(57)【要約】  本発明は、ＮＫ細胞上に発現したＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）を結合させることによってＮＫ細胞の細胞傷害性を誘発するために、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を結合させる多重特異性抗原結合タンパク質に関する。ここで、抗原結合タンパク質は、少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分と、少なくとも更なる標的抗原結合部分とを含む。ＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ポリペプチド鎖で順次結合された軽鎖及び重鎖可変領域を含み、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含むポリペプチド鎖のＮ末端の可変領域は、軽鎖可変領域である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重特異性抗原結合タンパク質であって、
（ａ）少なくとも第１の標的抗原結合部分と、
（ｂ）少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分と、を含み、ここで、前記少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分が、少なくとも１つの定常ドメインを含むＦａｂ断片、又はＦｃ部分に融合する、多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２】
前記２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分のうちの少なくとも１つが、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、及びダイアボディＤｂからなる群より選択される抗原結合分子である、請求項１に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３】
前記少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々が、ｓｃＦｖである、請求項１又は２に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４】
前記少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分が、ｓｃＤｂのフォーマットである、請求項１又は２に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項５】
前記少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々が、ポリペプチド鎖で順次結合された軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）とを含み、前記ポリペプチド鎖のＮ末端における前記可変領域が前記ＶＬである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項６】
前記ポリペプチド鎖中の前記少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の前記可変領域が、ＶＬ−ＶＨ、ＶＬ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ、又はＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨの順でＮ末端からＣ末端に位置する、請求項５に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項７】
前記ポリペプチド鎖中の前記少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の前記可変領域が、ＶＬ−ＶＨの順でＮ末端からＣ末端に位置する、請求項５又は６に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項８】
前記ポリペプチド鎖中の前記少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の前記可変領域が、ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨの順でＮ末端からＣ末端に位置する、請求項５又は６に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項９】
（ｉ）前記ポリペプチド鎖のＣ末端が、前記Ｆｃ部分のＣＨ２ドメインのＮ末端に融合する；又は、
（ｉｉ）前記ポリペプチド鎖のＣ末端が、前記Ｆｃ部分のヒンジのＮ末端に融合する；
（ｉｉｉ）前記ポリペプチド鎖のＮ末端が、前記Ｆｃ部分のＣＨ３ドメインのＣ末端に融合する；又は、
（ｉｖ）前記ポリペプチド鎖のＮ末端が、Ｆａｂ断片のＣ末端に融合する、請求項５〜８のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
前記ポリペプチド鎖のＮ末端が、前記Ｆｃ部分のＣＨ３ドメインのＣ末端に融合する、請求項５〜９のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
前記Ｆｃ部分が、単量体ＣＨ２−ＣＨ３断片、ヘテロ二量体Ｆｃ領域、及びホモ二量体Ｆｃ領域からなる群より選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
前記Ｆｃ部分がＦｃγ受容体に結合しないが、新生児型Ｆｃ受容体への結合を維持する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
２つのＣＤ１６抗原結合部分を含むｓｃＤｂ又はＤｂが、前記Ｆａｂ断片の一方の鎖のＣ末端に融合し、前記第１の標的抗原結合部分が、前記Ｆａｂ断片の他方の鎖のＣ末端に融合する、請求項１２に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
前記Ｆａｂ断片が、Ｎ末端にＨＳＡ抗原結合Ｆｖを含む、請求項１３に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１５】
前記抗原結合タンパク質が、四価である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１６】
少なくとも２つの標的抗原結合部分を含む、請求項１５に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１７】
第１の標的抗原結合部分、第２の標的抗原結合部分、及び二量体Ｆｃ部分に融合した少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む、請求項１６に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１８】
ＣＤ１６Ａ抗原結合部分がＩｇＧの各重鎖のＣ末端に融合し、前記ＩｇＧがＮ末端で前記２つのＦａｂの各々における第１の標的抗原結合Ｆｖ部分を含み、第２の標的抗原結合部分がＣＬドメインの各々にＣ末端で融合する、請求項１に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１９】
前記ＣＤ１６Ａ抗原結合部分が、
（ｉ）配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに／又は、
（ｉ）配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号５４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２０】
前記ＣＤ１６Ａ抗原結合部分が、
（ｉ）配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに／又は、
（ｉｉ）配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２１】
前記ＣＤ１６Ａ抗原結合部分が、（ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％相同若しくは同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％相同若しくは同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２２】
前記ＣＤ１６Ａ抗原結合部分が、（ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２３】
前記第１の標的抗原が、ＢＣＭＡ及びＥＧＦＲから選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２４】
前記第１の標的抗原が、ＢＣＭＡである、請求項２３に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２５】
前記タンパク質が、配列番号６１又は６３に示されるアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖と、配列番号６２又は６４に示されるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド鎖と、を含む四量体である、請求項２４に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２６】
前記タンパク質が、
（ｉ）配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド及び配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド；と、
（ｉｉ）配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド及び配列番号６４に示されるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド；と、
（ｉｉｉ）配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド及び配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド；と、
（ｉｖ）配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド及び配列番号６４に示されるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド；と、から選択される第１及び第２のポリペプチドを含む四量体である、請求項２５に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２７】
前記ＢＣＭＡ抗原結合部分が、
（ｉ）配列番号６７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに／又は、
（ｉｉ）配列番号７０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、を含む、請求項２４に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２８】
前記ＢＣＭＡ抗原結合部分が、
（ｉ）配列番号６５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％相同若しくは同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は
（ｉｉ）配列番号６６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％相同又は同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含む、請求項２４に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２９】
前記ＢＣＭＡ抗原結合部分が、
（ｉ）配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は
（ｉｉ）配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含む、請求項２４に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３０】
前記抗原結合タンパク質が、
（ｉ）以下を含む、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分：
（ａ）配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、
（ｂ）配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉ）以下を含む、ＢＣＭＡ抗原結合部分：
（ａ）配列番号６７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、
（ｉｉ）配列番号７０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項２４に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項３２】
医薬品として使用するための、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３３】
医薬品として使用するための、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
疾患を治療又は改善するための方法であって、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質又は請求項３１に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項３５】
前記疾患が、がんである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記疾患が、血液のがんである、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記疾患が、多発骨髄腫である、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
対象における疾患を治療及び／又は予防する方法であって、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質又は請求項３１に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項３９】
前記二重特異性抗原結合タンパク質を静脈内に投与することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記二重特異性抗原結合タンパク質を皮下に投与することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
第２の治療法を投与することを含む、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記第２の治療法が、抗ＰＤ−１抗体を含む治療法、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む治療法、ＣＤ３二重特異性抗体を含む治療法、抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む治療法、抗ＶＥＧＦ抗体を含む治療法、及び抗ＦｃＲＨ５抗体を含む治療法からなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記第２の治療法が、サイトカイン療法である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記サイトカイン療法が、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、及びＩＬ−６からなる群より選択されるサイトカインの投与を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記サイトカイン療法が、前記ＩＬ−２の投与を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記サイトカイン療法が、前記ＩＬ−１５の投与を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記対象が、がん患者である、請求項３４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記対象が、血液のがん患者である、請求項３４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記対象が、多発骨髄腫患者である、請求項３４〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記対象が、再発した／難治性の多発骨髄腫患者である、請求項３４〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記対象が、抗ＣＤ３８療法を受けたことがある、請求項３４〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記対象が、ダラツムマブを受けたことがある、請求項３４〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記対象が、ダラツムマブナイーブ、ダラツムマブ抵抗性、ダラツムマブ難治性（ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ）、又はダラツムマブ再発性（ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ  ｒｅｌａｐｓｅｄ）である、請求項３４〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記対象が、ダラツムマブ抵抗性、ダラツムマブ難治性、又はダラツムマブ再発性である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記対象が、ＣＤ１６Ａ多型を発現する、請求項３４〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＣＤ１６Ａ多型が、ＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ／Ｆ多型である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
二重特異性抗原結合タンパク質であって、
（ａ）少なくとも１つのＢＣＭＡ結合部分と、
（ｂ）少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分と、を含み、ここで、前記少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分が、少なくとも１つの定常ドメインを含むＦａｂ断片、又はＦｃ部分に融合する、二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項５８】
前記２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分のうちの少なくとも１つが、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、及びダイアボディＤｂからなる群より選択される抗原結合分子である、請求項５７に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項５９】
前記少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々が、ｓｃＦｖである、請求項５７又は５８に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項６０】
前記少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分が、ｓｃＤｂのフォーマットである、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項６１】
前記少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々が、ポリペプチド鎖で順次結合された軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）とを含み、前記ポリペプチド鎖のＮ末端における前記可変領域が前記ＶＬである、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項６２】
前記ポリペプチド鎖中の前記少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の前記可変領域が、ＶＬ−ＶＨ、ＶＬ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ、又はＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨの順でＮ末端からＣ末端に位置する、請求項６１に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項６３】
前記ポリペプチド鎖中の前記少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の前記可変領域が、ＶＬ−ＶＨの順でＮ末端からＣ末端に位置する、請求項６１又は６２に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項６４】
前記ポリペプチド鎖中の前記少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の前記可変領域が、ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨの順でＮ末端からＣ末端に位置する、請求項６１又は６２に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項６５】
（ｉ）前記ポリペプチド鎖のＣ末端が、前記Ｆｃ部分のＣＨ２ドメインのＮ末端に融合する；又は、
（ｉｉ）前記ポリペプチド鎖のＣ末端が、前記Ｆｃ部分のヒンジのＮ末端に融合する；
（ｉｉｉ）前記ポリペプチド鎖のＮ末端が、前記Ｆｃ部分のＣＨ３ドメインのＣ末端に融合する；又は、
（ｉｖ）前記ポリペプチド鎖のＮ末端が、Ｆａｂ断片のＣ末端に融合する、請求項６１〜６４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項６６】
前記ポリペプチド鎖のＮ末端が、前記Ｆｃ部分のＣＨ３ドメインのＣ末端に融合する、請求項６１〜６４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項６７】
前記Ｆｃ部分が、単量体ＣＨ２−ＣＨ３断片、ヘテロ二量体Ｆｃ領域、及びホモ二量体Ｆｃ領域からなる群より選択される、請求項５７〜６６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項６８】
前記Ｆｃ部分がＦｃγ受容体に結合しないが、新生児型Ｆｃ受容体への結合を保持する、請求項５７〜６７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項６９】
前記Ｆｃ部分が、少なくとも１つのエフェクタレス（ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ｌｅｓｓ）突然変異を含む、請求項５７〜６７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項７０】
前記少なくとも１つのエフェクタレス突然変異が、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ２３８Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、及びＰ３３１Ｓからなる群より選択される、請求項６９に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項７１】
前記少なくとも１つのエフェクタレス突然変異が、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ２３８Ｓ、及びＤ２６５Ａからなる群より選択される、請求項６９又は７０に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項７２】
前記少なくとも１つのエフェクタレス突然変異が、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、及びＤ２６５Ａからなる群より選択される、請求項６９〜７１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項７３】
前記Ｆｃ部分が、２つのエフェクタレス突然変異を有する、請求項６９〜７２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項７４】
前記２つのエフェクタレス突然変異が、Ｌ２３４Ｆ及びＬ２３５Ｅである、請求項７３に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項７５】
前記Ｆｃ部分が、３つのエフェクタレス突然変異を有する、請求項６９〜７２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項７６】
前記３つのエフェクタレス突然変異が、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、及びＤ２６５Ａである、請求項７５に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項７７】
前記少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分が、Ｆｃ部分に融合する、請求項５７〜７７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項７８】
２つのＢＣＭＡ標的化部分を含む、請求項５７〜７７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項７９】
２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分と、２つのＢＣＭＡ標的化部分と、を含む、請求項５７〜７８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項８０】
前記２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々がＩｇＧの各重鎖の前Ｃ末端に融合し、前記２つのＢＣＭＡ標的化部分の各々が前記ＩｇＧのＮ末端に融合する、請求項７９に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項８１】
図１３に示した構造を有する、請求項７７〜８０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項８２】
１つのＢＣＭＡ標的化部分を含む、請求項５７〜７７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項８３】
前記ＢＣＭＡ標的化部分が、前記少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分が融合している前記Ｆｃ部分のＮ末端に融合する、請求項８２に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項８４】
図５に示した構造を有する、請求項８２又は８３に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項８５】
前記ＣＤ１６Ａ抗原結合部分が、
（ｉ）配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号５１若しくは５６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに／又は、
（ｉｉ）配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号５４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、を含む、請求項５７〜８４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項８６】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ２が、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する、請求項８４に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項８７】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ２が、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有する、請求項８５に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項８８】
前記ＣＤ１６Ａ抗原結合部分が、
（ｉ）配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに／又は、
（ｉｉ）配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、を含む、請求項５７〜８５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項８９】
前記ＣＤ１６Ａ抗原結合部分が、（ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％相同若しくは同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％相同若しくは同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項５７〜８８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項９０】
前記ＣＤ１６Ａ抗原結合部分が、（ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項５７〜８９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項９１】
前記ＢＣＭＡ抗原結合部分が、
（ｉ）配列番号６７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに／又は、
（ｉｉ）配列番号７０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、を含む、請求項５７〜９０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項９２】
前記ＢＣＭＡ抗原結合部分が、（ｉ）配列番号６５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％相同若しくは同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｉｉ）配列番号６６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％相同若しくは同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項５７〜９１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項９３】
前記ＢＣＭＡ抗原結合部分が、（ｉ）配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｉｉ）配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項５７〜９２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項９４】
２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分と、２つのＢＣＭＡ標的化部分と、を含み、ここで、
（ａ）前記ＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々が、配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含み；
（ｂ）前記ＢＣＭＡ標的化部分の各々が、配列番号６７に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、配列番号７０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含む、請求項５７〜７４、請求項７７〜８１、及び請求項８５〜９３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項９５】
２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分と、２つのＢＣＭＡ標的化部分と、を含み、ここで、
（ａ）前記ＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々が、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み；
（ｂ）前記ＢＣＭＡ標的化部分の各々が、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項５７〜７４、請求項７７〜８１、及び請求項８５〜９４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項９６】
配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドと、配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドと、を含む四量体である、請求項５７〜７４、請求項７７〜８１、及び請求項８５〜９５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項９７】
配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドと、配列番号６４に示されるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドと、を含む四量体である、請求項５７〜９３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項９８】
（ｉ）前記ＣＤ１６Ａ抗原結合部分が、それぞれ：
（ａ）配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含み、
（ｉｉ）前記ＢＣＭＡ抗原結合部分が、それぞれ：
（ａ）配列番号６７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
（ｉｉ）配列番号７０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項８１に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項９９】
請求項５７〜９８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項１００】
医薬品として使用するための、請求項５７〜９８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１０１】
医薬品として使用するための、請求項９９に記載の医薬組成物。
【請求項１０２】
疾患を治療及び／又は予防する方法であって、請求項５７〜９８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質又は請求項９９に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項１０３】
前記疾患が、がんである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記疾患が、血液のがんである、請求項１０２又は１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記疾患が、多発骨髄腫である、請求項１０２〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記二重特異性抗原結合タンパク質を静脈内に投与することを含む、請求項１０２〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記二重特異性抗原結合タンパク質を皮下に投与することを含む、請求項１０２〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
第２の治療法を投与することを含む、請求項１０２〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記第２の治療法が、抗ＰＤ−１抗体を含む治療法、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む治療法、ＣＤ３二重特異性抗体を含む治療法、抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む治療法、抗ＶＥＧＦ抗体を含む治療法、及び抗ＦｃＲＨ５抗体を含む治療法からなる群より選択される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記第２の治療法が、サイトカイン療法である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
前記サイトカイン療法が、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、及びＩＬ−６からなる群より選択されるサイトカインの投与である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記サイトカインが、ＩＬ−１５である、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記サイトカインが、ＩＬ−２である、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１４】
前記対象が、がん患者である、請求項１０２〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記対象が、血液のがん患者である、請求項１０２〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記対象が、多発骨髄腫患者である、請求項１０２〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記対象が、再発した／難治性の多発骨髄腫患者である、請求項１０２〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記対象が、抗ＣＤ３８療法を受けたことがある、請求項１０２〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記対象が、ダラツムマブを受けたことがある、請求項１０２〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記対象が、ダラツムマブナイーブ、ダラツムマブ抵抗性、ダラツムマブ難治性、又はダラツムマブ再発性である、請求項１０２〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記対象が、ダラツムマブ抵抗性、ダラツムマブ難治性、又はダラツムマブ再発性である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記対象が、ＣＤ１６Ａ多型を発現する、請求項１０２〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記ＣＤ１６Ａ多型が、ＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ／Ｆ多型である、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記多重特異性抗原結合タンパク質又は二重特異性抗原結合タンパク質が、対象に投与された場合、前記対象のナチュラルキラー（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ：ＮＫ）細胞集団を実質的に枯渇又は減少させない、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質又は請求項５７〜９８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１２５】
請求項１〜３０のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質又は請求項５７〜９８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質を投与することを含む、枯渇又は減少したＮＫ細胞集団を有する対象を治療する方法。
【請求項１２６】
前記対象が、抗ＣＤ３８療法で以前に治療されている、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記抗ＣＤ３８療法が、ダラツムマブ療法である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分と２つのＢＣＭＡ標的化部分とを含む二重特異性抗原結合タンパク質であって、前記２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々がＩｇＧの各重鎖のＣ末端に融合し、前記２つのＢＣＭＡ標的化部分の各々が前記ＩｇＧの前記重鎖の各々のＮ末端に融合し、ここで、
（ｉ）前記ＣＤ１６Ａ抗原結合部分が、それぞれ：
（ａ）配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含み、
（ｉｉ）前記ＢＣＭＡ抗原結合部分が、それぞれ：
（ａ）配列番号６７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
（ｉｉ）配列番号７０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、二重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１２９】
対象におけるがんを治療する方法であって、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分と２つのＢＣＭＡ標的化部分とを含む二重特異性抗原結合タンパク質を前記対象へ投与することを含み、ここで、前記２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々がＩｇＧの各重鎖のＣ末端に融合し、前記２つのＢＣＭＡ標的化部分の各々が前記ＩｇＧの前記重鎖の各々のＮ末端に融合し、
（ｉ）前記ＣＤ１６Ａ抗原結合部分が、それぞれ：
（ａ）配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含み、
（ｉｉ）前記ＢＣＭＡ抗原結合部分が、それぞれ：
（ａ）配列番号６７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
（ｉｉ）配列番号７０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、方法。
【請求項１３０】
前記がんが、多発骨髄腫である、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
ＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合する、又はＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合することができる、抗体又は抗原結合タンパク質であって、
（ｉ）配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む第１の重鎖可変領域と、
（ｉｉ）配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む第１の軽鎖可変領域と、
（ｉｉｉ）配列番号６７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む第２の重鎖可変領域と、
（ｉｖ）配列番号７０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む第２の軽鎖可変領域と、を含む、抗体又は抗原結合タンパク質。
【請求項１３２】
（ｉ）前記第１の重鎖可変領域は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、
（ｉｉ）前記第１の軽鎖可変領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、
（ｉｉｉ）前記第２の重鎖可変領域は、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む、
（ｉｖ）前記第２の軽鎖可変領域は、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む、
（ｖ）前記第１の重鎖可変領域は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、及び前記第１の軽鎖可変領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、
（ｖｉ）前記第２の重鎖可変領域は、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む、及び前記第２の軽鎖可変領域は、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む、又は
（ｖｉｉ）前記第１の重鎖可変領域は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、及び前記第１の軽鎖可変領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む；並びに前記第２の重鎖可変領域は、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む、及び前記第２の軽鎖可変領域は、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１３１に記載の抗体又は抗原結合タンパク質。
【請求項１３３】
ＣＤ１６Ｂに結合しない、請求項１３１又は１３２に記載の抗体又は抗原結合タンパク質。
【請求項１３４】
対象のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞集団を、前記対象に投与された場合、実質的に枯渇又は減少させない、請求項１３１〜１３３のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合タンパク質。
【請求項１３５】
前記ＣＤ１６Ａが、ヒトＣＤ１６Ａである、請求項１３１〜１３４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合タンパク質。
【請求項１３６】
前記ＢＣＭＡが、ヒトＢＣＭＡである、請求項１３１〜１３５のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合タンパク質。
【請求項１３７】
請求項１３１〜１３６のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項１３８】
医薬品として使用するための、請求項１３１〜１３６のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合タンパク質。
【請求項１３９】
医薬品として使用するための、請求項１３７に記載の医薬組成物。
【請求項１４０】
疾患を治療及び／又は予防する方法であって、請求項１３１〜１３６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質又は請求項１３７に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項１４１】
前記疾患が、がんである、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
前記疾患が、血液のがんである、請求項１４０又は１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記疾患が、多発骨髄腫である、請求項１４０〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記抗体又は抗原結合タンパク質を、静脈内又は皮下に投与することを含む、請求項１４０〜１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
第２の治療法を投与することを含む、請求項１４０〜１４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記第２の治療法が、抗ＰＤ−１抗体を含む治療法、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む治療法、ＣＤ３二重特異性抗体を含む治療法、抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む治療法、抗ＶＥＧＦ抗体を含む治療法、及び抗ＦｃＲＨ５抗体を含む治療法からなる群より選択される、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記第２の治療法が、サイトカイン療法である、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４８】
前記サイトカイン療法が、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、及びＩＬ−６からなる群より選択されるサイトカインの投与である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記サイトカインが、ＩＬ−１５である、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記サイトカインが、ＩＬ−２である、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５１】
前記対象が、がん患者である、請求項１４０〜１５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５２】
前記対象が、血液のがん患者である、請求項１４０〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５３】
前記対象が、多発骨髄腫患者である、請求項１４０〜１５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５４】
前記対象が、再発した／難治性の多発骨髄腫患者である、請求項１４０〜１５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５５】
前記対象が、抗ＣＤ３８療法を受けたことがある、請求項１４０〜１５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５６】
前記対象が、ダラツムマブを受けたことがある、請求項１４０〜１５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５７】
前記対象が、ダラツムマブナイーブ、ダラツムマブ抵抗性、ダラツムマブ難治性、又はダラツムマブ再発性である、請求項１４０〜１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５８】
前記対象が、ダラツムマブ抵抗性、ダラツムマブ難治性、又はダラツムマブ再発性である、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
前記対象が、ＣＤ１６Ａ多型を発現する、請求項１４０〜１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６０】
前記ＣＤ１６Ａ多型が、ＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ／Ｆ多型である、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
請求項１３１〜１３６のいずれか一項に記載の抗体若しくは抗原結合タンパク質、又は請求項１３７に記載の医薬組成物を投与することを含む、枯渇又は減少したＮＫ細胞集団を有する対象を治療する方法。
【請求項１６２】
前記対象が、抗ＣＤ３８療法で以前に治療されている、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
前記抗ＣＤ３８療法が、ダラツムマブ療法である、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
ＣＤ１６Ａに結合する又はＣＤ１６Ａに結合することができる少なくとも１つのアームと、ＢＣＭＡに結合する又はＢＣＭＡに結合することができる少なくとも１つのアームと、を含む、抗体又は抗原結合タンパク質であって、
（ｉ）ＣＤ１６Ａに結合する又はＣＤ１６Ａに結合することができる前記少なくとも１つのアームが、
（ａ）配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含み、
（ｉｉ）ＢＣＭＡに結合する又はＢＣＭＡに結合することができる前記少なくとも１つのアームが、
（ａ）配列番号６７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
（ｉｉ）配列番号７０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、抗体又は抗原結合タンパク質。
【請求項１６５】
ＣＤ１６Ａに結合する又はＣＤ１６Ａに結合することができる前記少なくとも１つのアームが、ＢＣＭＡに結合する又はＢＣＭＡに結合することができる前記少なくとも１つのアームとは異なる、請求項１６４に記載の抗体又は抗原結合タンパク質。
【請求項１６６】
（ｉ）ＣＤ１６Ａに結合する又はＣＤ１６Ａに結合することができる前記少なくとも１つのアームが、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む；
（ｉｉ）ＣＤ１６Ａに結合する又はＣＤ１６Ａに結合することができる前記少なくとも１つのアームが、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む；
（ｉｉｉ）ＢＣＭＡに結合する又はＢＣＭＡに結合することができる前記少なくとも１つのアームが、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む；
（ｉｖ）ＢＣＭＡに結合する又はＢＣＭＡに結合することができる前記少なくとも１つのアームが、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む；
（ｖ）ＣＤ１６Ａに結合する又はＣＤ１６Ａに結合することができる前記少なくとも１つのアームが、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む；
（ｖｉ）ＢＣＭＡに結合する又はＢＣＭＡに結合することができる前記少なくとも１つのアームが、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む；又は、
（ｖｉｉ）ＣＤ１６Ａに結合する又はＣＤ１６Ａに結合することができる前記少なくとも１つのアームが、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み；ＢＣＭＡに結合する又はＢＣＭＡに結合することができる前記少なくとも１つのアームが、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１６４又は１６５に記載の抗体又は抗原結合タンパク質。
【請求項１６７】
ＣＤ１６Ｂに結合しない、請求項１６４〜１６６のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合タンパク質。
【請求項１６８】
対象のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞集団を、前記対象に投与された場合、実質的に枯渇又は減少させない、請求項１６４〜１６７のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合タンパク質。
【請求項１６９】
前記ＣＤ１６Ａが、ヒトＣＤ１６Ａである、請求項１６４〜１６８のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合タンパク質。
【請求項１７０】
前記ＢＣＭＡが、ヒトＢＣＭＡである、請求項１６４〜１６９のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合タンパク質。
【請求項１７１】
請求項１６４〜１７０のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項１７２】
医薬品として使用するための、請求項１６４〜１７０のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合タンパク質。
【請求項１７３】
医薬品として使用するための、請求項１７２に記載の医薬組成物。
【請求項１７４】
疾患を治療及び／又は予防する方法であって、請求項１６４〜１７０のいずれか一項に記載の抗体若しくは抗原結合タンパク質、又は請求項１７１に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項１７５】
前記疾患が、がんである、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
前記疾患が、血液のがんである、請求項１７４又は１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
前記疾患が、多発骨髄腫である、請求項１７４〜１７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７８】
前記抗体又は抗原結合タンパク質を、静脈内又は皮下に投与することを含む、請求項１７４〜１７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７９】
第２の治療法を投与することを含む、請求項１７４〜１７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８０】
前記第２の治療法が、抗ＰＤ−１抗体を含む治療法、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む治療法、ＣＤ３二重特異性抗体を含む治療法、抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む治療法、抗ＶＥＧＦ抗体を含む治療法、及び抗ＦｃＲＨ５抗体を含む治療法からなる群より選択される、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
前記第２の治療法が、サイトカイン療法である、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８２】
前記サイトカイン療法が、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、及びＩＬ−６からなる群より選択されるサイトカインの投与である、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８３】
前記サイトカインが、ＩＬ−１５である、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
前記サイトカインが、ＩＬ−２である、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８５】
前記対象が、がん患者である、請求項１７４〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８６】
前記対象が、血液のがん患者である、請求項１７４〜１８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８７】
前記対象が、多発骨髄腫患者である、請求項１７４〜１８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８８】
前記対象が、再発した／難治性の多発骨髄腫患者である、請求項１７４〜１８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８９】
前記対象が、抗ＣＤ３８療法を受けたことがある、請求項１７４〜１８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９０】
前記対象が、ダラツムマブを受けたことがある、請求項１７４〜１８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９１】
前記対象が、ダラツムマブナイーブ、ダラツムマブ抵抗性、ダラツムマブ難治性、又はダラツムマブ再発性である、請求項１７４〜１９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９２】
前記対象が、ダラツムマブ抵抗性、ダラツムマブ難治性、又はダラツムマブ再発性である、請求項１９１に記載の方法。
【請求項１９３】
前記対象が、ＣＤ１６Ａ多型を発現する、請求項１７４〜１９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９４】
前記ＣＤ１６Ａ多型が、ＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ／Ｆ多型である、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９５】
請求項１６４〜１７０のいずれか一項に記載の抗体若しくは抗原結合タンパク質、又は請求項１７１に記載の組成物を投与することを含む、枯渇又は減少したＮＫ細胞集団を有する対象を治療する方法。
【請求項１９６】
前記対象が、抗ＣＤ３８療法で以前に治療されている、請求項１９５に記載の方法。
【請求項１９７】
前記抗ＣＤ３８療法が、ダラツムマブ療法である、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９８】
ＢＣＭＡに結合する又はＢＣＭＡに結合することができる抗体又は抗原結合タンパク質であって、（ｉ）配列番号６７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号７０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、抗体又は抗原結合タンパク質。
【請求項１９９】
前記ＢＣＭＡが、ヒトＢＣＭＡである、請求項１９８に記載の抗体又は抗原結合タンパク質。
【請求項２００】
ＣＤ１６Ａに結合する又はＣＤ１６Ａに結合することができる少なくとも１つのアームを更に含む、請求項１９８又は１９９に記載の抗体又は抗原結合タンパク質。
【請求項２０１】
前記ＣＤ１６Ａが、ヒトＣＤ１６Ａである、請求項２００に記載の抗体又は抗原結合タンパク質。
【請求項２０２】
ＣＤ１６Ａに結合する又はＣＤ１６Ａに結合することができる前記少なくとも１つのアームが、（ｉ）配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項２００又は２０１に記載の抗体又は抗原結合タンパク質。
【請求項２０３】
（ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｉｉｉ）配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｉｖ）配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｖ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｖｉ）配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は、
（ｖｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変領域、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変領域；並びに配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖可変領域、及び配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖可変領域、を含む、請求項１９８〜２０２のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合タンパク質。
【請求項２０４】
請求項１９８〜２０３のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項２０５】
医薬品として使用するための、請求項１９８〜２０３のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合タンパク質。
【請求項２０６】
医薬品として使用するための、請求項２０７に記載の医薬組成物。
【請求項２０７】
疾患を治療及び／又は予防する方法であって、請求項１９８〜２０３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質又は請求項２０４に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項２０８】
前記疾患が、がんである、請求項２０７に記載の方法。
【請求項２０９】
前記疾患が、血液のがんである、請求項２０７又は２０８に記載の方法。
【請求項２１０】
前記疾患が、多発骨髄腫である、請求項２０７〜２０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１１】
前記抗体又は抗原結合タンパク質を、静脈内又は皮下に投与することを含む、請求項２０７〜２１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１２】
第２の治療法を投与することを含む、請求項２０７〜２１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１３】
前記第２の治療法が、抗ＰＤ−１抗体を含む治療法、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む治療法、ＣＤ３二重特異性抗体を含む治療法、抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む治療法、抗ＶＥＧＦ抗体を含む治療法、及び抗ＦｃＲＨ５抗体を含む治療法からなる群より選択される、請求項２１２に記載の方法。
【請求項２１４】
前記第２の治療法が、サイトカイン療法である、請求項２１２に記載の方法。
【請求項２１５】
前記サイトカイン療法が、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、及びＩＬ−６からなる群より選択されるサイトカインの投与である、請求項２１４に記載の方法。
【請求項２１６】
前記サイトカインが、ＩＬ−１５である、請求項２１５に記載の方法。
【請求項２１７】
前記サイトカインが、ＩＬ−２である、請求項２１５に記載の方法。
【請求項２１８】
前記対象が、がん患者である、請求項２０７〜２１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１９】
前記対象が、血液のがん患者である、請求項２０７〜２１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２０】
前記対象が、多発骨髄腫患者である、請求項２０７〜２１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２１】
前記対象が、再発した／難治性の多発骨髄腫患者である、請求項２０７〜２２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２２】
前記対象が、抗ＣＤ３８療法を受けたことがある、請求項２０７〜２２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２３】
前記対象が、ダラツムマブを受けたことがある、請求項２０７〜２２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２４】
前記対象が、ダラツムマブナイーブ、ダラツムマブ抵抗性、ダラツムマブ難治性、又はダラツムマブ再発性である、請求項２０７〜２２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２５】
前記対象が、ダラツムマブ抵抗性、ダラツムマブ難治性、又はダラツムマブ再発性である、請求項２２４に記載の方法。
【請求項２２６】
前記対象が、ＣＤ１６Ａ多型を発現する、請求項２０７〜２２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２７】
前記ＣＤ１６Ａ多型が、ＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ／Ｆ多型である、請求項２２６に記載の方法。
【請求項２２８】
請求項１９８〜２０３のいずれか一項に記載の抗体若しくは抗原結合タンパク質、又は請求項２０４に記載の組成物を投与することを含む、枯渇又は減少したＮＫ細胞集団を有する対象を治療する方法。
【請求項２２９】
前記対象が、抗ＣＤ３８療法で以前に治療されている、請求項２２８に記載の方法。
【請求項２３０】
前記抗ＣＤ３８療法が、ダラツムマブ療法である、請求項２２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１８年４月１３日出願の欧州仮特許出願第１８１６７３８４．９号、２０１８年４月１３日出願の欧州仮特許出願第１８１６７３８５．６号、２０１８年８月２４日出願の欧州仮特許出願第１８１９０６６１．１号、２０１８年８月２４日出願の欧州仮特許出願第１８１９０６６２．９号の優先権を主張し、これら各々の内容は参照によりその全体が援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１９年４月１０日作成の該ＡＳＣＩＩコピーは、０８７３５３＿０１０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、１３７，６５３バイトのサイズである。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上に発現したＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）を結合させることによってＮＫ細胞の細胞傷害性を誘発するために、ＮＫ細胞を結合させる多重特異性抗原結合タンパク質に関する。ここで、抗原結合タンパク質は、少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分と、少なくとも更なる標的抗原結合部分とを含む。
【背景技術】
【０００４】
国際公開第２００６／１２５６６８号及びＲｅｕｓｃｈら、「ＭＡＢＳ」（２０１４年）、第６巻、第３号、第７２８〜７３９頁には、ＣＤ１６Ａを結合するための二重特異性タンデムダイアボディ及びＮＫ細胞免疫療法のためのその使用について記載されている。
【０００５】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は細胞傷害性のＩＦＮ−γ自然リンパ球であり、ウイルス感染細胞及びがん細胞に対する防御の第１選択を構成すると考えられている（Ｃｅｒｗｅｎｋａ及びＬａｎｉｅｒ、「Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．」（２００１年）、第１巻、第１号、第４１〜９頁）。ＮＫ細胞の細胞傷害能力は、ＮＫ細胞溶解を腫瘍細胞に再誘導し、ＮＫ細胞の細胞表面上に発現されるＦｃγＲＩＩＩＡとしても知られる活性化受容体ＣＤ１６Ａを刺激することによって、がん免疫療法において利用することができる。
【０００６】
多重特異性抗体を用いる腫瘍細胞溶解のためのＮＫ細胞の誘導は、低毒性及び充分に受容可能な安全プロフィールを有する強力な免疫療法アプローチだと考えられる。
【０００７】
ＣＤ１６ＡはＮＫ細胞の細胞傷害活性を誘発する活性化受容体である。ＣＤ１６Ａに対する抗体の親和性は、ＮＫ細胞活性化を誘発するそれらの能力と直接相関し、したがって活性化に必要な抗体用量を減少させる。
【０００８】
ＮＫ細胞の細胞傷害活性は、ＣＤ１６Ａへの多価結合、例えばＣＤ１６Ａへの二価結合を介して結合力を増加させることによって増大させることができる。
【０００９】
しかしながら、ＣＤ１６Ａの二価性及び多価性は、ＮＫ細胞、γσＴ細胞、並びに単球、マクロファージ、及び樹状細胞のサブセットを含むＣＤ１６Ａ発現細胞の抗体媒介性架橋をもたらし得る。このような相互作用は、ＣＤ１６Ａを介する望ましくない細胞刺激をもたらすと予想される。例えば、ＮＫ細胞とＣＤ１６Ａ発現免疫細胞との架橋は、ＮＫ細胞活性化、サイトカイン放出、及び細胞指向性細胞傷害の誘導をもたらす。これはＮＫ細胞活性を低下させ、所望の抗腫瘍効果とは無関係にＮＫ細胞消耗を促進する。これにより、ＣＤ１６Ａ発現免疫細胞とのＮＫ細胞架橋は、ＮＫ細胞関与の治療効果を低下させることが予想される。最も重要なことには、アカゲザル及びタマリンにおいてＣＤ１６Ａに対して二価であるＣＤ１６指向性マウスＩｇＧ抗体（３Ｇ８）を用いて以前に記述したように、ＣＤ１６Ａとの二価又は多価相互作用を介した２つ以上のＮＫ細胞の架橋は、ＮＫ細胞活性化及び兄弟殺し（ＮＫ−ＮＫ細胞溶解）の誘導を引き起こし、最終的にはインビボにおいて効率的なＮＫ細胞枯渇をもたらす可能性がある（Ｃｈｏｉら、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（２００８年）、第１２４巻、第２１５〜２２２頁；Ｙｏｓｈｉｄａら、「Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」（２０１０年）、第１巻、第１２８頁）。したがって、ＮＫ溶解の誘導は、ＡＤＣＣを媒介するために利用可能なエフェクタ細胞の数を減少させて、治療用抗体の効力を損なう。
【００１０】
このように、兄弟殺し（ＮＫ−ＮＫ細胞溶解）によって減少しないＮＫ細胞の関与を増強することができる抗体が必要である。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、ＮＫ細胞上のＣＤ１６Ａと少なくとも二価の相互作用が可能であり、そのために、増大した結合親和性及び細胞傷害能力を有するが、好ましくはＮＫ−ＮＫ細胞溶解を誘導し得ないＣＤ１６Ａ結合抗体を提供する。
【００１２】
本発明とは以下を指す。
【００１３】
少なくとも１つの標的抗原結合部分と、少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分と、を含み、該２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分が、定常ドメイン、例えばＦａｂ断片又はＦｃ部分に融合した、多価及び多重特異性抗原結合タンパク質。好ましくは、標的抗原結合部分はまた、Ｆａｂ断片又はＦｃ部分に融合する。
【００１４】
例えば、抗原結合部分の各々は、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、ダイアボディ（Ｄｂ）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、又はＦａｂ断片からなる群より選択され得る。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分の軽鎖及び重鎖可変領域は、ポリペプチド鎖のＮ末端の可変領域が軽鎖可変領域であるように、ポリペプチドで順次結合され、これによって兄弟殺しの（ＮＫ−ＮＫ細胞溶解）誘導を妨げる。
【００１６】
多数のタンパク質構築物は、Ｆ（ａｂ）’、Ｆ（ａｂ）２’、ＣＨ２−ＣＨ３、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、Ｆｃ、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、又はＩｇＧなどの定常ドメインを含む種々のユニットに、Ｎ末端又はＣ末端で抗原結合部分を融合することによって利用可能である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＦｃγＲに結合しないが、ＦｃＲｎ及び任意には少なくとも１つの更なるＦｃ機能性への結合を保持する、サイレンシングされたＦｃ部分を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、一方ではＦｃγＲに結合しないようにサイレンシングされ、他方では経細胞輸送及びリサイクルのための異なる能力に基づく異なるインビボ薬物動態と相関する、ＦｃＲｎに結合するその能力を増加又は減少させる更なる突然変異を含み得る、Ｆｃ部分を含む。
【００１９】
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、少なくともＨＳＡ抗原結合部分を含む。例えば、抗原結合タンパク質は、２つ、３つ、又は４つのＨＳＡ抗原結合部分を含み得る。
【００２０】
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、少なくとも２つの異なる標的抗原結合部分、すなわち第１及び第２の標的抗原結合部分を含む。
【００２１】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａに対する親和性が増加又は減少したＣＤ１６Ａ抗原結合部分が適用される。
【００２２】
とりわけ、本発明は以下によって特徴付けられる。
【００２３】
１．以下によって、ＮＫ細胞の関与機能が強化される。
・Ｆａｂ断片又はＦｃ部分に融合した２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分。これにより、ＣＤ１６Ａへの二価結合に起因する細胞傷害能力が増大する。
・ＣＤ１６Ａに高い親和性で結合する、抗ＣＤ１６Ａ抗原結合部分の利用。
・兄弟殺し（ＮＫ−ＮＫ細胞溶解）を誘導しない特定の順序でＣＤ１６Ａ抗原結合を配置することによって兄弟殺しの誘導を回避し、これにより標的細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害活性の弱体化を防止する。
・兄弟殺しを回避することは、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分の結合親和性とは無関係である。
・ＦｃＲｎとの結合を維持しながら、ＦｃγＲ陽性単球又はＦｃγＲを発現する他の細胞への更なる結合を回避し、それによって血清半減期を延長するために、サイレンシングされたＦｃ部分を用いる。
【００２４】
２．この増強されたＮＫ細胞結合機能性は、調節可能な細胞傷害性、標的親和性、ＣＤ１６Ａ機能性、標的生物学、組織浸透及び分布、半減期及び曝露を達成する多数のタンパク質構築物に対する抗原結合部分のモジュール性に起因し得る。
【００２５】
本明細書に具体的に記載されている多様な抗体フォーマット、並びに種々の半減期及び異なる曝露を含む機能を使用することによって、高い医療上の必要性伴う様々な徴候に新規の治療薬を適合させることが可能となり、それぞれの設定に対して標的化された製品開発が得られる。
【００２６】
更に、ＮＫ細胞の兄弟殺しの欠如は、より長い細胞保持時間を特徴とし、かつ内因性ＮＫ細胞の関与のために使用されるか又はＮＫ細胞治療アプローチと組み合わせられる、高親和性で少なくとも二価の免疫細胞誘導剤（ｅｎｇａｇｅｒ）フォーマットの重要な特徴である。これらには、異なる供給源、例えば臍帯血由来、健常ドナーの末梢血由来、自家治療（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）のための患者由来、又は幹細胞由来であるＮＫ細胞が含まれる。これらの誘導剤は、このようなＮＫ細胞と混注又は予混合することができる。
【００２７】
標的への少なくとも二価の結合による標的結合親和性の増加、及び／又は２つの異なる第１及び第２の標的抗原結合部分による標的の二重標的化による標的選択性の増加を更に可能にするタンパク質フォーマットが、本明細書に提示される。
【００２８】
更なる機能性は、例えば、ヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＨＳＡ）結合部分のような抗原結合タンパク質中に組み込まれ得る。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、単量体であり、単量体Ｆｃ部分に融合したｓｃＤｂのフォーマットで二価のＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む、ｓｃＤｂ−ｍＦｃ抗原結合タンパク質を示す。図１では、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分からなるｓｃＤｂは、バリアントＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドと、Ｆｃ部分のＣ末端に融合した単一の標的抗原結合部分を含むｓｃＦｖと、からなるＦｃ部分のＮ末端に融合する。
【図２】図２は、単量体であり、単量体Ｆｃ部分に融合したｓｃＤｂのフォーマットで二価のＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む、ｓｃＤｂ−ｍＦｃ抗原結合タンパク質を示す。図２では、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分からなるｓｃＤｂは、バリアントＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドからなるＦｃ部分のＣ末端に融合し、単一の標的抗原結合部分を含むｓｃＦｖは、Ｆｃ部分のＮ末端に融合する。標的は、腫瘍関連標的である。
【図３】図３は、ヘテロ二量体であり、ヘテロ二量体（ＫｉＨ）Ｆｃ部分に融合したｓｃＤｂのフォーマットで二価のＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む、ＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ抗原結合タンパク質を示す。図３では、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分からなるｓｃＤｂは、ＣＨ２−ＣＨ３ヘテロ二量体からなるＦｃ部分のＮ末端でヒンジ又はミドルヒンジに融合し、単一の標的抗原結合部分を含むｓｃＦｖは、Ｆｃ部分のＣ末端に融合する。
【図４】図４は、ヘテロ二量体であり、ヘテロ二量体（ＫｉＨ）Ｆｃ部分に融合したｓｃＤｂのフォーマットで二価のＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む、ＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ抗原結合タンパク質を示す。図４では、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分からなるｓｃＤｂは、ＣＨ２−ＣＨ３ヘテロ二量体からなるＦｃ部分の２つのポリペプチドのうちの１つのＮ末端で、ヒンジ又はミドルヒンジに融合し、単一の標的抗原結合部分を含むｓｃＦｖは、ＣＨ２−ＣＨ３ヘテロ二量体（ＫｉＨ）Ｆｃ部分の他のポリペプチドのＮ末端でヒンジに融合する。
【図５】図５は、ヘテロ二量体であり、ヘテロ二量体（ＫｉＨ）Ｆｃ部分に融合したｓｃＤｂのフォーマットで二価のＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む、ＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ抗原結合タンパク質を示す。図５では、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分からなるｓｃＤｂは、ＣＨ２−ＣＨ３ヘテロ二量体からなるＦｃ部分のＣ末端に融合し、単一の標的抗原結合部分を含むｓｃＦｖは、ＣＨ２−ＣＨ３ヘテロ二量体（ＫｉＨ）Ｆｃ部分の他のポリペプチドのＮ末端でヒンジ又はミドルヒンジに融合する。
【図６】図６は、ヘテロ二量体であり、ヘテロ二量体（ＫｉＨ）Ｆｃ部分に融合したｓｃＤｂのフォーマットで二価のＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む、ＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ抗原結合タンパク質を示す。図６では、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分からなるｓｃＤｂは、ＣＨ２−ＣＨ３ヘテロ二量体からなるＦｃ部分のＣ末端に融合し、第１の標的抗原結合部分を含む第１のｓｃＦｖはＦｃ部分のＮ末端でヒンジ又はミドルヒンジに融合し、第２の（第１とは異なる）標的抗原結合部分を含む第２のｓｃＦｖはＣＨ２−ＣＨ３ヘテロ二量体（ＫｉＨ）Ｆｃ部分の他のポリペプチドのＮ末端でヒンジ又はミドルヒンジに融合する。第１及び第２の標的は、２つの異なる腫瘍関連標的である。
【図７】図７は、ＣＤ１６Ａ、標的、及びＨＳＡ抗原結合部分を含むヘテロ二量体Ｆａｂ断片−ｓｃＤｂ融合である、三重特異性ｓｃＤｂ−ＴｒｉＢ抗原結合タンパク質を示す。図７では、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分からなる二価ｓｃＤｂは、Ｆａｂ断片の２つのポリペプチドのうちの１つのＣ末端に融合し、２つの標的抗原結合部分からなる二価ｓｃＤｂは、Ｆａｂ断片の他のポリペプチドのＣ末端に融合し、そしてＦａｂ断片のＮ末端のＦｖは、ＨＳＡ抗原結合部分を提供する。
【図８】図８は、ＣＤ１６Ａ、標的、及びＨＳＡ抗原結合部分を含むヘテロ二量体Ｆａｂ断片−ｓｃＤｂ融合である、三重特異性ｓｃＤｂ−ＴｒｉＢ抗原結合タンパク質を示す。図８では、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分からなる二価ｓｃＤｂは、Ｆａｂ断片の２つのポリペプチドのうちの１つのＣ末端に融合し、単一の標的抗原結合部分からなるｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片の他のポリペプチドのＣ末端に融合し、そしてＦａｂ断片のＮ末端のＦｖは、ＨＳＡ抗原結合部分を提供する。標的は、腫瘍関連標的である。
【図９】図９は、ホモ二量体であり、ホモ二量体Ｆｃ部分のＮ末端又はＣ末端のミドルヒンジに融合したＤｂのフォーマットである二価ＣＤ１６Ａ抗原結合部分と、ｓｃＦｖのフォーマットである２つの標的抗原結合部分とを含む、Ｄｂ−Ｆｃ抗原結合タンパク質を示す。図９では、ｓｃＦｖはホモ二量体化ＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドのＣ末端に融合し、Ｄｂを含むポリペプチドはＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端のミドルヒンジに融合し、ここで、Ｄｂの２つのポリペプチドは、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含むＤｂに非共有結合的に結合する。標的は、腫瘍関連標的である。
【図１０】図１０は、ホモ二量体であり、ホモ二量体Ｆｃ部分のＮ末端又はＣ末端のミドルヒンジに融合したＤｂのフォーマットである二価ＣＤ１６Ａ抗原結合部分と、ｓｃＦｖのフォーマットである２つの標的抗原結合部分とを含む、Ｄｂ−Ｆｃ抗原結合タンパク質を示す。図１０では、ｓｃＦｖ標的抗原結合部分は、ホモ二量体化ＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端でミドルヒンジに融合し、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含むＤｂを含むポリペプチドは、Ｆｃホモ二量体のＣ末端に融合する。標的は、腫瘍関連標的である。
【図１１】図１１は、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分と、２つの標的抗原結合部分とをそれぞれｓｃＦｖのフォーマットで含み、Ｆｃホモダイマーに融合した、ホモ二量体及び四価であるＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗原結合タンパク質を示す。図１１では、ＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドの１つのＮ末端でヒンジに融合した２つのＣＤ１６Ａ抗原結合ｓｃＦｖ、及び２つの標的抗原結合ｓｃＦｖは、ＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドのＣ末端に融合する。
【図１２】図１２は、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分と、２つの標的抗原結合部分とをそれぞれｓｃＦｖのフォーマットで含み、Ｆｃホモダイマーに融合した、ホモ二量体及び四価であるＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗原結合タンパク質を示す。図１２では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分はＣ末端でＦｃホモ二量体に融合し、一方で、標的抗原結合ｓｃＦｖはＦｃホモ二量体のＮ末端でヒンジに融合する。標的は、腫瘍関連標的である。
【図１３】図１３は、Ｈ鎖のＣ末端に融合したｓｃＦｖのフォーマットである２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分とのＩｇＧ抗体融合を含む、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ抗原結合タンパク質を示す。一方で、２つの標的抗原結合部分は、ＩｇＧのＦａｂアーム内の各Ｆｖによって得られる。標的は、腫瘍関連標的である。
【図１４】図１４は、それに融合した４つのｓｃＦｖ抗原結合部分を有するＩｇＧ抗体融合を含む、Ｂｉ−ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ抗原結合タンパク質を示す。ここで、ｓｃＦｖのフォーマットである２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々は、Ｈ鎖のＣ末端に融合し、一方で第１の標的に結合する２つの抗原結合部分は、ＩｇＧのＦａｂアーム内の各Ｆｖによって得られ、第２の標的に結合する２つの抗原結合部分の各々は、２つのＣＬ鎖のＣ末端に融合する。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｂは、４つの抗原結合ｓｃＦｖがヘテロ二量体（ＫｉＨ）Ｆｃ部分に融合し、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分がＦｃ部分にＮ末端又はＣ末端のいずれかで融合した、ＫｉＨ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗原結合タンパク質を示す。図１５Ａは、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分を有するＫｉＨ−ｓｃＦｖ−Ｆｃを示し、この各々が、ＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドの一方のＮ末端でヒンジに融合し、第１の標的抗原結合部分を含むｓｃＦｖはＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドの一方のＣ末端に融合し、第２の標的抗原結合部分を含む別のｓｃＦｖは他のＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドのＣ末端に融合する。図１５Ｂは、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分を有するＫｉＨ−ｓｃＦｖ−Ｆｃを示し、この各々が、ＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドの一方のＣ末端で融合し、第１の標的抗原結合部分を含むｓｃＦｖはＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドの一方のＮ末端のヒンジに融合し、第２の標的抗原結合部分を含む別のｓｃＦｖは他のＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端のヒンジに融合する。
【図１６】図１６は、Ｈ鎖のＣ末端に融合したｓｃＦｖのフォーマットである２つの標的抗原結合部分とのＩｇＧ抗体融合を含む、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ抗原結合タンパク質を示す。一方で、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ＩｇＧのＦａｂアーム内の各Ｆｖによって得られる。標的は、腫瘍関連標的である。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｎは、実施例６における抗体媒介ＮＫ−ＮＫ細胞溶解の結果を示す。図１７Ａは、図１に示すように、Ｎ末端で単量体Ｆｃに融合したダイアボディフォーマット（ｓｃＤｂ）である２つの抗ＣＤ１６Ａ部分（及びＣ末端ではＴＡＡを標的とするｓｃＦｖ）を示す。図１７Ｂは、図２に示すように、Ｃ末端で単量体Ｆｃに融合したダイアボディフォーマット（ｓｃＤｂ）である２つの抗ＣＤ１６Ａ部分（及びＮ末端ではＴＡＡを標的とするｓｃＦｖ）を示す。図１７Ｃは、図３に示すように、Ｎ末端で非対称にＦｃへ融合したダイアボディフォーマット（ｓｃＤｂ）である２つの抗ＣＤ１６Ａ部分（及びＣ末端ではＴＡＡを標的とするｓｃＦｖ）を示す。図１７Ｄは、図４に示すように、Ｎ末端で非対称にＦｃへ融合したダイアボディフォーマット（ｓｃＤｂ）である２つの抗ＣＤ１６Ａ部分（及びＮ末端でＴＡＡを標的とするｓｃＦｖ）を示す。図１７Ｅは、図５に示すように、Ｃ末端で非対称にＦｃへ融合したダイアボディフォーマット（ｓｃＤｂ）である２つの抗ＣＤ１６Ａ部分（及びＮ末端ではＴＡＡを標的とするｓｃＦｖ）を示す。図１７Ｆは、図７に示すように、ＣＬのＣ末端でＦａｂへ融合したダイアボディフォーマット（ｓｃＤｂ）である２つの抗ＣＤ１６Ａ部分（及びＣＨ１のＣ末端ではＴＡＡを標的とするｓｃＤｂ）を示す。図１７Ｇは、図８に示すように、ＣＨ１のＣ末端でＦａｂへ融合したダイアボディフォーマット（ｓｃＤｂ）である２つの抗ＣＤ１６Ａ部分（及びＣＬのＣ末端ではＴＡＡを標的とするｓｃＤｂ）を示す。図１７Ｈは、図９に示すように、Ｎ末端でＦｃに融合したダイアボディ（Ｄｂ）フォーマットである２つの抗ＣＤ１６Ａ部分（及びＣ末端ではＴＡＡを標的とするｓｃＦｖ）を示す。図１７Ｉは、図１０に示すように、Ｃ末端でＦｃに融合したダイアボディ（Ｄｂ）フォーマットである２つの抗ＣＤ１６Ａ部分（及びＮ末端ではＴＡＡを標的とするｓｃＦｖ）を示す。図１７Ｊは、図１１に示すように、Ｎ末端でＦｃに融合したｓｃＦｖフォーマットである２つの抗ＣＤ１６Ａ部分（及びＣ末端ではＴＡＡを標的とするｓｃＦｖ）を示す。図１７Ｋは、図１２に示すように、Ｃ末端でＦｃに融合したｓｃＦｖフォーマットである２つの抗ＣＤ１６Ａ部分（及びＮ末端ではＴＡＡを標的とするｓｃＦｖ）を示す。図１７Ｌは、図１３に示すように、Ｃ末端でＦｃに融合したｓｃＦｖフォーマットである２つの抗ＣＤ１６Ａ部分（及びＮ末端でＴＡＡを標的とするＦａｂアーム）を示す。図１７Ｍは、図１５ａ及び図１５ｂに示すように、Ｎ末端で非対称にＦｃへ融合したｓｃＦｖフォーマットである２つの抗ＣＤ１６Ａ部分（及びＣ末端で２つのＴＡＡを標的とする２つのｓｃＦｖ）と、Ｃ末端でで非対称にＦｃへ融合したｓｃＦｖフォーマットである２つの抗ＣＤ１６Ａ部分（及びＮ末端で２つのＴＡＡを標的とする２つのｓｃＦｖ）を示す。図１７Ｎは、Ｃ末端でＦｃに融合したＴＡＡを標的とする２つのｓｃＦｖを伴うＩｇＧのＦａｂアームにおける２つの抗ＣＤ１６Ａ部分（図１６に示す通り）と、Ｃ末端でＦｃに融合したｓｃＦｖフォーマットである２つの抗ＣＤ１６Ａ部分（及びＮ末端でＴＡＡを標的とするＦａｂアーム；図１３に示す通り）との比較を示す。
【図１８】図１８Ａ〜図１８Ｂは、異なる抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖのＳＰＲ分析である。野生型ＩｇＧ１と比較した抗ＣＤ１６結合ｓｃＦｖ抗体（Ａｂ１６高、Ａｂ１６中、３Ｇ８、Ａｂ１６低）、及び操作したヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ）の、正規化した相対結合シグナルのＳＰＲセンサグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）。図１８Ａは、ヒトＣＤ１６Ａ−１５８Ｖに対する増強した結合を示す。図１８Ｂは、ヒトＣＤ１６Ａ−１５８Ｆに対する結合を示す。分析物を３１２．５ｎＭの単一濃度で測定した。
【図１９】図１９Ａ〜図１９Ｃは、１４０位のチロシン（Ｙ）が、立体構造エピトープの形成と、ｓｃＦｖ抗体のＣＤ１６Ａ特異的反応性とにとって重要であることを示す。単量体Ｆｃ又は膜アンカーを有するＥＣＤ配列の融合タンパク質として発現した、異なる組換えＣＤ１６バリアントを分析した。図１９Ａは、ニトロセルロース膜上の規定されたＣＤ１６抗原バリアントを含有するタンパク質スポットが、示されたＣＤ１６結合ｓｃＦｖとのそれらの反応性について試験されたことを示す。図１９Ｂは、抗体染色及びフローサイトメトリによって分析した、ＥＧＦＲ膜貫通ドメイン又はＧＰＩへの融合を介してアンカーされたＣＨＯ細胞上に発現したＣＤ１６抗原バリアント又はＥＧＦＲ抗原との、異なる抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖ、対照ｓｃＦｖ、又はｍＡｂの反応性を示す。図１９Ｃは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法による分離後の、ＣＤ１６抗原バリアントに対する異なる抗ＣＤ１６抗体の結合を示す。
【図２０】図２０は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ野生型、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ増強（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ）、ヒトＩｇＧ１Ｆｃサイレンシング（Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ）、ヒトＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ及びヒトＣＤ１６Ａ−１５８Ｆへの結合と比較した、抗ＣＤ１６結合ドメイン（Ａｂ１６低、Ａｂ１６中、Ａｂ１６高、３Ｇ８）のＳＰＲセンサグラムを示す。ＫＤ値は１：１結合モデルを用いて計算し、表５に示す。横座標：応答（応答単位）、縦座標：時間［秒］。
【図２１】図２１は、本明細書に記載されるある実験において組換え抗原として使用される、ヒト及びカニクイザルＣＤ１６Ａ並びにヒトＣＤ１６ＢバリアントのＥＣＤ配列の配列アラインメントを示す。ヒトＣＤ１６Ａ又はＣＤ１６Ｂの多型の位置は、それぞれ細い矢印及び太い矢印で表す。記号「＃」は、ヒトＣＤ１６ＢをＧＰＩ膜アンカーに連結する位置を表し、「ｄ」で表される位置は、成熟ＣＤ１６Ｂ抗原配列から切断される。カニクイザルのＣＤ１６ＡのＥＣＤ配列における変化は太字で表す。ヒトＣＤ１６ＡとヒトＣＤ１６Ｂとの間で配列変異のある位置は、角括弧で表す（検査した抗ＣＤ１６抗体のＣＤ１６Ａ特異的結合に重要である）。アラインメントにはＣＬＵＳＴＡＬ  Ｏ（１．２．４）多重配列アラインメントツールを使用した。
【図２２】図２２は、ＥＬＩＳＡにおける、ｍＡｂ  ３Ｇ８とＣＤ１６Ａとの異なる抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖ抗体の結合競合を示す。ＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ  ＥＣＤ−Ｆｃ融合抗原でコーティングされたプレートを、１ｎＭのｍＡｂ  ３Ｇ８と、示された濃度範囲において異なる抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖの段階希釈物との混合物と共にインキュベートした。ＣＤ１６Ａ結合ｍＡｂ  ３Ｇ８をペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で検出した。ＴＭＢ基質反応を、４５０ｎｍ（抽出物（４５０ｎｍ））で測定し、プロットし、分析した。
【図２３】図２３は、ＲＯＣＫ（登録商標）プラットフォームの概要を示す。
【図２４】図２４Ａ〜図２４Ｃは、多様なＣＤ１６Ａの二価で結合するＲＯＣＫ（登録商標）誘導剤の、正規化された相対結合解離相のＳＰＲセンサグラムを示す。ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿Ｃ、Ｄｂ−Ｆｃ＿Ａ、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿Ｄ、ＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ＿Ａ、ＴａｎｄＡｂ＿Ｃを含有する二価抗ＣＤ１６Ａドメインを、固定化ヒトＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ及びカニクイザルＣＤ１６上におけるＩｇＡｂ＿Ｅ（Ｆｃ増強、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ）及び一価抗ＣＤ１６Ａ断片ｓｃＦｖ  Ａｂ１６高と比較した。図２４Ａは、固定化ヒトＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ上のＳＰＲセンサグラムを示す。図２４Ｂは、カニクイザルＣＤ１６上のＳＰＲセンサグラムを示す。図２４Ｃは、解離の３時間後に受容体上に残存する抗体の凡例及び割合を示す。分析物を５０ｎＭの単一濃度で測定した。
【図２５】図２５は、ＮＫ細胞上のＩｇＧと比較したＲＯＣＫ（登録商標）抗体の細胞表面保留を示す。濃縮した初代ヒトＮＫ細胞に、１００μｇ／ｍＬのＴａｎｄＡｂ又は４００μｇ／ｍＬのＩｇＧを氷上において４５分にわたり前処理し、洗浄し、指定された時間３７℃でインキュベートして、解離させた。洗浄後、残りの抗体を、Ｈｉｓ−タグ付け可溶性ＢＣＭＡ、次いで１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ抗Ｈｉｓ、及び１５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ複合ヤギ抗マウスＩｇＧによって検出した。０時点からの平均蛍光強度を１００％に設定し、残りの抗体の割合を、非線形回帰を用いてプロットした。
【図２６】図２６Ａ〜図２６Ｃは、ＲＯＣＫ（登録商標）フォーマットにおけるＣＤ１６Ａの見かけ上の親和性が、可変ドメイン、位置決め、及びコネクタ長によって調整可能であることを示す。異なる位置（Ｎ：Ｆｃの抗ＣＤ１６Ｆｖ  Ｎ末端、Ｃ：Ｆｃの抗ＣＤ１６Ｆｖ  Ｃ末端）、抗体フォーマット、及び異なるドメイン順序における、異なるＣＤ１６結合Ｆｖ（Ａｂ１６中、Ａｂ１６高）を含有するＲＯＣＫ（登録商標）抗体への可溶性ＣＤ１６抗原の結合を、ＥＬＩＳＡにより分析した。点線でＣＤ１６結合Ｆｖを示した代表的なピクトグラムを、各群の下に示す。図２６Ａは、Ｆａｂ又はｓｃＦｖベースのＣＤ１６結合によるＣＤ１６Ａの見かけ上の親和性の概要を示す。図２６Ｂは、ダイアボディ（Ｄｂ）ベースのＣＤ１６結合によるＣＤ１６Ａの見かけ上の親和性の概要を示す。図２６Ｃは、異なるコネクタ長（１０ａａ又は３０ａａ）、及び抗ＣＤ１６Ｆｖのドメイン順序（ＨＬ：ｓｃＦｖドメイン順序ＶＨ−ＶＬ、ＬＨ：ｓｃＦｖドメイン順序ＶＬ−ＶＨ）を含むＣ末端ｓｃＦｖベースのＣＤ１６結合によるＣＤ１６Ａの見かけ上の親和性の概要を示す。全ての分析された抗体は、ＦａｂのＣ末端への融合の場合に、サイレンシングされたＦｃを含有するか、又はＦｃを欠く。黒塗り又は斜線で図示した結合特異性は、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、ＨＳＡ、又はＲＳＶを標的とする抗体ドメインを含んでいた。
【図２７】図２７Ａ〜図２７Ｃは、ヒトＩｇＧの存在下又は不在下における、初代ヒトＮＫ細胞に対するＲＯＣＫ（登録商標）抗体の結合を示す。図２７Ａは、３７℃で１０ｍｇ／ｍＬのポリクローナルヒトＩｇＧの存在下又は不在下において、示されたＦｃなしＲＯＣＫ（登録商標）の濃度を増加させて、初代ヒトＮＫ細胞を染色したことを示す。図２７Ｂは、３７℃で１０ｍｇ／ｍＬのポリクローナルヒトＩｇＧの存在下又は不在下において、示されたＦｃ融合ＲＯＣＫ（登録商標）の濃度を増加させて、初代ヒトＮＫ細胞を染色したことを示す。図２７Ｃは、３７℃で１０ｍｇ／ｍＬのポリクローナルヒトＩｇＧの存在下又は不在下において、示されたＩｇＧ様ＲＯＣＫ（登録商標）構築物の濃度を増加させて、初代ヒトＮＫ細胞を染色したことを示す。細胞結合抗体をフローサイトメトリで検出し、蛍光強度中央値（ｍｅｄｉａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：ＭＦＩ）を、非線形回帰による見かけ上の親和性（ＫＤ）の計算に用いた。
【図２８】図２８は、インビトロでのＮＫ兄弟殺しに関する種々のＲＯＣＫ（登録商標）抗体フォーマットの比較分析を示す。１：１のＥ：Ｔで４時間共インキュベーションした後の、自家ＮＫ細胞に対する異なるＲＯＣＫ（登録商標）抗体フォーマットの存在下における濃縮初代ヒトＮＫ細胞のインビトロカルセイン放出細胞傷害性アッセイ。いくつかの独立した実験の平均ＥＣ５０値を要約し、個々の点としてプロットした。ＲＯＣＫ（登録商標）抗体のフォーマットは、抗ＣＤ１６ドメインの位置、及びフォーマット／ドメインの順序に基づいて分類される。高親和性抗ＣＤ１６ドメイン及びサイレンシングされたＦｃを含有する構築物のみがグラフに含まれる。ＨＬ：ｓｃＦｖドメイン順序ＶＨ−ＶＬ、ＬＨ：ｓｃＦｖドメイン順序ＶＬ−ＶＨ。Ｎ−ｔｅｒｍ．＝Ｎ−末端、Ｃ−ｔｅｒｍ．＝Ｃ末端。
【図２９】図２９Ａ〜図２９Ｅは、対応する腫瘍標的を発現する細胞株に対して、いくつかのＲＯＣＫ（登録商標）抗体の存在下において、濃縮初代ヒトＮＫ細胞のインビトロ細胞傷害性を示す。図２９Ａは、Ｅ：Ｔ比が５：１でＳＡＢＣ値（アッセイ３回以上の平均値）によって示されるようにＢＣＭＡの差次的レベルを発現する、ＮＫ細胞及び標的細胞株ＮＣＩ−Ｈ９２９を用いた４時間カルセイン放出細胞傷害性アッセイにおける、示されたＢＣＭＡ標的化ＲＯＣＫ（登録商標）抗体の代表的なシグモイド型用量反応曲線を示す。図２９Ｂは、Ｅ：Ｔ比が５：１でＳＡＢＣ値（アッセイ３回以上の平均値）によって示されるようにＢＣＭＡの差次的レベルを発現する、ＮＫ細胞及び標的細胞株ＭＭ．１Ｓを用いた４時間カルセイン放出細胞傷害性アッセイにおける、示されたＢＣＭＡ標的化ＲＯＣＫ（登録商標）抗体の代表的なシグモイド型用量反応曲線を示す。図２９Ｃは、Ｅ：Ｔ比が５：１でＳＡＢＣ値（アッセイ３回以上の平均値）によって示されるようにＢＣＭＡの差次的レベルを発現する、ＮＫ細胞及び標的細胞株ＭＣ／ＣＡＲを用いた４時間カルセイン放出細胞傷害性アッセイにおける、示されたＢＣＭＡ標的化ＲＯＣＫ（登録商標）抗体の代表的なシグモイド型用量反応曲線を示す。図２９Ｄは、Ｅ：Ｔ比が５：１でＮＫ細胞及びＳＷ−９８２標的細胞による４時間カルセイン放出細胞傷害性アッセイにおける、示されたＥＧＦＲ標的化ＲＯＣＫ（登録商標）抗体、コンパレータ、又は一価結合対照の代表的なシグモイド型用量反応曲線を示す。図２９Ｅは、インビトロでの腫瘍標的細胞に対するＮＫ細胞結合親和性及び細胞傷害能力に関するＲＯＣＫ（登録商標）抗体の相関性を示す。初代ヒトＮＫ細胞に対するＲＯＣＫ（登録商標）抗体フォーマットの見かけ上の親和性（ＫＤ）を示す。同じＲＯＣＫ（登録商標）抗体のＥＣ５０値を、Ｅ：Ｔ比２：１でのＮＫ細胞及びＢＣＭＡ発現ＲＰＭＩ−８２２６標的細胞による３時間カルセイン放出細胞傷害性測定（左）、又はＥ：Ｔ比５：１でのＮＫ細胞及びＢＣＭＡ発現ＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞による４時間カルセイン放出細胞傷害性アッセイ（右）で測定した。ＳＡＢＣ、特異的抗体結合能（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）。
【図３０】図３０は、３００μｇの試験物質の単回静脈内投与後の、異なるＲＯＣＫ（登録商標）誘導剤フォーマットの薬物動態：経時的な抗体濃度（１又は３週間の観察期間）の比較を示している。
【図３１】図３１Ａ〜図３１Ｂは、ＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ／Ｖ健常ドナー（実線）と、ＣＤ１６Ａ−１５８Ｆ／Ｆ（破線）と、に対するＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉの細胞傷害性を示す。図３１Ａは、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞株についての結果を示す。図３１Ｂは、ＭＭ．１Ｓ細胞株についての結果を示す。
【図３２】図３２Ａ〜図３２Ｅは、多発骨髄腫細胞株に対するＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉのインビトロ細胞傷害性を示す。１６５ＫのＰＢＭＣ当たりＣＤ５６＋ＣＤ３ｅ−ＮＫ細胞の概数は約８０００細胞であり、したがってＮＫ：腫瘍比は約０．４であった（ＭＭ患者ＮＫ対腫瘍細胞の比を推定する臨床データと同様；データ示さず）。図３２Ａは、健康なヒト血液ドナーから単離され、後の実験のために凍結されたヒトＰＢＭＣを示す。解凍時のＰＢＭＣは、トリパンブルー染色で約８５％生存可能であり、後に７ＡＡＤによるＦＡＣＳで確認された。ＰＢＭＣ（約１６５Ｋ）をＢＣＭＡ＋多発骨髄腫瘍細胞株（約２０Ｋ）と共培養し、３７℃にて５％のＣＯ２でおよそ２０時間、０．１〜３０００ｐＭの３倍に段階希釈した試験物に曝露した。１６５ＫのＰＢＭＣ当たりＣＤ５６＋ＣＤ３ｅ−ＮＫ細胞の概数はおよそ８０００細胞であり、したがってＮＫ：腫瘍比は約０．４であった（ＭＭ患者ＮＫ対腫瘍細胞の比を推定する臨床データと同様；データ示さず）。図３２Ｂ〜図３２Ｅに示すように、抗体染色及びＦＡＣＳを用いて、ＭＭ腫瘍細胞上のＢＣＭＡ発現を測定し、多発骨髄腫標的細胞の細胞傷害性を観察した。データはソフトウェアプログラムＦｌｏｗＪｏ及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６で分析した。図３２ＢはＮＣＩ−Ｈ９２９細胞株を示し、図３２ＣはＲＰＭＩ−８２２６細胞株を示し、図３２ＤはＭＭ．１Ｓ細胞株を示し、図３２ＥはＭＯＬＰ−２細胞株を示す。非ＢＣＭＡ標的化／ＣＤ１６ａ陰性対照は、白抜きの記号で示す。ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、黒塗りの記号で示す。
【図３３】図３３Ａ〜図３３Ｃは、多発骨髄腫細胞株に対するＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉのインビトロ細胞傷害性を示す。図３３ＡはＮＣＩ−Ｈ９２９細胞株を示し、図３３ＢはＲＰＭＩ−８２２６細胞株を示し、図３３ＣはＭＭ．１５細胞株を示す。非ＢＣＭＡ標的化／ＣＤ１６ａ陰性対照は、白抜きの四角で示す。ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、黒塗りの丸で示す。ダラツムマブ（「Ｄａｒａ」）は、黒塗りの四角で示す。
【図３４】図３４Ａ〜図３４Ｃは、多発骨髄腫細胞株に対するＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉのインビトロ細胞傷害性を示す。ＮＫ細胞をＢＣＭＡ＋多発骨髄腫瘍細胞株と約４〜５のＥ：Ｔで共培養した。ドナーＡ…ＮＫ及び腫瘍細胞を、ＮＫ細胞及び試験物の添加前に、少なくとも３０分のあいだ０．５ｍｇ／ｍＬの低エンドトキシンｈＩｇＧでプレインキュベートした。ドナーＢ…プレインキュベーション工程なし。図３４Ａは、ドナーＡに対するＢＣＭＡ＋標的細胞の枯渇を示す。図３４Ｂは、ドナーＢに対するＳＫ−ＭＭ−２の枯渇を示す。図３４Ｃは、ドナーＢに対するＭＯＬＰ−２の枯渇を示す。図３４Ｂ及び図３４Ｃでは、非ＢＣＭＡ標的化／ＣＤ１６ａ陰性対照を白抜きの記号で示し、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉを黒塗りの記号で示す。
【図３５】図３５Ａ〜図３５Ｄは、低ＢＣＭＡ発現Ｒａｊｉ腫瘍細胞株に対して、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉ、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩＩ、及びＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩＩＩの細胞傷害性をインビトロで示す。ＢＣＭＡ＋標的細胞のインビトロでの溶解は、ＢＣＭＡ表面発現がほとんど検出できないにもかかわらず観察される。このインビトロ細胞傷害性アッセイは、５：１のＥ：Ｔで、濃縮初代ヒトＮＫ細胞４時間カルセイン放出アッセイを用いて行った。図３５Ａは、Ｒａｊｉ細胞株の溶解を示す。図３５Ｂは、Ｒａｊｉ細胞株の細胞傷害性を示す。図３５Ｃは、市販の抗ＢＣＭＡ抗体及びアイソタイプによって検出されるＢＣＭＡ発現を示す。図３５Ｄは、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉ、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩＩ、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩＩＩ、ＢＣＭＡ（Ｆｃサイレンシング）、及びアイソタイプによって検出されるＢＣＭＡ発現を示す。
【図３６】図３６Ａ〜図３６Ｃは、低ＢＣＭＡ発現Ｒａｊｉ腫瘍細胞株に対するＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉのインビトロ細胞傷害性を示す。図３６Ａは、Ｒａｊｉ細胞上のＢＣＭＡ発現を示す。図３６Ｂは、ＮＣＩ−Ｈ９２９（ＭＭ陽性対照）細胞上のＢＣＭＡ発現を示す。（Ａ）及び（Ｂ）について、ＡＰＣに複合した市販の抗ＢＣＭＡを、Ｒａｊｉ及びＮＣＩ−Ｈ９２９（ＭＭ陽性対照）細胞上のＢＣＭＡ発現の定量に用いた。（Ｃ）Ｒａｊｉ細胞及びＨ９２９細胞の細胞傷害性。ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉを黒塗りの記号で示し、非ＢＣＭＡ標的化／ＣＤ１６ａ陰性対照を白抜きの記号で示す。
【図３７】図３７Ａ〜図３７Ｂは、自家ＢＣＭＡ＋正常ヒト形質細胞に対するＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉのインビトロ活性を示す。図３７Ａは、陽性対照としての同種異系細胞を示す。図３７Ｂは、自家ＢＣＭＡ＋正常ヒト形質細胞を示す。ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉを黒塗りの記号で示し、非ＢＣＭＡ標的化／ＣＤ１６ａ陰性対照を白抜きの記号で示す。
【図３８】図３８Ａ〜図３８Ｃは、ＢＣＭＡ＋標的細胞の存在下におけるＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩによるＮＫ細胞上のＣＤ１６の活性化を示す。図３８ＡはＮＫ−ＣＤ１６＋細胞の数を示す。図３８ＢはＮＫＣＤ６９＋ＣＤ２５＋細胞の数を示す。図３８Ｃは標的細胞の数を示す。
【図３９】図３９Ａ〜図３９Ｂは、ＢＣＭＡ＋標的細胞の不在下におけるＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩによるＮＫ細胞上のＣＤ１６の活性化を示す。図３９ＡはＮＫ−ＣＤ１６＋細胞の数を示す。図３９ＢはＮＫＣＤ６９＋ＣＤ２５＋細胞の数を示す。
【図４０】図４０Ａ〜図４０Ｅは、ＮＫ細胞へのＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉの結合、及び血清存在下におけるＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉの細胞傷害性を示す。図４０Ａは、外因性ヒトＩｇの存在下における抗ＢＣＭＡ／ＣＤ１６ａの結合を示す。新鮮に調製されたヒトＮＫ細胞を、１０ｍｇ／ｍＬのＳＣＩＧ（Ｈｉｚｅｎｔｒａ）の存在下及び不在下において３７℃で１時間プレインキュベートし、次いで、指定された濃度でＤｙＬｉｇｈｔ６５０標識抗ＡＦＭ２６／ＣＤ１６ａにより染色した。図４０Ｂは、１００％の自家ヒト血清の存在下における抗ＢＣＭＡ／ＣＤ１６誘導標的細胞溶解を示す。エフェクタ細胞として新鮮に調製されたヒトＮＫ細胞を用いて、多発骨髄腫細胞株ＮＣＩ−Ｈ９２９を、指示濃度のＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉで処理した。ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉを添加する前に、細胞を、同じ健常ドナーからの熱不活性化自家ヒト血清と３７℃で３０分プレインキュベートした。図４０Ｃは、抗ＢＣＭＡ／ＣＤ１６ａが、ＮＫ細胞の喪失なしに５０％の自家ヒト血清の存在下でＢＣＭＡ＋標的細胞を枯渇させることを示す。図４０Ｄは、抗ＢＣＭＡ／ＣＤ１６ａが、ＮＫ細胞の喪失なしに５０％の自家ヒト血清の存在下でＢＣＭＡ＋標的細胞を枯渇させることを示す。図４０Ｃ及び図４０Ｄでは、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉを例として使用する。図４０Ｃ及び図４０Ｄでは、ヒトＮＫ細胞は、健康なヒト血液ドナーから単離された。ＮＫ細胞（図４０Ｄ）及びＭＭ．１Ｓ細胞（図４０Ｃ）を、アッセイセットアップの前に２時間、５０％ヒト自家血清中で別々にプレインキュベートした。ＮＫ細胞をおよそ５のＥ：Ｔ比でＭＭ．１Ｓ腫瘍細胞株と共培養し、３７℃にて５％のＣＯ２でおよそ２０時間、０．１〜１００ｎＭの１０倍に段階希釈した試験物に曝露した。ＣＤ１３８及びＣＤ５６による抗体染色とその後のＦＡＣＳとを用いて、ＭＭ．１Ｓ標的細胞の細胞傷害性性及びＮＫ生存をモニタした。データはソフトウェアプログラムＦｌｏｗＪｏ及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６で分析した。Ａｂ−１である非ＢＣＭＡ標的化／ＣＤ１６ａ陰性対照は、白抜きの記号で示す。ＢＣＭＡ／ＣＤ１６ａ抗体Ｉは、黒塗りの記号で示す。図４０Ｅは、第２の株Ｒ／Ｒ  ＭＭが、抗ＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａ抗体による治療のための標的指標であることを示す。この例では、ＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａ抗体Ｉを例として使用する。具体的には、この図のデータは、抗ＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａ抗体（例示目的のために使用したＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａ抗体Ｉ）が抗ＣＤ３８抗体（ダラツムマブ）と区別されることを示す。ダラツムマブはＭＭで補体依存性細胞傷害活性を有し（ｄｅ  Ｗｅｅｒｓ、Ｍ．ら（２０１１年）、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．」、そして第１８６巻、第３号、第１８４０〜１８４８頁）、ＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａ抗体Ｉはこれらの活性を有しないが、ＣＤ３８の架橋を介するシグナル伝達によりアポトーシスを誘導する能力を有する（（Ｏｖｅｒｄｉｊｋ、Ｍ．Ｂ．ら（２０１６年）、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．」、第１９７巻、第３号、第８０７〜８１３頁））。更に、ダラツムマブとは異なり、ＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａ抗体Ｉの活性は、図４１Ａ及び図４１Ｂに示されるようにＦｃ媒介薬物の活性を低下させるＣＤ１６Ａ多型によって影響されない。全体として、図４０Ｅは、ＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａ抗体ＩがＮＫ細胞（ＣＤ３８陽性である）を枯渇させないが、ダラツムンバブ（ｄａｒａｔｕｍｕｍｂａｂ）がＮＫ細胞を枯渇させることを示す。
【図４１】図４１Ａ〜図４１Ｂは、ＢＣＭＡ＋標的細胞の不在下におけるＣＤ１６Ａ発現及びＮＫ細胞活性化に対する血清の影響を示す。更に、血清存在下における低いＣＤ１６発現は、ＮＫ細胞の非ＣＤ１Ａ媒介活性化を示唆する。図４１Ａは血清によるより低いＣＤ１６Ａ検出を示す。図４１Ｂは、血清によるより高い非標的媒介活性化を示す。
【図４２】図４２Ａ〜図４２Ｃは、ＩＬ−１５処理がＭＭ細胞上の抗ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体の活性を増加したことを示す。図４２Ａは、（ａ）抗体なし、（ｂ）陰性対照１、（ｃ）陰性対照２、（ｄ）ＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａ抗体Ｉ、（ｅ）抗ＢＣＭＡ／ＣＤ１９抗体、及び（ｆ）ダラツムマブのいずれかで処理された腫瘍細胞の溶解率を示す。図４２Ｂは、（ａ）抗体＋ＩＬ−１５なし、（ｂ）陰性対照１＋ＩＬ−１５、（ｃ）陰性対照２＋ＩＬ−１５、（ｄ）ＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａ抗体Ｉ＋ＩＬ−１５、（ｅ）抗ＢＣＭＡ／ＣＤ１９抗体＋ＩＬ−１５、及び（ｆ）ダラツムマブ＋ＩＬ−１５のいずれかで処理された腫瘍細胞の溶解率を示す。図４２Ｃは、図４２Ａ及び図４２Ｂに示される陰性対照＃１、陰性対照＃２、及びＢＣＭＡ／ＣＤ１９の構造を示す。
【図４３】図４３は、ｄａｒａナイーブ患者、ｄａｒａ難治性患者の末梢血中のＮＫ細胞数を示す。図４３は、アテゾリズマブ試験のベースラインにおける末梢血（絶対数／ｕＬ）中のＮＫ血流データを示す。ＮＫ細胞をＣＤ５６／ＣＤ１６＋リンパ球としてゲーティングした。ＣＤ４５ｘＳＳＣ低集団（標準ゲーティング）、次いでＣＤ５６／ＣＤ１６＋集団にサブゲーティングした。アテゾリズマブでは、Ｄａｒａ難治性患者におけるＮＫレベルはＤａｒａナイーブよりも低く、健常ドナー範囲よりも低かった（点線間の領域）。
【図４４】図４４は、Ｒ／Ｒ  ＭＭ患者骨髄におけるＮＫ／腫瘍比を示す。
【図４５】図４５Ａ〜図４５Ｂは、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉによる細胞株のインビトロでの死滅を示す。ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉを黒丸で示し、ダラツムマブ（「Ｄａｒａ」）を黒い四角で示し、非標的抗ＣＤ１６Ａ二重特異性抗体であるＮＴｘ１６ａを白抜きされた四角で示す。図４５Ａでは、Ｅ：Ｔは０．０５であった。図４５Ｂでは、Ｅ：Ｔは０．５であった。
【図４６】図４６Ａ〜図４６Ｄは、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉ及びＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩＩの細胞傷害性に対する新鮮なＮＫ細胞の影響を示す。「新鮮に調製されたＮＫ細胞」とは、同一の日に新たに単離されたＰＢＭＣから精製されたＮＫ細胞を表す。「２日目のＮＫ細胞」とは、１日目に単離され、ＲＰＭＩ培地中で一晩培養されたＰＢＭＣから精製されたＮＫ細胞を表す。図４６Ａは、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞に対する新鮮に調製されたＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図４６Ｂは、ＭＭ．１Ｓ細胞に対する新鮮に調製されたＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図４６Ｃは、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞に対する２日目のＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図４６Ｄは、ＭＭ．１Ｓ細胞に対する２日目のＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。
【図４７】図４７は、凍結した原発性骨髄腫の骨髄単核細胞（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ：ＢＭＭＣ）におけるＦｃＲＨ５、ＢＣＭＡ、及びＣＤ３８の発現を示す。２０人のドナー及び対照（骨髄腫細胞株ＭＯＬＰ−２）由来の凍結原発性骨髄腫骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）について、ＦｃＲＨ５、ＢＣＭＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  １９Ｆ２）、ＣＤ３８細胞表面発現を評価した。簡単に言えば、ＢＭＭＣを解凍し、滅菌ＰＢＳで洗浄し、次いで１×１０＾６細胞／ｍＬの最終濃度まで再懸濁した。ＢＭＭＣを、生存率及び骨髄腫マーカー（ＣＤ４５、ＣＤ３１９、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＦｃＲＨ５）で染色した。細胞を固定し、洗浄した後、この細胞をＣａｎｔｏ  ＩＩ上で読み取った。ＦｃＲＨ５、ＢＣＭＡ、及びＣＤ３８の分析を、Ｌｉｖｅ／Ｓｉｎｇｌｅｔｓ／ＣＤ４５−／ＣＤ３１９＋細胞（骨髄腫細胞）を選択してＦｌｏｗＪｏで行った。ＦｃＲＨ５、ＢＣＭＡ、及びＣＤ３８のＭＥＳＦ（Ｌｏｇ１０）値を統計プロットソフトウェアＰｒｉｓｍでプロットした。
【図４８】図４８Ａ〜図４８Ｂは、正常なヒト形質細胞及び初代ＭＭ細胞上でのＢＣＭＡ発現を示す。図４８Ａは、正常ヒト形質細胞上でのＢＣＭＡの発現を示す。図４８Ｂは、凍結した原発性骨髄腫ＢＭＭＣにおけるＢＣＭＡ発現の例を示す。図４８Ａ及び図４８Ｂの両方について、ＢＣＭＡを用いて図４７に上述されたプロトコルに従って細胞を染色及びゲーティングし、次いで最大の％をＦｌｏｗＪｏにプロットした。灰色の斜線のピークはＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｎｕｓ  Ｏｎｅ（ＦＭＯ）対照であり、赤色のピークはＢＣＭＡ発現である。
【図４９】図４９Ａ〜図４９Ｆは、ＮＫ細胞活性化及びＲＯＣＫ誘導剤によるＩＦＮ−γ放出の誘導が、厳密に標的細胞の存在に依存していたことを示す。図４９Ａ〜図４９Ｃは、ＢＣＭＡ＋ＲＰＭＩ−８２２６標的細胞の存在下及び不在下における、ＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａ  ＲＯＣＫ誘導剤ＴａｎｄＡｂ＿Ａ、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿Ｄ、及びＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ＿Ａの濃度を増加させた場合のＰＢＭＣ培養物中のＣＤ６９＋ＮＫ細胞の割合を示す。図４９ＡはＴａｎｄＡｂ＿Ａのためのものであり、図４９ＢはｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿Ｄのためのものであり、図４９ＣはＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ＿Ａのためのものである。ヒトＰＢＭＣを、増加させた濃度の抗体の存在下（四角）又は、抗体の不在下（三角）において、ＲＰＭＩ−８２２６標的細胞（Ｅ：Ｔ比：５０：１）と共に（黒塗りの記号）又はＲＰＭＩ−８２２６標的細胞無し（白抜きの記号）で培養した。２２時間のインキュベーション後、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞上のＣＤ６９表面発現をフローサイトメトリで分析した。図４９Ｄ〜図４９Ｆは、新鮮に単離されたヒトＰＢＭＣが、ＢＣＭＡ＋ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の存在下又は不在下において、５０：１のＥ：Ｔ比で、１０μｇ／ｍＬのＴａｎｄＡｂ＿Ａ、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿Ｄ、若しくはＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ＿Ａと共に又はこれら無しで、培養されたことを示す。図４９ＤはＴａｎｄＡｂ＿Ａのためのものであり、図４９ＥはｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿Ｄのためのものであり、図４９ＦはＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ＿Ａのためのものである。２４時間のインキュベーション後、上清中のＩＦＮ−γ濃度を定量した。＊：検出の下限未満。
【図５０】図５０は、ＢＣＭＡ指向性Ｔ細胞誘導剤及びＲＯＣＫ誘導剤によって誘導された、ヒトＰＢＭＣ培養における炎症性サイトカイン放出の比較を示す。新鮮に単離したヒトＰＢＭＣを、ＢＣＭＡ／ＣＤ３  ＢｉＴＥ、又はＮＫ細胞誘導ＲＯＣＫ誘導剤ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿Ｄ若しくはＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ＿Ａの増加濃度の存在下又は不在下において、ＢＣＭＡ＋細胞株ＮＣＩ−Ｈ９２９（Ｅ：Ｔ比５０：１）と共培養した。２４時間のインキュベーション後、上清中のサイトカイン濃度を定量した。対照：抗体の追加なし。
【図５１】図５１は、いくつかのＲＯＣＫ（登録商標）抗体フォーマットの存在下における、Ａ−４３１細胞に対する濃縮初代ヒトＮＫ細胞のインビトロ細胞傷害性を示す。Ｅ：Ｔ比５：１での４時間カルセイン放出細胞傷害性アッセイにおける、示されたＥＧＦＲ標的化ＲＯＣＫ抗体の代表的なシグモイド型用量反応曲線。ＳＡＢＣ、特異的抗体結合能（アッセイ３回以上の平均値）。
【図５２】図５２Ａ〜図５２Ｄは、競合するポリクローナル、モノクローナル、又はＦｃ増強ＩｇＧの存在下又は不在下での、インビトロ細胞傷害性アッセイにおけるＲＯＣＫ（登録商標）及びＩｇＧ抗体の比較を示す。ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａ  ＴａｎｄＡｂ、抗ＣＤ３０  ＩｇＧ１（ＩｇＡｂ）、又はＦｃ媒介エフェクタ機能増強変異Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（ＩｇＡｂ（Ｆｃ増強））を有する抗ＣＤ３０  ＩｇＧ１の連続希釈液の存在下において、５：１のＥ：Ｔ比でエフェクタ細胞として初代ヒトＮＫ細胞を有するカルセイン標識ＣＤ３０＋ＫＡＲＰＡＳ−２９９標的細胞を用いた、４時間カルセイン放出細胞傷害性アッセイ。アッセイは、ＲＰＭＩ  １６４０培地中、又は１０ｍｇ／ｍＬのポリクローナルヒトＩｇＧ、１０ｍｇ／ｍＬのモノクローナルヒト抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧ１（ＩｇＡｂ）、若しくは１０ｍｇ／ｍＬのＦｃ増強モノクローナルヒト抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧ１（ＩｇＡｂ（Ｆｃ増強））を補充した培地中で実施した。図５２Ａは、ＲＰＭＩ  １６４０培地を示す。図５２Ｂは、１０ｍｇ／ｍＬのポリクローナルヒトＩｇＧを補充した培地を示す。図５２Ｃは、１０ｍｇ／ｍＬのモノクローナルヒト抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧ１を示す。図５２Ｄは、１０ｍｇ／ｍＬのＦｃ増強モノクローナルヒト抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧ１を示す。
【図５３】図５３Ａ〜図５３Ｄは、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩのＢＣＭＡ標的化部分及びＣＤ１６Ａ抗原結合部分の配列を示す。図５３Ａは、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩのＢＣＭＡ標的化部分のＣＤＲ配列を示す。図５３Ｂは、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩのＢＣＭＡ標的化部分の重鎖及び軽鎖可変領域配列を示す。図５３Ｃは、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩのＣＤ１６Ａ抗原結合部分のＣＤＲ配列を示す。図５３Ｄは、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の重鎖及び軽鎖可変領域配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
Ｉ．  定義
用語「多重特異性」とは、少なくとも２つの異なるエピトープ、特に異なる抗原のエピトープに結合する抗原結合部位からなる抗原結合分子を指す。「多重特異性」には、二重特異性、三重特異性、四重特異性が含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
用語「価数」とは、抗原結合タンパク質中の規定数の抗原結合部分の存在を示す。天然のＩｇＧは、２つの抗原結合部分を持ち、二価である。本発明に係る抗原結合タンパク質は、少なくとも三価である。四価、五価、及び六価の抗原結合タンパク質の例は、本明細書に記載されている。
【００３２】
用語「ポリペプチド」とは、アミノ酸残基がアミド結合で連続的に結合されたポリマーを指す。ある特定の実施形態では、用語「ポリペプチド」とは、通常３０個以上のアミノ酸からなる分子の群を指す。ポリペプチドは更に、二量体、三量体、及び上位オリゴマーなどの多量体、すなわち２つ以上のポリペプチド分子からなる多量体を形成してもよい。このような二量体、三量体等を形成するポリペプチド分子は、同一であっても、又は非同一であってもよい。このような多量体の対応する高次構造は、結果として、ホモ二量体又はヘテロ二量体、ホモ三量体又はヘテロ三量体等と称される。ヘテロ多量体の例としては、天然に存在する形態である抗体分子が挙げられ、２本の同一の軽ポリペプチド鎖と、２本の同一の重ポリペプチド鎖と、からなる。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」とはまた、修飾が、例えばグリコシル化、アセチル化、及びリン酸化などの翻訳後修飾によって影響を受ける、天然に修飾されたペプチド／ポリペプチド／タンパク質を指す。本明細書で言及される場合の「ペプチド」、「ポリペプチド」、又は「タンパク質」はまた、ペグ化のような化学的に修飾されたものであってもよい。このような修飾は当技術分野で公知であり、本明細書で以下に記載する。
【００３３】
「Ｆｖポリペプチド」とは、抗体可変（Ｆｖ）ドメインが順次結合された融合ポリペプチドを示す。ポリペプチドは、Ｎ末端及び／又はＣ末端の配列延長に加えて、連続するアミノ酸残基を有していてもよい。例えば、ポリペプチドは、好ましくはポリペプチドの精製及び検出にも有用であり得るＣ末端に、タグ配列を含有してもよい。タグ配列の例には、ヒスチジンタグ、例えば６個のＨｉｓ残基からなるＨｉｓタグ（配列番号５８）、又はＣタグ、例えばＥＰＥＡテトラペプチド（配列番号５９）がある。多量体抗原結合分子の場合、異なるＴａｇ配列は、異なるポリペプチド、例えば、第１のポリペプチドのためのＨｉｓタグと、ヘテロ二量体分子の第２のポリペプチドのためのＣタグとを使用してもよい。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、抗原結合部位を提供する可変ドメインと、定常抗体ドメイン、例えばポリペプチドに連結されたＣＬ、ＣＨ１ＣＨ、及び／又はＦｃ部分（ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。例えば、そのような実施形態は、少なくとも１つの定常抗体ドメイン、例えばＦｃ部分に融合したＦｖポリペプチドを含む。更なる実施形態では、ポリペプチドは、別の薬剤、例えば、毒素、免疫調節剤、又はシグナル発生剤に結合されていてもよい。
【００３４】
用語「Ｆｃ部分」とは、免疫グロブリンＨ鎖のＣ末端部分を含み、ＩｇＧ領域のＦｃ領域の少なくとも１つの機能、特にＦｃＲｎと結合する機能を保持しているポリペプチドを指す。抗体エフェクタの機能は、Ｆｃ領域の配列によって決定される。Ｆｃ部分は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、又はＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチド鎖から構成されていてもよい。ＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチド鎖は、別のＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチド鎖と組み合わされて、互いに結合した２つのＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドの二量体を形成する。ここで、二量体化は、ヒンジ領域ＮＣ末端のＣＨ２ドメインへの共有結合によって促進される。それゆえ、いくつかの実施形態では、Ｆｃ部分は、２つのＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチド鎖の二量体と、ヒンジ領域とからなる。好ましくは、Ｆｃ部分は、Ｉｇクラス、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、特にＩｇＧ１の定常ドメインからなる。軽鎖定常領域（ＣＬ）は、カッパ（κ）、ラムダ（λ）、及びシグマ（σ）から選択することができる。ここで、該ヒトラムダクラスは、ラムダ１〜４のサブクラスを有する。
【００３５】
「ヒンジ」ドメインは、Ｆｃ部分と同じ若しくは異なるＩｇＧクラスのものであってもよいし、又は操作され、天然には存在しないヒンジドメインであってもよい。ＩｇＧヒンジ領域の例は、配列番号２３に示されているようなアミノ酸配列を有する。短縮されたヒンジ領域などの野生型ヒンジ領域のバリアント、例えば配列番号２４のアミノ酸配列を有するミドルヒンジ（ｍｉｄｄｌｅ．ｈｉｎｇｅ）として示されたヒンジもまた含まれる。
【００３６】
用語「抗原結合タンパク質」及び「抗原結合分子」（ハイフンの有無にかかわらず）とは、抗原結合特性を有する免疫グロブリン誘導体を指すために、本明細書において互換的に使用される。すなわち、結合タンパク質は抗原結合分子である。結合タンパク質は、標的抗原と結合することができる免疫学的に機能する免疫グロブリン部分を含む。免疫学的に機能する免疫グロブリン部分は、免疫グロブリン若しくはその一部、免疫グロブリン部分に由来する融合ペプチド、又は抗原結合部位を形成する免疫グロブリン部分を結合する複合体を含み得る。各抗原結合部位は、抗原結合部分が由来する免疫グロブリン重鎖又は軽鎖の少なくともＣＤＲからなる。用語「抗原結合タンパク質」及び「抗原結合分子」（ハイフンの有無にかかわらず）とは、例えば追加の定常ドメインを有するＦｖドメインに基づくＩｇＧ様融合ポリペプチドを含む、それらの抗原に対する特異性及び親和性を保持する抗体断片、抗体誘導体、又は抗体様結合タンパク質を指すために、本明細書で互換的に使用される。価性、多重特異性、薬物動態学的、及び薬力学的特性などの所望の特徴に応じて、Ｆｖ及び定常ドメイン並びに／又は追加の機能ドメインは、例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ及びＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ、「ｍＡｂｓ」（２０１７年）、第９巻、第２号、第１８２〜１９２頁、又はＳｐｉｅｓｓら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（２０１５年）、第６７巻、第９５〜１０６頁に記載されているような、異なる分子フォーマット又はタンパク質足場においてモジュール的に組み立てられる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、単一のポリペプチド鎖からなる。このような抗原結合タンパク質は、単量体である。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、少なくとも２本のポリペプチド鎖からなる。このような抗原結合タンパク質は、多量体、例えば、二量体、三量体、又は四量体である。
【００３８】
好ましくは、抗原結合タンパク質はヒトであり、最も好ましくは完全ヒトである。
【００３９】
用語「抗原結合部分」とは、抗原の抗原性決定因子（エピトープ）に特に特異的に結合する、抗原結合タンパク質の抗体抗原結合部位又はパラトープを指す。抗原結合部位とは、抗原を認識することができ、抗原に特異的に結合する、抗原結合タンパク質の結合部分のことである。
【００４０】
本明細書中の「Ｆｖ」とは、抗原を認識する抗体の軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）両方の可変ドメインからなる抗原結合部分、すなわち抗原のエピトープに結合する部分を意味する。ある特定の実施形態では、抗原結合部位は、単一ドメイン（ｓｄＡｂ）、例えば、ラクダ類由来のＶＨＨ断片、又は軟骨魚類由来のＶＮＡＲ断片であってもよい。
【００４１】
各抗原結合部分は、同じエピトープに結合する抗体、すなわち免疫グロブリン、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）、及び抗体可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）によって形成されるが、一方で可変重鎖ドメイン（ＶＨ）は、３つの重鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）は、３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。抗原結合部位の可変重鎖及び軽鎖ドメインは、例えばペプチドリンカーによって互いに共有結合して、又は非共有結合的に互いに結合して、抗原結合部位を形成していてもよい。
【００４２】
「リンカー」とは、一方のドメインのＣ末端が他方の並置ドメインのＮ末端に結合されているか、又はその逆の場合もある、抗原結合部分を形成する２つの並置可変ドメインをリンカーペプチドで結合するアミノ酸の配列を指す。アミノ酸組成物については、Ｆｖ、すなわちＶＨ／ＶＬ、抗原結合部位、及び抗原認識部位の形成を阻害しないとともに、多量体化、例えば多重特異性抗原結合タンパク質のポリペプチドの二量体化を阻害しない、ペプチドリンカー配列が選択される。例えば、グリシン残基及びセリン残基からなるリンカーは、一般にプロテアーゼ耐性を与える。いくつかの実施形態では、（Ｇ２Ｓ）ｘペプチドリンカーが使用され、ここで、例えば、ｘ＝１〜２０、例えば（Ｇ２Ｓ）、（Ｇ２Ｓ）２、（Ｇ２Ｓ）３、（Ｇ２Ｓ）４、（Ｇ２Ｓ）５、（Ｇ２Ｓ）６、（Ｇ２Ｓ）７若しくは（Ｇ２Ｓ）８、又は（Ｇ３Ｓ）ｘペプチドリンカーが使用され、ここで、例えば、ｘ＝１〜１５、又は（Ｇ４Ｓ）ｘペプチドリンカーが使用され、ここで、例えば、ｘ＝１〜１０、好ましくは１〜６である。リンカーのアミノ酸配列は、例えば、抗原結合部位の形成及びポリペプチドの生産収率を向上させるために、ファージディスプレイ法などにより最適化することができる。
【００４３】
「コネクタ」とは、抗原結合部分を、Ｆａｂ断片、ヒンジ、又はＦｃ部分と結合させたペプチドを指す。定義により、コネクタは２つの可変ドメインを結合するペプチドではない。
【００４４】
リンカー及びコネクタの長さは、抗原結合部分のＦｖポリペプチドの折り畳み及び柔軟性に影響を与え得る。Ｆｖポリペプチドの所望の柔軟性は、標的抗原密度及び標的抗原へのアクセス性、すなわち標的抗原上のエピトープに依存する。より長いリンカー又はコネクタは、より機敏な抗原結合部位を有するより柔軟なＦｖポリペプチドを提供することができる。二量体抗原結合ポリペプチドの形成に対するリンカー長の効果は、例えば、Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａら、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」（２００１年）、第２４８巻、第４７〜６６頁；Ｐｅｒｉｓｉｃら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」（１９９４年）第２巻、第１２１７〜１２２６頁；Ｌｅ  Ｇａｌｌら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」（２００４年）、第１７巻、第３５７〜３６６頁、及び国際公開第９４／１３８０４号に記載されている。
【００４５】
一本鎖可変抗体断片」又は「ｓｃＦｖ」は、ペプチドリンカーを介して軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に任意に融合した、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）からなる抗原結合部位を含む。ｓｃＦｖは、次のポリペプチド鎖であってもよい：ポリペプチド鎖のＮ末端からＣ末端までのＶＬ−リンカー−ＶＨ又はＶＨ−リンカー−ＶＬ（Ｈｕｓｔｏｎら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」（１９８８年）、第８５巻、第５８７９〜８３頁）。ＶＨドメインとＶＬドメインと間のリンカーにより、抗原結合を可能にする所望の構造を形成することができる。
【００４６】
「抗原結合（Ｆａｂ）断片」又は「Ｆａｂ」は、重（Ｈ）鎖由来配列及び軽（Ｌ）鎖由来配列のそれぞれが二量体化して形成された１つの定常（ＣＨ１、ＣＬ）ドメイン及び１つの可変ドメイン（ＶＨ、ＶＬ）を含み、ここで、可変ドメインＶＨ及びＶＬは、抗原結合部位を構成する。２つのＦａｂ’断片は、ヒンジ領域を介してＦｃ部分にＮ末端でＦ（ａｂ’）２断片として結合する。
【００４７】
「ダイアボディ」（Ｄｂ）は、２対の可変重（ＶＨ）及び可変軽（ＶＬ）鎖ドメイン、第１の対及び第２の対からなり、２つのＶＬ／ＶＨ抗原結合部位に結合する、二価Ｆｖ分子を示す。可変ドメインの各対は、ポリペプチドの中で順次結合する。ある特定の実施形態では、二価のＦｖ分子は、２つの並置可変ドメインの第１及び第２の対からなり、ここで、各対において、２つの可変ドメインは、短いリンカーによって結合された可変ドメイン間の分子内会合を排除する短いペプチドリンカーによって融合する。可変ドメインの第１の対は、可変ドメインの第２の対と強制的に関連づけられてクロスオーバして、２つのＦｖ抗原結合部位を形成する。したがって、２つの抗原結合部分のそれぞれは、可変ドメインの第１の対の可変ドメイン１つ、及び可変ドメインの第２の可変ドメイン１つによって形成される。したがって、このようなダイアボディは、短いリンカーによって直接結合されていない２つの可変ドメインからなる、少なくとも１つの抗原結合部位を構成する。ダイアボディでは、第１の抗原結合部分の可変ドメインが第２の抗原結合部分の可変ドメインとリンカーで連結されている。例えば、第１の抗原結合部分のＶＨが第１のポリペプチド中の第２の抗原結合部分のＶＬに第１のリンカーで結合され、第１の抗原結合部分のＶＬが第２のポリペプチド中の第２の抗原結合部分のＶＨに第２のリンカーで結合されている。並置された可変ドメインの各対において、短い第１リンカー又は第２リンカーは、一方の可変ドメインのＣ末端と他方の可変ドメインのＮ末端とを接続するか、又はその逆である。各対において、可変ドメインは、ＶＬ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ、ＶＨ−ＶＨ、及びＶＬ−ＶＬとして、Ｎ末端からＣ末端まで配向することができ、ここで、対の２つの可変ドメインは、異なる抗原エピトープ特異性を有することができ、又は同じ抗原エピトープ特異性を有することができる。ある特定の例では、２つの可変ドメインは、一方の可変ドメインのＣ末端と、対の他方の可変ドメインのＮ末端との間のペプチド結合によって、直接連結されている。ダイアボディの可変ドメインの第１及び第２の対のそれぞれにおける２つの可変ドメインを連結する短いペプチドリンカーの長さは、リンカーによって連結された可変ドメイン間の分子内会合が妨げられるような長さである。このようなリンカーは「短い」。すなわち、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は約１２個のアミノ酸残基からなる。アミノ酸残基が０の場合、リンカーはペプチド結合である。このような短いリンカーは、２対の可変ドメイン間の正しい二量体化、及び２つのＦｖ抗原結合部位の形成を促進する。リンカーを約１２以下のアミノ酸残基に短縮することは、一般に、同じポリペプチド鎖上の隣接するドメインが互いに相互作用することを防止する。本発明の実施形態では、これらのリンカーは、約３〜約１２個、例えば５〜１０個、特に７〜９個の連続するアミノ酸残基からなる。リンカーの長さは、ダイアボディのポリペプチド内の特定のドメイン配向に調整されてもよい。その上、対の可変抗体ドメイン間に１２個以上のアミノ酸残基を伴うリンカーを有する２つのポリペプチドが、互いに正しく二量体化することは、原理的に可能である（例えば、Ｌｅ  Ｇａｌｌら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」（２００４年）、第１７巻、第３５７〜３６６頁を参照のこと）。
【００４８】
「一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）」は、第１及び第２のポリペプチドを融合する更なるリンカーを加えることによって、一本鎖ポリペプチドに変換されたダイアボディ誘導体を示す（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎら、「Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ」（１９９９年）、第２２６巻、第１７９〜１８８頁）。したがって、更なるリンカーは、第１のリンカーによって連結された第１及び第２の抗原結合部分の可変ドメインからなる第１のポリペプチドのＣ末端と、第２のリンカーによって連結された第１及び第２の抗原結合部分の認識可変ドメインからなる第２のポリペプチドのＮ末端とを連結している。よって、ｓｃＤｂは、単一のポリペプチド鎖、すなわちＦｖポリペプチドであり、ここで、２つの抗原結合部分の４つの可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端まで次の通り配置され：
−  ＶＬ−リンカー１−ＶＨ−リンカー３−ＶＬ−リンカー２−ＶＨ、又は
−  ＶＬ−リンカー１−ＶＬ−リンカー３−ＶＨ−リンカー２−ＶＨ、又は
−  ＶＨ−リンカー１−ＶＬ−リンカー３−ＶＨ−リンカー２−ＶＬ、又は
−  ＶＨ−リンカー１−ＶＨ−リンカー３−ＶＬ−リンカー２−ＶＬ、
リンカー１及びリンカー２は、ダイアボディで使用されるような「短い」リンカーであり、例えば、１３個未満、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のアミノ酸残基から構成される。
【００４９】
リンカー３は、すなわち、分子内折返し、及び２つのＮ末端可変ドメインと２つのＣ末端可変ドメインとの２つの抗原結合部分への会合を促進するｓｃＦｖに用いられるような、より柔軟なリンカーである。リンカー３は１３個以上のアミノ酸残基、例えば１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のアミノ酸残基からなる。いくつかの実施形態では、リンカー３は１５〜２５個、好ましくは１５〜２０個又は１３〜１８個のアミノ酸である。
【００５０】
用語「タンデムダイアボディ」は、翻訳されたポリペプチド鎖のうちの２つのホモ二量体化を可能にする単一遺伝子構築物中の少なくとも４つの可変ドメイン（２つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び２つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ））を連結することによって構築された、抗原結合分子を指す。このようなタンデムダイアボディでは、リンカーの長さは、分子が単量体一本鎖分子を形成するためにそれ自体に折り返すことができないように、可変ドメインの分子内のペアリングを防止するようなものであり、むしろ別の鎖の相補的なドメインとペアリングすることを余儀なくされる。可変ドメインはまた、この二量体化の間に対応する可変ドメインが対になるように配置される（Ｗｅｉｃｈｅｌら、「Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ」（２０１５年）、第２０巻、第１号、第２７〜３２頁；Ｒｅｕｓｃｈら、「ｍＡｂｓ」（２０１４年）、第６巻、第３号、第７２８〜７３９頁）。
【００５１】
「二重親和性リターゲティング分子（ＤＡＲＴ）」とは、タンパク質足場を指す。ここで、第１の抗原結合部分のＶＨは第２のポリペプチド上の第２の抗原結合部分のＶＬに連結され、第２の抗原結合部分のＶＨはＶＬ（Ａ）−ＶＨ（Ｂ）＋ＶＬ（Ｂ）−ＶＨ（Ａ）の配列で第１のポリペプチド上のＶＬに連結され、ここで、鎖間ジスルフィド結合は、分子を安定化させるために導入されている。
【００５２】
用語「標的」又は「標的抗原」とは、ＮＫ細胞がＮＫ細胞の細胞傷害性を誘導又は誘発するように指示されるべき細胞のタイプ、すなわち標的細胞若しくはウイルス感染細胞によって発現されるか、又はそれと関連する抗原を指す。標的抗原の例は、腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原（Ｔｕｍｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ：ＴＡＡ）であってもよい。腫瘍抗原又はＴＡＡは、標的細胞の表面に発現してもよいし、又はＭＨＣ制限ペプチドとしてＭＨＣ複合体によって示されてもよい。腫瘍抗原の例としては、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＣＲ４、ＣＳ−１、ＧＤ２、マトリックスメタロプロテアーゼ１（ＭＭＰ１）、ラミニン受容体前駆体タンパク質、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｅｐ−ＣＡＭ、ｇｐＡ３３、ＡＭＨＲＩＩ、ＰＤＧＦＲα、ＳＬＡＭＦ７、ＰＬＡＰ、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ（ＴＦ）抗原、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＩＧＦＲ、ＩＬ４−Ｒα、ＩＬ１３−Ｒ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＴＡＧ−７２、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ＢＩＮＧ−４、サイクリン−Ｂ１、９Ｄ７、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、テロメラーゼ、メソセリン、サバイビン、ＳＡＰ−１、がん精巣抗原（ＢＡＧＥファミリ、ＣＡＧＥファミリ、ＧＡＧＥファミリ、ＭＡＧＥファミリ、ＳＡＧＥファミリ、ＸＡＧＥファミリ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ−２、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｇｐ１００／ｐｍｅｌ１７、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１／−２、ＭＣ１Ｒ、β−カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、ＣＭＬ６６、ＭＡＲＴ−２、ｐ５３、Ｒａｓ、ＴＧＦ−βＲＩＩ、及びＴＣＲ（「Ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｈｏｌｌａｎｄ−Ｆｒｅｉ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．」、第６版、Ｋｕｆｅ  ＤＷ、Ｐｏｌｌｏｃｋ  ＲＥ、Ｗｅｉｃｈｓｅｌｂａｕｍ  ＲＲ．ら、編者Ｈａｍｉｌｔｏｎ（ＯＮ）：Ｂｅｃｋｅｒ；２００３年より）。「標的」及び「標的抗原」はまた、血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む。ある特定の実施形態では、標的抗原は、ＢＣＭＡである。
【００５３】
他の実施形態では、標的抗原は、例えば、デングウイルス、単純ヘルペス、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス、ヒトＴ細胞リンパ腫ウイルス、インフルエンザウイルス、ＲＳＶ、パピローマウイルス（上記のＥ６及びＥ７に加え、抗原を含む）インフルエンザウイルス、又はＨＩＶからのウイルス又は細菌性病原体のような感染性物質であってもよい。ＭＨＣ制限ペプチドとしてＭＨＣ複合体によって示されるペプチド標的もまた含まれる。
【００５４】
「ＣＤ１６Ａ」とは、ＮＫ細胞の細胞表面に発現する、別名ＦｃγＲＩＩＩＡとしても知られる活性化受容体ＣＤ１６Ａを指す。ＣＤ１６ＡはＮＫ細胞の細胞傷害活性を誘発する活性化受容体である。ＣＤ１６Ａに対する抗体の親和性は、ＮＫ細胞活性化を誘発する能力と直接相関しており、したがってＣＤ１６Ａに対する親和性が高いほど、活性化に必要な抗体の量を減らすことができる。抗原結合タンパク質の抗原結合部位はＣＤ１６Ａに結合するが、ＣＤ１６Ｂには結合しない。例えば、ＣＤ１６Ａに結合するがＣＤ１６Ｂには結合しない重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）可変ドメインからなる抗原結合部位は、ＣＤ１６Ｂには存在しないＣ末端配列ＳＦＦＰＰＧＹＱ（配列番号５７）及び／又はＣＤ１６Ａの残基Ｇ１３０及び／又はＹ１４１（配列番号４８）のアミノ酸残基からなるＣＤ１６Ａのエピトープに特異的に結合する抗原結合部位によって提供されてもよい。
【００５５】
「骨髄腫細胞」とは、悪性形質転換によって骨髄の中の形質細胞が生じた悪性（がん性）の形質細胞である。骨髄腫では、悪性形質細胞が大量の異常な抗体を産生するが、この抗体は感染と戦う能力がない。これらの異常抗体は、骨髄腫の腫瘍マーカーとして機能する、いわゆるモノクローナルタンパク質又はＭタンパク質である。骨髄腫細胞は、ＣＤ１９−／ＣＤ３８＋／ＣＤ１３８＋／ＢＣＭＡ＋という表現型を有する。したがって、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、及びＢＣＭＡは、骨髄腫細胞に発現する抗原を表す。また、ＣＤ１９／ＣＤ２０／ＣＤ２２／ＢＣＭＡ及び他の抗原に陽性であるＢ細胞系統の悪性表現型も含まれる（これは、古典的に血漿細胞として理解されていないが、メモリＢ細胞又は血漿前細胞系統からの進化である可能性がある表現型を含むべきである）。
【００５６】
「ＥＧＦＲ」とは、ヒトにおける上皮細胞増殖因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＥＧＦＲ；ＥｒｂＢ−１；ＨＥＲ１）を指し、活性化、突然変異、及び病態生理学的プロセスに関与していると記載されている全てのアイソフォーム又はバリアントを含む。ＥＧＦＲ抗原結合部位は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインにあるエピトープを認識する。ある特定の実施形態では、抗原結合部位は、ヒト及びカニクイザルＥＧＦＲに特異的に結合する。
【００５７】
上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は、受容体チロシンキナーゼのＨＥＲファミリのメンバーであり、４つのメンバー：ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）から構成されている。。リガンド結合（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦａ、ＨＢ−ＥＧＦ、ニューレグリン、ベタセルリン、アンフィレグリン）を介した受容体の刺激は、チロシンリン酸化を介して細胞内ドメインの内在性受容体チロシンキナーゼを活性化し、受容体のＨＥＲファミリメンバーとのホモ二量体化又はヘテロ二量体化を促進する。これらの細胞内ホスホチロシンは、ＭＡＰＫ及びＰＩ（３）Ｋ／Ａｋｔを含む様々なアダプタータンパク質又は酵素のドッキング部位として機能し、細胞増殖、血管新生、アポトーシス抵抗性、浸潤、及び転移に影響を与える多くのシグナル伝達カスケードを同時に開始する。
【００５８】
「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」は、ＥＧＦＲコード化配列のエクソン２〜７にまたがる塩基対のインフレーム欠失に起因する、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン変異体を指す（Ｇａｎ  ＨＫら、「ＦＥＢＳ」（２０１３年）、第２８０巻、第５３５０〜５３７０頁）。
【００５９】
用語「結合ドメイン」とは、本発明に関連して、標的分子（抗原）上の所与の標的エピトープ又は所与の標的側、それぞれ、例えばＣＤ１６及び標的細胞表面抗原に、（特異的に）結合する／相互作用する／認識するドメインを特徴付ける。第１の結合ドメイン（例えば、ＣＤ１６を認識）の構造及び機能、並びに好ましくは第２の結合ドメイン（標的細胞表面抗原を認識）の構造及び／又は機能は、抗体の構造及び／若しくは機能、例えば全長若しくは全免疫グロブリン分子の構造及び／若しくは機能に基づいており、並びに／又は抗体若しくはその断片の可変重鎖（ＶＨ）及び／若しくは可変軽鎖（ＶＬ）ドメインから導出される。好ましくは、第１の結合ドメインは、３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに／又は３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）が存在することを特徴とする。第２の結合ドメインはまた、好ましくは、標的の結合を可能にする抗体の最小構造要件を含む。より好ましくは、第２の結合ドメインは、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに／又は３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む。第１及び／又は第２の結合ドメインは、既存の（モノクローナル）抗体からのＣＤＲ配列を足場にグラフティングすることによってよりもむしろ、ファージディスプレイ法又はライブラリスクリーニング法によって産生されるか、又は得られることが想定される。
【００６０】
用語「（特異的に）結合する」、「（特異的に）認識する」、「（特異的に）指示される」、又は「（特異的に）反応する」とは、本発明に従って、それぞれ、結合ドメインが、標的分子（抗原）、例えばＣＤ１６ａ及び標的細胞表面抗原、例えばＢＣＭＡ上の所与のエピトープ又は所与の標的側と相互作用するか、又は特異的に相互作用することを意味する。
【００６１】
用語「本質的に／実質的に結合しない」又は「結合することができない」とは、本発明の結合ドメインがＣＤ１６ａ以外のタンパク質又は抗原と結合せず、標的細胞表面抗原は、すなわち、ＣＤ１６ａ以外のタンパク質又は抗原、及び標的細胞表面抗原に対して、約３０％以上、好ましくは約２０％以下、より好ましくは約１０％以下、特に好ましくは約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、又は約５％以下の反応性を示さず、これによりＣＤ１６ａ及び標的細胞表面抗原への結合がそれぞれ約１００％となることを意味する。
【００６２】
特異的な結合は、結合ドメイン及び抗原のアミノ酸配列の特異的なモチーフによって影響を受けると考えられている。したがって、結合は、それらの一次構造、二次構造、及び／又は三次構造の結果、並びに該構造の二次修飾の結果として達成される。抗原相互作用側とその特異的な抗原との特異的な相互作用により、該側と該抗原との単純な結合が生じてもよい。更に、抗原相互作用側とその特異的抗原との特異的相互作用は、代替的又は追加的に、例えば抗原の立体構造の変化の誘導、抗原のオリゴマー化等に起因してシグナルを開始させることがある。
【００６３】
用語「可変」とは、その配列に可変性を示し、特定の抗体の特異性及び結合親和性の決定に関与する、抗体又は免疫グロブリンドメインの部分（すなわち、「可変ドメイン（複数可）」）を指す。可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）とが対になることで、単一の抗原結合側を形成する。
【００６４】
可変性は、抗体の可変領域全体に均一に分布しているのではなく、重鎖及び軽鎖可変領域のそれぞれのサブドメインに集中している。これらのサブドメインは、「超可変領域」又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのより保存された（すなわち、非超可変）部分は「フレームワーク」領域（ＦＲＭ又はＦＲ）と呼ばれ、抗原結合面を形成するため三次元空間内において６つのＣＤＲのための足場を提供する。自然界に存在する重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、４つのＦＲＭ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）、主にβシート構成を採用し、３つの超可変領域によって連結され、βシート構造に連結し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する、４つのＦＲを含む。各鎖内の超可変領域は、ＦＲＭにより近接近して一緒に保持され、他の鎖の超可変領域とともに、抗原結合側の形成に寄与する（上述のＫａｂａｔら参照）。
【００６５】
用語「ＣＤＲ」及びその複数形「ＣＤＲｓ」とは、３つが軽鎖可変領域（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３）の結合特性を構成し、３つが重鎖可変領域（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）の結合特性を構成する、相補性決定領域を指す。ＣＤＲは抗体と抗原との特異的な相互作用に関与する残基のほとんどを含有しており、したがって抗体分子の機能的活性に寄与している。ＣＤＲは抗原特異性の主要な決定因子である。
【００６６】
正確な定義上のＣＤＲの境界及び長さは、異なる分類及び番号付けシステムに従う。したがって、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ｃｏｎｔａｃｔ、又は本明細書に記載される番号付けシステムを含む任意の他の境界定義によって参照され得る。異なる境界にもかかわらず、これらのシステムの各々は、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を構成するものにおいてある程度の重複を有する。よって、これらのシステムに係るＣＤＲ定義は、隣接するフレームワーク領域に関して長さ及び境界領域が異なる可能性がある。例えば、Ｋａｂａｔ（種間配列変異に基づくアプローチ）、Ｃｈｏｔｈｉａ（抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ、及びＩＭＧＴを参照されたい（Ｗｕ及びＫａｂａｔ、「Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．」（１９７０年）、第１３２巻、第２１１〜２５０頁；Ｃｈｏｔｈｉａら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」（１９８７年）、第１９６巻、第９０１〜９１７頁；ＭａｃＣａｌｌｕｍら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」（１９９６年）、第２６２巻、第７３２頁；Ｌｅｆｒａｎｃら、「Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」（２００３年）；第２７巻、第５５〜７７頁；Ｈｏｎｅｇｇｅｒら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｏｌ．」（２００１年）第３０９巻、第６５７〜６７０頁）。抗原結合側を特徴付けるための更に別の基準は、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されるＡｂＭ定義である。例えば、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ」（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ（Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．及びＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ハイデルベルグ）を参照されたい。２つの残基同定技術が、重複するが同一ではない領域を定義する範囲で、それらを組み合わせてハイブリッドＣＤＲを定義することができる。しかしながら、所謂Ｋａｂａｔシステムに準じた番号付けが好ましい。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されたＣＤＲは、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従って識別される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されたＣＤＲは、ＩＭＧＴアプローチに従って識別される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されたＣＤＲは、Ｈｏｎｅｇｇｅｒアプローチに従って識別される。
【００６７】
軽鎖のＣＤＲ３、特に重鎖のＣＤＲ３は、軽鎖及び重鎖可変領域内の抗原結合において最も重要な決定因子を構成し得る。いくつかの抗体構築物では、重鎖ＣＤＲ３が、抗原と抗体との間の主要な接触領域を構成しているように見える。ＣＤＲ３単独で変化するインビトロ選択スキームは、抗体の結合特性を変化させたり、又は抗原の結合に寄与する残基を決定したりするために使用することができる。したがって、ＣＤＲ３は典型的には、抗体結合側における分子多様性の最大の源である。Ｈ３は、例えば、アミノ酸残基が２個と短くてもよく、又はアミノ酸が２６個以上であってもよい。
【００６８】
古典的な全長抗体又は免疫グロブリンにおいて、各軽（Ｌ）鎖は、１つのジスルフィド共有結合によって重（Ｈ）鎖に連結されているが、一方で２本のＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結されている。ＶＨに最も近位のＣＨドメインは、通常、ＣＨ１と呼ばれる。定常（「Ｃ」）ドメインは、抗原結合には直接関与しないが、抗体依存性、細胞媒介性細胞傷害性、及び補体活性化などの様々なエフェクタ機能を呈する。抗体のＦｃ領域は、重鎖定常ドメイン内で構成され、例えば、細胞表面に位置するＦｃ受容体と相互作用することができる。
【００６９】
本明細書に記載された抗体結合分子のアミノ酸配列の修飾もまた企図される。例えば、抗体構築物の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましくあり得る。本抗体構築物のアミノ酸配列バリアントは、適切なヌクレオチド変化を抗体構築核酸に導入することによって、又はペプチド合成によって調製される。以下に説明するアミノ酸配列の修飾は全て、修飾されていない親分子の所望の生物学的活性（ＣＤ１６ａ及び標的細胞表面抗原への結合）を依然として保持する抗体構築物をもたらすはずである。
【００７０】
アミノ酸修飾としては、例えば、抗体結合分子のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は抗体結合分子のアミノ酸配列内の残基への挿入、及び／又は抗体結合分子のアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。欠失、挿入、及び置換の任意の組合せが作製されて最終分子に到達するが、但し、最終分子が所望の特徴を有することを条件とする。アミノ酸変化は、抗体結合分子の翻訳後処理も改変し得、例えば、グリコシル化部位の数又は位置を変えることができる。
【００７１】
例えば、１、２、３、４、５、又は６個のアミノ酸がＣＤＲの各々に挿入、置換、又は欠失されてもよく（もちろん、その長さに応じる）、一方で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２５個のアミノ酸がＦＲの各々に挿入、置換、又は欠失されてもよい。抗体構築物へのアミノ酸配列挿入としては、長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０残基〜１００以上の残基を含有するポリペプチドの範囲であるアミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。対応する修飾は、本発明の文脈で定義された抗体構築物の第３のドメイン内で行われてもよい。本発明の文脈で定義される抗体構築物の挿入バリアントは、酵素の抗体結合分子のＮ末端若しくはＣ末端への融合、又はポリペプチドへの融合を含む。
【００７２】
置換突然変異誘発に最も関心のある部位として、重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ、特に超可変領域領域（これらに限定されない）が挙げられるが、重鎖及び／又は軽鎖におけるＦＲの改変もまた企図される。置換は、好ましくは、本明細書に記載されているような保存的置換である。好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸がＣＤＲに置換されていてもよく、一方で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２５個のアミノ酸が、ＣＤＲ又はＦＲの長さに応じて、フレームワーク領域（ＦＲ）に置換されていてもよい。例えば、ＣＤＲ配列が６個のアミノ酸を包含する場合、これらのアミノ酸のうちの１個、２個、又は３個が置換されていることが想定される。同様に、ＣＤＲ配列が１５個のアミノ酸を包含する場合、これらのアミノ酸のうちの１個、２個、３個、４個、５個、又は６個が置換されていることが想定される。
【００７３】
一般に、アミノ酸が重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲの１つ以上又は全てにおいて置換されている場合、そのとき得られる「置換された」配列は、「元の」ＣＤＲ配列に対して、少なくとも約６０％又は約６５％、より好ましくは約７０％又は約７５％、更により好ましくは約８０％又は約８５％、及び特に好ましくは約９０％又は約９５％同一であることが好ましい。つまり、「置換された」配列とどの程度同一であるかは、ＣＤＲの長さに依存する。例えば、５個のアミノ酸を有するＣＤＲは、少なくとも１個のアミノ酸が置換されているために、その置換された配列に対して好ましくは約８０％同一である。したがって、抗体構築物のＣＤＲは、それらの置換された配列に対して異なる程度の同一性を有していてもよく、例えば、ＣＤＲＬ１は約８０％を有していてもよく、一方でＣＤＲＬ３は約９０％を有していてもよい。
【００７４】
好ましい置換（又は交換）は、保存的置換である。しかしながら、抗体構築物が、第１のドメインを介してＣＤ１６ａに結合し、第２のドメインを介して標的細胞表面抗原に結合する能力を保持している限り、任意の置換（非保存的置換、又は下記の表Ａに記載される「例示的置換」から１つ以上を含む）が想定され、及び／又はそのＣＤＲは、その時に置換された配列と同一性（「元の」ＣＤＲ配列に対して、少なくとも約６０％又は約６５％、より好ましくは約７０％又は約７５％、更により好ましくは約８０％又は約８５％、及び特に好ましくは約９０％又は約９５％の同一性）を有する。
【００７５】
保存的置換は、表Ａに「好ましい置換」の見出しの下で示される。かかる置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表Ａに「例示的置換」と表示されるか、又はアミノ酸クラスを参照して以下に更に記載されるより実質的な変化が導入され、産物が所望の特徴についてスクリーニングされ得る。
【００７６】
2021521275.tif 000003
【００７７】
本発明の抗体構築物の生物学的特性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、シート若しくはヘリックス立体構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖の容積の維持への置換の影響の点で著しく異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、一般的な側鎖特性に従って分類される：（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｓｎ、ｇｉｎ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び（６）芳香族性：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【００７８】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うことになる。抗体構築物の適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基は概してセリンで置換されて、分子の酸化的安定性が改善され、異常な架橋が阻止され得る。逆に、システイン結合（複数可）は抗体に付加されて、その安定性を改善することができる（特に、抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合）。
【００７９】
アミノ酸配列については、配列同一性及び／又は類似性は、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの局所的配列同一性アルゴリズム（１９８１年）、「Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．」、第２巻、第４８２頁；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの順序同一性アラインメントアルゴリズム（１９７０年）、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」、第４８巻、第４４３頁；Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性探索法（１９８８年）、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」、第８５巻、第２４４４頁；これらのアルゴリズムのコンピュータ実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ製、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、ウィスコンシン州マディソン）；Ｂｅｓｔ  Ｆｉｔ配列プログラム、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４年）、「Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．」、第１２巻、第３８７〜３９５頁に記載を含む、当技術分野で知られている標準的な技術を用いて、好ましくはデフォルトの設定を使用し決定されるか、又は検査により決定される。好ましくは、パーセント同一性は、次のパラメータに基づいてＦａｓｔＤＢによって計算される：ミスマッチペナルティ１；ギャップペナルティ１；ギャップ・サイズ・ペナルティ０．３３；及び連結ペナルティ３０、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第１２７〜１４９頁（１９８８年）、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．。
【００８０】
有用なアルゴリズムの例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、進歩的な対アラインメントを使用して関係する配列の群から複数の配列アラインメントを創出する。これはまた、アラインメントを創出するために使用されるクラスター関係を示す系図をプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８７年）、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．」、第３５巻、第３５１〜３６０頁の進歩的なアラインメント法を簡単にしたものを使用する。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ（１９８９年）、「ＣＡＢＩＯＳ５」、第１５１〜１５３頁に記載の方法に類似している。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、デフォルトギャップ重量３．００、デフォルトギャップ長重量０．１０、及びエンドギャップ重量を含む。
【００８１】
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」、第２１５巻、第４０３〜４１０頁；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．」、第２５巻、第３３８９〜３４０２頁；及び、Ｋａｒｉｎら（１９９３年）、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」、第９０巻、第５８７３〜５７８７頁に記載のＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９６年）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、第２６６巻、第４６０〜４８０頁から得られたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２はいくつかの検索パラメータを使用するが、そのほとんどがデフォルト値に設定されている。調整可能なパラメータは、次の値：重複スパン＝１、重複率＝０．１２５、ワードしきい値（Ｔ）＝ｌｌで設定されている。ＨＳＰ  Ｓ及びＨＳＰ  Ｓ２パラメータは動的な値であり、特定の配列の構成、及び関心のある配列が検索される特定のデータベースの構成に応じてプログラム自身によって確立される。しかしながら、感度を高めるために値を調整してもよい。
【００８２】
追加の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９３年）、「Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．」、第２５巻、第３３８９〜３４０２頁に記載のギャップＢＬＡＳＴである。ギャップＢＬＡＳＴはＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコアを使用；閾値Ｔパラメータは９に設定；ギャップなし拡張をトリガするための２ヒット法は、ギャップ長さｋに１０＋ｋのコストを課す；Ｘｕは１６に設定；Ｘｇはデータベース検索段階で４０に設定し、アルゴリズムの出力段階で６７に設定する。ギャップアラインメントは、約２２ビットに対応するスコアによってトリガされる。
【００８３】
一般に、個々のバリアントＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬ配列間のアミノ酸相同性、類似性、又は同一性は、本明細書に描かれた配列に対して少なくとも約６０％であり、より典型的には、好ましくは少なくとも約６５％又は約７０％、より好ましくは少なくとも約７５％又は約８０％、更により好ましくは少なくとも約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、及びほぼ約１００％の相同性又は同一性の増加を有する。同様に、本明細書中で同定される結合タンパク質の核酸配列に関する「パーセント（％）の核酸配列同一性」は、抗体構築物のコード配列中のヌクレオチド残基と同一である候補配列中のヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。具体的な方法は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを、重複スパン及び重複フラクションがそれぞれ１及び０．１２５に設定されたデフォルトパラメータに設定して利用する。
【００８４】
一般に、個々のバリアントＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬ配列をコードするヌクレオチド配列と、本明細書に記載のヌクレオチド配列との間の核酸配列の相同性、類似性、又は同一性は、少なくとも約６０％であり、より典型的には、好ましくは少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％、及びほぼ１００％の増加した相同性又は同一性を有する。したがって、「バリアントＣＤＲ」又は「バリアントＶＨ／ＶＬ領域」は、本発明の文脈で定義された親ＣＤＲ／ＶＨ／ＶＬに対する所定の相同性、類似性、又は同一性を有するものであり、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の親ＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬの特異性及び／又は活性を含むが、これらに限定されない、生物学的機能を共有する。
【００８５】
一実施形態では、本発明に係る抗体構築物のヒト生殖細胞に対する同一性の割合は、≧約７０％又は≧約７５％、より好ましくは≧約８０％又は≧約８５％、更により好ましくは≧約９０％、及び最も好ましくは≧約９１％、≧約９２％、≧約９３％、≧約９４％、≧約９５％、又は更に≧約９６％である。ヒト抗体の生殖細胞遺伝子産物との同一性は、治療中に患者の薬物に対する免疫応答を引き出す治療用タンパク質のリスクを低減するための重要な特徴であると考えられている。Ｈｗａｎｇ＆Ｆｏｏｔｅ（「Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」；「Ｍｅｔｈｏｄｓ」、第３６巻（２００５年）、第３〜１０頁）は、薬物抗体構築物の非ヒト部分の減少が、治療中の患者に抗薬物抗体を誘発するリスクの減少につながることを実証している。膨大な数の臨床的に評価された抗体医薬と、それぞれの免疫原性データとを比較することによって、抗体のＶ領域をヒト化することで、変化していない非ヒトＶ領域を有する抗体（患者の平均約２３．５９％）よりもタンパク質の免疫原性が低くなる（患者の平均約５．１％）傾向が示されている。したがって、抗体構築物の形態のＶ領域ベースタンパク質治療薬には、ヒト配列に対するより高い程度の同一性が望ましい。生殖細胞系の同一性を決定するこの目的のために、ＶＬのＶ領域は、ベクタＮＴＩソフトウェアを用いるヒト生殖細胞系Ｖセグメント及びＪセグメント（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）のアミノ酸配列と、同一のアミノ酸残基をＶＬのアミノ酸残基の総数によりパーセントで割ることによって算出されるアミノ酸配列と、を整列させることができる。ＶＨセグメント（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）についても同様であるが、例外として、ＶＨＣＤＲ３は、その高い多様性及び既存のヒト生殖細胞系ＶＨＣＤＲ３アラインメントパートナの欠如のために除外され得る。次いで、組換え技術を用いて、ヒト抗体生殖細胞系遺伝子に対する配列同一性を増加させることができる。
【００８６】
用語「抗体」とは、本明細書では最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含めた（これらに限定されない）、様々な抗体構造を包含する。
【００８７】
本明細書で使用される場合、用語「約」又は「およそ」とは、当業者によって決定される特定の値の許容できる誤差範囲を意味し、これは、その値がどのように測定又は決定されるか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」とは、当該技術分野での１実施当たり３つ又は３つよりも多くの標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、更により好ましくは１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味することができる。
【００８８】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「試薬」への言及は、そのような異なる試薬のうちの１つ以上を含み、「方法」への言及は、本明細書に記載される方法のために改変又は置換され得る当業者に公知の等価な工程及び方法への言及を含む。
【００８９】
別段の指示がない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」とは、一連の要素の全ての要素を指すものと理解されるべきである。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識、又は確認することができるであろう。このような等価物は、本発明によって包含されることが意図される。
【００９０】
用語「及び／又は」は、本明細書で使用される場合、「及び」、「又は」、及び「当該用語により接続される要素の全て又はその他の組合せ」の意味を含む。
【００９１】
用語「未満」又は「超」は、具体的な数を含む。例えば、２０未満とは、未満又は等価を意味する。同様に、「より大きい」又は「超」は、それぞれより大きい若しくは等価、又は超若しくは等価を意味する。
【００９２】
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通じて、文脈上他の意味を必要としない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、記載された整数若しくは工程、又は整数のグループ若しくは工程の包含を意味するが、いかなる他の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程のグループの除外をも意味しないことが理解されるであろう。本明細書で使用される場合、用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書で用語「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」と共に使用される際に用語「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」又は「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」で置き換えることができる。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、請求項の要素において特定されていないいかなる要素、工程、又は成分をも除外する。本明細書中で使用される場合、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、請求項の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程を排除しない。
【００９４】
本明細書中の各例において、用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」のいずれかは、他の２つの用語のいずれかで置き換えてもよい。
【００９５】
ＩＩ．  ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質
第１の態様では、本発明は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞ベースの標的アプローチのためのＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質を提供し、すなわち：
多重特異性抗原結合タンパク質であって、
−少なくとも第１の標的抗原結合部分と；
−少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分と；
−少なくとも１つの抗体定常ドメインと、を含む、ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質を提供する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、定常ドメインは、Ｆａｂ断片又はＦｃ部分の一部である。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、定常ドメインに融合され、ここで、定常ドメインは、Ｆａｂ断片（ＣＨ１若しくはＣＬ）又はＦｃ部分の一部であり得る。
【００９８】
したがって、更なる実施形態では、多重特異性抗原結合タンパク質は、
−少なくとも第１の標的抗原結合部分と；
−定常ドメイン、例えばＦａｂ断片又はＦｃ部分に融合した少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分と、を含む。
【００９９】
この抗原結合タンパク質は、ＮＫ細胞が媒介する細胞傷害性を、標的、例えば腫瘍抗原陽性細胞、ウイルス感染細胞、又は病原体に再誘導するように、ＮＫ細胞に作用する。
【０１００】
２つのＣＤ１６Ａ結合部分による二価結合により、ＣＤ１６Ａを介するＮＫ細胞結合強度の結合力が増加し、モノクローナル抗体又は抗体断片と比較して、例えば抗体依存性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）などのＮＫ細胞エフェクタ機能が増強され得る。
【０１０１】
ＮＫ細胞は、そのＣＤ１６Ａ受容体を介して多重特異性抗原結合タンパク質によって結合され、それによって、標的、例えば腫瘍関連抗原（ｔｕｍｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＴＡＡ）発現標的細胞に再誘導される。したがって、このような多重特異性抗原結合タンパク質は、ＮＫ細胞を選択的に再誘導し、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、又は病原体への溶解を媒介することができる。対照的に、ＩｇＧアイソタイプの全長抗体は、Ｆｃ領域を介して、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ（ＦｃγＲＩＩＩＢ）、ＣＤ３２Ａ（ＦｃγＲＩＩＡ）、ＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩＢ）、及びＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）を含む活性化及び抑制性Ｆｃγ受容体に結合する。しかしながら、ＣＤ１６Ａに対する特異性を有する抗原結合タンパク質は、ＮＫ細胞及びマクロファージ上に見出される活性化サブタイプＣＤ１６Ａを選択的に標的とするが、好中球上には見出されない。更に、抗原結合タンパク質と結合するＮＫ細胞は、ＣＤ１６Ａと二価に相互作用し、その結果、通常の抗体と比較しておよそ１，０００倍高い親和性をもたらす。
【０１０２】
ＣＤ１６ＡはＮＫ細胞の細胞傷害活性を誘発する活性化受容体である。ＣＤ１６Ａに対する抗体の親和性は、ＮＫ細胞活性化を誘発するそれらの能力と直接相関する。抗原結合タンパク質は、ＣＤ１６Ａに二価に結合する、すなわち２つの抗原結合部分と結合することにより、ＣＤ１６Ａに対するより高い結合力に起因して親和性を増加させる。
【０１０３】
更に、抗原結合部分を、Ｆｃ部分、又はＦｃＲｎ結合能を有するＩｇＧベース抗体に融合させることによって、血清半減期をｓｃＦｖベースの抗原結合足場と比較して延長することができ、これはインビボでの治療適用をより便利にする。それによって、そのようなＦｃ部分は、ＦｃＲｎへの結合の増加又は減少のために修飾され得る。これは、血清半減期、及び／又は細胞を介する結合ＩｇＧの輸送を更に調節する。後者は経細胞輸送とも呼ばれる（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら、１９９９年）。
【０１０４】
更に、抗原結合タンパク質と、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はＨＳＡ結合部分との融合によって、血清半減期を延長することができる。例えば、Ｆａｂ断片の血清半減期は、Ｆａｂ断片のＦｖ領域におけるＨＳＡ結合部分によって延長され得る一方で、ＣＤ１６Ａ結合部分及び標的抗原結合部分は、Ｆａｂ断片のＣ末端に融合する。あるいは、ＨＳＡ結合部分は、Ｆａｂ断片のＣ末端に融合し得、Ｆａｂ断片のＦｖ領域は、標的抗原又はＣＤ１６Ａ結合部分を提供し得る。
【０１０５】
抗原結合部分は、多くの方法でＦａｂ断片又はＦｃ部分に融合することができ、本明細書に記載される抗原結合タンパク質のモジュール構造は、所望の用途に応じて容易に設計及び選択することができる多数の足場を利用可能にする。
【０１０６】
好ましくは、ＶＨ及びＶＬ可変領域は、可変領域が抗原結合のために所望の立体構造で結合することを可能にするペプチドリンカーによって連結される。エキストラ可変ドメイン領域を含むポリペプチドは、コネクタによってＦａｂ断片の定常ドメイン又はＦｃ部分に融合される。
【０１０７】
抗原結合部分は、１つ又は複数のＦｖポリペプチドを含む抗原結合分子フォーマットによって提供され、例えば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一のポリペプチドにて連結された２つのｓｃＦｖからなるタンデム一本鎖Ｆｖ（（ｓｃＦｖ）２）、ダイアボディ（Ｄｂ）、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、又は二重親和性再標的化抗体（ＤＡＲＴＴＭ）によって提供される。ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質として特に好ましいのは、ｓｃＦｖ、Ｄｂ、又はｓｃＤｂである。各ｓｃＦｖは単一の抗原結合部分を提供するが、二価のＤｂ、ｓｃＤｂ、及び（ｓｃＦｖ）２は、抗原結合タンパク質に対して２つの抗原結合部分を提供する。好ましくは、二価Ｄｂ、ｓｃＤｂ若しくは（ｓｃＦｖ）２、又は２つのｓｃＦｖは、単一特異性であり、同じ抗原特異性の２つの抗原結合部分、すなわちＣＤ１６Ａ又は標的抗原を提供する。
【０１０８】
各抗原結合部分は、「コネクタ」又はペプチド結合によってＦａｂの定常ドメイン又はＦｃ部分に結合される。好ましくは、コネクタはペプチドである。特に、コネクタは、１〜３０個のアミノ酸残基の連続鎖、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個のアミノ酸残基からなるペプチドである。より具体的には、コネクタは、３〜３０、６〜２０、６〜１８、又は６〜１５個のアミノ酸残基からなる。いくつかの実施形態では、コネクタは、Ｇ及びＳアミノ酸残基から構成され、例えば、コネクタは、（Ｇ２Ｓ）ｘペプチドであり、ここで、ｘ＝１〜１０又は（Ｇ４Ｓ）ｙであり、ｙ＝１〜６であり、例えば、配列番号１９、２０、２１、又は２２に示されるようなアミノ酸配列を有するコネクタである。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、抗原結合部分は、Ｆｃ部分のＣＨ２ドメインのＮ末端にヒンジ領域を介して融合される。ヒンジ領域は、Ｆｃ部分と同じ若しくは異なるＩｇＧクラスのものであってもよいし、又は操作され、天然には存在しないヒンジドメインであってもよい。ＩｇＧ野生型ヒンジ領域の例は、配列番号２３に示されるようなアミノ酸配列を有する。修飾された（短縮された）ヒンジ領域の例（ミドルヒンジ）は、配列番号２４に示されるようなアミノ酸配列を有する。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分はＦｃ部分のＮ末端に融合し、一方で１つ又は２つの標的抗原結合部分はＦｃ部分のＣ末端に融合するか；又は、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分はＦｃ部分のＣ末端に融合し、１つ又は２つの標的抗原結合部分はＦｃ部分のＮ末端に融合する（例えば、ＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ；図３〜図６；Ｄｂ−Ｆｃ、図９〜図１０；Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、図１１〜図１２、及びＫｉＨ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、図１５Ａ及び図１５Ｂ）。
【０１１１】
更なる実施形態では、抗原結合部分は、Ｉｇ抗体、例えばＩｇＧに統合又は融合される。ＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々は、Ｆｃ部分のＣ末端、及び２つのＦａｂアームの各々に統合された標的抗原結合部分にｓｃＦｖとして融合され得る（ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ、図１３）。あるいは、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々は、Ｆａｂアームの各々におけるＦｖドメインとして統合され得る一方で、１つ又は２つの標的抗原結合部分は、Ｆｃ部分のＣ末端に融合され得る（ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ、図１６）。ある特定の実施形態では、追加の標的抗原結合部分は、ＣＬドメインの各々のＣ末端に融合され得る（Ｂｉ−ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ、図１４）。
【０１１２】
更なる実施形態では、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分及び標的抗原部分は、ＦａｂのＣ末端に融合し、一方でＦａｂのＦｖドメインは、第２又は第３の標的抗原結合部分を提供する（ｓｃＤｂ−ＴｒｉＢ（−ｓｃＦｖ）、図７及び図８）。あるいは、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ＦａｂのＣ末端に融合され得、標的抗原結合部分は、ＦａｂのＦｖドメインに統合される。
【０１１３】
抗原結合タンパク質は、ＣＤ１６Ａに対して少なくとも二価であり、すなわち、少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、同じ抗原に対する少なくとも２つの標的抗原結合部分、及び２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む四価の二重特異性である。
【０１１５】
更なる実施形態では、抗原結合部分は、第１及び第２の標的抗原結合部分、並びに２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む四価の三重特異性である。このような抗原結合タンパク質は、同時又は二重標的化に用いることができる。例えば、このような抗原結合タンパク質は、第１の腫瘍抗原結合部分（ＴＡＡ１）及び第２の腫瘍抗原結合部分（ＴＡＡ２）、並びに第１（ＴＡＡ１）及び第２（ＴＡＡ２）の腫瘍抗原を示す細胞に対してＮＫ細胞の細胞傷害性を再誘導するための、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む。あるいは、第１（ＴＡＡ１）の腫瘍抗原結合部分及び第２（ＴＡＡ２）の腫瘍抗原結合部分、並びに２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含むこのような三重特異性抗原結合タンパク質を使用して、ＮＫ細胞の細胞傷害性を、第１（ＴＡＡ１）又は第２（ＴＡＡ２）の腫瘍抗原のいずれかを発現する表現型的に異なる細胞型に再誘導することができる。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、三価及び二重特異性、三価及び三重特異性、四価及び二重特異性、四価及び三重特異性、四価及び四重特異性、六価及び三重特異性、又は六価及び二重特異性であり得る。
【０１１７】
第２の態様では、本発明は、ＮＫ細胞兄弟殺しを防止し、例えば増強されたＡＤＣＣなどの増強された免疫エフェクタ機能のための効率的なＮＫ細胞結合及び動員を可能にするＣＤ１６Ａ抗原結合部分のポリペプチド内における、少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分と、決定された抗ＣＤ１６Ａドメイン配列とを有する特定の抗原結合タンパク質フォーマットを提供する。
【０１１８】
ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質は、ダラツムマブが５０％以上のＮＫ溶解を誘導したアッセイにおいて、３０μｇ／ｍＬまでの抗体濃度で測定可能な１０％未満の最小溶解が存在しないか、又はわずかしか存在しない場合、ＮＫ−ＮＫ溶解を誘導するために陰性であると考えられる。
【０１１９】
ＮＫ細胞の兄弟殺しを阻害する効果は、ＮＫ細胞の結合及びエフェクタ機能のための動員が増強される一方で、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の特定の三次元構造の固有の特性と関連しているはずである。
【０１２０】
本明細書に開示された抗原結合タンパク質のＮ末端におけるＣＤ１６Ａの結合（例えば、実施例７に記載されたもの）は、一般に、Ｃ末端におけるＣＤ１６Ａの結合よりもＮＫ細胞の兄弟殺しが少なかった。しかしながら、本開示は、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかでＣＤ１６Ａと結合する抗原結合タンパク質を包含する（例えば、いずれかの末端における結合の例については、実施例７、８、及び９を参照されたい）。Ｎ末端ＣＤ１６結合に関して、より詳細には、実施例８に開示されているように、ＦａｂベースのＣＤ１６Ａ結合を用いて、より顕著なＮＫ細胞枯渇が観察された。更に、ＣＤ１６  Ｆｖのドメイン順序を分析することにより、ＶＨ−ＶＬ順序を含有する抗体フォーマットと比較して、ＶＬ−ＶＨドメイン順序を含有する抗体フォーマットによりＮＫ細胞兄弟殺しの明らかに減少した発生が誘導される。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、抗体を誘導するＮＫ細胞兄弟殺しの割合及びＮＫ細胞殺害の効力は、ＦａｂベースのＣＤ１６Ａ結合を回避し、ＣＤ１６結合Ｆｖドメインの有益なＶＬ−ＶＨ順序に焦点を合わせることによって改善される。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分のポリペプチド内の可変領域は、ポリペプチド、すなわちＦｖポリペプチドのＮ末端に軽鎖可変領域（ＶＬ）が位置するように、順次連結されなければならない。Ｎ末端に位置するＶＬの隣の可変領域は、ＶＬ又はＶＨであってもよい。注目すべきことに、ＶＬがＣＤ１６Ａ抗原結合部分のポリペプチドのＮ末端にあるようにＣＤ１６Ａ抗原結合部分の可変領域が位置する場合、兄弟殺しは、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分の結合親和性から独立して回避することができる。
【０１２３】
特に、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分がｓｃＦｖである場合、可変領域は、ポリペプチドのＮ末端からＣ末端：ＶＬ−ＶＨに位置する。
【０１２４】
特に、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分がＤｂである場合、可変領域は、Ｄｂを形成する２つのポリペプチドの各々におけるＮ末端からＣ末端：ＶＬ−ＶＨに位置する。
【０１２５】
特に、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分がｓｃＤｂである場合、可変領域は、（ｉ）ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ、又は（ｉｉ）ＶＬ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ、又は（ｉｉｉ）ＶＨ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＬのいずれかのポリペプチドのＮ末端からＣ末端に位置する。
【０１２６】
特に、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分が（ｓｃＦｖ）２である場合、可変領域は、ポリペプチドのＮ末端からＣ末端：ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨに位置する。
【０１２７】
ＣＤ１６Ａ抗原結合部分、例えば、ｓｃＦｖ、Ｄｂ、又はｓｃＤｂのポリペプチドは、コネクタを介して、（ｉ）そのＣ末端によってＦｃ部分のＣＨ２ドメインのＮ末端に若しくはヒンジ／ミドルヒンジ領域に、又は（ｉｉ）そのＮ末端によってＦｃ部分のＣＨ３ドメインのＣ末端に、若しくはＣＬ若しくはＣＨ１ドメインのＣ末端に、融合される。
【０１２８】
好ましくは、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分の両方は、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかで抗原結合タンパク質内に位置する。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、Ｆｃ部分に融合する。好ましくは、ＣＤ１６Ａ結合部分の両方は、Ｆｃ部分に対してＮ末端又はＣ末端のいずれかで融合する。Ｆｃ部分は、ＩｇＧ  Ｆｃ領域の少なくとも１つの機能性を保持する定常領域の一部を含有する。「Ｆｃ部分」は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。
【０１３０】
好ましくは、Ｆｃ部分は「サイレンシング」される。「サイレンシングされたＦｃ部分」とは、それ自体はＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）を含むＦｃガンマ受容体（Ｆｃγ）受容体（ＦｃγＲｓ）に結合しないが、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を保持する、修飾されたＦｃ部分を指す。ＦｃＲｎ結合は、ＩｇＧ、又はＦｃＲｎ結合Ｆｃ部分を含有する融合タンパク質をリソソーム分解から保護するため、上皮障壁を越えた経細胞輸送及びリサイクルを可能にし、結果として延長した血清半減期、及び循環におけるより長い持続性をもたらす。抗原結合タンパク質は、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分を介してＮＫ細胞上のＣＤ１６Ａと特異的に結合するように設計され、したがって、好ましい実施形態において、他のＦｃγ受容体へのＦｃ結合は防止されるべきである。したがって、ＦｃＲｎ結合を保持又は増強するＦｃ融合抗原結合タンパク質のＦｃ部分における修飾が好ましい。
【０１３１】
Ｆｃγ受容体への結合が減少しているか又は全く結合していないＩｇＧ１  Ｆｃ部分を生成するための突然変異又は変化（「サイレンシング突然変異」又は「エフェクタレス突然変異」と称する）のいくつかの組が、以下：Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ２３８Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｐ３３１Ｓからなる群の突然変異；又は、以下：Ｈ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓからなる群より選択され得るＦｃγ受容体への結合が減少したＩｇＧ２  Ｆｃ部分を生成するための突然変異；又は、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａからなる群より選択され得るＦｃγ受容体への結合が減少したＩｇＧ４  Ｆｃ部分を生成するための突然変異から選択されるものとして記載されている（Ｓｔｒｏｈｌ  Ｗ．、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（２００９年）、第２０巻、第１〜７頁；Ｋａｎｅｋｏ  Ｅ及びＮｉｗａ  Ｒ、「Ｂｉｏｄｒｕｇｓ」（２０１１年）、第２５巻、第１号、第１〜１１頁；Ｂａｕｄｉｎｏ  Ｌ．、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（２００８年）、第１８１巻、第６６６４〜６６６９頁）。
【０１３２】
更に、Ｆｃ部分は、血清半減期を調節するように、例えば、増加又は減少させるように操作することができる。抗原結合タンパク質の血清半減期を増加させるＩｇＧ１  Ｆｃ部分における、以下の突然変異が記載されている：Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｙ（Ｓｒｏｈｌ  Ｗ．、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（２００９年）第２０巻、第１〜７頁；Ｂｏｒｒｏｋ  ＭＪら、「Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（２０１７年）、第１０６巻、第４号、第１００８〜１０１７頁）。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１、Ｆｃ部分は、Ｋａｂａｔ  ＥＵ番号付けに従い、２３４位、２３５位、及び２６５位における突然変異の組を含み、特にこの突然変異の組は、Ｌ２３４Ｆ／Ｖ／Ａ、Ｌ２３５Ａ／Ｅ、及びＤ２６５Ａから選択される。特に、突然変異Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、及びＤ２６５Ａの組を含むＩｇＧ１  Ｆｃ部分が好ましい。したがって、いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、突然変異Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、及びＤ２６５Ａの組を有するサイレンシングされたＩｇＧ１  Ｆｃ部分を含む。記載されている全ての突然変異は、Ｋａｂａｔ  ＥＵ番号付けシステムに対応する（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．」、第５版、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、第９１〜３２４２号、第６６２、６８０、６８９頁（１９９１年）。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、突然変異Ｌ２３４Ｆ及びＬ２３５Ｅの組を有するサイレンシングされたＩｇＧ１  Ｆｃ部分を含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、互いに結合した２つの同一のＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドを含むホモ二量体Ｆｃ部分に融合し、ここで、共有二量体化は、ＣＨ２ドメインに対するヒンジ領域Ｎ末端によって促進される。
【０１３５】
抗原結合部分は、ヒンジ領域を介してＦｃ部分にＮ末端で融合するか、又はＣＨ３ドメインにＣ末端で融合することができる。ＣＤ１６Ａ抗原結合部分がＮ末端に融合している場合、第１の標的抗原結合部分は、好ましくはＦｃ領域にＣ末端で融合する。
【０１３６】
特定の実施形態では、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、Ｄｂが二量体化によってＦｃ部分（Ｄｂ−Ｆｃ）のＮ末端又はＣ末端に形成されるように融合し、ここで、ＣＤ１６Ａ抗原結合ＶＬ−ＶＨポリペプチドは、コネクタ及びヒンジ領域を介して、ＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端又はＣＨ３のＣ末端に融合し、標的抗原結合部分は、ｓｃＦｖとしてそれぞれの反対側の末端に融合する（図９、図１０）。好ましくは、ヒンジはミドルヒンジである（配列番号２４）。例えば、このような抗原結合タンパク質は、Ｆｃ領域に二量体化された２つのポリペプチド鎖を含み、ここで、各ポリペプチド鎖は、以下のＮ末端からＣ末端までを含む：
（ｉ）ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ（標的）−ＶＬ（標的）（図９）；
（ｉｉ）ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（標的）−ＶＨ（標的）（図９）；
（ｉｉｉ）ＶＬ（標的）−ＶＨ（標的）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）（図１０）；又は、
（ｉｖ）ＶＨ（標的）−ＶＬ（標的）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）（図１０）。
【０１３７】
別の実施形態では、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ｓｃＦｖとしてＦｃ部分（Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ）に融合し、ここで、第１の特異性（標的又はＣＤ１６Ａ結合）のｓｃＦｖは、ＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドの一方の末端に融合し、第２の特異性（ＣＤ１６Ａ又は標的結合）のｓｃＦｖは、二量体Ｆｃ部分を形成するＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドの他方の末端に融合する。それによって、２つの標的抗原結合部分の各々は、ｓｃＦｖとして、２つのＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドのそれぞれの対向する末端に融合する（図１１、図１２）。例えば、このような抗原結合タンパク質は、ヒンジ領域及びＦｃ領域にホモ二量体化する２つのポリペプチド鎖を含み、ここで、各ポリペプチド鎖は、ＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端にｓｃＦｖを含み、ドメインは以下のＮ末端からＣ末端に位置する：
（ｉ）ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ（標的）−ＶＬ（標的）（図１１）；
（ｉｉ）ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（標的）−ＶＨ（標的）（図１１）；
（ｉｉｉ）ＶＬ（標的）−ＶＨ（標的）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）（図１２）；又は、
（ｉｖ）ＶＨ（標的）−ＶＬ（標的）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）（図１２）。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ヘテロ二量体（非対称）Ｆｃ部分に融合する。このようなヘテロ二量体Ｆｃ部分は、２つのポリペプチドの（ヘテロ）二量体化を促進するＦｃ領域の２つのＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドの各々の修飾を含む。これらは、２つのＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドの集合を促進するために互いに相補的であるポリペプチドの各々における別々の修飾を含む。修飾は、アミノ酸置換に翻訳される核酸突然変異であり得る。このような変形は、「ノブ・イントゥ・ホール」（ＫｉＨ）として知られており、多数のバリアントの構築が、例えば、Ｒｉｄｇｗａｙらによって記載されている（「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、第９巻、第７号、第６１７〜６２１頁（１９９６年））。例えば、１つのＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドにおける置換Ｔ３６６Ｙ、及び他のポリペプチドにおける置換Ｙ４０７Ｔは、ＥＵ番号付けシステムに従う（Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、ＮＩＨ（１９９１年））。第１のＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドにおけるノブ・イントゥ・ホール置換Ｔ３６６Ｙ、及び第２のＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドにおけるＹ４０７Ｔ置換を含有するＦｃ部分の例は、配列番号３１、３２に示されるようなアミノ酸配列を有する。加えて、ヘテロ二量体化を促進する相補的な界面を生成するための更なる戦略が開発されている（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ及びＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ、「ＭＡＢＳ」（２０１７年）、第９巻、第２号、第１８２〜２１２頁に概説）。更なる実施形態では、ヘテロ二量体を更に安定化させ、収率を増加させるために、ジスルフィド架橋を組み込むことができる（Ｍｅｒｃｈａｎｔら、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．」（１９９８年）、第１６巻、第６７７〜６８１頁；Ａｔｗｅｌｌら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」、第２７０巻（１９９７年）、第２６〜３５頁）。
【０１３９】
特定の実施形態では、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ｓｃＤｂとしてヘテロ二量体Ｆｃ部分（ＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ）に融合し、ここで、ｓｃＤｂの単一のポリペプチドは第１のＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドに融合し、単一の標的抗原結合部分は、ｓｃＦｖとして同じ又は第２のＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドのそれぞれの反対側の末端に融合する（図３、図５）。例えば、このような抗原結合タンパク質は、中央でヘテロ二量体化された２つのポリペプチド鎖を含む。ヒンジ又はヒンジ及びＦｃ領域であって、第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端：ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３若しくはＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端：ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ（標的）−ＶＬ（標的）若しくはヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（標的）−ＶＨ（標的）を含み（図３）；又は、第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端：ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）若しくはヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）を含み、第２のポリペプチドはＮ末端からＣ末端：ＶＨ（標的）−ＶＬ（標的）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３若しくはＶＬ（標的）−ＶＨ（標的）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含み（図５）；又は、ｓｃＤｂの単一のポリペプチドは第１のＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドに融合し、単一の標的抗原結合部分は第２のＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドの同じ末端にｓｃＦｖとして融合する（図４）。例えば、このような抗原結合タンパク質は、２つのポリペプチド鎖を含み、ここで、第１のポリペプチド鎖は、以下のＮ末端からＣ末端：ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３若しくはＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含み、第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端：ＶＨ（標的）−ＶＬ（標的）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３又はＶＬ（標的）−ＶＨ（標的）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む（図４）。
【０１４０】
別の実施形態では、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ｓｃＤｂとしてヘテロ二量体Ｆｃ部分に融合し、ｓｃＤｂの単一のポリペプチドは第１のＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドに融合し、単一の第１の標的抗原結合部分（ＴＡＡ１）は、ｓｃＦｖとしてこの第１のＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドのそれぞれの反対側の末端に融合し、第２の標的抗原結合部分（ＴＡＡ２）は、ｓｃＦｖとして第１の標的抗原結合部分と同じ末端で第２のＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドに融合する（図６）。例えば、このような抗原結合タンパク質は、ヒンジ又はミドルヒンジ及びＦｃ領域においてヘテロ二量体化する２つのポリペプチド鎖を含み、ここで、第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端：ＶＨ（標的１）−ＶＬ（標的１）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ））又はＶＨ（標的１）−ＶＬ（標的１）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）又はＶＬ（標的１）−ＶＨ（標的１）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）又はＶＬ（標的１）−ＶＨ（標的１）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）を含み、第２のポリペプチドはＮ末端からＣ末端：ＶＨ（標的２）−ＶＬ（標的２）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３又はＶＬ（標的２）−ＶＨ（標的２）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む（図６）。
【０１４１】
更なる実施形態では、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ｓｃＦｖとしてヘテロ二量体Ｆｃ部分（ＫｉＨ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ）に各々融合し、２つのｓｃＦｖの各々は、第１及び第２のＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドの１つに融合し、単一の第１の標的抗原結合部分（ＴＡＡ１）は、ｓｃＦｖとして第１のＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドのそれぞれの反対側の末端に融合し、第２の標的抗原結合部分（ＴＡＡ２）は、ｓｃＦｖとして第１の標的抗原結合部分と同じ末端で第２のＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドに融合する（図１５）。例えば、このような抗原結合タンパク質は、Ｆｃ領域にヘテロ二量体化された２つのポリペプチド鎖を含み、ここで、第１のポリペプチド鎖は、以下のＮ末端からＣ末端：ＶＨ（標的１）−ＶＬ（標的１）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）又はＶＬ（標的１）−ＶＨ（標的１）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）を含み、第２のポリペプチドはＮ末端からＣ末端：ＶＨ（標的２）−ＶＬ（標的２）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）又はＶＬ（標的２）−ＶＨ（標的２）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）を含み（図１５ｂ）；あるいは、このような抗原結合タンパク質は、Ｆｃ領域においてヘテロ二量体化された２つのポリペプチド鎖を含み、ここで、第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端：ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ（標的１）−ＶＬ（標的１）又はＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（標的１）−ＶＨ（標的１）を含み、第２のポリペプチドはＮ末端からＣ末端：ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ（標的２）−ＶＬ（標的２）又はＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（標的２）−ＶＨ（標的２）を含む（図１５ａ）。
【０１４２】
更なる実施形態では、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ｓｃＤｂとして単量体Ｆｃ部分に融合する（ｓｃＤｂ−ｍＦｃ、図１、図２）。このような単量体Ｆｃ部分（ｍＦｃ）は、別のＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドとの二量体化を妨げるＣＨ３ドメインの突然変異を含有し、ヒンジ領域を欠くが、ＦｃＲｎ受容体への結合を維持し、他のＦｃγＲとは結合しない。このような突然変異は、Ｙｉｎｇら（「ＭＡＢＳ」（２０１４年）、第６巻、第５号、第１２０１〜１２１０頁；又は国際公開第２０１３／１３８６４３号）に記載されている。このような単量体Ｆｃ部分の例は、配列番号３０に示されるようなアミノ酸配列を有する。このような抗原結合タンパク質は単一のポリペプチド鎖からなり、ここで、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含むｓｃＤｂは、単量体Ｆｃ部分の一方の末端に融合し、標的抗原結合部分は、単量体Ｆｃ部分の他方の末端に融合する。このような抗原結合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端：ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ（標的）−ＶＬ（標的）又はＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（標的）−ＶＨ（標的）、又はＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ（標的）−ＶＬ（標的）、又はＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（標的）−ＶＨ（標的）（図１）、又はＶＨ（標的）−ＶＬ（標的）−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）、又はＶＬ（標的）−ＶＨ（標的）−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）、又はＶＨ（標的）−ＶＬ（標的）−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）、又はＶＬ（標的）−ＶＨ（標的）−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）（図２）を含む単一のポリペプチド鎖からなる。
【０１４３】
他の実施形態では、抗原結合部分のポリペプチドのＮ末端は、Ｆａｂ断片のＣ末端に融合する。例えば、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む１つのＤｂ、ｓｃＤｂ、又は２つのｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＣ末端に融合し、Ｆａｂ断片のＦｖは標的抗原結合部分を含む。
【０１４４】
他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、三重特異性であり（ｓｃＤｂ−ＴｒｉＢ（−ｓｃＦｖ）、ここで、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含むｓｃＤｂは、Ｆａｂ断片の２つのポリペプチドのうちの第１のポリペプチドにＣ末端で融合し、第１の標的抗原結合部分（ＴＡＡ１）は、ｓｃＦｖとして、又は二価のｓｃＤｂとして、Ｆａｂ断片の第２のポリペプチドにＣ末端で融合し、Ｆａｂ断片のＦｖは、第２の標的抗原結合部分（ＴＡＡ２）を提供する。特定の実施形態では、Ｆｖの第２の標的抗原結合部分は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）抗原結合部分である。このような抗原結合タンパク質は、ＦａｂにＣ末端で融合された２つのｓｃＤｂを有するＦａｂ断片融合にヘテロ二量体化された２つのポリペプチド鎖を含み、ここで、第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端：ＶＬ（ＨＳＡ）−ＣＬ−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）を含み、第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端：ＶＨ（ＨＳＡ）−ＣＨ１−ＶＨ（標的１）−ＶＬ（標的１）−ＶＨ（標的１）−ＶＬ（標的１）を含む（図７）。別の実施形態では、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含むｓｃＤｂ、及び第１の標的抗原結合部分を含むｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片にＣ末端で融合し、ここで、第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端：ＶＬ（ＨＳＡ）−ＣＬ−ＶＨ（標的１）−ＶＬ（標的１）を含み、第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端：ＶＨ（ＨＳＡ）−ＣＨ１−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）を含む（図８）。
【０１４５】
更なる実施形態では、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ＩｇＧにＣ末端で融合し、ここで、ＩｇＧの２つのＦａｂアームは、２つの更なる抗原結合部分を提供する（ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ、図１３）。このような抗原結合タンパク質では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む第１のｓｃＦｖは、第１のＨ鎖のＣＨ３にＣ末端で融合し、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む第２のｓｃＦｖは、第２のＨ鎖のＣＨ３に融合し、２つのＦａｂアームは、各Ｆｖと共に標的抗原結合部分を提供する。Ｆｖ’の両方は同じ標的抗原結合部分を有することができ、又は２つのＦｖ’は、第１及び第２の標的抗原結合部分を提供することができる。例えば、このような抗原結合タンパク質は、２つの同一のＨ鎖及び２つの同一のＬ鎖を含み、ここで、Ｈ鎖はＮ末端からＣ末端：ＶＨ（標的）−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）を含み、Ｌ鎖は、Ｎ末端からＣ末端：ＶＬ（標的）−ＣＬ（図１３）を含む。
【０１４６】
あるいは、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分のｓｃＦｖ−ＩｇＡｂがＩｇＧのＦａｂアームの２つのＦｖ’によって提供され、１つ又は２つの更なる抗原結合部分がＩｇＧにＣ末端で融合される。このような抗原結合タンパク質において、２つのＦａｂアームの各々は、各ＦｖとのＣＤ１６Ａ抗原結合部分を提供し、標的抗原結合部分を含む第１のｓｃＦｖは、第１のＨ鎖のＣＨ３にＣ末端で融合し、任意に、更なる第１又は第２の標的抗原結合部分を含む第２のｓｃＦｖは、第２のＨ鎖のＣＨ３に融合する。例えば、このような抗原結合タンパク質は、２つの同一のＨ鎖及び２つの同一のＬ鎖を含み、ここで、Ｈ鎖はＮ末端からＣ末端：ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（標的）−ＶＨ（標的）を含み、Ｌ鎖は、Ｎ末端からＣ末端：ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＣＬを含み（図１６）、又はＨ鎖は、Ｎ末端からＣ末端：ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ（標的）−ＶＬ（標的）を含み、Ｌ鎖は、Ｎ末端からＣ末端：ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＣＬを含む。
【０１４７】
更なる実施形態では、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分はＩｇＧに対してＣ末端で融合し、ＩｇＧの２つのＦａｂアームは２つの第１の標的抗原結合部分（ＴＡＡ１）を提供し、更なるｓｃＦｖ第２の標的抗原結合部分（ＴＡＡ２）は、２つのＣＬドメインのそれぞれに対してＣ末端で融合する（Ｂｉ−ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ、図１４）。このような抗原結合タンパク質において、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む第１のｓｃＦｖは、第１のＨ鎖のＣＨ３にＣ末端で融合し、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む第２のｓｃＦｖは、第２のＨ鎖のＣＨ３に融合し、２つのＦａｂアームは、各Ｆｖを有する第１の標的抗原結合部分（ＴＡＡ１）を提供し、２つの更なる第２の標的抗原結合部分（ＴＡＡ２）は、ＣＬドメインのそれぞれに融合したｓｃＦｖ第２の標的抗原結合部分のそれぞれによって提供される。例えば、このような抗原結合タンパク質は、２つの同一のＨ鎖及び２つの同一のＬ鎖を含み、ここで、Ｈ鎖はＮ末端からＣ末端：ＶＨ（標的１）−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）を含み、Ｌ鎖は、Ｎ末端からＣ末端：ＶＬ（標的１）−ＣＬ−ＶＬ（標的２）−ＶＨ（標的２）又はＶＬ（標的１）−ＣＬ−ＶＨ（標的２）−ＶＬ（標的２）を含む（図１４）。
【０１４８】
本発明によれば、多重特異性抗原結合タンパク質は、ＣＤ１６Ａに、及びＣＤ１６Ａとは異なる少なくとも標的抗原（ＴＡ）に特異的に結合するＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６Ａ結合部分は、ヒト及びカニクイザルＣＤ１６Ａに結合する。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ＣＤ１６Ａに特異的な重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、ここで、
（ｉ）ＣＤ１６Ａに特異的な重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；配列番号５１若しくは配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；配列番号５２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、ＣＤ１６Ａに特異的な軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含み；又は、
（ｉｉ）ＣＤ１６Ａに特異的な重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、配列番号１若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列を有し、並びに／又は
（ｉｉｉ）ＣＤ１６Ａに特異的な軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ここで、（ａ）ＶＨは、配列番号７３に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ１、配列番号７４に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ２、及び配列番号７５に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ３を含み；並びに、（ｂ）ＶＬは、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ１、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を含むか又は有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ３を含む。
【０１５２】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分のＶＨは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むか、又は有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分のＶＬは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むか、又は有する。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ａ）ＶＨは、配列番号８２に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ１、配列番号８３に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ２、及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ３を含み；並びに（ｂ）ＶＬは、配列番号８４に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ１、配列番号８５に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ２、及び配列番号８６に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ３を含む。
【０１５４】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分のＶＨは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むか、又は有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分のＶＬは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むか、又は有する。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ａ）ＶＨは、配列番号８７に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ１、配列番号８８に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ２、及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ３を含み；並びに（ｂ）ＶＬは、配列番号８９に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ１、配列番号９５に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ２、及び配列番号９０に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ３を含む。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分のＶＨは、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むか、又は有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分のＶＬは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むか、又は有する。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ａ）ＶＨは、配列番号９１に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ１、配列番号９２に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ２、及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ３を含み；並びに（ｂ）ＶＬは、配列番号９３に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ１、配列番号８５に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ２、及び配列番号９４に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ３を含む。
【０１５８】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分のＶＨは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むか、又は有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分のＶＬは、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むか、又は有する。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ａ）ＶＨは、配列番号８２に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ１、配列番号９５に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ２、及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ３を含み；並びに（ｂ）ＶＬは、配列番号９６に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ１、配列番号９７に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ２、及び配列番号９８に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ３を含む。
【０１６０】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分のＶＨは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むか、又は有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分のＶＬは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むか、又は有する。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ａ）ＶＨは、配列番号８２に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ１、配列番号９９に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ２、及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ３を含み；並びに（ｂ）ＶＬは、配列番号１００に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ１、配列番号１０１に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ２、及び配列番号１０２に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ３を含む。
【０１６２】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分のＶＨは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むか、又は有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分のＶＬは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むか、又は有する。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ａ）ＶＨは、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ１、配列番号１０３に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ２、及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ３を含み；並びに（ｂ）ＶＬは、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ１、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ２、及び配列番号１０４に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ３を含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ＶＨ及びＶＬを含み、ここで、（ａ）ＶＨは、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ１、配列番号１０３に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ２、及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ３を含み；並びに（ｂ）ＶＬは、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ１、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ２、及び配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を含むか又は有するＣＤＲ３を含む。
【０１６５】
ＣＤ１６Ａに対するこのＣＤ１６Ａ抗原結合部分はＣＤ１６Ｂに結合せず、既知のＣＤ１６ＡアロタイプＦ１５８及びＶ１５８に同様の親和性で結合する。ＩｇＧのヒンジ領域との相互作用に重要な１５８位のアミノ酸を変化させる２つの対立遺伝子一塩基多型がヒトＣＤ１６Ａで同定されている。ホモ接合１５８Ｆ／Ｆ及びヘテロ接合体１５８Ｖ／Ｆ対立遺伝子の対立遺伝子頻度は白人集団内で類似しており、それぞれ３５〜５２％又は３８〜５０％の範囲であったが、ホモ接合１５８Ｖ／Ｖ対立遺伝子は１０〜１５％でのみ見出された（Ｌｏｐｅｚ−Ｅｓｃａｍｅｚ  ＪＡら、「ＢＭＣ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ」（２０１１年）、第１２巻、第２頁）。したがって、類似の親和性による全ての患者集団におけるこの抗ＣＤ１６ＡドメインによるＮＫ細胞の結合及び活性化は有利である。このＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ヒト及びカニクイザルＣＤ１６Ａに結合する。更に、ＣＤ１６Ａには結合するがＣＤ１６Ｂには結合しない重鎖及び軽鎖可変ドメインを含むＣＤ１６Ａ抗原結合部分が、国際公開第２００６／１２５６６８号に記載されている。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合分子は、配列番号１及び２を有する抗ＣＤ１６Ａと比較して、ＣＤ１６Ａへの結合が改善された抗ＣＤ１６ＡＦｖドメインを含み、ＣＤ１６Ｂに結合せず、既知のＣＤ１６ＡアロタイプＦ１５８及びＶ１５８を同様の親和性で認識する。ある特定の実施形態では、親和性が改善された抗ＣＤ１６Ａ  Ｆｖドメインは、配列番号５３、５４、５５に示されるような配列を有するＶＣＤＲを含むか、又は配列番号２に示されるような配列を有するＶＬ、及び配列番号２に示されるような配列において少なくとも１つの変形を有するＶＨからなる。
【０１６７】
このような改善された結合剤は、親和性が成熟したＣＤ１６Ａ  Ｆｖ抗原結合部分であり得る。
【０１６８】
したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００システムにおいて精製されたｓｃＦｖ分子で測定した、０．１６μｇ／ｍＬのヒトＣＤ１６Ａ（配列番号４８）で被覆されたウェル上でＥＬＩＳＡで試験した場合、配列番号１及び２の抗ＣＤ１６Ａ  Ｆｖよりも高い親和性（例えば、親和性成熟による改善）並びに／又はヒトＣＤ１６Ａに対する選択性を示すＦｖドメインを含む。例えば、ヒトＣＤ１６Ａに対するそのようなより高い親和性は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、１５０倍を超えることができる。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００システム上で測定した一価結合親和性は、ＫＤ＝０．２７ｎＭ〜１．９１ｎＭであり得、これは、ヒトＣＤ１６Ａに対する配列番号１及び２の結合について測定した４０．５ｎＭよりも２１〜１５０倍高い。
【０１６９】
好ましくは、このような親和性が成熟したＦｖドメインは、更に、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００システム．Ｘ１００において精製されたｓｃＦｖ分子で測定した、０．１６μｇ／ｍＬのカニクイザルＣＤ１６Ａ（配列番号４９）で被覆されたウェル上でＥＬＩＳＡで試験した場合、カニクイザルＣＤ１６Ａに対する同様に改善された親和性を示す。例えば、カニクイザルＣＤ１６Ａに対するそのようなより高い親和性は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、５４１倍を超えることができる。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００システム上で測定された一価結合親和性は、ＫＤ＝０．２４〜３．６３ｎＭであり得、これは、配列番号１、２のカニクイザルＣＤ１６Ａへの結合について測定された１３２ｎＭよりも３６〜５４１倍高い。
【０１７０】
配列番号１、２の抗ＣＤ１６  Ｆｖにおいて、アミノ酸置換がＶＬドメイン（配列番号２）における特異的ＣＤ１６Ａ結合に対して有益である、特定の配列位置が同定されている（Ｘ３７、Ｘ４４、Ｘ４６）。表１を参照のこと。
【０１７１】
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【０１７２】
表１に示した全てのアミノ酸置換がＣＤ１６Ａへの結合に等しく重要であるわけではない。Ｘ４４位及びＸ４６位における置換はより重要であり得、好ましくは、親和性成熟クローンは、配列番号２のアミノ酸を保存する。
【０１７３】
特定の実施形態において、ＣＤ１６Ａ結合に更に関与するのは、ＬＣＤＲ３の配列、及びＬＣＤＲ１のＮ末端残基ＮＩ又はＬＣＤＲ２におけるＱＤＸ配列モチーフである。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分のＶＬは、配列番号５３、５４、及び５５に示された配列と比較して、１、２、３、４又は５個のアミノ酸置換を含む軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び軽鎖ＣＤＲ３を含み、ＶＬは、ＣＤ１６Ａへの結合特異性を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号５３の配列における１つ以上の置換は、３〜６位である。ある特定の実施形態では、配列番号５４の配列における置換は、３位にある。ある特定の実施形態では、配列番号５５の配列の６位の残基Ｙ及び８位の残基Ｖは置換されておらず、そして。好ましくは、ＬＣＤＲ３は、配列番号５５に示される配列を有する。
【０１７５】
更なる実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分のＶＬは、配列番号２の配列と比較して、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、又は８０％の配列同一性を有し、ここで、配列番号２の２３〜２７位までの残基ＧＧＨＮＩ、配列番号２の４９〜５２位までの配列モチーフＱＤＸＫは変異しておらず、ＶＬはＣＤ１６Ａへの結合特異性を保持する。
【０１７６】
ＣＤ１６Ａ抗原結合部分のＶＨにおいて、配列番号１の配列と比較して、ＨＣＤＲ１の９位及び／又はＨＣＤＲ２の１１位の置換は、ＣＤ１６Ａへの結合を改善するために有益である。特に、ＨＣＤＲ１の９位の残基はＱであり、及び／又はＨＣＤＲ２の１１位の残基はＶである。
【０１７７】
したがって、更なる実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分のＶＨは、配列番号１の配列と比較して、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、又は８０％の配列同一性を有し、ＨＣＤＲ１の９位の残基はＱであり、及び／又はＨＣＤＲ２の１１位の残基はＶである。
【０１７８】
したがって、ある実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分はＶＬ及びＶＨを含み、ここでＣＤ１６ＡのＶＬは、配列番号２の配列と比較して、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、又は８０％の配列同一性を有し、ここで、配列番号２の２３〜２７位までの残基ＧＧＨＮＩ、配列番号２の４９〜５２位までの配列モチーフＱＤＸＫは変異しておらず、ＶＬはＣＤ１６Ａへの結合特異性を保持し、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分のＶＨは、配列番号１の配列と比較して、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、又は８０％の配列同一性を有し、ＨＣＤＲ１の９位の残基はＱであり、及び／又はＨＣＤＲ２の１１位の残基はＶである。
【０１７９】
更なる実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分のＶＬは、配列番号２の配列と比較して、少なくとも約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９４％、約９３％、約９２％、約９１％、約９０％、約８９％、約８８％、約８７％、約８６％、約８５％、約８４％、約８３％、約８２％、約８１％、又は約８０％の配列同一性を有し、ここで、配列番号２の２３〜２７位までの残基ＧＧＨＮＩ、配列番号２の４９〜５２位までの配列モチーフＱＤＸＫは変異しておらず、ＶＬはＣＤ１６Ａへの結合特異性を保持する。
【０１８０】
ＣＤ１６Ａ抗原結合部分のＶＨにおいて、配列番号１の配列と比較して、ＨＣＤＲ１の９位及び／又はＨＣＤＲ２の１１位の置換は、ＣＤ１６Ａへの結合を改善するために有益である。特に、ＨＣＤＲ１の９位の残基はＱであり、及び／又はＨＣＤＲ２の１１位の残基はＶである。
【０１８１】
したがって、更なる実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分のＶＨは、配列番号１の配列と比較して、少なくとも約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９４％、約９３％、約９２％、約９１％、約９０％、約８９％、約８８％、約８７％、約８６％、約８５％、約８４％、約８３％、約８２％、約８１％、又は約８０％の配列同一性を有し、ＨＣＤＲ１の９位の残基はＱであり、及び／又はＨＣＤＲ２の１１位の残基はＶである。
【０１８２】
したがって、ある実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分はＶＬ及びＶＨを含み、ここでＣＤ１６ＡのＶＬは、配列番号２の配列と比較して、少なくとも約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９４％、約９３％、約９２％、約９１％、約９０％、約８９％、約８８％、約８７％、約８６％、約８５％、約８４％、約８３％、約８２％、約８１％、又は約８０％の配列同一性を有し、ここで、配列番号２の２３〜２７位までの残基ＧＧＨＮＩ、配列番号２の４９〜５２位までの配列モチーフＱＤＸＫは変異しておらず、ＶＬはＣＤ１６Ａへの結合特異性を保持し、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分のＶＨは、配列番号１の配列と比較して、少なくとも約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９４％、約９３％、約９２％、約９１％、約９０％、約８９％、約８８％、約８７％、約８６％、約８５％、約８４％、約８３％、約８２％、約８１％、又は約８０％の配列同一性を有し、ＨＣＤＲ１の９位の残基はＱであり、及び／又はＨＣＤＲ２の１１位の残基はＶである。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分のＶＨは、配列番号３に示される配列と比較して、少なくとも約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９４％、約９３％、約９２％、約９１％、約９０％、約８９％、約８８％、約８７％、約８６％、約８５％、約８４％、約８３％、約８２％、約８１％、又は約８０％の配列同一性を有する。
【０１８４】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９４％、約９３％、約９２％、約９１％、約９０％、約８９％、約８８％、約８７％、約８６％、約８５％、約８４％、約８３％、約８２％、約８１％、又は約８０％同一であるか又は相同であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９４％、約９３％、約９２％、約９１％、約９０％、約８９％、約８８％、約８７％、約８６％、約８５％、約８４％、約８３％、約８２％、約８１％、又は約８０％同一又は相同であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０１８５】
特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分はＶＬ及びＶＨを含み、ここで、ＶＬは、配列番号２、５、７、９、１１、及び１３を有する領域からなる群より選択され、ＶＨは、配列番号１、３、４、６、８、１０、及び１２からなる群より選択される。
【０１８６】
ＩＩＩ．  標的抗原結合部分
ある特定の実施形態では、標的抗原結合部分の標的抗原は、骨髄腫細胞又は形質細胞上に提示される抗原である。骨髄腫細胞とは、骨髄の中の形質細胞が生じた悪性（がん性）の形質細胞である。骨髄腫では、悪性形質細胞が大量の異常な抗体を産生するが、この抗体は感染と戦う能力がない。これらの異常抗体は、骨髄腫の腫瘍マーカーとして機能する、モノクローナルタンパク質又はＭタンパク質である。骨髄腫細胞は、ＣＤ１９−／ＣＤ３８＋／ＣＤ１３８＋／ＢＣＭＡ＋という表現型を有する。したがって、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、及びＢＣＭＡは、骨髄腫細胞に発現する抗原を表す。
【０１８７】
Ａ．ＢＣＭＡ
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ、ＣＤ２６９、又はＴＮＦＲＳＦ１７）は、Ｂ細胞活性化（ＢＡＦＦ）及びＡ増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）の結合を介し、形質細胞の長期生存に重要である、ＴＮＦ受容体スーパーファミリのタンパク質である（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ、Ｂ．Ｐ．ら、「ＢＣＭＡ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｌｉｖｅｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌｓ．」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（２００４年）、第１９９巻、第９１〜９６頁）。ヒトＢＣＭＡは、５４ａａ細胞外ドメイン、２３ａａ膜貫通ドメイン、及び１０７ａａ細胞内ドメインからなる１８４アミノ酸（ａａ）タンパク質である（Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：６０８（ヒト）１０２１４５３９９（カニクイザル）；ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ０２２２３（ヒト））。
【０１８８】
ＢＣＭＡは形質細胞の長期細胞生存に役割を果たす（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ、「ＪＥＭ」（２００４年）、第１９９巻、第１号、第９１〜９８頁）。ＢＣＭＡは正常形質細胞で発現し、多発骨髄腫において上方制御され、高い有病率である。
【０１８９】
ある特定の実施形態では、標的抗原結合部分は、ＢＣＭＡ、例えばＢＣＭＡの細胞外ドメインに特異的に結合する。
【０１９０】
好ましくは、本発明の抗原結合タンパク質において使用されるそのような抗ＢＣＭＡ  Ｆｖは、１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、最も好ましくは１０−１０Ｍ未満の平衡解離定数（ＫＤ）（Ｂｉａｃｏｒｅによって測定）を有するＢＣＭＡと相互作用する。標的抗原結合部分に組み込まれたこのような抗ＢＣＭＡ  Ｆｖドメインは、ＣＤ１６Ａが結合したＮＫ細胞を再誘導し、ＢＣＭＡ＋ＭＭ（多発骨髄腫）細胞の存在下においてＡＤＣＣを誘導することができる。インビトロで及びインビボでＢＣＭＡ＋骨髄腫細胞に対するＣＤ３を介してＴ細胞を結合する二重特異性抗体の概念実証が報告されている（例えば、Ｈｉｐｐ  Ｓ．ら、「Ｌｅｕｋｅｍｉａ．」（２０１７年８月）；第３１巻、第８号、第１７４３〜１７５１頁（Ｅｐｕｂ  ２０１６年１２月２７日））。ある特定の実施形態では、標的抗原結合部分は、約１×１０−９Ｍ〜約５×１０−９ＭのＫＤでＢＣＭＡに結合する。ある特定の実施形態では、標的抗原結合部分は、約２×１０−９ＭのＫＤでＢＣＭＡに結合する。
【０１９１】
このようなＢＣＭＡ抗原結合部分は、例えばＲｙａｎＭ．Ｃ．らの「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌｓ」に記載されているように、例えば、ファージ若しくはリボソームのライブラリスクリーニング法、又はＢＣＭＡの細胞外ドメインによる非ヒト動物の免疫化によって得ることができる。（「Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．」（２００７年）、第６巻、第３００９〜３０１８頁。）
【０１９２】
Ｒｙａｎらは、ＩｇＧとして又は抗体薬物複合体としてのいずれかの細胞傷害活性を有する抗ＢＣＭＡ抗体の産生について記載している。参考文献として援用されているＲｙａｎ  Ｍ．Ｃ．らは、腫瘍細胞標的化のためのヒトＢＣＭＡ選択抗体の生成について記載している。ヒトＢＣＭＡ細胞外ドメインに対する抗体を作製した（ＥＣＤ、アミノ酸５〜５１；ＮＰ＿００１１８３）。この抗体はインビトロでＭＭ細胞に対する強力なＡＤＣＣを誘導し、ＣＤ１６Ａ結合を増強するＦｃ突然変異により増加した。Ｈ９２９細胞に対するＳＧ１の結合親和性ＫＤは、飽和結合により５１ｎｍｏｌ／Ｌであった。これらの抗体は、ＭＭ細胞株に対するインビトロ抗腫瘍活性を示し、したがって、それらのＦｖドメインは、本発明に係る抗原結合タンパク質におけるＢＣＭＡ抗原結合部分として使用することができる。
【０１９３】
更に、国際公開第０２／０６６５１６号には、ＴＡＣＩと交差反応するＢＣＭＡ抗体が記載されている。抗ＢＣＭＡ／ＴＡＣＩ二重特異性抗体は、ＢＣＭＡの残基１〜４８、並びにＴＡＣＩの残基３０〜６７及び残基６８〜１５４に結合することが記載されている。その可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインは、本発明の抗原結合タンパク質中のＢＣＭＡ抗原結合部分として使用することができ、参照により組み込まれる。
【０１９４】
参照により組み込まれるＲａｍａｄｏｓｓら、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」（２０１５年）、第１３７巻、第５２８８〜５２９１頁は、悪性ＭＭ細胞を溶解するためにＴ細胞を再誘導する二重特異性（ＢｉＦａｂ−ＢＣＭＡ）抗体を記載する。二重特異性抗体は、それらが静止したがん幹細胞を標的とすると同時に、少数の腫瘍関連抗原を標的とするため、ＭＭの治療に有用であり得ることが記載される。
【０１９５】
国際公開第２０１４／１２２１４４号は、二重特異性フォーマットでヒトＢＣＭＡ及びＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗体を記載する。開示された抗ＢＣＭＡ可変ドメインは、本発明に係るＢＣＭＡ抗原結合部分に好適である。
【０１９６】
国際公開第２０１３／０７２４０６号は、Ｔ細胞を結合するためＣＤ３に対する第２の特異性を有する二重特異性一本鎖抗体において、ＢＣＭＡ−１〜ＢＣＭＡ−１０８として示される抗ＢＣＭＡ  Ｆｖドメインを開示する。ヒト腫瘍異種移植モデルにおけるこれらのＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体の抗腫瘍効力が記載され、したがって、これらの抗ＢＣＭＡ  Ｆｖドメインは、本発明のＢＣＭＡ抗原結合部分に使用することができる。
【０１９７】
Ｔ細胞又はＮＫ細胞のような免疫エフェクタ細胞と結合する二重特異性抗体において用いることができる、更なる抗ＢＣＭＡ抗体は、国際公開第２０１０／１０４９４９号、国際公開第２０１２／１６３８０５号、国際公開第２０１３／０７２４１５号、国際公開第２０１４／１４０２４８号、及び国際公開第２０１４／０６８０７９号に開示されている。また、これらの参考文献は、強力かつ効果的な骨髄腫細胞溶解を誘導するこのような抗ＢＣＭＡ  Ｆｖドメインを使用する高親和性かつ二重特異性の抗体でＢＣＭＡを特異的に標的化する、抗ＢＣＭＡ  Ｆｖドメインを記載する。したがって、概念実証は、ＭＭ細胞を溶解するためにＴ細胞を再誘導する二重特異性抗体における抗ＢＣＭＡ  Ｆｖドメインについて示されている。
【０１９８】
骨髄腫細胞上に発現された抗原に結合する更なる抗原結合部分、特にＢＣＭＡは、他の公知の若しくは市販の抗体に由来するか、又は当技術分野で公知の方法によって新規に生成することができる。例えば、ＢＣＭＡに特異的な可変ドメインは、ＢＣＭＡに特異的な可変断片（Ｆｖ）を選択することによって得ることができる。これは、例えば一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ファージ・ディスプレイ・ライブラリをスクリーニングすることによって、又はハイブリドーマ技術を介して達成することができる。例えば、ヒトｓｃＦｖ配列のＩｇＭベースのファージ・ディスプレイ・ライブラリは、ＢＣＭＡに特異的な結合剤を濃縮するために、数回のインビトロ選択に供することができる（実施例１）。選択されたｓｃＦｖの親和性は、親和性成熟によって更に増加し得る。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、ＢＣＭＡ標的化部分は、配列番号６７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号６８に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号７０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号７１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【０２００】
ある特定の実施形態では、ＢＣＭＡ標的化部分のＶＨは、配列番号６５に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％相同又は同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２０１】
ある特定の実施形態では、ＢＣＭＡ標的化部分のＶＬは、配列番号６６に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％相同又は同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２０２】
ある特定の実施形態では、ＢＣＭＡ標的化部分のＶＨは、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含むか、又は有する。ある特定の実施形態では、ＢＣＭＡ標的化部分のＶＬは、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含むか、又は有する。
【０２０３】
ある特定の実施形態では、ＢＣＭＡ標的化部分のＶＨは、配列番号３７に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％相同又は同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２０４】
ある特定の実施形態では、ＢＣＭＡ標的化部分のＶＬは、配列番号３８に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％相同又は同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２０５】
ある特定の実施形態では、ＢＣＭＡ標的化部分のＶＨは、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含むか、又は有する。ある特定の実施形態では、ＢＣＭＡ標的化部分のＶＬは、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含むか、又は有する。
【０２０６】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ結合抗体は、図１３に示される構造を有するｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ抗原結合タンパク質であり、これは、（ａ）ＶＬ−ＶＨの順序でホモ二量体ヒトＩｇＧ  ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃ部分のＣ末端に融合したｓｃＦｖのフォーマットの２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分と、（ｂ）ＩｇＧのＦａｂアーム内の各Ｆｖによって提供される２つの標的抗原結合部分とを含み、ここで、標的抗原結合部分はＢＣＭＡに結合する。
【０２０７】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々は、配列番号７３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号７４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号７５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従って識別される。ＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＶＨと、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＶＬと、を含む。
【０２０８】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有するコネクタを介して接続されたＦｃ部分のＣ末端に、以下の順序：ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−リンカーＬ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）で融合し、リンカーＬ３は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する。
【０２０９】
ある特定の実施形態では、ＢＣＭＡ標的化部分の各々は、配列番号６７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号６８に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号７０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号７１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従って識別される。ＢＣＭＡ標的化部分の各々は、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨと、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬと、を含む。
【０２１０】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体のＦｃ部分は、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１  ＣＨ２及びＣＨ３重鎖定常ドメインを含む、サイレンシングされたＦｃ部分である。ＣＨ２重鎖定常ドメインは、２つのサイレンシング突然変異（「エフェクタレス突然変異」とも称する）：Ｌ２３４Ｆ及びＬ２３５Ｅを有する。ＣＨ２重鎖定常ドメインは、配列番号７９に示されるアミノ酸配列を含む。ＣＨ３重鎖定常ドメインは、配列番号１０９に示されるアミノ酸配列を含む。ＢＣＭＡ標的化部分に連結されるＣＨ１重鎖定常ドメインは、配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含む。
【０２１１】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖１と、配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖２と、を含む。
【０２１２】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体は、図５に示される構造を有するＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃであり、これは、（ａ）ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨの順序でＩｇＧ  ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃ部分のＣ末端に融合したｓｃＤｂのフォーマットである２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分と、（ｂ）Ｆｃ部分のＮ末端に融合したｓｃＦｖのフォーマットの単一の標的抗原結合部分をと、含み、ここで、標的抗原結合部分はＢＣＭＡに結合する。
【０２１３】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々は、配列番号７３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号７４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号７５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従って識別される。ＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＶＨと、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＶＬと、を含む。
【０２１４】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ヘテロ二量体Ｆｃ部分に融合し、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有するコネクタを介して、以下の順序で接続される：ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−リンカーＬ１−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−リンカーＬ２−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−リンカーＬ１−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）、ここで、リンカーＬ１は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有し、リンカーＬ２は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する。
【０２１５】
ある特定の実施形態では、ＢＣＭＡ標的化部分の各々は、配列番号６７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号６８に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号７０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号７１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従って識別される。ＢＣＭＡ標的化部分の各々は、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨと、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬと、を含む。
【０２１６】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩＩＩのＦｃ部分は、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２及びＣＨ３重鎖定常ドメインを含む、サイレンシングされたＦｃ部分である。ＣＨ２重鎖定常ドメインは、２つのサイレンシング突然変異又はエフェクタレス突然変異：Ｌ２３４Ｆ及びＬ２３５Ｅを有する。ＣＨ２重鎖定常ドメインは、配列番号７９に示されるアミノ酸配列を含む。ＣＨ３重鎖定常ドメインは、１つのサイレンシング突然変異又はエフェクタレス突然変異Ｄ２６５Ａを有する。ＣＨ３重鎖定常ドメインは、配列番号８１に示されるアミノ酸配列を含む。
【０２１７】
ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体は、配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖１と、配列番号６４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖２と、を含む。
【０２１８】
本発明の多重特異性抗原結合タンパク質の一実施形態では、タンパク質は、配列番号６１及び６２又は配列番号６３及び６４に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む四量体である。
【０２１９】
Ｂ．ＥＧＦＲ
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞ベースのＥＧＦＲ標的化アプローチのためのＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質もまた提供される。
【０２２０】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載されるＥＧＦＲの抗原結合部分はまた、ＥＧＦＲｖＩＩＩにも結合する。したがって、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲ発現がん及びＥＧＦＲｖＩＩＩ発現がんの両方の治療に用いることができる。ＥＧＦＲとは対照的に、ＥＧＦＲｖＩＩＩはがん細胞にのみ発現し、健康な組織には発現しない。したがって、より広範な種類のＥＧＦＲ及び／又はＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性腫瘍、そして、並びにより広範な患者集団を、本明細書に記載されるＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質で標的化することができる。本明細書に記載される抗原結合タンパク質に適したＥＧＦＲ結合ドメインの例は、配列番号４０に示されるアミノ酸配列をＶＨとして含み、配列番号４１に示されるアミノ酸配列をＶＬとして含む。
【０２２１】
ＩＶ．  ポリヌクレオチド
本明細書に記載される実施形態のいずれか１つによる抗原結合タンパク質は、抗原結合分子を形成する個々のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを発現することによって産生され得る。従って、本発明の更なる実施形態は、本明細書中で上述したような抗体分子のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えばＤＮＡ又はＲＮＡである。
【０２２２】
ポリヌクレオチドは、当業者に公知である方法によって、例えば、ペプチドリンカーによって分離されたか又はポリペプチド鎖のペプチド結合によって直接連結されたかのいずれかである可変ドメインをコードする遺伝子を、適切なプロモータ、及び任意に適切な転写ターミネータに作動可能に連結された遺伝子構築物に結合させ、それを細菌、又は例えばＣＨＯ細胞などの他の好適な発現系において発現させることによって、構築することができる。使用されるベクタ系及び宿主に応じて、構成的及び誘導性プロモータを含む、任意の数の適切な転写及び翻訳要素を使用することができる。プロモータは、それが各宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現を駆動するように選択される。
【０２２３】
ポリヌクレオチドは、本発明の更なる実施形態を表すベクタ、好ましくは発現ベクタに挿入することができる。
【０２２４】
種々の発現ベクタ／宿主系を利用して、本発明のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを含有し、発現させることができる。大腸菌における発現のための発現ベクタの例には、哺乳動物細胞における発現のためのｐＳＫＫ（ＬｅＧａｌｌら、「Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」（２００４年）、第２８５巻、第１号第１１１〜２７頁）又はｐｃＤＮＡ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）がある。
【０２２５】
Ｖ．  治療方法
本発明は、更に、多重特異性抗原結合タンパク質、特に、本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合タンパク質及び少なくとも１つの更なる成分を含む組成物を提供する。
【０２２６】
本発明は更に、ＮＫ細胞ベースの免疫療法での使用のために、本明細書中に記載されるような、多重特異性抗原結合タンパク質又は多重特異性抗原結合タンパク質を含む組成物を提供する。ＮＫ細胞ベースの免疫療法は、内因性又は養子移入されたＮＫ細胞のいずれかが、本発明の抗原結合分子による結合を介して活性化される、活性ＮＫ細胞ベースの治療法を含む。特に、がん細胞のような異常細胞をＮＫ細胞が攻撃し殺す能力が増強される。
【０２２７】
更に、現在の免疫腫瘍学（ｉｍｍｕｎｏ−ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ＩＯ）の展望には、抗ＣＴＬＡ４及び抗ＰＤ−１抗体のような市販のチェックポイント調節因子が挙げられる。しかしながら、これらの薬剤は臨床的有効性を示しており（様々な徴候で通常２０〜３０％のＯＲＲ）、医学的必要性と機会は残る。このため、治療のこのような最近の進歩にも関わらず、より多くの数の患者において患者反応率の増加及び長期寛解を達成するために、新しい治療法が必要である。例えば、ＮＫ細胞はＭＭに対する免疫応答で重要な役割をし、ＩＭｉＤ、プロテアソーム阻害剤、最近承認された免疫療法、及び自家造血幹細胞移植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ＡＳＣＴ）を含む、現在の標準的な治療介入の臨床効果に関わる。ＭＭにおいてしばしば調節不全となる骨髄腫細胞に対する天然ＮＫ細胞の細胞傷害性を増強するために、多くの戦略が開発されている。アプローチには、サイトカイン刺激又は免疫チェックポイント標的化を介した活性の調節、及びＡＳＣＴ適格ＭＭにおける培養増殖ＮＫ細胞の養子移入が含まれる。これらのアプローチは非常に魅力的であるが、ＮＫ細胞の自然な細胞傷害性に依存するため、標的化されておらず、抗原特異的再標的化及びエフェクタ活性化の恩恵を受ける可能性がある。
【０２２８】
更に、ＩＯにおける合理的な組合せは、安全性を管理しながら、最大限の免疫効果を発揮できる薬剤に基づくべきである。有望なアプローチは適応免疫を超え（ほとんどのチェックポイント抗体はＴ細胞上でのみ活性を示す）、自然免疫の活性化を含み、したがって統合した免疫応答を生じる。延長された血清半減期に基づいて、本明細書に記載される抗体フォーマットは、これらの目的に理想的に適合し、現在市販されているモノクローナル抗体と同様の便利な投与を可能にし、理想的には、抗ＬＡＧ３抗体又は抗ＰＤ１抗体のようなチェックポイント調節因子と組み合わせることができる。
【０２２９】
ある特定の実施形態では、本発明は、多発骨髄腫の治療における使用のために、ＣＤ１６Ａと、ＢＣＭＡ、ＣＳ−１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８，及びＣＤ１３８からなる群より選択される骨髄腫細胞又は形質細胞上に発現された抗原とを特異的に結合する多重特異性抗原結合タンパク質を提供し、多重特異性抗原結合タンパク質を投与する工程を含む、使用方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、標的細胞抗原、例えば腫瘍抗原に特異的に結合する多重特異性抗原結合分子と、ＮＫ細胞免疫療法での使用のためのＣＤ１６Ａとを提供し、ここで、多重特異性抗原結合タンパク質は、エクスビボでＮＫ細胞と混合され、ＮＫ細胞及び多重特異性抗原結合分子の組成物は患者に投与される。
【０２３０】
特定の実施形態では、腫瘍抗原はＢＣＭＡであり、組成物は形質細胞障害又は自己免疫疾患、特に多発骨髄腫の治療に使用される。
【０２３１】
形質細胞疾患として、多発骨髄腫、形質細胞腫、形質細胞白血病、マクログロブリン血症、アミロイドーシス、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、孤立性骨形質細胞腫（ｓｏｌｉｔａｒｙ  ｂｏｎｅ  ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｍａ）、髄外性形質細胞腫、骨硬化性骨髄腫（ｏｓｔｅｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｍｙｅｌｏｍａ）、重鎖病、良性単クローン性γグロブリン血症（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｇａｍｍｏｐａｔｈｙ  ｏｆ  ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ：ＭＧＵＳ）、及びくすぶり型骨髄腫が挙げられる。
【０２３２】
自己免疫疾患は、例えば、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ：ＳＬＥ）又は関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＲＡ）である。
【０２３３】
したがって、本明細書では、特定の実施形態において、医学的使用及び方法が提供され、ここで、ＢＣＭＡ及びＣＤ１６Ａに特異的な抗原結合タンパク質、例えば、上に記載されるようなｓｃＤｂ−ｍＦｃ、ＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ、ｓｃＤｂ−Ｔｒｉｂ（−ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ、Ｂｉ−ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ、ＫｉＨ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｄｂ−Ｆｃ、又はＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃが、ＢＣＭＡ＋がん又は自己免疫疾患、例えば多発骨髄腫の治療のために有効量で対象に投与される。
【０２３４】
投与は、異なる方法、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、又は皮内投与によって行われる。用量は主治医及び他の臨床的因子により決定される。いずれか１人の対象に対する用量は、患者の体重、体表面積、年齢、性別、投与される特定の化合物、投与の時間及び経路、治療法の種類、一般的な健康状態、並びに同時投与される他の薬物を含む、多くの因子に依存する。「有効量」とは、疾患の経過及び重症度に影響を及ぼし、そのような病理の軽減又は寛解をもたらすのに充分な有効成分の量を指す。ＢＣＭＡ＋疾患の治療及び／又は予防に有用な「有効量」は、公知の方法を用いて決定することができる。
【０２３５】
更に、本発明は、疾患の治療又は改善のための方法を提供し、この方法は、本発明の多重特異性抗原結合タンパク質を、それを必要とする対象に投与する工程を含む。
【０２３６】
疾患の治療又は改善のための方法の好ましい実施形態において、該疾患は、多発骨髄腫である。
【０２３７】
本開示は、がん、例えば多発骨髄腫を治療及び／又は予防するための、本開示の抗原結合分子、例えばＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗原結合分子の使用を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、現在開示されている抗原結合分子、例えばＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗原結合分子、又はそれを含む医薬組成物を、多発骨髄腫（「ＭＭ」）に罹患している対象に投与することを含む。
【０２３８】
ある特定の実施形態では、抗原結合分子、例えばＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗原結合分子、又はそれを含む医薬組成物で治療される対象は、再発した／難治性（「ｒｅｌａｐｓｅｄ／ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ：Ｒ／Ｒ」）の多発骨髄腫患者である。ある特定の実施形態では、対象は、ダラツムマブを受けている。ある特定の実施形態では、対象は、ダラツムマブナイーブである。ある特定の実施形態では、対象は、ダラツムマブ抵抗性である。ある特定の実施形態では、対象は、ダラツムマブ難治性である。ある特定の実施形態では、対象は、ダラツムマブ再発性である。
【０２３９】
ある特定の実施形態では、抗原結合分子、例えばＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗原結合分子、又はそれを含む医薬組成物で治療される対象は、ＣＤ１６Ａ多型を発現する。例えば、限定するものではないが、ＣＤ１６Ａ多型は、ＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ／Ｆ多型である。実施例８を参照されたい（例えば、図３１Ａ及び図３１Ｂ）。
【０２４０】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される治療方法は、第２の治療法、例えば、Ｔ細胞ベースの治療法又はチェックポイント阻害剤ベースの治療法を投与することを更に含む。このような第２の治療法としては、抗ＴＩＧＩＴ抗体の投与を含む治療法、抗ＰＤ−１抗体（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ）の投与を含む治療法、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ）の投与を含む治療法、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ）の投与を含む治療法、及びＣＤ３二重特異性抗体（例えば、抗ＦｃＲＨ５／ＣＤ３抗体（参照によりその全体が組み込まれる、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３７８７９号に開示されているそのような抗体を含むが、これらに限定されない））の投与を含む治療法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４１】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される治療方法は、サイトカイン療法の投与を更に含む。本明細書中で使用される場合、「サイトカイン療法」とは、限定されるものではないが、ペグ化サイトカイン及びＦｃ融合サイトカインを含んだ、サイトカインの任意の誘導体又はその修飾物を含むいずれかの治療を指す。そのような実施形態と関連して使用され得るサイトカインの非限定的な例は、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、及びＩＬ−６が挙げられる。ある特定の実施形態では、本方法は、ＩＬ−１５を投与することを更に含む。ある特定の実施形態では、本方法は、ＩＬ−２を投与することを更に含む。実施例８に示すように、ＩＬ−１５及びＩＬ−２は、現在開示されているＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗原結合分子の活性を増加させることができる。
【０２４２】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている抗原結合分子、例えばＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗原結合分子、又はそれらを含む医薬組成物の投与は、第１選択（１Ｌ）治療薬となる。例えば、限定するものではないが、このような第１選択投与は、ＦｃベースのＭＯＡ、例えばダラツムマブ療法を介する治療機能の有効性の低下を示すＣＤ１６Ａ多型を呈する対象において生じ得る。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合分子の第１選択投与は、ＮＫ細胞の兄弟殺しが禁忌である対象において生じ得る。実施例８を参照されたい（例えば、図４０Ａ〜図４０Ｅ）。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合分子の第１選択投与は、ＣＲＳの回避が望まれる対象において生じ得る。
【０２４３】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている抗原結合分子、例えばＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗原結合分子、又はそれらを含む医薬組成物の投与は、第２選択（２Ｌ）又は第３選択（３Ｌ）治療薬となる。例えば、限定するものではないが、このような第２選択又は第３選択の投与は、ＦｃベースのＭＯＡ、例えばダラツムマブ治療を介して既に治療機能を受けている対象において生じ得る。ある特定の実施形態では、このような第２選択又は第３選択の治療は、ダラツムマブ治療に難治性又は抵抗性である対象において生じ得る。
【０２４４】
ある特定の実施形態では、多発骨髄腫の治療に使用するＮＫ細胞誘導剤を選択するために、以下の基準のうちの１つ以上が使用される：
・  ＮＫ細胞誘導剤は、２つの標的：ＮＫ細胞上のＣＤ１６Ａ及び多発骨髄腫細胞上のＢＣＭＡに結合することができる、
・  ＮＫ細胞誘導剤は、ＣＤ１６Ａに対して少なくとも二価であり、例えば、少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む、
・  ＮＫ細胞誘導剤は、ＣＤ１６Ｂと交差反応性ではなく、好ましくは非ヒト霊長類と交差反応性である、ＮＫ細胞二重特異性抗体である、
・  ＮＫ細胞誘導剤は、強力かつ一般的であり、ＢＣＭＡ＋腫瘍細胞及び原発性骨髄腫を標的依存的にインビトロで死滅（例えば、約６０％以上の細胞がＥＣ５０≦５ｎＭで死滅）させる、
・  ＮＫ細胞誘導剤は、ＮＫ細胞を有意に殺傷せず、例えば、ＮＫ細胞の兄弟殺しを減少又は回避する、
・  ＮＫ細胞誘導剤は、例えば、他のＴ細胞誘導剤よりも優れたインビトロサイトカイン放出プロファイル（例えば、ＮＫ細誘導剤はＣＲＳを欠く）を有し、有害事象はモニタ可能、管理可能、かつ可逆的である、
・  ＮＫ細胞誘導剤は、多発骨髄腫対象に静脈内投与することができる、そして、
・  ＮＫ細胞誘導剤は、週１回（ＱＷ）以下の頻度で投与される必要がある。
【０２４５】
ある特定の実施形態では、以下の薬力学（ＰＤ）バイオマーカーを、本開示の抗原結合タンパク質の投与に関連して使用することができる：血清Ｍタンパク質及び遊離軽鎖（ｆｒｅｅ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ：ＦＬＣ）の濃度、モノクローナル形質細胞の減少、治療後骨髄試料におけるＮＫ細胞の活性化及び動員、並びに末梢ＮＫ細胞の活性化。ある特定の実施形態では、治療方法は、ＢＭＣＡ依存性診断を含むことができるが、多発骨髄腫におけるＢＭＣＡの高い有病率に基づいて、そのような診断は必ずしも必要ではない。
【０２４６】
ＶＩ．  例示的な実施形態
ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）少なくとも１つの第１の標的抗原結合部分と、（ｂ）少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分とを含む多重特異性抗原結合タンパク質を対象とし、ここで、少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、少なくとも１つの定常ドメインを含むＦａｂ断片、又はＦｃ部分に融合する。ある特定の実施形態では、該２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分のうちの少なくとも１つは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、及びダイアボディＤｂからなる群より選択される抗原結合分子である。ある特定の実施形態では、少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々は、ｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ｓｃＤｂのフォーマットである。ある特定の実施形態では、該少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々は、ポリペプチド鎖で順次結合された軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）とを含み、該ポリペプチド鎖のＮ末端における該可変領域は該ＶＬである。ある特定の実施形態では、該ポリペプチド鎖中の該少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の該可変領域は、ＶＬ−ＶＨ、ＶＬ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ、又はＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨの順で該Ｎ末端からＣ末端に位置する。ある特定の実施形態では、該ポリペプチド鎖中の該少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の該可変領域は、ＶＬ−ＶＨの順で該Ｎ末端からＣ末端に位置する。ある特定の実施形態では、該ポリペプチド鎖中の該少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の該可変領域は、ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨの順で該Ｎ末端からＣ末端に位置する。ある特定の実施形態では、（ｉ）ポリペプチド鎖のＣ末端は、Ｆｃ部分のＣＨ２ドメインのＮ末端に融合する；又は（ｉｉ）ポリペプチド鎖のＣ末端は、Ｆｃ部分のヒンジのＮ末端に融合する；（ｉｉｉ）ポリペプチド鎖のＮ末端は、Ｆｃ部分のＣＨ３ドメインのＣ末端に融合する、又は（ｉｖ）ポリペプチド鎖のＮ末端は、Ｆａｂ断片のＣ末端に融合する。ある特定の実施形態では、該ポリペプチド鎖の該Ｎ末端は、該Ｆｃ部分のＣＨ３ドメインの該Ｃ末端に融合する。ある特定の実施形態では、該Ｆｃ部分は、単量体ＣＨ２−ＣＨ３断片、ヘテロ二量体Ｆｃ領域、及びホモ二量体Ｆｃ領域からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、Ｆｃ部分はＦｃγ受容体に結合しないが、新生児型Ｆｃ受容体への結合を保持する。ある特定の実施形態では、２つのＣＤ１６抗原結合部分を含むｓｃＤｂ又はＤｂは、該Ｆａｂ断片の一方の鎖の該Ｃ末端に融合し、該第１の標的抗原結合部分は、該Ｆａｂ断片の他方の鎖の該Ｃ末端に融合する。ある特定の実施形態では、Ｆａｂ断片は、Ｎ末端にＨＳＡ抗原結合Ｆｖを含む。
【０２４７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、四価である。
【０２４８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合タンパク質は、少なくとも２つの標的抗原結合部分を含む。
【０２４９】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合タンパク質は、第１の標的抗原結合部分、第２の標的抗原結合部分、及び二量体Ｆｃ部分に融合した少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む。
【０２５０】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合タンパク質は、ＩｇＧの各重鎖の該Ｃ末端に融合したＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含み、ここで、ＩｇＧはＮ末端で該２つのＦａｂの各々における第１の標的抗原結合Ｆｖ部分を含み、第２の標的抗原結合部分はＣＬドメインの各々にＣ末端で融合する。
【０２５１】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、（ｉ）配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｉｉ）配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号５４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
【０２５２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合タンパク質は、以下：（ｉ）配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｉｉ）配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む。
【０２５３】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％相同若しくは同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％相同若しくは同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む。
【０２５４】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む。
【０２５５】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合タンパク質は、ＢＣＭＡ及びＥＧＦＲから選択された第１の標的抗原を結合する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合タンパク質は、ＢＣＭＡである第１の標的抗原を結合する。
【０２５６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合タンパク質は、配列番号６１又は６３に示されるアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖と、配列番号６２又は６４に示されるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド鎖と、を含む四量体を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合タンパク質は、以下：（ｉ）配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド及び配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド；（ｉｉ）配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド及び配列番号６４に示されるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド；（ｉｉｉ）配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド及び配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド；並びに（ｉｖ）配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド及び配列番号６４に示されるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドと、から選択される第１及び第２のポリペプチドを含む四量体を含む。
【０２５７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合タンパク質は、以下：（ｉ）配列番号６７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｉｉ）配列番号７０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、ＢＣＭＡ抗原結合部分を含む。
【０２５８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合タンパク質は、以下：（ｉ）配列番号６５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％相同若しくは同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｉｉ）配列番号６６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％相同若しくは同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＢＣＭＡ抗原結合部分を含む。
【０２５９】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合タンパク質は、以下：（ｉ）配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｉｉ）配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＢＣＭＡ抗原結合部分を含む。
【０２６０】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合タンパク質は、以下：（ｉ）以下を含む、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分：（ａ）配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び（ｂ）配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；と、（ｉｉ）以下を含む、ＢＣＭＡ抗原結合部分：（ａ）配列番号６７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び（ｉｉ）配列番号７０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；と、を含む、抗原結合タンパク質を含む。
【０２６１】
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される多重特異性抗原結合タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を対象とする。
【０２６２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合タンパク質は、医薬品として使用するためのものである。
【０２６３】
ある特定の実施形態では、本開示は、疾患の治療又は改善のための方法を対象とし、この方法は、本明細書に記載される多重特異性抗原結合タンパク質、又は本明細書に記載される医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、疾患は、がんである。ある特定の実施形態では、疾患は、血液のがんである。ある特定の実施形態では、疾患は、多発骨髄腫である。
【０２６４】
ある特定の実施形態では、本開示は、対象における疾患を治療及び／又は予防する方法を対象とし、この方法は、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質、又は本明細書に記載される医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、多重特異性抗原結合タンパク質は、静脈内投与される。ある特定の実施形態では、多重特異性抗原結合タンパク質は、皮下投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、第２の治療法を投与することを含む。ある特定の実施形態では、第２の治療法は、抗ＰＤ−１抗体を含む治療法、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む治療法、ＣＤ３二重特異性抗体を含む治療法、抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む治療法、抗ＶＥＧＦ抗体を含む治療法、及び抗ＦｃＲＨ５抗体を含む治療法からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、第２の治療は、サイトカイン療法である。ある特定の実施形態では、該サイトカイン療法は、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、及びＩＬ６からなる群より選択されるサイトカインの投与を含む。ある特定の実施形態では、該サイトカイン療法は、ＩＬ−２の投与を含む。ある特定の実施形態では、該サイトカイン療法は、ＩＬ−１５の投与を含む。
【０２６５】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるような治療される対象は、がん患者である。ある特定の実施形態では、対象は、血液のがん患者である。ある特定の実施形態では、対象は、多発骨髄腫患者である。ある特定の実施形態では、対象は、再発した／難治性の多発骨髄腫患者である。ある特定の実施形態では、対象は、抗ＣＤ３８療法を受けている。ある特定の実施形態では、対象は、ダラツムマブを受けている。ある特定の実施形態では、該対象は、ダラツムマブナイーブ、ダラツムマブ抵抗性、ダラツムマブ難治性、又はダラツムマブ再発性である。ある特定の実施形態では、該対象は、ダラツムマブ抵抗性、ダラツムマブ難治性、又はダラツムマブ再発性である。ある特定の実施形態では、対象は、ＣＤ１６Ａ多型を発現する。ある特定の実施形態では、該ＣＤ１６Ａ多型は、ＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ／Ｆ多型である。
【０２６６】
ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）少なくとも１つのＢＣＭＡ結合部分と、（ｂ）少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分とを含む二重特異性抗原結合タンパク質を対象とし、ここで、少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、少なくとも１つの定常ドメインを含むＦａｂ断片、又はＦｃ部分に融合する。ある特定の実施形態では、該２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分のうちの少なくとも１つは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、及びダイアボディＤｂからなる群より選択される抗原結合分子である。ある特定の実施形態では、少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々は、ｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ｓｃＤｂのフォーマットである。ある特定の実施形態では、該少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々は、ポリペプチド鎖で順次結合された軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）とを含み、該ポリペプチド鎖のＮ末端における該可変領域は該ＶＬである。ある特定の実施形態では、該ポリペプチド鎖中の該少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の該可変領域は、ＶＬ−ＶＨ、ＶＬ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ、又はＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨの順で該Ｎ末端からＣ末端に位置する。
【０２６７】
ある特定の実施形態では、該ポリペプチド鎖中の該少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の該可変領域は、ＶＬ−ＶＨの順で該Ｎ末端からＣ末端に位置する。ある特定の実施形態では、該ポリペプチド鎖中の該少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の該可変領域は、ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨの順で該Ｎ末端からＣ末端に位置する。
【０２６８】
ある特定の実施形態では、本開示は、二重特異性抗原結合タンパク質を対象とし、ここで、（ｉ）ポリペプチド鎖のＣ末端は、Ｆｃ部分のＣＨ２ドメインのＮ末端に融合する；又は（ｉｉ）ポリペプチド鎖のＣ末端は、Ｆｃ部分のヒンジのＮ末端に融合する；（ｉｉｉ）ポリペプチド鎖のＮ末端は、Ｆｃ部分のＣＨ３ドメインのＣ末端に融合する、又は（ｉｖ）ポリペプチド鎖のＮ末端は、Ｆａｂ断片のＣ末端に融合する。ある特定の実施形態では、該ポリペプチド鎖の該Ｎ末端は、該Ｆｃ部分のＣＨ３ドメインの該Ｃ末端に融合する。ある特定の実施形態では、該Ｆｃ部分は、単量体ＣＨ２−ＣＨ３断片、ヘテロ二量体Ｆｃ領域、及びホモ二量体Ｆｃ領域からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、Ｆｃ部分はＦｃγ受容体に結合しないが、新生児型Ｆｃ受容体への結合を保持する。ある特定の実施形態では、Ｆｃ部分は、少なくとも１つのエフェクタレス突然変異を含む。ある特定の実施形態では、該少なくとも１つのエフェクタレス突然変異は、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ２３８Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、及びＰ３３１Ｓからなる群より選択される。ある特定の実施形態では、該少なくとも１つのエフェクタレス突然変異は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ２３８Ｓ、及びＤ２６５Ａからなる群より選択される。ある特定の実施形態では、該少なくとも１つのエフェクタレス突然変異は、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、及びＤ２６５Ａからなる群より選択される。ある特定の実施形態では、Ｆｃ部分は、２つのエフェクタレス突然変異を有する。ある特定の実施形態では、２つのエフェクタレス突然変異は、Ｌ２３４Ｆ及びＬ２３５Ｅである。ある特定の実施形態では、Ｆｃ部分は、３つのエフェクタレス突然変異を有する。ある特定の実施形態では、３つのエフェクタレス突然変異は、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、及びＤ２６５Ａである。
【０２６９】
ある特定の実施形態では、本開示の二重特異性抗原結合タンパク質は、少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分がＦｃ部分に融合されている。ある特定の実施形態では、本開示の二重特異性抗原結合タンパク質は、２つのＢＣＭＡ標的化部分を含む。ある特定の実施形態では、本開示の二重特異性抗原結合タンパク質は、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分及び２つのＢＣＭＡ標的化部分を含む。ある特定の実施形態では、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々がＩｇＧの各重鎖のＣ末端に融合し、２つのＢＣＭＡ標的化部分の各々がＩｇＧの該Ｎ末端に融合する。
【０２７０】
ある特定の実施形態では、本開示の二重特異性抗原結合タンパク質は、図１３に示される構造を有する二重特異性抗原結合タンパク質を含む。ある特定のそのような実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は、１つのＢＣＭＡ標的化部分を含む。ある特定のそのような実施形態では、該ＢＣＭＡ標的化部分は、該少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分が融合している該Ｆｃ部分の該Ｎ末端に融合する。
【０２７１】
ある特定の実施形態では、二重特異性抗原結合は、図５に示される構造を有する。
【０２７２】
ある特定の実施形態では、本開示の二重特異性抗原結合タンパク質は、以下：（ｉ）配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号５１若しくは５６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｉｉ）配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号５４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む。ある特定の実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ２は、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ２は、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有する。
【０２７３】
ある特定の実施形態では、本開示の二重特異性抗原結合タンパク質は、以下：（ｉ）配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｉｉ）配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む。ある特定の実施形態では、該ＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、（ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％相同若しくは同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％相同若しくは同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、該ＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、（ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０２７４】
ある特定の実施形態では、本開示の二重特異性抗原結合タンパク質は、以下：（ｉ）配列番号６７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｉｉ）配列番号７０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、ＢＣＭＡ抗原結合部分を含む。ある特定の実施形態では、該ＢＣＭＡ抗原結合部分は、（ｉ）配列番号６５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％相同若しくは同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｉｉ）配列番号６６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％相同若しくは同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、該ＢＣＭＡ抗原結合部分は、（ｉ）配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は（ｉｉ）配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０２７５】
ある特定の実施形態では、本開示の二重特異性抗原結合タンパク質は、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分及び２つのＢＣＭＡ標的化部分を含み、ここで、（ａ）ＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々は、配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含み、（ｂ）ＢＣＭＡ標的化部分の各々は、配列番号６７に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、配列番号７０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、（ａ）ＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み；（ｂ）ＢＣＭＡ標的化部分の各々は、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０２７６】
ある特定の実施形態では、本開示の二重特異性抗原結合タンパク質は、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドと、配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドと、を含む四量体である。ある特定の実施形態では、本開示の二重特異性抗原結合タンパク質は、配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドと、配列番号６４に示されるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドと、を含む四量体である。
【０２７７】
ある特定の実施形態では、本開示の二重特異性抗原結合タンパク質は、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分及び２つのＢＣＭＡ抗原結合部分を含み、ここで、（ｉ）該ＣＤ１６Ａ抗原結合部分が、それぞれ：（ａ）配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び（ｂ）配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、（ｉｉ）該ＢＣＭＡ抗原結合部分が、それぞれ：（ａ）配列番号６７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び（ｉｉ）配列番号７０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
【０２７８】
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される二重特異性抗原結合タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を対象とする。ある特定の実施形態では、該医薬組成物は、医薬品として使用するためのものである。
【０２７９】
ある特定の実施形態では、本開示は、疾患を治療及び／又は予防する方法を対象とし、この方法は、本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質又は本明細書に記載される医薬組成物を投与することを含む。ある特定の実施形態では、該疾患は、がんである。ある特定の実施形態では、該疾患は、血液のがんである。ある特定の実施形態では、該疾患は、多発骨髄腫である。ある特定の実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は、静脈内投与される。ある特定の実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は、皮下投与される。ある特定の実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は、第２の治療法で投与される。ある特定の実施形態では、第２の治療法は、抗ＰＤ−１抗体を含む治療法、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む治療法、ＣＤ３二重特異性抗体を含む治療法、抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む治療法、抗ＶＥＧＦ抗体を含む治療法、及び抗ＦｃＲＨ５抗体を含む治療法からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、第２の治療は、サイトカイン療法である。ある特定の実施形態では、該サイトカイン療法は、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、及びＩＬ−６からなる群より選択されるサイトカインの投与である。ある特定の実施形態では、該サイトカインは、ＩＬ−１５である。ある特定の実施形態では、該サイトカインは、ＩＬ−２である。ある特定の実施形態では、該対象は、血液のがん患者である。ある特定の実施形態では、該対象は、血液のがん患者である。ある特定の実施形態では、該対象は、多発骨髄腫患者である。ある特定の実施形態では、対象は、再発した／難治性の多発骨髄腫患者である。ある特定の実施形態では、該対象は、抗ＣＤ３８療法を受けている。ある特定の実施形態では、該対象は、ダラツムマブを受けている。ある特定の実施形態では、該対象は、ダラツムマブナイーブ、ダラツムマブ抵抗性、ダラツムマブ難治性、又はダラツムマブ再発性である。ある特定の実施形態では、該対象は、ダラツムマブ抵抗性、ダラツムマブ難治性、又はダラツムマブ再発性である。ある特定の実施形態では、該対象は、ＣＤ１６Ａ多型を発現する。ある特定の実施形態では、該ＣＤ１６Ａ多型は、ＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ／Ｆ多型である。
【０２８０】
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の多重特異性抗原結合タンパク質又は本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質を対象とし、ここで、多重特異性抗原結合タンパク質又は二重特異性抗原結合タンパク質は、対象に投与された場合、対象のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞集団を実質的に枯渇又は減少させない。
【０２８１】
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の多重特異性抗原結合タンパク質又は本明細書に記載の二重特異性抗原結合タンパク質を投与することを含む、枯渇又は減少したＮＫ細胞集団を有する対象を治療する方法を対象とする。ある特定の実施形態では、該対象は、抗ｃｄ３８療法で以前に治療されている。ある特定の実施形態では、該抗ｃｄ３８療法は、ダラツムマブ療法である。
【０２８２】
ある特定の実施形態では、本開示は、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分と２つのＢＣＭＡ標的化部分とを含む二重特異性抗原結合タンパク質を対象とし、ここで、該２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々がＩｇＧの各重鎖の該Ｃ末端に融合し、該２つのＢＣＭＡ標的化部分の各々が該ＩｇＧの該重鎖の各々の該Ｎ末端に融合し、ここで、（ｉ）該ＣＤ１６Ａ抗原結合部分が、それぞれ：（ａ）配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び（ｂ）配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、（ｉｉ）該ＢＣＭＡ抗原結合部分が、それぞれ：（ａ）配列番号６７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び（ｉｉ）配列番号７０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
【０２８３】
ある特定の実施形態では、本開示は、対象におけるがんを治療する方法を対象とし、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分と２つのＢＣＭＡ標的化部分とを含む二重特異性抗原結合タンパク質を該対象へ投与することを含み、ここで、該２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々がＩｇＧの各重鎖の該Ｃ末端に融合し、該２つのＢＣＭＡ標的化部分の各々が該ＩｇＧの該重鎖の各々の該Ｎ末端に融合し、（ｉ）該ＣＤ１６Ａ抗原結合部分が、それぞれ：（ａ）配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び（ｂ）配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、（ｉｉ）該ＢＣＭＡ抗原結合部分が、それぞれ：（ａ）配列番号６７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び（ｉｉ）配列番号７０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、該がんは、多発骨髄腫である。
【０２８４】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合する、又はＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合することができる、抗体又は抗原結合タンパク質を対象とし、以下を含む：（ｉ）配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む第１の重鎖可変領域、（ｉｉ）配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む第１の軽鎖可変領域；（ｉｉｉ）配列番号６７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む第２の重鎖可変領域、並びに（ｉｖ）配列番号７０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む第２の軽鎖可変領域。例えば、ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合する、又はＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合することができる、抗体又は抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変領域；（ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変領域；（ｉｉｉ）配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖可変領域；（ｉｖ）配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖可変領域；（ｖ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変領域及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変領域；（ｖｉ）配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖可変領域及び配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖可変領域；又は、（ｖｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変領域；及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変領域；並びに配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖可変領域及び配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖可変領域、を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のように、ＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合する、又はＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合することができる、抗体又は抗原結合タンパク質は、ＣＤ１６Ｂに結合しない。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のように、ＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合する、又はＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合することができる、抗体又は抗原結合タンパク質は、対象に投与された場合、対象のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞集団を実質的に枯渇又は減少させない。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のように、ＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合する、又はＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合することができる、抗体又は抗原結合タンパク質は、ヒトＣＤ１６Ａに結合する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のように、ＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合する、又はＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合することができる、抗体又は抗原結合タンパク質は、ヒトＢＣＭＡに結合する。
【０２８５】
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のように、ＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合する、又はＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合することができる抗体又は抗原結合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を対象とする。
【０２８６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のように、ＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合する、又はＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合することができる、抗体又は抗原結合タンパク質は、医薬品として使うためのものである。
【０２８７】
ある特定の実施形態では、本開示は、疾患を治療及び／又は予防する方法を対象とし、ここで、この方法は、本明細書に記載のように、ＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合する、若しくはＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合することができる抗体若しくは抗原結合タンパク質、又は本明細書に記載のように、ＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合する、若しくはＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合することができる抗体若しくは抗原結合タンパク質を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与すること、を含む。ある特定の実施形態では、疾患は、がんである。ある特定の実施形態では、疾患は、血液のがんである。ある特定の実施形態では、疾患は、多発骨髄腫である。ある特定の実施形態では、抗体又は抗原結合タンパク質は、静脈内投与される。ある特定の実施形態では、抗体又は抗原結合タンパク質は、皮下投与される。ある特定の実施形態では、疾患を治療及び／又は予防することであって、ここで、この方法は、本明細書に記載のように、ＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合する、若しくはＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合することができる抗体若しくは抗原結合タンパク質を投与することを含み、又は本明細書に記載のように、ＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合する、若しくはＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合することができる抗体若しくは抗原結合タンパク質を含む医薬組成物は、第２の治療法を投与することを含む。ある特定の実施形態では、第２の治療法は、抗ＰＤ−１抗体を含む治療法、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む治療法、ＣＤ３二重特異性抗体を含む治療法、抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む治療法、抗ＶＥＧＦ抗体を含む治療法、及び抗ＦｃＲＨ５抗体を含む治療法からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、第２の治療は、サイトカイン療法である。ある特定の実施形態では、該サイトカイン療法は、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、及びＩＬ−６からなる群より選択されるサイトカインの投与である。ある特定の実施形態では、該サイトカインは、ＩＬ−１５である。ある特定の実施形態では、該サイトカインは、ＩＬ−２である。ある特定の実施形態では、該対象は、血液のがん患者である。ある特定の実施形態では、該対象は、血液のがん患者である。ある特定の実施形態では、該対象は、多発骨髄腫患者である。ある特定の実施形態では、対象は、再発した／難治性の多発骨髄腫患者である。ある特定の実施形態では、該対象は、抗ＣＤ３８療法を受けている。ある特定の実施形態では、該対象は、ダラツムマブを受けている。ある特定の実施形態では、該対象は、ダラツムマブナイーブ、ダラツムマブ抵抗性、ダラツムマブ難治性、又はダラツムマブ再発性である。ある特定の実施形態では、該対象は、ダラツムマブ抵抗性、ダラツムマブ難治性、又はダラツムマブ再発性である。ある特定の実施形態では、対象は、ＣＤ１６Ａ多型を発現する。ある特定の実施形態では、該ＣＤ１６Ａ多型は、ＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ／Ｆ多型である。
【０２８８】
ある特定の実施形態では、本開示は、枯渇又は減少したＮＫ細胞集団を有する対象を治療する方法を対象とし、この方法は、本明細書に記載のように、ＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合する、若しくはＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合することができる抗体若しくは抗原結合タンパク質、又は本明細書に記載のように、ＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合する、若しくはＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに結合することができる抗体若しくは抗原結合タンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む。ある特定の実施形態では、該対象は、抗ＣＤ３８療法で以前に治療されている。ある特定の実施形態では、該抗ＣＤ３８療法は、ダラツムマブ療法である。
【０２８９】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ１６Ａに結合する又はＣＤ１６Ａに結合することができる少なくとも１つのアームと、ＢＣＭＡに結合する又はＢＣＭＡに結合することができる少なくとも１つのアームと、を含む、抗体又は抗原結合タンパク質を対象とし、ここで、（ｉ）ＣＤ１６Ａに結合する又はＣＤ１６Ａに結合することができる該少なくとも１つのアームは、（ａ）配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに（ｂ）配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、（ｉｉ）ＢＣＭＡに結合する又はＢＣＭＡに結合することができる該少なくとも１つのアームは、（ａ）配列番号６７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び（ｉｉ）配列番号７０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定のそのような実施形態では、ＣＤ１６Ａに結合する又はＣＤ１６Ａに結合することができる該少なくとも１つのアームは、ＢＣＭＡに結合する又はＢＣＭＡに結合することができる該少なくとも１つのアームとは異なる。ある特定のそのような実施形態では、（ｉ）ＣＤ１６Ａに結合する又はＣＤ１６Ａに結合することができる少なくとも１つのアームは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む；（ｉｉ）ＣＤ１６Ａに結合する又はＣＤ１６Ａに結合することができる少なくとも１つのアームは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｉｉｉ）ＢＣＭＡに結合する又はＢＣＭＡに結合することができる少なくとも１つのアームは、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む；（ｉｖ）ＢＣＭＡに結合する又はＢＣＭＡに結合することができる少なくとも１つのアームは、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む；（ｖ）ＣＤ１６Ａに結合する又はＣＤ１６Ａに結合することができる少なくとも１つのアームは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み；（ｖｉ）ＢＣＭＡに結合する又はＢＣＭＡに結合することができる少なくとも１つのアームは、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む；又は（ｖｉｉ）ＣＤ１６Ａに結合する又はＣＤ１６Ａに結合することができる少なくとも１つのアームは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む；並びに、ＢＣＭＡに結合する又はＢＣＭＡに結合することができる少なくとも１つのアームは、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定のそのような実施形態では、抗体又は抗原結合タンパク質は、ＣＤ１６Ｂに結合しない。ある特定のそのような実施形態では、抗体又は抗原結合タンパク質は、該対象に投与された場合、対象のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞集団を実質的に枯渇又は減少させない。ある特定のそのような実施形態では、抗体又は抗原結合タンパク質は、ヒトＣＤ１６Ａに結合する。ある特定のそのような実施形態では、抗体又は抗原結合タンパク質は、ヒトＢＣＭＡに結合する。
【０２９０】
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるように、ＣＤ１６Ａに結合する又はＣＤ１６Ａに結合することができる少なくとも１つのアームと、ＢＣＭＡに結合する又はＢＣＭＡに結合することができる少なくとも１つのアームと、を含む、抗体又は抗原結合タンパク質を含む医薬組成物、及び薬学的に許容される担体を対象とする。
【０２９１】
ある特定の実施形態では、本開示は、医薬品として使用するための、ＣＤ１６Ａに結合する又はＣＤ１６Ａに結合することができる少なくとも１つのアームと、ＢＣＭＡに結合する又はＢＣＭＡに結合することができる少なくとも１つのアームと、を含む、抗体又は抗原結合タンパク質を対象とする。
【０２９２】
ある特定の実施形態では、本開示は、疾患を治療及び／又は予防する方法を対象とし、ここで、この方法は、本明細書に記載のように、ＣＤ１６Ａに結合する若しくはＣＤ１６Ａに結合することができる少なくとも１つのアームと、ＢＣＭＡに結合する若しくはＢＣＭＡに結合することができる少なくとも１つのアームと、を含む、抗体若しくは抗原結合タンパク質、又は抗体若しくは抗原結合タンパク質などを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、疾患は、がんである。ある特定の実施形態では、疾患は、血液のがんである。ある特定の実施形態では、疾患は、多発骨髄腫である。ある特定の実施形態では、抗体又は抗原結合タンパク質は、静脈内投与される。ある特定の実施形態では、抗体又は抗原結合タンパク質は、皮下投与される。ある特定の実施形態では、疾患を治療及び／又は予防する方法であって、ここで、本明細書に記載のようにＣＤ１６Ａに結合する若しくはＣＤ１６Ａに結合することができる少なくとも１つのアームと、ＢＣＭＡに結合する若しくはＢＣＭＡに結合することができる少なくとも１つのアームとを含む、抗体若しくは抗原結合タンパク質、又は抗体若しくは抗原結合タンパク質などを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む該方法は、第２の治療法を投与することを含む。ある特定の実施形態では、第２の治療法は、抗ＰＤ−１抗体を含む治療法、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む治療法、ＣＤ３二重特異性抗体を含む治療法、抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む治療法、抗ＶＥＧＦ抗体を含む治療法、及び抗ＦｃＲＨ５抗体を含む治療法からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、第２の治療は、サイトカイン療法である。ある特定の実施形態では、該サイトカイン療法は、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、及びＩＬ−６からなる群より選択されるサイトカインの投与である。ある特定の実施形態では、該サイトカインは、ＩＬ−１５である。ある特定の実施形態では、該サイトカインは、ＩＬ−２である。ある特定の実施形態では、該対象は、血液のがん患者である。ある特定の実施形態では、該対象は、血液のがん患者である。ある特定の実施形態では、該対象は、多発骨髄腫患者である。ある特定の実施形態では、対象は、再発した／難治性の多発骨髄腫患者である。ある特定の実施形態では、該対象は、抗ＣＤ３８療法を受けている。ある特定の実施形態では、該対象は、ダラツムマブを受けている。ある特定の実施形態では、該対象は、ダラツムマブナイーブ、ダラツムマブ抵抗性、ダラツムマブ難治性、又はダラツムマブ再発性である。ある特定の実施形態では、該対象は、ダラツムマブ抵抗性、ダラツムマブ難治性、又はダラツムマブ再発性である。ある特定の実施形態では、対象は、ＣＤ１６Ａ多型を発現する。ある特定の実施形態では、該ＣＤ１６Ａ多型は、ＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ／Ｆ多型である。ある特定の実施形態では、本方法は、枯渇又は減少したＮＫ細胞集団を有する対象を治療することを含む。ある特定の実施形態では、該対象は、抗ＣＤ３８療法で以前に治療されている。ある特定の実施形態では、該抗ＣＤ３８療法は、ダラツムマブ療法である。
【０２９３】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＢＣＭＡに結合する又はＢＣＭＡに結合することができる、抗体又は抗原結合タンパク質を対象とし、抗体又は抗原結合タンパク質は：（ｉ）配列番号６７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び（ｉｉ）配列番号７０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、ＢＣＭＡは、ヒトＢＣＭＡである。ある特定の実施形態では、抗体又は抗原結合タンパク質は、ＣＤ１６Ａに結合する又はＣＤ１６Ａに結合することができる、少なくとも１つのアームを含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａは、ヒトＣＤ１６Ａである。ある特定のそのような実施形態では、ＣＤ１６Ａに結合する又はＣＤ１６Ａに結合することができる該少なくとも１つのアームは、（ｉ）配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び（ｉｉ）配列番号７６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定のそのような実施形態では、ＢＣＭＡに結合する又はＢＣＭＡに結合することができる、抗体又は抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；（ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｉｉｉ）配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；（ｉｖ）配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｖ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ｖｉ）配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は、（ｖｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む第１の重鎖可変領域、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む第１の軽鎖可変領域；並びに配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖可変領域及び配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖可変領域、を含む。
【０２９４】
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のようにＢＣＭＡに結合する又はＢＣＭＡに結合することができる抗体又は抗原結合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を対象とする。
【０２９５】
ある特定の実施形態では、本開示は、医薬品として使用するための、本明細書に記載のようにＢＣＭＡに結合する又はＢＣＭＡに結合することができる、抗体又は抗原結合タンパク質を対象とする。
【０２９６】
ある特定の実施形態では、本開示は、疾患を治療及び／又は予防する方法を対象とし、この方法は、ＢＣＭＡに結合する若しくはＢＣＭＡに結合することができる抗体若しくは抗原結合タンパク質、又はそれを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、疾患は、がんである。ある特定の実施形態では、疾患は、血液のがんである。ある特定の実施形態では、疾患は、多発骨髄腫である。ある特定の実施形態では、抗体又は抗原結合タンパク質は、静脈内投与される。ある特定の実施形態では、抗体又は抗原結合タンパク質は、皮下投与される。ある特定の実施形態では、疾患を治療及び／又は予防する方法であって、ＢＣＭＡに結合する若しくはＢＣＭＡに結合することができる抗体若しくは抗原結合タンパク質、又はそれを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含むこの方法は、第２の治療法を投与することを含む。ある特定の実施形態では、第２の治療法は、抗ＰＤ−１抗体を含む治療法、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む治療法、ＣＤ３二重特異性抗体を含む治療法、抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む治療法、抗ＶＥＧＦ抗体を含む治療法、及び抗ＦｃＲＨ５抗体を含む治療法からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、第２の治療は、サイトカイン療法である。ある特定の実施形態では、該サイトカイン療法は、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、及びＩＬ−６からなる群より選択されるサイトカインの投与である。ある特定の実施形態では、該サイトカインは、ＩＬ−１５である。ある特定の実施形態では、該サイトカインは、ＩＬ−２である。ある特定の実施形態では、該対象は、血液のがん患者である。ある特定の実施形態では、該対象は、血液のがん患者である。ある特定の実施形態では、該対象は、多発骨髄腫患者である。ある特定の実施形態では、対象は、再発した／難治性の多発骨髄腫患者である。ある特定の実施形態では、該対象は、抗ＣＤ３８療法を受けている。ある特定の実施形態では、該対象は、ダラツムマブを受けている。ある特定の実施形態では、該対象は、ダラツムマブナイーブ、ダラツムマブ抵抗性、ダラツムマブ難治性、又はダラツムマブ再発性である。ある特定の実施形態では、該対象は、ダラツムマブ抵抗性、ダラツムマブ難治性、又はダラツムマブ再発性である。ある特定の実施形態では、該対象は、ＣＤ１６Ａ多型を発現する。ある特定の実施形態では、該ＣＤ１６Ａ多型は、ＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ／Ｆ多型である。ある特定の実施形態では、抗体又は抗原結合タンパク質は、枯渇又は減少したＮＫ細胞集団を有する対象に投与される。ある特定の実施形態では、該対象は、抗ＣＤ３８療法で以前に治療されている。ある特定の実施形態では、該抗ＣＤ３８療法は、ダラツムマブ療法である。
【実施例】
【０２９７】
実施例１：ＢＣＭＡ抗原結合部分の構造
抗原結合部分を構築するために、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＧＰ（「Ｓｃｉｅｎｃｅ」（１９８５年）、第２２８巻、第１３１５〜７頁）及びＣｌａｃｋｓｏｎら（「Ｎａｔｕｒｅ」（１９９１年）、第３５２巻、第６２４〜８頁）に記載されているように、繊維状融合ファージ上での一本鎖Ｆｖドメイン（ｓｃＦｖ）の発現及び表示によって、並びに組換え標的抗原又は標的抗原陽性細胞上でパニングすることによる標的結合を示すｓｃＦｖをコードするファージ粒子の濃縮によって、選択された標的抗原への選択的結合を有するヒト抗体ライブラリから抗体断片を単離することができる。ＢＣＭＡ結合抗体断片を単離するために、ヒトＣＤ３ゼータの膜貫通領域及び細胞質ドメインに融合した、細胞表面アンカー型ヒトＢＣＭＡ（１−５４）又はカニクイザルＢＣＭＡ（１−５３）を安定に発現する組換えヒトＢＣＭＡ（１−５４）−Ｆｃ、カニクイザルＢＣＭＡ（１−５３）−Ｆｃ、及びＣＨＯ細胞を、その後のパニングの回で使用して、結合ファージ粒子を濃縮することができる。このために、ファージ粒子を、例えば室温で２時間、溶液中の組換えＦｃ融合抗原とインキュベートし、その後、タンパク質Ｇ被覆ビーズで捕獲し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ及びＰＢＳ中で洗浄して、未結合のファージを除去する。結合したファージをグリシンで溶出させる。標的抗原発現細胞上の結合ファージの濃縮のために、ファージは、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞と共に、例えば室温で１時間インキュベートされ、その後、細胞培養培地で洗浄され、そしてグリシンで結合ファージを溶出させる。Ｆｃ又は非トランスフェクトＣＨＯ細胞に選択的に結合する抗体断片をコードするファージ粒子の濃縮を減少させるために、ファージプールを、無関係なＦｃ融合抗原又は標的抗原陰性ＣＨＯ細胞とインキュベートする。結合したファージのパニング及び溶出の各回に続いて、溶出されたファージ粒子を使用して、大腸菌（ＸＬ１  Ｂｌｕｅ）に感染させ、ファージ及びｓｃＦｖコードＤＮＡを増殖させる。ファージパニングを繰り返し、濃縮されたファージクローンを増殖させた後、ＤＮＡを大腸菌から単離し、大腸菌におけるＨｉｓタグ付き（配列番号５９）ｓｃＦｖ抗体断片のその後の産生及び細菌ペリプラズム抽出物調製のため、標準的な分子生物学的技術を用いて、細菌発現ベクタ、例えばｐＳＫＫ２に再クローニングする。ｓｃＦｖ抗体断片を含有するペリプラズム抽出物を、ＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリなどのスクリーニング法に供して、標的抗原の結合を評価する。例えば、組換えヒトＢＣＭＡ（１−５４）−Ｆｃ又はカニクイザルＢＣＭＡ（１−５３）−Ｆｃを、標準的なＥＬＩＳＡマイクロウェルプレートに被覆された抗ヒトＦｃ抗体によって結合し、その後、細菌性ペリプラズム抽出物とインキュベーションし、大規模に洗浄する。ｓｃＦｖ結合は、抗Ｈｉｓ−ＨＲＰ複合体を用いて検出する。細胞発現ＢＣＭＡへのｓｃＦｖの結合を評価するために、細菌性ペリプラズム抽出物を、細胞表面にアンカーされたヒト又はカニクイザルＢＣＭＡを発現する組換えＣＨＯ細胞とインキュベートした後、洗浄し、フローサイトメトリにより抗Ｈｉｓ−Ｒ−ＰＥを用いて、結合したｓｃＦｖを検出する。ヒト及び／��はカニクイザルＢＣＭＡ抗原に選択的に結合したｓｃＦｖ抗体断片をコードするプラスミドを、それぞれの細菌クローンから単離し、ＤＮＡ配列を分析して、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列を得る。例えば、配列番号３９で記載されるようなアミノ酸配列を有するＢＣＭＡ抗原結合部分が得られている。ここで、ＶＨは配列番号３７に記載され、ＶＬは配列番号３８に記載される。
【０２９８】
実施例２：異なる抗原結合タンパク質足場の生成
２．１  ｓｃＤｂ−ｍＦｃ（図１及び図２）：
ｓｃＤｂ−ｍＦｃは、単量体であり、単量体Ｆｃ部分に融合したｓｃＤｂのフォーマットである二価ＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む、抗原結合タンパク質を指す。２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分からなるｓｃＤｂのいずれかは、バリアントＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドと、Ｆｃ部分のＣ末端に融合した単一の標的抗原結合部分を含むｓｃＦｖと、からなるＦｃ部分のＮ末端に融合する（図１）。又は、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分からなるｓｃＤｂは、バリアントＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドからなるＦｃ部分のＣ末端に融合し、単一の標的抗原結合部分を含むｓｃＦｖは、Ｆｃ部分のＮ末端に融合する（図２）。
【０２９９】
ＣＨＯ細胞におけるｓｃＤｂ−ｍＦｃ抗原結合タンパク質の発現のために、分子のコード配列を哺乳動物発現ベクタ系にクローニングした。簡潔に述べると、ｓｃＦｖ中の短いペプチドリンカー（配列番号１６〜１８）をコードする遺伝子配列により連結されたｓｃＦｖフォーマットにおける、抗ＴＡＡ（腫瘍関連抗原）Ｆｖドメイン及び抗ＣＤ１６Ａ  Ｆｖドメイン（配列番号１〜１３）をコードする遺伝子配列を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｅｎｅＡｒｔ（ドイツ、レーゲンスブルク）によって合成した。異なる可変ドメイン、及びサイレンシング点突然変異（配列番号３０）を含有する単量体Ｆｃ部分のＰＣＲ増幅産物を、対応するプライマーを用いて作製した。その後、異なる重複したＤＮＡ断片と、線形化された骨格ベクタとを、１つの等温反応中で組み合わせる。ｓｃＤｂ−ｍＦｃ発現構築物は、それぞれ、抗体の分泌を促進するためのＮ末端シグナルペプチドのコード配列、並びに抗体の分泌及び精製を促進するためのＦｃ部分を含有するように設計した。全ての構築物の配列は、特注プライマーを用いてＧＡＴＣ（ドイツ、ケルン）のＤＮＡ配列決定により確認した。ｓｃＤｂ−ｍＦｃの発現カセットは、抗ＣＤ１６Ａドメインが単量体Ｆｃ部分のＮ末端又はＣ末端に配置され、コネクタ配列（配列番号１９〜２２）を介して以下の可能な順序で連結されるようにクローニングされる。
【０３００】
１．）  ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）
２．）  ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ３−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）
３．）  ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ４−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ３−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ４−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）
４．）  ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ４−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ４−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）
【０３０１】
抗原結合タンパク質の構造では、配列番号１６に特異的なｓｃＤｂ−ｍＦｃ＿０１、ｓｃＤｂ−ｍＦｃ＿０２、ｓｃＤｂ−ｍＦｃ＿０５、及びｓｃＤｂ−ｍＦｃ＿０６をリンカーＬ１に使用し、配列番号１７をリンカーＬ２に使用し、配列番号１８をＬ３に使用する。抗原結合タンパク質の構造では、配列番号６０に特異的なｓｃＤｂ−ｍＦｃ＿０３、ｓｃＤｂ−ｍＦｃ＿０４、ｓｃＤｂ−ｍＦｃ＿０７、及びｓｃＤｂ−ｍＦｃ＿０８をリンカーＬ４に使用し、配列番号１７をリンカーＬ２に使用し、配列番号１８をＬ３に使用する。
【０３０２】
２．２  ＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ（図３〜図６）：
ＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ抗原結合タンパク質は、ヘテロ二量体であり、ヘテロ二量体（ＫｉＨ）Ｆｃ部分に融合したｓｃＤｂのフォーマットの二価ＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む。単一の標的抗原結合部分は、ｓｃＦｖによって提供される。
【０３０３】
ＫｉＨ−ｓｃＤｂ−ＦｃをコードするＤＮＡ発現構築物は、抗ＣＤ１６Ａ  Ｆｖドメイン（配列番号１〜１３）のコード配列を、同じベクタからの２つの遺伝子カセットの共発現のため、Ｆｃサイレンシング及び「ノブ・イントゥ・ホール」点突然変異（配列番号３１、３２）を伴うＩｇＧ１定常ドメインＣＨ２及びＣＨ３を含むＣＭＶ制御発現カセットを含有する修飾哺乳動物発現ベクタにクローニングすることによって生成する。ヘテロ二量体の三価二重特異性（図３〜図５）又は四価三重特異性（図６）Ｆｃ融合構築物の生成を可能にする、「ノブ・イントゥ・ホール」突然変異。その後、抗ＴＡＡ（腫瘍関連抗原）Ｆｖドメインをコードする遺伝子配列から、対応するプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅産物を生成する。得られた重複ＤＮＡ断片は、関連する位置で共発現ベクタに挿入する。Ｆｃサイレンシング及び「ノブ・イントゥ・ホール」点突然変異を含有する可変ドメイン及び定常ドメインをコードする、必要な全ての遺伝子配列は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｅｎｅＡｒｔ（ドイツ、レーゲンスブルク）によって合成した。ＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ発現構築物は、抗体の分泌及び精製を促進するために、それぞれＮ末端シグナルペプチド、Ｃタグ、及び／又はＨｉｓタグ（６ｘＨｉｓ）のコーディング配列を含有するように設計されている。全ての構築物の配列は、特注プライマーを用いてＧＡＴＣ（ドイツ、ケルン）のＤＮＡ配列決定により確認した。ＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ構築物の発現カセットは、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分が、以下の可能な順序でのみ、ヘテロ二量体Ｆｃ部分のＮ末端に位置し、コネクタ（配列番号１９〜２２）及びヒンジ（配列番号２３）若しくはミドルヒンジ（配列番号２４）を介して接続されているか、又はヘテロ二量体Ｆｃ部分のＣ末端に位置し、コネクタ（配列番号１９〜２２）を介して接続されるように、クローニングされる。
【０３０４】
１．）  ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）
２．）  ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ３−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）
３．）  ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ４−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ３−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ４−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）
４．）  ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ４−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ４−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）
【０３０５】
配列番号１６はリンカーＬ１に使用し、配列番号１７はリンカーＬ２に使用し、配列番号１８はリンカーＬ３に使用し、配列番号６０はリンカーＬ４に使用する。
【０３０６】
このような抗原結合タンパク質の例には、Ｎ末端からＣ末端まで以下の構造からなるＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ＿０８及びＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ＿１２がある。
【０３０７】
第１のポリペプチド鎖ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ミドルヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３及び第２のポリペプチド鎖ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ（標的）−ＶＬ（標的）（図３）；又は、第１のポリペプチド鎖ミドルヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）及び第２のポリペプチドＶＨ（標的）−ＶＬ（標的）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（図５）。
【０３０８】
２．３  ｓｃＤｂ−ＴｒｉＢ又はｓｃＤｂ−ＴｒｉＢ−ｓｃＦｖ
ｓｃＤｂ−ＴｒｉＢは、ＣＤ１６Ａ、標的、及びＨＳＡ抗原結合部分を含むヘテロ二量体Ｆａｂ断片である三重特異性抗原結合タンパク質であって、ここで、抗原結合部分は、Ｆａｂ断片のＣ末端に融合した２つのｓｃＤｂによって提供されるか（図７）、又は２つのＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質を含むｓｃＤｂのいずれかによって提供され、標的抗原結合部分を含むｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＣ末端に融合する（図８）。
【０３０９】
ｓｃＤｂ−ＴｒｉＢ（−ｓｃＦｖ）をコードするＤＮＡ発現構築物は、同一ベクタからの２つの遺伝子カセットの共発現のため、抗ＨＳＡ  Ｆｖドメイン（配列番号１４、１５）のコード配列を、融合体を有するＦａｂ部分のみの重鎖及び軽鎖定常ドメイン（配列番号３３〜３５）を含むＣＭＶ制御発現カセットを含有する修飾哺乳動物発現ベクタにクローニングすることによって作製する。その後、抗ＴＡＡ（腫瘍関連抗原）Ｆｖドメイン及び抗ＣＤ１６Ａ  Ｆｖドメイン（配列番号１〜１３）をコードする遺伝子配列から、対応するプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅産物を生成する。得られた重複ＤＮＡ断片は、関連する位置で共発現ベクタに挿入する。可変ドメイン及びＦａｂ部分のみ定常ドメインをコードする全ての必要な遺伝子配列を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｅｎｅＡｒｔ（ドイツ、レーゲンスブルク）により合成した。ｓｃＤｂ−ＴｒｉＢ（−ｓｃＦｖ）発現構築物は、抗体の分泌及び精製を促進するために、それぞれＮ末端シグナルペプチド、Ｃタグ、及び／又はＨｉｓタグ（６ｘＨｉｓ）のコーディング配列を含有するように設計されている。全ての構築物の配列は、特注プライマーを用いてＧＡＴＣ（ドイツ、ケルン）のＤＮＡ配列決定により確認した。ｓｃＤｂ−ＴｒｉＢ（−ｓｃＦｖ）構築物の発現カセットは、抗ＣＤ１６Ａドメインが、以下の可能な順序でＦａｂの重鎖又は軽鎖にコネクタ（配列番号１９〜２２）を介して接続されたＣＬのＣ末端又はＦａｂのＣＨ１に位置するように、クローニングされる。
【０３１０】
１．）  ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）
２．）  ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）
【０３１１】
このような抗原結合タンパク質の例には、Ｎ末端からＣ末端までの以下の構造を含むｓｃＤｂ−ＴｒｉＢ−ｓｃＦｖ＿０１がある。第１のポリペプチド鎖ＶＨ（ＨＳＡ）−ＣＨ１−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）及び第２のポリペプチド鎖ＶＬ（ＨＳＡ）−ＣＬ−ＶＨ（標的）−ＶＬ（標的）（図８）。配列番号１６はリンカーＬ１に使用し、配列番号１７又は配列番号１８はリンカーＬ２に使用する。
【０３１２】
２．４  Ｄｂ−Ｆｃ（図９〜図１０）：
Ｄｂ−Ｆｃは、ホモ二量体であり、ホモ二量体Ｆｃ部分（ＣＨ２−ＣＨ３）のＮ末端でヒンジに融合したＤｂのフォーマットの二価ＣＤ１６Ａ抗原結合部分と、Ｆｃ部分の他の末端に融合したｓｃＦｖのフォーマットの２つの標的抗原結合部分とを含む、抗原結合タンパク質である。ＣＨＯ細胞におけるＤｂ−Ｆｃ抗原結合タンパク質の発現のために、分子のコード配列を哺乳動物発現ベクタ系にクローニングした。簡潔に述べると、短いペプチドリンカー（配列番号１６）により連結された、抗ＴＡＡ（腫瘍関連抗原）Ｆｖドメイン及び抗ＣＤ１６Ａ  Ｆｖドメイン（配列番号１〜１３）をコードする遺伝子配列を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｅｎｅＡｒｔ（ドイツ、レーゲンスブルク）によって合成した。異なる可変ドメイン、及びサイレンシング点突然変異（配列番号２９）を含有するＦｃ部分のＰＣＲ増幅産物を、対応するプライマーを用いて作製した。その後、異なる重複したＤＮＡ断片と、線形化された骨格ベクタとを、１つの等温反応中で組み合わせる。Ｄｂ−Ｆｃ発現構築物は、抗体分泌を促進するためのＮ末端シグナルペプチドの配列を含有すように設計された。全ての構築物の配列は、特注プライマーを用いてＧＡＴＣ（ドイツ、ケルン）のＤＮＡ配列決定により確認した。Ｄｂ−Ｆｃの発現カセットは、抗ＣＤ１６Ａドメインが、以下の可能な順序でのみ、コネクタ（配列番号１９〜２２）を介してミドルヒンジ（配列番号２４）に接続されたホモ二量体Ｆｃ部分（ＣＨ２−ＣＨ３）のＮ末端若しくはＣ末端に位置するか、又はコネクタ（配列番号１９〜２２）を介してＣＨ３のＣ末端に位置するように、クローニングされる。
【０３１３】
１．）  ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）
２．）  ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）
【０３１４】
そのような抗原結合タンパク質の例にはＤｂ−Ｆｃ＿０２及びＤｂ−Ｆｃ＿０４があり、これらは、Ｎ末端からＣ末端まで、次の構造：ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ミドルヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ（標的）−ＶＬ（標的）（図９）；又はＶＨ（標的）−ＶＬ（標的）−ミドルヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）（図１０）からなる。配列番号１６をリンカーＬ１に使用する。
【０３１５】
２．５  Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ（図１１〜図１２）：
Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃは、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分及び２つの標的抗原結合部分を含み、各々ｓｃＦｖのフォーマットで、Ｆｃホモ二量体に融合した、ホモ二量体及び四価抗原結合タンパク質である。
【０３１６】
ＣＨＯ細胞におけるＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗原結合タンパク質の発現のために、分子のコード配列を哺乳動物発現ベクタ系にクローニングした。簡潔に述べると、短いペプチドリンカー（配列番号１７〜１８）により連結された、抗ＴＡＡ（腫瘍関連抗原）Ｆｖドメイン及び抗ＣＤ１６Ａ  Ｆｖドメイン（配列番号１〜１３）をコードする遺伝子配列を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＧｅｎｅＡｒｔ（ドイツ、レーゲンスブルク）によって合成した。異なる可変ドメインと、サイレンシング点突然変異（配列番号２９）を含有するＦｃ部分又は野生型Ｆｃ部分（配列番号３６）のいずれかとのＰＣＲ増幅産物を、対応するプライマーを用いて作製した。その後、異なる重複したＤＮＡ断片と、線形化された骨格ベクタとを、１つの等温反応中で組み合わせる。Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ発現構築物は、それぞれ、Ｎ末端シグナルペプチドのコード配列、並びに抗体の分泌及び精製を促進するためのＦｃ部分を含有するように設計した。全ての構築物の配列は、特注プライマーを用いてＧＡＴＣ（ドイツ、ケルン）のＤＮＡ配列決定により確認した。Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃの発現カセットは、抗ＣＤ１６Ａドメインが、以下の可能な順序でのみ、コネクタ（配列番号１９〜２２）若しくはヒンジ（配列番号２３）を介して接続されたＦｃ部分のＮ末端、又はコネクタ（配列番号１９〜２２）を介してＣＨ３に接続されたＦｃ部分のＣ末端に位置するように、クローニングされる。
【０３１７】
１．）  ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ３−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）
２．）  ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）
【０３１８】
このような抗原結合タンパク質の例には、Ｎ末端からＣ末端まで以下の構造からなる、Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿２７及びＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿２６がある。ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ（標的）−ＶＬ（標的）（図１１）；又はＶＨ（標的）−ＶＬ（標的）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）（図１２）。配列番号１７はリンカーＬ２に使用し、配列番号１８はリンカーＬ３に使用する。
【０３１９】
２．６  ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ（図１３）：
ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ抗原結合タンパク質は、ｓｃＦｖのフォーマットであるＩｇＧ抗体及び２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含み、ここで、ｓｃＦｖ  ＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々はＨ鎖の１つのＣ末端に融合し、２つの標的抗原結合部分は、ＩｇＧのＦａｂアーム内の各Ｆｖに提供される。
【０３２０】
ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂをコードするＤＮＡ発現構築物は、同一ベクタからの遺伝子カセット両方の共発現のために、抗ＴＡＡ  Ｆｖドメインのコード配列を、Ｆｃサイレンシング点突然変異（配列番号２５、２７〜２８）又は野生型Ｆｃ部分（配列番号２６〜２８）を伴う、重鎖及び軽鎖定常ドメインを含むＣＭＶ制御発現カセットを含有する修飾哺乳動物発現ベクタにクローニングすることによって作製する。その後、短いペプチドリンカー（配列番号１７〜１８）によって分離された抗ＣＤ１６Ａ  Ｆｖドメイン（配列番号１〜１３）をコードする遺伝子配列から、対応するプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅産物を生成する。得られた重複ＤＮＡ断片は、関連する位置で共発現ベクタに挿入する。Ｆｃサイレンシング点突然変異を含有する可変ドメイン及び定常ドメインをコードする、必要な全ての遺伝子配列は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｅｎｅＡｒｔ（ドイツ、レーゲンスブルク）によって合成した。ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ発現構築物は、それぞれ、Ｎ末端シグナルペプチドのコード配列、並びに抗体の分泌及び精製を促進するためのＦｃ部分を含有するように設計した。全ての構築物の配列は、特注プライマーを用いてＧＡＴＣ（ドイツ、ケルン）のＤＮＡ配列決定により確認した。ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂの発現カセットは、抗ＣＤ１６ＡドメインがＦｃ部分のＣ末端に配置され、コネクタ（配列番号１９〜２２）を介して以下の可能な順序で連結されるようにクローニングされる。
【０３２１】
１．）  ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ３−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）
２．）  ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）
【０３２２】
このような抗原結合タンパク質の例には、Ｎ末端からＣ末端までの以下の構造を含む、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿３０がある。
【０３２３】
第１のポリペプチド鎖ＶＨ（標的）−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）及び第２のポリペプチド鎖ＶＬ（標的）−ＣＬ（図１３）。配列番号１７はリンカーＬ２に使用し、配列番号１８はリンカーＬ３に使用する。
【０３２４】
２．７  Ｂｉ−ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ（図１４）：
Ｂｉ−ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ抗体、及びそこに融合した４つのｓｃＦｖ抗原結合部分を含み、ここで、ｓｃＦｖのフォーマットである２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々は２つのＨ鎖の一方のＣ末端に融合し、２つの標的抗原結合部分の各々は、２つのＣＬ領域の一方のＣ末端に融合する。
【０３２５】
Ｂｉ−ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂをコードするＤＮＡ発現構築物は、同一ベクタからの２つの遺伝子カセットの共発現のために、抗ＴＡＡ  Ｆｖドメインのコード配列を、Ｆｃサイレンシング点突然変異（配列番号２５、２７〜２８）を伴う、重鎖及び軽鎖定常ドメインを含むＣＭＶ制御発現カセットを含有する修飾哺乳動物発現ベクタにクローニングすることによって作製する。その後、短いペプチドリンカーによって分離された抗ＣＤ１６Ａ又は標的抗原結合Ｆｖドメイン（配列番号１〜１３）をコードする遺伝子配列から、対応するプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅産物を生成する。得られた重複ＤＮＡ断片は、関連する位置で共発現ベクタに挿入する。Ｆｃサイレンシング点突然変異を含有する可変ドメイン及び定常ドメインをコードする、必要な全ての遺伝子配列は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｅｎｅＡｒｔ（ドイツ、レーゲンスブルク）によって合成した。Ｂｉ−ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ発現構築物は、それぞれ、Ｎ末端シグナルペプチドのコード配列、並びに抗体の分泌及び精製を促進するためのＦｃ部分を含有するように設計した。全ての構築物の配列は、特注プライマーを用いてＧＡＴＣ（ドイツ、ケルン）のＤＮＡ配列決定により確認した。Ｂｉ−ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂの発現カセットは、抗ＣＤ１６ＡドメインがＦｃ部分のＣ末端に配置され、コネクタ（配列番号１９〜２２）を介して以下の可能な順序で連結されるようにクローニングされる。
【０３２６】
１．）  ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ３−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）
２．）  ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）
【０３２７】
このような抗原結合タンパク質の例には、Ｎ末端からＣ末端までの以下の構造を含む、Ｂｉ−ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０３がある。
【０３２８】
第１のポリペプチド鎖ＶＨ（標的１）−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）及び第２のポリペプチド鎖ＶＬ（標的１）−ＣＬ−ＶＬ（標的２）−ＶＨ（標的２）（図１４）。配列番号１７はリンカーＬ２に使用し、配列番号１８はリンカーＬ３に使用する。
【０３２９】
２．８  ＫｉＨ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ（図１５ａ及び図１５ｂ）：
ＫｉＨ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗原結合タンパク質は、ヘテロ二量体（ＫｉＨ）Ｆｃ部分に融合した４つのｓｃＦｖ抗原結合部分を含み、ここで、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかでＦｃ部分に融合する。
【０３３０】
ＫｉＨ−ｓｃＦｖ−ＦｃをコードするＤＮＡ発現構築物は、抗ＣＤ１６Ａ  Ｆｖドメイン（配列番号１〜１３）のコード配列を、同じベクタからの２つの遺伝子カセットの共発現のため、Ｆｃサイレンシング及び「ノブ・イントゥ・ホール」点突然変異（配列番号３１〜３２）を伴うＩｇＧ１定常ドメインＣＨ２及びＣＨ３を含むＣＭＶ制御発現カセットを含有する修飾哺乳動物発現ベクタにクローニングすることによって生成する。「ノブ・イントゥ・ホール」突然変異は、二重特異性Ｆｃ融合構築物の生成を可能にする。その後、抗ＴＡＡ（腫瘍関連抗原）Ｆｖドメインをコードする遺伝子配列から、対応するプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅産物を生成する。得られた重複ＤＮＡ断片は、関連する位置で共発現ベクタに挿入する。Ｆｃサイレンシング及び「ノブ・イントゥ・ホール」点突然変異を含有する可変ドメイン及び定常ドメインをコードする、必要な全ての遺伝子配列は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｅｎｅＡｒｔ（ドイツ、レーゲンスブルク）によって合成した。ＫｉＨ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ発現構築物は、抗体の分泌及び精製を促進するために、それぞれＮ末端シグナルペプチド、Ｆｃ部分、Ｃタグ、及びＨｉｓタグ（６ｘＨｉｓ）のコーディング配列を含有するように設計されている。全ての構築物の配列は、特注プライマーを用いてＧＡＴＣ（ドイツ、ケルン）のＤＮＡ配列決定により確認した。ＫｉＨ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ構築の発現カセットは、抗ＣＤ１６Ａドメインが、以下の可能な順序でのみ、コネクタ（配列番号１９〜２２）及びヒンジ（配列番号２３）を介して接続されたヘテロ二量体Ｆｃ部分のＮ末端、又はコネクタ（配列番号１９〜２２）を介してＦｃ部分のＣ末端に位置するように、クローニングされる。
【０３３１】
１．）  ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ３−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）
２．）  ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）
【０３３２】
このような抗原結合タンパク質の例には、Ｎ末端からＣ末端まで以下の構造からなる、ＫｉＨ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿０９及びＫｉＨ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿１１がある。
【０３３３】
第１のポリペプチド鎖ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ（標的１）−ＶＬ（標的１）及び第２のポリペプチド鎖ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ（標的２）−ＶＬ（標的２）（図１５ａ）；又は第１のポリペプチド鎖ＶＨ（標的１）−ＶＬ（標的１）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）及び第２のポリペプチド鎖ＶＨ（標的２）−ＶＬ（標的２）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）（図１５ｂ）。配列番号１７はリンカーＬ２に使用し、配列番号１８はリンカーＬ３に使用する。
【０３３４】
実施例３：安定なＣＨＯ細胞プールを用いたＮＫ細胞誘導剤抗体フォーマットの産生
宿主細胞培養
ＣＨＯ−Ｋ１チャイニーズハムスタ卵巣細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−６１）（Ｋａｏ及びＰｕｃｋ、１９６８年）の誘導体である、Ｆｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、Ｌ−グルタミン、１０％ＦＣＳ、及び１００μｇ／ｍＬゼオシンを補充したＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘ中で培養した。接着細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで分離し、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製の標準細胞培養プロトコルに従って継代培養した。
【０３３５】
懸濁液中での増殖に適応させるため、細胞を組織培養フラスコから分離し、血清を含まないＨｙＣｌｏｎｅ  ＣＤＭ４  ＣＨＯ培地中に置き、その後３７℃の５％のＣＯ２及び１２０ｒｐｍにて振盪フラスコ中でインキュベーションした。懸濁液適合Ｆｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ宿主細胞の培養のための標準培地は、Ｌ−グルタミン、ＨＴサプリメント、ペニシリン／ストレプトマイシン、及び１００μｇ／ｍＬゼオシンを補充したＨｙＣｌｏｎｅ  ＣＤＭ４  ＣＨＯであった。懸濁液適合細胞を、１０％ＤＭＳＯを有する培地中で凍結保存し、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ検出キット（Ｌｏｎｚａ）を用いてＭｙｃｏｐｌａｓｍａの陰性について試験した。
【０３３６】
安定的にトランスフェクトされた細胞プールの生成
分泌された組換え抗体、Ｆｃ融合構築物、又は比較用抗体を安定して発現する組換えＦｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞株を、懸濁液適合宿主細胞のトランスフェクションによって生成した。このために、目的のタンパク質（ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ）をコードする発現プラスミド（２．５μｇ）と、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いるＦｌｐリコンビナーゼ（ｐＯＧ４４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）との同時トランスフェクションの１日前に、細胞は、ゼオシンを含まない標準培地中に置いた。簡単に述べると、ベクタＤＮＡ及びトランスフェクション試薬を、合計１００μＬのＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ培地中においてＤＮＡ：ＰＥＩ比１：３（μｇ／μｇ）で混合し、１０分間インキュベートした後、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地１ｍＬ中に懸濁した２Ｅ＋６  Ｆｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に添加した。２４〜４８時間のインキュベーションに続いて、安定的にトランスフェクトされた細胞に対する選択を、６〜７μｇ／ｍＬのピューロマイシン二塩酸塩の添加によって開始し、その後、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地中において０．２Ｅ＋６生存細胞／ｍＬの密度に培養物を希釈した。Ｆｌｐリコンビナーゼは、部位特異的ＤＮＡ組換え（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、１９９１年）により組み込まれたＦＲＴ部位で、ゲノムへのＦｌｐ−Ｉｎ発現構築物の挿入を媒介する。選択の間、生存細胞密度を週２回測定し、細胞を遠心分離し、最大密度０．２Ｅ＋６生存細胞／ｍＬで新鮮な選択培地中に再懸濁した。組換えタンパク質産物を安定に発現する細胞プールは、振盪フラスコ中の標準培養培地に細胞を移した時点で、２−３週間の選択後に回収した。組換え分泌タンパク質の発現は、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）技術（下記参照）を用いた細胞培養上清のタンパク質ゲル電気泳動によって確認した。安定な細胞プールを、７．５％ＤＭＳＯを含有する培地中で凍結保存した。
【０３３７】
流加ＣＨＯ細胞懸濁培養物における組換えタンパク質の産生
組換えタンパク質を、細胞培養上清への分泌によって安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の１０日又は１１日間の流加培養にて産生した。このために、組換え抗体、Ｆｃ融合抗原、又は比較抗体を安定に発現する細胞を、ガス透過性キャップ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を備えたポリカーボネート三角フラスコ中の標準培地において６Ｅ＋５細胞／ｍＬの開始密度で播種し、１４０ｒｐｍで攪拌しながら３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。流加培養の間、培地には、０日目（開始日）に４０ｍＬ／ＬのＡｃｔｉＣＨＯ飼料Ａ（ＧＥヘルスケア）及び４ｍＬ／ＬのＡｃｔｉＣＨＯ飼料Ｂ（ＧＥヘルスケア）を補充し、３日目、５日目、及び７日目に２倍の量を補充した。細胞培養上清を、典型的に、７５％超の培養生存率で１０日又は１１日後に収集した。試料は、補給前に１日置きに産生培養物から採取し、細胞密度及び生存性を評価した。収集の日に、細胞培養上清を、更なる使用の前に先立って、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＰＬＵＳ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて遠心分離及び真空濾過（０．２２μｍ）によって除去した。
【０３３８】
発現力価定量：
細胞培養上清（ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ：ＣＳＳ）におけるタンパク質発現力価及び産物完全性は、産生培養物の５、７及び１０又は１１日目にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。試料は、４〜２０％のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  Ｐｒｅｃａｓｔ  ＳＤＳ  ＰＡＧＥ  Ｇｅｌｓ（Ｂｉｏｒａｄ）上にロードする前に、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ試料緩衝液と混合する。全タンパク質は、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いてゲル中で可視化する。生成物の力価は、既知濃度の参照抗体と比較することによって、半定量的に決定される。
【０３３９】
抗原結合タンパク質の精製
１．Ｆｃ部分を含む抗原結合タンパク質（実施例２に記載した、ｓｃＤｂ−ｍＦｃ、Ｄｂ−Ｆｃ、Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｂｉ−ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ）
標的タンパク質を、タンパク質Ａ及び調製ＳＥＣを含む２段階手順において、清澄化されたＣＨＯ細胞培養上清から精製した。タンパク質Ａについて、清澄化した上清を、ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅカラム（ＧＥヘルスケア）にロードした。リン酸緩衝食塩水ｐＨ７．４及び１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で洗浄した後、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ３．５及び１０ｍＭグリシン／ＨＣＬ  ｐＨ２．０による２段階勾配で、タンパク質を溶出した。画分の純度を、ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。許容可能な純度を示す画分をプールし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００プレップ・グレード・カラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分取ゲルろ過に供した。精製された標的分子を含有する溶出画分をプールし、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、４．５％ソルビトールｐＨ５．０を有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを用いて緩衝交換を行い、限外濾過によっておよそ１ｍｇ／ｍＬの典型的な濃度まで濃縮した。これらの構築物の典型的な純度（ＳＥ−ＨＰＬＣにより測定）は、８７，６％〜９９，８％の範囲であり、均質性（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は５８，４％〜１００％の間であった。
【０３４０】
２．κ−軽鎖及びＨｉｓタグを含有する実施例２に係る抗原結合タンパク質ＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ及びｓｃＤｂ−トリボディ−ｓｃＦｖ
標的タンパク質を、タンパク質Ｌ、ＩＭＡＣ、及び調製ＳＥＣを含む３段階手順において、清澄化されたＣＨＯ細胞培養上清から精製した。タンパク質Ｌについて、清澄化した上清を、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌカラム（ＧＥヘルスケア）にロードした。リン酸緩衝食塩水ｐＨ７．４及び１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で洗浄した後、１０ｍＭのグリシン／ＨＣＬ  ｐＨ３．０及び１０ｍＭグリシン／ＨＣＬ  ｐＨ２．０による２段階勾配で、タンパク質を溶出した。画分の純度を、ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。許容可能な純度を示す画分をプールし、更なるＩＭＡＣ精製に供した。このようにして、試料を、平衡化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ、１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．５）で希釈し（１：４）、ＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア）にロードした。平衡化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ、１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．５）で洗浄した後、タンパク質を、７％／３０％／１００％溶出緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ、０．４Ｍアルギニン、５００ｍＭイミダゾールｐＨ７．５）によって３段階勾配で溶出させた。画分の純度を、ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。許容可能な純度を示す画分をプールし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００プレップ・グレード・カラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分取ゲルろ過に供した。精製された標的分子を含有する溶出画分をプールし、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、４．５％ソルビトールｐＨ５．０を有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを用いて緩衝交換を行い、限外濾過によっておよそ１ｍｇ／ｍＬの典型的な濃度まで濃縮した。これらの構築物の典型的な純度（ＳＥ−ＨＰＬＣにより測定）は、９５，９％〜９９，８％の範囲であり、均質性（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は７２，２％〜９９，０％の間であった。
【０３４１】
３）第１のポリペプチドにＣタグを、第２のポリペプチドにＨｉｓタグを含有する、抗原結合タンパク質分子ＫｉＨ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ及びＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ
標的タンパク質を、Ｃタグ親和性クロマトグラフィ、ＩＭＡＣ、及び調製ＳＥＣを含む３段階手順において、清澄化されたＣＨＯ細胞培養上清から精製した。Ｃタグ親和性クロマトグラフィでは、清澄化した上清をＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＣタグＸＬカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードした。リン酸緩衝食塩水ｐＨ７．４で洗浄した後、２０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３．０でタンパク質を溶出させた。画分の純度を、ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。許容可能な純度を示す画分をプールし、更なるＩＭＡＣ精製に供した。このようにして、試料を、平衡化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ、１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．５）で希釈し（１：４）、ＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア）にロードした。平衡化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ、１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．５）で洗浄した後、タンパク質を、７％／３０％／１００％溶出緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ、０．４Ｍアルギニン、５００ｍＭイミダゾールｐＨ７．５）によって３段階勾配で溶出させた。画分の純度を、ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。許容可能な純度を示す画分をプールし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００プレップ・グレード・カラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分取ゲルろ過に供した。精製された標的分子を含有する溶出画分をプールし、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、４．５％ソルビトールｐＨ５．０を有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを用いて緩衝交換を行い、限外濾過によっておよそ１ｍｇ／ｍＬの典型的な濃度まで濃縮した。これらの構築物の典型的な純度（ＳＥ−ＨＰＬＣにより測定）は、９４，８％〜９９，０％の範囲であり、均質性（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は８６，８％〜１００％の間であった。
【０３４２】
４）ｓｃＤｂトリボディ
タンパク質を、ＩＭＡＣ及び調製ＳＥＣを含む２段階手順において、清澄化されたＣＨＯ細胞培養上清から精製した。ＩＭＡＣについて、清澄化した上清及び５ｍＭイミダゾールｐＨ７．０を、ＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア）にロードした。平衡化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ、１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．５）で洗浄した後、タンパク質を、７％／３０％／１００％溶出緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ、０．４Ｍアルギニン、５００ｍＭイミダゾールｐＨ７．５）によって３段階勾配で溶出させた。画分の純度を、ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。許容可能な純度を示す画分をプールし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００プレップ・グレード・カラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分取ゲルろ過に供した。精製された標的分子を含有する溶出画分をプールし、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、４．５％ソルビトールｐＨ５．０を有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを用いて緩衝交換を行い、限外濾過によっておよそ１ｍｇ／ｍＬの典型的な濃度まで濃縮した。これらの構築物の典型的な純度（ＳＥ−ＨＰＬＣにより測定）は、９５，１％〜１００％の範囲であり、均質性（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は８５，８％より上であった。
【０３４３】
ａ）  ｓｃＤｂ−トリボディ＿０９−１０
タンパク質を、Ｆａｂ／ラムダ親和性クロマトグラフィ、及び調製ＳＥＣを含む２段階手順において、清澄化されたＣＨＯ細胞培養上清から精製した。Ｆａｂ／ラムダ親和性クロマトグラフィでは、清澄化した上清をＦａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｌａｍｂｄａカラム（ＧＥヘルスケア）にロードした。リン酸緩衝食塩水ｐＨ７．４で洗浄した後、１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ３．５でタンパク質を溶出させた。画分の純度を、ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。許容可能な純度を示す画分をプールし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００プレップ・グレード・カラム（Ｇｅ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分取ゲルろ過に供した。精製された標的分子を含有する溶出画分をプールし、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、４．５％ソルビトールｐＨ５．０を有するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを用いて緩衝交換を行い、限外濾過によっておよそ１ｍｇ／ｍＬの典型的な濃度まで濃縮した。これらの構築物の典型的な純度（ＳＥ−ＨＰＬＣにより測定）は９４，８％より上、均質性（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は９２，７％より上であった。
【０３４４】
タンパク質分析
最終試料の均質性は、還元及び非還元条件下において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。試料は、非還元２倍ＳＤＳ  ＰＡＧＥ試料緩衝液、又は還元剤としてジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する還元２倍ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液と混合した。全ての試料を、４〜２０％のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  Ｐｒｅｃａｓｔ  ＳＤＳ  Ｐａｇｅ  Ｇｅｌにロードする前に、９５℃で５分間加熱した。２μｇの精製タンパク質試料をロードした。ゲル中のタンパク質を分離するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、１倍Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ緩衝液中において３００Ｖでおよそ２２分間行った。全タンパク質は、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いてゲル中で可視化した。Ｐａｇｅ  Ｒｕｌｅｒ  Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎラダーを分子量マーカーとして使用した。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける生成物バンドの相対的なシグナル強度を、可能性のある高分子量種又は低分子量種と比較した。
【０３４５】
タンパク質調製物の純度は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた分析用ＳＥ−ＨＰＬＣにより評価した。
【０３４６】
精製されたタンパク質は、更なる使用まで−８０℃でアリコートとして保存した。
【０３４７】
実施例４：３７℃での初代ヒトＮＫ細胞へのＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の結合、又はＥＬＩＳＡによる組換えヒトＣＤ１６Ａ可溶性抗原への結合
方法
バフィコートからのＰＢＭＣの単離及びヒトＮＫ細胞の濃縮
ＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離により、バフィコート（ドイツ赤十字社、マンハイム、ドイツ）より単離した。バフィコート試料は、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１４１９０−１６９）の２〜３倍量で希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：０７８６１）のクッション上で層にし、室温にて２５分間８００×ｇで休みなく遠心分離した。界面に位置するＰＢＭＣを回収し、ＰＢＳで３回洗浄した後に、刺激を与えずに一晩１０％ＦＣＳを補充した完全ＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。ＮＫ細胞の濃縮では、ＰＢＭＣを一晩培養してから採取し、未接触のヒトＮＫ細胞、及びＢｉｇ  Ｅａｓｙ  ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｍａｇｎｅｔ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：１８００１）を製造業者の指示に従って免疫磁気的に単離するため、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ  ＮＫ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：１９９５５）を用いて、陰性選択１回に使用した。
【０３４８】
細胞結合アッセイ及びフローサイトメトリ分析
濃縮ヒトＮＫ細胞のアリコートを、２％熱不活性化ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１０２７０−１０６）、０．１％アジ化ナトリウム（Ｒｏｔｈ、カールスルーエ、ドイツ、カタログ番号：Ａ１４３０．０１００）を含有するＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１４１９０−１６９）中で、指示されたＣＤ１６Ａ  ＡＡＦ構築物の１００μＬ連続希釈物と共に３７℃で４５分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で繰り返し洗浄した後、細胞結合抗体を、１５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ複合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｄｉａｎｏｖａ、カタログ番号：１０９−０９５−０９８）で検出した。最後の染色工程の後、細胞を再度洗浄し、死細胞を取り除くために、２μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｐ４１７０）を含有する０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメータ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、シュヴァルバッハ、ドイツ）を用いて、２〜５×１０３生細胞の蛍光を測定した。細胞試料の平均蛍光強度をＩｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、シュヴァルバッハ、ドイツを用いて算出した。二次及び三次試薬単独で染色された細胞の蛍光強度値を差し引いた後、その値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．００、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州ラホヤ、米国）を用いた非線形回帰分析に使用した。ＫＤの計算には、一部位結合（双曲線）の方程式を用いた。
【０３４９】
ＥＬＩＳＡにおけるＣＤ１６Ａ可溶性抗原結合の分析
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｎｏ  ＭａｘｉＳｏｒｐ；Ｎｕｎｃ）を、１００ｍＭの炭酸水素塩緩衝液中で組換えＮＫ細胞誘導剤抗体フォーマット又は対照抗体により４°Ｃで一晩被覆した。分子量に応じて、抗体を、およそ２０ｎＭのモル濃度に対応する２，０〜５，０μｇ／ｍＬの濃度で被覆した。ＰＢＳ中に溶解した３％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳（Ｍｅｒｃｋ）によるブロッキング工程の後、０．３％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳を含有するＰＢＳ中のヒトＩｇＧ１  Ｆｃ部分に融合したビオチン化組換えヒトＣＤ１６Ａ（４８Ｒ−１５８Ｖ）の段階希釈液を、プレート上で室温にて１．５時間インキュベートした。０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳの３００μＬ／ウェルで３回洗浄した後、プレートを検出ｊ複合体のストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ）と共に、と１：１００００希釈で室温にて１時間インキュベートした。０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳの３００μＬ／ウェルで３回洗浄した後、プレートをテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｓｅｒａｍｕｎ）と共に、発色が明らかに見えるようになるまでインキュベートした。１００μＬ／ウェルの０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることで、反応を停止した。マルチラベル・プレート・リーダ（Ｖｉｃｔｏｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、４５０ｎｍで吸光度を測定した。吸光度値をプロットし、非線形回帰、シグモイド型用量反応（可変勾配）、最小二乗（通常）適合を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．０７（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州ラホヤ、米国）により分析した。
【０３５０】
結果
指示されたＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の見かけの結合親和性は、少なくとも２つの独立した実験において、３７℃で初代ヒトＮＫ細胞で決定された。更に、ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の可溶性ＣＤ１６Ａ結合能を、ＥＬＩＳＡで分析した。どちらの方法も、ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質がＣＤ１６Ａに対して特異的な結合を示すことを実証している。二価のＣＤ１６結合により、高い親和性が得られる。ＮＫ細胞結合で測定したＫＤ値と、ＥＬＩＳＡで測定したＥＣ５０値との絶対値の違いは、方法論、試薬、及びアッセイセットアップの設定の違いに起因する。結果を表２に示す。
【０３５１】
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【０３５２】
実施例５：腫瘍標的細胞に対するＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の細胞傷害活性
方法：
細胞株の培養
Ａ−４３１（ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＣＲＬ−１５５５）を、１０％熱不活化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧナトリウム、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩（成分は全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を補充したＤＭＥＭ培地中で標準条件下で培養した。ＲＰＭＩ−８２２６（ＤＳＭＺ、カタログ番号：ＡＣＣ４０２）及びＭＭ．１Ｓ（ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＣＲＬ２９７４）を、１０％熱不活化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧナトリウム、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。ＳＵ−ＤＨＬ−６（ＤＳＭＺ、カタログ番号：ＡＣＣ５７２）を、２０％熱不活化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧナトリウム、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。ＮＣＩ−Ｈ９２９（ＤＳＭＺ、カタログ番号：ＡＣＣ１６３）を、２０％熱不活化ＦＣＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、及び１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び５０μＭメルカプトエタノール（成分は全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。
【０３５３】
全ての細胞株は、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下において３７℃で培養した。
【０３５４】
バフィコートからのＰＢＭＣの単離及びヒトＮＫ細胞の濃縮
ＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離により、バフィコート（ドイツ赤十字社、マンハイム、ドイツ）より単離した。バフィコート試料は、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１４１９０−１６９）の２〜３倍量で希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：０７８６１）のクッション上で層にし、室温にて２５分間８００×ｇで休みなく遠心分離した。界面に位置するＰＢＭＣを回収し、ＰＢＳで３回洗浄した後、これらを１０％熱不活化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧナトリウム、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中で刺激を与えずに一晩培養した。ＮＫ細胞の濃縮では、ＰＢＭＣを一晩培養してから採取し、未接触のヒトＮＫ細胞、及びＢｉｇ  Ｅａｓｙ  ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｍａｇｎｅｔ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：１８００１）を製造業者の指示に従って免疫磁気的に単離するため、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ  ＮＫ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：１９０５５）を用いて、陰性選択１回に使用した。
【０３５５】
４時間カルセイン放出細胞傷害性アッセイ
カルセイン放出細胞傷害性アッセイでは、指示された標的細胞を培養物から採取し、ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ  １６４０培地で洗浄し、１０μＭカルセインＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号：Ｃ３１００ＭＰ）により、３７℃でＦＣＳを含まないＲＰＭＩ培地中にて３０分間標識した。穏やかに洗浄した後、標識細胞を完全ＲＰＭＩ培地（１０％熱不活化ＦＣＳ、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地）中に、１ｘ１０５／ｍＬの密度になるように再懸濁した。次いで、１ｘ１０４個の標的細胞を、指示された（エフェクタ対標的）Ｅ：Ｔ比（通常、５：１又は２：１）で濃縮された初代ヒトＮＫ細胞、及び指示された抗体と一緒に、丸底９６ウェル・マイクロ・プレートの個々のウェルへ合計容量２００μＬ／ウェルで重複して播種した。自然放出、最大放出、及び抗体の不在下でのエフェクタによる標的の殺傷を、各プレート上において四重反復で測定した。
【０３５６】
２００ｇで２分間遠心分離した後、アッセイを、通常、５％ＣＯ２で加湿した雰囲気中において３７℃で４時間（いくつかののアッセイでは３時間、示した通り）インキュベートした。インキュベーション終了の１５分前に、ＲＰＭＩ培地中の２０μＬの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を、標的細胞を含有するウェルに添加した。２０μＬのＲＰＭＩ培地を他の全てのウェルに添加した。１００μＬの細胞培養上清を、５分間の追加の遠心分離後に各ウェルから５００ｇ採取し、放出されたカルセインの蛍光を、蛍光プレートリーダ（Ｖｉｃｔｏｒ  ３、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて５２０ｎｍで測定した。測定された計数に基づき、特異的細胞溶解度を以下の式に従って算出した：［蛍光（試料）−蛍光（自発）］／［蛍光（最大）−蛍光（自発）］×１００％。蛍光（自発）は、エフェクタ細胞及び抗体が存在しない場合の標的細胞からの蛍光計数を表し、蛍光（最大）は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加により誘導された総細胞溶解を表す。シグモイド型用量反応曲線及びＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．００、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州ラホヤ、米国）を使用して、非線形回帰／４パラメータロジスティック適合によって算出した。
【０３５７】
腫瘍標的細胞に対する抗原結合タンパク質の細胞傷害活性の結果を、表３に示す。
【０３５８】
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【０３５９】
実施例６：ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質によるＮＫ−ＮＫ溶解の評価
方法：
バフィコートからのＰＢＭＣの単離及びヒトＮＫ細胞の濃縮
ＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離により、バフィコート（ドイツ赤十字社、マンハイム、ドイツ）より単離した。バフィコート試料は、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１４１９０−１６９）の２〜３倍量で希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：０７８６１）のクッション上で層にし、室温にて２５分間８００×ｇで休みなく遠心分離した。界面に位置するＰＢＭＣを回収し、ＰＢＳで３回洗浄した後に、刺激を与えずに一晩１０％ＦＣＳを補充した完全ＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。ＮＫ細胞の濃縮では、ＰＢＭＣを一晩培養してから採取し、未接触のヒトＮＫ細胞、及びＢｉｇ  Ｅａｓｙ  ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｍａｇｎｅｔ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：１８００１）を製造業者の指示に従って免疫磁気的に単離するため、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ  ＮＫ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：１９０５５）を用いて、陰性選択１回に使用した。
【０３６０】
４時間カルセイン放出細胞傷害性アッセイ
ＮＫ−ＮＫ細胞溶解を評価するためのカルセイン放出細胞傷害性アッセイでは、濃縮した非活性化ＮＫ細胞の半分を、ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ  １６４０培地で洗浄し、１０μＭカルセインＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号：Ｃ３１００ＭＰ）により、３７℃でＦＣＳを含まないＲＰＭＩ培地中にて３０分間標識した。穏やかに洗浄した後、標識細胞を完全ＲＰＭＩ培地（１０％熱不活化ＦＣＳ、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地）中に再懸濁した。次いで、５ｘ１０４個の標的細胞を、１：１のＥ：Ｔ比で同一のドナーに由来するＮＫ細胞、及び指示された抗体と一緒に、丸底９６ウェル・マイクロ・プレートの個々のウェルへ合計容量２００μＬ／ウェルで重複して播種した。自然放出、最大放出、及び抗体の不在下でのエフェクタによる標的の殺傷を、各プレート上において四重反復で測定した。
【０３６１】
２００ｘｇで２分間遠心分離した後、アッセイを、５％ＣＯ２で加湿した雰囲気中において３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション終了の１５分前に、ＲＰＭＩ培地中の２０μＬの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を、標的細胞を含有するウェルに添加した。２０μＬのＲＰＭＩ培地を他の全てのウェルに添加した。１００μＬの細胞培養上清を、５分間の追加の遠心分離後に各ウェルから５００ｇ採取し、放出されたカルセインの蛍光を、蛍光プレートリーダ（Ｖｉｃｔｏｒ  ３、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて５２０ｎｍで測定した。測定された計数に基づき、特異的細胞溶解度を以下の式に従って算出した：［蛍光（試料）−蛍光（自発）］／［蛍光（最大）−蛍光（自発）］×１００％。蛍光（自発）は、エフェクタ細胞及び抗体が存在しない場合の標的細胞からの蛍光計数を表し、蛍光（最大）は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加により誘導された総細胞溶解を表す。シグモイド型用量反応曲線は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．００、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州ラホヤ、米国）を使用して、非線形回帰／４パラメータロジスティック適合によって算出し、ＥＣ５０［ｐＭ］及びＥｍａｘ［％］値を決定するのに使用した。
【０３６２】
ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質は、ダラツムマブが５０％以上のＮＫ溶解を誘導したアッセイにおいて、３０μｇ／ｍＬまでの抗体濃度で測定可能な１０％未満の最小溶解が存在しないか、又はわずかしか存在しない場合、ＮＫ−ＮＫ溶解を誘導するために陰性であると考えられる。
【０３６３】
結果：
抗原結合タンパク質の各々を、ＮＫ細胞媒介性ＮＫ溶解のための少なくとも２つの独立した４時間カルセイン放出細胞傷害性アッセイで試験した。
【０３６４】
結果を表４及び図１７Ａ〜図１７Ｎに概説し、ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質により誘導されるＮＫ−ＮＫ溶解に対する効力（ＥＣ５０）及び効果（Ｅｍａｘ）が、ＮＫ細胞上の組換えＣＤ１６Ａ抗原又はＣＤ１６Ａに対するこれらタンパク質の見かけの結合親和性と相関しないことを、明らかに実証した（表２に概説する）。加えて、抗原陽性腫瘍標的細胞の溶解に対するＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の効力（ＥＣ５０）もまた、ＮＫ−ＮＫ溶解を媒介する能力と相関しない。これらの知見から、ＮＫ−ＮＫ溶解を媒介する傾向は、抗ＣＤ１６Ａ  Ｆｖドメインそれ自体の特性ではなく、かつそれらの見かけ上の親和性の機能ではなく、フォーマットの特徴的な特性、特に、所与のＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の可変重鎖セグメント及び可変軽鎖セグメントのドメイン順序であると結論できる。
【０３６５】
2021521275.tif 000013
2021521275.tif 000014
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【０３６６】
表４は、Ｆｃ部分又はＦａｂ領域に融合された、フォーマットｓｃＤｂ、Ｄｂ、又はｓｃＦｖの２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む抗原結合タンパク質が、可変領域がｓｃＤｂ  ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ若しくはｓｃＤｂ  ＶＬ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ中、又はＤｂ  ＶＬ−ＶＨ若しくはｓｃＦｖ  ＶＬ−ＶＨ中のＮ末端からＣ末端に配置される場合、ＮＫ−ＮＫ溶解を誘導しないことを示す。それにより、結果は、ＮＫ−ＮＫ溶解が、ＥＣ５０及びＥｍａｘにより規定されるＮＫ細胞上の組換えＣＤ１６Ａ又はＣＤ１６Ａに対するこれらの抗原結合部分の見かけ上の結合親和性に依存しないことを実証する。更に、ＮＫ−ＮＫ溶解はまた、標的抗原結合ドメインから独立している。
【０３６７】
実施例７−再誘導された最適化細胞殺害（ＲＯＣＫ（登録商標））：自然免疫に関与するための汎用性の高い多重特異的で適格な抗体プラットフォーム
概要
ＲＯＣＫ（登録商標）（再誘導された最適化細胞殺害）プラットフォームに基づいて、ユニークな特性を持つ免疫細胞誘導剤のポートフォリオを開発した。この新規のモジュール式プラットフォームは、古典的モノクローナル抗体及び他の誘導剤の概念に対する、ＮＫ細胞結合の利点をもたらす。分子設計、結合親和性、免疫エフェクタ細胞の活性化、及びＰＫ特性を考慮した。ＲＯＣＫ（登録商標）プラットフォームは、自然免疫及び適応免疫の活性化を目的とする新規抗体を産生するために使用できる。
【０３６８】
この実施例では、「再誘導された最適化細胞殺害」（ＲＯＣＫ（登録商標））プラットフォームと呼ばれる、新規かつ完全にモジュール化されたプラットフォームが提示される。このプラットフォームは、自然免疫及び適応免疫の活性化を目的とするＮＫ細胞動員抗体の新しいクラスを生成するため、このようにユニークな抗ＣＤ１６Ａ結合ドメインを備えた、広範囲の異なるフォーマットを含む。
【０３６９】
材料及び方法
ＲＯＣＫ（登録商標）組換え抗体、対照、及び抗原バリアントの生成
異なる組換えタンパク質（抗原、抗体、対照）の遺伝子配列を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｅｎｅＡｒｔ（レーゲンスブルク、ドイツ）により合成し、又はＰＣＲにより誘導した。これらの組換えタンパク質をコードする発現ベクタは、それぞれの配列要素を、哺乳動物発現ベクタｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又は標準的な分子生物学技術を用いてその改変版にクローニングすることによって作製した。可溶性組換え抗原バリアントを、単量体Ｆｃ（Ｙｉｎｇら、「Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ」（２０１２年）第２８７巻、第１９３９９〜４０８頁）に対するＥＣＤ配列の融合タンパク質として構築した。細胞表面アンカー化抗原バリアントの発現では、ＥＣＤ配列をヒトＥＧＦＲの膜貫通ドメインに融合させるか（Ｗａｎｇら、「Ｂｌｏｏｄ」（２０１１年）第１１８巻、第１２５５〜６３頁）、又は翻訳後プロセシングのための全長プロペプチド配列及びＧＰＩアンカー化のための脂質化を有するヒトＣＤ１６Ｂ内因性配列を用いて、ＧＰＩを介してアンカー化した。いくつかの発現構築物では、元のベクタは、２つの抗体鎖の共発現のための２つのＣＭＶプロモータ制御発現カセットを含有するように修飾された。哺乳動物発現ベクタの更なる修飾は、ハイグロマイシン耐性をピューロマイシン耐性遺伝子で置換することであった。発現構築物は更に、分泌を促進するためにＮ末端シグナルペプチドのコード配列を含有するように設計された。融合パートナをコードする組換え融合構築物（例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ部分を有する抗原）配列では、伸長プライマーを用いてＰＣＲ増幅して、遺伝子融合又は制限酵素消化のための対応するリンカー又はコネクタ配列を構築した。得られた重複ＤＮＡ断片を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ法を用いて関連する位置で共発現ベクタに挿入して、最終構築物を得た（Ｇｉｂｓｏｎら、「Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」（２０１０年）、第７巻、第９０１〜３頁；Ｇｉｂｓｏｎら、「Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」（２００９年）第６巻、第３４３〜５頁）。全ての構築物の配列は、特注プライマーを用いてＧＡＴＣ（ドイツ、ケルン）のＳａｎｇｅｒ法により確認した。
【０３７０】
可溶性抗体若しくは抗原、又は細胞表面アンカー抗原を、先述のように、ＣＨＯ中で発現させた（Ｒｅｕｓｃｈら、「Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ」（２０１６年）、第２２巻、第５８２９〜３８頁）。標的タンパク質を、単量体又は多量体（ホモ二量体、ヘテロ二量体、又は四量体）生成物形態、及び融合親和性タグ、κ軽鎖又はＦｃ部分の存在に応じて、１つ又は２つの標準親和性クロマトグラフィ法（タンパク質Ａ、タンパク質Ｌ、Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｃ−ｔａｇ、又はＩＭＡＣ）を用いて、細胞培養上清から精製した。全タンパク質調製物を、サイズ排除クロマトグラフィで更に研磨し、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＵＶ−Ｖｉｓ分光法を用いて分析した。
【０３７１】
ドットブロット、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びウェスタンブロット
精製した組換えＣＤ１６抗原バリアントを、ニトロセルロース膜上にスポッティングするか、又は試料緩衝液と混合し、４〜２０％のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  Ｐｒｅｃａｓｔ  Ｇｅｌｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で分離した。全タンパク質を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｇｅｌ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎシステムを用いて画像化した。タンパク質は、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてＰＶＤＦ  Ｍｉｄｉ膜へウェスタンブロット法によって移した。膜を、ＴＢＳに溶解した３％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳（Ｍｅｒｃｋ）で３０分間ブロックし、２〜４μｇ／ｍＬの抗ＣＤ１６ｓｃＦｖ抗体と共に室温で１時間インキュベートし、続いてＴＢＳＴ（０，１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＴＢＳ）で洗浄し、ＴＢＳで２回洗浄した。膜を、二次検出複合体として希釈した抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ−ＨＲＰ（ＱＩＡＧＥＮ）１：３０００と共に室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＢＳ中の０，６６ｍｇ／ｍＬのＤＡＢ、０，０２％のＣｏＣｌ２、０，０１５％のＨ２Ｏ２の新鮮に調製された混合物を添加して比色展開（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）を開始し、水中で膜を洗浄して停止した。膜を乾燥させ、写真撮影した。
【０３７２】
ＥＬＩＳＡにおけるＣＤ１６Ａ抗原結合の分析
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｎｏ  ＭａｘｉＳｏｒｐ；Ｎｕｎｃ）を、１００ｍＭの炭酸水素塩緩衝液中で組換え抗原又は異なるＮＫ細胞誘導剤抗体フォーマットにより４°Ｃで一晩被覆した。分子量に応じて、０、５〜３μｇ／ｍＬの抗原又は２〜５μｇ／ｍＬの抗体フォーマットを被覆した。被覆された抗原についてはおよそ３０ｎＭ、又は被覆された抗体については１０〜２０ｎＭのモル数に等しかった。ＰＢＳ中に溶解した３％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳（Ｍｅｒｃｋ）でブロックした後、０，３％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳を含有するＰＢＳ中のＨｉｓタグｓｃＦｖ抗体又はビオチン化ＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ  ＥＣＤ−単量体Ｆｃ融合抗原の段階希釈物を、それぞれ、抗原又は抗体で被覆したプレート上において室温で１，５時間インキュベートした。結合競合を評価するために、ｓｃＦｖを滴定し、１ｎＭ又は１０ｎＭの３Ｇ８  ｍＡｂと共にプレート上でインキュベートした。０，１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳの３００μＬ／ウェルで３回洗浄した後、プレートを、検出複合体である、１：３０００希釈のＰｅｎｔａ−Ｈｉｓ−ＨＲＰ（Ｑｉａｇｅｎ）、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ）、又は競合３Ｇ８を検出するには、１：１００００希釈のＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｄｉａｎｏｖａ）と共に、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートを、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｓｅｒａｍｕｎ）と共に１〜２分間、又は発色が明確に見えるようになるまでインキュベートした。０．５ＭのＨ２ＳＯ４（１００μＬ／ウェル）を添加して、反応を停止した。マルチウェル・プレート・リーダ（Ｖｉｃｔｏｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、４５０ｎｍ（１秒）で吸光度を測定した。吸光度値をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．０７（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州ラホヤ、米国）を使用して、シグモイド型用量反応曲線に非線形回帰モデルを適合（４パラメータのロジスティック適合）させることにより、ＥＣ５０値を決定した。
【０３７３】
細胞株及び細胞培養
ＮＣＩ−Ｈ９２９（ＤＳＭＺ、カタログ番号：ＡＣＣ−１６３）、ＭＣ／ＣＡＲ（ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＣＲＬ−８０８３）、ＭＭ．１Ｓ（ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＣＲＬ−２９７４）、ＲＰＭＩ−８２２６（ＤＳＭＺ、カタログ番号：ＡＣＣ４０２）、ＫＡＲＰＡＳ−２９９（ＤＳＭＺ、カタログ番号：ＡＣＣ３１）、及びＳＷ−９８２（ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＨＴＢ−９３）を購入し、Ａ−４３１はＤｒ．Ｇ．Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ（ＤＫＦＺ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）から得た。全細胞を、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）（カタログ番号：１０２７０−１０６）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧ／１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（カタログ番号：１５４０−１２２）、及び２ｍＭのＬ−グルタミン（カタログ番号：２５０３０−０２４；全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充した、ＤＭＥＭ（カタログ番号：４１９６５−０３９）、ＩＭＤＭ（カタログ番号：１２４４０−０５３）、又はＲＰＭＩ  １６４０（カタログ番号：２１８７５−０３４）培地にて、加湿した５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃で標準条件下において培養した。
【０３７４】
ヒトＮＫ細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、上述のように、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：０７８６１）を用いて密度勾配遠心分離により、健常ボランティアのバフィコート（ドイツ赤十字社、マンハイム、ドイツ）から単離した（Ｆｕｓｓら、「Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」（２００９年）、第７章、第７部、第１頁）。ＰＢＭＣを、１０％熱不活化ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧナトリウム／１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中において、加湿雰囲気中３７℃及び５％ＣＯ２下でＯ／Ｎ培養し、その後、ＮＫ細胞を、製造業者の指示に従って、ＥａｓｙＳＥＰ（商標）Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＮＫ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：１７９５５）を用いる陰性ビーズ選択によって濃縮した。ＮＫ細胞単離の純度をフローサイトメトリにより測定し、通常、ＣＤ５６＋細胞は８０％未満であることを実証した（データ示さず）。
【０３７５】
細胞結合アッセイ及びフローサイトメトリ分析
０．２〜１ｘ１０６の濃縮ヒトＮＫ細胞のアリコートを、１０ｍｇ／ｍＬのポリクローナルヒトＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）の不在下において、又は指示のある場合は１０ｍｇ／ｍＬのポリクローナルヒトＩｇＧの存在下において、２％熱不活化ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１０２７０−１０６）、０．１％アジ化ナトリウム（Ｒｏｔｈ、カールスルーエ、ドイツ、カタログ番号：Ａ１４３０．０１００）を含有するＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１４１９０−１６９）中で、指示された構築物の１００μＬ段階希釈物と共に３７℃で４５分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液での反復洗浄後、細胞結合Ｈｉｓタグ化ｓｃＦｖ、ＴａｎｄＡｂ、又はａＴｒｉＦｌｅｘ抗体を、１０μｇ／ｍＬ抗Ｈｉｓ  ｍＡｂ  １３／４５／３１−２（Ｄｉａｎｏｖａ、ハンブルク、ドイツ、カタログ番号：ＤＩＡ９１０−１ＭＧ）で検出し、続いて１５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｄｉａｎｏｖａ、カタログ番号：１１５−０９５−０６２）で検出した。二重特異性ＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａ抗体構築物を、可溶性Ｈｉｓタグ化ＢＣＭＡ、続いて１０μｇ／ｍＬ抗Ｈｉｓ  ｍＡｂ  １３／４５／３１−２、続いて１５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ、及びと１５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｄｉａｎｏｖａ、カタログ番号：１０９−０９５−０９８）を伴う二重特異性Ｆｃ含有ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ構築物で、検出した。最後の染色工程の後、細胞を再度洗浄し、死細胞を取り除くために、２μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｐ４１７０）を含有する０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメータ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、シュヴァルバッハ、ドイツ）又はＣｙｔｏＦｌｅｘサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、クレフェルト、ドイツ）を用いて２〜５×１０３の生細胞の蛍光を測定し、細胞試料の蛍光強度の中央値を決定した。二次及び／又は三次試薬単独で染色した細胞の蛍光強度値を差し引いた後、その値を非線形回帰分析に用いた。平衡解離定数（ＫＤ）は、一部位結合（双曲線）適合、及びＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍソフトウェアＶ６又はＶ７（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州ラホヤ、米国）を用いて算出した。
【０３７６】
細胞傷害性アッセイ
カルセイン放出アッセイのために、標的細胞を、３７℃でＲＰＭＩ培地中にて３０分間、１０ｍＭカルセインＡＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：Ｃ３１００ＭＰ）で標識し、洗浄し、そして１×１０４個の腫瘍標的細胞を、増加する抗体濃度の存在下において、指示されたエフェクタ：標的（Ｅ：Ｔ）比で送料２００μＬのエフェクタ細胞と共に、９６ウェル・マイクロ・プレートの個々のウェルに播種した。ＮＫ兄弟殺しの評価のために、５×１０４個のカルセイン標識初代ヒトＮＫ細胞を、増加する抗体濃度の存在下において１：１のＥ：Ｔ比で自家ＮＫ細胞と共インキュベートした。特に指示がなければ、加湿した５％のＣＯ２雰囲気中にて３７℃で４時間インキュベートした後、上清に放出されたカルセインの蛍光（Ｆ）を、５２０ｎｍでプレートリーダ（Ｖｉｃｔｏｒ  ３又はＥｎＳｉｇｈｔ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｔｕｒｋｕ（フィンランド）により測定した。特異的細胞溶解は、以下のように算出した：［Ｆ（試料）−Ｆ（自発）］／［Ｆ（最大）−Ｆ（自発）］ｘ１００％。Ｆ（自発）とは、エフェクタ細胞及び抗体の不在下で標的細胞から放出される蛍光を表し、Ｆ（最大）とは、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｒｏｔｈ、カタログ番号：３０５１．２）の添加によって１％の最終濃度へ誘導される全細胞溶解後に放出される蛍光を表す。特異的標的細胞溶解（％）と標準偏差（ＳＤ）との平均値をプロットし、インビトロ効力（ＥＣ５０）を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖ６及びｖ７；ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州ラホヤ、米国）を用いたシグモイド型用量反応曲線（可変勾配）に非線形回帰モデルを適合させることにより決定した。
【０３７７】
表面プラズモン共鳴
ＣＤ１６Ａへの一価相互作用の動力学的結合分析、並びに一価及び二価抗ＣＤ１６Ａ結合分析物の定性的解離相比較を、ランニング緩衝液としてＨＢＳ−Ｐ＋（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０、ｐＨ７．４）を使用して、希釈液について、２５℃でＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＧＥヘルスケア）上で実施した。ＣＡＰセンサチップ（Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ、ＧＥヘルスケア）を、ＨＢＳ−Ｐ＋緩衝液を用いて一晩プレコンディショニングした。予備捕獲段階では、フローセル１〜４において５μＬ／分で１００秒間、Ｂｉｏｔｉｎ  ＣＡＰｔｕｒｅ試薬（ＧＥヘルスケア）によりチップ表面を処理した。
【０３７８】
種々の抗ＣＤ１６Ａ  ｓｃＦｖの速度論的結合分析のために、ビオチン化モノ−Ｆｃ（サイレンシング）−Ａｖｉ−タグ化受容体をＨＢＳ−Ｐ＋で調製し、フローセルＦｃ２及びＦｃ４で捕捉した（ヒトＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ、ヒトＣＤ１６Ａ−１５８Ｆ、ｓｃＦｖとの相互作用測定におよそ４０ＲＵ、及びＩｇＧとの相互作用測定におよそ１０ＲＵ）。ＩｇＧ及びｓｃＦｖは、示された一連の濃度でＨＢＳ−Ｐ＋緩衝液中で調製され、４０μＬ／分（会合時間１８０秒、解離時間３００秒）の流速で参照表面（Ｆｃ１、Ｆｃ３）及び受容体捕捉表面（Ｆｃ２、Ｆｃ４）に注入される。相互作用は、Ｍｕｌｔｉ  Ｃｙｃｌｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃモードを用いて測定し（全ての抗体は、４倍希釈系で調製した：１５０ｎＭ〜０．５８６ｎＭのｓｃＦｖ−Ａｂ１６中、５０ｎＭ〜０．１９５ｎＭのｓｃＦｖ−Ａｂ１６高、５００ｎＭ〜１．９５３ｎＭのｓｃＦｖ−ＡＢ１６低、ｓｃＦｖ−３Ｇ８及びヒトＩｇＧ１  Ｆｃ増強２００ｎＭ〜０．７８１ｎＭ、ヒトＩｇＧ１及びヒトＩｇＧ１  Ｆｃサイレンシング２０００ｎＭ〜７．８１３ｎＭ）、続いて、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ／２５０ｍＭのＮａＯＨによる再生サイクルを１０ｍＬ／分で１２０秒間行った。データは、基準表面（Ｆｃ２〜１、Ｆｃ４〜３）及びゼロ濃度（緩衝液対照）シグナルから、シグナルを減算することで参照された。速度論的評価は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ３．１）を用いて、データを１：１結合モデルに適合（ＲｍａｘとＲＩとを局所的に適合）させることによって行った。センサグラムの定性的比較のために、単一濃度（３１２．５ｎＭ）のｓｃＦｖ及びＩｇＧを、増加した捕捉レベルで参照及び受容体捕捉表面上に注入した（ヒトＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ  １８０ＲＵ及びヒトＣＤ１６Ａ−１５８Ｆ  ９０ＲＵ）。参照曲線を各曲線の最大値に正規化し、重ね合わせた。一価及び二価のＣＤ１６Ａ結合抗体又はリガンドの定性的解離相比較による、受容体保持の研究のために、ビオチン化モノ−Ｆｃ（サイレンシング）−Ａｖｉータグ化受容体を、ＨＢＳ−Ｐ＋で調製し、フローセルＦｃ２及びＦｃ３で捕捉した（ヒトＣＤ１６Ａ−１５８Ｖおよそ１６０ＲＵ、カニクイザルＣＤ１６およそ３２０ＲＵ）。Ａｂ１６高結合ドメイン及びコンパレータを組み込む目的の抗体（ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ、Ｄｂ−Ｆｃ、ＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ、ＴａｎｄＡｂ）、増強されたヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ）、並びに一価結合ｓｃＦｖ−Ａｂ１６高を、ＨＢＳ−Ｐ＋緩衝液中で５０ｎＭの濃度まで希釈し、参照表面（Ｆｃ１）及び受容体捕捉表面（Ｆｃ２、Ｆｃ３）に３０μＬ／分（会合時間１８０秒、解離時間３時間）の流速で注入する。表面を、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ／２５０ｍＭ  ＮａＯＨにより１０ｍＬ／分で１２０秒間再生した。データは、基準表面（Ｆｃ２〜１、Ｆｃ４〜３）及びゼロ濃度（緩衝液対照）シグナルから、シグナルを減算することで参照された。参照曲線を各曲線の最大値に正規化し、重ね合わせた。
【０３７９】
ＲＯＣＫ誘導剤の薬物動態試験
異なるＲＯＣＫ（登録商標）プラットフォームフォーマットの基本的薬物動態パラメータを、ＣＤ−１  ＳＷＩＳＳマウスで評価した。生活相試験はＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｐｈａｒｍａ  ＧｍｂＨが実施した。ＣＤ−１  ＳＷＩＳＳ雌マウス（例えば、ｎ＝２４）に、試験物質０．３ｍｇ（約１０ｍｇ／ｋｇ体重）を単回で静脈内投与した。異なる時点で血液を１〜３週間採取した。血液から血清を採取し、ＥＬＩＳＡ又はＭＳＤ技術に基づく確立されたアッセイで分析した。代表的な採血スケジュールは、１３の時点、例えば、投与前７日、５分、３０分、３０分、１時間、４時間、８時間、並びに１日目、２日目、３日目、４日目、７日目、１４日目、及び２１日目であった。血清濃度は、増強した化学ルミネッセンス（ＥＣＬ）検出を用いて、Ｔｒｉｓｔａｒ  ＬＢ９４１（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）でＥＬＩＳＡにより測定した。アッセイセットアップを確立するために、捕捉及び／又は検出器としての血清抗原及び／又はモノクローナル抗体の異なる組合せを試験した。アッセイは、アッセイ間／アッセイ内精度及び正確性、希釈直線性及び選択性、付着効果及びマトリックス効果のような更なる重要なパラメータに関して特徴付けた。
【０３８０】
ＮＫ細胞活性化アッセイ
５×１０５個のヒトＰＢＭＣを、指示された抗体濃度の存在下において、完全ＲＰＭＩ  １６４０培地中の１×１０４個のＲＰＭＩ−８２２６細胞の存在下又は不在下で、平底９６ウェル・マイクロ・プレートの個々のウェル中に播種した。加湿雰囲気中で５％ＣＯ２と共に３７℃で２２時間インキュベートした後、細胞を採取し、洗浄し、そしてＦＡＣＳ／ｈＩｇＧ緩衝液（１ｍｇ／ｍＬのポリクローナルヒトＩｇＧを補充したＦＡＣＳ緩衝液）中に再懸濁した。次いで、暗所で氷上にて１５分間、ＦＡＣＳ／ｈＩｇＧ緩衝液中のＣＤ５６−ＰＣ７及びＣＤ６９−ＰＣ５により細胞を染色した。ＦＡＣＳ緩衝液で繰り返し洗浄した後、１ｘ１０３〜１ｘ１０４個の細胞をフローサイトメトリで分析し、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞のＣＤ６９＋細胞割合を定量した。
【０３８１】
サイトカイン放出アッセイ
平底９６ウェル・マイクロタイタ・プレートを、室温で２〜４時間ＲＰＭＩ−１６４０／５％ＦＣＳによりブロックした後、総量２００μＬ／ウェル中の指示された抗体１０μｇ／ｍＬを伴う又は伴わない１×１０４個のＮＣＩ−Ｈ９２９腫瘍細胞を伴う又は伴わない５×１０５のＰＢＭＣを播種した。プレートを、加湿したインキュベータ内において３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。細胞培養上清を採取し、ＢＤ（商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔｈ１／Ｔｈ２  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＢＤバイオサイエンス）を用いるＢｉｏａｓｓａｙ  ＧｍｂＨ（ハイデルベルク、ドイツ）にて、サイトカインが定量されるまで−８０℃で貯蔵した。
【０３８２】
結果
抗ＣＤ１６Ａ抗体ドメインの生成の理論
Ｆｃ部分を含有する大部分の古典的治療用抗体は、低い内在性ＣＤ１６Ａ結合親和性（ＦｃγＲＩＩＩＡ）結合親和性を示し、ＣＤ１６Ａ上の認識部位を使用する免疫誘導剤はまたＩｇＧ抗体のＦｃ部分にも結合し（ｄｅ  Ｐａｌａｚｚｏら、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．」（１９９０年第５０巻、第７１２３〜８頁；ｄｅ  Ｐａｌａｚｚｏら、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．」（１９９２年）、第５２巻、第５７１３〜９頁）、ＣＤ１６Ａ結合について血清ＩｇＧと競合しなければならず、それによってＣＤ１６Ａ占有を制限し、そして有効であるために必要な治療用抗体の用量を増加させる。血漿ＩｇＧとの競合は、多発骨髄腫のような血漿ＩｇＧが高レベルであることを特徴とする疾患状態では、更に顕著である（Ｍｉｃｈａｌｌｅｔら、「Ｌｅｕｋｅｍｉａ」（２０１７年））。加えて、ヒトにおけるＣＤ１６Ａ多型（Ｍａｈａｗｅｎｉら、「Ｓｃｉ．Ｒｅｐ」（２０１８年）、第８巻、第１５９８３頁）では、最も顕著なバリアントであるＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ及びＣＤ１６Ａ−１５８ＦのＩｇＧへの結合親和性が異なり、したがってＦｃＲはＡＤＣＣと同様に機能するため、患者の個々のＣＤ１６Ａ遺伝子型に応じて古典的ｍＡｂ療法の効力レベルが異なる結果となる（Ｂｏｗｌｅｓら、「Ｂｌｏｏｄ」（２００６年）、第１０８巻、第２６４８〜５４頁；Ｂｕｒｃｈａｒｄら、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」（２０１３年）、第２０６巻、第１３０〜４頁）。本発明者らは、ＲＯＣＫ（登録商標）プラットフォームを利用して、ＣＤ１６Ａ２上のユニークなエピトープを認識し、血漿ＩｇＧ競合及びＣＤ１６Ａ多型に実質的に影響されない、抗ＣＤ１６Ａドメインを作製した。加えて、これは非常に強力なＡＤＣＣを媒介するＣＤ１６Ａへの高親和性結合のために設計され、したがって効果的な免疫監視であった。
【０３８３】
ＣＤ１６Ａに対する高い親和性及び選択性を有するこのような抗体部分の上記基準を満たすために、ヒトＰＢＭＣ由来のｓｃＦｖのライブラリをスクリーニングした。ヒトＣＤ１６Ｂバリアントを陰性選択のために用いることで、最初は低い親和性を有するが、ＣＤ１６Ａに対しては高い選択性を有する抗体を同定することができた。親和性成熟のための異なるアプローチ（例えば、軽鎖シャッフリング、重鎖のＣＤＲにおける合理的突然変異）を使用して、ＣＤ１６Ａに対する親和性は、２ｎＭのＫｄまで少なくともファクタ１００によって増加させることができた（ＡＢ１６高、表５）。低親和性（Ａｂ１６低）、中親和性（Ａｂ１６中）、及び高親和性結合ｓｃＦｖ（Ａｂ１６高）抗体のＣＤ１６Ａ結合特性を、ＳＰＲで特徴付け、前に記載され充分に特徴付けられたＣＤ１６汎特異的抗体３Ｇ８（Ｔａｍｍら、「Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」（１９９６年）、第１５７巻、第１５７６〜８１頁）、並びにＩｇＧ１  Ｆｃ又はＣＤ１６Ａ結合及びＦｃ介在エフェクタ機能増強変異Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（Ｌａｚａｒら、「Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ」（２００６年）、第１０３巻、第４００５〜１０頁）、又はサイレンシング変異Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ（Ｖｉｄａｒｓｓｏｎら、「Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」（２０１４年）、第５巻、第５２０頁；Ｂａｕｄｉｎｏら、「Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」（２００８年）、第１８１巻、第６６６４〜９頁；Ｈｅｚａｒｅｈら、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ」（２００１年）、第７５巻、第１２１６１〜８頁）を有する遺伝子組換えＦｃバリアントと比較した。Ａｂ１６中及びＡｂ１６高にはどちらも、ＣＤ１６Ａに対する優れた結合特性を確認した（図１８Ａ及び図１８Ｂ）。野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ、増強ＩｇＧ１  Ｆｃ、及びＣＤ１６汎特異的抗体３Ｇ８のＣＤ１６Ａ結合動態はＣＤ１６Ａ多型に依存したが、Ａｂ１６高及びＡｂ１６中及びＡｂ１６低は、対立遺伝子型であるＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ及びＣＤ１６Ａ−１５８Ｆに関わらず同等の動態学的結合特性を示した（表５、図１８Ａ、図１８Ｂ、及び図２０）。両抗体は更に、カニクイザルＣＤ１６Ａと良好な交差反応性を示した（図１９Ａ、表６）。更に、異なる親和性成熟戦略から同定した抗ＣＤ１６Ａ結合剤の特徴付けにより、別のユニークな特徴：ＣＤ１６Ａ遺伝子型変種に関わらないＣＤ１６Ａの均一な結合（表５、図１８Ａ、図１８Ｂ、及び図２０）が確認された。
【０３８４】
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【０３８５】
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【０３８６】
血清ＩｇＧの存在下における異なるエピトープへのＣＤ１６Ａ特異的結合
高度の多型性を示すＣＤ１６Ａの他に、ヒトＣＤ１６Ｂ（ＦｃγＲＩＩＩＢ）のアロタイプバリアントは、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の５つのアミノ酸が異なり（図２１）、いくつかは更なるグリコシル化を可能にし、その結果、ＮＡ１、ＮＡ２、及びＳＨと名付けられたＧＰＩアンカーＣＤ１６Ｂ顆粒球抗原の３つの異なるバリアントが生じる。注目すべきことに、ＣＤ１６及びＢの成熟ＥＣＤでは２つのアミノ酸位置だけが常に異なっている（図２１）。加えて、ＣＤ１６Ａ及びＣＤ１６Ｂの膜アンカーの異なる様式でも変化がある。成熟したＧＰＩアンカー型で切断されたＣＤ１６Ｂのカボキシ末端（ｃａｂｏｘｙｔｅｒｍｉｎａｌ）プロペプチド配列は、ＣＤ１６Ａ  ＥＣＤをその膜貫通ドメインに連結する配列と高い相同性を有する（図２１）。ＣＤ１６Ａ／ＣＤ１６Ｂ配列変形のどれが厳密にＣＤ１６Ａ選択性抗体の結合部位を決定するかを調べるために、組換えＣＤ１６抗原バリアントのセットを作製し、特徴付けた。ＣＤ１６Ｂ（ＮＡ１）ＥＣＤを、成熟型（プロペプチド欠乏）（ＣＤ１６Ｂ成熟）又はプロペプチド配列を含有する前駆体（ＣＤ１６Ｂ前駆体）のいずれかとして発現させた。加えて、ＣＤ１６Ｂ特異的アミノ酸をＣＤ１６Ａの相同残基で置換したＣＤ１６Ｂ前駆体ＥＣＤ変異体を作製し、結合アッセイ：ＣＤ１６Ｂ前駆体、Ｄ１２９Ｇ、ＣＤ１６Ｂ前駆体、Ｈ１４０Ｙ、ＣＤ１６Ｂ前駆体、Ｓ１８５Ｆで試験した。
【０３８７】
試験した全てのＣＤ１６Ａ及びＣＤ１６Ｂ抗原バリアントは、ＣＤ１６汎特異的抗体３Ｇ８により認識され、それらの分子的完全性が確認された（図１９Ａ、図１９Ｂ、図１９Ｃ、及び表６）。ＳｃＦｖ抗体Ａｂ１６中又は親和性改善Ａｂ１６高は、ＣＤ１６Ａ抗原を認識したが、ＣＤ１６Ｂの成熟又はプロペプチド含有ＥＣＤ融合抗原は認識しなかった。しかしながら、１４０位のＣＤ１６Ｂ  ＥＣＤヒスチジン（Ｈ）が、ＣＤ１６Ａの対応する位置に存在するアミノ酸であるチロシン（Ｙ）に変異した場合、ＣＤ１６Ｂのこの変異型（ＣＤ１６Ｂ前駆体、Ｈ１４０Ｙ）は、親和性が最適化されたｓｃＦｖ抗体Ａｂ１６中及びＡｂ１６高によって充分に認識された（図１９Ａ〜図１９Ｃ、表６）。図１９Ａ、図１９Ｂ、及び図１９Ｃに示されるように、１４０位のチロシン（Ｙ）は、立体構造エピトープの形成と、ｓｃＦｖ抗体のＣＤ１６Ａ特異的反応性とにとって重要である。
【０３８８】
カニクイザルＣＤ１６  ＥＣＤ配列がヒトＣＤ１６Ａと合計１６個のアミノ酸で異なるという事実にもかかわらず（図２１のアラインメント参照）、どちらの抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖも、カニクイザルＣＤ１６と良好な交差反応性を維持した（図１９Ａ、図１９Ｂ、図１９Ｃ、及び表６）。試験した抗体Ａｂ１６中及びＡｂ１６高によるＣＤ１６Ａ特異的認識に対する、ＣＤ１６  ＥＣＤの１４０位でのチロシン（Ｙ）の結合選択性及び重要性を、異なるＣＤ１６抗原バリアントのトランスジェニック発現を有する組換えＣＨＯ細胞を用いて確認した（図１９Ｂ）。ＣＤ１６Ｂ前駆体又はＣＤ１６Ｂ成熟抗原バリアントとは対照的に、ＣＤ１６Ａ又はＣＤ１６Ｂ前駆体、Ｈ１４０Ｙもまた、これらのｓｃＦｖ抗体を用いたウェスタンブロットでのＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に認められた（図１９Ｃ、及びデータ示さず）。還元された試料（データ示さず）のウェスタンブロットではシグナルは得られず、Ａｂ１６中及びＡｂ１６高による認識の場合、ＣＤ１６の１４０位のチロシンによって決定され得る立体構造エピトープが示唆される。
【０３８９】
ＣＤ１６Ａ上のＩｇＧ結合部位は、受容体の膜近位ＥＣＤ上の不連続な結合領域である。ＣＤ１６ＡとＩｇＧのＦｃ部分との低親和性相互作用のための重要なアミノ酸が以前に同定され、記載されている（Ａｈｍｅｄら、「Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ」（２０１６年）、第１９４巻、第７８〜８９頁）。抗体３Ｇ８は、ＣＤ１６Ａ及びＣＤ１６Ｂに結合し、ＩｇＧ結合をブロックすることが報告された（Ｔａｍｍら、「Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」（１９９６年）、第１５７巻、第１５７６〜８１頁）。ＩｇＧによるＣＤ１６Ａへの試験した抗体の結合のブロックは観察されなかった。ＣＤ１６Ａへの３Ｇ８  ｍＡｂの結合は、３Ｇ８の対応する可変ドメインを含有するｓｃＦｖ抗体の濃度の増加によって競合しなかったが、抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖ抗体Ａｂ１６中及びＡｂ１６高は、ＣＤ１６Ａ上の３Ｇ８  ｍＡｂをブロック又は置換せず、独立して結合し（図２２）、そして競合する３Ｇ８  ｍＡｂの不在下又は存在下において同様の親和性で結合した（表８）。表８に示すように、３Ｇ８はＣＤ１６上のＦｃ結合部位をブロックした。ＣＤ１６Ａ上の３Ｇ８結合部位の占有はＩｇＧ結合をブロックすることが知られているため、ＣＤ１６Ａ上の試験した抗ＣＤ１６抗体の結合部位は、ＩｇＧ結合部位とは異なると結論した。したがって、ｓｃＦｖ抗体Ａｂ１６高及びＡｂ１６中のＮＫ細胞結合ＫＤ値は、１０ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧの添加によってわずかに影響を受けたにすぎなかったが、抗体３Ｇ８のＣＤ１６結合部分の結合親和性は、生理学的ＩｇＧ濃度の存在下で２０倍以上減少した（表７）。したがって、これらの結果は、試験したＣＤ１６Ａ結合抗体Ａｂ１６高及びＡｂ１６低が、競合するＩｇＧレベル（例えば、ヒト血液中）によって損なわれないか、又はわずかしか損なわれないＣＤ１６Ａ特異的エピトープへの高親和性結合の利点を提供し、次いで、それらの力が多価抗腫瘍ＮＫ細胞結合ＲＯＣＫ（登録商標）抗体において利用されたことを示唆する。
【０３９０】
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【０３９１】
指示されたｓｃＦｖのＫＤ値は、１０ｍｇ／ｍＬのポリクローナルヒトＩｇＧの存在下又は不在下における、３７℃での濃縮された初代ヒトＮＫ細胞についての４つの独立した実験で決定された。
【０３９２】
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２つの独立したアッセイで測定した標準偏差による平均ＥＣ５０［ｎＭ］を示す。
【０３９３】
ＲＯＣＫ（登録商標）プラットフォーム
ＲＯＣＫ（登録商標）フォーマット
抗ＣＤ１６Ａドメインの汎用性を実証し、その可能性を最大限に活用するために、既知の抗体フォーマット（Ｓｐｉｅｓｓら、「Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」（２０１５年）、第６７巻、第９５〜１０６頁）及び新規に設計されたそのバリアントに基づくＲＯＣＫ（登録商標）構築物の広範なスペクトルが作成された。
【０３９４】
ＲＯＣＫ（登録商標）プラットフォーム抗体は、少なくとも１つの標的結合部位、及び二価結合を可能にする２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分を有する、多価多重特異性である。結合価、多重特異性、薬物動態、及び薬力学的特性などの所望の特徴に応じて、構築物は、定常領域を有する又は有しない結合ドメインからモジュール的に組み立てられる。ＲＯＣＫ（登録商標）抗体フォーマットは、（ｉ）ＦｃなしＲＯＣＫ（登録商標）、（ｉｉ）Ｆｃ融合ＲＯＣＫ（登録商標）、（ｉｉｉ）ＩｇＧ様ＲＯＣＫ（登録商標）、及び（ｉｖ）断片抗体結合ドメイン（Ｆａｂ）融合ＲＯＣＫ（登録商標）を含む４つの異なるファミリに分類することができる。ファミリメンバー（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の標的及びエフェクタ細胞結合部分は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、ダイアボディ（Ｄｂ）として、又は一連の機能性を可能にするＦａｂとしてのいずれかで、フォーマット化することができる。結合ドメインは、柔軟なリンカーを介してＣＨ２／ＣＨ３定常ドメインのＮ末端及びＣ末端に融合されるか、あるいは、ヒンジ又はより短いミドルヒンジを介してＮ末端に融合される（Ｍｅｒｃｈａｎｔら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」（２０１３年）第１１０巻、第Ｅ２９８７〜９６頁）。ファミリ（ｉ）では、結合ドメインはペプチドリンカーによって連結され、ＴａｎｄＡｂ（ＭｃＡｌｅｅｓｅら、「Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ」（２０１２年）、第８巻、第６８７〜９５頁）又はａＴｒｉＦｌｅｘ分子（Ｇａｎｔｋｅら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ」（２０１７年）、第３０巻、第６７３〜８４頁）として集合する。ＮＫ細胞の強力な結誘導及び活性化を確実にするために、抗ＣＤ１６Ａ部分を全てのファミリで二価結合のためにデザインした。ＲＯＣＫ（登録商標）誘導剤における腫瘍標的結合ドメインは、所望の結合強度及び／又は標的生物学に応じて、一価又は二価のいずれかであり得る。プラットフォームのモジュール性は、更に、複数の腫瘍抗原の共標的化のための、多価及び多重特異性誘導剤の構築を促進する。図２３に全４つのＲＯＣＫ（登録商標）ファミリ（ｉ〜ｉｖ）、その関連フォーマットを示す。ＲＯＣＫ（登録商標）フォーマットの汎用性を示すために、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、ＨＳＡ、又はＲＳＶのような異なる標的結合部分を選択した。
【０３９５】
本明細書に記載される機能アッセイにおいてより詳細に特徴付けられるＲＯＣＫ（登録商標）構築物の代表的な例は、固形腫瘍標的ＥＧＦＲ、又は多発骨髄腫における標的であるＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とする（表９Ａ、表９Ｂ、及び表９Ｃ）。表９Ａ、表９Ｂ、及び表９Ｃの構造に示される記号は、図２３に示される記号と一致する。全てのＲＯＣＫ（登録商標）構築物は完全ヒト抗体ドメインからなり、およそ１０２〜２５０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの場合において、タグ（Ｃタグ及び／又は６ｘＨｉｓタグ）をＣ末端に添加して、親和性クロマトグラフィによるヘテロ二量体抗体の選択的精製、非対称生成物中の２つの異なるポリペプチド鎖の分析、及び所望の生成物種の最終的な高純度（９０％超）を可能にした。
【０３９６】
ＦｃなしＲＯＣＫ（登録商標）ファミリ（ｉ）：Ｆｃなし構築物のこの群は、既知のＴａｎｄＡｂと、ａＴｒｉＦｌｅｘ（Ｇａｎｔｋｅら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ」（２０１７年）、第３０巻、第６７３〜８４頁）分子とを組み合わせたものであって、そのいくつかの製品はすでに臨床開発されている（Ｒｅｕｓｃｈら、「ＭＡｂｓ」（２０１４年）、第６巻、第７２８〜３９頁；Ｒｅｕｓｃｈら、「ＭＡｂｓ」（２０１５年）、第７巻、第５８４〜６０４頁；Ｅｌｌｗａｎｇｅｒら、「Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」（２０１７年）、第７巻；Ｒｅｕｓｃｈら、「Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．」（２０１６年）、第２２巻、第５８２９〜３８頁）。後者は、２つの異なる腫瘍関連抗原若しくは標的エピトープに対処するために２つの異なるｓｃＦｖ特異性を使用する、三重特異性フォーマットとして操作することができ、又はＰＫ伸長に使用することができる。この目的のために、抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメインを、その他の点では短命なＦｃなし抗体フォーマットの血清半減期を延長するために使用した。このファミリ内の両方のフォーマットは、二量体として、２つの別々のポリペプチド鎖上の対応する重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの相互作用により、ヘッド・トゥ・テールホモ二量体（ＴａｎｄＡｂ形式）、又はヘッド・トゥ・テール若しくはヘッド・トゥ・ヘッド様式のヘテロ二量体（ａＴｒｉＦｌｅｘ）として集合する。この群のメンバーは、およそ１０５ｋＤａの機能的二量体の質量を有するサイズで最小のＲＯＣＫ（登録商標）二重特異性構築物であり、Ｆｃ部分及びグリコシル化の両方を欠く。
【０３９７】
Ｆｃ融合ＲＯＣＫ（登録商標）ファミリ（ｉｉ）：このＦｃ含有抗体フォーマットのファミリは、Ｆｃγ受容体結合を回避するが、半減期延長のためにＦｃγＲｎ結合を維持するために、いくつかのＦｃバリアント（Ｖｉｄａｒｓｓｏｎら、「Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」（２０１４年）、第５巻、第５２０頁；Ｂａｕｄｉｎｏら、「Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」（２００８年）、第１８１巻、第６６６４〜９頁；Ｈｅｚａｒｅｈら、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ」（２００１年）、第７５巻、第１２１６１〜８頁）を含む。このように、Ｆｃγ受容体結合はＮＫ細胞結合ドメインのみによって媒介され、ＣＤ１６Ａに制限される。加えて、このファミリのＦｃ部分は、ＩｇＧ１ベースのホモ二量体（Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｄｂ−Ｆｃ）、ヘテロ二量体（ＫｉＨ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ）、又は単量体Ｆｃ（ｓｃＤｂ−ｍＦｃ）のいずれかであり得る。ヘテロ二量体化を容易にするために、古典的Ｙ４０７Ｔ（「ホール」）及びＴ３６６Ｙ（「ノブ」）突然変異を用いる「ノブ・イントゥ・ホール」（ＫｉＨ）技術が使用されている（Ｒｉｄｇｗａｙら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ」（１９９６年）、第９巻、第６１７〜２１頁）。単量体Ｆｃ（ｍＦｃ）部分は、標的及びＮＫ細胞結合部分との融合のために可撓性コネクタを用いて、既報（Ｙｉｎｇら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」（２０１２年）、第２８７巻、第１９３９９〜４０８頁）の通りに操作されている。抗ＣＤ１６Ａは、ＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ構築物の１つについて示されているように、Ｎ末端若しくはＣ末端の抗標的結合ドメインの反対側に位置するか、又はＮ末端の抗標的結合ドメインと並置されるかのいずれかである。ＣＤ１６Ａ結合ドメインに対するｓｃＤｂフォーマットを、ＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ及びｓｃＤｂ−ｍＦｃ構築物に適用した。Ｄｂ−Ｆｃフォーマットは、Ｃ末端又はＮ末端にダイアボディ分子を示すホモ二量体である。このＤｂ−Ｆｃフォーマットは、Ｃ末端の柔軟なリンカーを介して、又はＮ末端の拡張ヒンジ領域を介して、定常領域に融合した２つのＶＬ／ＶＨドメインから組み立てられる。
【０３９８】
ＩｇＧ様ＲＯＣＫ（登録商標）ファミリ（ｉｉｉ）：この二重特異性抗体群は、両方のＦａｂアーム内の可変断片（Ｆｖ）としてＣ末端に融合した又はＮ末端に位置する２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分を有する、原則的に「延長したヒトＩｇＧ１」分子（Ｃｏｌｏｍａら、「Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ」（１９９７年）、第１５巻、第１５９〜６３頁）である、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ及びＢｉ−ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂを包含した。対応する両端に位置する腫瘍標的結合ドメインについても同様である。Ｂｉ−ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ分子は、カッパ又はラムダ定常領域のＣ末端及びＣＨ３にフレキシブルなリンカーを介して融合した２つの追加の対の抗原結合性ｓｃＦｖを伴う、六価の三重特異性ＩｇＧ様構造を呈する。
【０３９９】
Ｆａｂ融合ＲＯＣＫ（登録商標）ファミリ（ｉｖ）：この群のメンバーは「拡張Ｆａｂ」分子であり、ｓｃＤｂ−ＴｒｉＢ及びｓｃＤｂ−ＴｒｉＢ−ｓｃＦｖフォーマットに細分することができる。どちらも、ｓｃＤｂ−ＴｒｉＢ−ｓｃＦｖ中のカッパ又はラムダ定常領域のＣ末端に、又はｓｃＤｂ−ＴｒｉＢの場合には、ＣＨ１のＣ末端に融合した二価のｓｃＤｂとして、抗ＣＤ１６Ａ結合部分を含む。ＰＫ−伸長については、Ｆａｂ断片のＮ末端の可変ドメインがＨＳＡ結合を提供する。腫瘍標的化は、それぞれの遊離Ｃ末端に融合した一価（ｓｃＤｂ−ＴｒｉＢ−ｓｃＦｖ）又は二価（ｓｃＤｂ−ＴｒｉＢ）結合部分（ｓｃＦｖ対ｓｃＤｂ）のいずれかによって達成される。
【０４００】
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【０４０１】
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【０４０２】
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【０４０３】
ＲＯＣＫ（登録商標）誘導剤はＣＤ１６Ａを介してＮＫ細胞誘導を最大にする結合力を利用する
ヒトＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ又はカニクイザルＣＤ１６からの解離を比較することによって、ＳＰＲにおける多様なＲＯＣＫ（登録商標）誘導剤フォーマットのＣＤ１６Ａ結合保持を検討し、そしてヒトＣＤ１６Ａへの結合を増強するｓｃＦｖ  Ａｂ１６高及び人工ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ）の一価結合と比較した。３時間の解離の間の試験した抗体の相対結合シグナルは、はるかに速い解離ＩｇＧ  Ｆｃ（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ）（１０％）又は一価結合ｓｃＦｖ  Ａｂ１６高（０％〜２．４％）と比較して、ヒトＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ（７６．６％〜９２．５％）及びカニクイザルＣＤ１６（８４．９％〜９７．９％）の両方で、試験した全てのＲＯＣＫ（登録商標）誘導剤の受容体保持において明らかな優位性を示した（図２４Ａ〜図２４Ｃ）。ＳＰＲによる解離測定の結果と一致して、Ａｂ１６高Ｆｖドメインを有するＴａｎｄＡｂなどのＲＯＣＫ（登録商標）誘導剤は、野生型Ｆｃドメインを有する古典的ＩｇＧ又はＦｃにおけるＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ突然変異を有する増強されたＩｇＧよりも、ＮＫ細胞の表面上で実質的に長い保持を示した（図２５）。
【０４０４】
全てがＣＤ１６Ａに対する２つの結合部位を含む、異なるＲＯＣＫ（登録商標）ＮＫ細胞誘導剤の見かけ上のＣＤ１６結合強度は、更に、抗ＣＤ１６可変ドメイン同一性（高親和性Ａｂ１６高又は中親和性Ａｂ１６中）、抗体フォーマット、並びに多重特異性（二重又は三重特異性を含むが、これらに限定されない）及び多価（四価又は六価の）ＲＯＣＫ（登録商標）ＮＫ細胞誘導剤における抗ＣＤ１６部分の位置に依存した。一価の結合特性と同様に、ＲＯＣＫ（登録商標）抗体を含有するＡｂ１６高による二価のＣＤ１６Ａ結合は、Ａｂ１６中ドメインを含有する対応するＲＯＣＫ（登録商標）誘導剤よりも、ＥＬＩＳＡにおいて高い見かけ上の親和性を有した。加えて、ＲＯＣＫ（登録商標）誘導剤内の抗ＣＤ１６Ａドメインの異なる配置により、段階的な親和性調整が可能になった：ＦｃドメインのＮ末端にＣＤ１６結合部分を含有するＲＯＣＫ（登録商標）構築物は、ＦｃのＣ末端への抗ＣＤ１６ドメインの融合を含有する抗体よりも高いＣＤ１６Ａに対する見かけ上の結合親和性を媒介した（図２６Ａ及び図２６Ｂ）。結合親和性の微調整は、２つのＣＤ１６結合ｓｃＦｖの融合と比較して、結合強度を増強したＦｃのＮ末端におけるＦａｂ又はダイアボディベースの結合モジュールのいずれかを使用することによって、達成することができた（図２６Ａ及び図２６Ｂ）。ＦｃのＣ末端にｓｃＦｖを含有するＲＯＣＫ（登録商標）誘導剤におけるＣＤ１６結合強度の更なる調整は、コネクタの長さを変えることによって達成することができ、これによって、より長いコネクタは、より短いコネクタよりも高い見かけ上の親和性ＣＤ１６結合を容易にした（図２６Ｃ）。おそらく、結合力だけでなく立体的側面もまたこれらの設定における見かけの結合親和性に影響を及ぼすが、一方でＣＤ１６Ａ結合に対して操作された異なる標的結合特異性の影響は無視できるものであった。
【０４０５】
ＥＬＩＳＡによって測定されたＣＤ１６Ａ結合特性がＮＫ細胞への結合と相関するかどうかを評価するために、Ａｂ１６中Ｆｖドメインを含有する選択されたセットのＲＯＣＫ（登録商標）誘導剤を、ヒト血清中の生理学的状況を模倣するポリクローナルヒトＩｇＧの不在下又は存在下において初代ヒトＮＫ細胞上で滴定し、そして見かけの親和性を非線形回帰によって決定した（図２７Ａ、図２７Ｂ、及び図２７Ｃ）。再び、Ｎ末端Ｆａｂ又はｓｃＦｖ中の抗ＣＤ１６Ａドメインを有する構築物（ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿Ａ及びＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿Ａ）は、Ｃ末端ｓｃＦｖ中の抗ＣＤ１６Ａドメインを有する対応する構築物（ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿Ｂ及びＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿Ｃ）と比較して、ＮＫ細胞に対して実質的に高い親和性を呈した。興味深いことに、中心の抗ＣＤ１６Ａダイアボディを有するＴａｎｄＡｂ（表９Ｂ）は、Ｎ末端Ｆａｂ又はｓｃＦｖを有する構築物と同様にＮＫ細胞に対して高い親和性を示したが、一方でａＴｒｉＦｌｅｘは、構築物のコアにおける同様の抗ＣＤ１６ＡダイアボディモチーフにもかかわらずＮＫ細胞に対して最低の親和性を示したものの、非対称可変ドメイン順序もまた示した。高ＩｇＧ濃度は、Ｎ末端Ｆａｂにおける抗ＣＤ１６ＡドメインとのＴａｎｄＡｂ及びｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ構築物の見かけ上の親和性に実質的な影響を及ぼさず、Ｎ末端又はＣ末端が構築物に融合しているかどうかに関係なく、抗ＣＤ１６Ａ  ｓｃＦｖを含有する構築物の結合に中程度の影響を及ぼし（ファクタ４〜９）、そしてａＴｒｉｆｌｅｘの親和性に対して最も強い阻害効果が観察された。
【０４０６】
ＮＫ細胞兄弟殺し及びＲＯＣＫ（登録商標）フォーマットの設計
ＣＤ１６に対する抗体の多価高親和性結合は、多数のＮＫ細胞上の受容体を架橋するリスクを有し、結果として、架橋された細胞のＣＤ１６Ａ媒介殺害をもたらし、したがってＮＫ細胞集団を枯渇させる（Ｃｈｏｉら、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（２００８年）、第１２４巻、第２１５〜２２頁）。このＮＫ細胞兄弟殺しは、ＮＫ細胞の細胞膜上のＣＤ３８を標的とするダラツムマブのような他のモノクローナル抗体で、既に示されている（Ｃａｓｎｅｕｆら、「Ｂｌｏｏｄ  Ａｄｖ．」（２０１７年１０月２４日）、第１巻、第２３号、第２１０５〜２１１４頁）。主なエフェクタ細胞集団を減少させることは、おそらく抗体媒介抗腫瘍応答の効力を妨げる。このため、各種ＲＯＣＫ（登録商標）フォーマットにより誘導されるＮＫ細胞兄弟殺しの程度をモニタする、インビトロアッセイが確立された。本明細書では、同じドナー由来の初代ヒトＮＫ細胞を、エフェクタ及び標的細胞として使用し、こうして上述のようにＮＫ細胞溶解の能力を決定することを可能にした。陽性対照として、ダラツムマブをアッセイセットアップに含めた。本発明者らは、ＣＤ１６Ａに対する単一の結合部位のみを含有する抗体を用いてＮＫ−ＮＫ兄弟殺しを観察したことがなく、ＣＤ１６Ａの二価性がＮＫ細胞架橋及びその後の兄弟殺しの必要条件であることが示唆される。興味深いことに、ＲＯＣＫ（登録商標）抗体のフォーマット又はドメイン順序に応じて、ＮＫ細胞兄弟殺しの発現だけでなく、ＮＫ細胞を殺害する能力も変化させることができた（図２８）。
【０４０７】
概して、分析された全てのＲＯＣＫ（登録商標）抗体フォーマットは、ダラツムマブと比較して改善されたＮＫ細胞兄弟殺しプロファイルを示し、平均１５８ｐＭの効力を有するＮＫ細胞指向性殺害をもたらした。試験した全てのＲＯＣＫ（登録商標）抗体フォーマットは、ＮＫ細胞殺害をほとんど誘導しないか、全く誘導しないかのいずれかであった。
【０４０８】
ＲＯＣＫ（登録商標）抗体のＮ末端融合抗ＣＤ１６Ａ部分を介したＣＤ１６Ａ結合は、Ｃ末端でのＣＤ１６Ａ結合と比較して、ＮＫ細胞兄弟殺しをより強固に回避するようであった。しかしながら、詳しくＮ末端ＣＤ１６結合に焦点を当てると、１４３９〜２３８９ｐＭの間の平均効力値を持つＦａｂベースのＣＤ１６Ａ結合を用いた、より顕著なＮＫ細胞枯渇が明らかになった。
【０４０９】
興味深いことに、ＣＤ１６  Ｆｖのドメイン順序を分析することによって、ＮＫ細胞溶解を誘導するＶＨ−ＶＬドメイン順序を含有する構築物とは対照的に、ドメイン順序がＶＬ−ＶＨである場合、実質的に低い数の構築物がＮＫ細胞兄弟殺しを誘導した。Ｃ末端又はＮ末端のいずれかにＣＤ１６  Ｆｖ  ＶＬ−ＶＨドメインを含有するＲＯＣＫ（登録商標）抗体のうち、わずかな構築物のみがＮＫ細胞兄弟殺しを誘導した。
【０４１０】
要約すると、抗体を誘導するＮＫ細胞兄弟殺しの割合及びＮＫ細胞殺害の効力は、ＦａｂベースのＣＤ１６Ａ結合を回避し、ＣＤ１６結合Ｆｖドメインの有益なＶＬ−ＶＨ順序に焦点を合わせることによって改善することができた。
【０４１１】
ＲＯＣＫ誘導剤の優れたインビトロ細胞傷害性
ＥＧＦＲ又はＢＣＭＡを標的とする種々のＲＯＣＫ（登録商標）誘導剤のインビトロ細胞傷害性を、カルセイン放出アッセイで評価した（図２９Ａ、図２９Ｂ、図２９Ｃ、図２９Ｄ、及び図２９Ｅ）。細胞表面で高（ＮＣＩ−Ｈ９２９）、中（ＭＭ．１Ｓ）、又は低（ＭＣ／ＣＡＲ）ＢＣＭＡレベルを発現する標的細胞上のＦｃ（ＩｇＡｂ＿Ｃ）にＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ突然変異を有する、Ａｂ１６中Ｆｖ含有誘導剤ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿Ｅ及びＦｃ増強抗ＢＣＭＡ  ＩｇＧ１と、Ａｂ１６高Ｆｖドメイン（ＴａｎｄＡｂ＿Ａ、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿Ｄ、Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿Ｂ、及びＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ＿Ａ）を有するＢＣＭＡ標的遺伝子を比較した（図２９Ａ〜図２９Ｃ）。例示的な細胞傷害性の結果は、ＢＣＭＡ高ＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞に対する異なるＲＯＣＫ（登録商標）誘導剤フォーマット間における効力及び有効性のわずかな差のみ（ＥＣ５０範囲：９．５ｐＭ〜５２．７ｐＭ）、ＢＣＭＡ中ＭＭ．１Ｓ標的細胞に対して同様の効力であるが強い効力の差（ＥＣ５０の範囲：１．８ｐＭ〜２９．１ｐＭ）、並びにＢＣＭＡ低ＭＡＣ／ＣＡＲ標的細胞に対する効力及び効力の強い差（ＥＣ５０の範囲：５９ｐＭ〜８５９ｐＭ）を明らかにした。より低いＥＣ５０値は、ＢＣＭＡ標的化ＴａｎｄＡｂ＿Ａ、ＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ＿Ａ、及びｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿Ｄについて生成された。これらの結果は、ＣＤ１６Ａに対する２つの価及びＮＫ細胞に対する見かけの親和性が、より感受性の低い標的細胞及び／又はより少ない数の細胞表面標的抗原を発現する標的細胞の、ＮＫ細胞媒介性溶解を誘発するのに有利であることを示唆する。注目すべきことに、ＣＤ１６Ａ単独の二価性は、ＮＫ細胞活性化マーカーＣＤ６９の抗体誘導性発現及びヒトＰＢＭＣ培養におけるサイトカイン放出が、標的細胞の存在に厳密に依存していたため、ＮＫ細胞活性化を媒介するには充分ではなかった（図４９Ａ〜図４９Ｆ）。更に、ＲＯＣＫ（登録商標）抗体を誘導するＮＫ細胞によってヒトＰＢＭＣ培養物中に放出された炎症性サイトカインレベルは、ＢＣＭＡ誘導性Ｔ細胞誘導剤によって放出されたものよりも数桁低かった（図５０）。
【０４１２】
ＢＣＭＡ標的化ＲＯＣＫ誘導剤、ＥＧＦＲ標的化ＲＯＣＫ（登録商標）誘導剤で得られた結果と同様に、ＥＧＦＲ標的化ＲＯＣＫ（登録商標）誘導剤は、Ｆｃ（ＩｇＡｂ＿Ｄ）、古典的ＥＧＦＲ標的化ＩｇＧ１（ＩｇＡｂ＿Ｂ）、又は同一のエフェクタ結合ドメイン及び標的結合ドメイン（図２９Ｄ及び図５１）を含む一価結合二重特異性誘導剤（ＢｉＫＥ）において、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ突然変異を伴うＦｃ増強抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧ１と比較した場合、一桁ｐＭ  ＥＣ５０値に達するＳＷ−９８２及びＡ−４３１標的細胞に対する殺害アッセイにおいて優れた効力を示した。ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ  ａＴｒｉＦｌｅｘ＿Ａは、ヒトＮＫ細胞に対する見かけ上の親和性が他のＲＯＣＫ（登録商標）誘導剤よりも実質的に低いにもかかわらず（図２７Ａ〜図２７Ｃ）、Ｆｃ増強抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧ１（ＩｇＡｂ＿Ｄ）と同様の効力を示した（図５１）。ＢＣＭＡ標的化ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿Ｅは、ＥＧＦＲ陽性、ＢＣＭＡ陰性標的細胞株Ａ−４３１に対して殺傷活性を示さなかったので、非特異的殺傷を除外することができる（図５１）。
【０４１３】
種々のＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａ誘導剤の見かけの親和性、及び図２９Ｅに示されるインビトロ細胞傷害性アッセイにおけるそれぞれの効力の分析は、ＮＫ細胞に対するＣＤ１６Ａに対する見かけ上の親和性と効力との相関を示唆する。相関は、２：１のＥ：ＴでのＲＰＭＩ−８２２６標的細胞に対する３時間の細胞傷害性アッセイだけでなく、ＮＫ細胞に対するＣＤ１６Ａへの高親和性結合が優れた細胞傷害能力に寄与することを支持する、５：１のＥ：Ｔ比でのＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞に対する４時間アッセイでも観察できた。
【０４１４】
ＴａｎｄＡｂを標的とするＲＯＣＫ（登録商標）ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａの従来の抗ＣＤ３０抗体及びＦｃ工学抗ＣＤ３０抗体に対する優位性は、インビトロ細胞傷害性アッセイを競合するＩｇＧの生理学的レベルの存在下で実施した場合、更に顕著であった。１０ｍｇ／ｍＬポリクローナルＩｇＧの補充は、全ての培養においてバックグラウンド溶解を明らかに増加させ（図５２Ｂ）、ほとんどはＮＫ細胞による血清ＩｇＧ誘発性脱顆粒に起因した（Ｊａｃｏｂｉら、「Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」（２００９年）、第１３３巻、第３９３〜４０１頁）。しかしながら、モノクローナルＩｇＧ（図５２Ｃ）又はＦｃ操作ＩｇＧ（図５２Ｄ）との競合は、活性を完全に遮断するか、又は従来の抗体の効力及び有効性を明らかに妨害した。ＲＯＣＫ  ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａ  ＴａｎｄＡｂ抗体は、生理的濃度の競合ＩｇＧの存在下でさえ、試験した全ての条件下で最大の細胞傷害能力及び有効性を示した（図５２Ａ〜図５２Ｄ、表１０）。
【０４１５】
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【０４１６】
ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａ  ＴａｎｄＡｂ、抗ＣＤ３０  ＩｇＧ１（ＩｇＡｂ）、又はＦｃ増強抗抗ＣＤ３０  ＩｇＧ１（ＩｇＡｂ（Ｆｃ増強））の段階希釈液の存在下において、５：１のＥ：Ｔ比でエフェクタ細胞として初代ヒトＮＫ細胞を有するカルセイン標識ＣＤ３０＋ＫＡＲＰＡＳ−２９９標的細胞を用いた、４時間カルセイン放出細胞傷害性アッセイ。アッセイは、ＲＰＭＩ  １６４０培地中単独で実施するか、又は１０ｍｇ／ｍＬのポリクローナルヒトＩｇＧ、１０ｍｇ／ｍＬのモノクローナルヒト抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧ１（ＩｇＡｂ）、若しくは１０ｍｇ／ｍＬのＦｃ増強抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧ１（ＩｇＡｂ＿Ｄ（Ｆｃ増強））を補充して実施した。
【０４１７】
ＰＫの調節
治療用抗体のもう別の重要なパラメータは、これらの血清半減期である。高度に細胞傷害性のある抗体については、迅速なクリアランスを可能にする短い半減期が好ましいであろう。対照的に、良好な安全性プロファイルを有する抗体については、頻繁な投与又は持続注入の必要性を回避することによって患者の利便性を高めるために、より長い半減期が好ましいようである。
【０４１８】
ＲＯＣＫ（登録商標）プラットフォームフォーマットの選択したセットの基本的な薬物動態パラメータを、ＣＤ−１  ＳＷＩＳＳマウスで分析した。ＲＯＣＫ（登録商標）誘導剤のＩｇＧ様ファミリのために、Ｎ末端Ｆａｂに抗ＣＤ１６部分を含有するか、又はＣＨ３のＣ末端に融合したｓｃＦｖとしてかのいずれかの２つの代表的なｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ抗体（ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿Ａ及びｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿Ｄ）を選択した。ＲＯＣＫ（登録商標）誘導剤のＦｃ融合ファミリについて、対称性Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿Ａ及び非対称性ｓｃＤｂ含有ＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ＿Ａ抗体を分析した。最後に、Ｆａｂ融合及びＦｃなしファミリについて、ＰＫ分析のために、ＴａｎｄＡｂ＿Ｂ、ａＴｒｉＦｌｅｘ＿Ａ、ａＴｒｉＦｌｅｘ＿Ｂ、及びｓｃＤｂ−Ｔｒｉｂ＿Ａ抗体を選択した。後者の２つは、ＰＫ伸長のためａＴｒｉＦｌｅｘ＿Ａにおける高親和性ＨＳＡ結合ドメインと比較して、低親和性のＨＳＡ結合部分を用いる。選択したＲＯＣＫ（登録商標）誘導剤における腫瘍標的化ドメインは、ヒトＥＧＦＲ又はＢＣＭＡのいずれかに特異的であった。標的結合部分及びＣＤ１６Ａ結合部分の両方は、対応するマウス類似体に対して交差反応性ではないため（データ示さず）、標的に関連した薬力学的作用は仮定できなかった。異なる試験物質の０．３ｍｇ（約１０ｍｇ／ｋｇ体重）の単回静脈内投与を受けた動物由来の血清試料を、１又は３週の間の異なる時点で収集し、ＥＬＩＳＡ又はＭＳＤ技術に基づく確立したアッセイにより分析した。基本的な薬物動態パラメータは、非コンパートメント薬物動態分析により決定した（表１１）。表１１の構造に示される記号は、図２３に示される記号と一致する。異なるＲＯＣＫ（登録商標）フォーマットを静脈内投与すると、血清中濃度は二指数関数的に低下した（図３０）。両方のＩｇＧ様フォーマットの半減期は、それぞれ、３２９．２及び３６４．３時間と同じ範囲であり、標準ＩｇＧ分子６３に匹敵することが示された。Ｆｃ融合フォーマットＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿Ａ及びＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃ＿Ａについて、それぞれ、９５．８又は７４．３時間の短い半減期が測定された。これらの血清半減期は、ＩｇＧ様と、Ｆｃなし及びＦａｂ融合ＲＯＣＫ（登録商標）フォーマットとの間であった。しかしながら、Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿Ａの観察期間は、両ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂフォーマットの３週間と比較して、わずか１週間であった。したがって、この値は過小評価であり得る。最も短い半減期は、Ｆｃなし及びＦａｂ融合ＲＯＣＫ（登録商標）フォーマットについて測定された。平均の見かけの最終半減期は、高親和性抗ＨＳＡ結合部分を含有するａＴｒｉＦｌｅｘ＿Ａについて３７．４時間、及びＴａｎｄＡｂについて１８．０時間であった。ｓｃＤｂ−Ｔｒｉｂ＿Ａの低親和性抗ＨＳＡドメインは、この構築物の半減期（１４．０時間）を延長することができなかった。循環血中の未変化薬物を定義する平均滞留時間（ｍｅａｎ  ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ  ｔｉｍｅｓ：ＭＲＴ）に基づいて、同様の順位付けを行うことができた。最も高いＭＲＴは、ＩｇＧ様及びＦｃ融合試験物質に対して５２８．５〜１１０．６時間であり、続いて、それぞれＴａｎｄＡｂ、ａＴｒｉＦｌｅｘ、及びｓｃＤｂ−Ｔｒｉｂにより表されるＦｃなし及びＦａｂ融合フォーマットに対して６１．６〜２８．５時間の比較的短いＭＲＴ値を示した。この順位はまた、クリアランス（Ｃ）が０．００６〜１．２２８ｍＬ／時の範囲であり、Ｆｃ又は抗ＨＳＡドメインのいずれも含有しないＴａｎｄＡｂ構築物について得られた最高値についても当てはまる。重要なパラメータはまた、生物体内の分子の最大量又は曝露量を経時的に定義する、曲線下面積（ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｄｅｒ  ｃｕｒｖｅ：ＡＵＣ）によっても決定される。予想通り、最高のＡＵＣ値はＦｃ含有フォーマットで達成された。約１０倍低い値は、より小さいＦｃなしフォーマットで測定した。ここでも、ＴａｎｄＡｂは長期生存試験物質と比較して、ＡＵＣが１００倍の差である最低曝露量を示した。薬物が全身に均一に分布している場合、体内の薬物総量を説明するのに必要な見かけの体積を定義する定常状態分布量（Ｖｓｓ）は、ＴａｎｄＡｂが最も高く（４．８ｍＬ）、続いてＩｇＧ様（それぞれ、３．３ｍＬ及び３．１ｍＬ）、Ｆｃ融合（２．２ｍＬ）、ａＴｒｉＦｌｅｘ（２．２ｍＬ）、及びｓｃＤｂトリボディ（１．５ｍＬ）の順であった。ｓｃＤｂトリボディのより低いＶｓｓ値は、分子の大部分が血液コンパートメント（血液）に残ることを意味する。結論として、異なるＲＯＣＫ（登録商標）フォーマットは、ＣＤ−１マウスにおいて異なるＰＫプロファイルを示し、半減期は１４〜３６４時間の範囲であった。
【０４１９】
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【０４２０】
実施例８−ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ結合抗体の活性
８．１．ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ結合抗体
本実施例では、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ結合抗体の研究：ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉ、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩＩ、及びＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩＩＩを提示する。
【０４２１】
この実施例に示されたデータによって実証されるように、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、ＡＤＣＣと同様のメカニズムで多発骨髄腫を治療する際に使用されるＮＫ細胞誘導剤であり、好ましい安全性プロファイルで有意な活性を達成する可能性を持つ。加えて、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、ダラツムマブ（抗ＣＤ３８抗体）抵抗性及び難治性（ｒｅｆｅｃｔｏｒｙ）多発骨髄腫患者を治療する可能性があることが示されている。更に、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、多発骨髄腫に対する別の治療、例えば、抗体（抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、及び抗ＶＥＧＦ抗体を含むが、これらに限定されない）を含む治療、及びサイトカインを含む治療（例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−２等）と組み合わせることができる。
【０４２２】
８．１．１．ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉ
ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、図１３に示される構造を有するｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ抗原結合タンパク質であり、これは、（ａ）ＶＬ−ＶＨの順序でホモ二量体ヒトＩｇＧ  ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃ部分のＣ末端に融合したｓｃＦｖのフォーマットの２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分と、（ｂ）ＩｇＧのＦａｂアーム内の各Ｆｖによって提供される２つの標的抗原結合部分とを含み、ここで、標的抗原結合部分はＢＣＭＡに結合する。
【０４２３】
ＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々は、配列番号７３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号７４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号７５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従って識別される。ＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＶＨと、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＶＬと、を含む。
【０４２４】
ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩのＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、分子のＦｃ部分のＣ末端に融合するし、コネクタ（配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する）を介して、以下の順序で接続される：ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−リンカーＬ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）。リンカーＬ３は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する。
【０４２５】
ＢＣＭＡ標的化部分の各々は、配列番号６７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号６８に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号７０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号７１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従って識別される。ＢＣＭＡ標的化部分の各々は、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨと、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬと、を含む。
【０４２６】
ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分及び２つのＢＣＭＡ標的化部分を含み、ここで、（ａ）２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々は、配列番号７３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１、配列番号７４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２、配列番号７５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２、及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３を含む；並びに、（ｂ）２つのＢＣＭＡ標的化部分の各々は、配列番号６７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１、配列番号６８に示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３、配列番号７０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１、配列番号７１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２、及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３を含む。
【０４２７】
ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉに対するＣＤ１６Ａ抗原結合部分及びＢＣＭＡ標的化部分のＣＤＲ配列の概要を、図５３Ａ及び図５３Ｃに示す。
【０４２８】
ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分及び２つのＢＣＭＡ標的化部分を含むみ、ここで、（ａ）ＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬとを含み；（ｂ）ＢＣＭＡ標的化部分の各々は、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
【０４２９】
ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉに対するＣＤ１６Ａ抗原結合部分及びＢＣＭＡ標的化部分のＶＨ及びＶＬ配列の概要を、図５３Ｂ及び図５３Ｄに示す。ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩのＦｃ部分は、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２を含むサイレンシングされたＦｃ部分であり、そしてＣＨ３重鎖定常ドメインは、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含む。ＣＨ２重鎖定常ドメインは、２つのサイレンシング突然変異（「エフェクタレス突然変異」とも称する）：Ｌ２３４Ｆ及びＬ２３５Ｅを有する。ＣＨ２重鎖定常ドメインは、配列番号７９に示されるアミノ酸配列を含む。ＣＨ３重鎖定常ドメインは、配列番号１０９に示されるアミノ酸配列を含む。ＢＣＭＡ標的化部分に連結されるＣＨ１重鎖定常ドメインは、配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含む。
【０４３０】
ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、１つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分、ホモ二量体ヒトＩｇＧ  ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃ部分、ＢＣＭＡ標的化部分のＶＨを含むポリペプチド鎖１を含み、ここで、該ポリペプチド鎖１は、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する。ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、ＢＣＭＡ標的化部分のＶＬを含むポリペプチド鎖２を含み、該ポリペプチド鎖２は、配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する。
【０４３１】
８．１．２．ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩＩ
ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩＩは、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分及び２つの標的抗原結合部分を含む、図２３（「ＴａｎｄＡｂ」の構造を参照）に示される構造を有する、ＦｃなしＴａｎｄＡｂであり、ここで、ＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ｓｃＦｖのフォーマットで提供され、標的抗原結合部分のＶＨ及びＶＬの間に配置される。
【０４３２】
ＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、以下の順序で標的抗原結合部分に融合される：
ＶＨＢＣＭＡ−リンカーＬ５−ＶＬＣＤ１６Ａ−リンカーＬ６−ＶＨＣＤ１６Ａ−リンカーＬ５−ＶＬＢＣＭＡ。
【０４３３】
リンカーＬ５は、配列番号１２９に示されるアミノ酸配列を有する。リンカーＬ５は、配列番号１３０に示されるアミノ酸配列を有する。
【０４３４】
ＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々は、配列番号７３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号７４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号７５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従って識別される。ＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＶＨと、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＶＬと、を含む。
【０４３５】
ＢＣＭＡ標的化部分の各々は、配列番号６７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号６８に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号７０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号７１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従って識別される。ＢＣＭＡ標的化部分の各々は、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨと、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬと、を含む。
【０４３６】
ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩＩは、２つのポリペプチドを含み、これら各々は、配列番号１２６に示されるアミノ酸配列を有する。
【０４３７】
８．１．３．ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩＩＩ
ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩＩＩは、図５に示される構造を有するＫｉＨ−ｓｃＤｂ−Ｆｃであり、これは、（ａ）ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨの順序でＩｇＧ  ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃ部分のＣ末端に融合したｓｃＤｂのフォーマットである２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分と、（ｂ）Ｆｃ部分のＮ末端に融合したｓｃＦｖのフォーマットの単一の標的抗原結合部分をと、含み、ここで、標的抗原結合部分はＢＣＭＡに結合する。
【０４３８】
ＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々は、配列番号７３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号７４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号７５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従って識別される。ＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＶＨと、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＶＬと、を含む。
【０４３９】
ＣＤ１６Ａ抗原結合部分は、ヘテロ二量体Ｆｃ部分に融合し、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有するコネクタを介して、以下の順序で接続される：ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−リンカーＬ１−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−リンカーＬ２−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−リンカーＬ１−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）。リンカーＬ１は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有し、リンカーＬ２は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する。
【０４４０】
ＢＣＭＡ標的化部分は、配列番号６７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号６８に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号７０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号７１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従って識別される。ＢＣＭＡ標的化部分の各々は、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨと、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬと、を含む。
【０４４１】
ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩＩＩは、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分及び１つのＢＣＭＡ標的化部分を含み、ここで、（ａ）２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分の各々は、配列番号７３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１、配列番号７４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２、配列番号７５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２、及び配列番号７８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３を含む；並びに、（ｂ）２つのＢＣＭＡ標的化部分の各々は、配列番号６７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１、配列番号６８に示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３、配列番号７０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１、配列番号７１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２、及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３を含む。
【０４４２】
ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩＩＩのＦｃ部分は、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２及びＣＨ３重鎖定常ドメインを含む、サイレンシングされたＦｃ部分である。ＣＨ２重鎖定常ドメインは、２つのサイレンシング突然変異（「エフェクタレス」突然変異）：Ｌ２３４Ｆ及びＬ２３５Ｅを有する。ＣＨ２重鎖定常ドメインは、配列番号７９に示されるアミノ酸配列を含む。ＣＨ３重鎖定常ドメインは、１つのサイレンシング突然変異（エフェクタレス突然変異）Ｄ２６５Ａを有する。ＣＨ３重鎖定常ドメインは、配列番号８１に示されるアミノ酸配列を含む。
【０４４３】
ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩＩＩは、２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分及びＩｇＧ  ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃ部分を含むポリペプチド鎖１を含み、ここで、該ポリペプチド鎖１は配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有する。ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩＩＩは、１つのＢＣＭＡ標的化部分を含むポリペプチド鎖２を含み、該ポリペプチド鎖２は配列番号６４に示されるアミノ酸配列を有する。
【０４４４】
８．２．結合特性
ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉ及びＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩＩＩの両方が、ＣＤ１６ＢではなくＣＤ１６Ａに特異的に結合する。ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、ＣＤ１６Ａ及びＢＣＭＡに対して高い結合親和性を有し、例えば、抗体は、約１６ｎＭのＫＤでＣＤ１６Ａに結合し、約２ｎＭのＫＤでＢＣＭＡに結合する。
【０４４５】
ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、ＥＬＩＳＡによって確認されるように、ＦｃγＲ結合を欠く。ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩはそのＦｃ領域を介してＣＤ１６Ａに結合しないため、ＣＤ１６Ａ多型とは無関係にＣＤ１６Ａに結合する。例えば、多発骨髄腫細胞株に対するＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉの細胞傷害性を、ＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ／Ｖ健常ドナー及びＣＤ１６Ａ−１５８Ｆ／Ｆ健常ドナーで同じ日に評価した。結果を図３１Ａ及び図３１Ｂに示す。ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、ＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ／Ｖと比較して、ＣＤ１６Ａ−１５８Ｆ／Ｆでは変化がないか、又は活性が増加した。対照的に、Ｆｃ領域を介してＣＤ１６ａに結合するダラツムマブは、ＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ／Ｖと比較してＣＤ１６Ａ−１５８Ｆ／Ｆの活性の低下を示した。多発骨髄腫細胞株に対するＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉの細胞傷害性もまた、ＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ／Ｆ健常ドナーで評価したが、これはＣＤ１６Ａ−１５８Ｆ／Ｆ及びＣＤ１６Ａ−１５８Ｖ／Ｖで観察された細胞傷害性の間であった（データ示さず）。
【０４４６】
８．３  多発骨髄腫標的細胞のインビトロ細胞傷害性
８．３．１．カルセインＡＭ細胞傷害性アッセイを用いる細胞傷害性の評価
エフェクタ細胞としてヒトＮＫ細胞を、標的細胞として多発骨髄腫細胞株を用いて、カルセインＡＭ細胞傷害性アッセイを行った。簡単に述べれば、標的細胞を、血清を含まない培地により３７℃で３０分間、１０μＭカルセインＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；マサチューセッツ州ウォルサム）で新たに標識した。遠心分離による２回の洗浄の後、細胞をアッセイ培地（１０％熱不活化ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ  １６４０）に再懸濁し、１×１０４細胞／ウェルの密度で、９６ウェルＵ底組織培養プレートに分注した。次いで、新鮮に調製されたエフェクタ細胞を、５×１０４細胞／ウェルの密度で各ウェルに添加した。３０分のインキュベーションの後、試験試料の段階希釈物（０．６４、３．２、１６、８０、４００、及び２０００ｐｍ）をプレートに加え、５％ＣＯ２と共に、加湿したインキュベータ内で３７℃で更に４時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを３００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を黒色の不透明な９６ウェル・マイクロ・プレート（ＯｐｔｉＰｌａｔｅ−９６；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；マサチューセッツ州ウォルサム）に移し、蛍光シグナルを、４９５／５１５ｎｍにおける励起／発光でＩｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  ＰＲＯプレートリーダ（Ｔｅｃａｎ  Ｔｒａｄｉｎｇ  ＡＧ；メンネドルフ、スイス）を用いて相対蛍光単位（ＲＦＵ）で測定した。標的細胞のみを含有するウェルからのシグナルは、標識細胞からのカルセインの自発的放出を表し、一方で１０％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；ミズーリ州セントルイス）で溶解した標的細胞を含有するウェルは最大放出を表した。非特異的エフェクタ細胞媒介細胞傷害性を、試験試料の添加なしに、標的及びエフェクタ細胞を含有するウェルにおいて測定した。特異的細胞傷害性の程度を、以下のように算出した：
細胞傷害性％＝１００＊（実験的放出−非特異的放出）／（最大放出−自然放出）。
【０４４７】
データを分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ；カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して４つのパラメータの非線形回帰モデルに適合させることによってプロットした。
【０４４８】
結果を表１２に示す。
【０４４９】
2021521275.tif 000031
【０４５０】
８．３．２．ＦＡＣＳを用いる細胞傷害性の評価
ヒトＰＢＭＣ及び単離されたＮＫ細胞を、健康なヒト血液ドナーＡから単離し、後の実験のために凍結させる。解凍時のＰＢＭＣは、トリパンブルー染色で約８５％生存可能であり、後に７ＡＡＤによるＦＡＣＳで確認された。ＰＢＭＣを、Ｅ：Ｙ比が約０．４又は約４〜５であるＢＣＭＡ＋多発骨髄腫瘍細胞株と共培養し、３７℃にて５％のＣＯ２でおよそ２０時間、０．１〜３０００ｐＭの３倍に段階希釈した試験物に曝露した。抗体染色及びＦＡＣＳを用いて、ＭＭ腫瘍細胞上のＢＣＭＡ発現を測定し、多発骨髄腫標的細胞の細胞傷害性を観察した。データはソフトウェアプログラムＦｌｏｗＪｏ及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６で分析した。結果を図３２Ａ〜図３２Ｅ、図３３Ａ〜図３３Ｃ、及び図３４Ａ〜図３４Ｃに示す。図３２Ａ〜図３２Ｅは、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉが、約０．４のＥ：Ｔ比（多発骨髄腫患者のコホートから決定）で有効であったことを示す。図３３Ａ〜図３３Ｃ及び図３４Ａ〜図３４Ｃは、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉに曝露されたヒトＮＫ細胞が、ＢＣＭＡ＋標的細胞を特異的に標的化し、枯渇させたことを示す。
【０４５１】
両方法による評価は、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉが広範囲の標的発現レベルにわたってインビトロで強力であったことを実証する。観察された有効性はＥ：Ｔ比と相関せず、そしてＢＣＭＡ発現と相関しなかった。加えて、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、多発骨髄腫細胞株においてダラツムマブと同様の効力を示した。図３３Ａ〜図３３Ｃを参照されたい。
【０４５２】
８．４．低ＢＣＭＡ発現腫瘍細胞に対するインビトロ細胞傷害性
ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉの低ＢＣＭＡ発現Ｒａｊｉ腫瘍細胞株に対するインビトロ細胞傷害性を、カルセイン放出アッセイ及びＦＡＣＳによって評価した。本研究では、上述のように多発骨髄腫標的細胞のインビトロ細胞傷害性を評価するために用いたカルセイン放出アッセイを使用した。新鮮に調製されたＮＫ細胞及びＲａｊｉ  Ｂｕｒｋｉｔｔ製リンパ腫瘍細胞株のＥ：Ｔ比は、約５であった。結果を図３５Ａ〜３５Ｄに示す。ＢＣＭＡ＋標的細胞のインビトロ溶解は、ＢＣＭＡ表面発現がほとんど検出できないにもかかわらず、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉ、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩＩ、及びＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩＩＩについて観察された。
【０４５３】
ＦＡＣＳアッセイについて、ヒトＮＫ細胞は、健康なヒト血液ドナーから単離された。ＮＫ細胞及びＲａｊｉ細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬの低エンドトキシンｈＩｇＧと共に、アッセイセットアップの少なくとも１時間前に別々にプレインキュベートした。ＮＫ細胞をおよそ５のＥ：Ｔ比でＲａｊｉ  Ｂｕｒｋｉｔｔ製リンパ腫瘍細胞株と共培養し、３７℃にて５％のＣＯ２でおよそ２０時間、１０〜１０００ｐＭの３倍に段階希釈した試験物に曝露した。抗体染色及びＦＡＣＳを用いて、ＲＡＪＩ標的細胞の細胞傷害性をモニタした。データはソフトウェアプログラムＦｌｏｗＪｏ及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６で分析した。結果を図３６Ａ〜図３６Ｃに示す。図３６Ｃに示されるように、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、低ＢＣＭＡ発現Ｒａｊｉ腫瘍細胞株に対してインビトロ細胞傷害性を示した。
【０４５４】
８．５．自家ＢＣＭＡ＋正常ヒト形質細胞に対するインビトロ活性
ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉの自家ＢＣＭＡ＋正常ヒト形質細胞に対するインビトロ活性を、ＦＡＣＳにより評価した。ヒトＮＫを、健常ヒト血液ドナーの末梢血から単離した。同じヒトドナー由来の骨髄を用いて、ヒト形質細胞を単離した。ＮＫ細胞、形質細胞、及びＮＣＩ−Ｈ９２９を、０．５ｍｇ／ｍＬの低エンドトキシンｈＩｇＧと共に、アッセイセットアップの少なくとも１時間前に別々にプレインキュベートした。同種異系：ＮＫ細胞をおよそ３のＥ：Ｔ比でＮＣＩ−Ｈ９２９腫瘍細胞株と共培養し、３７℃にて５％のＣＯ２でおよそ２０時間、３〜３０００ｐＭの３倍に段階希釈した試験物に曝露した。自家：ＮＫ細胞を、Ｅ：Ｔ比およそ２３でヒト形質細胞と共培養し、上記のように試験物質とインキュベートした。抗ＣＤ５６  Ｅ−４５０及びＣＤ１３８−ＡＰＣによる抗体染色と、その後のＦＡＣＳを用いて、Ｈ９２９及び形質細胞の細胞傷害性をモニタした。データはソフトウェアプログラムＦｌｏｗＪｏ及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６で分析した。
【０４５５】
結果を図３７Ａ及び図３７Ｂに示す。ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、自家ＢＣＭＡ＋正常ヒト形質細胞に対してインビトロ活性を示した。
【０４５６】
８．６．ＢＣＭＡ＋標的細胞が存在しない場合のＣＤ１６Ａの活性化の欠如
本発明者らはまた、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩがＢＣＭＡ＋標的細胞の不在下でＮＫ細胞を活性化できるかどうかを調べた。最初に、ＢＣＭＡ＋標的細胞の存在下において、ＮＫ細胞上のＣＤ１６の活性化と、ＣＤ１６レベルの維持とを試験した。ＮＫ細胞は、２人の独立した健常ヒト血液ドナーに由来した。ＮＫ細胞を、ＭＭ．１Ｓ  ＢＣＭＡ＋標的細胞と共培養し、０、０．０３、若しくは０．１ｎＭのいずれかの抗ＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａ抗体Ｉ、又はＡｂ−１（陰性対照／ＣＤ１６ａ）若しくは抗ＣＤ３８（ＤＡＲＡ陽性対照）に３７℃で２０時間曝露した。抗体染色及びＦＡＣＳを用いて、生きているＣＤ５６二量体／ＣＤ１６＋細胞及びＣＤ５６二量体／ＣＤ１６＋／ＣＤ６９＋／ＣＤ２５＋の数を、それぞれ図３４Ａ及び図３４Ｂに示すように決定した。ＢＣＭＡ＋標的細胞の枯渇を、図３４Ｃに提示する。データはソフトウェアプログラムＦｌｏｗＪｏ及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６で分析した。結果を図３８Ａ〜図３８Ｃに示す。ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、ＢＣＭＡ＋標的細胞の存在下でＮＫ細胞上のＣＤ１６レベルを活性化し、維持した。
【０４５７】
次に、ＢＣＭＡ＋標的細胞の不在下において、ＮＫ細胞上のＣＤ１６の活性化と、ＣＤ１６レベルの維持とを試験した。ＮＫ細胞は、２人の独立した健常ヒト血液ドナーに由来した。ＮＫ細胞を単独で培養し、０、０．０３、若しくは０．１ｎＭのいずれかの抗ＢＣＭＡ／ＣＤ１６ａ抗体Ｉ、又はＡｂ−１（陰性対照／ＣＤ１６ａ）若しくは抗ＣＤ３８（ＤＡＲＡ陽性対照）に３７℃で２０時間曝露した。ＣＤマーカー（ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＣＤ６９、及びＣＤ２５）並びにＦＡＣＳに対する抗体染色を用いて、生きているＣＤ５６二量体／ＣＤ１６＋細胞及びＣＤ５６二量体／ＣＤ１６＋／ＣＤ６９＋／ＣＤ２５＋の数を、それぞれ図３２Ａ及び図３２Ｂに示すように決定した。データはソフトウェアプログラムＦｌｏｗＪｏ及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６で分析した。結果を図３９Ａ〜図３９Ｃに示す。図３９Ａ〜３９Ｃに示すように、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、ＢＣＭＡ＋標的細胞の不在下で、ＮＫ細胞上のＣＤ１６レベルを活性化も減少もしなかった。ダラツムマブと比較して、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、ＮＫ細胞上のＣＤ１６＋の数及び発現の最小の減少を示し、そしてＢＣＭＡ＋標的細胞の不在下でＣＤ６９＋２５＋ＮＫ細胞の有意に低い数（例えば、約１００倍（ｎ＝２ドナー；単一実験））を示した。ＢＣＭＡ＋標的細胞の存在下において、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、ダラツムマブと同様の活性を示した。図３８Ｃを参照されたい。
【０４５８】
８．７．血清Ｉｇの存在下における活性
ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩのＮＫ細胞への結合、並びに血清又はＩｇ存在下でのＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉの細胞傷害性及びＮＫ生存を試験した。
【０４５９】
ヒトＮＫ細胞は、健康なヒト血液ドナーから単離された。ＮＫ細胞及びＮＣＩ−Ｈ９２９細胞又はＭＭ．１Ｓ細胞を、１０ｍｇ／ｍＬ血清Ｉｇ、５０％ヒト自家血清、又は１００％ヒト血清中で、アッセイセットアップ前に別々に２時間プレインキュベートした。ＮＫ細胞をおよそ５のＥ：Ｔ比でＮＣＩ−Ｈ９２９又はＭＭ．１Ｓ細胞と共培養し、３７℃にて５％のＣＯ２でおよそ２０時間、０．１〜１００ｎＭの１０倍に段階希釈した試験物に曝露した。ＣＤ１３８及びＣＤ５６による抗体染色とその後のＦＡＣＳとを用いて、ＭＭ．１Ｓ又はＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞の細胞傷害性性及びＮＫ生存をモニタした。データはソフトウェアプログラムＦｌｏｗＪｏ及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６で分析した。
【０４６０】
図４０Ａに示されるように、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、Ｉｇ又は血清の不在下と比較して、１０ｍｇ／ｍＬのＩｇ又は血清の存在下において減少した親和性によってＮＫ細胞に結合することができた。図４０Ｂに示されるように、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、Ｉｇ又は血清の不在下と比較して、血清の存在下において低下した効力でＢＣＭＡ＋標的細胞を死滅させることができた。図４０Ｃ及び図４０Ｄに示されるように、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、ＮＫ細胞の喪失なしに５０％の自家ヒト血清の存在下においてＢＣＭＡ＋標的細胞を枯渇させた。図４０Ｄ及び図４０Ｅに示すように、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩはＮＫ細胞を枯渇させなかったが、一方でダラツムマブはＮＫ細胞を枯渇させた。したがってヒトＩｇは、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩのＮＫ活性を阻害しない。
【０４６１】
ＢＣＭＡ＋標的細胞の不在下で、血清は、ＣＤ１６Ａ発現及びＮＫ細胞の活性化に影響した。図４１Ａ及び図４１Ｂを参照されたい。図４１Ａに示すように、血清は、ＣＤ１６Ａ発現を低下させた。図４１Ｂに示すように、血清は、ＮＫ細胞の非標的媒介活性を増加させた。したがって、血清存在下における低いＣＤ１６発現は、ＮＫ細胞の非ＣＤ１６Ａ媒介活性化を示唆する。
【０４６２】
８．８．サイトカイン併用療法
ダラツムマブ及びエロツズマブは、免疫調節薬（ＩＭｉＤ）及びプロテアソーム阻害薬との併用で有効である。組合せ活性のメカニズムがＮＫ細胞誘導剤に適用されることが期待される。例えば、ＩＭｉＤは、ＴＮＦ−、ＩＬ−１２、及びＩＬ−６の産生に影響を及ぼし、Ｔ細胞を刺激してＩＬ−２及びＩＦＮ−を分泌させ、ＮＫ細胞の数及び機能を間接的に亢進させる（Ｌｉｕら、「Ｊｏｕｒ．Ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ．」（２０１８年）、第１０３巻、第５号、第８２１〜８２８頁）。プロテアーゼ阻害剤はＭＨクラスＩの発現を減少させる。ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩとｉＭｉＤとの併用の理論的根拠として、以下が挙げられる：ＩＬ−１５は増殖を介してＮＫ細胞数を増加させ、抗ＴＩＧＩＴ抗体はＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞に対するチェックポイント阻害剤であり、並びに抗ＦｃＲＨ５／ＣＤ３抗体はＮＫ細胞をそれらの細胞傷害性能力のために使用して、腫瘍への更なるＴ細胞浸潤を駆動する。
【０４６３】
サイトカイン処理がＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体の活性に影響するかどうかを調べるために、ＩＬ−１５をＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉの処理に加えた。図４２Ａ及び図４２Ｂに示すように、ＩＬ−１５は、ＭＭ細胞においてＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉの活性を増加させた。ＭＭ枯渇の増加は、ＩＬ−１５の添加によりＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉで観察されたが、ダラツムマブでは観察されなかった。
【０４６４】
８．９．ダラツムマブＲ／Ｒ多発骨髄腫患者の治療のためのＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉの使用
ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体は、ダラツムマブ（「Ｄａｒａ」とも称される）とは異なる。例えば、ダラツムマブは多発骨髄腫（「ＭＭ」とも称される）において補体依存性細胞傷害活性性（ｄｅ  Ｗｅｅｒｓ，Ｍ．ら、「Ｊ．ｉｍｍｕｎ．」（２０１１年）、第１８６巻、第３号、第１８４０〜１８４８頁）、及びＣＤ３８の架橋を介したシグナル伝達によりアポトーシスを誘導する能力（Ｏｖｅｒｄｉｊｋ，Ｍ．Ｂ．ら、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（２０１６年）、第１９７巻、第３号、第８０７〜８１３頁）を有する。しかし、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、これらの活性を持たない。
【０４６５】
ダラツムマブとは異なり、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉの活性は、Ｆｃ媒介薬物の活性を低下させるＣＤ１６Ａ多型によって影響されない。図３１Ａ及び図３１Ｂを参照されたい。更に、ＣＤ３８療法（例えば、ダラツムマブ）とは異なり、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩはＮＫ細胞を枯渇させない。図４０Ａ、図４０Ｂ、図４０Ｃ、図４０Ｄ、及び４０Ｅを参照されたい。加えて、ＩＬ−１５処理はＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉの活性を増加させたが、ダラツムマブの活性は増加させなかった。図４２Ａ及び図４２Ｂを参照されたい。
【０４６６】
本明細書に開示された抗ＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａ抗体、例えばＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉの特徴を考慮すると、これらの抗ＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａ抗体、例えばＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、再発した／難治性（「Ｒ／Ｒ」）ＭＭ患者（例えば、ダラツムマブＲ／Ｒ多発骨髄腫患者）を治療するための候補である。ダラツムマブ難治性表現型は、補体阻害タンパク質のＣＤ３８下方制御及び上方制御により媒介されると考えられる（Ｎｉｊｈｏｆら、「Ｌｅｕｋｅｍｉａ」（２０１５年）第２９巻、第１０号、第２０３９〜２０４９頁；Ｎｉｊｈｏｆら、「Ｂｌｏｏｄ」（２０１６年）第１２８巻、第７号、第９５９〜９７０頁）。このようなＣＤ３８発現の消失はまた、ＮＫ細胞の兄弟殺しと同様に、ダラツムマブ抵抗に寄与する。本明細書に開示された抗ＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａ抗体の作用メカニズムは、そのような抗ＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａ抗体が、ダラツムマブＲ／Ｒ多発骨髄腫患者を治療するために使用され得ることを示す。
【０４６７】
ダラツムマブ難治性患者は、末梢血中のＮＫレベルが低い（Ｃａｓｎｅｕｆら、「Ｂｌｏｏｄ  Ａｄｖ．」（２０１７年）、第２４巻、第１号（２３）、第２１０５〜２１１４頁）。Ｓｔｅｗａｒｄら、「Ｂｌｏｏｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．」（２０１９年）第９巻、第２号、第１７頁には、Ｒ／Ｒ  ＭＭを治療するためのモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）に複合した抗ＦｃＲＨ５抗体−薬物である、ＤＦＲＦ４５３９Ａの第１相試験が開示されている。ＤＦＲＦ４５３９Ａの第Ｉ相試験におけるＤａｒａナイーブＭＭ患者、Ｄａｒａ難治性ＭＭ患者、及びＲ／Ｒ  ＭＭ患者の末梢血中におけるＮＫ細胞数を比較した結果を、図４３に示す。
【０４６８】
ＤＦＲＦ４５３９Ａの第Ｉ相試験におけるＲ／Ｒ  ＭＭ患者の骨髄中のＮＫ／腫瘍Ｅ：Ｔ比を、図４４に示す。図４５Ａ及び図４５Ｂに示されるＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉのインビトロ細胞株殺傷データは、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉが、ＤＦＲＦ４５３９Ａ第Ｉ相集団において見出されるＥ：Ｔ比において有効であることを示す。
【０４６９】
８．１０．新鮮なＮＫ細胞は細胞傷害性に影響する
新鮮ＮＫ細胞に対するＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉ及びＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩＩの細胞傷害性を、２日目のＮＫ細胞と比較した。新鮮なＮＫ細胞は、同じ日に新鮮に単離したＰＢＭＣから精製したＮＫ細胞であった。第２（２日目）のＮＫ細胞は、１日目に単離され、ＲＰＭＩ培地中で一晩培養されたＰＢＭＣから精製されたＮＫ細胞であった。結果を図４６Ａ、図４６Ｂ、図４６Ｃ、及び図４６Ｄに示す。図４６Ａ、図４６Ｂ、図４６Ｃ、及び図４６Ｄに示されるように、新鮮なＮＫ細胞は、２日目のＮＫ細胞よりも高い細胞傷害性を示した。
【０４７０】
実施例９−多発骨髄腫の治療のためのＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ結合抗体の使用
多発骨髄腫（「ＭＭ」）は、形質細胞の悪性腫瘍である。欧米では毎年約５６，０００人が新たにＭＭである診断されている。全生存率は改善しているが、利用可能な治療法に対して再発／難治性のもの、及び高リスクの第１選択（「１Ｌ」）疾患を示すものなど、満たされていない領域が残っている。以下の３つの治療クラスがＭＭ療法を変革し、現在の標準治療（「ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  ｃａｒｅ：ＳＯＣ」）のバックボーンを形成してる：（１）免疫調節剤（ＩＭｉＤｓ、例えばレナリドミド）−抗増殖作用、適応免疫系及び自然免疫系の増強を含む複数の潜在的なＭＯＡ）、（２）プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、並びに（３）ダラツムマブ（抗ＣＤ３８抗体であり、ＣＤ３８の架橋によってＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及びアポトーシスが誘発される）。
【０４７１】
ＮＫ細胞は免疫療法に広く用いられている。活性化受容体シグナルと阻害受容体シグナルとのバランスは、ＮＫ細胞の活性化を細胞傷害性を調節し、例えば、正常な健常組織では阻害シグナルが支配的である。ＮＫ細胞は、例えば、ダラツムマブ及びエロツズマブ（抗ＳＬＡＭＦ７抗体）のような、多発骨髄腫でのＦｃが媒介するがん治療法で重要なエフェクタである。ＮＫ細胞活性化及び腫瘍殺傷は、以下の作用メカニズム（「ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ：ＭＯＡ」）を介して起こり得る：（ａ）腫瘍細胞上のＭＨＣクラスＩの損失（例えば、Ｔ細胞応答を避けるため）；（ｂ）活性化ＮＫ細胞受容体（ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、及びＤＮＡＭ−１）をリガッティングする損傷細胞によるストレスリガンドの過剰発現、及び（ｃ）活性化受容体ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）にそれらのＦｃ領域を介して結合する、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）特異的な治療用抗体によるＮＫ細胞の活性化。ＮＫ細胞誘導剤はＭＯＡ（ｃ）に似ているが、本明細書に記載するように、ダラツムマブのＭＯＡとは異なるＭＯＡを使用する。従来のＦｃ−ＣＤ１６Ａ相互作用を介してＮＫ細胞を動員しない本開示のＮＫ誘導剤は、ＳＯＣと組み合わせて、ＭＭ患者、特に第２選択（「２Ｌ」）患者を治療する可能性を持つ。更に、２Ｌ及び第３選択（「３Ｌ」）の患者の大集団は再発時にダラツムマブ難治性となると予想されるが、本明細書に開示されているＮＫ細胞誘導剤、例えばＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉ及びＩＩＩに反応する（ＭＯＡの違いに起因）と予想される。
【０４７２】
現在開示されているＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質（例えば、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉ及びＩＩＩ）は、ＣＤ１６Ａに結合するＮＫ細胞誘導剤である。ＣＤ１６Ａは、ＮＫ細胞及びマクロファージの約９５％に構成的に発現し、そしてＮＫ細胞活性化受容体である。
【０４７３】
ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩは、Ｂ細胞成熟抗原（Ｂ−ｃｅｌｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＢＣＭＡ）に結合する。本明細書において議論されるように、ＢＣＭＡは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリのメンバーであり、形質細胞の長期細胞生存において役割を果たす（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ、「ＪＥＭ」（２００４年）第１９９巻、第１号、第９１〜９８頁）。ＢＣＭＡは正常形質細胞で発現し、多発骨髄腫において上方制御され、高い有病率である。ＢＣＭＡは、ＢＣＭＡ標的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法及びＢＣＭＡ抗体薬物複合体（ＡＤＣ）療法を含む、Ｒ／Ｒ多発骨髄腫免疫療法に対する、良く検証された標的である。
【０４７４】
凍結原発性骨髄腫骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）におけるＢＣＭＡ、ＣＤ３８、及びＦｃＲＨ５の発現レベルを測定した。結果を図４７に示す。図４７に示す通り、２０人のドナー及び対照（骨髄腫細胞株ＭＯＬＰ−２）由来の凍結原発性骨髄腫骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）について、ＦｃＲＨ５、ＢＣＭＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  １９Ｆ２）、ＣＤ３８細胞表面発現を評価した。簡単に言えば、ＢＭＭＣを解凍し、滅菌ＰＢＳで洗浄し、次いで１×１０＾６細胞／ｍＬの最終濃度まで再懸濁した。ＢＭＭＣを、生存率及び骨髄腫マーカー（ＣＤ４５、ＣＤ３１９、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＦｃＲＨ５）で染色した。細胞を固定し、洗浄した後、この細胞をＣａｎｔｏ  ＩＩ上で読み取った。ＦｃＲＨ５、ＢＣＭＡ、及びＣＤ３８の分析を、Ｌｉｖｅ／Ｓｉｎｇｌｅｔｓ／ＣＤ４５−／ＣＤ３１９＋細胞（骨髄腫細胞）を選択してＦｌｏｗＪｏで行った。ＦｃＲＨ５、ＢＣＭＡ、及びＣＤ３８のＭＥＳＦ（Ｌｏｇ１０）値を統計プロットソフトウェアＰｒｉｓｍでプロットした。
【０４７５】
図４８Ａ及び図４８Ｂに示されるように、ＢＣＭＡは、正常なヒト形質細胞において発現し（図４８Ａ）、ＭＭにおいて上方調節され、高い優先度で見出される（図４８Ｂ）。図４８Ｂに示された実験に使用した原発性ＭＭ細胞は、図４７について上述したプロトコルに従って染色及びゲーティングされた凍結原発性骨髄腫ＢＭＭＣであり、その後、最大の％をＦｌｏｗＪｏにプロットした。図４８Ｂ中の灰色の斜線のピークはＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｎｕｓ  Ｏｎｅ（ＦＭＯ）対照であり、もう一方のピークはＢＣＭＡ発現である。ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉは、試験した抗ＢＣＭＡ抗体と同様の結果を示した。
【０４７６】
ＢＣＭＡ標的化ＣＡＲ−Ｔ細胞療法及びＣＤ３／ＢＣＭＡ二重特異性抗体は、印象的な抗ＭＭ活性を示しているが、これらはサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の有意な例とも関連している。現在開示されている、ＮＫ誘導剤であるＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質（例えば、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉ）のＭＯＡは、このようなＣＲＳ関連療法からの分化を可能にする。例えば、好ましい安全性プロファイル及びＣＲＳの欠如は、現在開示されているＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質（例えば、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉ）が、ＭＭにおけるＳＯＣ又は他の免疫療法のいずれかと組み合わされることを可能にする（例えば、本明細書に示されるようなサイトカイン（例えば、ＩＬ−１５及びＩＬ−１２）（例えば、図４２Ａ及び図４２Ｂを参照のこと）。本明細書に開示されるＮＫ細胞ベースのアプローチはまた、Ｔ細胞療法及びチェックポイント阻害剤療法（例えば、ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＰＤ−１抗体（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ）、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ）、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ）、ＦｃＲＨ５／ＣＤ３二重特異性抗体等）と相乗作用することができる。
【０４７７】
以上のことから、多発骨髄腫の治療に使用するＮＫ細胞誘導剤を選択するために、以下の基準のうちの１つ以上が使用される：
・  ＮＫ細胞誘導剤は、２つの標的：ＮＫ細胞上のＣＤ１６Ａ及び多発骨髄腫細胞上のＢＣＭＡに結合することができる、
・  ＮＫ細胞誘導剤は、ＣＤ１６Ａに対して少なくとも二価であり、例えば、少なくとも２つのＣＤ１６Ａ抗原結合部分を含む、
・  ＮＫ細胞誘導剤は、ＣＤ１６Ｂと交差反応しないＮＫ細胞二重特異性抗体であり、非ヒト霊長類由来のＣＤ１６Ａと交差反応することができ、
・  ＮＫ細胞誘導剤は、強力かつ一般的であり、ＢＣＭＡ＋腫瘍細胞及び原発性骨髄腫を標的依存的にインビトロで殺傷する（例えば、約６０％以上の細胞がＥＣ５０≦５ｎＭで死滅）作用を有し、
・  ＮＫ細胞誘導剤は、ＮＫ細胞を有意に殺傷せず、例えば、ＮＫ細胞の兄弟殺しを減少又は回避する、
・  ＮＫ細胞誘導剤は、例えば、他のＴ細胞誘導剤よりも優れたインビトロサイトカイン放出プロファイル（例えば、ＮＫ細誘導剤はＣＲＳを欠く）を有し、有害事象はモニタ可能、管理可能、かつ可逆的である、
・  ＮＫ細胞誘導剤は、多発骨髄腫対象に静脈内投与することができる、そして、
・  ＮＫ細胞誘導剤は、週１回（ＱＷ）以下の頻度で投与される必要がある。
【０４７８】
即時に記述された選択戦略に関連して、以下の薬力学（ＰＤ）バイオマーカーを用いることができる：血清Ｍタンパク質と遊離軽鎖（ＦＬＣ）、モノクローナル形質細胞の減少、治療後骨髄試料におけるＮＫ細胞活性化と動員、及び末梢ＮＫ細胞活性化。直ちに記述される選択戦略は診断を含むことができるが、多発骨髄腫におけるＢＭＣＡの高い有病率に基づいて、診断は必ずしも必要ではない。
【０４７９】
ある種のＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗原結合タンパク質（例えば、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉ及びＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩＩＩ）は、上記の基準を満たす。
【０４８０】
要約すると、現在開示されているＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗原結合タンパク質（例えば、ＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体Ｉ及びＣＤ１６Ａ／ＢＣＭＡ抗体ＩＩＩ）を、多発骨髄腫を治療するために使用して、好ましい安全性プロファイルを有する持続的寛解を達成することができる。
【０４８１】
上述の本明細書で開示された主題を、理解を明確にする目的で、説明及び実施例によってある程度詳細に記載してきたが、その記載及び実施例は、本明細書で開示された主題の範囲を限定するものと解釈すべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、その全体が参考として明示的に組み込まれる。
【０４８２】
配列概要：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１７Ｈ】
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【図１７Ｉ】
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【図１７Ｊ】
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【図１７Ｋ】
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【図１７Ｌ】
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【図１７Ｍ】
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【図１７Ｎ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図２９Ｅ】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３２Ｅ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図４０Ｅ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４６Ｄ】
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【図４７】
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【図４８Ａ】
2021521275.tif 000147
【図４８Ｂ】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図４９Ｃ】
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【図４９Ｄ】
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【図４９Ｅ】
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【図４９Ｆ】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５２Ｃ】
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【図５２Ｄ】
2021521275.tif 000160
【図５３Ａ−１】
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【図５３Ａ−２】
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【図５３Ｂ】
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【図５３Ｃ−１】
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【図５３Ｃ−２】
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【図５３Ｄ】
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【配列表】
2021521275000001.app
【国際調査報告】
2021521275.tif 000167
2021521275.tif 000168
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2021521275.tif 000175