(57)【要約】  クロモリンまたはクロモリン誘導体化合物と抗炎症薬との組合せの治療有効量を投与することを含む、ニューロンの炎症状態、例えば筋萎縮性側索硬化症およびプリオン病を治療する方法が本明細書に記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の化合物と第２の化合物を同時投与することを含む、疾患もしくは状態を治療するまたは疾患もしくは状態の進行を遅らせることを必要とする対象において、前記疾患もしくは状態を治療するまたは疾患もしくは状態の進行を遅らせる方法であって、
前記疾患または状態はニューロンの炎症状態であり；
前記第１の化合物および前記第２の化合物は、独立して、
（ａ）式（Ｉ）：
【化１】
2021521122.tif 000007
［式中、
Ｘはハロゲン化物、ヒドロキシル、またはＯＣＯ（Ｃ１−８アルキル）であり；
ＹはＣＯ２Ｒ１またはＣＨ２ＯＲ２であり；
Ｒ１は、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、または−ＣＨ２ＣＯ２（Ｃ１−５アルキル）であり；
Ｒ２はＨまたは−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−４アルキル）である］
を有する化合物もしくはその薬学的に許容される塩；または
（ｂ）ビトルテロール、フェノテロール、イソプレナリン、レボサルブタモール、オルシプレナリン、ピルブテロール、プロカテロール、リトドリン、サルブタモール、テルブタリン、アルホルモテロール、バンブテロール、クレンブテロール、ホルモテロール、サルメテロール、アベジテロール、カルモテロール、インダカテロール、オロダテロール、ビランテロール、ネドクロミル、ケトチフェン、オロパタジン、オマリズマブ、ケルセチン、メポリズマブ、アゼラスチン、およびメチルキサンチン、ペミロラスト、オロパタジン、アルファトキシンＧ１、アルファトキシンＢ１、アルファトキシンＭ１、デオキシニバレノール、ゼアラレノン、オクラトキシンＡ、フモニシンＢ１、加水分解フモニシンＢ１、パツリン、およびエルゴタミンから選択されるか；または
（ｃ）エダラボンもしくはリルゾール；または
（ｄ）
【化２】
2021521122.tif 000008
もしくはその薬学的に許容される塩から選択されるか；または
（ｅ）非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；または
（ｆ）抗炎症ペプチド
であり、
前記第１の化合物と前記第２の化合物は、一緒になって、治療上有効である、
方法。
【請求項２】
前記式（Ｉ）の化合物が、
【化３】
2021521122.tif 000009
またはその薬学的に許容される塩から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の化合物がクロモリンナトリウムである、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の化合物が非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の化合物が、アセチルサリチル酸、ジフルニサル、サルサラート、イブプロフェン、デクスイブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、デクスケトプロフェン、フルルビプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン、インドメタシン、トルメチン、スリンダク、エトドラク、ケトロラク、ジクロフェナク、ナブメトン、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸、セレコキシブ、リコフェロン、ハイパーフォリン、およびフィグワートから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の化合物が、ＴＲＥＭ２などの抗炎症性遺伝子タンパク質からトランケートされた抗炎症性低分子ペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ニューロンの炎症状態が、ＡＬＳ、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、虚血性脳卒中、およびプリオン病である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ニューロンの炎症状態がＡＬＳである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ニューロンの炎症状態がプリオン病である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
同時投与が、脳幹および／または脊髄に位置するニューロン、ニューロン、または身体の随意筋に影響を及ぼす運動ニューロンに対するニューロン損傷を減速または停止させる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の化合物または前記第２の化合物が、皮下、静脈内、腹腔内、経口または経皮的に投与される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の化合物または前記第２の化合物が皮下投与される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の化合物または前記第２の化合物が静脈内投与される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の化合物または前記第２の化合物が腹腔内投与される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の化合物および前記第２の化合物が、薬物がＭ１からＭ２への変換因子として作用することを可能にする血液、脳、およびＣＳＦ濃度をもたらすように特別に調整された用量で投与される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月９日に出願された米国仮特許出願第６２／６５４，７７２号の優先権を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ルー・ゲーリック病としても知られる筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、随意筋を制御するニューロンの死を引き起こす特定の疾患である。ＡＬＳは、筋肉のこわばり、筋肉の痙縮、および筋肉のサイズ減少による漸進的な衰弱の悪化を特徴とする。その結果、発話、嚥下、呼吸が困難になり、最終的には死に至る。
【０００３】
米国では３０，０００人もの人々がＡＬＳに罹患しており、毎年５，０００人の新しい症例が診断されていると推定される。ＡＬＳを発症するほとんどの人は４０歳から７０歳の間であるが、この疾患はより若い年代でも発生し得る。世界的なＡＬＳの有病率は、人種、民族、または社会経済的グループとは相関しない。また、ＡＬＳは、２０歳以上の人々の１０万人の死亡のうち５人の原因であると推定されている。発生率は１０万人あたり約１〜２人である。ほとんどのＡＬＳ症例は散発性であり、症例の約５〜１０％のみが家族性ＡＬＳである。ＡＬＳは６０歳を超える人において最も一般的である。男性は、およそ２：１の割合で女性より多くこの疾患を発症する。対象の５０％が３年以内に死亡する。
【０００４】
ＡＬＳの発生率はハンチントン病の５倍であり、多発性硬化症とほぼ同じである。
【０００５】
ＡＬＳに関連する主な神経病変は、脊髄の運動ニューロンの喪失と脊髄のびまん性硬化症である。提案されている発症機序には、必ずしも遺伝子変異（例えばＳＯＤ１）には関連しない酸化ストレスの結果としての運動ニューロン損傷、グルタミン酸媒介興奮毒性、フリーラジカルの生成、細胞内カルシウムの増加、ＥＡＡＴ２機能の低下、異常なタンパク質凝集（ブニナ小体、および変異体が誤って折りたたまれ、他の分子と共沈することがある、ニューロフィラメントに富むヒアリン封入体を含む）、ならびにアポトーシスの徴候としてのカスパーゼ１および９の活性化の増加が含まれる。要約すると、ＡＬＳは遺伝的感受性と環境トリガの組合せによって引き起こされる。
【０００６】
ＡＬＳ患者における多くの試験では、抗体、ケモカイン、Ｔ細胞、およびゲートカルシウムチャネルのレベルの上昇を含む免疫応答の異常、ならびに他の炎症マーカが観察された。ＡＬＳ患者は、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１７  ＡＬＳ、およびＩＬ−６などの循環ケモカインおよびサイトカインのより高いレベルを示した。
【０００７】
健康な中枢神経系（ＣＮＳ）を有する対象では、ミクログリアが免疫の監視を提供する。傷害に応答して、ミクログリアは活性化され、炎症性サイトカイン、反応性ニトロ化中間体、反応性酸素化中間体、およびグルタミン酸塩を生成する。これらは、炎症領域のニューロンをアポトーシス機構によって変性させる。炎症の保護的側面には、ミクログリアによる破片の除去が含まれ、これはＴ細胞の修復と相互作用に重要である。
【０００８】
単球とミクログリアの早期活性化は、神経変性を悪化させ得る炎症性サイトカインの分泌を引き起こすことなく、免疫応答を調節して単球とミクログリアの固有の食作用能力を高めることにより、神経変性の進行を減速させる可能性を有する。
【０００９】
ミクログリアの特性の変化は、微小環境における様々な刺激（例えばサイトカイン）に対するそれらの応答に依存し、様々な表現型をもたらすことが公知である。サイトカイン、受容体、および他のマーカの発現の変化に基づき、単球およびマクロファージの状態は、古典的活性化（Ｍ１）、代替活性化（Ｍ２ａ）、ＩＩ型代替活性化（Ｍ２ｂ）、および後天性非活性化（Ｍ２ｃ）として定義されている。
【００１０】
ミクログリアは、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、Ｔ細胞由来の腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、または抗原提示細胞の存在に応答して活性化される。Ｍ１活性化ミクログリアは、活性酸素種を産生し、ＴＮＦαおよびインターロイキン（ＩＬ）−１βなどの炎症性サイトカインの産生増加をもたらすことができる。
【００１１】
マクロファージＭ２の活性化は、抗炎症作用および細胞外マトリックスの再編成に寄与することが公知のメディエータに関連する。Ｍ２ａ表現型を有するミクログリアは、食作用が増加しており、インスリン様成長因子１などの成長因子およびＩＬ−１０などの抗炎症性サイトカインを産生する。ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３によるマクロファージの刺激は、創傷治癒マクロファージと呼ばれることもあるＭ２ａ状態をもたらし、これは一般に、炎症性サイトカイン（ＩＬ−１、ＴＮＦおよびＩＬ−６）の産生が少ないことを特徴とする。Ｍ２ａ応答は、主にアレルギー反応、細胞外マトリックス沈着、およびリモデリングにおいて観察される。
【００１２】
Ｍ２ｂマクロファージは、Ｍ１活性化の特徴である高レベルの炎症性サイトカインを発現するだけでなく、高レベルの抗炎症性サイトカインＩＬ−１０も発現するという点で独特である。
【００１３】
最後に、Ｍ２ｃマクロファージの状態はＩＬ−１０によって刺激され、制御性マクロファージと呼ばれることもある。Ｍ２ｃマクロファージは、古典的な炎症性反応を伴わずに、細胞破片の食作用において役割を果たす抗炎症活性を有する。これらの細胞は、ＴＧＦβと高ＩＬ−１０、およびマトリックスタンパク質を発現する。Ｐｌｕｎｋｅｔｔらは、ＩＬ−１０が、グリア活性化および炎症性サイトカイン産生の減少を含む抗炎症反応を媒介することを報告した。
【００１４】
神経変性過程の治療のための潜在的な標的としてミクログリア活性化を調節するために、いくつかのアプローチが提案されてきた。神経変性過程の進行を止めるために非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）などの抗炎症薬を使用すると、内因性分子による炎症性および抗炎症性の両方の活性化が抑制され、Ｍ２ミクログリア機能および内因性のプラーク除去機構の有益な作用が不活性化され得ることが示唆されている。
【００１５】
以前の研究は主に２つの分野に焦点を合わせていた：炎症性サイトカインの毒性作用を抑える抗炎症薬；およびミクログリアを、Ｍ１状態から、毒性作用が減少し、食作用活性が増強されるＭ２状態に変換すること。複数の抗炎症薬が試験されているが、Ｍ１状態からＭ２状態へのミクログリアの変換にはほとんどまたは全く効果を示していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、ミクログリアのＭ１状態からＭ２状態への変換を調節することによる神経炎症状態の抗炎症治療が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
特定の実施形態では、本発明は、第１の化合物と第２の化合物を同時投与することを含む、疾患もしくは状態を治療するまたは疾患もしくは状態の進行を遅らせることを必要とする対象において、疾患もしくは状態を治療するまたは疾患もしくは状態の進行を遅らせる方法に関し、
疾患または状態はニューロンの炎症状態であり；
第１の化合物および第２の化合物は、独立して、
（ａ）式（Ｉ）：
【００１８】
【化１】
2021521122.tif 000002
【００１９】
［式中、
Ｘはハロゲン化物、ヒドロキシル、またはＯＣＯ（Ｃ１−８アルキル）であり；
ＹはＣＯ２Ｒ１またはＣＨ２ＯＲ２であり；
Ｒ１は、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、または−ＣＨ２ＣＯ２（Ｃ１−５アルキル）であり；
Ｒ２はＨまたは−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−４アルキル）である］
を有する化合物もしくはその薬学的に許容される塩；または
（ｂ）ビトルテロール、フェノテロール、イソプレナリン、レボサルブタモール、オルシプレナリン、ピルブテロール、プロカテロール、リトドリン、サルブタモール、テルブタリン、アルホルモテロール、バンブテロール、クレンブテロール、ホルモテロール、サルメテロール、アベジテロール、カルモテロール、インダカテロール、オロダテロール、ビランテロール、ネドクロミル、ケトチフェン、オロパタジン、オマリズマブ、ケルセチン、メポリズマブ、アゼラスチン、およびメチルキサンチン、ペミロラスト、オロパタジン、アルファトキシンＧ１、アルファトキシンＢ１、アルファトキシンＭ１、デオキシニバレノール、ゼアラレノン、オクラトキシンＡ、フモニシンＢ１、加水分解フモニシンＢ１、パツリン、およびエルゴタミンから選択されるか；または
（ｃ）エダラボンもしくはリルゾール；または
（ｄ）
【００２０】
【化２】
2021521122.tif 000003
【００２１】
もしくはその薬学的に許容される塩から選択されるか；または
（ｅ）非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；または
（ｆ）抗炎症ペプチド
であり、ならびに第１の化合物と第２の化合物は、一緒になって、治療上有効である。
【００２２】
特定の実施形態では、本発明は、ＡＬＳの治療のためのクロモリンまたはその塩もしくはエステルとエダラボンとの同時投与に関する。
【００２３】
特定の実施形態では、本発明は、ＡＬＳの治療のためのクロモリンまたはその塩もしくはエステルとリルゾールとの同時投与に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１Ａ〜図１Ｃは、クロモリンナトリウム処置がＴｇＳＯＤ１マウスの体重を変化させないことを示すグラフである。図１Ａは、二元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定により、Ｐ１３０のみで、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群での体重の有意な改善が明らかになったことを示す。また、Ｐ１００、Ｐ１１０、Ｐ１２０、Ｐ１３０、Ｐ１４０、およびＰ１５０では、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリンと比較してＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群で体重が有意に減少した。Ｐ１００、Ｐ１１０、Ｐ１２０、Ｐ１３０、Ｐ１４０、およびＰ１５０では、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群でも体重が有意に減少した。Ｐ１２０、Ｐ１３０、およびＰ１４０のみで、ＴｇＳＯＤ１−クロモリン群とＷｔＳＯＤ１−ビヒクル群の間で体重に有意差があった。図１Ｂは、雌性マウスにおいて、二元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定により、Ｐ１２０およびＰ１３０で野生型群と比較してＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群での体重の有意な減少が明らかになったことを示す（図１ｂ）。Ｐ１３０、Ｐ１４０、およびＰ１５０では、野生型群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群でも体重が有意に減少した。図１Ｃは、雄性マウスにおいて、二元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定により、Ｐ９０、Ｐ１００、Ｐ１１０、Ｐ１２０、Ｐ１３０、およびＰ１４０で、野生型群と比較してＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群での体重の有意な減少が明らかになったことを示す。Ｐ９０、Ｐ１００、Ｐ１１０、Ｐ１２０、およびＰ１３０では、野生型群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群でも体重が有意に減少した。雌性マウス：ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１９；明灰色）、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；暗灰色）、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１９；黒色）、およびＴｇＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；赤色）。雄性マウス：ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１８；明灰色）、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝２１；暗灰色）、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝２１；黒色）、ＴｇＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；赤色）。＊は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＴｇ−ＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＾は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；＃は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＠は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；％は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１、同じ統計的有意性が各記号に関連付けられている。データは中央値および四分位範囲として提示されている。
【図２】図２Ａ〜図２Ｃは、クロモリンナトリウム処置がＴｇＳＯＤ１マウスの神経学的スコアを改善し、疾患の発症を遅らせたことを示すグラフである。図２Ａは、二元配置分散分析により、Ｐ９０、Ｐ１００、Ｐ１１０、Ｐ１３０、およびＰ１４０でＴｇＳＯＤ１−クロモリン群と比較してＴｇＳＯＤ１−ビヒクル処置群での神経学的スコアの有意な増加が実証され、テューキーの事後分析により、これが明らかになったことを示す。図２Ｂは、雌性マウスにおいて、二元配置分散分析およびテューキーの事後分析により、Ｐ９０、Ｐ１００、Ｐ１２０、Ｐ１３０、およびＰ１４０でＴｇＳＯＤ１−クロモリン群と比較して雌性ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル処置群での神経学的スコアの有意な増加が明らかになったことを示す。図２Ｃは、雄性マウスにおいて、二元配置分散分析およびテューキーの事後分析により、Ｐ９０、Ｐ１００、およびＰ１１０でＴｇＳＯＤ１−クロモリン群と比較して雄性ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル処置群での神経学的スコアの有意な増加が明らかになったことを示す。群あたりのマウス数、雌性。雌性マウス：ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１９；明灰色）、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；暗灰色）、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１９；黒色）、およびＴｇＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；赤色）。雄性マウス：ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１８；明灰色）、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝２１；暗灰色）、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝２１；黒色）、ＴｇＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；赤色）。＊は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＴｇ−ＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＾は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；＃は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＠は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；％は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１、同じ統計的有意性が各記号に関連付けられている。データは中央値および四分位範囲として提示されている。
【図３】図３Ａ〜図３Ｃは、ＴｇＳＯＤ１マウスにおけるＰＡＧＥタスクの成績へのクロモリンナトリウム処置の効果を示すグラフである。図３Ａは、二元配置分散分析およびテューキーの事後分析により、Ｐ１２０およびＰ１４０でＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群におけるＰａＧＥ成績の有意な改善が明らかになったことを示す。ＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリン群と比較して、Ｐ８０、Ｐ１００、Ｐ１２０、およびＰ１４０でＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群におけるＰａＧＥの有意な低下があった。さらに、Ｐ１００とＰ１２０で、両方の野生型群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群ではＰａＧＥが有意に低下した。図３Ｂは、雌性マウスにおいて、二元配置分散分析およびテューキーの事後分析により、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリン群と比較してＰ１２０およびＰ１４０でＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群におけるＰａＧＥの有意な低下が明らかになったことを示す。さらに、Ｐ１００とＰ１２０で、両方の野生型群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群ではＰａＧＥが有意に低下した。重要なことに、Ｐ１００で２つのトランスジェニック群間に有意差があり、クロモリンで処置された雌性群では悪化し、この処置群ではＰ１４０でＰａＧＥ成績が改善した。図３Ｃは、雄性マウスにおいて、二元配置分散分析およびテューキーの事後分析により、Ｐ８０、Ｐ１００、およびＰ１２０で、両方の野生型群と比較してＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群におけるＰａＧＥの有意な低下が明らかになったことを示す。Ｐ１００とＰ１２０で、両方の野生型群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群ではＰａＧＥが有意に低下した。重要なことに、２つの雄性トランスジェニック群間に、Ｐ１２０でＰａＧＥの有意な改善があった。雌性マウス：ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１９；明灰色）、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；暗灰色）、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１９；黒色）、およびＴｇＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；赤色）。雄性マウス：ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１８；明灰色）、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝２１；暗灰色）、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝２１；黒色）、ＴｇＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；赤色）。データは中央値および四分位範囲として提示されている。＊は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＴｇ−ＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＾は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；＃は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＠は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；％は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１、同じ統計的有意性が各記号に関連付けられている。データは中央値および四分位範囲として提示されている。
【図４】図４Ａ〜図４Ｃは、クロモリンナトリウムがロータロッドの成績を変化させなかったことを示す。図４Ａは、二元配置分散分析およびテューキーの事後分析により、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルマウスとＴｇＳＯＤ１−クロモリンマウスの間でロータロッドの成績に差がないことが明らかになったことを示す。Ｐ７０、Ｐ９０、およびＰ１２０で、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリンの両方との間に有意差があった。同様に、事後分析により、すべての時点で、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリンと比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群でのロータロッドの成績の有意な低下が明らかになった。図４Ｂは、雌性マウスにおいて、二元配置分散分析およびテューキーの事後分析により、Ｐ７０、Ｐ９０およびＰ１２０で、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリンの両方との間の有意差が明らかになったことを示す。同様に、事後分析により、６８１のすべての時点で、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリンと比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群でのロータロッドの成績の有意な低下が明らかになった。図４Ｃは、雄性マウスにおいて、二元配置分散分析およびテューキーの事後分析により、雄性処置マウスではＰ７０、Ｐ９０およびＰ１２０で、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリンの両方との間の有意差が明らかになったことを示す。同様に、事後分析により、すべての時点で、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリンと比較して雄性ＴｇＳＯＤ１−クロモリン群でのロータロッドの成績の有意な低下が明らかになった。雌性マウス：ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１９；明灰色）、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；暗灰色）、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１９；黒色）、およびＴｇＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；赤色）。雄性マウス：ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１８；明灰色）、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝２１；暗灰色）、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝２１；黒色）、ＴｇＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；赤色）。＊は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＴｇ−ＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＾は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；＃は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＠は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；％は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１、同じ統計的有意性が各記号に関連付けられている。データは中央値および四分位範囲として提示されている。
【図５】５Ａ〜図５Ｃは、クロモリンナトリウムが歩行成績を変化させなかったことを示す。図５Ａは、二元配置分散分析およびテューキーの事後分析により、ＴｇＳＯＤ１−クロモリン群とＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群の間で歩幅に有意差がないことが明らかになったことを示す。Ｐ１２０では、両方の野生型群と比較してＴｇＳＯＤ１−ビヒクルでは歩幅が有意に減少した。同様に、事後分析により、Ｐ１２０で、野生型マウスと比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群での歩幅の有意な減少が明らかになり、クロモリン処置が歩幅に影響を及ぼさないことが示唆された。図５Ｂは、雌性マウスにおいて、二元配置分散分析およびテューキーの事後分析により、Ｐ１２０で、両方の野生型群と比較してＴｇＳＯＤ１−ビヒクルおよびＴｇＳＯＤ１−クロモリンで処置された雌性マウスの歩幅の有意な減少が明らかになったことを示す（図５ｂ）。図５Ｃは、雄性マウスにおいて、二元配置分散分析およびテューキーの事後分析により、Ｐ１２０で、両方の野生型群と比較してＴｇＳＯＤ１−ビヒクルおよびＴｇＳＯＤ１−クロモリンで処置された雄性マウスの歩幅の有意な減少が明らかになったことを示す。
【図６】図６Ａ〜図６Ｃは、クロモリンナトリウムが歩隔を変化させなかったことを示す。図６Ａは、二元配置分散分析およびテューキーの事後分析により、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクルと比較してＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群ではＰ１２０で歩隔の有意な増加が明らかになったことを示す。図６Ｂは、雌性マウスにおいて、二元配置分散分析により、歩隔に対する年齢の有意な影響が明らかになったことを示す。図６Ｃは、雄性マウスにおいて、二元配置分散分析およびテューキーの分析により、両方の野生型群と比較してＴｇＳＯＤ１−ビヒクルで処置されたマウスにおける歩隔の有意な増加が明らかになったことを示す。雌性マウス：ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１９；明灰色）、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；暗灰色）、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１９；黒色）、およびＴｇＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；赤色）。雄性マウス：ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１８；明灰色）、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝２１；暗灰色）、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝２１；黒色）、ＴｇＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；赤色）。＊は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＴｇ−ＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＾は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；＃は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＠は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；％は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１、同じ統計的有意性が各記号に関連付けられている。データは中央値および四分位範囲として提示されている。
【図７】図７Ａ〜図７Ｃは、クロモリンナトリウム処置がＴｇＳＯＤ１マウスにおける不全麻痺発症年齢を遅らせたことを示す。図７Ａは、不全麻痺発症年齢によって測定した運動症状の発症にクロモリン処置が有意な影響を及ぼした（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定）ことを示し、発症年齢の中央値はＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群では９９日、ＴｇＳＯＤ１−クロモリン群では１０７日であった。図７Ｂは、雌性マウスにおいて、クロモリン処置後に運動症状の発症が有意に遅延したことを示す（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定）。図７Ｃは、雄性マウスにおいて、クロモリン処置が運動症状の発症を有意に遅らせたことを示す（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定）。雌性マウス：ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１９；明灰色）、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；暗灰色）、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１９；黒色）、およびＴｇＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；赤色）。雄性マウス：ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１８；明灰色）、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝２１；暗灰色）、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝２１；黒色）、ＴｇＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；赤色）。＊は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＴｇ−ＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＾は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；＃は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＠は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；％は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１、同じ統計的有意性が各記号に関連付けられている。データは中央値および四分位範囲として提示されている。
【図８】図８Ａ〜図８Ｃは、クロモリンナトリウムが雌性ＴｇＳＯＤ１マウスの生存率を増加させたことを示す。図８Ａは、クロモリン処置が、クロモリン処置マウスの生存率に有意な影響を及ぼさなかったことを示す（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）。図８Ｂは、雌性マウスでのみ、生存率に対する処置の有意な効果があったことを示す（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定）。図８Ｃは、雄性マウスに対しては処置の効果がなかったことを示す。データは中央値および四分位範囲として提示されている。雌性マウス：ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１９；明灰色）、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；暗灰色）、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１９；黒色）、およびＴｇＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；赤色）。雄性マウス：ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１８；明灰色）、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝２１；暗灰色）、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝２１；黒色）、ＴｇＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；赤色）。＊は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＴｇ−ＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＾は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；＃は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＠は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；％は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１、同じ統計的有意性が各記号に関連付けられている。データは中央値および四分位範囲として提示されている。
【図９】図９Ａ〜図９Ｂは、クロモリン処置が神経保護的であり、ＴｇＳＯＤ１マウスにおける腰髄運動ニューロンの生存率を高めることを示す。図９Ａは、Ｈ＆Ｅ染色によって視覚化された腰髄運動ニューロンの代表的な画像を示す。図９Ｂは、一元配置分散分析およびダンの多重比較検定により、運動ニューロンの生存率が、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群で有意に増加したことが明らかになったことを示す。ＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリン群と比較して、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群では運動ニューロンの数が有意に減少した。両方の野生型群と比較して、ＴｇＳＯＤ１−クロモリン群でも運動ニューロンの数が減少した。ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１９；明灰色）、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン７５５（ｎ＝１７；暗灰色）、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１９；黒色）、およびＴｇＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；赤色）。＊は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＴｇ−ＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＾は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；＃は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＠は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；％は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１、同じ統計的有意性が各記号に関連付けられている。データは中央値および四分位範囲として提示されている。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｂは、クロモリン処置がＴｇＳＯＤ１マウスの脊髄の小神経膠細胞症を変化させないことを示す。図１０Ａは、腰髄のミクログリアがＩｂａ１特異的抗体とＤＡＢ染色を使用して視覚化されたことを示す。図１０Ｂは、Ｉｂａ１陽性細胞面積の割合の定量化により、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルと比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリンマウスにおけるＩｂａ１陽性細胞面積の割合に差がないことが明らかになったことを示す。一元配置分散分析およびテューキーの事後分析によって示されるように、両方の野生型群と比較して、ビヒクルおよびＴｇＳＯＤ１−クロモリンの両方の脊髄におけるＩｂａ１陽性細胞面積の割合が有意に増加した。ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１９；明灰色）、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；暗灰色）、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１９；黒色）、およびＴｇＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；赤色）。＊は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＴｇ−ＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＾は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；＃は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＠は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；％は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１、同じ統計的有意性が各記号に関連付けられている。データは中央値および四分位範囲として提示されている。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｅは、クロモリン処置がＴｇＳＯＤ１マウスの脊髄における炎症性サイトカイン／ケモカインのレベルを低下させたことを示すグラフである。図１１Ａ：ＩＬ−１ｂ、図１１Ｂ：ＩＬ−５、図１１Ｃ：ＩＬ−６、図１１Ｄ：ＣＸＣＬ１、図１１Ｅ：ＴＮＦａ。一元配置分散分析および事後分析により、クロモリン処置は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群と比較して、ＴｇＳＯＤ１−クロモリン群におけるＣＸＣＬ１（図１１Ｄ）およびＴＮＦａ（図１１Ｅ）レベルを有意に低下させることが明らかになった。両方の野生型群と比較して、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群とＴｇＳＯＤ１−クロモリン群の両方の脊髄におけるＩＬ−１ｂ（図１１Ａ）、ＩＬ−５（図１１Ｂ）、ＩＬ−６（図１１Ｃ）、ＣＸＣＬ１（図１１Ｄ）、およびＴＮＦａ（図１１Ｅ）のレベルに有意差があった。Ｔｇ群とＷｔ群の間で、ＩＬ−１ｂ（図１１Ａ）、ＣＸＣＬ１（図１１Ｄ）、およびＴＮＦａ（図１１Ｅ）が有意に増加した一方で、ＩＬ−５（図１１Ｂ）およびＩＬ−６（図１１Ｃ）レベルは有意に減少した。ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１５；明灰色）、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１９；暗灰色）、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１７；黒色）、およびＴｇＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；赤色）。＊は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＴｇ−ＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＾は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；＃は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＠は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；％は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１、同じ統計的有意性が各記号に関連付けられている。データは中央値および四分位範囲として提示されている。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｇは、クロモリン処置がＴｇＳＯＤ１マウスの血漿中の炎症性サイトカイン／ｃ７９２ヘモカインのレベルを低下させたことを示すグラフである。図１２Ｂ、図１２Ｄ、および図１２Ｅは、一元配置分散分析および事後分析により、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群におけるＩＬ−２（図１２Ｂ）、ＩＬ−６（図１２Ｄ）、およびＩＬ−１０（図１２Ｅ）レベルの有意な減少が明らかになったことを示す。ＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリン群の両方と比較して、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群の血漿中のＩＬ−２（図１２Ｂ）、ＩＬ−６（図１２Ｄ）、およびＩＬ−１０（図１２Ｅ）、およびＴＮＦα（図１２Ｇ）レベルには有意差があった。一元配置分散分析により、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル群と比較してＴｇＳＯＤ１−ビヒクルマウスでＣＸＣＬ１（図１２Ｆ）レベルが増加する傾向、およびＷｔＳＯＤ１−クロモリン群と比較して増加する傾向が実証された。群間でＩＬ−１β（図１２Ａ）およびＩＬ−５（図１２Ｃ）のレベルに統計的な有意差はなかった。最後に、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリンマウスではＴＮＦαレベルが減少する傾向があった（図１２Ｇ）。ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１１；明灰色）、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１１；暗灰色）、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝９；黒色）、およびＴｇＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝９；赤色）。＊は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＴｇ−ＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＾は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；＃は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＠は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；％は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１、同じ統計的有意性が各記号に関連付けられている。データは中央値および四分位範囲として提示されている。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｅは、クロモリン処置が脊髄のＧＰＲ３５レベルを増加させたことを示す。図１３Ａは、脊髄試料からのＧＰＲ３５およびｂ−アクチンの代表的なイムノブロットを示す。図１３Ｂは、脊髄ウェスタンブロットの一元配置分散分析およびテューキーの事後分析により、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群でＧＰＲ３５レベルが増加する傾向があることが明らかになったことを示す。ＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリンと比較して、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群ではＧＰＲ３５レベルが有意に減少した。ＴｇＳＯＤ１−クロモリン群と野生型群のいずれかとの間でＧＰＲ３５レベルに有意差はなかった。図１３Ｃは、ＧＰＲ３５（赤色）、ＮｅｕＮ（緑色）の代表的な免疫蛍光画像、および腰髄からのマージ画像を示す。ＧＰＲ３５は、ニューロンマーカであるＮｅｕＮと共局在している。図１３Ｄは、一元配置分散分析およびテューキーの事後分析により、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルと比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群におけるＧＰＲ３５レベルの有意の増加が明らかになったことを示す。図１３Ｅは、一元配置分散分析および事後分析により、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルと比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群におけるニューロンＧＰＲ３５レベルの有意な増加が明らかになったことを示す。ウェスタンブロットの場合、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝２１；明灰色）、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１９；暗灰色）、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１８；黒色）、およびＴｇＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；赤色）。免疫蛍光法の場合、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝６；明灰色）、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝６；暗灰色）、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝６；黒色）、およびＴｇＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝６；赤色）。＊は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＴｇ−ＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＾は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；＃は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＠は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；％は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１、同じ統計的有意性が各記号に関連付けられている。データは中央値および四分位範囲として提示されている。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｂは、クロモリン処置がＴｇＳＯＤ１マウスの脊髄または血漿中のＭＣＰ−１レベルを変化させないことを示す。図１４Ａは、一元配置分散分析および事後分析により、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリン群の両方と比較して、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルマウスの脊髄におけるＭＣＰ−１レベルの有意な増加が明らかになったことを示す。しかし、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルと比較して、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンの脊髄のＭＣＰ−１レベルに対してはクロモリン処置の効果がなかった。図１４Ｂは、一元配置分散分析および事後分析により、いずれの群においても血漿中のＭＣＰ−１レベルは変化しなかったことが明らかになったことを示す。脊髄の場合、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１５；明灰色）、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１９；暗灰色）、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１７；黒色）、およびＴｇＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１７；赤色）。血漿の場合、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝１１；明灰色）、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝１１；暗灰色）、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル（ｎ＝９；黒色）、およびＴｇＳＯＤ１−クロモリン（ｎ＝９；赤色）。＊は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＴｇ−ＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＾は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；＃は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す；＠は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルの差を示す；％は、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−クロモリンの差を示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１、同じ統計的有意性が各記号に関連付けられている。データは中央値および四分位範囲として提示されている。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
概要
本開示は、他の治療法と組み合わせて、喘息の治療に使用されるＦＤＡ承認薬であるクロモリンの潜在的に新しい作用機序を明らかにする。本明細書に記載されるように、クロモリンは、Ｍ１攻撃状態からＭ２食作用状態への免疫ミクログリア活性化を調節する有意な能力を示し、運動ニューロン変性を減速または停止させることが期待される。Ｍ２状態のミクログリアは、過剰な炎症性サイトカインを貪食し、そうすることにより、シナプスおよび神経の損傷の拡大を防ぐ。クロモリンは、皮下注射可能な形態（Ｉｒａｄｉｃａ−Ｑ）で入手可能であり、改善されたバイオアベイラビリティを提供する。さらなる研究により、クロモリンがβアミロイドおよびαシヌクレインペプチドに結合し、それらのより高次の凝集体への重合を阻害することが示されている。これらのペプチドの凝集は家族性ＡＬＳ（ＦＡＬＳ）の対象で観察されており、凝集はＳＯＤ１タンパク質の変異によって引き起こされる。クロモリンは、ＳＯＤ１モノマーの凝集の阻害剤として作用し得る。インビトロ試験で、クロモリンがＳＯＤ１遺伝子を阻害することが示された。さらに、動物モデルとヒトの薬物動態試験の両方において、クロモリンが血液脳関門を通過することが試験で示されている。健常志願者およびアルツハイマー病を有する対象の血漿とＣＳＦの両方で、クロモリンの薬物動態が検討されている。
【００２６】
クロモリン皮下注射後の血漿バイオアベイラビリティは、ＳＯＤ１の蓄積と沈殿を妨げるのに十分な、脳内のサイトカイン、フリーラジカル、および毒素に関連する神経炎症を改善する濃度になる。
【００２７】
ＳＯＤ１トランスジェニックマウス（脳内でＳＯＤ１負荷を発症しているマウス）を使用した動物モデルでのさらなる試験により、腹腔内（ＩＰ）投与されたクロモリンの利点の統計的に有意な証拠が提供された。これらの結果は、Ｉｒａｄｉｃａ−Ｑ処置が、ＡＬＳのトランスジェニック動物モデルにおいて脳のＳＯＤ１負荷によって引き起こされる行動の低下を減速させる可能性を有することを示す。
【００２８】
本明細書に記載されているように、クロモリンナトリウム処置は、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスモデルにおいて疾患の発症および進行を遅らせ、足グリップ持久力（ＰａＧＥ）タスクにおける運動障害を低減し、生存率を改善した（雌性マウスのみ）。さらに、クロモリン処置は、腰髄運動ニューロンを有意に節約し、ＴｇＳＯＤ１マウスの脊髄および血漿中の炎症性サイトカイン／ケモカインレベルを低下させた。最後に、クロモリン処置は、ニューロンのＧＰＲ３５レベルの増加につながった。総合すると、これらの所見は、クロモリンがＧＰＲ３５の活性化を介してＴｇＳＯＤ１マウスにおける免疫応答を調節し得ることを示唆する。
【００２９】
特定の実施形態では、クロモリンは、肥満細胞の脱顆粒を阻害し、喘息、アレルギー性鼻炎、肥満細胞症、および結膜炎を治療するために使用される。動物モデルでは、クロモリン処置は肥満細胞の活性化と脱顆粒を弱め、ヒスタミンの発現とマクロファージの浸潤を低減する。さらに、クロモリンは、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦａ、ＣＣＬ３、およびＭＣＰ１などの炎症性ケモカインおよびサイトカインの発現を低下させる。特定の実施形態では、クロモリンは、最小限のアミロイド沈着で、若齢Ｔｇ２５７６  ＡＤ  ３３３マウスにおけるＡβ凝集を減少させる。クロモリンはまた、ＡＰＰＳｗｅｄｉｓｈを発現するＴｇ２５７６マウスにおける脳のＡβレベルに有意な影響を及ぼす。プラークへのミクログリアの動員およびＡβのミクログリア取り込みの増強に対するクロモリンのこれらの観察された作用は、クロモリンがミクログリアの活性化状態を、神経炎症に有利に働く状態から食作用を促進する状態へと変換させ得ることを示唆する。
【００３０】
小神経膠細胞症は、ＷｔＳＯＤ１マウスと比較してＴｇＳＯＤ１マウスの脊髄で有意に増加する；しかしながら、本明細書に記載されているように、ビヒクルとクロモリンで処置されたＴｇＳＯＤ１マウスとの間に差はなかった。ただし、クロモリンに応答した炎症性サイトカインおよびケモカインの変化は、ミクログリアの活性化状態の炎症性から抗炎症性へのシフトを誘導する可能性がある。炎症に対するクロモリン処置の効果をさらに明らかにするために、脊髄のサイトカインとケモカインの変化を測定した。炎症性サイトカインであるＩＬ−１βとＴＮＦα、およびケモカインＣＸＣＬ１は脊髄で有意に増加し、一方サイトカインＩＬ−５とＩＬ−６は、ＷｔＳＯＤ１マウスと比較してＴｇＳＯＤ１マウスの脊髄で減少した。重要なことに、クロモリンナトリウム処置は、ＴｇＳＯＤ１マウスの脊髄におけるＣＸＣＬ１およびＴＮＦαレベルを有意に減少させた。
【００３１】
ＣＸＣＬ１は、好中球の炎症部位への移動を媒介することに関与する走化性サイトカインである；ＡＬＳの患者では、ＣＸＣＬ１レベルが有意に増加する。具体的には、ＣＸＣＬ１レベルは、ＡＬＳ患者から単離された単球およびＡＬＳ患者由来の線維芽細胞において増加する。特定の実施形態では、本開示は、ＣＸＣＬ１レベルが、ＡＬＳ患者で以前に報告されたのと同様に、ＴｇＳＯＤ１マウスの脊髄において増加するという発見に関する。ＣＸＣＬ１がＡＤ患者の血液から脳への単球の経内皮移動に寄与することが示されていることを考えると、ＣＸＣＬ１は、ＡＬＳ患者のマクロファージによる末梢神経浸潤に寄与する可能性がある。したがって、クロモリンを使用してＣＸＣＬ１の発現を低下させることは、ＡＬＳ患者における炎症反応を低下させるのに非常に有益である可能性がある。
【００３２】
特定の実施形態では、クロモリンナトリウム処置はまた、ＴｇＳＯＤ１マウスの脊髄におけるＴＮＦαのレベルを有意に減少させた。星状膠細胞とニューロンはＴＮＦαを産生することができるが、ミクログリアが神経炎症中のＴＮＦα放出の主な供給源であると推測されている。ＴＮＦαは、ＧＬＴ−１の発現を低下させ、Ｃａ２＋透過性ＡＭＰＡＲの迅速な膜挿入を誘導することにより、腰髄運動ニューロンに対するＡＭＰＡＲ媒介興奮毒性を増強することが示されている。したがって、特定の実施形態では、クロモリン処置は、ＡＭＰＡ媒介興奮毒性を減少させることによってその神経保護作用のいくつかを提供し得る。特定の実施形態では、クロモリンナトリウムの内因性標的受容体であるＧＰＲ３５の増加が、処置後に観察された。
【００３３】
ＧＰＲ３５は主に免疫細胞で発現されるが、心血管疾患、炎症性疾患、および神経疾患に関与している。ＧＰＲ３５は、アスピリンの抗炎症作用およびクロモリンの抗アレルギー作用に寄与する。炎症におけるその役割に加えて、末梢神経系ニューロンでのＧＰＲ３５の活性化は、シナプス伝達に関与する機構の抑制につながる。具体的には、交感神経ニューロンでのＧＰＲ３５の活性化は、電位依存性Ｃａ２＋チャネルの阻害および後根神経節におけるフォルスコリン誘導性サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の産生をもたらした。さらに、ＣＮＳでは、ＧＰＲ３５の活性化は、海馬のＣＡ１領域におけるニューロンの発火を抑制した。総合すると、これらの所見は、ＧＰＲ３５活性がニューロンの興奮性とシナプス伝達を変化させ、したがって、炎症反応を弱めることに加えて、ＧＰＲ３５の活性化は、ＡＬＳの興奮毒性を防ぐことによってさらなる治療上の利益も提供する可能性があることを示唆する。
【００３４】
ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、およびＩＬ−８などの炎症性サイトカインは、ＡＬＳ患者の血漿または血清試料中で上昇し、疾患の進行と共にレベルが上昇することが報告されている。さらに、末梢血の炎症性サイトカインはＡＬＳの診断バイオマーカとして提案されている。したがって、特定の実施形態では、本開示は、治療のための薬力学的バイオマーカを同定するための、末梢におけるクロモリンナトリウム治療の効果に関する。サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０は、ＷｔＳＯＤ１マウスと比較してＴｇＳＯＤ１マウスの血漿中で増加した。さらに、脊髄での所見と同様に、野生型マウスと比較して、ＴｇＳＯＤ１マウスの血漿中でＴＮＦαおよびＣＸＣＬ１レベルの有意な増加が観察された。クロモリン処置は、ＩＬ−２、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０のレベルを有意に減少させ、血漿中のＴＮＦαレベルを減少させる傾向をもたらし、クロモリン処置がＴｇＳＯＤ１マウスの末梢血の炎症を軽減することを示唆した。ＩＬ−２とＴＮＦαは炎症性サイトカインであると考えられているが、ＩＬ−６は炎症性と抗炎症性の両方の特性を示す。興味深いことに、ＩＬ−１０はマクロファージの代謝再プログラミングによって炎症反応を阻害することが示されている。特定の実施形態では、クロモリン処置は、ＡＬＳの潜在的な診断バイオマーカである末梢血炎症性サイトカインのレベルの低下をもたらした。ＭＣＰ−１レベルは、ＴｇＳＯＤ１マウスの脊髄で増加したが血漿では増加せず、ＡＬＳ患者の脳脊髄液では増加したが、クロモリン処置は、ＴｇＳＯＤ１マウスの脊髄または血漿中の４０７ＭＣＰ−１レベルに影響を及ぼさなかった。
【００３５】
特定の実施形態では、本開示は、クロモリンナトリウム処置（６．３ｍｇ／ｋｇ）が、雄性および雌性の両方のマウスにおいてＰａＧＥタスクでの成績を有意に改善し、疾患の発症を遅らせたという発見に関する。しかし、生存率の改善には雌性特異的効果があった。試験は、雄性マウスと比較して、トランスジェニック雌性ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける明確な疾患の進行とより大きな治療上の改善を示唆する。具体的には、雌性ＴｇＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスは、雄性コホートと比較して生存期間の延長を示すことが示された。特定の実施形態では、クロモリンナトリウムは、雌性ＴｇＳＯＤ１マウスにおいてより大きな神経保護作用を示す。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、これらの所見の別の説明は、クロモリンと雌性ホルモン受容体との相互作用の可能性である。
【００３６】
総合すると、これらの所見は、クロモリンナトリウム処置がＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスモデルで疾患の発症と進行を遅らせ、運動障害を低減し（ＰａＧＥ）、生存率を改善する（雌性マウスのみ）ことを示す。さらに、クロモリン処置は腰髄運動ニューロンの生存率を有意に増加させた。クロモリン処置は小神経膠細胞症に影響を及ぼさなかったが、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの脊髄および血漿中の炎症性サイトカインおよびケモカインのレベルを低下させ、クロモリンがミクログリアの活性化状態を（抗炎症性の方に）変化させることを示唆した。クロモリン処置はまた、ＧＰＲ３５レベルを増加させ、クロモリン媒介作用のいくつかがＧＰＲ３５活性化による可能性があることを示唆した。したがって、他の薬剤と組み合わせたクロモリンは、ＡＬＳの治療に有用である。
【００３７】
定義
本明細書で別段の定義がない限り、本出願で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。一般に、本明細書に記載される、化学、細胞および組織培養、分子生物学、細胞および癌生物学、神経生物学、神経化学、ウイルス学、免疫学、微生物学、薬理学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学、ならびにそれらの技術に関連して使用される命名法は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されている。
【００３８】
本開示の方法および技術は、一般に、別段の指示がない限り、当技術分野で周知の従来の方法に従って、ならびに本明細書全体で引用され、論じられる様々な一般的およびより特定の参考文献に記載されるように実施される。例えば、“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ”，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２０００）；Ｍｏｔｕｌｓｋｙ，“Ｉｎｔｕｉｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ”，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９５）；Ｌｏｄｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄ．”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，７ｔｈ  ｅｄ．”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９９９）；およびＧｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．”，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（２０００）参照。
【００３９】
本明細書で使用される化学用語は、本明細書で別段の定義がない限り、“Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ”，Ｐａｒｋｅｒ  Ｓ．，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃ．Ａ．（１９８５）に例示されるように、当技術分野で使用される従来の使用法に従って使用される。
【００４０】
「アルキル」基または「アルカン」は、完全に飽和している直鎖または分岐の非芳香族炭化水素である。典型的には、直鎖または分岐アルキル基は、別段の定義がない限り、１〜約２０個の炭素原子、好ましくは１〜約１０個の炭素原子を有する。直鎖および分岐アルキル基の例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ペンチルおよびオクチルが含まれる。Ｃ１−６の直鎖または分岐アルキル基は、「低級アルキル」基とも呼ばれる。
【００４１】
さらに、本明細書、実施例、および特許請求の範囲全体で使用される「アルキル」（または「低級アルキル」）という用語は、「非置換アルキル」および「置換アルキル」の両方を含むことが意図されており、後者は、炭化水素骨格の１つ以上の炭素上の水素を置換する置換基を有するアルキル部分を指す。そのような置換基としては、別段の指定がない限り、例えばハロゲン（例えばフルオロ）、ヒドロキシル、カルボニル（カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシルなど）、チオカルボニル（例えばチオエステル、チオアセタート、またはチオホルマート）、アルコキシ、ホスホリル、ホスファート、ホスホナート、ホスフィナート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、スルファート、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分を挙げることができる。好ましい実施形態では、置換アルキル上の置換基は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６シクロアルキル、ハロゲン、カルボニル、シアノ、またはヒドロキシルから選択される。より好ましい実施形態では、置換アルキル上の置換基は、フルオロ、カルボニル、シアノ、またはヒドロキシルから選択される。炭化水素鎖上で置換された部分は、適切な場合、それ自体置換され得ることが当業者に理解されるであろう。例えば、置換アルキルの置換基には、アミノ、アジド、イミノ、アミド、ホスホリル（ホスホナートおよびホスフィナートを含む）、スルホニル（スルファート、スルホンアミド、スルファモイルおよびスルホナートを含む）、およびシリル基の置換および非置換形態、ならびにエーテル、アルキルチオ、カルボニル（ケトン、アルデヒド、カルボキシラート、およびエステルを含む）、−ＣＦ３、−ＣＮなどが含まれ得る。例示的な置換アルキルを以下に記載する。シクロアルキルは、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノアルキル、カルボニル置換アルキル、−ＣＦ３、−ＣＮなどでさらに置換することができる。
【００４２】
「Ｃｘ−ｙ」という用語は、アシル、アシルオキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアルコキシなどの化学部分と組み合わせて使用される場合、鎖中にｘ〜ｙ個の炭素を含む基を包含することが意図されている。例えば、「Ｃｘ−ｙアルキル」という用語は、ハロアルキル基を含む、鎖中にｘ〜ｙ個の炭素を含む直鎖アルキルおよび分枝鎖アルキル基を含む、置換または非置換飽和炭化水素基を指す。好ましいハロアルキル基には、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、およびペンタフルオロエチルが含まれる。「Ｃ２−ｙアルケニル」および「Ｃ２−ｙアルキニル」という用語は、長さが類似し、上記のアルキルへの置換が可能であるが、それぞれ少なくとも１つの二重結合または三重結合を含む置換または非置換不飽和脂肪族基を指す。
【００４３】
上記のすべて、ならびに本出願で言及される他の刊行物、特許および公開特許出願は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。矛盾する場合は、特定の定義を含む本明細書が支配する。
【００４４】
「患者」または「対象」という用語は、特定の治療を必要とする哺乳動物を指す。好ましい実施形態では、患者は、霊長動物、イヌ、ネコ、またはウマである。別の好ましい実施形態では、患者はヒトである。
【００４５】
状態または患者を「治療する」とは、臨床結果を含む有益なまたは望ましい結果を得るための措置を講じることを指す。本明細書で使用され、当技術分野でよく理解されているように、「治療」は、臨床結果を含む有益なまたは望ましい結果を得るためのアプローチである。有益なまたは望ましい臨床結果には、検出可能か検出不可能かにかかわらず、１つ以上の症状または状態の緩和または改善、疾患の程度の減少、疾患の安定した（すなわち悪化しない）状態、疾患の拡大の防止、疾患の進行の遅延または減速、病状の改善、および寛解（部分的または全体的）が含まれ得るが、これらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けていない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延長させることを意味し得る。さらに、この用語には、支持療法、すなわち、関連する疾患、病的状態、または障害の改善に向けて別の特定の療法を補足するために使用される治療が含まれる。
【００４６】
化合物の投与に関して、「投与する」という用語は、組成物および／またはその医薬組成物を対象に提供する任意の方法を指す。そのような方法は当業者に周知であり、経口投与、経皮投与、吸入による投与、経鼻投与、局所投与、膣内投与、眼投与、耳内投与、脳内投与、直腸投与、および静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、硝子体内投与などの注射を含む非経口投与が含まれるが、これらに限定されない。投与は継続的または間欠的であり得る。様々な態様では、製剤は治療的に投与され得る、すなわち既存の疾患または状態を治療するために投与され得る。さらなる様々な態様では、製剤は予防的に投与され得る、すなわち疾患または状態の予防のために投与され得る。
【００４７】
「同時投与」および「同時投与する」という用語は、同時投与（２つ以上の治療薬を同時に投与すること）、および治療薬がある程度同時に患者内に存在する限り、異なる時点の投与（１つ以上の治療薬をさらなる１つ以上の治療薬の投与とは異なる時点で投与すること）の両方を指す。
【００４８】
「有効量」という用語は、所望の結果を達成する、または望ましくない状態に影響を及ぼすのに十分な量を指す。例えば、「治療有効量」とは、所望の治療結果を達成する、または望ましくない症状に影響を及ぼすのに十分であるが、一般に有害な副作用を引き起こすには不十分な量を指す。特定の患者に対する特定の治療上有効な用量レベルは、治療される障害および障害の重症度；使用される特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的健康状態、性別および食事；投与の時間；投与経路；使用される特定の化合物の排泄率；治療期間；使用される特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物、ならびに医学技術分野で周知の同様の因子を含む様々な因子に依存する。例えば、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルで化合物の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることは、十分に当業者の技術範囲内である。所望する場合は、投与の目的で有効１日量を複数の用量に分割することができる。結果として、単回投与組成物は、１日投与量を構成する量またはその約数を含有し得る。禁忌が発生した場合は、個々の医師が投与量を調整することができる。投与量は変動する可能性があり、１日または数日間、毎日１回以上の投与で投与され得る。所与のクラスの医薬品の適切な投与量に関する手引きは文献に見出すことができる。さらなる様々な態様では、製剤は「予防的に有効な量」、すなわち疾患または状態の予防に有効な量で投与され得る。
【００４９】
併用療法
本発明の一態様は、併用療法に関する。このタイプの治療は、有効成分の同時投与が、単一治療薬のみの投与によって達成される治療効果よりも大きい治療効果を達成するので、有利である。
【００５０】
特定の実施形態では、２つ以上の治療薬の同時投与は、単一治療薬のみの投与によって達成される治療効果よりも大きい治療効果を達成する。この点で、併用療法は効果的である。ある治療薬の治療効果は、別の治療薬の同時投与によって増強される。
【００５１】
特定の実施形態では、２つ以上の治療薬の同時投与は、各単一治療薬の投与によって達成される治療効果の合計にほぼ等しい治療効果を達成する。これらの実施形態では、併用療法は「相加的」であると言われる。
【００５２】
特定の実施形態では、２つ以上の治療薬の同時投与は、相乗効果、すなわち、組合せの個々の成分の治療効果の合計よりも大きい治療効果を達成する。
【００５３】
併用療法を構成する有効成分は、単一剤形によって、または各活性薬剤の別々の投与によって一緒に投与され得る。特定の実施形態では、第１と第２の治療薬は単一の剤形で投与される。特定の実施形態では、第１、第２、および第３の治療薬は、単一の剤形で投与される。薬剤は、単一の錠剤、丸剤、カプセル、または非経口投与用の溶液などに製剤化され得る。
【００５４】
特定の実施形態では、治療薬は単一剤形で投与され、個々の治療薬は他の治療薬（１つまたは複数）から単離されている。そのような方法で剤形を製剤化することは、潜在的に反応性の治療薬の構造的完全性を、それらが投与されるまで維持するのを助ける。このタイプの製剤は、剤形の製造中および長期保存のために有用であり得る。特定の実施形態では、治療薬は、１つのカプセル内に収納された、隔離された領域または別個のカプレットなどを含み得る。特定の実施形態では、治療薬は、錠剤によって構成される単離された層で提供される。
【００５５】
あるいは、治療薬は、別個の組成物として、例えば別個の錠剤または溶液として投与され得る。１つ以上の活性薬剤は、他の活性薬剤（１つまたは複数）と同時に投与され得るか、または活性薬剤は間欠的に投与され得る。治療薬の投与間の時間の長さは、所望の治療効果を達成するように調整され得る。特定の場合には、１つ以上の治療薬は、他の治療薬（１つまたは複数）の投与のわずか数分（例えば約１、２、５、１０、３０、または６０分）後に投与され得る。あるいは、１つ以上の治療薬は、他の治療薬（１つまたは複数）の投与の数時間（例えば約２、４、６、１０、１２、２４、または３６時間）後に投与され得る。特定の実施形態では、残りの治療薬の投与との間に、１つ以上の治療薬の複数の投与量を投与することが有利な場合がある。例えば、ある治療薬は、他の治療薬（１つまたは複数）の投与の２時間後に投与され、次いで１０時間後に再び投与され得る。重要なことに、各有効成分の治療効果は、各治療薬の持続時間の少なくとも一部の間重複する必要があり、そのため、併用療法の全体的な治療効果は、一部には、併用療法の組合せ効果または相乗効果に起因する。
【００５６】
活性薬剤の投与量は、一般に、組合せの各薬剤の薬力学的特性、活性薬剤（１つまたは複数）の投与の様式および経路、治療される患者の健康、所望する治療の程度、併用療法がもしあれば、その性質と種類、および治療の頻度と所望の効果の性質を含む多くの因子に依存する。一般に、活性薬剤の投与量範囲は、多くの場合、１日あたり約０．００１〜約２５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。約７０ｋｇの体重を有する正常な成人の場合、約０．１〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の投与量が典型的には好ましい。しかしながら、治療される対象の年齢および体重、意図される投与経路、投与される特定の薬剤などに応じて、この一般的な投与量範囲にいくらかの変動性が必要とされ得る。２つ以上の異なる活性薬剤が併用療法で一緒に使用されるので、各薬剤の効力およびそれらを一緒に使用して達成される相互作用効果を考慮しなければならない。重要なことに、特定の哺乳動物の投与量範囲および最適投与量の決定もまた、本開示の恩恵を受ける当業者の能力の範囲内である。
【００５７】
特定の実施形態では、医薬の組合せは、第２の成分と比較して比較的大量の第１の成分を有することが有利であり得る。特定の場合には、第１の活性薬剤と第２の活性薬剤との比率は、約１００：１、９０：１、８０：１、７０：１、６０：１、５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１５：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、または５：１である。特定の実施形態では、医薬品のより均等な分布を有することが好ましい場合がある。特定の場合には、第１の活性薬剤と第２の活性薬剤との比率は、約４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、または１：４である。特定の実施形態では、医薬の組合せが、第１の成分と比較して比較的大量の第２の成分を有することが有利であり得る。特定の場合には、第２の活性薬剤と第１の活性薬剤との比率は、約３０：１、２０：１、１５：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、または５：１である。特定の場合には、第２の活性薬剤と第１の活性薬剤との比率は、約１００：１、９０：１、８０：１、７０：１、６０：１、５０：１、または４０：１である。重要なことに、第１の治療薬と第２の治療薬の上記で特定された組合せのいずれかを含む組成物は、１日あたり約１、２、３、４、５、６、もしくはそれ以上の回数の分割用量で、または所望の結果を達成するのに有効な放出速度を提供する形態で投与され得る。一実施形態では、剤形は、第１および第２の活性薬剤の両方を含む。一実施形態では、剤形は１日１回しか投与する必要がなく、剤形は第１および第２の活性薬剤の両方を含む。
【００５８】
例えば、ヒトへの静脈内投与を意図する製剤は、約０．１ｍｇ〜約５ｇの第１の治療薬および約０．１ｍｇ〜約５ｇの第２の治療薬を含んでよく、これらの両方が、全組成物の約５〜約９５％の範囲の適切で好都合な量の担体材料と配合される。単位投与量は、一般に、約０．５ｍｇ〜約１５００ｍｇの第１の治療薬および０．５ｍｇ〜約１５００ｍｇの第２の治療薬を含む。好ましい実施形態では、投与量は、約２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇ、または１０００ｍｇなど、最大で約１５００ｍｇの第１の治療薬である。好ましい実施形態では、投与量は、約２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇ、または１０００ｍｇなど、最大で約１５００ｍｇの第２の治療薬である。
【００５９】
投与量および間隔は、特定の活性部分（１つまたは複数）のそれぞれの調節作用または最小有効濃度（ＭＥＣ）を維持するのに十分な血漿レベルを提供するように、個体または群ベースで調整され得る。ＭＥＣは各化合物および個体によって異なるが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投与量は、個体の特性および投与経路によって異なる。しかし、ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを使用して血漿濃度を決定することができる。特定の実施形態では、用量を減少させ得る。特定の実施形態では、用量を増加させ得る。さらに、長期治療レジメンは、特定の化合物（１つまたは複数）に関して投与量を増加および減少させる交互の期間を含み得る。
【００６０】
相乗効果および増強
「相乗的」という用語は、任意の２つ以上の単剤の相加効果よりも有効である組合せを指す。相乗効果により、個々の療法のより低い量（用量）を使用して疾患の有効な治療が可能になる。より低い用量は、有効性を低下させることなく、より低い毒性をもたらす。さらに、相乗効果により、有効性が改善され得る。最後に、相乗効果により、単剤療法と比較して疾患の回避または軽減の改善がもたらされ得る。
【００６１】
併用療法は、いずれかの薬剤を単独で使用する場合に通常必要とされるよりも低い用量の第１の治療薬もしくは第２の治療薬（本明細書では「見かけの一方向の相乗効果」と呼ばれる）、またはより低い用量の両方の治療薬（「二方向の相乗効果」と呼ばれる）の生成物を可能にし得る。
【００６２】
併用療法は、いずれかの薬剤を単独で使用する場合に通常必要とされるよりも低い用量のいずれか１つの治療薬（本明細書では「見かけの一方向の相乗効果」と呼ばれる）、またはより低い用量のすべての治療薬の生成物を可能にし得る。
【００６３】
特定の実施形態では、１つ以上の治療薬と残りの治療薬（１つまたは複数）との間で示される相乗効果は、他の治療薬の投与量なしで投与された場合、治療薬の１つの投与量が治療量未満になるということである。
【００６４】
「増強」または「増強する」という用語は、化合物の１つが、患者に投与された別の化合物（１つまたは複数）の治療効果を増加または増強する組合せを指す。いくつかの場合には、増強は、特定の治療の有効性、忍容性、もしくは安全性、またはそれらの任意の組合せの改善をもたらすことができる。
【００６５】
特定の実施形態では、本発明は、１つ以上の治療薬の治療有効用量を、前記１つ以上の治療薬の治療効果を増強するのに有効な別の治療薬の用量と共に含む医薬組成物に関する。他の実施形態では、本発明は、１つ以上の治療薬の患者における治療効果を、別の治療薬を患者に投与することによって増強する方法に関する。
【００６６】
特定の好ましい実施形態では、本発明は、一部には、残りの治療薬（１つまたは複数）と一緒に治療効果をもたらすのに十分な量の１つ以上の治療薬の相乗的な組合せを対象とする。例えば、特定の実施形態では、１つ以上の治療薬の用量のみで得られる効果よりも少なくとも約２倍（または少なくとも約４、６、８、もしくは１０倍）大きい治療効果が達成される。特定の実施形態では、相乗的組合せは、１つ以上の治療薬の用量のみで得られる効果よりも最大で約２０、３０、または４０倍大きい治療効果を提供する。そのような実施形態では、相乗的組合せは、本明細書で「見かけの一方向の相乗効果」と呼ばれるものを示し、これは、残りの治療薬（１つまたは複数）の用量が１つ以上の治療薬の効果を相乗的に増強するが、１つ以上の治療薬の用量は残りの治療薬（１つまたは複数）の効果を有意に増強しないと思われることを意味する。
【００６７】
特定の実施形態では、活性薬剤の組合せは二方向の相乗効果を示し、これは、第２の治療薬が第１の治療薬の効果を増強し、第１の治療薬が第２の治療薬の効果を増強することを意味する。したがって、本発明の他の実施形態は、薬剤間の相乗効果によって各薬剤の用量が減少し、減少した用量の薬剤の組合せから得られる治療効果が増強される、第２の治療薬と第１の治療薬との組合せに関する。二方向の相乗効果は、第１の治療薬と第２の治療薬の効力比に起因して、実際の投与量では必ずしも容易に明らかになるとは限らない。例えば、一方の治療薬が他方の治療薬と比較してはるかに高い治療効力を示す場合、二方向の相乗効果を検出することは困難であり得る。
【００６８】
併用療法の相乗効果は、生物活性アッセイによって評価し得る。例えば、治療薬は、ＥＣ９０値に基づいてほぼ等効力の治療効果を与えるように設計されたモル比で混合される。次に、３つの異なるモル比を各組合せに使用して、相対的な効力の推定値の変動を可能にする。これらのモル比を、希釈系列全体を通して維持する。対応する単剤療法も、標準的な一次アッセイ形式を使用して併用療法と並行して評価する。併用療法の治療効果と単剤療法の治療効果の比較により、相乗効果の尺度が得られる。組合せ分析の設計についてのさらなる詳細は、Ｂ  Ｅ  Ｋｏｒｂａ（１９９６）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．２９：４９に見出すことができる。相乗効果、相加性、または拮抗作用の分析は、ＣａｌｃｕＳｙｎ（商標）プログラム（Ｂｉｏｓｏｆｔ，Ｉｎｃ．）を使用して前述のデータを分析することによって決定できる。このプログラムは、モンテカルロ統計パッケージを使用した統計的評価と組み合わせた、広く受け入れられているＣｈｏｕとＴａｌａｌａｙの方法を使用して薬物相互作用を評価する。データは、中央値効果と用量効果のプロット、アイソボログラム、および組合せ指数［ＣＩ］プロットを含むいくつかの異なる形式で標準偏差と共に表示される。後者の分析では、１．０より大きいＣＩは拮抗作用を表し、１．０未満のＣＩは相乗効果を示す。
【００６９】
本発明の組成物は、中等度から重度の疾患の症例からの緩和を得る機会を提示する。第１および第２の治療薬の本発明の組合せによって提供される相乗効果または相加効果または増強効果のために、治療薬のそれぞれの低減された投与量を使用することが可能であり得る。第１、第２、および第３の治療薬の本発明の組合せによって提供される相乗効果または相加効果または増強効果のために、治療薬のそれぞれの低減された投与量を使用することが可能であり得る。より少ない量の薬剤を使用することにより、それぞれに関連する副作用の数と程度を低減し得る。さらに、本発明の組合せは、一部の患者が特に敏感である副作用を回避する。
【００７０】
医薬組成物および製剤
特定の実施形態では、本発明はまた、薬学的に許容される担体と組み合わせて本明細書に記載される１つ以上の化合物を含む医薬組成物を提供する。好ましくは、これらの組成物は、経口、非経口、鼻腔内、舌下もしくは直腸投与のため、または吸入もしくは吹送による投与のために、錠剤、丸剤、カプセル、散剤、顆粒、滅菌非経口溶液もしくは懸濁液、定量エアロゾルもしくは液体スプレー、点滴剤、アンプル、自動注入装置または坐剤などの単位剤形である。化合物は、適切な量の薬物を連続的に送達するように設計された経皮パッチに組み込まれ得ることも想定される。
【００７１】
散剤および錠剤などの固体組成物を調製するために、主要有効成分を、薬学的に許容される担体、例えばトウモロコシデンプン、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガムなどの従来の錠剤化成分、および他の医薬希釈剤、例えば水と混合して、均質な混合物を含有する固体予備製剤組成物を形成する。これらの予備製剤組成物を均質であると呼ぶ場合、組成物が等しく有効な単位剤形に容易に細分され得るように、有効成分が組成物全体に均一に分散されていることを意味する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、乾燥粉末組成物は、肺への吸入のために微粉化される。例えば、その全体が、および特にその中に記載されている乾燥粉末クロモリン製剤に関して、参照により本明細書に明示的に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／０２６３２５７号参照。他の実施形態では、乾燥粉末組成物は、少なくとも１つの賦形剤をさらに含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの賦形剤は、ラクトース一水和物および／またはステアリン酸マグネシウムを含む。
【００７３】
本明細書で使用される「治療有効量」という語句は、医療処置に適用できる妥当な利益／リスク比で、少なくとも動物における細胞の亜集団において何らかの所望の治療効果を生み出すのに有効である本発明の組成物中の治療薬の量を意味する。
【００７４】
「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に見合った、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題および合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適した化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために本明細書で使用される。
【００７５】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という語句は、対象化合物を身体のある器官または部分から身体の別の器官または部分に運ぶまたは輸送することに関与する、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば潤滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸）、または溶媒封入材料などの薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤のその他の成分と適合性であり、患者に有害ではないという意味で「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体として機能することができる材料のいくつかの例には、以下が含まれる：（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；（２）コーンスターチおよび馬鈴薯デンプンなどのデンプン；（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）カカオバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；（９）落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質不含水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボナートおよび／またはポリ無水物；ならびに（２２）医薬製剤に使用される他の非毒性の適合性物質。
【００７６】
上記のように、本発明の組成物に見出される化合物の特定の実施形態は、アミノまたはアルキルアミノなどの塩基性官能基を含み得、したがって、薬学的に許容される酸と薬学的に許容される塩を形成することができる。この点で「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の組成物に含まれる化合物の比較的非毒性の無機および有機酸付加塩を指す。これらの塩は、投与ビヒクルまたは剤形製造過程においてｉｎ  ｓｉｔｕで、または遊離塩基形態の本発明の精製化合物を適切な有機酸または無機酸と別々に反応させ、こうして形成された塩をその後の精製中に単離することによって調製することができる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩などが含まれる。（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ”，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９参照）。
【００７７】
本発明の組成物が含む化合物の薬学的に許容される塩には、例えば非毒性の有機酸または無機酸からの、化合物の従来の非毒性塩または第四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、そのような従来の非毒性塩には、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、スルファミン酸塩、リン酸塩、硝酸塩などの無機酸に由来するもの；および酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、グリコール酸塩、ステアリン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、パルミチン酸塩、マレイン酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、フェニル酢酸塩、グルタミン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、スルファニル酸塩、２−アセトキシ安息香酸塩、フマル酸塩、トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンジスルホン酸塩、シュウ酸塩、イセチオン酸塩などの有機酸から調製される塩が含まれる。
【００７８】
他の場合には、本発明の組成物に含まれる化合物は、１つ以上の酸性官能基を含み得、したがって、薬学的に許容される塩基と薬学的に許容される塩を形成することができる。これらの場合の「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の比較的非毒性の無機および有機塩基付加塩を指す。これらの塩は、同様に、投与ビヒクルまたは剤形製造過程においてｉｎ  ｓｉｔｕで、または遊離酸形態の精製化合物を、薬学的に許容される金属カチオンの水酸化物、炭酸塩もしくは重炭酸塩などの適切な塩基、アンモニア、または薬学的に許容される有機第一級、第二級もしくは第三級アミンと別々に反応させることによって調製することができる。代表的なアルカリ塩またはアルカリ土類塩には、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、およびアルミニウム塩などが含まれる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが含まれる。（例えば、上記のＢｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．参照）。
【００７９】
ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの湿潤剤、乳化剤および潤滑剤、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味料、香味料および芳香剤、防腐剤および抗酸化剤もまた、組成物中に存在し得る。
【００８０】
薬学的に許容される抗酸化剤の例には、以下が含まれる：（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤。
【００８１】
本発明の製剤には、経口、経鼻、局所（口腔内および舌下を含む）、直腸、膣および／または非経口投与に適した製剤が含まれる。製剤は、単位剤形で好都合に提供され得、製薬分野で周知の任意の方法によって調製され得る。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、治療される宿主、特定の投与様式に応じて異なる。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に、治療効果を生じさせる化合物の量である。一般に、１００％のうち、この量は、有効成分の約０．１％〜約９９％、好ましくは約５％〜約７０％、最も好ましくは約１０％〜約３０％の範囲である。
【００８２】
これらの製剤または組成物を調製する方法は、２つ以上の活性化合物を担体、および任意で、１つ以上の副成分と組み合わせる工程を含む。一般に、製剤は、１つ以上の活性化合物を液体担体、または細かく分割された固体担体、またはその両方と均一かつ密接に組み合わせ、次に必要に応じて生成物を成形することによって調製される。
【００８３】
懸濁液は、活性化合物に加えて、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにそれらの混合物などの懸濁化剤を含み得る。
【００８４】
非経口投与に適した本発明の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される滅菌等張水溶液または非水溶液、分散液、懸濁液もしくは乳濁液、または使用の直前に滅菌注射液もしくは分散液に再構成され得る滅菌粉末と組み合わせた２つ以上の治療薬を含み、糖、アルコール、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁化剤もしくは増粘剤を含み得る。
【００８５】
本発明の医薬組成物に使用し得る適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング材料の生成物によって、分散液の場合は必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の生成物によって維持することができる。
【００８６】
これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤を含み得る。対象化合物に対する微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることによって確保し得る。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含めることも望ましい場合がある。さらに、注射可能な医薬品形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の含有によってもたらされ得る。
【００８７】
２つ以上の治療薬を含む組成物は、単独で、または他の治療薬と組み合わせて、従来の賦形剤、すなわち経口、非経口、経鼻、静脈内、皮下、経腸、または当技術分野で公知の他の適切な投与様式に適した、薬学的に許容される有機または無機担体物質との混合物として使用することができる。適切な薬学的に許容される担体には、水、塩溶液、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゲラート、ラクトース、アミロースまたはデンプンなどの炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらに限定されない。医薬製剤は、滅菌することができ、所望する場合は、補助剤、例えば潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧緩衝液に影響を与えるための塩、着色剤、香味料および／または芳香物質などと混合することができる。それらはまた、所望する場合は、他の活性薬剤、例えば他の鎮痛剤と組み合わせることができる。非経口適用には、油性溶液もしくは水溶液、ならびに坐剤を含む懸濁液、乳濁液、またはインプラントが特に適する。アンプルは便利な単位剤形である。経口適用には、錠剤、糖衣錠、液体、点滴剤、坐剤、またはカプセル、カプレットおよびゲルキャップが特に適する。経口使用を意図する組成物は、当技術分野で公知の任意の方法に従って調製され得、そのような組成物は、錠剤の製造に適した不活性で非毒性の医薬賦形剤からなる群より選択される１つ以上の薬剤を含み得る。そのような賦形剤には、例えばラクトースなどの不活性希釈剤；コーンスターチなどの造粒および崩壊剤；デンプンなどの結合剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤が含まれる。錠剤は、被覆されていなくてもよく、または口当たりの良さのためまたは有効成分の放出を遅らせるために公知の技術によって被覆されていてもよい。経口使用のための製剤はまた、有効成分が不活性希釈剤と混合されている硬質ゼラチンカプセルとして提示され得る。
【００８８】
水性懸濁液は、上記で特定された薬物の組合せを含み、その混合物は、懸濁化剤として適切な１つ以上の賦形剤、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの薬学的に許容される合成ゴムまたは天然ゴムを有する。油性懸濁液は、上記で特定された薬物の組合せを植物油または鉱油に懸濁することによって製剤化され得る。油性懸濁液は、蜜ろうまたはセチルアルコールなどの増粘剤を含み得る。シロップ、エリキシルなどが使用でき、甘味のあるビヒクルが用いられる。注射可能な懸濁液も調製され得、その場合、適切な液体担体、懸濁化剤などが使用され得る。活性化合物を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥化合物を、例えば注射用製品の調製のために使用することも可能である。
【００８９】
併用療法の一態様は、有効量または治療量未満の量の１つ以上の治療薬を投与すること、および残りの治療薬（１つまたは複数）を、前記１つ以上の治療薬によって提供される治療効果を増強するのに有効な量で投与することを含む、ヒトにおける有効な治療的処置を提供するための方法に関する。治療薬は、治療薬の投与間隔（または治療効果）が重複する限り、同時にまたは異なる時間に投与することができる。言い換えれば、本発明の方法によれば、特定の好ましい実施形態では、治療薬は、互いに同じ剤形で投与される必要はなく、さらには同じ投与経路によって投与される必要さえない。むしろ、この方法は、治療有効レベルの１つ以上の治療薬がヒトに投与され、前記治療薬（１つまたは複数）の前もしくは投与間隔の間またはヒトが治療効果を経験している間に、元の１つ以上の治療薬の治療効果を増強するために有効量の他の治療薬（１つまたは複数）が投与される場合に、ヒトで得られる驚くべき相乗的および／または相加的利益を対象とする。
【００９０】
注射可能なデポ形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマーにおいて対象化合物のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製される。ポリマーに対する薬物の比率、および使用される特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が含まれる。デポ注射用製剤はまた、体組織と適合性であるリポソームまたはマイクロエマルジョンに薬物を閉じ込めることによって調製される。
【００９１】
本発明の製剤は、経口的、非経口的、局所的、または経直腸的に投与され得る。それらは、言うまでもなく各投与経路に適した形態で投与される。
【００９２】
本明細書で使用される「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与様式を意味し、限定されることなく、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内および胸骨内注射および注入を含む。皮下投与が好ましい。
【００９３】
本明細書で使用される「全身投与」、「全身的に投与される」、「末梢投与」および「末梢的に投与される」という語句は、患者の系に入り、したがって代謝および他の同様の過程に供されるように、中枢神経系への直接投与以外の化合物、薬物または他の物質の投与、例えば皮下投与を意味する。
【００９４】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に対する毒性を伴わずに、特定の患者、組成物、および投与様式について所望の治療応答を達成するのに有効な有効成分の量が得られるように変化させ得る。
【００９５】
選択される投与量レベルは、使用される本発明の特定の化合物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄または代謝の速度、吸収の速度および程度、治療の期間、使用される特定の化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康および以前の病歴、ならびに医療分野で周知の同様の因子を含む様々な因子に依存する。
【００９６】
当技術分野における通常の技術を有する医師または獣医は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師または獣医は、医薬組成物に使用される活性化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることができる。
【００９７】
本発明の活性化合物を単独で投与することは可能であるが、前記化合物を医薬製剤（組成物）として投与することが好ましい。
【００９８】
この治療を受ける患者は、霊長動物、特にヒト、ならびにウマ、ウシ、ブタおよびヒツジなどの他の哺乳動物、ならびに家禽およびペット全般を含む、治療を必要とする任意の動物である。
【００９９】
特定の実施形態では、本発明は、第１の化合物を含む治療有効量の医薬組成物と、第２の化合物を含む治療有効量の医薬組成物とを同時投与することを含む、疾患または状態の治療を必要とする対象において疾患または状態を治療する方法に関する。特定の実施形態では、疾患または状態は、ニューロンの炎症状態である。
【０１００】
特定の実施形態では、本発明は、第１の化合物を含む治療有効量の第１の医薬組成物と、第２の化合物を含む治療有効量の第２の医薬組成物とを同時投与することを含む、疾患または状態の進行を遅らせることを必要とする対象において疾患または状態の進行を遅らせる方法に関する。特定の実施形態では、疾患または状態は、ニューロンの炎症状態である。
【０１０１】
特定の実施形態では、第１の化合物は、以下の式（Ｉ）：
【０１０２】
【化３】
2021521122.tif 000004
【０１０３】
［式中、
Ｘはハロゲン化物、ヒドロキシル、またはＯＣＯ（Ｃ１−８アルキル）であり；
ＹはＣＯ２Ｒ１またはＣＨ２ＯＲ２であり；
Ｒ１は、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｈ、Ｃ１−３アルキル、または−ＣＨ２ＣＯ２（Ｃ１−５アルキル）であり；
Ｒ２はＨまたは−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−３アルキル）である］
を有する。
特定の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩に関する。
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、
【０１０４】
【化４】
2021521122.tif 000005
【０１０５】
またはその薬学的に許容される塩から選択される。
【０１０６】
特定の実施形態では、第１の化合物は、ビトルテロール、フェノテロール、イソプレナリン、レボサルブタモール、オルシプレナリン、ピルブテロール、プロカテロール、リトドリン、サルブタモール、テルブタリン、アルホルモテロール、バンブテロール、クレンブテロール、ホルモテロール、サルメテロール、アベジテロール、カルモテロール、インダカテロール、オロダテロール、ビランテロール、ネドクロミル、ケトチフェン、オロパタジン、オマリズマブ、ケルセチン、メポリズマブ、アゼラスチン、メチルキサンチン、ペミロラスト、オロパタジン、アルファトキシンＧ１、アルファトキシンＢ１、アルファトキシンＭ１、デオキシニバレノール、ゼアラレノン、オクラトキシンＡ、フモニシンＢ１、加水分解フモニシンＢ１、パツリン、およびエルゴタミンから選択される。
【０１０７】
特定の実施形態では、第１の化合物は、以下の化合物：
【０１０８】
【化５】
2021521122.tif 000006
【０１０９】
またはその薬学的に許容される塩から選択される。特定の実施形態では、第１の化合物は、エダラボンおよびリルゾールから選択される。
【０１１０】
特定の実施形態では、第２の化合物は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）から選択される。
【０１１１】
特定の実施形態では、第２の化合物は、アセチルサリチル酸、ジフルニサル、サルサラート、イブプロフェン、デクスイブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、デクスケトプロフェン、フルルビプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン、インドメタシン、トルメチン、スリンダク、エトドラク、ケトロラク、ジクロフェナク、ナブメトン、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸、セレコキシブ、リコフェロン、ハイパーフォリン、およびフィグワートから選択される。
【０１１２】
特定の実施形態では、第２の化合物は、ＴＲＥＭ２などの抗炎症性遺伝子タンパク質からトランケートされた抗炎症性低分子ペプチドから選択される。
【０１１３】
特定の実施形態では、本発明は、「第１の化合物」と称される化合物の複数の医薬組成物と、任意で、「第２の化合物」と称される化合物の複数の医薬組成物とを同時投与することを含む方法に関する。例えば、式（Ｉ）の化合物を含む組成物は、エダラボンを含む組成物と同時投与することができる。あるいは、式（Ｉ）の化合物を含む組成物は、リルゾールを含む組成物と同時投与することができる。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物を含む組成物は、リルゾールを含む組成物、およびイブプロフェンまたはメロキシカムなどのＮＳＡＩＤを含む組成物と同時投与することができる。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物を含む組成物は、エダラボンを含む組成物、およびイブプロフェンまたはメロキシカムなどのＮＳＡＩＤを含む組成物と同時投与することができる。
【０１１４】
特定の実施形態では、ニューロンの炎症状態は、ＡＬＳ、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、虚血性脳卒中、またはプリオン病である。例えば、ニューロンの炎症状態はＡＬＳである。あるいは、ニューロンの炎症状態はプリオン病である。
【０１１５】
特定の実施形態では、特許請求される方法は、脳幹および／または脊髄に位置するニューロン、ニューロン、または身体の随意筋に影響を及ぼす運動ニューロンに対するニューロン損傷の減速をもたらす。
【０１１６】
特定の実施形態では、特許請求される方法は、脳幹および／または脊髄に位置するニューロン、ニューロン、または身体の随意筋に影響を及ぼす運動ニューロンに対する損傷の停止をもたらす。
【０１１７】
特定の実施形態では、化合物または組成物は、皮下、静脈内、腹腔内、吸入、経口、または経皮によって投与される。例えば、組成物は皮下投与される。あるいは、組成物は静脈内投与される。
【０１１８】
特定の実施形態では、化合物または組成物は、薬物がＭ１からＭ２への変換因子として作用することを可能にする血液、脳、およびＣＳＦ濃度をもたらすように特別に調整された用量で投与される。
【０１１９】
特定の実施形態では、特許請求される方法は、運動ニューロンを制御し、ＡＬＳ発現に影響を及ぼす脳領域に関連する身体機能の改善または症状の軽減をもたらす。特定の実施形態では、特許請求される方法は、ＡＬＳに罹患している患者の気分および社会的行動の改善をもたらす。
【実施例】
【０１２０】
方法
化学物質
クロモリンナトリウムはＡＺＴｈｅｒａｐｉｅｓから提供され、これをＰＢＳに溶解した。インビボ実験には１００ｍＭ溶液を使用した。ダルベッコのＰＢＳを使用して、腹腔内注射用の溶液を前述のように６．３ｍｇ／ｋｇの最終用量に希釈した。
【０１２１】
動物
この試験では１４９匹のマウスを使用した。すべての動物の世話、飼育および実験は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅによって設定されたガイドラインに従って実施した。これらの実験は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された（２０１４Ｎ００００１８）。すべてのマウスが餌と水を自由に摂取できるようにした。マウスを運動障害について定期的に評価し、前述のように苦痛を最小限に抑えるために主要な麻痺（神経学的スコア＝４、以下の神経学的スコア参照）の発症時に安楽死させた。軽度の麻痺（神経学的スコア＝２）を示したマウスには、長いシッパーチューブとヒドロゲルを備えたウォータボトルを与えた。この試験で使用したエンドポイントは、ＡＬＳ  ＴＤＩによって以前に報告された基準、１５秒以内に自己回復する能力の喪失（神経学的スコア＝４）、またはケージの床の餌に到達するための移動が不可能であることに基づいた。人道的なエンドポイントに達したマウスは、３時間以内に安楽死させた。
【０１２２】
ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス：
Ｂ６ＳＪＬ−Ｔｇ（ＳＯＤ１  Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニック雄性マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し、Ｃ５７ＢＬ／６雌性マウスと交配させて、野生型（Ｗｔ）ＳＯＤ１および変異型トランスジェニック（Ｔｇ）ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ発現マウスを得た。マウスの遺伝子型を決定するために、出生後２８〜４０日目に取得した尾生検からＲＮＡ抽出および相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）合成を行い、続いて変異型Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１遺伝子のプライマ（ＧＧＧＡＡＧＣＴＧＴＴＧＴＣＣＣＡＡＧおよびＣＡＡＧＧＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＧＡＧＡＧＣ）を使用した定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。以下に説明するように、年齢と同腹仔の両方が一致するＷｔＳＯＤ１およびＴｇＳＯＤ１の雄性および雌性のマウスをすべての試験に使用した。
【０１２３】
行動
すべての行動評価、データ収集、および分析は、実験条件（すなわち遺伝子型および治療）を知らされていない治験責任医師によって実施された。
【０１２４】
歩行分析
手動の歩行分析は、以前の試験と同様の四肢ペインティング手順を用いて実施した。簡単に言うと、マウスを最初に、ホームケージに直接つながる水平な廊下を横断するように、適切な方向に穏やかに微調整することによって訓練した。試験日に、非毒性の食用色素（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブラッシングして後肢の底部を塗り、マウスを一枚の紙の上でホームケージへの道を歩かせた。各実験時点（Ｐ７０、Ｐ９０、Ｐ１１０、Ｐ１３０、Ｐ１５０）で３回の試行を行った。歩幅と歩隔を、２つの連続する足跡において、足跡のボールマウント領域で同じポイント間の距離を測定することによって決定し、２〜３の後肢の歩幅から計算した。３回の試行にわたる４〜６の歩幅の平均データを計算した。
【０１２５】
ロータロッド
前述のように、マウスを固定速度（１６ｒｐｍ）の回転ロッド（３．０ｃｍ）（Ｒｏｔａｍｅｘ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）上に置いた。マウスを、Ｐ４０で１回、ロータロッド上に１８０秒間留まるように訓練した。各実験時点（Ｐ７０、Ｐ９０、Ｐ１１０、Ｐ１３０、Ｐ１５０）について、マウスが回転ロッド上で費やした時間を最大１８０秒まで計算した。各時点で３回の試行を実施し、各セッションの最大値を分析に使用した。
【０１２６】
足グリップ持久力試験（ＰａＧＥ）
ＰａＧＥ試験を前述のように実施した。簡単に言うと、逆さにして、開いたケージの底から約４５ｃｍ上に保持した従来のハウジングケージのワイヤの蓋の上にマウスを置いた。実験時点（Ｐ７０、Ｐ９０、Ｐ１１０、Ｐ１３０、Ｐ１５０）について、グリッド上で費やされた時間（落下する前）を最大値９０秒まで記録した。３つの個別の試行からの最大値を分析に使用した。
【０１２７】
体重および神経学的スコア
Ｐ５０から開始して、体重と神経学的スコア（ＡＬＳ  ＴＤＩ基準を使用）（Ｈａｔｚｉｐｅｔｒｏｓ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）“Ａ  Ｑｕｉｃｋ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ＡＬＳ．”  Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ（１０４）；Ｌｅｉｔｎｅｒ  Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．（２００９）“Ｗｏｒｋｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ＡＬＳ  ｍｉｃｅ：Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｅｓｔｉｎｇ＆ｃｏｌｏｎｙ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．”  Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．）を、死亡または安楽死まで５日ごとに各マウスについて記録した。ＡＬＳＴＤＩ基準は次のとおりである：
スコア０：マウスを尾で吊り下げたときに外側正中線からの後肢の完全な伸長、および２〜３回吊り下げて、マウスがこれを２秒間保持することができる。
スコア１：尾の吊り下げの間に、外側正中線の方向への肢伸長の虚脱もしくは部分的虚脱（衰弱）または後肢の震え。
スコア２：１２インチの歩行の間に趾が少なくとも２回下に曲がるか、または肢の一部がケージの底／テーブルに沿って引きずられる。
スコア３：硬直した麻痺または最小限の関節の動き、足は前進運動を行うために使用されない。
スコア４：マウスをどちらかの側に置いた後１５秒以内に、マウスは直立することができない。
＊スコア４を得た時点でマウスを安楽死させた。
【０１２８】
組織解剖
神経学的スコアが４に達した時点で、ＴｇＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスから組織を解剖した。緩やかな流れのＣＯ２（チャンバー容量の１０〜３０％／分）を投与し、続いて直ちに断頭することによってマウスを犠死させた。脳、腓腹筋、および前脛骨筋組織を取り出し、ドライアイスで凍結した。脊髄を取り除き、液体窒素のガス副産物中に穏やかに押し下げることによって凍結し、腰部と非腰部に解剖した。すべての組織を使用前に−８０°Ｃで保存した。さらに、尾の試料を抽出して、マウスの遺伝子型決定のために２回目の確認ｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。尾の試料は、使用するまで−２０°Ｃで保存した。
【０１２９】
運動ニューロンの定量化
腰髄の縦断切片（１０μｍ）を新鮮な凍結組織から切り取った。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、前述のように組織切片で実施した。前角を含む領域内で、すべての運動ニューロンを、前角内の運動ニューロン密度が最も高い領域をカバーするために、動物あたり３つの個別切片（それぞれ２０〜３０μｍ離れている）について計数する。すべての計数は、遺伝子型を知らされていない個人によって行われた。Ｚｅｉｓｓ顕微鏡の２０倍対物レンズ（０．８  ＮＡ）を使用して画像を取得し、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ画像解析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で処理した。
【０１３０】
Ｉｂａ１免疫組織化学５１６分析
凍結した脊髄切片を４％ＰＦＡ／ＰＢＳで７２時間固定し、ＰＢＳ中の３０％スクロースで脱水した。切片をＰＢＳで３回（各５分）洗浄し、ＰＢＳ中の３％Ｈ２Ｏ２と共に１５分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼをクエンチした。続いて切片をＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中の５％（ｖ／ｖ）正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用してブロックした。Ｉｂａ１に対する一次抗体（ウサギポリクローナル、１：４００、Ｗａｋｏ、Ｎｏ．０１９−１９７４１）を、２．５％（ｖ／ｖ）正常ヤギ血清、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む緩衝液で希釈し、４°Ｃで一晩インキュベートした。翌日、試料をＰＢＳで３回（各１０分）洗浄した。ビオチン化二次抗体（１：２００）およびＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ＨＲＰキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して一次抗体を検出し、供給者の指示に従ってＤＡＢ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で展開した。切片を一連の段階的エタノールで脱水し、キシレンで透明にし、Ｃｙｔｏｓｅａｌ−ＸＹＬキシレンベースの封入剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共にカバーガラスをかけた。光学顕微鏡（ＴＥ３６０  Ｅｃｌｉｐｓｅ；Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）を使用して１０倍の倍率で切片を画像化した。Ｉｂａ１陽性細胞面積（Ｉｂａ１陽性細胞が占める面積を総面積で割ったもの）を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｖｏｘｅｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ  ｐｌｕｇｉｎ，ＮＩＨ，ＵＳＡ）を使用して各脊髄切片について定量化した。マウスあたり２〜３の切片を分析した。各切片からの値を平均して、各動物についての平均値を得た。
【０１３１】
Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙのマルチスポットサイトカインアッセイ
脊髄凍結組織を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｏ．７８４３０）を添加した氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｏ．８９９０）でホモジナイズした。ＯｐｔｉｍａＴＬ超遠心機とＴＬＡ１２０．２ロータ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、試料を４５，０００ｇ、４°Ｃで３０分間遠心分離した。電気化学発光ベースのマルチアレイ法およびＭＥＳＯ  Ｑｕｉｃｋｐｌｅｘ  ＳＱ  １２０システム（ＭＳＤ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して、脊髄組織に由来する上清中または血漿中の１０種類の炎症性サイトカインおよびケモカインの発現レベルを評価した。９６ウェルのＶ−ＰＬＥＸ  Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｍｏｕｓｅ  １キット（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｎｏ．Ｋ１５０４８Ｄ）を使用して、製造者の指示に従ってＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ１／ＫＣ／ＧＲＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ｐ７０、およびＴＮＦαを同時に測定した。簡単に言うと、試料をキャリブレータで希釈し、サイトカイン捕捉抗体のアレイで被覆したプレートに添加した。試料をプレート内で室温にて振とうしながら２時間インキュベートし、続いてキットで提供される洗浄緩衝液で洗浄した。検出抗体溶液を各ウェルに添加し、プレートを２時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、２×読み取り緩衝液Ｔを添加した。シグナルをＭＥＳＯ  ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ  ＳＱ  １２０機器で直ちに測定し、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  ＷＯＲＫＢＥＮＣＨ  ４．０ソフトウェア（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して分析した。上清または血漿試料中のタンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。グラフの値は、対応するタンパク質濃度に正規化したサイトカインのレベルを表す。
【０１３２】
ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１  ＥＬＩＳＡアッセイ
脊髄組織をホモジナイズし、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙサイトカインアッセイに関する章に記載されているように上清を得た。９６ウェルのＭｏｕｓｅ  ＣＣＬ２／ＪＥ／ＭＣＰ−１  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｏ．ＭＪＥ００Ｂ）を使用して、製造者の指示に従って脊髄組織から生成された上清または血漿中でＭＣＰ−１レベルを測定した。簡単に言うと、試料および希釈した標準品を、ＭＣＰ−１特異的抗体で被覆したプレートに添加した。試料をプレート内で室温にてシェーカ上で２時間インキュベートし、続いてキットで提供される洗浄緩衝液で洗浄した。その後、ＭＣＰ−１に対するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体を各ウェルに添加し、シェーカ上で室温にて２時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、基質溶液と共に室温で３０分間インキュベートした。次に、停止溶液を添加し、マイクロプレートリーダ（Ｓｙｎｅｒｇｙ  ２，Ｂｉｏｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）でシグナルを読み取った。光学密度を４０５ｎｍで測定し、５４０ｎｍで測定した光学密度で補正した。試料中のＭＣＰ−１レベルを、ＭＣＰ−１標準曲線に基づいて計算した。上清中のタンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定した。グラフの値は、対応するタンパク質濃度に正規化したＭＣＰ−１のレベルを表す。
【０１３３】
ＧＰＲ３５ウェスタンブロット
以前に記載されているように（Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）ウェスタンブロットを実施した。簡単に言うと、マウス脊髄タンパク質７５μｇを試料緩衝液に再懸濁し、９５℃で５分間煮沸し、１０〜２０％トリシンゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分画し、次いでＴｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳＴ）を含むトリス緩衝生理食塩水中の５％乳で膜をブロックした後、ＧＰＲ３５（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ；ＮＢＰ２−２４６４０）およびβ−アクチン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ；４９６７Ｓ）に特異的な抗体で免疫検出した。一次抗体を一晩インキュベートし、続いてＴＢＳＴで４回洗浄（１５分、室温）した後、二次抗体（ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ；およびＨＲＰ結合ヤギ抗−マウス  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）と共に１時間インキュベートした。ＴＢＳＴで４回洗浄（１５分、室温）した後、ＥＣＬ検出システム（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用してタンパク質を可視化した。ＧＰＲ３５の総密度値（ＩＤＶ）をβ−アクチンに正規化した。
【０１３４】
ＧＰＲ３５免疫蛍光
凍結したマウス腰髄を１０μｍの切片にし、前述の方法を使用して染色した。組織切片を４％パラホルムアルデヒドで固定し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、５％ＢＳＡ、および正常ヤギ血清の混合物でブロックした。ＧＰＲ３５（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ；ＮＢＰ２−２４６４０）およびＮｅｕＮ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ；ＭＡＢ３７７）に特異的な抗体を使用して、４℃で一晩共染色を行った。ＰＢＳで３回洗浄した後、切片をＣｙ３結合ヤギ抗マウス抗体およびＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）と共にインキュベートした。１０の２０倍視野を各切片から画像化し、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＩｍａｇｅＪ）のオープンソースソフトウェアを使用して分析した。
【０１３５】
統計
本文中のデータは中央値として提示している。中央値を表す中央線、四分位範囲を表すエッジ、および１０〜９０パーセンタイルを表すひげを用いて母集団データをグラフ表示するために、箱ひげ図を使用する。データを、中央値±四分位範囲またはパーセント値としても表す。標本サイズは図の凡例に含まれる。無関係な試料についての比較は、有意レベル（α）０．０５で、二元配置分散分析とそれに続くテューキーもしくはシダックの多重比較検定、または一元配置分散分析とそれに続くテューキーの多重比較事後検定を使用して実施した。ｐ＜０．０５および＞０．００００１について、正確なＰ値（両側）を報告する。
【０１３６】
試験の承認
すべての動物実験は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（２０１４Ｎ００００１８）によって承認された。
【０１３７】
結果
１４９匹の雄性および雌性の年齢と同腹子が一致するトランスジェニック（Ｔｇ）ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスおよび野生型（Ｗｔ）ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスを次の内訳で使用した：雌性（ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル１９匹、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン１７匹、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル１９匹、およびＴｇＳＯＤ１−クロモリン１７匹）ならびに雄性（ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル１８匹、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン２１匹、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル２１匹、ＴｇＳＯＤ１−クロモリン１７匹）。マウスに、Ｐ６０から開始して安楽死まで週５日、ビヒクルまたはクロモリンナトリウム（６．３ｍｇ／ｋｇ、９６ｉ．ｐ．）のいずれかを１日１回注射した。
【０１３８】
クロモリンナトリウム治療はＴｇＳＯＤ１マウスの体重を変化させない
最初に、クロモリンナトリウム処置が体重に及ぼす影響を各群で評価した。二元配置分散分析により、体重への年齢［Ｆ（９、１１４３）＝１０．５８、ｐ＜０．０００１］、処置［Ｆ（３、１１４３）＝４７．９９、ｐ＜０．０００１］、および年齢×処置の相互作用効果［Ｆ（２７、１１４３）＝４．５７８、ｐ＜０．０００１］の有意な影響が明らかになった。テューキーの多重比較検定により、Ｐ１００、Ｐ１１０、Ｐ１２０、Ｐ１３０、Ｐ１４０、およびＰ１５０で、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリンの両方と比較してＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群で体重の有意な減少があったことが明らかになった（図１Ａ〜図１Ｃ）。Ｐ１００、Ｐ１１０、Ｐ１２０、Ｐ１３０、Ｐ１４０、およびＰ１５０では、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群でも体重が有意に減少した。Ｐ１２０、Ｐ１３０、およびＰ１４０のみで、ＴｇＳＯＤ１−クロモリン群とＷｔＳＯＤ１−ビヒクル群の間で体重に有意差があった。重要なことに、Ｐ１３０でＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群では体重の有意な改善があり、クロモリン処置がこの時点で処置マウスの体重減少を遅らせたことを示唆した（図１Ａ）。また、雌性と雄性のマウスの体重に対する処置の影響を別々に評価した。二元配置分散分析により、雌性マウスの体重への年齢［Ｆ（９、５２４）＝５．６８６、ｐ＜０．０００１］、処置［Ｆ（３、５２４）＝１３．７６、ｐ＜０．０００１］、および年齢×処置の相互作用効果［Ｆ（２７、５２４）＝４．５７８、ｐ＜０．０００１］の有意な影響が明らかになった。テューキーの多重比較検定により、Ｐ１２０およびＰ１３０で、野生型群と比較してＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群では体重が有意に減少したことが明らかになった（図１Ｂ）。Ｐ１３０、Ｐ１４０、およびＰ１５０では、野生型群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群でも体重が有意に減少した。雄性マウスでの二元配置分散分析により、雄性マウスの体重への年齢［Ｆ（８、５４９）＝７．１１、ｐ＜０．０００１］、処置［Ｆ（３、５４９）＝５８．４８、ｐ＜０．０００１］、および年齢×処置の相互作用効果［Ｆ（２４、５４９）＝３．６２３、ｐ＜０．０００１］の有意な影響が明らかになった。テューキーの多重比較検定により、Ｐ９０、Ｐ１００、Ｐ１１０、Ｐ１２０、Ｐ１３０、およびＰ１４０で、野生型群と比較してＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群では体重が有意に減少したことが明らかになった（図１Ｃ）。Ｐ９０、Ｐ１００、Ｐ１１０、Ｐ１２０、およびＰ１３０では、野生型群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群でも体重が有意に減少した（図１Ｃ）。したがって、クロモリン処置は、有意な改善が観察されたＰ１３０を除いて、ＴｇＳＯＤ１マウスの体重に影響を及ぼさなかった。
【０１３９】
クロモリンナトリウム処置は、ＴｇＳＯＤ１マウスの神経学的スコアを改善し、疾患の発症を遅らせた
次に、クロモリンナトリウム処置後の神経学的スコアの変化を評価した。二元配置分散分析により、神経学的スコアへの年齢［Ｆ（９、５４８）＝１７２．３、ｐ＜０．０００１］、処置［Ｆ（１、５４８）＝３５．３２、ｐ＜０．０００１］、および有意な年齢×処置相互作用［Ｆ（９、５４８）＝４．７３９、ｐ＜０．０００１］の有意な影響が明らかになった。テューキーの事後分析により、Ｐ９０、Ｐ１００、Ｐ１１０、Ｐ１３０、およびＰ１４０で、ＴｇＳＯＤ１−クロモリン群と比較してＴｇＳＯＤ１−ビヒクル処置群での神経学的スコアの有意な増加が明らかになり、クロモリン処置が疾患の発症および進行を有意に遅らせたことを示唆した（図２Ａ）。二元配置分散分析により、雌性マウスの神経学的スコアへの年齢［Ｆ（９、２６９）＝９１．８３、ｐ＜０．０００１］、処置［Ｆ（１、２６９）＝３１．９９、ｐ＜０．０００１］、および有意な年齢×処置相互作用［Ｆ（９、２６９）＝３．１７５、ｐ＜０．００１２］の有意な影響が明らかになった。テューキーの事後分析により、Ｐ９０、Ｐ１００、Ｐ１２０、Ｐ１３０、およびＰ１４０で、ＴｇＳＯＤ１−クロモリン群と比較して雌性ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル処置群での神経学的スコアの有意な増加が明らかになった（図２Ｂ）。雌性マウスと同様に、二元配置分散分析により、雄性マウスの神経学的スコアへの年齢［Ｆ（８、２６０）＝９６．８１、ｐ＜０．０００１］、処置［Ｆ（１、２６０）＝１５．９９、ｐ＜０．０００１］、および有意な年齢×処置相互作用［Ｆ（８、２６０）＝３．８０１、ｐ＝０．０００３］の有意な影響が明らかになった。テューキーの事後分析により、Ｐ９０、Ｐ１００、およびＰ１１０で、ＴｇＳＯＤ１−クロモリン群と比較して雄性ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル処置群での神経学的スコアの有意な増加が明らかになった（図２Ｃ）。これらの所見は、クロモリン処置がＴｇＳＯＤ１マウスの発症および進行を遅らせたことを示唆する。
【０１４０】
クロモリンナトリウム処置は、ＰＡＧＥタスクの成績を改善したが、ロータロッドまたは歩行成績を変化させなかった
クロモリンナトリウム処置の影響を、足グリップ持久力（ＰａＧＥ）タスクを使用して筋力の変化についても評価した。二元配置分散分析により、ＰａＧＥに対する年齢［Ｆ（４、４９２）＝３１．７３、ｐ＜０．０００１］、処置［Ｆ（３、４９２）＝４８．４９、ｐ＜０．０００１］、および有意な年齢×処置相互作用［Ｆ（１２、４９２）＝１０．８９、ｐ＜０．０００１］の有意な影響が明らかになった（図３Ａ）。テューキーの事後分析により、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリン群と比較して、Ｐ８０、Ｐ１００、Ｐ１２０、およびＰ１４０でＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群におけるＰａＧＥの有意な低下が明らかになった（図３Ａ）。さらに、Ｐ１００とＰ１２０で、両方の野生型群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群ではＰａＧＥの成績が有意に低下した。重要なことに、Ｐ１２０およびＰ１４０で、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリンにおけるＰａＧＥ成績の有意な改善があった（図３Ａ）。同様に、二元配置分散分析により、雌性マウスにおけるＰａＧＥへの年齢［Ｆ（４、２７４）＝４１．１４、ｐ＜０．０００１］、処置［Ｆ（３、２７４）＝５３．４１、ｐ＜０．０００１］、および有意な年齢×処置相互作用［Ｆ（１２、２７４）＝１６．２、ｐ＜０．０００１］の有意な影響が明らかになった（図３Ｂ）。テューキーの事後分析により、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリン群と比較して、Ｐ１２０およびＰ１４０でＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群でのＰａＧＥ成績の有意な低下が明らかになった（図３Ｂ）。さらに、Ｐ１００とＰ１２０で、両方の野生型群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群ではＰａＧＥの成績が有意に低下した。重要なことに、Ｐ１００でＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＴｇＳＯＤ１−クロモリンの間には統計的な有意差があり、クロモリン処置群はＰａＧＥ成績のより大きな低下を示し、処置群ではＰ１４０で有意な改善が明らかになった（図３Ｂ）。雄性マウスにおいて、二元配置分散分析により、ＰａＧＥへの年齢［Ｆ（３、２０８）＝１３．３４、ｐ＜０．０００１］、処置［Ｆ（３、２０８）＝４８、ｐ＜０．０００１］、および有意な年齢×処置相互作用［Ｆ（９、２０８）＝５．８２８、ｐ＜０．０００１］の有意な影響が明らかになった（図３Ｃ）。テューキーの事後分析により、Ｐ８０、Ｐ１００、およびＰ１２０で、両方の野生型群と比較してＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群におけるＰａＧＥの有意な低下が明らかになった。Ｐ１００とＰ１２０で、両方の野生型群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群ではＰａＧＥが有意に低下した。重要なことに、２つの雄性トランスジェニック群間に、Ｐ１２０でＰａＧＥの有意な改善があった（図３Ｃ）。したがって、クロモリン処置は、ビヒクルで処置されたＴｇＳＯＤ１群と比較して、クロモリンで処置されたＴｇＳＯＤ１マウスにおけるＰａＧＥ成績を改善した。
【０１４１】
ロータロッド試験を使用して運動協調性を評価した。二元配置分散分析により、年齢［Ｆ（２、３６１）＝３４．４９、ｐ＜０．０００１］および処置［Ｆ（３、３６１）＝４２．２５、ｐ＜０．０００１］の有意な影響が明らかになった。しかし、ロータロッドの成績への有意な年齢×処置相互作用はなかった［Ｆ（６、３６１）＝０．７０４、ｐ＝０．６４６］。テューキーの事後分析により、Ｐ７０、Ｐ９０、Ｐ１２０で、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリンの両方との間の有意差が明らかになった（図４Ａ）。同様に、事後分析により、すべての時点で、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリンと比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群におけるロータロッドの成績の有意な低下が明らかになった（図４Ａ）。しかし、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルマウスとＴｇＳＯＤ１−クロモリンマウスの間でロータロッドの成績に差はなかった。雌性マウスにおいて、二元配置分散分析により、年齢［Ｆ（２、１７６）＝１９．０４、ｐ＜０．０００１］および処置［Ｆ（３、１７６）＝１４．４８、ｐ＜０．０００１］の有意な影響が明らかになった。しかし、ロータロッドの成績への有意な年齢×処置相互作用はなかった［Ｆ（６、１７６）＝０．４９８、ｐ＝０．８０８６］。テューキーの事後分析により、Ｐ７０、Ｐ９０、およびＰ１２０で、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリンの両方との間の有意差が明らかになった（図４Ｂ）。同様に、事後分析により、すべての時点で、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリンと比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群におけるロータロッドの成績の有意な低下が明らかになった（図４Ｂ）。雄性マウスにおいて、二元配置分散分析により、年齢［Ｆ（２、１６９）＝９．９７、ｐ＜０．０００１］および処置［Ｆ（３、１６９）＝２８．１５、ｐ＜０．０００１］の有意な影響が明らかになった。しかし、ロータロッドの成績への有意な年齢×処置の相互作用はなかった［Ｆ（６、１６９）＝０．５６１、ｐ＝０．７６０４］。テューキーの事後分析により、雄性処置マウスにおいてＰ７０、Ｐ９０およびＰ１２０で、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルとＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリンの両方との間の有意差が明らかになった（図４Ｃ）。同様に、事後分析により、すべての時点で、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリンと比較して雄性ＴｇＳＯＤ１−クロモリン群におけるロータロッドの成績の有意な低下が明らかになった（図４Ｃ）。これらのデータは、クロモリン処置がＴｇＳＯＤ１マウスのロータロッドの成績を変化させなかったことを示す。
【０１４２】
クロモリン処置の影響を、歩幅と歩隔を測定することによって歩行成績についても評価した。二元配置分散分析により、すべての群で歩幅に対する年齢［Ｆ（２、４０３）＝６２．７８、ｐ＜０．０００１］、処置［Ｆ（３、４０３）＝１８．９６、ｐ＜０．０００１］、および年齢×処置相互作用［Ｆ（６、４０３）＝１６．９９、ｐ＜０．０００１］の有意な影響が明らかになった。テューキーの事後分析では、Ｐ１２０で両方の野生型群と比較してＴｇＳＯＤ１−ビヒクルでの歩幅の有意な減少が明らかになった（図５ａ）。同様に、事後分析により、Ｐ１２０で野生型マウスと比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群の歩幅の有意な減少が明らかになり（図５Ａ）、クロモリン処置が歩幅に影響を及ぼさないことを示唆した。雌性マウスにおいて、二元配置分散分析により、歩幅への年齢［Ｆ（２、１９０）＝２７．８５、ｐ＜０．０００１］、処置［Ｆ（３、１９０）＝８．３８９、ｐ＜０．０００１］、および年齢×処置相互作用［Ｆ（６、１９０）＝６．２７８、ｐ＜０．０００１］の有意な影響が明らかになった。テューキーの事後分析では、Ｐ１２０で両方の野生型群と比較して、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルおよびＴｇＳＯＤ１−クロモリンで処置された雌性マウスの歩幅の有意な減少が明らかになった（図５Ｂ）。同様に、雄性マウスにおいて、二元配置分散分析により、歩幅への年齢［Ｆ（２、２０５）＝３７．９、ｐ＜０．０００１］、処置［Ｆ（３、２０５）＝１０．８４、ｐ＜０．０００１］、および年齢×処置相互作用［Ｆ（６、２０５）＝１０．８６、ｐ＜０．０００１］の有意な影響が明らかになった。テューキーの事後分析により、Ｐ１２０で両方の野生型群と比較して、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルおよびＴｇＳＯＤ１−クロモリンで処置された雄性マウスの歩幅の有意な減少が明らかになった（図５Ｃ）。さらに、処置後の歩隔の変化も評価した。すべての群で、二元配置分散分析により、処置の効果はなかったが、歩隔への年齢［Ｆ（２、３９７）＝１８．３、ｐ＜０．０００１］および年齢×処置［Ｆ（６、３９７）＝３．１５９、ｐ＝０．００４９］］の有意な影響があったことが明らかになった。テューキーの事後分析により、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクルと比較してＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群ではＰ１２０で歩隔の有意な増加が明らかになった（図６Ａ）。雌性マウスのみの二元配置分散分析により、年齢［Ｆ（２、１９３５）＝５．８３７、ｐ＝０．００３５］のみの有意な影響が明らかになった（図６Ｂ）。さらに、雄性マウスでの二元配置分散分析により、処置の効果はなかったが、歩隔への年齢［Ｆ（２、１８９）＝１４．８４、ｐ＜０．０００１］および年齢×処置［Ｆ（６、１８９）＝３．９７８、ｐ＝０．０００９］の有意な影響があったことを明らかになった。事後分析により、両方の野生型群と比較して、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルで処置されたマウスにおける歩隔の有意な増加が明らかになった（図６Ｃ）。したがって、クロモリン処置は、ＴｇＳＯＤ１マウスの歩行成績（例えば歩幅または歩隔）を変化させなかった。
【０１４３】
不全麻痺の発症時の年齢および生存率に対するクロモリンナトリウム処置の影響
不全麻痺発症時の年齢で測定した運動症状の発症に対してもクロモリン処置の有意な影響があり（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定、ｐ＜０．０００１）、発症年齢の中央値はＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群では９９日、ＴｇＳＯＤ１−クロモリン群では１０７日であった（図７Ａ）。雌性マウス（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定、ｐ＝０．０００９）（図７Ｂ）および雄性マウス（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定、ｐ＝０．０１９３）（図７Ｃ）の両方が、クロモリン処置後に運動症状の発症の有意な遅延を示した。クロモリン処置は、すべての処置マウス（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定、ｐ＝０．１０９６）または雄性マウスのみ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定、ｐ＜０．８８３１）で生存率に有意な影響を及ぼしたわけではなかったが（図８Ａ、図８Ｃ）、雌性マウスの生存率に対する処置の有意な影響があった（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定、ｐ＝０．０１）（図８Ｂ）。これらの結果は、クロモリン処置がすべてのＴｇＳＯＤ１マウスで不全麻痺年齢を遅らせるが、雌性ＴｇＳＯＤ１マウスの生存率のみを高めることを示唆する。
【０１４４】
クロモリン処置は神経保護的であり、腰髄２２４運動ニューロンの生存率を高める
次に、腰髄運動ニューロンの数に対するクロモリン処置の影響を評価した。腰髄の運動ニューロンを、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を使用して視覚化し、一元配置分散分析により、群間での有意差が明らかになった［Ｆ（４、８３）＝６０．３１、ｐ＜０．０００１］。ダンの多重比較検定により、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｐ＜０．０００１）およびＷｔＳＯＤ１−クロモリン（ｐ＜０．０００１）群と比較して、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群における運動ニューロン数の有意な減少が明らかになった。さらに、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンとＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｐ＝０．００７７）およびＷｔＳＯＤ１−クロモリン（ｐ＝０．００８１）群との間で運動ニューロン数の有意な減少があった。重要なことに、運動ニューロンの生存率は、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群で有意に増加し（ｐ＝０．００３３）（図９Ｂ）、クロモリン処置が神経保護的であることを示唆した。
【０１４５】
クロモリン処置はＴｇＳＯＤ１マウスの脊髄の小神経膠細胞症を変化させない
クロモリンによる１週間の急性処置は、β−アミロイドプラーク周辺のミクログリアの数の増加につながることが以前に示されているが、慢性処置は、ミクログリアの取り込みとＡβのクリアランスを有意に促進した。したがって、腰髄領域あたりのミクログリア細胞の割合を定量化することにより、ミクログリク症に対するクロモリン処置の影響を評価した。ミクログリアマーカＩｂａ１を使用して、ＴｇＳＯＤ１マウスでの慢性処置後に同様の作用が観察されるかどうかを判定した。以前に報告されたように、本発明者は、ＷｔＳＯＤ１と比較して、ビヒクルで処置されたＴｇＳＯＤ１マウスの腰髄におけるＩｂａ１陽性細胞面積の割合の有意な増加を認めた（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。さらに、一元配置分散分析およびテューキーの事後分析によって示されるように、両方の野生型群と比較して、ビヒクルおよびクロモリンで処置されたＴｇＳＯＤ１の両方の脊髄におけるＩｂａ１陽性細胞面積の割合が有意に増加した［Ｆ（４、８２）＝５３．１２、ｐ＜０．０００１］（図１０Ｂ）。しかし、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルと比較して、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンの腰髄におけるＩｂａ１陽性細胞面積の割合に有意な変化はなかった（図１０Ｂ）。これらのデータは、クロモリン処置がＴｇＳＯＤ１マウスの腰髄の小神経膠細胞症を変化させないことを示す。
【０１４６】
クロモリン処置は、ＴｇＳＯＤ１マウスの脊髄における炎症性サイトカイン／ケモカインのレベルを低下させた
クロモリン処置の炎症への影響を評価するために、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙのマルチスポットアッセイシステムを使用することにより、マウスの脊髄溶解物中の炎症性サイトカインおよびケモカインのレベルを測定した。このアッセイにより、神経炎症応答に重要であることが公知のＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、およびＴＮＦαを含む１０種類のサイトカインおよびケモカインの同時測定が可能になる。これら１０種類のサイトカインとケモカインのうち、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ１、ＴＮＦａを含む５種類のみを検出することができた。一元配置分散分析およびテューキーの事後分析により、両方の野生型群と比較してＴｇＳＯＤ１−ビヒクルおよびＴｇＳＯＤ１−クロモリン群の両方の脊髄で、ＣＸＣＬ１［Ｆ（３、６４）＝１８．１５、ｐ＜０．０００１］、ＩＬ−１ｂ［Ｆ（３、１３０）＝６６．３１、ｐ＜０．０００１］、ＩＬ−５［Ｆ（３、１２９）＝１２９．９、ｐ＜０．０００１］、ＩＬ−６［Ｆ（３、１３５）＝４３．４１、ｐ＜０．０００１］、およびＴＮＦａ［Ｆ（３、６４）＝２７．９４、ｐ＜０．０００１］のレベルに有意差があることが明らかになった（図１１）。Ｔｇ群とＷｔ群の間でＩＬ−６（ｐ＜０．０００１）およびＩＬ−５（ｐ＜０．０００１）レベルの有意な減少があった（図１１Ｂおよび図１１Ｃ）。重要なことに、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群ではＣＸＣＬ１（ｐ＝０．０２７３）およびＴＮＦａ（ｐ＝０．０２７３）レベルの有意な減少があり（図１１Ｄおよび図１１Ｅ）、クロモリン処置が、処置されたトランスジェニックマウスの脊髄における炎症性サイトカインおよびケモカインの発現を減少させたことを示唆した。
【０１４７】
クロモリン処置は、ＴｇＳＯＤ１マウスの血漿中の炎症性サイトカイン／ケモカインのレベルを低下させた
Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙの同じ炎症性パネルを使用して、マウスのサブセット（雌性：ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル１３匹、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン１５匹、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル６匹、およびＴｇＳＯＤ１−クロモリン６匹；ならびに雄性：ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル１４匹、ＷｔＳＯＤ１−クロモリン１０匹、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル６匹、ＴｇＳＯＤ１−クロモリン３匹）の血漿中のサイトカインとケモカインのレベルを評価した。ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ１、ＩＬ−１０、およびＴＮＦαを含む血漿中の１０種類の炎症性サイトカインのうち７種類を測定することができた。一元配置分散分析およびテューキーの事後分析により、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリン群の両方と比較してＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群の血漿中のＩＬ−２［Ｆ（３、６５）＝７．７３１、ｐ＜０．０００２］、ＩＬ−６［Ｆ（３、６３）＝６．３３２、ｐ＜０．０００８］、およびＩＬ−１０［Ｆ（３、６５）＝７．１９５、ｐ＜０．０００３］レベルの有意な増加が明らかになった（図１２Ｂ、図１２Ｄおよび図１２Ｅ）。一元配置分散分析により、ＣＸＣＬ１レベルの有意な増加が明らかになり［Ｆ（４、６９）＝９．３７７、ｐ＜０．０２４７］、テューキーの事後分析では、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル群と比較してＴｇＳＯＤ１−ビヒクルマウスでのＣＸＣＬ１レベルの有意な増加（ｐ＝０．０３１８）、およびＷｔＳＯＤ１−クロモリン群と比較して増加する傾向（ｐ＝０．０８４７）が明らかになった（図１２Ｆ）。ＴＮＦαレベルも有意に増加し［Ｆ（４、６７）＝１２．４６、ｐ＜０．００６］、事後分析により、ＷｔＳＯＤ１−クロモリンと比較してＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群におけるＴＮＦαの有意な増加が明らかになった（ｐ＝０．００４３）（図１２Ｇ）。群間でＩＬ−１βおよびＩＬ−５レベルに統計的な有意差はなかった（図１２Ａおよび図１２Ｃ）。重要なことに、ＩＬ−２（ｐ＝０．０２１１）、ＩＬ−６（ｐ＝０．０２７３）、およびＩＬ−１０（ｐ＝０．００９５）のレベルは、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群で有意に減少した（図１２Ｂ、図１２Ｄおよび図１２Ｅ）。最後に、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリンマウスではＴＮＦαレベルが減少する傾向があった（ｐ＝０．１１０）（図１２Ｇ）。これらの結果は、クロモリン処置がＴｇＳＯＤ１マウスの血漿中のサイトカインレベルを低下させたことを示す。
【０１４８】
以前の試験で、ＡＬＳではＣＣＬ２／ＭＣＰ−１レベルが有意に増加することが示されている。しかし、本発明者が分析に使用した特定のパネルには表示されなかったため、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙアッセイを使用してＭＣＰ−１レベルを測定することはできなかった。したがって、同じ脊髄および血漿試料でＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＭＣＰ−１レベルに対するクロモリン処置の影響を評価した。一元配置分散分析およびテューキーの事後分析により、ＭＣＰ−１のレベルは、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクルおよびＷｔＳＯＤ１−クロモリン群の両方と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリンマウスの脊髄で有意に増加したことが明らかになった［Ｆ（３、９２）＝４６．２４、ｐ＜０．０００１］（図１４Ａ）。しかし、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルと比較して、ＴｇＳＯＤ１−クロモリンの脊髄のＭＣＰ−１レベルに対してはクロモリン処置の効果がなかった。さらに、ＭＣＰ−１レベルはいずれの群の血漿でも変化しなかった［Ｆ（３、３２）＝２．３５７、ｐ＜０．０９０２］（図１４Ｂ）。したがって、クロモリン処置は、ＴｇＳＯＤ１マウスの脊髄または血漿中のＭＣＰ−１レベルに影響を及ぼさなかった。
【０１４９】
クロモリン処置はＴｇＳＯＤ１マウスの脊髄のＧＰＲ３５レベルを増加させた
クロモリンナトリウムは、マスト細胞生物学において重要な役割を果たすことが示唆されている受容体である、Ｇタンパク質共役受容体３５（ＧＰＲ３５）の強力なアゴニストであり、喘息の治療の潜在的な標的である。ここでは、脊髄の非腰部領域でのウェスタンブロット分析を使用して、ＧＰＲ３５発現へのクロモリンの影響を評価した。一元配置分散分析により、ウェスタンブロットで測定したＧＲＰ３５レベルの有意差［Ｆ（３、７０）＝１．４８６、ｐ＜０．００７］が明らかになり、テューキーの事後分析では、ＷｔＳＯＤ１−ビヒクル（ｐ＝０．００４７）およびＷｔＳＯＤ１−クロモリン群（ｐ＝０．０４５９）と比較してＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群におけるＧＰＲ３５レベルの有意な減少が明らかになった（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。さらに、ＴｇＳＯＤ１−クロモリン群とＷｔＳＯＤ１群のいずれかとの間に有意差はなかった。しかし、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクル群と比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群ではＧＰＲ３５が増加する傾向があった（ｐ＝０．１６７）（図１３Ｂ）。次に、腰髄の免疫蛍光法を用いてこれらの所見を確認した。一元配置分散分析により、腰髄におけるＧＲＰ３５強度の有意差が明らかになった［Ｆ（３、１９）＝１．１７４、ｐ＜０．０３４８］（図１３Ｃおよび図１３Ｄ）。さらに、テューキーの事後分析により、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルと比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群におけるＧＰＲ３５レベルの有意な増加が明らかになった（ｐ＝０．０４４９）（図１３Ｄ）。ＧＰＲ３５は、ニューロンマーカであるＮｅｕＮと共局在し（図１３Ｃ）、一元配置分散分析［Ｆ（３、８）＝０．３７５、ｐ＜０．０３３３］および事後分析（ｐ＝０．０４１１）で測定した場合、ＴｇＳＯＤ１−ビヒクルと比較してＴｇＳＯＤ１−クロモリン群ではニューロンＧＰＲ３５レベルが有意に増加した（図１３Ｅ）。総合すると、これらの所見は、クロモリンが、ＴｇＳＯＤ１マウスにおいてＧＰＲ３５発現を調節することおよび／またはＧＰＲ３５をニューロン発現パターンにシフトすることによってその神経保護効果を提供し得ることを示唆する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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