(57)【要約】【目的】新型構造の抗ＶＥＧＦ−抗ＰＤ１二重特異性抗体を提供する。【解決手段】新型構造の抗ＶＥＧＦ−抗ＰＤ１二重特異性抗体は、分子免疫学の技術分野に属する。前記抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で表されるアミノ酸配列であり、ＣＤＲ−Ｈ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列であり、ＣＤＲ−Ｈ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で表されるアミノ酸配列であり、前記抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で表されるアミノ酸配列である。二重特異性抗体Ｐｓ３Ｖｍは、ＰＤ−１およびＶＥＧＦタンパク質と有効に結合することができ、且つＰＤＬ−１と有効に競合してＰＤ−１タンパク質と結合し、ＶＥＧＦ−Ａと有効に競合してＶＥＧＦタンパク質と結合することができると同時に、Ｔ細胞機能を有効に刺激して、サイトカインＩＬ−２およびＩＦＮ−γを分泌させることができるが、アイソタイプコントロール抗体は、Ｔ細胞の増殖とＩＬ−２、ＩＦＮ−γの分泌を促進することができない。また、二重特異性抗体Ｐｓ３Ｖｍは、さらに、マウスの腫瘍成長を明らかに抑制することもできる。【選択図】図９
2021535193.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
新型構造の抗ＶＥＧＦ−抗ＰＤ１二重特異性抗体であって、前記抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で表されるアミノ酸配列であり、ＣＤＲ−Ｈ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列であり、ＣＤＲ−Ｈ３が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で表されるアミノ酸配列であり、前記抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で表されるアミノ酸配列である新型構造の抗ＶＥＧＦ−抗ＰＤ１二重特異性抗体。
【請求項２】
前記抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で表されるヌクレオチド配列であり、ＣＤＲ−Ｈ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で表されるヌクレオチド配列であり、ＣＤＲ−Ｈ３が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で表されるヌクレオチド配列であり、前記抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で表されるヌクレオチド配列である請求項１に記載の新型構造の抗ＶＥＧＦ−抗ＰＤ１二重特異性抗体。
【請求項３】
前記抗体の重鎖定常領域の配列が、ヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域配列であり、軽鎖定常領域の配列が、ヒトｋ抗体の軽鎖定常領域配列である請求項１に記載の新型構造の抗ＶＥＧＦ−抗ＰＤ１二重特異性抗体。
【請求項４】
前記抗体の重鎖アミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で表される請求項１に記載の新型構造の抗ＶＥＧＦ−抗ＰＤ１二重特異性抗体。
【請求項５】
前記抗体の軽鎖アミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で表される請求項１に記載の新型構造の抗ＶＥＧＦ−抗ＰＤ１二重特異性抗体。
【請求項６】
前記抗体の重鎖ヌクレオチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１で表される請求項２に記載の新型構造の抗ＶＥＧＦ−抗ＰＤ１二重特異性抗体。
【請求項７】
前記抗体の軽鎖ヌクレオチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２で表される請求項２に記載の新型構造の抗ＶＥＧＦ−抗ＰＤ１二重特異性抗体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体および薬剤的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の前記抗体のＶＥＧＦとＰＤ１の活性を抑制または中和する医薬の作製における用途。
【請求項１０】
前記ＶＥＧＦとＰＤ１の活性を抑制または中和する医薬が、癌の治療に使用される請求項９に記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子免疫学の技術分野に属する新型構造の抗ＶＥＧＦ−抗ＰＤ１二重特異性抗体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、いわゆる血管透過性因子（vascular permeability factor, VPF）は、高度に特異的な血管内皮細胞増殖因子であり、血管透過性増加、細胞外基質変性、血管内皮細胞単層の遊走、増殖、および血管形成等を促進する作用を有する。血管内皮増殖因子は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、および胎盤増殖因子（placental growth factor, PGF）を含む１つのファミリーである。ＶＥＧＦは、通常、ＶＥＧＦ−Ａである。ＶＥＧＦ−Ａは、新生血管の形成を促進して、血管透過性を増加させることができ、ＶＥＧＦ−Ｂは、非新生血管で形成される腫瘍内で作用し、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄは、癌組織の新生血管および新生リンパ管の形成で作用し、ＶＥＧＦ−Ｅも、潜在的な新生血管形成因子であり、ＰＧＦは、新生血管の形成を促進して血管透過性を増加させ、実験的脈絡膜新生血管中のＰＧＦの発現を大幅に増加させる。血管内皮増殖因子と特異的に結合する高親和性受容体を血管内皮増殖因子受容体（vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR）と称し、主に、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３の３種類に分けることができる。ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２は、主に、腫瘍血管内皮表面に分布して、腫瘍血管の生成を調整し、ＶＥＧＦＲ−３は、主に、リンパ内皮表面に分布して、腫瘍リンパ管の生成を調整する。ＶＥＧＦは、高度に保存されたホモ二量体糖タンパク質である。分子量がそれぞれ２４ｋＤａの２本の単鎖は、ジスルフィド結合により二量体を形成する。ＶＥＧＦ分解されたモノマーは、不活性であり、Ｎ２グリコシル基の除去は、生物効果に対して影響はないが、細胞分泌において作用する可能性がある。ｍＲＮＡの異なるスプライシング方法により、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８５、ＶＥＧＦ２０６等の少なくとも５種類のタンパク質形式が生成されるが、そのうちＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５は、分泌型可溶性タンパク質であり、血管内皮細胞に直接作用して血管内皮細胞の増殖を促進し、血管透過性を増加させることができる。１９９０年に、米国ハーバード大学のフォークマン（Folkman）博士は、著名なフォークマン理論、すなわち、腫瘍組織の成長は、新生血管生成に依存して十分な酸素と栄養物を提供することにより維持する必要があるという理論を提出し、ＶＥＧＦ臨床応用の基礎とみなされている。ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲの結合を防ぐモノクローナル抗体は、血管内皮成長因子を抑制することができるため、各種転移性癌の治療に用いる。
【０００３】
プログラム死受容体（programmed death 1, PD-1）は、免疫グロブリンスーパーファミリーとして重要な免疫抑制分子であり、２６８アミノ酸残基の膜タンパク質である。最初は、アポトーシスのマウスＴ細胞ハイブリドーマ２Ｂ４．１１からクローニングされた。ＰＤ−１をターゲットとする免疫調節は、抗腫瘍、抗感染、抗自己免疫疾患、および臓器移植生存等に対していずれも重要な意義を持つ。そのリガンドＰＤ−Ｌ１をターゲットとしてもよく、対応する抗体は、同じ作用をもたらすこともできる。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１を結合することによってＴ細胞のプログラム死が始まるため、腫瘍細胞が免疫逃避を獲得する。ＰＤ−１は、少なくとも２つのリガンドを有し、１つはＰＤ−Ｌ１であり、１つはＰＤ−Ｌ２である；ＰＤ−Ｌ１は、少なくとも２つのリガンドを有し、１つはＰＤ−１であり、１つはＣＤ８０である；ＰＤ−Ｌ２は、少なくとも２つのリガンドを有し、１つはＰＤ−１であり、１つはＲＧＭＢである。ＰＤ−Ｌ１／Ｌ２は、抗原提示細胞においてどちらも発現し、ＰＤ−Ｌ１は、様々な組織においても発現する。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１を結合することによってＴ細胞活性化の共抑制信号を媒介するため、Ｔ細胞活性化および増殖を調整し、ＣＴＬＡ−４に類似する負の調整作用をもたらす。中国系アメリカ人科学者陳列平実験室は、まず、ＰＤ−Ｌ１が腫瘍組織において高発現し、ＣＤ８Ｔ細胞の腫瘍浸潤性を調整する機能を発見した。そのため、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１をターゲットとする免疫調節は、抗腫瘍に対して重要な意義を持つ。近年、様々な抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体が腫瘍免疫治療の臨床研究において迅速に発展している。現在、ペンブロリズマブ（Pembrolizumab）およびニボルマブ（Nivolumab）が既にＦＤＡによって末期黒色腫への使用に認可されている。ニボルマブは、最近、米国のＦＤＡによって末期扁平上皮非小細胞肺癌の治療にも使用できることが認可された。また、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体）、アベルマブ（Avelumab）（抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体）等も既に多くの末期臨床研究に入り、非小細胞癌、黒色腫、膀胱癌等の多くの腫瘍種を含んでいる。ＰＤ−１抗体の広い抗腫瘍の展望と驚くべき薬効により、業界は、一般的に、ＰＤ−１経路に対する抗体が様々な腫瘍の治療のブレークスルーになり、非小細胞性肺癌、腎細胞癌、卵巣癌、黒色腫、白血病および貧血病等に使用することができると考えている。２０１２年および２０１３年の米国癌学会（ＡＡＣＲ）総会および米国臨床腫瘍学会（ＡＳＣＯ）総会においてＰＤ−１抗体医薬の臨床薬効データが発表された後、ＰＤ−１抗体は、世界の製薬業界において最も勢いのある研究中抗体医薬となっている。
【０００４】
二重機能性抗体は、二重特異性抗体であり、抗原に結合した２つのアームが異なる特異性を有する非天然抗体である。二重機能性抗体の構築は、通常、生物学方法および化学クロスリンキング法を採用する。抗体工学および分子生物学技術の発展に伴い、ここ数年で、新しいタイプの二重機能性抗体の構築方法、遺伝子工学法が発展した。遺伝子工学法を採用することにより、様々な機能、様々な用途の二重機能性抗体を構築できるだけでなく、ヒト化二重機能性抗体の構築も実現することができる。新しい二次ターゲティングシステムとして、二重機能性抗体は、臨床治療において潜在的な応用価値を有する。２０１４年１２月３日、米国ＦＤＡは、アムジェン（Amgen）社が研究開発した二重特異性抗体ブリンサイト（Blincyto）（ブリナツモマブ（Blinatumomab））の発売を認可し、急性リンパ細胞白血病の治療に使用できるようになった。ブリナツモマブは、ＣＤ１９、ＣＤ３二重特異性抗体であり、ブリンサイト（ブリナツモマブ）は、米国ＦＤＡが認可した最初の二重特異性抗体である。現在、開発された二重機能性抗体の形式は、既に４０種類以上あることが証明されているが、生産効率が低く、薬物動態学的性能が低い等の問題により、二重特異性抗体の研究は、未だに極めて困難である。
【０００５】
中国発明専利出願番号２０１５１０６９２４８４５．５、専利名称“抗ＶＥＧＦ−抗ＰＤ−１二重機能性抗体およびその応用”は、二重機能性抗体がＰＤ１抗体を骨格とし、抗ＶＥＧＦが単鎖結合して形成された抗ＶＥＧＦ−抗ＰＤ−１の二重機能性抗体を提供している。本発明は、この二重機能性抗体を基礎として、構造および配列の最適化を行う。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、安定し、且つ全く新しい抗ＶＥＧＦ−抗ＰＤ１二重特異性抗体Ｐｓ３Ｖｍを提供することであり、この抗体は、高親和性および高特異性を有し、ＶＥＧＦとＰＤ１の２種類のターゲットを特異的に識別することができるため、抗体の効果が単一で、複雑な病床に適応させることができない等の既存の欠陥を解決することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の技術方案により実現される。
【０００８】
新型構造の抗ＶＥＧＦ−抗ＰＤ１二重特異性抗体Ｐｓ３Ｖｍであって、前記抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で表されるアミノ酸配列であり、ＣＤＲ−Ｈ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列であり、ＣＤＲ−Ｈ３が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で表されるアミノ酸配列であり、前記抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で表されるアミノ酸配列である新型構造の抗ＶＥＧＦ−抗ＰＤ１二重特異性抗体Ｐｓ３Ｖｍ。
【０００９】
好ましくは、前記抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で表されるヌクレオチド配列であり、ＣＤＲ−Ｈ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で表されるヌクレオチド配列であり、ＣＤＲ−Ｈ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で表されるヌクレオチド配列であり、前記抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で表されるヌクレオチド配列である。
【００１０】
好ましくは、前記抗体の重鎖定常領域の配列は、ヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域配列であり、軽鎖定常領域の配列は、ヒトｋ抗体の軽鎖定常領域配列である。
【００１１】
好ましくは、前記抗体の重鎖アミノ酸配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で表される。
【００１２】
好ましくは、前記抗体の軽鎖アミノ酸配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で表される。
【００１３】
好ましくは、前記抗体の重鎖ヌクレオチド配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１で表される。
【００１４】
好ましくは、前記抗体の軽鎖ヌクレオチド配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２で表される。
【００１５】
前記抗体および薬剤的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物。
【００１６】
前記抗体のＶＥＧＦとＰＤ１の活性を抑制または中和する医薬の作製における用途。
【００１７】
好ましくは、前記ＶＥＧＦとＰＤ１の活性を抑制または中和する医薬は、癌の治療に使用される。
【発明の効果】
【００１８】
二重特異性抗体Ｐｓ３Ｖｍは、ＰＤ−１およびＶＥＧＦタンパク質と有効に結合することができ、且つＰＤＬ−１と有効に競合してＰＤ−１タンパク質と結合し、ＶＥＧＦ−Ａと有効に競合してＶＥＧＦタンパク質と結合することができると同時に、Ｔ細胞機能を有効に刺激して、サイトカインＩＬ−２およびＩＦＮ−γを分泌させることができるが、アイソタイプコントロール抗体は、Ｔ細胞の増殖とＩＬ−２、ＩＦＮ−γの分泌を促進することができない。また、二重特異性抗体Ｐｓ３Ｖｍは、さらに、マウスの腫瘍成長を明らかに抑制することもできるため、最も優れた試験効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＰＤ−１およびＶＥＧＦ抗原のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動結果図である（そのうち、ＡはＶＥＧＦ抗原であり、ＢはＰＤ−１抗原である）。
【００２０】
【図２】抗ＰＤ−１ヒト化抗体ＰＤＡＢの電気泳動検出結果図である。
【００２１】
【図３】抗ＶＥＧＦヒト化抗体アバスチン（Avastin）の電気泳動検出結果図である。
【００２２】
【図４】二重特異性抗体Ａ３Ｐ４の電気泳動検出結果図である。
【００２３】
【図５】二重特異性抗体Ａ３Ｐ４のＳＥＣ検出結果図である。
【００２４】
【図６】二重特異性抗体Ｖｓ３Ｐ４のタンパク質構造概略図である。
【００２５】
【図７】二重特異性抗体Ｖｓ３Ｐ４の電気泳動検出結果図である。
【００２６】
【図８】二重特異性抗体Ｖｓ３Ｐ４のＳＥＣ検出結果図である。
【００２７】
【図９】二重特異性抗体Ｐｓ３Ｖｍのタンパク質構造概略図である。
【００２８】
【図１０】二重特異性抗体Ｐｓ３Ｖｍの電気泳動検出結果図である。
【００２９】
【図１１】二重特異性抗体Ｐｓ３ＶｍのＳＥＣ検出結果図である。
【００３０】
【図１２】ＥＬＩＳＡで  ＰＤＡＢ、Ａ３Ｐ４、Ｖｓ３Ｐ４、Ｐｓ３ＶｍとＰＤ１−Ｈｉｓを比較した時の相対結合活性図である。
【００３１】
【図１３】ＥＬＩＳＡでアバスチン、Ａ３Ｐ４、Ｖｓ３Ｐ４とｒＨｕＶＥＧＦを比較した時の相対結合活性図である。
【００３２】
【図１４】競合ＥＬＩＳＡでＰＤＡＢ、Ａ３Ｐ４、Ｖｓ３Ｐ４、Ｐｓ３Ｖｍ、アバスチンとＰＤ１の結合エピトープの特異性を識別したものである。
【００３３】
【図１５】競合ＥＬＩＳＡでＰＤＡＢ、Ａ３Ｐ４、Ｖｓ３Ｐ４、Ｐｓ３Ｖｍ、アバスチンとＶＥＧＦの結合エピトープの特異性を識別したものである。
【００３４】
【図１６】ニボルマブ、ＰＤＡＢ、Ｖｓ３Ｐ４、Ｐｓ３Ｖｍ、およびＩｇＧ１により体外でＴ細胞を誘導して分泌されたＩＬ−２の量の抗体濃度に伴う変化図である。
【００３５】
【図１７】ニボルマブ、ＰＤＡＢ、Ｖｓ３Ｐ４、Ｐｓ３Ｖｍ、およびＩｇＧ１により体外でＴ細胞を誘導して分泌されたＩＦＮ−γの量の抗体濃度に伴う変化図である。
【００３６】
【図１８】予め構築されたマウスモデルの体重の変化図である。
【００３７】
【図１９】予め構築されたマウスモデルの腫瘍体積の変化図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明をよりよく理解するために、以下、実施形態と図面を組み合わせて、本発明をさらに詳しく説明するが、以下の実施形態は、単に本発明を説明するためのものであって、限定するためのものではない。以下の実施形態に用いられる材料、試剤、器具、および方法は、特に説明しない場合、いずれも本分野における通常材料、試剤、器具、および方法であって、いずれも商業の経路で得られるものである。
【００３９】
実施例１  ＰＤ１およびＶＥＧＦ抗原、抗体の作製
【００４０】
１、ＰＤ−１抗原の発現ベクターの構築
【００４１】
南京キングスレイ（Kingsray）社が合成したヒトのＰＤ−１のｃＤＮＡは、遺伝子ＩＤが５１３３であり、ｃＤＮＡＩＤがＮＭ＿００５０１８．２である。細胞外領域のＰＤ−１遺伝子を合成した後、精製用のＦｃタグを追加してＰＤ−１−ｍＦｃを取得し、両端にＸｂａ  ＩとＢａｍ  ＨＩの２つの制限酵素スプライス部位を導入して、ｐＴＴ５発現プラスミドに接続し、シークエンシングにより正確性を検証した。シークエンシング済みのプラスミドをトランス（Trans）１０（北京トランスジェンバイオテック（Beijing TransGen Biotech）社より購入）にトランスフェクトして、モノクローンを選び取り、１リットルのＬＢ液体培地を接種した。ＯＤ600が１の時に、遠心分離で菌体を収集し、プラスミドマキシプレップキット（キアゲン（Qiagen）社より購入）を用いてプラスミドを抽出した。
【００４２】
２、ＶＥＧＦ抗原の発現ベクターの構築
【００４３】
遺伝子ＶＥＧＦ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７４２２）に対応するアミノ酸とマウスＩｇＧのＦｃタンパク質断片ｍＦｃ（Ig gamma-2A chain C region）を融合して、ＶＥＧＦ−ｍＦｃを取得した。２９３Ｆ細胞発現システムにおけるターゲット遺伝子の発現効率を向上させるため、配列を最適化して、両端にＸｂａ  ＩとＢａｍ  ＨＩの２つの制限酵素スプライス部位を導入し、ｐＴＴ５発現プラスミドに接続して、シークエンシングにより正確性を検証した。シークエンシング済みのプラスミドをトランス１０（北京トランスジェンバイオテック社より購入）にトランスフェクトして、モノクローンを選び取り、１リットルのＬＢ液体培地を接種した。ＯＤ600が１の時に、遠心分離で菌体を収集し、プラスミドマキシプレップキット（キアゲン社より購入）を用いてプラスミドを抽出した。
【００４４】
３、ＰＤ−１およびＶＥＧＦ抗原の発現および精製
【００４５】
シークエンシングにより検証した正確な発現ベクターを２９３Ｆ細胞（インビトロジェン（Invitrogen）社から購入）にトランスフェクトして、３７度、５％のＣＯ2、１３０ｒｐｍ／分で７日間培養した後、遠心分離で上清を収集した。上清を４０００ｒｐｍで１０分遠心分離してから、０．４５μｍの濾過膜でフィルタリングし、濾液に４００ｍＭのＮａＣｌを追加して、ｐＨを８．０に調整した。サンプルを０．２μｍの濾過膜で再度フィルタリングした後、サンプルをＰＢＳ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、２ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４）で平衡化した５ｍＬのハイトラップ（HiTrap）プロテインＡカラムに負荷した。サンプルを負荷した後、ＰＢＳを用いて流速５ｍＬ／分で洗浄した。紫外線モニタは、標準レベルであった。バッファー（Buffer）Ｂ（１Ｍグリシン（Glycine）、ｐＨ３．５）を流速１ｍＬ／分で溶出し、ピークの流出液を収集してトリス（Tris）でｐＨ７．５まで中和し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動結果は、図１に示した通りである。限外濾過濃縮管でピークの溶出液を濃縮してＰＢＳ中に液体交換することにより、抗原を得た。
【００４６】
４、抗ＰＤ１ヒト化抗体の構築
【００４７】
（１）抗原免疫したマウスおよびハイブリドーマスクリーニング
【００４８】
本実験において、８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを３匹選択し、腹腔内注射法により、ＰＤ−１細胞外領域抗原とフロインドのコンプリートアジュバントの混合を用いてマウスを毎週１回、計３回免疫した。最後の免疫後、１週間マウスの血清力価を測定し、条件を満たして力価が８Ｋよりも大きくなった後、免疫を１回補強した。結果に示されているように、３匹のマウス全てが力価を満たしている（ネガティブコントロールの２倍よりも大きく、且つ０．２５よりも大きいＯＤ450値に対応する希釈価が抗体の力価であり、力価が８Ｋ以上であれば要件を満たす）。３日後、マウスを安楽死処分して、マウスの脾臓を取り出し、粉砕後、脾臓細胞集団を得た。マウスの血清力価のＥＬＩＳＡ検出結果は、表１に示した通りである。
【００４９】
【表１】
2021535193.tif 000003
【００５０】
フローサイトメトリー（fluorescence-activated cell sorting, FACS）を利用して抗ヒトＰＤ−１抗体のＢ細胞をスクリーニングし、ＲＰＭＩ１６４０培地に置いて、骨髄腫細胞（ＳＰ２／０）を加えて均一に混合し、５０％ＰＥＧ溶液を用いて細胞融合を行った。融合した後の細胞を適切に希釈して、複数の９６ウェル細胞培養プレートに分けて培養し、ＨＡＴ選択培地を加えて、融合されていないＢ細胞と骨髄腫細胞を死なせ、ハイブリドーマ細胞を得た。２週間培養した後、９６ウェルプレート細胞培養の上清を収集して、ＰＤ−１抗原を被覆した９６ウェルマイクロプレートと１時間結合させ、抗マウス／ＨＲＰ二次抗体を加えて１時間インキュベーションした。最後に、ＴＭＢ発色試薬を加えて１０分間反応させ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの光吸収値を測定し、ＰＤ−１と結合活性を有するハイブリドーマ細胞を選別した（一次スクリーニング：１２枚の９６ウェルプレート、ＯＤ値≧０．５のウェル数４２個を得た）。続いて、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を行ってスクリーニングし、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断活性を有するハイブリドーマ細胞を選別した。そして、限界希釈法によりサブクローニングして、限界希釈した細胞を９６ウェルプレートで培養し、クローンが全ウェルの１／６まで成長した時に、モノクローンおよびポリクローンを標識して、モノクローンに対してＥＬＩＳＡ検出を行った。検出した後、ＯＤ値が最も高いモノクローンを限界希釈して９６ウェルプレートに入れ、上述したように、再度サブクローニングを行った。このプロセスを陽性ウェル率が１００％になるまで数回繰り返して、株の構築が成功したら、最後に、抗ＰＤ−１マウスモノクローナル抗体細胞株を得た。限界希釈法によるサブクローニング結果は、表２に示した通りであり、親和性の識別結果は、表３に示した通りである。
【００５１】
【表２】
2021535193.tif 000004
【００５２】
【表３】
2021535193.tif 000005
【００５３】
（２）抗ＰＤ−１マウス抗体可変領域遺伝子の検索
【００５４】
抗ＰＤ−１ハイブリドーマクローンを選択して、トリゾール（Trizol）法により全ＲＮＡを抽出し、抗体サブタイプ（アイソタイプ（Isotype））特異的プライマーまたはユニバーサルプライマーを用いて逆転写ＰＣＲを行って、それぞれ抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）の遺伝子を増幅した。続いて、クローニングベクターに接続して、ＤＮＡ配列解析を行った。最後に、完全なＶＬおよびＶＨのＤＮＡ配列を取得して、対応するアミノ酸配列に翻訳した。抗ＰＤ−１マウス抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３−１４であり、そのうち、重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５−１７であり、軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３  アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８−２０である。
【００５５】
（３）抗ＰＤ−１マウスモノクローナル抗体の可変領域遺伝子のヒト化改造
【００５６】
（ａ）重鎖のヒト化
【００５７】
まず、ＩｇＢｌａｓｔ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast）を使用して、マウスＰＤ−１抗体のＶＨ遺伝子と相同性の高いヒト生殖系列遺伝子（germline gene）を分析した。その結果、重鎖ＩＧＨＶ３−２３がアミノ酸レベルで８３％の相同性を有することを示したため、重鎖可変領域候補遺伝子のテンプレートとして選択した。マウスＰＤ−１抗体のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３をカバット（Kabat）番号付け規則に基づいて番号付し、対応するＣＤＲ領域のアミノ酸配列をＩＧＨＶ３−２３のフレームワーク領域に導入した。フレームワーク領域のアミノ酸Ｎｏ．４９（Ｓ−＞Ｔ）およびＮｏ．７８（Ｔ−＞Ｎ）をマウスＰＤ−１抗体の最初の配列に変異させた。その後、重鎖ＣＤＲ  Ｈ１  Ｎｏ．３３（Ｇ−＞Ｄ）およびＨ２  Ｎｏ．５６（Ｓ−＞Ｒ）を追加で変異させることにより、重鎖可変領域のヒト化を完了した。抗ＰＤ−１ヒト化抗体の重鎖アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１であり、そのうち、重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２−２４である。
【００５８】
（ｂ）軽鎖のヒト化
【００５９】
まず、ＩｇＢｌａｓｔ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast）を使用して、マウスＰＤ−１抗体のＶＬ遺伝子と相同性の高いヒト生殖系列遺伝子を分析した。その結果、軽鎖ＩＧＫＶ１−１６がアミノ酸レベルで８６％の相同性を有することを示したため、軽鎖可変領域候補遺伝子のテンプレートとして選択した。マウスＰＤ−１抗体のＣＤＬ−Ｈ１、ＣＤＬ−Ｈ２、およびＣＤＬ−Ｈ３をカバット番号付け規則に基づいて番号付し、対応するＣＤＲ領域のアミノ酸配列をＩＧＫＶ１−１６のフレームワーク領域に導入した。フレームワーク領域のアミノ酸Ｎｏ．８３（Ｆ−＞Ｍ）をマウスＰＤ−１抗体の最初の配列に変異させた。その後、軽鎖ＣＤＲ  Ｌ１  Ｎｏ．３１（Ｓ−＞Ｔ）およびＮｏ．３４（Ｓ−＞Ａ）、Ｌ２  Ｎｏ．５６（Ｄ−＞Ｌ）を追加で変異させることにより、軽鎖可変領域のヒト化を完了した。抗ＰＤ−１ヒト化抗体の軽鎖アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５であり、そのうち、軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＬ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６−２８である。
【００６０】
（４）抗ＰＤ−１ヒト化抗体の親和性成熟
【００６１】
抗ＰＤ−１ヒト化抗体の５つのＣＤＲ領域（Ｌ１、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３）に対して、それぞれ変異体ライブラリーを設計し、変異点は、全てのＣＤＲ領域の非保存部位を含んだ。ＳＯＥ−ＰＣＲ反応により単鎖抗体（ｓｃＦｖ）遺伝子を取得し、ＤＮＡゲル回収および酵素消化を行った後、酵素消化したｐＣＡＮＴＡＢ−５Ｅファージディスプレイベクターと接続させて、ＴＧ１コンピテント細菌を電気形質転換し、５つのＣＤＲ変異を含む単鎖抗体ライブラリーを得た。Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを感染させることにより、組換えファージを作製して、水簸を計３回行い、結合能力の強い抗体変異体を保留して濃縮した。水簸を行う度に、それぞれ組換えファージとビオチン標識組換えヒトＰＤ−１抗原を２時間結合させてから、ストレプトアビジン磁気ビーズを追加して３０分結合させた。続けて、２％のＴＰＢＳ、１％のＴＰＢＳ、およびＰＢＳを用いて毎回５分、５回洗浄して、水簸を行った後すぐにＴＧ１細胞を感染させ、次の組換えファージの作製に使用した。３回水簸を行った後に濃縮したＴＧ１モノクローンを選び取り、組換えファージの上清を作製して、１μｇ／ｍＬのＰＤ−１抗原を被覆した９６ウェルマイクロプレートと１時間結合させ、Ｍ１３／ＨＲＰ二次抗体を加えて１時間インキュベーションした。最後に、ＯＰＤを加えて１０分間発色反応を行い、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの光吸収値を測定した。データを分析した後、抗体含有変異体の相対的親和性を計算し、それぞれＬ３、Ｈ１、Ｈ３変異体ライブラリーから、親和性が大幅に向上した３個、６個、５個のクローンをフィルタリングした。最後に、Ｈ３変異体ライブラリーから親和性の最も高い１つのクローンＰＤＡＢを選択して、次の研究を進めた。電気泳動結果は、図２に示した通りである。
【００６２】
５、抗ＶＥＧＦヒト化抗体の構築
【００６３】
本実験で使用した抗ＶＥＧＦヒト化抗体は、ロシュ（Roche）（ジェネンテック（Genentech）） 社が２００４年に発売したベバシズマブ（Bevacizumab）（アバスチン（Avastin））であり、専利ウェブサイト等に公開されているタンパク質配列ウェブサイトから抗体配列（ＣＮ１０１２１００５１Ａ）を得た。ＶＥＧＦ抗体の軽鎖および重鎖ｃＤＮＡを人為的に合成し、合成したｃＤＮＡをそれぞれｐＴＴ５プラスミドにクローニングして、シークエンシングによりプラスミド構築の正確性を確定した。シークエンシング済みのプラスミドをトランス１０（北京トランスジェンバイオテック社より購入）にトランスフェクトして、モノクローンを選び取り、１リットルのＬＢ液体培地を接種した。ＯＤ600が１の時に、遠心分離で菌体を収集し、プラスミドマキシプレップキット（キアゲン社より購入）を用いてプラスミドを抽出した。シークエンシングにより識別した正確なＶＥＧＦ重鎖発現ベクターおよび軽鎖発現ベクター（１：１）を２９３Ｆ細胞に共トランスフェクトして、３７度、５％のＣＯ2、１３０ｒｐｍ／分で７日間培養した後、遠心分離で上清を収集した。上清を４０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、０．４５μｍの濾過膜でフィルタリングして、濾液に４００ｍＭのＮａＣｌを加え、ｐＨを８．０に調整した。サンプルを０．２μｍの濾過膜で再度フィルタリングした後、サンプルをＰＢＳ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、２ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４）で平衡化した５ｍＬのハイトラップ・マブセレクト（HiTrap MabSelect）カラム（ＧＥ社より購入）に負荷した。サンプルを負荷した後、ＰＢＳを用いて流速５ｍＬ／分で洗浄した。紫外線モニタは、標準レベルであった。バッファーＢ（１Ｍグリシン、ｐＨ３．５）を流速１ｍＬ／分で溶出して、流出ピークを収集してトリスでｐＨ７．５まで中和し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ非還元電気泳動結果は、図３に示した通りである。限外濾過濃縮管で溶出ピークを濃縮して、ＰＢＳの中に液体交換することにより、抗体ＶＥＧＦタンパク質を得た。
【００６４】
実施例２  候補二重特異性抗体の作製
【００６５】
１、ｓｃＦｖ−ＶＥＧＦ−リンカー−ＰＤ１−Ｈ鎖構造の二重特異性抗体（Ａ３Ｐ４）の作製
【００６６】
抗ＶＥＧＦヒト化抗体が既にあることを基礎として、重鎖および軽鎖可変領域遺伝子を抽出し、ペプチドで接続して一本鎖抗体ｓｃＦｖ−ＶＥＧＦを形成した。ｓｃＦｖ−ＶＥＧＦを抗ＰＤ１抗体重鎖のＮ端にクローニングし、ｓｃＦｖ−ＶＥＧＦ−リンカー−ＰＤ１−Ｈ鎖構造の二重特異性抗体を構築した。この重鎖発現ベクターと抗ＰＤ１抗体の軽鎖発現ベクターを２９３Ｆ細胞に共トランスフェクトして、上清を収集し、浄化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量と純度を識別し（図４）、ＳＥＣでこの配列の抗体二量体が比較的多いことを検出した（図５）。
【００６７】
２、ｄｓＦｖ−ＶＥＧＦ−リンカー−ＰＤ１−Ｈ鎖構造の二重特異性抗体（Ｖｓ３Ｐ４）の作製
【００６８】
最初の実験を基礎として、新たな構造を再設計する。抗ＶＥＧＦヒト化抗体の重鎖および軽鎖可変領域遺伝子を抽出し、ＶＨ４４ｃｙｓおよびＶＬ１００ｃｙｓ変異を行い（鎖間ジスルフィド結合を増やして凝集を改善した）、ペプチド鎖で接続して一本鎖抗体ｄｓＦｖ−ＶＥＧＦを形成した。ｄｓＦｖ−ＶＥＧＦを抗ＰＤ１抗体重鎖のＮ端にクローニングし、ｄｓＦｖ−ＶＥＧＦ−リンカー−ＰＤ１−Ｈ鎖構造の二重特異性抗体を構築した（図６）。この重鎖発現ベクターと抗ＰＤ１抗体の軽鎖発現ベクターを２９３Ｆ細胞に共トランスフェクトして、上清を収集し、浄化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量と純度を識別し（図７）、ＳＥＣ検出を行った（図８）。
【００６９】
３、ｄｓＦｖ−ＰＤ１−リンカー−ＶＥＧＦ−Ｈ鎖構造の二重特異性抗体（Ｐｓ３Ｖｍ）の作製
【００７０】
３回目の構造最適化設計は、抗ＰＤ１ヒト化抗体が既にあることを基礎として、重鎖および軽鎖可変領域遺伝子を抽出し、ＶＨ４４ｃｙｓおよびＶＬ１００ｃｙｓ変異を行い（鎖間ジスルフィド結合を増やして凝集を改善した）、ペプチド鎖で接続して一本鎖抗体ｄｓＦｖ−ＰＤ１を形成した。ｄｓＦｖ−ＰＤ１を抗ＶＥＧＦ抗体重鎖のＮ端にクローニングし、ｄｓＦｖ−ＰＤ１−リンカー−ＶＥＧＦ−Ｈ鎖構造の二重特異性抗体を構築した（図９）。この重鎖発現ベクターと抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖発現ベクターを２９３Ｆ細胞に共トランスフェクトして、上清を収集し、浄化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量と純度を識別し（図１０）、ＳＥＣ検出を行った（図１１）。Ｐｓ３Ｖｍ抗体の重鎖アミノ酸およびヌクレオチド配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１であり、重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５−７であり、Ｐｓ３Ｖｍ抗体の軽鎖アミノ酸およびヌクレオチド配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２であり、軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８である。
【００７１】
実施例３  二重特異性抗体の親和性の測定
【００７２】
１、二重特異性抗体とＰＤ−１の親和性
【００７３】
ＰＤ−１−ｍＦｃでマイクロプレートをコーティングして、１%のＢＳＡでブロッキングし、異なる濃度の抗体ＰＤＡＢ、Ａ３Ｐ４、Ｖｓ３Ｐ４、Ｐｓ３Ｖｍをマイクロプレートに追加して、３７℃でインキュベーションした後、酵素標識二次抗体を追加して、３７℃で３０分インキュベーションした。マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの光吸収値を測定した。抗体ＰＤＡＢ、Ａ３Ｐ４、Ｖｓ３Ｐ４、Ｐｓ３Ｖｍと抗原ＰＤ−１の結合結果が明示しているように、抗体ＰＤＡＢ、Ａ３Ｐ４、Ｖｓ３Ｐ４、Ｐｓ３Ｖｍは、いずれもＰＤ−１タンパク質と有効に結合し、その結合効率は、用量反応関係を表した。結果は、図１２および表４に示した通りである。
【００７４】
【表４】
2021535193.tif 000006
【００７５】
２、二重特異性抗体とＶＥＧＦの親和性
【００７６】
ＶＥＧＦ−ｍＦｃでマイクロプレートをコーティングして、１%のＢＳＡでブロッキングし、異なる濃度の抗体アバスチン、Ａ３Ｐ４、Ｖｓ３Ｐ４、Ｐｓ３Ｖｍをマイクロプレートに追加して、３７℃でインキュベーションした後、酵素標識二次抗体を追加して、３７℃で３０分インキュベーションした。マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの光吸収値を測定した。抗体アバスチン、Ａ３Ｐ４、Ｖｓ３Ｐ４、Ｐｓ３ＶｍとＶＥＧＦの結合結果が明示しているように、抗体アバスチン、Ａ３Ｐ４、Ｖｓ３Ｐ４、Ｐｓ３Ｖｍは、いずれもＶＥＧＦタンパク質と有効に結合し、その結合効率は、用量反応関係を表した。結果は、図１３および表５に示した通りである。
【００７７】
【表５】
2021535193.tif 000007
【００７８】
実施例４  二重特異性抗体の特異性の測定
【００７９】
１、二重特異性抗体のＰＤ−１に対する特異性
【００８０】
ＰＤ−１−ｍＦｃでマイクロプレートをコーティングして、１%のＢＳＡでブロッキングし、異なる濃度の抗体ＰＤＡＢ、Ａ３Ｐ４、Ｖｓ３Ｐ４、Ｐｓ３Ｖｍ、アバスチンとＰＤＬ−１−ｈＦｃを混合して、３７℃でインキュベーションした後、酵素標識二次抗体を追加して、３７℃で３０分インキュベーションした。マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの光吸収値を測定した。抗体ＰＤＡＢ、Ａ３Ｐ４、Ｖｓ３Ｐ４、Ｐｓ３Ｖｍ、アバスチンと抗原ＰＤ−１の結合結果が明示しているように、抗体ＰＤＡＢ、Ａ３Ｐ４、Ｖｓ３Ｐ４、Ｐｓ３Ｖｍ、アバスチンは、いずれもＰＤ−１と有効に競合してＰＤ−１タンパク質と結合し、その結合効率は、用量反応関係を表した。結果は、図１４に示した通りである。
【００８１】
２、二重特異性抗体のＶＥＧＦに対する特異性
【００８２】
ＶＥＧＦ−ｍＦｃでマイクロプレートをコーティングして、１%のＢＳＡでブロッキングし、異なる濃度の抗体アバスチン、Ａ３Ｐ４、Ｖｓ３Ｐ４、Ｐｓ３Ｖｍ、ＰＤＡＢとＶＥＧＦ−Ａ−ｈＦｃを混合して、３７℃でインキュベーションした後、酵素標識二次抗体を追加して、３７℃で３０分インキュベーションした。マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの光吸収値を測定した。抗体アバスチン、Ａ３Ｐ４、Ｖｓ３Ｐ４、Ｐｓ３Ｖｍ、ＰＤＡＢとＶＥＧＦの結合結果が明示しているように、抗体アバスチン、Ａ３Ｐ４、Ｖｓ３Ｐ４、Ｐｓ３Ｖｍ、ＰＤＡＢは、いずれもＶＥＧＦ−Ａタンパク質と有効に競合してＶＥＧＦタンパク質と結合し、その結合効率は、用量反応関係を表した。結果は、図１５に示した通りである。
【００８３】
実施例５  候補二重特異性抗体がＴ細胞を体外誘導してＩＬ−２を分泌する
【００８４】
フィコール（Ficoll）遠心分離法（ＧＥ社より購入）およびＣＤ４＋Ｔ細胞濃縮カラム（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D Systems）社より購入）により、新鮮なＰＢＭＣを作製し、ヒトＴ細胞を精製した。細胞を９６ウェル平底プレートに載せて、一晩培養した後、０．００９６、０．０４８、０．２４、１．２、６、および３０μｇ／ｍＬの６種類の異なる濃度の抗体ＮＩＶＯ、ＰＤＡＢ、Ｖｓ３Ｐ４、Ｐｓ３Ｖｍを加えて、同じ６種類の濃度のアイソタイプコントロール抗体ＩｇＧ１をネガティブコントロールとして追加し、３日間培養した後、上清液を収集して、ルミネックス（Luminex）装置（ライフテクノロジー（LifeTechnology）社より購入）およびサイトカインＩＬ−２検出キット（ＢＤバイオサイエンス（BD Biosciences）社より購入）で上清ＩＬ−２の分泌レベルを測定した。その結果、図１６に示した通り、二重特異性抗体Ｖｓ３Ｐ４およびＰｓ３Ｖｍは、いずれもＴ細胞の機能を有効に刺激してサイトカインＩＬ−２を分泌することができ、且つ抗体濃度と関連していたが、アイソタイプコントロール抗体は、Ｔ細胞の増大およびＩＬ−２の分泌を促進することができなかった。
【００８５】
実施例６  候補二重特異性抗体がＴ細胞を体外誘導してＩＦＮ−γを分泌する
【００８６】
フィコール遠心分離法（ＧＥ社より購入）およびＣＤ４＋Ｔ細胞濃縮カラム（Ｒ＆Ｄシステムズ社より購入）により、新鮮なＰＢＭＣを作製し、ヒトＴ細胞を精製した。ミルテニー（Miltenyi）ＣＤ１４単球精製キットを使用して単球を精製し、単球とＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（ペプロテク（PeproTech）社より購入）を７日間一緒に培養して、ＤＣ細胞を生成した。細胞を９６ウェル平底プレートに載せて、一晩培養した後、各培養物は、総体積２００μＬ中、１０ｅ５個の生成されたＴ細胞および１０ｅ４個の樹状細胞を含んでいた。０．００９６、０．０４８、０．２４、１．２、６、および３０μｇ／ｍＬの６種類の異なる濃度の抗体ＮＩＶＯ、ＰＤＡＢ、Ｖｓ３Ｐ４、Ｐｓ３Ｖｍを加えて、６種類の濃度のアイソタイプコントロール抗体ＩｇＧ１をネガティブコントロールとして追加した。細胞を３７℃で５日間培養した後、各培養物から１００μＬの培地を取り出して、サイトカインＩＦＮ−γの測定に使用した。ＯｐｔＥＩＡ  ＥＬＩＳＡキット（ＢＤバイオサイエンス社より購入）を用いてＩＦＮ−γのレベルを測定した。その結果、図１７に示した通り、二重特異性抗体Ｖｓ３Ｐ４およびＰｓ３Ｖｍは、いずれもＴ細胞の機能を有効に刺激してサイトカインＩＦＮ−γを分泌することができ、且つ濃度と関連していたが、アイソタイプコントロール抗体は、Ｔ細胞の増大およびＩＦＮ−γの分泌を促進することができなかった。
【００８７】
実施例７  候補二重特異性抗体がマウスの腫瘍成長を抑制する
【００８８】
１、マウスモデルを予め構築し、実験に適合するＰＢＭＣ細胞を選択する
【００８９】
本実験が採用するＰＢＭＣ細胞、ヒト結腸癌Ｃｏｌｏ−２０５細胞、Ｂ−ＮＤＧマウスは、いずれも市場で一般的に入手できる種類である。
【００９０】
中国科学院から購入したヒト結腸癌Ｃｏｌｏ−２０５細胞を６．０＊１０7以上になるまで培養し、バイオサイトジェン（Biocytogen）社から購入したＢ−ＮＤＧマウス（それぞれ２．０＊１０6個の細胞、計３０匹のマウス）を皮下接種した。マウスは正常に給餌され、腫瘍が１００ｍｍ3の大きさになった時に、購入先の異なるヒトＰＢＭＣ細胞をバイオサイトジェン社から購入したＢ−ＮＤＧ重度免疫不全マウスの体内にそれぞれ１＊１０7腹腔内注射し、腫瘍が順調に形成されるまで、腫瘍の成長状況を観察した（１０グループのＰＢＭＣ細胞を選択し、各グループを３匹のマウスに注射して、平行実験を行った）。
【００９１】
実験結果は、表６および図１８、１９に示した通りである（図表中は、いずれも平均数である）。
【００９２】
【表６】
2021535193.tif 000008
【００９３】
２、選択したＰＢＭＣ細胞を用いて動物モデルを構築する
【００９４】
マッチングに成功したＰＢＭＣ細胞（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ８、Ｇ１０）を選択して、バイオサイトジェン社から購入したＢ−ＮＤＧ−ｂ２ｍのＭＨＣをノックアウトした重度免疫不全マウスの体内に注射し（それぞれ１＊１０7個の細胞）、同時に、ヒト結腸癌Ｃｏｌｏ−２０５細胞を皮下接種して、腫瘍が順調に形成されるかどうかを観察した。これは、予備実験であり、８匹のマウスのみに接種および注射し（２組の平行実験を行い）、腫瘍性を観察した。順調に腫瘍を形成したＰＢＭＣ細胞を選択して、次の段階の実験を行った。
【００９５】
腫瘍体積の変化は、表７に示した通りである（表中は、いずれも平均数である）：Tumor Volume (mm3)
【００９６】
【表７】
2021535193.tif 000009
【００９７】
３、実験用動物モデルの構築
【００９８】
上述したＰＢＭＣ細胞（Ｇ１０）を選択して、バイオサイトジェン社から購入したＢ−ＮＤＧ−ｂ２ｍのＭＨＣをノックアウトした重度免疫不全マウスの体内に注射し（それぞれ１＊１０7個の細胞、計４グループ、各グループに６匹のマウス）、同時に、ヒト結腸癌Ｃｏｌｏ−２０５細胞を皮下接種して、腫瘍が順調に形成されるかどうかを観察した。腫瘍の成長状況に基づいて、マウスを４つのグループ、ネガティブコントロールグループ（生理食塩水を腹腔内注射）、Ｖｓ３Ｐ４グループ（Ｖｓ３Ｐ４抗体３ｍｇ／ｋｇを尾静脈注射）、Ｐｓ３Ｖｍグループ（Ｐｓ３Ｖｍ抗体３ｍｇ／ｋｇを尾静脈注射）、ポジティブコントロールグループベバシズマブ（３ｍｇ／ｋｇを尾静脈注射）に無作為に分けた。３日に１回、計２１日投薬を行った。腫瘍体積の変化は、表８に示した通りである：Tumor Volume (mm3)
【００９９】
【表８】
2021535193.tif 000010
【０１００】
本発明は、３種類の異なる構造の抗ＶＥＧＦ−抗ＰＤ１二重特異性抗体の試験を行い、分子、細胞、動物レベルから、それぞれ抗体効果を検証した。結果に示されているように、二重特異性抗体Ｐｓ３Ｖｍ（ＶＥＧＦを骨格とし、ｄｓＦｖ−ＰＤ１モノマーを挿入した）が最も優れた試験効果を有し、ＰＤ−１およびＶＥＧＦタンパク質と有効に結合することができ、且つＰＤＬ−１と有効に競合してＰＤ−１タンパク質と結合し、ＶＥＧＦ−Ａと競合してＶＥＧＦタンパク質と結合することができると同時に、Ｔ細胞機能を有効に刺激して、サイトカインＩＬ−２およびＩＦＮ−γを分泌させることができたが、アイソタイプコントロール抗体は、Ｔ細胞の増殖とＩＬ−２、ＩＦＮ−γの分泌を促進することができなかった。また、二重特異性抗体Ｐｓ３Ｖｍは、さらに、マウスの腫瘍成長を明らかに抑制することができた。
【０１０１】
以上のごとく、この発明を実施形態により開示したが、この発明を限定する意図はない。当業者であれば容易に理解できるように、この発明の精神および範囲から逸脱しなければ、適当な変更ならびに修正が当然なされうるものであるから、その特許権保護の範囲は、特許請求の範囲を基準として定めなければならない。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明が設計する二重特異性抗体Ｐｓ３Ｖｍは、ＰＤ−１およびＶＥＧＦタンパク質と有効に結合することができ、且つＰＤＬ−１と有効に競合してＰＤ−１タンパク質と結合し、ＶＥＧＦ−Ａと有効に競合してＶＥＧＦタンパク質と結合することができると同時に、Ｔ細胞機能を有効に刺激して、サイトカインＩＬ−２およびＩＦＮ−γを分泌させることができるが、アイソタイプコントロール抗体は、Ｔ細胞の増殖とＩＬ−２、ＩＦＮ−γの分泌を促進することができない。また、二重特異性抗体Ｐｓ３Ｖｍは、さらに、マウスの腫瘍成長を明らかに抑制することもできるため、最も優れた試験効果を有し、産業上の利用性を有する。
【図１】
2021535193.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2021535193.tif 000017
【図８】
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【図９】
2021535193.tif 000019
【図１０】
2021535193.tif 000020
【図１１】
2021535193.tif 000021
【図１２】
2021535193.tif 000022
【図１３】
2021535193.tif 000023
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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