(57)【要約】抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメント、抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物およびそれらの使用を提供する。前記抗体はクローディン１８．２と顕著な結合活性及び親和性を有するとともに、腫瘍細胞に対して高効率の体外ＡＤＣＣ殺傷活性を有し、抗腫瘍医薬の調製において使用できる。【選択図】図１
2021535744.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
（１）前記重鎖可変領域はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、但し
（ａ１）前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３及びそれらと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、
（ａ２）前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１０４、配列番号１０５及びそれらと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、
（ａ３）前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１０６、配列番号１０７及びそれらと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、及び
（２）前記軽鎖可変領域はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、但し
（ａ４）前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１０８であり、
（ａ５）前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１及びそれらと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、
（ａ６）前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６及びそれらと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択される、
抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
（１）前記重鎖可変領域は配列番号１０１で示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、配列番号１０５で示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ２及び配列番号１０６で示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ３を含み、及び
（２）前記軽鎖可変領域は配列番号１０８で示されるアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、配列番号１１１で示されるアミノ酸配列のＬＣＤＲ２及び配列番号１１５で示されるアミノ酸配列のＬＣＤＲ３を含む、
請求項１に記載の抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記抗体はマウス由来抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１又は２に記載の抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
（１）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、
（ｂ１）配列番号５０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８８で示されるアミノ酸配列、
（ｂ２）（ｂ１）で示されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され、且つ（ｂ１）で示されるアミノ酸配列と機能が同一又は類似するアミノ酸配列、及び
（ｂ３）（ｂ１）で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、及び
（２）前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、
（ｂ４）配列番号５１、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８４、配列番号８６、配列番号９０で示されるアミノ酸配列、
（ｂ５）（ｂ４）で示されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され、且つ（ｂ４）で示されるアミノ酸配列と機能が同一又は類似するアミノ酸配列、及び
（ｂ６）（ｂ４）で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択される、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７９、配列番号７９において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７９と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７９と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８１、配列番号８１において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８１と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、請求項４に記載の抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
（１）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、
（ｃ１）配列番号８２、配列番号８８で示されるアミノ酸配列、
（ｃ２）（ｃ１）で示されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され、且つ（ｃ１）で示されるアミノ酸配列と機能が同一又は類似するアミノ酸配列、及び
（ｃ３）（ｃ１）で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、及び
（２）前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、
（ｃ４）配列番号８４、配列番号８６、配列番号９０で示されるアミノ酸配列、
（ｃ５）（ｃ４）で示されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され、且つ（ｃ４）で示されるアミノ酸配列と機能が同一又は類似するアミノ酸配列、及び
（ｃ６）（ｃ４）で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択される、
請求項４に記載の抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８２、配列番号８２において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８２と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８２と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８４、配列番号８４において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８４と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８４と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８２、配列番号８２において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８２と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８２と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８６、配列番号８６において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８６と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８６と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８８、配列番号８８において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８８と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８８と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８４、配列番号８４において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８４と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８４と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８８、配列番号８８において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８８と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８８と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８６、配列番号８６において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８６と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８６と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８２、配列番号８２において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８２と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８２と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号９０、配列番号９０において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号９０と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号９０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、又は
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８８、配列番号８８において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８８と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８８と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号９０、配列番号９０において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号９０と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号９０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、
請求項６に記載の抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
前記重鎖アミノ酸配列は配列番号９２、配列番号９２において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号９２と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号９２と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖アミノ酸配列は配列番号９４、配列番号９４において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号９４と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号９４と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、又は
前記重鎖アミノ酸配列は配列番号９６、配列番号９６において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号９６と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号９６と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖アミノ酸配列は配列番号９８、配列番号９８において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号９８と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号９８と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、請求項７に記載の抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする単離されたヌクレオチド。
【請求項１０】
（１）  前記重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号９３又は配列番号９７で示され、及び
（２）  前記軽鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号９５又は配列番号９９で示される、
請求項９に記載のヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載のヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１２】
原核細胞及び真核細胞から選択され、好ましくは哺乳類細胞である、請求項１１に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを調製する方法であって、請求項１２に記載の宿主細胞において抗体を発現させるステップ、および宿主細胞から前記抗体を単離するステップを含む、方法。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメント及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１５】
クローディン１８．２を標的とする医薬を製造するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項１６】
前記クローディン１８．２を標的とする医薬は胃癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、頭頚部癌及び胆嚢癌の治療に使用される、請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体医薬技術分野に関し、具体的に抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメント、抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃癌は世界で発病率が五番目に高い癌であり、その致死率は三番目の高さとなっている。現在、化学療法が末期又は再発性胃癌の標準的な一次治療である。９０％以上の癌患者は普通の化学療法及び標的化学療法を受けるが、化学療法は一般的に癌を治愈することはできず、患者の生存期間を延長し、及び生活の質を改善できるだけであり、且つ薬剤耐性も容易に生じやすい。生物学的標的治療は、通常、腫瘍特異抗原又は腫瘍関連抗原をターゲットとし、ターゲットに対する抗体の結合又はブロッキングにより、人体の免疫応答を誘発し、周囲の正常な細胞及び組織には及ばずに、腫瘍を選択的に殺傷する。標的治療の特異性は強く、副作用は少なく、治療効果は確実である。
【０００３】
しかし悪性腫瘍の異質性から、癌により異なる分子生物学特性が表される。特に胃癌は、異質程度が比較的高く、従来開発された胃癌に対する生物学的標的治療医薬は、単剤使用では基本的に無効であり、又はごく一部の患者にしか有効ではない。その理由は、これらモノクローナル抗体医薬のターゲットは胃癌患者の特定のサブタイプにのみ発現するためである。典型的な例は、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）であり、これは化学療法と合わせ良好な治療効果を有するが、全胃癌患者の１５％のＨＥＲ２陽性個体にしか適用されない。
【０００４】
密着結合タンパク質（Ｃｌａｕｄｉｎｓ）は細胞間の密着結合構造を決定する最も重要な骨格タンパク質であり、接着結合に参与し、且つ腫瘍細胞の転移及び侵襲において重要な役目を果たす。クローディン（Ｃｌａｕｄｉｎ）タンパク質は哺乳類の上皮及び内皮細胞に広く存在し、その分布は主に上皮細胞側面および基底細胞質膜である。
【０００５】
異なるクローディンタンパク質は異なる組織においてそれぞれ特異的発現を有し、但しクローディン１８（Ｃｌａｕｄｉｎ１８、ＣＬＤＮ１８）遺伝子は３ｑ２２．３に位置決めされ、分子量２４ｋＤａ、２６１個のアミノ酸残基を含み、Ｃｌａｕｄｉｎｓスーパーファミリーメンバーであり、そのタンパク質構造は２個の細胞外ループ及び４個の膜貫通領域を含む。ヒトＣＬＤＮ１８タンパク質の２つのサブタイプはそれぞれＣＬＤＮ１８．１（ＮＭ＿０１６３６９．３）及びＣＬＤＮ１８．２（ＮＭ＿００１００２０２６．２）であり、両者のタンパク質の一次構造配列において、Ｎ末端シグナルペプチドから細胞外ループ１（Ｌｏｏｐ１）構造までのある位置のアミノ酸残基において少し区別されるだけで、特に細胞外ループ１では、ＣＬＤＮ１８．１及びＣＬＤＮ１８．２は８個のアミノ酸のみ異なる。この他、ＣＬＤＮ１８の二種類のサブタイプタンパク質の種間配列相同性も非常に高い。但しＣＬＤＮ１８．２の細胞外ループ１はヒト、マウス、アカゲザル等の異なる種における配列は完全に一致し、ヒトとマウスのＣＬＤＮ１８．２タンパク質相同性は８４％に達し、ＣＬＤＮ１８．２タンパク質配列は極めて保守的であることを表している（Ｏ．Ｔｕｒｅｃｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ４８１：  ８３−９２，  ２０１１）。
【０００６】
ＣＬＤＮ１８の二種類のサブタイプタンパク質は、それぞれ異なる組織で発現し、生理学機能を発揮する。ＣＬＤＮ１８．１は正常な肺組織細胞に組成的に発現する。ＣＬＤＮ１８．２タンパク質は正常な胃上皮細胞膜に発現し、胃以外の各組織ではいずれも発現しないか、又は極めて低い発現となる。Ｓａｌｉｎ等（Ｕ．  Ｓａｌｉｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４（２３）：  ７６２４−３４，  ２００８）はＲＴ−ＰＣＲ及び免疫組織化学方法を適用して胃癌、膵臓癌、食道癌等を含む複数の癌組織がＣＬＤＮ１８．２陽性であり、全体発現陽性率は６２．７％であることを検出した。別の研究では、正常な胃壁細胞に発現するＣＬＤＮ１８．２タンパク質は均一な糖鎖修飾を有し、細胞間構造は緻密であるが、胃癌細胞間構造はバラバラであり、細胞は容易に侵襲転移し、その上に発現するＣＬＤＮ１８．２タンパク質のグリコシル化は不完全であり、ターゲット露出を招く可能性があることが示されている（ＷＯ２００４／０４７８６３）。よって、ＣＬＤＮ１８．２は理想の腫瘍関連抗原ターゲットとなる可能性がある。
【０００７】
現在、アステラス社（Ａｓｔｅｌｌａｓ  Ｐｈａｒｍａ  Ｉｎｃ．）により開発されたヒトクローディン１８．２をターゲットとするモノクローナル抗体医薬Ｚｏｌｂｅｔｕｘｉｍａｂ（別名ＩＭＡＢ３６２）の臨床効果が著しい。ＩＩ期臨床試験（Ｓ．Ｂａｔｒａｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３４  （ｎｏ．１８＿ｓｕｐｐｌ），  ２０１６）が示すように、モノクローナル抗体医薬と化学薬剤により末期又は再発性胃癌に対して併用治療を行い、その患者中位生存期間は１３．２カ月であり、化学療法だけ用いた８．４カ月より明らかに長い。ＣＬＤＮ１８．２を標的とする特異性抗体は末期の胃、胃食道接合部腺癌患者の無増悪生存期間及び全生存期間を明らかに改善できることが初歩的に証明された。
【０００８】
ＷＯ２００４／０４７８６３は、ヒト／マウスキメラモノクローナル抗体の調製を記載しており、これは世界で初めてヒトクローディン１８．２ターゲットに対して開発された治療性抗体（以下抗ＣＬＤＮ１８．２抗体と略す）であると記載されている。当該特許出願に記載の抗体は主に抗体依存性細胞介在性細胞傷害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，  ＡＤＣＣ）によりＣＬＤＮ１８．２陽性腫瘍細胞を特異的に殺傷する。しかし、当該特許出願に記載の抗体と腫瘍細胞の間の特異的な識別及び殺傷は、主にＣＬＤＮ１８．２ターゲットの腫瘍細胞における発現の豊富度に依存し、細胞表面にＣＬＤＮ１８．２が高く発現されるときのみ、比較的明らかな結合及び殺傷活性が体現される。これは腫瘍細胞を選択的に殺傷する能力を高める高親和性モノクローナル抗体を調製する必要があることを示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上の従来技術に基づき、本発明は、優れた抗腫瘍活性を有する、高効率のＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は一つの方面において、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記重鎖可変領域は重鎖可変領域の相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖可変領域の相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）及び／又は重鎖可変領域の相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、前記軽鎖可変領域は軽鎖可変領域の相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖可変領域の相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）及び／又は軽鎖可変領域の相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む、抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１１】
一部の実施形態において、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
（１）前記重鎖可変領域はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
（ａ１）前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３及びそれらと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、
（ａ２）前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１０４、配列番号１０５及びそれらと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、
（ａ３）前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１０６、配列番号１０７及びそれらと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、及び
（２）前記軽鎖可変領域はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、但し
（ａ４）前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１０８であり、
（ａ５）前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１及びそれらと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、
（ａ６）前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６及びそれらと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択される、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１２】
一つの具体的な実施形態において、本発明は、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１０１、１０５及び１０６又は配列番号１０１、１０５及び１０６で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するＣＤＲである重鎖可変領域、及び前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３それぞれが配列番号１０８、１１１及び１１５又は配列番号１０８、１１１及び１１５で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するＣＤＲである軽鎖可変領域を有する、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１３】
一部の具体的な実施形態において、本発明による抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントはモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００１４】
一部の具体的な実施形態において、本発明による抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントはマウス由来抗体又はその抗原結合フラグメント、キメラ抗体又はその抗原結合フラグメント又はヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００１５】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
（１）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、
（ｂ１）配列番号５０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７７、配列番号７９で示されるアミノ酸配列、
（ｂ２）（ｂ１）で示されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され、且つ（ｂ１）で示されるアミノ酸配列と機能が同一又は類似するアミノ酸配列、及び
（ｂ３）（ｂ１）で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、及び
（２）前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、
（ｂ４）配列番号５１、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８１で示されるアミノ酸配列、
（ｂ５）（ｂ４）で示されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され、且つ（ｂ４）で示されるアミノ酸配列と機能が同一又は類似するアミノ酸配列、及び
（ｂ６）（ｂ４）で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択される、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１６】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号５０、配列番号５０において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号５０と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号５０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号５１、配列番号５１において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号５１と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号５１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１７】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号５０、配列番号５０において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号５０と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号５０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７０、配列番号７０において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７０と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１８】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号５０、配列番号５０において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号５０と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号５０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７１、配列番号７１において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７１と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１９】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７２、配列番号７２において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７２と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７２と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７３、配列番号７３において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７３と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７３と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００２０】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７４、配列番号７４において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７４と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７４と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７５、配列番号７５において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７５と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７５と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００２１】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号５０、配列番号５０において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号５０と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号５０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７６、配列番号７６において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７６と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７６と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００２２】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７７、配列番号７７において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７７と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７７と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７８、配列番号  ７８において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号  ７８と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号  ７８と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００２３】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７４、配列番号７４において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７４と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７４と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７０、配列番号７０において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７０と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００２４】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７４、配列番号７４において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７４と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７４と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７１、配列番号７１において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７１と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００２５】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７４、配列番号７４において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７４と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７４と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７６、配列番号７６において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７６と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７６と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００２６】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７２、配列番号７２において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７２と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７２と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７６、配列番号  ７６において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７６と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号  ７６と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００２７】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７７、配列番号７７において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７７と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７７と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７０、配列番号  ７０において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７０と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００２８】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７７、配列番号７７において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７７と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７７と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７６、配列番号７６において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７６と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７６と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００２９】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７９、配列番号７９において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７９と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７９と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７０、配列番号  ７０において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７０と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００３０】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７９、配列番号７９において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７９と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７９と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７６、配列番号  ７６において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７６と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号  ７６と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００３１】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号５０、配列番号  ５０において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号５０と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号５０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８０、配列番号８０において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８０と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００３２】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号５０、配列番号  ５０において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号５０と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号５０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８１、配列番号８１において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８１と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００３３】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７９、配列番号７９において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７９と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７９と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８０、配列番号８０において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８０と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００３４】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７９、配列番号７９において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号７９と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号７９と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８１、配列番号８１において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８１と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００３５】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、さらに、ヒト由来ＩｇＧ１又はその変異体の重鎖定常領域、ヒト由来ｋａｐｐａ鎖又はその変異体の軽鎖定常領域を含む、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００３６】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、配列番号７９で示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域に対して、
（ｃ１）Ｋ３Ｑ、Ｌ１９Ｒ、Ｒ４２Ｇ、Ｐ４５Ｌ、Ａ４９Ｓ、Ｅ７３Ｄ、Ｔ７８Ｓ、Ｅ８２Ｑ、Ｓ８４Ｎ、Ｓ８８Ａ、Ｍ９３Ｖ、Ａ１１８Ｓのアミノ酸置換を行い、置換後のアミノ酸配列は配列番号８２で示され、
（ｃ２）Ｋ３Ｑ、Ｖ５Ｌ、Ｌ１９Ｒ、Ｒ４２Ｇ、Ｐ４５Ｌ、Ａ４９Ｓ、Ｅ７３Ｄ、Ａ７５Ｓ、Ｅ８２Ｑ、Ｓ８Ｎ、Ｓ８８Ａ、Ｍ９３Ｖ、Ａ１１８Ｓのアミノ酸置換を行い、置換後のアミノ酸配列は配列番号８８で示され、
且つ配列番号８１で示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域に対して、
（ｃ３）Ｄ１Ｅ、Ｓ９Ｐ、Ｓ１０Ｔ、Ｔ１２Ｓ、Ｖ１３Ｌ、Ｔ１４Ｓ、Ａ１５Ｐ、Ｋ１８Ｒ、Ｋ２１Ｌ、Ｐ４９Ａ、Ｋ５１Ｌ、Ｇ６３Ｓ、Ｖ６４Ｉ、Ｄ６６Ａ、Ｔ６９Ｓ、Ｖ８４Ｌ、Ａ８６Ｐ、Ａ１０６Ｑ、Ｌ１１２Ｉのアミノ酸置換を行い、置換後のアミノ酸配列は配列番号８４で示され、
（ｃ４）Ｓ９Ｄ、Ｔ１２Ａ、Ｔ１４Ｓ、Ａ１５Ｌ、Ｋ１８Ｒ、Ｖ１９Ａ、Ｍ２１Ｉ、Ｓ２２Ｎ、Ｔ６９Ｓ、Ｖ８４Ｌ、Ｌ８９Ｖ、Ａ１０６Ｑ、Ｌ１１２Ｉのアミノ酸置換を行い、置換後のアミノ酸配列は配列番号８６で示され、
（ｃ５）Ａ９Ｌ、Ｔ１２Ｐ、Ａ１５Ｌ、Ｅ１７Ｑ、Ｋ１８Ｐ、Ｖ１９Ａ、Ｔ２０Ｓ、Ｍ２１Ｉ、Ｋ４５Ｒ、Ｐ４９Ｓ、Ｋ５１Ｒ、Ｔ６９Ｓ、Ｔ８０Ｋ、Ｓ８３Ｒ、Ｑ８５Ｅ、Ｌ８９Ｖ、Ａ９０Ｇ、Ａ１０６Ｑ、Ｌ１１２Ｉのアミノ酸置換を行い、置換後のアミノ酸配列は配列番号９０で示される、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００３７】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、
（１）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、
（ｃ１）配列番号８２、配列番号８８で示されるアミノ酸配列、
（ｃ２）（ｃ１）で示されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され、且つ（ｃ１）で示されるアミノ酸配列と機能が同一又は類似するアミノ酸配列、及び
（ｃ３）（ｃ１）で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、及び
（２）前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、
（ｃ４）配列番号８４、配列番号８６、配列番号９０で示されるアミノ酸配列、
（ｃ５）（ｃ４）で示されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され、且つ（ｃ４）で示されるアミノ酸配列と機能が同一又は類似するアミノ酸配列、及び
（ｃ６）（ｃ４）で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択される、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００３８】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８２、配列番号８２において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８２と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８２と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８４、配列番号８４において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８４と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８４と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００３９】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８２、配列番号８２において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８２と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８２と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８６、配列番号８６において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８６と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８６と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００４０】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８８、配列番号８８において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８８と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８８と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８４、配列番号８４において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８４と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８４と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００４１】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８８、配列番号８８において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８８と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８８と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８６、配列番号８６において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８６と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８６と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００４２】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８２、配列番号８２において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８２と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８２と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号９０、配列番号９０において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号９０と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号９０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００４３】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８８、配列番号８８において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号８８と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号８８と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号９０、配列番号９０において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号９０と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号９０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００４４】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、重鎖アミノ酸配列は配列番号９２、配列番号９２において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号９２と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号９２と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ軽鎖アミノ酸配列は配列番号９４、配列番号９４において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号９４と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号９４と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００４５】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、重鎖アミノ酸配列は配列番号９６、配列番号９６において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号９６と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号９６と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、且つ軽鎖アミノ酸配列は配列番号９８、配列番号９８において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加され且つ配列番号９８と機能が同一のアミノ酸配列又は配列番号９８と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【００４６】
本発明は別の方面において、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする単離されたヌクレオチドを提供する。
【００４７】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、
（１）  前記重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号９３又は配列番号９７で示され、
（２）  前記軽鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号９５又は配列番号９９で示される、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を提供する。
一部の具体的な実施形態において、本発明は、
（１）  前記重鎖アミノ酸配列配列番号９２をコードするヌクレオチド配列は配列番号９３で示され、及び
（２）  前記軽鎖アミノ酸配列配列番号９４をコードするヌクレオチド配列は配列番号９５で示される、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を提供する。
【００４８】
一部の具体的な実施形態において、本発明は、
（１）  前記重鎖アミノ酸配列配列番号９６をコードするヌクレオチド配列は配列番号９７で示され、及び
（２）  前記軽鎖アミノ酸配列配列番号９８をコードするヌクレオチド配列は配列番号９９で示される、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を提供する。
【００４９】
本発明の別の方面において、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを発現する発現ベクターを提供する。本発明による発現ベクターは、本発明の単離されたヌクレオチド分子を含む。
【００５０】
本発明の別の方面において、前記の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００５１】
一部の実施形態において、本発明による宿主細胞は原核細胞及び真核細胞から選択される。一部の実施形態において、前記の宿主細胞は細菌であり、好ましくは大腸菌である。もう一つの好ましい実施形態において、前記の宿主細胞は哺乳類細胞である。
【００５２】
本発明の別の方面において、前記宿主細胞において抗体を発現させるステップ、および宿主細胞から前記抗体を単離するステップを含む本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントを調製する方法を提供する。
【００５３】
本発明の別の方面において、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態において、本発明は、さらに他の活性成分、例えば他の抗体、標的医薬等を含む本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態において、前記薬学的に許容される担体は酸化防止剤、ポリペプチド、タンパク質、親水性ポリマー、アミノ酸、糖、キレート、糖アルコール、イオン及び界面活性剤から選択される。一つの具体的な実施形態において、前記薬学的に許容される担体は緩衝水溶液である。もう一つの具体的な実施形態において、前記薬学的に許容される担体はリポソームの形式である。
【００５４】
経口又は非経口投与に適するように、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントと薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を混合して、医薬製剤に調製することができる。投与方法としては、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、脳内、眼内、気管内、皮下、経鼻投与を含むが、これらに限定されない。前記製剤は如何なる手段で使用されてもよく、例えば点滴又は急速静注で、上皮又は皮膚粘膜（例えば口腔粘膜又は直腸等）より吸收される手段で使用できる。投与は全身でも局部でもよい。前記製剤は当分野の既知の方法で調製でき、且つ医薬製剤分野で通常使用される担体、希釈剤又は賦形剤を含むことができる。
【００５５】
本発明の別の方面において、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメント又は本発明の医薬組成物を必要とされる個体に投与することを含むＣＬＤＮ１８．２を標的とする治療方法を提供する。
【００５６】
本発明の別の方面において、ＣＬＤＮ１８．２を標的とする医薬を製造するための、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメント又は本発明の医薬組成物の使用を提供する。一部の実施形態において、前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする医薬は胃癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、頭頚部癌及び胆嚢癌の治療に使用される。一部の実施形態において、本発明が抗腫瘍医薬を製造するための、上記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメント又は本発明の医薬組成物の使用を提供し、好ましくは、前記腫瘍は胃癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、頭頚部癌及び胆嚢癌から選択される。
【発明の効果】
【００５７】
本発明が提供する抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントは顕著な抗腫瘍作用を有し、親和性が高く、体外ＡＤＣＣ腫瘍細胞殺傷能力が強く、顕著な技術的な優位性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１はキメラ抗体とＣＬＤＮ１８．２細胞の結合であり、但し横座標は抗体濃度、単位はｎｇ／ｍｌ、縦座標は４５０ｎｍのＯＤ値である。
【図２】図２はキメラ抗体とＣＬＤＮ１８．１細胞の結合であり、但し横座標は抗体濃度、単位はｎｇ／ｍｌ、縦座標は４５０ｎｍのＯＤ値である。
【図３】図３はファージＦａｂとＣＬＤＮ１８．２タンパク質の結合であり、但し横座標はファージの力価、縦座標は４５０ｎｍのＯＤ値である。
【図４】図４はヒト化抗体とＣＨＯ−Ｋ１−ＣＬＤＮ１８．２細胞の結合であり、但し横座標は抗体濃度、単位はｍｇ／ｍｌ、縦座標は細胞と結合する平均蛍光強度ＭＦＩである。
【図５】図５はヒト化抗体とＣＨＯ−Ｋ１−ＣＬＤＮ１８．１細胞の結合であり、但し横座標は抗体濃度、単位はｍｇ／ｍｌ、縦座標は細胞と結合する平均蛍光強度ＭＦＩである。
【図６】図６はヒト化抗体のＡＤＣＣ活性である。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
定義
本文で使用される科学及び技術用語の意味は別途定義がある場合を除き、当業者が通常理解する意味である。本文に記載の細胞及び組織培養、分子生物学およびタンパク質及びオリゴ又はポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションで使用する命名及び技術は当分野で公知であり且つ普遍的に使用されるものである。組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成及び組織培養と形質転換（例えばエレクトロポレーション、脂質トランスフェクション）については標準技術を用いる。酵素反応及び精製技術はメーカーの説明書又は当分野で普遍的に使用される又は本文に記載の方法に基づき行う。前述の技術及び方法は通常、当分野で公知であり且つ本明細書で引用及び検討された複数の総合的な及び比較的具体的な文献に記載されているように使用される。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）  （第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨークコールドスプリングハーバー（１９８９））を参照できる。本文に記載の分析化学、合成有機化学および医学及び薬学化学において使用される命名および実験室方法及び技術は当分野で公知であり且つ普遍的に使用されるものである。
【００６０】
本発明において、用語“少なくとも８０％の配列同一性を有する”とは、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有することを指す。本発明において、用語“少なくとも８５％の配列同一性を有する”とは、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有することを指す。一部の好ましい実施形態において、本発明に記載の配列同一性は少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％とすることができる。２つの配列の間の配列比較及び同一性の百分比測定はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｓｔｕｔｕｔｅホームページのＢＬＡＳＴＮ／ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムにより行うことができる。
【００６１】
抗体分子において、軽鎖の三つの高可変領域及び重鎖の三つの高可変領域は三次元空間において相対的な位置に排列されて抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は結合する抗原の三次元表面と相補的であり、且つ各重鎖及び軽鎖の三つの高可変領域はすべて“相補性決定領域”又は“ＣＤＲ”と称される。アミノ酸の各ドメインへの分配はＫａｂａｔ『免疫学の関心のあるタンパク質の配列』（国立衛生研究院、メリーランド州ベセスダ（１９８７及び１９９１））又はＣｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）に基づき定義される。
【００６２】
本発明に記載の“抗原結合フラグメント”とは抗原結合活性を有するＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント及びヒトクローディン１８．２と結合するＦｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメントを指す。Ｆｖフラグメントは抗体重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むが、定常領域はなく、そして全ての抗原結合部位を有する最小抗体フラグメントである。一般的に、Ｆｖ抗体はさらにＶＨ及びＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーを含み、且つ抗原結合に必要な構造を形成できる。また、異なる連結物により２つの抗体可変領域を一本のポリペプチド鎖に連結してもよく、単鎖抗体又は単鎖Ｆｖ  （ｓｃＦｖ）と称される。
【００６３】
本発明に記載の抗体とは、免疫グロブリン分子又はその免疫活性部分を指し、即ち特異的に抗原を結合する（それと免疫応答する）の抗原結合部位を含む分子である。“特異的に結合する”とは、抗体が抗原の一つ又は複数の抗原決定基と反応するが、他のポリペプチドとは反応しない又は非常に低い親和性（Ｋｄ＞１０−６）で他のポリペプチドと結合することを指す。抗体はポリクローナル、単クローン、キメラ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びＦａｂ発現ライブラリーを含むが、これに限らない。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は単一のクローン細胞株から得られる抗体であり、前記の細胞株は真核、原核又はファージのクローン細胞株に限らない。モノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントはハイブリドーマ技術、組み換え技術、ファージディスプレイ技術及びＣＤＲ  ｇｒａｆｔｉｎｇなどの合成技術又はその他の従来技術により組み換えして得られる。
【００６４】
本発明に記載の“マウス由来抗体”は当分野の知識及び技能により調製されたヒトＣＬＤＮ１８．２に対するモノクローナル抗体である。調製時にＣＬＤＮ１８．２抗原を被験体に注射し、その後、必要な配列又は機能特性を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離する。
【００６５】
本発明に記載の“キメラ抗体”はマウス由来抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域を融合させて形成された抗体であり、マウス由来抗体により誘発される免疫応答を低下させることができる。キメラ抗体を樹立するには、まずマウス由来特異性モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを樹立し、その後マウスハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子をクローニングし、それから必要に応じてヒト抗体の定常領域遺伝子をクローニングし、マウス可変領域遺伝子とヒト定常領域遺伝子を連結してキメラ遺伝子を形成した後、発現ベクターに挿入し、最後に真核工業システム又は原核工業システムにおいてキメラ抗体分子を発現させる。
【００６６】
本発明に記載の“ヒト化抗体”はＣＤＲ移植抗体とも称し、マウスのＣＤＲ配列をヒトの抗体可変領域フレーム（ＦＲ）に移植して生成される抗体である。この種の可変領域フレーム配列は公共のＤＮＡデータベース又は公開されている参考文献から得ることができ、例えばＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  （ＩＭＧＴ）ホームページｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ又は免疫グロブリン学会誌、２００１ＩＳＢＮ０１２４４１３５１から得られる。
【００６７】
以下の代表的な実施例は本発明をより良く説明するためのものであり、本発明の保護範囲を限定するものではない。以下の実施例において条件を注記していない実験方法は通常、通常の条件、例えばコールド・スプリング・ハーバーの抗体技術実験ハンドブック、分子クローニングハンドブック等、或いは原料又は商品のメーカーが提案する条件で行うことができる。実施例において使用される材料、試薬は特別な説明がない限り、いずれも市販のものである。
【実施例】
【００６８】
実施例１    陽性対照抗体の調製
１、陽性対照抗体ＩＭＡＢ３６２−ｓｉｍｉｌａｒ−ｈＧ１の調製：
特許出願ＷＯ２００７／０５９９９７が提供する１７５Ｄ１０クローン（ＩＭＡＢ３６２）抗体配列（即ち本公開の配列番号１１及び配列番号１２）に基づき、南京金斯瑞生物科技有限公司に依頼し、コドン最適化後、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターに合成した。構築されたプラスミドはｐｃＤＮＡ３．１−ｈＧ１及びｐｃＤＮＡ３．１−ｈＫを含む。プラスミドを１：１の割合でｅｘｐｉＣＨＯ細胞にコトランスフェクションして一過性発現させ、回転速度１１０ｒｐｍ、３７℃、８％  のＣＯ２で４日間培養した後、３２℃のシェーカーに移して引き続き８−１０日間培養した。４５００ｒｐｍで、２５分間遠心分離し、採取したタンパク質の上澄みをＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーで精製した：０．１ＭのＮａＯＨ溶液でＡＫＴＡクロマトグラフィーシステム及びクロマトグラフィーカラムを３０  分間洗浄し、超純水できれいにすすぎ、ｐＨ７．４の２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で１０カラム体積で平衡化し、流速を２  ｍｌ／分間とし、サンプルをロードし、平衡化バッファーで１０カラム体積でクロマトグラフィーカラムを洗浄し、ｐＨ３．４の５０ｍＭの酢酸緩衝液で３−５カラム体積で溶出し、溶出したタンパク質を採取し、限外濾過濃縮して抗体をｐＨ７．０の２０ｍＭのリン酸塩緩衝液に置換して保存した。
【００６９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動結果は、陽性抗体ＩＭＡＢ３６２−ｓｉｍｉｌａｒ−ｈＧ１の分子量は約１５５ＫＤであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ純度が９０％より大きいことを示した。
【００７０】
２、マウス由来陽性対照抗体ＩＭＡＢ３６２−ｓｉｍｉｌａｒ−ｍＧ２ａの調製：
即ち、陽性抗体可変領域配列とマウスＩｇＧ２ａ定常領域を組み合わせた抗体配列配列番号１３及び配列番号１４である。コドン最適化後、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターに合成した。構築されたプラスミドはｐｃＤＮＡ３．１−ｍＧ２ａ及びｐｃＤＮＡ３．１−ｍＫを含む。プラスミドを１：１の割合でｅｘｐｉＣＨＯ細胞にコトランスフェクションして陽性抗体タンパク質を一過性発現させた。得られた上澄みタンパク質をＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーで精製した：０．１ＭのＮａＯＨ溶液でＡＫＴＡクロマトグラフィーシステム及びクロマトグラフィーカラムを３０  分間洗浄し、超純水できれいにすすぎ、ｐＨ７．４の２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で１０カラム体積で平衡化し、流速を２  ｍｌ／分間とし、サンプルをロードし、平衡化バッファーで１０カラム体積でクロマトグラフィーカラムを洗浄し、ｐＨ３．４の５０ｍＭの酢酸緩衝液で３−５カラム体積で溶出し、溶出したタンパク質を採取し、限外濾過濃縮して抗体をｐＨ７．０の２０ｍＭのリン酸塩緩衝液に置換して保存した。
【００７１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動結果は、陽性抗体ＩＭＡＢ３６２−ｓｉｍｉｌａｒ−ｍＧ２ａの非還元型電気泳動はタンパク質分子量約１５５ＫＤを示し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ純度は９０％よりも大きいことを示した。
【００７２】
実施例２    ＣＬＤＮ１８．２抗原遺伝子の合成及び発現ベクターの構築
ヒトＣＬＤＮ１８．２抗原を発現する融合タンパク質配列設計は以下表１で示される。
【表１】
2021535744.tif 000003
【００７３】
上記設計されたヒトＣＬＤＮ１８．２抗原の融合タンパク質配列に対して真核コドン最適化を行い、遺伝子５’端にＮｏｔＩ等の制限酵素切断部位及びｔＰＡシグナルペプチド配列を加え、遺伝子３’端にＸｈｏＩ等の制限酵素切断部位およびＭｙｃ−Ｈｉｓ融合タンパク質タグを加える。上記配列番号１、３、５、６配列を合成し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターに構築し、ヒトＣＬＤＮ１８．２抗原を発現したＤＮＡプラスミドを得た。プラスミドはｐｃＤＮＡ３．１−ｌｏｏｐ１、ｐｃＤＮＡ３．１−ＴＭＬ、ｐｃＤＮＡ３．１−ＣｐＧ−ｌｏｏｐ１およびｐｃＤＮＡ３．１−ＣＬＤＮ１８．２−ＦＬを含む。
【００７４】
上記配列番号７、９配列は宝生物工程（大連）有限公司（以下、宝生物公司と略す）により最適化後に合成し、レンチウイルスベクターｐＬＶＸ−ＮＳ−ＺｓＧｒｅｅｎ（宝生物公司）に構築した。構築したレンチウイルスプラスミドｐＬＶＸ−ＣＬＤＮ１８．２−ＺｓＧｒｅｅｎ及びｐＬＶＸ−ＣＬＤＮ１８．１−ＺｓＧｒｅｅｎをさらにＨＥＫ２９３−ＣＬＤＮ１８．２融合緑色蛍光タンパク質安定発現細胞株の構築、およびＨＥＫ２９３−ＣＬＤＮ１８．１融合緑色蛍光タンパク質安定発現細胞株の構築に用いる。
【００７５】
増幅培養されたプラスミドを制限酵素切断の同定に用い、同定結果は、制限酵素切断標的バンドが予想された大きさと一致することを示し、これは構築が正しいことを示した。
【００７６】
実施例３    ＣＬＤＮ１８．２抗原タンパク質の発現
１、プラスミドＤＮＡ体外一過性トランスフェクション
実施例２で増幅培養したプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞（中国科学院生物化学及び細胞生物学研究所、以下上海細胞所と略す）に体外一過性トランスフェクションし、タンパク質レベルで分析した。具体的な実験ステップは以下のとおり：トランスフェクションの前日、３×１０５個／ｃｍ２の接種密度でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートに平らに敷き、一晩培養し（培地成分：１０％のウシ胎児血清ＤＭＥＭ培地＋１％のペニシリン−ストレプトマイシン）、細胞はトランスフェクション当日、完全に壁に付着し、細胞の豊富さは７０％−９０％に達し（６ウェルプレートの各ウェルの大きさは９ｃｍ２であり、細胞コンフルエントは約２−２．５×１０６個／ウェルである）、ＰＥＩ陽イオントランスフェクション試薬（ｓｉｇｍａ）又はリポソーム（Ｌｉｐｏ３０００，  Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してＤＮＡプラスミドと混合し、ＤＮＡプラスミドトランスフェクション複合体を調製し、細胞を加えて室温で５−２０分間静置し、３７℃、５％の  ＣＯ２で、４−５時間インキュベートし、６ウェルプレートに血清を含む完全培地を補充し、４８−７２時間培養し、外来遺伝子を体外で真核細胞において一過性発現させた。
【００７７】
２、ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔハイブリダイゼーション
一過性トランスフェクションした後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を採取し、標的タンパク質とウサギ抗ヒトクローディン１８抗体（Ｔｈｅｒｍｏ，  Ｃａｔ：  ７００１７８）を室温で２時間ハイブリダイゼーションし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、アルカリ性リン酸酵素標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ，  Ｃａｔ：  ３１３４６）と室温で１時間ハイブリダイゼーションし、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔで標的タンパク質の発現状況を検出した：Ｌｉｐｏリポソームトランスフェクションシステムを用いて、プラスミドは標的タンパク質ＣＬＤＮ１８．２−ｌｏｏｐ１及びＣＬＤＮ１８．２−ＴＭ−ｌｏｏｐ１の発現に成功し、分子量はそれぞれ１１ＫＤ及び１４ＫＤであり、ｐｃＤＮＡ３．１−ＣＬＤＮ１８．２−ＦＬプラスミドは標的タンパク質ＣＬＤＮ１８．２の発現に成功し、分子量の大きさは２９ＫＤであった。
【００７８】
実施例４  マウスハイブリドーマの調製
１、動物免疫：
ＱＩＡＧＥＮエンドトキシンフリープラスミドマキシ抽出キット説明書に基づき、プラスミドＤＮＡ抽出調製し、これにはｐｃＤＮＡ３．１−ｌｏｏｐ１（以下Ｌｏｏｐ１と略す）、ｐｃＤＮＡ３．１−ＴＭ−Ｌｏｏｐ１（以下ＴＭＬと略す）、ｐｃＤＮＡ３．１−ＣｐＧ−ｌｏｏｐ１（以下Ｌｏｏｐ１−Ｃと略す）が含まれる。各プラスミドは以下の表２の実験群に基づきマウス免疫を行い、但しＳＪＬマウスは北京維通利華実験動物技術有限公司から購入し、ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣ５７マウスは南京市玄武区華阜康生物製品中心から購入した。免疫はＺｈｉｗｅｉ  Ｃｈｅｎ等に記載の方法（Ｚ．Ｃｈｅｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １２３（６）：２６２９−２６４２（２０１３））を参照し、適切に修正した。具体的には以下のとおり：ＤＮＡプラスミドをインビボ遺伝子導入装置（上海塔瑞莎生物技術有限公司）により２点に分け、マウス左右後肢の筋肉にそれぞれに注射し、各点で等量のＤＮＡプラスミドを注射し、注射体積は５０μｌであった。注射後、すぐに導入装置の電極でマウスの注射部位に電気パルス刺激を入力し、電圧を３６Ｖとし、合計６回パルスした。電気パルス刺激はマウス筋肉細胞のＤＮＡプラスミド吸収を促進し、マウスＤＮＡ免疫応答、特に体液免疫応答レベルを高めることができる。ＤＮＡ免疫は２週間毎に１回注射し、合計３回免疫した。２回目及び３回目の免疫の７日後、マウス眼底静脈叢から採血し、フローサイトメトリー分析を行い、血清抗体中に明らかなＣＬＤＮ１８陽性シグナルが検出された時、マウスに対してＨＥＫ２９３−ＣＬＤＮ１８．２細胞を抗原として採用し、５×１０７個／ｍｌ細胞懸濁液を調製し、１００μｌ即ち５×１０６個の細胞でマウスに腹腔注射し、免疫を追加した。
【表２】
2021535744.tif 000004
【００７９】
２、免疫血清のＦＡＣＳ検出：
マウスの２回目、３回目のＤＮＡ免疫の一週間後、それぞれマウス眼底静脈叢を採集し、免疫血清を調製した。ブロッキング溶液（２％ＢＳＡのＰＢＳ）で１：５０の体積で血清を希釈した。ヒト胃癌細胞ＮＵＧＣ４（南京科佰生物科技有限公司）を早期蘇生させて培養し、１０％ウシ胎児血清含有１６４０培地、３７℃、５％  ＣＯ２で培養した。細胞状態が良好で、成長集密度が７０−８０％である時、胃癌細胞消化液（斉氏生物科技有限公司）、３７℃で、細胞を１５分間消化処理した。完全な１６４０培地で消化を終了し、１０００ｒｐｍで、５分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。適量のブロッキング溶液を加え、細胞を再懸濁し、細胞密度を１×１０６個／ｍｌに調節した。１００μｌの  ＮＵＧＣ４細胞と１００μｌの希釈マウス血清を混合し、４℃で１時間インキュベートし、Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で２回洗浄し、毎回１０００ｒｐｍで、５分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。１００μｌ  のＰＥ標識ヤギ抗マウス抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、４℃で１時間インキュベートし、Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で２回洗浄し、毎回１０００ｒｐｍで、５分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。３００μｌの  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒを加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー分析装置で検出した。
【００８０】
ＤＮＡ免疫の２回目の後、ナンバー＃０１０３マウスは明らかな陽性シグナルシフトが検出され、当該ナンバーのマウスに抗ＣＬＤＮ１８特異性抗体反応が生じたことを表す。またＤＮＡ免疫の３回目の後、すべてのマウスに陽性シグナルが検出されたが、ナンバー＃０１０１、＃０１０２、＃０１０３、＃０２０３、＃０３０１、＃０３０３マウスはＣＬＤＮ１８陽性率が５０％より大きく、これは３回目のＤＮＡ免疫の後、これらマウス体内に明らかな抗体免疫応答が生じ、血清中に比較的高いレベルの抗ＣＬＤＮ１８抗体が存在することを表す。
【００８１】
３、マウスハイブリドーマ細胞の調製：
マウス骨髓瘤細胞懸濁液の調製：２週間前にマウス骨髓瘤細胞ＳＰ２／０を蘇生させ、１０％ウシ胎児血清含有１６４０培地で、３７℃、５％の  ＣＯ２で培養、継代した。融合当日、ＳＰ２／０細胞状態を観察した。顕微鏡検査によりＳＰ２／０細胞集密度は７０％−８０％であったため、細胞は対数生長期にあると判断した。３００ｇ、５分間の遠心分離によりＳＰ２／０細胞を採取し、２０ｍｌの  ＰＢＳ、１０００ｒｐｍ、５分間で１回洗浄し、上澄みを廃棄した。適量の１６４０培地で再懸濁し、ＳＰ２／０細胞濃度を１×１０７個／ｍｌに調節し、使用に備える。
【００８２】
マウス飼育層細胞懸濁液の調製：融合前日、２０匹の週齢１０−１２週の健康なＢａｌｂ／ｃマウスを頸椎脱臼により死亡させ、滅菌手術メスでマウス腹部の皮膚を開き、先に腹部に横に小さくメスを加え、それから縦方向に胸部に向かって切り開き、マウスの腹部を露出させた。腹腔マクロファージ細胞を採取した：まずアルコール綿棒でマウス腹部を消毒し、それから注射器でマウスの腹腔に５ｍｌの１６４０基礎培地を注射し、マウスの腹部を５分間優しくさすってマッサージし、その後、注射器で腹腔の液体を吸い戻した。１回繰り返し、３ｍｌの１６４０基礎培地を注射した後、吸い戻した（または腹膜を切り開いた後、パスツールピペットで残りのマクロファージ細胞を吸い戻した）。採取したマクロファージ細胞を１５００ｒｐｍで、１０分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、１０ｍｌ（１０％ウシ胎児血清含有１６４０培地）で細胞を再懸濁し、使用に備える。
【００８３】
マウス脾臓リンパ細胞懸濁液の調製：細胞追加免疫後３−４日目、免疫マウス脾臓細胞を取ってＳＰ２／０と融合させた。マウスを頸椎脱臼により死亡させ、腹膜を滅菌で切断し、脾臓を取り出して周囲の結合組織を剥がし取った。マウス脾臓細胞を研磨した後、７０μｍのメッシュで濾過し、予め１５ｍｌの  １６４０培地を装填した５０ｍｌの遠心分離管に入れ、単細胞懸濁液を調製した。１５００ｒｐｍで、５分間、１６４０培地で洗浄し、上澄みを廃棄した。４ｍｌの赤血球溶解液（Ｓｉｇｍａ）を加えて赤血球を約２分間溶解した。同じ体積の１６４０培地を加え、１５００ｒｐｍで、５分間遠心分離し、上層赤血球層を廃棄した。２０ｍｌの  ＰＢＳで再懸濁し、２回洗浄し、１５００ｒｐｍで，５分間遠心分離した。２回目の洗浄後、１５ｍｌの  ＰＢＳで細胞を再懸濁し、この時、もし塊のある結合組織が残っていれば、細胞を全部ふるいにかけ、新しい５０ｍｌの遠心分離管に移すことができ、脾臓リンパ細胞をカウントし、適量の１６４０培地で再懸濁し、脾臓細胞を１×１０７個／ｍｌに調節した。
【００８４】
１×１０８個の脾臓細胞を取り、１：１の割合でＳＰ２／０細胞と混合し、１５００ｒｐｍで、５分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。ＢＴＸ電気融合緩衝液で再懸濁して均一に混ぜ、ＢＴＸ電気融合装置の説明書の手順に従って、電気融合操作を行った。融合後の細胞を室温で３０分間静置し、その中に１×ＨＡＴ、１０％のウシ胎児血清を含む１６４０選択培地を加え、それから予め調製した飼育層細胞懸濁液を加え、９６ウェルプレートを合計２００枚敷き詰め、３７℃、５％  のＣＯ２で５−７日間培養した。その後、１×ＨＴを含む培地を用いて液を取り換え、融合後のハイブリドーマ細胞クローンを培養した。
【００８５】
実施例５  陽性細胞株の調製
ａ．ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＬＤＮ１８．２安定細胞株の構築
１週間前にＣＨＯ−Ｋ１細胞（上海細胞所）を蘇生させ、１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥ／Ｆ１２完全培地で、３７℃、５％  のＣＯ２で培養した。細胞をトランスフェクションしたプラスミドはｐｃＤＮＡ３．１−ＣＬＤＮ１８．２−ＦＬであった（合成配列は配列番号６を参照）。トランスフェクション当日、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の成長密度は８０％−９０％に達し、Ｂｉｏｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌエレクトロポレーション操作の説明に基づき、プラスミドをＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションし、トランスフェクションした細胞を予熱されている完全培地を有する培養皿に全部移し、３７℃、５％の  ＣＯ２で一晩静置して培養した。２日目、最終濃度１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｓｉｇｍａ）耐性を加えて３−４日間スクリーニングし、Ｇ４１８耐性を含む完全培地で少なくとも５回継代し、クローンが安定した後、細胞ＣＬＤＮ１８．２の発現状況を検出した。その結果、陽性抗体ＩＭＡＢ３６２−ｓｉｍｉｌａｒ−ｈＧ１（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）で細胞をインキュベートし、フローサイトメトリーで分析し、ＣＨＯ−Ｋ１ブランク細胞と比較し、トランスフェクション細胞は５回継代した後、トランスフェクション細胞はヒトクローディン１８．２を安定発現することを示した。
【００８６】
ｂ．ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＬＤＮ１８．１安定細胞株の構築
ｐＬＶＸ−ＣＬＤＮ１８．１−ＺｓＧｒｅｅｎプラスミドをテンプレートとし、プライマー配列配列番号１５及び配列番号１６を設計し、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ（Ｔａｋａｒａ）説明書に基づきＰＣＲ系を設定し、ＰＣＲ工程は９８℃で３０秒変性し、６０℃で３０秒アニーリングし、７２℃で１分間伸長し、３０回サイクルで増幅してＣＬＤＮ１８．１−ＦＬ標的遺伝子フラグメントを得た（配列番号１７を参照）。ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩの両酵素で標的遺伝子及びｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを切断し、Ｔ４連結酵素（Ｔａｋａｒａ）を１６℃で一晩連結した。連結した生成物をＥ．ｃｏｌｉ大腸菌に形質転換し、ミニ抽出キットでプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＣＬＤＮ１８．１を抽出する。プラスミドを上記ステップでＣＨＯ−Ｋ１細胞にエレクトロポレーションし、Ｇ４１８耐性培地で培養し、細胞を継代し、ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔの結果、トランスフェクションした細胞は抗ＣＬＤＮ１８抗体（Ｔｈｅｒｍｏ）により染色されて陽性反応を呈し、ＦＡＣＳ分析では、トランスフェクション細胞はＣＬＤＮ１８．２陽性抗体ＩＭＡＢ３６２−ｓｉｍｉｌａｒ−ｈＧ１と１０μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした後、陰性蛍光シグナルを示した。これはトランスフェクションＣＬＤＮ１８．１細胞の構築が成功したことを表す。
【００８７】
実施例６  母クローンのハイブリドーマ抗体スクリーニング
融合後に得られた母クローンハイブリドーマ細胞に対して一次スクリーニングを行い、スクリーニング方法は以下を含む：細胞ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳでハイブリドーマ細胞培養の上澄みをそれぞれ検出し、その中からＣＬＤＮ１８陽性ハイブリドーマ母クローンがスクリーニングされる。一次スクリーニングでＣＬＤＮ１８陽性を示したクローンを拡大培養した後、二次スクリーニングを行い、その中からＦＡＣＳでＣＬＤＮ１８．２陽性ＣＬＤＮ１８．１陰性を示すハイブリドーマ母クローンがスクリーニングされる。ハイブリドーマ抗体は２回の細胞ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによってスクリーニングされ、数百株の母クローン細胞から合計９株のＣＬＤＮ１８．２特異性抗体を分泌する母クローン細胞がスクリーニングされ、ＨＥＫ２９３−ＣＬＤＮ１８．２細胞と陽性結合できるが、ＨＥＫ２９３−ＣＬＤＮ１８．１細胞との結合は陰性であった。
【００８８】
実施例７  サブクローンの培養及びスクリーニング
１、サブクローンの培養
実施例６のスクリーニングで得られたハイブリドーマ細胞で単クローンを調製した。２４ウェルプレートでハイブリドーマ細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を調製した。１個のクローン細胞毎にカウントし、１６４０完全培地は細胞最終濃度を１×１０４個／ｍｌに調節し、それぞれ６０μｌの細胞懸濁液を取り１４０μｌの  １６４０完全培地を加え、合計２００μｌとし、均一に混合し、前日−２０℃で保存した半固形培地Ｄ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を取り出し、４℃で解凍し、３７℃で１時間予熱してから使用した。２．５ｍｌの半固形培地を取り、２００μｌの細胞懸濁液で十分に均一に混合し、室温で１５分間静置し、均一に混合された半固形培地細胞懸濁液を６ウェル細胞培養板（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移し、接種数はウェル毎に細胞６００個であり、ウェルプレートの周りに適量の滅菌水を加え、３７℃、５％のＣＯ２に置いて５−７日間培養した。ウェルプレート内の細胞が緻密な球形単クローン細胞群体に成長したら、１０μｌのピペットチップで吸い取り、２００μｌ  １×ＨＴ、１０％ＣｌｏｎｅＥａｓｙ及び１０％のウシ胎児血清を敷き詰めた１６４０培地に移し、細胞懸濁液を十分に混合し、３７℃、５％  のＣＯ２で２−３日間培養した。
【００８９】
２、サブクローンのスクリーニング
サブクローン細胞培養上澄み抗体のＣＬＤＮ１８．２特異性同定に採用するスクリーニング方法は、細胞ＥＬＩＳＡにより、ＣＬＤＮ１８．２及びＣＬＤＮ１８．１安定的にトランスフェクションされた細胞に対する上澄み抗体の陽性結合状況をそれぞれ検出した。具体的な実施方法は以下のとおり：
１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ完全培地を用いて、３７℃、５％  のＣＯ２でＨＥＫ２９３−ＣＬＤＮ１８．１及びＨＥＫ２９３−ＣＬＤＮ１８．２細胞をそれぞれ培養した。細胞成長集密度が８０％−９０％に達した時、０．５ｍＭ  のＥＤＴＡ−ＰＢＳ非トリプシン消化液で、室温で、細胞を消化し、１０００ｒｐｍで、５分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。ＤＭＥＭ完全培地で再懸濁し、細胞濃度を６×１０５個／ｍｌに調節した。細胞を予めポリリジンでコーティングされた９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に平らに敷き、各ウェル１００μｌ、３７℃、５％のＣＯ２で２４時間培養し、細胞をウェル底で均一にコンフルエントにさせた。培養上澄みを吸い捨て、４％のパラホルムアルデヒドで、室温で、細胞２０分間固定し、２００μｌ  のＰＢＳで３回、毎回２分間洗浄した。２００μｌ  の３％のＢＳＡ−ＰＢＳでウェルプレートを、３７℃で、１時間ブロッキングした。サブクローン培養上澄み１００μｌを取り、ウェルプレートに入れ、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳで５回洗浄した。ブロッキング溶液１：１００００で希釈したＨＲＰ−ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ）を３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで５回洗浄した。１００μｌの  ＴＭＢ単一成分発色溶液を加え、室温で５−１０分間光を避け、２Ｍの硫酸で終止し、マイクロプレートリーダーＯＤ４５０で読み取った。結果は表３に示されるように、ハイブリドーマ培養上澄みのＣＬＤＮ１８．２との結合が強い陽性サブクローン（即ちＯＤ値が陽性対照ＯＤ値より５０％高いもの）はＳ３Ｆ１０Ｃ５、Ｓ５Ｈ３Ａ６、Ｓ５Ｈ３Ｂ６、Ｓ５Ｈ３Ｄ６、Ｓ６Ｆ１０Ｅ７、Ｓ６Ｈ９Ｂ８、Ｓ６Ｈ９Ｃ８、Ｃ４０Ｂ１０Ｄ９、Ｃ４２Ｂ１２Ｄ１０及びＣ５８Ｂ１１Ｅ１１を含む。これらサブクローンにおいて、Ｓ５Ｈ３Ａ６、Ｓ５Ｈ３Ｂ６、Ｓ５Ｈ３Ｄ６、Ｃ４０Ｂ１０Ｄ９、Ｃ４２Ｂ１２Ｄ１０及びＣ５８Ｂ１１Ｅ１１はＣＬＤＮ１８．１細胞との結合が陰性であることを示した。
【表３】
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【００９０】
サブクローンＢ４Ｂ１０Ｇ３、Ｓ５Ｈ３Ｂ６、Ｓ６Ｈ９Ｂ８、Ｃ４０Ｂ１０Ｄ９、Ｃ４２Ｂ１２Ｄ１０及びＣ５８Ｂ１１Ｅ１１に対してクローン拡大培養を行った。２００μＬのピペットで９６ウェルプレートにおける細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を全部２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移し、２％のＣｌｏｎｅＥａｓｙ、１０％のウシ胎児血清を含む１６４０培地１ｍｌを加え、３７℃、５％のＣＯ２の培養箱で３−４日間培養した。
【００９１】
実施例８  抗体サブタイプの同定
マウス抗体サブタイプ同定キットＳＢＡ  Ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）説明書操作手順に従って、被検サブクローン細胞培養上澄みを加えてマウス抗体のサブタイプを同定した。同定結果は以下のとおり：
サブクローンＢ４Ｂ１０Ｇ３は、抗体重鎖定常領域サブタイプはマウスＩｇＧ２ｂであり、抗体軽鎖定常領域サブタイプはマウスＫａｐｐａ鎖である、
サブクローンＳ５Ｈ３Ｂ６は、抗体重鎖定常領域サブタイプはマウスＩｇＭであり、抗体軽鎖定常領域サブタイプはマウスＫａｐｐａ鎖である、
サブクローンＳ６Ｈ９Ｂ８は、抗体重鎖定常領域サブタイプはマウスＩｇＧ３であり、抗体軽鎖定常領域サブタイプはマウスＫａｐｐａ鎖である、
サブクローンＣ５８Ｂ１１Ｅ１１は、抗体重鎖定常領域サブタイプはマウスＩｇＧ２ｃであり、抗体軽鎖定常領域サブタイプはマウスＫａｐｐａ鎖である、
サブクローンＣ４０Ｂ１０Ｄ９は、抗体重鎖定常領域サブタイプはマウスＩｇＭであり、抗体軽鎖定常領域サブタイプはマウスＫａｐｐａ鎖である、
サブクローンＣ４２Ｂ１２Ｄ１０は、抗体重鎖定常領域サブタイプはマウスＩｇＭであり、抗体軽鎖定常領域サブタイプはマウスＫａｐｐａ鎖である。
【００９２】
実施例９  抗体可変領域シーケンス
２４ウェルプレートからモノクローナルハイブリドーマ細胞を採取し、１×１０６個／ｍｌ、合計１ｍｌに調節し、１０００ｒｐｍで、５分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。ＱＩＡＧＥＮ社のＲＮＡ抽出キット（Ｃａｔ：＃７４１３４）説明書操作手順に従って、細胞の全ＲＮＡのミニ抽出を行い、ＮａｎｏＤｒｏｐ核酸定量分析装置でＲＮＡ濃度を測定する。続いて、Ｔａｋａｒａ逆転写キット（Ｃａｔ：＃６１１０Ａ）に従って、２μｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、−８０℃で保存し、使用に備える。ｃＤＮＡをテンプレートとし、Ｔａｋａｒａ社のＰｒｅｍｉｘＴａｑ酵素操作説明書に従って、抗体軽重鎖シーケンスのＰＣＲ系及びＰＣＲ装置プログラムをそれぞれセットする。ＰＣＲ系で使用されるプライマーは蘇州金唯智公司により合成され、具体的なプライマー配列は以下のとおり：
重鎖シーケンスプライマーＶＨ−Ｆは以下を含む：
ＶＨ−Ｆ１（プライマー配列配列番号１８及び配列番号１９を含む）、ＶＨ−Ｆ２（プライマー配列配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、およびプライマー配列配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５を含む）、ＶＨ−Ｆ３（プライマー配列配列番号２６）
重鎖シーケンスプライマーＶＨ−Ｒは以下を含む：
ＶＨ−Ｒ１（プライマー配列配列番号２７）、ＶＨ−Ｒ２（プライマー配列配列番号２８）
軽鎖シーケンスプライマーＶＬ−Ｆは以下を含む：
ＶＬ−Ｆ１（プライマー配列配列番号２９）、ＶＬ−Ｆ２（プライマー配列配列番号３０及び配列番号３１を含む）、ＶＬ−Ｆ３（プライマー配列配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４を含む）
軽鎖シーケンスプライマーＶＬ−Ｒは以下を含む：
ＶＬ−Ｒ（プライマー配列配列番号３５）
ＰＣＲ増幅して得られたＰＣＲ生成物を蘇州金唯智公司に委託してシーケンスし、シーケンス結果は表４を参照。
【表４】
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【００９３】
実施例１０  キメラ抗体の調製
実施例９で得られたマウス由来抗体可変領域配列に基づき、ヒトＩｇＧ１定常領域をマウス抗体可変領域と組み合わせ、遺伝子合成方式によりヒトマウスキメラ抗体を構築し、さらに抗体の親和性及び抗体性質を研究した。
【００９４】
ａ．  ヒトマウスキメラ抗体遺伝子の合成
蘇州金唯智生物科技有限公司に委託し、キメラ抗体遺伝子を合成、最適化し、真核発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）に構築し、キメラ抗体をそれぞれ１ＣＨＩ、３ＣＨＩ、７ＣＨＩ、１７ＣＨＩ、１８ＣＨＩ、１９ＣＨＩと命名した。各キメラ抗体に対応する抗体可変領域配列は以下の表５に示される：
【表５】
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【００９５】
ｂ．  キメラ抗体発現及びタンパク質の精製
上記キメラ抗体軽重鎖遺伝子を含むプラスミドを１：１の割合でＨＥＫ２９３Ｅ細胞（上海細胞所）に一過性トランスフェクションした。回転速度１１０ｒｐｍで、３７℃、８％  のＣＯ２で７日間振動培養した。４５００ｒｐｍで、２０分間遠心分離し、上澄みタンパク質を得て、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した：０．１ＭのＮａＯＨ溶液でＡＫＴＡクロマトグラフィーシステム及びクロマトグラフィーカラムを３０  分間洗浄し、超純水できれいにすすぎ、ｐＨ７．４の２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で１０カラム体積で平衡化し、流速を２  ｍｌ／分間とし、サンプルをロードし、平衡化バッファーで１０カラム体積でクロマトグラフィーカラムを洗浄し、ｐＨ３．４の５０ｍＭの酢酸緩衝液で３−５カラム体積で溶出し、溶出したタンパク質を採取し、限外濾過濃縮して抗体をｐＨ５．５５の５０ｍＭの酢酸塩緩衝液に置換して保存した。
【００９６】
そのうち、キメラ抗体３ＣＨＩ、１８ＣＨＩ  及び１９ＣＨＩの  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動はキメラ抗体３ＣＨＩ、１８ＣＨＩ  及び１９ＣＨＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥ純度がいずれも９０％より大きいことを示した。
【００９７】
実施例１１    キメラ抗体とＣＬＤＮ１８．２の特異的結合測定
２週間前にＨＥＫ２９３−ＣＬＤＮ１８．２及びＨＥＫ２９３−ＣＬＤＮ１８．１細胞を蘇生させ、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ完全培地で、３７℃、５％  ＣＯ２で培養した。細胞成長集密度が８０％−９０％に達したら、０．５ｍＭの  ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）で、室温で細胞を消化し、１０００ｒｐｍで、５分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。ＤＭＥＭ完全培地で再懸濁し、細胞濃度を６×１０５個／ｍｌに調節した。細胞を予め２．５μｇ／ウェルのポリリジン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングされた９６ウェルプレートにそれぞれ平らに敷き詰め、各ウェル１００μｌ、３７℃、５％  ＣＯ２で２４時間培養し、細胞をウェル底で均一にコンフルエントにさせた。培養上澄みを吸い捨て、４％のパラホルムアルデヒドで、室温で、細胞を２０分間固定し、２００μｌ  のＰＢＳで３回、毎回２分間洗浄した。２００μｌ  の３％のＢＳＡ−ＰＢＳでウェルプレートを、３７℃で、１時間ブロッキングした。３％のＢＳＡ−ＰＢＳで各キメラ抗体濃度を６μｇ／ｍｌに希釈し、６倍の勾配で希釈し、７つの濃度に希釈した。同時に同じ濃度の勾配で希釈したＩＭＡＢ３６２−ｓｉｍｉｌａｒ−ｈＧ１を陽性対照とし、ヒトＩｇＧ１，  ｋａｐｐａ同型対照抗体（以下Ｉｓｏｔｙｐｅと称す、中美冠科生物技術（太倉）有限公司から提供）を陰性対照とし、それぞれＨＥＫ２９３−ＣＬＤＮ１８．２及びＨＥＫ２９３−ＣＬＤＮ１８．１プレートに入れる。３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳで５回洗浄した。ブロッキング溶液を１：１００００で希釈したＨＲＰ−ａｎｔｉ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ）を３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで５回洗浄した。１００μｌの  ＴＭＢ単一成分発色溶液を加えて室温で５−１０分間光を避け、５０μｌの  ２Ｍ硫酸を加えて終止し、マイクロプレートリーダーＯＤ４５０で読み取った。データ処理：オリジナルデータをＧｒａｐｈＰａｄ  ５．０ソフトウエアに入れてプロットして計算した。結果は表６を参照。
【表６】
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【００９８】
各キメラ抗体とＣＬＤＮ１８．２細胞及びＣＬＤＮ１８．１細胞の結合状況は図１及び図２に示される、但しｉｓｏｔｙｐｅは陰性対照、ＩＭＡＢ３６２−ｓｉｍｉｌａｒ−ｈＧ１は陽性対照である。その結果、各キメラ抗体の結合曲線はいずれも濃度勾配依存性を示した。但し、１７ＣＨＩはＣＬＤＮ１８．２及びＣＬＤＮ１８．１といずれも強い陽性結合を発現し、１９ＣＨＩはＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ１８．１と弱い陽性結合を発現し、そして１ＣＨＩ、３ＣＨＩ及び１８ＣＨＩ抗体は特異的にＣＬＤＮ１８．２と結合できたがＣＬＤＮ１８．１とは結合しなかった。同時に、抗ＣＬＤＮ１８．２特異性抗体において、３ＣＨＩ抗体のＥＣ５０数値は比較的小さく、且つ陽性対照抗体ＩＭＡＢ３６２−ｓｉｍｉｌａｒ−ｈＧ１のＥＣ５０値に近く、比較的強くＣＬＤＮ１８．２との特異的結合活性を示した。
【００９９】
実施例１２  キメラ抗体の親和性成熟
実施例１１から、親和性が陽性対照抗体と最も近いキメラ抗体３ＣＨＩを選び、体外で親和性成熟及びスクリーニングを行った。主にファージＦａｂ抗体ライブラリーを用いてＣＬＤＮ１８．２特異性を維持する同時に親和性を向上させる抗体をスクリーニングした。
【０１００】
ファージスクリーニング結果は図３に示されるように、ファージ抗体Ｃ１−２２、Ａ１−１８等はいずれもオリジナル３ＣＨＩファージ抗体（ＷＴ）より更に高いＣＬＤＮ１８．２結合活性を発現した。ファージをシーケンスした後、アミノ酸部位が変異したＣＤＲ配列を得て、これら変異部位を改めて組み合わせ、ヒトＩｇＧ１定常領域を有するキメラ抗体を構築した。ファージ由来のキメラ抗体に改めてナンバーを付して命名し、その後、細胞ＥＬＩＳＡにより上記３０個のキメラ抗体とＣＬＤＮ１８．２が特異的結合であるか否か同定し、同定結果は表７に示されるように、表中、ＣＬＤＮ１８．１結合陰性且つＣＬＤＮ１８．２結合陽性に合致する特異性抗体は合計１８個あり、アミノ酸配列はそれぞれ表１１に示される。
【０１０１】
【表７】
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【表８】
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【０１０２】
ヒト胃癌細胞ＮＵＧＣ４および安定的にトランスフェクションされた細胞ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＬＤＮ１８．１（実施例５で調製された）をそれぞれ用いて、ＦＡＣＳ技術により上記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の細胞レベルにおける特異性及び親和性を検証した。結果は表９に示されるように、体外における抗体親和性成熟とスクリーニングを経て、オリジナル３ＣＨＩ抗体に比べ、各抗体ともＮＵＧＣ４細胞におけるＣＬＤＮ１８．２ターゲットと結合でき、ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＬＤＮ１８．１細胞とは結合しなかった。ＦＡＣＳのＭＦＩ（平均蛍光強度）で示される抗体親和性レベルに基づき、陽性対照抗体ＩＭＡＢ３６２−ｓｉｍｉｌａｒ−ｈＧ１に比べ、３３０ＣＨＩ抗体はその標的ＮＵＧＣ４細胞の親和性に顕著な向上が見られた。
【表９】
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【０１０３】
Ｆｏｒｔｅｂｉｏ分子相互作用装置で上記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のタンパク質レベルにおける親和性を検証した：まず、抗体溶液及び抗原希釈液を調製し、ＳＤ緩衝液（０．０２％のＴｗｅｅｎ２０及び０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ溶液）でキメラ抗体を最終濃度５μｇ／ｍｌに希釈し、抗原タンパク質クローディン１８．２−ＨｉｓをＳＤ緩衝液で４倍の濃度勾配で希釈し、濃度をそれぞれ１０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、０．６２５μｇ／ｍｌ、０μｇ／ｍｌとした。その後、ＡＨＣセンサを選択して抗体を固定化し、異なる濃度の抗原を結合し、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６の操作説明に従って親和性測定を行った。
【０１０４】
その結果、陽性対照抗体ＩＭＡＢ３６２−ｓｉｍｉｌａｒ−ｈＧ１が３７℃のときＣＬＤＮ１８．２タンパク質と結合した平衡解離定数（ＫＤ）は７．１４ｎＭであり、３３０ＣＨＩ及び３０５ＣＨＩ抗体ＫＤ値はそれぞれ０．８４ｎＭ及び０．８７ｎＭであり、陽性対照に比べ、その抗体親和性は顕著に一桁向上した（表１０を参照）。
【表１０】
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【０１０５】
実施例１３    キメラ抗体体外ＡＤＣＣ活性測定
測定実験の前日、ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＬＤＮ１８．２（実施例５で調製した）細胞を消化し、完全培地で細胞を再懸濁し、細胞をカウントし、密度を１×１０５個／ｍｌに調整し、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％の  ＣＯ２の培養箱で一晩培養し、測定当日、フェノールレッド不含１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）を３７℃までインキュベートし、抗体を５倍の勾配で希釈し、ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＬＤＮ１８．２が敷かれた９６ウェルプレートを取り出し、培地を破棄し、各ウェルに２５μｌのフェノールレッド不含１６４０を加え、希釈した抗体をサンプルウェルに入れ、抗体の最終濃度をそれぞれ１０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ、０．０１６μｇ／ｍｌ及び０．００３２μｇ／ｍｌにし、対照ウェルに等量のＩＭＡＢ３６２−ｓｉｍｉｌａｒ−ｈＧ１及びヒトＩｇＧ１同型の対照抗体（ＣｒｏｗｎＢｉｏ）をそれぞれ加え、３７℃、５％の  ＣＯ２の培養箱で１時間インキュベートした。
【０１０６】
安定的にトランスフェクションされヒトＣＤ１６Ａタンパク質及びＮＦＡＴ報告遺伝子タンパク質を発現したＪｕｒｋａｔ細胞（以下Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ１６Ａ／ＮＦと称す）をエフェクター細胞とし、遠心分離管に移し、室温で、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、５ｍｌのフェノールレッド不含１６４０培地で再懸濁して１回洗浄し、１０００ｒｐｍで、５分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、フェノールレッド不含１６４０で細胞を再懸濁し、細胞密度を８×１０６個／ｍｌに調整した。
【０１０７】
２０：１のエフェクター／ターゲット比（即ちエフェクター細胞とターゲット細胞数の割合は２０：１）に基づき、ウェルプレートにＪｕｒｋａｔ−ＣＤ１６Ａ／ＮＦ細胞２×１０５個、２００ｇで、２分間遠心分離し、エフェクター・ターゲット細胞を十分に接触させ、３７℃、５％のＣＯ２の培養箱で５−６時間インキュベートし、検出３０分間前に、プレートを室温まで回復させ、Ｂｉｏ−Ｔｕｒｂｏホタルルシフェラーゼアッセイキット（江蘇瑞安生物技術有限公司）の操作説明書に従って、検出試薬を加え、被検上澄みを白色平底９６ウェルプレートに移し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｌｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬ蛍光マイクロプレートリーダーでウェルプレート蛍光シグナルを検出した。オリジナルデータをＧｒａｐｈｐａｄ  ５．０ソフトウエアに入れて計算分析し、結果は表１１に示される。
【表１１】
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【０１０８】
Ｉｓｏｔｙｐｅ陰性対照に比べ、各キメラ抗体蛍光シグナルは濃度勾配に応じて用量依存性を示した。実験群において、キメラ抗体  ３３０ＣＨＩのＥＣ５０は０．２２ｎＭであり、キメラ抗体  ３０５ＣＨＩのＥＣ５０は０．２８ｎＭであり、その抗体のＡＤＣＣ  ＥＣ５０活性は陽性対照抗体ＩＭＡＢ３６２−ｓｉｍｉｌａｒ−ｈＧ１（０．７２ｎＭ）に比べ３倍以上向上した。したがって、キメラ抗体はＣＬＤＮ１８．２に対する細胞結合活性及び親和性が向上すると同時に、抗体体外ＡＤＣＣ活性作用も有効的に向上できた。
【０１０９】
実施例１４  抗体ヒト化
実施例１２において体外親和性成熟改造後の抗体３３０ＣＨＩをヒト化配列の最適化を行った。ヒト化配列の最適化及び抗体の物理化学性質の同定は杭州皓陽生物技術有限公司に委託して行った。ヒト化配列の最適化は免疫遺伝子データベース（ＩＭＧＴ）により、３ＣＨＩ抗体及び３３０ＣＨＩ抗体可変領域のマウス由来の配列ソースを確認し、相同性アラインメント  により、３ＣＨＩ抗体及び３３０ＣＨＩ抗体の重鎖可変領域配列のＦＲ領域はマウス抗体ＩＧＨＶ５−１５＊０１に由来し、抗体軽鎖可変領域のＦＲ配列はマウス抗体ＩＧＫＶ８−１９＊０１に由来する。マウス抗体ＣＤＲ領域とヒト由来抗体ＦＲ領域を組み換えてヒト化抗体を形成する、但し採用するヒト由来抗体軽重鎖テンプレートと対応するマウス抗体可変領域配列の類似度は６５％又はそれ以上に達し、ヒト由来抗体のソースは表１２を参照。最終的なヒト化抗体の名称及び配列は表１３に示される。
【表１２】
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【表１３】
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【０１１０】
ヒト化抗体軽重鎖遺伝子を含むプラスミドベクターを１：１の割合でＨＥＫ２９３Ｅ細胞にコトランスフェクションし、１１０ｒｐｍで、３７℃、８％の  ＣＯ２で７日間振動培養した。４５００ｒｐｍで、２０分間遠心分離し、上澄みタンパク質を得た。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティークロマトグラフィーにより精製した：０．１ＭのＮａＯＨ溶液でＡＫＴＡクロマトグラフィーシステム及びクロマトグラフィーカラムを３０  分間洗浄し、超純水できれいにすすぎ、ｐＨ７．４の２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で１０カラム体積で平衡化し、流速を２  ｍｌ／分間とし、サンプルをロードし、平衡化バッファーで１０カラム体積でクロマトグラフィーカラムを洗浄し、ｐＨ３．４の５０ｍＭの酢酸緩衝液で３−５カラム体積で溶出し、溶出したタンパク質を採取し、限外濾過濃縮して抗体をｐＨ６．５的２０ｍＭのリン酸塩緩衝液に置換して保存した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）により精製後の抗体純度を測定し、ヒト化抗体  Ｈｕ３３０−１、  Ｈｕ３３０−２及び  Ｈｕ３３０−４の単量体タンパク質の純度はいずれも９５％以上に達し、そのうち、Ｈｕ３３０−１を例に、抗体重鎖分子量は４８．７２ＫＤであり、軽鎖分子量は２４．２１ＫＤであった。
【０１１１】
実施例１５    ＦＡＣＳによる細胞レベルにおけるヒト化抗体のヒトＣＬＤＮ１８．２との結合特異性及び親和性の検出
胃癌細胞消化液でＣＨＯ−Ｋ１−ＣＬＤＮ１８．２細胞及びＣＨＯ−Ｋ１−ＣＬＤＮ１８．１細胞（実施例５で調製された）をそれぞれ消化処理し、３７℃で、１５分間消化し、完全培地で終止し、１０００ｒｐｍで、５分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、２％のウシ胎児血清−ＰＢＳ希釈液で細胞を再懸濁し、細胞を１×１０６個／ｍｌに調節し、９６ウェルＵベースプレートにウェル毎に１００μｌの細胞懸濁液を加え、２％のウシ胎児血清−ＰＢＳでヒト化抗体及び対照抗体をそれぞれ最終濃度１０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ及び０．０１６μｇ／ｍｌまで希釈し、同体積を細胞と均一に混合し、４℃で１時間インキュベートし、１０００ｒｐｍで、５分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、各ウェルに２００μｌの  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え２回洗浄し、毎回１０００ｒｐｍで、５分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、１００μｌの  ＰＥ−ａｎｔｉ  ｈｕｍａｎ  Ｆｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、４℃で１時間インキュベートし、Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で２回洗浄し、毎回１０００ｒｐｍで、５分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。３００μｌの  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒを加えて細胞を再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｊａｚｚフローサイトメトリー分析装置で検出した。
【０１１２】
結果は図４及び図５に示されるように、各ヒト化抗体Ｈｕ３３０−１、Ｈｕ３３０−３、Ｈｕ３３０−５及びＨｕ３３０−６はいずれもＣＬＤＮ１８．２と特異的結合を発現し、ＣＬＤＮ１８．１細胞との結合は陰性であった。但し、ヒト化抗体Ｈｕ３３０−１の結合曲線はほぼキメラ抗体３３０ＣＨＩと完全重なり、これは抗体がヒト化後、その親和性はキメラ抗体と明らかな差異はなく、基本的に一致するレベルを保つことを表す。Ｇｒａｐｈｐａｄフィッティング曲線に基づき計算された抗体の相対平衡解離定数Ｋｄ値は表１４に示され、ヒト化抗体Ｈｕ３３０−１のＫｄ値は１．７ｎＭであり、陽性対照抗体（２８．７ｎＭ）より顕著に低く、これは、ヒト化抗体とＣＬＤＮ１８．２発現細胞の結合活性が陽性対照抗体ＩＭＡＢ３６２−ｓｉｍｉｌａｒ−ｈＧ１よりも約１５倍高いことを表す。
【表１４】
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【０１１３】
実施例１６    Ｆｏｒｔｅｂｉｏによるタンパク質レベルにおけるヒト化抗体のヒトＣＬＤＮ１８．２との結合特異性及び親和性の測定
別の方法は、上記ヒト化抗体のタンパク質レベルにおける親和性を検証し、ＡＨＣセンサを選択して抗体を固定化し、異なる濃度の抗原と結合させ、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６の操作説明書に従って親和性測定を行った。結果は表１５に示されるように、ヒト化抗体  Ｈｕ３３０−１が３７℃のときＣＬＤＮ１８．２タンパク質と結合した平衡解離定数（ＫＤ）は５．２６ｎＭであり、陽性対照に比べ、その抗体親和性は顕著に約１８倍向上した。
【表１５】
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【０１１４】
実施例１７    ルシフェラーゼ標識によるヒト化抗体の体外ＡＤＣＣ活性の測定
ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＬＤＮ１８．２細胞（実施例５で調製された）をターゲット細胞とし、細胞密度を１×１０５個／ｍｌに調節し、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％の  ＣＯ２培養箱で一晩培養し、ヒト化抗体を５倍の勾配で希釈し、抗体の最終濃度をそれぞれ１０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ、０．０１６μｇ／ｍｌ及び０．００３２μｇ／ｍｌとし、対照ウェルに等量のＩＭＡＢ３６２−ｓｉｍｉｌａｒ−ｈＧ１及び  ３３０ＣＨＩのキメラ抗体を加え、３７℃、５％  ＣＯ２の培養箱で１時間インキュベートし、エフェクター細胞Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ１６Ａ／ＮＦをエフェクター／ターゲット比２０：１の割合で、各ウェルに２×１０５個のエフェクター細胞を入れ、２００ｇで、２分間遠心分離し、エフェクター・ターゲット細胞を十分に接触させ、３７℃、５％  のＣＯ２の培養箱で５−６時間インキュベートし、Ｂｉｏ−Ｔｕｒｂｏホタルルシフェラーゼアッセイキットでウェルプレート蛍光シグナルを検出し、測定結果は表１６に示される。
【表１６】
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【０１１５】
ＩＭＡＢ３６２−ｓｉｍｉｌａｒ−ｈＧ１陽性抗体に比べ、ヒト化抗体Ｈｕ３３０−１及びＨｕ３３０−２のＥＣ５０は６倍以上低く、且つキメラ抗体ＡＤＣＣ活性と基本的に同じであった。これにより、ヒト化抗体は高い親和性を有すると同時に、陽性抗体に比べても比較的高いＡＤＣＣ生物学活性を示すことが説明された。
【０１１６】
実施例１８    ＲＴＣＡによる体外における腫瘍細胞に対するヒト化抗体のＡＤＣＣ殺傷活性の測定
ヒト末梢血からＰＢＭＣ細胞を単離し、同体積の２％のウシ胎児血清を含むＰＢＳを加えて血液サンプルを希釈し、５０ｍｌの遠心分離管に１５ｍｌの  Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ密度勾配遠心分離液（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を加え、それから希釈した血液サンプルを加え、遠心分離機のブレーキをオフにし、室温で、１２００ｇ、１０分間遠心分離した。遠心分離後、白膜層が見え、その中に濃縮されたＰＢＭＣ細胞が含まれ、白膜層を吸い取り、新しい遠心分離管に移し、赤血球溶解液（Ｓｉｇｍａ）の操作説明書に従って、室温で赤血球を溶解し、２ｍＭの  ＥＤＴＡ及び２％のウシ胎児血清を含むＰＢＳで２回洗浄し、室温で、４００ｇ、１０分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、５％のウシ胎児血清を含む１６４０完全培地で細胞を再懸濁し、ＰＢＭＣ濃度を３×１０６個／ｍｌに調節し、次に、ヒト胃癌細胞ＮＵＧＣ４をターゲット細胞とし、ヒト胃癌組織由来細胞消化液で処理し、１０００ｒｐｍで、５分間遠心分離し、細胞を採集し、上澄みを廃棄し、細胞を１．５×１０５個／ｍｌに調節し、Ｅ−Ｐｌａｔｅ  ９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌの細胞懸濁液を加え、３７℃、５％の  ＣＯ２で培養し、２４時間超えた後、１６４０培地で希釈した抗体を加え、抗体最終濃度を２μｇ／ｍｌとし、３７℃、５％の  ＣＯ２で１時間インキュベートし、エフェクター細胞ＰＢＭＣをエフェクター／ターゲット比２０：１の割合で、各ウェルに３×１０５個のエフェクター細胞を加え、２００ｇ、２分間遠心分離し、エフェクター・ターゲット細胞を十分に接触させ、３７℃、５％  ＣＯ２の培養箱で２１時間インキュベート・殺傷し、ＲＴＣＡ検出装置により腫瘍細胞の９６ウェルプレートにおける抵抗値（Ｃｅｌｌ  Ｉｎｄｅｘ、ＣＩ）をリアルタイムに記録し、式ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ％＝［（対照群ＣＩ−実験群ＣＩ）／対照群ＣＩ］×１００％により、ヒト化抗体腫瘍殺傷パーセンテージを計算した。
【０１１７】
結果は図６に示されるように、ＲＴＣＡにより、エフェクター・ターゲット細胞をインキュベートした８〜２１時間以内に、各群の腫瘍細胞殺傷率は時間の延長とともに増加したことをリアルタイム検出した。体外殺傷２１時間目、ヒト化抗体Ｈｕ３３０−１のＮＵＧＣ４細胞に対する最大殺傷率は４５％であり、腫瘍細胞に対するＩＭＡＢ３６２−ｓｉｍｉｌａｒ−ｈＧ１陽性抗体のＡＤＣＣ殺傷活性に比べて１０％（Ｐ＜０．０５）高かった。
【０１１８】
以上より、ヒト化抗体Ｈｕ３３０−１は特異的にＣＬＤＮ１８．２に標的結合でき、その結合活性及び親和性は分子レベル及び細胞レベルにおいて、いずれも陽性抗体ＩＭＡＢ３６２−ｓｉｍｉｌａｒ−ｈＧ１よりも１５−１８倍高く、抗体で媒介されるターゲット細胞に対する体外ＡＤＣＣの殺傷作用は、抗体濃度の依存性を表し、比較的低い濃度の時、Ｈｕ３３０−１は一定の腫瘍細胞殺傷効果を発揮した。
【０１１９】
実施例１９  ヒト化抗体定常領域の最適化
Ｈｕ３３０−１ヒト化抗体可変領域配列と５個のアミノ酸部位変異を含むＩｇＧ１定常領域配列を組み合わせ、Ｆｃ変異型ヒト化抗体  Ｈｕ３３０−１−５Ｍ（配列は表１４を参照）を構築発現し、当該Ｆｃ変異を含む陽性抗体５Ｍを別途構築し（配列は表１７を参照）、Ｆｃ段の対照とした。
【０１２０】
【表１７】
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【０１２１】
ＦＡＣＳによりＦｃ変異のヒト化抗体とターゲットＣＬＤＮ１８．２結合の影響を同定した。胃癌細胞消化液でＮＵＧＣ４細胞をそれぞれ消化処理し、３７℃で、１５分間消化し、完全培地で終止し、１０００ｒｐｍで、５分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、２％のウシ胎児血清−ＰＢＳ希釈液で細胞を再懸濁し、細胞を１×１０６個／ｍｌに調節し、９６ウェルＵベースプレートに各ウェル１００μｌ細胞懸濁液を加え、２％のウシ胎児血清−ＰＢＳで抗体を最終濃度５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌ及び０．００８μｇ／ｍｌまで希釈し、同体積を細胞と均一に混合し、４℃で１時間インキュベートし、１０００ｒｐｍで、５分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、各ウェルに２００μｌの  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え２回洗浄し、毎回１０００ｒｐｍで、５分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、１００μｌの  ＰＥ−ａｎｔｉ  ｈｕｍａｎ  Ｆｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、４℃で１時間インキュベートし、Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で２回洗浄し、毎回１０００ｒｐｍで、５分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。３００μｌの  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒを加えて細胞を再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｊａｚｚフローサイトメトリー分析装置で検出した。結果は表１８に示される。
【表１８】
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【０１２２】
Ｆｃ変異のヒト化抗体とＮＵＧＣ４ターゲット細胞の結合陽性率は抗体濃度に伴い上昇し、次第に飽和し、その結合曲線はヒト化抗体の結合曲線とほぼ完全に重なり、且つ陽性対照抗体ＩＭＡＢ３６２−ｓｉｍｉｌａｒ−ｈＧ１に比べ、Ｈｕ３３０−１−５Ｍ抗体結合活性は１５倍上昇し、これにより、定常領域Ｆｃフラグメントのアミノ酸に変異が生じても、ＣＬＤＮ１８．２ターゲットに対する抗体の特異性及び結合活性は変わらないことが示された。
【０１２３】
実施例２０  最適化されたヒト化抗体の体外ＡＤＣＣ殺傷活性の検出
１、ルシフェラーゼ標識によるＦｃ変異のヒト化抗体の体外ＡＤＣＣ活性の測定：
ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＬＤＮ１８．２細胞（実施例５で調製された）をターゲット細胞とし、細胞密度を１×１０５個／ｍｌに調節し、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％  のＣＯ２の培養箱で一晩培養し、抗体を５倍の勾配で希釈し、最終濃度をそれぞれ１０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ、０．０１６μｇ／ｍｌ及び０．００３２μｇ／ｍｌとし、３７℃、５％の  ＣＯ２で１時間インキュベートし、エフェクター細胞Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ１６Ａ／ＮＦをエフェクター／ターゲット比２０：１の割合で、各ウェルプレートに２×１０５個のエフェクター細胞を加え、２００ｇで２分間遠心分離し、エフェクター・ターゲット細胞を十分に接触させ、３７℃、５％  ＣＯ２の培養箱で５−６時間インキュベートし、Ｂｉｏ−Ｔｕｒｂｏホタルルシフェラーゼアッセイキットでウェルプレート蛍光シグナルを検出し、結果は表１９に示される。
【表１９】
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【０１２４】
Ｆｃ変異陽性抗体（５Ｍ）およびヒト化Ｈｕ３３０−１抗体はＩＭＡＢ３６２−ｓｉｍｉｌａｒ−ｈＧ１よりＡＤＣＣ活性はいずれも３倍高く、Ｆｃ変異後のＨｕ３３０−１−５Ｍ抗体ＥＣ５０は０．１７ｎＭであり、陽性対照抗体ＩＭＡＢ３６２−ｓｉｍｉｌａｒ−ｈＧ１のＡＤＣＣ活性よりも８倍以上高く、体外ＡＤＣＣ増強效果を明らかに最適化した。
【０１２５】
２、ＬＤＨ法により体外における腫瘍細胞に対するＦｃ変異のヒト化抗体のＡＤＣＣ殺傷活性を測定する：
ヒト末梢血からＰＢＭＣ細胞を単離してエフェクター細胞とし、同体積の２％のウシ胎児血清を含むＰＢＳを加えて血液サンプルを希釈し、５０ｍｌの遠心分離管に１５ｍｌの  Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ密度勾配遠心分離液（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を加え、それから希釈した血液サンプルを加え、遠心分離機のブレーキをオフにし、室温で、１２００ｇ、１０分間遠心分離した。遠心分離後、白膜層が見え、その中に濃縮されたＰＢＭＣ細胞が含まれ、白膜層を吸い取り、新しい遠心分離管に移し、赤血球溶解液（Ｓｉｇｍａ）の操作説明書に従って、室温で赤血球を溶解し、２ｍＭ  のＥＤＴＡ及び２％ウシ胎児血清を含むＰＢＳで２回洗浄し、室温で、４００ｇ、１０分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、熱不活化血清で２％のウシ胎児血清を含む１６４０（以下熱不活化培地を称す）を調製し、細胞を再懸濁し、ＰＢＭＣ濃度を３×１０６個／ｍｌに調節し、ヒト胃癌細胞ＮＵＧＣ４をターゲット細胞とし、ヒト胃癌組織由来細胞消化液で処理し、１０００ｒｐｍで、５分間遠心分離し、細胞を採集し、上澄みを廃棄し、細胞を１．５×１０５個／ｍｌに調節し、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌの細胞懸濁液を加え、３７℃、５％  ＣＯ２で２４時間培養し、培地を吸い捨て、熱不活化培地で希釈した抗体を加え、抗体最終濃度をそれぞれ１０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ、０．０１６μｇ／ｍｌ及び０．００３２μｇ／ｍｌとし、３７℃、５％  ＣＯ２で１時間インキュベートし、エフェクター細胞ＰＢＭＣをエフェクター／ターゲット比２０：１の割合で、各ウェルに３×１０５個のエフェクター細胞を加え、２００ｇで、２分間遠心分離し、エフェクター・ターゲット細胞を十分に接触させ、３７℃、５％  ＣＯ２の培養箱で２２時間インキュベート・殺傷した。インキュベート終了時、ＬＤＨキット（東仁化学科技（上海）有限公司）説明書の手順に従って、ウェルプレートにＷＳＴ基質試薬を加え、光を避けて２０−３０分間発色させ、ＯＤ４５０ｎｍ値を測定し、オリジナルデータを式ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ％＝（実験群吸收値−ターゲット細胞自発値−エフェクター細胞値）／（ターゲット細胞最大値−ターゲット細胞自発値）×１００％に入れ、実験群及びすべての対照群吸收値＝当該群吸收値−バックグラウンド  値であり、結果は表２０に示される。
【表２０】
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【０１２６】
Ｆｃ変異のヒト化抗体Ｈｕ３３０−１−５Ｍは体外において腫瘍細胞ＮＵＧＣ４を殺傷でき、そのＡＤＣＣ殺傷效果は抗体濃度と用量依存性を呈し、算出されたＥＣ５０（０．３ｎＭ）はＩＭＡＢ３６２−ｓｉｍｉｌａｒ−ｈＧ１陽性抗体ＥＣ５０活性よりも８倍向上し、同時に、Ｈｕ３３０−１−５Ｍの腫瘍細胞に対する最大殺傷率は１３０％であり、陽性抗体の８０％よりも、顕著に増強された体外ＡＤＣＣ殺傷効果を示した。
【０１２７】
以上より、Ｆｃ変異したＨｕ３３０−１−５Ｍヒト化抗体は、ＣＬＤＮ１８．２の標的結合能力において、陽性抗体ＩＭＡＢ３６２−ｓｉｍｉｌａｒ−ｈＧ１の親和性より１５倍向上した一方、Ｆｃ最適化後に媒介された体外ＡＤＣＣ殺傷腫瘍細胞の能力はさらに増強され、そのＥＣ５０活性は陽性抗体より８倍向上し、最大殺傷效果は６０％以上向上した。
【０１２８】
以上の内容をまとめ、本発明が提供するＣＬＤＮ１８．２抗体はＣＬＤＮ１８．２と顕著な結合活性及び親和性を有するとともに、腫瘍細胞に対して高効率の体外ＡＤＣＣ殺傷活性を有し、当該抗体は高効率の抗腫瘍作用を持つことを示し、抗腫瘍医薬の調製において使用でき、広い市場が見込める。
【０１２９】
以上、本発明について詳細に説明したが、当業者は本発明の精神及び範囲を逸脱しない前提において、本発明に対して各種の補正及び変更を行うことができると理解できる。本発明の権利範囲は上記の詳細説明に限られないが、請求の範囲に属すと理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年2月26日(2021.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
（１）前記重鎖可変領域は配列番号１０１で示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、配列番号１０５で示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ２及び配列番号１０６で示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ３を含み、及び
（２）前記軽鎖可変領域は配列番号１０８で示されるアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、配列番号１１１で示されるアミノ酸配列のＬＣＤＲ２及び配列番号１１５で示されるアミノ酸配列のＬＣＤＲ３を含む、
抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記抗体はマウス由来抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１に記載の抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
（１）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８８で示されるアミノ酸配列から選択され、及び
（２）前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号８１、配列番号８４、配列番号８６、配列番号９０で示されるアミノ酸配列から選択される、
請求項１に記載の抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７９であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８１であり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８２であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８４であり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８２であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８６であり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８８であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８４であり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８８であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８６であり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８２であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号９０であり、又は
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８８であり、且つ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号９０である、
請求項３に記載の抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記重鎖アミノ酸配列は配列番号９２であり、且つ前記軽鎖アミノ酸配列は配列番号９４であり、又は
前記重鎖アミノ酸配列は配列番号９６であり、且つ前記軽鎖アミノ酸配列は配列番号９８である、請求項４に記載の抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする単離されたヌクレオチド。
【請求項７】
（１）  前記重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号９３又は配列番号９７で示され、及び
（２）  前記軽鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号９５又は配列番号９９で示される、
請求項６に記載のヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメント及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項９】
クローディン１８．２を標的とする医薬を製造するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項１０】
前記クローディン１８．２を標的とする医薬は胃癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、頭頚部癌及び胆嚢癌の治療に使用される、請求項９に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
ファージスクリーニング結果は図３に示されるように、ファージ抗体Ｃ１−２２、Ａ１−１８等はいずれもオリジナル３ＣＨＩファージ抗体（ＷＴ）より更に高いＣＬＤＮ１８．２結合活性を発現した。ファージをシーケンスした後、アミノ酸部位が変異したＣＤＲ配列を得て、これら変異部位を改めて組み合わせ、ヒトＩｇＧ１定常領域を有するキメラ抗体を構築した。ファージ由来のキメラ抗体に改めてナンバーを付して命名し、その後、細胞ＥＬＩＳＡにより上記３０個のキメラ抗体とＣＬＤＮ１８．２が特異的結合であるか否か同定し、同定結果は表７に示されるように、表中、ＣＬＤＮ１８．１結合陰性且つＣＬＤＮ１８．２結合陽性に合致する特異性抗体は合計１８個あり、アミノ酸配列はそれぞれ表８に示される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
実施例１９  ヒト化抗体定常領域の最適化
Ｈｕ３３０−１ヒト化抗体可変領域配列と５個のアミノ酸部位変異を含むＩｇＧ１定常領域配列を組み合わせ、Ｆｃ変異型ヒト化抗体  Ｈｕ３３０−１−５Ｍ（配列は表１７を参照）を構築発現し、当該Ｆｃ変異を含む陽性抗体５Ｍを別途構築し（配列は表１７を参照）、Ｆｃ段の対照とした。
【国際調査報告】
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