(57)【要約】  本開示は、遺伝子分析疾患診断のための方法、およびそのような分析を実施するためのシステムを提供するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）電子医療記録（ＥＭＲ）から対象のフェノームを決定する工程であって、前記フェノームが、前記ＥＭＲから抽出された複数の臨床フェノタイプを含む、工程、
（ｂ）前記臨床フェノタイプを標準化された用語に変換する工程、
（ｃ）前記対象の潜在的な鑑別診断の第１のリストを生成する工程、
（ｄ）前記対象由来のＤＮＡサンプルの遺伝子シーケンシングを実行する工程、
（ｅ）前記ＤＮＡの遺伝子変異を決定する工程、
（ｆ）（ｃ）および（ｅ）の結果を分析して、前記対象の潜在的な鑑別診断の第２のリストを生成する工程であって、前記第２のリストがランク順である、工程、および
（ｇ）（ｆ）の前記分析の結果を含むレポートを生成する工程
を含む方法。
【請求項２】
（ａ）に先立って前記対象の前記ＥＭＲを生成する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｂ）が自然言語処理を利用して前記変換を実行する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）〜（ｃ）および（ｄ）〜（ｅ）を並行して実行する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
遺伝子シーケンシングが、高速全ゲノムシーケンシング（ｒＷＧＳ）、超高速全ゲノムシーケンシング、または高速全エクソームシーケンシング（ｒＷＥＳ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡサンプルが生物学的サンプル由来のものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが、血清、唾液、頬スミア／スワブ、血漿、糞便、脳脊髄液、または尿である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルが血液である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的サンプルが乾燥血液スポットである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子シーケンスが、ｒＷＧＳおよびｒＷＥＳを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記ランク付けされたリストが、（ｂ）の前記標準化された用語と同じ用語で表現された既知の臨床フェノタイプが入力されたデータベースのクエリーを介して実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
（ｆ）の遺伝子変異を決定する工程が、前記遺伝子変異の注釈付けおよび分類を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子変異を利用して確率的診断を生成する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子変異を注釈付けし、意義不明（ＶＵＳ）、病原性（Ｐ）、または、おそらく病原性（ＬＰ）であると分類する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
健常個体の集団において対立遺伝子頻度が５％未満、２．５％未満、１％未満、０．１％未満またはそれ以下の遺伝子変異のみが保持される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
（ｅ）の遺伝子変異を決定する工程が、
病原性に基づいて全てのディプロタイプを、意義不明（ＶＵＳ）、病原性（Ｐ）、または、おそらく病原性（ＬＰ）であると同定し且つランク付けするための前記遺伝子変異の注釈付けを
更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
局所的なゲノムベース上の前記注釈付けされたＶＵＳ、ＬＰ、およびＰディプロタイプを、（ｃ）の潜在的な鑑別診断の前記第１のリストに関連する対応するゲノム領域と比較することによって、潜在的な鑑別診断の前記第２のリストが生成される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝子変異が、臨床フェノタイプの適合度のランク、ディプロタイプの病原性のランク、および／または健常個体の集団における前記遺伝子変異の対立遺伝子頻度の組み合わせに基づいてランク付けされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象の生物学的親由来のＤＮＡサンプルの遺伝子シーケンシングを実行する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
両方の生物学的親について遺伝子シーケンシングを行い、トリオディプロタイプが特定の遺伝疾患の既知の遺伝パターンに適合する結果のみが得られる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
両方の生物学的親について遺伝子シーケンシングを行い、親の健康状態（健康または罹患）を用いて、親のディプロタイプが特定の遺伝疾患の既知の遺伝パターンに適合する結果のみが得られる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象のゲノムに存在するが前記親のゲノムには存在しない遺伝子変異を利用して、前記対象の診断が決定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
遺伝子シーケンスが、全ゲノム、全エクソーム、または遺伝子パネルのシーケンシングを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象が５歳未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記対象が乳児、胎児、または新生児である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記潜在的な鑑別診断が遺伝疾患を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法が自動化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
（ｇ）に基づいて前記対象のための治療レジメンを生成する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象に治療を提供する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
（ａ）が、補足的な臨床情報を分析して前記フェノームを決定する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）を複数の対象について実行し、それにより、複数のＥＭＲ、複数のフェノーム、および複数の臨床フェノタイプを生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
（ａ）を複数の対象について実行し、それにより、複数のＥＭＲ、複数のフェノーム、および複数の臨床フェノタイプを生成する、請求項２に記載の方法。
【請求項３３】
前記複数のＥＭＲ、前記複数のフェノーム、および前記複数の臨床フェノタイプを非一時的メモリーに記録して検索可能データベースを生成する工程を更に含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記複数のＥＭＲ、前記複数のフェノーム、および前記複数の臨床フェノタイプを非一時的メモリーに記録して検索可能データベースを生成する工程を更に含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記データベースを利用して、第２の対象における遺伝子データ、遺伝子型、または疾患もしくは障害をスクリーニングする工程、または前記対象の診断を更新する工程を更に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記データベースを利用して、第２の対象における遺伝子データ、遺伝子型、または疾患もしくは障害をスクリーニングする工程、または前記対象の診断を更新する工程を更に含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つのプロセッサーと非一時的メモリーとを備えるコントローラーであって、前記コントローラーが請求項１に記載の（ａ）〜（ｃ）および（ｅ）〜（ｇ）を実行するように構成されている、コントローラー
を備えるシステム。
【請求項３８】
（ａ）複数の対象について複数の電子医療記録（ＥＭＲ）を生成する工程、
（ｂ）自然言語処理を使用して前記ＥＭＲから前記複数の対象の複数のフェノームを決定する工程であって、前記フェノームがそれぞれ前記ＥＭＲの各々から抽出された複数の臨床フェノタイプを含む、工程、ならびに
（ｃ）前記複数のＥＭＲ、前記複数のフェノーム、および前記複数の臨床フェノタイプを非一時的メモリーに記録して、検索可能データベースを生成する工程、
（ｄ）前記データベースを利用して、新規の対象における疾患もしくは障害をスクリーニングするか、または前記複数の対象のうちの１例の診断を更新する工程
を含む方法。
【請求項３９】
少なくとも１つのプロセッサーと非一時的メモリーとを備えるコントローラーであって、前記コントローラーが請求項３８に記載の（ａ）〜（ｃ）を実行するように構成されている、コントローラー
を備えるシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１８年４月１８日出願の米国特許出願第６２／６５９，４９５号に対する利益を主張するものである。先行する各出願の開示は、本出願の開示においてその一部と見なされ、参照により援用されている。
【０００２】
発明の分野
本発明は、全般的には、遺伝子分析に関し、より具体的には、遺伝疾患の特性評価を迅速に実施するための方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景情報
遺伝疾患は、特に新生児、小児、および心血管集中治療室（ＩＣＵ）に入院中の乳児の約１５％を占め、米国において乳児死亡原因の首位に位置付けられている（１−１１）。乳児疾患の進行は速いことから、病因診断も同様に迅速にすることによって、苦痛、罹患率および死亡率を軽減し得る介入を通知すべきである（１２，１３）。しかしながら、こうした病因診断が為されるのは稀である。公知の遺伝疾患は、１３，０００種を超えている（１４，１５）。それらの症状は、重篤疾患の乳児において共通することがよくあり、通常、古典的な説明に関しては要約されている（１４，１５）。標準的なゲノムシーケンシングは、結果が出るまでに数週間かかり、これは入院患者の管理をガイドするには遅すぎる。高速全ゲノムシーケンシング（ｒＷＧＳ）は、診断の迅速化を実現することで、時間内に正確な医療介入を可能にし、遺伝疾患の乳児の罹患率および死亡率を低減するものである（１２，１３）。更になお、予後が一様に悲惨な遺伝疾患では、迅速な診断により、苦痛を軽減し悲嘆的過程を救済し得る終末期ケアの決定が促進される。ＩＣＵの重篤疾患の乳児における高速ゲノムシーケンシングの診断的および臨床的有用性および費用効果の実証が、臨床研究によって開始されており、症例のうち、診断率は４２〜５７％、医療管理の変更は３０〜７２％、転帰の変化は２４〜３４％であることがレポートされている（１２，１４，１６−３０）。こうした証拠を鑑み、新たな標準治療としての国家医療制度の導入の加速が希求されるようになってきた（３１−３３）。例えば、２０１９年以降、重篤疾患に罹患している全ての子供を対象としたケアの一環として、高速全ゲノムシーケンシングが、英国（ＵＫ）の国民保健サービスによって提供されている（３４）。また、医療および心臓ＩＣＵにいる年長児および成人を対象として高速全ゲノムシーケンシングの臨床的有用性が研究されている。ＩＣＵにおける普遍的な実施に対する主要な障害とされているのは、英国外での医療費償還制が存在しないこと、小児科医によるゲノム医学知識が欠如していること、および最新の、臨床的な、高速ゲノムシーケンシングおよび解釈は資本および労働集約度が高いという点である。
【０００４】
研究の場においては、２６時間という高速ゲノムシーケンシングによる診断が以前に報告されている（１６，１７）。一方、これまでに報告されてきた臨床研究では、ゲノムシーケンシングによる最速の遺伝子診断は３７時間、診断までの平均時間は１６日とされ、且つ最大のコホートは患者６３例のみで構成されていた（８，１６−３０）。これらの臨床研究においてコホートが小規模であり、診断までの時間が長くかかったことは、最新の高速ゲノムシーケンシング方法の限界を裏付けるものである。本明細書に記載されている自動暫定診断による遺伝疾患の臨床診断を行うためには、より高度な方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、遺伝子分析を実施するための方法および自律システムを提供する。本発明は、遺伝疾患の迅速な診断を提供するものである。
【０００６】
したがって、一実施形態において、本発明は、遺伝子分析を実施するための方法を提供する。
本方法は、以下を含む：
（ａ）電子医療記録（ＥＭＲ）から対象のフェノームを決定する工程であって、該フェノームが、該ＥＭＲから抽出された複数の臨床フェノタイプを含む、工程、
（ｂ）該臨床フェノタイプを標準化された用語（１つまたは複数）に変換する工程、
（ｃ）該対象の潜在的な鑑別診断の第１のリストを生成する工程、
（ｄ）該対象由来のＤＮＡサンプルの遺伝子シーケンシングを実行する工程、
（ｅ）ＤＮＡの遺伝子変異を決定する工程、
（ｆ）（ｃ）および（ｅ）の結果を分析して、該対象の潜在的な鑑別診断の第２のリストを生成する工程であって、該第２のリストがランク順である、工程、
（ｇ）（ｆ）の該分析結果を含むレポートを生成する工程。
【０００７】
実施形態において、本方法は、対象のフェノームを決定する工程に先立って、対象のＥＭＲを生成する工程を更に含む。
実施形態において、臨床フェノタイプの標準化された用語への変換は、臨床自然言語処理（ＣＮＬＰ）を用いたフェノタイプの抽出、および１つ以上の標準化された用語への変換によって実行される。
実施形態において、遺伝子シーケンシングには、ｒＷＧＳ、高速全エクソームシーケンシング（ｒＷＥＳ）、または高速遺伝子パネルシーケンシングが含まれる。
【０００８】
別の実施形態において、本発明は、複数の対象における遺伝子分析を実施するための方法を提供する。
本方法は、以下を含む：
（ａ）複数の対象に対し複数のＥＭＲを生成する工程、
（ｂ）自然言語処理を使用して該ＥＭＲから該複数の対象の複数のフェノームを決定する工程であって、該フェノームがそれぞれ該ＥＭＲの各々から抽出された複数の臨床フェノタイプを有する、工程、
（ｃ）該複数のＥＭＲ、該複数のフェノーム、および該複数の臨床フェノタイプを非一時的メモリーに記録して、検索可能データベースを生成する工程、
（ｄ）該データベースを利用して、新規の対象における疾患もしくは障害をスクリーニングするか、または該複数の対象のうちの１例の診断を更新する工程。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、本発明の方法を実行するためのシステムを提供する。
本システムは、少なくとも１つのプロセッサーと非一時的メモリーとを有するコントローラーを備える。
本コントローラーは、本明細書に記載されている方法の１つ以上のプロセスを実行するように構成されている。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ａ〜Ｂは、標準的且つ高速ゲノムシーケンシングによる遺伝疾患の診断のフロー図を示す。Ａは、遺伝疾患の診断のフロー図である。Ｂは、遺伝疾患の診断のフロー図である。
【図２】Ａ〜Ｂは、臨床自然言語処理が、手動の電子健康記録（ＥＨＲ）レビューまたはヒトオンラインメンデル性遺伝（ＯＭＩＭ）の臨床概要よりも詳細なフェノームを抽出し得ることを示した図が描写されている。Ａは、概略図である。Ｂは、概略図である。
【図３】Ａ〜Ｈは、遺伝疾患が疑われる子供において観察されたフェノタイプ特徴と予期されるフェノタイプ特徴の比較を示す。Ａは、データが描写されたグラフ図である。Ｂは、データが描写されたグラフ図である。Ｃは、データが描写されたグラフ図である。Ｄは、データが描写されたベン図である。Ｅは、データが描写されたグラフ図である。Ｆは、データが描写されたグラフ図である。Ｇは、データが描写されたグラフ図である。Ｈは、データが描写されたベン図である。
【図４】９７種の遺伝疾患の診断を受けた子供９５例における観察された患者フェノタイプ特徴と予期される患者フェノタイプ特徴の重複を示したベン図である。
【図５】Ａ〜Ｂは、手動で、ＣＮＬＰによって、およびＯＭＩＭによって同定されたフェノタイプ特徴の精度、再現率、およびＦ１スコアを描写した一連のグラフである。Ａは、データを描写した一連のグラフ図である。Ｂは、データを描写した一連のグラフ図である。
【図６】本発明の一実施形態における高速ゲノムシーケンシングによる遺伝疾患の暫定診断のための自律システムのソフトウェア構成要素のフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、ゲノム分析のための革新的な計算方法およびプラットフォームに基づくものである。本発明が提供するプロトタイプの自律システムは、集中治療室集団における遺伝疾患の迅速な診断を目的とし、臨床自然言語処理（ＣＮＬＰ）を実行して、電子医療記録（ＥＭＲ）から急性疾患の子供の深層フェノームを自動的に同定するものである。本明細書に記載の方法およびプラットフォームでは、中央値２０：１０時間での遺伝疾患の臨床診断が提供されている。本臨床診断では、遺伝疾患の自動暫定診断を用い、ゲノムシーケンシング機器ごとに週当たり患者３０例にスケーリングできる。
【００１２】
実施例において詳細に考察されているように、標的治療をタイムリーに通知することによって、高速遺伝子またはゲノムシーケンシングにより、重病の遺伝疾患の子供、特に新生児および小児用集中治療室（ＩＣＵ）の乳児の転帰を改善することが可能である。一方で、結果を解読する高度な資格を有する専門家が必要とされるため、広範囲にわたる実行が妨げられている。
【００１３】
様々な実施形態において、本開示は、自動フェノタイプ検査および解釈を伴う遺伝疾患の集団規模の暫定診断のためのプラットフォームを提供するものである。本明細書中に提供されている実施例に詳述されているように、血液から直接的にビーズベースのゲノムライブラリー調製を行い、１５．５時間で対合した１００ｎｔリードのシーケンシングを実施したことによって、ゲノムシーケンシングを促進した。ＣＮＬＰは、８０％の精度および９３％の再現率で、電子健康記録から、子供の深層フェノームを自動抽出した。１０５種の遺伝疾患を患う子供１０１例において、手動解釈で使用されたフェノタイプ特徴０．９の一致と比較して、ＣＮＬＰで抽出されたフェノタイプ特徴の平均４．３が該疾患の予期されるフェノタイプ特徴と一致した。暫定診断は、全ての遺伝疾患の予期されるフェノタイプ特徴に関する患者のＣＮＬＰフェノームの類似性のランク付けと、患者の全てのゲノム変異の病原性のランク付けとを併用することによって自動化された。自動化された後向き診断は、専門家による手動解釈とほぼ完全に（９７種の遺伝疾患を患う子供９５例において、９７％の再現率、９９％の精度で）一致した。前向きとしては、本開示のプラットフォームおよび方法により、重篤疾患のＩＣＵ乳児７例中３例が正しく（精度および再現率１００％で）診断を受け、平均時間は２２：１９時間節約された。各症例において、診断は治療に影響を与えた。中央値２０：１０時間での自動フェノタイプ検査および解釈によるゲノムシーケンシングは、ＩＣＵでの採用を増加させ、それによって、正確な治療がタイムリーに実施される見込みが高まる可能性がある。
【００１４】
本組成物および方法について説明するに当たって、事前に理解すべき点は、本発明が、記載された特定の方法および実験条件に限定されるものではなく、そのような組成物、方法、および条件が変動する可能性があるということである。
また、当然のことながら、本明細書中に使用されている用語は、もっぱら特定の実施形態を説明することを目的としたものであって、限定することを意図するものではない。本発明の範囲限定箇所は、添付の特許請求の範囲だけに限られているからである。
【００１５】
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」が、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されている場合、複数形の指示対象を含む。ただし、文脈上他の意味に解釈されることが明確である場合は、その限りではない。したがって、例えば、「方法」に言及している場合、１つ以上の方法、および／または本明細書に記載のタイプのステップが包含される。このことは、本開示およびその他を読むことにより、当業者にとって明らかになるであろう。
【００１６】
別段の定義が無い限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する当業者によって遍く理解されているのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験には、本明細書に記載されているものと類似もしくは同等の任意の方法および材料を使用してもよいが、好ましい方法および材料については、以下に説明する通りである。
【００１７】
方法
一態様において、本発明は、遺伝子分析を実施するための方法を提供する。疾患もしくは障害、特に稀な遺伝疾患を診断するために、分析を利用する場合がある。本方法は、遺伝疾患を除外するためにも利用される場合がある。本発明の方法は、乳児、新生児もしくは胎児などの５歳未満の対象における遺伝疾患を検出および／または診断するのに特に有用である。
【００１８】
実施形態において本方法は、以下の工程を含む：
（ａ）電子医療記録（ＥＭＲ）から対象のフェノームを決定する工程であって、該フェノームが、該ＥＭＲから抽出された複数の臨床フェノタイプを含む、工程、
（ｂ）該臨床フェノタイプを標準化された用語に変換する工程、
（ｃ）該対象の潜在的な鑑別診断の第１のリストを生成する工程、
（ｄ）該対象由来のＤＮＡサンプルの遺伝子シーケンシングを実行する工程、
（ｅ）ＤＮＡの遺伝子変異を決定する工程、
（ｆ）（ｃ）および（ｅ）の結果を分析して、該対象の潜在的な鑑別診断の第２のリストを生成する工程であって、該第２のリストがランク順である、工程、および
（ｇ）（ｆ）の該分析結果を備えるレポートを生成する工程。
【００１９】
実施形態において、本方法は、対象のフェノームを決定する工程に先立って対象のＥＭＲを生成する工程を、更に含む場合がある。
【００２０】
本明細書において、「フェノーム」とは、細胞、組織、器官、生物、または種によって発現される全てのフェノタイプのセットを指す。このフェノタイプは、生物のフェノタイプ形質を表す。
【００２１】
本明細書において、「ＥＭＲ」とは電子医療記録を指し、本明細書中では「電子健康記録」または「ＥＨＲ」と同義に使用されている。
【００２２】
本方法は、電子医療記録（ＥＭＲ）から対象のフェノームを決定する工程を含む。この決定は、ＥＭＲから複数の臨床フェノタイプを抽出することによって実施する。対象のＥＭＲの非標準化および標準化フィールドからの自然言語処理および／または自動特徴抽出を使用して、当該の個人の疾患の臨床的特徴のリストを作成する。
【００２３】
次いで臨床フェノタイプを標準化された用語に変換する工程を、当該技術分野において公知の様々な計算方法を利用して実施する。一実施形態では、変換を自然言語処理により実行する。このタイプの処理は、非構造化テキストの変換およびマイニングの目的に利用されている。代替的に、離散的または構造化されたフィールドで編成されたデータを、当該技術分野において公知である従来のクエリー言語を利用して検索／変換する場合もある。標準化された用語の実施形態には、ヒトフェノタイプオントロジー、ＳＮＯＭＥＤ−ＣＴ(Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｚｅｄ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ)、および国際疾病分類−臨床修正(Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅｓ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ)が含まれる。
【００２４】
また、本方法は、該対象の潜在的な鑑別診断の第１のリストを生成する工程を伴う。この生成を実行する際には、変換済み臨床フェノタイプの標準化用語と同じ用語にて表現された既知の臨床フェノタイプを入力したデータベースのクエリーが用いられる。既知の臨床フェノタイプのデータベースの実施形態には、ヒトオンラインメンデル性遺伝−臨床概要、およびオルファネット臨床徴候および症状が含まれる。このリストの生成には、適合度に基づいて全ての潜在的な鑑別診断をランク付けするアルゴリズムを使用する場合もある。また、標準化された階層的な用語における観察されたフェノタイプと予期されるフェノタイプの距離の合計に基づいて、全ての潜在的な鑑別診断をランク付けするアルゴリズムを、本リストの生成に使用する場合もある。
【００２５】
次いで、対象由来のＤＮＡサンプルに対して実行されたゲノムシーケンシングから、遺伝子変異を決定する。実施形態において、この決定には、遺伝子変異の注釈付けおよび分類が含まれる。対象のゲノムの遺伝子変異の全てまたは一部に対する注釈付けを実行する目的は、例えば、意義不明（ｏｆ  ｕｎｃｅｒｔａｉｎ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）（ＶＵＳ）、病原性（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）（Ｐ）、またはおそらく病原性（ｌｉｋｅｌｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）（ＬＰ）等のカテゴリーの全ての変異を同定すること、ならびに、健常個体の集団において、対立遺伝子頻度が５、４、３、２、１、０．５、もしくは０．１％未満の遺伝子変異を保持することにある。病原性に基づいて全てのディプロタイプを、カテゴリー別に、例えば、意義不明（ＶＵＳ）、病原性（Ｐ）、またはおそらく病原性（ｌｉｋｅｌｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）（ＬＰ）として同定し且つランク付けするための遺伝子変異の注釈付けを、本方法に更に含める場合もある。分類システムの実施形態は、米国臨床遺伝・ゲノム学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）と、分子病理学標準および配列変異の解釈に関するガイドラインのための協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳｅｑｕｅｎｃｅＶａｒｉａｎｔｓ）との共同コンセンサス勧告である。連続的で確率的なスケールでの変異およびディプロタイプの病原性の注釈付けを、本方法に更に含める場合もある。例えば、良性（ｂｅｎｉｇｎ）であることが十分に確立されている変異のスコアは０であり、病原性変異であることが十分に確立されている変異のスコアは１であり、おそらく良性（ｌｉｋｅｌｙ  ｂｅｎｉｇｎ）、意義不明およびおそらく病原性変異のスコアは０〜１である。
【００２６】
次いで、局所的なゲノムベース上の該注釈付けされたＶＵＳ、ＬＰ、およびＰディプロタイプを、潜在的な鑑別診断の第１のリストに関連する対応するゲノム領域と比較することによって、対象の潜在的な鑑別診断の第２のリストを生成する。臨床フェノタイプの適合度のランク、ディプロタイプの病原性のランク、および／または健常個体の集団における該遺伝子変異の対立遺伝子頻度の組み合わせに基づいて、遺伝子変異をランク付けする。潜在的な鑑別診断のリスト中に、継続的なスケールで患者の病態の原因となる確率の注釈付けが、更に含まれる（バイナリ診断／診断結果無しとはならない）場合もある。
【００２７】
実施形態では、対象のゲノムに基づき決定された遺伝子変異を利用して、潜在的な診断の第２のリストを生成する際に使用するための、確率的診断を生成する場合もある。
【００２８】
次いで、最も高い確率で診断を同定するために、対象の潜在的な鑑別診断を、好ましくはスコアの順に、記述したレポートが生成される。
【００２９】
本発明の方法は、図１Ｂに図示されている通りである。図１Ｂは、臨床自然言語処理（ＣＮＬＰ）を介して対象のＥＭＲからフェノームを自動抽出すること、ＳＮＯＭＥＤ−ＣＴからヒトフェノタイプオントロジー（Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ）（ＨＰＯ）用語（標準化された用語など）に変換すること、包括的な鑑別診断遺伝子リストを導出すること、ゲノム配列の変異を同定すること、それらの変異を遺伝子ごとに病原性の原因となる可能性のあるディプロタイプにアセンブルすること、遺伝子型と鑑別診断リストを統合すること、および最高ランクの暫定診断を保持すること、を含むＡＩを図示したフローチャートである。
【００３０】
本発明の方法は、無数の遺伝子分析タイプによって疾患を同定することを可能にするものである。
【００３１】
本明細書に記載の方法は、親、例えば、母方および／または父方の遺伝子型が知られている周産期試験において有用である。一態様では、本方法を使用して、対象をレッシュ・ナイハン症候群などの疾患のリスクにさらす、それぞれの親からのマーカー、例えば、突然変異の有害な組み合わせが対象に遺伝したかどうかを決定する。この疾患は、常染色体劣性疾患、例えば脊髄性筋萎縮症である可能性がある。この疾患は、Ｘ連鎖、例えば、脆弱Ｘ症候群である可能性がある。この疾患は、遺伝子の優性突然変異によって引き起こされる疾患、例えばハンチントン病である可能性がある。いくつかの実施形態において、母方の核酸配列は、参照配列である。いくつかの実施形態において、父方の核酸配列は、参照配列である。いくつかの実施形態において、マーカー、例えば突然変異は、各親に共通である。いくつかの実施形態において、マーカー、例えば突然変異は、一方の親に特異的である。
【００３２】
いくつかの実施形態において、構築される個体ハプロタイプは、母方のハプロタイプ、父方のハプロタイプ、または胎児のハプロタイプなどである。ハプロタイプは、個体の同じ染色体上の同じ場所にある対立遺伝子を含む。このプロセスは、「ハプロタイプフェージング」または「フェージング」としても知られている。ハプロタイプは、ユニットとして遺伝した１つ以上の密接に関連した対立遺伝子の任意の組み合わせであり得る。ハプロタイプは、遺伝子変異の異なる組み合わせを含む場合がある。一塩基多型のペアと同程度に小さいアーティファクトは、明確なハプロタイプを描くことを可能にしている。代替的に、いくつかの遺伝子座からの結果を、ハプロタイプと呼ぶ場合もある。例えば、ハプロタイプは、１つの単位として遺伝する可能性が高いと統計的に関連付けられている単一の染色分体上のＳＮＰのセットであり得る。
【００３３】
いくつかの実施形態では、胎児の遺伝子変異と母方の遺伝子変異を区別するために、または２つの母方の染色体遺伝子座のどちらが胎児に遺伝したかを決定するために、母方のハプロタイプを使用する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法を使用して、胎児の遺伝子変異がＸ連鎖劣性遺伝子変異である、乳児もしくは妊婦内の胎児などの対象のゲノムにおける関心のある領域における遺伝子変異の有無を検出する場合がある。本疾患の男性は特定の遺伝子変異に対してヘミ接合性であることから、Ｘ連鎖劣性疾患は男の胎児において発生する頻度が高い。本明細書に記載の方法を使用して検出できる例示的なＸ連鎖劣性疾患には、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、Ｘ連鎖無γグロブリン血症、血友病Ａ、および血友病Ｂが包含される。これらのＸ連鎖劣性変異は、遺伝性変異またはデノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）変異であり得る。
【００３５】
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されているのは、乳児または妊婦内の胎児のゲノムにおける関心領域における遺伝子変異の有無を検出する方法であり、本方法において、胎児の遺伝子変異は、デノボの遺伝子変異または父方から遺伝した遺伝子変異である。いくつかの実施形態では、父方のゲノムを配列決定することによって、遺伝子変異が父方から遺伝した遺伝子変異であるかそれともデノボ遺伝子変異であるかを明らかにする。つまり、胎児の遺伝子変異が父親に存在せず、且つ記載の方法が胎児の遺伝子変異が母方のゲノムと区別可能であることを示唆する場合、胎児の遺伝子変異はデノボ変異である。したがって、本明細書中に提供されているのは、胎児の遺伝子変異が遺伝性の遺伝子変異であるかそれともデノボ遺伝子変異であるかを決定する方法である。いくつかの実施形態では、母親のゲノムを配列決定することによって、遺伝子変異が父方から遺伝した遺伝子変異であるかそれともデノボ遺伝子変異であるかを明らかにする。つまり、胎児の遺伝子変異が母親に存在せず、且つ記載の方法が胎児の遺伝子変異が父方のゲノムと区別可能であることを示唆する場合、胎児の遺伝子変異はデノボ変異である。したがって、本明細書中に提供されているのは、胎児の遺伝子変異が遺伝性の遺伝子変異であるかそれともデノボ遺伝子変異であるかを決定する方法である。
【００３６】
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されているのは、乳児または妊婦内の胎児のゲノムにおける関心領域における遺伝子変異の有無を検出する方法であり、本方法において、胎児の遺伝子変異は、デノボコピー数多型（コピー数減損多型など）または父方から遺伝したコピー数多型（コピー数減損多型など）である。いくつかの実施形態では、父方のゲノムを配列決定することによって、コピー数多型が父方から遺伝したコピー数多型であるかそれともデノボコピー数多型であるかを明らかにする。つまり、胎児の遺伝子変異が父親に存在せず、且つ記載の方法が胎児のコピー数多型が母方のゲノムと区別可能であることを示唆する場合、胎児のコピー数多型は、デノボコピー数多型である。したがって、本明細書中に提供されているのは、胎児のコピー数多型が遺伝性のコピー数多型であるかそれともデノボコピー数多型であるかを決定する方法である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法を使用して、胎児の遺伝子変異が常染色体劣性の胎児遺伝子変異である乳児または妊婦内の胎児のゲノムの関心領域における遺伝子変異の有無の検出が可能である。いくつかの実施形態において、常染色体胎児遺伝子変異は、ＳＮＰである。いくつかの実施形態において、胎児遺伝子変異は、コピー数多型、例えばコピー数減損多型、または微小欠失である。
【００３８】
本開示の方法は、遺伝子シーケンシングを企図したものである。シーケンシングは、当該技術分野において公知である任意の方法によるものであり得る。シーケンシング方法としては、限定されるものではないが、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔシーケンシングベースの技術、チェーンターミネーションベースの技術、ショットガンシーケンシング、ブリッジＰＣＲシーケンシング、単一分子リアルタイムシーケンシング、イオン半導体シーケンシング（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）シーケンシング）、ナノポアシーケンシング、パイロシーケンシング（４５４）、シーケンシング合成、結紮によるシーケンシング（ＳＯＬｉＤ（商標）シーケンシング）、電子顕微鏡によるシーケンシング、ジデオキシシーケンシング反応（サンガー法）、大規模並列シーケンシング、ポロニーシーケンシング、およびＤＮＡナノボールシーケンシングが挙げられる。いくつかの実施形態において、シーケンシングは、プライマーを鋳型にハイブリダイズさせて、鋳型／プライマー二本鎖を形成すること、ポリメラーゼが鋳型依存的にプライマーにヌクレオチドを付加することを可能にする条件下で、検出可能に標識されたヌクレオチドの存在下で二本鎖をポリメラーゼ酵素と接触させること、組み込まれた標識ヌクレオチドからのシグナルを検出すること、接触および検出のステップを少なくとも１回順番に繰り返すことを含み、組み込まれた標識ヌクレオチドの連続検出によって、核酸配列を決定する。いくつかの実施形態において、シーケンシングは、ペアエンドリードを得ることを含む。
【００３９】
いくつかの実施形態において、全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）または高速ＷＧＳ（ｒＷＧＳ）を使用して、サンプル由来の核酸のシーケンシングを実行する。いくつかの実施形態では、ターゲットシーケンシングを実行する。このシーケンシングは、ＤＮＡシーケンシングまたはＲＮＡシーケンシングのいずれかであり得る。ターゲットシーケンシングは、全ゲノムのサブセットに対するものである可能性がある。いくつかの実施形態では、ターゲットシーケンシングは、イントロン、エクソン、非コーディング配列、またはそれらの組み合わせに対するものである。他の実施形態では、サンプル由来のＤＮＡのターゲット全エクソームシーケンシング（ＷＥＳ）を実行する。ＤＮＡは、超並列シーケンシングである次世代シーケンシングプラットフォーム（ＮＧＳ）を使用してシーケンシングされる。ＮＧＳテクノロジーはハイスループットのシーケンス情報を提供し、対象の配列に整列する各シーケンスリードが計数可能であるという点で、デジタル定量情報を提供する。ある実施形態において、クローン的に増幅されたＤＮＡ鋳型または単一のＤＮＡ分子は、フローセル内で、超並列方式で配列決定される（例えば、国際公開第２０１４／０１５０８４号に記載されている通りである）。ＮＧＳは、ハイスループットの配列情報を提供するだけでなく、各シーケンスリードが計数可能であり、個々のクローンＤＮＡ鋳型または単一のＤＮＡ分子を表すという点で、定量的な情報を提供する。ＮＧＳのシーケンシング技術には、パイロシーケンシング、リバーシブルダイターミネーターを使用したＳＢＳ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）法、オリゴヌクレオチドプローブライゲーションによるシーケンシング、およびイオン半導体シーケンシングが包含される。個々のサンプル由来のＤＮＡに対し、個別にシーケンシング（すなわち、シングルプレックスシーケンシング）を実行する場合もあれば、あるいは、複数のサンプル由来のＤＮＡをプールし、１回のシーケンシング実行でインデックス付きゲノム分子としてシーケンシング（すなわち、マルチプレックスシーケンシング）を実行して、最大数億個のＤＮＡシーケンスリードを生成する場合もある。市販のプラットフォームには、例えば、ＳＢＳ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）法、イオン半導体シーケンシング、パイロシーケンシング、リバーシブルダイターミネーターシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、単一分子シーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、およびナノポアシーケンシングのためのプラットフォームが包含される。実施形態において、本開示の方法論には、イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ）製ＨｉＳｅｑ（商標）Ｘ１０、ＨｉＳｅｑ（商標）、１０００、ＨｉＳｅｑ（商標）２０００、ＨｉＳｅｑ（商標）２５００、ＨｉＳｅｑ（商標）４０００、ＮｏｖａＳｅｑ（商標）６０００、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒｓ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）ｓｙｓｔｅｍｓ）、アプライド・バイオシステムズ・ライフ・テクノロジーズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＳＯＬｉＤ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｏｎ  ＰＧＭ（商標）シーケンサー、ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（商標）シーケンサー）から提供されているようなシステムが利用されている。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡのｒＷＧＳが実行される。いくつかの実施形態では、対象のサンプル（乳児、新生児、または胎児など）に対してｒＷＧＳを実行する。いくつかの実施形態では、対象のサンプルと一緒に母方のサンプルに対してｒＷＧＳを実行する。いくつかの実施形態では、対象のサンプルと一緒に父方のサンプルに対してｒＷＧＳを実行する。いくつかの実施形態では、対象のサンプルと一緒に母方および父方のサンプルに対してｒＷＧＳを実行する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡの高速全エクソームシーケンシング（ｒＷＥＳ）が実行される。いくつかの実施形態では、対象のサンプル（乳児、新生児、または胎児など）に対してｒＷＥＳを実行する。いくつかの実施形態では、対象のサンプルと一緒に母方のサンプルに対してｒＷＥＳを実行する。いくつかの実施形態では、対象のサンプルと一緒に父方のサンプルに対してｒＷＥＳを実行する。いくつかの実施形態では、対象のサンプルと一緒に母方および父方のサンプルに対してｒＷＥＳを実行する。
【００４２】
本明細書において用いられているように、本明細書における「突然変異」という用語は、参照配列に対する置換、挿入、欠失（切断など）を含むがこれらに限定されない、参照配列に導入された変化を指す。突然変異は、ＤＮＡの大きなセクション（例えば、コピー数多型）を含む場合がある。突然変異は、染色体全体（例えば、異数性）を含む場合がある。突然変異は、ＤＮＡの小セクションを含む場合がある。ＤＮＡの小セクションを含む突然変異の例としては、例えば、点突然変異または単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、複数ヌクレオチド多型、挿入（例えば、遺伝子座での１つ以上のヌクレオチドであるが遺伝子座全体よりは少ないヌクレオチドの挿入）、複数のヌクレオチド変化、欠失（例えば、遺伝子座における１つ以上のヌクレオチド）、および反転（例えば、１つ以上のヌクレオチドの配列の反転）が挙げられる。突然変異の結果としては、限定されるものではないが、参照配列によってコードされるタンパク質には見られない新規の特徴、性質、機能、フェノタイプ、または形質を生ずることが挙げられる。いくつかの実施形態では、参照シーケンスは、親シーケンスである。いくつかの実施形態では、参照配列は、参照ヒトゲノム、例えば、ｈ１９である。いくつかの実施形態では、参照配列は、非癌（または非腫瘍）配列に由来する。いくつかの実施形態では、突然変異は遺伝したものである。いくつかの実施形態では、突然変異は自然発生またはデノボである。
【００４３】
本明細書において、「遺伝子」は、ポリペプチドの産生に関与するＤＮＡセグメントを指し、例えば、コーディング領域の前後の領域と、個々のコーディングセグメント（エクソン）の間に介在する配列（イントロン）が挙げられる。
【００４４】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体のいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有する場合もあれば、公知または未知の任意の機能を実行する場合もある。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは多本鎖（例えば、一本鎖、二本鎖、および三重らせん）であると考えられ、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／もしくは類似体、または修飾形態のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド（修飾ヌクレオチドもしくは塩基、またはそれらの類似体を含む）を含む。遺伝暗号は縮重しているため、特定のアミノ酸をコードするために複数のコドンが使用される場合があり、本発明は、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを包含する。ポリヌクレオチドが使用条件下で所望の機能性（例えば、ヌクレアーゼ耐性を増加させる修飾（デオキシ、２’−Ｏ−Ｍｅ、ホスホロチオエートなど）を保持する限り、任意のタイプの修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を使用しても差し支えない。また、検出または捕捉の目的で、標識、例えば、放射性または非放射性の標識またはアンカー（ビオチンなど）が組み込まれる場合もある。ポリヌクレオチドという用語には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）も包含される。ポリヌクレオチドは、天然に存在する場合もあれば、または天然に存在しない場合もある。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、もしくはその両方、および／または修飾された形態、および／またはそれらの類似体を含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって分断される場合がある。１つ以上のホスホジエステル結合は、代替の連結基によって置換することが可能である。これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、リン酸塩が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセタール」）（式中、各ＲまたはＲ’は、独立してＨであるか、あるいはエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジルを任意で含む置換または非置換アルキル（炭素数１〜２０）である）で置換される実施形態が包含される。必ずしも全てのポリヌクレオチド結合が、円形部分を必要とするとは限らない。ポリヌクレオチドの非限定的な例は、下記の通り：遺伝子または遺伝子フラグメントのコーディング領域または非コーディング領域、遺伝子間ＤＮＡ、リンケージ分析から定義された遺伝子座（遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小核ＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、アダプター、およびプライマーである。ポリヌクレオチドには、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドが含まれる場合がある。ヌクレオチド構造への修飾（存在する場合）が付与されるのは、ポリマーのアセンブリーの前または後であり得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって分断される場合がある。重合後に、例えば、標識成分、タグ、反応性部分、または結合パートナーとの結合によって、ポリヌクレオチドが更に修飾される場合がある。ポリヌクレオチド配列は、提供される場合、特に明記しない限り、５’から３’の方向にリストされる。
【００４５】
本明細書において、「ポリペプチド」は、アミノ酸から構成され、当業者にタンパク質として認識されている組成物を指す。本明細書中に使用されているのは、アミノ酸残基を表す従来の１文字コードまたは３文字コードである。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書中に互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、線状または分枝状である場合もあれば、修飾アミノ酸が含まれている場合もあれば、非アミノ酸によって分断される場合もある。また、この用語は、自然にまたは介入によって（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、またはその他の操作もしくは変更（標識成分との結合などによって））修飾された、アミノ酸ポリマーを包含する。また、定義には、例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、およびそれらに類するもの）、ならびに当技術分野で知られている他の修飾を含むポリペプチドも、包含される。
【００４６】
本明細書において用いられているように、本明細書における「サンプル」という用語は、核酸を含む、または含むと推定される、任意の物質を指す。サンプルは、対象から得られた生物学的サンプルであり得る。核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡであり得る。核酸サンプル中の核酸は、一般に、ハイブリダイズしたプライマーを伸長するための鋳型として機能する。いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは生物学的液体サンプルである。液体サンプルは、全血、血漿、血清、腹水、脳脊髄液、汗、尿、涙、唾液、頬側サンプル、虫歯すすぎ、糞便または臓器のすすぎであり得る。液体サンプルは、本質的に無細胞の液体サンプル（例えば、血漿、血清、汗、尿、および涙）であり得る。他の実施形態において、生物学的サンプルは、固形の生物学的サンプル、例えば、糞便または組織生検（腫瘍生検など）である。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養成分（限定されるものではないが、細胞培養培地、組換え細胞および細胞成分における細胞の増殖から生じる馴化培地が挙げられる）が、サンプルに具備される場合もある。いくつかの実施形態において、サンプルは、複数の供給源からの核酸の混合物である生物学的サンプルであり、すなわち、生物学的サンプルに対し複数の寄与者、例えば、個人２人以上が存在する。一実施形態において、生物学的サンプルは、乾燥血液スポットである。
【００４７】
本発明において、対象は、典型的にはヒトであるが、そのゲノム上にメチル化マークを有する任意の種であり得る（例えば、限定されるものではないが、犬、猫、ウサギ、牛、鳥、ラット、馬、豚、または猿が挙げられる）。一実施形態において、対象はヒトの子供である。いくつかの実施形態において、子供は、５歳未満、４歳未満、３歳未満、２歳未満または１歳未満である。実施形態において、対象は乳児、新生児、または胎児である。
【００４８】
コンピューターシステム
本発明は、機能的構成要素および様々な処理ステップに関して部分的に説明されている。そのような機能的構成要素および処理ステップの実現は、任意の数の構成要素、操作、および技術を、指定された機能を実行し、様々な結果を達成するように構成することによるものであり得る。例えば、本発明では、様々な生物学的サンプル、バイオマーカー、要素、材料、コンピューター、データソース、ストレージシステムおよび媒体、情報収集技術およびプロセス、データ処理基準、統計分析、回帰分析、ならびにそれらに類するものが使用される可能性があり、これにより、様々な機能を遂行することを可能としている。加えて、本発明は医学的診断の文脈において記載されているが、本発明は、任意の数のアプリケーション、環境、およびデータ分析と組み合わせて実施される場合もある。本明細書に記載のシステムは、本発明の単なる例示的な用途である。
【００４９】
本発明の様々な態様による遺伝子分析方法は、例えば、コンピューターシステム上で動作するコンピュータープログラムを使用して、任意の好適な方法で実施することができる。本発明の様々な態様による例示的な遺伝子分析システムは、コンピューターシステム（例えば、プロセッサーとランダムアクセスメモリーとを具備した従来のコンピューターシステム（リモートアクセス可能アプリケーションサーバー、ネットワークサーバー、パーソナルコンピューターまたはワークステーションなど）と併せて実装される場合もある。コンピューターシステムはまた、追加的なメモリーデバイスまたは情報ストレージシステム（大容量ストレージシステムおよびユーザーインターフェース、例えば、従来のモニター、キーボードおよびトラッキングデバイスなど）を具備したものが、好適である。一方、コンピューターシステムは、任意の好適なコンピューターシステムおよび関連する機器を具備する場合があり、任意の好適な方法で構成して差し支えない。一実施形態において、コンピューターシステムは、独立型のシステムを具備する。別の実施形態において、コンピューターシステムは、サーバーとデータベースとを具備したコンピューターネットワークの一部である。
【００５０】
遺伝子情報の受信、処理、および分析に必要なソフトウェアは、単一のデバイスに実装される場合もあれば、または複数のデバイスに実装される場合もある。情報の記録および処理がユーザーに対してリモートで実行されるように、ソフトウェアをネットワーク経由でアクセス可能とすることもできる。本発明の様々な態様による遺伝子分析システムおよびその様々な要素は、データ収集、処理、分析、レポート、および／もしくは診断などの遺伝子分析を促進する機能ならびに操作を提供する。本遺伝子分析システムは、サンプルに関連する情報を管理し、分析および／または診断を促進する。例えば、本実施形態では、コンピューターシステムは、コンピュータープログラムを実行して、これにより、ゲノムに関連する情報の受信、記録、検索、分析、およびレポートを可能にしている。コンピュータープログラムは、生データを処理して補足データを生成するための処理モジュール、ならびに生データおよび補足データを分析して病状モデルおよび／または診断情報を生成するための分析モジュールなど、様々な機能もしくは操作を実行する複数のモジュールを具備する場合がある。
【００５１】
遺伝子分析システムによって実行される手順に、遺伝子分析および／または疾患診断を促進するための任意の好適なプロセスを含めてもよい。一実施形態において、遺伝子分析システムは、病状モデルを確立し、且つ／または患者の病状を決定するように構成される。疾患状態を決定または同定する工程に、疾患について患者の病態に関連する任意の有用情報を生成すること、例えば、診断を実行すること、診断に有用な情報を提供すること、疾患の病期もしくは進行を評価すること、疾患への感受性を示す可能性のある病態を同定すること、更なる試験が推奨されるかどうかを同定すること、１つ以上の治療プログラムの有効性を予測および／もしくは評価すること、あるいは他の方法で疾患状態、疾患の可能性、または患者の他の健康面を評価することを含める場合もある。
【００５２】
また、遺伝子分析システムで、様々な追加的モジュールおよび／または個々の機能が提供される場合もある。例えば、遺伝子分析システムは、レポート機能も具備し、例えば、処理および分析機能に関連する情報が提供されるようになっている場合もある。また、遺伝子分析システムでは、アクセスの制御および他の管轄機能の実行などの、様々な管轄および管理機能が提供される場合もある。また、遺伝子解析システムでは、臨床的意思決定支援も提供されて、分析の対象となった患者に対して医師が個別のゲノムまたは精密医療を提供するのを支援し得る。
【００５３】
遺伝子分析システムでは、ゲノムデータおよび／または対象の健康または福祉に関連する追加的な対象データに基づいて、疾患状態モデルを適切に生成し、および／または患者の診断が提供される。遺伝子データは、任意の好適な生物学的サンプルから得ることができる。
【００５４】
下記実施例は、本発明の利点および特徴を更に説明することを目的に提供されたものであって、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。本実施例は使用される可能性のある典型的なものであるが、当業者に知られている他の手順、方法論、または技術を代替的に使用しても差し支えない。
【実施例】
【００５５】
実施例１
遺伝疾患を診断するための、高速ゲノムシーケンシング
本実施例では、集中治療室の集団における遺伝疾患の迅速な診断を目的としたプロトタイプの自律システムについて説明する。臨床自然言語処理（ＣＮＬＰ）を実行して、電子医療記録（ＥＭＲ）から急性疾患の子供の深層フェノームを自動的に同定するものである。
【００５６】
実験材料および方法
研究デザイン
本研究が設計された目的は、ゲノムシーケンシングにより遺伝疾患を極めて迅速に集団規模にて暫定診断するためのプロトタイプ自律システムの開発を支援するためのトレーニングおよび試験データセット、ならびに、結果として得られたシステムの分析および診断パフォーマンスを後向きおよび前向きの両方にて試験するための個別データセットを提供することにある。本研究において分析対象となった４０１例は、米国サンディエゴのレイディ・チルドレンズ・ホスピタル（Ｒａｄｙ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）で、診断率、診断までの時間、診断の臨床的有用性、結果、および高速ゲノムシーケンシングの医療利用を調査した４つの研究に登録された第１の症候性の子供由来の利用しやすいサンプルであった（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０３２１１０３９、ＮＣＴ０２９１７４６０、およびＮＣＴ０３３８５８７６）（１８，２２−２４，２８，３０）。本研究のうちの一方を、ゲノムおよびエクソームシーケンシングの無作為化対照試験（ＮＣＴ０３２１１０３９）とし、他方をコホート研究とした。対象全員が、病因不明の症候性疾患を患っており、遺伝的障害を伴うことを疑われた。対象全員が、レイディ・チルドレンズ・ホスピタル・エピック（Ｒａｄｙ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｅｐｉｃ）ＥＨＲとゲノム配列（ゲノムまたはエクソーム）とを有し、これらは、遺伝疾患診断の目的に手動で解釈されていた。これらに含まれていたのは、５つの群、すなわち、高速全ゲノムシーケンシングによって遺伝疾患の検査を受け、そのＥＨＲを使用してＣＮＬＰのトレーニングを受けた子供１６例（表４）；ＣＮＬＰのパフォーマンスを試験するためにＥＨＲが使用された、高速ゲノムシーケンシングによる診断を受けた遺伝疾患の子供１０例（表５）；ゲノム配列およびＥＨＲを使用して自律診断システムの後向きパフォーマンスを試験した、高速ゲノムシーケンシングによる診断を受けた遺伝疾患の子供１０１例；ＤＮＡサンプルおよびＥＨＲの併用によって自律診断システムの前向きのパフォーマンス試験を受けた、遺伝疾患が疑われる重篤疾患の子供７例（表１）；ならびに高速ゲノムシーケンシングによって遺伝疾患の診断が明らかにされなかった対照子供２７４例であった。
【００５７】
標準的、臨床的、高速全ゲノムおよびエクソームシーケンシング、分析ならびに解釈
標準的な臨床ｒＷＧＳおよびｒＷＥＳが実施されたラボラトリーは、米国病理学会（ＣＡＰ：Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ）によって認可され、且つ臨床検査改善修正法案（ＣＬＩＡ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  Ａｍｅｎｄｍｅｎｔｓ）によって認定されたラボラトリーであった。専門家らは、エピックＥＨＲから各子供の疾患を代表する主要な臨床的特徴を選択し、それらを、Ｐｈｅｎｏｍｉｚｅｒ（商標）またはＰｈｅｎｏｌｙｚｅｒ（商標）（１６，１８，２０−２４，４５，６３）による遺伝子診断にマッピングした。可能な場合は、三つ組でＥＤＴＡ血液サンプルを採取した。ゲノムＤＮＡを、ＥＺ１  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＸＬ（商標）ロボットおよびＥＺ１  ＤＳＰ  ＤＮＡ（商標）血液キット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）製）を使用して分離した。Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ（商標）アッセイキット（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）製）で、Ｇｅｍｉｎｉ  ＥＭ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（商標）（モレキュラー・デバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）製）を使用して、ＤＮＡの品質を評価した。ゲノムＤＮＡを、超音波処理（コバリス社（Ｃｏｖａｒｉｓ）製）により断片化し、バーコード化されたペアエンドＰＣＲフリーのライブラリーをＴｒｕＳｅｑ  ＤＮＡ  ＬＴ（商標）キット（イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）製）またはＨｙｐｅｒキット（ＫＡＰＡバイオシステムズ社（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製）を使用してｒＷＧＳ用に調製した。シーケンシングライブラリーを、Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（商標）（ＫＡＰＡバイオシステムズ社（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製）およびＨｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＮＧＳ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｋｉｔ（商標）（アドバンストアナリティティカル社（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）製）でそれぞれ分析した。記載されているように（１６）、イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）製ＨｉＳｅｑ（商標）２５００（高速ランモード）、ＨｉＳｅｑ（商標）４０００、またはＮｏｖａＳｅｑ（商標）６０００（Ｓ２フローセル）機器を使用して４５倍のカバレッジで、ペアエンド１０１ｎｔ  ｒＷＧＳを実施した。ｒＷＥＳは、ＧｅｎｅＤｘ（商標）によって実施した。エクソームの濃縮にはｘＧｅｎＥｘｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｎｅｌ（商標）ｖ  １．０（インテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製）を使用し、増幅にはＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ポリメラーゼ（アジレント社（Ａｇｉｌｅｎｔ）製）を使用した（１８，６４）。配列をヒトゲノムアセンブリＧＲＣｈ３７（ｈｇ１９）にアライメントし、変異をＤＲＡＧＥＮ（商標）プラットフォーム（ｖ．２．５．１、サンディエゴのイルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）製）で同定した（１６）。既知の構造変異を有する２１個のサンプルにおいて最高の感度および精度が得られた組み合わせである、Ｍａｎｔａ（商標）およびＣＮＶｎａｔｏｒ（商標）（ＤＮＡｎｅｘｕｓ（商標）を使用）を用いて、構造変異を同定した（表６）（１８，６５，６６）。構造変異を、既知の疾患遺伝子のコード領域に影響を及ぼし、対立遺伝子頻度がＲＣＩＧＭデータベースで２％未満であるものを保持するように、フィルタリングした。ヌクレオチドおよび構造変異は、標準的なガイドライン（５０，６７）に従い、Ｏｐａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ（商標）（Ｆａｂｒｉｃ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して臨床分子遺伝学者によって注釈付けし、分析し、解釈した。Ｏｐａｌ（商標）は、病原性に関して変異に注釈付けし、疾患遺伝子アルゴリズムＶＡＡＳＴ、遺伝子負荷試験、および、（患者由来の観察されたＨＰＯフェノタイプ用語を組み合わせた）アルゴリズムＰＨＥＶＯＲ（フェノタイプ駆動型変異オントロジー再ランク付け）に基づいて、ランク順の鑑別診断を生成し、フェノタイプの一致および遺伝子スコアに基づいて疾患遺伝子を再ランク付けした（６８−７０）。自動生成され、ランク付けされた結果を、反復的なＯｐａｌ検索によって手動で解釈した。最初に、対立遺伝子頻度が１％未満の変異をＥｘｏｍｅ  Ｖａｒｉａｎｔ  Ｓｅｒｖｅｒ（商標）、１０００  Ｇｅｎｏｍｅｓ  Ｓａｍｐｌｅｓ（商標）、およびＥｘｏｍｅ  ＡｇｇｒｅｇａｔｉｏｎＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（商標）データベース内に保持するように、変異をフィルタリングした（７１）。変異を、デノボ、劣性および優性遺伝パターンについて更にフィルタリングした。次いで、診断を裏付ける証拠を、公開されている文献と比較して手動で評価した。分析、解釈、およびレポートには、専門家が平均６時間作業することを要した。ｒＷＧＳまたはｒＷＥＳが、罹患率または死亡率の低減に利用可能な暫定診断を確立した場合、記載されているように、これを直ちに臨床チームに伝えた。全ての原因変異を、必要に応じて、サンガーシーケンシングまたは染色体マイクロアレイによって確証した。二次所見はレポートされなかったが、この情報を家族が受諾することに同意した場合には、医療において治療的・予防的介入が可能な（ｍｅｄｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｏｎａｂｌｅ  ）な偶発的所見がレポートされた。
【００５８】
自然言語処理およびフェノタイプの抽出
ＥＨＲからＨＰＯ用語を抽出するのに要したステップは、下記４つである。
【００５９】
１）臨床記録を、ＥＨＲデータウェアハウスからエクスポートし、互換性のある形式（ＪＳＯＮ）に変換して、ＣＬｉＸＥＮＲＩＣＨ（商標）にロードした。
【００６０】
２）ＨＰＯ用語（およびその同義語）を入力として使用し、ＣＬｉＸクエリーを出力として使用して、半自動化されたクエリーマップを作成した。ＨＰＯ用語を、ＣＬｉＸエンコーディングエンジンに通過させ、認識されたＨＰＯ用語または同義語ごとにＣＬｉＸ事後調整ＳＮＯＭＥＤ（商標）表現を作成した。完全一致以外の場合は、手動レビューを使用して、生成されたＣＬｉＸ（商標）クエリーを検証した。一致または不正確な一致が存在しなかった場合には、ＨＰＯのフェノタイプとＳＮＯＭＥＤ−ＣＴ（商標）のフェノタイプが適切に一致するように、新規のコンテンツがＣｌｉｎｉｔｈｉｎｋＳＮＯＭＥＤ（商標）拡張ファイルおよび用語ファイルに追加された。この反復的プロセスによって、結果として、ＨＰＯ用語１２，７８６個中の６０％（７，７０６）を網羅するＣＬｉＸ（商標）クエリーセット（２０１７年１０月９日版ＨＰOビルド）が作成された。
【００６１】
３）非構造化データが収録されているＥＨＲドキュメントを、ＣＮＬＰエンジンに通過させた。自然言語処理エンジンは、構造化されていないテキストを読み取り、ＨＰ０００７９７３：網膜異形成に対応する以下の例に示すような構造化された形式にて調整された後のＳＮＯＭＥＤ表現としてエンコードした。
【００６２】
2021521886.tif 000002
【００６３】
各ＳＮＯＭＥＤ表現は、いずれも状況ラッパー内に含まれる、関連する臨床所見(associated clinical finding)、時間的文脈（temporal context）、所見文脈(finding context)、対象文脈(subject context)など、いくつかの部分で構成されている。完全に調整された後のＳＮＯＭＥＤ表現を取り込むことによって、臨床ノートの正しいコンテキストが確実に保持される。一部のＨＰＯフェノタイプは、ＳＮＯＭＥＤ内に見つからないため、ＨＰ０００８０２０：進行性錐体ジストロフィーのエンコーディングである下記の例に示すような調整された後の表現を使用してのみ表すことが可能である。
【００６４】
2021521886.tif 000003
【００６５】
ここで、「臨床コース」の追加属性と適切な値「プログレッシブ」を使用して、表現を更に修飾する。Ｃｌｉｎｉｔｈｉｎｋ（商標）は、これらのＳＮＯＭＥＤ（商標）表現への参照を使用して、ブール論理に連携させて、ＨＰＯ用語に対応するクエリーを作成した。下記に示すのは、ＨＰ０００８８６６：再発性感染症に続発する成長障害のクエリーの例である。
【００６６】
2021521886.tif 000004
【００６７】
2021521886.tif 000005
【００６８】
2021521886.tif 000006
【００６９】
非構造化データから作成されたエンコーディングで、これらのクエリーの１つをトリガーするには、全てのコンポーネントが一致している必要がある。ゆえに、影響を受けた兄弟を説明する臨床ノートのエンコーディングは、家族歴のエンコーディングであるため、クエリーをトリガーしない。ただし、クエリーはレコードの対象（すなわち、患者）で用語を検索する。更になお、ここで留意すべき点は、一部の個々のＨＰＯ同義語から1を超えるＳＮＯＭＥＤ（商標）表現が生成されることである。ゆえに、クエリーセットで使用される各クエリーは、多くの場合、２つを超えるＳＮＯＭＥＤ（商標）表現の複合物である。クエリーセット内の各表現（いずれも状況ラッパー内に含まれる、関連する臨床所見、時間的文脈、所見文脈および対象文脈）から、クエリーセット内の各表現（関連する全てのＳＮＯＭＥＤ（商標）コードを伴う）から、上記の不変なものを除外した場合には、発明者が、より読み易いフォーマットを作成して、Ｃｌｉｎｉｔｈｉｎｋ（商標）によって作成された各クエリー内の収録内容を言語的に示してもよい。
【００７０】
４）次いで、このエンコードされたデータを、ＣＬｉＸ（商標）クエリーテクノロジー（抽象化）を介して照会した。ＨＰＯクエリーをトリガーするには、エンコードされたデータに完全一致、またはその論理的な子孫の１つ（ＳＮＯＭＥＤ（商標）オントロジーの親子階層を利用したもの）を収録することによって、結果的に、各患者のＨＰＯ用語のリストが作成されるようにする必要があった。
【００７１】
ｒＷＧＳ
ＥＤＴＡ血液１０μＬまたはＮｕｃｌｅｉｃ−Ｃａｒｄ  Ｍａｔｒｉｘ（商標）乾燥血液スポット（サーモフィッシャー社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）製）の５つの３ｍｍパンチから、Ｎｅｘｔｅｒａ  ＤＮＡ  Ｆｌｅｘ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ（商標）キット（イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）製）および５サイクルのＰＣＲにより、記載通りに（３５）、シーケンシングライブラリーを調製した。構造変異分析用に、上記のようにＨｙｐｅｒ（商標）キット（ＫＡＰＡバイオシステムズ社（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製）によってライブラリーを調製した。ライブラリーを、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ（商標）アッセイ（サーモフィッシャー社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）製）で定量化した。Ｎｏｖａｓｅｑ（商標）６０００  Ｓ１試薬キット  （イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）製）を使用してＳ１  Ｆｃでインデックスを作成せずに、ライブラリーをシーケンシング（２×１０１ｎｔ）した。配列をヒトゲノムアセンブリＧＲＣｈ３７（ｈｇ１９）にアライメントし、ヌクレオチド変異をＤＲＡＧＥＮ（商標）プラットフォーム（ｖ．２．５．１、イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）製）で同定した（１６）。
【００７２】
自動化三次分析
自動化変異解釈を、ＭＯＯＮ（商標）（Ｄｉｐｌｏｉｄ）を使用して実行した（７２）。データソースおよびバージョンは、下記の通り：ＣｌｉｎＶａｒ：２０１８−０４−２９；ｄｂＮＳＦＰ：３．５；ｄｂＳＮＰ：１５０；ｄｂｓｃＳＮＶ：１．１；Ａｐｏｌｌｏ：２０１８−０７−２０；Ｅｎｓｅｍｂｌ：３７；ｇｎｏｍＡＤ：２．０．１；ＨＰＯ：２０１７−１０−０５；ＤＧＶ：２０１６−０３−０１；ｄｂＶａｒ：２０１８−０６−２４；ＭＯＯＮ：２．０．５）である。決定木、ベイズモデル、ニューラルネットワーク、および自然言語処理を使用して変異を順次フィルタリングしてランク付けすることによって、ＭＯＯＮ（商標）で潜在的な暫定診断のリストを生成した。以前の研究者によってアップロードされた何千もの以前の患者サンプルを使用して、ＭＯＯＮ（商標）を繰り返しトレーニングした。ＭＯＯＮ（商標）のトレーニングには、この研究で分析されたサンプルは使用されなかった。
【００７３】
フィルタリングパイプラインは、偽陰性を最小限に抑えるように設計されていた。ＳＮＶ分析では、ＭＯＯＮ（商標）で、低品質且つ一般的な変異（ｇｎｏｍＡＤで＞２％）、およびＣｌｉｎＶａｒ（商標）で既知の、おそらく良性の変異／良性変異を除外した。保持されたのは、コード領域の変異、スプライス部位領域の変異、および非コーディング領域の既知の病原性変異のみであった。独自の障害モデルに基づいて、残りの変異に疾患注釈付けが追加された（７２）。障害モデルでは、遺伝学文献の自然言語処理を実行して、疾患、疾患遺伝子、遺伝パターン、特定の臨床的特徴、およびその他のメタデータ間の関連が、継続的に自動抽出される。
【００７４】
後続のステップには、関連する疾患の遺伝パターン、変異の既知の病原性、および注釈付けされた疾患の典型的な発症年齢範囲に応じた可変頻度のしきい値を使用して、変異頻度でフィルタリングすることが含まれていた。家族分析（デュオ／トリオ分析）では、常染色体優性、常染色体劣性、Ｘ連鎖優性、またはＸ連鎖劣性遺伝パターンに従ったフェノタイプと変異の共分離が考慮された。親子変異の分離は厳密なフィルター基準として適用されなかったため、家族分析において、非メンデル性遺伝（浸透度が不完全な場合など）に従う原因となる突然変異が確実に同定された。被験者のみの分析で保持された変異は、コールされた変異の接合性が注釈付けされた疾患の遺伝パターンに適合する変異だけに限られた。最後のフィルターステップでは、フェノタイプの重複スコアリングが、患者に対するフェノタイプが記載された入力ＨＰＯ用語と、公開済み文献に基づいて注釈付けされた注釈付き障害の既知の疾患症状との間で為された。フェノタイプが注釈付けされた疾患と一致する遺伝子の変異のうち、Ａｐｏｌｌｏ（商標）に基づいて制限が多すぎると見なされものは、分析対象から除外された。変異の最終ランクは、フェノタイプの一致と変異の効果を考慮した独自のアルゴリズムに基づいていた。加えて、ＭＯＯＮ（商標）では、ランク付けされた変異の病原性を支持する全てのメタデータが提供された。また、ＭＯＯＮ（商標）では、劣性疾患について、全ての稀有な変異（ｇｎｏｍＡＤで＜２％）、および保因者の状態の注釈付きリストが返された。
【００７５】
構造変異分析用に、ＭＯＯＮ（商標）では、Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｖａｒｉａｎｔｓ（商標）（ＤＧＶ）に基づいて既知の良性ＳＶが削除された。ｄｂＶａｒにリストされている病原性ＳＶと重複するＳＶは、分析用に保持された。ＭＯＯＮ（商標）で、既知の疾患遺伝子（Ａｐｏｌｌｏ（商標））のコード領域と重複していないＳＶを、残りの変異から破棄した。家族分析を実施した場合、ＳＶの分離が考慮されたが、非メンデル性遺伝パターン（例えば、不完全な浸透度）も支持された。最後のフィルターステップでは、入力ＨＰＯ用語とＳＶの影響を受ける遺伝子の少なくとも１つの既知の疾患症状との間に、フェノタイプの重複があったＳＶのみが、保持された。次いで、ＭＯＯＮ（商標）でレポートされた候補ＳＶのランク付けリストでは、ランキングの大部分が、フェノタイプの重複に基づいていた。
【００７６】
統計分析
子供の遺伝疾患に関連するフェノームの複雑さを評価する目的で、発明者らは、手動レビュー、ＣＮＬＰによって同定されたフェノタイプを比較し、ＯＭＩＭでの各患者の診断に関してリストした。全ての分析は、Ｒｖ３．３．３で実施された（７３）。ＣＮＬＰを患者のＥＨＲに適用した場合、作成されたＨＰＯ用語のリストには、臨床ノートのフェノタイプと完全に一致する用語、および完全一致のスーパークラス（祖先用語）である用語の両方が、含まれていた。ＲパッケージｏｎｔｏｌｏｇｙＩｎｄｅｘ（商標）ｖ２．４を使用して、ＨＰＯの２０１７年１０月版ビルドをＲにロードし、ＯＭＩＭコーパス全体の各ＨＰＯ用語のＩＣを計算した（７４）。臨床的特異性を反映する用語フェノタイプのＩＣは、ＩＣ（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）＝−ｌｏｇ（ｐｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）で与えられる。式中、ｐｐｈｅｎｏｔｙｐｅは、ＯＭＩＭ（商標）の全ての疾患を対象として正確な用語またはそのサブクラスの１つが観察される確率とした。手動およびＣＮＬＰによって抽出されたフェノタイプは、「フェノタイプ異常」（ＨＰ：００００１１８）のサブクラスに制限されていたことから、「臨床修飾因子」（ＨＰ：００１２８２３）、「頻度」（ＨＰ：００４０２７９）、「遺伝形式」（ＨＰ：００００００５）、および「死亡率／加齢」（ＨＰ：００４０００６）のサブクラスであるＯＭＩＭ（商標）用語は、分析には含まれていなかった。フェノタイプセットは、ＲパッケージｈｐｏＰｌｏｔ（商標）ｖ２．４を使用して各患者のＨＰＯグラフをプロットすることにより、最初に視覚的に比較された（７５）。関心対象の結果の要約統計量には、平均、標準偏差（ＳＤ）、および範囲が含まれる。有意差を検定する前に、シャピロ−ウィルク検定を使用して結果変数の正規性を検定した。正規性に対し偏差が生じたため、フェノタイプカウントとＩＣとの差分を、両側マンホイットニーＵ検定で評価し、データが対応している場合は、ウィルコクソン符号順位検定で評価した。相関はスピアマンの順位相関係数（ｒｓ）で評価した。精度および再現率は、それぞれｔｐ／（ｔｐ＋ｆｐ）およびｔｐ／（ｔｐ＋ｆｎ）によって与えられた。式中、ｔｐは真陽性、ｆｐは偽陽性、ｆｎは偽陰である。真陽性の数ｔｐの定義は、下記の２段階で為された。第１に、ｔｐをフェノタイプのセット間で重複するＨＰＯ用語の数に設定した。第２に、フェノタイプセット間のＨＰＯ階層（親子用語）内で最大１度離隔した用度に基づいてｔｐを計算し、正確ではないが類似する一致を許容した。追加的なグラフィックを、パッケージｇｇｐｌｏｔ２  ｖ２．２．１およびｅｕｌｅｒｒｖ４．０．０で作成した（７６，７７）。全ての分析で、ｐ＜０．０５の有意差カットオフを使用した。
【００７７】
結果
遺伝疾患を診断するための、高速ゲノムシーケンシング
高速ゲノムシーケンシングの現在の方法の限界に照らして、本発明者らは、従来のワークフローの自動化および加速によって、ゲノムシーケンシングによる迅速且つハイスループットの遺伝疾患暫定診断用の自動化プラットフォームを開発した（図１）。従来の臨床ゲノムシーケンシングでは、血液からゲノムＤＮＡを手動精製すること、ＤＮＡ品質を評価すること、ＤＮＡ濃度を正規化すること、シーケンシングライブラリーを調製すること、およびライブラリー品質を評価する準備工程を要する（図１Ａ）。代わりに、本発明者らは、直接的に血液または乾燥血液スポットから手動で、トランスポゾンが付着されたマイクロビーズを使用して、シーケンシングライブラリーを調製した（Ｎｅｘｔｅｒａ  ＤＮＡ  Ｆｌｅｘ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（商標）、イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）製；図１Ｂ）（３５）。この方法が、より迅速かつより労力がかからなかったためである。注目すべきことに、乾燥血液スポットは、世界中の義務付けられた新生児スクリーニングで使用されるサンプルタイプである。後向きサンプルを使用した４回のランでは、従来のＤＮＡ精製およびライブラリー調製（Ｔｒｕｓｅｑ  ＤＮＡ  ＰＣＲフリーのＬｉｂｒａｒｙＰｒｅｐ  Ｋｉｔ（商標）イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）製；表１）を用いて少なくとも１０時間を要したのと比較して、乾燥血液スポットからＮｅｘｔｅｒａ（商標）ライブラリーを手動で調製するのに平均２時間４５分を要した。Ｎｅｘｔｅｒａ  Ｆｌｅｘ（商標）は、標準的な方法と同様、サンプルをバッチで準備することを可能にし、液体処理ロボットによる自動化に適していた。
【００７８】
準備工程に続いて、以前の方法では、ＨｉＳｅｑ（商標）２５００シーケンサー（イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）製）を高速ランモードで使用して高速ゲノムシーケンシングを実行し、シーケンシング機器ごとに１つのサンプル（２×１０１ｎｔの〜１２０ギガベース（Ｇｂ））を約２５時間でシーケンシングした（図１Ａ）（１６，１７）。ここで、本発明者らは、代わりに、ＮｏｖａＳｅｑ（商標）６０００シーケンサーおよびＳ１フローセル（イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）製）を使用して高速ゲノムシーケンシングを行った（図１Ｂ）。なぜなら、この機器はより迅速で労力もかからず、シーケンシングランを設定し、ラン後に機器を自動的に洗浄するために必要な手順が少なくて済んだからである。後向きサンプルを使用した４回のランでは、２×１０１ｎｔゲノムシーケンシングに平均１５：３２時間かかり、フローセル当たり４０４〜５３７Ｇｂが得られた。これは、２〜３個の４０Ｘゲノムシーケンシングに十分であった（表１、表２）。
【００７９】
Ｄｙｎａｍｉｃ Ｒｅａｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ＧＥＮｏｍｉｃｓ（商標）（ＤＲＡＧＥＮ（商標）、イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）製）は、速度、感度および精度が高度に最適化された、アライメントおよび変異コールのための一種のハードウェアおよびソフトウェアプラットフォームである（１６）。本発明者らは、シーケンサーからＤＲＡＧＥＮ（商標）プラットフォームへのファイルの転送を自動化するための、スクリプトを作成した。次に、ＤＲＡＧＥＮ（商標）プラットフォームは、リードをリファレンスゲノムに自動的にアライメントし、ヌクレオチド変異を同定して遺伝子型を同定した。アライメントおよび変異コールは、１５０Ｇｂのペアエンド１０１ｎｔシーケンスの中央値で１時間を要した（一次および二次分析、表１）。この新規な方法の分析パフォーマンスは、血液サンプルの受け取りからゲノム変異遺伝子型の出力に至るまで、ヌクレオチドの挿入／欠失の検出における感度が低いことを除いて、参照ヒトゲノムサンプル、後向き患者サンプル、および前向き患者サンプルを用いた標準的な臨床方法と同様であった（表２、表３）。新規な方法では、構造の変化が、評価対象から外された。
【００８０】
電子健康記録（ＥＨＲ）のＣＮＬＰ
遺伝疾患の診断では、子供の疾病の観察された臨床的特徴（フェノタイプ特徴）と全ての遺伝疾患の予期される特徴との重複に基づいて鑑別診断を決定する必要がある。ただし、包括的なＥＨＲレビューには、数時間かかる場合がある。加えて、手動のフェノタイプ特徴選択は、少なく且つ主観的であると考えられ（３６，３７）、専門家の評価者でさえ、記載されていない偏見が解釈に入ってしまう場合がある（図１Ａ）。本発明者らは、専門家の意見による偏見が入らない、ＥＨＲからの自動的な完全フェノタイプ特徴抽出を模索した。アプローチとして最も簡単なのは、国際疾病分類（ＩＣＤ）医療診断コード、または診断関連群（ＤＲＧ）コードなど、普遍的で構造化されたフェノタイプ特徴を抽出することである。ただし、これらは少なく、十分な特異性を欠く（３８，３９）。代わりに、発明者らは、奇少疾病患者を同定する用途に合わせて最適化されたＣＮＬＰ（ＣＬｉＸ  ＥＮＲＩＣＨ（商標）、クリニシンク社（Ｃｌｉｎｉｔｈｉｎｋ  Ｌｔｄ．）製）を用いて、患者ＥＨＲの非構造化テキストから臨床的特徴を抽出した（図１Ｂ、図２Ａ）。次に、発明者らは、遺伝疾患診断のためにゲノムシーケンシングを受けた子供１６人のトレーニングセットを使用して、レイディ・チルドレンズ・ホスピタル・エピック（Ｒａｄｙ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｅｐｉｃ）ＥＨＲのプロトコールを繰り返し最適化した（表４）。ＣＬｉＸ  ＥＮＲＩＣＨ（商標）からの標準出力は、ＳＮＯＭＥＤ−ＣＴ（商標）（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｚｅｄ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ）の形態である。しかしながら、我々の自動化された方法は、遺伝疾患の臨床的特徴を説明するために設計された階層的な参照用語である、ヒトフェノタイプオントロジー（Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ）（ＨＰＯ）に記載されているフェノタイプ特徴を必要とした（図２Ｂ）。この理由から、発明者らは、１２，７８６のＨＰＯ用語（同義語を含む１３，６８５）の７，７０６（６０％）、およびオルファネット希少疾患（Ｏｒｐｈａｎｅｔ  Ｒａｒｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ）のＨＰＯ用語（２０１８年６月リリース）の７５．４％を用語的および論理的方法によってＳＮＯＭＥＤ−ＣＴ（商標）にマッピングし、手動で検証した。これにより、ＣＮＬＰによってＥＨＲから抽出されたフェノタイプ特徴をＳＮＯＭＥＤ−ＣＴの概念からＨＰＯ用語に自動変換することが可能になった（図１Ｂ）。対照的に、Ｄｈｏｍｂｒｅｓ  ｅｔａｌ．（２０１６）は、ＨＰＯ用語の９２％をＳＮＯＭＥＤ−ＣＴにマッピングしたが、オントロジー的に有効で臨床的に関連性があることが示されたのは４９％のみであった（４０）。
【００８１】
最適化されたＣＮＬＰのパフォーマンスは、遺伝疾患の診断のためにゲノムシーケンシングを受けた試験対象児１０人のＥＨＲを用いて試験した。トレーニングセットと試験セットは重複していなかった。正確なＥＨＲフェノタイプ特徴の一致とそれらの階層的なルート用語の両方が、第１のレコードからゲノムシーケンシングの登録時まで抽出された。ＣＮＬＰは、患者１人当たり約２０秒で、平均８６．７のフェノタイプ特徴（標準偏差（ＳＤ）３２．８、範囲２６〜１５８、表５）を同定した。ＥＨＲの詳細な手動レビューを実行して、試験対象子供における全ての真陽性、偽陽性、および偽陰性のＣＮＬＰフェノタイプ特徴を同定した。これに基づくと、ＣＮＬＰの適合率（正の予測値、ＰＰＶ）は０．８０（ＳＤ０．１３、範囲０．５０〜０．９３）であり、再現率（感度）は０．９３（ＳＤ０．０２、範囲０．９１〜０．９６；表５）であった。これは、以前のＣＮＬＰベースのＨＰＯ用語の抽出を凌駕していた（３６，４１）。偽陽性（ＦＰ）の主な理由は、下記の通り：
１）誤って解釈された文脈（ｎ＝３１）による誤ったＣＬｉＸ（商標）エンコーディング（ｎ＝８９、２３７のフェノタイプ特徴の３８％）、認識されない見出し（ｎ＝２３）、誤った頭字語の展開（ｎ＝２１）、臨床用語の誤った解釈（ｎ＝８）、または、誤って帰属された疾患の所見部位（ｎ＝６）；
２）ソーステキストの曖昧さ（認識されない、または正しくない構文、略語、頭字語、または用語；ｎ＝４６、２３７の１９％）；
３）ＳＮＯＭＥＤ／ＨＰＯ／臨床的洞察力の間の不一致（ｎ＝２０、８％）；
４）ペーストされた引用を非臨床テキストとして認識できない（ｎ＝６８、２９％）；ならびに
５）不正なクエリーロジック（ｎ＝１４、６％）（表５）。
【００８２】
遺伝疾患が疑われる子供のＣＮＬＰ由来のフェノームの特性評価
自律診断システムの開発は、遺伝疾患が疑われる子供のフェノームのトポグラフィーに関する知識の不足によって妨げられてきた（３６，４２−４４）。したがって、本発明者らは、ＥＨＲ  ＣＮＬＰ由来のフェノームと、レイディ・チルドレンズ・ホスピタル（Ｒａｄｙ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）で、遺伝疾患診断のためにゲノムシーケンシングを受ける第１の症候性の子供３７５例（ゲノムシーケンシングで診断された子供１０１例：図３のＡ〜Ｄ、診断されなかった子供２７４例：図３Ｅ〜Ｈ）を手動で解釈する際に専門家によって選択された比較的少ないフェノタイプ特徴とを比較した。１０５種の遺伝疾患のゲノム診断を受けたこれら子供のうち１０１例（４例は二重診断を受けた）において、本発明者らはまた、観察されたフェノタイプ特徴を、ヒトオンラインメンデル性遺伝（ＯＭＩＭ）の臨床概要分野から得られたそれらの疾患に関して予期されるフェノタイプ特徴と比較した（１８，２２−２４，４１）。診断を受けた子供１０１例において、ＣＮＬＰ（平均１１６．１、ＳＤ９３．６、範囲１３−５２１）は、解釈時の専門家による手動選択（平均４．２、ＳＤ２．６、範囲１〜１６）よりも２７倍多く、ＯＭＩＭ（平均２７．３、ＳＤ２２．８、範囲１〜１００）よりも４倍多くのフェノタイプ特徴を同定した（図３Ａ、図３Ｄ）（４５，４６）。同様に、以前の研究では、ＣＮＬＰによって抽出されたフェノタイプ特徴は包括的で専門家による手動抽出よりも２倍多く（３６）、ＣＮＬＰによって抽出されたフェノタイプ特徴はオルファネット（Ｏｒｐｈａｎｅｔ）ＨＰＯ用語よりも１８倍多いことが示された（４７）。診断を受けた子供１０１例では、診断されなかった子供２７４例におけるよりも多くのフェノタイプ特徴が、ＣＮＬＰにより抽出された（平均、それぞれ１１６．１対９０．７、Ｐ＝０．０００４、マンホイットニーＵ検定、図３Ａ、図３Ｄ、図３Ｅ、図３Ｈ）。これは、診断されなかった子供の一部は、分子診断をするのに十分詳細な医療記録がなかった可能性を示唆した。加えて、診断を受けた子供（平均２．７４用語、ＳＤ１．７、範囲０〜９）では、診断されなかった子供（平均１．５２用語、ＳＤ１．４８、範囲０〜７）よりもＣＮＬＰと手動で抽出されたフェノタイプ特徴の間に大きな重複が存在していた（Ｐ＜０．０００１、マンホイットニーＵ検定；図３Ｄ、図３Ｈ）。このことから、診断されなかった子供の一部は、フェノタイプ特徴に関して一貫性に欠ける情報を有していたことが示唆された。
【００８３】
診断を受けた子供１０１例において、ＣＮＬＰによって抽出されたフェノタイプ特徴は、手動で抽出されたフェノタイプ特徴（平均０．９２用語、ＳＤ１．０２、範囲０〜４）よりも有意に多く、予期されるＯＭＩＭのフェノタイプ特徴（平均４．３１用語、ＳＤ４．５９、範囲０〜３２）と重複していた（Ｐ＜０．０００１、対応あるウィルコクソン検定；図３Ｂ）。コホートには偶発的所見である８つの遺伝疾患が含まれていたが、その遺伝疾患を除外してもこれらの結果は実質的に不変であった（図４）。ゆえに、ＣＮＬＰによるＯＭＩＭフェノタイプ特徴の再現率は低い（平均０．２０、ＳＤ０．１６、範囲０〜０．６７）が、専門家の手動解釈で使用される少ない専門家の手動フェノタイプ特徴（平均０．０４、ＳＤ０．０６、範囲０〜０．２５）に比べて実質的に高かった（図５）。ただし、ＯＭＩＭと比較した場合、ＣＮＬＰによって抽出されたフェノタイプ特徴の数がはるかに多いと、手動抽出（平均０．２５、ＳＤ０．３０、範囲０〜１）よりも精度が低下する（平均０．０４、ＳＤ０．０３、範囲０〜０．１５）。このことから、設計上、自律診断システムは偽陽性のフェノタイプ特徴にペナルティを課すべきではないことが示唆される。抽出されたものと１度の階層的分離を伴うフェノタイプ特徴が含まれる場合、再現率とＦ１値が増加した（不正確な一致を伴うＣＮＬＰ再現率の平均０．２９、ＳＤ０．２２、範囲０〜１；不正確な一致を伴うＣＮＬＰ  Ｆ１の平均０．１２、ＳＤ０．０８、範囲０〜０．３８；完全に一致するＣＮＬＰ  Ｆ１の平均０．０６、ＳＤ０．０５、範囲０〜０．２３）。このことから、設計上、自律システムには、抽出された用語の階層的な親が含まれている必要があることが示唆された（図５）。
【００８４】
伝統的に、遺伝疾患は、１つまたは複数の疾病特徴的なフェノタイプ特徴の同定によって臨床的に診断されてきた。そのようなフェノタイプ特徴は、情報量（ＩＣ、そのフェノタイプ特徴が全てのＯＭＩＭ疾患で観察される確率の対数）が多い（図２）（４８）。潜在的な懸念は、ＣＮＬＰによって抽出されたフェノタイプ特徴は、解釈中に専門家によって手動で優先順位が付けられたフェノタイプ特徴よりも情報量が少ないということであった。ただし、子供１０１例のうち、ＣＮＬＰフェノタイプ特徴の平均ＩＣ（８．１、ＳＤ２．０、範囲２．６〜１１．４）は、手動（７．８、ＳＤ２．０、範囲２．１〜１１．４；Ｐ＝０．００３、マンホイットニーＵ検定）またはＯＭＩＭフェノタイプ特徴（７．３、ＳＤ１．７、範囲３．２−１１．４）よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０００１、マンホイットニーＵ検定、図３Ｅ）。本発明者らが留意している点は、平均ＩＣが、手動およびＣＮＬＰによって抽出されたフェノタイプ特徴の数と有意に相関したことである（それぞれ、スピアマンのｒｈｏ０．２４、Ｐ＝０．０２およびスピアマンのｒｈｏ０．４４、Ｐ＜０．０００１；図３Ｃ）。ＣＮＬＰフェノタイプ特徴の平均ＩＣは手動フェノタイプ特徴よりも高く（図３Ｆ）、平均ＩＣはＣＮＬＰによって抽出されたフェノタイプ特徴の数と有意に相関した（スピアマンのｒｈｏ  ０．３０、Ｐ＜０．０００１；図３Ｇ）。
【００８５】
子供の遺伝疾患診断用の自律システムの後向きパフォーマンス
遺伝疾患の自動診断の残りのステップは、全ての遺伝疾患に関する患者のＣＮＬＰフェノームの自動ランク付けと、文献知識およびインシリコツールに基づく全てのゲノム変異の病原性の自動ランク付けとを組み合わせることであった（図１、図６）。患者のＣＮＬＰ由来のフェノタイプ特徴およびゲノム変異を自律解釈ソフトウェア（ＭＯＯＮ（商標）、Ｄｉｐｌｏｉｄ）に自動的に転送するためのスクリプトが、発明者らによって記述された。ＭＯＯＮ（商標）で、医学文献の自然言語処理によって各遺伝疾患に関連するフェノタイプ特徴を同定した。これは、ＯＭＩＭ（商標）臨床概要に記載されているフェノタイプ特徴よりも多くのフェノタイプ特徴のセットとされるのが、通例であった。次いで、ＭＯＯＮ（商標）で患者に対するフェノタイプ特徴を各遺伝疾患に関連するものと比較し、子供の疾患を引き起こす可能性をランク付けした。
【００８６】
また、ユーザー介入無しに、患者のヌクレオチド変異および構造変異を、終了時に直ぐＤＲＡＧＥＮ（商標）プラットフォームからＭＯＯＮに自動的に転送するスクリプトが、発明者らによって記述された。高速ゲノムシーケンシングでは、平均４，７４２，５９５ヌクレオチド変異および１９．３構造変異（ＳＶ）が存在し、エクソームシーケンシングでは、患者１人当たり平均３９，０６６ヌクレオチド変異および１０．３ＳＶが存在した。これらのうち、ＭＯＯＮ（商標）は、高速ゲノムシーケンシング、および高速エクソームシーケンシングについて、対立遺伝子頻度２％未満であり、既知の疾患遺伝子に影響を及ぼした、それぞれ６７，５８９ヌクレオチド変異および１２ＳＶ、ならびに７９１ヌクレオチド変異および４．５ＳＶを保持したにて。ＭＯＯＮ（商標）のベイズフレームワークと確率モデルは、１５のインシリコ予測ツール、ＣｌｉｎＶａｒ（商標）判定、および遺伝パターンベースの対立遺伝子頻度を使用して、これらの変異の病原性をランク付けした。シングルトン分析およびファミリートリオ分析で、それぞれ平均５つおよび３つの暫定診断をランク付けした（表６）。ＭＯＯＮ（商標）は、感度が最適化されているため、診断を受けた対象当たり６ヌクレオチド変異の中央値（範囲２〜２４）を候補に挙げた。手動の解釈によって陰性と見なされた場合、偽陽性診断を最終候補に挙げたことも、しばしばであった。ただし、ＩｎｔｅｒＶａｒ（商標）ソフトウェアでＭＯＯＮ（商標）出力を処理し、病原性およびおそらく病原性の変異のみを保持することによって、両方とも大幅に改善された（４９）。ＩｎｔｅｒＶａｒ（商標）は、コンセンサス病原性勧告２８のうち、１８に関して変異を分類した（５０）。具体的には、意義不明（ＶＵＳ）変異のトリアージである。自動解釈は、変異およびＨＰＯ用語が転送されてから、暫定診断と裏付けとなる証拠（ラボラトリー所長のレビュー用に、その障害に一致する患者のフェノタイプ特徴を含む）が表示されるまで、中央値で５分かかった。４回のランで、血液または血液スポットが受信されてから上位ランクの変異として正しい診断が表示されるまでの時間は、１９：１４〜２０：２５時間（中央値１９：３８時間；表１の後向き症例）であった。これは、毎日の臨床オペレーションサイクルによく適合しており、午前中のサンプルの受け取りにより、午後のライブラリーの調製、一晩のゲノムシーケンシング、および翌朝のラボラトリー所長によるレビュー用暫定レポートが可能となった。
【００８７】
本発明者らは、遺伝疾患１０５種のうち９７種の診断を受けた子供１０１例中９５例において、自律システムと以前のチームベースの手動の専門家による解釈との間の一致を後向きに調べた。本発明者らが除外した所見８つは、（予期されるフェノタイプ特徴のいずれかの現在の証拠無しに）レポートされたが偶発的であると見なされたものであった。このコホートは人種および祖先が多様であった。１１種の診断は構造変異に関連し、８６種の診断はヌクレオチド変異に関連していた。トレーニング患者は、試験セットに含まれていなかった。患者２例において、新しい診断の改訂された臨床レポートが発行された（乳児６００７、ＥＩＥＥ９、Ｘｐ２２ｄｅｌ、および患者６０３３、コケイン症候群Ｂ、ＥＲＣＣ６ｐ．Ｇｌｙ５２８Ｇｌｕおよびｃ．−１５＋３Ｇ＞Ｔが、機能研究によって検証された）。ゆえに、最初の専門家による手動による解釈では、９８％（９７中９５）の再現率があった。発明者らは、手動診断の再分析を実施しなかったが、最初に臨床的にレポートされて以来、それら手動診断はどれも降格されていなかった。自律診断システムの精度は、９９％（９４中９３）、再現率は９７％（９７中９４）であった。ヌクレオチド変異および構造変異の場合、正しい診断のランク中央値は1番目であった（範囲１〜４ヌクレオチド変異；範囲１〜１３  ＳＶ；表６）。
【００８８】
３例の偽陰性自律診断は、下記症例で構成されていた。
【００８９】
常染色体優性アルポート症候群（ＣＯＬ４Ａ４  ｃ．４７１５Ｃ＞Ｔ、ｐ．Ｐｒｏ１５７２Ｌｅｕ）の乳児６１５９は、血尿、ネフローゼ症候群、糸球体腎炎、高血圧、および全身浮腫を患っていた。ＯＭＩＭ（商標）によって示唆されたように、ＣＯＬ４Ａ４関連アルポート症候群（ＣＡＳ）が常染色体劣性であり、ｐ．Ｐｒｏ１５７２Ｌｅｕは常染色体劣性アルポート症候群のＣｌｉｎＶａｒ（商標）で病原性として記録された。ただし、常染色体優性ＣＡＳのレポートは多数に及んでいる。変異は母性遺伝した。乳児の母親は無症候性であったことから、報告されているように、発明者らは、母親が常染色体優性ＣＡＳの不完全な浸透度を示したと推定した（５１，５２）。自律システムは、乳児を常染色体劣性ＣＡＳの保因者として分類した。
【００９０】
乳児２５３は常染色体優性視神経萎縮プラス症候群（ＯＰＡ１ｃ．５５６＋１Ｇ＞Ａ）を有していた。自律システムでは、７０種のＣＮＬＰフェノタイプ特徴とＭＯＯＮ（商標）疾患フェノタイプ特徴モデルとの重複が不十分なため、この変異はランク付けされなかった。最近のレポートによると、ＯＰＡ１は、乳児２５３と同様、複雑で重度の多系統ミトコンドリア病に関連している可能性がある。
【００９１】
新生児２１３は、右胸心および大血管転位症を患っており、シングルトンゲノムシーケンシングを受け、手動診断によって、ＮＯＤＡＬにおけるおそらく病原性の変異に関連する常染色体優性内臓逆位５型であるとされた（ｃ．７７８Ｇ＞Ａ；ｐ．Ｇｌｙ２６０Ａｒｇ）。この変異は、自律システムによって除外された。この除外は、ＩｎｔｅｒＶａｒ（商標）によるＶＵＳとしての分類（ＰＭ１−ＰＰ３−ＰＰ５に基づく）およびＣｌｉｎＶａｒでの矛盾する解釈の存在（「おそらく良性」であるという判定など）に基づいて行われた。
【００９２】
手動解釈中に専門家によって選択された比較的少ないフェノタイプ特徴がＣＮＬＰによって同定されたフェノタイプ特徴に置き換えられたとき、自律システムの再現率は減少した（８８％、９７中８５）。
【００９３】
子供の遺伝疾患診断用の自律システムの前向きパフォーマンス
本発明者らは、集中治療室にいる重篤疾患の乳児７人および以前に診断を受けた乳児３人において、自律診断システムの性能を最速の手動方法と前向きに比較した（表１）。血液サンプルから自律型プラットフォームによる診断までの時間の中央値は、手動による時間の中央値が４８：２３時間（範囲３４：３８〜５６：０３時間）であるのに対し、１９：５６時間（範囲１９：１０〜３１：０２時間）であった。これには、オペレーターのエラーが原因でまたはデータセンターのダウンタイムが原因で遅延した、２つの自動ランが含まれていた。自律システムとＩｎｔｅｒＶａｒ（商標）の後処理を組み合わせることで、３通りの診断が実施されたが、それらの診断のうち偽陽性のものは皆無であった。診断は３つとも全て、手動による方法およびサンガーシーケンシングによって確証された。第１は、糖尿病性ケトアシドーシスで小児集中治療室に入院した７週齢の女児患者３５２例であった。高速ゲノムシーケンシングは、シングルトン被験者に対して実行された。自律システムでは、１９：１１時間で、インスリン遺伝子（ＩＮＳ  ｃ．２６Ｃ＞Ｇ、ｐＰｒｏ９Ａｒｇ）において、これまでにレポートされていないヘテロ接合型ミスセンス変異が同定された。このミスセンス変異は、常染色体優性の永続的な新生児真性糖尿病に関連している（ＯＭＩＭ疾患記録６０６１７６）。ＡＣＭＧ／ＡＭＰの病原性基準によると、変異は、「意義不明」（ＶＵＳ）であった。４２：０４時間後、最速の手動方法を使用した親子トリオシーケンシングで結果が確認された。変異がデノボであることが明らかにされたことにより、変異の分類が、「おそらく病原性」に変更された。
【００９４】
第２の診断を受けた１７月齢の男児患者７０５２は、以前は健康であったが、偽性敗血症性ショック、代謝性アシドーシス、壊疽性膿疱症、低ガンマグロブリン血症で小児集中治療室に入院した。シングルトン、被験者、高速シーケンシングおよび自動解釈は、２２：０４時間にＸ連鎖無ガンマグロブリン血症１（ＯＭＩＭ：３００７５５）に関連するブルトン型チロシンキナーゼ遺伝子（ＢＴＫ  ｃ．９７４＋２Ｔ＞Ｃ）の病原性ヘミ接合性変異を同定した。これは、最速の手動方法による同時トリオランよりも１６：３３時間速かった。この暫定的な結果は、高用量の静脈内免疫グロブリンによる治療（血清ＩｇＧ＞６００ｍｇ／ｄＬを維持するため）、および６週間の抗生物質治療に信用性を与えた。この暫定診断は、ラボラトリー所長による自律的な結果のレビュー時に臨床チームに口頭で伝えられた。以後、臨床全ゲノムシーケンシングは同じ結果を返し、変異が母性遺伝することを明らかにした。
【００９５】
３回目の診断が実施された患者４１２は、発作で新生児ＩＣＵに入院した３日齢の男児であり、フェノバルビタールに反応するという優勢な乳児痙攣の家族歴を有していた。自律システムは、カリウム電位依存性チャネル、ＫＱＴ様サブファミリー、メンバー２遺伝子（ＫＣＮＱ２ｃ．１０５１Ｃ＞Ｇ）において「おそらく病原性」のヘテロ接合変異を同定した。この遺伝子は、常染色体優性の良性家族性新生児痙攣１（ＯＭＩＭ（商標）疾患記録１２１２００）に関連する。診断は、２０：５３時間で実施された。これは、最速の手動方法による同時ランよりも２７：３０時間速かった。診断によってフェノバルビタールを用いた治療に対し信用性が与えられると共に、予後に変化が認められたことから、ラボラトリー所長が結果をレビューした際に、臨床チームに対し暫定結果が口頭で伝えられた。
【００９６】
残りの患者４例については、手動または自律的な方法のいずれにおいても、診断が明白でなかった。
【００９７】
考察
以前は、臨床診療におけるゲノムシーケンシングによる診断までの最速時間が、３７時間であった（８，１５−２６）。ただし、プロトコールは、極度に労力および資本集約的であり、且つ一度に１つのサンプルに制限されていた。本明細書において、発明者らは、ユーザーの介入を軽減し、ランごとに最大２人の親子トリオまたは６人の被験者のスループットを要した中央値２０：１０時間での遺伝疾患診断用プロトタイプの自律システムについて説明した。ＩＣＵでのほとんどの意思決定は、多職種からなる医療チームが参加する朝の回診で、慎重に行われる。ゆえに、２０時間の診断では、朝の回診に間に合うように検査を命じたオンコールの医師に結果が返される。これにより、回診中の情報転送が簡素化され、管理上の決定が促進される。重篤疾患の乳児では、２０時間の診断が重要となる。タイムリーなゲノム診断の大部分によって、ＩＣＵ管理が変革される結果になるからである（１６−２５）。
【００９８】
２０時間に及ぶ遺伝疾患診断に対応した自律型プラットフォームは、病因不明な疾患を有するＩＣＵの急性疾患乳児のニーズを満たすように設計されていた。地域のＩＣＵに入院した乳児の１０〜１２％が、当日中の診断および標的治療の実施による恩恵を享受する可能性があると推定されている（８，１６−３０）。２０１４年、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、重篤疾患の子供に対する暫定レポートを許可する条件を、診断によって転帰が改善され得る管理上の変化が示唆され、且つサンガーシーケンシングを用いて結果が確証されるまでレポートが遅延することにより、回避可能な罹患または死亡をもたらす場合とした（１８，２０，２１）。我々の以前の経験では、暫定診断はゲノムシーケンシング症例の１７％（６８４例中１１４例）でレポートされた。レポートされるまでの平均時間は３．６日であった。２０時間の診断が転帰の改善に関連する可能性が高い症状として挙げられるのは、新生児てんかん性脳症、代謝性疾患（患者３５２の場合）、免疫不全に関連する可能性のある敗血症性ショック（患者７０５２の場合）、臓器不全、および既知の病因が無く体外式膜型人工肺が考慮される症例である（１８−２４，２８）。ゆえに、自律診断システムの制限された適用は、標的治療の早期実施によって罹患または死亡が回避される可能性がある新生児および小児のＩＣＵ入院の亜集団において、標準的な迅速検査よりも早く、ラボラトリー所長のレビューのための暫定診断を同定することである。２０時間の診断が急性介入を通知しかつ結果が出るまでの時間が長くなると効果が無い重篤疾患患者の割合と緊急医療の場面の程度を評価することが重要となる。
【００９９】
本開示は、ＥＨＲからの深層デジタルフェノームの自動抽出について実証した。本明細書においてＣＮＬＰによる遺伝疾患の子供のＥＨＲからのフェノタイプ特徴抽出の分析的パフォーマンスは、前報に比べてかなり向上しており、専門家による手動ＥＨＲレビューを取って換わるのに十分であるように思われた（３６，４１）。前報と一致して、ＣＮＬＰでは、手動解釈中に専門家によって選択されたフェノタイプ特徴より２７倍多くのフェノタイプ特徴が、ＥＨＲから抽出された（３６，４１，４７）。加えて、ＣＮＬＰフェノームの平均情報量は、手動解釈中に専門家が選択したフェノタイプ特徴に比べて多かった。深層ＣＮＬＰフェノームの方が優位であることが明らかにされた理由は、手動解釈中に専門家によって選択されたフェノタイプ特徴に比べて、予期される（ＯＭＩＭ）臨床的特徴との重複が実質的に多かったからである。手動解釈中に専門家によって選択されたフェノタイプ特徴は、自律診断システムで使用した場合、ＣＮＬＰベースのフェノタイプ特徴よりも診断有用性が劣っていた。これは、患者のコホートのゲノムシーケンシングに関する２つの最近のレポートと一致し、解釈時に１５を超えるフェノタイプ特徴が使用された場合、１〜５が使用された場合よりも診断率が高かった（５３，５４）。
【０１００】
本明細書において、本発明者らは、シーケンシング結果の完全に自動化された解釈を記載した。重篤疾患の子供９５例において、自律システムは、専門家のチームによって行われた９７の遺伝疾患診断を再現した場合に、再現率９７％、且つ精度９９％であった。システムが複数の診断を提案した場合、一番目となったのは、正しい診断に関連する変異のランク中央値であった。３つの偽陰性の自律的な結果には、説明が付されており、パラメーター調整によって対処できるか、または変異病原性の評価をラボラトリー間で異ならしめるタイプであった（５５）。前向きには、分子ラボラトリー所長が、自律システムにより７人の重病ＩＣＵ乳児のうち３人（１００％の精度と再現率）で正しい暫定診断が行われ、平均２２：１９時間の時間が節約できたと判断した。ゲノム診断を世界中の地域のＩＣＵ乳児に拡大するには不十分な専門家アナリスト、分子ラボラトリー所長、遺伝医学者および遺伝カウンセラーを考えると、そのような診断性能は、いくつかのハイスループット臨床アプリケーションを示唆するのに十分であった（３１−３３）。監視あり自律システムは、効果的な最上位の暫定診断を提供し得、これにより、未解決または困難な症例、変異の手動キュレーション、および医療管理文献の要約を含めた臨床レポート生成に、貴重な認知リソースを確保することを可能にしている。第二に、手動による解釈で診断が得られない症例の約６７％では、分析がいつ完了したと見なすべきかを知ることが困難である。更なる開発により、自律診断システムは、そのような場合に独立した客観的な分析を提供することができる。第三に、自律システムでは、未解決の症例の定期的再分析が可能であった。遺伝子疾患関連では新たに２５０例、変異疾患関連では新たに９，２００例が毎年レポートされているため、これを手動で実行するのは、厄介である。ただし、再分析により、年間最大８〜１０％の新しい診断が得られた（５６−６０）。自動化された再分析には、ＥＨＲの更新されたＣＮＬＰを含めることができる。これが有用とされるのは、フェノタイプが時間と共に進化する場合である。遺伝子検査の既知のリスクは、過剰診断の結果としての過剰治療である（６１）。定期的な自律再分析では、遺伝子の因果関係または変異の病原性を再分類した結果診断に変更が生じた場合、および／または重複フェノームが最小であった場合もまた、検出される。自律システムは、自動操縦と同様、ゲノム解釈の労働集約度を低減することを可能にする。しかし、自動操縦が発明されてから１０６年経った今でも、民間航空機のコックピットにはパイロット２人が依然として雇用されている。同様に、熟練チームは、文献をキュレートし、近い将来に向けて厳しい決定／分類を行う必要がある。
【０１０１】
自律システムは、いくつかの制限を伴う。第１に、システムのパフォーマンスは、一部は、既往歴および身体検査の質、およびＥＨＲノートへの書き込みの完全性に基づいている。自律診断システムのパフォーマンスは許容範囲内ではあるが、追加的なトレーニング；ＯＭＩＭ（商標）、Ｏｒｐｈａｎｅｔ（商標）、および文献中の遺伝疾患に関連するヒトフェノタイプオントロジー（Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ）用語の、ＣＮＬＰのネイティブ原語であるＳＮＯＭＥＤ−ＣＴ（商標）へのマッピングの増加；構造化ＥＨＲフィールドからのフェノタイプの包含；フェノタイプ重症度の測定（ＥＨＲドキュメントにおけるフェノタイプ用語の頻度など）；および重大な陰性フェノタイプ（そのフェノタイプがないことにより特定の診断が除外される疾病特徴的フェノタイプ）によって改善を図るべきことが期待されている。この一環として、関連する不正確なフェノタイプの一致に適切に重み付けする、改善された非独立フェノタイプの多変量一致には、定量的なデータモデルが必要である。可能ではあるが、自律システムは、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（商標）などの商用変異データベースアノテーション（を利用していなかったため、変異レポートの現行の標準である労働集約的な文献キュレーションは排除されていない。構造変異による遺伝疾患の診断には、標準的なライブラリーの調製、および所用時間に数時間を加算する追加的なソフトウェアステップを要する。自律システムには、手動による解釈と同じ対立遺伝子と病気の頻度に関する知識が利用されているため、少数人種または民族が過小評価され、後者の群における病原性の判定は確実性が低い。同様に、自律システムでは、手動の解釈と同じ変異病原性決定のコンセンサスガイドラインが利用されているため、病原性の判定と同じ一般的な制限が適用される（５５−６１）。
【０１０２】
病因不明な重病の乳児にゲノム医療を広く採用する上での障壁のなかでも主要なものは、訓練を受けていない医療従事者と、遺伝医学者、分子ラボラトリー所長、遺伝カウンセラーなどの領域専門家の大幅な不足である。手動のゲノム分析および解釈は、極めて労働集約的である。加えて、稀少遺伝疾患が極めて多数あることにより、非専門家が簡単に領域を習得するのを妨げている。それゆえ、小児ゲノム医療は、その一般的な採用に人工知能を要する第１の臨床分野の１つであると考えられる（６２）。病因不明な重病の乳児の診断は、自律診断システムの早期適用の代表例とされる。そのような症例はＩＣＵに豊富にあり、最適な結果を得るには、結果が出るまでの時間を短縮することが重要となるからである。
【０１０３】
図の凡例
図１：標準的且つ高速ゲノムシーケンシングによる、遺伝疾患の診断のフロー図。Ａ：手動分析および解釈が最短の２６時間で行われるが、診断までの平均時間が１６日である、ゲノムシーケンシング（ＧＳ）による患者１例の従来の臨床診断のステップ（８，１６−３０）。ゲノムシーケンシングは手動で要求された。本発明者らは、血液からゲノムＤＮＡを手動で抽出し、ＤＮＡ品質を評価（ＱＡ）して、ＤＮＡ濃度を手動で正規化した。次いで、本発明者らは、ＴｒｕＳｅｑ  ＰＣＲフリーＤＮＡ（商標）シーケンシングライブラリーを手動で調製し、ＱＡの再度実行によって、ライブラリー濃度を手動で正規化した。ゲノムシーケンシングは、ＨｉＳｅｑ（商標）２５００システム（イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）製）で、高速ランモード（ＲＲＭ）で実行された。配列を、アライメントおよび変異コール用に、ＤＲＡＧＥＮ（商標）プラットフォームバージョン１（イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）製）に手動で転送した。フェノタイプ特徴を、電子健康記録（ＥＨＲ）の手動レビューによって同定した。変異ファイルおよびフェノタイプ特徴を、Ｏｐａｌ（商標）ソフトウェア（Ｆａｂｒｉｃ）に手動でロードし、解釈を手動で実行した。Ｂ：最短１９時間で最大６人の患者を同時に自律診断するステップ（図６）。含まれる手順は以下の通り：１．ポータルを使用したＥＨＲによって、自動で指示入力を行う。２．Ｎｅｘｔｅｒａ  ＤＮＡ  Ｆｌｅｘ（商標）シーケンシングライブラリーを２．５時間で血液から直接的に手動にてまたはロボットで調製する。３．ＮｏｖａＳｅｑ  ６０００システムおよびＳ１フローセル（イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）製）を使用して１５．５時間での高速４０倍カバレッジゲノムシーケンシングを行う。４．ＤＲＡＧＥＮプラットフォームバージョン２（イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）製）を使用して、１時間でシーケンス転送、アライメント、および変異コールを自動で行う。５．臨床自然言語処理（ＣＮＬＰ）を用い、ＥＨＲから患者フェノームの自動抽出を行い、ヒトフェノタイプオントロジー（ＨＰＯ）用語に２０秒で変換する。６．変異およびフェノタイプファイルの自動転送、およびＣＮＬＰフェノームと全ての遺伝疾患（ＭＯＯＮ、Ｄｉｐｌｏｉｄ）の自動ベイジアン比較、および集約された文献知識とｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測ツール（ＩｎｔｅｒＶａｒ）に基づくゲノム変異の病原性の自動評価および最高ランクの暫定診断の自動表示を行う。
【０１０４】
図２：臨床自然言語処理は、手動のＥＨＲレビューまたはＯＭＩＭ（商標）臨床概要よりも詳細なフェノームを抽出できる。Ａ：４つの抽出されたＨＰＯ用語を示す、メープルシロップ尿症の８日齢の乳児（患者３４１）のＥＨＲから抽出された文のＣＮＬＰ例。Ｂ：新生児３４１のＥＨＲの手動レビューによっておよびＣＮＬＰ（赤）によって抽出されたＨＰＯフェノタイプ特徴、ならびに予期されるフェノタイプ特徴（ＯＭＩＭ臨床概要に由来、青）階層表示。黄色の円：ＣＮＬＰおよび専門家のレビューの両方によって抽出されたフェノタイプ特徴。紫色の円：ＣＮＬＰとＯＭＩＭ（商標）の間のフェノタイプの重複。灰色の円：ＨＰＯ階層内の同定されたフェノタイプ特徴の親用語の場所。情報量（ＩＣ）は、ＩＣ（フェノタイプ）＝−ｌｏｇ（ｐｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）によって定義された。式中、ｐｐｈｅｎｏｔｙｐｅは、ＯＭＩＭ（商標）の全ての疾患を対象として正確な用語またはそのサブクラスの１つを観察する確率であった。情報量は上（一般）から下（特定）へと増加する。
【０１０５】
図３：遺伝疾患が疑われる子供３７５例において観察されたフェノタイプ特徴と予期されるフェノタイプ特徴の比較。Ａ−Ｄ：１０５種の遺伝疾患の診断を受けた子供１０１例。Ｅ−Ｈ：ゲノムシーケンシングによる診断を受けなかった遺伝疾患が疑われる子供２７４例。手動のＥＨＲレビューにより同定されたフェノタイプ特徴は黄色で、ＣＮＬＰにより同定されたフェノタイプ特徴は赤で、ＯＭＩＭ（商標）臨床概要から導き出された予期されるフェノタイプ特徴は青で示されている。Ａ：遺伝疾患の子供１０１例におけるフェノタイプ特徴（対数変換）の数の度数分布。患者ごとに検出された特徴の平均数は、手動レビューで４．２（ＳＤ２．６、範囲１〜１６）、ＣＮＬＰで１１６．１（ＳＤ９３．６、範囲１３〜５２１）、およびＯＭＩＭ（商標）で２７．３（ＳＤ２２．８、範囲１〜１００）であった（ＯＭＩＭ（商標）対手動：Ｐ＜．０００１；ＣＮＬＰ対ＯＭＩＭ（商標）：Ｐ＜．０００１；ＣＮＬＰ対手動：Ｐ＜０．０００１；対応のあるウィルコクソン検定）。Ｂ：診断を受けた患者１０１例における各フェノタイプ特徴セットの情報量（ＩＣ）の度数分布である。手動レビューの平均ＩＣは７．８（ＳＤ２．０、範囲２．１〜１１．４）、ＣＮＬＰの場合は８．１（ＳＤ２．０、範囲２．６〜１１．４）、およびＯＭＩＭ（商標）の場合は７．３（ＳＤ１．７、範囲３．２〜１１．４）、（手動対ＯＭＩＭ（商標）：Ｐ＜．０００１；ＣＮＬＰ対ＯＭＩＭ（商標）：Ｐ＜．０００１；手動対ＣＮＬＰ：Ｐ＝０．００３；マンホイットニーＵ検定）。Ｃ：各患者におけるフェノタイプ用語の平均情報量とフェノタイプ用語の数との相関。スピアマンの順位相関係数（ｒｓ）は、手動で抽出されたフェノタイプ特徴で０．２４（Ｐ＝０．０２）、ＣＮＬＰで０．４４（Ｐ＜０．０００１）、ＯＭＩＭ（商標）で−０．００１（Ｐ＞０．０５）であった。Ｄ：診断を受けた患者についての３通りの方法によるフェノタイプ用語の重複を示すベン図。ＣＮＬＰによって抽出されたフェノタイプ特徴（平均４．３１項、ＳＤ４．５９、範囲０〜３２）は、手動の場合（平均０．９２用語、ＳＤ１．０２、範囲０〜４）よりも、予期されるＯＭＩＭ（商標）のフェノタイプ特徴と重複が有意により多かった（Ｐ＜０．０００１、ＯＭＩＭと重複する用語の数の差異についての、対応のあるウィルコクソン検定）。Ｅ：遺伝疾患の疑いがあるが、ゲノムシーケンシングでは診断されなかった子供２７４例におけるフェノタイプ特徴（対数変換）の数の度数分布。特徴の平均数は、手動レビューでは３．０（ＳＤ１．９、範囲１〜１２）、ＣＮＬＰでは９０．７（ＳＤ８１．１、範囲６〜４８２）であった（ＣＮＬＰ対手動：Ｐ＜０．０００１、対応のあるウィルコクソン検定）。Ｆ：未診断患者２７３例における各フェノタイプ特徴セットの度数分布ＩＣ。平均ＩＣは、手動レビューでは７．７（ＳＤ２．１、範囲２．１〜１１．４）、ＣＮＬＰでは８．１（ＳＤ２．０、範囲２．６〜１１．４）であった（手動−ＣＮＬＰ：Ｐ＜０．０００１、マンホイットニーＵ検定）。Ｇ：各患者における、フェノタイプ用語の平均情報量とフェノタイプ用語の数との相関。ｒｓは、手動で抽出されたフェノタイプ特徴では０．０２（Ｐ＞０．０５）、ＣＮＬＰでは０．３０（Ｐ＜０．０００１）であった。Ｈ：診断を受けていない患者についての、ＣＮＬＰおよび手動の方法によるフェノタイプ用語の重複を示したベン図。
【０１０６】
図４：９７種の遺伝疾患の診断を受けた子供９５例における、観察された患者フェノタイプ特徴と予期される患者フェノタイプ特徴との重複を示したベン図。解釈中に専門家による手動ＥＨＲレビューによって同定されたフェノタイプ特徴は、黄色で示されている。ＣＮＬＰによって同定されたフェノタイプ特徴は、赤で示されている。予期されるフェノタイプ特徴は、ＯＭＩＭ（商標）臨床概要から導き出され、青色で示されている。本発明者らは、偶発的所見であると考えられた８つの診断を除外した。ＣＮＬＰによって抽出されたフェノタイプは、手動で抽出されたフェノタイプ（平均０．９７、ＳＤ１．０３、範囲０〜４）よりも、予期されるＯＭＩＭ（商標）フェノタイプとの重複が多かった（平均４．５５、ＳＤ４．６２、範囲０〜３２）。
【０１０７】
図５：手動、ＣＮＬＰ、およびＯＭＩＭ（商標）によって同定されたフェノタイプ特徴の精度、再現率、およびＦ１スコアである。データは、１０５種の遺伝疾患を有する子供１０１例から得られたものである。精度（ＰＰＶ）はｔｐ／ｔｐ＋ｆｐで与えられ、式中、ｔｐを真陽性とし、ｆｐを偽陽性とした。再現率（感度）はｔｐ／ｔｐ＋ｆｎによって与えられ、式中、ｆｎを偽陰性とした。Ａ：正確なフェノタイプ特徴の一致に基づいて計算された精度および再現率。手動対ＯＭＩＭ（商標）−精度：平均０．２５、ＳＤ０．３０、範囲０〜１；再現率：平均０．０４、ＳＤ０．０６、範囲０〜０．２５；Ｆ１：平均０．０７、ＳＤ０．０９、範囲０〜０．４０；ｃＮＬＰ対ＯＭＩＭ−精度：平均０．０４、ＳＤ０．０３、範囲０〜０．１５；再現率：平均０．２０、ＳＤ０．１６、範囲０〜０．６７；Ｆ１：平均０．０６、ＳＤ０．０５、範囲０〜０．２３。手動対ｃＮＬＰ−精度：平均０．７１、ＳＤ０．２８、範囲０〜１；再現率：平均０．０３、ＳＤ０．０２、範囲０〜０．１；Ｆ１：平均０．０６、ＳＤ０．０４、範囲０〜０．１７。Ｂ：不正確なフェノタイプの一致（１度の階層的分離を伴う用語）を考慮して計算された精度および再現率。手動対ＯＭＩＭ（商標）−精度：平均０．４、ＳＤ０．３４、範囲０〜１；再現率：平均０．０９、ＳＤ０．１３、範囲０〜１；Ｆ１：平均０．１３、ＳＤ０．１３、範囲０〜０．５７；ｃＮＬＰ対ＯＭＩＭ（商標）−精度：平均０．０９、ＳＤ０．０７、範囲０〜０．３８；再現率：平均０．２９、ＳＤ０．２２、範囲０〜１；Ｆ１：平均０．１２、ＳＤ０．０８、範囲０〜０．３８。手動対ｃＮＬＰ−精度：平均０．７９、ＳＤ０．２４、範囲０〜１；再現率：平均０．０６、ＳＤ０．０４、範囲０〜０．１９；Ｆ１：平均０．１１、ＳＤ０．０７、範囲０〜０．３２。
【０１０８】
図６：高速ゲノムシーケンシングによる遺伝疾患の暫定診断のための自律システムのソフトウェア構成要素のフロー図。略語：ＧＳ：高速全ゲノムシーケンシング；ＧＥＭＳ：ゲノム管理システム；ＨＰＯ：ヒトフェノタイプオントロジー；ＬＩＭＳ：クラリティー（Ｃｌａｒｉｔｙ）ラボラトリー情報管理システム；データ型は、下記の通り
＊：ＨＬ７／ＦＨＩＲ；†：ＪＳＯＮ；‡：ｂｃｌ；□：ｖｃｆ
である。
【０１０９】
参考文献
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【０１１０】
補足資料
表
（表１）高速標準法（Ｓｔｄ．）、および高速で自律的なプラットフォーム（Ａｕｔｏ．）を使用したゲノムシーケンシングによる、遺伝疾患の診断の主要なステップの期間ならびに測定基準
一次（１０）および二次（２０）分析：生データのベースコールからＦＡＳＴＱ形式への変換、リファレンスゲノムに対するリードのアライメント、および変異コール。三次（３０）分析処理：変異およびフェノタイプ特徴を処理し、Opal解釈ソフトウェア（Ｆａｂｒｉｃ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）で手動解釈できるようにするか、ＭＯＯＮ解釈ソフトウェア（Ｄｉｐｌｏｉｄ）で暫定的な自動診断を表示する時間。Ｄｅｖ．Ｄｅｌａｙ：全般的発達遅延。ＰＰＨＮ：新生児の持続性肺高血圧症。ＨＩＥ：低酸素性虚血性脳症。ｎ．a．：該当無し。＊ＮｏｖａＳｅｑ試薬の第２のセットを解凍するための時間が含まれている。†データセンターの移転による、ジョブの手動再開を伴う１０：２０時間のダウンタイムが含まれている。患者２６３、６１２４、および３００３は、自律システムによって後向きに分析された。患者２６３は、自律システムによって２回分析された。患者６１９４、２９０、３５２、３６２、４１２、および７０７２は、自律的および標準的な診断方法の両方によって前向きに分析された。
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【０１１１】
（表２）後向きサンプルにおける、標準的なライブラリー調製と新しいライブラリー調製、および標準的なゲノムシーケンシングと高速ゲノムシーケンシングの分析性能の比較
標準的なライブラリー調製およびゲノムシーケンシングの方法は、それぞれＴｒｕＳｅｑ（商標）ＰＣＲフリーのライブラリー調製、およびＳ２フローセルを備えたＮｏｖａＳｅｑ（商標）６０００での２×１００ｎｔシーケンシングであった。新しいライブラリー調製とゲノムシーケンシングの方法は、それぞれＮｅｘｔｅｒａＦｌｅｘ（商標）ライブラリー調製とＳ１フローセルを備えたＮｏｖａＳｅｑ（商標）６０００での２×１００ｎｔシーケンシングであった。「中央値」列は、ランＲ１７ＡＡ９７８、Ｒ１７ＡＡ９７８、Ｒ１７ＡＡ０５９、およびＲ１７ＡＡ１１９の中央値である。対照１および対照２は、それぞれ５個のサンプルと５２個のサンプルとの平均値である。変異コールの分析パフォーマンスは、サンプルＮＡ１２８７８において、ＮＩＳＴのゲノム・イン・ア・ボトル（Ｇｅｎｏｍｅ−ｉｎ−ａ−ｂｏｔｔｌｅ）の結果と比較して評価された（７６）。注：Ｓ１フローセルおよびＴｒｕＳｅｑ（商標）ＰＣＲフリーライブラリー（右端）を使用したＮＡ１２８７８対照ランは、２×１５１ｎｔであった。
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略語：ｎｔ：ヌクレオチド；ＦＣ：フローセル；Ｇｂ：ギガベース；Ｑ：品質スコア；OMIM：ヒトオンラインメンデル性遺伝；ＱＣ：品質管理；ＣＤ：コーディングドメイン；Ｔｉ／Ｔｖ比：ヌクレオチド遷移の数とヌクレオチド変換の数の比；ＰＰＶ：正の予測値；ＳＮＶ：一塩基変異；インデル：ヌクレオチド挿入欠失変異。
【０１１２】
（表３）７つの一致する前向きサンプルにおける、標準的なライブラリー調製およびゲノムシーケンシング方法と新しいライブラリー調製およびゲノムシーケンシング方法の分析性能の比較
標準的なライブラリー調製およびゲノムシーケンシング方法は、ＫＡＰＡ  Ｈｙｐｅｒ（商標）キットを使用してライブラリー調製を行った対象７０５２および４１２を除き、それぞれＴｒｕＳｅｑ（商標）ＰＣＲフリーライブラリー調製物およびＳ２フローセルを備えたＮｏｖａＳｅｑ６０００であった。新しいライブラリー調製およびゲノムシーケンシング方法は、それぞれＮｅｘｔｅｒａ（商標）Ｆｌｅｘライブラリー調製およびＳ１フローセルを備えたＮｏｖａＳｅｑ（商標）６０００であった。
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略語：Ｌ：レーン；Ｒ：リード；ｎｔ：ヌクレオチド；Ｇｂ：ギガベース；Ｑ：品質スコア；OMIM：ヒトオンラインメンデル性遺伝；ＱＣ：品質管理；ＣＤ：コーディングドメイン；Ｔｉ／Ｔｖ比：ヌクレオチド遷移の数とヌクレオチド変換の数の比。
【０１１３】
（表４）ＣＮＬＰのトレーニングに使用された遺伝疾患の子供１６例の特性
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略語：ＥＩＥＥ：初期の乳児てんかん性脳症；ＡＤ：常染色体優性；ＤＮ：デノボ；Ｐ：病原性；ＬＰ：おそらく病原性；Ｍ：男；Ｆ：女；Ｓ：シングルトン；Ｄ：デュオ；Ｔ：トリオ；Ｉ：遺伝；ＸＬＤ：Ｘ連鎖優性；ＭＥＣＲＮ：横紋筋融解症、心不整脈、および神経変性を伴う、再発性の代謝性脳筋症の危機；Ｕ：未定；OMIM：ヒトオンラインメンデル性遺伝。
【０１１４】
（表５）遺伝疾患の子供１０例におけるＥｈＨＲからＣＮＬＰによって抽出された、フェノタイプ特徴の精度および再現率
精度＝ｔｐ／ｔｐ＋ｆｐ．再現率＝ｔｐ／ｔｐ＋ｆｎ．
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略語：ＥＩＥＥ：初期の乳児てんかん性脳症；ＡＤ：常染色体優性；ＡＲ：常染色体劣性；ＤＮ：デノボ；Ｐ：病原性；ＬＰ：おそらく病原性；Ｓ：シングルトン；Ｔ：トリオ；Ｉ：遺伝；Ｕ：未定；OMIM：ヒトオンラインメンデル性遺伝；ＣＦ：臨床的特徴。
【０１１５】
(表６)遺伝疾患の子供１１例における、ＭＯＯＮによって最終候補に挙げられた構造変異の数、およびＭＯＯＮでの原因変異ランク
全てのサンプルをシングルトンとして実行した。
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略語：ｇＶＣＦ：ゲノム変異コールファイル；ｒＷＥＳ：高速全エクソームシーケンシング；ｒＷＧＳ：高速全ゲノムシーケンシング；ＳＶ：構造変異。
【０１１６】
（表７）高速臨床ゲノムシーケンシングに関してレポートされた暫定診断の要約統計量
総被験者とは、検査を受けた子供を指す。
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【０１１７】
本発明に関しては、上記の実施例を参照して説明してきたが、修正および変形は、本発明の趣旨および範囲内に含まれることが理解されよう。
したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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