(57)【要約】  本発明は、メリチンが抗がん剤と結合された、メリチン−抗がん剤結合体に関するものであって、メリチンおよび抗がん剤を連結し、メリチン−抗がん剤結合体を製造する方法に関する。本発明の結合体は、Ｍ２型腫瘍関連ＴＡＭを標的とする抗がん物質であって、Ｍ２型腫瘍関連ＴＡＭを選択的に選別することに優れた効果を示すので、将来、Ｍ２型腫瘍関連マクロファージを標的とする薬物伝達用途に活用されうるであろう。
2021526548.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メリチンが抗がん剤と結合された、メリチン−抗がん剤結合体。
【請求項２】
前記抗がん剤は、アポトーシス性（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）ペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のメリチン−抗がん剤結合体。
【請求項３】
前記プロアポトーシス性ペプチドは、ＫＬＡ、アルファ−ディフェンシン−１（ａｌｐｈａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎ−１）、ＢＭＡＰ−２８、Ｂｒｅｖｅｎｉｎ−２Ｒ、ブフォリンＩＩｂ（Ｂｕｆｏｒｉｎ ＩＩｂ）、セクロピンＡ−マガイニン２（ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ− Ｍａｇａｉｎｉｎ ２、ＣＡ−ＭＡ−２）、セクロピンＡ（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ）、セクロピンＢ（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｂ）、クリソフィシン−１（ｃｈｒｙｓｏｐｈｓｉｎ−１）、Ｄ−Ｋ６Ｌ９、ゴメシン（Ｇｏｍｅｓｉｎ）、ラクトフェリシンＢ（Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｃｉｎ Ｂ）、ＬＬＬ２７、ＬＴＸ−３１５、マガイニン２（Ｍａｇａｉｎｉｎ ２）、マガイニンＩＩ−ボンベシン結合体（Ｍａｇａｉｎｉｎ ＩＩ−ｂｏｍｂｅｓｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＭＧ２Ｂ）、パルダキシン（Ｐａｒｄａｘｉｎ）およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項２に記載のメリチン−抗がん剤結合体。
【請求項４】
前記抗がん剤は、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、エンチノスタット（Ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ）、グラドリビン（Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、プララトレキセート（Ｐｒａｌａｔｒｅｘａｔｅ）、ロルラチニブ（Ｌｏｒｌａｔｉｎｉｂ）、メイタンシンＤＭ１（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ  ＤＭ１）、メイタンシンＤＭ３（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ  ＤＭ３）、メイタンシンＤＭ４（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ  ＤＭ４）およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項１に記載のメリチン−抗がん剤結合体。
【請求項５】
前記結合体は、Ｍ２型腫瘍関連マクロファージを標的とするものであることを特徴とする請求項１に記載のメリチン−抗がん剤結合体。
【請求項６】
前記結合体は、抗がん剤に比べて抗がん活性が向上されたものであることを特徴とする請求項１に記載のメリチン−抗がん剤結合体。
【請求項７】
前記メリチンおよび抗がん剤は、化学的リンカーまたは直接連携によって連結されたものであることを特徴とする請求項１に記載のメリチン−抗がん剤結合体。
【請求項８】
前記化学的リンカーは、メリチンおよび抗がん剤上のアミン基（ａｍｉｎｅ）、カルボキシ基（ｃａｒｂｏｘｙｌ）またはスルフヒドリル基（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ）を介して結合するものであることを特徴とする請求項７に記載のメリチン−抗がん剤結合体。
【請求項９】
前記化学的リンカーは、両末端にカルボジイミド基（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（Ｎ −ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ；ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ）、イミドエステル（ｉｍｉｄｏｅｓｔｅｒ）、ペンタフルオロフェニルエステル（ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｅｓｔｅｒ）、ヒドロキシメチルホスフィン（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）、マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、ハロアセチル（ｈａｌｏａｃｅｔｙｌ）、ピリジルジスルフィド（ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）、チオスルホネート（ｔｈｉｏｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ビニールスルホン（ｖｉｎｙｌｓｕｌｆｏｎｅ）およびこれらの組み合わせから選択される官能基を含むことを特徴とする請求項７に記載のメリチン−抗がん剤結合体。
【請求項１０】
前記化学的リンカーは、ＥＤＣ（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、ＤＣＣ（Ｎ、Ｎ’− ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、ＳＡＴＡ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ）、スルホン−ＳＭＣＣ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（ＮＤｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、ＤＭＡ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ・２ＨＣｌ）、ＤＭＰ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ・２ＨＣｌ）、ＤＭＳ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ・２ＨＣｌ）、ＤＴＢＰ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ３，３’− ｄｉｔｈｉｏｂｉｓｐｒｏｐｉｏｎｉｍｉｄａｔｅ・２ＨＣｌ）、スルホ−ＳＩＡＢ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ（４−ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ）ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ）、ＳＩＡＢ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ（４−ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ）ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ）、ＳＢＡＰ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３−（ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ＳＩＡ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｉｏｄｏａｃｅｔａｔｅ）、ＳＭ（ＰＥＧ）ｎ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ −（［Ｎ− ｍａｌｅｉｍｉｄ ｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］−＃ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ ｅｓｔｅｒ、前記ｎ＝２、４、６、８、１２、または２４）、ＳＭＣＣ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−Ｄｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、ＬＣＳＭＣＣ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ− ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙ−（６ ａｍｉｄｏｃａｐｒｏａｔｅ））、スルホ−ＥＭＣＳ（Ｎ−εｅｓｔｅｒ）、ＥＭＣＳ（Ｎ−εスルホ−ＧＭＢＳ（Ｎ−γｅｓｔｅｒ）、ＧＭＢＳ（Ｎ−γｅｓｔｅｒ）、スルホ−ＫＭＵＳ（Ｎ−κｅｓｔｅｒ）、スルホ−ＭＢＳ（ｍ− ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）、ＭＢＳ（ｍ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）、スルホ−ＳＭＰＢ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（ｐｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ）ｂｕｔｙｒａｔｅ）、ＳＭＰＢ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（ｐｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ）ｂｕｔｙｒａｔｅ）、ＡＭＡＳ（Ｎ−α−ｍａｌｅｉｍｉｄｏａｃｅｔ−ｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）、ＢＭＰＳ（Ｎ−β−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）、ＳＭＰＨ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ６−［（β−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ］）、ＰＥＧ１２−ＳＰＤＰ（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏｌ−ｔｅｔｒａｏｘａｏｃｔａｔｒｉａｃｏｎｔａｎｅ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）、ＰＥＧ４−ＳＰＤＰ、スルホ−ＬＣＳＰＤＰ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ６−［３’−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ）、ＳＰＤＰ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ＬＣ−ＳＰＤＰ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ６−［３’−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ）、ＳＭＰＴ（４−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−ａｌｐｈａ−ｍｅｔｈｙｌ−ａｌｐｈａ（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｔｏｌｕｅｎｅ）、ＤＳＳ（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｅｒａｔｅ）、ＢＳ（ＰＥＧ）５（ｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｅｎｔａ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ））、ＢＳ（ＰＥＧ）９（ｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｎｏｎａ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ））、ＢＳ３（ｂｉｓ［ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ］ｓｕｂｅｒａｔｅ）、ＢＳＯＣＯＥＳ（ｂｉｓ［２−（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｏｘｙ）ｅｔｈｙｌ］ｓｕｌｆｏｎｅ）、ＰＤＰＨ（３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）、ＤＳＧ（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉ ｄｙｌ ｇｌｕｔａｒａｔｅ）、ＤＳＰ（ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ［ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ］）、ＢＭ（ＰＥＧ）ｎ（１，８−ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｏ−ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ、ｎ＝２または３）、ＢＭＢ（１，４−ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔａｎｅ）、ＢＭＤＢ（１，４−ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｙｌ−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｅ）、ＢＭＨ（ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｅ）、ＢＭＯＥ（ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｏｅｔｈａｎｅ）、ＤＴＭＥ（ｄｉｔｈｉｏｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｏｅｔｈａｎｅ）、ＴＭＥＡ（ｔｒｉｓ（２−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｅ）、ＤＳＳ（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｅｒａｔｅ）、ＤＳＴ（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｔａｒｔａｒａｔｅ）、ＤＴＳＳＰ（３、３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ［ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ］）、ＥＧＳ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｂｉｓ［ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｓｕｃｃｉｎａｔｅ］）、スルホ−ＥＧＳ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ ｂｉｓ［ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｓｕｃｃｉｎａｔｅ］）とＴＳＡＴ（ｔｒｉｓ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ａｍｉｎｏｔ ｒｉａｃｅｔａｔｅ）、ＤＦＤＮＢ（１，５−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−２、４−ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ）およびこれらの組み合わせから選択されるものであることを特徴とする請求項７に記載のメリチン−抗がん剤結合体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の結合体を含む、腫瘍関連マクロファージ媒介疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１２】
前記疾患は、肺癌、転移癌、乳がんであることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記疾患は、ルイス肺癌または炎症性疾患であることを特徴とする請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、Ｍ２型腫瘍関連マクロファージの除去によるがんの成長および転移の予防または治療用薬学的組成物であることを特徴とする請求項１１に記載の組成物
【請求項１５】
メリチンおよび抗がん剤を連結する段階を含む、メリチン−抗がん剤結合体を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メリチン（ｍｅｌｉｔｔｉｎ）が抗がん剤と結合された、メリチン−抗がん剤結合体に関するものであって、より具体的には、本発明の組成物はＭ１型腫瘍関連マクロファージと癌細胞には影響を与えることなく、Ｍ２型腫瘍関連マクロファージのみを抑制するメリチン−抗がん剤結合体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍関連マクロファージは、ほとんどすべての組織から発見される重要な先天性免疫細胞であって、骨髄に由来して血液で循環し、血管外漏出を通じて組織から分化される。この腫瘍関連マクロファージの腫瘍抑制Ｍ１マクロファージまたは腫瘍支持Ｍ２マクロファージの二つの表現型に分類される。Ｍ１マクロファージは、抗原を提示する強力な能力を有し、一般にインターフェロン−γ、脂肪糖類（ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αによって活性化され、伝染症作用および殺菌作用をする。
【０００３】
Ｍ２マクロファージは、多様な細胞外基質成分、血管新生および走化性因子を放出することにより、免疫抑制、腫瘍形成および血管形成を促進するものとして知られている。一般にＩＬ−４とＩＬ−１３によって誘導され、アルギナーゼ−１，ｍａｎｎｏｓｅ（ＭＭＲ、ＣＤ２０６）、スカベンジャー受容体（ＳＲ−Ａ、ＣＤ２０４）のようなＭ２だけの独特のマーカーを発現することにより、Ｍ１マクロファージと区別される。
【０００４】
メリチン（Ｍｅｌｉｔｔｉｎ）は、ミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ  Ｌ．）のハチ毒の主要成分であり、２６個のアミノ酸残基を有する両親媒性ペプチドである。メリチンは、気孔形成、融合および小胞形成のような膜−摂動（ｐｅｒｔｕｒｂｉｎｇ）効果を有する。メリチンは、腫瘍細胞に対する細胞の毒性と細胞の成長を抑制する、またはアポトーシスおよびネクローシスを誘導する能力があるので、腫瘍−保有マウスの研究に用いられてきた（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００４；５３：４１１〜４２１．）。
【０００５】
また、従前メリチンが用いられた技術としては、メリチンを含む動脈硬化治療用組成物（韓国特許出願公開第１０−２０１１−０１１７７８９号）、メリチンを含む繊維芽細胞様滑膜細胞の活性を抑制する組成物（韓国特許出願公開第１０−２０１１−０１１７７８８号）などが知られている。
【０００６】
一方、メリチンを用いてＭ２型マクロファージを選択的にアポトーシスする薬学的組成物は確認されたが（韓国特許出願公開第１０−２０１９−００２１７６５号）、これを結合パートナーとしたＭ２ターゲッティング薬学組成物に関する技術は、知られたところがない。そこで、本発明者らはメリチンが抗がん剤と結合された結合体を製造し、メリチンが腫瘍マウスモデルにおいて、Ｍ１型腫瘍関連マクロファージであるＣＤ８６＋腫瘍関連マクロファージおよび癌細胞には影響を与えることなく、Ｍ２型腫瘍関連マクロファージであるＣＤ２０６＋腫瘍関連マクロファージのみを抑制することを確認することで、既存の抗がん剤による副作用が顕著に減少した本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、メリチンが抗がん剤と結合されたメリチン−抗がん剤結合体を提供するものである。
【０００８】
本発明のもう一つの目的は、メリチンと抗がん剤を結合し、メリチン−抗がん剤結合体を製造する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決するための本発明の一実施態様は、メリチンと抗がん剤が結合されたメリチン−抗がん剤結合体を提供する。
【００１０】
本発明の用語「メリチン（Ｍｅｌｉｔｔｉｎ；ＭＥＬ）」は、ハチ毒の主要成分を構成するペプチドである。前記本明細書にて使用される用語「ハチ毒（ｂｅｅ  ｖｅｎｏｍ；ＢＶ）」は、ミツバチ（Ａｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａ）の腹部で生成される酸性および塩基性分泌物の混合物であって、苦い無色の液体形態を帯び、その主な成分は、ペプチドであるメリチン（ｍｅｌｉｔｔｉｎ）、アパミン（ａｐａｍｉｎ）、肥満細胞脱顆粒化（ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｎｇ；ＭＣＤ）ペプチド、および酵素であるホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２；ＰＬＡ２）などであり、この他に様々な微量の成分を含む。したがって、本発明のメリチンは、ミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）のハチ毒から分離されることができるが、これに限定されない。
【００１１】
本発明の具体的な一実施態様では、ＣＤ２０６＋Ｍ２マクロファージを標的とするＭＥＬペプチドにＧＧＧＳリンカーを介してアポトーシスペプチドｄＫＬＡを結合した結合体をＭ１型およびＭ２型マクロファージに処理し、他の真核細胞には影響を及ぼすことなく腫瘍基質内のＭ２型マクロファージのみを除去することを確認し（図１〜３）、ＭＥＬペプチドにＤＭ１抗がん剤を結合した結合体も同様に腫瘍基質内のＭ２型マクロファージのみを除去することを確認し（図４）、ミトコンドリア膜撹乱による細胞死であることを、細胞呼吸の測定を通じて確認し（図５〜６）、本発明の結合体がミトコンドリア内に挿入されたことを染色を通じて確認した（図７）。また、実験マウスにＭＥＬ、ｄＫＬＡ、およびＭＥＬ−ｄＫＬＡを処理したとき、ＭＥＬ−ｄＫＬＡ結合体が腫瘍の大きさと重量をさらに減少させ（図８）、また、腫瘍結節の数と腫瘍内への転移を抑制し（図９）、前記結合体が実験マウス乳癌の成長を抑制し、肺および全身への転移を抑制することを発光を通じて確認した（図１０〜１１）。また、ＭＥＬ−抗がん剤結合体を処理したとき、癌に多く発現されるとして知られたＣＤ４４、Ｍ２型マクロファージマーカーとして知られたＣＣＬ２２、血管生成、転移および浸透マーカーとして知られたＨＩＦ−１α、Ｍ２型マクロファージマーカーであるＹｍ１、腫瘍細胞の移動および定着に関与するＭＭＰ−９の発現が低くなることを確認し（図１２）、染色を通じて腫瘍内の免疫細胞の割合の変化を測定し、Ｍ２型ＴＡＭだけが減少したことを確認し（図１３）、Ｍ２型腫瘍関連ＴＡＭの選択的細胞死が起きたことを染色を通じて確認した（図１４）。また、ＭＥＬとＭＥＬ−ｄＫＬＡを処理した後、腫瘍内皮細胞をコンフォーカルで撮影して内皮細胞内血管密度が減少することを確認した（図１５）。
【００１２】
本発明のメリチンは、Ｍ２型マクロファージを標的とする役割を果たし、メリチンに結合された抗がん剤をＭ２型マクロファージに伝達することにより抗がん活性を示すことができるが、これに限定されない。
【００１３】
本発明の用語「抗がん剤」とは、癌を治療するための化学療法に使われる薬剤の総称であって、前記抗がん剤は、化合物またはプロアポトーシス性（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）ペプチドであることができるが、これに限定されるものではない。
【００１４】
本発明において、前記用語「がん」とは、身体組織の自律的な過剰成長によって異常に増殖した腫瘍、または腫瘍を形成する病を意味する。
【００１５】
具体的には、前記がんは、肺癌（例えば、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、悪性中皮腫）、中皮腫、膵臓癌（例えば、膵管癌、膵臓内分泌腫瘍）、咽頭がん、喉頭がん、食道がん、胃がん（例えば、乳頭腺癌、粘液性腺癌、腺扁平上皮癌）、十二指腸がん、小腸がん、大腸がん（例えば、結腸癌、直腸癌、肛門癌、家族性大腸癌、遺伝性鼻ポリープ大腸癌、消化管間質腫瘍）、乳がん（例えば、浸潤性乳管癌、非浸潤性乳管癌、炎症性乳がん）、卵巣癌（例えば、上皮性卵巣癌、精巣外胚細胞腫瘍、卵巣性胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍）、精巣腫瘍、前立腺癌（例えば、ホルモン−依存性前立腺癌、ホルモン−非依存性前立腺癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌、原発性肝臓癌、間外胆管がん）、甲状腺がん（例えば、甲状腺髄質癌）、腎臓癌（例えば、腎細胞癌、腎盂と尿管の移行上皮がん）、子宮がん（例えば、子宮頸がん、子宮体がん、子宮肉腫）、脳腫瘍（例えば、髄芽腫、神経膠腫、松果体性細胞腫瘍、毛様細胞性星細胞腫、びまん性星細胞腫、退形成性性細胞腫、下垂体腺腫）、網膜芽腫、皮膚癌（例えば、基底細胞癌、悪性黒色腫）、肉腫（例えば、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、軟組織肉腫）、悪性骨腫瘍、膀胱癌、血液癌（例えば、多発性骨髄腫、白血病、悪性リンパ腫、ホジキン病、慢性骨髄増殖性疾患）、原発不明がんなどであることができ、より具体的には、肺癌、転移癌または乳がんであることができ、さらに具体的には、前記肺がんはルイス肺癌であることができるが、これに限定されない。
【００１６】
本発明において、前記抗がん剤は、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、エンチノスタット（Ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ）、グラドリビン（Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、プララトレキセート（Ｐｒａｌａｔｒｅｘａｔｅ）、ロルラチニブ（Ｌｏｒｌａｔｉｎｉｂ）、メイタンシンＤＭ１（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ  ＤＭ１）、メイタンシンＤＭ３（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ  ＤＭ３）、メイタンシンＤＭ４（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ  ＤＭ４）であることができるが、これに制限されない。
【００１７】
本発明の用語「プロアポトーシス（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｓｉｓ）」とは、細胞が能動的に生体エネルギーであるＡＴＰを積極的に消費しながら死に至る過程を意味し、典型的なアポトーシス過程は、細胞の縮小、ＤＮＡの規則的な切断、そして細胞膜の断片化によって行われる。異常な細胞分裂、放射線、紫外線、細菌感染またはウイルス感染などが原因で、細胞が正常な機能を維持できなくなる場合、アポトーシスが誘導されうる。
【００１８】
本発明において、前記プロアポトーシス性ペプチドは、ＫＬＡ、アルファ−ディフェンシン−１（ａｌｐｈａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎ−１）、ＢＭＡＰ−２８、Ｂｒｅｖｅｎｉｎ−２Ｒ、ブフォリンＩＩｂ （Ｂｕｆｏｒｉｎ ＩＩｂ ）、セクロピンＡ−マガイニン２（ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ− Ｍａｇａｉｎｉｎ ２、ＣＡ−ＭＡ−２）、セクロピンＡ（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ）、セクロピンＢ（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｂ）、クリソフィシン−１（ｃｈｒｙｓｏｐｈｓｉｎ−１）、Ｄ−Ｋ６Ｌ９、ゴメシン（Ｇｏｍｅｓｉｎ）、ラクトフェリシンＢ（Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｃｉｎ Ｂ）、ＬＬＬ２７、ＬＴＸ−３１５、マガイニン２（Ｍａｇａｉｎｉｎ ２）、マガイニンＩＩ−ボンベシン結合体（Ｍａｇａｉｎｉｎ ＩＩ− ｂｏｍｂｅｓｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＭＧ２Ｂ）、パルダキシン（Ｐａｒｄａｘｉｎ）であることができるが、これに制限されない。
【００１９】
本発明の用語「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、アミド結合（またはペプチド結合）により連結されたアミノ酸からなるポリマーを意味する。本発明の目的上、癌細胞に対して高い選別力を有し、強力な抗がん活性を示すペプチドを意味する。
【００２０】
本発明において、前記ペプチドは前記アミノ酸配列を有することが好ましいが、これに限定されるものではない。本発明の好ましい実施態様によれば、前記ペプチドは、前記アミノ酸の割合が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％と高いのが好ましい。
【００２１】
本発明において、前記ペプチドは、標的化配列、タグ（ｔａｇ）、標識された残基、半減期またはペプチドの安定性を増加させるための特定の目的で考案された追加のアミノ酸配列も含むことができる。また、本発明のペプチドは、エフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ）、薬物、プロドラッグ、毒素、ペプチド、伝達分子などのカップリングパートナーと連結されることができる。
【００２２】
本発明において、前記ペプチドは、当分野で広く知られた様々な方法で獲得することができる。詳細には、遺伝子組換えとタンパク質発現システムを利用して製造する、またはペプチド合成のような化学的合成を通じて試験管内で合成する方法、および無細胞タンパク質合成法などで製造することができる。
【００２３】
本発明において、前記ペプチドは、薬学的に許容可能な塩の形態で製造されうる。具体的に酸を添加することで塩を形成することができ、例えば、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸など）、有機カルボン酸（例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸のようなハロ酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、タルタル酸、サリチル酸）、および酸性糖（グルクロン酸、ガラクツロン酸、グルコン酸、アスコルビン酸）、酸性多糖（例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、アルギニン酸）、コンドロイチン硫酸などのスルホン酸糖エステルを含む有機スルホン酸（例えば、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸）などを添加して塩を形成することができる。
【００２４】
本発明の用語「結合体」は、メリチンペプチドと抗がん剤が結合された結合体であって、Ｍ２型腫瘍関連マクロファージを標的とするものであることができる。前記結合体は、薬物が標的とするＭ２型マクロファージに結合して、マクロファージのミトコンドリアを損傷させることで、腫瘍の生長と転移を抑制し、周辺の血管新生を選択的に抑制することにより、癌を抑制することができる。
【００２５】
すなわち、本発明の結合体は、抗がん剤に比べて抗がん活性が向上されたものであることができるが、これに限定されるものではない。
【００２６】
本発明において、前記結合体は、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡで購入したＭＥＬ（配列番号１；ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ）にｄＫＬＡ（配列番号２；ｄ［ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ］）ペプチドをＧＧＧＧＳ  ｌｉｎｋｅｒを介して連結するものであることができ、またはＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ、Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、Ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ、Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ、ＰｒａｌａｔｒｅｘａｔｅおよびＬｏｒｌａｔｉｎｉｂのような抗がん剤をＳＰＤＰリンカーを介して連結するものであることができる。また、Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ  ＤＭ１、Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ  ＤＭ３およびＭａｙｔａｎｓｉｎｅ  ＤＭ４は、リンカーなしで結合して製造することができるが、これに限定されるものではない。
【００２７】
すなわち、本発明の結合体は、メリチンが化学リンカーを介したり、または、または直接抗がん剤と連携した形態であることができるが、これに限定されない。
【００２８】
本発明において、前記用語「化学的リンカー」は、メリチンおよび抗がん剤上のアミン基（ａｍｉｎｅ）、カルボキシ基（ｃａｒｂｏｘｙｌ）またはスルフヒドリル基（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ）を通じて結合するものであることができるが、これに限定されない。具体的には、前記化学的リンカーは、ＥＤＣ（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、ＤＣＣ（Ｎ、Ｎ’−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａ
ｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、ＳＡＴＡ、（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ）、スルホ−ＳＭＣＣ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（ＮＤｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、ＤＭＡ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ・２ＨＣｌ）、ＤＭＰ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ・２ＨＣｌ）、ＤＭＳ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ・２ＨＣｌ）、ＤＴＢＰ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓｐｒｏｐｉｏｎｉｍｉｄａｔｅ・２ＨＣｌ）、スルホ−ＳＩＡＢ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ（４−ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ）ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ ）、ＳＩＡＢ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ （４−ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ）ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ）、ＳＢＡＰ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３−（ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ＳＩＡ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｉｏｄｏａｃｅｔａｔｅ）、ＳＭ（ＰＥＧ）ｎ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−（［Ｎ− ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］−＃ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ ｅｓｔｅｒ、前記ｎ＝２、４、６、８、１２、または２４）、ＳＭＣＣ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−Ｄｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、ＬＣＳＭＣＣ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍ ｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙ−（６−ａｍｉｄｏｃａｐｒｏａｔｅ））、スルホ−ＥＭＣＳ（Ｎ−εｅｓｔｅｒ）、ＥＭＣＳ（Ｎ−εスルホ−ＧＭＢＳ（Ｎ−γｅｓｔｅｒ）、ＧＭＢＳ（Ｎ−γｅｓｔｅｒ）、スルホ−ＫＭＵＳ（Ｎ−κｅｓｔｅｒ）、スルホ−ＭＢＳ（ｍ− ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ− Ｎｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）、ＭＢＳ（ｍ− ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅ ｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）、スルホ−ＳＭＰＢ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−（ｐｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ）ｂｕｔｙｒａｔｅ）、ＳＭＰＢ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−（ｐｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ）ｂｕｔｙｒａｔｅ）、ＡＭＡＳ（Ｎ−α−ｍａｌｅｉｍｉｄｏａｃｅｔ−ｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）、ＢＭＰＳ（Ｎ−β− ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）、ＳＭＰＨ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ６−［（β−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ］）、ＰＥＧ１２−ＳＰＤＰ（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏｌ−ｔｅｔｒａｏｘａｏｃｔａｔｒｉａｃｏｎｔａｎｅ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）、ＰＥＧ４−ＳＰＤＰ、スルホ−ＬＣＳＰＤＰ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ６−［３’−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ）、ＳＰＤＰ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ＬＣ−ＳＰＤＰ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ６−［３’−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ）、ＳＭＰＴ（４−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−ａｌｐｈａ−ｍｅｔｈｙｌ−ａｌｐｈａ（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｔｏｌｕｅｎｅ）、ＤＳＳ（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｅｒａｔｅ）、ＢＳ（ＰＥＧ）５（ｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｅｎｔａ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ））、ＢＳ（ＰＥＧ）９（ｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｎｏｎａ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ））、ＢＳ３（ｂｉｓ［ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ］ｓｕｂｅｒａｔｅ）、ＢＳＯＣＯＥＳ（ｂｉｓ［２−（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｏｘｙ）ｅｔｈｙｌ］ｓｕｌｆｏｎｅ）、ＰＤＰＨ（３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）、ＤＳＧ（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙ ｌ ｇｌｕｔａｒａｔｅ ）、ＤＳＰ（ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ［ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ］）、ＢＭ（ＰＥＧ）ｎ（１，８−ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｏ− ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌで、ｎ＝２または３）、ＢＭＢ（１，４−ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔａｎｅ）、ＢＭＤＢ（１，４−ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｙｌ−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｅ）、ＢＭＨ（ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｅ）、ＢＭＯＥ（ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｏｅｔｈａｎｅ）、ＤＴＭＥ（ｄｉｔｈｉｏｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｏｅｔｈａｎｅ）、ＴＭＥＡ（ｔｒｉｓ（２−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｅ）、ＤＳＳ（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｅｒａｔｅ ）、ＤＳＴ（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｔａｒｔａｒａｔｅ）、ＤＴＳＳＰ（３、３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ［ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ］）、ＥＧＳ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｂｉｓ［ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｓｕｃｃｉｎａｔｅ］）、スルホ−ＥＧＳ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ ｂｉｓ［ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｓｕｃｃｉｎａｔｅ］）とＴＳＡＴ（ｔｒｉｓ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ａｍｉｎｏｔ ｒｉａｃｅｔａｔｅ）、ＤＦＤＮＢ（１，５−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ）及びこれらの組み合わせであることができるが、これに限定されるものではない。
【００２９】
本発明の用語「腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ、Ｔｕｍｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ）」は、がんの成長、転移など全般的な腫瘍微小環境に関連して重要な役割を担うマクロファージであって、腫瘍の周辺に存在する腫瘍関連マクロファージは、腫瘍細胞の成長、転移と密接に関連している。腫瘍関連マクロファージは、腫瘍抑制Ｍ１または腫瘍支持Ｍ２マクロファージの二つの表現型に分類される。Ｍ２型腫瘍関連マクロファージは、がんの成長を促進するＩＬ−１０、ＴＧＦβおよびＣＣＬ１８のようなサイトカインを生成し、表面の受容体を通じてＴ細胞、ＮＫ細胞の抗腫瘍活性を抑制する機能をする。こうした腫瘍関連マクロファージは、骨髄（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ）、卵黄嚢（Ｙｏｌｋ  ｓａｃ）または髄外造血（ｅｘｔｒａｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ）のうち、特に脾臓で発生した単核球とマクロファージから分化したものであることができ、好ましくは骨髄（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ）から分離されるものであることができるが、これに限定されない。
【００３０】
前記課題を解決するための本発明のもう一つの実施態様は、腫瘍関連マクロファージ媒介疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００３１】
本発明において、前記組成物はＭ２型腫瘍関連マクロファージの除去による癌の生長および転移の予防または治療用薬学的組成物であることができるが、これに限定されるものではない。
【００３２】
本発明の用語「腫瘍関連マクロファージ」は、前述した通りである。
【００３３】
本発明の用語では、「予防」は、本発明に係る結合体によって腫瘍の生長および転移を抑制したり、または遅延させたりする全ての行為を意味する。
【００３４】
本発明の用語「治療」は、前記の結合体によって腫瘍の生長および転移の症状が好転したり、有利に変更されたりするすべての行為を意味する。
【００３５】
本発明において、前記結合体は、ヒトに用いるのが好ましいが、炎症性疾患または癌が発生し、本発明のペプチド投与により癌が抑制または減少しうる牛、馬、羊、豚、ヤギ、ラクダ、ゴーラル、犬や猫などの家畜にも用いることができる。
【００３６】
本発明の癌の予防または治療組成物において、前記組成物を投与する投与経路及び投与方法は、特に制限されず、目的とする当該部位に前記組成物が達することができる限り、任意の投与経路及び投与方式に従うことができる。具体的には、前記組成物は、経口または非経口の多様な経路を通じて投与されることができ、その投与経路の非限定的な例としては、眼球、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、非側内または吸入などを通じて投与されることが挙げられる。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与することができる。
【００３７】
本発明において、前記薬学的組成物は、薬学的組成物の製造に通常使われる薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができ、前記担体は、非自然的担体（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｉｎｇ  ｃａｒｒｉｅｒ）を含むことができる。
【００３８】
本発明において、前記用語「薬学的に許容可能な」は、前記組成物に晒される細胞やヒトに毒性がない特性を示すことを意味する。
【００３９】
より具体的には、前記薬学的組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤、および滅菌注射溶液の形態で製剤化して使用しうるが、当業界でがんの予防または治療のために用いられる剤形であれば、これらに限定されない。
【００４０】
前記薬学的組成物に含まれうる担体、賦形剤および希釈剤としては、具体的な例として、ラクトース、ブドウ糖、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ；ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、ポリラクティック酸（ＰＬＡ；Ｐｏｌｙ  Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ）、ポリ−Ｌ−ラクティック酸（ＰＬＬＡ；ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）、鉱物油などを挙げることができる。
【００４１】
製剤化する場合には、通常使われる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製されうる。
【００４２】
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれており、このような固形製剤は、前記抽出物とその分画物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調剤することができる。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用することができる。
【００４３】
経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使われる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれることができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などが含まれることができる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使われることができる。坐剤の基剤としては、ウィテプソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使われることができる。
【００４４】
前記課題を解決するための本発明のもう一つの実施態様は、メリチンと抗がん剤を連結する段階を含む、メリチン−抗がん剤結合体を製造する方法を提供する。
【００４５】
本発明のもう一つの態様は、前記結合体またはこれを含む薬学的組成物をこれを必要とする個体に投与する段階を含む、腫瘍関連マクロファージ媒介疾患の予防または治療方法を提供する。
【００４６】
前記課題を解決するための本発明のもう一つの実施態様は、メリチンと抗がん剤が連結されたメリチン−抗がん剤の腫瘍関連マクロファージ「媒介疾患の予防または治療目的」を提供する。
【発明の効果】
【００４７】
本発明のＭＥＬ−抗がん剤結合体は、Ｍ２型腫瘍関連ＴＡＭを標的とする抗がん物質として、Ｍ２型腫瘍関連ＴＡＭを選択的に選別する優れた効果を示すので、ＭＥＬと抗がん剤の結合方法は、今後、Ｍ２型腫瘍関連マクロファージを標的とする薬物伝達用途に活用されうるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１ａ】ＭＴＳ測定を通じたＭ１に対するｄＫＬＡ、ＭＥＬおよびＭＥＬ−ｄＫＬＡの細胞毒性を示すグラフである。
【図１ｂ】ＭＴＳ測定を通じたＭ２に対するｄＫＬＡ、ＭＥＬおよびＭＥＬ−ｄＫＬＡの細胞毒性を示すグラフである。
【図１ｃ】ＰＩ染色を通じて細胞周期を測定して分析したグラフである。
【図２】Ｍ１のｄＫＬＡ、ＭＥＬおよびＭＥＬ−ｄＫＬＡに対する変化をＡｎｎｅｘｉｎ  ＶＦＩＴＣおよびＭＩｔｏＴｒａｃｋｅｒ−Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓで染色し、フローサイトメトリを通じて比較分析したグラフである。
【図３】Ｍ２のｄＫＬＡ、ＭＥＬおよびＭＥＬ−ｄＫＬＡに対する変化をＡｎｎｅｘｉｎ  ＶＦＩＴＣおよびＭＩｔｏＴｒａｃｋｅｒ−Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓで染色し、フローサイトメトリを通じて比較分析したグラフである。
【図４】ＭＴＳ測定を通じたＭ２に対するＭＥＬ−ＤＭ１の細胞毒性を示すグラフである。
【図５ａ】ミトコンドリア膜撹乱による細胞死を測定するための細胞内の呼吸変化を示すグラフである。
【図５ｂ】ミトコンドリア膜撹乱による細胞死を測定するための細胞内の解糖作用の変化を示すグラフである。
【図５ｃ】ミトコンドリア膜撹乱による細胞死を測定するための基底呼吸の変化を示すグラフである。
【図５ｄ】ミトコンドリア膜撹乱による細胞死を測定するための細胞ＡＴＰ生産の変化を示すグラフである。
【図５ｅ】ミトコンドリア膜撹乱による細胞死を測定するための細胞内の最大呼吸の変化を示すグラフである。
【図６ａ】ミトコンドリア膜撹乱による細胞死を測定するためにＸＦで測定した細胞エネルギー表現型の変化を示すグラフである。
【図６ｂ】ミトコンドリア膜撹乱による細胞死を測定するための細胞内の酸素の割合（ＯＣＲ）の変化を示すグラフである。
【図６ｃ】ミトコンドリア膜撹乱による細胞死を測定するための細胞外の酸性化率（ＥＣＡＲ）の変化を示すグラフである。
【図７ａ】ミトコンドリア内ＭＥＬ、ｄＫＬＡおよびＭＥＬ−ｄＫＬＡの位置を示す染色写真である。
【図７ｂ】ミトコンドリア内ＭＥＬ、ｄＫＬＡおよびＭＥＬ−ｄＫＬＡの相関係数である。
【図８ａ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡの抗癌効果を比較するために、腫瘍の大きさを比較したグラフである。
【図８ｂ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡの抗癌効果を比較するために、腫瘍の重量を比較したグラフである。
【図８ｃ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡの抗癌効果を比較するために、腫瘍の大きさを比較したｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅグラフである。
【図８ｄ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡの抗癌効果を比較するために、実験マウスの体重の変化を比較したグラフである。
【図９ａ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡの抗癌効果を比較するために、実験マウスの肺を比較した写真である。
【図９ｂ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡの癌転移抑制効果比較のために、実験マウスの肺を染色して比較した写真である。
【図９ｃ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡの抗癌効果を比較するために、肺の腫瘍結節数を比較したグラフである。
【図１０ａ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡの抗癌効果を比較するために、マウスにおいて発光因子を注入してがんの成長を比較した写真である。
【図１０ｂ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡの抗癌効果を比較するために、マウスにおいて発光強度を比較したグラフである。
【図１０ｃ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡの抗癌効果を比較するために、マウスにおいて腫瘍の大きさを比較したグラフである。
【図１０ｃ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡの抗癌効果を比較するために、マウスにおいて転移領域全体の発光強度を比較したグラフである。
【図１０ｃ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡの抗癌効果を比較するために、マウスにおいて転移領域全体の面積を比較したグラフである。
【図１１ａ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡの癌転移抑制効果を比較するために、マウスにおいて発光因子を注入してがんの転移を比較した写真である。
【図１１ｂ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡの癌転移抑制効果を比較するために、マウスにおいて発光強度全体を比較した写真である。
【図１２ａ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡの抗癌効果を比較するために、がん発現マーカーであるＣＤ４４の発現を測定して比較したグラフである。
【図１２ｂ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡの抗癌効果を比較するために、Ｍ２型マクロファージマーカーであるＣＣＬ２２の発現を測定して比較したグラフである。
【図１２ｃ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡの抗癌効果を比較するために、転移および浸透マーカーとして知られているＨＩＦ−αの発現を測定して比較したグラフである。
【図１２ｄ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡの抗癌効果を比較するために、マクロファージマーカーとして知られているＹｍ１の発現を測定して比較したグラフである。
【図１２ｅ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡの抗癌効果を比較するために、腫瘍細胞の移動および定着に関与するＭＭＰ−９の発現を測定して比較したグラフである。
【図１３ａ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡによるＭ２型腫瘍関連ＴＡＭ細胞数の選択的減少を比較するために、Ｍ１型腫瘍関連マクロファージの腫瘍基質内への潜入をＣＤ４５＋Ｆ４／８０＋ＣＤ８６＋で染色して示したグラフである。
【図１３ｂ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡによるＭ２型腫瘍関連ＴＡＭ細胞数の選択的減少を比較するために、Ｍ２型腫瘍関連マクロファージの腫瘍基質内への潜入をＣＤ４５＋Ｆ４／８０＋ＣＤ２０６＋で染色して示したグラフである。
【図１３ｃ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡによるＭ２型腫瘍関連ＴＡＭ細胞数の選択的減少を比較するために、Ｍ１型腫瘍関連マクロファージの腫瘍基質内に潜入したＣＤ４５＋Ｆ４／８０＋ＣＤ８６＋を表に変換して示したグラフである。
【図１３ｄ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡによるＭ２型腫瘍関連ＴＡＭ細胞数の選択的減少を比較するために、Ｍ２型腫瘍関連マクロファージの腫瘍基質内に潜入したＣＤ４５＋Ｆ４／８０＋ＣＤ２０６＋を表に変換して示したグラフである。
【図１３ｅ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡによるＭ１／Ｍ２割合の変化を比較するためのグラフである。
【図１３ｆ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡによるＣＤ４  Ｔ細胞の変化を比較するためのグラフである。
【図１３ｇ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡによるＣＤ８  Ｔ細胞の変化を比較するためのグラフである。
【図１３ｈ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡによる制御性Ｔ細胞の変化を比較するためのグラフである。
【図１３ｉ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡによる樹状細胞の変化を比較するためのグラフである。
【図１４ａ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡによるＭ２型腫瘍関連ＴＡＭの選択的細胞死を比較するためにＭ１を染色して示したグラフである。
【図１４ｂ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡによるＭ２型腫瘍関連ＴＡＭの選択的細胞死を比較するためにＭ２を染色して示したグラフである。
【図１４ｃ】ＭＥＬ−ｄＫＬＡによるＭ２型腫瘍関連ＴＡＭの選択的細胞死を比較するために染色されたＭ１とＭ２の割合を示したグラフである。
【図１５ａ】ＭＥＬおよびＭＥＬ−ｄＫＬＡの抗−血管生長効果を比較するためにＬＬＣ腫瘍の内皮細胞を免疫蛍光染色を施した写真である。
【図１５ｂ】ＭＥＬおよびＭＥＬ−ｄＫＬＡの抗−血管生長効果を比較するために区域当たりの血管の密度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
製造例１.ＭＥＬを活用した多様な抗がん剤の結合
【００５０】
１−１．ＭＥＬ−ｄＫＬＡ結合体
【００５１】
ＭＥＬの様々な抗がん剤薬物との結合の容易性を確認するためにｄＫＬＡの結合を行った。
【００５２】
ＭＥＬ（配列番号１）とｄＫＬＡ（配列番号２）は、短いペプチドに該当するので、ペプチド間アミド結合により連結することができる。このとき、ＭＥＬとｄＫＬＡ間の相互作用およびフォールドを最小限に抑えるために、中間に４つのグリシンおよび１つのセリンからなるリンカーを配置して両端を区分した。ＫＬＡは、体内の分解を最小化するためにＬ型ではないＤ型異性体を使用した。
【００５３】
１−２．ＭＥＬ−ＤＭ１結合体
【００５４】
ＭＥＬの様々な抗がん剤薬物との結合の容易性を確認するためにＤＭ１との結合を行った。
【００５５】
より具体的には、メリチンはアミノ酸配列のＮ末端にＭａｌｅｉｍｉｄｅ構造が合成されたものを購入した。Ｍａｌｅｉｍｉｄｅは、ＤＭ１が持つｆｒｅｅ−ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ  ｇｒｏｕｐ（−ＳＨ）と共有結合をなすことができる。Ｂｏｒｉｃ  ａｃｉｄ  ＢｕｆｆｅｒでメリチンとＤＭ１を２時間反応させた後、ａｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｍｅｒｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を利用してＰＢＳでＢｕｆｆｅｒ  ｅｘｃｈａｎｇｅおよび非結合メリチンをろ過した。メリチンは、約３ｋ  Ｄａの分子量を有し、ＤＭ１が結合されると、３．６ｋ  Ｄａ以上の分子量を有するようになる。使用したフィルタは、３ｋ  Ｄａ以上の物質をろ過することで、ＤＭ１が結合されたメリチンを分離し、これはＱ−ＴＯＦ質量分析計で確認した。
【００５６】
実施態様１−１．ＭＥＬを通じたＭ２型マクロファージへのアポトーシスを惹起するペプチドｄＫＬＡ伝達
【００５７】
ＭＥＬ−ｄＫＬＡがＭ２マクロファージにおいてアポトーシスを誘導するか否かを調査するために、いくつかの容量のｄＫＬＡ、ＭＥＬおよびＭＥＬ−ｄＫＬＡ（０．１〜１μＭ）で細胞の生存率を測定した。
【００５８】
より具体的には、ｄＫＬＡ（配列番号２）、ＭＥＬ（配列番号１）、ＭＥＬ−ｄＫＬＡ（配列番号３；ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱＧＧＧＧＳ−ｄ［ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ］）ペプチドと５−ｃａｒｂｏｘｙｌ ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＴＭＲ）−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｄＫＬＡ、ＭＥＬおよびＭＥＬ−ＫＬＡペプチドは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）で購入した。ＴＭＲは、ペプチドのＮ−ターミナルに位置するアミノ基と結合され、すべてのペプチドは、９５％以上精製されたペプチドを使用した。ネズミ科のルイス肺癌（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｗｉｓ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＬＬＣ）細胞とマウスのマクロファージＲＡＷ２６４．７は、１０％の熱−不活性ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（Ｗｅｌｇｅｎｅ））と１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）が添加されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｗｅｌｇｅｎｅ、Ｋｏｒｅａ）で培養した。Ｍ２型に分化されたマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）は、培地にＩＬ−４とＩＬ−１３を２４時間の間処理した。処理後には、細胞を４８時間の間血清が不足した状態で培養した。Ｍ１型マクロファージは、ＬＰＳ  １ｎｇ／ｍＬを２４時間処理して分化を誘導した。
【００５９】
細胞生存率テストは、ＭＴＳアッセイを用いて測定した。ＲＡＷ２６４．７マクロファージをＭ１型またはＭ２型マクロファージに分化させ、９６ウェルプレートに３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ接種した。翌日、ＰＢＳ、ｄＫＬＡ、ＭＥＬおよびＭＥＬ−ｄＫＬＡをそれぞれ処理した。２４時間後、培養液を入れ替え、２０μＬ  ＭＴＳ反応液（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ、ＵＳＡ）を細胞に処理して、３７℃で反応させた後、４９０ｎｍで蛍光を測定し、細胞生存力を測定した。
【００６０】
その結果、図１から見られるように、ｄＫＬＡは真核細胞の膜を撹乱させることができないので、対照群として使用した。細胞生存率は、０．６〜０．５μＭのＭＥＬ−ｄＫＬＡおよび７９〜７１％のＭＥＬを処理し、２４時間反応させたとき、約５５〜５３％減少した。Ｍ２マクロファージに対するＭＥＬ−ｄＫＬＡの半分最大抑制濃度（Ｔｈｅ  ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ；ＩＣ５０）は、ＭＥＬを単独で使用した時よりも低かった（０．８５μＭ  ＭＥＬ−ｄＫＬＡ／０．６〜０．８μＭ  ＭＥＬ）。しかし、Ｍ１マクロファージの生存率は、０．６〜０．８μＭのＭＥＬ−ｄＫＬＡを処理したとき８６〜６６％、０．６〜０．８μＭのＭＥＬを処理したとき７４％であった。したがって、前記マクロファージを相手にしたＭＥＬとＭＥＬ−ｄＫＬＡ両物質間のＩＣ５０テストでは、有意義な差がないことが確認された（図１ａ、ｂ）。
【００６１】
また、ＭＥＬ−ｄＫＬＡが腫瘍細胞のランダム死を惹起するか否かを調査するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＩ染色を通じて細胞周期を調べた。
【００６２】
より具体的には、細胞を７０％の冷エタノールで固定し、２０℃で２４時間保管した後、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを含むＰＢＳにｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｄｏｄｉｄｅ（ＰＩ）を５０μｇ／ｍｌ濃度になるように混ぜて細胞に施し、フローサイトメトリ方法を使って測定した。
【００６３】
その結果、０．１〜１μＭのＭＥＬ−ｄＫＬＡは、ＬＬＣ腫瘍細胞に対して細胞毒性を示さなかった（図１ｃ）。
【００６４】
実施態様１−２．ＭＥＬ−ｄＫＬＡのミトコンドリア膜撹乱によるＭ２マクロファージのアポトーシス
【００６５】
Ｍ２マクロファージの死がＭＥＬ−ｄＫＬＡ処理によるミトコンドリア膜撹乱によって惹起されたか否かを確認するために、フローサイトメトリを行った。
【００６６】
より具体的には、Ａｎｎｅｘｉ ｎ  Ｖ−ｆｌｕｏｒｅｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  ＲｅｄＢＯＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞を染色した。細胞は、２４ウェルプレートに５ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ接種し、翌日、０．８μＭペプチドを処理した。処理１、３、そして６時間後、細胞を無血清培養液で１時間２５０ｎＭ  ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒと反応させた。それから細胞を回収し、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖと再び反応させた。反応させた細胞をＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで測定し、ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ、Ｉｎｃ．、ＣＡ、ＵＳＡ）を使って分析した。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒは、膜電荷に応じて原形質膜を通過してミトコンドリア内に蓄積されることができる。すなわち、生細胞のミトコンドリア膜では、染色を確認することができるが、膜撹乱によってアポトーシスが行われる細胞に対しては染色が難しい。
【００６７】
その結果、図２〜３から見られるように、Ｍ１マクロファージは、ＭＥＬおよびＭＥＬ−ｄＫＬＡペプチドを１、３時間処理したときの効果が見られず、６時間処理したとき、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ染色が低くなり、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ＋染色が増加したが、有意義な変化は見られなかった（図２）。しかし、Ｍ２マクロファージでＭＥＬ−ｄＫＬＡを６時間処理すると、相当数の細胞が死ぬことが確認された。一方、ＭＥＬおよびｄＫＬＡを単独で使用した場合には、有意義な差を発見することができなかった（図３）。
【００６８】
実施態様１−３．ＭＥＬによるＭ２型マクロファージへのアポトーシスを惹起する抗がん剤ＤＭ１伝達
【００６９】
ＭＥＬ−ＤＭ１がＭ２マクロファージでアポトーシスを誘導するか否かを調査するためにＤＭ１、ＭＥＬおよびＭＥＬ−ＤＭ１を細胞に施し、細胞の生存率を測定した。
【００７０】
ＭＥＬ−ＤＭ１抗がん剤結合方法および細胞の実験方法は、上述した通りである。
【００７１】
その結果、図４から見られるように、ＭＥＬおよびＤＭ１をそれぞれ処理したときより、ＭＥＬ−ＤＭ１結合体を処理したとき、より高いＭ２選択的アポトーシス効果が確認され、ＭＥＬ−抗がん剤結合体は、より優れた効果を示すことが確認された。
【００７２】
実施態様２．ＭＥＬ−ｄＫＬＡによる代謝作用の変化を測定
【００７３】
ＭＥＬ−ｄＫＬＡがミトコンドリアの代謝作用に及ぼす影響を測定するために海馬のアッセイを行った。
【００７４】
より具体的には、代謝作用の測定は、ＸＦ２４  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｘ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使って測定した。Ｍ２に分化されたＲＡＷ２６４．７細胞をＸＦ−２４プレートに（３ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に接種し、翌日、状況の変化による潜在的なストレスを最小限にするため、各ペプチド１μＭを施し、５％ ＣＯ2の条件である３７℃インキュベーターで培養した。しばらく培養に適応化した後には４５００ｍｇ／Ｌ  Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ（ｗ／ｖ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４ｍＭＬ−グルタミンを添加した５００μＬ  ＸＦ  ｒｕｎｎｉｎｇ培養液（ｐＨ７．４）に細胞を接種した後、二酸化炭素がない３７℃環境で培養し、代謝毒素（１μＭオリゴマイシン、０．５μＭ  ｃａｒｂｏｎｙｌ  ｃｙａｎｉｄｅ  ｐ−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｏｘｙ−ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｏｎｅ［ＦＣＣＰ］、０．５μＭ  ｒｏｔｅｎｏｎｅとａｎｔｉｍｙｃｉｎ  Ａ［Ｒｏｔ／ＡＡ］）は、薬物ポートに担持した。その後、薬物を添加して、細胞内酸素消費率（ＯＣＲ）と細胞外酸性化率（ＥＣＡＲ）をリアルタイムで測定した。
【００７５】
また、ＯＣＲは１２回の時点で測定した。３回は基底状態、３回はオリゴマイシン添加後、ＡＴＰ−連結呼吸、３回はＦＣＣＰ添加後、最大呼吸、および残りの３回はＲｏｔ／ＡＡ添加後、非−ミトコンドリア性呼吸を示すポイントを測定し、ミトコンドリアの呼吸能力を測定した。その作用の割合を示すＥＣＡＲも同じポイントで測定した。
【００７６】
その結果、図５〜６から見られるように、ＭＥＬ−ｄＫＬＡグループの基底呼吸率はＰＢＳグループに比べて著しく低下した。しかし、ｄＫＬＡあるいはＭＥＬのみを処理した場合には、ＰＢＳに比べて基底ＯＣＲの変化が見られなかった（図５ａ、ｂ）。また、ＭＥＬ−ｄＫＬＡは著しくＡＴＰ生産を減少させた（図５ａ、ｄ）。また、ＭＥＬ−ｄＫＬＡ処理を行う場合、最大呼吸が著しく低下した（図５ａ、ｅ）。基底解糖作用能力は有意義な変化が示されず、オリゴマイシンを処理するとすべてのグループで上昇した（図５ｂ）。エネルギー標準型でもＭＥＬ−ｄＫＬＡが基底状態、ストレス状態の両状態でいずれも呼吸能力を低下させたことが確認された（図６ａ、ｂ）。しかし、基底ＥＣＡＲは、ＭＥＬ−ｄＫＬＡ処理によって抑制されないが、ＭＥＬ−ｄＫＬＡによってストレスを受けていた状況のグループにおいて、ＥＣＡＲはｄＫＬＡグループに比べてやや減少した。しかし、ＰＢＳグループとＭＥＬ−ｄＫＬＡグループを比較して有意義な差は示されなかった（図６ａ、ｃ）。
【００７７】
これにより、細胞質の解糖作用では、ＭＥＬ−ｄＫＬＡの影響が微々たることを確認し、よってミトコンドリア呼吸の機能異常は、ミトコンドリアを標的としたＭＥＬ−ｄＫＬＡによるものであることを知ることができた。
【００７８】
実施態様３．ＭＥＬ−ｄＫＬＡの選択的なミトコンドリア内への浸透力を測定
【００７９】
Ｍ２型マクロファージのミトコンドリア内ＭＥＬ−ｄＫＬＡの浸透および位置を確認すべく染色を通じて蛍光顕微鏡で確認した。また、定量分析のためにＰＡＳＣＡＬ  ５  ＬＳＭ画像計測を行った。
【００８０】
より具体的には、Ｍ２に分化されたＲＡＷ２６４．７マクロファージを１μＭのＴＭＲ−結合ｄＫＬＡ、ＭＥＬまたはＭＥＬ−ｄＫＬＡと一緒に２時間培養した。非結合ペプチドは、洗浄で洗い流した後、細胞を２５０ｎＭ  ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３０分間染色した。染色した後、細胞は再び４μｇ／ｍＬ  ４’６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ、ＵＳＡ）を添加したＰＢＳに１０分間染色した。染色された細胞は、レーザースキャンコンフォーカル顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定し、ミトコンドリア内ＭＥＬ−ｄＫＬＡの位置確認はＬＳＭ５画像測定器（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）で測定した。
【００８１】
その結果、図７から見られるように、前記画像測定によりミトコンドリア内にＭＥＬ−ｄＫＬＡがかなり存在していることが確認されたが、ＭＥＬは確認されず、ｄＫＬＡは少ない数の細胞に結合したことが確認された（図７ａ）。また、唯一ＭＥＬ−ｄＫＬＡのみミトコンドリアと正の相関関係（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）を見せ、ｄＫＬＡおよびＭＥＬはミトコンドリアと関連性を示さなかった（図７ｂ）。
【００８２】
これにより、ＭＥＬ−ｄＫＬＡは選択的にミトコンドリアに反応し、浸透することができることが確認された。
【００８３】
実施態様４．ＭＥＬ−ｄＫＬＡによるマウスの腫瘍細胞増殖抑制効果の測定
【００８４】
実施態様４−１．ＭＥＬ−ｄＫＬＡによるマウスの肺がん細胞抑制効果の測定
【００８５】
ＭＥＬ−ｄＫＬＡとＭＥＬの抗癌効果をｉｎ  ｖｉｖｏで比較するために、肺癌細胞を持つマウスにＰＢＳ、ｄＫＬＡ、ＭＥＬもしくはＭＥＬ−ｄＫＬＡペプチドを注射した後、腫瘍の変化を確認した。
【００８６】
より具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスは、ＤＢＬ（Ｋｏｒｅａ）で購入し、ＬＬＣ腫瘍細胞は、マットリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）と混ぜてマウスの右脇腹に注射した（５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）。腫瘍細胞を注入し、５日後に、組換えられたｄＫＬＡ、ＭＥＬおよびＭＥＬ−ｄＫＬＡペプチドは、３日間（１７５ｎｍｏｌ／ｋｇずつ体重／重量）腹腔内に計３回注射した。すべての腫瘍組織は、注射後１２日後に回収した。前記動物実験は、慶熙大学校、動物管理委員会の承認を受けており［ＫＨＵＡＳＰ（ＳＥ）−１７−０８７］、動物は病原菌のない１２時間の光／闇サイクル環境で水や食料の自律配食で管理した。
【００８７】
その結果、図８から見られるように、ＰＢＳおよびｄＫＬＡを注射したマウスからは、着実にマウスの腫瘍が育つことが確認された。ＭＥＬ−ｄＫＬＡ注射は、ＰＢＳを注射した対照群に比べて大幅に腫瘍の成長を阻害した。また、ｄＫＬＡを注射したグループと比較したときも、腫瘍の大きさと重量がかなり減少したことを確認した（図８ａ、ｂ）。また、ＭＥＬを注射したグループでもかなり腫瘍の大きさが減少したことを確認した。ここで重要なのは、ＭＥＬ−ｄＫＬＡを投与したグループからｄＫＬＡグループに比べて大幅に腫瘍の大きさと重量が減少したことが示されたことである（図８ｃ）。その反面、すべてのグループにおいてマウスの体重は変わらなかったことが確認された（図８ｄ）。
【００８８】
これにより、肺がんでＭＥＬ−ｄＫＬＡが、他のペプチドと抗がん剤単独処理よりもはるかに腫瘍の生長と転移を抑制することが確認された。
【００８９】
実施態様４−２．ＭＥＬ−ｄＫＬＡによるマウスの乳がん細胞抑制効果の測定
【００９０】
ＭＥＬ−ｄＫＬＡとＭＥＬの腫瘍抑制および癌転移抑制効果を測定するために腫瘍を確認し、染色を通じて肺の転移程度を確認した。
【００９１】
より具体的には、４Ｔ１乳がん細胞（１ｘ１０5）をＢＡＬＢ／ｃマウスに注射し、３日後に１７５ｎｍｏｌ／ｋｇのＰＢＳ、ｄＫＬＡ、ＭＥＬおよびＭＥＬ−ｄＫＬＡを３日間隔で、それぞれのグループに注射した。転移の程度と肺表面の結節を調査するために、癌細胞注射１５日後に、マウスを犠牲にして、肺の表面結節を確認した。
【００９２】
その結果、図９から見られるように、ＭＥＬ−ｄＫＬＡを処理したグループからは肺の表面の結節が著しく減ったが、ＭＥＬおよびｄＫＬＡを単独で処理したグループから結節の減少が起こらなかったことが確認された（図９ａ）。
【００９３】
また、通常の方法でＨ＆Ｅ染色を施し、肺の転移程度を測定した。
【００９４】
より具体的には、Ｈ＆Ｅ染色はｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ溶液に組織を浸し、細胞の核を紫に染めた後、酸性アルコール溶液で核を除いた残りの染色を除去し、エオシンが添加された溶液に組織を再び浸し、細胞をピンク色に染めて細胞の構造を観察した。
【００９５】
その結果、図９から見られるように、ＰＢＳおよびｄＫＬＡを処理したグループからは腫瘍細胞が広く広がり、転移が起こったことが確認された。一方、ＭＥＬおよびＭＥＬ−ｄＫＬＡを処理したグループからは比較的少ない転移が起こったことが確認された（図９ｂ）。しかし、ＭＥＬ−ｄＫＬＡは結節の数を大幅に減少させたのに対し、ＭＥＬを単独で処理したときは、有意義な結節の数の減少は、起こらなかった（図９ｃ）。
【００９６】
また、蛍光物質４Ｔ１−ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）をマウスに注入してＭＥＬ−ｄＫＬＡが腫瘍の成長と転移に及ぼす影響を蛍光を通じて確認した。
【００９７】
より具体的には、まず、乳がん細胞を乳房に同位移植したとき、ＭＥＬ−ｄＫＬＡが腫瘍の成長と転移に及ぼす影響を確認するため、４Ｔ１−ルシフェラーゼ乳がん細胞（１ｘ１０5）を免疫不全マウスであるＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに注射した。５日後、４回、乳腺で腫瘍塊が育ち始めた時点から１７５ｎｍｏｌ／ｋｇのＰＢＳ、ｄＫＬＡ、ＭＥＬおよびＭＥＬ−ｄＫＬＡを３日に一度、各グループに注射した。腫瘍の成長を測定するためにｃａｌｉｐｅｒ機器を利用して、３日に一度、腫瘍の大きさが測定され、すべての腫瘍組織は、注射後４週間後に回収した。腫瘍移植４週目、腫瘍のリンパ節および肺への転移を確認するために腹腔投与でルシフェラーゼ酵素の基質であるルシフェリン（Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）を４０ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈して、１００μｌずつマウスに投与した。約１５分間反応させた後、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ機器であるＮｉｇｈｔＯｗｌ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して発光を測定し、マウスの写真と一緒に分析して、全身および肺への転移程度を分析した。前記動物実験は、慶熙大学校、動物管理委員会の承認を受けており［ＫＨＵＡＳＰ（ＳＥ）−１８−１３３］、動物は病原菌のない１２時間の光／闇サイクル環境で水や食料の自律配食で管理した。
【００９８】
ひいては、腫瘍細胞の転移を確認するために、尾静脈を介して４Ｔ１−ルシフェラーゼ乳がん細胞（１ｘ１０5）をＢＡＬＢ／ｃマウスに注射した。３日後から１７５ｎｍｏｌ／ｋｇのＰＢＳ、ｄＫＬＡ、ＭＥＬおよびＭＥＬ−ｄＫＬＡを３日に一度、各グループに注射した。癌細胞注射１５日後に、腹腔投与でルシフェラーゼ酵素の基質であるルシフェリン（Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）を４０ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈して、１００μｌずつマウスに投与し、約１５分間反応させた後、ＮｉｇｈｔＯｗｌ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してマウスの写真と一緒に全身及び肺への癌細胞定着および転移の程度を分析した。
【００９９】
その結果、図１０〜１１から見られるようにＰＢＳを処理したグループからは、乳腺における乳がん塊が急速に成長したことが確認できた。ＭＥＬ−ｄＫＬＡを処理したグループからは乳がん細胞の成長を効果的に低減し、ＭＥＬおよびｄＫＬＡを単独処理したグループからは乳がんの成長の減少効果が有意に起こらなかった（図１０ａ〜１０ｃ）。脇のリンパ節と肺への転移を確認した結果からも同様にＰＢＳグループでは転移が起こった面積が広く、転移部位の発光値が非常に高いことが確認できた。ｄＫＬＡやＭＥＬグループでは、転移面積上、ＰＢＳグループと大きな差異はなく、発光数値は減少する傾向を示したが、有意性を示さなかった。ＭＥＬ−ｄＫＬＡで転移がほとんど観察されず、転移面積および発光数値が有意に減少したことが確認された（図１０ｄ、ｅ）。
【０１００】
また、腫瘍細胞の転移性を確認するための実験においても同様にＰＢＳおよびｄＫＬＡを処理したグループでは、癌細胞の発光値が全身で高く測定され、ＭＥＬを処理した場合、ＰＢＳまたはｄＫＬＡに比べ転移が減少したことが確認された。ＭＥＬ−ｄＫＬＡグループでは、肺における癌細胞の発光値が非常に低く測定されており、全身からもＭＥＬに比べても有意に低い転移性が示された（図１１）。
【０１０１】
これにより、乳がんでＭＥＬ−ｄＫＬＡが他のペプチドおよび抗がん剤を単独で処理したときよりもはるかに腫瘍の生長と転移を抑制することが確認できた。
【０１０２】
実施態様５．ＭＥＬ−ｄＫＬＡの腫瘍転移遺伝子発現程度の測定
【０１０３】
ＭＥＬ−ｄＫＬＡの腫瘍転移抑制能力を測定するために、細胞外基質リガンドと相互作用して、転移と浸透を促進し、癌から多く発現されるとして知られたＣＤ４４、Ｍ２型マクロファージマーカーとして知られているＣＣＬ２２、血管の生成、転移および浸透マーカーとして知られているＨＩＦ−１ α、Ｍ２型マクロファージマーカーであるＹｍ１、腫瘍細胞の移動および定着に関与するＭＭＰ−９の発現を定量ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを使って測定した。
【０１０４】
より具体的には、肺組織からｅａｓｙ−ＢＬＵＥ  ＲＮＡ抽出キット（ｉＮｔＲＯＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｋｏｒｅａ）を使ってＲＮＡを抽出し、ｃｙｃｌｅｓｃｒｉｐｔ ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｂｉｏｎｅｅｒ 、Ｋｏｒｅａ）マニュアルに沿ってｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ合成の条件は、９５で１５秒、５５で１０秒、７２で１０秒であり、各反応は３回行った。その後、ＣＤ４４：ｆｏｒｗａｒｄ、（配列番号４；５’−ＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＡＧＣ  ＴＧＧＡ−３’）；（配列番号５；ｒｅｖｅｒｓｅ、５’−ＧＣＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣＣＣＡＣＡ−３’）； ＣＣＬ２２：ｆｏｒｗａｒｄ、（配列番号６；５’−ＴＣＣＣＡＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＴＡＡＡ−３’）；ｒｅｖｅｒｓｅ、（配列番号７；５’−ＧＧＴＴＴＧＧＡＴＣＡＡ  ＧＣＣＣＴＴＴ−３’）；ＨＩＦ−１α：ｆｏｒｗａｒｄ、（配列番号８；５’−ＴＣＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’）； ｒｅｖｅｒｓｅ、（配列番号９；５’−ＴＧＣＣＴＴＧＴＡＴＧＧＧＡＧＣＡＴＴ−３’）；Ｙｍ−１：ｆｏｒｗａｒｄ、（配列番号１０；５’−ＣＡＴＴＣＡＧＴＣＡＧＴＴＡＴＣＡＧＡＴＴＣＣ−３’）；ｒｅｖｅｒｓｅ、（配列番号１１；５’−ＡＧＴＧＡＧＴＡＧＣＡＧＣＣＴＴＧＧ−３’）；ＭＭＰ−９：ｆｏｒｗａｒｄ、（配列番号１２；５’−ＴＧＡＡＴＣＡＧＣＴＧＧＣＴＴＴＴＧＴＧ−３’）；ｒｅｖｅｒｓｅ、（配列番号１３；５’−ＧＴＧＧＡＴＡＧＣＴＣＧ  ＧＴＧＧＴＧＴＴ−３’）；プライマーを用いて、ｔｈｅ ＳｅｎｓｉＦＡＳＴ ＳＹＢＲ  ｎｏ− Ｒｏｘ ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ 、Ｋｏｒｅａ）を使って定量ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行った。
【０１０５】
その結果、図１２から見られるように、ＷＴと比較してＰＢＳを処理したグループにおいてＣＤ４４発現が顕著に増加し、ＭＥＬ−ｄＫＬＡを処理したグループはＰＢＳ、ｄＫＬＡ、ＭＥＬを処理したグループよりもＣＤ４４発現レベルが著しく低下した（図１２ａ）。ＣＣＬ２２およびＨＩＦ−１αもＷＴに比べてＰＢＳを処理したグループにおいて発現が増加したが、ＭＥＬ−ｄＫＬＡを処理したグループでは著しく低くなることを確認した。一方、ｄＫＬＡおよびＭＥＬを処理したグループではＰＢＳグループと大きく変わらないことを確認した（図１２ｂ〜１２ｃ）。Ｙｍ１の場合、ＰＢＳグループに比べてｄＫＬＡグループではむしろ大幅に増加することが確認され、ＭＥＬおよびＭＥＬ−ｄＫＬＡ処理グループではＰＢＳグループと特別の差は見られなかった（図１２ｄ）。ＭＭＰ−９の発現は、ＰＢＳグループおよびｄＫＬＡグループで高く測定され、ＭＥＬを処理したグループでは、ＰＢＳグループと比べたとき、低くなることが確認された。一方、ＭＥＬ−ｄＫＬＡを処理したグループでは、ＭＥＬを処理したグループよりもＭＭＰ−９の発現レベルがより低くなることが確認された（図１２Ｅ）。
【０１０６】
これにより、ＭＥＬ−ｄＫＬＡがＭＥＬおよびｄＫＬＡを単独で使用したときよりも、顕著に高い腫瘍の転写因子発現抑制効果があることを確認した。
【０１０７】
実施態様６．フローサイトメトリを使ったＣＤ２０６＋Ｍ２型腫瘍関連ＴＡＭを標的とするＭＥＬ−ｄＫＬＡ分析
【０１０８】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＭＥＬ−ｄＫＬＡペプチドをＭ２型腫瘍関連ＴＡＭを標的とするペプチドとして使用できるか否か確認するために、腫瘍組織を培養し、これらを染色して個別に分析し、細胞の増加を確認した。
【０１０９】
より具体的には、腫瘍細胞を薄くつぶし、ＤＮａｓｅＩ（１Ｕ／ｍＬ）およびＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｄ（１ｍｇ／ｍＬ）が添加されたＤＭＥＭで分離した。組織は、３７℃で１時間弱く攪拌し、１００−μＭナイロン網フィルターで分離した。赤血球はＰｈｒｍｌｙｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ＢＥ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で溶解した。個別の細胞は、４０μｍのナイロン網フィルターを通過して、次の抗体で染色した。ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ４＋ＣＤ８−）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ４−ＣＤ８＋）、Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）、樹状細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋）およびＭ１（ＣＤ４５＋Ｆ４／８０＋ＣＤ８６＋）またはＭ２マクロファージ（ＣＤ４５＋Ｆ４／８０＋ＣＤ２０６＋）：抗−ＣＤ４５−ＦＩＴＣ、抗−ＣＤ４−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）、抗−ＣＤ８−ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）、抗−ＣＤ４−ＦＩＴＣ、抗−ＣＤ２５−ＰＥ、抗−Ｆｏｘｐ３−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、抗−ＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ、抗−ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣｃｙ７、抗−Ｇｒ１−ＰＥｃｙ７、抗−ＣＤ８６−ＰＥｃｙ７および抗−ＣＤ２０６−ＡＰＣ抗体。Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖは、プレマクロファージ細胞率を測定するために、すでに処理した。
【０１１０】
その結果、図１３から見られるように、Ｆ４８０＋ＣＤ８６＋Ｍ１型腫瘍関連マクロファージは、ＰＢＳおよびｄＫＬＡ投与グループと比較して、ＭＥＬ投与グループではやや増加したがｄＫＬＡグループと有意義な差は確認できなかった。一方、ＭＥＬ−ｄＫＬＡを投与したグループでは、ＭＥＬグループと比較してＦ４８０＋ＣＤ８６＋Ｍ１型腫瘍関連マクロファージが大幅に増加することを確認した（図１３ａ、ｃ）。ＰＢＳおよびｄＫＬＡ投与グループにおいてＣＤ４５＋白血球内Ｍ２型腫瘍関連Ｆ４／８０＋ＣＤ２０６＋ＴＡＭの割合は、約２０％であった。ＭＥＬグループとＭＥＬ−ｄＫＬＡグループではＰＢＳグループに比べてＭ２型腫瘍関連ＴＡＭ細胞が半分ほど減少し、約１０％の割合であることを確認した（図１３ｂ、ｄ）。しかし、Ｍ１／Ｍ２の割合は、ＭＥＬグループに比べてＭＥＬ−ｄＫＬＡグループではるかに高いことを確認した。たとえＭ２型腫瘍関連ＴＡＭは、ＭＥＬとＭＥＬ−ｄＫＬＡグループでＰＢＳとｄＫＬＡグループに比べて大幅に低くなったが（図１３ｅ）、ＣＤ４  Ｔ細胞、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓ、ＣＤ８  Ｔ細胞と樹状細胞のようなその他の白血球には変化がなく、これらには影響を与えないことが確認された（図１３ｆ〜１３ｉ）。
【０１１１】
また、マウス内でＭ２型腫瘍関連ＴＡＭ細胞が選択的にアポトーシスされたことを確認するために、Ｍ１型腫瘍関連ＴＡＭ（Ｆ４／８０  ＣＤ８６＋）およびＭ２型腫瘍関連ＴＡＭ（Ｆ４／８０  ＣＤ２０６＋）をそれぞれＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖで染色した。
【０１１２】
その結果、図１４から見られるように、ＣＤ８６＋Ｍ１型腫瘍関連ＴＡＭはＡｎｎｅｘｉｎ染色された細胞の増加が対照群ＰＢＳグループと比較して、すべてのグループで見られなかった（図１４ａ）。また、ＭＥＬおよびＭＥＬ−ｄＫＬＡグループでＭ２型腫瘍関連ＴＡＭの減少が起きたが、かなりの量のＣＤ２０６＋Ｍ２型腫瘍関連ＴＡＭ細胞死は、唯一ＭＥＬ−ｄＫＬＡ投与グループでのみ確認できた（図１４ｂ）。ＭＥＬ−ｄＫＬＡの投与によるアポトーシスの割合は、Ｍ１型腫瘍関連ＴＡＭよりＭ２型腫瘍関連ＴＡＭではるかに多く示された（図１４ｃ）。
【０１１３】
これにより、ＭＥＬ−ｄＫＬＡは選択的にＭ２型腫瘍関連ＴＡＭのアポトーシスを誘導し、ＭＥＬ処理したときよりＭ１／Ｍ２の割合がはるかに増加したことを確認した。
【０１１４】
実施態様８．腫瘍内ＣＤ２０６＋ＴＡＭの減少と抗−血管生長効果との関係
【０１１５】
ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）は、血管内皮で活発に分泌され、血管生長を事前に知ることができるマーカーとしてよく知られている。腫瘍の血管生長は、腫瘍内の酸素が低い地域への酸素と栄養分を供給するための必須手段であり、がんの成長と転移とも密接している。Ｍ２−二極化マクロファージは、血管生長要素の主な前駆体としてｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９およびＶＥＧＦを含み、マクロファージの密度も血管生長と関連がある。したがって、腫瘍内Ｍ２型腫瘍関連ＴＡＭの減少が血管生長の減少を惹起するか否かを確認するため、免疫染色を施し、コンフォーカルを利用して確認した。
【０１１６】
より具体的には、組織をパラホルムアルデヒドと一緒に２４時間乾燥した。その後、ロータリミクロトーム（ｒｏｔａｒｙ  ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を用いて、４μｍの厚さに切り、ｔｒｉ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒと一緒に１分間オートクレーブして復元した。復元された組織切片は、抗−マウス血清内皮細胞接着物質（ＰＥＣＡＭ；ＣＤ３１）抗体（１：２００；ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）とＡｌｅｘａ−４８８と結合した抗−ウサギ二次抗体（１：５００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒に培養して可視化した。染色後の切片は、マウントして、レーザー走査コーンフォーカル顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）で分析した。すべての画像はＬＳＭ５  ＰＡＳＣＡＬで撮影し、ＩｍａｇｅＪ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて蛍光値を分析した。
【０１１７】
その結果、図１５から見られるように、ＭＥＬとＭＥＬ−ｄＫＬＡグループ両方著しいＣＤ３１＋内皮細胞の減少が確認された（図１５ａ、ｂ）。
【０１１８】
これにより、血管生長の抑制は、Ｍ２型腫瘍関連ＴＡＭの減少と関連があることを確認した。
【０１１９】
腫瘍基質内ＴＡＭ濃度は、腫瘍の成長、転移および血管生長と密接な関連がある。しかし、単純にマクロファージを減らす方法は、効果的な前記腫瘍の成長および血管生長のような問題を解決することができなかった。本発明により、向上された抗がん効果は、Ｍ１／Ｍ２の割合が高いことと関連があるものと思われた。本発明のＭＥＬ−ｄＫＬＡは、選択的にＭ２型腫瘍関連ＴＡＭを減少させ、効果的にＭ１／Ｍ２の割合を向上させ、ミトコンドリアの自殺を誘導し、腫瘍の成長および血管生長を抑制した。したがって、ＭＥＬ−ｄＫＬＡは効果的にＭ２型腫瘍関連ＴＡＭを標的とする癌治療薬として使用することができるであろう。
【０１２０】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更しないで他の具体的な形で実施されうることを理解できるであろう。これに関連し、上述した実施態様は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものでないということを理解しなければならない。本発明の範囲は、前記の詳細な説明よりは後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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