(57)【要約】本発明は、カルシトニン模倣体の（１１）位又は（１９）位に位置するリシン残基がアシル化されたカルシトニン模倣体、及び、糖尿病、体重過多、過剰な摂食及びメタボリック症候群、ＮＡＳＨ、アルコール性及び非アルコール性脂肪性肝疾患の治療、血糖レベルの調節、糖負荷試験に対する反応の調節、食物摂取の調節、及び、骨粗鬆症の治療、及び、変形性関節症の治療を含む、様々な疾患及び障害の治療における薬剤としてのその使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシトニン模倣体であって、当該カルシトニン模倣体の１１位に位置するリシン残基がアシル化、及び／又は、当該カルシトニン模倣体の１９位に位置するリシン残基がアシル化されており、
当該リシン残基の側鎖ε−アミノ基が、以下に挙げるいずれか：
連結基を有していても良いＣ１６以上鎖長の脂肪酸、又は
連結基を有していても良いＣ１６以上鎖長の二価脂肪酸
から選ばれるアシル基によりアシル化されているカルシトニン模倣体。
【請求項２】
前記カルシトニン模倣体は、式（Ｉ）（ａ）：
CX2X3LSTCX8LGKAc…
〔式中、
X2＝A, G又はS
X3＝N又はS
X8＝M, V又はα−アミノイソブチル酸（AiB）であり、
KAcは、側鎖ε−アミノ基が、以下に挙げるいずれか：
連結基を有していても良いＣ１６以上鎖長の脂肪酸、又は
連結基を有していても良いＣ１６以上鎖長の二価脂肪酸
から選ばれるアシル基によりアシル化されているリシン残基である。〕
で表されるカルシトニン模倣体である、請求項１に記載のカルシトニン模倣体。
【請求項３】
前記カルシトニン模倣体は、式（Ｉ）（ｂ）：
CX2X3LSTCX8LGX11X12X13X14X15X16X17X18KAc…
〔式中、
X2＝A, G又はS
X3＝N又はS
X8＝M, V又はα−アミノイソブチル酸（AiB）
X11＝R, K, T, A又はKAc
X12＝L又はY
X13＝S, T, W又はY
X14＝Q, K, R又はA
X15＝D, E又はN
X16＝L又はF
X17＝H又はN
X18＝R, K又はNであり、
KAcは、側鎖ε−アミノ基が、以下に挙げるいずれか：
連結基を有していても良いＣ１６以上鎖長の脂肪酸、又は
連結基を有していても良いＣ１６以上鎖長の二価脂肪酸
から選ばれるアシル基によりアシル化されているリシン残基である。〕
で表されるカルシトニン模倣体である、請求項１に記載のカルシトニン模倣体。
【請求項４】
前記カルシトニン模倣体は、式（ＩＩ）：
CX2X3LSTCX8LGX11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27GX29X30X31P
〔式中、
X2＝A, G又はS
X3＝N又はS
X8＝M, V又はα−アミノイソブチル酸（AiB）
X11＝KAc, R, K, T又はA
X12＝L又はY
X13＝S, T, W又はY
X14＝Q, K, R又はA
X15＝D, E又はN
X16＝L又はF
X17＝H又はN
X18＝R, K又はN
X19＝KAc, L, F又はK
X20＝Q, H又はA
X21＝T又はR
X22＝Y又はF
X23＝S又はP
X24＝G, K, Q又はR
X25＝T, I又はM
X26＝S, N, D, G又はA
X27＝T, V, F又はI
X29＝S, A, P又はV
X30＝N, G又はE
X31＝A, T又はSであり、
X11又はX19のいずれか一方又はその両方はKAcであり、
KAcは、側鎖ε−アミノ基が、以下に挙げるいずれか：
Ｃ１６以上鎖長の脂肪酸
Ｃ１６以上鎖長の二価脂肪酸
連結基−Ｃ１６以上鎖長の脂肪酸、又は
連結基−Ｃ１６以上鎖長の二価脂肪酸
から選ばれるアシル基によりアシル化されているリシン残基である。〕
で表されるカルシトニン模倣体である、前記いずれかの請求項に記載のカルシトニン模倣体。
【請求項５】
前記式（ＩＩ）のカルシトニン模倣体は、下記式：
CX2X3LSTCX8LGX11LX13X14X15LX17X18X19X20TX22PX24TDVGANAP
〔式中、
X2＝A, G又はS
X3＝N又はS
X8＝M, V又はAiB
X11＝KAc, R, K, T又はA
X13＝T, S又はY
X14＝Q又はA
X15＝D又はE
X17＝H又はN
X18＝R又はK
X19＝KAc, L, F又はK
X20＝Q, H又はA
X22＝Y又はF
X24＝K, Q又はRであり、
X11又はX19のいずれか一方又はその両方はKAcであり、
KAcは、側鎖ε−アミノ基が、以下に挙げるいずれか：
Ｃ１６以上鎖長の脂肪酸
Ｃ１６以上鎖長の二価脂肪酸
連結基−Ｃ１６以上鎖長の脂肪酸、又は
連結基−Ｃ１６以上鎖長の二価脂肪酸
から選ばれるアシル基によりアシル化されているリシン残基である。〕
で表されるカルシトニン模倣体である、請求項４に記載のカルシトニン模倣体。
【請求項６】
X2がSであり且つX3がNである；またはX2がGであり且つX3がNである；またはX2がAであり且つX3がSである、請求項４又は５に記載のカルシトニン模倣体。
【請求項７】
X11がKAcであり、X17がHであり、X18がKであり、X19がLであり、且つX20がQ又はAである；または
X11がKAcであり、X17がHであり、X18がRであり、X19がLであり、且つX20がQ又はAである；または
X11がKAcであり、X17がNであり、X18がKであり、X19がFであり、且つX20がH又はAである；または
X11がKAcであり、X17がNであり、X18がRであり、X19がFであり、且つX20がH又はAである；または
X11がR又はKであり、X17がHであり、X18がKであり、X19がKAcであり、且つX20がQ又はAである；または
X11がR又はKであり、X17がHであり、X18がRであり、X19がKAcであり、且つX20がQ又はAである；または
X11がR又はKであり、X17がNであり、X18がKであり、X19がKAcであり、且つX20がH又はAである；または
X11がR又はKであり、X17がNであり、X18がRであり、X19がKAcであり、且つX20がH又はAである、前記請求項４乃至６のいずれかに記載のカルシトニン模倣体。
【請求項８】
X2がSであり、X3がNであり、X11がKAcであり、X13がSであり、X17がHであり、X18がK又はRであり、X19がLであり、X20がQ又はAであり、且つX22がYである；または
X2がSであり、X3がNであり、X11がR又はKであり、X13がSであり、X17がHであり、X18がK又はRであり、X19がKAcであり、X20がQ又はAであり、且つX22がYである、前記請求項４乃至７のいずれかに記載のカルシトニン模倣体。
【請求項９】
X2がAであり、X3がSであり、X11がKAcであり、X13がSであり、X17がHであり、X18がK又はRであり、X19がLであり、X20がQ又はAであり、且つX22がFである；または
X2がAであり、X3がSであり、X11がR又はKであり、X13がSであり、X17がHであり、X18がK又はRであり、X19がKAcであり、X20がQ又はAであり、且つX22がFである、前記請求項４乃至７のいずれかに記載のカルシトニン模倣体。
【請求項１０】
X2がGであり、X3がNであり、X11がKAcであり、X13がTであり、X17がNであり、X18がK又はRであり、X19がFであり、X20がH又はAであり、且つX22がFである；または
X2がGであり、X3がNであり、X11がR又はKであり、X13がTであり、X17がNであり、X18がK又はRであり、X19がKAcであり、X20がH又はAであり、且つX22がFである、前記請求項４乃至７のいずれかに記載のカルシトニン模倣体。
【請求項１１】
前記カルシトニン模倣体は、式（ＩＩＩ）：
CSNLSTCX6LGX7LSQDLHRX8QTYPKX1TX5VGANAP
で表される３３ｍｅｒペプチドであるか、又は
前記カルシトニン模倣体は、式（ＩＶ）：
CSNLSTCX6LGX7LSQDLHRX8QTYPKX1X2X3TX5VGANAP
で表される３５ｍｅｒペプチドであるか、又は
前記カルシトニン模倣体は、式（Ｖ）：
CSNLSTCX6LGX7LSQDLHRX8QTYPKX1X2X3X4TX5VGANAP
で表される３６ｍｅｒペプチドであるか、又は
前記カルシトニン模倣体は、式（ＶＩ）：
CSNLSTCX6LG KAcLZX1X2X3X4TX5VGANAP
で表される３７ｍｅｒペプチド
〔式中、
X1乃至X4の各々はアミノ酸であって、X1乃至X4のうち少なくとも一つは塩基性アミノ酸残基であり、且つ／又は、X1乃至X4のうち少なくとも二つは独立して極性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基であり、且つ／又は、X1乃至X4のうち少なくとも一つはGly残基であるが、但し、X1乃至X4はいずれも酸性残基ではなく；
X5はD又はNであり、；
X6はAiB又はMであり、；
X7はKAcであり且つX8はLであるか、又は、X7はR又はKであり且つX8はKAcであるかのいずれかであり；
Zは、SQDLHRLSNNFGA、SQDLHRLQTYGAI、又はANFLVHSSNNFGAから選ばれ；
KAcは、側鎖ε−アミノ基が、以下に挙げるいずれか：
Ｃ１６以上鎖長の脂肪酸
Ｃ１６以上鎖長の二価脂肪酸
連結基−Ｃ１６以上鎖長の脂肪酸、又は
連結基−Ｃ１６以上鎖長の二価脂肪酸
から選ばれるアシル基によりアシル化されているリシン残基である。〕
である、請求項１に記載のカルシトニン模倣体。
【請求項１２】
X1及びX4のうち少なくとも一つは塩基性アミノ酸残基である、請求項１１に記載のカルシトニン模倣体。
【請求項１３】
X1及びX4のうち少なくとも一つは塩基性アミノ酸残基であり、X1乃至X4のうち少なくとも二つは独立して極性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基であり、且つ、X1乃至X4はいずれも酸性残基ではない、請求項１１又は１２に記載のカルシトニン模倣体。
【請求項１４】
X1乃至X4のうち少なくとも三つは独立して極性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基であり、且つ、X1乃至X4はいずれも酸性残基ではない、請求項１１乃至１３のいずれかに記載のカルシトニン模倣体。
【請求項１５】
X1乃至X4の全てが独立して極性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基であり、且つ、X1乃至X4はいずれも酸性残基ではない、請求項１１乃至１４のいずれかに記載のカルシトニン模倣体。
【請求項１６】
X1乃至X4の全てが独立して極性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基であり、X1乃至X4のうち少なくとも三つは塩基性アミノ酸残基であり、且つ、X1乃至X4はいずれも酸性残基ではない、請求項１１乃至１５のいずれかに記載のカルシトニン模倣体。
【請求項１７】
塩基性アミノ酸残基はArg、His又はLysから選ばれ、且つ／又は、極性アミノ酸残基はSer、Thr、Asn、Gln又はCysから選ばれる、請求項１１乃至１６のいずれかに記載のカルシトニン模倣体。
【請求項１８】
X1がAsn、Phe、Val、Gly、Ile、Leu、Lys、His又はArgから選ばれ；
X2がAla、Asn、His、Leu、Ser、Thr、Gly又はLysから選ばれ；
X3がAla、Phe、Ile、Ser、Pro、Thr、Gly又はLysから選ばれ；且つ／又は、
X4がIle、Leu、Gly、His、Arg、Asn、Ser、Lys、Thr又はGlnから選ばれ；
X1又はX4のうち少なくとも一つは塩基性アミノ酸残基であり、且つ／又は、X1乃至X4のうち少なくとも二つは独立して極性アミノ酸残基及び／又は塩基性アミノ酸残基であり、且つ／又は、X1乃至X4のうち少なくとも一つはGly残基である、請求項１１乃至１７のいずれかに記載のカルシトニン模倣体。
【請求項１９】
X1がAsn、Gly、Ile、His又はArgから選ばれ；
X2がAsn、Leu、Thr、Gly又はLysから選ばれ；
X3がPhe、Pro、Ile、Ser、Thr、Gly又はLysから選ばれ；且つ／又は、
X4がGly、His、Asn、Ser、Lys、Thr又はGlnから選ばれ；
X1又はX4のうち少なくとも一つは塩基性アミノ酸残基であり、且つ／又は、X1乃至X4のうち少なくとも二つは独立して極性アミノ酸残基及び／又は塩基性アミノ酸残基であり、且つ／又は、X1乃至X4のうち少なくとも一つはGly残基である、前記請求項１１乃至１８のいずれかに記載のカルシトニン模倣体。
【請求項２０】
前記式（ＩＩＩ）乃至（Ｖ）のいずれかで表されるカルシトニン模倣体が、以下に挙げる保存的置換：
ペプチドの１５位に位置するAsp残基がGluで置換されている；
ペプチドの１８位に位置するArg残基がLysで置換されている；及び／又は
ペプチドの２４位に位置するLys残基がArgで置換されている
から選ばれる一つ以上の保存的置換を含んでいる、請求項１１乃至１９のいずれかに記載のカルシトニン模倣体。
【請求項２１】
前記式（ＶＩ）で表されるカルシトニン模倣体であって、式（ＶＩ）のペプチドのZ成分が、SQDLHRLQTYGAI、又は、SQDLHRLSNNFGAであり、
以下に挙げる保存的置換：
ペプチドの１５位に位置するAsp残基がGluで置換されている；及び／又は
ペプチドの１８位に位置するArg残基がLysで置換されている
から選ばれる一つ以上の保存的置換を含んでいる、請求項１１乃至１９のいずれかに記載のカルシトニン模倣体。
【請求項２２】
前記連結基は、グルタミン酸残基、及び／又は、一つのＯＥＧアミノ酸又は二つ以上のＯＥＧアミノ酸が一体となった連結を含むオリゴエチレングリコール（ＯＥＧ）アミノ酸連結基を含み、
当該ＯＥＧアミノ酸は、以下の式：
【化１】
2021535119.tif 000038
〔式中、ｎは１乃至１０の数字である〕
で表される、請求項１乃至２１のいずれかに記載のカルシトニン模倣体。
【請求項２３】
前記ＯＥＧアミノ酸連結基は、二つ乃至六つのＯＥＧアミノ酸が一体となった連結を含む、請求項２２に記載のカルシトニン模倣体。
【請求項２４】
前記ＯＥＧアミノ酸連結基は、さらに、当該ＯＥＧアミノ酸連結基のアミノ末端又はカルボキシ末端に、一つ以上のグルタミン酸残基を含む、請求項２２又は２３に記載のカルシトニン模倣体。
【請求項２５】
前記ｎが１である、請求項２２乃至２４のいずれかに記載のカルシトニン模倣体。
【請求項２６】
前記ＯＥＧアミノ酸連結基は、以下に挙げるいずれか：
【化２】
2021535119.tif 000039
から選ばれる、請求項２２乃至２４のいずれかに記載のカルシトニン模倣体。
【請求項２７】
前記連結基が、以下に挙げる：
【化３】
2021535119.tif 000040
である、請求項２６に記載のカルシトニン模倣体。
【請求項２８】
前記アシル基は、
Ｃ１８以上鎖長の脂肪酸
Ｃ１８以上鎖長の二価脂肪酸
連結基−Ｃ１８以上鎖長の脂肪酸、又は
連結基−Ｃ１８以上鎖長の二価脂肪酸
から選ばれる、請求項１乃至２７のいずれかに記載のカルシトニン模倣体。
【請求項２９】
前記アシル基は、以下に挙げるいずれか：
Ｃ１８乃至Ｃ３０の脂肪酸
Ｃ１８乃至Ｃ３０の二価脂肪酸
連結基−Ｃ１８乃至Ｃ３０の脂肪酸
連結基−Ｃ１８乃至Ｃ３０の二価脂肪酸
から選ばれる、請求項１乃至２８のいずれかに記載のカルシトニン模倣体。
【請求項３０】
前記アシル基は、以下に挙げるいずれか：
Ｃ１８乃至Ｃ２２の脂肪酸
Ｃ１８乃至Ｃ２２の二価脂肪酸
連結基−Ｃ１８乃至Ｃ２２の脂肪酸
連結基−Ｃ１８乃至Ｃ２２の二価脂肪酸
から選ばれる、請求項１乃至２９のいずれかに記載のカルシトニン模倣体。
【請求項３１】
KAcが、連結基−二価脂肪酸でアシル化されており、
当該連結基−二価脂肪酸は、二価脂肪酸がＣ１８乃至Ｃ２２の二価脂肪酸であり、且つ、当該連結基が以下に挙げる：
【化４】
2021535119.tif 000041
である、請求項１乃至３０のいずれかに記載のカルシトニン模倣体。
【請求項３２】
前記ペプチドは、以下に挙げるいずれか：
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKTDVGANAP
CSNLSTC(AiB)LGKAcLSQDLHRLQTYPKTDVGANAP
CGNLSTC(AiB)LGKAcLTQDLNKFHTFPKTDVGANAP
CSNLSTCVLGKAcLSQELHKLQTYPRTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQELHRLQTYPKTDVGANAP
CASLSTCVLGKAcLSQDLHKLQTFPKTDVGANAP
CASLSTCMLGKAcLSQDLHKLQTFPKTDVGANAP
CGNLSTCMLGKAcLSQDLNKFHTFPQTDVGANAP
CSNLSTC(AiB)LGKAcLANFLVHSSNNFGAILPKTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHSSTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHSSNTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLSNNFGAILSSTNVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYGAILSPKTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLANFLVHSSNNFGAILPKTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKILSSTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKGLITTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKNNFGTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKRTTQTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHTTNTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHGGQTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHKKNTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHKKHTDVGANAP
CSNLSTC(AiB)LGRLSQDLHRKAcQTYPKTDVGANAP
CSNLSTCMLGRLSQELHRKAcQTYPKTDVGANAP
から選択され、
当該KAcは、請求項１乃至３２のいずれかにおいて定められたものである、請求項１乃至３１のいずれかに記載のカルシトニン模倣体。
【請求項３３】
前記ペプチドは、以下に挙げるいずれか：
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTC(AiB)LGKAcLSQDLHRLQTYPKTDVGANAP-NH2
AcCGNLSTC(AiB)LGKAcLTQDLNKFHTFPKTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCVLGKAcLSQELHKLQTYPRTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQELHRLQTYPKTDVGANAP-NH2
AcCASLSTCVLGKAcLSQDLHKLQTFPKTDVGANAP-NH2
AcCASLSTCMLGKAcLSQDLHKLQTFPKTDVGANAP-NH2
AcCGNLSTCMLGKAcLSQDLNKFHTFPQTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTC(AiB)LGKAcLANFLVHSSNNFGAILPKTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHSSTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHSSNTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLSNNFGAILSSTNVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYGAILSPKTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLANFLVHSSNNFGAILPKTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKILSSTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKGLITTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKNNFGTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKRTTQTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHTTNTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHGGQTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHKKNTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHKKHTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTC(AiB)LGRLSQDLHRKAcQTYPKTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQELHRLQTYPKTDVGANAP-NH2
から選択され、
当該KAcは、連結基−二価脂肪酸でアシル化され、
当該連結基−二価脂肪酸は、二価脂肪酸がＣ１８乃至Ｃ２２の二価脂肪酸であり、且つ、当該連結基が以下に挙げる：
【化５】
2021535119.tif 000042
である、請求項１乃至３２のいずれかに記載のカルシトニン模倣体。
【請求項３４】
経腸投与のために製剤化された、請求項１乃至３３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項３５】
前記ペプチドは、コーティングされたクエン酸粒子を含む経口投与用医薬組成物に製剤化されており、当該コーティングされたクエン酸粒子はペプチドの経口バイオアベイラビリティを増加させる、請求項３４に記載のペプチド。
【請求項３６】
経口投与のための担体を用いて製剤化された、請求項１乃至３５のいずれかに記載のペプチド。
【請求項３７】
前記担体は、５−ＣＮＡＣ、ＳＮＡＤ、又はＳＮＡＣを含む、請求項３６に記載のペプチド。
【請求項３８】
非経口投与用に製剤化された、請求項１乃至３３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項３９】
注射用に製剤化された、請求項３８に記載のペプチド。
【請求項４０】
請求項１乃至３３のいずれかに記載のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項４１】
薬剤として使用するための請求項１乃至３３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項４２】
糖尿病（Ｉ型及び／又はＩＩ型）、体重過多、過剰な摂食、メタボリック症候群、関節リウマチ、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性脂肪性肝疾患、骨粗鬆症、若しくは変形性関節症、血糖値の調節不良、糖負荷試験に対する反応の調節不良、又は食物摂取の調節不良の治療に使用するための請求項１乃至３３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項４３】
メトホルミンまたは別のインスリン抵抗性改善薬と組み合わされており、糖尿病（Ｉ型及び／又はＩＩ型）、体重過多、過剰な摂食、メタボリック症候群、関節リウマチ、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性脂肪性肝疾患、骨粗鬆症、若しくは変形性関節症、血糖値の調節不良、糖負荷試験に対する反応の調節不良、又は食物摂取の調節不良の治療に使用するために、メトホルミンまたは別のインスリン抵抗性改善薬と組み合わされた、請求項１乃至３３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項４４】
体重過多状態の処置に使用するために、体重減少薬と組み合わされた、請求項１乃至３３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項４５】
前記体重過多状態は肥満である、請求項４４に記載のペプチド。
【請求項４６】
請求項１乃至３３のいずれかに記載のペプチド、及び、インスリン抵抗性改善薬を含む配合剤。
【請求項４７】
請求項１乃至３３のいずれかに記載のペプチド、及び、体重減少薬を含む配合剤。
【請求項４８】
糖尿病（Ｉ型及び／又はＩＩ型）、体重過多、過剰な摂食、メタボリック症候群、関節リウマチ、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性脂肪性肝疾患、骨粗鬆症、若しくは変形性関節症、血糖値の調節不良、糖負荷試験に対する反応の調節不良、又は食物摂取の調節不良の治療方法であって、有効量の請求項１乃至３３のいずれかに記載されたペプチドを、当該処置を必要とする患者に投与する処置方法。
【請求項４９】
糖尿病（Ｉ型及び／又はＩＩ型）、体重過多、過剰な摂食、メタボリック症候群、関節リウマチ、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性脂肪性肝疾患、骨粗鬆症、若しくは変形性関節症、血糖値の調節不良、糖負荷試験に対する反応の調節不良、又は食物摂取の調節不良の治療方法であって、有効量の請求項１乃至３３のいずれかに記載されたペプチドを、メトホルミンまたは別のインスリン抵抗性改善薬と組み合わせて、当該処置を必要とする患者に投与する処置方法。
【請求項５０】
体重過多状態の処置方法であって、有効量の請求項１乃至３３のいずれかに記載されたペプチドを、体重減少薬と組み合わせて、当該処置を必要とする患者に投与する処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アシル化されたカルシトニンの模倣体に関し、限定されないが、糖尿病（Ｉ型及び／又はＩＩ型）、体重過多、過剰摂食、及び、メタボリック症候群、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、アルコール性及び非アルコール性脂肪性肝疾患、血糖値の調節、糖負荷試験に対する反応の調節、又は食物摂取の調節、骨粗鬆症の治療、及び、変形性関節症を含む種々の疾患及び障害の治療における薬剤としてのそれらの使用にまで及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
世界的に約２億５千万人の糖尿病患者が存在し、その数は次の２０年間で倍増することが予測されている。この集団の９０％超が２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）を患っている。現在のところ、Ｔ２ＤＭに罹患しているか、または顕性Ｔ２ＤＭに先行する段階にある人々の５０−６０％しか診断されていないと推定されている。
【０００３】
Ｔ２ＤＭは、炭水化物代謝及び脂肪代謝の異常を特徴とする異種疾患である。Ｔ２ＤＭの原因は多因子性であり、筋肉、肝臓、すい臓、及び脂肪組織等の組織におけるβ細胞機能およびインスリン感受性に影響を及ぼす遺伝的要素及び環境的要素の両方が含まれる。結果として、インスリン分泌障害が観察され、β細胞機能の進行性の低下及び慢性インスリン抵抗性が平行して起こる。膵内分泌部が末梢インスリン抵抗性を補償できないため、高血糖及び臨床的糖尿病の発症に至る。インスリン媒介性のグルコース取り込みに対する組織抵抗性は、現在のところ、Ｔ２ＤＭの主要な病態生理学的決定要因として認識されている。
【０００４】
Ｔ２ＤＭの最適な介入の成功基準は、血糖値を低下させることであり、これは、 より低いピークグルコースレベル及びより急速なクリアランスによって説明される、血糖値の慢性的な低下と、食物摂取後の高いグルコースレベルを許容する能力の増大の両方であり得る。これらの状況はどちらも、β細胞のインスリン産生量及び機能にかかる負担を少なくする。
【０００５】
Ｉ型糖尿病は、食物摂取に応答してインスリンを産生する能力の喪失を特徴と し、したがって、血中グルコースを正常な生理学的レベルまで調節できないことを特徴とする。
【０００６】
骨の物理的構造は、疾患及び傷害を含む様々な要因によって損なわれ得る。最も一般的な骨疾患の１つは骨粗鬆症であり、これは、骨量の低下及び骨組織の構造的劣化を特徴とし、骨の脆弱性をもたらし、特に、股関節、脊椎及び手首を骨折しやすくなる。骨粗鬆症は、骨吸収の速度が骨形成の速度を上回るような不均衡が存在する場合に発症する。有効量の抗吸収剤、例えば、カルシトニンの投与によって、 骨の吸収が防止されることが示されている。
【０００７】
関節の疾患、例えば、変形性関節症（ＯＡ）、関節リウマチ（ＲＡ）又は若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）を含み、また、自己免疫応答から生じる炎症、例えば、ループス、強直性脊椎炎（ＡＳ）又は多発性硬化症（ＭＳ）を含む、炎症性疾患及び変性疾患は、 疼痛及び関節の破壊に起因した実質的な運動の喪失をもたらし得る。 関節内の骨を覆って緩衝する軟骨は、経時的に劣化する場合があり、したがって、 一方の骨に対する他方の骨の運動を制限し得る、かつ／または関節の運動中に一方の骨による他方の骨への損傷を引き起こし得る、２つの骨の直接的な接触を不必要に許容する。軟骨直下の軟骨下骨もまた劣化し得る。有効量の抗吸収剤、例えば、 カルシトニンの投与によって、骨の吸収が防止され得る。
【０００８】
カルシトニンは、広範囲の種にわたって高度に保存されている。天然の全長カルシトニンは、 ３２アミノ酸長である。 天然カルシトニンの配列の例を以下に示す。
【０００９】
サケ      CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP
ウナギ    CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTDVGAGTP
ニワトリ  CASLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTDVGAGTP
マウス    CGNLSTCMLGTYTQDLNKFHTFPQTSIGVEAP
ラット    CGNLSTCMLGTYTQDLNKFHTFPQTSIGVGAP
ウマ      CSNLSTCVLGTYTQDLNKFHTFPQTAIGVGAP
イヌ−１  CSNLSTCVLGTYSKDLNNFHTFSGIGFGAETP
イヌ−２  CSNLSTCVLGTYTQDLNKFHTFPQTAIGVGAP
ブタ      CSNLSTCVLSAYWRNLNNFHRFSGMGFGPETP
ヒト      CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP
【００１０】
改善された特性を提供することを目的とする修飾されたアミノ酸配列を有する天然カルシトニンの合成変異体が、ＷＯ２０１３／０６７３５７及びＷＯ２０１５／０７１２２９に開示されている。
【００１１】
しかし、カルシトニン及びカルシトニン模倣体のようなペプチドは、概してクリアランスが急速で半減期が短いため、吸収特性、分布特性、代謝特性及び排泄特性が不充分である。そのためペプチド薬は、一般的に毎日の経口投与が必要とされる。皮下（s.c.）注射経由の投与治療を毎日行うことは、個々の患者にとって不便であって、毎日注射に伴う不快感を避けようとして治療計画を遵守しない原因となり得るから、現在において最善の投与方法とはいえない。それゆえ、皮下注射を利用する週１回の投薬によって患者の生活の質が向上するであろうし、さらに治療計画を遵守する助けになるであろう。
【００１２】
ペプチド薬のインビボ（in vivo）半減期を向上させようとする技術については、当技術分野において数多くの取り組みが知られている。そのような取り組みには、タンパク質分解安定性（例えば、Ｎ−及びＣ−末端の保護、Ｄ−アミノ酸又は非天然アミノ酸へのアミノ酸の置換、ペプチドの閉環などによる）や、腎クリアランスの低減（例えば、大分子ポリマーやアルブミンやイムノグロブリン等の大分子へのペプチドの結合による）が含まれる。しかし、そのようなペプチド薬の修飾は、
例えば、薬物有効性の低減、薬物過敏のような予想外の有害副作用等の点で有害となる可能性があることも、当技術分野において知られている。そのため、そのような修飾によってペプチド薬の治療特性が必ず向上するか否かについて予測することはできない。
一週間に１回だけ投与したいペプチド薬の開発することは困難であると考えられる。
【００１３】
ペプチド薬の薬物動態的及び薬力学な特性を向上させるための取り組みの一つとして、ペプチドのアシル化がある。トライヤー（Trier）らは、治療作用がある２つのペプチド、すなわちグルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ２）及びサケカルシトニン（ｓＣＴ）を長さを変えた（Ｃ８−Ｃ１６）アシル基を用いてアシル化することによる効果を研究した（PhD thesis, 2016, "Acylation of Therapeutic Peptides", DTU; http://orbit.dtu.dk/files/127682557/PhD_thesis_Sofie.Trier.pdfから入手可能）。ＧＬＰ２をアシル化した効果は、同様のペプチドについて以前実施した観察に基づいて広範に予測できるものであることが判明したが、その一方で、ｓＣＴをアシル化した場合に観察される効果は、予測不可能であることが判明した。例えば、トライヤーらは、ｓＣＴを（ペプチド主鎖上の位置を変えて）アシル化すると、受容体の効力（receptor potency）について実質的な損失（６０％から８０％の損失）を一貫して生じるのに対し、アシル化したＧＬＰ２については受容体の効力が保持されることを見出した。したがって、トライヤーらは、ｓＣＴのアシル化に関連する（特に、短鎖（Ｃ８）アシル化に関する）何らかの有用な特性は発見しなかったものの、ｓＣＴのアシル化に関連する予想外で且つ有意の不利な効果が数多くあること、その最も顕著なものとして受容体の効力について有意の損失があることが明らかとなった。もう一つ注目すべき点は、トライヤーらの研究は、サケカルシトニンの１８位（Ｌｙｓ１８）アシル化に焦点を当てていることである。これは、サケカルシトニンの効果（efficacy）を向上させることを目指したそれ以前の研究において、１８位が修飾（ＰＥＧ化で修飾する場合であって、アシル化する場合ではない）のために優れた位置であることを突き止めたからである。それらの研究において、ｓＣＴの１８位ＰＥＧ化によって、Ｃｙｓ１位又はＬｙｓ１１位を修飾した類似ペプチドよりも優れた効果が得られることが見いだされた（Youn et al, J. Control. Release, 2006, 334-342）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０６７３５７号
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２０１５／０７１２２９号
【非特許文献１】PhD thesis, 2016, "Acylation of Therapeutic Peptides", DTU; http://orbit.dtu.dk/files/127682557/PhD_thesis_Sofie.Trier.pdf
【非特許文献２】Youn et al, J. Control. Release, 2006, 334-342
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の概要
本発明者らは、カルシトニン模倣体を、当該カルシトニン模倣体の１１位に位置するリシン残基、又は、当該カルシトニン模倣体の１９位に位置するリシン残基、をアシル化すると、特に、特定のアシル部分（acyl moieties）を用いてアシル化すると、同等の非アシル化ペプチドと比べてペプチドの効果が予想外に向上し、ペプチドの作用の持続時間も長くなることを見出した。同様に、カルシトニン模倣体の効果が、１１位又は１９位のアシル化に対応して極めて大きく向上することが見い出されたが、その一方で、１８位のアシル化は劣った結果となり、ヨウン（Youn）らの知見に反していた。かようにして本発明者らは、一日１回投与する必要がなく、一週間に１回だけ投与すれば足りる、薬効が高い、新規のアシル化カルシトニン模倣体を開発した。
【００１７】
したがって、態様の一つにおいて本発明は、カルシトニン模倣体の１１位に位置するリシン残基がアシル化、及び／又は、カルシトニン模倣体の１９位に位置するリシン残基がアシル化された、カルシトニン模倣体を提供する。当該リシン残基の側鎖ε−アミノ基は、以下に挙げるいずれかから選ばれるアミノ基：連結基を有していても良いＣ１６以上鎖長の脂肪酸；又は、連結基を有していても良いＣ１６以上鎖長の二価脂肪酸、によりアシル化されている。
【００１８】
本明細書において、“カルシトニン模倣体”とは、カルシトニン受容体を活性化するペプチド（すなわち、カルシトニン受容体作用薬）を意味し、好ましくは、アミリン受容体も活性化するペプチド（すなわち、アミリン及びカルシトニン両受容体作用薬）を意味する。
【００１９】
一定の好ましい実施形態において、カルシトニン模倣体は、３２アミノ酸長から３７アミノ酸長である。最も好ましくは、カルシトニン模倣体は、３２アミノ酸長である。
【００２０】
好ましい態様の一つにおいて、カルシトニン模倣体は、
１１位に位置するリシン残基がアシル化されている、式（Ｉ）（ａ）：
CX2X3LSTCX8LGKAc…
〔式中、
X2＝A, G又はS
X3＝N又はS
X8＝M, V又はα−アミノイソブチル酸（AiB）であり、
KAcは、側鎖ε−アミノ基が、以下に挙げるいずれか：
連結基を有していても良いＣ１６以上鎖長の脂肪酸、又は
連結基を有していても良いＣ１６以上鎖長の二価脂肪酸
から選ばれるアシル基によりアシル化されているリシン残基である。〕
で表されるカルシトニン模倣体であるか、
【００２１】
又は、１９位に位置するリシン残基がアシル化されている、式（Ｉ）（ｂ）：
CX2X3LSTCX8LGX11X12X13X14X15X16X17X18KAc…
〔式中、
X2＝A, G又はS
X3＝N又はS
X8＝M, V又はα−アミノイソブチル酸（AiB）
X11＝R, K, T, A又はKAc（好ましくは、R, K又はKAcであり、最も好ましくは、R又はKである。）
X12＝L又はY（好ましくは、Lである。）
X13＝S, T, W又はY（好ましくは、T, S又はYである。）
X14＝Q, K, R又はA（好ましくは、Q又はAであり、最も好ましくは、Qである。）
X15＝D, E又はN（好ましくは、D又はEである。）
X16＝L又はF（最も好ましくは、Lである。）
X17＝H又はN
X18＝R, K又はN（好ましくは、R又はKである。）であり、
KAcは、側鎖ε−アミノ基が、以下に挙げるいずれか：
連結基を有していても良いＣ１６以上鎖長の脂肪酸、又は
連結基を有していても良いＣ１６以上鎖長の二価脂肪酸
から選ばれるアシル基によりアシル化されているリシン残基である。〕
で表されるカルシトニン模倣体である。
【００２２】
好ましくは、式（Ｉ）（ａ）又は式（Ｉ）（ｂ）のカルシトニン模倣体は、３２アミノ酸長から３７アミノ酸長であり、より好ましくは、３２、３３、３６又は３７アミノ酸長である。最も好ましくは、式（Ｉ）（ａ）又は式（Ｉ）（ｂ）のカルシトニン模倣体は、３２アミノ酸長である。
【００２３】
本発明の好ましい態様の一つにおいて、カルシトニン模倣体は、式（ＩＩ）：
CX2X3LSTCX8LGX11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27GX29X30X31P
〔式中、
X2＝A, G又はS
X3＝N又はS
X8＝M, V又はα−アミノイソブチル酸（AiB）
X11＝KAc, R, K, T又はA（最も好ましくは、KAc, R又はKである。）
X12＝L又はY
X13＝S, T, W又はY
X14＝Q, K, R又はA
X15＝D, E又はN
X16＝L又はF
X17＝H又はN
X18＝R, K又はN
X19＝KAc, L, F又はK（最も好ましくは、KAc, L又はFである。）
X20＝Q, H又はA
X21＝T又はR
X22＝Y又はF
X23＝S又はP
X24＝G, K, Q又はR
X25＝T, I又はM
X26＝S, N, D, G又はA
X27＝T, V, F又はI
X29＝S, A, P又はV
X30＝N, G又はE
X31＝A, T又はS（最も好ましくは、A又はTである。）であり、
X11はKAcであり、且つ／又は、X19はKAcであり（X11はKAcであり、且つ、X19はL, F又はK、好ましくはL又はFであるか；X11はR, K, T又はA、好ましくはR又はKであり、且つ、X19はKAcであるか；X11はKAcであり且つX19はKAcであるかのいずれかというように）、
KAcは、側鎖ε−アミノ基が、以下に挙げるいずれか：
Ｃ１６以上鎖長の脂肪酸
Ｃ１６以上鎖長の二価脂肪酸
連結基−Ｃ１６以上鎖長の脂肪酸、又は
連結基−Ｃ１６以上鎖長の二価脂肪酸
から選ばれるアシル基によりアシル化されているリシン残基である。〕
で表されるカルシトニン模倣体である。
【００２４】
好ましくは、式（ＩＩ）の３２ｍｅｒカルシトニン模倣体は：
CX2X3LSTCX8LGX11LX13X14X15LX17X18X19X20TX22PX24TDVGANAP
〔式中、
X2＝A, G又はS
X3＝N又はS
X8＝M, V又はAiB
X11＝KAc, R, K, T又はA（最も好ましくは、KAc, R又はKである。）
X13＝T, S又はY
X14＝Q又はA（最も好ましくは、Qである。）
X15＝D又はE
X17＝H又はN
X18＝R又はK
X19＝KAc, L, F又はK（最も好ましくは、KAc, L又はFである。）
X20＝Q, H又はA
X22＝Y又はF
X24＝K, Q又はRであり、
X11はKAcであり、且つ／又は、X19はKAcであり、
KAcは、側鎖ε−アミノ基が、以下に挙げるいずれか：
Ｃ１６以上鎖長の脂肪酸
Ｃ１６以上鎖長の二価脂肪酸
連結基−Ｃ１６以上鎖長の脂肪酸、又は
連結基−Ｃ１６以上鎖長の二価脂肪酸
から選ばれるアシル基によりアシル化されているリシン残基である。〕
で表されるカルシトニン模倣体である。
【００２５】
好ましくは、X2がSであり且つX3がNである；またはX2がGであり且つX3がNである；またはX2がAであり且つX3がSである。
好ましくは、X13がS又はTであり、最も好ましくは、Sである。
好ましくは、X24がR又はKである。
【００２６】
好ましい実施形態において、
X11がKAcであり、X17がHであり、X18がKであり、X19がLであり、且つX20がQ又はAである；または
X11がKAcであり、X17がHであり、X18がRであり、X19がLであり、且つX20がQ又はAである；または
X11がKAcであり、X17がNであり、X18がKであり、X19がFであり、且つX20がH又はAである；または
X11がKAcであり、X17がNであり、X18がRであり、X19がFであり、且つX20がH又はAである；または
X11がR又はKであり、X17がHであり、X18がKであり、X19がKAcであり、且つX20がQ又はAである；または
X11がR又はKであり、X17がHであり、X18がRであり、X19がKAcであり、且つX20がQ又はAである；または
X11がR又はKであり、X17がNであり、X18がKであり、X19がKAcであり、且つX20がH又はAである；または
X11がR又はKであり、X17がNであり、X18がRであり、X19がKAcであり、且つX20がH又はAである。
【００２７】
好ましい実施形態において、X2がSであり、X3がNであり、X11がKAcであり、X13がSであり、X17がHであり、X18がK又はRであり、X19がLであり、X20がQ又はAであり、且つX22がYである；または、X2がSであり、X3がNであり、X11がR又はKであり、X13がSであり、X17がHであり、X18がK又はRであり、X19がKAcであり、X20がQ又はAであり、且つX22がYである。
好ましい実施形態において、X2がAであり、X3がSであり、X11がKAcであり、X13がSであり、X17がHであり、X18がK又はRであり、X19がLであり、X20がQ又はAであり、且つX22がFである；または、X2がAであり、X3がSであり、X11がR又はKであり、X13がSであり、X17がHであり、X18がK又はRであり、X19がKAcであり、X20がQ又はAであり、且つX22がFである。
好ましい実施形態において、X2がGであり、X3がNであり、X11がKAcであり、X13がTであり、X17がNであり、X18がK又はRであり、X19がFであり、X20がH又はAであり、且つX22がFである；または、X2がGであり、X3がNであり、X11がR又はKであり、X13がTであり、X17がNであり、X18がK又はRであり、X19がKAcであり、X20がH又はAであり、且つX22がFである。
【００２８】
他の好ましい態様において、本発明は、カルシトニン模倣体に関し、当該カルシトニン模倣体は、式（ＩＩＩ）：
CSNLSTCX6LGX7LSQDLHRX8QTYPKX1TX5VGANAP
で表される３３ｍｅｒペプチドであるか、又は
当該カルシトニン模倣体は、式（ＩＶ）：
CSNLSTCX6LGX7LSQDLHRX8QTYPKX1X2X3TX5VGANAP
で表される３５ｍｅｒペプチドであるか、又は
当該カルシトニン模倣体は、式（Ｖ）：
CSNLSTCX6LGX7LSQDLHRX8QTYPKX1X2X3X4TX5VGANAP
で表される３６ｍｅｒペプチドであるか、又は
前記カルシトニン模倣体は、式（ＶＩ）：
CSNLSTCX6LGKAcLZX1X2X3X4TX5VGANAP
で表される３７ｍｅｒペプチド
〔式中、
X1乃至X4の各々はアミノ酸であって、X1乃至X4のうち少なくとも一つは塩基性アミノ酸残基であり、且つ／又は、X1乃至X4のうち少なくとも二つは独立して極性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基であり、且つ／又は、X1乃至X4のうち少なくとも一つはGly残基であるが、但し、X1乃至X4はいずれも酸性残基ではなく；
X5はD又はNであり、；
X6はAiB又はMであり、；
X7はKAcであり且つX8はLであるか、又は、X7はR又はKであり且つX8はKAcであるかのいずれかであり；
Zは、SQDLHRLSNNFGA、SQDLHRLQTYGAI、又はANFLVHSSNNFGAから選ばれ；
KAcは、側鎖ε−アミノ基が、以下に挙げるいずれか：
Ｃ１６以上鎖長の脂肪酸
Ｃ１６以上鎖長の二価脂肪酸
連結基−Ｃ１６以上鎖長の脂肪酸、又は
連結基−Ｃ１６以上鎖長の二価脂肪酸
から選ばれるアシル基によりアシル化されているリシン残基である。〕
である。
【００２９】
好ましくは、式（ＩＩＩ）から式（ＶＩ）において、X1及びX4のうち少なくとも一つは塩基性アミノ酸残基である。
より好ましくは、X1及びX4のうち少なくとも一つは塩基性アミノ酸残基であり、X1乃至X4のうち少なくとも一つより多くのものは独立して極性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基であり、且つ、X1乃至X4はいずれも酸性残基ではない。
より好ましくは、X1乃至X4のうち少なくとも三つは独立して極性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基であり、且つ、X1乃至X4はいずれも酸性残基ではない。
より好ましくは、X1乃至X4の全てが独立して極性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基であり、且つ、X1乃至X4はいずれも酸性残基ではない。
最も好ましくは、X1乃至X4の全てが独立して極性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基であり、X1乃至X4のうち少なくとも三つは塩基性アミノ酸残基であり、且つ、X1乃至X4はいずれも酸性残基ではない。
【００３０】
アミノ酸残基は、塩基性側鎖を有する天然又は非天然アミノ酸残基のいずれでもよく、Ａｒｇ、Ｈｉｓ又はＬｙｓから選択し得るが、これらに限定されない。
極性アミノ酸残基は、極性の非帯電側鎖を有する天然又は非天然アミノ酸残基のいずれでもよく、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ又はＣｙｓから選択し得るが、これらに限定されない。
本明細書において用いられる用語“酸性残基”は、例えばＧｌｕやＡｓｐのような、酸性側鎖を有する天然又は非天然アミノ酸残基を指す。
【００３１】
好ましい実施形態において、
X1がAsn、Phe、Val、Gly、Ile、Leu、Lys、His又はArgから選ばれ；
X2がAla、Asn、His、Leu、Ser、Thr、Gly又はLysから選ばれ；
X3がAla、Phe、Ile、Ser、Pro、Thr、Gly又はLysから選ばれ；且つ／又は、
X4がIle、Leu、Gly、His、Arg、Asn、Ser、Lys、Thr又はGlnから選ばれ；
X1又はX4のうち少なくとも一つは塩基性アミノ酸残基であり、且つ／又は、X1乃至X4のうち少なくとも二つは独立して極性アミノ酸残基及び／又は塩基性アミノ酸残基であり、且つ／又は、X1乃至X4のうち少なくとも一つはGly残基である。
【００３２】
好ましい実施形態において、
X1がAsn、Gly、Ile、His又はArgから選ばれ；
X2がAsn、Leu、Thr、Gly又はLysから選ばれ；
X3がPhe、Pro、Ile、Ser、Thr、Gly又はLysから選ばれ；且つ／又は、
X4がGly、His、Asn、Ser、Lys、Thr又はGlnから選ばれ；
X1又はX4のうち少なくとも一つは塩基性アミノ酸残基であり、且つ／又は、X1乃至X4のうち少なくとも二つは独立して極性アミノ酸残基及び／又は塩基性アミノ酸残基であり、且つ／又は、X1乃至X4のうち少なくとも一つはGly残基である。
【００３３】
上記の式（ＩＩＩ）から式（Ｖ）で表される本発明のペプチドは、以下に挙げる保存的置換：
ペプチドの１５位に位置するAsp残基がGluで置換されている；
ペプチドの１８位に位置するArg残基がLysで置換されている；及び／又は
ペプチドの２４位に位置するLys残基がArgで置換されている
から選ばれる一つ以上の保存的置換を含んでいてもよい。
【００３４】
上記の式（ＶＩ）で表される本発明のペプチドは、
式（ＶＩ）のペプチドのZ成分が、SQDLHRLSNNFGA 又は、SQDLHRLQTYGAI、であり、
以下に挙げる保存的置換：
ペプチドの１５位に位置するAsp残基がGluで置換されている；及び／又は
ペプチドの１８位に位置するArg残基がLysで置換されている
から選ばれる一つ以上の保存的置換を含んでいてもよい。
【００３５】
本発明の全ての態様において、前記連結基は、グルタミン酸残基、及び／又は、一つのＯＥＧアミノ酸又は二つ以上のＯＥＧアミノ酸が一体となった連結を含むオリゴエチレングリコール（ＯＥＧ）アミノ酸連結基を含み、
当該ＯＥＧアミノ酸は、以下の式：
【００３６】
【化１】
2021535119.tif 000002
【００３７】
〔式中、ｎは１乃至１０の数字であり、好ましくは１乃至５の数字であり、１乃至３の数字であり、１又は２の数字であり、最も１の数字である。〕
で表される。
【００３８】
前記ＯＥＧアミノ酸連結基は、一つのＯＥＧアミノ酸又は二つ乃至六つのＯＥＧアミノ酸が一体となった連結を含み得る。
より好ましくは、前記ＯＥＧアミノ酸連結基は、一つのＯＥＧアミノ酸又は二つ又は三つのＯＥＧアミノ酸が一体となった連結を含み得る。
最も好ましくは、前記ＯＥＧアミノ酸連結基は、二つのＯＥＧアミノ酸が一体となった連結を含み得る。
前記ＯＥＧアミノ酸連結基は、さらに、当該ＯＥＧアミノ酸連結基のアミノ末端又はカルボキシ末端に、一つ以上のグルタミン酸残基を含み得る。
【００３９】
好ましくは、前記ＯＥＧアミノ酸連結基は、以下に挙げるいずれかから選ばれる：
【００４０】
【化２】
2021535119.tif 000003
【００４１】
好ましくは、前記ＯＥＧアミノ酸連結基は、以下に挙げるものである：
【００４２】
【化３】
2021535119.tif 000004
【００４３】
好ましい実施形態において、前記アシル基は、Ｃ１８以上鎖長の脂肪酸、Ｃ１８以上鎖長の二価脂肪酸、連結基−Ｃ１８以上鎖長の脂肪酸、又は、連結基−Ｃ１８以上鎖長の二価脂肪酸から選ばれる。
好ましくは、前記アシル基は、以下に挙げるいずれかから選ばれる：
Ｃ１８乃至Ｃ３０の脂肪酸、好ましくはＣ１８乃至Ｃ２２の脂肪酸
Ｃ１８乃至Ｃ３０の二価脂肪酸、好ましくはＣ１８乃至Ｃ２２の二価脂肪酸
連結基−Ｃ１８乃至Ｃ３０の脂肪酸、好ましくは連結基−Ｃ１８乃至Ｃ２２の脂肪酸、又は、
連結基−Ｃ１８乃至Ｃ３０の二価脂肪酸、好ましくは連結基−Ｃ１８乃至Ｃ２２の脂肪酸
【００４４】
好ましくは、Ｃ１８の二価脂肪酸は、オクタデカン二酸（CAS No. 871-70-5）である。
【００４５】
好ましい実施形態において、KAcが、連結基−二価脂肪酸でアシル化されており、
当該連結基−二価脂肪酸は、二価脂肪酸がＣ１８乃至Ｃ２２の二価脂肪酸であり、且つ、当該連結基が以下に挙げるものである。
【００４６】
【化４】
2021535119.tif 000005
【００４７】
好ましくは、本発明のカルシトニン模倣体は、以下に挙げるいずれか：
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQELHRLQTYPKTDVGANAP
CSNLSTCVLGKAcLSQELHKLQTYPRTDVGANAP
CASLSTCVLGKAcLSQDLHKLQTFPKTDVGANAP
CGNLSTCMLGKAcLSQDLNKFHTFPQTDVGANAP
CSNLSTC(AiB)LGKAcLSQDLHRLQTYPKTDVGANAP
CGNLSTC(AiB)LGKAcLTQDLNKFHTFPKTDVGANAP
CSNLSTC(AiB)LGKAcLANFLVHSSNNFGAILPKTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHSSTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHSSNTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLSNNFGAILSSTNVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYGAILSPKTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLANFLVHSSNNFGAILPKTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKILSSTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKGLITTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKNNFGTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKRTTQTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHTTNTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHGGQTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHKKNTDVGANAP
CSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHKKHTDVGANAP
CSNLSTC(AiB)LGRLSQDLHRKAcQTYPKTDVGANAP
CSNLSTCMLGRLSQELHRKAcQTYPKTDVGANAP
から選択され、
当該KAcは、上記において定められたものである。
上記ペプチドの８位に位置するアミノ酸残基は、任意的にAiBで置換され得る。
【００４８】
好ましくは、本発明のカルシトニン模倣体は、以下に挙げるいずれか：
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTC(AiB)LGKAcLSQDLHRLQTYPKTDVGANAP-NH2
AcCGNLSTC(AiB)LGKAcLTQDLNKFHTFPKTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCVLGKAcLSQELHKLQTYPRTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQELHRLQTYPKTDVGANAP-NH2
AcCASLSTCVLGKAcLSQDLHKLQTFPKTDVGANAP-NH2
AcCGNLSTCMLGKAcLSQDLNKFHTFPQTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHSSTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHSSNTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLSNNFGAILSSTNVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYGAILSPKTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLANFLVHSSNNFGAILPKTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKILSSTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKGLITTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKNNFGTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKRTTQTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHTTNTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHGGQTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHKKNTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGKAcLSQDLHRLQTYPKHKKHTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTC(AiB)LGKAcLANFLVHSSNNFGAILPKTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTC(AiB)LGRLSQDLHRKAcQTYPKTDVGANAP-NH2
AcCSNLSTCMLGRLSQELHRKAcQTYPKTDVGANAP-NH2
から選択され、
当該KAcは、連結基−二価脂肪酸でアシル化され、
当該二価脂肪酸がＣ１８乃至Ｃ２２の二価脂肪酸であり、且つ、当該連結基が以下に挙げるものである。
【００４９】
【化５】
2021535119.tif 000006
【００５０】
好ましくは、Ｃ１８の二価脂肪酸は、オクタデカン二酸である。
上記ペプチドの８位に位置するアミノ酸残基は、任意的にAiBで置換され得る。上記ペプチドにおいて、“Ａｃ”とは、ペプチドのＮ−末端がアセチル化されていることを指しており、“−ＮＨ２”とは、ペプチドのＣ−末端がアミド化されていることを指している。
【００５１】
本発明のカルシトニン模倣体は、経腸投与のために製剤化されたものであってもよい。例えば、カルシトニン模倣体は、コーティングされたクエン酸粒子を含む経口投与用医薬組成物に製剤化されており、当該コーティングされたクエン酸粒子はペプチドの経口バイオアベイラビリティを増加させるものであってもよい。
上記に替えて、又は、上記に加えて、経口投与のための担体を用いて製剤化されたものであってもよい。例えば、５−ＣＮＡＣ、ＳＮＡＤ、又はＳＮＡＣを含む担体が挙げられる。
本発明のカルシトニン模倣体は、非経口投与用に製剤化されたものであってもよい。例えば、カルシトニン模倣体は、注射用に製剤化されたものであってもよい。
【００５２】
本発明は、上記のカルシトニン模倣体を含む医薬組成物にも関する。
また本発明は、薬剤として使用するための上記のカルシトニン模倣体にも関する。その点に関し、カルシトニン模倣体は、糖尿病（Ｉ型及び／又はＩＩ型）、体重過多、過剰摂食、メタボリック症候群、関節リウマチ、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性脂肪性肝疾患、骨粗鬆症、若しくは変形性関節症、血糖値の調節不良、糖負荷試験に対する反応の調節不良、又は食物摂取の調節不良の治療に使用するためのものであってもよい。
また、カルシトニン模倣体は、メトホルミンまたは別のインスリン抵抗性改善薬との結合体をしたものを投与してもよい。
【００５３】
本発明のペプチドは、第１のアミノ酸の正電荷を減少させるように、そのＮ−末端をアシル化するか、又は、別の方法で修飾してもよいし、それとは独立して、そのＣ−末端をアミド化してもよい。
【００５４】
ペプチドは、医薬として投与するために製剤化することができ、経腸投与用又は非経口投与用に製剤化することができる。好ましい製剤は注射であり、好ましくは皮下注射である。しかし、ペプチドは、担体を用いて経口投与用に製剤化してもよく、任意選択的に、担体は経口バイオアベイラビリティを増加する。好適な担体には、５−ＣＮＡＣ、ＳＮＡＤ、又はＳＮＡＣを含むものが包含される。
【００５５】
任意選択的に、ペプチドは、コーティングされたクエン酸粒子を含む経口投与用医薬組成物に製剤化され、当該コーティングされたクエン酸粒子はペプチドの経口バイオアベイラビリティを増加させる。
【００５６】
本発明は、薬剤として使用するための本発明のペプチドを包含する。当該ペプチドは、糖尿病（Ｉ型及び／又はＩＩ型）、体重過多、過剰摂食、メタボリック症候群、関節リウマチ、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性脂肪性肝疾患、骨粗鬆症、若しくは変形性関節症、血糖値の調節不良、糖負荷試験に対する反応の調節不良、又は食物摂取の調節不良の治療に使用することができる。特に、当該ペプチドは、望ましくなく高い絶食時血糖値を低下させるため、 又は、望ましくなく高いＨｂＡ１ｃを低下させるため、 又は、糖負荷試験に対する望ましくなく高い反応を低下させるために使用することができる。また、本発明のペプチドは、肝トリグリセリドを減少させるため、及び／又は、患者の肝内における脂肪蓄積を低下させるために使用することもできる。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本発明のペプチドは、ペプチドを生成するために本発明の属する技術分野において知られている合成（化学的）技術や遺伝子組み換え技術などから、適した方法を用いて製造することができる。好ましくは、合成法を用いてペプチドを製造する。合成ペプチドの合成は、本発明の属する技術分野においてよく知られており、様々な保護基を利用する固相ペプチド合成の手法（例えば、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ｂｚｌ、ｔＢｕなどの使用）が包含されるが、これに限定されない。
【００５８】
いくつかの実施形態において、上で論じたカルシトニン模倣体のＮ末端側は、第１のアミノ酸の正電荷を減少させるように修飾される。例えば、アセチル、プロピオニル、又はスクシニル基は、システイン−１上に置換されてもよい。正電荷を減少させる代替の方法は、限定されないが、ポリエチレングリコール系のＰＥＧ化、 又は、Ｎ末端でのグルタミン酸もしくはアスパラギン酸等の別のアミノ酸の付加を含む。代替として、リジン、グリシン、ホルミルグリシン、ロイシン、アラニン、アセチルアラニン、及び、ジアラニルを含む他のアミノ酸が、上で論じたペプチドのＮ末端に付加されてもよい。当業者は理解するように、複数のシステイン残基を有するペプチドは、そのような２つのシステイン残基間にジスルフィド結合をしばしば形成する。本明細書に記載される全てのそのようなペプチドは、特にＣｙｓ１−Ｃｙｓ７の位置に、１つ以上のそのようなジスルフィド結合を任意選択的に含むと定義される。これを模倣して、１位および７位のシステインは、α−アミノスベリン酸結合によって一緒に置換されてもよい。
本開示のカルシトニン模倣体は遊離酸の形態で存在し得るが、Ｃ末端アミノ酸がアミド化されていることが好ましい。本発明者は、そのようなアミド化がペプチドの有効性、及び／又は、バイオアベイラビリティに寄与し得ると予想する。Ｃ−末端アミノ酸をアミド化するために、合成化学法を適用することができる。本開示のカルシトニン模倣体のアミ ド化形態を製造するための好ましい手法は、既知の技法に従ってペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼの存在下で前駆体（所望のアミド化生成物のＣ−末端アミノ基の代わりにグリシンを有する）を反応させることであり、前駆体は、例えば、ＵＳ４７０８９３４及びＥＰ０３０８０６７及びＥＰ０３８２４０３に記載される反応においてアミ ド化生成物に変換される。
【００５９】
アミド化生成物の製造は、ＵＳ７４４５９１１においてＣｏｎｓａｌｖｏら、ＵＳ２００６／０２９２６７２においてＭｉｌｌｅｒら、２００２，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２６：２４９−２５９においてＲａｙら、及び、２００４，Ｂｉｏｐｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｊｕｌｙ，ｐｐ．４４−４６においてＭｅｈｔａによって記載されたプロセス及びアミド化酵素を用いても達成することができる。
【００６０】
好ましいアミド化ペプチドの製造は、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの可溶性融合タンパク質として、Ｅ．ｃｏｌｉ中でグリシン伸長前駆体を生成することによって、または、ＵＳ６１０３４９５に記載される手法に従って前駆体を直接発現させることによって進めてもよい。そのようなグリシン伸長前駆体は、Ｃ−末端を除いて、所望のアミド化生成物と同一の分子構造を有する（生成物は−−Ｘ−−ＮＨ２で停止するのに対し、前駆体は−−Ｘ−ｇｌｙで停止し、Ｘは生成物のＣ−末端アミノ酸残基である）。上記刊行物に記載されるα−アミド化酵素は、前駆体から生成物への変換を触媒する。その酵素は、上記で引用したＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈａｒｍの記事に記載されるように、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において遺伝子組み換えによって製造されるのが好ましい。
【００６１】
本開示のペプチド活性剤の遊離酸形態は、「前駆体」上にＣ末端グリシンを含まないことを除いて同様にして生成することができ、前駆体は、代わりに最終ペプチド生成物であり、アミド化ステップを必要としない。
【００６２】
別途記載される場合を除いて、本開示のカルシトニン模倣体の好ましい投与量は、 治療目的及び予防目的の両方で同一である。所望の投与量は、以下において詳細に論じられ、投与様式に応じて異なる。
【００６３】
別途記載される場合及び文脈から明らかな場合を除いて、本明細書における投与量は、薬学的賦形剤、希釈剤、担体又は他の成分による影響を受けない又はそれらを考慮に入れない活性化合物（すなわち、カルシトニン模倣体）の重量を指すが、 そのような追加の成分が含まれることが望ましい。ペプチド活性剤の送達のために医薬品産業において一般的に使用されるいずれの剤形（カプセル、錠剤、注射等）  も、本明細書における使用に適しており、「賦形剤」 、「希釈剤」、又は「担体」という用語は、該産業において活性成分と一緒にそのような剤形に典型的に含まれるような非活性成分を含む。好ましい経口剤形は以下において詳細に論じられるが、 それは本開示の活性剤を投与する限定的な様式であると見なされるべきではない。
【００６４】
本開示のカルシトニン模倣体は、多数の疾患又は障害を治療するために患者に投与することができる。本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、動物界に属する任意の生物を意味する。ある実施形態において、「患者」という用語は、脊椎動物、より好ましくは、ヒトを含む哺乳動物を指す。
【００６５】
したがって、本開示は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病もしくはメタボリック症候群、肥満の治療方法、又は食欲抑制の方法、又はインスリン抵抗性を軽減するための方法、又は、望ましくなく高い絶食時血清グルコースレベルを低下させるための方法、又は望ましくなく高いピーク血清グルコースレベルを低下させるための方法、又は望ましくなく高いピーク血清インスリンレベルを低下させるための方法、又は糖負荷試験に対する望ましくなく大きな反応を軽減するための方法、又は骨粗鬆症を治療するための方法、又は変形性関節症を治療するための方法、又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を治療するための方法、又はアルコール性脂肪性肝疾患を治療するための方法、又は肝臓トリグリセリドを減少させるための方法、又は対象者の肝臓内における脂肪蓄積を低下させるための方法におけるペプチドの使用を含む。
【００６６】
性別、年齢、及び身長等の多数の因子を考慮に入れた、正常な体重の範囲に関する当該技術分野で認識されている数多くの尺度が存在する。本明細書に記載される治療計画又は予防計画を必要とする患者は、その体重が認識されている基準を超える患者、又は、遺伝的因子、環境的因子、もしくは他の認識されている危険因子に起因して、一般的な集団よりも過体重もしくは肥満となる危険性が高い患者を含む。 本開示によれば、糖尿病を治療するためにカルシトニン模倣体が使用され得ることが想定され、その場合、体重管理が治療の一態様である。
【００６７】
ある実施形態において、方法は、前記状態の治療のために、薬学的有効量の本明細書に記載のペプチドのうちのいずれか１つを、それを必要とする患者に経腸投与することを含む。
【００６８】
ある実施形態において、方法は、前記状態の治療のために、薬学的有効量の本明細書に記載のペプチドのうちのいずれか１つを、それを必要とする患者に非経口投与することを含む。非経口投与（腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、皮内注射、 又は筋肉内注射を含む）には、例えば、ゴマ油もしくはラッカセイ油中又は水性プロピレングリコール中のいずれかの本開示のペプチドの溶液が用いられ得る。水溶液は、必要であれば適切に緩衝されるべきであり、液体希釈剤を最初に等張性にするべきである。これらの水溶液は、静脈内注射の目的に適している。油性溶液は、 動脈内注射、筋肉内注射、及び皮下注射の目的に適している。滅菌条件下におけるこれら全ての溶液の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技術によって容易に達成される。非経口用途の場合、好適な調製物の例として、溶液、好ましくは油性溶液又は水溶液、及び懸濁液、エマルジョン、又は坐剤を含む植込剤が挙げられる。ペプチドは、注射剤とともに一般的に使用される滅菌生理食塩水又は５％食塩水デキストロース溶液等の液体担体に分散させる等、複数回又は単回投与形式の滅菌形態に製剤化することができる。
【００６９】
前記方法は、患者が前記状態を患っているかどうかを決定する予備ステップ、及び／又は、例えば、各症例において、経口糖負荷試験もしくは安静時血糖値の測定を行い、前記患者における状態を軽減するのに前記治療がどの程度有効であるのかを決定する後続ステップを含み得る。
【００７０】
経口腸溶性製剤は、舌下経路又は頬側経路を介した血流への移動を可能にするように口腔内に保持される製剤とは対照的に、胃の下の腸において後に放出され、したがって門脈を経由して肝臓に送達されるように、嚥下によって摂取される。
【００７１】
本開示における使用に適した剤形は、錠剤、ミニ錠剤、カプセル、顆粒、ペレット、粉末、発泡性固体、及びチュアブル固体製剤を含む。そのような製剤は、好ましくは加水分解ゼラチン又は低分子量ゼラチンであるゼラチンを含み得る。そのような製剤は、カルシトニン模倣体と加水分ゼラチン又は低分子量ゼラチンとを含む均質な水溶液を凍結乾燥し、結果として得られた固体材料を前記経口医薬製剤にさらに加工することによって得ることができ、この場合、ゼラチンは１０００ダルトンから１５０００ダルトンの平均分子量を有し得る。そのような製剤は、５−ＣＮＡＣ又は本明細書に開示される他の化合物等の保護的担体化合物を含み得る。
【００７２】
錠剤及びカプセル等の経口製剤が好ましいが、本開示において使用される組成物は、シロップ、エリキシル剤等、及び坐剤等の形態を取ることができる。経口送達は、便利で、比較的容易であり、また概ね無痛であり、他の送達様式と比較して患者コンプライアンスの増大をもたらすため、一般的に最適な送達経路である。しかしながら、消化管内で変動するｐＨ、強力な消化酵素、ならびに活性薬剤不透過性の消化管膜等の生物学的、化学的、及び物理的障壁は、カルシトニン様ペプチドの哺乳動物への経口送達を問題のあるものにし、例えば、哺乳動物において甲状腺の濾胞傍細胞によって、ならびに鳥類及び魚類の鰓後腺によって分泌される長鎖ポリペプチドホルモンであるカルシトニンの経口送達は、消化管におけるカルシトニンの安定性が不十分であること、及び腸壁を通ってカルシトニンを血流へと容易に輸送する能力の不足に少なくとも部分的に起因して、本来困難であることが分かっていた。
しかしながら、 好適な経口製剤を以下に記載する。
【００７３】
患者の治療
ある実施形態において、本開示のカルシトニン模倣体は、患者における模倣体の血清レベルを１ミリリットル当たり５ピコグラムから１０００ナノグラム、好ましくは５０ピコグラムから５００ナノグラム、例えば、１ミリリットル当たり１ナノグラムから３００ナノグラムに維持するのに十分な投与量で投与される。血清レベルは、当該技術分野で既知の手法のうち、ラジオイムノアッセイ法や質量分析法などの適した手法によって測定することができる。担当医は、患者の反応をモニタリングすることができ、次いで、個々の患者の代謝および反応を考慮するために用量をある程度変更することができる。ほぼ同時の放出は、本開示の全ての構成成分を単一の丸剤又はカプセルとして投与することによって最も良好に達成される。しかしながら、本開示はまた、例えば、必要な量のカルシトニン模倣体を２つ以上の錠剤又はカプセルに分割することも含み、それらは一緒になって全ての成分の必要量を提供するように一緒に投与されてもよい。本明細書で使用される「薬学的組成物」は、限定されないが、所与の投与で１つ以上の錠剤又はカプセル（又は他の剤形）が推奨されているかどうかにかかわらず、患者への特定の投与に適切な完全な投与量を含む。
【００７４】
本開示のカルシトニン模倣体は、Ｕｎｉｇｅｎｅ  Ｅｎｔｅｒｉｐｅｐ（登録商標）製品に用いられる方法を使用して経口投与のために製剤化することができる。これらは、米国特許第５，９１２，０１４号、米国特許第６，０８６，９１８号、米国特許第６，６７３，５７４号、米国特許第７，３１６，８１９号、米国特許第８，０９３，２０７号、及び米国公開公報第２００９／０３１７４６２号に記載されるような方法を含み得る。具体的には、これらは、ＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン等の膜輸送体への化合物の結合（conjugation）の使用、１つ以上のプロテアーゼ阻害剤、及び／又は、コーティングされていてもよいｐＨ降下剤、及び／又は、耐酸性保護ビヒクル、及び／又は、界面活性剤であってもよい吸収促進剤との合剤の使用を含み得る。
【００７５】
ある実施形態において、本開示のカルシトニン模倣体は、米国特許公開第２００９／０３１７４６２号において既知の方法で経口投与されるように製剤化されることが好ましい。
【００７６】
ある実施形態において、本開示のカルシトニン模倣体は、好適な担体化合物との混合によって、経腸投与、特に経口投与のために製剤化することができる。好適な担体化合物は、米国特許第５，７７３，６４７号及び米国特許第５８６６５３６号に記載されるものを含み、それらの中でも、５−ＣＮＡＣ（一般的にその二ナトリウム塩としての、Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸）は特に効果的である。他の好ましい担体又は送達剤は、ＳＮＡＤ（１０−（２−ヒドロキシベンズアミド）デカン酸のナトリウム塩）及びＳＮＡＣ（Ｎ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸のナトリウム塩）である。ある実施形態において、本開示の薬学的組成物は、送達有効量の、すなわち、所望の効果のために化合物を送達するのに十分な量の、５−ＣＮＡＣ等の担体を含む。一般に、５−ＣＮＡＣ等の担体は、全組成物の２．５重量％から９９．４重量％、より好ましくは２５重量％から５０重量％の量で存在する。
【００７７】
加えて、ＷＯ００／０５９８６３は、式Ｉ
【００７８】
【化６】
2021535119.tif 000007
【００７９】
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、独立して、水素、−ＯＨ、−ＮＲ６Ｒ７、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキル、又はＣ１−Ｃ４アルコキシであり；
Ｒ５は、置換もしくは非置換のＣ２−Ｃ１６アルキレン、置換もしくは非置換のＣ２−Ｃ１６アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２−Ｃ１２アルキル（アリーレン）、又は置換もしくは非置換のアリール（Ｃ１−Ｃ１２アルキレン）であり；
Ｒ６及びＲ７は、独立して、水素、酸素、又はＣ１−Ｃ４アルキルである〕
【００８０】
の二ナトリウム塩、ならびに、カルシトニン、例えば、サケカルシトニン等の活性薬剤の経口送達に特に有効であるそれらの水和物および溶媒和物を開示しており、 それらは本開示において使用することができる。
【００８１】
任意選択的に微粒子化された５−ＣＮＡＣを使用した好ましい腸溶性製剤は、 概してＷＯ２００５／０１４０３１に記載される通りであり得る。
【００８２】
化合物は、Ｂｏｎｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＬｉｍｉｔｅｄのＣａｐｓｉｔｏｎｉ ｎ製品に用いられる方法を使用して経口投与のために製剤化することができる。 それらは、Ａｘｃｅｓｓ製剤に取り入れられた方法を含み得る。より具体的には、 活性成分は、胃を通過することに耐えられる腸溶性カプセルに封入することができる。腸溶性カプセルは、例えば、ＷＯ０２／０２８４３６に記載されるように、親水性の芳香族アルコール吸収促進剤と一緒に活性化合物を含有し得る。既知の様式において、腸溶性コーティングは、例えば、３から７のｐＨで、ｐＨ感受性の様式で透過性になり得る。ＷＯ２００４／０９１５８４もまた、芳香族アルコール吸収促進剤を用いた好適な製剤化方法を記載している。
【００８３】
化合物は、Ｏｒａｍｅｄ製品に見られる方法を使用して製剤化することができ、  これは、ＷＯ２００７／０２９２３８に見られるような、又はＵＳ５，１０２，６６６に記載されるようなω−３脂肪酸を用いた製剤を含み得る。
【００８４】
一般に、薬学的に許容される塩（特に、一ナトリウム塩又は二ナトリウム塩）、溶媒和物（例えば、アルコール溶媒和物）、及びこれらの担体又は送達剤の水和物が使用され得る。
【００８５】
本開示による医薬組成物の経口投与は、定期的に、例えば、毎日又は毎週ベースで１回以上；間欠的に、例えば、１日又は１週間の間に不定期に；又は周期的に、例えば、数日間又は数週間の期間中に定期的に投与した後、 投与しない期間を設ける、などによって達成することができる。本明細書に開示される実施形態の医薬組成物の剤形は、任意の既知の形態であってもよく、例えば、液体剤形又は固体剤形であり得る。液体剤形は、溶液、エマルジョン、懸濁液、シロップ、及びエリキシル剤を含む。活性化合物及び５−ＣＮＡＣ等の担体に加えて、液体製剤は、当該技術分野において一般的に使用される不活性賦形剤、例えば、可溶化剤、例えば、エタノール；綿実油、ヒマシ油、及びゴマ油等の油；湿潤剤；乳化剤；懸濁剤；甘味剤；香味剤；及び水等の溶媒も含み得る。 固体剤形は、カプセル、軟質ゲルカプセル、錠剤、カプレット、粉末、顆粒、又は他の固体経口剤形を含み、それらの全てが当該技術分野で周知の方法によって調製され得る。医薬組成物は、限定されないが、ｐＨ調整剤、防腐剤、香味剤、矯味剤、芳香剤、保湿剤、等張剤、着色剤、界面活性剤、可塑化剤、ステアリ ン酸マグネシウム等の潤滑剤、流動補助剤、圧縮補助剤、可溶化剤、賦形剤、微晶質セルロース、例えば、ＦＭＣ社によって供給されるＡｖｉｃｅｌ  ＰＨ  １０２等の希釈剤、又はそれらの任意の組み合わせを含む添加剤を、慣例的に用いられる量で追加的に含み得る。他の添加剤は、リン酸緩衝塩、クエン酸、グリコール、及び他の分散剤を含み得る。組成物はまた、アクチノニン又はエピアクチノニン及びそれらの誘導体；アプロチニン、トラジロール、及びボーマンバーク阻害剤等の、１つ以上の酵素阻害剤も含み得る。さらに、輸送阻害剤、すなわち、ケトプロフィン（Ketoprofin）等の［ｒｈｏ］−糖タンパク質が、本開示の組成物中に存在してもよい。本開示の医薬組成物は、従来の方法によって、例えば、活性化合物、５−ＣＮＡＣ等の担体、及び任意の他の成分の混合物をブレンドし、練り、カプセルに充填するか、または、カプセルに充填する代わりに、成形した後、さらに打錠又は圧縮成形して錠剤を得ることによって調製することができる。 加えて、既知の方法によって固体分散体を形成した後、さらに加工して錠剤又はカプセルを形成してもよい。好ましくは、本開示の医薬組成物中の成分は、固体剤形全体にわたって均質に又は均一に混合される。
【００８６】
代替として、活性化合物は、担体との結合体（a conjugate）として製剤化とすることができ、当該キャリアは、米国公開公報第２００３／００６９１７０号に記載されるようなオリゴマー、例えば下記のオリゴマーであってもよい。
【００８７】
【化７】
2021535119.tif 000008
【００８８】
そのような結合体は、そこに記載されるような脂肪酸および胆汁塩と組み合わせて投与することができる。
例えば、Ｍａｎｓｏｏｒらに記載されるように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との結合体が用いられてもよい。
【００８９】
代替として、活性化合物を、ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミン（ＳＮＡＰ）及びカーボポール（Carbopol）溶液と、又はタウロコール酸塩及びカーボポール溶液と混合して、粘膜付着性エマルジョンを形成することができる。
【００９０】
活性化合物は、Ｐｒｅｇｏらに開示されるようなキトサンナノカプセルに充填することによって（任意選択的に、Ｐｒｅｇｏ  Ｐｒｅｇｏ  Ｃ、Ｔｏｒｒｅｓ  Ｄ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｅｇｉａ  Ｅ、Ｎｏｖｏａ−Ｃａｒｂａｌｌａｌ  Ｒ、Ｑｕｉｎｏａ  Ｅ、  Ａｌｏｎｓｏ  ＭＪ．に記載されているようにＰＥＧ修飾した）、又は、Ｇａｒｃｉａ−Ｆｕｅｎｔｅｓらに開示されるようにキトサン又はＰＥＧでコーティングされた脂質ナノ粒子に充填することによって製剤化することができる。この目的のためのキトサンナノ粒子は、Ｇｕｇｇｉらに記載されるようにイミノチオラン修飾されてもよい。それらは、Ｄｏｇｒｕらに記載されるように、水／油／水エマルジョン中に製剤化することができる。活性化合物のバイオアベイラビリティは、Ｓｉｎｋｏら又はＳｏｎｇらに記載されるように、タウロデオキシコール酸塩又はラウロイルカルニチンを用いることにより増加させることができる。一般に、担体として好適なナノ粒子は、ｄｅ  ｌａ  Ｆｕｅｎｔｅらにおいて論じられており、本開示において使用することができる。
【００９１】
経口製剤に好適な他の戦略は、Ｃｈｉａｓｍａ  ＬｔｄのＷＯ２００５／０９４７８５に記載されるような一過性の透過性促進剤（ＴＰＥ）系の使用を含む。ＴＰＥは、疎水性溶媒中に固体親水性粒子を懸濁させた油性懸濁液を用いて、薬物分子を好ましくない消化管（ＧＩ）環境による不活性化から保護し、また同時に、ＧＩ壁に作用してカーゴ薬物分子の透過を誘導する。
【００９２】
粘膜上の排出ポンプの作用を阻害するために、ＵＳ２００８／０２００５６３に記載されるようなグルタチオン又は多数のチオール基を含有する化合物の使用もさらに含まれる。そのような手法の実例は、Ｃａｌｉｃｅｔｉ，  Ｐ．  Ｓａｌｍａｓｏ，  Ｓ．，  Ｗａｌｋｅｒ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ，  Ａ．  （２００４）  ‘Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒａｌ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ＰＥＧ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ．’  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．，  ２２，  ３１５−３２３、  Ｇｕｇｇｉ，  Ｄ．，  Ｋｒａｕｌａｎｄ，  Ａ．  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ，  Ａ．（２００３）  ‘Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｓｔｏｍａｃｈ：  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒａｌ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｓａｌｍｏｎ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ．’Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌ．  ９２，  １２５−１３５、及び、Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ，  Ａ．，  Ｐｉｎｔｅｒ，  Ｙ．，  Ｇｕｇｇｉ，  Ｄ．，  Ｋａｈｌｂａｃｈｅｒ，  Ｈ．，  Ｓｃｈｏｆｆｍａｎｎ，  Ｇ．，  Ｓｃｈｕｈ，  Ｍ．，  Ｓｃｈｍｅｒｏｌｄ，  Ｉ．，  Ｄｅｌ  Ｃｕｒｔｏ，  Ｍ．Ｄ．，  Ｄ’Ａｎｔｏｎｉｏ，  Ｍ．，  Ｅｓｐｏｓｉｔｏ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｈｕｃｋ，  Ｃｈ．  （２００５）  ‘Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｉｏｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｉｎ  ｏｒａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ’  −Ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｐｔ．  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌｅａｓｅ，  １０６，  ２６−３３にも記載されている。
【００９３】
活性化合物は、ＷＯ２００４／０８４８７０に記載されるようなシームレスのマイクロスフェアに製剤化することができ、 活性な薬学的成分は、ミニスフェアに製剤化されたエマルジョン、マイクロエマルジョン、又は懸濁液として可溶化され、従来のまたは新規のコーティング技術のいずれかによって様々にコーティングされる。その結果は、「予め可溶化された」形態で封入された薬物であり、経口投与されると、消化管に沿った特定の位置に対して、特定の速度で、活性薬物の所定の即時放出または持続放出を提供する。基本的に、薬物を予め可溶化することで、同時に透過性及び薬物安定性を増強しながら、その動態プロファイルの予測可能性を高める。
【００９４】
ＵＳ２００９／００７４８２４に記載されるように、キトサンでコーティングされたナノカプセルを用いてもよい。ナノカプセルは胃液の作用に対して安定であるため、この手法を用いて投与される活性分子はナノカプセル内で保護される。加えて、この系の粘膜付着特性は腸壁への付着時間を延長し（これらの系の消化管通過に遅延が見られることが確認されている）、活性分子のより効果的な吸収を促進する。
【００９５】
ＴＳＲＬｌ  Ｉｎｃ．によって開発された方法が使用されてもよい。これらは、正電荷及び負電荷の両方を担持する天然由来のコラーゲン抽出物であるゼラチンが、レシチンミセル中に含有される活性成分の粒子をコーティングし、それらの凝集又はクランピングを防止する、親水性可溶化技術 （ＨＳＴ）を含む。この結果、極性相互作用を介して疎水性薬物粒子の改善された水和性がもたらされる。加えて、 両親媒性のレシチンが、溶解流体と粒子表面との間の表面張力を低下させる。
【００９６】
活性成分は、賦形剤としてククルビットウリルを用いて製剤化されてもよい。
【００９７】
代替として、Ｍｅｒｒｉｏｎ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＧＩＰＥＴ技術を用いて、ＵＳ２００７／０２３８７０７に記載されるような中間鎖脂肪酸もしくは中間鎖脂肪酸誘導体、又はＵＳ７２６８２１４に記載されるような膜移行ペプチドであり得る吸収促進剤とともに活性成分を含有する腸溶性コーティング錠剤を生成することもできる。
【００９８】
経口投与用の薬物カプセルに入れられた放出制御剤形を膨張式パウチ内に収容してなるＧＩＲＥＳ（商標）技術を用いることができる。カプセルが溶解すると、 ガス発生系が胃内でパウチを膨張させる。臨床試験において、パウチが胃内に１６から２４時間保持されることが示されている。
【００９９】
代替として、胃内の酵素分解に耐えることを可能にし、その吸収を促進させる保護修飾因子に活性成分を結合（conjugated）させてもよい。活性成分は、単分散の短鎖メトキシポリエチレングリコール糖脂質誘導体と共有結合させることができ、 それを精製した後で結晶化及び凍結乾燥して、乾燥した活性な医薬成分とする。そのような方法は、ＵＳ５４３８０４０及びｗｗｗ．  ｂｉｏｃｏｎ．  ｃｏｍに記載されている。
【０１００】
また、活性成分の送達のために肝指向性小胞（ＨＤＶ）を用いてもよい。ＨＤＶは、活性成分を封入するリポソーム （≦１５０ｎｍの直径）からなってもよく、それらの脂質二重層内に肝細胞ターゲティング分子も含有する。ターゲティング分子は、封入された活性成分の肝細胞への送達を誘導し、したがって、比較的少量の活性成分が効果をもたらすのに必要とされる。そのような技術はＵＳ２００９／００８７４７９に記載され、さらにｗｗｗ．  ｄｉａｓｏｍｅ．  ｃｏｍにも記載されている。
【０１０１】
活性成分は、インスリンに関してＵＳ２００２／０１１５５９２に記載されるような長鎖ＰＥＧ種と任意選択的に混合された中鎖部分グリセリドと会合して、アルコール及び共溶媒を含む実質的に非水性の親水性媒体を追加的に含有する組成物に組み込まれてもよい。
【０１０２】
代替として、Ｓｈｅｎ  Ｚ，Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ  Ｓ，  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．  ２００２  Ａｐｒ；１９（４）：３９１−５  ‘Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐａｔｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ’に記載されるような腸パッチが使用されてもよい。
【０１０３】
活性成分は、米国特許第７１８９４１４号に記載されるような疎水性ポリマーとブレンドされたハイドロゲルから形成される浸食性マ トリックスに組み込むことができる。
【０１０４】
治療される成人ヒトの好適な経口投与量レベルは、０．０５ｍｇから５ｍｇの範囲、好ましくは約０．１ｍｇから２．５ｍｇであり得る。
【０１０５】
患者の投薬治療の頻度は、１週間に１回から４回、好ましくは週１回から２回、及び、最も好ましくは週１回である。治療は、少なくとも６週間、好ましくは少なくとも６ヶ月間、好ましくは少なくとも１年間の長期間にわたって、また任意選択的に生涯にわたって維持されることが望ましいであろう。
【０１０６】
関連する状態のための併用治療は、本発明による組成物と、１つ以上の他の治療薬の別個の投与とを用いて行うことができる。代替として、本開示による組成物は、 併用投与のために１つ以上の他の治療薬を組み込んでもよい。
【０１０７】
本開示による併用療法は、記載されるような活性化合物と、インスリン、ＧＬＰ−２、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、もしくはアミリンとの組み合わせ、又は一般的に他の抗糖尿病薬との組み合わせを含む。
したがって、合剤を含む併用療法は、メトホルミン、ブホルミン及びフェンホルミン等のビグアナイド、バラグリタゾン、ピオグリタゾン、リボグリタゾン、ロシグリタゾン及びトログリタゾン等のＴＺＤ（ＰＰＡＲ）、アレグリタザール、ムラグリタザール及びテサグリタザール等の二重ＰＰＡＲアゴニストを含むインスリン抵抗性改善薬；又はカルブタミド、クロルプロパミド、グリクラジド、トルブタミド、トラザミド、グリピジド、グリベンクラミド、グリブリド、グリキドン、グリクロピラミド及びグリメピリリド等のスルホニルウレア、ナテグリニド、レパグリニド及びミチグリニド等のメグリチニド／グリニド（Ｋ＋）、エキセナチド、リキシセナチド、リラグルチド、セマグルチド、デュラグルチド及びアルビグルチド等のＧＬＰ−１類似体、アログリプチン、リナグリプチン、サキサグリプチン、シタグリプチン及びビルダグリプチン等のＤＰＰ−４阻害剤を含む分泌促進物質；（即効型）インスリンリスプロ、インスリンアスパト、インスリングルリジン、（長時間作用型）インスリングラルギン、インスリンデテミル、吸入用のインスリンエクスベラ及びＮＰＨインスリン等のインスリン類似体又は特殊な製剤；ならびにアカルボース、ミグリトール、及びボグリボース等のα−グルコシダーゼ阻害剤、プラムリンチド等のアミリン類似体、ダパグリフロジン、エンパグリフロジン、レモグリフロジン及びセルグリフロジン等のＳＧＬＴ２阻害剤を含む他の薬剤だけではなく、ベンフルオレックス及びトルレスタットを含む様々な薬剤とともに行われ得る。
【０１０８】
さらなる組み合わせは、レプチンとの同時投与又は合剤化を含む。レプチン抵抗性は、２型糖尿病の十分に確立された構成要素である。しかし、レプチンの注射は、これまでこの状態を改善することができていない。これとは対照的に、アミリンが、したがってアミリン様能力を有する分子が、サケカルシトニン模倣体として、レプチン感受性を改善することが可能であることを支持する証拠が存在する。アミリン／レプチンの組み合わせは、体重及び食物摂取に対する相乗効果、及びインスリン抵抗性も示している［Ｋｕｓａｋａｂｅ  Ｔら］。
【０１０９】
さらに好ましい併用療法は、本発明のペプチドと、１つ以上の体重減少薬との合剤化又は同時投与を含む。そのような体重減少薬は、限定されないが、リパーゼ阻害剤（例えば、オルリスタット等の膵リパーゼ阻害剤）、食欲抑制アンフェタミン誘導体（例えば、フェンテルミン）、トピラマート、Ｑｙｓｍｉａ（登録商標）（フェンテルミン／トピラマートの組み合わせ）、５−ＨＴ２Ｃ受容体作用薬（例えば、ロカセリン）、Ｃｏｎｔｒａｖｅ（登録商標）（ナルトレキソン／ブプロピオンの組み合わせ）、グルカゴン様ペプチド−１［ＧＬＰ−１］類似体及び誘導体（例えば、リラグルチド、セマグルチド）、筋小胞体／小胞体（ＳＲ）Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）阻害剤（例えば、サルコリピン）、繊維芽細胞成長因子２１［ＦＧＦ−２１］受容体作用薬（例えば、ＦＧＦ−２１の類似体）、及び、β３アドレナリン受容体作用薬（例えば、ミラベグロン）を含む。そのような組み合わせは、肥満等の体重過多状態の処置に使用し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
図の説明
【図１−１】図１：食物摂取及び体重に関しての、ＫＢＰ３４６、ＫＢＰ３４７、ＫＢＰ３４９、ＫＢＰ３５１、ＫＢＰ３５２、ＫＢＰ３５３及びＫＢＰ０８９の比較        Ａ）食物摂取、０−４時間；Ｂ）体重変化、４時間；Ｃ）食物摂取、４−２４時間；Ｄ）体重変化、２４時間；Ｅ）食物摂取２４−４９時間；Ｆ）体重変化、４８時間
【図１−２】図１：食物摂取及び体重に関しての、ＫＢＰ３４６、ＫＢＰ３４７、ＫＢＰ３４９、ＫＢＰ３５１、ＫＢＰ３５２、ＫＢＰ３５３及びＫＢＰ０８９の比較        Ａ）食物摂取、０−４時間；Ｂ）体重変化、４時間；Ｃ）食物摂取、４−２４時間；Ｄ）体重変化、２４時間；Ｅ）食物摂取２４−４９時間；Ｆ）体重変化、４８時間
【図２】図２：ＫＢＰ３７５、ＫＢＰ３７６及びＫＢＰ３７７の単回投与試験        単回投与をｔ＝０に実施した。各分子の３６ｎｍｏｌ／ｋｇ単回投与による食物摂取及び体重への効果を１６８時間観察し、非アシル化ベンチマークと直接比較した。Ａ）食物摂取；Ｂ）体重変化
【図３−１】図３：ＫＢＰ３５６、ＫＢＰ３５８、ＫＢＰ３６２、ＫＢＰ３６４、ＫＢＰ３６８及びＫＢＰ３７０の投与反応試験        単回投与をｔ＝０に実施した。各分子の３６ｎｍｏｌ／ｋｇ単回投与による食物摂取及び体重への効果を１６８時間観察した。Ａ−Ｂ）アシル化したＫＢＰ−０６６変異体の食物摂取及び体重；Ｃ−Ｄ）アシル化したＫＢＰ−０６２変異体の食物摂取及び体重；Ｅ−Ｆ）アシル化したＫＢＰ−１１０変異体
【図３−２】図３：ＫＢＰ３５６、ＫＢＰ３５８、ＫＢＰ３６２、ＫＢＰ３６４、ＫＢＰ３６８及びＫＢＰ３７０の投与反応試験        単回投与をｔ＝０に実施した。各分子の３６ｎｍｏｌ／ｋｇ単回投与による食物摂取及び体重への効果を１６８時間観察した。Ａ−Ｂ）アシル化したＫＢＰ−０６６変異体の食物摂取及び体重；Ｃ−Ｄ）アシル化したＫＢＰ−０６２変異体の食物摂取及び体重；Ｅ−Ｆ）アシル化したＫＢＰ−１１０変異体
【図３−３】図３：ＫＢＰ３５６、ＫＢＰ３５８、ＫＢＰ３６２、ＫＢＰ３６４、ＫＢＰ３６８及びＫＢＰ３７０の投与反応試験        単回投与をｔ＝０に実施した。各分子の３６ｎｍｏｌ／ｋｇ単回投与による食物摂取及び体重への効果を１６８時間観察した。Ａ−Ｂ）アシル化したＫＢＰ−０６６変異体の食物摂取及び体重；Ｃ−Ｄ）アシル化したＫＢＰ−０６２変異体の食物摂取及び体重；Ｅ−Ｆ）アシル化したＫＢＰ−１１０変異体
【図４−１】図４：ＫＢＰ３７２及びＫＢＰ３５６の単回高用量投与による食物摂取及び体重への効果        Ａ）ＫＢＰ−０４２Ａ１１．０３（ＫＢＰ３７２）の食物摂取への効果；Ｂ）ＫＢＰ−０４２Ａ１１．０３（ＫＢＰ３７２）の体重への効果；Ｃ）ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３（ＫＢＰ３５６）の食物摂取への効果；Ｄ）ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３（ＫＢＰ３５６）の体重への効果
【図４−２】図４：ＫＢＰ３７２及びＫＢＰ３５６の単回高用量投与による食物摂取及び体重への効果        Ａ）ＫＢＰ−０４２Ａ１１．０３（ＫＢＰ３７２）の食物摂取への効果；Ｂ）ＫＢＰ−０４２Ａ１１．０３（ＫＢＰ３７２）の体重への効果；Ｃ）ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３（ＫＢＰ３５６）の食物摂取への効果；Ｄ）ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３（ＫＢＰ３５６）の体重への効果
【図５】図５：ＫＢＰ−３５０についての４時間食物摂取の研究
【図６】図６：食物摂取の蓄積量        Ａ）全期間に亘る食物摂取の蓄積。食物摂取は、研究開始から２１日目までの間、毎日１回観察した。ｎ＝３−４ケージ。＋／−  ＳＥＭ。；Ｂ）図９Ａに示したデータ曲線下の総面積。ｎ＝９−１０。＋／−  ＳＥＭ。
【図７】図７：研究期間中のＺＤＦ体重        Ａ）個々のラットのグラム表示体重；Ｂ）ビヒクル重量で正規化し、パーセント表示した体重。        体重は、最初の２１日間を通して毎日記録し、その後は、研究終了（６２日）の１週間前まで１週間に２回記録した。ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３群の体重を、研究終了（６２日）の１週間前まで毎日観察した。ｎ＝９−１０ラット。＋／−  ＳＥＭ。
【図８】図８：ＺＤＦ絶食時血糖値        絶食６ｈ後の絶食時血糖値を、研究開始後、０日目、１４日目、２８日目、４２日目及び６２日目に測定した。ｎ＝９−１０。＋／−  ＳＥＭ。
【図９】図９：ＺＤＦ  ＨｂＡ１ｃ値        Ａ）ベースライン時点のＨｂＡ１ｃ；Ｂ）研究終了時点のＨｂＡ１ｃ；ＨｂＡ１ｃは、研究開始の３日前に測定した。ＨｂＡ１ｃは、研究終了時点である６２日目に測定した。ｎ＝９−１０。＋／−  ＳＥＭ。
【図１０】図１０：経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）            Ａ）雄のＺＤＦラットにおける１８０分間に亘るＯＧＴＴ；Ｂ）前記Ａ）に示されたＯＧＴＴを実施している間の曲線下の総面積；ＯＧＴＴは、処置の８週間後に実施した。ラットは、マイナス３０分（−３０）時点で事前に１１ｈ絶食させておいた。血糖レベルは、−３０分、０分、１５分、３０分、６０分、１２０分及び１８０分の時点で測定した。グルコースは、０分時点で経口投与した。３３．３ｍｍｏｌ*Ｌ−１を超える血糖値に対し、検出の上限値；３３．３ｍｍｏｌ*Ｌ−１を割り当てた。ラットは、生理食塩水又はＫＢＰ−０６６又はＫＢＰ−０６６Ａを、その同じ日に、事前投与しなかった。ｎ＝９−１０。
【図１１】図１１：ＫＢＰ−３０５、ＫＢＰ−３０６、ＫＢＰ−３０７、ＫＢＰ−３５６、３８１、ＫＢＰ−３８２及びＫＢＰ−３８３の単回投与試験          単回投与をｔ＝０に行い、各分子の３ｎｍｏｌ／ｋｇ単回投与による食物摂取及び体重への効果を９６時間観察し、他の分子及びビヒクルと直接比較し、最適なアシル化長を決定した。          Ａ）グラム（ｇ）表示の急速食物摂取；Ｂ）グラム（ｇ）表示の体重変化；ｎ＝４  一群当たりのラット。＋／−  ＳＥＭとしてのデータ。
【図１２】図１２：アシル化長が異なるＫＢＰ−０６６Ａ１１化合物（．０３、．０４及び．０５アシル化）を用いたＨＦＤ  ＳＤラットにおける６週間体重減少の研究          ラットを、ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３、ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０４、ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０５又はビヒクルで処置し、３日目ごとに４ｎｍｏｌ化合物／ｋｇの単独皮下注射により投与を行った。体重を研究期間を通して記録した。          Ａ）グラム（ｇ）表示の一日食物摂取；Ｂ）個々のラットのグラム（ｇ）表示の体重減少；ｎ＝６  一群当たりのラット。＋／−  ＳＥＭとしてのデータ。
【図１３】図１３：アシル化長が異なるＫＢＰ−０６６Ａ１１化合物（．０３、．０４又は．０５アシル化）を用いたＨＦＤ  ＳＤラットにおける体重減少の研究から得られる追加的なパラメータ          ラットを、ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３、ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０４、ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０５又はビヒクルで処置した。ラットには、３日目ごとに４ｎｍｏｌ化合物／ｋｇの単独皮下注射により投与を行った。          Ａ）経口糖負荷試験；Ｂ）ＯＧＴＴの曲線下の増加した面積；Ｃ）研究終了時点における精巣上体ＷＡＴのグラム（ｇ）表示重量；Ｄ）研究終了時点における鼠径部ＷＡＴのグラム（ｇ）表示重量；Ｅ）研究終了時点における腎周囲ＷＡＴのグラム（ｇ）表示重量；Ｆ）研究終了時点における体重のベースライン時点からの変化のグラム（ｇ）表示；体重は、研究期間を通して毎日記録した。；ｎ＝６  一群当たりのラット。＋／−  ＳＥＭとしてのデータ。
【図１４】図１４：放射性標識サケカルシトニン（１２５Ｉ−ｓＣＴ）をトレーサーとして用い、２つの異種、すなわちラット（Rattus norvegicus）及びヒト（Homo sapiens）由来の２％血清アルブミン中で実施した競合的リガンド結合アッセイ          トレーサーとして、０．２５ｎｍ  １２５Ｉ−ｓＣＴを用いた。；Ａ）２％ＲＳＡ中で実施した競合的結合アッセイ；Ｂ）２％ＨＳＡ中で実施した競合的結合アッセイ；Ｃ）＋／−  ＳＥＭとしてのデータ。
【図１５】図１５：ＫＢＰ−０６６主鎖上のアシル化位置を調べるためのＫＢＰ−３５６、ＫＢＰ−３８６、ＫＢＰ−３８７、ＫＢＰ−３８８、ＫＢＰ−３８９及びＫＢＰ−３９０の単回投与試験          単回投与をｔ＝０に行い、各分子の３ｎｍｏｌ／ｋｇ単回投与による食物摂取及び体重への効果を９６時間観察し、他の分子及びビヒクルと直接比較し、最適なアシル化長を決定した。          Ａ）グラム（ｇ）表示の急速食物摂取；Ｂ）グラム（ｇ）表示の体重変化；ｎ＝４  一群当たりのラット。＋／−  ＳＥＭとしてのデータ。
【図１６】図１６：ＫＢＰ−０２１主鎖上のアシル化位置を調べるためのＫＢＰ−３９１、ＫＢＰ−３１２、ＫＢＰ−３１３、ＫＢＰ−３１４、ＫＢＰ−３１５、ＫＢＰ−３１６、ＫＢＰ−３１７及びＫＢＰ−３１８の単回投与試験          単回投与をｔ＝０に行い、各分子の３ｎｍｏｌ／ｋｇ単回投与による食物摂取及び体重への効果を９６時間観察し、他の分子及びビヒクルと直接比較し、最適なアシル化長を決定した。          Ａ）グラム（ｇ）表示の急速食物摂取；Ｂ）グラム（ｇ）表示の体重変化；ｎ＝４  一群当たりのラット。＋／−  ＳＥＭとしてのデータ。
【図１７】図１７：ＫＢＰ−０６６Ａ１１化合物（．０３であってアシル化長が同じであるが、アシル化位置が異なるＡ１１及びＡ１９）を用いたＨＦＤ  ＳＤラットにおける６週間体重減少の研究          ラットに、ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３（ＫＢＰ−３５６）、ＫＢＰ−０６６Ａ１９．０３（ＫＢＰ−３８９）又はビヒクルを、３日目ごとに４ｎｍｏｌ化合物／ｋｇの単独皮下注射により投与した。体重及び食物摂取を、研究期間を通して毎日記録した。          Ａ）研究期間中におけるグラム（ｇ）表示の一日食物摂取；Ｂ）個々のラットのグラム（ｇ）表示の体重減少；ｎ＝６  一群当たりのラット。＋／−  ＳＥＭとしてのデータ。
【図１８】図１８：アシル化長が異なるＫＢＰ−０６６Ａ１１化合物（．０３、．０４又は．０５アシル化）を用いたＨＦＤ  ＳＤラットにおける体重減少の研究から得られる追加的なパラメータ          ラットを、ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３、ＫＢＰ−０６６Ａ１９．０３又はビヒクルで処置した。ラットには、３日目ごとに４ｎｍｏｌ化合物／ｋｇの単独皮下注射により投与を行った。          Ａ）経口糖負荷試験；Ｂ）ＯＧＴＴの曲線下の増加した面積；Ｃ）研究終了時点における精巣上体ＷＡＴのグラム（ｇ）表示重量；Ｄ）研究終了時点における鼠径部ＷＡＴのグラム（ｇ）表示重量；Ｅ）研究終了時点における腎周囲ＷＡＴのグラム（ｇ）表示重量；Ｆ）研究終了時点における体重のベースライン時点からの変化のグラム（ｇ）表示；体重は、研究期間を通して毎日記録した。；ｎ＝６  一群当たりのラット。＋／−  ＳＥＭとしてのデータ。
【図１９】図１９：ＫＢＰ−３５６、ＫＢＰ−３８４及びＫＢＰ−３８５を用いたＫＢＰ−０６６主鎖のアシル化連結基の調査          単回投与をｔ＝０に行い、各分子の４ｎｍｏｌ／ｋｇ単回投与による体重への効果を９６時間観察し、他の分子と直接比較し、最適なアシル化連結基を決定した。          Ａ）グラム（ｇ）表示の急速食物摂取；Ｂ）グラム（ｇ）表示の体重変化；ｎ＝４  一群当たりのラット。＋／−  ＳＥＭとしてのデータ。
【実施例】
【０１１１】
実施例
本開示の実施形態を以下の実施例において説明するが、これらは、本開示を理解するのに役立つように記載されるのであって、その後に続く特許請求の範囲において定義される本開示の範囲を限定すると見なされるべきではない。以下の実施例は、  当業者に、記載される実施形態をどのように作製及び使用するかの完全な開示及び説明を提供するために記載されるのであって、本開示の範囲を限定することを意図するものでもなく、また、以下の実験が実施した全てのまたは唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。用いられる数（例えば、量、温度等）に関して精度を確保する努力を行ったが、ある程度の実験誤差及び偏差を考慮に入れるべきである。別途示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧または大気圧近傍である。
【０１１２】
細胞及び細胞株
カルシトニン、アミリン及びＣＧＲＰ受容体を発現する以下の細胞株を購入し、製造者の指示に従って培養した。
１．カルシトニン受容体（ＣＴＲ）：ＤｉｓｃｏｖｅＲｘのＵ２ＯＳ−ＣＡＬＣＲ（カタログ番号９３−０５６６Ｃ３）
２．アミリン受容体（ＡＭＹ−Ｒ）：ＤｉｓｃｏｖｅＲｘのＣＨＯ−Ｋ１  ＣＡＬＣＲ＋ＲＡＭＰ３（カタログ番号９３−０２６８Ｃ２）
【０１１３】
試薬
チオフラビンＴ（Ｔ３５１６、シグマ）。アッセイストックＴｈＴは、５ｍＭリン酸ナトリウム  ｐＨ７中の１０ｍＭ溶液として調製した。それを小分けし、遮光、−２０℃で保管した。ストックＴｈＴは、使用直前に解凍し、希釈した。
試験に供するカルシトニン模倣体（以下において「アシル化ＫＢＰｓ」又は単に「ＫＢＰｓ」を称する。）について、最終の緩衝状態は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ７．５である。
ウエル内における最終のペプチド濃度は、１００−２００μＭとすべきであり、最終のＴｈＴ濃度は、４μＭとすべきである。ＴｈＴは最後に加える（１０μＬ）。
【０１１４】
動物モデル
動物モデル研究において、１２週齢の健康なＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを用い、アシル化ＫＢＰｓの有効性を評価した。一部の実施例において、試験前及び試験中のラットに普通食を給餌したのに対し、他の実施例においては、１２週齢の健康なＳＤラットに対し、試験前の８週間及び試験期間中に、高脂肪食（ＨＦＤ）を給餌した。
【０１１５】
アシル化カルシトニン模倣体
以下の表１ａ及び表１ｂに、試験に供したアシル化カルシトニン模倣体のアミノ酸配列を列記した。そこで用いられているように：
１  アシル化は、KAc−（グルタミン酸連結基）−（C16脂肪酸［パルミチン酸塩］）を意味する；
２  アシル化は、KAc−（グルタミン酸連結基）−（C18二価脂肪酸［オクタデカン二酸］）を意味する；
３  アシル化は、KAc−（Ｎ−末端に結合したグルタミン酸残基と一緒に連結した2xOEGアミノ酸）−（C18二価脂肪酸［オクタデカン二酸］）を意味する；
４  アシル化は、KAc−（Ｎ−末端に結合したグルタミン酸残基と一緒に連結した2xOEGアミノ酸）−（C20二価酸［エイコサン二酸］）を意味する；
５  アシル化は、KAc−（Ｎ−末端に結合したグルタミン酸残基と一緒に連結した2xOEGアミノ酸）−（C22二価酸［ドコサン二酸］）を意味する；
６  アシル化は、KAc−（Ｎ−末端に結合したグルタミン酸残基と一緒に連結した2xOEGアミノ酸）−（C16二価酸［ヘキサデカン二酸］）を意味する；
７  アシル化は、KAc−（Ｎ−末端に結合したグルタミン酸残基と一緒に連結した3xOEGアミノ酸）−（C18二価酸［オクタデカン二酸］）を意味する；
８  アシル化は、KAc−（Ｎ−末端に結合したグルタミン酸残基と一緒に連結した1xOEGアミノ酸）−（C18二価酸［オクタデカン二酸］）を意味する；
９  アシル化は、KAc−（Ｎ−末端に結合したグルタミン酸残基と一緒に連結した2xOEGアミノ酸）−（C24二価酸［テトラコサン二酸］）を意味する；
１０  アシル化は、KAc−（Ｎ−末端に結合したグルタミン酸残基と一緒に連結した2xOEGアミノ酸）−（C26二価酸［ヘキサコサン二酸］）を意味する；
１１  アシル化は、KAc−（Ｎ−末端に結合したグルタミン酸残基と一緒に連結した2xOEGアミノ酸）−（C14二価酸［テトラデカン二酸］）を意味する
【０１１６】
試験に供したカルシトニン模倣体は、以下の修飾前コアペプチド配列に基づいている：
CSNLSTCMLGRLSQDLHRLQTYPKTDVGANAP  (KBP089)
CSNLSTC(AiB)LGRLSQDLHRLQTYPKTDVGANAP  (KBP066)
CGNLSTC(AiB)LGRLTQDLNKFHTFPKTDVGANAP   (KBP062)
CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTDVGANAP   (KBP042)
CSNLSTC(AiB)LGRLANFLVHSSNNFGAILPKTDVGANAP   (KBP110)
CSNLSTCMLGRLSQELHRLQTYPKTDVGANAP   (KBP021)
【０１１７】
表１ｂにおいて、以下の付加的な名称も用いた：
アシル化アミノ酸            ＫＢＰ修正名称
０１                        Ａ０１
０２                        Ａ０２
０３                        Ａ０３
・・                        ・・
ＸＸ                        ＡＸＸ
・・                        ・・
３１                        Ａ３１
３２                        Ａ３２
【０１１８】
アシル化の類型              付加名称
Ｃ１６                      ．０１
Ｃ１８二価酸                ．０２
Ｃ１８二価酸  2*OEG        ．０３
Ｃ２０二価酸  2*OEG        ．０４
Ｃ２２二価酸  2*OEG        ．０５
Ｃ１６二価酸  2*OEG        ．０６
Ｃ１８二価酸  3*OEG        ．０７
Ｃ１８二価酸  1*OEG        ．０８
Ｃ２４二価酸  2*OEG        ．０９
Ｃ２６二価酸  2*OEG        ．１０
Ｃ１４二価酸  2*OEG        ．１１
【０１１９】
実施例において、名称修正ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３は、ＫＢＰ−０６６コア配列の１１位がＣ１８二価酸2*OEGアシル化されたリシン残基で置換される修飾をしてなるペプチドを指す。
【０１２０】
【表１】
2021535119.tif 000009
【０１２１】
【表２】
2021535119.tif 000010
【０１２２】
【表３】
2021535119.tif 000011
【０１２３】
【表４】
2021535119.tif 000012
【０１２４】
【化８】
2021535119.tif 000013
【０１２５】
【化９】
2021535119.tif 000014
【０１２６】
【化１０】
2021535119.tif 000015
【０１２７】
【化１１】
2021535119.tif 000016
【０１２８】
最初のアシル化研究（実施例  １−５）
実施例１（図  １及び５）
異なる位置（９位“Ａ０９”、１１位“Ａ１１”、１６位“Ａ１６”、１８位“Ａ１８”、及び３２位“Ａ３２”）の１アシル化変異体の単回投与による食物摂取及び体重への効果と、非アシル化ベンチマークペプチド（ＫＢＰ−０８９）による効果の、１２週齢のリーンＳＤラットにおける比較
【０１２９】
【表５】
2021535119.tif 000017
【０１３０】
試験の４日前に、ラットを１匹ずつケージに入れた。それらを体重により６つの群に無作為化した（ビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）、ＫＢＰ（用量：２５ｎｍｏｌ／ｋｇ（^１００μｇ／ｋｇ））。ラットを一晩絶食させ、次いで、午前中に、皮下投与を用いてペプチド又はビヒクルの単回投与で処置した。食物摂取量を以下の間隔（０−４時間、４−２４時間、２４−４８時間）でモニタリングした。ベースラインにおける体重、及び、皮下注射後２４時間及び４８時間における体重を測定した。
１アシル化を用いた位置“Ａ０９”、“Ａ１１”及び“Ａ３２”のアシル化は、ｉｎ  ｖｉｖｏ反応を延長させたため（図１）、さらに試験するに値するものであった（以下を参照）。１２位（図５）、１６位及び１８位は、受け入れられない結果を示したため、さらに試験を進めることはなかった。
【０１３１】
実施例２：β−アレスチンアッセイ
PathHunter β−アレスチンＧＰＣＲアッセイは、β−アレスチンと活性化ＧＰＣＲとの相互作用を検出することによってＧＰＣＲを活性化させるリガンドの能力を直接測定する全細胞機能アッセイである。β−アレスチン動員はＧタンパク質シグナル伝達とは独立しているため、これらのアッセイは、事実上あらゆるＧｉ− 、  Ｇｓ、 またはＧｑ−カップリング受容体のために使用され得る、強力かつ普遍的なスクリーニング及びプロファイリングのプラットフォームを提供する。
【０１３２】
このシステムにおいて、ＧＰＣＲをインフレーム（in frame）となるように、
小さな酵素断片であるＰｒｏＬｉｎｋ（商標）と融合させ、β−アレスチンと、より大きなβ−ｇａｌのＮ末端欠失変異体との融合タンパク質（酵素アクセプター又はＥＡと称される）を安定に発現する細胞において共発現させた。ＧＰＣＲの活性化は、ＰｒｏＬｉｎｋでタグ付けされたＧＰＣＲへのβ−アレスチンの結合を刺激し、  ２つの酵素断片に相補性を持たせ、 その結果と して活性β−ｇａｌ酵素の形成をもたらす。この相互作用は、化学発光性のＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用して測定され得る酵素活性を増加させる。
【０１３３】
独立したバイオアッセイにおいて、ＣＴＲ及びＡＭＹ−Ｒ細胞を、下記の表２及び表３に特定される漸増用量のＫＢＰ（１００、２０、４、０．８、０．１６、０．０３２ｎＭ及びビヒクル）を用いて、表示される時点に処理した。
アッセイは、白色３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、７８４０８０）で行った。実験の前日に、１０μＬの細胞型特異的培地に１ウェル当たり２５００個の細胞で細胞を播種した。ＧＰＣＲによって媒介されるβ−アレスチン動員を定量化するために、Ｐａｔｈｈｕｎｔｅｒ（商標）  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（９３−０００１、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）を使用して、製造者の指示書に従ってアッセイを行った。
【０１３４】
反応の延長／持続は、カルシトニン受容体（ＣＴＲ）：ＤｉｓｃｏｖｅＲｘのＵ２ＯＳ−ＣＡＬＣＲ（カタログ番号９３−０５６６Ｃ３）細胞株を用いて行い、そして、古典的な３時間産出量とは対照的に、β−アレスチン蓄積を３時間、６時間、２４時間、４８時間又は７２時間に亘って行い、アッセイと分析を行った。
β−アレスチン研究の結果を、表２（２アシル化）及び表３（３アシル化）に記載する。
【０１３５】
【表６】
2021535119.tif 000018
【０１３６】
【表７】
2021535119.tif 000019
【０１３７】
β−アレスチン研究は、以下の点を示した。
１）アシル化の効力は、ペプチドのアシル化位置の点では、次のとおりである：Ａ１１＞Ａ３２＞Ａ０９。
２）１１位（Ａ１１）の２又は３アシル化は、カルシトニン受容体（ＣＴＲ）、アミリン受容体（ＡＭＹ−Ｒ）、ＣＴＲ応答延長、及び、食物摂取抑制の活性化の点では、いずれのペプチドコアについても概して、極めて優れたアシル化／位置の組み合わせである。
３）異なるペプチドコアを用いたアシル化ＫＢＰは、同じアシル化を用いて修飾する場合に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて同様の効力及びパターンを示す。
【０１３８】
実施例３（図２）
ＫＢＰ０８９の３アシル化変異体であるＡ０９（ＫＢＰ３７５）、Ａ１１（ＫＢＰ３７６）及びＡ３２（ＫＢＰ３７７）の単回投与による食物摂取及び体重への効果と、非アシル化ベンチマークペプチド（ＫＢＰ−０８９）による効果の、１２週齢のＨＦＤ  ＳＤラットにおける比較
【０１３９】
【表８】
2021535119.tif 000020
【０１４０】
試験の４日前に、ラットを１匹ずつケージに入れた。それらを体重により１１個の群に無作為化した（ビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）、ＫＢＰ（用量：３６ｎｍｏｌ／ｋｇ（１５０−１５７μｇ／ｋｇ））。ラットを一晩絶食させ、次いで、午前中に、皮下投与を用いてペプチド又はビヒクルの単回投与で処置した。食物摂取量を以下の間隔（０−４時間、４−２４時間、２４−４８時間  …  １４４−１６８時間）でモニタリングした。ベースラインにおける体重、及び、皮下注射後２４時間ごとの体重を測定した。
動物モデル研究により、β−アレスチン研究の結果が確認され、未修飾ペプチドとの対比において改善された効果を証明した。
１）コアペプチドとしてＫＢＰ−０８９を用いたアシル化位置の有益度の点では、Ａ１１＞Ａ３２＞Ａ０９。
２）２アシル化及び３アシル化は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの活性及び効果の延長の点では、所定の投与量において非アシル化ＫＢＰ−０８９よりも極めて優れている。
動物モデル研究は、９位アシル化によってペプチドの効力が未修飾ペプチドと比較して低下することも示したため、９位を、さらに研究を進める重要な位置付けから除外した。
【０１４１】
実施例４（図３）
異なるペプチドコアを用いた３アシル化変異体であるＡ１１及びＡ３２の単回投与による食物摂取及び体重への効果と、それぞれの非アシル化ベンチマークＫＢＰ（ＫＢＰ−０６６、ＫＢＰ−０６２及びＫＢＰ−１１０）による効果の、２０週齢のＨＦＤ  ＳＤラットにおける比較
【０１４２】
【表９】
2021535119.tif 000021
【０１４３】
試験の４日前に、ラットを１匹ずつケージに入れた。それらを体重により１１個の群に無作為化した（ビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）、ＫＢＰ（用量：４ｎｍｏｌ／ｋｇ（^１７μｇ／ｋｇ）、１２ｎｍｏｌ／ｋｇ（^５０μｇ／ｋｇ）、又は、３６ｎｍｏｌ／ｋｇ（^１５０μｇ／ｋｇ））。ラットを一晩絶食させ、次いで、午前中に、皮下投与を用いてペプチド又はビヒクルの単回投与で処置した。食物摂取量を以下の間隔（０−４時間、４−２４時間、２４−４８時間  …  １４４−１６８時間）でモニタリングした。ベースラインにおける体重、及び、皮下注射後２４時間ごとの体重を測定した。
結果は、以下のとおりである：
１）ペプチドコアは、１１位又は３２位のアシル化により観察される向上には影響を与えなかった。
２）Ａ１１は、Ａ３２よりも良好なアシル化部位であった。
【０１４４】
実施例５（図４）
２０週齢のＨＦＤ  ＳＤラットにおける、ＫＢＰ−０４２及びＫＢＰ−０６６のＡ１１／３アシル化変異体の単回高用量投与による食物摂取及び体重への効果
試験の４日前に、ラットを１匹ずつケージに入れた。ラットを、体重により１１個の群に無作為化した（ビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）、ＫＢＰ（用量：３００ｎｍｏｌ／ｋｇ（^１０００μｇ／ｋｇ））。
【０１４５】
【表１０】
2021535119.tif 000022
【０１４６】
ラットを一晩絶食させ、次いで、午前中に、皮下投与を用いてペプチド又はビヒクルの単回投与で処置した。食物摂取量を以下の間隔（０−４時間、４−２４時間、２４−４８時間  …  １８８−３１２時間）でモニタリングした。ベースラインにおける体重、及び、皮下注射後２４時間ごとの体重を測定した。
ＫＢＰ３５６及びＫＢＰ３７２を用いた高用量試験は、効果がｉｎ  ｖｉｖｏで数日間持続する優れた延長を示した。したがって、これらのアシル化ペプチドは、週１回投与ペプチド治療薬の開発にとって明確な候補である。
【０１４７】
実施例６（図６−１０）
化合物ＫＢＰ−３５６（ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３）の研究を、さらに進めた。この化合物は、ペプチドの８位にＡｉＢ残基、及び、１１位に好ましいアシル化を含む。
長期研究を、雄ＺＤＦラット（肥満性ホモ接合体劣性形質（obese homozygous recessive）（ｆａ／ｆａ）系統：３７０）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、米国）において行った。ラットは５週齢のものを配達した。ラットは、１ケージ当たり２匹−３匹入れて飼育した。
【０１４８】
雄ＺＤＦラットの長期処置：
ラットを、Ｎｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅの動物施設へ、５週齢（−６日）の時点で配達した。ラットを３日間順応させた。ＨｂＡ１ｃ、及び、ＢＷを記録した（−３日）。ラットを、ＨｂＡ１ｃ（第１位）及びＢＷ（第２位）に基づいて、４日目に無作為化した。１日目に研究を開始した。
【０１４９】
投与の濃度及び頻度
動物に、１日一回、ＫＢＰ−０６６又は生理食塩水（ビヒクル）を投与した。
ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３の投与は、３日ごとに１回行った。投与は、正午前後に皮下投与（ｓｃ）した。
生理食塩水：投与容量は１ｍＬ／ｋｇとした。
ＫＢＰ−０６６：投与容量は１ｍＬ／ｋｇとし、投与濃度は５、５０又は５００μｇ／ｋｇとし、化合物濃度は５、５０又は５００ｍｇ／Ｌとした。ｎｍｏｌ／ｋｇ表示の投与等量は、それぞれ１．４３、１４．３又は１４３ｎｍｏｌ／ｋｇである。
ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３：投与容量は１ｍＬ／ｋｇとし、投与濃度は２５ｎｍｏｌ／ｋｇとし、化合物濃度は２５ｍｍｏｌ／Ｌとした。μｇ／ｋｇ表示の投与等量は、１０４μｇ／ｋｇである。
【０１５０】
【表１１】
2021535119.tif 000023
【０１５１】
【表１２】
2021535119.tif 000024
【０１５２】
処置群ごとの１週間の総投与量
５μｇ／ｋｇ  ＫＢＰ−０６６は、３５μｇ／ｋｇ／週、又は、１０ｎｍｏｌ／ｋｇ／週に等しい。
５０μｇ／ｋｇ  ＫＢＰ−０６６は、３５０μｇ／ｋｇ／週、又は、１００．４ｎｍｏｌ／ｋｇ／週に等しい。
５００μｇ／ｋｇ  ＫＢＰ−０６６は、３５００μｇ／ｋｇ／週、又は、１００４ｎｍｏｌ／ｋｇ／週に等しい。
２５ｎｍｏｌ／ｋｇ  ＫＢＰ−０６６は、２４３．４μｇ／ｋｇ／週、又は、５８．３ｎｍｏｌ／ｋｇ／週に等しい。
化合物は、生理食塩水に溶解し、−２０℃で保管した。小分けしたものを投与直前に解凍した。
【０１５３】
試験結果のまとめ
−３日：ＨｂＡ１ｃ測定
１日目：（研究の第１日）、ラットを６時間絶食させ、ＢＧ及び血液サンプルを採取した。その後、投与を行った。
１４日目：絶食時血糖（ＦＢＧ）＋血液サンプル（６時間絶食）
２８日目：ＦＢＧ＋血液サンプル（６時間絶食）
４２日目：ＦＢＧ＋血液サンプル（６時間絶食）
５７日目：（群１＋２）／５８日目（群３＋４）  ＫＢＰ−０６６又はＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３を事前投与しないＯＧＴＴ（１１時間絶食）。Ｈｂ１Ａｃは、ＯＧＴＴ途中のｔ＝１２０又はｔ＝１８０の時点に測定した。
６２日目：ＦＢＧ＋血液サンプル（６時間絶食）
【０１５４】
食物摂取
食物摂取は、毎日モニターした。体重は、最初の３週間は毎日モニターし、それから３週間目以降は、１週間に２回モニターした。
【０１５５】
絶食時血糖値
絶食時血糖値は、Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｃｋ（登録商標）  Ａｖｉａ  モニタリングシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ｒｏｔｋｒｅｕｓ、スイス）を使用して、２週間ごとにモニターした：測定は、尾静脈から行った。
【０１５６】
ＨｂＡ１ｃ
ラットは、１回目（不作為化）及び２回目（２回目ＯＧＴＴ後）のＨｂＡ１ｃ測定のためには非絶食とした。血液一滴をＨｂＡ１ｃカセットに適用し、ＤＣＡバンテージアナライザー（ＤＣＡ  Ｖａｎｔａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いてＨｂＡ１ｃを測定した。化合物又は生理食塩水の投与は、１回目及び２回目のＨｂＡ１ｃ測定の測定中に、引き続き行った。
【０１５７】
経口糖負荷試験
経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）は処置の８週間後に行った。前日からの体重を用いて、グルコース投与量を計算した。動物は１１時間絶食させた。−３０分時点（以下の図表を参照）よりもおよそ４５分前に加熱した。動物には、第１回目ＯＧＴＴの実施中に、ＫＢＰ−０６６、ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３又は生理食塩水を事前投与したが、第２回目ＯＧＴＴにおいては事前投与しなかった。それゆえ、以下の図表には（Ｃ）と記載している。
【０１５８】
【表１３】
2021535119.tif 000025
【０１５９】
結果
図６Ａ＋Ｂ、食物摂取の蓄積
図６Ａに、研究経過中の食物摂取蓄積を示す。Ａ１１処置群は、ビヒクル群よりも食物摂取が少なかった。また、投与量が高いほど、食物摂取の低下がより大きくなった。アシル化されたＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３処置群は、ＫＢＰ−０６６の全ての投与量群と比べて、食物摂取の低下が最も大きかった。研究終了時点において、全ての処置群は、研究期間中の食物消費について、ビヒクル群と比べて有意の低下がみられ、アシル化ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３処置群は、食物摂取について最も大きな低下；すなわち、ビヒクル群との対比（図６Ｂ）で３５％に達する食物摂取の低下を示した。
【０１６０】
図７Ａ＋Ｂ、体重
全ての処置群において、研究の最初３週間が経過する間に体重が減少した。ＺＤＦビヒクルラットは病態悪化が進行し、その体重／増加率を維持できなくなったが（図７Ａ）、処置群は体重の点でビヒクル群に追いついた。
ビヒクル群と比較した体重増加速度は、投与量に依存し、また、処置群で用いた化合物のタイプにも依存した（図７Ｂ）。アシル化ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３処置群の回復速度は最も遅く、１４．３ｎｍｏｌ／ｋｇ群及び１４３ｎｍｏｌ／ｋｇ群がそれに続き、体重回復が最も速いものは１．４３ｎｍｏｌ／ｋｇ群であった。
これは、アシル化ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３を３日ごとに１回皮下投与療法により投与する場合には、非アシル化ＫＢＰ−０６６を１日１回皮下投与する場合に勝る付加的な薬理学的利益を有することを示している。
【０１６１】
図８、絶食時血糖値
ＺＤＦビヒクルラットは病態悪化が進行し、ＦＧＢを維持できなくなったが、全ての処置群は研究が経過する間、ビヒクル群と比べてＦＢＧを効果的に減衰させた。アシル化ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３処置は、最も効果的な処置であり、この処置だけが、この極めて攻撃的な２型糖尿病の動物モデルにおける６２日間の研究中にＦＢＧの増加をわずか５ｍＭとすることができた。非アシル化ＫＢＰ−０６６は、投与量依存的にＦＢＧを低下させたが、しかし、ＦＢＧ減衰においてアシル化処置群の効力と同等ではなかった。また、これは、アシル化ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３が、非アシル化ＫＢＰ−０６６に勝る付加的な薬理学的利益を有することを示している。
【０１６２】
図９、ベースライン時点及び研究終了時点のＨｂＡ１ｃ
期待されるように、雄ＺＤＦラットにおける糖尿病の発症及び処置様式を開始する前のベースライン時点のＨｂＡ１ｃは、ほぼ同じである（図９Ａ）。
研究終了時点（６２日目）において、全ての処置群は、ビヒクル群と比べてＨｂＡ１ｃレベルを優位に低下させていた。興味深いことに、アシル化ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３処置群は、最も低いＨｂＡ１ｃ値を有していた。また、それは、全ての非アシル化ＫＢＰ−０６６処置群と比べても有意に低く（図９Ｂ）、非アシル化同等体との対比においてアシル化がさらに優位であることを示している。
【０１６３】
図１０、経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）
経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）は処置の８週間後に行った。その結果を図１０Ａに示す。処置によって誘導されたＦＢＧの相違により、個々のＯＧＴＴ曲線は著しく異なっている。この相違は、計算されたｔＡＵＣ値において目立っている（図１０Ｂ）。全ての処置群は、ビヒクル群と比べて有意に低いｔＡＵＣを有している。アシル化ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３処置群は、最も低いｔＡＵＣ値を有しており、３つの非アシル化ＫＢＰ−０６６処置群のうちの２つと比べても有意に低く、残った１群である１４３ｎｍｏｌ／ｋｇ  ＫＢＰ−０６６（図１０Ｂ）と比べたときのｐ値は０．０６であった。
結論として、まとめられたデータは、肥満かつ糖尿ＺＤＦラットにおいて、アシル化ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３を３日ごとに皮下投与療法により投与する場合には、非アシル化ＫＢＰ−０６６を毎日１回皮下投与する場合に勝る付加的な薬理学的利益を有することを示している。
【０１６４】
実施例１−６の結果の概要
アシル化部位によるアシル化研究の結果
０９位（ペプチドの９位のアシル化）
１アシル化を用いたＡ０９位のアシル化は、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性の持続的な延長を生じさせ、これは試験をさらに進める価値があった（図１Ａ−Ｆ）。
さらに、２アシル化及び３アシル化を用いたＡ０９位のアシル化は、ＣＴＲ及びＡＭＹＲ受容体の両方のＥＣ５０を減弱化し、ＣＴＲの延長応答を生じさせなかった（表３−４）。
しかし、２アシル化及び３アシル化を用いた位置Ａ０９のアシル化は、以前観察されていたコアペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの効果延長を妨害し、アシル化ＫＢＰの効力をビヒクルと同様にしてしまう。それゆえ、それらは、３６ｎｍｏｌ／ｋｇ化合物を単回皮下注射した後の食物摂取と体重の低下の両方において、非アシル化コアペプチド（図２Ａ−Ｂ）よりも効力が低かった。
したがって、位置Ａ０９について、さらに検討することはなかった。
【０１６５】
Ａ１１位（ペプチドの１１位のアシル化）
１アシル化を用いたＡ１１位のアシル化は、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性の持続的な延長を生じさせ、これは試験をさらに進める価値があった（図１Ａ−Ｆ）。
２アシル化及び３アシル化を用いたＡ１１位のアシル化は、ＣＴＲ及びＡＭＹＲ受容体の両方について最良のＥＣ５０値アッセイ結果が得られ、全てのコアペプチドに亘って最高の延長応答の値（ｔＡＵＣ）を生じさせた（表３−４）。
さらに、Ａ１１／３アシル化は、コアペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を、３６ｎｍｏｌ／ｋｇ化合物を単回皮下注射した後の食物摂取の低下（図２Ａ）と体重の低下（図２Ｂ）の両方において、非アシル化コアペプチドと比べて有意に向上させた。また、Ａ１１／３アシル化は、コアペプチドとしてＫＢＰ−０８９を用いた場合の他のいずれのアシル化位置と比べても、食物摂取と体重の低下の点でより優れていた（図２Ａ−Ｂ）。
【０１６６】
この相違は、３つの投与量の全て（４ｎｍｏｌ／ｋｇ、１２ｎｍｏｌ／ｋｇ及び３６ｎｍｏｌ／ｋｇ）は、それらに対応するＡ３２／３アシル化ペプチドよりも優れていた用量反応試験において、さらに理解される。効力の点で、最も低用量である４ｎｍｏｌ／ｋｇのＡ１１／３は、３６ｎｍｏｌ／ｋｇのＡ３２／３アシル化ペプチドと同様のプロファイルを有していた。これは、試験を行った全てのコアペプチドについて矛盾なく実証されていた（図３Ａ−Ｆ）。
３アシル化を用いたＡ１１位の効力をさらに調べるために、３アシル化を用いて位置Ａ１１をアシル化したＫＢＰ−０４２及びＫＢＰ−０６６を高投与量（３００ｎｍｏｌ／ｋｇ）で試験し、非アシル化体と比較したところ、バイオアベオラビリティの延長と組み合わされたｉｎ  ｖｉｖｏ効果の延長について潜在的な最大効果を示した。（図４Ａ−Ｄ）。
Ａ１１位の３アシル化は、ＫＢＰ−０４２（図４Ａ）及びＫＢＰ−０６６（図４Ｃ）の両方について、食物摂取を１２０時間以上減衰し、^１４４時間後にビヒクル群における食物消費レベルへ回復した。処置によって媒介された体重減少は、ＫＢＰ−０４２（図４Ｂ）及びＫＢＰ−０６６（図４Ｄ）の両方について、９６時間後にピークに達し、体重は、^２４０時間後にベースラインレベルへ回復した。
結論として、Ａ１１は、リガンド効力を保存し、ｉｎ  ｖｉｖｏ効果の延長を最大化する点で、試験したもののなかで最良の位置であった。
【０１６７】
Ａ１２位（ペプチドの１２位のアシル化）
１アシル化を用いたＡ１２位のアシル化は、４時間食物摂取研究において、ビヒクル群と比較して最も悪いｉｎ  ｖｉｖｏの結果を生じさせた（図５）。
したがって、Ａ１２位は、アシル化するための良い候補ではなく、試験をさらに進めることはなかった。
【０１６８】
Ａ１６位（ペプチドの１６位のアシル化）
１アシル化を用いたＡ１６位のアシル化は、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性の延長を示さなかった（図１Ａ−Ｆ）。
したがって、Ａ１６位は、１アシル化を用いる良い候補ではなく、試験をさらに進めることはなかった。
【０１６９】
Ａ１８位（ペプチドの１８位のアシル化）
１アシル化を用いたＡ１６位のアシル化は、４−２４時間の試験期間に亘り有効であったが、しかし、長期活性研究においては、観察された効果が維持されなかった（ＫＢＰ−３４７、４８時間、図１Ｆ）。
したがって、Ａ１８位は、１アシル化を用いる良い候補ではなく、試験をさらに進めることはなかった。
【０１７０】
Ａ３２位（ペプチドの３２位のアシル化）
１アシル化を用いたＡ３２位のアシル化は、食物摂取と体重の低下の両方において、ｉｎ  ｖｉｖｏでの効果の延長を示し、試験したもののなかで最良であった（図１Ａ−Ｆ）。
２アシル化及び３アシル化を用いたＡ３２位のアシル化は、ＣＴＲ及びＡＭＹＲ受容体の両方について、Ａ１１位と比べてＥＣ５０のアッセイ値が劣っている結果が得られた。Ａ３２位のアシル化は、Ａ１１位と比べて、ＣＴＲが媒介する応答の延長を僅かに減衰したが、それでもなお応答の延長を維持していた（表３−４）。
Ａ３２位のアシル化は、試験した全てのコアペプチドについて、対応する非アシル化体に比べて、単回皮下投与によるｉｎ  ｖｉｖｏ効果を向上させた。
しかし、この位置は、等量投与でのｉｎ  ｖｉｖｏ研究の実施中に試験した全ての２アシル化及び３アシル化において、Ａ１１よりも劣っていた（図２Ａ−Ｂ、図３Ａ−Ｆ）。
結論として、Ａ３２は、１、２及び３アシル化を用いてリガンド効力を保存し、ｉｎ  ｖｉｖｏ効果を向上させる観点において、Ａ１１位と比べて、良くも悪くもない位置であった。
【０１７１】
さらなるアシル化研究（実施例７−１２）
実施例７：β−アレスチン及びチオフラビンＴアッセイ
追加的なPathHunter β−アレスチンＧＰＣＲアッセイを、実施例２に関連して記載したのと同じ手順を用いて実施した。独立したバイオアッセイにおいて、  ＣＴＲ及びＡＭＹ−Ｒ細胞を、表４．１−表４．４に特定される漸増用量のＫＢＰ（１μＭ−０．１ｎＭの範囲、及びビヒクル）を用いて、表示される時点に処理した。
【０１７２】
チオフラビンＴアッセイも行った。チオフラビンＴ（ＴｈＴ）は、アミロイド繊維を検出するために広く用いられている染料である。繊維の存在下で、ＴｈＴは、４５０ｎｍにおける最大励起と、４８０ｎｍにおける増強発光を有するのに対し、ＴｈＴはアミロイド繊維と結合しないと、これらの波長において本質的に非蛍光性である。
したがって、蛍光プレートリーダと組み合わせたＴｈＴは、アミロイド繊維存在について多数のｉｎ  ｖｉｔｒｏサンプルをスクリーニングするための理想的なツールである。
ＫＢＰに用いられるＴｈＴアッセイは、インスリン繊維形成を測定するためにＮｉｅｌｓｅｎらによって記述された手順（Nielsen L, Khurana R, Coats A, Frokjaer S, Brange J, Vyas S, et al. Effect of environmental factors on the kinetics of insulin fibril formation: elucidation of the molecular mechanism. Biochemistry. 2001; 40(20): 6036-46.1）を改変したものである。
【０１７３】
繊維形成スクリーニングアッセイは、３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、７８４０８０）で、最終容量を２０μＬとした同じサンプルを３つ用いて行った。アッセイの過程でサンプル蒸発を防止するために、光学粘着フィルムを用いてプレートを封止した。
プレートを、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ７．０．２  ソフトウエア、及び、温度３７℃、励起波長４５０ｎｍ及び発光波長４８０℃に設定したテンプレートを組み込んだＳｐｅｃｔｒａＭａｘなどの蛍光プレートリーダに格納する。
プレートリーダは、１０分おきに２４時間測定し、最初の読み取り前に５秒間のプレート振動、及び、他の全ての読み取り前に３５秒間のプレート振動を行う。代替として、プレートを、以下のインキュベーション時間経過後に読み取る；０時間、１時間、２時間、４時間及び２４時間。
【０１７４】
相対的蛍光ユニット（ＲＦＵ）を時間の関数としてプロットする。繊維形成は、Ｎｉｅｌｓｅｎらによって記述されているように、ベースラインを超えるＲＦＵの増加として決定される。
本明細書においては、ペプチド繊維形成能力を反映する単一の出力を得るために、１８ｈ蛍光シグナルに基づいて、４つの繊維形成階層が定義されている：
無し＝  ＜１０００ＲＦＵ、低＝  １０００−３０００ＲＦＵ、中＝  ３０００−１００００、高＝  ＞１００００
チオフラビンＴアッセイの結果を、表４．１から表４．４にも示す。
【０１７５】
【表１４】
2021535119.tif 000026
【０１７６】
【表１５】
2021535119.tif 000027
【０１７７】
【表１６】
2021535119.tif 000028
【０１７８】
【表１７】
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【０１７９】
【表１８】
2021535119.tif 000030
【０１８０】
結果  −  アシル化長
アシル化長の関数としてみたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力の点では、アシル化長とｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力の間に、明らかな相関がみられた。最も短かいアシル化である、１１（Ｃ１４二価酸）及び６（Ｃ１６二価酸）によって、ＣＴＲ及びＡＭＹＲ受容体の両方において最も低いＥＣ５０値となった（表４．１）のに対し、最も長いアシル化である、９（Ｃ２４二価酸）及び１０（Ｃ２６二価酸）は、両方の受容体において、いくつかの最高のＥＣ５０値を記録した。
ＫＢＰ−０６６主鎖を用いたこの系で試験したアシル化ペプチドは、いずれも、繊維形成の問題を生じなかった。
【０１８１】
結果  −  ＫＢＰ−０６６主鎖上のアシル化位置
この系におけるＣＴＲ及びＡＭＹＲ受容体のＥＣ５０値は、表４．２に列挙している。ＫＢＰ−０６６主鎖上のアシル化位置の関数としてみたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力の点では、３つの位置が、カルシトニン及びアミリン受容体デュアルアゴニスト能力を有するものとして突出している。Ａ１１、Ａ１９及びＡ２４は全て、両方の受容体のＥＣ５０値が５ｘ１０−９Ｍの範囲内であって無比のものであるのに対し、その他の試験した位置は、それとの比較において充分な能力を有してなかった。Ａ１１、Ａ１９及びＡ２４における効力の増加は、ＫＢＰ−０６６主鎖についてのｉｎ  ｖｉｖｏ効果の改善につながることが明白である（本明細書に添付した図１５、１７及び１８を参照）。興味深いことに、Ａ０９はこのなかで最も良好なＣＴＲアゴニストであるものの、ＡＭＹＲ活性には乏しいが、これは、Ｎ−末端に近い位置のアシル化されるとＡＭＹＲ活性が妨害され、偏ったリガンドが形成されることを示唆している。
無比のペプチド（ＫＢＰ−０６６Ａ１６．０３（３８７））がＴｈＴアッセイにおいて“低”スコアを与えたが、ＫＢＰ−０６６主鎖のほとんどの位置について、繊維形成は、明白には出現しなかった。
【０１８２】
結果  −  ＫＢＰ−０２１主鎖上のアシル化位置
この系におけるＣＴＲ及びＡＭＹＲ受容体のＥＣ５０値は、表４．３に列挙している。ＫＢＰ−０２１主鎖上のアシル化位置の関数としてみたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力の点では、２つの位置が、デュアルアゴニスト能力を有するものとして突出している。Ａ１１及びＡ１９は両方とも、両方の受容体のＥＣ５０値が５ｘ１０−９Ｍの範囲内であって無比のものであるのに対し、その他の試験した位置は、それとの比較において充分な能力を有してなかった。Ａ１１及びＡ１９における効力の増加も、ＫＢＰ−０２１主鎖についてのｉｎ  ｖｉｖｏ効果の改善につながることが明白である（本明細書に添付した図１６を参照）。
興味深いことに、繊維形成は、ＫＢＰ−０２１主鎖について明白に出現したが、試験されたペプチドの中で無比であるＡ１９は、ＴｈＴアッセイにおいて “高”スコアを与えたにもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方において良好な効力を与えた。その隣の位置である１８位も、ＴｈＴアッセイにおいて高めの “中”スコアを与えたことから、ＫＢＰ−０２１主鎖は、主鎖のこの領域がアシル化されると、繊維形成の影響を受けやすいことを示唆している。
さらに、Ａ１１位上の４アシル化及び５アシル化はＴｈＴアッセイにおいて“低”スコアと評点されたが、この問題は、有利なＡ１１位のアシル化には影響しなかったことから、鎖長がさらに長いアシル化も、この主鎖ＫＢＰ−０２１について明白に繊維形成を出現させた。
【０１８３】
結果  −  アシル化連結基
この系におけるＣＴＲ及びＡＭＹＲのＥＣ５０値は、表４．４に列挙している。ＫＢＰ−０６６主鎖上のアシル化位置の関数としてみたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力の点では、ＯＥＧ−ＯＥＧ−γＧＬＵ連結基（３５６）は、ＯＥＧ−ＯＥＧ−ＯＥＧ−γＧＬＵ（３８５）、及び、ＯＥＧ−γＧＬＵ（３８４）と比べて、ＣＴＲにおけるＥＣ５０がほぼ１０倍であったが、しかしながら、ＡＭＹＲにおける全ての連結基のＥＣ５０が５×１０−９Ｍの範囲であり、極めて近似していた。
繊維形成の点では、最も短い連結基であるＯＥＧ−γＧＬＵ（３８４）はＴｈＴアッセイにおいて“低”スコアとなったのに対し、他の２つの連結基は“無し”スコアとなった。
【０１８４】
実施例８：（図１１）
高脂肪食を実験前８週間給餌した２０週齢の高齢ＳＤラットを用いた急速的条件設定における食物摂取及び体重についての、位置及び主鎖が同じである幾つかアシル化変異体（３、４、５、６、９、１０、１１）、すなわち位置及び主鎖がそれぞれＡ１１及びＫＢＰ−０６６であるものの単回投与による効果の比較
【０１８５】
【表１９】
2021535119.tif 000031
【０１８６】
ラットを試験の４日前に１匹ずつケージに入れた。ラットを、体重によって無作為化して８つの群（ビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）、ＫＢＰ（用量：３ｎｍｏｌ／ｋｇ（^１０−１１μｇ／ｋｇ））に分けた。それらを一晩、絶食させてから、ペプチド又はビヒクルを、午前中に皮下投与を用いて、単回投与により処置した。食物摂取を以下の間隔（０−４時間、４−２４時間、２４−４８時間、４８−７２時間及び７２−９６時間）でモニターした。体重を、ベースラインの時点、及び、皮下注射後４時間、２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間の時点で測定した。
【０１８７】
図１１の結果  −  食物摂取及び体重
アシル化６、１０、１１は、食物摂取及び体重を減衰させることが可能であり、２４時間時点で抑制がピークに達し、その後、ビヒクルレベルに回復した。アシル化９は、食物摂取及び体重を減衰させることが可能であり、４８時間時点で抑制がピークに達し、その後、ビヒクルレベルに回復した。アシル化３は、食物摂取及び体重を減衰させることが可能であり、７２時間時点で抑制がピークに達し、その後、ビヒクルレベルに回復した。アシル化４及び５は、食物摂取及び体重を減衰させることが可能であり、９６時間時点で抑制がピークに達し、その後、回復した。
そのため、げっ歯類における３日間ごとの投与は、ヒトにおける１週間に１回投与につながるところ、当初の目標は、食物摂取及び体重を少なくとも７２時間抑制することであったから、アシル化３、４及び５は、アシル化長について優良な候補である。
【０１８８】
実施例９（図１２、１３及び１４）
急速試験の結果によれば最良の能力を示すもの、すなわちアシル化変異体（３、４、５）について、さらに研究を進め、同じ位置及び主鎖、すなわちＡ１１及びＫＢＰ−０６６を用いたアシル化による効果を比較するために、繰り返し投与を用いる研究を行った。食物摂取及び体重を、高脂肪食を研究開始前８週間給餌した２０週齢のＳＤラットにおける長期的条件設定（５週間研究）を行うことにより調べた。
【０１８９】
【表２０】
2021535119.tif 000032
【０１９０】
ラットを２匹ずつケージに入れ、体重によって無作為化して処置群（ビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）、ＫＢＰ（用量：３ｎｍｏｌ／ｋｇ（^１４μｇ／ｋｇ））に分けた。食物摂取及び体重を、３５日間、毎日モニターした。研究終了時に、ＯＧＴＴを実施し、その後、殺処分して脂肪組織の採取及び重量測定を実施した。
【０１９１】
高脂肪食を与えた雄ＳＤラットの長期処置
ラットを、Ｎｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅの動物施設へ、１２週齢の時点で配達し、直ちに高脂肪食に切り替え、追加的に８週間、給餌した。研究開始前、ラットを体重により無作為化した。研究は第１日目に開始した。
【０１９２】
投与濃度及び頻度
動物に、ＫＢＰを３日目ごとに投与した。投与は、毎回正午前後に皮下経路（ＳＣ）で行った。化合物を生理食塩水に溶解し、−２０℃で保管した。小分けしたものを投与直前に解凍した。
生理食塩水：投与容量は１ｍＬ／ｋｇとした。
ＫＢＰ：投与容量は１ｍＬ／ｋｇとし、投与濃度は４ｎｍｏｌ／ｋｇとした。
投与等量は、μｇ／ｋｇ表示で^１４μｇ／ｋｇであった。処置群ごとの１週間の総投与量：４ｎｍｏｌ／ｋｇ  ＫＢＰは、２８ｎｍｏｌ／ｋｇ／週、又は、^１００μｇ／ｋｇ／週
【０１９３】
試験結果のまとめ
１日目：（研究の第１日）投与を行った。
１−３５日目：食物摂取及び体重の毎日測定
３５日目：体重の研究終了時点
３５日目：経口糖負荷試験
３５日目：殺処分＋脂肪組織の重量測定
【０１９４】
経口糖負荷試験
糖負荷試験（ＯＧＴＴ）は処置の５週間後に行った。前日からの体重を用いて、グルコース投与量を計算した。動物は１１時間絶食させた。−３０分時点（以下の図表を参照）よりもおよそ４５分前に加熱した。動物には、ＯＧＴＴの１日前に、ＫＢＰ又はビヒクルを投与した。
【０１９５】
【表２１】
2021535119.tif 000033
【０１９６】
白色脂肪組織（ＷＡＴ）の重量測定
精巣上体全体及び腎周囲のＷＡＴ蓄積を切り取って、重量を測定した。鼠径部ＷＡＴについては、特定された解剖学的に限定された領域（a fixed anatomical limited area）を切り取って、重量を測定した。
【０１９７】
図１２の結果、食物摂取及び体重
図１２は、長期研究の期間中に亘る処置の関数としての食物摂取及び体重の変化を示す。図１２Ａは、アシル化３、４及び５の食物摂取の動態を示しており、一方、図１２Ｂは、アシル化３、４及び５によって媒介された体重減少を示す。
【０１９８】
図１３の結果、ＯＧＴＴ及び脂肪組織
図１３は、ＯＧＴＴから得られた結果を、それに対応するｉＡＵＣ（ＯＧＴＴ）（図Ａ＋Ｂ）とともに示し、さらに、３つの異なる脂肪組織、すなわち精巣上体、鼠径部及び腎周囲の重量（図１３Ｃ−Ｅ）、及び、研究終了時の体重（図１３Ｆ）を示す。アシル化３を用いた処置は、ｉＡＵＣ（ＯＧＴＴ）、精巣上体ＷＡＴの大きさ、腎周囲ＷＡＴの大きさ、及び、体重の有意な低下を引き起こした。アシル化４及びアシル化５を用いた処置は、ｉＡＵＣ（ＯＧＴＴ）、精巣上体ＷＡＴの大きさ、及び、体重の有意な低下を引き起こしたが、腎周囲ＷＡＴの大きさについては引き起こさなかった。いずれの処置も、鼠径部ＷＡＴの大きさを優位に低下させなかった。アシル化３は、アシル化４／５と比較すると、ビヒクルに対してわずかに良好であったが、しかしながら、処置群の間に有意差はなかった。
【０１９９】
図１４の結果、競合的Ｉ−１２５  ｓＣＴリガンド結合
アシル化４及びアシル化５の急速的条件設定における効果の向上を、ヒトに適用できるか否か調べるために、競合的リガンド結合アッセイを行って、げっ歯類と人の血清アルブミンに対するアシル化体の結合を探求した。図１４は、げっ歯類由来２％血清アルブミン（ＲＳＡ）中（図４Ａ）、又は、ヒト由来２％血清アルブミン（ＨＳＡ）中（図４Ｂ）での、ＫＢＰ−０６６Ａ１１．０３及びＫＢＰ−０６６Ａ１１．０５と、放射性標識Ｉ−１２５  サケカルシトニン（ＮＥＸ４２３、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）との競合的結合を示す。アッセイを２％ＨＳＡ中で行った場合には、ＥＣ５０について、アシル化３とアシル化５の間に差は生じなかった。しかし、アッセイを２％ＲＳＡ中で行った場合には、５アシル化は、ＩＣ５０をさらに右側にシフトさせたことから、アッセイにおいてはＲＳＡに対してより親和性が強いことが示唆される。そのため、急速的条件設定において観察される効果の向上は、げっ歯類に対して特有の現象であるし、ヒトには適用できないと強く推測される。
【０２００】
実施例１０（図１５）
２０週齢の高脂肪食ＳＤラットにおける食物摂取及び体重についての、異なる位置の３アシル化変異体（９位“Ａ０９”、１１位“Ａ１１”、１２位“Ａ１２”、１６位“Ａ１６”、１８位“Ａ１８”、１９位“Ａ１９”及び３２位“Ａ３２”）の単回投与による効果の相互比較
【０２０１】
【表２２】
2021535119.tif 000034
【０２０２】
ラットを、試験前の４日間、１匹ずつケージに入れた。ラットを体重によって無作為化して、８つの群（ビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）、ＫＢＰ（用量：４ｎｍｏｌ／ｋｇ（^１０−１１μｇ／ｋｇ））に分けた。それらを一晩絶食させてから、ペプチド又はビヒクルを、午前中に皮下投与を用いて、単回投与により処置した。食物摂取を、以下の間隔（０−４時間、４−２４時間、２４−４８時間、４８−７２時間、７２−９６時間）でモニターした。体重を、ベースラインの時点、及び、皮下注射後４時間、２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間の時点で測定した。２つの主鎖、すなわち、ＫＢＰ−０６６及びＫＢＰ−０２１について試験した。
【０２０３】
図１５の結果  −  食物摂取及び体重
主鎖上の位置に関して、ＫＢＰ−０６６の結果は以下のとおりである。急速的条件設定の４ｎｍｏｌ／ｋｇにおいて（図５）、Ａ１１位及びＡ１９位は、７２時間の食物摂取、及び、９６時間の体重の両方を抑制する点で、２つの最良な位置であった。３番目に良好な位置は、Ａ２４であり、Ａ１８及びＡ１６が次に続いた。アシル化する位置として最も効力が低い位置はＡ１２であり、この位置は、食物摂取及び体重の両方へのＤＡＣＲＡが介在する効果と少々妨害しあうことから、アシル化するためには不利であると考えられる。
これらのデータに基づくと、Ａ１１及びＡ１９は、ＫＢＰ−０６６の主鎖をアシル化するために好ましい位置である。
【０２０４】
図１６の結果  −  食物摂取及び体重
異なる主鎖であるＫＢＰ−０２１を、ＫＢＰ−０６６の実験条件と同じ実験条件として用いる場合には、位置のパターンが少々異なっていた。
【０２０５】
【表２３】
2021535119.tif 000035
【０２０６】
急速的条件設定の３ｎｍｏｌ／ｋｇにおいて（図６）、Ａ１１位及びＡ１９位は、
ＫＢＰ−０６６主鎖について観察されたような７２時間の食物摂取、及び、９６時間の体重の両方を抑制する点で、はるかに最良な２つの位置であった。３番目に良好な位置はＡ１８であったが、Ａ１１位及びＡ１９位と比べて、はるかに劣っていた。２４位はビヒクルよりも良好であったが、ＫＢＰ−０６６主鎖について観察された程度には到底及ばない。Ａ１６位、Ａ１２位及びＡ０９位は、いずれも食物摂取及び体重の両方に対してビヒクルと区別できず、ペプチド活性を損なっていたことから、それらの位置のアシル化は不利であることを示唆する。
しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性の表４．３は、Ａ１９及びＡ１８は、ＫＢＰ−０２１と組み合わせると、繊維形成の点で大きな問題があり、このことから、ＫＢＰ−０２１主鎖については、Ａ１１がアシル化するための好ましい位置となる。
【０２０７】
実施例１１（図１７及び図１８）
急速試験の結果によれば最良の能力を示すもの、すなわちアシル化位置（Ａ１１及びＡ１９）について、さらに研究を進め、同じアシル化及び主鎖、すなわち３アシル化及びＫＢＰ−０６６をそれぞれ用いたアシル化による効果を比較するために、繰り返し投与を用いる研究を行った。
食物摂取及び体重を、高脂肪食を研究開始前８週間給餌した２０週齢の高齢ＳＤラットにおける長期的条件設定（５週間研究）を行うことにより調べた。
【０２０８】
【表２４】
2021535119.tif 000036
【０２０９】
実施例９において説明した実験手順を踏襲した。簡単に説明すると、ラットを２匹ずつケージに入れ、体重によって無作為化して処置群（ビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）、ＫＢＰ（用量：４ｎｍｏｌ／ｋｇ（^１４μｇ／ｋｇ））に分けた。食物摂取及び体重を、３５日間、毎日モニターした。研究終了時に、ＯＧＴＴを実施し、その後、殺処分して脂肪組織の採取及び重量測定を実施した。
【０２１０】
図１７の結果  −  長期的条件設定におけるＡ１１及びＡ１９についての食物摂取及び体重の比較
図１７は、長期研究の期間中に亘る処置の関数としての食物摂取の変化（図１７Ａ）及び体重の変化（図１７Ｂ）を示す。Ａ１１及びＡ１９はいずれも、処置５週間後に、食物摂取を同様の様式で抑制し、体重を優位に低下させた。しかし、体重への効果の点で、Ａ１１位とＡ１９位の間に有意差はなかった。
【０２１１】
図１８の結果  −  ＯＧＴＴ及び脂肪組織の
図１８は、ＯＧＴＴから得られた結果を、それに対応するｉＡＵＣ（ＯＧＴＴ）（図Ａ＋Ｂ）とともに示し、さらに、３つの異なる脂肪組織、すなわち精巣上体、鼠径部及び腎周囲の重量（図１８Ｃ−Ｅ）、及び、研究終了時の体重（図１８Ｆ）を示す。実験においてＡ１１を用いた処置は、ｉＡＵＣ（ＯＧＴＴ）、精巣上体ＷＡＴの大きさ、腎周囲ＷＡＴの大きさ、及び、体重の有意な低下を引き起こした。実験においてＡ１９を用いた処置は、ｉＡＵＣ（ＯＧＴＴ）、精巣上体ＷＡＴの大きさ、及び、体重の有意な低下を引き起こしたが、腎周囲ＷＡＴの大きさについては引き起こさなかった。いずれの処置も、鼠径部ＷＡＴの大きさを優位に低下させなかった。Ａ１１は、Ａ１９と比較すると、ビヒクルに対してわずかに良好であったが、しかしながら、処置群の間に有意差はなかった。
【０２１２】
実施例１２（図１９）
高脂肪食を実験前８週間給餌した２０週齢の高齢ＳＤラットを用いた急速的条件設定における食物摂取及び体重についての、位置及び主鎖が同じである３つのアシル化連結基変異体（３、７及び８）、すなわち位置及び主鎖がそれぞれＡ１１及びＫＢＰ−０６６であるものの単回投与による効果の比較
【０２１３】
【表２５】
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【０２１４】
ラットを、試験前の４日間、１匹ずつケージに入れた。ラットを体重によって無作為化して、８つの群（ビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）、ＫＢＰ（用量：４ｎｍｏｌ／ｋｇ（^１３−１４μｇ／ｋｇ））に分けた。それらを一晩絶食させてから、ペプチド又はビヒクルを、午前中に皮下投与を用いて、単回投与により処置した。食物摂取を、以下の間隔（０−４時間、４−２４時間、２４−４８時間、４８−７２時間、７２−９６時間）でモニターした。体重を、ベースラインの時点、及び、皮下注射後４時間、２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間の時点で測定した。
【０２１５】
図１９の結果  −  食物摂取及び体重
試験した３つの連結基は全て、急速的条件設定において良好であり、全ての連結基において、食物摂取を回復前の７２時間まで減衰させた（図１９Ａ）。アシル化３は、９６時間後に、アシル化７及びアシル化８よりも、わずかに良好であった。これは、対応する体重減少（図１９Ｂ）から明白であり、アシル化３は早期（２４時間）にアシル化７及び８と識別され、その後の７２時間及び９６時間の時点において識別され続けた。
【０２１６】
実施例７−１２の結果の概要
図１１−１４及び表４．１から収集したデータは、Ｃ１８二価酸からＣ２２二価酸の範囲であるアシル化３、４及び５が、ヒトにおける１週間に１回投与療法のためのアシル化ペプチドを開発するに際し、代替性があることを示唆している。
それゆえ、Ｃ１８、Ｃ２０及びＣ２２二価酸は、本発明にとって好ましいアシル化の長さである。
【０２１７】
アシル化位置
図１５、図１７及び図１８から収集したデータは、Ａ１９が、急速的条件設定において、やや有利かもしれないのに対し、Ａ１１が、ＫＢＰ−０６６主鎖と３アシル化を用いる長期的条件設定において、やや有利であることを示している。
Ａ１１及びＡ１９は、いずれもＫＢＰ−０６６主鎖と組み合わせたときに、繊維形成の問題を生じなかった（表４．２）。
総合すると、これらのデータは、Ａ１１位及びＡ１９位のアシル化は、ＫＢＰ−０６６主鎖と組み合わせると、ヒトにおける１週間に１回投与療法を開発するためにアシル化するための、２つの最良の万能な位置であることを示唆している。
それゆえ、Ａ１１及びＡ１９は、ＫＢＰ−０６６をアシル化するための好ましい位置である。
同様に、表４．３及び図１６に基づいて、Ａ１１及びＡ１９は、ＫＢＰ−０２１と組み合わせたときに、２つの最良のアシル化位置であることが明白である。
しかし、Ａ１９は、この条件設定において極めて繊維形成しやすいことから、総合的な性能に基づくと、３アシル化したＡ１１が、ＫＢＰ−０２１にとって好ましいアシル化の位置及び長さである。
【０２１８】
アシル化連結基
この試験及び表４．４に基づくと、連結基が短くなると繊維形成の問題が起きる可能性があり、連結基が長くなっても良いことがないことから、ＯＥＧ−ＯＥＧ−γＧＬＵ連結基が、最適な連結基である。さらに図１９が示すように、ＯＥＧ−ＯＥＧ−γＧＬＵ連結基は、急速的条件設定のｉｎ  ｖｉｖｏにおいて最良の能力を示すものでもあることから、総合的に好ましいアシル化連結基となる。
【０２１９】
本明細書において、別途明示的に示されない限り、「又は」という語は、条件のうちの１つのみが満たされることを必要とする操作語 「排他的な又は」とは対照的に、記載される条件のいずれか又は両方が満たされる場合に真値を返す操作語の意味で使用される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を意味するのではなく、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の意味で使用される。上記で認められた全ての先行する教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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