(57)【要約】  Ｊａｋ−Ｓｔａｔ経路を制御して細胞を分化、脱分化、若返りさせる技術及びその使用が提供される。低分子化合物の組み合わせ、サイトカインの組み合わせ又は組換えタンパク質の組み合わせ、遺伝子編集技術、遺伝子組替え技術によりを細胞中のＪａｋ−Ｓｔａｔシグナル伝達経路の遺伝子又はタンパク質ターゲットを定量及び／又は定時的に制御することにより、若返った細胞製品及び／又は異なる種類の細胞製品を得る。この製品は、細胞、組織、臓器、生体のリプログラミング；組織工学材料の構築；哺乳動物の組織、臓器損傷及び老化、退化した組織、臓器の修復；細胞、組織、臓器及び生体の老化進行の遅延又は逆転；細胞、組織、臓器及び生体の免疫調節に適用できる。【選択図】図１
2021522859.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｊａｋ−Ｓｔａｔ経路を制御し、細胞を分化、脱分化、分化転換、若返り、老化、アポトーシスさせる技術及びその使用であって、
前記方法は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を定量及び／又は定時的に活性化又は抑制することである、ことを特徴とする技術及びその使用。
【請求項２】
前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化又は抑制する方法において、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路中で高発現する又は高発現される、低発現する又は発現が抑制される遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＣＸＣＬ２（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＹ５７７９０５．１）、ＳＯＳ１（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００５６３３．３）、ＳＴＡＴ５Ｂ（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿０１２４４８．３）、ＪＡＫ１（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１３２１８５７．１）、ＪＡＫ３（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿０００２１５．３）、ＳＯＣＳ３（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００３９５５．４）、ＩＬ６ＳＴ（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１２４３８３５．１）、ＳＴＡＴ１（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００７３１５．３）、ＳＴＡＴ２（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿１９８３３２．１）、ＳＴＡＴ３（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿２１３６６２．１）、ＳＴＡＴ４（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１２４３８３５．１）、ＳＴＡＴ６（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１１７８０８１．１）、ＳＴＡＴ５Ａ（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１２８８７２０．１）、ＩＲＦ９（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００６０８４．４）、ＩＬ６（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿００５２４９７４５．５）、ＩＬ６Ｒ（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿１８１３５９．２）、ＩＬ２（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿０００５８６．３）（例えば、ＩＬ２Ａ及び／又はＩＬ２Ｂ）、ＰＲＫＣＤ（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１３５４６７９．１）、ＣＸＣＬ１２（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿０００６０９．６）、ＣＸＣＲ４（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００３４６７．２）、ＪＡＫ２（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００４９７２．３）、ＩＬ１５ＲＡ（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１３５１０９５．１）、ＩＬ２０ＲＢ（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿００６７１３６６５．４）、ＧＨＲ（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１２４２４０６．２）和ＰＲＬＲ（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１２０４３１４．２）のうちの少なくとも１種を含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＪａｋ−Ｓｔａｔ経路を制御し、細胞を分化、脱分化、分化転換、若返り、老化、アポトーシスさせる技術及びその使用。
【請求項３】
前記細胞は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴを制御する初期標的細胞であり、前記標的細胞は、ヒト、ネズミ、サル、ブタを含む哺乳動物に由来し、前記標的細胞は、線維芽細胞、上皮細胞、脂肪細胞、血液細胞、間葉系幹細胞、神経細胞、筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、破骨細胞を含み、
前記方法により製造された細胞は、本発明において目的細胞として定義され、標的細胞に由来し、標的細胞中でＪＡＫ−ＳＴＡＴを制御する過程において産生する特徴が異なる様々な種類の細胞を含み、前記特徴は、分化、逆分化、分化転換、若返り、老化、アポトーシスのうちの少なくとも１種を含む、ことを特徴とする請求項１又は２に記載のＪａｋ−Ｓｔａｔ経路を制御し、細胞を分化、脱分化、分化転換、若返り、老化、アポトーシスさせる技術及びその使用。
【請求項４】
前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に対する定量的な活性化又は抑制において、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に対する活性化又は抑制の定量は、目的細胞中のＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の遺伝子又はタンパク質ターゲットの少なくとも１種が標的細胞に対して１〜３００倍のうちのいずれか１つの倍数アップレギュレート又はダウンレギュレートし、或いは安全にノックアウトされて発現しないことである、ことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のＪａｋ−Ｓｔａｔ経路を制御し、細胞を分化、脱分化、分化転換、若返り、老化、アポトーシスさせる技術及びその使用。
【請求項５】
前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に対する定時的な活性化又は抑制において、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に対する活性化又は抑制の定時は、標的細胞中でＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の遺伝子又はタンパク質ターゲットの少なくとも１種が高発現するか、低発現するか、又は発現しないように２４時間〜２２０日間制御され、これにより得られる目的細胞は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の遺伝子又はタンパク質ターゲットのうちの少なくとも１種を高発現、低発現又は非発現に長期間維持し、或いは、標的細胞と同じ発現レベルに回復させる、ことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のＪａｋ−Ｓｔａｔ経路を制御し、細胞を分化、脱分化、分化転換、若返り、老化、アポトーシスさせる技術及びその使用。
【請求項６】
前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化又は抑制する方法において、ＮＯＤ様受容体シグナル伝達経路、焦点接着斑（Ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）、細胞周期、クエン酸回路、ＴＧＦ  ｂｅｔａシグナル伝達経路、ＷＮＴシグナル伝達経路、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路、Ｐ５３シグナル伝達経路、インスリンシグナル伝達経路、カルシウム（Ｃａｌｃｉｕｍ）シグナル伝達経路、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１９、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２０、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２２、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２４、ＩＬ７  ＨＤＡＣ（ヒストンデアセチラーゼ）、ＰＫＣシグナル伝達経路、ＲＡＲ経路、アデニル酸シクラーゼシグナル伝達経路、ＨＭＴ（ヒストンメチルトランスフェラーゼ）、ＤＮＭＴ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ）、及びヒストンデメチラーゼ阻害剤からなる群から選択される経路又はターゲットのうちの少なくとも１種を調節することによりＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化又は抑制することができる、ことを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載のＪａｋ−Ｓｔａｔ経路を制御し、細胞を分化、脱分化、分化転換、若返り、老化、アポトーシスさせる技術及びその使用。
【請求項７】
ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の細胞ターゲット及び細胞シグナル伝達経路を活性化又は抑制し、
前記ＮＯＤ様受容体シグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＮＡＩＰ、ＩＬ６、ＣＸＣＬ１２、  ＮＯＤ１、ＴＡＢ３、ＣＡＲＤ６、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ３、ＣＡＲＤ８、ＣＡＲＤ９、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ１２、ＣＡＳＰ４、ＣＡＳＰ５、ＮＦＫＢ１、ＴＭＥＭ１７３、ＴＮＦ、ＮＦＫＢＩＢ、ＮＯＤ２、ＰＹＤＣ１、ＰＹＣＡＲＤ、ＴＡＢ１、ＴＡＢ２、ＴＮＦ、ＴＬＲ４、ＮＬＲＰ１、ＮＬＲＰ１２、ＮＬＲＰ３、ＮＬＲＰ６、ＭＣＵ、ＲＩＰＫ３、ＲＨＯＡ、ＴＡＫ１、ＢＩＲＣ２、ＡＴＧ１６Ｌ１、ＡＴＧ５、ＡＴＧ１２、ＴＡＮＫからなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記焦点接着斑経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＴＮＸＢ、ＲＡＰＧＥＦ１、ＩＴＧＢ８、ＳＲＣ、ＴＨＢＳ１、ＩＴＧＡ３、ＶＣＬ、ＣＡＰＮ２、ＦＬＴ４、ＦＬＴ１、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ１０、ＩＴＧＡ１１、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡ７、ＩＴＧＡ８、ＩＴＧＡ９、ＩＴＧＡＶ、ＰＤＲＶＧ、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＧＦＤ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＢＩＲＣ３、  ＢＩＲＣ２、ＢＣＬ２、ＤＯＣＫ１、ＦＮ１、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＣＴＮＮＢ１からなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記細胞周期を制御するための遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＭＡＤ２Ｌ１、ＢＵＢ１、ＯＲＣ１、ＯＲＣ２、ＯＲＣ３、ＯＲＣ４、ＯＲＣ５、ＯＲＣ６、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＣＮＡ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＢ２、ＣＣＮＢ３、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ４、Ｅ２Ｆ５、ＥＰ３００、ＦＺＲ１、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＳＴＡＧ１、ＳＴＡＧ２、ＣＤＣ１４Ａ、ＣＤＣ１４Ｂ、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＣ２５Ｂ、ＭＹＣ、ＳＭＣ３、ＣＤＣ１６、ＹＷＨＡＨ、ＹＷＨＡＢ、ＹＷＨＡＱ、ＹＷＨＡＥ、ＹＷＨＡＧ、ＹＷＨＡＺからなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記クエン酸回路を制御するための遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＩＤＨ３Ｇ、ＩＤＨ３Ｂ、ＭＤＨ２、ＳＤＨＢ、ＯＧＤＨ、ＭＤＨ１、ＯＧＤＨＬ、ＳＵＣＬＧ１、ＳＵＣＬＧ２、ＳＵＣＬＡ２、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＣ、ＰＤＨＡ１、ＰＤＨＢ、ＡＣＬＹからなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記ＴＧＦ  ｂｅｔａシグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＴＨＢＳ１、ＦＳＴ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２．ＴＧＦＢＲ３、ＢＭＰ４、ＲＵＮＸ３、ＲＵＮＸ２、ＣＲＥＢＢＰ、  ＩＦＮＧ、ＨＲＡＳ、ＦＯＳ、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＡＣＶＲＬ１、ＦＯＸＯ３、ＭＴＯＲ、ＫＲＡＳ、ＣＲＥＢ１、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ４、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ４Ｇ、ＰＩＫ３Ｒ３からなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記ＷＮＴシグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＰＲＫＣＡ、ＷＮＴ７Ｂ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＬＲＰ６、ＣＴＮＮＢ１、ＦＺＤ４、ＣＣＮＤ２、ＰＲＩＣＫ、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ１、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ４Ｂからなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＣＩＲ１、ＫＡＴ２Ｂ、ＭＡＭＬ２、ＰＳＥＮ２、ＤＶＬ２、ＲＦＮＧ、ＳＮＷ１、ＤＬＬ４、ＤＴＸ３、ＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＤＴＸ１、ＤＴＸ２、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＴＢＰ１、ＣＴＢＰ２、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２からなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記Ｐ５３シグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＣＣＮＧ２、ＳＩＡＨ１、ＢＢＣ３、ＴＰ５３ＡＩＰ１、ＴＰ５３、ＳＥＴＤ７、ＡＴＦ３、ＣＣＮＡ２、ＣＤＫ２、ＣＣＮＧ１、ＣＨＥＫ１、ＰＲＫＣ  ＤＫＡＴ２Ｂ、ＰＲＬ２３、ＰＰＰ２ＣＡからなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記カルシウムシグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＲＹＲ１、ＲＹＲ２、ＲＹＲ３、ＥＳＲ１、ＡＲ（アンドロゲン受容体）、ＫＤＲ（キナーゼインサートドメイン受容体）、ＶＤＲ（ビタミンＤ受容体）、ＩＴＰＲ１、ＩＴＰＲ２、ＩＴＰＲ３、ＰＤＥ１Ａ、ＰＤＥ１Ｂ、ＰＤＥ１Ｃ、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＤ、ＰＲＫＣＥ、ＰＲＫＣＧからなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記インスリンシグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＲＡＰＧＥＦ１、ＰＨＫＧ１、ＰＹＧＬ、ＴＲＩＰ１０、ＩＮＳ、ＩＮＳＲ、ＩＲＳ１、ＰＤＰＫ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＨＲＡＳ、ＧＲＢ２、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ１１からなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記ＰＫＣの遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、ＰＲＫＤＣ、ＰＲＫＣＺ、ＰＲＫＣＥ、ＰＲＫＣＧ、ＰＲＫＣＤ、ＰＲＫＣＨ、ＰＲＫＣＩ、ＰＲＫＣＱ、ＰＲＫＤ１、ＳＬＣ９Ａ５、ＭＡＰＫ３、ＭＡＰＫ９、ＭＡＰＫ８、ＭＡＰＫ１からなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記ＲＡＲ中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＲＡＲＡ、ＲＡＲＳ、ＲＡＲＢ、ＲＡＲＧ、ＲＸＲＡ、ＲＸＲＧ、ＦＡＭ１２０Ｂ、ＮＣＯＡ１、ＮＣＯＲ２からなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記ＨＤＡＣを制御する遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１からなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記アデニル酸シクラーゼシグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＡＤＣＹ１０、ＡＤＣＹＡＰ１、ＡＤＣＹ１、ＡＤＣＹ２、ＡＤＣＹ６、ＡＤＣＹ３、ＧＮＡＩ１、ＧＮＡＬ、ＧＮＡＴ３、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＲ２Ｂ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＲＫＡＲ１Ｂ、ＰＲＫＡＣＧ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＰＲＫＡＲ２Ａ、ＮＣＡＭ１、ＣＤＫＮ１Ａからなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記ＨＭＴ中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＨＮＭＴ、ＤＮＭＴ１、ＫＭＴ２Ａ、ＥＨＭＴ２、ＥＨＭＴ１、ＫＭＴ２Ａ、ＤＯＴ１Ｌ、ＥＺＨ２、ＳＥＴＤ７、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤ２からなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記ＤＮＭＴ中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＨＭＴ２、ＥＨＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＣＤＨ１、ＰＡＲＰ１、ＭＢＤ２からなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記ヒストンデメチラーゼ中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＫＤＭ１Ａ、ＫＤＭ４Ａ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ４Ｂ、ＫＤＭ４Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｄ、ＫＤＭ１Ｂ、ＨＩＳＴＩＨ３Ａ、ＨＩＳＴ４Ｈ４、ＨＩＳＴ２Ｈ３Ｃ、ＨＡＴ１、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｆ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｊ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＥ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＢ、ＣＬＯＣＫ、ＮＯＣＡ１からなる群から選択される１種又は複数種である、ことを特徴とする請求項６項に記載のＪａｋ−Ｓｔａｔ経路を制御し、細胞を分化、脱分化、分化転換、若返り、老化、アポトーシスさせる技術及びその使用。
【請求項８】
前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を定量的に活性化又は抑制する技術は、低分子化合物の組み合わせ、サイトカインの組み合わせ又は組換えタンパク質の組み合わせ、遺伝子編集技術及び遺伝子組替え技術のうちの少なくとも１種を採用し、
前記低分子化合物の組み合わせは、
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤：フェニル酪酸ナトリウム、酪酸塩、酪酸ナトリウム、ＶＰＡ、スクリプタイド、アピシジン、ＬＢＨ−５８９（パノビノスタット）、ＭＳ−２７５、ＳＡＨＡ（ボリノスタット）、トリコスタチン（ＴＳＡ）、サマプリンＡ（ｐｓａｍｍａｐｌｉｎ  Ａ）、スプリトマイシン、ＳＲＴ１７２０、レスベラトロール、シルチノール、ＡＰＨＡ、ＣＩ−９９４、デプデシン、ＦＫ−２２８、ＨＣ毒素、ＩＴＦ−２３５７（ジビノスタット）、チダミド、ＲＧＦＰ  ９６６、ＰＨＯＢ、ＢＧ４５、ネクスツラスタットＡ、ＴＭＰ２６９、ＣＡＹ１０６０３、ＭＧＣＤ−０１０３、ニルツバシン（Ｎｉｌｔｕｂａｃｉｎ）、ＰＸＤ−１０１（ベリノスタット）、ピロキサミド、ツバシン（Ｔｕｂａｃｉｎ）、ＥＸ−５２７、ＢＡＴＣＰ、カンビノール、ＭＯＣＰＡＣ、ＰＴＡＣＨ、ＭＣ１５６８、ＮＣＨ５１及びＴＣ−Ｈ１０６
ＴＧＦ−β阻害剤：６１６４５２、ＬＹ２１０９７６１、ピルフェニドン、Ｒｅｐｓｏｘ（Ｅ−６１６４５２）、ＳＢ４３１５４２、Ａ７７−０１、Ａ８３０１、ＧＷ７８８３８８、ＩＴＤ−１、ＳＤ２０８、ＳＢ５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＡＳＰ３０２９、Ｄ４４７６及びＳＢ５０５１２４
ＰＫＣ阻害剤：Ｇｏ６９８３、Ｇｏ６９７６及びビシンドリルマレイミドＩ（ＧＦ１０９２０３Ｘ）
ＷＮＴ／β−カテニンアゴニスト：ＭＡＹ−２６２６１１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬｉＣｌ、Ｌｉ２ＣＯ３、ＴＤ１１４−２、ＡＺＤ２８５８、ＡＺＤ１０８０、ＢＩＯ、ケンパウロン、ＴＷＳ１１９、ＬＹ２０９０３１４、ＣＢＭ１０７８、ＳＢ２１６７６３及びＡＲ−Ａ０１４４１８
ｃＡＭＰアゴニスト：フォルスコリン、ＩＢＭＸ、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ＮＫＨ４７７、８−ｐＣＰＴ−２′−Ｏ−Ｍｅ−ｃＡＭＰ、ＧＳＫ２５６０６６、アプレミラスト（ＣＣ−１０００４）、ロフルミラスト、シロミラスト、ロリプラム、ミルリノン、８−Ｂｒｏｍｏ−ｃＡＭＰ、ジブチリル−Ｃａｍｐ、Ｓｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰｓ
ＲＡＲアゴニスト：ＴＴＮＰＢ、ベキサロテン、Ｃｈ５５、タミバロテン、レチノール、ＡＭ５８０、ＡＴＲＡ、ビタミンＡ、ビタミンＡ誘導物及び１３−ｃｉｓ  ＲＡ
ＲＯＣＫ阻害剤：Ｙ−２７６３２、Ｙ−２７６３２  ２ＨＣｌ、チアゾビビン、リパスディル（Ｋ−１１５）、ファスジル、ＧＳＫ４２９２８６Ａ、ＲＫＩ−１４４７及びＰＫＩ−１３１３
ＪＮＫ阻害剤：ＳＰ６００１２５、ＪＮＫ阻害剤ＩＸ、ＡＳ６０１２４５、ＡＳ６０２８０１及びＪＮＫ−ＩＮ−８
ＤＮＭＴ阻害剤：ＲＧ１０８、チオグアニン、５−Ａｚａ−２'−デオキシシチジン（デシタビン）、ＳＧＩ−１０２７、ゼブラリン及び５−アザシチジン（ＡＺＡ）
ＨＭＴ阻害剤：ＥＰＺ００４７７７、ＥＰＺ５６７６、ＧＳＫ５０３、ＢＩＸ  ０１２９４及びＳＧＣ  ０９４６
ヒストンデメチラーゼ阻害剤：パルネート（トラニルシプロミン）、トラニルシプロミン（２−ＰＣＰＡ）  ＨＣｌ  ＳＰ２５０９、４ＳＣ−２０２、ＯＲＹ−１００１（ＲＧ−６０１６）、ＧＳＫＪ１及びＧＳＫ−ＬＳＤ１
ＪＡＫ−ＳＴＡＴ阻害剤：ＳＴＡＴ５−ＩＮ−１、ＪＡＫ３−ＩＮ−１、ＪＡＫ３−ＩＮ−７、ＷＰ１０６６、ホモハリントンニン、ピリドン６、ピリドン６、アルテスネイト、ルキソリチニブ、ＳＨ−４−５４、バリシチニブ、ルキソリチニブリン酸塩、ＡＧ−４９０、バリシチニブリン酸塩、ＳＡＲ−２０３４７、ＣＹＴ３８７メシレート、ＡＳ１５１７４９９、ペフィシチニブ、ルキソリチニブ硫酸塩、ＮＳＣ  ７４８５９、Ｓｔａｔｔｉｃ、トファシチニブクエン酸塩、ピモジド、オクラシチニブマレイン酸塩、ルキソリチニブＳエナンチオマー、ＳＢ１３１７、ニクロサミド、スクテラリン、ソルシチニブ、モグロール、ニフロキサジド、ＴＧ１０１３４８（ＳＡＲ３０２５０３）、ＡＧ−１４７８（チルホスチンＡＧ−１４７８）（ＥＧＦＲ阻害剤）
ＫＸ２−３９１（Ｓｒｃ阻害剤）、ＰＫＩ−４０２（ＰＩ３Ｋα／β／γ／δ及びｍＴＯＲ阻害剤）、ＮＳＣ  ７４８５９（Ｓ３Ｉ−２０１）（ＳＴＡＴ３阻害剤）、フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ）（ＳＴＡＴ−１阻害剤）、Ｕ０１２６−ＥｔＯＨ（ＵＯ１２６  ＥｔＯＨ）（ＭＥＫ１及びＭＥＫ２阻害剤）、ＳＧＩ−１７７６遊離塩基（Ｐｉｍ１、Ｐｉｍ２及びＰｉｍ３阻害剤）、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）（ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−Ｒａｆ及びＢ−Ｒａｆ阻害剤）、ＰＬＸ−４７２０（Ｂ−ＲａｆＶ６００Ｅ及びｃ−Ｒａｆ−１Ｙ３４０Ｄ／Ｙ３４１Ｄ阻害剤）
のうちの１種又は複数種を含み、
前記サイトカインの組み合わせ又は組換えタンパク質の組み合わせは、ＰＤＧＦＡＡ、ＰＤＧＦＡＢ、ＢＭＰ４、ＩＧＦ１、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、インスリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−ｂｅｔａ１、Ｎｏｇｇｉｎ、ＢＭＰ−２、Ｓｈｈ、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ２、ＨＧＦ、ＩＦＮ  ｇａｍｍａ、ＩＬ−２、ＩＬ−６  Ｒ  ａｌｐｈａ、ＩＬ−２Ｒａｌｐｈａ、ＴＮＦ−ａｌｐｈａ、ＴＮＦ−ｂｅｔａ、ＴＰＯ、ＩＧＦ２、ＩＧＦＢＰ５、ＩＧＦＢＰ６、ＩＧＦＢＰ４、ＩＧＦＢＰ７、ＩＧＦＢＰ９、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＭＭＰ３、ＧＤＦ１１、ＴＩＭＰ２を含み、
前記遺伝子編集技術は、ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９遺伝子編集技術及びＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術によりＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲット、例えばＳＴＡＴ５Ａをアップレギュレート又はノックアウトすることを含み、
前記遺伝子組替え技術は、レンチウイルス又はレトロウイルスによりＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲット、例えば、ＳＴＡＴ５Ａを過剰発現又は抑制することを含む、ことを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載のＪａｋ−Ｓｔａｔ経路を制御し、細胞を分化、脱分化、分化転換、若返り、老化、アポトーシスさせる技術及びその使用。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＪａｋ−Ｓｔａｔシグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲットをノックアウトすることによりスーパー線維芽細胞（例えば、ＳＴＡＴ５）を製造し、
前記スーパー線維芽細胞は、普通線維芽細胞に対してＳＴＡＴ５遺伝子をノックアウトした後の３〜１５０日内で得られた、若返ったとともにテロメアが延長したスーパー線維芽細胞であり、
前記間葉系幹細胞の老化を逆転する方法は、間葉系幹細胞を低分子化合物の組み合わせ又は遺伝子編集により処理し、最終的に若返った間葉系幹細胞を製造することであり、
前記低分子化合物の組み合わせは、Ｊａｋ−Ｓｔａｔ阻害剤、ＷＮＴ／β−カテニンアゴニスト、ＤＮＭＴ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤及びｃＡＭＰアゴニストのうちの少なくとも１種を含み、
前記遺伝子編集による処理は、Ｊａｋ−Ｓｔａｔシグナル伝達経路の遺伝子又はタンパク質ターゲット（例えば、ＳＴＡＴ５）をノックアウトすることであり、
前記低分子化合物の組み合わせによる処理は、１〜１５μＭのＣＨＩＲ９９０２１、１μＭ〜１５μＭの５−アザシチジン（ＡＺＡ）；及び／又は１μＭ〜１５μＭの５−アザシチジン（ＡＺＡ）、３〜５０μＭのフォルスコリン；及び／又は１μＭ〜１５μＭの５−アザシチジン（ＡＺＡ）、３〜５０μＭのフォルスコリン、１〜１５μＭのＣＨＩＲ９９０２１で間葉系幹細胞を１〜２８日間処理することである、ことを特徴とする請求項１から８のいずれか１項に記載のＪａｋ−Ｓｔａｔ経路を制御し、細胞を分化、脱分化、分化転換、若返り、老化、アポトーシスさせる技術及びその使用、
前記いずれかの方法、それにより製造された細胞製品（例えば、修復型線維芽細胞）又は前記細胞製品の誘導物、例えば、細胞培養液／培地、細胞製品の溶解液、キット、薬物、健康製品、食品、化粧品若しくは医療機器の使用、
組織工学材料の種細胞、組織工学材料の足場の由来源として哺乳動物組織、臓器損傷及び老化、退化した組織、臓器を修復することにおける、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法、それにより製造された細胞製品及び／又は細胞製品の誘導物の使用、
医学研究における又は免疫調節剤とする請求項１から９のいずれか１項に記載の方法、それにより製造された細胞製品及び／又は細胞製品の誘導物の使用、
インビトロ／インビボでの哺乳動物の組織、臓器、生体の老化進行の予防、遅延、逆転における請求項１から９のいずれか１項に記載の方法、それにより製造された細胞製品及び／又は細胞製品の誘導物の使用、及び
細胞、組織、臓器、生体のリプログラミング、又は細胞、組織、臓器、生体の若返りにおける前記いずれかの方法、それにより製造された細胞製品及び／又は細胞製品の誘導物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞生物学の技術分野に属し、Ｊａｋ−Ｓｔａｔ経路を制御して細胞を分化、脱分化、若返りさせる技術及びその使用に関し、特にＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を制御して細胞の分化、脱分化、分化転換、若返り、老化、アポトーシスを調節し、生体寿命を延長させる方法、その細胞製品の製造及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、再生医療と抗老化の「聖杯」と見なされている。個体が老化を始めると、体内の幹細胞も老化し、骨、軟骨、心臓、筋肉、脳、皮膚、膵臓、肝臓、腎臓、胃腸管などを含む複数の臓器の悪変又は退化を引き起こす。免疫系機能の異常も老化に関係している。実際、組織や臓器の慢性的な炎症は、それらの退化や老化の原因である。老化細胞には通常、ＤＮＡの損傷又は変異、テロメアの短縮、エピジェネティクス、レドックス、エネルギー代謝の異常、増殖能力の低下、死細胞の増加などの問題が存在する。老化した幹細胞は、特定の細胞種に分化する能力を失い、他の細胞種へ異常的に分化する。例えば、知られているように、老齢個体に由来する骨髄間葉系幹細胞は、軟骨への分化能力が低下し、脂肪形成能力が向上する。したがって、脂肪組織で満たされた老化骨髄は、「黄色骨髄」とも呼ばれている。同様に、高齢者の神経幹細胞は、ニューロンへの分化が減少され、アストロサイトへの分化が増加する。これは、高齢者の認知能力の低下に関係していると考えられている。
【０００３】
幹細胞、特に、間葉系幹細胞は、その入手しやすさ、スケーラブルかつ多用途、成長因子の放出作用、及び免疫調節能力により、老化進行及び関連疾患を治療又は介入する有力候補となっている。間葉系幹細胞は、臨床的には、移植片対宿主病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄損傷、紅斑性狼瘡、関節炎及び老化などの多種類の疾患の治療に広く使用されている。同種異系の使用について、臍帯間葉系幹細胞は、幅広く考慮されている。しかし、「非自己」細胞の長期／反復使用には常に臨床的なリスクが存在する。自家移植の方が安全だと考えられているが、残念ながら、年齢を重ねると間葉系幹細胞も老化する。老化した間葉系幹細胞は、多くの重要な機能を失ったので、その臨床応用が制限される。人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）は、高齢者から取得可能な若い細胞であり、治療に適した細胞源と考えられていた。しかし、ｉＰＳの誘導効率が低く、かつ外来遺伝子の導入が必要であるため、遺伝的変異が発生する場合が多く、臨床応用に有利ではない。最近、若返りの方法として遺伝子改変が使用されているが、この方法には依然としてオフターゲット及び腫瘍形成のリスクがある。従って、自己若返り可能で安全な細胞を製造する方法の開発、及び自己若返り可能で安全な修復型細胞の取得は、人間老化進行の予防、遅延及び逆転、組織、臓器構造又は機能の修復、健康状態及び生活の質の向上に対しては非常に重要である。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、Ｊａｋ−Ｓｔａｔ経路を制御して細胞を分化、脱分化、若返りさせる技術及びその使用、特にＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を制御して細胞の分化、脱分化、分化転換、若返り、老化、アポトーシスを調節し、老化を逆転し、生体寿命を延長させる方法を提供することを目的とする。この方法により得られる細胞生成物（例えば、修復型線維芽細胞、若返った間葉系幹細胞）は、人間老化進行の予防、遅延及び逆転、組織、臓器構造又は機能の修復に適用できる。本発明の技術により製造された修復型線維芽細胞は、皮膚線維芽細胞の特性と間葉系幹細胞の特性を兼ね備えるため、修復型皮膚線維芽細胞（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、略称：ｒＦｉｂ）と命名され、誘導若返り間葉系幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｎｄ  ｒｅｊｕｖｅｎａｔｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ，ｉｒＭＳＣ）又は誘導間葉系幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ，ｉＭＳＣ）とも命名されてもよく、本明細書においてｒＦｉｂと記される。
【０００５】
本発明の技術的手段は、以下の通りである。ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を定量及び／又は定時的に活性化又は抑制するＪａｋ−Ｓｔａｔ経路を制御して細胞を分化、脱分化、若返りさせる技術及びその使用。
【０００６】
前記方法において、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路中で高発現する又は高発現される、低発現する又は発現が抑制される遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＣＸＣＬ２（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＹ５７７９０５．１）、ＳＯＳ１（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００５６３３．３）、ＳＴＡＴ５Ｂ（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿０１２４４８．３）、ＪＡＫ１（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１３２１８５７．１）、ＪＡＫ３（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿０００２１５．３）、ＳＯＣＳ３（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００３９５５．４）、ＩＬ６ＳＴ（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１２４３８３５．１）、ＳＴＡＴ１（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００７３１５．３）、ＳＴＡＴ２（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿１９８３３２．１）、ＳＴＡＴ３（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿２１３６６２．１）、ＳＴＡＴ４（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１２４３８３５．１）、ＳＴＡＴ６（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１１７８０８１．１）、ＳＴＡＴ５Ａ（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１２８８７２０．１）、ＩＲＦ９（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００６０８４．４）、ＩＬ６（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿００５２４９７４５．５）、ＩＬ６Ｒ（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿１８１３５９．２）、ＩＬ２（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿０００５８６．３）（例えば、ＩＬ２Ａ及び／又はＩＬ２Ｂ）、ＰＲＫＣＤ（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１３５４６７９．１）、ＣＸＣＬ１２（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿０００６０９．６）、ＣＸＣＲ４（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００３４６７．２）、ＪＡＫ２（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００４９７２．３）、ＩＬ１５ＲＡ（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１３５１０９５．１）、ＩＬ２０ＲＢ（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿００６７１３６６５．４）、ＧＨＲ（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１２４２４０６．２）和ＰＲＬＲ（遺伝子番号／Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００１２０４３１４．２）のうちの少なくとも１種を含む。
【０００７】
前記細胞は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴを制御する初期標的細胞であり、前記標的細胞は、ヒト、ネズミ、サル、ブタを含む哺乳動物に由来し、前記標的細胞は、線維芽細胞、上皮細胞、脂肪細胞、血液細胞、間葉系幹細胞、神経細胞、筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、破骨細胞を含み、
前記方法により製造された細胞は、本明細書において目的細胞として定義され、標的細胞に由来し、標的細胞中でＪＡＫ−ＳＴＡＴを制御する過程において産生する特徴が異なる様々な種類の細胞を含み、前記特徴は、分化、逆分化、分化転換、若返り、老化、アポトーシスのうちの少なくとも１種を含む。
【０００８】
ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に対する活性化又は抑制の定量は、目的細胞中のＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の遺伝子又はタンパク質ターゲットの少なくとも１種が標的細胞に対して１〜３００倍のうちのいずれか１つの倍数アップレギュレート又はダウンレギュレートすることである。
【０００９】
ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に対する活性化又は抑制の定時は、標的細胞中でＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の遺伝子又はタンパク質ターゲットの少なくとも１種が高発現するか、低発現するか、又は発現しないように２４時間〜２２０日間制御され、これにより得られる目的細胞は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の遺伝子又はタンパク質ターゲットのうちの少なくとも１種を高発現、低発現又は非発現に長期間維持し、或いは、標的細胞と同じ発現レベルに回復させる。
【００１０】
前記方法において、ＮＯＤ様受容体シグナル伝達経路、焦点接着斑（Ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）、細胞周期、クエン酸回路、ＴＧＦ  ｂｅｔａシグナル伝達経路、ＷＮＴシグナル伝達経路、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路、Ｐ５３シグナル伝達経路、インスリンシグナル伝達経路、カルシウム（Ｃａｌｃｉｕｍ）シグナル伝達経路、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１９、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２０、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２２、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２４、ＩＬ７  ＨＤＡＣ（ヒストンデアセチラーゼ）、ＰＫＣシグナル伝達経路、ＲＡＲ経路、アデニル酸シクラーゼシグナル伝達経路、ＨＭＴ（ヒストンメチルトランスフェラーゼ）、ＤＮＭＴ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ）、及びヒストンデメチラーゼ阻害剤からなる群から選択される経路又はターゲットのうちの少なくとも１種を調節することによりＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化又は抑制することができる。
【００１１】
ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の細胞ターゲット及び細胞シグナル伝達経路を活性化又は抑制し、
前記ＮＯＤ様受容体シグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＮＡＩＰ、ＩＬ６、ＣＸＣＬ１２、  ＮＯＤ１、ＴＡＢ３、ＣＡＲＤ６、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ３、ＣＡＲＤ８、ＣＡＲＤ９、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ１２、ＣＡＳＰ４、ＣＡＳＰ５、ＮＦＫＢ１、ＴＭＥＭ１７３、ＴＮＦ、ＮＦＫＢＩＢ、ＮＯＤ２、ＰＹＤＣ１、ＰＹＣＡＲＤ、ＴＡＢ１、ＴＡＢ２、ＴＮＦ、ＴＬＲ４、ＮＬＲＰ１、ＮＬＲＰ１２、ＮＬＲＰ３、ＮＬＲＰ６、ＭＣＵ、ＲＩＰＫ３、ＲＨＯＡ、ＴＡＫ１、ＢＩＲＣ２、ＡＴＧ１６Ｌ１、ＡＴＧ５、ＡＴＧ１２、ＴＡＮＫからなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記焦点接着斑経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＴＮＸＢ、ＲＡＰＧＥＦ１、ＩＴＧＢ８、ＳＲＣ、ＴＨＢＳ１、ＩＴＧＡ３、ＶＣＬ、ＣＡＰＮ２、ＦＬＴ４、ＦＬＴ１、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ１０、ＩＴＧＡ１１、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡ７、ＩＴＧＡ８、ＩＴＧＡ９、ＩＴＧＡＶ、ＰＤＲＶＧ、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＧＦＤ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＢＩＲＣ３、  ＢＩＲＣ２、ＢＣＬ２、ＤＯＣＫ１、ＦＮ１、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＣＴＮＮＢ１からなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記細胞周期を制御するための遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＭＡＤ２Ｌ１、ＢＵＢ１、ＯＲＣ１、ＯＲＣ２、ＯＲＣ３、ＯＲＣ４、ＯＲＣ５、ＯＲＣ６、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＣＮＡ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＢ２、ＣＣＮＢ３、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ４、Ｅ２Ｆ５、ＥＰ３００、ＦＺＲ１、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＳＴＡＧ１、ＳＴＡＧ２、ＣＤＣ１４Ａ、ＣＤＣ１４Ｂ、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＣ２５Ｂ、ＭＹＣ、ＳＭＣ３、ＣＤＣ１６、ＹＷＨＡＨ、ＹＷＨＡＢ、ＹＷＨＡＱ、ＹＷＨＡＥ、ＹＷＨＡＧ、ＹＷＨＡＺからなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記クエン酸回路を制御するための遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＩＤＨ３Ｇ、ＩＤＨ３Ｂ、ＭＤＨ２、ＳＤＨＢ、ＯＧＤＨ、ＭＤＨ１、ＯＧＤＨＬ、ＳＵＣＬＧ１、ＳＵＣＬＧ２、ＳＵＣＬＡ２、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＣ、ＰＤＨＡ１、ＰＤＨＢ、ＡＣＬＹからなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記ＴＧＦ  ｂｅｔａシグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＴＨＢＳ１、ＦＳＴ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２．ＴＧＦＢＲ３、ＢＭＰ４、ＲＵＮＸ３、ＲＵＮＸ２、ＣＲＥＢＢＰ、  ＩＦＮＧ、ＨＲＡＳ、ＦＯＳ、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＡＣＶＲＬ１、ＦＯＸＯ３、ＭＴＯＲ、ＫＲＡＳ、ＣＲＥＢ１、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ４、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ４Ｇ、ＰＩＫ３Ｒ３からなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記ＷＮＴシグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＰＲＫＣＡ、ＷＮＴ７Ｂ、ＰＲＩＣＫＬＥ１、ＬＲＰ６、ＣＴＮＮＢ１、ＦＺＤ４、ＣＣＮＤ２、ＰＲＩＣＫ、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ１、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ４Ｂからなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＣＩＲ１、ＫＡＴ２Ｂ、ＭＡＭＬ２、ＰＳＥＮ２、ＤＶＬ２、ＲＦＮＧ、ＳＮＷ１、ＤＬＬ４、ＤＴＸ３、ＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＤＴＸ１、ＤＴＸ２、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＴＢＰ１、ＣＴＢＰ２、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２からなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記Ｐ５３シグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＣＣＮＧ２、ＳＩＡＨ１、ＢＢＣ３、ＴＰ５３ＡＩＰ１、ＴＰ５３、ＳＥＴＤ７、ＡＴＦ３、ＣＣＮＡ２、ＣＤＫ２、ＣＣＮＧ１、ＣＨＥＫ１、ＰＲＫＣ  ＤＫＡＴ２Ｂ、ＰＲＬ２３、ＰＰＰ２ＣＡからなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記カルシウムシグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＲＹＲ１、ＲＹＲ２、ＲＹＲ３、ＥＳＲ１、ＡＲ（アンドロゲン受容体）、ＫＤＲ（キナーゼインサートドメイン受容体）、ＶＤＲ（ビタミンＤ受容体）、ＩＴＰＲ１、ＩＴＰＲ２、ＩＴＰＲ３、ＰＤＥ１Ａ、ＰＤＥ１Ｂ、ＰＤＥ１Ｃ、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＤ、ＰＲＫＣＥ、ＰＲＫＣＧからなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記インスリンシグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＲＡＰＧＥＦ１、ＰＨＫＧ１、ＰＹＧＬ、ＴＲＩＰ１０、ＩＮＳ、ＩＮＳＲ、ＩＲＳ１、ＰＤＰＫ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＨＲＡＳ、ＧＲＢ２、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ１１からなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記ＰＫＣの遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、ＰＲＫＤＣ、ＰＲＫＣＺ、ＰＲＫＣＥ、ＰＲＫＣＧ、ＰＲＫＣＤ、ＰＲＫＣＨ、ＰＲＫＣＩ、ＰＲＫＣＱ、ＰＲＫＤ１、ＳＬＣ９Ａ５、ＭＡＰＫ３、ＭＡＰＫ９、ＭＡＰＫ８、ＭＡＰＫ１からなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記ＲＡＲ中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＲＡＲＡ、ＲＡＲＳ、ＲＡＲＢ、ＲＡＲＧ、ＲＸＲＡ、ＲＸＲＧ、ＦＡＭ１２０Ｂ、ＮＣＯＡ１、ＮＣＯＲ２からなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記ＨＤＡＣを制御する遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１からなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記アデニル酸シクラーゼシグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＡＤＣＹ１０、ＡＤＣＹＡＰ１、ＡＤＣＹ１、ＡＤＣＹ２、ＡＤＣＹ６、ＡＤＣＹ３、ＧＮＡＩ１、ＧＮＡＬ、ＧＮＡＴ３、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＲ２Ｂ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＲＫＡＲ１Ｂ、ＰＲＫＡＣＧ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＰＲＫＡＲ２Ａ、ＮＣＡＭ１、ＣＤＫＮ１Ａからなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記ＨＭＴ中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＨＮＭＴ、ＤＮＭＴ１、ＫＭＴ２Ａ、ＥＨＭＴ２、ＥＨＭＴ１、ＫＭＴ２Ａ、ＤＯＴ１Ｌ、ＥＺＨ２、ＳＥＴＤ７、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤ２からなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記ＤＮＭＴ中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＨＭＴ２、ＥＨＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＣＤＨ１、ＰＡＲＰ１、ＭＢＤ２からなる群から選択される１種又は複数種であり、
前記ヒストンデメチラーゼ中の遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＫＤＭ１Ａ、ＫＤＭ４Ａ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ４Ｂ、ＫＤＭ４Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｄ、ＫＤＭ１Ｂ、ＨＩＳＴＩＨ３Ａ、ＨＩＳＴ４Ｈ４、ＨＩＳＴ２Ｈ３Ｃ、ＨＡＴ１、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｆ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｊ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＥ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＢ、ＣＬＯＣＫ、ＮＯＣＡ１からなる群から選択される１種又は複数種である。
【００１２】
前記方法は、低分子化合物の組み合わせ、サイトカインの組み合わせ又は組換えタンパク質の組み合わせ、遺伝子編集技術及び遺伝子組替え技術のうちの少なくとも１種を採用し、
前記低分子化合物の組み合わせは、
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤：フェニル酪酸ナトリウム、酪酸塩、酪酸ナトリウム、ＶＰＡ、スクリプタイド、アピシジン、ＬＢＨ−５８９（パノビノスタット）、ＭＳ−２７５、ＳＡＨＡ（ボリノスタット）、トリコスタチン（ＴＳＡ）、サマプリンＡ（ｐｓａｍｍａｐｌｉｎ  Ａ）、スプリトマイシン、ＳＲＴ１７２０、レスベラトロール、シルチノール、ＡＰＨＡ、ＣＩ−９９４、デプデシン、ＦＫ−２２８、ＨＣ毒素、ＩＴＦ−２３５７（ジビノスタット）、チダミド、ＲＧＦＰ  ９６６、ＰＨＯＢ、ＢＧ４５、ネクスツラスタットＡ、ＴＭＰ２６９、ＣＡＹ１０６０３、ＭＧＣＤ−０１０３、ニルツバシン（Ｎｉｌｔｕｂａｃｉｎ）、ＰＸＤ−１０１（ベリノスタット）、ピロキサミド、ツバシン（Ｔｕｂａｃｉｎ）、ＥＸ−５２７、ＢＡＴＣＰ、カンビノール、ＭＯＣＰＡＣ、ＰＴＡＣＨ、ＭＣ１５６８、ＮＣＨ５１及びＴＣ−Ｈ１０６
ＴＧＦ−β阻害剤：６１６４５２、ＬＹ２１０９７６１、ピルフェニドン、Ｒｅｐｓｏｘ（Ｅ−６１６４５２）、ＳＢ４３１５４２、Ａ７７−０１、Ａ８３０１、ＧＷ７８８３８８、ＩＴＤ−１、ＳＤ２０８、ＳＢ５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＡＳＰ３０２９、Ｄ４４７６及びＳＢ５０５１２４
ＰＫＣ阻害剤：Ｇｏ６９８３、Ｇｏ６９７６及びビシンドリルマレイミドＩ（ＧＦ１０９２０３Ｘ）
ＷＮＴ／β−カテニンアゴニスト：ＭＡＹ−２６２６１１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬｉＣｌ、Ｌｉ２ＣＯ３、ＴＤ１１４−２、ＡＺＤ２８５８、ＡＺＤ１０８０、ＢＩＯ、ケンパウロン、ＴＷＳ１１９、ＬＹ２０９０３１４、ＣＢＭ１０７８、ＳＢ２１６７６３及びＡＲ−Ａ０１４４１８
ｃＡＭＰアゴニスト：フォルスコリン、ＩＢＭＸ、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ＮＫＨ４７７、８−ｐＣＰＴ−２′−Ｏ−Ｍｅ−ｃＡＭＰ、ＧＳＫ２５６０６６、アプレミラスト（ＣＣ−１０００４）、ロフルミラスト、シロミラスト、ロリプラム、ミルリノン、８−Ｂｒｏｍｏ−ｃＡＭＰ、ジブチリル−Ｃａｍｐ、Ｓｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰｓ
ＲＡＲアゴニスト：ＴＴＮＰＢ、ベキサロテン、Ｃｈ５５、タミバロテン、レチノール、ＡＭ５８０、ＡＴＲＡ、ビタミンＡ、ビタミンＡ誘導物及び１３−ｃｉｓ  ＲＡ
ＲＯＣＫ阻害剤：Ｙ−２７６３２、Ｙ−２７６３２  ２ＨＣｌ、チアゾビビン、リパスディル（Ｋ−１１５）、ファスジル、ＧＳＫ４２９２８６Ａ、ＲＫＩ−１４４７及びＰＫＩ−１３１３
ＪＮＫ阻害剤：ＳＰ６００１２５、ＪＮＫ阻害剤ＩＸ、ＡＳ６０１２４５、ＡＳ６０２８０１及びＪＮＫ−ＩＮ−８
ＤＮＭＴ阻害剤：ＲＧ１０８、チオグアニン、５−Ａｚａ−２'−デオキシシチジン（デシタビン）、ＳＧＩ−１０２７、ゼブラリン及び５−アザシチジン（ＡＺＡ）
ＨＭＴ阻害剤：ＥＰＺ００４７７７、ＥＰＺ５６７６、ＧＳＫ５０３、ＢＩＸ  ０１２９４及びＳＧＣ  ０９４６
ヒストンデメチラーゼ阻害剤：パルネート（トラニルシプロミン）、トラニルシプロミン（２−ＰＣＰＡ）  ＨＣｌ  ＳＰ２５０９、４ＳＣ−２０２、ＯＲＹ−１００１（ＲＧ−６０１６）、ＧＳＫＪ１及びＧＳＫ−ＬＳＤ１
ＪＡＫ−ＳＴＡＴ阻害剤：ＳＴＡＴ５−ＩＮ−１、ＪＡＫ３−ＩＮ−１、ＪＡＫ３−ＩＮ−７、ＷＰ１０６６、ホモハリントンニン、ピリドン６、ピリドン６、アルテスネイト、ルキソリチニブ、ＳＨ−４−５４、バリシチニブ、ルキソリチニブリン酸塩、ＡＧ−４９０、バリシチニブリン酸塩、ＳＡＲ−２０３４７、ＣＹＴ３８７メシレート、ＡＳ１５１７４９９、ペフィシチニブ、ルキソリチニブ硫酸塩、ＮＳＣ  ７４８５９、Ｓｔａｔｔｉｃ、トファシチニブクエン酸塩、ピモジド、オクラシチニブマレイン酸塩、ルキソリチニブＳエナンチオマー、ＳＢ１３１７、ニクロサミド、スクテラリン、ソルシチニブ、モグロール、ニフロキサジド、ＴＧ１０１３４８（ＳＡＲ３０２５０３）、ＡＧ−１４７８（チルホスチンＡＧ−１４７８）（ＥＧＦＲ阻害剤）
ＫＸ２−３９１（Ｓｒｃ阻害剤）、ＰＫＩ−４０２（ＰＩ３Ｋα／β／γ／δ及びｍＴＯＲ阻害剤）、ＮＳＣ  ７４８５９（Ｓ３Ｉ−２０１）（ＳＴＡＴ３阻害剤）、フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ）（ＳＴＡＴ−１阻害剤）、Ｕ０１２６−ＥｔＯＨ（ＵＯ１２６  ＥｔＯＨ）（ＭＥＫ１及びＭＥＫ２阻害剤）、ＳＧＩ−１７７６遊離塩基（Ｐｉｍ１、Ｐｉｍ２及びＰｉｍ３阻害剤）、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）（ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−Ｒａｆ及びＢ−Ｒａｆ阻害剤）、ＰＬＸ−４７２０（Ｂ−ＲａｆＶ６００Ｅ及びｃ−Ｒａｆ−１Ｙ３４０Ｄ／Ｙ３４１Ｄ阻害剤）
のうちの１種又は複数種を含み、
前記サイトカインの組み合わせ又は組換えタンパク質の組み合わせは、ＰＤＧＦＡＡ、ＰＤＧＦＡＢ、ＢＭＰ４、ＩＧＦ１、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、インスリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−ｂｅｔａ１、Ｎｏｇｇｉｎ、ＢＭＰ−２、Ｓｈｈ、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ２、ＨＧＦ、ＩＦＮ  ｇａｍｍａ、ＩＬ−２、ＩＬ−６  Ｒ  ａｌｐｈａ、ＩＬ−２Ｒａｌｐｈａ、ＴＮＦ−ａｌｐｈａ、ＴＮＦ−ｂｅｔａ、ＴＰＯ、ＩＧＦ２、ＩＧＦＢＰ５、ＩＧＦＢＰ６、ＩＧＦＢＰ４、ＩＧＦＢＰ７、ＩＧＦＢＰ９、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＭＭＰ３、ＧＤＦ１１、ＴＩＭＰ２を含み、
前記遺伝子編集技術は、ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９遺伝子編集技術及びＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術によりＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲット、例えばＳＴＡＴ５Ａをアップレギュレート又はノックアウトすることを含み、
前記遺伝子組替え技術は、レンチウイルス又はレトロウイルスによりＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲット、例えば、ＳＴＡＴ５Ａを過剰発現又は抑制することを含む。
【００１３】
上述した方法で製造される修復型線維芽細胞であって、前記修復型線維芽細胞中のＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路は抑制され、前記ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路中の低発現し又は発現が抑制される遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＳＯＳ１、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＳＯＣＳ３、ＩＬ６ＳＴ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ６、ＳＴＡＴ５Ａ、ＩＲＦ９、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ２、ＩＬ２Ａ、ＩＬ２Ｂ、ＰＲＫＣＤ、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ４、ＪＡＫ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ２０ＲＢ、ＧＨＲ、ＣＸＣＬ２及びＰＲＬＲのうちの少なくとも１種を含む修復型線維芽細胞。
【００１４】
前記修復型線維芽細胞中のシグナル伝達経路は、以下の変化が発生する。ＮＯＤ様受容体シグナル伝達経路が抑制され、及び／又はＴＧＦ−β受容体シグナル伝達経路が抑制され、及び／又はインスリンシグナル伝達経路がダウンレギュレートされ、及び／又はｗｎｔシグナル伝達経路がアップレギュレートされ、及び／又はｎｏｔｃｈシグナル伝達経路がダウンレギュレートされ、及び／又はｐ５３シグナル伝達経路がダウンレギュレートされる。
【００１５】
前記修復型線維芽細胞の製造方法であって、前記修復型線維芽細胞の標的細胞は普通線維芽細胞であり、前記普通線維芽細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ネズミ、ブタ）の結合組織（例えば、血液、皮膚、骨髄、心臓）に由来する製造方法。
【００１６】
前記製造方法において、普通線維芽細胞に対して低分子化合物の組み合わせにより処理し、修復型線維芽細胞を得る。前記低分子化合物の組み合わせは、Ｊａｋ−Ｓｔａｔ阻害剤、ＷＮＴ／β−カテニンアゴニスト、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、及びｃＡＭＰアゴニストのうちの少なくとも１種を含む。
【００１７】
前記修復型線維芽細胞の製造方法は、ＲＡＲアゴニスト、ＤＮＭＴ阻害剤、ＨＭＴ阻害剤、ヒストンデメチラーゼ阻害剤、ａｓｃｏｒｂａｔｅ（アスコルビン酸）、ＪＮＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤及びＴＧＦ−β阻害剤のうちの少なくとも１種を使用することをさらに含む。
【００１８】
前記修復型線維芽細胞の製造方法において、時系列で段階的に第１段階化合物及び第２段階化合物を使用する。前記第１段階化合物はＷＮＴ／β−カテニンアゴニスト、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤及びｃＡＭＰアゴニストであり、或いは前記第１段階化合物は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ＴＧＦ−β受体阻害剤、ＷＮＴ／β−カテニンアゴニスト及びｃＡＭＰアゴニストである。前記第２段階化合物は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、ＷＮＴ／β−カテニンアゴニスト、ｃＡＭＰアゴニスト、ＲＡＲアゴニスト、ＨＭＴ阻害剤、ａｓｃｏｒｂａｔｅ（アスコルビン酸）、ＰＫＣ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含む。
【００１９】
前記製造方法において、０．０５〜１０ｍＭのＶＰＡ、１〜１５μＭのＣＨＩＲ９９０２１、０．５〜１０μＭのＲｅｐｓｏｘ、３〜５０μＭのフォルスコリン、１〜２０μＭのＧｏ６９８３、１〜２５μＭのＹ−２７６３２、０．０２〜１μＭのＡＭ５８０、０．５〜１５μＭのＥＰＺ００４７７７、０．２ｍＭのＶｃ、０．２〜２０μＭのＴＴＮＰＢ、１〜１５μＭの５−アザシチジン、１〜５０μＭのＳＰ６００１２５のうちの少なくとも１種を使用する。或いは、まず第１段階化合物で普通線維芽細胞を２〜１０日間処理する。前記第１段階化合物は、０．０５〜１０ｍＭのＶＰＡ、１〜１５μＭのＣＨＩＲ９９０２１、０．５〜１０μＭのＲｅｐｓｏｘ、３〜５０μＭのフォルスコリンを含む。第１段階処理した後、第２段階化合物により４〜２０日間処理する。前記第２段階化合物は、０．０５〜１０ｍＭのＶＰＡ、１〜１５μＭのＣＨＩＲ９９０２１、０．５〜１０μＭのＲｅｐｓｏｘ、３〜５０μＭのフォルスコリン、１〜２０μＭのＧｏ６９８３、１〜２５μＭのＹ−２７６３２、０．０２〜１μＭのＡＭ５８０、０．５〜１５μＭのＥＰＺ００４７７７、０．２ｍＭのＶｃ、０．２〜２０μＭのＴＴＮＰＢを含む。
【００２０】
前記修復型線維芽細胞のテロメアの長さは、初期の普通線維芽細胞よりも１．５〜１２倍延長し、未成年個体の同種細胞のレベルに近い。前記修復型線維芽細胞で製造された別の種類の細胞（例えば、骨芽細胞、軟骨細胞）は、同一動物個体に由来する同種細胞に比べ、テロメアが延長し、より強い機能活性を示す。
【００２１】
上述した方法により製造された修復型線維芽細胞で製造された細胞生成物（例えば、細胞分泌物、細胞溶解液）は、組織工学材料の構築、細胞、組織、臓器及び生体老化の遅延又は逆転に適用できる。
【００２２】
組織工学材料の構築、細胞、組織、臓器及び生体老化の遅延又は逆転における前記修復型線維芽細胞の使用。
【００２３】
普通線維芽細胞に対してＳＴＡＴ5遺伝子をノックアウトすることにより製造されるスーパー線維芽細胞。
【００２４】
前記スーパー線維芽細胞の製造方法において、普通線維芽細胞に対してＳＴＡＴ５遺伝子をノックアウトした後の３〜１００日内で若返ったとともにテロメアが延長したスーパー線維芽細胞を得る。
【００２５】
前記製造方法は、間葉系幹細胞を低分子化合物の組み合わせ又は遺伝子編集により処理し、最終的に若返った間葉系幹細胞を製造することである。前記低分子化合物の組み合わせは、Ｊａｋ−Ｓｔａｔ阻害剤、ＷＮＴ／β−カテニンアゴニスト、ＤＮＭＴ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤及びｃＡＭＰアゴニストのうちの少なくとも１種を含む。前記遺伝子編集による処理は、Ｊａｋ−Ｓｔａｔシグナル伝達経路の遺伝子又はタンパク質ターゲット（例えば、ＳＴＡＴ５Ａ）をノックアウトすることである。
【００２６】
前記低分子化合物の組み合わせによる処理は、１〜１５μＭのＣＨＩＲ９９０２１、１μＭ〜１５μＭの５−アザシチジン（ＡＺＡ）；及び／又は１μＭ〜１５μＭの５−アザシチジン（ＡＺＡ）、３〜５０μＭのフォルスコリン；及び／又は１μＭ〜１５μＭの５−アザシチジン（ＡＺＡ）、３〜５０μＭのフォルスコリン、１〜１５μＭのＣＨＩＲ９９０２１で間葉系幹細胞を１〜２８日間処理することである。
【００２７】
前記方法により製造された細胞製品（例えば、修復型線維芽細胞）又は前記細胞製品の細胞培養液／培地、細胞製品の溶解液、キット、薬物、健康製品、食品、化粧品又は医療機器の使用。
【００２８】
組織工学材料の種細胞、組織工学材料の足場の由来源として哺乳動物組織、臓器損傷及び老化、退化した組織、臓器を修復することにおける、前記方法により製造された細胞製品（例えば、修復型線維芽細胞）の使用。
【００２９】
医学研究における又は免疫調節剤とする前記方法により製造された細胞製品（例えば、修復型線維芽細胞）の使用。
【００３０】
インビトロ／インビボでの哺乳動物の組織、臓器、生体の老化進行の予防、遅延、逆転における前記方法により製造された細胞製品（例えば、修復型線維芽細胞）の使用。
【００３１】
細胞、組織、臓器、生体のリプログラミング、又は細胞、組織、臓器、生体の若返りにおける前記方法により製造された細胞製品の使用。
【００３２】
本発明では、Ｊａｋ−Ｓｔａｔシグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲットを定量及び／又は定時的に制御することにより、細胞の分化、脱分化、分化転換、若返り、老化、アポトーシスを調節し、老化を逆転し、生体寿命を延長させる。低分子化合物の組み合わせ、サイトカインの組み合わせ、又は組換えタンパク質の組み合わせ、遺伝子編集技術、遺伝子組替え技術により細胞中のＪａｋ−Ｓｔａｔシグナル伝達経路における遺伝子又はタンパク質ターゲットを定量及び／又は定時的に制御する。前記遺伝子又はタンパク質ターゲットは、ＣＸＣＬ２，ＳＯＳ１、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＳＯＣＳ３、ＩＬ６ＳＴ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ６、ＳＴＡＴ５Ａ、ＩＲＦ９、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ２（例えば、ＩＬ２Ａ及び／又はＩＬ２Ｂ）、ＰＲＫＣＤ、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ４、ＪＡＫ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ２０ＲＢ、ＧＨＲ及びＰＲＬＲのうちの少なくとも１種を含む。前記Ｊａｋ−Ｓｔａｔシグナル伝達経路を制御する低分子化合物の組み合わせは、Ｊａｋ−Ｓｔａｔ阻害剤、ＷＮＴ／β−カテニンアゴニスト、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤及びｃＡＭＰアゴニスト、ＲＡＲアゴニスト、ＤＮＭＴ阻害剤、ＨＭＴ阻害剤、ヒストンデメチラーゼ阻害剤、ａｓｃｏｒｂａｔｅ（アスコルビン酸）、ＪＮＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤及びＴＧＦ−β阻害剤のうちの少なくとも１種を含む。前記サイトカインの組み合わせ又は組換えタンパク質の組み合わせは、ＰＤＧＦＡＡ、ＰＤＧＦＡＢ、ＢＭＰ４、ＩＧＦ１、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、インスリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−ｂｅｔａ１、Ｎｏｇｇｉｎ（ノギン）、ＢＭＰ−２、Ｓｈｈ、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ２、ＨＧＦ、ＩＦＮ  ｇａｍｍａ、ＩＬ−２、ＩＬ−６  Ｒ  ａｌｐｈａ、ＩＬ−２Ｒａｌｐｈａ、ＴＮＦ−ａｌｐｈａ、ＴＮＦ−ｂｅｔａ、ＴＰＯ、ＩＧＦ２、ＩＧＦＢＰ５、ＩＧＦＢＰ６、ＩＧＦＢＰ４、ＩＧＦＢＰ７、ＩＧＦＢＰ９、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＭＭＰ３、ＧＤＦ１１、ＴＩＭＰ２を含む。前記遺伝子編集技術は、ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９遺伝子編集技術及びＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術によりＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲット、例えば、ＳＴＡＴ５Ａをアップレギュレート又はノックアウトする。前記遺伝子組替え技術は、レンチウイルス又はレトロウイルスによりＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲット、例えばＳＴＡＴ５Ａを過剰発現又は抑制する。
【００３３】
本発明では、低分子化合物により線維芽細胞中のＪａｋ−Ｓｔａｔシグナル伝達経路の遺伝子又はタンパク質ターゲット（例えば、ＳＴＡＴ５Ａ、ＪＡＫ１）を抑制することで、修復型皮膚線維芽細胞を製造する。前記修復型皮膚線維芽細胞中のＪａｋ−Ｓｔａｔシグナル伝達経路は抑制される。修復型線維芽細胞中のシグナル伝達経路は、以下の変化が発生する。ＮＯＤ様受容体シグナル伝達経路が抑制され、及び／又はTGF-β受容体シグナル伝達経路が抑制され、及び／又はインスリンシグナル伝達経路がダウンレギュレートされ、及び／又はｗｎｔシグナル伝達経路がアップレギュレートされ、及び／又はｎｏｔｃｈシグナル伝達経路がダウンレギュレートされ、及び／又はｐ５３シグナル伝達経路がダウンレギュレートされる。前記修復型線維芽細胞のテロメアの長さは、初期の普通線維芽細胞よりも１．５〜１２倍延長し、未成年個体の同種細胞のレベルに近い。前記修復型線維芽細胞で製造された別の種類の細胞（例えば、骨芽細胞、軟骨細胞）は、同一動物個体に由来する同種細胞に比べ、テロメアが延長し、より強い機能活性を示す。前記修復型線維芽細胞及び当該細胞で製造された細胞生成物（例えば、細胞分泌物、細胞溶解液）は、組織工学材料の構築、細胞、組織、臓器及び生体老化の遅延又は逆転に適用できる。
【００３４】
本発明で提供されるＪａｋ−Ｓｔａｔシグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲットを定量及び／又は定時的に制御することで細胞の分化、脱分化、分化転換、若返り、老化、アポトーシスを調節し、老化を逆転し、生体寿命を延長させる技術は、異なる種類の細胞間の分化転換を促進でき、異なる種類の若返った細胞（例えば、間葉系幹細胞の老化を逆転し、スーパー線維芽細胞を製造する）の製造に適用でき、細胞の老化及びアポトーシスの促進に適用できる。前記技術により製造された細胞及び細胞の生成物は、インビトロ／インビボでの哺乳動物の組織、臓器、生体の老化進行の予防、遅延、逆転に使用され、細胞、組織、臓器、生体のリプログラミングに使用され、組織工学材料の種細胞、組織工学材料の足場の由来源として哺乳動物組織、臓器損傷及び老化、退化した組織、臓器を修復することに使用される。
【００３５】
発明のメカニズム
細胞中のＪａｋ−Ｓｔａｔシグナル伝達経路の遺伝子又はタンパク質ターゲットの発現を制御して細胞の異なる代謝経路の変化を定量及び／又は定時的に調節することにより、標的細胞の細胞状態を改変させ、異なる種類の他の細胞に又は異なる細胞特性を有するように変換する。
【００３６】
従来技術に比べ、本発明は、以下の有益な効果を有する。
本発明で提供される修復型線維芽細胞は、同一の個体に由来する線維芽細胞、同一の年齢層のドナーに由来する線維芽細胞に比べ、前記修復型線維芽細胞は、若返りの特徴を有するが、腫瘍形成性を有しない。前記若返りの特徴は、例えば、エピジェネティクスの変化及び／又は老化関連遺伝子発現量の変化及び／又は細胞テロメアの延長及び／又は細胞増殖速度の増加及び／又は細胞の長期で安定的な継代の能力を含む。この若返った細胞及びその細胞生成物は、哺乳動物の生体の老化を逆転し、寿命を延長させることができる。本発明で提供されるＪａｋ−Ｓｔａｔシグナル伝達経路中の遺伝子又はタンパク質ターゲットを定量及び／又は定時的に制御することにより細胞の分化、脱分化、分化転換、若返り、老化、アポトーシスを調節し、老化を逆転し、生体寿命を延長させる技術は、細胞の分化、脱分化、分化転換、若返り、老化、アポトーシスを体系的に調節することができ、この技術により製造された細胞及び細胞生成物は、インビトロ／インビボでの哺乳動物の組織、臓器、生体の老化進行の予防、遅延、逆転に適用でき、細胞、組織、臓器、生体のリプログラミングに適用でき、組織工学材料の種細胞、組織工学材料の足場の由来源として哺乳動物の組織、臓器損傷、及び老化、退化した組織、臓器を修復することに適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】修復型皮膚線維芽細胞（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ｒＦｉｂ）の製造を示す。
【図２】ｒＦｉｂはＦｉｂ及びｂＭＳＣに比べ、若返りの特徴を有することを示す。
【図３】老化したｂＭＳＣの骨形成分化及び軟骨形成分化の能力はｒＦｉｂよりも悪く、ｒＦｉｂは腫瘍形成性を有しないことを示す。
【図４】ｒＦｉｂはインビトロで免疫調節機能を有することを示す。
【図５】ｒＦｉｂ細胞はインビボ免疫調節の機能を有することを示す。
【図６】ｒＦｉｂは年齢制限なしの骨欠損修復能力を有することを示す。
【図７】インビボ軟骨修復実験を示す。
【図８】ＳＴＡＴ５遺伝子を抑制することにより、皮膚線維芽細胞は若返り、多方向分化の能力を得ることを示す。
【図９】ＳＴＡＴ５をノックアウトした後のＳＴＡＴ５及びＨ３Ｋ９ｍｅの変化状況を示す。
【図１０】別の株の６２歳の（６２Ｙ）のＦｉｂに対してＳＴＡＴ５をノックアウトした後の若返り及び分化能力の検出を示す。
【図１１】ＭＳＣ細胞の若返りを示す。異なる化合物で細胞を３日間処理した後、β−ガラクトシダーゼ染色を行う。５５Ｙ＝５５歳、８２Ｙ＝８２歳；Ｙ＝ｙｅａｒは細胞ドナーの年齢を示す。
【図１２】ｒＦｉｂ細胞は、老齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの寿命を延長させ、その骨密度を高めることができることを示す。
【図１３】ｒＦｉｂ細胞がマウスの複数の臓器に分布し、機能性細胞に分化することができることを示す。
【図１４】ｒＦｉｂ細胞は、老齢骨粗鬆症マウスの骨密度を向上できることを示す。
【図１５】ｒＦｉｂ培養液は、皮膚の愈合を顕著に促進できることを示す。ｒＦｉｂ培養液群は、モデル構築の１２日後にほとんど完全に愈合した。
【図１６】ｒＦｉｂは、マウスの下肢虚血症状を改善できることを示す。
【図１７】Ｍｉｘ  Ｙ処理により細胞ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ３遺伝子の発現が抑制され（Ａ−Ｂ）、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子がダウンレギュレートされ、テロメアが延長し（Ｃ−Ｄ）、細胞が若返ることを示す。
【図１８】Ｍｉｘ  Ｐｎ処理により、細胞ＳＴＡＴ５の発現がダウンレギュレートされ（Ａ）、ＡＴＦ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ及びＩＬ６の発現が抑制され（Ｂ−Ｅ）、細胞が若返ることを示す。
【図１９】Ｍｉｘ  Ｙ−Ｍｉｘ  Ｐｎ２処理により、線維芽細胞ＪＡＫ１の発現が抑制され（Ａ）、そのテロメアの長さが延長する（Ｂ）ことを示す。
【図２０】皮膚線維芽細胞から神経細胞への変換を示す。図２０Ａは、皮膚線維芽細胞から変換した神経細胞のＴｕｊ１染色を示し、図２０Ｂは、Ｎｅｓｔｉｎ発現量の測定を示す。
【図２１】低分子化合物で作用することにより、ＥＳから神経への分化過程において、ＳＴＡＴ５遺伝子の発現がアップレギュレートされることを示す。
【図２２】ＫＥＧＧ経路が多く含まれるモジュールを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
実施例１：修復型皮膚線維芽細胞の取得及びその特性の同定
【００３９】
１、ヒト皮膚線維芽細胞を６ウェルプレートに接種し、皮膚線維芽細胞培養液中で２４時間培養した。
【００４０】
２、細胞培養液を低分子カクテル組み合わせＭｉｘ  Ｖを含むＦｉｂ誘導培養液に交換し、２日ごとに液体を交換した。
【００４１】
３、低分子カクテル組み合わせＭｉｘ  Ｖを含むｒＦｉｂ誘導培養液で５日間培養した後、培養液を低分子カクテル組み合わせＭｉｘ  Ｐを含むｒＦｉｂ誘導培養液に交換し、２日ごとに液体を交換した。
【００４２】
４、低分子カクテル組み合わせＭｉｘ  Ｐを含むｒＦｉｂ誘導培養液で７日間培養した後、培養液を１０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ、１００ｎｇ／ｍＬ  ＰＤＧＦ−ＡＢ及び１０ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ４を添加したＨＧ−ＤＭＥＭ、又は１０％ＦＢＳを添加したＨＧ−ＤＭＥＭに交換し、或いはｒＦｉｂ培地（培地）で培養した。細胞を３日間処理した後、長期継代した。細胞を３日間処理した後、同定を始めた。
【００４３】
５、長期継代時に、ｒＦｉｂをＭＳＣ基礎培地中で培養し、細胞コンフルエンスが９０％に達した時に継代した。
【００４４】
皮膚線維芽細胞培養液：１０％ＦＢＳ＋ＨＧ−ＤＭＥＭ；又はブランド：ＨＣｅｌｌ、商品番号：ＦＭＳ００３ＣのＦｉｂｓｔａｒ−ＣＯ培地。
【００４５】
Ｍｉｘ  Ｖ：１０％ＦＢＳを添加した高グルコース（ＨＧ）−ＤＭＥＭ（０．５ｍＭのＶＰＡ、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、１μＭのＲｅｐｓｏｘ、１０μＭのフォルスコリンを含む）
【００４６】
Ｍｉｘ  Ｐ：１０％ＦＢＳを添加したＨＧ−ＤＭＥＭ（０．５ｍＭのＶＰＡ、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、１μＭのＲｅｐｓｏｘ、１０μＭのフォルスコリン、１０μＭのＳＰ６００１２５、５μＭのＧｏ  ６９８３、５μＭのＹ−２７６３２、０．０５μＭのＡＭ５８０、５μＭのＥＰＺ００４７７７、０．２ｍＭのＶｃ、５μＭのＴＴＮＰＢを含む）
【００４７】
或いは、ブランドがＨＣｅｌｌ、商品番号がＦＧＳ００４０のＦｉｂＧｒｏ培地に０．５ｍＭのＶＰＡ、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、１μＭのＲｅｐｓｏｘ、１０μＭのフォルスコリン、１０μＭのＳＰ６００１２５、５μＭのＧｏ  ６９８３、５μＭのＹ−２７６３２、０．０５μＭのＡＭ５８０、５μＭのＥＰＺ００４７７７、０．２ｍＭのＶｃ、５μＭのＴＴＮＰＢを添加した。
【００４８】
ＭＳＣ基礎培地：１０％ＦＢＳ＋ＬＧ−ＤＭＥＭ；Ｃｙａｇｅｎから購入された商品番号ＨＵＸＭＡ−９００１１の骨髄間葉系幹細胞完全培地；又はブランドＨＣｅｌｌ、商品番号ＣＲＭ００１６−０１のｒＦｉｂ培地。
【００４９】
備考：特に指定のない限り、実施例で使用されている細胞はヒトに由来する。
【００５０】
図１：修復型皮膚線維芽細胞（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ｒＦｉｂ）の製造
【００５１】
Ａは皮膚線維芽細胞（Ｆｉｂ）からｒＦｉｂに変換する過程の模式図である。ほぼ老化したＦｉｂ（Ｐ１３継代）がｒＦｉｂに変換した後、巨大な増殖可能性を得た（さらに１９継代増殖可能）。同様の処理過程は、骨髄間葉系幹細胞の死を誘発した。
【００５２】
ＢはｒＦｉｂ及びその相同Ｆｉｂを長期増幅する時に増殖曲線の比較である。処理して得られたｒＦｉｂの増殖速度は相同Ｆｉｂよりも速かった。
【００５３】
Ｃは変換前後の細胞三系分化（脂肪・骨・軟骨への分化）能力の組織化学的分析（親皮膚細胞は一人の３９歳ボランティアのＰ８継代細胞代に由来する）である。サンプルを０日目（Ｆｉｂ、処理前）、５日目、１２日目、１５日目（ｒＦｉｂ）に複数回増幅し、２１日間の分化誘導後、その骨形成、脂肪形軟骨形成の能力を検出した。Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ（骨芽細胞）（骨成形、アリザリンレッド染色により同定）、Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ（脂肪細胞）（脂肪成形、オイルレッド染色により同定）、軟骨細胞（Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）（軟骨成形、アルシアンブルー染色により同定）。複数回の継代後（Ｐ９継代、Ｐ１６継代）、ｒＦｉｂ細胞は依然として良好な三系分化（脂肪・骨・軟骨への分化）能力を維持した。
【００５４】
Ｄは、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲにより、骨形成分化誘導の１４日後にＡＬＰレベル、軟骨形成分化誘導の１４日後にＣＯＬ２Ａ１レベル、脂肪形成分化誘導の２１日後にＰＰＡＲＧレベルを分析した結果を示す。結果から分かるように、ｒＦｉｂ細胞は、若いｂＭＳＣと同様に、誘導された後、三系分化に関連した遺伝子を高発現する。Ｄ０（Ｆｉｂ）と比較し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ≧３であった。
【００５５】
Ｅ−Ｇは、低分子の組み合わせにより処理した後の、異なる時点での細胞のＪＡＫ１、ＳＴＡＴ５の発現変化（処理後に低下）、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ）の発現状況（５日後に高発現）、及びテロメア長さの変化（１５日目に顕著に延長）を示す。
【００５６】
Ｈは、ｒＦｉｂ細胞に対するトランスクリプトーム解析を示す。その集合状況は、Ｆｉｂ及びｂＭＳＣに近く、ｉＰＳＣ及びＥＳＣと異なり、皮膚線維芽細胞の特性及び間葉系幹細胞の特性を兼ね備える。ｒＦｉｂは、安全で、腫瘍形成性を有しない細胞である。
【００５７】
図２：ｒＦｉｂはＦｉｂ及びｂＭＳＣに比べ、若返った特徴を有する
【００５８】
Ａは、Ｄ０（Ｐ１１継代の親Ｆｉｂ）、Ｄ１５（ｒＦｉｂ）のＨ３Ｋ９ｍｅ３及びＨ４Ｋ２０ｍｅ３の免疫蛍光染色を示す。ｒＦｉｂ細胞の老化マーカーＨ４Ｋ２０ｍｅ３は、その相同Ｆｉｂよりも顕著に減少した。
【００５９】
ＢとＣは、Ｄ０（Ｐ１１継代の親Ｆｉｂ）、Ｄ１５（ｒＦｉｂ）のγＨ２ＡＸの免疫蛍光染色及び定量分析を示す。ｒＦｉｂ細胞の老化マーカーγＨ２ＡＸは、その相同Ｆｉｂよりも顕著に減少した。
【００６０】
Ｄは、２つの老齢個体に由来のＦｉｂ、ｂＭＳＣ、ｒＦｉｂの長期増幅中の増殖曲線を示す。同じ色は、同一個体に由来する細胞を示す。ｒＦｉｂの増殖速度は、同一個体に由来するｂＭＳＣ及びＦｉｂよりも速く、若いｂＭＳＣ（３３歳）よりも速かった。
【００６１】
Ｅ−Ｇは、複数種の細胞老化マーカー（ＣＤＫＮ１Ａ、ＡＴＦ３及びＩＬ−６）のｑ−ＲＴ−ＰＣＲ検出を示す。ｒＦｉｂ細胞及びｒＦｉｂ細胞によって誘導された骨芽細胞及び軟骨細胞の老化マーカーの発現は顕著に低下した。ここで、１２Ｗは、妊娠１２Ｗに流産した胎児に由来する皮膚細胞を示す。
【００６２】
Ｈは、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲを用い、Ｔ／Ｓ値でＦｉｂ、ｒＦｉｂ、ｂＭＳＣ及びその分化した骨芽細胞（ｒＦｉｂ−ＯＢ、ｂＭＳＣ−ＯＢ）、軟骨芽細胞（ｒＦｉｂ−ＣＨ、ｂＭＳＣ−ＣＨ）の相対テロメア長さを測定した。
【００６３】
Ｅ−Ｈ図において、同一個体に由来の細胞は、同じ色で示される。＊は、相同Ｆｉｂと比較した有意差を示し、＃は、対応するｂＭＳＣ、ｂＭＳＣ−ＯＢ（ｂＭＳＣが分化した骨芽細胞）、及びｂＭＳＣ−ＣＨ（ｂＭＳＣが分化した軟骨芽細胞）と比較した有意差を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃ｐ＜０．００１、ｎ＝３であった。
【００６４】
図３：老化したｂＭＳＣ骨形成及び軟骨形成分化能力はｒＦｉｂよりも悪く、ｒＦｉｂは腫瘍形成性を有しない。
【００６５】
Ａは、異なる年齢の個体に由来するｂＭＳＣ及びｒＦｉｂの骨形成分化のアリザリンレッド染色を示す。結果から分かるように、老齢個体に由来するｂＭＳＣ骨形成分化能力は大幅に低下したが、同一個体のｒＦｉｂは良好な骨形成分化能力を保持した。
【００６６】
Ｂは、異なる年齢の個体に由来するｂＭＳＣ及びｒＦｉｂの脂肪形成分化のオイルレッドＯ染色を示す。結果から分かるように、老齢個体に由来するｂＭＳＣの脂肪形成分化能力は大幅に向上したが、老齢個体に由来するｒＦｉｂは若齢個体と一致する脂肪形成分化能力を保持した。
【００６７】
Ｃ−Ｄは、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲにより対応する細胞の骨形成（ＡＬＰ）、脂肪形成（ＰＰＡＲＧ）のマーカー遺伝子を定量分析した結果を示す。結果は染色結果と一致した。
【００６８】
Ｄは、異なる年齢個体に由来するｂＭＳＣ及びｒＦｉｂの軟骨形成分化におけるＣＯＬ２Ａ１及びＭＭＰ１３免疫組織化学染色を示す。老齢ｂＭＳＣが軟骨形成分化した後、ＣＯＬ２Ａ１が低発現し、ＭＭＰ１３が高発現したが、老齢個体に由来するｒＦｉｂは若齢個体のＣＯＬ２Ａ１／ＭＭＰ１３の発現と類似した。
【００６９】
Ｆ−Ｇは、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲにより異なる年齢の個体に由来するｂＭＳＣ及びｒＦｉｂが軟骨形成分化した後のＣＯＬ２Ａ１及びＭＭＰ１３の発現を検出した結果を示す。結果は染色結果と一致した。
【００７０】
Ｈは、Ｐ９継代、Ｐ１３継代のｒＦｉｂ、及びその相同Ｐ６継代のＦｉｂの核型検出を示す。結果から分かるように、ｒＦｉｂは長期継代されたとしても核型がそのＦｉｂと一致した。
【００７１】
Ｉは、ｒＦｉｂ奇形腫形成試験を示す。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を陽性対照とした。ｈＥＳＣをＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下移植した結果、奇形腫（明らかな三胚葉構造がある）が形成された一方、ｒＦｉｂのマウスに移植した結果、腫瘍な形成が観察されなかった。
【００７２】
Ｊは、細胞のテロメア長さ及びテロメラーゼの発現状況の分析を示す。ｒＦｉｂ細胞は、その相同Ｆｉｂ細胞よりもテロメアが顕著に延長し、誘導完成した後においても依然として安定に保持されたが、誘導過程においてテロメラーゼが一過性に高発現し、その後、低発現のレベルに復元した。この点は腫瘍細胞と異なる（腫瘍細胞においてテロメラーゼは継続的に高発現する）。これは、ｒＦｉｂが若返りながら、腫瘍形成性を有しないことを示している。
【００７３】
６．１インビトロ免疫調節試験
【００７４】
マイトマイシンＣで２．５時間処理し、消化して計数し、細胞を１×１０５細胞／ウェルで２４ウェルプレートに接種した。リンパ球をカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＤＡ−ＳＥ）により３７℃で３０分間染色し、２×１０５の密度で２４ウェルプレートに接種した。最終濃度２μｇ／ｍｌのＰＨＡでリンパ球の増殖を刺激した。ｂＭＳＣ＋リンパ球＋ＰＨＡ共培養群、ｒＦｉｂ＋リンパ球＋ＰＨＡ共培養群、皮膚線維芽細胞＋リンパ球＋ＰＨＡ共培養群、リンパ球＋ＰＨＡ陽性対照群、及びリンパ球単独陰性対照群の５群を設定した。５日間共培養５した後、各ウェルのリンパ球を採取し、ＰＢＳで３回リンスした。抗ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８抗体を用い、フローサイトメーターによりリンパ球の増殖状況を検出した。抗体は、いずれもＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入された。
【００７５】
図４：ｒＦｉｂはインビトロで免疫調節機能を有する。
【００７６】
Ａは、親Ｆｉｂ、ｒＦｉｂ、ｂＭＳＣをそれぞれＴ細胞と混合リンパ球反応で培養したことを示す。健康ボランティアに由来するＰＢＭＣはＣＦＳＥで標識された。「Ｔ＋ＰＨＡ」群に比べ、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝３であった。結果から分かるように、ｒＦｉｂは、Ｔ細胞の増殖を抑制する能力を有し、その相同Ｆｉｂ細胞は、Ｔ細胞の増殖を抑制する能力を有せず、ｒＦｉｂは免疫調節能力を有することを示している。
【００７７】
Ｂ−Ｃは、ｒＦｉｂがＣＤ４＋免疫細胞サブタイプに対して調節能力を有することを示す。
【００７８】
Ｄ−Ｅは、ｒＦｉｂがＣＤ８＋免疫細胞サブタイプに対して調節能力を有することを示す。
【００７９】
６．２インビボ免疫調節実験
【００８０】
１×１０６の密度で１０ｃｍ培養皿中でｂＭＳＣ、ｒＦｉｂ、皮膚線維芽細胞を４８時間培養した後、培養液を０．２２μｍ濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過して細胞又は細胞破片を除去し、限外ろ過遠心チューブで１００倍濃縮した。
【００８１】
８〜１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに対して２５ｍｇ／ｋｇ体重でＰＢＳに溶解したコンカナバリンを尾静脈注射して急性肝障害を誘導し、ＰＢＳのみを注射して対照とした（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。各群に６匹のマウスがある。３０分間後、異なる濃縮培地又はＰＢＳを尾静脈注射した。培地を尾静脈注射した８．５時間後、マウスを安楽死させた。血液及び肝臓を採取した。肝臓をＨＥで染色し、フローサイトメーターによりＣＤ３＋Ｔ細胞を検出し、血液でＡＬＴ／ＡＳＴを検出した。
【００８２】
血清ＡＬＴ／ＡＳＴの定量は説明書に従ってＥＬＩＳＡキット（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を用いて行った。各群に対して３つの独立した繰り返しサンプルを設置し、データは、平均値±ＳＤで表される。
【００８３】
図５：ｒＦｉｂ細胞はインビボ免疫調節能力を有する。
【００８４】
Ａは、コンカナバリンでＣ５７ＢＬ／６マウスの急性肝障害を誘導し、濃縮したｒＦｉｂの細胞培養液で治療した結果を示す。結果から分かるように、ｒＦｉｂ培養液で治療されたマウスは、肝臓に明らかな異常（出血、壊死など）がなかった。
【００８５】
Ｂは、細胞培養液を尾静脈注射した８．５時間後の肝臓組織におけるＴリンパ球の絶対値を測定した結果を示す。結果から分かるように、ｒＦｉｂの培養液は、ｂＭＳＣと同様に顕著な免疫調節能力を有した。
【００８６】
Ｃ−Ｄは、ｒＦｉｂ培養液で治療されたマウスは、その血液ＡＬＴ及びＡＳＴがいずれも正常レベルに近く、顕著な肝損傷症状がないことを示す。
【００８７】
６．３普通遺伝子のＰＣＲ
【００８８】
総ＲＮＡの抽出は、ＴＲＩｚｏｌキット（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）の説明書に従って行った。Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ  ＲＴキット（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）によりＲＮＡ（１．０μｇ）をｃＤＮＡに逆転写した。ｑ−ＲＴ−ＰＣＲにおいて、ｃＤＮＡをテンプレートとし、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＥＸ  ＴａｑＴＭＩＩ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）を特異的プライマー及びＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎとして使用した。循環条件は、製造業者（Ｔａｋａｒａ）の説明に従った。相対発現レベルは、内部リファレンス（ＡＣＴＩＮ）により正規化された。ｇＰＣＲにおいて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、Ｐｒｅｍｉｘ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）をヒト特異的プライマーＡＣＴＩＮとして使用した。
【００８９】
実施例２：ｒＦｉｂ細胞は骨欠損修復能力を有する。
【００９０】
倫理委員会の承認の下で８〜１０週齢、体重２０〜２４ｇのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを用いて大腿骨欠損モデルを建築し、各群に５匹の動物を使用した。モデル構築方法は、ペントバルビタールナトリウムの麻酔下で、皮膚及び皮下組織を切開し、大腿直筋と半腱様筋を鈍性分離し、十分な大腿骨中段を露出させた。右側大腿骨の中心部の近位で手術を行った。手術で４ｍｍ×１ｍｍの連続的な骨欠損を構築した。皮膚線維芽細胞（Ｆｉｂ）、骨髄間葉系幹細胞（ｂＭＳＣ）及びｒＦｉｂをＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ，ＮｕｃＢｌｕｅ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌ）で染色した後、Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合し、５×１０５細胞／匹のマウスで欠損部位に移植（投与）した。
【００９１】
移植の２８日後、マウスに致死量のペントバルビタールナトリウムを注入して安楽死させた。マウス大腿を鈍性分離し、４％ＰＦＡで固定し、μＣＴイメージング（ＳｋｙＳｃａｎ  １２７２，Ｂｒｕｋｅｒ  ｍｉｃｒｏＣＴ）により検出し、採取したデータを分析した。
【００９２】
図６：ｒＦｉｂは、年齢制限なしの骨欠損修復能力を有する。
【００９３】
Ａはマウス大腿骨中段欠損モデルの手術操作模式図である。
【００９４】
Ｂは、異なる群のマウス大腿骨サンプル及びＨ＆Ｅ染色を示す。若齢ｂＭＳＣ（３１歳）及びｒＦｉｂ（３９歳）はいずれも良好な骨欠損修復能力を有する。
【００９５】
Ｃは、ｒＦｉｂ細胞をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２により標識し、青色の蛍光を自己発光できることを示す。修復部位の切片は、ｒＦｉｂ細胞が欠損部位に新しい骨を形成し、数、位置が新生骨細胞に対応することを示している。
【００９６】
Ｄは、異なる実験群のｍｉｃｒｏ−ＣＴ分析を示す。老齢個体に由来のｒＦｉｂ（６２歳）は骨欠損を修復できるが、骨欠損修復能力が非常に弱い。
【００９７】
Ｅは、異なる実験群のｍｉｃｒｏ−ＣＴ分析を示す。若齢（３９歳）及び老齢（６２歳）個体に由来のｒＦｉｂの修復能力は近く、ｒＦｉｂの骨欠損修復能力が年齢により制限されないことを示している。
【００９８】
実施例３：ｒＦｉｂ細胞は軟骨欠損修復能力を有する。
【００９９】
関節軟骨欠損モデルと細胞移植
【０１００】
８〜１０週齢、体重２０〜２４ｇのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを用いた。改良した関節軟骨モデルを用いてｒＦｉｂの治療効果を評価した（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。生検パンチを用いて大腿骨遠位端の滑車溝中で関節軟骨欠損（１．５ｍｍ×１ｍｍ）を構築した。細胞（２．５×１０５／３５μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ）をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で標識し、欠損部位に植え込んだ。細胞を含まないＭａｔｒｉｇｅｌを植え込んで対照とした。
【０１０１】
図７：インビボ軟骨修復実験
【０１０２】
Ａ−Ｂは、軟骨組織サンプル及び１０μｍ切片のサフラニン・ファストグリーンで染色した。サフラニン・ファストグリーン染色において、赤色は軟骨を示し、緑色は骨組織を示す。若齢ｒＦｉｂ（３９歳）とｂＭＳＣ（３１歳）はいずれも軟骨欠損を修復することができ、老齢ｂＭＳＣ（６２歳）は新しい組織を生成できるが、新生軟骨がない一方、老齢個体に由来のｒＦｉｂ（６２歳）であっても軟骨組織を形成することができる。
【０１０３】
Ｃは、軟骨修復のＰｉｎｅｄａスコアを示す。結果から分かるように、老齢個体に由来のｒＦｉｂ（６２歳）と若齢個体に由来のｒＦｉｂ（３９歳）は類似する軟骨修復能力を有する。
【０１０４】
Ｄ図において、切片から分かるように、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で標識されたｒＦｉｂは新しい軟骨組織を形成した。新たに生成した軟骨組織は正常軟骨の構造形態と類似し、異常組織の生成がない。
【０１０５】
実施例４〜１２：異なる低分子化合物の組み合わせにより異なる時間処理し、修復型線維芽細胞を得た。同定方法は実施例１と同様であった。組み合わせを下表（表１）に示す。
【０１０６】
【表１】
2021522859.tif 000003
2021522859.tif 000004
【０１０７】
実施例１３：スーパー線維芽細胞の製造
【０１０８】
１、ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９のｓｔａｔ５Ａ遺伝子がノックアウトされたベクタープラスミドの構築：以下のプラスミドはｃｙａｇｅｎ社から購入された。
ｐＬＶ［２ｇＲＮＡ］−ＥＧＦＰ：Ｔ２Ａ：Ｐｕｒｏ−Ｕ６＞ｈＳＴＡＴ５Ａ［ｇＲＮＡ＃４］−Ｕ６＞ｈＳＴＡＴ５Ａ［ｇＲＮＡ＃１０］
ｐＬＶ［Ｅｘｐ］−ＣＢｈ＞ｈＣａｓ９：Ｔ２Ａ：Ｈｙｇｒｏ
【０１０９】
２、製品説明書に従ってウイルスを導入し、ウイルスを導入した後の１日目に、ウイルスを含有する培地を除去し、新鮮な完全培地に交換した。３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータでインキュベートした。
【０１１０】
３、ウイルスを導入した後の２日目以降、レンチウイルスが持つ遺伝子は発現し始め、細胞を引き続き培養し、発現生成物をさらに累積し、又は細胞表現型を変化させた。
【０１１１】
４、細胞を増幅した後、抗生物質でウイルスが導入された細胞を精製し、細胞を１０％ＦＢＳ含有ＨＧ−ＤＭＥＭで引き続き拡大培養し、細胞を１５０日間連続培養した。
【０１１２】
図８：ＳＴＡＴ５遺伝子を抑制することにより、皮膚線維芽細胞は若返り、多方向分化能力を取得することができる。
【０１１３】
Ａは、ＷＧＣＮＡにより確定された１２，０３６個の遺伝子から選別されたｒＦｉｂのＫＥＧＧ経路が多く含まれる２つの代表的なモジュール及びいくつかのサンプルにおける２つの遺伝子モジュールの発現変化の箱ヒゲ図である。
【０１１４】
Ｂから分かるように、ＳＴＡＴ５遺伝子をノックアウトした後、引き続き４０日間培養し、免疫組織化学染色によりＦｉｂのＳＴＡＴ５をノックアウトした後（Ｆｉｂ−ＳＴＡＴ５−ＫＯ）のＨ４Ｋ２０ｍｅ３（老化マーカーが多いほど老化する）は対照よりも顕著に減少した。
【０１１５】
Ｃ．老化マーカー遺伝子の同定（ＡＴＦ３、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＬ６、ＣＤＫＮ１Ａ、老化した細胞が高発現）を示す。結果から分かるように、ＳＴＡＴ５をノックアウトしたＦｉｂ細胞老化マーカー遺伝子の発現は顕著に低下した。
【０１１６】
Ｄから分かるように、ＳＴＡＴ５をノックアウトした後のＦｉｂが骨成形（Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ  Ｓ、アリザリンレッド染色）軟骨成形（Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ、アルシアンブルー染色）能力を示す。
【０１１７】
Ｅ−Ｇは、ＳＴＡＴ５遺伝子をノックアウトした後の、細胞ＪＡＫ１、ＳＴＡＴ５の発現変化（ノックアウトした後に低下）、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ）の発現状況（４３日後に高発現）、及びテロメア長さの変化（５４日目に顕著に延長）を示す。
【０１１８】
Ｈは、線維芽細胞においてＪａｋ−Ｓｔａｔシグナル伝達経路を制御し、細胞及び生体を若返りさせる模式図である。
【０１１９】
図９：ＳＴＡＴ５をノックアウトした後のＳＴＡＴ５及びＨ３Ｋ９ｍｅの変化状況
【０１２０】
Ａは、Ｆｉｂに対してＳＴＡＴ５をノックアウトした後、ＳＴＡＴ５Ａが発現しなくなることを示す。
【０１２１】
Ｂは、ＳＴＡＴ５のノックアウトがＨ３Ｋ９ｍｅに影響を与えないことを示す。
【０１２２】
図１０：別の株の６２歳の（６２Ｙ）のＦｉｂに対してＳＴＡＴ５をノックアウトした後の若返り及び分化能力の検出を示す。
【０１２３】
Ａは、老化関連遺伝子の検出を示す。
【０１２４】
Ｂは、骨形成、軟骨形成分化の検出を示す。
【０１２５】
Ｃ−Ｄは、テロメラーゼ及びテロメア長さの検出を示す。
【０１２６】
Ｅは、ＳＴＡＴ５発現状況の検出を示す。
【０１２７】
Ｆは、Ｍｉｘ  Ｖ＋Ｍｉｘ  Ｐシステムで処理した同一株の細胞のＳＴＡＴ５の検出を示す。
【０１２８】
実施例１４：ＭＳＣ細胞の若返り
【０１２９】
１、１０％ＦＢＳ含有低糖ＤＭＥＭで異なる個体に由来の骨髄間葉系幹細胞を培養した。
【０１３０】
２、異なる化合物の組み合わせで細胞を３日間処理した後、細胞を引き続き１０％ＦＢＳ含有低糖ＤＭＥＭ培養液中で３日間培養した後、β−ガラクトシダーゼ染色を行った。
【０１３１】
【表２】
2021522859.tif 000005
【０１３２】
図１１：ＭＳＣ細胞の若返り
異なる化合物で細胞を３日間処理した後、β−ガラクトシダーゼ染色を行った。５５Ｙ＝５５歳、８２Ｙ＝８２歳、Ｙ＝ｙｅａｒ：細胞ドナーの年齢
【０１３３】
実施例１５：ｒＦｉｂの静脈注射により老化マウスの寿命を延長できる。
【０１３４】
同一の３９歳の個体に由来するＰ９継代のＦｉｂ、Ｐ１３継代のｒＦｉｂ、及び同一の６２歳の個体に由来するｒＦｉｂをＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で標識し、２００μＬ  ＤＭＥＭに溶解した。細胞（１０６／匹）を自然に老化したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（４３週齢；このマウスの平均寿命は３６〜３８週齢である。４３週齢は人間の約８６歳に相当する）に尾静脈注射した。溶媒群では、２００μＬ  ＤＭＥＭのみを注射した。マウスが自然に死亡した後、サンプリングして検出した。
【０１３５】
図１２は、ｒＦｉｂ細胞は、老齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの寿命を延長させ、その骨密度を高めることができることを示す。
【０１３６】
Ａは、老化マウスの生存曲線を示す。ｒＦｉｂ細胞が注射されたマウスは、細胞が若齢個体（３９歳）に由来しても、老齢個体（６２歳）に由来しても、マウスの寿命を効果的に延長できる。若齢のＦｉｂ細胞であっても、寿命の延長作用を有せず、生存曲線は溶媒群と有意差がなかった。
【０１３７】
Ｂは、２群のマウス形態の観察を示す。４３週齢のマウスは明らかに老化しており（毛が乱雑で、光沢がなく、傴僂であった）、ｒＦｉｂ細胞を注射した４週間後のマウス状態が明らかに改善されずい、ＤＭＥＭを注射されたマウスは４週間後にさらに老化した。
【０１３８】
Ｃ−Ｅは、それぞれ１０週齢、２５週齢、４７週齢（４３週齢にＤＭＥＭを注射、４７週齢に死亡）、４９週齢（４３週齢にｒＦｉｂを注射、４９週齢に死亡）の４匹のネズミの解剖写真であり、胃粘膜切片をＨ＆Ｅ染色し、第３腰椎のｍｉｃｒｏ−ＣＴ分析図である。同図から分かるように、ｒＦｉｂ細胞が注射されたマウスの胃腸管の外観は若齢マウス（１０Ｗ、２５Ｗ）に近く、胃粘膜の厚さ、密度及び腰椎小柱骨構造は２５Ｗマウスの状態に近く、ＤＭＥＭ注射群の老化マウスの胃腸管には顕著な病変があり、胃粘膜が短くて疎らであり、腰椎小柱骨の欠損、断裂が深刻であった。
【０１３９】
Ｆは、Ｍｉｃｒｏ−ＣＴデータ分析を示す。ｒＦｉｂが注射された老齢マウスは、その骨密度（ＢＭＤ）、相対骨体積（ＢＶ／ＴＶ）がいずれも２５週齢のマウスに近く、小柱骨の数（Ｔｂ．Ｎ）及び小柱骨の分離度（Ｔｂ．Ｓｐ）は、ＤＭＥＭが注射されたマウスに対していずれも改善された（各群に５匹の動物がある。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝５）。
【０１４０】
Ｇは、ｐ１６Ｉｎｋ４ａの発現分析を示す。ｒＦｉｂが注射された老齢マウスと２５週齢及び１０週齢のマウスには有意差がなく、ＤＭＥＭが注射された老齢マウスｐ１６Ｉｎｋ４ａの発現は顕著に向上した。
【０１４１】
Ｈは、骨芽細胞（ＡＬＰ）、破骨細胞（ＴＲＡＰ）の染色分析を示す。ｒＦｉｂ細胞が注射された老齢マウスは、ＤＭＥＭ群よりも骨芽細胞の発現が顕著に向上し、破骨細胞の発現が低下した。
【０１４２】
Ｉ−Ｊは、骨芽細胞（Ｉ）、破骨細胞（Ｊ）の定量分析を示す。ｒＦｉｂ細胞が注射された老齢マウスの骨芽細胞、破骨細胞の発現は２５週齢マウスに近かった。
【０１４３】
Ｋにおいて、免疫組織化学染色から分かるように、ｒＦｉｂが注射されたマウスの骨にヒト抗体（ｈＣＤ２９、緑色）陽性が出現し、骨形成マーカーであるオステオカルシンが発現され（赤色）、ｒＦｉｂがＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの体内で骨芽細胞に分化したことを示している。
【０１４４】
Ｌ−Ｍから分かるように、ｒＦｉｂ培養液におけるＧＤＦ１１（抗老化機能を有するタンパク質）及びＰＤＧＦＡ（骨成形に有利であるタンパク質）の分泌量は、その相同Ｆｉｂよりも顕著に高く、ｒＦｉｂの抗老化及び骨密度向上機能は傍分泌作用に関係がある可能性がある。
【０１４５】
図１３は、ｒＦｉｂ細胞がマウスの複数の臓器に分布し、機能性細胞に分化することができることを示す。
【０１４６】
Ａ−Ｂは、ｒＦｉｂ細胞がマウスの胃、脾臓、肺、肝臓に分布することを示す（蛍光法及びＰＣＲ法により検出）。
【０１４７】
Ｃは、ｒＦｉｂ細胞がマウスの骨骼に分布することを示す（ＰＣＲ法により検出する。１＃〜１０＃はマウスの番号を示し、１＃〜５＃はｒＦｉｂ細胞が注射されたマウスであり、６＃〜１０＃はＤＭＥＭが注射されたマウスである）。
【０１４８】
Ｄにおいて、免疫組織化学染色から分かるように、ｒＦｉｂが注射されたマウスの骨にヒト抗体（ｈＣＤ２９、緑色）陽性が出現し、骨形成マーカーであるオステオカルシンが発現され（赤色）、ｒＦｉｂがＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの体内で骨芽細胞に分化したことを示している。
【０１４９】
Ｅから分かるように、ｒＦｉｂの他の傍分泌物（ＢＦＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ）はＦｉｂと同じであるか、又は有意差がなく、抗老化機能を発揮する主なメカニズムではない。
【０１５０】
実施例１６：ｒＦｉｂの静脈注射により老齢骨粗鬆症動物の骨密度が向上する。
【０１５１】
図１４は、ｒＦｉｂ細胞は、老齢骨粗鬆症マウスの骨密度を向上できることを示す。
【０１５２】
Ａは、ヒト細胞を用いて老齢性骨粗鬆症（２８ＷのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）を介入した結果を示す。実験群では、１＊１０６ｒＦｉｂ細胞を２００μＬ  ＤＭＥＭに分散して尾静脈注射した。対照群では、ＤＭＥＭのみを注射し、週に１回、合計３週間投与した。１回目の注射後の２８日目に安楽死させ、サンプリングし、腰椎骨の密度を測定した。Ｍｉｃｒｏ−ＣＴ結果から分かるように、実験群マウスの第３腰椎の小柱骨の構造はさらに緻密であった。
【０１５３】
Ｂは、実験群マウスのＭｉｃｒｏ−ＣＴデータ分析結果を示す。結果から分かるように、その骨密度（ＢＭＤ）、相対骨体積（ＢＶ／ＴＶ）及び小柱骨の数（Ｔｂ．Ｎ）は、いずれも向上した。
【０１５４】
実施例１７：ｒＦｉｂ細胞の培養液は動物皮膚創面の愈合を促進できる。
【０１５５】
Ｃ５７マウスを用い、その背部に幅８ｃｍの皮膚全層欠損を作り、対照群では治療せず、ｒＦｉb培地群ではｒＦｉｂ培養液で毎日塗布治療した。
【０１５６】
図１５は、ｒＦｉｂ培養液は、皮膚の愈合を顕著に促進できることを示す。ｒＦｉｂ培養液群は、モデル構築の１２日後にほとんど完全に愈合した。
【０１５７】
実施例１８：ｒＦｉｂはマウスの下肢虚血状況を改善できる。
【０１５８】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの片側大腿動脈を結紮して下肢虚血モデルを構築した。手術後にレーザードップラーによりモデル構築の成功を検証した後、大腿動脈結紮点及びその遠端、近端に１×１０６細胞を１回限り注射した。細胞注射後の７日目、１４日目にレーザードップラーにより血流量を測定した。
【０１５９】
図１６は、ｒＦｉｂがマウスの下肢虚血症状を改善できることを示す。
【０１６０】
Ａは、レーザードップラーによりマウスの下肢血流状況を検出した結果を示す。結果から分かるように、ｒＦｉｂ及びｂＭＳＣはマウスの下肢虚血状況を顕著に改善できる。
【０１６１】
Ｂは、マウス下肢を結紮した後の７日目の写真である。対照群は、正常側の下肢を示す。Ｉｓｃｈｅｍｉｃは結紮側の下肢を示す。結果から分かるように、ｒＦｉｂ群及びｂＭＳＣ群の結紮側の下肢壊死状況が顕著に軽度である。
【０１６２】
実施例１９：異なる化合物の組み合わせによるｒＦｉｂ細胞の製造
【０１６３】
１、皮膚線維芽細胞を６ウェルプレートに接種し、皮膚線維芽細胞培養液中で２４時間培養した。
【０１６４】
２、細胞培養液を低分子化合物組み合わせＭｉｘ  Ｙを含むｒＦｉｂ誘導培養液に交換し、２日ごとに液体を交換し、細胞を１０日間処理した。
【０１６５】
３、低分子化合物組み合わせＭｉｘ  Ｙで処理した後、培養液を１０％ＦＢＳが添加されたＨＧ−ＤＭＥＭに交換し、細胞を引き続き３日間培養した後に同定し、又はｒＦｉｂ培地で培養した。
【０１６６】
５、長期継代時に、ｒＦｉｂをＭＳＣ基礎培地中で培養し、細胞コンフルエンスが９０％に達した時に継代した。
【０１６７】
皮膚線維芽細胞培養液：１０％ＦＢＳ＋ＨＧ−ＤＭＥＭ；又はブランド：ＨＣｅｌｌ、商品番号：ＦＭＳ００３ＣのＦｉｂｓｔａｒ−ＣＯ培地。
【０１６８】
Ｍｉｘ  Ｙ：  １０％ＦＢＳを添加した高グルコース（ＨＧ）−ＤＭＥＭ（５μＭのＹ−２７６３２、０．２ｍＭのＶｃ、５μＭのＥＰＺ００４７７７、１０μＭのフォルスコリン、１μＭのＲｅｐｓｏｘを含む）。
【０１６９】
或いは、ブランドがＨＣｅｌｌ、商品番号がＦＧＳ００４０のＦｉｂＧｒｏ培地に５μＭのＹ−２７６３２、０．２ｍＭのＶｃ、５μＭのＥＰＺ００４７７７、１０μＭのフォルスコリン、１μＭのＲｅｐｓｏｘを添加した。
【０１７０】
ＭＳＣ基礎培地：１０％ＦＢＳ＋ＬＧ−ＤＭＥＭ；Ｃｙａｇｅｎから購入された商品番号ＨＵＸＭＡ−９００１１の骨髄間葉系幹細胞完全培地；又はブランドＨＣｅｌｌ、商品番号ＣＲＭ００１６−０１のｒＦｉｂ培地。
【０１７１】
図１７は、Ｍｉｘ  Ｙ処理により細胞ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ３遺伝子の発現が抑制され（Ａ−Ｂ）、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子がダウンレギュレートされ、テロメアが延長し（Ｃ−Ｄ）、細胞が若返ることを示す。
【０１７２】
実施例２０：異なる化合物の組み合わせによるｒＦｉｂ細胞の製造
【０１７３】
１、皮膚線維芽細胞を６ウェルプレートに接種し、皮膚線維芽細胞培養液中で２４時間培養した。
【０１７４】
２、細胞培養液を低分子化合物組み合わせＭｉｘ  Ｐｎを含むｒＦｉｂ誘導培養液に交換し、２日ごとに液体を交換し、細胞を７日間処理した。
【０１７５】
３、低分子化合物組み合わせＭｉｘ  Ｐｎで処理した後、培養液を１０％ＦＢＳを添加したＨＧ−ＤＭＥＭに交換し、細胞を引き続き３日間培養した後に同定し、又はｒＦｉｂ培地で培養した。
【０１７６】
５、長期継代時に、ｒＦｉｂをＭＳＣ基礎培地中で培養し、細胞コンフルエンスが９０％に達した時に継代した。
【０１７７】
皮膚線維芽細胞培養液：１０％ＦＢＳ＋ＨＧ−ＤＭＥＭ；又ハブランド：ＨＣｅｌｌ、商品番号：ＦＭＳ００３ＣノＦｉｂｓｔａｒ−ＣＯ培地。
【０１７８】
Ｍｉｘ  Ｐｎ：１０％ＦＢＳヲ添加シタＨＧ−ＤＭＥＭ（０．５ｍＭノＶＰＡ、３μＭノＣＨＩＲ９９０２１、１μＭノＲｅｐｓｏｘ、１０μＭノフォルスコリン、５μＭノＧｏ  ６９８３、５μＭノＹ−２７６３２、０．０５μＭノＡＭ５８０、５μＭノＥＰＺ００４７７７、０．２ｍＭノＶｃ、５μＭノＴＴＮＰＢ、１０μＭノ５−Ａｚａ−２'−デオキシシチジンヲ含ム）。
【０１７９】
或いは、ブランドがＨＣｅｌｌ、商品番号がＦＧＳ００４０のＦｉｂＧｒｏ培地に０．５ｍＭのＶＰＡ、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、１μＭのＲｅｐｓｏｘ、１０μＭのフォルスコリン、５μＭのＧｏ  ６９８３、５μＭのＹ−２７６３２、０．０５μＭのＡＭ５８０、５μＭのＥＰＺ００４７７７、０．２ｍＭのＶｃ、５μＭのＴＴＮＰＢ、１０μＭの５−Ａｚａ−２'−デオキシシチジンを添加した。
【０１８０】
ＭＳＣ基礎培地：１０％ＦＢＳ＋ＬＧ−ＤＭＥＭ；Ｃｙａｇｅｎから購入された商品番号ＨＵＸＭＡ−９００１１の骨髄間葉系幹細胞完全培地；又はブランドＨＣｅｌｌ、商品番号ＣＲＭ００１６−０１のｒＦｉｂ培地。
【０１８１】
図１８：Ｍｉｘ  Ｐｎ処理により、細胞ＳＴＡＴ５の発現がダウンレギュレートされ（Ａ）、ＡＴＦ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＧＡＤＤ４５Ｂ及びＩＬ６の発現が抑制され（Ｂ−Ｅ）、細胞が若返ることを示す。
【０１８２】
実施例２１：異なる化合物の組み合わせによるｒＦｉｂ細胞の製造
【０１８３】
１、皮膚線維芽細胞を６ウェルプレートに接種し、皮膚線維芽細胞培養液中で２４時間培養した。
【０１８４】
２、細胞培養液を低分子カクテル組み合わせＭｉｘ  Ｙを含むｒＦｉｂ誘導培養液に交換し、２日ごとに液体を交換した。
【０１８５】
３、低分子カクテル組み合わせＭｉｘ  Ｙを含むｒＦｉｂ誘導培養液で９日間培養した後、培養液を１０％ＦＢＳを添加したＨＧ−ＤＭＥＭに交換し、３〜７日間処理した。
【０１８６】
４、ステップ３の処理後に、低分子化合物組み合わせＭｉｘ  Ｐｎ２を含むｒＦｉｂ誘導培養液を加え、２日ごとに液体を交換した。
【０１８７】
５、低分子化合物組み合わせＭｉｘ  Ｐｎ２を含むｒＦｉｂ誘導培養液で７日間培養した後、培養液を１０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、１００ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ−ＡＢ及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４を添加したＨＧ−ＤＭＥＭに交換し、細胞を３日間処理し、或いは１０％ＦＢＳを添加したＨＧ−ＤＭＥＭに交換して細胞を３日間処理し、或いはｒＦｉｂ培地で培養し、３日後に同定した。
【０１８８】
６、長期継代時に、ｒＦｉｂをＭＳＣ基礎培地中で培養し、細胞コンフルエンスが９０％に達した時に継代した。
【０１８９】
皮膚線維芽細胞培養液：１０％ＦＢＳ＋ＨＧ−ＤＭＥＭ；又はブランド：ＨＣｅｌｌ、商品番号：ＦＭＳ００３ＣのＦｉｂｓｔａｒ−ＣＯ培地。
【０１９０】
Ｍｉｘ  Ｙ：１０％ＦＢＳを添加した高グルコース（ＨＧ）−ＤＭＥＭ（５μＭのＹ−２７６３２、０．２ｍＭのＶｃ、５μＭのＥＰＺ００４７７７、１０μＭのフォルスコリン、１μＭのＲｅｐｓｏｘを含む）。
【０１９１】
或いは、ブランドがＨＣｅｌｌ、商品番号がＦＧＳ００４０のＦｉｂＧｒｏ培地に５μＭのＹ−２７６３２、０．２ｍＭのＶｃ、５μＭのＥＰＺ００４７７７、１０μＭのフォルスコリン、１μＭのＲｅｐｓｏｘを添加した。
【０１９２】
Ｍｉｘ  Ｐｎ：１０％ＦＢＳを添加したＨＧ−ＤＭＥＭ（０．５ｍＭのＶＰＡ、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、１μＭのＲｅｐｓｏｘ、１０μＭのフォルスコリン、５μＭのＧｏ  ６９８３、５μＭのＹ−２７６３２、０．０５μＭのＡＭ５８０、５μＭのＥＰＺ００４７７７、０．２ｍＭのＶｃ、５μＭのＴＴＮＰＢを含む）
【０１９３】
或いは、ブランドがＨＣｅｌｌ、商品番号がＦＧＳ００４０のＦｉｂＧｒｏ培地に０．５ｍＭのＶＰＡ、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、１μＭのＲｅｐｓｏｘ、１０μＭのフォルスコリン、５μＭのＧｏ  ６９８３、５μＭのＹ−２７６３２、０．０５μＭのＡＭ５８０、５μＭのＥＰＺ００４７７７、０．２ｍＭのＶｃ、５μＭのＴＴＮＰＢを添加した。
【０１９４】
ＭＳＣ基礎培地：１０％ＦＢＳ＋ＬＧ−ＤＭＥＭ；Ｃｙａｇｅｎから購入された商品番号ＨＵＸＭＡ−９００１１の骨髄間葉系幹細胞完全培地；又はブランドＨＣｅｌｌ、商品番号ＣＲＭ００１６−０１のｒＦｉｂ培地。
【０１９５】
図１９は、Ｍｉｘ  Ｙ−Ｍｉｘ  Ｐｎ２処理により、線維芽細胞ＪＡＫ１の発現が抑制され（Ａ）、そのテロメアの長さが延長する（Ｂ）ことを示す。
【０１９６】
実施例２２：皮膚線維芽細胞が神経細胞に分化変換する。
【０１９７】
１、皮膚線維芽細胞を６ウェルプレートに接種し、皮膚線維芽細胞培養液中で２４時間培養した。
【０１９８】
２、細胞培養液を低分子化合物組み合わせＭｉｘ  Ｎｅｕを含む神経誘導培養液に交換し、２日ごとに液体を交換した。
【０１９９】
３、低分子化合物組み合わせＭｉｘ  Ｎｅｕを含む神経誘導培養液で細胞を５〜１２日間培養した後、長紡錘形の細胞形態が神経細胞の形態に変化したことが観察され、培養液を神経細胞培養液に交換し、継続的に継代培養した。
【０２００】
４、分化転換した神経細胞を免疫蛍光及び定量ＰＣＲにより同定した。
【０２０１】
皮膚線維芽細胞培養液：１０％ＦＢＳ＋ＨＧ−ＤＭＥＭ；又はブランド：ＨＣｅｌｌ、商品番号：ＦＭＳ００３ＣのＦｉｂｓｔａｒ−ＣＯ培地。
【０２０２】
Ｍｉｘ  Ｎｅｕ：１０％ＦＢＳを添加したＨＧ−ＤＭＥＭ（０．５μＭのＡ８３０１、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、５μＭのＥＰＺ００４７７７、１０μＭのＲＧ１０８、２μＭのパルネート、１０μＭのＣＨＩＲ９９０２１、５０μＭのフォルスコリン、０．５ｍＭのＶＰＡ、０．０５μＭのＡＭ５８０、１μＭのＢＩＸ  ０１２９４を含む）。
【０２０３】
神経細胞培養液：５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２、５ｍＬのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ、１／１００のＮ２、１／５０のＢ２７、１００μＭのｃＡＭＰ、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ＭｌのＧＤＮＦ、１０％（ｖ／ｖ）のＫＯＳＲ。
【０２０４】
図２０：皮膚線維芽細胞から神経細胞への変換を示す。
【０２０５】
Ａは、皮膚線維芽細胞から変換した神経細胞のＴｕｊ１染色を示す。
【０２０６】
Ｂは、Ｎｅｓｔｉｎ発現量の測定を示す。
【０２０７】
実施例２３：胚性幹細胞は神経細胞に分化する。
【０２０８】
１、接着培養された胚性幹細胞を消化した後、神経誘導液中で懸濁培養した。
【０２０９】
２、神経誘導液中で１０〜１５日間培養した後、細胞が続々に壁に接着することが観察され、懸濁培養された細胞をｍａｔｒｉｇｅｌで処理された６ウェルプレートに接種し、細胞を接着培養し、引き続き神経誘導液で５〜７日間培養した。
【０２１０】
３、細胞が壁に接着した後、神経誘導液を神経細胞培養液に交換した。
【０２１１】
４、誘導細胞に対して神経マーカーの免疫蛍光染色及び定量ＰＣＲの同定を行った。
【０２１２】
神経誘導液：１０％ＫＯＳＲを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、５μＭのＹ−２７６３２、０．５ｍＭのＶＰＡ、５μＭのＥＰＺ００４７７７、１０μＭのフォルスコリン、１μＭのＲｅｐｓｏｘを含む）。
【０２１３】
神経細胞培養液：５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２、５ｍＬのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ、１／１００のＮ２、１／５０のＢ２７、１００μＭのｃＡＭＰ、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ＭｌのＧＤＮＦ、１０％（ｖ／ｖ）のＫＯＳＲ。
【０２１４】
図２１は、低分子化合物で作用することにより、ＥＳから神経への分化過程において、ＳＴＡＴ５遺伝子の発現がアップレギュレートされることを示す。
【０２１５】
実施例２４：実施例１で製造されたｒＦｉｂ細胞中のシグナル伝達経路の特徴
【０２１６】
実施例１に示される製造方法において、異なる個体に由来するｒＦｉｂ細胞に対してトランスクリプトームのシーケンシングを行い、ＷＧＣＮＡにより各細胞サンプルの１２０３６個の遺伝子を分析し、１２個のクラスタリングモジュールを得た。
【０２１７】
図２２は、ＫＥＧＧ経路が多く含まれるモジュールを示す。
【０２１８】
棒グラフは、ＫＥＧＧ経路が多く含まれる１２個のモジュールを示す。各ＫＥＧＧ経路の代表的な遺伝子は遺伝子メンバーの順序に従って示される。箱ヒゲ図は、各モジュール中の遺伝子の平均発現レベルの分布を示す。
【図１】
2021522859.tif 000006
【図２】
2021522859.tif 000007
【図３】
2021522859.tif 000008
【図４】
2021522859.tif 000009
【図５】
2021522859.tif 000010
【図６】
2021522859.tif 000011
【図７】
2021522859.tif 000012
【図８】
2021522859.tif 000013
【図９】
2021522859.tif 000014
【図１０】
2021522859.tif 000015
【図１１】
2021522859.tif 000016
【図１２】
2021522859.tif 000017
【図１３】
2021522859.tif 000018
【図１４】
2021522859.tif 000019
【図１５】
2021522859.tif 000020
【図１６】
2021522859.tif 000021
【図１７】
2021522859.tif 000022
【図１８】
2021522859.tif 000023
【図１９】
2021522859.tif 000024
【図２０】
2021522859.tif 000025
【図２１】
2021522859.tif 000026
【図２２】
2021522859.tif 000027
【国際調査報告】
2021522859.tif 000028
2021522859.tif 000029
2021522859.tif 000030
2021522859.tif 000031
2021522859.tif 000032
2021522859.tif 000033
2021522859.tif 000034
2021522859.tif 000035