(57)【要約】ＳＣ−β細胞を産生するための分化方法、および遺伝子発現を測定するために幹細胞由来細胞をスクリーニングする方法を本明細書中に開示する。ＳＣ−ＥＣ細胞も本明細書中に開示する。本明細書中に記載の研究において、シングルセルＲＮＡシーケンシングを使用して、多能性幹細胞の膵ベータ細胞へのインビトロ分化中に産生された細胞型を同定し、記載した。この分析により、ＳＣ−ベータ細胞形成の根底にある一連の転写の変化の前例のない見解を提供し、運命を決定する時点および細胞が分化の道を辿り得る別の経路を明らかにする。
2021522819.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞由来腸クロム親和性細胞。
【請求項２】
１またはそれを超える以下の遺伝子：ＴＰＨ１、ＳＬＣ１８Ａ１、ＬＭＸ１Ａ、ＰＡＸ４、ＤＤＣ、ＴＲＰＡ１、ＳＣＮ３Ａ、ＡＤＲα２Ａ、ＦＥＶ、ＴＡＣ１、およびＣＸＣＬ１４を発現する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記遺伝子ＴＰＨ１、ＬＭＸ１Ａ、およびＳＬＣ１８Ａ１を共発現する、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
前記遺伝子の前記発現が、インビボ膵臓集団と比較して富化される、請求項２または３に記載の細胞。
【請求項５】
セロトニン（５−ＨＴ）を産生することができる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６】
１またはそれを超える以下のマーカー：Ｇ６ＰＣ２、ＮＰＴＸ２、ＩＳＬ１、およびＰＤＸ１を発現しない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７】
ＫＣｌでの脱分極の際にインビトロでセロトニンを放出する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８】
高グルコースでの刺激の際にインビトロでセロトニンを放出しない、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９】
インビトロで内分泌細胞、膵臓前駆細胞、または多能性幹細胞から分化される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１０】
前記膵臓前駆細胞が、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞およびＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞からなる群より選択される、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞からなる群より選択される、請求項９に記載の細胞。
【請求項１２】
前記細胞がヒトである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞を含む細胞系。
【請求項１４】
１またはそれを超える請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞を含むＳＣ−膵島。
【請求項１５】
インビトロで前駆細胞からＳＣ−ＥＣ細胞を産生する方法であって、膵臓前駆細胞を含む細胞の集団を、細胞クラスタリングを促進する条件下で、ａ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、ｂ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ｃ）γ−セクレターゼ阻害剤、ｄ）ＥＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子、ｅ）レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、およびｆ）ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤を含む少なくとも６つのＥＣ成熟因子と接触させて、前記集団中の少なくとも１つの膵臓前駆細胞の少なくとも１つのＳＣ−ＥＣへの分化を誘導する、接触させる工程を含む、方法。
【請求項１６】
前記ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤がＡｌｋ５阻害剤ＩＩを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤がトリヨードサイロニン（Ｔ３）を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記γ−セクレターゼ阻害剤がＸＸＩを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＥＧＦファミリー由来の前記少なくとも１つの成長因子がベータセルリンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＲＡシグナル伝達経路活性化剤がＲＡを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＳＨＨ経路阻害剤がＳａｎｔ１を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
細胞の前記集団を、必要に応じて、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と接触させる、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤がＬＤＮ１９３１８９を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
内分泌細胞の集団中の細胞を同定する方法であって、
内分泌細胞の集団に拡散擬時間解析を適用する工程；
内分泌細胞の前記集団内の１またはそれを超える細胞によって発現される１またはそれを超える遺伝子を同定する工程；および
前記１またはそれを超える細胞をＳＣ−β細胞またはＳＣ−ＥＣ細胞として同定する工程であって、ここで、前記ＳＣ−β細胞が少なくともＩＳＬ１およびＥＲＯ１Ｂを発現し、前記ＳＣ−ＥＣ細胞が少なくともＴＰＨ１およびＬＭＸ１Ａを発現する、同定する工程
を含む、方法。
【請求項２５】
内分泌細胞の集団内のＳＣ−β細胞を同定する方法であって、
内分泌細胞の集団を、少なくともＩＳＬ１およびＥＲＯ１Ｂを発現する細胞についてスクリーニングする工程；および
内分泌細胞の前記集団内の細胞を、前記細胞が少なくともＩＳＬ１およびＥＲＯ１Ｂを発現する場合にＳＣ−β細胞と同定する工程
を含む方法。
【請求項２６】
内分泌細胞の集団内のＳＣ−ＥＣ細胞を同定する方法であって、
内分泌細胞の集団を、少なくともＴＰＨ１およびＬＭＸ１Ａを発現する細胞についてスクリーニングする工程；および
内分泌細胞の前記集団内の細胞を、前記細胞が少なくともＴＰＨ１およびＬＭＸ１Ａを発現する場合にＳＣ−ＥＣ細胞と同定する工程
を含む方法。
【請求項２７】
細胞の集団を分化に向ける方法であって、分化プロトコール中に細胞運命の制御因子の発現を調整し、それにより、所定の細胞運命への細胞の集団を分化に向ける工程を含む、方法。
【請求項２８】
ＳＣ−β細胞に富む集団を形成する方法であって、抗ＣＤ４９ａおよびマイクロビーズを解離した細胞の溶液に適用する工程；およびＣＤ４９ａに富む細胞を単離し、それにより、ＳＣ−β細胞に富む集団を形成させる工程、を含む、方法。
【請求項２９】
ＳＣ−β細胞を含むＳＣ−膵島を産生する方法であって、
分化プロセスからステージ６クラスターを得る工程；
再凝集手技を使用してステージ６クラスターを解離する工程；
解離した単一細胞を再懸濁および染色する工程であって、前記細胞がＣＤ４９ａに対して染色される、再懸濁および染色する工程；
マイクロビーズを、染色された解離した単一細胞の懸濁液に添加する工程；
前記単一細胞を磁気的に分離する工程；および
前記分離した単一細胞を合わせて、ＳＣ−β細胞の収率が高い細胞集団を形成する工程
を含む、方法。
【請求項３０】
前記細胞を、抗ヒトＣＤ４９ａ抗体を使用してＣＤ４９ａについて染色する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞集団が７０％ＳＣ−β細胞の高収率を示す、請求項２９または請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞集団が８０％ＳＣ−β細胞の高収率を示す、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
細胞の集団を分化に向ける方法であって、分化プロトコール中に細胞運命の制御因子の発現を阻害する工程であって、前記制御因子がＡＲＸである、阻害する工程を含み、それにより、細胞の集団をＳＣ−β細胞への分化に向ける、方法。
【請求項３４】
細胞の集団を分化に向ける方法であって、分化プロトコール中に細胞運命の第１の制御因子の発現を阻害する工程であって、前記第１の制御因子がＡＲＸである、阻害する工程、および分化プロトコール中に細胞運命の第２の制御因子の発現を活性化する工程であって、前記第２の制御因子がＰＡＸ４である、活性化する工程を含み、それにより、細胞の集団をＳＣ−β細胞への分化に向ける、方法。
【請求項３５】
細胞の集団を分化に向ける方法であって、分化プロトコール中にＬＭＸ１Ａを破壊する工程を含み、それにより、ＳＣ−ＥＣの産生を低下させ、細胞の集団をＳＣ−β細胞への分化に向ける、方法。
【請求項３６】
ＬＭＸ１Ａの前記破壊は、遺伝子編集技術を使用したノックダウンによって起こる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＬＭＸ１Ａの前記破壊は、遺伝子編集技術を使用したノックアウトによって起こる、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月７日に出願された米国仮出願第６２／６６８，２４２号の利益を主張する。上記出願の全教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
膵ベータ細胞は血糖の制御因子であり、膵ベータ細胞が自己免疫性に破壊されるか、機能障害に陥ると１型および２型の糖尿病を生じる。近年、多能性幹細胞を膵ベータ細胞に変換するインビトロ分化プロトコールが開発されている１〜３。例えば、「ＳＣ−ベータ」（幹細胞由来ベータ細胞）プロトコール１は、インビボでベータ細胞を生成する幹細胞に由来するシグナル伝達キュー（signaling  cue）の組み合わせを使用して段階的に分化させる。得られた幹細胞由来ベータ細胞は、糖尿病の動物モデルにおいてグルコースチャレンジに応答してインスリンを分泌し、代謝ホメオスタシスを修復する１。したがって、インビトロ分化プロトコールは、糖尿病のための細胞ベースの治療の開発における最も有力な候補である。
【背景技術】
【０００３】
インビトロで任意の細胞型を産生するようにチャレンジすると、定方向分化によって生成された細胞は不均一となる。そのプロセスの各ステップで、所望の経路を辿る細胞もあれば、逸脱する細胞もある。効率を改善するために、分化中に産生された全ての細胞型を同定することが重要である。高処理シングルセルＲＮＡシーケンシング４は、数千もの個別の細胞の偏りのない転写プロファイリングによって細胞型を特徴付ける。シングルセルＲＮＡシーケンシングは、多数の臓器の細胞型を包括的に特徴付けるために適用されている（ヒト成人５〜９およびマウス胚の１０，１１膵臓のいくつかの研究が含まれる）。
【０００４】
ベータ細胞分化プロトコールを用いた以前の研究により、いくつかの重要な所見が得られている。インスリンおよび他の重要なベータ細胞マーカーの共発現（グルコースで刺激されるインスリン分泌との組み合わせ）により、ベータ細胞が実際にインビトロで産生されることが最初に証明された。バルク遺伝子発現プロファイルを特徴づける研究１２、１３では、数千もの遺伝子の転写ランドスケープおよびエピジェネティックランドスケープが変化することが示された。Ｐｅｔｅｒｓｅｎら１４は、シングルセルｑＰＣＲを用いてインビトロ膵臓分化モデルを提唱した。これらの研究では、インビトロベータ細胞の前またはそれに並行して産生された全ての細胞型の同一性および状態を包括的に判定していなかった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書中に記載の研究において、シングルセルＲＮＡシーケンシングを使用して、多能性幹細胞の膵ベータ細胞へのインビトロ分化中に産生された細胞型を同定し、記載した。この分析により、ＳＣ−ベータ細胞形成の根底にある一連の転写の変化の前例のない見解を提供し、運命を決定する時点および細胞が分化の道を辿り得る別の経路を明らかにする。
【０００６】
とりわけ、この分析により、ＳＣ−ベータプロトコールで腸クロム親和性細胞と酷似した幹細胞由来細胞（ＳＣ−ＥＣ細胞）が産生されることが明らかにされた。これらのＳＣ−ＥＣ細胞は、ＳＣ−ベータ細胞と一緒に産生される異なる細胞型を表す。インビボで、腸クロム親和性細胞は、セロトニンを産生して分泌する上皮内分泌細胞である。腸クロム親和性細胞およびセロトニンシグナル伝達は、いくつかの疾患の病態生理学、特に腸の炎症に関連する病態生理学で重要な役割を果たし得る。前述の細胞の転写シグネチャーを記載し、ＫＣｌで脱分極されたときに前述の細胞がセロトニンを分泌する能力（インビトロでの新規のヒト細胞の作製を実証する）も記載する。本発明は、その一部が、ＧＩ管におけるセロトニンシグナル伝達を改変、すなわち改善し得る薬物のスクリーニングのためのモデルとしての役割を果たし得る、これらの天然に存在しないＳＣ−ＥＣ細胞に関し；ＳＣ−ＥＣ細胞は、細胞代償療法のために直接使用することもできる。
【０００７】
さらなる態様では、本明細書中に記載の研究では、インビトロでの膵ベータ細胞分化によって産生される細胞型のマーカーを同定する。シングルセルＲＮＡシーケンシングの結果により、インビトロベータ細胞分化中に産生された全細胞集団の完全なトランスクリプトームが詳細に特徴付けられる。このデータを使用して、単一の集団または集団の組み合わせが特異的に富化される遺伝子を同定することができる。これらの遺伝子が所与の集団に特異的であるという知識を活用して、インビトロでの膵ベータ細胞分化方法、および他の細胞型（アルファ細胞など）へのインビトロでの分化方法をさらに開発することができる。
【０００８】
より具体的には、これらの遺伝子を、少なくとも（ｉ）特定の集団の抗体ベースの同定および／または富化のための表面マーカーとして、および（ｉｉ）遺伝子撹乱（ノックアウト、活性化、または阻害など）のための標的として使用することができる。この後者の態様により、望ましくない運命に誤分化できないように遺伝子編集されている「テーラーメイドの」（非野生型）幹細胞系を作製することが可能である。すなわち、分化プロセス中の（多能性段階および／または分化プロセスの１またはそれを超えるその後の時点での）細胞の遺伝子発現の調節により、分化ルートを開閉して、細胞を所望の経路に向かわせるか、望ましくない経路から逸脱させることができる。
【０００９】
幹細胞由来腸クロム親和性細胞（すなわち、天然に存在しない腸クロム親和性細胞）を本明細書中に開示する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、細胞は、１またはそれを超える以下の遺伝子：ＴＰＨ１、ＳＬＣ１８Ａ１、ＬＭＸ１Ａ、ＰＡＸ４、ＤＤＣ、ＴＲＰＡ１、ＳＣＮ３Ａ、ＡＤＲα２Ａ、ＦＥＶ、ＴＡＣ１、およびＣＸＣＬ１４を発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、遺伝子ＴＰＨ１、ＬＭＸ１Ａ、およびＳＬＣ１８Ａ１を共発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子の発現は、インビボ膵臓集団と比較して富化される。いくつかの実施形態では、細胞は、１またはそれを超える以下のマーカー：Ｇ６ＰＣ２、ＮＰＴＸ２、ＩＳＬ１、およびＰＤＸ１を発現しない。
【００１１】
いくつかの実施形態では、細胞は、セロトニン（５−ＨＴ）を産生することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、ＫＣｌでの脱分極の際にインビトロでセロトニンを放出し、そして／または高グルコースでの刺激の際にインビトロでセロトニンを放出しない。
【００１２】
いくつかの実施形態では、細胞は、インビトロで内分泌細胞、膵臓前駆細胞、または多能性幹細胞から分化される。いくつかの態様では、前記膵臓前駆細胞は、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞およびＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞からなる群より選択される。いくつかの態様では、前記多能性幹細胞は、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞はヒトである。
【００１３】
本明細書中に記載の幹細胞由来腸クロム親和性細胞を含む細胞系も本明細書中に開示する。１またはそれを超える本明細書中に記載の幹細胞由来腸クロム親和性細胞を含むＳＣ−膵島も本明細書中に開示する。
【００１４】
インビトロで前駆細胞からＳＣ−ＥＣ細胞を産生する方法が本明細書に開示される。方法は、膵臓前駆細胞を含む細胞の集団を、細胞クラスタリングを促進する条件下で、ａ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、ｂ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ｃ）γ−セクレターゼ阻害剤、ｄ）ＥＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子、ｅ）レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、およびｆ）ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤を含む少なくとも６つのＥＣ成熟因子と接触させて、集団中の少なくとも１つの膵臓前駆細胞の少なくとも１つのＳＣ−ＥＣへの分化を誘導する、接触させる工程を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤がＡｌｋ５阻害剤ＩＩを含む、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤がトリヨードサイロニン（Ｔ３）を含む、γ−セクレターゼ阻害剤がＸＸＩを含む、ＥＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子がベータセルリンを含む、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤がＲＡを含む、かつ／またはＳＨＨ経路阻害剤がＳａｎｔ１を含む。いくつかの実施形態では、細胞の集団を、必要に応じて、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＬＤＮ１９３１８９）と接触させる。
【００１６】
内分泌細胞の集団中の細胞（例えば、ＳＣ−β細胞、ＳＣ−α細胞、および／またはＳＣ−ＥＣ細胞）を同定する方法も本明細書に開示される。方法は、内分泌細胞の集団に拡散擬時間解析を適用する工程；内分泌細胞の集団内の１またはそれを超える細胞によって発現される１またはそれを超える遺伝子を同定する工程；および１またはそれを超える細胞をＳＣ−β細胞、ＳＣ−α細胞またはＳＣ−ＥＣ細胞として同定する工程であって、ここで、ＳＣ−β細胞が少なくともＩＳＬ１およびＥＲＯ１Ｂを発現し、ＳＣ−ＥＣ細胞が少なくともＴＰＨ１およびＬＭＸ１Ａを発現する、同定する工程を含む。
【００１７】
内分泌細胞の集団内のＳＣ−β細胞を同定する方法も本明細書に開示される。方法は、内分泌細胞の集団を、少なくともＩＳＬ１およびＥＲＯ１Ｂを発現する細胞についてスクリーニングする工程；および内分泌細胞の集団内の細胞を、細胞が少なくともＩＳＬ１およびＥＲＯ１Ｂを発現する場合にＳＣ−β細胞と同定する工程を含む。
【００１８】
内分泌細胞の集団内のＳＣ−ＥＣ細胞を同定する方法が本明細書に開示される。方法は、内分泌細胞の集団を、少なくともＴＰＨ１およびＬＭＸ１Ａを発現する細胞についてスクリーニングする工程；および内分泌細胞の集団内の細胞を、細胞が少なくともＴＰＨ１およびＬＭＸ１Ａを発現する場合にＳＣ−ＥＣ細胞と同定する工程を含む。
【００１９】
細胞の集団を分化に向ける方法であって、分化プロトコール中に細胞運命の制御因子の発現を調整し、それにより、所定の細胞運命への細胞の集団を分化に向ける工程を含む、方法が本明細書に開示される。
【００２０】
ＳＣ−β細胞に富む集団を形成する方法も本明細書に開示される。方法は、抗ＣＤ４９ａ抗体およびマイクロビーズを解離した細胞の溶液に適用する工程；およびＣＤ４９ａに富む細胞を単離し、それにより、ＳＣ−β細胞に富む集団を形成させる工程、を含む。
【００２１】
ＳＣ−β細胞を含むＳＣ−膵島を産生する方法が本明細書に開示される。方法は、分化プロセスからステージ６クラスターを得る工程；再凝集手技を使用してステージ６クラスターを解離する工程；解離した単一細胞を再懸濁および染色する工程であって、細胞がＣＤ４９ａに対して染色される、再懸濁および染色する工程；マイクロビーズを、染色された解離した単一細胞の懸濁液に添加する工程；単一細胞を磁気的に分離する工程；および分離した単一細胞を合わせて、ＳＣ−β細胞の収率が高い細胞集団を形成する工程を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、細胞を、抗ヒトＣＤ４９ａ抗体を使用してＣＤ４９ａについて染色する。いくつかの実施形態では、細胞集団は７０％ＳＣ−β細胞の高収率を示す。いくつかの実施形態では、細胞集団は８０％ＳＣ−β細胞の高収率を示す。
【００２３】
細胞の集団を分化に向ける方法も本明細書に開示される。方法は、分化プロトコール中に細胞運命の制御因子の発現を阻害する工程であって、制御因子がＡＲＸである、阻害する工程を含み、それにより、細胞の集団をＳＣ−β細胞への分化に向ける。
【００２４】
細胞の集団を分化に向ける方法も本明細書に開示される。方法は、分化プロトコール中に細胞運命の第１の制御因子の発現を阻害する工程であって、例えば、第１の制御因子がＡＲＸである、阻害する工程、および分化プロトコール中に細胞運命の第２の制御因子の発現を活性化する工程であって、例えば、第２の制御因子がＰＡＸ４である、活性化する工程を含み、それにより、細胞の集団をＳＣ−β細胞への分化に向ける。
【００２５】
細胞の集団を分化に向ける方法が本明細書に開示される。方法は、分化プロトコール中にＬＭＸ１Ａを破壊する工程を含み、それにより、ＳＣ−ＥＣの産生を低下させ、細胞の集団をＳＣ−β細胞への分化に向ける。いくつかの実施形態では、ＬＭＸ１Ａの破壊は、遺伝子編集技術を使用したノックダウンによって起こる。いくつかの実施形態では、ＬＭＸ１Ａの破壊は、遺伝子編集技術を使用したノックアウトによって起こる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公報のコピーは、請求および必要な料金の支払いにより、官庁により提供されるであろう。
【００２７】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｇは、インビトロベータ細胞分化のシングルセルＲＮＡシーケンシングを実証する。図１Ａは、ＰａｇｌｉｕｃａらのＳＣ−ベータプロトコールのステージ３〜６の終了時にフローサイトメトリーによって同定された細胞集団のまとめを提供する。ＰＤＸ１：膵臓転写因子、ＮＫＸ６．１：ベータ細胞転写因子、ＩＮＳ：インスリン（ベータ細胞ホルモン）、ＣＨＧＡ：クロモグラニンＡ（汎内分泌マーカー）。図１Ｂは、分化した（ステージ６、１３日目）ＳＣ−ベータクラスターの免疫蛍光イメージングを示し、これは、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチド（インスリンの一成分）の染色が不均一な集団を示す。図１Ｃは、同一の分化の異なる時点でサンプリングした細胞を特徴づけるためのｉｎＤｒｏｐｓシングルセルＲＮＡシーケンシングを使用した研究デザインの略図を提供する。図１Ｄは、「ｘ１」プロトコールのステージ３〜６の終了時にサンプリングした細胞のｔＳＮＥ投影図を示す。細胞を、Ｌｏｕｖａｉｎコミュニティ検出を使用して、割り当てられたそのクラスターに応じて色分けした。プロット下部に沿ったバーは、クラスターの相対比率を示す。細胞の色についての説明文は、その後のパネルで使用した説明文と同一である。図１Ｅは、ＳＣ−ベータ分化において同定された細胞型にわたって発生的に関連する遺伝子およびマーカーの発現プロファイルを提供する。各集団は、特異的なマーカーを有する。図１Ｆは、腸クロム親和性細胞マーカーＳＬＣ１８Ａ１の免疫蛍光イメージングを示す。ＳＬＣ１８Ａ１＋細胞は、クラスターの周辺に存在する。図１Ｇは、非内分泌マーカーＳＯＸ９の免疫蛍光イメージングを示す。ＳＯＸ９＋細胞は、クラスターの中心付近に局在している。
【図１−２】同上。
【図１−３】同上。
【００２８】
【図２−１】図２Ａ〜２Ｉは、ＳＣ−ベータ細胞が最終分化段階での長期培養中に機能的かつ転写安定性を示すことを実証している。図２Ａは、ステージ６中の機能および転写の変化を研究するための実験デザインの略図を提供する。図２Ｂは、５週間にわたる３つの独立した分化についての連続した低グルコース（２．８ｍＭ）チャレンジおよび高グルコース（２０ｍＭ）チャレンジを示すグルコース刺激インスリン分泌を示す。図２Ｃは、高グルコースにおけるインスリン分泌の低グルコースにおけるインスリン分泌に対する比として計算した刺激指数を提供する。刺激指数１（破線）は、非応答細胞を表す。図２Ｄは、ステージ５の５週間の培養期間中の６つの時点由来の３８，００４個の細胞のｔＳＮＥプロットを示す。細胞を、割り当てられたその集団に応じて色分けしている。各週のクラスターの相対比率を、縦棒として表示している。図２Ｅは、１週間ごとに分析された各細胞型の発現プロファイルの相関関係を示す。図２Ｆは、各細胞の拡散擬時間（ＤＰＴ）値で網掛けした０〜６週目のＳＣ−ベータ細胞のｔＳＮＥ投影図を示す。暗色のラインは、ＤＰＴの変化についての近似等高線を示す。図２Ｇは、所与の細胞についてのＤＰＴ分布を示し、この図は、その後の時間から採取した細胞が平均してこのプロセスにさらに沿うことを示す。図２Ｈは、ベータ細胞における発現が拡散擬時間（アルファ０．００１でのＦＤＲ調整から算出したｑ値）と相関する遺伝子を示すボルカノプロットを提供する。図２Ｉは、ベータ細胞の拡散擬時間に沿って示された選択遺伝子の発現を示す。灰色のドットは、擬時間によって選別した各細胞由来の測定値であり、重ね合わせたラインは移動平均を示す。
【図２−２】同上。
【図２−３】同上。
【００２９】
【図３−１】図３Ａ〜３Ｅは、腸クロム親和性細胞を実証する。図３Ａは、ＳＣ−ベータ細胞とＳＣ−ＥＣ細胞との間の遺伝子発現プロファイルの比較を提供する。強調表示した遺伝子は、セロトニン合成または腸クロム親和性のマーカーに必要である。図３Ｂは、インビトロ集団（上のパネル）およびヒト膵臓内分泌細胞型（下）にわたるＳＣ−ＥＣ富化遺伝子の発現レベルを示す。図３Ｃは、ＷＴマウス膵島と、ＥＥＤノックアウトを介したベータ−細胞特異的ＰＲＣ２アブレーションから２５週間後のマウス膵島との間の遺伝子発現の比較を提供する。紫色の遺伝子は、下方制御されたベータ−細胞同一性遺伝子であり、赤色の遺伝子は、（図３Ａ）で認められるセロトニン／ＥＣシグネチャーの一部である。図３Ｄは、ＳＣ−ＥＣ細胞マーカーＬＭＸ１Ａ、ＴＰＨ１、ＳＬＣ１８Ａ１の免疫蛍光染色を示し、これは、セロトニン（５−ＨＴ）との共存を示す。図３Ｅは、マウス腎臓被膜中へのＳＣ−ベータ分化クラスターの移植から８週間後に回収した移植組織のＣ−ペプチド（ＩＮＳ）およびＳＬＣ１８Ａ１についての免疫蛍光染色を示す。
【図３−２】同上。
【図３−３】同上。
【００３０】
【図４−１】図４Ａ〜４Ｆは、再凝集が内分泌細胞を富化するためのスケーラブルな機能保存法であることを実証する。図４Ａは、再凝集手技の略図である。細胞は、酵素的に解離され、継続懸濁培養中に再凝集される。４日後に接着できない非内分泌細胞を濾過によって除去する。図４Ｂは、単一分化由来のネイティブクラスターおよび再凝集クラスターからシーケンシングした細胞のｔＳＮＥを示し、これは、非内分泌集団の強い枯渇を示す。図４Ｃは、内分泌細胞の存在量の測定のための代表的なフローサイトメトリー分析を提供する。内分泌細胞は、ＣＨＧＡを発現する。図４Ｄは、６０の再凝集分化および４１のネイティブ分化における集団の組成（フローサイトメトリーによってアッセイした場合）のまとめを示す。図４Ｅは、５２の対応のあるネイティブ分化対再凝集分化の刺激指数（２０ｍＭグルコースで放出されたインスリン／２ｍＭで放出されたインスリン）を示す。ウィルコクソン順位和検定を使用してｐ値を計算した。図４Ｆは、Ｃ−ペプチド（インスリンの断片）の免疫蛍光染色を示し、ＳＬＣ１８Ａ１は、再凝集クラスター中での区別可能な隣接を示す。
【図４−２】同上。
【００３１】
【図５−１】図５Ａ〜５Ｈは、ステージ５の時間経過を実証する。図５Ａは、４６２０４個の細胞のｔＳＮＥ投影図を示し、ステージ４完了時（０日目）、ステージ５完了時（７日目）、またはステージ５の中間に前記細胞が存在するかどうかにしたがって濃淡をつけている。サンプリング時間（左）およびＮＥＵＲＯＧ３発現（右）。図５Ｂは、割り当てた細胞同一性クラスターにしたがって濃淡をつけた（shaded）図５Ａと同一のｔＳＮＥ投影図を提供する。図５Ｃは、両方の独立した分化の各日についての図５Ｂ中の各クラスター由来の細胞画分を示す。図５Ｄは、内分泌誘導、ＳＣ−ＥＣ、およびＳＣ−ベータクラスターにおける細胞の拡散擬時間（ＤＰＴ）解析を示す。（上）解析のために選択した細胞型の略図。（下）３つの可能性のある各枝に沿ったＤＰＴにおけるランクによって濃淡をつけた、選択した細胞のｔＳＮＥ投影図。図５Ｅは、図５Ｄ由来のＤＰＴ順序付けに沿った重要遺伝子の発現を示す。３つの枝を順次示す。灰色ドットは各細胞であり、重ね合わせたラインは移動平均である。図５Ｆは、図５Ｄ〜５Ｅに見られるようにＤＰＴによって順序付けした６３５個の遺伝子の凝集体パターンを示すヒートマップを提供する。図５Ｇは、図５Ｂ〜５Ｃ中に示したクラスターのマーカーを示すヒートマップを提供する。図５Ｈは、重要な細胞型の主な発生軌跡を示す、ＳＣ−ベータプロトコールのための系譜モデルを提供する。
【図５−２】同上。
【図５−３】同上。
【００３２】
【図６−１】図６Ａ〜６Ｇは、２つのＳＣ−ベータプロトコールバリアントの比較を提供する。図６Ａ〜６Ｂは、プロトコール「ｘ１」（図６Ａ）および「ｘ２」（図６Ｂ）におけるステージ３および４の変化ならびにステージ４および５の終了時の代表的なフローサイトメトリーの結果のまとめを提供する。図６Ｃは、図１Ｄと比較した「ｘ２」プロトコールのステージ３〜６の終了時にサンプリングした細胞のｔＳＮＥ投影図を示す。細胞を、Ｌｏｕｖａｉｎコミュニティ検出を使用して、割り当てられたそのクラスターに応じて色分けした。濃淡（shading）の説明文の詳細は、パネル（ｅ）に記載されている。図６Ｄは、プロトコール「ｘ１」および「ｘ２」由来の細胞集団の比較を提供する。約２０００個の高変動遺伝子のＴＰＭ値のｚスコアを使用して、相関関係を計算している。横列および縦列を、階層クラスタリングを使用して順序付けている。図６Ｅ〜６Ｆは、細胞型（図６Ｅ）および分化（図６Ｆ）によって色分けした、３つの分化由来のステージ６のｔＳＮＥ埋め込みを示す。図６Ｇは、ＨＵＥＳ８（ＥＳ細胞）およびｉＰＳ１０１６／３１（ｉＰＳ細胞）に由来する細胞集団の相関関係を示す。
【図６−２】同上。
【図６−３】同上。
【図６−４】同上。
【００３３】
【図７−１】図７Ａ〜７Ｃは、グルコース刺激インスリン分泌を実証する。図７Ａは、連続ＧＳＩＳアッセイデザインのまとめを提供する。図７Ｂは、数週間にわたってアッセイした３つの独立したフラスコについての完全データを示す。円は技術的３回反復を表し、バーは平均測定値を示す。図７Ｃは、図７Ｂ由来の試料と並行して実施した死体ヒト膵島の７バッチについての完全データを示す。
【図７−２】同上。
【図７−３】同上。
【００３４】
【図８−１】図８Ａ〜８Ｄは、ステージ６の時間経過を実証する。図８Ａは、ステージ６の時間経過データを埋め込んでいるｔＳＮＥを示し、サンプリング時間（上の横列）および代表的なマーカー遺伝子（下の横列）によって濃淡をつけている。図８Ｂは、ベータ−細胞機能に必要な重要遺伝子についての発現プロファイルを示す。図８Ｃ〜８Ｄは、ヒト死体膵島由来ベータ細胞と、インビトロ前駆体と、ＳＣ−ベータ細胞との間のグローバル発現の比較を提供する。強調表示した遺伝子は、図８Ｂに示す遺伝子と同一である。
【図８−２】同上。
【００３５】
【図９】図９Ａ〜９Ｄは、ＳＣ−アルファ細胞の特徴付けを実証する。図９Ａは、ＳＣ−ベータ（紫色）およびＳＣ−アルファ細胞（赤色）における数週間のステージ６中のインスリン発現およびグルカゴン発現を示す（濃淡は、各細胞に関するバイオリンプロットであり、連結した点は中央値の連結である）。図９Ｂは、死体膵島アルファ細胞とベータ細胞との間で差次的に発現された遺伝子の発現レベルを示す。図９Ｃは、膵島アルファ細胞、ＳＣ−アルファ細胞、ＳＣ−ベータ細胞、および膵島ベータ細胞について示した（ｃ）由来の遺伝子の発現レベルのヒートマップを提供する。図９Ｄは、膵島ベータ細胞で上方制御した遺伝子がＳＣ−ベータ細胞で上方制御され、アルファ細胞で上方制御した遺伝子がＳＣ−アルファ（多ホルモン）細胞で上方制御されることを示す。マン・ホイットニーのＵ検定を使用してｐ値を計算した。
【００３６】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは、ＳＣ−腸クロム親和性細胞の特徴付けを実証する。図１０Ａは、トリプトファンからのセロトニン合成の略図を提供する。図１０Ｂは、低グルコースおよび高グルコースの順次チャレンジおよびその後のＫＣｌ脱分極中のセロトニン放出を示す。上のパネル：ＳＣ−ベータ分化したクラスターの３つのバッチ。下のパネル：ヒト死体膵島対照の２つのバッチ。
【００３７】
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｃは、ステージ６の時間経過由来の非内分泌細胞の特徴付けを実証する。図１１Ａは、日数（上の横列）または細胞同一性に関連する遺伝子（下の横列）によって濃淡をつけた、ステージ６の時間経過由来の非内分泌細胞のｔＳＮＥ埋め込みを示す。図１１Ｂは、Ｌｏｕｖａｉｎコミュニティ検出によって同定されたクラスターおよび分化の週毎の各クラスターにおける細胞画分を示す。図１１Ｃは、非内分泌細胞の各上清のマーカーの遺伝子発現ヒートマップを提供する。
【図１１−２】図１１Ａ〜１１Ｃは、ステージ６の時間経過由来の非内分泌細胞の特徴付けを実証する。図１１Ａは、日数（上の横列）または細胞同一性に関連する遺伝子（下の横列）によって濃淡をつけた、ステージ６の時間経過由来の非内分泌細胞のｔＳＮＥ埋め込みを示す。図１１Ｂは、Ｌｏｕｖａｉｎコミュニティ検出によって同定されたクラスターおよび分化の週毎の各クラスターにおける細胞画分を示す。図１１Ｃは、非内分泌細胞の各上清のマーカーの遺伝子発現ヒートマップを提供する。
【００３８】
【図１２−１】図１２Ａ〜１２Ｄは、ステージ５の時間経過を実証する。図１２Ａは、ステージ５の時間経過データを埋め込んでいるｔＳＮＥを示し、サンプリング時間（上の横列）および代表的なマーカー遺伝子（下の横列）によって濃淡をつけている。図１２Ｂは、ステージ５の０日目（上の横列）および１日目（下の横列）由来の前駆細胞の擬時間順序付けを示し、これは、初期前駆体の間で集団が均一であることを示している。１日目に、ＮＫＸ６．１＋前駆体はＮＥＵＲＯＧ３発現を誘導する。図１２Ｃは、０日目の前駆体の擬時間順序付けに最も相関する（または逆相関する）５０個の遺伝子のヒートマップを提供する。図１２Ｃは、ステージ５集団にわたって動的に発現された受容体、リガンド、およびシグナル伝達エフェクターのヒートマップを提供する。
【図１２−２】同上。
【図１２−３】同上。
【図１２−４】同上。
【００３９】
【図１３】図１３は、本明細書中で使用した分化プロトコールを提供する。
【００４０】
【図１４】図１４は、本明細書中で使用したシングルセルＲＮＡシーケンシングデータセットを提供する。
【００４１】
【図１５】図１５は、本明細書中で同定した全ての細胞集団のまとめを提供する。
【００４２】
図１６〜４３は、図１〜１５由来の一定のデータを再度示し、さらなるデータを提供する。
【００４３】
【図１６−１】図１６Ａ〜１６Ｇは、インビトロベータ細胞分化のシングルセルＲＮＡシーケンシングを実証する。図１６Ａは、ＰａｇｌｉｕｃａらのＳＣ−ベータプロトコールのステージ３〜６の終了時にフローサイトメトリーによって同定された細胞集団のまとめを提供する。ＰＤＸ１：膵臓転写因子、ＮＫＸ６．１：ベータ細胞転写因子、ＩＮＳ：インスリン（ベータ細胞ホルモン）、ＣＨＧＡ：クロモグラニンＡ（汎内分泌マーカー）。図１６Ｂは、同一分化のいくつかの時点由来の細胞をサンプリングするためのｉｎＤｒｏｐｓの使用を実証する。図１６Ｃは、ＳＣ−ベータ分化中に同定された細胞型にわたって発生的に関連する遺伝子およびマーカーの発現プロファイルを提供する。濃淡は平均発現（ｚ正規化ｔｐｍ）を示し、円の直径は発現の割合を示す。図１６Ｄ〜１６Ｇは、「ｘ１」プロトコールのステージ３〜６の終了時にサンプリングした細胞のｔＳＮＥ投影図を示す。細胞を、割り当てられたその集団に応じて色分けしている。横棒は、細胞型の比率を示す。
【図１６−２】同上。
【図１６−３】同上。
【図１６−４】同上。
【００４４】
【図１７−１】図１７Ａ〜１７Ｉは、ＳＣ−ベータ細胞がステージ６における長期培養中に同一性を維持し、成熟マーカー発現を獲得することを実証する。図１７Ａは、プロトコールｖ８のステージ６中の機能および転写の変化を研究するための実験デザインを提供する。図１７Ｂは、５週間にわたる３つの独立した分化についての連続した低グルコース（２．８ｍＭ）チャレンジおよび高グルコース（２０ｍＭ）チャレンジを示すグルコース刺激インスリン分泌を示す。図１７Ｃは、図１７Ｂ中のデータについての刺激指数（２０ｍＭグルコースで放出されたインスリン／２ｍＭで放出されたインスリン）を提供する。図１７Ｄは、ステージ６の５週間にわたる６つの時点由来の３８，４９４細胞のｔＳＮＥ投影図を示す。細胞を、それに割り当てた型に応じて色分けした。縦棒は、各週における集団の比を示す。図１７Ｅは、内分泌誘導マーカー遺伝子の発現を示す。図１７Ｆは、週毎に分析された各々の主要細胞型の発現プロファイルの相関関係を示す。細胞型の色は、（ｄ）中の色と一致させた。図１７Ｇは、ｔＳＮＥ上に示したＳＣ−ベータ細胞の擬時間順序（上）およびサンプリングした週によって層別化したＳＣ−ベータ擬時間順序の分布（下）を提供する。図１７Ｈは、ＳＣ−ベータ擬時間に沿った動的遺伝子の同定を提供する。変化倍率は、擬時間軌跡の開始と終了を比較している。ｑ値は、完全モデルおよび削減モデルを比較する尤度比検定由来のＦＤＲ調整された（アルファ＝０．００１）ｐ値である（方法を参照のこと）。図１７Ｉは、ＳＣ−ベータ擬時間に沿って示された選択遺伝子の発現を提供する。各点は、（図１７Ｇ）に見られるように選別して濃淡をつけた細胞の発現を表す。線は擬時間回帰の結果を示す。
【図１７−２】同上。
【図１７−３】同上。
【図１７−４】同上。
【００４５】
【図１８−１】図１８Ａ〜１８Ｅは、幹細胞由来腸クロム親和性細胞（ＳＣ−ＥＣ細胞）の特徴付けを提供する。図１８Ａは、ＳＣ−ベータとＳＣ−ＥＣとの遺伝子発現プロファイルの比較を提供する。青色の遺伝子は、セロトニン合成または腸クロム親和性のマーカーに必要である。図１８Ｂは、インビトロ集団（上のパネル）およびヒト膵臓内分泌細胞（下のパネル）にわたるＳＣ−ＥＣ富化遺伝子の発現レベルを示す。図１８Ｃ〜１８Ｄは、ＳＣ−ＥＣ細胞マーカーの免疫蛍光染色を示し、これは、ｖ８プロトコールにおけるセロトニン（５−ＨＴ）との共存を示す。スケールバー：１００μｍ。図１８Ｅは、（ｖ４）ＳＣ−膵島クラスターの移植から８週間後に回収した移植組織の免疫蛍光染色を示す。
【図１８−２】図１８Ａ〜１８Ｅは、幹細胞由来腸クロム親和性細胞（ＳＣ−ＥＣ細胞）の特徴付けを提供する。図１８Ａは、ＳＣ−ベータとＳＣ−ＥＣとの遺伝子発現プロファイルの比較を提供する。青色の遺伝子は、セロトニン合成または腸クロム親和性のマーカーに必要である。図１８Ｂは、インビトロ集団（上のパネル）およびヒト膵臓内分泌細胞（下のパネル）にわたるＳＣ−ＥＣ富化遺伝子の発現レベルを示す。図１８Ｃ〜１８Ｄは、ＳＣ−ＥＣ細胞マーカーの免疫蛍光染色を示し、これは、ｖ８プロトコールにおけるセロトニン（５−ＨＴ）との共存を示す。スケールバー：１００μｍ。図１８Ｅは、（ｖ４）ＳＣ−膵島クラスターの移植から８週間後に回収した移植組織の免疫蛍光染色を示す。
【００４６】
【図１９−１】図１９Ａ〜１９Ｄは、ＩＴＧＡ１／ＣＤ４９ａでのＳＣ−ベータ細胞の精製を実証する。図１９Ａは、ステージ６の時間経過データにおけるＩＴＧＡ１／ＣＤ４９ａの発現を示す。図１９Ｂは、ネイティブクラスター、非選別の再凝集クラスター、およびＣＤ４９ａ＋選別再凝集クラスターのＳＣ−ベータ（上）および内分泌（下）マーカーの免疫蛍光を提供する。スケールバー：１００μｍ。図１９Ｃは、５つの生物学的に独立したｖ８分化のための３つの適合条件下でのＳＣ−ベータ細胞画分（Ｃ−ｐｅｐ＋／ＮＫＸ６．１＋）およびＳＣ−ＥＣ細胞画分（ＳＬＣ１８Ａ１＋）のフローサイトメトリー定量を提供する。図１９Ｄは、同一の分化についての刺激指数を提供する。（図１９Ｃ〜１９Ｄ）では、記号は、平均およびエラーバー（示す場合）が、３つの独立して再凝集した生物学的複製物の間の標準誤差に対応することを示す。ｐ値は、（両側の）独立したｔ検定に由来する。
【図１９−２】同上。
【００４７】
【図２０−１】図２０Ａ〜２０Ｉは、インビトロ内分泌誘導の高解像度マップを提供する。図２０Ａ〜２０Ｃは、５１，２７４細胞のｔＳＮＥ投影図を示し、（図２０Ａ）ステージ５内のサンプリング時間、（図２０Ｂ）ＮＥＵＲＯＧ３発現、および（図２０Ｃ）割り当てられた細胞型にしたがって濃淡を付けている。図２０Ｃ上の矢印は、重要系譜の分岐を示す。図２０Ｄは、両方の独立した分化の各日についての図２０Ｃ中の各クラスター由来の細胞の割合を示す。図２０Ｅは、ＮＫＸ６．１＋前駆体からＳＣ−ベータ細胞およびＳＣ−ＥＣ細胞への経路上の各細胞の枝割り当ての濃淡をつけたｔＳＮＥおよび擬時間値を示す。図２０Ｆは、図２０Ｅ由来の擬時間順序付けに沿って選択されたマーカー遺伝子の発現を提供する。点は、擬時間順序にしたがって選別および濃淡をつけた単一細胞における発現を示す。線は、各枝についての擬時間に対する回帰を示す（青色：ＳＣ−ＥＣ、紫色：ＳＣ−ベータ）。図２０Ｇは、有意な枝特異的発現パターン有する遺伝子を示す。ｑ値は、分枝モデルおよび非分枝モデルを比較する尤度比検定由来のＦＤＲ調整された（アルファ＝０．００１）ｐ値である（方法を参照のこと）。図２０Ｈは、図２０Ｃ〜２０Ｄ中に示したクラスターについての転写因子の平均発現値を提供する。濃淡は平均発現（ｚ正規化ｔｐｍ）を示し、円の直径は発現の割合を示す。図２０Ｉは、ＳＣ−ベータプロトコールによって産生された重要細胞型のために提案された発生モデルを提供する。
【図２０−２】同上。
【図２０−３】同上。
【図２０−４】同上。
【００４８】
【図２１−１】図２１Ａ〜２１Ｍは、２つのＳＣ−ベータプロトコールバリアントおよび得られた細胞型の比較を提供する。図２１Ａ〜２１Ｃは、関連マーカーの染色を示す、分化した（ｖ８、ステージ６、１３日目）ＳＣ−膵島の免疫蛍光イメージングを提供する。図２１Ａは、ＳＣ−ベータ細胞が、典型的には周辺に存在し、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチド（プロインスリンの断片）の両方に陽性であることを示す。図２１Ｂは、ＳＣ−ＥＣ細胞がＳＬＣ１８Ａ１（腸クロム親和性細胞マーカー）に陽性であることを示す。これらの細胞も周辺に存在する。図２１Ｃは、ＳＯＸ９で印を付けた非内分泌細胞が、ＳＣ−膵島の中心付近に最もよく見出されることを示す。スケールバー：１００μｍ。図２１Ｄ〜２１Ｅは、プロトコールｘ１（図２１Ｄ）およびｘ２（図２１Ｅ）におけるステージ３および４の変化ならびにステージ４および６の終了時の代表的なフローサイトメトリーの結果のまとめを提供する。図２１Ｆ〜２１Ｉは、プロトコールｘ２のステージ３〜６の終了時にサンプリングした細胞のｔＳＮＥ投影図を提供する。図２１Ｆ〜２１Ｉ中の細胞を、割り当てたクラスターに応じて色分けした。横棒は、細胞型の比率を示す。（図１６Ｄ〜１６Ｇと比較のこと）。図２１Ｊは、プロトコールｘ１およびｘ２由来の細胞集団の比較を提供する。２０００個の高変動遺伝子の（各クラスターについての）平均ｔｐｍ値のｚスコアを使用して、相関関係を計算している。横列および縦列を、階層クラスタリングを使用して順序付けている。細胞を、図２１Ｆ〜２１Ｉおよび図１６Ｄ〜１６Ｇにおいて見られるようにラベリングする。図２１Ｋ〜２１Ｌは、細胞型（図２１Ｋ）および分化（図２１Ｌ）によって色分けした、３つの分化由来のステージ６のｔＳＮＥ投影図を提供する。図２１Ｍは、ＨＵＥＳ８（ＥＳ細胞、ｖ４およびｘ３）およびｉＰＳ１０１６／３１（ｉＰＳ細胞、ｖ４）に由来する細胞集団の相関関係を提供する。色は図２１Ｋと同じである。図２１Ｊに見られるように相関を計算している。
【図２１−２】同上。
【図２１−３】同上。
【図２１−４】同上。
【図２１−５】同上。
【００４９】
【図２２−１】図２２Ａ〜２２Ｃは、ステージ６の時間経過中のグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）の機能アッセイを提供する。図２２Ａは、連続ＧＳＩＳアッセイのデザインを提供する。図２２Ｂは、数週間にわたってアッセイした３つの独立したフラスコについての完全データを提供する。円は個別の技術的３回反復であり、バーはこれらの３回反復の平均を示す。図２２Ｃは、図２２Ｂ由来の試料と並行して実施した死体ヒト膵島の７ドナーについての完全データを提供する。
【図２２−２】図２２Ａ〜２２Ｃは、ステージ６の時間経過中のグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）の機能アッセイを提供する。図２２Ａは、連続ＧＳＩＳアッセイのデザインを提供する。図２２Ｂは、数週間にわたってアッセイした３つの独立したフラスコについての完全データを提供する。円は個別の技術的３回反復であり、バーはこれらの３回反復の平均を示す。図２２Ｃは、図２２Ｂ由来の試料と並行して実施した死体ヒト膵島の７ドナーについての完全データを提供する。
【図２２−３】図２２Ａ〜２２Ｃは、ステージ６の時間経過中のグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）の機能アッセイを提供する。図２２Ａは、連続ＧＳＩＳアッセイのデザインを提供する。図２２Ｂは、数週間にわたってアッセイした３つの独立したフラスコについての完全データを提供する。円は個別の技術的３回反復であり、バーはこれらの３回反復の平均を示す。図２２Ｃは、図２２Ｂ由来の試料と並行して実施した死体ヒト膵島の７ドナーについての完全データを提供する。
【００５０】
【図２３−１】図２３Ａ〜２３Ｆは、ステージ６のＳＣ−ベータ細胞が特徴的なベータ細胞マーカーを発現することを実証する。図２３Ａ〜２３Ｂは、サンプリング時間（図２３Ａ）および代表的なマーカー遺伝子（図２３Ｂ）によって濃淡をつけた、ステージ６の時間経過データのｔＳＮＥ投影図を提供する。発現を最大値に対して正規化し、隣接細胞にわたって平滑化する。図２３Ｃは、ベータ−細胞機能に必要な重要遺伝子についての発現プロファイルを提供する。濃淡は平均発現（ｔｐｍ、ｌｏｇ基準化）を示し、円の直径は発現の割合を示す。図２３Ｄ〜２３Ｅは、ヒト死体膵島由来ベータ細胞と、インビトロ前駆体（図２３Ｄ）およびＳＣ−ベータ細胞（図２３Ｅ）との間のグローバル発現の比較を提供する。前駆体からＳＣ−ベータ細胞への遺伝子発現のシフトに留意のこと。図２３Ｃ由来の全てのパネル中に示した全ての遺伝子を、赤色の円で示す。図２３Ｆは、遺伝子セット富化解析（ＧＳＥＡ）由来の結果を提供し、これは、図２３Ｃ由来の遺伝子セットが分化中に有意に上方制御されることを示している。プロットした値は、ＧＳＥＡで報告されたＦＤＲのｑ値の−ｌｏｇ１０（上限は１０）であり、符号は効果の方向を示す（すなわち、紫色の陽性値は、ＮＫＸ６．１前駆体と比較してＳＣ−ベータ細胞で上方制御される）。
【図２３−２】同上。
【図２３−３】同上。
【００５１】
【図２４−１】図２４Ａ〜２４Ｄは、ＳＣ−ベータ細胞およびＳＣ−アルファ細胞の相互およびその膵島対応物との比較を提供する。図２４Ａは、数週間のステージ６中のＳＣ−ベータ細胞（紫色の分布）およびＳＣ−アルファ細胞（赤色の分布）におけるインスリン発現およびグルカゴン発現を示し、その特定の時点由来のＳＣ−ベータ細胞またはＳＣ−アルファ細胞を紫色の点で示している。連結した線は、各時点での各集団の中央値を連結したものである。図２４Ｂは、Ｂａｒｏｎら．２０１６のデータ由来の死体膵島アルファ細胞および膵島ベータ細胞で富化された遺伝子の同定を示す。図２４Ｃは、膵島アルファ細胞、ＳＣ−アルファ細胞、ＳＣ−ベータ細胞、および膵島ベータ細胞について示した図２４Ｂ由来の遺伝子の発現レベルのヒートマップを提供する。図２４Ｄは、膵島ベータ細胞で富化された遺伝子がＳＣ−ベータ細胞で上方制御され、アルファ細胞で富化された遺伝子がＳＣ−アルファ細胞で上方制御されることを示す。表示のｐ値は、（両側の）ウィルコクソン順位和検定を使用して計算する。箱ひげ図中：ボックスは第一四分位点から第三四分位点までの範囲を示し、ひげは５パーセンタイルから９５パーセンタイルまでを示し、中央の線は中央値を示し、ボックスの切り欠き（box  notching）は、中央値の９５パーセンタイル信頼区間を示す。
【図２４−２】同上。
【００５２】
【図２５−１】図２５Ａ〜２５Ｆは、ＳＣ−ＥＣ細胞がセロトニンを分泌し、他のプロトコール中に存在することを実証する。図２５Ａは、トリプトファンからのセロトニン合成の略図を提供する。第１のおよび律速合成ステップのために、腸クロム親和性細胞はＴＰＨ１を使用するのに対して、セロトニン作動性ニューロンはＴＰＨ２を使用する。図２５Ｂは、低グルコースおよび高グルコースの順次チャレンジおよびその後のＫＣｌ脱分極中のセロトニン放出を示す。上のパネル：３つの独立したＳＣ−ベータ分化由来のクラスター。下のパネル：２ドナー由来のヒト死体膵島。記号は、各試料の個別の反復の値を示す（同一試料由来の異なるクラスターを分割し、個別に測定する）。ｐ値を、（両側）ウィルコクソン順位和検定（ｎ．ｓ＝ｐ＞０．０５で有意でない）を使用して計算する。図２５Ｃ〜２５Ｄは、ＥＣマーカー遺伝子（青色で示す）の発現がバルクＲＮＡシーケンシング（Ｇｕｐｔａら由来）で検出可能であり、ＮＫＸ６．１（ＧＦＰ）＋細胞の選別によって富化される（変化倍率、平均発現、および差次的発現ｑ値として示す）ことを示す。正の変化倍率は、ＮＫＸ６．１（ＧＦＰ）＋細胞におけるより高い発現を示す。ＳＣ−ＥＣマーカーの富化は、ベータ細胞マーカー（紫色で示す）に匹敵し、アルファ細胞マーカー（赤色で示す）の逆である。示した全ての値は、計算した結果およびＧｕｐｔａら．２０１８から得た結果から直接再現される。図２５Ｅは、フローサイトメトリーを提供し、これは、ｖ８  ＳＣ−ベータプロトコールの分化のＳＣ−ＥＣ細胞においてＳＬＣ１８Ａ１がＮＫＸ６．１＋と共発現されることを示す。この例は、１００を超える独立した分化の代表である。図２５Ｆは、ＷＴマウス膵島と、ＥＥＤノックアウトを介したベータ−細胞特異的ＰＲＣ２アブレーションから２５週間後のマウス膵島との間の遺伝子発現の比較を提供する。紫色の遺伝子は、例示的な下方制御されたベータ−細胞同一性遺伝子であり、青色の遺伝子は、セロトニン／ＥＣシグネチャーを表す。ｑ値は、Ｌｉｍｍａ差次的発現分析由来のＦＤＲ補正（アルファ＝０．０５）ｐ値である。
【図２５−２】同上。
【００５３】
【図２６−１】図２６Ａ〜２６Ｄは、ステージ６の時間経過由来の非内分泌細胞の特徴付けを実証する。図２６Ａ〜２６Ｂは、回収日（図２６Ａ）または細胞同一性に関連する遺伝子（図２６Ｂ）によって濃淡をつけた、ステージ６の時間経過由来の非内分泌細胞のｔＳＮＥ投影図を提供する。発現を最大値に対して正規化し、隣接細胞にわたって平滑化する。図２６Ｃは、割り当てたクラスターによって濃淡をつけたｔＳＮＥ投影図および分化の週毎の各クラスター中の細胞の割合の棒グラフを提供する。図２６Ｄは、非内分泌細胞の各亜集団の集団特異的マーカーの遺伝子発現を示す。濃淡は平均発現（ｚ正規化ｔｐｍ）を示し、円の直径は発現の割合を示す。
【図２６−２】同上。
【００５４】
【図２７−１】図２７Ａ〜２７Ｋは、再凝集が内分泌細胞を富化するためのスケーラブルな機能保存法であることを実証する。図２７Ａは、非内分泌細胞を除去するための再凝集手技の略図を提供する。細胞は、酵素的に解離され、継続懸濁培養中に再凝集される。非内分泌細胞は接着できず、濾過によって除去される。図２７Ｂは、ＳＣ−ベータ富化クラスターを産生するためのＣＤ４９ａ富化手技の略図を提供する。解離細胞を抗ＣＤ４９ａＰＥコンジュゲート抗体で染色し、抗ＰＥ磁気マイクロビーズとインキュベートし、磁気的に分離する。富化細胞は、ロッカー上の６ウェルプレート中で再凝集される。図２７Ｃは、単一分化由来のネイティブクラスターおよび再凝集クラスターからシーケンシングした細胞のｔＳＮＥ投影図を提供し、これは非内分泌集団の強い枯渇を示す。両パネル中の細胞を、プロトコールｖ８を用いて分化させた。図２７Ｄは、Ｃ−ペプチド、ＧＣＧ、およびＳＬＣ１８Ａ１の免疫蛍光染色を示し、これらが再凝集クラスター中で区別可能に隣接していることを示している（プロトコールｖ８）。示した画像は、ｚ−ｓｔａｃｋの最大輝度投影法による画像である。各パネルは、全てのマーカーについて染色した個別の代表的クラスターを示す。スケールバー：１００μｍ。図２７Ｅ〜２７Ｆは、再凝集前および再凝集後の内分泌細胞存在量（プロトコールｖ８由来）の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。内分泌細胞は、ＣＨＧＡを発現する。図２７Ｇは、プロトコールｖ８を用いて実施した６０の再凝集（ＲＡ）分化および４１のネイティブ独立分化における集団の組成（フローサイトメトリーアッセイした場合）のまとめを示す。スピナーフラスコ中で再凝集させた。（両側）ウィルコクソン順位和検定を使用してｐ値を計算した。図２７Ｇおよび図２７Ｈの箱ひげ図中：ボックスは第一四分位点から第三四分位点までの範囲を示し、ひげは５パーセンタイルから９５パーセンタイルまでを示し、中央の線は中央値を示し、ボックスの切り欠きは、中央値の９５パーセンタイル信頼区間を示す。図２７Ｈは、対応のあるネイティブ対再凝集の比較を用いた５２の独立したプロトコールｖ８分化の刺激指数（２０ｍＭグルコースで放出されたインスリン／２ｍＭで放出されたインスリン）を提供する。（両側）ウィルコクソン符号付き順位検定を使用してｐ値を計算した。図２７Ｉは、図１９Ｄに示した刺激指数に対応する、図７に見られるように実施した静的グルコース刺激インスリン分泌アッセイの完全データを提供する。円は個別の技術的３回反復であり、バーはこれらの３回反復の平均を示す。図２７Ｊは、ヒト膵島、ネイティブＳＣ−ベータクラスター（ステージ６、２２日目、ｖ８）、および適合したＣＤ４９ａで磁気選別した富化ＳＣ−ベータ膵島のグルコース応答性インスリン分泌の動的灌流（ｃｙｎａｍｉｃ  ｐｅｒｉｆｕｓｉｏｎ）アッセイを示す。各ポイントは、３つの技術的反復の平均であり、縦棒は、３回反復の標準誤差を示す。図２７Ｋは、各処置における等しい有効時間に対して正規化した第１の低グルコース刺激と高グルコース刺激とを比較する曲線下面積を示す。
【図２７−２】同上。
【図２７−３】同上。
【図２７−４】同上。
【図２７−５】同上。
【００５５】
【図２８−１】図２８Ａ〜２８Ｆは、ステージ５の時間経過マーカーおよび前駆体集団の不均一性を実証する。図２８Ａ〜２８Ｂは、回収日（図２８Ａ）および集団マーカー遺伝子（図２８Ｂ）によって濃淡をつけた、ステージ５の時間経過データのｔＳＮＥ投影図を提供する。発現を最大値に対して正規化し、隣接細胞にわたって平滑化する。図２８Ｃは、０日目（上）および１日目（下）の前駆細胞の擬時間解析を示す。各ｔＳＮＥ上の濃淡は、各細胞の割り当てた擬時間値を示す。図２８Ｄは、ステージ５の０日目（上の横列）および１日目（下の横列）由来の前駆細胞の擬時間順序付けを示し、これは、初期前駆体の集団が均一であることを示す。各細胞を、（図２８Ｃ）に見られるように濃淡をつけた点として示す。遺伝子発現を、重ね合わせた線として示した擬時間回帰から予想した。図２８Ｅは、擬時間解析によって取得したステージ５の０日目の不均一性のまとめを提供する。擬時間順序付けの開始と終了との間の変化倍率。擬時間を用いたモデルおよび用いないモデルの尤度比検定由来のｑ値。図２８Ｆは、ステージ５集団にわたって動的に発現された受容体、リガンド、およびシグナル伝達エフェクターのヒートマップを提供する。濃淡は平均発現（ｚ正規化ｔｐｍ）を示し、円の直径は発現の割合を示す。
【図２８−２】同上。
【００５６】
【図２９】図２９は、時間経過データセットおよび死体膵島由来の全ての集団にわたる重要なマーカー遺伝子の発現を提供する。左の縦列は、原データセットを示す。濃淡は平均発現（ｚ正規化ｔｐｍ）を示し、円の直径は発現の割合を示す。
【００５７】
【図３０】図３０は、時間経過データセット由来の全ての集団にわたる腸内分泌マーカー遺伝子の発現を提供する。左側の縦列は、原データセットを示す。濃淡は平均発現（ｚ正規化ｔｐｍ）を示し、円の直径は発現の割合を示す。
【００５８】
【図３１】図３１Ａ〜３１Ｄは、フローサイトメトリーゲーティングストラテジーの例を実証する。図３１Ａ〜３１Ｃは、ステージ６、１３日目のｖ８プロトコールでのステージ６の時間経過分化１（内部ＩＤ：ＤＡ−０８９）を示す。図３１Ａ：副次的物質のみの対照。図３１Ｂ：Ｃ−ペプチドおよびＮＫＸ６．１の染色によるＳＣ−ベータ細胞分化。図３１Ｃ：ＣＨＧＡおよびＮＫＸ６．１の染色による内分泌細胞の同定。結果は、１００を超えるｖ８分化の代表であり、典型的なＳＣ−ベータの百分率は２５〜４５％である。図３１Ｄは、例示的なＣＤ４９ａ＋磁気精製を提供する。左のパネルは選別前のＣＤ４９ａ＋分布を示し、右のパネルは１ラウンドの磁気分離後の分布を示す（方法を参照のこと）。結果は、１０を超える富化実験の代表である。
【００５９】
【図３２】図３２は、研究で使用した分化プロトコールの詳細を提供する。この研究を通して使用したＳＣ−ベータプロトコールの異なるバージョンのまとめ。
【００６０】
【図３３】図３３は、研究で同定した全細胞集団のまとめを提供する。各集団については、それらの識別に重要なマーカー、それらが識別されたデータセットを列挙し、稀な集団については、他の集団との関連に関する説明を列挙している。
【００６１】
【図３４】図３４は、ステージ５およびステージ６の時間経過データを提供する。各プロットは、２つのデータセット（ステージ６およびステージ５の時間経過データセット）のうちの１つにおける所与の集団についてのＺｅｉｓｅｌら（Ｃｅｌｌ  ２０１８）富化スコアの値を表す。全遺伝子についての富化スコアの分布を、過去データとして灰色で示す。赤色のバーは、各集団のために選択したトップマーカーおよびトップＴＦのスコアの値を示す。選択したマーカーは富化スコアを有することに留意のこと。
【００６２】
【図３５】図３５は、ステージ５および６についてのトップ２５の最も富化された遺伝子のまとめを提供する。Ｚｅｉｓｅｌら由来の富化統計値を、所与の集団で特異的に付加される遺伝子を同定するためのマーカースコアとして使用した。このスコアを、ステージ５およびステージ６の時間経過データセット中の主な集団の各々について計算し、次いで、各集団についての最高の富化スコアを有するトップ２５（全体）の遺伝子を選んだ。
【００６３】
【図３６】図３６は、ステージ５および６についてのトップ１０の転写因子（ＴＦ）のまとめを提供する。Ｚｅｉｓｅｌら由来の富化統計値を、所与の集団で特異的に付加される遺伝子を同定するためのマーカースコアとして使用した。このスコアを、ステージ５およびステージ６の時間経過データセット中の主な集団の各々について計算し、次いで、各集団についての最高の富化スコアを有するトップ１０の転写因子を選んだ。
【００６４】
【図３７】図３７は、ＳＣ−ベータ分化プロトコールｖ１の完全な仕様を提供し、使用した細胞培養培地のステージ毎および日毎の説明を提供する。
【００６５】
【図３８】図３８は、ＳＣ−ベータ分化プロトコールｖ４の完全な仕様を提供し、使用した細胞培養培地のステージ毎および日毎の説明を提供する。
【００６６】
【図３９】図３９は、ＳＣ−ベータ分化プロトコールｖ８の完全な仕様を提供し、使用した細胞培養培地のステージ毎および日毎の説明を提供する。
【００６７】
【図４０】図４０は、ＳＣ−ベータ分化プロトコールｘ１の完全な仕様を提供し、使用した細胞培養培地のステージ毎および日毎の説明を提供する。
【００６８】
【図４１】図４１は、ＳＣ−ベータ分化プロトコールｘ２の完全な仕様を提供し、使用した細胞培養培地のステージ毎および日毎の説明を提供する。
【００６９】
【図４２】図４２は、ＳＣ−ベータ分化プロトコールｘ３の完全な仕様を提供し、使用した細胞培養培地のステージ毎および日毎の説明を提供する。
【００７０】
【図４３】図４３は、研究で生成されたシングルセルＲＮＡシーケンシングデータセットのまとめを提供する。この表は、プロトコール、細胞系、ｉｎＤｒｏｐｓライブラリー数、ｉｎＤｒｏｐｓ試薬の供給元、および研究における各データセットについてシーケンシングした細胞数、ならびに対応する図を具体的に挙げている。
【００７１】
【図４４−１】図４４は、図２３Ｄ〜２３Ｅにまとめた全遺伝子についての差次的遺伝子発現を詳述したチャートを提供する。
【図４４−２】同上。
【図４４−３】同上。
【図４４−４】同上。
【図４４−５】同上。
【図４４−６】同上。
【図４４−７】同上。
【図４４−８】同上。
【図４４−９】同上。
【図４４−１０】同上。
【図４４−１１】同上。
【図４４−１２】同上。
【図４４−１３】同上。
【図４４−１４】同上。
【図４４−１５】同上。
【図４４−１６】同上。
【図４４−１７】同上。
【図４４−１８】同上。
【図４４−１９】同上。
【図４４−２０】同上。
【図４４−２１】同上。
【図４４−２２】同上。
【図４４−２３】同上。
【図４４−２４】同上。
【図４４−２５】同上。
【図４４−２６】同上。
【図４４−２７】同上。
【図４４−２８】同上。
【図４４−２９】同上。
【図４４−３０】同上。
【図４４−３１】同上。
【図４４−３２】同上。
【図４４−３３】同上。
【図４４−３４】同上。
【図４４−３５】同上。
【図４４−３６】同上。
【図４４−３７】同上。
【図４４−３８】同上。
【図４４−３９】同上。
【図４４−４０】同上。
【図４４−４１】同上。
【図４４−４２】同上。
【図４４−４３】同上。
【図４４−４４】同上。
【図４４−４５】同上。
【図４４−４６】同上。
【図４４−４７】同上。
【図４４−４８】同上。
【図４４−４９】同上。
【図４４−５０】同上。
【図４４−５１】同上。
【図４４−５２】同上。
【図４４−５３】同上。
【図４４−５４】同上。
【図４４−５５】同上。
【図４４−５６】同上。
【図４４−５７】同上。
【図４４−５８】同上。
【図４４−５９】同上。
【図４４−６０】同上。
【図４４−６１】同上。
【図４４−６２】同上。
【図４４−６３】同上。
【図４４−６４】同上。
【図４４−６５】同上。
【図４４−６６】同上。
【図４４−６７】同上。
【図４４−６８】同上。
【図４４−６９】同上。
【図４４−７０】同上。
【図４４−７１】同上。
【図４４−７２】同上。
【図４４−７３】同上。
【図４４−７４】同上。
【図４４−７５】同上。
【図４４−７６】同上。
【図４４−７７】同上。
【図４４−７８】同上。
【図４４−７９】同上。
【図４４−８０】同上。
【図４４−８１】同上。
【図４４−８２】同上。
【図４４−８３】同上。
【図４４−８４】同上。
【図４４−８５】同上。
【図４４−８６】同上。
【図４４−８７】同上。
【図４４−８８】同上。
【図４４−８９】同上。
【図４４−９０】同上。
【図４４−９１】同上。
【図４４−９２】同上。
【図４４−９３】同上。
【図４４−９４】同上。
【図４４−９５】同上。
【図４４−９６】同上。
【図４４−９７】同上。
【図４４−９８】同上。
【図４４−９９】同上。
【図４４−１００】同上。
【図４４−１０１】同上。
【図４４−１０２】同上。
【図４４−１０３】同上。
【図４４−１０４】同上。
【図４４−１０５】同上。
【図４４−１０６】同上。
【図４４−１０７】同上。
【図４４−１０８】同上。
【図４４−１０９】同上。
【図４４−１１０】同上。
【図４４−１１１】同上。
【図４４−１１２】同上。
【図４４−１１３】同上。
【図４４−１１４】同上。
【図４４−１１５】同上。
【図４４−１１６】同上。
【図４４−１１７】同上。
【図４４−１１８】同上。
【図４４−１１９】同上。
【図４４−１２０】同上。
【図４４−１２１】同上。
【図４４−１２２】同上。
【図４４−１２３】同上。
【図４４−１２４】同上。
【図４４−１２５】同上。
【図４４−１２６】同上。
【図４４−１２７】同上。
【図４４−１２８】同上。
【図４４−１２９】同上。
【図４４−１３０】同上。
【図４４−１３１】同上。
【図４４−１３２】同上。
【図４４−１３３】同上。
【図４４−１３４】同上。
【図４４−１３５】同上。
【図４４−１３６】同上。
【図４４−１３７】同上。
【図４４−１３８】同上。
【図４４−１３９】同上。
【図４４−１４０】同上。
【図４４−１４１】同上。
【図４４−１４２】同上。
【図４４−１４３】同上。
【図４４−１４４】同上。
【図４４−１４５】同上。
【図４４−１４６】同上。
【図４４−１４７】同上。
【図４４−１４８】同上。
【図４４−１４９】同上。
【図４４−１５０】同上。
【図４４−１５１】同上。
【図４４−１５２】同上。
【図４４−１５３】同上。
【図４４−１５４】同上。
【図４４−１５５】同上。
【図４４−１５６】同上。
【図４４−１５７】同上。
【図４４−１５８】同上。
【図４４−１５９】同上。
【図４４−１６０】同上。
【図４４−１６１】同上。
【図４４−１６２】同上。
【図４４−１６３】同上。
【図４４−１６４】同上。
【図４４−１６５】同上。
【図４４−１６６】同上。
【図４４−１６７】同上。
【図４４−１６８】同上。
【図４４−１６９】同上。
【図４４−１７０】同上。
【図４４−１７１】同上。
【図４４−１７２】同上。
【図４４−１７３】同上。
【図４４−１７４】同上。
【図４４−１７５】同上。
【図４４−１７６】同上。
【図４４−１７７】同上。
【図４４−１７８】同上。
【図４４−１７９】同上。
【図４４−１８０】同上。
【図４４−１８１】同上。
【図４４−１８２】同上。
【図４４−１８３】同上。
【図４４−１８４】同上。
【図４４−１８５】同上。
【図４４−１８６】同上。
【図４４−１８７】同上。
【図４４−１８８】同上。
【図４４−１８９】同上。
【図４４−１９０】同上。
【図４４−１９１】同上。
【図４４−１９２】同上。
【図４４−１９３】同上。
【図４４−１９４】同上。
【図４４−１９５】同上。
【図４４−１９６】同上。
【図４４−１９７】同上。
【図４４−１９８】同上。
【図４４−１９９】同上。
【図４４−２００】同上。
【図４４−２０１】同上。
【図４４−２０２】同上。
【図４４−２０３】同上。
【図４４−２０４】同上。
【図４４−２０５】同上。
【図４４−２０６】同上。
【図４４−２０７】同上。
【図４４−２０８】同上。
【図４４−２０９】同上。
【図４４−２１０】同上。
【図４４−２１１】同上。
【図４４−２１２】同上。
【図４４−２１３】同上。
【図４４−２１４】同上。
【図４４−２１５】同上。
【図４４−２１６】同上。
【図４４−２１７】同上。
【図４４−２１８】同上。
【図４４−２１９】同上。
【図４４−２２０】同上。
【図４４−２２１】同上。
【図４４−２２２】同上。
【図４４−２２３】同上。
【図４４−２２４】同上。
【図４４−２２５】同上。
【図４４−２２６】同上。
【図４４−２２７】同上。
【図４４−２２８】同上。
【図４４−２２９】同上。
【図４４−２３０】同上。
【図４４−２３１】同上。
【図４４−２３２】同上。
【図４４−２３３】同上。
【図４４−２３４】同上。
【図４４−２３５】同上。
【図４４−２３６】同上。
【図４４−２３７】同上。
【図４４−２３８】同上。
【図４４−２３９】同上。
【図４４−２４０】同上。
【図４４−２４１】同上。
【図４４−２４２】同上。
【図４４−２４３】同上。
【図４４−２４４】同上。
【図４４−２４５】同上。
【図４４−２４６】同上。
【図４４−２４７】同上。
【００７２】
【図４５−１】図４５は、図２３ＦにまとめたＮＫＸ６．１＋細胞とＳＣ−ベータ細胞との間の（Ｈａｌｌｍａｒｋ遺伝子セットおよびカスタム遺伝子セットについての）ＧＳＥＡの結果を詳述したチャートを提供する。
【図４５−２】図４５は、図２３ＦにまとめたＮＫＸ６．１＋細胞とＳＣ−ベータ細胞との間の（Ｈａｌｌｍａｒｋ遺伝子セットおよびカスタム遺伝子セットについての）ＧＳＥＡの結果を詳述したチャートを提供する。
【図４５−３】図４５は、図２３ＦにまとめたＮＫＸ６．１＋細胞とＳＣ−ベータ細胞との間の（Ｈａｌｌｍａｒｋ遺伝子セットおよびカスタム遺伝子セットについての）ＧＳＥＡの結果を詳述したチャートを提供する。
【図４５−４】図４５は、図２３ＦにまとめたＮＫＸ６．１＋細胞とＳＣ−ベータ細胞との間の（Ｈａｌｌｍａｒｋ遺伝子セットおよびカスタム遺伝子セットについての）ＧＳＥＡの結果を詳述したチャートを提供する。
【図４５−５】図４５は、図２３ＦにまとめたＮＫＸ６．１＋細胞とＳＣ−ベータ細胞との間の（Ｈａｌｌｍａｒｋ遺伝子セットおよびカスタム遺伝子セットについての）ＧＳＥＡの結果を詳述したチャートを提供する。
【００７３】
【図４６−１】図４６は、図２３ＦにまとめたＳＣ−ベータ細胞と膵島ベータ細胞との間の（Ｈａｌｌｍａｒｋ遺伝子セットおよびカスタム遺伝子セットについての）ＧＳＥＡの結果を詳述したチャートを提供する。
【図４６−２】図４６は、図２３ＦにまとめたＳＣ−ベータ細胞と膵島ベータ細胞との間の（Ｈａｌｌｍａｒｋ遺伝子セットおよびカスタム遺伝子セットについての）ＧＳＥＡの結果を詳述したチャートを提供する。
【図４６−３】図４６は、図２３ＦにまとめたＳＣ−ベータ細胞と膵島ベータ細胞との間の（Ｈａｌｌｍａｒｋ遺伝子セットおよびカスタム遺伝子セットについての）ＧＳＥＡの結果を詳述したチャートを提供する。
【図４６−４】図４６は、図２３ＦにまとめたＳＣ−ベータ細胞と膵島ベータ細胞との間の（Ｈａｌｌｍａｒｋ遺伝子セットおよびカスタム遺伝子セットについての）ＧＳＥＡの結果を詳述したチャートを提供する。
【図４６−５】図４６は、図２３ＦにまとめたＳＣ−ベータ細胞と膵島ベータ細胞との間の（Ｈａｌｌｍａｒｋ遺伝子セットおよびカスタム遺伝子セットについての）ＧＳＥＡの結果を詳述したチャートを提供する。
【００７４】
【図４７−１】図４７は、図２３ＦにまとめたＮＫＸ６．１＋細胞と膵島ベータ細胞との間の（Ｈａｌｌｍａｒｋ遺伝子セットおよびカスタム遺伝子セットについての）ＧＳＥＡの結果を詳述したチャートを提供する。
【図４７−２】図４７は、図２３ＦにまとめたＮＫＸ６．１＋細胞と膵島ベータ細胞との間の（Ｈａｌｌｍａｒｋ遺伝子セットおよびカスタム遺伝子セットについての）ＧＳＥＡの結果を詳述したチャートを提供する。
【図４７−３】図４７は、図２３ＦにまとめたＮＫＸ６．１＋細胞と膵島ベータ細胞との間の（Ｈａｌｌｍａｒｋ遺伝子セットおよびカスタム遺伝子セットについての）ＧＳＥＡの結果を詳述したチャートを提供する。
【図４７−４】図４７は、図２３ＦにまとめたＮＫＸ６．１＋細胞と膵島ベータ細胞との間の（Ｈａｌｌｍａｒｋ遺伝子セットおよびカスタム遺伝子セットについての）ＧＳＥＡの結果を詳述したチャートを提供する。
【図４７−５】図４７は、図２３ＦにまとめたＮＫＸ６．１＋細胞と膵島ベータ細胞との間の（Ｈａｌｌｍａｒｋ遺伝子セットおよびカスタム遺伝子セットについての）ＧＳＥＡの結果を詳述したチャートを提供する。
【００７５】
【図４８】図４８は、ステージ６のＳＣ−ベータ細胞の擬時間解析（図１７を参照のこと）を使用して同定したトップ２５の最も相関する遺伝子およびトップ２５の逆相関遺伝子をまとめたチャートを提供する。このまとめは、ベータ細胞成熟のプロセスを潜在的に駆動するか生じさせる遺伝子を同定する。
【００７６】
【図４９】図４９は、ステージ５の０日目の前駆体プールの擬時間解析を使用して同定した、トップ２５の最も相関する遺伝子およびトップ２５の逆相関遺伝子をまとめたチャートを提供する。このまとめは、正確なＳＣ−ベータ前駆体の特異化を潜在的に駆動するか生じさせる遺伝子を同定する。
【００７７】
【図５０】図５０は、ステージ５の１日目の前駆体プールの擬時間解析を使用して同定した、トップ２５の最も相関する遺伝子およびトップ２５の逆相関遺伝子をまとめたチャートを提供する。このまとめは、正確なＳＣ−ベータ前駆体の特異化を潜在的に駆動するか生じさせる遺伝子を同定する。
【００７８】
【図５１−１】図５１は、内分泌誘導のステージ５プロセスの擬時間解析を使用して同定した、トップ２５の最も相関する遺伝子およびトップ２５の逆相関遺伝子をまとめたチャートを提供する。このまとめは、内分泌のプロセスの特異化および枝決定を潜在的に駆動するか生じさせる遺伝子を同定する。
【図５１−２】図５１は、内分泌誘導のステージ５プロセスの擬時間解析を使用して同定した、トップ２５の最も相関する遺伝子およびトップ２５の逆相関遺伝子をまとめたチャートを提供する。このまとめは、内分泌のプロセスの特異化および枝決定を潜在的に駆動するか生じさせる遺伝子を同定する。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
表Ａ：ステージ６のＳＣ−ベータ細胞の擬時間回帰分析を詳述したチャートを提供する。チャートは、全遺伝子についてのステージ６のＳＣ−ベータ擬時間の回帰分析の結果を提供する（図１７を参照のこと）。
【００８０】
表Ｂ：ステージ６のＳＣ−ベータ細胞の擬時間回帰分析のＧＳＥＡの結果を詳述したチャートを提供する（図５２を参照のこと）。ＧＳＥＡの結果は、関連のない遺伝子セットを示している。
【００８１】
表Ｃ：ステージ５の０日目の前駆体の擬時間回帰分析を詳述したチャートを提供する。チャートは、全遺伝子についてのステージ５集団の遺伝子発現の回帰分析の結果を提供する（図２８を参照のこと）。
【００８２】
表Ｄ：ステージ５の１日目の前駆体の擬時間回帰分析を詳述したチャートを提供する。チャートは、全遺伝子についてのステージ５集団の遺伝子発現の回帰分析の結果を提供する（図２８を参照のこと）。
【００８３】
表Ｅ：ステージ５のＳＣ−ベータおよびＳＣ−ＥＣ分枝の擬時間回帰分析を詳述したチャートを提供する。チャートは、全遺伝子についてのステージ５集団の遺伝子発現の回帰分析の結果を提供する（図２０を参照のこと）。
【００８４】
本開示の態様は、幹細胞由来ベータ細胞（ＳＣ−β）細胞を産生するための代替プロトコールに関する。本開示の他の態様は、ＳＣ−βクラスター内に含まれる細胞について同定、識別、および富化する方法、ならびに複数の潜在的な分化の結果を伴う細胞の分化を特定の分化の結果に向けるか、または特定の分化の結果から離れるようにする方法に関する。本開示のさらなる他の態様は、幹細胞由来腸クロム親和性（ＳＣ−ＥＣ）細胞に関する。
【００８５】
定義
便宜上、ここで、すなわち本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語は、本明細書でまとめられる。特に定義がない限り、本明細書で使用される技術的および科学的用語はすべて、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。
【００８６】
「分化した細胞」という用語は、その用語が本明細書で定義されるように、そのネイティブ形態では多能性ではない任意の初代細胞を意味する。別の言い方をすれば、「分化した細胞」という用語は、細胞分化プロセスにおけるあまり特殊化してない細胞型の細胞（例えば、幹細胞、例えば人工多能性幹細胞）に由来するより特殊化した細胞型の細胞を指す。理論に拘束されることを望まないが、通常の個体発生のプロセスにある多能性幹細胞は、最初に、膵臓細胞を形成することができる内胚葉細胞および他の内胚葉細胞型に分化することができる。内胚葉細胞がさらに分化すると膵臓経路に至り、この経路では、約９８％の細胞が外分泌細胞、小管細胞、またはマトリックス細胞になり、約２％が内分泌細胞になる。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「体細胞」という用語は、生殖系列細胞とは対照的に、生物の体を形成する任意の細胞を指す。哺乳動物では、生殖系列細胞（「配偶子」としても公知）は、受精中に融合して接合子（これから、哺乳動物胚全体が発生する）と称される細胞を生産する精子および卵子である。哺乳動物の体内のあらゆる他の細胞型（精子および卵子、それらが作られる細胞（生殖母細胞）ならびに未分化幹細胞を除く）は、体細胞である；内臓、皮膚、骨、血液および結合組織はすべて、体細胞から構成される。いくつかの実施形態では、体細胞は「非胚性体細胞」であり、これは、胚に存在しないかまたは胚から得られない体細胞であって、インビトロでこのような細胞の増殖から生じない体細胞を意味する。いくつかの実施形態では、体細胞は「成体体細胞」であり、これは、胚以外の生物もしくは胎児に存在するかもしくは胚以外の生物もしくは胎児から得られるか、またはインビトロでこのような細胞の増殖から生じる細胞を意味する。特に指示がない限り、本明細書中に記載の方法を、インビボおよびインビトロの両方で実施することができる。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「成体細胞」という用語は、胚発生後に体全体に見られる細胞を指す。
【００８９】
本明細書中で使用される用語「内胚葉細胞」は、非常に初期の胚における３つの主要な生殖細胞層のうちの１つ（他の２つの生殖細胞層は、中胚葉および外胚葉である）に由来する細胞を指す。内胚葉は、３つの層の最も内側にある。内胚葉細胞が分化して最初に胚の腸を生じ、次いで、気道および消化管（例えば、腸）、肝臓、および膵臓の内膜を生じる。
【００９０】
本明細書中で使用される用語「内胚葉起源の細胞」は、内胚葉細胞から発生または分化した任意の細胞を指す。例えば、内胚葉起源の細胞としては、肝臓、肺、膵臓、胸腺、腸、胃、および甲状腺の細胞が挙げられる。理論に拘束されることを望まないが、肝臓および膵臓前駆体（pancreas  progenitor）（脾臓前駆体（pancreatic  progenitor）とも呼ばれる）は、胚の前腸中の内胚葉細胞から発生する。その特異化の直後に、肝臓および膵臓の前駆体は、顕著に異なる細胞機能および再生能を迅速に獲得する。これらの変化は、脊椎動物の間で高度に保存されている誘導シグナルおよび遺伝子制御因子によって誘発される。
【００９１】
用語「膵臓前駆体（pancreatic  progenitor）」または「膵臓前駆物質（pancreatic  precursor）」は本明細書では互換的に使用され、任意の膵臓内分泌細胞、膵臓外分泌細胞、または膵管細胞を形成することができる幹細胞を指す。本明細書中で使用される用語「Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆体」または「Ｐｄｘ１＋膵臓前駆体」は、膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞である細胞を指す。Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆体は、マーカーＰｄｘ１を発現する。他のマーカーとしては、限定されないが、Ｃｄｃｐ１、またはＰｔｆ１ａ、またはＨＮＦ６、またはＮＲｘ２．２が挙げられる。Ｐｄｘ１の発現は、抗Ｐｄｘ１抗体を使用した免疫化学または定量的ＲＴ−ＰＣＲなどの当業者に公知の任意の方法によって評価され得る。本明細書中で使用される用語「Ｐｄｘ１陽性ＮＫＸ６−１陽性膵臓前駆体」または「Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆体」は、膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞である細胞を指す。Ｐｄｘ１陽性ＮＫＸ６−１陽性膵臓前駆体は、マーカーＰｄｘ１およびＮＫＸ６−１を発現する。他のマーカーとしては、限定されないが、Ｃｄｃｐ１、またはＰｔｆ１ａ、またはＨＮＦ６、またはＮＲｘ２．２が挙げられる。ＮＫＸ６−１の発現は、抗ＮＫＸ６−１抗体を使用した免疫化学または定量的ＲＴ−ＰＣＲなどの当業者に公知の任意の方法によって評価され得る。
【００９２】
用語「幹細胞由来β細胞」、「ＳＣ−β細胞」、および「成熟ＳＣ−β細胞」は、膵臓β細胞を示す少なくとも１つのマーカーを示し、インスリンを発現し、内因性成熟β細胞に特徴的なＧＳＩＳ応答を示す細胞（例えば、膵臓β細胞）を指す。いくつかの実施形態では、「ＳＣ−β細胞」は、成熟膵臓β細胞を含む。本開示の方法が出発点として任意の細胞を使用して任意のインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆物質からＳＣ−β細胞を誘導することができるので、ＳＣ−β細胞は幹細胞から（例えば、直接）誘導される必要がない（例えば、本発明がこの様式に制限されることを意図しないので、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、前駆細胞、部分的に再プログラム化された体細胞（例えば、人工多能性幹細胞と人工多能性幹細胞から誘導される体細胞との間の中間の状態に部分的に再プログラムされている体細胞）、複能性細胞、全能性細胞、前述の細胞のいずれかの分化転換バージョンなどを使用することができる）と理解すべきである。ＳＣ−β細胞およびかかるＳＣ−β細胞を得る方法の例は、ＷＯ２０１５／００２７２４号およびＷＯ２０１４／２０１１６７号（これらの両方の全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【００９３】
本明細書中で使用される用語「外分泌細胞」は、外分泌腺（すなわち、管を介して分泌物を放出する腺）の細胞を指す。特定の実施形態では、外分泌細胞は、小腸に分泌される酵素を産生する膵臓細胞である膵臓外分泌細胞を指す。これらの酵素は、食物が胃腸管を通過するときに食物の消化を補助する。膵臓外分泌細胞はまた、２つのホルモンであるインスリンおよびグルカゴンを分泌するランゲルハンス島として公知である。
【００９４】
「表現型」という用語は、実際の遺伝子型にかかわらず、特定の組の環境条件および因子の下で細胞または生物を規定する１つまたは多くの全生物学的特徴を指す。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「多能性」という用語は、異なる条件下で、１つを超える分化した細胞型に分化し、好ましくは３つすべての生殖細胞層に特徴的な細胞型に分化する能力を有する細胞を指す。多能性細胞は、例えば、ヌードマウステラトーマ形成アッセイを使用して、１つを超える細胞型、好ましくは３つすべての胚葉に分化する能力を主に特徴とする。多能性はまた、胚性幹（ＥＳ）細胞マーカーの発現により証明されるが、好ましい多能性試験は、３つの各胚葉の細胞に分化する能力の実証である。このような細胞を単に培養しても、自然にそれらが多能性になるわけではないことに留意すべきである。再プログラム化多能性細胞（例えば、本明細書でその用語が定義されるｉＰＳ細胞）はもまた、一般に培養においてごく限られた回数の分裂能力を有する初代細胞の親と比べて、成長能力を喪失せずに、長期継代能力の特徴を有する。
【００９６】
本明細書中で使用される場合、用語「ｉＰＳ細胞」および「人工多能性幹細胞」は互換的に使用され、例えば、１またはそれを超える遺伝子の強制的な発現を誘導することによって非多能性細胞（典型的には，成体体細胞）から人為的に誘導させた（例えば、誘導されるか完全な逆転による）多能性幹細胞を指す。
【００９７】
「前駆体」または「前駆」細胞という用語は本明細書では互換的に使用され、分化により生じ得る細胞と比べて原始的である（すなわち、完全に分化した細胞よりも発生経路または進行の初期段階にある）細胞表現型を有する細胞を指す。多くの場合、前駆細胞はまた、有意なまたは非常に高い増殖能力を有する。前駆細胞は、発生経路と、細胞が発生および分化する環境とに応じて、複数の異なる分化した細胞型または単一の分化した細胞型を生じさせ得る。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、増殖することができる未分化細胞であって、多数の母細胞を生成する能力を有するより多くの前駆細胞を生じさせ、そして、分化した娘細胞または分化可能な娘細胞を生じさせることができる未分化細胞を指す。娘細胞それ自体は、親発生能力を有する１つまたはそれを超える細胞も保持しながら、誘導されて増殖し、１つまたはそれを超える成熟細胞型にその後分化する子孫を生産し得る。「幹細胞」という用語は、特定の環境下において、より特殊化または分化した表現型に分化する能力または可能性を有する前駆体のサブセットであって、特定の環境下において、実質的に分化せずに増殖する能力を保持する前駆体のサブセットを指す。一実施形態では、幹細胞という用語は、一般に、その子孫細胞（子孫）が、胚性細胞および組織の進行的多様化において生じる際に、分化により、例えば完全に個別の特徴を獲得することにより、多くの場合に異なる方向で特殊化する天然に存在する母細胞を指す。細胞分化は、多くの細胞分裂を介して典型的に起こる複雑なプロセスである。分化した細胞は、それ自体が多分化能細胞に由来する多分化能細胞に由来し得る、など。これらの各多分化能細胞は幹細胞であると考えられ得るが、細胞型の範囲はそれぞれかなり変動し得る。いくつかの分化した細胞はまた、より高い発生能力の細胞を生じさせる能力を有する。このような能力は天然であり得るか、または様々な因子による処理により人工的に誘導され得る。多くの生物学的事例では、幹細胞は、１つを超える異なる細胞型の子孫を生産し得るので、それらもまた「多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）」であるが、これは「幹性」を必要としない。自己複製は、幹細胞定義の他の古典的な部分であり、本明細書で使用される場合、それは必須である。理論的には、自己複製は、２つの主要機構のいずれかにより起こり得る。幹細胞は非対称に分裂し得、一方の娘は幹状態を保持し、他方の娘は、いくつかの異なる他の特異的機能および表現型を発現する。あるいは、集団中の幹細胞のいくつかは２つの幹に対称的に分裂するので、全体として集団中のいくつかの幹細胞を維持し得るが、集団中の他の細胞は、分化した子孫のみを生じさせる。形式的には、幹細胞として開始する細胞は、分化した表現型に進行し得るが、幹細胞表現型に「戻り」、幹細胞表現型を再発現する（当業者により「脱分化」または「再プログラミング」または「逆分化（ｒｅｔｒｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」と称されることが多い用語）ことが可能である。本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞」という用語は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、胎盤幹細胞などを含む。
【００９９】
細胞個体発生の文脈では、「分化した」または「分化している」という形容詞は、「分化した細胞」が、それが比較される細胞よりもさらに進んで発生経路を進行している細胞であることを意味する相対的な用語である。したがって、幹細胞は、系統制限前駆細胞（例えば、中胚葉幹細胞）に分化し得、そしてこれは、経路をさらに進んで他の種類の前駆細胞（例えば、心筋細胞前駆体）に分化し、次いで、最終段階の分化した細胞（これは、特定の組織型において特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持していてもよいしまたは保持していなくてもよい）に分化し得る。
【０１００】
用語「胚性幹細胞」は、胚の胚盤胞の内部細胞塊の多能性幹細胞を指すために使用される（米国特許第５，８４３，７８０号、同第６，２００，８０６号を参照のこと）。かかる細胞を、体細胞核移植に由来する胚盤胞の内部細胞塊から同様に得ることができる（例えば、米国特許第５，９４５，５７７号、同第５，９９４，６１９号、同第６，２３５，９７０号を参照のこと）。胚性幹細胞の際立った特徴は、胚性幹細胞表現型を限定することである。したがって、ある細胞が他の細胞と区別することができるような胚性幹細胞の１またはそれを超える固有の特徴を保有する場合、この細胞は、胚性幹細胞の表現型を有する。例示的な際立った胚性幹細胞の特徴としては、制限されないが、遺伝子発現プロファイル、増殖能、分化能、核型、および特定の培養条件に対する応答性などが挙げられる。
【０１０１】
用語「成体幹細胞」または「ＡＳＣ」は、非胚組織（胎児、小児、および成人の組織が挙げられる）由来の任意の複能性幹細胞を指すために使用される。幹細胞は、多種多様の成体組織（血液、骨髄、脳、嗅上皮、皮膚、膵臓、骨格筋、および心筋が挙げられる）から単離されている。これらの幹細胞の各々を、遺伝子発現、因子応答性、および培養時の形態に基づいて特徴づけることができる。例示的な成体幹細胞としては、神経幹細胞、神経堤幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、および膵臓幹細胞が挙げられる。前述のとおり、幹細胞は、実質的にあらゆる組織に存在することが見出されている。したがって、本発明は、実質的に任意の動物組織から幹細胞集団を単離することができることを認識する。
【０１０２】
本明細書中で使用される用語「再プログラミング」は、体細胞の分化状態を変更するか転換する（reverse）プロセスを指す。細胞は、再プログラミング前に部分的または末端で分化され得る。再プログラミングは、体細胞から多能性細胞への分化状態の完全な転換を含む。かかる分化の完全な転換により、人工多能性（ｉＰＳ）細胞が産生される。本明細書中で使用される再プログラミングはまた、分化状態の細胞の、例えば、複能性状態への、または多能性でも複能性でもないが、細胞であってそれが生じる分化した細胞の１またはそれを超える特異的な特徴が失われている細胞である体細胞への部分的転換（例えば、分化した細胞の異なる体細胞型への直接再プログラミング）を包含する。再プログラミングは、一般に、接合体が成体に発生するまでの細胞分化中に生じる核酸修飾（例えば、メチル化）、クロマチン凝縮、エピジェネティック変化、ゲノム刷り込みなどの遺伝性パターンのうちの少なくともいくつかの変更（例えば、転換）に関与する。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「薬剤」という用語は、任意の化合物または物質、例えば限定されないが、小分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド、薬物、イオンなどを意味する。「薬剤」は、任意の化学物質、実体または部分、例えば限定されないが、合成および天然に存在するタンパク質性および非タンパク質性実体であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、核酸、核酸類似物、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、核酸のオリゴマー、アミノ酸または炭水化物、例えば限定されないが、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡザイム、糖タンパク質、ｓｉＲＮＡ、リポタンパク質、アプタマーならびにそれらの改変および組み合わせである。特定の実施形態では、薬剤は、化学部分を有する小分子である。例えば、化学部分は、置換または非置換アルキル、芳香族またはヘテロシクリル部分、例えばマクロライド、レプトマイシンおよび関連天然産物またはその類似体を含む。化合物は、所望の活性および／もしくは特性を有することが公知であり得るか、または様々な化合物のライブラリから選択され得る。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「接触」という用語（すなわち、少なくとも１つの内分泌細胞またはその前駆体と成熟因子または成熟因子の組み合わせとの接触）は、成熟因子ならびに細胞をインビトロで一緒にインキュベートする（例えば、成熟因子を培養中の細胞に添加する）ことを含むことを意図する。いくつかの実施形態では、「接触」という用語は、被験体において天然に存在し得る本明細書に開示される化合物への細胞のインビボ曝露（すなわち、天然の生理学的プロセスの結果として起こり得る曝露）を含むことを意図しない。本明細書に記載の実施形態のように、少なくとも１つの内分泌細胞またはその前駆体を成熟因子と接触させる工程は、任意の適切な方法で行われ得る。例えば、細胞は、付着培養または懸濁培養で処理され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞クラスタリングを促進する条件で処理される。本開示は、細胞クラスタリングを促進する任意の条件を企図する。細胞クラスタリングを促進する条件の例としては、限定されないが、低付着組織培養プレート、スピナーフラスコ、またはアグリウェルプレート（ａｇｇｒｅｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）中の懸濁培養が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明者らは、１０％血清を含有する培地で、クラスターが依然として安定であることを観察した。いくつかの実施形態では、クラスタリングを促進する条件には、低血清培地が含まれる。
【０１０５】
また、成熟因子と接触させた細胞を別の薬剤、例えば成長因子または他の分化薬剤または環境と同時にまたはその後接触させて、細胞を安定化し得るかまたは細胞をさらに分化させ得ると理解される。
【０１０６】
本明細書で言及される「細胞培養培地」（本明細書では「培養培地」または「培地」とも称される）という用語は、細胞を培養するための培地であって、細胞生存性を維持して増殖を支援する栄養素を含有する培地である。細胞培養培地は、適切な組み合わせで以下のいずれかを含有し得る：塩、緩衝液、アミノ酸、グルコースまたは他の糖、抗生物質、血清または血清代替物および他の成分、例えばペプチド成長因子など。特定の細胞型に通常使用される細胞培養培地は、当業者に公知である。
【０１０７】
用語「細胞系」は、典型的には、単一の祖先細胞または規定された祖先細胞集団および／もしくは実質的に同一の祖先細胞集団に由来している大部分が同一のまたは実質的に同一の細胞の集団を指す。細胞系は、培養物中で長期間（例えば、数ヶ月、数年、無期限）維持されている場合があるか、維持できる場合がある。細胞系は、細胞の培養寿命を無期限にする自発性または誘導性の形質転換プロセスを受けている場合がある。細胞系としては、そのようなものとして当該分野で認識されている全ての細胞系が挙げられる。細胞系の個別の細胞の少なくともいくつかの性質が相互に異なり得るように、細胞が経時的に変異およびおそらくエピジェネティック変化を獲得することが認識される。いくつかの実施形態では、細胞系は、本明細書中に記載の細胞に由来する幹細胞を含む。
【０１０８】
「外因性」という用語は、その天然供給源以外の細胞または生物に存在する物質を指す。例えば、「外因性核酸」または「外因性タンパク質」という用語は、人の手を伴うプロセスにより、それが通常は見られないかまたはより少量で見られる生物系（例えば、細胞または生物）に導入されている核酸またはタンパク質を指す。物質が細胞、または物質を受け継ぐ細胞祖先に導入される場合、それは外因性であるとみなされるであろう。対照的に、「内因性」という用語は、生物系にネイティブである物質を指す。
【０１０９】
「発現」という用語は、ＲＮＡおよびタンパク質を産生すること、および必要に応じてタンパク質を分泌することを伴う細胞プロセス、例えば該当する場合には、限定されないが、転写、翻訳、フォールディング、改変およびプロセッシングを指す。「発現産物」は、遺伝子から転写されたＲＮＡと、遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳により得られたポリペプチドとを含む。
【０１１０】
本明細書中で使用される用語「遺伝子改変された」または「操作された」細胞は、人為的手段を含むプロセスによって外因性核酸が導入されている細胞（または核酸の少なくとも一部を受け継いだかかる細胞の子孫）を指す。核酸は、例えば、細胞に対して外因性の配列を含んでよく、核酸は、ネイティブ配列（すなわち、細胞中に天然に見出される配列）であるが、天然に存在しない配置（例えば、異なる遺伝子由来のプロモーターに連結されたコード領域）の配列、またはネイティブ配列の変更バージョンなどを含んでよい。細胞への核酸移入のプロセスを、任意の適切な技術によって行うことができる。適切な技術としては、リン酸カルシウムまたは脂質が媒介するトランスフェクション、エレクトロポレーション、およびウイルスベクターを使用した形質導入または感染が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはその一部を細胞のゲノムに組み込む。核酸は、その後、ゲノムから除去されるか切り出されていてもよいが、但し、改変されていないが等価な細胞と比較して、かかる除去または切り出しによって細胞が検出可能に変更されることを条件とする。遺伝子改変されたという用語には細胞への改変されたＲＮＡの直接導入（例えば、合成改変ＲＮＡ）が含まれることを意図することを認識すべきである。かかる合成改変ＲＮＡとしては、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによる急速な分解を防止し、ＲＮＡに対する細胞の自然免疫応答またはインターフェロン応答を回避するか軽減するための改変が挙げられる。改変としては、制限されないが、例えば、（ａ）末端改変、例えば、５’末端改変（リン酸化  脱リン酸化、コンジュゲーション、逆連結など）、３’末端改変（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆連結など）、（ｂ）塩基修飾、例えば、改変塩基、安定化塩基、不安定化塩基、またはパートナーの範囲を広げる塩基と対合した塩基、またはコンジュゲートした塩基との置換、（ｃ）糖修飾（例えば、２’位または４’位での糖修飾）または糖の置換、および（ｄ）ヌクレオシド間連結の改変（ホスホジエステル結合の改変または置換が挙げられる）が挙げられる。かかる改変が翻訳を妨げる範囲（すなわち、例えば、ウサギ網状赤血球のインビトロ翻訳アッセイにおいて、改変されない場合と比較して５０％またはそれを超える翻訳が低下する）範囲において、改変は、本明細書中に記載の方法および組成物に適切ではない。
【０１１１】
本明細書中で使用される用語「同一性」は、２つまたはそれを超える核酸またはポリペプチドの配列が同一である程度を指す。評価域にわたる（例えば、目的の配列の長さにわたる）目的の配列と第２の配列との間の同一率を、配列を整列させ、ギャップを導入して同一性を最大化して、同一残基と反対側にある評価域内の残基（ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を決定し、域内に含まれる目的の配列または第２の配列の総残基数（どちらか多い方）で割り、１００を掛けることによって計算することができる。特定の同一率を達成するために必要な同一残基数を計算するとき、端数を最も近い整数に丸めるべきである。同一率を、当該分野で公知の種々のコンピュータプログラムを使用して計算することができる。例えば、ＢＬＡＳＴ２、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴなどのコンピュータプログラムでアラインメントし、目的の配列間の同一率を得る。Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３に見られるように修正されたＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２２６４−２２６８，１９９０）を、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ら，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）に組み込む。比較のためのギャップ挿入アラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ら．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）に記載のようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用する。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、各プログラムのデフォルトパラメータを使用してよい。ＰＡＭ２５０行列またはＢＬＯＳＵＭ６２行列を使用してよい。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から公的に入手可能である。これらのプログラムについては、以下のＵＲＬワールド・ワイド・ウェブアドレスを有するウェブサイトを参照のこと：「ｎｃｂｉ．ｎｌｍ  ｎｉｈ．ｇｏｖ」。特定の実施形態では、同一率を、ＮＣＢＩが提供するデフォルトパラメータを用いてＢＬＡＳＴ２を使用して計算する。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「単離された」または「部分的に精製された」という用語は、核酸またはポリヌクレオチドの場合には、その天然供給源に見られる核酸もしくはポリヌクレオチドと共に存在し、および／または分泌ポリペプチドの場合には、細胞により発現されるかもしくは分泌されると核酸もしくはポリヌクレオチドと共に存在するであろう少なくとも１つの他の成分（例えば、核酸またはポリヌクレオチド）から分離された核酸またはポリヌクレオチドを指す。化学合成核酸もしくはポリヌクレオチド、またはインビトロ転写／翻訳を使用して合成されたものは、「単離された」とみなされる。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「単離された細胞」という用語は、それが本来見られる生物から取り出されている細胞またはこのような細胞の子孫を指す。必要に応じて、細胞は、インビトロで、例えば他の細胞の存在下で培養されている。必要に応じて、その後、細胞は、第２の生物に導入されるか、またはそれ（またはそれに由来する細胞）が単離された生物に再導入される。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、細胞の単離された集団に関する「単離された集団」という用語は、細胞の混合または不均質集団から取り出されて分離されている細胞の集団を指す。いくつかの実施形態では、単離された集団は、細胞が単離または濃縮された不均質集団と比較して実質的に純粋な細胞集団である。
【０１１５】
特定の細胞集団に関する用語「実質的に純粋な」は、総細胞集団を構成する細胞に対する純度が少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の細胞集団を指す。
【０１１６】
「濃縮する」または「濃縮された」という用語は本明細書では互換的に使用され、１種類の細胞の収率（割合）が、開始培養物または調製物中のその種類の細胞の割合よりも少なくとも１０％増加していることを意味する。
【０１１７】
用語「再生」または「自己再生」または「増殖」は本明細書では互換的に使用され、長期間、および／または数ヶ月から数年にわたって同一の非特殊化細胞型に分裂することによって幹細胞が自己再生する能力を指すために使用される。いくつかの例では、増殖は、単一の細胞の２つの同一の娘細胞への分裂の反復による細胞の拡大増殖（expansion）を指す。
【０１１８】
本明細書中で使用される用語「系譜」は、共通の祖先を有する細胞または共通の発生的運命を有する細胞について述べている。例えば、内胚葉を起源とするか、「内胚葉系譜」である細胞の文脈において、これは、細胞が、内胚葉細胞に由来しており、内胚葉系譜が制限する経路（最終的に内胚葉細胞を生じる１またはそれを超える発生系譜経路など）に沿って分化することができ、順次、肝臓細胞、胸腺、膵臓、肺、および腸に分化することができることを意味する。
【０１１９】
本明細書中で使用される場合、用語「異種の」は、異なる種に由来する細胞を指す。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「マーカー」は、細胞の特徴および／または表現型を説明するために使用される。マーカーは、目的の特徴を含む細胞の選択に使用され得る。マーカーは、特定の細胞により変動するであろう。特定の細胞型の細胞の形態学的、機能的もしくは生化学的（酵素的）特徴または細胞型により発現される分子にかかわらず、マーカーは特徴的である。好ましくは、このようなマーカーはタンパク質であり、より好ましくは、抗体または当技術分野で利用可能な他の結合分子に対するエピトープを有する。しかしながら、マーカーは、細胞に見られる任意の分子、例えば限定されないが、タンパク質（ペプチドおよびポリペプチド）、脂質、多糖類、核酸およびステロイドからなり得る。形態学的特徴または形質の例としては、限定されないが、形状、サイズおよび核対細胞質比が挙げられる。機能的特徴または形質の例としては、限定されないが、特定の基材への付着能力、特定の色素の取り込み能力または排出能力、特定の条件下における遊走能力および特定の系統に沿った分化能力が挙げられる。マーカーは、当業者に利用可能な任意の方法により検出され得る。マーカーはまた、形態学的特徴の非存在、またはタンパク質、脂質などの非存在であり得る。マーカーは、ポリペプチドおよび他の形態学的特徴の存在および非存在のユニークな特徴のパネルの組み合わせであり得る。
【０１２１】
「モジュレートする」という用語は、当技術分野におけるその使用と一致して使用され、すなわち、目的のプロセス、経路または現象の定性的または定量的な変更、変化または改変を引き起こすかまたは促進することを意味する。限定されないが、このような変更は、プロセス、経路または現象の異なる成分または分岐の相対的な強度または活性の増加、減少または変更であり得る。「モジュレーター」は、目的のプロセス、経路または現象の定性的または定量的な変更、変化または改変を引き起こすかまたは促進する薬剤である。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸として定義される。
【０１２３】
用語「ポリヌクレオチド」を、本明細書中ではヌクレオシドのポリマーを示すために「核酸」と互換的に使用する。典型的には、本発明のポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって連結された、ＤＮＡまたはＲＮＡ中に天然に見出されるヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）から構成される。しかし、この用語は、天然に存在する核酸中に見出されるかかどうかと無関係に化学的または生物学的に改変された塩基、改変された骨格などを含むヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログを含む分子を包含し、かかる分子は、一定の適用に好ましい場合がある。本出願でポリヌクレオチドに言及する場合、ＤＮＡ、ＲＮＡの両方（いずれの場合も一本鎖および二本鎖の形態の両方（ならびに各一本鎖分子の相補物））が提供されると理解される。本明細書中で使用される「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド材料自体および／または特定の核酸を生化学的に特徴づける配列情報（すなわち、塩基の略語として使用される文字の連続）を指すことができる。本明細書中に示すポリヌクレオチド配列は、特に指示がない限り、５’から３’への方向で示す。
【０１２４】
本明細書中で使用される用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーを指す。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書では互換的に使用される。ペプチドは、典型的には約２アミノ酸長と６０アミノ酸長との間の比較的短いポリペプチドである。本明細書中で使用されるポリペプチドは、典型的には、タンパク質中に最もよく見られる２０種のＬ−アミノ酸などのアミノ酸を含む。しかし、当該分野で公知の他のアミノ酸および／またはアミノ酸アナログを使用することができる。ポリペプチド中の１またはそれを超えるアミノ酸は、例えば、炭水化物基、リン酸基、脂肪酸基、コンジュゲーションのためのリンカー、官能基などの化学物質の付加によって改変され得る。共有結合または非共有結合した非ポリペプチド部分を有するポリペプチドは、依然として「ポリペプチド」と見なされる。例示的な改変としては、グリコシル化およびパルミトイル化が挙げられる。ポリペプチドは、天然供給源から精製され得るか、組換えＤＮＡテクノロジーを使用して産生され得るか、従来の固相ペプチド合成などの化学的手段によって合成され得る。本明細書中で使用される用語「ポリペプチド配列」または「アミノ酸配列」は、ポリペプチド材料自体および／またはポリペプチドを生化学的に特徴づける配列情報（すなわち、アミノ酸名の略語として使用される文字の連続または三文字表記）を指すことができる。本明細書中に示すポリペプチド配列は、特に指示がない限り、Ｎ末端からＣ末端への方向で示す。
【０１２５】
ポリペプチドに関する用語「バリアント」は、例えば、全長ポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一のポリペプチドであり得る。バリアントは、全長ポリペプチドの断片であり得る。バリアントは、天然に存在するスプライスバリアントであり得る。バリアントは、ポリペプチドの断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一のポリペプチドであり得、ここで、全長野生型ポリペプチドまたはそのドメインが目的の活性を有する限り、断片は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％である。いくつかの実施形態では、ドメインは、少なくとも１００、２００、３００、または４００アミノ酸長であり、配列中の任意のアミノ酸の位置から始まり、Ｃ末端に向かって伸長している。タンパク質活性を消失させるか、実質的に低下させることが当該分野で公知の変異は、回避することが好ましい。いくつかの実施形態では、バリアントは、全長ポリペプチドのＮおよび／またはＣ末端の一部を欠く（例えば、いずれかの末端から１０、２０、または５０個までのアミノ酸を欠いている）。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、成熟（全長）ポリペプチドの配列を有し、ここで、成熟（全長）ポリペプチドは、１またはそれを超える部分（通常の細胞内タンパク質分解プロセシング中（例えば、共翻訳プロセシングまたは翻訳後プロセシング中）に除去されるシグナルペプチドなど）を有していたポリペプチドを意味する。タンパク質を天然に発現する細胞からタンパク質を精製すること以外でタンパク質が産生されるいくつかの実施形態では、タンパク質はキメラポリペプチドであり、ここで、キメラポリペプチドは、２またはそれを超える種由来の部分を含むことを意味する。タンパク質を天然に発現する細胞からタンパク質を精製すること以外でタンパク質が産生されるいくつかの実施形態では、タンパク質は誘導体であり、ここで、誘導体は、その配列がタンパク質の生物学的活性を実質的に低下させない限り、タンパク質がこのタンパク質に関連しないさらなる配列を含むことを意味する。
【０１２６】
本明細書中で使用される用語「機能的断片」は、断片が由来するポリペプチドと比較してサイズが小さいが実質的に相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、ここで、機能的断片のポリペプチド配列が、断片が由来するポリペプチドの約少なくとも５０％、または６０％または７０％または８０％または９０％または１００％または１００％を超える、例えば、１．５倍、２倍、３倍、４倍、または４倍を超えて生物学的に有効に作用する。機能的断片のポリペプチドは、抗原性の減少、（転写因子に見られるような）ＤＮＡ結合の増加、または（ＲＮＡの安定性または分解の制御で見られるような）ＲＮＡ結合の変化が挙げられ得るさらなる機能を有し得る。
【０１２７】
用語「ベクター」は、宿主細胞への導入のためのＤＮＡ配列を挿入することができる担体ＤＮＡ分子を指す。好ましいベクターは、ベクターに連結された核酸の自律複製および／または発現が可能なベクターである。ベクターに作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができるベクターを、本明細書中で「発現ベクター」と称する。したがって、「発現ベクター」は、宿主細胞中での目的の遺伝子の発現に必要な制御領域を含む特殊化されたベクターである。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、ベクター中の別の配列に作動可能に連結される。ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターを使用する場合、ウイルスベクターの複製機能が欠損していることが好ましく、例えば、複製をコードする全てのウイルス核酸を除去することによって欠損させることができる。複製欠損ウイルスベクターは、依然として感染性を保持し、複製型アデノウイルスベクターと類似する様式で細胞に侵入するが、しかし、細胞に入った時点で、複製欠損ウイルスベクターは再生したり数が増えたりしない。ベクターはまた、リポソームおよびナノ粒子ならびにＤＮＡ分子を細胞に送達させるための他の手段を包含する。
【０１２８】
用語「作動可能に連結された」は、コード配列の発現に必要な制御配列が、コード配列を発現させるためにＤＮＡ分子内のコード配列に対して適切な位置に配置されていることを意味する。この同一の定義は、時折、発現ベクター内のコード配列および転写調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、および終結エレメント）の配置に適用される。用語「作動可能に連結された」としては、発現すべきポリヌクレオチド配列の前に適切な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ）を有すること、発現調節配列の調節下でポリヌクレオチド配列を発現させるための正確な読み枠を維持すること、およびポリヌクレオチド配列によってコードされる所望のポリペプチドの産生が挙げられる。
【０１２９】
用語「ウイルスベクター」は、細胞内への核酸構築物の担体としてのウイルスまたはウイルス関連ベクターの使用を指す。構築物は、細胞に感染させるか形質導入するために、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）など（レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターが挙げられる）のような非複製型の欠損ウイルスゲノムに組み込むかパッケージングされ得る。ベクターは、細胞のゲノムに組み込まれても、組み込まれなくてもよい。構築物は、必要に応じてトランスフェクションのためのウイルス配列を含んでもよい。あるいは、構築物は、エピソーム複製が可能なベクター（例えば、ＥＰＶベクターおよびＥＢＶベクター）に組み込まれてよい。
【０１３０】
用語「制御配列」および「プロモーター」は本明細書中では互換的に使用され、作動可能に連結されたタンパク質コード配列の転写を誘導または調節する核酸配列（開始シグナル、エンハンサー、およびプロモーターなど）を指す。いくつかの例では、組換え遺伝子の転写は、発現が意図される細胞型における組換え遺伝子の発現を調節するプロモーター配列（または他の転写制御配列）の調節下にある。組換え遺伝子が、天然に存在する形態のタンパク質の転写を調節する配列と同一であるか異なる転写制御配列の調節下にあり得ることも理解される。いくつかの例では、プロモーター配列は、特定の遺伝子の転写開始に必要な細胞の合成機序によって認識されるか、合成機序に導入される。
【０１３１】
本明細書中で使用される場合、用語「転写因子」は、ＤＮＡ結合ドメインを使用してＤＮＡの特定の部分に結合し、ＤＮＡからＲＮＡへの遺伝情報の伝達（または転写）を調節するシステムの一部であるタンパク質を指す。本明細書中で使用される場合、「増殖すること」および「増殖」は、細胞分裂による集団中の細胞数の増加（成長）を指す。細胞増殖は、環境（成長因子および他の分裂促進因子が挙げられる）に応答した複数のシグナル伝達経路の調和の取れた活性化に起因すると一般的に理解されている。細胞増殖はまた、細胞内または細胞外のシグナルの作用および細胞増殖を遮断するか負の影響を及ぼす機序に由来する放出によって促進され得る。
【０１３２】
「選択マーカー」という用語は、発現されると、選択的表現型、例えば、細胞傷害剤もしくは細胞増殖抑制剤に対する耐性（例えば、抗生物質耐性）、栄養原栄養性、またはタンパク質を発現する細胞と発現しない細胞とを区別する根拠として使用され得る特定のタンパク質の発現を細胞に付与する遺伝子、ＲＮＡまたはタンパク質を指す。発現が容易に検出され得るタンパク質、例えば蛍光もしくは発光タンパク質、または基質に作用して発色、蛍光もしくは発光物質を生産する酵素（「検出可能なマーカー」）は、選択マーカーのサブセットを構成する。多能性細胞において選択的または排他的に通常発現される遺伝子にネイティブな発現制御エレメントに連結された選択マーカーの存在は、多能性状態に再プログラム化されている体細胞を同定および選択することを可能にする。様々な選択マーカー遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）、ピューロマイシン耐性遺伝子（ｐｕｒｏ）、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、アデノシンジアミナーゼ（ａｄａ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＣ）、ヒグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇ）、多剤耐性遺伝子（ｍｄｒ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）およびｈｉｓＤ遺伝子が使用され得る。検出可能なマーカーとしては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色、サファイア色、黄色、赤色、オレンジ色およびシアン色蛍光タンパク質ならびにこれらのいずれかの改変体が挙げられる。発光タンパク質、例えばルシフェラーゼ（例えば、ホタルまたはウミシイタケのルシフェラーゼ）も有用である。当業者には明らかであるように、本明細書で使用される場合、「選択マーカー」という用語は、遺伝子または遺伝子の発現産物、例えばコードされたタンパク質を指し得る。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、選択マーカーは、それを発現しないかまたは有意に低いレベルでそれを発現する細胞と比べて、それを発現する細胞に増殖および／または生存の利点を付与する。このような増殖および／または生存の利点は、典型的には、特定の条件、すなわち「選択的条件」下で細胞が維持される場合に生じる。有効な選択を保証するために、細胞の集団は、マーカーを発現しない細胞が増殖および／もしくは生存せず、集団から排除されるか、またはその数が集団のごくわずかまで減少するような条件下および十分な期間維持され得る。マーカーを発現しない細胞をほとんどまたは完全に排除するための選択条件下で細胞の集団を維持することにより、増殖および／または生存上の利点を付与するマーカーを発現する細胞を選択するプロセスは、本明細書では「陽性選択」と称され、マーカーは、「陽性選択に有用」であるといわれる。陰性選択および陰性選択に有用なマーカーもまた、本明細書に記載される特定の方法の関心対象である。このようなマーカーの発現は、それを発現しないかまたは有意に低いレベルでそれを発現する細胞と比べて、マーカーを発現する細胞に増殖および／または生存上の不利益を付与する（または、言い換えればマーカーを発現しない細胞は、マーカーを発現する細胞と比べて、増殖および／または生存上の利点を有すると考えられる）。したがって、マーカーを発現する細胞は、選択条件で十分な期間維持されると、細胞の集団からほとんどまたは完全に排除される。
【０１３４】
本明細書中で使用される「レポーター遺伝子」は、幹細胞の表現型に付加する、細胞内に遺伝子導入される任意の遺伝子を包含する。本発明に開示のレポーター遺伝子は、蛍光遺伝子、発光遺伝子、酵素遺伝子、および耐性遺伝子を包含することが意図されるが、当業者が容易に検出することができる他の遺伝子も包含することが意図される。本発明のいくつかの実施形態では、レポーター遺伝子は、特定の幹細胞、心血管幹細胞およびその分化した子孫の同定のためのマーカーとして使用される。レポーター遺伝子は、一般に、レポーター遺伝子の発現の測定によってモニタリングされる１またはそれを超える条件に依存する様式でレポーター遺伝子の発現を制御する配列に作動可能に連結される。いくつかの場合、レポーター遺伝子の発現は、生細胞中で決定され得る。生細胞レポーター遺伝子アッセイを使用する場合、レポーター遺伝子発現は、複数の時点（例えば、２、３、４、５、６、８、または１０またはそれを超える時点）でモニタリングされ得る。いくつかの場合、生細胞レポーターアッセイを使用する場合、レポーター遺伝子発現は、少なくとも約１０分から約２４時間までの頻度（例えば、２０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１８時間の頻度、または約１０分間と約２４時間との間の任意の整数由来の別の頻度）でモニタリングされる。
【０１３５】
「被験体」および「個体」という用語は本明細書では互換的に使用され、細胞を得ることができ、および／または本明細書に記載される細胞による処置（予防的処置を含む）が提供される動物、例えばヒトを指す。特定の動物、例えばヒト被験体に特異的な感染、状態または疾患状態の処置では、被験体という用語は、その特定の動物を指す。本明細書で互換的に使用される場合、「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」は、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタおよび非ヒト霊長類を含む。「被験体」という用語はまた、任意の脊椎動物、例えば限定されないが、哺乳動物、爬虫類、両生類および魚類を包含する。しかしながら、有利には、被験体は、哺乳動物、例えばヒトまたは他の哺乳動物、例えば飼育哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマなどまたは生産哺乳動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタなどである。
【０１３６】
単離された細胞に適用される場合、「処置する」、「処置すること」、「処置」などの用語は、細胞を任意の種類のプロセスもしくは条件に供すること、または細胞に対して任意の種類の操作もしくは手順を実施することを含む。被験体に適用される場合、この用語は、医療的または外科的注意、ケアまたは管理を個体に提供することを指す。通常、個体は病気もしくは負傷状態であるか、または集団の平均的なメンバーと比べて増加した病気リスクがあり、このような注意、ケアまたは管理を必要とする。
【０１３７】
本明細書中で使用される場合、「処置すること」および「処置」という用語は、被験体が疾患の少なくとも１つの症状の低減または疾患の改善、例えば有益なまたは所望の臨床的結果となるように、有効量の組成物を被験体に投与することを指す。本発明の目的では、有益または所望の臨床的結果としては、限定されないが、検出可能または検出不可能にかかわらず、１つまたはそれを超える症状の緩和、疾患の程度の減弱、疾患状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患進行の遅延もしくは減速、疾患状態の改善もしくは軽減および寛解（部分的または完全にかかわらず）が挙げられる。処置は、処置を受けない場合に予想される生存と比較して生存を延長することを指し得る。したがって、当業者は、処置が疾患状態を改善し得るが、疾患の完治ではない可能性があることを理解する。本明細書中で使用される場合、用語「処置」としては、予防が挙げられる。あるいは、処置は、疾患の進行が軽減されるか停止された場合に、「有効」である。「処置」はまた、処置を受けていない場合に予想される生存期間と比較した生存期間の延長を意味し得る。
【０１３８】
本明細書中で使用される場合、用語「投与すること」、「導入すること」、および「移植すること」は、導入される細胞の少なくとも一部が所望の部位に局在化される方法または経路による、被験体への本発明の細胞の配置の文脈で互換的に使用される。細胞を、膵臓または胃腸管に直接移植することができるか、あるいは、被験体内の所望の位置に送達される任意の適切な経路によって投与することができ、その位置で移植された細胞の少なくとも一部または前述の細胞の成分が依然として生存する。被験体への投与後の細胞の生存期間は、数時間もの短さ（例えば、２４時間）、数日間まで、数年間もの長さまでであり得る。いくつかの例では、移植された細胞が移植位置で維持され、移植された細胞の移動を回避するために、細胞を、例えば、カプセル（例えば、マイクロカプセル）中で皮下投与することもできる。
【０１３９】
本明細書中で使用される句「非経口投与」および「非経口投与される」は、腸内投与および局所投与以外の、通常は注射による投与様式を意味し、制限されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、脳脊髄内、および胸骨内への注射および注入が挙げられる。本明細書中で使用される句「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」、および「末梢に投与される」は、動物の系内に入り、したがって代謝および他の類似のプロセスに供されるような、中枢神経系への直接投与以外の幹細胞由来細胞および／またはその子孫および／または化合物および／または他の材料の投与（例えば、皮下投与）を意味する。
【０１４０】
「組織」という用語は、特定の特殊機能を共に実行する特殊化した細胞の群または層を指す。「組織特異的」という用語は、特定の組織に由来する細胞の供給源を指す。
【０１４１】
「減少する」、「低下した」、「低下」、「減少」または「阻害する」という用語はすべて、本明細書では一般に、統計学的に有意な量の減少を意味するために使用される。しかしながら、誤解を避けるために、「低下した」、「低下」、「減少する」または「阻害する」は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約２０％または少なくとも約３０％または少なくとも約４０％または少なくとも約５０％または少なくとも６０％または少なくとも約７０％または少なくとも約８０％または少なくとも約９０％の減少または１００％までの減少（すなわち、参照サンプルと比較して非存在レベル）または１０〜１００％の任意の減少を意味する。
【０１４２】
「増加した」、「増加する」もしくは「増強する」または「活性化する」という用語はすべて、本明細書では一般に、統計学的に有意な量の増加を意味するために使用される；いかなる誤解も避けるために、「増加した」、「増加する」もしくは「増強する」または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約２０％もしくは少なくとも約３０％もしくは少なくとも約４０％もしくは少なくとも約５０％もしくは少なくとも約６０％もしくは少なくとも約７０％もしくは少なくとも約８０％もしくは少なくとも約９０％の増加もしくは１００％までの増加もしくは１０〜１００％の任意の増加、または参照レベルと比較して少なくとも約２倍もしくは少なくとも約３倍もしくは少なくとも約４倍もしくは少なくとも約５倍もしくは少なくとも約１０倍の増加もしくは２倍〜１０倍もしくはそれを超える任意の増加を意味する。
【０１４３】
「統計学的に有意」または「有意に」という用語は、統計学的有意性を指し、一般に、マーカーの通常の濃度よりも２標準偏差（２ＳＤ）低いまたはそれよりも低いことを意味する。前記用語は、差があることの統計的証拠を指す。それは、帰無仮説が実際に真である場合、帰無仮説を拒絶する決定を行う確率として定義される。決定は、多くの場合、ｐ値を使用して行われる。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、「含むこと」または「含む」という用語は、本発明に必須の組成物、方法およびその各成分に関して使用されるが、必須か否かにかかわらず、不特定要素の包含を含む。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所定の実施形態に必要とされる要素を指す。前記用語は、本発明のその実施形態の基本的かつ新規または機能的な特徴に実質的に影響を及ぼさないさらなる要素の存在を許容する。
【０１４６】
「からなる」という用語は、本明細書に記載される組成物、方法およびその各成分を指し、実施形態のその説明に列挙されていないいかなる要素に対しても排他的である。
【０１４７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈上明確な表示がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、本明細書に記載される種類の１つまたはそれを超える方法および／もしくは工程を含み、ならびに／またはこれは、本開示などを読むことにより当業者には明らかであろう。
【０１４８】
幹細胞
幹細胞は、有糸分裂細胞の分裂によって幹細胞自体を再生する能力を保持し、さまざまな特殊化された細胞型に分化することができる細胞である。哺乳動物幹細胞の２つの広範な型は、以下である：胚盤胞で見出される胚性幹（ＥＳ）細胞、および成体組織で見出される成体幹細胞。発生中の胚では、幹細胞は、全ての特殊化された胚組織に分化することができる。成体生物では、幹細胞および前駆細胞は、身体の修復システムとして作用して特殊化された細胞を補充するが、再生器官（血液、皮膚、または腸組織など）の正常な代謝回転も維持する。多能性幹細胞は、３つの胚葉のうちのいずれかに由来する細胞に分化することができる。
【０１４９】
幹細胞の使用に関して一定の実施形態を以下に記載しているが、本明細書中に記載の例示的なプロトコールと類似するプロトコールを使用して、生殖細胞を、幹細胞の代わりに、または幹細胞と共に用いて少なくとも１つの分化細胞を得ることができる。適切な生殖細胞を、例えば、最終月経期から約８〜１１週間後に採取したヒト胎児材料中に存在する始原生殖細胞から調製することができる。例示的な生殖細胞調製方法は、例えば、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６，１９９８および米国特許第６，０９０，６２２号に記載されている。
【０１５０】
実質的に無限の複製能およびほとんどの細胞型に分化する潜在性を有するＥＳ細胞（例えば、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）またはマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ））は、原理上は、臨床治療のための分化細胞を生成するための無制限の出発材料を提供する（ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｎｆｏ／ｓｃｉｒｅｐｏｒｔ／２００６ｒｅｐｏｒｔ．ｈｔｍ、２００６）。
【０１５１】
ｈＥＳＣ細胞は、例えば、Ｃｏｗａｎら（Ｎ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：１３５３，２００４）およびＴｈｏｍｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５，１９９８）に記載されており；他の霊長類由来の胚性幹細胞、アカゲザル幹細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７８４４，１９９５）、マーモセット幹細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５５：２５４，１９９６）、およびヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６，１９９８）を、本明細書中に開示の方法で使用してもよい。ｍＥＳＣは、例えば、Ｔｒｅｍｍｌら（Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈａｐｔｅｒ  １：Ｕｎｉｔ  １Ｃ．４，２００８）に記載されている。幹細胞は、例えば、単能性、全能性、複能性、または多能性であり得る。いくつかの例では、少なくとも１つの胚葉または３つ全ての胚葉の誘導物である子孫を作製することができる霊長類起源の任意の細胞を、本明細書中に開示の方法で使用してよい。
【０１５２】
一定の例では、ＥＳ細胞は、例えば、Ｃｏｗａｎら（Ｎ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：１３５３，２００４）および米国特許第５，８４３，７８０号およびＴｈｏｍｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７８４４，１９９５に記載のように単離され得る。例えば、ｈＥＳＣ細胞を、Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第６，２００，８０６号；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５，１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３  ｆｆ．，１９９８）およびＲｅｕｂｉｎｏｆｆら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：３９９，２０００に記載の技術を使用して、ヒト胚盤胞細胞から調製することができる。ｈＥＳＣと等価な細胞型としは、その多能性誘導体（例えば、ＷＯ０１／５１６１０号（Ｂｒｅｓａｇｅｎ）に概説された原始外胚葉様（ＥＰＬ）細胞など）が挙げられる。ｈＥＳＣを、ヒト着床前胚から得ることもできる。あるいは、体外受精（ＩＶＦ）胚を使用することができるか、一細胞ヒト胚を、胚盤胞期まで拡大増殖することができる（Ｂｏｎｇｓｏら，Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  ４：７０６，１９８９）。胚を、Ｇ１．２培地およびＧ２．２培地中で胚盤胞期まで培養する（Ｇａｒｄｎｅｒら，Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．６９：８４，１９９８）。プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ）への短時間の曝露によって発生した胚盤胞から透明帯を除去する。内部細胞塊を、免疫手術によって単離することができ、この免疫手術では、胚盤胞をウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清の１：５０希釈物に３０分間曝露し、次いで、ＤＭＥＭ中で５分間の洗浄を３回行い、モルモット補体の１：５希釈物（Ｇｉｂｃｏ）に３分間曝露する（Ｓｏｌｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７２：５０９９，１９７５）。ＤＭＥＭ中でのさらに２回の洗浄後、溶解された栄養外胚葉細胞を、穏やかなピペット操作によってインタクトな内部細胞塊（ＩＣＭ）から除去し、ＩＣＭをｍＥＦフィーダー層にプレーティングする。９〜１５日後、内部細胞塊由来派生物（outgrowth）を、カルシウムおよびマグネシウムを含まない１ｍＭ  ＥＤＴＡ含有リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）への曝露、ディスパーゼまたはトリプシンへの曝露、またはマイクロピペットでの機械的解離のいずれかによってクランプ中に解離し；次いで、新鮮な培地を含むｍＥＦに再プレーティングすることができる。形態が未分化の成長中のコロニーを、マイクロピペットによって個別に選択し、クランプ中に機械的に解離し、再プレーティングすることができる。ＥＳ様形態は、見かけ上核対細胞質比が高く、かつ核小体が明らかな小型のコロニーとして特徴付けられる。次いで、得られたｈＥＳＣを、例えば、短時間のトリプシン処理、ダルベッコＰＢＳ（２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）への曝露、ＩＶ型コラゲナーゼ（約２００Ｕ／ｍＬ；Ｇｉｂｃｏ）への曝露、またはマイクロピペットによる各コロニーの選択によって、１〜２週間毎に規定通りに分割することができる。いくつかの例では、約５０〜１００細胞のクランプサイズが最適である。ｍＥＳＣ細胞を、例えば、Ｃｏｎｎｅｒら（Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｕｎｉｔ  ２３．４，２００３）に記載の技術を使用して調製することができる。
【０１５３】
胚性幹細胞を、霊長類種のメンバーの胚盤胞から単離することができる（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｔｈｏｍｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７８４４，１９９５）。ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を、Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第６，２００，８０６；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５，１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３  ｆｆ．，１９９８）およびＲｅｕｂｉｎｏｆｆら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：３９９，２０００に記載の技術を使用してヒト胚盤胞細胞から調製することができる。ｈＥＳ細胞と等価な細胞型としては、その多能性誘導体（ＷＯ０１／５１６１０号（Ｂｒｅｓａｇｅｎ）に概説された原始外胚葉様（ＥＰＬ）細胞など）が挙げられる。
【０１５４】
あるいは、いくつかの実施形態では、ｈＥＳ細胞を、ヒト着床前胚から得ることができる。あるいは、体外受精（ＩＶＦ）胚を使用することができるか、一細胞ヒト胚を、胚盤胞期まで拡大増殖することができる（Ｂｏｎｇｓｏら，Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  ４：７０６，１９８９）。胚を、Ｇ１．２培地およびＧ２．２培地中で胚盤胞期まで培養する（Ｇａｒｄｎｅｒら，Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．６９：８４，１９９８）。プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ）への短時間の曝露によって発生した胚盤胞から透明帯を除去する。内部細胞塊を、免疫手術によって単離し、この免疫手術では、胚盤胞をウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清の１：５０希釈物に３０分間曝露し、次いで、ＤＭＥＭ中で５分間の洗浄を３回行い、モルモット補体の１：５希釈物（Ｇｉｂｃｏ）に３分間曝露する（Ｓｏｌｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７２：５０９９，１９７５）。ＤＭＥＭ中でのさらに２回の洗浄後、溶解された栄養外胚葉細胞を、穏やかなピペット操作によってインタクトな内部細胞塊（ＩＣＭ）から除去し、ＩＣＭをｍＥＦフィーダー層にプレーティングする。
【０１５５】
９〜１５日後、内部細胞塊由来派生物を、カルシウムおよびマグネシウムを含まない１ｍＭ  ＥＤＴＡ含有リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）への曝露、ディスパーゼまたはトリプシンへの曝露、またはマイクロピペットでの機械的解離のいずれかによってクランプ中に解離し；次いで、新鮮な培地を含むｍＥＦに再プレーティングする。形態が未分化の成長中のコロニーを、マイクロピペットによって個別に選択し、クランプ中に機械的に解離し、再プレーティングする。ＥＳ様形態は、見かけ上核対細胞質比が高く、かつ核小体が明らかな小型のコロニーとして特徴付けられる。次いで、得られたＥＳ細胞を、短時間のトリプシン処理、ダルベッコＰＢＳ（２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）への曝露、ＩＶ型コラゲナーゼ（約２００Ｕ／ｍＬ；Ｇｉｂｃｏ）への曝露、またはマイクロピペットによる各コロニーの選択によって、１〜２週間毎に規定通りに分割する。約５０〜１００細胞のクランプサイズが最適である。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、ヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞は、本明細書中に開示の方法で原始内胚葉細胞に分化させるために使用することができる多能性幹細胞である。ｈＥＧ細胞を、最終月経期から約８〜１１週間後に採取したヒト胎児材料中に存在する始原生殖細胞から調製することができる。適切な調製方法は、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６，１９９８および米国特許第６，０９０，６２２号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【０１５７】
簡潔に述べれば、生殖堤を処理して脱凝集細胞を形成させる。ＥＧ成長培地は、ＤＭＥＭ、４５００ｍｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース、２２００ｍｇ／Ｌ  ｍＭ  ＮａＨＣＯ３；１５％ＥＳ用ウシ胎児血清（ＢＲＬ）；２ｍＭグルタミン（ＢＲＬ）；１ｍＭピルビン酸ナトリム（ＢＲＬ）；１０００〜２０００Ｕ／ｍＬヒト組換え白血病抑制因子（ＬＩＦ、Ｇ酵素）；１〜２ｎｇ／ｍＬヒト組換えｂＦＧＦ（Ｇ酵素）；および１０μＭフォルスコリン（１０％ＤＭＳＯ中）である。９６ウェル組織培養プレートを、５０００ｒａｄのγ線照射で不活化したＬＩＦ、ｂＦＧＦ、またはフォルスコリンを含まない改変ＥＧ成長培地中で３日間培養したフィーダー細胞（例えば、ＳＴＯ細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５０３）のサブコンフルエント層を用いて調製し、約０．２ｍＬの初代生殖細胞（ＰＧＣ）懸濁液を各ウェルに添加する。７〜１０日後にＥＧ成長培地に第１継代（照射したＳＴＯマウス線維芽細胞を用いて事前に調製した２４ウェル培養ディッシュの１つのウェルに各ウェルを移す）を行う。細胞の形態がＥＧ細胞と一致するまで、典型的には、７〜３０日後または１〜４継代後まで、培地を毎日交換して細胞を培養する。
【０１５８】
一定の例では、幹細胞は、本明細書中に開示の方法にしたがった少なくとも１つの成熟因子への曝露前に未分化（例えば、特定の系譜に決定づけられていない細胞）であり得るのに対して、他の例では、本明細書中に記載の少なくとも１つの成熟因子（複数可）の曝露前に幹細胞が１またはそれを超える中間細胞型に分化することが望ましい場合がある。例えば、幹細胞は、胚または成体起源の分化細胞と区別するために使用することができる未分化細胞の形態学的、生物学的、または物理的な特徴を示し得る。いくつかの例では、未分化細胞は、二次元の顕微鏡的視野（two  dimensions  of  a  microscopic  view）中で、核対細胞質比が高く、かつ核小体が明らかな細胞のコロニー中に現われ得る。幹細胞は、幹細胞自体であり得るか（例えば、実質的にいかなる未分化細胞も存在しない）、分化細胞の存在下で使用され得る。一定の例では、幹細胞は、幹細胞が成長して必要に応じて分化することができるような適切な栄養素および必要に応じて他の細胞の存在下で培養され得る。例えば、胚線維芽細胞または線維芽細胞様細胞は、幹細胞の成長を補助するために培養物中に存在し得る。線維芽細胞は、幹細胞成長の一つの段階中に存在し得るが、全ての段階に必要ではない。例えば、線維芽細胞は、最初の培養段階の幹細胞培養物に添加してよいが、１またはそれを超えるその後の培養段階の幹細胞培養物に添加しなくてよい。
【０１５９】
本発明の全ての態様で使用される幹細胞は、任意の種類の組織（例えば、胎児組織もしくは胎児前組織などの胚組織または成体組織）由来の任意の細胞であり得、幹細胞は、異なる細胞型の子孫（例えば、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）のうちの少なくとも１つの全ての誘導物）を産生する適切な条件下で可能な特徴を有する。これらの細胞型は、樹立細胞系の形態で提供され得るか、これらの細胞型を初代胚組織から直接入手し、分化のために直ちに使用してよい。ＮＩＨ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙに列挙された細胞（例えば、ｈＥＳＢＧＮ−０１、ｈＥＳＢＧＮ−０２、ｈＥＳＢＧＮ−０３、ｈＥＳＢＧＮ−０４（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．）；ＨＥＳ−１、ＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、ＨＥＳ−４、ＨＥＳ−５、ＨＥＳ−６（ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；Ｍｉｚ−ｈＥＳ１（ＭｉｚＭｅｄｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ−Ｓｅｏｕｌ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；ＨＳＦ−１、ＨＳＦ−６（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｔ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）；およびＨ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ａｌｕｍｎｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）））が含まれる。いくつかの実施形態では、幹細胞由来細胞への化学的に誘導された分化のために使用されたヒト幹細胞または多能性幹細胞の供給源は、ヒト胚の破壊を伴わなかった。
【０１６０】
別の実施形態では、幹細胞を、固形組織が挙げられる組織から単離することができる。いくつかの実施形態では、組織は、皮膚、脂肪組織（例えば、脂肪の組織）、筋肉組織、心臓組織または心組織である。他の実施形態では、組織は、例えば、これらに制限されないが、臍帯血、胎盤、骨髄、または軟骨の組織である。
【０１６１】
目的の幹細胞としては、種々の型の胚細胞、例として、Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５に記載のヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞；他の霊長類由来の胚性幹細胞（アカゲザル幹細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７８４４）；マーモセット幹細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５５：２５４）；およびヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞（Ｓｈａｍｂｌｏｆｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６，１９９８）など）も挙げられる。系譜が決定された幹細胞（中胚葉幹細胞など）および他の初期心原性細胞も関心が寄せられている（Ｒｅｙｅｓら（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９８：２６１５−２６２５；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ＆Ｂａｄｅｒ（１９９６）Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．７８（２）：２０５−１６などを参照のこと）。幹細胞は、任意の哺乳動物種、例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、霊長類などから得ることができる。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の方法および組成物において使用される多能性細胞の供給源としてヒト胚を破壊しなかった。
【０１６２】
ＥＳ細胞は、特定の分化系譜に関係していないときは未分化であると見なされている。かかる細胞は、胚または成体起源の分化細胞と区別される形態学的特徴を示す。未分化のＥＳ細胞は、当業者によって容易に認識され、典型的には、二次元の顕微鏡的視野中で、核対細胞質比が高く、かつ核小体が明らかな細胞のコロニー中に現れる。未分化のＥＳ細胞は、未分化細胞の存在を検出するためのマーカーとして使用され得る遺伝子を発現し、そのポリペプチド産物は、陰性選択のマーカーとして使用され得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０２２４４１１Ａ１号；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ（２００４）Ｂｌｏｏｄ  １０３（８）：２９５６−６４；およびＴｈｏｍｓｏｎ（１９９８），前出（それぞれ、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。ヒトＥＳ細胞系は、未分化の非ヒト霊長類ＥＳおよびヒトＥＣ細胞を特徴づける細胞表面マーカー（ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、およびアルカリホスファターゼが含まれる）を発現する。ＳＳＥＡ−４エピトープを保有するグロボ系列糖脂質ＧＬ７は、ＳＳＥＡ−３エピトープを保有するグロボ系列糖脂質ＧｂＳへのシアル酸の付加によって形成される。したがって、ＧＬ７は、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４の両方に対する抗体と反応する。未分化のＥＳ細胞系は、ＳＳＥＡ−１で染色されなかったが、分化細胞はＳＳＥＡ−Ｉで強く染色された。未分化形態のｈＥＳ細胞を増殖させる方法は、ＷＯ９９／２０７４１号、ＷＯ０１／５１６１６号、およびＷＯ０３／０２０９２０号に記載されている。
【０１６３】
内皮細胞、筋肉、および／または神経幹細胞の適切な供給源由来の細胞の混合物を、当該分野で公知の方法によって哺乳動物ドナーから採取することができる。適切な供給源は造血微小環境である。例えば、好ましくは動員された（すなわち、リクルートされた）循環末梢血は、被験体から除去され得る。あるいは、骨髄は、哺乳動物（自家移植を受けたヒト患者など）から得てよい。いくつかの実施形態では、幹細胞を、米国特許第７，３９０，４８４号および同第７，４２９，４８８号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に開示のように、例えば、ＣｙｔｏｒｉのＣＥＬＵＴＩＯＮ（商標）ＳＹＳＴＥＭを使用して被験体の脂肪組織から得ることができる。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、ヒト臍帯血細胞（ＨＵＣＢＣ）は、本明細書中に開示の方法で有用である。ヒトＵＢＣ細胞は、造血前駆細胞および間葉系前駆細胞の豊富な供給源として認識されている（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒら，１９９２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４１０９−４１１３）。以前に、臍帯血および胎盤血は、乳児の出生時に通常は破棄される老廃物と見なされていた。臍帯血細胞は、移植可能な幹細胞および前駆細胞の供給源として、および悪性疾患（すなわち、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、および神経芽細胞腫（ｎｕｅｒｏｂｌａｓｔｏｍａ））および非悪性疾患（ファンコニー貧血および再生不良性貧血など）の処置のための骨髄再構築細胞の供給源として使用される（Ｋｏｈｌｉ−Ｋｕｍａｒら，１９９３  Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．８５：４１９−４２２；Ｗａｇｎｅｒら，１９９２  Ｂｌｏｏｄ  ７９；１８７４−１８８１；Ｌｕら，１９９６  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ  ２２：６１−７８；Ｌｕら，１９９５  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ４：４９３−５０３）。ＨＵＣＢＣの明白な利点は、これらの細胞が胎児細胞に酷似して免疫が未成熟であり、それにより、宿主による拒絶リスクが有意に軽減されることである（Ｔａｙｌｏｒ＆Ｂｒｙｓｏｎ，１９８５Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：１４９３−１４９７）。ヒト臍帯血は、間葉系前駆細胞および造血前駆細胞、ならびに内皮細胞前駆物質を含み、これらは、組織培養で拡大増殖させることができる（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒら，１９９２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４１０９−４１１３；Ｋｏｈｌｉ−Ｋｕｍａｒら，１９９３  Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．８５：４１９−４２２；Ｗａｇｎｅｒら，１９９２  Ｂｌｏｏｄ  ７９；１８７４−１８８１；Ｌｕら，１９９６  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ  ２２：６１−７８；Ｌｕら，１９９５  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ４：４９３−５０３；Ｔａｙｌｏｒ＆Ｂｒｙｓｏｎ，１９８５Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：１４９３−１４９７  Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ，１９９５  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ３５：６９４−７０２；Ｃｈｅｎら，２００１  Ｓｔｒｏｋｅ  ３２：２６８２−２６８８；Ｎｉｅｄａら，１９９７  Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ９８：７７５−７７７；Ｅｒｉｃｅｓら，２０００  Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  １０９：２３５−２４２）。臍帯血中の造血前駆細胞の総含有量は、骨髄に等しいか骨髄を超え、さらに、ＨＵＣＢＣ中の増殖性の高い造血細胞は骨髄中の８倍であり、ＣＤ１４、ＣＤ３４、およびＣＤ４５などの造血マーカーを発現する（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓら，２００１  Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒ．１７１：１０９−１１５；Ｂｉｃｋｎｅｓｅら，２００２  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １１：２６１−２６４；Ｌｕら，１９９３  Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７８：２０８９−２０９６）。
【０１６５】
別の実施形態では、多能性細胞は、造血微小環境（循環末梢血（好ましくは末梢血の単核画分に由来する）、臍帯血、骨髄、胎児肝臓、または哺乳動物の卵黄嚢など）に存在する細胞である。幹細胞、特に神経幹細胞はまた、中枢神経系（髄膜が挙げられる）に由来し得る。
【０１６６】
別の実施形態では、多能性細胞は、短時間のプロテアーゼ消化を使用してＥＳ細胞を採取し、未分化のヒトＥＳＣの小さなクランプを懸濁培養物中で成長させることによって形成される胚様体中に存在する。馴化培地の除去によって分化が誘導される。得られた胚様体を、半固体基板上にプレーティングする。分化細胞の形成は、約７日後から約４週間後に認められ得る。幹細胞のインビトロ培養由来の生存分化細胞を、胚様体または類似の構造物を部分的に解離して細胞凝集体を得ることによって選択する。目的の細胞を含む凝集体を、凝集体における細胞間の接触を実質的に維持する方法を使用して、表現型の特徴について選択する。
【０１６７】
別の実施形態では、幹細胞は、再プログラム化幹細胞（体細胞または分化細胞由来の幹細胞など）であり得る。かかる実施形態では、脱分化幹細胞は、例えば、制限されないが、新生物性細胞、腫瘍細胞、およびがん細胞、あるいは、誘導再プログラム化細胞（人工多能性幹細胞またはｉＰＳ細胞など）であり得る。
【０１６８】
クローニングおよび細胞培養
本明細書に記載される技術に使用され得る分子遺伝学および遺伝子工学の例示的な方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）の最新版に見られ得る。細胞生物学、タンパク質化学および抗体技術は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｌｉｇａｎら、ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｓ．Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏら、Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）およびＣｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｌｉｇａｎら、ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ．）に見られ得る。遺伝子操作のための例示的な試薬、クローニングベクターおよびキットは、例えば、ＢｉｏＲａｄ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎＴｅｃｈおよびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．から商業的に入手され得る。
【０１６９】
適切な細胞培養方法は、例えば、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ
ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）；Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｍ．Ａ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ＆Ｉ．Ｆ．Ｒａｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）およびＥｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｋ．Ｔｕｒｋｓｅｎ  ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ
Ｐｒｅｓｓ）の最新版に一般に記載される細胞培養方法に見られ得る。適切な組織培養供給品および試薬は、例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｎａｌｇｅｎｅ−Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．およびＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓから市販されている。
【０１７０】
多能性幹細胞は、当業者により、分化を促進せずに増殖を促進する培養条件を使用して、培養で連続的に増殖され得る。例示的な血清含有ＥＳ培地は、８０％ＤＭＥＭ（例えば、Ｋｎｏｃｋ−Ｏｕｔ  ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ）、２０％の規定の牛胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）または血清代替物（国際公開第９８／３０６７９号）のいずれか、１％非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノールで構成される。使用直前に、ヒトｂＦＧＦは４ｎｇ／ｍＬに添加される（国際公開第９９／２０７４１号、Ｇｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）。伝統的には、ＥＳ細胞は、フィーダー細胞、典型的には胚組織または胎児組織に由来する線維芽細胞の層上で培養される。
【０１７１】
Geronの科学者らは、多能性ＳＣが、フィーダー細胞を用いずに、未分化状態で維持され得ることを発見した。フィーダーフリー培養の環境は、適切な細胞基材、特に、細胞外マトリクス、例えばＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）またはラミニンを含む。典型的には、細胞が完全に分散する前（すなわち、コラゲナーゼＩＶで約５分）に、酵素消化を停止する。次いで、約１０個〜２，０００個の細胞の塊を、さらに分散させずに基材上に直接プレーティングする。
【０１７２】
フィーダーフリー培養は、分化することなく細胞の増殖を支持する因子を含む栄養培地によって支持される。かかる因子は、かかる因子を分泌する細胞（照射（約４，０００ｒａｄ）初代マウス胚線維芽細胞、テロメル化（telomerized）マウス線維芽細胞、またはｐＰＳ細胞由来の線維芽細胞様細胞など）と共に培地を培養することにより、培地に導入され得る。無血清培地（２０％血清代替物および４ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦを補充したＫＯ  ＤＭＥＭなど）中にてフィーダーを密度約５〜６×１０４ｃｍ−２でプレーティングすることによって培地を順化することができる。１〜２日間馴化させた培地にさらなるｂＦＧＦを補充し、その培地を使用して多能性ＳＣ培養物を１〜２日間支持する。フィーダーフリー培養方法の特徴は、ＷＯ０１／５１６１６号；およびＸｕら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：９７１，２００１でさらに考察されている。
【０１７３】
顕微鏡下で、ＥＳ細胞は、核対細胞質比が高く、核小体が明らかであり、あまり識別できない細胞間結合を有する小型のコロニーを形成する。霊長類ＥＳ細胞は、ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３および４、ならびにＴｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１と命名された抗体を使用して検出可能なマーカーを発現する（Ｔｈｏｍｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５，１９９８）。マウスＥＳ細胞を、ＳＳＥＡ−１の正の対照ならびにＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１の負の対照として使用することができる。ＳＳＥＡ−４は、ヒト胎児性癌（ｈＥＣ）細胞で一貫して提示される。インビトロで多能性ＳＣを分化させると、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１の発現が喪失され、ＳＳＥＡ−１（未分化のｈＥＧ細胞上にも見出される）の発現が増加する。
【０１７４】
幹細胞由来細胞の生成方法
本開示の態様は、幹細胞由来細胞（例えば、ＳＣ−β細胞、ＳＣ−ＥＣ細胞、ＳＣ−α細胞など）の生成に関する。一般に、少なくとも１つの幹細胞由来細胞またはその前駆物質（例えば、本明細書中に開示の方法にしたがって産生された膵臓前駆体）は、異なる細胞の混合物または組み合わせ（例えば、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆体、Ｐｄｘ１およびＮＫＸ６−１を共発現する膵臓前駆体、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆体、内分泌細胞（例えば、β様細胞、α様細胞、ＥＣ様細胞）、非内分泌細胞、および／または他の多能性細胞もしくは幹細胞などの細胞の混合物）を含むことができる。
【０１７５】
少なくとも１つの幹細胞由来細胞またはその前駆物質を、幹細胞または多能性細胞を所望の分化段階に分化させるための任意の適切な培養プロトコールにしたがって産生することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの幹細胞由来細胞またはその前駆物質は、少なくとも１つの多能性細胞を、ある期間少なくとも１つの多能性細胞が少なくとも１つの幹細胞由来細胞またはその前駆物質に分化するのに適切な条件下で培養することによって産生される。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの幹細胞由来細胞またはその前駆物質は、幹細胞由来細胞またはその前駆物質の実質的に純粋な集団である。いくつかの実施形態では、幹細胞由来細胞またはその前駆物質の集団は、多能性細胞または分化細胞の混合物（例えば、ＳＣ−β細胞とＳＣ−ＥＣ細胞の混合物）を含む。いくつかの実施形態では、ＳＣ−β細胞またはその前駆物質の集団は、胚性幹細胞または多能性細胞またはｉＰＳ細胞を実質的に含まないか欠いている。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、体細胞（例えば、線維芽細胞）を、被験体から、例えば、組織生検（例えば、皮膚生検など）として単離し、さらに分化するように人工多能性幹細胞に再プログラム化して、本明細書中に記載の組成物および方法で用いるための少なくとも１つの幹細胞由来細胞またはその前駆物質を産生することができる。いくつかの実施形態では、体細胞（例えば、線維芽細胞）は、当業者に公知の方法によって培養物中に維持され、いくつかの実施形態では、増殖（propagated）後、本明細書中に開示の方法によって幹細胞由来細胞に変換される。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの幹細胞由来細胞またはその前駆物質は、当業者に公知の方法によって培養物中に維持され、いくつかの実施形態では、増殖後、本明細書中に開示の方法によって幹細胞由来細胞に変換される。
【０１７９】
さらに、少なくとも１つの幹細胞由来細胞またはその前駆物質（例えば、膵臓前駆体）は、任意の哺乳動物種（非限定的な例には、マウス、ウシ、サル、ブタ、ウマ、ヒツジ、またはヒトの細胞が含まれる）に由来し得る。明確かつ簡潔にするために、本明細書中の方法の記載は、哺乳動物の少なくとも１つの幹細胞由来細胞またはその前駆物質を指すが、本明細書中に記載の方法の全てを少なくとも１つの幹細胞由来細胞またはその前駆物質の他の細胞型に容易に適用することができると理解すべきである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの幹細胞由来細胞またはその前駆物質は、ヒト個体に由来する。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、幹細胞由来細胞は、ＷＯ２０１５／００２７２４号およびＷＯ２０１４／２０１１６７号（その両方が本明細書中で参考として援用される）に開示の方法を使用して産生され得る。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、ＷＯ２０１５／００２７２４号およびＷＯ２０１４／２０１１６７号に開示の方法は、（例えば、ステージ３および４で）変更または修正される。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞は、集団中の少なくともいくつかの原始腸管細胞をＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞に分化させることによって、例えば、原始腸管細胞を、ｉ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤およびｉｉ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤と接触させて、少なくともいくつかの原始腸管細胞のＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞への分化を誘導することによって分化プロトコールのステージ３で得られ、ここで、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞はＰｄｘ１を発現する。他の実施形態では、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞を、集団中の少なくともいくつかの原始腸管細胞をＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞に分化させることによって、例えば、原始腸管細胞を、ｉ）ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子およびｉｉ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤と接触させて、少なくともいくつかの原始腸管細胞のＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞への分化を誘導することによって得ることができ、ここで、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞はＰｄｘ１を発現する。
【０１８２】
本開示は、原始腸管細胞をＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞に分化するように誘導する任意のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤の使用を企図する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤はＬＤＮ１９３１８９を含む。
【０１８３】
本開示は、原始腸管細胞をＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞に分化するように誘導するＦＧＦファミリー由来の任意の成長因子の使用を企図する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子は、角化細胞成長因子（ＫＧＦ）を含む。
【０１８４】
本開示は、原始腸管細胞をＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞に分化するように誘導する任意のＲＡシグナル伝達経路活性化剤の使用を企図する。いくつかの実施形態では、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤はレチノイン酸を含む。
【０１８５】
当業者は、剤（agent）の使用濃度が変動し得ることを認識する。いくつかの実施形態では、原始腸管細胞を、２０ｎＭ〜２０００ｎＭの間の濃度でＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、原始腸管細胞を、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、１１０ｎＭ、１２０ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭ、１５０ｎＭ、１６０ｎＭ、１７０ｎＭ、１８０ｎＭ、または１９０ｎＭの濃度でＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、原始腸管細胞を、１９１ｎＭ、１９２ｎＭ、１９３ｎＭ、１９４ｎＭ、１９５ｎＭ、１９６ｎＭ、１９７ｎＭ、１９８ｎＭ、または１９９ｎＭの濃度でＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、原始腸管細胞を、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１０００ｎＭ、１１００ｎＭ、１２００ｎＭ、１３００ｎＭ、１４００ｎＭ、１５００ｎＭ、１６００ｎＭ、１７００ｎＭ、１８００ｎＭ、または１９００ｎＭの濃度でＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、原始腸管細胞を、２１０ｎＭ、２２０ｎＭ、２３０ｎＭ、２４０ｎＭ、２５０ｎＭ、２６０ｎＭ、２７０ｎＭ、２８０ｎＭ、または２９０ｎＭの濃度でＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、原始腸管細胞を、２００ｎＭの濃度でＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と接触させる。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、原始腸管細胞を、５ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬの間の濃度でＦＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子と接触させる。いくつかの実施形態では、原始腸管細胞を、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、または４０ｎｇ／ｍＬの濃度でＦＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子と接触させる。いくつかの実施形態では、原始腸管細胞を、６０ｎｇ／ｍＬ、６５ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、８５ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、９５ｎｇ／ｍＬ、または１００ｎｇ／ｍＬの濃度でＦＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子と接触させる。いくつかの実施形態では、原始腸管細胞を、４１ｎｇ／ｍＬ、４２ｎｇ／ｍＬ、４３ｎｇ／ｍＬ、４４ｎｇ／ｍＬ、４５ｎｇ／ｍＬ、４６ｎｇ／ｍＬ、４７ｎｇ／ｍＬ、４８ｎｇ／ｍＬ、または４９ｎｇ／ｍＬの濃度でＦＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子と接触させる。いくつかの実施形態では、原始腸管細胞を、５１ｎｇ／ｍＬ、５２ｎｇ／ｍＬ、５３ｎｇ／ｍＬ、５４ｎｇ／ｍＬ、５５ｎｇ／ｍＬ、５６ｎｇ／ｍＬ、５７ｎｇ／ｍＬ、５８ｎｇ／ｍＬ、または５９ｎｇ／ｍＬの濃度でＦＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子と接触させる。いくつかの実施形態では、原始腸管細胞を、５０ｎｇ／ｍＬの濃度でＦＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子と接触させる。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、原始腸管細胞を、０．０１μＭ〜１．０μＭの間の濃度でＲＡシグナル伝達経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、原始腸管細胞を、０．０２μＭ、０．０３μＭ、０．０４μＭ、０．０５μＭ、０．０６μＭ、０．０７μＭ、０．０８μＭ、または０．０９μＭの濃度でＲＡシグナル伝達経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、原始腸管細胞を、０．２０μＭ、０．３０μＭ、０．４０μＭ、０．５０μＭ、０．６０μＭ、０．７０μＭ、０．８０μＭ、または０．９０μＭの濃度でＲＡシグナル伝達経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、原始腸管細胞を、０．１μＭの濃度でＲＡシグナル伝達経路活性化剤と接触させる。
【０１８８】
一般に、原始腸管細胞は、適切な培養培地（例えば、懸濁培養物）中で、少なくともいくつかの原始腸管細胞のＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞への分化を誘導するのに十分な期間維持される。例示的な適切な培養培地を、以下の表１に示す。
【表１】
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【０１８９】
いくつかの実施形態では、Ｓ３培地を、原始腸管細胞の膵臓前駆細胞への分化に適切な培養培地として使用することができる。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、懸濁培養物中で原始腸管細胞を接触させる。いくつかの実施形態では、懸濁培養物を、スピナーフラスコ中で維持する。いくつかの実施形態では、期間は少なくとも２日間である。いくつかの実施形態では、懸濁培養物を毎日補充する。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞を、集団中の少なくともいくつかの原始腸管細胞をＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞に分化させることによって、例えば、原始腸管細胞を、ｉ）ＬＤＮ１９３１８９およびｉｉ）ＲＡと接触させて、少なくともいくつかの原始腸管細胞のＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞への分化を誘導することによって得ることができ、ここで、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞はＰｄｘ１を発現する。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞を、集団中の少なくともいくつかの原始腸管細胞をＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞に分化させることによって、例えば、原始腸管細胞を、ｉ）ＫＧＦおよびｉｉ）ＲＡと接触させて、少なくともいくつかの原始腸管細胞のＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞への分化を誘導することによって得ることができ、ここで、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞はＰｄｘ１を発現する。Ｐｄｘ１＋
【０１９３】
いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、集団中の少なくともいくつかのＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞をＰｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞に分化させることによって、例えば、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞を、ｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリー由来の少なくとも１つの成長因子と接触させて、集団中の少なくともいくつかのＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞のＰｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞への分化を誘導することによって分化プロトコールのステージ４で得ることができ、ここで、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞は少なくともＮＫＸ６−１を発現する。他の実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、集団中の少なくともいくつかのＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞をＮＫＸ６−１陽性膵臓前駆細胞に分化させることによって、例えば、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞を、ｉ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤およびｉｉ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤と接触させて、集団中の少なくともいくつかのＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞のＰｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞への分化を誘導することによって得ることができ、ここで、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞は少なくともＮＫＸ６−１を発現する。
【０１９４】
本開示は、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞をＰｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞に分化するように誘導するＦＧＦファミリー由来の任意の成長因子の使用を企図する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子は、角化細胞成長因子（ＫＧＦ）を含む。
【０１９５】
本開示は、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞をＰｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞に分化するように誘導する任意のＲＡシグナル伝達経路活性化剤の使用を企図する。いくつかの実施形態では、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤はレチノイン酸を含む。
【０１９６】
本開示は、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞をＰｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞に分化するように誘導する任意のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤の使用を企図する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤はＬＤＮ１９３１８９を含む。
【０１９７】
当業者は、剤（例えば、成長因子）の使用濃度が変動し得ることを認識する。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞を、１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの間の濃度でＦＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞を、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、または４０ｎｇ／ｍＬの濃度でＦＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞を、６０ｎｇ／ｍＬ、６５ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、８５ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、９５ｎｇ／ｍＬ、または１００ｎｇ／ｍＬの濃度でＦＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞を、４１ｎｇ／ｍＬ、４２ｎｇ／ｍＬ、４３ｎｇ／ｍＬ、４４ｎｇ／ｍＬ、４５ｎｇ／ｍＬ、４６ｎｇ／ｍＬ、４７ｎｇ／ｍＬ、４８ｎｇ／ｍＬ、または４９ｎｇ／ｍＬの濃度でＦＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞を、５１ｎｇ／ｍＬ、５２ｎｇ／ｍＬ、５３ｎｇ／ｍＬ、５４ｎｇ／ｍＬ、５５ｎｇ／ｍＬ、５６ｎｇ／ｍＬ、５７ｎｇ／ｍＬ、５８ｎｇ／ｍＬ、または５９ｎｇ／ｍＬの濃度でＦＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞を、５０ｎｇ／ｍＬの濃度でＦＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子と接触させる。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞を、０．０１μＭ〜１．０μＭの間の濃度でＲＡシグナル伝達経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞を、０．０２μＭ、０．０３μＭ、０．０４μＭ、０．０５μＭ、０．０６μＭ、０．０７μＭ、０．０８μＭ、または０．０９μＭの濃度でＲＡシグナル伝達経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞を、０．２０μＭ、０．３０μＭ、０．４０μＭ、０．５０μＭ、０．６０μＭ、０．７０μＭ、０．８０μＭ、または０．９０μＭの濃度でＲＡシグナル伝達経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞を、０．１μＭの濃度でＲＡシグナル伝達経路活性化剤と接触させる。
【０１９９】
一般に、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞は、適切な培養培地中で、集団中の少なくともいくつかのＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞のＰｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞への分化を誘導するのに十分な期間維持される。例示的な適切な培養培地を、上記の表１に示す。いくつかの実施形態では、細胞クラスタリングを促進する条件は、懸濁培養物を含む。いくつかの実施形態では、懸濁培養物を、スピナーフラスコ中で維持する。いくつかの実施形態では、期間は少なくとも５日間である。いくつかの実施形態では、懸濁培養物を一日おきに補充する。いくつかの実施形態では、成熟因子を一日おきに補充する。
【０２００】
いくつかの実施形態では、集団中の少なくとも１０％のＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞を、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞に分化するように誘導する。いくつかの実施形態では、少なくとも９５％のＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞を、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞に分化するように誘導する。
【０２０１】
一般に、任意のＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞を、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞に分化させることができる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞は、Ｐｄｘ１、ＮＫＸ６−１、および／またはＦｏｘＡ２を発現する。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞は、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞を、細胞クラスタリングを促進する条件下で、ｉ）ＫＧＦと接触させて、少なくともいくつかのＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞のＰｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞への分化を誘導することによって得られ、ここで、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞は、少なくともＰｄｘ１およびＮＫＸ６−１を発現する。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞は、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞を、細胞クラスタリングを促進する条件下で、ｉ）ＲＡおよびｉｉ）ＬＤＮ１９３１８９と接触させて、少なくともいくつかのＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞のＰｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞への分化を誘導することによって得られ、ここで、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞は、少なくともＰｄｘ１およびＮＫＸ６−１を発現する。
【０２０４】
いくつかの態様では、（例えば、分化プロトコールのステージ５中に）Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞から内分泌細胞を産生する方法は、（例えば、細胞クラスタリングを促進する条件下で）Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を含む細胞の集団を、ｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤およびｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤を含む少なくとも２つの成熟因子と接触させて、集団中の少なくとも１つのＰｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を内分泌細胞に誘導する、接触させる工程を含む。
【０２０５】
本開示は、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞の内分泌細胞への分化を誘導する任意のＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤の使用を企図する。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、ＴＧＦ−β受容体タイプＩキナーゼシグナル伝達を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤はＡｌｋ５阻害剤ＩＩを含む。
【０２０６】
本開示は、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞の内分泌細胞への分化を誘導する任意の甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤の使用を企図する。いくつかの実施形態では、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、トリヨードサイロニン（Ｔ３）を含む。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、方法は、細胞の集団（例えば、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞）を、少なくとも１つのさらなる成熟因子と接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、Ｐｄｘ１＋ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ−セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリー由来の少なくとも１つの成長因子、またはｖ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤のうちの少なくとも１つと接触させる工程を含む。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのさらなる成熟因子はγ−セクレターゼ阻害剤を含む。本開示は、集団中のＰｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞の内分泌細胞への分化を誘導することができる任意のγ−セクレターゼ阻害剤の使用を企図する。いくつかの実施形態では、γ−セクレターゼ阻害剤はＸＸＩを含む。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのさらなる成熟因子は、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤（例えば、低濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤）を含む。本開示は、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞の内分泌細胞への分化を誘導する任意のＲＡシグナル伝達経路活性化剤の使用を企図する。いくつかの実施形態では、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤はＲＡを含む。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのさらなる成熟因子は、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤を含む。本開示は、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞の内分泌細胞への分化を誘導する任意のＳＨＨ経路阻害剤の使用を企図する。いくつかの実施形態では、ＳＨＨ経路阻害剤はＳａｎｔ１を含む。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのさらなる成熟因子は、ＥＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子を含む。本開示は、集団中のＰｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞の内分泌細胞への分化を誘導することができるＥＧＦファミリー由来の任意の成長因子の使用を企図する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子は、ベータセルリンを含む。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのさらなる成熟因子は、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤を含む。本開示は、集団中のＰｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞の内分泌細胞への分化を誘導することができるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤の使用を企図する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤はＬＤＮ１９３１８９を含む。
【０２１３】
当業者は、剤の使用濃度が変動し得ることを認識する。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、１００ｎＭ〜１００μＭの間の濃度で少なくとも１つのＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、１０μＭの濃度で少なくとも１つのＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、または９００ｎＭの濃度で少なくとも１つのＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、または９μＭの濃度で少なくとも１つのＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、９．１μＭ、９．２μＭ、９．３μＭ、９．４μＭ、９．５μＭ、９．６μＭ、９．７μＭ、９．８μＭ、または９．９μＭの濃度で少なくとも１つのＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、または１９μＭの濃度で少なくとも１つのＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、１０．１μＭ、１０．２μＭ、１０．３μＭ、１０．４μＭ、１０．５μＭ、１０．６μＭ、１０．７μＭ、１０．８μＭ、または１０．９μＭの濃度で少なくとも１つのＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、０．１μＭ〜１０μＭの間の濃度で甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、１μＭの濃度で甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、または０．９μＭの濃度で甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、１．１μＭ、１．２μＭ、１．３μＭ、１．４μＭ、１．５μＭ、１．６μＭ、１．７μＭ、１．８μＭ、または１．９μＭの濃度で甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、または９μＭの濃度で甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と接触させる。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、０．１μＭ〜１０μＭの間の濃度でγ−セクレターゼ阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、１μＭの濃度でγ−セクレターゼ阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、または０．９μＭの濃度でγ−セクレターゼ阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、１．１μＭ、１．２μＭ、１．３μＭ、１．４μＭ、１．５μＭ、１．６μＭ、１．７μＭ、１．８μＭ、または１．９μＭの濃度でγ−セクレターゼ阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、または９μＭの濃度でγ−セクレターゼ阻害剤と接触させる。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、２ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬの間の濃度でＥＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１１ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、１３ｎｇ／ｍＬ、１４ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１６ｎｇ／ｍＬ、１７ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、または１９ｎｇ／ｍＬの濃度でＥＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、３０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、４５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、５５ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、６５ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、８５ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、９５ｎｇ／ｍＬ、または１００ｎｇ／ｍＬの濃度でＥＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、２１ｎｇ／ｍＬ、２２ｎｇ／ｍＬ、２３ｎｇ／ｍＬ、２４ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、２６ｎｇ／ｍＬ、２７ｎｇ／ｍＬ、２８ｎｇ／ｍＬ、または２９ｎｇ／ｍＬの濃度でＥＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、２０ｎｇ／ｍＬの濃度でＥＧＦファミリー由来の少なくとも１つの成長因子と接触させる。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、０．０１μＭ〜１．０μＭの間の濃度でＲＡシグナル伝達経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、０．０２μＭ、０．０３μＭ、０．０４μＭ、０．０５μＭ、０．０６μＭ、０．０７μＭ、０．０８μＭ、または０．０９μＭの濃度でＲＡシグナル伝達経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、０．２０μＭ、０．３０μＭ、０．４０μＭ、０．５０μＭ、０．６０μＭ、０．７０μＭ、０．８０μＭ、または０．９０μＭの濃度でＲＡシグナル伝達経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、０．１μＭの濃度でＲＡシグナル伝達経路活性化剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、低濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤と接触させる。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、０．１μＭと０．５μＭとの間の濃度で少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、０．１１μＭ、０．１２μＭ、０．１３μＭ、０．１４μＭ、０．１５μＭ、０．１６μＭ、０．１７μＭ、０．１８μＭ、０．１９μＭ、０．２μＭ、０．２１μＭ、０．２２μＭ、０．２３μＭ、または０．２４μＭの濃度で少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、０．２６μＭ、０．２７μＭ、０．２８μＭ、０．２９μＭ、０．３０μＭ、０．３１μＭ、０．３２μＭ、０．３３μＭ、０．３４μＭ、０．３５μＭ、０．３６μＭ、０．３７μＭ、０．３８μＭ、０．３９μＭ、０．４０μＭ、０．４１μＭ、０．４２μＭ、０．４３μＭ、０．４４μＭ、０．４５μＭ、０．４６μＭ、０．４７μＭ、０．４８μＭ、または０．４９μＭの濃度で少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤と接触させる。いくつかの実施形態では、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、０．２５μＭの濃度で少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤と接触させる。
【０２２０】
一般に、細胞の集団は、適切な培養培地中で、集団中のＰｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞のうちの少なくとも１つの内分泌細胞への分化を誘導するのに十分な期間維持される。例示的な培養培地を、表２に示す。
【表２】
2021522819.tif 000004
【０２２１】
いくつかの実施形態では、ＢＥ５培地を、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞の内分泌細胞への分化に適切な培養培地として使用することができる。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、細胞クラスタリングを促進する条件は、懸濁培養物を含む。いくつかの実施形態では、期間は少なくとも５日間である。いくつかの実施形態では、期間は、５日間と７日間との間である。いくつかの実施形態では、期間は少なくとも７日間である。いくつかの実施形態では、懸濁培養物を（例えば、成熟因子で）毎日補充する。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、集団中の少なくとも１５％のＰｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、内分泌細胞に分化するように誘導する。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、集団中の少なくとも５０％のＰｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、内分泌細胞に分化するように誘導する。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、集団中の少なくとも９９％のＰｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を、内分泌細胞に分化するように誘導する。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、３つのクラスのＣＨＧＡ＋内分泌細胞は、分化プロトコールのステージ５および／またはステージ６で形成される。３つのクラスのＣＨＧＡ＋内分泌細胞は、ＳＣ−β細胞、ＳＣ−α細胞、およびＳＣ−ＥＣ細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、非内分泌細胞（例えば、ＳＯＸ９＋非内分泌細胞）は、分化プロトコールのステージ５および／またはステージ６で形成される。
【０２２７】
本開示のいくつかの態様では、分化プロトコールのステージ５中に形成される内分泌細胞は、ＳＣ−β細胞に似ている。いくつかの実施形態では、内分泌細胞は、以下のうちの少なくとも１つを発現する：ベータ細胞マーカーのうちで特に、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１、およびＩＳＬ１。いくつかの態様では、内分泌細胞は、ＳＣ−β細胞に成熟し得るインスリン陽性内分泌細胞である。いくつかの実施形態では、ＳＣ−β細胞は、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１、ＩＳＬ１、ＰＡＸ４、およびＰＤＸ１を発現する。
【０２２８】
本開示のいくつかの態様では、分化プロトコールのステージ５中に形成される内分泌細胞は、ＳＣ−ＥＣ細胞に似ている。いくつかの実施形態では、内分泌細胞は、以下のうちの少なくとも１つを発現する：ＣＨＧＡ、ＴＰＨ１、ＬＭＸ１Ａ、およびＳＬＣ１８Ａ１。いくつかの実施形態では、ＳＣ−ＥＣ細胞は、ＴＰＨ１、ＬＭＸ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ１、およびＦＥＶを発現する。いくつかの実施形態では、ＳＣ−ＥＣ細胞は、ＩＮＳおよびＰＤＸ１を発現しない。
【０２２９】
本開示のいくつかの態様では、分化プロトコールのステージ５中に形成される内分泌細胞は、アルファ様細胞（例えば、多ホルモン性細胞）に似ている。いくつかの実施形態では、内分泌細胞は、以下のうちの少なくとも１つを発現する：ＧＣＧ、ＡＲＸ、ＩＲＸ２、およびＩＮＳ。いくつかの実施形態では、ＳＣ−α細胞は、ＧＣＧ、ＡＲＸ、ＩＲＸ２、ＣＤ３６、およびＩＳＬ１を発現する。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、幹細胞由来細胞を、例示的な適切な培養培地中で内分泌細胞を培養することによって分化プロトコールのステージ６で得ることができる。いくつかの実施形態では、Ｓ３培地を、内分泌細胞を幹細胞由来細胞に成熟させるのに適切な培養培地として使用することができる。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、内分泌細胞を、例示的な適切な培養培地中で、ｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、およびｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤を含む少なくとも２つの成熟因子と培養して、集団中の少なくとも１つの内分泌細胞の幹細胞由来細胞への分化または成熟を誘導することによって、幹細胞由来細胞を分化プロトコールのステージ６で得ることができる。いくつかの実施形態では、ＣＭＲＬＳ培地を、内分泌細胞を幹細胞由来細胞に成熟させるのに適切な培養培地として使用することができる。いくつかの態様では、ＣＭＲＬＳ培地に１０％ＦＢＳを補充する。
【０２３２】
本開示は、幹細胞由来細胞に成熟させるための内分泌細胞の分化を誘導する任意のＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤の使用を企図する。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、ＴＧＦ−β受容体タイプＩキナーゼシグナル伝達を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤はＡｌｋ５阻害剤ＩＩを含む。
【０２３３】
本開示は、幹細胞由来細胞に成熟させるための内分泌細胞の分化を誘導する任意の甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤の使用を企図する。いくつかの実施形態では、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、トリヨードサイロニン（Ｔ３）を含む。
【０２３４】
本開示のいくつかの態様では、幹細胞由来細胞は、１）原始腸管細胞をＲＡおよびＫＧＦと接触させて、少なくともいくつかの原始腸管細胞のＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞への分化を誘導すること；２）Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞をＫＧＦと接触させて、少なくともいくつかのＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞のＰｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞への分化を誘導すること；３）Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞をＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ、Ｔ３、ＲＡ、ＳＡＮＴ１、およびベータセルリンと接触させて、少なくともいくつかのＰｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞の内分泌細胞への分化を誘導すること；および内分泌細胞をＡｌｋ５ｉおよびＴ３と接触させて、少なくともいくつかの内分泌細胞の幹細胞由来細胞への分化を誘導することによって得られる。
【０２３５】
本開示のいくつかの態様では、幹細胞由来細胞は、１）原始腸管細胞をＲＡおよびＬＤＮ１９３１８９と接触させて、少なくともいくつかの原始腸管細胞のＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞への分化を誘導すること；２）Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞をＲＡおよびＬＤＮ１９３１８９と接触させて、少なくともいくつかのＰｄｘ１＋膵臓前駆細胞のＰｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞への分化を誘導すること；３）Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞をＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ、Ｔ３、ＲＡ、ＳＡＮＴ１、およびベータセルリンと接触させて、少なくともいくつかのＰｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞の内分泌細胞への分化を誘導すること；および内分泌細胞をＡｌｋ５ｉおよびＴ３と接触させて、少なくともいくつかの内分泌細胞の幹細胞由来細胞への分化を誘導することによって得られる。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、幹細胞由来細胞を、解離（例えば、酵素的解離）を使用して精製し、その後に再凝集させる。いくつかの態様では、細胞を、ステージ５後に酵素的に解離させる。いくつかの実施形態では、再凝集させると、幹細胞由来膵島内の類似の細胞の領域内に内分泌細胞集団が区画化される。いくつかの実施形態では、分化細胞の集団は、特定の型の幹細胞由来細胞（例えば、ＳＣ−β細胞、ＳＣ−α細胞、またはＳＣ−ＥＣ細胞）が富化される。
【０２３７】
分化プロトコールのステージの転写プロファイリング
本開示のいくつかの態様では、シングルセルシーケンシング（例えば、高処理シングルセルＲＮＡシーケンシング）を使用して、インビトロ分化プロトコール（例えば、インビトロベータ細胞分化プロトコール）を使用して産生した全細胞集団の完全なトランスクリプトームを詳細に特徴づける。いくつかの実施形態では、特定の遺伝子は、富化している細胞の単一集団または細胞の組み合わせとして同定される。いくつかの態様では、シングルセルシーケンシングを、インビトロ分化プロトコールの全段階で実施する。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、ステージ３の終了時から分化プロトコールのステージ６の終了時までのシーケンシングを行う（例えば、ベータ細胞分化プロトコール）。いくつかの態様では、個別の細胞集団を異なるステージで同定する。例えば、前駆体をステージ３および４で同定し；３つのタイプの内分泌細胞をステージ４、５、および６で同定し；１つのタイプの非内分泌細胞をステージ５および６で同定する。
【０２３９】
いくつかの態様では、分化プロトコールのステージ３で同定された前駆体は、複製している膵臓前駆体（例えば、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆体）である。いくつかの態様では、分化プロトコールのステージ４で同定された前駆体は、Ｐｄｘ１＋、ＮＫＸ６−１膵臓前駆体を含む。いくつかの態様では、分化プロトコールのステージ４で同定された内分泌細胞は、アルファ様細胞（例えば、ＳＣ−アルファ細胞）である。いくつかの態様では、分化プロトコールのステージ５および６で同定された内分泌細胞は、ＣＨＧＡ＋内分泌細胞である。一定の態様では、ＣＨＧＡ＋内分泌細胞としては、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１、ＩＳＬ１、および他のベータ細胞マーカーを発現するＳＣ−ベータ細胞；ＧＣＧ、ＡＲＸ、ＩＲＸ２、およびＩＮＳを発現するアルファ様細胞；およびＣＨＧＡ、ＴＰＨ１、ＬＭＸ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ１を発現するＳＣ−ＥＣ細胞が挙げられる。いくつかの態様では、分化プロトコールのステージ５および６で同定された非内分泌細胞は、ＳＯＸ９＋非内分泌細胞である。いくつかの実施形態では、分化プロトコールにより細胞の亜集団が産生され、この亜集団としては、以下が挙げられる：ステージ４、５、および６のＳＳＴ＋／ＨＨＥＸ＋細胞；ステージ５および６のＦＯＸＪ１＋細胞；ステージ５のＦＥＶ＋／ＰＡＸ４＋細胞；ステージ５および６のＰＨＯＸ２Ａ＋細胞；ステージ６のＧＡＰ４３＋細胞；およびステージ６のＯＮＥＣＵＴ３＋細胞。
【０２４０】
本開示のいくつかの態様では、分化プロトコールの終了時に（例えば、ステージ６後）、クラスターが形成される。いくつかの実施形態では、クラスターは、１またはそれを超える細胞型を含む。いくつかの態様では、クラスターをスクリーニングして、クラスター内に含まれる種々の細胞を同定する。いくつかの実施形態では、クラスターを、シングルセルシーケンシング（例えば、高処理シングルセルＲＮＡシーケンシング）を使用してスクリーニングして、クラスター内に存在する細胞を同定する。いくつかの態様では、クラスターは、１またはそれを超えるＳＣ−β細胞、多ホルモン性細胞（例えば、ＳＣ−α細胞）、およびＳＣ−ＥＣ細胞を含む。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、異なる時点（例えば、ステージ３、ステージ４、ステージ５、またはステージ６）での細胞（例えば、ＳＣ−β細胞、ＳＣ−α細胞、ＳＣ−ＥＣ細胞など）の各集団のＲＮＡシーケンシングの結果を使用して、各々の集団内の発現が富化された遺伝子を同定する。いくつかの実施形態では、個別の集団中の各細胞についての富化スコアを計算する。例えば、富化スコアを計算して、分化中の特定の時点で所与の集団が特異的に富化された遺伝子を同定することができる。富化スコアは、所与のクラスターの一部である全ての細胞をクラスター内に存在しない全ての細胞と比較することによって発現レベルおよび遺伝子を発現する細胞の数を比較する。遺伝子富化を計算する方法は、Ｚｅｉｓｅｌら（Ｃｅｌｌ  ２０１８）（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。例えば、遺伝子ｉおよびクラスターｊの富化スコア（Ｅｉ，ｊ）は、以下のように計算する：
【数１】
2021522819.tif 000005
（式中、ｆｉ，ｊは、クラスター中の非ゼロ発現値の分数値であり、ｆｉ，ｊは、クラスター中に存在しない細胞の非ゼロ発現値の分数値である）。同様に、ｉｉ，ｊは、クラスター中の平均発現であり、ｉｉ，ｊは、クラスター中に存在しない細胞の平均発現である。平均または非ゼロ分数値がゼロに向かうにつれて富化スコアが無限大に向かうのを回避するために、小さな定数ε１＝０．１およびε２＝０．０１を加えている。富化スコアの計算後、各集団についてのトップの遺伝子および転写因子が同定され得る。いくつかの実施形態では、各集団についての富化スコアが最高のトップ１０、１５、２０、２５、３０、または３５（全体）遺伝子を選択する。いくつかの実施形態では、各集団についての富化スコアが最高のトップ５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の転写因子を選択する。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、分化プロトコールのステージ５のＳＣ−β細胞は、ＮＰＴＸ２、ＳＬＣ３０Ａ８、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＥＰＡＳ１、ＴＭＣＣ３、ＣＡＬＢ２、ＰＣＤＨ７、ＣＨＯＤＬ、ＮＥＦＭ、ＩＴＧＡ１、ＣＸＣＬ１２、ＩＳＬ１、Ｇ６ＰＣ２、ＥＲＯ１Ｂ、ＳＬＣ１７Ａ６、ＰＣＰ４、ＰＬＸＮＡ２、ＧＡＰ４３、ＲＡＢ２９、ＡＳＰＨ、ＩＮＳ、ＮＥＦＬ、ＳＹＮＰＯ、ＶＬＤＬＲ、およびＬＲＦＮ２からなる群より選択される１またはそれを超える富化された遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、分化プロトコールのステージ５のＳＣ−β細胞は、ＥＰＡＳ１、ＩＳＬ１、ＯＴＰ、ＭＡＦＡ、ＮＲ３Ｃ１、ＥＢＦ１、ＴＳＨＺ１、ＭＡＦＢ、ＦＯＸＯ１、およびＰＡＸ６からなる群より選択される１またはそれを超える富化された転写因子を含む。いくつかの実施形態では、分化プロトコールのステージ６のＳＣ−β細胞は、ＩＡＰＰ、ＰＣＤＨ７、ＰＣＰ４、ＡＳＢ９、ＮＥＦＭ、ＮＰＴＸ２、ＰＲＰＨ、ＴＢＸ３、ＩＴＧＡ１、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＩＮＳ、ＥＲＯ１Ｂ、ＣＡＬＢ２、Ｇ６ＰＣ２、ＢＡＣＥ２、ＣＣＳＥＲ１、ＥＤＡＲＡＤＤ、ＰＬＸＮＡ２、ＥＰＡＳ１、ＬＺＴＳ１、ＥＲＭＮ、ＴＭＥＭ１９６、ＣＲＴＡＣ１、ＬＲＦＮ２、およびＮＴＮＧ２からなる群より選択される１またはそれを超える富化された遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、分化プロトコールのステージ６のＳＣ−β細胞は、ＴＢＸ３、ＥＰＡＳ１、ＩＳＬ１、ＨＯＰＸ、ＰＡＸ４、ＰＤＸ１、ＲＸＲＧ、ＢＮＣ２、ＰＯＵ２Ｆ２、およびＯＮＥＣＵＴ２からなる群より選択される１またはそれを超える富化された転写因子を含む。いくつかの実施形態では、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＩＳＬ１、ＥＲＯ１Ｂ、およびＰＡＸ４のうちの少なくとも１つを発現するＳＣ−β細胞が同定される。いくつかの態様では、ＳＣ−β細胞は、ＩＳＬ１およびＥＲＯ１Ｂを発現する。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、分化プロトコールのステージ５のＳＣ−α細胞は、ＡＲＸ、ＧＣＧ、ＰＹＹ、ＴＴＲ、ＰＰＹ、ＡＧＴ、ＤＰＰ４、ＨＭＰ１９、ＴＭＥＭ２３６、Ｃ２ＣＤ４Ｂ、ＳＬＣ７Ａ１４、ＮＰＷ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＧＡＳＴ、ＡＫＡＰ１２、ＵＣＮ３、ＦＲＲＳ１Ｌ、ＱＰＣＴ、ＶＡＴ１Ｌ、ＩＳＬ１、Ｃ２ＣＤ４Ａ、ＩＲＸ２、ＰＬＰＰＲ５、ＩＲＸ１、およびＥＴＶ１からなる群より選択される１またはそれを超える富化された遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、分化プロトコールのステージ５のＳＣ−α細胞は、ＡＲＸ、ＩＳＬ１、ＩＲＸ２、ＩＲＸ１、ＥＴＶ１、ＰＡＸ６、ＬＨＸ１、ＪＵＮＢ、ＰＯＵ３Ｆ２、およびＨＯＸＢ２からなる群より選択される１またはそれを超える富化された転写因子を含む。いくつかの実施形態では、分化プロトコールのステージ６のＳＣ−α細胞は、ＡＲＸ、ＧＣＧ、ＤＰＰ４、ＰＰＹ、ＩＱＧＡＰ２、ＡＧＴ、セルピンＤ１、ＧＣ、ＰＹＹ、セルピンＥ２、ＨＭＰ１９、ＴＭＥＭ４５Ｂ、ＣＲＨ、ＥＴＶ１、ＬＯＸＬ４、セルピンＩ１、ＶＩＭ、Ｃ５ｏｒｆ３８、ＧＲＩＮ３Ａ、ＳＰＴＳＳＢ、ＳＳＴＲ２、ＬＤＢ２、ＴＭＥＭ２３６、ＢＴＢＤ１１、およびＬＰＡＲ１からなる群より選択される１またはそれを超える富化された遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、分化プロトコールのステージ６のＳＣ−α細胞は、ＡＲＸ、ＥＴＶ１、ＩＲＸ１、ＪＵＮＢ、ＩＲＸ２、ＰＯＵ６Ｆ２、ＧＬＩ３、ＰＯＵ３Ｆ２、ＦＯＳＢ、およびＥＧＲ４からなる群より選択される１またはそれを超える富化された転写因子を含む。いくつかの実施形態では、ＧＣＧ、ＡＲＸ、ＩＲＸ２、ＣＤ３６、およびＩＳＬ１のうちの少なくとも１つを発現するＳＣ−α細胞が同定される。いくつかの態様では、ＳＣ−α細胞は、ＡＲＸ、ＧＣＧ、およびＩＲＸ２を発現する。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、分化プロトコールのステージ５のＳＣ−ＥＣ細胞は、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＢＬＮ１、ＴＰＨ１、ＳＴＣ１、ＡＤＲＡ２Ａ、ＭＭＥ、Ｂ３ＧＡＴ１、ＣＲＹＢＡ２、ＤＮＡＪＣ１２、ＭＧＬＬ、ＰＴＨＬＨ、ＰＲＰＳ２、ＧＤＦ６、ＺＰＬＤ１、ＯＶＯＳ２、ＦＡＢＰ３、ＣＮＴＮＡＰ２、ＰＡＬＭ２、ＮＥＵＲＯＤ４、ＦＸＹＤ２、ＩＦＩ６、ＳＬＣ１８Ａ１、ＲＡＳＧＲＰ１、ＬＭＸ１Ａ、およびＲＴＮ４ＲＬ２からなる群より選択される１またはそれを超える富化された遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、分化プロトコールのステージ５のＳＣ−ＥＣ細胞は、ＮＥＵＲＯＤ４、ＬＭＸ１Ａ、ＦＥＶ、ＮＲ０Ｂ１、ＺＢＴＢ７Ｃ、ＡＳＣＬ２、ＮＦＫＢＩＺ、ＭＮＸ１、ＭＡＦＢ、およびＴＲＰＳ１からなる群より選択される１またはそれを超える富化された転写因子を含む。いくつかの実施形態では、分化プロトコールのステージ６のＳＣ−ＥＣ細胞は、ＣＯＬ５Ａ２、ＳＬＣ１８Ａ１、ＴＰＨ１、ＣＢＬＮ１、ＭＭＥ、ＭＧＬＬ、ＳＴＣ１、ＯＶＯＳ２、ＳＬＩＴＲＫ１、ＰＬＤ５、ＳＴＡＣ、ＦＥＶ、ＧＰＣ４、ＦＡＴＥ１、ＢＲＩＮＰ３、ＴＡＣ１、ＲＡＳＧＲＰ１、ＫＣＮＳ３、ＣＸＣＬ１４、ＡＤＨ６、ＬＭＸ１Ａ、ＤＮＡＪＣ１２、ＧＲＩＡ４、ＰＲＰＳ２、およびＦＡＭ１３４Ｂからなる群より選択される１またはそれを超える富化された遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、分化プロトコールのステージ６のＳＣ−ＥＣ細胞は、ＦＥＶ、ＬＭＸ１Ａ、ＮＥＵＲＯＤ４、ＳＩＸ２、ＡＳＣＬ１、ＮＦＡＴＣ２、ＭＮＸ１、ＮＫＸ２−２、ＣＡＳＺ１、およびＥＴＳ２からなる群より選択される１またはそれを超える富化された転写因子を含む。いくつかの実施形態では、ＴＰＨ１、ＳＬＣ１８Ａ１、ＬＭＸ１Ａ、およびＰＡＸ４のうちの少なくとも１つを発現するＳＣ−ＥＣ細胞が同定される。いくつかの態様では、ＳＣ−ＥＣ細胞は、ＬＭＸ１およびＴＰＨ１を発現する。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、分化プロトコールのステージ５の非内分泌細胞は、ＣＡＬＢ１、ＣＯＬ９Ａ３、ＣＹＲ６１、ＴＹＭＳ、ＳＯＸ３、ＡＤＧＲＧ６、ＰＣＬＡＦ、ＲＩＰＰＬＹ３、ＧＭＮＮ、ＣＴＧＦ、ＰＬＰＰ２、ＭＹＢＬ２、ＰＨＬＤＡ３、ＣＥＮＰＵ、ＩＤ３、ＴＫ１、ＶＣＡＮ、ＡＤＡＭＴＳ１８、Ｃ５、ＡＵＲＫＢ、ＩＤ１、ＵＢＥ２Ｃ、ＨＭＧＢ２、ＷＦＤＣ２、およびＤＤＢ２からなる群より選択される１またはそれを超える富化された遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、分化プロトコールのステージ５の非内分泌細胞は、ＳＯＸ３、ＭＹＢＬ２、ＩＤ３、ＩＤ１、ＨＭＧＡ２、ＦＯＸＭ１、ＦＯＳＢ、ＦＯＳ、ＨＥＳ４、およびＥＧＲ２からなる群より選択される１またはそれを超える富化された転写因子を含む。いくつかの実施形態では、分化プロトコールのステージ６の非内分泌細胞は、ＦＮ１、ＵＰＫ１Ｂ、ＡＮＸＡ２、ＬＹＺ、ＩＦＩＴＭ３、ＦＲＺＢ、ＺＦＰ３６Ｌ１、ＴＡＣＳＴＤ２、ＭＴＴＰ、ＣＰＢ１、ＣＬＰＳ、ＳＰＩＢ、ＳＰＩＮＫ１、ＮＴＳ、ＮＯＴＣＨ２、ＧＦＲＡ３、ＣＬＤＮ６、ＳＰＡＲＣ、ＣＮＮ２、ＥＦＥＭＰ１、ＣＰＡ２、ＡＨＮＡＫ、ＬＹＰＤ６Ｂ、ＳＬＣ４Ａ４、およびＴＴＹＨ１からなる群より選択される１またはそれを超える富化された遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、分化プロトコールのステージ６の非内分泌細胞は、ＳＰＩＢ、ＴＥＡＤ２、ＴＧＩＦ１、ＴＣＦ７Ｌ１、ＰＴＦ１Ａ、ＦＯＳＬ２、ＳＯＸ２１、ＫＬＦ５、ＳＯＸ２、およびＭＥＣＯＭからなる群より選択される１またはそれを超える富化された転写因子を含む。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、本明細書中および図３５で同定された１またはそれを超える富化された遺伝子を使用して、特定の細胞集団を分離および単離する（例えば、内分泌細胞から非内分泌細胞を分離するか、大きい方の細胞集団からＳＣ−α、ＳＣ−β、またはＳＣ−ＥＣ細胞を分離する）。例えば、ＩＡＰＰ、ＰＣＤＨ７、ＰＣＰ４、ＡＳＢ９、ＮＥＦＭ、ＮＰＴＸ２、ＰＲＰＨ、ＴＢＸ３、ＩＴＧＡ１、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＩＮＳ、ＥＲＯ１Ｂ、ＣＡＬＢ２、Ｇ６ＰＣ２、ＢＡＣＥ２、ＣＣＳＥＲ１、ＥＤＡＲＡＤＤ、ＰＬＸＮＡ２、ＥＰＡＳ１、ＬＺＴＳ１、ＥＲＭＮ、ＴＭＥＭ１９６、ＣＲＴＡＣ１、ＬＲＦＮ２、およびＮＴＮＧ２からなるリストより選択される１またはそれを超える遺伝子の発現が富化されたと同定された細胞（例えば、ＳＣ−β細胞）は、同一の発現の富化を示さない細胞（例えば、ＳＣ−α細胞、ＳＣ−ＥＣ細胞、および／または非内分泌細胞）から単離され得る。いくつかの実施形態では、さらなる細胞表面マーカーは、欧州特許第３３８４２８６Ａ１号および米国特許出願公開第２００９／０２６３８９６号（その両方全体が、本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、分化細胞の集団は、特定の型の幹細胞由来細胞（例えば、ＳＣ−β細胞、ＳＣ−α細胞、またはＳＣ−ＥＣ細胞）が富化される。いくつかの態様では、分化細胞の集団は、ＳＣ−β細胞、ＳＣ−α細胞、またはＳＣ−ＥＣ細胞が富化されている。いくつかの態様では、分化細胞の集団は、ＳＣ−β細胞表面マーカーとしてＩＴＧＡ１（ＣＤ４９ａ）を有するＳＣ−β細胞が富化されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４９ａ染色および磁気マイクロビーズを使用して、分化細胞の集団からＳＣ−β細胞を選別および単離する。単離されたＳＣ−β細胞は、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％までのＳＣ−β細胞を含む富化されたクラスターまたは膵島を形成する。いくつかの態様では、クラスターは、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、または２％未満のＳＣ−ＥＣ細胞を含む。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、細胞の集団の幹細胞由来細胞への分化は、特定の表面マーカーを標的にすることによって方向づけられるか操作される。例えば、分化プロセスを、得られた幹細胞由来細胞集団の大部分がＳＣ−β細胞などの１つの細胞型であるように方向付けることができる。いくつかの態様では、標的にされるべき表面マーカーは、本明細書中に記載のＲＮＡシーケンシングを使用して同定された１またはそれを超える富化された遺伝子および／または転写因子である。いくつかの態様では、標的にされるべき表面マーカーは、図３５および３６で同定された１またはそれを超える富化された遺伝子および／または転写因子である。
【０２４９】
いくつかの態様では、公知の必須因子を阻害するかノックアウトし、それにより、特定の細胞型（例えば、ＳＣ−β細胞、ＳＣ−α細胞、ＳＣ−ＥＣ細胞）の発生を阻害することができる。他の態様では、公知の必須因子を活性化し、それにより、細胞（例えば、ＳＣ−β細胞、ＳＣ−α細胞、ＳＣ−ＥＣ細胞）の発生を増大させることができる。いくつかの実施形態では、当業者に公知の任意の遺伝子編集ツール（例えば、ＴＡＬＥＮＳ、ＣＲＩＳＰＲなど）を使用して、必須因子を阻害するか活性化するための標的にすることができる。いくつかの実施形態では、腫瘍抑制因子（例えば、ＲＢ１および／またはＮＦ２）をノックアウトまたは阻害し、それにより、幹細胞および／または前駆体の調節されない成長をもたらし、細胞を分化できないようにすることができる。
【０２５０】
一定の態様では、ＳＣ−ＥＣ細胞の発生の阻害およびＳＣ−β細胞の発生の増加により、ＳＣ−β細胞の集団を増加させる。例えば、ＳＣ−ＥＣ細胞の発生または産生は、ＬＭＸ１Ａ（ＳＣ−ＥＣ細胞の富化された転写因子）の破壊によって阻害される。ＬＭＸ１ＡのノックダウンまたはＬＭＸ１Ａのノックアウト（例えば、ＣＲＩＳＰＲを使用）のいずれかによってＬＭＸ１Ａを破壊することができる。分化中のＳＣ−ＥＣ細胞産生の破壊により、得られた分化細胞の集団は、ＳＣ−β細胞の収量の増加を示す。別の例では、ＰＤＸ１、ＮＥＵＲＯＧ３、およびＩＮＳＭ１は、ＳＣ−β細胞発生に必須であることが公知の転写因子である。１またはそれを超えるこれらの因子を標的にすること（例えば、必須因子のうちの１つの発現の調整）により、ＳＣ−β細胞発生を調整することができる。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、分化プロトコール中に細胞運命を調節する１またはそれを超える転写因子が同定され得る。例えば、ＰＡＸ４およびＡＲＸは、ＳＣ−β細胞およびＳＣ−α細胞の分化の例示的な制御因子である。この制御因子は、分化細胞の運命を調節する。いくつかの態様では、制御因子を、遺伝子編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）を使用して標的にして制御因子の発現を調整し、それにより、分化プロセスの運命を調節することができる。いくつかの態様では、第１の制御因子をノックアウトまたは阻害することができる一方で、第２の制御因子を活性化することができる。いくつかの態様では、ＡＲＸを阻害またはノックアウトし、および／もしくはＰＡＸ４を活性化し、それにより、分化している細胞の集団にＳＣ−β細胞を形成させる。別の態様では、ＡＲＸを活性化し、および／またはＰＡＸをノックアウトもしくは阻害し、それにより、分化している細胞の集団にＳＣ−α細胞を形成させる。
【０２５２】
幹細胞由来腸クロム親和性細胞
本開示のいくつかの態様では、幹細胞由来腸クロム親和性細胞（ＳＣ−ＥＣ）を提供する。本明細書中に開示のＳＣ−ＥＣ細胞は、ネイティブＥＣ細胞の多くの際立った特徴を共有するが、一定の態様において異なる。いくつかの実施形態では、ＳＣ−ＥＣ細胞は、非ネイティブの（すなわち、天然に存在しない）非内因性の細胞である。本明細書中で使用される場合、「非ネイティブ」は、ＳＣ−ＥＣ細胞が一定の態様において天然に存在するＥＣ細胞（すなわち、ネイティブＥＣ細胞）と著しく異なることを意味する。しかし、これらの顕著な相違によって一定の相違を示すＳＣ−ＥＣ細胞が生じ得るが、ＳＣ−ＥＣ細胞は依然としてネイティブＥＣ細胞と類似の様式で挙動することができ、ネイティブＥＣ細胞と比較して一定の機能が変化している（例えば、改善されている）と認識すべきである。
【０２５３】
本開示のＳＣ−ＥＣ細胞は、正常なＥＣ細胞機能に重要なＥＣ細胞の多くの特性を共有する。いくつかの実施形態では、ＳＣ−ＥＣ細胞は、セロトニン（５−ＨＴ）を産生することができる。いくつかの実施形態では、ＳＣ−ＥＣ細胞は、ＫＣｌでの脱分極の際にセロトニンを放出する。一定の態様では、ＳＣ−ＥＣ細胞は、ＫＣｌでの脱分極の際にインビトロでセロトニンを放出する。ＳＣ−ＥＣ細胞は、高グルコースでの刺激の際にセロトニンを放出しない。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、ＳＣ−ＥＣ細胞は、１またはそれを超える以下の遺伝子：ＴＨＰ１、ＳＬＣ１９Ａ１、ＬＭＸ１Ａ、ＰＡＸ４、ＤＤＣ、ＴＲＰＡ１、ＳＣＮ３Ａ、ＡＤＲα２Ａ、ＦＥＶ、ＴＡＣ１、およびＣＸＣＬ１４を発現する。いくつかの実施形態では、ＳＣ−ＥＣ細胞は、遺伝子ＴＰＨ１、ＬＭＸ１Ａ、およびＳＬＣ１９Ａ１を共発現する。いくつかの実施形態では、ＳＣ−ＥＣ細胞は、ＴＰＨ１およびＬＭＸ１Ａを共発現する。いくつかの態様では、ＳＣ−ＥＣ細胞は、１またはそれを超える以下のマーカー：Ｇ６ＰＣ２、ＮＰＴＸ２、ＩＳＬ１、ＰＤＸ、およびＥＲＯ１Ｂを発現しない。
【０２５５】
本発明はＳＣ−ＥＣ細胞が由来する出発細胞に制限されることを意図しないので、ＳＣ−ＥＣ細胞は任意の出発細胞からインビトロで分化する。例示的な出発細胞としては、制限されないが、内分泌細胞またはその任意の前駆物質（ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞など）、および多能性幹細胞、胚性幹細胞、および人工多能性幹細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＳＣ−ＥＣ細胞を、再プログラム化細胞、部分再プログラム化細胞（すなわち、体細胞、例えば、人工多能性細胞と人工多能性細胞から誘導される体細胞との間の中間の状態にあるように部分的に再プログラム化されている線維芽細胞）、分化転換細胞からインビトロで分化させる。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示のＳＣ−ＥＣ細胞を、内分泌細胞またはその前駆物質からインビトロで分化させることができる。いくつかの実施形態では、ＳＣ−ＥＣ細胞を、ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞、Ｐｄｘ１＋膵臓前駆細胞、および多能性幹細胞からなる群より選択される前駆物質からインビトロで分化させる。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ＳＣ−ＥＣ細胞またはＳＣ−ＥＣ細胞が由来する多能性幹細胞はヒトである。いくつかの実施形態では、ＳＣ−ＥＣ細胞はヒトである。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、ＳＣ−ＥＣ細胞は、遺伝子改変されていない。いくつかの実施形態では、ＳＣ−ＥＣ細胞は、細胞を遺伝子改変していない状態でネイティブＥＣ細胞と共有する特徴を獲得している。いくつかの実施形態では、ＳＣ−ＥＣ細胞は遺伝子改変されている。
【０２５７】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書中に記載のＳＣ−ＥＣ細胞を含む細胞系を提供する。いくつかの態様では、本開示は、本明細書中に記載のＳＣ−ＥＣ細胞を含むＳＣ−膵島を提供する。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞、例えばＳＣ−ＥＣ細胞の集団は移植可能であり、例えば、ＳＣ−ＥＣ細胞の集団は被験体に投与され得る。いくつかの実施形態では、ＳＣ−ＥＣ細胞の集団を投与される被験体は、（例えば、自己細胞療法のために）ＳＣ−ＥＣ細胞に分化させるために使用される多能性幹細胞が得られた同じ被験体である。いくつかの実施形態では、被験体は、異なる被験体である。いくつかの実施形態では、被験体は腸炎症などの腸障害を患っているか、または正常被験体である。例えば、移植、例えば、臓器移植のための細胞（例えば、ＳＣ−ＥＣ細胞の集団を含む組成物）は、移植に適切な形態であり得る。
【０２５９】
前記方法は、細胞を、それを必要とする被験体、例えば、哺乳動物の被験体、例えば、ヒトの被験体に投与することをさらに含み得る。細胞の供給源は、哺乳動物、好ましくは、ヒトであり得る。細胞の供給源またはレシピエントはまた、非ヒトの被験体、例えば、動物モデルであり得る。「哺乳動物」という用語は、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、ヤギ、ウマ、サル、イヌ、ネコ、および好ましくは、ヒトを含む生物を含む。同様に、移植可能な細胞は、これらの生物、例えば、非ヒトのトランスジェニック生物のいずれかから得ることができる。一実施形態では、移植可能な細胞は、遺伝子操作されており、例えば、細胞は、外因性の遺伝子を含むか、または内因性遺伝子を不活性化もしくは変化させるように遺伝子操作されている。
【０２６０】
ＳＣ−ＥＣ細胞の集団を含む組成物は、埋め込み可能なデバイスを使用して、被験体に投与され得る。埋め込み可能なデバイスおよび関連技術は当技術分野で公知であり、送達システムとして有用であり、本明細書に示される化合物または組成物の連続放出送達または時限放出送達が望ましい。加えて、埋め込み可能なデバイスの送達システムは、化合物または組成物の送達の特異的な点（例えば、局所部位または臓器）の標的化に有用である。Ｎｅｇｒｉｎら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２２（６）：５６３（２００１）。代替的な送達方法を伴う時限放出技術もまた、本発明に使用され得る。例えば、ポリマー技術、持続放出技術および被包技術に基づく時限放出製剤（例えば、ポリマー、リポソーム）もまた、本明細書に示される化合物および組成物の送達に使用され得る。
【０２６１】
被験体への投与のために、本明細書に開示される方法により生産された細胞集団、例えば、ＳＣ−ＥＣ細胞の集団は、例えば、薬学的に許容され得る組成物で被験体に投与され得る。これらの薬学的に許容され得る組成物は、１つまたはそれを超える薬学的に許容され得る担体（添加剤）および／または希釈剤と共に製剤化された治療有効量の上記ＳＣ−ＥＣ細胞の集団を含む。
【０２６２】
以下に詳細に記載されるように、本発明の薬学的組成物は、固体または液体形態、例えば以下のために適合されたものを含め、投与のために特別に製剤化され得る：（１）経口投与、例えば、水薬（水溶液もしくは非水性溶液または懸濁物）、ロゼンジ、糖衣錠、カプセル、丸剤、錠剤（例えば、頬、舌下および全身での吸収を目的としたもの）ボーラス、粉末、顆粒、舌への塗布のためのペースト；（２）非経口投与、例えば、無菌の溶液もしくは懸濁物または持続放出製剤としての、例えば、皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射による；（３）局所塗布、例えば、クリーム、軟膏または制御放出パッチまたは皮膚に適用されるスプレー；（４）膣内または直腸内、例えば、ペッサリー、クリームまたは泡；（５）舌下；（６）眼；（７）経皮；（８）経粘膜；または（９）経鼻。加えて、化合物は、患者に埋め込まれ得るか、または薬剤送達システムを使用して注射され得る。例えば、Ｕｒｑｕｈａｒｔ，ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２４：１９９−２３６（１９８４）；Ｌｅｗｉｓ，ｅｄ．“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ”（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１）；米国特許第３，７７３，９１９号；および米国特許第３５  ３，２７０，９６０号を参照のこと。
【０２６３】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る」という用語は、健全な医療的判断の範囲内にあり、合理的な利益／リスク比に相応の、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するために適切な化合物、材料、組成物および／または投与形態を指す。
【０２６４】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」という用語は、１つの臓器または身体の一部から別の臓器または身体の部分に、目的の化合物を運搬または輸送することに関与する、薬学的に許容され得る材料、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体の充填剤（ｆｉｌｌｅｒ）、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、滑沢剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛またはステアリン酸）または溶媒被包材料を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、患者に対して傷害性でないという意味で、「許容され得る」べきである。薬学的に許容され得る担体として機能し得る材料のいくつかの例としては、（１）糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；（３）セルロースおよびその誘導体、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロースおよび酢酸セルロース；（４）粉末状のトラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク；（８）賦形剤、例えば、ココアバターおよび坐剤ワックス；（９）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリル酸エチル；（１３）アガー；（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質を含まない水；（１７）等張性食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝化溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ酸無水物；（２２）増量剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、例えば、ポリペプチドおよびアミノ酸；（２３）血清成分、例えば、血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬ；（２２）Ｃ２−Ｃ１２アルコール、例えば、エタノール；ならびに（２３）薬学的製剤に使用される他の非毒性の適合性物質が挙げられる。湿潤剤、着色剤、放出剤（ｒｅｌｅａｓｅ  ａｇｅｎｔ）、コーティング剤、甘味料、矯味矯臭剤、芳香剤、保存剤および抗酸化剤もまた、製剤に存在し得る。前記用語、例えば「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容され得る担体」などは、本明細書では互換的に使用される。
【０２６５】
細胞集団に関して本明細書で使用される場合、「治療有効量」という語句は、細胞集団中の関連細胞、例えばＳＣ−ＥＣ細胞、または本発明のＳＣ−ＥＣ細胞を含む組成物の量であって、任意の医療的処置に適用可能な合理的な利益／リスク比で、動物中の細胞の少なくとも部分集団においていくらかの所望の治療効果を生じさせるために有効な量を意味する。例えば、腸管または胃腸管の疾患または障害（例えば、腸の炎症および過敏性腸疾患など）の少なくとも１つの症状の統計的に有意な測定可能な変化を得るのに十分である、被験体に投与されるＳＣ−ＥＣ細胞の集団の量。治療有効量の決定は、十分に当業者の能力内である。一般に、治療有効量は、被験体の既往歴、年齢、状態、性別ならびに被験体における医学的状態の重症度および種類、ならびに、他の薬学的に活性な薬剤の投与により変動し得る。
【０２６６】
本明細書で使用される場合、「投与する」という用語は、所望の効果が生じるように、所望の部位における組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による被験体への組成物の配置を指す。本明細書に記載の化合物または組成物は、当技術分野で公知の任意の適切な経路、例えば限定されないが、経口または非経口の経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、肺、鼻、直腸および局所（例えば、頬および舌下）の投与により投与され得る。
【０２６７】
例示的な投与様式としては、限定されないが、注射、注入、点滴注入、吸入または経口摂取が挙げられる。「注射」は、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、心室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内および胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）の注射および注入を含む。好ましい実施形態では、組成物は、静脈内注入または注射により投与される。
【０２６８】
疾患または障害の「処置」、「予防」、または「改善」は、かかる疾患または障害の発症を遅延または予防すること、かかる疾患または障害に関連する状態の進行を、前記状態の進行または重症度の悪化または増悪を、逆転、緩和、改善、阻害、減速もしくは停止することを意味する。一実施形態では、疾患または障害の症状は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％緩和される。
【０２６９】
特定の実施形態では、被験体は、哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。「患者」および「被験体」という用語は、本明細書では互換的に使用される。好ましくは、被験体は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシであり得るが、これらの例に限定されない。
【０２７０】
ＳＣ−ＥＣ細胞の集団を含む組成物の投与の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な投与量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な投与量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順により決定され得る。大きな治療指数を示すＳＣ−ＥＣ細胞の集団を含む組成物が好ましい。
【０２７１】
ＳＣ−ＥＣ細胞の集団を含む組成物の量は、複数の十分確立された動物モデルを使用して試験され得る。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための投与量の範囲を処方するために使用され得る。このような化合物の投与量は、好ましくは、ほとんど毒性を有しないか、または、毒性を有しないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される投与形態および採用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。
【０２７３】
治療有効投与量の、ＳＣ−ＥＣ細胞の集団を含む組成物は、細胞培養アッセイから最初に推定され得る。あるいは、任意の特定の投与量の効果が、適切なバイオアッセイによりモニタリングされ得る。
【０２７４】
処置の持続期間および頻度に関して、処置が治療的利益を提供している時を決定し、投与量を増加または減少させるか、投与頻度を増加または減少させるか、処置を中断するか、処置を再開するか、または、処置レジメンに他の変更を加えるかを決定するために、被験体をモニタリングするのは、技量を有する臨床医にとって典型的なことである。投与スケジュールは、ＳＣ−ＥＣ細胞に対する被検体の感受性などの数多くの臨床的要因に応じて、１週間１回から毎日に変動し得る。所望の投与量は一度に投与され得るか、または部分投与量、例えば２〜４つの部分投与量に分割され、一定期間にわたって、例えば、日を通しての適切な間隔または他の適切なスケジュールで投与され得る。このような部分投与量は、単位投与形態として投与され得る。いくつかの実施形態では、投与は、長期、例えば、数週間または数か月の期間にわたって、毎日１回またはそれを超える投与量である。投与スケジュールの例は、１週間、２週間、３週間、４週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月または６カ月またはそれを超えて、毎日、１日２回、１日３回、１日４回またはそれより頻繁な投与である。
【０２７５】
本発明の別の態様では、前記方法は、本明細書に開示されるＳＣ−ＥＣ細胞の単離された集団の使用を提供する。本発明の一実施形態では、本明細書に開示されるＳＣ−ＥＣ細胞の単離された集団は、処置を必要とする被験体への移植において使用するための薬学的組成物の生産に使用され得る。
【０２７６】
本発明の一実施形態は、被験体における腸障害または腸疾患を処置する方法であって、本明細書に開示されるＳＣ−ＥＣ細胞の集団を含む有効量の組成物を、腸障害または腸疾患を有する被験体に投与することを含む方法に関する。さらなる実施形態では、本発明は、腸障害または腸疾患を処置するための方法であって、本明細書に開示されるＳＣ−ＥＣ細胞の集団を含む組成物を、腸障害または腸疾患を有するかまたはそれを発症する増加したリスクを有する被験体にセロトニンを分泌するのに十分な有効量で投与することを含む方法を提供する。
【実施例】
【０２７７】
実施例１：シングルセルＲＮＡシーケンシングによるインビトロベータ細胞分化の図表化
ヒト幹細胞をインビトロ分化させて、ベータ細胞（喪失されると１型糖尿病を引き起こすインスリン分泌細胞型）を産生することができる。このプロセスの習得に向けたステップとして、インビトロベータ細胞分化中にサンプリングした１００，０００個を超える個別の細胞の転写プロファイリングを報告し、明らかとなる細胞集団を記載した。ベータ細胞、アルファ様多ホルモン性細胞、膵臓外分泌細胞に類似する非内分泌細胞に対応する集団、および腸クロム親和性細胞に類似する以前に報告されていない集団が分離された。ベータ様細胞およびアルファ様細胞が外因性成長因子を含まない培養において数週間にわたって非常に安定していること、および、インビボでのベータ細胞の成熟に関連する遺伝子発現の変化がインビトロで繰り返されたことを示していた。幹細胞由来腸クロム親和性細胞のトランスクリプトームを記載し、この細胞がインビトロでセロトニンを合成および分泌することができることが示された。外分泌細胞を除去するために、内分泌細胞型を効率的に選択するスケーラブルな解離および再凝集技術を特徴付けた。最後に、高解像度のシーケンシング時間経過（high-resolution  sequencing  time  course）を使用してヒト膵臓内分泌誘導中の遺伝子発現の動態を特徴付け、それにより、インビトロベータ細胞分化の系譜モデルを得た。本明細書中に記載の結果は、ヒト幹細胞分化の現状により深い見通しをもたらし、膵島細胞のインビトロでの分化およびその再生医療への応用をさらに試みる上での飛躍点となる。
【０２７８】
ＳＣ−ベータプロトコールでは、３Ｄクラスター中で成長したヒト多能性幹細胞を、ステージ特異的誘導因子（別個の培地および成長因子）を使用して６つのステージを介してベータ細胞に分化させる。これらのステージ中の進行および効率を、免疫蛍光顕微鏡法およびフローサイトメトリーを使用して測定する（図１Ａ）。最初の３つの分化ステージで、ほぼ同種（約９０％）のＰＤＸ１（膵臓のマスター転写因子）を発現する前駆体の集団が生成される（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ  ２０１３）。その後、別個の集団は、染色マーカー（Ｃ−ペプチド（インスリンの断片）、汎内分泌マーカーＣＨＧＡ、およびベータ細胞転写因子  ＮＫＸ６．１が挙げられる）によって同定可能である（図１Ａ）。所望のＳＣ−ベータ細胞は、３つ全てのマーカーを発現する。個別のクラスター内で、ＣＨＧＡ＋内分泌細胞は、周囲にマントルを形成する（図１Ｂ）。
【０２７９】
本明細書中に記載のように、インビトロベータ細胞分化プロセスの深い理解のためにシングルセルＲＮＡシーケンシングおよびコンピュータ解析法を適用する。目的は、細胞型の遺伝子発現プロファイルによって異なる膵臓分化ステージが明らかとなる細胞型を最初に定義し、その後にその系譜の起源および成熟の軌跡を特徴づけることである。この細胞は、細胞の描写によってインビトロでのベータ細胞分化のプロセスが正確に定義され、さらなるプロトコールエンジニアリングをガイドする。これらは、幹細胞の分化を糖尿病の処置に発展させるための重要なステップである。
【０２８０】
ＳＣ−ベータ分化は４つの主な細胞集団を産生する
２つの修正したプロトコールを用いて行った２つの分化のステージ３〜６の終了時にサンプリングした４０，４４４個の細胞を、ｉｎＤｒｏｐｓを使用してシーケンシングした。第１の目的は、予め選択した少数の遺伝子の抗体パネルよりもむしろ細胞集団の完全なトランスクリプトームを使用して細胞集団を定義することであった。系統的にシグナル伝達因子を差し引くことによって（データ示さず）、フローサイトメトリーによって測定した場合に、有意に改変されたシグナル伝達因子が、比は異なるが類似する集団を生成することが発見された（図７Ａ〜７Ｂ、図１３）。したがって、第２の目的は、２つの異なるプロトコール由来の細胞の転写類似性を測定することであった。本研究を通して、３Ｄ懸濁培養物中でＳＣ−ベータが分化するという事実を、同一の分化を繰り返しサンプリングするために活用した。
【０２８１】
前駆体（ステージ３および４）、３つのタイプの内分泌細胞（ステージ４、５、および６）、および非内分泌細胞（ステージ５および６）の別個の集団を同定した。両方のプロトコールでは、ステージ３の細胞が複製している膵臓前駆体の単一集団を含むことを示す（ＰＤＸ１＋、図１Ｄ〜１Ｅ）。ステージ４の終了までに、前駆体の別の集団が認められ、第１の内分泌細胞も認められ、これはステージ５および６のＳＣ−アルファ細胞集団に対応する。最後に、ステージ５および６で、以下の３つの主なクラスのＣＨＧＡ＋内分泌細胞が認められる（図１Ｄ〜１Ｅ）：（ｉ）ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１、ＩＳＬ１、および他のベータ細胞マーカーを発現するＳＣ−ベータ細胞（ｉｉ）ＧＣＧ、ＡＲＸ、ＩＲＸ２だけでなくＩＮＳも発現するアルファ様細胞、および（ｉｉｉ）腸クロム親和性細胞（ＳＣ−ＥＣ）に最も類似する、ＣＨＧＡ、ＴＰＨ１、ＬＭＸ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ１を発現する内分泌細胞型。ステージ５および６で、非内分泌細胞は、有意に不均一な最終集団を形成する。したがって、２つのあまり望ましくない集団（ＳＣ−ＥＣおよび非内分泌）の細胞型と並んで、成人膵島細胞型（ＳＣ−ベータ細胞およびＳＣ−アルファ細胞）に対応するトランスレーショナル関連性を有する２つの細胞集団が同定される。
【０２８２】
試験した２つのプロトコールバリアントの細胞型の比が大きく異なると予想されるにもかかわらず（図１Ｄ、図６Ｃ）、個別の集団の遺伝子発現は、２つのプロトコールの間で非常に類似していた（図６Ｄ）。高レベルのＦＯＸＪ１＋によって標識された単一の集団は、たった１つのプロトコールで存在していた（図１５）。これらの集団の同一性に影響を及ぼすことなく集団の比に有意に影響を及ぼすことができるプロトコールの修正が存在すると結論づけた。異なる多能性幹細胞を用いて行ったＳＣ−ベータ分化によって異なる集団が生成されるかどうかの確認も試みた。胚性幹細胞（ＥＳＣ、ＨＵＥＳ８株）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ、１０１６／３１株）の分化から産生されたステージ６細胞をシーケンシングし、各分化の対応する細胞型の間に高い相関関係が認められた（図６Ｅ〜６Ｇ）。まとめると、これらの結果から、インビトロベータ細胞分化プロトコールが分化因子および幹細胞系における混乱に対して比較的頑強な系譜の進行をガイドすることが確立される。
【０２８３】
ＳＣ−ベータ細胞は機能的で、有糸分裂後に最終分化される
ＳＣ−ベータ細胞の重要な性質は、そのグルコース応答性および内因性ヒトベータ細胞に対する転写類似性である。これらの性質をステージ６の数週間にわたって特徴付け、その間に、細胞を、外因性シグナル伝達因子を含まない無血清培地で培養した（プロトコールｖ８）。１週間間隔で３つの独立した分化からサンプリングして、シングルセルＲＮＡシーケンシング、インビトログルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）、およびフローサイトメトリーを、ステージ６の数週間にわたって実施した（図２Ａ）。
【０２８４】
ＳＣ−ベータクラスターは、ステージ６培養においておよそ２週間後にグルコースに応答してインスリンを分泌する能力を獲得し、この能力がさらに約４週間保持される（図２Ｂ〜２Ｃ、図７）。グルコースに対する機能的応答（１より大きい刺激指数）が全ての週で認められた。認められた刺激指数は、ＳＣ−ベータクラスターと並んで実施したヒト膵島対照と同一の範囲であったが、分泌の規模は典型的には膵島の方が大きかった。これらの結果は、グルコース応答性が安定な形質であり、外因性の因子も血清も必要としないことを初めて示している。
【０２８５】
並行して行ったシングルセルシーケンシングによる測定値から、各集団のトランスクリプトームが測定時点にわたって高度に相関することが認められた。各フラスコおよび時点で、ＳＣ−ベータ細胞（ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＩＳＬ１、ＰＡＸ４を発現する）、多ホルモン性細胞（ＧＣＧ、ＩＮＳ、ＡＲＸ、ＩＳＬ１）、およびＳＣ−ＥＣ細胞（ＴＰＨ１、ＳＬＣ１８Ａ１、ＬＭＸ１Ａ、ＰＡＸ４）を含む内分泌集団ならびにＣＨＧＡ−非内分泌細胞を同定した（図２Ｄ、図８Ａ）。小さく稀な集団が、０週目、またはその後の時点のみで存在する（図１５）。集団および時点によって細胞をグループ化すると（図２Ｅ）、同一の時点由来の異なる細胞型の間よりも、異なる時点の同一の細胞型の間で遥かに高い相関関係が認められた。これらの結果は、分化中に形成された集団が長期培養中に転写的に安定であることを示す。
【０２８６】
グルコースに対するインスリンの分泌能力と一致して、ＳＣ−ベータ細胞は、インスリンの遺伝子発現、タンパク質合成、パッケージング、および分泌の制御に関与する重要な遺伝子を発現することが認められた（図８Ｂ）。死体膵島ベータ細胞中で発現されるが、ステージ４のＮＫＸ６．１＋前駆体で発現されないこれらの遺伝子は、ＳＣ−ベータ細胞の出現中に上方制御され、その後安定化する（図８Ｃ〜８Ｄ）。細胞周期関連遺伝子（ＴＯＰ２Ａなど）がほとんど発現しないか全く発現せず、細胞周期インヒビターＣＤＫＮ１Ｃを高発現することによって証明されるように、細胞複製は最小なようである（図８Ａ）。
【０２８７】
最後に、この時間経過中に生じたＳＣ−ベータの遺伝子発現の改良をより正確に説明することを試みた。最初に、ＳＣ−ベータ細胞のさらなるクラスタリングによって枝または別個の亜集団を欠く単一集団が明らかになることを確認した（図２Ｆ）。次いで、拡散擬時間（ＤＰＴ）（Ｈａｇｈｖｅｒｄｉ  ２０１６；Ｗｏｌｆ  ２０１７）を使用して、細胞の転写状態に応じて細胞を順序付けた。ＤＰＴ順序付けは、細胞の実時間のサンプリングと十分に合致する（図２Ｇ）。擬時間順序を遺伝子発現と相関させると、ステージ６中に発現が調整される遺伝子が同定される（図２Ｈ）。相関した遺伝子としては、ＩＡＰＰおよびベータ細胞の成熟度の公知のマーカー（ＨＯＰＸ（Ｈｒｖａｔｉｎ  ２０１４）、ＮＥＦＭ（Ａｒｄａ  ２０１６）、ＢＭＰ５（Ａｒｄａ  ２０１６）、およびＳＩＸ２（Ｈｒｖａｔｉｎ  ２０１４；Ａｒｄａ  ２０１６）など）が挙げられるが（図２Ｉ）、いくつかの成熟度のマーカー（ＵＣＮ３、ＭＡＦＡ、およびＳＩＸ３）は、発現が変化しなかった。逆相関する遺伝子としては、ＬＤＨＡ（適切なベータ細胞の代謝感知にはその抑制が必要）およびＩＧＦ２（ＩＮＳ遺伝子のすぐ下流にあり、ＩＮＳゲノム遺伝子座での転写をより良好に調節することが示唆されている分泌ペプチド）が挙げられる。したがって、ステージ６におけるＳＣ−ベータ細胞変動の主軸が細胞型のさらなる改良に対応すると結論づけた。
【０２８８】
多ホルモン性細胞（ＩＮＳ＋／ＧＣＧ＋）は未成熟アルファ細胞である。
インスリン遺伝子およびグルカゴン遺伝子の両方を発現する多ホルモン性細胞は、いくつかのインビトロ膵臓分化プロトコールで報告されている。多ホルモン性細胞は、グローバルトランスクリプトームが膵島アルファ細胞と適合するが、インスリンを誤って発現する細胞を示すことが実証された。インスリンのこの誤った発現は、ステージ６の経過中に補正される（図９Ａ）。これらの細胞は、ＳＣ−アルファ細胞と称される。ＳＣ−アルファ細胞とＳＣ−ベータ細胞とを比較するために、ヒト成体死体のアルファ細胞とベータ細胞との間で差次的に発現される遺伝子を最初に同定した（図９Ｂ）。アルファ細胞での発現がより高い遺伝子（転写因子ＡＲＸ、ＩＲＸ１、ＩＲＸ２ならびにマーカーＤＰＰ４、ＣＤ３６、およびＴＴＲが挙げられる）がＳＣ−アルファ細胞中でより高いのに対して、ベータ細胞の遺伝子はＳＣ−ベータ細胞中でより高かった（図９Ｄ〜９Ｅ）。この結果は、インビトロ由来多ホルモン性細胞が最終的に単一ホルモン性グルカゴン発現細胞に変わるという以前の所見と一致する（Ｂｒｕｉｎ  ２０１４）。胎児膵臓は、インスリンおよびグルカゴンを共発現するアルファ様（ＡＲＸ＋）細胞を含むことが報告されており（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  １９８８；Ｄｅ  Ｋｒｉｊｇｅｒ  １９９２；Ｔｅｉｔｅｌｍａｎ  １９９３；Ｐｏｌａｋ  ２０００；Ｒｉｅｄｅｌ  ２０１２）、これは胚形成でより稀となり、成人膵臓に存在しない。ＳＣ−アルファ細胞はインビトロで観察されたこれらの胎児対応物の具体化されたものであると結論づけた。
【０２８９】
ＴＰＨ１＋細胞はインビトロで最も類似する腸クロム親和性細胞を産生した
広範な調査で、ＴＰＨ１、ＮＫＸ６．１、および低レベルのインスリンを発現するが、ベータ−細胞マーカーＧ６ＰＣ２、ＮＰＴＸ２、ＩＳＬ１、およびＰＤＸ１の発現を欠くという点でＳＣ−ベータ細胞と異なる非膵島内分泌細胞の集団を同定した（図１Ｅ）。これらのＴＰＨ１＋細胞が幹細胞由来腸クロム親和性細胞型（ＳＣ−ＥＣ）を示すと結論づけた。腸クロム親和性細胞は、腸内でセロトニン（５−ＨＴ）を合成して分泌し、腸内でこれらの細胞は全般的な化学受容器としての機能を果たす（Ｂｅｌｌｏｎｏ  ２０１７）。ＳＣ−ベータ細胞（図３Ａ）と比較して、ＳＣ−ＥＣ細胞は、セロトニン合成に必要な遺伝子（ＴＰＨ１、ＤＤＣ、ＳＬＣ１８Ａ１、図１０Ａ）および腸クロム親和性細胞のマーカー（ＬＭＸ１Ａ（Ｇｒｏｓｓ  ２０１６）、ＴＲＰＡ１（Ｎｏｚａｗａ  ２００９）、ＳＣＮ３Ａ（Ｂｅｌｌｏｎｏ  ２０１７）、ＡＤＲα２Ａ（Ｂｅｌｌｏｎｏ  ２０１７）、ＦＥＶ（Ｗａｎｇ  ２０１０）、ＴＡＣ１（Ｈｅｉｔｚ  １９７６）、およびＣＸＣＬ１４（Ｌｅｊａ  ２００９）が含まれる）をより高いレベルで発現する。これらの遺伝子の発現は、他のインビトロ集団と比較して、インビボ膵臓集団と比較しても、ＳＣ−ＥＣ細胞で特異的に富化される（図３Ｂ）。免疫染色により（図３Ｄ）、ＳＣ−ＥＣ細胞は、ＴＰＨ１、ＬＭＸ１Ａ、およびＳＬＣ１８Ａ１を共発現することが確認され、セロトニン（５−ＨＴ）を産生することが可能である。移植８週間後にアッセイしたところ、これらの細胞は、マウスの腎臓被膜中のクラスターの移植の際に安定なままであった（図３Ｅ）。セロトニン分泌を測定するためにセロトニンＥＬＩＳＡを使用して、インビトロで分化されたＳＣ−膵島クラスターがＫＣｌでの脱分極の際にセロトニンを放出することができるが（図１０Ａ）、高グルコースでの刺激の際には放出できず、これはＥＣ細胞の予想される挙動（Ｍａｒｔｉｎ  ２０１７）と一致すると確認された。
【０２９０】
ＴＰＨ１を介したセロトニン産生がヒトベータ細胞で報告されているが（Ａｌｍａｃａ  ２０１６）、ＴＰＨ１の発現はインビボベータ集団にもインビトロベータ集団にも認められなかった（Ｂａｒｏｎ  ２０１６，Ｘｉｎ  ２０１６；Ｓｅｇｅｒｓｔｏｌｐｅ  ２０１６；Ｍｕｒａｒｏ  ２０１６；Ｅｎｇｅ  ２０１７）。他の研究では、年齢または状況に依存する様式でベータ細胞においてセロトニンが産生される場合があることが示されており、このことはこれらのシングルセルＲＮＡシーケンシングデータでは捉えられない場合がある（Ａｌｍａｃａ  ２０１６；Ｇｏｙｖａｅｒｔｓ  ２０１６；Ｏｈｔａ  ２０１１）。ＴＰＨ１および他のＥＣマーカーの発現は正常な膵島由来のＲＮＡ−Ｓｅｑデータセット中に見出されなかったが、最近発表されたデータから撹乱マウスベータ細胞におけるセロトニン／ＥＣプログラムの誘導シグナルが同定された（Ｌｕ  ２０１８）。具体的には、Ｐｏｌｙｃｏｍｂ抑制複合体２（ＰＲＣ２）成分ＥＥＤのベータ−細胞特異的ノックアウトから２５週間後、Ｔｐｈ１、Ｌｍｘ１ａ、Ｓｌｃ１８ａ１、およびＴｒｐａ１の上方制御およびベータ細胞同一性遺伝子の下方制御が認められた（図３Ｃ）。これは、膵島内でセロトニン／ＥＣ発現プログラムを誘導することができるという状況が存在することを示す。
【０２９１】
非内分泌細胞の腺房細胞および管細胞への分化
いくつかの細胞は、ステージ４および５中に内分泌への運命を辿らない（図１１）。これらの非内分泌細胞は、その重要な転写因子（ＳＯＸ９、ＰＴＦ１Ａ）の発現および内分泌マーカーの欠如においてより早いステージ由来の前駆細胞型と最も似ている。ステージ５および６までに、これらの細胞は、主に懸濁培養クラスターの中心に存在する（図１Ｇ）。インビボ内分泌細胞およびインビトロ内分泌細胞の両方は大部分が分裂を終了しているのに対して、非内分泌細胞はより後期でより多くの細胞周期関連遺伝子を保持している（ＴＯＰ２Ａ、図８Ａ）。これらの細胞は内分泌プログラムに従わないが、これらの細胞は前駆体ステージで維持されない代わりに、外分泌膵臓細胞への分化を維持する。ステージ６での継続培養中に、これらの細胞の発現プロファイルが変化し、その後に腺房細胞および管細胞に系譜が二分される（図１１Ｂ〜１１Ｃ）。
【０２９２】
再凝集は、非内分泌細胞の除去によってクラスターをインビトロで精製する
増殖する潜在性を有する非内分泌細胞を移植する際の懸念を考慮して、スケーラブルな有糸分裂後内分泌細胞の富化方法を探求した。単一細胞への解離後の再凝集の調節は、新生児膵臓（Ｂｒｉｔｔ  １９８１）およびインビトロ由来ベータ様細胞調製物（Ａｇｕｌｎｉｃｋ  ２０１５）から内分泌細胞を精製するために使用されている。最近の内分泌細胞の再凝集方法（Ａｇｕｌｎｉｃｋ  ２０１５；Ｈｉｌｄｅｒｉｎｋ  ２０１５；Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ２０１４；Ｓｐｉｊｋｅｒ  ２０１３；Ｚｕｅｌｌｉｇ  ２０１７）は、効率を向上させるためにマイクロパターン化表面、懸滴、可溶性細胞外マトリックス因子、またはＲＨＯキナーゼ阻害を利用する。いかなるこれらのさらなる因子または条件の非存在下でもステージ５後の酵素による解離後の再凝集をＳＣ−ベータプロトコール（図４Ａ）に適用できることが分かった。これは、スケーラブルで実施が容易な内分泌精製方法である。シングルセルＲＮＡシーケンシングにより、この再凝集が複製可能な非内分泌細胞を枯渇させる一方で、内分泌集団のトランスクリプトームの同一性を保持することが確認される（図４Ｂ）。フローサイトメトリーによって定量した場合（図４Ｃ〜４Ｄ）、再凝集されたクラスターは精製された内分泌細胞から構成され、ネイティブクラスターと比較して内分泌細胞が非常に富化されている。さらに、ベータ細胞機能は、ＧＳＩＳによって測定した場合、再凝集によって改善される（図４Ｅ）。興味深いことに、再凝集後にクラスターを染色すると、類似細胞の領域内に内分泌細胞集団が顕著に区画化されることを示す（図４Ｆ）。内分泌細胞の有糸分裂後の性質を考慮すると、この細胞型の仕分けは、クローン拡大増殖よりもむしろ再凝集後の優先的な細胞型接着またはクラスター内移動に原因する可能性がある。要約すると、再凝集は、ＳＣ−ベータ分化プロトコールにおいて残存する非内分泌細胞を枯渇させるためのスケーラブルな方法である。
【０２９３】
共通の前駆体がＳＣ−ベータおよびＳＣ−ＥＣ細胞を形成する
シングルセルＲＮＡシーケンシングから、ＳＣ−ベータ分化のプロセスを完全に調節することにつながる洞察を得るために、同定された主な細胞集団の形成動力学を理解しなければならない。特に、ＳＣ−ベータ細胞およびＳＣ−ＥＣ細胞の転写プログラムおよび出現のタイミングの類似性が、これらの細胞の特異化中の移行期を特に興味深いものにしている。シングルセルシーケンシングは、単一スナップショットおよび連続サンプリングの両方から発生軌跡を再構築することができる（Ｔｕｓｉ  ２０１８；Ｓｃｈｉｅｂｉｎｇｅｒ  ２０１７）。ステージ４では存在しない複数の新規の細胞型がステージ５終了時に存在するが、いずれのデータセットによっても移行期は捕捉されなかった。この欠陥を補うために、約４５，０００個の細胞を、２つの独立した分化についてステージ５の全期間にわたって毎日の間隔で選択してシーケンシングした。
【０２９４】
グローバルな視点から、このデータセット中の個別の細胞は、ステージ５（０日目）の出発集団と終了時に存在する集団がつながっている連続体を形成する。この連続体の２つの極は、内分泌になった細胞（ＣＨＧＡ＋）および内分泌にならなかった細胞（最初は前駆体であり、その後は非内分泌細胞になる）である。ＮＥＵＲＯＧ３（一過性に発現されるインビボ内分泌誘導のマスター制御因子）は、この連続体内で非内分泌細胞と内分泌細胞を架橋している細胞によって発現される（図５Ａ）。クラスタリングは、グローバルな視点をまとめており（図５Ｂ、図１２Ａ）、異なるステージの段階的出現を示し（図５Ｃ）、これらのステージのマーカーを明らかにしている（図５Ｇ）。ステージ５開始時に存在するいくつかの細胞は、ＳＣ−アルファへの運命に向かう内分泌誘導（ＡＲＸ＋で示す）または部分的内分泌誘導（ＦＥＶ＋／ＩＳＬ−で示す）を既に受けている。ステージ４前駆体をＳＣ−ベータ細胞とつなぐ軌跡は、さらに詳細に調査した２つの主な分岐事象を含むようである（図５Ｂ中の矢印）。
【０２９５】
ステージ４の終わりに、前駆体は、一方の端がＳＯＸ２＋、ＦＲＺＢ＋、およびＰＤＸ１低であり他方がＮＫＸ６．１＋、ＰＴＦ１Ａ＋、およびＰＤＸ１高である勾配の形態の不均一な遺伝子発現を示す単一集団を形成する（図１２Ｂ〜１２Ｃ）。後者の一番端（the  latter  extreme）は、内分泌誘導に備えた細胞を示し、この内分泌誘導の大部分は次の２日間で開始される。この内分泌誘導の開始は、ステージ５中の細胞の最初の大きな分岐であり、それにより、一過性の細胞状態が形成される。この状態は、遺伝子（転写因子ＮＥＵＲＯＧ３、ＦＥＶ、ＦＯＸＪ１、ＬＭＸ１Ｂ、ＭＮＸ１、ＩＮＳＭ１が挙げられる）の誘導およびシグナル伝達経路の重要なエフェクター（Ｎｏｔｃｈ、Ｗｎｔ、Ｈｉｐｐｏ、ＦＧＦ、およびＥＧＦなど）の発現の変化（図１２Ｄ）によって指し示される。これは、膵臓内分泌誘導を開始および駆動する一連の事象（インビボ生検によって得ることが不可能でないにしても困難なもの）に前例のない見解をもたらす。
【０２９６】
Ｓ５において内分泌誘導が進行するにつれて、主にＳＣ−ベータおよびＳＣ−ＥＣに運命づけられる。これら２つの細胞型はＳ５Ｄ３に最も早く出現し、これはＳ５中の第２の分枝点を示す。この分岐をさらに調査するために、ＳＣ−ベータ、ＳＣ−ＥＣ、および内分泌誘導クラスター由来の細胞を選択し、拡散擬時間解析（ＰＤＴ、図５Ｄ）を適用した。この解析は、２つの枝に沿った進行と相関する遺伝子を同定する（図５Ｅ）。内分泌誘導に関連するいくつかの遺伝子が一過性であり（ＮＥＵＲＯＧ３、ＳＵＳＤ２）、一方で、他の遺伝子は依然として安定に発現される（ＬＭＸ１Ｂ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＰＡＸ４）。ＳＣ−ベータおよびＳＣ−ＥＣがこのプロセスによってオンにされる多数の遺伝子の発現を共有するにもかかわらず、その明確な同一性は、ＩＳＬ１、ＥＲＯ１Ｂ（ＳＣ−ベータについて）、およびＴＰＨ１、ＬＭＸ１Ａ（ＳＣ−ＥＣについて）が含まれる遺伝子の固有の発現によって証明される（図５Ｅ〜５Ｆ）。したがって、ＳＣ−ベータ細胞およびＳＣ−ＥＣ細胞は、ステージ５中に引き起こされる内分泌誘導のプロセスにおける最終分枝点として派生する。
【０２９７】
ステージ５のこの高解像度の時間経過から、ＳＣ−ベータ分化によって産生される細胞型の系譜の関係性を示すモデルを構築した（図５Ｈ）。
【０２９８】
考察
ベータ細胞は、疾患で喪失した細胞を置き換える、創薬のためのモデルを提供することが期待されている再生医療分野の最有力候補である。ベータ細胞および他の細胞型のための定方向分化プロトコールによって所望の集団の範囲外のさらなる細胞型が産生されるので、シングルセルＲＮＡシーケンシングは、細胞型の同一性および起源を解き明かすのに比類なく適している。この研究では、シングルセルＲＮＡシーケンシング実験を使用して、ＳＣ−ベータ分化中に形成された細胞型およびその転写軌跡を包括的に特徴付けた。偏りのないアプローチの使用により、予想される集団をさらに説明することができ、予想外の集団も同定することができる。
【０２９９】
数百万個のヒト細胞をほぼ同調して段階的に分化することにより、ＳＣ−ベータ分化によって産生された各細胞型を試験し、幹細胞療法の目的との関連性を評価するための前例のない機会が与えられる。インビトロでグルコースに応答する機能的ＳＣ−ベータ細胞がシグナル伝達エフェクターを使用しない長期培養下で単一の転写安定性集団を構成することが示された。最後の分化ステージ中のＳＣ−ベータ細胞内の少数の動的遺伝子のうちで、ベータ細胞成熟のマーカーとして以前に特徴付けられたいくつかの遺伝子が見出された。ＳＣ−ベータ細胞を掘り下げて調査すると、多ホルモン性細胞の同一性は、これらの細胞がインスリンを発現するが他のベータ細胞マーカーを欠くことによって以前は不明瞭であった。転写因子の発現およびグローバルな類似性に基づいて、これらの多ホルモン性細胞が初期にインスリンを誤発現するアルファ様（ＳＣ−アルファ）細胞を直接形成すると結論づけた。移植において、これらの細胞は、ＳＣ−膵島内での局所相互作用またはオートクリンシグナル伝達によってベータ細胞機能を改善し得る。最後に、内分泌誘導できない前駆体がその代わりに膵臓外分泌細胞型に成熟することを示した。これらの前駆体が複製し得ること、および、これらの前駆体が移植デバイス内の限られた空間を占め得ることの両方のために、これらの前駆体は望ましくないようである。内分泌細胞を富化するために、外分泌細胞を枯渇させ、ＳＣ−ベータクラスターのグルコース応答性インスリン分泌を増強するスケーラブルな再凝集方法を記載した。
【０３００】
分析の驚くべき所見は、ＮＫＸ６．１、ＣＨＧＡの免疫染色およびＧＣＧの欠如に基づいて以前はよく前駆体に分類されていたＳＣ−ＥＣ細胞の存在である。ＳＣ−ＥＣ細胞はＳＣ−ベータ細胞と発生上密接に関連しているが、これらは内分泌誘導プロセスの後期分岐から形成される別個の細胞型である。インビボでは、腸クロム親和性細胞は、マウスおよびヒトの膵島のシングルセル研究において認められていない（Ｂａｒｏｎ  ２０１６，Ｘｉｎ  ２０１６；Ｓｅｇｅｒｓｔｏｌｐｅ  ２０１６；Ｍｕｒａｒｏ  ２０１６；Ｅｎｇｅ  ２０１７）。腸クロム親和性細胞は、おそらくヒト膵臓で生じ得る。例えば、数例の原発性膵臓セロトニン産生カルチノイド腫瘍が報告されており（Ｔｓｏｕｋａｌａｓ  ２０１７；Ｋａｗａｍｏｔｏ  ２０１１）、膵臓腸クロム親和性細胞集団がまれに存在する可能性が示唆される。ベータ細胞中のＰＲＣ２ノックアウトが最終的に成体マウス膵島におけるベータ細胞マーカーの下方制御および腸クロム親和性マーカーの上方制御（おそらくベータ細胞の腸クロム親和性細胞への分化転換のシグナル）を誘導するという証拠も公表されたデータセットに示されていた（Ｌｕ  ２０１８）。これは、腸クロム親和性細胞が通常は抑制されるまれな代替の膵臓の運命であるという考えを支持している。
【０３０１】
この特徴づけにより、ベータ細胞分化のさらに改善されたプロトコールの情報が得られる。例えば、シグナル伝達経路の活性化または阻害によって細胞運命が調節されるという仮説は、細胞型にわたる受容体発現の相違および遺伝子発現に基づいて推測されるシグナル伝達活性によってガイドされ得る。さらに、インビトロ内分泌誘導研究により、そのインビボ対応物に変換する洞察が得られ得る。
【０３０２】
全体的に見て、ヒト幹細胞療法を追い求めて開発した幹細胞由来産物の包括的かつ詳細な分析を提供した。このタイプの高解像度発現プロファイリングは、首尾よくかつ安全な治療につなげるためにインビトロで産生された細胞の同一性を、確信を持って評価するのに必要である。
【０３０３】
実施例２：ヒトインビトロベータ細胞分化中の細胞同一性の図表化
この実施例は、実施例１由来の一定のデータを再度示し、さらなるデータを提供する。
【０３０４】
ヒト幹細胞をインビトロで分化させて、膵臓ベータ細胞（インスリン分泌細胞型の喪失が１型糖尿病の基礎となるインスリン分泌細胞型）を産生することができる。このプロセスの習得に向けたステップとして、インビトロでのベータ細胞分化中にサンプリングした１００，０００個を超える個別の細胞の転写プロファイリングを報告し、明らかとなる細胞集団を記載する。ベータ細胞、アルファ様多ホルモン性細胞、膵臓外分泌細胞に類似する非内分泌細胞に対応する集団、および腸クロム親和性細胞に類似する以前に報告されていない集団が分離される。内分泌細胞が外因性成長因子を含まない培養においてその同一性を維持していること、および、インビボでのベータ細胞の成熟に関連する遺伝子発現の変化がインビトロで繰り返されることを示す。スケーラブルな再凝集技術を実施して非内分泌細胞を枯渇させ、ベータ集団のための表面マーカーとしてＣＤ４９ａ／ＩＴＧＡ１を同定し、８０％の純度まで磁気選別を可能にする。最後に、高解像度のシーケンシング時間経過を使用してヒト膵臓内分泌誘導中の遺伝子発現の動態を特徴付け、インビトロベータ細胞分化の系譜モデルを開発する。本研究は、ヒト幹細胞分化の現状により深い見通しをもたらし、膵島細胞の分化およびその再生医療への応用をさらに試みる上でのガイドとなる。
【０３０５】
ＳＣ−ベータプロトコールでは、３Ｄクラスター中で成長したヒト多能性幹細胞を、幹細胞由来ベータ細胞を含む「ＳＣ−膵島」を産生するための特定の誘導因子を使用して６つのステージを介して分化させる。進行および効率を、免疫蛍光顕微鏡法およびフローサイトメトリーを使用して測定する（図１６Ａ）。最初の３つの分化ステージで、ほぼ同種（約９０％）のマスター転写因子ＰＤＸ１を発現する前駆体の集団が生成される。その後、別個の集団は、Ｃ−ペプチド（プロインスリンの断片）、汎内分泌マーカーＣＨＧＡ、およびベータ細胞転写因子ＮＫＸ６．１の染色によって同定される（図１６Ａ、図２１Ａ）。
【０３０６】
ここに、インビトロベータ細胞分化の深い理解を生み出すためにシングルセルＲＮＡシーケンシングおよびコンピュータ解析法を適用する（図１６Ｂ）。出現した細胞型を、インビトロベータ細胞分化を細胞毎に正確に説明するそのグローバル遺伝子発現プロファイルによって、各分化ステージで定義する。これらは、幹細胞の分化を糖尿病の処置に発展させるための重要なステップである。
【０３０７】
ＳＣ−膵島は４つの主要な細胞型を含む
２つの修正プロトコールを使用して行った分化由来のステージ３〜６の終了時にサンプリングした４０，４４４個の細胞を、そのトランスクリプトーム全体を使用して細胞集団を定義するためにシーケンシングした。これら２つのプロトコールは、元の１ｖ１ステージ３および４因子のサブセットを使用し、ステージ４で異なった集団比が得られる（図２１Ｄ〜２１Ｅ、図３２）。本研究を通して、３Ｄ懸濁培養物中でＳＣ−ベータが分化するという事実を、長期にわたって同一の分化を繰り返しサンプリングするために活用した。
【０３０８】
同定した主な集団（図１６Ｃ〜１６Ｇ、図２９）は、前駆体（ステージ３および４中）、３つのタイプの内分泌細胞（ステージ４、５、および６）、および１つのタイプの非内分泌細胞（ステージ５および６）である。両方のプロトコールでは、ステージ３の細胞は、複製している膵臓前駆体（ＰＤＸ１＋）の単一集団を含む。ステージ４の終了までに、ＮＫＸ６．１＋前駆体が認められ、第１のアルファ様細胞も認められる。最後に、ステージ５および６で、以下の３つのクラスのＣＨＧＡ＋内分泌細胞が認められる：（ｉ）ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１、ＩＳＬ１、および他のベータ細胞マーカーを発現するＳＣ−ベータ細胞（ｉｉ）ＧＣＧ、ＡＲＸ、ＩＲＸ２だけでなくＩＮＳも発現するアルファ様細胞、および（ｉｉｉ）腸クロム親和性細胞（ＳＣ−ＥＣ、図２１Ｂ）に最も類似する、ＣＨＧＡ、ＴＰＨ１、ＬＭＸ１Ａ、ＳＬＣ１８Ａ１を発現する内分泌細胞型。ステージ５および６で、ＳＯＸ９＋非内分泌細胞（図２１Ｃ）は、有意に不均一な最終集団を形成する。したがって、２つの他の集団（ＳＣ−ＥＣおよび非内分泌細胞）と並んで、成人膵島細胞型（ＳＣ−ベータ細胞およびＳＣ−アルファ細胞）に対応するトランスレーショナル関連性を有する２つの細胞集団が同定された。
【０３０９】
これらの主な集団の範囲外で、両方のプロトコールは、ステージ４の終了時という早期に出現するＳＳＴ＋／ＨＨＥＸ＋／ＩＳＬ１＋細胞の小集団を含む。高レベルのＦＯＸＪ１＋によって標識された単一集団は、たった１つのプロトコールで存在していた（図３３）。プロトコールバリアントの細胞型の比が大きく異なると予想されるにもかかわらず（図１６Ｄ〜１６Ｇ、図２１Ｆ〜２１Ｉ）、プロトコールにわたって共有されたあらゆる細胞型は類似の遺伝子発現シグネチャーを示した（図２１Ｊ）。細胞型の同一性を変化させることなく、プロトコールの修正によって集団の比に有意に影響を及ぼすことができると結論づけた。
【０３１０】
最後に、胚性幹細胞（ＥＳＣ、ＨＵＥＳ８株）の分化から産生されたステージ６細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ、１０１６／３１株）と比較して、対応する細胞型の間に高い相関関係が認められた（図２１Ｋ〜２１Ｍ）。まとめると、これらの結果は、インビトロベータ細胞分化プロトコールが分化因子および幹細胞系における撹乱に対して頑強な系譜の進行をガイドすることを確立する。
【０３１１】
ＳＣ−ベータ細胞は安定に同一性を維持する
ＳＣ−ベータ細胞の重要な性質は、グルコース応答性および内因性ヒトベータ細胞に対する転写類似性である。外因性シグナル伝達因子を含まない無血清培地を使用して、これらの性質をステージ６の数週間にわたって特徴付けた（プロトコールｖ８）。毎週の間隔で３つの分化からサンプリングして、シングルセルＲＮＡシーケンシングおよびインビトログルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）試験を、ステージ６の数週間にわたって実施した（図１７Ａ）。
【０３１２】
ＳＣ−膵島は、ステージ６の最初の１週間でグルコース応答性のインスリン分泌を獲得し、この能力がさらに約４週間保持される（図１７Ｂ〜１７Ｃ、図７）。認められた刺激指数はヒト膵島対照と同一の範囲であったが、分泌の規模は膵島の方が大きかった。これらの結果は、グルコース応答性が安定な形質であり、外因性因子も血清も必要としないことを示す。
【０３１３】
並行して、ステージ６細胞集団が長期間の培養中でその同一性を維持するかどうかを評価した。前のデータセットに見られるように、ＳＣ−ベータ、ＳＣ−アルファ、ＳＣ−ＥＣ細胞、および非内分泌細胞が同定される（図１７Ｄ〜１７Ｅ、図２３Ａ〜２３Ｂ）。小さく稀な集団（図３３）が０週目のみに存在し、その後に消失するか（ＰＨＯＸ２Ａ＋）、ステージ６の後期に最初に検出される（ＧＡＰ４３＋、ＯＮＥＣＵＴ３＋）。デルタ細胞に類似するＳＳＴ＋／ＨＨＥＸ＋細胞も小さな集団を構成する。任意の時点由来の他の細胞型と比較して、絶対期間（ｒ２＞０．８）および相対期間の両方で、異なる時点の同一細胞型間で高い相関が認められる（図１７Ｆ）。重要なことに、内分泌細胞について、ステージ６中に前駆体状態に向かう分化の証拠も、代替の運命に向かう分化転換の証拠も認められない。したがって、同一性の尺度としての機能を果たすグローバル転写プロファイルが、長期ステージ６培養中に維持されると結論づけた。
【０３１４】
そのグルコース応答性と一致して、ＳＣ−ベータ細胞が、ベータ細胞同一性１５、代謝感知およびシグナル伝達１６、ならびにインスリンの合成、パッケージング、および分泌１７の重要な遺伝子を発現することが観察される。概して、これらの遺伝子は、死体膵島ベータ細胞およびＳＣ−ベータ細胞の両方で発現されるが、後期のＮＫＸ６．１＋前駆体では発現されない（図２３Ｃ〜２３Ｆ）。細胞周期関連遺伝子（ＴＯＰ２Ａ）の無視できる発現および細胞周期インヒビターＣＤＫＮ１Ｃの高発現によって証明されるように、細胞の複製は最小のようである。
【０３１５】
長期間生じるＳＣ−ベータ遺伝子発現の改良を説明することを試みる。擬時間解析を適用することにより、擬時間を使用して細胞の転写状態および抑制された遺伝子発現に応じて細胞を順序付けて、動的遺伝子を同定した（図１７Ｇ〜１７Ｈ）。擬時間に沿って増加する遺伝子としては、ＩＡＰＰおよびベータ細胞の成熟度の他のマーカー（ＨＯＰＸ１３、ＮＥＦＭ１８、およびＳＩＸ２１３、１８（図１７Ｉ）など）が挙げられるが、成熟度または年齢のいくつかのマーカー（ＵＣＮ３１９、ＭＡＦＡ１８、およびＳＩＸ３１８）は発現されなかった。減少した遺伝子としては、ＬＤＨＡ（適切な代謝感知にはその抑制が必要２０）およびＩＧＦ２（ＩＮＳ遺伝子の下流にあり、インスリンのゲノム遺伝子座の転写をより良好に制御することが示唆されている分泌ペプチド）が挙げられる。要約すると、ステージ６中のＳＣ−ベータのトランスクリプトーム中に比較的軽微な変化が認められ、そのうちのいくつかは公知の成熟マーカーに対応する。
【０３１６】
初期ＳＣ−アルファ細胞はインスリンを発現する
インスリンおよびグルカゴンの両方をコードする多ホルモン性細胞は、いくつかのインビトロ膵臓分化プロトコールで報告されている。グルカゴンの範囲外で、これらの細胞は膵島アルファ細胞の多数のマーカーを発現するが、特徴を示すことなくインスリンを発現する。これに基づき、かつインスリン発現がステージ６中に訂正されるので（図２４Ａ）、これらの細胞はＳＣ−アルファ細胞と称される。ＳＣ−アルファ細胞およびＳＣ−ベータ細胞のそのインビボ対応物との類似性を調査するために、成体死体のアルファ細胞とベータ細胞との間で差次的に発現される遺伝子を同定した５（図２４Ｂ）。アルファ細胞での発現がより高い遺伝子がＳＣ−アルファ細胞中でより高いのに対して、ベータ細胞富化遺伝子はＳＣ−ベータ細胞でより高かった（図２４Ｃ〜２４Ｄ）。この結果は、インビトロ由来多ホルモン性細胞が単一ホルモン性グルカゴン発現細胞に変わるという以前の所見と一致する２１。インスリンおよびグルカゴンを共発現する細胞は、以下の２つの状況において観察されている：ヒト胎児膵臓発生（ＩＮＳ＋／ＧＣＧ＋／ＡＲＸ＋細胞がアルファ前駆物質として説明されている）２２および２型糖尿病（ＩＮＳ＋／ＧＣＧ＋細胞が脱分化したベータ細胞として説明されている）２３。これらの状況が単一ホルモン性ＳＣ−アルファ細胞へ向かう一過性の状態であるという証拠を考慮すると、インビトロ多ホルモン性細胞は、発生上のＩＮＳ＋／ＧＣＧ＋／ＡＲＸ＋細胞と適合する可能性がより高い。
【０３１７】
幹細胞由来腸クロム親和性細胞
この調査で、ＴＰＨ１、ＮＫＸ６．１、および低レベルのインスリンを発現するが、ベータ細胞マーカーＧ６ＰＣ２、ＮＰＴＸ２、ＩＳＬ１、およびＰＤＸ１を欠く内分泌細胞の集団を同定した。これらの細胞は幹細胞由来腸クロム親和性細胞（ＳＣ−ＥＣ）であるとの仮説が立てられる。腸クロム親和性細胞は、腸内でセロトニン（５−ＨＴ）を合成して分泌し、腸内でこれらの細胞は化学受容器としての機能を果たす２４。そのトランスクリプトームは、マウス腸上皮２５およびオルガノイド２６のシングルセルシーケンシングによって特徴付けられている。ＳＣ−ベータ細胞（図１８Ａ）と比較して、ＳＣ−ＥＣ細胞は、セロトニン合成に必要な遺伝子（ＴＰＨ１、ＤＤＣ、ＳＬＣ１８Ａ１、図２５Ａ）、ならびにＬＭＸ１Ａ、ＡＤＲα２Ａ、ＦＥＶ、ＴＡＣ１、およびＣＸＣＬ１４などのマーカーを発現する。これらの遺伝子の発現は、他のインビトロ集団およびインビボ膵臓集団の両方と比較して、ＳＣ−ＥＣ細胞で豊富である（図１８Ｂ）。免疫染色により（図１８Ｃ〜１８Ｄ）、ＳＣ−ＥＣ細胞は、ＴＰＨ１、ＬＭＸ１Ａ、およびＳＬＣ１８Ａ１を共発現し、セロトニン（５−ＨＴ）を含むことが確認されている。ＳＣ−ベータ細胞と同様に、これらの細胞は、マウスの腎臓被膜中の移植を生き残る（図１８Ｅ）。ＳＣ−膵島は、ＫＣｌでの脱分極の際にセロトニンを放出するが、高グルコースでの刺激の際には放出せず（図２５Ｂ）、これは、ＥＣ細胞の予想される挙動と一致する２７。ＳＣ−ＥＣ細胞は、本研究の全てのデータセットで認められる。異なるプロトコールを用いたｉＰＳＣ分化由来のバルク発現データ２８においてもＳＣ−ＥＣ遺伝子の発現が認められ（図２５Ｃ〜２５Ｅ）、他のベータ細胞プロトコールにわたるＥＣ細胞および多能性細胞系の存在が示唆される。
【０３１８】
セロトニンはヒトベータ細胞中で産生されることが報告されているが２９、ＴＰＨ１の発現はインビボベータ集団にもインビトロベータ集団にも観察されておらず５〜９、膵臓のシングルセルプロファイリングにおいてＥＣ細胞にも見出されていない５〜１１。他の研究では、年齢または状況に依存する様式でベータ細胞がセロトニンを産生することが示されており、これは既存のシングルセルデータセットでは調査されていない２９〜３１。しかし、最近発表されたデータから撹乱マウスベータ細胞におけるセロトニン／ＥＣプログラムの誘導シグナルが同定され３２、ベータの運命とＥＣの運命との間の短い「距離」が示唆される。具体的には、Ｐｏｌｙｃｏｍｂ抑制複合体２（ＰＲＣ２）成分ＥＥＤのベータ−細胞特異的ノックアウトから２５週間後、腸クロム親和性マーカー遺伝子Ｔｐｈ１、Ｌｍｘ１ａ、Ｓｌｃ１８ａ１、およびＴｒｐａ１の上方制御が認められる（図２５Ｆ）。この分析は、ベータ細胞脱分化モデルにおいてセロトニン／ＥＣプログラムが誘導されることを示し、ベータの運命とＥＣの運命との間の関係が示唆される。
【０３１９】
非内分泌細胞の運命
いくつかの細胞は、ステージ４および５中に内分泌への運命を辿らない（図１１）。これらの非内分泌細胞は、その重要な転写因子の発現および内分泌マーカーの欠如においてより早いステージ由来の膵臓前駆細胞型と類似している。インビボ内分泌細胞およびインビトロ内分泌細胞の両方は大部分が分裂を終了しているのに対して、これらの非内分泌細胞は細胞周期関連遺伝子の発現を保持している（ＴＯＰ２Ａ、図２９）。これらの細胞は内分泌拘束（endocrine  commitment）に従わず、前駆体として留まることもない代わりに、外分泌膵細胞への運命に向かって分化するようである。ステージ６での継続培養中に、これらの細胞は、膵臓の腺房細胞、間葉細胞、および管細胞のマーカーを発現する集団に分割する（図１１）。
【０３２０】
内分泌細胞およびＳＣ−ベータ細胞の精製
単一細胞への解離後の再凝集の調節は、新生児膵臓３３およびインビトロベータ細胞調製物３４から内分泌細胞を精製するために使用されている。酵素による解離後の再凝集をステージ５の後に適用することができることが分かった。以前の方法と異なり、このアプローチは効率を向上させるためにマイクロパターン化表面、懸滴、可溶性細胞外マトリックス因子のいずれも必要としないので、このアプローチはスケーラブルである。シングルセルシーケンシング、フローサイトメトリー、およびＧＳＩＳを使用して（図２７Ａ〜２７Ｈ）、この再凝集手技により非内分泌細胞が枯渇される一方で、細胞同一性を維持し、かつベータ細胞機能を改善することが示される。興味深いことに、再凝集後にＳＣ−膵島を染色すると、類似細胞の領域内に内分泌細胞集団が顕著に区画化されることを示す。
【０３２１】
内分泌富化の範囲外で、ＳＣ−ベータ細胞を特異的に富化する方法を調査した。この解析は、新規のＳＣ−ベータ表面マーカーとしてＩＴＧＡ１（ＣＤ４９ａ）を同定する（図１９Ａ）。興味深いことに、成人膵島ＩＴＧＡ１内の発現はベータ細胞に特異的ではない５。抗ＣＤ４９ａ染色および磁気マイクロビーズを使用して、ＳＣ−ベータ細胞を標識して効率的に選別した。この方法は、５％未満のＳＣ−ＥＣ細胞と共に８０％までのＳＣ−ベータ細胞を含むクラスターを産生する（図１９Ｂ〜１９Ｃ）。さらなるＥＳＣ系および２つのｉＰＳＣ系の分化由来の匹敵する精製が観察される（データ示さず）。これらの高度に精製されたＳＣ−膵島は、インビトロでグルコースに応答し（図１９Ｄ、図２７Ｉ〜２７Ｋ）、静的ＧＳＩＳおよび動的ＧＳＩＳの両方において未選別の再凝集ＳＣ−膵島と比較して刺激指数が高いが、両方のＧＳＩＳにおいて死体膵島と比較して分泌規模は小さい。したがって、シングルセルシーケンシングデータは、インビトロで産生されたベータ細胞を富化するための新規のアプローチを明らかにした。
【０３２２】
ＳＣ−ベータ細胞の起源および系譜
シングルセルシーケンシングは、単一スナップショットおよび連続サンプリングの両方から複雑な発生軌跡を再構築することができる。ＳＣ−ベータ細胞およびＳＣ−ＥＣ細胞は、ステージ４の終了時に存在せず、ステージ５の経過中に出現する。重要な遺伝子（ＰＡＸ４、ＮＫＸ６−１など）が共に発現されることを考慮して、これらの細胞が内分泌誘導中に個別に形成されるかどうか、または一方が他方の前駆物質であるかどうかを決定することを試みた。この目的を達成するために、約４５，０００個の細胞を、２つの独立した分化についてステージ５の全期間にわたって毎日の間隔でシーケンシングした。
【０３２３】
グローバルな視点から、このデータセット中の個別の細胞は、ステージ５の０日目の集団と７日目の集団がつながっている連続体を形成する。ＮＥＵＲＯＧ３（一過性に発現されるインビボ内分泌誘導のマスター制御因子）は、異なる細胞型が次第に出現するにつれて、この連続体内で内分泌細胞と非内分泌細胞を架橋している細胞によって発現される（図２０Ａ〜２０Ｄ、図２０Ｈ、図２８Ａ〜２８Ｂ）。いくつかの０日目細胞は既に内分泌細胞であり、ＳＣ−アルファ細胞（ＡＲＸ＋）またはＳＳＴおよびＨＨＥＸを共発現するデルタ様細胞のいずれかと適合する。他の０日目細胞（ＮＥＵＲＯＧ３−ではなくＦＥＶ＋／ＩＳＬ−で示す）は、その後の時点に由来するＮＥＵＲＯＧ３＋細胞と類似しており、おそらく部分的な内分泌誘導を示している。前駆体をＳＣ−ベータ細胞とつなぐ軌跡は、調査した２つの分岐事象を含む（図２０Ｃ中の矢印）。
【０３２４】
内分泌誘導の開始は、ステージ５中の細胞の第１の主な分岐である。０日目に、前駆体は、ＳＯＸ２＋、ＦＲＺＢ＋、ＰＤＸ１低からＮＫＸ６．１＋、ＰＴＦ１Ａ＋、ＰＤＸ１高細胞までの勾配によって特徴付けられる単一の不均一な集団を形成する（図２８Ｃ〜２８Ｅ）。これらの集団の擬時間順序付けにより、前述の勾配と相関する３３５個の遺伝子が同定される。１日目に、ＮＫＸ６．１＋、ＰＴＦ１Ａ＋、ＰＤＸ１高の勾配終了部でＮＥＵＲＯＧ３＋発現が認められ、したがって、これらの遺伝子が内分泌誘導に最も備えている前駆体を指し示すと推測される。多数の他の転写因子および細胞シグナル伝達遺伝子の変化によってＮＥＵＲＯＧ３が発現される（図２８Ｆ）。内分泌誘導をまだ受けていないか受けられないＮＫＸ６−１＋細胞のサブセットの間で、１日目から開始されるＣＤＸ２の上方制御も認められる（図２８Ｂ、図２８Ｄ）。解析により、ＮＫＸ６．１＋、ＰＴＦ１Ａ＋、およびＰＤＸ１高によって指し示されたステージ４前駆体変動の軸が明らかとなり、内分泌誘導の潜在性が予測される。
【０３２５】
ステージ５内分泌誘導によりＳＣ−ベータ細胞およびＳＣ−ＥＣ細胞が生じ、これらの型の最初期の細胞は３日目に出現する。グローバルクラスタリングおよびマニホールド埋め込みは、ＳＣ−ベータ運命およびＳＣ−ＥＣ運命の後期分枝を示唆する。この分枝の所見を検証するために、全てのＳＣ−ベータ細胞、ＳＣ−ＥＣ細胞、およびＮＥＵＲＯＧ３＋細胞の拡散擬時間を計算した（図２０Ｅ〜２０Ｇ）。各遺伝子へのフィッティングは、共変数として擬時間および枝割り当ての両方を組み込んだモデルであり、これらのモデルを、枝ラベルを含まない１つのフィットと比較する。いくつかの遺伝子（ＮＥＵＲＯＧ３およびＮＫＸ６．１など）は動的に発現するが枝依存性を示さないか、わずかしか示さず（図２０Ｆ）、一方で、３１３個の枝関連遺伝子（多数の転写因子ならびに重要なＳＣ−ベータおよびＳＣ−ＥＣの運命の遺伝子が挙げられる）が同定される（ｑ値０．００１未満および４よりも大きい変化倍率）。解析は、ＳＣ−ベータ細胞およびＳＣ−ＥＣ細胞が、一方が他方の前駆体としての機能を果たすというよりも、共通のＮＥＵＲＯＧ３＋誘導中間体から出現することを示唆している。したがって、これは、ＳＣ−ベータ形成の軌跡上の第２の運命分岐を構成する。この解析から、ＳＣ−ベータ分化によって産生される細胞型の系譜のモデルが提案される（図２０Ｉ）。
【０３２６】
考察
ベータ細胞は、再生医療分野のフロントランナーである。それにもかかわらず、ベータ細胞のための定方向分化プロトコールにより、ベータ細胞と一緒に他の細胞が産生される。この研究では、シングルセルＲＮＡシーケンシング実験を使用して、ＳＣ−ベータ分化中に形成された細胞を包括的に特徴付けた。
【０３２７】
数百万個の細胞を段階的に同期分化することにより、ヒト発生プロセスを研究する前例のない機会が与えられる。ＳＣ−ベータ細胞は、インビトロでグルコースに応答し、シグナル伝達モジュレーターを使用しない長期培養下でその同一性を維持することを示す。動的遺伝子としては、ベータ細胞成熟のいくつかのマーカーが挙げられる。さらに、多ホルモン性細胞の同一性については、以前より議論の余地があった。多ホルモン性細胞がインスリンを一過性にのみ誤発現するアルファ様（ＳＣ−アルファ）細胞を示すと結論づける。移植において、これらの細胞は、ＳＣ−膵島内での局所相互作用またはオートクリンシグナル伝達によってベータ細胞機能を改善し得る。内分泌誘導できない前駆体が膵臓外分泌細胞型に向けて進行することを示す。これらの前駆体が複製し得るか、移植デバイス内の重要な空間を占拠し得るので、これらの前駆体は望ましくないようである。これらの前駆体を排除するために、内分泌細胞を富化するスケーラブルな再凝集方法を記載する。さらに、ＣＤ４９ａをＳＣ−ベータ細胞の表面マーカーと同定し、磁気選別によって純度の高いＳＣ−ベータクラスターを生成する。
【０３２８】
この解析の予想外の所見は、インビトロでのＳＣ−ＥＣ細胞の存在である。ＳＣ−ＥＣ細胞はＳＣ−ベータ細胞と密接に関連しているが基本的に異なり、分化の後期分岐から生じることが示される。この酷似および重要な遺伝子（ＮＫＸ６．１＋／ＣＨＧＡ＋／ＧＣＧ−）の発現プロファイルを考慮すると、これらの細胞は、予め選択された遺伝子群を使用した方法で分析した場合に、前駆体または真のベータ細胞のいずれかに誤分類され得る１４。インビボでは、腸クロム親和性細胞は、マウスおよびヒトの膵島の研究において認められていない５〜９。それにもかかわらず、原発性膵臓セロトニン産生カルチノイド腫瘍の極めて稀な報告が、膵臓腸クロム親和性細胞の常在を支持している３５。重要なことに、ＣＤ４９ａ精製によりＳＣ−ＥＣ細胞が枯渇することが示される。
【０３２９】
この研究により、ベータ細胞分化プロトコールの今後の開発のための情報が得られる。例えば、シグナル伝達経路の調整によって細胞運命が調節されるという仮説は受容体の発現パターンまたは推測されるシグナル伝達活性によってガイドされ得る。ＳＣ−ベータ細胞は死体ベータ細胞と非常に類似しているが、依然として異なり、この相違としては、ＵＣＮ３、ＭＡＦＡ、およびＳＩＸ３の発現を欠くことが挙げられる。これらの遺伝子はおそらくインビボでの移植後に発現されるが、これらの遺伝子はこれまで以上のインビトロでの成熟ＳＣ−ベータ細胞を追い求める中での次のマイルストーンを示す。並行して、ＳＣ−ベータ分化の特徴付けにおけるさらなるマイルストーンは、タンパク質、エピジェネティクス、および系譜のシングルセル測定に由来する。
【０３３０】
全体的に見て、ヒトへの治療を予定した幹細胞産物の包括的かつ詳細な分析を提供する。このタイプの高解像度シングルセルプロファイリングは、首尾よくかつ安全な治療につなげるのに必要なステップを示す。
【０３３１】
方法
細胞培養
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を、以前に記載のように維持し、分化させた１。多能性幹細胞系は、Ｍｅｌｔｏｎ  ｌａｂまたはＳｅｍｍａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって維持されたストックから入手した。ＤＮＡフィンガープリント（Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）によって細胞系を同定し、試験した全ての系は、日常的なマイコプラズマの検証において陰性であった。多能性幹細胞系を、３７℃、５％ＣＯ２、湿度１００％のインキュベーター中の７０ｒｐｍでスピンした５００ｍＬスピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＶＷＲ）中で、ｍＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，８５８５０）を使用したクラスター懸濁培養物形式で維持した。細胞を７２時間毎に継代した：ｈＰＳＣクラスターを、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ＡＴ１０４−５００）および軽度の機械的破壊を使用して単一細胞に解離し、計数し、ｍＴｅＳＲ１＋１０μＭ  Ｙ２７６３２（ＤＮＳＫ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＤＮＳＫ−ＫＩ−１５−０２）中に０．５Ｍ細胞／ｍＬで播種した。
【０３３２】
ｍＴｅＳＲ１培地を除去し、プロトコールに適切な培地および成長因子または小分子の補足物質で置き換えることによって、継代から７２時間後にフラスコでの分化を開始した（図３２および図３７〜４２を参照のこと）。小分子およびシグナル伝達因子を調製し、単回使用アリコートとして保存した。供給中、分化したクラスターを５〜１０分間重力沈降させ、培地を吸引し、３００ｍＬの予め温めた培地を添加する。ヒト細胞を含む全ての実験は、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＩＲＢおよびＥＳＣＲＯ委員会によって承認されていた。
【０３３３】
フローサイトメトリー
懸濁培養物（１〜２ｍＬ）からサンプリングした分化したクラスターを、３７℃でＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ；１２６０４０１３）を使用して解離し、機械的に破壊して単一細胞を形成させ、４％ＰＦＡを使用して室温で３０分間固定し、ＰＢＳ中にて４℃で保存した。染色のために、固定した単一細胞を、ブロッキング緩衝液中にて室温で１時間インキュベートし、次いで、一次抗体を含むブロッキング緩衝液中でインキュベートし（室温で１時間または４℃で一晩）、ブロッキング緩衝液で３回洗浄し、ブロッキング溶液中で二次抗体と共にインキュベートし（室温で１時間）、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ；６８７００）で３回洗浄し、再懸濁した。ブロッキング緩衝液：ＰＢＳ＋０．１％サポニン（Ｓｉｇｍａ；４７０３６）＋５％ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ；１００１８１−２３４）。染色された細胞を、ＬＳＲ−ＩＩ、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはＡｔｔｕｎｅ  ＮｘＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のフローサイトメーターを使用して分析した。例示的なゲーティングストラテジーを、図１３に示す。この研究で示した結果は、１００を超える独立したｖ８分化の代表である。
【０３３４】
免疫蛍光顕微鏡法
分化したクラスターを、４％ＰＦＡ中にて室温で１時間固定し、洗浄し、ＯＣＴで凍結し、切片にした。染色前に、パラフィン包埋試料をＨｉｓｔｏ−Ｃｌｅａｒで処理してパラフィンを除去した。全てのスライドをエタノール勾配によって再水和し、煮沸抗原回復試薬（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０）中で３０分間インキュベートした。染色のために、スライドをＣＡＳブロック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；００８１２０）中にて一次抗体と４℃で一晩インキュベートし、３回洗浄し、二次抗体中にて室温で２時間インキュベートし、洗浄し、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｈ−１２００）またはＤＡＰＩを含むＰｒｏＬｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｍｏｕｎｔａｎｔ中にマウントし、カバーガラスで覆い、透明マニキュアでシールした。代表的な領域を、Ａｐｏｔｏｍｅを備えたＺｅｉｓｓ．Ｚ２またはＺｅｉｓｓ  ＣｅｌｌＤｉｓｃｏｖｅｒｅｒ７顕微鏡を用いて画像化した。示した画像は、適合しているか類似しているステージ由来の少なくとも３つの生物学的に異なる分化の類似の結果の代表である。
【０３３５】
抗体
一次抗体（供給者；カタログ番号、有効希釈度）：ラット抗Ｃ−ペプチド（ＤＨＳＢ；ＧＮ−ＩＤ４；１：１００）、マウス抗ＮＫＸ６．１（ＤＨＳＢ；Ｆ５５Ａ１２；１：５０）、ウサギ抗ＣＨＧＡ（Ａｂｃａｍ；ａｂ１５１６０；１：５００）、ウサギ抗ＳＬＣ１８Ａ１（Ｓｉｇｍａ；ＨＰＡ０６３７９７；１：３００）、ウサギ抗ＬＭＸ１Ａ（Ｓｉｇｍａ；ＨＰＡ０３００８８；１：３００）、ヒツジ抗ＴＰＨ１（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ＡＢ１５４１；１：１００）、ヤギ抗５−ＨＴ（Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ；２００７９；１：１０００）、ウサギ抗ＳＯＸ９（Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ；ＡＣ−０２８４ＲＵＯ；１：５００）、マウス抗グルカゴン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．；ＳＣ−５１４５９２；１：３００）。
【０３３６】
二次抗体（供給者；カタログ番号、全てを１：３００希釈で使用）：抗ラット５９４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ．；Ａ２１２０９）、抗マウス５９４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ．；Ａ２１２０３）、抗マウス６４７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ．；Ａ３１５７１）、抗ウサギ４８８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ．；Ａ２１２０６）、抗ウサギ５９４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ．；Ａ２１２０９）、抗ウサギ６４７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ．；Ａ３１５７３）、抗ヤギ６４７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ．；Ａ２１４４７）、抗ヒツジ４８８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ．；Ａ１１０１５）、抗ラット４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓ．；７１２−５４６−１５３）、抗ラット４０５（Ａｂｃａｍ；ａｂ１７５６７０）。
【０３３７】
移植研究
分化したクラスターの移植を、以前に記載のように行った１。簡潔に述べれば、約５００ＩＥＱのヒト膵島または約５×１０６個のステージ６ネイティブ（１０日目、非再凝集）ＳＣ−膵島クラスターを、８週齢と１２週齢との間の雄ＳＣＩＤベージュマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓ）の腎臓被膜下に移植した。移植から指定の時間後、移植片を含む腎臓を切開し、４％ＰＦＡ中にて４℃で一晩固定した。固定された腎臓をパラフィン包埋し、免疫蛍光染色のために切片にし、免疫蛍光染色を上記のように実施した。全ての動物研究は、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＩＡＣＵＣによって承認されていた。
【０３３８】
グルコース刺激によるインスリンおよびセロトニンの分泌
ヒト膵島（約４００ＩＥＱ，Ｐｒｏｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）またはＳＣ−膵島クラスター（分化２８日と６０日の間の約４×１０６細胞と等価）を、技術的３回反復およびインスリン／セロトニン含有量試料を収集するために４つの部分に分割した。Ｋｒｅｂｓ緩衝液（ＫＲＢ）を調製した：１２８ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、２．７ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１５６３００８０）、０．１％ＢＳＡを含む脱イオン水。クラスターを低グルコース（２．８ｍＭ）ＫＲＢで２回洗浄し、次いで、２４ウェルプレートインサート（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｓｅｒｔ；ＰＩＸＰ０１２５０）にロードし、３７℃のインキュベーター中の低グルコースＫＲＢ中にて１時間ファスティングして残存インスリンを除去した。クラスターを低グルコースＫＲＢで１回洗浄し、低グルコースＫＲＢ中で１時間インキュベートし、上清を回収した。次いで、クラスターを高グルコース（２０ｍＭ）ＫＲＢに１時間移し、上清を回収した。この手順をさらに１回繰り返し、クラスターを高グルコースインキュベーションと第２の低グルコースインキュベーションの間で１回洗浄して残存グルコースを除去した。最後に、クラスターを、２．８ｍＭグルコースおよび３０ｍＭ  ＫＣｌ（脱分極チャレンジ）を含むＫＲＢ中で１時間インキュベートし、次いで、上清を回収した。次いで、クラスターを、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓを使用して単一細胞に分散させ、細胞数を、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって自動的に計数して、インスリンレベルを細胞数で正規化した。分泌したインスリンを含む上清試料を、Ｈｕｍａｎ  Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ（ＡＬＰＣＯ，８０−ＩＮＳＨＵＵ−Ｅ０１．１）およびセロトニンＥＬＩＳＡ（ＡＬＰＣＯ；１７−ＳＥＲＨＵ−Ｅ０１−ＦＳＴ）を使用して処理した。
【０３３９】
グルコース刺激インスリン分泌についての動的灌流アッセイ
動的ＧＳＩＳを以前に記載のように実施した１９。Ｐｒｏｄｏｌａｂｓの非糖尿病ヒト膵島（試料あたり直径１００〜２５０ｕｍのサイズの２５ＩＥＱの膵島をハンドピックした、ｎ＝３）およびネイティブまたは精製したＳＣ−ベータクラスター（試料あたり直径１００〜２５０μｍのサイズの２５クラスターをハンドピックした、ｎ＝３）を、全自動Ｐｅｒｉｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲｅｐ）でアッセイした。チャンバーを、２．８ｍＭまたは２０ｍＭグルコース、またはＫＲＢ緩衝液中の３０ｍＭ  ＫＣＬを含む２．８ｍＭグルコースにて流速１００ｕｌ／分で連続的に灌流した。チャンバーを、ファスティングのために最初に低グルコース（２．８ｍＭ）で１時間灌流し、次いで、低グルコースで１５分間インキュベーション後、高グルコース（２０ｍＭ）で３０分間チャレンジした。次いで、試料を低グルコースで１５分間灌流後、低グルコースおよび３０ｍＭ  ＫＣｌで１５分間灌流した。上清中のインスリン濃度を、Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｃｏ；８０−ＩＮＳＨＵＵ）を使用して決定した。インスリン分泌レベルを、総細胞数で正規化した（ｕＩＵ／ｍＬ／１０００細胞）。
【０３４０】
非内分泌細胞を除去するための再凝集手技
確実に方法（以前の関連技術とは異なる３４、３６〜３９）を数十億個の細胞の規模で展開することができるようにするために、再凝集手技を拡張可能なように最適化した。ＳＣ−膵島を、ステージ５分化の終了時に単一細胞に解離した。３００ｍＬのＳＣ−膵島培養物をＰＢＳで洗浄し、２５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ中にて３７℃で２０分間インキュベートした。次いで、細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳでクエンチしてスピンダウンし、その後に１０ｍＬのステージ６培養培地に再懸濁した。残存する非解離細胞のクラスターを、Ｐ１０００ピペットを使用して機械的に解離させた。単一細胞の上清をステージ６培地で体積５０ｍＬまでさらに希釈後、４０μｍメッシュのフィルター（ｐｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ）に通していかなる残存する非解離クラスターも除去した。解離した単一細胞を計数し、スピナーフラスコ中のステージ６培地中に１Ｍ細胞／ｍＬの密度で播種し、インキュベーター中にて７０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で培養した。内分泌細胞は２４時間以内にクラスターに自己凝集し、一方で、前駆細胞は上清中にとどまっている。培養４８時間後、全ての細胞をスピンダウンし、新鮮なステージ６培地に再懸濁することによって細胞に給餌した。その後に２０μｍメッシュのフィルター（ｐｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ）を使用して、４８時間毎に培地を交換した。内分泌細胞が富化された再凝集クラスターを、２０μｍメッシュのフィルターで回収し、元の体積のステージ６培地を含むスピナーフラスコ中に再度播種した。２０μｍメッシュのフィルターを通過した単一細胞を含む上清を破棄した。
【０３４１】
ＣＤ４９ａ／ＩＴＧＡ１を使用した磁気富化
ステージ６クラスター（ステージ６の２週目に採取）を、７５ｍＬのステージ６培養から開始して、上記の再凝集項に見られるように解離させた。解離した単一細胞を、選別緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁し、３５μｍメッシュのフィルターで濾過した。細胞を計数し、１５ｍＬコニカルチューブ中で１０Ｍ細胞／３００μＬの密度に再懸濁した。細胞を、１：１００希釈の抗ヒトＣＤ４９ａ  ＰＥコンジュゲート（ＢＤ番号５５９５９６）抗体を使用して室温で２０分間染色し、遮光し、３分毎に撹拌した。染色された細胞を、スピンダウン（５分間、３００ｇ）し、その最初の密度１０Ｍ細胞／３００μＬまで再懸濁することによって、１５ｍＬの選別緩衝液で２回洗浄した。マイクロビーズで標識するために、各１０Ｍ細胞について４０μＬの抗ＰＥ  ＵｌｔｒａＰｕｒｅ  ＭＡＣＳマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  １３０−１０５−６３９）を添加し、細胞溶液を４℃で１５分間インキュベートし、５分毎に撹拌した。染色された細胞を上記のように２回洗浄し、標的密度２５Ｍ〜３０Ｍ細胞／５００μＬに再懸濁した。次いで、体積５００μＬ（３０Ｍ細胞以下を含む）を、推奨プロトコールを使用して、ＱｕａｄｒｏＭａＣＳ分離器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  １３０−０９０−９７６）中のＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  １３０−０４２−４０１）で磁気分離した。簡潔に述べれば、５００μＬの細胞を予備洗浄したカラムに添加し、３ｍＬの選別緩衝液で３回洗浄し、分離器から取り出し、最終体積５ｍＬで洗浄した。異なるカラム由来の最終細胞分画をプールした。成功したＰＥ富化を、Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）フローサイトメーターでの生細胞フローサイトメトリーによって検証し、典型的な実験において７０％＋の富化が示された。例示的な精製結果を図１６に示す。この方法は論文に示された結果においては使用されなかったとはいえ、ＬＳカラムに２回通過させるとＣＤ４９ａ＋細胞が９０％まで富化されるが（下流で得られるＳＣ−ベータ画分は９０％を上回る）、回収細胞数は減少する。富化した細胞をステージ６培地で０．５Ｍ細胞／ｍＬの濃度に希釈し、超低接着６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ番号３４７１）に２ｍＬ培養物／ウェルで播種し、再凝集させるために２７ｒｐｍのロッカーに置いた。次いで、通常のプロトコールにしたがってクラスターを４８時間毎に給餌した。規模の理由から、再凝集対照実験をロッカー中で行ったが、内分泌富化効率はスピナーフラスコ中よりも低いことに留意のこと。典型的な収量は、総細胞数約１５０Ｍから開始した場合、およそ１０〜１５Ｍ精製細胞であった。細胞を、精製７〜９日後に機能について評価した。
【０３４２】
シーケンシングのための分化細胞の調製
分化したクラスターを、以下のようにシングルセルＲＮＡシーケンシングのために調製した：１〜２ｍＬ懸濁培養物をスピナーフラスコからサンプリングし、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓで解離させ（３７℃、５〜１５分間）、冷ＰＢＳ＋１％ＢＳＡでクエンチし、Ｐ１０００ピペットで穏やかに分散させた。次いで、細胞を遠心分離し（３００ｒｐｍ、３分間）、冷ＰＢＳ＋１％ＢＳＡに再懸濁し、７０μｍメッシュのフィルターで濾過した。遠心分離、再懸濁、および濾過を、合計で３回繰り返した。次いで、細胞を計数し、１３％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ；Ｄ１５５６）を含む１×ＰＢＳでｉｎＤｒｏｐｓの作業希釈度（１００，０００細胞／ｍＬ）まで再懸濁した。
【０３４３】
ｉｎＤｒｏｐｓシングルセルＲＮＡシーケンシング
シングルセルＲＮＡシーケンシングを、以前に記載のようにｉｎＤｒｏｐｓプラットフォームを使用して実施した４，４０。ほとんどの試料を、「ｉｎＤｒｏｐｓ  ｖ２」バーコードを付けたヒドロゲルビーズ（１  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ，Ｈａｒｖａｒｄ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｒｅ）を使用して実行し、１つの実験では「ｉｎＤｒｏｐｓ  ｖ３」ビーズ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｒｅ）を使用して実行した。ｉｎＤｒｏｐｓプロトコール後、各生物試料を、被包後に１０００〜３０００細胞のいくつかのアリコートに分割した。少なくとも２つのライブラリーアリコートを、各試料から個別に調製し、推奨される指標配列を使用して指標付けし、プールし、ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でシーケンシングした。第１の実験セット（ステージ３〜６時間経過）は、時点あたり数千個の細胞のシーケンシングを含んでおり、予想される細胞型の多様性を評価した。次のステージ５および６の時間経過のために、技術的反復として個別のフラスコを使用し、個別の時点由来の数千もの細胞を測定し、それにより、稀な集団または主な細胞型の僅かな変化を同定する能力が増加した。
【０３４４】
ｉｎＤｒｏｐｓの生データの処理
シーケンシングの読み取りデータを、以前に公開されたｉｎＤｒｏｐｓパイプライン（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｉｎｄｒｏｐｓ／ｉｎｄｒｏｐｓ／）にしたがって処理した。パイプラインを実行するために、Ｅｎｓｅｍｂｌ  ＧＲＣｈ３８ヒトゲノムアセンブリおよびＧＲＣｈ３８．８８トランスクリプトームアノテーションから参照インデックスを構築した。簡潔に述べれば、パイプラインは、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃを使用して読み取りデータをトリミングし、読み取りデータをヒトトランスクリプトームにマッピングするためにＢｏｗｔｉｅ１．１．１を使用し、ＵＭＩＦＭと呼ばれる固有の分子識別子を使用して転写物の発現数を定量する。各ライブラリーについて、ＵＭＩＦＭカウント行列を以下のようにフィルタリングした：３カウント未満の遺伝子を除去した；ミトコンドリアでコードされた注釈付が不十分な遺伝子を除去した；ＵＭＩＦＭカウント７５０（ステージ５および６の時間経過）未満または１０００（全ての他のデータセット）未満の細胞を除去した。各細胞のカウントの合計を１０，０００に対して正規化することによって個別の細胞の総カウントの変動を取り除いた。これらの正規化されたカウントを以下の入力データとして使用し、データ表示のためにＴＰＭ値に変換した。
【０３４５】
次元削減およびクラスタリング
各データセットの次元削減およびクラスタリングを、Ｚｅｉｓｅｌら．２０１８４１に示したアプローチの修正バージョンに大まかにしたがって行った。非正規化カウントを使用して、高可変遺伝子を、以前に記載のように４１、平均発現の関数として変動係数の高い外れ値を見出すことによって同定した。次いで、各データセット内で、（奥行き正規化）カウント値を、遺伝子ごとにさらにｚ正規化してｚ正規値を得た。可変遺伝子のｚ正規値（データセットあたり）を、主成分分析（ＰＣＡ）の入力データとして使用した。ステージ５データセットの主成分を計算すると、細胞周期マーカーＴＯＰ２Ａと相関する遺伝子（０．１５より大きいピアソン相関）が同定され、これを排除した。Ｌｅｉｄｅｎコミュニティ検出４２（Ｌｏｕｖａｉｎコミュニティ検出の現在公開されている改良版）を使用してクラスタリングを行った。コミュニティ検出のために、最初の５０ＰＣの空間中に細胞の２５０（ステージ５および６の時間経過）または１００（他のデータセット）の近傍の相互エッジのみを保持することによって相互ｋＮＮグラフを作成した。必要とあれば、細胞注釈づけを改善するために、細胞のサブセットに対するコミュニティ検出を繰り返した。相互エッジのみを保持することによってデータ内で正確に区別することが最も困難なクラスターに対応するＳＳＴ＋／ＨＨＥＸ＋細胞を分離する能力が改善されることに留意のこと。各データベースについて、この次元削減手技後のクラスタリングを、データセットあたり２回行った。第１のパスを使用して、平均ライブラリーサイズがより小さいか、発現マーカーを欠くか（Ｚｅｉｓｅｌら中のスコアを使用して定義）、明らかに二重発現パターンを示すクラスターを同定した。ステージ５および６の時間経過について、この第１のフィルタリングパスを、時点あたり１回実行し、完全データセット（その後に完全なデータセットに使用）について再度実行した。フィルタリングした細胞を、第２のクラスタリングパスで無視した。この第２のクラスタリングパス後、個別のクラスターを、その発現プロファイルを、各集団についての予め定義されたマーカー遺伝子セットと相関させることによって同一性に割り当てた（必要に応じて、他と統合する）。クラスターの解釈後、クラスターのｓｃｉｋｉｔ−ｌｅａｒｎランダムフォレスト分類器をトレーニングし、アウト・オブ・ブートストラップ予測を使用して、最終ラベルを細胞に割り当てた。この分類器を、ランダム木を通して予測ラベルが６６％の大多数を占める細胞を保持することによって第１のパスフィルターで除去された細胞を回復させるために使用することもでき、それにより、データセットを通しておよそ５％の細胞が戻された。これらの保持された細胞を下流分析に組み込んだが、主成分が見出されたときは無視した。ｔＳＮＥ投影図を、最初の２５主成分を使用したＣ  Ｂａｒｎｅｓ−Ｈｕｔ  ｔ−ＳＮＥ実装（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｌｖｄｍａａｔｅｎ／ｂｈｔｓｎｅ）のＰｙｔｈｏｎラッパーで計算した。ラベル内の平均遺伝子発現レベルを計算するために、そのラベルに割り当てられた全ての細胞についてのＵＭＩＦＭカウントを合計し、これらの合計したカウントに対してｔｐｍ正規化を��算した。クラスター内の所与の遺伝子を発現する細胞画分も、（同一データセットの任意の細胞中の）その遺伝子の１％の最大発現を発現時の定量のための閾値として使用して計算した。（図２１Ｊ、図２１Ｍ、図１７Ｆに見られるような）細胞群の相関関係を、データセット全体を通して高度に変動する２０００個の遺伝子を最初に選択し、（上記のように）各細胞群内の平均発現を計算し、異なるクラスを通して各遺伝子をｚ正規化し、次いで、これらの２０００個の遺伝子についての試料間のピアソンｒ相関係数を計算することによって計算した。
【０３４６】
拡散擬時間解析
拡散擬時間解析（ＤＰＴ）４３を、１０の非標準化主成分中の１００の最近傍を使用したＳｃａｎｐｙパッケージ４４を使用して行い、１０の拡散成分を見出した。次いで、ＤＰＴを手作業で指定したルートセルから計算し、セルを、ＤＰＴ枝に沿ってそのランクによって順序付けた（存在する場合）。ステージ５分枝解析では、ＳＣ−ベータまたはＳＣ−ＥＣのクラスターに割り当てられた細胞を、その枝に割り当て、一方で、前駆細胞を枝に無作為に割り当てた。各枝に沿った擬時間は、順位付けられた細胞の順序に対応して０から１まで増減するが、両方の枝が値０．５で共通の前駆体から分岐するように前駆体のランクを調整する。発現が擬時間の関数である遺伝子を同定するために、ＢＥＡＭ４５モデルのあるバージョンを実装した。非分枝擬時間軌跡について、２つの負の二項一般化線形モデルを、ＶＧＡＭ  Ｒパッケージを用いてフィッティングした。第１のモデルは、擬時間の自然スプライン関数を組み込んだ完全モデルである。第２のモデルは、擬時間スプライン項を含まない削減モデルである。分枝軌跡について、第２の完全モデルは、回帰変数として各細胞の枝項を組み込んでいる。次いで、枝間または擬時間軌跡を通した変化倍率を、回帰した値を使用して計算する。その特定の解析で解析した全ての細胞に対してそれぞれ回帰を行い、回帰で得られた試料のサイズは以下である：図１７Ｇ〜１７Ｉ中の削減については１０，０３４（ＳＣ−ベータ細胞数）、図２８Ｃ〜２８Ｅ中の削減については５，１３１（ステージ５、０日目の前駆体数）および５，１０９（ステージ５、１日目の前駆体数）、ならびに図２０Ｅ〜２０Ｇ中の削減については１８，０９９（前駆体、内分泌誘導、ＳＣ−ＥＣ、またはＳＣ−ベータ細胞の数）。ＢＥＡＭの刊行物で行ったように、完全モデルおよび削減モデル下のデータの尤度を、尤度比検定（自由度３を用いる）を使用して比較し、ＦＤＲ（アルファ＝０．００１）補正済みのｑ値として報告する。これによって有用な有意性の相対尺度が得られるが、この解析は、細胞の擬時間値が最初に試験したいくつかの遺伝子に由来するという事実を説明しないので、有意水準がおそらく誇張されることに留意のこと４６。擬時間解析由来の変化倍率を報告するとき、推定発現の下限（ｔｐｍ＝１０）により、強制的に高変化倍率を人為的に防止する。次いで、軌跡の開始時と終了時との間の変化倍率を、軌跡の最初および最後の５％における平均推定発現の比較によって計算する。
【０３４７】
ヒト膵島ｉｎＤｒｏｐｓデータの解析
Ｂａｒｏｎら５由来の生のシーケンシング読み取り値を上記のように再度処理して、インビトロシーケンシングデータと同一の基準でそれらをアラインメントした。ＵＭＩＦＭカウントを、上記のとおり発現削減のためにｔｐｍに変換した。最後に、上記のようにクラスタリングを行って、元の刊行物に見られるように同一の細胞クラスを同定した。
【０３４８】
ベータ−細胞ＥＥＤ２ノックアウトデータの再解析
処理したＲＮＡシーケンシングデータを、ＧＥＯ（受入番号ＧＳＥ１１０６４８）からダウンロードした。リードカウント値を入力データとして使用して、Ｖｏｏｍ４７およびＬｉｍｍａ４８を使用した線形モデルを作成した。元データは、２つの時点（ノックアウト誘導から８および２５週間後）で解析した３つの異なる遺伝子型（ＷＴ、ヘテロ接合性、およびホモ接合性のＥＥＤ２−ｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子）を含む。二連である、２５週間のヘテロ接合性試料およびホモ接合性試料を除いて、合計１５試料について、全ての条件は３連の試料を有した。デザイン・コントラストパラメトリゼーションを使用して、データセット中の６つの条件全てにわたって複製群を最初に定義し、その後にＥＥＤ２  ＫＯ条件後の２５週間の間にＷＴ、ヘテロ接合性、およびホモ接合性のＥＥＤ２−ｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子について差次的に発現される遺伝子を同定した。アルファ＝０．０５を用いたＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ  ＦＤＲ手技を使用して、多重仮説検定を補正した。
【０３４９】
選別したＮＫＸ６．１（ＧＦＰ）＋／−集団の再解析
Ｇｕｐｔａら２８由来の完全な統計解析を、刊行物の補足資料からダウンロードした。報告された平均発現、変化倍率、および有意値を直接使用して、関連する図を作成した。
【０３５０】
遺伝子セット富化解析
遺伝子セット富化解析（ＧＳＥＡ）を、ＮＫＸ６．１＋前駆体、ＳＣ−ベータ細胞、および膵島ベータ細胞の間の変化倍率、またはＳＣ−ベータ擬時間発現を追跡した変化倍率を入力データとして使用した「予め順位付けした」分析を行うためのＧＳＥＡ３．０を使用して実施した。ＭＳｉｇＤＢのＨａｌｌｍａｒｋ（ｈ．ａｌｌ．ｖ６．２）およびＣａｎｏｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｗａｙカテゴリー（ｃ２．ｃｐ．ｖ６．２）ならびに１つの単一の分析における図８で定義したカスタム遺伝子セットを含む分析を実施して、確実に多重仮説検定のために適切に補正した。５遺伝子という小さなセットサイズが含まれていたが、そうでなければデフォルト設定を使用して実施した。
【０３５１】
参考文献
【化１】
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【化２】
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【化３】
2021522819.tif 000008
【化４】
2021522819.tif 000009
【化５】
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【図１−１】
2021522819.tif 000011
【図１−２】
2021522819.tif 000012
【図１−３】
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【図２−１】
2021522819.tif 000014
【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２１−５】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２７−４】
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【図２７−５】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４４−３】
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【図４６−３】
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【図４６−４】
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【図４６−５】
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【図４７−１】
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【図４７−２】
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【図４７−３】
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【図４７−４】
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【図４７−５】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１−１】
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【図５１−２】
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【国際調査報告】
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