(57)【要約】アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴОＰβアンタゴニストドメイン、および免疫チェックポイントアンタゴニストドメインの２つまたはそれより多くを含む、二機能性および三機能性融合タンパク質が本明細書に開示される。さらに、本開示は、アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴОＰβアンタゴニストドメイン、および免疫チェックポイントアンタゴニストドメインの２つまたはそれより多くを含む二機能性または三機能性融合タンパク質を投与することを含む、がん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、または異形成障害を処置する方法を提供する。必要に応じて、このような方法は、がん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、または異形成障害を処置するための追加の活性薬剤または支持療法を投与することをさらに含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴＧＦβアンタゴニストドメイン、および免疫チェックポイントアンタゴニストドメインから選択される２つまたはそれより多くのドメインを含む融合タンパク質。
【請求項２】
アクチビンアンタゴニストドメインおよびＴＧＦβアンタゴニストドメインを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
アクチビンアンタゴニストドメインおよび免疫チェックポイントアンタゴニストドメインを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ＴＧＦβアンタゴニストドメインおよび免疫チェックポイントアンタゴニストドメインを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴＧＦβアンタゴニストドメイン、および免疫チェックポイントアンタゴニストドメインを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴＧＦβアンタゴニストドメイン、および／または免疫チェックポイントアンタゴニストドメインに対して異種であるポリペプチドドメインをさらに含む、任意の先行する請求項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
リンカードメインをさらに含む、任意の先行する請求項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記融合タンパク質の前記ドメインが、
ａ．Ａ−Ｘ−Ｔ；
ｂ．Ａ−Ｘ−Ｉ；
ｃ．Ｔ−Ｘ−Ｉ；
ｄ．Ａ−Ｘ−Ｈ−Ｘ−Ｔ；
ｅ．Ａ−Ｘ−Ｈ−Ｘ−Ｉ；
ｆ．Ｉ−Ｘ−Ｈ−Ｘ−Ｔ；
ｇ．Ａ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ｉ；
ｈ．Ｔ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｉ；
ｉ．Ａ−Ｘ−Ｉ−Ｘ−Ｔ；
ｊ．Ａ−Ｘ−Ｔ−Ｈ−Ｘ−Ｉ；
ｋ．Ｔ−Ｘ−Ａ−Ｈ−Ｘ−Ｉ；
ｌ．Ａ−Ｘ−Ｉ−Ｈ−Ｘ−Ｔ；
ｍ．Ａ−Ｘ−Ｈ−Ｔ−Ｘ−Ｉ；
ｎ．Ｔ−Ｘ−Ｈ−Ａ−Ｘ−Ｉ；および
ｏ．Ａ−Ｘ−Ｈ−Ｉ−Ｘ−Ｔ
（式中、（ｉ）「Ａ」は、アクチビンアンタゴニストドメインに相当し；（ｉｉ）「Ｔ」は、ＴＧＦβアンタゴニストドメインに相当し；（ｉｉｉ）「Ｉ」は、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインに相当し；（ｉｖ）「Ｈ」は、前記アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴＧＦβアンタゴニストドメイン、および免疫チェックポイントアンタゴニストドメインに対して異種であるポリペプチドドメインに相当し；（ｖ）「Ｘ」は、必要に応じたリンカードメインに相当し；前記ドメインの配置が、Ｎ末端からＣ末端か、またはＣ末端からＮ末端である）
からなる群から選択される順序で配置されている、任意の先行する請求項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
先行する請求項のいずれかに記載の融合タンパク質を含むホモ二量体。
【請求項１０】
アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴＧＦβアンタゴニストドメイン、および免疫チェックポイントアンタゴニストドメインから選択される２つまたはそれより多くのポリペプチドドメインを含むヘテロ二量体。
【請求項１１】
ａ．Ａ−Ｘ−Ｔ；
ｂ．Ａ−Ｘ−Ｉ；
ｃ．Ｔ−Ｘ−Ｉ；
ｄ．Ａ−Ｘ−Ｈ−Ｘ−Ｔ；
ｅ．Ａ−Ｘ−Ｈ−Ｘ−Ｉ；
ｆ．Ｉ−Ｘ−Ｈ−Ｘ−Ｔ；
ｇ．Ａ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ｉ；
ｈ．Ｔ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｉ；
ｉ．Ａ−Ｘ−Ｉ−Ｘ−Ｔ；
ｊ．Ａ−Ｘ−Ｔ−Ｈ−Ｘ−Ｉ；
ｋ．Ｔ−Ｘ−Ａ−Ｈ−Ｘ−Ｉ；
ｌ．Ａ−Ｘ−Ｉ−Ｈ−Ｘ−Ｔ；
ｍ．Ａ−Ｘ−Ｈ−Ｔ−Ｘ−Ｉ；
ｎ．Ｔ−Ｘ−Ｈ−Ａ−Ｘ−Ｉ；および
ｏ．Ａ−Ｘ−Ｈ−Ｉ−Ｘ−Ｔ
（式中、（ｉ）「Ａ」は、アクチビンアンタゴニストドメインに相当し；（ｉｉ）「Ｔ」は、ＴＧＦβアンタゴニストドメインに相当し；（ｉｉｉ）「Ｉ」は、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインに相当し；（ｉｖ）「Ｈ」は、前記アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴＧＦβアンタゴニストドメイン、および免疫チェックポイントアンタゴニストドメインに対して異種であるポリペプチドドメインに相当し；（ｖ）「Ｘ」は、必要に応じたリンカードメインに相当し；前記ドメインの配列が、Ｎ末端からＣ末端かまたはＣ末端からＮ末端である）
から選択される２つのポリペプチドを含む、請求項１０に記載のヘテロ二量体。
【請求項１２】
ａ．免疫チェックポイントアンタゴニストドメインおよびＴＧＦβアンタゴニストドメインを含む第１のポリペプチド；ならびに
ｂ．アクチビンアンタゴニストドメインを含む第２のポリペプチド
を含むヘテロ二量体。
【請求項１３】
前記第２のポリペプチドが、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインをさらに含む、請求項１２に記載のヘテロ二量体。
【請求項１４】
ａ．ＴＧＦβアンタゴニストドメインおよびアクチビンアンタゴニストドメインを含む第１のポリペプチド；ならびに
ｂ．免疫チェックポイントアンタゴニストドメインを含む第２のポリペプチド
を含むヘテロ二量体。
【請求項１５】
前記第２のポリペプチドが、ＴＧＦβアンタゴニストドメインをさらに含む、請求項１４に記載のヘテロ二量体。
【請求項１６】
前記第２のポリペプチドが、アクチビンアンタゴニストドメインをさらに含む、請求項１４に記載のヘテロ二量体。
【請求項１７】
前記アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴＧＦβアンタゴニストドメイン、および／または免疫チェックポイントアンタゴニストドメインに対して異種である１つまたは複数のポリペプチドドメインをさらに含む、請求項１２から１６のいずれか一項に記載のヘテロ二量体。
【請求項１８】
１つまたは複数のリンカードメインをさらに含む、任意の先行する請求項に記載のヘテロ二量体。
【請求項１９】
前記アクチビンアンタゴニストドメインが、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドである、任意の先行する請求項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項２０】
前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドが、
ａ．配列番号１１０の２１〜３０位のいずれか１つで開始し、配列番号１１０の１１０〜１３５位のいずれか１つで終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ．配列番号１１０の２１位で開始し、配列番号１１０の１３５位で終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号１１０の３０位で開始し、配列番号１１０の１１０位で終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｄ．配列番号１１１に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｅ．配列番号１１２に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、請求項１９に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項２１】
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、アクチビンに結合する、請求項１９または２０に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項２２】
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、アクチビンＡに結合する、請求項２１に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項２３】
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、アクチビンＢに結合する、請求項２１または２２に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項２４】
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ１１にさらに結合する、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項２５】
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定した場合、アクチビンＡおよび／またはアクチビンＢのシグナル伝達を阻害する、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項２６】
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定した場合、ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ１１のシグナル伝達をさらに阻害する、請求項２５に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項２７】
前記アクチビンアンタゴニストドメインが、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドである、任意の先行する請求項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項２８】
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、
ａ．配列番号５０の２０〜２９位のいずれか１つで開始し、配列番号５０の１０９〜１３４位のいずれか１つで終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ．配列番号５０の２０位で開始し、配列番号５０の１３４位で終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号５０の２９位で開始し、配列番号５０の１０９位で終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｄ．配列番号５１に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｅ．配列番号５２に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｆ．配列番号５４に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｇ．配列番号５５に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、請求項２７に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項２９】
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、アクチビンに結合する、請求項２７または２８に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項３０】
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、アクチビンＡに結合する、請求項２９に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項３１】
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、アクチビンＢに結合する、請求項２９または３０に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項３２】
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ１１にさらに結合する、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項３３】
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定した場合、アクチビンＡおよび／またはアクチビンＢのシグナル伝達を阻害する、請求項２７から３２のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項３４】
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定した場合、ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ１１のシグナル伝達をさらに阻害する、請求項３３に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項３５】
前記アクチビンアンタゴニストドメインが、アクチビンに結合する抗体またはその抗原結合断片である、任意の先行する請求項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項３６】
前記抗体またはその抗原結合断片が、アクチビンＡに結合する、請求項３５に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項３７】
前記抗体またはその抗原結合断片が、アクチビンＢに結合する、請求項３５または請求項３６に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項３８】
前記抗体が、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定した場合、アクチビンＡおよび／またはアクチビンＢのシグナル伝達を阻害する、請求項３５から３７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項３９】
前記アクチビンアンタゴニストドメインが、ＡｃｔＲＩＩ受容体に結合する抗体またはその抗原結合断片である、任意の先行する請求項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項４０】
前記抗体またはその抗原結合断片が、ＡｃｔＲＩＩＡに結合する、請求項３９に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項４１】
前記抗体またはその抗原結合断片が、ＡｃｔＲＩＩＢに結合する、請求項３９または４０に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項４２】
前記抗体またはその抗原結合断片が、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定した場合、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはアクチビン−ＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達を阻害する、請求項３９から４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項４３】
前記抗体またはその抗原結合断片が、ビマグルマブまたはその抗原結合断片である、請求項３９に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項４４】
前記ＴＧＦβアンタゴニストドメインが、ＴβＲＩＩポリペプチドである、任意の先行する請求項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項４５】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、
ａ．配列番号１の２３〜３５位のいずれか１つで開始し、配列番号１の１５３〜１５９位のいずれか１つで終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ．配列番号１の２３位で開始し、配列番号１の１５９位で終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号１の３５位で開始し、配列番号１の１５３位で終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｄ．配列番号２の２３〜６０位のいずれか１つで開始し、配列番号２の１７８〜１８４位のいずれか１つで終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｅ．配列番号２の２３位で開始し、配列番号２の１８４位で終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｆ．配列番号２の６０位で開始し、配列番号２の１７８位で終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｇ．配列番号１８に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｈ．配列番号２７に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｉ．配列番号２０に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ならびに
ｊ．配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８；および３９のいずれか１つに対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、請求項４４に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項４６】
前記ポリペプチドが、ＴＧＦβに結合する、請求項４４または４５に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項４７】
前記ポリペプチドが、ＴＧＦβ１に結合する、請求項４６に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項４８】
前記ポリペプチドが、ＴＧＦβ３に結合する、請求項４６または４７に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項４９】
前記ポリペプチドが、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定した場合、ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ３のシグナル伝達を阻害する、請求項４６から４８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項５０】
前記ＴＧＦβアンタゴニストドメインが、ベータグリカンポリペプチドである、任意の先行する請求項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項５１】
前記ベータグリカンポリペプチドが、
ａ．配列番号１２０の２１〜２８位のいずれか１つで開始し、配列番号１２０の３８１〜７８７位のいずれか１つで終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ．配列番号１２０の２１位で開始し、配列番号１２０の７８７位で終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号１２０の２８位で開始し、配列番号１２０の３８１位で終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｄ．配列番号１２１に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｅ．配列番号１２５に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、請求項５０に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項５２】
前記ポリペプチドが、ＴＧＦβに結合する、請求項５０または５１に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項５３】
前記ポリペプチドが、ＴＧＦβ１に結合する、請求項５２に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項５４】
前記ポリペプチドが、ＴＧＦβ２に結合する、請求項５１または５２に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項５５】
前記ポリペプチドが、ＴＧＦβ３に結合する、請求項５１から５４のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項５６】
前記ポリペプチドが、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定した場合、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、および／またはＴＧＦβ３のシグナル伝達を阻害する、請求項５０から５５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項５７】
前記ＴＧＦβアンタゴニストドメインが、ＴＧＦβに結合する抗体またはその抗原結合断片である、任意の先行する請求項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項５８】
前記抗体またはその抗原結合断片が、ＴＧＦβ１に結合する、請求項５７に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項５９】
前記抗体またはその抗原結合断片が、ＴＧＦβ２に結合する、請求項５７または請求項５８に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項６０】
前記抗体またはその抗原結合断片が、ＴＧＦβ３に結合する、請求項５７から５９のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項６１】
前記抗体またはその抗原結合断片が、抗体：フレソリムマブ、メテリムマブ、Ｌｉｌｙ２１Ｄ１、ＬｉｌｙＤＭ４、ＸＯＭＡ０８９、およびＸＯＭＡ６８１、またはその抗原結合断片から選択される、請求項５７に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項６２】
前記抗体が、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定した場合、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、および／またはＴＧＦβ３のシグナル伝達を阻害する、請求項５７から６１のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項６３】
異種の部分が、相互作用対の第１または第２のメンバーを含む、任意の先行する請求項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項６４】
前記異種の部分が、ヘテロ二量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸改変を含む、請求項６３に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項６５】
前記異種の部分が、免疫グロブリンＦｃドメインである、任意の先行する請求項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項６６】
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、ヒト免疫グロブリンＦｃドメインである、請求項６５に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項６７】
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、免疫グロブリンＧ１Ｆｃドメインである、請求項６５または６６に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項６８】
前記リンカーが、１０〜２５アミノ酸長の間である、任意の先行する請求項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項６９】
前記リンカーが、
ａ．（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝≧２）；
ｂ．（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝≧３）；
ｃ．（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝≧４）；および
ｄ．配列番号４〜７、１９、２１、２５、２６、４０、および６３〜６７のうちいずれか１つのアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、任意の先行する請求項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項７０】
前記リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ≠≧５）を含む、請求項６９に記載のヘテロ多量体。
【請求項７１】
前記リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ≠≧５）を含む、請求項６９に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項７２】
グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、および脂質部分にコンジュゲートしたアミノ酸から選択される１つまたは複数の改変されたアミノ酸残基を含む、任意の先行する請求項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項７３】
グリコシル化されている、請求項６５に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項７４】
ＣＨＯ細胞における前記ポリペプチドの発現のグリコシル化パターン特性を有する、請求項７３に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項７５】
単離されている、任意の先行する請求項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項７６】
組換え体である、任意の先行する請求項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項７７】
前記免疫チェックポイントアンタゴニストドメインが、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、および／またはＢ７−Ｈ４の１つまたは複数を阻害する、任意の先行する請求項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項７８】
前記免疫チェックポイントアンタゴニストドメインが、ＰＤ−１を阻害する、請求項７７に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項７９】
前記免疫チェックポイントアンタゴニストドメインが、ＰＤ−Ｌ１を阻害する、請求項７７に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項８０】
前記免疫チェックポイントアンタゴニストドメインが、ＣＴＬＡ−４を阻害する、請求項７７に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項８１】
前記免疫チェックポイントアンタゴニストドメインが、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、および／またはＢ７−Ｈ４の１つまたは複数に結合する抗体またはその抗原結合断片である、任意の先行する請求項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項８２】
前記免疫チェックポイントアンタゴニストドメインが、ＰＤ−１に結合する抗体またはその抗原結合断片である、請求項８１に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項８３】
前記免疫チェックポイントアンタゴニストドメインが、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体またはその抗原結合断片である、請求項８１に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項８４】
前記免疫チェックポイントアンタゴニストドメインが、ＣＴＬＡ４に結合する抗体またはその抗原結合断片である、請求項８１に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項８５】
前記免疫チェックポイントアンタゴニストドメインが、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマズ、アテゾリズマブ、アベルマブ、およびデュルバルマブから選択される抗体、またはその抗原結合断片である、任意の先行する請求項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体。
【請求項８６】
任意の先行する請求項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬調製物。
【請求項８７】
いずれかの先行する請求項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体に対するコード配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８８】
請求項８７に記載のポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項８９】
請求項８７または８８に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項９０】
ＣＨＯ細胞である、請求項８９に記載の細胞。
【請求項９１】
請求項８８または８８に記載のポリヌクレオチドの発現に適切な条件下で細胞を培養するステップを含む、アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴＧＦβアンタゴニストドメインから選択される２つまたはそれより多くのドメインを含む融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体を作製する方法。
【請求項９２】
がん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、または異形成障害を処置する方法であって、それを必要とする患者に請求項１から８６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、ホモ二量体、ヘテロ二量体または医薬調製物のうちの１つまたは複数の有効量を投与するステップを含む、方法。
【請求項９３】
前記がん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、または異形成障害が、リンパ系または骨髄系の造血器腫瘍、線維肉腫または横紋筋肉腫などの間葉起源の腫瘍、黒色腫、眼球内黒色腫、非黒色腫皮膚がん、奇形癌腫、神経芽腫、神経膠腫、脳幹神経膠腫、視覚路および視床下部の神経膠腫、乏突起神経膠腫、腺癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、癌腫、非小細胞肺癌、肝細胞腫、肝細胞癌、子宮内膜がんまたは子宮癌、唾液腺癌、分化甲状腺癌、肺の癌腫、陰茎癌、副腎皮質癌、内分泌膵島細胞癌、結腸癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肛門癌、胆管癌、絨毛癌、胚性癌腫、上皮細胞癌、リンパ腫、成人ホジキンリンパ腫、成人非ホジキンリンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、セミノーマ、神経膠芽腫、多形神経膠芽腫、肉腫、ユーイング肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、軟組織肉腫、カポジ肉腫、骨／悪性線維肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、サルコイドーシス肉腫、子宮肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病、ヘアリー細胞白血病、骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病、骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、慢性骨髄球性白血病、白血病  骨肉腫、多発性骨髄腫、リンパ系腫瘍、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ）、扁平上皮癌（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ）、腹膜の扁平上皮癌、頚部扁平上皮癌、転移性頚部扁平上皮癌、転移性頚部扁平上皮癌、潜在性転移性頚部扁平上皮癌、ウィルムス腫瘍、星状細胞腫、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肝細胞がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がん、胃腸がん、消化管カルチノイド腫瘍、膵臓がん、外分泌膵臓がん、膵島細胞膵臓がん、子宮頸がん、子宮頸部異形成、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、肝臓がん、神経内分泌腫瘍、甲状腺髄様癌、副甲状腺がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、腎臓または腎がん、前立腺がん、外陰がん、頭頚部がん、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門がん、星状細胞腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、胆管がん、肝外胆管がん、骨がん、骨の線維性骨異形成症、脳腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、胚細胞腫瘍、ホジキン病、髄芽腫、松果体腫瘍、松果体腫、テント上神経外胚葉性腫瘍（ｓｕｐｒａｔｅｎｔｏｒｉａｌ  ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ  ｔｕｍｏｒ）、上衣腫、上皮がん、上皮性異形成、粘膜上皮異形成、食道がん、食道異形成、眼のがん、ゴーシェ病、胆嚢がん、妊娠性絨毛腫瘍、絨毛性腫瘍、高ガンマグロブリン血症、下咽頭がん、腸がん、腸ポリープまたは腺腫、小腸がん、大腸がん、喉頭がん、口唇または口腔がん、リンパ増殖性障害、マクログロブリン血症、ワルデンシュトレ��ムマクログロブリン血症、中皮腫、悪性胸腺腫、胸腺腫、転移性潜在性形質細胞腫瘍、骨髄異形成症候群、骨増殖性障害、鼻腔または副鼻腔がん、上咽頭がん、中咽頭がん、パラプロテイン血症、陰茎がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、網膜芽細胞腫、唾液腺がん、セザリー症候群、皮膚がん、精巣がん、尿道がん、子宮がん、腟がん、無汗性外胚葉異形成、前後異形成、窒息性胸郭異形成、心房指異形成(atriodigital  dysplasia)、気管支肺異形成、大脳異形成、軟骨外胚葉異形成、鎖骨頭蓋異形成、先天性外胚葉異形成、頭蓋骨幹異形成、頭蓋手根足根骨異形成、頭蓋骨幹端異形成、象牙質異形成、骨幹異形成、外胚葉異形成、エナメル質異形成、脳眼異形成、骨端半肢形成異常、多発性骨端異形成、点状骨端異形成、顔面指趾生殖器異形成、家族性線維性顎異形成、家族性白色襞性異形成、線維筋性異形成、開花性骨異形成（ｆｌｏｒｉｄ  ｏｓｓｅｏｕｓ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、遺伝性腎−網膜異形成、発汗性外胚葉異形成、発汗減少性外胚葉異形成（ｈｙｐｏｈｉｄｒｏｔｉｃ  ｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、リンパ性減少性胸腺異形成（ｌｙｍｐｈｏｐｅｎｉｃ  ｔｈｙｍｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、乳腺異形成、下顎顔面異形成（ｍａｎｄｉｂｕｌｏｆａｃｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、骨幹端異形成（ｍｅｔａｐｈｙｓｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、Ｍｏｎｄｉｎｉ異形成、単骨性線維性骨異形成、多発性骨端異形成（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｐｉｐｈｙｓｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、眼耳脊椎異形成（ｏｃｕｌｏａｕｒｉｃｕｌｏｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、眼歯指異形成、眼脊椎異形成（ｏｃｕｌｏｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、歯牙異形成（ｏｄｏｎｔｏｇｅｎｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、眼下顎異形成（ｏｐｔｈａｌｍｏｍａｎｄｉｂｕｌｏｍｅｌｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、根尖性セメント質異形成（ｐｅｒｉａｐｉｃａｌ  ｃｅｍｅｎｔａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、多骨性線維性骨異形成、偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成（ｐｓｅｕｄｏａｃｈｏｎｄｒｏｐｌａｓｔｉｃ  ｓｐｏｎｄｙｌｏｅｐｉｐｈｙｓｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、網膜異形成、中隔視神経異形成、脊椎骨端異形成（ｓｐｏｎｄｙｌｏｅｐｉｐｈｙｓｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、心室橈骨異形成（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｏｒａｄｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、良性の繁殖異常（ｄｙｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）障害（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞性状態、組織肥大化、および）、白斑症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎（ｓｏｌａｒ  ｃｈｅｉｌｉｔｉｓ）、日光角化症、重鎖病、滑膜腫、頭蓋咽頭腫、血管芽腫（emangioblastoma）、聴神経腫瘍、ならびに髄膜腫からなる群から選択される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記がん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、または異形成障害を処置するための１つまたは複数の追加の活性薬剤または支持療法の投与をさらに含む、請求項９２または９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記追加の活性薬剤または支持療法が、免疫チェックポイントアンタゴニストであり、前記免疫チェックポイントアンタゴニストが、ポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合断片、低分子、および／またはポリヌクレオチドから選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記免疫チェックポイントアンタゴニストが、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、および／またはＢ７−Ｈ４の１つまたは複数に結合する抗体またはその抗原結合断片である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記抗体が、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、およびデュルバルマブ、またはその抗原結合断片である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記追加の活性薬剤または支持療法が、アクチビンアンタゴニストであり、前記アクチビンアンタゴニストが、ポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合断片、低分子、および／またはポリヌクレオチドから選択される、請求項９５から９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記アクチビンアンタゴニストが、任意の先行する請求項に記載のＡｃｔＲＩＩポリペプチドである、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記アクチビンアンタゴニストが、任意の先行する請求項に記載のＡｃｔＲＩＩ抗体である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記アクチビンアンタゴニストが、任意の先行する請求項に記載のアクチビン抗体である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０２】
前記追加の活性薬剤または支持療法が、ＴＧＦβアンタゴニストであり、前記ＴＧＦβアンタゴニストが、ポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合断片、低分子、および／またはポリヌクレオチドから選択される、請求項９４から１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ＴＧＦβアンタゴニストが、任意の先行する請求項に記載のＴβＲＩＩポリペプチドである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ＴＧＦβアンタゴニストが、任意の先行する請求項に記載のＴＧＦβ抗体である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ＴＧＦβアンタゴニストが、任意の先行する請求項に記載のベータグリカンポリペプチドである、請求項１０２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年６月１５日に出願された米国仮出願第６２／６８５，７４７号の優先権の利益を主張する。前述の出願は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
がんの処置において、化学療法は高い毒性を伴い、耐性がん細胞バリアントの出現をもたらし得ることが長い間認識されている。腫瘍の生存および成長にとって重要な、過剰発現したまたは活性化した腫瘍タンパク質に対する標的化療法を用いても、がん細胞は変わらず変異および適応し、例えば、冗長経路を利用することによって、標的化経路への依存性を低減する。がん免疫療法は、がん細胞を標的とする代わりに、免疫系の活性化に焦点を当てる、がん処置における新たなパラダイムである。その原理は、宿主の免疫応答、特に適応Ｔ細胞応答を再装備して、がん細胞、特に、他の処置形態を逃れた微小残存病変を死滅させるための免疫監視機構を提供し、それ故に、長期持続性防御免疫を達成することである。
【０００３】
２０１１年の黒色腫の処置に関する抗ＣＴＬＡ−４抗体であるイピリムマブのＦＤＡによる承認は、がん免疫療法における新たな時代を先導した。抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１療法によって、臨床試験において黒色腫、腎臓がん、および肺がんにおける持続性応答が誘導されたという実証は、その時代の到来をさらに表している（Pardoll,  D.  M.,  Nat  Immunol.  2012;  13:1129-32）。しかし、おそらく、抗ＣＴＬＡ−４処置が、一次Ｔ細胞阻害チェックポイントを妨害することによって、新たな自己反応性Ｔ細胞の生成をもたらし得ることが原因で、イピリムマブ療法はその毒性プロファイルによって制限される。ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を阻害することにより、主に、本質的に抗ウイルス性または抗がん性である疲弊Ｔ細胞における既存の慢性免疫応答の脱阻害がもたらされるが（Wherry,  E.  J.,  Nat  Immunol.  2011;  12:492-9）、それにもかかわらず、抗ＰＤ−１療法によって、致命的となる可能性のある肺関連自己免疫有害事象がもたらされることがあり得る。これまでの抗ＰＤ１および抗ＰＤ−Ｌ１の有望な臨床活性にもかかわらず、治療活性を高めることもしくは毒性を低下させることのいずれか、またはその両方によって治療指数を高めることが、免疫療法の開発の中心的目標のままである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Pardoll,  D.  M.,  Nat  Immunol.  2012;  13:1129-32
【非特許文献２】Wherry,  E.  J.,  Nat  Immunol.  2011;  12:492-9
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
よって、患者においてがんを処置するための、有効な療法、特に毒性プロファイルの低い療法に対する満たされていない高い需要が依然として存在する。したがって、本開示の目的は、それを必要とする患者においてがんを処置するための組成物および改良された方法を提供することである。
一部分では、本明細書で示すデータは、アクチビンアンタゴニスト（阻害剤）およびＴＧＦβアンタゴニストを単独でまたは組み合わせて使用して、がんを処置することができることを実証する。特に、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、または汎特異的ＴＧＦβ抗体による処置が、がんモデルにおいて、別々に、腫瘍負荷を低下させ、生存時間を増加させることが示された。さらに、アクチビンアンタゴニストをＴＧＦβアンタゴニストと組み合わせて使用して、いずれかの薬剤単独に関して観察された効果と比較して、抗腫瘍活性を相乗的に増加させることができることが示された。さらに、このデータは、アクチビンおよびＴＧＦβアンタゴニスト療法の有効性が、免疫系に依存することを示す。したがって、一部分では、本開示は、アクチビンおよびＴＧＦβアンタゴニストを免疫療法薬として、特に、多種多様ながん（例えば、免疫抑制および／または免疫疲弊に関連するがん）を処置するために使用することができるという発見に関する。任意の特定の理論に拘束されることを望まないが、このようなアクチビンおよびＴＧＦβアンタゴニストは、単独でまたは免疫チェックポイントアンタゴニスト（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、および／またはＢ７−Ｈ４の１つまたは複数に結合するおよびそれを阻害する抗体、またはその抗原結合断片）と組み合わせて使用した場合、がんを処置するのに特に有用であり得ると考えられる。したがって、本開示は、一部分では、アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴＧＦβアンタゴニストドメイン、および免疫チェックポイントアンタゴニストドメインから選択される２つまたはそれより多くのドメインを含む、二機能性および三機能性融合タンパク質を提供する。本開示は、例えば、がん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、または異形成障害を処置するために、このような二機能性および三機能性融合タンパク質を使用する方法をさらに提供する。必要に応じて、このような方法は、がん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、または異形成障害を処置するための追加の活性薬剤または支持療法を患者に投与することをさらに含む。他の公知の腫瘍免疫療法剤（ｉｍｍｕｎｏ−ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ａｇｅｎｔ）と同様に、このような二機能性および三機能性融合タンパク質が患者の免疫応答を増強する能力は、がんの分野以外のより広い治療との関連を有し得る。例えば、免疫増強剤は、多種多様な感染性疾患、特に免疫抑制および／または免疫疲弊を促進する病原体を処置するのに有用であり得ることが提唱されている。また、このような免疫増強剤は、ワクチン（例えば、感染性疾患およびがんワクチン）の免疫化効率をブーストするのに有用であり得る。
【０００６】
ある特定の態様では、本開示のアクチビンアンタゴニストは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、およびアクチビンＡＥ）を阻害する薬剤である。アクチビンアンタゴニストとしては、例えば、アクチビン結合ドメイン（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン）を含むポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗アクチビン、抗ＡｃｔＲＩＩＡ、および抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体またはその抗原結合断片）、低分子、およびポリヌクレオチドが挙げられる。アクチビン阻害に関する効果は、例えば、本明細書に記載のものを含む細胞に基づくアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のアクチビンアンタゴニストは、アクチビンに結合し得る。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載のものを含む、例えば、結合親和性アッセイを使用して決定することができる。特に、本開示は、一部では、アクチビンに結合するアクチビンアンタゴニストドメインを含む二機能性および三機能性融合タンパク質を提供する。例えば、好適なアクチビンアンタゴニストドメインとしては、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアクチビン結合ドメインおよびアクチビン、ＡｃｔＲＩＩＡ、またはＡｃｔＲＩＩＢに結合する抗体、またはその抗原結合断片が挙げられる。一部の実施形態では、本開示のアクチビンアンタゴニストは、少なくとも１×１０−８Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、少なくともアクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、および／またはアクチビンＥに結合する。一部の実施形態では、本開示のアクチビンアンタゴニスト、またはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−８Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、少なくともアクチビンＡおよび／またはアクチビンＢに結合する。一部の実施形態では、アクチビンアンタゴニストドメイン（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメイン）は、例えば、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０を含む１つまたは複数の追加のリガンドにさらに結合し得る。一部の実施形態では、アクチビンアンタゴニストドメインおよびＴＧＦβアンタゴニストドメインまたは免疫チェックポイントアンタゴニストドメインの１つまたは複数を含む二機能性または三機能性融合タンパク質を使用して、がん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、または異形成障害を処置することができる。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストドメインおよび免疫チェックポイントアンタゴニストドメインを含む二機能性融合タンパク質をアクチビンアンタゴニストと組み合わせて使用して、がん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、または異形成障害を処置することができる。
【０００７】
ある特定の態様では、本開示のＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、および／またはＴＧＦβ３）を阻害する薬剤である。ＴＧＦβアンタゴニストとしては、例えば、ＴＧＦβ結合ドメイン（例えば、ＴβＲＩＩおよびベータグリカンの細胞外ドメイン）を含むポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片（例えば、抗ＴＧＦβ、抗ＴβＲＩＩ、および抗ベータグリカン抗体またはその抗原結合断片）、低分子、およびポリヌクレオチドが挙げられる。ＴＧＦβ阻害に関する効果は、例えば、本明細書に記載のものを含む細胞に基づくアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のアクチビンアンタゴニストは、ＴＧＦβに結合し得る。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載のものを含む、例えば、結合親和性アッセイを使用して決定することができる。特に、本開示は、一部では、ＴＧＦβに結合するＴＧＦβアンタゴニストドメインを含む二機能性および三機能性融合タンパク質を提供する。例えば、好適なアクチビンアンタゴニストドメインとしては、ＴβＲＩＩまたはベータグリカンポリペプチドのＴＧＦβ結合ドメインおよびＴＧＦβ、ＴβＲＩＩ、またはベータグリカンに結合する抗体、またはその抗原結合断片が挙げられる。一部の実施形態では、本開示のＴＧＦβアンタゴニストは、少なくとも１×１０−８Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３に結合する。一部の実施形態では、本開示のＴＧＦβアンタゴニスト、またはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−８Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に結合するが、ＴＧＦβ２には実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍより高いＫＤで結合する）。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストドメインおよびアクチビンアンタゴニストドメインまたは免疫チェックポイントアンタゴニストドメインの１つまたは複数を含む二機能性または三機能性融合タンパク質を使用して、がん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、または異形成障害を処置することができる。一部の実施形態では、アクチビンアンタゴニストドメインおよび免疫チェックポイントアンタゴニストドメインを含む二機能性融合タンパク質をＴＧＦβアンタゴニストと組み合わせて使用して、がん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、または異形成障害を処置することができる。
【０００８】
ある特定の態様では、本開示の免疫チェックポイントアンタゴニストは、１つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、および／またはＢ７−Ｈ４）を阻害する薬剤である。免疫チェックポイントアンタゴニストとしては、例えば、免疫チェックポイント結合ドメインを含むポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片、低分子、およびポリヌクレオチドが挙げられる。免疫チェックポイント阻害に関する効果は、例えば、本明細書に記載のものを含む細胞に基づくアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示の免疫チェックポイントアンタゴニストは、免疫チェックポイントタンパク質に結合し得る。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載のものを含む、例えば、結合親和性アッセイを使用して決定することができる。特に、本開示は、一部では、免疫チェックポイントタンパク質に結合する免疫チェックポイントアンタゴニストドメインを含む二機能性および三機能性融合タンパク質を提供する。例えば、好適な免疫チェックポイントアンタゴニストドメインとしては、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、および／またはＢ７−Ｈ４の１つまたは複数に結合する抗体、またはその抗原結合断片が挙げられる。一部の実施形態では、本開示の免疫チェックポイントアンタゴニストは、少なくとも１×１０−８Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、および／またはＢ７−Ｈ４に結合する。一部の実施形態では、本開示の免疫チェックポイントアンタゴニスト、またはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−８Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＴＬＡ４に結合する。一部の実施形態では、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインおよびＴＧＦβアンタゴニストドメインまたはアクチビンアンタゴニストドメインの１つまたは複数を含む二機能性または三機能性融合タンパク質を使用して、がん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、または異形成障害を処置することができる。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストドメインおよびアクチビンアンタゴニストドメインを含む二機能性融合タンパク質を免疫チェックポイントアンタゴニストと組み合わせて使用して、がん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、または異形成障害を処置することができる。
【０００９】
一部の実施形態では、本開示は、アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴＧＦβアンタゴニストドメイン、および免疫チェックポイントアンタゴニストドメインから選択される２つまたはそれより多くのドメインを含む融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、タンパク質は、アクチビンアンタゴニストドメインおよびＴＧＦβアンタゴニストドメインを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、アクチビンアンタゴニストドメインおよび免疫チェックポイントアンタゴニストドメインを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＴＧＦβアンタゴニストドメインおよび免疫チェックポイントアンタゴニストドメインを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴＧＦβアンタゴニストドメイン、および免疫チェックポイントアンタゴニストドメインを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴＧＦβアンタゴニストドメイン、および／または免疫チェックポイントアンタゴニストドメインに対して異種であるポリペプチドドメインをさらに含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、リンカードメインをさらに含む。一部の実施形態では、融合タンパク質のドメインは、ａ）Ａ−Ｘ−Ｔ；ｂ）Ａ−Ｘ−Ｉ；ｃ）Ｔ−Ｘ−Ｉ；ｄ）Ａ−Ｘ−Ｈ−Ｘ−Ｔ；ｅ）Ａ−Ｘ−Ｈ−Ｘ−Ｉ；ｆ）Ｉ−Ｘ−Ｈ−Ｘ−Ｔ；ｇ）Ａ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ｉ；ｈ）Ｔ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｉ；ｉ）Ａ−Ｘ−Ｉ−Ｘ−Ｔ；ｊ）Ａ−Ｘ−Ｔ−Ｈ−Ｘ−Ｉ；ｋ）Ｔ−Ｘ−Ａ−Ｈ−Ｘ−Ｉ；ｌ）Ａ−Ｘ−Ｉ−Ｈ−Ｘ−Ｔ；ｍ）Ａ−Ｘ−Ｈ−Ｔ−Ｘ−Ｉ；ｎ）Ｔ−Ｘ−Ｈ−Ａ−Ｘ−Ｉ；およびｏ）Ａ−Ｘ−Ｈ−Ｉ−Ｘ−Ｔ（式中、（ｉ）「Ａ」は、アクチビンアンタゴニストドメインに相当し；（ｉｉ）「Ｔ」は、ＴＧＦβアンタゴニストドメインに相当し；（ｉｉｉ）「Ｉ」は、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインに相当し；（ｉｖ）「Ｈ」は、前記アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴＧＦβアンタゴニストドメイン、および免疫チェックポイントアンタゴニストドメインに対して異種であるポリペプチドドメインに相当し；（ｖ）「Ｘ」は、必要に応じたリンカードメインに相当し；前記ドメインの配置が、Ｎ末端からＣ末端か、またはＣ末端からＮ末端である）からなる群から選択される順序で配置されている、任意の先行する請求項に記載の融合タンパク質。
【００１０】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されている融合タンパク質のいずれかを含むホモ二量体を提供する。
【００１１】
一部の実施形態では、本開示は、アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴＧＦβアンタゴニストドメイン、および免疫チェックポイントアンタゴニストドメインから選択される２つまたはそれより多くのポリペプチドドメインを含むヘテロ二量体を提供する。
【００１２】
一部の実施形態では、ヘテロ二量体は、ａ）Ａ−Ｘ−Ｔ；ｂ）Ａ−Ｘ−Ｉ；ｃ）Ｔ−Ｘ−Ｉ；ｄ）Ａ−Ｘ−Ｈ−Ｘ−Ｔ；ｅ）Ａ−Ｘ−Ｈ−Ｘ−Ｉ；ｆ）Ｉ−Ｘ−Ｈ−Ｘ−Ｔ；ｇ）Ａ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ｉ；ｈ）Ｔ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｉ；ｉ）Ａ−Ｘ−Ｉ−Ｘ−Ｔ；ｊ）Ａ−Ｘ−Ｔ−Ｈ−Ｘ−Ｉ；ｋ）Ｔ−Ｘ−Ａ−Ｈ−Ｘ−Ｉ；ｌ）Ａ−Ｘ−Ｉ−Ｈ−Ｘ−Ｔ；ｍ）Ａ−Ｘ−Ｈ−Ｔ−Ｘ−Ｉ；ｎ）Ｔ−Ｘ−Ｈ−Ａ−Ｘ−Ｉ；およびｏ）Ａ−Ｘ−Ｈ−Ｉ−Ｘ−Ｔ（式中、（ｉ）「Ａ」は、アクチビンアンタゴニストドメインに相当し；（ｉｉ）「Ｔ」は、ＴＧＦβアンタゴニストドメインに相当し；（ｉｉｉ）「Ｉ」は、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインに相当し；（ｉｖ）「Ｈ」は、前記アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴＧＦβアンタゴニストドメイン、および免疫チェックポイントアンタゴニストドメインに対して異種であるポリペプチドドメインに相当し；（ｖ）「Ｘ」は、必要に応じたリンカードメインに相当し；前記ドメインの配列が、Ｎ末端からＣ末端かまたはＣ末端からＮ末端である）から選択される２つのポリペプチドを含む。
【００１３】
一部の実施形態では、本開示は、ａ）免疫チェックポイントアンタゴニストドメインおよびＴＧＦβアンタゴニストドメインを含む第１のポリペプチド；ならびにｂ）アクチビンアンタゴニストドメインを含む第２のポリペプチドを含むヘテロ二量体を提供する。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインをさらに含む。
【００１４】
一部の実施形態では、本開示は、ａ）ＴＧＦβアンタゴニストドメインおよびアクチビンアンタゴニストドメインを含む第１のポリペプチド；ならびにｂ）免疫チェックポイントアンタゴニストドメインを含む第２のポリペプチドを含むヘテロ二量体を提供する。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＴＧＦβアンタゴニストドメインをさらに含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、アクチビンアンタゴニストドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ヘテロ二量体は、アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴＧＦβアンタゴニストドメイン、および／または免疫チェックポイントアンタゴニストドメインに対して異種である１つまたは複数のポリペプチドドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ヘテロ二量体は、１つまたは複数のリンカードメインをさらに含む。一部の実施形態では、アクチビンアンタゴニストドメインは、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドである。一部の実施形態では、ヘテロ二量体は、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、ａ）配列番号１１０の２１〜３０位のいずれか１つで開始し、配列番号１１０の１１０〜１３５位のいずれか１つで終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ｂ）配列番号１１０の２１位で開始し、配列番号１１０の１３５位で終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ｃ）配列番号１１０の３０位で開始し、配列番号１１０の１１０位で終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ｄ）配列番号１１１に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｅ）配列番号１１２に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、アクチビンに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、アクチビンＡに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、アクチビンＢに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ１１にさらに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定した場合、アクチビンＡおよび／またはアクチビンＢのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定した場合、ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ１１のシグナル伝達をさらに阻害する。一部の実施形態では、アクチビンアンタゴニストドメインは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ａ）配列番号５０の２０〜２９位のいずれか１つで開始し、配列番号５０の１０９〜１３４位のいずれか１つで終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ｂ）配列番号５０の２０位で開始し、配列番号５０の１３４位で終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ｃ）配列番号５０の２９位で開始し、配列番号５０の１０９位で終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ｄ）配列番号５１に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ｅ）配列番号５２に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ｆ）配列番号５４に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｇ）配列番号５５に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、アクチビンに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、アクチビンＡに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、アクチビンＢに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ１１にさらに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定した場合、アクチビンＡおよび／またはアクチビンＢのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定した場合、ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ１１のシグナル伝達をさらに阻害する。一部の実施形態では、アクチビンアンタゴニストドメインは、アクチビンに結合する抗体またはその抗原結合断片である。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、アクチビンＡに結合する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、アクチビンＢに結合する。一部の実施形態では、抗体は、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定した場合、アクチビンＡおよび／またはアクチビンＢのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、アクチビンアンタゴニストドメインは、ＡｃｔＲＩＩ受容体に結合する抗体またはその抗原結合断片である。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＡｃｔＲＩＩＡに結合する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＡｃｔＲＩＩＢに結合する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定した場合、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはアクチビン−ＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ビマグルマブまたはその抗原結合断片である。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストドメインが、ＴβＲＩＩポリペプチドである。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ａ）配列番号１の２３〜３５位のいずれか１つで開始し、配列番号１の１５３〜１５９位のいずれか１つで終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ｂ）配列番号１の２３位で開始し、配列番号１の１５９位で終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ｃ）配列番号１の３５位で開始し、配列番号１の１５３位で終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ｄ）配列番号２の２３〜６０位のいずれか１つで開始し、配列番号２の１７８〜１８４位のいずれか１つで終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ｅ）配列番号２の２３位で開始し、配列番号２の１８４位で終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ｆ）配列番号２の６０位で開始し、配列番号２の１７８位で終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ｇ）配列番号１８に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ｈ）配列番号２７に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ｉ）配列番号２０に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ならびにｊ）配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８；および３９のいずれか１つに対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＴＧＦβに結合する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＴＧＦβ１に結合する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＴＧＦβ３に結合する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定した場合、ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ３のシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストドメインは、ベータグリカンポリペプチドである。一部の実施形態では、ベータグリカンポリペプチドは、ａ）配列番号１２０の２１〜２８位のいずれか１つで開始し、配列番号１２０の３８１〜７８７位のいずれか１つで終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ｂ）配列番号１２０の２１位で開始し、配列番号１２０の７８７位で終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ｃ）配列番号１２０の２８位で開始し、配列番号１２０の３８１位で終了する配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ｄ）配列番号１２１に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｅ）配列番号１２５に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、ポリペプチドが、ＴＧＦβに結合する。一部の実施形態では、ポリペプチドが、ＴＧＦβ１に結合する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＴＧＦβ２に結合する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＴＧＦβ３に結合する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定した場合、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、および／またはＴＧＦβ３のシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストドメインは、ＴＧＦβに結合する抗体またはその抗原結合断片である。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＴＧＦβ１に結合する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＴＧＦβ２に結合する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＴＧＦβ３に結合する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、抗体：フレソリムマブ、メテリムマブ、Ｌｉｌｙ２１Ｄ１、ＬｉｌｙＤＭ４、ＸＯＭＡ０８９、およびＸＯＭＡ６８１、またはその抗原結合断片から選択される。一部の実施形態では、抗体は、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定した場合、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、および／またはＴＧＦβ３のシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、異種の部分は、相互作用対の第１または第２のメンバーを含む。一部の実施形態では、異種の部分は、ヘテロ二量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸改変を含む。一部の実施形態では、異種の部分は、免疫グロブリンＦｃドメインである。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、ヒト免疫グロブリンＦｃドメインである。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、免疫グロブリンＧ１Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、リンカーは、１０〜２５アミノ酸長の間である。一部の実施形態では、リンカーは、ａ）（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝≧２）；ｂ）（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝≧３）；ｃ）（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝≧４）；およびｄ）配列番号４〜７、１９、２１、２５、２６、４０、および６３〜６７のうちいずれか１つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ≠≧５）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ≠≧５）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体は、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、および脂質部分にコンジュゲートしたアミノ酸から選択される１つまたは複数の改変されたアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体は、グリコシル化されている。一部の実施形態では、融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体は、ＣＨＯ細胞における前記ポリペプチドの発現のグリコシル化パターン特性を有する。一部の実施形態では、融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体は、単離されている。一部の実施形態では、融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体は、組換え体である。一部の実施形態では、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、および／またはＢ７−Ｈ４の１つまたは複数を阻害する。一部の実施形態では、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインは、ＰＤ−１を阻害する。一部の実施形態では、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインは、ＰＤ−Ｌ１を阻害する。一部の実施形態では、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインは、ＣＴＬＡ−４を阻害する。一部の実施形態では、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、および／またはＢ７−Ｈ４の１つまたは複数に結合する抗体またはその抗原結合断片である。一部の実施形態では、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインは、ＰＤ−１に結合する抗体またはその抗原結合断片である。一部の実施形態では、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインは、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体またはその抗原結合断片である。一部の実施形態では、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインは、ＣＴＬＡ４に結合する抗体またはその抗原結合断片である。一部の実施形態では、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインは、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマズ、アテゾリズマブ、アベルマブ、およびデュルバルマブから選択される抗体、またはその抗原結合断片である。
【００１５】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されている融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体のいずれかおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬調製物を提供する。
【００１６】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されている融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体のいずれかに関するコード配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１７】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されているポリヌクレオチドのいずれかに作動可能に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドを提供する。
【００１８】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されているポリヌクレオチドのいずれかを含む細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【００１９】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されているポリヌクレオチドのいずれかの発現に適切な条件下で細胞を培養するステップを含む、アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴＧＦβアンタゴニストドメインから選択される２つまたはそれより多くのドメインを含む融合タンパク質、ホモ二量体またはヘテロ二量体を作製する方法を提供する。
【００２０】
一部の実施形態では、本開示は、がん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、または異形成障害を処置する方法であって、それを必要とする患者に本明細書に開示されている融合タンパク質、ホモ二量体、ヘテロ二量体または医薬調製物のいずれかのうちの１つまたは複数の有効量を投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、がん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、または異形成障害は、リンパ系または骨髄系の造血器腫瘍、線維肉腫または横紋筋肉腫などの間葉起源の腫瘍、黒色腫、眼球内黒色腫、非黒色腫皮膚がん、奇形癌腫、神経芽腫、神経膠腫、脳幹神経膠腫、視覚路および視床下部の神経膠腫、乏突起神経膠腫、腺癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、癌腫、非小細胞肺癌、肝細胞腫、肝細胞癌、子宮内膜がんまたは子宮癌、唾液腺癌、分化甲状腺癌、肺の癌腫、陰茎癌、副腎皮質癌、内分泌膵島細胞癌、結腸癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肛門癌、胆管癌、絨毛癌、胚性癌腫、上皮細胞癌、リンパ腫、成人ホジキンリンパ腫、成人非ホジキンリンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、セミノーマ、神経膠芽腫、多形神経膠芽腫、肉腫、ユーイング肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、軟組織肉腫、カポジ肉腫、骨／悪性線維肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、サルコイドーシス肉腫、子宮肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病、ヘアリー細胞白血病、骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病、骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、慢性骨髄球性白血病、白血病  骨肉腫、多発性骨髄腫、リンパ系腫瘍、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ）、扁平上皮癌（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ）、腹膜の扁平上皮癌、頚部扁平上皮癌、転移性頚部扁平上皮癌、転移性頚部扁平上皮癌、潜在性転移性頚部扁平上皮癌、ウィルムス腫瘍、星状細胞腫、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肝細胞がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がん、胃腸がん、消化管カルチノイド腫瘍、膵臓がん、外分泌膵臓がん、膵島細胞膵臓がん、子宮頸がん、子宮頸部異形成、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、肝臓がん、神経内分泌腫瘍、甲状腺髄様癌、副甲状腺がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、腎臓または腎がん、前立腺がん、外陰がん、頭頚部がん、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門がん、星状細胞腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、胆管がん、肝外胆管がん、骨がん、骨の線維性骨異形成症、脳腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、胚細胞腫瘍、ホジキン病、髄芽腫、松果体腫瘍、松果体腫、テント上神経外胚葉性腫瘍（ｓｕｐｒａｔｅｎｔｏｒｉａｌ  ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ  ｔｕ��ｏｒ）、上衣腫、上皮がん、上皮性異形成、粘膜上皮異形成、食道がん、食道異形成、眼のがん、ゴーシェ病、胆嚢がん、妊娠性絨毛腫瘍、絨毛性腫瘍、高ガンマグロブリン血症、下咽頭がん、腸がん、腸ポリープまたは腺腫、小腸がん、大腸がん、喉頭がん、口唇または口腔がん、リンパ増殖性障害、マクログロブリン血症、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、中皮腫、悪性胸腺腫、胸腺腫、転移性潜在性形質細胞腫瘍、骨髄異形成症候群、骨増殖性障害、鼻腔または副鼻腔がん、上咽頭がん、中咽頭がん、パラプロテイン血症、陰茎がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、網膜芽細胞腫、唾液腺がん、セザリー症候群、皮膚がん、精巣がん、尿道がん、子宮がん、腟がん、無汗性外胚葉異形成、前後異形成、窒息性胸郭異形成、心房指異形成(atriodigital  dysplasia)、気管支肺異形成、大脳異形成、軟骨外胚葉異形成、鎖骨頭蓋異形成、先天性外胚葉異形成、頭蓋骨幹異形成、頭蓋手根足根骨異形成、頭蓋骨幹端異形成、象牙質異形成、骨幹異形成、外胚葉異形成、エナメル質異形成、脳眼異形成、骨端半肢形成異常、多発性骨端異形成、点状骨端異形成、顔面指趾生殖器異形成、家族性線維性顎異形成、家族性白色襞性異形成、線維筋性異形成、開花性骨異形成（ｆｌｏｒｉｄ  ｏｓｓｅｏｕｓ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、遺伝性腎−網膜異形成、発汗性外胚葉異形成、発汗減少性外胚葉異形成（ｈｙｐｏｈｉｄｒｏｔｉｃ  ｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、リンパ性減少性胸腺異形成（ｌｙｍｐｈｏｐｅｎｉｃ  ｔｈｙｍｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、乳腺異形成、下顎顔面異形成（ｍａｎｄｉｂｕｌｏｆａｃｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、骨幹端異形成（ｍｅｔａｐｈｙｓｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、Ｍｏｎｄｉｎｉ異形成、単骨性線維性骨異形成、多発性骨端異形成（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｐｉｐｈｙｓｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、眼耳脊椎異形成（ｏｃｕｌｏａｕｒｉｃｕｌｏｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、眼歯指異形成、眼脊椎異形成（ｏｃｕｌｏｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、歯牙異形成（ｏｄｏｎｔｏｇｅｎｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、眼下顎異形成（ｏｐｔｈａｌｍｏｍａｎｄｉｂｕｌｏｍｅｌｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、根尖性セメント質異形成（ｐｅｒｉａｐｉｃａｌ  ｃｅｍｅｎｔａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、多骨性線維性骨異形成、偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成（ｐｓｅｕｄｏａｃｈｏｎｄｒｏｐｌａｓｔｉｃ  ｓｐｏｎｄｙｌｏｅｐｉｐｈｙｓｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、網膜異形成、中隔視神経異形成、脊椎骨端異形成（ｓｐｏｎｄｙｌｏｅｐｉｐｈｙｓｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、心室橈骨異形成（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｏｒａｄｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、良性の繁殖異常（ｄｙｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）障害（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞性状態、組織肥大化、および）、白斑症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎（ｓｏｌａｒ  ｃｈｅｉｌｉｔｉｓ）、日光角化症、重鎖病、滑膜腫、頭蓋咽頭腫、血管芽腫（emangioblastoma）、聴神経腫瘍、ならびに髄膜腫からなる群から選択される。一部の実施形態では、方法は、がん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、または異形成障害を処置するための１つまたは複数���追加の活性薬剤または支持療法の投与をさらに含む。一部の実施形態では、追加の活性薬剤または支持療法は、免疫チェックポイントアンタゴニストであり、前記免疫チェックポイントアンタゴニストが、ポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合断片、低分子、および／またはポリヌクレオチドから選択される。一部の実施形態では、免疫チェックポイントアンタゴニストは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、および／またはＢ７−Ｈ４の１つまたは複数に結合する抗体またはその抗原結合断片である。一部の実施形態では、抗体は、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、およびデュルバルマブ、またはその抗原結合断片である。一部の実施形態では、追加の活性薬剤または支持療法は、アクチビンアンタゴニストであり、前記アクチビンアンタゴニストが、ポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合断片、低分子、および／またはポリヌクレオチドから選択される。一部の実施形態では、アクチビンアンタゴニストは、本明細書に開示されているＡｃｔＲＩＩポリペプチドのいずれかである。一部の実施形態では、アクチビンアンタゴニストは、本明細書に開示されているＡｃｔＲＩＩ抗体のいずれかである。一部の実施形態では、アクチビンアンタゴニストは、本明細書に開示されているアクチビン抗体のいずれかである。一部の実施形態では、追加の活性薬剤または支持療法は、ＴＧＦβアンタゴニストであり、ＴＧＦβアンタゴニストは、ポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合断片、低分子、および／またはポリヌクレオチドから選択される。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、本明細書に開示されているＴβＲＩＩポリペプチドのいずれかである。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、本明細書に開示されているＴＧＦβ抗体のいずれかである。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、本明細書に開示されているベータグリカンポリペプチドのいずれかである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ヒトＴＧＦβ受容体ＩＩ型（ｈＴβＲＩＩ）（ＮＰ＿００３２３３．４）（配列番号１）のＢ（短い）アイソフォームのための天然前駆体のアミノ酸配列を示す。実線下線は、プロセッシングされた細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（残基２３〜１５９）を示し、二重下線は、Ａ（長い）アイソフォームにおいて置き換えられたバリンを示す。点線下線は、リーダー（残基１〜２２）を表す。
【００２２】
【図２】図２は、ヒトＴβＲＩＩ（ＮＰ＿００１０２００１８．１）（配列番号２）のＡ（長い）アイソフォームのための天然前駆体のアミノ酸配列を示す。実線下線は、プロセッシングされたＥＣＤ（残基２３〜１８４）を示し、二重下線は、スプライスで生じたイソロイシン置換を示す。点線下線は、リーダー（残基１〜２２）を表す。
【００２３】
【図３】図３は、５つの異なるＴβＲＩＩ構築物のリンカー配列の比較を示す。
【００２４】
【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３、ならびにいくつかの異なるＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質構築物の１つとの間の結合親和性を表形式で示す。
【図４Ｂ】同上。
【００２５】
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｃは、いくつかの異なるＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質構築物の１つに対するＴＧＦβ１の親和性を試験するレポーター遺伝子アッセイからの結果をグラフで表す。図５Ｂおよび５Ｄは、いくつかの異なるＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質構築物の１つに対するＴＧＦβ３の親和性を試験するレポーター遺伝子アッセイからの結果をグラフで表す。図５Ｅおよび５Ｆは、これらの同じ実験からのＩＣ５０のデータを表形式で提示する。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【図５Ｄ】同上。
【図５Ｅ】同上。
【図５Ｆ】同上。
【００２６】
【図６】図６は、Ｃｌｕｓｔａｌ  ２．１を使用する、ヒトＩｇＧアイソタイプからのＦｃドメインの多重配列アラインメントを示す。ヒンジ領域は、点線下線によって示される。二重下線は、非対称鎖の対形成を促進するためのＩｇＧ１  Ｆｃにおいて設計された位置の例、ならびに他のアイソタイプであるＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に関して対応する位置を示す。
【００２７】
【図７】図７は、複数のＡｃｔＲＩＩＢおよびＡｃｔＲＩＩＡの結晶構造の複合分析に基づいて、ボックスで示したリガンドに直接接触すると本明細書において推測される残基を有するヒトＡｃｔＲＩＩＡおよびヒトＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインのアラインメントを示す。
【００２８】
【図８】図８は、様々な脊椎動物のＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質［ラット（配列番号１０１）；ブタ（配列番号１０２）；マウス（配列番号１０３）；ヒト（配列番号１０４）；ウシ（配列番号１０８）；およびアフリカツメガエル（配列番号１０５）］（それらの細胞内ドメインは含まない）、ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質（配列番号１０６）（その細胞内ドメインは含まない）、およびコンセンサスＡｃｔＲＩＩ前駆体タンパク質（配列番号１０７）の複数の配列アラインメントを示す。
【００２９】
【図９】図９は、様々な脊椎動物のＡｃｔＲＩＩＡタンパク質（それらの細胞内ドメインは含まない）の複数の配列アラインメントを示す。
【００３０】
【図１０】図１０は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体およびＴβＲＩＩ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体と比較した比較ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体ＩＣ５０データを示す。ＩＣ５０は、本明細書に記載されるようにＡ−２０４  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙによって決定した。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と同様にアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、およびＢＭＰ１０シグナル伝達経路を阻害する。しかし、ＢＭＰ９シグナル伝達経路のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体による阻害は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と比較して著明に低減した。これらのデータは、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体が対応するＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と比較してアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、およびＢＭＰ１０のより選択的なアンタゴニストであることを実証する。さらに、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体は、ＴβＲＩＩ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体と同様に、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３シグナル伝達経路を阻害する。
【００３１】
【図１１】図１１は、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体およびＴβＲＩＩ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体と比較した比較ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体ＩＣ５０データを示す。ＩＣ５０は、本明細書に記載されるようにＡ−２０４  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙによって決定した。ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体は、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体と同様にアクチビンＡ、アクチビンＢ、およびＧＤＦ１１シグナル伝達経路を阻害する。しかし、ＢＭＰ１０シグナル伝達経路のＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体による阻害は、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体と比較して著明に低減した。これらのデータは、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体が対応するＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体と比較してアクチビンＡ、アクチビンＢ、およびＧＤＦ１１のより選択的なアンタゴニストであることを実証する。さらに、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体は、ＴβＲＩＩ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体と同様に、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３シグナル伝達経路を阻害する。
【００３２】
【図１２】図１２は、切断された、バリアントＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１、Ｌ７９Ｄ）ドメインのアミノ酸配列（配列番号１０９）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
１．概観
ＴＧＦβスーパーファミリーは、ＴＧＦβ、アクチビン、Ｎｏｄａｌ、骨形成遺伝子タンパク質（ＢＭＰ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、および抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）を含む、３０を超える分泌因子から構成される［Ｗｅｉｓｓら（２０１３年）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２巻（１号）：４７〜６３頁］。スーパーファミリーのメンバーであって、脊椎動物および非脊椎動物のいずれにおいても見出されるメンバーは、多様な組織内で遍在的に発現し、動物の寿命を通して発生の最早期に機能する。実際、ＴＧＦβスーパーファミリータンパク質は、幹細胞の自己再生、原腸形成、分化、器官の形態形成、および成体組織のホメオスタシスの鍵となるメディエーターである。ＴＧＦβスーパーファミリーによるシグナル伝達の異常が、広範にわたるヒト病態と関連することは、この活性の遍在性と符合する。
【００３４】
ＴＧＦβスーパーファミリーのリガンドは、１つの単量体の中央３−１／２ターンヘリックスが、他の単量体のベータ−ストランドにより形成される凹部表面に対してパッキングされる、同じ二量体構造を共有する。ＴＧＦβファミリーメンバーの大半は、分子間ジスルフィド結合によりさらに安定化される。このジスルフィド結合は、「システインノット」モチーフと称されるモチーフを生成する他の２つのジスルフィド結合により形成されるリングを横切る［Ｌｉｎら（２００６年）、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、１３２巻：１７９〜１９０頁；およびＨｉｎｃｋら（２０１２年）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８６巻：１８６０〜１８７０頁］。
【００３５】
ＴＧＦβスーパーファミリーのシグナル伝達は、Ｉ型およびＩＩ型のセリン／スレオニンキナーゼ受容体の異種複合体（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘ）によって媒介され、これらは、リガンド刺激の際に、下流のＳＭＡＤタンパク質（例えば、ＳＭＡＤタンパク質１、２、３、５、および８）をリン酸化および活性化する［Ｍａｓｓａｇｕｅ、２０００年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１巻：１６９〜１７８頁］。これらのＩ型およびＩＩ型受容体は、システインリッチな領域を持つリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および、予測セリン／スレオニンキナーゼ特異性を持つ細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。概して、Ｉ型受容体は、細胞内シグナル伝達を媒介する一方、ＩＩ型受容体は、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドの結合に必要とされる。Ｉ型およびＩＩ型の受容体は、リガンド結合後に安定な複合体を形成し、ＩＩ型受容体によるＩ型受容体のリン酸化をもたらす。
【００３６】
ＴＧＦβファミリーは、結合するＩ型受容体と、活性化させるＳｍａｄタンパク質とに基づき、系統発生上の２つの分枝に分けられる。１つは、近年進化した分枝であり、例えば、ＴＧＦβ、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ３およびＮｏｄａｌを含み、これは、Ｓｍａｄ２および３を活性化するＩ型受容体を介してシグナル伝達する［Ｈｉｎｃｋ  （２０１２）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８６：１８６０−１８７０］。他の分枝は、スーパーファミリーのより遠い関連タンパク質を含み、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ１、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７を含み、これは、Ｓｍａｄ１、５、および８を介してシグナル伝達する。
【００３７】
ＴＧＦβアイソフォームは、ＴＧＦβスーパーファミリーの基礎となるメンバーであり、そのうち、哺乳動物では、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３と表示される３つのアイソフォームが公知である。生物活性な成熟ＴＧＦβリガンドは、ホモ二量体として機能し、主に、Ｉ型受容体であるＡＬＫ５を介してシグナル伝達するが、加えてまた、内皮細胞内のＡＬＫ１を介してもシグナル伝達することが見出されている［Ｇｏｕｍａｎｓら（２００３年）、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、１２巻（４号）：８１７〜８２８頁］。ＴＧＦβ１は、最も夥多であり、かつ、遍在的に発現するアイソフォームである。ＴＧＦβ１は、創傷治癒において重要な役割を果たすことが公知であり、恒常的に活性なＴＧＦβ１トランス遺伝子を発現するマウスは、線維症を発症する［Ｃｌｏｕｔｈｉｅｒら（１９９７年）、Ｊ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、１００巻（１１号）：２６９７〜２７１３頁］。ＴＧＦβ１の発現は、ヒト神経膠芽腫細胞において最初に説明されたが、胚神経系のニューロン内および星状膠細胞内で生じる。ＴＧＦβ３は当初、ヒト横紋筋肉腫細胞系から単離され、以来、肺腺癌および腎癌細胞系において見出されている。ＴＧＦβ３は、口蓋および肺の形態形成に重要であることが公知である［Ｋｕｂｉｃｚｋｏｖａら（２０１２年）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１０巻：１８３頁］。
【００３８】
アクチビンは、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーであり、当初、濾胞刺激ホルモンの分泌の調節因子として発見されたが、その後、多様な生殖的および非生殖的役割が特徴付けられている。２つの近縁のβサブユニットのホモ／ヘテロ二量体（それぞれ、βＡβＡ、βＢβＢ、およびβＡβＢ）である、３つの主要なアクチビン形態（Ａ、Ｂ、およびＡＢ）が存在する。ヒトゲノムはまた、主に肝臓内で発現する、アクチビンＣおよびアクチビンＥもコードし、βＣまたはβＥを含有するヘテロ二量体形態もまた公知である。ＴＧＦβスーパーファミリーにおいて、アクチビンは、卵巣および胎盤の細胞におけるホルモン生成を刺激し得、神経細胞の生存を支援し得、細胞周期の進行に対して細胞型に依存して正もしくは負に影響を及ぼし得、そして、少なくとも両生類の胚において中胚葉分化を誘導し得る、独特かつ多機能の作用因子である［ＤｅＰａｏｌｏら（１９９１年）、Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．１９８巻：５００〜５１２頁；Ｄｙｓｏｎら（１９９７年）、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．７巻：８１〜８４頁；およびＷｏｏｄｒｕｆｆ（１９９８年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５巻：９５３〜９６３頁］。いくつかの組織では、アクチビンのシグナル伝達は、その関連するヘテロ二量体であるインヒビンによってアンタゴナイズされる。例えば、下垂体からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）分泌の制御において、アクチビンは、ＦＳＨの合成および分泌を促進するが、インヒビンは、ＦＳＨの合成および分泌を低減する。アクチビンの生活性を調節し得、そして／または、アクチビンに結合し得る他のタンパク質としては、フォリスタチン（ＦＳ）、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ、ＦＬＲＧまたはＦＳＴＬ３としても公知）およびα２−マクログロブリンが挙げられる。
【００３９】
本明細書で記載される通り、「アクチビンＡ」に結合する作用因子は、単離βＡサブユニットの文脈であれ、二量体の複合体（例えば、βＡβＡホモ二量体またはβＡβＢヘテロ二量体）としてであれ、βＡサブユニットに特異的に結合する作用因子である。ヘテロ二量体の複合体（例えば、βＡβＢヘテロ二量体）の場合、「アクチビンＡ」に結合する作用因子は、βＡサブユニット内に存在するエピトープには特異的であるが、複合体のβＡ以外のサブユニット（例えば、複合体のβＢサブユニット）内に存在するエピトープには結合しない。同様に、「アクチビンＡ」にアンタゴナイズする（これを阻害する）本明細書で開示される作用因子は、単離βＡサブユニットの文脈であれ、二量体の複合体（例えば、βＡβＡホモ二量体またはβＡβＢヘテロ二量体）としてあれ、βＡサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性を阻害する作用因子である。βＡβＢヘテロ二量体の場合、「アクチビンＡ」を阻害する作用因子は、βＡサブユニットの１つまたは複数の活性を特異的に阻害するが、複合体のβＡ以外のサブユニット（例えば、複合体のβＢサブユニット）の活性は阻害しない作用因子である。この原則はまた、「アクチビンＢ」、「アクチビンＣ」、および「アクチビンＥ」に結合し、かつ／またはこれらを阻害する作用因子にも当てはまる。「アクチビンＡＢ」にアンタゴナイズする本明細書で開示される作用因子は、βＡサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性と、βＢサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性とを阻害する作用因子である。
【００４０】
ＢＭＰおよびＧＤＦは、併せて、ＴＧＦβスーパーファミリーの特徴的折り畳みを共有するシステインノットサイトカインのファミリーを形成する［Ｒｉｄｅｒら（２０１０年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、４２９巻（１号）：１〜１２頁］。このファミリーは、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ２ａ、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３ｂ（ＧＤＦ１０としても公知）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９（ＧＤＦ２としても公知）、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１（ＧＤＦ１１としても公知）、ＢＭＰ１２（ＧＤＦ７としても公知）、ＢＭＰ１３（ＧＤＦ６）、ＢＭＰ１４（ＧＤＦ５としても公知）、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１、ＧＤＦ３（ＶＧＲ２としても公知）、ＧＤＦ８（ミオスタチンとしても公知）、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１５およびｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃを含む。骨形成を誘導する能力であって、ＢＭＰにそれらの名称を与えた能力のほか、ＢＭＰ／ＧＤＦは、広範にわたる組織の発達における形態形成活性も提示する。ＢＭＰ／ＧＤＦホモおよびヘテロ二量体は、Ｉ型およびＩＩ型受容体の二量体の組合せと相互作用して、複数の可能なシグナル伝達複合体をもたらし、ＳＭＡＤ転写因子の２つの競合するセットのうちの１つを活性化させる。ＢＭＰ／ＧＤＦは、高度に特異的で、局在化された機能を有する。これらは、ＢＭＰ／ＧＤＦ発現の発達上の制限を含む多数の形で調節されており、高アフィニティでサイトカインに結合するいくつかの特異的ＢＭＰアンタゴニストタンパク質の分泌を介して調節されている。興味深いことに、これらの多数のアンタゴニストは、ＴＧＦβスーパーファミリーのリガンドに相似している。
【００４１】
一部分では、本明細書で示すデータは、アクチビンアンタゴニストおよびＴＧＦβアンタゴニストをがんを処置するために単独でまたは組み合わせて使用することができることを実証する。特に、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、または汎特異的ＴＧＦβ抗体による処置が、がんモデルにおいて、別々に、腫瘍負荷を低下させ、生存時間を増加させることが示された。さらに、アクチビンアンタゴニストをＴＧＦβアンタゴニストと組み合わせて使用して、いずれかの薬剤単独に関して観察された効果と比較して、抗腫瘍活性を相乗的に増加させることができることが示された。いずれの特定の理論に拘束されることも望まないが、このようなアクチビンおよびＴＧＦβアンタゴニストは、免疫チェックポイントアンタゴニスト（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、および／またはＢ７−Ｈ４の１つまたは複数に結合するおよびそれを阻害する抗体、またはその抗原結合断片）と組み合わせて使用した場合、がんを処置するのに特に有用であり得ると考えられる。したがって、本開示は、一部分では、アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴＧＦβアンタゴニストドメイン、および免疫チェックポイントアンタゴニストドメインから選択される２つまたはそれより多くのドメインを含む、二機能性および三機能性融合タンパク質を提供する。本開示は、例えば、がん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、または異形成障害を処置するために、このような二機能性および三機能性融合タンパク質を使用する方法をさらに提供する。
【００４２】
本明細書中で使用される用語は、一般に、本開示の文脈の範囲内で、かつ、各々の用語が使用される特定の文脈において、当該分野におけるその通常の意味を有する。本開示の組成物および方法、ならびに、これらの作製方法および使用方法の記載において、専門家にさらなる案内を提供するために、特定の用語が以下または本明細書中の他の場所で論じられている。用語の任意の使用の範囲および意味は、それが使用される特定の文脈から明らかである。
【００４３】
「相同」は、そのあらゆる文法的な形態および語の綴りのバリエーションにおいて「共通する進化的起源」を有する２つのタンパク質間の関係を指し、同じ生物種のスーパーファミリーからのタンパク質ならびに異なる生物種からの相同タンパク質を含む。このようなタンパク質（およびこれをコードする核酸）は、％同一性の観点であれ、特定の残基もしくはモチーフおよび保存された位置の存在によるものであれ、その配列類似性によって反映されるように、配列の相同性を有する。
【００４４】
用語「配列類似性」は、そのあらゆる文法的な形態において、共通する進化の起源を共有している場合も共有していない場合もある、核酸もしくはアミノ酸配列間の同一性もしくは対応性の程度をいう。しかし、一般的な用法およびこの出願において、用語「相同」は、「高度に」のような副詞で修飾されるとき、配列の類似性を指す場合があり、そして、共通する進化の起源に関連していてもしていなくてもよい。
【００４５】
参照ポリペプチド（またはヌクレオチド）配列に照らした「配列同一性パーセント（％）」または「同一性パーセント（％）」とは、配列を決定し、必要な場合、最大の配列同一性パーセントを達成するようにギャップを導入した後における、保存的置換は配列同一性の一部と考えない場合の、候補配列内のアミノ酸残基（または核酸）の百分率であって、参照ポリペプチド（ヌクレオチド）配列内のアミノ酸残基（または核酸）と同一であるアミノ酸残基（または核酸）の百分率と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定することを目的とするアラインメントは、当該分野の技術の範囲内にある種々の方式で、例えば、ＢＬＡＳＴソフトウェア、ＢＬＡＳＴ−２ソフトウェア、ＡＬＩＧＮソフトウェア、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなど、一般に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、配列を決定するのに適切なパラメータであって、比較される配列の全長にわたり最大のアラインメントを達成するのに必要とされる、任意のアルゴリズムを含むパラメータを決定することができる。しかし、本明細書の目的では、アミノ酸（核酸）配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムである、ＡＬＩＧＮ−２を使用して生成する。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により作成され、ソースコードは、使用説明書と共に、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、２０５５９に提出され、ここで、米国著作権登録第ＴＸＵ５１００８７号として登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．から一般に利用可能であるが、ソースコードからコンパイルすることもできる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム上の使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変化しない。
【００４６】
「アゴナイズする」とは、すべてのその文法的形態において、タンパク質および／または遺伝子を（例えば、タンパク質の遺伝子発現を活性化もしくは増幅することによって、または不活性のタンパク質を活性状態となるように誘導することによって）活性化するプロセス、あるいはタンパク質および／または遺伝子の活性を増加させるプロセスを指す。
【００４７】
「アンタゴナイズする」とは、すべてのその文法的形態において、タンパク質および／または遺伝子を（例えば、タンパク質の遺伝子発現を阻害もしくは減少させることによって、または活性のタンパク質を不活性状態となるように誘導することによって）阻害するプロセス、あるいはタンパク質および／または遺伝子の活性を減少させるプロセスを指す。
【００４８】
本明細書および特許請求の範囲の全体にわたって数値に関して使用される「約」および「およそ」という用語は、当業者によく知られ、許容される精度区間を意味する。
【００４９】
本明細書に開示される数値範囲は、範囲を規定する数を含む。
【００５０】
「ａ」および「ａｎ」という用語は、この用語が使用される文脈が明らかに他を指示しない限り、複数の対象物を含む。「ａ」（または「ａｎ」）という用語、ならびに「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書において、互換可能に使用することができる。さらにまた、本明細書において使用される「および／または」は、他のものを伴うか、もしくは伴わない、２つまたはそれよりも多くの特定の特徴または成分のそれぞれの特定の開示とすべきである。したがって、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）および「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの語句において使用される「および／または」という用語は、以下の態様のそれぞれを包含することが意図される：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
【００５１】
本明細書全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、言及された整数または整数の群の包含という意味を含むが、任意の他の整数または整数の群の除外という意味を含まないことが理解されるであろう。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、より狭い「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」および「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語の使用も包含する。
【００５２】
「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語は、特定の材料またはステップ、および本明細書に開示される本発明の基本および新規の特性に著しく影響を与えないものに限定される。
【００５３】
本明細書で使用される「認識可能な親和性」という用語は、５０ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）での結合を意味する。
【００５４】
「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸の鎖を指すために、本明細書において互換可能に使用される。鎖は、直鎖状または分岐状であってもよく、これは、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、および／または非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語は、天然で、または介入によって修飾されたアミノ酸鎖も包含し；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲーションなど。また、この定義内には、例えば、アミノ酸の１つまたは複数のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）および当技術分野において公知の他の修飾を含有する、ポリペプチドも含まれる。ポリペプチドは、一本鎖または会合鎖として存在し得ることが理解される。
【００５５】
「へテロマー」または「ヘテロ多量体」という用語は、少なくとも第１のポリペプチド鎖と、第２のポリペプチド鎖とを含む複合体であって、第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、第１のポリペプチド鎖と、少なくとも１つのアミノ酸残基だけ異なる複合体を指す。へテロマーは、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖により形成される「ヘテロ二量体」を含む場合もあり、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖に加えて、１つまたは複数のポリペプチド鎖が存在するより高次の構造を形成する場合もある。ヘテロ多量体の例示的な構造として、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体、およびさらなるオリゴマー構造が挙げられる。本明細書では、ヘテロ二量体を、Ｘ：Ｙまたは、これと同義に、Ｘ−Ｙと表示する［表示中、Ｘは第１のポリペプチド鎖を表し、Ｙは第２のポリペプチド鎖を表す］。本明細書では、より高次のへテロマーおよびオリゴマー構造を対応する形式で表示する。ある特定の実施形態では、ヘテロ多量体は、組換え（例えば、１つまたは複数のポリペプチド構成要素が、組換えタンパク質であり得る）であり、単離されており、かつ／または精製されている。
【００５６】
２．ＡｃｔＲＩＩ、ＴＧＦβＲＩＩ、およびベータグリカンポリペプチド
本明細書で使用される場合、「ＴβＲＩＩ」という用語は、任意の種由来のトランスフォーミング成長因子ベータ受容体ＩＩ型（ＴβＲＩＩ）タンパク質のファミリーおよび変異誘発または他の改変によってこのようなＴβＲＩＩタンパク質から導出されたバリアントを指す。本明細書におけるＴβＲＩＩへの言及は、現在特定されている形態のいずれか１つに対する言及であると理解される。ＴβＲＩＩファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成される膜貫通タンパク質である。「ＴβＲＩＩポリペプチド」という用語は、任意の天然に生じるＴβＲＩＩファミリーメンバーのポリペプチド、および有用な活性を維持した任意のこれらのバリアント（変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを含む。
【００５７】
上記に記載するように、ヒトＴβＲＩＩは、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）における選択的スプライシングによって生じた、Ａ（長い）およびＢ（短い）の少なくとも２つのアイソフォームで天然に存在する（図１および２、配列番号１および２）。配列番号１の残基２３〜１５９に対応する配列番号２７は、ＴβＲＩＩの天然の全長細胞外ドメインの短いアイソフォームを表す。配列番号２の残基２３〜１８４に対応する配列番号１８は、ＴβＲＩＩの天然の全長細胞外ドメインの長いアイソフォームを表す。他に言及されない限り、ＴβＲＩＩの短いアイソフォームおよび長いアイソフォームに基づくバリアントに関するアミノ酸位置の番号付けは、それぞれ、天然前駆体の配列番号１および配列番号２における対応する位置を指す。
【００５８】
ある特定の実施形態では、本開示は、バリアントＴβＲＩＩポリペプチドを提供する。本開示のＴβＲＩＩポリペプチドは、限定されるものではないが、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３などのＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーと結合し得、これらの機能を阻害し得る。ＴβＲＩＩポリペプチドは、天然に存在するＴβＲＩＩポリペプチドの切断ＥＣＤドメインと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列、必要に応じて、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列からなるか、またはこれらのアミノ酸配列を含み、そのＣ末端が、配列番号１のアミノ酸１５３〜１５９のいずれかに存在する、ポリペプチドを含み得る。ＴβＲＩＩポリペプチドは、天然に存在するＴβＲＩＩポリペプチドの切断ＥＣＤドメインと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列、必要に応じて、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列からなるか、またはこれらのアミノ酸配列を含み、そのＣ末端が、配列番号２のアミノ酸１７８〜１８４のいずれかに存在する、ポリペプチドを含み得る。特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列、必要に応じて、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。必要に応じて、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１６０〜５６７からなる配列から、または配列番号２のアミノ酸１８５〜５９２からなる配列から、５より多くの連続したアミノ酸、あるいは１０、２０、３０、４０、５０、５２、６０、７０、８０、９０、１００、１５０もしくは２００またはそれよりも多くの連続したアミノ酸を含まない。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１６０〜５６７を含まない。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜２２を含まない。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜２２および１６０〜５６７を含まない。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１８５〜５９２を含まない。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜２２を含まない。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜２２および１８５〜５９２を含まない。プロセシングされていないＴβＲＩＩポリペプチドは、任意のシグナル配列、および任意のＮ末端からシグナル配列への配列を、含むか、または除かれているかのいずれかであり得る。本明細書で詳細に述べるように、プロセシングされたＴβＲＩＩポリペプチドのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸２３〜３５または配列番号２のアミノ酸２３〜６０のいずれかに存在し得る。プロセシングされたＴβＲＩＩポリペプチドの例としては、限定されるものではないが、配列番号１のアミノ酸２３〜１５９（配列番号２７に記��）、配列番号１のアミノ酸２９〜１５９（配列番号２８に記述）、配列番号１のアミノ酸３５〜１５９（配列番号２９に記述）、配列番号１のアミノ酸２３〜１５３（配列番号３０に記述）、配列番号１のアミノ酸２９〜１５３（配列番号３１に記述）、配列番号１のアミノ酸３５〜１５３（配列番号３２に記述）、配列番号２のアミノ酸２３〜１８４（配列番号１８に記述）、配列番号２のアミノ酸２９〜１８４（配列番号３３に記述）、配列番号２のアミノ酸６０〜１８４（配列番号２９に記述）、配列番号２のアミノ酸２３〜１７８（配列番号３４に記述）、配列番号２のアミノ酸２９〜１７８（配列番号３５に記述）、および配列番号２のアミノ酸６０〜１７８（配列番号３２に記述）が挙げられる。ＴβＲＩＩの長いアイソフォームに基づく対応するバリアントが、挿入に隣接するＣ末端位で保存的なＶａｌ−Ｉｌｅ置換とともに２５アミノ酸挿入をコードするヌクレオチド配列を含むことは当業者によって理解される。したがって、ＴβＲＩＩポリペプチドは、単離されたＴβＲＩＩポリペプチドの細胞外部分を含んでいてもよく、これは、短いアイソフォームおよび長いアイソフォームの両方、これらのバリアント（例えば、配列番号１のアミノ酸２３〜１５９または配列番号２のアミノ酸２３〜１８４に対応する配列中に、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０または３５以下のアミノ酸置換を含むバリアントを含む）、これらの断片、および前述のいずれかを含む融合タンパク質を含むが、それぞれの場合において、好ましくは、前述のＴβＲＩＩポリペプチドのいずれかは、ＴＧＦβ１もしくはＴＧＦβ３の少なくとも１つまたは両方について実質的に親和性を維持する。一般に、ＴβＲＩＩポリペプチドは、生物学的に関連する温度、ｐＨレベルおよびオスモル濃度で、水溶液に可溶性であるように設計される。
【００５９】
一部の実施形態では、本開示のバリアントＴβＲＩＩポリペプチドは、変更されたリガンド結合プロファイルを付与する１つまたは複数の変異を細胞外ドメイン中に含む。ＴβＲＩＩポリペプチドは、天然に存在するＴβＲＩＩポリペプチドの対応する部分に対して、アミノ酸配列中に１つ、２つ、５つまたはそれよりも多くの変更を含んでいてもよい。一部の実施形態では、変異は、配列番号１の７０位に対応する位置で、置換、挿入または欠失をもたらす。一部の実施形態では、変異は、配列番号１の１１０位に対応する位置で、置換、挿入または欠失をもたらす。例としては、限定されるものではないが、配列番号１のそれぞれ７０位および１１０位に対応する位置における、ＮからＤへの置換、またはＤからＫへの置換が挙げられる。このようなバリアントＴβＲＩＩポリペプチドの例としては、限定されるものではないが、配列番号３６〜３９に記述される配列が挙げられる。ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６もしくは４７、またはこれらのサイレントバリアント、あるいはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこれらの相補体とハイブリダイズする核酸のいずれか１つによってコードされる、ポリペプチドまたはその部分を含んでいてもよい。特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１２、またはこのサイレントバリアント、あるいはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこれらの相補体とハイブリダイズする核酸のいずれか１つによってコードされる、ポリペプチドまたはその部分を含んでいてもよい。
【００６０】
一部の実施形態では、本開示のバリアントＴβＲＩＩポリペプチドは、ヒトＴβＲＩＩアイソフォームＣにおいて天然に存在するように（Ｋｏｎｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８：３１８，  ２００７）、ヒトＴβＲＩＩ  ＥＣＤのＣ末端の近くに位置するグルタミン酸残基の対（配列番号１の１５１位および１５２位、または配列番号２の１７６位および１７７位）の間の３６アミノ酸（配列番号４１）の挿入をさらに含む。
【００６１】
ＴβＲＩＩポリペプチドが、ＴβＲＩＩリガンドを選択的にアンタゴナイズするように改変され得ることが実証されている。Ｎ７０残基は、可能性があるグリコシル化部位を表す。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、グリコシル化されていない。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、グリコシル化されていないか、またはＡｓｎ１５７位でのグリコシル化が低減されている。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、グリコシル化されていないか、またはＡｓｎ７３位でのグリコシル化が低減されている。
【００６２】
ある特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドはＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に結合し、ＴβＲＩＩポリペプチドはＴＧＦβ２への実質的な結合を示さない。ある特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３に結合する。結合は、溶液中、またはＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムなどの表面プラズモン共鳴システムにおいて、精製されたタンパク質を使用して評価され得る。
【００６３】
ある特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３細胞内シグナル伝達を阻害し、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ２シグナル伝達に対する中程度または限定的な阻害効果を有する。細胞シグナル伝達に対する阻害効果は、当技術分野において公知の方法によってアッセイすることができる。
【００６４】
これらを基に、ＴβＲＩＩポリペプチドの活性部分は、配列番号１のアミノ酸配列２３〜１５３、２３〜１５４、２３〜１５５、２３〜１５６、２３〜１５７または２３〜１５８、および配列番号１のアミノ酸２４〜３５のいずれかで開始するこれらの配列のバリアントを含んでいてもよい。同様に、ＴβＲＩＩポリペプチドの活性部分は、配列番号２のアミノ酸配列２３〜１７８、２３〜１７９、２３〜１８０、２３〜１８１、２３〜１８２または２３〜１８３、および配列番号２のアミノ酸２４〜６０のいずれかで開始するこれらの配列のバリアントを含んでいてもよい。例示的なＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列２９〜１５９、３５〜１５９、２３〜１５３、２９〜１５３および３５〜１５３、または配列番号２のアミノ酸配列２９〜１８４、６０〜１８４、２３〜１７８、２９〜１７８および６０〜１７８を含む。これらの範囲内のバリアント、特に、配列番号１または配列番号２の対応する部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するものも企図される。配列番号１のアミノ酸１６０〜５６７または配列番号２のアミノ酸１８５〜５９２からなる配列を含まないＴβＲＩＩポリペプチドが選択されてもよい。特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列、必要に応じて、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【００６５】
一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号９４〜１００のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９７％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号９４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９７％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号９８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９７％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００６６】
本明細書で使用する場合、用語「ＡｃｔＲＩＩＢ」とは、任意の種に由来するアクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）タンパク質のファミリーと、変異誘発または他の改変によるこのようなＡｃｔＲＩＩＢタンパク質に由来する改変体とを指す。本明細書におけるＡｃｔＲＩＩＢに対する言及は、現在同定されている形態のうちの任意の１つに対する言及であるものと理解される。ＡｃｔＲＩＩＢファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチな領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび予測セリン／スレオニンキナーゼ活性を持つ細胞質ドメインから構成される、膜貫通タンパク質である。
【００６７】
用語「ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩＢファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチド、ならびに、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合体およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを包含する。このような改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの例は、本開示を通して提供されるほか、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２００６／０１２６２７号、同第ＷＯ２００８／０９７５４１号および同第ＷＯ２０１０／１５１４２６号においても提供されている。本明細書で記載される、全てのＡｃｔＲＩＩＢ関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、そうでないことが具体的に指示されない限りにおいて、下記で提供される、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体のタンパク質配列（配列番号５０）の番号付けに基づく。
【００６８】
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体のタンパク質配列は、以下の通りである。
【化１】
2021526835.tif 000002
【００６９】
シグナルペプチドは、一重下線で指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示し、潜在的な、内因性Ｎ−連結グリコシル化部位は、二重下線で指し示す。
【００７０】
プロセシング後の細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列は、以下の通りである。
【化２】
2021526835.tif 000003
【００７１】
一部の実施形態では、タンパク質は、Ｎ末端における「ＳＧＲ・・・」配列により生成することができる。細胞外ドメインのＣ末端「テール」は、一重下線で指し示す。「テール」を欠失させた配列（Δ１５配列）は、以下の通りである。
【化３】
2021526835.tif 000004
【００７２】
配列番号１の６４位においてアラニン（Ａ６４）を有するＡｃｔＲＩＩＢの形態についてはまた、文献、例えば、Ｈｉｌｄｅｎら（１９９４年）、Ｂｌｏｏｄ、８３巻（８号）：２１６３〜２１７０頁を参照されたい、においても報告されている。本出願人らは、Ａ６４置換を有するＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対する親和性が比較的低いことを確認した。これに対し、６４位においてアルギニン（Ｒ６４）を有する、同じＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対する親和性が、低ｎＭ〜高ｐＭの範囲である。したがって、Ｒ６４を有する配列を、本開示におけるヒトＡｃｔＲＩＩＢのための「野生型」参照配列として使用する。
【００７３】
６４位においてアラニンを有するＡｃｔＲＩＩＢの形態は、以下の通りである。
【化４】
2021526835.tif 000005
【００７４】
シグナルペプチドは、一重下線で指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示す。
代替的なＡ６４形態の、プロセシング後の細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列は、以下の通りである。
【化５】
2021526835.tif 000006
【００７５】
一部の実施形態では、タンパク質は、Ｎ末端における「ＳＧＲ・・・」配列により生成することができる。細胞外ドメインのＣ末端「テール」は、一重下線で指し示す。「テール」を欠失させた配列（Δ１５配列）は、以下の通りである。
【化６】
2021526835.tif 000007
【００７６】
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質をコードする核酸配列であって、ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体のアミノ酸１〜５１３をコードする、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１１０６．３のヌクレオチド２５〜１５６０を表す核酸配列を、下記（配列番号５６）に示す。示される配列は、６４位においてアルギニンを提示するが、代わりに、アラニンを提示するように改変することができる。シグナル配列に下線を付す。
【化７】
2021526835.tif 000008
【００７７】
プロセシング後のヒト細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸配列は、以下（配列番号５７）の通りである。示される配列は、６４位においてアルギニンを提示するが、代わりに、アラニンを提示するように改変することができる。
【化８】
2021526835.tif 000009
【００７８】
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインおよびヒトＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインのアミノ酸配列のアラインメントを、図７に例示する。このアラインメントは、両方の受容体内のアミノ酸残基であって、ＡｃｔＲＩＩリガンドに直接接触すると考えられるアミノ酸残基を指し示す。例えば、複合ＡｃｔＲＩＩ構造は、ＡｃｔＲＩＩＢ−リガンドの結合ポケットが、部分的に、残基Ｙ３１、Ｎ３３、Ｎ３５、Ｌ３８〜Ｔ４１、Ｅ４７、Ｅ５０、Ｑ５３〜Ｋ５５、Ｌ５７、Ｈ５８、Ｙ６０、Ｓ６２、Ｋ７４、Ｗ７８〜Ｎ８３、Ｙ８５、Ｒ８７、Ａ９２、およびＥ９４〜Ｆ１０１により規定されることを指し示した。図７を参照のこと。これらの位置では、保存的変異が許容されることが予測される。
【００７９】
加えて、ＡｃｔＲＩＩＢは、完全に保存された細胞外ドメインの大きな連なりを伴って、脊椎動物間で良好に保存されている。例えば、図８は、多様なＡｃｔＲＩＩＢオーソログと比較してヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの多重配列アラインメントを描示する。ＡｃｔＲＩＩＢに結合するリガンドの多くもまた、高度に保存されている。したがって、これらのアラインメントから、リガンド結合ドメイン内の鍵となるアミノ酸位置であって、正常なＡｃｔＲＩＩＢ−リガンド結合活性に重要なアミノ酸位置を予測するほか、正常なＡｃｔＲＩＩＢ−リガンド結合活性を著明に変更せずに、置換を許容する可能性が高いアミノ酸位置も予測することが可能である。したがって、本開示の方法に従い有用な活性ヒトＡｃｔＲＩＩＢ改変体ポリペプチドは、別の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＢの配列に由来する、対応する位置における１つまたは複数のアミノ酸を含んでもよいし、ヒトまたは他の脊椎動物配列内の残基と類似する残基を含んでもよい。以下の例は、限定的であると意図せずに、活性ＡｃｔＲＩＩＢ改変体を規定するこの手法を例示する。ヒト細胞外ドメイン（配列番号１０４）内のＬ４６は、ＸｅｎｏｐｕｓのＡｃｔＲＩＩＢ（配列番号１０５）ではバリンであるので、この位置は変更することができ、任意選択で、Ｖ、Ｉ、もしくはＦなどの別の疎水性残基、またはＡなどの非極性残基に変更することができる。ヒト細胞外ドメイン内のＥ５２はＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、この部位がＥ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、ＹおよびおそらくＡなどの極性残基を含む、広範な変化を許容し得ることを示す。ヒト細胞外ドメイン内のＴ９３はＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、広範な構造バリエーションがこの位置で許容され、Ｓ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、ＧおよびＹなどの極性残基が好まれることを示す。ヒト細胞外ドメイン内のＦ１０８はＸｅｎｏｐｕｓではＹであり、したがってＹまたは他の疎水性基、例えばＩ、ＶまたはＬが許容されるはずである。ヒト細胞外ドメイン内のＥ１１１はＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、Ｄ、Ｒ、ＫおよびＨ，ならびにＱおよびＮを含む荷電残基がこの位置で許容されることを示す。ヒト細胞外ドメイン内のＲ１１２はＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、ＲおよびＨを含む塩基性残基がこの位置で許容されることを示す。ヒト細胞外ドメイン内の１１９位のＡは、比較的保存が不良であり、齧歯動物ではＰとして現れ、ＸｅｎｏｐｕｓではＶとして現れるので、この位置では、本質的に任意のアミノ酸が許容されるはずである。
【００８０】
さらに、当該分野では、ＡｃｔＲＩＩタンパク質は、特にリガンド結合に関する、構造機能的特徴との関係で特徴付けられている［Ａｔｔｉｓａｎｏら（１９９２年）、Ｃｅｌｌ、６８巻（１号）：９７〜１０８頁；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６巻（１号）：１８〜２２頁；Ａｌｌｅｎｄｏｒｐｈら（２００６年）、ＰＮＡＳ、１０３巻（２０号）：７６４３〜７６４８頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（２００３年）、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２２巻（７号）：１５５５〜１５６６頁；ならびに米国特許第７，７０９，６０５号、同第７，６１２，０４１号、および同第７，８４２，６６３号］。本明細書の教示に加えて、これらの参考文献も、１つまたは複数の正常な活性（例えば、リガンド結合活性）を保持するＡｃｔＲＩＩＢ改変体をどのようにして生成するのかについての指針を十分に提供している。
【００８１】
例えば、３フィンガーの毒素フォールドとして公知の構造モチーフを規定することは、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体によるリガンド結合に重要であり、各単量体の受容体の細胞外ドメイン内の様々な位置に配置された保存されたシステイン残基により形成される［Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９年）、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ、６巻：１８〜２２頁；およびＨｉｎｃｋ（２０１２年）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、５８６巻：１８６０〜１８７０頁］。したがって、これらの保存されたシステインの最外殻により画されるようなヒトＡｃｔＲＩＩＢのコアとなるリガンド結合性ドメインは、配列番号５０（ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体）の２９〜１０９位に対応する。したがって、これらのシステインによって画されるコア配列に隣接する構造的に秩序のより乏しいアミノ酸は、必ずしもリガンド結合性を変更することなく、Ｎ末端で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８残基だけ、かつ／またはＣ末端で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５残基だけ短縮することができる。Ｎ末端および／またはＣ末端短縮型についての例示的なＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインとして、配列番号５１、５２、５４、５５および１０９が挙げられる。
【００８２】
Ａｔｔｉｓａｎｏらは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインのＣ末端におけるプロリンノットの欠失が、受容体のアクチビンに対する親和性を低減することを示した。前駆体配列番号５０のアミノ酸２０〜１１９を含有するＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質である「ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１１９）−Ｆｃ」は、ＧＤＦ１１およびアクチビンへの結合が、プロリンノット領域と、完全膜近傍ドメインとを含むＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−Ｆｃと比べて低減されている（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照されたい）。しかし、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１２９）−Ｆｃタンパク質は、プロリンノット領域が破壊されていてもなお、野生型と比べてある程度低減されているが、同様の活性を保持する。
【００８３】
したがって、アミノ酸１３４、１３３、１３２、１３１、１３０、および１２９（配列番号５０に照らして）で終止するＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインは全て、活性であることが予測されるが、１３４または１３３で終止する構築物が最も活性であり得る。同様に、残基１２９〜１３４（配列番号５０に照らして）のいずれにおける変異も、リガンド結合親和性を大幅に変更することはないと予測される。この裏付けとして、当該分野では、Ｐ１２９およびＰ１３０（配列番号５０に照らして）の変異は、リガンド結合を実質的に減殺しないことが公知である。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、アミノ酸１０９（最後のシステイン）という前方の位置で終結し得るが、１０９および１１９またはその間（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、または１１９）で終結する形態は、リガンド結合が低減されることが予測される。アミノ酸１１９（本明細書の配列番号５０に照らして）は保存が良好でないので、たやすく変更または短縮される。１２８（配列番号５０に照らして）またはこの後方で終結するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、リガンド結合活性を保持するはずである。配列番号５０に照らして、１１９および１２７またはその間（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、または１２７）で終結するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、中程度の結合能を有する。これらの形態のいずれも、臨床状況または実験状況に応じて、使用が所望され得る。
【００８４】
ＡｃｔＲＩＩＢのＮ末端では、アミノ酸２９またはこの前方（配列番号５０に照らして）で始まるタンパク質は、リガンド結合活性を保持することが予測される。アミノ酸２９は、最初のシステインを表す。２４位（配列番号５０に照らして）における、アラニンからアスパラギンへの変異は、リガンド結合に実質的に影響を及ぼさずに、Ｎ結合型グリコシル化配列を導入する［米国特許第７，８４２，６６３号］。これは、シグナル切断ペプチドとシステイン架橋領域との間の領域であって、アミノ酸２０〜２９に対応する領域内の変異が、良好に許容されることを確認する。特に、２０、２１、２２、２３、および２４位（配列番号５０に照らして）で始まるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、一般的なリガンド結合活性を保持するはずであり、２５、２６、２７、２８、および２９位（配列番号５０に照らして）で始まるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドもまた、リガンド結合活性を保持すると予測される。例えば、米国特許第７，８４２，６６３号では、驚くべきことに、２２、２３、２４または２５で始まるＡｃｔＲＩＩＢ構築物が最も大きな活性を有することが実証されている。
【００８５】
まとめると、ＡｃｔＲＩＩＢの活性部分（例えば、リガンド結合部分）の一般式は、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９を含む。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、例えば、配列番号５０のアミノ酸２０〜２９のいずれか１つに対応する残基で始まり、配列番号５０のいずれか１つのアミノ酸１０９〜１３４に対応する位置で終わるＡｃｔＲＩＩＢの部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなり得る。他の例としては、配列番号５０の２０〜２９または２１〜２９位で開始し、配列番号５０の１１９〜１３４、１１９〜１３３、１２９〜１３４、または１２９〜１３３位で終了するポリペプチドが挙げられる。他の例としては、配列番号５０の２０〜２４、２１〜２４、または２２〜２５位で開始し、配列番号５０の１０９〜１３４、１１９〜１３４または１２９〜１３４位で終了する構築物が挙げられる。これらの範囲内のバリアントとしてはまた、特に、配列番号５０の対応する部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するものが企図される。
【００８６】
本明細書で記載される改変は、多様な形で組み合わせることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ改変体は、リガンド結合ポケット内における１、２、５、６、７、８、９、１０または１５以下の保存的アミノ酸変化と、リガンド結合ポケット内の４０、５３、５５、７４、７９、および／または８２位における０、１、またはこれを超える非保存的変更とを含む。ばらつきが特に良好に許容され得る結合ポケットの外部の部位として、細胞外ドメイン（上記で言及した）のアミノ末端およびカルボキシ末端と、４２〜４６および６５〜７３位（配列番号５０に照らして）とが挙げられる。実際、６５位におけるアスパラギンからアラニンへの変更（Ｎ６５Ａ）は、バックグラウンドをＡ６４とするときのリガンド結合を改善するので、バックグラウンドをＲ６４とするときのリガンド結合に有害作用を及ぼさないことが予測されている［米国特許第７，８４２，６６３号］。この変化はおそらく、バックグラウンドをＡ６４とするときのＮ６５におけるグリコシル化を消失させることから、この領域内の著明な変化は、許容される可能性が高いことが実証される。Ｒ６４Ａ変化は許容が不良であるが、Ｒ６４Ｋは許容が良好であるので、６４位では、Ｈなどの別の塩基性残基が許容され得る［米国特許第７，８４２，６６３号］。追加的に、当技術分野で記載された変異生成プログラムの結果は、保存することが多くの場合有益なＡｃｔＲＩＩＢにおけるアミノ酸位置があることを指し示す。配列番号５０に照らして、これらには、８０位（酸性または疎水性アミノ酸）、７８位（疎水性、特にトリプトファン）、３７位（酸性、特にアスパラギン酸またはグルタミン酸）、５６位（塩基性アミノ酸）、６０位（疎水性アミノ酸、特にフェニルアラニンまたはチロシン）が含まれる。したがって、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドにおいて保存され得るアミノ酸のフレームワークを提供する。保存することが所望され得る他の位置は、以下の通りである：５２位（酸性アミノ酸）、５５位（塩基性アミノ酸）、８１位（酸性）、９８（極性または帯電、特にＥ、Ｄ、ＲまたはＫ）（全て配列番号５０に照らして）。
【００８７】
一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５０に関して、７９位に天然に生じるロイシンを含む。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５０に関して、７９位に酸性アミノ酸（例えば、天然に生じるＤまたはＥアミノ酸残基あるいは人工酸性アミノ酸）を含む。代替の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５０に関して、７９位に酸性アミノ酸（例えば、天然に生じるＤまたはＥアミノ酸残基あるいは人工酸性アミノ酸）を含まない。
【００８８】
用語「ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩＡファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを含む。このような改変体ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの例は、本開示を通して、および参照によりその全体を本明細書に組み込む国際特許出願公開番号ＷＯ２００６／０１２６２７およびＷＯ２００７／０６２１８８に提供されている。本明細書で記載されるあらゆるＡｃｔＲＩＩＡ関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、他に特段の指定がなければ、下記に示すヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質配列（配列番号１１０）の番号付けに基づく。
【００８９】
ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質配列を次に示す：  
【化９】
2021526835.tif 000010
【００９０】
シグナルペプチドは、単一の下線によって指し示し；細胞外ドメインは、太字フォントで指し示し；潜在的な内在性Ｎ結合型グリコシル化部位は、二重の下線によって指し示す。
プロセシングされた細胞外ヒトＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド配列を次に示す：  
【化１０】
2021526835.tif 000011
【００９１】
細胞外ドメインのＣ末端「テイル」は、単一の下線によって指し示す。「テイル」を欠失した配列（Δ１５配列）を次に示す：
【化１１】
2021526835.tif 000012
【００９２】
ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質をコードする核酸配列を下記に示し（配列番号１１３）、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１６１６．４のヌクレオチド１５９〜１７００に対応する。シグナル配列に下線を引く。
【化１２−１】
2021526835.tif 000013
【化１２−２】
2021526835.tif 000014
【００９３】
プロセシングされた細胞外ヒトＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドをコードする核酸配列を次に示す：
【化１３】
2021526835.tif 000015
【００９４】
ＡｃｔＲＩＩＡは、脊椎動物の間で十分に保存されており、細胞外ドメインの大きな区間（ｓｔｒｅｔｃｈ）が完全に保存されている。例えば、図９は、種々のＡｃｔＲＩＩＡオルソログと比較した、ヒトＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインの多重配列アラインメントを描写する。ＡｃｔＲＩＩＡに結合するリガンドの多くも高度に保存されている。したがって、これらのアラインメントから、正常なＡｃｔＲＩＩＡリガンド結合活性に重要な、リガンド結合性ドメイン内の重要なアミノ酸位置を予測すると共に、正常なＡｃｔＲＩＩＡリガンド結合活性を有意に変更することのない、置換に寛容である可能性があるアミノ酸位置を予測することが可能である。したがって、現在開示されている方法に従って有用な活性ヒトＡｃｔＲＩＩＡ改変体ポリペプチドは、別の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＡの配列由来の対応する位置に１つもしくは複数のアミノ酸を含み得る、またはヒトもしくは他の脊椎動物配列における残基と同様の残基を含み得る。
【００９５】
限定を意味するものではないが、次の例は、活性ＡｃｔＲＩＩＡ改変体を定義するこのアプローチを例証する。図９に例証するように、ヒト細胞外ドメインにおけるＦ１３は、Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ（ヒツジ）（配列番号１１５）、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ（ニワトリ）（配列番号１１６）、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ（ウシ）（配列番号１１７）、Ｔｙｔｏ  ａｌｂａ（フクロウ）（配列番号１１８）、およびＭｙｏｔｉｓ  ｄａｖｉｄｉｉ（コウモリ）（配列番号１１９）ＡｃｔＲＩＩＡにおいてＹであり、Ｆ、Ｗ、およびＹを含む芳香族残基が、この位置で許容されることを指し示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＱ２４は、Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ  ＡｃｔＲＩＩＡではＲであり、Ｄ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、およびＥを含む荷電残基がこの位置で許容されることを指し示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＳ９５は、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓおよびＴｙｔｏ  ａｌｂａ  ＡｃｔＲＩＩＡではＦであり、この部位が、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、Ｙなどの極性残基、およびおそらくＬ、Ｉ、またはＦなどの疎水性残基を含む多種多様な変化に寛容となり得ることを指し示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＥ５２は、Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ  ＡｃｔＲＩＩＡではＤであり、ＤおよびＥを含む酸性残基が、この位置で許容されることを指し示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＰ２９は、保存が比較的不良であり、Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ  ＡｃｔＲＩＩＡではＳとして出現し、Ｍｙｏｔｉｓ  ｄａｖｉｄｉｉ  ＡｃｔＲＩＩＡではＬとして出現し、したがって、本質的に任意のアミノ酸がこの位置で許容される筈である。
【００９６】
その上、上記のように、ＡｃｔＲＩＩタンパク質は、構造／機能的な特徴の観点から、特にリガンド結合に関して当該分野で特徴付けられている［Ａｔｔｉｓａｎｏら（１９９２年）Ｃｅｌｌ、６８巻（１号）：９７〜１０８頁；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６巻（１号）：１８〜２２頁；Ａｌｌｅｎｄｏｒｐｈら（２００６年）ＰＮＡＳ、１０３巻（２０号）：７６４３〜７６４８頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（２００３年）Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２２巻（７号）：１５５５〜１５６６頁；ならびに米国特許第７，７０９，６０５号、第７，６１２，０４１号、および第７，８４２，６６３号］。本明細書の教示に加えて、これらの参考文献は、１つまたは複数の所望の活性（例えば、リガンド結合活性）を保持するＡｃｔＲＩＩＡ改変体を生成する仕方についてのガイダンスを十分に提供する。
【００９７】
例えば、３−フィンガートキシンフォールドとして公知の明確な構造モチーフは、Ｉ型およびＩＩ型受容体によるリガンド結合に重要であり、各単量体の受容体の細胞外ドメイン内の変動的な位置に位置する保存されたシステイン残基によって形成される［Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９年）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ、６巻：１８〜２２頁；およびＨｉｎｃｋ（２０１２年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、５８６巻：１８６０〜１８７０頁］。したがって、これらの保存されたシステインの最外部によって境界を画定されるヒトＡｃｔＲＩＩＡのコアリガンド結合性ドメインは、配列番号１１０（ＡｃｔＲＩＩＡ前駆体）の３０〜１１０位に対応する。したがって、これらのシステインにより境界を画定されたコア配列に隣接する構造的により秩序的でないアミノ酸は、必ずしもリガンド結合を変更することなく、Ｎ末端において約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９残基、およびＣ末端において約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５残基、切断することができる。例示的なＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインは、配列番号１１１および１１２を含む。
【００９８】
したがって、ＡｃｔＲＩＩＡの活性部分（例えば、リガンド結合）の一般式は、配列番号１１０のアミノ酸３０〜１１０を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなるポリペプチドである。したがって、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、例えば、配列番号１１０のアミノ酸２１〜３０のうちのいずれか１つに対応する残基から始まり、配列番号１１０のアミノ酸１１０〜１３５のうちのいずれか１つに対応する位置で終わるＡｃｔＲＩＩＡの部分に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得るか、これから本質的になり得るか、またはこれからなり得る。他の例としては、配列番号１１０の２１〜３０、２２〜３０、２３〜３０、２４〜３０位から選択される位置で開始し、配列番号１１０の１１１〜１３５、１１２〜１３５、１１３〜１３５、１２０〜１３５、１３０〜１３５、１１１〜１３４、１１１〜１３３、１１１〜１３２、または１１１〜１３１位から選択される位置で終了する構築物が挙げられる。これらの範囲内の改変体、特に、配列番号１１０の対応する部分に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる改変体も考慮される。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号１１０のアミノ酸３０〜１１０に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチドを含み得るか、これから本質的になり得るか、またはこれからなり得る。任意選択で、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号１１０のアミノ酸３０〜１１０に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、リガンド結合性ポケットにおいて１、２、５、１０または１５個以下の保存的アミノ酸変化を含むポリペプチドを含む。  
【００９９】
「ベータグリカンポリペプチド」という用語は、任意の天然に存在するベータグリカンタンパク質（ＴＧＦＢＲ３、またはその非ヒトオルソログの１つによってコードされる）、および有用な活性を維持した任意のこれらのバリアント（変異体、断片、融合体およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを含む。
【０１００】
ヒトベータグリカンのアイソフォームＡの前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３２３４．２）は以下の通りである。
【化１４】
2021526835.tif 000016
【０１０１】
シグナルペプチドは一重下線によって示され、細胞外ドメインは太字フォントで示され、膜貫通ドメインは点線下線によって示される。このアイソフォームは、二重下線によって上記で示された単一のアラニンの挿入によって、ベータグリカンのアイソフォームＢと異なる。
【０１０２】
プロセシングされたベータグリカンのアイソフォームＡのポリペプチド配列は以下の通りである。
【化１５】
2021526835.tif 000017
【０１０３】
ヒトベータグリカンのアイソフォームＡのプロセシングされていない前駆体タンパク質をコードする核酸配列を下記に示し（配列番号１２２）、これは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００３２４３．４のヌクレオチド５１６〜３０６８に対応する。シグナル配列は実線下線によって示され、膜貫通領域は点線下線によって示される。
【化１６】
2021526835.tif 000018
【０１０４】
プロセシングされたベータグリカンのアイソフォームＡの細胞外ドメインをコードする核酸配列を下記に示す（配列番号１２３）。
【化１７−１】
2021526835.tif 000019
【化１７−２】
2021526835.tif 000020
【０１０５】
ヒトベータグリカンのアイソフォームＢの前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１８２６１２．１）は以下の通りである。
【化１８】
2021526835.tif 000021
【０１０６】
シグナルペプチドは一重下線によって示され、細胞外ドメインは太字フォントで示され、膜貫通ドメインは点線下線によって示される。
【０１０７】
プロセシングされたベータグリカンのアイソフォームＢのポリペプチド配列は以下の通りである。
【化１９】
2021526835.tif 000022
【０１０８】
ヒトベータグリカンのアイソフォームＢのプロセシングされていない前駆体タンパク質をコードする核酸配列を下記に示し（配列番号１２６）、これは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１９５６８３．１のヌクレオチド５１６〜３０６５に対応する。シグナル配列は実線下線によって示され、膜貫通領域は点線下線によって示される。
【化２０−１】
2021526835.tif 000023
【化２０−２】
2021526835.tif 000024
【０１０９】
プロセシングされたベータグリカンのアイソフォームＢの細胞外ドメインをコードする核酸配列を下記に示す（配列番号１２７）。
【化２１−１】
2021526835.tif 000025
【化２１−２】
2021526835.tif 000026
【０１１０】
ある特定の実施形態では、本開示は、断片、機能的バリアント、およびこれらの改変形態を含む、少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドを含む二機能性または三機能性融合タンパク質に関する。好ましくは、本開示の発明による使用のためのベータグリカンポリペプチドは可溶性である（例えば、ベータグリカンの細胞外リガンド結合ドメイン）。他の好ましい実施形態では、本開示の発明による使用のためのベータグリカンポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦβアイソフォーム（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、および／またはＴＧＦβ３）のリガンドと結合し、およびこれらの活性（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害する。一部の実施形態では、本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質は、配列番号１２１または１２５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質は、配列番号１２１のアミノ酸２１〜２８のいずれか１つで開始し、配列番号１２１のアミノ酸３８１〜７８７のいずれか１つで終了するポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１２１のアミノ酸２１〜３８１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質は、配列番号１２１のアミノ酸２１〜７８７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質は、配列番号１２１のアミノ酸２８〜３８１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質は、配列番号１２１のアミノ酸２８〜７８７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質は、配列番号１２１のアミノ酸２１〜７８１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカ���ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質は、配列番号１２１のアミノ酸２８〜７８１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質は、配列番号１２５のアミノ酸２１〜２８のいずれか１つで開始し、配列番号１２５のアミノ酸３８０〜７８６のいずれか１つで終了するポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質は、配列番号１２５のアミノ酸２１〜３８０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質は、配列番号１２５のアミノ酸２１〜７８６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質は、配列番号１２５のアミノ酸２８〜３８０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質は、配列番号１２５のアミノ酸２８〜７８６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質は、配列番号１２５のアミノ酸２１〜７８０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質は、配列番号１２５のアミノ酸２８〜７８０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのベータグリカンポリペプチドを含む。  
【０１１１】
上記に記載するように、本開示は、天然に存在するＴβＲＩＩポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチドと特定の程度の配列同一性または類似性を共有する、ＴβＲＩＩポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチドを提供する。２つのアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列は、最適な比較の目的のためにアラインメントされる（例えば、ギャップは、最適なアラインメントのために第１および第２のアミノ酸もしくは核酸配列の１つまたは両方に導入することができ、非相同配列は、比較の目的のために無視することができる）。次いで、対応するアミノ酸位置でのアミノ酸残基が比較される。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置で同じアミノ酸残基によって占められる場合、その結果、分子はその位置で同一である（本明細書で使用される場合、アミノ酸「同一性」はアミノ酸「相同性」と等価である）。２つの配列の間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【０１１２】
配列の比較、ならびに２つの配列の間の同一性および類似性パーセントの決定は、数学的アルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．，  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．，  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  １，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．，  ｅｄｓ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  １９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．，  Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１）を使用して達成することができる。
【０１１３】
一実施形態では、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）におけるＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （４８）：４４４−４５３  （１９７０））のアルゴリズムを使用して決定される。詳細な実施形態では、以下のパラメーターがＧＡＰプログラムにおいて使用される：Ｂｌｏｓｕｍ  ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、ならびにギャップの重みが１６、１４、１２、１０、８、６または４、および長さの重みが１、２、３、４、５または６。さらに別の実施形態では、２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２（１）：３８７  （１９８４））（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）におけるＧＡＰプログラムを使用して決定される。例示的なパラメーターは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、ならびにギャップの重みが４０、５０、６０、７０または８０、および長さの重みが１、２、３、４、５または６を使用することを含む。他に規定のない限り、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２行列、ＧＡＰの重みが１０および長さの重みが３を使用するＧＡＰプログラムを使用して決定されるべきであり、このようなアルゴリズムが所望の同一性パーセントをコンピュータで計算できない場合、本明細書に開示される好適な代替を選択すべきである。
【０１１４】
別の実施形態では、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０の重みの残余テーブル、ギャップ長さペナルティが１２およびギャップペナルティが４を使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている、Ｅ．  ＭｙｅｒｓおよびＷ．  Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，  ４：１１−１７  （１９８９））のアルゴリズムを使用して決定される。
【０１１５】
２つのアミノ酸配列の間の最良の全体的なアラインメントを決定するための別の実施形態は、Ｂｒｕｔｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｏｍｐ．  Ａｐｐ．  Ｂｉｏｓｃｉ．，  ６：２３７−２４５  （１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定することができる。配列アラインメントにおいて、クエリーおよび対象の配列は両方ともアミノ酸配列である。前記網羅的配列アラインメントの結果は、同一性パーセントに関して提示される。一実施形態では、アミノ酸配列同一性は、Ｂｒｕｔｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｏｍｐ．  Ａｐｐ．  Ｂｉｏｓｃｉ．，  ６：２３７−２４５  （１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して行なわれる。詳細な実施形態では、アミノ酸アラインメントの同一性および類似性パーセントを計算するために用いられるパラメーターは、行列＝ＰＡＭ  １５０、ｋ−タプル＝２、ミスマッチペナルティ＝１、連結ペナルティ＝２０、ランダム化群の長さ＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティ＝５およびギャップサイズペナルティ＝０．０５を含む。
【０１１６】
本開示のポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）は、Ｎ末端で様々なリーダー配列のいずれかを追加で含んでいてもよい。このような配列は、ペプチドが、真核系において発現し、分泌経路を標的にすることを可能にするであろう。例えば、Ｅｒｎｓｔら、米国特許第５，０８２，７８３号（１９９２年）を参照されたい。あるいは、天然のシグナル配列（例えば、天然のＴβＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡまたはベータグリカンのシグナル配列）は、細胞からの放出を生じさせるために使用されてもよい。可能なリーダー配列は、天然のリーダー、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）およびミツバチのメリチン（それぞれ、配列番号２２〜２４）を含む。ＴＰＡリーダー配列が組み込まれる融合タンパク質の例としては、配列番号９、１１、１３、１５、１７、８２、８５、８８、９１および１１０が挙げられる。シグナルペプチドのプロセシングは、他の変数の中で、選択されるリーダー配列、使用される細胞型および培養条件に応じて変化し得、したがって、プロセシングされたポリペプチドのための実際のＮ末端開始部位は、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかの方向で、１、２、３、４または５アミノ酸までシフトし得る。ＴβＲＩＩの長いアイソフォームに基づく対応するバリアントが、挿入に隣接するＣ末端位で保存的なＶａｌ−Ｉｌｅ置換とともに２５アミノ酸挿入を含むことは当業者によって理解される。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、本開示は、ポリペプチドのグリコシル化を変更するように、ポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ベータグリカンポリペプチド）の特定の変異を企図する。このような変異は、Ｏ連結もしくはＮ連結グリコシル化部位などの１つまたは複数のグリコシル化部位を導入あるいは取り除くように、選択され得る。アスパラギン連結グリコシル化認識部位は、一般に、適切な細胞内グリコシル化酵素によって特異的に認識される、トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−トレオニン（または、アスパラギン−Ｘ−セリン）（ここで、「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を含む。変更はまた、（Ｏ連結グリコシル化部位のための）野生型ポリペプチドの配列への１つもしくは複数のセリンまたはトレオニン残基の付加あるいは置換によって行なわれてもよい。グリコシル化認識部位の１番目もしくは３番目のアミノ酸位置の１つまたは両方での種々のアミノ酸置換または欠失（および／または２番目の位置でのアミノ酸欠失）は、改変されたトリペプチド配列で非グリコシル化をもたらす。ポリペプチドにおける糖質部分の数を増加させる別の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的または酵素的カップリングによる。使用されるカップリングの様式に応じて、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基；（ｄ）セリン、トレオニンもしくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基；（ｅ）フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンのものなどの芳香族残基；または（ｆ）グルタミンのアミド基に付着し得る。これらの方法は、参照により本明細書に組み込まれる、１９８７年９月１１日に公開された国際公開第８７／０５３３０号およびＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ  （１９８１）  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ｐｐ．  ２５９−３０６に記載されている。ポリペプチドに存在する１つまたは複数の糖質部分の除去は、化学的および／または酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化は、例えば、ポリペプチドのトリフルオロメタンスルホン酸化合物または等価な化合物への曝露を含み得る。この処理は、連結されている糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたはすべての糖の切断をもたらすが、アミノ酸配列は無傷なままである。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２５９：５２およびＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８１）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １１８：１３１によってさらに記載されている。ポリペプチドにおける糖質部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １３８：３５０による記載の種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成することができる。哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞および植物細胞が、すべて、ペプチドのアミノ酸配列に影響を与え得る異なるグリコシル化パターンを導入し得るので、ポリペプチドの配列は、必��により、使用される発現系の種類に応じて調整されてもよい。一般に、ヒトにおける使用のためのポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）は、適切なグリコシル化を提供する哺乳動物細胞系、例えば、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞系で発現するが、他の哺乳動物発現細胞系、操作されたグリコシル化酵素を有する酵母細胞系および昆虫細胞も同様に有用であると予想される。
【０１１８】
本開示は、変異体、特に、ポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）のコンビナトリアル変異体のセット、ならびに切断型変異体を作製する方法をさらに企図し、コンビナトリアル変異体のプールは、機能的バリアント配列を特定するために特に有用である。このようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、アゴニストもしくはアンタゴニストのいずれかとして作用し得るか、あるいはすべて一緒になって新規の活性を持つ、ポリペプチドバリアントを作製することであり得る。種々のスクリーニングアッセイを下記に提供し、このようなアッセイは、バリアントを評価するために使用され得る。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、ベータグリカンおよび／またはＴβＲＩＩポリペプチドバリアントを含む二機能性または三機能性融合タンパク質は、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、ベータグリカンまたはＴβＲＩＩリガンドに結合する能力、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、ベータグリカンまたはＴβＲＩＩリガンドのＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、ベータグリカンまたはＴβＲＩＩポリペプチドへの結合を予防する能力、またはＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、ベータグリカンまたはＴβＲＩＩリガンドによって引き起こされるシグナル伝達を干渉する能力についてスクリーニングされてもよい。
【０１１９】
天然に存在するポリペプチドの細胞外ドメインを含むポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）に対する選択性または一般に増加した効力を有するコンビナトリアル誘導バリアントを作製することができる。同様に、変異誘発は、対応する野生型ポリペプチドと劇的に異なる血清半減期を有するバリアントを生じさせることができる。例えば、変更されたタンパク質は、天然ＴβＲＩＩポリペプチドの破壊、またはそうでなければ除外または不活性化をもたらす、タンパク質分解または他のプロセスに対して、より安定またはより不安定のいずれかにすることができる。このようなバリアント、およびこれらをコードする遺伝子は、ＴβＲＩＩポリペプチドの半減期を調節することによって、ＴβＲＩＩポリペプチドのレベルを変更するために利用することができる。例えば、短い半減期は、より一時的な生物学的効果を生じさせることができ、患者内での組換えポリペプチドのレベルのより厳密な制御を可能にし得る。Ｆｃ融合タンパク質中では、変異を、リンカー（もしあれば）および／またはＦｃ部分中に生じさせて、タンパク質の半減期を変更することができる。
【０１２０】
コンビナトリアルライブラリーは、可能性があるポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）配列の少なくとも一部分をそれぞれ含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリーの手段で生成してもよい。例えば、可能性があるポリペプチドのヌクレオチド配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるいはより大きな融合タンパク質（例えば、ファージディスプレイ用）のセットとして、発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、遺伝子配列に酵素的にライゲートすることができる。
【０１２１】
可能性があるポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）バリアントのライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から作製することができる、多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成機で行なうことができ、次いで、合成遺伝子を発現用の適切なベクターにライゲートすることができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野で周知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，  ＳＡ  （１９８３）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；  Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８１）  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，  Ｐｒｏｃ．  ３ｒｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ｅｄ．  ＡＧ  Ｗａｌｔｏｎ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ｐｐ２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １１：４７７を参照されたい）。このような技術は、他のタンパク質の指向進化において用いられている（例えば、Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：  ４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：  ６３７８−６３８２；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第５，１９８，３４６号および米国特許第５，０９６，８１５号を参照されたい）。
【０１２２】
あるいは、他の形態の変異誘発を利用して、コンビナトリアルライブラリーを作製することができる。例えば、ポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）バリアントは、例えば、アラニンスキャニング変異誘発など（Ｒｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１５６５−１５７２；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：３０９５−３０９９；Ｂａｌｉｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｇｅｎｅ  １３７：１０９−１１８；Ｇｒｏｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１８：５９７−６０１；Ｎａｇａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８：２８８８−２８９２；Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３８；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）を使用してスクリーニングすることにより；リンカースキャニング変異誘発（Ｇｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９３：６５３−６６０；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １２：２６４４−２６５２；ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３１６）により；飽和変異誘発（Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：６１３）により；ＰＣＲ変異誘発（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １：１１−１９）により；または化学的変異誘発等を含むランダム変異誘発（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ；およびＧｒｅｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７：３２−３４）により、作製およびライブラリーから単離することができる。リンカースキャニング変異誘発は、特に、コンビナトリアル条件では、ポリペプチドの切断（生体活性）型を特定するための魅力的な方法である。
【０１２３】
広範囲の技術が、点変異および切断により作られたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするために、さらに言えば、ある特定の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、当技術分野で公知である。このような技術は、一般に、ポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはベータグリカンポリペプチド）のコンビナトリアル変異誘発により作製される遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く使用されている技術は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能発現ベクターにクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、および所望の活性の検出が、生成物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を促進する条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。好ましいアッセイとしては、リガンド結合アッセイおよびリガンド媒介細胞シグナル伝達アッセイが挙げられる。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、本開示のポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ベータグリカンポリペプチド）は、天然ポリペプチド中に天然に存在する任意のものに加えて、翻訳後修飾をさらに含んでいてもよい。このような修飾としては、限定されるものではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ペグ化（ポリエチレングリコール）およびアシル化が挙げられる。結果として、修飾されたポリペプチドは、ポリエチレングリコール、脂質、モノサッカリドまたはポリサッカリド、およびホスフェートなどの非アミノ酸要素を含有し得る。ポリペプチドの機能性に対するこのような非アミノ酸要素の効果は、他のポリペプチドバリアントについて、本明細書に記載するようにして試験され得る。ポリペプチドが、ポリペプチドの新生型を切断することによって細胞中で生成される場合、翻訳後プロセシングも、タンパク質の適正なフォールディングおよび／または機能のために重要であり得る。異なる細胞（ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ−２９３など）は、このような翻訳後の活性に関する特異的な細胞内の仕組みおよび特徴的機構を有し、ポリペプチドの適正な修飾およびプロセシングを確実にするために選択され得る。
【０１２５】
ある特定の態様では、本開示は、融合タンパク質を提供し、一部の実施形態では、第１の部分は、リンカーによって異種部分（例えば、Ｆｃ部分）と接続される。一部の実施形態では、リンカーはグリシンおよびセリンリッチリンカーである。他の中性に近いアミノ酸、例えば、限定されるものではないが、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、ＰｒｏおよびＡｌａもリンカー配列中で使用され得る。一部の実施形態では、リンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒを含有するアミノ酸配列の様々な順列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、１０アミノ酸長より大きい。さらなる実施形態では、リンカーは、少なくとも１２、１５、２０、２１、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、リンカーは、４０、３５、３０、２５、２２または２０アミノ酸未満である。一部の実施形態では、リンカーは、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２１、１０〜１５、１０、１５〜２５、１７〜２２、２０または２１アミノ酸長である。一部の好ましい実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（ＧＧＧＧＳ）（配列番号１９）、またはその反復の（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ≧２）を含む。特定の実施形態では、ｎ≧３またはｎ＝３〜１０である。本出願は、（ＧＧＧＧＳ）４リンカーによって一緒に融合したＴβＲＩＩ部分および異種部分を含むタンパク質が、ｎ＜４の場合のＴβＲＩＩ融合タンパク質と比較して、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に対してより強い親和性で会合するという驚くべき知見を教示する。このため、好ましい実施形態では、ｎ≧４またはｎ＝４〜１０である。本出願は、ｎ＞４である（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーを含むタンパク質が、（ＧＧＧＧＳ）４リンカーを有するタンパク質と同様の阻害特性を有していたことも教示する。このため、一部の実施形態では、ｎは、（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーにおいて、４を超えない。一部の実施形態では、ｎ＝４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜８、５〜７または５〜６である。一部の実施形態では、ｎ＝３、４、５、６または７である。特定の実施形態では、ｎ＝４である。一部の実施形態では、（ＧＧＧＧＳ）ｎ配列を含むリンカーは、Ｎ末端トレオニンも含む。一部の実施形態では、リンカーは、以下のいずれか１つである。
【化２２−１】
2021526835.tif 000027
【０１２６】
一部の実施形態では、リンカーは、ＴＧＧＧＰＫＳＣＤＫ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｎ末端トレオニンが欠如した、配列番号２１、４〜７、２５〜２６または４０のいずれか１つである。一部の実施形態では、リンカーは、グリシンリッチ（例えば、２〜１０、２〜５、２〜４、２〜３個のグリシン残基）であってもよく、例えば、トレオニン／セリンおよびグリシンの単一の配列またはトレオニン／セリンおよび／もしくはグリシンの繰り返し配列、例えば、ＧＧＧ（配列番号６３）、ＧＧＧＧ（配列番号６４）、ＴＧＧＧＧ（配列番号６５）、ＳＧＧＧＧ（配列番号６６）、またはＳＧＧＧ（配列番号６７）シングレット、またはリピートを含有してもよい。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号２６または４０のアミノ酸配列を含まない。
【０１２７】
ある特定の態様では、本明細書に開示のポリペプチドの機能的バリアントまたは改変形態は、ポリペプチド（例えば、アクチビンアンタゴニストポリペプチド、ＴＧＦβアンタゴニストポリペプチド、または免疫チェックポイントアンタゴニストポリペプチド）の少なくとも一部分および１つまたは複数の異種部分を有する融合タンパク質を含む。このような異種部分の周知の例としては、限定されるものではないが、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）またはヒト血清アルブミンが挙げられる。異種部分は、所望の特性を付与するように選択され得る。例えば、一部の異種部分は、親和性クロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離のために特に有用である。親和性精製の目的のためには、グルタチオン結合樹脂、アミラーゼ結合樹脂、およびニッケルまたはコバルト結合樹脂などの、親和性クロマトグラフィー用の関連するマトリックスが使用される。このようなマトリックスの多くは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＧＳＴ精製システムおよび（ＨＩＳ６）融合パートナーを用いる有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）などの「キット」の形態で入手可能である。別の例としては、異種部分は、ポリペプチド（例えば、アクチビンアンタゴニストポリペプチド、ＴＧＦβアンタゴニストポリペプチド、または免疫チェックポイントアンタゴニストポリペプチド）の検出を容易にするために選択され得る。このような検出ドメインの例としては、様々な蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、および特異的抗体が入手可能である通常は短いペプチド配列である「エピトープタグ」が挙げられる。特異的モノクローナル抗体が容易に入手可能である周知のエピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）およびｃ−ｍｙｃタグが挙げられる。一部の場合では、異種部分は、Ｘａ因子またはトロンビンに対するものなどの、プロテアーゼ切断部位を有し、これは、関連するプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それによって融合タンパク質から組換えタンパク質を自由にすることを可能にする。次いで、自由になったタンパク質は、その後のクロマトグラフィー分離によって、異種部分から単離することができる。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のポリペプチド（例えば、アクチビンアンタゴニストポリペプチド、ＴＧＦβアンタゴニストポリペプチド、または免疫チェックポイントアンタゴニストポリペプチド）は、ポリペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏで安定化するドメイン（「安定剤」ドメイン）と融合される。「安定化する」とは、これが破壊の減少、腎臓によるクリアランスの減少、または他の薬物動態効果によるものかに関わらず、血清半減期を増加させるものを意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合は、広範囲のタンパク質における望ましい薬物動態学的特性を付与することが公知である。同様に、ヒト血清アルブミンとの融合は、望ましい特性を付与することができる。選択され得る異種部分の他の種類としては、多量体化（例えば、二量体化、四量体化）ド��インおよび機能的ドメインが挙げられる。
【０１２８】
融合タンパク質の異なる要素は、所望の機能性と合致する任意の様式で配置されてもよいことが理解される。例えば、アクチビンアンタゴニストポリペプチド、ＴＧＦβアンタゴニストポリペプチド、または免疫チェックポイントアンタゴニストポリペプチドは、異種ドメインに対してＣ末端に置かれてもよく、あるいは、異種ドメインは、アクチビンアンタゴニストポリペプチド、ＴＧＦβアンタゴニストポリペプチド、または免疫チェックポイントアンタゴニストポリペプチドに対してＣ末端に置かれてもよい。アクチビンアンタゴニストポリペプチド、ＴＧＦβアンタゴニストポリペプチド、または免疫チェックポイントアンタゴニストポリペプチドおよび異種ドメインは、融合タンパク質中で隣接している必要はなく、追加のドメインまたはアミノ酸配列が、いずれかのドメインのＣ末端もしくはＮ末端に、またはドメイン間に含まれていてもよい。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリンＦｃドメイン」または単に「Ｆｃ」という用語は、免疫グロブリン鎖の定常領域のカルボキシル末端部分、好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常領域またはこれらの部分を意味すると理解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または５）２つまたはそれよりも多くのドメインおよび免疫グロブリンヒンジ領域の組合せを含んでいてもよい。好ましい実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、好ましくは、ＣＨ１ドメインが欠如している。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域である。
【０１３０】
一実施形態では、重鎖定常領域の由来となる免疫グロブリンのクラスは、ＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３または４）である。
【０１３１】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（Ｇ１Ｆｃ）のために使用され得る天然アミノ酸配列の例を下記に示す（配列番号５８）。点線下線はヒンジ領域を示し、実線下線は天然に存在するバリアントを有する位置を示す。一部分では、本開示は、配列番号５８と７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなるポリペプチドを提供する。Ｇ１Ｆｃにおいて天然に存在するバリアントは、配列番号５８（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５７を参照されたい）において使用される番号付け体系によるＥ１３４ＤおよびＭ１３６Ｌを含むであろう。
【化２２−２】
2021526835.tif 000028
【０１３２】
必要に応じて、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、Ａｓｐ−２６５、リジン３２２およびＡｓｎ−４３４などの残基で１つまたは複数の変異を有する。ある特定の場合では、これらの変異の１つまたは複数（例えば、Ａｓｐ−２６５変異）を有する変異体ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインに対して、Ｆｃγ受容体への結合能力が低減されている。他の場合では、これらの変異の１つまたは複数（例えば、Ａｓｎ−４３４変異）を有する変異体Ｆｃドメインは、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインに対して、ＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）への結合能力が増加している。
【０１３３】
ヒトＩｇＧ２のＦｃ部分（Ｇ２Ｆｃ）のために使用され得る天然アミノ酸配列の例を下記に示す（配列番号５９）。点線下線はヒンジ領域を示し、二重下線は、配列中で矛盾するデータベースが存在する位置を示す（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１８５９による）。一部分では、本開示は、配列番号５９と７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなるポリペプチドを提供する。
【化２３】
2021526835.tif 000029
【０１３４】
ヒトＩｇＧ３のＦｃ部分（Ｇ３Ｆｃ）のために使用され得るアミノ酸配列の２つの例を下記に示す。Ｇ３Ｆｃにおけるヒンジ領域は、他のＦｃ鎖の最大で４倍程度の長さであり得、類似の１７残基セグメントに先行する３つの同一の１５残基セグメントを含有する。下記に示す第１のＧ３Ｆｃ配列（配列番号６０）は、単一の１５残基セグメントからなる短いヒンジ領域を含有するが、第２のＧ３Ｆｃ配列（配列番号６１）は全長ヒンジ領域を含有する。それぞれの場合で、点線下線はヒンジ領域を示し、実線下線は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１８５９による天然に存在するバリアントを有する位置を示す。一部分では、本開示は、配列番号６０または６１と７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなるポリペプチドを提供する。
【化２４−１】
2021526835.tif 000030
【化２４−２】
2021526835.tif 000031
【０１３５】
Ｇ３Ｆｃにおける天然に存在するバリアント（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８６０を参照されたい）は、配列番号６０において使用される番号付け体系に変換される場合、Ｅ６８Ｑ、Ｐ７６Ｌ、Ｅ７９Ｑ、Ｙ８１Ｆ、Ｄ９７Ｎ、Ｎ１００Ｄ、Ｔ１２４Ａ、Ｓ１６９Ｎ、Ｓ１６９ｄｅｌ、Ｆ２２１Ｙを含み、本開示は、これらの１つまたは複数のバリエーションを含有するＧ３Ｆｃドメインを含む融合タンパク質を提供する。加えて、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ３遺伝子（ＩＧＨＧ３）は、異なるヒンジの長さによって特徴付けられる構造的多形を示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５９を参照されたい）。詳細には、バリアントＷＩＳは、Ｖ領域の大部分およびＣＨ１領域のすべてが欠如している。これは、ヒンジ領域中に通常存在する１１個に加えて、７位に余分な鎖間ジスルフィド結合を有する。バリアントＺＵＣは、大部分のＶ領域、ＣＨ１領域のすべて、およびヒンジの一部分が欠如する。バリアントＯＭＭは、対立遺伝子型または別のガンマ鎖サブクラスを表わし得る。本開示は、これらのバリアントの１つまたは複数を含有するＧ３Ｆｃドメインを含む追加の融合タンパク質を提供する。
【０１３６】
ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分（Ｇ４Ｆｃ）のために使用され得る天然アミノ酸配列の例を下記に示す（配列番号６２）。点線下線はヒンジ領域を示す。一部分では、本開示は、配列番号６２と７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなるポリペプチドを提供する。
【化２５】
2021526835.tif 000032
【０１３７】
Ｆｃドメイン中の種々の遺伝子操作された変異は、Ｇ１Ｆｃ配列（配列番号５８）に関して本明細書において提示され、Ｇ２Ｆｃ、Ｇ３ＦｃおよびＧ４Ｆｃ中の類似の変異は、図６におけるＧ１Ｆｃとのそれらのアラインメントから誘導することができる。不均一なヒンジ長に起因して、アイソタイプアラインメント（図６）に基づく類似のＦｃの位置は、配列番号５８、５９、６０、６１および６２中で異なるアミノ酸数を持つ。ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる免疫グロブリン配列（例えば、配列番号５８、５９、６０、６１および６２）中の所与のアミノ酸位置は、番号付けが、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースにおけるように全ＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる）を包含する場合に、同じ位置とは異なる数字により特定されることも明らかであり得る。
【０１３８】
免疫グロブリンの他のクラスであるＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）およびＩｇＭ（Ｉｇμ）を使用してもよい。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択は、米国特許第５，５４１，０８７号および米国特許第５，７２６，０４４号において詳細に議論されている。特定の結果を達成するためのある特定の免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択は、当技術分野における技量のレベル内であると考えられる。免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡ構築物の部分は、少なくともヒンジドメインの部分を含み、好ましくは、ＦｃガンマのＣＨ３ドメイン、またはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはＩｇＭのいずれか中の相同ドメインの少なくとも一部分を含む。
【０１３９】
さらにまた、免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸の置換または欠失が、本明細書に開示される方法および組成物の実施において有用であり得ることが企図される。一例は、ＣＨ２領域の上部にアミノ酸置換を導入して、Ｆｃ受容体に対する親和性が低減されたＦｃバリアントを作製することあろう（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５９：３６１３）。
【０１４０】
例えば、本出願は、遺伝子操作されたＦｃ領域またはバリアントＦｃ領域を有するＦｃ融合タンパク質をさらに提供する。このような抗体およびＦｃ融合タンパク質は、例えば、抗原依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのエフェクター機能の調節において有用であり得る。加えて、改変は、抗体およびＦｃ融合タンパク質の安定性を改善し得る。抗体およびＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列バリアントは、適切なヌクレオチド変化をＤＮＡに導入することによって、またはペプチド合成によって、調製される。このようなバリアントとしては、例えば、本明細書に開示される抗体およびＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列からの欠失、ならびに／またはこのアミノ酸配列への挿入、ならびに／またはこのアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。欠失、挿入および置換の任意の組合せは、最終構築物が所望の特性を持つならば、最終構築物に達するために行なわれる。グリコシル化部位の数または位置の変化などのアミノ酸の変化はまた、抗体およびＦｃ融合タンパク質の翻訳後プロセスを変更し得る。
【０１４１】
低減されたエフェクター機能を有する抗体およびＦｃ融合タンパク質は、限定されないが、Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（国際公開第９４／２８０２７号および国際公開第９８／４７５３１号を参照されたい；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００；  １６−２６も参照されたい）に記載のＡｌａ−Ａｌａ変異を含む、アミノ酸配列における変化を導入することによって生成され得る。したがって、ある特定の実施形態では、Ａｌａ−Ａｌａ変異を含む定常領域内の変異を有する本開示のＦｃ融合タンパク質は、エフェクター機能を低減または無効化するために使用され得る。これらの実施形態によれば、抗体およびＦｃ融合タンパク質は、２３４位でのアラニンへの変異、もしくは２３５位でのアラニンへの変異、またはこれらの組合せを含んでいてもよい。一実施形態では、抗体またはＦｃ融合タンパク質は、ＩｇＧ４フレームワークを含み、Ａｌａ−Ａｌａ変異は、２３４位でのフェニルアラニンからアラニンへの変異、および／または２３５位でのロイシンからアラニンへの変異を記載する。別の実施形態では、抗体またはＦｃ融合タンパク質は、ＩｇＧ１フレームワークを含み、Ａｌａ−Ａｌａ変異は、２３４位でのロイシンからアラニンへの変異、および／または２３５位でのロイシンからアラニンへの変異を記載する。抗体またはＦｃ融合タンパク質は、代替で、または追加で、ＣＨ２ドメイン中の点変異Ｋ３２２Ａを含む他の変異を保有していてもよい（Ｈｅｚａｒｅｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７５：  １２１６１−８）。
【０１４２】
特定の実施形態では、抗体またはＦｃ融合タンパク質は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増強または阻害するかのいずれかのために改変されていてもよい。調節されたＣＤＣ活性は、Ｆｃ領域中の１つもしくは複数のアミノ酸の置換、挿入または欠失を導入することによって、達成され得る（例えば、米国特許第６，１９４，５５１号を参照されたい）。あるいは、または加えて、システイン残基が、Ｆｃ領域に導入されていてもよく、それによって、この領域において鎖間のジスルフィド結合の形成を可能にする。このようにして作製されたホモ二量体抗体は、改善もしくは低減された内部移行能、および／または増加もしくは減少した補体媒介細胞死滅を有し得る。Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １７６：１１９１−１１９５  （１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，  Ｂ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：２９１８−２９２２  （１９９２）、国際公開第９９／５１６４２号、Ｄｕｎｃａｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：  ７３８−４０  （１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；ならびに国際公開第９４／２９３５１号を参照されたい。
【０１４３】
ある特定の好ましい実施形態では、本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質は、アクチビンアンタゴニストポリペプチド、ＴＧＦβアンタゴニストポリペプチド、または免疫チェックポイントアンタゴニストポリペプチドから選択される少なくとも２つまたはそれより多くのポリペプチドドメインを含むヘテロ多量体であり、２つまたはそれより多くのポリペプチドドメインは、共有結合的にまたは非共有結合的に会合している。一部の実施形態では、かかる二機能性または三機能性融合タンパク質ヘテロ多量体は、ヘテロ二量体の複合体であるが、より高次のヘテロ多量体の複合体もまた含まれ、これらに限定されないが、例えば、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体およびさらなるオリゴマー構造である。一部の実施形態では、本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質は、少なくとも１つの多量体化ドメインを含む。本明細書に開示される場合、用語「多量体化ドメイン」は、少なくとも第１のポリペプチドと少なくとも第２のポリペプチドとの間の共有結合的または非共有結合的な相互作用を促進するアミノ酸またはアミノ酸の配列を指す。本明細書に開示のポリペプチドは、多量体化ドメインに共有結合的または非共有結合的に連結し得る。好ましくは、多量体化ドメインは、第１のポリペプチドと、第２のポリペプチドとの間の相互作用を促進して、ヘテロ多量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）を促進し、任意選択でホモ多量体形成（例えば、ホモ二量体形成）を妨げるかまたはそれ以外の様式で不利にさせ、それによって所望のヘテロ多量体の収率を上昇させる。
【０１４４】
当該分野で公知の多くの方法を使用して、タンパク質ヘテロ多量体を生成することができる。例えば、天然には生じないジスルフィド結合は、フリーのチオールが第２のポリペプチド上の別のフリーのチオール含有残基と相互作用して、ジスルフィド結合が第１のポリペプチドと、第２のポリペプチドとの間で形成されるように、第１のポリペプチド上で、天然に生じるアミノ酸をシステインなどのフリーのチオール含有残基で置きかえることにより構築することができる。ヘテロ多量体の形成を促進する相互作用の追加の例は、Ｋｊａｅｒｇａａｒｄら、ＷＯ２００７１４７９０１などに記載されているイオン性相互作用；Ｋａｎｎａｎら、Ｕ．Ｓ．８，５９２，５６２などに記載されている静電ステアリング効果；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｕ．Ｓ．２０１２０３０２７３７などに記載されているコイルドコイル相互作用；ＰａｃｋおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、（１９９２年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１巻：１５７９〜１５８４頁などに記載されているロイシンジッパー；およびＰａｃｋら、（１９９３年）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１巻：１２７１〜１２７７頁などに記載されているヘリックスターンヘリックスモチーフを含むが、これらに限定されない。多様なセグメントの連結は、例えば、化学的架橋、ペプチドリンカー、ジスルフィド架橋などによる共有結合、またはアビジン−ビオチンなどによる親和性相互作用、またはロイシンジッパー技術を介して得ることができる。
【０１４５】
相互作用ペアの第１および第２のメンバーは非対称ペアであってもよく、これは、ペアのメンバーが、自己会合よりも優先的に互いに会合することを意味する。したがって、非対称相互作用ペアの第１および第２のメンバーは会合して、ヘテロ二量体の複合体を形成することができる。代替的に、相互作用ペア非誘導型であってもよく、これは、アのメンバーが、実質的な優先性なく互いに会合することも自己会合することもでき、そのため、同じまたは異なるアミノ酸配列を有し得ることを意味する。したがって、非誘導相互作用ペアの第１および第２のメンバーは会合して、ホモ二量体複合体またはヘテロ二量体の複合体を形成してもよい。任意選択で、相互作用ペアの第１のメンバー（例えば、非対称ペアまたは非誘導相互作用ペア）は、共有結合的に相互作用ペアの第２のメンバーに会合する。任意選択で、相互作用ペアの第１のメンバー（例えば、非対称ペアまたは非誘導相互作用ペア）は、非有結合的に相互作用ペアの第２のメンバーに会合する。
【０１４６】
単一細胞株からの非対称の免疫グロブリンに基づくタンパク質の大規模産生において生じる問題は、「鎖会合課題」として公知である。二重特異性抗体の産生において顕著に直面するように、鎖会合課題は、単一細胞株において異なる重鎖および／または軽鎖が産生される場合に、固有に生じる複数の組合せの中から所望の多重鎖タンパク質を効率的に産生するという難題に関係する［Ｋｌｅｉｎら（２０１２年）ｍＡｂｓ  ４巻：６５３〜６６３頁］。この問題は、同じ細胞内で２種の異なる重鎖および２種の異なる軽鎖が産生される場合に最も喫緊となり、この場合、１種のみが典型的に望まれるときに、総計１６通りの可能な鎖組合せ（これらのいくつかは同一であるが）が存在する。にもかかわらず、同じ原理が、２種の異なる（非対称）重鎖のみを取り込む所望の多重鎖融合タンパク質の収量縮小の原因である。
【０１４７】
単一細胞株においてＦｃ含有融合ポリペプチド鎖の所望のペア形成を増加させて、許容される収量で好ましい非対称融合タンパク質を産生する様々な方法が、当該分野で公知である［Ｋｌｅｉｎら（２０１２年）ｍＡｂｓ  ４巻：６５３〜６６３頁；およびＳｐｉｅｓｓら（２０１５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７（２Ａ）：９５−１０６］。Ｆｃ含有鎖の所望のペア形成を得るための方法として、電荷に基づくペア形成（静電ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ））、「ノブ・ホール型（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」立体ペア形成およびＳＥＥＤｂｏｄｙペア形成およびロイシンジッパーベースのペア形成が挙げられるがこれらに限定されない［Ｒｉｄｇｗａｙら（１９９６年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ９巻：６１７〜６２１頁；Ｍｅｒｃｈａｎｔら（１９９８年）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １６巻：６７７〜６８１頁；Ｄａｖｉｓら（２０１０年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２３巻：１９５〜２０２頁；Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎら（２０１０）；２８５：１９６３７−１９６４６；Ｗｒａｎｉｋら（２０１２）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８７：４３３３１−４３３３９；ＵＳ５９３２４４８；ＷＯ１９９３／０１１１６２；ＷＯ２００９／０８９００４およびＷＯ２０１１／０３４６０５］。本明細書において記載されるように、これらの方法を使用して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体複合体を生成することができる。
【０１４８】
例えば、特異的ポリペプチドの間の相互作用を促進し得る１つの手段は、Ａｒａｔｈｏｏｎら、Ｕ．Ｓ．７，１８３，０７６およびＣａｒｔｅｒら、Ｕ．Ｓ．５，７３１，１６８などにおいて記載されている、凸部対凹部（ノブ・ホール）（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ−ｉｎｔｏ−ｃａｖｉｔｙ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ））相補領域を操作することによる手段である。「凸部」は、第１のポリペプチド（例えば、第１の相互作用ペア）の界面に由来する小型のアミノ酸側鎖を、より大型の側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることにより構築する。任意選択で、大型のアミノ酸側鎖をより小型のアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチド（例えば、第２の相互作用ペア）の界面上に、凸部と同一または同様なサイズの相補的「凹部」を創出する。第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドの界面に位置および寸法が適切な凸部または凹部が存在する場合は、隣接する界面において、それぞれ、対応する凹部または凸部を操作することが必要とされるだけである。
【０１４９】
中性のｐＨ（７．０）では、アスパラギン酸およびグルタミン酸は、負に帯電し、リシン、アルギニン、およびヒスチジンは、正に帯電している。これらの帯電残基を使用して、ヘテロ二量体の形成を促進し、同時に、ホモ二量体の形成を妨げることができる。反対の電荷の間では、誘引性の相互作用が生じ、同じ電荷の間では、排斥性の相互作用が生じる。部分的に、本明細書で開示されるタンパク質複合体は、帯電界面残基の部位指向変異誘発を実行することにより、ヘテロ多量体の形成（例えば、ヘテロ二量体の形成）を促進するための誘引性の相互作用、および任意選択で、ホモ二量体の形成（例えば、ホモ二量体の形成）を妨げるための排斥性の相互作用を使用する。
【０１５０】
例えば、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインの界面は、ドメイン間相互作用に関与する４つの固有の電荷残基ペア：Ａｓｐ３５６−Ｌｙｓ４３９’、Ｇｌｕ３５７−Ｌｙｓ３７０’、Ｌｙｓ３９２−Ａｓｐ３９９’、およびＡｓｐ３９９−Ｌｙｓ４０９’［第２の鎖内の残基の番号付けは（’）で指し示している］を含む。ここで、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメイン内の残基を表示するのに使用される番号付けスキームは、ＫａｂａｔによるＥＵ番号付けスキームに準拠することに留意されたい。ＣＨ３ドメイン間相互作用に存在する２回転対称に起因して、構造内では、各固有の相互作用が２回現れる（例えば、Ａｓｐ３９９−Ｌｙｓ４０９’およびＬｙｓ４０９−Ａｓｐ３９９’）。野生型配列では、Ｋ４０９−Ｄ３９９’は、ヘテロ二量体の形成およびホモ二量体の形成のいずれにも好都合である。第１の鎖内の電荷極性を切り換える単一の変異（例えば、Ｋ４０９Ｅ；陽性電荷から、陰性電荷への切換え）は、第１の鎖のホモ二量体の形成に不都合な相互作用をもたらす。この不都合な相互作用は、同じ電荷間（陰性間；Ｋ４０９Ｅ−Ｄ３９９’およびＤ３９９−Ｋ４０９Ｅ’）で生じる排斥性の相互作用のために発生する。第２の鎖内の電荷極性を切り換える同様の変異（Ｄ３９９Ｋ’；陰性電荷から、陽性電荷への切換え）は、第２の鎖のホモ二量体の形成に不都合な相互作用（Ｋ４０９’−Ｄ３９９Ｋ’およびＤ３９９Ｋ−Ｋ４０９’）をもたらす。しかし、同時に、これらの２つの変異（Ｋ４０９ＥおよびＤ３９９Ｋ’）は、ヘテロ二量体の形成には好都合な相互作用（Ｋ４０９Ｅ−Ｄ３９９Ｋ’およびＤ３９９−Ｋ４０９’）をもたらす。
【０１５１】
ヘテロ二量体の形成およびホモ二量体の阻止における静電ステアリング効果は、追加の帯電残基の変異によりさらに増強することができ、これは、第２の鎖内の反対に帯電した残基とペア形成する場合もしない場合もあり、例えばＡｒｇ３５５およびＬｙｓ３６０が挙げられる。下記の表は、電荷を変化させる可能な変異であって、ヘテロ多量体の形成を増強するのに単独または組合せで使用し得る変異を列挙する。
【表１】
2021526835.tif 000033
【０１５２】
一部の実施形態では、相互作用が静電的に不都合となるように、本出願の融合タンパク質内のＣＨ３間の界面を構成する１つまたは複数の残基を、帯電アミノ酸で置き換える。例えば、界面内の正に帯電したアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、またはヒスチジン）を、負に帯電したアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置き換える。代替的に、または前出の置換と組み合わせて、界面内の負に帯電したアミノ酸を、正に帯電したアミノ酸で置き換える。ある特定の実施形態では、アミノ酸を、所望の電荷特徴を有する天然に生じないアミノ酸で置き換える。負に帯電した残基（ＡｓｐまたはＧｌｕ）をＨｉｓへと変異させることは、立体的問題を引き起こし得る側鎖体積の増大をもたらすことに留意されたい。さらに、Ｈｉｓのプロトンドナー形態およびプロトンアクセプター形態は、局在化環境に依存する。デザイン戦略とともにこれらの問題を考慮に入れるべきである。ヒトＩｇＧサブクラスおよびマウスＩｇＧサブクラスでは、界面残基が高度に保存されるため、本明細書で開示される静電ステアリング効果は、ヒトおよびマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に適用することができる。この戦略はまた、ＣＨ３ドメインの界面における非帯電残基の帯電残基への改変にも拡張することができる。
【０１５３】
部分的に、本開示は、電荷ペア形成（静電ステアリング）に基づいて相補的となるように操作されたＦｃ配列を使用した、非対称Ｆｃ含有ポリペプチド鎖の所望のペア形成を提供する。静電相補性を有するＦｃ配列のペアの一方は、任意選択のリンカーありまたはなしで、構築物の第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドに任意に融合して、ヘテロ多量体を生成することができる。この単鎖は、第１のＦｃと相補的なＦｃ配列と共に最適な細胞において共発現させて、所望の多重鎖構築物の生成に有利に働くことができる。静電ステアリングに基づくこの例において、配列番号６８［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｅ１３４Ｋ／Ｄ１７７Ｋ）］および配列番号６９［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｋ１７０Ｄ／Ｋ１８７Ｄ）］は、操作されたアミノ酸置換に二重の下線が引かれた相補的Ｆｃ配列の例であり、構築物の第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドは、配列番号６８または配列番号６９のいずれかに融合することができるが、これらの両方には融合できない。天然のｈＧ１Ｆｃ、天然のｈＧ２Ｆｃ、天然のｈＧ３Ｆｃおよび天然のｈＧ４Ｆｃの間の高度なアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃにおける対応する位置のアミノ酸置換（図６を参照）が、下記の相補的ｈＧ１Ｆｃペア（配列番号６８および６９）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃペアを生成するであろうと認めることができる。
【化２６】
2021526835.tif 000034
【０１５４】
部分的に、本開示は、立体相補性のために操作されたＦｃ配列を使用した、非対称Ｆｃ含有ポリペプチド鎖の所望のペア形成を提供する。部分的に、本開示は、立体相補性の例としてノブ・ホール型ペア形成を提供する。立体相補性を有するＦｃ配列のペアの一方は、任意選択のリンカーありまたはなしで、構築物の第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドに任意に融合して、ヘテロ多量体を生成することができる。この単鎖は、第１のＦｃと相補的なＦｃ配列と共に最適な細胞において共発現されて、所望の多重鎖構築物の生成に有利に働くことができる。ノブ・ホール型ペア形成に基づくこの例において、配列番号７０［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｔ１４４Ｙ）］および配列番号７１［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｙ１８５Ｔ）］は、操作されたアミノ酸置換に二重の下線が引かれた相補的Ｆｃ配列の例であり、構築物のＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号７０または配列番号７１のいずれかに融合することができるが、これらの両方には融合できない。天然のｈＧ１Ｆｃ、天然のｈＧ２Ｆｃ、天然のｈＧ３Ｆｃおよび天然のｈＧ４Ｆｃの間の高度なアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃにおける対応する位置のアミノ酸置換（図６を参照）が、下の相補的ｈＧ１Ｆｃペア（配列番号７０および７１）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃペアを生成するであろうと認めることができる。
【化２７】
2021526835.tif 000035
【０１５５】
操作されたジスルフィド結合と組み合わせたノブ・ホール型ペア形成に基づくＦｃ相補性の例は、配列番号７２［ｈＧ１Ｆｃ（Ｓ１３２Ｃ／Ｔ１４４Ｗ）］および配列番号７３［ｈＧ１Ｆｃ（Ｙ１２７Ｃ／Ｔ１４４Ｓ／Ｌ１４６Ａ／Ｙ１８５Ｖ）］に開示されている。これらの配列における操作されたアミノ酸置換には二重の下線が引かれ、構築物ＴＧＦβスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型ポリペプチドは、配列番号７２または配列番号７３のいずれかに融合することができるが、これらの両方には融合できない。天然のｈＧ１Ｆｃ、天然のｈＧ２Ｆｃ、天然のｈＧ３Ｆｃおよび天然のｈＧ４Ｆｃの間の高度なアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃにおける対応する位置のアミノ酸置換（図６を参照）が、下記の相補的ｈＧ１Ｆｃペア（配列番号７２および７３）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃペアを生成するであろうと認めることができる。
【化２８】
2021526835.tif 000036
【０１５６】
部分的に、本開示は、ヒトＩｇＧおよびＩｇＡ  ＣＨ３ドメインの指状嵌合型（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｉｎｇ）β−ストランドセグメントを生成するように操作されたＦｃ配列を使用した、非対称Ｆｃ含有ポリペプチド鎖の所望のペア形成を提供する。このような方法は、ＳＥＥＤｂｏｄｙ融合タンパク質の形成を可能にするストランド交換操作ドメイン（ｓｔｒａｎｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）（ＳＥＥＤ）ＣＨ３ヘテロ二量体の使用を含む［Ｄａｖｉｓら（２０１０年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｅｌ  ２３巻：１９５〜２０２頁］。ＳＥＥＤｂｏｄｙ相補性を有するＦｃ配列のペアの一方は、任意選択のリンカーありまたはなしで、構築物の第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドに任意に融合して、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドの融合タンパク質を生成することができる。この単鎖は、第１のＦｃと相補的なＦｃ配列と共に最適な細胞において共発現されて、所望の多重鎖構築物の生成に有利に働くことができる。ＳＥＥＤｂｏｄｙ（Ｓｂ）ペア形成に基づくこの例において、配列番号７４［ｈＧ１Ｆｃ（ＳｂＡＧ）］および配列番号７５［ｈＧ１Ｆｃ（ＳｂＧＡ）］は、ＩｇＡ  Ｆｃに由来する操作されたアミノ酸置換に二重の下線が引かれた相補的ＩｇＧ  Ｆｃ配列の例であり、構築物の第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドは、配列番号７４または配列番号７５のいずれかに融合することができるが、これらの両方には融合できない。天然のｈＧ１Ｆｃ、天然のｈＧ２Ｆｃ、天然のｈＧ３Ｆｃおよび天然のｈＧ４Ｆｃの間の高度なアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ１Ｆｃ、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃの対応する位置におけるアミノ酸置換（図６を参照）が、下記の相補的ＩｇＧ−ＩｇＡペア（配列番号７４および７５）において使用することができるＦｃ単量体を生成するであろうと認めることができる。
【化２９】
2021526835.tif 000037
【０１５７】
部分的に、本開示は、切断可能なロイシンジッパードメインであって、Ｆｃ  ＣＨ３ドメインのＣ末端に結合させたロイシンジッパードメインを伴う非対称のＦｃ含有ポリペプチド鎖の所望のペア形成を提供する。ロイシンジッパーの結合は、ヘテロ二量体の抗体重鎖の優先的なアセンブリーを引き起こすのに十分である［Ｗｒａｎｉｋら（２０１２年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８７巻：４３３３１〜４３３３９頁］。本明細書で開示される通り、ロイシンジッパー形成鎖に結合させたＦｃ配列のペアの一方を、任意選択のリンカーを伴うかまたは伴わずに、構築物の第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドへと任意に融合させて、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドの融合タンパク質を生成することができる。この単鎖を、選択した細胞内で相補的なロイシンジッパー形成鎖に結合させたＦｃ配列と共に共発現させて、所望の多重鎖構築物の生成を優先することができる。精製後における、構築物の、細菌性エンドプロテイナーゼであるＬｙｓ−Ｃによるタンパク質分解性消化により、ロイシンジッパードメインを放出することができ、構造が天然Ｆｃと同一のＦｃ構築物をもたらす。ロイシンジッパーのペア形成に基づくこの例では、配列番号７６［ｈＧ１Ｆｃ−Ａｐ１（酸性）］および配列番号７７［ｈＧ１Ｆｃ−Ｂｐ１（塩基性）］が、相補的なＩｇＧ  Ｆｃ配列［配列中、操作された相補的ロイシンジッパー配列に下線を付す］の例であり、構築物の第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドは、配列番号７６または配列番号７７のいずれかに融合させてよいが、これらの両方には融合させない。天然のｈＧ１Ｆｃ、天然のｈＧ２Ｆｃ、天然のｈＧ３Ｆｃ、および天然のｈＧ４Ｆｃの間の高度なアミノ酸配列同一性を踏まえると、任意選択のリンカーを伴うかまたは伴わずに、ｈＧ１Ｆｃ、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３Ｆｃ、またはｈＧ４Ｆｃ（図６を参照されたい）に結合させたロイシンジッパー形成配列により、下記（配列番号７６および７７）の相補的なロイシンジッパー形成ペアにおいて使用され得るＦｃ単量体が生成されることが理解され得る。
【化３０】
2021526835.tif 000038
【０１５８】
ある特定の態様では、本開示は、第１のポリペプチドであって、第１のポリペプチドの等電点（ｐＩ）を変更する１つもしくは複数のアミノ酸修飾を含む第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドであって、第２のポリペプチドの等電点を変更する１つもしくは複数のアミノ酸修飾を含む第２のポリペプチドに関する。一部の実施形態では、約５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、または９．０より高いｐＩ値を有する１つまたは複数の候補ドメインは、完全マルチドメインタンパク質の構築のために選択される。他の実施形態では、約９．０、８．５、８．０、７．５、７．０、６．５、６．０、５．５、または５．０より低いｐＩ値を有する１つまたは複数の候補ドメインは、完全マルチドメインタンパク質の構築のために選択される。単一のタンパク質が複数の荷電形態を有することは、当業者によって理解されるであろう。任意の特定の理論に拘束されることを望まないが、タンパク質の荷電は、限定されるものではないが、アミノ酸置換、カチオン化、脱アミノ化、カルボキシ末端のアミノ酸異種性、リン酸化およびグリコシル化を含むいくつかの異なる機構によって改変され得る。
【０１５９】
タンパク質のｐＩは、限定されるものではないが、等電点電気泳動および様々なコンピュータアルゴリズム（例えば、Bjellqvist  et  al.,  1993,  Electrophoresis  14:1023を参照されたい）を含む種々の方法によって決定することができる。一実施形態では、ｐＩは、多重温度冷蔵槽再循環ユニットおよびＥＰＳ  ３５０１  ＸＬ電源を備えたＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ  ２電気泳動システムを使用して決定される。プレキャストアンフォラインゲル（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｐＩ範囲２．５〜１０）に、タンパク質試料が負荷される。広範囲ｐＩマーカー標準物質（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ｐＩ範囲３〜１０、８μＬ）が、タンパク質の相対ｐＩを決定するために使用される。電気泳動は、例えば、１５００Ｖ、５０ｍＡで１０５分間、行うことができる。ゲルは、例えば、精製水で１×に希釈されたＳｉｇｍａ固定溶液（５×）を使用して固定される。染色は、例えば、Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、室温で終夜行われる。脱染は、例えば、２５％のエタノール、８％の酢酸および６７％の精製水からなる溶液を用いて行われる。等電点は、例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ密度計を使用して、標準物質の検量線と比較して決定される。１または複数の計量は、異なるｐＨ値、異なる温度、異なる剪断応力、および異なる凍結／融解サイクルからなる群から選択される１または複数の異なる条件下で、ドメインの安定性を特徴付ける計量をさらに含んでもよい。
【０１６０】
一部では、本開示は、所望のヘテロマー種の精製を容易にするＦｃドメインにおけるさらなる変異と組み合わせた、上記の方法による非対称のＦｃ含有ポリペプチド鎖の所望の対形成を提供する。例は、一方のＦｃ含有ポリペプチド鎖中の２つの負荷電アミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸）および相補的Ｆｃ含有ポリペプチド鎖中の２つの正荷電アミノ酸（例えば、アルギニン）（配列番号７８〜７９）のさらなる置換を加えた、配列番号７２〜７３に開示されているような、操作されたジスルフィド結合と組み合わせたノブ・ホ−ル型対形成に基づくＦｃドメインの相補性である。これら４つのアミノ酸置換は、等電点または正味の分子電荷の差異に基づいて、異種ポリペプチド混合物からの所望のヘテロマー融合タンパク質の選択的精製を容易にする。これらの配列における操作されたアミノ酸置換は以下で二重の下線が引かれ、第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドは、配列番号７８または配列番号７９のいずれかに融合することができるが、これらの両方には融合できない。天然のｈＧ１Ｆｃ、天然のｈＧ２Ｆｃ、天然のｈＧ３Ｆｃおよび天然のｈＧ４Ｆｃの間の高度なアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃにおける対応する位置のアミノ酸置換（図６を参照）が、下の相補的ｈＧ１Ｆｃペア（配列番号７８−７９）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃペアを生成するであろうと認めることができる。
【化３１】
2021526835.tif 000039
【０１６１】
別の例は、一方のＦｃ含有ポリペプチド鎖（配列番号８０）の２１３位におけるヒスチジンのアルギニンへの置換を加えた、配列番号７２〜７３に開示されているような、操作されたジスルフィド結合と組み合わせたノブ・ホール型対形成に基づくＦｃドメインの相補性を含む。この置換（Ｋａｂａｔらの番号付けシステムではＨ４３５Ｒと示される）は、プロテインＡに対する親和性の差異に基づいて望ましくないホモ二量体からの所望のヘテロマーの分離を容易にする。操作されたアミノ酸置換は二重下線によって示され、構築物の第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドを、配列番号８０または配列番号７３の、両方ではないが、いずれかに融合させることができる。天然ｈＧ１Ｆｃと天然ｈＧ２Ｆｃと天然ｈＧ３Ｆｃと天然ｈＧ４Ｆｃの間の高いアミノ酸配列同一度を考えると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３Ｆｃ、またはｈＧ４Ｆｃ（図６を参照されたい）における対応する位置でのアミノ酸置換によって、配列番号８０（下記）および配列番号７３の相補的ｈＧ１Ｆｃ対の代わりに使用することができる相補的Ｆｃ対を生じることが認識され得る。
【化３２】
2021526835.tif 000040
【０１６２】
３．核酸および製造の方法
ある特定の実施形態では、本開示は、ポリペプチドならびにそれを含む二機能性または三機能性融合タンパク質、ホモ二量体およびヘテロ二量体の単離された形態および／または精製された形態を入手可能にし、これは、他のタンパク質および／もしくは他のポリペプチド種から単離されるか、またはそうでなければ、これらを実質的に含まない（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％含まない）。ポリペプチドは、一般に、組換え核酸からの発現によって生成される。よって、本開示のポリペプチド、ならびにこれらを含む二機能性または三機能性融合タンパク質、ホモ二量体、およびヘテロ二量体は、一般に、組換え体である。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、本開示は、タンパク質の部分（例えば、受容体の細胞外リガンド結合ドメインまたは抗体のリガンド結合ドメイン）のためのコード配列を含む可溶性のポリペプチドならびにそれを含む二機能性または三機能性融合タンパク質、ホモ二量体およびヘテロ二量体をコードする核酸を含む。さらなる実施形態では、本開示は、このような核酸を含む宿主細胞にも関連する。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、本開示のポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系の使用）、酵母または哺乳動物細胞において発現され得る。他の好適な宿主細胞が当業者に公知である。したがって、本開示の一部の実施形態は、ポリペプチドを生成する方法にさらに関連する。
【０１６４】
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に開示される断片、機能的バリアントおよび融合タンパク質を含む、ポリペプチドならびにそれを含む二機能性または三機能性融合タンパク質、ホモ二量体およびヘテロ二量体のいずれかをコードする単離された核酸および／または組換え核酸を提供する。配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６、４７、５６、５７、８３、８６、８９、９２、１１３、１１４、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３２、１３５、１３８、および１４２は、ＩｇＧ  Ｆｃドメインと融合した細胞外ドメインを含むＴβＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢまたはベータグリカンポリペプチドならびにそのバリアントをコードする。対象の核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。このような核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。これらの核酸は、例えば、ポリペプチドを作成するための方法において、または直接治療剤（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉまたは遺伝子治療アプローチ）として使用され得る。
【０１６５】
ある特定の態様では、ポリペプチドをコードする対象の核酸は、配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６、４７、５６、５７、８３、８６、８９、９２、１１３、１１４、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３２、１３５、１３８、および１４２のバリアントである核酸を含むことがさらに理解される。バリアントのヌクレオチド配列は、対立遺伝子バリアントなどの、１つもしくは複数のヌクレオチドの置換、付加または欠失によって異なる配列を含む。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、本開示は、配列番８、１０、１２、１４、１６、４６、４７、５６、５７、８３、８６、８９、９２、１１３、１１４、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３２、１３５、１３８、および１４２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である単離された核酸配列または組換え核酸配列を提供する。当業者には、配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６、４７、５６、５７、８３、８６、８９、９２、１１３、１１４、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３２、１３５、１３８、および１４２と相補的な核酸配列、および配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６、４７、５６、５７、８３、８６、８９、９２、１１３、１１４、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３２、１３５、１３８、および１４２のバリアントも本開示の範囲内であることは明らかである。さらなる実施形態では、本開示の核酸配列は、単離されているか、組換えであるか、および／もしくは異種ヌクレオチド配列と融合されているか、またはＤＮＡライブラリー中の核酸配列であり得る。
【０１６７】
他の実施形態では、本開示の核酸は、配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６、４７、５６、５７、８３、８６、８９、９２、１１３、１１４、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３２、１３５、１３８、および１４２において指定されたヌクレオチド配列、配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６、４７、５６、５７、８３、８６、８９、９２、１１３、１１４、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３２、１３５、１３８、および１４２の相補体配列、またはその断片に、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。上記で議論されたように、当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシーな条件が多様であり得ることを容易に理解する。例えば、６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、２．０×ＳＳＣで、５０℃での洗浄を行なうことができる。例えば、洗浄ステップ中の塩濃度は、約２．０×ＳＳＣ、５０℃の低ストリンジェンシーから、約０．２×ＳＳＣ、５０℃の高ストリンジェンシーまで選択することができる。加えて、洗浄ステップにおける温度は、室温、約２２℃の低ストリンジェンシー条件から、約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで上昇させることができる。温度および塩の両方を変化させることができ、または、他の変数を変えながら、温度もしくは塩濃度を一定に保持してもよい。一部の実施形態では、本開示は、６×ＳＳＣ、室温の低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、続いて、２×ＳＳＣ、室温で洗浄した核酸を提供する。
【０１６８】
配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６、４７、５６、５７、８３、８６、８９、９２、１１３、１１４、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３２、１３５、１３８、および１４２において記述された核酸と異なる単離された核酸も、遺伝コードにおける縮重に起因して、本開示の範囲内である。例えば、いくつかのアミノ酸が、２つ以上の三連塩基によって指定される。同じアミノ酸を特定するコドン、またはシノニム（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジンに対するシノニムである）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を与えない「サイレント」変異をもたらし得る。しかしながら、対象のタンパク質のアミノ酸配列における変更をもたらすＤＮＡ配列多型が、哺乳動物細胞の間に存在すると予想される。当業者には、特定のタンパク質をコードする核酸の１つまたは複数のヌクレオチド（最大でヌクレオチドの約３〜５％）におけるこれらのバリエーションが、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因して所与の種の個体の間で存在し得ることは明らかである。ありとあらゆるこのようなヌクレオチドバリエーションおよび結果として生じるアミノ酸多型は、本開示の範囲内である。
【０１６９】
ＴβＲＩＩの長いアイソフォームに基づく対応するバリアントが、挿入に隣接するＣ末端位で保存的なＶａｌ−Ｉｌｅ置換とともに２５アミノ酸挿入をコードするヌクレオチド配列を含むことは当業者には明らかである。ＴβＲＩＩの長い（Ａ）アイソフォームまたは短い（Ｂ）アイソフォームのいずれかに基づく対応するバリアントが、天然に存在するＴβＲＩＩのアイソフォームＣについての記載と同じ場所で、１０８ヌクレオチドの挿入を含み、３６アミノ酸の挿入をコードするバリアントヌクレオチド配列（配列番号４１）を含むことも明らかである。
【０１７０】
ある特定の実施形態では、本開示の組換え核酸は、発現構築物中で、１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現のために使用される宿主細胞について適切である。多数の種類の適切な発現ベクターおよび好適な調節配列が、種々の宿主細胞に対して当技術分野で公知である。典型的には、前記１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列としては、限定されるものではないが、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合性部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびにエンハンサー配列またはアクチベーター配列が挙げられ得る。当技術分野で公知の構成プロモーターまたは誘導プロモーターは、本開示によって企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または２以上のプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドなどのエピソームにおいて細胞中で存在していてもよく、または発現構築物は染色体に挿入されてもよい。好ましい実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含有する。選択マーカー遺伝子は、当技術分野において周知であり、使用される宿主細胞とともに変わる。
【０１７１】
本明細書に開示されるある特定の態様では、対象の核酸は、ポリペプチド（例えば、二機能性または三機能性融合タンパク質）をコードし、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクター中で提供される。調節配列は、当技術分野で認識され、Ｔポリペプチドの発現を指示するために選択される。したがって、調節配列という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。例示的な調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：    Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （１９９０）に記載されている。例えば、作動可能に連結された場合に、ＤＮＡ配列の発現を制御する広い範囲の発現制御配列のいずれかを、これらのベクター中で使用して、ポリペプチド（例えば、二機能性または三機能性融合タンパク質）をコードするＤＮＡ配列を発現させることができる。このような有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０の早期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス前初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、発現がＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより指示されるＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質に対する制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素に対するプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、例えば、Ｐｈｏ５、酵母α−接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系のポリヘドロンプロモーター、ならびに原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知の他の配列、ならびにこれらの様々な組合せが挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現される所望のタンパク質の種類などの因子に依存し得ることが理解されるべきである。また、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、および抗生物質マーカーなどのベクターによってコードされる任意の他のタンパク質の発現も、考慮されるべきである。
【０１７２】
本開示に含まれる組換え核酸は、クローニングされた遺伝子またはその一部分を、原核細胞、真核細胞（酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物）のいずれかまたはその両方における発現のために好適なベクターにライゲートすることによって、生成することができる。組換えポリペプチド（例えば、二機能性または三機能性融合タンパク質）の生成のための発現ビヒクルとしては、プラスミドおよび他のベクターが挙げられる。例えば、好適なベクターとしては、以下の種類のプラスミド：Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における発現のための、ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミドおよびｐＵＣ由来プラスミドが挙げられる。
【０１７３】
一部の哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を容易にするための原核生物配列、および真核細胞中で発現される１つまたは複数の真核生物転写ユニットの両方を含有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇに由来するベクターは、真核細胞のトランスフェクションのための好適な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターの一部は、原核細胞および真核細胞の両方で複製および薬物耐性選択を容易にするために、ｐＢＲ３２２などの細菌プラスミド由来の配列で改変される。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）、またはエプスタインバーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）などのウイルスの誘導体を、真核細胞におけるタンパク質の一過性発現のために使用することができる。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、遺伝子治療の送達システムの説明において、下記に見出すことができる。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において用いられる種々の方法は、当技術分野において周知である。原核細胞および真核細胞の両方に対する他の好適な発現系、ならびに一般的な組換え手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄ．，  ｅｄ．  ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）を参照されたい。一部の例では、バキュロウイルス発現系の使用によって組換えポリペプチドを発現させることが望ましくあり得る。このようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩなど）が挙げられる。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃ．）などのベクターは、ＣＨＯ細胞における対象のポリペプチド（例えば、二機能性または三機能性融合タンパク質）の生成のために設計される。好ましい実施形態では、ベクターは、ＨＥＫ−２９３細胞における対象のポリペプチドの生成のために設計される。明らかであるように、対象の遺伝子構築物を使用して、例えば、精製のために、融合タンパク質またはバリアントタンパク質を含むタンパク質を生成させるために、培養中に増殖された細胞における対象のポリペプチドの発現を引き起こすことができる。
【０１７５】
本開示は、対象のポリペプチド（例えば、二機能性または三機能性融合タンパク質）の１つまたは複数に対するコード配列（例えば、配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６、４７、５６、５７、８３、８６、８９、９２、１１３、１１４、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３２、１３５、１３８、および１４２）を含む組換え遺伝子でトランスフェクトされた宿主細胞にも関連する。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、本明細書に開示される二機能性または三機能性融合タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用する）、酵母または哺乳動物細胞において発現させてもよい。他の好適な宿主細胞が当業者に公知である。
【０１７６】
したがって、本開示は、対象のポリペプチド（例えば、二機能性または三機能性融合タンパク質）を生成するための方法にさらに関連する。例えば、ポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、適切な条件下で培養して、ポリペプチドの発現を生じさせることができる。ポリペプチドを、分泌させ、細胞およびポリペプチドを含有する培地の混合物から単離することができる。あるいは、ポリペプチドは、細胞質または膜画分に維持されてもよく、細胞は、回収され、溶解され、タンパク質が単離される。細胞培養物は、宿主細胞および培地を含む。細胞培養のための好適な培地は、当技術分野において周知である。対象のポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ポリペプチドの特定のエピトープに対して特異的な抗体を用いる免疫親和性精製、ならびにポリペプチドに融合したドメインに結合する薬剤を用いる親和性精製（例えば、プロテインＡカラムがＦｃ融合を精製するために使用され得る）を含む、タンパク質を精製するための、当技術分野において公知の技術を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、またはその両方から単離することができる。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、その精製を容易にするドメインを含有する融合タンパク質である。例としては、精製は、例えば、以下の３つまたはそれよりも多くを任意の順序で含む一連のカラムクロマトグラフィーによって達成することができる：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィー。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて終了することができる。
【０１７７】
別の実施形態では、組換えポリペプチド（例えば、二機能性または三機能性融合タンパク質）の所望の部分のＮ末端で、ポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列などの精製リーダー配列についてコードする融合遺伝子は、Ｎｉ２＋金属樹脂を使用する親和性クロマトグラフィーによって、発現した融合タンパク質の精製を可能にし得る。次いで、精製リーダー配列は、その後、エンテロキナーゼによる処理によって除去されて、精製されたポリペプチドを提供することができる（例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４１１：１７７；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：８９７２を参照されたい）。
【０１７８】
融合遺伝子を作成するための技術は周知である。本質的には、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の連結は、ライゲーションのための平滑末端または交互末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要によりコヒーシブ末端の充填、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、ならびに酵素的ライゲーションを用いる、慣用の技術に従って行なわれる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む慣用の技術によって、合成することができる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、キメラ遺伝子配列を作製するためにその後にアニーリングすることができる、２つの連続的な遺伝子断片の間の相補的なオーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して、行なうことができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｅｄｓ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：  １９９２を参照されたい）。
【０１７９】
４．抗体アンタゴニスト
ある特定の態様では、本開示は、アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴＧＦβアンタゴニストドメイン、および免疫チェックポイントアンタゴニストドメインの２つまたはそれより多くを含む二機能性または三機能性融合タンパク質に関し、アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴＧＦβアンタゴニストドメイン、および免疫チェックポイントアンタゴニストドメインの１つまたは複数が、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、および／またはＴＧＦβ３）、ＡｃｔＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、ＴβＲＩＩ、ベータグリカン、および免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、および／またはＢ７−Ｈ４）の１つまたは複数に結合する抗体、またはその抗原結合ドメインである。特に、アクチビン、ＴＧＦβ、ＴβＲＩＩ、ベータグリカン、および免疫チェックポイント阻害剤の１つまたは複数に結合する抗体、またはその抗原結合ドメインを含むこのような二機能性または三機能性融合タンパク質を使用して、本明細書に記載の１つまたは複数の疾患または状態（例えば、がん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、および異形成障害）を処置または予防することができる。
【０１８０】
一部の実施形態では、アクチビンアンタゴニストドメインは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、および／またはアクチビンＡＣ）に結合する抗体、またはその抗原結合ドメインである。本明細書で使用される場合、アクチビン抗体（抗アクチビン抗体）とは、一般に、抗体がアクチビンの標的化における診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でアクチビンに結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗アクチビン抗体の無関係の非アクチビンタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅまたは他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイによって測定される、抗体のアクチビンへの結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗アクチビン抗体は、異なる種由来のアクチビンの中で保存されたアクチビンのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗アクチビン抗体はヒトアクチビンに結合する。他の好ましい実施形態では、抗アクチビン抗体は、アクチビンが同族のＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合するのを阻害し、したがって、これらの受容体を介するアクチビン媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害し得る。ヒトアクチビンに結合する。アクチビンは配列相同性を共有し、したがって、１つのアクチビン（例えば、アクチビンＡ）に結合する抗体は１つまたは複数の追加のアクチビン（例えば、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＣ）に結合し得ることに留意されたい。一部の実施形態では、抗アクチビン抗体は、少なくともアクチビンＡおよび／またはアクチビンＢに結合する。アクチビン抗体の例は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／０１７５７６号に開示されている。これらの抗体のいずれか、またはその抗原結合断片は、二機能性または三機能性融合タンパク質および本開示の方法に組み込まれ得る。一部の実施形態では、アクチビン抗体は、ＲＥＧＮ２４７７、またはその抗原結合断片である。
【０１８１】
一部の実施形態では、アクチビンアンタゴニストドメインは、ＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）に結合する抗体、またはその抗原結合ドメインである。本明細書で使用される場合、ＡｃｔＲＩＩ抗体（抗ＡｃｔＲＩＩ抗体）は、一般に、抗体が、ＡｃｔＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）を標的とする際に、診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でＡｃｔＲＩＩに結合する抗体を指す。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ抗体は、ＡｃｔＲＩＩＡに結合するが、ＡｃｔＲＩＩＢには結合しないか、または実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍより大きいＫＤでＡｃｔＲＩＩＢに結合するかまたは比較的中程度の結合、例えば、約１×１０−８Ｍまたは約１×１０−９Ｍを有する）。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ抗体は、ＡｃｔＲＩＩＢに結合するが、ＡｃｔＲＩＩＡには結合しないか、または実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍより大きいＫＤでＡｃｔＲＩＩＡに結合するかまたは比較的中程度の結合、例えば、約１×１０−８Ｍまたは約１×１０−９Ｍを有する）。さらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ抗体は、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢに結合する。ある特定の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩ抗体の、関連しない、非ＡｃｔＲＩＩタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイによって測定した場合、抗体のＡｃｔＲＩＩへの結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満であるか、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩ抗体は、様々な種に由来するＡｃｔＲＩＩの間で保存されているＡｃｔＲＩＩのエピトープ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）に結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩ抗体は、ヒトＡｃｔＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）に結合する。ＡｃｔＲＩＩＡは、ＡｃｔＲＩＩＢに対する配列相同性を有し、したがって、ＡｃｔＲＩＩＡに結合する抗体は、一部の場合には、ＡｃｔＲＩＩＢにも結合するおよび／またはそれを阻害する場合があり、逆もまたしかりである。このようなＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡｃｔＲＩＩＡ抗体の例は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／０６４７７１号、同第ＷＯ２０１３／０６３５３６号、同第ＷＯ２０１７／１５６４８８号、同第ＷＯ２０１０／１２５００３号、および同第ＷＯ２０１３／１８８４４８号に開示されている。これらの抗体のいずれか、またはその抗原結合断片は、二機能性または三機能性融合タンパク質および本開示の方法に組み込まれ得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂ抗体は、ビマグルマブ、またはその抗原結合断片である。
【０１８２】
一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストドメインは、ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２および／またはＴＧＦβ３）に結合する抗体、またはその抗原結合ドメインである。本明細書で使用される場合、ＴＧＦβ抗体（抗ＴＧＦβ抗体）は、一般に、抗体が、ＴＧＦβを標的化する診断剤および／または治療剤として有用であるように十分な親和性でＴＧＦβに結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＴＧＦβ抗体が無関係の非アクチビンタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、ＴＧＦβに対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＴＧＦβ抗体は、異なる種に由来するＴＧＦβの間で保存されているＴＧＦβのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＴＧＦβ抗体は、ヒトＴＧＦΒに結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＴＧＦβ抗体は、ＴＧＦβが、同族のＩ型受容体、ＩＩ型受容体、または共受容体（例えば、ＴβＲＩＩ、ＡＬＫ５、およびベータグリカン）に結合するのを阻害し、よって、これらの受容体を介するＴＧＦβに媒介されるシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害し得る。ＴＧＦβは配列相同性を共有し、したがって、１つのＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１）に結合する抗体は１つまたは複数の追加のＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ２および／またはＴＧＦβ３）に結合し得ることに留意されたい。一部の実施形態では、抗ＴＧＦβ抗体は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３に結合する。代替の実施形態では、抗ＴＧＦβ抗体は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に結合するが、ＴＧＦβ２には結合しないか、または実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍより大きいＫＤでＴＧＦβ２に結合するかまたは比較的中程度の結合、例えば、約１×１０−８Ｍまたは約１×１０−９Ｍを有する）。一部の実施形態では、ＴＧＦβ抗体は、フレソリムマブ、またはその抗原結合断片である。一部の実施形態では、ＴＧＦβ抗体は、メテリムマブ、またはその抗原結合断片である。
【０１８３】
一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストドメインは、ＴβＲＩＩに結合する抗体、またはその抗原結合ドメインである。本明細書で使用される場合、ＴβＲＩＩ抗体（抗ＴβＲＩＩ抗体）は、一般に、抗体が、ＴβＲＩＩを標的化する診断剤および／または治療剤として有用であるように十分な親和性でＴβＲＩＩに結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＴβＲＩＩ抗体が無関係の非ＴβＲＩＩタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、ＴβＲＩＩに対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＴβＲＩＩ抗体は、異なる種に由来するＴβＲＩＩの間で保存されているＴβＲＩＩのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＴβＲＩＩ抗体は、ヒトＴβＲＩＩに結合する。
【０１８４】
一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストドメインは、ベータグリカンに結合する抗体、またはその抗原結合ドメインである。本明細書で使用される場合、ベータグリカン抗体（抗ベータグリカン抗体）は、一般に、抗体が、ベータグリカンを標的化する診断剤および／または治療剤として有用であるように十分な親和性でベータグリカンに結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ベータグリカン抗体が無関係の非ベータグリカンタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、ベータグリカンに対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ベータグリカン抗体は、異なる種に由来するベータグリカンの間で保存されているベータグリカンのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ベータグリカン抗体は、ヒトベータグリカンに結合する。
【０１８５】
一部の実施形態では、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインは、ＰＤ−１に結合する抗体、またはその抗原結合ドメインである。本明細書で使用される場合、ＰＤ−１抗体（抗ＰＤ−１抗体）は、一般に、抗体が、ＰＤ−１を標的化する（例えば、ＰＤ−１媒介性免疫抑制活性を阻害する）診断剤および／または治療剤として有用であるように十分な親和性でＰＤ−１に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体が無関係の非ベータグリカンタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、ＰＤ−１に対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、異なる種に由来するＰＤ−１の間で保存されているＰＤ−１のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ヒトＰＤ−１に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１がＰＤ−Ｌ１に結合するのを阻害し得る。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ、またはその抗原結合断片である。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ペムブロリズマブ、またはその抗原結合断片である。
【０１８６】
一部の実施形態では、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインは、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体、またはその抗原結合ドメインである。本明細書で使用される場合、ＰＤ−Ｌ１抗体（抗ＰＤ−Ｌ１抗体）は、一般に、抗体が、ＰＤ−Ｌ１を標的化する（例えば、ＰＤ−Ｌ１媒介性免疫抑制活性を阻害する）診断剤および／または治療剤として有用であるように十分な親和性でＰＤ−Ｌ１に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が無関係の非ベータグリカンタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、ＰＤ−Ｌ１に対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、異なる種に由来するＰＤ−Ｌ１の間で保存されているＰＤ−Ｌ１のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１に結合するのを阻害し得る。一部の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、またはその抗原結合断片である。一部の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アベルマブ、またはその抗原結合断片である。一部の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、デュルバルマブ、またはその抗原結合断片である。
【０１８７】
一部の実施形態では、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインは、ＣＴＬＡ４に結合する抗体、またはその抗原結合ドメインである。本明細書で使用される場合、ＣＴＬＡ４抗体（抗ＣＴＬＡ４抗体）は、一般に、抗体が、ＣＴＬＡ４を標的化する（例えば、ＣＴＬＡ４媒介性免疫抑制活性を阻害する）診断剤および／または治療剤として有用であるように十分な親和性でＣＴＬＡ４に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体が無関係の非ベータグリカンタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、ＣＴＬＡ４に対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、異なる種に由来するＣＴＬＡ４の間で保存されているＣＴＬＡ４のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、ヒトＣＴＬＡ４に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、ＣＴＬＡ４がＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するのを阻害し得る。一部の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、イピリムマブ、またはその抗原結合断片である。
【０１８８】
一部の実施形態では、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインは、ＢＴＬＡに結合する抗体、またはその抗原結合ドメインである。本明細書で使用される場合、ＢＴＬＡ抗体（抗ＢＴＬＡ抗体）は、一般に、抗体が、ＢＴＬＡを標的化する（例えば、ＢＴＬＡ媒介性免疫抑制活性を阻害する）診断剤および／または治療剤として有用であるように十分な親和性でＢＴＬＡに結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＢＴＬＡ抗体が無関係の非ベータグリカンタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、ＢＴＬＡに対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＢＴＬＡ抗体は、異なる種に由来するＢＴＬＡの間で保存されているＢＴＬＡのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＢＴＬＡ抗体は、ヒトＢＴＬＡに結合する。
【０１８９】
一部の実施形態では、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインは、ＬＡＧ３に結合する抗体、またはその抗原結合ドメインである。本明細書で使用される場合、ＬＡＧ３抗体（抗ＬＡＧ３抗体）は、一般に、抗体が、ＬＡＧ３を標的化する（例えば、ＬＡＧ３媒介性免疫抑制活性を阻害する）診断剤および／または治療剤として有用であるように十分な親和性でＬＡＧ３に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＬＡＧ３抗体が無関係の非ベータグリカンタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、ＬＡＧ３に対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＬＡＧ３抗体は、異なる種に由来するＬＡＧ３の間で保存されているＬＡＧ３のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＬＡＧ３抗体は、ヒトＬＡＧ３に結合する。
【０１９０】
一部の実施形態では、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインは、ＴＩＭ３に結合する抗体、またはその抗原結合ドメインである。本明細書で使用される場合、ＴＩＭ３抗体（抗ＴＩＭ３抗体）は、一般に、抗体が、ＴＩＭ３を標的化する（例えば、ＴＩＭ３媒介性免疫抑制活性を阻害する）診断剤および／または治療剤として有用であるように十分な親和性でＴＩＭ３に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体が無関係の非ベータグリカンタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、ＴＩＭ３に対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、異なる種に由来するＴＩＭ３の間で保存されているＴＩＭ３のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、ヒトＴＩＭ３に結合する。
【０１９１】
一部の実施形態では、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインは、ＬＡＩＲ１に結合する抗体、またはその抗原結合ドメインである。本明細書で使用される場合、ＬＡＩＲ１抗体（抗ＬＡＩＲ１抗体）は、一般に、抗体が、ＬＡＩＲ１を標的化する（例えば、ＬＡＩＲ１媒介性免疫抑制活性を阻害する）診断剤および／または治療剤として有用であるように十分な親和性でＬＡＩＲ１に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＬＡＩＲ１抗体が無関係の非ベータグリカンタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、ＬＡＩＲ１に対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＬＡＩＲ１抗体は、異なる種に由来するＬＡＩＲ１の間で保存されているＬＡＩＲ１のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＬＡＩＲ１抗体は、ヒトＬＡＩＲ１に結合する。
【０１９２】
一部の実施形態では、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインは、Ｂ７−ＤＣに結合する抗体、またはその抗原結合ドメインである。本明細書で使用される場合、Ｂ７−ＤＣ抗体（抗Ｂ７−ＤＣ抗体）は、一般に、抗体が、Ｂ７−ＤＣを標的化する（例えば、Ｂ７−ＤＣ媒介性免疫抑制活性を阻害する）診断剤および／または治療剤として有用であるように十分な親和性でＢ７−ＤＣに結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗Ｂ７−ＤＣ抗体が無関係の非ベータグリカンタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、Ｂ７−ＤＣに対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗Ｂ７−ＤＣ抗体は、異なる種に由来するＢ７−ＤＣの間で保存されているＢ７−ＤＣのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗Ｂ７−ＤＣ抗体は、ヒトＢ７−ＤＣに結合する。
【０１９３】
一部の実施形態では、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインは、ＨＶＥＭに結合する抗体、またはその抗原結合ドメインである。本明細書で使用される場合、ＨＶＥＭ抗体（抗ＨＶＥＭ抗体）は、一般に、抗体が、ＨＶＥＭを標的化する（例えば、ＨＶＥＭ媒介性免疫抑制活性を阻害する）診断剤および／または治療剤として有用であるように十分な親和性でＨＶＥＭに結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＨＶＥＭ抗体が無関係の非ベータグリカンタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、ＨＶＥＭに対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＨＶＥＭ抗体は、異なる種に由来するＨＶＥＭの間で保存されているＨＶＥＭのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＨＶＥＭ抗体は、ヒトＨＶＥＭに結合する。
【０１９４】
一部の実施形態では、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインは、ＴＩＭ４に結合する抗体、またはその抗原結合ドメインである。本明細書で使用される場合、ＴＩＭ４抗体（抗ＴＩＭ４抗体）は、一般に、抗体が、ＴＩＭ４を標的化する（例えば、ＴＩＭ４媒介性免疫抑制活性を阻害する）診断剤および／または治療剤として有用であるように十分な親和性でＴＩＭ４に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＴＩＭ４抗体が無関係の非ベータグリカンタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、ＴＩＭ４に対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＴＩＭ４抗体は、異なる種に由来するＴＩＭ４の間で保存されているＴＩＭ４のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＴＩＭ４抗体は、ヒトＴＩＭ４に結合する。
【０１９５】
一部の実施形態では、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインは、Ｂ７−Ｈ３に結合する抗体、またはその抗原結合ドメインである。本明細書で使用される場合、Ｂ７−Ｈ３抗体（抗Ｂ７−Ｈ３抗体）は、一般に、抗体が、Ｂ７−Ｈ３を標的化する（例えば、Ｂ７−Ｈ３媒介性免疫抑制活性を阻害する）診断剤および／または治療剤として有用であるように十分な親和性でＢ７−Ｈ３に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗Ｂ７−Ｈ３抗体が無関係の非ベータグリカンタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、Ｂ７−Ｈ３に対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗Ｂ７−Ｈ３抗体は、異なる種に由来するＢ７−Ｈ３の間で保存されているＢ７−Ｈ３のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗Ｂ７−Ｈ３抗体は、ヒトＢ７−Ｈ３に結合する。
【０１９６】
一部の実施形態では、免疫チェックポイントアンタゴニストドメインは、Ｂ７−Ｈ４に結合する抗体、またはその抗原結合ドメインである。本明細書で使用される場合、Ｂ７−Ｈ４抗体（抗Ｂ７−Ｈ４抗体）は、一般に、抗体が、Ｂ７−Ｈ４を標的化する（例えば、Ｂ７−Ｈ４媒介性免疫抑制活性を阻害する）診断剤および／または治療剤として有用であるように十分な親和性でＢ７−Ｈ４に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗Ｂ７−Ｈ４抗体が無関係の非ベータグリカンタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、Ｂ７−Ｈ４に対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗Ｂ７−Ｈ４抗体は、異なる種に由来するＢ７−Ｈ４の間で保存されているＢ７−Ｈ４のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗Ｂ７−Ｈ４抗体は、ヒトＢ７−Ｈ４に結合する。
【０１９７】
抗体という用語は、最も広い意味で本明細書で使用され、限定されるものではないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を含む、様々な抗体構造を包含する。抗体断片とは、無傷抗体が結合する抗原に結合する無傷抗体の一部分を含む、無傷抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。例えば、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９：１２９−１３４；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ｖｏｌ．  １１３，  Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），  ｐｐ．  ２６９−３１５  （１９９４）；国際公開第９３／１６１８５号；ならびに米国特許第５，５７１，８９４号、米国特許第５，５８７，４５８号および米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。本明細書に開示される抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。特定の実施形態では、本開示の抗体は、それらに付着され、検出されることが可能な標識（例えば、標識は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であり得る）を含む。好ましい実施形態では、本開示の抗体は、単離された抗体である。
【０１９８】
ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る、２つの抗原結合性部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９：１２９−１３４  （２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：  ６４４４−６４４８を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９：１２９−１３４に記載されている。
【０１９９】
シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分、または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分を含む抗体断片である。ある特定の実施形態では、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である。例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照されたい。
【０２００】
抗体断片は、限定されるものではないが、無傷抗体のタンパク質消化、および本明細書に記載の組換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による生成を含む様々な技術によって作成することができる。
【０２０１】
本明細書における抗体は、任意のクラスの抗体であり得る。抗体のクラスとは、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。５つの主要な抗体のクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューとよばれる。
【０２０２】
一般に、本明細書に開示される方法における使用のための抗体は、好ましくは、高い結合親和性で、その標的抗原に特異的に結合する。親和性は、ＫＤ値として表わされてもよく、固有の結合親和性（例えば、最小アビディティ効果を有する）を反映する。典型的には、結合親和性は、無細胞の状況または細胞に関連する状況に関わらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定される。本明細書に開示されるアッセイを含む、当技術分野において公知のいくつかのアッセイのいずれかを使用して、結合親和性測定値を得ることができ、例えば、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイ）、放射性標識抗原結合性アッセイ（ＲＩＡ）およびＥＬＩＳＡが挙げられる。一部の実施形態では、本開示の抗体は、少なくとも、１×１０−９もしくはそれよりも強い、１×１０−１０もしくはそれよりも強い、１×１０−１１もしくはそれよりも強い、１×１０−１２もしくはそれよりも強い、１×１０−１３もしくはそれよりも強い、または１×１０−１４もしくはそれよりも強いＫＤで、それらの標的抗原［例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）  ＴβＲＩＩ、ベータグリカン、ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３）、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、およびＢ７−Ｈ４］に結合する。
【０２０３】
ある特定の実施形態では、ＫＤは、以下のアッセイによって記載されるようにして、目的の抗体のＦａｂバージョンおよびその標的抗原を用いて行なわれるＲＩＡによって、測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、未標識抗原の滴定系列の存在中、最低濃度の放射性標識抗原（例えば、１２５Ｉ標識）でＦａｂを平衡化すること、次いで、抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートを用いて結合した抗原を捕捉することによって、測定される［例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９３：８６５−８８１を参照されたい］。アッセイのための条件を確立するために、マルチウェルプレート（例えば、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を、捕捉性抗Ｆａｂ抗体（例えば、Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ製）でコーティングし（例えば、終夜）、その後、好ましくは、室温（およそ２３℃）でウシ血清アルブミンを用いてブロッキングする。非吸着プレートにおいて、放射性標識抗原を、目的のＦａｂの連続希釈により混合する［例えば、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５７：４５９３−４５９９における、抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する］。次いで、目的のＦａｂを、好ましくは、終夜インキュベートして、しかし、インキュベーションは、平衡に達することを確実にするために、より長い時間（例えば、約６５時間）継続してもよい。その後、混合物を、好ましくは、室温で約１時間、インキュベーションのために、捕捉プレートに移す。次いで、溶液を除去し、プレートを、好ましくは、ポリソルベート２０およびＰＢＳの混合物で数回洗浄する。プレートが乾燥したら、シンチレーション剤（例えば、ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ（登録商標）、Ｐａｃｋａｒｄ製）を添加し、プレートを、ガンマカウンター（例えば、ＴＯＰＣＯＵＮＴ（登録商標）、Ｐａｃｋａｒｄ製）でカウントする。
【０２０４】
別の実施形態によれば、ＫＤは、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化抗原ＣＭ５チップとともに使用して、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランのバイオセンサーチップ（ＣＭ５、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を、供給業者の使用説明書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。例えば、抗原を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で、５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）に希釈した後、５μｌ／分の流速で注入して、カップリングしたタンパク質のおよそ１０応答単位（ＲＵ）を達成することができる。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを、未反応基をブロッキングするために注入する。動態測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を有するＰＢＳ中に、およそ２５μｌ／分の流速で注入する。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、例えば、単純な一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア  バージョン３．２）を使用して、会合および解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによって、計算する。平衡解離定数（ＫＤ）を、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する［例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９３：８６５−８８１を参照されたい］。会合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）、例えば、上記の表面プラズモン共鳴アッセイにより１０６Ｍ−１秒−１を超える場合、次いで、会合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）は、ストップフローを備える分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（登録商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で、撹拌キュベットを用いて測定される場合に、増加させた濃度の抗原の存在中で、ＰＢＳ中の２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光発光強度（例えば、励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）の増加または減少を測定する、蛍光消光技術を使用して決定することができる。
【０２０５】
ｈｕｍａｎ  ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、およびアクチビンＡＣ）、ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３）  ＴβＲＩＩ、ベータグリカン、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、およびＢ７−Ｈ４の核酸ならびにアミノ酸配列は、当技術分野において周知であり、したがって、本開示による使用のための抗体アンタゴニストは、当技術分野における知識および本明細書に提供される教示に基づいて、当業者によって日常的に作成され得る。
【０２０６】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。キメラ抗体とは、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来するが、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なる供給源または種に由来する抗体を指す。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：６８５１−６８５５に記載されている。一部の実施形態では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）およびヒト定常領域を含む。一部の実施形態では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された、「クラススイッチ」抗体である。一般に、キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【０２０７】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるキメラ抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体とは、非ヒト超可変領域（ＨＶＲ）由来のアミノ酸残基、およびヒトフレームワーク領域（ＦＲ）由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、ＨＶＲのすべてまたは実質的にすべて（例えば、ＣＤＲ）が非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト抗体のものに対応する、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのすべてを実質的に含む。ヒト化抗体は、必要に応じて、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、ヒト化を受けた抗体を指す。
【０２０８】
ヒト化抗体およびこれらを作成する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ  （２００８）  Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  １３：１６１９−１６３３に概説されており、さらに、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３；米国特許第５，８２１，３３７号、米国特許第７，５２７，７９１号、米国特許第６，９８２，３２１号および米国特許第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４［ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフト化を記載している］；Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （１９９１）  ２８：４８９−４９８（「再表面化」を記載している）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３−６０（「ＦＲシャッフリング」を記載している）；Ｏｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１−６８；ならびにＫｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  （２０００）  ８３：２５２−２６０  （ＦＲシャッフリングへの「ガイド付き選択」アプローチを記載している）に記載されている。
【０２０９】
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域としては、限定されるものではないが、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域［例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１：２２９６を参照されたい］；軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体の定常配列に由来するフレームワーク領域［例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：４２８５；およびＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５１：２６２３を参照されたい］；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系列フレームワーク領域［例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ  （２００８）  Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  １３：１６１９−１６３３を参照されたい］：およびＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域［例えば、Ｂａｃａ  ｅｔ  ｃｄ．，  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：１０６７８−１０６８４；およびＲｏｓｏｋ  ｅｔ  ｃｄ．，  （１９９６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：２２６１１−２２６１８を参照されたい］が挙げられる。
【０２１０】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を使用して生成することができる。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ  （２００１）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ５：  ３６８−７４およびＬｏｎｂｅｒｇ  （２００８）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０：４５０−４５９に記載されている。
【０２１１】
ヒト抗体は、免疫原［例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３）  ＴβＲＩＩ、ベータグリカン、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、およびＢ７−Ｈ４］を、抗原負荷に応答して、無傷ヒト抗体またはヒト可変領域を有する無傷抗体を生成するように改変されたトランスジェニック動物に投与することによって、調製され得る。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、または染色体外に存在するか、もしくは動物の染色体にランダムに統合される、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部分を含有する。このようなトランスジェニック動物において、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説として、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ  （２００５）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３：１１１７−１１２５；米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，５８４号（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載している）；米国特許第５，７７０，４２９号（ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している）；米国特許第７，０４１，８７０号（Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している）；ならびに米国特許出願公開第２００７／００６１９００号（ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している）を参照されたい。このような動物によって作製される無傷抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに改変され得る。
【０２１２】
本明細書に提供されるヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によって作成することもできる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞系が記載されている［例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  （１９８４）  １３３：  ３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐｐ．  ５１−６３，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４７：  ８６を参照されたい］。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により作製されるヒト抗体はまた、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １０３：３５５７−３５６２に記載されている。追加の方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞系からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）およびＮｉ，  Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ  （２００６）  ２６（４）：２６５−２６８  （２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されるものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ  （２００５）  Ｈｉｓｔｏｌ．  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．，  ２０（３）：９２７−９３７  （２００５）およびＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ  （２００５）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｉｎｄ  Ｅｘｐ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  ２７（３）：１８５−９１に記載されている。
【０２１３】
本明細書に提供されるヒト抗体はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって作製してもよい。このような可変ドメイン配列は、次いで、所望のヒト定常ドメインと組み合わされ得る。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術は、本明細書に記載される。
【０２１４】
例えば、本開示の抗体は、所望の活性（１つまたは複数）を有する抗体について、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって、単離され得る。ファージディスプレイライブラリーを作製するため、および所望の結合特性を保有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための、種々の方法が当技術分野において公知である。このような方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７，  Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎ．Ｊ．において概説されており、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４；  Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：  ６２４−６２８；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１−５９７；Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ  （２００３）  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５，  Ｌｏ，  ｅｄ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎ．Ｊ．；Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３３８（２）：２９９−３１０；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３４０（５）：１０７３−１０９３；  Ｆｅｌｌｏｕｓｅ  （２００４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２；およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：  １１９−１３２にさらに記載されている。
【０２１５】
ある特定のファージディスプレイ法では、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別にクローニングし、ファージライブラリーにランダムに組換えし、次いで、これをＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １２：  ４３３−４５５に記載されているようにして、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、またはＦａｂ断片としてのいずれかで、抗体断片を提示する。免疫された供給源由来のライブラリーは、ハイブリドーマを構築する要件なしで、免疫原［例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３）  ＴβＲＩＩ、ベータグリカン、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、およびＢ７−Ｈ４］に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  ＥＭＢＯ  Ｊ、１２：  ７２５−７３４に記載されるようにして、ナイーブレパートリーを、クローニングして（例えば、ヒトから）、任意の免疫化なしで、広範囲の非自己抗原に対し、自己抗原にも対する抗体の単一供給源を提供することができる。最後に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ  （１９９２）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２７：  ３８１−３８８に記載されるようにして、幹細胞由来の再構成されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して、高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再構成を達成することによって、ナイーブライブラリーを合成的に作成することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許刊行物としては、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、米国特許出願公開第２００５／０１１９４５５号、米国特許出願公開第２００５／０２６６０００号、米国特許出願公開第２００７／０１１７１２６号、米国特許出願公開第２００７／０１６０５９８号、米国特許出願公開第２００７／０２３７７６４号、米国特許出願公開第２００７／０２９２９３６号および米国特許出願公開第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
【０２１６】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体（典型的には、モノクローナル抗体）は、１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６またはそれよりも多い）抗原に対する、少なくとも２つの異なるエピトープ（例えば、２、３、４、５もしくは６またはそれよりも多い）に対する結合特異性を有する。
【０２１７】
「オクトパス抗体」を含む、３つまたはそれよりも多くの機能的抗原結合部位を有する遺伝子操作された抗体も本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号を参照されたい）。
【０２１８】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体とは、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体、すなわち、この集団を構成する個々の抗体が、同一であるか、および／または同じエピトープに結合することを指すが、例えば、天然に存在する変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の生成の間に生じる、可能性があるバリアント抗体は除き、このようなバリアントは、一般に、少量で存在する。典型的には異なるエピトープに対して作られる異なる抗体を含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープに対して作られる。そのため、「モノクローナル」という修飾語句は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含む種々の技術によって作成され得、このような方法およびモノクローナル抗体を作成するための他の例示的な方法は本明細書に記載される。
【０２１９】
例えば、アクチビンＡに由来する免疫原を使用することによって、抗タンパク質／抗ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体は、標準的なプロトコールによって作成することができる［例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８８）  ｅｄ．  ｂｙ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい］。マウス、ハムスターまたはウサギなどの哺乳動物を、アクチビンＡポリペプチドの免疫原性形態、抗体応答を誘発する能力がある抗原性断片、または融合タンパク質で免疫することができる。タンパク質またはペプチドに対して免疫原性を付与するための技術としては、担体へのコンジュゲーション、または当技術分野において周知の他の技術が挙げられる。アクチビンＡポリペプチドの免疫原性部分は、アジュバントの存在中で投与することができる。免疫化の進行は、血漿または血清中の抗体価の検出によって、監視することができる。標準的なＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイを、抗体産生のレベルおよび／または結合親和性のレベルを評価するための抗原としての免疫原とともに使用することができる。
【０２２０】
アクチビンＡの抗原性調製物による動物の免疫後、抗血清を得ることができ、所望により、ポリクローナル抗体を、血清から単離することができる。モノクローナル抗体を生成するために、抗体産生細胞（リンパ球）を、免疫された動物から回収し、標準的な体細胞融合手順によって、ミエローマ細胞などの不死化細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。このような技術は、当技術分野において周知であり、例えば、ハイブリドーマ技術［例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  （１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：  ４９５−４９７を参照されたい］、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術［例えば、Ｋｏｚｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，  ４：７２を参照されたい］、およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶハイブリドーマ技術［Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  ｐｐ．  ７７−９６］が挙げられる。ハイブリドーマ細胞は、アクチビンＡポリペプチドと特異的反応性の抗体の産生のために、免疫化学的にスクリーニングすることができ、モノクローナル抗体を、このようなハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離することができる。
【０２２１】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変を、本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによってＦｃ領域バリアントを作製し得る。Ｆｃ領域バリアントは、１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば、置換、欠失および／または付加）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでいてもよい。
【０２２２】
例えば、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の半減期が重要である適用に対する望ましい候補にする、一部の、しかしすべてではないエフェクター機能を持つ抗体バリアントを企図し、それにもかかわらず、ある特定のエフェクター機能［例えば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）］は不必要または有害である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害アッセイを実施して、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低減／欠乏を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体がＦｃγＲ結合性を欠くが（そのため、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性がある）、ＦｃＲｎ結合能を保持していることを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ  （１９９１）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９：４５７−４９２に概説されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２；米国特許第５，８２１，３３７号；およびＢｒｕｇｇｅｍａｎｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）    Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６６：１３５１−１３６１に記載されている。あるいは、非放射活性アッセイ法を用いてもよい（例えば、ＡＣＴＩ（商標）、フローサイトメトリー用の非放射活性細胞傷害アッセイ；ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．；およびＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）、非放射活性細胞傷害性アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）。このようなアッセイのために有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、または加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６に開示されているものなどの動物モデルで評価してもよい。Ｃ１ｑ結合アッセイもまた、抗体がＣ１ｑに結合することができず、そのため、ＣＤＣ活性を欠くことを確認するために行ってもよい［例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号および国際公開第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい］。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行なってもよい［例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３；Ｃｒａｇｇ，  Ｍ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２；およびＣｒａｇｇ，  Ｍ．  Ｓ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｊ．  Ｇｌｅｎｎｉｅ  （２００４）  Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３を参照されたい］。ＦｃＲｎ結合およびｉｎ  ｖｉｖｏのクリアランス／半減期の決定は、当技術分野において公知の方法を使用して行うこともできる［例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，  Ｓ．  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８（１２）：１７５９−１７６９を参照されたい］。
【０２２３】
低減したエフェクター機能を有する本開示の抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９の１つまたは複数の置換を有する抗体が挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ変異体としては、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７および３２７の２つまたはそれよりも多くに置換を有するＦｃ変異体が挙げられ、残基２６５および２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０２２４】
ある特定の実施形態では、システインが遺伝子操作された抗体を作出することが望ましいことがあり、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ」は、抗体の１つまたは複数の残基がシステイン残基と置換されている。特定の実施形態では、置換された残基は、抗体のアクセス可能部位に存在する。それらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、抗体を、薬物部分またはリンカー−薬物部分などの他の部分とコンジュゲートするために使用して、本明細書においてさらに記載されるようにして、免疫コンジュゲートを作出し得る。ある特定の実施形態では、以下の残基のいずれか１つまたは複数が、システインで置換されていてもよい：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システインが遺伝子操作された抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるようにして、作製してもよい。
【０２２５】
加えて、望ましい抗体を特定するために、抗体をスクリーニングするために使用される技術は、得られる抗体の特性に影響を与えることがある。例えば、抗体が溶液中で抗原を結合するために使用される場合、溶液の結合を試験することが望ましくあり得る。様々な異なる技術を、特定の望ましい抗体を特定するために、抗体および抗原の間の相互作用を試験するために利用可能である。様々な技術としては、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）結合アッセイ、ＢｉａｃｏｒｅＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄの常磁性ビーズシステム）、ウエスタンブロット、免疫沈降アッセイおよび免疫組織化学的検査が挙げられる。
【０２２６】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体および／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、抗体および／もしくは結合ポリペプチドの結合親和性ならびに／または他の生物学的特性を改善することが望ましくあり得る。抗体および／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、抗体および／または結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することによって、あるいはペプチド合成によって、調製され得る。このような改変としては、例えば、抗体および／もしくは結合ポリペプチドのアミノ酸配列からの欠失、ならびに／またはこのアミノ酸配列への挿入、ならびに／またはこのアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。欠失、挿入および置換の任意の組合せは、最終構築物が所望の特性、例えば、標的との結合（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、およびアクチビンＡＣ）、ＴＧＦβ（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３）  ＴβＲＩＩ、ベータグリカン、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、およびＢ７−Ｈ４の結合）を持つならば、最終構築物に達するために行うことができる。
【０２２７】
変更（例えば、置換）は、例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲにおいて行なってもよい。このような変更は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基において（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  （２００８）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０７：１７９−１９６  （２００８）を参照されたい）、および／またはＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）において行なうことができ、得られるバリアントＶＨまたはＶＬは、結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築し、二次ライブラリーから再選択することによる親和性成熟は、当技術分野において記載されている［例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ    Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７，  Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎ．Ｊ．，  （２００１）を参照されたい］。親和性成熟の一部の実施形態では、多様性は、任意の種々の方法によって、成熟のために選択された可変遺伝子に導入される（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド定方向変異誘発）。次いで、二次ライブラリーが作出される。次いで、ライブラリーを、所望の親和性を有する任意の抗体バリアントを特定するためにスクリーニングする。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６残基）がランダム化される、ＨＶＲ定方向アプローチを含む。抗原結合性に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを使用して、具体的に特定され得る。特に、ＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ３が、多くの場合、標的にされる。
【０２２８】
ある特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、このような変更が、抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減させない限り、１つまたは複数のＨＶＲ内で生じさせ得る。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的変更（例えば、本明細書に提供されるような保存的置換）を、ＨＶＲにおいて行なってもよい。このような変更は、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＳＤＲの外側であり得る。上記において提供されるバリアントＶＨおよびＶＬ配列のある特定の実施形態では、それぞれのＨＶＲは、変更されていないか、または１、２もしくは３以下のアミノ酸置換を含むかのいずれかである。
【０２２９】
変異誘発のために標的にされ得る抗体および／または結合ポリペプチドの残基または領域の特定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  （１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４４：１０８１−１０８５に記載されているように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕなどの荷電残基）の残基または基が特定され、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えられて、抗体または結合ポリペプチドと抗原の相互作用が影響を受けるか否かを決定する。さらなる置換を、最初の置換に対する機能的感受性を実証するアミノ酸位置に導入してもよい。あるいは、または加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を使用して、抗体および抗原の間の接触点を特定することができる。このような接触残基および隣接する残基は、置換の候補として標的にされてもよく、または除外されてもよい。バリアントは、それらが所望の特性を含有するか否かを決定するためにスクリーニングされ得る。
【０２３０】
アミノ酸配列の挿入は、１残基から１００またはそれよりも多くの残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列間挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントとしては、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴについて）もしくは抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドとの抗体のＮ末端またはＣ末端の融合が挙げられる。
【０２３１】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体および／または結合ポリペプチドは、当技術分野において公知であって、容易に入手可能である、追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに改変されていてもよい。抗体および／または結合ポリペプチドの誘導体化のために好適な部分としては、限定されるものではないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性に起因して、製造中の利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであってもよく、分岐または非分岐であってもよい。抗体および／または結合ポリペプチドに付着するポリマーの数は変更されてもよく、２以上のポリマーが付着する場合、それらは、同じまたは異なる分子であり得る。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数および／または種類は、限定されるものではないが、抗体誘導体および／または結合ポリペプチド誘導体が規定された条件下での治療において使用されるかに関わらず、改善される抗体および／もしくは結合ポリペプチドの特定の特性または機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
【０２３２】
５．低分子アンタゴニスト
他の態様では、本開示は、低分子、または低分子の組合せであるアクチビンアンタゴニスト、ＴＧＦβアンタゴニスト、および／または免疫チェックポイントアンタゴニストに関する。特に、本開示は、一部分では、このような低分子を、アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴＧＦβアンタゴニストドメイン、および免疫チェックポイントアンタゴニストドメインの２つまたはそれより多くを含む二機能性または三機能性融合タンパク質と組み合わせて使用して、本明細書に記載の１つまたは複数の疾患または状態（例えば、がん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、および異形成障害）を処置または予防することに関する。
【０２３３】
ある特定の態様では、低分子は、アクチビンアンタゴニストである。一部の実施形態では、低分子は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、および／またはアクチビンＡＣを阻害する。一部の実施形態では、低分子はアクチビンＡを阻害するが、アクチビンＢを阻害しないか、または実質的に阻害しない。一部の実施形態では、低分子はアクチビンＢを阻害するが、アクチビンＡを阻害しないか、または実質的に阻害しない。一部の実施形態では、低分子は、アクチビンＡおよびアクチビンＢを阻害する。一部の実施形態では、低分子はＡｃｔＲＩＩＡを阻害するが、ＡｃｔＲＩＩＢを阻害しないか、または実質的に阻害しない。一部の実施形態では、低分子はＡｃｔＲＩＩＢを阻害するが、ＡｃｔＲＩＩＡを阻害しないか、または実質的に阻害しない。一部の実施形態では、低分子は、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢを阻害する。
【０２３４】
ある特定の態様では、低分子は、ＴＧＦβアンタゴニストである。一部の実施形態では、低分子は、少なくともＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、および／またはＴＧＦβ３）を阻害する。一部の実施形態では、低分子は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３を阻害するが、ＴＧＦβ２を阻害しないか、または実質的に阻害しない。一部の実施形態では、低分子は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３を阻害する。一部の実施形態では、低分子は、ＴβＲＩＩを阻害する。一部の実施形態では、低分子は、ベータグリカンを阻害する。
【０２３５】
ある特定の態様では、低分子は、免疫チェックポイントアンタゴニストである。一部の実施形態では、低分子は、ＰＤ−１を阻害する。一部の実施形態では、低分子は、ＰＤ−Ｌ１を阻害する。一部の実施形態では、低分子は、ＣＴＬＡ４を阻害する。一部の実施形態では、低分子は、ＢＴＬＡを阻害する。一部の実施形態では、低分子は、ＬＡＧ３を阻害する。一部の実施形態では、低分子は、ＴＩＭ３を阻害する。一部の実施形態では、低分子は、ＬＡＩＲ１を阻害する。一部の実施形態では、低分子は、Ｂ７−ＤＣを阻害する。一部の実施形態では、低分子は、ＨＶＥＭを阻害する。一部の実施形態では、低分子は、ＴＩＭ４を阻害する。一部の実施形態では、低分子は、Ｂ７−Ｈ３を阻害する。一部の実施形態では、低分子は、Ｂ７−Ｈ４を阻害する。
【０２３６】
小分子アンタゴニストは、直接的または間接的な阻害剤であり得る。例えば、間接的な小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、少なくとも１つもしくは複数のタンパク質［例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３  ＴβＲＩＩ、ベータグリカン、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、およびＢ７−Ｈ４］の発現（例えば、転写、翻訳、細胞分泌、またはそれらの組合せ）を阻害することができる。代替的に、直接的な小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、例えば、１つもしくは複数のタンパク質［アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３  ＴβＲＩＩ、ベータグリカン、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、およびＢ７−Ｈ４］に直接的に結合し、そうすることで前記１つもしくは複数のタンパク質の活性を阻害することができる。１つまたは複数の間接的な小分子アンタゴニストおよび１つまたは複数の直接的な小分子アンタゴニストの組合せを、本明細書で開示される方法に従って使用することができる。
【０２３７】
本開示の結合有機低分子アンタゴニストは、公知の方法論（例えば、ＰＣＴ公開の国際公開第００／００８２３号および国際公開第００／３９５８５号を参照されたい）を使用して、特定および化学合成され得る。一般に、本開示の低分子アンタゴニストは、通常、約２０００ダルトン未満のサイズ、あるいは約１５００、７５０、５００、２５０または２００ダルトン未満のサイズであり、このような有機低分子は、好ましくは、本明細書に記載のポリペプチドに特異的に結合する能力がある。このような低分子アンタゴニストは、周知の技術を使用して、過度の実験なく特定され得る。これに関して、ポリペプチド標的に結合する能力がある分子についての有機低分子ライブラリーをスクリーニングするための技術は、当技術分野において周知であることに留意されたい（例えば、国際出願公開の国際公開第００／００８２３号および国際公開第００／３９５８５号を参照されたい）。
【０２３８】
本開示の結合有機低分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミン、Ｎ−置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、ウレア、カルバメート、カーボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、アリールスルホネート、ハロゲン化アルキル、アルキルスルホネート、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、塩化スルホニル、ジアゾ化合物、および酸塩化物であり得る。
【０２３９】
６．ポリヌクレオチドアンタゴニスト
他の態様では、本開示は、ポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドの組合せであるアクチビンアンタゴニスト、ＴＧＦβアンタゴニスト、および／または免疫チェックポイントアンタゴニストに関する。特に、本開示は、一部分では、このようなポリヌクレオチドを、アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴＧＦβアンタゴニストドメイン、および免疫チェックポイントアンタゴニストドメインの２つまたはそれより多くを含む二機能性または三機能性融合タンパク質と組み合わせて使用して、本明細書に記載の１つまたは複数の疾患または状態（例えば、がん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、および異形成障害）を処置または予防することに関する。
【０２４０】
ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは、アクチビンアンタゴニストである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくともアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、および／またはアクチビンＡＣ）を阻害する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはアクチビンＡを阻害するが、アクチビンＢを阻害しないか、または実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはアクチビンＢを阻害するが、アクチビンＡを阻害しないか、または実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、アクチビンＡおよびアクチビンＢを阻害する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはＡｃｔＲＩＩＡを阻害するが、ＡｃｔＲＩＩＢを阻害しないか、または実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはＡｃｔＲＩＩＢを阻害するが、ＡｃｔＲＩＩＡを阻害しないか、または実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢを阻害する。
【０２４１】
ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは、ＴＧＦβアンタゴニストである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくともＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、および／またはＴＧＦβ３）を阻害する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３を阻害するが、ＴＧＦβ２を阻害しないか、または実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３を阻害する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＴβＲＩＩを阻害する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ベータグリカンを阻害する。
【０２４２】
ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは、免疫チェックポイントアンタゴニストである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＰＤ−１を阻害する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＰＤ−Ｌ１を阻害する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＴＬＡ４を阻害する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＢＴＬＡを阻害する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＬＡＧ３を阻害する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＴＩＭ３を阻害する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＬＡＩＲ１を阻害する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｂ７−ＤＣを阻害する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＨＶＥＭを阻害する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＴＩＭ４を阻害する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｂ７−Ｈ３を阻害する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｂ７−Ｈ４を阻害する。
【０２４３】
本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストは、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ分子［例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）］、アプタマーおよび／またはリボザイムであり得る。ヒトＴアクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３  ＴβＲＩＩ、ベータグリカン、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、およびＢ７−Ｈ４の核酸ならびにアミノ酸配列は、当技術分野において公知であり、したがって、本開示の方法による使用のためのポリヌクレオチドアンタゴニストは、当技術分野における知識および本明細書に提供される教示に基づいて、当業者によって日常的に作成され得る。
【０２４４】
例えば、アンチセンス技術は、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡにより、または三重らせん形成により、遺伝子発現を制御するために使用することができる。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ  （１９９１）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ５６：５６０；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌａ．  （１９８８）において議論されている。三重らせん形成は、例えば、Ｃｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４５６；およびＤｅｒｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３００において議論されている。これらの方法は、ポリヌクレオチドの相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。一部の実施形態では、アンチセンス核酸は、所望の遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部分に対して相補的な一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含む。しかしながら、絶対的な相補性は、好ましいが、必要でない。
【０２４５】
本明細書で言及される「ＲＮＡの少なくとも一部分に対して相補的」な配列とは、ＲＮＡとハイブリダイズして、安定な二重鎖を形成することが可能であるのに十分な相補性を有する配列を意味し；本明細書に開示される遺伝子の二本鎖アンチセンス核酸の場合では、したがって、二重鎖ＤＮＡの一本鎖が試験され得るか、または三重鎖形成がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般に、ハイブリダイズする核酸が大きいほど、それが含有し得、安定な二重鎖（または場合によっては三重鎖）を依然として形成し得るＲＮＡとの塩基ミスマッチが多くなる。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定するための標準的手順の使用によって、容認できるミスマッチの程度を確かめることができる。
【０２４６】
メッセージの５’末端、例えば、ＡＵＧ開始コドンまで、およびＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列に対して相補的であるポリヌクレオチドは、翻訳を阻害する際に最も効率的に働くはずである。しかしながら、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に対して相補的な配列は、同様に、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に有効であることが示されている［例えば、Ｗａｇｎｅｒ，  Ｒ．，  （１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３−３３５を参照されたい］。したがって、本開示の遺伝子の５’または３’非翻訳非コード領域のいずれかに対して相補的なオリゴヌクレオチドは、内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害するためのアンチセンスアプローチにおいて使用することができるであろう。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に対して相補的なポリヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補体を含むはずである。ｍＲＮＡコード領域に対して相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは、あまり効果的ではない翻訳の阻害剤であるが、本開示の方法に従って使用することができるであろう。本開示のｍＲＮＡの５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域またはコード領域とハイブリダイズするように設計されているかに関わらず、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長でなければならず、好ましくは、６〜約５０ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオチドである。詳細な態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０２４７】
一実施形態では、本開示のアンチセンス核酸は、外因性配列からの転写によって、細胞内で生成される。例えば、ベクターまたはその一部分は、転写され、本開示の遺伝子のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を生成する。このようなベクターは、所望のアンチセンス核酸をコードする配列を含有するであろう。このようなベクターは、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを生成することができる限り、エピソームに残ったままであり得るか、または染色体に統合され得る。このようなベクターは、当技術分野において標準的な組換えＤＮＡ技術の方法によって構築することができる。ベクターは、脊椎動物細胞における複製および発現のために使用される、プラスミド、ウイルス、または当技術分野において公知の他のものであり得る。本開示の所望の遺伝子をコードする配列、またはその断片の発現は、脊椎動物細胞、好ましくは、ヒト細胞中で作用する、当技術分野において公知の任意のプロモーターによってであり得る。このようなプロモーターは、誘導的または構成的であり得る。このようなプロモーターとしては、限定されるものではないが、ＳＶ４０早期プロモーター領域［例えば、Ｂｅｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ  （１９８１）  Ｎａｔｕｒｅ  ２９：３０４−３１０を参照されたい］、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列に含有されるプロモーター［例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８０）  Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７を参照されたい］、ヘルペスチミジンプロモーター［例えば、Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７８：１４４１−１４４５を参照されたい］、およびメタロチオネイン遺伝子の調節配列［例えば、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８２）  Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２を参照されたい］が挙げられる。
【０２４８】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドアンタゴニストは、１つまたは複数の遺伝子の発現を標的にする干渉ＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子である。ＲＮＡｉとは、標的化ｍＲＮＡの発現に干渉するＲＮＡの発現を指す。詳細には、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）による特異的ｍＲＮＡとの相互作用を介して、標的化遺伝子を発現抑制する。ｄｓＲＮＡ複合体は、次いで、細胞による分解に対して標的にされる。ｓｉＲＮＡ分子は、十分に相補的（例えば、その遺伝子に対して少なくとも８０％の同一性）な標的遺伝子の発現に干渉する、１０〜５０ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ二重鎖である。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０２４９】
追加のＲＮＡｉ分子としては、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、また短干渉ヘアピンおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。ｓｈＲＮＡ分子は、ループによって連結された標的遺伝子由来のセンス配列およびアンチセンス配列を含有する。ｓｈＲＮＡは、核から細胞質に輸送され、ｍＲＮＡとともに分解される。Ｐｏｌ  ＩＩＩまたはＵ６プロモーターは、ＲＮＡｉのためにＲＮＡを発現するために使用することができる。Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．［Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．  （２００２）  １６：９４８−９５８，  ２００２］は、ＲＮＡｉに影響を及ぼす手段としてヘアピンへフォールディングされる低分子ＲＮＡ分子を使用している。したがって、このような短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子はまた、本明細書に記載の方法において有利に使用される。機能的ｓｈＲＮＡのステムおよびループの長さは様々であり、ステムの長さは約２５〜約３０ｎｔのどこかの範囲であり得、ループのサイズは、サイレンシング活性に影響を与えることのない、４〜約２５ｎｔの範囲内であり得る。任意の特定の理論に拘束されることは望まないが、これらのｓｈＲＮＡは、ＤＩＣＥＲ  ＲＮａｓｅの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）生成物と共通点があり、任意のイベントにおいて、特異的遺伝子の発現を阻害するための同じ能力を有する。ｓｈＲＮＡは、レンチウイルスベクターから発現させることができる。ｍｉＲＮＡは、「ステム−ループ」構造によって特徴付けられるプレｍｉＲＮＡとして最初に転写される約１０〜７０ヌクレオチド長の一本鎖ＲＮＡであり、その後、ＲＩＳＣによるさらなるプロセシング後に、成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされる。
【０２５０】
限定されないがｓｉＲＮＡを含むＲＮＡｉを媒介する分子は、化学合成（Ｈｏｈｊｏｈ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５２１：１９５−１９９，  ２００２）、ｄｓＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：９９４２−９９４７，  ２００２）によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって（Ｄｏｎｚｅｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：ｅ４６，  ２００２；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：６０４７−６０５２，  ２００２）、およびＥ．ｃｏｌｉのＲＮａｓｅ  ＩＩＩなどのヌクレアーゼを使用する二本鎖ＲＮＡの加水分解によって（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：９９４２−９９４７，  ２００２）、生成され得る。
【０２５１】
別の態様によれば、本開示は、限定されるものではないが、デコイＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、複合体化ＤＮＡ、カプセル化ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ネイキッドＲＮＡ、カプセル化ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉を生じさせる能力がある分子、またはこれらの組合せを含む、ポリヌクレオチドアンタゴニストを提供する。
【０２５２】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストはアプタマーである。アプタマーは、二本鎖ＤＮＡ分子および一本鎖ＲＮＡ分子を含む、核酸分子であって、これは、結合して、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３  ＴβＲＩＩ、ベータグリカン、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、およびＢ７−Ｈ４ポリペプチドなどの標的分子に特異的に結合する三次構造を形成する。アプタマーの作製および治療的使用は、当技術分野において十分に確立されている。例えば、米国特許第５，４７５，０９６号を参照されたい。アプタマーについての追加の情報は、米国特許出願公開第２００６０１４８７４８号に見ることができる。核酸アプタマーは、例えば、指数的富化によるリガンドの系統進化（ＳＥＬＥＸ）プロセスを介して、当技術分野において公知の方法を使用して選択される。ＳＥＬＥＸは、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、米国特許第５，５８０，７３７号、米国特許第５，５６７，５８８号、米国特許第５，７０７，７９６号、米国特許第５，７６３，１７７号、米国特許第６，０１１，５７７号および米国特許第６，６９９，８４３号に記載の、標的分子に対する高度に特異的な結合を有する核酸分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化のための方法である。アプタマーを特定するための別のスクリーニング方法は、米国特許第５，２７０，１６３号に記載されている。ＳＥＬＥＸプロセスは、種々の二次元および三次元構造を形成するための核酸の能力、ならびに実質的に、単量体または多量体のいずれであるかに関わらず、他の核酸分子およびポリペプチドを含む、任意の化学化合物とともに、リガンドとして機能する（特異的結合対を形成する）ためのヌクレオチド単量体内で利用可能な化学的多様性に基づく。任意のサイズまたは組成の分子が、標的としての機能を果たし得る。ＳＥＬＥＸ法は、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択、ならびに所望の結合親和性および選択性を達成するために、同じ一般的な選択スキームを使用して、結合、分割および増幅の段階的な反復を含む。ランダム化配列のセグメントを含み得る、核酸の混合物から開始して、ＳＥＬＥＸ法は、混合物を結合のために有利な条件下で標的と接触させるステップ；標的分子に特異的に結合しているそれらの核酸から未結合の核酸を分割するステップ；核酸−標的複合体を解離させるステップ；核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅して、核酸のリガンド富化混合物を得るステップを含む。結合、分割、解離および増幅のステップは、所望により、多くのサイクルを繰り返して、標的分子に対して非常に特異的な高親和性の核酸リガンドを与える。
【０２５３】
典型的には、このような結合分子は、動物に対して別々に投与されるが［例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  （１９９１）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ５６：５６０を参照されたい］、このような結合分子はまた、宿主細胞によって取り込まれ、ｉｎ  ｖｉｖｏで発現されるポリヌクレオチドから、ｉｎ  ｖｉｖｏで発現させることができる［例えば、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌａ．  （１９８８）を参照されたい］。
【０２５４】
８．例示的な治療的使用
本明細書で使用される場合、障害または状態を「予防する」治療薬とは、統計学的試料中で、未処置の対照試料と比べて、処置試料における障害もしくは状態の発生を低減させるか、あるいは未処置の対照試料と比べて、障害または状態の１つもしくは複数の症状の発生を遅延させるか、またはその症状の重症度を低減させる化合物を指す。
【０２５５】
「処置」、「処置すること」、「緩和」などの用語は、本明細書において、一般に、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを意味し、処置される状態の１つもしくは複数の症状の重症度を改善すること、緩和すること、および／または減少させることを指すためにも使用され得る。効果は、疾患、状態もしくはその症状の開始または再発を、完全または部分的に遅延させる観点から予防的であってもよく、ならびに／あるいは疾患もしくは状態、および／または疾患もしくは状態に起因する有害効果を、部分的または完全に治癒させる観点で治療的であってもよい。本明細書で使用される「処置」は、哺乳動物、特に、ヒトの疾患または状態の任意の処置を包含し、（ａ）疾患もしくは状態に罹患しやすくあり得るが、それを有するとまだ診断されていない対象において生じる疾患または状態を予防すること；（ｂ）疾患もしくは状態を阻害すること（例えば、その発生を阻止すること）；あるいは（ｃ）疾患もしくは状態を軽減すること（例えば、疾患もしくは状態の退行を引き起こすこと、１つもしくは複数の症状の改善を提供すること）を含む。
【０２５６】
「患者」、「対象」または「個体」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかを指す。これらの用語には、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、実験動物、家畜動物（ウシ、ブタ、ラクダなどを含む）、コンパニオン動物（例えば、イヌ、ネコ、他の飼育動物など）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）を含む。特定の実施形態では、患者、対象または個体はヒトである。
【０２５７】
本明細書で使用される場合、「組合せ」、「との組み合わせで」、「共投与」などは、第２の療法が身体内で依然として有効であるように（例えば、２つの化合物が、患者において同時に有効であり、これは、２つの化合物の相乗効果を含み得る）、任意の形態の投与を指す。有効性は、血液、血清または血漿中の薬剤の測定可能な濃度に関連しないことがある。例えば、異なる治療用化合物は、同じ製剤中または別々の製剤中のいずれかで、同時的または逐次的のいずれかで、異なるスケジュールで投与することができる。したがって、このような処置を受ける個体は、異なる療法の組合せ効果から利益を得ることができる。本開示の１つまたは複数の二機能性または三機能性融合タンパク質は、１つもしくは複数の他の追加薬剤または支持療法と同時に、その前に、またはその後に、投与することができる。一般に、それぞれの治療剤は、特定の薬剤について決定された用量および／またはタイムスケジュールで投与される。レジメンにおいて用いられる特定の組合せは、達成される療法および／または所望の治療効果とともに、本開示のアンタゴニストの適合性を考慮に入れる。
【０２５８】
一部分では、本明細書で示すデータは、アクチビンアンタゴニストおよびＴＧＦβアンタゴニストを単独でまたは組み合わせて使用して、がんを処置することができることを実証する。特に、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、または汎特異的ＴＧＦβ抗体による処置が、がんモデルにおいて、別々に、腫瘍負荷を低下させ、生存時間を増加させることが示された。さらに、アクチビンアンタゴニストをＴＧＦβアンタゴニストと組み合わせて使用して、いずれかの薬剤単独に関して観察された効果と比較して、抗腫瘍活性を相乗的に増加させることができることが示された。いずれの特定の理論に拘束されることも望まないが、このようなアクチビンおよびＴＧＦβアンタゴニストは、単独で、または免疫チェックポイントアンタゴニスト（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、および／またはＢ７−Ｈ４の１つまたは複数に結合するおよびそれを阻害する抗体、またはその抗原結合断片）と組み合わせて使用した場合、がんを処置するのに特に有用であり得ると考えられる。したがって、本開示は、一部分では、アクチビンアンタゴニストドメイン、ＴＧＦβアンタゴニストドメイン、および免疫チェックポイントアンタゴニストドメインから選択される２つまたはそれより多くのドメインを含む、二機能性および三機能性融合タンパク質を提供する。本開示は、例えば、がん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、または異形成障害を処置するために、このような二機能性および三機能性融合タンパク質を使用する方法をさらに提供する。必要に応じて、このような方法は、がん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、または異形成障害を処置するための追加の活性薬剤または支持療法を患者に投与することをさらに含む。他の公知の腫瘍免疫療法剤と同様に、このような二機能性および三機能性融合タンパク質が患者の免疫応答を増強する能力は、がんの分野以外のより広い治療との関連を有し得る。例えば、免疫増強剤は、多種多様な感染性疾患、特に免疫抑制および／または免疫疲弊を促進する病原体を処置するのに有用であり得ることが提案されている。また、このような免増強剤は、ワクチン（例えば、感染性疾患およびがんのワクチン）の免疫化の有効性をブーストするのに有効であり得る。
【０２５９】
一般に、「腫瘍」は、良性および悪性のがん、ならびに休眠腫瘍を指す。一般的に、「がん」は、原発性悪性細胞または腫瘍（例えば、細胞が、元の悪性腫瘍または腫瘍の部位以外の対象の体の部位に移動していないもの）および二次悪性細胞または腫瘍（例えば、転移、元の腫瘍の部位と異なる二次的な部位への悪性細胞または腫瘍細胞の移動から生じるもの）を指す。転移は、局所的または遠位であり得る。転移は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、血液および血小板数、肝機能研究、胸部Ｘ線、特異的症状のモニタリングに加えた骨のスキャン、ならびにこれらの組合せの単一のまたは組み合わせた使用によって、最も高い頻度で検出される。
【０２６０】
本開示の二機能性および三機能性融合タンパク質を使用して、限定されるものではないが、膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、子宮頚部、膵臓、直腸、前立腺、胃、表皮、および脳のがんを含む、様々な形態のがん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、および異形成障害を処置することができる。本開示の二機能性および三機能性融合タンパク質によって処置され得るがんの例は、限定されるものではないが、リンパ系または骨髄系の造血器腫瘍、線維肉腫または横紋筋肉腫などの間葉起源の腫瘍、黒色腫、眼球内黒色腫、非黒色腫皮膚がん、奇形癌腫、神経芽腫、神経膠腫、脳幹神経膠腫、視覚路および視床下部の神経膠腫、乏突起神経膠腫、腺癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、癌腫、非小細胞肺癌、肝細胞腫、肝細胞癌、子宮内膜がんまたは子宮癌、唾液腺癌、分化甲状腺癌、肺の癌腫、陰茎癌、副腎皮質癌、内分泌膵島細胞癌、結腸癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肛門癌、胆管癌、絨毛癌、胚性癌腫、上皮細胞癌、リンパ腫、成人ホジキンリンパ腫、成人非ホジキンリンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、セミノーマ、神経膠芽腫、多形神経膠芽腫、肉腫、ユーイング肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、軟組織肉腫、カポジ肉腫、骨／悪性線維肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、サルコイドーシス肉腫、子宮肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病、ヘアリー細胞白血病、骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病、骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、慢性骨髄球性白血病、白血病  骨肉腫、多発性骨髄腫、リンパ系腫瘍、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ）、扁平上皮癌（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ）、腹膜の扁平上皮癌、頚部扁平上皮癌、転移性頚部扁平上皮癌、転移性頚部扁平上皮癌、潜在性転移性頚部扁平上皮癌、ウィルムス腫瘍、星状細胞腫、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肝細胞がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がん、胃腸がん、消化管カルチノイド腫瘍、膵臓がん、外分泌膵臓がん、膵島細胞膵臓がん、子宮頸がん、子宮頸部異形成、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、肝臓がん、神経内分泌腫瘍、甲状腺髄様癌、副甲状腺がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、腎臓または腎がん、前立腺がん、外陰がん、頭頚部がん、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門がん、星状細胞腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、胆管がん、肝外胆管がん、骨がん、骨の線維性骨異形成症、脳腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、胚細胞腫瘍、ホジキン病、髄芽腫、松果体腫瘍、松果体腫、テント上神経外胚葉性腫瘍（ｓｕｐｒａｔｅｎｔｏｒｉａｌ  ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ  ｔ��ｍｏｒ）、上衣腫、上皮がん、上皮性異形成、粘膜上皮異形成、食道がん、食道異形成、眼のがん、ゴーシェ病、胆嚢がん、妊娠性絨毛腫瘍、絨毛性腫瘍、高ガンマグロブリン血症、下咽頭がん、腸がん、腸ポリープまたは腺腫、小腸がん、大腸がん、喉頭がん、口唇または口腔がん、リンパ増殖性障害、マクログロブリン血症、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、中皮腫、悪性胸腺腫、胸腺腫、転移性潜在性形質細胞腫瘍、骨髄異形成症候群、骨増殖性障害、鼻腔または副鼻腔がん、上咽頭がん、中咽頭がん、パラプロテイン血症、陰茎がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、網膜芽細胞腫、唾液腺がん、セザリー症候群、皮膚がん、精巣がん、尿道がん、子宮がん、腟がん、無汗性外胚葉異形成、前後異形成、窒息性胸郭異形成、心房指異形成(atriodigital  dysplasia)、気管支肺異形成、大脳異形成、軟骨外胚葉異形成、鎖骨頭蓋異形成、先天性外胚葉異形成、頭蓋骨幹異形成、頭蓋手根足根骨異形成、頭蓋骨幹端異形成、象牙質異形成、骨幹異形成、外胚葉異形成、エナメル質異形成、脳眼異形成、骨端半肢形成異常、多発性骨端異形成、点状骨端異形成、顔面指趾生殖器異形成、家族性線維性顎異形成、家族性白色襞性異形成、線維筋性異形成、開花性骨異形成（ｆｌｏｒｉｄ  ｏｓｓｅｏｕｓ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、遺伝性腎−網膜異形成、発汗性外胚葉異形成、発汗減少性外胚葉異形成（ｈｙｐｏｈｉｄｒｏｔｉｃ  ｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、リンパ性減少性胸腺異形成（ｌｙｍｐｈｏｐｅｎｉｃ  ｔｈｙｍｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、乳腺異形成、下顎顔面異形成（ｍａｎｄｉｂｕｌｏｆａｃｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、骨幹端異形成（ｍｅｔａｐｈｙｓｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、Ｍｏｎｄｉｎｉ異形成、単骨性線維性骨異形成、多発性骨端異形成（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｐｉｐｈｙｓｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、眼耳脊椎異形成（ｏｃｕｌｏａｕｒｉｃｕｌｏｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、眼歯指異形成、眼脊椎異形成（ｏｃｕｌｏｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、歯牙異形成（ｏｄｏｎｔｏｇｅｎｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、眼下顎異形成（ｏｐｔｈａｌｍｏｍａｎｄｉｂｕｌｏｍｅｌｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、根尖性セメント質異形成（ｐｅｒｉａｐｉｃａｌ  ｃｅｍｅｎｔａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、多骨性線維性骨異形成、偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成（ｐｓｅｕｄｏａｃｈｏｎｄｒｏｐｌａｓｔｉｃ  ｓｐｏｎｄｙｌｏｅｐｉｐｈｙｓｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、網膜異形成、中隔視神経異形成、脊椎骨端異形成（ｓｐｏｎｄｙｌｏｅｐｉｐｈｙｓｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、心室橈骨異形成（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｏｒａｄｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、良性の繁殖異常（ｄｙｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）障害（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞性状態、組織肥大化、および）、白斑症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎（ｓｏｌａｒ  ｃｈｅｉｌｉｔｉｓ）、日光角化症、重鎖病、滑膜腫、頭蓋咽頭腫、血管芽腫（emangioblastoma）、聴神経腫瘍、ならびに髄膜腫が挙げられる。
【０２６１】
ある特定の態様では、本開示の二機能性および三機能性融合タンパク質を１つまたは複数の追加の活性薬剤または支持療法と組み合わせて使用して、様々な形態のがん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、および異形成障害を処置することができる。例えば、１つまたは複数のがん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、および異形成障害を処置するための追加の治療剤は、限定されるものではないが、細胞傷害剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、免疫調節剤、抗生剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ケモカイン、プロドラッグ、毒素、酵素または他の活性薬剤を含んだ。有用な追加の活性薬剤は、例えば：抗有糸分裂剤、抗キナーゼ剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生剤、アルカロイド剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、およびこれらの組合せから選択される医薬特性を有し得る。
【０２６２】
一部の実施形態では、追加の活性薬剤または支持療法としては、例えば、フルオロウラシル、アファチニブ、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、アキシチニブ、アミノグルテチミド、アムサクリン、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ブセレリン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ビカルタミド、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カペシタビン、カリケアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ−２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、クラドリビン、カンプトテカン、クリゾチニブ、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シプロテロン、クロドロネート、ダカルバジン、ダサチニブ、ジエンエストロール、ディナシクリブ、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノ−モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エルロチニブ、エストラムスチン、エピドフィロトキシン、エルロチニブ、エンチノスタット、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、エトポシドリン酸塩、エキセメスタン、フィルグラスチム、フィンゴリモド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、フルオキシメステロン、３’，５’−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルドロコルチゾン、フルダラビン、フルタミド、ゴセレリン、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、フラボピリドール、フォスタマチニブ、ガネテスピブ、ＧＤＣ−０８３４、ＧＳ−１１０１、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イブルチニブ、イダルビシン、レバミソール、イデラリシブ、イホスファミド、イマチニブ、レトロゾール、アスパラギナーゼ、ロイプロリド、ラパチニブ、レノリダミド、ロイコボリン、イロノテカン、ＬＦＭ−Ａ１３、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メゲストロール、メトトレキセート、ミトキサントロン、ニルタミド、ミトラマイシン、マイトマイシン、ノコダゾール、オクトレオチド、ミトタン、ナベルビン、ネラチニブ、ニロチニブ、ニトロソウレア、オラパリブ、プリコマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、オキサリプラチン、ＰＣＩ−３２７６５、ペントスタチン、プリカマイシン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、タモキシフェン、ポルフィマー、テモゾロミド、メスナ、テマゾロミド（ＤＴＩＣの水性形態）、トランスプラチナム、サリドマイド、チオグアニン、ラルチトレキセド、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、バタラニブ、ビノレルビン、ビンブラスチン、リツキシマブ、パミドロネート、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド、ＺＤ１８３９、リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（例えば、オンコナーゼ）  ＤＮａｓｅ  Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシン−��、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、シュードモナス内毒素、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ  １−アルファ、ＭＩＰ  １−ベータ、ＩＰ−１０、アンギオスタチン、バキュロスタチン、カンスタチン、マスピン、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＰｌＧＦペプチドおよび抗体、抗血管増殖因子抗体、抗Ｆｌｋ−１抗体、抗Ｆｌｔ−１抗体およびペプチド、抗Ｋｒａｓ抗体、抗ｃＭＥＴ抗体、抗ＭＩＦ（マクロファージ遊走−阻止因子）抗体、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン−１２、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−ベータ、トロンボスポンジン、２−メトキシエステラジオール（2-methoxyoestradiol）、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭ１０１、Ｍａｒｉｍａｓｔａｔ、ペントサンポリ硫酸、アンギオポイエチン−２、インターフェロン−アルファ、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、Ｌｉｎｏｍｉｄｅ（ロキニメックス）、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン、アンギオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板第四因子、ＡＬＫ１ポリペプチド（例えば、ダランテルセプト）、ミノサイクリン、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンフォトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、リンフォトキシン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、造血因子、インターロイキン（ＩＬ）、コロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン、インターフェロン−アルファ、ベータもしくはラムダ、幹細胞増殖因子、Ｓ１因子、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、糖タンパク質ホルモン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、肝細胞増殖因子、プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤ラクトーゲン、ＯＢタンパク質、腫瘍壊死因子−アルファおよび／もしくはベータ、ミューラー管抑制物質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、血管内皮成長因子、インテグリン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、神経成長因子、例えばＮＧＦ−ベータ、血小板成長因子、インスリン様成長因子−Ｉおよび／もしくは−ＩＩ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨誘導性因子、インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、ＬＩＦ、Ｋｉｔ−リガンドまたはＦＬＴ−３）、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子、ＬＴ、アルキル化剤、ニトロソウレア、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、アントラサイクリン、コルチコステロイドホルモン、性ホルモン、標的化抗腫瘍化合物、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、テモゾロミド、５−フルオロウラシル、カペシタビン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、ゲムシタビン、シタラビン（ａｒａ−Ｃ）、フルダラビン、ペメトレキセド、トポテカン、イリノテカン、エトポシド（ＶＰ−１６）、テニポシド、ダウノルビシン、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、エピルビシン、イダルビシン、またはミトキサントロンのうちの１つまたは複数が挙げられる。
【０２６３】
一部の実施形態では、追加の活性薬剤または支持療法は、例えば、１つまたは複数の放射性核種を含む。本開示の方法に従って使用することができる放射性核種としては、限定されるものではないが、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ｐｂ、および２２７Ｔｈが挙げられる。一部の実施形態では、治療用放射性核種は、好ましくは、２０〜６，０００ｋｅＶの範囲、好ましくはオージェ放射体に関しては６０〜２００ｋｅＶの範囲、ベータ放射体に関しては１００〜２，５００ｋｅＶの範囲、およびアルファ放射体に関しては４，０００〜６，０００ｋｅＶの範囲の崩壊エネルギーを有する。一般に、有用なベータ粒子放出核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは２０〜５，０００ｋｅＶ、より好ましくは１００〜４，０００ｋｅＶ、および最も好ましくは５００〜２，５００ｋｅＶである。オージェ放出粒子とともに実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。例えば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、Ｉ−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍおよびＩｒ−１９２である。有用なベータ粒子放出核種の崩壊エネルギーは、好ましくは１，０００ｋｅＶ未満であり、より好ましくは１００ｋｅＶ未満であり、および最も好ましくは７０ｋｅＶ未満である。アルファ粒子を生成しながら実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。このような放射性核種としては、限定されるものではないが：Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３、Ｔｈ−２２７およびＦｍ−２５５が挙げられる。有用なアルファ粒子を放出する放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２，０００〜１０，０００ｋｅＶ、より好ましくは３，０００〜８，０００ｋｅＶ、および最も好ましくは４，０００〜７，０００ｋｅＶである。有用な追加の潜在的放射性同位体としては、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５Ｂｒ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、．１６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、および１６９Ｙｂが挙げられる。
【０２６４】
一部の実施形態では、追加の活性薬剤または支持療法は、例えば、１つまたは複数の光活性薬剤または染料を含む。蛍光色素などの蛍光組成物、および他の色素原、または染料、例えば、可視光に対して感受性のポルフィリンを使用して、適切な光を病変に向けることによって、病変を検出および処置することができる。療法では、これは、光放射線、光線療法、または光力学療法と称されている。Joni  et  al.  (eds.),  (Libreria  Progetto  1985);  van  den  Bergh,  Chem.  Britain  (1986),  22:430を参照されたい。さらに、光線療法を実現するために、モノクローナル抗体を光活性化色素に連結させてもよい。Mew  et  al.,  J.  Immunol.  (1983),130:1473;  idem.,  Cancer  Res.  (1985),  45:4380；Oseroff  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  (1986),  83:8744;  idem.,  Photochem.  Photobiol.  (1987),  46:83；Hasan  et  al.,  Prog.  Clin.  Biol.  Res.  (1989),  288:471；Tatsuta  et  al.,  Lasers  Surg.  Med.  (1989),  9:422；Pelegrin  et  al.,  Cancer  (1991),  67:2529を参照されたい。
【０２６５】
一部のがん／腫瘍は、特に、腫瘍抗原に対して特異的なＴ細胞において、ある特定の免疫チェックポイント経路を利用することによって免疫監視機構を回避することができる（Pardoll,  2012,  Nature  Reviews  Cancer  12:252-264）。がん治療のためのチェックポイント阻害剤抗体に関する研究は、がん処置に耐性であると以前に考えられたがんを処置することに成功した（例えば、Ott  &  Bhardwaj,  2013,  Frontiers  in  Immunology  4:346；Menzies  &  Long,  2013,  Ther  Adv  Med  Oncol  5:278-85；Pardoll,  2012,  Nature  Reviews  Cancer  12:252-64；Mavilio  &  Lugli）。大多数の抗がん剤とは対照的に、チェックポイント阻害剤は、腫瘍細胞を直接標的としないが、免疫系の内因性抗腫瘍活性を増強するために、リンパ球受容体またはそれらのリガンドをむしろ標的とする。（Pardoll,  2012,  Nature  Reviews  Cancer  12:252-264）。このような阻害剤は、罹患した細胞、組織または病原体に対する免疫応答を調節することによって主に作用するため、このような薬剤の抗腫瘍効果を増強するために他の治療モダリティ、ＡＤＣ、および／またはインターフェロンと組み合わせてこれらを使用することができる。
【０２６６】
抗ＰＤ１抗体は、黒色腫、非小細胞肺がん、膀胱がん、前立腺がん、結腸直腸がん、頭頚部がん、トリプルネガティブ乳がん、白血病、リンパ腫および腎細胞がんの処置のために使用されてきた（Topalian  et  al.,  2012,  N  Engl  J  Med  366:2443-54；Lipson  et  al.,  2013,  Clin  Cancer  Res  19:462-8；Berger  et  al.,  2008,  Clin  Cancer  Res  14:3044-51；Gildener-Leapman  et  al.,  2013,  Oral  Oncol  49:1089-96；Menzies  &  Long,  2013,  Ther  Adv  Med  Oncol  5:278-85）。例示的な抗ＰＤ１抗体としては、ペンブロリズマブ（ＭＫ−３４７５、Ｍｅｒｃｋ）、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ＡＭＰ−２２４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＡＭＰ−５１４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１、Ｃｕｒｅｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．）、ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、セミプリマブ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｎｏｆｉ）が挙げられる。抗ＰＤ１抗体は、例えば、ＡＢＣＡＭ（ＡＢ１３７１３２）、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（ＥＨ１２．２Ｈ７、ＲＭＰ１−１４）およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊ１０５、Ｊ１１６、ＭＩＨ４）から市販されている。
【０２６７】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、尿路上皮癌、非小細胞肺がん、転移性メルケル細胞癌、および胃がんの処置のために使用されている。例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体としては、アテゾリズマブ（Ｒｏｃｈｅ  Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）、アベルマブ（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ  ａｎｄ  Ｐｆｉｚｅｒ）、およびデュルバルマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）が挙げられる。
【０２６８】
抗ＣＴＬ４Ａ抗体は、黒色腫、前立腺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がんの処置に関する臨床試験において使用されている（Robert  &  Ghiringhelli,  2009,  Oncologist  14:848-61；Ott  et  al.,  2013,  Clin  Cancer  Res  19:5300；Weber,  2007,  Oncologist  12:864-72；Wada  et  al.,  2013,  J  Transl  Med  11:89）。例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体としては、イピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）およびトレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。イピリムマブは、最近、転移性黒色腫の処置に関するＦＤＡの承認を受けた（Wada  et  al.,  2013,  J  Transl  Med  11:89）。
【０２６９】
ＣＴＬＡ４、ＰＤ１およびＰＤ−Ｌ１に対するチェックポイント阻害剤が臨床的に最も進歩しているが、他の潜在的なチェックポイント抗原も公知であり、例えば、ＬＡＧ３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、およびＴＩＭ４を含む治療用阻害剤の標的として使用することができる（例えば、Pardoll,  2012,  Nature  Reviews  Cancer  12:252-264）。
【０２７０】
ある特定の態様では、本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質は、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤を含むか、またはそれと組み合わせて使用されてもよい。本開示の二機能性もしくは三機能性融合タンパク質の一部を含み得るか、または本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質と組み合わせて使用することができる例示的なチェックポイント阻害剤としては、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、およびＴＩＭ４の１つまたは複数の阻害剤が挙げられる。一部の実施形態では、本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質の一部を含み得るか、または本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質と組み合わせて使用することができるチェックポイント阻害剤としては、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、およびＰＤ−Ｌ１の１つまたは複数の阻害剤が挙げられる。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ４阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ４抗体）は、本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質の一部を含むか、または本開示の二機能性または三機能性タンパク質と組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、ＰＤ１阻害剤（例えば、ＰＤ１抗体）は、本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質の一部を含むか、または本開示の二機能性または三機能性タンパク質と組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１阻害剤（例えば、ＰＤ−Ｌ１抗体）は、本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質の一部を含むか、または本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質と組み合わせて使用することができる。
【０２７１】
ある特定の態様では、本開示の二機能性および三機能性融合タンパク質は、ワクチン接種プロトコールと組み合わせた場合、様々な形態のがん、腫瘍、前腫瘍性障害、過剰増殖性障害、および／または異形成障害を処置する際により有効であり得る。腫瘍に対するワクチン接種に対する多くの実験戦略が考案されている（Rosenberg,  S.,  2000,  Development  of  Cancer  Vaccines,  ASCO  Educational  Book  Spring:  60-62；Logothetis,  C.,  2000,  ASCO  Educational  Book  Spring:  300-302；Khayat,  D.  2000,  ASCO  Educational  Book  Spring:  414-428；Foon,  K.  2000,  ASCO  Educational  Book  Spring:  730-738を参照されたい；Restifo,  N.  and  Sznol,  M.,  Cancer  Vaccines,  Ch.  61,  pp.  3023-3043  in  DeVita,  V.  et  al.  (eds.),  1997,  Cancer:  Principles  and  Practice  of  Oncology.  Fifth  Editionも参照されたい）。これらの戦略の１つでは、自家または同種異系間腫瘍細胞を使用してワクチンを調製する。これらの細胞ワクチンは、ＧＭ−ＣＳＦを発現するように腫瘍細胞が形質導入される場合に、有効性を増加させたことが示されている（Dranoff  et  al.  (1993)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci  U.S.A.  90:  3539-43）。したがって、一部の実施形態では、１つまたは複数の二機能性および三機能性タンパク質を免疫原性剤、例えば、がん細胞、精製腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド、および炭水化物分子を含む）、細胞、および免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子をトランスフェクトした細胞と組み合わせることができる（He  et  al  (2004)  J.  Immunol.  173:4919-28）。使用することができる腫瘍ワクチンの非限定例としては、黒色腫抗原のペプチド、例えば、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼ、またはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようトランスフェクトされた腫瘍細胞のペプチドが挙げられる。
【０２７２】
他の態様では、本開示の方法は、特定の毒素または病原体に暴露された患者を処置することを対象とした。したがって、本開示は、治療有効量の本開示の１つまたは複数の二機能性または三機能性融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含み、必要に応じて、感染性疾患を処置するために１つまたは複数の追加の支持療法および／または活性薬剤を投与することをさらに含む、対象の感染性疾患（例えば、ウイルス、細菌または寄生生物による感染）を処置または予防する方法をさらに提供する。
【０２７３】
一部の実施形態では、本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質を使用して、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス）；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エボラウイルス）；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルス）；Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ハンタウイルス、ブンヤウイルス（ｂｕｎｇａ  ｖｉｒｕｓ）、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；Ａｒｅｎａ  ｖｉｒｉｄａｅ（出血熱ウイルス）；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｂ型肝炎ウイルス）；Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ（パルボウイルス）；Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（大部分のアデノウイルス）；Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１およびＨＳＶ−２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）；ならびに未分類のウイルス（例えば、海綿状脳症の病原体、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損型サテライト（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ）であると考えられる）、非Ａ、非Ｂ型肝炎の病原体（クラス１＝内因的に伝染するもの；クラス２＝非経口的に伝染するもの（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークウイルスおよび関連ウイルス、ならびにアストロウイルス）、水痘、感冒、ウイルス性気管支炎、サイトメガロウイルス感染症、コロラドダニ炎、デング熱、エボラ出血熱、流行性耳下腺炎、「手足口」病、肝炎、単純ヘルペス、帯状疱疹、ＨＰＶ、インフルエンザ（Ｆｌｕ）、ラッサ熱、はしか、マールブルグ出血熱、伝染性単核球症、おたふくかぜ、灰白髄炎、進行性多巣性白質脳症（progressive  multifocal  leukencephalopathy）、狂犬病、風疹、ＳＡＲＳ、天然痘、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性肺炎、ウエストナイル疾患、黄熱病、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏ��ｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（群ＡのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（群ＢのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ｖｉｒｉｄａｎｓ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（嫌気性種）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、病原性Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉａ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、およびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｌｉ、脾脱疽、細菌性成人呼吸促迫症候群、細菌性髄膜炎、ブルセラ病、カンピロバクター症、ネコひっかき病、気管支炎、コレラ、ジフテリア、チフス、淋病、レジオネラ症、らい病（ハンセン病）、レプトスピラ症、リステリア症、ライム病、類鼻疽、ＭＲＳＡ感染症、マイコバクテリア感染症、髄膜炎、ノカルジア症、腎炎、糸球体腎炎、歯周病、百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）（百日咳（Ｗｈｏｏｐｉｎｇ  Ｃｏｕｇｈ））、疫病、肺炎球菌性肺炎、オウム病、Ｑ熱、ロッキー山紅斑熱（ＲＭＳＦ）、サルモネラ症、猩紅熱（scarlet  dever）、細菌性赤痢、梅毒、敗血症性ショック、出血性ショック（ｈａｅｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｓｈｏｃｋ）、敗血症症候群、破傷風、トラコーマ、結核、野兎病、腸チフス、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、およびＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、アスペルギルス症；鵞口瘡、クリプトコッカス症、ブラストミセス症、コクシジオイデス症、ヒストプラズマ症（ahistoplasmosis）、赤痢アメーバ、大腸バランチジウム、フォーラーネグレリア、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ種、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏ��ｇｙｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、アフリカトリパノソーマ症、アメーバ症、回虫症、バベシア症、シャーガス病、肝吸虫症、クリプトスポリジウム症、嚢虫症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、自由生活性アメーバ感染症、ジアルジア虫症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポーラ症、カラアザール、リーシュマニア症、マラリア、メタゴニムス症、ハエ症、オンコセルカ症、シラミ寄生症、蟯虫感染症、疥癬、住血吸虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫症、旋毛虫病、鞭虫症、およびトリパノソーマ症から選択される１種または複数のウイルス、バクテリア、または寄生生物による感染を処置または予防することができる。
【０２７４】
一部の実施形態では、本開示は、有効量の本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質を病原体を処置するための第２の治療剤、例えば、抗生剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、または抗寄生生物薬と組み合わせてそれを必要とする患者に投与することによって、感染性疾患を処置する方法を提供する。
【０２７５】
９．医薬組成物
本明細書に記載の薬剤（例えば、二機能性および三機能性融合タンパク質）は、医薬組成物に製剤化され得る。本開示による使用のための医薬組成物は、１つもしくは複数の生理的に許容される担体または賦形剤を使用して、慣用の方法で製剤化され得る。このような製剤は、一般に、ほとんどの規制上の要件に適合する、実質的にパイロジェンフリーである。
【０２７６】
ある特定の実施形態では、本開示の治療方法は、組成物を全身的または局所的に、インプラントまたはデバイスとして投与することを含む。投与される場合、本開示における使用のための治療用組成物は、パイロジェンフリーの、生理学的に許容される形態である。上記に記載の組成物中に、必要に応じて含まれていてもよい、本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質以外の治療的に有用な薬剤は、本明細書に開示される方法において、対象の化合物と同時にまたは連続的に投与され得る。
【０２７７】
典型的には、本明細書に開示されるタンパク質治療剤は、非経口で、特に、静脈内または皮下に投与される。非経口投与に好適な医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される無菌の等張の水溶液もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液またはエマルジョン、あるいは使用の直前に無菌注射溶液または分散液に再構成され得る無菌粉末と組み合わせて、１つまたは複数の本開示の二機能性または三機能性融合タンパク質を含んでいてもよく、これは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁化剤もしくは増粘剤を含有していてもよい。本開示の医薬組成物において用いられ得る好適な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合には必要な粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。
【０２７８】
組成物および製剤は、所望により、活性成分を含有する１つもしくは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサーデバイスで提供されてもよい。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチック製のホイルを含んでいてもよい。パックまたはディスペンサーデバイスは、投与についての使用説明書が添付されていてもよい。
【０２７９】
さらに、組成物は、標的組織部位への送達のための形態でカプセル化または注射されてもよい。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、１つまたは複数の治療用化合物（例えば、二機能性および三機能性タンパク質）を標的組織部位に送達する能力があり、組織が成長するための構造を提供し、最適には、身体内に再吸収される能力があるマトリックスを含んでいてもよい。例えば、マトリックスは、本開示の二機能性および三機能性タンパク質の徐放を提供し得る。このようなマトリックスは、他の移植医学適用のために現在使用されている材料で形成されてもよい。
【０２８０】
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容的外観および界面特性に基づく。対象の組成物の特定の適用は、適切な製剤を規定する。組成物のための有望なマトリックスは、生分解性で、化学的に規定される、硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物であり得る。他の有望な材料は、骨または皮膚コラーゲンなどの、生分解性で、生物学的に十分に規定されるものである。さらなるマトリックスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリックス成分で構成される。他の有望なマトリックスは、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミナートまたは他のセラミックなどの、非生分解性で、化学的に規定されるものである。マトリックスは、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムなどの上記で述べた種類の材料のいずれかの組合せで構成され得る。バイオセラミックは、カルシウム−アルミナート−ホスフェート中などの組成物中で改変されてもよく、処理して孔径、粒子径、粒子形状および生分解性が改変される。
【０２８１】
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、経口的に、所定量の薬剤を活性成分としてそれぞれ含有する、例えば、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（風味付けされた基剤、通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガカントを使用する）、散剤、顆粒剤の形態で、あるいは水性もしくは非水性液体中の液剤または懸濁剤として、あるいは水中油型もしくは油中水型の液体エマルジョンとして、あるいはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、あるいはトローチ（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤を使用する）として、ならびに／あるいは洗口剤などとして投与することができる。薬剤はまた、ボーラス、舐剤またはペーストとして投与されてもよい。
【０２８２】
経口投与用の固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣剤、散剤、顆粒剤など）において、本発明の１つまたは複数の治療用化合物は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、例えば、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、および／または以下のいずれかと混合され得る：（１）フィラーまたは増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸；（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシアなど；（３）保湿剤、例えば、グリセロール；（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のシリケートおよび炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延剤、例えば、パラフィン；（６）吸収促進剤、例えば、第４級アンモニウム化合物；（７）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなど；（８）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイトクレー；（９）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびこれらの混合物；ならびに（１０）着色剤。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合において、医薬組成物はまた、緩衝剤を含んでいてもよい。同様の種類の固体組成物はまた、ラクトースまたは乳糖などの賦形剤、および高分子量ポリエチレングリコールなどを使用する、軟および硬ゼラチンカプセルにおいてフィラーとして用いられてもよい。
【０２８３】
経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が挙げられる。活性成分に加えて、液体剤形は、当技術分野において一般に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含有していてもよい。不活性希釈剤以外に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、着色剤、香料ならびに保存剤などの補助剤も含み得る。
【０２８４】
懸濁剤は、活性化合物に加えて、懸濁化剤、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにこれらの混合物を含有していてもよい。
【０２８５】
本発明の組成物はまた、補助剤、例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤を含有していてもよい。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの包含によって、確実にされ得る。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを組成物に含めることも望ましくあり得る。加えて、注射可能な医薬形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤の包含によって、もたらされ得る。
【０２８６】
投薬量レジメンは、対象の本発明の化合物（例えば、二機能性および三機能性タンパク質）の作用を変える様々な要因を考慮して、主治医によって決定されることが理解される。様々な要因としては、限定されるものではないが、患者の年齢、性別および食事、疾患の重症度、投与時間、ならびに他の臨床的要因が挙げられる。必要に応じて、投薬量は、再構成において使用されるマトリックスの種類、および組成物中の化合物の種類によって変化し得る。最終組成物への他の公知の成長因子の添加も投薬量に影響を与え得る。進行は、骨の成長および／または修復、例えば、Ｘ線（ＤＥＸＡを含む）、組織形態計測的決定およびテトラサイクリン標識の定期的評価によって、監視することができる。
【０２８７】
ある特定の実施形態では、本発明は、本開示の二機能性および三機能性タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ産生のための遺伝子治療も提供する。このような治療は、上記で列挙したような障害を有する細胞または組織への二機能性または三機能性ポリヌクレオチド配列の導入によって、その治療効果を達成するであろう。二機能性または三機能性ポリヌクレオチド配列の送達は、キメラウイルスなどの組換え発現ベクター、またはコロイド分散系を使用して、達成することができる。標的化リポソームの使用が、二機能性または三機能性ポリヌクレオチド配列の治療的送達のために好ましい。
【０２８８】
本明細書において教示されている遺伝子治療のために利用され得る様々なウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または好ましくは、レトロウイルスなどのＲＮＡウイルスが挙げられる。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスまたは鳥類レトロウイルスの誘導体である。単一の外来遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例としては、限定されるものではないが、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられる。いくつかの追加のレトロウイルスベクターは、複数の遺伝子を組み込むことができる。すべてのこれらのベクターは、形質導入細胞を特定および作製することができるように、選択マーカー用の遺伝子を移行または組み込むことができる。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を付着させることによって、標的特異的にすることができる。好ましい標的化は、抗体を使用することによって、達成される。当業者は、特定のポリヌクレオチド配列が、二機能性または三機能性ポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベクターの標的特異的送達を可能にするために、レトロウイルスゲノムに挿入され、またはウイルスエンベロープに付着され得ることを認識する。好ましい実施形態では、ベクターは、骨または軟骨に標的化される。
【０２８９】
あるいは、組織培養細胞は、従来のリン酸カルシウムトランスフェクションによって、レトロウイルス構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをコードするプラスミドで直接トランスフェクトされ得る。次いで、これらの細胞は、目的の遺伝子を含有するベクタープラスミドでトランスフェクトされる。得られる細胞は、レトロウイルスベクターを培養培地に放出する。
【０２９０】
二機能性または三機能性ポリヌクレオチドのための別の標的化送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならび水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質に基づく系が挙げられる。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの送達ビヒクルとして有用な人工膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび無傷のビリオンが水性の内部に封入され、生物学的に活性な形態で細胞に送達され得る（例えば、Ｆｒａｌｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，  ６：７７，  １９８１を参照されたい）。リポソームビヒクルを使用する効率的な遺伝子導入のための方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Ｍａｎｎｉｎｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ６：６８２，  １９８８を参照されたい。リポソーム組成物は、通常、リン脂質の組合せ、通常、ステロイド、特に、コレステロールとの組合せである。他のリン脂質または他の脂質も使用し得る。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度および二価カチオンの存在に依存する。
【０２９１】
リポソームの製造において有用な脂質の例としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドなどのホスファチジル化合物が挙げられる。例示的なリン脂質としては、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。リポソームの標的化はまた、例えば、器官特異性、細胞特異性および細胞小器官特異性に基づくことによっても可能であり、当技術分野において公知である。
【０２９２】
本開示は、ｐＨを調整するための酸および塩基；ならびに狭い範囲内でｐＨを保つための緩衝剤を含んで、変更され得る製剤を提供する。
例示
【０２９３】
以下、本発明を一般に記載し、本発明のある特定の実施形態の例示の目的のために単に含まれ、本発明を限定することを意図するものではない、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。
【実施例】
【０２９４】
（実施例１）
ＴβＲＩＩ受容体融合タンパク質バリアントの作製
ＴβＲＩＩ  ＥＣＤバリアント
ヒトＴβＲＩＩの可溶性細胞外部分およびヒトＦｃ部分を含むＴβＲＩＩ融合タンパク質を作製した。それぞれの融合タンパク質について、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＴβＲＩＩアミノ酸配列を、いくつかの異なるリンカーの１つによって、配列番号４９のアミノ酸配列を有するＩｇＧ  Ｆｃ部分と融合した。それぞれの融合タンパク質は、配列番号２３のアミノ酸配列（下記）を有するＴＰＡリーダー配列も含んでいた。
組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号２３）
【０２９５】
いくつかの設計された構築物の実例の概要を図３として提示する。例示項において試験された異なる構築物についての配列を詳述した表を下記に提示する。
【表２】
2021526835.tif 000041
【０２９６】
構築物の成分についてのアミノ酸配列およびそれぞれの構築物を、これらの構築物を発現するために使用される核酸配列とともに、下記に提示する。
ＴβＲＩＩ部分：アミノ酸配列
【化３３】
2021526835.tif 000042
Ｆｃ部分：アミノ酸配列
【化３４】
2021526835.tif 000043
ｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃ：核酸配列
【化３５】
2021526835.tif 000044
ｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃ：アミノ酸配列
【化３６】
2021526835.tif 000045
【０２９７】
下記の動物実験のために、ヒトＦｃドメインがマウスＩｇＧ１  Ｆｃドメインによって置き換えられた配列番号９のバリアント形態を使用した。このバリアントをｈＴβＲＩＩ−ｍＦｃという。
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）３−ｈＦｃ：核酸配列
【化３７】
2021526835.tif 000046
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）３−ｈＦｃ：アミノ酸配列
【化３８】
2021526835.tif 000047
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ：核酸配列
【化３９−１】
2021526835.tif 000048
【化３９−２】
2021526835.tif 000049
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ：アミノ酸配列
【化４０】
2021526835.tif 000050
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ：リーダー配列を欠くアミノ酸配列
【化４１】
2021526835.tif 000051
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ：リーダー配列を欠き、ｈＴβＲＩＩ部分の前のグリシンを欠く、アミノ酸配列
【化４２】
2021526835.tif 000052
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ：リーダー配列を欠き、ｈＴβＲＩＩ部分の前のグリシンおよびアラニンを欠く、アミノ酸配列
【化４３】
2021526835.tif 000053
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ：リーダー配列を欠き、ｈＴβＲＩＩ部分の前のグリシン、アラニンおよびトレオニンを欠く、アミノ酸配列
【化４４】
2021526835.tif 000054
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ：リーダー配列を欠き、ｈＴβＲＩＩ部分の前のグリシン、アラニン、トレオニンおよびイソロイシンを欠く、アミノ酸配列
【化４５】
2021526835.tif 000055
ｈＴβＲＩＩ  （Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ：リーダー配列を欠き、ｈＴβＲＩＩ部分の前のグリシン、アラニン、トレオニン、イソロイシンおよびプロリンを欠く、アミノ酸配列
【化４６】
2021526835.tif 000056
ｈＴβＲＩＩ  （Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ：リーダー配列を欠き、ｈＴβＲＩＩ部分の前のグリシン、アラニン、トレオニン、イソロイシン、プロリンおよびプロリンを欠く、アミノ酸配列
【化４７】
2021526835.tif 000057
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）２−ｈＦｃ：核酸配列
【化４８】
2021526835.tif 000058
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）２−ｈＦｃ：アミノ酸配列
【化４９】
2021526835.tif 000059
ｈＴβＲＩＩ拡張ヒンジ−ｈＦｃ：核酸配列
【化５０】
2021526835.tif 000060
ｈＴβＲＩＩ拡張ヒンジ−ｈＦｃ：アミノ酸配列
【化５１】
2021526835.tif 000061
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）５−ｈＦｃ：アミノ酸配列
【化５２】
2021526835.tif 000062
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）６−ｈＦｃ：アミノ酸配列
【化５３】
2021526835.tif 000063
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）５−ｈＦｃ：ヌクレオチド配列
【化５４】
2021526835.tif 000064
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）６−ｈＦｃ：ヌクレオチド配列
【化５５−１】
2021526835.tif 000065
【化５５−２】
2021526835.tif 000066
【０２９８】
様々な構築物は、ＣＨＯ細胞中で成功裏に発現され、分析的なサイズ排除クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるように、高純度に精製された。ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）２−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）３−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）５−ｈＦｃおよびｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）６−ｈＦｃタンパク質は、３７℃で１３日間ＰＢＳ中で保持された場合に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定される同様の強い安定性を示した。ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）２−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）３−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃタンパク質は、ラット、マウスまたはヒト血清中でも保持され、同様の強い安定性を示した。
【０２９９】
ＴβＲＩＩ  ＥＣＤバリアント
上記に記載の融合タンパク質（例えば、配列番号１８）に含まれるＴβＲＩＩドメインに加えて、本開示は、代替のＴβＲＩＩドメインを含む融合タンパク質も企図する。例えば、融合タンパク質は、下記に示す野生型ｈＴβＲＩＩｓｈｏｒｔ（２３〜１５９）配列（配列番号２７）、または下記に開示する任意の他のＴβＲＩＩポリペプチドを含んでいてもよい。
【化５６】
2021526835.tif 000067
【０３００】
（１）下記に示すｈＴβＲＩＩｓｈｏｒｔ（２３〜１５９／Ｄ１１０Ｋ）アミノ酸配列（配列番号３６）、ここで、置換された残基に下線を引いている。
【化５７】
2021526835.tif 000068
【０３０１】
（２）下記に示すＮ末端で切断されたｈＴβＲＩＩｓｈｏｒｔ（２９〜１５９）アミノ酸配列（配列番号２８）。
【化５８】
2021526835.tif 000069
【０３０２】
（３）下記に示すＮ末端で切断されたｈＴβＲＩＩｓｈｏｒｔ（３５〜１５９）アミノ酸配列（配列番号２９）。
【化５９】
2021526835.tif 000070
【０３０３】
（４）下記に示すＣ末端で切断されたｈＴβＲＩＩｓｈｏｒｔ（２３〜１５３）アミノ酸配列（配列番号３０）。
【化６０】
2021526835.tif 000071
【０３０４】
（５）下記に示すＣ末端で切断されたｈＴβＲＩＩｓｈｏｒｔ（２３〜１５３／Ｎ７０Ｄ）アミノ酸配列（配列番号３８）、ここで、置換された残基に下線を引いている。
【化６１】
2021526835.tif 000072
【０３０５】
出願人はまた、上記および下記に示す野生型ｈＴβＲＩＩｌｏｎｇ（２３〜１８４）配列（配列番号２０）に基づいて、対応する５つのバリアント（配列番号３７、３３、３４、３９）も構想し、ここで、２５アミノ酸の挿入に下線を引いている。スプライシングが、挿入に隣接するＣ末端位での保存的アミノ酸置換（Ｖａｌ→Ｉｌｅ）をもたらすことに留意されたい。
【化６２】
2021526835.tif 000073
【０３０６】
（１）下記に示すｈＴβＲＩＩｌｏｎｇ（２３〜１８４／Ｄ１３５Ｋ）アミノ酸配列（配列番号３７）、ここで、置換された残基に二重下線を引いている。
【化６３】
2021526835.tif 000074
【０３０７】
（２）下記に示すＮ末端で切断されたｈＴβＲＩＩｌｏｎｇ（２９〜１８４）アミノ酸配列（配列番号３３）。
【化６４】
2021526835.tif 000075
【０３０８】
（３）下記に示すＮ末端で切断されたｈＴβＲＩＩｌｏｎｇ（６０〜１８４）アミノ酸配列（配列番号２９と同じ）。
【化６５】
2021526835.tif 000076
【０３０９】
（４）下記に示すＣ末端で切断されたｈＴβＲＩＩｌｏｎｇ（２３〜１７８）アミノ酸配列（配列番号３４）。
【化６７】
2021526835.tif 000077
【０３１０】
（５）下記に示すＣ末端で切断されたｈＴβＲＩＩｌｏｎｇ（２３〜１７８／Ｎ９５Ｄ）アミノ酸配列（配列番号３９）、ここで、置換された残基に二重下線を引いている。
【化６８】
2021526835.tif 000078
【０３１１】
追加のＴβＲＩＩ  ＥＣＤバリアントとしては、以下が挙げられる。
（Ａ）下記に示すＮおよびＣ末端で切断されたｈＴβＲＩＩｓｈｏｒｔ（３５〜１５３）またはｈＴβＲＩＩｌｏｎｇ（６０〜１７８）アミノ酸配列（配列番号３２）。
【化６９】
2021526835.tif 000079
【０３１２】
（Ｂ）下記に示すＮおよびＣ末端で切断されたｈＴβＲＩＩｓｈｏｒｔ（２９〜１５３）アミノ酸配列（配列番号３１）。
【化７０】
2021526835.tif 000080
【０３１３】
（Ｃ）下記に示すＮおよびＣ末端で切断されたｈＴβＲＩＩｌｏｎｇ（２９〜１７８）アミノ酸配列（配列番号３５）。
【化７１】
2021526835.tif 000081
【０３１４】
上記のバリアント（配列番号３６、２８、２９、３０、３８、３７、３３、３４、３９、３２、３１および３５）のいずれかは、ｈＴβＲＩＩアイソフォームＣにおいて天然に存在するように（Ｋｏｎｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８：３１８，  ２００７）、ｈＴβＲＩＩ  ＥＣＤのＣ末端の近くに位置するグルタミン酸残基の対（配列番号１の１５１位および１５２位、または配列番号２の１７６位および１７７位）の間の３６アミノ酸（配列番号４１）の挿入を組み込むことができた。
【化７２】
2021526835.tif 000082
【０３１５】
例として、任意の挿入部位に隣接する対のグルタミン酸残基を、ｈＴβＲＩＩｓｈｏｒｔ（２９〜１５９）バリアント（配列番号２８）について、下記に表す（下線）。
【化７３】
2021526835.tif 000083
【０３１６】
Ｆｃドメインバリアント
上記に記載の構築物を、配列番号４９のアミノ酸配列を有するＦｃドメインを用いて作製したが、本開示は、ヒトＩｇＧ２  Ｆｃドメイン（配列番号４２、下記）または全長ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（ｈＧ１Ｆｃ）（配列番号４３、下記）を含む、代替Ｆｃドメインを含むｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃ融合タンパク質を企図する。必要に応じて、Ｆｃドメインと無関係のポリペプチドを、Ｆｃドメインの場所に付着させることができた。
【化７４】
2021526835.tif 000084
【０３１７】
リーダー配列バリアント
上記に記載の作製された構築物は、ＴＰＡリーダー配列を含んでいたが、天然のリーダー配列（配列番号２２、下記）またはミツバチメリチン（配列番号２４、下記）のリーダー配列などの代替リーダー配列を使用し得る。
【化７５】
2021526835.tif 000085
【０３１８】
（実施例２）
細胞に基づくアッセイにおける受容体融合タンパク質バリアントによる分化リガンド阻害
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）２−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）３−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃおよびｈＴβＲＩＩ拡張ヒンジ−ｈＦｃタンパク質に対するＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２ならびにＴＧＦβ３の親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）装置によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価し、結果を図４Ａおよび４Ｂにまとめる。それぞれの融合タンパク質は、高親和性でＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に結合する能力があったが、（Ｇ４Ｓ）４より長いか、または（Ｇ４Ｓ）４と同じ長さのリンカーを有する構築物は、驚くべきことに、（Ｇ４Ｓ）４より短い長さのリンカーを有する構築物よりも、高親和性でＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３の両方に結合する能力があった。ＴＧＦβ２およびいずれかの構築物の間の結合は、低いか、または一過性であった。構築物の脱グリコシル化は、結合を変化させなかった。
【０３１９】
Ａ５４９細胞におけるレポーター遺伝子アッセイを使用して、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３の活性を阻害するｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃバリアントの能力を決定した。このアッセイは、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２レポータープラスミド（Ｄｅｎｎｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８，  ＥＭＢＯ  １７：  ３０９１−３１００）、およびトランスフェクト効率について制御するためのＲｅｎｉｌｌａレポータープラスミド（ｐＲＬＣＭＶ）でトランスフェクトされたヒト肺癌細胞系に基づく。ＣＡＧＡモチーフは、ＴＧＦβ応答遺伝子（例えば、ＰＡＩ−１）のプロモーター中に存在し、そのため、このベクターは、一般に、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３を介してシグナル伝達する因子のために使用される。
【０３２０】
アッセイの初日に、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）：ＣＣＬ−１８５（商標））を４８ウェルプレートに分配した。２日目に、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２、ｐＲＬＣＭＶ、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ９（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、およびＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する溶液をプレインキュベートし、次いで、０．１％のＢＳＡで補充されたＥａｇｌｅ最小必須培地（ＥＭＥＭ、ＡＴＣＣ（登録商標））に添加し、これを、３７℃、５％のＣＯ２で終夜、インキュベーションのために、蒔かれた細胞に適用した。３日目に、培地を除去し、細胞を、下記に記載のようにして調製されたリガンドおよび阻害剤の混合物とともに、３７℃、５％のＣＯ２で終夜インキュベートした。
【０３２１】
被験物質の連続希釈を、アッセイ緩衝液（ＥＭＥＭ＋０．１％のＢＳＡ）中、４８ウェルプレートで行った。試験リガンドを含有する等体積のアッセイ緩衝液を添加して、以前に決定されたＥＣ５０と等しい最終リガンド濃度を得た。ヒトＴＧＦβ１、ヒトＴＧＦβ２、およびヒトＴＧＦβ３は、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈから入手した。試験溶液を、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、混合物の一部をすべてのウェルに添加した。試験溶液との終夜のインキュベートの後、細胞をリン酸緩衝食塩水ですすぎ、次いで、ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１９４１）で溶解し、−７０℃で終夜保管した。４日目および最終日に、プレートを穏やかに振とうしながら室温に温めた。細胞溶解物を二反復で化学発光プレート（９６ウェル）に移し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１９８０）からの試薬を用いて発光光度計で分析して、正規化されたルシフェラーゼ活性を決定した。
【０３２２】
図５Ａ〜５Ｆにおいて示されるように、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）２−ｈＦｃ；ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）３−ｈＦｃ；ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ；ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）５−ｈＦｃ；ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）６−ｈＦｃ；ｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃ；およびｈＴβＲＩＩ拡張ヒンジ−ｈＦｃタンパク質はすべて、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３の両方を阻害する能力があった。興味深いことに、改善されたＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３阻害とｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）２−ｈＦｃ；ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）３−ｈＦｃおよびｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ構築物についてのリンカーの長さの間に相関が存在したが（図５Ｅ）、この改善傾向は、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）５−ｈＦｃおよびｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）６−ｈＦｃ構築物について、プラトーになったように見えた（図５Ｆ）。
【０３２３】
（実施例３）
ＡｃｔＲＩＩＢ：ＴβＲＩＩヘテロ二量体の生成
細胞外ドメインとＦｃドメインの間に位置するリンカーによりＦｃドメインにそれぞれ別々に融合したヒトＡｃｔＲＩＩＢおよびヒトＴβＲＩＩの細胞外ドメインを含む可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロマー複合体を構築した。個々の構築物は、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドと称され、それぞれに関する配列を以下に提供する。
【０３２４】
ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃまたはＴβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体複合体と対照的に、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロマー複合体の形成を促進するための方法は、非対称ヘテロマー複合体の形成をガイドするＦｃドメインのアミノ酸配列に変更を導入することである。Ｆｃドメインを使用して非対称相互作用対を作製するための多くの異なるアプローチについて、本開示において記載する。
【０３２５】
１つのアプローチでは、それぞれ、配列番号８２、８４、８５、および８７のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＴβＲＩＩ−Ｆｃポリペプチド配列において例示されるように、一方のＦｃドメインを変更して相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入する一方で、他方のＦｃドメインを変更して相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入する。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドはそれぞれ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）リーダー（配列番号２３）およびＡｃｔＲＩＩＢまたはＴβＲＩＩ細胞外部分と改変されたＦｃ部分の間に位置する（Ｇ４Ｓ）４リンカーを用いる。
【０３２６】
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号８２）は以下に示される：
【化７６】
2021526835.tif 000086
【０３２７】
リーダー（シグナル）配列とリンカーに下線を引いている。可能なホモ二量体複合体のいずれかよりもむしろ、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（酸性アミノ酸をリシンで置き換えること）を上記二重下線によって示したように、ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号８２のアミノ酸配列は、必要に応じて、Ｃ末端から除去されたリシン（Ｋ）とともに提供され得る。
【０３２８】
このＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸配列（配列番号８３）によってコードされる：
【化７７】
2021526835.tif 000087
【０３２９】
プロセシングされたＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号８４）は以下の通りであり、必要に応じて、Ｃ末端から除去されたリシン（Ｋ）とともに提供されてもよい。
【化７８】
2021526835.tif 000088
【０３３０】
ＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号８５）の相補的形態は以下の通りである：
【化７９】
2021526835.tif 000089
【０３３１】
リーダー配列とリンカーに下線を引いている。上記配列番号８２および８４のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドによるヘテロ二量体形成をガイドするために、２つのアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を上記二重下線によって示したように、ＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号８５のアミノ酸配列は、必要に応じて、Ｃ末端にリシン（Ｋ）を付加して与えられてもよい。
【０３３２】
このＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸（配列番号８６）によってコードされる：
【化８０−１】
2021526835.tif 000090
【化８０−２】
2021526835.tif 000091
【０３３３】
プロセシングされたＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質の配列（配列番号８７）は以下の通りであり、必要に応じて、Ｃ末端にリシン（Ｋ）を付加して与えられてもよい。
【化８１】
2021526835.tif 000092
【０３３４】
それぞれ、配列番号８４および配列番号８７のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＴβＲＩＩ−Ｆｃタンパク質は、同時に発現され、ＣＨＯ細胞系から精製され、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じ得る。
【０３３５】
非対称のＦｃ融合タンパク質を使用してヘテロ多量体複合体の形成を促進する別のアプローチでは、Ｆｃドメインを変更して、相補的疎水性相互作用ならびにそれぞれ、配列番号８８〜９０および９１〜９３のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＴβＲＩＩ−Ｆｃポリペプチド配列に例示したように、追加の分子間ジスルフィド結合を導入する。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドとＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドはそれぞれ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）リーダーを用いる。
【０３３６】
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号８８）は以下に示される：
【化８２】
2021526835.tif 000093
【０３３７】
リーダー（シグナル）配列とリンカーに下線を引いている。可能なホモ二量体複合体のいずれかよりもむしろ、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインでおよびトレオニンをトリプトファン（trytophan）で置き換えること）を上記二重下線によって示したように、融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号８８のアミノ酸配列は、必要に応じて、Ｃ末端から除去されたリシン（Ｋ）とともに提供され得る。
【０３３８】
このＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸配列（配列番号８９）によってコードされる：
【化８３−１】
2021526835.tif 000094
【化８３−２】
2021526835.tif 000095
【０３３９】
プロセシングされたＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドは以下の通りである：
【化８４】
2021526835.tif 000096
【０３４０】
ＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号９１）の相補的形態は以下の通りであり、必要に応じて、Ｃ末端から除去したリシン（Ｋ）とともに提供され得る。
【化８５】
2021526835.tif 000097
【０３４１】
リーダー配列とリンカーに下線を引いている。上記配列番号８８および９１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドによるヘテロ二量体形成をガイドするために、４つのアミノ酸置換を上記二重下線によって示したように、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号９１のアミノ酸配列は、必要に応じて、Ｃ末端から除去されたリシン（Ｋ）とともに提供されてもよい。
【０３４２】
このＡ  ＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸配列（配列番号９２）によってコードされる：
【化８６】
2021526835.tif 000098
【０３４３】
プロセシングされたＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質の配列は以下の通りであり、必要に応じて、Ｃ末端から除去されたリシン（Ｋ）とともに提供されてもよい。
【化８７】
2021526835.tif 000099
【０３４４】
それぞれ、配列番号９０および配列番号９３のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＴβＲＩＩ−Ｆｃタンパク質は、同時に発現され、ＣＨＯ細胞系から精製され、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じ得る。
【０３４５】
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体の活性を比較するために、それぞれが、配列番号８２、８４、８５、８７、８８、９０、９１、または９３のいずれか１つに存在するようなＡｃｔＲＩＩＢまたはＴβＲＩＩ細胞外ドメインのいずれか；改変されていないｈＧ１Ｆｃドメイン（ホモ二量体の形成を促進する）；およびＡｃｔＲＩＩＢまたはＴβＲＩＩ細胞外部分と改変されていないＦｃ部分の間に位置する（Ｇ４Ｓ）４リンカーを含む、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体とＴβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体を生成した。これらのホモ二量体の両方が、配列番号２３のＴＰＡリーダー配列を使用して発現された。
【０３４６】
上記の様々なヘテロ二量体およびホモ二量体の精製は、例えば、任意の順序で、以下のものの３つまたはそれより多くを含む一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成され得る：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびエピトープに基づく親和性クロマトグラフィー（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＢ上のエピトープを対象とする抗体または機能的に同等のリガンドを用いる）、ならびにマルチモーダルクロマトグラフィー（例えば、静電リガンドと疎水性リガンドの両方を含有する樹脂を用いる）。精製は、ウイルス濾過と緩衝液交換により完了され得る。
【０３４７】
（実施例４）
細胞に基づくアッセイにおける受容体融合タンパク質バリアントによる差示的なリガンドの阻害
Ａ５４９細胞におけるレポーター遺伝子アッセイを使用して、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０の活性を阻害するＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体の能力を決定し、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体およびＴβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体の活性の阻害と比較したが、そのすべては実施例３において上記されている。このアッセイは、トランスフェクション効率を制御するために、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２レポータープラスミド（Dennler  et  al,  1998,  EMBO  17:  3091-3100）およびウミシイタケレポータープラスミド（ｐＲＬＣＭＶ）を用いてトランスフェクトしたヒト肺癌細胞系に基づく。ＣＡＧＡモチーフはＴＧＦβ−応答性遺伝子（例えば、ＰＡＩ−１）のプロモーター中に存在するため、このベクターは、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３によりシグナル伝達する因子にとって一般的に有用である。
【０３４８】
アッセイの初日に、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）：ＣＣＬ−１８５（商標））を４８ウェルプレートに分配した。２日目に、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２、ｐＲＬＣＭＶ、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ９（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）およびＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する溶液をプレインキュベートし、次いで、０．１％のＢＳＡで補充されたＥａｇｌｅ最小必須培地（ＥＭＥＭ、ＡＴＣＣ（登録商標））に添加し、これを、３７℃、５％のＣＯ２で終夜、インキュベーションのために、蒔かれた細胞に適用した。３日目に、培地を除去し、細胞を、下記に記載のようにして調製されたリガンドおよび阻害剤の混合物とともに、３７℃、５％のＣＯ２で終夜インキュベートした。
【０３４９】
被験物質の連続希釈を、アッセイ緩衝液（ＥＭＥＭ＋０．１％のＢＳＡ）中、４８ウェルプレートで行った。試験リガンドを含有する等体積のアッセイ緩衝液を添加して、以前に決定されたＥＣ５０と等しい最終リガンド濃度を得た。試験溶液を、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、混合物の一部をすべてのウェルに添加した。試験溶液との終夜のインキュベートの後、細胞をリン酸緩衝食塩水ですすぎ、次いで、ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１９４１）で溶解し、−７０℃で終夜保管した。４日目および最終日に、プレートを穏やかに振とうしながら室温に温めた。細胞溶解物を二反復で化学発光プレート（９６ウェル）に移し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１９８０）からの試薬を用いて発光光度計で分析して、正規化されたルシフェラーゼ活性を決定した。
【０３５０】
図１０に例示したように、ＴβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体は、この細胞に基づくアッセイにおいて、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３を阻害することが可能であるが、ＴＧＦβ２、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ９、またはＢＭＰ１０を阻害しなかった。対照的に、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ１０を阻害することが可能であるが、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、またはＴＧＦβ３を阻害しなかった。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、およびＢＭＰ１０を阻害することが可能であるが、ＢＭＰ９またはＴＧＦβ２を阻害しなかった。これらのデータは、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体とＴβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体の強力な阻害剤の特徴の多くを保持し、よって、Ｓｍａｄ  ２／３に関連するＴＧＦβスーパーファミリーのリガンドの２つの別個の群（すなわち、ＴＧＦβおよびアクチビン／ＧＤＦ）に、特有に影響を及ぼすことが可能であるリガンドトラップの興味深い分類を表すことを実証する。さらに、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体はＢＭＰ９を阻害せず、よって、ＡｃｔＲＩＩＢに関連するリガンドに対して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃは、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体よりもより選択的なアンタゴニストである。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体は、このような選択的アンタゴニズムがＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３の阻害と組み合わせて所望されるある特定の適用において、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体よりもより有用であろう。
【０３５１】
（実施例５）
ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロ二量体の生成
細胞外ドメインとＦｃドメインの間に位置するリンカーによりＦｃドメインにそれぞれ別々に融合したヒトＡｃｔＲＩＩＡおよびヒトＴβＲＩＩの細胞外ドメインを含む可溶性ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロマー複合体を構築した。個々の構築物は、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドと称され、それぞれに関する配列を以下に提供する。
【０３５２】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃまたはＴβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体複合体と対照的に、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロマー複合体の形成を促進するための方法は、非対称ヘテロマー複合体の形成をガイドするＦｃドメインのアミノ酸配列に変更を導入することである。Ｆｃドメインを使用して非対称相互作用対を作製するための多くの異なるアプローチについて、本開示において記載する。
【０３５３】
１つのアプローチでは、それぞれ、配列番号１２８、１３０、１３１、および１３３のＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃおよびＴβＲＩＩ−Ｆｃポリペプチド配列において例示されるように、一方のＦｃドメインを変更して相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入する一方で、他方のＦｃドメインを変更して相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入する。ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドはそれぞれ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）リーダー（配列番号２３）およびＡｃｔＲＩＩＡまたはＴβＲＩＩ細胞外部分と改変されたＦｃ部分の間に位置する（Ｇ４Ｓ）４リンカーを用いる。
【０３５４】
ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号１２８）は以下に示される：
【化８８】
2021526835.tif 000100
【０３５５】
リーダー（シグナル）配列とリンカーに下線を引いている。可能なホモ二量体複合体のいずれかよりもむしろ、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（酸性アミノ酸をリシンで置き換えること）を上記二重下線によって示したように、ＡｃｔＲＩＩＡ融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１２８のアミノ酸配列は、必要に応じて、Ｃ末端から除去されたリシン（Ｋ）とともに提供され得る。
【０３５６】
このＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸配列（配列番号１２９）によってコードされる：
【化８９】
2021526835.tif 000101
【０３５７】
プロセシングされたＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１３０）は以下の通りであり、必要に応じて、Ｃ末端から除去されたリシン（Ｋ）とともに提供されてもよい。
【化９０】
2021526835.tif 000102
【０３５８】
ＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１３１）の相補的形態は以下の通りである：
【化９１】
2021526835.tif 000103
【０３５９】
リーダー配列とリンカーに下線を引いている。上記配列番号１２８および１３０のＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチドによるヘテロ二量体形成をガイドするために、２つのアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を上記二重下線によって示したように、ＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１３１のアミノ酸配列は、必要に応じて、Ｃ末端にリシン（Ｋ）を付加して与えられてもよい。
【０３６０】
このＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸（配列番号１３２）によってコードされる：
【化９２】
2021526835.tif 000104
【０３６１】
プロセシングされたＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質の配列（配列番号１３３）は以下の通りであり、必要に応じて、Ｃ末端にリシン（Ｋ）を付加して与えられてもよい。
【化９３】
2021526835.tif 000105
【０３６２】
それぞれ、配列番号１３０および配列番号１３３のＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃおよびＴβＲＩＩ−Ｆｃタンパク質は、同時に発現され、ＣＨＯ細胞系から精製され、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じ得る。
【０３６３】
非対称のＦｃ融合タンパク質を使用してヘテロ多量体複合体の形成を促進する別のアプローチでは、Ｆｃドメインを変更して、相補的疎水性相互作用ならびにそれぞれ、配列番号１３４、１３６、１３７、および１３９のＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃおよびＴβＲＩＩ−Ｆｃポリペプチド配列に例示したように、追加の分子間ジスルフィド結合を導入する。ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチドとＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドはそれぞれ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）リーダーを用いる。
【０３６４】
ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号１３４）は以下に示される：
【化９４】
2021526835.tif 000106
【０３６５】
リーダー（シグナル）配列とリンカーに下線を引いている。可能なホモ二量体複合体のいずれかよりもむしろ、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインでおよびトレオニンをトリプトファンで置き換えること）を上記二重下線によって示したように、融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１３４のアミノ酸配列は、必要に応じて、Ｃ末端から除去されたリシン（Ｋ）とともに提供されてもよい。
【０３６６】
このＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸配列（配列番号１３５）によってコードされる：
【化９５】
2021526835.tif 000107
【０３６７】
プロセシングされたＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチドは以下の通りである：
【化９６】
2021526835.tif 000108
【０３６８】
ＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１３７）の相補的形態は以下の通りであり、必要に応じて、Ｃ末端から除去したリシン（Ｋ）とともに提供されてもよい。
【化９７】
2021526835.tif 000109
【０３６９】
リーダー配列とリンカーに下線を引いている。上記配列番号１３４および１３６のＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチドによるヘテロ二量体形成をガイドするために、４つのアミノ酸置換を上記二重下線によって示したように、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１３７のアミノ酸配列は、必要に応じて、Ｃ末端から除去されたリシン（Ｋ）とともに提供されてもよい。
【０３７０】
このＡ  ＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸配列（配列番号１３８）によってコードされる：
【化９８】
2021526835.tif 000110
【０３７１】
プロセシングされたＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質の配列は以下の通りであり、必要に応じて、Ｃ末端から除去されたリシン（Ｋ）とともに提供されてもよい。
【化９９】
2021526835.tif 000111
【０３７２】
それぞれ、配列番号１３４および配列番号１３７のＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃおよびＴβＲＩＩ−Ｆｃタンパク質は、同時に発現され、ＣＨＯ細胞系から精製され、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じ得る。
【０３７３】
ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体の活性を比較するために、それぞれ、配列番号１２８、１３０、１３１、１３３、１３４、１３６、１３７、および１３９のいずれか１つに存在するようなＡｃｔＲＩＩＡまたはＴβＲＩＩ細胞外ドメインのいずれか；改変されていないｈＧ１Ｆｃドメイン（ホモ二量体の形成を促進する）；ならびにＡｃｔＲＩＩＡまたはＴβＲＩＩ細胞外部分と改変されていないＦｃ部分の間に位置する（Ｇ４Ｓ）４リンカーを含む、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体とＴβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体を生成した。これらのホモ二量体の両方が、配列番号２３のＴＰＡリーダー配列を使用して発現された。
【０３７４】
上記の様々なヘテロ二量体およびホモ二量体の精製は、例えば、任意の順序で、以下のものの３つまたはそれより多くを含む一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成され得る：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびエピトープに基づく親和性クロマトグラフィー（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡ上のエピトープを対象とする抗体または機能的に同等のリガンドを用いる）、ならびにマルチモーダルクロマトグラフィー（例えば、静電リガンドと疎水性リガンドの両方を含有する樹脂を用いる）。精製は、ウイルス濾過と緩衝液交換により完了され得る。
【０３７５】
（実施例６）
細胞に基づくアッセイにおける受容体融合タンパク質バリアントによる差示的なリガンドの阻害
Ａ５４９細胞におけるレポーター遺伝子アッセイを使用して、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、およびＢＭＰ１０の活性を阻害するＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体の能力を決定し、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体およびＴβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体の活性の阻害と比較した、そのすべては実施例３において上記されている。このアッセイは、トランスフェクション効率を制御するために、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２レポータープラスミド（Dennler  et  al,  1998,  EMBO  17:  3091-3100）およびウミシイタケレポータープラスミド（ｐＲＬＣＭＶ）を用いてトランスフェクトしたヒト肺癌細胞系に基づく。ＣＡＧＡモチーフはＴＧＦβ−応答性遺伝子（例えば、ＰＡＩ−１）のプロモーター中に存在するため、このベクターは、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３によりシグナル伝達する因子にとって一般的に有用である。
【０３７６】
アッセイの初日に、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）：ＣＣＬ−１８５（商標））を４８ウェルプレートに分配した。２日目に、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２、ｐＲＬＣＭＶ、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ９（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）およびＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する溶液をプレインキュベートし、次いで、０．１％のＢＳＡで補充されたＥａｇｌｅ最小必須培地（ＥＭＥＭ、ＡＴＣＣ（登録商標））に添加し、これを、３７℃、５％のＣＯ２で終夜、インキュベーションのために、蒔かれた細胞に適用した。３日目に、培地を除去し、細胞を、下記に記載のようにして調製されたリガンドおよび阻害剤の混合物とともに、３７℃、５％のＣＯ２で終夜インキュベートした。
【０３７７】
被験物質の連続希釈を、アッセイ緩衝液（ＥＭＥＭ＋０．１％のＢＳＡ）中、４８ウェルプレートで行った。試験リガンドを含有する等体積のアッセイ緩衝液を添加して、以前に決定されたＥＣ５０と等しい最終リガンド濃度を得た。試験溶液を、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、混合物の一部をすべてのウェルに添加した。試験溶液との終夜のインキュベートの後、細胞をリン酸緩衝食塩水ですすぎ、次いで、ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１９４１）で溶解し、−７０℃で終夜保管した。４日目および最終日に、プレートを穏やかに振とうしながら室温に温めた。細胞溶解物を二反復で化学発光プレート（９６ウェル）に移し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１９８０）からの試薬を用いて発光光度計で分析して、正規化されたルシフェラーゼ活性を決定した。
【０３７８】
図１１に例示したように、ＴβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体は、この細胞に基づくアッセイにおいて、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３を阻害することが可能であるが、ＴＧＦβ２、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、またはＢＭＰ１０を阻害しなかった。対照的に、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、およびＢＭＰ１０を阻害することが可能であるが、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、またはＴＧＦβ３を阻害しなかった。ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびＧＤＦ１１を阻害することが可能であるが、ＢＭＰ１０またはＴＧＦβ２を阻害しなかった。これらのデータは、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモ二量体とＴβＲＩＩ−Ｆｃホモ二量体の強力な阻害剤の特徴の多くを保持し、よって、Ｓｍａｄ  ２／３に関連するＴＧＦβスーパーファミリーのリガンドの２つの別個の群（すなわち、ＴＧＦβおよびアクチビン／ＧＤＦ）に、特有に影響を及ぼすことが可能であるリガンドトラップの興味深い分類を表すことを実証する。さらに、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体はＢＭＰ９１０を阻害せず、よって、ＡｃｔＲＩＩＡに関連するリガンドに対して、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃは、ＡｃｔＲＩＩＡホモ二量体よりもより選択的なアンタゴニストである。したがって、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロ二量体は、このような選択的アンタゴニズムがＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３の阻害と組み合わせて所望されるある特定の適用において、ＡｃｔＲＩＩＡホモ二量体よりもより有用であろう。
【０３７９】
（実施例７）
ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質の生成
ヒトまたはマウスのＦｃドメインに融合したヒトＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメイン（その間にリンカーを有する）を有するＡｃｔＲＩＩＡ融合タンパク質を生成した。この構築物は、それぞれ、ｈＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃおよびｈＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃと称される。
【０３８０】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは、ＣＨＯ細胞系から精製されたものを下に示す（配列番号１４０）：
【化１００】
2021526835.tif 000112
【０３８１】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃタンパク質は、ＣＨＯ細胞系で発現された。３つの異なるリーダー配列を検討した：
（ｉ）ミツバチメリチン（配列番号２４）
（ｉｉ）組織プラスミノーゲン活性化因子（配列番号２３）
（ｉｉｉ）天然ＡｃｔＲＩＩＡリーダー配列：ＭＧＡＡＡＫＬＡＦＡＶＦＬＩＳＣＳＳＧＡ（配列番号１４３）。
【０３８２】
選択された形態はＴＰＡのリーダーを用い、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列を有する：  
【化１０１】
2021526835.tif 000113
【０３８３】
このポリペプチドは、以下の核酸配列によってコードされる：
【化１０２】
2021526835.tif 000114
【０３８４】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃの両方は、組換え発現に非常に適合した。タンパク質は、タンパク質の単一の明確なピークとして精製された。Ｎ末端配列決定は、−ＩＬＧＲＳＥＴＱＥ（配列番号１４４）の単一の配列を明らかにした。精製は、例えば、次のうち３種またはそれよりも多くを任意の順序で含む、一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成することができる：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィー。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了することができる。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって判定したときは９８％を超える、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって判定したときは９５％を超える純度に精製された。
【０３８５】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃは、リガンドへの高い親和性を示した。標準のアミンカップリング手順を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ５チップの上にＧＤＦ−１１またはアクチビンＡを固定化した。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃタンパク質を系に加え、結合を測定した。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは５×１０−１２の解離定数（ＫＤ）でアクチビンに結合し、９．９６×１０−９のＫＤでＧＤＦ１１に結合した。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃは、同様にふるまった。
【０３８６】
薬物動態学的研究において、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは非常に安定していた。ラットに１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃタンパク質を投与し、タンパク質の血漿中レベルを２４、４８、７２、１４４および１６８時間後に測定した。別個の研究では、ラットに１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇで投与した。ラットでは、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは１１〜１４日の血清中半減期を有し、薬物の循環レベルは２週後にかなり高かった（１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇの最初の投与の場合はそれぞれ１１μｇ／ｍｌ、１１０μｇ／ｍｌまたは３０４μｇ／ｍｌ）。カニクイザルでは、血漿中半減期は１４日を実質的に超え、薬物の循環レベルは１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇの最初の投与の場合はそれぞれ２５μｇ／ｍｌ、３０４μｇ／ｍｌまたは１４４０μｇ／ｍｌであった。
【０３８７】
（実施例８）ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質の生成
その間に最小限のリンカーを有する、ヒトまたはマウスのＦｃドメインに融合しているヒトＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインを有する、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質を構築した。構築物は、ｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃおよびｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃとそれぞれ呼ぶ。
【０３８８】
ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃは、ＣＨＯ細胞系から精製されたものを下に示す（配列番号１４５）：
【化１０３】
2021526835.tif 000115
【０３８９】
ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃタンパク質は、ＣＨＯ細胞系で発現された。３つの異なるリーダー配列を検討した：（ｉ）ミツバチメリチン（配列番号２４）、（ｉｉ）組織プラスミノーゲン活性化因子（配列番号２３）、および（ｉｉｉ）天然ｈＡｃｔＲＩＩＢ：ＭＧＡＡＡＫＬＡＦＡＶＦＬＩＳＣＳＳＧＡ（配列番号１４８）。
【０３９０】
選択された形態はＴＰＡのリーダーを用い、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列（配列番号１４６）を有する：
【化１０４】
2021526835.tif 000116
【０３９１】
このポリペプチドは、以下の核酸配列（配列番号１４７）によってコードされる：
【化１０５】
2021526835.tif 000117
【０３９２】
ＣＨＯ細胞で生成された物質のＮ末端配列決定は、−ＧＲＧＥＡＥの主要な配列（配列番号１４９）を明らかにした。注目すべきことに、文献で報告された他の構築物は、−ＳＧＲ…配列で始まる。
【０３９３】
精製は、例えば、次のうち３種またはそれよりも多くを任意の順序で含む、一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成することができる：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィー。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了することができる。
【０３９４】
ＡｃｔＲＩＩＢ（２０−１３４）−ｈＦｃについてのいくつかのリガンドの親和性を、ＢｉａｃｏｒｅTM機器でｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。結果を以下の表にまとめる。ＡｃｔＲＩＩＢ（２０−１３４）−ｈＦｃはアクチビンＡ、アクチビンＢ、およびＧＤＦ１１に高い親和性で結合した。
【表３】
2021526835.tif 000118
【０３９５】
（実施例９）
アクチビンおよびＴＧＦβアンタゴニストの抗腫瘍活性
ｈＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃ、ｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ、およびｈＴβＲＩＩ−ｍＦｃ融合タンパク質の強力な抗腫瘍活性を同系マウスの白血病モデルにおいて調査した。８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを無作為に処置に割り当て（１群当たりｎ＝１０）、がん細胞を投与する２日前に始めて、週に２回、ｈＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ｈＴβＲＩＩｌｏｎｇ（２３〜１８４）−ｍＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはビヒクル（リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ、５ｍｌ／ｋｇ）で腹腔内に処置した。０日目に、各マウスに、ＰＢＳ（１００μＬ）中に懸濁した１×１０６個のＲＬ♂１（ＲＬ雄１）細胞を皮下接種した。ＲＬ雄１は、ＢＡＬＢ／ｃ起源のｘ線に誘導された白血病である（Sato  H  et  al.,  1973,  J  Exp  Med  138:593-606）。マウスに接種した後に、体重および腫瘍体積を週に２回測定した。カリパスで得た２次元の測定値から腫瘍体積を計算した：腫瘍体積（ｍｍ３で）＝（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２（式中、ＬおよびＷは、それぞれ、腫瘍長および幅（ｍｍで）である）。完全な腫瘍退縮と無腫瘍生存は両方、Teicher  BA  (ed)  Anticancer  Drug  Development  Guide:  Preclinical  Screening,  Clinical  Trials,  and  Approval;  Humana  Press,  1997によって定義された。地域のＩＡＣＵＣ規制では、生存分析に使用されるエンドポイントは、２０００ｍｍ３より大きい腫瘍体積、２０％を超える体重の損失、または手足の麻痺であった。異なる群の生存曲線を生存期間中央値および対数順位（マンテル−コックス）検定によって比較した。
【０３９６】
以下の表に示したように、ｈＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃとｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃの両方は、抗腫瘍活性を示した。しかし、ｈＴβＲＩＩ−ｍＦｃは、このモデルにおいていずれの認識可能な抗腫瘍活性も示さなかった。
【表４】
2021526835.tif 000119
【０３９７】
ビヒクルおよびｈＴβＲＩＩ−ｍＦｃで処置したマウスの０と比較して、ｈＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃまたはｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃによる処置によって、５６日目に、１０匹のマウスの２匹（２０％）が無腫瘍状態となった。生存期間中央値の増加および対数順位検定における高い有意差によって、ｈＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃとｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃはそれぞれ、腫瘍を有するマウスの生存を増加させたことも示される。ビヒクルで処置した群の０と比較して、ｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃで処置したマウスの５０％が３４日目までに完全な腫瘍退縮を示したため、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃに対する初期応答は特にロバストであった。これらの結果によって、ｈＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃおよびｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃは、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有することが示され、これらのタンパク質が、他のアクチビンアンタゴニストと同様に、がんの処置に有用であり得ることが示される。
【０３９８】
同じマウスの白血病モデルを使用して、次いで、ｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃが、ｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃのものに類似する抗腫瘍活性を有するかどうか、および抗腫瘍活性がＴ細胞に媒介される免疫に依存するかどうかを評価した。８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを無作為に処置に割り当て（１群当たりｎ＝１０）、がん細胞を投与する２日前に始めて、週に２回、ｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはビヒクル（ＰＢＳ、５ｍｌ／ｋｇ）で腹腔内に処置した。さらに、７週齢のＴ細胞免疫欠損のＮＣｒ−ヌードマウスを無作為に処置に割り当て（１群当たりｎ＝１０）、がん細胞を投与する２日前に始めて、週に２回、ｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはビヒクル（ＰＢＳ、５ｍｌ／ｋｇ）で腹腔内に処置した。最後に、上記実験の間のおよそ７週間、無腫瘍のままであった４匹のマウス（ｈＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃで処置した２匹のマウス、およびｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃで処置した２匹のマウス）にＲＬ雄１細胞を再負荷し、抗腫瘍免疫メモリーについて試験した。０日目に、各マウスに、ＰＢＳ（１００μＬ）中に懸濁した１×１０６個のＲＬ♂１（ＲＬ雄１）細胞を皮下接種した。マウスに接種した後に、体重および腫瘍体積を週に２回測定した。地域のＩＡＣＵＣ規制では、生存分析に使用されるエンドポイントは、２０００ｍｍ３より大きい腫瘍体積、２０％を超える体重の損失、または後脚の麻痺であった。
【０３９９】
以下の表に示されるように、ｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃおよびｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃの抗腫瘍効果は、マウスの株に依存した。
【表５】
2021526835.tif 000120
【０４００】
ｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃとｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃは両方、以下の表に示されたように、免疫競合ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて抗腫瘍活性を示した。ｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃまたはｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃによる処置によって、ビヒクル処置マウスの０と比較して、それぞれ、マウスの１０％または３０％を５６日目に無腫瘍状態にさせた。生存期間中央値の増加および対数順位検定における高い有意差によって、ｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃとｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃはそれぞれ、腫瘍を有するマウスの生存を促進したことも実証される。重要なことに、ＮＣｒ−ヌードマウスにおけるｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃおよびｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃの抗腫瘍効果は存在せず、ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して顕著に鈍化し、それによって、ＡｃｔＲＩＩＢリガンドのこれらの阻害剤に対する作用機構においてＴ細胞免疫を関係させる。さらに、前の実験から持ち越された４匹すべての無腫瘍マウスは、ＲＬ雄１腫瘍細胞を繰り返し接種したにも関わらず、本実験の全体を通して検出可能な腫瘍成長を示さなかった。これらの結果は、免疫細胞が、ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドにおいてｈＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃまたはｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃで処置することによってもたらされるＲＬ雄１腫瘍の退縮を媒介する、および有効な抗腫瘍免疫応答によって、腫瘍抗原に対する免疫記憶が生じたというさらなるエビデンスをもたらす。さらに、これらの結果によって、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃおよびｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃの抗腫瘍活性が確認され、この活性においてＴ細胞免疫を強く関係させる。まとめると、このデータは、アクチビンアンタゴニストを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫活性を強化することができ、よって、このようなアンタゴニストは、免疫活性の上昇が望ましい種々の障害および状態を処置するのに有用であり得る（例えば、がん免疫療法への適用および様々な病原体の処置）ことを示唆する。任意の特定の理論に拘束されることを望まないが、このようなアクチビンアンタゴニストは、免疫チェックポイントアンタゴニスト（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、および／またはＢ７−Ｈ４の１つまたは複数に結合するおよびそれを阻害する抗体、またはその抗原結合断片）と組み合わせて使用した場合、がんを処置するのに特に有用であり得ると考えられる。
【０４０１】
（実施例１０）
アクチビンとＴＧＦβアンタゴニストの併用療法の抗腫瘍活性
実施例９で記載したのと同じマウス白血病モデルを使用して、次いで、ｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃ抗腫瘍活性が、ＴＧＦβアンタゴニストと組み合わせることによって強化され得るかどうかを調査した。この組合せの研究では、汎特異的ＴＧＦβ抗体（高い親和性でＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３に結合するもの）をＴＧＦβアンタゴニストとして使用した。
【０４０２】
８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを無作為に処置に割り当て（１群当たりｎ＝１０）、がん細胞を投与する２日前に始めて、週に２回、ｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＴＧＦβ抗体（ｍＡｂ）（１０ｍｇ／ｋｇ）、ｈＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃおよびＴＧＦβｍＡｂの組合せ（両方とも１０ｍｇ／ｋｇ）、またはビヒクル（リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ、５ｍｌ／ｋｇ）で腹腔内に処置した。０日目に、各マウスに、ＰＢＳ（１００μＬ）中に懸濁した１×１０６個のＲＬ♂１（ＲＬ雄１）細胞を皮下接種した。ＲＬ雄１は、ＢＡＬＢ／ｃ起源のｘ線に誘導された白血病である（Sato  H  et  al.,  1973,  J  Exp  Med  138:593-606）。マウスに接種した後に、前の実施例において記載したように、体重および腫瘍体積を週に２回測定した。異なる群の生存曲線を生存期間中央値および対数順位（マンテル−コックス）検定によって比較した。
【０４０３】
以下の表に示されるように、アクチビンアンタゴニストおよびＴＧＦβアンタゴニストによる併用療法は、各アンタゴニスト単独に対して観察されたよりも高い抗腫瘍活性を示した。
【表６】
2021526835.tif 000121
【０４０４】
ｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃ単独またはＴＧＦβ  ｍＡｂ単独による処置は、このモデルにおいて腫瘍退縮に関する中程度の効果、すなわち、それぞれ３０％および２０％の無腫瘍状態を示した。ｈＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃおよびＴＧＦβ  ｍＡｂによる併用処置は、抗腫瘍活性において驚くべきかつ有意な増加、すなわち、７０％の無腫瘍状態およびおよそ２倍の生存期間中央値時間をもたらした。この種の相乗効果は、一般に、個々の薬剤が、異なる細胞機構を介して作用することのエビデンスであると考えられる。したがって、アクチビンまたはＴＧＦβシグナル伝達経路のいずれかの阻害によって抗腫瘍活性が促進され得るが、両方の経路の阻害を使用して、抗腫瘍活性の増加が望ましいこのような実験または臨床状況において抗腫瘍活性を相乗的に増加させることができる。まとめると、これらのデータは、アクチビンおよびＴＧＦβのアンタゴニストを単独で使用してがんを処置することができるが、特に、組み合わせてがんを処置することができることを示す。任意の特定の理論に拘束されることを望まないが、このようなアクチビンアンタゴニストおよびＴＧＦβアンタゴニストは、免疫チェックポイントアンタゴニスト（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ４、Ｂ７−Ｈ３、および／またはＢ７−Ｈ４の１つまたは複数に結合するおよびそれを阻害する抗体またはその抗原結合断片）と組み合わせて使用した場合、がんを処置するのに特に有用であり得ると考えられる。
【０４０５】
参照による組み込み
本明細書において言及されたすべての刊行物および特許は、各個の刊行物または特許が、参照により本明細書に組み込まれると具体的かつ個々に示されている場合のように、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４０６】
主題の特定の実施形態を説明してきたが、上記の明細書は例示的なものであって、限定的なものではない。多くの改変は、本明細書および下記の特許請求の範囲の検討の際に、当業者に明らかになるであろう。本発明の全範囲は、特許請求の範囲を均等物のその全範囲と一緒に参照し、本明細書をこのような変形と一緒に参照することによって、決定されるべきである。
【図１】
2021526835.tif 000122
【図２】
2021526835.tif 000123
【図３】
2021526835.tif 000124
【図４Ａ】
2021526835.tif 000125
【図４Ｂ】
2021526835.tif 000126
【図５Ａ】
2021526835.tif 000127
【図５Ｂ】
2021526835.tif 000128
【図５Ｃ】
2021526835.tif 000129
【図５Ｄ】
2021526835.tif 000130
【図５Ｅ】
2021526835.tif 000131
【図５Ｆ】
2021526835.tif 000132
【図６】
2021526835.tif 000133
【図７】
2021526835.tif 000134
【図８】
2021526835.tif 000135
【図９】
2021526835.tif 000136
【図１０】
2021526835.tif 000137
【図１１】
2021526835.tif 000138
【図１２】
2021526835.tif 000139
【配列表】
2021526835000001.app
【国際調査報告】
2021526835.tif 000140
2021526835.tif 000141
2021526835.tif 000142
2021526835.tif 000143