(57)【要約】【課題】  ＡＰＪ抗体及びＥｌａｂｅｌａとのその融合タンパク質並びにその医薬組成物及び用途を提供する。【解決手段】  アペリン受容体（ＡＰＪ）抗体及びＥｌａｂｅｌａとのその融合タンパク質が本明細書において提供される。ＡＰＪ抗体及びＥｌａｂｅｌａを有する融合タンパク質の医薬組成物並びに肺動脈性高血圧、肺高血圧の１つ若しくは複数の症状又は心不全の１つ若しくは複数の症状の処置、予防又は改善におけるその使用も本明細書において提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸配列を含む、ヒトＡＰＪに特異的に結合する抗体であって、各アミノ酸配列は、独立して、
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１０、配列番号７、配列番号４及び配列番号１；
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号８、配列番号５及び配列番号２；
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１、配列番号９、配列番号６及び配列番号３；
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１８、配列番号１５及び配列番号１２；
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号２１、配列番号１９、配列番号１６及び配列番号１３；及び
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号２２、配列番号２０、配列番号１７及び配列番号１４
から選択される、抗体。
【請求項２】
１又は２つのアミノ酸配列を含み、各アミノ酸配列は、独立して、
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１、配列番号４、配列番号７及び配列番号１０；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１２、配列番号１５及び配列番号１８
から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
１又は２つのアミノ酸配列を含み、各アミノ酸配列は、独立して、
ａ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号２、配列番号５及び配列番号８；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９及び配列番号２１
から選択される、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
１又は２つのアミノ酸配列を含み、各アミノ酸配列は、独立して、
ａ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号３、配列番号６、配列番号９及び配列番号１１；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０及び配列番号２２
から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
１又は２つのアミノ酸配列を含み、各アミノ酸配列は、独立して、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
１又は２つのアミノ酸配列を含み、各アミノ酸配列は、独立して、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
配列番号１及び配列番号１２、配列番号４及び配列番号１５、配列番号７及び配列番号１８並びに配列番号１０及び配列番号１８から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列の組合せを含むか又はさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
配列番号２及び配列番号１３、配列番号５及び配列番号１６、配列番号８及び配列番号１９並びに配列番号５及び配列番号２１から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列の組合せを含むか又はさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号３及び配列番号１４、配列番号６及び配列番号１７、配列番号９及び配列番号２０並びに配列番号１１及び配列番号２２から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の組合せを含むか又はさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
ａ．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４のアミノ酸配列の組合せ；
ｂ．配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７のアミノ酸配列の組合せ；
ｃ．配列番号５、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１８、配列番号２１及び配列番号２２のアミノ酸配列の組合せ；及び
ｄ．配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０のアミノ酸配列の組合せ
から選択されるアミノ酸配列の組合せを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１；軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号２；軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号３；重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１２；重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１３；及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１４；
ｂ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号４；軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号５；軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６；重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１５；重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１６；及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１７；
ｃ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７；軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号８；軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号９；重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１８；重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１９；及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号２０；又は
ｄ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１０；軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号５；軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１；重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１８；重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号２１；及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号２２
を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１０；軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号５；軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１；重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１８；重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号２１；及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号２２を含む、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
１又は２つのアミノ酸配列を含み、各アミノ酸配列は、独立して、
ａ．軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列：配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６３；並びに上に列挙される前記アミノ酸配列の１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるアミノ酸配列、及び
ｂ．重鎖可変ドメインのアミノ酸配列：配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７及び配列番号６８；並びに上に列挙される前記アミノ酸配列の１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるアミノ酸配列
から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドをコードする配列は、１つ又は２つのポリヌクレオチド配列を含み、各ポリヌクレオチド配列は、独立して、
ａ．軽鎖可変ドメインのポリヌクレオチドをコードする配列：配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３；並びに上に列挙される前記ポリヌクレオチド配列の１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるポリヌクレオチド配列、及び
ｂ．重鎖可変ドメインのポリヌクレオチドをコードする配列：配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７及び配列番号７８；並びに上に列挙される前記ポリヌクレオチド配列の１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるポリヌクレオチド配列
から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６３から独立して選択されるアミノ酸配列を含むか又はさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１６】
配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７及び配列番号６８から独立して選択されるアミノ酸配列を含むか又はさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
配列番号５９及び配列番号６４、配列番号６０及び配列番号６５、配列番号６１及び配列番号６６、配列番号６２及び配列番号６７並びに配列番号６３及び配列番号６８から独立して選択される軽鎖及び重鎖可変ドメインのアミノ酸配列の組合せを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
１つ又は２つのアミノ酸配列を含み、各アミノ酸配列は、独立して、
ａ．軽鎖定常領域のアミノ酸配列：配列番号７９、配列番号８０及び配列番号８１；及び
ｂ．重鎖定常領域のアミノ酸配列：配列番号８２、配列番号８３及び配列番号８４
から選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
ヒトＡＰＪに特異的に結合する抗体であって、
ａ．ヒトＡＰＪ受容体への結合における、本明細書において提供される参照抗体と比べての同じ又はより良好なＫｄ；及び
ｂ．前記ＡＰＪ抗体がヒトＡＰＪ上の参照ＡＰＪ抗体と結合について交差競合すること
から選択される１つ又は複数の特性を有する抗体。
【請求項２０】
ヒトＡＰＪ受容体上の、本明細書において提供される参照ＡＰＪ抗体と結合について交差競合する、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
前記参照ＡＰＪ抗体は、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体を含む、請求項１９又は２０に記載の抗体。
【請求項２２】
前記参照ＡＰＪ抗体は、軽鎖可変領域のアミノ酸配列の配列番号６２及び重鎖可変領域のアミノ酸配列の配列番号６７の組合せ又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列の配列番号６３及び重鎖可変領域のアミノ酸配列の配列番号６８の組合せを含む、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
マウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、抗原結合抗体フラグメント、一本鎖抗体、二本鎖抗体、三本鎖抗体、四本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）ｘフラグメント、ドメイン抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体及びＩｇＧ４抗体から選択される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２４】
マウスＡＰＪ抗体又はヒト化ＡＰＪ抗体である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２５】
ＡＰＪモノクローナル抗体である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２６】
前記抗体の前記Ｋｄは、約１ｎＭ〜２００ｎＭ又は約１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載のＡＰＪ抗体及びＥｌａｂｅｌａフラグメントを含むＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質。
【請求項２８】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抗体と、１、２、３、４、５、６、７又は８つのＥｌａｂｅｌａフラグメントと、ペプチドリンカー（リンカー）とを含むＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質であって、ペプチドリンカー配列（リンカー）を通して、Ｅｌａｂｅｌａフラグメントであって、各Ｅｌａｂｅｌａフラグメントは、独立して、順Ｅｌａｂｅｌａフラグメント又はその突然変異体である、ＥｌａｂｅｌａフラグメントのＮ末端をＡＰＪ抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端に結合するか；又はＥｌａｂｅｌａフラグメントであって、各Ｅｌａｂｅｌａフラグメントは、独立して、逆Ｅｌａｂｅｌａフラグメント又はその突然変異体である、ＥｌａｂｅｌａフラグメントのＣ末端をＡＰＪ抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端に結合するかのいずれかである、Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質。
【請求項２９】
ＡＰＪ抗体と、１、２、３又は４つのＥｌａｂｅｌａフラグメントと、ペプチドリンカー（リンカー）とを含み；且つペプチドリンカー配列（リンカー）を通して、Ｅｌａｂｅｌａフラグメントであって、各Ｅｌａｂｅｌａフラグメントは、独立して、順Ｅｌａｂｅｌａフラグメント又はその突然変異体である、ＥｌａｂｅｌａフラグメントのＮ末端をＡＰＪ抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端に結合する、請求項２７又は２８に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
ＡＰＪ抗体と、１、２、３又は４つのＥｌａｂｅｌａフラグメントと、ペプチドリンカー（リンカー）とを含み；且つペプチドリンカー配列（リンカー）を通して、Ｅｌａｂｅｌａフラグメントであって、各Ｅｌａｂｅｌａフラグメントは、独立して、逆Ｅｌａｂｅｌａフラグメント又はその突然変異体である、ＥｌａｂｅｌａフラグメントのＣ末端をＡＰＪ抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端に結合する、請求項２７又は２８に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
ＡＰＪ抗体と、２つのＥｌａｂｅｌａフラグメントと、ペプチドリンカー配列（リンカー）とを含み；且つペプチドリンカー配列（リンカー）を通して、Ｅｌａｂｅｌａフラグメントであって、各Ｅｌａｂｅｌａフラグメントは、独立して、順Ｅｌａｂｅｌａフラグメント又はその突然変異体である、ＥｌａｂｅｌａフラグメントのＮ末端をＡＰＪ抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端に結合する、請求項２７又は２８に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
ＡＰＪ抗体と、２つのＥｌａｂｅｌａフラグメントと、ペプチドリンカー配列（リンカー）とを含み；且つペプチドリンカー配列（リンカー）を通して、Ｅｌａｂｅｌａフラグメントであって、各Ｅｌａｂｅｌａフラグメントは、独立して、逆Ｅｌａｂｅｌａフラグメント又はその突然変異体である、ＥｌａｂｅｌａフラグメントのＣ末端をＡＰＪ抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端に結合する、請求項２７又は２８に記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
前記ＡＰＪ抗体、Ｅｌａｂｅｌａフラグメント及びペプチドリンカー配列は、以下の方法：
ペプチドリンカー配列（リンカー）を通して、ＥｌａｂｅｌａフラグメントのＮ末端をＡＰＪ抗体の軽鎖のＣ末端に結合すること：Ｎ’−Ｒ−リンカー−Ｅｌａｂｅｌａ−Ｃ’；及び
ペプチドリンカー配列（リンカー）を通して、ＥｌａｂｅｌａフラグメントのＮ末端をＡＰＪ抗体の重鎖のＣ末端に結合すること：Ｎ’−Ｒ−リンカー−Ｅｌａｂｅｌａ−Ｃ’
の１つにおいて、前記融合タンパク質を形成するように融合され、
ここで、Ｎ’は、融合タンパク質ポリペプチドのＮ末端を表し、Ｃ’は、前記融合タンパク質ポリペプチドのＣ末端を表し、Ｅｌａｂｅｌａは、前記Ｅｌａｂｅｌａフラグメント又はその突然変異体を表し、Ｒは、請求項１〜２６のいずれか一項から選択される前記軽鎖又は重鎖アミノ酸配列を表し、及びリンカーは、前記ペプチドリンカーを表す、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
前記ペプチドリンカー（リンカー）配列は、配列番号１２２、配列番号１２３及び配列番号１２４から独立して選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載のＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質。
【請求項３５】
前記ペプチドリンカー（リンカー）は、配列番号１２３を含む、請求項２７〜３４のいずれか一項に記載のＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質。
【請求項３６】
前記Ｅｌａｂｅｌａフラグメントは、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１６６及び配列番号１６７から独立して選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２７〜３５のいずれか一項に記載のＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質。
【請求項３７】
前記Ｅｌａｂｅｌａフラグメントは、配列番号９３、配列番号９４、配列番号１０３、配列番号１０７、配列番号１０９及び配列番号１１６から独立して選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載のＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質。
【請求項３８】
前記Ｅｌａｂｅｌａフラグメントは、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４及び配列番号１５５から独立して選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２７〜３７のいずれか一項に記載のＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質。
【請求項３９】
（ｉ）配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０のアミノ酸配列の組合せ；
（ｉｉ）配列番号９３、配列番号９４、配列番号１０３、配列番号１０７、配列番号１０９及び配列番号１１６から独立して選択されるアミノ酸配列；及び
（ｉｉｉ）配列番号１２３
を含む、請求項２７〜３８のいずれか一項に記載のＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質。
【請求項４０】
請求項２７〜３９のいずれか一項に記載のＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４１】
請求項４０に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４２】
請求項４１に記載のベクターを含む宿主細胞株。
【請求項４３】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抗体及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項４４】
請求項２７〜３９のいずれか一項に記載のＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項４５】
肺動脈性高血圧を処置又は予防するための薬剤の調製における、請求項２７〜３９のいずれか一項に記載のＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の使用。
【請求項４６】
肺高血圧を処置又は予防するための薬剤の調製における、請求項２７〜３９のいずれか一項に記載のＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の使用。
【請求項４７】
心不全を処置又は予防するための薬剤の調製における、請求項２７〜３９のいずれか一項に記載のＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の使用。
【請求項４８】
２型糖尿病及びその関連メタボリックシンドロームを処置又は予防するための薬剤の調製における、請求項２７〜３９のいずれか一項に記載のＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の使用。
【請求項４９】
肺動脈性高血圧、肺高血圧、２型糖尿病及びその関連メタボリックシンドローム又は心不全の２つ及び３つ以上の病態を処置又は予防するための薬剤の調製における、請求項２７〜３９のいずれか一項に記載のＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の使用。
【請求項５０】
前記医薬組成物は、静脈内又は皮下に投与される、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
アペリン受容体（ＡＰＪ）抗体及びＥｌａｂｅｌａとのその融合タンパク質が本明細書において提供される。ＡＰＪ抗体及びＥｌａｂｅｌａを有する融合タンパク質の医薬組成物並びに肺動脈性高血圧、肺高血圧の１つ若しくは複数の症状又は心不全の１つ若しくは複数の症状の処置、予防又は改善におけるその使用も本明細書において提供される。
【背景技術】
【０００２】
ＡＰＪは、７つの膜貫通ユニット及び３０８アミノ酸を有し、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のファミリーに属する。血管作用性ペプチドのアペリンは、ＡＰＪ受容体の最も早期に発見された内因性リガンドである。アペリン及びＡＰＪは、ヒト中枢神経系並びに肺、心臓、胸部などの様々な末梢組織（非特許文献１；非特許文献２）、特に心血管内皮細胞及び心臓組織（非特許文献３）に広く分布される。いくつかの試験によると、アペリン／ＡＰＪシグナル伝達系は、心筋収縮力を増強し、血圧を低下させ、新血管形成を促進し、下垂体関連ホルモンの免疫応答及び放出を調節し、インスリン分泌などを調節し、糖尿病性血管症、心不全、心房細動及び虚血再灌流障害の病態生理学的事象に関与する可能性があることが示されている。
【０００３】
Ｅｌａｂｅｌａは、近年発見されているＡＰＪ受容体の別の内因性リガンドであり、大きい注目を集めている（非特許文献４；非特許文献５）。Ｅｌａｂｅｌａは、ヒト染色体４上の３つのエクソンによってコードされ、以前には非コードＲＮＡであると考えられた。しかし、試験により、Ｅｌａｂｅｌａは、５４アミノ酸のタンパク質（その成熟体は、わずか３２アミノ酸からなる）をコードする保存ＯＲＦを有することが見出されている。Ｅｌａｂｅｌａ／ＡＰＪシグナル伝達経路は、胚の心臓及び脈管構造の発生における決定的役割を担うことが示されている。試験では、Ｅｌａｂｅｌａ及びＥｌａｂｅｌａ突然変異体がＡＰＪ受容体のＧαｉ１及びβ−アレスチン２シグナル伝達経路を活性化し得ることが確認されている。さらに、ＥｌａｂｅｌａポリペプチドのＣ末端における突然変異は、ＡＰＪ受容体シグナル伝達経路への嗜好性を誘発し得る（非特許文献６）。受容体シグナル伝達経路の嗜好性は、新しい薬剤開発への重要な方向性をもたらす（非特許文献７）。分離灌流心臓及びインビボ血行動態並びに心エコー測定を用いることにより、Ｅｌａｂｅｌａ又はＥｌａｂｅｌａ突然変異体は、動脈圧を低下させ、心臓に対する陽性変力効果を発揮する可能性があることが見出された（非特許文献８；非特許文献６）。他の試験により、糖尿病性腎症を有する患者におけるＥｌａｂｅｌａ含量が微量アルブミン尿／クレアチニン比（ＡＣＲ）と負に相関することも見出された（非特許文献９）。
【０００４】
ＥｌａｂｅｌａとＡＰＪ抗体との融合により、Ｅｌａｂｅｌａの半減期が有意に延長され、Ｅｌａｂｅｌａ分子の生物学的活性が保持され得る。同時に、ＡＰＪ抗体及びＥｌａｂｅｌａの融合タンパク質が、抗体によって提供される分子標的化を有し、肺動脈性高血圧（ＰＡＨ）、肺高血圧（ＰＨ）、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）及びその関連メタボリックシンドローム並びに心不全の１つ又は複数の疾患の処置における役割を担うことは、Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質のドラッガビリティを改善することに役立つ。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６，８４６，６３４号明細書
【特許文献２】米国特許第６，６９６，２４５号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／０２０２５１２号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００４／０２０２９９５号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００４／００３８２９１号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００４／０００９５０７号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００３／００３９９５８号明細書
【特許文献８】米国特許第６７０３１９９号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２００５／０２３８６４６号明細書
【特許文献１０】米国特許第４９４６７７８号明細書
【特許文献１１】米国特許第４３３１６４７号明細書
【特許文献１２】米国特許第４５１８５８４号明細書
【特許文献１３】米国特許第４７３７４６２号明細書
【特許文献１４】米国特許第５０１１９１２号明細書
【特許文献１５】ＰＣＴ出願国際公開第９３／１０１５１号パンフレット
【特許文献１６】米国特許第５４５７０３５号明細書
【特許文献１７】米国特許第４７５１１８０号明細書
【特許文献１８】米国特許第４９３５２３３号明細書
【特許文献１９】ＰＣＴ出願国際公開第９４／１０３０８号パンフレット
【特許文献２０】米国特許第４６４０８３５号明細書
【特許文献２１】米国特許第４４９６６８９号明細書
【特許文献２２】米国特許第４３０１１４４号明細書
【特許文献２３】米国特許第４６７０４１７号明細書
【特許文献２４】米国特許第４７９１１９２号明細書
【特許文献２５】米国特許第４１７９３３７号明細書
【特許文献２６】米国特許第６１３３４２６号明細書
【特許文献２７】米国特許第６２１０９２４号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋａｗａｍａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１５３８：１６２−７１
【非特許文献２】Ｍｅｄｈｕｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８４：１１６２−７２
【非特許文献３】Ｋｌｅｉｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．１２６：２３３−４０
【非特許文献４】Ｃｈｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  ２７：６７２−６８０；
【非特許文献５】Ｐａｕｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３：１２４８６３６
【非特許文献６】Ｍｕｒｚａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｊ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５９：２９６２−７２
【非特許文献７】Ｂｏｌｏｇｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２５：１２−２５
【非特許文献８】Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １３５：１１６０−１１７３
【非特許文献９】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．４８：１３４７−１３５４
【非特許文献１０】Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ５３：１２１−１２９
【非特許文献１１】Ｒｏｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４
【非特許文献１２】Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｃｈ．７（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｐａｕｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）
【非特許文献１３】Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，１９９１
【非特許文献１４】Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６
【非特許文献１５】Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−２６
【非特許文献１６】Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９−８３
【非特許文献１７】Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−４８
【非特許文献１８】Ｐｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−２３
【非特許文献１９】Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ
【非特許文献２０】Ｂａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：３６０５−０６
【非特許文献２１】Ｏ’Ｄｏｗｄ，  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｇｅｎｅ．１３６：３５５−６０
【非特許文献２２】Ｂｏｕｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４６：１７６４−７１
【非特許文献２３】Ｙｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２９８：Ｅ５９−６７
【非特許文献２４】Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，９，１１２６−１１３６
【非特許文献２５】Ｈａｒｒｉｓ，Ｒ．Ｊ．，１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ７０５：１２９−１３４
【非特許文献２６】Ｃｏｌｉｇａｎ  ａｔ  ｐａｇｅｓ  ２．７．１−２．７．１２  ａｎｄ  ｐａｇｅｓ  ２．９．１−２．９．３
【非特許文献２７】Ｂａｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ）”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ  ７９−１０４（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）
【非特許文献２８】Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−５６７
【非特許文献２９】Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）
【非特許文献３０】Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｄ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８８）
【非特許文献３１】Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４：３９２−４０３
【非特許文献３２】Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３
【非特許文献３３】Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０：３５０−３６８
【非特許文献３４】Ｐａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８：７２４−７３３
【非特許文献３５】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６：７−８８
【非特許文献３６】Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：２８８−２９１
【非特許文献３７】Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：５３５−５３９
【非特許文献３８】Ｌｕｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：５００−０６
【非特許文献３９】Ｋｏｒｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４２３
【非特許文献４０】Ｋｏｒｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：９５−１０８
【非特許文献４１】Ｋｒｉａｎｇｋｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：３１−４０
【非特許文献４２】Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３
【非特許文献４３】Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−８３
【非特許文献４４】Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−６
【非特許文献４５】ｄｅ  Ｇｒａａｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：３７９−８７
【非特許文献４６】Ｎｉｓｏｎｏｆｆｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９６０，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０
【非特許文献４７】Ｐｏｒｔｅｒ，１９５９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９
【非特許文献４８】Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １：４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９６７）
【非特許文献４９】Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ  Ｔｉｔｕｓ，Ｊ．Ａ．ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００３），ｐａｇｅｓ  ２．８．１−２．８．１０  ａｎｄ  ２．１０Ａ．１−２．１０Ａ．５
【非特許文献５０】Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：１０６
【非特許文献５１】Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ，“Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ  １６６（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）
【非特許文献５２】Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ  １３７（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）
【非特許文献５３】Ｗａｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４２：１３３
【非特許文献５４】Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｇｅｎｅ  ３７：７３
【非特許文献５５】Ｃｒａｉｋ，１９８５，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３：１２−１９
【非特許文献５６】Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献５７】Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４
【非特許文献５８】Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５
【非特許文献５９】Ｂｙｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６７７
【非特許文献６０】Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ  １０．１９．１−１０．１９．１１
【非特許文献６１】Ｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：３９９２−４００１
【非特許文献６２】Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９
【非特許文献６３】Ｈｏｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４４：１９１
【非特許文献６４】Ｆａｎｓｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７−７８
【非特許文献６５】Ｍｏｕｌｔ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４２２−４２７
【非特許文献６６】Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：２２２−２４５
【非特許文献６７】Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１３：２１１−２２２
【非特許文献６８】Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−１４８
【非特許文献６９】Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６
【非特許文献７０】Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−３８４
【非特許文献７１】Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２７：２４４−２４７
【非特許文献７２】Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−３７６
【非特許文献７３】Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７−８７
【非特許文献７４】Ｓｉｐｐｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：１５−１９
【非特許文献７５】Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４−１７０
【非特許文献７６】Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８３：１４６−１５９
【非特許文献７７】Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：４３５５−４３５８
【非特許文献７８】Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））
【非特許文献７９】Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｔｏｏｚｅ，Ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））
【非特許文献８０】Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５
【非特許文献８１】Ｎｙｇｒｅｎ  ａｎｄ  Ｕｈｌｅｎ，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：４６３−４６９
【非特許文献８２】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６
【非特許文献８３】Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ  ９  ａｎｄ  １１
【非特許文献８４】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ２．１０  ａｎｄ  ６．３−６．４
【非特許文献８５】Ｖｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：２８７
【非特許文献８６】Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７
【非特許文献８７】Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８：３１
【非特許文献８８】Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−２０
【非特許文献８９】Ｇｌｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ  ２３：１７５
【非特許文献９０】ＭｃＭａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２８２１
【非特許文献９１】Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８５
【非特許文献９２】Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８０）  ａｎｄ  ２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２０００），Ｍａｃｋ  ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｃｏｍｐａｎｙ
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＡＰＪに特異的に結合する抗体が本明細書において提供される。
【０００８】
１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸配列を含む、ＡＰＪに特異的に結合する抗体であって、各アミノ酸配列は、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１、配列番号４、配列番号７及び配列番号１０；
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号２、配列番号５及び配列番号８；
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号３、配列番号６、配列番号９及び配列番号１１；
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１２、配列番号１５及び配列番号１８；
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９及び配列番号２１；及び
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０及び配列番号２２
から選択される、抗体が本明細書において提供される。
【０００９】
ＡＰＪに特異的に結合する抗体及び１、２、３、４、５、６、７又は８つのＥｌａｂｅｌａフラグメントのペプチドリンカー配列（リンカー）を含むＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質であって、ペプチドリンカー配列（リンカー）を通して、Ｅｌａｂｅｌａフラグメントであって、各Ｅｌａｂｅｌａフラグメントは、独立して、順Ｅｌａｂｅｌａフラグメント又はその突然変異体である、ＥｌａｂｅｌａフラグメントのＮ末端をＡＰＪ抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端に結合するか；又はペプチドリンカー配列（リンカー）を通して、Ｅｌａｂｅｌａフラグメントであって、各Ｅｌａｂｅｌａフラグメントは、独立して、逆Ｅｌａｂｅｌａフラグメント又はその突然変異体である、ＥｌａｂｅｌａフラグメントのＣ末端をＡＰＪ抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端に結合する、Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質が本明細書において提供される。
【００１０】
ＡＰＪ抗体と、２つのＥｌａｂｅｌａフラグメントと、２つのペプチドリンカー配列（リンカー）とを含むＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質であって、ペプチドリンカー配列（リンカー）を通して、ＥｌａｂｅｌａフラグメントのＮ末端をＡＰＪ抗体の軽鎖のＣ末端に結合するか：Ｎ’−Ｒ−リンカー−Ｅｌａｂｅｌａ−Ｃ’；又はペプチドリンカー配列（リンカー）を通して、ＥｌａｂｅｌａフラグメントのＮ末端をＡＰＪ抗体の重鎖のＣ末端に結合し：Ｎ’−Ｒ−リンカー−Ｅｌａｂｅｌａ−Ｃ’であり；ここで、Ｎ’は、融合タンパク質ポリペプチドのＮ末端を表し、Ｃ’は、融合タンパク質ポリペプチドのＣ末端を表し、Ｅｌａｂｅｌａは、順Ｅｌａｂｅｌａフラグメント又はその突然変異体を表し、Ｒは、ＡＰＪ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ酸配列を表し、及びリンカーは、ペプチドリンカー配列を表す、Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質が本明細書において提供される。
【００１１】
本明細書に記載されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが本明細書において提供される。
【００１２】
本明細書に記載されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが本明細書において提供される。
【００１３】
本明細書に記載される１つのベクターを含む宿主細胞株が本明細書において提供される。
【００１４】
ＡＰＪ抗体又はＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質及び本明細書に記載される薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物が本明細書において提供される。
【００１５】
ＰＡＨ及びＰＡＨ関連疾患を処置、予防又は改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＡＰＪ抗体又はＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の使用が本明細書において提供される。
【００１６】
ＰＨ及びＰＨ関連疾患を処置、予防又は改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＡＰＪ抗体又はＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の使用が本明細書において提供される。
【００１７】
心不全及び心不全関連疾患を処置、予防又は改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＡＰＪ抗体又はＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の使用が本明細書において提供される。
【００１８】
２型糖尿病及び関連メタボリックシンドロームを処置、予防又は改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＡＰＪ抗体又はＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の使用が本明細書において提供される。
【００１９】
ＰＡＨ、ＰＨ、２型糖尿病及び関連メタボリックシンドローム又は心不全の２つ及び３つ以上の疾患を同時に処置、予防又は改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＡＰＪ抗体又はＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の使用が本明細書において提供される。
【００２０】
ＰＡＨの１つ又は複数の症状を処置、予防又は改善するための方法であって、治療的に有効な用量の、本明細書に記載されるＡＰＪ抗体又はＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質を対象に投与することを含む方法が本明細書において提供される。
【００２１】
ＰＨの１つ又は複数の症状を処置、予防又は改善するための方法であって、治療的に有効な用量の、本明細書に記載されるＡＰＪ抗体又はＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質を対象に投与することを含む方法が本明細書において提供される。
【００２２】
心不全の１つ又は複数の症状を処置、予防又は改善するための方法であって、治療的に有効な用量の、本明細書に記載されるＡＰＪ抗体又はＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質を対象に投与することを含む方法が本明細書において提供される。
【００２３】
２型糖尿病及び関連メタボリックシンドロームの１つ又は複数の症状を処置、予防又は改善するための方法であって、治療的に有効な用量の、本明細書に記載されるＡＰＪ抗体又はＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質を対象に投与することを含む方法が本明細書において提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】組み換えｈＡＰＪ抗体Ｌ１Ｈ１（配列番号５９及び配列番号６４を含む）及びＬ４Ｈ４（配列番号６２及び配列番号６７を含む）の（５００ｎＭ又は４ｎＭの抗体濃度で）ｈＡＰＪへの特異的結合のＦＡＣＳ試験の結果を示す。灰色ピークは、陰性対照であり、Ｌ１Ｈ１又はＬ４Ｈ４のＣＨＯ−ＤＨＦＲ−への結合曲線を表す。実線ピークは、Ｌ１Ｈ１（図１Ａ及び１Ｂ）又はＬ４Ｈ４（図１Ｃ及び１Ｄ）のＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＡＰＪへの結合曲線を表す。
【図２】Ｅｌａｂｅｌａ／ＡＰＪシグナル伝達経路を活性化するためのｈＡＰＪ抗体Ｌ５Ｈ５（配列番号６３及び配列番号６８を含む）及びリンカー２−Ｅｌａｂｅｌａ−１１（配列番号１２３及び配列番号９３を含む）融合タンパク質並びにＬ５Ｈ５及びリンカー２−ＥＡ５（配列番号１２３及び配列番号９４を含む）融合タンパク質のレポーター遺伝子アッセイ試験の活性化曲線を示し、ＥＣ５０は、それぞれ３．６ｎＭ及び２．６ｎＭである。
【図３】Ｅｌａｂｅｌａ／ＡＰＪシグナル伝達経路を活性化するためのｈＡＰＪ抗体Ｌ５Ｈ５及びリンカー２−ＥＡ１（配列番号１２３及び配列番号１０３を含む）融合タンパク質並びにＬ５Ｈ５及びリンカー２−ＥＡ２（配列番号１２３及び配列番号１０７を含む）融合タンパク質のレポーター遺伝子アッセイ試験の活性化曲線を示し、ＥＣ５０は、それぞれ５．０ｎＭ及び２．２ｎＭである。
【図４】Ｅｌａｂｅｌａ／ＡＰＪシグナル伝達経路を活性化するためのｈＡＰＪ抗体Ｌ５Ｈ５及びリンカー２−ＥＡ３（配列番号１２３及び配列番号１０９を含む）融合タンパク質並びにＬ５Ｈ５及びリンカー２−ＥＡ４（配列番号１２３及び配列番号１１６を含む）融合タンパク質のレポーター遺伝子アッセイ試験の活性化曲線を示し、ＥＣ５０は、それぞれ２０．３ｎＭ及び５．４ｎＭである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
定義
本明細書において特に定義されない限り、本明細書に記載される科学用語及び技術用語は、当業者によって理解される意味を有するものとする。一般に、薬理学、生物学、生化学、細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及びタンパク質核酸化学並びにハイブリダイゼーションに関連する命名法及び技術は、この分野において周知であり、一般的に使用されるものである。
【００２６】
本出願では、ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示すために標準的な一文字又は三文字略語が使用される。ポリペプチド配列が記載される場合、アミノ基を有する第１のアミノ酸残基（Ｎ’）は、左端にあり、カルボキシル基を有する最後のアミノ酸残基（Ｃ’）は、右端にあり、例えば本発明に係るＥｌａｂｅｌａフラグメント及びその突然変異体配列：配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０及び配列番号１２１である。逆ポリペプチド配列は、アミノ酸がオリジナルに対して逆の順序で配置されたポリペプチド配列、例えば上記のＥｌａｂｅｌａフラグメント及びその突然変異体配列から変換された逆Ｅｌａｂｅｌａフラグメント及びその突然変異体配列：配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４及び配列番号１５５を指す。一本鎖及び二本鎖核酸配列の上鎖の５’末端が左側にあり、それらの３’末端が右側にある。ポリペプチドの特定の部分は、アミノ酸６７〜１３４などのアミノ酸残基数によって表されるか、又はＬｙｓ６７〜Ｌｙｓ１３４など、その部位の実際の残基によって表され得る。特定のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、参照配列とのその相違を示すことによって表すこともできる。
【００２７】
「個体」という用語は、限定はされないが、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット又はマウスを含む動物を指す。用語「個体」及び「患者」は、例えば、哺乳動物個体、例えばヒト個体を指し、一実施形態ではヒトを指すように互換可能に用いられる。
【００２８】
「処置」という用語の意味は、障害、疾患若しくは病態又は障害、疾患若しくは病態に関連する１つ若しくは複数の症状を低減又は排除するか；或いは障害、疾患又は病態の病巣を低減又は排除することを含む。
【００２９】
「予防」という用語の意味は、障害、疾患若しくは病態及び／又はそれに伴う症状の発症を遅延及び／又は軽減するか；個体が障害、疾患又は病態を被ることを予防するか；或いは障害、疾患又は病態を被る個体のリスクを低減することを含む。
【００３０】
「制御」という用語は、疾患、障害若しくは病態又は１つ若しくは複数の症状（例えば、疼痛）の進行、伝播又は悪化を予防又は緩徐化することを指す。ときに、個体は、病態、障害又は疾患の治癒をもたらさない予防薬又は治療薬の有益な効果から利益を得る。一実施形態では、「制御」という用語は、溶骨による痛みの進行、伝播又は悪化を予防又は緩徐化することを指す。
【００３１】
「治療的に有効な用量」及び「有効量」という用語の意味は、投与されるとき、障害、疾患又は病態の１つ又は複数の症状の発現を予防するか又はそれらを軽減するのに十分である化合物又は化合物の組合せの量を指す。用語「治療的に有効な用量」又は「有効量」は、研究者、獣医師、医師又は臨床医によって探求される、生体分子（例えば、タンパク質、酵素、ＲＮＡ又はＤＮＡ）、細胞、組織、系、動物又はヒトにおける生物学的又は医学的応答を引き起こすのに十分である化合物の量も指す。
【００３２】
「薬学的に許容できる担体」、「薬学的に許容できる賦形剤」、「生理学的に許容できる担体」又は「生理学的に許容できる賦形剤」という用語は、薬学的に許容できる材料、組成物又は担体、例えば液体若しくは固体充填剤、希釈剤、溶媒又はパッケージング材料を指す。一実施形態では、「薬学的に許容できる」各成分は、医薬製剤の他の成分に適合し、ヒト又は動物の組織又は臓器との接触に適し、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応、免疫原性若しくは他の問題又は合併症を伴わず、合理的なリスク・ベネフィット比に対応する。
【００３３】
「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される許容できる誤差を指し、部分的には、その値がどのように測定又は判定されるかに依存する。特定の実施形態では、「約」又は「およそ」という用語は、１、２、３又は４標準偏差以内を意味する。特定の実施形態では、「約」又は「およそ」という用語は、所与の値又は範囲の５０％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％又は０．０５％以内を意味する。
【００３４】
「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって互いに結合された２つ以上のアミノ酸を含む分子を指す。これらの用語は、例えば、天然及び人工タンパク質及びタンパク質配列のペプチド類似体（突然変異タンパク質、変異体及び融合タンパク質など）並びに翻訳後又は共有結合的若しくは非共有結合的に修飾されたタンパク質を包含する。ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、モノマー又はポリマーであり得る。
【００３５】
「ポリペプチドフラグメント」という用語は、対応する完全長タンパク質からのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端欠失を有するポリペプチドを指す。例えば、フラグメント長さは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、５０、７０、８０、９０、１００、１５０又は２００アミノ酸の長さであり得る。フラグメント長さは、例えば、最大で１，０００、７５０、５００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１４、１３、１２、１１又は１０アミノ酸であり得る。フラグメントは、一方の末端又は両方において１つ又は複数のさらなるアミノ酸、例えば異なる天然タンパク質からのアミノ酸配列（例えば、Ｆｃ又はロイシンジッパードメイン）又は人工アミノ酸配列（例えば、人工結合配列）をさらに含み得る。
【００３６】
本発明のポリペプチドは、任意の理由で又は任意の手段により、例えば（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させ、（２）酸化に対する感受性を低下させ、（３）タンパク質複合体を形成するように親和性を改変し、（４）結合親和性を改変し、（５）他の物理化学的又は機能的特性を与えるか又は調節することによって修飾されたポリペプチドを含む。類似体は、ポリペプチドの突然変異タンパク質を含む。例えば、単一又は複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）は、天然配列中で行われ得る（例えば、分子間接触を形成するポリペプチドのドメインの外部）。「保存的アミノ酸置換」は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させないものである（例えば、アミノ酸の置換は、親配列に存在するヘリックスを破壊すべきでなく、又は親配列にその特性又は機能を与えるために必要とされる他の二次的な構造タイプに干渉すべきでない）。
【００３７】
ポリペプチドの「突然変異体」は、別のポリペプチド配列と比べてアミノ酸配列中の１つ又は複数の残基の挿入、欠失及び／又は置換を含むアミノ酸配列を含む。本発明の変異体は、融合タンパク質を含んでいた。
【００３８】
ポリペプチドの「誘導体」は、ポリエチレングリコール、アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）、リン酸化及びグリコシル化など、例えば他の化学部分への結合によって化学修飾されたポリペプチドである。
【００３９】
特に示されない限り、「抗体」という用語は、２つの完全長重鎖及び２つの完全長軽鎖を含む抗体並びにそれらの誘導体、変異体、フラグメント及び突然変異タンパク質を含み、その例は後述される。
【００４０】
「抗体」という用語は、抗原結合部分及び任意選択的に、抗原への抗体の結合を促進する立体配座を抗原結合部分が取るのを可能にする足場又はフレームワーク部分を含むタンパク質である。抗体の例としては、完全抗体、抗体フラグメント（抗体の抗原結合部分など）、抗体誘導体及び抗体類似体が挙げられる。例えば、抗体は、グラフトされたＣＤＲ又はＣＤＲの誘導体を含む、代替的なタンパク質足場又は人工足場を含み得る。足場としては、限定はされないが、導入される抗体由来の足場、例えば抗体の三次元構造を安定させるもの及び例えば生体適合性ポリマーのための完全に合成の足場が挙げられる。例えば、（非特許文献１０）；（非特許文献１１）を参照されたい。さらに、抗体は、ペプチド抗体模倣体（「ＰＡＭ」）又は足場としてフィブリンリガンドを用いる抗体模倣体を含む足場のいずれかであり得る。
【００４１】
抗体は、天然免疫グロブリンなどの構造を有し得る。「免疫グロブリン」は、四量体分子である。天然免疫グロブリンにおいて、各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対からなり、各対は、「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端は、主に抗原認識に関連している約１００〜１１０のアミノ酸の可変ドメインを含む。各鎖のカルボキシル末端は、主にエフェクターの効果に関連している定常領域を画定する。ヒト抗体軽鎖は、κ及びλ軽鎖に分類される。重鎖は、μ、δ、α又はεに分類され、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥなどの同じタイプの抗原を画定した。軽鎖及び重鎖内で、可変及び定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合され、重鎖は、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。（非特許文献１２）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成し、このようにして完全な免疫グロブリンが２つの結合部位を有する。
【００４２】
天然免疫グロブリン鎖は、相補性決定領域又はＣＤＲとしても知られている、３つの超可変領域によって結合された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ基本構造を示す。Ｎ末端からＣ末端へと、軽鎖及び重鎖は、構造ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。全ての構造ドメイン中のアミノ酸の分布は、（非特許文献１３）におけるＫａｂａｔらと一致していた。
【００４３】
特に規定されない限り、「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン又は特異的結合についてインタクトな抗体と競合し得る、その抗原結合部分のいずれかを意味する。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ技術、インタクトな抗体の酵素的若しくは化学的切断によって産生され得る。抗原結合部分としては、特に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、構造ドメイン抗体（ｄＡｂ）が挙げられ、相補性決定領域（ＣＤＲ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、二本鎖抗体（二重特異性抗体）、三本鎖抗体（三重特異性抗体）、四本鎖抗体（四重特異性抗体）及びポリペプチド特異的抗原に結合する免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドを含む。
【００４４】
Ｆａｂフラグメントは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを有する一価フラグメントであり；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ヒンジ領域においてジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂフラグメントを有する二価フラグメントであり；Ｆｖフラグメントは、ＶＨ及びＶＬドメインを有し；ｄＡｂフラグメントは、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン又はＶＨ若しくはＶＬドメインの抗原結合フラグメントを有する（特許文献１及び特許文献２；特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６及び特許文献７；非特許文献１４）。
【００４５】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ及びＶＨ領域がリンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）を通して結合されて、連続タンパク質抗体を形成する融合タンパク質であり、ここで、リンカーは、タンパク質鎖がそれ自体で折り畳まれて、一価抗原結合部位を形成するのを可能にするのに十分に長い（例えば、（非特許文献１５）；及び（非特許文献１６）を参照されたい）。
【００４６】
二本鎖抗体は、２つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であり、ポリペプチド鎖はそれぞれ、同じ鎖上の２つのドメインの対形成を可能にしないほど短いリンカーによって結合されたＶＨ及びＶＬ領域を含む。したがって、各ドメインが別のポリペプチド鎖上の相補的ドメインと対形成することを可能にする（例えば、（非特許文献１７）；（非特許文献１８）を参照されたい）。二本鎖抗体の２つのポリペプチド鎖が同一である場合、それらの対形成から生じる二本鎖抗体は、同一の抗原結合部位を有する。異なる配列を有するポリペプチド鎖を用いて、異なる抗原結合部位を有する二本鎖抗体を作製することができる。同様に、三本鎖及び四本鎖抗体は、３つ及び４つのポリペプチド鎖を含み、同じか又は異なり得る３つ及び４つの抗原結合部位を形成する抗体である。
【００４７】
本明細書では、（非特許文献１３）においてＫａｂａｔらが説明している方法を用いて、所与の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を同定する。１つ又は複数のＣＤＲを共有結合的又は非共有結合的に分子中に組み込んで、それを抗体にし得る。抗体は、より大きいポリペプチド鎖をＣＤＲに組み込むことができる。ＣＤＲは、別のポリペプチド鎖に共有結合することができるか、又はＣＤＲに非共有結合的に組み込むことができ、抗体が、該当する特定の抗原に特異的に結合することを可能にする。
【００４８】
抗体は、１つ又は複数の結合部位を有し得る。２つ以上の結合部位がある場合、結合部位は、互いに同一であるか又は異なり得る。例えば、天然ヒト免疫グロブリンは、通常、２つの同一の結合部位を有する一方、「二重特異性」又は「二機能性」抗体は、２つの異なる結合部位を有する。
【００４９】
「マウス抗体」という用語は、マウス免疫グロブリン配列に由来する１つ又は複数の可変及び定常領域を有する抗体を含む。
【００５０】
「ヒト化抗体」という用語は、マウス抗体分子の相補性決定領域の配列をヒト抗体可変領域のフレームワークにグラフトすることによって作製される抗体である。
【００５１】
「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」又は「抗原結合部位」という用語は、抗原と相互作用し、抗原に対する抗体の特異性及び親和性に寄与するアミノ酸残基を含む抗体の部分である。それらの抗原に特異的に結合する抗体について、これらの用語は、そのＣＤＲドメインの少なくとも１つの少なくとも一部を含む。
【００５２】
「エピトープ」という用語は、抗体に（例えば、抗体によって）結合する分子の部分である。エピトープは、分子の非隣接部分（例えば、ポリペプチドにおいて、ポリペプチドの一次配列において隣接していないが、ポリペプチドの三次及び四次構造において、抗体によって互いに結合されるのに十分に近いアミノ酸残基）を含み得る。
【００５３】
２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチド配列の「同一性パーセント」は、ＧＡＰコンピュータプログラム（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ；ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．３（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の一部）のデフォルトパラメータ比較配列を用いて決定される。
【００５４】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、全文を通して同義的に使用され、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体（例えば、ペプチド核酸及び非天然ヌクレオチド類似体）を用いて生成されるＤＮＡ又はＲＮＡ類似体並びにそれらのハイブリッドを含み得る。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得る。一実施形態では、本発明において含まれる核酸分子は、抗体又はそのフラグメント、誘導体、変異タンパク質又は変異体をコードする連続オープンリーディングフレームを含む。
【００５５】
２つの一本鎖ヌクレオチドは、それらの配列が逆平行であり得る場合、互いに「相補的」であり、一方のポリヌクレオチド中の各ヌクレオチドが他方のポリヌクレオチド中の相補的ヌクレオチドと反対であり、ギャップが導入されず、各配列の５’又は３’末端に対形成しないヌクレオチドが見られないようになっている。２つのポリヌクレオチドが中程度にストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズし得る場合、一方のポリヌクレオチドは、他方のポリヌクレオチドと「相補的」である。したがって、一方のポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドに相補的であり得るが、その相補配列でない。
【００５６】
「担体」という用語は、それに連結された別の核酸を細胞内に導入するのに使用され得る核酸である。担体の１つのタイプは、「プラスミド」であり、さらなる核酸セグメントに結合可能な直鎖状又は環状二本鎖ＤＮＡ分子を指す。担体の別のタイプは、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）であり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム内に導入され得る。一部の担体は、それらが導入された宿主細胞において自己複製可能である（例えば、細菌複製起点を含む細菌担体及び遊離型哺乳動物担体）。他の担体（例えば、非遊離型哺乳動物担体）は、宿主細胞内に導入されると宿主細胞ゲノム内に組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。「発現担体」は、選択されたポリヌクレオチドの発現を指令し得る担体のタイプである。
【００５７】
制御配列がヌクレオチド配列の発現（例えば、発現のレベル、時間又は部位）に影響を及ぼす場合、ヌクレオチド配列は、制御配列に「操作可能に連結される」。「制御配列」は、それが操作可能に連結される核酸の発現（例えば、発現のレベル、時間又は部位）に影響を及ぼす核酸である。制御遺伝子は、例えば、制御される核酸に対して直接又は１つ又は複数の他の分子（例えば、制御配列及び／又は核酸に結合するポリヌクレオチド）を通して作用する。制御配列の例としては、プロモータ、エンハンサー及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）が挙げられる。制御配列のさらなる例が（非特許文献１９）；及び（非特許文献２０）などに記載され得る。
【００５８】
「宿主細胞」という用語は、本明細書において提供されるものなどの核酸を発現するのに使用される細胞を指す。宿主細胞は、原核生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり得るか、又はそれは、真核生物、例えば単細胞真核生物（例えば、酵母又は他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコ又はトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト、サル、ハムスター、ラット、マウス又は昆虫の細胞）又はハイブリドーマであり得る。通常、宿主細胞は、宿主細胞において後に発現され得るペプチドコード核酸で形質転換又はトランスフェクトされ得る培養細胞である。「組み換え宿主細胞」という語句は、予測される発現の核酸で形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を示すのに使用され得る。宿主細胞は、核酸を含むが、制御配列が、核酸と操作可能に連結されるように宿主細胞中に導入されない限り、所望のレベルでその核酸を発現しない細胞でもあり得る。「宿主細胞」という用語は、特定の対象の細胞だけでなく、その細胞の子孫又は潜在的な子孫も指すことが理解されるべきである。続く世代で起こる特定の修飾、例えば突然変異又は環境的影響のため、このような子孫は、実際に、親細胞と異なり得るが、なお本発明において使用されるこの用語の範囲内に含まれる。
【００５９】
ＡＰＪ受容体
ＡＰＪは、３７７アミノ酸からなる７つの膜貫通単位を有するＧタンパク質共役受容体である（非特許文献２１）。現在まで、試験によると、ＡＰＪは、ヒト中枢神経系及び肺、心臓、胸部などの様々な末梢組織（非特許文献１；非特許文献２）、特に心血管内皮細胞及び心臓組織（非特許文献３）において広範に分布されていることが示されている。ＡＰＪは、主に心血管系の調節に関与し、さらにインスリンの調節並びに糖尿病及び肥満関連疾患の調節機構において重要な有意性を有することが報告されている（非特許文献２２；非特許文献２３）。本明細書で用いられるとき、「ヒトＡＰＪ」及び「ｈＡＰＪ」は、共にヒト由来ＡＰＪを指し、互換可能に用いることができる。本明細書で用いられるとき、「マウスＡＰＪ」及び「ｍＡＰＪ」は、共にマウス由来ＡＰＪを指し、やはり互換可能に用いることができる。
【００６０】
一実施形態では、ここで提示される抗体は、ヒトＡＰＪに特異的に結合する抗体である。一実施形態では、ここで提示される融合タンパク質は、細胞膜上のＡＰＪに特異的に結合するＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質であり、ここで、融合タンパク質は、これらの細胞内でのＥｌａｂｅｌａ／ＡＰＪシグナル伝達を活性化し得る。さらなる実施形態では、ここで提示される融合タンパク質は、ヒトＡＰＪに結合するＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質であり、ここで、融合タンパク質は、他種（サル及びマウスなど）のＡＰＪに結合し、これらの種内でのＥｌａｂｅｌａ／ＡＰＪシグナル伝達を活性化し得る。
【００６１】
一実施形態において、ＡＰＪのアミノ酸及びポリヌクレオチド配列が以下に列挙され、配列データは、アメリカ国立生物工学情報センターのＧｅｎｅ−Ｂａｎｋデータベース及び欧州バイオインフォマティクス研究所のＵｎｉｐｒｏｔデータベースから入手される。
ヒト（ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））ポリヌクレオチド（配列番号５５）；受託番号：Ｘ８９２７１。
ヒト（ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））アミノ酸（配列番号２３）；受託番号：ＣＡＡ６１５４６。
サル（アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ））ポリヌクレオチド（配列番号５６）；受託番号：ＡＦ１００２０６。
サル（アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ））アミノ酸（配列番号２４）；受託番号：ＡＡＣ７２４０４。
ラット（ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））ポリヌクレオチド（配列番号５７）；受入番号：ＡＢ０３３１７０。
ラット（ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））アミノ酸（配列番号２５）；受入番号：ＢＡＡ９５００２。
マウス（ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））ポリヌクレオチド（配列番号５８）；受入番号：ＡＪ００７６１２；及びマウス（ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））アミノ酸（配列番号２６）；受入番号：ＣＡＢ５０６９６。
【００６２】
血管作用性ペプチド受容体の抗体（ＡＰＪ抗体）
一実施形態において、ＡＰＪ抗体が本明細書において提供される。別の実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、完全ＡＰＪ抗体である。別の実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、ＡＰＪ抗体フラグメントである。別の実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、ＡＰＪ抗体の誘導体である。別の実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、ＡＰＪ抗体突然変異タンパク質である。別の実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、ＡＰＪ抗体の変異体である。
【００６３】
一実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸配列を含み、これらはそれぞれ、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１、配列番号４、配列番号７及び配列番号１０；
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号２、配列番号５及び配列番号８；
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号３、配列番号６、配列番号９及び配列番号１１；
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１２、配列番号１５及び配列番号１８；
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９及び配列番号２１；及び
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０及び配列番号２２
から選択される。
【００６４】
表１は、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体の軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列並びに対応するポリヌクレオチドコード配列を列挙している。表２は、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列並びに対応するポリヌクレオチドコード配列を列挙している。
【００６５】
【表１】
2021526833.tif 000002
【００６６】
【表２】
2021526833.tif 000003
【００６７】
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、５、４、３、２又は１つのアミノ酸付加、置換及び／又は欠失は、表１及び２に列挙されるＣＤＲアミノ酸配列の１つと異なる配列を含む。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、４、３、２又は１つのアミノ酸付加、置換及び／又は欠失は、表１及び２に列挙されるＣＤＲアミノ酸配列の１つと異なる配列を含む。
【００６８】
別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、３、２又は１つのアミノ酸付加、置換及び／又は欠失は、表１及び２に列挙されるＣＤＲアミノ酸配列の１つと異なる配列を含む。
【００６９】
別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、２又は１つのアミノ酸付加、置換及び／又は欠失は、表１及び２に列挙されるＣＤＲアミノ酸配列の１つと異なる配列を含む。
【００７０】
さらなる実施形態において、本明細書において提供される抗体は、１つのアミノ酸付加、置換及び／又は欠失は、表１及び２に列挙されるＣＤＲアミノ酸配列の１つと異なる配列を含む。
【００７１】
一実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、１又は２つのアミノ酸配列を含み、各アミノ酸配列は、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１、配列番号４、配列番号７及び配列番号１０；
ｂ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１２、配列番号１５及び配列番号１８
から選択される。
【００７２】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、１又は２つのアミノ酸配列を含み、各アミノ酸配列は、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号２、配列番号５及び配列番号８；
ｂ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９及び配列番号２１
から選択される。
【００７３】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、１又は２つのアミノ酸配列を含み、各アミノ酸配列は、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号３、配列番号６、配列番号９及び配列番号１１；
ｂ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０及び配列番号２２
から選択される。
【００７４】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、１、２、３又は４つのアミノ酸配列を含み、各アミノ酸配列は、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１、配列番号４、配列番号７及び配列番号１０；
ｂ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１２、配列番号１５及び配列番号１８；
ｃ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号２、配列番号５及び配列番号８；
ｄ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９及び配列番号２１
から選択される。
【００７５】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、１、２、３又は４つのアミノ酸配列を含み、各アミノ酸配列は、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１、配列番号４、配列番号７及び配列番号１０；
ｂ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１２、配列番号１５及び配列番号１８；
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号３、配列番号６、配列番号９及び配列番号１１；
ｄ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０及び配列番号２２
から選択される。
【００７６】
さらなる実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、１、２、３又は４つのアミノ酸配列を含み、各アミノ酸配列は、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号２、配列番号５及び配列番号８；
ｂ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９及び配列番号２１；
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号３、配列番号６、配列番号９及び配列番号１１；
ｄ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０及び配列番号２２
から選択される。
【００７７】
一実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、１、２又は３つのアミノ酸配列を含み、各アミノ酸配列は、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１から選択される。
【００７８】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、１、２又は３つのアミノ酸配列を含み、各アミノ酸配列は、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２から選択される。
【００７９】
一実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、以下のリスト：配列番号１及び配列番号１２、配列番号４及び配列番号１５、配列番号７及び配列番号１８並びに配列番号１０及び配列番号１８から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列の組合せを含む。
【００８０】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、以下のリスト：配列番号２及び配列番号１３、配列番号５及び配列番号１６、配列番号８及び配列番号１９並びに配列番号５及び配列番号２１から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列の組合せを含む。
【００８１】
さらなる実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、以下のリスト：配列番号３及び配列番号１４、配列番号６及び配列番号１７、配列番号９及び配列番号２０並びに配列番号１１及び配列番号２２から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の組合せを含む。
【００８２】
一実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、
ａ．以下のリスト：配列番号１及び配列番号１２、配列番号４及び配列番号１５、配列番号７及び配列番号１８並びに配列番号１０及び配列番号１８から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列の組合せ；及び
ｂ．以下のリスト：配列番号２及び配列番号１３、配列番号５及び配列番号１６、配列番号８及び配列番号１９並びに配列番号５及び配列番号２１から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列の組合せ
を含む。
【００８３】
一実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、
ａ．以下のリスト：配列番号１及び配列番号１２、配列番号４及び配列番号１５、配列番号７及び配列番号１８並びに配列番号１０及び配列番号１８から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列の組合せ；及び
ｂ．以下のリスト：配列番号３及び配列番号１４、配列番号６及び配列番号１７、配列番号９及び配列番号２０並びに配列番号１１及び配列番号２２から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の組合せ
を含む。
【００８４】
一実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、
ａ．以下のリスト：配列番号２及び配列番号１３、配列番号５及び配列番号１６、配列番号８及び配列番号１９並びに配列番号５及び配列番号２１から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列の組合せ；及び
ｂ．以下のリスト：配列番号３及び配列番号１４、配列番号６及び配列番号１７、配列番号９及び配列番号２０並びに配列番号１１及び配列番号２２から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の組合せ
を含む。
【００８５】
さらなる実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、
ａ．以下のリスト：配列番号１及び配列番号１２、配列番号４及び配列番号１５、配列番号７及び配列番号１８並びに配列番号１０及び配列番号１８から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列の組合せ；
ｂ．以下のリスト：配列番号２及び配列番号１３、配列番号５及び配列番号１６、配列番号８及び配列番号１９並びに配列番号５及び配列番号２１から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列の組合せ；及び
ｃ．以下のリスト：配列番号３及び配列番号１４、配列番号６及び配列番号１７、配列番号９及び配列番号２０並びに配列番号１１及び配列番号２２から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の組合せ
を含む。
【００８６】
一実施形態では、本明細書において提供される抗体は、
（ａ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号２；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号３；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１２；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１３；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１４；
（ｂ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号４；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号５；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１５；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１６；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１７；
（ｃ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号８；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号９；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１８；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１９；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号２０；
（ｄ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１０；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号５；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１８；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号２１；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号２２
を含む。
【００８７】
別の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、
軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１０；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号５；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１８；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号２１；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号２２
を含む。
【００８８】
一実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、１又は２つのアミノ酸配列を含み、各アミノ酸配列は、独立して、以下のリスト：
ａ．軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列：配列番号５９（Ｌ１）、配列番号６０（Ｌ２）、配列番号６１（Ｌ３）、配列番号６２（Ｌ４）及び配列番号６３（Ｌ５）；並びにいずれかの上記の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；及び
ｂ．重鎖可変ドメインのアミノ酸配列：配列番号６４（Ｈ１）、配列番号６５（Ｈ２）、配列番号６６（Ｈ３）、配列番号６７（Ｈ４）及び配列番号６８（Ｈ５）；並びにいずれかの上記の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列
から選択される。
【００８９】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体のポリヌクレオチドコード配列は、１又は２つのポリヌクレオチドコード配列を含み、各ポリヌクレオチドコード配列は、独立して、以下に列挙されるポリヌクレオチド配列：
ａ．軽鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列：配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２及び配列番号７３；並びにいずれかの上記の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチド配列；及び
ｂ．重鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列：配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７及び配列番号７８；並びにいずれかの上記の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチド配列
から選択される。
【００９０】
一実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、以下のリスト：配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６３から独立して選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９１】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、以下のリスト：配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７及び配列番号６８から独立して選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９２】
一実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、以下に列挙される軽鎖及び重鎖可変ドメインのアミノ酸配列：配列番号５９及び配列番号６４（Ｌ１Ｈ１）、配列番号６０及び配列番号６５（Ｌ２Ｈ２）、配列番号６１及び配列番号６６（Ｌ３Ｈ３）、配列番号６２及び配列番号６７（Ｌ４Ｈ４）並びに配列番号６３及び配列番号６８（Ｌ５Ｈ５）から独立して選択されるアミノ酸配列の組合せを含む。
【００９３】
「ＬｘＨｙ」という記号を用いて、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体を示すこともでき、ここで、「ｘ」は、軽鎖可変領域配列コードに対応し、「ｙ」は、重鎖可変領域配列コードに対応する。例えば、Ｌ２Ｈ２は、配列番号６０（Ｌ２）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号６５（Ｈ２）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する完全抗体である。
【００９４】
一実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、１又は２つのアミノ酸配列を含み、各アミノ酸配列は、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列：配列番号７９、配列番号８０及び配列番号８１；及び
ｂ．重鎖定常ドメインのアミノ酸配列：配列番号８２、配列番号８３及び配列番号８４
から選択される。
【００９５】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、独立して、以下に列挙される軽鎖及び重鎖定常ドメインのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列の組合せを含む：配列番号７９及び配列番号８２、配列番号８０及び配列番号８３、配列番号８０及び配列番号８４、配列番号８１及び配列番号８３並びに配列番号８１及び配列番号８４から選択される。
【００９６】
一実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、本明細書に列挙される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ及びＦＲ（フレームワーク）のアミノ酸配列を含む。ＦＲのアミノ酸配列は、軽鎖又は重鎖可変ドメインに含まれ、別個に示されていない。一実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される軽鎖ＣＤＲ１配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される軽鎖ＣＤＲ２配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される軽鎖ＣＤＲ３配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される重鎖ＣＤＲ１配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される重鎖ＣＤＲ２配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される重鎖ＣＤＲ３配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における軽鎖ＦＲ１配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における軽鎖ＦＲ２配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における軽鎖ＦＲ３配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における軽鎖ＦＲ４配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における重鎖ＦＲ１配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における重鎖ＦＲ２配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における重鎖ＦＲ３配列を含む。さらなる実施形態において、抗体は、本明細書における重鎖ＦＲ４配列を含む。
【００９７】
一実施形態において、抗体の軽鎖ＣＤＲ３配列は、６、５、４、３、２又は１つ以下のアミノ酸付加、置換及び／又は欠失は、上に示される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の配列番号１１と異なる。別の実施形態において、抗体の重鎖ＣＤＲ配列は、６、５、４、３、２又は１つ以下のアミノ酸付加、置換及び／又は欠失は、上に示される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の配列番号２２と異なる。さらなる実施形態において、抗体の軽鎖ＣＤＲ３配列は、６、５、４、３、２又は１つ以下のアミノ酸付加、置換及び／又は欠失は、上に示される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の配列番号１１と異なり、抗体の重鎖ＣＤＲ３配列は、６、５、４、３、２又は１つ以下のアミノ酸付加、置換及び／又は欠失は、上に示される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の配列番号２２と異なる。
【００９８】
一実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、本明細書に列挙されるＬ４（配列番号６２）又はＬ５（配列番号６３）軽鎖可変ドメイン配列から選択される軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＡＰＪ抗体の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸の相違は、Ｌ４（配列番号６２）又はＬ５（配列番号６３）の１つの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と異なり、各配列の相違は、独立して、アミノ酸残基の欠失、挿入又は置換である。別の実施形態において、ＡＰＪ抗体の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、Ｌ４（配列番号６２）又はＬ５（配列番号６３）の１つの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ＡＰＪ抗体の軽鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、Ｌ４（配列番号７２）又はＬ５（配列番号７３）の１つのポリヌクレオチドコード配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％同一であるヌクレオチドコード配列を含む。別の実施形態において、ＡＰＪ抗体の軽鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、Ｌ４（配列番号７２）又はＬ５（配列番号７３）の１つの軽鎖可変ドメインの１つの相補的ポリヌクレオチドコード配列と中程度の条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態において、ＡＰＪ抗体の軽鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、Ｌ４（配列番号７２）又はＬ５（配列番号７３）の１つの軽鎖可変ドメインの相補的ポリヌクレオチドコード配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。
【００９９】
一実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、本明細書に列挙されるＨ４（配列番号６７）又はＨ５（配列番号６８）重鎖可変ドメイン配列から選択される重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ＡＰＪ抗体の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸は、Ｈ４（配列番号６７）又はＨ５（配列番号６８）の１つの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列と異なり、各配列の相違は、独立して、１つのアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換である。別の実施形態において、ＡＰＪ抗体の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、Ｈ４（配列番号６７）又はＨ５（配列番号６８）の１つの重鎖可変ドメイン配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ＡＰＪ抗体の重鎖可変ドメインは、Ｈ４（配列番号７７）又はＨ５（配列番号７８）の１つの重鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％同一であるポリヌクレオチドコード配列を含む。別の実施形態において、ＡＰＪ抗体重鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、Ｈ４（配列番号７７）又はＨ５（配列番号７８）の１つの重鎖可変ドメインの相補的ポリヌクレオチドコード配列と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、ＡＰＪ抗体重鎖可変ドメインのポリヌクレオチドコード配列は、Ｈ４（配列番号７７）又はＨ５（配列番号７８）の１つの重鎖可変ドメインの相補的ポリヌクレオチドコード配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。
【０１００】
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、Ｌ１Ｈ１（配列番号５９及び配列番号６４）、Ｌ２Ｈ２（配列番号６０及び配列番号６５）、Ｌ３Ｈ３（配列番号６１及び配列番号６６）、Ｌ４Ｈ４（配列番号６２及び配列番号６７）又はＬ５Ｈ５（配列番号６３及び配列番号６８）又はその所望の表現型（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＥ若しくはＩｇＤ）又はそのＦａｂ若しくはＦ（ａｂ’）２フラグメントの組合せを含む抗体である。
【０１０１】
一実施形態では、本明細書において提供される抗体は、Ｌ４Ｈ４（配列番号６２及び配列番号６７）若しくはＬ５Ｈ５（配列番号６３及び配列番号６８）の組合せ、又はそれらの交換アイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＥ若しくはＩｇＤ）、又はそれらのＦａｂ若しくはＦ（ａｂ’）２フラグメントの組合せを含む抗体である。
【０１０２】
本明細書において提供される抗体は、当技術分野において公知の定常領域のいずれかを含み得る。軽鎖定常領域は、例えば、κ又はλ軽鎖定常領域、例えばマウスκ又はλ軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域は、例えば、α、δ、ε、γ又はμ重鎖定常領域、例えばマウスα、δ、ε、γ又はμ重鎖定常領域であり得る。一実施形態において、軽鎖又は重鎖定常領域は、天然定常領域のフラグメント、誘導体、変異体又は突然変異体である。
【０１０３】
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、ヒト軽鎖κ定常ドメイン又はそのフラグメントをさらに含む。軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ヒト軽鎖κ定常ドメインのアミノ酸配列：（配列番号８０）；及び
ヒト軽鎖λ定常ドメインのアミノ酸配列：（配列番号８１）。
【０１０４】
別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、ヒト重鎖重鎖又はそのフラグメントをさらに含む。重鎖定常ドメインのアミノ酸配列は、以下のとおりに提供される：
ヒト重鎖定常ドメインのアミノ酸配列（ｈＩｇＧ２）：（配列番号８３）、及び
ヒト重鎖定常ドメインのアミノ酸配列（ｈＩｇＧ４）：（配列番号８４）。
【０１０５】
一実施形態では、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列は、以下のとおりである：配列番号１５７及び配列番号１５８。
【０１０６】
一実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、マウス由来抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、抗原結合抗体フラグメント、一本鎖抗体、二本鎖抗体、三本鎖抗体、四本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）ｘフラグメント、構造ドメイン抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体又はＩｇＧ４抗体から選択される。
【０１０７】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、ＡＰＪモノクローナル抗体である。
【０１０８】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、以下のリスト：配列番号５９及び配列番号６４、配列番号６０及び配列番号６５、配列番号６１及び配列番号６６、配列番号６７及び配列番号６３並びに配列番号６３及び配列番号６８から選択されるアミノ酸配列の組合せを含むモノクローナル抗体である。
【０１０９】
一実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、マウスＡＰＪ抗体である。別の実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体は、ヒト化ＡＰＪ抗体である。
【０１１０】
一実施形態において、本明細書において提供されるＡＰＪ抗体のＫｄ値は、約１ｎＭ〜２００ｎＭ又は約１ｎＭ〜１００ｎＭである。
【０１１１】
抗体及び抗体フラグメント
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、完全長抗体（完全長重鎖及び／又は軽鎖を有するポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含む）である。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、抗体フラグメント、例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆｃ又はＦｄフラグメントであり、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、二本鎖抗体、三本鎖抗体、四本鎖抗体、ｖ−ＮＡＲ又はビス−ｓｃＦｖに組み込まれ得る（例えば、（非特許文献２４）を参照されたい）。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、フィブロネクチンポリペプチド単一特異性抗体を含む、（特許文献８）に開示されるものなどの抗体ポリペプチドも含む。別の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、一本鎖ポリペプチドである、（特許文献９）に開示される他の抗体ポリペプチドも含む。
【０１１２】
一実施形態において、ハイブリドーマ中の該当するモノクローナル抗体を発現するＩｇＧ遺伝子の可変領域は、ヌクレオチドプライマーを用いて増幅される。これらのプライマーは、当業者によって合成され得るか、又は中でも特にＶＨａ、ＶＨｂ、ＶＨｃ、ＶＨｄ、ＣＨ１、ＶＬ及びＣＬ領域のためのプライマーを含む、マウス及びヒト可変領域のためのプライマーを合成する市販業者から購入され得る。これらのプライマーは、それぞれＩＭＭＵＮＯＺＡＰ（商標）Ｈ又はＩＭＭＵＮＯＺＡＰ（商標）Ｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのベクターに後に挿入され得る重鎖又は軽鎖可変領域を増幅するのに使用され得る。次に、これらのベクターは、発現のために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母又は哺乳動物に基づく系に導入され得る。ＶＨ及びＶＬ領域の融合を含む大量の一本鎖タンパク質は、これらの方法を用いて産生され得る（（非特許文献１５）を参照されたい）。
【０１１３】
抗体などの特定のタンパク質は、様々な翻訳後修飾を受けることができることが当業者によって理解されるべきである。これらの修飾のタイプ及び程度は、タンパク質を発現するのに使用される宿主細胞系並びに培養条件に左右されることが多い。このような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペリジン形成、アスパラギン酸塩異性化及びアスパラギン脱アミド化の変化を含み得る。カルボキシペプチダーゼの高頻度の修飾により、カルボキシル末端塩基性残基（リジン又はアルギニンなど）が失われ得る（（非特許文献２５）に記載されるように）。
【０１１４】
マウスモノクローナル抗体の産生のための一般的な方法は、ハイブリドーマ細胞による。モノクローナル抗体は、様々な確立した技術によって単離及び精製され得る。このような単離技術としては、プロテイン−Ａセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる（例えば、（非特許文献２６）；（非特許文献２７）を参照されたい）。モノクローナル抗体は、抗体の特定の特性（例えば、重鎖又は軽鎖アイソタイプ、結合特異性など）に基づいて選択される適切なリガンドを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。固体担体上に固定される好適なリガンドの例としては、プロテインＡ、プロテインＧ、抗定常領域（軽鎖又は重鎖）抗体、抗イディオタイプ抗体及びＴＧＦ−β結合タンパク質又はそのフラグメント若しくは変異体が挙げられる。
【０１１５】
（非特許文献２８）によって記載されるように、抗体結合部位の中心における相補性決定領域（ＣＤＲ）の分子進化も、増加した親和性を有する抗体、例えばｃ−ｅｒｂＢ−２に対する増加した親和性を有する抗体を単離するのに使用されている。したがって、このような技術は、ヒトＡＰＪに対する抗体を調製するのに有用である。
【０１１６】
ヒトＡＰＪに対する抗体は、例えば、インビトロ又はインビボのいずれかで、ＡＰＪの存在を検出するアッセイにおいて使用され得る。
【０１１７】
抗体は、従来の技術のいずれかによっても調製され得る。例えば、抗体は、それらを天然で発現する細胞から精製され得るか（例えば、抗体は、それを産生するハイブリドーマから精製され得る）又はこの分野において公知の任意の技術を用いて組み換え発現系において産生され得る。例えば、（非特許文献２９）；及び（非特許文献３０）。これは、以下の核酸の節において説明されている。
【０１１８】
抗体は、任意の公知の技術によって調製され、所望の特性についてスクリーニングされ得る。いくつかの技術は、関連する抗体（例えば、抗ＡＰＪ抗体）のポリペプチド鎖（又はその部分）をコードする核酸の単離及び核酸の操作に関連する。核酸は、別の関連する核酸と融合されるか、又は１つ又は複数のアミノ酸残基を付加、削除又は置換するための組み換えＤＮＡ技術（例えば、誘発突然変異又は他の従来の技術）によって修飾され得る。
【０１１９】
上述されるＣＤＲの１つ又は複数を含有する本発明に係る抗体の親和性を向上させることが必要とされる場合、このような抗体は、ＣＤＲの維持（非特許文献３１）、鎖シャッフリング（非特許文献３２）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異株の使用（非特許文献３３）、ＤＮＡシャッフリング（非特許文献３４）、ファージディスプレイ（非特許文献３５）及びさらなるＰＣＲ技術（非特許文献３６）を含む、いくつかの親和性成熟プロトコルによって得られる。親和性成熟のこれらの方法の全ては、（非特許文献３７）に記載されている。
【０１２０】
一実施形態において、ＡＰＪ抗体のフラグメントは、本明細書において提供される。このようなフラグメントは、全体的に、抗体に由来する配列又はさらなる配列を含み得る。抗原結合フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体及びドメイン抗体が挙げられる。他の例は、（非特許文献３８）において提供されている。
【０１２１】
一本鎖抗体は、単一ポリペプチド鎖を生じるように、アミノ酸架橋（短ペプチドリンカー）によって重鎖及び軽鎖可変ドメイン（Ｆｖ領域）フラグメントを連結することによって形成され得る。このような一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２つの可変ドメインポリペプチド（ＶＬ及びＶＨ）をコードするＤＮＡ間のペプチドリンカーをコードする融合ＤＮＡによって調製されている。得られるポリペプチドは、それ自体で折り畳まれて、抗原結合モノマーを形成し得るか、又はそれらは、２つの可変ドメイン間のフレキシブルリンカーの長さに応じて、多量体（例えば、二量体、三量体又は四量体）を形成し得る（非特許文献３９；非特許文献４０）。様々なＶＬ及びＶＨ含有ポリペプチドを組み合わせることにより、様々なエピトープに結合する多量体ｓｃＦｖが形成され得る（非特許文献４１）。一本鎖抗体の産生のために開発された技術としては、（特許文献１０）；（非特許文献４２）；（非特許文献４３）；（非特許文献４４）；（非特許文献４５）に記載されるものが挙げられる。限定はされないが、可変ドメイン組合せＬ１Ｈ１を含むｓｃＦｖを含む、本明細書において提供される抗体に由来する一本鎖抗体が本発明によって包含される。
【０１２２】
１つの抗体に由来する抗原結合フラグメントは、従来の方法に従い、例えば抗体のタンパク質分解的加水分解、例えば全抗体のペプシン又はパパイン消化によっても得られる。例として、抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれるＳＳフラグメントを生じる、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって生成され得る。このフラグメントは、チオール還元剤を用いてさらに切断されて、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価フラグメントを生じ得る。任意選択的に、切断反応は、ジスルフィド結合の切断をもたらすスルフヒドリル基のブロッキング基を用いて行われ得る。代替例として、パパインを用いた酵素的切断により、２つの一価Ｆａｂフラグメント及びＦｃフラグメントを直接生成する。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇらの（特許文献１１）、（非特許文献４６）；（非特許文献４７）；（非特許文献４８）；及び（非特許文献４９）によって記載されている。重鎖を分離して一価軽鎖−重鎖フラグメント（Ｆｄ）を形成するなど、抗体を切断するための他の方法、フラグメントの他の切断又は他の酵素的、化学的若しくは遺伝子学的技術も、フラグメントがインタクトな抗体によって認識される抗原に結合する限り使用され得る。
【０１２３】
抗体フラグメントの別の形態は、抗体の１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドである。ＣＤＲは、ＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを構築することによって得られる。このようなポリヌクレオチドは、例えば、鋳型として抗体産生細胞のｍＲＮＡを用いて可変領域を合成するポリメラーゼ連鎖反応を用いることによって調製される（例えば、（非特許文献５０）；（非特許文献５１）；及び（非特許文献５２）を参照されたい）。抗体フラグメントは、本明細書に記載される抗体の少なくとも１つの可変領域ドメインをさらに含み得る。したがって、例えば、Ｖ領域ドメインは、モノマー及びＶＨ又はＶＬドメインであり得、これは、後述されるように１×１０−７Ｍ以上の親和性でＡＰＪに結合し得る。
【０１２４】
可変領域ドメインは、任意の天然可変ドメイン又はその操作された形態であり得る。操作された形態とは、組み換えＤＮＡ操作技術を用いて生成された可変領域ドメインを意味する。このような操作された形態は、例えば、特定の抗体のアミノ酸配列における又はそれに対する挿入、欠失又は変化により、特定の抗体可変領域から生成されるものを含む。具体的な例は、第１の抗体からの少なくとも１つのＣＤＲ及び任意選択的に１つ又は複数のフレームワークアミノ酸を含有する操作された可変領域ドメイン及び第２の抗体からの可変領域ドメインの残りの部分を含む。
【０１２５】
可変領域ドメインは、Ｃ末端アミノ酸において、少なくとも１つの他の抗体ドメイン又はそのフラグメントに共有結合され得る。したがって、例えば、可変領域ドメイン中に存在するＶＨドメインは、免疫グロブリンＣＨ１ドメイン又はそのフラグメントに連結され得る。同様に、ＶＬドメインは、ＣＫドメイン又はそのフラグメントに連結され得る。このように、例えば、抗体は、Ｆａｂフラグメントであり得、ここで、抗原結合ドメインは、それらのＣ末端において、それぞれＣＨ１及びＣκドメインに共有結合的に連結される関連するＶＨ及びＶＬドメインを含有する。ＣＨ１ドメインは、さらなるアミノ酸で拡張されて、例えばＦａｂ’フラグメントに見られるようなヒンジ領域又はヒンジ領域ドメインの部分を生じるか、又は抗体ＣＨ２及びＣＨ３ドメインなどのさらなるドメインを生じ得る。
【０１２６】
抗体の誘導体及び変異体
Ｌ１及びＨ１のヌクレオチド配列は、例えば、ランダム突然変異誘発によって又は部位特異的突然変異誘発（例えば、オリゴヌクレオチド特異的部位特異的突然変異）によって改変されて、非突然変異ポリヌクレオチドと比較して、１つ又は複数の特定のヌクレオチド置換、欠失又は挿入を含む改変ポリヌクレオチドを生成し得る。このような改変を行うための技術の例は、（非特許文献５３）；（非特許文献５４）；（非特許文献５５）；（非特許文献５６）；並びに（特許文献１２）及び（特許文献１３）に記載されている。これらの及び他の方法は、非誘導体化抗体と比較して、所望の特性、例えばＡＰＪに対する親和性、アビディティ若しくは特異性又はインビボ若しくはインビトロ安定性の向上又は生体内副作用の減少を有する、例えばＡＰＪ抗体の誘導体を作製するのに使用され得る。
【０１２７】
本発明の範囲内の抗ＡＰＪ受容体抗体の他の誘導体は、抗ＡＰＪ抗体ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合された異種ポリペプチドを含む組み換え融合タンパク質の発現などにより、他のタンパク質又はポリペプチドと共に、抗ＡＰＪ受容体抗体又はそのフラグメントの共有結合的又は凝集性コンジュゲートを含む。例えば、共役ペプチドは、異種シグナル（又はリーダー）ポリペプチド、例えば酵母α−因子リーダー又はエピトープタグなどのペプチドであり得る。融合タンパク質を含有する抗体は、抗原結合タンパク質（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）の精製又は同定を促進するために加えられるペプチドを含み得る。抗体は、（非特許文献５７）及び（特許文献１４）に記載されるように、ＦＬＡＧペプチドにも連結され得る。ＦＬＡＧペプチドは、高度に抗原性であり、特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって可逆的に結合されるエピトープを提供し、発現された組み換えタンパク質の迅速なアッセイ及び容易な精製を可能にする。ＦＬＡＧペプチドが所与のポリペプチドに融合された融合タンパク質を調製するのに有用な試薬は市販されている（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）。別の実施形態において、１つ又は複数の抗体を含有するオリゴマーは、ＡＰＪ受容体アンタゴニストとして用いられ得る。オリゴマーは、共有結合的に連結された又は非共有結合的に連結された二量体、三量体又はより高次のオリゴマーの形態であり得る。２つ以上の抗体を含むオリゴマーの使用が想定され、一例はホモ二量体である。他のオリゴマーとしては、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体などが挙げられる。
【０１２８】
一実施形態は、抗体に融合されたペプチド部分間の共有結合的又は非共有結合的相互作用を通して結合された複数の抗体を含むオリゴマーに関する。このようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサ）又はオリゴマー形成を促進する特性を有するペプチドであり得る。ロイシンジッパー及び抗体に由来する特定のポリペプチドは、以下により詳細に記載されるように、それに結合された抗体のオリゴマー形成を促進し得るペプチドである。
【０１２９】
特定の実施形態において、オリゴマーは、２〜４つの抗体を含む。オリゴマーの抗体は、上述される形態のいずれか、例えば変異体又はフラグメントなどの任意の形態であり得る。好ましくは、オリゴマーは、ＡＰＪ結合活性を有する抗体を含む。
【０１３０】
一実施形態において、オリゴマーは、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを用いて調製される。抗体由来ポリペプチドの様々な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合された特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、（非特許文献５８）；（非特許文献５９）；及び（非特許文献６０）によって記載されている。本明細書において提供される一実施形態は、抗ＡＰＪ抗体のＥｌａｂｅｌａフラグメントを抗体のＦｃ領域に融合することによって生成された２つの融合タンパク質を含む二量体に関する。二量体は、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合を適切な発現ベクターに挿入し、組み換え発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞において遺伝子融合を発現させ、発現された融合タンパク質によく類似した抗体分子を組み立てさせることによって作製され得、その直後に、鎖間ジスルフィド結合がＦｃ部分間に形成されて、二量体が得られる。
【０１３１】
本明細書において使用される際の「Ｆｃポリペプチド」という用語は、抗体のＦｃ領域に由来するポリペプチドの天然及び突然変異タンパク質形態を含む。二量化を促進するヒンジ領域を含有するこのようなポリペプチドの切断形態も含まれる。Ｆｃ部分（及びそれから形成されたオリゴマー）を含む融合タンパク質は、プロテインＡ又はプロテインＧカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製の利点を提供する。
【０１３２】
（特許文献１５）（参照により本明細書に援用される）に記載される１つの好適なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＮ末端ヒンジ領域からＦｃ領域の天然Ｃ末端まで伸びる一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、（特許文献１６）及び（非特許文献６１）に記載されるＦｃ突然変異タンパク質である。この突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化されており、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化されており、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化されていることを除いて、（特許文献１５）に示される天然Ｆｃ配列のものと同一である。突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対する低下した親和性を示す。他の実施形態において、ＡＰＪ抗体の重鎖及び／又は軽鎖の可変部分は、抗体重鎖及び／又は軽鎖の可変部分と置換され得る。
【０１３３】
代わりに、オリゴマーは、ペプチドリンカー（スペーサペプチド）を伴うか又は伴わずに複数の抗体を含む融合タンパク質である。好適なペプチドリンカーの中には、（特許文献１７）及び（特許文献１８）に記載されるものがある。
【０１３４】
オリゴマー抗体を調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を含む。ロイシンジッパードメインは、それらが見られるタンパク質のオリゴマー形成を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、元々、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定され（非特許文献６２）、それ以来、様々な異なるタンパク質において見出されている。公知のロイシンジッパーの中には、二量化又は三量化する天然ペプチド及びその誘導体がある。可溶性オリゴマータンパク質を産生するのに好適なロイシンジッパードメインの例は、（特許文献１９）に記載され、肺表面活性剤タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーは、（非特許文献６３）（参照により本明細書に援用される）に記載される。それに融合された異種タンパク質の安定した三量化を可能にする修飾ロイシンジッパーの使用は、（非特許文献６４）に記載される。一方法において、ロイシンジッパーペプチドに融合された抗ＡＰＪ抗体フラグメント又は誘導体を含む組み換え融合タンパク質は、好適な宿主細胞において発現され、形成された可溶性オリゴマー抗ＡＰＪ抗体フラグメント又は誘導体は、培養上清から回収される。
【０１３５】
別の実施形態において、抗体誘導体は、本明細書に開示されるＣＤＲの少なくとも１つを含み得る。例えば、１つ又は複数のＣＤＲは、公知の抗体フレームワーク領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）に組み込まれるか、又はその半減期を増加させるために好適なビヒクルに共役され得る。好適なビヒクルとしては、限定はされないが、Ｆｃ、アルブミン、トランスフェリンなどが挙げられる。これらの及び他の好適なビヒクルは、この分野において公知である。このような共役ＣＤＲペプチドは、モノマー、二量体、四量体又は他の形態であり得る。一実施形態において、１つ又は複数の水溶性ポリマーは、１つ又は複数の特定の位置、例えば結合剤のアミノ末端で結合される。一例において、抗体誘導体は、限定はされないが、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール又はポリプロピレングリコールを含む、１つ又は複数の水溶性ポリマー結合を含む。例えば、（特許文献２０）、（特許文献２１）、（特許文献２２）、（特許文献２３）、（特許文献２４）及び（特許文献２５）を参照されたい。特定の実施形態において、誘導体は、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース又は他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）及びポリビニルアルコール並びにこのようなポリマーの混合物の１つ又は複数を含む。特定の実施形態において、１つ又は複数の水溶性ポリマーは、１つ又は複数の側鎖にランダムに結合される。特定の実施形態において、ＰＥＧは、抗体などの結合剤の治療的能力を向上させるように働き得る。いくつかのこのような方法は、例えば、任意の目的のために参照により本明細書に援用される（特許文献２６）において説明されている。
【０１３６】
抗体が結合特異性を保持する限り、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する抗体が本明細書において提供される。したがって、抗体構造への修飾が本発明の範囲内に包含される。これらは、抗体のヒトＡＰＪ結合能を破壊しない、保存的又は非保存的であり得るアミノ酸置換を含み得る。保存的アミノ酸置換は、生物系における合成ではなく化学的ペプチド合成によって典型的に組み込まれる非天然アミノ酸残基を包含し得る。これは、ペプチド模倣体及びアミノ酸部分の他の逆又は反転形態を含む。保存的アミノ酸置換は、その位置においてアミノ酸残基の極性又は電荷に対する影響がほとんど又は全くないように、標準的残基による天然アミノ酸残基の置換も含み得る。非保存的置換は、アミノ酸又はアミノ酸模倣体のあるクラスのメンバーを、異なる物理的特性（例えば、サイズ、極性、疎水性、電荷）を有する別のクラスからのメンバーと交換することを含み得る。
【０１３７】
さらに、当業者は、各所望のアミノ酸残基において単一のアミノ酸置換を含む、試験される変異体を生成し得る。次に、変異体は、当業者に公知の活性アッセイを用いてスクリーニングされ得る。このような変異体は、好適な変異体についての情報を収集するのに使用され得る。例えば、特定のアミノ酸残基への変化が、破壊された、望ましくないほど低下した又は不適切な活性をもたらすことが発見された場合、このような変化を有する変異体は、回避され得る。言い換えると、このような日常的な実験から収集される情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が単独で又は他の突然変異と組み合わせて回避されるべきであるアミノ酸を容易に決定することができる。
【０１３８】
特定の実施形態では、当業者は、周知の技術を用いて、本明細書に記載されるポリペプチドの好適な変異体を決定することができる。特定の実施形態において、当業者は、活性にとって重要でない領域を標的にすることにより、活性を破壊せずに変化され得る分子の好適な領域を特定し得る。特定の実施形態において、類似のポリペプチドの中で、残基及び保存される分子の部分を特定することができる。特定の実施形態において、生物学的活性又は構造にとって重要であり得る領域でも、生物学的活性を破壊せずに又はポリペプチド構造に悪影響を与えずに保存的アミノ酸置換に供され得る。さらに、当業者は、活性又は構造にとって重要である、類似のポリペプチドにおける残基を特定する構造−機能試験を検討することができる。このような比較を考慮して、類似のタンパク質における活性又は構造にとって重要であるアミノ酸残基に対応する、タンパク質におけるアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、このような予測される重要なアミノ酸残基の代わりに化学的に類似したアミノ酸置換を選択し得る。
【０１３９】
特定の実施形態では、当業者は、類似のポリペプチドにおける該当する構造に関連する三次元構造及びアミノ酸配列を分析することもできる。このような情報を考慮して、当業者は、その三次元構造に関して抗体のアミノ酸残基のアライメントを予測し得る。特定の実施形態において、当業者は、タンパク質の表面にあることが予測されるアミノ酸残基に根本的な変更を行わないことを選択し得、これは、このような残基が他の分子との重要な相互作用に関与し得るためである。いくつかの科学刊行物が二次構造の予測をテーマにしている。（非特許文献６５）；（非特許文献６６）；（非特許文献６７）；（非特許文献６８）；（非特許文献６９）及び（非特許文献７０）を参照されたい。さらに、二次構造を予測するのを支援するコンピュータプログラムが現在入手可能である。例えば、３０％超の配列同一性又は４０％超の類似性を有する２つのポリペプチド又はタンパク質は、類似の構造トポロジーを有することが多い。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の成長は、ポリペプチド又はタンパク質の構造内の折り畳みの潜在的な数を含む、二次構造の向上した予測可能性を提供した。（非特許文献７１）を参照されたい。所与のポリペプチド又はタンパク質中に限られた数の折り畳みがあること及び臨界数の構造が決定された後、構造予測が有意に正確になることが示唆されている（非特許文献７２）。
【０１４０】
二次構造を予測するさらなる方法としては、「スレッディング」（非特許文献７３；非特許文献７４）、「プロファイル分析」（非特許文献７５；非特許文献７６；非特許文献７７）及び「進化学的関連性」（（非特許文献７１）及び（非特許文献７２）を参照されたい）が挙げられる。特定の実施形態において、抗体の変異体は、グリコシル化変異体を含み、ここで、グリコシル化部位の数及び／又はタイプが親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して改変されている。特定の実施形態において、変異体は、天然タンパク質より多い又は少ない数のＮ−結合グリコシル化部位を含む。代わりに、置換によるこのような配列の除去は、存在するＮ−結合炭水化物鎖を除去する。Ｎ−結合炭水化物鎖の再配列も提供され、ここで、１つ又は複数のＮ−結合グリコシル化部位（典型的に、天然に存在するもの）が削除され、１つ又は複数の新しいＮ−結合部位が生成される。さらなる好ましい抗体変異体は、システイン変異体を含み、ここで、１つ又は複数のシステイン残基は、親アミノ酸配列と比較して、欠失されるか又は別のアミノ酸（例えば、セリン）と置換される。システイン変異体は、抗体が、例えば不溶性封入体の単離後、生物学的に活性な立体配座に再度折り畳まれなければならない場合に有用であり得る。システイン変異体は、一般に、天然タンパク質より少ないシステイン残基を有し、典型的に、不対システインから生じる相互作用を最小限に抑えるために偶数を有する。
【０１４１】
（保存的又は非保存的にかかわらず）所望のアミノ酸置換は、このような置換が所望されるときに当業者によって決定され得る。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、ヒトＡＰＪに対する抗体の重要な残基を同定するため又は本明細書に記載されるヒトＡＰＪに対する抗体の親和性を増大若しくは低下させるために使用され得る。
【０１４２】
特定の実施形態によれば、好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させ、（２）酸化に対する感受性を低下させ、（３）タンパク質複合体を形成するように結合親和性を改変し、（４）結合親和性を改変し、且つ／又は（５）このようなポリペプチドにおける他の物理化学的又は機能的特性を与えるか又は調節するものである。特定の実施形態によれば、単一又は複数のアミノ酸置換（特定の実施形態において、保存的アミノ酸置換）は、天然配列中で行われ得る（特定の実施形態において、分子間接触を形成するドメインの外部のポリペプチドの部分において）。特定の実施形態において、保存的アミノ酸置換は、典型的に、親配列の構造的特徴を実質的に変更することができない（例えば、置換アミノ酸は、親配列に存在するヘリックスを破壊すべきでなく、又は親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破壊すべきでない）。この分野において認識されているポリペプチドの二次及び三次構造の例は、（非特許文献７８）；（非特許文献７９）；及び（非特許文献８０）に記載され、これらのそれぞれは、参照により本明細書に援用される。
【０１４３】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、ポリマー、脂質又は他の部分と化学結合され得る。
【０１４４】
抗原結合剤は、生体適合性フレームワーク構造に組み込まれる本明細書に記載されるＣＤＲの少なくとも１つを含み得る。一実施形態において、生体適合性フレームワーク構造は、局在化した表面領域における抗原（例えば、ＣＤＲ、可変領域など）に結合するアミノ酸の１つ又は複数の配列を提示することができる、立体配座的に安定した構造的支持体、又はフレームワーク、又は足場を形成するのに十分なポリペプチド又はその部分を含む。このような構造は、天然ポリペプチド又はポリペプチド「折り畳み」（構造モチーフ）であり得るか、又は天然ポリペプチド又は折り畳みと比べて、アミノ酸の付加、欠失又は置換などの１つ又は複数の修飾を有し得る。これらの足場は、ヒト、他の哺乳動物、他の脊椎動物、無脊椎動物、植物、細菌又はウイルスなどの任意の種の（又は２つ以上の種の）ポリペプチドに由来し得る。
【０１４５】
典型的に、生体適合性フレームワーク構造は、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質足場又は骨格に基づいている。例えば、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルジノスタチン、シトクロムｂ、ＣＰ１ジンクフィンガー、ＰＳＴ１、コイルドコイル、ＬＡＣＩ−Ｄ１、Ｚドメイン及びテンダミスタットドメインに基づくものが使用され得る（例えば、（非特許文献８１）を参照されたい）。
【０１４６】
さらに、当業者は、好適な結合剤が、本明細書に具体的に開示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の１つ又は複数など、これらの抗体の部分を含むことを認識する。重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の領域の少なくとも１つは、抗体が非置換ＣＤＲの結合特異性を保持する限り、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得る。抗体の非ＣＤＲ部分は、非タンパク分子であり得、ここで、結合剤は、ヒトＡＰＪに対する本明細書に開示される抗体の結合をクロスブロックする。抗体の非ＣＤＲ部分は、非タンパク分子であり得、ここで、抗体は、競合結合アッセイにおいてヒトＥｌａｂｅｌａペプチドへの、抗体Ｌ４Ｈ４によって示されるものと類似の結合パターンを示す。抗体の非ＣＤＲ部分は、アミノ酸から構成され得、ここで、抗体は、組み換え結合タンパク質又は合成ペプチドであり、組み換え結合タンパク質は、ヒトＡＰＪへの本明細書に開示される抗体の結合をクロスブロックする。抗体の非ＣＤＲ部分は、アミノ酸から構成され得、ここで、抗体は、組み換え抗体であり、組み換え抗体は、競合結合アッセイにおいてヒトＡＰＪペプチドへの、抗体Ｌ４Ｈ４の少なくとも１つによって示されるものと類似の結合パターンを示す。
【０１４７】
ＡＰＪ抗体及びＥｌａｂｅｌａの融合タンパク質（Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質）
一実施形態では、ＡＰＪに特異的に結合する抗体及びＥｌａｂｅｌａフラグメントを含むＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質が本明細書において提供される。
【０１４８】
別の実施形態では、ＡＰＪに特異的に結合する抗体と、１、２、３、４、５、６、７又は８つのＥｌａｂｅｌａフラグメントと、ペプチドリンカー（リンカー）とを含むＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質が本明細書において提供され；融合タンパク質は、ペプチドリンカー配列（リンカー）を通して、１つのＥｌａｂｅｌａフラグメントであって、各Ｅｌａｂｅｌａフラグメントは、独立して、順Ｅｌａｂｅｌａフラグメント又は突然変異体である、ＥｌａｂｅｌａフラグメントのＮ末端を１つのＡＰＪ抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端に結合するか；又は融合タンパク質は、１つのＥｌａｂｅｌａフラグメントであって、各Ｅｌａｂｅｌａフラグメントは、独立して、逆Ｅｌａｂｅｌａフラグメント又は突然変異体である、ＥｌａｂｅｌａフラグメントのＣ末端を１つのＡＰＪ抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端に結合する。
【０１４９】
別の実施形態では、ＡＰＪに特異的に結合する抗体と、１、２、３又は４つのＥｌａｂｅｌａフラグメントと、ペプチドリンカー（リンカー）とを含むＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質が本明細書において提供され；融合タンパク質は、ペプチドリンカー配列（リンカー）を通して、１つのＥｌａｂｅｌａフラグメントであって、各Ｅｌａｂｅｌａフラグメントは、独立して、順Ｅｌａｂｅｌａフラグメント又は突然変異体である、１つのＥｌａｂｅｌａフラグメントのＮ末端を１つのＡＰＪ抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端に結合する。
【０１５０】
別の実施形態では、ＡＰＪに特異的に結合する抗体と、１、２、３又は４つのＥｌａｂｅｌａフラグメントと、ペプチドリンカー（リンカー）とを含むＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質が本明細書において提供され；融合タンパク質は、ペプチドリンカー配列（リンカー）を通して、１つのＥｌａｂｅｌａフラグメントであって、各Ｅｌａｂｅｌａフラグメントは、独立して、逆Ｅｌａｂｅｌａフラグメント又は突然変異体である、１つのＥｌａｂｅｌａフラグメントのＣ末端を１つのＡＰＪ抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端に結合する。
【０１５１】
別の実施形態では、ＡＰＪに特異的に結合する抗体と、２つのＥｌａｂｅｌａフラグメントと、ペプチドリンカー（リンカー）とを含むＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質が本明細書において提供され；融合タンパク質は、ペプチドリンカー配列（リンカー）を通して、１つのＥｌａｂｅｌａフラグメントであって、各Ｅｌａｂｅｌａフラグメントは、独立して、順Ｅｌａｂｅｌａフラグメント又は突然変異体である、１つのＥｌａｂｅｌａフラグメントのＮ末端を１つのＡＰＪ抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端に結合する。
【０１５２】
別の実施形態では、ＡＰＪに特異的に結合する抗体と、２つのＥｌａｂｅｌａフラグメントと、ペプチドリンカー（リンカー）とを含むＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質が本明細書において提供され；融合タンパク質は、ペプチドリンカー配列（リンカー）を通して、１つのＥｌａｂｅｌａフラグメントであって、各Ｅｌａｂｅｌａフラグメントは、独立して、逆Ｅｌａｂｅｌａフラグメント又は突然変異体である、１つのＥｌａｂｅｌａフラグメントのＣ末端を１つのＡＰＪ抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端に結合する。
【０１５３】
別の実施形態では、ＡＰＪ抗体と、２つのＥｌａｂｅｌａフラグメントと、ペプチドリンカー（リンカー）とを含むＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質が本明細書において提供され；融合タンパク質は、１つのＥｌａｂｅｌａフラグメントのＮ末端を１つのＡＰＪ抗体軽鎖のＣ末端に結合するか：Ｎ’−Ｒ−リンカー−Ｅｌａｂｅｌａ−Ｃ’；又は１つのＥｌａｂｅｌａフラグメントのＮ末端を１つのＡＰＪ抗体重鎖のＣ末端に結合し：Ｎ’−Ｒ−リンカー−Ｅｌａｂｅｌａ−Ｃ’であり；ここで、Ｎ’は、融合タンパク質ポリペプチド鎖のＮ末端を表し、Ｃ’は、融合タンパク質ポリペプチド鎖のＣ末端を表し、Ｅｌａｂｅｌａは、順Ｅｌａｂｅｌａフラグメント又は突然変異体を表し、Ｒは、ＡＰＪ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ酸配列を表し、及びリンカーは、ペプチドリンカー配列を表す。
【０１５４】
別の実施形態では、ＡＰＪ抗体と、２つのＥｌａｂｅｌａフラグメントと、ペプチドリンカー（リンカー）とを含むＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質が本明細書において提供され；融合タンパク質は、ペプチドリンカー（リンカー）を通して、１つのＥｌａｂｅｌａフラグメントのＣ末端を１つのＡＰＪ抗体軽鎖のＮ末端に結合するか：Ｎ’−Ｅｌａｂｅｌａ−リンカー−Ｒ−Ｃ’；又は１つのＥｌａｂｅｌａフラグメントのＣ末端を１つのＡＰＪ抗体重鎖のＮ末端に結合し：Ｎ’−Ｅｌａｂｅｌａ−リンカー−Ｒ−Ｃ’；ここで、Ｎ’は、融合タンパク質ポリペプチド鎖のＮ末端を表し、Ｃ’は、融合タンパク質ポリペプチド鎖のＣ末端を表し、Ｅｌａｂｅｌａは、逆Ｅｌａｂｅｌａフラグメント又は突然変異体を表し、Ｒは、ＡＰＪ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ酸配列を表し、及びリンカーは、ペプチドリンカー配列を表す。
【０１５５】
別の実施形態では、ＡＰＪ抗体と、２つのＥｌａｂｅｌａフラグメントと、ペプチドリンカー（リンカー）とを含むＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質が本明細書において提供され；融合タンパク質は、ペプチドリンカー（リンカー）を通して、１つのＥｌａｂｅｌａフラグメントのＮ末端を１つのＡＰＪ抗体軽鎖のＣ末端に結合し：Ｎ’−Ｒ−リンカー−Ｅｌａｂｅｌａ−Ｃ’；ここで、Ｎ’は、融合タンパク質ポリペプチド鎖のＮ末端を表し、Ｃ’は、融合タンパク質ポリペプチド鎖のＣ末端を表し、Ｅｌａｂｅｌａは、順Ｅｌａｂｅｌａフラグメント又は突然変異体を表し、Ｒは、ＡＰＪ抗体軽鎖アミノ酸配列を表し、及びリンカーは、ペプチドリンカー配列を表す。
【０１５６】
別の実施形態では、ＡＰＪ抗体と、２つのＥｌａｂｅｌａフラグメントと、ペプチドリンカー（リンカー）とを含むＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質が本明細書において提供され；融合タンパク質は、ペプチドリンカー（リンカー）を通して、１つのＥｌａｂｅｌａフラグメントのＮ末端を１つのＡＰＪ抗体重鎖のＣ末端に結合し：Ｎ’−Ｒ−リンカー−Ｅｌａｂｅｌａ−Ｃ’；ここで、Ｎ’は、融合タンパク質ポリペプチド鎖のＮ末端を表し、Ｃ’は、融合タンパク質ポリペプチド鎖のＣ末端を表し、Ｅｌａｂｅｌａは、順Ｅｌａｂｅｌａフラグメント又は突然変異体を表し、Ｒは、ＡＰＪ抗体重鎖アミノ酸配列を表し、及びリンカーは、ペプチドリンカー配列を表す。
【０１５７】
一実施形態では、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質における順Ｅｌａｂｅｌａフラグメント又はその変異体は、独立して、以下のアミノ酸配列：配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１６６及び配列番号１６７の１つから選択される。
【０１５８】
一実施形態では、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質における順Ｅｌａｂｅｌａフラグメントは、独立して、以下のアミノ酸配列：配列番号９２、配列番号９３、配列番号１０３、配列番号１０７、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１６６及び配列番号１６７の１つから選択される。
【０１５９】
一実施形態では、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質における逆Ｅｌａｂｅｌａフラグメント又はその変異体は、独立して、以下のアミノ酸配列：配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４及び配列番号１５５の１つから選択される。
【０１６０】
一実施形態では、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質におけるペプチドリンカー（リンカー）配列は、独立して、１〜２００アミノ酸残基、２〜１００アミノ酸残基、５〜５０アミノ酸残基、６〜２５アミノ酸残基又は１０〜２０アミノ酸残基を含む。
【０１６１】
別の実施形態では、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質におけるリンカー（リンカー）配列は、独立して、以下のアミノ酸配列：配列番号１２２、配列番号１２３及び配列番号１２４の１つの完全長、一部又は反復アミノ酸配列を含む。
【０１６２】
別の実施形態では、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質におけるリンカー配列は、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：配列番号１２２、配列番号１２３及び配列番号１２４から選択される。
【０１６３】
一実施形態では、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１５８であり、及び重鎖アミノ酸配列は、以下の配列：配列番号１５６、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４及び配列番号１６５の１つである。一実施形態では、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５８及び配列番号１５６である。別の実施形態では、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５８及び配列番号１５９である。別の実施形態では、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５８及び配列番号１６０である。別の実施形態では、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５８及び配列番号１６１である。別の実施形態では、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５８及び配列番号１６２である。別の実施形態では、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５８及び配列番号１６３である。別の実施形態では、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５８及び配列番号１６４である。さらなる実施形態では、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５８及び配列番号１６５である。
【０１６４】
核酸
一態様において、本発明は、単離核酸分子を提供する。核酸は、例えば、Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質の全て又は部分、例えば本発明のＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質又はそのフラグメント、誘導体、突然変異タンパク質若しくは変異体の一方又は両方の鎖をコードするポリヌクレオチド；ハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分なポリヌクレオチド；ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定するか、分析するか、突然変異させるか、又は増幅するためのＰＣＲプライマー又はシーケンシングプライマー；ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸及び上記のものの相補的配列を含む。核酸は、任意の長さであり得る。核酸は、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００又はそれを超えるヌクレオチド長であり得、且つ／又は１つ又は複数のさらなる配列、例えば制御配列を含み得、且つ／又はより大きい核酸、例えばベクターの一部であり得る。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡヌクレオチド及びその人工変異体（例えば、ペプチド核酸）を含み得る。
【０１６５】
抗体ポリペプチド（例えば、重鎖又は軽鎖、可変ドメインのみ又は完全長）をコードする核酸は、ＡＰＪ抗原で免疫付与されたマウスのＢ細胞から単離され得る。抗体又はＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの従来の手順によって単離され得る。
【０１６６】
重鎖及び軽鎖可変領域の可変領域をコードする核酸配列が上に示される。当業者は、遺伝暗号の縮重により、本明細書に開示されるポリペプチド配列のそれぞれが多数の他の核酸配列によってコードされることを理解する。本発明は、本発明の各抗体又はＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質をコードする各縮重ヌクレオチド配列を提供する。
【０１６７】
本発明は、特定のハイブリダイゼーション条件下で他の核酸（例えば、Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質のいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸）にハイブリダイズする核酸をさらに提供する。核酸をハイブリダイズさせるための方法は、この分野において周知である。例えば、（非特許文献８２）を参照されたい。本明細書において定義されるように、例えば、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、約５０％のホルムアミドのハイブリダイゼーション緩衝液、６×ＳＳＣを含有する予洗溶液及び５５℃のハイブリダイゼーション温度（又は４２℃のハイブリダイゼーション温度で、約５０％のホルムアミドを含有するものなどの他の類似のハイブリダイゼーション溶液）及び０．５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で、６０℃の洗浄条件を使用する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４５℃で６×ＳＳＣ中でハイブリダイズし、続いて、６８℃で０．１×ＳＳＣ、０．２％のＳＤＳで１回以上洗浄する。さらに、当業者は、互いに少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸が、典型的に、互いにハイブリダイズされたままであるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増大又は低下させるように、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を操作することができる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基本的パラメータ及び好適な条件を考案するための指針は、例えば、（非特許文献８３）；及び（非特許文献８４）によって記載されており、例えばＤＮＡの長さ及び／又は塩基組成に基づいて当業者によって容易に決定され得る。変化が突然変異によって核酸に導入され得、それにより、それがコードするポリペプチド（例えば、抗体）のアミノ酸配列の変化をもたらす。突然変異は、この分野において公知の任意の技術を用いて導入され得る。一実施形態において、１つ又は複数の特定のアミノ酸残基は、例えば、部位特異的突然変異誘発プロトコルを用いて変化される。別の実施形態において、１つ又は複数のランダムに選択された残基は、例えば、ランダム突然変異誘発プロトコルを用いて変化される。それがどのように作製されても、突然変異ポリペプチドは、発現され、所望の特性についてスクリーニングされ得る。
【０１６８】
突然変異は、それがコードするポリペプチドの生物学的活性をそれほど変更せずに、核酸に導入され得る。例えば、ヌクレオチド置換を行って、非必須アミノ酸残基におけるアミノ酸置換をもたらすことができる。一実施形態において、Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質について本明細書において提供されるヌクレオチド配列又はそのフラグメント、変異体若しくは誘導体は、それらが、２つ以上の異なるアミノ酸残基を有する配列を生じるように、アミノ酸残基の１つ又は複数の欠失又は置換を含む、Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質について本明細書において提供されるアミノ酸配列をコードするように突然変異される。別の実施形態において、突然変異誘発は、２つ以上の異なるアミノ酸残基を有する配列を生じるように、Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質について本明細書に示される１つ又は複数のアミノ酸残基に隣接するアミノ酸を挿入する。代わりに、１つ又は複数の突然変異が核酸に導入され得、この核酸は、それがコードするポリペプチドの生物学的活性（例えば、ＡＰＪへの結合）を選択的に変化させる。例えば、突然変異は、生物学的活性を定量的に又は定性的に変化させ得る。定量的変化の例は、活性を増大させるか、低下させるか又はなくすことを含む。定性的変化の例は、Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質の抗原特異性を変化させることを含む。
【０１６９】
別の態様において、本発明は、本発明の核酸配列の検出のためのプライマー又はハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに好適な核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、本発明の完全長ポリペプチドをコードする核酸配列の一部のみ、例えばプローブ若しくはプライマーとして使用され得るフラグメント又は本発明のポリペプチドの活性部分（例えば、ＡＰＪ結合部分）をコードするフラグメントを含み得る。
【０１７０】
本発明の核酸の配列に基づくプローブを用いて、核酸又は類似の核酸、例えば本発明のポリペプチドをコードする転写産物を検出することができる。プローブは、標識基、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素又は酵素補因子を含み得る。このようなプローブを用いて、ポリペプチドを発現する細胞を同定することができる。
【０１７１】
別の態様において、本明細書において提供されるベクターは、本発明のポリペプチド又はその一部をコードする核酸を含む。ベクターの例としては、限定はされないが、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター及び発現ベクター、例えば組み換え発現ベクターが挙げられる。
【０１７２】
本明細書において提供される組み換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含み得る。組み換え発現ベクターは、発現される核酸配列に操作可能に連結される、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ又は複数の制御配列を含む。制御配列は、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの（例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモータ及びサイトメガロウイルスプロモータ）、特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指令するもの（例えば、組織特異的制御配列、（非特許文献８５）、（非特許文献８６）を参照されたく、これらのそれぞれの開示内容は、全体が参照により本明細書に援用される）及び特定の処理又は条件に応答して、ヌクレオチド配列の誘導性発現を指令するもの（例えば、哺乳類細胞におけるメタロチオニンプロモータ及び原核生物細胞系及び真核生物細胞系の両方におけるｔｅｔ−応答性及び／又はストレプトマイシン応答性プロモータ（同文献を参照されたい）を含む。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどの要因に左右され得ることを当業者は認識する。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それにより、本明細書に記載される核酸によってコードされる融合タンパク質又はペプチドを含む、タンパク質又はペプチドを産生し得る。
【０１７３】
別の態様において、本発明は、本発明の組み換え発現ベクターが導入された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の原核生物細胞又は真核生物細胞であり得る。原核生物宿主細胞は、グラム陰性又はグラム陽性菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はバシラス属（ｂａｃｉｌｌｉ）を含む。より高等な真核細胞は、昆虫細胞、酵母細胞及び哺乳動物由来の樹立細胞系を含む。好適な哺乳動物宿主細胞系の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はＶｅｇｇｉｅ  ＣＨＯなどのそれらの誘導体及び無血清培地中で増殖する関連する細胞系（（非特許文献８７）を参照されたい）又はＤＨＦＲが欠乏したＣＨＯ株ＤＸＢ−１１（（非特許文献８８）を参照されたい）を含む。さらなるＣＨＯ細胞系は、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−６１）、ＥＭ９（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ−１８６１）及びＷ２０（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ−１８６２）を含む。さらなる宿主細胞は、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ−１６５１）（（非特許文献８９）を参照されたい）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１６３）、ＡＭ−１／Ｄ細胞（（特許文献２７）に記載される）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０）細胞系、アフリカミドリザル腎臓細胞系ＣＶ１に由来するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７０）（（非特許文献９０）を参照されたい）、２９３、２９３  ＥＢＮＡ又はＭＳＲ  ２９３などのヒト胚腎臓細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換された霊長類細胞系、正常な２倍体細胞、初代組織、初代移植のインビトロ培養物に由来する細胞株、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫ又はＪｕｒｋａｔ細胞を含む。細菌、真菌、酵母及び哺乳動物細胞宿主と共に使用するための適切なクローニング及び発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓら（非特許文献９１）によって記載されている。
【０１７４】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換又はトランスフェクション技術により、原核生物又は真核生物細胞に導入され得る。哺乳類細胞の安定したトランスフェクションについて、使用される発現ベクター及びトランスフェクション技術に応じて、細胞のごく一部のみが外来性ＤＮＡをそれらのゲノムに組み込み得ることが知られている。これらの成分を同定し、選択するために、（例えば、抗生物質に対する耐性のために）選択可能なマーカーをコードする遺伝子は、一般に、該当する遺伝子と共に宿主細胞に導入される。好ましい選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシン及びメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を与えるものを含む。導入された核酸が安定的にトランスフェクトされた細胞は、他の方法の中でも特に薬剤選択によって同定され得る（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は、生存するが、他の細胞は死亡する）。
【０１７５】
形質転換された細胞は、ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養され得、ポリペプチドは、従来のタンパク質精製手順によって回収される。１つのこのような精製手順が以下の実施例に記載されている。本明細書において使用することが想定されたポリペプチドは、汚染性内因性物質を実質的に含まない実質的に均一な組み換え哺乳動物ＡＰＪ抗体又はＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質ポリペプチドを含む。
【０１７６】
ＡＰＪ抗体の活性
ＡＰＪ抗体の活性は、ＡＰＪに特異的に結合する際の、本明細書において提供される抗体の効果を指す。一実施形態において、本明細書において提供されるマウス又はヒト化抗体は、ヒトＡＰＪ受容体に特異的に結合する。
【０１７７】
一実施形態において、ヒトＡＰＪ受容体に結合する本明細書において提供される抗体のＫｄは、約０．０１ｎＭ〜１０００ｎＭ、０．１ｎＭ〜５００ｎＭ、０．５ｎＭ〜２００ｎＭ、１ｎＭ〜２００ｎＭ又は１０ｎＭ〜１００ｎＭの範囲である。ヒトＡＰＪ受容体に結合する、本明細書において提供される抗体のＫｄは、約１ｎＭ〜２００ｎＭの範囲である。さらに別の実施形態において、ヒトＡＰＪ受容体に結合する、本明細書において提供される抗体のＫｄは、約１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲である。さらに別の実施形態において、ヒトＡＰＪ受容体に結合する、本明細書において提供される抗体のＫｄは、約１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ又は１００ｎＭである。
【０１７８】
一実施形態において、本明細書において提供される抗体は、ヒトＡＰＪ受容体に特異的に結合し、１つ又は複数の以下の特性を有する：
ａ．ヒトＡＰＪ受容体への結合における、参照抗体と比べて実質的に同様の又はより良好なＫｄを提供すること；及び
ｂ．ヒトＡＰＪ受容体に対する参照抗体との交差競合的結合。
【０１７９】
一実施形態において、参照抗体は、軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列の配列番号６２及び重鎖可変ドメインのアミノ酸配列の配列番号６７の組合せを含む。
【０１８０】
本明細書において使用される際、「実質的に同様」という用語は、参照抗体のＫｄと同等であるか、又はその約２００％、１８０％、１６０％、１５０％、１４０％、１２０％、１１０％、１００％、９９％、９８％、９７％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％若しくは５０％であることを意味する。一実施形態において、参照抗体は、軽鎖配列番号６２及び重鎖配列番号６７の組合せを含む。
【０１８１】
ＡＰＪ抗体及びＥｌａｂｅｌａの融合タンパク質の生物学的活性
ＡＰＪ抗体及びＥｌａｂｅｌａの融合タンパク質の生物学的活性は、Ｅｌａｂｅｌａの生物学的活性及びＡＰＪ抗体の活性を含む。ＡＰＪ抗体の活性は、上述されるとおりである。「Ｅｌａｂｅｌａの生物学的活性」は、Ｅｌａｂｅｌａ受容体（例えば、ＡＰＪ）にインビボで結合し、それを活性化し、細胞内ストレス応答を引き起こす、Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質の生物学的活性を指す。細胞ストレス応答は、限定はされないが、心筋収縮力を増強すること、血管を弛緩させること、血圧を低下させ、利尿を減少させること、（制尿ホルモンの放出を減少させること）、下垂体関連ホルモンの免疫応答及び放出を調節することなどを含む。Ｅｌａｂｅｌａ及びＡＰＪ抗体の生物学的活性を組み合わせて、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質は、Ｅｌａｂｅｌａ及びＡＰＪに関連する様々な疾患及び症状を処置するために使用可能である。融合タンパク質は、Ｅｌａｂｅｌａ及び／又はＡＰＪに対して作用することによってその生物学的効果を発揮し、そのため、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質による処置は、疾患又は症状が「Ｅｌａｂｅｌａ刺激を増強すること」から利益を得る対象を処置するために使用可能である。これらの対象は、「Ｅｌａｂｅｌａ刺激療法を必要とする」対象と称される。これらの対象は、急性心不全、慢性心不全、肺高血圧及び肺動脈性高血圧を含み、糖尿病性血管症、心不全、心房細動及び虚血再灌流障害を有する対象をさらに含む。
【０１８２】
一実施形態では、Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質の生物学的活性は、レポーター遺伝子アッセイ測定手法を用いて検出され、インビトロでＡＰＪを活性化する場合のＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の機能が定量化される。
【０１８３】
一実施形態では、Ｅｌａｂｅｌａ／ＡＰＪシグナル伝達経路を活性化する場合の、本明細書において提供される抗体及びＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質のＥＣ５０は、およそ０．１ｎＭ〜１００ｎＭ、０．５ｎＭ〜２０ｎＭ、１ｎＭ〜１０ｎＭ又は１ｎＭ〜５ｎＭの範囲である。
【０１８４】
医薬組成物
一実施形態では、本明細書において提供される医薬組成物は、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質及び１つ又は複数の薬学的に許容できる担体を含む。
【０１８５】
一実施形態では、医薬組成物は、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質並びに以下：Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質に適したｐＨを有する緩衝液、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、低分子量ポリペプチド（例えば、１０未満のアミノ酸を有するポリペプチド）、タンパク質、アミノ酸、糖の例（デキストリンなど）、複合体（例えば、ＥＤＴＡ）、グルタチオン、安定剤及び賦形剤から選択される１つ又は複数の物質を含む。一実施形態では、本明細書において提供される医薬組成物は、保存剤も含み得る。一実施形態では、本明細書において提供される医薬組成物は、希釈剤として適切な賦形剤溶液を用いて、凍結乾燥粉末に調製され得る。薬剤処方において使用可能な成分のさらなる例が（非特許文献９２）に示されている。
【０１８６】
処置の方法
一実施形態において、ＰＡＨを処置、予防又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質又はその医薬組成物を対象に投与することを含む方法が本明細書において提供される。
【０１８７】
別の実施形態において、ＰＨを処置、予防又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質又はその医薬組成物を対象に投与することを含む方法が本明細書において提供される。
【０１８８】
別の実施形態において、心不全を処置、予防又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質又はその医薬組成物を対象に投与することを含む方法が本明細書において提供される。
【０１８９】
別の実施形態において、Ｔ２Ｄ及びその関連メタボリックシンドロームを処置、予防又は改善する方法であって、治療的に有効な投与量の、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質又はその医薬組成物を対象に投与することを含む方法が本明細書において提供される。
【０１９０】
別の実施形態では、肺高血圧、肺動脈性高血圧、２型糖尿病及びその関連メタボリックシンドローム又は心不全の２以上の疾患を処置、予防又は改善する方法であって、治療的に有効な用量の、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質又はその医薬組成物を対象に投与することを含む方法が本明細書において提供される。
【０１９１】
本明細書において提供される使用のいずれか１つにおいて、本明細書において提供される医薬組成物は、静脈内又は皮下注射が意図される。
【０１９２】
Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質の医薬組成物は、例えば、限定はされないが、非経口的に、局所的に又は吸入により、任意の好適な技法により投与され得る。医薬組成物は、注射される場合、例えば関節内、静脈内、筋肉内、病変内、腹腔内又は皮下経路を介した迅速な注射又は連続注入により投与され得る。それは、例えば、疾患又は損傷部位での局在化された投与、例えば経皮投与及び植込錠の徐放と考えられる。吸入による送達は、例えば、経鼻又は経口吸入、噴霧器の使用、エアロゾル形態でのＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の吸入などを含む。他の選択肢として、経口製剤、例えば丸剤、シロップ剤又はロゼンジ剤が挙げられる。
【０１９３】
投与量及び投与の頻度は、投与経路、用いられる具体的なＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質、処置される疾患の性質及び重症度、病態が急性又は慢性であるか及び対象の大きさ及び全身状態などの要因に応じて変化し得る。適切な投与量は、この分野において公知の手順により、例えば用量漸増試験を含み得る臨床試験において決定され得る。
【０１９４】
本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質は、例えば、所定の期間にわたって一定の間隔で例えば１回又は２回以上投与され得る。特定の実施形態において、Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質は、少なくとも１ヶ月又はそれを超える期間で１回、例えば１、２若しくは３ヶ月間にわたって又は無期限に投与される。慢性疾患を処置するために、長期処置が一般に最も有効である。しかしながら、急性疾患を処置するために、例えば１〜６週間のより短い期間にわたる投与で十分であり得る。一般に、Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質は、１つ又は複数の選択された指標についてベースラインに対する医学的に関連する改善の程度が患者に見られるまで投与される。
【０１９５】
ここで提示される処置計画の一例は、２型糖尿病及びその関連メタボリックシンドローム、急性心不全、慢性心不全、肺高血圧又は肺動脈性肺高血圧によって引き起こされる症状を処置するために、適切な投与量で１週間以上につき１回のＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の皮下注入を含む。Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質は、所望の結果が得られるまで、例えば患者の症状が治まるまで、週に１回又は月に１回投与され得る。処置は、必要に応じて再開され得るか又は維持量が投与され得る。
【０１９６】
患者のＢＮＰ又はｐｒｏ−ＢＮＰ濃度及び体重は、患者の圧力の変化を検出するために、Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質による処置前、その間及び／又はその後にモニターされ得る。いくつかの疾患について、ＢＮＰ又はｐｒｏ−ＢＮＰの変化は、疾患の進行などの要因により変化し得る。ＢＮＰ又はｐｒｏ−ＢＮＰ濃度は、公知の技術を用いて決定され得る。
【０１９７】
本明細書における方法及び組成物の特定の実施形態は、例えば、Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質及び１つ又は複数のＥｌａｂｅｌａアゴニスト、本明細書において提供される２つ以上のＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質又は本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質及び１つ又は複数の他のＥｌａｂｅｌａアゴニストの使用を含む。さらなる実施形態において、Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質は、単独で又は患者が罹患している症状を処置するのに使用される他の薬剤と組み合わせて投与される。これらの薬剤の例は、タンパク性及び非タンパク性薬剤を含む。複数の薬剤が組み合わせて投与される場合、投与量は、この分野において周知であるように、それ相応に調整されるべきである。「併用投与」又は併用療法は、同時投与に限定されず、少なくとも１つの他の治療剤を患者に投与することを含む投与過程の間に抗原及びタンパク質が少なくとも１回投与される処置計画も含む。
【０１９８】
一方、心不全及び肺動脈性肺高血圧並びに関連疾患を処置するための薬剤を調製するための方法であって、薬剤は、上記の疾患の関連疾患の処置のために、本明細書において提供されるＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質及び薬学的に許容できる賦形剤の混合物を含む方法が本明細書において提供される。薬剤の調製方法は、上述されるとおりである。
【０１９９】
ヒトＡＰＪに特異的に結合するＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質に関連する組成物、キット及び方法が本明細書においてさらに提供される。ＡＰＪに結合するポリペプチドの全て又は一部をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子並びにその誘導体及びフラグメント、例えばＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質又はＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質誘導体の全て又は一部をコードする核酸も提供される。このような核酸を含むベクター及びプラスミド並びにこのような核酸及び／又はベクター及びプラスミドを含む細胞及び細胞系が本明細書においてさらに提供される。本明細書において提供される方法は、例えば、ヒトＡＰＪに結合するＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質を調製、同定又は単離するための方法、Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質がＡＰＪに結合するかどうかを決定するための方法及びＡＰＪに結合するＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質を動物モデルに投与する方法を含む。
【実施例】
【０２００】
本明細書に記載される技術的解決法は、以下の実施例によってさらに例証される。
【０２０１】
規定されない場合、本明細書に記載される出発材料及び機器は、市販されているか、又は当技術分野において一般的に使用されるものである。以下の実施例における方法は全て、特に規定されない限り、当技術分野における従来の方法である。
【０２０２】
１．免疫付与のための抗原の調製
ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−細胞を６ウェルプレート中に播種した。２４時間の培養後、細胞に、ｈＡＰＪ遺伝子を運ぶように修飾したｐＴＭ１５プラスミドをトランスフェクトした（ヌクレオチド配列について配列番号５５及びアミノ酸配列について配列番号２３を参照されたい）。トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００についてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって推奨されるトランスフェクション条件に従うことにより実施した。トランスフェクションから４８時間後、培地を、３００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含有する完全培地と交換し、次に培地を３日ごとに変更した。約２週間培養後、安定なクローンが出現した。細胞コロニーを消化し、分散させてから、細胞を継代し、細胞が１００％の治癒度まで成長するまでさらに培養した。安定な細胞株を、Ｖ５標識抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＦＡＣＳにより検出し、加圧後の細胞集団をＦＡＣＳ検出の結果に従って同定した。選択されたＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＡＰＪ細胞は、細胞膜上で多数のｈＡＰＪを発現した。最後に、サブクローニング及びさらなる同定後、３つのＡＰＪ細胞株を高発現安定細胞株として選択した。ｈＡＰＪの高発現を伴うこれらの細胞株は、抗体調製のための免疫原として使用可能である（実施例２を参照されたい）。
【０２０３】
さらに、ｈＡＰＪ細胞外ドメイン及びｈＩｇＧ  ＦＣの融合タンパク質は、抗体調製のための免疫原としても使用可能である。調製方法は、以下のとおりである：ｈＡＰＪ、ｈＩｇＧ２  ＦＣ及びリンカーの細胞外ドメインの融合タンパク質遺伝子配列をｐＴＭ５プラスミドにサブクローニングした。ＡＰＪ細胞外ドメイン融合タンパク質は、懸濁されたＨＥＫ２９３細胞内で高度に且つ一過性に発現された。次に、細胞上清を収集し、ＡＰＪ細胞外ドメイン融合タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
【０２０４】
２．ＡＰＪ抗体の調製
抗原及び水酸化アルミニウムアジュバントを混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週）に皮下注射した。マウスを毎週１回追加免疫した。全部で６回分の免疫後、尾を切断することにより、血液サンプルを収集した。次に、血清を遠心分離により収集し、血清力価をＦＡＣＳにより分析した。許容できる抗体力価が得られると、マウスを頚椎脱臼により屠殺し、それらの脾臓細胞を無菌条件下で収集した。さらに、ＳＰ２／０細胞を増殖の対数期に収集し、遠心分離し、細胞ペレッを無血清培地と共に再懸濁し、次に２回目として遠心分離及び再懸濁し、計数した。類似数の脾臓細胞及びＳＰ２／０細胞を混合し、次いで３回の洗浄−遠心分離を行った。最終の遠心分離からの細胞ペレットを緩やかに剥離した後、予備加温したＰＥＧ−１５００を滴下し、続いてピペットで混合し、次に３０ｍＬの予備加温した無血清培地を徐々に添加し、ＰＥＧ融合を終了させた。遠心分離後、細胞ペレットを剥離し、続いて融合培地を添加した。脾臓細胞及び支持細胞層細胞を９６ウェルプレート中に蒔き、１００μＬの培地を各ウェルに添加した。融合後のハイブリドーマ細胞及び層支持細胞を９６ウェルプレート内で一緒に培養し、続いて非融合細胞を除去するため、ＨＡＴ（サルシン、アメトプテリン及びチミジン）を選択した。１０日後、培養プレート内のハイブリドーマ細胞の上清をＥＬＩＳＡ分析のために収集した。
【０２０５】
３．ＡＰＪ抗体のＥＬＩＳＡスクリーニング
ｈＡＰＪの過剰発現を伴うＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＡＰＪ細胞及びｈＡＰＪの発現を伴わないＣＨＯ−ＤＨＦＲ−細胞をそれぞれ９６ウェルプレート中に播種した。細胞が９０％のコンフルエンスに成長したとき、培地の上清を除去し、付着細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１００％メタノールを添加し、細胞を４℃で固定し、次に１００μＬのＨ２Ｏ２−ＰＢＳを添加し、続いて室温で２０分間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。（ＰＢＳに溶解した）ＢＳＡでのブロッキング後、ハイブリドーマ上清を添加し、４℃で９０分間インキュベートした。数回洗浄後、１００μＬの希釈した二次抗体ヤギ抗マウスＦｃ−ＨＲＰを各ウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。５回にわたり洗浄後、１００μＬのＴＭＢ発色基質を各ウェルに添加し、３７℃で１５分間インキュベートし、５０μＬの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加し、反応を終了させ、ＯＤ４５０値を読み取った。（ＰＢＳに溶解した）１％ＢＳＡでのブロッキング後、ハイブリドーマ上清を添加し、４℃で９０分間インキュベートした。次に、抗ｈＡＰＪモノクローナル抗体をスクリーニングするため、上記のＥＬＩＳＡ法を実施した。陽性対照は、免疫後のマウス血清であり；陰性対照は、細胞培養上清であった。ＥＬＩＳＡによる初期分析後、抗ｈＡＰＪ抗体を分泌するいくつかの陽性ハイブリドーマクローンを同定した。抗ｈＡＰＪ抗体を分泌するそれらのハイブリドーマクローンを選択し、クローニングを経て、抗ｈＡＰＪ抗体を分泌する安定な細胞株を得た。最後に、陽性ハイブリドーマによって分泌される腹水抗体の親和性を検証し、ＦＡＣＳ分析により順位付けした（実施例９を参照されたい）。
【０２０６】
４．ＡＰＪ抗体遺伝子のクローニング及びサブクローニング
抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を収集した。ハイブリドーマｍＲＮＡをＱＩＡＧＥＮ  ｍＲＮＡ抽出キットの製造業者のプロトコルに従って抽出した。次に、抽出されたｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。逆転写プライマーは、マウスの軽鎖及び重鎖定常領域に対して特異的なプライマーであり、重鎖逆転写プライマーは、（５’−ＴＴＴＧＧＲＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣ−３’）であり、軽鎖逆転写プライマーは、（５’−ＴＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡ−３’）及び（５’−ＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡ−３’）である。ＲＴ−ＰＣＲ反応条件は、以下のとおりにであった：２５℃で５分、５０℃で６０分及び７０℃で１５分。逆転写されたｃＤＮＡを５００μＬになるまで０．１ｍＭのＴＥで希釈し、その後、限外ろ過遠心分離管（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５）に加え、１０分間にわたって２，０００ｇで遠心分離した。ろ液を除去し、５００μＬの０．１ｍＭのＴＥを加え、１０分間にわたって２，０００ｇで遠心分離した。ろ液を除去し、調製管を新しい遠心分離管に逆さに入れ、１０分間にわたって２，０００ｇで遠心分離して、精製されたｃＤＮＡを得た。精製されたｃＤＮＡ（１０μＬ）を鋳型として取った後、４μＬの５倍のテーリングバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）、４μＬのｄＡＴＰ（１ｍＭ）及び１０Ｕ末端トランスフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、均一に混合し、３７℃で５分間、６５℃で５分間再度インキュベートした。その後、ポリＡテイルｃＤＮＡを鋳型として使用し、抗体の軽鎖及び重鎖可変領域の遺伝子を増幅するためにＰＣＲを行った。上流プライマーは全て、オリゴｄＴであり、重鎖下流プライマーは、（５’−ＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣ−３’）及び（５’−ＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＴＣＣＡＴＡＧＴＴＣＣ−３’）であり、軽鎖下流プライマーは、（５’−ＡＣＴＣＧＴＣＣＴＴＧＧＴＣＡＡＣＧＴＧ−３’）であった。ＰＣＲ反応条件は、以下のとおりであった：９５℃で５分；９５℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１分、４０サイクル；及び７２℃で７分。ＰＣＲ産物をＰＭＤ  １８−Ｔベクター（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）に連結し、その後、配列決定した。次に、ＰＣＲプライマーを、抗体のＤＮＡ配列に基づき、完全な軽鎖、重鎖シグナルペプチド及び可変ドメイン及びマウスＩｇＧ１定常領域を発現ベクターｐＴＭ５に連結するように設計した。
【０２０７】
５．ＡＰＪ抗体のヒト化、最適化及びサブクローニング
ＮＣＢＩデータベースを用いて、スクリーニングしたマウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域の配列を相同性抗体と整列させ、ヒト化のために選択した抗体の可変領域配列に相同なヒト抗体の生殖系列遺伝子配列（Ｉｇ生殖系列遺伝子配列）を探索し、ＣＤＲ配列を除いて最高の相同性を有するヒト遺伝子配列をＣＤＲグラフトのための鋳型として用いて、ヒト化抗体可変領域配列を得た。ヒト化抗体の軽鎖及び重鎖の遺伝子を合成し、次にヒトＩｇＧ２又はＩｇＧ４定常領域配列と組合せ、組み換えヒト化抗体配列全体を得た。実施例８に従い、組み換え抗体の発現を達成し、それらのＡＰＪに対する親和性を、ステップ１０に記載のようなＦＡＣＳにより分析した。ＡＰＪに対する最良の親和性を保持するヒト化抗体候補をその群から選択し、その可変領域配列を、ＡＰＪに対する改善された親和性についての部位特異的突然変異誘発によりさらに修飾した。
【０２０８】
ヒト化抗体の最適化された重鎖及び軽鎖可変領域配列をＣＲＯにより合成し、完全重鎖可変領域配列を、重鎖定常領域を負荷していた発現ベクターｐＴＭ５とさらに結合させ；同様に、完全軽鎖可変領域配列を、軽鎖定常領域を負荷していた発現ベクターｐＴＭ５と結合させた。
【０２０９】
６．ヒト化ＡＰＪ抗体及びＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の構築
最適化されたヒト化抗体を重鎖のＣ末端でＥｌａｂｅｌａフラグメントと融合させ、Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質を形成した。２つの配列を架橋としてのリンカーによって連結した。重複ＰＣＲにより、ヒト化ＡＰＪ抗体の重鎖核酸配列を「リンカーＥｌａｂｅｌａフラグメント」に部分的に連結し、Ｎｈｅ１及びＮｏｔ１の制限部位をプライマーの両端に付加することで、完全融合タンパク質配列を発現ベクターｐＴＭ５に結合した。Ｅｌａｂｅｌａ融合タンパク質配列が発現ベクターｐＴＭ５に結合してから、配列決定分析を実施し、その構築の正確さを確認した。
【０２１０】
７．ＡＰＪ抗体及びＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の一過性発現
ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ発現細胞株の５×１０５／ｍＬの懸濁細胞を振とうフラスコに播種した。３７℃及び５％ＣＯ２での２４時間の回転後、細胞密度は、１×１０６個／ｍＬに達し、次にトランスフェクションのために使用した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をトランスフェクション試薬として使用し、トランスフェクション中、ＤＮＡと混合した。双方の混合物を静止状態で１５分間インキュベートし、次に細胞培養物に添加した。ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物で処理後の細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間回転させ、次にトリプトンを、発現に要求される補充物として細胞培養物に添加した。発現の完了後（９６時間超）、細胞上清を抗体精製及び分離のために収集した。
【０２１１】
８．ＡＰＪ抗体及びＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質の精製及び分離
実施例８から収集した細胞上清を８０００ｒｐｍで遠心分離し、細胞及び細胞片を除去し、次に０．２２μｍのフィルターで濾過し、精製のために清澄な上清を得た。精製プロセスは、クロマトグラフを通して実施した。第一に、上清をＡ／Ｇタンパク質共役アフィニティークロマトグラフィーカラムを通して濾過し、抗体又は融合タンパク質を、Ａ／Ｇタンパク質共役アフィニティークロマトグラフィーカラムのガンドへの結合後、カラム内で維持した。抗体又は融合タンパク質は、３．０以下のｐＨを有する溶離剤を用いて、クロマトグラフィーカラムから溶離させた。収集した溶離剤を直ちに１Ｍトリス−ＨＣｌで中和させた。次に、抗体又は融合タンパク質の溶離剤をＰＢＳ又は他の緩衝液に透析した。
【０２１２】
９．ＦＡＣＳ分析を通した機能的ＡＰＪ抗体の結合活性検証
１０５個のＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＡＰＪ細胞を１．５ｍＬのＥＰ管に剥離し、収集するため、ＥＤＴＡを含有するＰＢＳを使用した。上清を遠心分離後に除去した。陰性対照サンプルをＦＡＣＳローディングバッファー（ＰＢＳ、２％ＦＢＳ）で再懸濁した。陽性対照について、特定濃度での２００μＬの抗体上清を再懸濁した細胞に添加し、次に室温でインキュベートし；次にその細胞を１５００ｒｐｍで遠心分離し、上清を除去し、ＦＡＣＳローディングバッファーで洗浄し、再び遠心分離した。細胞を再懸濁し、続いてＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス蛍光二次抗体を１：５０の希釈で添加（２００μＬ／ウェル）し、暗所、室温で３０分間インキュベートした。遠心分離後、上清を除去し、細胞をＦＡＣＳローディングバッファーで洗浄し、再び遠心分離し、分析のためにローディングバッファーを再懸濁した。図１Ａ〜図１Ｄに示す実験結果では、左側の灰色ピークは、ブランク細胞ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−と結合する５００ｎＭのマウス腹水抗体Ｌ１Ｈ１の陰性対照であり、実線ピークは、ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＡＰＪと結合する、５００ｎＭ（図１Ａ）及び４ｎＭ（図１Ｂ）の各々でのマウス腹水抗体Ｌ１Ｈ１の結合曲線であり、灰色ピークの陰性対照と比べて明らかに右側にシフトし、Ｌ１Ｈ１とｈＡＰＪとの特異的結合であることが判明した。右の灰色ピークは、ブランク細胞ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−に結合する５００ｎＭのマウス腹水抗体Ｌ４Ｈ４の陰性対照であり、実線ピークは、ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−ｈＡＰＪと結合する、５００ｎＭ（図１Ｃ）及び４ｎＭ（図１Ｄ）の各々でのマウス腹水抗体Ｌ４Ｈ４の結合曲線であり、灰色ピークの陰性対照と比べて明らかに右側にシフトし、Ｌ４Ｈ４とｈＡＰＪとの特異的結合であることが判明した。
【０２１３】
１０．Ｅｌａｂｅｌａ及びＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質によるＥｌａｂｅｌａ／ＡＰＪシグナル伝達経路のインビトロ活性化のレポーター遺伝子アッセイ測定
３５０００個のｈＡＰＪ−ＣＲＥ−ルシフェラーゼ発現ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−細胞／ウェルを９６ウェルプレート中に播種し、３７℃で一晩培養した。２日目に培養上清を除去し、細胞を無血清培地で２回洗浄し、残留液体を吸引した。０．６μＭのフォルスコリン５０μＬを予め９６ウェルプレートに添加し、次に無血清培地で希釈した５０μＬのＥｌａｂｅｌａ融合タンパク質又はＥｌａｂｅｌａ−１１ポリペプチドを添加し、３７℃で６時間インキュベートした。刺激後、１００μＬのＢｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏ化学発光基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、次に細胞可溶化物を白色９６ウェルプレートに移し、蛍光の相対強度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み取った。データをｐｒｉｓｍ５．０でフィットさせ、ＥＣ５０を計算した。Ｌ１Ｈ１及びＬ４Ｈ４の抗体は、遮断又は活性化しなかった。図２は、レポーター遺伝子実験によって検出した、Ｌ５Ｈ５とリンカー２−Ｅｌａｂｅｌａ−１１との融合タンパク質及びＬ５Ｈ５とリンカー２−ＥＡ５との融合タンパク質によって活性化されたＥｌａｂｅｌａ／ＡＰＪシグナル伝達経路の活性化曲線を示し、各々のＥＣ５０は、３．６１ｎＭ及び２．５５ｎＭであった。図３は、レポーター遺伝子実験によって検出した、Ｌ５Ｈ５とリンカー２−ＥＡ１との融合タンパク質及びＬ５Ｈ５とリンカー２−ＥＡ２との融合タンパク質によって活性化されたＥｌａｂｅｌａ／ＡＰＪシグナル伝達経路の活性化曲線を示し、各々のＥＣ５０は、４．９５ｎＭ及び２．１６ｎＭであった。図４は、レポーター遺伝子実験によって検出した、Ｌ５Ｈ５とリンカー２−ＥＡ３との融合タンパク質及びＬ５Ｈ５とリンカー２−ＥＡ４との融合タンパク質によって活性化されたＥｌａｂｅｌａ／ＡＰＪシグナル伝達経路の活性化曲線を示し、各々のＥＣ５０は、２０．２７ｎＭ及び５．４３ｎＭであった。
【０２１４】
上記の実施例は、本明細書における本開示の範囲を限定することなく、保護を必要とする実施形態を作製及び使用する方法を当業者に詳細に開示及び説明するために提供される。当業者に明らかな変更形態は、本明細書中の特許請求の範囲内にある。本明細書に引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれの刊行物、特許又は特許出願が具体的且つ個別に参照により本明細書に援用されているかのように参照により本明細書に援用される。
【図１Ａ】
2021526833.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年3月26日(2021.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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