(57)【要約】  本発明は、Ｓ−エクオールで乳癌を治療又は予防するための方法及び組成物を提供する。本方法及び組成物は、特に、トリプルネガティブ乳癌を治療するのに適する。Ｓ−エクオールは、単独で、又は１つ以上の細胞障害性又は免疫療法の合成物又は分子と組み合わせて投与され得る。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ−エクオールを含む製剤を、その必要がある対象に薬学的有効量投与することを含む、乳癌の治療又は予防方法。
【請求項２】
前記対象は、トリプルネガティブ乳癌と診断されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記製剤は、１０〜２００ｍｇのＳ−エクオールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記製剤は、５０〜１５０ｍｇのＳ−エクオールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記製剤は、約５０ｍｇのＳ−エクオールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記製剤は、約１５０ｍｇのＳ−エクオールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記製剤は、経口、静脈内、腹腔内又は皮下投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記対象はヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｓ−エクオールは、１つ以上の他の癌治療と組み合わせて投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｓ−エクオールは、免疫療法剤と組み合わせて投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫療法剤は、抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）を対象とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体は、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤＬ−１）を対象とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体は、ペムブロリズマブである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体は、アテゾリズマブである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体は、アベルマブである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記製剤は、本質的に、ゲニステイン、ダイゼイン及び／又はＩＢＳＯ０３５６９である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ゲニステイン、ダイゼイン及び／又はＩＢＳＯ０３５６９は、Ｓ−エクオールとともに同時投与されることはない、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記製剤は、本質的にＲ−エクオールを含まない、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｓ−エクオールは、化学的に製造される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記製剤は、日に１回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記製剤は、日に２回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記製剤は、日に３回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記製剤は、日に４回投与される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［政府支援についての記載］
本発明は、アメリカ国立衛生研究所及びテキサス州癌研究助成契約により認められた助成番号ＣＡ２０６５２９及びテキサス州癌予防研究所により認められた助成番号ＤＰ１５００５５のもと米国政府支援により実現した。米国政府及びテキサス州政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１８年０６月１５日出願の米国仮出願第６２／６８５，３９２号の優先権を主張し、その開示のすべてが参照により本明細書に援用される。
【０００３】
［発明の分野］
本発明は、Ｓ−エクオール又はＳ−エクオールを含む製剤組成物を薬学的有効量用いて乳癌を治療又は予防するための方法及び組成物に関する。好ましい実施形態において、本発明は、トリプルネガティブ乳癌の治療に関する。別の実施形態において、本方法は、Ｓ−エクオールを用いた治療と、免疫療法等の別の抗癌治療との組み合わせに関する。
【背景技術】
【０００４】
［関連技術の説明］
乳癌は、不均一性が高く、複数のサブタイプからなる。トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）は、エストロゲン受容体α（ＥＲα）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）及びヒト上皮増殖因子受容体２型（ＨＥＲ２）の発現がない、乳癌のサブタイプである（Ｃｌｅａｔｏｒ他（２００７）、Ｋａｎｇ他（２００８）、Ｃｈｉａ及びＴｕｔｔ（２００７）、Ｄｉａｚ他（２００７）、Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ａｎｇｕｌｏ（２００７）、Ｒｅｉｓ−Ｆｉｌｈｏ及びＴｕｔｔ（２００８）、Ｉｒｖｉｎ及びＣａｒｅｙ（２００８））。ＴＮＢＣはすべての乳癌のおよそ１５％を占めるが、ＴＮＢＣの患者の死亡率は、他のサブタイプの乳癌に比べて不相応な程高い。ＴＮＢＣは、さらに急速な増悪が起こりやすいが（Ｇｅｒｓｏｎ他（２００８）、Ｄｅｎｔ他（２００７）、Ｈａｆｆｔｙ他（２００６）、Ｋａｐｌａｎ及びＭａｌｍｇｒｅｎ（２００８））、「トリプルネガティブ」という特徴が、ＴＮＢＣ患者に、標準的なホルモン療法及びＨＥＲ２標的療法の利益を得られなくしている（Ｂａｕｍ他（２００２）、Ｄａｖｉｅｓ他（２０１３）、Ｇｏｓｓ他（２００５）、Ｓａｎｔｅｎ他（２００９）、Ｓｈｏｕ他（２００４）、Ｓｍｉｔｈ他（２００５））。ＴＮＢＣに対して治療の展望がいくらかあるにもかかわらず、化学療法は、ＴＮＢＣ患者にとって依然として唯一の標準的な治療である。現在の化学療法に抵抗性を示す患者は、実質的な臨床的有用性がなく、不必要な毒性を被ってしまう。したがって、ＴＮＢＣにとってさらに安全で有効な治療を開発することが、急務である。
【０００５】
近年、癌免疫療法において、大きな臨床上の飛躍的前進があり（Ｍｅｌｌｍａｎ他（２０１１）、Ｋａｕｆｍａｎ他（２０１３）、Ｂｒｏｗｅｒ（２０１５）、Ｔｏｐａｌｉａｎ他（２０１５））、免疫療法には、免疫抑制用免疫チェックポイント分子ＣＴＬＡ−４（細胞障害性Ｔリンパ球関連タンパク質４又はＣＤ１５２［表面抗原分類１５２］）、ＰＤ−１（プログラム細胞死タンパク質１）及びＰＤ−Ｌ１（プログラム死リガンド１、Ｈｏｄｉ他（２０１０）、Ｗｏｌｃｈｏｋ他（２０１３）、Ｔｏｐａｌｉａｎ他（２０１４））を阻害することが含まれる。ＰＤ−１は、Ｔ細胞が体内の他の細胞を攻撃することを妨げるように「オフスイッチ」として機能する、Ｔ細胞に対するチェックポイントタンパク質である。ＰＤ−１は、腫瘍細胞に、ＰＤ−Ｌ１とともに相互作用する。ＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ−１と相互作用すると、Ｔ細胞が腫瘍細胞を攻撃するのを妨げてしまう。ＰＤ−１阻害薬は、現在、一定の癌を治療することに使用されている。
【０００６】
チェックポイント阻害を用いた癌免疫療法の総説が、Ｒｉｂａｓ及びＷｏｌｃｈｏｋ（２０１８）（本明細書の参考文献リストを参照）にあるように公開されており、その全体が、参照により、特に、免疫療法で標的とされる経路と、そのチェックポイント阻害の点で使用する抗体とを検討する目的で、本明細書に援用される。その上、患者の「ミュータノーム（ｍｕｔａｎｏｍｅ）」、すなわち、自家Ｔ細胞が異物と認識し得る癌特有の新生抗原決定基を生成する体細胞突然変異のセットに基づいて、癌ワクチンの標的を合理的に選択する方法が、Ｓａｈｉｎ及びＴｕｒｅｃｉ（２０１８）に論じられている（本明細書の文献リストを参照）。この公開もまた、その全体が、参照により本明細書に援用され、免疫系の細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞障害性細胞）を活性化して腫瘍細胞を攻撃させ得るような腫瘍抗原を個別に標的にすることを論じたものである。図１０及び図１１を参照。このようなタイプの癌免疫療法の両方を、本発明に係るＳ−エクオールの使用と組み合わせることができる。
【０００７】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、健康な免疫系を機能させる際主要な役割を果たす。それらは、抗体を作るようにＢ細胞を支援し、微生物を死滅させるマクロファージの能力を活性化させ、他の免疫細胞を体の感染領域又は炎症領域に補充する。このような活動は、種々のサイトカイン及びケモカインの産生によって統制される。未関与のＣＤ４＋Ｔ細胞が、支配的な炎症性又は抗炎症性環境に基づいて、Ｔｈ１細胞又はＴｈ２細胞に分化することができ、このように活性化したＴｈ１及びＴｈ２が、別個のサイトカインの産生パターン及び機能を有することが、先頃から分かってきている。一般に、Ｔｈ１細胞は、細胞内の病原体の根絶と関連付けられる一方で、Ｔｈ２細胞は、細胞外の病原体及び寄生体に対する応答に深く関わるものである。制御が利かなくなったＴｈ１の応答は、自己免疫に関与し、異常なＴｈ２の応答は、アレルギー及び喘息の発生と関連付けられる。しかしながら、このモデルでは、Ｔｈ１のシグナル伝達における欠損及び／又はサイトカインとによって、関節リウマチ及び多発性硬化症等の自己免疫疾患がなお発生し得ることが観察されることについて説明がつかなかった。さらに最近（２００６）、ＣＤ４Ｔ細胞の第３のサブセット、Ｔｈ１７細胞が、炎症性バイアスを有していると、確認された。動物モデルを用いたその後の研究及びヒトの研究が、Ｔｈ１７細胞について、このような細胞によりＩＬ−１７の分泌物が媒介する、細胞外の細菌及び真菌に対する免疫系の防御と自己免疫疾患の発生とにおいて、主要な役割を果たしていることを、証明した。樹状細胞等の抗原提示細胞からのＩＬ−２３の分泌物は、病原体を取り込み処理することにより活性化されており、次に、Ｔｈ１７細胞を活性化する。（Ｂ細胞の免疫学：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／ｐｕｂｉｌｃ−ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｂｉｔｅｓｉｚｅｄ−ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ｃｅｌｌｓ／ｔｈ１７−ｃｅｌｌｓ）図１１を参照。
【０００８】
ＣＤ８＋（細胞傷害性）Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞と同様に、胸腺において生成され、Ｔ細胞受容体を発現する。しかしながら、ＣＤ４分子ではなく、細胞傷害性Ｔ細胞の方が、二量体の共受容体、ＣＤ８を発現し、このＣＤ８は、通常、１つのＣＤ８α鎖と１つのＣＤ８β鎖とからなる。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、すべての有核細胞に認められるＭＨＣクラスＩ分子により提示されるペプチドを認識する。ＣＤ８ヘテロ二量体は、Ｔ細胞／抗原提示細胞の相互作用中にＭＨＣクラスＩの保護された部分（α３領域）に結合している（図１０を参照）。ＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球又はＣＴＬと呼ばれることが多い）は、ウイルス及び細菌を含む細胞内の病原体に対する免疫防御及び腫瘍の監視のために非常に重要である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗原を認識し活性化すると感染又は悪性細胞を死滅させる主要な仕組みを３つ有する。第１が、サイトカインの分泌物、主に、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γであって、これらは、抗腫瘍性と抗微生物作用を有する。第２の主な機能は、細胞傷害性顆粒の産生と放出である。この顆粒はまた、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に認められるものであって、タンパク質、パーフォリン及びグランザイムの２つのファミリーを含む。パーフォリンは、補体の膜侵襲複合体と同様に、標的細胞の膜に孔を形成する。この孔によって、細胞傷害性顆粒に含まれるグランザイムも、感染又は悪性細胞の中に入ることができる。グランザイムは、細胞内のタンパク質を切断するセリンプロテアーゼであり、ウイルス性のタンパク質の産生を停止させ、最後に、標的細胞のアポトーシスをもたらすことになる。細胞傷害性顆粒は、健康な周りの組織への非特異的傍観者損傷（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｙｓｔａｎｄｅｒ  ｄａｍａｇｅ）を避けられるように、標的細胞の方向にのみ、免疫シナプスに沿って位置合わせされて、解放される（図１０を参照）。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、顆粒を解放し、感染細胞を死滅させ、そして、新しい標的へと移動し繰り返し死滅させることができ、これは、シリアルキリング（ｓｅｒｉａｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ）と呼ばれることが多い。ＣＤ８＋Ｔ細胞による感染細胞の破壊という第３の主な機能は、Ｆａｓ／ＦａｓＬの相互作用によるものである。活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞が、細胞表面にＦａｓＬを発現し、ＦａｓＬが、標的細胞の表面の受容体、Ｆａｓに結合する。この結合によって、標的細胞の表面のＦａｓ分子が、三量体を形成し、三量体が、シグナル伝達分子を引き合わせる。このシグナル伝達分子によって、カスパーゼのカスケードが活性化され、これによってもまた、標的細胞がアポトーシスに至る。ＣＤ８＋Ｔ細胞は両方の分子を発現可能であるので、Ｆａｓ／ＦａｓＬの相互作用は、兄弟殺しと呼ばれる、ＣＤ８＋Ｔ細胞が相互に死滅させ合って、免疫応答の最後の収縮段階の間に、免疫エフェクター細胞が排除される仕組みである。ウイルス、細胞内細菌、腫瘍に対する免疫防御における重要な役割の上に、ＣＤ８＋Ｔ細胞はまた、免疫病理、すなわち、免疫が媒介する損傷につながる過剰な免疫応答を助長する可能性もある。
（Ｂｉｔｅｓｉｚｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙより：  ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／ｐｕｂｌｉｃ−ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｂｉｔｅｓｉｚｅｄ−ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ｃｅｌｌｓ／ｃｄ８−ｔ−ｃｅｌｌｓ）
【０００９】
ＮＫ細胞について、ＰＫ１３６モノクローナル抗体が、マウスＮＫ１．１）と、ナチュラルキラー細胞により発現した抗原と、Ｃ５７ＢＬ及びＮＺＢを含む、ＮＫ１．１マウスの系統のＴ細胞のサブセットと反応する。ＢＡＬＢ／ｃ、ＳＪＬ、ＡＫＲ、ＣＢＡ、Ｃ３Ｈ及びＡ等、一般に使用されるいくつかの研究用マウスの系統は、ＮＫ１．１抗原を発現しない。このような系統におけるＮＫ細胞の検知のため、モノクローナル抗体ＤＸＳ１４−５９７１を用いる。ＰＫ１３６及びＤＸＳでＣ５７ＢＬ／６脾臓細胞を同時に染色すると、大多数の細胞並びに少ない割合のＤＸＳ＋ＰＫ１３６−及びＤＫＳ−ＰＫ１３６＋細胞の存在によって、両方のマーカーが同時発現することが明らかである。
【００１０】
ＣＤ４５（リンパ球共通抗原）とそれに関連付けられた分子とが、Ｔ細胞の活性化に重要であることも示されている。ＣＤ４５は、すべての白血球に発現する受容体型プロテインチロシンホスファターゼであり、このような細胞の機能において非常に重要な役割を果たす。Ｔ細胞において、ＣＤ４５の細胞外ドメインが、いくつかの異なるアイソフォームで発現され、発現される特定のアイソフォームは、細胞の特定の分集団、その成熟状態、それ以前に抗原にさらされたことがあるか否かによって変わる。ＣＤ４５の発現は、ＴＣＲによるＴ細胞の活性化に必須であり、各種のＣＤ４５アイソフォームが、Ｔ細胞の活性化を支持する各種の能力を発揮することが、確認されている。ＣＤ４５の細胞内領域のチロシンホスファターゼの活性は、ＴＣＲからのシグナル伝達を支持するため非常に重要であることが示されているが、ＣＤ４５の各種のアイソフォームに対するリガンドの性質は、不明瞭のままである。さらに、潜在的リガンドがＣＤ４５の機能を調節することができる精密な仕組みは、不明である。興味深いことに、Ｔ細胞において、ＣＤ４５は、多数の、膜結合性かつ細胞内の分子と関連し、これには、ＴＣＲ−ＣＤ３複合体及びＣＤ４／ＣＤ８の構成成分が含まれることが、示されている。その上、ＣＤ４５は、ｓｒｃファミリーのＲ５６ｌｃｋ及びｐ５９ｆｙｎと、ＳｙｋファミリーのＺＡＰ−７０とを含むとともに、２９〜３４ｋＤａの多数のタンパク質を有する、いくつかの細胞内タンパク質チロシンキナーゼと関連することが報告されている。このようなＣＤ４５関連分子は、ＣＤ４５チロシンホスファターゼの活動及び機能を規制する際に重要な役割を果たし得る。しかしながら、ＣＤ４５関連分子（例えばＣＤ４５−ＡＰ及びＬＰＡＰ）のいくつかの役割は、近年、さらに良く理解されるようになってきているものの、その他のものの役割は、なおよく分かっていない。本明細書中の参考文献リストのＡｌｔｉｎ及びＳｌｏａｎ（１９９７）を参照。
【００１１】
しかしながら、期待が高まるこのような免疫療法は、癌患者のサブセットに対してのみ有効であって、通常の治療法ではない。特に、ＴＮＢＣ患者における抗ＰＤ−１抗体臨床試験は、患者の１０〜２０％の範囲に客観的応答があり、さらに患者の２０％が、もしそうでなければ急速に進行するであろう病気がある程度安定した、という控えめな有効性しか実証していない（Ｎａｎｄａ他（２０１６）、Ｅｍｅｎｓ他（２０１５）、Ｄｉｒｉｘ他（２０１５）、Ｒｕｇｏ他（２０１５）、Ｄａｗｏｏｄ及びＲｕｇｏ（２０１６））。よって、免疫療法に対する個々の応答が向上するように、よりよい治療法を特定する臨床上の差し迫った必要性がある。
【００１２】
ＰＤ−１及びそのリガンドのＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞の免疫を抑制する免疫チェックポイント分子である（Ｌｉｎ他（２０１０）、Ｃｕｒｉｅｌ他（２００３）、Ｂｒａｈｍｅｒ他（２０１２）、Ｐａｒｄｏｌｌ及びＤｒａｋｅ（２０１２）、Ｐａｒｄｏｌｌ（２０１２））。ＰＤ−Ｌ１は、腫瘍細胞及び、Ｔｒｅｇを含む一部の免疫細胞において過剰発現する（Ｌｉｎ他（２０１０）、Ｃｕｒｉｅｌ他（２００３）、Ｐａｒｄｏｌｌ（２０１２）、Ｔｏｐａｌｉａｎ他２０１２））。抗ＰＤ−１（αＰＤ−１）及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体（αＰＤ−Ｌ１）を用いた免疫療法で、種々の癌の治療がうまくいくことが証明されている（Ｂｒａｈｍｅｒ（２０１２）、Ｐａｒｄｏｌｌ及びＤｒａｋｅ（２０１２）、Ｐａｒｄｏｌｌ（２０１２））。ＴＮＢＣに対する初期の臨床試験は、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１が、介入に有効な標的であり、治療毒性が低いことを示している。高負担の術前治療後、化学療法耐性となり、ＰＤ−Ｌ１を発現した転移性ＴＮＢＣの女性２７名の第Ｉ相臨床研究において、応答率は、αＰＤ−１抗体であるペムブロリズマブに対して１８．４％だった（Ｎａｎｄａ他２０１６）。αＰＤ−Ｌ１抗体であるアテゾリズマブの同様の臨床研究は、２１の評価可能な、ＰＤ−１が発現するＴＮＢＣ腫瘍において１９％という応答率をもたらした（Ｅｍｅｎｓ他（２０１５）、Ｄａｗｏｏｄ及びＲｕｇｏ（２０１６））。別のグループが、ＰＤ−Ｌ１発現に対して選択されていない、１６８のＴＮＢＣ腫瘍において、別のαＰＤ−Ｌ１抗体であるアベルマブへの応答率が８．６％という報告をし（Ｄｉｒｉｘ他２０１５）、ＰＤ−Ｌ１腫瘍発現のレベルは、腫瘍応答に影響を与えることにおいて重要となり得ることを示している。ある程度の疾病の安定化が、このような高悪性のサブタイプの乳癌において、この３つの臨床試験で患者の約２０％に見受けられた。深刻な毒性は、殆どなく、免疫調節に関連していた。このような臨床データは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸が、特にＴＮＢＣにおいて、おそらくは有効性を高めるためのアプローチと組み合わせると、治療標的となり得ることを示している。
【００１３】
乳癌細胞におけるエストロゲンの様々な生理学的作用を媒介するエストロゲン受容体には、２つの別個のタイプがある。第１の受容体は、エストロゲン依存性の乳腺腫瘍の増殖を支持するＥＲα受容体である。第２は、前臨床モデルにおいて乳腺腫瘍細胞の増殖を著しく減じるように、逆に作用するとみられるＥＲβ受容体である（Ｃｌａｒｋｅ他（２００３）、Ｄｅｒｏｏ及びＫｏｒａｃｈ（２００６）、Ｄｅｒｏｏ及びＢｕｅｎｓｕｃｅｓｏ（２０１０）、Ｈｏｎｍａ他（２００８）、Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ及びＫａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ（２０００）、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ及びＮｏｒｒｉｓ（２００２）、Ｍｕｒｐｈｙ及びＷａｔｓｏｎ（２００６）、Ｓｈａａｂａｎ他（２００８）。よって、ＥＲβは、乳癌における腫瘍抑制遺伝子とみなすことができる。ＥＲβは、ＴＮＢＣ癌の約４０％に発現し、ＥＲβを標的とする治療上の可能性は、ＴＮＢＣにおいてはまだ調べられていない。前臨床モデルから臨床研究へ移行することを可能にする進歩が、最近２つあった。第１の進歩は、新たに発見された、ＥＲβの抗腫瘍活性を回復させる仕組みであり（Ｈａｒｒｉｓ（２００７）、Ｈａｒｔｍａｎ他（２００９）、Ｈｅｌｄｒｉｎｇ他（２００７）、Ｔｈｏｍａｓ及びＧｕｓｔａｆｓｓｏｎ（２０１１））、第２は、ヒトにおいて臨床上の安全性、薬力学及び耐性上の試験がすでに行なわれているＥＲβアゴニスト（Ｓ−エクオール）の経口製剤の開発である（Ｊａｃｋｓｏｎ他（２０１１ａ＆ｂ）、Ｓｅｔｃｈｅｌｌ他（２００５）、Ｓｅｔｃｈｅｌｌ（２００２）、Ｓｃｈｗｅｎ他（２０１２）。
【００１４】
エストロゲン受容体（ＥＲβ、核又は細胞質）が、ＴＮＢＣのおよそ半数に存在すると報告されている（Ｍａｒｏｔｔｉ他（２０１０）、Ｒｅｅｓｅ他（２０１４））。よって、ＥＲβ特有の修飾及び／又はリガンド結合によるＥＲβ抗腫瘍活性を取り戻すことは、素晴らしいＴＮＢＣ治療の機会となる。しかしながら、ＥＲβを標的とする治療の可能性は、部分的には、抗腫瘍活性を利用する方法についての知識が不十分であることから、広範囲には利用されてきていない。ＥＲαではなく、ＥＲβにおけるリン酸化チロシン残基（Ｙ３６）が、ＴＮＢＣ細胞におけるＥＲβの抗腫瘍活性を制御するのに重要であることが、最近確認された（Ｙｕａｎ他（２０１４）、Ｙｕａｎ他（２０１６））。
【００１５】
このリン酸化チロシン残基（ｐＹ３６）が、フェニルアラニン基（Ｙ３６Ｆ）を追加することにより意図的に突然変異させられると、ＥＲβ標的遺伝子の活性化が、ＴＮＢＣ細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）において弱まった。Ｙ３６Ｆの突然変異はまた、ＥＲβが生体内外において腫瘍細胞の増殖を抑制する能力を消し去った。したがって、この前臨床研究は、ＥＲβの抗腫瘍活性におけるｐＹ３６の重要性を強く支持するものである。
【００１６】
ｐＹ３６の状態が乳癌患者の生存と相関するという証拠もある。国立癌研究所（ＮＣＩ）からの予後組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を用いて研究が行われており、臨床経過観察記録を伴った、大規模コホートの乳腺腫瘍サンプルからなる。全７２６の読取可能なＩＨＣサンプルを用いると、ｐＹ３６−ネガティブ腫瘍を有する患者は、ｐＹ３６−ポジティブ腫瘍を有する患者に比べて、無病生存期間全体が統計学的に有意に短くなることが分かった。興味深いことに、生存との関連性は、ステージＩＩ及びＩＩＩの病気においてのみ見受けられ、このことは、ｐＹ３６活性が、転移性の乳癌に局所的に進行することによる増悪に作用し得るという興味深い可能性を提起する。まとめると、ｐＹ３６の強度は、すべてのＥＲβよりも強い、患者のアウトカムとの相関を有するとみられ、これまで真価を認められていないこのリン酸化チロシンスイッチの臨床上の重要性を明確に示している。図１４を参照。
【００１７】
Ｓ−エクオール、ＥＲβアゴニストは、ラットの海馬のニューロンにおいて、呼吸及び最大解糖系フラックス、並びに卵巣切除されたマウスからの脳におけるチトクロム酸化酵素（ＣＯＸ）活性度及びＣＯＸ１タンパク質レベルを増加させることが、これまでに示され、ヒト対象において、健康への影響及び安全性を評価する研究がされてきた（Ｙａｏ他（２０１３）、Ｊｅｎｋｓ他（２００２）、Ｊａｃｋｓｏｎ他（２０１１ａ＆ｂ）、Ｕｓｕｉ他（２０１３））。
【００１８】
Ｓ−エクオールは、化学的に（すなわち、化学合成で）、又は大豆及びムラサキツメクサにあることが分かっているイソフラボンであるダイゼインの腸内細菌による代謝を介した生体内分解（生合成）によって、産生可能である。Ｓ−エクオールの構造を以下に示す。
【化１】
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【００１９】
エクオールは、キラル中心を有し、よって、２つのエナンチオマーの形態で存在し得る。Ｓ−エクオール、Ｒ−エクオール、ラセミ体エクオール（ｒａｃｅｍｉｃ  ｅｑｕｏｌ）、エクオールの非ラセミ体混合物（まとめて「エクオール」とする）、エクオールの組成物、エクオールの無水結晶多形、エクオールの調製プロセス、及びエクオールを用いた方法が、米国特許第８，７１６，４９７号明細書（２０１２年９月１０日出願）、米国特許第８，０４８，９１３号明細書（２００９年９月１４日出願）、米国特許第７，９６０，４３２号明細書（２００８年７月３日出願）、米国特許第７，３９６，８５５号（２００３年７月２４日出願）、米国特許第８，２６３，７９０号明細書（２０１１年６月１日）、米国特許第７，９６０，５７３号明細書（２００９年５月４日出願）、米国特許第７，５２８，２６７号明細書（２００５年８月１日出願）、米国特許第８，６６８，９１４号明細書（２００９年７月３１日出願）、米国特許第８，５８０，８４６号（２００６年８月１８日出願）、米国特許第８，４５０，３６４号明細書（２０１２年４月９日出願）、及び米国特許第８，１５３，６８４号明細書（２００９年１０月２日出願）、米国特許第９，４０８，８２４号明細書（２０１４年３月５日出願）、及び米国特許第９，９１４，７１８号明細書（２０１５年１０月１４日出願）に記載されており、それぞれは、その全体が参照により援用される。
【００２０】
イソフラボン及びそれから導出された生成物を含む製剤が、これまで疾病治療に使用されてきた。例えば、エクオール、ゲニステイン及びダイゼインの混合物、又はエクオール、ゲニステイン、ダイゼイン及びＩＢＳＯ０３５６９の混合物が、神経変性及びアルツハイマー病を治療又は予防する可能性が示されている。Ｚｈａｏ他（２００９）、米国特許第８，５５２，０５７号明細書、Ｙａｏ他（２０１３）（まとめて「Ｂｒｉｎｔｏｎ他」とする）を参照のこと。Ｓ−エクオールが、単独で、アルツハイマー病を治療するためのものとして、記載されている。米国特許出願公開第２０１８／００２８４９１号明細書として公開された米国特許出願第１５／６５９，１１４号及び国際公開第ＷＯ／２０１８／０２２６０４号を参照されたく、当該文献は、その全体が参照によって援用される。
【００２１】
しかしながら、当該技術において、過去において治療が困難であった他の病状の治療のためにＳ−エクオールを利用する方法が依然として必要とされている。特に、当該技術において、Ｓ−エクオールを利用する方法が、乳癌の治療において、特に、乳癌腫瘍が、エストロゲン受容体α、プロゲステロン受容体及びＨＥＲ−２受容体にネガティブの場合（「トリプルネガティブ乳癌」）、既知のアゴニスト及びそのような受容体のアンタゴニストでは治療不可能な場合にはなおさら、必要とされている。
【００２２】
本明細書において言及した特許及び科学文献は、当業者に利用可能な知識を明らかにしている。本明細書に引用したすべての米国特許及び公開又は非公開の米国特許出願は、参照により援用される。本明細書に引用したすべての外国の特許及び特許出願は、参照により援用される。本明細書に引用した他のすべての公開文献、文書、原稿及び科学文献は、参照により援用される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２３】
［参考文献］
【非特許文献１】Ａｌｔｉｎ，Ｊ．Ｇ．及びＳｌｏａｎ，Ｅ．Ｋ．，「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣＤ４５  ａｎｄ  ＣＤ４５−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７５（５）：４３０−４３５（１９９７）
【非特許文献２】Ｂａｕｍ  Ｍ．，Ｂｕｚｄａｒ  Ａ．Ｕ．，Ｃｕｚｉｃｋ  Ｊ．，「Ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ  ａｌｏｎｅ  ｏｒ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  ａｌｏｎｅ  ｆｏｒ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｗｏｍｅｎ  ｗｉｔｈ  ｅａｒｌｙ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ」，ｆｉｒｓｔ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＴＡＣ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌ，Ｌａｎｃｅｔ，３５９：  ２１３１−２１３９，（２００２）
【非特許文献３】Ｂｅｅｌｅｎ  Ｋ．，Ｚｗａｒｔ  Ｗ．，Ｌｉｎｎ  Ｓ．Ｃ．，「Ｃａｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｕｉｄｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ？」，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ.，９：  ５２９−５４１，（２０１２）
【非特許文献４】Ｂｒａｈｍｅｒ，  Ｊ．  Ｒ．他，「Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ  １  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒ」，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３６６，２４５５−２４６５，  ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａｌ２００６９４（２０１２）
【非特許文献５】Ｂｒｏｗｅｒ，  Ｖ．，「Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｏｍｅｓ  ｏｆ  ａｇｅ」，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，１０７，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｊｎｃｉ／ｄｊｖ０６９（２０１５）
【非特許文献６】Ｃｈｅｎ，  Ｌ．及びＦｌｉｅｓ，Ｄ．Ｂ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ」，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３，２２７−２４２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｉ３４０５（２０１３）
【非特許文献７】Ｃｈｉａ，Ｋ．及びＴｕｔｔ，Ａ．，「Ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ」：Ａｎ  ｕｐｄａｔｅ，Ａｄｖ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ４，７５−８０，（２００７）
【非特許文献８】Ｃｈｏ，Ｊ．Ｌ．，Ａｌｌａｎｓｏｎ，Ｍ．及びＲｅｅｖｅ，Ｖ．Ｅ．，「Ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｓｋｉｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ」，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  ９，６０８−６１４，ｄｏｉ：１０，１０３９／ｂ９ｐｐ００ｌ６８ａ（２０１０）
【非特許文献９】Ｃｌａｒｋｅ  Ｒ．，Ｌｉｕ  Ｍ．，Ｂｏｕｋｅｒ  Ｋ．Ｂ．他，「Ａｎｔｉｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ」，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．，２２，７３１６−７３３９，（２００３）
【非特許文献１０】Ｃｌｅａｔｏｒ，Ｓ．，Ｈｅｌｌｅｒ，Ｗ．及びＣｏｏｍｂｅｓ，Ｒ．Ｃ．，「Ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｐｔｉｏｎｓ」，Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．８，２３５−２４４，（２００７）
【非特許文献１１】Ｃｏａｔｅｓ他，「Ｔａｉｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  −  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：Ｓｔ．  Ｇａｌｌｅｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｅａｒｌｙ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１５」，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２６（８）：１５３３−４６，（２０１５）
【非特許文献１２】Ｃｕｒｉｅｌ，Ｔ．Ｊ．他，「Ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  Ｂ７−Ｈ１  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ」，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，５６２−５６７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ８６３（２００３）
【非特許文献１３】Ｄａｖｉｅｓ  Ｃ．，Ｐａｎ  Ｈ．，Ｇｏｄｗｉｎ  Ｊ．，他，「Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  ｔｏ  １０  ｙｅａｒｓ  ｖｅｒｓｕｓ  ｓｔｏｐｐｉｎｇ  ａｔ  ５  ｙｅａｒｓ  ａｆｔｅｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：  ＡＴＬＡＳ，  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌ」，Ｌａｎｃｅｔ，３８１：８０５−８１６，２０１３
【非特許文献１４】Ｄａｗｏｏｄ，Ｓ．及びＲｕｇｏ，Ｈ．Ｓ．，「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：  ＰＤ−１  ａｎｄ  ＰＤ−Ｌ１  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ」，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｐａｌｌｉａｔ  Ｃａｒｅ  １０，３３６−３４２，ｄｏｉ：１０．１０９７／ＳＰＣ．０００００００００００００２４３（２０１６）
【非特許文献１５】Ｄｅｎｔ，Ｒ．他，「Ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ」，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３，４４２９−４４３４（２００７）
【非特許文献１６】Ｄｅｒｏｏ  Ｂ．Ｊ．，Ｋｏｒａｃｈ  Ｋ．Ｓ．，「Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１６：５６１−５７０，（２００６）
【非特許文献１７】Ｄｅｒｏｏ  Ｂ．Ｊ．，Ｂｕｅｎｓｕｃｅｓｏ  Ａ．Ｖ．，「Ｍｉｎｉｒｅｖｉｅｗ：  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｅｔａ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｅｎｔ  ｓｔｕｄｉｅｓ」，Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ２４：１７０３−１７１４，（２０１０）
【非特許文献１８】Ｄｉａｚ，Ｌ．Ｋ．，Ｃｒｙｎｓ，Ｖ．Ｌ．，Ｓｙｍｍａｎｓ，Ｗ．Ｆ．及びＳｎｅｉｇｅ，Ｎ．，「Ｔｒｉｐｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｂａｓａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  Ｆｒｏｍ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ」，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｎａｔｏｍｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １４，４１９−４３０（２００７）
【非特許文献１９】Ｄｉｒｉｘ，Ｌ．Ｙ．，Ｔａｋａｃｓ，Ｉ．及びＮｉｋｏｌｉｎａｋｏｓ，Ｐ．ｅ．ａ．，「Ａｖｅｌｕｍａｂ  （ＭＳＢ００１０７１８Ｃ），  ａｎ  ａｎｔｉ−ＰＤ−ＬＩ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｃａｌｌｙ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：  Ａ  ｐｈａｓｅ  ｌｂ  ＪＡ  ＹＥＬＩＮ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒ  ｔｒｉａｌ」，２０１５，Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｓｌ−０４，（２０１５）
【非特許文献２０】Ｅｍｅｎｓ，Ｌ．Ａ．，Ｂｒａｉｔｅｈ，Ｆ．Ｓ．及びＣａｓｓｉｅｒ，Ｐ．ｅ．ａ．，「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＤ−Ｌ１  ｂｙ  ＭＰＤＬ３２８０Ａ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  （ＴＮＢＣ）」，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ２８５９，（２０１５）
【非特許文献２１】Ｇｅｒｓｏｎ，Ｒ．，Ａｌｂａｎ，Ｆ．，Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ，Ａ．及びＳｅｒｒａｎｏ，Ａ．，「Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｒａｔｅｓ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｒｉｐｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｅ」，Ｇａｅ  Ｍｅｄ  Ｍｅｘ  １４４，２７−３４，（２００８）
【非特許文献２２】Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ａｎｇｕｌｏ，Ａ．Ｍ．，「Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｒｉｐｌｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ」，Ｃｌｉｎ  Ａｄｖ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  ５，９５６−９５７（２００７）
【非特許文献２３】Ｇｏｓｓ  Ｐ．Ｅ．，Ｉｎｇｌｅ  Ｊ．Ｎ．，Ｍａｒｔｉｎｏ  Ｓ．，他，「Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  ａｓ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：  ｕｐｄａｔｅｄ  ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｆｒｏｍ  ＮＣＩＣ  ＣＴＧ  ＭＡ．１７．」，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ９７：  １２６２−１２７１，（２００５）
【非特許文献２４】Ｈａｆｆｔｙ，Ｂ．Ｇ．他，「Ｌｏｃｏｒｅｇｉｏｎａｌ  ｒｅｌａｐｓｅ  ａｎｄ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｌｙ  ｍａｎａｇｅｄ  ｔｒｉｐｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｅａｒｌｙ−ｓｔａｇｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ」，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２４，５６５２−５６５７（２００６）
【非特許文献２５】Ｈａｒｒｉｓ  Ｈ．Ａ．，「Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｅｔａ：  ｒｅｃｅｎｔ  ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｔｕｄｉｅｓ」，Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２１：１−１３，（２００７）
【非特許文献２６】Ｈａｒｔｍａｎ  Ｊ．，Ｓｔｒｏｍ  Ａ．，Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｍ  Ｊ．Ａ．，「Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ．７４：６３５−６４１，（２００９）
【非特許文献２７】Ｈｅｌｄｒｉｎｇ  Ｎ．，Ｐｉｋｅ  Ａ．，Ａｎｄｅｒｒｓｏｎ  Ｓ．他，「Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：  ｈｏｗ  ｄｏ  ｔｈｅｙ  ｓｉｇｎａｌ  ａｎｄ  ｗｈａｔ  ａｒｅ  ｔｈｅｉｒ  ｔａｒｇｅｔｓ」，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．８７：９０５−９３１，（２００７）
【非特許文献２８】Ｈｏｎｍａ  Ｎ．，Ｈｏｒｉ  Ｒ．，Ｉｗａｓｅ  Ｔ．他，「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｅｔａ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，２６：３７２７−３７３４，（２００８）
【非特許文献２９】Ｉｒｖｉｎ，Ｗ．Ｊ．Ｊ．及びＣａｒｅｙ，Ｌ．Ａ．，「Ｗｈａｔ  ｉｓ  ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ？」，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．４４，２７９９−２８０５，（２００８）
【非特許文献３０】ＪａｃｋｓｏｎＲ．Ｌ．，Ｇｒｅｉｗｅ  Ｊ．Ｓ．，Ｓｃｈｗｅｎ  Ｒ．Ｊ．，「Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｌｔｈ  ｂｅｎｅｆｉｔｓ  ｏｆ  Ｓ−ｅｑｕｏｌ，  ａｎ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ  ａｇｏｎｉｓｔ」，Ｎｕｔｒ  Ｒｅｖ．６９：４３２−４４８，（２０１１ａ）
【非特許文献３１】Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｒ．Ｌ．，Ｇｒｅｉｗｅ  Ｊ．Ｓ．，Ｓｃｈｗｅｎ  Ｒ．Ｊ．，「Ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｓｅ  ａｎｄ  ｓｔｅａｄｙ−ｓｔａｔｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｓ−ｅｑｕｏｌ，  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｎｏｎｈｏｒｍｏｎａｌ，  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ−ａｇｏｎｉｓｔ  ｂｅｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ」，Ｍｅｎｏｐａｕｓｅ，１８  １８５−１９３，（２０１１ｂ）
【非特許文献３２】Ｊｅｎｋｓ他，「Ａ  ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｓ−ｅｑｕｏｌ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ｓｏｙ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ  ｏｎ  ｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｈｏｔ  ｆｌａｓｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈ，２１（２０１２）  ６７４−６８２，  （２００２）
【非特許文献３３】Ｋａｎｇ，Ｓ．Ｐ．，Ｍａｒｔｅｌ，Ｍ．及びＨａｒｒｉｓ，Ｌ．Ｎ．，「Ｔｒｉｐｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｐｔｉｏｎｓ」，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ，２０，４０−４６，（２００８）
【非特許文献３４】Ｋａｐｌａｎ，Ｈ．Ｇ．及びＭａｌｍｇｒｅｎ，Ｊ．Ａ．，「Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｔｒｉｐｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ」，Ｂｒｅａｓｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １４，４５６−４６３，（２００８）
【非特許文献３５】Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ  Ｂ．，Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ  Ｊ．，「Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ：  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ」，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２：３３５−３４４，（２０００）
【非特許文献３６】Ｋｉｔｔａｎｅｈ他，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：  Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ」，Ｂｉｏｍａｒｋ  Ｃａｎｃｅｒ  ５，６１−７０，（２０１３）
【非特許文献３７】Ｋｒｅｇｅ，Ｊ．Ｈ．他，「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ」，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，１５６７７−１５６８２，（１９９８）
【非特許文献３８】Ｌｉｎ，Ｐ．Ｙ．他，「Ｂ７−Ｈｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｅｘ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８５，２７４７−２７５３，ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１０００４９６（２０１０）
【非特許文献３９】Ｍａｒｏｔｔｉ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｃｏｌｌｉｎｓ，  Ｌ．  Ｃ．，  Ｈｕ，  Ｒ．  ＆  Ｔａｍｉｍｉ，  Ｒ．  Ｍ．，「Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｅｔａ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ：  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｎｕｒｓｅｓ’  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔｕｄｙ」，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２３，  １９７−２０４，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｏｄｐａｔｈｏｌ．２００９．  １５８，  （２０１０）
【非特許文献４０】ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ  Ｄ．，Ｎｏｒｒｉｓ  Ｊ．，「Ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９６：１６４２−１６４４，（２００２）
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【非特許文献４２】Ｍｕｒｐｈｙ  Ｌ．Ｃ．，Ｗａｔｓｏｎ  Ｐ．Ｈ．，「Ｉｓ  ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｅｔａ  ａ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ？」，Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ，１３：３２７−３３４，（２００６）
【非特許文献４３】Ｎａｎｄａ，Ｒ．他，「Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：  Ｐｈａｓｅ  ｌｂ  ＫＥＹＮＯＴＥ−０１２  Ｓｔｕｄｙ」，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３４，２４６０−２４６７，ｄｏｉ：１０．１２００／ＪＣ０．２０ｌ５．６４．８９３１  （２０１６）
【非特許文献４４】Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．及びＤｒａｋｅ，Ｃ．，「Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｅａｒｎｓ  ｉｔｓ  ｓｐｏｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｎｋｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０９，２０１−２０９，ｄｏｉ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２０１１２２７５（２０１２）
【非特許文献４５】Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．，「Ｔｈｅ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １２，２５２−２６４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｃ３２３９（２０１２）
【非特許文献４６】Ｐｆｅｆｆｅｒｌｅ，Ａ．Ｄ．他，「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ」，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １４，Ｒ１２５，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｇｂ−２０１３−１４−１１−ｒ１２５（２０１３）
【非特許文献４７】Ｒｅｅｓｅ，Ｊ．Ｍ．他，「ＥＲβ：  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ，  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ＥＲ  ａｌｐｈａ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  −ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ」，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  １４，７４９，ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２４０７−１４−７４９（２０１４）
【非特許文献４８】Ｒｅｉｓ−Ｆｉｌｈｏ，Ｊ．Ｓ．及びＴｕｔｔ，Ａ．Ｎ．Ｊ．，「Ｔｒｉｐｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｕｒｓ：  Ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ」，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ５２，１０８−１１８，（２００８）
【非特許文献４９】Ｒｉｂａｓ，Ａ．及びＷｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．，「Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５９：１３５０−１３５５，（２０１８）
【非特許文献５０】Ｒｕｇｏ，Ｈ．Ｓ．他，「Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ  （ＭＫ−３４７５）  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＰＤ−ＬＩ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ，  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  （ＥＲ＋）／ＨＥＲ２−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｅｎｒｏｌｌｅｄ  ｉｎ  ＫＥＹＮＯＴＥ−０２８」，２０１５  Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｓ５−０７（２０１５）
【非特許文献５１】Ｓａｃｈｓ，Ｊ．Ｒ．他，「Ｏｐｔｉｍａｌ  ｄｏｓｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｉｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ：  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｃａｓｅｓ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｂｙ  ｅｘａｍｐｌｅ」，Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２２（６）：ＯＦ１−７（２０１６）
【非特許文献５２】Ｓａｈｉｎ，Ｕ．及びＴｕｒｅｃｉ，Ｏ．，「Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５９：１３５５−１３５６，（２０１８）
【非特許文献５３】Ｓａｎｔｅｎ  Ｒ．Ｊ．，Ｂｒｏｄｉｅ  Ｈ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ  Ｅ．Ｒ．，他，「Ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ａｒｏｍａｔａｓｅ：  ｓａｇａ  ｏｆ  ａｎ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ」，Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ．  ３０：３４３−３７５，（２００９）
【非特許文献５４】Ｓｃｈｗｅｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｇｒｅｉｗｅ，Ｊ．Ｓ．，Ｓｃｈｗｅｎ，Ｒ．Ｊ．，「Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ｓ−ｅｑｕｏｌ  ｉｎ  ｒａｔ，  ｍｏｎｋｅｙ  ａｎｄ  ｍａｎ」，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．  ５０：２０７４−２０８３，（２０１２）
【非特許文献５５】Ｓｅｔｃｈｅｌｌ，Ｋ．Ｄ．，Ｃｌｅｒｉｃｉ  Ｃ．，Ｌｅｐｈａｒｔ  Ｅ．Ｄ．，他，「Ｓ−ｅｑｕｏｌ，  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ，  ｉｓ  ｔｈｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ  ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｏｙ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｆｌｏｒａ」，Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎｉ  Ｎｕｔｒ．  ８１：１０７２−１０７９，（２００５）
【非特許文献５６】Ｓｅｔｃｈｅｌｌ，Ｋ．Ｄ．，「Ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｅｑｕｏｌ−  ａ  ｃｌｕｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｓｏｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ」，Ｎａｔｕｒｅ．  １３２：３５７７−３５８４，（２００２）
【非特許文献５７】Ｓｈａａｂａｎ  Ａ．Ｍ．，Ｇｒｅｅｎ  Ａ．Ｒ．，Ｋａｒｔｈｉｋ  Ｓ．，「Ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＥＲｂｅｔａｌ，  ＥＲｂｅｔａ２，  ａｎｄ  ＥＲｂｅｔａ５  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ」，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １４：５２２８−５２３５，（２００８）
【非特許文献５８】Ｓｈａｒｍａ，  Ｐ．及びＡｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．，「Ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：  ｔｏｗａｒｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｕｒａｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ」，Ｃｅｌｌ  １６１，２０５−２１４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０ｌ５．０３．０３０（２０１５）
【非特許文献５９】Ｓｈｏｕ  Ｊ．，Ｍａｓｓａｒｗｅｈ  Ｓ．，Ｏｓｂｏｒｎｅ  Ｃ．Ｋ．，他，「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ  ｉｎ  ＥＲ／ＨＥＲ２−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ」，ＪＮａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ９６：９２６−９３５，２００４
【非特許文献６０】Ｓｍｉｔｈ  Ｉ．Ｅ．，Ｄｏｗｓｅｔｔ  Ｍ．，Ｅｂｂｓ  Ｓ．，他，「Ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ，  ｔａｍｏｘｉｆｅｎ，  ｏｒ  ｂｏｔｈ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：  Ｔｈｅ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ，  ｔａｍｏｘｉｆｅｎ，  ｏｒ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  （ＩＭＰＡＣＴ）  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌ」，Ｊ  Ｃｌｉｎｉ  Ｏｎｅ．  ２３：５１０８−５１１６，（２００５）
【非特許文献６１】Ｔｈｏｍａｓ  Ｃ．，Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  Ｊ．Ａ．，「Ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＥＲ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．  １１：５９７−６０８，（２０１１）
【非特許文献６２】Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｄｒａｋｅ，Ｃ．Ｇ．及びＰａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．，「Ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅ：  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｄｅｎｏｍｉｎａｔｏｒ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌ  ２７，４５０−４６１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｃｅｌｌ．２０１５．０３．００１（２０１５）
【非特許文献６３】Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｄｒａｋｅ，Ｃ．Ｇ．及びＰａｒｄａｌｌ，Ｄ．Ｍ．，「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ＰＤ−１／Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｏ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ」，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４，２０７−２１２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｏｉ．２０１１．１２．００９（２０１２）
【非特許文献６４】Ｕｒｒｕｔｉｃｏｅｃｈｅａ  Ａ．，Ｓｍｉｔｈ  Ｉ，Ｄｏｗｓｅｔｔ  Ｍ．，「Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ  Ｋｉ−６７  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２３：７２１２−７２２０，（２００５）
【非特許文献６５】Ｕｓｕｉ他，「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  Ｓ−ｅｑｕｏｌ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ  ｏｒ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｊａｐａｎｅｓｅ，  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｅｘ  ａｎｄ  ｅｑｕｏｌ  ｓｔａｔｕｓ」，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，７８  ３６５−３７２，（２０１３）
【非特許文献６６】Ｙａｏ他，「Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓ−ｅｑｕｏｌ  ａｎｄ  Ｒ／Ｓ−ｅｑｕｏｌ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｈｙｔｏＳＥＲＭ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ」，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５１４  １２８−１４１，（２０１３）
【非特許文献６７】Ｙｕａｎ，Ｂ．他，「Ａ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｓｗｉｔｃｈ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＥＲｂｅｔａ」，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２４，３３７８−３３９０，ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣ１７４０８５（２０１４）
【非特許文献６８】Ｙｕａｎ  Ｂ．，Ｃｈｅｎｇ  Ｌ．，Ｃｈｉａｎｇ  Ｈ．Ｃ．，他，「Ｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ  ＥＲβ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｓｗｉｔｃｈ」，Ｊ  Ｃｌｉｎｉ  Ｉｎｖｅｓｔ．１２４（８）：３３７８−９０，（２０１４）
【非特許文献６９】Ｙｕａｎ，Ｂ．他，「Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＥＲｂｅｔａ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ，  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ，  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ」，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，ｄｏｉ：１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．１００１８（２０１６）
【非特許文献７０】Ｚｈａｏ他，「Ａ  ｓｅｌｅｃｔ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  β−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」，Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１５０（２）：７７０−７８３，（２００９）
【発明の概要】
【００２４】
以下の簡単な概要は、本発明のすべての特徴及び態様を含むことを意図せず、本発明がこの概要に記載されるすべての特徴及び態様を含む必要があるということを示唆するものではない。
【００２５】
本発明者らは、Ｓ−エクオール、好ましくは単離された純粋なＳ−エクオールが、乳癌患者に利益をもたらし得ることを見出した。特に、本発明者らは、免疫療法と組み合わせたＳ−エクオールが、特に、乳癌の、中でも、トリプルネガティブ乳癌の治療に有効であることを見出した。
【００２６】
したがって、本発明の目的は、以下を提供することである。
１．Ｓ−エクオールを含む製剤を、その必要がある対象に薬学的有効量投与することにより、乳癌を治療又は予防する方法。
２．前記対象は、トリプルネガティブ乳癌と診断されている、項目１に記載の方法。
３．前記製剤は、１０〜２００ｍｇのＳ−エクオールを含む、項目１に記載の方法。
４．前記製剤は、５０〜１５０ｍｇのＳ−エクオールを含む、項目１に記載の方法。
５．前記製剤は、約５０ｍｇのＳ−エクオールを含む、項目１に記載の方法。
６．前記製剤は、約１５０ｍｇのＳ−エクオールを含む、項目１に記載の方法。
７．前記製剤は、経口、静脈内、腹腔内又は皮下投与される、項目１に記載の方法。
８．前記対象はヒトである、項目１に記載の方法。
９．前記Ｓ−エクオールは、１つ以上の他の癌治療と組み合わせて投与される、項目１に記載の方法。
１０．前記Ｓ−エクオールは、免疫療法剤と組み合わせて投与される、項目９に記載の方法。
１１．前記免疫療法剤は、抗体である、項目１０に記載の方法。
１２．前記抗体は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）を対象とする、項目１１に記載の方法。
１３．前記抗体は、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤＬ−１）を対象とする、項目１２に記載の方法。
１４．前記抗体は、ペムブロリズマブである、項目１２に記載の方法。
１５．前記抗体は、アテゾリズマブである、項目１３に記載の方法。
１６．前記抗体は、アベルマブである、項目１３に記載の方法。
１７．前記製剤は、本質的に、ゲニステイン、ダイゼイン及び／又はＩＢＳＯ０３５６９である、項目１に記載の方法。
１８．ゲニステイン、ダイゼイン及び／又はＩＢＳＯ０３５６９は、Ｓ−エクオールとともに同時投与されることはない、項目１に記載の方法。
１９．前記製剤は、本質的にＲ−エクオールを含まない、項目1に記載の方法。
２０．前記Ｓ−エクオールは、化学的に製造される、項目１に記載の方法。
２１．前記製剤は、日に１回投与される、項目１に記載の方法。
２２．前記製剤は、日に２回投与される、項目１に記載の方法。
２３．前記製剤は、日に３回投与される、項目１に記載の方法。
２４．前記製剤は、日に４回投与される、項目１に記載の方法。
【００２７】
本発明はまた、本明細書における方法のために記載したＳ−エクオールを含む組成物に関する。
【００２８】
本発明の上述及び他の目的、特徴及び利点は、同様の参照符号が各種の図面において同じ部分を指す添付の図面に図示されるように、以下の本発明の好ましい実施形態のより具体的な記載から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】図１は、腫瘍増殖に対するＥＲβシグナル伝達の宿主における効果を示す。図１Ａは、ＷＴ、ＫＯ及びＫＩ動物由来の組織におけるマウスのＥＲβの免疫ブロットを示すものである。ポンソーＳでタンパク質ローディングに対して染色している。
【図１Ｂ】図１は、腫瘍増殖に対するＥＲβシグナル伝達の宿主における効果を示す。図１Ｂは、ＷＴ及びＫＩ雌マウス（ｎ＝８）に、同系マウスの乳房腫瘍組織を同所性注入したこと（Ｍ−Ｗｎｔｌ、１ｘ１０４）．＊ｐ＜０．０５を示す。
【図２Ａ】図２は、免疫細胞におけるＥＲβシグナル伝達の役割を示す図である。図２Ａは、キメラ試験の模式図を示す。
【図２Ｂ】図２は、免疫細胞におけるＥＲβシグナル伝達の役割を示す図である。図２Ｂは、キメラマウス（ＷＴ＞ＷＴ：ｎ＝１０，ＫＩ＞ＷＴ：ｎ＝４）．ｐ＝０．０００３における腫瘍増殖を示す。
【図２Ｃ】図２は、免疫細胞におけるＥＲβシグナル伝達の役割を示す図である。図２Ｃは、腫瘍由来の全ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。
【図２Ｄ】図２は、免疫細胞におけるＥＲβシグナル伝達の役割を示す図である。図２Ｄは、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）を発現する、腫瘍由来のＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。
【図３】図３は、組合せ療法の概要を示す。
【図４Ａ】図４は、ＡＴ３乳房腫瘍細胞株が接種されたマウスにおいて、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＳ−エクオールの効果を示す。マウスには、抗ＰＤ−１抗体を３日ごとに２００μｇ、Ｓ−エクオールを一日あたり５０ｍｇ／ｋｇ投与した。図４Ａは、個々に、Ｓ−エクオール及び抗ＰＤ−１抗体が、腫瘍体積を、対照群と比較して減少させるが、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＳ−エクオールは、腫瘍体積を、３５日の事後投与を通して、Ｓ−エクオール又は抗ＰＤ−１抗体単独と比較して減少させることを示す。
【図４Ｂ】図４は、ＡＴ３乳房腫瘍細胞株が接種されたマウスにおいて、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＳ−エクオールの効果を示す。マウスには、抗ＰＤ−１抗体を３日ごとに２００μｇ、Ｓ−エクオールを一日あたり５０ｍｇ／ｋｇ投与した。図４Ｂは、個々に、Ｓ−エクオール及び抗ＰＤ−１抗体が、腫瘍重量を、対照群と比較して減少させるが、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＳ−エクオールは、腫瘍重量を、Ｓ−エクオール又は抗ＰＤ−１抗体単独と比較して減少させることを、示す。
【図４Ｃ】図４は、ＡＴ３乳房腫瘍細胞株が接種されたマウスにおいて、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＳ−エクオールの効果を示す。マウスには、抗ＰＤ−１抗体を３日ごとに２００μｇ、Ｓ−エクオールを一日あたり５０ｍｇ／ｋｇ投与した。図４Ｃは、溶媒＋ＩｇＧ２ａ、Ｓ−エクオール＋ＩｇＧ２ａ、溶媒＋抗ＰＤ−１抗体及びＳ−エクオール＋抗ＰＤ−１抗体で治療されたマウスからの腫瘍を示し、また、個々に、Ｓ−エクオール及び抗ＰＤ−１抗体が、腫瘍の大きさを、対照群と比較して小さくするが、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＳ−エクオールは、腫瘍の大きさを、Ｓ−エクオール又は抗ＰＤ−１抗体単独と比較して小さくすることを示している。
【図５Ａ】図５は、腫瘍浸潤リンパ球の解析を示す。図５Ａは、Ｓ−エクオール又は抗ＰＤ−１抗体単独で治療したマウスと比較して、Ｓ−エクオールと抗ＰＤ−１抗体とを併用して治療したマウスにおいて、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞の割合が増加したことを示す。
【図５Ｂ】図５は、腫瘍浸潤リンパ球の解析を示す。図５Ｂは、Ｓ−エクオール又は抗ＰＤ−１抗体単独で治療したマウスと比較して、Ｓ−エクオールと抗ＰＤ−１抗体とを併用して治療したマウスにおいて、ＣＤ４＋細胞が減少したことを示す。
【図５Ｃ】図５は、腫瘍浸潤リンパ球の解析を示す。図５Ｃは、Ｓ−エクオール又は抗ＰＤ−１抗体単独で治療したマウスと比較して、Ｓ−エクオールと抗ＰＤ−１抗体とを併用して治療したマウスにおいて、ＣＤ８＋細胞が増加したことを示す。
【図５Ｄ】図５は、腫瘍浸潤リンパ球の解析を示す。図５Ｄは、Ｓ−エクオール又は抗ＰＤ−１抗体単独で治療したマウスと比較して、Ｓ−エクオールと抗ＰＤ−１抗体とを併用して治療したマウスにおいて、ＮＫ１．１＋細胞が増加したことを示す。
【図６】図６は、Ｅ０７７１乳房腫瘍細胞株を接種したマウスにおいて抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＳ−エクオールの効果を示す。マウスには、抗ＰＤ−１抗体を３日ごとに２００μｇと、Ｓ−エクオールを日に５０ｍｇ／ｋｇ投与した。図６は、Ｓ−エクオールと抗ＰＤ−１抗体とを併用すると、腫瘍体積が、２８日の事後接種を通して、Ｓ−エクオール又は抗ＰＤ−１抗体単独と比較して減少することを示している。
【図７Ａ】図７は、Ｅ０７７１乳房腫瘍細胞株を接種したマウスにおいて抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＳ−エクオールの効果を示す。図７Ａは、溶媒＋ＩｇＧ２ａ、Ｓ−エクオール＋ＩｇＧ２ａ、溶媒＋抗ＰＤ−１抗体及びＳ−エクオール＋抗ＰＤ−１抗体で治療したマウスからの腫瘍を示す。
【図７Ｂ】図７は、Ｅ０７７１乳房腫瘍細胞株を接種したマウスにおいて抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＳ−エクオールの効果を示す。図７Ｂは、Ｓ−エクオール又は抗ＰＤ−１抗体単独と比較して、Ｓ−エクオールと抗ＰＤ−１抗体との併用では、腫瘍重量が減少したことを示す。
【図８】図８は、Ｓ−エクオールが、ｐＹ３６を刺激し、生体内における腫瘍増殖を抑制することを示す。図８Ａは、ｐＹ３６−特異的リン酸化シグナルが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞内において、ＥＲα／ＥＲβ共通アゴニスト１７−β−エストラジオールと、２つのＥＲβ−特異的アゴニストジアリールプロピオニトリル（ＤＰＮ）及びＳ−エクオールとにより、促進されたことを示す。図８Ｂは、Ｓ−エクオール治療が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞由来の異種移植腫瘍増殖（ｎ＝５）を抑制したことを示す。図８Ｃは、異種移植腫瘍におけるＫｉ６７の発現を示す。図８Ｄは、溶媒治療による異種移植腫瘍サンプル及びＳ−エクオール治療による異種移植腫瘍サンプルにおけるＥＲβ−ｐＹ３６シグナルを示す。＊ｐ，０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。以下に挙げるＹｕａｎ他（２０１６）を参照されたく、当該文献は、参照により本明細書にすべての目的のため援用される。
【図９】図９は、Ｓ−エクオールによる患者の治療のための一般化されたプロトコルを示す。
【図１０】図１０は、ＣＤ８＋細胞の活動の概略図を示す。
【図１１】図１１は、ＣＤ４＋細胞の活動の概略図を示す。
【図１２】図１２は、パイロット臨床試験の結果を示す（以下の実施例７）。
【図１３】図１３は、Ｓ−エクオールを用いたヒト臨床試験の概略を示す。
【図１４Ａ】図１４は、ｐＹ３６と、乳癌における疾病予後との関係を示す図である。図１４Ａは、ｐＹ３６−ＥＲβのＩＨＣ強度と相関するステージＩＩ〜ＩＩＩのサンプルにおける無病全生存期間のカプラン・マイヤー推定値を示す。
【図１４Ｂ】図１４は、ｐＹ３６と、乳癌における疾病予後との関係を示す図である。図１４Ｂは、（Ａ）のＩＨＣ強度と全ＥＲβ  ＩＨＣと相関するステージＩＩ〜ＩＩＩのサンプルにおける無病全生存期間のカプラン・マイヤー推定値を示す。
【図１５Ａ】図１５は、Ｓ−エクオールが、異種移植マウスモデルにおいてＴＮＢＣ細胞の増殖を減少させることを示す。図１５Ａは、対照群とＳ−エクオールで治療したマウス群の腫瘍におけるＫｉ−６７陽性を示す。
【図１５Ｂ】図１５は、Ｓ−エクオールが、異種移植マウスモデルにおいてＴＮＢＣ細胞の増殖を減少させることを示す。図１５Ｂは、Ｋｉ−６７免疫組織化学的検査（ＩＨＣ；ｘ４０）の画像を示す。
【図１６Ａ】図１６は、ＥＭＴ６乳房腫瘍を用いたＳ−エクオール及び／又はα−ＰＤ−１による治療である。マウスに、３×１０５ＥＭＴ６細胞を注入し、α−ＰＤ−１を、３日ごとに２００μｇ／マウス腹腔内投与し、Ｓ−エクオールを、経口胃管栄養法により５０ｍｇ／ｋｇ／日投与した。図１６Ａは、溶媒とα−ＩｇＧ２ａとを併用した場合（青色の線（〇））、Ｓ−エクオールとα−ＩｇＧ２ａとを併用した場合（赤色の線（□））、溶媒とα−ＰＤ−１とを併用した場合（紫色の線（◇））及びＳ−エクオールとα−ＰＤ−１とを併用した場合（緑色の線（△））の腫瘍接種後２８日間にわたる腫瘍体積を示す。
【図１６Ｂ】図１６は、ＥＭＴ６乳房腫瘍を用いたＳ−エクオール及び／又はα−ＰＤ−１による治療である。マウスに、３×１０５ＥＭＴ６細胞を注入し、α−ＰＤ−１を、３日ごとに２００μｇ／マウス腹腔内投与し、Ｓ−エクオールを、経口胃管栄養法により５０ｍｇ／ｋｇ／日投与した。図１６Ｂは、溶媒とα−ＩｇＧ２ａとを併用した場合（青色の点（〇））、Ｓ−エクオールとα−ＩｇＧ２ａとを併用した場合（赤色の点（□））、溶媒とα−ＰＤ−１とを併用した場合（紫色の点（◇））及びＳ−エクオールとα−ＰＤ−１とを併用した場合（緑色の点（△））の腫瘍接種後のＥＭＴ６腫瘍重量を示す。
【図１６Ｃ】図１６は、ＥＭＴ６乳房腫瘍を用いたＳ−エクオール及び／又はα−ＰＤ−１による治療である。マウスに、３×１０５ＥＭＴ６細胞を注入し、α−ＰＤ−１を、３日ごとに２００μｇ／マウス腹腔内投与し、Ｓ−エクオールを、経口胃管栄養法により５０ｍｇ／ｋｇ／日投与した。図１６Ｃは、溶媒とα−ＩｇＧ２ａとを併用した場合（上の行）、Ｓ−エクオールとα−ＩｇＧ２ａとを併用した場合（上から２番目の行）、溶媒とα−ＰＤ−１とを併用した場合（上から３番目の行）及びＳ−エクオールとα−ＰＤ−１とを併用した場合（下の行）の腫瘍接種後の腫瘍の大きさを示す。
【図１７Ａ】図１７は、治療後のＥＭＴ６腫瘍細胞におけるマーカーの発現を示す。図１７Ａは、ＣＤ４５の発現を示している。
【図１７Ｂ】図１７は、治療後のＥＭＴ６腫瘍細胞におけるマーカーの発現を示す。図１７Ｂは、ＣＤ８の発現を示している。
【図１７Ｃ】図１７は、治療後のＥＭＴ６腫瘍細胞におけるマーカーの発現を示す。図１７Ｃは、ＣＤ４の発現を示している。
【図１７Ｄ】図１７は、治療後のＥＭＴ６腫瘍細胞におけるマーカーの発現を示す。図１７Ｄは、ＮＫ１．１の発現を示している。
【図１７Ｅ】図１７は、治療後のＥＭＴ６腫瘍細胞におけるマーカーの発現を示す。図１７Ｅは、ＣＤ３の発現割合としてのＣＤ１０７ａの発現を示している。
【図１７Ｆ】図１７は、治療後のＥＭＴ６腫瘍細胞におけるマーカーの発現を示す。図１７Ｆは、ＣＤ８の発現割合としてのＣＤ１０７ａの発現を示している。
【図１７Ｇ】図１７は、治療後のＥＭＴ６腫瘍細胞におけるマーカーの発現を示す。図１７Ｇは、ＣＤ４の発現割合としてのＣＤ１０７ａの発現を示している。
【図１７Ｈ】図１７は、治療後のＥＭＴ６腫瘍細胞におけるマーカーの発現を示す。図１７Ｈは、ＮＫ１．１の発現割合としてのＣＤ１０７ａの発現を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
他の定義をしない限り、本明細書に使用されるすべての技術的及び化学的用語は、本発明の属する技術分野における当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似する又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用可能であるが、好ましい方法及び材料を記載している。一般的に、細胞及び分子生物学並びに分子化学に関して使用される専門語及びそれらの技術は、周知のものであり、本技術分野において通常使用されるものである。特に限定はしないが、特定の実験方法が、一般に、当該技術において周知の、また、本明細書を通して引用及び述べている種々の全体的な参考文献及びさらに個別の参考文献に記載の従来の方法によって、概ね実施されている。明確化のため、下記の用語を以下において定義する。
【００３１】
「実質的に純粋な」は、純度を低下させる任意のタンパク質が、約９０％の純度、好ましくは９５％の純度、さらに好ましくは９８％の純度であることを意味する。
【００３２】
「実質的に存在しない」は、純度を低下させる任意のタンパク質が、約１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは２％未満であることを意味する。
【００３３】
「およそ」又は「約」は、測定対象物が、＋／−１０％以内、好ましくは＋／−５％以内、より好ましくは＋／−２％以内であることを意味する。
【００３４】
「ＴＮＢＣ腫瘍」とは、ＩＨＣ法により、ＥＲ−アルファ及びＰＲについて癌細胞が５％未満又は５％核染色されたものかつＨＥＲ−２について０、１＋又は２＋染色されたものと定義する。蛍光インサイツハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）のみをＨＥＲ−２に対して実施する場合、ＨＥＲ−２は、２．０未満又は２．０である必要がある。（細胞質の染色に拘わらず）ＥＲ−ベータ又はｐＹ３６全体の明らかな核染色を示す腫瘍細胞は、ポジティブとスコアリングされることになる。
【００３５】
本発明は、Ｓ−エクオールによる乳癌の予防及び／又は治療に関する。本発明者らは、Ｓ−エクオールが、有効な免疫療法が限定されている、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）に対して特に有用な治療であることを見出した。
【００３６】
Ｓ−エクオールの投与量及び投与計画は、Ｓ−エクオールが、乳癌発生のリスクがある患者に予防的に投与されているのか否か、乳癌とすでに診断されている患者の治療として投与されているのか否かにより異なってくる。乳癌発生のリスクがある人は、乳癌の家族歴がある人及び／又はＢＲＣＡ１遺伝子若しくはＢＲＣＡ２遺伝子に１つ以上の突然変異を有する可能性のある人である。乳癌とすでに診断されている患者において、投与量及び投与計画はまた、癌の病期（Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期、ＩＶ期又はＶ期）に、含まれるリンパ節の数、腫瘍の大きさ及び同時に実施する他の治療法の利用可能性及び／又は判定によって変化し得る。投与量及び投与計画はまた、限定はしないがＥＲα、ＰＲ、ＨＥＲ２、Ｋｉ６７及びｐＹ３６を含む、腫瘍細胞上又は中に存在する種々の分子マーカーにより変化し得る。攻撃性及び／又は腫瘍再発の可能性について予後診断となるマーカー診断テストには、オンコタイプＤＸ（登録商標）乳癌検査、ＭａｍｍａＰｒｉｎｔ（登録商標）、ＰＡＭ−５０  ＲＯＲ、ＥｎｄｏＰｒｅｄｉｃｔ（登録商標）及びＢｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｄｅｘが含まれる。このようなマーカーは、限定はしないが、Ｋｉ６７、ＳＴＫ１５、サバイビン、ＣＣＮＢ１（サイクリンＢ１）、ＭＹＢＬ２等の増殖遺伝子、ＭＭＰ１１（ストロメライシン（Ｓｔｒｏｍｏｌｙｓｉｎ）３）、ＣＴＳＬ２（カテプシンＬ２）等の侵入遺伝子（ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｇｅｎｅｓ）、ＨＥＲ２遺伝子ＧＲＢ２及びＨＥＲ２、エストロゲン遺伝子ＥＲ、ＰＧＲ、ＢＣＬ２及びＳＣＵＢＥ２、並びにＧＳＴＭ１、ＣＤ６８及びＢＡＧ１等の他の癌関連遺伝子を含み（Ｋｉｔｔａｎｅｈ他（２０１３）、Ｃｏａｔｅｓ他（２０１５）も参照）、双方、参照によりその全体がすべての目的のため援用される。
【００３７】
Ｓ−エクオールは、１日あたり１回以上１服用量あたり１〜４００ｍｇ、より好ましくは１０〜３２０ｍｇ、より好ましくは５０〜１５０ｍｇを投与可能である。非限定的実施例は、２ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、８０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、１６０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３２０ｍｇ等の服用量又はおよそ若しくは約そのような服用量を含む。その服用量を、１日あたり１回、２回、３回又は４回、好ましくは１日２回（Ｂ．Ｉ．Ｄ．）投与可能である。投与計画は、無期限に、すなわち、マーカーが検査され服用量に対する応答性が判定される間隔における時間、継続させることができる。このような間隔の例は、２週間、４週間、２か月、４か月、６か月等の間隔又は約若しくはおよそこのような間隔である。上限は、投与計画に関して、必要ない。
【００３８】
投与されたＳ−エクオールは、好ましくは経口投与用に製剤化されたものだが、他の投与経路も考えられ、それには、経直腸、点眼、経口（例えば、舌下）、非経口（例えば、皮下、筋肉内、皮内及び静脈内）並びに経皮投与が含まれる。
【００３９】
本発明に係る組成物又は製剤は、１つ以上の製薬上許容可能な又は産業標準のフィラーを含み得る。フィラーは、組成物で治療される対象に有害であってはならない。フィラーは、固体若しくは液体、又は両方であり得る。フィラーは、活性Ｓ−エクオールを、単位服用量として、例えば錠剤として、製剤可能であり、Ｓ−エクオールを約１０％〜８０％の重量含み得るのが一般的である。組成物は、周知の製剤技術の任意のものにより、例えば、成分を混合し、任意選択的に、製剤分野で周知の賦形剤、希釈剤（例えば、水）及び助剤を含有させることにより、調製可能である。
【００４０】
経口投与に適切な組成物を、カプセル剤、カシェ剤、菱形剤又は錠剤等、個別の単位で提供可能であって、それぞれが、抽出エキスを、粉末又は顆粒として、水性若しくは非水性液体中の溶液又は懸濁液として、又は油中水若しくは水中油型エマルションとして、所定量含む。このような組成物は、活性Ｓ−エクオールと、１つ以上の適切な担体（上述のように１つ以上の副成分（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ）を含有し得る）とを関連付けるステップを含む、任意の適切な製剤方法により、調製可能である。一般に、本発明の組成物は、Ｓ−エクオールを、液体若しくは微粉固体の担体と又はその両方と、均一にかつ密に混合させ、次に、必要な場合は、結果として得られる混合物を成形することにより調製される。例えば、錠剤は、任意選択的に１つ以上の副成分とともに、抽出エキスを含む粉末又は顆粒を含有させるか又は成形することにより、調製可能である。圧縮錠剤は、粉末又は顆粒の形態の抽出エキスを、任意選択的に結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤及び／又は表面活性剤／分散剤と混合して、適切な機械で圧縮することにより、調製可能である。成形錠剤は、粉末化した合成物を不活性液体結合剤で湿らせて、適切な機械で成形することにより作製可能である。
【００４１】
砂糖等、例えば、ラクトース、ショ糖、マンニトール又はソルビトール、セルロース製剤及び／又はリン酸カルシウム、例えば、リン酸三カルシウム又はリン酸水素カルシウムといった適切なフィラーと、さらに、デンプンのり、例えば、トウモロコシ、小麦粉、米又はバレイショデンプン、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース（ｍｅｔｈｙｌｃｅｕｌｌｏｓｅ）及び／又はポリビニルピロリドンを用いたデンプンのり等の結合剤と、必要に応じて、上述のデンプン、さらに、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニル型ピロリドン、カンテン又はアルギン酸若しくは、アルギン酸ナトリウム等のアルギン酸塩等の崩壊薬と、である。添加物は、滑沢剤及び潤滑剤、例えば、ケイ酸、タルク、マグネシウム若しくはステアリン酸カルシウム等のステアリン酸又はステアリン酸塩、及び／あるいはポリエチレングリコールであり得る。糖衣錠には、適切で任意選択的に腸溶性のコーティングが施され、なかでも、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール及び／若しくは二酸化チタンを含み得る濃縮砂糖溶液、又は適切な有機溶媒若しくは溶媒混合物のコーティング溶液であって、すなわち、腸溶性コーティング製剤のための、微結晶セルロース、酢酸セルロースフタル酸若しくはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートフタル酸等の適切なセルロース製剤の溶液が、用いられている。染料又は色素を、錠剤又は糖衣錠コーティングに、例えば、識別目的で又は有効成分の各種服用量を示すために、添加し得る。
【００４２】
他の経口投与可能な医薬組成物は、例えば、ゼラチンからなる乾燥充填カプセル剤であり、また、ゼラチンと、グリセロール又はソルビトール等の可塑剤とからなる軟質密封カプセル（ｓｏｆｔ，  ｓｅａｌｅｄ  ｃａｐｓｕｌｅ）である。乾燥充填カプセル剤は、顆粒の形態の抽出エキスを、例えば、ラクトース等のフィラー、デンプン等の結合剤及び／又はタルク若しくはステアリン酸マグネシウム等のグリカント（ｇｌｉｃａｎｔ）と、適切な場合安定剤との混合物中に含み得る。軟質カプセルにおいて、抽出エキスは、好ましくは、脂肪油、パラフィン油又は液状ポリエチレングリコール等の適切な液体に溶解又は懸濁されており、そこに、安定剤も添加し得る。
【００４３】
本発明の一態様によれば、Ｓ−エクオールを含む組成物は、米国特許第７，９６０，４３２号明細書（２００８年７月３日出願）、米国特許第７，３９６，８５５号明細書（２００３年７月２４日出願）及び米国特許第９，４０８，８２４号明細書（２０１４年３月５日出願）に記載のものを含み、それぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【００４４】
本発明の別の態様によれば、Ｓ−エクオールは、米国特許第８，７１６，４９７号明細書（２０１２年９月１０日出願）、米国特許第８，２６３，７９０号明細書（２０１１年６月１日出願）、米国特許第７，９６０，５７３号明細書（２００９年５月４日出願）、米国特許第７，５２８，２６７号明細書（２００５年８月１日出願）及び米国特許第９，９１４，７１８号明細書（２０１４年１０月１４日出願）に記載のプロセスにより、化学的に（すなわち、化学合成により）調製可能であり、それぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される。例えば、Ｓ−エクオールは、エナンチオ選択的に、キラル配位子を有するイリジウム触媒を用いて調製可能である。Ｓ−エクオールをエナンチオ選択的に調製するこのような方法は、参照により援用される。
【００４５】
本発明の別の態様によれば、Ｓ−エクオールは、米国特許第９，９１４，７１８号明細書（出願番号１４／８８３，６１７、２０１５年１０月１４日出願）に記載のＳ−エクオールの無水結晶多形等、Ｓ−エクオールを単一の無水結晶多形にすることができ、その開示は、Ｓ−エクオールの無水結晶多形を特徴づけるのに用いられる化学的及び物理的特性を含め、その全体が参照により援用される。例えば、米国特許出願公開第２０１６／０１０２０７０号に記載のＳ−エクオールの無水結晶多形は、以下の特徴的なＸ線粉体回折パターン波数（ｃｍ−１）：３４３３、３０２３、３００３、２９０８、２８４４、１８８９、１６１４、１５９４、１５１７、１５０８、１４６９、１４５４、１４３８、１４００、１３６１、１３２３、１２９５、１２７６、１２６１、１２３４、１２１３、１１７６、１１５６、１１１６、１０６４、１０２０、９３５、８９７、８６５、８４０、８２５、８１０、７６９、７３４、６３１、６１６、５４７、５１７、４８０及び４６１を有する。Ｓ−エクオールの無水結晶多形の特徴は、参照により援用される。
【００４６】
Ｓ−エクオールは、１つ以上の追加の癌治療と組み合わせて、投与することができ、追加の癌治療には、外科手術（乳房＋／−腋窩）、細胞傷害性化学療法、放射線、免疫療法、癌ワクチン、細胞経路阻害剤（タンパク質又はペプチド、核酸ベースの［ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ］及び／又はホルモン（アジュバント内分泌）療法が含まれる。乳癌治療に適する細胞傷害性化学療法の例には、限定はしないが、ドキソルビシン（アドリアマイシン）及びエピルビシン（エレンス）等のアントラサイクリン、パクリタキセル（タキソール（登録商標））及びドセタキセル（タキソテール（登録商標））等のタキサン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン、シクロホスファミド（シトキサン）及びカルボプラチン（パラプラチン（登録商標））が含まれる。アジュバント内分泌療法の例には、タモキシフェン並びに、アナストロゾール（アリミデックス（登録商標））、エキセメスタン（アロマシン（登録商標））及びレトロゾール（フェマーラ（登録商標））等のアロマターゼ阻害剤が含まれる。免疫療法の例には、限定はしないが、ペムブロリズマブ（キイトルーダ（登録商標）、ＭＫ−３４７５）、ニボルマブ（オプジーボ（登録商標））、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、トレメリムマブ、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、アベルマブ、トラスツズマブ、ＰＤＲ００１及びＭＧＤ００９が含まれる。既知の細胞経路阻害剤の一例は、ラパチニブ等のチロシンキナーゼ阻害剤である。免疫療法モノクローナル抗体又は他の癌療法の適切な投与量は、効能に基づいて決定され、その決定は、十分、当該技術分野の技術の範囲内である。投薬は、ｍｇ、ｍｇ／ｋｇ又はｍｇ／ｍ２であってよい。Ｓａｃｈｓ他（２０１６）を参照のこと。当該文献は、参照によりその全体が、治療用抗体、小分子及び投与量の例を含めて、すべての目的のため本明細書に援用される。Ｓ−エクオール及び／又は追加の治療用組成物は、服用量、毒性及び効能によって、日に１回、２回、３回又はそれ以上投与することができる。投薬は、数日間、数週間又は数か月にわたって行うことができ、連続して又は断続的に行うことができる。免疫療法の典型的な投与量は、５０〜５００ｍｇ／日であり、より好ましくは１００〜４００ｍｇ／日であり、より好ましくは１５０〜２５０ｍｇ／日である。特定の実施形態では、服用量を、１５０ｍｇ／日若しくは１５０ｍｇを日に２回、又は２５０ｍｇ／日若しくは２５０ｍｇを日に２回とすることができる。他の実施形態では、投与量は、患者の体重に基づいて、例えば、０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１、２又は５ｍｇ／ｋｇとすることができる。投与量はまた、ｍｇ／ｍ２として、例えば、５０〜５００ｍｇ／ｍ２、より好ましくは１００〜３００ｍｇ／ｍ２、例えば、約１００、１５０、２００、２５０又は３００ｍｇ／ｍ２とすることができる。
【００４７】
投与量は、前述の範囲の任意の範囲の約下限か若しくは下限より多くすることができ、又は上述の範囲の任意の範囲の約上限か若しくは上限より少なくすることができる。
【００４８】
Ｓ−エクオール＋／−の他の癌治療に対する応答性は、１つ以上の細胞マーカーを、画像処理技術、細胞増殖アッセイ及び腫瘍の直接検査により、解析することによって、評価することができる。細胞マーカーの解析は、免疫組織化学的若しくは免疫細胞化学的技術を用いて、又はハイブリダイゼーション法及びポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）等の核酸検出により、行うことができる。有糸分裂及び腫瘍増殖を評価するための好ましいバイオマーカーは、Ｋｉ６７（Ｂｅｅｌｅｎ他（２０１２）、Ｕｒｒｕｔｉｃｏｅｃｈｅａ他（２００５））である。
【００４９】
以下の実施例は、本発明を理解しやすくするために提供するものであって、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。本発明の趣旨から逸脱せずに示された手順を変更することができることを理解されたい。
【００５０】
［実施例］
本発明のプロセスは、以下の実施例に関連してさらによく理解されるであろうが、実施例は、例証に過ぎず、本発明の範囲を限定することは意図していない。開示の実施形態への種々の変更及び改変は、当業者に明らかであろう。また、このような変更及び改変は、限定はしないが、本発明の趣旨及び添付の特許請求の範囲から逸脱せずに行うことができる本発明のプロセス、製剤及び／又は方法に関するものを含む。
【実施例１】
【００５１】
新たに特定されたリン酸化チロシンスイッチが、ＥＲβの腫瘍外因性機能を制御するか否かを判定するために、内在性マウスＥＲβの対応のチロシン残基がフェニルアラニン（Ｙ−Ｆ）に突然変異した全身ノックイン（ＫＩ）マウスモデル（Ｃ５７ＢＬ／６）を確立した。これまでに報告されているＥＲβノックアウト（ＫＯ）マウス（Ｋｒｅｇｅ他（１９９８））と一致するが、このようなリン酸化による突然変異ＫＩマウスは、明らかな発育異常はなく、ＷＴ同腹仔と全く区別不可能である（非公開データ）。ＫＯ及びＫＩマウスにおけるＥＲβ発現の調査は、Ｙ−Ｆ突然変異タンパク質が、骨髄及び膵臓を含めて複数の組織においてＷＴ  ＥＲβと比較可能なレベルで発現したことを示した（図１Ａ）。種々の起源の同系マウスの腫瘍細胞を、ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ型乳癌特性を有するＭＭＴＶ−Ｗｎｔ乳房腫瘍細胞株を含めて（Ｐｆｅｆｆｅｒｌｅ他（２０１３））、ＷＴ及びＫＩレシピエントマウスに移植した。全例で、腫瘍細胞は、ＥＲβ  ＫＩレシピエントマウスにおいて、同系のＷＴ対応物におけるよりも、さらに力強く増殖した（図１Ｂ、データは図示せず）。このようなデータは、明らかに、リン酸化チロシンスイッチが、複数の腫瘍タイプにおけるＥＲβ  腫瘍外因性抗腫瘍活性にとって重要であることを示している。
【実施例２】
【００５２】
以下の実験は、抗腫瘍免疫の役割に基づいた腫瘍阻害における宿主ＥＲβシグナル伝達と、癌免疫療法における最近の臨床上の進歩とをさらに詳述しようとするものである（Ｔｏｐａｌｉａｎ他（２０１５）、Ｃｈｅｎ及びＦｌｉｅｓ（２０１３）、Ｓｈａｒｍａ及びＡｌｌｉｓｏｎ（２０１５））。骨髄移植を必要とするマウスキメラの実験を行った。図２Ａに図示したように、まず、ＷＴレシピエントマウスに照射し（１０Ｇｙ）、内在性骨髄細胞を死滅させ、続いて、同系のＫＩ又はＷＴドナーから骨髄を移植した。ＫＩ＞ＷＴ及びＷＴ＞ＷＴマウスにおいてキメラ化がうまくいくことを確認した後、骨髄を移植してから８週で腫瘍細胞を注入した。腫瘍増殖が、ＷＴ＞ＷＴ対照群に対して、（ＫＩ免疫細胞を伴う）ＫＩ＞ＷＴキメラの方が顕著に多かった（図２Ｂ）。このことは、ＫＩ免疫細胞による腫瘍増殖制御が不十分であったことを示唆している。よって、このようなデータは、腫瘍外因性ＥＲβが、免疫応答に対して抗腫瘍活性することの重要性と関連している。
【実施例３】
【００５３】
次に、腫瘍浸潤免疫細胞個体群を解析した。腫瘍浸潤ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の総数は、ＷＴ＞ＷＴマウスと比較してＫＩ＞ＷＴマウスでは減少し（図２Ｃ、データは図示せず）、さらに、ＫＩマウスにおける抗腫瘍免疫が損なわれるという見解を支持するものである。さらに、ＩＦＮγ−産生ＣＤ８＋（抗腫瘍）細胞の有症率が、ＷＴ＞ＷＴマウスからの腫瘍と比較してＫＩ＞ＷＴマウスからの腫瘍では顕著に減少し（図２Ｄ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害の効力が、機能的ＥＲβのシグナル伝達の欠如で損なわれたことを示唆している。本明細書には図示していない付加的な予備データは、抗腫瘍Ｔ細胞を刺激するものである、樹状細胞の活性化もまた、ＭＨＣ−ＩＩ発現の減少から明らかであるように、ＫＩ＞ＷＴキメラマウスにおいて損なわれたことを、示している。さらに、エフェクターＴ細胞は、活性化が低下し（ＣＤ４４／ＣＤ６２Ｌの減少）、ＫＩ＞ＷＴキメラにおいて他のエフェクター機能が減少してしまっている［例えば、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）α、インターロイキン（ＩＬ）−２及びパーフォリンの減少、データは図示せず］。このようなデータは、抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクタの活性が、ＥＲβに応じて増強され、腫瘍内免疫細胞の蓄積が改善されることを強く示唆している。したがって、ＥＲβ抗腫瘍活性を、Ｓ−エクオール等臨床的に安全なＥＲβアゴニストで回復させることによって、既存の抗癌免疫療法の有効性が向上し、ＴＮＢＣの治療の有効性が高くなる。
【実施例４】
【００５４】
以下の３つのマウス乳房腫瘍株、（１）Ｅ０７７１（Ｂ６バックグラウンド）、（２）ＡＴ−３（Ｂ６バックグラウンド）及び（３）４Ｔ１（ＢａｌｂＣバックグラウンド）に対して、腫瘍増殖における、ＰＤ−１阻害薬と、Ｓ−エクオールと、２つの治療法の組み合わせとの効果を判定するために試験を行った。この実験デザインは、（一例としてＡＴ−３を用いた）４群、（１）対照群、（２）αＰＤ−１、（３）Ｓ−エクオール、（４）αＰＤ−１＋Ｓ−エクオール（図３）を含み、マウスの２×１０５の細胞を、４番目の乳腺脂肪パッドに皮下注入することにより行った。抗体にα−ＰＤ−１を投与、マウス１体あたり２００μｇを３日ごとに腹腔内注入し、Ｓ−エクオールを５０ｍｇ／１ｋｇ／日経口胃管栄養法により投与した。治療は、腫瘍接種後７日から開始した。腫瘍増殖経路を、反復測定線形混合モデルを用いて、治療したマウスにおいて比較した。主要評価項目は、腫瘍の大きさの対数であり、検定統計量は、治療×時間の交互作用である。腫瘍を約１０回測定した。研究において使用したレシピエントマウスの数（一群ごとにｎ＝８）は、上記研究に基づいたものだった。この実験による結果（図４〜７）は、Ｓ−エクオールが抗癌免疫療法を促進することができることを、実証するものである。
【実施例５】
【００５５】
それぞれの群における腫瘍の大きさ及び重量の測定に加えて、免疫表現型検査を実施して、単一の療法と組み合わせ療法との抗腫瘍効果により多くの機構的洞察（ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｉｎｓｉｇｈｔ）を得た。腫瘍、脾臓及び排出リンパ節を採取し秤量した。抗凝固化血液を心臓穿刺により採血した。腫瘍を、免疫組織化学的検査のためパラフィン包埋し、ルミネックスによるｍＲＮＡ及びタンパク質解析のため急速凍結した。（表現型／機能のために）フローサイトメトリーを、（定量化のために）ＶｉＣｅｌｌ（登録商標）を用いて、腫瘍浸潤物、腫瘍排出リンパ節及び脾臓からの免疫細胞を解析した。解析には、ＣＤ３＋全Ｔ細胞並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセット、エフェクター機能（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、パーフォリン、ＣＤ１０７ａ）、活性化（例えば、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ）及び疲弊（例えば、ＰＤ−１、Ｔｉｍ３、Ｌａｇ３）が含まれる。抗原提示細胞（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１ｃ−単球／マクロファージ、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞）、ＮＫ１．１＋ＮＫｐ４６＋ＮＫ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘｐ３＋）及び骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１ｈｉ）も、解析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞受容体の多様性を、市販のキット（Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で評価した。局所的な細胞増殖も、Ｋｉ６７及びＢｒｄＵの染色で試験した。
【実施例６】
【００５６】
前臨床の動物モデルにおけるさらなる研究が、Ｓ−エクオールを用いてＴＮＢＣ乳癌を治療することについての見解を支持する。免疫不全マウスの異種移植実験では、ヒトＴＮＢＣ乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１を用いたが、腫瘍成長が、Ｓ−エクオール治療で対照群と比較して６０％抑制された。５×１０６ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、６週齢の雌の胸腺欠損ヌードマウスの乳腺脂肪パッドに同所注入した（Ｈａｒｌａｎ）。腫瘍量が（接種の約１週間後）５０〜５８ｍｍ３に達したとき、マウスに、毎日（日に２０又は６０ｍｇ／ｋｇの）Ｓ−エクオールを又は溶媒対照群としてＰＢＳを皮下注入した。腫瘍形成に続いて、ノギス測定を、２つの直交する軸線、長さ（Ｌ）と幅（Ｗ）とに沿って行い、体積（Ｖ）を、式Ｖ＝［Ｌ×（Ｗ２）］／２で推定した。マウスから採取した異種移植腫瘍を、１０％の中性緩衝ホルマリン中で固定し、脱水し、パラフィンで包埋し、３μｍ厚さの切片にした。溶媒対照群からの代表的な腫瘍切片及びＳ−エクオールで治療したマウスに、Ｋｉ−６７発現に対する試験をして細胞増殖を評価し、ＥＲβ  ｐＹ３６に対する試験をした。実験における統計的有意性を、両側スチューデントｔ検定により評価した。すべてのアッセイにおいて、ｐ＜０．０５が、統計学的に有意であるとみなされた。この実験結果を図８及び図１５に示す。以下に挙げるＹｕａｎ他２０１６を参照されたく、当該文献は、参照により本明細書にすべての目的のため援用される。
【実施例７】
【００５７】
パイロットバイオマーカー臨床試験を、ＴＮＢＣと確認されている対象２０名に実施して、腫瘍細胞増殖の指標であるＫｉ６７について、ＥＲβアゴニストＳ−エクオールの効果を判定した。腫瘍細胞増殖を、Ｋｉ−６７について免疫組織学的染色を行うことにより測定した。プロトコルの概要を示す図１３を参照。Ｋｉ−６７は、遺伝子ＭＫＩ６７遺伝子によりコードされており、核膜の分解の後に続いて細胞質に分散される個々の有糸分裂染色体を維持することを求められている。腫瘍のＫｉ−６７陽性細胞の画分を測定することが、癌患者の予後を評価するための信頼できるパラメータであることが、知られている。ＴＮＢＣの対象は、Ｋｉ６７が非常に高レベルであることが分かっている。
【００５８】
研究に登録された患者は、病歴、身体、検査所見、放射線画像診断及び診断用生検を受けた。Ｋｉ６７（増殖マーカー）、全ＥＲβ、ｐＹ３６−ＥＲβ（リン酸化ＥＲβ）、Ｂ７Ｈ１（ＰＤＬ−１としても知られる）及びＢＲＣＡ１（乳癌１、早発性）の免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）を、治療に先立ちコア針生検組織サンプルを用いて行った。患者に、予定されている腫瘍手術前に又は一次全身療法の開始前に、Ｓ−エクオール５０ｍｇを２日に１回およそ２週間（１０〜２１日）経口投与した。腫瘍サンプルを、外科手術又は２週間の再度のコア針生検により得た。Ｋｉ６７、全ＥＲβ、リン酸化ＥＲβ（ｐＹ３６）及びＢＲＣＡ１の治療後ＩＨＣ評価を得た。Ｋｉ６７の減少は、ヒト乳癌の試験において短期及び長期両方のホルモン療法の有効性を検証済みの代替マーカーであり、Ｓ−エクオールを用いた治療の前と後との比較を行った。Ｓ−エクオールは、測定可能な減少をＫｉ６７に生じ、この腫瘍タイプにおける有効性を示した。ｃ−ＤＮＡマイクロアレイプラットフォームを用いて、Ｓ−エクオールによる活性化の結果として得られるＥＲβの下流の転写標的も発見した。
【００５９】
本研究に適格な女性は、これまで未治療で、任意の大きさの無処置の原発性乳腺腫瘍を伴うトリプルネガティブ乳癌と、改めて診断されている。この疾患のすべての段階が適格である。ステージング手技又は中心ライン留置等、進行疾患について標準的な術前評価又は治療前の精密検査を受けている間に、Ｓ−エクオールを服用してもらった。一次手術を実施した場合、標準的な診断評価後の組織残渣が、２週間のバイオマーカー評価のために使用される。患者に、２週間のＳ−エクオール治療の終わりに一次手術がなかった場合、１４ゲージコア針生検の第２セットが、標準的な任意の全身療法の開始前に得られる。図９を参照。
【００６０】
バード社製１４ゲージ針を用いたコア生検を取得するための標準的手技を、登録前にＴＮＢＣを判定するために用いた。可能な場合はいつでも、ＩＨＣ解析に使用される腫瘍組織を、診断用コア生検と同時に取得する。組織サンプルは、すべてと、ｐＹ３６  ＥＲβと、Ｋｉ６７とを染色するために送られ、解析された。ＥＲα、ＰＲ及びＨＥＲ−２の試験を、検証済みの方法を用いて実施した。  ＴＮＢＣ腫瘍とは、ＩＨＣにより、ＥＲα及びＰＲについて癌種の５％未満の核が染色され、ＨＥＲ−２について０、１又は２＋の染色がされたものと定義する。Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製の全ゲノムＤＡＳＬ（登録商標）ＨＴプラットフォームは、極めて低量のＲＮＡ（５０ｐｇ）の入力で遺伝子発現をプロファイリングするために設計されたものであるが、Ｓ−エクオールへの曝露前後に得た対のＦＦＰＥ組織を調べるために用いられた。
【００６１】
統計解析を行い、ＥＲβ発現ＴＮＢＣが、Ｋｉ６７の測定可能な程度の低下により明示されるように、Ｓ−エクオールに応答することが示された。一次解析で、Ｋｉ６７発現の幾何平均の変化を、ベースラインから２週間まで統計的に予測した。これは、ログ変換データにおける前後の差分について１標本ｔ−検定を用いて実行され、９５％の信頼区間であると大まかに言える。ＩＭＰＡＣＴ試験によれば、２週間後のＫｉ６７発現の幾何平均における変化は、アナストロゾール群、タモキシフェン群及び組合せ群それぞれについて、〜７６、〜５９．５及び〜６３．９％であり、標準偏差は、ログスケールでおよそ１．０だった。このことは、Ｋｉ６７発現における低下に対する検定を行うためには、効果量が１．０〜１．５、検定力＞９０％であるとともに、両側α＝０．０５、標本サイズが、自然増加及び脱落の可能性における変動を考慮して少なくとも４５名の患者であることを示している。すべての計算を、ＳＡＳ  ｖ９．２＋（ニューカロライナ州ケーリー）又はＲ  ｖ２．１５＋（オーストリア国ウィーン）で実行した。２０名の患者を登録し研究を完了した。１７名の患者が、評価可能な治療前後のサンプルを有していた。この１７名の評価可能な患者のうち、Ｋｉ−６７が、４名の患者で３０％を超える減少をし、１名の患者で２０％を超える減少をし、７名の患者で０〜２０％の減少をした（５名の患者は、Ｋｉ−６７減少なし）。図１２を参照。
【実施例８】
【００６２】
フォローアップ臨床試験は、新たにＴＮＢＣと診断された２５名の患者を登録し、患者に、治療及び評価を、Ｓ−エクオールの服用量を２日に１回１５０ｍｇに増量したことを除いて、実施例７において説明したように行った。Ｓ−エクオールを用いた治療は、１０〜２１日間である。Ｋｉ６７を、実施例７において記載したように解析した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１７Ｈ】
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【国際調査報告】
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