(57)【要約】  本出願は、創傷治癒及び組織再生、瘢痕形成の減少、並びに血管新生の促進における、ラブリシンとしても既知であるプロテオグリカン４タンパク質の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織再生又は創傷治癒を促進し、同時に瘢痕形成を減少させる方法であって、ラブリシンを含む医薬製剤を、必要な患者の創傷又は組織損傷部位に投与することを含む方法。
【請求項２】
ラブリシンが組換えヒトラブリシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ラブリシンが配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１の残基２５〜１４０４のアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ラブリシンが、配列番号１の配列又は配列番号１の残基２５〜１４０４の配列との少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記創傷又は組織損傷が眼に存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記創傷又は組織損傷が角膜に存在する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記創傷が、皮膚の表皮層、真皮層、及び／又は皮下組織層に存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記創傷が、皮膚への切り傷、穿刺、裂創、裂傷、擦り傷、若しくは剥離であるか、又は外科的切開である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記創傷が、打撲傷である、請求項１〜４のいずれか一項又は請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記創傷が、熱傷である、請求項１〜４のいずれか一項又は請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記創傷が、皮膚潰瘍である、請求項１〜４のいずれか一項又は請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記潰瘍が、褥瘡（圧迫潰瘍）、糖尿病性潰瘍、又は細菌感染により引き起こされる潰瘍である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記創傷が、非関節性、非骨性、及び骨以外の部位に存在し、且つ前記創傷は、骨、関節、関節軟骨、腱、又は靱帯には存在しない、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ラブリシンが１μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの濃度で提供される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ラブリシンが１００μｇ／ｍＬの濃度で提供される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ラブリシンが１ｃｍ2の創傷面積当たり１０〜１５０μｇの量で提供される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ラブリシンが１ｃｍ2の創傷面積当たり７５〜１００μｇの量で提供される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記医薬製剤が溶液、懸濁液、乳濁液、ローション、クリーム、ゲル、ペースト、又は軟膏として投与される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記医薬製剤が前記創傷に局所的に適用される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記医薬製剤が前記創傷に適用される創傷被覆材の含浸物として投与される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記医薬製剤は、抗生物質、若しくは抗炎症剤、若しくは鎮痛剤をさらに含むか、又は前記医薬製剤を、抗生物質、抗炎症剤、若しくは鎮痛剤と共に投与する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記鎮痛剤が、リドカイン又はベンゾカインである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗生物質が、ネオマイシン、ポリミキシンｂ、バシトラシン、エリスロマイシン、レタパムリン、スルファセタミドナトリウム、ムピロシン、プラモキシン、スルファジアジン銀、マフェニド、又はオゼノキサシンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記医薬製剤を、液滴として又は前記創傷の部位での注射により投与することを含む請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記医薬製剤は、ヒアルロン酸を含まない、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ラブリシンを含む、組織再生又は創傷治癒の促進と、同時の瘢痕形成の減少とでの使用のための医薬組成物。
【請求項２７】
必要な患者の身体における部位で血管新生を誘発する方法であって、新規血管の形成を誘発するのに十分な量で、前記部位に、ラブリシンを含む医薬製剤を投与することを含む方法。
【請求項２８】
ラブリシンが組換えヒトラブリシンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ラブリシンが配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１の残基２５〜１４０４のアミノ酸配列を有する、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
ラブリシンが配列番号１の配列又は配列番号１の残基２５〜１４０４の配列との少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ラブリシンが１μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの濃度で提供される、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ラブリシンが１００μｇ／ｍＬの濃度で提供される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ラブリシンが前記部位の１ｃｍ2の面積当たり１０〜１５０μｇの量で提供される、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ラブリシンが前記部位の１ｃｍ2の面積当たり７５〜１００μｇの量で提供される、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ラブリシンが前記部位に局所的に投与される、請求項２７〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ラブリシンが注射により前記部位に投与される、請求項２７〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記医薬製剤がヒアルロン酸を含まない、請求項２７〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記身体における前記部位が、皮膚であるか、又は角膜を除く眼である、請求項２７〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記身体における前記部位が、非関節性であり、非骨性であり、及び骨以外であり、且つ前記部位は、骨、関節、又は関節軟骨には存在しない、請求項２７〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ラブリシンを含む、血管新生の促進での使用のための医薬組成物。
【請求項４１】
薬学的に許容される担体をさらに含む請求項２６又は４０に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
眼での異常な創傷治癒を処置するか又は予防する方法であって、異常な創傷治癒に罹患しているか又は異常な創傷治癒のリスクがある眼にラブリシンを投与することを含む方法。
【請求項４３】
前記異常な創傷治癒が角膜の瘢痕化である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記異常な創傷治癒が角膜混濁である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
ラブリシンが、１μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの濃度で提供される、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
ラブリシンが、前記創傷のサイズを基準として１ｃｍ2当たり１０〜１５０μｇの量で提供される、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ラブリシンが、配列番号１の配列又は配列番号１の残基２５〜１４０４の配列との少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ラブリシンが、点滴薬又は軟膏として眼に投与される、請求項４２〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
ラブリシンが、角膜移植、レーザー屈折矯正角膜切除術、レーザー上皮下角膜切削形成術、又はレーザーインサイチュ角膜切削形成術の完了時に眼に投与される、請求項４２〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本出願は、２０１８年６月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／６８８，１６３号に対する優先権及びこの明細書の利益を主張しており、この出願の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の分野
[0002]  本発明は、ラブリシンとしても既知であるヒト糖タンパク質ＰＲＧ４の新規の用途に関する。より具体的には、本発明は、創傷治癒を促進するための薬剤としてのＰＲＧ４の用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
[0003]  プロテオグリカン４遺伝子（ＰＲＧ４）は、巨核球刺激因子（ＭＳＦ）、並びに高度にグリコシル化された別のスプライスバリアント、及びラブリシンとしても既知である「表面ゾーンタンパク質（superficial zone protein）」のグリコフォームをコードする。表面ゾーンタンパク質は、最初は、表面ゾーンからの外植片軟骨の表面に局在しており、馴化培地で同定された。ラブリシンとしても既知であるＰＲＧ４は、滑液から初めて単離され、軟骨−ガラス界面及びラテックス−ガラス界面にて、滑液と同様のインビトロでの潤滑性を示した。ＰＲＧ４は、滑膜線維芽細胞の産物として後に同定され、このＰＲＧ４の潤滑性は、エクソン６によりコードされる９４０個のアミノ酸の大きいムチン様ドメイン内のＯ−連結β（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃオリゴ糖に依存していることが発見された。ラブリシン分子は様々にグリコシル化されており、いくつかの天然に存在するスプライスバリアントが報告されている。これらは、本明細書ではまとめてＰＲＧ４と称される。ＰＲＧ４は、身体内では、数ある部位の中でも特に、滑膜、腱、関節軟骨（例えばメニスカス）の表面、及び眼の保護膜に存在していることが分かっており、関節の潤滑及び滑膜の恒常性で重要な役割を果たす。
【０００４】
[0004]  ラブリシンは、荷重負荷表面間の摩擦を減少させることがよく知られており（Swann et al., J Biol Chem, 1981, 256: 5921-5; Schmidt et al., JAMA Ophthalmol, 2013, 131(6):766-76）、従って、このラブリシンの潜在的な利点に関する研究は主に関節に焦点を当てているが、ラブリシンは肝臓、心臓、肺、腎臓、及び他の組織で発現されており（Ikegawa et al., Cytogenet Cell Genet, 2000, 90(3-4):291-7）、これらの組織でのラブリシンの役割は未だ分かりにくいままである。屈指症関節症内反股心膜炎（Camptodactyly Arthropathy Coxa Vara Pericarditis）（ＣＡＣＰ）という疾患は、ＰＲＧ４での変異と関連しており（Marcelino et al., Nat Genet, 1999, 23(3):319-22）、この患者は、関節変性、慢性炎症、及び心膜炎に罹患しており（Mannurita et al., Eur J Hum Gen, 2014, 22:197-201）、このことは、ラブリシンが、潤滑に加えて複数の生物学的機能を有することを示唆する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
[0005]  ヒトでは、ラブリシンは、関節の滑液中に高濃度（約４００μｇ／ｍＬ）で見出されており、血液中では低濃度（＞１００μｇ／ｍＬ）で観察されている（Ikegawa et al., Cytogenet Cell Genet, 2000, 90(3-4):291-7; Ai et al. PLoS One, 2015, 10(e0116237)）。しかしなながら、本明細書で示すように、本出願人は、ラブリシンの特性が、このラブリシンの潤滑性及び抗付着性を超えて伸びることを発見している。従って、これまで刊行物は、ラブリシンの喪失が組織変性につながる可能性があることを示しているが（Jay et al., Arthritis Rheum, 2010, 62(8):2382-91; Ruan et al., Transl Med, 2013, 5(176); Jay et al., Matrix Biology, 2014, 39:17-24）、本出願人は、ラブリシンが創傷治癒及び組織再生において重要な役割を果たすことを初めて実証したと信じている。具体的には、本出願人は、ラブリシンが組織損傷部位で発現され、創傷治癒を促進する生理学的反応を誘発し、それにより瘢痕形成を抑制することを発見している。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の概要
[0006]  本発明は、創傷治癒及び組織再生の促進におけるＰＲＧ４のこれまで知られていない関与を利用する。本出願人の発見の根底にあるのは、ＰＲＧ４が創傷治癒を促進する推定上の機序への理解である。本明細書で示すように、ＰＲＧ４は、１）線維化反応を阻害することにより、２）血管新生及び損傷への血流を増加させることにより、３）炎症反応（例えば、マクロファージの分極（macrophage polarization））を調節することにより、並びに４）組織修復を媒介するために免疫細胞及び成体幹細胞（ＭＳＣ）を動員することにより、内在性の修復及び再生を増強し得る。従って、ＰＲＧ４を多くの新規の方法で使用して、創傷治癒をもたらし得る。
【０００７】
[0007]  従って、一態様では、本発明は、組織再生又は創傷治癒を促進し、同時に瘢痕形成を減少させる方法を提供する。この方法は、必要な患者の創傷又は組織損傷部位に、ラブリシンを含む医薬製剤を投与することを含む。一実施形態では、この医薬製剤は、薬学的に許容される担体を含み得る。
【０００８】
[0008]  一実施形態では、このラブリシンは、組換えヒトラブリシンである。一実施形態では、このラブリシンは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、このラブリシンは、配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。別の実施形態では、このラブリシンは、ヒトラブリシンの既知の相同体又はバリアントである。
【０００９】
[0009]  一実施形態では、創傷は皮膚に存在する。例えば、この創傷は、皮膚の表皮、真皮、及び／又は皮下組織に存在する。一実施形態では、この創傷は、表皮に存在する。別の実施形態では、この創傷は、表皮及び真皮に存在する。別の実施形態では、この創傷は、表皮、真皮、及び皮下組織に存在する。別の実施形態では、この創傷は、真皮及び皮下組織に存在する。別の実施形態では、この創傷は、皮下組織に存在する。別の実施形態では、この創傷は、真皮に存在する。
【００１０】
[0010]  一実施形態では、創傷又は組織損傷は、眼に存在する。例えば、一実施形態では、この創傷又は組織損傷は、角膜に存在する。
【００１１】
[0011]  一実施形態では、創傷又は組織損傷は、皮膚への切り傷、穿刺、裂創、裂傷、熱傷、擦り傷、若しくは剥離であるか、又は外科的切開である。別の実施形態では、この創傷は、打撲傷である。別の実施形態では、この創傷は、熱傷である。さらに別の実施形態では、この創傷は、皮膚潰瘍である。この潰瘍は、褥瘡（圧迫）潰瘍、糖尿病性潰瘍であり得るか、又は細菌感染若しくは壊死により引き起こされ得る。別の実施形態では、この創傷又は組織損傷は、？瘡であり得る。さらなる実施形態では、この創傷又は組織損傷は、以前に形成された瘢痕組織が外科的に切除されている部位である。別の実施形態では、この創傷は、非関節性、非骨性、及び骨以外の部位に存在し、且つこの創傷は、骨、関節、関節軟骨、腱、又は靱帯には存在しない。
【００１２】
[0012]  一実施形態では、このラブリシンを、１μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの濃度で与える。別の実施形態では、このラブリシンを、１００μｇ／ｍＬの濃度で与える。さらなる実施形態では、このラブリシンを、１ｃｍ2の創傷面積当たり５０μｇ〜１５０ｕｐの量で与える。さらなる実施形態では、このラブリシンを、１ｃｍ2の創傷面積当たり５０μｇ〜５００μｇの量で与えるが、別の実施形態では、このラブリシンを、１ｃｍ2の創傷面積当たり約７５μｇ〜１００μｇの量で与える。さらに別の実施形態では、このラブリシンを、１ｃｍ2の創傷面積当たり１０〜１５０μｇの量で与える。
【００１３】
[0013]  さらなる実施形態では、ラブリシンを含む医薬製剤を、溶液、懸濁液、乳濁液、ローション、クリーム、ゲル、ペースト、又は軟膏として投与する。一実施形態では、この溶液を、組織損傷部位に局所的に点滴薬として投与するか、又は組織損傷部位での注射により投与する。一実施形態では、この医薬製剤を、組織損傷部位に局所的に適用するか、又は損傷部位への注射により投与する。さらなる実施形態では、この医薬製剤は、ヒアルロン酸を含まない。
【００１４】
[0014]  別の実施形態では、医薬製剤を、創傷に適用される創傷被覆材の含浸物として創傷又は組織損傷に投与する。
【００１５】
[0015]  一実施形態では、医薬製剤を、鎮痛剤と共に投与するか、又はこの投与される医薬組成物は、鎮痛剤を含む。例えば、この鎮痛剤は、リドカイン又はベンゾカインである。
【００１６】
[0016]  一実施形態では、医薬製剤を、抗生物質若しくは抗炎症剤と共に投与するか、又はこの投与される医薬組成物は、抗生物質若しくは抗炎症剤を含む。例えば、この抗生物質は、ネオマイシン、ポリミキシンｂ、バシトラシン、エリスロマイシン、レタパムリン、スルファセタミドナトリウム、ムピロシン、プラモキシン、スルファジアジン銀、マフェニド、又はオゼノキサシン（ozenoaxacin）である。例えば、この抗炎症剤は、ヒドロコルチゾンである。
【００１７】
[0017]  一実施形態では、本発明は、組織再生又は創傷治癒の促進と、同時の瘢痕形成の減少とでの使用のための、ラブリシンを含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、この医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。
【００１８】
[0018]  別の実施形態では、本発明は、必要な患者の身体における部位で血管新生を誘発する方法を提供する。この方法は、新規血管の形成を誘発するのに十分な量で、この部位に、ラブリシンを含む医薬製剤を投与することを含む。一実施形態では、この医薬製剤は、薬学的に許容される担体を含み得る。
【００１９】
[0019]  一実施形態では、このラブリシンは、組換えヒトラブリシンである。一実施形態では、このラブリシンは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、このラブリシンは、請求項１の配列との少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。このラブリシンを、１μｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬの濃度で与え得、例えば１００μｇ／ｍＬで与え得る。このラブリシンを、この部位の１ｃｍ2の面積当たり１０μｇ〜１５０μｇの量で与え得るが、別の実施形態では、このラブリシンは、この部位の１ｃｍ2の面積当たり７５〜１００μｇの量で与える。
【００２０】
[0020]  血管新生を促進するために、このラブリシンを、例えば、この部位に局所的に投与し得るか、又は注射によりこの部位に投与し得る。一実施形態では、この医薬製剤は、ヒアルロン酸を含まない。さらなる実施形態では、血管新生が必要な部位は、組織損傷又は創傷（例えば、皮膚への切り傷、穿刺、裂創、裂傷、擦り傷、若しくは剥離、外科的切開、又は熱傷、又は打撲傷、又は潰瘍）の部位である。例えば、組織損傷又は創傷の部位は表皮であり得、この創傷の深さに応じて真皮又は皮下組織を含み得る。
【００２１】
[0021]  一実施形態では、組織損傷又は創傷の部位は、眼に存在しているが、角膜には存在していない。
【００２２】
[0022]  さらなる実施形態では、本発明は、ラブリシンを含む、血管新生の促進での使用のための医薬組成物を提供する。一実施形態では、この医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。
【００２３】
[0023]  一態様では、本発明は、眼での異常な創傷治癒を処置するか又は予防する方法を提供する。この方法は、異常な創傷治癒に罹患しているか又は異常な創傷治癒のリスクがある眼にラブリシンを投与することを含む。一実施系形態では、この異常な創傷治癒は、角膜の瘢痕化であるが、別の実施形態では、角膜混濁である。一実施形態によれば、このラブリシンを、１μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの濃度で与え、及び／又はこの創傷のサイズを基準として１ｃｍ2当たり１０〜１５０μｇの量で与える。一実施形態では、このラブリシンは、配列番号１の配列又は配列番号１の残基２５〜１４０４の配列との少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。一実施形態では、このラブリシンを、点滴薬又は軟膏として眼に投与する。一実施形態では、このラブリシンを、角膜移植（keratinoplasty）、レーザー屈折矯正角膜切除術、レーザー上皮下角膜切削形成術、又はレーザーインサイチュ角膜切削形成術の完了時に眼に投与する。
【００２４】
図面の簡単な説明
[0024]  本特許又は本出願のファイルは、カラーで作成された少なくとも１枚の図面を含む。この特許公報又は特許出願公報のカラー図面付きのコピーは、請求及び必要な手数料の支払により特許庁から提供されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】[0025]ラブリシンが創傷治癒を調節する提案されている機序を示す模式図である。
【図２】[0026]最初の損傷時から数週間にわたり測定した、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの耳の創傷（最初は２ｍｍ直径のパンチ）の直径（ｍｍ）を示す折れ線グラフである。ラブリシン処置により創傷治癒が有意に増加するが、ラブリシンのノックアウトにより創傷治癒がブロックされることが示されている（ｎ＝１２／群）。
【図３】[0027]マウスの耳由来の組織の免疫組織染色の４枚の写真を含む。緑色の染色は、ラブリシンの存在を示し、青色の染色は、ラブリシンを発現していない細胞の存在を示す。示すように、ラブリシンノックアウトマウスでは、青色の染色の存在のみにより表されるようにラブリシンが存在していない（左下のパネル）のに対して、ＭＲＬ「スーパーヒーラー」マウスでは、組織全体にわたり緑色の染色のみにより表されるようにサンプル全体にわたりラブリシンが豊富である（右上のパネル）。Ｃ５７ＢＬ／６ラブリシン処置マウスでは、ＭＲＬマウスと同程度ではないが、全体にわたり緑色の染色により表されるように組織全体にわたりラブリシンが見られる（右下のパネル）のに対して、未処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、緑色のわずかな小さいスポットと共に全体にわたり青色の染色により表されるようにラブリシンは存在しない（左上のパネル）。従って、図３は、ラブリシン染色が、自発的スーパーヒーラー（例えばＭＲＬマウス）での損傷後に増加すること、及びラブリシン染色が、損傷後の治癒の増加及び線維化／瘢痕化の減少と相関していることを示す。
【図４】[0028]最初の損傷時から数週間にわたり測定した、パンチ損傷部位でのマウスの耳における灌流単位（ＰＵ）での血流を示す折れ線グラフであり、ラブリシン処置により損傷部位での血流が有意に増加することを示す（ｎ＝１２／群）。
【図５】[0029]損傷部位を囲む治癒組織におけるＣＤ３１＋血管の数により示した、パンチ損傷を受けているマウスの耳における血管新生のレベルを示す折れ線グラフである。耳の損傷後、ラブリシン処置動物では、血管数の増加を観察し、ラブリシンＫＯ動物では、より少ない血管を観察する（ｎ＝１２）。
【図６】[0030]ＤＡＰＩ（即ち、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）によるマウス耳組織の免疫組織化学染色の下記の一連の画像である：組織が損傷していない（上部のパネル）、組織が損傷しており且つ担体を投与した（中央のパネル）、及び組織が損傷しており且つＰＲＧ４を投与した（下部のパネル）。赤色は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の存在を示しており、非損傷組織には存在せず、担体のみを投与した損傷組織にはわずかに存在しており、画像全体にわたり赤色の点で示されるように、ラブリシンを投与した損傷組織には多くが存在する。図６は、ＭＳＣが損傷領域に遊走し且つラブリシンに反応することを示す。耳において、損傷していない組織ではＭＳＣ（赤色）が量的に観察されないが、損傷後には観察され得る。ラブリシン処置により、ＭＳＣは、耳の損傷した軟骨構造を完全に再配置させる（ｎ＝５／群）。
【図７】[0031]表面プラズモン共鳴により測定した場合の、共鳴単位（ＲＵ）対濃度で測定したＰＡＩ−１（プラスミノーゲン活性化阻害因子−１）ラブリシン結合親和性を示す折れ線グラフである。ラブリシンはＰＡＩ−１に直接結合し得、結合定数は、これら２種の生分子の間の強い結合を示す２．７１２×１０-6Ｍであった。
【図８Ａ】[0032]ラブリシンが、複数の細胞型で及びインビボでＨＩＦ１ａ及びＶＥＧＦをどのように上方調節するかを示すグラフである。正常なヒト関節及び骨関節炎（ＯＡ）のヒト関節に由来する滑膜線維芽細胞を、ラブリシン（１００μｇ／ｍＬ）に曝露した（図８Ａ及び図８Ｂ）。正常細胞及びＯＡ細胞では、ラブリシンは、ＨＩＦ１ａ及びＶＥＧＦのｍＲＮＡの発現を有意に上方調節した。この観察をＨＥＫ２９３細胞で検証し、ＨＩＦ１ａ及びＶＥＧＦのｍＲＮＡは、ラブリシン処置後に両方とも上方調節されることを観察した（図８Ｃ）。図８Ａ〜８Ｃの棒グラフでは、ラブリシン処置を左側の棒として示し（頂部に＊）、ＰＢＳコンコロールは右側の棒であり、図８Ａ〜８Ｃのそれぞれでは、ラブリシンの棒はＰＢＳの棒と比べて高い。
【図８Ｂ】[0032]ラブリシンが、複数の細胞型で及びインビボでＨＩＦ１ａ及びＶＥＧＦをどのように上方調節するかを示すグラフである。正常なヒト関節及び骨関節炎（ＯＡ）のヒト関節に由来する滑膜線維芽細胞を、ラブリシン（１００μｇ／ｍＬ）に曝露した（図８Ａ及び図８Ｂ）。正常細胞及びＯＡ細胞では、ラブリシンは、ＨＩＦ１ａ及びＶＥＧＦのｍＲＮＡの発現を有意に上方調節した。この観察をＨＥＫ２９３細胞で検証し、ＨＩＦ１ａ及びＶＥＧＦのｍＲＮＡは、ラブリシン処置後に両方とも上方調節されることを観察した（図８Ｃ）。図８Ａ〜８Ｃの棒グラフでは、ラブリシン処置を左側の棒として示し（頂部に＊）、ＰＢＳコンコロールは右側の棒であり、図８Ａ〜８Ｃのそれぞれでは、ラブリシンの棒はＰＢＳの棒と比べて高い。
【図８Ｃ】[0032]ラブリシンが、複数の細胞型で及びインビボでＨＩＦ１ａ及びＶＥＧＦをどのように上方調節するかを示すグラフである。正常なヒト関節及び骨関節炎（ＯＡ）のヒト関節に由来する滑膜線維芽細胞を、ラブリシン（１００μｇ／ｍＬ）に曝露した（図８Ａ及び図８Ｂ）。正常細胞及びＯＡ細胞では、ラブリシンは、ＨＩＦ１ａ及びＶＥＧＦのｍＲＮＡの発現を有意に上方調節した。この観察をＨＥＫ２９３細胞で検証し、ＨＩＦ１ａ及びＶＥＧＦのｍＲＮＡは、ラブリシン処置後に両方とも上方調節されることを観察した（図８Ｃ）。図８Ａ〜８Ｃの棒グラフでは、ラブリシン処置を左側の棒として示し（頂部に＊）、ＰＢＳコンコロールは右側の棒であり、図８Ａ〜８Ｃのそれぞれでは、ラブリシンの棒はＰＢＳの棒と比べて高い。
【図８Ｄ】[0032]ラブリシンが、複数の細胞型で及びインビボでＨＩＦ１ａ及びＶＥＧＦをどのように上方調節するかを示すグラフである。ＥＬＩＳＡを使用して、ＶＥＧＦのレベルを検証した（図８Ｄ）。図８Ｄでは、左から右へ、左端の２本の棒は、ＰＢＳ（左）又はラブリシン（右）で処置した正常な滑膜細胞でのタンパク質濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、中央の２本の棒は、ＰＢＳ（左）又はラブリシン（右）で処置した骨関節炎の滑膜細胞でのタンパク質濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、右端の棒は、ＰＢＳ（左）又はラブリシン（右）で処置したＨＥＫ２９３細胞でのタンパク質濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。
【図８Ｅ】[0032]ラブリシンが、複数の細胞型で及びインビボでＨＩＦ１ａ及びＶＥＧＦをどのように上方調節するかを示すグラフである。図８Ｅは、ラブリシンを注射したラットにおいて、ラブリシン注射後１４〜２８日でＶＥＧＦが系統的に上方調節されたことを示す。＊を有する１４日目、２９日目、及び２４日目での点を持つ棒グラフの上の線は、ラブリシンで処置されたラットでのＶＥＧＦレベルを表し、下の線は、未処置ラットでのＶＥＧＦレベルを表す。
【図９】[0033]Ｃ５７ＢＬ／６対ラブリシンノックアウトマウス（ＫＯ）においてマクロファージから分泌されたＩＬ−１、ＩＬ−６、及びＴＮＦαのレベルを示す棒グラフである（＊は、ｐ＜０．０５の有意性を示す）。ラブリシンＫＯマクロファージの分極は、野生型コントロールと比較して炎症促進生因子の増加をもたらす（ｎ＝４）。
【図１０】[0034]ＴＬＲ４ノックアウト細胞、ラブリシンを投与したＴＬＲ４ノックアウト細胞、ラブリシンノックアウト細胞、及びＰＡＩ−１を投与したラブリシンノックアウト細胞でのＨＩＦ１ａ及びＶＥＧＦのレベルを示す棒グラフである。遺伝子発現のレベルを、リボソームサブユニット１８ｓに対して正規化する。ラブリシン処置後のＨＩＦ１α及びＶＥＧＦの上方調節は、ＴＬＲ４及びＰＡＩ−１と無関係である（ｎ＝５）。
【図１１】[0035]耳損傷後１週間の損傷部位での、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ラブリシンを投与したＣ５７ＢＬ／６マウス、及びラブリシンノックアウト（ＫＯ）マウスにおけるＣＤ１４＋マクロファージ及びＧＲ１＋好中球の存在を示すフローサイトメトリーデータである。データが示すように、損傷後に、Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びラブリシンＫＯマウスと比較して、ラブリシンで処置した損傷部位内で、２倍多い好中球及びマクロファージが見出される。（３匹の雄及び３匹の雌で１つの群当たりｎ＝６）。
【図１２】[0036]完全長（非トランケート型）のヒトＰＲＧ４のアミノ酸配列（配列番号１：１４０４個の残基）である。残基１〜２４（太字で示す）はシグナル配列を表し、残基２５〜１４０４はヒトＰＲＧ４の成熟配列を表す。この糖タンパク質は、その活性形態ではシグナル配列を必要としない。
【図１３Ａ】[0037]完全長の１４０４ＡＡヒトＰＲＧ４タンパク質をコードするＰＲＧ４遺伝子の核酸配列（配列番号２）を示す。
【図１３Ｂ】[0037]完全長の１４０４ＡＡヒトＰＲＧ４タンパク質をコードするＰＲＧ４遺伝子の核酸配列（配列番号２）を示す。
【図１３Ｃ】[0037]完全長の１４０４ＡＡヒトＰＲＧ４タンパク質をコードするＰＲＧ４遺伝子の核酸配列（配列番号２）を示す。
【図１４Ａ】[0038]損傷後４週間でのＣ５７ＢＬ／６マウス及びＰＲＧ４ノックアウトマウスにおける耳パンチ創傷の写真である。元々の損傷は、４ｍｍ2パンチであった。左耳を、コントロールとしての担体（ＤＭＳＯ）で処置し、右耳を、ｒｈＰＲＧ４で処置した。ＰＲＧ４で処置した耳でのパンチ創傷は、未処置耳と比較して有意に閉じている。
【図１４Ｂ】[0039]耳パンチ損傷を受け、且つ示したようにＤＭＳＯ又はｒｈＰＲＧ４で処置されたＣ５７ＢＬ／６マウス及びＰＲＧ４−／−マウスに関する数週間での創傷面積（ｍｍ2）対損傷後の時間の折れ線グラフである。点線は、ＰＲＧ４処置を表す。６匹の雄及び６匹の雌で１つの群当たりＮ＝１２。元々の損傷は、４ｍｍ2パンチであった。
【図１４Ｃ】[0040]耳パンチ損傷を受け、且つ示したようにＤＭＳＯ又はｒｈＰＲＧ４で処置されたＣ５７ＢＬ／６マウス、ＰＡＩ−／−マウス、ＴＬＲ４−／−マウス、及びＰＡＩ−／−ＴＬＲ４−／−マウスに関する数週間での創傷面積（ｍｍ2）対損傷後の時間の折れ線グラフである。６匹の雄及び６匹の雌で１つの群当たりＮ＝１２。元々の損傷は、４ｍｍ2パンチであった。
【図１４Ｄ】[0040]耳パンチ損傷を受け、且つ示したようにＤＭＳＯ又はｒｈＰＲＧ４で処置されたＣ５７ＢＬ／６マウス、ＰＡＩ−／−マウス、ＴＬＲ４−／−マウス、及びＰＡＩ−／−ＴＬＲ４−／−マウスに関する数週間での創傷面積（ｍｍ2）対損傷後の時間の折れ線グラフである。６匹の雄及び６匹の雌で１つの群当たりＮ＝１２。元々の損傷は、４ｍｍ2パンチであった。
【図１５】[0041]耳パンチによる損傷からの所与の日数でのマクロファージ（Ｆ４／８０＋；左）及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ；右）におけるＶＥＧＦ（上部）、ＴＧＦβ（中央）、及びＰＲＧ４（下部）の相対的な発現を示す一連の棒グラフである（１つの時点当たりｎ＝３）。
【図１６Ａ】[0042]Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＰＲＧ４−／−ノックアウトマウス、及びＴＬＲ４−／−でのＣＤ３８＋マクロファージ（Ｍ１）及びＣＤ２０６＋マクロファージ（Ｍ２）の存在を示すフローサイトメトリーデータと、様々な処置群でのＣＤ３８＋細胞の割合を示す棒グラフとを含む。
【図１６Ｂ】[0042]Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＰＲＧ４−／−ノックアウトマウス、及びＴＬＲ４−／−でのＣＤ３８＋マクロファージ（Ｍ１）及びＣＤ２０６＋マクロファージ（Ｍ２）の存在を示すフローサイトメトリーデータと、様々な処置群でのＣＤ３８＋細胞の割合を示す棒グラフとを含む。
【図１７】[0043]損傷後４週間でのαＳＭＡ（白色）によるマウス耳組織の免疫組織化学染色の一連の画像を示す。白線は、元々の創傷部位を示す。（３匹の雄及び３匹の雌で１つの群当たりｎ＝６）。
【図１８Ａ】[0044]示されているようにｒｈＰＲＧ４又はＤＭＳＯで処置された非損傷Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＴＬＲ４−／−から採取されたマクロファージ（Ｆ４／８０＋）及びＭＳＣ（Ｓｃａ１＋ＣＡ１４０ａ＋）の割合を示すフローサイトメトリーデータを含む。
【図１８Ｂ】[0044]示されているように様々な処置群における相対的なＮＦκＢ発現又は相対的な遺伝子発現を示す棒グラフを含む。（３匹の雄及び３匹の雌で１つの群当たりｎ＝６）。
【図１９】[0045]損傷から数週間の期間にわたり測定した損傷前の非損傷血流レベルと比較してマウス耳における損傷部位での血流を示す折れ線グラフである。ｒｈＰＲＧ４処置は、損傷部位での血流を有意に増加させた。（３匹の雄及び３匹の雌で１つの群当たりｎ＝６）。元々の損傷は、４ｍｍ2パンチであった。
【図２０】[0046]示したように様々な処置群における損傷後１週間での損傷したマウス耳内の１ｍｍ2当たりのＣＤ３１＋血管の数の散布図である。（３匹の雄及び３匹の雌で１つの群当たりｎ＝６）。元々の損傷は、４ｍｍ2パンチであった。
【図２１】[0047]ＤＡＰＩ（即ち、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）によるマウス耳組織の免疫組織化学染色の一連の画像である。上部のパネルでは、組織サンプル全体にわたり広がっている青色染色の存在は、核を示し、赤色染色の存在（同様に画像全体にわたり広がっている）は、ＭＳＣを示す。左下のパネル（ＰＲＧ４による処置）では、新たな組織（＃１  皮膚、＃２  軟骨、及び＃３  毛包）へのこれらのＭＳＣの寄与が追跡され、右側のパネルでのＤＭＳＯ処置マウスでは、ＭＳＣは線維様組織（＃４）に寄与した。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の詳細な説明
[0048]  創傷治癒は、損傷後に組織が自己修復する複雑なプロセスであり、様々な生理学的プロセス（例えば、止血、炎症、血管新生等の新規組織の増殖及び成長、並びに組織の再構築又は成熟）を含む。創傷とは、身体組織の外部又は内部の切断を伴う損傷のことである。例えば、創傷は、身体内の臓器若しくは組織の上皮層の破壊を伴う内部であり得るか、又は皮膚若しくは眼の上皮層の破壊を伴う外部であり得る。創傷治癒は、そのような創傷が修復され且つ身体組織の切断が閉じるプロセスを指す。
【００２７】
[0049]  創傷治癒反応は、動物界での最も原始的な且つ保存されている生理学的反応の１つであり、なぜならば、組織の完全性／恒常性の回復が生死の分かれ目であり得るからである。哺乳類での創傷治癒は、免疫細胞と、瘢痕の形成による創傷の閉鎖を媒介するために他の組織常在細胞（例えば成体幹細胞）を調節し得る炎症性シグナル伝達分子とにより主に媒介されている。本明細書で実証されているように、本出願人は、魚から象までの動物界全体にわたり見出されるタンパク質であるラブリシン（Ikegawa et al., Cytogenet Cell Genet, 2000, 90(3-4):291-7）が、損傷直後の幹細胞で高度に発現されることを観察している。
【００２８】
[0050]  本明細書で実証されているように、ラブリシンは、１）線維化反応を阻害することにより、２）血管新生及び損傷への血流を増加させることにより、３）炎症反応（例えば、Ｍ１に対してＭ２へのマクロファージの分極）を調節することにより、並びに４）組織修復を媒介するために免疫細胞及び成体幹細胞（ＭＳＣ）を動員することにより、内在性の創傷修復及び組織再生を増強する。
【００２９】
[0051]  図１は、ラブリシンがこれらの効果を達成する潜在的な機序を示す。本質的には、正常レベルのラブリシンが創傷部位に存在する場合には、線維化及び炎症促進性サイトカインの増加は瘢痕化を引き起こすが、ラブリシンが、生理学的に利用可能なレベルよりも高いレベルで創傷部位に存在する場合には、線維化が阻害され、マクロファージは、抗炎症性サイトカインの発現を引き起こすＭ２分極を示し、且つ他の経路が活性化されて血管新生、及び免疫、及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が動員され、その結果、瘢痕形成を最小限に抑えるか又は瘢痕を形成することなく優れた創傷治癒が得られる。従って、本発明によれば、且つ本明細書で実証されているように、ラブリシンは、瘢痕形成を引き起こす線維化を減少させるか又は阻害することによるだけでもなく、抗炎症性サイトカインの発現を引き起こすＭ２分極をマクロフアージが示すのを促進することによっても、及び血管新生、及び免疫、及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が動員される他の経路の活性化によっても、創傷治癒及び組織再生を促進する。
【００３０】
[0052]  多くの組織は、通常の状況下では十分な創傷治癒を示すが、一次侵襲（primary insult）（損傷／疾患）が持続する場合には、慢性炎症及び不適切な線維性修復が引き起こされ得る。潰瘍性病変で見られるように、慢性炎症は治癒を妨げる。皮膚の線維化が続くと、瘢痕化が引き起こされて美観が損なわれるが、臓器でのマトリックスの進行性沈着により、臓器の構造及び機能が損なわれて疾患及び死亡が引き起こされる（Gurtner et al., Nature, 2008, 453:314）。
【００３１】
[0053]  本明細書で説明されている創傷治癒においてラブリシンにより調節される経路を理解することは、ラブリシンを使用して、同種の正常細胞による損傷組織の再生を促進し得ること、及びラブリシンの発現を調節することにより、線維性修復反応の代わりに再生反応が誘発されて創傷治癒が増強され得ることを示唆する。
【００３２】
[0054]  線維性修復反応により、瘢痕組織が形成される。この生理学的プロセスでは、損傷組織は、線維化に起因して（正常組織ではなく）瘢痕組織に置き換えられ、その結果、正常な皮膚とは異なる方法でコラーゲンが沈着する。しかしながら、本発明の方法は、組織の再生又は新生をもたらす創傷治癒への生理学的アプローチを促進し、即ち、線維性瘢痕化沈着ではなく、損傷組織の新たな正常の且つ機能的な組織への置き換えを促進する。例えば、本発明の方法によれば、破損した又は損傷した組織が正常で健康な細胞／組織に置き換えられ、且つ損傷部位で瘢痕形成が減少するか又は除去される。本明細書で実証されているように、この再生反応は、ラブリシンの、血管新生を促進する能力、線維化反応を阻害する能力、Ｍ１からＭ２へのマクロファージ分極を促進し、それにより炎症反応を炎症促進性から抗炎症性へと調節する能力、並びに組織修復及び組織損傷部位を媒介するために免疫細胞及び成体幹細胞（ＭＳＣ）を動員する能力に起因する。
【００３３】
[0055]  従って、本発明は、創傷治癒又は組織再生を促進し、同時に瘢痕形成を減少させる方法であって、ラブリシン（ＰＲＧ４）を創傷に投与する方法を提供する。本発明の一実施形態によれば、創傷部位で観察される組織再生のレベルは、外来性ラブリシンを使用することなく起こるであろうレベルと比べて高く、且つ瘢痕形成のレベルは、外来性ラブリシンを使用することなく起こるであろうものと比較して低い。
【００３４】
ＰＲＧ４タンパク質
[0056]  ラブリシンとも称されるＰＲＧ４は、ヒトでは巨核球刺激因子（ＭＳＦ）遺伝子から発現される潤滑ポリペプチド（ＰＲＧ４としても既知である）である（NCBI Accession Number AK131434-U70136を参照されたい）。ラブリシンは、身体の関節面を被覆する遍在性の内在性糖タンパク質である。ラブリシンは、主に強力な細胞保護性で抗付着性の境界潤滑剤として作用する高表面活性分子（例えば水を保持する）である。この分子は、この分子が組織表面に付着して保護することを可能にする、末端タンパク質ドメイン間に位置する長い中心ムチン様ドメイン（central mucin-like domain）を有する。この中心ムチン様ドメインの天然形態は、調査した全ての動物において、ＫＥＰＡＰＴＴ（配列番号３）と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列の複数の反復配列を含む。天然ラブリシンは、典型的には、この反復配列の複数の冗長な形態を含み、この反復配列は、典型的には、プロリン残基及びスレオニン残基を含み、少なくとも１つのスレオニンは、ほとんどの反復配列においてグリコシル化されている。スレオニンアンカー型Ｏ−結合糖側鎖（threonine anchored O-linked sugar side chain）は、ラブリシンの境界潤滑機能に重要である。この側鎖部分は、典型的には、β（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ部分であり、このβ（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃは、典型的には、シアル酸又はＮ−アセチルノイラミン酸でキャップされている。このポリペプチドはまた、Ｎ−結合オリゴ糖も含む。天然に存在する完全長のラブリシンをコードする遺伝子は、１２個のエクソンを含み、天然に存在するＭＳＦ遺伝子産物は、ヘモペキシン様領域及びソマトメジン様領域を含むビトロネクチンに対する複数のポリペプチド配列相同性を有する１，４０４個のアミノ酸（分泌配列を含む）を含む。中心に位置するエクソン６は、９４０個の残基を含む。エクソン６は、反復配列に富むＯ−グリコシル化されたムチン様ドメインをコードする。
【００３５】
[0057]  ラブリシンのタンパク質骨格のアミノ鎖配列は、ヒトＭＳＦ遺伝子のエクソンの選択的スプライシングに応じて異なり得る。異質性に対するこの頑健性は、中心ムチンドメインから４７４個のアミノ酸を欠失しているが、それでもなお、変異しているが妥当な潤滑を達成するラブリシンの組換え形態を研究者らが作製した場合に例示された（Flannery et al., Arthritis Rheum 2009; 60(3):840-7）。ＰＲＧ４は、単量体としてだけでなく、Ｎ−末端及びＣ−末端の両方において保存されたシステイン−リッチドメインを介してジスルフィドした二量体及び多量体としても存在することが分かっている。Lubris, LLCは、ヒトラブリシンの完全長組換え形態を開発している。この分子は、Selexisのチャイニーズハムスター卵巣細胞系統（ＣＨＯ−Ｍ）を使用して発現されており、最終的な見かけ上の分子量は４５０〜６００ｋＤａであり、多分散多量体が１，０００ｋＤａ以上で測定されることが多く、これらは全て、ＳＤＳトリス酢酸３〜８％ポリアクリルアミドゲルによる分子量標準物質との比較によって推定された。全グリコシル化の内、約半分は二糖単位（ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ）を含み、半分が三糖単位（ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−シアル酸）を含む。この組換えヒトＰＲＧ４産生方法は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１４／０６１８２７号で開示されている。
【００３６】
[0058]  様々な天然の及び組換えのＰＲＧ４タンパク質及びアイソフォームの内のいずれか１つ又は複数を、本明細書で説明されている様々な実施形態で利用し得る。例えば、米国特許第６，４３３，１４２号；同第６，７４３，７７４号；同第６，９６０，５６２号；同第７，０３０，２２３号、及び同第７，３６１，７３８号は、ヒトＰＲＧ４発現産物の様々な形態を作製する方法を開示しており、これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の実践での使用に好ましいのは、ＣＨＯ細胞から発現された完全長のグリコシル化された組換えＰＲＧ４（即ちラブリシン）である。このタンパク質は、Ｏ−結合β（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃオリゴ糖により様々にグリコシル化された配列ＫＥＰＡＰＴＴ（配列番号３）の反復配列を含む中心エクソンと、ビトロネクチンに対する相同性を有するＮ末端配列及びＣ末端配列とを含む１，４０４個のアミノ酸（図１２；配列番号１を参照されたい）を含む。この分子は、個々の分子のグリコシル化パターンが変化している多分散であり、単量体種、二量体種、及び多量体種を含み得る。
【００３７】
[0059]  本明細書で使用される場合、用語「ＰＲＧ４」は、用語「ラブリシン」と互換的に使用される。広義には、これらの用語は、任意の機能的な単離された又は精製された天然の又は組換えのＰＲＧ４タンパク質、その相同体、機能的断片、アイソフォーム、及び／又は変異体を指す。全ての有用な分子は、好ましくはＯ−結合グリコシル化と一緒に、エクソン６によりコードされる配列、又はその相同体若しくはトランケート型バージョン（例えば、この中心ムチン様ＫＥＰＡＰＴＴ反復配列ドメイン内の反復配列がより少ないバージョン）を含む。全ての有用な分子はまた、エクソン１〜５及び７〜１２によりコードされる配列の少なくとも生物学的に活性な部分（即ち、ＥＣＭ及び内皮表面に対する親和性のこの分子への付与に関与する配列）も含む。ある特定の実施形態では、好ましいＰＲＧ４タンパク質は、５０ｋＤａ〜５００ｋＤａの平均モル質量を有し、好ましくは２２４〜４６７ｋＤａの平均モル質量を有し、ＰＲＧ４タンパク質の１種若しくは複数種の生物学的に活性な部分、又はその機能的断片（例えば潤滑断片）若しくは相同体を含む。より好ましい実施形態では、ＰＲＧ４タンパク質は、２２０ｋＤａ〜約２８０ｋＤａの平均モル質量の単量体を含む。
【００３８】
[0060]  実施形態によっては、機能的に又は生物学的に活性なＰＲＧ４断片及び相同体は、配列番号１との、又はＰＲＧ４のエクソン１〜５及び７〜１２によりコードされる配列との、又は配列番号１の残基２５〜１４０４との少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％のアミノ酸配列同一性を有することが意図されている。実施形態によっては、機能的に又は生物学的に活性なＰＲＧ４断片及び相同体は、配列番号１の残基２５〜１４０４との少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％の配列同一性を有することが意図されている。別の実施形態では、ＰＲＧ４は、組換えヒトラブリシンである。別の実施形態では、ＰＲＧ４は、配列番号１のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、ＰＲＧ４は、配列番号１の残基２５〜１４０４のアミノ酸配列を有する。
【００３９】
[0061]  ２種のアミノ酸配列又は２種の核酸のパーセント同一性を決定するために、これらの配列を、最適な比較目的のためにアラインさせる（例えば、第２のアミノ酸配列又は核酸配列との最適なアラインメントのために、第１のアミノ酸配列又は核酸配列の配列にギャップを導入し得る）。これら２種の配列の間のパーセント同一性は、これらの配列により共有される同一の位置の数の関数である（即ち、％同一性＝（同一の位置の数／位置の総数）×１００）。２種の配列の間のパーセント相同性の決定を、数学的アルゴリズムを使用して達成し得る。２種の配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの比限定的な例は、Karlin and Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-77のように改変されているKarlin and Altschul, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-68のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol., 215:403-10のNBLASTプログラム及びXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレトイド検索を、NBLASTプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施し得る。BLASTタンパク質検索を、XBLASTプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施し得る。比較目的のためにギャップアラインメントを得るべく、Gapped BLASTを、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Research, 25(17):3389-3402で説明されているように利用し得る。BLASTプログラム及びGapped BLASTプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラム（例えば、XBLAST及びNBLAST）のデフォルトパラメータを使用し得る。
【００４０】
[0062]  実施形態によっては、機能的ＰＲＧ４断片及び相同体は、天然ＰＲＧ４と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％の活性（例えば生物学的活性）を有することが意図されている。
【００４１】
[0063]  ＰＲＧ４タンパク質等のタンパク質の単離方法、精製方法、及び組換え発現方法は、当分野で公知である。ある特定の実施形態では、この方法は、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ等の標準的な分子生物学技術を使用して、ＰＲＧ４タンパク質又はアイソフォームをコードするｍＲＮＡ及びｃＤＮＡをクローニングして単離することで始まる。次いで、ＰＲＧ４タンパク質又はアイソフォームをコードする単離ｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングし、組換えＰＲＧ４タンパク質を産生するための宿主細胞で発現させ、細胞培養物上清から単離する。組換えヒトＰＲＧ４の産生方法は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１４／０６１８２７号に記載されている。
【００４２】
処置する創傷又は組織損傷の種類
[0064]  既に述べたように、創傷とは、身体組織の外部又は内部の切断を伴う損傷のことである。例えば、創傷は、身体内の臓器若しくは組織の上皮層の破壊を伴う内部であり得るか、又は皮膚若しくは眼の上皮層の破壊を伴う外部であり得る。創傷治癒は、そのような創傷が修復され且つ身体組織の切断が閉じるプロセスを指す。
【００４３】
[0065]  一態様では、本発明の方法は、ＰＲＧ４による皮膚の創傷又は損傷組織の処置を提供する。創傷は、表皮、真皮、若しくは皮下組織、又はこれらの層の内の１つ若しくは複数に存在し得る。組織損傷は、打撲、血腫、又は壊死によるケースのように、表皮はまだ損なわれていない可能性があるが、真皮、皮下組織、さらには筋肉組織への損傷が存在する場合には、皮膚の表面下に存在し得る。
【００４４】
[0066]  本発明の方法は、皮膚への創傷（例えば、切り傷、裂創、裂傷、熱傷、打撲傷、剥離、穿刺、又は外科的切開）の処置を意図する。潰瘍等の創傷の処置も、本発明により意図されている。例えば、圧迫潰瘍（床ずれ若しくは褥瘡）、糖尿病性潰瘍、又は壊死若しくは感染により引き起こされる潰瘍を、本発明の方法に従ってラブリシンで処置して、組織再生を促進し且つ瘢痕形成を減少させ得る。？瘡の処置も意図されており、なぜならば、？瘡は、皮膚の上皮組織の破壊を伴うからである。
【００４５】
[0067]  本発明の方法はまた、ＰＲＧ４を使用する、眼への創傷の処置及び眼での異常な創傷治癒の処置も意図する。眼での異常な創傷治癒及び創傷治癒障害は、炎症性細胞の活性化、増殖因子及びサイトカインの放出、眼細胞の増殖及び分化、毛細血管透過性の増加、基底膜マトリックス組成物の変化、細胞外マトリックスの沈着の増加、線維化、血管新生、並びに組織再構築により、重度の眼組織損傷を引き起こす場合がある。特に、角膜での異常な創傷治癒は、健康な角膜には存在しない血管及びリンパ管が生じる場合がある。さらに、角膜実質への損傷は必ずしも角膜瘢痕化を誘発するとは限らないことから、角膜瘢痕化は、眼での異常な創傷治癒の結果である。
【００４６】
[0068]  従って、本発明の方法は、ＰＲＧ４を使用する、眼の創傷又は損傷組織の処置を提供する。一実施形態では、本発明の方法は、眼にラブリシンを投与することによる、この眼での異常な創傷治癒又は創傷治癒障害の処置を提供する。このラブリシンを、眼での創傷の特定の位置に投与してもよいし、眼に全体的に投与してもよい。処置され得る一部の創傷として、眼への眼科手術により引き起こされたものが挙げられる。例えば、一実施形態では、本発明の方法は、レーザー照射への眼の曝露に起因する角膜混濁を予防する、及び／又は処置する。一実施形態では、本発明の方法は、角膜での創傷治癒を促進し、それにより、角膜への外科的損傷又は外傷（例えば、侵襲的な又は非侵襲的な角膜手術と関連する外傷）と関連する角膜瘢痕組織の形成を予防するか又は阻害する。例えば、角膜への外傷は、レーザー角膜移植手順、又はレーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）、又はレーザーインサイチュ角膜切削形成術（ＬＡＳＩＫ）、又はレーザー上皮下角膜切削形成術（ＬＡＳＥＫ）に起因し得る。他の実施形態では、眼へのＰＲＧ４の投与により、角膜の創傷治癒が促進される。例えば、本発明の方法に従う眼へのＰＲＧ４の投与を使用して、角膜の瘢痕化を処置し得るか又は予防し得る。角膜の瘢痕化は、例えば、数ある中でも特に、帯状疱疹、単純ヘルペス１型若しくは２型、コンタクトレンズの使用、又は事故若しくは負傷に起因する角膜の引っ掻き傷若しくは熱傷により引き起こされ得る。実施形態によっては、ＰＲＧ４を眼に投与して、角膜の混濁に起因して視界不良又は視力の低下を引き起こす可能性がある（例えば角膜での）既存の瘢痕組織の存在を減少させる。一実施形態によれば、この眼は、ヒトの眼である。一実施形態によれば、この眼は、疾患又は損傷を受けた場合に異常な創傷治癒のリスクがある。例えば、外科的損傷（例えば、限定されないが、ＰＲＫ、ＬＡＳＥＫ、若しくはＬＡＳＩＫ）、又は事故による損傷、又は眼に触れる物体からの眼は、この眼を、異常な創傷治癒のリスクにさらす可能性がある。例えば、疾患（例えば、眼に損傷を与える可能性がある前述のウイルス性疾患）も、眼を、異常な創傷治癒のリスクにさらす可能性がある。
【００４７】
[0069]  本発明の方法は、例えば外傷（例えば、転倒、自動車事故、穿刺又はナイフ創傷、銃撃、若しくは鈍器外傷；内出血若しくは打撲；又は外科的損傷）の結果としての、皮膚を超えた組織及び臓器への内部損傷の処置を提供する。従って、ラブリシンを神経系（脳、脊髄、神経）の組織、筋肉組織、上皮組織、又は結合組織に投与して、創傷治癒及び組織再生を促進し、同時に瘢痕組織の形成を減少させ得る。耳、眼、唇、腎臓、肝臓、膵臓、肺、胃、食道、気管、膀胱、腸、結腸、心臓、内分泌器官、又は血管への創傷の処置及び瘢痕化の減少も、本発明により意図されている。内部損傷の処置のために、ラブリシンを、局所注射により投与してもよいし、外科的介入により局所的に投与してもよい。創傷治癒のための静脈内全身投与も意図されている。本発明は、身体中の外科的創傷（例えば、例えば消化管での上皮組織を穿孔するか又は破断するもの）の処置を意図する。
【００４８】
[0070]  一実施形態では、処置する創傷は、非骨性であり、骨以外であり、及び非関節性である位置に存在する。一実施形態では、処置する創傷は、骨、又は関節、又は関節軟骨、又は腱、又は靱帯での創傷ではない。従って、本発明は、組織再生又は創傷治癒を促進し、同時に瘢痕形成を減少させる方法であって、ＰＲＧ４を、必要な患者での創傷又は組織損傷部位に投与し、この創傷は、骨、又は関節、又は関節軟骨、又は腱、又は靱帯には存在しない、方法を含む。本発明は、組織再生又は創傷治癒を促進し、同時に瘢痕形成を減少させる方法であって、ＰＲＧ４を、必要な患者での創傷又は組織損傷部位に投与し、この創傷は、非骨性であり、骨以外であり、及び非関節性である位置に存在する、方法を含む。一実施形態では、処置する創傷は、軟骨での創傷ではない。従って、本発明は、組織再生又は創傷治癒を促進し、同時に瘢痕形成を減少させる方法であって、ＰＲＧ４を、必要な患者での創傷又は組織損傷部位に投与し、この創傷は軟骨に存在しない、方法を含む。一実施形態では、処置する創傷は、関節軟骨ではない軟骨での創傷である。従って、本発明は、組織再生又は創傷治癒を促進し、同時に瘢痕形成を減少させる方法であって、ＰＲＧ４を、必要な患者での創傷又は組織損傷部位に投与し、この創傷は、関節軟骨ではない、方法を含む。例えば、この軟骨は、耳又は鼻に存在する可能性がある。
【００４９】
[0071]  本発明はまた、皮膚上か又は身体中の他の箇所で、患者での既存の瘢痕の外観を除去するか又は低減する方法も提供する。そのような方法によれば、瘢痕組織を、例えば外科的切除により除去し得、ラブリシンを瘢痕除去の領域に与えて、既存の瘢痕の部位での組織再生を促進させる。
【００５０】
[0072]  本発明の方法は、組換えヒトラブリシンを含む医薬組成物を、創傷被覆材の含浸物として創傷又は組織損傷に適用し得ることを提供する。この創傷被覆材は、ガーゼ、パッド、又は包帯であり得る。ラブリシンを含浸させ得る材料として、下記が挙げられる：綿、ポリエステル、レーヨン、若しくは前述の織物のブレンド、アルギン酸カルシウム若しくはアルギン酸ナトリウム、ポリエチレン、ポリウレタンのフィルム若しくは発泡体、ポリアクリレート、ポリプロピレン、セルロース、ポリエステルフィルム、ナイロン、エラスタン、又は包帯若しくは創傷被覆材に適切な他の材料。
【００５１】
[0073]  本発明の方法によれば、処置する創傷又は組織損傷は、ヒト患者上／中に存在する。しかしながら、ウマ若しくはイヌ、又は他の哺乳動物の処置も意図されている。そのような獣医学的用途では、処置する特定の種由来の天然の又は組換えのラブリシンを使用し得る。
【００５２】
[0074]  さらに、本発明はまた、血管新生を誘発する方法も提供する。例えば、本発明によれば、血管新生を誘発する方法は、血管新生が必要である患者の身体上の部位に、ラブリシンを含む医薬組成物を適用することを含む。この部位は、例えば、皮膚の創傷（例えば、切り傷、熱傷、剥離、穿刺、若しくは裂創）の可能性があるか、又はこの部位は、人体の臓器若しくは他の組織での損傷の可能性がある。
【００５３】
ＰＲＧ４の投与
[0075]  ＰＲＧ４は身体内で自然に産生されるが、患者での組織損傷の部位に外来性ＰＲＧ４を投与した場合には、本発明の効果が観察される。従って、一実施形態では、患者に投与するＰＲＧ４は、外来性ヒトＰＲＧ４であるが、別の実施形態では、患者に投与するＰＲＧ４は、組換えヒトＰＲＧ４（ｒｈＰＲＧ４）である。別の実施形態では、ｒｈＰＲＧ４は、配列番号１の配列を有するが、別の実施形態では、ｒｈＰＲＧ４は、配列番号１の残基２５〜１４０４の配列を有する。
【００５４】
[0076]  ＰＲＧ４を、多くの方法により患者に投与し得る。例えば、ＰＲＧ４を、創傷部位に局所的に投与してもよいし、ＰＲＧ４を、例えば注射により創傷部位に局所的に投与してもよい。ＰＲＧ４をまた、静脈内投与により全身投与してもよい。
【００５５】
[0077]  投与するＰＲＧ４の量は、創傷のサイズ、創傷の深さ、及び身体での創傷の位置等の変数に依存するだろう。
【００５６】
[0078]  実施形態によっては、本発明に従う局所的な又は局所注射による組織損傷部位への投与のためのＰＲＧ４の治療上有効な量は、０．１μｇ／ｋｇ〜４０００μｇ／ｋｇ、又は０．１μｇ／ｋｇ〜１０００μｇ／ｋｇ、又は０．１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、又は０．１〜５０μｇ／ｋｇの範囲である。実施形態によっては、投与するＰＲＧ４の治療上有効な量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、又は１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、又は１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。投与するＰＲＧ４はまた、０．１μｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬ、又は１μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、又は１０μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ、又は１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ、又は５０μｇ／ｍＬ〜１５０μｇ／ｍＬの範囲でもあり得る。実施形態によっては、ＰＲＧ４を、約１００μｇ／ｍＬの濃度で投与する。実施形態によっては、ＰＲＧ４を、１回の用量当たり１〜１００μＬという少量で投与する。
【００５７】
[0079]  ある特定の実施形態では、総量２ｍｇ〜１０ｍｇ（例えば、２ｍｇ〜１０ｍｇ、２ｍｇ〜５ｍｇ、２ｍｇ〜３ｍｇ、３ｍｇ〜４ｍｇ、４ｍｇ〜５ｍｇ、５ｍｇ〜６ｍｇ、６ｍｇ〜７ｍｇ、７ｍｇ〜８ｍｇ、８ｍｇ〜９ｍｇ、９ｍｇ〜１０ｍｇ、又は５ｍｇ〜１０ｍｇ）のラブリシンを、一度に創傷に投与する。ある特定の実施形態では、１０ｍｇ超のラブリシンを、創傷に投与する。本発明では、静脈内投与に使用されるＰＲＧ４の用量は、局所的投与又は局所投与に使用される用量と比べて少なくとも１．５倍高いか、又は少なくとも２倍高いか、又は少なくとも３倍高いか、又は少なくとも４倍高いか、又は少なくとも５倍高いか、又は少なくとも１０倍高いことが意図されている。
【００５８】
[0080]  ある特定の実施形態では、創傷に投与するラブリシンの量は、この創傷のサイズに基づく。例えば、投与するラブリシンの量は、１ｃｍ2の創傷面積当たり１０μｇ〜１０００μｇの範囲であるか、又は１ｃｍ2の創傷面積当たり５０μｇ〜５００μｇの範囲であるか、又は１ｃｍ2の創傷面積当たり５０μｇ〜３００μｇの範囲であるか、又は１ｃｍ2の創傷面積当たり１０μｇ〜１５０μｇの範囲であるか、又は１ｃｍ2の創傷面積当たり５μｇ〜１００μｇの範囲であるか、又は１ｃｍ2の創傷面積当たり２５μｇ〜１５０μｇの範囲であるか、又は１ｃｍ2の創傷面積当たり４０μｇ〜１２０μｇの範囲であるか、又は１ｃｍ2の創傷面積当たり７０μｇ〜１００μｇの範囲であるか、又は１ｃｍ2の創傷面積当たり５０μｇ〜１５０μｇの範囲であるか、１ｃｍ2の創傷面積当たり７５μｇ〜１００μｇの範囲であるか、又は１ｃｍ2の創傷面積当たり約８０μｇの量である。ラブリシンを送達するための医薬組成物の製剤に応じて、この製剤中のラブリシンの量は、担体から創傷部位へのラブリシンの前述の量の送達を確実にするために調整が必要な場合がある。治療上有効な量のラブリシンの担体からの送達を確実にするための製剤の調整は、当該技術分野の技術の範囲内である。
【００５９】
[0081]  組織損傷部位へのラブリシンの投与を、創傷治癒が完了するまで、毎日、１日おきに、３日毎に、４日毎に、５日毎に、６日毎に、１週間に１回、又は１週間おきに実行し得る。完全な処置は、例えば、１週間、２週間、３週間、又は１ヶ月にわたり得る。慢性的な皮膚の状態を処置する場合には、この状態の解消に必要とされる限り、処置を継続し得る。
【００６０】
[0082]  ＰＲＧ４の全身投与も、本発明のいくつかの実施形態により意図されている。例えば、ＰＲＧ４を、経腸的な方法（例えば、経口送達、直腸送達、舌下送達、唇下送達、又は頬送達）で全身投与し得る。ＰＲＧ４を、吸入送達、静脈内送達、筋肉内送達、皮下送達、皮内送達、又は経粘膜送達により、非経口的な方法（例えば経鼻）で全身投与し得る。
【００６１】
[0083]  眼へのＰＲＧ４の送達のために、ラブリシンを、溶液、懸濁液、乳濁液、又はゲルに組み込み得る。ＰＲＧ４の眼科用組成物を、例えば、コラーゲンシールド、コンタクトレンズ、又は眼表面上に配置されている角膜への薬剤の送達が可能な他の固体マトリックスの使用により、眼に送達し得る。同様に、ＰＲＧ４を、点滴薬又は軟膏として眼に送達し得る。例えば、ＰＲＧ４を、眼の表面に適用してもよいし、眼の結膜嚢に適用してもよいし、眼の潅注により適用してもよい。眼科用途では、ＰＲＧ４を、創傷又は損傷の発生後に可能な限り早く、且つＰＲＧ４が創傷又な損傷の部位と接触し続けて涙管に速やかに流されないことを可能にする方法により、創傷又は損傷の位置に送達すべきである。しかしながら、このことが発生した場合には、治癒を確実にすべく創傷表面との接触の継続を確実にするためには、ＰＲＧ４の再適用が必要な場合がある。
【００６２】
[0084]  本明細書で意図されているＰＲＧ４の全身投与の好ましい経路は、静脈内投与である。最適な用量を、創傷のサイズ、創傷の位置、並びに組織損傷のレベル及び種類等の変数に応じて、日常的な実験により決定し得る。全身投与の場合、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、或いは０．５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、或いは１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、或いは２ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、或いは５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、或いは０．０５〜１．５０ｍｇ／ｋｇの用量を投与し、損傷の完全な治癒が達成されるまで、例えば、１日に１回、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、１週間おきに１回で投与し得る。
【００６３】
医薬製剤
[0085]  創傷治癒及び血管新生の促進での使用のために、投与されるＰＲＧ４は、好ましくは、薬学的に許容される担体と組み合わせられている。薬学的に許容される担体として、合理的なベネフィット／リスク比に応じて、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴うことなくヒト及び動物の組織と接触した使用に適した緩衝液、担体、及び添加剤が挙げられる。この担体は、製剤の他の成分に適合し且つレシピエントに対して有害ではないという意味で「許容される」べきである。薬学的に許容される担体として、薬学的投与に適合する緩衝液、溶媒、分散媒体、コーティング、等張剤及び吸収遅延剤、並びに同類のものが挙げられる。
【００６４】
[0086]  溶液として送達されるＰＲＧ４の場合には、適切な担体として、生理食塩水、静菌水、Cremophor ELTM（BASF, Parsippany, NJ）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。適切な担体として、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、並びにこれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒体も挙げられ得る。この担体は、製造及び貯蔵の条件下で安定しているべきであり、且つ微生物に対して保護されているべきである。薬学的に活性な物質のための担体の使用は、当該技術分野で既知である。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.（Mack Publishing Company, 1990）を参照されたい。
【００６５】
[0087]  実施形態によっては、ＰＲＧ４の医薬製剤は滅菌されている。医薬製剤の滅菌は、既知のメカニズムにより達成可能である。
【００６６】
[0088]  ラブリシンを含む医薬製剤のｐＨは、典型的には３〜１１であり、より好ましくは５〜９又は６〜８であり、最も好ましくは７〜８（例えば７〜７．５）である。
【００６７】
[0089]  局所投与の場合には、ラブリシンを、ペースト、軟膏、クリーム、ローション、ゲル、香油、若しくは膏薬、又は他の懸濁液若しくは乳濁液に組み込み得る。そのような医薬組成物は、下記を含み得る：水；油；増粘剤、例えば、セルロース、ペクチン、メチルセルロース、若しくはカーボポール；緩衝剤、例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、若しくは酒石酸緩衝液；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ若しくはクエン酸；乳化剤、例えば、ワックス、セトステアリルアルコール、若しくはポリソルベート２０；保湿剤、例えば、グリセリン、グリセリル脂肪酸エステル、プロピレングリコール、若しくはポリエチレングリコール；透過促進剤、例えば、ＤＭＳＯ、尿素、トリエタノールアミド、アルコール、脂肪酸、脂肪酸エステル、ポリオール、ラウリル硫酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム、レシチン、Spans（登録商標）、Tweens（登録商標）、ポロクサマー、miglyol（登録商標）、若しくはプロピレングリコール；及び／又は保存料、例えば、安息香酸、アルコール、第四級アンモニウム化合物、若しくは有機水銀化合物、例えばチメロサール。軟膏、香油、又は膏薬は、例えばワセリン又はペトロラタムを含み得、且つ油性基剤、吸収性基剤、油中水型乳濁液基剤、水中油型乳濁液基剤、又は水溶性基剤で作られ得る。クリーム及びローションとして、油中水型乳濁液又は水中油型乳濁液が挙げられ得る。ゲルは、化学的な若しくは物理的なゲル又は単相系若しくは二相系を含むヒドロゲル基剤又はオルガノゲル基剤を含み得る。これらの局所製剤に適した基剤として、ペトロラタム、白色ペトロラタム、黄色軟膏若しくは白色軟膏、鉱物油、ラノリン、コレステロール、ステアリルアルコール、ポリエチレングリコール、白色ワックス、カルボマー、カルボキシメチルセルロース、又はヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられ得る。局所製剤用の基剤は、皮膚に適合し、安定し、滑らかであり、柔軟であり、非刺激性であり、且つ水又は他の液体製剤の吸収が可能であり及び組み込まれたラブリシンの医薬活性の放出が可能であるべきである。基剤は、滅菌可能であるべきである。ペースト、軟膏、クリーム、ローション、ゲル、香油、若しくは膏薬の調製は、当業者に既知である。
【００６８】
[0090]  眼への投与の場合には、ＰＲＧ４を、眼科的に許容される製剤（例えば、溶液、又は軟膏、又はゲル、又はコラーゲンインサート）に組み込み得る。製剤は、ＰＲＧ４の徐放を提供し得る。例えば、眼用のＰＲＧ４の徐放製剤を、コラーゲンインサートにより達成し得る。
【００６９】
[0091]  いくつかの実施形態によれば、ラブリシン及び抗生物質を含む医薬製剤が提供される。投与し得る抗生物質の例として、下記が挙げられる：アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、リファキシミン、ロラカルベフ、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム、シラスタチン、メロペネム、セファドロキシル、セファゾリン、セフラジン、セファピリン、セファロチン、セファレキシン、セファクロル、セフォキシチン、セフォテタン、セファマンドール、セフメタゾール、セフォニシド、ロラカルベフ、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフチブテン、セフチゾキシム、モキサラクタム、セフトリアキソン、セフェピム、セフタロリンフォサミル、セフトビプロール、テイコプラニン、バンコマイシン、テラバンシン、ダルババンシン、オリタバンシン、クリンダマイシン、リンコマイシン、ダプトマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン、スピラマイシン、アズトレオナム、フラゾリドン、ニトロフラントイン、リネゾリド、ポジゾリド、トレゾリド、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、ジクロキサシリン（dicloaxcillin）、フルクロキサシリン、メズロシリン（mexclocillin）、メチシリン、ナフシリン（mafcillin）、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＧ、ピペラシリン、テモシリン、チカルシリン、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナジフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、マフェニド、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジメトキシン、スルファニルアミド、スルファサラジン、スルフイソキサゾール、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、スルホンアミドクリソイジン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、クロファジミン、ダプソン、カプレオマイシン（capremoycine）、サイクロセリン、エタンブトール、エチオナミド、イソニアジド、ピラジナミド、リファンピシン、リファンピン、リファブチン（rifaburin）、リファペンチン、ストレプトマイシン、アルスフェナミン、クロラムフェニコール、ホスホマイシン（fosmomycin）、フシジン酸、メトロニダゾール、ムピロシン、プラテンシマイシン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、チアンフェニコール、チゲサイクリン、チニダゾール、又はトリメトプリム。
【００７０】
[0092]  いくつかの実施形態によれば、ラブリシンと、鎮痛剤又は麻酔薬とを含む医薬製剤が提供される。例えば、鎮痛剤又は麻酔薬は、リドカイン、テトラカイン、ベンゾカイン、プリロカイン（priolocaine）、ジブカイン、プラモキシン、プロパラカイン、プロキシメタカイン、アメソカイン塩酸塩、ブタムベン、又はオキシブプロカインであり得る。
【実施例】
【００７１】
実施例１−「スーパーヒーラー」ＭＲＬマウスでのラブリシン発現
[0093]  本出願人は、自然再生能力を有する動物（例えば、ＭＲＬ「スーパーヒーラー」マウス）は、通常、損傷後にラブリシン発現の増加を示すことを発見した。このことを、下記のようにマウスモデルを使用して決定した。
【００７２】
[0094]  耳に２ｍｍ直径のパンチ損傷を与えた後、ＭＲＬマウス、Ｃ５７ＢＬ／６コントロールマウス（未処置）、ラブリシン処置Ｃ５７ＢＬ／６マウス、及びラブリシンノックアウトマウスの耳からの組織サンプルを免疫組織化学染色して、損傷後３日でのこの組織中のラブリシンの存在を観察した。図３に示すように、緑色の染色はラブリシンの存在を示すが、青色の染色は、ラブリシンを含まない通常の細胞を示す。予想したように、青色染色のみにより証明されるようにラブリシンノックアウトマウスではラブリシンが存在しなかった（左下のパネル）が、ＭＲＬ「スーパーヒーラー」マウスでは、画像全体にわたる濃い緑色の蛍光により実証されているようにサンプル全体にわたりラブリシンが豊富であった（右上のパネル）。Ｃ５７ＢＬ／６ラブリシン処置マウスでは、青色及び緑色の均一な混合により証明されているように組織全体にわたりラブリシンが見られた（右下のパネル）が、ラブリシンは、ＭＲＬマウスと同程度まで存在しなかったが、未処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、青色染色のみにより証明されているようにラブリシンが存在しなかった（左上のパネル）。
【００７３】
[0095]  ＭＲＬマウスはまた、瘢痕化が減少している、損傷に対する再生反応も示した。この実験により、ラブリシン染色の増加は、創傷治癒の増加及び損傷後の線維化／瘢痕化の減少と相関していることが実証される。
【００７４】
[0096]  この観察から、ラブリシンは、損傷後の再生反応と比べて修復（瘢痕）を調節する役割を果たすことが示唆される。
【００７５】
実施例２−マウスでの臨界サイズの耳創傷における外来性ラブリシンの効果
[0097]  耳は、上皮、毛包、腺組織、及び軟骨を含む３つ全ての胚葉由来の組織を含むことから、再生を研究するのに理想的なモデルである。従って、創傷治癒への外来性ラブリシンの効果を観察するために、マウスモデルを使用した。
【００７６】
[0098]  各マウスに、０日目に、耳の２ｍｍ直径のパンチアウトを行なった。２４匹のマウスはＣ５７ＢＬ／６マウスであったが、１２匹はラブリシンノックアウトマウス（Ｐｒｇ４tm1Mawa；Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine）であった。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの半分（ｎ＝１２）に、損傷時に、並びに損傷後１、２、及び３週間で、１００μｇ／ｍＬの濃度でパンチ部位にラブリシン２５μＬを局所投与した。他の１２匹のＣ５７ＢＬ／６マウスには、ラブリシンを投与しなかった。
【００７７】
創傷の観察サイズへの効果
[0099]  マウスを、パンチアウト後に１週間に１回観察し、各画像において既知の参照基準と共に創傷部位を撮影することにより、創傷のサイズを測定した。結果を図２に示し、図２は、損傷後４週間まで、ラブリシンを投与したＣ５７ＢＬ／６マウスでの平均創傷直径は約１．０ｍｍ（パンチアウトのサイズの半分）であったが、ラブリシンを投与しなかったＣ５７ＢＬ／６マウスは、平均して１．５０ｍｍに近い創傷サイズを有したことを示す。ノックアウトマウスは、創傷サイズの減少が最も小さかった。このデータは、ラブリシン処置により創傷治癒が有意に増加するが、ラブリシンのノックアウトにより創傷治癒がブロックされることを示す。
【００７８】
損傷部位での血管新生及び血流への効果
[0100]  ラブリシンが損傷部位での血管新生及び血流への効果を有するかどうかを決定するために、Ｃ５７Ｂｌ／６処置マウス及びコントロールマウス、並びにラブリシンＫＯマウスで、耳の損傷部位での血流を測定した。レーザー屈折スペックルパターンを使用して灌流を決定する定量的方法であるレーザースペックル灌流イメージング（laser speckle perfusion imaging）（ＬＳＰＩ）を使用して、測定値を得た。画像の露光時間は１５ミリ秒であった。高解像度画像を、カスタムＬＳＰＩアルゴリズムを使用して処理し、この機器のために事前に定義されて検証された任意の単位である灌流単位（ＰＵ）で測定した定量的カラー灌流マップを作成した（Forrester et al., (2002) Med Biol Eng Comput 40:687-
697; Forrester et al., (2004) EEE Trans Biomed Eng 51:2074-2084）。血流を、１週間に１回定量した。図４に示すように、損傷部位での血流レベルは、ラブリシンを投与しなかったマウス及びラブリシンＫＯマウスと比べて、ラブリシンを投与したＣ５７ＢＬ／６マウスで有意に増加し、このことは、創傷部位への外来性ラブリシンの投与により、創傷組織への血流が有意に増加することを示唆する。
【００７９】
[0101]  血流の増加を観察したことから、マウスを、血管新生（即ち、新規血管の形成）に関しても試験した。標準的な免疫組織化学染色を使用して損傷後１週間で血管新生を測定し、この画像から、陽性の血管の数を定量した。
【００８０】
[0102]  図５に示すように、未処置のＣ５７ＢＬ／６マウスと比較して、ラブリシンを投与したＣ５７ＢＬ／６マウスの治癒組織では、ＣＤ３１+血管の数が増加した。ノックアウトマウスは血管がさらに少なく、このことは、ラブリシンが治癒組織での血管新生への正の効果を有することを示す。
【００８１】
[0103]  図１９に示すように、損傷後１、２、３、及び４週間で測定した耳パンチ創傷により損傷したマウスで測定した場合に、ｒｈＰＲＧ４は、組織損傷部位への血流を有意に増加させた。示すように、ＴＬＲ４−／−マウス（担体又はｒｈＰＲＧ４で処置した）及びｒｈＰＲＧ４で処置したＣ５７ＢＬ／６マウスは、損傷後に最高レベルの血流を有した。
【００８２】
[0104]  同様に、図２０で実証されているように、損傷耳内で測定した１ｍｍ2当たりのＣＤ３１＋血管の数により測定した場合に、耳への４ｍｍ2パンチ損傷後１週間で、ｒｈＰＲＧ４処置マウス及びＴｌｒ４−／−マウスでは血管の数の増加を観察し、Ｐｒｇ４−／−動物ではより少ない血管を観察した。ＰＲＧ４処置動物及びＴＬＲ４−／−動物では、損傷部位での最高レベルの血管新生を観察した。
【００８３】
創傷部位へのＭＳＣ遊走への効果
[0105]  ラブリシンにより媒介される修復における幹細胞の役割も調べた。標識細胞集団の運命を追跡して反応を特徴付けるために、マウスが７〜９週齢である場合に、５連続日中の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射（１日当たり１ｍｇ）により４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ、Sigma Aldrich）でマウスを誘発した。耳中のＰｒｘ１系統ＭＳＣ（ｔｄＴｏｍａｔｏ+ve）の運命マップのために、サンプルを組織学的／蛍光イメージングにより調べた。
【００８４】
[0106]  ラブリシンによる処置によって、組織損傷領域への間葉系幹細胞（ＭＳＣ）遊走を観察した。損傷後１週間以内に、損傷部位でＭＳＣの実質的な増加を観察した。しかしながら、外来性ラブリシン処置のみで、これらのＭＳＣは、新たな耳（耳介軟骨）の再生に寄与した。図６に示すように、赤い点の非存在により証明されているように、非損傷耳組織では、ＭＳＣを本質的に観察しなかった（上のパネル）。しかしながら、ＭＳＣは、創傷をコントロールとして担体で処置した（中央のパネル）及びラブリシンで処置した（下のパネル）損傷耳由来の組織中に存在していた。しかしながら、ラブリシン処置により、ＭＳＣは、耳の損傷した軟骨構造を完全に再配置し、ラブリシンなしでは、ＭＳＣは、ほぼ同量で存在していなかった。このデータは、ラブリシンが組織損傷部位への成体幹細胞（ＭＳＣ）の動員に関与して組織修復を媒介すること、及びラブリシン処置は、これらの細胞の潜在力を、通常の創傷治癒条件下で観察されるものと比べて増強することを示唆する。
【００８５】
[0107]  ラブリシンがＭＳＣに影響を及ぼして創傷治癒を促進させるというさらなる証拠を、図２１の画像に示す。ｒｈＰＲＧ４で処置したＭＳＣ系統レポーターマウスでの全厚耳損傷の後に、Ｔｏｍａｔｏ陽性細胞（ＭＳＣ）の運命マッピングは、このＭＳＣが、軟骨及び真皮の再生の主な貢献者であり、且つ新たな毛包に貢献することを示した（図２１、左側の画像）。この再生反応は、ビヒクル（ＤＭＳＯ；右側の画像）で処置した野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）マウスでは観察されず、興味深いことに、系統がトレースされたＭＳＣ細胞は、無秩序な線維性瘢痕を生じさせた（図２１；右側の画像）。
【００８６】
免疫細胞の動員への効果
[0108]  本出願人は、ラブリシン処置した損傷後のマクロファージの集団及び分極を調べた。創傷部位内に存在する細胞を定量するために、マウスを、最初の耳の創傷損傷と同じ領域で、２ｍｍの貫通した耳パンチで再損傷させた。これにより、最初の損傷から沈着した組織の回収が可能となった。製造手順に従って、gentleMACS（商標）Dissociator (Milteny, Bergisch Gladbach, Germany)を使用して、耳組織を解離させた。得られた細胞懸濁液をろ過し、９０％ＭｅＯＨ  ５００μｌに再懸濁させ、室温で５〜１０分にわたり放置した。次いで、細胞を遠心分離し、液体を除去し、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０  ５００μｌを添加して、室温で２０分にわたり細胞を透過処理した。細胞を再度遠心分離し、液体を除去し、各チューブにＴｗｅｅｎ緩衝液５０μｌ及び抗体０．５μｇを添加し、室温で３０〜４５分にわたり暗所にてインキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣｓ緩衝液で３回洗浄し、次いでＦＡＣｓ緩衝液に再懸濁させた。次いで、ＦＡＣｓ  Ｃａｌｉｂｅｒを使用して細胞を測定した。結果を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。
【００８７】
[0109]  図１１でフローサイトメトリー分析により示すように、コントロール及びラブリシンＫＯマウスと比較して、ラブリシン処置後の損傷耳では、ＣＤ１４+マクロファージ及びＧｒ１好中球の両方の動員の増加を観察した。実際には、未処置Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びラブリシンＫＯマウスと比較して、ラブリシン処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、損傷部位内で約２倍の免疫細胞を見出しており、このことは、創傷部位への外来性ラブリシンの適用により、この部位でのマクロファージ及び好中球の存在が増加することを示す。
【００８８】
考えられる作用機序
[0110]  本明細書のデータは、ラブリシン処置が、１）線維化反応を阻害することにより、２）血管新生及び損傷への血流を増加させることにより、３）炎症反応（例えば、マクロファージの分極）を調節することにより、並びに４）組織再生を媒介するために免疫細胞及び成体幹細胞（ＭＳＣ）を動員することにより、耳内の臨界サイズの欠損の内在性の修復を増強し得ることを示す。本明細書で提供される証拠は、ＰＲＧ４の非存在が（Ｐｒｇ４−／−ＫＯマウスにより実証されているように）正常な治癒を決定的に損なうことを示しており、且つラブリシンが、創傷治癒を調節するために少なくとも下記の３つの経路を介して作用することにより再生反応を促進することを示唆しており、１つは、損傷部位での血管新生及び血流調節のレベルで作用し（ＮＦκＢ／ＨＩＦ１α／ＶＥＧＦ）、１つは、線維化反応を調節し（ＰＡＩ−１）、最後は、Ｍ１表現型又はＭ２表現型のいずれかへのマクロファージの分極を調節する（ＴＬＲ４）。本明細書で提供される証拠は、これらの多面的な効果がラブリシンに特に起因することを示唆しており、なぜならば、これらの効果は、ラブリシン欠乏（ＫＯ）マウスでは生じないからである。これらのインビトロ及びインビボでの予備的な結果は、ラブリシンが、創傷治癒の保存された下記の段階：血液凝固、炎症、組織生成、及び組織再構築の各々の側面を調節することにより、損傷後に、修復反応（瘢痕化）を抑制し、同時に再生反応（治癒）を増強することを示唆する。
【００８９】
[0111]  結果は、ラブリシンが単球／マクロファージ上のＴＬＲ４と相互作用して、これらの免疫細胞の炎症促進性（Ｍ１）対抗炎症性（Ｍ２）の分極を調節することを示唆した。同時に、ラブリシンはまた、ＰＡＩ−１に結合して線維化反応も調節する。それに応じて、ラブリシンは、ＨＩＦ１α及びＶＥＧＦの発現を順に上方調節するＮＦκＢシグナル伝達を調節して、創傷領域内の血流及び血管新生を増加させる。本発明者らはまた、ラブリシンにより媒介される修復における幹細胞の役割も調べており、創傷領域内の組織常在性のＭＳＣが、損傷直後にラブリシン及びＰＡＩ−１の両方を高レベルで発現することを発見している。
【００９０】
ラブリシン−ＰＡＩ−１相互作用
[0112]  プラスミノーゲン活性化阻害因子−１（ＰＡＩ−１）は、セリンプロテアーゼ阻害因子（セルピン）遺伝子ファミリのメンバーであり、セリンプロテアーゼ、ｕＰＡ、及びｔＰＡの阻害因子である（Ghosh et al., J Cell Physiol. 2012, 227(2):493-507）。ｕＰＡ／ｔＰＡの阻害により、プラスミノーゲンからプラスミンへの変換及びプラスミン依存性ＭＭＰ活性化が阻害される。通常の創傷治癒では、ＰＡＩ−１は、ＴＧＦ−βにより上方調節され得、次いで、ｕＰＡ及びｔＰＡに結合して不活性化する（Botta et al., J Cell Sci. 2012, 125(Pt 18):4241-52）。これにより、ＭＭＰの活性化及び組織再構築が阻害される（凝血塊の安定性）。これにより、創傷領域ではフィブリンが増加し、周囲の細胞によるコラーゲン１の産生が対応して増加し、線維化パッチが生じる（瘢痕形成）（Castro et al., J. Biol Chem., 2014, 289(42):29001-13）。
【００９１】
[0113]  典型的には（心臓を除く）、ＰＡＩ−１欠乏動物は、線維化の減少を伴う、損傷後の創傷治癒の増加を示し（Chan et al., Am J Pathol., 2001, 159(5):1681-8; Ghosh et al., PLoS One, 2013, 8(5):e63825）、これは、本発明者らの仮説及び予備的なデータと一致する。しかしながら、ＰＡＩ−１の完全な欠失は、血栓の形成／安定化の低下に起因して実質的な失血を引き起こす可能性があり、潜在的には死を引き起こす可能性がある（Iwaki et al., J Thromb Haemost., 2011, 9(6):1200-6）。
【００９２】
[0114]  本明細書で提供されるデータは、図７で実証されているように、ラブリシンがＰＡＩ−１に直接結合することを示す。ＰＡＩ−１へのラブリシンの結合を、Biacore X100 SPR機器（GE Healthcare, Pittsburg PA）を使用して評価した。ヒトＰＡＩ−１（R&D Systems, Minneapolis, MN）を、標準的なアミンカップリング化学を使用してＣＭ５センサーチップ（GE Healthcare, Little Chalfont, United Kingdom）のフローセル２上に固定し、３００〜５００反応単位（ＲＵ）を得た。参照細胞（フローセル１）を、活性化及び不活性化により調製した。結合アッセイを、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を補充したＰＢＳランニング緩衝液で実施した。ラブリシン溶液をランニング緩衝液に緩衝液交換し、０．５７６〜４２０μｇ／ｍＬの範囲の少なくとも５種の濃度を、２５℃での１分の接触時間により３０μＬ／分の流速で注射した。１．５分にわたり解離をモニタリングした後、１Ｍ  ＮａＣｌを注射することにより、結合したラブリシンをチップ表面から取り除いた。本発明者らは、ラブリシンが、２．７１２×１０-6の結合定数（Ｋd）でＰＡＩ−１に直接結合し得ると決定し、この結合定数は、これら２種の分子間の強い親和性を示す。
【００９３】
[0115]  ＰＡＩ−１とラブリシンとの相互作用は、ＰＡＩ−１の既知のリガンドであるビトロネクチン（ＶＴＮ）内のＳＭＢドメインとほぼ同一であるラブリシンのＮ末端ソマトメジンＢ（ＳＭＢ）ドメインに起因している可能性がある（Arroyo De Prada et al., Eur J Biochem. 2002, 269:184）。ＶＴＮは、ＰＡＩ−１の活性及び安定性の調節で中心的な役割を果たすことが知られている（Jang et al., Surgery, 2000, 127(696); Zhou et al., Nat Struct Biol, 2003, 10:541）。データは、ＰＡＩ−１に結合したラブリシンが、ＰＡＩ−１シグナル伝達の競合的阻害剤として作用し、創傷治癒の増加及び線維化の減少が観察される程度までＰＡＩ−１の活性を阻害するが、血栓形成が阻害されて慢性的な失血が観察される程度までは阻害しないことを示唆する。
【００９４】
[0116]  さらに、図１７に示すように、Ｐａｉ−１-/-（ＤＭＳＯ処置）マウス及びＣ５７ＢＬ／６マウス（ｒｈＰＲＧ４処置）における耳の損傷は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＤＭＳＯ処置）と比較して有意に少ないα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ、線維化マーカー）の発現を示す。図１７の画像を、マウスの耳パンチ創傷モデルでの損傷後４週間で撮影した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、頑強なαＳＮＡ染色（白色）を示すが、Ｃ５７ＢＬ／６ｒｈＰＲＧ４処置マウス及びＰＡＩ−１−／−マウスでは、αＳＭＡ染色の減少が観察される。
【００９５】
ラブリシン−ＮＦκＢ／ＨＩＦ１α／ＶＥＧＦ
[0117]  本明細書で提供されるデータは、ラブリシンが、潜在的にＮＦκＢの上流及び／又は下流のＨＩＦ１α依存性経路を介したＶＥＧＦの活性化により血管新生を調節することを示唆する（Fitzpatrick et al., J Immunol. 2011, 186(2):1091-6）。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管内皮細胞のための非常に特異的なマイトジェンであり、２つのＶＥＧＦ対立遺伝子の内の１つでも欠いている動物は、心血管系の発達の異常のために誕生前に死亡する（Haiko et al., Mol Cell Biol. 2008 28(15):4843-50）。低酸素誘発性ＶＥＧＦ産生は、発達過程での臓器形成に伴う血管新生を刺激する。そのため、ＨＩＦ１α（低酸素誘発性因子）は、典型的には低酸素の領域において、ＶＥＧＦの強力な活性化因子として文献で公知である（van Tuyl et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2005 288(1):L167-78; Arany et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 93(23):12969-73）。
【００９６】
[0118]  図８Ａ〜Ｅのデータにより示されるように、ラブリシンは、複数の細胞型及びインビボにおいて、ＨＩＦ１ａ及びＶＥＧＦを上方調節する。インビトロでこの効果を実証するために、正常なヒト関節及び骨関節炎（ＯＡ）のヒト関節に由来する滑膜線維芽細胞をラブリシン（１００μｇ／ｍＬ；２ｍＬ（図８Ａ〜Ｂ）に曝露し、２４時間後に測定を行なった。正常細胞及びＯＡ細胞では、外来性ラブリシンの投与により、ＨＩＦ１ａ（図８Ａ）及びＶＥＧＦ（図８Ｂ）のｍＲＮＡの発現が有意に上方調節された。この観察をＨＥＫ２９３細胞で検証し、ＨＩＦ１ａ及びＶＥＧＦのｍＲＮＡは、ラブリシン処置（１００μｇ／ｍＬ；２ｍＬ）の２４時間後に両方とも上方調節されることを観察した（図８Ｃ）。
【００９７】
[0119]  図８Ｄに示すように、ＥＬＩＳＡを使用して、ＰＢＳ担体（コントロール）又はラブリシン（１００μｇ／ｍＬ：２ｍＬ）に曝露した正常な滑膜細胞、骨関節炎の滑膜細胞、及びＨＥＫ２９３細胞におけるＶＥＧＦタンパク質のレベルを検証した。各タイプの細胞では、ラブリシンの存在は、コントロ−ルと比べてＶＥＧＦのレベルを有意に上方調節した。
【００９８】
[0120]  図８Ｅのデータは、ＶＥＧＦタンパク質レベルの上昇への、体外から投与されたラブリシンのインビボ効果をさらに実証する。この実験では、５匹のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、尾静脈注射によりラブリシン（２００μｇ／ｋｇ）を注射し、血清中のＶＥＧＦレベルを、０、１４、２０、及び２４日目に、ＥＬＩＳＡを使用してアッセイした。図８Ｅに示すように、ＶＥＧＦは、ラブリシンを投与しなかったラット（ＶＥＧＦ発現の定常レベルを示した）でのＶＥＧＦレベルと比較して、ラブリシン注射後１４〜２４日で全身的に有意に上方調節された。
【００９９】
[0121]  さらに、このラブリシン−ＶＥＧＦ経路はＨＩＦ１α依存性であり、なぜならば、ＨＩＦ１α阻害剤で処置された細胞は、ラブリシン処置後にＶＥＧＦ発現の増加を示さないからである。
【０１００】
[0122]  加えて、本発明者らは、ｒｈＰＲＧ４で処置したか又は処置していない耳創傷から、マクロファージ（Ｆ４／８０+）及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を単離した。図１５に示すように、本発明者らは、ｒｈＰＲＧ４が、マクロファージでは血管内皮増殖因子（Ｖｅｇｆ）の発現を有意に増加させるがＭＳＣでは増加させず、マクロファージ及びＭＳＣでは、Ｔｇｆβ発現を有意に減少させることを観察した。これらの結果から、損傷後のＭＳＣではＰｒｇ４発現が上方調節されること、及び外来性ｒｈＰＲＧ４は内在性Ｐｒｇ４の発現を阻害する（負のフィードバック）ことも実証される。さらに、ＴＧＦβはＰｒｇ４を上方調節することが既知である（Schmidt et al., Osteoarthr. Cartil. 2008, 16, 90; Jones et al., Eur. Cell. Mater, 2007, 13;40）が、本発明者らは、ここで、ｒｈＰＲＧ４発現とＴｇｆβ発現との間に負のフィードバックループが存在することを示す。
【０１０１】
[0123]  Ｔｌｒ４-/-マクロファージがＭ２分極バイアスを有することが既に分かっており（Orr et al., Diabetes 2012, 61:2718）、本発明者らは、ｒｈＰＲＧ４で処置されたＣ５７ＢＬ／６マクロファージもＭ２バイアスを示すことを発見した（図１６Ａ〜Ｂ）。ＶＥＧＦの増加はマクロファージの抗炎症性（Ｍ２）分極と関連している（Lai et al., J. Cell. Mol. Med., 2018, 23:14027; Wheeler et al. PLoS One 2018, 13: e0191040）ことから、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＴｌｒ４-/-マウスから骨髄単球を単離し、Ｍ２表現型へと分極した。
【０１０２】
[0124]  単球をマウスから単離してマクロファージ（Ｍ０）へ分化させ、次いで、ＬＰＳにより炎症促進性マクロファージ（Ｍ１）へと分極したか、又はＩＬ−４により抗炎症性マクロファージ（Ｍ２）へと分極した。図１６Ａ〜Ｂで提供される結果は、Ｃ５７ＢＬ／６単球由来のマクロファージがｒｈＰＲＧ４の存在下でＭ１分極の減少及びＭ２分極の増強を示すことを示す。Ｐｒｇ４-/-マウス由来のマクロファージは、Ｍ１分極の増強及びＭ２分極の減少を示し、このことはｒｈＰＲＧ４処置により救出され得、ＰＲＧ４又はＰＲＧ４の欠如がマクロファージの分極を調節することを示す。これらの効果はＴＬＲ４依存性であると思われ、なぜならば、Ｔｌｒ４-/-マクロファージはＭ１分極の減少及びＭ２分極の増強を示し、これらはｒｈＰＲＧ４処置により変更されないからである。さらに、ｒｈＰＲＧ４によるＴｌｒ４-/-マクロファージの処置は相加効果がなく、このことは、分極を調節するというｒｈＰＲＧ４の能力はＴＬＲ４依存性であることを示唆する。
【０１０３】
[0125]  加えて、図１８Ａ〜Ｂに示すように、本発明者らは、ｒｈＰＲＧ４処置もＮＦκＢ活性を上方調節すると決定した。非損傷マウスからマクロファージ及びＭＳＣを単離し、ｔｄＴｏｍａｔｏレポーティングベクターによりＮＦκＢ活性化をモニタリングした。図１８Ａ〜Ｂに示すデータは、ｒｈＰＲＧ４処置が、非損傷マウス由来のマクロファージ及びＭＳＣにおいてＮＦκＢ発現を上方調節することを示す。このことはＴＬＲ４とは無関係で生じると思われ、なぜならば、ＴＬＲ４−／−マウスとＣ５７ＢＬ／６マウスとの間で同一の反応が観察されたからである。本発明者らは、ｒｈＰＲＧ４が、インビトロ及びインビボの両方でＮＦκＢシグナル伝達を調節することを既に示しており（Iqbal et al., 2016, Sci Rep., 6: 18910）、ＮＦκＢレポーターの使用を介して、図１８Ａ〜Ｂに示すように、本発明者らは、ｒｈＰＲＧ４処置後のＮＦκＢ及びＨｉｆｌα及びＶｅｇｆの同時活性化を実証している。しかしながら、マクロファージのみがＨｉＦｌα及びＶｅｇＦの発現の増加を示しており（ＭＳＣは示さない）、このことは、ＰＲＧ４への曝露時の血管新生促進反応がマクロファージにより駆動されるがＭＳＣにより駆動されないことを示唆する。
【０１０４】
[0126]  図１８Ａ〜Ｂはまた、ｒｈＰＲＧ４が、ＨＩＦ１αによるＶＥＧＦの活性化を介して血管新生を調節することも示唆する。このことは、ＮＦκＢの下流で潜在的に生じる（Fitzpatrick, et al., J. Immunol., 2011, 186:1091）。低酸素誘発性ＶＥＧＦ産生は、発達過程での臓器形成に伴う血管新生を刺激する。そのため、ＨＩＦ１α（低酸素誘発性因子）は、典型的には低酸素の領域において、ＶＥＧＦの強力な活性化因子として文献で公知である（Van Tuyl et al., Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2005, 288:L167）。図１８Ａ〜Ｂでのインビトロデータ及び図１５でのエクスビボデータは、ｒｈＰＲＧ４によるマクロファージの処置によりｍＲＮＡレベルでＶｅｇｆが増加することを示す。
【０１０５】
ラブリシン−ＴＬＲ４相互作用
[0127]  ＴＬＲは、自然免疫系に関与するマクロファージにより主に発現されるパターン認識受容体の重要なクラスである。ＴＬＲが活性化されると、自然免疫細胞反応が引き起こされる（Parker et al., Clin Exp Immunol. 2007;147:199-207, Zhang et al., Cell Mol Life Sci. 2006;63:2901-7）。ＴＬＲは、病原体により発現される病原体関連微生物パターン（ＰＡＭＰ）として既知の高度に保存されたモチーフを認識するか、又は壊死細胞若しくは死にかけている細胞から放出されるダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ／アラーミン）を認識する（Rickard et al., Cell. 2014;157:1175-88）。ＴＬＲ４は、正常な創傷治癒に必要であり（Suga et al., J Dermatol Sci. 2014 73(2):117-24; Dasu et al., J Diabetes Complications. 2013 27(5):417-21）、且つＴＬＲ４を欠いているマウスはＭ２（又は抗炎症性）表現型へのバイアスを示すように、Ｍ１対Ｍ２の分極に必要である（Orr et al., Diabetes. 2012 61(11):2718-27）。
【０１０６】
[0128]  本発明者らは、ラブリシン欠乏マウスでマクロファージの分極を調べた。図９に示すように、ラブリシン欠乏（ＫＯ）マウスのマクロファージはＭ１（炎症促進性）分極バイアスを示し、野生型コントロールマウスと比べて有意に多くのＩＬ−１、ＩＬ−６、及びＴＮＦαを産生する。換言すると、ラブリシンノックアウトマウスでのマクロファージの分極は、野生型コントロールと比較して炎症促進性因子の増加をもたらす。ＴＬＲ４ノックアウト動物のマクロファージはＭ２バイアスを示す（Gupta et al., Biochem Biophys Res Commun. 2016 477(3):503-8）ことを考慮すると、このことは、ラブリシンの存在がＴＬＲ４を少なくとも部分的に不活性化するが、ラブリシンが存在しないとＴＬＲ４の活性化がマクロファージの炎症促進性分極をもたらすことを示唆する。
【０１０７】
[0129]  さらに、図１６Ａ〜Ｂに示されているデータにおいて、本発明者らは、ＰＲＧ４によるマクロファージの処置は、Ｍ１を阻害してＭ２分極を増強し、且つＴＬＲ−４依存性であると決定した。図１６Ａ〜Ｂは、Ｐｒｇ４-/-マウスでのマクロファージの分極がＭ１（炎症促進性）分極バイアスを示すが、ｒｈＰＲＧ４で処置したＣ５７ＢＬ／６マクロファージはＭ２バイアスを示すことを示す。
【０１０８】
ＰＡＩ−１−ＶＥＧＦ−ＴＬＲ４シグナル伝達
[0130]  ＰＡＩ−１、ＶＥＧＦ、及びＴＬＲ４シグナル伝達経路は、複数のレベルで相互作用し（Siegel-Axel et al., Diabetologia. 2014 57(5):1057-66; Wu et al., Am J Pathol. 2014 184(6):1900-10; Biernaskie et al., Cell Stem Cell. 2009 5(6):610-23）、本発明者らのデータは、これらの経路のそれぞれがインビトロで独立していることを示唆する。図１０に示すように、ラブリシン処置後のＶＥＧＦ転写の増加はＴＬＲ４に依存しておらず、なぜならば、ＴＬＲ４ノックアウト細胞は、ラブリシン処置後にＶＥＧＦを依然として発現するからである。加えて、図１０で実証されているように、ラブリシンノックアウト細胞を組換えＰＡＩ−１で処置した場合には、ＶＥＧＦの増加は観察されず、このことは、ラブリシン処置後のＶＥＧＦ上方調節はＰＡＩ−１とは無関係であることを示唆する。
【０１０９】
ＰＲＧ４により媒介される再生反応は、ＴＬＲ４及びＰＡＩ−１を介して作用する
[0131]  図１４Ａ〜Ｄで説明されているデータは、ｒｈＰＲＧ４が、局所的に適用された場合に創傷治癒を増強すること、及びＰｒｇ４の非存在が正常な治癒を決定的に損なう（図１４Ａ）ことを明確に実証する。本明細書で説明されているマウス耳創傷モデルからの結果は、このＰＲＧ４により媒介される再生反応が、ＴＬＲ４及びプラスミノーゲン活性化阻害因子−１（ＰＡＩ−１）を介して作用していることを示唆する。具体的には、Ｔｌｒ４-/-マウス及びＰａｉ−１-/-マウスは、（Ｃ５７ＢＬ／６と比較して）耳創傷治癒の改善を示し、ｒｈＰＲＧ４の外来性送達は、これらの株の両方において、この効果をさらに増強する（図１４Ｃ〜Ｄ）。さらに、Ｔｌｒ４-/-Ｐａｉ−１-/-二重ノックアウトは、ｒｈＰＲＧ４で処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスと同一の再生反応を示す。それにもかかわらず、Ｔｌｒ４-/-Ｐａｉ−１-/-マウスへのｒｈＰＲＧ４の添加は、耳創傷治癒への相加効果を有していない（図１４Ｄ）。このことは、ＴＬＲ４及びＰＡＩ−１シグナル伝達は耳創傷治癒の負の調節因子であり、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでのｒｈＰＲＧ４処置は、これらのシグナル伝達を阻害して再生能力を増加させることを示唆する。
【０１１０】
実施例４：ヒト患者での創傷の処置
糖尿病性潰瘍
[0132]  ヒト患者は、いくつかの足の指に糖尿病性潰瘍を呈する。各潰瘍を調べて洗浄する。１００μｇ／ｍＬの量で組換えヒトラブリシを含む溶液を、滅菌リン酸緩衝生理食塩水中の一連の点滴薬として各潰瘍に適用する。１平方センチメートルの潰瘍化組織当たりラブリシン８０μｇを適用する。この溶液が乾燥すると、各潰瘍に適切な包帯を置く。この処置を、４週間にわたり毎週繰り返す。処置が完了すると、潰瘍は治癒しており、組織は再生している。かつて損傷していた部位には、目立った瘢痕組織は存在していない。
【０１１１】
表皮剥離
[0133]  ヒト患者は、自転車事故の後に、腕、足、及び腹に、「路上発疹」として一般に知られている剥離を呈する。この創傷を洗浄し、剥離した皮膚に、組換えヒトラブリシンを含む滅菌ゲルを局所的に適用し、適切な包帯で覆う。１平方センチメートルの創傷組織当たり少なくとも８０μｇのラブリシンを適用する。この処置を４週間にわたり毎週繰り返し、再適用時には、まだ治癒していない組織の残余領域にのみラブリシン軟膏を適用する。従って、毎週、ラブリシン軟膏の適用を必要とする組織は少なくなる。路上発疹が最終的に治癒すると、目に見える瘢痕化は存在していない。
【０１１２】
切り傷又は裂創
[0134]  ヒト患者は、右手の人差し指に、３ｃｍの裂創を呈する。この裂創を洗浄し、この裂創に、組換えヒトラブリシンを含む軟膏を適用した後、この裂創を数本の縫合糸で縫合する。絆創膏を適用する。毎日、１ｃｍ長の損傷当たり約８０μｇの量で、この患部に、ラブリシンを含む軟膏を再適用する。１週間後に抜糸する。縫合痕が消えるまで、さらに１週間にわたり、創傷に毎日ラブリシン軟膏を適用する。裂創部位での瘢痕形成は観察されない。
【０１１３】
眼の損傷
[0135]  レーザー屈折矯正角膜切除術を受けた後、ヒト患者は、片目で角膜混濁を発症する。この患者に、ＰＲＧ４を含む点眼薬を処方する。この患者は、１日に４回、眼の結膜嚢に、１００μｇ／ｍＬのＰＲＧ４の０．０５ｍＬの液滴を２回適用し、急速なまばたきにより角膜表面にＰＲＧ４を適用する。１週間後、角膜混濁がなくなり、患者の視覚はもはや曇っていない。
【図１】
2021527645.tif 000002
【図２】
2021527645.tif 000003
【図３】
2021527645.tif 000004
【図４】
2021527645.tif 000005
【図５】
2021527645.tif 000006
【図６】
2021527645.tif 000007
【図７】
2021527645.tif 000008
【図８Ａ】
2021527645.tif 000009
【図８Ｂ】
2021527645.tif 000010
【図８Ｃ】
2021527645.tif 000011
【図８Ｄ】
2021527645.tif 000012
【図８Ｅ】
2021527645.tif 000013
【図９】
2021527645.tif 000014
【図１０】
2021527645.tif 000015
【図１１】
2021527645.tif 000016
【図１２】
2021527645.tif 000017
【図１３Ａ】
2021527645.tif 000018
【図１３Ｂ】
2021527645.tif 000019
【図１３Ｃ】
2021527645.tif 000020
【図１４Ａ】
2021527645.tif 000021
【図１４Ｂ】
2021527645.tif 000022
【図１４Ｃ】
2021527645.tif 000023
【図１４Ｄ】
2021527645.tif 000024
【図１５】
2021527645.tif 000025
【図１６Ａ】
2021527645.tif 000026
【図１６Ｂ】
2021527645.tif 000027
【図１７】
2021527645.tif 000028
【図１８Ａ】
2021527645.tif 000029
【図１８Ｂ】
2021527645.tif 000030
【図１９】
2021527645.tif 000031
【図２０】
2021527645.tif 000032
【図２１】
2021527645.tif 000033
【配列表】
2021527645000001.app
【国際調査報告】
2021527645.tif 000034
2021527645.tif 000035
2021527645.tif 000036