(57)【要約】【課題】ＣＤＲの生殖細胞系列化および開発クオリティの最適化は複雑で多因子的な課題である。【解決手段】  本明細書において、プログラム細胞死１（ＰＤ１）に特異的に結合する抗体分子、ならびにその関連する核酸分子、ベクターおよび宿主細胞が提供される。さらに本明細書において、当該抗体分子の医療用途が提供される。【選択図】図１
2021515542.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分であって、当該抗体は、重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域を含有し、
（ａ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｂ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＶＹＹＦＤＹ（配列番号４４）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｃ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＦＦＤＹ（配列番号４５）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｄ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＡＦＤＹ（配列番号４６）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｅ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＴＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号４８）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＩＰＷＴ（配列番号４７）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｆ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＡＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号４９）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＤ（配列番号５０）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｇ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＴＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号４８）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＩＰＷＴ（配列番号４７）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｈ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＡＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号４９）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＤ（配列番号５０）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｉ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＮＴＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号５１）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＴＷＬＮ（配列番号５２）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＡＳ（配列番号５３）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｊ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＶＹＹＦＤＹ（配列番号４４）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＨＳ（配列番号５４）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、または
（ｋ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＶＹＹＦＤＹ（配列番号４４）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含む、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
（ａ）前記ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号１を含み、かつ、前記ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号２を含み、
（ｂ）前記ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号３を含み、かつ、前記ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号４を含み、
（ｃ）前記ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号５を含み、かつ、前記ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号６を含み、
（ｄ）前記ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号７を含み、かつ、前記ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号８を含み、
（ｅ）前記ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号９を含み、かつ、前記ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号１０を含み、または
（ｆ）前記ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号１１を含み、かつ、前記ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号１２を含む、請求項１記載の抗体またその抗原結合部分。
【請求項３】
抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分であって、当該抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含有する重鎖可変（ＶＨ）領域、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含有する軽鎖可変（ＶＬ）領域を含有し、
（ａ）ＨＣＤＲ１は、アミノ酸配列Ｇ−Ｆ−Ｔ−Ｆ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｘ１−Ｍ−Ｓを含み、式中、Ｘ１はＬまたは任意の他のアミノ酸であり（配列番号２６）、
（ｂ）ＨＣＤＲ２は、アミノ酸配列Ｘ１−Ａ−Ｘ２−Ｉ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｙ−Ｙ−Ｘ６−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇを含み、式中、Ｘ１はＶ、またはＶの保存的置換であり、Ｘ２はＴまたはＮであり、Ｘ３はＡまたはＳであり、Ｘ４はＥまたはＮであり、Ｘ５はＴまたはＫであり、またＸ６はＰまたはＶであり（配列番号２７）、
（ｃ）ＨＣＤＲ３は、アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｄ−Ｙを含み、式中、Ｘ１はＱまたは任意の他のアミノ酸（例えば、Ｔ、Ｌ、ＭまたはＮ）であり、Ｘ２はＬまたは任意の他のアミノ酸（例えば、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、ＳまたはＶ）であり、Ｘ３はＹ、またはＹの保存的置換（例えば、Ｈ）であり、Ｘ４はＹまたは任意の他のアミノ酸（例えば、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｍ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、ＳまたはＷ）であり、またＸ５はＦまたは任意の他のアミノ酸（例えば、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、ＳまたはＷ）であり（配列番号２８）、
（ｄ）ＬＣＤＲ１は、アミノ酸配列Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−Ｉ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５を含み、式中、Ｘ１はＳまたはＳの保存的置換であり、Ｘ２はＳまたはＳの保存的置換であり、Ｘ３はＹまたはＹの保存的置換であり、Ｘ４はＬまたはＬの保存的置換であり、またＸ５はＮもしくはＴまたはＮもしくはＴの保存的置換であり（配列番号３２）、
（ｅ）ＬＣＤＲ２は、アミノ酸配列Ｘ１−Ａ−Ｘ２−Ｓ−Ｌ−Ｘ３−Ｘ４を含み、式中、Ｘ１はＡもしくはＴ、またはＡもしくはＴの保存的置換であり、Ｘ２はＳまたはＳの保存的置換であり、Ｘ３はＱまたは任意の他のアミノ酸であり、またＸ４はＳまたは任意の他のアミノ酸であり（配列番号３３）、ならびに
（ｆ）ＬＣＤＲ３は、アミノ酸配列Ｑ−Ｑ−Ｘ１−Ｙ−Ｓ−Ｘ２−Ｐ−Ｘ３−Ｔを含み、式中、Ｘ１はＳまたは任意の他のアミノ酸であり、Ｘ２はＴまたは任意の他のアミノ酸であり、またＸ３はＷまたは任意の他のアミノ酸である（配列番号３４）、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４】
抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分であって、当該抗体または抗原結合部分は、ＰＤ１への結合を、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合部分と交差競合し、ならびに
（ａ）完全生殖細胞系列ヒトフレームワークアミノ酸配列を含有し、
（ｂ）ヒトＰＤ１およびカニクイザルＰＤ１に対して特異的に結合し、
（ｃ）２６０ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０で、ヒトＰＤ１のヒトＰＤ−Ｌ１への結合を拮抗し、
（ｄ）３２ｎＭ未満のＫＤで、単量体カニクイザルＰＤ１に結合し、
（ｅ）６．５ｎＭ未満のＥＣ５０で、カニクイザルＰＤ１発現細胞に結合し、
（ｆ）カニクイザルＰＤ１およびヒトＰＤ１における機能的に同一のエピトープに結合し、
（ｇ）ＬＣＤＲ２中に高いＭＨＣクラスＩＩ結合アフィニティをもつヒト生殖細胞系列ペプチド配列を含有し、
（ｈ）抗体Ｍａｂ００５の可変ドメイン配列を含有する抗ＰＤ１抗体と比較して、少ない数の免疫原性ペプチドを含有し、
（ｉ）抗体Ｍａｂ００５の可変ドメイン配列を含有する抗ＰＤ１抗体と比較して、低い免疫原性を示し、
（ｊ）脱免疫化ＶＬ領域を含有し、
（ｋ）ＫＤＲ、ＦＺＤ５、ＵＬＢＰ２およびＥＰＨＢ６のうちの１または複数に対する結合を示さず、
（ｌ）ＫＤＲ、ＦＺＤ５、ＵＬＢＰ２およびＥＰＨＢ６のうちの１または複数を、無効にしないまたは最小限で無効にする、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５】
前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項６】
前記ＶＨ領域、前記ＶＬ領域、または前記ＶＨ領域と前記ＶＬ領域との両方は、１つまたは複数のヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列を含有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項７】
前記ＶＨ領域、前記ＶＬ領域、または前記ＶＨ領域と前記ＶＬ領域との両方は、前記ＣＤＲが挿入されたヒト可変領域フレームワークスキャホールドのアミノ酸配列を含有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項８】
前記ＶＨ領域は、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が挿入されたＩＧＨＶ３−７ヒト生殖細胞系列スキャホールドのアミノ酸配列を含有する、請求項１または３に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項９】
前記ＶＬ領域は、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が挿入されたＩＧＫＶ１−３９ヒト生殖細胞系列スキャホールドのアミノ酸配列を含有する、請求項１、３および８のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項１０】
前記抗体は、免疫グロブリン定常領域を含有する、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項１１】
前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＹである、請求項１０記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項１２】
前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２である、請求項１１記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項１３】
前記免疫グロブリン定常領域は、免疫学的に不活性である、請求項１０記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項１４】
前記免疫グロブリン定常領域は、野生型ヒトＩｇＧ４定常領域、Ｓ２２８Ｐのアミノ酸置換を含有するヒトＩｇＧ４定常領域、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａのアミノ酸置換を含有するヒトＩｇＧ１定常領域、または野生型ヒトＩｇＧ２定常領域である、請求項１０記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項１５】
前記免疫グロブリン定常領域は、配列番号１３〜１９のいずれか１つを含有する、請求項１３記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項１６】
前記抗体または抗原結合部分は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ、またはｂｉｓ−ｓｃＦｖである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗原結合部分。
【請求項１７】
前記抗体は、モノクローナルである、請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項１８】
前記抗体は、四量体抗体、四価抗体、または多特異性抗体である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項１９】
前記抗体は、第一の抗原および第二の抗原に特異的に結合する二特異性抗体であり、前記第一の抗原はＰＤ１であり、前記第二の抗原はＰＤ１ではない、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項２０】
前記抗体または抗原結合部分は、（ａ）ヒトＰＤ１に特異的に結合する、または（ｂ）ヒトＰＤ１およびカニクイザルＰＤ１に特異的に結合する、請求項１から１９のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項２１】
前記抗体または抗原結合部分は、ＩｇＧ１形式であり、前記抗原結合部分は、約９０℃から約９３℃の溶融温度（Ｔｍ）である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項２２】
前記抗体または抗原結合部分は、ヒト化抗体Ｍａｂ００５の可変ドメイン配列を含有する抗ＰＤ１抗体と比較して、露出アミノ酸残基の酸化が減少する、請求項１から２１のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合部分。
【請求項２３】
治療剤に結合された請求項１から２２のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合部分を含有する免疫結合体。
【請求項２４】
前記治療剤が、細胞毒素、放射性同位体、化学療法剤、免疫調節剤、抗血管新生剤、抗増殖剤、アポトーシス促進剤、細胞増殖抑制酵素、細胞溶解性酵素、治療用核酸、抗血管新生剤、抗増殖剤、またはアポトーシス促進剤である、請求項２３記載の免疫結合体。
【請求項２５】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合部分、または請求項２３もしくは２４に記載の免疫結合体、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含有する、医薬組成物。
【請求項２６】
核酸分子であって、請求項１から２２のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合部分の
（ａ）ＶＨ領域のアミノ酸配列、
（ｂ）ＶＬ領域のアミノ酸配列、または
（ｃ）ＶＨ領域およびＶＬ領域の両方のアミノ酸配列、をコードする核酸分子。
【請求項２７】
請求項２６に記載の核酸分子を含有する発現ベクター。
【請求項２８】
請求項２６に記載の核酸分子、または請求項２７に記載の発現ベクターを含有する組換え宿主細胞。
【請求項２９】
抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分を作製する方法であって、
核酸分子が発現される条件下で、請求項２７に記載の発現ベクターを含有する組換え宿主細胞を培養し、それにより抗体または抗原結合部分を作製すること、および
当該宿主細胞または培養物から、前記抗体または抗原結合部分を単離すること、を含む、方法。
【請求項３０】
対象において、免疫反応を強化する方法であって、請求項１から２２のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合部分の、請求項２３もしくは２４に記載の免疫結合体の、または請求項２５に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３１】
対象において、癌、感染症もしくは免疫性疾患を治療または予防する方法であって、請求項１から２２のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合部分の、請求項２３もしくは２４に記載の免疫結合体の、または請求項２５に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３２】
前記癌が、膵臓癌、メラノーマ、乳癌、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳腫瘍または中枢神経系の癌、末梢神経系の癌、食道癌、子宮頸癌、子宮癌または子宮内膜癌、口腔または咽頭の癌、肝癌、腎癌、精巣癌、胆管癌、小腸癌または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、または血液組織の癌である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記感染症が、ウイルス性、細菌性、真菌性、または寄生虫性である、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
前記感染症が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症である、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体分子、前記抗原結合部分、前記免疫結合体、または前記医薬組成物を投与することは、前記対象において、血管腫を誘発しないか、または最小限の血管腫を誘発する、請求項３０から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
癌、感染症、または免疫性疾患の治療における使用のための、請求項１から２２のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合部分、請求項２３もしくは２４に記載の免疫結合体、または請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記癌が、膵臓癌、メラノーマ、乳癌、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳腫瘍または中枢神経系の癌、末梢神経系の癌、食道癌、子宮頸癌、子宮癌または子宮内膜癌、口腔または咽頭の癌、肝癌、腎癌、精巣癌、胆管癌、小腸癌または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、または血液組織の癌である、請求項３６に記載の使用のための抗体もしくは抗原結合部分、免疫結合体、または医薬組成物。
【請求項３８】
前記感染症が、ウイルス性、細菌性、真菌性、または寄生虫性である、請求項３６に記載の使用のための抗体もしくは抗原結合部分、免疫結合体、または医薬組成物。
【請求項３９】
前記感染症が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症である、請求項３６に記載の使用のための抗体もしくは抗原結合部分、免疫結合体、または医薬組成物。
【請求項４０】
癌、感染症、または免疫疾患の治療における抗体もしくは抗原結合部分、免疫結合体または医薬組成物の使用は、血管腫を誘発しない、または最小限の血管腫を誘発する、請求項３６に記載の使用のための抗体もしくは抗原結合部分、免疫結合体、または医薬組成物。
【請求項４１】
医薬品としての使用のための、請求項１から２２のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合部分、請求項２３もしくは２４に記載の免疫結合体、または請求項２５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月２９日に出願された英国特許出願第１８１７６５２．９号明細書、２０１８年１０月８日に出願された英国特許出願第１８１６３７２．５号明細書、２０１８年７月１０日に出願された英国特許出願第１８１１３０２．７号明細書、２０１８年５月１日に出願された英国特許出願第１８０７１７６．１号明細書、および２０１８年３月８日に出願された英国特許出願第１８０３７４５．７号明細書の利益を主張するものであり、それら各開示内容は、その全体で参照により本明細書に援用される。
【０００２】
電子的に提出されるテキストファイルに関する説明
本明細書とともに電子的に提出される以下のテキストファイルの内容は、その全体で参照により本明細書に援用される：コンピューター読み取り可能な形式の配列表のコピー（ファイルの名称：ＵＨＥＬ＿００１＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、データ記録日：２０１９年３月７日、ファイルサイズは１１３，１３９バイト）。
【０００３】
本発明は、ＰＤ１（プログラム細胞死１、ＰＤＣＤ１、ＣＤ２７９、ＰＤ−１、ＳＬＥＢ２、ＰＤ−ｌ、ＳＬＥ１としても知られる）に特異的に結合する抗体分子およびその医療用途に関する。
【背景技術】
【０００４】
ＰＤ１は免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである細胞表面受容体であり、主にＴ細胞上で発現するが、プロＢ細胞上でも観察される、細胞表面受容体である。ＰＤ１は２つの公知のリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を結合する。これらリガンドとＴ細胞上のＰＤ１との相互作用により、Ｔ細胞炎症活性が下方制御されるが、これが免疫自己寛容を促進する。したがって、ＰＤ１は免疫「チェックポイント」であると説明されている。このチェックポイント活性は、自己抗原に反応するリンパ節常在性Ｔ細胞においてアポトーシス（プログラム細胞死）を促進することによって、自己免疫リスクを最小化することが実証されている。重要なことには、ＰＤ１ライゲーションもまた、制御性（抗炎症性）Ｔ細胞の生存を促進する。
【０００５】
非病的状態におけるＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１（２）結合の役割は、自己寛容に重要であるが、それはまた、それによって腫瘍細胞が免疫監視の間に「外来性」として特定されることを免れる重要な機序でもある。実際にＰＤ−Ｌ１は、数種の癌において高度に発現されることが示されている。したがってＰＤ１を標的とし、またその機能に拮抗するモノクローナル抗体は、高ＰＤ−Ｌ１発現を伴うおよび／または高レベルの変異が現れる、悪性細胞に対する免疫反応を後押しすることによって、癌治療の際に有意な潜在的価値があるものとなり得る。数多くの前臨床のエビデンスおよびより最近の臨床のエビデンスが、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１（２）結合を遮断することが、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を促進して、また血液悪性腫瘍および固形悪性腫瘍の両方の成長を阻害することが可能であるということを示唆する。ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１活性はまた、例えばＨＩＶ等である慢性疾患で誘導され得るため、抗ＰＤ１アンタゴニスト抗体もまた、感染症環境において治癒的価値を有し得る。ゆえに、アンタゴニスト性の抗ＰＤ１  ｍＡｂは、癌、免疫疾患および感染症の環境において免疫治療剤として作用し、現在確立されている治療法の有効性を増幅させる可能性を有している。
【０００６】
現在承認されている抗体治療剤の大部分は、免疫化されたげっ歯類に由来する。そうした抗体の多くが、マウスＣＤＲのヒトｖ−遺伝子フレームワーク配列への「移植」を介した、「ヒト化」として知られるプロセスを経ている（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ９：７６７−７７４を参照のこと）。このプロセスは多くの場合、不正確であり、得られた抗体の標的結合アフィニティの低下が生じる。元の抗体の結合アフィニティに戻すために、通常、移植されたｖ−ドメインの可変ドメインフレームワーク中の重要な位置にマウス残基が導入される（「復帰突然変異（ｂａｃｋ−ｍｕｔａｔｉｏｎ）」としても知られる）。
【０００７】
ＣＤＲ移植および復帰突然変異によりヒト化された抗体は臨床において、完全マウスｖ−ドメインによるものと比較して低い免疫反応率を誘導することが示されているが、この基礎的な移植法を使用してヒト化された抗体は、物理的に不安定である可能性があり、移植ＣＤＲループ内に免疫原性モチーフがいまだ保存されていることから、いまだ重大な臨床開発リスクを負っている。タンパク質の免疫原性に関する動物実験は、ヒトでの免疫反応の予測とはならないことが多く、治療用途の抗体操作は、予測されるヒトＴ細胞エピトープ含量、非ヒト生殖細胞系列アミノ酸含量、および精製タンパク質が凝集してしまう可能性を最小化することに焦点が置かれている。
【０００８】
ゆえに理想的なヒト化アゴニスト性抗ＰＤ１抗体は、ｖ−ドメイン中に、詳細に特徴解析されたヒト生殖細胞系列配列のフレームワークとＣＤＲの両方に存在する残基と同一の残基を可能な限り多く有している抗体である。Ｔｏｗｎｓｅｎｄら（２０１５；ＰＮＡＳ  １１２：１５３５４−１５３５９）は、抗体の作製方法を記載しており、当該方法においてラット抗体、ウサギ抗体およびマウス抗体に由来するＣＤＲは、好ましいヒトフレームワーク内に移植され、次いで「拡張バイナリー置換（ａｕｇｍｅｎｔｅｄ  ｂｉｎａｒｙ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」と呼ばれるヒト生殖細胞系列化（ｈｕｍａｎ  ｇｅｒｍ−ｌｉｎｉｎｇ）方法が行われる。この方法は、元の抗体のパラトープにおいては基礎的な柔軟性を示したが、研究者らが正確性の高い抗体−抗原の共結晶構造データを有している場合であっても、任意の所与の抗体のＣＤＲループ中のどの個々の残基がどの組み合わせでヒト生殖細胞系列に転換され得るかを確実に予測することは未だ不可能である。さらにＴｏｗｎｓｅｎｄらの研究では、ヒト生殖細胞系列中に存在する残基を超えた、開発リスクモチーフの除去が有益となる可能性がある位置に突然変異誘導を加えることには対処していない。これは技術の限界であり、この限界によってプロセスが本質的に非効率的となり、開始抗体配列を改変する余剰な段階が必要となる。さらに現時点では、個々のｖ−ドメインのタンパク質配列で離れた位置にある改変のいずれが、リスクモチーフを排除しながら、抗原結合のアフィニティと特異性の維持を促進し得るのかは、たとえパートナーｖ−ドメイン上であったとしても正確に予測することはできない。
【０００９】
このようにＣＤＲの生殖細胞系列化および開発クオリティの最適化は複雑で多因子的な課題であるため、本例においては以下をはじめとする複合的な分子の機能特性が維持されるまたは改善されることが好ましい：標的結合特異性、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達アンタゴニズム、高い正確性の前臨床安全性試験を容易にするできる限り類似する必要があるヒトおよび実験動物種（例えばカニクイザルとして知られるｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ、すなわちＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の両方に由来するＰＤ１に対するアフィニティ、ｖ−ドメインの生物物理的安定性、ならびに／または製造目的に最適である必要があるＩｇＧ発現収率。抗体操作実験から、重要なＣＤＲ中のたった１つの残基位置での突然変異であっても、これら望ましい分子特性のすべてに対し劇的な負の影響を与え得ることが示されている。
【００１０】
国際公開第２０１５／０８５８４７Ａ１号は、「ＭＡｂ００５」と名づけられたアンタゴニスト性マウス抗ＰＤ１  ＩｇＧ分子、ならびにＭＡｂ００５のヒト化型の調製を記載している。そのＭＡｂ００５のヒト化型は、古典的なヒト化技術、すなわちＫａｂａｔ規定のマウスＣＤＲをヒトの重鎖および軽鎖のフレームワーク配列に移植することにより作製されており、ヒトフレームワーク残基の一部は、対応する位置のＭＡｂ００５マウス残基に復帰突然変異されている可能性がある。上述の理由によって、国際公開第２０１５／０８５８４７Ａ１号に記載されるＭＡｂ００５のヒト化型は理想的ではない。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、多くの抗ＰＤ１抗体、およびその医療用途を提供する。
【００１２】
本発明の１つの態様によると、ヒトＰＤ１に、および任意でカニクイザルＰＤ１にも特異的に結合する抗体分子、またはその抗原結合部分が提供され、当該抗体分子または抗原結合部分は、
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ１：Ｇ−Ｆ−Ｔ−Ｆ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｌまたは任意のアミノ酸（例えば、Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ）−Ｍ−Ｓ（配列番号２６）と、
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ２：ＶまたはＶ−Ａ−Ｔ／Ｎ−Ｉ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ／Ｓ−Ｅ／Ｎ−Ｔ／Ｋ−Ｙ−Ｙ−Ｐ／Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇの保存的置換（配列番号２７）と、
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ３：Ｑまたは任意のアミノ酸（例えば、Ｔ／Ｌ／Ｍ／Ｎ）−Ｌまたは任意のアミノ酸（例えば、Ｇ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｖ）−ＹまたはＹの保存的置換（例えば、Ｈ）−Ｙまたは任意のアミノ酸（例えば、Ａ／Ｄ／Ｆ／Ｇ／Ｍ−Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｓ／Ｗ）−Ｆまたは任意のアミノ酸（例えば、Ａ／Ｄ／ＥＩ／Ｋ／Ｍ／Ｓ／Ｗ）−Ｄ−Ｙ（配列番号２８）と、を伴う重鎖可変領域を含む。
【００１３】
本発明の態様において、抗体分子もしくは抗原結合部分のＨＣＤＲ１は、配列ＧＦＴＦＳＳＹＭＭＳ（配列番号２９、国際公開第２０１５／０８５８４７Ａ１号、米国特許出願公開第２０１６／３７６３６７Ａ１号に開示されるＭＡｂ００５マウス／ヒト化抗体のＨＣＤＲ１）、ＴＩＳＧＧＧＡＮＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号３０、国際公開第２０１５／０８５８４７Ａ１号、米国特許出願公開第２０１６／３７６３６７Ａ１号に開示されるＭＡｂ００５マウス／ヒト化抗体のＨＣＤＲ２）を除外してもよく、および／または抗体分子もしくは抗原結合部分のＨＣＤＲ３は、配列ＱＬＹＹＦＤＹ（配列番号３１、国際公開第２０１５／０８５８４７Ａ１号、米国特許出願公開第２０１６／３７６３６７Ａ１号に開示されるＭＡｂ００５マウス／ヒト化抗体のＨＣＤＲ３）を除外してもよい。
【００１４】
抗体分子または抗原結合部分は、
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＬＣＤＲ１：Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−Ｉ−Ｓ、またはＳ−Ｓの保存的置換、またはＳ−Ｙの保存的置換、またはＹ−Ｌの保存的置換、またはＬ−Ｎ／Ｔの保存的置換、またはＮもしくはＴの保存的置換（配列番号３２）と、
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＬＣＤＲ２：Ａ／Ｔ、またはＡもしくはＴ−Ａ−Ｓの保存的置換、またはＳ−Ｓ−Ｌ−Ｑの保存的置換または任意のアミノ酸（例えば、Ａ／Ｈ）−Ｓまたは任意のアミノ酸（例えば、Ｄ、Ｙ）（配列番号３３）と、
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＬＣＤＲ３：Ｑ−Ｑ−Ｓまたは任意のアミノ酸（例えば、Ｖ）−Ｙ−Ｓ−Ｔまたは任意のアミノ酸（例えば、Ｉ）−Ｐ−Ｗまたは任意のアミノ酸（例えば、Ｌ）−Ｔ（配列番号３４）と、を伴う軽鎖可変領域をさらに含んでもよい。
【００１５】
本発明の態様において、抗体分子もしくは抗原結合部分のＬＣＤＲ１は、配列ＬＡＳＱＴＩＧＴＷＬＴ（配列番号３５、国際公開第２０１５／０８５８４７Ａ１号、米国特許出願公開第２０１６／３７６３６７Ａ１号に開示されるＭＡｂ００５マウス／ヒト化抗体のＬＣＤＲ１）を除外してもよく、および／または、抗体分子もしくは抗原結合部分のＬＣＤＲ２は、配列ＴＡＴＳＬＡＤ（配列番号３６、国際公開第２０１５／０８５８４７Ａ１号、米国特許出願公開第２０１６／３７６３６７Ａ１号に開示されるＭＡｂ００５マウス／ヒト化抗体のＬＣＤＲ２）を除外してもよく、および／または抗体分子もしくは抗原結合部分のＬＣＤＲ３は、配列ＱＱＶＹＳＩＰＷＴ（配列番号３７、国際公開第２０１５／０８５８４７Ａ１号、米国特許出願公開第２０１６／３７６３６７Ａ１号に開示されるＭＡｂ００５マウス／ヒト化抗体のＬＣＤＲ３）を除外してもよい。
【００１６】
一部の態様において、本明細書は、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分を開示するものであり、当該抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含有する重鎖可変（ＶＨ）領域、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含有する軽鎖可変（ＶＬ）領域を含有し、この場合において、
（ａ）ＨＣＤＲ１は、アミノ酸配列Ｇ−Ｆ−Ｔ−Ｆ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｘ１−Ｍ−Ｓを含み、式中、Ｘ１はＬまたは任意の他のアミノ酸であり（配列番号２６）、
（ｂ）ＨＣＤＲ２は、アミノ酸配列Ｘ１−Ａ−Ｘ２−Ｉ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｙ−Ｙ−Ｘ６−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇを含み、式中、Ｘ１はＶ、またはＶの保存的置換であり、Ｘ２はＴまたはＮであり、Ｘ３はＡまたはＳであり、Ｘ４はＥまたはＮであり、Ｘ５はＴまたはＫであり、またＸ６はＰまたはＶであり（配列番号２７）、
（ｃ）ＨＣＤＲ３は、アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｄ−Ｙを含み、式中、Ｘ１はＱまたは任意の他のアミノ酸（例えば、Ｔ、Ｌ、ＭまたはＮ）であり、Ｘ２はＬまたは任意の他のアミノ酸（例えば、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、ＳまたはＶ）であり、Ｘ３はＹ、またはＹの保存的置換（例えば、Ｈ）であり、Ｘ４はＹまたは任意の他のアミノ酸（例えば、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｍ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、ＳまたはＷ）であり、またＸ５はＦまたは任意の他のアミノ酸（例えば、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、ＳまたはＷ）であり（配列番号２８）、
（ｄ）ＬＣＤＲ１は、アミノ酸配列Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−Ｉ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５を含み、式中、Ｘ１はＳ、またはＳの保存的置換であり、Ｘ２はＳ、またはＳの保存的置換であり、Ｘ３はＹ、またはＹの保存的置換であり、Ｘ４はＬ、またはＬの保存的置換であり、またＸ５はＮもしくはＴ、またはＮもしくはＴの保存的置換であり（配列番号３２）、
（ｅ）ＬＣＤＲ２は、アミノ酸配列Ｘ１−Ａ−Ｘ２−Ｓ−Ｌ−Ｘ３−Ｘ４を含み、式中、Ｘ１はＡもしくはＴ、またはＡもしくはＴの保存的置換であり、Ｘ２はＳ、またはＳの保存的置換であり、Ｘ３はＱまたは任意の他のアミノ酸であり、またＸ４はＳまたは任意の他のアミノ酸であり（配列番号３３）、ならびに
（ｆ）ＬＣＤＲ３は、アミノ酸配列Ｑ−Ｑ−Ｘ１−Ｙ−Ｓ−Ｘ２−Ｐ−Ｘ３−Ｔを含み、式中、Ｘ１はＳまたは任意の他のアミノ酸であり、Ｘ２はＴまたは任意の他のアミノ酸であり、またＸ３はＷまたは任意の他のアミノ酸である（配列番号３４）。
【００１７】
一部の態様において、本発明は、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分を提供するものであり、当該抗体は、重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域を含有し、この場合において、
（ａ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｂ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＶＹＹＦＤＹ（配列番号４４）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｃ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＦＦＤＹ（配列番号４５）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｄ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＡＦＤＹ（配列番号４６）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｅ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＴＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号４８）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＩＰＷＴ（配列番号４７）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｆ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＡＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号４９）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＤ（配列番号５０）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｇ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＴＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号４８）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＩＰＷＴ（配列番号４７）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｈ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＡＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号４９）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＤ（配列番号５０）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｉ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＮＴＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号５１）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＴＷＬＮ（配列番号５２）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＡＳ（配列番号５３）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｊ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＶＹＹＦＤＹ（配列番号４４）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＨＳ（配列番号５４）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、または
（ｋ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＶＹＹＦＤＹ（配列番号４４）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含む。
【００１８】
一部の態様において、本明細書は、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分を開示するものであり、当該抗体は、重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域を含有し、この場合において、
当該ＶＨ領域のアミノ酸配列は、
（ａ）配列番号３８のＨＣＤＲ１と、
（ｂ）配列番号３９、配列番号４８、配列番号４９、または配列番号５１のＨＣＤＲ２と、
（ｃ）配列番号４０、配列番号４４、配列番号４５、または配列番号４６のＨＣＤＲ３とを含み、
当該ＶＬ領域のアミノ酸配列は、
（ａ’）配列番号４１または配列番号５２のＬＣＤＲ１と、
（ｂ’）配列番号４２、配列番号５０、配列番号５３、または配列番号５４のＬＣＤＲ２と、
（ｃ’）配列番号４３、または配列番号４７のＬＣＤＲ３とを含む。
【００１９】
一部の態様において、本明細書は、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分を開示するものであり、当該抗体は、重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域を含有し、この場合において、
（ａ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号１を含み、かつ、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号２を含み、
（ｂ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号３を含み、かつ、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号４を含み、
（ｃ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号５を含み、かつ、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号６を含み、
（ｄ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号７を含み、かつ、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号８を含み、
（ｅ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号９を含み、かつ、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号１０を含み、または
（ｆ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号１１を含み、かつ、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号１２を含む。
【００２０】
さらに本発明により、治療剤に連結された、融合された、または結合された、本明細書に規定される抗体分子またはその抗原結合部分を含有する免疫結合体が提供される。
【００２１】
別の態様において、本発明は、本明細書に規定される抗体分子またはその抗原結合部分をコードする核酸分子を提供する。
【００２２】
さらに、本発明の核酸分子を含有するベクターが提供される。
【００２３】
また、本明細書に規定される本発明の核酸分子またはベクターを含有する宿主細胞も提供される。
【００２４】
さらなる態様において、抗ＰＤ１抗体および／またはその抗原結合部分を作製する方法も提供され、当該方法は、当該抗体および／もしくはその抗原結合部分の発現ならびに／または産生が生じる条件下で、本発明の宿主細胞を培養することと、当該宿主細胞または培養物から、当該抗体および／またはその抗原結合部分を単離することと、を含む。
【００２５】
本発明の別の態様において、本明細書に規定される本発明の抗体分子もしくはその抗原結合部分、または本明細書に規定される本発明の核酸分子、または本明細書に規定される本発明のベクターを含有する医薬組成物が提供される。
【００２６】
さらに、対象において免疫反応を強化する方法が提供され、当該方法は、本明細書に規定される本発明の抗体分子もしくはその抗原結合部分の有効量、または本明細書に規定される本発明の免疫結合体の有効量、または本明細書に規定される本発明の核酸分子の有効量、または本明細書に規定される本発明のベクターの有効量、または本明細書に規定される本発明の医薬組成物の有効量を投与することを含む。
【００２７】
さらなる態様において、対象において癌を治療または予防する方法が提供され、当該方法は、本明細書に規定される本発明の抗体分子もしくはその抗原結合部分の有効量、または本明細書に規定される本発明の免疫結合体の有効量、または本明細書に規定される本発明の核酸分子の有効量、または本明細書に規定される本発明のベクターの有効量、または本明細書に規定される本発明の医薬組成物の有効量を投与することを含む。
【００２８】
さらに、医薬品としての使用のための、本明細書に規定される抗体分子もしくはその抗原結合部分、または本明細書に規定される免疫結合体、または本明細書に規定される核酸分子、または本明細書に規定されるベクター、または本明細書に規定される医薬組成物が提供される。本発明はさらに、癌の治療における使用のための、本明細書に規定される本発明の抗体分子もしくはその抗原結合部分、または本明細書に規定される本発明の免疫結合体、または本明細書に規定される本発明の核酸分子、または本明細書に規定される本発明のベクター、または本明細書に規定される本発明の医薬組成物を提供する。
【００２９】
別の態様において、本発明は、例えば抗癌剤などの第二の治療剤と組み合わされる併用において、別個に使用する、連続して使用する、または同時に使用するための、本明細書に規定される本発明の抗体分子もしくはその抗原結合部分、または免疫結合体、または核酸分子、または使用のためのベクター、または治療方法を提供する。
【００３０】
さらなる態様において、癌の治療のための医薬品の製造における、本明細書に規定される本発明の抗体分子もしくはその抗原結合部分の使用、または本明細書に規定される本発明の免疫結合体の使用、または本明細書に規定される本発明の核酸分子の使用、または本明細書に規定される本発明のベクターの使用、または本明細書に規定される本発明の医薬組成物の使用が提供される。
【００３１】
本発明はさらに、対象において感染症を治療または予防する方法を提供するものであり、当該方法は、本明細書に規定される抗体分子もしくはその抗原結合部分の有効量、または本明細書に規定される免疫結合体の有効量、または本明細書に規定される核酸分子の有効量、または本明細書に規定されるベクターの有効量、または本明細書に規定される医薬組成物の有効量を投与することを含む。
【００３２】
感染症は、すべての態様において、ウイルス性、細菌性、真菌性、または寄生虫性からなる群から選択されてもよい。一実施形態において、感染症は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症である。
【００３３】
また、感染症の治療における使用のための、本明細書に規定される抗体分子もしくはその抗原結合部分、または本明細書に規定される免疫結合体、または本明細書に規定される核酸分子、または本明細書に規定されるベクター、または本明細書に規定される医薬組成物が提供される。
【００３４】
さらに、感染症の治療のための医薬品の製造における、本明細書に規定される抗体分子もしくはその抗原結合部分の使用、または本明細書に規定される免疫結合体の使用、または本明細書に規定される核酸分子の使用、または本明細書に規定されるベクターの使用、または本明細書に規定される医薬組成物の使用が提供される。
【００３５】
本発明はさらに、対象において感染症を治療または予防する方法を提供するものであり、当該方法は、本明細書に規定される抗体分子もしくはその抗原結合部分の有効量、または本明細書に規定される免疫結合体の有効量、または本明細書に規定される核酸分子の有効量、または本明細書に規定されるベクターの有効量、または本明細書に規定される医薬組成物の有効量を投与することを含む。
【００３６】
本発明はさらに、ヒトＰＤ１に特異的に結合し、および任意でカニクイザルのＰＤ１にも特異的に結合する抗体分子、またはその抗原結合部分を作製する方法を提供するものであり、当該方法は、
（１）非ヒト源由来の抗ＰＤ１  ＣＤＲをヒトｖ−ドメインフレームワーク内に移植し、ヒト化抗ＰＤ１抗体分子またはその抗原結合部分を作製する工程、
（２）ＣＤＲ中に１つまたは複数の変異を含有する当該ヒト化抗ＰＤ１抗体分子またはその抗原結合部分のクローンのライブラリーを作製する工程、
（３）ヒトＰＤ１への結合、および任意でカニクイザルのＰＤ１への結合についても当該ライブラリーをスクリーニングする工程、
（４）スクリーニングする工程（３）から、ヒトＰＤ１に特異的に結合する、および任意でカニクイザルＰＤ１にも特異的に結合するクローンを選択する工程、ならびに
（５）ヒトＰＤ１に特異的に結合し、および任意でカニクイザルＰＤ１にも特異的に結合する抗体分子、またはその抗原結合部分を、工程（４）から選択されたクローンから作製する工程、を含む。
【００３７】
当該方法は、工程（４）で選択されたクローンに基づき、例えば工程（４）で選択されたクローンのＣＤＲ中の特定の位置でのさらなる探索的な突然変異誘導に基づき、追加のクローンを作製して、ヒト化を強化し、および／またはヒトＴ細胞エピトープ含量を最小化し、および／または工程（５）で作製された抗体分子もしくはその抗原結合部分の製造特性を改善するさらなる工程を含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１。ヒトおよびカニクイザルのＰＤ１−Ｆｃタンパク質に対する、ライブラリー由来抗ＰＤ１  Ｆａｂの直接結合ＥＬＩＳＡ。複数のファージ選択ブランチからクローンが誘導された。選択ブランチにおいて、ファージ群は、ビオチン化されたヒトまたはカニクイザルのＰＤ１タンパク質に対し各ラウンドで選択された。標準選択は、Ｒ２〜Ｒ４と番号付けされた。「ハンマー−ハグ」ラウンドは、Ｒ２−ＨおよびＲ３−Ｈと番号付けされた。各選択ラウンドの後、ライブラリー由来クローン（黒色円）は、ヒト（ｈ）およびカニクイザル（ｃ）の両方のＰＤ１に対し、ペリプラズム発現したＦａｂタンパク質としてスクリーニングされた。各ラウンドの平均±ＳＤ値は、灰色の棒で表されている。ヒトＩｇＧ１  Ｆａｂとして発現されるｍＡｂ００５  ｖ−ドメインを、各プレートにおける陽性対照（灰色円）として用いた。
【図２】図２Ａ〜図２Ｂ。ヒトおよびカニクイザルのＰＤ１−Ｆｃタンパク質への精製単量体Ｆａｂ結合に関する、直接的力価測定ＥＬＩＳＡ。Ｍａｂ００５、およびヒトＦａｂ形式のライブラリー由来クローンが、ヒト（図２Ａ）およびカニクイザル（図２Ｂ）のＰＤ１−Ｆｃタンパク質に対する直接結合ＥＬＩＳＡにおいて力価測定（単位ｎＭ）された。
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｂ。生殖細胞系列への変異に関する、ＣＤＲ残基の寛容の分析。ＥＬＩＳＡ陽性の６４個の固有ｓｃＦｖクローン群のＣＤＲにおける、マウスアミノ酸保持頻度の図をそれぞれＶＬ（図３Ａ、配列番号１１０、１１４および１１６）ドメインおよびＶＨ（図３Ｂ、配列番号９５、９２および１０６）ドメインについて示す。ＨＣＤＲ３以外では、ヒト／マウス残基の突然変異誘導の標的とされた残基のみプロットされている。Ｘ軸上のカッコ内に記載されるＣＤＲ残基は、移植に使用されたヒト生殖細胞系列（ＩＧＫＶ１−３９およびＩＧＨＶ３−７）中に存在する残基と同一である。両方の図において、７５％での灰色の破線は、ヒト生殖細胞系列によるマウス残基の置換の寛容性に対するカットオフを表している。
【図３Ｂ】同上。
【図４】図４Ａ〜図４Ｂ。ヒトおよびカニクイザルのＰＤ１−Ｆｃタンパク質への、ライブラリー由来ＩｇＧ１ヌルクローンの結合に関する、直接的力価測定ＥＬＩＳＡ。Ｍａｂ００５、およびヒトＩｇＧ１ヌル形式のライブラリー由来クローンが、ヒト（図４Ａ）およびカニクイザル（図４Ｂ）のＰＤ１−Ｆｃタンパク質に対する直接結合ＥＬＩＳＡにおいて力価測定（単位ｎＭ）された。
【図５Ａ】図５Ａ〜図５Ｄ。ヒトおよびカニクイザルのＰＤ１−Ｆｃタンパク質への、デザインＩｇＧ１ヌルクローンＩｇＧ１−０１からＩｇＧ１−１５の結合に関する、直接的力価測定ＥＬＩＳＡ。Ｍａｂ００５、およびヒトＩｇＧ１ヌル形式のデザインクローンが、ヒト（図５Ａ、図５Ｂ）およびカニクイザル（図５Ｃ、図５Ｄ）のＰＤ１−Ｆｃタンパク質に対する直接結合ＥＬＩＳＡにおいて力価測定（単位ｎＭ）された。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【図５Ｄ】同上。
【図６】図６Ａ〜図６Ｂ。ＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎにおけるＩｇＧ１ヌルタンパク質のエピトープ競合解析。抗ＰＤ１  ＩｇＧ１ヌルクローンに、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ技術を使用したエピトープ競合アッセイを行った。このアッセイにおいて、ライブラリー由来ＩｇＧ（図６Ａ）およびデザインＩｇＧ（図６Ｂ）は、Ｍａｂ００５  ＩｇＧ１ヌルに対して、溶液中のヒトＰＤ１タンパク質への結合を競合することにより、相対的アフィニティと、親Ｍａｂ００５エピトープの保持に関して解析された。解析されたすべてのクローンは、ＰＤ１に対するＭａｂ−００５結合の、強力で濃度依存性の中和を示した。
【図７】図７Ａ〜図７Ｃ。ヒトＰＤ１＋ＣＨＯ細胞に対するフローサイトメトリー結合。ヒトＰＤ１を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する特異的な結合に関して、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）、リードライブラリー由来ＩｇＧ（図７Ａ）およびデザインＩｇＧ（図７Ｂ）を検証した。ほぼすべてのクローンについてヒトＰＤ１に対して濃度依存性の結合が観察されるとともに、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）ではより弱い結合が観察された。唯一の例外がクローンＩｇＧ１−１５であり、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）よりも弱い結合を示した（図７Ｃ）。
【図８】図８Ａ〜図８Ｂ。カニクイザルＰＤ１＋  ＣＨＯ細胞に対する結合のフローサイトメトリー試験。カニクイザルＰＤ１を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞に対する特異的な結合に関して、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）、リードライブラリー由来ＩｇＧ（図８Ａ）およびデザインＩｇＧ（図８Ｂ）を検証した。ほぼすべてのクローンについてカニクイザルＰＤ１に対して濃度依存性の結合が観察されるとともに、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）では有意により強い結合が観察された。
【図９】図９。細胞系ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニズムアッセイ。ヒトＩｇＧ１ヌル形式でのリードクローンＩｇＧ１−１１、ＩｇＧ１−１４、ＩｇＧ１−０６Ｄ０２およびＩｇＧ１−１６Ｈ１０に関する、細胞表面におけるヒトＰＤ１機能のアンタゴニズムの分析では、新規クローンすべてが、濃度依存性拮抗作用を呈して、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）およびＩｇＧ４  ニボルマブアナログの両方と比較してより高い相対効力を伴うことが示された。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｅ。非特異的（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）結合解析チップアレイアッセイ。ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）のための４９７５個のヒト受容体に対して、アレイ系結合スクリーニングを実行した後で、結合特異性の確認分析を、チップ上で行ったが、当該チップにおいては、ＰＤ１をコードするプラスミドおよび推定上のＭａｂ００５非特異的結合タンパク質が配置されており、これを用いてＨＥＫ２９３細胞がトランスフェクトされた。すべてのプラスミドの有効なトランスフェクションは、一緒にコードされたマーカーのＺＳグリーンをスクリーニングすることにより確認された（図１０Ａ）。次いでそれぞれのチップを、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）（図１０Ｂ）、アイソタイプＩｇＧ１（図１０Ｃ）、リツキシマブ（図１０Ｄ）および一次抗体なし（図１０Ｅ）を用いてデュプリケートで調べた。これら解析により、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）のみがＰＤ１に対する結合を示したが、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）はまたＫＤＲ、ＦＺＤ５およびＵＬＢＰ２タンパク質に対する予期せぬ非特異的な結合を示した。
【図１１−１】図１１Ａ〜図１１Ｔ。非特異的結合解析再アレイアッセイ。結合特異性の解析をチップに対して行った。チップには、関連性のある標的をコードするプラスミドが配置されており、当該プラスミドを使用してＨＥＫ２９３細胞がトランスフェクトされた。すべてのプラスミドのトランスフェクションは、一緒にコードされたマーカーのＺＳグリーンをスクリーニングすることにより確認された（図１１Ａ）。次いでそれぞれのチップを、ペムブロリズマブアナログ（図１１Ｂ）、リツキシマブ（図１１Ｃ）、アイソタイプＩｇＧ１（図１１Ｄ）、ｍＶＨ／ｍＶＬ  Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１（図１１Ｅ）、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）（図１１Ｆ）ならびにライブラリー由来のリードＩｇＧおよびデザインリードＩｇＧ（図１１Ｇ〜図１１Ｔ）を用いてデュプリケートで調べた。これら解析により、ｍＶＨ／ｍＶＬ  Ｍａｂ００５  ＩｇＧ１（オリジナルのマウスハイブリドーマｖ−ドメイン）およびＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）がいずれもＰＤ１に対する結合を示したが、これらはまたＫＤＲ、ＦＺＤ５およびＵＬＢＰ２タンパク質に対する予期せぬ非特異的な結合も示した。対照的に、リード抗体（図１１Ｇ〜図１１Ｔ）のうち、ＰＤ１以外の任意のタンパク質に対して測定可能なシグナル（すなわち、結合していること）を示すものはなかった。
【図１１−２】同上。
【図１１−３】同上。
【図１１−４】同上。
【図１２−１】図１２Ａ〜図１２Ｐ。一過性トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を用いたフローサイトメトリによるＰＤ１結合解析。結合特異性の解析は、ヒトＰＤ１（灰色線）またはＺＳグリーンマーカ（黒色線）のいずれかをコードしたプラスミドで一過性トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞で行った。次いでトランスフェクトした細胞は、ｍＶＨ／ｍＶＬ  Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）、ペムブロリズマブアナログ、アイソタイプＩｇＧ１、およびリード抗体のサブセット（ＩｇＧ１−０６Ｄ０２、ＩｇＧ１−１２ＨＯ４、ＩｇＧ１−０５、ＩｇＧ１−０８）を用いて染色した。各抗体は、高濃度（５μｇ／ｍｌ）と中程度の濃度（１μｇ／ｍｌ）とで繰り返し染色で用いた。これら解析により、全ての抗体（アイソタイプコントロールＩｇＧ１以外）が、ＰＤ１に対する結合を示したが、ＺＳグリーンをトランスフェクトした細胞に対して測定可能なシグナルを示す抗体はないということが確認された。
【図１２−２】同上。
【図１３−１】図１３Ａ〜図１３Ｐ。一過性トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を用いたフローサイトメトリによるＦＺＤ５結合解析。結合特異性の解析は、ヒトＦＺＤ５（灰色線）またはＺＳグリーンマーカ（黒色線）のいずれかをコードしたプラスミドで一過性トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞で行った。次いでトランスフェクトした細胞は、ｍＶＨ／ｍＶＬ  Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）、ペムブロリズマブアナログ、アイソタイプＩｇＧ１、およびリード抗体のサブセット（ＩｇＧ１−０６Ｄ０２、ＩｇＧ１−１２ＨＯ４、ＩｇＧ１−０５、ＩｇＧ１−０８）を用いて染色した。各抗体は、高濃度（５μｇ／ｍｌ）と中程度の濃度（１μｇ／ｍｌ）とで繰り返し染色で用いた。これら解析により、ＦＺＤ５発現細胞に対する結合を示した抗体は、ｍＶＨ／ｍＶＬ  Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１およびＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）のみであることが確認された。
【図１３−２】同上。
【図１４−１】図１４Ａ〜図１４Ｐ。一過性トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を用いたフローサイトメトリによるＫＤＲ結合解析。結合特異性の解析は、ヒトＫＤＲ（灰色線）またはＺＳグリーンマーカ（黒色線）のいずれかをコードしたプラスミドで一過性トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞で行った。次いでトランスフェクトした細胞は、ｍＶＨ／ｍＶＬ  Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）、ペムブロリズマブアナログ、アイソタイプＩｇＧ１、およびリード抗体のサブセット（ＩｇＧ１−０６Ｄ０２、ＩｇＧ１−１２ＨＯ４、ＩｇＧ１−０５、ＩｇＧ１−０８）を用いて染色した。各抗体は、高濃度（５μｇ／ｍｌ）と中程度の濃度（１μｇ／ｍｌ）とで繰り返し染色で用いた。これら解析により、ＫＤＲ発現細胞に対する結合を示した抗体は、ｍＶＨ／ｍＶＬ  Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１およびＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）のみであることが確認された。
【図１４−２】同上。
【図１５−１】図１５Ａ〜図１５Ｐ。一過性トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を用いたフローサイトメトリによるＵＬＢＰ２結合解析。結合特異性の解析は、ヒトＵＬＢＰ２（灰色線）またはＺＳグリーンマーカ（黒色線）のいずれかをコードしたプラスミドで一過性トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞で行った。次いでトランスフェクトした細胞は、ｍＶＨ／ｍＶＬ  Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）、ペムブロリズマブアナログ、アイソタイプＩｇＧ１、およびリード抗体のサブセット（ＩｇＧ１−０６Ｄ０２、ＩｇＧ１−１２ＨＯ４、ＩｇＧ１−０５、ＩｇＧ１−０８）を用いて染色した。各抗体は、高濃度（５μｇ／ｍｌ）と中程度の濃度（１μｇ／ｍｌ）とで繰り返し染色で用いた。これら解析により、ＵＬＢＰ２発現細胞に対する結合を示した抗体は、ｍＶＨ／ｍＶＬ  Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１およびＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）のみであることが確認された。
【図１５−２】同上。
【図１６−１】図１６Ａ〜図１６Ｆ。非特異的結合解析ＥＬＩＳＡアッセイ。ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）、ｍＶＨ／ｍＶＬ  Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１、ライブラリー由来クローンおよびヒトＩｇＧ１ヌル形式でのデザインクローンを、ヒトＰＤ１（図１６Ａ）およびカニクイザルＰＤ１（図１６Ｂ）、ヒトＶＥＧＦＲ２（図１６Ｃ）およびアカゲザルＶＥＧＦＲ２（図１６Ｄ）、ヒトＦＺＤ５（図１６Ｅ）およびＢＳＡ（図１６Ｆ）のタンパク質に対する直接結合ＥＬＩＳＡにおいて力価測定（単位μｇ／ｍｌ）した。これら解析により、全ての抗ＰＤ１抗体がＰＤ１に対する結合を示したが、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）およびｍＶＨ／ｍＶＬ  Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１のみが、ＶＥＧＦＲ２およびＦＺＤ５のタンパク質への測定可能な非特異的結合を示すことが確認された。
【図１６−２】同上。
【図１６−３】同上。
【図１７】図１７。ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）による、ｍＶＨ／ｍＶＬ  Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１およびＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）に対するＶＥＧＦＲ２結合。ヒトおよびアカゲザルの単量体ＶＥＧＦＲ２−ｈｉｓタンパク質を、抗ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ抗体で捕捉した、ｍＶＨ／ｍＶＬ  Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１およびＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）に対する直接結合ＥＬＩＳＡにおいて、力価測定（単位ｎＭ）した。これら解析により、両方の抗ＰＤ１抗体がＶＥＧＦＲ２組換えタンパク質に対する結合を示したが、結合は、高濃度の可溶性分析物でのみ観察されることが確認された。結果的に、信頼できるＫＤ値は生成されなかった。
【図１８】図１８。細胞系ＶＥＧＦＲ２アゴニズムアッセイ。ｍＶＨ／ｍＶＬ  Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）、ライブラリー由来クローンおよびヒトＩｇＧ１ヌル形式でのデザインクローンを、ヒトＶＥＧＦＲ２シグナル伝達アッセイにおいて力価測定（単位ｎＭ）した。ｍＶＨ／ｍＶＬ  Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）および陽性対照のタンパク質（ヒトＶＥＧＦ−１６５）の全てが、強い、濃度依存性のＶＥＧＦＲ２アゴニズムを誘発した。リードクローンＩｇＧ１−０４、ＩｇＧ１−０８、ＩｇＧ１−０６Ｄ０２およびＩｇＧ１−１２Ｈ０４は、１μＭ程度の高い濃度であっても、測定可能なアゴニズムを示さなかった。
【図１９】図１９。ＩｇＧの示差走査熱量測定法（ＤＳＣ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）。以下のＩｇＧ１ヌル形式での抗体に関するＤＳＣアッセイのデータ：（ｍＡｂ−１）ＩｇＧ１−０５、（ｍＡｂ−２）ＩｇＧ１−０８、（ｍＡｂ−３）ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）、（ｍＡｂ−４）ＩｇＧ１−０６Ｄ０２、および（ｍＡｂ−５）ＩｇＧ１−１２Ｈ０４。
【図２０Ａ】図２０Ａ〜図２０Ｂ。強制酸化の前および後のＩｇＧからのトリプシン処理ペプチドの逆相クロマトグラフィー解析。逆相クロマトグラムが、以下のＩｇＧ１ヌル形式での抗体に関して：ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）（図２０Ａ）が最大６ペプチドで三価後の変化を示すこと、一方で例えばＩｇＧ１−０６Ｄ０２（図２０Ｂ）であるリードクローンは、２つの変形体のみで酸化に対する強い抵抗性を示すこと、が示された。
【図２０Ｂ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明の第一の態様によると、ヒトＰＤ１、およびカニクイザルＰＤ１にも特異的に結合する抗体分子、またはその抗原結合部分が提供され、当該抗体分子または抗原結合部分は、
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ１：Ｇ−Ｆ−Ｔ−Ｆ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｌまたは任意のアミノ酸（例えば、Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ）−Ｍ−Ｓ（配列番号２６）と、
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ２：ＶまたはＶ−Ａ−Ｔ／Ｎ−Ｉ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ／Ｓ−Ｅ／Ｎ−Ｔ／Ｋ−Ｙ−Ｙ−Ｐ／Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇの保存的置換（配列番号２７）と、
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ３：Ｑまたは任意のアミノ酸（例えば、Ｔ／Ｌ／Ｍ／Ｎ）−Ｌまたは任意のアミノ酸（例えば、Ｇ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｖ）−ＹまたはＹの保存的置換（例えば、Ｈ）−Ｙまたは任意のアミノ酸（例えば、Ａ／Ｄ／Ｆ／Ｇ／Ｍ−Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｓ／Ｗ）−Ｆまたは任意のアミノ酸（例えば、Ａ／Ｄ／ＥＩ／Ｋ／Ｍ／Ｓ／Ｗ）−Ｄ−Ｙ（配列番号２８）と、を伴う重鎖可変領域を含む。
【００４０】
一部の態様では、本明細書に提供される抗ＰＤ１抗体または抗原結合部分は、配列番号２０または配列番号２１を含有する、または配列番号２０または配列番号２１からなる、ＰＤ１タンパク質に特異的に結合する。一部の態様では、本明細書に提供される抗ＰＤ１抗体または抗原結合部分は、配列番号２０または配列番号２１に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するＰＤ１タンパク質に特異的に結合する。
【００４１】
本発明の態様において、抗体分子もしくは抗原結合部分のＨＣＤＲ１は、配列ＧＦＴＦＳＳＹＭＭＳ（配列番号２９、国際公開第２０１５／０８５８４７Ａ１号、米国特許出願公開第２０１６／３７６３６７Ａ１号に開示されるＭＡｂ００５マウス／ヒト化抗体のＨＣＤＲ１）、および／または配列ＴＩＳＧＧＧＡＮＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号３０、国際公開第２０１５／０８５８４７Ａ１号、米国特許出願公開第２０１６／３７６３６７Ａ１号に開示されるＭＡｂ００５マウス／ヒト化抗体のＨＣＤＲ２）を除外してもよく、および／または抗体分子もしくは抗原結合部分のＨＣＤＲ３は、配列ＱＬＹＹＦＤＹ（配列番号３１、国際公開第２０１５／０８５８４７Ａ１号、米国特許出願公開第２０１６／３７６３６７Ａ１号に開示されるＭＡｂ００５マウス／ヒト化抗体のＨＣＤＲ３）を除外してもよい。
【００４２】
本発明による抗体分子またはその抗原結合部分は、
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＬＣＤＲ１：Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−Ｉ−Ｓ、またはＳ−Ｓの保存的置換、またはＳ−Ｙの保存的置換、またはＹ−Ｌの保存的置換、またはＬ−Ｎ／Ｔの保存的置換、またはＮもしくはＴの保存的置換（配列番号３２）と、
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＬＣＤＲ２：Ａ／Ｔ、またはＡもしくはＴ−Ａ−Ｓの保存的置換、またはＳ−Ｓ−Ｌ−Ｑの保存的置換または任意のアミノ酸（例えば、Ａ／Ｈ）−Ｓまたは任意のアミノ酸（例えば、Ｄ、Ｙ）（配列番号３３）と、
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＬＣＤＲ３：Ｑ−Ｑ−Ｓまたは任意のアミノ酸（例えば、Ｖ）−Ｙ−Ｓ−Ｔまたは任意のアミノ酸（例えば、Ｉ）−Ｐ−Ｗまたは任意のアミノ酸（例えば、Ｌ）−Ｔ（配列番号３４）と、を伴う軽鎖可変領域をさらに含んでもよい。
【００４３】
本発明の態様において、抗体分子もしくは抗原結合部分のＬＣＤＲ１は、配列ＬＡＳＱＴＩＧＴＷＬＴ（配列番号３５、国際公開第２０１５／０８５８４７Ａ１号、米国特許出願公開第２０１６／３７６３６７Ａ１号に開示されるＭＡｂ００５マウス／ヒト化抗体のＬＣＤＲ１）を除外してもよく、および／または、抗体分子もしくは抗原結合部分のＬＣＤＲ２は、配列ＴＡＴＳＬＡＤ（配列番号３６、国際公開第２０１５／０８５８４７Ａ１号、米国特許出願公開第２０１６／３７６３６７Ａ１号に開示されるＭＡｂ００５マウス／ヒト化抗体のＬＣＤＲ２）を除外してもよく、および／または抗体分子もしくは抗原結合部分のＬＣＤＲ３は、配列ＱＱＶＹＳＩＰＷＴ（配列番号３７、国際公開第２０１５／０８５８４７Ａ１号、米国特許出願公開第２０１６／３７６３６７Ａ１号に開示されるＭＡｂ００５マウス／ヒト化抗体のＬＣＤＲ３）を除外してもよい。
【００４４】
一部の態様において、本明細書は、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分を開示するものであり、当該抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含有する重鎖可変（ＶＨ）領域、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含有する軽鎖可変（ＶＬ）領域を含有し、この場合において、
（ａ）ＨＣＤＲ１は、アミノ酸配列Ｇ−Ｆ−Ｔ−Ｆ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｘ１−Ｍ−Ｓを含み、式中、Ｘ１はＬまたは任意の他のアミノ酸（例えば、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹ）であり（配列番号２６）、
（ｂ）ＨＣＤＲ２は、アミノ酸配列Ｘ１−Ａ−Ｘ２−Ｉ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｙ−Ｙ−Ｘ６−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇを含み、式中、Ｘ１はＶ、またはＶの保存的置換であり、Ｘ２はＴまたはＮであり、Ｘ３はＡまたはＳであり、Ｘ４はＥまたはＮであり、Ｘ５はＴまたはＫであり、またＸ６はＰまたはＶであり（配列番号２７）、
（ｃ）ＨＣＤＲ３は、アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｄ−Ｙを含み、式中、Ｘ１はＱまたは任意の他のアミノ酸（例えば、Ｔ、Ｌ、ＭまたはＮ）であり、Ｘ２はＬまたは任意の他のアミノ酸（例えば、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、ＳまたはＶ）であり、Ｘ３はＹ、またはＹの保存的置換（例えば、Ｈ）であり、Ｘ４はＹまたは任意の他のアミノ酸（例えば、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｍ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、ＳまたはＷ）であり、またＸ５はＦまたは任意の他のアミノ酸（例えば、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、ＳまたはＷ）であり（配列番号２８）、
（ｄ）ＬＣＤＲ１は、アミノ酸配列Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−Ｉ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５を含み、式中、Ｘ１はＳまたはＳの保存的置換であり、Ｘ２はＳまたはＳの保存的置換であり、Ｘ３はＹまたはＹの保存的置換であり、Ｘ４はＬまたはＬの保存的置換であり、またＸ５はＮもしくはＴまたはＮもしくはＴの保存的置換であり（配列番号３２）、
（ｅ）ＬＣＤＲ２は、アミノ酸配列Ｘ１−Ａ−Ｘ２−Ｓ−Ｌ−Ｘ３−Ｘ４を含み、式中、Ｘ１はＡもしくはＴ、またはＡもしくはＴの保存的置換であり、Ｘ２はＳ、またはＳの保存的置換であり、Ｘ３はＱまたは任意の他のアミノ酸（例えば、ＡまたはＨ）であり、またＸ４はＳまたは任意の他のアミノ酸（例えば、ＤまたはＹ）であり（配列番号３３）、
（ｆ）ＬＣＤＲ３は、アミノ酸配列Ｑ−Ｑ−Ｘ１−Ｙ−Ｓ−Ｘ２−Ｐ−Ｘ３−Ｔを含み、式中、Ｘ１はＳまたは任意の他のアミノ酸（例えば、Ｖ）であり、Ｘ２はＴまたは任意の他のアミノ酸（例えば、Ｉ）であり、またＸ３はＷまたは任意の他のアミノ酸（例えば、Ｌ）である（配列番号３４）。
【００４５】
一部の態様において、本明細書は、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分を開示するものであり、この場合において当該抗体は、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１−ＨＣＤＲ１−ＦＲ２−ＨＣＤＲ２−ＦＲ３−ＨＣＤＲ３−ＦＲ４を含有する重鎖可変（ＶＨ）領域、およびアミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１−ＬＣＤＲ１−ＦＲ２−ＬＣＤＲ２−ＦＲ３−ＬＣＤＲ３−ＦＲ４を含有する軽鎖可変（ＶＬ）領域を含有し、この場合において、ＨＣＤＲ１は、配列番号２６であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２７であり、ＨＣＤＲ３は、配列番号２８であり、ＬＣＤＲ１は、配列番号３２であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号３３であり、そしてＬＣＤＲ３は、配列番号３４であり、この場合において当該重鎖のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４のアミノ酸配列は、配列番号１２０（表２を参照のこと）内の重鎖のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４のアミノ酸配列であり、またこの場合において当該軽鎖のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４のアミノ酸配列は、配列番号１２２（表２を参照のこと）内の軽鎖のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４のアミノ酸配列である。
【００４６】
本明細書に詳述されるように、本発明者らは、国際公開第２０１５／０８５８４７Ａ１号、米国特許出願公開第２０１６／３７６３６７Ａ１号に開示されるマウス抗ＰＤ１抗体ＭＡｂ００５から誘導されたＣＤＲ配列を使用し、多数の最適化された抗ＰＤ１抗体分子を作製することに初めて成功した。本発明の実施形態において、これら抗体分子は、ヒトＰＤ１ならびにカニクイザルＰＤ１に対する結合特異性およびアフィニティを同等に有するよう選択された（最大限に正確な霊長類の毒性試験およびｐｋ試験を容易にするため）。本明細書に記載される最適化抗体分子にさらなる改善を行うことによって、カニクイザルのＰＤ１オルソログへの結合の改善、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達の中和における有効性の改善、可変ドメインの安定性の改善、高い発現収率、および／または免疫原性の可能性の低下が提供される。詳細には、これら抗体はまた、ヒト受容体であるＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２としても知られる）、ＦＺＤ５およびＵＬＢＰ２への非特異的結合を切断することによって、ＭＡｂ００５と比較してＰＤ１結合の特異性を劇的に改善させた。
【００４７】
一部の態様において、本発明の最適化抗ＰＤ１抗体分子は、対応するマウスＣＤＲまたはその他（例えばフレームワーク）のアミノ酸の位置で、必ずしも最大数のヒト生殖細胞系列の置換を有するとは限らない。以下の実施例の項に詳述されるように、本発明者らは、「最大限にヒト化された」抗体分子は、抗ＰＤ１結合特性および／または他の望ましい性質に関して、必ずしも「最大限に最適化」されているとは限らないことを見出した。
【００４８】
一部の実施形態では、本発明の最適化抗ＰＤ１抗体分子は、カニクイザルＰＤ１における機能的に同一のエピトープのそれらの結合で、Ｍａｂ００５抗体（国際公開第２０１５／０８５８４７Ａ１号、米国特許出願公開第２０１６／３７６３６７Ａ１号）よりも改善される。以下の実験の項で詳述するように、本発明者らは、いくつかの最適化クローンが、単量体カニクイザルＰＤ１タンパク質への結合に関して３２ｎＭより低い値のビアコアＫＤ値（例えば、２．７〜１５ｎＭ）およびカニクイザルＰＤ１を発現するＣＨＯ細胞のフローサイトメトリー染色において６．５ｎＭ（例えば、０．８６〜２．１７ｎＭ）より低いＥＣ５０値を示すことを見出した。
【００４９】
本発明は、本明細書に記載される抗体分子またはその抗原結合部分のアミノ酸配列に対する改変を包含する。例えば本発明は、その性質に大きな影響を与えない、機能的に同等の可変領域およびＣＤＲを含有する抗体分子およびその対応する抗原結合部分、ならびに活性および／もしくはアフィニティが強化された、および／または低下したバリアントを包含する。例えばアミノ酸配列は、ＰＤ１に対し所望の結合アフィニティを有する抗体が得られるように変異されてもよい。１残基から数百以上の残基を含有するポリペプチドの長さの範囲のアミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合を含み、ならびに単一アミノ酸残基または複数のアミノ酸残基の配列間挿入を含む挿入が予期される。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体分子、またはエピトープタグに融合された抗体分子が挙げられる。抗体分子のその他の挿入バリアントとしては、酵素またはポリペプチドの、抗体Ｎ末端または抗体Ｃ末端への融合が挙げられ、それにより血液循環中の抗体の半減期が延長される。
【００５０】
本発明の抗体分子または抗原結合部分は、グリコシル化ポリペプチドおよび非グリコシル化ポリペプチド、ならびに他の翻訳後修飾を有するポリペプチド、例えば異なる糖類でのグリコシル化、アセチル化およびリン酸化を有するポリペプチドを含んでもよい。例えば１つまたは複数のアミノ酸残基を付加、除去または置換させ、グリコシル化部位を形成または除去させることにより、本発明の抗体分子または抗原結合部分を変異させて、当該翻訳後修飾を変化させてもよい。
【００５１】
本発明の抗体分子または抗原結合部分は、例えば抗体中の潜在的なタンパク質分解部位を除去するアミノ酸置換により改変されてもよい。
【００５２】
抗体分子またはその抗原結合部分において、ＨＣＤＲ１は、以下のアミノ酸配列を有してもよい：Ｇ−Ｆ−Ｔ−Ｆ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ−Ｍ−Ｓ（配列番号５５）；ＨＣＤＲ２は、以下のアミノ酸配列を有してもよい：Ｖ−Ａ−Ｔ／Ｎ−Ｉ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｓ／Ａ−Ｅ／Ｎ−Ｔ／Ｋ−Ｙ−Ｙ−Ｖ／Ｐ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号５６）；またＨＣＤＲ３は、以下のアミノ酸配列を有してもよい：Ｑ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｔ−Ｌ／Ｇ／Ｋ／Ｑ／Ｍ／Ｓ／Ｖ−Ｙ／Ｈ−Ｙ／Ａ／Ｄ／Ｇ／Ｆ／Ｍ−Ｆ／Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｓ／Ｗ／Ｙ−Ｄ−Ｙ（配列番号５７）。
【００５３】
例えば、ＨＣＤＲ１は、以下のアミノ酸配列を有してもよい：Ｇ−Ｆ−Ｔ−Ｆ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｌ／Ａ／Ｓ−Ｍ−Ｓ（配列番号５８）；ＨＣＤＲ２は、以下のアミノ酸配列を有してもよい：Ｖ−Ａ−Ｔ−Ｉ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｓ／Ａ−Ｅ／Ｎ−Ｔ／Ｋ−Ｙ−Ｙ−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号５９）；またＨＣＤＲ３は、以下のアミノ酸配列を有してもよい：Ｑ−Ｌ／Ｖ−Ｙ−Ｙ／Ｇ／Ｆ／Ａ−Ｆ／Ｙ／Ａ−Ｄ−Ｙ（配列番号６０）。
【００５４】
抗体分子またはその抗原結合部分において、ＬＣＤＲ１は、以下のアミノ酸配列を有してもよい：Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｔ／Ｓ−Ｉ−Ｇ／Ｓ−Ｔ／Ｓ−Ｗ／Ｙ−Ｌ−Ｔ／Ｎ（配列番号６１）；ＬＣＤＲ２は、アミノ酸配列Ｔ／Ａ−Ａ−Ｔ／Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ａ／Ｑ／Ｈ−Ｄ／Ｓ（配列番号６２）を有してもよい；またＬＣＤＲ３は、以下のアミノ酸配列を有してもよい：Ｑ−Ｑ−Ｖ／Ｓ−Ｙ−Ｓ−Ｉ／Ｔ−Ｐ−Ｗ／Ｌ−Ｔ（配列番号６３）。
【００５５】
例えば、ＬＣＤＲ１は、以下のアミノ酸配列を有してもよい：Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−Ｉ−Ｇ／Ｓ−Ｔ／Ｓ−Ｗ／Ｙ−Ｌ−Ｎ（配列番号６４）；ＬＣＤＲ２は、アミノ酸配列Ａ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｑ／Ｈ−Ｓ（配列番号６５）を有してもよい；またＬＣＤＲ３は、以下のアミノ酸配列を有してもよい：Ｑ−Ｑ−Ｓ−Ｙ−Ｓ−Ｉ／Ｔ−Ｐ−Ｗ−Ｔ（配列番号６６）。
【００５６】
本発明の特定の実施形態において、抗体分子または抗原結合部分は、以下を含有してもよい：
（ａ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＴＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号４８；ＨＣＤＲ２）、ＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＩＰＷＴ（配列番号４７；ＬＣＤＲ３）［クローン０６Ｄ０２］；または
（ｂ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳ（配列番号６７；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＮＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号６８；ＨＣＤＲ２）、ＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＴＷＬＮ（配列番号５２；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＴＳＬＡＳ（配列番号６９；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＩＰＷＴ（配列番号４７；ＬＣＤＲ３）［クローン０８Ｆ０４］；
（ｃ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＡＥＴＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号７０；ＨＣＤＲ２）、ＱＬＹＦＦＤＹ（配列番号４５；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１；ＬＣＤＲ１）、ＴＡＳＳＬＱＤ（配列番号７１；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３；ＬＣＤＲ３）［クローン１１Ｇ０５］；
（ｄ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳ（配列番号６７；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９；ＨＣＤＲ２）、ＱＬＹＹＡＤＹ（配列番号７２；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１；ＬＣＤＲ１）、ＴＡＳＳＬＡＤ（配列番号７３；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＩＰＷＴ（配列番号４７；ＬＣＤＲ３）［クローン１２Ｅ０２］；
（ｅ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＡＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号４９；ＨＣＤＲ２）、ＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＳＳＬＱＤ（配列番号５０；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３；ＬＣＤＲ３）［クローン１２Ｈ０４］；
（ｆ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＮＴＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号５１；ＨＣＤＲ２）、ＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＴＷＬＮ（配列番号５２；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＳＳＬＡＳ（配列番号５３；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３；ＬＣＤＲ３）［クローン１２Ｂ０７］；
（ｇ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＡＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号４９；ＨＣＤＲ２）、ＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号７４；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３；ＬＣＤＲ３）［クローン１３Ｇ０２］；
（ｈ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＳＭＳ（配列番号７５；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＡＥＴＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号７０；ＨＣＤＲ２）、ＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＩＰＷＴ（配列番号４７；ＬＣＤＲ３）［クローン１４Ｃ０７］；
（ｉ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＮＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号６８；ＨＣＤＲ２）、ＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＧＴＹＬＮ（配列番号７６；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＴＳＬＱＳ（配列番号７７；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＩＰＷＴ（配列番号４７；ＬＣＤＲ３）［クローン１５Ｃ１０］；
（ｊ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＡＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号４９；ＨＣＤＲ２）、ＱＬＹＡＦＤＹ（配列番号４６；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＧＳＹＬＮ（配列番号７８；ＬＣＤＲ１）、ＴＡＳＳＬＱＳ（配列番号７９；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＩＰＷＴ（配列番号４７；ＬＣＤＲ３）［クローン１６Ｃ０７］；
（ｋ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９；ＨＣＤＲ２）、ＱＶＹＹＦＤＹ（配列番号４４；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＳＳＬＨＳ（配列番号５４；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３；ＬＣＤＲ３）［クローン１６Ｈ１０］；
（ｌ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＰＭＳ（配列番号８０；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＴＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号４８；ＨＣＤＲ２）、ＱＬＹＹＹＤＹ（配列番号８１；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＴＷＬＮ（配列番号５２；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＳＳＬＱＹ（配列番号８２；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３；ＬＣＤＲ３）［クローン１７Ｂ１１］；
（ｍ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳ（配列番号６７；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９；ＨＣＤＲ２）、ＱＬＹＹＡＤＹ（配列番号７２；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３；ＬＣＤＲ３）［クローンＩｇＧ１−０１（ＶＬドメインはＪＫ４配列を含有する）］；
（ｎ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳ（配列番号６７；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９；ＨＣＤＲ２）、ＱＬＹＹＡＤＹ（配列番号７２；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３；ＬＣＤＲ３）［クローンＩｇＧ１−０２（ＶＬドメインはＪＫ１配列を含有する）］；
（ｏ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳ（配列番号６７；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９；ＨＣＤＲ２）、ＱＬＹＹＡＤＹ（配列番号７２；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号７４；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３；ＬＣＤＲ３）［クローンＩｇＧ１−０３（ＶＬドメインはＪＫ１配列を含有する）］；
（ｐ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９；ＨＣＤＲ２）、ＱＶＹＹＦＤＹ（配列番号４４；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３；ＬＣＤＲ３）［クローンＩｇＧ１−０４（ＶＬドメインはＪＫ４配列を含有する）］；
（ｑ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９；ＨＣＤＲ２）、ＱＶＹＹＦＤＹ（配列番号４４；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３；ＬＣＤＲ３）［クローンＩｇＧ１−０５（ＶＬドメインはＪＫ１配列を含有する）］；
（ｒ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９；ＨＣＤＲ２）、ＱＶＹＹＦＤＹ（配列番号４４；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号７４；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３；ＬＣＤＲ３）［クローンＩｇＧ１−０６（ＶＬドメインはＪＫ１配列を含有する）］；
（ｓ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９；ＨＣＤＲ２）、ＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３；ＬＣＤＲ３）［クローンＩｇＧ１−０７（ＶＬドメインはＪＫ４配列を含有する）］；
（ｔ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９；ＨＣＤＲ２）、ＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３；ＬＣＤＲ３）［クローンＩｇＧ１−０８（ＶＬドメインはＪＫ１配列を含有する）］；
（ｕ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９；ＨＣＤＲ２）、ＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号７４；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３；ＬＣＤＲ３）［クローンＩｇＧ１−０９（ＶＬドメインはＪＫ１配列を含有する）］；
（ｖ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９；ＨＣＤＲ２）、ＱＬＹＦＦＤＹ（配列番号４５；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３；ＬＣＤＲ３）［クローンＩｇＧ１−１０（ＶＬドメインはＪＫ４配列を含有する）］；
（ｗ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９；ＨＣＤＲ２）、ＱＬＹＦＦＤＹ（配列番号４５；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３；ＬＣＤＲ３）［クローンＩｇＧ１−１１（ＶＬドメインはＪＫ１配列を含有する）］；
（ｘ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９；ＨＣＤＲ２）、ＱＬＹＦＦＤＹ（配列番号４５；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号７４；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３；ＬＣＤＲ３）［クローンＩｇＧ１−１２（ＶＬドメインはＪＫ１配列を含有する）］；
（ｙ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９；ＨＣＤＲ２）、ＱＬＹＡＦＤＹ（配列番号４６；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３；ＬＣＤＲ３）［クローンＩｇＧ１−１３（ＶＬドメインはＪＫ４配列を含有する）］；
（ｚ）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９；ＨＣＤＲ２）、ＱＬＹＡＦＤＹ（配列番号４６；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３；ＬＣＤＲ３）［クローンＩｇＧ１−１４（ＶＬドメインはＪＫ１配列を含有する）］；
（ｚ１）アミノ酸配列
ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８；ＨＣＤＲ１）、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９；ＨＣＤＲ２）、ＱＬＹＡＦＤＹ（配列番号４６；ＨＣＤＲ３）、ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号７４；ＬＣＤＲ１）、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２；ＬＣＤＲ２）およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３；ＬＣＤＲ３）［クローンＩｇＧ１−１５（ＶＬドメインはＪＫ１配列を含有する）］。
【００５７】
一部の態様において、本発明は、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分を提供するものであり、当該抗体は、重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域を含有し、この場合において、
（ａ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｂ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＶＹＹＦＤＹ（配列番号４４）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｃ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＦＦＤＹ（配列番号４５）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｄ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＡＦＤＹ（配列番号４６）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｅ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＴＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号４８）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＩＰＷＴ（配列番号４７）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｆ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＡＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号４９）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＤ（配列番号５０）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｇ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＴＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号４８）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＩＰＷＴ（配列番号４７）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｈ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＡＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号４９）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＤ（配列番号５０）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｉ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＮＴＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号５１）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＴＷＬＮ（配列番号５２）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＡＳ（配列番号５３）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、
（ｊ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＶＹＹＦＤＹ（配列番号４４）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＨＳ（配列番号５４）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、または
（ｋ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＶＹＹＦＤＹ（配列番号４４）のＨＣＤＲ３を含み、ならびにＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含む。
【００５８】
一部の態様において、本明細書は、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分を開示するものであり、この場合において当該抗体は、重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域を含有し、この場合において当該ＶＨ領域は、表１７のＶＨ領域アミノ酸配列のうちのいずれか１つを含有し、当該ＶＬ領域は、表１７のＶＬ領域アミノ酸配列のいずれか１つを含有する。
【００５９】
一部の態様において、本明細書は、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分を開示するものであり、当該抗体は、重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域を含有し、この場合において、
（ａ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号１を含み、かつ、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号２を含み、
（ｂ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号３を含み、かつ、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号４を含み、
（ｃ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号５を含み、かつ、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号６を含み、
（ｄ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号７を含み、かつ、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号８を含み、
（ｅ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号９を含み、かつ、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号１０を含み、または
（ｆ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号１１を含み、かつ、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号１２を含む。
【００６０】
一部の態様において、本明細書は、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分を開示するものであり、当該抗体は、重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域を含有し、この場合において、
（ａ）ＶＨ領域アミノ酸配列は、配列番号１に対し、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であり、ＶＬ領域アミノ酸配列は、配列番号２に対し、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である；
（ｂ）ＶＨ領域アミノ酸配列は、配列番号３に対し、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であり、ＶＬ領域アミノ酸配列は、配列番号４に対し、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である；
（ｃ）ＶＨ領域アミノ酸配列は、配列番号５に対し、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であり、ＶＬ領域アミノ酸配列は、配列番号６に対し、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である；
（ｄ）ＶＨ領域アミノ酸配列は、配列番号７に対し、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であり、ＶＬ領域アミノ酸配列は、配列番号８に対し、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である；
（ｅ）ＶＨ領域アミノ酸配列は、配列番号９に対し、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であり、ＶＬ領域アミノ酸配列は、配列番号１０に対し、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である；または
（ｆ）ＶＨ領域アミノ酸配列は、配列番号１１に対し、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であり、ＶＬ領域アミノ酸配列は、配列番号１２に対し、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である。一部の態様において、抗ＰＤ１抗体のＣＤＲアミノ酸配列は、列挙される配列中のＣＤＲアミノ酸配列に対して１００％同一であるが、ＦＲアミノ酸配列は、列挙される配列中のＦＲアミノ酸配列に対し、１００％未満の同一性である。
【００６１】
一部の態様において、本明細書に規定される抗体または抗原結合部分は、単離されてもよい。
【００６２】
本明細書に規定される抗体分子または抗原結合部分は、ＰＤ１への結合を、本明細書に開示されるＣＤＲセットを含有する抗体またはその抗原結合部分と交差競合できる。一部の実施形態において、本発明は、単離された抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分を提供するものであって、当該抗体または抗原結合部分は、本明細書に開示するＣＤＲのセットを含む抗体または抗原結合部分と、ＰＤ１との結合に関して交差競合し、また（ａ）完全なヒト生殖細胞系列フレームワークのアミノ酸配列を含み；（ｂ）ヒトＰＤ１およびカニクイザルＰＤ１に特異的に結合し；（ｃ）２６０ｎｇ／ｍｌより低いＥＣ５０でヒトＰＤ１のヒトＰＤ−Ｌ１への結合を拮抗し；（ｄ）３２ｎＭより低いＫＤで単量体カニクイザルＰＤ１と結合し；（ｅ）６．５ｎＭより低いＥＣ５０でカニクイザルＰＤ１発現細胞に結合し；（ｆ）カニクイザルＰＤ１およびヒトＰＤ１における機能的に同一のエピトープに結合し；（ｇ）ＬＣＤＲ２において高いＭＨＣクラスＩＩ結合アフィニティをもつヒト生殖細胞系列ペプチド配列を含み；（ｈ）抗体Ｍａｂ００５の可変ドメイン配列を含む抗ＰＤ１抗体と比較して少ない数の免疫原性ペプチドを含み；（ｉ）抗体Ｍａｂ００５の可変ドメイン配列を含む抗ＰＤ１抗体と比較して低い免疫原性を示し；（ｊ）脱免疫化ＶＬ領域（例えば、完全脱免疫化ＶＬ領域）を含み；（ｋ）ＫＤＲ、ＦＺＤ５、ＵＬＢＰ２およびＥＰＨＢ６のうちの１もしくは複数への結合を示さず；ならびに／または（ｌ）ＫＤＲ、ＦＺＤ５、ＵＬＢＰ２およびＥＰＨＢ６のうちの１もしくは複数を無効にしないもしくは最小限で無効にする。一部の実施形態では、抗体または抗原結合部分のＫＤ値は、ビアコア解析により決定できる。一部の実施形態では、抗体または抗原結合部分のＥＣ５０値は、ＰＤ−１発現細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）のフローサイトメトリー染色により決定できる。一部の実施形態では、ＫＤＲ、ＦＺＤ５、ＵＬＢＰ２またはＥＰＨＢ６への結合は、フローサイトメトリー解析により決定できる。
【００６３】
一部の実施形態では、抗ＰＤ１抗体または抗原結合部分は、低い免疫原性を有する。特定の場合においては、抗体または抗原結合部分は、ＧＦＴＦＳＳＹＭＭＳ（配列番号２９）のＨＣＤＲ１、ＴＩＳＧＧＧＡＮＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号３０）のＨＣＤＲ２、ＱＬＹＹＦＤＹ（配列番号３１）のＨＣＤＲ３、ＬＡＳＱＴＩＧＴＷＬＴ（配列番号３５）のＬＣＤＲ１、ＴＡＴＳＬＡＤ（配列番号３６）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＶＹＳＩＰＷＴ（配列番号３７）のＬＣＤＲ３を含む抗ＰＤ１抗体と比べて、低い免疫原性を示す。一部の例では、抗体または抗原結合部分の免疫原性リスクは、インシリコで、当該抗体または部分（例えば抗体または部分の可変領域にある）におけるＴ細胞エピトープの位置を特定することにより決定されてもよい。
【００６４】
例えば、抗体または抗原結合部分にあるＴ細胞エピトープは、ｉＴｏｐｅ（商標）を使用して特定されてもよい。ｉＴｏｐｅ（商標）を使用して、ヒトＭＨＣクラスＩＩに対する無差別的な高いアフィニティの結合を有するペプチドのＶＬ領域およびＶＨ領域の配列を分析することができる。無差別的な高いアフィニティのＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドは、薬剤タンパク質の臨床免疫原性に関する高いリスク指標であるＴ細胞エピトープの存在と相関すると考えられている。ｉＴｏｐｅ（商標）ソフトウェアは、ペプチドのアミノ酸側鎖と、３４種のヒトＭＨＣクラスＩＩアレルの開放末端結合溝（ｇｒｏｏｖｅ）内の特定の結合ポケット（特にポケット位置；ｐ１、ｐ４、ｐ６、ｐ７およびｐ９）との間の有益な相互作用を予測する。これらのアレルは、広く存在する最も普遍的なＨＬＡ−ＤＲアレルであり、任意の特定の民族集団で最も多く存在するものによって起こる重み付けはない。当該アレルのうちの２０種が、「開いた」ｐ１構造を含有している。そして１４種が「閉じた」構造を含有しており、８３位のグリシンがバリンで置換されている。重要な結合残基の位置は、被験タンパク質配列にわたり８アミノ酸が重複している９ｍｅｒペプチドのインシリコ生成により取得される。このプロセスによって、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する、または結合しないペプチド同士を高い正確性で識別することに成功した。
【００６５】
抗体または抗原結合部分中のＴ細胞エピトープは、ＴＣＥＤ（商標）（Ｔ細胞エピトープデータベース（Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（商標）））を使用してＶＬ領域配列とＶＨ領域配列とを解析し、過去にインビトロでの他のタンパク質配列のヒトＴ細胞エピトープマッピング解析により特定されたＴ細胞エピトープとの合致を検索することにより特定されてもよい。ＴＣＥＤ（商標）を使用して、非関連タンパク質に由来するペプチドの大きな（１０，０００個を超えるペプチド）データベースに対する任意の被験配列と、抗体配列とを検索する。
【００６６】
一部の実施形態では、抗ＰＤ１抗体または抗原結合部分は、その配列において以下のペプチドのうちの１つまたは複数の数が少ないことから、低い免疫原性を呈する場合がある：高アフィニティ外来物（「ＨＡＦ」−高免疫原性リスク）、低アフィニティ外来物（「ＬＡＦ」−低免疫原性リスク）、および／またはＴＣＥＤ＋（過去にＴＣＥＤ（商標）データベースにおいて特定されたエピトープ）。
【００６７】
一部の実施形態では、抗ＰＤ１抗体または抗原結合部分は、その配列において高い生殖細胞系列エピトープ（ＧＥ）含量を有する場合がある。一部の例では、抗ＰＤ１抗体または抗原結合部分は、その配列（例えば、ＶＬ領域配列および／またはＶＨ領域配列において）において３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個（または２０個より多い）生殖細胞系列エピトープを有する。生殖細胞系列エピトープは、高いＭＨＣクラスＩＩ結合アフィニティをもつヒト生殖細胞系列ペプチド配列として規定され得る。生殖細胞系列エピトープの９ｍｅｒペプチドは、広範な生殖細胞系列ペプチドを用いた過去の研究により立証されたように、Ｔ細胞寛容によって免疫原性である可能性は低い。重要なことは、そうした生殖細胞系列のｖ−ドメインエピトープ（ヒト抗体定常領域中の類似配列によりさらに補助される）は、抗原提示細胞の細胞膜でのＭＨＣクラスＩＩ占有に関しても競合するため、Ｔ細胞刺激に必要とされる「活性化閾値」を達成するのに充分な外来性ペプチド提示のリスクを低下させることである。ゆえにＧＥ含量の高さは抗体治療剤の臨床開発では有益な性質であり、低免疫原性をもたらし得る。一部の例では、抗ＰＤ１抗体または抗原結合部分は、高いＭＨＣクラスＩＩ結合アフィニティをもつヒト生殖細胞系列ペプチド配列（例えば生殖細胞系列エピトープ）を、ＬＣＤＲ２に含有する。
【００６８】
ある実施形態では、抗ＰＤ１抗体または抗原結合部分は、抗体Ｍａｂ００５の可変ドメイン配列（表２）を含む抗ＰＤ１抗体と比較して、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方のフレームワークに存在するＨＡＦ、ＬＡＦ、および／またはＴＣＥＤ＋エピトープの数が少ない場合がある。一部の実施形態では、ＨＡＦ、ＬＡＦおよび／またはＴＣＥＤ＋エピトープは、抗ＰＤ１抗体もしくは抗原結合部分のＶＬ領域配列および／またはＶＨ領域配列に存在しない。
【００６９】
例えば、Ｍａｂ００５のＬＣＤＲ−１中に存在するＴＣＥＤ＋およびＨＡＦペプチドの「ＶＴＩＴＣＬＡＳＱ」（配列番号８３）は、抗ＰＤ１抗体または抗原結合部分において６位でＬをＲに変異させることで除去され得、この配列は軽鎖ＧＥの「ＶＴＩＴＣＲＡＳＱ」（配列番号８４）に転換される。
【００７０】
一部の実施形態では、Ｍａｂ００５のＬＣＤＲ−１中に存在するＬＡＦペプチド「ＩＧＴＷＬＴＷＹＱ」（配列番号８５）は、抗ＰＤ１抗体または抗原結合部分において（表１２）、４位に単一のマウス残基Ｗのみを保持することで除去され得、この配列は「ＩＳＳＷＬＮＷＹＱ」（配列番号８６）に転換される。
【００７１】
一部の実施形態では、Ｍａｂ００５  ＨＡＦペプチド「ＬＬＩＹＴＡＴＳＬ」（配列番号８７）および「ＬＩＹＴＡＴＳＬＡ」（配列番号８８）、ならびにＬＡＦペプチド「ＩＹＴＡＴＳＬＡＤ」（配列番号８９）は、抗ＰＤ１抗体または抗原結合部分において、マウス配列「ＴＡＴＳＬＡＤ」（配列番号３６）から完全な生殖細胞系列配列「ＡＡＳＳＬＱＳ」（配列番号４２）へのＬＣＤＲ２の変異によって、除かれてＧＥ配列に変換できる。
【００７２】
Ｍａｂ００５  ＦＷ３／ＬＣＤＲ３領域はまた、ＬＡＦペプチド「ＹＹＣＱＱＶＹＳＩ」（配列番号９０）をコードする。一部の実施形態では、このエピトープは、抗ＰＤ１抗体または抗原結合部分において、６位のＶのＳへの生殖細胞系列化変異によって除くことができる。
【００７３】
Ｍａｂ００５のＶＨ領域において、ペプチド配列「ＬＹＹＦＤＹＷＧＱ」（配列番号９１）（ＨＣＤＲ３およびＦＷ４にわたる）は、ＬＡＦであることがわかった。一部の実施形態において、このペプチドにおける３位のＹのＡへの変異により、抗ＰＤ１抗体または抗原結合部分（表４、１２）におけるこのエピトープの除去が可能になる。
【００７４】
「交差競合する」、「交差競合」、「交差遮断する」、「交差遮断される」、および「交差遮断すること」という用語は本明細書において相互交換可能に使用され、抗体またはその部分がもつ、標的ＰＤ１（例えば、ヒトＰＤ１）に対する直接結合または本発明の抗ＰＤ１抗体のアロステリック調節を介した間接的結合を干渉する能力を意味する。抗体またはその部分が、別物質による標的結合に干渉することができる度合、つまり本発明により交差遮断する、または交差競合すると言えるかどうかは、競合結合アッセイを使用して決定され得る。結合競合アッセイの一例は、ＨＴＲＦ法（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｔｉｍｅ  Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）である。１つの特に適した定量的交差競合アッセイは、ＦＡＣＳ系またはＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ系の方法を使用して、標識（例えばＨｉｓタグ化、ビオチン化、または放射性標識）された抗体またはその部分と、他の抗体またはその部分との間の、標的への結合に関する競合を測定する。概して、交差競合抗体またはその部分は、例えば、アッセイの間に、および第二の抗体またはその部分の存在下で、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドの記録される変位が、所与の量で存在する潜在的に交差遮断する抗体またはその断片による、（例えばＦＡＣＳ系競合アッセイにおける）理論上の最大変位（例えばコールド（例えば非標識）抗体または交差遮断されるために必要なその断片による変位）の１００％以下となるように、交差競合アッセイにおいて標的に結合することとなるものである。交差競合抗体またはその部分は、１０％〜１００％、または５０％〜１００％の記録される変位を有することが好ましい。
【００７５】
本明細書において規定される抗ＰＤ１抗体分子または抗原結合部分は、熱的に安定であってもよい。一部の場合では、抗体分子または抗原結合部分は、マウス抗ＰＤ１抗体のＭａｂ００５またはＭａｂ００５−ＩｇＧ１（ヒト化）と実質的に同じ熱的安定性を有してもよい。一部の場合では、抗体分子または抗原結合部分は、マウス抗ＰＤ１抗体のＭａｂ００５またはＭａｂ００５−ＩｇＧ１（ヒト化）よりも熱的な安定性が高くてもよい。一部の例では、抗体分子または抗原結合部分は、約９０℃〜約９３℃の融解温度（Ｔｍ）を有してもよく、およびＩｇＧ１形式であってもよい。一部の態様では、抗体分子または抗原結合部分は、約９０．８℃〜約９２．２℃のＴｍを有してもよく、およびＩｇＧ１形式であってもよい。一部の態様においては、抗原結合部分は、Ｆａｂ形式であってもよい。抗体分子またはその抗原結合部分の融解温度は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）アッセイにより解析されてもよい。
【００７６】
本明細書に規定される抗ＰＤ１抗体分子または抗原結合部分は、酸化に対して抵抗性（例えば、露出アミノ酸残基の酸化に対する抵抗性）であってもよい。一部の場合では、抗体分子または抗原結合部分は、マウス抗ＰＤ１抗体のＭａｂ００５またはＭａｂ００５−ＩｇＧ１（ヒト化）と比較して、または抗体Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１（ヒト化）の可変ドメイン配列を含有する抗ＰＤ１抗体と比較して、低い露出アミノ酸残基の酸化を経てもよい。抗体分子またはその抗原結合部分の酸化抵抗性は、酸化試薬（例えば、Ｈ２Ｏ２）を抗体分子または抗原結合部分に添加し、酸化により誘導された変化を逆相（ＲＰ）および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）法により解析することにより解析されてもよい。
【００７７】
ある実施形態では、抗体分子またはその抗原結合部分はＰＤ１に特異的に結合して、細胞膜受容体ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２としても知られている）、ＦＺＤ５（Ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体５）、ＵＬＢＰ２（ＵＬ１６結合タンパク質２）およびＥＰＨＢ６のうちの１または複数とは結合しない（または特異的に結合しない）。一部の態様においては、ＫＤＲ、ＦＺＤ５、ＵＬＢＰ２および／またはＥＰＨＢ６は、ヒトタンパク質である。一部の実施形態においては、ＫＤＲは、アカゲザルタンパク質である。一部の実施形態では、ヒトＫＤＲタンパク質は、配列番号２２のアミノ酸配列か、または配列番号２２に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、またはこれらからなる。一部の実施形態では、アカゲザルＫＤＲタンパク質は、配列番号２３のアミノ酸配列か、または配列番号２３に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、またはこれらからなる。一部の実施形態では、ヒトＦＺＤ５タンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列か、または配列番号２４に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、またはこれらからなる。一部の実施形態では、ヒトＵＬＢＰ２タンパク質は、配列番号２５のアミノ酸配列か、または配列番号２５に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、またはこれらからなる。一部の実施形態では、抗体分子またはその抗原結合部分は、ＫＤＲ、ＦＺＤ５、ＵＬＢＰ２およびＥＰＨＢ６のうちのいずれとも結合しない。一部の実施形態では、抗体分子またはその抗原結合部分は、抗体Ｍａｂ００５またはＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）が示す前記細胞膜受容体への結合と比較して、ＫＤＲ、ＦＺＤ５、ＵＬＢＰ２およびＥＰＨＢ６のうちの１または複数への結合は少ない。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分のＰＤ１、ＫＤＲ、ＦＺＤ５、ＵＬＢＰ２またはＥＰＨＢ６への結合は、フローサイトメトリー解析で決定できる。
【００７８】
一部の実施形態では、本明細書で開示する抗体分子またはその抗原結合部分は、ＰＤ１に特異的に結合して、ＫＤＲ、ＦＺＤ５、ＵＬＢＰ２およびＥＰＨＢ６（例えば、ヒトＫＤＲ、ヒトＦＺＤ５、ヒトＵＬＢＰ２またはヒトＥＰＨＢ６）のうちの１または複数を無効にしないまたは最小限で無効にする。一部の実施形態では、本明細書で開示する抗体分子またはその抗原結合部分は、ＰＤ１に特異的に結合して、抗体Ｍａｂ００５またはＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）で示されるＫＤＲ、ＦＺＤ５、ＵＬＢＰ２またはＥＰＨＢ６のアゴニズムと比較して、ＫＤＲ、ＦＺＤ５、ＵＬＢＰ２およびＥＰＨＢ６（例えば、ヒトＫＤＲ、ヒトＦＺＤ５、ヒトＵＬＢＰ２またはヒトＥＰＨＢ６）のうちの１または複数のアゴニズムが少ない。一部の場合では、抗体分子またはその抗原結合部分によるＫＤＲ、ＦＺＤ５、ＵＬＢＰ２またはＥＰＨＢ６のアゴニズムは、ＫＤＲ（またはＶＥＧＦＲ２）、ＦＺＤ５、ＵＬＢＰ２またはＥＰＨＢ６のシグナル伝達レポーターアッセイによって決定できる。
【００７９】
本明細書に規定される抗体分子または抗原結合部分は、１つまたは複数の置換、欠失および／または挿入を含んでもよく、それらにより例えばグリコシル化部位（Ｎ結合型またはＯ結合型）、脱アミノ化部位、リン酸化部位または異性化／断片化部位などの翻訳後修飾（ＰＴＭ：ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）部位が除去される。
【００８０】
３５０を超えるタイプのＰＴＭが公知である。重要なＰＴＭの型としては、リン酸化、グリコシル化（Ｎ結合型およびＯ結合型）、ＳＵＭＯ化、パルミトイル化、アセチル化、硫酸化、ミリストイル化、プレニル化、および（Ｋ残基およびＲ残基の）メチル化が挙げられる。特定のＰＴＭの原因となる推定アミノ酸部位を特定するための統計的手法は、当分野に周知である（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １：１３１８−１３２１を参照のこと）。例えば置換、欠失および／または挿入によりそうした部位を除去し、次いで任意で（ａ）結合活性、および／または（ｂ）ＰＴＭの消失を検証（実験的に、および／または理論的に）することが予期される。
【００８１】
例えば、ＭＡｂ００５マウスＨＣＤＲ２（本明細書に規定される、すなわちアミノ酸配列ＶＡＴＩＳＧＧＧＡＮＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号９２））は、１０位の残基（Ｎ）で推定脱アミド化部位を有すると特定されている。本発明のＨＣＤＲ２中の同等の位置にあるこの部位を、例えば保存的置換または非保存的置換（例えば、Ｅ、Ｑ、ＳまたはＤへの）により除去することが予期される（例えばクローン０６Ｄ０２、ならびに表３および４の他のクローンと同様に）。
【００８２】
同様に、ＭＡｂ００５マウスＨＣＤＲ１（本明細書に規定される、すなわちアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＭＭＳ（配列番号２９））は、８位の残基（Ｍ）で推定酸化部位を有すると特定されている。本発明のＨＣＤＲ１中の同等の位置にあるこの部位を、例えば保存的置換または非保存的置換（例えば、Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙへの）により除去することが予期される（例えばクローン０６Ｄ０２、ならびに表３および４のさらなる配列と同様に）。
【００８３】
抗体分子またはその抗原結合部分は、ヒト、ヒト化またはキメラであってもよい。
【００８４】
抗体分子またはその抗原結合部分は、１つまたは複数のヒト可変ドメインフレームワークスキャホールドを含有してもよく、その中にはＣＤＲが挿入されている。例えば、ＶＨ領域、ＶＬ領域、またはＶＨ領域およびＶＬ領域の両方が、１つまたは複数のヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列を含有してもよい。
【００８５】
抗体分子またはその抗原結合部分は、ＩＧＨＶ３−７ヒト生殖細胞系列スキャホールドを含有してもよく、その中には対応するＨＣＤＲ配列が挿入されている。抗体分子またはその抗原結合部分は、ＩＧＨＶ３−７ヒト生殖細胞系列スキャホールドのアミノ酸配列を含有するＶＨ領域を含有してもよく、その中には対応するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列のセットが挿入されている。
【００８６】
抗体分子またはその抗原結合部分は、ＩＧＫＶ１−３９ヒト生殖細胞系列スキャホールドを含有してもよく、その中には対応するＬＣＤＲ配列が挿入されている。抗体分子またはその抗原結合部分は、ＩＧＫＶ１−３９ヒト生殖細胞系列スキャホールドのアミノ酸配列を含有するＶＬ領域を含有してもよく、その中には対応するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列のセットが挿入されている。
【００８７】
抗体分子またはその抗原結合部分は、中に対応するＨＣＤＲ配列が挿入されているＩＧＨＶ３−７ヒト生殖細胞系列スキャホールドと、中に対応するＬＣＤＲ配列が挿入されているＩＧＫＶ１−３９ヒト生殖細胞系列スキャホールドとを含有してもよい。抗体分子またはその抗原結合部分は、中に対応するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列のセットが挿入されているＩＧＨＶ３−７ヒト生殖細胞系列スキャホールドのアミノ酸配列を含有するＶＨ領域と、中に対応するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列のセットが挿入されているＩＧＫＶ１−３９ヒト生殖細胞系列スキャホールドのアミノ酸配列を含有するＶＬ領域とを含有してもよい。ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、表４のクローンのいずれか１つのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列であってもよい（６つすべてのＣＤＲ配列が、同じクローン由来である）。
【００８８】
一部の態様では、抗体分子またはその抗原結合部分は、免疫グロブリン定常領域を含有してもよい。一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２である。追加的な実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２である。抗体分子またはその抗原結合部分は、免疫学的に不活性な定常領域を含有してもよい。一部の態様では、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分は、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域か、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａのアミノ酸置換を含有するヒトＩｇＧ１定常領域か、またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７ＡおよびＰ３３１Ｓのアミノ酸置換を含有するヒトＩｇＧ１定常領域かを含有する免疫グロブリン定常領域を含有してもよい。一部の態様では、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分は、野生型ヒトＩｇＧ２定常領域または野生型ヒトＩｇＧ４定常領域を含有する、免疫グロブリン定常領域を含有してもよい。一部の態様では、抗ＰＤ１抗体は、表１８のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含有する免疫グロブリン定常領域を含有してもよい。表１８のＦｃ領域配列は、ＣＨ１ドメインから始まる。一部の態様では、抗ＰＤ１抗体は、ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ１−３ＭまたはヒトＩｇＧ１−４ＭのＦｃ領域のアミノ酸配列を含有する免疫グロブリン定常領域を含有してもよい。例えば、ヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）のＦｃ領域は、野生型のヒトＩｇＧ４のＦｃ領域と比較して以下の置換を含有する：Ｓ２２８Ｐ。例えば、ヒトＩｇＧ１−３ＭのＦｃ領域は、野生型のヒトＩｇＧ１のＦｃ領域と比較して以下の置換を含有する：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ。一方で、ヒトＩｇＧ１−４ＭのＦｃ領域は、野生型のヒトＩｇＧ１のＦｃ領域と比較して以下の置換を含有する：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７ＡおよびＰ３３１Ｓ。一部の態様では、免疫グロブリン分子の定常領域中のアミノ酸残基の位置は、ＥＵの命名法（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｔｈｅｒａｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：７７−９４）に従って番号付けされる。一部の態様では、免疫グロブリン定常領域は、ＲＤＥＬＴ（配列番号９３）モチーフ、またはＲＥＥＭ（配列番号９４）モチーフ（表１８の下線部分）を含有してもよい。ＲＥＥＭ（配列番号９４）アロタイプは、ＲＤＥＬＴ（配列番号９３）アロタイプよりも少ないヒト集団に存在する。一部の態様では、抗ＰＤ１抗体は、配列番号１３〜１９のいずれか１つを含有する免疫グロブリン定常領域を含有してもよい。一部の態様では、抗ＰＤ１抗体は、表４のクローンのいずれか１つの６つのＣＤＲアミノ酸配列、および表１８のＦｃ領域アミノ酸配列のいずれか１つを含有してもよい。一部の態様では、抗ＰＤ１抗体は、表１８のＦｃ領域アミノ酸配列のいずれか１つを含有する免疫グロブリン重鎖定常領域、およびカッパ軽鎖定常領域またはラムダ軽鎖定常領域である免疫グロブリン軽鎖定常領域を含有してもよい。
【００８９】
一部の態様において、本明細書は、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分を開示するものであり、当該抗体は、重鎖可変（ＶＨ）領域、軽鎖可変（ＶＬ）領域、および重鎖定常領域を含有し、この場合において、
（ａ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、ならびに重鎖定常領域は、配列番号１３〜１９のいずれか１つを含み； 
（ｂ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＶＹＹＦＤＹ（配列番号４４）のＨＣＤＲ３を含み、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、ならびに重鎖定常領域は、配列番号１３〜１９のいずれか１つを含み； 
（ｃ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＦＦＤＹ（配列番号４５）のＨＣＤＲ３を含み、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、ならびに重鎖定常領域は、配列番号１３〜１９のいずれか１つを含み； 
（ｄ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＡＦＤＹ（配列番号４６）のＨＣＤＲ３を含み、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、ならびに重鎖定常領域は、配列番号１３〜１９のいずれか１つを含み； 
（ｅ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＴＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号４８）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＩＰＷＴ（配列番号４７）のＬＣＤＲ３を含み、ならびに重鎖定常領域は、配列番号１３〜１９のいずれか１つを含み； 
（ｆ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＡＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号４９）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＤ（配列番号５０）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、ならびに重鎖定常領域は、配列番号１３〜１９のいずれか１つを含み； 
（ｇ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＴＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号４８）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＩＰＷＴ（配列番号４７）のＬＣＤＲ３を含み、ならびに重鎖定常領域は、配列番号１３〜１９のいずれか１つを含み； 
（ｈ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＡＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号４９）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＤ（配列番号５０）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、ならびに重鎖定常領域は、配列番号１３〜１９のいずれか１つを含み； 
（ｉ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＮＴＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号５１）のＨＣＤＲ２、およびＱＬＹＧＦＤＹ（配列番号４０）のＨＣＤＲ３を含み、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＴＷＬＮ（配列番号５２）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＡＳ（配列番号５３）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、ならびに重鎖定常領域は、配列番号１３〜１９のいずれか１つを含み； 
（ｊ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＶＹＹＦＤＹ（配列番号４４）のＨＣＤＲ３を含み、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＨＳ（配列番号５４）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、ならびに重鎖定常領域は、配列番号１３〜１９のいずれか１つを含み；または
（ｋ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＧＦＴＦＳＳＹＬＭＳ（配列番号３８）のＨＣＤＲ１、ＶＡＴＩＳＧＧＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号３９）のＨＣＤＲ２、およびＱＶＹＹＦＤＹ（配列番号４４）のＨＣＤＲ３を含み、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＮ（配列番号４１）のＬＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号４２）のＬＣＤＲ２、およびＱＱＳＹＳＴＰＷＴ（配列番号４３）のＬＣＤＲ３を含み、ならびに重鎖定常領域は、配列番号１３〜１９のいずれか１つを含む。 
【００９０】
一部の態様において、本明細書は、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分を開示するものであり、当該抗体は、重鎖可変（ＶＨ）領域、軽鎖可変（ＶＬ）領域、および重鎖定常領域を含有し、この場合において、
（ａ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号１を含有し、または配列番号１からなり、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号２を含有し、または配列番号２からなり、および重鎖定常領域は、野生型ヒトＩｇＧ４定常領域、Ｓ２２８Ｐのアミノ酸置換を含有するヒトＩｇＧ４定常領域、野生型ヒトＩｇＧ２定常領域、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域、またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａのアミノ酸置換を含有するヒトＩｇＧ１定常領域を含有し、
（ｂ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号３を含有し、または配列番号３からなり、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号４を含有し、または配列番号４からなり、および重鎖定常領域は、野生型ヒトＩｇＧ４定常領域、Ｓ２２８Ｐのアミノ酸置換を含有するヒトＩｇＧ４定常領域、野生型ヒトＩｇＧ２定常領域、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域、またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａのアミノ酸置換を含有するヒトＩｇＧ１定常領域を含有し、
（ｃ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号５を含有し、または配列番号５からなり、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号６を含有し、または配列番号６からなり、および重鎖定常領域は、野生型ヒトＩｇＧ４定常領域、Ｓ２２８Ｐのアミノ酸置換を含有するヒトＩｇＧ４定常領域、野生型ヒトＩｇＧ２定常領域、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域、またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａのアミノ酸置換を含有するヒトＩｇＧ１定常領域を含有し、
（ｄ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号７を含有し、または配列番号７からなり、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号８を含有し、または配列番号８からなり、および重鎖定常領域は、野生型ヒトＩｇＧ４定常領域、Ｓ２２８Ｐのアミノ酸置換を含有するヒトＩｇＧ４定常領域、野生型ヒトＩｇＧ２定常領域、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域、またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａのアミノ酸置換を含有するヒトＩｇＧ１定常領域を含有し、
（ｅ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号９を含有し、または配列番号９からなり、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号１０を含有し、または配列番号１０からなり、および重鎖定常領域は、野生型ヒトＩｇＧ４定常領域、Ｓ２２８Ｐのアミノ酸置換を含有するヒトＩｇＧ４定常領域、野生型ヒトＩｇＧ２定常領域、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域、またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａのアミノ酸置換を含有するヒトＩｇＧ１定常領域を含有し、または、
（ｆ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号１１を含有し、または配列番号１１からなり、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号１２を含有し、または配列番号１２からなり、および重鎖定常領域は、野生型ヒトＩｇＧ４定常領域、Ｓ２２８Ｐのアミノ酸置換を含有するヒトＩｇＧ４定常領域、野生型ヒトＩｇＧ２定常領域、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域、またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａのアミノ酸置換を含有するヒトＩｇＧ１定常領域を含有する。
【００９１】
一部の態様において、本明細書は、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分を開示するものであり、当該抗体は、重鎖可変（ＶＨ）領域、軽鎖可変（ＶＬ）領域、および重鎖定常領域を含有し、この場合において、
（ａ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号１を含有し、または配列番号１からなり、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号２を含有し、または配列番号２からなり、および重鎖定常領域は、配列番号１３〜１９のいずれか１つを含有する； 
（ｂ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号３を含有し、または配列番号３からなり、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号４を含有し、または配列番号４からなり、および重鎖定常領域は、配列番１３〜１９のいずれか１つを含有する； 
（ｃ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号５を含有し、または配列番号５からなり、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号６を含有し、または配列番号６からなり、重鎖定常領域は、配列番号１３〜１９のいずれか１つを含有する； 
（ｄ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号７を含有し、または配列番号７からなり、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号８を含有し、または配列番号８からなり、重鎖定常領域は、配列番号１３〜１９のいずれか１つを含有する； 
（ｅ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号９を含有し、または配列番号９からなり、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号１０を含有し、または配列番号１０からなり、重鎖定常領域は、配列番号１３〜１９のいずれか１つを含有する；または
（ｆ）ＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号１１を含有し、または配列番号１１からなり、ＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号１２を含有し、または配列番号１２からなり、および重鎖定常領域は、配列番号１３〜１９のいずれか１つを含有する。 
【００９２】
一部の態様では、抗ＰＤ１抗体は、免疫エフェクターが無効であってもよい。一部の態様では、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分は、免疫エフェクター機能を誘導せず、任意で免疫エフェクター機能を抑制する。一部の態様では、抗ＰＤ１抗体は、ヒトＦｃγＲＩ受容体、ＦｃγＲＩＩａ受容体、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体、およびＦｃγＲＩＩＩｂ受容体への測定可能な結合を欠いてもよいが、ヒトＦｃγＲＩＩｂ受容体への結合は維持し、任意で、ヒトＦｃＲｎ受容体への結合も維持する。ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩｂは、活性化受容体の例示である。ＦｃγＲＩＩｂは、阻害性受容体の例示である。ＦｃＲｎは、リサイクル受容体の例示である。一部の態様では、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分のヒトＦｃ受容体への結合アフィニティは、ビアコア（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標））解析により測定されてもよい。一部の態様では、ＨＴＲＦ法（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｔｉｍｅ  Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を使用して、ヒトＦｃ受容体への抗ＰＤ１抗体の結合を試験することができる。ＨＴＲＦ法の１つの例において、ヒトＩｇＧ１（野生型）が標識され、一揃いのＦｃガンマ受容体も同様にされ、次いで組換えＦｃ断片を含む抗体が、力価測定競合に使用される。一部の態様では、ＰＤ１陽性細胞と、ヒト白血球および抗ＰＤ１抗体とが混合されてもよく、そしてＣＤＣ、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰによる細胞殺傷が測定されてもよい。一部の態様では、ヒトＩｇＧ１−３Ｍ（表１８を参照）のＦｃ領域のアミノ酸配列を含有する抗ＰＤ１抗体は、エフェクターが無効である。一部の態様では、ヒトＩｇＧ１−３Ｍ（表１８を参照）のＦｃ領域のアミノ酸配列を含有する抗ＰＤ１抗体は、エフェクターが無効でない。
【００９３】
抗体分子またはその抗原結合部分は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆｖ断片、四量体抗体、四価抗体、多特異性抗体（例えば二価抗体）、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、モノクローナル抗体、または融合タンパク質であってもよい。１つの実施形態では、抗体は、第一の抗原と第二の抗原とに特異的に結合する二特異性抗体であってもよく、この場合において第一の抗原はＰＤ１であり、第二の抗原はＰＤ１ではない。抗体分子、ならびにその構築方法および使用方法は、例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ＆Ｈｕｄｓｏｎ（２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（９）：１１２６−１１３６）に記載されている。
【００９４】
本発明の別の態様では、治療剤に結合された、本明細書に規定される本発明の抗体分子またはその抗原結合部分を含有する免疫結合体が提供される。
【００９５】
適切な治療剤の例示としては、細胞毒素、放射性同位体、化学療法剤、免疫調節剤、抗血管新生剤、抗増殖剤、アポトーシス促進剤、ならびに細胞増殖抑制酵素および細胞溶解性酵素（例えば、ＲＮＡｓｅ）が挙げられる。さらなる治療剤としては、例えば免疫調節剤、抗血管新生剤、抗増殖剤またはアポトーシス促進剤をコードする遺伝子などの治療用核酸が挙げられる。これら薬剤の記述子は、相互排他的ではなく、ゆえに治療剤は、上述の用語の１つまたは複数を使用して記載されてもよい。
【００９６】
免疫結合体における使用に適した治療剤の例としては、タキサン、メイタンシン、ＣＣ−１０６５、およびデュオカルマイシン、カリケアミシンおよび他のエンジイン、ならびにオーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）が挙げられる。他の例としては、抗葉酸剤、ビンカアルカロイド、およびアントラサイクリンが挙げられる。植物毒素、他の生物活性タンパク質、酵素（すなわちＡＤＥＰＴ）、放射性同位体、光増感剤が、免疫結合体において使用されてもよい。さらに結合体は、細胞毒性剤として二次的な担体、例えばリポソームまたはポリマーなどを使用して作製され得る。適切な細胞毒素としては、細胞の機能を阻害または妨害し、および／または細胞の破壊をもたらす薬剤が挙げられる。代表的な細胞毒素としては、抗生物質、チューブリン重合の阻害剤、ＤＮＡに結合し、破壊するアルキル化剤、そしてタンパク質合成を破壊する、または例えばタンパク質キナーゼ、ホスファターゼ、トポイソメラーゼ、酵素およびサイクリンなどの必須の細胞タンパク質の機能を破壊する薬剤が挙げられる。
【００９７】
代表的な細胞毒素としては、以下に限定されないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、ゾルビシン、ミトキサントロン、エピルビシン、カルビシン、ノガラマイシン、メノガリル、ピタルビシン（ｐｉｔａｒｕｂｉｃｉｎ）、バルルビシン、シタラビン、ゲムシタビン、トリフルリジン、アンシタビン、エノシタビン、アザシチジン、ドキシフルジン（ｄｏｘｉｆｌｕｈｄｉｎｅ）、ペントスタチン、ブロクスジン（ｂｒｏｘｕｈｄｉｎｅ）、カペシタビン、クラドビン（ｃｌａｄｈｂｉｎｅ）、デシタビン、フロクスジン（ｆｌｏｘｕｈｄｉｎｅ）、フルダラビン、グーゲロチン、ピューロマイシン、テガフール、チアゾフン（ｔｉａｚｏｆｕｈｎ）、アダマイシン（ａｄｈａｍｙｃｉｎ）、シスプラチン、カルボプラチン、シクロフォスファミド、ダカルバジン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、メクロレタミン、プレドニゾン、プロカルバジン、メトトレキサート、フルロウラシル（ｆｌｕｒｏｕｒａｃｉｌ）、エトポシド、タキソール、タキソールアナログ、例えばシスプラチンおよびカルボプラチンなどのプラチン類、マイトマイシン、チオテパ、タキサン、ビンクリスチン、ダウノルビシン、エピルビシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、タモキシフェン、イダルビシン、ドラスタチン／オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、ヘミアステリン（ｈｅｍｉａｓｔｅｒｌｉｎ）、エスペラミシン、ならびにマイタンシノイドが挙げられる。
【００９８】
適切な免疫調節剤としては、腫瘍に対するホルモンの作用を遮断する抗ホルモン剤、およびサイトカイン産生を抑制する、自己抗原発現を下方制御する、またはＭＨＣ抗原をマスクする免疫抑制剤が挙げられる。
【００９９】
さらに、本明細書に規定される本発明の抗体分子またはその抗原結合部分をコードする核酸分子も提供される。核酸分子は、本明細書に記載される抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分の、（ａ）ＶＨ領域のアミノ酸配列、（ｂ）ＶＬ領域のアミノ酸配列、または（ｃ）ＶＨ領域とＶＬ領域の両方のアミノ酸配列をコードしてもよい。一部の態様では、本明細書に規定される核酸分子が単離されてもよい。
【０１００】
さらに、本明細書に規定される本発明の核酸分子を含有するベクターが提供される。ベクターは、発現ベクターであってもよい。
【０１０１】
また、本明細書に規定される本発明の核酸分子またはベクターを含有する宿主細胞も提供される。宿主細胞は、組換え宿主細胞であってもよい。
【０１０２】
さらなる態様において、抗ＰＤ１抗体および／またはその抗原結合部分を作製する方法も提供され、当該方法は、当該抗体および／もしくはその抗原結合部分の発現ならびに／または産生が生じる条件下で、本発明の宿主細胞を培養することと、当該宿主細胞または培養物から、当該抗体および／またはその抗原結合部分を単離することと、を含む。
【０１０３】
本発明の別の態様において、本明細書に規定される本発明の抗体分子もしくはその抗原結合部分、または本明細書に規定される本発明の核酸分子、または本明細書に規定される本発明のベクターを含有する医薬組成物が提供される。
【０１０４】
さらに、対象において免疫反応を強化する方法が提供され、当該方法は、本明細書に規定される本発明の抗体分子またはその抗原結合部分の有効量、または本明細書に規定される本発明の免疫結合体の有効量、または本明細書に規定される本発明の核酸分子の有効量、または本明細書に規定される本発明のベクターの有効量、または本明細書に規定される本発明の医薬組成物の有効量を当該対象に投与することを含む。
【０１０５】
さらなる態様において、対象において癌を治療または予防する方法が提供され、当該方法は、本明細書に規定される本発明の抗体分子もしくはその抗原結合部分の有効量、または本明細書に規定される本発明の免疫結合体の有効量、または本明細書に規定される本発明の核酸分子の有効量、または本明細書に規定される本発明のベクターの有効量、または本明細書に規定される本発明の医薬組成物の有効量を当該対象に投与することを含む。一部の場合では、本明細書に規定される本発明の抗体分子もしくはその抗原結合部分、または本明細書に規定される本発明の免疫結合体、または本明細書に規定される本発明の核酸分子、または本明細書に規定される本発明のベクターを対象に投与することは、対象において血管腫を誘発しないかまたは最小限の血管腫を誘発する。
【０１０６】
例えば、癌は、膵臓癌、メラノーマ、乳癌、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳腫瘍または中枢神経系の癌、末梢神経系の癌、食道癌、子宮頸癌、子宮癌または子宮内膜癌、口腔または咽頭の癌、肝癌、腎癌、精巣癌、胆管癌、小腸癌または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、または血液組織の癌であり得る。
【０１０７】
本発明はさらに、癌の治療における使用のための、本明細書に規定される本発明の抗体分子もしくはその抗原結合部分、または本明細書に規定される本発明の免疫結合体、または本明細書に規定される本発明の核酸分子、または本明細書に規定される本発明のベクター、または本明細書に規定される本発明の医薬組成物を提供する。
【０１０８】
別の態様において、本発明は、例えば抗癌剤などの第二の治療剤と組み合わせた併用において、別個に使用する、連続して使用する、または同時に使用するための、本明細書に規定される本発明の抗体分子もしくはその抗原結合部分、または免疫結合体、または核酸分子、または使用のためのベクター、または治療方法を提供する。
【０１０９】
さらなる態様において、癌の治療のための医薬品の製造における、本明細書に規定される本発明の抗体分子もしくはその抗原結合部分の使用、または本明細書に規定される本発明の免疫結合体の使用、または本明細書に規定される本発明の核酸分子の使用、または本明細書に規定される本発明のベクターの使用、または本明細書に規定される本発明の医薬組成物の使用が提供される。
【０１１０】
本発明はさらに、対象において感染症もしくは免疫疾患を治療または予防する方法を提供するものであり、当該方法は、本明細書に規定される抗体分子もしくはその抗原結合部分の有効量、または本明細書に規定される免疫結合体の有効量、または本明細書に規定される核酸分子の有効量、または本明細書に規定されるベクターの有効量、または本明細書に規定される医薬組成物の有効量を当該対象に投与することを含む。
【０１１１】
一実施形態において、本発明は、治療における使用のための本明細書に開示されるアミノ酸配列を含有する抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０１１２】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤、担体または希釈剤を含有してもよい。薬学的に許容可能な賦形剤は、二次的な反応を引き起こさない医薬組成物に入れられる化合物または化合物の組み合わせであってもよく、例えば、抗ＰＤ１抗体分子の投与の促進、その持続期間の延長、および／もしくは体内におけるその有効性の増加、または溶液中の可溶度の上昇を可能にする。これら薬学的に許容可能なビヒクルは周知であり、抗ＰＤ１抗体分子の投与形態の効果に応じて当業者により適合される。
【０１１３】
一部の実施形態では、抗ＰＤ１抗体分子は、凍結乾燥されて提供され、投与前に再構成されてもよい。例えば凍結乾燥された抗体分子は、滅菌水で再構成され、個体への投与前に生理食塩水と混合される。
【０１１４】
抗ＰＤ１抗体分子は通常、医薬組成物の形態で投与され、当該医薬組成物は、抗体分子に加えて少なくとも１つの構成要素を含有してもよい。したがって医薬組成物は、抗ＰＤ１抗体分子に加えて、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、または当業者に周知の他の物質を含有してもよい。そうした物質は、非毒性でなければならず、そして抗ＰＤ１抗体分子の効能に干渉してはならない。担体または他の物質の正確な性質は、投与経路に依存することとなり、これは、以下に検討されるように、ボーラス、点滴、注射または任意の他の適切な経路によるものであってもよい。
【０１１５】
例えば注射などによる皮下投与または静脈内投与などの非経口投与に関しては、抗ＰＤ１抗体分子を含有する医薬組成物は、発熱物質を含まず、そして適切なｐＨ、等張性および安定性の非経口に受容可能な水溶液の形態であってもよい。当業者であれば、例えば塩化ナトリウム注射溶液、リンゲル注射溶液、乳酸リンゲル注射溶液などの等張ビヒクルを使用して適切な溶液を調製することができる。保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤、および／または他の添加剤を必要に応じて採用してもよく、例えばリン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化剤；保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；例えばメチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３’−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド；例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；例えばポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンなどの単糖、二糖および他の炭水化物；例えばＥＤＴＡなどのキレート剤；例えばショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；例えばナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；および／または例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０１１６】
抗ＰＤ１抗体分子を含有する医薬組成物は、治療される状態に応じて、単独で投与されてもよく、または他の治療と併用されて、同時に、または連続のいずれかで投与されてもよい。
【０１１７】
本明細書に記載の抗ＰＤ１抗体分子は、ヒトまたは動物の身体の治療方法に使用されてもよく、治療には、予防的または防止的な治療が含まれる（例えば、個体において症状が発生する前に、当該個体において当該症状が発生するリスクを低下させるため、その発生を遅延させるため、または発生後の重症度を低下させるための治療）。治療方法は、抗ＰＤ１抗体分子を、その必要のある個体に投与することを含んでもよい。
【０１１８】
投与は通常、「治療有効量」でされ、これは、患者に対し有益性を示すのに充分な量である。そうした有益性は、少なくとも１つの症状の少なくとも改善であってもよい。投与される実際の量、投与速度、および投与の経時変化は、治療されるものの、特に治療される哺乳動物の、性質および重症度、個々の患者の臨床状態、障害の原因、組成物の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および医療従事者がわかっている他の因子に依存することとなる。例えば用量の決定などの治療の指示は、一般開業医および他の医師の責の範囲内にあり、治療される疾患の症状の重症度、および／または治療される疾患の進行に依存し得る。抗体分子の適切な投与量は、当分野に周知である（Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７：６５９−６６４；Ｂａｇｓｈａｗｅ  Ｋ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ４：９１５−９２２）。具体的な用量は、本明細書において、またはＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（２００３）において示され、投与される薬剤のタイプに応じた用量が、使用され得る。抗体分子の治療有効量または適切な用量は、そのインビトロ活性と、動物モデルにおけるインビボ活性とを比較することにより決定され得る。マウスおよび他の被験動物における有効用量を、ヒトに外挿する方法は公知である。正確な投与量は、抗体が予防用であるかまたは治療用であるか、治療される領域の大きさおよび位置、抗体の正確な性質（例えば全抗体、断片）および抗体に付加された任意の検出可能な標識または他の分子の性質をはじめとする多くの因子に依存することとなる。
【０１１９】
典型的な抗体投与量は、全身投与に対しては１００μｇ〜１ｇ、また局所投与に対しては１μｇ〜１ｍｇの範囲である。初回に高い負荷投与量で、その後は１回または複数回の低投与量が投与されてもよい。典型的には、抗体は、例えばＩｇＧ１アイソタイプまたはＩｇＧ４アイソタイプなどの全抗体である。これは成人患者の単回治療用の投与量であり、小児および幼児に対しては相対的に調整され得、そして分子量に比例して他の抗体形式にも調整され得る。治療は、医師の裁量で毎日、週２回、毎週、または毎月の間隔で繰り返され得る。個々の治療スケジュールは、抗体組成物の薬物動態および薬力学的性質、投与経路、ならびに治療される症状の性質に依存し得る。
【０１２０】
治療は定期的であってもよく、投与の間の期間は、約２週間またはそれ以上であってもよく、例えば約３週間以上、約４週間以上、約１カ月に１回以上、約５週間以上、または約６週間以上であってもよい。例えば、治療は、２週〜４週ごと、または４週〜８週ごとであってもよい。治療は、外科手術の前、および／もしくは後に行われてもよく、ならびに／または外科的治療もしくは浸潤的手順の解剖学的位置に直接投与または適用されてもよい。適切な製剤および投与経路は、上記に記載される。
【０１２１】
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗ＰＤ１抗体分子は、皮下注射として投与されてもよい。皮下注射は、例えば長期間の予防用／治療用の自己注射器を使用して投与されてもよい。
【０１２２】
一部の好ましい実施形態では、抗ＰＤ１抗体分子の治療効果は、いくつかの半減期の間、持続し得、投与量に依存する。例えば抗ＰＤ１抗体分子の単回投与の治療効果は、個体において、１カ月以上、２カ月以上、３カ月以上、４カ月以上、５カ月以上、または６カ月以上、持続し得る。
【０１２３】
本発明はさらに、ヒトＰＤ１に特異的に結合し、および任意でカニクイザルのＰＤ１にも特異的に結合する抗体分子、またはその抗原結合部分を作製する方法を提供するものであり、当該方法は、
（１）非ヒト源由来の抗ＰＤ１  ＣＤＲをヒトｖ−ドメインフレームワーク内に移植し、ヒト化抗ＰＤ１抗体分子またはその抗原結合部分を作製する工程、
（２）ＣＤＲ中に１つまたは複数の変異を含有する当該ヒト化抗ＰＤ１抗体分子またはその抗原結合部分のクローンのライブラリーを作製する工程、
（３）ヒトＰＤ１への結合について、および任意でカニクイザルのＰＤ１への結合についても当該ライブラリーをスクリーニングする工程、
（４）スクリーニングする工程（３）から、ヒトＰＤ１に特異的に結合する、および任意でカニクイザルＰＤ１にも特異的に結合するクローンを選択する工程、ならびに
（５）ヒトＰＤ１に特異的に結合し、および任意でカニクイザルＰＤ１にも特異的に結合する抗体分子、またはその抗原結合部分を、工程（４）から選択されたクローンから作製する工程、を含む。
【０１２４】
当該方法は、工程（４）で選択されたクローンに基づき、例えば工程（４）で選択されたクローンのＣＤＲ中の特定の位置でのさらなる探索的な突然変異誘導に基づき、追加のクローンを作製して、ヒト化を強化し、および／またはヒトＴ細胞エピトープ含量を最小化し、および／または工程（５）で作製された抗体分子もしくはその抗原結合部分の製造特性を改善するさらなる工程を含んでもよい。
【０１２５】
上述の方法に適用可能な改善は、以下の実施例１に記載されるとおりである。
【０１２６】
本明細書で用いる場合、“ＰＤ１”の語は、ＰＤ１の生物学的活性の少なくとも一部を保持する、プログラム細胞死タンパク質１およびそのバリアントを指す。本明細書において使用される場合、ＰＤ１は、ヒト、ラット、マウスおよびニワトリを含むすべての種の天然配列ＰＤ１を含む。“ＰＤ１”の語は、ヒトＰＤ１のバリアント、アイソフォームおよび種のホモログを含むために使用される。本発明の抗体は、ヒト以外の種に由来するＰＤ１、特にカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）由来のＰＤ１と交差反応し得る。ヒトおよびカニクイザルのＰＤ１アミノ酸配列の例を、表１９に提供する。ある実施形態では、抗体は、完全にヒトＰＤ１に特異的であってもよく、非ヒトとの交差反応性を呈さなくてもよい。
【０１２７】
本明細書において使用される場合、本発明の抗体の文脈において使用される場合の「アンタゴニスト」、または「抗ＰＤ１アンタゴニスト抗体」（「抗ＰＤ１抗体」と相互交換可能に称される）とは、ＰＤ１に結合することができる、ならびにＰＤ１の生物学的活性を阻害することができる、および／またはＰＤ１シグナル伝達により介在される下流経路を阻害することができる抗体を指す。抗ＰＤ１アンタゴニスト抗体には、例えばＰＤ１に対する受容体結合および／または細胞反応の惹起など、ＰＤ１シグナル伝達により介在される下流経路を含めた、（有意に）ＰＤ１の生物学的活性（を含めた）を遮断する、拮抗する、抑制する、または低下させることができる抗体を包含する。本発明の目的に対し、「抗ＰＤ１アンタゴニスト抗体」という用語は、ＰＤ１それ自体、およびＰＤ１の生物学的活性（限定されないが、Ｔ細胞の抗腫瘍細胞活性の活性化を抑制する能力を含む）、または活性もしくは生物学的活性の結果が、任意の意義のある程度に実質的に無効化される、減少される、または中和されるすべての用語、タイトル、ならびに機能的状態および機能的特性を包含することが明示的に理解されるであろう。
【０１２８】
他の受容体よりも高いアフィニティ、高いアビディティ、より容易に、および／またはより長い期間、ＰＤ１と結合する場合、当該抗体は、ＰＤ１に「特異的に結合する」、「特異的に相互作用する」、「優先的に結合する」、「結合する」または「相互作用する」。
【０１２９】
「抗体分子」は、例えば炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、「抗体分子」という用語は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のみならず、任意の抗原結合断片（例えば「抗原結合部分」）またはその一本鎖、抗体を含む融合タンパク質、ならびに例えば限定されないが、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（例えばサメ抗体およびラクダ科抗体）、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ、およびｂｉｓ−ｓｃＦｖを含む抗原認識部位を含有する免疫グロブリン分子の任意の他の改変構造体も包含する。
【０１３０】
「抗体分子」は、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などの任意のクラスの抗体を包含するが、抗体はいずれか特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、様々なクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンにはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの５種類の主要なクラスがある。これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）に分けられる場合があり、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２がある。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域はそれぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。このサブユニットの構造、および様々なクラスの免疫グロブリンの三次元構造は周知である。
【０１３１】
抗体分子の「抗原結合部分」という用語は、本明細書において使用される場合、ＰＤ１に特異的に結合する能力を保持する、インタクトな抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体分子の抗原結合機能は、インタクトな抗体の断片により実現され得る。抗体分子の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例示としては、Ｆａｂ；Ｆａｂ’；Ｆ（ａｂ’）２；ＶＨドメインとＣＨ１ドメインとからなるＦｄ断片；抗体の１つのアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片、および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。
【０１３２】
「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用される。「Ｆｃ領域」は、天然配列のＦｃ領域またはバリアントのＦｃ領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６の位置のアミノ酸残基、またはＰｒｏ２３０の位置のアミノ酸残基から、そのカルボキシル末端に及ぶと規定される。Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、ＫａｂａｔにあるＥＵインデックスの番号である。免疫グロブリンのＦｃ領域は通常、ＣＨ２とＣＨ３の２つの定常ドメインを含有する。当分野に知られているように、Ｆｃ領域は、二量体型または単量体型で存在し得る。
【０１３３】
抗体の「可変領域」とは、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域の、いずれか単独または組み合わせを指す。当分野に知られているように、重鎖および軽鎖の可変領域は各々、超可変領域としても知られている３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に繋がる４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなり、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲに隣接するＦＲを選択するとき、例えば抗体のヒト化または最適化を行うとき、同じ基準クラスのＣＤＲ配列を含有する抗体由来のＦＲが好ましい。
【０１３４】
本出願において使用されるＣＤＲの定義は、当分野で創出された多くの異質的な、しばしば矛盾するスキームにおいて使用されるドメインを組み合わせており、免疫グロブリンレパートリー分析と、遊離状態および抗原との共結晶状態の抗体の構造分析との組み合わせに基づいている（Ｓｗｉｎｄｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，ａｂＹｓｉｓ：Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．［ＰＭＩＤ：２７５６１７０７；Ｅｐｕｂ  ２２  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１６］によるレビューを参照のこと）。本明細書において使用されるＣＤＲの定義（「統合（Ｕｎｉｆｉｅｄ）」定義）は、そうしたすべての過去の洞察の教示を組み込んでおり、潜在的に標的−結合の相補性を介在する完全な残基の状況を抽出するために必要なすべての適切なループ位置を含む。
【０１３５】
表１は、本明細書に規定されるＭＡｂ００５マウス抗ＰＤ１抗体のＣＤＲのアミノ酸配列（「統合」スキーム）を、同じＣＤＲを規定する周知の代替的な系と比較して示している。
【０１３６】
“Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１（ヒト化）”の語は、表２における可変重鎖領域配列の標識ＰＤ１−ＶＨ１および可変軽鎖領域配列の標識ＰＤ１−ＶＬ１ならびにヒトＩｇＧ１定常領域を含む抗ＰＤ１抗体を指す。
【０１３７】
本明細書において使用される場合、「保存的置換」という用語は、アミノ酸を、機能活性を大きく有害には変化させない別のアミノ酸で置換することを指す。「保存的置換」の好ましい例は、１つのアミノ酸を、以下のＢＬＯＳＵＭ  ６２置換マトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，ＰＮＡＳ  ８９：１０９１５−１０９１９を参照のこと）において０以上の値（≧０）を有する別のアミノ酸で置換することである。
【０１３８】
【化１】
2021515542.tif 000003
【０１３９】
「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）という用語は、例えば任意の真核細胞クローン、原核細胞クローンもしくはファージクローンなどの１つのコピーまたはクローンから誘導された抗体またはその抗原結合部分を指し、それが作製された方法ではない。本発明のモノクローナル抗体は、均質、または実質的に均質な集団で存在することが好ましい。
【０１４０】
「ヒト化」抗体分子とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を最小限に含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または他の抗原結合性の抗体下位配列）である、非ヒト（例えばマウス）抗体分子またはその抗原結合部分の形態を指す。ヒト化抗体は、レシピエントのＣＤＲ由来の残基が、所望の特異性、アフィニティおよび能力を有する例えばマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であってもよい。
【０１４１】
「ヒト抗体または完全ヒト抗体」とは、ヒト抗体遺伝子を担持するトランスジェニックマウスから誘導された、またはヒト細胞から誘導された抗体分子またはその抗原結合部分を指す。
【０１４２】
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列は別の種に由来する抗体分子またはその抗原結合部分を指すことが意図され、例えば、可変領域配列はマウス抗体に由来し、定常領域配列はヒト抗体に由来する抗体分子などである。
【０１４３】
「抗体−薬剤結合体」および「免疫結合体」とは、ＰＤ１に結合し、ならびに細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、および／または治療剤と結合される抗体分子またはその抗原結合部分を指し、抗体誘導体を含む。
【０１４４】
本発明の抗体分子、またはその抗原結合部分は、例えば組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、またはそうした技術もしくは当分野に既に公知である他の技術との組み合わせなどの当分野に周知の技術を使用して作製され得る。
【０１４５】
「単離された分子」（分子が、例えばポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体である場合）という用語は、その起源または誘導の源によって、（１）自然状態では付随する天然の関連構成要素と関連していない分子、（２）同じ種由来の他の分子を実質的に含まない分子、（３）異なる種由来の細胞により発現された分子、または（４）自然に発生しない分子である。したがって、化学的に合成された分子、または天然での起源である細胞とは異なる細胞系で発現された分子は、その天然の関連構成要素から「単離される」。さらに分子は、当分野に周知の精製技術を使用した単離によって、天然の関連構成要素を実質的に含まない状態にされ得る。分子純度または均質性は、当分野に周知の多くの手段により解析され得る。例えばポリペプチドサンプルの純度は、当分野に周知の技術を使用してポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用し、ゲルを染色してポリペプチドを可視化して解析されてもよい。ある目的に対し、ＨＰＬＣ、または精製分野で周知の他の手段を使用することにより、さらに高い分解能が提供される場合がある。
【０１４６】
「エピトープ」という用語は、抗体分子の抗原結合領域のうちの１つまたは複数で抗体分子に認識され、結合されることができる分子の部分、またはその抗原結合部分を指す。エピトープは、一次、二次または三次のタンパク質構造の規定領域からなる場合があり、抗体またはその抗原結合部分の抗原結合領域に認識される標的の二次構造単位または二次構造ドメインの組み合わせを含む。同じくエピトープは、例えばアミノ酸または糖側鎖などの規定の化学的に活性な分子の表面群からなる場合があり、特定の三次元構造特性ならびに特定の電荷特性を有する場合がある。本明細書において使用される場合、「抗原性エピトープ」という用語は、当分野に周知の任意の方法、例えば従来的な免疫アッセイ法、抗体競合結合アッセイ、またはｘ線結晶法もしくは関連する構造決定法（例えばＮＭＲ）により決定されたときに、抗体分子が特異的に結合することができるポリペプチドの部分として規定される。
【０１４７】
「結合アフィニティ」または「ＫＤ」という用語は、特定の抗原−抗体の相互作用の解離速度を指す。ＫＤは、「ｏｆｆ−ｒａｔｅ（ｋｏｆｆ）」とも呼ばれる解離速度の、「ｏｎ−ｒａｔｅ（ｋｏｎ）」、すなわち会合速度に対する比率である。ゆえにＫＤは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎに等しく、モル濃度（Ｍ）として表される。従って、ＫＤが小さくなると、結合アフィニティは強くなる。ゆえにＫＤが１μＭであれば、ＫＤが１ｎＭの場合と比較して結合アフィニティが弱いことを示す。抗体のＫＤ値は、当分野に確立された方法を使用して決定され得る。抗体のＫＤの決定方法の１つは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用するものであり、典型的には、例えばビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））システムなどのバイオセンサーシステムを使用する。
【０１４８】
「有効性」という用語は、生物活性の測定値であり、本明細書に記載のＰＤ１活性アッセイにおいて測定される活性の５０％を阻害する、抗原ＰＤ１に対する抗体または抗体薬剤結合体のＩＣ５０すなわち有効濃度として表す場合もある。
【０１４９】
本明細書において使用される場合、「有効量」または「治療有効量」という文言は、所望の治療結果を実現するために必要な（用量での、および期間に対する、および投与手段に対する）量を指す。有効量は、活性剤の、対象に治療上有益な影響を与えるために必要な少なくとも最小量であるが、対象に毒性のある量よりは少ない量である。
【０１５０】
本発明の抗体分子の生物活性に関して本明細書において使用される場合、「阻害する」または「中和する」という用語は、限定されないが、ＰＤ１に対する抗体分子の生物活性、または抗体分子とＰＤ１の結合相互作用を含む、阻害されるものの例えば進行または重症度を実質的に拮抗する、妨げる、予防する、抑える、減速させる、破壊する、除去する、停止させる、低下させる、または反転させる抗体の能力を意味する。
【０１５１】
「宿主細胞」には、ポリヌクレオチド挿入物の組み込みのためのベクターに対するレシピエントであってもよく、またはレシピエントである個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫物を含み、当該子孫物は、自然の、偶発的な、または意図的な変異により、元の親細胞と完全に同一（形態において、またはゲノムＤＮＡの相補体において）であるとは限らない場合がある。宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチドをインビボでトランスフェクトされた細胞が含まれる。
【０１５２】
本明細書において使用される場合、「ベクター」とは、宿主細胞において、関心の１つまたは複数の遺伝子または配列を送達することができる、そして好ましくは発現することができる構築物を意味する。ベクターの例としては限定されないが、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡまたはＲＮＡの発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン縮合剤と会合したＤＮＡまたはＲＮＡの発現ベクター、リポソーム中に封入されたＤＮＡまたはＲＮＡの発現ベクター、および例えば産生細胞などの特定の真核細胞が挙げられる。
【０１５３】
本明細書において使用される場合、別段が示唆されない限り、「治療すること」という用語は、そうした用語が適用される障害もしくは症状、またはそうした障害もしくは症状の１つまたは複数症状を反転させる、改善させる、その進行を阻害する、その進行を遅延させる、発症を遅延させる、または予防することを意味する。本明細書において使用される場合、別段の示唆が無い限り、「治療」という用語は、上述に規定される治療の行為を指す。「治療すること」という用語は、対象のアジュバント療法およびネオアジュバント療法も含む。誤解を避けるために、本明細書において「治療」という言及は、治癒的、緩和的、および予防的な治療に対する言及を含む。誤解を避けるために、本明細書において「治療」という言及は、治癒的、緩和的、および予防的な治療に対する言及もさらに含む。
【０１５４】
本明細書において、実施形態は、「含む、含有する」という文言で記載されているか、さもなければ「〜からなる」および／または「本質的に〜からなる」として記載される類似した実施形態も提供されることを理解されたい。
【０１５５】
本発明の態様または実施形態が、マーカッシュ群または他の択一的な群で記載されている場合、本発明は、概して列挙される群全体のみならず、当該群の各メンバーを個々に、および当該主要群のうちの可能性のあるすべての亜群、そして当該群メンバーの１つまたは複数を欠いた主要群も包含する。本発明はさらに、請求される本発明の群メンバーのいずれかの１つまたは複数の明白な除外を予期するものである。
【０１５６】
別段の規定がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって普遍的に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾が生じる場合、本明細書が定義を含めて主導をとるものとする。本明細書および特許請求の範囲の全体を通じて、「含む、含有する」という文言、または例えば「含む、含有する」または「含むこと、含有すること」といった変化形は、記述される整数値の含有、または整数値の群の含有を示唆するが、任意の他の整数値または整数値の群の除外は示唆しないと理解される。文脈により別段であることを要しない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形は単数を含むものとする。「例えば」という用語の後に続くあらゆる例示は、包括的または限定であることは意味しない。
【０１５７】
本発明の実施は、別段の示唆が無い限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来的な技術を採用し、それら技術は当分野の技術範囲内にある。
【０１５８】
本発明の特定の非限定的な実施形態を、添付の図面を参照しながら記載することとする。
【実施例】
【０１５９】
実施例１．最適化抗ＰＤ１治療用抗体の作製
イントロダクション
本実施例において、本発明者らは、アゴニスト性の最適化抗ＰＤ１抗体のパネルの作製に成功した。これら抗ＰＤ１抗体は良好に発現され、生物物理的に安定であり、溶解度が高く、そして好ましいヒト生殖細胞系列に対し最大の同一性を有している。
【０１６０】
材料及び方法
ＰＤ１ライブラリーの作製および選択
ＰＤ１  Ｆａｂレパートリーは、大量オリゴ合成およびＰＣＲにより組み立てられた。次いで増幅されたＦａｂレパートリーを制限酵素−ライゲーションを介してファージミドベクター内にクローニングし、大腸菌ＴＧ−１細胞内に形質転換した。ファージレパートリーは、原則として過去に詳述されるようにレスキューされた（Ｆｉｎｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ６８１：３８３−４０１）。
【０１６１】
ファージ選択は、ストレプトアビジン磁気マイクロビーズをビオチン化ＰＤ１標的タンパク質（ヒトまたはカニクイザルのいずれか）でコーティングし、ビーズをＰＢＳで３回洗浄して、５％スキムミルクタンパク質を加えたＰＢＳ  ｐＨ７．４中に再懸濁させることにより実施された。これらビーズは、選択のラウンド１では１００ｎＭの標的タンパク質でコーティングされており、その後の３回の連続ラウンドでは抗原濃度は減少した。各ラウンドにおいて、ファージはトリプシンを使用して溶出され、その後、ＴＧ１細胞内に再感染された。
【０１６２】
ペリプラズム抽出物の作製（小スケール）
個々の大腸菌クローンにおいて、可溶性Ｆａｂの産生が行われた。対数増殖期の大腸菌ＴＧ１細胞は、１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドイソプロピルを用いて誘導された。可溶性Ｆａｂを含有するペリプラズム抽出物は、以下の凍結／融解サイクルにより作製された：細菌細胞沈殿物を一晩、−２０℃で凍結させ、その後室温で融解させ、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中に再懸濁させた。室温で振とうし、遠心分離を行った後に、可溶性Ｆａｂを含有する上清を収集した。
【０１６３】
Ｆａｂの産生と精製
大規模産生のために、抗ＰＤ１  Ｆａｂのパネルを選択した。大腸菌ＴＧ１  培養液（５００ｍｌ）を調製して、上記のような可溶性Ｆａｂ発現を誘導した。可溶性Ｆａｂを含有するペリプラズム抽出物は、上記のような凍結／融解サイクルによって抽出した。可溶性Ｆａｂを含有する上清を、１時間後に、室温での天地反転、遠心分離および０．２２μｍの膜を通る濾過で回収した。可溶性Ｆａｂは、Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ  ＨＰアフィニティカラム（関連したＨｉｓタグによる精製用）と、その後の修飾プロテインＡまたはＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＧ−ＣＨ１アフィニティマトリックスカラムでの精製による２段階の精製手順により精製した。
【０１６４】
ＩｇＧの発現および精製
Ｍａｂ００５バリアントおよびペムブロリズマブアナログを合わせたリードパネル抗ＰＤ１抗体の重鎖ならびに軽鎖の可変ドメインをコードする哺乳動物コドン最適化合成遺伝子を、エフェクター機能を無効化したヒトＩｇＧ１（「ＩｇＧ１ヌル（ＩｇＧ１ｎｕｌｌ）」；正常免疫グロブリンＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣ機能を無効にする、下方ヒンジ内にＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ変異を含有するヒトＩｇＧ１）およびヒトＣκドメインをそれぞれ含有する、哺乳動物発現ベクターにクローン化した。哺乳動物発現系において、重鎖および軽鎖を含有するベクターの共トランスフェクションを実施し、次いでプロテインＡ系のＩｇＧ精製、定量、ならびに変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でＱＣを行った。
【０１６５】
ＦａｂおよびＩｇＧに対する直接結合ＥＬＩＳＡ
組換えタンパク質に対するリードパネルの結合および交差反応性は、最初に結合ＥＬＩＳＡにより評価した。ヒトＰＤ１のヒトＦｃタグ化組換えタンパク質、およびカニクイザルＰＤ１のヒトＦｃタグ化組換えタンパク質で、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）平底９６ウェルプレートの表面上を１μｇ／ｍｌでコーティングした。精製されたＦａｂまたはＩｇＧのサンプルは、５００ｎＭから始まり０．９８ｎＭまでの２倍連続希釈で漸増して、コーティングされた抗原に結合できるようにした。Ｆａｂは、マウス抗ｃ−ｍｙｃ抗体、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したロバ抗マウスＩｇＧを使用して検出した。ＩｇＧは、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したマウス抗ヒトＩｇＧを使用して検出した。結合シグナルは、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質溶液（ＴＭＢ）を用いて可視化され、吸光度は４５０ｎｍで測定した。
【０１６６】
ＩｇＧ１ヌル抗体に対する、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎエピトープ競合アッセイ
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（パーキンエルマー社）は、３８４ウェルの白色マイクロタイタープレート（グライナー社）において２５μｌの最終量で実施した。反応緩衝液は、１ｘＰＢＳ  ｐＨ７．３（Ｏｘｏｉｄ社、カタログ番号ＢＲ００１４Ｇ）および０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（シグマ社、カタログ番号Ｐ９４１６）を含有した。精製したＩｇＧサンプルは、５００ｎＭの最終濃度で始まる３倍連続希釈で漸増され、室温で２０分間、０．６ｎＭの最終濃度でビオチン化ヒトＰＤ１−Ｈｉｓ／Ａｖｉタグとともにインキュベートした。０．３ｎＭでの親ＩｇＧおよび２０μｇ／ｍｌ（最終濃度）での抗ヒトＩｇＧ１アクセプタービーズを添加し、混合物を室温で１時間インキュベートした。次いで、ストレプトアビジンドナービーズを２０μｇ／ｍｌ（最終濃度）で添加し、室温で３０分間インキュベートした。発光は、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダー（パーキンエルマー社）において測定され、ＥｎＶｉｓｉｏｎマネージャーソフトウェアを使用して解析した。値は、１秒当たりのカウント数（ＣＰＳ：Ｃｏｕｎｔｓ  Ｐｅｒ  Ｓｅｃｏｎｄ）として報告され、クロストークに対して補正した。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、カリフォルニア州ラホヤ）においてＭＦＩ値と、４つのパラメータとを使用して算出された。
【０１６７】
単量体型のヒトおよびカニクイザルのＰＤ１溶液に対する、ＩｇＧアフィニティのビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）解析
精製したＩｇＧのアフィニティ（ＫＤ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥ社）上で、抗原溶液を用いてＳＰＲを介して決定した。マウス抗ヒト抗体（ＣＨ１特異的）を、２チャンネル用のウィザード指示に従い、ｐＨ４．５の酢酸緩衝液中、アミンカップリングを使用してＣＭ５センサーチップ上に２０００ＲＵレベルにまで固定した。１つのチャンネルは、バックグラウンドシグナルの補正用に使用した。標準的なランニング緩衝液であるＨＢＳ−ＥＰ  ｐＨ７．４を使用した。１０μｌの１０ｍＭグリシンをｐＨ１．５で、２０μｌ／分で単回注入することにより、再生を行った。ＩｇＧサンプルは、３０μｌ／分、５０ｎＭで２分間注入され、その後、６０秒間の解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）が続いた。単量体抗原（ヒトＰＤ１  ＨｉｓタグしたまたはカニクイザルＰＤ１  Ｈｉｓタグ）は、１００ｎＭから３．１ｎＭへと希釈する２倍連続希釈で、２分間、３０μｌ／分で注入され、次いで３００秒の解離速度が続いた。得られたセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）は、ビアコア３０００エバリュエーション（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ社）ソフトウェアを使用して解析した。ＫＤは、１：１のラングミュア結合モデルに対し、会合相および解離相の同時フィッティングを行うことにより算出した。
【０１６８】
ＩｇＧのフローサイトメトリー
精製したＩｇＧを、ＣＨＯ−Ｋ１安定発現株およびＣＨＯ−Ｋ１野生型細胞上で発現したヒトならびにカニクイザルのＰＤ１に対する結合に関して、ＦＡＣにおいて試験した。ＩｇＧサンプルは、５００ｎＭに始まり０．９８ｎＭまでの３倍連続希釈で漸増した。ＩｇＧの結合は、ＦＩＴＣに結合したマウス抗ヒトＩｇＧを用いて検出した。結果は、フローサイトメーターのＢＬ−１チャンネル検出器（Ａｔｔｕｎｅ（商標）  ＮｘＴ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）において、１サンプル当たり１００００個の細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を検証することにより解析した。
【０１６９】
ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１細胞に基づくアンタゴニズムアッセイ
ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１遮断細胞系バイオアッセイ（プロメガ社）を用いて、抗体のＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１相互作用遮断能を測定した。アッセイ前日に、ＰＤ−Ｌ１  ａＡＰＣ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞を融解して、細胞回復培地（９０％のハムＦ１２／１０％のＦＢＳ）に移した。９６ウェル白色平底アッセイプレート２枚の６０個の内側ウェルそれぞれに、１ウェル当たり１００μｌで、細胞懸濁液を注入した。外側ウェルとアッセイプレートとのそれぞれに細胞回復培地を加えて、３７℃／５％のＣＯ２で一晩インキュベートした。アッセイの当日、サンプルＩｇＧを、アッセイ緩衝液（９９％のＲＰＭＩ  １６４０／１％のＦＢＳ）中で３００ｎＭから０．０４ｎＭに４倍希釈し、希釈当たり４０μｌを、ＰＤ−Ｌ１  ａＡＰＣ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞を含有するアッセイプレートに添加した。陽性阻害対照には、ヒトＰＤ１抗体ＡＦ１０８６（Ｒ＆Ｄシステムズ社）、ＩｇＧ１ヌル形式でのｍＡｂ００５およびＩｇＧ１ヌル形式でのペムブロリズマブｍａｂアナログを含めた。陰性阻害対照としては、無関係のＩｇＧを含めた。次いでアッセイ緩衝液（９９％のＲＰＭＩ  １６４０／１％のＦＢＳ）中で、ＰＤ１エフェクター細胞を融解して、細胞懸濁液を、ＰＤ−Ｌ１  ａＡＰＣ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＩｇＧ用量設定サンプルを含有するアッセイプレートのウェルに添加した。アッセイプレートを、３７℃／５％ＣＯ２のインキュベーター内で６時間インキュベートし、５〜１０分間周囲温度と平衡にし、次いで８０μｌのＢｉｏ−Ｇｌｏ（商標）試薬（プロメガ社）を添加した。アッセイプレートを、さらに５〜３０分間周囲温度でインキュベートし、次いで１０分、２０分、および３０分において発光シグナルを測定した。
【０１７０】
抗体ｖ−ドメインＴ細胞エピトープ含量：インシリコ分析
インシリコ技術（Ａｂｚｅｎａ社（Ａｂｚｅｎａ，Ｌｔｄ．））は、治療用抗体および治療用タンパク質中のＴ細胞エピトープの位置の特定に基づいており、抗体ｖ−ドメイン中の潜在的な免疫原性を評価するために使用した。ｉＴｏｐｅ（商標）を使用して、ヒトＭＨＣクラスＩＩに対して無差別的な高いアフィニティ結合を有するペプチドに関し、重要なリードのＶＬ配列およびＶＨ配列を解析した。無差別的な高いアフィニティのＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドは、薬剤タンパク質の臨床免疫原性に関する高いリスク指標であるＴ細胞エピトープの存在と相関すると考えられている。ｉＴｏｐｅ（商標）ソフトウェアは、ペプチドのアミノ酸側鎖と、３４種のヒトＭＨＣクラスＩＩアレルの開放末端結合溝（ｇｒｏｏｖｅ）内の特定の結合ポケット（特にポケット位置；ｐ１、ｐ４、ｐ６、ｐ７およびｐ９）との間の有益な相互作用を予測する。これらアレルは、広く存在する最も普遍的なＨＬＡ−ＤＲアレルであり、任意の特定の民族集団で最も多く存在するものによって起こる重み付けはない。当該アレルのうちの２０種が、「開いた」ｐ１構造を含有している。そして１４種が「閉じた」構造を含有しており、８３位のグリシンがバリンで置換されている。重要な結合残基の位置は、被験タンパク質配列にわたり８アミノ酸が重複している９ｍｅｒペプチドのインシリコ生成により取得される。このプロセスによって、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する、または結合しないペプチド同士を高い正確性で識別することに成功した。
【０１７１】
さらに、ＴＣＥＤ（商標）（Ｔ細胞エピトープデータベース（Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（商標）））を使用して配列を解析し、過去にインビトロでの他のタンパク質配列のヒトＴ細胞エピトープマッピング解析により特定されたＴ細胞エピトープとの合致を検索した。ＴＣＥＤ（商標）を使用して、非関連タンパク質に由来するペプチドの大きな（１０，０００個を超えるペプチド）データベースに対する任意の被験配列と、抗体配列とを検索する。
【０１７２】
抗体ｖ−ドメインの特異性検証：ヒト受容体アレイ解析
ヒト細胞膜受容体プロテオームアレイを、Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘ社（Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘ  Ｌｔｄ．）で実施した。プライマリスクリーン：５μｇ／ｍｌのＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）抗体を、４９７５個のヒト原形質膜タンパク質を個々に発現する１スライド当たりの固定ＨＥＫ２９３細胞（１４スライドセット、１スライドセット当たりｎ＝２スライド）に対する結合についてスクリーニングした。すべてのトランスフェクション効率が、最小閾値を超えていた。抗体結合は、ＡＦ６４７蛍光二次抗ヒトＩｇＧ１抗体を使用して検出した。プライマリーヒット（デュプリケートスポット）は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ上で蛍光（ＡＦ６４７およびＺｓＧｒｅｅｎ１）を解析することにより特定した。全ヒットをコードするベクターを配列解析して、その正確な正体を確認した。確認／特異性スクリーニング：全ヒットをコードするベクターに加えて、ＭＳ４Ａ１（ＣＤ２０）およびＥＧＦＲをコードする対照ベクターが、新しいスライド上にデュプリケートでスポットされ、これを使用して、前述のようにヒトＨＥＫ２９３細胞を逆トランスフェクトした。すべてのトランスフェクション効率が、最小閾値を超えていた。同一の固定スライドを、各被験抗体をそれぞれ５μｇ／ｍｌで、陰性対照抗体を５μｇ／ｍｌで、リツキシマブのバイオシミラー（陽性対照）を１μｇ／ｍｌで、アイソタイプＩｇＧ１（Ａｂ００１０２ヒトＩｇＧ１抗フルオレセイン）、または被験分子無し（二次抗体のみ、陰性対照）（１処理あたりｎ＝２スライド）を用いて処理した。スライドは上述のように解析された。フローサイトメトリー確認スクリーニング：ＺｓＧｒｅｅｎ１のみをコードする発現ベクター、またはＺｓＧｒｅｅｎ１と、ＰＤ１、ＦＺＤ５、ＫＤＲまたはＵＬＢＰ２とを、ヒトＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。各生存形質移入体を、被験抗体およびアイソタイプコントロール抗体それぞれの１ｍｇ／ｍｌおよび５ｍｇ／ｍｌと共にインキュベートした。細胞を洗浄し、細胞マイクロアレイスクリーニングで用いられるのと同じＡＦ６４７抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ検出抗体と共にインキュベートした。細胞を再び洗浄し、Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーター（ＢＤ社）を用いてフローサイトメトリーで解析した。７ＡＡＤのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色を用いて、死細胞を除外して、ＺｓＧｒｅｅｎ１−陽性細胞（すなわち、トランスフェクト細胞）を解析のために選択した。
【０１７３】
ＤＳＣ解析
被験物質のＴｍは、ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＰＥＡＱ−ＤＳＣ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、英国モルバーン）ランニングバージョン１．２２ソフトウェアを使用して解析した。２０〜１１０℃の範囲にわたり２００℃／時の速さでサンプルを加熱した。温度データは、タンパク質濃度に基づき正規化された。タンパク質のＴｍは、加熱スキャンデータから決定された。
【０１７４】
強制酸化解析
以下のインタクトなＩｇＧの強制酸化解析のために：ＰＢＳ緩衝液中のＩｇＧ１ヌルサンプルを、室温で２時間、０．５％のＨ２Ｏ２で処理し、次いでＤｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００ＲＳ  ＨＰＬＣシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、英国ヘメルヘムステッド）でのＲＰ解析（インタクトな抗体およびサブユニット、トリプシンペプチド）前に−８０℃で保存した。インタクトな抗体の還元に関して、ＤＴＴを最終濃度０．３３Ｍまで添加して、サンプルを室温で１時間インキュベートし、ＲＰで直ちに解析した。クロマトグラフィー分離は、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００ＲＳ  ＨＰＬＣシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、英国へメルヘムステッド）に接続されたＰＬＲＰ−Ｓ  １０００、５μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍのカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、英国ストックポート）を使用して実施した。この方法は、２４分間にわたる、８０％緩衝液Ａ（０．０２％のＴＦＡ、７．５％のアセトニトリルの水溶液）から５０％緩衝液Ｂ（０．０２％のＴＦＡ、７．５％のＨ２Ｏのアセトニトリル溶液）までの直線勾配で構成された。流速は、０．５ｍＬ／分、温度は解析中、７０℃で維持された。検出は、２８０ｎｍのＵＶ吸収により実施された。
【０１７５】
以下の消化ＩｇＧの強制酸化解析のために：天然のおよび酸化したＩｇＧ１ヌルサンプルを、ＳＭＡＲＴ  Ｄｉｇｅｓｔ（商標）キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、英国へメルヘムステッド）を用いて、メーカーのプロトコールに従い使用してトリプシンで消化した。得られたトリプシンペプチドは、ＲＰで直ちに解析した。クロマトグラフィーによる分離は、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００ＲＳ  ＨＰＬＣシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、英国へメルヘムステッド）に接続されたＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＣＳＨ  Ｃ１８カラム、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ社、英国エルストリー）を使用して実施した。この方法は、４分間にわたる９５％緩衝液Ａ（０．１％ＦＡの水溶液）から１５％緩衝液Ｂ（０．０８５％ＦＡの７５％アセトニトリル溶液）までの直線勾配、次いで２２分間にわたる１５％緩衝液Ｂから６０％緩衝液Ｂまでの直線勾配で構成された。流速は、０．２ｍＬ／分、温度は解析中、４０℃で維持された。検出は、２８０ｎｍのＵＶ吸収により実施された。
ＨＩＣ解析に関して、クロマトグラフィーによる分離は、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００ＲＳ  ＨＰＬＣシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、英国へメルヘムステッド）に接続されたＴＳＫｇｅｌ  Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲ  ４．６ｍｍ×３５ｍｍ  ＨＩＣカラム（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．社、英国レディング）を使用して実施した。この方法は、９分間にわたる６０％緩衝液Ａ（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、２Ｍ硫酸アンモニウム）から９０％緩衝液Ｂ（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）までの直線勾配で構成された。流速は、１．２ｍＬ／分であった。検出は、２８０ｎｍのＵＶ吸収により実施された。
【０１７６】
結果および考察
好ましいヒト生殖細胞系列ｖ−遺伝子へのＣＤＲ移植
アゴニストマウス抗ＰＤ１  ＩｇＧ  ＭＡｂ００５のＣＤＲ（ｍＶＨ／ｍＶＬ、国際公開第２０１５／０８５８４７Ａ１号および表２を参照のこと）を、ＣＤＲ移植法を使用して、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのｖ−ドメインフレームワーク配列スキャホールドに最初に導入した。最適な薬剤様性能を有する最終リード治療用ＩｇＧ化合物に向けて、遺伝子操作の努力を傾けるために、親抗体のＣＤＲを、「好ましい」生殖細胞系列スキャホールドのＩＧＨＶ３−７およびＩＧＫＶ１−３９に移植することを選択した。それらスキャホールドは、良好な溶解性および薬剤開発クオリティを有することが知られており、発現されたヒト抗体レパートリーにおいて高頻度に使用されている。
【０１７７】
これらスキャホールドおよび移植されたＣＤＲの定義は、表２に概要を掲載した。マウス抗ＰＤ１抗体の重鎖配列と軽鎖配列とについても表２に示す。このＣＤＲ移植のプロセスは周知であるが、ヒトｖ−ドメイン配列の所与のセットが非ヒトＣＤＲ移植にとって適切なアクセプターフレームワークとして機能するかどうかを予測するのは未だ困難である。不適切なフレームワークの使用は、標的結合機能の減少、タンパク質安定性の問題、さらには最終ＩｇＧの発現の低下につながり得る。そこでＣＤＲ突然変異誘導の鋳型としてＩＧＨＶ３−７／ＩＧＫＶ１−３９移植が採用され、改善クローンの選択が行われた。
【０１７８】
ライブラリー作製およびスクリーニング
ＣＤＲが移植されたＩＧＨＶ３−７／ＩＧＫＶ１−３９のｖ−ドメイン配列を、Ｆａｂファージディスプレイ形式に組み込み、突然変異誘導ライブラリーカセットを、オリゴ合成およびアセンブリにより作製した。最終Ｆａｂライブラリーをファージディスプレイベクター内にライゲートし、エレクトロポレーション法を介して大腸菌内に形質転換して、１．３×１０９個の独立したクローンを生成した。ライブラリーの構造品質は、９６個のクローンを配列解析することにより検証された。この配列解析データにより、マウスまたはヒトいずれかの生殖細胞系列の各相違位置の残基をコードする位置を、効率的におよそ５０％の頻度でサンプリングされたことが示された。ライブラリーは、ヘルパーファージＭ１３を使用してレスキューされ、選択はビオチン化されたヒトおよびカニクイザルのＰＤ１−Ｆｃタンパク質に対し、複数の別個のブランチにおいて実施された。
【０１７９】
選択後スクリーニング（図１）およびＤＮＡシーケンシングにより、ＥＬＩＳＡにおいてヒトおよびカニクイザルＰＤ１に強い結合と、ＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎアッセイにおいてヒトおよびカニクイザルＰＤ１へのＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）の結合の＞５０％の阻害とを示した、６４個の固有のヒトおよびカニクイザルＰＤ１結合Ｆａｂクローンの存在が明らかになった。これら６４個のクローンの中で、フレームワーク配列は完全に生殖細胞系列を維持していた一方で、すべてのＣＤＲ中における変異も観察された（表３）。リードクローンは、ヒトおよびカニクイザルのＰＤ１−Ｆｃの両方への結合に対するＥＬＩＳＡシグナルと比較したＣＤＲ生殖細胞系列化のレベルに基づき格付けされた。次いでこの格付けの上位１２個のクローンのｖ−ドメインをＩｇＧ発現ベクターにサブクローニングし、以下のさらなる検証を行った（表４）。上位１２個のクローンはまた、大腸菌の発現からＦａｂタンパク質として発現され、均質に精製され、定量され、ヒトＰＤ１−ＦｃおよびカニクイザルＰＤ１−Ｆｃにおける直接ＥＬＩＳＡ結合解析に適用された（図２ＡおよびＢ、表５）。予期せずに、カニクイザルＰＤ１タンパク質におけるＦａｂタンパク質の力価測定により、いくつかのライブラリー由来クローンに関して、Ｍａｂ００５（ヒト化）Ｆａｂのものよりも有意に改善された結合のＥＣ５０値が示された（表５）。このことが、ヒトＰＤ１結合で観察されたものとほぼ同等であるライブラリー由来クローン全てについてのＥＣ５０値を導き、一方で、カニクイザルのＭａｂ００５（ヒト化）Ｆａｂの結合は、ヒトよりも有意に低かった。実際には、Ｍａｂ００５（ヒト化）Ｆａｂの結合は、カニクイザルＰＤ１において十分に弱く、与えられた最も高い濃度（５００ｎＭ）であっても結合シグナル飽和は達成されなかったが、これはこのタンパク質に関して、カニクイザルＰＤ１  ＥＣ５０値が算出できなかったことを意味する（表５）。これら値が、立証された単量体Ｆａｂタンパク質で生じるので、それらは、いくつかのクローンにおけるカニクイザルタンパク質に関して、１：１結合の改善を反映していた。
【０１８０】
生殖細胞系列化変異は、ライブラリー選択から直接誘導されたリードクローンのすべてのＣＤＲにおいて観察されたが、配列解析を行うことで、ヒト化が最大となるようクローンをさらに設計することが可能となる可能性がある。したがって、ヒトおよびカニクイザルのタンパク質に対する結合シグナルを有する６４個の配列−固有ヒットを使用して、この機能的に特徴解析された集団のＣＤＲにおけるマウスアミノ酸の保持頻度を解析した。位置的なアミノ酸保持頻度は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインでの百分率として表されている（それぞれ図３Ａおよび３Ｂ）。ＲＦ＜７５％を有するマウス残基は、一連のコンビナトリアルデザインにおいて、標的−結合パラトープに必須ではない可能性がある位置とみなされ、生殖細胞系列化に対し開かれている可能性がある（表４）。ＶＨドメインにおいて（ＣＤＲ−Ｈ３は除外する）、ＣＤＲ−Ｈ１およびＨ２における９個のマウス残基のうちの４個のみが、約７５％の保持頻度を示し、またＣＤＲ−Ｈ１に存在する単独のマウス残基（Ｍ）は、機能性クローンのいずれにも存在せず、頻度値は０％であった（図３Ｂ）。ＶＬドメインにおいて、Ｍａｂ００５配列由来の１３個のマウスＣＤＲ残基のうち２個のみが、＞７５％の頻度で保持されていた（図３Ａ）。この解析は、ＣＤＲ−Ｌ２配列全体が、ＩＧＫＶ１−３９に対して生殖系列同一性を与える可能性があることを強く示唆した。重要なことには、Ｍａｂ００５のＣＤＲ−Ｌ３内に存在し、ほぼ１００％で保持される（図３Ａ）ものであるトリプトファン（Ｗ）残基は、軽鎖スプライシング中Ｊセグメントによって提供される位置にあり、また開始ライブラリーにおけるヒトＪＫ４配列の使用に起因して、非ヒトとしてみなされるだけであった。この観察により、ヒトＪＫ１は天然に、その位置にＷ残基を含有し、得られる軽鎖配列はＣＤＲ−Ｌ２およびＬ３において完全な生殖系列を与える（表４）ため、一連のデザインクローン内の軽鎖の再設計にＪＫ４の代わりにヒトＪＫ１配列を含むことが可能になる。
【０１８１】
ＲＦ＞７５％のマウス残基のみを含有するデザインには、「ＭＨ」という接頭辞（ＭＨ＝最大限にヒト化（Ｍａｘｉｍａｌｌｙ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ））をつけた。別のデザインｖ−ドメインセット（「ＴＴＰ」＝完全に理論的に可能（Ｔｏｔａｌ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ））もまた生成され、ＶＬおよびＶＨの両ドメインについて、集団で観察される最もヒト化されたＣＤＲを組み合わせた。トータルで、以下の５個のデザインＶＨドメインおよび３個のデザインＶＬドメインが生成された：ＣＤＲ−Ｈ１およびＨ３におけるＶＨドメインＭＨ−ＡＡ−ＶＨ、ＭＨ−ＬＶ−ＶＨ、ＭＨ−ＬＧ−ＶＨ、ＭＨ−ＬＦ−ＶＨ、ＭＨ−ＬＡ−ＶＨのサンプリングバリアント配列、一方ＣＤＲ−Ｌ１におけるＭＨ−ＶＬ、ＭＨ−ＪＫ１−ＶＬ、ＴＴＰ−ＪＫ１−ＶＬサンプリングバリアントであって、またＪＫ４がＪＫ１に置換されてもいる。実際、ＴＴＰ−ＪＫ１−ＶＬにおけるＷからＹへの変異およびＪＫ４からＪＫ１への変異が、この配列をｖ−ドメイン全体にわたる完全ヒト生殖系列にさせる。これら構造は、マトリックス化された手法により共トランスフェクトされて、合計で１５個の最終デザインＩｇＧを生成した（表４）。ＭＨおよびＴＴＰのクローンは、遺伝子合成により生成され、（上述の１２個のライブラリー由来クローン、ならびに陽性対照のＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）とともに）ヒト発現ベクターにクローニングされ、ＩｇＧ１ヌル形式で作製された。すべてのＩｇＧが、哺乳動物細胞の一過性トランスフェクションから容易に発現され、精製された。
【０１８２】
リードＩｇＧの特異性および有効性の特徴解析
次いで上述の精製ＩｇＧを、直接力価測定ＥＬＩＳＡ形式において、ヒトおよびカニクイザルのＰＤ１−Ｆｃへの結合に関して試験した。この解析により、いくつかのライブラリー由来クローンが、ヒトおよびカニクイザルのＰＤ１結合プロファイルと、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）と類似したＥＣ５０値（２倍以内）またはＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）よりも改善したＥＣ５０値とを有することを示した（図４ＡおよびＢ、表６）。注目すべき例外の１つは、ＰＤ１の両オルソログに対して低い結合性を示したクローンＩｇＧ１−１４Ｃ０７であり、このクローンのＥＣ５０値を決定することを不可能にさせている。同様に、デザインＩｇＧの大半が、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）と類似したＥＣ５０値（３倍以内）またはＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）より改善されたＥＣ５０値を有した（図５Ａ〜Ｄ、表７）。しかしながら、クローンＩｇＧ１−０１、ＩｇＧ１−０２およびＩｇＧ１−０３は、ＰＤ１の１つのまたは両オルソログに対して低い結合性を示した、これは、これらクローンにおけるＣＤＲ−Ｈ１およびＨ３の変異が、組合せで用いた場合に結合を崩壊させるということを示している。直接結合ＩｇＧのＥＬＩＳＡのＥＣ５０値は、真の１：１結合アフィニティよりもアビディティに強く影響を受けるため、本発明者らは次に、以下に概要されるように高感度な液相エピトープの競合およびビアコア結合アフィニティ決定を実施した。
【０１８３】
ビオチン化単量体型ヒトＰＤ１に対するＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）結合とのエピトープ競合に関するＩｇＧの試験が可能であるＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎアッセイを確立した。このアッセイにおいて、上位の性能を有するライブラリー由来ＩｇＧおよびデザインＩｇＧは、ＩＣ５０値を介してより効率的に識別された（表８）。多くのクローンは、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）に対して同等または改善されたＭａｂ００５エピトープに関する競合を示したが（図６Ａおよび６Ｂ）、いくつかは、以下を含む欠陥的なエピトープ競合（Ｍａｂ００５より２倍以上低い）を示した：ＩｇＧ１−１５Ｃ１０、ＩｇＧ１−１３Ｇ０２、ＩｇＧ１−０８Ｆ０４、ＩｇＧ１−１６Ｃ０７、ＩｇＧ１−１２Ｈ１１、ＩｇＧ１−１２Ｅ０２、ＩｇＧ１−１４Ｃ０７、ＩｇＧ１−０１、ＩｇＧ１−０２、ＩｇＧ１−０３、ＩｇＧ１−０６、ＩｇＧ１−０９、ＩｇＧ１−１２およびＩｇＧ１−１５（表８）。特に、このアッセイで最も低い性能のデザインＩｇＧは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて低いカニクイザルオルソログ交差反応性を有することが先にわかっているもの、およびＷからＹへのＣＤＲ−Ｌ１生殖細胞系列化変異を含む全てのクローンを含んでいた。
【０１８４】
結合アフィニティのビアコア解析は、すべてのＩｇＧに関して、液相の単量体型ヒトおよびカニクイザルのＰＤ１タンパク質に対して実施された。全ての場合において、低いＣｈｉ２値を伴う正確な１：１結合アフィニティが得られた（表９）。これらの解析から、ＦａｂおよびＩｇＧのＥＬＩＳＡならびにＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎアッセイにおいて最も高いＥＣ５０値およびＩＣ５０値を一貫して与えるライブラリー由来クローンは、ヒトおよびカニクイザルのＰＤ１に対し最も高いアフィニティ結合も示したことが示された。重要なことには、ライブラリー由来クローンＩｇＧ１−０６Ｄ０２、ＩｇＧ１−１２Ｂ０７、ＩｇＧ１−１２Ｈ０４およびＩｇＧ１−１６Ｈ１０ならびにデザインクローンＩｇＧ１−０４、ＩｇＧ１−０５、ＩｇＧ１−０８、ＩｇＧ１−１０、ＩｇＧ１−１１、ＩｇＧ１−１３およびＩｇＧ１−１４の全てが、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）と比較してヒトおよびカニクイザルの両ＰＤ１に関して改善された結合アフィニティを示した。重要なことは、これらアフィニティにおける改善が、予期せずに、これらクローンのヒト／カニクイザルのアフィニティを３倍未満（すべてのＫＤ値が＜４．９ｎＭ）に正規化させたことであり、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）が８倍の差を呈したこととは対照的である（ヒトＫＤ−４．０ｎＭ、カニクイザルＫＤ−３２．０ｎＭ）。ヒトおよびカニクイザルの標的オルソログの間で３倍未満のアフィニティ差であることは、前臨床薬剤開発解析において非常に有益であり、これによって例えばサルの安全性試験、ＰＫおよびＰＤのモデリング試験などの有意に良好なデザインおよび解釈が可能となる。両方のＰＤ１オルソログに対する結合のこの相対的な正規化により、ＩｇＧ１−ペムブロリズマブアナログに結合する際にリード化合物同士が類似性が高くなるようにさせて、これは２．７のアフィニティ差を呈する。さらに、クローンＩｇＧ１−１４およびＩｇＧ１−１５のアフィニティの比較で、ＩｇＧ１−１４のＣＤＲ−Ｌ１（表４）における単一の「マウス」Ｗ残基の影響が確認されたが、これはこの単一の残基のＩｇＧ１−１５におけるＹへの変異が、ヒトおよびカニクイザルのＰＤ１に対するＫＤが約１０倍欠如することをもたらすからである（表９）。この知見は、ＣＤＲ残基がヒト生殖系列同一性に変換され得るかまたはされ得ないかを「事前的」に決定することの困難さを強調したが、これはＷからＹへの変異が、通常、比較的に保存的置換であるとされているからである。
【０１８５】
細胞膜でのリードＩｇＧ結合特異性のフローサイトメトリー解析
ＰＤ１に対する抗体を、フローサイトメトリーを介して、細胞表面での濃度依存性結合に関して分析した。最初の解析は、ヒトまたはカニクイザルＰＤ１で安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞で行った。これら解析では、リードライブラリー由来のクローン（図７Ａ）およびデザインクローン（図７Ｂ、７Ｃ）が、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）と同等またはＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）よりも改善された有効性で、膜に存在するヒトＰＤ１に対する濃度依存性結合を呈することが示された（図１０）。重要なことには、ＣＤＲ−Ｌ１の「Ｗ」残基の影響は、ＩｇＧ１−１４がヒトＰＤ１に関してＩｇＧ１−１５よりも強い結合を示したことから再び観察された（図７Ｃ）。カニクイザルＰＤ１  ＣＨＯ細胞で行った解析では、さらに、いくつかのライブラリー由来（図８Ａ）およびデザイナーリード（図８Ｂ）が、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）と比較してカニクイザルＰＤ１に対する有意に改善された結合を呈することが確認された（表１０）。非トランスフェクトＣＨＯ細胞においては、最も高い濃度であっても、いずれのクローンでも結合シグナルは観察されなかった。
【０１８６】
ＰＤ１−ＰＤＬ１遮断アッセイにおけるリードＩｇＧ解析
細胞系ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１遮断レポーターアッセイでは、全ての被験クローンが、ＰＤ１の濃度依存性アンタゴニズムを呈した。重要なことには、複数のクローン（ＩｇＧ１−０６Ｄ０２、ＩｇＧ１−１２Ｈ０４、ＩｇＧ１−１６Ｈ１０、ＩｇＧ１−０５、ＩｇＧ１−０８、ＩｇＧ１−１１およびＩｇＧ１−１４を含む）が、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）と比較して、ＰＤ１遮断において改善された有効性を呈した（表１１）。さらには、クローンＩｇＧ１−０６Ｄ０２およびＩｇＧ１−１６Ｈ１０は、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）及びＩｇＧ４ニボルマブアナログよりも高い、アッセイにおいて最大のシグナルを呈した（図９）。
【０１８７】
抗体ｖ−ドメインＴ細胞エピトープ解析
インシリコ技術（Ａｂｚｅｎａ，Ｌｔｄ．社）は、治療用抗体および治療用タンパク質中のＴ細胞エピトープの位置の特定に基づいており、Ｍａｂ００５およびリード抗体のｖ−ドメイン両方の免疫原性の評価に使用した。ｖ−ドメイン配列の解析は、重複する９ｍｅｒペプチド（各々が最後のペプチドと８残基重複する）を用いて実施され、３４種のＭＨＣクラスＩＩアロタイプの各々に対して試験した。各９ｍｅｒを、ＭＨＣクラスＩＩ分子との潜在的な「適合」および相互作用に基づいてスコア化した。ソフトウェアにより算出されるペプチドスコアは、０〜１の間である。高い平均結合スコアを出したペプチド（ｉＴｏｐｅ（商標）スコアリング機能において＞０．５５）が強調された。ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの＞５０％（すなわち３４種のアレルのうちの１７種）が高い結合アフィニティ（スコア＞０．６）を有する場合、そうしたペプチドは、「高アフィニティ」ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドとして規定され、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含有するリスクが高いとみなされる。低アフィニティＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドは、多くのアレル（＞５０％）に、＞０．５５の結合スコア（しかし大部分は＞０．６ではない）で結合する。配列のさらなる解析は、ＴＣＥＤ（商標）を使用して実施された。この配列を使用して、ＢＬＡＳＴサーチによりＴＣＥＤ（商標）をデータ検索し、過去にＡｂｚｅｎａ  Ｌｔｄ．社で実施されたインビトロＴ細胞エピトープマッピング研究でＴ細胞反応を刺激した非関連タンパク質／抗体由来のペプチド（Ｔ細胞エピトープ）間で任意の高い配列相同性を特定した。
【０１８８】
ペプチドを、以下の４つのクラスに分類した：高アフィニティ外来物（「ＨＡＦ」−高免疫原性リスク）、低アフィニティ外来物（「ＬＡＦ」−低免疫原性リスク）、ＴＣＥＤ＋（過去にＴＣＥＤデータベースにおいて特定されたエピトープ）、および生殖細胞系列エピトープ（「ＧＥ」−高いＭＨＣクラスＩＩ結合アフィニティを有するヒト生殖細胞系列ペプチド配列）。生殖細胞系列エピトープの９ｍｅｒペプチドは、広範な生殖細胞系列ペプチドを用いた過去の研究により立証されたように、Ｔ細胞寛容によって免疫原性である可能性は低い。重要なことは、そうした生殖細胞系列のｖ−ドメインエピトープ（ヒト抗体定常領域中の類似配列によりさらに補助される）は、抗原提示細胞の細胞膜でのＭＨＣクラスＩＩ占有に関しても競合するため、Ｔ細胞刺激に必要とされる「活性化閾値」を達成するのに充分な外来性ペプチド提示のリスクを低下させることである。ゆえにＧＥ含量が高いことは、抗体治療剤の臨床開発において有益な性質である。
【０１８９】
表１２に示されるように、重要なリードｖ−ドメインは、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）と比較してペプチドエピトープ含量において有意に有益な変化を示した（表１２）。ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）のｖ−ドメインフレームワーク領域（すなわち、ＣＤＲ配列の外側）および全てのリードは、生殖細胞系列の配列であったため（表２）、予測された免疫原性における改善の全ては、ＣＤＲ残基の生殖細胞系列化の結果として生じた（表４、１２）。実際に、いくつかのクローンでは、完全に脱免疫化したＶＬドメインが存在した。ＧＥエピトープ含量もまた、リードクローン（全てのリードにおいて１から≧３）のＶＬ領域内で有意に増加しており、またＴＣＥＤ＋エピトープは、すべてのリードにおけるＶＬドメインから除去されていた（表１２）。重要なことは、複数のＨＡＦおよびＬＡＦエピトープが、リードクローンのＶＬ  ＣＤＲ中に存在する生殖細胞系列化変異によって除去されていたことである。例えば、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）のＬＣＤＲ−１中に存在するＴＣＥＤ＋およびＨＡＦペプチドの「ＶＴＩＴＣＬＡＳＱ」（配列番号８３）は、すべてのリードクローンにおいて、６位のＬからＲへの変異により除去され、この配列は、軽鎖ＧＥの「ＶＴＩＴＣＲＡＳＱ」（配列番号８４）に転換された。同様に、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）のＬＣＤＲ−１に存在するＬＡＦペプチド「ＩＧＴＷＬＴＷＹＱ」（配列番号８５）は、すべてのリードクローンにおいて、４位に単一のマウス残基Ｗのみを保持することで除去され、この配列は、「ＩＳＳＷＬＮＷＹＱ」（配列番号８６）に転換された（表１２）。クローン０６Ｄ０２、ＩｇＧ１−０５、ＩｇＧ１−０８、ＩｇＧ１−１１およびＩｇＧ１−１４においては、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）ＨＡＦペプチド「ＬＬＩＹＴＡＴＳＬ」（配列番号８７）および「ＬＩＹＴＡＴＳＬＡ」（配列番号８８）、ならびにＬＡＦペプチド「ＩＹＴＡＴＳＬＡＤ」（配列番号８９）は、マウス配列「ＴＡＴＳＬＡＤ」（配列番号３６）から完全な生殖細胞系列配列「ＡＡＳＳＬＱＳ」（配列番号４２）へのＬＣＤＲ−２の変異によって、除かれてＧＥ配列に変換できる。ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）ＦＷ３／ＬＣＤＲ３領域はまた、ＬＡＦペプチド「ＹＹＣＱＱＶＹＳＩ」（配列番号９０）をコードする。このエピトープは、６位のＶをＳに生殖細胞系列化変異することで、全てのリードにおいて除去された。ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）のＶＨ領域において、ペプチド配列「ＬＹＹＦＤＹＷＧＱ」（配列番号９１）（ＨＣＤＲ３およびＦＷ４にわたる）は、ＬＡＦであることがわかった。このペプチドの３位におけるＹからＡへの変異により、クローンＩｇＧ１−１４におけるこのエピトープの除去が可能になる（表４、１２）。
【０１９０】
抗体結合特異性解析
早期臨床試験において、Ｍａｂ００５のヒト化形態が、例えば血管腫等である、ヒト患者における異常な毒性が報告されたが、これは他の抗ＰＤ１療法または抗ＰＤ−Ｌ１療法では見られていない。これらの報告は、ヒト化Ｍａｂ００５が、他の抗ＰＤ１抗体に存在しなかった、固有の「非特異的な」結合特性を有する可能性を示唆している。血管腫は、過剰な血管の集合により形成される良性の腫瘍であり、しばしば皮膚で発達するが、それらはまた肝臓や他の器官で発達可能である。発明者らは、Ｍａｂ００５は、血管発生または組織分化と関連する未確認かつ予測不可能受容体と結合する可能性があると仮定した。この可能性を検証するために、４９７５個の固有のヒト細胞膜受容体を発現する細胞の高密度アレイの使用に基づくインビトロ技術（Ｒｅｔｒｏｇｅｎｉｘ，Ｌｔｄ．社）を使用して、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）での非特異的（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）な結合の特異性をスクリーニングした。この受容体アレイ結合スクリーニングにより、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）が膜発現ＰＤ１への強い結合を示すこと、しかし以下の４種の潜在的な非特異的結合の特異性も有することが特定された：ＦＺＤ５（Ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体５）、ＵＬＢＰ２（ＵＬ１６結合タンパク質２）、ＥｐｈＢ６およびＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２としても知られる）。血管腫は、例えばＶＥＧＦＲ２等である血管生物学関連受容体において変異を有する患者において自然発生することが知られており、また例えばラムシルマブ（抗ＶＥＧＦＲ２）等である、癌治療用血管標的薬剤の使用において、報告されている副作用がある。さらに、ＦＺＤ５は、血管腫発症に関連するＷｎｔ経路シグナル伝達受容体であるため、これら受容体のうちのいずれかの機能を調節することは、血管生物学を調節することのようである。さらに、ＵＬＢＰ２は、ナチュラルキラー細胞活性化受容体ＮＫＧ２Ｄ用であることがわかっているリガンドであるため、抗ＰＤ１での癌治療中のこのタンパク質への結合の結果は不明である。
【０１９１】
これら非特異的結合事象を確認するために、これら受容体および対照をコードするプラスミドを、ＤＮＡ配列に関して提出した。これら解析により、コードされたタンパク質が、確かに正しい配列であったことが確認された。次いで対照および可能性のある標的受容体に関するプラスミドサンプルを、デュプリケートでの繰り返し解析用の新規チップ上に再配列した。再配列したプラスミドの全てからの発現の有効な誘導は、ＺＳグリーン用のチップのスキャンを介して確認されたが、ＺＳグリーンは、内部対照マーカーとして全ての発現プラスミドに対して同時にコードされた。この解析により、プラスミドが点在していた全ての場所において、はっきりと検出可能なＺＳの発現が見られた（図１０Ａ）。さらに、次いで同様に点在したスライドを用いて、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）で（図１０Ｂ）、アイソタイプＩｇＧ１で（陰性対照、図１０Ｃ）、リツキシマブ（ＩｇＧ１の陽性対照、図１０Ｄ）でトランスフェクトした細胞、および一次抗体プローブを適用しなかったチップ（図１０Ｅ）を再検出した。これら解析により、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）は再び、ＰＤ１、ＦＺＤ５、ＵＬＢＰ２およびＫＤＲでトランスフェクトした細胞上のバックグラウンド（両チップ上）に対して測定可能な結合を示すが、ＦｃγＲ１ａ（ＩｇＧ１ヌルアイソタイプ）への、またはＥｐｈＢ６（図１０Ｂ）を含むその他のスポットへの結合は示さないことがわかった。リツキシマブは、予測通り、ＣＤ２０およびＦｃγＲ１ａ（ＩｇＧ１アイソタイプに起因する）に対する結合を示したが、ＰＤ１、ＦＺＤ５、ＵＬＢＰ２、ＥｐｈＢ６およびＫＤＲに対しては観察可能な結合はなかった（図１０Ｄ）。アイソタイプコントロール抗体（図１０Ｃ）でプローブしたチップおよび一次抗体でプローブしなかったチップ（図１０Ｅ）において、予期された制御タンパク質のみが何らかのシグナルを示した。この制御チップの明白な性能により、ＰＤ１、ＦＺＤ５、ＵＬＢＰ２およびＫＤＲにおけるＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）結合シグナルが特異的であるということが確認された。
【０１９２】
この非特異的結合活性の起源と、これがこの試験において生成したライブラリー由来ＩｇＧおよびデザインＩｇＧにおいて保持されているのか否かを調べるために、さらなるチップ結合解析を実施した（図１１Ａ〜Ｔ）。上記のように、再配列したプラスミドを再び、トランスフェクション性能について確認し、ＺＳグリーン発現の導入を確認した（図１１Ａ）。さらなるコントロール抗体、ペムブロリズマブアナログ（図１１Ｂ）およびリツキシマブ（図１１Ｃ）の両方は、それらのそれぞれの同族標的にのみ結合して、またアイソタイプコントロールＩｇＧ１は結合が見られなかった（図１１Ｄ）。ｍＶＨ／ｍＶＬ  Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１およびＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）を用いた一次解析（それぞれ図１１Ｅ及びＦ）は、先にＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）でのみ観察された（図１０Ｂ）非特異的結合シグナルがまた、ｍＶＨ／ｍＶＬ  Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１でプローブしたチップに存在することがわかった。この知見により、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）の非特異的結合反応性は、元のマウスハイブリドーマから直接誘導されるものであり、またヒト化過程の間に誘導されるポリリアクティビティ（ｐｏｌｙｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）の結果ではないことが確認された。したがって、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）の非特異的結合活性は、ＣＤＲ内に直接含まれているが、これはマウスＣＤＲがヒト生殖細胞系列フレームワークに移植されたときに保持されたからである。
【０１９３】
次いで、リードライブラリー由来抗体およびデザイン抗体を用いて、この同一のチップセットをプローブした。驚くべきことに、抗体ＩｇＧ１−０６Ｄ０２（図１１Ｇ）、ＩｇＧ１−１１Ｇ０５（図１１Ｈ）、ＩｇＧ１−１２Ｈ０４（図１１Ｉ）、ＩｇＧ１−１６Ｈ１０（図１１Ｊ）、ＩｇＧ１−０４（図１１Ｋ）、ＩｇＧ１−０５（図１１Ｌ）、ＩｇＧ１−０６（図１１Ｍ）、ＩｇＧ１−０８（図１１Ｎ）、ＩｇＧ１−１１（図１１Ｏ）、ＩｇＧ１−１３（図１１Ｐ）ＩｇＧ１−１４（図１１Ｑ）、ＩｇＧ１−１５（図１１Ｒ）、ＩｇＧ１−１２Ｂ０７（図１１Ｓ）およびＩｇＧ１−１０（図１１Ｔ）のいずれもが、デュプリケート解析のいずれかにおいて、ＰＤ１とは別のターゲットに対する測定可能な結合を何も示さなかった。この知見により、リード抗体が高度な特異性とＰＤ１のみへの強力な結合とを保持することと、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）で観察された非特異的反応性が除かれたこととが示された。
【０１９４】
直交性の、高感度アッセイによりこの知見を最終的に確認するために、ＫＤＲ、ＵＬＢＰ２、ＦＺＤ５およびＺＳグリーンのみ（陰性対照）に関して配列検証プラスミドを用いて、ヒト細胞株ＨＥＫ２９３の一過性トランスフェクションを実行した。次いで、トランスフェクト細胞は、ｍＶＨ／ｍＶＬ  Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）、ペムブロリズマブアナログ、アイソタイプＩｇＧ１、およびリード抗体のサブセット（ＩｇＧ１−０６Ｄ０２、ＩｇＧ１−１２ＨＯ４、ＩｇＧ１−０５、ＩｇＧ１−０８）を用いて染色した。各抗体を、受容体トランスフェクト細胞およびＺＳグリーントランスフェクト細胞の両方に対して、高濃度（５μｇ／ｍｌ）および中程度の濃度（１μｇ／ｍｌ）で繰り返し染色で用いた（バックグラウンド結合を測定するため）。ＰＤ１トランスフェクト細胞の５μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌ両方での染色（図１２Ａ〜１２Ｐ）において、アイソタイプコントロール以外の全ての被験抗体が、ＰＤ１トランスフェクト細胞で予測された強力で特異的な染色を示したが、ＺＳグリーントランスフェクト細胞では示さなかった。対照的に、ＦＺ５トランスフェクト細胞（図１３Ａ〜１３Ｐ）、ＫＤＲトランスフェクト細胞（図１４Ａ〜１４Ｐ）およびＵＬＢＰ２トランスフェクト細胞（図１５Ａ〜１５Ｐ）の染色は、図１１よりのチップデータと完全に一致したが、ｍＶＨ／ｍＶＬ  Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１およびＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）のみは、５μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの両方で３標的の全てにおいて強い結合シグナル示した。抗体ＩｇＧ１−０６Ｄ０２、ＩｇＧ１−１２ＨＯ４、ＩｇＧ１−０５、ＩｇＧ１−０８、ペムブロリズマブアナログ、またはアイソタイプＩｇＧ１のいずれもが、どちらの濃度でも、ＦＺ５、ＫＤＲまたはＵＬＢＰ２をトランスフェクトした細胞のうちのいずれに対しても、バックグラウンド上で測定可能な結合を示すものはなかった。さらなる高感度のＥＬＩＳＡアッセイでは、これら抗体はまた、ヒトおよびカニクイザルＰＤ１（図１６Ａ、Ｂ）に結合するが、ヒトもしくはアカゲザルＶＥＧＦＲ２（図１６Ｃ、Ｄ）、ヒトＦＺＤ５（図１６Ｅ）の組換え外部ドメインに対して、またはＢＳＡタンパク質（図１６Ｆ）に対しては結合しなかった。これら知見により、突然変異誘導および再選択工程で誘導されるＣＤＲ配列は、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）と関連した臨床毒性の一次ドライバであり得る受容体ＫＤＲ、ＦＺＤ５およびＵＬＢＰ２の非特異的結合を予期せずに除いたということを完全に確認した。
【０１９５】
最後に、ＰＤ１アフィニティ評価に関して上記した条件を用いて、ビアコアを介してＶＥＧＦＲ２に対するｍＶＨ／ｍＶＬ  Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１およびＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）のアフィニティを評価する試みを行った。ヒトおよびアカゲザルの単量体ＶＥＧＦＲ２−ｈｉｓタンパク質を、ｍＶＨ／ｍＶＬ  Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１およびＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）に対して力価測定した。ここでまた、両抗体は、ＶＥＧＦＲ２組換えタンパク質に対して結合を示したが、結合シグナルは、非常に高濃度の可溶性分析物でのみ観察された（図１７）。結果として、乏しい適合値（Ｃｈｉ２＞６．６）である複雑な曲線が、生成できたもののすべてであり、信頼できるＫＤ値は正確には導かれなかった。このことは、ヒトＶＥＧＦＲ２であってもアカゲザルＶＥＧＦＲ２であってもいずれの抗体のアフィニティが低く、μＭ領域にある可能性があるということを示した。
【０１９６】
ＶＥＧＦＲ２活性解析
ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）におけるＶＥＧＦＲ２反応性が、受容体を活性化することが可能であるかどうかを検証するために、ヒトＶＥＧＦＲ２受容体アッセイを用いて、天然のＶＥＧＦ反応エレメントＮＦＡＴ（プロメガ社）の制御下での、ルシフェラーゼ発現の誘導を調べた。このアッセイにおいて、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）およびｍＶＨ／ｍＶＬ  Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１の両方が、ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達の強い濃度依存性活性を示し（ｎＭ領域にある）、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）はｍＶＨ／ｍＶＬ  Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１よりも強力であった（図１８）。しかしながら、ＩｇＧ１−Ｍａｂ００５（ヒト化）の活性化能は、有意に、組換えヒトＶＥＧＦ−１６３のものよりも低かった（図１８）。重要なことには、クローンＭＡＢ０４、ＭＡＢ０８、０６Ｄ０２および１２Ｈ０４のそれぞれがまた、このアッセイで解析されたが、１μＭの高さの濃度であっても、観測可能な活性化シグナルは現れなかった。実際には、リードＩｇＧクローンに関して、最大濃度でのシグナルは、アイソタイプコントロールＩｇＧ１で観察されたシグナルよりも少なかった（図１８）。
【０１９７】
ＩｇＧ安定性解析
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して、全体的な分子構造の安定性の指標としてのタンパク質の熱的安定性を測定する。試験されたすべてのＩｇＧ１ヌルタンパク質が、ＤＳＣ解析と完全に適合可能であり、同等のサンプル均一性および協同性を示した（図１９）。各抗体に対し測定された温度遷移中点（Ｔｍ：ｔｈｅｒｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｍｉｄｐｏｉｎｔｓ）を表１３に示す。５個すべてのＩｇＧが、ＣＨ２ドメインと同様に、７２．２℃から７２．４℃のＴｍ１値を示し、すべてのサンプルが高い完全性を有していたことが示唆された。しかしながら、予期せずに、全てのリードＩｇＧ（ＩｇＧ１−０５、ＩｇＧ１−０８、ＩｇＧ１−０６Ｄ０２およびＩｇＧ１−１２Ｈ０４）が、それらのＦａｂドメインで極めて高い安定性を示し、Ｔｍ２の値は９０．８℃から９２．２℃の範囲であった（表１３）。対照的に、Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１（ヒト化）は、有意に低いＦａｂ安定性であり、Ｔｍ値は８３．８℃であった（表１３）。すべての抗体の可変ドメインフレームワーク領域および抗体定常領域が、同一の配列であり、したがってすべての改善が、ＣＤＲ配列の差異によってのみ介在されたという点から、Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１（ヒト化）よりもリード抗体に関する、Ｆａｂ安定性の大幅な上昇は予想外であった。
【０１９８】
例えばトリプトファンおよびメチオニンなどの露出アミノ酸残基の酸化は、ｍＡｂの一般的な分解経路である。重要なことは、抗体のＣＤＲ中の重要な側鎖の酸化も、標的結合アフィニティの低下をもたらすことから、潜在的に生物活性に影響を与え得るということである。酸化は通常、タンパク質の保存中に経時的に発生するプロセスであり、リアルタイムで酸化リスクを解析する標準的な実験方法は、タンパク質に参加試薬を添加することである。この実験において、０．５％  Ｈ２Ｏ２のＰＢＳ溶液を用いて２時間、室温で処理することによりＩｇＧを強制的に酸化させた。酸化は、例えば酸化型の極性を上昇させることで、抗体全体の疎水性を変化させる場合があるため、強制酸化により誘導された潜在的な変化を、逆相（ＲＰ）および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）法により解析した。
ＲＰ解析では、インタクトなＩｇＧ形式（表１４）または還元されたＩｇＧ形式（表１５）のいずれにおける、クローンＩｇＧ１−０５、ＩｇＧ１−０８、ＩｇＧ１−０６Ｄ０２およびＩｇＧ１−１２Ｈ０４のいずれに関しても、保持時間の変化は観察されず、これは側鎖において有意な酸化は生じなかったことを示唆する。対照的に、Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１（ヒト化）のＨ２Ｏ２処理により、インタクトなＩｇＧ（表１４）のカラム保持時間の約０．６分の減少が、また還元された軽鎖（表１５）では約０．８分の減少が観察され、これは露出アミノ酸の酸化が、抗体軽鎖内で特異的に生じていたことを示唆した。Ｈ２Ｏ２処理の前後における、トリプシンペプチドフィンガープリントのＲＰ解析もまた、Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１（ヒト化）ではないすべてのＩｇＧでは、側鎖の酸化による変化は最小限であったことを示した。Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１（ヒト化）では、強制酸化後の５つのペプチドの欠如または還元に次いで、６つのさらなるペプチドが出現した（図２０Ａ）。対照的にクローンＩｇＧ１−０５、ＩｇＧ１−０８、ＩｇＧ１−０６Ｄ０２およびＩｇＧ１−１２Ｈ０４は、有意に少ないペプチドが同時の欠如を示した。例えば、ＩｇＧ１−０６Ｄ０２は、Ｈ２Ｏ２処理後に、ちょうど２つのトリプシンペプチドの欠如と、２つのさらなるピークの出現を示した（図２０Ｂ）。
【０１９９】
Ｈ２Ｏ２処理はまた、５つすべての被験体で、ＨＩＣにおける保持時間の減少を誘導したが、これは露出アミノ酸の酸化がわずかであったことを示唆した（表１６）。ここでまた、ＨＩＣで最も大きく減少した保持時間（１．１分）が、Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１（ヒト化）で観察された一方で、クローンＩｇＧ１−０５、ＩｇＧ１−０８、ＩｇＧ１−０６Ｄ０２およびＩｇＧ１−１２Ｈ０４での減少はほんの０．２〜０．３分であった。総じて、これら知見により、リードクローンＩｇＧ１−０５、ＩｇＧ１−０８、ＩｇＧ１−０６Ｄ０２およびＩｇＧ１−１２Ｈ０４は、予期せずに、Ｍａｂ００５−ＩｇＧ１（ヒト化）と比較して、改善された物理的安定性と酸化による変化に対する抵抗性とを有することが示唆された。
【０２００】
本明細書に概要される解析を組み合わせると、驚くべきことに、これら抗体のＣＤＲにおいて、生殖細胞系列と非生殖細胞系列のアミノ酸の両方を深くサンプリングすることで、複数の最終分子において標的結合特異性、免疫原性リスク、有効性、生物物理的安定性および化学的安定性のリスクを同時に最適化することが可能となったことが示された。
【０２０１】
限定されないが特許、特許出願、記事、書誌、および論文を含む本明細書に引用されるすべての書面、または書面の一部は、その全体ですべての目的に対し、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。組み込まれた書面、または書面の一部の１つまたは複数が、本出願の用語定義と矛盾する用語を定義する場合、本出願にある定義が優先される。しかしながら、本明細書に引用されるすべての参照文献、記事、公表文献、特許、公表特許、および特許出願に関する言及は、それらが正当な先行技術を構成する、または世界の任意の国における普遍的で一般的な知識の一部を形成するという承認、または任意の形態の示唆として見なされず、または見なされるべきではない。
【０２０２】
本発明は好ましい実施形態または例示的実施形態を参照して記載されているが、当業者であれば、本発明の主旨および範囲を逸脱することなくそれらに対する様々な改変および変動を行うことが可能であること、およびそうした改変は本明細書において予期されることが明白であると認識するであろう。本明細書に開示される、および添付の請求の範囲に記載される特定の実施形態に関し、限定は意図されておらず、何らの示唆もないものとする。
【表１】
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【表２】
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【表３−１】
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【表３−２】
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【表４−１】
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【表４−２】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９−１】
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【表１９−２】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021515542.tif 000067
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