、膜貫通ドメインは、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＴＣＲアルファ、またはＴＣＲベータからのＴＣＲ膜貫通ドメインである。場合によっては、細胞内ドメインは、ＣＤ３イプシロンのみ、ＣＤ３ガンマのみ、ＣＤ３デルタのみ、ＴＣＲアルファのみ、またはＴＣＲベータのみに由来する。
【０２２３】
場合によっては、ＴＣＲサブユニットは、（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＴＣＲ細胞内ドメインを含み、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）のうち少なくとも２つは同じＴＣＲサブユニット由来である。
【０２２４】
場合によっては、ＴＣＲ細胞外ドメインは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、それらの機能的断片、及び少なくとも１つだが２０以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択される、タンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む。
【０２２５】
場合によっては、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、それらの機能的断片、及び少なくとも１つだが２０以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択される、タンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。
【０２２６】
場合によっては、ＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、またはＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメインから選択されるタンパク質の刺激ドメイン、またはそれらに対して少なくとも１つの修飾を有するアミノ酸配列を含むＴＣＲ細胞内ドメインを含む。
【０２２７】
場合によっては、ＴＣＲサブユニットは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメイン及び／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインから選択されるタンパク質の刺激ドメイン、またはそれらに対して少なくとも１つの修飾を有するアミノ酸配列を含む細胞内ドメインを含む。
【０２２８】
場合によっては、組換え核酸は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。場合によっては、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ならびに少なくとも１つだが２０以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択される、タンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。
【０２２９】
場合によっては、ＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＴＣＲゼータ鎖、Ｆｃイプシロン受容体１鎖、Ｆｃイプシロン受容体２鎖、Ｆｃガンマ受容体１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ２鎖、Ｆｃガンマ受容体３ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体３ｂ鎖、Ｆｃベータ受容体１鎖、ＴＹＲＯＢＰ（ＤＡＰ１２）、ＣＤ５、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８９、ＣＤ２７８、ＣＤ６６ｄ、それらの機能的断片、及び少なくとも１つだが２０以下の修飾を有するそのアミノ酸配列からなる群から選択される、タンパク質の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）またはその一部を含む、ＴＣＲサブユニットのＩＴＡＭを含む。場合によっては、ＩＴＡＭは、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはＣＤ３イプシロンのＩＴＡＭを置換する。場合によっては、ＩＴＡＭは、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択され、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択される別のＩＴＡＭを置換する。
【０２３０】
場合によっては、ＴＦＰ、ＴＣＲアルファ定常ドメイン、ＴＣＲベータ定常ドメイン、及びそれらの任意の組み合わせは、内因性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することができる。場合によっては、（ａ）ＴＣＲ定常ドメインがＴＣＲアルファ定常ドメインであり、ＴＣＲベータ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはそれらの組み合わせの内因性サブユニットを含むＴＣＲ複合体にＴＦＰが機能的に統合されるか、（ｂ）ＴＣＲ定常ドメインがＴＣＲベータ定常ドメインであり、ＴＣＲアルファ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはそれらの組み合わせの内因性サブユニットを含むＴＣＲ複合体にＴＦＰが機能的に統合されるか、あるいは（ｃ）ＴＣＲ定常ドメインがＴＣＲアルファ定常ドメイン及びＴＣＲベータ定常ドメインであり、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはそれらの組み合わせの内因性サブユニットを含むＴＣＲ複合体にＴＦＰが機能的に統合される。
【０２３１】
場合によっては、上記の、それに対して少なくとも１つだが２０以下の修飾は、細胞シグナル伝達を媒介するアミノ酸の修飾、またはＴＦＰへのリガンド結合に応答してリン酸化されるアミノ酸の修飾を含む。
【０２３２】
場合によっては、ヒト抗体またはヒト化抗体は抗体断片である。場合によっては、抗体断片は、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体ドメイン、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインである。場合によっては、抗原結合ドメインを含むヒト抗体またはヒト化抗体は、抗ＣＤ１９結合ドメイン、抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合ドメイン、抗メソテリン（ＭＳＬＮ）結合ドメイン、抗ＣＤ２２結合ドメイン、抗ＢＡＦＦ結合ドメイン、抗ＰＤ−１結合ドメイン、及び抗ＲＯＲ−１結合ドメインからなる群から選択される。
【０２３３】
場合によっては、核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選択される。場合によっては、核酸はｍＲＮＡである。場合によっては、組換え核酸は核酸類似体を含み、この核酸類似体は組換え核酸のコード配列にはない。場合によっては、核酸類似体は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホン酸ヌクレオチド、チオールホスホン酸ヌクレオチド、及び２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホロアミダイトからなる群から選択される。
【０２３４】
場合によっては、組換え核酸はリーダー配列をさらに含む。場合によっては、組換え核酸はプロモーター配列をさらに含む。場合によっては、組換え核酸はポリ（Ａ）尾部をコードする配列をさらに含む。場合によっては、組換え核酸は３’ＵＴＲ配列をさらに含む。場合によっては、核酸は、単離された核酸または天然に存在しない核酸である。場合によっては、核酸はｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写した核酸である。
【０２３５】
場合によっては、組換え核酸は、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインをコードする配列をさらに含む。場合によっては、組換え核酸は、ＴＣＲベータ膜貫通ドメインをコードする配列をさらに含む。場合によっては、組換え核酸は、ＴＣＲアルファ膜貫通ドメインをコードする配列及びＴＣＲベータ膜貫通ドメインをコードする配列をさらに含む。
【０２３６】
いくつかの実施形態において、本明細書にさらに開示されるのは、本明細書に開示される組換え核酸を含むベクターである。場合によっては、ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。場合によっては、ベクターはＡＡＶ６ベクターである。場合によっては、ベクターはプロモーターをさらに含む。場合によっては、ベクターはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写したベクターである。
【０２３７】
所望の分子をコードする核酸配列は、当技術分野において公知の組換え法を用いて、例えば、標準的な技術を使用して、遺伝子を発現する細胞のライブラリーをスクリーニングすることによって、遺伝子を含むことが既知であるベクターから遺伝子を誘導することによって、または遺伝子を含む細胞及び組織から直接単離することによって得ることができる。あるいは、対象となる遺伝子を、クローニングではなく合成的に作製することができる。
【０２３８】
本開示は、本開示のＤＮＡが挿入されたベクターも提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルス由来のベクターは、導入遺伝子の長期間の安定した組み込み及び娘細胞へのその伝搬を可能にするため、長期間の遺伝子移入を実現するのに適したツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞を形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルス由来のベクターを上回る別の利点を有する。これらはまた、免疫原性が低いという別の利点を有する。
【０２３９】
別の実施形態では、本開示の所望のＴＦＰをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター（Ａ５／３５）である。別の実施形態では、ＴＦＰをコードする核酸の発現は、スリーピングビューティ、クリスパー、ＣＡＳ９、及びジンクフィンガーヌクレアーゼなどのトランスポゾンを使用して達成することができる。参照により本明細書に組み込まれる、以下、Ｊｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．９．１０：７０４−７１６を参照のこと。
【０２４０】
本開示の発現構築物はまた、標準的な遺伝子送達プロトコルを用いた、核酸免疫法及び遺伝子療法に使用することができる。遺伝子送達の方法は、当技術分野において公知である（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号を参照）。別の実施形態では、本開示は遺伝子療法ベクターを提供する。
【０２４１】
核酸は、いくつかの種類のベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含むが、これらに限定されないベクターにクローニングすることができる。特に対象となるベクターとして、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが挙げられる。
【０２４２】
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は、当技術分野において周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）、ならびに他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、好適なベクターには、少なくとも１種の生物において機能する複製起点、プロモーター配列、利便な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択マーカーが含まれている（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、及び米国特許第６，３２６，１９３号）。
【０２４３】
哺乳動物細胞への遺伝子移入のための、ウイルスを用いた系がいくつか開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系に利便なプラットフォームを提供する。当技術分野で公知の技術を用いて、選抜された遺伝子をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次いで、組換えウイルスを単離し、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏのいずれかで対象の細胞に送達することができる。いくつかのレトロウイルス系が、当技術分野において公知である。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターを使用する。いくつかのアデノウイルスベクターが、当技術分野において公知である。一実施形態では、レンチウイルスベクターを使用する。
【０２４４】
追加のプロモーターエレメント、例えばエンハンサーは転写開始の頻度を調節する。通常これは、開始部位の上流３０〜１１０ｂｐの領域に位置するが、いくつかのプロモーターは開始部位の下流にも機能的エレメントを含むことが示されている。エレメントが互いに反転または移動するときにプロモーター機能が維持されるように、プロモーターエレメント間の間隔は柔軟であることが多い。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隔は、５０ｂｐの距離まで大きくすることができ、それ以降は活性が低下し始める。プロモーターによっては、転写を活性化するために、個々のエレメントを協働的に機能させることも、または独立して機能させることもできると思われる。
【０２４５】
哺乳動物のＴ細胞においてＴＦＰ導入遺伝子を発現することができるプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然ＥＦ１ａプロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素的送達に関与する伸長因子１複合体のアルファサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳動物の発現プラスミドに広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローニングされた導入遺伝子からのＴＦＰ発現を駆動させるのに有効であることが示されている（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照）。プロモーターの別の例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに機能的に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルな発現を駆動できる強力な構成的プロモーター配列である。ただし、他の構成的プロモーター配列も使用することができ、これには、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バールウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターなどであるが、それらに限定されないヒト遺伝子プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本開示は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターもまた、本開示の一部として企図される。誘導性プロモーターを使用すると、それが機能的に連結されているポリヌクレオチド配列の発現を、そのような発現が望ましい場合はオンにし、発現が望ましくない場合はオフにすることができる分子スイッチが得られる。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリン調節プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４６】
細胞に導入される発現ベクターはまた、ＴＦＰポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させようとする細胞集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にする選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれかまたは両方を含むことができる。他の態様では、選択マーカーを個別のＤＮＡ片上に担持して、同時トランスフェクト手順に使用することができる。選択マーカーとレポーター遺伝子はいずれも、宿主細胞での発現ができる適切な調節配列と隣接させることができる。有用な選択マーカーとして、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【０２４７】
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を同定するため、及び調節配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物もしくは組織に存在しないか、またはそれらによって発現されない遺伝子であり、いくつかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によって発現が顕在化されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の適切な時点で評価される。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子を含み得る（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７９：７９−８２）。適切な発現系は周知であり、公知の技術を用いて調製するか、または市販品を入手することができる。一般に、レポーター遺伝子の最大発現レベルを示す最小５’隣接領域をもつ構築物を、プロモーターとして同定する。そのようなプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結することで、作用物質のプロモーター駆動性転写を調節する能力に関する評価に使用することができる。
【０２４８】
遺伝子を細胞に導入し発現させる方法は、当技術分野において公知である。発現ベクターの文脈において、当技術分野の任意の方法によって、宿主細胞、例えば哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫細胞にベクターを容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段によって宿主細胞に移入することができる。
【０２４９】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法として、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクター及び／または外因性核酸を含む細胞の産生方法は、当技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
【０２５０】
対象となるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、ＤＮＡベクター及びＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞への遺伝子挿入に最も幅広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る（例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び同第５，５８５，３６２号を参照のこと）。
【０２５１】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段としては、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフィア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベース系などのコロイド分散系が挙げられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの送達ビヒクルとして使用される例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。標的化ナノ粒子またはその他の好適なサブミクロンサイズの送達系でのポリヌクレオチドの送達といった他の最先端の標的化核酸送達方法が利用可能である。
【０２５２】
非ウイルス送達系を利用する場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。核酸の宿主細胞への導入（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏ）に脂質製剤の使用が企図されている。別の態様では、核酸は脂質と会合していてもよい。脂質と会合した核酸は、リポソームの水性内部に封入されてもよく、リポソームの脂質二重層内に散在させてもよく、リポソームとオリゴヌクレオチドの双方に会合した連結分子を介してリポソームに結合されてもよく、リポソームに内包されてもよく、リポソームと複合体化されてもよく、脂質を含有する溶液中に分散させてもよく、脂質と混合されてもよく、脂質と複合体化されてもよく、脂質中に懸濁液として含有されもよく、ミセルに含有されるかもしくはそれと複合体化されてもよく、またはそれ以外の方法で脂質と会合されてもよい。脂質、脂質／ＤＮＡ、または脂質／発現ベクター会合組成物は、溶液中においていかなる特定の構造にも限定されない。例えば、それらは、二層構造で、ミセルとして、または「崩壊」構造で存在し得る。それらはまた、単に溶液中に散在していてもよく、場合によりサイズまたは形状が均一ではない凝集体を形成してもよい。脂質は脂肪物質であり、天然に存在する脂質または合成の脂質であり得る。例えば、脂質は、細胞質に天然に存在する脂肪滴、ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、及びアルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素及びその誘導体を含有する化合物のクラスを含む。
【０２５３】
使用に適した脂質は、市販品の供給元から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手することができ、リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、Ｋ＆Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）から入手することができ、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから入手することができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及びその他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から入手することができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質原液は、約−２０℃で保存することができる。クロロホルムはメタノールよりも容易に蒸発するので、単独の溶媒としてはクロロホルムを使用する。「リポソーム」とは、封入脂質二重層または凝集体の生成によって形成される多様な単膜及び多重膜の脂質ビヒクルを包含する一般用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内部水性媒体をもつ小胞構造を有することを特徴とし得る。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。これは、リン脂質を過剰の水溶液中で懸濁させると自然に形成される。脂質成分は、自己再構成を受けた後、閉鎖構造を形成し、脂質二重層間に水及び溶解された溶質を取り込む（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：５０５−１０）。しかしながら、通常の小胞構造とは異なる構造を溶液中で有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造をとることも、または単に脂質分子の不均一な凝集体として存在することもできる。また、リポフェクタミン−核酸複合体も企図される。
【０２５４】
外因性核酸の宿主細胞への導入に使用する方法、またはそれ以外の本開示の阻害剤への細胞の曝露に使用する方法を問わず、宿主細胞中の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。そのようなアッセイには、例えば、サザン及びノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ、及びＰＣＲなどの当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット）または本開示の範囲内にある薬剤の同定に関する本明細書に記載のアッセイによって、特定のペプチドの有無を検出するなどの「生化学的」アッセイが含まれる。
【０２５５】
本開示はＴＦＰをコードする核酸分子を含むベクターをさらに提供する。一態様では、ＴＦＰベクターを細胞、例えばＴ細胞に直接形質導入することができる。一態様では、ベクターは、クローニングまたは発現ベクター、例えば１種以上のプラスミド（例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重微小染色体）、レトロウイルス及びレンチウイルスのベクター構築物を含むがこれらに限定されないベクターである。一態様では、ベクターは、哺乳動物Ｔ細胞においてＴＦＰ構築物を発現することができる。一態様では、哺乳動物Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。
【０２５６】
改変Ｔ細胞
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される組換え核酸または本明細書に開示されるベクターを含む改変Ｔ細胞であり、当該改変Ｔ細胞は内因性ＴＣＲの機能的破壊を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのはまた、本明細書に開示される核酸のＴＦＰをコードする配列、または本明細書に開示される核酸の配列によってコードされるＴＦＰを含む改変Ｔ細胞であり、当該改変Ｔ細胞は内因性ＴＣＲの機能的破壊を含む。いくつかの実施形態において、本明細書にさらに開示されるのは、本明細書に開示されるＴＦＰをコードする配列、または本明細書に開示される核酸の配列によってコードされるＴＦＰを含む改変同種Ｔ細胞である。
【０２５７】
場合によっては、Ｔ細胞はＴＣＲ定常ドメインをコードする異種配列をさらに含み、当該ＴＣＲ定常ドメインは、ＴＣＲアルファ定常ドメイン、ＴＣＲベータ定常ドメイン、またはＴＣＲアルファ定常ドメインとＴＣＲベータ定常ドメインである。場合によっては、機能的に破壊される内因性ＴＣＲは、内因性ＴＣＲアルファ鎖、内因性ＴＣＲベータ鎖、または内因性ＴＣＲアルファ鎖と内因性ＴＣＲベータ鎖である。場合によっては、機能的に破壊された内因性ＴＣＲは、未改変の対照Ｔ細胞のものと比較して、ＭＨＣペプチド複合体への結合が減少する。場合によっては、機能的破壊は、内因性ＴＣＲをコードする遺伝子の破壊である。場合によっては、内因性ＴＣＲをコードする遺伝子の破壊とは、Ｔ細胞のゲノム由来の内因性ＴＣＲをコードする遺伝子の配列の除去である。場合によっては、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。場合によっては、Ｔ細胞はＣＤ８＋  Ｔ細胞またはＣＤ４＋  Ｔ細胞である。場合によっては、Ｔ細胞は同種Ｔ細胞である。場合によっては、改変Ｔ細胞は、抑制分子の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸を、細胞内シグナル伝達ドメインからの陽性シグナルを含む第２のポリペプチドと会合して、さらに含む。場合によっては、抑制分子は、ＰＤ１の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドとを含む。
【０２５８】
Ｔ細胞源
増殖及び遺伝子改変の前に、Ｔ細胞源を対象から採取する。「対象」という用語は、免疫応答を誘発することができる生物（例えば、哺乳動物）を包含することを意図する。対象の例として、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びそれらのトランスジェニック種が挙げられる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む、多くの供給源から得ることができる。本開示のある特定の態様では、当技術分野において利用可能な任意の数のＴ細胞株を使用することができる。本開示のある特定の態様では、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの、当業者に公知の任意の数の技術を用いて、対象から採取された血液単位から得ることができる。好ましい一態様では、個体の血流からの細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は通常、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞を含むリンパ球、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含有する。一態様では、アフェレーシスによって採取された細胞を洗浄して血漿画分を除去し、以降の処理ステップに備えて、細胞を適切な緩衝液または培地に入れてもよい。本開示の一態様では、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。代替的態様では、洗浄溶液はカルシウムを含まず、またマグネシウムを含んでいなくても、またはすべてではないものの二価カチオンの多くを含んでいなくてもよい。初期活性化ステップにカルシウムが存在しないことにより、活性化を増大させることができる。当業者であれば容易に理解できるように、洗浄ステップは、当業者に公知の方法、例えば半自動の「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ（登録商標）２９９１細胞処理装置、Ｂａｘｔｅｒ  ＯｎｃｏｌｏｇｙＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ（登録商標）５）を製造業者の指示に従って使用することにより行うことができる。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ非含有ＰＢＳ、Ｍｇ非含有ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅＡ、または緩衝剤を含む、または含まないその他の生理食塩水などに再懸濁してもよい。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁させてもよい。
【０２５９】
一態様では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）グラジエントによる遠心分離、または対向流遠心溶出法により単球を減少させることによって、末梢血リンパ球から単離する。陽性選択技術または陰性選択技術によって、特定のＴ細胞の亜集団、例えばＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋  Ｔ細胞をさらに単離することができる。例えば、一態様では、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な期間、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば３ｘ２８）をコンジュゲートしたビーズ、例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔとインキュベートすることによって、Ｔ細胞を単離する。一態様では、期間は約３０分である。さらなる態様では、期間は、３０分〜３６時間の範囲またはそれ以上の範囲であり、その間のすべての整数値である。さらなる態様では、期間は少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。さらに別の好ましい態様では、期間は１０〜２４時間である。一態様では、インキュベーション期間は２４時間である。腫瘍組織または免疫不全個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する場合など、他の細胞型と比較してＴ細胞が少ない場合には、状況を問わず、Ｔ細胞の単離に長いインキュベーション時間を用いてもよい。さらに、用いるインキュベーション時間を長くすることにより、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の捕捉効率を増加させることができる。したがって、時間を単に短縮または延長することにより、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させることができ、及び／またはＴ細胞に対するビーズの比率を（本明細書でさらに記載されるように）増減させることにより、培養開始時またはプロセス中の他の時点で、可否に応じてＴ細胞の亜集団を優先的に選択することができる。加えて、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３及び／または抗ＣＤ２８抗体の比率を増減させることにより、培養開始時または他の望ましい時点で、可否に応じてＴ細胞の亜集団を優先的に選択することができる。当業者であれば、本開示の文脈において、複数回の選択も使用できることを認識されよう。ある特定の態様では、活性化及び増殖過程において、選択手順を実施して「非選択」細胞を使用することが望ましい場合がある。「非選択」細胞はまた、さらに数回の選択を行ってもよい。
【０２６０】
陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に固有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせを用いて行うことができる。１つの方法は、陰性選択された細胞に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体カクテルを使用する、負磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞の分取及び／または選別である。例えば、陰性選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するには、モノクローナル抗体カクテルは通常、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体を含む。ある特定の態様では、通常ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、及びＦｏｘＰ３＋を発現する制御性Ｔ細胞を濃縮するかまたは陽性選択することが望ましい場合がある。あるいは、ある特定の態様では、抗Ｃ２５がコンジュゲートされたビーズまたは他の類似の選択方法によって、制御性Ｔ細胞を減少させる。
【０２６１】
一実施形態では、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢ、及びパーフォリン、またはその他の適切な分子、例えばその他のサイトカインの１つ以上を発現するＴ細胞集団を選択することができる。細胞発現のスクリーニング方法は、例えばＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／１２６７１２号に記載の方法で決定することができる。
【０２６２】
陽性選択または陰性選択によって所望の細胞集団を単離する場合に、細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変更することができる。ある特定の態様では、ビーズと細胞の混合量を大幅に減少させて（例えば、細胞濃度を増加させて）、細胞とビーズの接触を最大にすることが望ましい場合がある。例えば、一態様では、２０億細胞／ｍＬの濃度を使用する。一態様では、１０億細胞／ｍＬの濃度を使用する。さらなる態様では、１億細胞／ｍＬ超を使用する。さらなる態様では、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万細胞／ｍＬの細胞濃度を使用する。さらに別の一態様では、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億細胞／ｍＬの細胞濃度を使用する。さらなる態様では、１億２５００万または１億５０００万細胞／ｍＬの濃度を使用することができる。高濃度を使用すると、細胞収率、細胞活性化、及び細胞増殖の増加を生じさせることができる。さらに、高細胞濃度の使用により、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの、対象となる標的抗原の発現が弱い場合がある細胞、または腫瘍細胞が多く存在する試料（例えば、白血病の血液、腫瘍組織など）からの細胞をより効率的に捕捉することが可能になる。そのような細胞集団は治療的価値を有する可能性があり、取得することが望ましいと予想される。例えば、高濃度の細胞の使用により、通常はＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋  Ｔ細胞の効率的な選択が可能になる。
【０２６３】
関連する態様では、低濃度の細胞を使用することが望ましい場合がある。Ｔ細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の混合物を大幅に希釈することによって、粒子と細胞との間の相互作用が最小限に抑えられる。これにより、所望の抗原を大量に発現する細胞が選択され、粒子に結合される。例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、ＣＤ２８の発現レベルがより高く、希薄濃度でＣＤ８＋  Ｔ細胞よりも効率的に捕捉される。一態様では、使用される細胞の濃度は５ｘ１０６／ｍＬである。他の態様では、使用される濃度は、約１ｘ１０５／ｍＬ〜１ｘ１０６／ｍＬ、及びその間のあらゆる整数値であり得る。他の態様では、細胞は、様々な長さの時間にわたって、様々な速度で２〜１０℃または室温にてローテーター上でインキュベートすることができる。
【０２６４】
刺激用のＴ細胞はまた、洗浄ステップ後に凍結することもできる。理論に束縛されるものではないが、凍結及びその後の解凍ステップにより、顆粒球及びある程度の単球を細胞集団から除去することで、より均一な産物が得られる。血漿と血小板を除去する洗浄ステップの後、細胞を凍結溶液中に懸濁させてもよい。多くの凍結溶液及びパラメーターが当技術分野で公知であり、この状況において有用であるが、１つの方法は、２０％ＤＭＳＯ及び８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または１０％デキストラン４０と５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、及び７．５％ＤＭＳＯを含有する培養培地、または３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０と５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、及び７．５％ＤＭＳＯを含有する培養培地、または例えばＨｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａを含有する他の好適な細胞凍結培地を使用し、次いで細胞を−８０℃になるまで毎分１の速度で凍結させ、液体窒素貯蔵タンクの蒸気相中で保存することを含む。他の制御凍結方法を使用しても、−２０℃または液体窒素中で無制御に急速凍結する方法を使用してもよい。ある特定の態様では、凍結保存した細胞を本明細書に記載されるように解凍して洗浄し、室温で１時間静置した後、本開示の方法を使用して活性化する。
【０２６５】
また、本開示の文脈において、本明細書に記載される細胞の増殖が必要となり得る前の時点で、対象から血液試料またはアフェレーシス産物を採取することも企図される。したがって、増殖させる細胞の供給源は、必要に応じていつでも採取することができ、本明細書に記載されるようなＴ細胞療法が有益である、任意の数の疾患または病態に向けたＴ細胞療法に後ほど使用するために単離して凍結することができる。一態様では、血液試料またはアフェレーシスは、概ね健康な対象から採取される。ある特定の態様では、血液試料またはアフェレーシスは、疾患を発症する危険性があるが、まだ疾患を発症していない概ね健康な対象から採取され、対象となる細胞は後ほど使用するために単離して凍結される。ある特定の態様では、Ｔ細胞を増殖させ、凍結し、後で使用してもよい。ある特定の態様では、試料は、本明細書に記載される特定の疾患と診断された直後であるが、何らかの治療をする前に患者から採取される。さらなる態様では、関連する任意の数の治療法の前に、対象由来の血液試料またはアフェレーシスから細胞を単離する。このような治療法には、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤などの薬剤、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、及びミコフェノレートなどの免疫抑制剤、抗体、またはアレムツズマブ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ロミデプシンなどの他の免疫除去薬、ならびに照射による治療を含むが、これらに限定されない。
【０２６６】
本開示のさらなる態様では、Ｔ細胞は、機能的Ｔ細胞を対象に残す治療後に直接患者から採取される。この点に関して、ある種のがん治療、特に免疫系に損傷を与える薬物による治療後で、通常であれば患者が治療から回復中である治療直後の期間は、得られるＴ細胞の質が、ｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖に最適であるか、または増強され得ることが観察されている。同様に、本明細書に記載の方法を用いたｅｘ  ｖｉｖｏ操作後、これらの細胞は、移植及びｉｎ  ｖｉｖｏ増殖の増強に好ましい状態であり得る。したがって、本開示の文脈の範囲内で、この回復期中に、Ｔ細胞、樹状細胞、または造血系統の他の細胞を含む血液細胞を採取することが企図される。さらに、ある特定の態様では、動員（例えば、ＧＭ−ＣＳＦによる動員）及び条件付きレジメンを用いて、特に療法後のある規定された時間枠の間、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、及び／または増殖にとって有利に働く条件を対象に作り出すことができる。例示的な細胞型として、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及び免疫系の他の細胞が挙げられる。
【０２６７】
Ｔ細胞の活性化及び増殖
Ｔ細胞は一般に、例えば米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、及び同第７，５７２，６３１号に記載の方法を使用して、活性化及び増殖することができる。
【０２６８】
一般に、本開示のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する作用物質、及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドがそこに結合された表面と接触することによって増強させることができる。特に、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載されるように、表面上に固定された抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片、または抗ＣＤ２抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアを伴うプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触などによって刺激され得る。Ｔ細胞の表面での補助分子の共刺激には、補助分子と結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、Ｔ細胞の集団を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４＋  Ｔ細胞またはＣＤ８＋  Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するための、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ２８抗体の例として、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、当技術分野で一般に知られている他の方法と同様に使用することができる（Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５−３９７７，１９９８、Ｈａａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９、Ｇａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．２２７（１−２）：５３−６３，１９９９）。
【０２６９】
刺激に曝露された時間がさまざまであるＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、通常の血液またはアフェレーシス末梢血単核細胞産物は、細胞傷害性またはサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）よりも多くヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３及びＣＤ２８受容体を刺激することによりＴ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖すると、約８〜９日目以前には、主としてＴＨ細胞からなるＴ細胞の集団を産生するが、約８〜９日目以後、Ｔ細胞の集団は、ＴＣ細胞の集団を次第に多く含むようになる。したがって、治療の目的に応じて、主としてＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することが有利な場合がある。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されている場合、このサブセットの増殖度をより高めるのに有益な場合がある。
【０２７０】
さらに、ＣＤ４及びＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーも、細胞の増殖過程で大幅に、ただし大部分において再現性を伴って変動する。したがって、そのような再現性により、特定の目的に応じて活性化Ｔ細胞産物を調整することが可能になる。
【０２７１】
抗ＣＤ１９、抗ＢＣＭＡ、抗ＣＤ２２、抗ＲＯＲ１、抗ＰＤ−１、または抗ＢＡＦＦ  ＴＦＰを構築した後、種々のアッセイを使用して、分子の活性を評価することができ、この活性として、抗原刺激後のＴ細胞を増殖する能力、再刺激の非存在下でＴ細胞増殖を維持する能力、及び適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び動物モデルでの抗がん活性などがあるが、これらに限定されない。抗ＣＤ１９、抗ＢＣＭＡ、抗ＣＤ２２、抗ＲＯＲ１、抗ＰＤ−１、または抗ＢＡＦＦ  ＴＦＰの効果を評価するためのアッセイについては、以下でさらに詳細に記載する。
【０２７２】
初代Ｔ細胞におけるＴＦＰ発現のウエスタンブロット分析を用いて、単量体及び二量体の存在を検出することができる（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照）。極めて簡潔には、ＴＦＰを発現するＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との１：１混合物）を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１０日よりも長く増殖させた後、溶解して、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかける。ＴＣＲ鎖に対する抗体を使用して、ウエスタンブロッティングでＴＦＰを検出する。非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に同じＴ細胞のサブセットを使用して、共有結合二量体の生成の評価を可能にする。
【０２７３】
抗原刺激後のＴＦＰ＋Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖は、フローサイトメトリーにより測定することができる。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との混合物を、アルファＣＤ３／アルファＣＤ２８、及びＡＰＣで刺激した後、プロモーターの制御下でＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターで形質導入し、分析する。例示的なプロモーターとして、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１アルファ、ユビキチンＣ、またはホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセットでの培養の６日目に、ＧＦＰの蛍光をフローサイトメトリーにより評価する（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照）。あるいは、０日目にＣＤ４＋  Ｔ細胞とＣＤ８＋  Ｔ細胞との混合物を、アルファＣＤ３／アルファＣＤ２８被覆磁気ビーズで刺激し、１日目に、ＴＦＰを発現するバイシストロニックなレンチウイルスベクターを、２Ａリボソームスキッピング配列を用いたｅＧＦＰと共に使用して、ＴＦＰに形質導入する。洗浄後、ＣＤ１９＋  Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２−ＣＤ１９）、野生型Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２野生型）、または抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体の存在下でｈＣＤ３２及び４−１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ＢＢＬ−３／２８）のいずれかで再刺激する。外因性ＩＬ−２を隔日１００ＩＵ／ｍＬで培養物に加える。ビーズに基づく計数を用いてフローサイトメトリーによりＧＦＰ＋  Ｔ細胞を数える（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照）。
【０２７４】
再刺激を実施せずに持続したＴＦＰ＋  Ｔ細胞の増殖も測定することができる（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照）。簡潔には、０日目にアルファＣＤ３／アルファＣＤ２８被覆磁気ビーズで刺激を与え、１日目に、示されたＴＦＰに形質導入した後、培養の８日目に平均Ｔ細胞体積（ｆｌ）を、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ＩＩＩ粒子カウンターを使用して測定する。
【０２７５】
動物モデルを使用してＴＦＰ−Ｔ活性を測定することもできる。例えば、免疫不全マウスにおいて、初代ヒトｐｒｅ−Ｂ  ＡＬＬの処理にヒトＣＤ１９特異的ＴＦＰ＋  Ｔ細胞を使用する異種移植モデルを用いることができる（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照）。極めて簡潔には、ＡＬＬの定着後に、マウスを処置群に関してランダム化する。異なる数の改変Ｔ細胞を１：１比で、Ｂ−ＡＬＬを有するＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ−／−マウスに同時注入する。マウス由来の脾臓ＤＮＡにおける各ベクターのコピー数を、Ｔ細胞の注入後の様々な時点で評価する。１週間間隔で動物を白血病について評価する。アルファＣＤ１９−ゼータＴＦＰ＋  Ｔ細胞、またはモック形質導入Ｔ細胞を注入したマウスにおいて、末梢血ＣＤ１９＋  Ｂ−ＡＬＬ芽細胞数を測定する。各群の生存曲線を、ログランク検定を用いて比較する。加えて、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ−／−マウスにＴ細胞を注入後４週間の末梢血ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の絶対数も分析することができる。マウスに白血病細胞を注入し、３週間後に、ｅＧＦＰに連結されたＴＦＰをコードするバイシストロニックレンチウイルスベクターでＴＦＰを発現するように操作したＴ細胞を注入する。注入の前に、モック形質導入細胞と混合することにより、４５〜５０％のインプットＧＦＰ＋  Ｔ細胞に対してＴ細胞を正規化し、フローサイトメトリーにより確認する。１週間隔で動物を白血病について評価する。ＴＦＰ＋  Ｔ細胞群の生存曲線を、ログランク検定を用いて比較する。
【０２７６】
用量依存的なＴＦＰ処置反応を評価することができる（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照）。例えば、２１日目に、ＴＦＰ  Ｔ細胞を注入したマウス、同数のモック形質導入Ｔ細胞を注入したマウス、またはＴ細胞を注入していないマウスにおいて、白血病の定着後３５〜７０日目に末梢血を採取する。３５日目及び４９日目に、各群のマウスからランダムに採血して、末梢血ＣＤ１９＋  ＡＬＬ芽細胞数の測定を行った後、殺処分する。残りの動物は、５７日目及び７０日目に評価する。
【０２７７】
細胞増殖及びサイトカイン産生の評価については、例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）に以前に記載されている。簡潔には、ＴＦＰ介在型増殖の評価は、洗浄したＴ細胞を、ＣＤ１９を発現するＫ５６２細胞（Ｋ１９）、またはＣＤ３２及びＣＤ１３７を発現するＫ５６２細胞（ＫＴ３２−ＢＢＬ）と、最終的なＴ細胞：Ｋ５６２細胞比が２：１になるように混合して、マイクロタイタープレート中にて実施する。使用前にガンマ線によりＫ５６２細胞を照射する。抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）及び抗ＣＤ２８（クローン９．３）モノクローナル抗体を、ＫＴ３２−ＢＢＬ細胞を含む培養物に加え、Ｔ細胞の増殖を刺激する陽性対照として機能させる。これは、このシグナルが長期間のＣＤ８＋  Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖を裏付けるという理由による。Ｔ細胞を、培養物中で、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）蛍光ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びフローサイトメトリーを使用して、製造業者の指示に従って計数する。ＴＦＰ＋  Ｔ細胞を、ｅＧＦＰ−２Ａが連結されたＴＦＰ発現レンチウイルスベクターで操作したＴ細胞を使用してＧＦＰの発現により同定する。ＧＦＰを発現しないＴＦＰ＋  Ｔ細胞については、ビオチン化組換えＣＤ１９タンパク質及び二次アビジン−ＰＥコンジュゲートによりＴＦＰ＋  Ｔ細胞を検出する。Ｔ細胞でのＣＤ４＋及びＣＤ８＋の発現も、特異的モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により同時に検出される。サイトカインの測定を、再刺激の２４時間後に採取した上清で、ヒトＴＨ１／ＴＨ２サイトカインサイトメトリービーズアレイキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、製造業者の指示に従って実施する。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して蛍光を評価し、データを製造業者の指示に従って解析する。
【０２７８】
細胞毒性を、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによって評価することができる（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照）。標的細胞（Ｋ５６２株及び初代ｐｒｏ−Ｂ−ＡＬＬ細胞）に、５１Ｃｒ（ＮａＣｒＯ４，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒである）を、３７℃で２時間、頻繁に撹拌しながら充填し、これを完全ＲＰＭＩで２度洗浄し、マイクロタイタープレートに播種する。エフェクターＴ細胞を、種々のエフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で完全なＲＰＭＩのウェル中の標的細胞と混合する。さらに、培地のみを含むウェル（自然放出、ＳＲ）、または界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００の１％溶液を含むウェル（総放出、ＴＲ）を用意する。３７℃で４時間のインキュベーション後に、各ウェルから上清を採取する。次に、放出された５１Ｃｒをガンマ粒子カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．）を使用して測定する。各条件を少なくとも３連で実施し、細胞溶解率（％）を、式：細胞溶解率（％）＝（ＥＲ−ＳＲ）／（ＴＲ−ＳＲ）（式中、ＥＲは、各実験条件で放出された５１Ｃｒの平均を表す）を用いて算出する。
【０２７９】
画像技術を用いて、腫瘍を保有する動物モデルにおけるＴＦＰの特異的輸送及び増殖を評価することができる。そのようなアッセイは、例えば、Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２２：１５７５−１５８６（２０１１）に記載されている。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−（ＮＳＧ）マウスにＮａｌｍ−６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−３２７３（商標））を静注した７日後に、ＴＦＰ構築物のエレクトロポレーション後４時間のＴ細胞を静注する。ホタルルシフェラーゼを発現するレンチウイルス構築物をＴ細胞に安定的にトランスフェクトし、マウスの生物発光を撮像する。あるいは、Ｎａｌｍ−６異種移植モデルにおけるＴＦＰ＋  Ｔ細胞の単回注射の治療有効性及び特異性を、以下のように測定することができる。ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼを安定的に発現するように形質導入したＮａｌｍ−６を注射し、続いて７日後に、ＣＤ１９  ＴＦＰをエレクトロポレーションしたＴ細胞を尾静脈に単回注射する。注射後の様々な時点で動物を撮像する。例えば、５日目（処置の２日前）及び８日目（ＴＦＰ＋ＰＢＬの２４時間後）の代表的なマウスにおけるホタルルシフェラーゼ陽性白血病の光子密度ヒートマップを作成することができる。
【０２８０】
本明細書の実施例の項に記載のもの、ならびに当技術分野において公知のものを含めた他のアッセイもまた、本明細書に開示される抗ＣＤ１９、抗ＢＣＭＡ、抗ＣＤ２２、抗ＲＯＲ１、抗ＰＤ−１、または抗ＢＡＦＦ  ＴＦＰ構築物を評価するために用いることができる。
【０２８１】
医薬組成物
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、（ａ）本開示の改変Ｔ細胞、及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。そのような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液、グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、ならびに防腐剤を含んでもよい。本開示の組成物は、一態様では、静脈内投与用に製剤化される。
【０２８２】
本開示の医薬組成物は、治療（または予防）する疾患に適した方法で投与することができる。投与の量及び頻度は、患者の病態、ならびに患者の疾患の種類及び重症度のような要因によって決定することになるが、適切な投与量を臨床試験によって決定してもよい。
【０２８３】
一実施形態では、医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製能力のあるレンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶ  ｇａｇ、残留抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ、マウス抗体、プールされたヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地成分、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌、及び真菌からなる群から選択される、汚染物質を実質的に含まず、例えば検出可能なレベルの汚染物質が存在しない。一実施形態では、細菌は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ａ群からなる群から選択される少なくとも１種である。
【０２８４】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療量」が示されている場合、投与される本開示の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染症または転移の程度、及び患者（対象）の病態に関する個体差を考慮して、医師が決定することができる。一般に、本明細書に記載のＴ細胞を含む医薬組成物は、範囲内のすべての整数値を含む、１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重、場合によっては１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重の投与量で投与できるといってよい。また、Ｔ細胞組成物を、これらの投与量で複数回投与してもよい。細胞は、免疫療法において一般に公知である注入技術を用いて投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照）。
【０２８５】
ある特定の態様では、活性化Ｔ細胞を対象に投与し、その後引き続き再採血を行い（またはアフェレーシスを実施）、それに由来するＴ細胞を本開示に従って活性化し、これらの活性化及び増殖したＴ細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。この過程を、数週間ごとに複数回実施することができる。ある特定の態様では、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血からＴ細胞を活性化することができる。ある特定の態様では、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、または１００ｃｃの採血からＴ細胞を活性化することができる。
【０２８６】
本組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸液、注入、または移植によるものを含む、任意の利便な方法で行ってよい。本明細書に記載の組成物は、患者に、経動脈投与、皮下投与、皮内投与、腫瘍内投与、リンパ節内投与、髄内投与、筋肉内投与、静脈内（ｉ．ｖ．）注射投与、または腹腔内投与することができる。一態様では、本開示のＴ細胞組成物は、皮内注射または皮下注射によって患者に投与される。一態様では、本開示のＴ細胞組成物は、ｉ．ｖ．注射によって投与される。Ｔ細胞組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射してもよい。
【０２８７】
特定の例示的な態様では、対象は白血球搬出法を受けてもよい。これは、ｅｘ  ｖｉｖｏで白血球を採取、濃縮、または減少させ、対象となる細胞、例えばＴ細胞を選択及び／または単離するものである。このようなＴ細胞分離株を、当技術分野において公知の方法で増殖し、本開示の１種以上のＴＦＰ構築物を導入できるように処理することで、本開示の改変Ｔ−Ｔ細胞を生成することができる。引き続き、高用量の化学療法と、それに続く末梢血幹細胞移植による標準治療を、それを必要とする対象が受けてもよい。ある特定の態様では、対象は、移植後または移植と同時に、本開示の増殖した改変Ｔ細胞の注入を受ける。追加の態様では、増殖細胞を術前または術後に投与する。
【０２８８】
患者に投与すべき上記処置の投与量は、治療する病態及び治療のレシピエントの厳密な性質に応じて異なる。ヒト投与の投与量の秤量は、当技術分野で許容される慣行に従って行うことができる。例えば、アレムツズマブの用量は一般に、成人患者の場合、１〜約１００ｍｇの範囲であり、通常は１〜３０日の期間、毎日投与する。好ましい１日用量は、１〜１０ｍｇ／日であるが、場合によっては、最大４０ｍｇ／日の多用量を用いてもよい（米国特許第６，１２０，７６６号に記載）。
【０２８９】
一実施形態では、ＴＦＰを、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を用いてＴ細胞に導入し、本開示のＴＦＰ  Ｔ細胞の最初の投与、及びそれに続く１回以上の本開示のＴＦＰ  Ｔ細胞の投与を対象（例えば、ヒト）に行うが、その場合、１回以上の後続投与は、先の投与の、１５日後未満、例えば１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２日後に投与される。一実施形態では、本開示のＴＦＰ  Ｔ細胞の複数回投与は、１週間ごとに対象（例えばヒト）に実施され、例えば、本開示のＴＦＰ  Ｔ細胞の２、３、または４回の投与を１週間ごとに実施する。一実施形態では、１週間ごとに複数回のＴＦＰ  Ｔ細胞の投与（例えば、１週間ごとに２、３、または４回の投与）（本明細書ではサイクルとも称する）を対象（例えばヒト対象）が受けた後、１週間はＴＦＰ  Ｔ細胞の投与をせず、その後、さらに１回以上のＴＦＰ  Ｔ細胞の投与（例えば、１週間ごとに複数回のＴＦＰ  Ｔ細胞の投与）を対象に実施する。別の実施形態では、複数サイクルのＴＦＰ  Ｔ細胞を対象（例えばヒト対象）が受け、各サイクルの間隔は、１０、９、８、７、６、５、４、または３日未満である。一実施形態では、ＴＦＰ  Ｔ細胞は、１週間に３回の投与になるように隔日投与される。一実施形態では、本開示のＴＦＰ  Ｔ細胞は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８週間、またはそれより長く投与される。
【０２９０】
一態様では、ＣＤ１９  ＴＦＰ  Ｔ細胞を、レンチウイルスなどのレンチウイルス型ウイルスベクターを使用して産生する。その方法で産生されるＴＦＰ−Ｔ細胞は、安定的にＴＦＰを発現する。
【０２９１】
一態様では、ＴＦＰ  Ｔ細胞は、形質導入後、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日間、ＴＦＰベクターを一過性に発現する。ＴＦＰの一過性発現は、ＲＮＡ  ＴＦＰベクターの送達によって行うことができる。一態様では、ＴＦＰ  ＲＮＡを、エレクトロポレーションによってＴ細胞に形質導入する。
【０２９２】
一過性に発現するＴＦＰ  Ｔ細胞（特に、マウスｓｃＦｖ保持ＴＦＰ  Ｔ細胞）を使用して治療される患者に生じ得る潜在的な問題は、複合治療後のアナフィラキシーである。
【０２９３】
理論に束縛されるものではないが、そのようなアナフィラキシー反応は、体液性抗ＴＦＰ反応を発症している患者、すなわち抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＴＦＰ抗体によって引き起こされる可能性があると思われる。抗原への曝露が１０〜１４日間中断された場合に、患者の抗体産生細胞が、ＩｇＧアイソタイプ（アナフィラキシーを引き起こさない）からＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチを行うと考えられる。
【０２９４】
一過性ＴＦＰ療法（ＲＮＡ形質導入によって産生されるものなど）の過程で抗ＴＦＰ抗体反応が患者に生じる危険性が高い場合、ＴＦＰ  Ｔ細胞注入の中断は、１０〜１４日よりも長く継続するべきではない。
【０２９５】
改変Ｔ細胞の作製方法
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、本開示の改変Ｔ細胞を作製する方法であり、この方法は、（ａ）ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、またはそれらの組み合わせをコードする内因性ＴＣＲ遺伝子を破壊し、それにより内因性ＴＣＲ遺伝子の機能的破壊を含んだＴ細胞を作製することと、（ｂ）内因性ＴＣＲ遺伝子の機能的破壊を含んだＴ細胞に、本開示の組換え核酸または本明細書に開示されるベクターを形質導入することとを含む。場合によっては、破壊は、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、またはＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖をコードする内因性遺伝子を標的とするヌクレアーゼタンパク質、またはヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸配列をＴ細胞に形質導入することを含む。
【０２９６】
いくつかの実施形態において、本明細書にさらに開示されるのは、本開示の改変Ｔ細胞を作製する方法であり、この方法は、内因性ＴＣＲ遺伝子の機能的破壊を含んだＴ細胞に、本明細書に開示される組換え核酸または本明細書に開示されるベクターを形質導入することを含む。場合によっては、内因性ＴＣＲ遺伝子の機能的破壊を含んだＴ細胞は、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、またはＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖をコードする内因性ＴＣＲ遺伝子の機能的破壊を含んだＴ細胞である。
【０２９７】
場合によっては、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。場合によっては、内因性ＴＣＲ遺伝子の機能的破壊を含んだＴ細胞は、未改変の対照Ｔ細胞のものと比較して、ＭＨＣ−ペプチド複合体への結合が減少する。
【０２９８】
場合によっては、ヌクレアーゼはメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼ、またはｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼである。場合によっては、組換え核酸またはベクターに含まれる配列は、切断部位で内因性ＴＣＲサブユニット遺伝子に挿入され、この内因性ＴＣＲサブユニット遺伝子への配列の挿入により内因性ＴＣＲサブユニットが機能的に破壊される。場合によっては、ヌクレアーゼはメガヌクレアーゼである。場合によっては、メガヌクレアーゼは、第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットは認識配列の第１の認識半部位に結合し、第２のサブユニットは認識配列の第２の認識半部位に結合する。場合によっては、メガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、このリンカーは第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。
【０２９９】
遺伝子編集技術
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変Ｔ細胞は、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ（登録商標）、例えば米国特許第８，６９７，３５９号を参照）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ、例えば米国特許第９，３９３，２５７号を参照）、メガヌクレアーゼ（１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列を含む大きな認識部位を有するエンドデオキシリボヌクレアーゼ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ、例えばＵｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）ｖｌ１，６３６−６４６を参照）、またはｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼとＴＡＬリピートとの融合タンパク質）の方法などの遺伝子編集技術を用いて操作される。このようにして、キメラ構築物を操作すると、立体構造またはシグナル伝達能力など、各サブユニットの望ましい特性を組み合わせることができる。それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｎｄｅｒ  ＆  Ｊｏｕｎｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１４）ｖ３２，３４７−５５、及びＪｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９．１０：７０４−７１６も参照のこと。いくつかの実施形態では、複数の天然ＴＣＲサブユニットドメインの態様を有する（すなわち、キメラである）ように、ＴＦＰサブユニットの１つ以上の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞質ドメインが操作される。
【０３００】
近年、治療応用の礎となる、ヒトゲノムを恒久的に改変し、部位特異的ゲノム修飾を疾患関連遺伝子に導入する技術が開発されている。現在、これらの技術は「ゲノム編集」として一般に知られている。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術を用いて、内因性ＴＣＲ遺伝子を破壊する。いくつかの実施形態では、言及する内因性ＴＣＲ遺伝子は、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、またはＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、内因性ＴＣＲ遺伝子における複数のゲノム遺伝子座の同時破壊を可能にする多重ゲノム編集を容易にする。いくつかの実施形態では、多重ゲノム編集技術を適用して、内因性ＴＣＲ、及び／またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、及び／またはプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、及び／または他の遺伝子の発現が欠損している遺伝子破壊Ｔ細胞を産生する。
【０３０２】
現在の遺伝子編集技術には、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムが含まれる。これら４種の主要なクラスの遺伝子編集技術は、ＤＮＡのユーザー定義配列の結合と、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）の介在という共通の作用機序を共有している。さらにＤＳＢは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または（ドナーＤＮＡが存在する場合）相同組換え（ＨＲ）、すなわちドナーＤＮＡ断片から相同配列を導入する事象のいずれかにより修復することができる。加えて、ニッカーゼヌクレアーゼは一本鎖ＤＮＡ切断（ＳＳＢ）を産生する。ＤＳＢは、ドナーＤＮＡから相同配列を導入する事象である、一本鎖ＤＮＡ組み込み（ｓｓＤＩ）または一本鎖鋳型修復（ｓｓＴＲ）によって修復することができる。
【０３０３】
ゲノムＤＮＡの遺伝子改変は、対象となる遺伝子座のＤＮＡ配列を認識するように操作された部位特異的な希少切断エンドヌクレアーゼを使用して実施することができる。操作された部位特異的エンドヌクレアーゼを作製する方法は、当技術分野において公知である。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を、ゲノム内の所定の部位を認識して切断するように操作することができる。ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを、Ｆｏｋ１制限酵素のヌクレアーゼドメインに融合して含むキメラタンパク質である。合理的手段または実験的手段によりジンクフィンガードメインを再設計し、長さ１８塩基対の所定のＤＮＡ配列に結合するタンパク質を作製することができる。この操作されたタンパク質ドメインをＦｏｋ１ヌクレアーゼに融合することにより、ゲノムレベルの特異度でＤＮＡ切断を標的とすることが可能である。ＺＦＮは、広範囲の真核生物における遺伝子の付加、除去、及び置換の標的化に幅広く使用されている（Ｄｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３，５９７８に概説）。同様に、ゲノムＤＮＡの特異的部位を切断するＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を産生することができる。ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮは、操作された部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼドメインに融合して含む（Ｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．２３：９３−９に概説）。ただし、ＴＡＬＥＮの場合、ＤＮＡ結合ドメインは、それぞれが単一のＤＮＡ塩基対を特異的に認識するＴＡＬエフェクタードメインの縦列配列を含む。小型ＴＡＬＥＮは、二量体化を必要としない代替エンドヌクレアーゼ構造を有する（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．４：１７６２）。小型ＴＡＬＥＮは、操作された部位特異的ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを。Ｉ−ＴｅｖＩホーミングエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインに融合して含む。Ｆｏｋ１とは異なり、Ｉ−ＴｅｖＩは二本鎖ＤＮＡ切断を生成するために二量体化を必要としないため、小型ＴＡＬＥＮは単量体として機能する。
【０３０４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに基づいて操作されたエンドヌクレアーゼもまた、当技術分野において公知である（Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．８：２２８１−２３０８、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０：９５７−６３）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集技術は、ＤＮＡ標的化の特異性及び切断活性を、短鎖ガイドＲＮＡまたは二重鎖ｃｒＲＮＡ／ＴｒａｃｒＲＮＡによってプログラム可能であるエンドヌクレアーゼタンパク質で構成されている。ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、（１）通常は微生物Ｃａｓ９である、カスパーゼエフェクターヌクレアーゼ、及び（２）ヌクレアーゼをゲノム内の対象となる位置に誘導する１８〜２０ヌクレオチドの標的化配列を含む短鎖「ガイドＲＮＡ」またはＲＮＡ二重鎖という２つの要素を含む。それぞれが異なる標的化配列を持つ複数のガイドＲＮＡを同じ細胞で発現させることにより、ゲノム内の複数の部位を同時に標的とするＤＮＡ切断が可能である（マルチプレックスゲノム編集）。
【０３０５】
当技術分野において公知であるＣＲＩＳＰＲシステムには２つのクラスがあり（Ａｄｌｉ（２０１８）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．９：１９１１）、それぞれ複数のＣＲＩＳＰＲ型が含まれている。クラス１には、古細菌で一般的にみられるＩ型及びＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムが含まれる。また、クラスＩＩにはＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、及びＶＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムが含まれる。最も幅広く使用されているＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムであるが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムはゲノム編集の研究者によって別の目的に再利用されている。過去数年内で、１０を超える異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が改造された（Ａｄｌｉ（２０１８）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．９：１９１１）。そのうち、Ａｃｉｄ−ａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ（ＡｓＣｐｆ１）及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＬｂＣｐｆ１）由来のＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）タンパク質などが特に興味深い。
【０３０６】
ホーミングエンドヌクレアーゼは、植物及び真菌のゲノムに一般的にみられる１５〜４０塩基対の切断部位を認識する天然に存在するヌクレアーゼ群である。それらは、グループ１の自己スプライシングイントロン及びインテインなどの寄生生物ＤＮＡ要素と頻繁に連係する。これらは、染色体に二本鎖切断を生じさせ、細胞ＤＮＡ修復機構を動員することにより、宿主ゲノムの特異的位置での相同組換えまたは遺伝子挿入を自然に促進する（Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００６），Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８：４９−９５）。特定のアミノ酸の置換により、ホーミングヌクレアーゼのＤＮＡ切断特異性をリプログラムすることができる（Ｎｉｙｏｎｚｉｍａ（２０１７），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｉ．３０（７）：５０３−５２２）。メガヌクレアーゼ（ＭＮ）は、細菌のホーミングエンドヌクレアーゼに由来し、固有の標的部位に合わせて操作された、生得的なヌクレアーゼ活性をもつ単量体タンパク質である（Ｇｅｒｓｂａｃｈ（２０１６），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２４：４３０−４４６）。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼは、操作されたＩ−ＣｒｅＩホーミングエンドヌクレアーゼである。他の実施形態では、メガヌクレアーゼは、操作されたＩ−ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼである。
【０３０７】
言及した４種の主要な遺伝子編集技術に加えて、メガヌクレアーゼ、ＺＦＮ、及びＴＡＬＥＮの融合体を含むキメラタンパク質を操作して、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの結合親和性とメガヌクレアーゼの切断特異性を利用する新規な単量体酵素が産生されている（Ｇｅｒｓｂａｃｈ（２０１６），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２４：４３０−４４６）。例えば、ｍｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥＮ由来のＤＮＡ結合ドメインの調整の容易さとメガヌクレアーゼの高い切断効率とを兼ね備える単一のキメラタンパク質である。
【０３０８】
遺伝子編集技術を実行するには、ヌクレアーゼが、またＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの場合には、ｇＲＮＡが、対象となる細胞に効率的に送達されなければならない。物理的方法、化学的方法、及びウイルスによる方法などの送達方法も当技術分野において公知である（Ｍａｌｉ（２０１３）．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１９：３−８．）。場合によっては、物理的送達方法は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、または微粒子銃の使用から選択することができるが、これに限定されない。一方、化学的送達方法では、リン酸カルシウム、脂質、またはタンパク質などの複雑な分子の使用を必要とする。いくつかの実施形態では、ウイルス送達方法は、アデノウイルス、レンチウイルス、及びレトロウイルスなどであるがこれらに限定されないウイルスを使用する遺伝子編集技術に適用される。
【０３０９】
治療方法
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、治療を必要とする対象におけるがんの治療方法であり、この方法は、本明細書に開示される、治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書にさらに開示されるのは、治療を必要とする対象におけるがんの治療方法であり、この方法は、（ａ）本明細書に開示される方法に従って作製される改変Ｔ細胞、及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
【０３１０】
場合によっては、改変Ｔ細胞は同種異系Ｔ細胞である。場合によっては、有効量の未改変の対照Ｔ細胞を投与した対象と比較して、対象において放出されるサイトカインが少ない。場合によっては、本明細書に開示される組換え核酸または本明細書に開示されるベクターを含む有効量の改変Ｔ細胞を投与した対象と比較して、対象において放出されるサイトカインが少ない。
【０３１１】
場合によっては、この方法は、医薬組成物の有効性を増加させる薬剤と組み合わせて医薬組成物を投与することを含む。場合によっては、この方法は、医薬組成物に付随する１つ以上の副作用を改善する薬剤と組み合わせて医薬組成物を投与することを含む。
【０３１２】
場合によっては、がんは固形癌、リンパ腫、または白血病である。場合によっては、がんは、腎細胞癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、及び胃癌からなる群から選択される。
【０３１３】
本開示は、ＴＦＰ及びＴＣＲアルファ及び／またはベータ定常ドメインを発現するようにＴ細胞を遺伝子改変し、改変Ｔ細胞を、それを必要とするレシピエントに注入するタイプの細胞療法を含む。注入された細胞は、レシピエントの腫瘍細胞を殺傷することができる。抗体療法とは異なり、この改変Ｔ細胞はｉｎ  ｖｉｖｏで複製可能であるため、長期的に残存し、持続的な腫瘍制御をもたらすことができる。様々な態様において、患者に投与されるＴ細胞、またはその継代は、患者へのＴ細胞の投与後、少なくとも４か月間、５か月間、６か月間、７か月間、８か月間、９か月間、１０か月間、１１か月間、１２か月間、１３か月間、１４か月間、１５か月間、１６か月間、１７か月間、１８か月間、１９か月間、２０か月間、２１か月間、２２か月間、２３か月間、２年間、３年間、４年間、または５年間、患者に存続する。
【０３１４】
本開示はまた、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡにより、ＴＦＰ及びＴＣＲアルファ及び／またはベータ定常ドメインを一過性発現するようにＴ細胞を改変し、改変Ｔ細胞を、それを必要とするレシピエントに注入するタイプの細胞療法も含む。注入された細胞は、レシピエントの腫瘍細胞を殺傷することができる。したがって、様々な態様において、患者に投与されたＴ細胞は、患者へのＴ細胞の投与後、１か月未満、例えば３週間、２週間、または１週間存在する。
【０３１５】
特定の理論に束縛されるものではないが、改変Ｔ細胞によって誘発される抗腫瘍免疫応答は、能動的な免疫応答の場合もあれば、または受動的な免疫応答の場合もあり、あるいは直接免疫応答か間接免疫応答かに起因し得る。
【０３１６】
一態様では、本開示のヒト改変Ｔ細胞は、哺乳動物におけるｅｘ  ｖｉｖｏ免疫付与及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏ療法のためのワクチンの一種であり得る。一態様では、哺乳動物はヒトである。
【０３１７】
ｅｘ  ｖｉｖｏ免疫付与に関して、細胞を哺乳動物に投与する前に、ｉ）細胞の増殖、ｉｉ）ＴＦＰ及びＴＣＲアルファ及び／またはベータ定常ドメインをコードする核酸の細胞への導入、またはｉｉｉ）細胞の凍結保存のうちの少なくとも１つをｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う。
【０３１８】
ｅｘ  ｖｉｖｏ手順は当技術分野において周知されており、以下で網羅的に考察する。簡潔には、細胞は哺乳動物（例えばヒト）から単離され、本明細書に開示されるベクターで遺伝子改変（すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入またはトランスフェクト）される。改変Ｔ細胞を哺乳動物のレシピエントに投与して、治療上の利点をもたらすことができる。哺乳動物のレシピエントはヒトであってもよく、改変細胞はそのレシピエントに対して自己由来であり得る。あるいは、細胞は、レシピエントに対して、同種異系、同系、または異種であり得る。
【０３１９】
造血幹細胞及び前駆細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖のための手順は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，１９９，９４２号に記載されており、本開示の細胞に適用することができる。他の好適な方法は当技術分野において公知であるため、本開示は、細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖に関するいかなる特定の方法にも限定されない。簡潔には、Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ培養及び増殖は、（１）末梢血採取または骨髄移植片からの哺乳動物由来ＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞の回収、及び（２）そのような細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖を含む。米国特許第５，１９９，９４２号に記載の細胞増殖因子に加えて、ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３、及びｃ−ｋｉｔリガンドなどの他の因子を、細胞の培養及び増殖に使用することができる。
【０３２０】
ｅｘ  ｖｉｖｏ免疫付与に関しては、細胞を用いたワクチンの使用に加え、本開示はまた、患者の抗原に対する免疫応答を誘発するｉｎ  ｖｉｖｏ免疫付与のための組成物及び方法を提供する。
【０３２１】
一般に、本明細書に記載されるように活性化及び増殖した細胞は、免疫不全状態の個体に起こる疾患の治療及び予防に利用することができる。
【０３２２】
本開示の改変Ｔ細胞は、単独で投与しても、あるいは希釈剤及び／またはＩＬ−２もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の成分と組み合わせて医薬組成物として投与してもよい。
【０３２３】
併用療法
本明細書に記載の改変Ｔ細胞は、他の公知の薬剤及び療法と組み合わせて使用することができる。本明細書で使用される場合、「組み合わせて」投与するとは、対象が疾患に罹患している期間、対象に２種（またはそれ以上）の異なる治療が送達されること、例えば、患者が障害と診断された後で、かつ障害が治癒する前もしくは消失する前、または他の理由で治療が中止される前に、２種以上の治療が送達されることを意味する。いくつかの実施形態では、第１の治療の送達が、第２の送達の開始時に引き続き行われているため、投与面で重複がある。これを本明細書で「同時」または「同時送達」と称することもある。他の実施形態では、第１の治療の送達は、他の治療の送達が開始される前に終了する。いずれの場合のいくつかの実施形態においても、投与の組み合わせにより、治療の有効性は高まる。例えば、第１の治療をせずに第２の治療が投与された場合に認められるもの、または類似の状況が第１の治療により認められるものよりも、第２の治療が有効である、例えば、第２の治療を減らしても同等の効果が認められるか、または第２の治療で症状が大幅に軽減する。いくつかの実施形態では、送達は、症状、または疾患に関連する他のパラメーターの軽減が、他方の治療をせずに送達される一方の治療で観察されるであろうものよりも大きいような送達である。２種の治療の効果は、部分的に相加的、完全に相加的、または相加を超える場合がある。送達は、送達された第１の治療の効果が、第２の治療が送達されるときに引き続き検出可能であるような送達であり得る。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、「少なくとも１種の追加治療薬」は、改変Ｔ細胞を含む。また、同じかもしくは異なる標的抗原、または同じ標的抗原上の同じかもしくは異なるエピトープに結合する複数のＴＦＰを発現するＴ細胞も提供される。Ｔ細胞の第１のサブセットが第１のＴＦＰとＴＣＲアルファ及び／またはベータ定常ドメインを発現し、Ｔ細胞の第２のサブセットが第２のＴＦＰとＴＣＲアルファ及び／またはベータ定常ドメインを発現するＴ細胞の集団も提供される。
【０３２５】
本明細書に記載の改変Ｔ細胞と、少なくとも１種の追加治療薬とは、同時に、同じ組成物かもしくは別々の組成物で、または逐次的に投与することができる。逐次投与の場合、本明細書に記載の改変Ｔ細胞を最初に投与し、追加薬剤を２番目に投与しても、または投与の順序を逆にしてもよい。
【０３２６】
さらなる態様では、本明細書に記載の改変Ｔ細胞は、手術、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、及びＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、またはアレムツズマブなどの他の免疫除去薬、抗ＣＤ３抗体、または他の抗体療法、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ロミデプシン、サイトカイン、及び照射、Ｉｚｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２００８  ＪＮｅｕｒｏｓｕｒｇ  １０８：９６３−９７１に記載されるようなペプチドワクチンと併用して治療レジメンに使用することができる。
【０３２７】
一実施形態では、改変Ｔ細胞の投与に伴う副作用を軽減または改善する薬剤を対象に投与することができる。改変Ｔ細胞の投与に伴う副作用として、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）及び血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）、別称マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＲＳの症状として、高熱、悪心、一過性低血圧、低酸素症などが挙げられる。したがって、本明細書に開示される方法は、本明細書に記載の改変Ｔ細胞を対象に投与すること、及び改変Ｔ細胞を用いた治療により生じる可溶性因子のレベル上昇を管理する薬剤をさらに投与することを含み得る。一実施形態では、対象において上昇する可溶性因子は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、及びＩＬ−６のうちの１つ以上である。したがって、この副作用に対処するために投与される薬剤は、これらの可溶性因子の１つ以上を中和する薬剤であり得る。そのような薬剤として、ステロイド、ＴＮＦαの阻害剤、及びＩＬ−６の阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。ＴＮＦα阻害剤の例はエタネルセプトである。ＩＬ−６阻害剤の例はトシリズマブ（ｔｏｃ）である。
【０３２８】
一実施形態では、改変Ｔ細胞の活性を増強する薬剤を対象に投与することができる。例えば、一実施形態では、薬剤は抑制分子を阻害する薬剤であり得る。抑制分子、例えばプログラム死１（ＰＤ１）は、いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞が免疫エフェクター応答を高める能力を低下させることができる。抑制分子の例として、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及びＴＧＦＲベータが挙げられる。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質レベルでの阻害による抑制分子の阻害は、改変Ｔ細胞の性能を最適化することができる。各実施形態では、阻害性核酸、例えば阻害性核酸、例えばｄｓＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを使用して、ＴＦＰ発現細胞における抑制分子の発現を阻害することができる。ある実施形態では、阻害剤はｓｈＲＮＡである。ある実施形態では、抑制分子は、改変Ｔ細胞内で阻害される。これらの実施形態では、抑制分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子が、ＴＦＰの構成要素、例えば構成要素のすべてをコードする核酸に連結される。一実施形態では、抑制シグナルの阻害剤は、例えば、抑制分子に結合する抗体または抗体断片であり得る。例えば、薬剤は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、またはＣＴＬＡ４に結合する抗体または抗体断片であり得る（例えば、イピリムマブ（別称ＭＤＸ−０１０及びＭＤＸ−１０１、Ｙｅｒｖｏｙ（商標）として市販、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ、トレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒから入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、旧称チシリムマブ、ＣＰ−６７５，２０６））。ある実施形態では、薬剤は、ＴＩＭ３に結合する抗体または抗体断片である。ある実施形態では、薬剤は、ＬＡＧ３に結合する抗体または抗体断片である。
【０３２９】
いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の活性を増強する薬剤は、例えば、第１のドメインと第２のドメインとを含む融合タンパク質であり得、その場合、第１のドメインは抑制分子またはその断片であり、第２のドメインは、陽性シグナルに関連するポリペプチド、例えば、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、陽性シグナルに関連するポリペプチドは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳの共刺激ドメイン、例えばＣＤ２８、ＣＤ２７、及び／またはＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメイン、及び／または例えばＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメイン、例えば本明細書に記載のものを含み得る。一実施形態では、融合タンパク質は、ＴＦＰを発現するものと同じ細胞によって発現される。別の実施形態では、融合タンパク質は、抗ＣＤ１９  ＴＦＰを発現しない細胞、例えばＴ細胞によって発現される。
【実施例】
【０３３０】
本発明を、以下の実験実施例を参照してさらに詳細に説明する。これら実施例は、例示説明のみを目的として提供するものであり、特に指定のない限り、限定的であることを意図しない。したがって、本発明は、いかなる場合も以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に示す教示の結果として明らかにされるすべてのいかなる変更をも包含すると解釈されるべきである。さらなる説明がなくても、当業者は、前述の説明及び以下の例示的な実施例を用いて、本発明の化合物を作製して利用し、請求される方法を実施することができると考えられる。以下の実施例は、本発明の種々の態様を具体的に示すものであり、いかなる場合においても本開示のそれ以外の部分を限定するものとみなされるべきではない。
【０３３１】
実施例１〜５の背景
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が認識する外来抗原は、小さなペプチドとして処理され、抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合されている。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体は、Ｔ細胞受容体のアルファ及びベータサブユニット（ＴＣＲα／β）またはガンマ及びデルタサブユニット（ＴＣＲγδ）、ならびにＣＤ３二量体のＣＤ３γ／ε、ＣＤ３δ／ε、ＣＤ３ζ／ζを含むグループ化した二量体によって形成される。Ｔ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）及びＴ細胞受容体ベータ定常（ＴＲＢＣ）遺伝子は、それぞれＴＣＲα及びＴＣＲβの定常Ｃ末端領域をコードする。
【０３３２】
ＴＣＲ定常領域（複数可）の破壊は、細胞表面へのＴＣＲαまたはＴＣＲβの移行を遮断し、それによりＴＣＲ受容体複合体のアセンブリを阻害する。ＴＣＲ受容体全体のアセンブリを阻害するには、ＴＣＲαまたはＴＣＲβの移行を減じるだけで十分である。したがって、ＴＣＲ複合体の不活性化は、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）法、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼを使用する遺伝子編集法を用いて、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子を標的化することにより行うことができる。ただし、ＣＤ３εまたはＣＤ３γまたはＣＤ３δ融合タンパク質に基づくＴＦＰ  Ｔ細胞には、機能的ＴＣＲ複合体に組み込むＴＣＲα／βの表面発現を必要とする。
【０３３３】
受容体抗原によるドナーＴ細胞の表面でのＴＣＲ複合体の活性化（すなわち、抗原提示細胞の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によって提示される抗原の認識）は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）及びサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）などの望ましくない作用を引き起こす可能性がある。したがって、以下の実施例は、ＴＣＲαまたはＴＣＲβの短縮型をコードする導入遺伝子をＴＣＲノックアウト細胞に導入する方法、及び自己切断シグナル（例えば、Ｔ２Ａ）によって分離された融合タンパク質自体について記載する。一実施形態では、ＴＣＲαまたはＴＣＲβの短縮型は、ＴＣＲαまたはＴＣＲβの膜貫通ドメイン及び結合ペプチドドメイン（ＣＰ）を含む。別の実施形態では、ＴＦＰの抗原結合ドメインは、短縮型または全長ＴＣＲα及び／またはＴＣＲβのＮ末端に融合される。
【０３３４】
実施例１．ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）の設計
ＴＲＡを不活性化するｃｒＲＮＡを、ＤｅｓｋＧｅｎ（商標）ＣＲＩＳＰＲライブラリーウェブサイト（ｗｗｗ．ｄｅｓｋｇｅｎ．ｃｏｍ）で公開されている「Ｄｕｎｎｅ  ２０１７」アルゴリズムを用いて設計した。ＴＲＡ遺伝子座と結合するいかなるｃｒＲＮＡも、ＴＲＡ遺伝子の二本鎖切断を効率的に生じさせることができる。ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼのオフターゲット活性を最小限に抑えるため、使用したｃｒＲＮＡはオフターゲットスコアが９０％超であり、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  Ｈｕｍａｎゲノムビルド３８（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）ゲノム内の最も近似する相同配列とのミスマッチが少なくとも３つ含まれる。好ましい実施形態では、１つのミスマッチは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の８ｂｐ上流に位置する。表１〜２は、ＴＲＡ遺伝子を不活性化するために選択された例示的なｃｒＲＮＡ配列（表１）及び予測されるオフターゲット活性（表２）を示している。
【０３３５】
【表１】
2021515598.tif 000003
【０３３６】
【表２】
2021515598.tif 000004
【０３３７】
ＴＲＢを不活性化するｃｒＲＮＡを、上記のＤｕｎｎｅ  ２０１７アルゴリズムを用いて設計した。ＴＣＲβの定常領域は２つの遺伝子、すなわちＴＲＢＣ１とＴＲＢＣ２によってコードされているため、ｃｒＲＮＡはＴＲＢＣ１とＴＲＢＣ２双方の同一配列に誘導される。その結果、ＤｅｓｋＧｅｎ（商標）によって生成されるオフターゲットスコアは９４％未満である。ただし、ＴＲＢＣ１とＴＲＢＣ２の標的化を除き、ｃｒＲＮＡとＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８ゲノムとの間の他の相同配列は少なくとも３つのミスマッチをもつ。好ましい実施形態では、これらのミスマッチのうち１つは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の８ｂｐ上流に局在する。表３〜４は、ＴＲＢ遺伝子を不活性化するために選択された例示的なｃｒＲＮＡ配列（表３）及び予測されるオフターゲット活性（表４）を示している。
【０３３８】
【表３】
2021515598.tif 000005
【０３３９】
【表４−１】
2021515598.tif 000006
【０３４０】
【表４−２】
2021515598.tif 000007
【０３４１】
【表４−３】
2021515598.tif 000008
【０３４２】
実施例２：Ｊｕｒｋａｔ細胞での内因性ＴＣＲαまたはβの編集
Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＴＲＡまたはＴＲＢ遺伝子の不活性化を、ＴＲＡまたはＴＲＢ遺伝子に対するＳｐＣａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）のエレクトロポレーションによって行った。細胞はエレクトロポレーションするまで、１ｍＬあたり０．２ｘ１０６細胞で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び３００ｍｇ／ＬのＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中に保持した。ＴＲＡまたはＴＲＢ遺伝子を標的とするＳｐＣａｓ９リボ核タンパク質を、ＴＲＡＣ（ＴＲＡＣ２−４５９８）またはＴＲＢＣ（ＴＲＢＣ−４４３４５）のいずれかを標的とするｃｒＲＮＡと、ｔｒａｃｒＲＮＡとを分子比１：１でアニールすることにより調製した。アニールされた二重鎖を分子比１．５：１でＳｐＣａｓ９タンパク質と混合した。０．６１μＭのＲＮＰを２．５×１０６個のＴ細胞と混合し、Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に関する製造業者のプロトコルに従ってエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションは１６００Ｖ、１０ｍｓ、３パルスに設定した。パルスをかけた後、細胞を直ちに温培地に移し、３７℃で３日間インキュベートした。
【０３４３】
フローサイトメトリーによりＴＣＲαβ及びＣＤ３εの表面発現の減少を観察することにより、編集効果を評価した。結果をＴＲＡ編集細胞（左パネル）及びＴＲＢ編集細胞（右パネル）として図２に示す。編集したＪｕｒｋａｔ細胞を、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）細胞分離システムによって精製した。編集したＪｕｒｋａｔ細胞を、抗ＴＣＲαβ  ＩＰ２７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃１７−９９８６−４２）抗体及び抗ＣＤ３ε  ＳＫ７抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃２５−００３６−４２）に対して陰性に選択した。ＴＣＲαβまたはＣＤ３εを表面に発現している細胞を、ＭＡＣＳ  ＭＳ（型番＃１３０−０４１−３０１）またはＬＳ（型番＃１３０−０４１−３０６）カラムに固定するとともに、ＴＣＲαβ及びＣＤ３εの両方に対して陰性である、編集したＪｕｒｋａｔ細胞をカラムフロースルーで回収し、上記に指定した培地中０．４×１０６細胞／ｍＬで培養液中に保持した。
【０３４４】
実施例３．ヒトＴ細胞の編集
次に、ヒトドナー由来の初代Ｔ細胞においてＴＲＡまたはＴＲＢ遺伝子を不活性化する。エレクトロポレーションの２〜４日前に、１０％のヒト血清（ｈＡＢ、Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ＨＰ  １０２２）及び３００Ｕ．ｍｌ−１  ＩＬ２（Ｐｅｔｒｏｔｅｃｈ＃２００−０２）を補充したＣＴＳ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ培地（Ｇｉｂｃｏ＃Ａ１０２２１０１）中の１：１比のＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ＃１１１３２Ｄ）に特異的なＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ヒトＴ細胞活性化因子ビーズを用いてＴ細胞を活性化した。ＴＲＡまたはＴＲＢ遺伝子を標的とするＳｐＣａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を、ＴＲＡＣ（ＴＲＡＣ２−４５９８）またはＴＲＢＣ（ＴＲＢＣ−４４３４５）のいずれかを標的とするｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを分子比１：１でアニールすることにより調製した。アニールされた二重鎖を分子比１．５：１でＳｐＣａｓ９タンパク質と混合した。０．６１μＭのＲＮＰを２．５×１０６個のＴ細胞と混合し、Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍに関する製造業者のプロトコルに従ってエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションは１６００Ｖ、１０ｍｓ、３パルスに設定した。１０％ｈＡＢ（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ＃ＨＰ１０２２）、３００ｕ．ｍｌ−１  ＩＬ２（Ｐｅｔｒｏｔｅｃｈ＃２００−０２）、２５ｎｇ．ｍＬ−１  ＩＬ７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ＃２０７−ＩＬ−０１０）を含む温培地（ＣＴＳ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ（Ｇｉｂｃｏ＃Ａ１０４８５０１）に細胞を直ちに移し、３７℃でインキュベートして、編集したＴ細胞を約３〜５日の倍加時間で増殖させた。フローサイトメトリーによりＴＣＲαβ及びＣＤ３εの表面発現の減少を測定することにより、編集効果を評価した。編集したＴ細胞を、製造業者に従い、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ（登録商標），Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）細胞分離システムを使用して精製し、抗ＴＣＲαβ  ＩＰ２７抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃１４−９９８６−８２）及び抗ＣＤ３ε  ＳＫ７抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃１６−００３６−８１）に対して陰性に選択した。ＴＣＲαβまたはＣＤ３εを表面に発現している細胞を、ＭＡＣＳ  ＭＳ（型番＃１３０−０４１−３０１）またはＬＳ（型番＃１３０−０４１−３０６）カラムに固定するとともに、ＴＣＲαβ及びＣＤ３εの両方に対して陰性である、編集したＴ細胞をカラムフロースルーで回収し、上記に指定した培地中１０６細胞／ｍＬで培養液中に保持した。結果を図３に示す。
【０３４５】
実施例４：ＴＣＲ陰性Ｔ細胞の同種性
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを使用して、ＴＣＲαβノックアウト（ＫＯ）細胞の同種性について評価した。カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＳＦＥ）標識色素をＴＣＲα及びＴＣＲβ  ＫＯ  Ｔ細胞に組み込み、続いてＨＬＡ一致（自己反応）ドナーまたは不一致（同種反応）ドナー（それぞれドナー１及び２）からの増殖停止したＰＢＭＣ（Ｓｔｒｅｃｋ，Ｉｎｃ．）と細胞を１：１比で共培養した。５ｎｇ／ｍＬのホルボールミリスタートアセタート（ＰＭＡ）及び５００ｎｇ／ｍＬのイオノマイシンを、独立したＴＣＲ刺激に対する陽性対照として使用した。またプレートに結合した抗ＣＤ３εを、ＴＣＲα及びＴＣＲβノックアウトＴ細胞におけるＴＣＲ受容体の欠損を確認するための間接的な対照として使用した。ドナーＴ細胞の増殖を、ＣＳＦＥの減少によってモニタリングした。刺激なしの２４時間のインキュベーション後に増殖の基礎レベルを測定し、５日間のインキュベーション期間後に再びレベルを測定した。ＣＳＦＥ色素は細胞分裂時に半分に希釈されるため、Ｔ細胞で発生した増殖の量を評価し、ＨＬＡ一致ドナー対照及び不一致ドナー対照と比較した。結果を図４に示す。
【０３４６】
ＴＣＲαβ及びＣＤ３εの表面発現を実施例２に記載のように、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞（図９Ａ〜Ｃ）及びドナーＴ細胞（図１０Ａ〜Ｂ）について分析した。図９Ａ〜Ｃは、野生型細胞（図９Ａ）、形質導入を伴わないＴＲＢ  ＫＯ細胞（図９Ｂ）、ＴＣＲβ全長（ＦＬ）ＴＦＰの形質導入を伴うＴＲＢ  ＫＯ細胞（図９Ｃ）におけるＣＤ３対ＴＣＲαβの表面発現を示す。ＣＤ３及びＴＣＲαβが陰性−陰性の細胞集団を視覚化するゲートがプロットに描かれ、各四分区間にある細胞の比率が４隅に示されている。
【０３４７】
図１０Ａ〜Ｂは、短縮型ヒトＴＲＢＣ遺伝子（図１０Ａ）及びマウスＴＲＡＣ−Ｔ２Ａ−ＴＲＢＣ遺伝子（図１０Ｂ）を形質導入したＴＲＢノックアウト細胞におけるＣＤ３対ＴＣＲαβの表面発現を示す。ＣＤ３及びＴＣＲαβが陰性−陰性の細胞集団を視覚化するゲートがプロットに描かれ、各四分区間にある細胞の比率が４隅に示されている。
【０３４８】
実施例５：ＴＣＲ陰性細胞におけるＴ細胞受容体融合タンパク質の発現
ＴＲＡまたはＴＲＢの不活性化は、すべてのＴＣＲサブユニットの細胞表面への移行を遮断する。その結果、外因性ＴＲＡまたはＴＲＢ導入遺伝子が、それぞれＴＲＡ−／−またはＴＲＢ−／−細胞で発現され、機能的ＴＦＰ  Ｔ細胞が得られる。
【０３４９】
Ｊｕｒｋａｔ細胞の形質導入
ＴＦＰ導入遺伝子を、例えば、同時係属中の米国特許公開第２０１７−０１６６６２２号に記載されているように、レンチウイルスを使用してＪｕｒｋａｔ細胞に導入した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を感染多重度（ＭＯＩ）５でウイルスとインキュベートした。２４時間のインキュベーション後、培地を交換した。形質導入の有効性及びＴＦＰの発現を、対象となるＴＦＰ結合因子に特異的なリガンドを使用したフローサイトメトリー、及び／またはＴＣＲαβ及びＣＤ３εの表面発現により評価した。
【０３５０】
Ｔ細胞の形質導入
ＴＦＰ導入遺伝子を、例えば、同時係属中の米国特許公開第２０１７−０１６６６２２号に記載されているように、レンチウイルスを使用してＴ細胞に導入した。Ｔ細胞を感染多重度（ＭＯＩ）５のウイルス、さらに５μｇ／ｍＬのポリブレンと６００ｇで１００分間遠心分離した。２４時間の遠心分離後、培地を交換した。形質導入の有効性及びＴＦＰの発現を、対象となるＴＦＰ結合因子に特異的なリガンドを使用したフローサイトメトリー、及び／またはＴＣＲαβ及びＣＤ３εの表面発現により評価した。
【０３５１】
ヒトＴＣＲα／β  ＴＦＰの発現
ＴＣＲα陰性細胞は依然としてＴＣＲβを発現し、逆にＴＣＲαはＴＣＲβ陰性細胞で発現される。したがって、ＴＣＲα  ＴＦＰをＴＲＡ−／−細胞で発現させ、ＴＣＲβ  ＴＦＰをＴＲＢ−／−細胞で発現させた。ＴＣＲα／β及びＴＣＲα／β  ＴＦＰの複数の形式をＴＣＲ陰性細胞において試験し、ＴＣＲ複合体全体の移行を復元するための最適な構造を決定した（図５）。ＴＣＲα／β全長（ＦＬ）ＴＦＰを、いずれかの可変エキソン（Ｖ）といずれかの接合部エキソン（Ｊ）とをアセンブリし、続いてＴＣＲ遺伝子座からの定常エキソンのすべてをアセンブリすることにより作製した。一実施形態では、多様なエキソンＤをＶとＪとの間に配置することができ得る。場合により、変異またはインデルを各エキソンの接合部に付加して、組換え活性化遺伝子（ＲＡＧ）酵素の活性を模倣することができ得る。ＴＲＡＶ残基を、国際的なＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ、ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に従って列挙する。
ＴＲＡ−／−細胞で発現したＴＣＲα（ＦＬ）ＦＭＣ６３  ＴＦＰ
Ｎｔ−ＦＭＣ６３−ＴＲＡ（Ｖ１３−１（１−２５６）；Ｊ１３；Ｃ）−Ｃｔ
Ｎｔ−ＦＭＣ６３−ＴＲＡ（Ｖ８−１；Ｊ２０；Ｃ）−Ｃｔ
Ｎｔ−ＦＭＣ６３−ＴＲＡ（Ｖ２９ＤＶ５；Ｊ４４；Ｃ）−Ｃｔ
ＴＲＡ−／−細胞で発現した短縮型ＴＣＲα  ＴＦＰ
Ｎｔ−ＦＭＣ６３−ＴＲＡ（Ｖ１３−１（３３−２５６）；Ｊ１３；Ｃ）−Ｃｔ
Ｎｔ−ＦＭＣ６３−ＴＲＡ（Ｖ１３−１（１０５−２５６）；Ｊ１３；Ｃ）−Ｃｔ
【０３５２】
ＴＲＡ−／−細胞で発現した短縮型ＴＣＲα、ＴＲＡＣ残基を、国際的なＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に従って付番する。
Ｎｔ−ＴＲＡＣ７−１７４−Ｃｔ
Ｎｔ−ＴＲＡＣ１２８−１７４−Ｃｔ
ＴＲＢ−／−細胞で発現したＴＣＲβ（ＦＬ）ＦＭＣ６３  ＴＦＰ
Ｎｔ−ＦＭＣ６３−ＴＲＢ（Ｖ９；Ｊ１−１；Ｃ１）−Ｃｔ
Ｎｔ−ＦＭＣ６３−ＴＲＢ（Ｖ７−９；Ｊ１−５；Ｃ１）−Ｃｔ
Ｎｔ−ＦＭＣ６３−ＴＲＢ（Ｖ５−１；Ｊ２−２；Ｃ１）−Ｃｔ
【０３５３】
ＴＲＢ−／−細胞で発現した短縮型ＴＣＲβ  ＴＦＰ、ＴＲＢＣ残基は上記の国際ＩＭＧＴ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍに従って付番する。
Ｎｔ−ＦＭＣ６３−ＴＲＢＣ１（−８）−１７３−Ｃｔ
Ｎｔ−ＦＭＣ６３−ＴＲＢＣ１１２２−１７４−Ｃｔ
Ｎｔ−ＦＭＣ６３−ＴＲＢＣ１１２７−１７４−Ｃｔ
【０３５４】
短縮型ヒトＴＣＲα／β  ＴＦＰの発現
ＴＣＲαとＴＣＲβ両方の定常ドメインの過剰発現は、ＴＣＲ複合体全体の細胞表面への移行を促進するのに十分であり得る。これを試験するため、２Ａ自己切断型ペプチドによって分離されるＴＣＲα及びＴＣＲβの定常ドメインをコードするＴＲＰ導入遺伝子を設計した。一実施形態では、ＴＦＰ結合因子はＴＲＡＣ及び／またはＴＲＢＣのＮ末端に融合される。別の実施形態では、ＴＦＰは、ＣＤ３分子に融合され、ＴＲ［Ａ／Ｂ］Ｃ導入遺伝子とは独立して発現する。
【０３５５】
短縮型マウスＴＣＲα／β  ＴＦＰの発現
ヒトＴＣＲ定常領域は、それらのマウスホモログと互換性がある。加えて、マウスＴＣＲ定常領域は、ヒト細胞での発現時にＣＤ３ζ／ＴＣＲ複合体の安定性を高める。そこで、２Ａ自己切断型ペプチドによって分離されるマウスＴＣＲα及びＴＣＲβの定常ドメインをコードするＴＦＰ導入遺伝子を設計した。一実施形態では、ＴＦＰ結合因子はｍＴＲＡＣ及び／またはｍＴＲＢＣのＮ末端に融合される。別の実施形態では、ＴＦＰ結合因子は、ＣＤ３分子に保持され、ｍＴＲ［Ａ／Ｂ］Ｃ導入遺伝子とは独立して発現する。
ＴＲＡ−／−またはＴＲＢ−／−細胞で発現するｍＴＲ［Ａ／Ｂ］Ｃ導入遺伝子
Ｎｔ−ＦＭＣ６５−ｍＴＲＡＣ１１４−１６９−Ｔ２Ａ−ｍＴＲＢＣ１２３−１７３−Ｃｔ
Ｎｔ−ｍＴＲＡＣ１１４−１６９−Ｔ２Ａ−ｍＴＲＢＣ１２３−１７３−Ｃｔ
【０３５６】
マウス化ヒトＴＣＲα／β  ＴＦＰの発現
ヒトＴＣＲα及びＴＣＲβの定常領域間の親和性を増加させるために、ヒトＴＣＲ残基がマウスＴＣＲで置換されている一連の配列を設計した。置換を、ＴＣＲαの定常領域に導入し、それらの置換は、残基Ｐ９０Ｓ、Ｅ９１Ｄ、Ｓ９２Ｖ、Ｓ９３Ｐを含む。ＴＣＲβの定常領域に導入された置換は、Ｅ１１Ｋ、Ｓ１５Ａ、Ｆ１２９Ｉ、Ｅ１３２Ａ、Ｑ１３５Ｈであった。このような置換により、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣはＴＣＲ複合体全体の細胞表面への移行に十分なものとなった。したがって、導入遺伝子Ｎｔ−ＦＭＣ６３−ＴＲＡＣ（−７）−１７４Ｐ９０Ｓ，Ｅ９１Ｄ，Ｓ９２Ｖ，Ｓ９３Ｐ−Ｔ２Ａ−ＴＲＢＣ１（−８）−１７３Ｅ１１Ｋ，Ｓ１５Ａ，Ｆ１２９Ｉ，Ｅ１３２Ａ，Ｑ１３５Ｈ−ＣｔによってＴＲＡ−／−またはＴＲＢ−／−細胞でＴＦＰを発現させた。
【０３５７】
増強されたＴＣＲα  ＴＦＰの発現
ヒトＴＣＲαβ複合体のいくつかの構造は、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）に公開されている。このような構造は、ＴＣＲα／ＴＣＲβの相互作用に関与する残基、およびＴＲＢＣに近似するが、ＴＣＲα／ＴＣＲβの相互作用には関与しない、ＴＲＡＣの他の残基を強調する。したがって、Ｖ２２Ｗ、Ｆ８５．５Ｅ、Ｔ８４Ｄ、Ｓ８５．１Ｄ、Ｖ８４．１Ｗといった、ＴＲＡＣにおける１つ以上の置換によって、ＴＣＲβに対するＴＣＲαの親和性を増強することが可能である。
【０３５８】
ＴＲＡ−／−細胞での増強されたＴＲＡＣ−ＴＦＰの発現は、ＴＣＲ全体の細胞表面への移行を復元する。ＷＴ細胞において増強されたＴＲＡＣ−ＴＦＰは効率的に、ＴＣＲ複合体の内因性ＴＣＲα分子の代わりとなる。増強型ＴＲＡＣは、ＴＦＰ結合因子なしで発現し、ＴＣＲ複合体の細胞表面への移行を効率的に復元する。その場合、ＴＦＰ結合因子はＣＤ３分子に融合され、２Ａ自己切断型ペプチドを両方のコード配列（ＣＤＳ）の間に配置することにより、増強されたＴＲＡＣ導入遺伝子とは独立して、または同じ導入遺伝子に発現する。
【０３５９】
同様に、ＴＲＢＣにおける置換は、ＴＣＲα／ＴＣＲβ間の相互作用を増強する。個別にまたは組み合わせてＴＲＢＣに導入される置換Ｖ２２Ｗは、ＴＲＢ−／−細胞においてＴＣＲ全体の細胞表面への移行を復元するのに十分である。ＴＲＢ−／−細胞での増強されたＴＲＢＣ−ＴＦＰの発現は、ＴＣＲ全体の細胞表面への移行を復元する。野生型細胞において増強されたＴＲＢＣ−ＴＦＰの発現は効率的に、ＴＣＲ複合体の内因性ＴＣＲβ分子の代わりとなる。増強されたＴＲＢＣがＴＦＰ結合因子なしで発現する場合、ＴＦＰ結合因子はＣＤ３分子に融合され、２Ａ自己切断型ペプチドを両方のＣＤＳの間に配置することにより、増強されたＴＲＢＣ導入遺伝子とは独立して、または同じ導入遺伝子に発現する。
【０３６０】
ハイブリッドＩｇＧ／ＴＣＲα／β  ＴＦＰの発現
ＴＣＲαとＴＣＲβとの間の相互作用は、ＴＣＲα及びＴＣＲβの可変ドメインをＩｇＧ定常ドメインで置換することによって増強される。したがって、ＩｇＧ重鎖定常ドメインＣＨ１をＴＲＢＣのＮ末端に融合し、ＩｇＧ軽鎖定常ドメインＣＬをＴＲＡＣのＮ末端に融合した。最後に、ＴＦＰをＣＬのＮ末端に付加した。一実施形態では、両方の構築物は、以下に示されているように、それらの間に２Ａ自己切断型ペプチドを配置することにより、同一の導入遺伝子によってコードされる：Ｎｔ−ＦＭＣ６３−ＩｇＧＣＬ（−７）−１２５−ＴＲＡＣ（−６）−１７４−Ｔ２Ａ−ＩｇＧＣＨ１（−７）−１２２−ＴＲＢＣ（−８）−１７３。別の実施形態では、ＩｇＧＣＬとＩｇＧＣＨ１の位置が交換される。別の実施形態では、ＴＦＰ結合因子はＩｇＧＣＬまたは／及びＩｇＧＣＨ１のＮ末端に融合されるか、またはＣＤ３分子に融合され、独立して発現される。別の実施形態では、残基置換ＩｇＧＣＬＦ７Ａ、ＩｇＧＣＨ１Ａ２０Ｌを導入して、ＣＨ１／ＣＬの相互作用を増強する。
【０３６１】
ドメインスワップされたＴＣＲ−ＴＦＰの発現
ＴＣＲα／β／γ／δ分子は、同様の構造組織を採る。Ｎ末端では、それらのＶ（Ｄ）Ｊ領域は免疫グロブリン（ＩｇＶ）様の立体構造を採るが、それらのＣ領域は免疫グロブリン（ＩｇＣ）様のドメイン、続いて接続ペプチド（ＣＰ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及びＣ末端の短い細胞内尾部（ＩＣ）で構成される。これらの分子間の高い構造的相同性にもかかわらず、ＴＣＲαはＴＣＲβとのみ対形成し、ＴＣＲγはＴＣＲδとのみ対形成する。その結果、ＴＣＲαのドメイン（複数可）をＴＣＲγドメイン（複数可）と、ＴＣＲβのドメイン（複数可）をＴＣＲγドメイン（複数可）と交換すると、内因性ＴＣＲ分子と対形成しないＴＦＰが産生される。例えば、Ｎｔ−ＦＭＣ６３−ＩｇＣα−ＣＰγ−ＴＭγ−ＩＣγ−２Ａ−ＩｇＣβ−ＣＰδ−ＩＣδ−Ｃｔは、ＩｇＣαＣＰγＴＭγＩＣγがＩｇＣｂＣＰｄＩＣｄとは特異的に相互作用するが、ＴＲＡ−／−細胞の内因性ＴＣＲβまたはＴＲＢ−／−細胞の内因性ＴＣＲａとは相互作用しない、同種異系受容体を産生する。別の実施形態では、ＴＦＰ結合因子はＩｇＣβまたは／及びＩｇＣαのＮ末端に融合されるか、またはＣＤ３分子に融合され、独立して発現される。交換されたドメインの異なる組み合わせを、本明細書で開示される方法で使用することができる。
【０３６２】
ＴＣＲ遺伝子座における２Ａ自己切断型ペプチドのノックイン（ＫＩ）
ＣＰドメイン上流の自己切断シグナルをＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子にインフレームで導入すると、内因性短縮型のＴＣＲαまたはＴＣＲβが産生される。したがって、ＣＰ及びＴＭドメインを含む切断シグナルの下流の配列は、細胞表面に移行される。対照的に、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む切断シグナルの上流の部分は、細胞表面に移行しない。一実施形態では、自己切断シグナルが、相同組換え修復（ＨＤＲ）または一本鎖鋳型修復（ｓｓＴＲ）により、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子にインフレームで挿入される。ＨＤＲはＤＮＡ一本鎖切断（ＳＳＢ）またはＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）によって誘発されるが、ｓｓＴＲはＳＳＢによってのみ誘発される。一実施形態では、カスタムエンドヌクレアーゼを使用してＣＰ領域上流にＤＳＢを生じさせるか、ニッカーゼを使用してＴＲＡＣまたはＴＲＢＣの同じ領域にＳＳＢを生じさせる。自己切断シグナルを含む相同ドナーＤＮＡは、内因性標的と少なくとも４０塩基対（ｂｐ）の相同性を有する必要があり、一本鎖でも二本鎖でもよく、線状でも環状であってもよい。加えて、相同ドナーＤＮＡは、カスタムエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼによって切断されないように複数の塩基置換を含む。一実施形態では、ＣＤ３−ＴＦＰ導入遺伝子が、遺伝子編集前または後に細胞に挿入される。別の実施形態では、相同ドナーＤＮＡは、自己切断ペプチドの下流のＴＦＰ配列をＴＲＡＣまたはＴＲＢＣにインフレームでコードする。その結果、ＴＦＰ−ＴＣＲ融合分子は内因性ＴＣＲ受容体の制御下にあり、ゲノムによって外因性プロモーターがランダムに複数挿入される危険性はない。模式図を図６に示す。
【０３６３】
実施例６：ＴＦＰを発現するヒトＴＣＲ陰性Ｔ細胞の細胞毒性
ルシフェラーゼを用いた細胞毒性アッセイ（「Ｌｕｃ−Ｃｙｔｏ」アッセイ）は、共培養後の残存生標的細胞におけるルシフェラーゼ酵素活性を間接的に測定することにより、ＴＦＰ  Ｔ細胞の細胞毒性を評価するものである。
【０３６４】
ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）発現腫瘍細胞の産生
Ｌｕｃ−Ｃｙｔｏアッセイに使用した標的細胞は、ホタルルシフェラーゼを発現するＮａｌｍ６（ＤＳＭＺ型番＃ＡＣＣ１２８）及びＫ５６２（（ＡＴＣＣ（登録商標）型番＃ＣＣＬ−２４３（商標））細胞を安定的に形質導入することにより産生された、Ｎａｌｍ６−Ｌｕｃ（ＣＤ１９陽性）及びＫ５６２−Ｌｕｃ（ＣＤ１９陰性）であった。ホタルルシフェラーゼをコードするＤＮＡは、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって合成し、シングルプロモーターレンチウイルスベクターｐＣＤＨ５２７Ａ−１（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のマルチクローニング部位に挿入した。レンチウイルスは製造業者の指示に従って封入した。次に、２４時間かけて腫瘍細胞にレンチウイルスを形質導入し、ピューロマイシン（５μｇ／ｍＬ）で選別した。Ｎａｌｍ６−Ｌｕｃ細胞及びＫ５６２−Ｌｕｃ細胞の産生の成否は、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）で細胞内のルシフェラーゼ酵素活性を測定することにより確認した。
【０３６５】
Ａｌｌｏ−ＴＦＰ  Ｔ細胞の表現型の特性決定
同種ＴＦＰ  Ｔ細胞を、ヒトＴＣＲαβ（抗ヒトＴＣＲ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏ、クローンＢＷ２４２／４１２を用いる）、マウスＴＣＲαβ（抗マウスＴＣＲβ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＨ５７−５９７を用いる）、ヒトＣＤ３ε（抗ヒトＣＤ３ε  ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＵＣＨＴ１を用いる）、ヒトＣＤ４（抗ヒトＣＤ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＲＰＡ−Ｔ４を用いる）、ヒトＣＤ８（抗ヒトＣＤ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＳＫ−１を用いる）、及びＴＦＰ（ビオチン化ＣＤ１９（型番＃ＣＤ９−Ｈ８２５９、ＡｃｒｏＢｉｏ）によるＣＤ１９結合因子ＦＭＣ６３の検出を用いる）の発現について調べた。比較として同じドナー由来の野生型Ｔ細胞（編集なし）を同じパネルで調べた。
【０３６６】
結果を図７に示す。野生型Ｔ細胞は、ヒトＴＣＲαβ及びＣＤ３εの表面発現を示すが、マウスＴＣＲβの表面発現は示さない。対照的に、同種ＴＦＰ  Ｔ細胞は、ヒトＴＣＲαβの表面発現を示さず、編集の成功を表している。同種ＴＦＰ  Ｔ細胞でのマウスＴＣＲβの表面発現は、表面でのヒトＣＤ３εの検出と一貫しており、完全なＴＣＲ複合体の再構築の成功を示唆している。ヒトＣＤ４及びＣＤ８の発現については、野生型細胞とＴＦＰ  Ｔ細胞との間で有意差はない。表面ＣＤ１９結合因子（ＦＭＣ６３、配列番号Ｘ）の検出は、同種ＴＦＰ  Ｔ細胞でのみ観察される。
【０３６７】
Ｔ細胞の細胞毒性を評価するＬｕｃ−Ｃｙｔｏアッセイ
Ｌｕｃ−Ｃｙｔｏアッセイを、様々なエフェクター（Ｔ細胞）対標的（腫瘍細胞）（Ｅ対Ｔ）比でＴ細胞を腫瘍細胞と混合することにより準備した。標的細胞（Ｎａｌｍ６−ＬｕｃまたはＫ５６２−Ｌｕｃ）を、１０％熱不活化（ＨＩ）ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地を入れた９６ウェルプレートに１ウェルあたり１０，０００細胞で播種した。Ｅ対Ｔ比が３：１、１：１、または１：３になるように、同種異系ＴＦＰ  Ｔ細胞を１ウェルあたり３００００、１００００、または３３３３細胞で腫瘍細胞に加えた。細胞の混合物を５％ＣＯ２と共に、３７℃で２４時間インキュベートした。ルシフェラーゼ酵素活性を、Ｔ細胞と腫瘍細胞の共培養物中の残存生標的細胞からの活性を測定するＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。
【０３６８】
結果を図８に示す。同種異系ＴＦＰ  Ｔ細胞であるＡｌｌｏ  ＣＤ３ε−ＴＦＰ  Ｔ細胞及びＡｌｌｏ  ｍＴＣＲαβ−ＴＦＰ  Ｔ細胞は、ＣＤ１９陽性腫瘍細胞Ｎａｌｍ６−Ｌｕｃに対して頑強かつ特異的な溶解を示したが、ＣＤ  １９陰性腫瘍細胞Ｋ５６２−Ｌｕｃには示さなかった。
【０３６９】
ＴＦＰを発現するヒトＴＣＲ陰性Ｔ細胞のＭＬＲ
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを使用して、ＴＦＰを発現するヒトＴＣＲ陰性Ｔ細胞の同種性について評価した。不一致のＰＢＭＣドナー細胞を、ＣＤ１９陰性細胞の磁気細胞分離によって、最初にＢ細胞枯渇させる。ＰＢＭＣを親油性の細胞標識色素ＰＫＨで標識し、０．４％パラホルムアルデヒドで固定する。同時に、異なる色のＰＫＨ色素を標的Ｔ細胞に組み込む。その後、ＴＦＰを発現するヒトＴＣＲ陰性Ｔ細胞と、同じドナーの野生型Ｔ細胞とを、１：１比（ＰＢＭＣ対Ｔ細胞）で共培養するか、Ｔ細胞を単独で培養する。ドナーＴ細胞の増殖を、６〜１２日の時点にわたりＰＫＨ色素を追跡することによりモニタリングする。ＰＫＨ色素は細胞分裂時に半分に希釈されるため、Ｔ細胞で発生する増殖の量を評価し、野生型対照と比較する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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