(57)【要約】  本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から由来した、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆから選択されたいずれか一つ以上から由来の莢膜多糖類、及びそれぞれの前記莢膜多糖類に接合された一つまたは二つ以上の担体タンパク質を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物、及びその製造方法を提供する。本発明の一実施形態によれば、肺炎球菌感染の予防または治療用免疫原性組成物を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトコッカス・ニューモニエから由来した、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆから選択されたいずれか一つ以上から由来の莢膜多糖類、及びそれぞれの前記莢膜多糖類に接合された一つまたは二つ以上の担体タンパク質を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物。
【請求項２】
前記免疫原性組成物が血清型２由来の多糖類を含む場合、前記多糖類は活性化されて分子量１００〜４００ｋＤａの状態で前記担体タンパク質に結合されて接合体を形成するか、
前記免疫原性組成物が血清型１７Ｆ由来の多糖類を含む場合、前記多糖類は活性化されて分子量４００〜９００ｋＤａの状態で前記担体タンパク質に結合されて接合体を形成するか、または、
前記免疫原性組成物が血清型２０由来の多糖類を含む場合、前記多糖類は活性化されて分子量４００〜８００ｋＤａの状態で前記担体タンパク質に結合されて接合体を形成する、請求項１に記載のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物。
【請求項３】
前記免疫原性組成物が血清型２由来の多糖類を含む場合、前記血清型２由来の多糖類を含む免疫原性接合体が１，０００〜１６，０００ｋＤａの分子量を有するか、
前記免疫原性組成物が血清型１７Ｆ由来の多糖類を含む場合、前記血清型１７Ｆ由来の多糖類を含む免疫原性接合体が３００〜４，５００ｋＤａの分子量を有するか、または、
前記免疫原性組成物が血清型２０由来の多糖類を含む場合、前記血清型２０由来の多糖類を含む免疫原性接合体が１，０００〜４，０００ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物。
【請求項４】
前記担体タンパク質が破傷風トキソイドまたはＣＲＭ１９７である、請求項１に記載のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物。
【請求項５】
前記免疫原性組成物が血清型２由来の多糖類を含む場合、前記免疫原性接合体内の担体タンパク質に対する血清型２莢膜多糖類の比（多糖類／タンパク質、Ｗ／Ｗ）が０．５〜２．０であるか、
前記免疫原性組成物が血清型１７Ｆ由来の多糖類を含む場合、前記免疫原性接合体内の担体タンパク質に対する血清型１７Ｆ莢膜多糖類の比（多糖類／タンパク質、Ｗ／Ｗ）が０．５〜１８であるか、または、
前記免疫原性組成物が血清型２０由来の多糖類を含む場合、前記免疫原性接合体内の担体タンパク質に対する血清型２０由来の莢膜多糖類の比（多糖類／タンパク質、Ｗ／Ｗ）が１〜５である、請求項１に記載のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物。
【請求項６】
前記血清型２由来の多糖類を含む免疫原性接合体の場合、全体分子量の２０〜６０％がＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在するか、
前記血清型１７Ｆ由来の多糖類を含む免疫原性接合体の場合、全体分子量の１５〜６０％がＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在するか、または、
前記血清型２０由来の多糖類を含む免疫原性接合体の場合、全体分子量の７０〜９０％がＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在する、請求項１に記載のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物。
【請求項７】
前記血清型２由来の多糖類を含む免疫原性接合体の場合、前記接合体に接合された多糖類の酸化度が２〜１８であるか、
前記血清型１７Ｆ由来の多糖類を含む免疫原性接合体の場合、前記接合体に接合された多糖類の酸化度が１〜２２であるか、または、
前記血清型２０由来の多糖類を含む免疫原性接合体の場合、前記接合体に接合された多糖類の酸化度が４〜１６である、請求項１に記載のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物。
【請求項８】
前記免疫原性組成物は、１５個の異なる血清型から由来した多糖類がそれぞれの担体タンパク質に接合され、
前記血清型が、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆであり、
前記血清型がそれぞれＣＲＭ１９７に接合された、請求項１に記載のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物。
【請求項９】
前記免疫原性組成物は、２３個の異なる血清型から由来した多糖類がそれぞれの担体タンパク質に接合され、
前記血清型が、１、２、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆであり、
前記血清型のうち、血清型３及び５から由来した莢膜多糖類が担体タンパク質ＴＴに接合され、血清型１、２、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆから由来した莢膜多糖類が担体タンパク質ＣＲＭ１９７にそれぞれ接合された、請求項１に記載のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記免疫原性組成物は、２４個の異なる血清型から由来した多糖類がそれぞれの担体タンパク質に接合され、
前記血清型が、２、３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆであり、
前記血清型のうち、血清型１及び５から由来した莢膜多糖類が担体タンパク質ＴＴに接合され、血清型２、３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆから由来した莢膜多糖類が担体タンパク質ＣＲＭ１９７にそれぞれ接合された、請求項１に記載のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記免疫原性組成物が生理学的に許容可能なビヒクルを含む、請求項１に記載のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記免疫原性組成物がワクチンである、請求項１に記載のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物。
【請求項１３】
（ａ）ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆからなる群より選択されたいずれか一つ以上の血清型から由来した莢膜多糖類を生産する細菌細胞を発酵して溶解する段階と、
（ｂ）前記溶解された細胞からストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆから由来した莢膜多糖類を精製する段階と、
（ｃ）前記精製された多糖類を酸化剤と反応させて活性化させる段階と、
（ｄ）前記活性化された多糖類を担体タンパク質と配合し、担体タンパク質に結合されたストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を形成する段階とを含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物の製造方法。
【請求項１４】
前記製造方法が、血清型２及び１７Ｆ由来の莢膜多糖類の場合、（ｃ）段階の前に、前記精製されたストレプトコッカス・ニューモニエの莢膜多糖類を加水分解して多糖類をサイジングする段階をさらに含む、請求項１３に記載のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物の製造方法。
【請求項１５】
前記（ｄ）段階で配合された担体タンパク質が、シアノ水素化ホウ素、ボラン−ピリジン、及び水素化ホウ素交換樹脂からなる群より選択されたいずれか一つ以上の還元剤と反応して、前記活性化された多糖類と接合体を形成する、請求項１３に記載のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物の製造方法。
【請求項１６】
前記（ｃ）段階では、２０〜２５℃の温度で１５〜２０時間、多糖類１μｇ当り過ヨウ素酸塩０．０１〜０．２２μｇを反応させる、請求項１３に記載のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物の製造方法。
【請求項１７】
請求項１３から１６のうちいずれか一項に記載の製造方法によって収得された、ストレプトコッカス・ニューモニエ感染の予防または治療用ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体。
【請求項１８】
ストレプトコッカス・ニューモニエから由来した、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆから選択されたいずれか一つ以上から由来の莢膜多糖類、及びそれぞれの前記莢膜多糖類に接合された一つまたは二つ以上の担体タンパク質を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を個体に有効量投与することで、個体内でストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び／または３３Ｆの感染を予防または治療する方法。
【請求項１９】
ストレプトコッカス・ニューモニエから由来した、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆから選択されたいずれか一つ以上から由来の莢膜多糖類、及びそれぞれの前記莢膜多糖類に接合された一つまたは二つ以上の担体タンパク質を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体の肺炎球菌感染の予防または治療用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、肺炎球菌）の免疫原性組成物及びワクチンに関し、より具体的には、ストレプトコッカス・ニューモニエの莢膜多糖類−担体タンパク質接合体を含む免疫原性組成物及びワクチンに関する。
【０００２】
本出願は、２０１８年４月１８日出願の韓国特許出願第１０−２０１８−００４５２４５号、２０１８年４月１８日出願の韓国特許出願第１０−２０１８−００４５２４６号、２０１８年４月１８日出願の韓国特許出願第１０−２０１８−００４５２４７号、及び２０１８年４月１８日出願の韓国特許出願第１０−２０１８−００４５２４８号に基づく優先権を主張し、当該出願の明細書及び図面に開示された内容は、すべて本出願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、肺炎の主要な原因菌であるだけでなく、敗血症、菌血症、髄膜炎などの侵襲性疾患を引き起こす。統計庁の［２０１４年死亡原因統計］によれば、２０１４年肺炎による死亡率は、１０万名当り２３．７名と２０１３年に対比して１１％増加し、２０１５年対比で２．８倍増加したことが示され、肺炎による死亡率は持続的に増加している趨勢である。また、２０１２年ＷＨＯによれば、２００８年全世界的にＨＩＶ陰性の５歳以下の幼児４７６，０００名がストレプトコッカス・ニューモニエによる感染で死亡し、これは５歳以下幼児の死亡原因のうち５％を占めた。ストレプトコッカス・ニューモニエは、その外部（細胞膜）を囲んでいる主要な病原性因子である莢膜多糖類の構造的、免疫学的特性によって約９０種以上の血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）に分類される。
【０００４】
ストレプトコッカス・ニューモニエによる疾患を予防するため、１９７７年Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔ Ａｕｓｔｒｉａｎによって１４価多糖類ワクチンが開発され、その後、２３価多糖類ワクチンに発展した。多価肺炎球菌多糖類ワクチンは、老人及び高危険患者において、ストレプトコッカス・ニューモニエ疾患の予防に有用であると立証された。しかし、乳児及び小児は、殆どのストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類に対して免疫反応が良好に起こらないが、これは、Ｔ−細胞非依存的免疫反応現象のためである。そこで、Ｔ−細胞依存的反応を起こし得るストレプトコッカス・ニューモニエ莢膜多糖類と担体タンパク質との接合ワクチンが開発された。
【０００５】
７価ストレプトコッカス・ニューモニエ接合体ワクチン（プレベナー（Ｐｒｅｖｎａｒ）（登録商標））は、最も発生頻度が高い７個の血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ及び２３Ｆ由来の莢膜多糖類を含む。２０００年、米国で最初に承認された後、乳児及び小児において、侵襲性肺炎球菌疾患及び中耳炎に対し、免疫原性が高くて効果的であると立証された。その後、６個の血清型１、３、５、６Ａ、７Ｆ、１９Ａが加えられた１３価接合体ワクチンであるプレベナー１３（Ｐｒｅｖｎａｒ１３（登録商標））と３個の血清型１、５、７Ｆが加えられた１０価接合体ワクチンであるシンフロリックス（Ｓｙｎｆｌｏｒｉｘ（登録商標））が次々開発され、ストレプトコッカス・ニューモニエによる侵襲性疾患の数をさらに減少させた。しかし、プレベナー、プレベナー１３及びシンフロリックスの導入による血清型交替が表れ、全般的にワクチンに含まれた血清型による疾患の数が減少したため、相対的に重要度が低かった非ワクチン血清型の重要性がかえって強調されている。
【０００６】
特に、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２０によって引き起こされる侵襲性肺炎球菌疾患の発生率が北米とブラジルで増加した（例えば、文献［Kendall B. et al., Vaccine. 34:474-478, 2016］、［Yildirim I. et al., Pediatr Infect Dis J. 31(10):1016-1021, 2012］または［Caierγo J. et al., PLoS ONE 9(10):e111129, 2014］参照）。また、カナダで行われたＣＡＳＰＥＲ研究では、血清型１９Ａの外に、血清型８、１２Ｆの発生増加が観察された（Sα-Leγo A. et al., J Clin Microbiol., 49(4):1369-75, 2011）。近年発表された研究でも、ノルウェー及びイスラエルでプレベナー１３の導入後に非ワクチン血清型による疾患が増加したと報告し、このような非ワクチン血清型として２３Ａ、２３Ｂ、１２Ｆ、１５Ａ／１５Ｂ／１５Ｃ、３１、３３Ｆ、７Ｃ及び８を挙げている（Martin J., Pediatr Infect Dis J., 33(11):e286-90, 2014）。
【０００７】
ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２、９Ｎ、１７Ｆ及び／または２０によって引き起こされる肺炎球菌疾患の発生率が徐々に増加しているにも、これら血清型による感染を効果的に予防または治療できる研究は十分ではない。
【０００８】
したがって、より広い適用範囲を提供できるように、多価多糖類ワクチンには含まれたが接合ワクチンには含まれていない血清型を含む、非ワクチン血清型に対する免疫原性接合体及び免疫原性組成物に対する必要性が増加している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明は、適用範囲を拡大できる多価ワクチンを提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明は、従来の接合ワクチンに含まれていない新たな血清型を含む免疫原性組成物を提供することを他の目的とする。
【００１１】
また、本発明は、優れた抗体力価を有する肺炎球菌接合ワクチンを提供することをさらに他の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一態様は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から由来した、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆから選択されたいずれか一つ以上から由来の莢膜多糖類、及びそれぞれの前記莢膜多糖類に接合された担体タンパク質を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。
【００１３】
一実施例において、前記免疫原性組成物が血清型２由来の多糖類を含む場合、前記多糖類は活性化されて分子量１００〜４００ｋＤａの状態で前記担体タンパク質に結合されて接合体を形成するか、
前記免疫原性組成物が血清型１７Ｆ由来の多糖類を含む場合、前記多糖類は活性化されて分子量４００〜９００ｋＤａの状態で前記担体タンパク質に結合されて接合体を形成するか、または、
前記免疫原性組成物が血清型２０由来の多糖類を含む場合、前記多糖類は活性化されて分子量４００〜８００ｋＤａの状態で前記担体タンパク質に結合されて接合体を形成する、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。
【００１４】
本発明の一実施例は、前記免疫原性組成物が血清型２由来の多糖類を含む場合、前記血清型２由来の多糖類を含む免疫原性接合体が１，０００〜１６，０００ｋＤａの分子量を有するか、
前記免疫原性組成物が血清型１７Ｆ由来の多糖類を含む場合、前記血清型１７Ｆ由来の多糖類を含む免疫原性接合体が３００〜４，５００ｋＤａの分子量を有するか、または、
前記免疫原性組成物が血清型２０由来の多糖類を含む場合、前記血清型２０由来の多糖類を含む免疫原性接合体が１，０００〜４，０００ｋＤａの分子量を有する、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。
【００１５】
本発明の一実施例は、前記担体タンパク質が破傷風トキソイド（ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｏｉｄ、以下、「ＴＴ」とも称する）またはＣＲＭ１９７である、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。望ましくは、１個のみの血清型を含む免疫原性組成物は担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を含み得る。
【００１６】
本発明の一実施例は、前記免疫原性組成物が血清型２由来の多糖類を含む場合、前記免疫原性接合体内の担体タンパク質に対する血清型２莢膜多糖類の比（多糖類／タンパク質、Ｗ／Ｗ）が０．５〜２．０であるか、
前記免疫原性組成物が血清型１７Ｆ由来の多糖類を含む場合、前記免疫原性接合体内の担体タンパク質に対する血清型１７Ｆ莢膜多糖類の比（多糖類／タンパク質、Ｗ／Ｗ）が０．５〜１８であるか、または、
前記免疫原性組成物が血清型２０由来の多糖類を含む場合、前記免疫原性接合体内の担体タンパク質に対する血清型２０由来の莢膜多糖類の比（多糖類／タンパク質、Ｗ／Ｗ）が１〜５である、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。
【００１７】
本発明の一実施例において、前記血清型２由来の多糖類を含む免疫原性接合体の場合、全体分子量の２０〜６０％がＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在するか、
前記血清型１７Ｆ由来の多糖類を含む免疫原性接合体の場合、全体分子量の１５〜６０％がＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在するか、または、
前記血清型２０由来の多糖類を含む免疫原性接合体の場合、全体分子量の７０〜９０％がＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在する、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。
【００１８】
本発明の一実施例において、前記血清型２由来の多糖類を含む免疫原性接合体の場合、前記接合体に接合された多糖類の酸化度が２〜１８であるか、
前記血清型１７Ｆ由来の多糖類を含む免疫原性接合体の場合、前記接合体に接合された多糖類の酸化度が１〜２２であるか、または、
前記血清型２０由来の多糖類を含む免疫原性接合体の場合、前記接合体に接合された多糖類の酸化度が４〜１６である、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。
【００１９】
本発明の一実施例において、１５個の異なる血清型から由来した多糖類がそれぞれの担体タンパク質に接合され、
前記血清型が、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆであり、
前記血清型がＣＲＭ１９７に接合された、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。
【００２０】
本発明の一実施例において、２３個の異なる血清型から由来した多糖類がそれぞれの担体タンパク質に接合され、
前記血清型が、１、２、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆであり、
前記血清型のうち、血清型３及び５から由来した莢膜多糖類が担体タンパク質ＴＴに接合され、血清型１、２、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆから由来した莢膜多糖類が担体タンパク質ＣＲＭ１９７に接合された、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。
【００２１】
本発明の一実施例において、２４個の異なる血清型から由来した多糖類がそれぞれの担体タンパク質に接合され、
前記血清型が、２、３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆであり、
前記血清型１及び５から由来した莢膜多糖類が担体タンパク質ＴＴに接合され、血清型２、３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆから由来した莢膜多糖類が担体タンパク質ＣＲＭ１９７に接合された、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。
【００２２】
本発明の一実施例において、前記免疫原性組成物が生理学的に許容可能なビヒクルを含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。
【００２３】
本発明の一実施例において、前記免疫原性組成物がワクチンである、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。
【００２４】
本発明の他の一態様は、（ａ）ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆからなる群より選択されたいずれか一つ以上の血清型から由来した莢膜多糖類を生産する細菌細胞を発酵して溶解する段階と、
（ｂ）前記溶解された細胞からストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆから由来した莢膜多糖類を精製する段階と、
（ｃ）前記精製された多糖類を酸化剤と反応させて活性化させる段階と、
（ｄ）前記活性化された多糖類を担体タンパク質と配合し、担体タンパク質に結合されたストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を形成する段階とを含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物の製造方法を提供する。
【００２５】
本発明の一実施例において、前記製造方法が、血清型２及び１７Ｆ由来の莢膜多糖類の場合、（ｃ）段階の前に、前記精製されたストレプトコッカス・ニューモニエの莢膜多糖類を加水分解して多糖類をサイジングする段階をさらに含み得る。
【００２６】
本発明の一実施例において、前記（ｄ）段階で配合された担体タンパク質が、シアノ水素化ホウ素（ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）、ボラン−ピリジン、及び水素化ホウ素交換樹脂からなる群より選択されたいずれか一つ以上の還元剤と反応して、前記活性化された多糖類と接合体を形成する、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物の製造方法を提供する。
【００２７】
本発明の一実施例において、前記（ｃ）段階では、２０〜２５℃の温度で１５〜２０時間、多糖類１μｇ当り過ヨウ素酸塩０．０１〜０．２２μｇを反応させる、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物の製造方法を提供する。
【００２８】
本発明のさらに他の一態様は、上記の方法によって収得された、ストレプトコッカス・ニューモニエ感染の予防または治療用ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を提供する。
【００２９】
本発明のさらに他の一態様は、ストレプトコッカス・ニューモニエから由来した、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆから選択されたいずれか一つ以上から由来の莢膜多糖類、及びそれぞれの前記莢膜多糖類に接合された一つまたは二つ以上の担体タンパク質を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を個体に有効量投与することで、個体内でストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び／または３３Ｆの感染を予防または治療する方法を提供する。ここで、「及び／または」は「及び」又は「または」を意味する。
【００３０】
前記方法は、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆからなる群より選択されたいずれか一つまたは二つ以上の血清型に対して感染を予防または治療でき、１５個の血清型に対する感染を予防するか、２３個の血清型に対する感染を予防するか、または、２４個の血清型に対する感染を予防し得る。
【００３１】
本発明のさらに他の一態様は、ストレプトコッカス・ニューモニエから由来した、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆから選択されたいずれか一つ以上から由来の莢膜多糖類、及びそれぞれの前記莢膜多糖類に接合された一つまたは二つ以上の担体タンパク質を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体の肺炎球菌感染の予防または治療用途を提供する。
【００３２】
本発明の一実施例は、ストレプトコッカス・ニューモニエから由来した、血清型２の莢膜多糖体、及び前記莢膜多糖体と結合された担体タンパク質を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２の免疫原性接合体を提供する。
【００３３】
本発明の一実施例において、前記血清型２の多糖体は、活性化されて分子量１００〜４００ｋＤａの状態で前記担体タンパク質に結合されて接合体を形成し得る。
【００３４】
本発明の一実施例において、前記免疫原性接合体は１，０００〜１６，０００ｋＤａの分子量を有し得、前記担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり得る。
【００３５】
本発明の一実施例において、前記免疫原性接合体内の担体タンパク質に対する血清型２莢膜多糖体の比（Ｗ／Ｗ）は０．５〜２．０であり得る。
【００３６】
前記血清型２の免疫原性接合体の２０〜６０％はＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在し得る。他の実施例において、酸化度が２〜１８であるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２の免疫原性接合体を提供する。
【００３７】
ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２の多糖体は、糖含量１μｇ当り過ヨウ素酸塩０．０２〜０．１２μｇを添加して酸化させてタンパク質に接合したとき、接合体の分子量が１，０００〜１６，０００ｋＤａであり、分子量の分布が２０〜６０％（０．３ｋｄ以下）であり、多糖体／タンパク質の比率が０．５〜２．０であり得る。
【００３８】
本発明の一実施例において、前記免疫原性接合体及び生理学的に許容可能なビヒクルを含む免疫原性組成物を提供し得る。
【００３９】
本発明の他の実施例において、前記免疫原性組成物を含むワクチンを提供し得る。
【００４０】
本発明のさらに他の実施例において、（ａ）ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２莢膜多糖体を生産する細菌細胞を発酵して溶解する段階と、
（ｂ）前記溶解された細胞からストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２莢膜多糖体を精製する段階と、
（ｃ）精製されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２莢膜多糖体を加水分解して多糖体をサイジングする段階と、
（ｄ）前記（ｃ）段階のサイジングされた多糖体を酸化剤と反応させて前記多糖体を活性化させる段階と、
（ｅ）前記活性化された多糖体を担体タンパク質と配合し、担体タンパク質に結合されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２莢膜多糖体の接合体を形成する段階とを含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２の免疫原性接合体の製造方法を提供し得る。
【００４１】
前記（ｅ）段階で配合された担体タンパク質は還元剤と反応して、前記活性化された多糖体と接合体を形成し得る。
【００４２】
前記（ｄ）段階は、２０〜２５℃の温度で１５〜２０時間、多糖体１μｇ当り過ヨウ素酸塩０．０２〜０．１２μｇを反応させる工程を含み得る。
【００４３】
前記（ｅ）段階の担体タンパク質と配合される活性化された多糖体は、分子量が１００〜４００ｋＤａであり得る。
【００４４】
前記担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２の免疫原性接合体の製造方法を提供し得る。
【００４５】
前記免疫原性接合体は、１，０００〜１６，０００ｋＤａの分子量を有し得る。
【００４６】
本発明の一実施例において、前記担体タンパク質に対する活性化された血清型２莢膜多糖体の初期投入比（担体タンパク質：多糖体）は０．５〜２：１であり得る。
【００４７】
本発明の他の実施例において、免疫原性接合体の少なくとも２０〜６０％がＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在する、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２の免疫原性接合体の製造方法を提供し得る。
【００４８】
本発明の一実施例において、上記の方法で得られた免疫原性接合体を提供し得る。
【００４９】
本発明の一実施例において、上記の方法で得られた免疫原性接合体及び生理学的に許容可能なビヒクルを含む免疫原性組成物を提供し得る。
【００５０】
他の実施例において、前記免疫原性組成物を含むワクチンを提供し得る。
【００５１】
本発明の一実施例は、ストレプトコッカス・ニューモニエから由来した、血清型９Ｎの莢膜多糖体、及び前記莢膜多糖体と結合された担体タンパク質を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型９Ｎの免疫原性接合体を提供する。
【００５２】
本発明の一実施例において、前記血清型９Ｎの多糖体は、活性化されて分子量２００〜７００ｋＤａの状態で前記担体タンパク質に結合されて接合体を形成し得る。
【００５３】
前記免疫原性接合体は５００〜４，０００ｋＤａの分子量を有し得、前記担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり得る。
【００５４】
前記免疫原性接合体内の担体タンパク質に対する血清型９Ｎ莢膜多糖体の比（Ｗ／Ｗ）は０．１〜５であり、望ましくは０．５〜２．５であり得る。
【００５５】
一実施例において、前記免疫原性接合体の１５〜６０％がＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在し得る。
【００５６】
一実施例において、前記接合体は酸化度が２〜１９であり得る。
【００５７】
本発明の一実施例において、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型９Ｎの多糖体は、糖含量１μｇ当り過ヨウ素酸塩０．０２〜０．１９μｇを添加して酸化させてタンパク質に接合したとき、接合体の分子量が５００〜４，０００ｋＤａであり、分子量の分布が１５〜６０％（０．３ｋｄ以下）であり、多糖体／タンパク質の比率が０．５〜２．５であり得る。
【００５８】
本発明の一実施例において、免疫原性接合体及び生理学的に許容可能なビヒクルを含む免疫原性組成物を提供し得る。
【００５９】
本発明の他の実施例において、前記免疫原性組成物を含むワクチンを提供し得る。
【００６０】
本発明のさらに他の実施例において、（ａ）ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型９Ｎ莢膜多糖体を生産する細菌細胞を発酵して溶解する段階と、
（ｂ）前記溶解された細胞からストレプトコッカス・ニューモニエ血清型９Ｎ莢膜多糖体を精製する段階と、
（ｃ）前記多糖体を酸化剤と反応させて活性化させる段階と、
（ｄ）前記活性化された多糖体を担体タンパク質と配合し、担体タンパク質に結合されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型９Ｎ莢膜多糖体の接合体を形成する段階とを含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型９Ｎの免疫原性接合体の製造方法を提供し得る。
【００６１】
前記（ｄ）段階で配合された担体タンパク質は還元剤と反応して、前記活性化された多糖体と接合体を形成する、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型９Ｎの免疫原性接合体の製造方法を提供し得る。
【００６２】
前記（ｃ）段階は、２０〜２５℃の温度で１５〜２０時間、多糖体１μｇ当り過ヨウ素酸塩０．０２〜０．１９μｇを反応させる工程を含み得る。
【００６３】
前記（ｃ）段階の酸化剤と反応する多糖体は、４００〜９００ｋＤａの分子量を有し得る。
【００６４】
前記（ｄ）段階の担体タンパク質と配合される活性化された多糖体は、２００〜７００ｋＤａの分子量を有し得る。
【００６５】
前記免疫原性接合体は、５００〜４，０００ｋＤａの分子量を有し得る。
【００６６】
担体タンパク質に対する活性化された血清型９Ｎ莢膜多糖体の初期投入比（担体タンパク質：多糖体）は０．５〜２．５：１であり得る。
【００６７】
一実施例において、免疫原性接合体の少なくとも１５〜６０％がＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在し得る。
【００６８】
本発明の一実施例において、上記の方法で得られた免疫原性接合体を提供し得る。本発明の一実施例において、上記の方法で得られた免疫原性接合体及び生理学的に許容可能なビヒクルを含む免疫原性組成物を提供し得る。他の実施例において、前記免疫原性組成物を含むワクチンを提供し得る。
【００６９】
本発明の一実施例は、ストレプトコッカス・ニューモニエから由来した、血清型１７Ｆの莢膜多糖体、及び前記莢膜多糖体と結合された担体タンパク質を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１７Ｆの免疫原性接合体を提供する。
【００７０】
前記血清型１７Ｆの多糖体は、活性化されて分子量４００〜９００ｋＤａの状態で前記担体タンパク質に結合されて接合体を形成し得る。
【００７１】
本発明の一実施例において、前記免疫原性接合体は３００〜４，５００ｋＤａの分子量を有し得、担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり得る。
【００７２】
本発明の一実施例において、前記免疫原性接合体内の担体タンパク質に対する血清型１７Ｆ莢膜多糖体の比（Ｗ／Ｗ）は０．５〜１８であり得る。
【００７３】
前記血清型１７Ｆの免疫原性接合体の１５〜６０％はＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在し得る。他の実施例において、酸化度が１〜２２であるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１７Ｆの免疫原性接合体を提供する。
【００７４】
ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１７Ｆの多糖体は、糖含量１μｇ当り過ヨウ素酸塩０．０１〜０．２２μｇを添加して酸化させてタンパク質に接合したとき、接合体の分子量が３００〜４，５００ｋＤａであり、分子量の分布が１５〜６０％（０．３ｋｄ以下）であり、多糖体／タンパク質の比率が０．５〜１８であり得る。
【００７５】
本発明の一実施例において、前記免疫原性接合体及び生理学的に許容可能なビヒクルを含む免疫原性組成物を提供し得る。
【００７６】
本発明の他の実施例において、前記免疫原性組成物を含むワクチンを提供し得る。
【００７７】
本発明のさらに他の実施例において、（ａ）ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１７Ｆ莢膜多糖体を生産する細菌細胞を発酵して溶解する段階と、
（ｂ）前記溶解された細胞からストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１７Ｆ莢膜多糖体を精製する段階と、
（ｃ）精製されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１７Ｆ莢膜多糖体を加水分解して多糖体をサイジングする段階と、
（ｄ）前記（ｃ）段階のサイジングされた多糖体を酸化剤と反応させて前記多糖体を活性化させる段階と、
（ｅ）前記活性化された多糖体を担体タンパク質と配合し、担体タンパク質に結合されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１７Ｆ莢膜多糖体の接合体を形成する段階とを含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１７Ｆの免疫原性接合体の製造方法を提供し得る。
【００７８】
前記（ｅ）段階で配合された担体タンパク質は、還元剤と反応して、前記活性化された多糖体と接合体を形成する、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１７Ｆの免疫原性接合体の製造方法を提供し得る。
【００７９】
前記（ｄ）段階は、２０〜２５℃の温度で１５〜２０時間、多糖体１μｇ当り過ヨウ素酸塩０．０１〜０．２２μｇを反応させる工程を含み得る。
【００８０】
前記（ｅ）段階の担体タンパク質と配合される活性化された多糖体は、分子量が４００〜９００ｋＤａであり得る。
【００８１】
前記免疫原性接合体は、３００〜４，５００ｋＤａの分子量を有し得る。
【００８２】
前記担体タンパク質に対する活性化された血清型１７Ｆ莢膜多糖体の初期投入比（担体タンパク質：多糖体）は１：１であり得る。
【００８３】
一実施例において、免疫原性接合体の分子量の少なくとも１５〜６０％がＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在し得る。
【００８４】
本発明の一実施例において、上記の方法で得られた免疫原性接合体を提供し得る。本発明の一実施例において、上記の方法で得られた免疫原性接合体及び生理学的に許容可能なビヒクルを含む免疫原性組成物を提供し得る。他の実施例において、前記免疫原性組成物を含むワクチンを提供し得る。
【００８５】
本発明の一実施例は、ストレプトコッカス・ニューモニエから由来した、血清型２０の莢膜多糖体、及び前記莢膜多糖体と結合された担体タンパク質を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２０の免疫原性接合体を提供する。
【００８６】
前記血清型２０の多糖体は、活性化されて分子量４００〜８００ｋＤａの状態で前記担体タンパク質に結合されて接合体を形成し得る。
【００８７】
本発明の一実施例において、前記免疫原性接合体は１，０００〜４，０００ｋＤａの分子量を有し得、前記担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり得る。
【００８８】
本発明の一実施例において、前記免疫原性接合体内の担体タンパク質に対する血清型２０莢膜多糖体の比（Ｗ／Ｗ）は１〜５であり得る。
【００８９】
前記血清型２０の免疫原性接合体の７０〜９０％はＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在し得る。他の実施例において、酸化度が４〜１６であるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２０の免疫原性接合体を提供する。
【００９０】
ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２０多糖体は、糖含量１μｇ当り過ヨウ素酸塩０．０１〜０．０４μｇを添加して酸化させてタンパク質に接合したとき、接合体の分子量が１，０００〜４，０００ｋＤａであり、分子量の分布が７０〜９０％（０．３ｋｄ以下）であり、多糖体／タンパク質の比率が１〜５であり得る。
【００９１】
本発明の一実施例において、前記免疫原性接合体及び生理学的に許容可能なビヒクルを含む免疫原性組成物を提供し得る。
【００９２】
本発明の他の実施例において、前記免疫原性組成物を含むワクチンを提供し得る。
【００９３】
本発明のさらに他の実施例において、（ａ）ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２０莢膜多糖体を生産する細菌細胞を発酵して溶解する段階と、
（ｂ）前記溶解された細胞からストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２０莢膜多糖体を精製する段階と、
（ｃ）前記多糖体を酸化剤と反応させて活性化させる段階と、
（ｄ）前記活性化された多糖体を担体タンパク質と配合し、担体タンパク質に結合されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２０莢膜多糖体の接合体を形成する段階とを含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２０の免疫原性接合体の製造方法を提供し得る。
【００９４】
前記（ｄ）段階で配合された担体タンパク質は、還元剤と反応して、前記活性化された多糖体と接合体を形成し得る。
【００９５】
前記（ｃ）段階は、２０〜２５℃の温度で１５〜２０時間、多糖体１μｇ当り過ヨウ素酸塩０．０１〜０．０４μｇを反応させる工程を含み得る。
【００９６】
一実施例において、前記（ｄ）段階の担体タンパク質と配合される活性化された多糖体は、分子量が４００〜８００ｋＤａであり得る。
【００９７】
本発明の一実施例において、前記免疫原性接合体は１，０００〜４，０００ｋＤａの分子量を有し得る。
【００９８】
一実施例において、担体タンパク質に対する活性化された血清型２０莢膜多糖体の初期投入比（担体タンパク質：多糖体）は１：１であり得る。
【００９９】
一実施例において、免疫原性接合体の少なくとも７０〜９０％がＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在し得る。
【０１００】
本発明の一実施例において、上記の方法で得られた免疫原性接合体を提供し得る。
【０１０１】
本発明の一実施例において、上記の方法で得られた免疫原性接合体及び生理学的に許容可能なビヒクルを含む免疫原性組成物を提供し得る。
【０１０２】
他の実施例において、前記免疫原性組成物を含むワクチンを提供し得る。
【０１０３】
本発明の一態様は、ストレプトコッカス・ニューモニエから由来した、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆから選択されたいずれか一つ以上から由来の莢膜多糖類、及びそれぞれの前記莢膜多糖類に接合された担体タンパク質を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。
【０１０４】
一実施例において、前記免疫原性組成物が血清型２由来の多糖類を含む場合、前記多糖類は活性化されて分子量１００〜４００ｋＤａの状態で前記担体タンパク質に結合されて接合体を形成するか、
前記免疫原性組成物が血清型１７Ｆ由来の多糖類を含む場合、前記多糖類は活性化されて分子量４００〜９００ｋＤａの状態で前記担体タンパク質に結合されて接合体を形成するか、または、
前記免疫原性組成物が血清型２０由来の多糖類を含む場合、前記多糖類は活性化されて分子量４００〜８００ｋＤａの状態で前記担体タンパク質に結合されて接合体を形成する、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。
【０１０５】
本発明の一実施例は、前記免疫原性組成物が血清型２由来の多糖類を含む場合、前記血清型２由来の多糖類を含む免疫原性接合体が１，０００〜１６，０００ｋＤａの分子量を有するか、
前記免疫原性組成物が血清型１７Ｆ由来の多糖類を含む場合、前記血清型１７Ｆ由来の多糖類を含む免疫原性接合体が３００〜４，５００ｋＤａの分子量を有するか、または、
前記免疫原性組成物が血清型２０由来の多糖類を含む場合、前記血清型２０由来の多糖類を含む免疫原性接合体が１，０００〜４，０００ｋＤａの分子量を有する、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。
【０１０６】
本発明の一実施例は、前記担体タンパク質が破傷風トキソイド（ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｏｉｄ、「ＴＴ」とも称する）またはＣＲＭ１９７である、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。望ましくは、１個のみの血清型を含む免疫原性組成物は担体タンパク質でＣＲＭ１９７を含み得る。
【０１０７】
本発明の一実施例は、前記免疫原性組成物が血清型２由来の多糖類を含む場合、前記免疫原性接合体内の担体タンパク質に対する血清型２莢膜多糖類の比（多糖類／タンパク質、Ｗ／Ｗ）が０．５〜２．０であるか、
前記免疫原性組成物が血清型１７Ｆ由来の多糖類を含む場合、前記免疫原性接合体内の担体タンパク質に対する血清型１７Ｆ莢膜多糖類の比（多糖類／タンパク質、Ｗ／Ｗ）が０．５〜１８であるか、または、
前記免疫原性組成物が血清型２０由来の多糖類を含む場合、前記免疫原性接合体内の担体タンパク質に対する血清型２０由来の莢膜多糖類の比（多糖類／タンパク質、Ｗ／Ｗ）が１〜５である、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。
【０１０８】
本発明の一実施例において、前記血清型２由来の多糖類を含む免疫原性接合体の場合、全体分子量の２０〜６０％がＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在するか、
前記血清型１７Ｆ由来の多糖類を含む免疫原性接合体の場合、全体分子量の１５〜６０％がＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在するか、または、
前記血清型２０由来の多糖類を含む免疫原性接合体の場合、全体分子量の７０〜９０％がＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在する、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。
【０１０９】
本発明の一実施例において、前記血清型２由来の多糖類を含む免疫原性接合体の場合、前記接合体に接合された多糖類の酸化度が２〜１８であるか、
前記血清型１７Ｆ由来の多糖類を含む免疫原性接合体の場合、前記接合体に接合された多糖類の酸化度が１〜２２であるか、または、
前記血清型２０由来の多糖類を含む免疫原性接合体の場合、前記接合体に接合された多糖類の酸化度が４〜１６である、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。
【０１１０】
本発明の一実施例において、１５個の異なる血清型から由来した多糖類がそれぞれの担体タンパク質に接合され、
前記血清型が、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆであり、
前記血清型がＣＲＭ１９７に接合された、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。
【０１１１】
本発明の一実施例において、２３個の異なる血清型から由来した多糖類がそれぞれの担体タンパク質に接合され、
前記血清型が、１、２、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆであり、
前記血清型のうち、血清型３及び５から由来した莢膜多糖類が担体タンパク質ＴＴに接合され、血清型１、２、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆから由来した莢膜多糖類が担体タンパク質ＣＲＭ１９７に接合された、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。
【０１１２】
本発明の一実施例において、２４個の異なる血清型から由来した多糖類がそれぞれの担体タンパク質に接合され、
前記血清型が、２、３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆであり、
前記血清型１及び５から由来した莢膜多糖類が担体タンパク質ＴＴに接合され、血清型２、３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆから由来した莢膜多糖類が担体タンパク質ＣＲＭ１９７に接合された、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。
【０１１３】
本発明の一実施例において、前記免疫原性組成物が生理学的に許容可能なビヒクルを含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。
【０１１４】
本発明の一実施例において、前記免疫原性組成物がワクチンである、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を提供する。
【０１１５】
本発明の他の一態様は、（ａ）ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆからなる群より選択されたいずれか一つ以上の血清型から由来した莢膜多糖類を生産する細菌細胞を発酵して溶解する段階と、
（ｂ）前記溶解された細胞からストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆから由来した莢膜多糖類を精製する段階と、
（ｃ）前記精製された多糖類を酸化剤と反応させて活性化させる段階と、
（ｄ）前記活性化された多糖類を担体タンパク質と配合し、担体タンパク質に結合されたストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を形成する段階とを含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物の製造方法を提供する。
【０１１６】
本発明の一実施例において、前記製造方法が、血清型２及び１７Ｆ由来の莢膜多糖類の場合、（ｃ）段階の前に、前記精製されたストレプトコッカス・ニューモニエの莢膜多糖類を加水分解して多糖類をサイジングする段階をさらに含み得る。
【０１１７】
本発明の一実施例において、前記（ｄ）段階で配合された担体タンパク質が、シアノ水素化ホウ素、ボラン−ピリジン、及び水素化ホウ素交換樹脂からなる群より選択されたいずれか一つ以上の還元剤と反応して、前記活性化された多糖類と接合体を形成する、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物の製造方法を提供する。
【０１１８】
本発明の一実施例において、前記（ｃ）段階では、２０〜２５℃の温度で１５〜２０時間、多糖類１μｇ当り過ヨウ素酸塩０．０１〜０．２２μｇを反応させる、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物の製造方法を提供する。
【０１１９】
本発明のさらに他の一態様は、上記の方法によって収得された、ストレプトコッカス・ニューモニエ感染の予防または治療用ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を提供する。
【０１２０】
本発明のさらに他の一態様は、ストレプトコッカス・ニューモニエから由来した、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆから選択されたいずれか一つ以上から由来の莢膜多糖類、及びそれぞれの前記莢膜多糖類に接合された一つまたは二つ以上の担体タンパク質を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物を個体に有効量投与することで、個体内でストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び／または３３Ｆの感染を予防または治療する方法を提供する。ここで、「及び／または」は「及び」又は「または」を意味する。
【０１２１】
前記方法は、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆからなる群より選択されたいずれか一つまたは二つ以上の血清型に対して感染を予防または治療でき、１５個の血清型に対する感染を予防するか、２３個の血清型に対する感染を予防するか、または、２４個の血清型に対する感染を予防し得る。
【０１２２】
本発明のさらに他の一態様は、ストレプトコッカス・ニューモニエから由来した、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆから選択されたいずれか一つ以上から由来の莢膜多糖類、及びそれぞれの前記莢膜多糖類に接合された一つまたは二つ以上の担体タンパク質を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体の肺炎球菌感染の予防または治療用途を提供する。
【０１２３】
本発明の一実施例は、ストレプトコッカス・ニューモニエから由来した、血清型２の莢膜多糖体、及び前記莢膜多糖体と結合された担体タンパク質を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２の免疫原性接合体を提供する。
【０１２４】
本発明の一実施例において、前記血清型２の多糖体は、活性化されて分子量１００〜４００ｋＤａの状態で前記担体タンパク質に結合されて接合体を形成し得る。
【０１２５】
本発明の一実施例において、前記免疫原性接合体は１，０００〜１６，０００ｋＤａの分子量を有し得、前記担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり得る。
【０１２６】
本発明の一実施例において、前記免疫原性接合体内の担体タンパク質に対する血清型２莢膜多糖体の比（Ｗ／Ｗ）は０．５〜２．０であり得る。
【０１２７】
前記血清型２の免疫原性接合体の２０〜６０％はＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在し得る。他の実施例において、酸化度が２〜１８であるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２の免疫原性接合体を提供する。
【０１２８】
ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２の多糖体は、糖含量１μｇ当り過ヨウ素酸塩０．０２〜０．１２μｇを添加して酸化させてタンパク質に接合したとき、接合体の分子量が１，０００〜１６，０００ｋＤａであり、分子量の分布が２０〜６０％（０．３ｋｄ以下）であり、多糖体／タンパク質の比率が０．５〜２．０であり得る。
【０１２９】
本発明の一実施例において、前記免疫原性接合体及び生理学的に許容可能なビヒクルを含む免疫原性組成物を提供し得る。
【０１３０】
本発明の他の実施例において、前記免疫原性組成物を含むワクチンを提供し得る。
【０１３１】
本発明のさらに他の実施例において、（ａ）ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２莢膜多糖体を生産する細菌細胞を発酵して溶解する段階と、
（ｂ）前記溶解された細胞からストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２莢膜多糖体を精製する段階と、
（ｃ）精製されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２莢膜多糖体を加水分解して多糖体をサイジングする段階と、
（ｄ）前記（ｃ）段階のサイジングされた多糖体を酸化剤と反応させて前記多糖体を活性化させる段階と、
（ｅ）前記活性化された多糖体を担体タンパク質と配合し、担体タンパク質に結合されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２莢膜多糖体の接合体を形成する段階とを含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２の免疫原性接合体の製造方法を提供し得る。
【０１３２】
前記（ｅ）段階で配合された担体タンパク質は、還元剤と反応して、前記活性化された多糖体と接合体を形成し得る。
【０１３３】
前記（ｄ）段階は、２０〜２５℃の温度で１５〜２０時間、多糖体１μｇ当り過ヨウ素酸塩０．０２〜０．１２μｇを反応させる工程を含み得る。
【０１３４】
前記（ｅ）段階の担体タンパク質と配合される活性化された多糖体は、分子量が１００〜４００ｋＤａであり得る。
【０１３５】
前記担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２の免疫原性接合体の製造方法を提供し得る。
【０１３６】
前記免疫原性接合体は、１，０００〜１６，０００ｋＤａの分子量を有し得る。
【０１３７】
一実施例において、前記担体タンパク質に対する活性化された血清型２莢膜多糖体の初期投入比（担体タンパク質：多糖体）は０．５〜２：１であり得る。
【０１３８】
他の実施例において、免疫原性接合体の少なくとも２０〜６０％がＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在する、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２の免疫原性接合体の製造方法を提供し得る。
【０１３９】
本発明の一実施例において、上記の方法で得られた免疫原性接合体を提供し得る。
【０１４０】
本発明の一実施例において、上記の方法で得られた免疫原性接合体及び生理学的に許容可能なビヒクルを含む免疫原性組成物を提供し得る。
【０１４１】
他の実施例において、前記免疫原性組成物を含むワクチンを提供し得る。
【０１４２】
本発明の一実施例は、ストレプトコッカス・ニューモニエから由来した、血清型９Ｎの莢膜多糖体、及び前記莢膜多糖体と結合された担体タンパク質を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型９Ｎの免疫原性接合体を提供する。
【０１４３】
本発明の一実施例において、前記血清型９Ｎの多糖体は、活性化されて分子量２００〜７００ｋＤａの状態で前記担体タンパク質に結合されて接合体を形成し得る。
【０１４４】
前記免疫原性接合体は５００〜４，０００ｋＤａの分子量を有し得、前記担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり得る。
【０１４５】
前記免疫原性接合体内の担体タンパク質に対する血清型９Ｎ莢膜多糖体の比（Ｗ／Ｗ）は０．１〜５であり、望ましくは０．５〜２．５であり得る。
【０１４６】
一実施例において、前記免疫原性接合体の１５〜６０％がＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在し得る。
【０１４７】
一実施例において、前記接合体は酸化度が２〜１９であり得る。
【０１４８】
本発明の一実施例において、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型９Ｎの多糖体は、糖含量１μｇ当り過ヨウ素酸塩０．０２〜０．１９μｇを添加して酸化させてタンパク質に接合したとき、接合体の分子量が５００〜４，０００ｋＤａであり、分子量の分布が１５〜６０％（０．３ｋｄ以下）であり、多糖体／タンパク質の比率が０．５〜２．５であり得る。
【０１４９】
本発明の一実施例において、免疫原性接合体及び生理学的に許容可能なビヒクルを含む免疫原性組成物を提供し得る。
【０１５０】
本発明の他の実施例において、前記免疫原性組成物を含むワクチンを提供し得る。
【０１５１】
本発明のさらに他の実施例において、（ａ）ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型９Ｎ莢膜多糖体を生産する細菌細胞を発酵して溶解する段階と、
（ｂ）前記溶解された細胞からストレプトコッカス・ニューモニエ血清型９Ｎ莢膜多糖体を精製する段階と、
（ｃ）前記多糖体を酸化剤と反応させて活性化させる段階と、
（ｄ）前記活性化された多糖体を担体タンパク質と配合し、担体タンパク質に結合されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型９Ｎ莢膜多糖体の接合体を形成する段階とを含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型９Ｎの免疫原性接合体の製造方法を提供し得る。
【０１５２】
前記（ｄ）段階で配合された担体タンパク質は、還元剤と反応して、前記活性化された多糖体と接合体を形成する、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型９Ｎの免疫原性接合体の製造方法を提供し得る。
【０１５３】
前記（ｃ）段階は、２０〜２５℃の温度で１５〜２０時間、多糖体１μｇ当り過ヨウ素酸塩０．０２〜０．１９μｇを反応させる工程を含み得る。
【０１５４】
前記（ｃ）段階の酸化剤と反応する多糖体は、４００〜９００ｋＤａの分子量を有し得る。
【０１５５】
前記（ｄ）段階の担体タンパク質と配合される活性化された多糖体は、２００〜７００ｋＤａの分子量を有し得る。
【０１５６】
前記免疫原性接合体は、５００〜４，０００ｋＤａの分子量を有し得る。
【０１５７】
担体タンパク質に対する活性化された血清型９Ｎ莢膜多糖体の初期投入比（担体タンパク質：多糖体）は０．５〜２．５：１であり得る。
【０１５８】
一実施例において、免疫原性接合体の少なくとも１５〜６０％がＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在し得る。
【０１５９】
本発明の一実施例において、上記の方法で得られた免疫原性接合体を提供し得る。本発明の一実施例において、上記の方法で得られた免疫原性接合体及び生理学的に許容可能なビヒクルを含む免疫原性組成物を提供し得る。他の実施例において、前記免疫原性組成物を含むワクチンを提供し得る。
【０１６０】
本発明の一実施例は、ストレプトコッカス・ニューモニエから由来した、血清型１７Ｆの莢膜多糖体、及び前記莢膜多糖体と結合された担体タンパク質を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１７Ｆの免疫原性接合体を提供する。
【０１６１】
前記血清型１７Ｆの多糖体は、活性化されて分子量４００〜９００ｋＤａの状態で前記担体タンパク質に結合されて接合体を形成し得る。
【０１６２】
本発明の一実施例において、前記免疫原性接合体は３００〜４，５００ｋＤａの分子量を有し得、担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり得る。
【０１６３】
本発明の一実施例において、前記免疫原性接合体内の担体タンパク質に対する血清型１７Ｆ莢膜多糖体の比（Ｗ／Ｗ）は０．５〜１８であり得る。
【０１６４】
前記血清型１７Ｆの免疫原性接合体の１５〜６０％はＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在し得る。他の実施例において、酸化度が１〜２２であるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１７Ｆの免疫原性接合体を提供する。
【０１６５】
ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１７Ｆの多糖体は、糖含量１μｇ当り過ヨウ素酸塩０．０１〜０．２２μｇを添加して酸化させてタンパク質に接合したとき、接合体の分子量が３００〜４，５００ｋＤａであり、分子量の分布が１５〜６０％（０．３ｋｄ以下）であり、多糖体／タンパク質の比率が０．５〜１８であり得る。
【０１６６】
本発明の一実施例において、前記免疫原性接合体及び生理学的に許容可能なビヒクルを含む免疫原性組成物を提供し得る。
【０１６７】
本発明の他の実施例において、前記免疫原性組成物を含むワクチンを提供し得る。
【０１６８】
本発明のさらに他の実施例において、（ａ）ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１７Ｆ莢膜多糖体を生産する細菌細胞を発酵して溶解する段階と、
（ｂ）前記溶解された細胞からストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１７Ｆ莢膜多糖体を精製する段階と、
（ｃ）精製されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１７Ｆ莢膜多糖体を加水分解して多糖体をサイジングする段階と、
（ｄ）前記（ｃ）段階のサイジングされた多糖体を酸化剤と反応させて前記多糖体を活性化させる段階と、
（ｅ）前記活性化された多糖体を担体タンパク質と配合し、担体タンパク質に結合されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１７Ｆ莢膜多糖体の接合体を形成する段階とを含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１７Ｆの免疫原性接合体の製造方法を提供し得る。
【０１６９】
前記（ｅ）段階で配合された担体タンパク質は、還元剤と反応して、前記活性化された多糖体と接合体を形成する、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１７Ｆの免疫原性接合体の製造方法を提供し得る。
【０１７０】
前記（ｄ）段階は、２０〜２５℃の温度で１５〜２０時間、多糖体１μｇ当り過ヨウ素酸塩０．０１〜０．２２μｇを反応させる工程を含み得る。
【０１７１】
前記（ｅ）段階の担体タンパク質と配合される活性化された多糖体は、分子量が４００〜９００ｋＤａであり得る。
【０１７２】
前記免疫原性接合体は、３００〜４，５００ｋＤａの分子量を有し得る。
【０１７３】
前記担体タンパク質に対する活性化された血清型１７Ｆ莢膜多糖体の初期投入比（担体タンパク質：多糖体）は１：１であり得る。
【０１７４】
一実施例において、免疫原性接合体の分子量の少なくとも１５〜６０％がＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在し得る。
【０１７５】
本発明の一実施例において、上記の方法で得られた免疫原性接合体を提供し得る。本発明の一実施例において、上記の方法で得られた免疫原性接合体及び生理学的に許容可能なビヒクルを含む免疫原性組成物を提供し得る。他の実施例において、前記免疫原性組成物を含むワクチンを提供し得る。
【０１７６】
本発明の一実施例は、ストレプトコッカス・ニューモニエから由来した、血清型２０の莢膜多糖体、及び前記莢膜多糖体と結合された担体タンパク質を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２０の免疫原性接合体を提供する。
【０１７７】
前記血清型２０の多糖体は、活性化されて分子量４００〜８００ｋＤａの状態で前記担体タンパク質に結合されて接合体を形成し得る。
【０１７８】
本発明の一実施例において、前記免疫原性接合体は１，０００〜４，０００ｋＤａの分子量を有し得、前記担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり得る。
【０１７９】
本発明の一実施例において、前記免疫原性接合体内の担体タンパク質に対する血清型２０莢膜多糖体の比（Ｗ／Ｗ）は１〜５であり得る。
【０１８０】
前記血清型２０の免疫原性接合体の７０〜９０％はＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在し得る。他の実施例において、酸化度が４〜１６であるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２０の免疫原性接合体を提供する。
【０１８１】
ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２０多糖体は、糖含量１μｇ当り過ヨウ素酸塩０．０１〜０．０４μｇを添加して酸化させてタンパク質に接合したとき、接合体の分子量が１，０００〜４，０００ｋＤａであり、分子量の分布が７０〜９０％（０．３ｋｄ以下）であり、多糖体／タンパク質の比率が１〜５であり得る。
【０１８２】
本発明の一実施例において、前記免疫原性接合体及び生理学的に許容可能なビヒクルを含む免疫原性組成物を提供し得る。
【０１８３】
本発明の他の実施例において、前記免疫原性組成物を含むワクチンを提供し得る。
【０１８４】
本発明のさらに他の実施例において、（ａ）ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２０莢膜多糖体を生産する細菌細胞を発酵して溶解する段階と、
（ｂ）前記溶解された細胞からストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２０莢膜多糖体を精製する段階と、
（ｃ）前記多糖体を酸化剤と反応させて活性化させる段階と、
（ｄ）前記活性化された多糖体を担体タンパク質と配合し、担体タンパク質に結合されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２０莢膜多糖体の接合体を形成する段階とを含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２０の免疫原性接合体の製造方法を提供し得る。
【０１８５】
前記（ｄ）段階で配合された担体タンパク質は、還元剤と反応して、前記活性化された多糖体と接合体を形成し得る。
【０１８６】
前記（ｃ）段階は、２０〜２５℃の温度で１５〜２０時間、多糖体１μｇ当り過ヨウ素酸塩０．０１〜０．０４μｇを反応させる工程を含み得る。
【０１８７】
一実施例において、前記（ｄ）段階の担体タンパク質と配合される活性化された多糖体は、分子量が４００〜８００ｋＤａであり得る。
【０１８８】
本発明の一実施例において、前記免疫原性接合体は１，０００〜４，０００ｋＤａの分子量を有し得る。
【０１８９】
一実施例において、担体タンパク質に対する活性化された血清型２０莢膜多糖体の初期投入比（担体タンパク質：多糖体）は１：１であり得る。
【０１９０】
一実施例において、免疫原性接合体の少なくとも７０〜９０％がＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在し得る。
【０１９１】
本発明の一実施例において、上記の方法で得られた免疫原性接合体を提供し得る。
【０１９２】
本発明の一実施例において、上記の方法で得られた免疫原性接合体及び生理学的に許容可能なビヒクルを含む免疫原性組成物を提供し得る。
【０１９３】
他の実施例において、前記免疫原性組成物を含むワクチンを提供し得る。
＜血清型２０多糖類−担体タンパク質接合体の特性＞
一実施形態において、接合体は、１，３００〜４，３００ｋＤａ、１，２５０〜４，２５０ｋＤａ、１，２００〜４，２００ｋＤａ、１，１５０〜４，１５０ｋＤａ、１，１００〜４，１００ｋＤａ、または、１，０００〜４，０００ｋＤａの分子量を有し得る。上記の範囲のうち任意の範囲内のすべての整数は、実施形態として見なされる。
【０１９４】
前記分子量の範囲において、接合体の収率が優れ、安定的に接合体を形成することができる。また、遊離糖（ｆｒｅｅ ｓｕｇａｒ）の比率を低減させることができる。さらに、前記分子量の範囲で優れた免疫原性に寄与することができる。
【０１９５】
個別的な多糖類−タンパク質接合体を精製した後、これらを配合して本発明の免疫原性組成物を製剤化する。
【０１９６】
本発明の血清型の多糖類−タンパク質接合体は、担体タンパク質に対する糖類の比（多糖類の量／タンパク質の量）（重量／重量）によって特性化することができる。
【０１９７】
一実施形態において、前記多糖類−タンパク質接合体のうちの各血清型の担体タンパク質に対する糖類の比（ｗ／ｗ）は、０．１〜７、０．２〜７．５、０．３〜７、０．４〜６．５、０．５〜６、０．６〜６．５、０．７〜６、０．８〜５．８、０．９〜５．６、０．９５〜５．３、または１〜５であり得る。例えば、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５であり得る。
【０１９８】
他の実施形態において、前記担体タンパク質に対する糖類の比（ｗ／ｗ）は１〜５、１．２〜４．５、または１．３〜４であり得る。
【０１９９】
望ましくは、前記担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり得る。
【０２００】
担体タンパク質に対する糖類の比率が上記の範囲であれば、接合体の収率が優れ、安定的に接合体を形成することができる。また、遊離糖の比率を低減させることができる。また、上記の範囲であると、免疫原性に優れるだけでなく、他の血清型との干渉なく安定的に接合体を維持することができる。
【０２０１】
本発明の接合体及び免疫原性組成物は、前記担体タンパク質に共有的に接合されていないが、多糖類−タンパク質接合体組成物中に存在する遊離糖類（ｆｒｅｅ ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を含むことができる。前記遊離糖類は、前記多糖類−タンパク質接合体と非共有的に結合できる（すなわち、前記多糖類−タンパク質接合体に非共有的に結合または吸着されるか、それとも、前記多糖類−タンパク質接合体中にまたは前記多糖類−タンパク質接合体によって捕獲され得る）。
【０２０２】
望ましい実施形態において、前記多糖類−タンパク質接合体は、各血清型の多糖類の総量に対して約７０％、約６０％、約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、または１０％未満の各血清型の遊離多糖類を含む。
【０２０３】
また、各血清型の多糖類−タンパク質接合体をその分子サイズ分布（Ｋｄ）によって特性化することができる。サイズ排除クロマトグラフィー媒質（ＣＬ−４Ｂ、架橋アガロースビーズ、４％）を使用して前記接合体の相対的な分子サイズ分布を測定することができる。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を重力流カラムに使用して接合体の分子サイズ分布をプロファイリングする。前記媒質中の気孔から排除される大きい分子は小さい分子よりも速く溶離される。フラクションコレクタを使用してカラム溶出物を収集する。前記フラクションを糖類分析によって比色測定する。Ｋｄの測定のため、カラムを目盛り化して分子が完全に排除されるフラクション（Ｖ０）、（Ｋｄ＝０）、及び最大維持を見せるフラクション（Ｖｉ）、（Ｋｄ＝１）を設定する。特定のサンプル特性に到達したフラクション（Ｖｅ）を式「Ｋｄ＝（Ｖｅ−Ｖ０）／（Ｖｉ−Ｖ０）」によってＫｄと関連付ける。
【０２０４】
望ましい実施形態において、各血清型の多糖類−タンパク質接合体の少なくとも３０％はＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在し得る。
【０２０５】
望ましい実施形態において、前記多糖類−タンパク質接合体の少なくとも９５％はＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在し得る。望ましい実施形態において、各血清型の多糖類−タンパク質接合体の少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％はＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在し得る。望ましい実施形態において、各血清型の多糖類−タンパク質接合体の少なくとも６０％はＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在し得る。望ましい実施形態において、各血清型の多糖類−タンパク質接合体の５０％〜９０％はＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在し得る。望ましい実施形態において、各血清型の多糖類−タンパク質接合体の６５％〜９０％はＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在し得る。望ましい実施形態において、各血清型の多糖類−タンパク質接合体の７０％〜９０％はＣＬ−４Ｂカラムで０．３Ｋｄ以内に存在し得る。
＜１．４ 莢膜多糖類−担体タンパク質接合体の組合せ＞
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２、９Ｎ、１７Ｆ及び２０からなる群より選択された一つ以上の多糖類とタンパク質との接合体を含む。一実施形態において、前記免疫原性組成物のうちいずれか一つは、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆからなる群より選択されたいずれか一つ以上から由来の多糖類が担体タンパク質に追加的に接合された接合体を含むことができる。
【０２０６】
一実施形態において、前記免疫原性組成物のうちいずれか一つの多糖類−タンパク質接合体は、ＣＲＭ１９７及び／またはＴＴに個別的に接合される。望ましくは、２３価または２４価免疫原性組成物は、ＣＲＭ１９７及びＴＴを担体タンパク質として共に含むことができ、この場合、望ましくは、血清型５は担体タンパク質としてＴＴを含む。一実施例において、２３価免疫原性組成物は、血清型３及び５由来の多糖類がＴＴに接合され、血清型１、２、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆ由来の多糖類がＣＲＭ１９７に接合される。一実施例において、２４価免疫原性組成物は、血清型１及び５由来の多糖類がＴＴに接合され、血清型２、３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３ＦがＣＲＭ１９７に接合される。
【０２０７】
一実施形態において、前記免疫原性組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４個の異なる血清型由来の多糖類−タンパク質接合体を含むことができる。
＜２．免疫原性組成物の投与量＞
各用量中の莢膜多糖類−担体タンパク質接合体の量を、典型的なワクチンのうち顕著な副作用なしに免疫保護反応を誘導する量として選択する。このような量は、特異的な免疫原が使用され、どのように提供されるかによって変わり得る。
＜２．１ 莢膜多糖類−担体タンパク質接合体の量＞
免疫原性組成物中の特定の莢膜多糖類−担体タンパク質接合体の量は、前記接合体に対する（接合された及び接合されていない）全体多糖類を基準にして計算することができる。例えば、２０％遊離多糖類を有する莢膜多糖類−担体タンパク質接合体は、１００μｇの多糖類用量のうち約８０μｇの接合された多糖類及び約２０μｇの接合されていない多糖類を有することを意味し得る。前記多糖類−タンパク質接合体の量は、前記肺炎球菌血清型によって変わり得る。前記多糖類の濃度は、アントロンまたはウロン酸分析によって測定し得る。
【０２０８】
前記免疫原性組成物中の異なる多糖類成分の「免疫原性量」は多様であり得、それぞれ約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、約５０μｇ、約６０μｇ、約７０μｇ、約８０μｇ、約９０μｇまたは約１００μｇの任意の特定の多糖類抗原を含むことができる。
【０２０９】
一般に、それぞれの用量は、与えられた血清型に対して０．１μｇ〜１００μｇ、特に０．５μｇ〜２０μｇ、より特に１．０μｇ〜１０μｇ、さらに特に２．０μｇ〜５．０μｇの多糖類を含むことができる。上記の範囲のうち任意の範囲内のすべての整数は、実施形態として見なされる。
【０２１０】
一実施形態において、それぞれの用量は、それぞれの特定の莢膜多糖類−担体タンパク質接合体に対し、約１．０μｇ、約１．２μｇ、約１．４μｇ、約１．６μｇ、約１．８μｇ、約２．０μｇ、約２．２μｇ、約２．４μｇ、約２．６μｇ、約２．８μｇ、約３．０μｇ、約３．２μｇ、約３．４μｇ、約３．６μｇ、約３．８μｇ、約４．０μｇ、約４．２μｇ、約４．４μｇ、約４．６μｇ、約４．８μｇ、約５．０μｇ、約５．２μｇ、約５．４μｇ、約５．６μｇ、約５．８μｇまたは約６．０μｇの多糖類を含むことができる。
【０２１１】
一実施形態において、それぞれの用量は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び／または３３Ｆ由来の多糖類−タンパク質接合体に対して１〜３μｇの多糖類を含むことができる。例えば、約１．１μｇ、約１．２μｇ、約１．３μｇ、約１．４μｇ、約１．５μｇ、約１．６μｇ、約１．７μｇ、約１．８μｇ、約１．９μｇ、約２．０μｇ、約２．１μｇ、約２．２μｇ、約２．３μｇ、約２．４μｇ、約２．５μｇ、約２．６μｇ、約２．７μｇ、約２．８μｇ、約２．９μｇまたは約３．０μｇの多糖類を含むことができる。
【０２１２】
一実施例において、追加的に血清型６Ｂ由来の多糖類−タンパク質接合体を含む場合、２〜６μｇの多糖類を含むことができる。
＜２．２ 担体タンパク質の量＞
一実施形態において、前記担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７及び／またはＴＴであり得る。
【０２１３】
一実施形態において、前記担体タンパク質がＣＲＭ１９７であれば、免疫原性組成物は１０μｇ〜１５０μｇ、２０μｇ〜１００μｇ、２５μｇ〜９５μｇの担体タンパク質を含むことができる。例えば、本発明の一実施形態による２４価免疫原性組成物は、７０〜９０μｇの担体タンパク質を含むことができる。
【０２１４】
一実施形態において、前記担体タンパク質がＴＴであれば、免疫原性組成物は５μｇ〜１５μｇ、８μｇ〜１０μｇの担体タンパク質を含むことができる。
＜３．アジュバント＞
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、一種以上のアジュバントをさらに含むことができる。「アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）」とは、抗原に対する免疫反応を増大させる化合物または混合物を指称する。アジュバントは、例えば、ないか又は弱い抗体力価または細胞媒介免疫反応を誘導することのように、単独投与時には、弱い免疫原性を有する抗原に対する免疫反応を増強させ、及び／または、抗原に対する抗体力価を増加させ、及び／または、個体で免疫反応を達成するのに効果的な抗原の用量を減少させることができる。したがって、アジュバントはほとんど免疫反応を増加させる役割をし、これは当業者に周知である。組成物の有効性を増強させる好適なアジュバントとしては、以下のようなものを含むが、これらに限定されない。
【０２１５】
一実施例において、アジュバントは、アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどを含むことができる。
【０２１６】
特定の実施形態において、アジュバントはアルミニウム塩である。アルミニウム塩アジュバントは、ミョウバン−沈殿ワクチンまたはミョウバン−吸着ワクチンであり得る。アルミニウム塩アジュバントは、当業界で周知のことである。アルミニウム塩としては、水和されたアルミナ、アルミナ水和物、アルミナ３水和物（ＡＴＨ）、アルミニウム水和物、アルミニウム３水和物、アルヒドロゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）、スーパーフォス（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ）、アンホジェル（Ａｍｐｈｏｇｅｌ）、水酸化アルミニウム（ＩＩＩ）、アルミニウムヒドロキシホスフェート硫酸塩（リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ））、無定形アルミナ、３水和されたアルミナ、またはトリヒドロキシアルミニウムを含むが、これらに限定されない。
【０２１７】
ＡＰＡは、アルミニウムヒドロキシホスフェートの水性懸濁液である。ＡＰＡは、塩化アルミニウムとリン酸ナトリウムとを１：１の体積比で混合してアルミニウムヒドロキシホスフェートを沈殿させることで製造される。混合工程の後、高せん断ミキサを使用して物質の大きさに縮小させることで、大きさ２〜８μｍ範囲の標的凝集体粒子を収得する。その後、生成物を生理食塩水で透析し濾過して蒸気滅菌させる。
【０２１８】
特定の実施形態において、商業的に入手可能なＡｌ（ＯＨ）３（例えば、デンマーク／Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．（米国ニューヨーク州ウェストベリー）のアルヒドロゲルまたはスーパーフォス）を使用して、５０〜２００ｇのタンパク質／１ｍｇの水酸化アルミニウムの比率でタンパク質を吸着させる。他の実施形態において、タンパク質の吸着は、タンパク質のｐＩ（等電ｐＨ）及び媒質のｐＨによって変わる。ｐＩが低いタンパク質は、ｐＩがより高いタンパク質よりも強力に、正電荷に帯電したアルミニウムイオンに吸着される。アルミニウム塩は、２〜３週間にかけて徐々に放出するＡｇデポ（ｄｅｐｏｔ）を確立でき、及び／または、大食細胞の非特異活性化及び補体活性化に関与でき、及び／または、（望ましくは尿酸刺激を通じて）先天性免疫メカニズムを刺激することができる。
【０２１９】
望ましい実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム及び水酸化アルミニウムからなる群より選択されたアルミニウムベースのアジュバントである。一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、リン酸アルミニウムアジュバントを含む。
＜４．剤形＞
本発明の免疫原性組成物は、液体形態（すなわち、溶液または懸濁液）に、または、凍結乾燥した形態に製剤化することができる。液状剤形は、そのパッケージングされた形態で直接投与できるため、本発明の凍結乾燥された組成物に対して求められる水性媒質内での再組成の必要なく注射に理想的である。
【０２２０】
本発明の免疫原性組成物の製剤化は、当技術分野で認められる方法を使用して行うことができる。例えば、個別的な肺炎球菌接合体を生理学的に許容可能なビヒクルと一緒に製剤化して前記組成物を製造することができる。前記ビヒクルの例としては、非制限的に、水、緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）及びデキストロース溶液が挙げられる。
【０２２１】
本発明は、開示された多糖類−タンパク質接合体の組合せのうちいずれか一つ、及び薬学的に許容可能な賦形剤、担体または希釈剤を含む免疫原性組成物を提供する。
【０２２２】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、液体形態、望ましくは水性液体形態である。
【０２２３】
本発明の免疫原性組成物は、緩衝剤、塩、２価陽イオン、非イオン性界面活性剤、凍結保護剤、例えば糖、及び酸化防止剤、例えば遊離ラジカル除去剤及びキレート剤、及びこれらの任意の多数の組合せのうち１種以上を含むことができる。
【０２２４】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、緩衝剤を含む。一実施形態において、前記緩衝剤は、約３．５〜約７．５のｐＫａを有する。一実施形態において、前記緩衝剤は、リン酸塩、コハク酸塩、ヒスチジンまたはクエン酸塩である。幾つかの実施形態において、前記緩衝剤は最終濃度１ｍＭ〜１０ｍＭのコハク酸塩である。特定の実施形態において、前記コハク酸塩の最終濃度は約５ｍＭである。
【０２２５】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は塩を含む。一実施形態において、前記塩は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム及びこれらの組合せからなる群より選択される。望ましい実施形態において、前記塩は塩化ナトリウムである。特定の実施形態において、本発明の免疫原性組成物は１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
【０２２６】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、界面活性剤を含む。前記界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート８０（ツイン８０）、ポリソルベート６０（ツイン６０）、ポリソルベート４０（ツイン４０）、ポリソルベート２０（ツイン２０）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（ブリッジ（Ｂｒｉｊ）５８、ブリッジ３５を含むが、これに制限されない）だけでなく、その他の物質、例えばトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＰ４０、スパン（Ｓｐａｎ）８５及びプルロニックシリーズの非イオン性界面活性剤（例えば、プルロニック１２１）を含むがこれらに制限されない、１種以上の非イオン性界面活性剤からなる群より選択される。望ましい実施形態において、免疫原性組成物は、ポリソルベート８０またはポリソルベート２０、望ましくはポリソルベート２０を含む。望ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約０．００１％〜約２％（約０．００５％以下が望ましい）濃度のポリソルベート２０を含む。
【０２２７】
一実施形態において、本発明の容器は、ガラス、金属（例えば、鋼鉄、ステンレス鋼、アルミニウムなど）、及び／または重合体（例えば、熱可塑性物質、弾性重合体、熱可塑性−弾性重合体）から製造される。一実施形態において、本発明の容器はガラスから製造される。
【０２２８】
一実施形態において、本発明は、開示された免疫原性組成物のうちいずれか一つで充填された注射器を提供する。特定の実施形態において、前記注射器は、シリコーン処理され、及び／またはガラスから製造される。
＜５．用途＞
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、薬剤として使用するためのものである。組成物内の接合体の量は、有意な逆効果なしに免疫保護反応を誘導する量として選択される。この量は、肺炎球菌の血清型によって変わり得る。
【０２２９】
本発明の免疫原性組成物は、対象において細菌感染、疾病または状態の予防、治療または改善のために多様な治療学的または予防学的方法で使用することができる。特に、本発明の免疫原性組成物は、対象においてストレプトコッカス・ニューモニエ感染、疾病または状態の予防、治療または改善のために使用することができる。
【０２３０】
本明細書内に引用されたすべての参考文献または特許出願は、本発明に参照として引用される。
【０２３１】
本発明を実施例を挙げて例示する。後述する実施例は、特に言及しない限り、当分野の熟練者に周知且つ通常の標準技法で実施される。これら実施例は例示的なものに過ぎず、本発明を制限するものではない。
【０２３２】
本発明の免疫原性組成物は、対象において細菌感染、疾病または状態の予防、治療または改善のために多様な治療学的または予防学的方法で使用することができる。特に、本発明の免疫原性組成物は、対象においてストレプトコッカス・ニューモニエ感染、疾病または状態の予防、治療または改善のために使用することができる。
【０２３３】
本発明は、対象に免疫学的有効量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む、前記対象でストレプトコッカス・ニューモニエ感染、疾病または状態を予防、治療または改善する方法を提供する。
【０２３４】
一実施形態において、前記感染、疾病または状態は、肺炎、副鼻腔炎、中耳炎、急性中耳炎、脳髄膜炎、菌血症、敗血症、膿胸、結膜炎、骨髓炎、化膿性関節炎、心内膜炎、腹膜炎、心膜炎、乳様突起炎、蜂窩織炎、軟組織感染及び脳膿瘍からなる群より選択される。
【０２３５】
本発明は、対象に免疫学的有効量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む、前記対象でストレプトコッカス・ニューモニエに対する免疫反応を誘導する方法を提供する。
【０２３６】
本発明に開示された免疫原性組成物は、ワクチンとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明に開示された免疫原性組成物を対象でストレプトコッカス・ニューモニエ感染を予防するために使用することができる。したがって、本発明は、対象に免疫学的有効量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む、前記対象でストレプトコッカス・ニューモニエによる感染を予防する方法を提供する。
【０２３７】
一実施形態において、前記感染は、肺炎、副鼻腔炎、中耳炎、急性中耳炎、脳髄膜炎、菌血症、敗血症、膿胸、結膜炎、骨髓炎、化膿性関節炎、心内膜炎、腹膜炎、心膜炎、乳様突起炎、蜂窩織炎、軟組織感染及び脳膿瘍からなる群より選択される。一実施形態において、前記ワクチン化される対象は、哺乳動物、例えばヒト、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシまたはイヌである。
【０２３８】
本発明に開示された免疫原性組成物は、対象でストレプトコッカス・ニューモニエと関連した感染、疾病または状態の予防、治療または改善方法に使用するためのものである。一実施形態において、前記感染、疾病または状態は、肺炎、副鼻腔炎、中耳炎、急性中耳炎、脳髄膜炎、菌血症、敗血症、膿胸、結膜炎、骨髓炎、化膿性関節炎、心内膜炎、腹膜炎、心膜炎、乳様突起炎、蜂窩織炎、軟組織感染及び脳膿瘍からなる群より選択される。
【０２３９】
本発明に開示された免疫原性組成物は、ワクチンとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明に開示された免疫原性組成物を対象でストレプトコッカス・ニューモニエ感染を予防するために使用することができる。したがって、本発明に開示された免疫原性組成物は、対象でストレプトコッカス・ニューモニエによる感染を予防する方法に使用するためのものである。一実施形態において、前記感染は、肺炎、副鼻腔炎、中耳炎、急性中耳炎、脳髄膜炎、菌血症、敗血症、膿胸、結膜炎、骨髓炎、化膿性関節炎、心内膜炎、腹膜炎、心膜炎、乳様突起炎、蜂窩織炎、軟組織感染及び脳膿瘍からなる群より選択される。一実施形態において、前記ワクチン化される対象は、哺乳動物、例えばヒト、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシまたはイヌである。
【０２４０】
本発明の免疫原性組成物は、全身経路または粘膜経路を通じて投与することで肺炎球菌感染に敏感なヒトの保護又は治療に使用することができる。一実施形態において、本発明に開示された免疫原性組成物を筋肉内、腹腔内、皮内または皮下経路で投与する。一実施形態において、本発明に開示された免疫原性組成物を筋肉内、腹腔内、皮内または皮下注射によって投与する。一実施形態において、本発明に開示された免疫原性組成物を筋肉内または皮下注射によって投与する。
【０２４１】
ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ：酵素結合免疫吸着検定法）により、ワクチン化された対象の血清からの抗体を固体支持体に吸着された多糖類とともに培養する。結合された抗体を酵素接合された２次検出抗体を使用して検出する。
【０２４２】
前記ＥＬＩＳＡは、ヒト血清中に存在する型特異性ＩｇＧ抗−ストレプトコッカス・ニューモニエ莢膜多糖類（ＰＳ）抗体を測定する。ヒト血清の希釈物を型特異性カプセルＰＳ−コーティングされた微量滴定プレートに加える場合、前記カプセルＰＳに特異的な抗体が前記微量滴定プレートに結合する。前記プレートに結合された抗体をヤギ抗−ヒトＩｇＧアルカリ性ホスファターゼ−標識抗体に続いてｐ−ニトロフェニルフォスフェート基質を使用して検出する。
【０２４３】
着色された最終生成物の光学密度は、血清中に存在する抗カプセルＰＳ抗体の量に比例する。
【０２４４】
一実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２、９Ｎ、１７Ｆ及び２０から選択された一つ以上の多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物は、ヒトにおいてＥＬＩＳＡ分析によって測定されるように、少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．３、０．３５、０．４または０．５μｇ／ｍｌの濃度でストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１５Ｂ多糖類に結合可能なＩｇＧ抗体を誘導することができる。
【０２４５】
一実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２、９Ｎ、１７Ｆ及び２０から選択された一つ以上の多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物は、対象に投与したとき、オプソニン−開始食作用分析により、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２、９Ｎ、１７Ｆ及び２０から選択された一つ以上の血清型のストレプトコッカス・ニューモニエを食菌作用可能な抗体の形成を誘導することができる。
【０２４６】
一実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２、９Ｎ、１７Ｆ及び２０から選択された一つ以上の多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物は、ＯＰＡ分析で試験したとき、接合されていない天然ストレプトコッカス・ニューモニエ莢膜多糖類に対して得られたＯＰＡ力価よりも大きいＯＰＡ力価を有する。
【０２４７】
機能性抗体及び補体の存在下で食作用効果が細胞によるストレプトコッカス・ニューモニエ細胞の殺害を測定する肺炎球菌オプソニン−開始食作用分析（ＯＰＡ）は、肺炎球菌ワクチンの有効性を評価するのに重要な代用物であると見なされる。
【０２４８】
オプソニン−開始食作用分析（ＯＰＡ）は、ストレプトコッカス・ニューモニエ細胞、試験しようとする熱不活性化されたヒト血清、分化されたＨＬ−６０細胞（食細胞）及び外因性補体供給源（例えば、幼若ウサギ補体）の混合物を一緒に培養することで行うことができる。オプソニン−開始食作用は培養中に進行され、抗体及び補体でコーティングされた細菌細胞はオプソニン−開始食作用時に殺害される。オプソニン−開始食作用から脱出した生存細菌のコロニー形成単位（ｃｆｕ）を、分析混合物を塗抹して測定する。前記ＯＰＡ力価は、試験血清なしに対照用ウェル上で５０％の細菌数減少を生成させる相互希釈として定義される。前記ＯＰＡ力価を５０％殺害カットオフを含む２個の希釈物から補間する。
【０２４９】
１：８以上の終点力価は、前記殺害類型ＯＰＡから陽の結果として見なされる。
【０２５０】
一実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２、９Ｎ、１７Ｆ及び２０から選択された一つ以上の多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物は、オプソニン−開始食作用殺害分析（ＯＰＡ）によって測定されるように、対象の少なくとも５０％でストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２、９Ｎ、１７Ｆ及び２０から選択された一つ以上の血清型に対して少なくとも１：８の力価を誘導することができる。一実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２、９Ｎ、１７Ｆ及び２０から選択された一つ以上の多糖類−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物は、オプソニン−開始食作用殺害分析（ＯＰＡ）によって測定されるように、対象の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または少なくとも９３％でストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２、９Ｎ、１７Ｆ及び２０に対して少なくとも１：８の力価を誘導することができる。
＜６．本発明の免疫原性組成物で治療される対象＞
本発明に開示された免疫原性組成物は、対象において細菌感染、疾病または状態を予防、治療または改善するための多様な治療学的または予防学的方法に使用することができる。
【０２５１】
望ましい実施形態において、前記対象はヒトである。望ましい実施形態において、前記対象は新生児（すなわち、３ヶ月以下）、乳児（すなわち、３ヶ月から１歳まで）、または幼児（すなわち１歳から４歳まで）である。
【０２５２】
一実施形態において、本発明に開示された免疫原性組成物はワクチンとして使用するためのものである。一実施形態において、前記ワクチン化される対象は、１歳未満であり得る。例えば、前記ワクチン化される対象は、年齢が約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１または約１２ヶ月であり得る。一実施形態において、前記ワクチン化される対象は、年齢が約２、約４または約６ヶ月である。他の実施形態において、前記ワクチン化される対象は、２歳未満である。例えば、前記ワクチン化される対象は、年齢が約１２ヶ月〜約１５ヶ月であり得る。一部の場合では、本発明による免疫原性組成物の１回用量だけが必要であるが、一部の状況下では第２、第３または第４用量で提供されてもよい。
【０２５３】
一実施形態において、前記ワクチン化される対象は、５０歳以上の成人、より望ましくは５５歳以上の成人である。
【０２５４】
一実施形態において、前記ワクチン化される対象は、６５歳以上、７０歳以上、７５歳以上または８０歳以上の成人である。
【０２５５】
一実施形態において、前記ワクチン化される対象は、免疫低下した個人、特にヒトである。一般に、免疫低下した個人は、感染因子による攻撃に対して正常な体液または細胞防御を開始する能力が弱化または減少した人と定義する。
【０２５６】
本発明の一実施形態において、前記ワクチン化される免疫低下した対象は、免疫系を損傷させる疾病または状態を患っており、肺炎球菌疾病に対して保護するかまたはその疾病を治療するには十分でない抗体反応を生成させる。
【０２５７】
一実施形態において、前記疾病は、原発性免疫不全疾患である。望ましくは、前記原発性免疫不全疾患は、複合Ｔ−及びＢ−細胞免疫不全、抗体欠乏、明確に定義された症侯群、免疫調節不全の疾病、食細胞疾患、先天性免疫不全、自己炎症性疾患及び補体欠損からなる群より選択される。
【０２５８】
特定の実施形態において、前記ワクチン化される免疫低下した対象は、ＨＩＶ−感染、後天性免疫不全症侯群（ＡＩＤＳ）、癌、慢性心臓または肺疾患、うっ血性心不全、糖尿病、慢性肝疾病、アルコール依存症、硬変症、脳脊髄液漏、心筋症、慢性気管支炎、気腫、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、脾臓機能障害（例えば、鎌状赤血球症）、脾臓機能欠損（無脾症）、血液癌、白血病、多発性骨髄腫、ホジキン病、リンパ腫、腎不全、ネフローゼ症候群及び喘息からなる群より選択された疾病を患い得る。
【０２５９】
本発明の一実施形態において、前記ワクチン化される免疫低下した対象は、栄養失調を患い得る。
【０２６０】
特定の実施形態において、前記ワクチン化される免疫低下した対象は、感染に対する身体の耐性を低下させる投薬中または治療中であり得る。
【０２６１】
特定の実施形態において、前記ワクチン化される免疫低下した対象は、喫煙者であり得る。
【０２６２】
特定の実施形態において、前記ワクチン化される免疫低下した対象は、５×１０９細胞／リットル以下、４×１０９細胞／リットル以下、３×１０９細胞／リットル以下、２×１０９細胞／リットル以下、１×１０９細胞／リットル以下、０．５×１０９細胞／リットル以下、０．３×１０９細胞／リットル以下、または０．１×１０９細胞／リットル以下の白血球細胞数（白血球数）を有する。
【０２６３】
白血球細胞数（白血球数）は、血液中の白血球細胞（ＷＢＣ）の数である。前記ＷＢＣは、殆どＣＢＣ（完全血球数）の部分として測定される。白血球細胞は血液中で感染と戦う細胞であって、酸素を運搬する赤血球とは異なる。
【０２６４】
異なる類型の白血球細胞、例えば好中球（多形核白血球；ＰＭＮ）、桿状核細胞（未熟好中球）、Ｔ型リンパ球（Ｔ−細胞）、Ｂ型リンパ球（Ｂ−細胞）、単球、好酸球及び好塩基球が存在する。この類型の白血球細胞はすべて白血球細胞数に反映される。前記白血球細胞の正常範囲は、約４，３００〜１０，８００細胞／血液立方ミリメートルである。これも白血球数と称し得、４．３〜１０．８×１０９／リットルとして国際単位で表し得る。
【０２６５】
特定の実施形態において、前記ワクチン化される免疫低下した対象は、好中球減少症を患っている。特定の実施形態において、前記ワクチン化される免疫低下した対象は、２×１０９細胞／リットル以下、１×１０９細胞／リットル以下、０．５×１０９細胞／リットル以下、０．１×１０９細胞／リットル以下、または０．０５×１０９細胞／リットル以下の好中球数を有する。
【０２６６】
低い白血球細胞数または「好中球減少症」は、循環する血液中の好中球が非正常的に低い水準である状態である。好中球は、感染を予防し、感染と戦うことを補助する特異な種類の白血球細胞である。癌患者が好中球減少症を患う最も通常の理由は、化学療法の副作用である。化学療法に起因する好中球減少症は、患者の感染危険性を高めて癌治療中断の原因になる。
【０２６７】
特定の実施形態において、前記ワクチン化される免疫低下した対象は、５００／ｍｍ３以下のＣＤ４＋細胞数、３００／ｍｍ３以下のＣＤ４＋細胞数、２００／ｍｍ３以下のＣＤ４＋細胞数、１００／ｍｍ３以下のＣＤ４＋細胞数、７５／ｍｍ３以下のＣＤ４＋細胞数、または５０／ｍｍ３以下のＣＤ４＋細胞数を有する。
【０２６８】
ＣＤ４細胞試験は通常ｍｍ３の細胞数として報告される。正常的なＣＤ４数は５００〜１，６００であり、ＣＤ８数は３７５〜１，１００である。ＣＤ４数はＨＩＶを患う患者において大きく低下する。
【０２６９】
本発明の一実施形態において、本発明に開示された免疫低下した対象のうち任意の対象は、ヒト男性またはヒト女性である。
＜７．規定食餌法＞
一部の場合、本発明による免疫原性組成物の１回用量だけが必要であるが、一部の状況下では、例えば、深刻な免疫不全状態では、第２、第３または第４用量が提供されてもよい。初期ワクチン化に続いて、対象は１回または数回の追加的な免疫投与を適切な間隔で受けることができる。
【０２７０】
一実施形態において、本発明による免疫原性組成物のワクチン化スケジュールは単回用量である。特定の実施形態において、前記単回用量スケジュールは、少なくとも２歳の健康なヒトに対するものである。
【０２７１】
一実施形態において、本発明による免疫原性組成物のワクチン化スケジュールは、数回用量スケジュールである。特定の実施形態において、前記数回用量スケジュールは、約１ヶ月〜約２ヶ月の間隔で空けられた一連の２回用量からなる。特定の実施形態において、前記数回用量スケジュールは、約１ヶ月の間隔で空けられた一連の２回用量、または、約２ヶ月の間隔で空けられた一連の２回用量からなる。
【０２７２】
他の実施形態において、前記数回用量スケジュールは、約１ヶ月〜約２ヶ月の間隔で空けられた一連の３回用量からなる。他の実施形態において、前記数回用量スケジュールは、約１ヶ月の間隔で空けられた一連の３回用量、または約２ヶ月の間隔で空けられた一連の３回用量からなる。
【０２７３】
さらに他の実施形態において、前記数回用量スケジュールは、約１ヶ月〜約２ヶ月の間隔で空けられた一連の３回用量、及び続いて前記１回用量の後、約１０ヶ月〜約１３ヶ月目の第４用量からなる。さらに他の実施形態において、前記数回用量スケジュールは、約１ヶ月の間隔で空けられた一連の３回用量、及び続いて前記１回用量の後、約１０ヶ月〜約１３ヶ月目の第４用量、または約２ヶ月の間隔で空けられた一連の３回用量、及び続いて前記１回用量の後、約１０ヶ月〜約１３ヶ月目の第４用量からなる。
【０２７４】
一実施形態において、前記数回用量スケジュールは、１歳に少なくとも１回用量（例えば、１、２または３回用量）に続いて、少なくとも１回の幼児用量からなる。
【０２７５】
一実施形態において、前記数回用量スケジュールは、２ヶ月齢で出発して約１ヶ月〜約２ヶ月の間隔で空けられた（例えば、用量間隔２８〜５６日）一連の２回または３回用量、及び続いて１２〜１８ヶ月齢に幼児用量からなる。一実施形態において、前記数回用量スケジュールは、２ヶ月齢で出発して約１ヶ月〜約２ヶ月の間隔で空けられた（例えば、用量間隔２８〜５６日）一連の３回用量、及び続いて１２〜１５ヶ月齢に幼児用量からなる。さらに他の実施形態において、前記数回用量スケジュールは、２ヶ月齢で出発して約２ヶ月の間隔で空けられた一連の２回用量、及び続いて１２〜１８ヶ月齢に幼児用量からなる。
【０２７６】
一実施形態において、前記数回用量スケジュールは２、４、６及び１２〜１５ヶ月齢に一連の４回ワクチン用量からなる。
【０２７７】
一実施形態において、初回用量は０日目に提供され、１回以上の追加用量が約２〜約２４週範囲の間隔で、望ましくは４〜８週の投与間隔で提供される。
【０２７８】
一実施形態において、初回用量は０日目に提供され、追加用量は約３ヶ月後に提供される。
【発明の効果】
【０２７９】
本発明は、従来適用範囲を提供しなかった血清型１７Ｆなどの新たな血清型に対する免疫原性接合体を提供することができる。
【０２８０】
本発明は、従来適用範囲を提供しなかった新たな血清型接合体を含むことで、広い適用範囲を提供可能な多価肺炎球菌ワクチンを提供することができる。
【０２８１】
また、特別な干渉現象なしに多様な肺炎球菌血清型に対する抗体を形成できて幅広い免疫スペクトルを提供することができる。
【０２８２】
本発明は、優れた抗体力価を提供することができる。
【０２８３】
本発明による多価肺炎球菌ワクチンは副作用が少ない。
【０２８４】
本発明によるワクチンは、嬰乳児に接種可能であり、老人にも接種することができる。
【発明を実施するための形態】
【０２８５】
以下、本発明を実施例などを挙げてより具体的に説明する。しかし、本発明による実施例は多くの他の形態に変形でき、本発明の範囲が下記の実施例に限定されると解釈されてはならない。本発明の実施例は、本発明の具体的な理解を助けるために例示的に提供されるものである。
＜実施例１．血清型２、９Ｎ、１７Ｆまたは２０由来の多糖類−タンパク質接合体ワクチンの製造＞
［１．ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２由来の多糖類−タンパク質接合体］
（ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２由来の多糖類−タンパク質接合体の調製
マスタ及び調製用細胞バンクの調製）
ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２を受託機関［Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）］（菌株ＡＴＣＣ６３０２）から入手した。菌株を増殖させ、動物由来の成分を除去するために、数世代のシードストック（ｓｅｅｄ ｓｔｏｃｋ）を培養した。凍結保存剤としての合成グリセロールとともに、シードバイアルを冷凍保存した（−７０℃未満）。細胞バンク調製のため、すべての培養物を大豆をベースとする培地で増殖させた。凍結の前に、遠心分離によって細胞を濃縮し、使用済みの培地を除去した後、凍結保存剤（例えば、合成グリセロール）を含む新たな培地に細胞ペレットを再懸濁した。
（発酵）
調製用細胞バンクからの培養物を、大豆ベースの培地を含むシードボトル（ｓｅｅｄ ｂｏｔｔｌｅ）に播種した。成長条件が満たされるまで、撹拌せずに一定温度で培養した。シードボトルを使用し、温度、ｐＨ及び撹拌速度が制御される、大豆ベースの培地を含むシード発酵機に播種した。成長が中断した後、または、発酵機の作業容量に到達したときに発酵を終結させた。不活性化剤を添加することによって発酵工程を終結させた後、連続流遠心分離と濾過の組合せを使用して細胞デブリを除去した。
（精製）
肺炎球菌多糖類の精製は、多層濾過、数回の濃縮／透析濾過作業、及び沈殿／溶出段階で行った。
（活性化）
計算された量の０．１Ｎ塩酸溶液及びＷＦＩを順次に添加することで、０．０１Ｎ塩酸溶液で最終的な多糖体濃度が約２．０ｇ／Ｌになるように調整した。多糖類の加水分解のため、約６０℃で６０分間加水分解反応を行った。反応液の温度を常温に下げた後、０．１Ｍリン酸水素ナトリウム溶液を添加して反応ｐＨを約６．０に調整した。ｐＨ調整後、温度を２３℃に調整した。糖１ｍｇ当りおよそ０．０２３〜０．１１４ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウムを添加することで酸化を開始させた。２３℃で１８時間、酸化反応を行った。
【０２８６】
活性化した多糖類の濃縮及び透析濾過を１００ｋＤａのＭＷＣＯ限外濾過膜を使用して行った。１０倍の透析濾過体積のＷＦＩに対して透析濾過を行った。その後、精製された活性化した多糖類を２〜８℃で保存した。精製された活性化した多糖類を、特に（ｉ）比色検定による多糖類濃度、（ｉｉ）比色検定によるアルデヒド濃度、（ｉｉｉ）酸化度、及び（ｉｖ）ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによる分子量によって特性化した。
【０２８７】
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳは、多糖類及び多糖類−タンパク質接合体の分子量を決定するために使用される。ＳＥＣは、流体力学体積に基づいて多糖類を分離するために使用される。屈折率（ＲＩ）及び多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）検出器が分子量を決定するために使用される。光が物質と相互作用すると光が散乱し、散乱光の量は濃度、ｄｎ／ｄｃの二乗（特異屈折率増加）、及び物質のモル質量と関連する。ＭＡＬＬＳ検出器からの散乱光の信号及びＲＩ検出器からの濃度信号からの読取値に基づいて分子量測定値が計算される。
【０２８８】
活性化した多糖類の酸化度（ＤＯ）は、糖繰り返し単位のモルをアルデヒドのモルで除して決定される。多様な比色方法によって、例えば、アントロン（Ａｎｔｈｒｏｎｅ）方法を使用して糖繰り返し単位のモルを決定する。また、パークジョンソン（Ｐａｒｋ−Ｊｏｈｎｓｏｎ）比色方法を使用してアルデヒドのモルを決定する。
【０２８９】
望ましくは、上記の方法で得られた活性化したストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２莢膜多糖類は、２〜１８の酸化度及び約１００ｋＤａ〜４００ｋＤａの分子量を有する。
（接合工程）
活性化した多糖類を、活性化した多糖類１ｇ当り２〜８ｇの比でスクロースと配合した。次いで、配合された混合物のボトルを凍結乾燥した。凍結乾燥された活性化した多糖類を含むボトルを−２０〜−３０℃で保存した。計算された量のＣＲＭ１９７タンパク質を別途に凍結乾燥した。凍結乾燥されたＣＲＭ１９７を−２０〜−３０℃で保存した。
【０２９０】
凍結乾燥された活性化した多糖類を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で再組成した。多糖類の溶解が完了すると、無水ＤＭＳＯを再組成のために凍結乾燥されたＣＲＭ１９７に加えた。反応容器中で、再組成された活性化した多糖類を再組成されたＣＲＭ１９７と配合（投入比０．５〜２：１）した後、完全に混合した。１．０モル当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）を反応混合物に加えることで接合反応を開始させた。１％（ｖ／ｖ）の目標濃度でＷＦＩを反応混合物に添加し、２３℃で２２〜２６時間反応させた。２．０モル当量の水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を添加し、５％（ｖ／ｖ）の目標濃度でＷＦＩを反応混合物に添加して未反応のアルデヒドをキャップすることで、接合反応を終了させた。キャップ反応は２３℃で４．５時間行った。
【０２９１】
接合体溶液を、１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜を使用する濃縮及び透析濾過による精製のため、調製中に０．９％塩化ナトリウム溶液で希釈した。希釈した接合体溶液を０．８μｍのフィルターに通過させ、１５〜４０倍の透析濾過体積の０．９％塩化ナトリウム溶液を使用して透析濾過を行った。透析濾過が完了した後、残留液を０．２μｍのフィルターを通して濾過した。約０．５５ｍｇ／ｍｌ未満の濃度になるように、接合体溶液を０．９％塩化ナトリウム溶液で希釈し、滅菌濾過して２〜８℃で保存した。
【０２９２】
精製された血清型２接合体を、特に、（ｉ）比色検定（Ｌｏｗｒｙ）による多糖体濃度、（ｉｉ）比色検定によるタンパク質濃度、（ｉｉｉ）タンパク質に対する糖類の比率、（ｉｖ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＣＬ−４Ｂ）による分子サイズ分布、（ｖ）遊離糖の含量及び（ｖｉ）ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによる分子量によって特性化した。
【０２９３】
上記の製造方法に基づいて酸化度（ＤＯ）を調節しながら、血清型２接合体の特性変化を観察した。結果を表１にまとめて示す。
【０２９４】
【表１】
2021522213.tif 000002
【０２９５】
上記の製造方法に基づいて凍結乾燥時に活性化多糖類とＣＲＭ１９７との配合比率を調節しながら、血清型２接合体の特性変化を観察した。結果を表２にまとめて示す。
【０２９６】
【表２】
2021522213.tif 000003
【０２９７】
（血清型２多糖類−タンパク質接合体の免疫原性の研究）
ＣＲＭ１９７に全部個別的に接合されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２多糖類−タンパク質接合体を含む単価接合体組成物を製剤化した。
【０２９８】
表１及び表２の単価免疫原性組成物の免疫原性をＥＬＩＳＡによってウサギで分析し、血清中の血清型特異的ＩｇＧの濃度を測定した。
【０２９９】
体重２．５〜３．５ｋｇのニュージーランド白ウサギのメス５羽のグループを、提案されたヒト臨床用量（接合体２．２μｇ；＋ＡｌＰＯ４としてのアルミニウム０．２５ｍｇ／ｍｌ）で０週目に筋肉内経路で免疫した。２週目にウサギを同じ用量の複合体ワクチンで再度免疫し、４週目に採血した。血清型特異的ＥＬＩＳＡを０週目及び４週目の血清サンプルに対して行った。
【０３００】
分析結果を表３に示した。単価接合体組成物（接合体番号１−６）で免疫したウサギは、血清型２の総ＩｇＧ力価の著しい増加を示した。他の接合体で免疫したウサギも、総ＩｇＧ力価の著しい増加を示した。
【０３０１】
表３は、表１の接合体番号１−６で免疫した後のＩｇＧ濃度を測定した結果である。
【０３０２】
【表３】
2021522213.tif 000004
【０３０３】
［２．ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型９Ｎ由来の多糖類−タンパク質接合体］
（ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型９Ｎ由来の多糖類−タンパク質接合体の調製
マスター及び調製用細胞バンクの調製）
ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型９Ｎを受託機関［Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）］（菌株ＡＴＣＣ６３０９）から入手した。血清型２と同じ方式で行った。
（発酵）
血清型２と同じ方式で行った。
（精製）
血清型２と同じ方式で行った。
（活性化）
計算された量のＷＦＩを順次に添加することで、最終的な多糖類濃度を約２．０ｇ／Ｌに調整した。必要に応じて、反応ｐＨを約６．０に調整した。ｐＨ調整後、反応温度を２３℃に調整した。糖１ｍｇ当りおよそ０．０２４〜０．１８９ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウムを添加することで酸化を開始させた。２３℃で１８時間、酸化反応を行った。
【０３０４】
活性化した多糖類の濃縮及び透析濾過を１００ｋＤａのＭＷＣＯ限外濾過膜を使用して行った。１０倍の透析濾過体積のＷＦＩに対して透析濾過を行った。その後、精製された活性化した多糖類を２〜８℃で保存した。精製された活性化した多糖類を、特に（ｉ）比色検定による多糖類濃度、（ｉｉ）比色検定によるアルデヒド濃度、（ｉｉｉ）酸化度、及び（ｉｖ）ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによる分子量によって特性化した。
【０３０５】
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳは、多糖類及び多糖類−タンパク質接合体の分子量を決定するために使用される。ＳＥＣは、流体力学体積に基づいて多糖類を分離するために使用される。屈折率（ＲＩ）及び多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）検出器が分子量を決定するために使用される。光が物質と相互作用すると光が散乱し、散乱光の量は濃度、ｄｎ／ｄｃの二乗（特異屈折率増加）、及び物質のモル質量と関連する。ＭＡＬＬＳ検出器からの散乱光の信号及びＲＩ検出器からの濃度信号からの読取値に基づいて分子量測定値が計算される。
【０３０６】
活性化した多糖類の酸化度（ＤＯ）は、糖繰り返し単位のモルをアルデヒドのモルで除して決定される。多様な比色方法によって、例えば、アントロン（Ａｎｔｈｒｏｎｅ）方法を使用することで糖繰り返し単位のモルを決定する。また、パークジョンソン（Ｐａｒｋ−Ｊｏｈｎｓｏｎ）比色方法を使用してアルデヒドのモルを決定する。
【０３０７】
望ましくは、上記の方法で得られた活性化したストレプトコッカス・ニューモニエ血清型９Ｎ莢膜多糖類は、２〜１９の酸化度及び約２００ｋＤａ〜７００ｋＤａの分子量を有する。
（接合工程）
活性化した多糖類を担体タンパク質としてのＣＲＭ１９７と、活性化した多糖類１ｇ当り０．５〜２ｇの比で配合した。次いで、配合された混合物を凍結乾燥した。凍結乾燥された活性化した多糖類とＣＲＭ１９７との混合物を−２０℃で保存した。
【０３０８】
凍結乾燥された活性化した多糖類とＣＲＭ１９７との混合物を０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液中で再組成した後、十分に混合した。反応溶液中の最終的な多糖類濃度は約１０〜２０ｇ／Ｌであった。１．２モル当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）を反応混合物に加えることで接合を開始させ、３７℃で４８時間反応させた。接合反応液と同じ体積の０．９％塩化ナトリウム溶液を添加した後、２．０モル当量の水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を添加して未反応のアルデヒドをキャップすることで、接合反応を終了させた。キャップ反応は２３℃で４．５時間行った。
【０３０９】
接合体溶液を、１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜を使用する濃縮及び透析濾過による精製のため、調製中に０．９％塩化ナトリウム溶液で希釈した。希釈した接合体溶液を０．４５μｍのフィルターに通過させ、濃縮及び透析濾過による精製を行った。１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜を使用する透析濾過は、透析濾過体積の１５〜４０倍の０．９％塩化ナトリウム溶液を使用して行った。透析濾過が完了した後、残留液を０．２μｍのフィルターを通して濾過した。接合体溶液を約０．５５ｍｇ／ｍｌ未満の濃度になるように希釈し、滅菌濾過して２〜８℃で保存した。
【０３１０】
精製された血清型９Ｎ接合体を、特に、（ｉ）比色検定（Ｌｏｗｒｙ）による多糖体濃度、（ｉｉ）比色検定によるタンパク質濃度、（ｉｉｉ）タンパク質に対する糖類の比率、（ｉｖ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＣＬ−４Ｂ）による分子サイズ分布、（ｖ）遊離糖の含量及び（ｖｉ）ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによる分子量によって特性化した。
【０３１１】
上記の製造方法に基づいて酸化度（ＤＯ）を調節しながら、血清型９Ｎ接合体の特性変化を観察した。結果を表４にまとめて示す。
【０３１２】
【表４】
2021522213.tif 000005
【０３１３】
上記の製造方法に基づいて凍結乾燥時に活性化多糖類とＣＲＭ１９７との配合比率を調節しながら、血清型９Ｎ接合体の特性変化を観察した。結果を表５にまとめて示す。
【０３１４】
【表５】
2021522213.tif 000006
【０３１５】
上記の製造方法に基づいて接合反応溶液中の多糖類濃度を調節しながら、血清型９Ｎ接合体の特性変化を観察した。結果を表６にまとめて示す。
【０３１６】
【表６】
2021522213.tif 000007
【０３１７】
（血清型９Ｎ多糖類−タンパク質接合体の免疫原性の研究）
ＣＲＭ１９７に全部個別的に接合されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型９Ｎ多糖類−タンパク質接合体を含む単価接合体組成物を製剤化した。
【０３１８】
表４〜６の単価免疫原性組成物の免疫原性をＥＬＩＳＡによってウサギで分析し、血清中の血清型特異的ＩｇＧの濃度を測定した。
【０３１９】
血清型２と同じ方式でメスのニュージーランド白ウサギのグループを筋肉内経路で免疫した。
【０３２０】
分析結果を表７に示した。単価接合体組成物（接合体番号２−８）で免疫したウサギは、血清型９Ｎの総ＩｇＧ力価の著しい増加を示した。他の接合体で免疫したウサギも、総ＩｇＧ力価の著しい増加を示した。
【０３２１】
表７は、表５の接合体番号２−８で免疫した後のＩｇＧ濃度を測定した結果である。
【０３２２】
【表７】
2021522213.tif 000008
【０３２３】
［３．ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１７Ｆ由来の多糖類−タンパク質接合体］
（ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１７Ｆ由来の多糖類−タンパク質接合体の調製マスター及び調製用細胞バンクの調製）
ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１７Ｆを受託機関［Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）］（ＡＴＣＣ６３１７）から入手した。菌株を増殖させ、動物由来の成分を除去するために、数世代のシードストックを培養した。血清型２と同じ方式で行った。
（発酵）
血清型２と同じ方式で行った。
（精製）
血清型２と同じ方式で行った。
（活性化）
計算された量の０．１Ｎ塩酸溶液及びＷＦＩを順次に添加することで、０．０１Ｎ塩酸溶液で最終的な多糖体濃度が約２．０ｇ／Ｌになるように調整した。多糖類の加水分解のため、約６０℃で６０分間加水分解反応を行った。反応液の温度を常温に下げた後、０．１Ｍリン酸水素ナトリウム溶液を添加して反応ｐＨを約６．０に調整した。ｐＨ調整後、温度を２３℃に調整した。糖１ｍｇ当りおよそ０．００８〜０．２１９ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウムを添加することで酸化を開始させた。２３℃で１８時間、酸化反応を行った。
【０３２４】
活性化した多糖類の濃縮及び透析濾過を１００ｋＤａのＭＷＣＯ限外濾過膜を使用して行った。１０倍の透析濾過体積のＷＦＩに対して透析濾過を行った。その後、精製された活性化した多糖類を２〜８℃で保存した。精製された活性化した多糖類を、特に（ｉ）比色検定による多糖類濃度、（ｉｉ）比色検定によるアルデヒド濃度、（ｉｉｉ）酸化度、及び（ｉｖ）ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによる分子量によって特性化した。
【０３２５】
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳは、多糖類及び多糖類−タンパク質接合体の分子量を決定するために使用される。ＳＥＣは、流体力学体積に基づいて多糖類を分離するために使用される。屈折率（ＲＩ）及び多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）検出器が分子量を決定するために使用される。光が物質と相互作用すると、光が散乱し、散乱光の量は濃度、ｄｎ／ｄｃの二乗（特異屈折率増加）、及び物質のモル質量と関連する。ＭＡＬＬＳ検出器からの散乱光の信号及びＲＩ検出器からの濃度信号からの読取値に基づいて分子量測定値が計算される。
【０３２６】
活性化した多糖類の酸化度（ＤＯ）は、糖繰り返し単位のモルをアルデヒドのモルで除して決定される。多様な比色方法によって、例えば、アントロン（Ａｎｔｈｒｏｎｅ）方法を使用して糖繰り返し単位のモルを決定する。また、パークジョンソン（Ｐａｒｋ−Ｊｏｈｎｓｏｎ）比色方法を使用してアルデヒドのモルを決定する。
【０３２７】
望ましくは、上記の方法で得られた活性化したストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１７Ｆ莢膜多糖類は、１〜２２の酸化度及び４００ｋＤａ〜９００ｋＤａの分子量を有する。
（接合工程）
活性化した多糖類を担体タンパク質としてのＣＲＭ１９７と、活性化した多糖類１ｇ当り１．０ｇの比で配合した。次いで、配合された混合物を凍結乾燥した。凍結乾燥された活性化した多糖類とＣＲＭ１９７との混合物を−２０℃で保存した。
【０３２８】
凍結乾燥された活性化した多糖類とＣＲＭ１９７との混合物を０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．２±０．１）中で再組成した。反応溶液中の最終的な多糖類濃度は１５．０〜２５．０ｇ／Ｌであった。１．２モル当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）を反応混合物に加えることで接合を開始させ、３７℃で４８時間反応させた。接合反応液と同じ体積の０．９％塩化ナトリウム溶液と２．０モル当量の水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を添加して未反応のアルデヒドをキャップすることで、接合反応を終了させた。キャップ反応は２３℃で４．５時間行った。
【０３２９】
接合体溶液を、１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜を使用する濃縮及び透析濾過による精製のため、調製中に０．９％塩化ナトリウム溶液で希釈した。希釈した接合体溶液を０．４５μｍのフィルターに通過させ、２段階の濃縮及び透析濾過による精製を行った。１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜を使用する透析濾過は、透析濾過体積の２０倍の０．９％塩化ナトリウム溶液を使用して行った。１段階の透析濾過が完了した後、接合体の残留液を０．２μｍのフィルターを通して濾過して２〜８℃で保存した。接合体溶液を約０．５５ｍｇ／ｍｌ未満の濃度になるように希釈し、滅菌濾過して２〜８℃で保存した。
【０３３０】
精製された血清型１７Ｆ接合体を、特に、（ｉ）比色検定（Ｌｏｗｒｙ）による多糖体濃度、（ｉｉ）比色検定によるタンパク質濃度、（ｉｉｉ）タンパク質に対する糖類の比率、（ｉｖ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＣＬ−４Ｂ）による分子サイズ分布、（ｖ）遊離糖の含量及び（ｖｉ）ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによる分子量によって特性化した。
【０３３１】
上記の製造方法に基づいて酸化度（ＤＯ）及び反応溶液中の多糖類の濃度を調節しながら、血清型１７Ｆ接合体の特性変化を観察した。結果を表８にまとめて示す。
【０３３２】
【表８】
2021522213.tif 000009
【０３３３】
（血清型１７Ｆ多糖類−タンパク質接合体の免疫原性の研究）
ＣＲＭ１９７に全部個別的に接合されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１７Ｆ多糖類−タンパク質接合体を含む単価接合体組成物を製剤化した。
【０３３４】
表８の単価免疫原性組成物の免疫原性をＥＬＩＳＡによってウサギで分析し、血清中の血清型特異的ＩｇＧの濃度を測定した。
【０３３５】
血清型２と同じ方式でメスのニュージーランド白ウサギのグループを筋肉内経路で免疫した。
【０３３６】
分析結果を表９に示した。単価接合体組成物（接合体番号３−８）で免疫したウサギは、血清型１７Ｆの総ＩｇＧ力価の著しい増加を示した。他の接合体で免疫したウサギも、総ＩｇＧ力価の著しい増加を示した。
【０３３７】
表９は、表８の接合体番号３−８で免疫した後のＩｇＧ濃度を測定した結果である。
【０３３８】
【表９】
2021522213.tif 000010
【０３３９】
［４．ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２０由来の多糖類−タンパク質接合体］
（ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２０由来の多糖類−タンパク質接合体の調製
マスター及び調製用細胞バンクの調製）
ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２０を受託機関［Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）］（菌株ＡＴＣＣ６３２０）から入手した。血清型２と同じ方式で行った。
（発酵）
血清型２と同じ方式で行った。
（精製）
血清型２と同じ方式で行った。
（活性化）
計算された量の０．１Ｎ塩酸溶液及びＷＦＩを順次に添加することで、０．０１Ｎ塩酸溶液で最終的な多糖体濃度が約２．０ｇ／Ｌになるように調整した。糖１ｍｇ当りおよそ０．０１０〜０．０３８ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウムを添加することで酸化を開始させた。２３℃で１８時間、酸化反応を行った。
【０３４０】
活性化した多糖類の濃縮及び透析濾過を１００ｋＤａのＭＷＣＯ限外濾過膜を使用して行った。透析濾過容量の１０倍のＷＦＩに対して透析濾過を行った。その後、精製された活性化した多糖類を２〜８℃で保存した。精製された活性化した多糖類を、特に（ｉ）比色検定による多糖類濃度、（ｉｉ）比色検定によるアルデヒド濃度、（ｉｉｉ）酸化度、及び（ｉｖ）ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによる分子量によって特性化した。
【０３４１】
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳは、多糖類及び多糖類−タンパク質接合体の分子量を決定するために使用される。ＳＥＣは、流体力学体積に基づいて多糖類を分離するために使用される。屈折率（ＲＩ）及び多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）検出器が分子量を決定するために使用される。光が物質と相互作用すると光が散乱し、散乱光の量は濃度、ｄｎ／ｄｃの二乗（特異屈折率増加）、及び物質のモル質量と関連する。ＭＡＬＬＳ検出器からの散乱光の信号及びＲＩ検出器からの濃度信号からの読取値に基づいて分子量測定値が計算される。
【０３４２】
活性化した多糖類の酸化度（ＤＯ）は、糖繰り返し単位のモルをアルデヒドのモルで除して決定される。多様な比色方法によって、例えば、アントロン（Ａｎｔｈｒｏｎｅ）方法を使用して糖繰り返し単位のモルを決定する。また、パークジョンソン（Ｐａｒｋ−Ｊｏｈｎｓｏｎ）比色方法を使用してアルデヒドのモルを決定する。
【０３４３】
望ましくは、上記の方法で得られた活性化したストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２０莢膜多糖類は、４〜１６の酸化度及び約４００ｋＤａ〜８００ｋＤａの分子量を有する。
（接合工程）
活性化した多糖類を担体タンパク質としてのＣＲＭ１９７と、活性化した多糖類１ｇ当り１．０ｇの比で配合した。次いで、配合された混合物を凍結乾燥した。凍結乾燥された活性化した多糖類とＣＲＭ１９７との混合物を−２０℃で保存した。
【０３４４】
凍結乾燥された活性化した多糖類とＣＲＭ１９７との混合物を０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．２±０．１）中で再組成した。反応溶液中の最終的な多糖類濃度は約１５．０ｇ／Ｌであった。１．２モル当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）を反応混合物に加えることで接合を開始させ、３７℃で４８時間反応させた。接合反応液と同じ体積の０．９％塩化ナトリウム溶液と２．０モル当量の水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を添加して未反応のアルデヒドをキャップすることで、接合反応を終了させた。キャップ反応は２３℃で４．５時間行った。
【０３４５】
接合体溶液を、１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜を使用する濃縮及び透析濾過による精製のため、調製中に０．９％塩化ナトリウム溶液で希釈した。希釈した接合体溶液を０．４５μｍのフィルターに通過させ、２段階の濃縮及び透析濾過による精製を行った。１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜を使用する透析濾過は、透析濾過体積の２０倍の０．９％塩化ナトリウム溶液を使用して行った。１段階の透析濾過が完了した後、接合体の残留液を０．２μｍのフィルターを通して濾過して２〜８℃で保存した。接合体溶液を約０．５５ｍｇ／ｍｌ未満の濃度になるように希釈し、滅菌濾過して２〜８℃で保存した。
【０３４６】
精製された血清型２０接合体を、特に（ｉ）比色検定（Ｌｏｗｒｙ）による多糖体濃度、（ｉｉ）比色検定によるタンパク質濃度、（ｉｉｉ）タンパク質に対する糖類の比率、（ｉｖ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＣＬ−４Ｂ）による分子サイズ分布、（ｖ）遊離糖の含量及び（ｖｉ）ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによる分子量によって特性化した。
【０３４７】
上記の製造方法に基づいて酸化度（Ｄｏ）を調節しながら、血清型２０接合体の特性変化を観察した。結果を表１０にまとめて示す。
【０３４８】
【表１０】
2021522213.tif 000011
【０３４９】
ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２０由来の多糖類−タンパク質接合体の免疫原性の研究
ＣＲＭ１９７に全部個別的に接合されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２０多糖類−タンパク質接合体を含む単価接合体組成物を製剤化した。
【０３５０】
表１０の単価免疫原性組成物の免疫原性をＥＬＩＳＡによってウサギで分析し、血清中の血清型特異的ＩｇＧの濃度を測定した。
【０３５１】
血清型２と同じ方式でメスのニュージーランド白ウサギのグループを筋肉内経路で免疫した。
【０３５２】
分析結果を表１１に示した。単価接合体組成物（接合体番号４−７）で免疫したウサギは、血清型２０の総ＩｇＧ力価の著しい増加を示した。他の接合体で免疫したウサギも、総ＩｇＧ力価の著しい増加を示した。
【０３５３】
表１１は、表１０の接合体番号４−７で免疫した後のＩｇＧ濃度を測定した結果である。
【０３５４】
【表１１】
2021522213.tif 000012
【０３５５】
＜実施例２．多価ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖類−タンパク質接合体の調製＞
［５．ストレプトコッカス・ニューモニエ１５価多糖類−タンパク質接合体］
（ストレプトコッカス・ニューモニエ１５価多糖類−タンパク質接合体の調製）
ＣＲＭ１９７に全部個別的に接合されたストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆ由来の多糖類−タンパク質接合体を含む１５価接合体組成物（１５ｖＰｎＣ）を製剤化した。
【０３５６】
血清型２及び９Ｎは上述した方法で接合体を調製し、その他の血清型は韓国特許出願第１０−２０１２−００６５８９３に開示された方法に基づいて接合体を製造した。
【０３５７】
バッチ容積（ｂａｔｃｈ ｖｏｌｕｍｅ）及びバルク糖類濃度に基づいて最終バルク濃縮液の必要量を計算した。必要量の０．８５％塩化ナトリウム、ポリソルベート８０及びコハク酸塩緩衝液を予めラベリングした製剤容器に添加した後、バルク濃縮液を添加した。十分に混合し、０．２２μｍのフィルターを通して濾過した。バルクリン酸アルミニウムの添加中及び添加後に、製剤化されたバルク液を徐々に混合した。ｐＨを確認し、必要に応じて調節した。製剤化されたバルク生成物を２〜８℃で保存した。得られたワクチン組成物は、総０．５ｍｌ中に、２．２μｇの各糖類（ただし、６Ｂの場合は４．４μｇ）、約３２μｇのＣＲＭ１９７担体タンパク質、０．１２５ｍｇのアルミニウム元素（０．５ｍｇリン酸アルミニウム）アジュバント、約４．２５ｍｇの塩化ナトリウム、約２９５μｇのコハク酸塩緩衝液、及び約１００μｇのポリソルベート８０を含んでいる。
（ストレプトコッカス・ニューモニエ１５価多糖類−タンパク質接合体の免疫原性の研究）
ＩｇＧ濃度の測定
前記１５価免疫原性組成物の免疫原性をＥＬＩＳＡによってウサギで分析し、血清中の血清型特異的ＩｇＧの濃度を測定した。
【０３５８】
体重２．５〜３．５ｋｇのニュージーランド白ウサギのメス６羽のグループを、提案されたヒト臨床用量（４．４μｇの血清型６Ｂを除き、各接合体２．２μｇ；＋ＡｌＰＯ４としてのアルミニウム０．２５ｍｇ／ｍｌ）で０週目に筋肉内経路で免疫した。３週目にウサギを同じ用量の接合体ワクチンで再度免疫し、３週間隔で採血した。血清型特異的ＥＬＩＳＡを各血清サンプルに対して行った。
【０３５９】
本発明によるワクチン製剤及び比較例のワクチン製剤に対する血清型特異的免疫反応をＩｇＧ ＥＬＩＳＡによって評価した。分析結果を表１２に示した。接種後の時間経過によるＩｇＧ濃度（Ｕ／ｍｌ）を示す。１５ｖＰｎＣで免疫したウサギはＰｒｅｖｎａｒ１３を通じては得られなかった血清型２及び９Ｎに対する抗体を生成し、特に血清型追加によって価数が増加したにもＰｒｅｖｎａｒ１３と比べて同等又は優れた血清ＩｇＧ力価を誘導できることが確認された。
【０３６０】
【表１２】
2021522213.tif 000013
【０３６１】
ＯＰＡ分析結果
１５価多糖類−タンパク質接合体が機能的抗体反応を誘導したか否かを確認するため、オプソニン食細胞作用死滅検定（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｋｉｌｌｉｎｇ ａｓｓａｙ（ＭＯＰＡ））を行った。
【０３６２】
各個体別に、同一量の血清を採取し、同じグループ同士に血清をプーリング（ｐｏｏｌｉｎｇ）した。ストレプトコッカス・ニューモニエを各血清型別にＴＨＹ培地で培養し、１０００ＣＦＵ／１０ｕＬになるように希釈した。オプソニン化緩衝液（Ｏｐｓｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）２００ｕＬ、希釈血清１０ｕＬ、希釈ストレプトコッカス・ニューモニエ１０ｕＬを混合し、室温で１時間反応させた。あらかじめ分化させたＨＬ−６０細胞と補体との混合液を添加し、ＣＯ２培養器（３７℃）で１時間反応させた。温度を低めて食細胞作用を中断させ、反応液５ｕＬをあらかじめ３０〜６０分間乾燥させた寒天培地に塗抹した。ＣＯ２培養器（３７℃）で１２〜１８時間培養し、群集の個数を数えた。ＯＰＡ力価は、５０％死滅が観察される希釈倍数で表現した。比較例として、１３価ワクチン（Ｐｒｅｖｎａｒ１３、ファイザー）を使用して同様に評価し、その結果を表１３に示した。
【０３６３】
【表１３】
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【０３６４】
［６．ストレプトコッカス・ニューモニエ２３価多糖類−タンパク質接合体］
（ストレプトコッカス・ニューモニエ２３価多糖類−タンパク質接合体の調製）
ＣＲＭ１９７にストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、２、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆ由来の多糖類を接合させた多糖類−タンパク質接合体、及びＴＴ（破傷風トキソイド）にストレプトコッカス・ニューモニエ血清型３及び５を接合させた多糖類−タンパク質接合体を含む２３価接合体組成物（２３ｖＰｎＣ）を製剤化した。
【０３６５】
血清型２、９Ｎ、１７Ｆ及び２０は上述した方法で接合体を調製し、その他の血清型は韓国特許出願第１０−２０１２−００６５８９３、米国特許出願６２／３７１，５２９、６２／３７１，５５３及び６２／６２６，４８２に開示された方法に基づいてＣＲＭ１９７またはＴＴに接合された接合体を製造した。
【０３６６】
バッチ容積及びバルク糖類濃度に基づいて最終バルク濃縮液の必要量を計算した。必要量の０．８５％塩化ナトリウム、ポリソルベート８０及びコハク酸塩緩衝液を予めラベリングした製剤容器に添加した後、バルク濃縮液を添加した。十分に混合し、０．２２μｍのフィルターを通して濾過した。バルクリン酸アルミニウムの添加中及び添加後に、製剤化されたバルク液を徐々に混合した。ｐＨを確認し、必要に応じて調節した。製剤化されたバルク生成物を２〜８℃で保存した。得られたワクチン組成物は、総０．５ｍｌ中に、２．２μｇの各糖類（ただし、６Ｂの場合は４．４μｇ）、約５０〜８５μｇのＣＲＭ１９７担体タンパク質、実験量のアルミニウムアジュバント（例えば、表１４のグループ３の場合、０．１２５ｍｇのアルミニウム元素、すなわち０．５ｍｇのリン酸アルミニウム）、約４．２５ｍｇの塩化ナトリウム、約２９５μｇのコハク酸塩緩衝液、及び約１００μｇのポリソルベート８０を含んでいる。
（ストレプトコッカス・ニューモニエ２３価多糖類−タンパク質接合体の免疫原性の研究）
ＩｇＧ濃度の測定
前記２３価免疫原性組成物の免疫原性をＥＬＩＳＡによってウサギで分析し、血清中の血清型特異的ＩｇＧの濃度を測定した。アジュバントを含む２３ｖＰｎＣワクチンがワクチン血清型特異的免疫反応を誘導する能力について調査した。
【０３６７】
体重２．５〜３．５ｋｇのニュージーランド白ウサギのメス５羽のグループを、提案されたヒト臨床用量（４．４μｇの血清型６Ｂを除き、各接合体２．２μｇ）にＡｌＰＯ４としてのアルミニウムをそれぞれ０．０６２５ｍｇ／ｍｌ、０．１２５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ及び１ｍｇ／ｍｌで加えて０週目に筋肉内経路で免疫した。２週目にウサギを同じ用量の複合体ワクチンで再度免疫し、４週目に採血した。血清型特異的ＥＬＩＳＡを０週目及び４週目の血清サンプルに対して行った。
【０３６８】
比較例として１３価ワクチン（Ｐｒｅｖｎａｒ１３、ファイザー）を使用して同様に評価し、分析結果を表１４に示した。接種から４週経過後のＩｇＧ濃度（Ｕ／ｍｌ）を示す。
【０３６９】
２３ｖＰｎＣワクチンとＰｒｅｖｎａｒ１３を２回投与した後、プーリングした血清サンプルで測定された幾何平均力価（ＧＭＴ；Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ Ｍｅａｎ Ｔｉｔｅｒ）が示されている。このデータは、アジュバントを２３ｖＰｎＣ剤形に含ませることで、アジュバントを含まない同じワクチンと比べてより高いレベルのＩｇＧ抗体が誘導されることを証明する。特に、血清型２、９Ｎ、１７Ｆ及び２０をすべて含む２３価免疫原性ワクチンを得ることができることを確認した。下記の結果で確認できるように、特にＰｒｅｖｎａｒ１３を通じては得られなかった、血清型２などに対する抗体を生成することができた。また、大幅に増加した価数にもかかわらず、他の血清型の抗原に対する抗体生成に大きい影響を与えないながら、含まれたすべての血清型に対する免疫反応を誘導できることを確認した。
【０３７０】
【表１４】
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【０３７１】
［７．ストレプトコッカス・ニューモニエ２４価多糖類−タンパク質接合体］
（ストレプトコッカス・ニューモニエ２４価多糖類−タンパク質接合体の調製）
ＣＲＭ１９７にストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２、３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆ由来の多糖類を接合させた多糖類−タンパク質接合体、及びＴＴにストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１及び５を接合させた多糖類−タンパク質接合体を含む２４価接合体組成物（２４ｖＰｎＣ）を製剤化した。血清型２、９Ｎ、１７Ｆ及び２０は上述した方法で接合体を調製し、その他の血清型は韓国特許出願第１０−２０１２−００６５８９３、米国特許出願６２／３７１，５２９、６２／３７１，５５３及び６２／６２６，４８２に開示された方法によってＣＲＭ１９７またはＴＴに接合された接合体を製造した。
【０３７２】
バッチ容積及びバルク糖類濃度に基づいて最終バルク濃縮液の必要量を計算した。必要量の０．８５％塩化ナトリウム、ポリソルベート８０及びコハク酸塩緩衝液を予めラベリングした製剤容器に添加した後、バルク濃縮液を添加した。十分に混合し、０．２２μｍのフィルターを通して濾過した。バルクリン酸アルミニウムの添加中及び添加後に、製剤化されたバルク液を徐々に混合した。ｐＨを確認し、必要に応じて調節した。製剤化されたバルク生成物を２〜８℃で保存した。得られたワクチン組成物は、総０．５ｍｌ中に、２．２μｇの各糖類（ただし、６Ｂの場合は４．４μｇ）、約５０〜９０μｇのＣＲＭ１９７担体タンパク質、０．１２５ｍｇのアルミニウム元素（０．５ｍｇリン酸アルミニウム）アジュバント、約４．２５ｍｇの塩化ナトリウム、約２９５μｇのコハク酸塩緩衝液、及び約１００μｇのポリソルベート８０を含んでいる。
（ストレプトコッカス・ニューモニエ２４価多糖類−タンパク質接合体の免疫原性の研究）
ＯＰＡ分析結果
２４価多糖類−タンパク質接合体が機能的抗体反応を誘導したか否かを確認するため、上述した１５価ワクチンと同じ方法で３羽のウサギでオプソニン食細胞作用死滅検定（Ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｋｉｌｌｉｎｇ ａｓｓａｙ（ＯＰＡ））を行った。
【０３７３】
【表１５】
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【０３７４】
上記の結果から、血清型２、９Ｎ、１７Ｆ及び２０をすべて含む２４価ワクチンを得ることができることを確認し、特に、Ｐｒｅｖｎａｒ１３を通じては得られなかった、血清型２、１７Ｆなどに対する抗体を生成することができた。また、Ｐｒｅｖｎａｒ１３に血清型を１１個も追加したにも、他の血清型の抗原に対する抗体生成に大きい影響を与えないながら、含まれたすべての血清型に対する免疫反応を誘導できることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０３７５】
本発明の免疫原性組成物は、薬剤として使用することができる。
【０３７６】
本発明の免疫原性組成物は、細菌感染、疾病または状態の予防、治療または改善のため、多様な治療学的または予防学的方法で使用することができる。特に、本発明の免疫原性組成物は、個体においてストレプトコッカス・ニューモニエ感染、疾病または状態の予防、治療または改善のために使用することができる。
【０３７７】
一実施形態において、個体に免疫学的有効量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む、対象においてストレプトコッカス・ニューモニエに対する免疫反応を誘導する方法を提供することができる。
【国際調査報告】
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