(57)【要約】  本発明は、特に粘膜ワクチン接種又は抗オピオイド治療を介した、特に癌の予防及び／又は治療、又は免疫応答の処置に関連して、組織透過化に有用な新規なペプチド、組成物及びそれらの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
Ｚ−Ｚ１−Ｘａａ４Ｘａａ５ＲＸａａ７Ｘａａ８−Ｚ２  （Ｉ）
の合計で５個〜１０個のアミノ酸のペプチドであって、
式（Ｉ）中、Ｚは細胞浸透部分であり、Ｚ１は、式（ＩＩ）：
Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３  （ＩＩ）
の１個〜３個のアミノ酸の任意のペプチド部分であり、
式（ＩＩ）中、Ｘａａ１及びＸａａ２は存在する場合も存在しない場合もあり、存在する場合、Ｘａａ１及びＸａａ２は独立して正に帯電したアミノ酸であり、Ｘａａ３は非極性アミノ酸であり、Ｘａａ４はＡｌａ、Ｓｅｒ及びＶａｌから選択されるアミノ酸であり、Ｒはアルギニンであり、Ｘａａ５及びＸａａ８は独立して正に帯電したアミノ酸であり、Ｘａａ７は非極性アミノ酸であり、Ｚ２は式（ＩＩＩ）：
Ｘａａ９Ｘａａ１０  （ＩＩＩ）
の１個〜２個のアミノ酸の任意のペプチド部分であり、
式（ＩＩＩ）中、Ｘａａ９は正に帯電したアミノ酸であり、Ｘａａ１０は存在する場合も存在しない場合もあり、存在する場合、Ｘａａ１０は非極性アミノ酸であり、式（Ｉ）の少なくとも１つのアミノ酸はＤ−アミノ酸である、ペプチド。
【請求項２】
Ｚ１が存在しない、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
Ｚ２が存在しない、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
Ｘａａ４がＡｌａである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
Ｘａａ５がＡｒｇである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６】
Ｘａａ５がＬｙｓである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
Ｘａａ８がＡｒｇである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８】
Ｘａａ７がＴｒｐである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項９】
下記式（Ｉａ）：
2021527642.tif 000004
（Ｉａ）
（式（Ｉａ）中、Ｚは、請求項１〜８のいずれかに記載されている通りであり、Ｒ１は、ＯＨ及びＮＨ２等のアミノ基から選択される）を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１０】
Ｚがミリストイル基等の脂肪酸部分である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１１】
全てのアミノ酸がＤ−アミノ酸である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１２】
配列番号２の請求項１〜１１のいずれか１つに記載のペプチド。
【請求項１３】
配列番号４の請求項１〜１２のいずれか１つに記載のペプチド。
【請求項１４】
薬剤又はワクチンアジュバントとして使用するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の少なくとも１つのペプチドと、その薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１６】
前記組成物が眼科用又は経口用の組成物である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ゲフィチニブ等の抗癌剤をさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ナロキソン等の抗オピオイド剤をさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ワクチンをさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
有効量の少なくとも１つの治療効果のある活性剤と、前記活性剤の重量ベースで０．０１％〜８０％重量／体積の量の少なくとも１つの粘膜浸透促進剤とを含む経粘膜的薬物送達システムであって、前記粘膜浸透促進剤が、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の少なくとも１つのペプチドである、経粘膜的薬物送達システム。
【請求項２１】
治療薬の組織浸透を増強するため前記治療薬と組み合わせて使用するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２２】
癌、特に癌腫の予防及び／又は治療のため抗癌剤と組み合わせて使用するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２３】
オピオイド使用障害の予防及び／又は治療のため抗オピオイド剤と組み合わせて使用するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２４】
ワクチンと組み合わせて使用するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２５】
疾患又は障害に罹患している被験体における治療の有効性を増強する方法であって、前記被験体において、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物又はその医薬製剤を、前記疾患又は障害に治療効果のある薬剤と組み合わせて投与することを含み、前記治療効果のある薬剤の組織浸透が、本発明の化合物の非存在下で投与された場合の前記治療効果のある薬剤の組織浸透と比較して増強される、方法。
【請求項２６】
癌に罹患している被験体を予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする被験体において、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のペプチド又はその医薬製剤を抗癌剤と組み合わせて投与することを含む、方法。
【請求項２７】
オピオイド使用障害に罹患している被験体を予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする被験体において、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のペプチド又はその医薬製剤を抗オピオイド剤と組み合わせて投与することを含む、方法。
【請求項２８】
被験体において免疫を誘導する方法であって、それを必要とする被験体において、ワクチン、特に粘膜ワクチンを請求項１〜１３のいずれか一項に記載のペプチドと組み合わせて投与することを含む、方法。
【請求項２９】
眼障害に罹患している被験体を予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする被験体において、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のペプチド又はその医薬製剤を眼科用薬剤と組み合わせて投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインキナーゼＣゼータ型の新たな阻害剤、及び特に癌治療の関連で組織透過剤としてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
タイトジャンクション（ＴＪ）は、傍細胞空間を通るイオン又は分子の通過を調節する、隣接する上皮細胞又は内皮細胞間の複雑な構造である。ＴＪはまた、頂端側と基底外側とを明確に区別することによって細胞分化を決定する。ＴＪは、タンパク質の様々なセグメント、すなわち膜貫通タンパク質（クローディン、オクルディン、接合部接着分子（ＪＡＭ）等）、及び細胞質足場タンパク質（ＺＯ−１（ｚｏｎｕｌａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ−１（ゾニューラオクルディン１））、シンギュリン、アファディン、ＭＡＧＩ１（膜結合型グアニル酸キナーゼ）等）で構成される。ＴＪの細胞骨格タンパク質はアクチン及び微小管である（Ｖａｎ  Ｉｔａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３６：１５７−１６５）。
【０００３】
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）は、調節ドメイン及び触媒ドメインを含むセリン／スレオニンキナーゼのファミリーである。ＰＫＣはいくつかの細胞機能に関係があるとされている。ＰＫＣアイソフォームは、従来型（α、β１、β２、γ）、新規（δ、ε、η、μ、θ）、及び非定型（ζ、ι／λ）のアイソフォームに分類される。従来のアイソフォーム及び新規アイソフォームとは異なり、非定型のＰＫＣアイソフォームはＣ１ドメイン（ホルボールエステル／ジアシルグリセロール結合ドメイン）を持たず、他のＰＫＣアイソフォームの膜局在化を担う。プロテインキナーゼＣアイソタイプゼータ（ζ）のペプチド阻害剤が開発され、広範囲の腫瘍、乾癬等の過剰増殖性障害、及びＨＩＶ等のウイルス感染症に対して有効であると記載されている（国際公開第９３／２０１０１号）。
【０００４】
いくつかのＰＫＣアイソフォームが、ＴＪの調節に関係があるとされている。非定型プロテインＰＫＣゼータはＴＪタンパク質の集合に必要であり、非定型ＰＫＣは細胞極性に関与することが示されている（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，２００８，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，８８：１３４１−１３７８；Ｈｉｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３３：１−７）。ＰＫＣゼータ及びＰＫＣイオタは７２％の相同的に同一のアミノ酸配列を共有している。これには、高度に保存された偽基質領域が含まれる（Ｓｅｌｂｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２４２９６−２４３０２）。偽基質（ＰＳ）領域又はＰＳプロトタイプは、そのキナーゼドメインに存在する基質結合部位を遮断することによりプロテインキナーゼを不活性な細胞質形態に保つ役割を担う調節ドメインに存在する配列であり、ＰＫＣゼータアミノ酸配列１１３〜１２６に対応する（Ｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１７２６−１７２８）。
【０００５】
ＴＪの分子構造に関する知識の最近の進歩により、タイトジャンクション調節物質が開発された。上皮接合部開口剤は、乏しい薬物吸収を緩和するタイトジャンクション調節物質であり、これは、臨床開発における経口薬物候補の失敗の中心的な理由である（Ｋｅｎｎｅｄｙ，１９９７，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，２：４３６−４４４；Ｌｉｐｉｎｓｋｉ，２０００，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４４：２３５−２４９）。吸収促進剤として使用されるＴＪ調節剤は、狭い治療域及び非特異的な作用機序に悩まされている。ＴＪの毒性及び不可逆的な開放は、これらの薬剤の失敗の主な理由である（Ｄｅｌｉ，２００９，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１７８８：８９２−９１０；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４８：１２８５−１２８９；Ｓｗｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１１：１１３２−１１４２）。例えば、接合部開口剤１（ＪＯ−１）と呼ばれる、上皮接合タンパク質デスモグレイン２（ＤＳＧ２）に結合する小さな組換えアデノウイルス血清型３由来タンパク質が開発され、腫瘍に対する、特に固形腫瘍の治療に使用されるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に対する薬物透過性を高めることが示されている。残念ながら、免疫原性を引き起こすことも示されている（Ｂｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７１：７０８０−７０９０）。
【０００６】
癌腫（全てのサブタイプを含む）は、上皮細胞の悪性形質転換であり、癌症例の約８０％を占めている。上皮腫瘍は、特に５００Ｄａを超えるサイズ範囲の薬物の腫瘍への浸透を制限する細胞間接合部によって緊密に接続されている（Ｌｉｐｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，４６：３−２６；Ｌａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．，２１０：２７５４−２７６４）。抗腫瘍薬の標的となる多くの受容体は、抗腫瘍薬がアクセスできない腫瘍細胞のタイトジャンクションの間に隠れている／沈んでいることがわかっている。これは、薬剤耐性、したがって腫瘍再発の重要な理由の１つと考えられている（Ｂｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７１：７０８０−７０９０）。したがって、ほとんどの場合、抗腫瘍薬は、薬物活性の欠如のためではなく、標的のアクセシビリティの問題のために効果がない。
【０００７】
さらに、粘膜組織は、約４００ｍ２の大きな表面積のため、様々な病原体への侵入口として機能する。粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）と呼ばれる粘膜表面の免疫学的成分は、抗原に対する免疫応答を開始し、次いで粘膜固有層に拡散する。粘膜免疫の誘導は、現在、広範な研究の対象であり、現在広範囲に調査されている投与の粘膜部位、他の粘膜部位及び／又は全身的に免疫応答を誘導するための１つ以上の粘膜部位でのワクチンの投与を含む粘膜ワクチン接種である。粘膜ワクチン接種は、いくつかの利点、すなわち、ａ）投与の容易さ、ｂ）微生物の付着及び侵入を阻害する、免疫グロブリンＡ発現の刺激を提供する。しかしながら、粘膜ワクチンの送達は、高分子の通過を制限する細胞間ＴＪの存在によって妨げられる（Ｂｏｒｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃｈｉｔｏｓａｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２（Ｃｈｉｔｏｓａｎ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ），２１１−２２４）。
【０００８】
したがって、安全で、可逆的で、効果的で、理想的には既知の作用様式を備えた新たなＴＪ調節剤を開発する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第９３／２０１０１号
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、細胞内に入るとプロテインキナーゼＣゼータ型（ＰＫＣζ）の阻害剤として作用する新規ペプチドを見出すことに関し、これは組織完全性の一時的な低下を予期せず誘発し、これは組織のタイトジャンクションの開口部を示している可能性がある。本発明のペプチドのこの特性は、一過性の組織透過性を誘導するために、特に、粘膜ワクチン接種で使用される抗体又は高分子等の大きな治療用分子の浸透を増強するために有利に使用され得る。組織透過性特性はまた、高分子量薬物、例えば、インスリン等のペプチド及びタンパク質薬物の経粘膜送達に使用され得て、かかる薬物の非経口投与を回避し得る。さらに、一時的に誘発される組織透過化は、治療剤が特に毒性であり、例えば抗腫瘍薬の場合に、標的細胞の基底外側部へのアクセスを得る必要がある治療の場合に有益となり得う。別の態様によれば、本発明のペプチドを、例えば、眼の疾患又は障害の治療のための眼科用調製物として、薬物（特に生物学的製剤又は高分子）の眼への送達に使用することができる。
【００１１】
本発明のペプチドは、組織への薬物浸透を増加させることによって抗癌薬の有効性を増加させ、例えばアジュバントとして同時送達された場合に粘膜ワクチンに対する免疫応答を有意に改善するのに有用となり得る。
【００１２】
本発明の目的は、毒性が低く、医薬用途に有用な効率的で一過性の組織透過性を誘導する能力を有するＰＫＣζの新たな阻害剤を提供することである。特に、本発明の目的は、治療剤、特に粘膜浸透促進剤、より具体的には鼻浸透促進剤のための組織浸透増強剤を提供することである。
【００１３】
本発明の第１の態様は、式（Ｉ）／配列番号１の化合物と並んで、その薬学的に許容される塩及び薬学的に活性な変異体を提供する。
【００１４】
本発明の別の態様は、本発明による少なくとも１つの化合物を含む医薬組成物に関する。
【００１５】
本発明の別の態様は、癌、特に癌腫の予防及び／又は治療における抗癌腫治療に使用するための本発明による化合物にある。
【００１６】
本発明の別の態様は、粘膜ワクチン接種で使用するための本発明による化合物にある。
【００１７】
本発明の別の態様は、オピオイド使用障害、特にオピオイド過剰投与又はオピオイド依存の予防及び／又は治療に使用するための本発明による化合物にある。
【００１８】
本発明の別の態様は、医薬組成物、特にワクチン組成物の調製のための本発明による化合物の使用にある。
【００１９】
本発明の別の態様は、疾患又は障害に罹患している被験体において治療の有効性を増強する方法であって、当該被験体において、本発明による化合物又はその医薬製剤を、当該疾患又は障害に治療効果のある薬剤と組み合わせて投与することを含み、当該治療効果のある薬剤の組織浸透が、本発明の化合物の不在下で投与された場合に当該治療効果のある薬剤の組織浸透と比較して増強される方法にある。
【００２０】
本発明の別の態様は、癌腫の癌に罹患している被験体を予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする被験体において、本発明による化合物又はその医薬製剤を抗癌腫治療と組み合わせて投与することを含む方法である。
【００２１】
本発明の別の態様は、本発明による化合物と組み合わせて粘膜ワクチンを投与することを含む、免疫を誘導する方法である。
【００２２】
本発明の別の態様は、オピオイド使用障害、特にオピオイド過剰投与又はオピオイド依存に罹患している被験体を予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする被験体において、本発明による化合物又はその医薬製剤を抗オピオイド剤と組み合わせて投与することを含む方法である。
【００２３】
本発明の別の態様は、眼障害に罹患している被験体を予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする被験体において、本発明によるペプチド又はその医薬製剤を眼科用薬剤と組み合わせて投与することを含む方法である。
【００２４】
本発明の別の態様は、有効量の少なくとも１つの治療活性剤及び本発明による少なくとも１つの粘膜浸透促進剤を含む経粘膜的薬物送達システムである。
【００２５】
本発明の別の態様は、有効量の少なくとも１つの治療活性剤及び本発明による少なくとも１つの粘膜浸透促進剤を含む眼送達システム又は製剤である。
【００２６】
本発明のさらなる目的及び有利な態様は、特許請求の範囲から、及び／又は添付の図面を参照する本発明の実施形態の以下の詳細な説明から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、実施例１０に記載されるとおりにＴＥＥＲによって測定された、本発明のペプチド（Ｐ４）（試験１及び試験２で２回測定）、比較ペプチド（ＣＰ４）、及び対照溶液の存在下（ｔ＝０分、２０分、４０分、６０分及び８０分）での鼻上皮単層の上皮完全性を示す。
【図２】図２は、実施例２に記載されるように３００分の期間にわたって（最終濃度５０μＭのペプチド）、対照（ビヒクル）及び比較ペプチドＣＰ４と比較した、鼻上皮単層全体で本発明のＰ３及びＰ４のペプチドで誘導される放出によって測定されたＦＩＴＣ複合化インスリンの透過性を示す。値は平均±Ｓ．Ｄ（ｎ＝３）である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
「細胞浸透部分」という用語は、脂質二重層（例えば、細胞膜）を横切って移動する能力を有するペプチド又は非ペプチド部分を指す。細胞浸透部分が別の分子（積み荷（ｃａｒｇｏ））に複合化すると、脂質二重層（細胞膜等）を越えて細胞又は組織への、また血液脳関門を越える、当該積み荷分子の効率的な輸送を支援又は増強し、言い換えれば、細胞浸透部分は膜貫通担体として作用する。
【００２９】
細胞浸透部分は脂肪酸部分であり得て、例えばアシル化によって、例えばＮ−ミリストイル化又はパルミトイル化によってペプチド骨格に共有結合され得る。本発明による細胞浸透部分として使用できる脂肪酸の例としては、カプリル酸（オクタン酸；Ｃ８：０）、カプリル酸（デカン酸；Ｃ１０：０）、ラウリン酸（ドデカン酸；Ｃ１２：０）、ミリスチン酸（テトラデカン酸；Ｃ１４：０）、パルミチン酸（ヘキサデカン酸、Ｃ１６：０）、ステアリン酸（オクタデカン酸、Ｃ１８：０）、アラキジン酸（イコサン酸、Ｃ２０：０）、ベヘン酸（ドコサン酸、Ｃ２２：０）、リグノセリン酸（テトラコサン酸、Ｃ２４：０）、セロチン酸（ヘキサコサン酸）が挙げられる。
【００３０】
あるいは、本発明の文脈における細胞浸透部分は、細胞浸透ナノ粒子又はカチオン性リポソーム等、例えば、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（登録商標）製剤（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ミリストイル−Ａｒｇ７、ステアリル−Ａｒｇ８、コレステリル−Ａｒｇ９、ステアリル−ＴＰ１０（ＰｅｐＦｅｃｔ３と称される）、ステアリル−（Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ）４、Ｃ１２Ｒ９、Ｃ１２ｄＲ９、Ｃ１２ｄＲ９−１、Ｃ１２ｄＲ９−２、Ｃ１４Ｒ１１、Ｃ１４ｄＲ１１（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、上記；Ｄｉ  Ｐｉｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、前出）において、又はパルトイル鎖及びアルギニン残基を含むベクター（Ｂｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４４：４６８−４７１）において別の細胞浸透性部分に複合化された脂質細胞浸透部分であり得る。
【００３１】
あるいは、細胞浸透部分は、天然タンパク質若しくは２つの天然配列の融合によって形成されたキメラペプチド、又は合理的に設計された合成ペプチドに由来するペプチド配列であり得る。ペプチド細胞浸透部分の例としては、限定されるものではないが、ＴＡＴ（ＨＩＶ転写のトランス活性化因子）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ホメオティックタンパク質アンテナペディア（ＡＮＴｐ、ペネトラチン）、Ｗ／Ｒ、ＮＬＳ（核局在化シグナル）、ＡｌｋＣＷＫ１８、ＤｉＣＷＫ１８、トランスポータン、ＤｉｐａＬｙｔｉｃ、Ｋ１６ＲＧＤ、Ｐｌａｅ、Ｋｐｌａｅ、ｃＫｐｌａｅ、ＭＧＰ、ＨＡ２、ＬＡＲＬ４６、（ＬＡＲＬ）ｎ、Ｈｅｌ−１１−７、ＫＫ、ＫＷＫ、ＲＷＲ、ロリゴマー、ヘルペスウイルスＶＰ２２、ＳＣＷＫｎ、ＲＧＤ、８−リジン、ＭＰＧ、ｐＶＥＣ、ＡＲＦ（１−２２）、ＢＰｒＰｐ（１−２８）、ＶＴ５、ＭＡＰ、ＳＧ３、Ｐｅｐ−７、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）、ステープルペプチド、プレニル化ペプチド、ペプデューシン、Ｐｅｐ−１、ポリアルギニン（９−アルギニン、８−アルギニン、６−アルギニン）、Ｒ６Ｗ３、ＴＰ１０、（Ａｒｇ−Ｘ−Ａｒｇ）ｎペプチドのようなアルギニンに富むぺプチド（ここで、Ｘは一般的な炭素鎖スペーサー）、プロリンに富むペプチドが挙げられる（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２（２）：１６２−７；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，９９１：２８１−９２；Ｂｅｃｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，５８７（１２）：１６９３−１７０２；Ｄｉ  Ｐｉｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，２１（５）：３５６−３６９；Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｐ．，４（５）：５２８−５３４）。
【００３２】
特定の態様によれば、細胞浸透部分は、Ｓｖｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３３（４）：１８６−１９２に記載されている通りである。
【００３３】
一態様によれば、細胞浸透部分は、既知のライゲーションプロトコルを使用して、チアゾリジン、チオエーテル、ジスルフィド又はヒドラゾンの結合を介して本発明のペプチドの残りの骨格に複合化することができる（Ｂｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１前出）。
【００３４】
あるいは、本発明の文脈における細胞浸透部分は、特定の細胞、例えば癌ホーミングペプチドの場合の癌細胞において、タイトジャンクションを特異的に標的化するためのホーミングペプチド（ＨＰ）配列を含み得る。例えば、本発明による細胞浸透部分は、例えば、Ｓｖｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３３（４）：１８６−１９２に記載されているように、細胞浸透部分に複合化されたホーミングペプチド（ＨＰ）配列又は細胞透過性ホーミングペプチド（ＣＰＨＰ）を含み得る。
【００３５】
別の態様によれば、本発明によるペプチドを、例えばそのＣ末端で、ホーミングペプチドにさらに複合化することができる。
【００３６】
「ホーミングペプチド」又はＨＰは、固有の内在化特性を持たず、その積み荷を特定の細胞表面受容体にのみ送達するペプチドを指し、他のＨＰはそれ自体が細胞透過特性を持っている。
【００３７】
「ミリストイル化」という用語は、アミド結合を介したミリストイル基の本発明のペプチドのアミノ酸、特にＮ末端残基のアルファ−アミノ基への複合化を指す。
【００３８】
「治療用分子」又は「治療活性剤」という用語は、疾患の治療又は予防に使用される分子を指す。本発明の文脈における治療用分子の例として、限定されるものではないが、予防的ワクチン（特定の疾患又は病原体に対する免疫を獲得するプロセスで使用される）で使用される分子、治療用ワクチン（例えば、癌治療用ワクチン、又はアレルゲンに対する寛容を誘導するためのワクチン）で使用される分子、治療用抗体（例えば、癌治療用抗体）、低分子量薬物（例えば、癌治療で使用される細胞毒性薬又は酵素阻害剤）、及び麻酔剤が挙げられる。
【００３９】
「プロテインキナーゼＣゼータ型」又は「ＰＫＣζ」という用語は、プロテインキナーゼＣアイソフォームのタイプを指す。
【００４０】
「ＴＪ」と略記される「タイトジャンクション」という用語は、傍細胞空間を通るイオン又は分子の通過を調節する、隣接する上皮細胞又は内皮細胞間の複雑な構造を指す。ＴＪは、タンパク質の様々なセグメント、すなわちクローディン、オクルディン、接合部接着分子（ＪＡＭ）等膜貫通タンパク質と、ＺＯ−１、シンギュリン、アファディン、膜結合型グアニル酸キナーゼ（ＭＡＧＩ１）等の細胞質足場タンパク質とで構成される。タイトジャンクションに対する本発明のペプチドの効果は、ｉ）経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の測定、ｉｉ）傍細胞マーカー（例えば、フルオレセイン−デキストラン）の見かけの透過性（Ｐａｐｐ）の決定、ｉｉｉ）ＴＪタンパク質の蛍光免疫染色及びそれに続くイメージング、ｉｖ）ＴＪタンパク質のｍＲＮＡ及びタンパク質発現の判定により監視することができる。
【００４１】
本明細書で定義される「癌腫」という用語は、上皮細胞（癌腫の全てのサブタイプを含む）の悪性形質転換を伴う疾患である。「癌腫」という用語は、限定されるものではないが、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、食道癌、肝細胞癌、卵巣癌、結腸直腸癌、及び頭頸部癌によって例示される疾患を示す。この用語は、胃癌及び他の固形腫瘍も包含する。
【００４２】
本明細書で定義される「粘膜ワクチン」という用語は、投与の粘膜部位、他の粘膜部位で、及び／又は全身的に免疫応答の誘導をもたらす１つ以上の粘膜部位で投与されるワクチンを指す。粘膜組織は、鼻、口腔、腸、肺、眼、直腸及び膣の組織を含む。「鼻ワクチン」は、鼻の粘膜部位に投与されるワクチンを定義する。
【００４３】
本明細書で定義される「眼又は眼科の疾患」という用語は、ブドウ膜炎、強膜炎、角膜炎、雪盲、タイゲソン表層性点状角膜炎、角膜血管新生、フックスジストロフィー、乾性角結膜炎、虹彩炎、シェーグレン症候群、ヴェグナー肉芽腫症、ベーチェット症候群、ブドウ膜黄斑浮腫、脈絡膜血管新生、網膜血管炎、黄斑浮腫、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、緑内障、白内障、脈絡網膜の炎症、脈絡膜網膜の瘢痕、脈絡膜変性、脈絡膜ジストロフィー、脈絡膜出血、網脈絡膜炎、高血圧性網膜症、黄斑変性、後眼部及び前眼部の疾患等の眼に影響を与える疾患を指す。
【００４４】
「オピオイド使用障害」という用語は、オピオイドを使用したいという強い欲求、オピオイドに対する耐性の増加、及びオピオイドが突然中止された場合の離脱症候群等のオピオイドの使用に関連する臨床的に重大な障害又は苦痛を示す。特に、中毒及び依存は、オピオイド使用障害の最も深刻な要素である。
【００４５】
本明細書で定義される「神経系の疾患又は障害」という用語は、中枢神経系（ＣＮＳ）及び／又は末梢神経系に影響を与える疾患であり、限定されるものではないが、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、末梢神経障害、パーキンソン病、アルツハイマー病及びハンチントン病、鬱病、不安及び精神傷害等の精神神経障害、又はオピオイド、アルコール若しくはニコチンの乱用若しくは中毒等の物質乱用に関連する疾患によって例示される疾患を示す。
【００４６】
本発明による治療の「有効性」という用語は、本発明による使用又は方法に反応した疾患の経過の変化に基づいて測定することができる。例えば、本発明による治療の有効性は、病気の徴候又は症状に対するその影響によって測定することができる。被験体が病気の望ましくない症状の部分的若しくは完全な緩和、又は軽減を経験したときに、反応が達成される。特定の実施形態によれば、有効性は、単独で使用される同じ分子の効果と比較して、本発明の化合物と組み合わせて使用される治療用分子の効果の増加の評価を通じて測定することができる。例えば、本発明による抗癌治療の有効性は、腫瘍サイズへの影響を追跡することによって、又はこのように治療された患者群間の生存の改善によって監視することができる。
【００４７】
本発明による治療の「有効性」という用語は、本発明のペプチドなしで投与される治療と比較した治療副作用の減少に基づいて測定することができる。
【００４８】
本発明によるワクチンの「有効性」という用語は、免疫系応答の変化に基づいて判断することができる。例えば、本発明によるワクチン接種の有効性は、特定の疾患／病原体に対する獲得免疫に対するその影響によって測定することができる。例えば、ワクチン接種への反応は、被験体が病原体の増殖を排除又は予防する特殊な全身性の細胞及びプロセスを獲得したときに達成される。
【００４９】
本発明はまた、アレルゲン、例えば、組み換えアレルゲンの粘膜（例えば、口又は鼻）浸透を増加させることによって、アレルギーワクチンの有効性（寛容の誘導）を増加させるために使用され得る。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「治療」及び「治療すること」等は、一般に、所望の薬理学的及び生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾患、その症状又は状態を予防又は部分的に予防するという点で予防的であり得、及び／又は疾患、状態、症状又は疾患に起因する有害作用の部分的若しくは完全な治癒に関して治療的であり得る。
【００５１】
本明細書で使用される「透過化」という用語は、膜の片側に存在する薬剤に対して膜を透過性にするプロセスを指す。本発明の文脈では、本発明の化合物によって達成される透過化は、上皮細胞層を横切る分子の浸透を増強する。いくつかの薬剤に対する組織透過性を増加させる本発明の化合物の能力は、以下に記載されるような既知のアッセイで試験することができる。
【００５２】
本明細書で使用される「被験体」という用語は、哺乳動物を指す。例えば、本発明によって企図される哺乳動物としては、ヒト、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等の家畜、実験用げっ歯類等が挙げられる。
【００５３】
「Ｄ−アミノ酸」という用語は、アミノ酸のＤ立体異性体又はアミノ酸の「右手（ｒｉｇｈｔ−ｈａｎｄｅｄ）」異性体を指す。
【００５４】
本発明の文脈では、非極性アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ及びＰｒｏ、又はそれらの保存的置換から選択され得る。
【００５５】
本発明の文脈では、正に帯電したアミノ酸は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ若しくはＨｉｓ、又はそれらの保存的置換から選択される。
【００５６】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置のアミノ酸残基の極性又は電荷にほとんど又はまったく影響がないように、天然アミノ酸残基を非天然残基で置換することを含み得る。所望のアミノ酸置換は、かかる置換が望まれるときに当業者によって決定され得る。「変異体」という用語はまた、参照ペプチド配列に実質的に相同であるが、１つ以上のアミノ酸がアミノ酸類縁体によって化学的に修飾又は置換されているため、参照配列のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するペプチド又はポリペプチドを含む。例えば、非天然残基を導入して、ペプチドベースの治療薬の薬理学的特性を高めることができる（Ｇｅｕｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５６，１２６２；Ｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ，３，１２８２）。
【００５７】
別の特定の実施形態によれば、本発明のペプチドを、任意にＣ末端でアミド化することができる。
【００５８】
「医薬製剤」という用語は、有効成分（複数の場合もある）の生物学的活性が明白に有効であることを可能にするような形態であり、当該製剤が投与され得る被験体に毒性となり得る追加の成分を含まない調製物を指す。
本発明の化合物
【００５９】
一態様によれば、下記式（Ｉ）：
Ｚ−Ｚ１−Ｘａａ４Ｘａａ５ＲＸａａ７Ｘａａ８−Ｚ２  （Ｉ）
の合計で５個〜１０個のアミノ酸のペプチドであって、
式（Ｉ）中、Ｚは細胞浸透部分であり、
Ｚ１は、式（ＩＩ）：
Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３    （ＩＩ）
の１個〜３個のアミノ酸の任意のペプチド部分であり、
式（ＩＩ）中、Ｘａａ１及びＸａａ２は存在する場合も存在しない場合もあり、存在する場合、Ｘａａ１及びＸａａ２は独立して正に帯電したアミノ酸、より具体的にはＡｒｇであり、Ｘａａ３は非極性アミノ酸、特にＧｌｙであり
Ｘａａ４は、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＶａｌから選択されるアミノ酸、より具体的にはＡｌａであり、
Ｒはアルギニンであり、
Ｘａａ５及びＸａａ８は独立して正に帯電したアミノ酸、より具体的にはＡｒｇであり、
Ｘａａ７は非極性アミノ酸、より具体的にはＴｒｐであり、
Ｚ２は式（ＩＩＩ）：
Ｘａａ９Ｘａａ１０  （ＩＩＩ）
の１個〜２個のアミノ酸の任意のペプチド部分であり、
【００６０】
式（ＩＩＩ）中、Ｘａａ９は正に帯電したアミノ酸、より具体的にはＬｙｓであり、Ｘａａ１０は存在する場合も存在しない場合もあり、存在する場合、Ｘａａ１０は非極性アミノ酸、特にＬｅｕであり、式（Ｉ）の少なくとも１つのアミノ酸はＤ−アミノ酸である、ペプチドを提供する。
【００６１】
特定の実施形態によれば、式（Ｉ）のペプチドが提供され、ここで、上記細胞浸透部分Ｚは、ペプチドのＮ末端に共有結合している。
【００６２】
別の特定の実施形態によれば、配列番号１のアミノ酸コンセンサス配列によって表すことができる、式（Ｉ）の合計で５個〜１０個のアミノ酸のペプチドが提供される。
【００６３】
別のさらなる特定の態様によれば、Ｚ１が存在しない式（Ｉ）のペプチドが提供される。
【００６４】
別のさらなる特定の態様によれば、Ｚ２が存在しない式（Ｉ）のペプチドが提供される。
【００６５】
別のさらなる特定の態様によれば、Ｚ１及びＺ２が存在しない式（Ｉ）のペプチドが提供される。
【００６６】
別のさらなる特定の態様によれば、Ｘａａ４がＡｌａである式（Ｉ）のペプチドが提供される。
【００６７】
別のさらなる特定の態様によれば、Ｘａａ５がＡｒｇである式（Ｉ）のペプチドが提供される。
【００６８】
別のさらなる特定の態様によれば、Ｘａａ５がＬｙｓである式（Ｉ）のペプチドが提供される。
【００６９】
別のさらなる特定の態様によれば、Ｘａａ８がＡｒｇである式（Ｉ）のペプチドが提供される。
【００７０】
別のさらなる特定の態様によれば、Ｘａａ５及びＸａａ８がＡｒｇである式（Ｉ）のペプチドが提供される。
【００７１】
別のさらなる特定の態様によれば、Ｘａａ５がＬｙｓであり、Ｘａａ８がＡｒｇである式（Ｉ）のペプチドが提供される。
【００７２】
別のさらなる特定の態様によれば、Ｘａａ７がＴｒｐである式（Ｉ）のペプチドが提供される。
【００７３】
別のさらなる特定の態様によれば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのアミノ酸がＤ−アミノ酸である式（Ｉ）のペプチドが提供される。
【００７４】
別のさらなる特定の態様によれば、５つのアミノ酸がＤ−アミノ酸である式（Ｉ）のペプチドが提供される。
【００７５】
別のさらなる特定の態様によれば、全てのアミノ酸がＤ−アミノ酸である式（Ｉ）のペプチドが提供される。
【００７６】
別のさらなる実施形態によれば、下記式（Ｉａ）の本発明のペプチドが提供される：
2021527642.tif 000002
（Ｉａ）
式（Ｉａ）中、Ｚは本明細書に記載のとおりであり、Ｒ１はＯＨ及びＮＨ２等のアミノ基から選択され、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ又は少なくとも５つのアミノ酸はＤ−アミノ酸である。
【００７７】
別のさらなる実施形態によれば、下記式（ＩＩａ）の本発明のペプチドが提供される：
2021527642.tif 000003
（ＩＩａ）
式（Ｉａ）中、Ｚは本明細書に記載のとおりであり、Ｒ１はＯＨ及びＮＨ２等のアミノ基から選択され、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ又は少なくとも５つのアミノ酸はＤ−アミノ酸である。
【００７８】
さらなる特定の態様によれば、上記細胞浸透部分Ｚは脂肪酸部分である。
【００７９】
別のさらなる特定の態様によれば、脂肪酸部分はミリストイル基である。
【００８０】
別のさらなる特定の実施形態では、配列番号２の本発明のペプチド（ペプチドＰ４）が提供される。
【００８１】
別のさらなる特定の実施形態では、配列番号４（ペプチドＰ３）の本発明のペプチドが提供される。
【００８２】
一実施形態によれば、本発明の化合物は、合成法、特に固相ペプチド合成によって調製することができる。一実施形態によれば、市販されていない細胞浸透部分を、グラフト前に、標準的な方法に従って最初に別々に調製することができる。
【００８３】
特定の実施形態によれば、本発明の化合物は、プロテインキナーゼＣゼータ型（ＰＫＣζ）の阻害剤である。
【００８４】
特定の実施形態によれば、本発明の化合物は、一時的なタイトジャンクション開口剤である。
組成物
【００８５】
本発明の医薬組成物は、本発明による１つ以上の化合物と、その薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含むことができる。
【００８６】
特定の態様によれば、組成物は、医学的障害の治療又はワクチンにおいて有用な化合物をさらに含む。
【００８７】
特定の態様によれば、本発明の組成物は抗癌組成物である。
【００８８】
特定の態様によれば、本発明の組成物は、抗オピオイド組成物である。
【００８９】
特定の態様によれば、本発明の組成物は眼科用組成物である。
【００９０】
特定の態様によれば、本発明の組成物は経口組成物である。
【００９１】
別の特定の態様によれば、本発明の組成物は、ワクチン組成物、特にワクチン組成物等の粘膜ワクチン組成物である。
【００９２】
本発明の組成物は、癌、特に癌腫の治療に有用な少なくとも１つの薬剤をさらに含み得る。
【００９３】
別の特定の態様によれば、本発明の組成物は、神経系の疾患又は障害、特に神経変性疾患又は精神神経障害の治療に有用な少なくとも１つの薬剤をさらに含み得る。
【００９４】
別の特定の態様によれば、本発明の組成物は、オピオイド使用障害、特にオピオイド過剰投与又はオピオイド依存の治療に有用な少なくとも１つの薬剤をさらに含み得る。
【００９５】
別の特定の態様によれば、本発明の組成物は、ブドウ膜炎等の眼障害の治療に有用な少なくとも１つの眼科用薬剤をさらに含み得る。
【００９６】
別の特定の態様によれば、癌、特に癌腫の治療に有用な薬剤は、アルキル化剤、血管新生阻害剤、抗体（例えば、ベバシズマブ、ダクリズマブ等から選択される抗腫瘍モノクローナル抗体等）、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤、抗増殖剤、オーロラキナーゼ阻害剤、アポトーシスプロモーター（例えば、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ及びＢｆｌ−１）阻害剤、デスレセプター経路の活性化因子、Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼ阻害剤、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞誘導（Ｂｉ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｎｇａｇｅｒ））抗体、生物学的応答修飾因子、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤、増殖因子阻害剤、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）−９０阻害剤、脱メチル化剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、ホルモン療法、免疫物質（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、アポトーシス阻害タンパク質（ＩＡＰ）インターカレーター抗生物質（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）、キナーゼ阻害剤、ラパマイシン阻害剤の哺乳類標的、ｍｉｃｒｏＲＮＡのマイトジェン活性化細胞外シグナル調節キナーゼ阻害剤、多価結合タンパク質、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ポリＡＤＰ（アデノシン二リン酸）−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、プラチナ化学療法剤、ポロ様キナーゼ（Ｐｌｋ）阻害剤、プロテアソーム阻害剤、プリン類縁体、ピリミジン類縁体、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、レチノイド／デルトイド植物アルカロイド、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、トポイソメラーゼ阻害剤、樹状細胞療法に使用される薬剤、又は癌治療に適した／承認された任意の他の活性物質、例えば、国際公開公報第２０１１／１５６７６１号に記載されているものから選択される。特に、癌、特に癌腫の治療に有用な薬剤は、トラスツズマブ、ラムシルマブ、ドセタキセル、塩酸ドキソルビシン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、エルロチニブ、アファチニブ、ゲフィチニブ、ベバシズマブ、クリゾチニブ、セリチニブ、セツキシマブ、ニボルマブ、ペンブロルジマブ、メトトレキサート及びブレオマイシンから選択される。
【００９７】
特定の態様によれば、癌腫の治療に有用な薬剤が、タンパク質（例えば、抗体）、キナーゼ、設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ：Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ａｎｋｙｒｉｎ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、小分子又は癌治療に適した／承認された他の活性物質から選択される、本発明による医薬組成物が提供される。
【００９８】
さらなる特定の実施形態によれば、本発明の少なくとも１つのペプチドと、少なくともゲフィチニブとを含む本発明による医薬組成物が提供される。
【００９９】
別のさらなる特定の実施形態によれば、本発明の少なくとも１つのペプチドと、少なくとも酢酸ブセレリンとを含む本発明による医薬組成物が提供される。
【０１００】
別の特定の態様によれば、オピオイド使用障害の治療に有用な薬剤は、オピオイド受容体アンタゴニスト又はオピオイド受容体モジュレーター等の抗オピオイド剤である。
【０１０１】
別のさらなる特定の態様によれば、抗オピオイド剤は、ナロキソン及びブプレノルフィン、又はそれらの組み合わせから選択される。
【０１０２】
別の特定の態様によれば、神経系の疾患又は障害の治療に有用な薬剤は、ナルトレキソン、スマトリプタン、ゾルミトリプタン、ニコチン、ミダゾラム、ロラゼパム、フェンタニル、ケタミン、ケトロラック、ブトルファノール、ヒドロモルフォンから選択される。
【０１０３】
特定の態様によれば、本発明の組成物は、以下の群から選択される少なくとも１つの薬剤をさらに含み得る：アルコール（ナルトレキソン等）の使用に関連する疾患又は障害、アナフィラキシーショック（ピネフリン（ｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）、フェントラミン又はエンタカポン等）、片頭痛（スマトリプタン又はゾルミトリプタン等）、通年性及び季節性アレルギー性鼻炎（ブデソニド、ジプロピオン酸ベクロメタゾン及び一水和物（微粉化）、フロ酸モメタゾン、トリアムシノロンアセトニド、プロピオン酸フルチカゾン、フロ酸フルチカゾン、塩酸アゼラスチン又はクロモグリク酸ナトリウムを含むフルチカゾン）、ニコチン離脱症状（ニコチン等）、低血糖症（グルカゴン等）、痙攣（ミダゾラム又はロラゼパム等）の予防及び／又は治療に有用な薬剤、又は子宮内膜症の予防及び／又は治療に有用な薬剤（卵巣刺激用の酢酸ナファレリン等）、又は疼痛制御に有用な薬剤（フェンタニル、ケタミン、ケトロラク、ブトルファノール又はヒドロモルフォン等）をさらに含み得る。
【０１０４】
別の態様によれば、本発明の組成物は、鼻腔内送達に適した少なくとも１つの治療用ペプチド（酢酸デスモプレシン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、インターフェロンベータ又はＭａｇｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，３（４）：５２９−５３９、又はＬｏｃｈｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，６４：６１４−６２８に列挙されるもの等）、特に、ホルモン及びその類縁体又は誘導体（インスリン、グルカゴン、バソプレッシン等）、インターフェロン（インターフェロン−ベータ等）、生物学的に活性なペプチド（増殖因子、インターロイキン、酵素等）、中枢神経系で機能する神経伝達物質又は神経イオンチャネルを調節する化合物又は分子（抗鬱薬（ブプロピオン）、神経伝達物質受容体アゴニスト／アンタゴニスト、抗痙攣剤（トピラメート、ゾニサミデ）等）、並びに例えば、米国特許出願公開第２００８／０２９９０７９号に記載されているもののような任意の他の活性剤をさらに含み得る。
【０１０５】
本発明の組成物は、ワクチン接種、特にコレラ毒素の組み換えＢサブユニット及び不活化コレラ菌（ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）Ｏ１（稲葉及び小川血清型）、コレラ菌Ｏ１の死滅全細胞、並びにコレラ菌Ｏ１３９、生弱毒化ロタウイルスｐ１ａ（８）型、ｇ１〜ｇ４又はｒｉｘ  ４４１４型、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａの弱毒化生株、生弱毒化インフルエンザウイルス、生弱毒化一価又は五価のロタウイルス、生弱毒化三価、二価及び一価のポリオウイルス、生弱毒化チフス菌の細菌、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）を有する又は有しない不活化コレラ菌Ｏ１古典的バイオタイプ及びＥｌ  Ｔｏｒバイオタイプ（Ｍｅｖｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ＆ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０（８）：２１７５−２１８７；Ｓａｅ−Ｈａｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４６：ｅ８５）を更に含み得る。等の粘膜ワクチン接種に有用な少なくとも１つの薬剤をさらに含み得て
【０１０６】
さらなる特定の態様によれば、治療活性剤と、該活性剤の重量ベースで０．０１％〜２０％重量／体積の量で本発明による少なくとも１つのペプチドを含む組成物が提供される。
【０１０７】
さらなる特定の態様によれば、治療活性剤と、該活性剤の重量ベースで０．０１％〜８０％重量／体積の量で本発明による少なくとも１つのペプチドを含む組成物が提供される。
【０１０８】
本発明の組成物は、ミョウバン、安定剤、抗菌剤、バッファー、着色剤、香味剤、アジュバント等の１つ以上の薬学的に許容される追加の成分をさらに含み得る。
【０１０９】
本発明の組成物はまた、注射又は持続注入によるものを含むがこれらに限定されない非経口投与用に製剤化され得る。注射用製剤は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルションの形態であり得、これらに限定されないが、懸濁剤、安定剤及び分散剤を含む配合剤を含み得る。組成物はまた、無菌のパイロジェンフリー水を含むがこれらに限定されない適切なビヒクルで再構成するための粉末形態で提供され得る。
【０１１０】
本発明の組成物は、吸入用に製剤化することができ、これは、限定されるものではないが、乾燥粉末として、又はジクロロジフルオロメタン若しくはトリクロロフルオロメタン等の噴射剤を使用するエアロゾルの形態で投与することができる溶液、懸濁液又はエマルションを含む形態であり得る。
【０１１１】
特定の実施形態によれば、本発明による組成物は、腫瘍内注射用である。
【０１１２】
特定の実施形態によれば、本発明による組成物は、粘膜表面送達用である。特定の実施形態によれば、本発明による組成物は、腸上皮バリアを越えて生物製剤又は高分子を送達するのに、特にペプチド、ホルモン及び抗体等の生物製剤を経口送達するのに有用である。
【０１１３】
別の特定の態様では、本発明による組成物は、単回又は複数回の投与による送達に適合している。
【０１１４】
あるいは、本発明の組成物はまた、エアロゾル化可能な溶液又は吸入可能な薬学的に許容される組成物として製剤化され得る。かかる製剤では、本発明による化合物は、例えば、吸入可能な乾燥粉末として、又はエアロゾル化可能な溶液として調製される。特に、経鼻送達に適した組成物は、液滴（例えば、点眼薬）、スプレー、ゲル、懸濁液、エマルション、マイクロエマルション、ミセル製剤、リポソーム製剤、粉末、微粒子及びナノ粒子として製剤化することができる。
【０１１５】
特定の実施形態によれば、本発明の組成物は獣医用組成物である。
【０１１６】
さらなる材料と並んで製剤処理技術等は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ“Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”，２２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓの第５部に述べられており、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１７】
本発明は、本発明のペプチド、その組成物、及び医学的障害の治療において、特に治療活性物質の組織透過促進剤として、特に抗癌剤、抗オピオイド剤と組み合わせて、又はワクチン組成物のアジュバントとして、有用な本発明のペプチドを用いる方法を提供する。
【０１１８】
本発明は、本発明のペプチド、その組成物、及び医学的障害、特に癌腫の治療又はワクチン接種プロセスにおいて有用な本発明のペプチドを使用する方法を提供する。
投与様式
【０１１９】
本発明の組成物を、経口、非経口、舌下、経皮、経粘膜、局所、吸入、頬側若しくは鼻腔内の投与、又はそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない任意の方法で投与又は送達することができる。非経口投与としては、限定されるものではないが、腫瘍内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下及び筋肉内が挙げられる。
【０１２０】
別の特定の実施形態では、本発明による化合物は、注射によって全身投与される。
【０１２１】
別の特定の実施形態では、本発明による化合物は、吸入によって投与される。
【０１２２】
別の特定の実施形態では、本発明による化合物は、経粘膜的に投与される。
【０１２３】
別の特定の実施形態では、本発明による化合物は、鼻腔内で投与される。
【０１２４】
別の特定の実施形態では、本発明による化合物は、腫瘍内で投与される。
【０１２５】
別の特定の実施形態では、本発明による化合物は、局所的に、特に眼に投与される。
【０１２６】
別の特定の実施形態では、本発明による化合物は経口投与される。
【０１２７】
特定の実施形態では、本発明による方法は、本発明の化合物又はその組成物の気管支鏡ガイド下腫瘍内注射を含む、本発明による化合物を被験体の肺の腫瘍に投与する方法である。
【０１２８】
個人に対する単回又は複数回用量の投薬量は、薬物動態特性、被験体の状態及び特徴（性別、年齢、体重、健康及びサイズ）、症状の程度、併用している治療、治療の頻度及び望ましい効果を含む様々な要因に応じて異なる。
組み合わせ
【０１２９】
一態様によれば、本発明の化合物は、疾患の予防及び／又は治療に有用な少なくとも１つの治療用分子と組み合わせて投与されるものである。
【０１３０】
一態様によれば、本発明の化合物は、癌、特に癌腫の予防及び／又は治療に有用な少なくとも１つの治療用分子と組み合わせて投与されるものである。
【０１３１】
一態様によれば、本発明の化合物は、ワクチン接種、特に粘膜ワクチン接種に有用な治療用分子と組み合わせて投与されるものである。
【０１３２】
別の態様によれば、本発明の化合物は、神経系の疾患又は障害、特に神経変性疾患又は精神神経障害の予防及び／又は治療に有用な少なくとも１つの治療用分子と組み合わせて投与されるものである。
【０１３３】
別の態様によれば、本発明の化合物は、オピオイド使用障害の予防及び／又は治療に有用な少なくとも１つの治療用分子、特に鼻腔内送達に適した抗オピオイドと組み合わせて投与されるものである。
【０１３４】
別の態様によれば、本発明の化合物は、神経系の疾患又は障害、特に神経変性疾患又は精神神経障害の治療に有用であり、鼻腔内送達に適した少なくとも１つの薬剤と組み合わせて投与されるものである。例えば、本発明の化合物は、鼻腔内送達を介した血液脳関門（ＢＢＢ）によるこれらの薬剤の送達を増強するために使用される。
【０１３５】
本発明は、化合物が、治療レジメン又は少なくとも１つの助剤の前に、それと同時に又はそれと連続して被験体に投与される、本発明の化合物の投与を包含する。当該少なくとも１つの助剤と同時に投与される本発明による化合物は、同じ又は異なる組成物で、同じ又は異なる投与経路で投与することができる。
【０１３６】
一態様によれば、本発明の化合物は、肺癌の治療に有用な少なくとも１つの治療用分子と共に、任意に同じ組成物で同時に投与することができる。
【０１３７】
さらなる特定の態様によれば、本発明の化合物は、ガイド付き気管支鏡検査によって腫瘍内に投与することができる。
【０１３８】
別の特定の実施形態では、本発明による化合物は、ブドウ膜炎等の眼の疾患又は障害の治療のために局所的に投与される。
【０１３９】
本発明による化合物は、少なくとも１つのワクチン組成物と共に、任意に同じ組成物で同時に投与することができる。
【０１４０】
別の態様によれば、本発明の化合物は、オピオイド使用障害の予防及び／又は治療に有用な少なくとも１つの治療用分子、特に鼻腔内送達に適している１つ以上の抗オピオイドと組み合わせて、任意に同じ組成物で同時に投与することができる。
患者
【０１４１】
一実施形態では、本発明による被験体は癌腫に罹患しているか、又は罹患するリスクがある。
【０１４２】
さらなる実施形態では、本発明による被験体は、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、食道癌、肝細胞癌、卵巣癌、結腸直腸癌及び頭頸部癌、並びに他の固形腫瘍に罹患しているか、又は罹患するリスクがある。
【０１４３】
さらなる実施形態では、本発明による被験体は、肺癌に罹患しているか、又は罹患するリスクがある。
【０１４４】
さらなる実施形態では、本発明による被験体は、胃癌に罹患しているか、又は罹患するリスクがある。
【０１４５】
さらなる実施形態では、本発明による被験体は、神経系の疾患又は障害、特に神経変性疾患又は精神神経障害に罹患しているか、又は罹患するリスクがある。
【０１４６】
さらなる実施形態では、本発明による被験体は、オピオイド使用障害に罹患しているか、又は罹患するリスクがある。
【０１４７】
さらなる実施形態では、本発明による被験体は、ブドウ膜炎等の眼障害に罹患しているか、又は罹患するリスクがある。
【０１４８】
別の実施形態では、本発明による被験体は、例えばインフルエンザウイルス、ロタウイルス、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  Ｃｈｏｌｅｒａｅ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｈｙｐｈｉ）又はポリオウイルスの感染症に対するワクチン接種等の粘膜ワクチン接種に供される。
本発明による使用
【０１４９】
本発明による化合物は、治療用分子、特に、任意の疾患の予防及び／又は治療に使用されるもの、特に癌（例えば、癌腫）の予防及び／又は治療、又はオピオイド使用障害又はワクチン接種に使用されるものの効果を増強するのに有用である。
【０１５０】
別の態様によれば、本発明による化合物を、血液脳関門（ＢＢＢ）を通る、皮膚を横断する薬剤の送達を考慮して、又は局所麻酔を改善することを考慮して組織を通る麻酔薬の拡散を改善するために使用することができる。
【０１５１】
特定の態様によれば、本発明のペプチドは、既知のＰＫＣζ偽基質に対して様々な利点を示し、その内いくつかは、タイトジャンクション調節におけるＰＫＣζの役割を調査するためのツールとして使用され、マウス回腸のタイトジャンクションを妨害することができると記載されている（Ｊａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，４３７（２），２８９−２９９）が、透過剤としての使用は示唆されておらず、それらの有効性を高めるための治療用又はワクチン高分子との組み合わの示唆はさらに少ない。本発明の別の態様は、疾患又は障害に罹患している被験体において治療の有効性を増強する方法であって、当該被験体において、本発明による化合物又はその医薬製剤を、当該疾患又は障害に治療効果のある薬剤と組み合わせて投与することを含み、当該治療効果のある薬剤の組織浸透が、本発明の化合物の不在下で投与された場合に当該治療効果のある薬剤の組織浸透と比較して増強される方法にある。
【０１５２】
本明細書で引用された参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、本発明の個々の態様の単一の例示として意図される、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるものではなく、機能的に等価な方法及び構成要素が本発明の範囲に含まれる。実際、本明細書に示され、説明されたものに加えて、本発明の様々な修正が、前述の説明から当業者に明らかになるであろう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。本発明を説明したが、以下の実施例は、限定ではなく例示として提示されている。
実施例
【０１５３】
次の略語は、それぞれ以下の定義を指す。
ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；Ｃａｃｏ−２（ヒト腸上皮細胞）；ＣＴＲＬ（対照）；ＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）；ＤＣＭ（ジクロロメタン）；ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）；ＥＤＴ（エタンジチオール）；ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）；ＦＤ（フルオレセイン結合デキストラン）；Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）；ＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）；ＨＯＢＴ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）；ｉ．ｎ．（鼻腔内）；ｍｙｒ（ミリストイル基）；ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）；ＯＣＡ＿ＥＧＦＲ１９ｄｅｌ（ＥＧＦＲ  ｅｘ１９：ｄｅｌ変異を有する腫瘍を含む細胞培養物）；Ｏｖａ（オボアルブミン）；Ｐａｐｐ（見かけの透過性）；ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）；ＰＫＣζ（プロテインキナーゼＣゼータ型）；ＰＳ（偽基質）；ＴＥＥＲ（経上皮電気抵抗）；ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）；ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）；ＴＪ（タイトジャンクション）；ＺＯ−１（ゾニューラオクルディン−１）。
【０１５４】
実施例１：本発明による化合物の合成
本発明の化合物は、固相ペプチド合成によって調製される。実例として、ペプチドＰ４（配列番号２）の合成の工程を以下に提供する：
【０１５５】
工程１−反応容器をジクロロメタン（ＤＣＭ）で洗浄し、底部に窒素を吹き付けて、その後完全に排出した。
【０１５６】
工程２−樹脂の膨潤：２−クロロトリチルクロリドを反応容器内に秤量し、次いで樹脂をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；１５ｍｌ／ｇ）で３０分間膨潤させた。
【０１５７】
工程３−ペプチドのＣ末端から最初のＤ−アミノ酸のカップリング：１．６ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨを試験管に秤量し、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−アミノ酸をＤＭＦ／ＤＣＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１：１）に溶解した（１５ｍｌ／ｇ）。溶液を上記の反応容器に移し、１０倍のＤＩＥＡ（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）を加え、室温で３０分間窒素と混合した。
【０１５８】
工程４−樹脂の活性部位を遮断する：５ｍＬのメタノールを反応容器に加え、１０分間底部に風を吹き付けた。反応容器から水を抜き、ＤＭＦ（３倍）、ＤＣＭ（３倍）及びＤＭＦ（３倍）で洗浄した。
【０１５９】
工程５−脱保護：反応容器から水を抜き、次いで２０％ピペリジン（１５ｍｌ／ｇ）を加えてＦｍｏｃ保護基を除去した。１０分間を１回及び５分間を１回、混合物の底部に風を吹き付けた。次いで、反応容器をＤＭＦ（３倍）、ＤＣＭ（３倍）、ＤＭＦ（３倍）で洗浄した。
【０１６０】
工程６−カップリングの監視：樹脂の試料を採取し、２５％ニンヒドリン−アルコール溶液２滴及び２０％フェノール−アルコール溶液１滴を加え、次いで、ピリジン１滴を加え、次に試料を１０５℃で５分間加熱し、濃い青色への色の変化は陽性反応を示し、色の変化がないことは反応がないことを示す。
【０１６１】
工程７−濃縮：３倍過剰の保護アミノ酸、５ｇのＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＨＯＢＴ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）（１ｇ）及びＤＩＥＡ（２ｍｌ）をＤＭＦに加えて溶解し、次にＤＣＭ（１５ｍｌ／ｇ）を加え、混合物を１時間反応させた。
【０１６２】
工程８−洗浄：反応容器をＤＣＭ（１５ｍｌ／ｇ）及びＤＭＦ（１５ｍｌ／ｇ）で交互に３回洗浄した。
【０１６３】
工程９−モニタリング：工程６と同様。
【０１６４】
工程１０−残りのＤ−アミノ酸のカップリング：工程５〜９を繰り返して、他のアミノ酸をカップリングさせた。
【０１６５】
工程１１−ペプチドのＮ末端でｍｙｒ基を連結する。
【０１６６】
工程１２−洗浄：最後のアミノ酸（Ｎ末端からの最初のアミノ酸）のカップリング及び脱保護の後に、次の試薬：２倍のＤＭＦ（１０ｍｌ／ｇ）、２倍のメタノール（１０ｍｌ／ｇ）、２倍のＤＭＦ（１０ｍｌ／ｇ）、２倍のＤＣＭ（１０ｍｌ／ｇ）で順番に樹脂を洗浄し、次いで、１０分間ブロー乾燥（ｄｒａｗ  ｄｒｙｉｎｇ）した。
【０１６７】
工程１３−切断：切断を以下の試薬を用いて行った：ＴＦＡ  ９４．５％（トリフルオロ酢酸）、水２．５％、ＥＤＴ  ２．５％（エタンジチオール）、ＴＩＳ  １％（トリイソプロピルシラン）。切断時間は２時間であった。
【０１６８】
工程１４−ブロー乾燥及び洗浄：切断溶液を可能な限り窒素ガスでブロー乾燥し、無水エーテルで６回洗浄し、空気中で乾燥させた。
【０１６９】
工程１５−ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）による精製。精製溶液を凍結乾燥し、白色粉末形態の生成物を得た。
【０１７０】
ＨＰＬＣによる精製
粗ペプチドを精製水に溶解し、以下の条件下で精製した。
粗ペプチドを精製水で溶解する。精製条件は以下の通りである：
ポンプＡ：１００％水中の０．１％トリフルオロ酢酸  ０．１％ＴＦＡ−１００％水溶液
ポンプＢ：１００％アセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸  ０．１％ＴＦＡ−１００％ＡＣＮ溶液
調製カラム：Ｖｅｎｕｓｉ  ＭＲＣ−ＯＤＳ  Ｃ１８  ３０×２５０ｍｍ．
分取カラム：Ｖｅｎｕｓｉ  ＭＲＣ−ＯＤＳ  Ｃ１８  ３０×２５０ｍｍ
総流量：１．０ｍｌ／分流量：１．０ｍｌ／分
ローディング量：３ｍｌのサンプリング量：３ｍｌ
検出波長：２２０ｎｍ検出波：２２０ｎｍ
勾配        勾配
時間（分）    Ａ      Ｂ
０５．００  ９０％  １０％
３０．００  ２０％  ８０％
３０．１０  停止
【０１７１】
本発明の他のペプチドの合成は、異なる又は追加のアミノ酸を使用して配列番号１のペプチドをもたらすことにより、同様の方法で調製することができる。細胞浸透部分のグラフトは、ペプチド細胞浸透部分の場合の固相合成等の当業者に知られている標準的な方法を介して、又は本明細書に記載されるように達成され得る。
【０１７２】
本発明の化合物はまた、化学選択的ライゲーション合成で調製することができる（Ｂｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、前出）。
【０１７３】
実施例２：高分子の膜透過性に対する様々な長さのペプチドの効果が増加
治療用分子の透過性に対する本発明のペプチドの潜在的効果を評価するために、ＦＩＴＣインスリン（スイス国ブフスＳＧのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、上皮単層を横切る傍細胞薬物輸送（頂端から基底外側部）を評価するためのモデルとして使用する。
【０１７４】
実験の過程で単層の完全性が維持されることを保証するために、以下に記載するように、これらの研究の前後に経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定する。
【０１７５】
ＭｕｃｉｌａｉｒＴＭヒト初代鼻及び気管支上皮細胞（スイス国ジュネーブのＥｐｉｔｈｅｌｉｘ  ｓａｒｌ）及びＣａｃｏ−２ヒト腸上皮細胞を使用する（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，２０１３，Ｔｏｘｉｃｏｌ．ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２７：１１５１−１１５６）。
【０１７６】
各実験の前に、培養培地を各コンパートメントから取り出し、単層を２００μｌの生理食塩水（０．９％）で１回、温かいハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（３７℃）で１回洗浄する。基底外側コンパートメントに、６００μＬの予熱したＨＢＳＳを入れ、細胞を３７℃のインキュベーターに３０分間戻し、平衡化する。平衡化後、本発明のペプチド及び傍細胞マーカー（ＦＩＴＣインスリン）を上皮単層の頂端側に適用する。本発明によるペプチドＰ４（配列番号２）及びＰ３（配列番号４）を、比較ペプチドＣＰ４（配列番号３）と比較して試験する。
【０１７７】
全てのペプチドを５０μＭの最終濃度で使用する。ビヒクルを対照（ＣＴＲＬ）として使用する。ＦＤ溶液を頂端コンパートメントに加えて、最終容量を２００μｌにする。１００μＬの試料を各ウェルの基底外側コンパートメントから１５０分間にわたって３０分ごとに採取し、シンク（ｓｉｎｋ）状態を維持するために各容量を等量の新たな温かいバッファーと交換する。ＦＤの蛍光を、蛍光プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｍｘプレートリーダー、スイス国ルツェルンのＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＧｍｂＨ）を使用して、４８５及び５２０ｎｍの励起波長及び発光波長をそれぞれ使用して、黒色の９６ウェルプレートで測定する。累積放出量（ｎｇ）は、累積的に放出された薬物の実際の量に対応し、任意の時点での懸濁培地中の量に各サンプリング中に失われた薬物の量を加えたものに対応する。
【０１７８】
図２に示すように、比較ペプチドＣＰ４は、対照と比較して、傍細胞マーカーであるインスリンＦＩＴＣの透過性をわずかに増加させた。予期せぬことに、本発明のＰ３及びＰ４のＤ−アミノ酸ペプチドは、インスリンＦＩＴＣの透過性を、対照ペプチドＣＰ４よりもはるかに大きく増加させた。
【０１７９】
経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）：組織培養の頂端部コンパートメントに２００μｌの培地を添加した後、ＥＶＯＭＸボルトオーム計（イギリス国スティーブニッジのＷｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、各時点で３回ずつ培養物全体の抵抗を測定する。ＴＥＥＲ値（Ω）は、下記式を使用して変換され正規化される：ＴＥＥＲ（Ωｃｍ２）＝（抵抗値（Ω）−１００（Ω））×０．３３（ｃｍ２）、式中、１００Ωは膜の抵抗であり、０．３３ｃｍ２は上皮の全表面積である。
【０１８０】
実施例３：膜貫通基の役割
上皮細胞層を通る高分子の透過性の増強における本発明のペプチドにある膜貫通基（ミリストイル）の役割を評価するために、本発明のペプチドＰ４（配列番号２）の透過能力を、ミリストイル基のない同じペプチドに対応する比較ペプチドと比較する。取り込み実験及びＴＥＥＲを、実施例２に記載されているように実施する。
【０１８１】
実施例４：傍細胞透過性の時間枠
本発明のペプチドの透過性効果の持続時間を評価するため、様々な長さのペプチドの見かけの透過性を以下のとおり評価する。見かけの透過性とは、試料が収集された時点で放出されたＦＤの量を指す。この実施例では、３０分又は６０分の時点で見られるように、放出されたＦＤの量が徐々に減少するにつれてタイトジャンクション傍細胞空間が徐々に閉じることを間接的に示す。
【０１８２】
試験したペプチド、取り込み実験及びＴＥＥＲは、実施例２に記載されている通りである。
ＦＤの見かけの透過性：ＦＤの見かけの透過性（Ｐａｐｐ）は、式１を使用して計算する：Ｐａｐｐ＝（ｄＱ／ｄｔ）／Ａ＊Ｃ０  （１）
【０１８３】
ペプチドはＰＫＣ偽基質に対応するため、競合基質である可能性があり、したがって、偽基質配列の長さが長いほど、ＰＫＣゼータに対する阻害効果が高くなり、その結果、高分子の傍細胞透過化が高くなると仮定される。そのため、本発明のペプチドは、高分子の望ましい傍細胞透過性を達成することを可能にすると同時に、細胞毒性を回避するために望ましいこの効果のより高い可逆性を提示することを可能にする最適化された長さを有する（より長い時間のＰＫＣゼータ阻害は潜在的にＴＪタンパク質の分解を高め、細胞増殖に影響する）（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ．ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１１５：３５６５−３５７３；Ｗｈｙｔｅ  ｅｔ．ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１２３：３３１６−３３２８）。
【０１８４】
実施例５：細胞生存率に対するＰＫＣゼータＰＳペプチドの効果
比較ペプチドと比較した本発明のペプチドの潜在的毒性の評価を、以下のように細胞生存率アッセイで行った。
【０１８５】
Ｃａｃｏ−２細胞（ヒト腸上皮細胞株）の生存率を、ＷＳＴ−１ベースの比色分析法を使用した細胞増殖アッセイによって決定する。Ｃａｃｏ−２細胞（５＊１０３細胞／ウェル）を９６ウェルマルチプレートに蒔き、ペプチドＰ４及び比較ペプチドＣＰ４を種々の濃度、すなわち１０、５０及び１００μＭで２４時間処理する（長期細胞生存率の研究）。ＷＳＴ−１試薬（細胞培養培地で１：１０に希釈）を、取扱説明書（ドイツ国マンハイムのＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧＭＢＨ）の記載に従って追加する。ペプチド又は対照と３７℃で１時間〜３時間インキュベートした後、４５０ｎｍの吸光度（６９０ｎｍの参照）をＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｍｘプレートリーダーで測定する。細胞生存率の割合は、培養培地のみに曝露された細胞（対照群）の吸光度と比較して測定された吸光度に基づいて計算される。２％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を、細胞毒性の陽性対照として使用する。
【０１８６】
実施例６：タイトジャンクションタンパク質オクルディン及びＺＯ−１の再分布に対する本発明のペプチドの効果
ヒト初代鼻及び気管支上皮細胞のタイトジャンクション構造に対する本発明のペプチドの効果を、以下のとおり共焦点顕微鏡法によって評価する。
【０１８７】
ＭｕｃｉｌａｉｒＴＭヒト初代鼻及び気管支上皮細胞（スイス国ジュネーブのＥｐｉｔｈｅｌｉｘ  ｓａｒｌ）を５０μＭの本発明のペプチドＰ４又は比較ペプチドＣＰ４と２時間インキュベートし、３７℃のリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋なし）で２回洗浄する。細胞をメタノール／アセトン（５０：５０）で２０℃で５分間固定し、風乾し、ＴＢＳＴ（トリスバッファー生理食塩水（ＴＢＳ）及びポリソルベート２０の混合物）で洗浄する。細胞単層を、ＰＢＳ中３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液を使用して室温で６０分間ブロックし、希釈バッファー中のオクルディンに対する一次抗体（Ｃａｔ：３３１５８８、スイス国ツークのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）希釈（１：２００））及びＺＯ−１（ゾニューラオクルディン−１タンパク質）（カタログ：３３９１９４、スイス国ツークのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；希釈（１：２００））と共にインキュベートする。試料をマウントし（ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール）を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウンティング培地；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、レーザー走査型共焦点顕微鏡（ＣＬＳＭ；Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ６３／１．４０（オイル）ＤＩＣ対物レンズ、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １００Ｍ−ＬＳＭ  ５１０；ドイツ国オーバーコッヘンのＣａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を使用して２４時間以内に評価する。画像キャプチャの少なくとも５つの個別の部位を、各試料の均一な単層の厚さの領域で無作為に選択する。個々の細胞単層間で同等の条件を確立するため、刺激されていない単層と刺激された単層との間の頂端から基底膜までの垂直方向の深さが同じである同数の水平スライス（５１２＊５１２ピクセル）に相当する画像を取得する。
【０１８８】
実施例７：本発明のペプチドを含む併用治療の効果
本発明のペプチドと、上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼドメイン（ＥＧＦＲ−ＴＫ）の選択的阻害剤であることが知られている、プロテインキナーゼ阻害剤の抗腫瘍剤であるゲフィチニブ（Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン）との組み合わせの効果を、非小細胞肺癌のモデルで以下のとおり調査する。
【０１８９】
ゲフィチニブは、２００３年に食品医薬品局（ＦＤＡ）によって、最も一般的なタイプの肺癌である非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療のための第三選択療法として最初に承認された細胞毒性小分子であり、最近では第一選択療法となっている（２０１５年７月）。ゲフィチニブは、治療への耐性が現れる前の化学療法と比較して、無増悪生存期間（ＰＦＳ＝７．７カ月〜１２．９カ月）を大幅に改善することが示されている。クリニックでは、ゲフィチニブの通常の投与量は２５０ｍｇ／日であるが、ゲフィチニブのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの阻害濃度はマイクロモル（μＭ）である。
【０１９０】
ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）のチロシンキナーゼドメインが変異したＨＣＣ８２７細胞（肺腺癌）を使用する（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でタグ付けされている、モデルＯｎｃｏＣｉｌＡｉｒＴＭ）。ＥＧＦ受容体ｅｘ１９：ｄｅｌ変異（ＯＣＡ＿ＥＧＦＲ１９ｄｅｌと表記）を持つ腫瘍を含む合計２４のＯｎｃｏＣｉｌＡｉｒＴＭ培養物（Ｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０５：１１１−１１９）を、ペプチドＰ４と組み合わせて又はそれを含まずに１４日間ゲフィチニブ（又はＺＤ−１８３９、「イレッサ」）（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（スイス国ルツェルン）で処理する。ＯＣＡ＿ＥＧＦＲ１９ｄｅｌ培養物を、培地で１μＭ及び５μＭの２つの最終濃度に希釈されたＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）ストックから調製する。ペプチドＰ４を頂端側に投与し、ゲフィチニブの場合２種類の投与を試みる（インサートの基底外側又は頂端側）。ペプチドＰ４を、２００μＭのストックから開始する培地で１μＭの最終濃度で使用する。Ｐ４を、ゲフィチニブ投与のちょうど５分前に培養物に投与する。
【０１９１】
腫瘍形態計測を、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｃａｍ顕微鏡プラットフォームを使用する蛍光顕微鏡法によって解決する。増殖曲線は、２日ごとに取得される様々な画像に基づいており、緑色蛍光タンパク質陽性（ＧＦＰ＋）腫瘍の面積は、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェア（米国メリーランド州ロックビルのＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を使用して測定される。各時点で、インサートのサイズに対する腫瘍が占める総面積の比率を計算し、治療開始時の０日目のパーセンテージとして表される（腫瘍占有率）。同一の分析設定、すなわち固定蛍光強度の閾値及び固定サイズの閾値（９００ｍ２超）を全ての処理済み画像に適用する。腫瘍増殖阻害のパーセンテージを、次の式を使用して計算する。（１−［治療群の腫瘍占有率／対照群の腫瘍占有率］×１００）。
【０１９２】
実施例８：抗原特異的血清ＩｇＧ及びＩｇＧ１応答に対する本発明のペプチドのアジュバント効果
粘膜ワクチンの有効性に対する本発明のペプチドの効果は、Ｐ４と可溶性タンパク質抗原との組み合わせを投与することにより調査され、誘導された免疫化を調査した。
【０１９３】
６週齢の雌性Ｃ５７−ＢＬ／６マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（フランス国ハーラン）から購入し、動物倫理委員会の対応するガイドラインに従って標準的な条件下で飼育する。マウス（ｎ＝５）を、０日目、１４日目及び２８日目に麻酔下で鼻腔内（ｉ．ｎ．）投与により、次の免疫原で免疫する：陰性対照としての生理食塩水（ＰＢＳ）、オボアルブミン（Ｏｖａ）（ＮａＣｌ  ０．９％溶液中）又はＯｖａ＋Ｐ４  Ｏｖａ／用量（５μｇ）（ＮａＣｌ  ０．９％中のＯｖａの溶液及びＮａＣｌ  ０．９％中のＰ４の溶液の混合物）を混合物として各動物群に１２μＬ（鼻腔あたり６μＬ）で投与する。Ｐ４を５μｇ／用量の濃度で使用する。血液試料を、最初の予防接種の１日前と最後の予防接種の１週間後に採取する。
【０１９４】
抗原特異的血清抗体（全ＩｇＧ及びＩｇＧ１）をＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）によって測定する。簡単に説明すると、９６ウェルプレートを、ウェルごとにＯｖａ抗原（１００ｎｇ）で４℃で一晩コーティングする。プレートを１００μｌのＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸バッファー生理食塩水）及び３％ＢＳＡ（ドイツ国のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により３７℃で２時間ブロックし、洗浄バッファーで４回洗浄した後、１００μｌの段階希釈血清試料（ＩｇＧ：ＩｇＧ１の場合、１：５０〜１：８１９２００）とともに３７℃で１．５時間インキュベートする。４回洗浄した後、プレートを１００μｌの１：８０００希釈のＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識抗マウス全ＩｇＧ抗体及びＩｇＧ１（フランス国のＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）抗体とともに１時間インキュベートする。プレートを４回洗浄し、１００μｌのＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）基質（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；イリノイ州ロックフォード）を加えてＨＲＰを定量する。抗体価は、ナイーブバックグラウンドを差し引いた後の光学密度−対数希釈曲線の中点で決定され、応答しないマウスには任意の力価１０が与えられる。
【０１９５】
実施例９：抗オピオイドと組み合わせた本発明のペプチドの鼻腔内送達
本発明のペプチドの単独又は抗オピオイドであるナロキソンとの組み合わせの鼻腔内送達のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を以下のとおり調査する。
【０１９６】
雌性Ｗｉｓｔｅｒラット（体重２２５〜２５０ｇ）をケタミンとキシアルジンとの組み合わせで麻酔し、カニューレを頸動脈に挿入する。カニューレを、血液がサンプリングされ、ヘパリンを含む生理食塩水で置換えられる三方弁に挿入する。ナロキソンを、単独で又は本発明のペプチドと組み合わせて、ラットの鼻孔に８ｍｍ挿入されたマイクロピペットチップを介して鼻腔内に投与する。ナロキソン投与前、並びに投与後５、１５、３０、６０及び１２０分に血液試料を採取する。血液の各試料（０．５ｍｌ）をヘパリン処理した１ｍｌシリンジに収集し、１０μｌのヘパリン（５００Ｕ／ｍｌ）を含む冷却した１．５ｍｌのポリプロピレンチューブに移す。チューブを約３０００ｒｐｍで２０分間、２〜８℃で遠心分離し、血漿上清を−２００℃で保管されているマイクロ遠心チューブに移す。血漿中のナロキソンの濃度及び曲線下面積を決定する。Ｃｍａｘ（薬物の最大血清濃度）及びＴｍａｘ（Ｃｍａｘが観察される時間）の値は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）又はＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）を使用して決定し、バイオアベイラビリティの値（静脈内注射と比較して）は、時間の関数としての血漿ナロキソン（又は他の試験薬）濃度のプロットから得られた曲線下面積から計算される。
実施例１０：上皮の完全性に対する本発明のペプチドの効果
【０１９７】
上皮の完全性に対する本発明のペプチドの潜在的効果を評価するために、本発明のペプチドの存在下での経上皮電気抵抗を測定する。
【０１９８】
経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）がボルトオーム計がＳＴＸ−２箸電極（米国フロリダ州サラソータのＷＰＩ）を備えていたことを除いて、実施例２と同様に測定した。ＭｕｃｉｌａｉｒＴＭヒト初代鼻上皮細胞を実施例２のとおり使用した（単一ドナーに由来；ＥＰ０１−バッチ番号ＭＤ０６９２０１）。ＭｕｃｉｌａｉｒＴＭ培地及び対照溶液（すなわち、生理食塩水５０μｌ＋ＭｕｃｉｌａｉｒＴＭ培地５０μｌ）中１００μＭの濃度のペプチドＰ４（配列番号２）及び比較ペプチドＰ４（配列番号３）を実験の開始（ｂｅｇｇｉｎｇ）時（ｔ＝０）組織培養物の頂端コンパートメントに投与し、インキュベーションの２０分、４０分、６０分及び８０分（ｔ＝２０分、ｔ＝４０分、ｔ＝６０分、及びｔ＝８０分）後に測定を行った。全てのＴＥＥＲ値は、対照に対するパーセンテージとして表される（ベースライン値は２４２Ω＊ｃｍ２であった）。全ての実験を少なくとも２回行った（試験１及び試験２）。
【０１９９】
経上皮電気抵抗は、上皮の完全性の尺度であり、試験した薬剤（本発明のペプチド）による上皮タイトジャンクションの調節を示し得て、ここで、ＴＥＥＲ値の減少は、タイトジャンクション間の傍細胞空間の増加を示し、したがって、薬物及び治療用高分子の輸送の増加の可能性を示す。
【０２００】
ペプチドＰ４は、ｔ＝２０分で対照溶液及び比較ペプチドＰ４（ＣＰ４）と比較してＴＥＥＲ値を減少させ、この効果はｔ＝４０分及びｔ＝６０分で持続した（図１）。ｔ＝８０分において、ＴＥＥＲ値は、以前の時点で測定された値と比較して増加した（図１）。
【０２０１】
これらの結果は、本発明のペプチドが上皮タイトジャンクション開口部を増加させることができ（タイトジャンクション間の傍細胞空間の増加）、これが順次、他の分子の送達を可能にし得ることを支持する。観察された一過性の効果は、それらのペプチドがタイトジャンクションの一過性の開口を誘発することができるであろうことを示唆している。
【０２０２】
配列表
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（コンセンサス）／式（Ｉ）
Ｚ−［Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３］０−１−Ｘａａ４Ｘａａ５ＲＸａａ７Ｘａａ８−［Ｘａａ９Ｘａａ１０］０−１  （Ｉ）
の合計で５個〜１０個のアミノ酸のペプチドであって、
式中、Ｚは細胞浸透部分であり、Ｘａａ１及びＸａａ２は存在する場合も存在しない場合もあり、存在する場合、Ｘａａ１及びＸａａ２は独立して正に帯電したアミノ酸であり、Ｘａａ３は非極性アミノ酸であり、Ｘａａ４はＡｌａ、Ｓｅｒ及びＶａｌから選択されるアミノ酸であり、Ｒはアルギニンであり、Ｘａａ５及びＸａａ８は独立して正に帯電したアミノ酸であり、Ｘａａ７は非極性アミノ酸であり、Ｘａａ９は正に帯電したアミノ酸であり、Ｘａａ１０は存在する場合も存在しない場合もあり、存在する場合、Ｘａａ１０は非極性アミノ酸であり、式（Ｉ）の少なくとも１つのアミノ酸はＤ−アミノ酸である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（Ｐ４）
Ｍｙｒ−Ｄ−Ａｌａ  Ｄ−Ｌｙｓ  Ｄ−Ａｒｇ  Ｄ−Ｔｒｐ  Ｄ−Ａｒｇ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（比較ペプチドＣＰ４）
Ｍｙｒ−ＡＫＲＷＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（Ｐ３）
Ｍｙｒ−Ｄ−Ａｌａ  Ｄ−Ａｒｇ  Ｄ−Ａｒｇ  Ｄ−Ｔｒｐ  Ｄ−Ａｒｇ
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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