(57)【要約】  細胞老化を遅延し、悪性転化に抵抗することができるヒト間葉系幹細胞の調製方法を提供する。調製方法は、ＦＯＸＯ３タンパク質の２５３番目のアミノ酸残基をコードするコドンの、セリンをコードするコドンからアラニンをコードするコドンへの変異と、ＦＯＸＯ３タンパク質の３１５番目のアミノ酸残基をコードするコドンの、セリンをコードするコドンからアラニンをコードするコドンへの変異との２つの変異を、多能性幹細胞のゲノムに対して行うステップを含む。前記方法で調製された組換え間葉系幹細胞、及び細胞移植治療におけるその使用をさらに提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２に示すタンパク質をコードする遺伝子をゲノムに有する組換え間葉系幹細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の組換え間葉系幹細胞を含む細胞移植治療用製品。
【請求項３】
細胞移植治療における請求項１に記載の組換え間葉系幹細胞の使用。
【請求項４】
配列表の配列番号２に示すタンパク質をコードする遺伝子をゲノムに有する組換え多能性幹細胞。
【請求項５】
請求項４に記載の組換え多能性幹細胞を含む細胞移植治療用製品。
【請求項６】
細胞移植治療における請求項４に記載の組換え多能性幹細胞の使用。
【請求項７】
ＦＯＸＯ３タンパク質の２５３番目のアミノ酸残基をコードするコドンの、セリンをコードするコドンからアラニンをコードするコドンへの変異と、ＦＯＸＯ３タンパク質の３１５番目のアミノ酸残基をコードするコドンの、セリンをコードするコドンからアラニンをコードするコドンへの変異との２つの変異を、多能性幹細胞のゲノムに対して行って、組換え多能性幹細胞を得るステップを含む、組換え多能性幹細胞の調製方法。
【請求項８】
前記多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒト胚性幹細胞がＨ９細胞株であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法により調製された組換え多能性幹細胞。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換え多能性幹細胞を含む細胞移植治療用製品。
【請求項１２】
細胞移植治療における請求項１０に記載の組換え多能性幹細胞の使用。
【請求項１３】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法により、組換え多能性幹細胞を調製するステップ（１）と、
ステップ（１）で得られた組換え多能性幹細胞を用いて、組換え間葉系幹細胞を調製するステップ（２）と、を含む、組換え間葉系幹細胞の調製方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法により調製された組換え間葉系幹細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組換え間葉系幹細胞を含む細胞移植治療用製品。
【請求項１６】
細胞移植治療における請求項１４に記載の組換え間葉系幹細胞の使用。
【請求項１７】
配列表の配列番号２に示すタンパク質。
【請求項１８】
配列表の配列番号３に示すＤＮＡ分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に属し、細胞老化を遅延し、悪性転化に抵抗することができるヒト間葉系幹細胞、その調製方法及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞移植治療は、近年、再生医学分野の最も将来性及び潜在力がある発展方向であり、特定の細胞を体内の病巣部位に移植することで、組織の再生を促進して疾患を治癒する方法である。幹細胞は、自己複製能力及び多能性を有するので、細胞増殖を介して自体の数の安定性を維持できるだけでなく、他の細胞に分化して組織を修復することができるため、細胞治療のための最適な材料となる。細胞移植治療は、骨髄幹細胞移植による白血病の治療などの分野で非常に顕著な治療効果を示しているが、その幅広い使用は様々な課題に直面している。現在、細胞移植治療を制限する主な要因は、有効性と安全性という２つの点にある。
【０００３】
細胞移植治療の有効性は、主に、移植前の移植物の品質、及び体内に入った後活着し再生機能を発揮できるか否かによって反映される。一方では、移植物は、体外培養過程において一定の「寿命」があり、具体的には、複製のプレッシャーによる影響を連続的に受けて、限られた連続継代後、細胞老化（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）状態になり、増殖を停止して機能を失い、更に分化能力に影響を及ぼして、治療効果に影響を与える。他方では、細胞移植の部位は一般的に、疾患や老化の組織微小環境に位置し、それにおける炎症性因子、有害な代謝産物等は、外因性移植物に損傷を与える。以上の２つの点はいずれも細胞の深刻な機能の減退をもたらして、移植効率の低下を引き起こす。細胞移植治療の安全性は、主に、長期移植後の腫瘍形成のリスクである。細胞移植物は病体で連続的にプレッシャーを受け、ゲノムが非常に不安定になる恐れがあり、がん遺伝子やがん抑制遺伝子に変異が発生すると、がんに進化し、安全上のリスクを引き起こす可能性がある。
【０００４】
如何に特定の介入手段により細胞移植治療の効率を向上させ、腫瘍形成のリスクを可能な限り低減させるかは、従来から、再生医学の幅広い応用を支配する課題である。しかしながら、今まで、この技術的なボトルネックを克服できる簡単で効果的な方法は開発されていない。現在、細胞移植の効果を向上させる試みは、主に、移植部位の微小環境の改善及び移植物の「環境ストレス耐性」の特性の強化という２つの点に集めている。多くの研究は、細胞の正常な機能の発揮に不利である病体微小環境において外因性「栄養及び保護因子」を補充することにより移植効果を改善するが、該方法は短期間にしか移植環境を改善できず、移植再発等の不良な予後の問題が際立っている。これに比べて、特定の方法により移植物の「内因」を改善し、すなわち、移植材料自体の固有の環境ストレス耐性能力を強化することにより移植効果の改善を実現することは、より直接的で長時間作用が可能な手段である。現在、少数の研究によれば、レンチウイルス又はレトロウイルスベクターを利用して環境ストレス耐性タンパク質を導入し、細胞内の特定のシグナル伝達経路又は遺伝子発現を調節し、環境ストレスに対する細胞の耐性を強化し、更に細胞移植の治療効果を向上させる。一連の前臨床研究では、細胞の固有の環境ストレス耐性の特性を向上させる可能性が証明されているが、組み込む型ウイルスベクターによって仲介する遺伝的調節において、ゲノムのランダムな組み込みが必ず存在し、遺伝子変異のリスクが大きくなり、安全性の心配が高まり、臨床における応用価値が大幅に低下した。
【０００５】
遺伝子ターゲティング編集技術の発展は、細胞移植治療の進歩を極めて促進している。この技術によれば、ゲノム上の遺伝子コードを正確に編集することができ、現在、遺伝子ターゲティング編集技術を利用して疾患細胞の病原性変異を矯正するケースが大量に報告されている。正常な機能を回復する遺伝子矯正細胞は、体外増殖により自家移植に使用でき、細胞移植治療のための好ましい材料である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、細胞老化を遅延し、悪性転化に抵抗することができるヒト間葉系幹細胞、その調製方法及び使用を提供することである。
【０００７】
本発明は、組換え間葉系幹細胞（ＦＯＸＯ３遺伝子増強型間葉系幹細胞、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡＭＳＣ細胞）の保護を求めており、そのゲノムは、配列表の配列番号２に示すタンパク質をコードする遺伝子を有する。前記組換え間葉系幹細胞のゲノムには、配列表の配列番号４に示すタンパク質をコードする遺伝子がない。前記組換え間葉系幹細胞は、具体的には、発明の概要に記載の下記方法により調製される組換え間葉系幹細胞であってもよい。
【０００８】
本発明は、組換え多能性幹細胞（ＦＯＸＯ３遺伝子増強型の多能性幹細胞、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡｈＥＳＣ細胞）の保護をさらに求めており、そのゲノムは、配列表の配列番号２に示すタンパク質をコードする遺伝子を有する。前記組換え多能性幹細胞のゲノムには、配列表の配列番号４に示すタンパク質をコードする遺伝子がない。前記組換え多能性幹細胞は、具体的には、発明の概要に記載の下記方法により調製される組換え多能性幹細胞であってもよい。
【０００９】
本発明は、細胞移植治療に使用される製品の製造における組換え細胞の使用が保護請求されており、前記組換え細胞は前記組換え間葉系幹細胞又は前記組換え多能性幹細胞である。前記治療は、具体的には、免疫不全疾患の治療であってもよい。前記治療は、具体的には、免疫不全患者の疾患の治療であってもよい。前記治療は、具体的には、後肢虚血の治療であってもよく、前記治療は、具体的には、免疫不全患者の後肢虚血の治療であってもよい。前記組換え細胞は、移植細胞として細胞移植治療に使用される。
【００１０】
本発明は、細胞移植治療における組換え細胞の使用が保護請求されており、、前記組換え細胞は前記組換え間葉系幹細胞又は前記組換え多能性幹細胞である。前記治療は、具体的には、免疫不全疾患の治療であってもよい。前記治療は、具体的には、免疫不全患者の疾患の治療であってもよい。前記治療は、具体的には、後肢虚血の治療であってもよい。前記治療は、具体的には、免疫不全患者の後肢虚血の治療であってもよい。前記組換え細胞は、移植細胞として細胞移植治療に使用される。
【００１１】
本発明は、組換え多能性幹細胞の調製方法の保護がさらに保護請求されており、、ＦＯＸＯ３タンパク質の２５３番目のアミノ酸残基をコードするコドンの、セリンをコードするコドンからアラニンをコードするコドンへの変異と、ＦＯＸＯ３タンパク質の３１５番目のアミノ酸残基をコードするコドンの、セリンをコードするコドンからアラニンをコードするコドンへの変異との２つの変異（且ついずれも遺伝子のホモ接合変異）を、多能性幹細胞のゲノムに対して行って、組換え多能性幹細胞を得るステップを含む。
【００１２】
ＦＯＸＯ３タンパク質の２５３番目のアミノ酸残基をコードするコドンの、セリンをコードするコドン（ｔｃｃ）からアラニンをコードするコドン（ｇｃｃ）への変異と、ＦＯＸＯ３タンパク質の３１５番目のアミノ酸残基をコードするコドンの、セリンをコードするコドン（ｔｃｔ）からアラニンをコードするコドン（ｇｃｔ）への変異との２つの変異（且ついずれも遺伝子のホモ接合突然変異）を、多能性幹細胞のゲノムに対して行って、組換え多能性幹細胞を得る。
【００１３】
前記多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞である。前記多能性幹細胞は市販のヒト胚性幹細胞株である。前記ヒト胚性幹細胞はＨ９細胞株である。
【００１４】
前記ＦＯＸＯ３タンパク質は、具体的には、配列表の配列番号４に示してもよい。
【００１５】
本発明は、組換え間葉系幹細胞の調製方法がさらに保護請求されており、
ＦＯＸＯ３タンパク質の２５３番目のアミノ酸残基をコードするコドンの、セリンをコードするコドンからアラニンをコードするコドンへの変異と、ＦＯＸＯ３タンパク質の３１５番目のアミノ酸残基をコードするコドンの、セリンをコードするコドンからアラニンをコードするコドンへの変異との２つの変異（且ついずれも遺伝子のホモ接合変異）を、多能性幹細胞のゲノムに対して行って、組換え多能性幹細胞を得るステップ（１）と、
ステップ（１）で得られた組換え多能性幹細胞を用いて、組換え間葉系幹細胞を調製するステップ（２）と、を含む。
【００１６】
ＦＯＸＯ３タンパク質の２５３番目のアミノ酸残基をコードするコドンの、セリンをコードするコドン（ｔｃｃ）からアラニンをコードするコドン（ｇｃｃ）への変異と、ＦＯＸＯ３タンパク質の３１５番目のアミノ酸残基をコードするコドンの、セリンをコードするコドン（ｔｃｔ）からアラニンをコードするコドン（ｇｃｔ）への変異との２つの変異（且ついずれも遺伝子のホモ接合変異）を、多能性幹細胞のゲノムに対して行って、組換え多能性幹細胞を得る。
【００１７】
組換え多能性幹細胞を用いて、組換え間葉系幹細胞を調製する方法は、具体的には、
組換え多能性幹細胞から胚様体を分化させて、胚様体を得るステップ（１）と、
ステップ（１）で得られた胚様体を繊維状細胞が現れるまで培養するステップ（２）と、
ステップ（２）終了後、細胞を収集し、継代して培養するステップ（３）と、
ステップ（３）終了後、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５がいずれも陽性である細胞を選別し、組換え間葉系幹細胞を得るステップ（４）と、を含む。
【００１８】
以上のいずれかに記載された方法により調製される組換え多能性幹細胞又は以上のいずれかに記載された方法により調製される組換え間葉系幹細胞は、全て本発明の保護範囲に属する。
【００１９】
本発明は、配列表の配列番号２に示すタンパク質が保護請求されている。
【００２０】
本発明は、配列表の配列番号３に示すＤＮＡ分子が更に保護請求されている。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】実施例１における形態学的同定の結果である。
【図２】実施例１における多能性幹遺伝子の発現レベルの検出結果である。
【図３】実施例２におけるＦＯＸＯ３転写活性の結果である。
【図４】実施例２における核内局在化の結果である。
【図５】実施例２における外因性刺激での細胞活性の結果である。
【図６】実施例２における成長能の測定結果である。
【図７】実施例２におけるＳＡ−β−Ｇａｌ染色の結果である。
【図８】実施例２における有害代謝物含有量の検出結果である。
【図９】実施例２における増殖能の検出結果である。
【図１０】実施例２における細胞核構造完全性の検出結果である。
【図１１】実施例２におけるプロセス模式図である。
【図１２】実施例２における足場非依存性増殖能の結果である。
【図１３】実施例３におけるマウスの前脛骨筋に細胞を移植した結果である。
【図１４】実施例３における後肢虚血の免疫不全マウスの筋肉に細胞を移植した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
下記実施例は、本発明をより良好に理解するためのものであり、本発明を限定するものではない。特に断りのない限り、下記実施例における実験方法は、いずれも通常の方法である。特に断りのない限り、下記実施例に使用される試験材料は、いずれも通常の生化学試薬店から購入され得るものである。以下の実施例における定量的試験は、いずれも３回の繰り返し実験とされ、結果をその平均値とする。特に断りのない限り、細胞培養環境はいずれも３７℃、５％  ＣＯ２である。
【００２３】
ｂｔｕは、ｂｇａｌ−ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  ｕｎｉｔｓの略称である。参照文献：An HSV amplicon-based helper system for helper-dependent adenoviral vectors. Shuji Kubo, et al. BBRC. 2003. 307(4): 826-830。
ヘルパーアデノウイルスベクターｐＡＭＨＤＡｄＧＴ８−４（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃２６４２１）は、ｐＡＭＨＤＡｄＧＴ８−４ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ製、製品番号２６４２１、https://www.addgene.org/26421/）と略称される。
ヒト胚性腎細胞株２９３をトランスフェクトした派生細胞株１１６細胞は、１１６細胞と略称される。参照文献：Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Palmer D. and Ng P. Molecular Therapy. 2003. 8(5): 846-52.。
ヘルパーアデノウイルスＡｄＨＰＢＧＦ３５は、ウイルスＡｄＨＰＢＧＦ３５と略称される。参照文献：Genome Size and Structure Determine Efficiency of Postinternalization Steps and Gene Transfer of Capsid-Modified Adenovirus Vectors in a Cell-Type-Specific Manner. Dmitry M. Shayakhmetov, et al., Journal of Virology. 2004. 78(18): 10009-10022.。参照文献：Yang J, Li J, Suzuki K, et al. Genetic enhancement in cultured human adult stem cells conferred by a single nucleotide recoding[J]. Cell Research, 2017, 27(9):1178-1181.。
ヒト胚性幹細胞Ｈ９細胞株は、Ｈ９細胞（ＷｉＣｅｌｌ社製、製品番号ＷＡ０９（Ｈ９）−ＤＬ−７）と略称される。
レトロウイルスベクター及びパッケージングプラスミドは、いずれもＡｄｄｇｅｎｅ製のｐＢＡＢＥ−ｎｅｏ−ｈＴＥＲＴ（＃１７７４）、ｐＢＡＢＥ−ｚｅｏ−ｌａｒｇｅ  Ｔ  ｇｅｎｏｍｉｃ（＃１７７８）、ｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏ−ＨＲＡＳ  Ｖ１２（＃１７６８）、ｇａｇ／ｐｏｌ（＃１４８８７）、ＶＳＶ−Ｇ（＃８４５４）である。
Ｐ５３をノックダウンしたレンチウイルスベクタープラスミドＰＬＶＴＨＭ−ｓｈＰ５３については、参照文献は、Yang J, Li J, Suzuki K, et al. Genetic enhancement in cultured human adult stem cells conferred by a single nucleotide recoding[J]. Cell Research, 2017, 27(9):1178-1181.であり、すなわち、文献における「For generating lentiviral vectors encoding shRNA targeting P53, shRNA oligos 13, 18 were cloned into the pLVTHM/GFP vector (12247, Addgene) pre-cleaved by ClaI and MluI 」である。
間葉系幹細胞培地（ｈＭＳＣ培地）は、ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２５７１０７１）、ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１００９１１４８）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５０７０−０６３）、及び組換えヒト線維芽細胞成長因子（ＪＰＣ、ｂＦＧＦ）からなり、ＭＥＭ培地とウシ胎児血清の体積比は９０：１０であり、培地において、ペニシリン／ストレプトマイシンの濃度は１ｇ／１００ｍｌであり、組換えヒト線維芽細胞成長因子の濃度は１０ｎｇ／ｍｌである。
間葉系幹細胞分化培地は、ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２５７１０７１）、ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１００９１１４８）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５０７０−０６３）、組換えヒト線維芽細胞成長因子（ＪＰＣ、ｂＦＧＦ）、及びＴＧＦ−β（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ、ＨＺ１１３１）からなり、ＭＥＭ培地とウシ胎児血清の体積比は９０：１０であり、培地において、ペニシリン／ストレプトマイシンの濃度は１ｇ／１００ｍｌであり、組換えヒト線維芽細胞成長因子の濃度は１０ｎｇ／ｍｌであり、ＴＧＦ−βの濃度は５ｎｇ／ｍｌである。
【００２４】
特に断りのない限り、実施例における超高速遠心分離パラメータはいずれも１９２００ｒｐｍ、２．５時間である。
【００２５】
実施例１、ＦＯＸＯ３増強型の多能性幹細胞の調製
一、組換えプラスミドの構築
配列表の配列番号１に示すＤＮＡ分子を、ｐＡＭＨＤＡｄＧＴ８−４ベクターのＳａｌＩとＳｐｅＩ酵素切断部位の間に挿入して、組換えプラスミドを得た。
【００２６】
二、組換えアデノウイルスの調製
１、ステップ１で得られた組換えプラスミドを、ＰＩ−ＳｃｅＩを用いて酵素で切断し、線状化プラスミドを得た。
２、ステップ１で得られた線状化プラスミドとウイルスＡｄＨＰＢＧＦ３５の両方を１１６細胞に導入し、組換えアデノウイルスをパッケージングした後、超高速遠心分離により、組換えアデノウイルス粒子を取得した。
３、組換えアデノウイルス粒子を標的細胞に感染させた。
ステップ２で得られた組換えアデノウイルス粒子を用いてＨ９細胞（１×１０７個の細胞：１５  ｂｔｕウイルス）に感染させ、感染後の２−４日目に、Ｇ４１８（２５〜４００ｇ／ｍｌ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加えてポジティブスクリーニングし、感染後の１０−１３日目に、４μＭ  Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（ＧＡＮＣ，ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加えてネガティブスクリーニングし、正確に組み込まれていない細胞を選別して除去し、最終的に生存した細胞を配列決定して同定し（ＰＣＲプライマーは、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡｓｅｑＦ：ＧＡＴＴＴＡＣＴＡＴＡＴＣＡＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＣ、及び、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡｓｅｑＲ：ＴＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＧＴＣＣＡであり、配列決定プライマーはＧＡＴＴＴＡＣＴＡＴＡＴＣＡＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＣである）、ＦＯＸＯ３対立遺伝子の部位が正確に編集された細胞を得て、プラスミドｐＣＡＧ−Ｆｌｐｏ−２Ａ−ｐｕｒｏを細胞に一時的にトランスフェクトすることでＧ４１８耐性遺伝子を除去し、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／＋  ｈＥＳＣ細胞を得た。
４、ステップ２で得られた組換えアデノウイルス粒子を用いてＦＯＸＯ３２ＳＡ／＋  ｈＥＳＣ細胞（１×１０７個の細胞：１５  ｂｔｕウイルス）に感染させ、感染後の２−４日目に、Ｇ４１８（２５〜４００ｇ／ｍｌ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加えてポジティブスクリーニングし、感染後の１０−１３日目に、４μＭ  Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（ＧＡＮＣ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加えてネガティブスクリーニングし、正確に組み込まれていない細胞を選別して除去し、最終的に生存した細胞を配列決定して同定し（ＰＣＲプライマーは、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡｓｅｑＦ：ＧＡＴＴＴＡＣＴＡＴＡＴＣＡＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＣ、及び、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡｓｅｑＲ：ＴＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＧＴＣＣＡであり、配列決定プライマーはＧＡＴＴＴＡＣＴＡＴＡＴＣＡＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＣである）、ＦＯＸＯ３対立遺伝子の部位が正確に編集された細胞を得て、プラスミドｐＣＡＧ−Ｆｌｐｏ−２Ａ−ｐｕｒｏを、細胞に一時的にトランスフェクトすることでＧ４１８耐性遺伝子を除去し、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ｈＥＳＣ細胞を得た。ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ｈＥＳＣ細胞は、ＦＯＸＯ３増強型の多能性幹細胞である。
【００２７】
全ゲノムシーケンシングの結果によれば、Ｈ９細胞に比べて、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ｈＥＳＣ細胞の相違は、ＦＯＸＯ３タンパク質の２５３番目のアミノ酸残基をコードするコドンの、セリンをコードするコドン（ｔｃｃ）からアラニンをコードするコドン（ｇｃｃ）への変異と、ＦＯＸＯ３タンパク質の３１５番目のアミノ酸残基をコードするコドンの、セリンをコードするコドン（ｔｃｔ）からアラニンをコードするコドン（ｇｃｔ）への変異との２つの変異（且ついずれも遺伝子のホモ接合変異）が、ゲノムに発生しただけである。変異後の遺伝子によりコードされるタンパク質は配列表の配列番号２に示され、そのコードフレームが配列表の配列番号３に示される。
【００２８】
Ｈ９細胞において、ＦＯＸＯ３タンパク質は配列表の配列番号４に示され、そのコードフレームが配列表の配列番号５に示される。
【００２９】
三、ＦＯＸＯ３増強型の多能性幹細胞の同定
Ｈ９細胞はＦＯＸＯ３＋／＋ｈＥＳＣで表される。ＦＯＸＯ３増強型の多能性幹細胞はＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡｈＥＳＣで表される。
【００３０】
１、形態学的同定
形態学的同定の結果を図１に示す。Ｈ９細胞と同様に、ＦＯＸＯ３増強型の多能性幹細胞は、依然として体内で内胚葉細胞、中胚葉細胞、外胚葉細胞に分化する能力があった。
【００３１】
２、多能性幹遺伝子の発現レベルの検出
細胞内の、多能性幹遺伝子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ）が発現されたタンパク質のレベルを免疫蛍光法で検出した。免疫蛍光同定用の抗体は、ａｎｔｉ−ＮＡＮＯＧ  （Ａｂｃａｍ，ａｂ２１６２４）、ａｎｔｉ−ＯＣＴ４  （Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ５２７９）、ａｎｔｉ−ＳＯＸ２  （Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ、ｓｃ１７３２０）であった。
【００３２】
結果を図２に示す。Ｈ９細胞とＦＯＸＯ３増強型の多能性幹細胞は、いずれも多能性幹遺伝子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ）を正常に発現できる。
【００３３】
実施例２、ＦＯＸＯ３増強型の間葉系幹細胞の調製及びその機能検出
一、ＦＯＸＯ３増強型の間葉系幹細胞の調製
１、実施例１で得られたＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ｈＥＳＣ細胞から胚様体を分化し、胚様体（ＥＢ）を得た。
２、ステップ１で得られた胚様体を、マトリゲル （ｍａｔｒｉｇｅｌ）によってコーティングされた６ウェルプレートに接種して、繊維状細胞が発生するまで（約２週間）（間葉系幹細胞分化培地を用いて）培養した。
３、ステップ２終了後、細胞を収集し、トリプシンで消化した後、新たな間葉系幹細胞分化培地に接種し、２週間培養した。
４、ステップ３終了後、フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５がいずれも陽性である細胞を選別し、すなわち、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞とも呼ばれるＦＯＸＯ３増強型の間葉系幹細胞を得た。
【００３４】
二、対照用間葉系幹細胞の調製
ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ｈＥＳＣ細胞の代わりにＨ９細胞を使用し、ステップ１に従って、ＦＯＸＯ３＋／＋  ＭＳＣ細胞とも呼ばれる対照用間葉系幹細胞を得た。
【００３５】
三、表現型の同定及び機能の検出
１、表現型の同定
フルオレセインＦＩＴＣ標識抗ヒト細胞表面認識分子ＣＤ９０抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、製品番号５５５５９５）、フルオレセインＰＥ標識抗ヒト細胞表面認識分子ＣＤ７３抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、製品番号５５０２５７）、フルオレセインＡＰＣ標識抗ヒト細胞表面認識分子ＣＤ１０５抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、製品番号１７−１０５７−４２）、フルオレセインＡＰＣ標識アイソタイプコントロール用抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、製品番号５５５７５１）、フルオレセインＰＥ標識アイソタイプコントロール用抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、製品番号５５５７４９）、フルオレセインＦＩＴＣ標識アイソタイプコントロール用抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、製品番号５５５７４２）
細胞表面マーカーを検出した。ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞とＦＯＸＯ３＋／＋  ＭＳＣ細胞は、いずれもＭＳＣ固有の表面マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５を発現することができ、無関係なＣＤ３４、ＣＤ４３及びＣＤ４５を発現させなかった。
【００３６】
２、ＦＯＸＯ３増強型の間葉系幹細胞における環境ストレス耐性遺伝子ＦＯＸＯ３のアクティブ活性化
（１）ＦＯＸＯ３転写活性
ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞とＦＯＸＯ３＋／＋  ＭＳＣ細胞をそれぞれ試験細胞とした。
ＦＨＲＥ−Ｌｕｃプラスミドは、市販のＦＯＸＯ３転写活性レポータープラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ、＃１７８９）であった。
Ｒｅｎｉｌｌａベクターが記載されている参照文献：Wang S, Hu B, Ding Z, et al. ATF6 safeguards organelle homeostasis and cellular aging in human mesenchymal stem cells[J]. Cell Discov, 2018, 4(1).。
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＦＨＲＥ−ＬｕｃプラスミドとＲｅｎｉｌｌａベクター（２×１０５個の細胞：０．２μｇ：ＦＨＲＥ−Ｌｕｃベクター：０．２μｇ：Ｒｅｎｉｌｌａベクター）を試験細胞に共トランスフェクトし、４８時間培養し、次に、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイキット（Ｖｉｇｏｒｏｕｓ社製、Ｔ００２）を用いて細胞を分解し、生物発光法により細胞におけるＦＯＸＯ３転写活性を検出した。
結果を図３に示す。図３において、左側円柱形はＦＯＸＯ３＋／＋  ＭＳＣ細胞に対応し、右側円柱形はＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞に対応している。その結果、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞におけるＦＯＸＯ３転写活性は、ＦＯＸＯ３＋／＋  ＭＳＣ細胞よりも明らかに高いことが分かった。
【００３７】
（２）核内局在化
抗ヒトＦＯＸＡ２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製、製品番号８１８６Ｓ）、抗ヒトＬａｍｉｎ  Ｂ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製、製品番号ｓｃ−６２１７）
ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞とＦＯＸＯ３＋／＋  ＭＳＣ細胞をそれぞれ試験細胞とした。
試験細胞を取り、細胞核タンパク質と細胞質タンパク質抽出キット（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、Ｐ００２８）を用いて、細胞質及び細胞核成分タンパク質をそれぞれ抽出し、次に、等量のタンパク質を取って、それぞれＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ（細胞質マーカーβ−ｔｕｂｕｌｉｎと細胞核マーカーＬａｍｉｎ  Ｂ１を参照とする）を行い、それぞれ細胞質及び細胞核におけるＦＯＸＯ３のタンパク質含有量を検出した。
結果を図４に示す。ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣにおけるＦＯＸＯ３タンパク質は明らかに細胞核に入り、具体的には、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞の細胞核におけるＦＯＸＯ３タンパク質はＦＯＸＯ３＋／＋  ＭＳＣ細胞よりも高く、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞の細胞質におけるＦＯＸＯ３タンパク質はＦＯＸＯ３＋／＋  ＭＳＣ細胞よりもわずかに低いことが示された。
【００３８】
３、環境ストレス耐性と抗細胞老化の特性
（１）外因性刺激での高い細胞活性
ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞とＦＯＸＯ３＋／＋  ＭＳＣ細胞をそれぞれ試験細胞とした。
具体的なステップは以下のとおりであった。試験細胞を６ウェルプレートに広げ、５００μＭの過酸化水素で試験細胞を２４時間刺激し、刺激が完了した後、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＥＧＦＰアポトーシス検出キット（Ｖｉｇｏｒｏｕｓ、Ａ００２）を用いて、細胞のアポトーシスの状況を検出した。過酸化水素により刺激されなかった並列対照を設けた。
結果を図５に示す。過酸化水素の刺激のもとで、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞はより強い細胞活性を有した。
【００３９】
（２）成長能の測定
ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞とＦＯＸＯ３＋／＋  ＭＳＣ細胞をそれぞれ試験細胞とした。
連続的に継代培養された試験細胞の成長能を細胞計数により統計した。
結果を図６に示す。ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞の倍増率はＦＯＸＯ３＋／＋ＭＳＣ細胞よりも明らかに高く、細胞老化に対する優れた抵抗能力を示している。
【００４０】
（３）ＳＡ−β−Ｇａｌ染色
β−ガラクトシダーゼ染色は、老化際にＳＡ−ｂｅｔａ−Ｇａｌ  （ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）の活性レベルが高くなることに基づいて、老化細胞又は組織を染色して検出する方法である。
ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞の継代細胞とＦＯＸＯ３＋／＋  ＭＳＣ細胞の継代細胞をそれぞれ試験細胞とした。
初代細胞は第３世代に継代した細胞である。後代細胞は第９世代に継代した細胞である。
試験細胞をＳＡ−β−Ｇａｌ染色し、次に、写真を撮ってＳＡ−β−Ｇａｌ陽性細胞の割合を統計した。
結果を図７に示す。図７において、左側は後代細胞の染色後の写真であり、右側は初代細胞と後代細胞における染色陽性細胞の割合であった。ＦＯＸＯ３＋／＋  ＭＳＣ細胞の後代細胞は大量で青色を示しており、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞の後代細胞はほとんど青色を示していなかった。このことから、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞の老化プロセスが遅いことを示した。
【００４１】
（４）有害代謝物の含有量の検出
ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞の第７世代に継代した細胞とＦＯＸＯ３＋／＋  ＭＳＣ細胞の第７世代に継代した細胞をそれぞれ試験細胞とした。
試験細胞を酸素遊離基プローブＨ２ＤＣＦＤＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、製品番号Ｃ６８２７、作動濃度１Ｍ）とともに３０分間共インキュベートし、フローサイトメトリーを用いてＨ２ＤＣＦＤＡの強度（細胞内の活性酸素の含有量を示す）を検出した。
結果を図８に示す。ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞の第７世代に継代した細胞には、より少ない活性酸素が蓄積され、それは、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞の第７世代に継代した細胞は有害代謝物をより効果的に除去できることを示している。
【００４２】
（５）増殖能の検出
抗ヒトＫｉ  ６７抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、製品番号ＶＰ−ＲＭ０４）
ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞の継代細胞とＦＯＸＯ３＋／＋  ＭＳＣ細胞の継代細胞をそれぞれ試験細胞とした。
初代細胞は第３世代に継代した細胞である。後代細胞は第７世代に継代した細胞である。
免疫蛍光染色法により、増殖活性に関連する試験細胞におけるＫｉ６７の発現を検出した。
結果を図９に示す。ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞の後代細胞にはより高いＫｉ６７陽性細胞率があった。
【００４３】
（６）細胞核構造完全性の検出
抗ヒトＬＡＰ２抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、製品番号６１１０００）
ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞の第７世代に継代した細胞とＦＯＸＯ３＋／＋  ＭＳＣ細胞の第７世代に継代した細胞をそれぞれ試験細胞とした。
免疫蛍光染色法により、試験細胞における核膜タンパク質Ｌａｍｉｎ  Ｂ１とＬＡＰ２の発現を検出した。
結果を図１０に示す。ＦＯＸＯ３＋／＋  ＭＳＣ細胞の第７世代に継代した細胞に比べて、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞の第７世代に継代した細胞のうちの核膜に異常のある細胞（矢印は核膜に異常のある細胞を指し、核膜タンパク質が染色の後に明らかな核膜の輪郭を見えない）の数は明らかに減少し、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞の第７世代に継代した細胞はより完全な細胞核構造を有することを示している。
【００４４】
４、悪性転化に抵抗する特性
（１）ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡＴＭＳＣ細胞とＦＯＸＯ３＋／＋ＴＭＳＣ細胞の調製
ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞とＦＯＸＯ３＋／＋  ＭＳＣ細胞をそれぞれ試験細胞とした。
プロセス模式図は図１１に示され、ＭＳＣの悪性転化は、テロメアの伸長、がん抑制遺伝子の欠如、及びがん原遺伝子の変異という３つのことを含み、その過程は３種のレトロウイルスと１種のレンチウイルスを感染させることにより実現される。レンチウイルスは、緑色蛍光ＧＦＰタンパク質を同時に発現させることができ、また細胞の視認可能な標識を実現することができる。体外悪性転化システムを利用して、腫瘍形成因子を試験細胞に移し、非腫瘍のＭＳＣを腫瘍化のＭＳＣ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ＭＳＣ、ＴＭＳＣ）に転化した。
「１．」それぞれ１０μｇのプラスミドｐＢＡＢＥ−ｎｅｏ−ｈＴＥＲＴ、プラスミドｇａｇ／ｐｏｌ、及びプラスミドＶＳＶ−Ｇを、１×１０７個の２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトし、培養上澄みを収集して、超高速遠心分離によりレトロウイルス粒子（レトロウイルス粒子Ａ）を取得した。それぞれ１０μｇのプラスミドｐＢＡＢＥ−ｚｅｏ−ｌａｒｇｅ  Ｔ  ｇｅｎｏｍｉｃ、プラスミドｇａｇ／ｐｏｌ、及びプラスミドＶＳＶ−Ｇを、１×１０７個の２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトし、培養上澄みを収集して、超高速遠心分離によりレトロウイルス粒子（レトロウイルス粒子Ｂ）を取得した。それぞれ１０μｇのプラスミドｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏ−ＨＲＡＳ  Ｖ１２、プラスミドｇａｇ／ｐｏｌ、及びプラスミドＶＳＶ−Ｇを、１×１０７個の２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトし、培養上澄みを収集して、超高速遠心分離によりレトロウイルス粒子（レトロウイルス粒子Ｃ）を取得した。
「２．」１５μｇのプラスミドＰＬＶＴＨＭ−ｓｈＰ５３、１０μｇのプラスミドｐｓＰＡＸ、及び５μｇのプラスミドｐＭＤ．２Ｇを、１×１０７個の２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトし、培養上澄みを収集して、超高速遠心分離によりレンチウイルス粒子を取得した。
「３．」レトロウイルス粒子Ａ（Ｇ４１８による選別）、レトロウイルス粒子Ｂ（ｚｅｏｃｉｎによる選別）、及びレトロウイルス粒子Ｃ（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎによる選別）を、試験細胞に順に感染させ、３種のウイルスがいずれも組み込まれた細胞を取得し、次に、細胞にレンチウイルス粒子を感染させた。
ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞に対して上記ステップを行い、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡＴＭＳＣ細胞を得た。
ＦＯＸＯ３＋／＋  ＭＳＣ細胞に対して上記ステップを行い、ＦＯＸＯ３＋／＋ＴＭＳＣ細胞を得た。
【００４５】
（２）足場非依存性増殖能
腫瘍細胞は、非接着性寒天にクローンに成長することができるが、非瘤細胞は成長できず、従って、足場非依存性増殖能は、実体腫瘍への腫瘍細胞の形成に緊密に関連している。
ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡＴＭＳＣ細胞とＦＯＸＯ３＋／＋ＴＭＳＣ細胞をそれぞれ試験細胞とした。
試験細胞と溶解状態のアガロース（０．３５％）を均一に混合し、細胞培養皿に迅速に広げ、アガロースが凝固した後、ＴＭＳＣ培地を覆って培養し、足場非依存性増殖能を観察した。
写真と相対クローンのサイズは図１２に示される。ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＴＭＳＣ細胞の足場非依存性増殖能は、ＦＯＸＯ３＋／＋ＴＭＳＣ細胞よりも大幅に弱くなった。
【００４６】
（３）体内腫瘍形成能力
ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡＴＭＳＣ細胞とＦＯＸＯ３＋／＋ＴＭＳＣ細胞をそれぞれ試験細胞とした。
試験細胞（３×１０６個の細胞）をヌードマウス（品種：Ｂａｌｂ／Ｃ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ）の後肢の関節に近く箇所に移植し（細胞懸濁液を後肢の関節に近く箇所の筋肉に注射する）、２−３ヶ月移植後、後肢に明らかな腫れが出現し、マウスを処理して、後肢を切り取って天秤で秤量した。
相対質量（相対質量＝ＦＯＸＯ３＋／＋ＴＭＳＣを移植した後肢の質量／ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＴＭＳＣを移植した後肢の質量）を計算した。相対質量は２．７３±０．２２であった。ＦＯＸＯ３＋／＋ＴＭＳＣを移植した後肢の質量は、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＴＭＳＣを移植した後肢の質量より明らかに大きかった。
ＦＯＸＯ３＋／＋ＴＭＳＣは、骨肉腫のような腫瘍を生じることができ、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＴＭＳＣは、腫瘍形成の能力を徹底的に失った。
本実施例の結果から分かるように、ＦＯＸＯ３増強型の間葉系幹細胞におけるＦＯＸＯ３がアクティブ的に活性化され、体内にも体外にも環境ストレス耐性、抗細胞老化及び悪性転化に対する抵抗特性を示している。
【００４７】
実施例３、細胞移植治療におけるＦＯＸＯ３増強型の間葉系幹細胞の使用
試験細胞：実施例２で調製されたＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞又はＦＯＸＯ３＋／＋  ＭＳＣ細胞。
ルシフェラーゼｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを過剰発現させたレンチウイルスベクターは、ｌｕｃレンチウイルスベクターと略称される。参照文献：SIRT6 safeguards human mesenchymal stem cells from oxidative stress by coactivating NRF2. Pan et.al,. Cell research. (2016) 26:190-205、すなわち、文献における「luciferase (Control)-expressed vector」。
レンチウイルスパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸは、プラスミドｐｓＰＡＸと略称される（Ａｄｇｅｎｅ製、製品番号１２２６０）。レンチウイルスパッケージングプラスミドｐＭＤ２．Ｇは、プラスミドｐＭＤ２．Ｇと略称される（Ａｄｇｅｎｅ製、製品番号１２２５９）。２９３Ｔ細胞（ヒト胚性腎細胞）：ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−３２１６。
【００４８】
本実施例では、試験細胞を細胞移植治療に使用した。
一、ルシフェラーゼ標識試験細胞の調製
１、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１５μｇのｌｕｃレンチウイルスベクター、１０μｇのプラスミドｐｓＰＡＸ、及び５μｇのプラスミドｐＭＤ．２Ｇを、１×１０７個の２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトして、４８時間培養し、次に上澄み液を収集した。
２、ステップ１で得られた上澄み液を取り、４℃、１９２００ｒｐｍの条件で２．５時間遠心分離し、上澄みを捨て、ｈＭＳＣ培地で懸濁沈殿させて、ウイルス溶液を得た。
３、ステップ２で得られたウイルス溶液を試験細胞（４×１０５個の細胞：ＭＯＩ＝３  ｂｔｕ／ｃｅｌｌ）に感染させ、ｈＭＳＣ培地で３日間培養し、細胞を収集し、トリプシンで消化した後、新たなｈＭＳＣ培地に接種して３日間培養し、ルシフェラーゼ標識試験細胞を得た。
【００４９】
二、マウスの前脛骨筋への細胞の移植
１×１０６個のルシフェラーゼ標識試験細胞を、ＣＤ−１ヌードマウスの左右脚の前脛骨筋に注射し、７日間の後、動物ライブイメージャーで脚部に残留されているＭＳＣを検出した。ＦＯＸＯ３＋／＋ＭＳＣ細胞に対応する相対光強度は１であり、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞に対応する相対光強度は５．８±０．２８であった。
結果を図１３に示し、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣ細胞は、ＦＯＸＯ３＋／＋  ＭＳＣ細胞よりも長く成長することができた。
【００５０】
三、後肢虚血の免疫不全マウス筋肉への細胞移植
先ず、７．０番号の非吸収性手術糸を用いて、免疫不全マウス（ＢＡＬＢ／ｃ  Ｎｕｄｅマウス）の右後脚の動脈を結紮した直後、３×１０６個の試験細胞を右後脚の結紮部位の筋肉に注射し、移植後の０、４、８、１２、１６日目のマウスの後肢血流の回復状況をレーザードップラー流量計で検出した。試験細胞の注射の代わりにＰＢＳ緩衝液の注射を用いた対照処理を設置した。
各処理ごとに５匹のマウスを設置し、結果はその平均値とした。
結果を図１４に示す。図１４において、ＮＩは結紮されないマウスの左後脚を表し、Ｉｓｃｈは結紮された右後脚であった。ＰＢＳ緩衝液の注射又はＦＯＸＯ３＋／＋  ＭＳＣの移植に比べて、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣの移植は、損傷した後肢の血流をより速く回復することができ、ＦＯＸＯ３２ＳＡ／２ＳＡ  ＭＳＣは損傷した血管の再生及び修復に寄与したことを示している。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明に係るヒト間葉系幹細胞変異体は、環境ストレス及び細胞老化に抵抗することができ、より優れた組織修復機能及び悪性腫瘍の転化に対する抵抗能力を有する。本発明は、細胞移植治療における有効性と安全性という２つの重要なボトルネックとなる課題を同時に解決し、細胞移植治療の分野では応用や普及の価値が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2021514605.tif 000011
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2021514605.tif 000014
【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年8月28日(2020.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２に示すタンパク質をコードする遺伝子をゲノムに有する組換え間葉系幹細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の組換え間葉系幹細胞を含む細胞移植治療用製品。
【請求項３】
配列表の配列番号２に示すタンパク質をコードする遺伝子をゲノムに有する組換え多能性幹細胞。
【請求項４】
請求項３に記載の組換え多能性幹細胞を含む細胞移植治療用製品。
【請求項５】
ＦＯＸＯ３タンパク質の２５３番目のアミノ酸残基をコードするコドンの、セリンをコードするコドンからアラニンをコードするコドンへの変異と、ＦＯＸＯ３タンパク質の３１５番目のアミノ酸残基をコードするコドンの、セリンをコードするコドンからアラニンをコードするコドンへの変異との２つの変異を、多能性幹細胞のゲノムに対して行って、組換え多能性幹細胞を得るステップを含む、組換え多能性幹細胞の調製方法。
【請求項６】
前記多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒト胚性幹細胞がＨ９細胞株であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法により調製された組換え多能性幹細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の組換え多能性幹細胞を含む細胞移植治療用製品。
【請求項１０】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法により、組換え多能性幹細胞を調製するステップ（１）と、
ステップ（１）で得られた組換え多能性幹細胞を用いて、組換え間葉系幹細胞を調製するステップ（２）と、を含む、組換え間葉系幹細胞の調製方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法により調製された組換え間葉系幹細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組換え間葉系幹細胞を含む細胞移植治療用製品。
【請求項１３】
配列表の配列番号２に示すタンパク質。
【請求項１４】
配列表の配列番号３に示すＤＮＡ分子。
【国際調査報告】
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