(57)【要約】  治療用タンパク質および安定性改善量の安定化賦形剤を含む安定性強化製剤が本明細書に開示され、安定化強化製剤は、安定化賦形剤を欠いている以外は安定性強化製剤と同一である対照製剤と比較して、改善された安定性パラメータを特徴とする。さらに、治療用製剤の安定性を改善する方法またはタンパク質関連プロセスのパラメータを改善する方法が本明細書に開示される。
2021515766.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用タンパク質および安定性改善量の安定化賦形剤を含む安定性強化製剤であって、前記安定化賦形剤を欠いている以外は前記安定性強化製剤と同一である対照製剤と比較して、改善された安定性パラメータを特徴とする、安定性強化製剤。
【請求項２】
前記治療用タンパク質が、抗体である、請求項１に記載の安定性強化製剤。
【請求項３】
前記抗体が、抗体薬物複合体である、請求項２に記載の安定性強化製剤。
【請求項４】
前記安定化賦形剤が、ヒンダードアミン化合物である、請求項１に記載の安定性強化製剤。
【請求項５】
前記安定化賦形剤が、アニオン性芳香族化合物である、請求項１に記載の安定性強化製剤。
【請求項６】
前記安定化賦形剤が、官能化アミノ酸化合物である、請求項１に記載の安定性強化製剤。
【請求項７】
前記安定化賦形剤が、オリゴペプチドである、請求項１に記載の安定性強化製剤。
【請求項８】
前記安定化賦形剤が、短鎖有機酸である、請求項１に記載の安定性強化製剤。
【請求項９】
前記安定化賦形剤が、低分子量ポリ酸である、請求項１に記載の安定性強化製剤。
【請求項１０】
前記安定化賦形剤が、ジオン化合物またはスルホン化合物である、請求項１に記載の安定性強化製剤。
【請求項１１】
前記安定化賦形剤が、双性イオン化合物である、請求項１に記載の安定性強化製剤。
【請求項１２】
前記安定化賦形剤が、水素結合性元素を有するクラウディング剤である、請求項１に記載の安定性強化製剤。
【請求項１３】
前記安定化賦形剤が、約１ｍＭ〜約５００ｍＭの量で添加される、請求項１に記載の安定性強化製剤。
【請求項１４】
前記安定化賦形剤が、約５ｍＭ〜約２５０ｍＭの量で添加される、請求項１３に記載の安定性強化製剤。
【請求項１５】
前記安定化賦形剤が、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの量で添加される、請求項１４に記載の安定性強化製剤。
【請求項１６】
前記安定化賦形剤が、約５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの量で添加される、請求項１５に記載の安定性強化製剤。
【請求項１７】
前記改善された安定性パラメータが、熱保存安定性である、請求項１に記載の安定性強化製剤。
【請求項１８】
前記熱保存安定性が、約１０℃〜３０℃の温度で改善される、請求項１７に記載の安定性強化製剤。
【請求項１９】
前記改善された安定性パラメータが、改善された凍結／解凍安定性である、請求項１に記載の安定性強化製剤。
【請求項２０】
前記改善された安定性パラメータが、改善された剪断安定性である、請求項１に記載の安定性強化製剤。
【請求項２１】
前記製剤が、前記対照製剤と比較して、減少した粒子数を有する、請求項１に記載の安定性強化製剤。
【請求項２２】
前記製剤が、前記対照製剤と比較して、改善された生物学的活性を有する、請求項１に記載の安定性強化製剤。
【請求項２３】
治療用製剤の安定性を改善する方法であって、安定性改善量の安定化賦形剤を前記治療用製剤に添加し、それによって前記治療用製剤の前記安定性を改善することを含み、前記治療用製剤の前記安定性は、前記安定化賦形剤を欠いている以外は前記治療用製剤と同一である対照製剤の安定性と比較して、測定される、方法。
【請求項２４】
前記安定化賦形剤が、ヒンダードアミン、アニオン性芳香族化合物、官能化アミノ酸、オリゴペプチド、短鎖有機酸、低分子量ポリ酸、ジオン、スルホン、双性イオン化合物、および水素結合性元素を有するクラウディング剤からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記対照製剤の前記安定性と比較して、前記治療用製剤の前記安定性を測定する前記ステップが、安定性関連パラメータを測定することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記安定性関連パラメータが、熱保存安定性、凍結／解凍安定性、および剪断安定性からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記治療用製剤が、治療用タンパク質を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記治療用タンパク質が抗体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体が、抗体薬物複合体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
タンパク質関連プロセスのパラメータを改善する方法であって、前記タンパク質関連プロセスのキャリア溶液に安定性改善量の安定化賦形剤を添加することを含み、前記キャリア溶液が目的のタンパク質を含み、それによって前記パラメータを改善する、方法。
【請求項３１】
前記パラメータが、タンパク質生成のコスト、タンパク質生成の量、タンパク質生成の速度、およびタンパク質生成の効率からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記目的のタンパク質が、治療用タンパク質である、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年３月７日に出願された米国特許仮出願第６２／６３９，９５０号、および２０１８年６月１日に出願された米国特許仮出願第６２／６７９，６４７号の利益を主張する。上記の各出願の内容全体が、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本出願は、概して、安定化賦形剤を有するタンパク質製剤などのバイオポリマー製剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
バイオポリマーは、治療目的または非治療目的で使用することができる。タンパク質、抗体、または酵素を含む製剤などのバイオポリマーベースの治療薬は、疾患の治療に広く使用されている。酵素、ペプチド、または構造タンパク質を含む製剤などの非治療バイオポリマーは、家庭、栄養、商業、および工業用途などの非治療用途において有用である。
【０００４】
特に興味深いのは、タンパク質バイオポリマーの治療的および非治療的な使用である。タンパク質は複雑なバイオポリマーであり、それぞれが独自に折り畳まれた３Ｄ構造と表面エネルギーマップ（疎水性／親水性領域と電荷）を備えている。濃縮されたタンパク質溶液では、これらの巨大分子は、その正確な形状と表面エネルギー分布に応じて、強く相互作用し、さらに複雑な様式で絡み合うことがある。強い特異的相互作用のための「ホットスポット」は、タンパク質のクラスター化を引き起こし、溶液の粘度を増加させる。これらの問題に対処するために、多くの賦形剤化合物がバイオ医薬製剤で使用され、局所的な相互作用とクラスタリングを妨げることによって、溶液の粘度を下げることを目指している。これらの取り組みは、個別に調整され、しばしば、経験的に、時には、コンピューターでの（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）シミュレーションによって導かれる。賦形剤化合物の組み合わせが提供されてもよいが、そのような組み合わせを最適化することは、経験的に、およびケースごとに、進めなければならない。
【０００５】
治療用途で使用されるタンパク質などのバイオポリマーは、疾患の治療のために、体内へ導入できるように製剤化する必要がある。例えば、特定の状況下では、静脈内（ＩＶ）注射によってこれらの製剤を投与する代わりに、皮下（ＳＣ）または筋肉内（ＩＭ）経路によって抗体およびタンパク質／ペプチドバイオポリマー製剤を送達することが有利である。ただし、ＳＣまたはＩＭ注射で患者のコンプライアンスと快適さをより良好にするために、シリンジ内の液体の容量は、通常２〜３ｍＬに制限され、製剤の粘度は、通常約２０センチポアズ（ｃＰ）未満であり、そのため、従来の医療機器および小口径の針を使用して製剤を送達することができる。これらの送達パラメータは、送達される製剤の投与量の要件と必ずしもうまく適合しない。
【０００６】
例えば、抗体は、それらの意図された治療効果を発揮するために、高用量レベルで送達される必要があるかもしれない。制限された液量を使用して高用量レベルの抗体製剤を送達するには、送達ビヒクル中に高濃度の抗体が必要になることがあり、１５０ｍｇ／ｍＬのレベルを超えることがある。この投与量レベルでは、タンパク質溶液の粘度対濃度のプロットは、それらの線形−非線形遷移を超えており、製剤の粘度は、濃度の増加とともに劇的に上昇する。しかしながら、粘度の増加は、標準的なＳＣまたはＩＭ送達システムと相容れない。バイオポリマーベースまたはタンパク質ベースの治療薬の溶液は、沈殿、断片化、酸化、脱アミド化、濁り、乳白化、変性、およびゲル形成、可逆的または不可逆的凝集などの安定性の問題が発生しやすくなる。安定性の問題により、溶液の保存期間が制限され、または特別な取り扱いが必要になる。
【０００７】
注射用のタンパク質製剤を生成するための１つのアプローチは、治療用タンパク質溶液を、ＳＣまたはＩＭ送達に好適な懸濁液を形成するように再構成され得る粉末に変換することである。凍結乾燥は、タンパク質粉末を生成するための標準的な技術である。凍結乾燥、噴霧乾燥、さらなる沈殿、続いて超臨界流体抽出が、その後の再構成のためのタンパク質粉末を生成するために使用されてきた。粉末懸濁液は、再溶解前は粘度が低いため（同じ総用量の溶液と比較して）、粒子が針を通るのに十分小さければ、ＳＣまたはＩＭ注射に好適であり得る。ただし、粉末に存在するタンパク質結晶には、免疫反応を引き起こす固有のリスクがある。再溶解後の不確かなタンパク質の安定性／活性は、さらなる懸念を投げかける。タンパク質粉末懸濁液によって導入される制限を回避しつつ、治療目的のために低粘度タンパク質製剤を生成する技術が、当該技術分野で依然として必要とされている。
【０００８】
抗体薬物複合体（ＡＤＣ）などのより複雑な抗体製剤は、粘度と安定性の問題に対して特に脆弱である。ＡＤＣは、化学リンカーを介して小分子薬剤をモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に結合させ、ｍＡｂは、異常な「標的細胞」上の特定の抗原を標的とし、小分子薬物は、その標的細胞に対して特異的抗原効果を有するように選択される。ｍＡｂが標的細胞抗原に接触すると、それとそれに結合した薬物が、細胞によって摂取され、細胞内部へと移行する。細胞内では、ｍＡｂおよび／またはリンカーが分解され、薬物が放出されて、細胞に対してその生物学的効果が発揮される。通常、薬物は、化学療法剤であり、全身的に放たれると非常に毒性がある。ＡＤＣは、化学療法剤をその標的である癌細胞に直接接触させる。小分子のｍＡｂへのこの結合は、治療用タンパク質製剤に影響を与える粘度と安定性の問題を悪化させ得る。ペイロード化合物は、通常、疎水性の小分子であり、薬物抗体比が増加すると、より大きなＡＤＣでは、安定性、溶解性、および溶液相互作用の特性に著しい影響を与える可能性がある。製剤中の塩濃度が高いと、ＡＤＣ複合体間の疎水性相互作用が増加し、ＡＤＣの溶解度が、非結合抗体よりも塩の影響に敏感になる。ＡＤＣ溶液の処理または保存は、特に薬物対抗体比（ＤＡＲ）が高い場合、ＡＤＣ種の凝集または沈殿を引き起こす可能性がある。薬物結合はまた、ｍＡｂ、特にそのＦｃドメインの立体構造安定性にも影響を与える可能性がある。さらに、薬物の結合により、ｍＡｂの正味の表面電荷も減少し、ＡＤＣの溶解度に影響を与え得る。
【０００９】
上に記載のタンパク質の治療用途に加えて、酵素、ペプチド、および構造タンパク質などのバイオポリマーを、非治療用途に使用することができる。これらの非治療用バイオポリマーは、例えば、植物源、動物源に由来する、または細胞培養物から生成される、多くの異なる経路から生成することができる。
【００１０】
非治療用タンパク質は、通常は水中で、顆粒状または粉末状の材料として、あるいは溶液または分散液として生成、輸送、保存、および処理することができる。非治療用途のバイオポリマーは、球状または繊維状のタンパク質であり得、これらの材料の特定の形態は、限られたか水への溶解度を有するか、または溶解時に高い粘度を示す可能性がある。これらの溶液の特性は、非治療材料の製剤、取り扱い、保存、ポンプ輸送、および性能に課題を提示する可能性があるため、非治療用タンパク質溶液の粘度を低下し、溶解度と安定性を改善する方法が必要である。
【００１１】
当該技術分野では、特に高いタンパク質濃度において、タンパク質製剤の粘度を低下させ、かつ／または安定性を改善する、真に普遍的なアプローチが依然として必要とされている。当該技術分野では、タンパク質の活性を維持しながら、この粘度低下を達成する追加の必要性が存在する。さらに、調整可能な徐放性プロファイルを有する製剤とともに使用するために、およびデポ注射に適合した製剤とともに使用するために、粘度低下システムを適合させることが望ましい。さらに、タンパク質および他のバイオポリマーを生成するためにプロセスを改善することが望ましい。
【発明の概要】
【００１２】
実施形態において、本明細書に開示されるものは、液体製剤であり、タンパク質と、ヒンダードアミン、アニオン性芳香族、官能化アミノ酸、オリゴペプチド、短鎖有機酸、および低分子量脂肪族ポリ酸からなる群から選択される賦形剤化合物とを含み、賦形剤化合物は、粘度低下量で添加される。実施形態では、タンパク質は、ＰＥＧ化タンパク質であり、賦形剤は、低分子量脂肪族ポリ酸である。実施形態では、製剤は、医薬組成物であり、治療用製剤は、治療用タンパク質を含み、賦形剤化合物は、医薬的に許容される賦形剤化合物である。実施形態では、製剤は、非治療用製剤であり、非治療用製剤は、非治療用タンパク質を含む。実施形態では、粘度低下量は、製剤の粘度を、対照製剤の粘度よりも低い粘度に低減する。実施形態では、製剤の粘度は、対照製剤の粘度よりも少なくとも約１０％低い、または対照製剤の粘度よりも少なくとも約３０％低い、または対照製剤の粘度よりも少なくとも約５０％低い、または対照製剤の粘度よりも少なくとも約７０％低い、または対照製剤の粘度よりも少なくとも約９０％低い。実施形態では、粘度は、約１００ｃＰ未満、または約５０ｃＰ未満、または約２０ｃＰ未満、または約１０ｃＰ未満である。実施形態では、賦形剤化合物は、５０００Ｄａ未満、または１５００Ｄａ未満、または５００Ｄａ未満の分子量を有する。実施形態では、製剤は、少なくとも約２５ｍｇ／ｍＬのタンパク質、または少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬのタンパク質、または少なくとも約２００ｍｇ／ｍＬのタンパク質、または少なくとも約３００ｍｇ／ｍＬのタンパク質を含む。実施形態では、製剤は、約５ｍｇ／ｍＬ〜約３００ｍｇ／ｍＬの賦形剤化合物を含み、または約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの賦形化合物を含み、または約２０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬを含み、または約２５ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬの賦形化合物を含む。実施形態では、製剤は、対照製剤と比較した場合、改善された安定性を有する。実施形態では、賦形剤化合物は、ヒンダードアミンである。実施形態では、ヒンダードアミンは、カフェイン、テオフィリン、チラミン、プロカイン、リドカイン、イミダゾール、アスパルテーム、サッカリン、およびアセスルファムカリウムからなる群から選択される。実施形態では、ヒンダードアミンは、カフェインである。実施形態では、ヒンダードアミンは、局所注射用麻酔化合物である。ヒンダードアミンは、独立した薬理学的特性を有することができ、ヒンダードアミンは、独立した薬理学的効果を有する量で製剤中に存在し得る。実施形態では、ヒンダードアミンは、治療上有効量未満の量で製剤中に存在し得る。独立した薬理学的活動は、局所麻酔であり得る。実施形態では、独立した薬理活性を有するヒンダードアミンは、製剤の粘度をさらに低下させる第２の賦形剤化合物と組み合わされる。第２の賦形剤化合物は、カフェイン、テオフィリン、チラミン、プロカイン、リドカイン、イミダゾール、アスパルテーム、サッカリン、およびアセスルファムカリウムからなる群から選択することができる。実施形態では、製剤は、防腐剤、界面活性剤、糖、多糖、アルギニン、プロリン、ヒアルロニダーゼ、安定剤、および緩衝液からなる群から選択される追加の薬剤を含むことができる。
【００１３】
さらに、本明細書に開示されるものは、哺乳動物において疾患または障害を治療する方法であって、当該哺乳動物に液体治療用製剤を投与することを含み、治療用製剤は、治療上有効量の治療用タンパク質を含み、製剤は、ヒンダードアミン、アニオン性芳香族、官能化アミノ酸、オリゴペプチド、短鎖有機酸、および低分子量脂肪族ポリ酸からなる群から選択される薬学的に許容される賦形剤化合物をさらに含み、治療用製剤は、疾患または障害の治療に有効である。実施形態では、治療用タンパク質は、ＰＥＧ化タンパク質であり、賦形剤化合物は、低分子量脂肪族ポリ酸である。実施形態では、賦形剤は、ヒンダードアミンである。実施形態では、ヒンダードアミンは、局所麻酔化合物である。実施形態では、製剤は、皮下注射、または筋肉内注射、または静脈内注射によって投与される。実施形態では、賦形剤化合物は、治療用製剤中に粘度低下量で存在し、粘度低下量は、治療用製剤の粘度を対照製剤の粘度より低い粘度に低減する。実施形態では、治療用製剤は、対照製剤と比較した場合、改善された安定性を有する。実施形態では、賦形剤化合物は、本質的に純粋である。
【００１４】
本明細書にさらに開示されるものは、それを必要とする哺乳動物において、治療用タンパク質の注射部位で疼痛を軽減する方法であり、液体治療用製剤を注射によって投与することを含み、治療用製剤は、治療上有効量の治療用タンパク質を含み、製剤は、局所注射用麻酔剤化合物からなる群から選択される薬学的に許容される賦形剤化合物をさらに含み、薬学的に許容される賦形剤化合物は、粘度低下量で製剤に添加され、哺乳動物は、対照治療用製剤の投与よりも、賦形剤化合物を含む治療用製剤の投与で、より少ない疼痛を経験し、対照治療用製剤は、賦形剤化合物を含まず、それ以外は治療用製剤と同一である。
【００１５】
実施形態において、本明細書に開示されるものは、液体タンパク質製剤の安定性を改善する方法であり、治療用タンパク質と、ヒンダードアミン、アニオン性芳香族、官能化アミノ酸、オリゴペプチド、短鎖有機酸、および低分子量脂肪族ポリ酸からなる群から選択される賦形剤化合物とを含む液体タンパク質製剤を調製することを含み、液体タンパク質製剤は、対照液体タンパク質製剤と比較して改善された安定性を示し、対照液体タンパク質製剤は、賦形剤化合物を含まず、それ以外は液体タンパク質製剤と同一である。液体製剤の安定性は、低温保存条件安定性、室温安定性または昇温安定性であり得る。
【００１６】
また、実施形態において、本明細書に開示されるものは、タンパク質とヒンダードアミン、アニオン性芳香族、官能化アミノ酸、オリゴペプチド、短鎖有機酸、および低分子量脂肪族ポリ酸からなる群から選択される賦形剤化合物とを含む液体製剤であり、製剤中の賦形剤化合物の存在は、タンパク質拡散相互作用パラメータｋＤ、または２番目のビリアル係数Ｂ２２によって測定される改善されたタンパク質間相互作用特性をもたらす。実施形態では、製剤は、治療用製剤であり、治療用タンパク質を含む。実施形態では、製剤は、非治療用製剤であり、非治療用タンパク質を含む。
【００１７】
実施形態において、本明細書でさらに開示されるものは、上に記載の液体製剤を提供し、それを処理方法で使用することを含む、タンパク質関連プロセスを改善する方法である。実施形態では、処理方法は、濾過、ポンピング、混合、遠心分離、膜分離、凍結乾燥、またはクロマトグラフィを含む。実施形態では、処理方法は、細胞培養物採取、クロマトグラフィ、ウイルス不活化、および濾過からなる群から選択される。実施形態では、処理方法は、クロマトグラフィプロセスまたは濾過プロセスである。実施形態では、濾過プロセスは、ウイルス濾過プロセスまたは限外濾過／透析濾過プロセスである。
【００１８】
また、本明細書に開示されるものは、タンパク質関連プロセスのパラメータを改善する方法であり、ヒンダードアミン、アニオン性芳香族、官能化アミノ酸、オリゴペプチド、短鎖有機酸、低分子量脂肪族ポリ酸、およびジオンおよびスルホンからなる群から選択される少なくとも１つの賦形剤化合物を含む粘度低下賦形剤添加剤を提供すること、およびタンパク質関連プロセスのキャリア溶液に粘度低下量の少なくとも１つの賦形剤化合物を添加することを含み、キャリア溶液は、目的のタンパク質を含み、これによって、パラメータが改善される。実施形態では、パラメータは、タンパク質生成のコスト、タンパク質生成の量、タンパク質生成の速度、およびタンパク質生成の効率からなる群から選択することができる。パラメータは、プロキシパラメータであり得る。実施形態では、タンパク質関連プロセスは、上流処理プロセスである。上流の処理プロセスのためのキャリア溶液は、細胞培養培地であり得る。実施形態では、キャリア溶液が細胞培養培地である場合、キャリア溶液に賦形剤添加物を加えるステップは、賦形剤添加物を補助培地に加えて賦形剤含有補助培地を形成する第１のサブステップ、および賦形剤含有補助培地を細胞培養培地に添加する第２のサブステップを含む。他の実施形態では、タンパク質関連プロセスは、下流処理プロセスである。下流プロセスは、クロマトグラフィプロセスであり得、クロマトグラフィプロセスは、プロテイン−Ａクロマトグラフィプロセスであり得る。実施形態では、クロマトグラフィプロセスは、目的のタンパク質を回収することであり、目的のタンパク質は、対照溶液と比較して、改善された純度、改善された収率、より少ない粒子、より少ないミスフォールディング、またはより少ない凝集からなる群から選択される改善されたタンパク質関連パラメータによって特徴付けられる。実施形態では、改善されたタンパク質関連パラメータは、クロマトグラフィプロセスからの目的のタンパク質の改善された収量である。他の実施形態では、タンパク質関連プロセスは、濾過、注入、注射、ポンプ、混合、遠心分離、膜分離、および凍結乾燥からなる群から選択されるプロセスであり、選択されたプロセスは、対照プロセスよりも少ない力で済む。実施形態では、タンパク質関連プロセスは、細胞培養プロセス、細胞培養採取プロセス、クロマトグラフィプロセス、ウイルス不活化プロセス、および濾過プロセスからなる群から選択される。実施形態では、タンパク質関連プロセスは、ウイルス不活化プロセスであり、ウイルス不活化プロセスは約２．５〜約５．０のｐＨレベルで行われる、またはウイルス不活化プロセスは対照プロセスよりも高いｐＨで行われる。他の実施形態では、タンパク質関連プロセスは、濾過プロセスである。濾過プロセスは、ウイルス除去濾過プロセスまたは限外濾過／透析濾過プロセスであり得る。濾過プロセスは、改善された濾過関連パラメータによって特徴付けることができる。改善された濾過関連パラメータは、対照溶液の濾過速度よりも速い濾過速度であり得る。改善された濾過関連パラメータは、対照濾過プロセスによって生成される凝集タンパク質の量よりも少ない量の凝集タンパク質の生成であり得る。改善された濾過関連パラメータは、対照濾過プロセスの物質移動効率よりも高い物質移動効率であり得る。改善された濾過関連パラメータは、対照濾過プロセスによって生成された標的タンパク質の濃度または収量よりも高い濃度またはより高い収量の標的タンパク質であり得る。
【００１９】
本明細書にさらに開示されるものは、粘度低下賦形剤添加剤が、２つ以上の賦形剤化合物を含む、上記の方法である。実施形態では、少なくとも１つの賦形剤化合物は、ヒンダードアミンである。実施形態では、少なくとも１つの賦形剤化合物は、カフェイン、サッカリン、アセスルファムカリウム、アスパルテーム、テオフィリン、タウリン、１−メチル−２−ピロリドン、２−ピロリジノン、ナイアシンアミド、およびイミダゾールからなる群から選択される。実施形態では、少なくとも１つの賦形剤化合物は、カフェイン、タウリン、ナイアシンアミド、およびイミダゾールからなる群から選択される。実施形態では、少なくとも１つの賦形剤化合物は、アニオン性芳香族賦形剤であり、一部の実施形態では、アニオン性芳香族賦形剤は、４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸であり得る。実施形態では、粘度低下量は、少なくとも１つの賦形剤化合物が約１ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬである、または粘度低下量は、少なくとも１つの賦形剤化合物が約１ｍＭ〜約４００ｍＭである、または粘度低下量は、約２ｍＭ〜約１５０ｍＭの量である。実施形態では、キャリア溶液は、防腐剤、糖、多糖、アルギニン、プロリン、界面活性剤、安定剤、および緩衝液からなる群から選択される追加の薬剤を含む。実施形態では、目的のタンパク質は、治療用タンパク質であり、治療用タンパク質は、組換えタンパク質であり得る、またはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片、融合タンパク質、ＰＥＧ化タンパク質、抗体薬物複合体、合成ポリペプチド、タンパク質断片、リポタンパク質、酵素、および構造ペプチドからなる群から選択され得る。実施形態では、方法は、第２の粘度低下賦形剤をキャリア溶液に添加するステップをさらに含み、第２の粘度低下化合物を添加するステップは、パラメータにさらなる改善を加える。
【００２０】
さらに、キャリア溶液が本明細書に開示され、目的のタンパク質が溶解された液体媒体、および粘度低下添加剤を含み、キャリア溶液は、対照溶液のものよりも低い粘度を有する。キャリア溶液は、防腐剤、糖、多糖、アルギニン、プロリン、界面活性剤、安定剤、および緩衝液からなる群から選択される追加の薬剤をさらに含むことができる。
【００２１】
さらに、本開示は、安定性強化製剤に関し、治療用タンパク質および安定性改善量の安定化賦形剤を含み、安定性強化製剤は、安定化賦形剤を欠いているがそれ例外は安定性強化製剤と同一である対照製剤と比較して、改善された安定性パラメータを特徴とする。実施形態では、治療用タンパク質は、抗体であり、抗体は、抗体薬物複合体であり得る。安定化賦形剤は、ヒンダードアミン化合物、アニオン性芳香族化合物、官能化アミノ酸化合物、オリゴペプチド、短鎖有機酸、低分子量ポリ酸、ジオン化合物もしくはスルホン化合物、双性イオン化合物、または水素結合元素を含む密集剤（ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）であり得る。実施形態では、安定化賦形剤は、約１ｍＭ〜約５００ｍＭの量、または約５ｍＭ〜約２５０ｍＭの量、または約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの量で、または約５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの量で製剤に添加することができる。改善された安定性パラメータは、例えば、熱保存安定性（ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）であり得、熱保存安定性は、約１０℃〜３０℃の温度で改善される。実施形態では、改善された安定性パラメータは、改善された凍結／解凍安定性または改善された剪断安定性である。実施形態では、安定性強化製剤は、対照と比較して、粒子数が少ない。実施形態では、安定性強化製剤は、対照と比較して、改善された生物学的活性を有する。
【００２２】
また、本明細書に開示されるものは、治療用製剤の安定性を改善する方法であって、安定性改善量の安定化賦形剤を治療用製剤に添加し、それによって治療用製剤の安定性を改善することを含み、治療用製剤の安定性は、安定化賦形剤を欠いている以外は治療用製剤と同一である対照製剤の安定性と比較して、測定される。安定化賦形剤は、ヒンダードアミン、アニオン性芳香族化合物、官能化アミノ酸、オリゴペプチド、短鎖有機酸、低分子量ポリ酸、ジオン、スルホン、双性イオン化合物、または水素結合を伴うクラウディング剤であり得る。実施形態では、治療用製剤の安定性を測定するステップは、安定性関連パラメータ、例えば、熱保存安定性、凍結／解凍安定性、および剪断安定性からなる群から選択されるパラメータを測定することを含み得る。実施形態では、治療用製剤は、抗体であり得る治療用タンパク質を含み、抗体は、抗体薬物複合体であり得る。本明細書にさらに開示されるものは、タンパク質関連プロセスのパラメータを改善する方法であり、安定性改善量の安定化賦形剤をタンパク質関連プロセスのキャリア溶液に添加することを含み、キャリア溶液は、目的のタンパク質を含み、それによってパラメータを改善し、目的のタンパク質は、治療用タンパク質であり得る。実施形態では、パラメータは、タンパク質生成のコスト、タンパク質生成の量、タンパク質生成の速度、およびタンパク質生成の効率からなる群から選択することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】は、動的光散乱により評価された、ストレスおよび非ストレス条件下でのモノクローナル抗体の溶液についての粒子サイズ分布のグラフを示す。図１のデータ曲線は、比較を可能にするためのベースラインオフセットを有する。サンプル１−Ａの曲線は、１００強度ユニットでオフセットされ、サンプル１−ＦＴの曲線は、Ｙ−軸において２００強度ユニットでオフセットされている。
【図２】は、動的光散乱によって評価された、いくつかの分子集団のサンプル直径対マルチモーダルサイズ分布を測定するグラフを示す。図２のデータ曲線は、比較を可能にするためのベースラインオフセットを有する。サンプル２−Ａの曲線は、１００強度ユニットでオフセットされ、サンプル２−ＦＴの曲線は、Ｙ−軸において２００強度ユニットでオフセットされている。
【図３】は、８〜１０分の保持時間における、単量体のメインピークを有するモノクローナル抗体溶液のサイズ排除クロマトグラムを示す。図３のデータ曲線は、比較を可能にするためのベースラインオフセットを有する。サンプル２−Ｃ、２−Ａおよび２−ＦＴの曲線は、Ｙ−軸方向にオフセットされている。
【図４】は、モノクローナル抗体などの治療用タンパク質を生成するための発酵プロセス（「上流処理」）のステップを示すブロック図を提示する。
【図５】は、モノクローナル抗体などの治療用タンパク質を生成するための精製プロセス（「下流処理」）のステップを示すブロック図を提示する。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書に開示されるものは、濃縮タンパク質溶液の送達を可能にする製剤およびそれらの生成方法である。実施形態では、本明細書に開示されるアプローチは、従来のタンパク質溶液と比較して、より低粘度の液体製剤または液体製剤中でより高濃度の治療用もしくは非治療用タンパク質をもたらすことができる。
【００２５】
実施形態では、本明細書に開示されるアプローチは、従来のタンパク質溶液と比較して、改善された安定性を有する液体製剤をもたらすことができる。一態様では、安定な製剤は、それに含まれるタンパク質が、ストレス条件にさらされたとき、その物理的および化学的安定性または完全性、およびの治療的または非治療的効力を実質的に保持するものである。別の態様では、安定な製剤は、それに含まれるタンパク質が、その可溶性、単量体、または非凝集の状態を実質的に保持するものである。本明細書で使用される場合、ストレス条件は、製剤中のタンパク質に悪影響を与える物理的または化学的条件である。有利なことに、安定した製剤はまた、それに溶解したタンパク質の凝集または沈殿に対する保護を提供することができる。
【００２６】
物理的ストレス条件の例としては、機械的剪断、気／液界面との接触、凍結融解サイクル、保存条件下での長期保存（低温保存条件、室温条件、または高温保存条件のいずれか）または他の変性条件への曝露などの物理的摂動が含まれる。例えば、低温保存条件では、冷蔵庫または冷凍庫での保存が必要になる場合がある。いくつかの例では、低温保存条件は、１０℃以下の温度での保存が必要になる場合がある。追加の例では、低温保存条件は、約２℃〜約１０℃の温度での保存を必要とする。他の例では、低温保存条件は、約４℃の温度での保存を必要とする。追加の例では、低温保存条件は、約−２０℃以下などの凍結温度での保存を必要とする。別の例では、低温保存条件は、約−８０℃〜約０℃の温度での保存を必要とする。室温保存条件は、例えば、約１０℃〜約３０℃の周囲温度での保存が必要になる場合がある。高温保存条件は、約３０℃を超える温度での保存が必要になる場合がある。例えば、約３０℃〜約５０℃の温度での高温安定性は、加速劣化試験の一部として使用され、通常の周囲（１０〜３０℃）条件での長期保存を予測することができる。ストレス条件はまた、例えば、その三次構造に影響を与えることにより、製剤中のタンパク質の安定性または完全性に影響を与え得る、ｐＨの変化などの化学的摂動を含み得る。
【００２７】
高分子科学および工学分野の当業者にはよく知られているが、溶液中のタンパク質は、絡み合いを形成する傾向があり、絡み合った鎖の並進移動が制限され、タンパク質の治療効果または非治療効果が妨げられる可能性がある。実施形態では、本明細書に開示される賦形剤化合物は、溶液中の賦形剤化合物と標的タンパク質との間の特異的な相互作用により、タンパク質のクラスター化を抑制することができる。本明細書に開示される賦形剤化合物は、天然または合成であり得、望ましくは、ＦＤＡが一般に安全であると認識する物質（「ＧＲＡＳ」）である。
【００２８】
１．定義
本開示の適用上、用語「タンパク質」は、通常１〜３０００ｋＤａの分子量を有し、個々の三次構造を生成するのに十分長い鎖長を有するアミノ酸の配列を指す。一部の実施形態では、タンパク質の分子量は、約５０〜２００ｋＤａである。他の実施形態では、タンパク質の分子量は、約２０〜１０００ｋＤａ、または約２０〜２０００ｋＤａである。用語「タンパク質」と対照的に、用語「ペプチド」は、個々の三次構造を持たないアミノ酸の配列を指す。多種多様なバイオポリマーが、「タンパク質」という用語の範囲に含まれる。例えば、用語「タンパク質」は、抗体、アプタマー、融合タンパク質、ＰＥＧ化タンパク質、合成ポリペプチド、タンパク質断片、リポタンパク質、酵素、構造ペプチドなどを含む、治療用または非治療用タンパク質を意味し得る。
【００２９】
ａ．治療用バイオポリマーと関連定義
治療効果を有するタンパク質を含むこれらのバイオポリマーは、「治療用バイオポリマー」と呼ばれる場合がある。治療効果を有するこれらのタンパク質は、「治療用タンパク質」と呼ばれる場合がある。
【００３０】
非限定的な例としては、治療用タンパク質は、ホルモンおよびプロホルモン（例えば、インスリンおよびプロインスリン、グルカゴン、カルシトニン、甲状腺ホルモン（Ｔ３もしくはＴ４または甲状腺刺激ホルモン）、副甲状腺ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子など）；凝固および抗凝固因子（例えば、組織因子、フォン・ヴィルブランド因子、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、プロテインＣ、プラスミノーゲン活性化因子（ウロキナーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子）、トロンビン）；サイトカイン、ケモカイン、および炎症性メディエーター；インターフェロン；コロニー刺激因子；インターロイキン（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０）；増殖因子（例えば、血管内皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、形質転換増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、神経栄養増殖因子、インスリン様増殖因子等）；アルブミン；コラーゲンおよびエラスチン；造血因子（例えば、エリスロポエチン、トロンボポエチン等）；骨誘導因子（例えば、骨形成タンパク質）；受容体（例えば、インテグリン、カドヘリンなど）；膜表面タンパク質；輸送タンパク質；調節タンパク質；抗原タンパク質（例えば、抗原として作用するウイルス成分）；および抗体、などの哺乳動物タンパク質を挙げることができる。
【００３１】
特定の実施形態では、治療用タンパク質は、抗体であり得る。「抗体」という用語は、本明細書ではその最も広い意味で使用され、非限定的な例としては、モノクローナル抗体（例えば、免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長抗体を含む）、単鎖分子、二重特異性および多特異性抗体、ダイアボディ、抗体薬物複合体、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、ポリクローナル抗体（免疫不全患者のための治療として使用されるポリクローナル免疫グロブリンなど）、および抗体の断片（例えば、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆｖ、ナノボディ、およびＦ（ａｂ’）２を含む）が挙げられる。抗体は「免疫グロブリン」とも呼ばれる。抗体は、生物学的に重要な物質である特定のタンパク質または非タンパク質の「抗原」に対して向けれられていることが理解される。患者への治療上有効量の抗体の投与は、抗原と複合体を形成し、それによって、その生物学的特性を変化させて、患者が治療効果を経験することができる。
【００３２】
実施形態では、抗体は、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）であり得る。抗体−薬物複合体は、抗体の高度に特異的な標的化能を、細胞毒性化合物のような治療上活性な化合物と組み合わせた、治療用タンパク質のカテゴリである。ＡＤＣは、生分解性の化学リンカーを介して、治療活性剤にリンクされた抗体で構成される。より詳細には、ＡＤＣには、ヒトまたはヒト化ｍＡｂが含まれていてもよく、正常細胞では発現が最小限または全くないが、異常な「標的」細胞では発現される抗原に特異的である。ＡＤＣは、さらに、標的細胞を破壊することができる細胞毒性剤などの強力な薬剤を含む。そのような薬剤は、通常、全身的には毒性であるため、一般的な全身投与には好適ではない。ＡＤＣのｍＡｂコンポーネントの標的化能により、全てが全身に分配されることはなく、薬剤が標的細胞に特異的に誘導され、標的細胞によって吸収され、それらの細胞内で効果を発揮することができる。ＡＤＣを形成するために、ｍＡｂは、細胞外環境（例えば、静脈内および間質循環）で安定であるが、ＡＤＣが細胞内に取り込まれると分解する、不安定な結合を有する薬剤に連結される。ＡＤＣと薬剤との間の結合が分解されると、薬剤は細胞内に放出されて、細胞に影響を及ぼす。ＡＤＣは、これらの化合物を単独で使用するには毒性が高すぎる場合は特に、細胞障害性薬剤との使用に好適である。がん化学療法では、例えば、ＡＤＣでの使用のために選択された薬剤のいくつかは、従来の抗がん剤よりも数桁もの強い毒性がある。例としては、抗微小管剤、アルキル化剤、およびＤＮＡ副溝結合剤が挙げられ、これらは毒性が高すぎてうまく投与できない場合があるが、癌細胞でのみ発現される抗原と結合するｍＡｂの特異性を使用して、癌細胞を標的とすることができる。ＡＤＣが腫瘍に局在し、表面の標的細胞の抗原に結合すると、その複合体は、細胞内へと小胞内に内部移行し得る。内在化した小胞は、互いに融合し、エンドソーム−リソソーム経路に入り、そこでプロテアーゼに接触し、ｍＡｂおよび／またはリンカー分子が消化され、それによって薬剤のペイロードが放たれる。ペイロード（例えば、細胞毒性剤）は、次いで、リソソーム膜を通過して、細胞質および／または核に入り、そこで、その医薬（例えば、細胞毒性）効果を発揮する。非常に強力な医薬化合物のこの集中的な送達により、これらの薬剤への正常組織の曝露を最小限に抑えながら、意図した治療効果を最大化する。ＡＤＣを含む製剤は、ＡＤＣが治療される標的細胞に到達するように、静脈内または局所投与に好適である。
【００３３】
特定の実施形態では、治療用タンパク質は、ＰＥＧ化されており、それらがポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）および／またはポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）ユニットを含むことを意味する。ＰＥＧ化タンパク質、またはＰＥＧタンパク質複合体は、溶解性、薬物動態、薬力学、免疫原性、腎クリアランス、安定性などの有益な特性により、治療用途において有用性が見出されている。ＰＥＧ化タンパク質の非限定的な例は、ＰＥＧ化インターフェロン（ＰＥＧ−ＩＦＮ）、ＰＥＧ化抗ＶＥＧＦ、ＰＥＧタンパク質結合薬、アダジェン、ペグアスパラガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペグロチカーゼ、ペグビソマント、ＰＥＧ化エポエチン−β、およびセルトリズマブペゴルである。
【００３４】
ＰＥＧ化タンパク質は、タンパク質と１つ以上の反応性官能基を有するＰＥＧ試薬との反応などの様々な方法によって合成することができる。ＰＥＧ試薬の反応性官能基は、リジン、ヒスチジン、システイン、Ｎ末端などの標的タンパク質の部位で、タンパク質との結合を形成することができる。典型的なＰＥＧ化試薬は、アルデヒド、マレイミド、スクシンイミドなどの反応性官能基を有し、タンパク質上の標的アミノ酸残基と特異的な反応性を有している。ＰＥＧ化試薬は、約１〜約１０００のＰＥＧ鎖長および／またはＰＰＧ反復単位を有することができる。ＰＥＧ化の他の方法としては、グリコ−ＰＥＧ化が含まれ、タンパク質が最初にグリコシル化され、次いでグリコシル化された残基が第２のステップでＰＥＧ化される。特定のＰＥＧ化プロセスは、シアリルトランスフェラーゼやトランスグルタミナーゼなどの酵素によって支援される。
【００３５】
ＰＥＧ化タンパク質は、天然の非ＰＥＧ化タンパク質よりも治療上の利点を提供できるが、これらの材料は、精製、溶解、濾過、濃縮、および投与を困難にする物理的または化学的特性を有する場合がある。タンパク質のＰＥＧ化は、天然のタンパク質と比較して、より高い溶液粘度をもたらす可能性があり、これは一般に、より低い濃度でのＰＥＧ化タンパク質溶液の製剤を必要とする。
【００３６】
最小限の注射量で患者に投与できるように、安定した低粘度の溶液でタンパク質治療薬を製剤化することが望ましい。例えば、薬物の皮下（ＳＣ）または筋肉内（ＩＭ）注射は、一般に、好ましくは２ｍＬ未満の少量の注射量を必要とする。ＳＣとＩＭの注射経路は、自己投与型のケアに好適である。これは、直接的な医学的監督下でのみ行われる静脈内（ＩＶ）注射と比較して、より低コストで、より扱いやすい。ＳＣまたはＩＭ注射用の製剤は、細いゲージの針を通して治療用溶液を容易に流すことができるように、一般に３０ｃＰ未満、好ましくは２０ｃＰ未満の低い溶液粘度を必要とする。少量の注射容量と低粘度の要件のこの組み合わせは、ＳＣまたはＩＭ注射経路でのＰＥＧ化タンパク質治療剤の使用に課題を提示する。
【００３７】
治療上有効量の治療用タンパク質を含む製剤は、「治療用製剤」と呼ばれる場合がある。治療用製剤に含まれる治療用タンパク質は、その「タンパク質活性成分」と呼ばれることもある。通常、治療用製剤は、他の任意選択的な成分を含むかまたは含まずに、治療上有効量のタンパク質活性成分および賦形剤を含む。本明細書で使用される場合、「治療用」という用語は、既存の障害の治療および障害の予防の両方を含む。治療用タンパク質には、例えば、ベバシズマブ、トラスツズマブ、アダリムマブ、インフリキシマブ、エタネルセプト、ダルベポエチンアルファ、エポエチンアルファ、セツキシマブ、フィルグラスチム、およびリツキシマブなどのタンパク質が含まれる。他の治療用タンパク質は、当業者によく知られているであろう。
【００３８】
「治療」は、症状の発症の予防または遅延、および／または障害の症状を緩和または寛解を含み、障害を治癒、癒し、緩和、改善、矯正、またはその他の形で障害に有益に影響することを意図したあらゆる手段を含む。治療を必要とするこれらの患者には、すでに特定の障害を有する患者と、障害の予防が望まれる患者の両方が含まれる。障害は、急性または慢性疾患、または哺乳動物を急性または慢性疾患にかかりやすくする病態を含む、哺乳動物の恒常性の健常さを変化させる任意の状態である。障害の非限定的な例としては、癌、代謝障害（例えば、糖尿病）、アレルギー障害（例えば、喘息）、皮膚障害、心血管障害、呼吸障害、血液障害、筋骨格障害、炎症性またはリウマチ性障害、自己免疫障害、胃腸障害、泌尿器障害、性的および生殖障害、神経障害などが含まれる。治療の目的での「哺乳動物」という用語は、ヒト、飼育動物、ペット動物、家畜、競技用（ｓｐｏｒｔｉｎｇ）動物、使役動物などを含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指し得る。したがって、「治療」には、獣医学的な治療とヒトの治療の両方が含まれ得る。便宜上、そのような「治療」を受けている哺乳動物は、「患者」と呼ぶことができる。特定の実施形態では、患者は、子宮内の胎児動物を含む任意の齢であり得る。
【００３９】
実施形態では、治療は、それを必要とする哺乳動物に、治療上有効量の治療用製剤を提供することを含む。「治療上有効量」は、それを必要とする哺乳動物に投与される少なくとも最小濃度の治療用タンパク質であり、既存の障害の治療または予想される障害の予防（そのような治療またはそのような「治療介入」である予防）に効果を現す。治療用製剤中に活性成分として含まれ得る治療上有効量の様々な治療用タンパク質は、当該技術分野でよく知られているかもしれない。または、今後発見されるか、または治療介入に適用される治療用タンパク質について、治療上有効量は、当業者によって、通常の実験のみを使用して、実施される標準的な技術によって決定され得る。
【００４０】
ｂ．非治療用バイオポリマーおよび関連定義
非治療目的（すなわち、治療を含まない目的）、例えば、家庭、栄養、商業、および産業用途、に使用されるこれらのタンパク質は、「非治療用タンパク質」と呼ばれる場合がある。非治療用タンパク質を含む製剤は、「非治療用製剤」と呼ばれる場合がある。非治療用タンパク質は、植物源、動物源に由来するか、または細胞培養物から生成され得る。それらはまた、酵素または構造タンパク質であり得る。非治療用タンパク質は、触媒、ヒトと動物の栄養、加工補助剤、洗浄剤、廃棄物処理など、家庭、栄養、商業、および産業の用途に使用することができる。
【００４１】
非治療用バイオポリマーの重要なカテゴリは、酵素のカテゴリである。酵素には、例えば、触媒、ヒトおよび動物の栄養成分、加工助剤、洗浄剤、廃棄物処理剤など、いくつかの非治療用途がある。酵素触媒は、さまざまな化学反応を促進するために使用される。非治療用使用のための酵素触媒の例としては、カタラーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、およびリガーゼが挙げられる。ヒトおよび動物の栄養用の酵素の使用には、栄養補助食品、タンパク質の栄養源、微量栄養素のキレート化または制御された送達、消化補助剤、およびサプリメントが含まれる。これらは、アミラーゼ、プロテアーゼ、トリプシン、ラクターゼなどに由来し得る。酵素加工助剤は、ベーキング、醸造、発酵、ジュース加工、ワイン製造のような業務における食品および飲料製品の生産を改善するために使用される。これらの食品および飲料加工補助剤の例としては、アミラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、グルカナーゼ、リパーゼ、およびラクターゼが挙げられる。酵素は、バイオ燃料の生成にも使用することができる。例えば、バイオ燃料用のエタノールは、セルロース系材料やリグノセルロース系材料などのバイオマス原料の酵素分解によって助けられる。そのような原料物質をセルラーゼとリグニナーゼで処理することで、バイオマスが発酵して燃料となる基質に変わる。他の商業用途では、酵素は、洗剤、クリーナー、および汚れを浮かす補助剤として、洗濯、食器洗い、表面洗浄、および機器洗浄用途に使用される。この目的のための典型的な酵素には、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、およびリパーゼが含まれる。さらに、非治療用酵素は、セルラーゼによる織物の軟化、皮革加工、廃棄物処理、汚染堆積物処理、水処理、パルプの漂白、パルプの軟化と剥離など、様々な商業的および工業的プロセスで使用される。これらの目的のための典型的な酵素は、アミラーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、およびリグニナーゼである。
【００４２】
非治療用バイオポリマーの他の例としては、ケラチン、コラーゲン、ゼラチン、エラスチン、フィブロイン、アクチン、チューブリン、またはそれらの加水分解、分解、または誘導体化形態などの繊維状または構造タンパク質を含む。これらの材料は、ゼラチン、アイスクリーム、ヨーグルト、菓子などの食品成分の調製と製剤化に使用される。それらはまた、増粘剤、レオロジー調整剤、口当たり改善剤として、および栄養タンパク質の供給源として食品に添加される。化粧品およびパーソナルケア業界では、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、および加水分解されたケラチンが、スキンケアおよびヘアケア製剤として広く使用されている。非治療用バイオポリマーのさらに他の例は、ベータラクトグロブリン、アルファラクトアルブミン、および血清アルブミンなどの乳清タンパク質である。これらの乳清タンパク質は、酪農業務からの副生成物として大量に生成され、様々な非治療用途に使用されてきた。
【００４３】
２．測定
実施形態では、本明細書に記載のタンパク質含有製剤は、単量体損失に対して耐性があり、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）分析によって測定される。本明細書で使用されるＳＥＣ分析では、分析物のメインピークは、一般に、製剤に含まれる標的タンパク質に関連しており、タンパク質のこのメインピークは、単量体ピークと呼ばれる。単量体ピークは、凝集（二量体、三量体、オリゴマーなど）または断片化状態とは対照的に、単量体状態での標的タンパク質、例えばタンパク質活性成分の量を表す。単量体のピーク面積は、標的タンパク質に関連する単量体、凝集体、断片のピークの総面積と比較できる。したがって、タンパク質含有製剤の安定性は、経過時間後の単量体の相対量によって観察できる。本発明のタンパク質含有製剤の安定性の改善は、したがって、賦形剤を含まない対照製剤中のパーセント単量体と比較して、一定の経過時間後、高いパーセント単量体として測定することができる。
【００４４】
実施形態では、理想的な安定性の結果は、ＳＥＣ分析によって決定されるように、９８〜１００％の単量体ピークを有することである。実施形態では、本発明のタンパク質含有製剤の安定性の改善は、ストレス条件への曝露後、賦形剤を含まない対照製剤でのパーセント単量体と比較して、そのような対照製剤が同じストレス条件にさらされた場合、より高いパーセント単量体として測定され得る。実施形態では、ストレス条件は、低温保存、高温保存、空気への曝露、光への曝露、気泡への曝露、剪断条件への曝露、または凍結／解凍サイクルへの曝露であり得る。
【００４５】
実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質含有製剤は、タンパク質粒子サイズの増加に耐性があり、動的光散乱（ＤＬＳ）分析によって測定される。本明細書で使用されるＤＬＳ分析では、タンパク質含有製剤中のタンパク質の粒子サイズは、中央粒径として観察することができる。理想的には、ＤＬＳ分析にかけられた場合、標的タンパク質の中央粒径は、比較的変化しないはずであり、なぜなら、粒径が、凝集状態（二量体、三量体、オリゴマーなど）または断片化状態とは対照的に、単量体状態での有効成分を表すためである。中央粒径の増加は、凝集したタンパク質を表す可能性がある。したがって、タンパク質含有製剤の安定性は、経過時間後の中央粒径の相対的変化によって観察することができる。
【００４６】
実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質含有製剤は、ＤＬＳ分析により測定されるように、多分散粒子サイズ分布を形成することに耐性がある。実施形態では、タンパク質含有製剤は、コロイドタンパク質粒子の単分散粒子サイズ分布を含むことができる。実施形態では、理想的な安定性の結果は、製剤の初期中央粒径と比較して中央粒径の変化が１０％未満であることである。実施形態では、本発明のタンパク質含有製剤の安定性の改善は、一定の経過時間後、賦形剤を含まない対照製剤の中央粒径と比較して、中央粒径のより低いパーセント変化として測定され得る。実施形態では、本発明のタンパク質含有製剤の安定性の改善は、ストレス条件への曝露後、賦形剤を含まない対照製剤での中央粒径のパーセント変化と比較して、そのような対照製剤が同じストレス条件にさらされた場合、中央粒径のより低いパーセント変化として測定され得る。実施形態では、ストレス条件は、低温保存、高温保存、空気への曝露、光への曝露、気泡への曝露、剪断条件への曝露、または凍結／解凍サイクルへの曝露であり得る。実施形態では、本発明のタンパク質含有製剤治療用製剤の安定性の改善は、賦形剤を含まない対照製剤での多分散の粒子サイズ分布のパーセント変化と比較して、そのような対照製剤が同じストレス条件にさらされた場合、ＤＬＳにより測定される、より少ない多分散粒子サイズ分布として測定され得る。
【００４７】
実施形態では、本明細書に開示されるタンパク質含有製剤は、濁度、光散乱、および／または粒子計数分析によって測定されるように、粒子形成、変性、または沈殿に対して耐性がある。濁度、光散乱、または粒子計測分析では、一般的に、値が小さいほど、製剤中の懸濁粒子の数が少ないことを表す。濁度、光散乱、または粒子計数の増加は、標的タンパク質の溶液が安定していないことを示している可能性がある。したがって、タンパク質含有製剤の安定性は、経過時間後の濁度、光散乱、または粒子計測の相対量によって観察され得る。実施形態では、理想的な安定性な結果は、低くて比較的一定の濁度、光散乱、または粒子計数値を有することである。実施形態では、本明細書に記載のタンパク質含有製剤の安定性の改善は、賦形剤を含まない対照製剤の濁度、光散乱、または粒子計数値と比較して、一定の経過時間後、より低い濁度、より低い光散乱、またはより少ない粒子数として測定され得る。実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質含有製剤の安定性の改善は、賦形剤を含まない対照製剤の濁度、光散乱、または粒子計数と比較して、そのような対照製剤が同じストレス条件にさらされた場合、より低い濁度、より低い光散乱、またはより少ない粒子数として測定され得る。実施形態では、ストレス条件は、低温保存、高温保存、空気への曝露、光への曝露、気泡への曝露、剪断条件への曝露、または凍結／解凍サイクルへの曝露であり得る。実施形態では、本明細書に開示されるタンパク質含有製剤は、対照製剤と比較して、より高いパーセンテージの生物学的活性を保持する。生物学的活性は、結合アッセイを介して、または哺乳動物での治療効果を介して観察することができる。
【００４８】
３．治療用製剤
一態様では、本明細書に開示される製剤および方法は、治療上有効量の治療用タンパク質および賦形剤化合物を含む、改善されたまたは低減された粘度の安定した液体製剤を提供する。実施形態では、製剤は、許容可能な有効成分の濃度および許容可能な粘度を提供しながら、安定性を改善することができる。実施形態では、製剤は、対照製剤と比較した場合、安定性の改善を提供する。本開示の適用上、対照製剤は、賦形剤化合物を欠く以外は、治療用製剤とあらゆる点で、乾燥重量ベースで同一であるタンパク質活性成分を含む製剤である。実施形態では、製剤は、長期保存、２５〜４５℃などの高温、凍結／解凍条件、剪断または混合、注射、希釈、気泡曝露、酸素曝露、光曝露、および凍結乾燥のストレス条件下で、安定性の改善を提供する。実施形態では、タンパク質含有製剤の改善された安定性は、対照製剤と比較して、可溶性凝集体、粒子、目視不可の粒子（ｓｕｂｖｉｓｉｂｌｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、またはゲル形成がより低いパーセンテージの形態である。
【００４９】
液体タンパク質製剤の粘度は、様々な要因によって影響を受ける可能性があることが理解され、限定されないが、タンパク質自体の性質（例えば、酵素、抗体、受容体、融合タンパク質など）、そのサイズ、三次元構造、化学組成、および分子量、製剤中のその濃度、タンパク質以外の製剤の成分、望ましいｐＨ範囲、製剤の保存条件、および患者に製剤を投与する方法、が含まれる。本明細書に記載の賦形剤化合物とともに使用するのに最も好適な治療用タンパク質は、好ましくは本質的に純粋であり、すなわち、汚染タンパク質を含まない。実施形態において、「本質的に純粋な」治療用タンパク質は、すべて組成物中の治療用タンパク質および汚染タンパク質の総重量に基づいて、治療用タンパク質の少なくとも９０重量％、または好ましくは少なくとも９５重量％、またはより好ましくは少なくとも９９重量％を含むタンパク質組成物である。明確にするために、賦形剤として添加されるタンパク質は、この定義に含まれることを意図していない。本明細書に記載の治療用製剤は、医薬品グレードの製剤、すなわち、哺乳動物を治療するための使用が意図された製剤であり、タンパク質活性成分の所望の治療効果が達成可能で、製剤が投与される哺乳動物に有毒な成分を含有しない形態である。
【００５０】
実施形態では、治療用製剤は、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬのタンパク質活性成分を含む。他の実施形態では、治療用製剤は、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬのタンパク質活性成分を含む。他の実施形態では、治療用製剤は、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質活性成分を含む。他の実施形態では、治療用製剤は、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質活性成分を含む。他の実施形態では、治療用製剤は、少なくとも２００ｍｇ／ｍＬのタンパク質活性成分を含む。さらに他の実施形態では、治療用製剤溶液は、少なくとも３００ｍｇ／ｍＬのタンパク質活性成分を含む。一般に、本明細書に開示される賦形剤化合物は、約５〜約３００ｍｇ／ｍＬの量で治療用製剤に添加される。実施形態では、賦形剤化合物は、約１０〜約２００ｍｇ／ｍＬの量で添加することができる。実施形態では、賦形剤化合物は、約２０〜約１００ｍｇ／ｍＬの量で添加することができる。実施形態では、賦形剤は、約２５〜約７５ｍｇ／ｍＬの量で添加することができる。
【００５１】
様々な分子量の賦形剤化合物は、製剤中のタンパク質活性成分と組み合わせる場合、特定の有利な特性のために選択される。賦形剤化合物を含む治療用製剤の例を、以下に提供する。実施形態では、賦形剤化合物は、５０００Ｄａ未満の分子量を有する。実施形態では、賦形剤化合物は、１０００Ｄａ未満の分子量を有する。実施形態では、賦形剤化合物は、５００Ｄａ未満の分子量を有する。
【００５２】
実施形態では、本明細書に開示される賦形剤化合物は、粘度低下量で治療用製剤に添加される。実施形態では、粘度低下量は、対照製剤と比較した場合、製剤の粘度を少なくとも１０％低減する賦形剤化合物の量である。本開示の適用上、対照製剤は、賦形剤化合物を欠く以外は、治療用製剤とあらゆる点で乾燥重量ベースで同一であるタンパク質活性成分を含む製剤である。実施形態では、粘度低下量は、対照製剤と比較した場合、製剤の粘度を少なくとも３０％低下させる賦形剤化合物の量である。実施形態では、粘度低下量は、対照製剤と比較した場合、製剤の粘度を少なくとも５０％低下させる賦形剤化合物の量である。実施形態では、粘度低下量は、対照製剤と比較した場合、製剤の粘度を少なくとも７０％低下させる賦形剤化合物の量である。実施形態では、粘度低下量は、対照製剤と比較した場合、製剤の粘度を少なくとも９０％低下させる賦形剤化合物の量である。
【００５３】
実施形態では、粘度低下量は、１００ｃＰ未満の粘度を有する治療用製剤をもたらす。他の実施形態では、治療用製剤は、５０ｃＰ未満の粘度を有する。他の実施形態では、治療用製剤は、２０ｃＰ未満の粘度を有する。さらに他の実施形態では、治療用製剤は、１０ｃＰ未満の粘度を有する。本明細書で使用される「粘度」という用語は、本明細書に開示される方法によって測定されたときの動粘度値を指す。
【００５４】
本開示による治療用製剤は、製剤の安定性を改善する特定の有利な特性を有する。実施形態では、治療用製剤は、剪断分解、相分離、曇り、酸化、脱アミド化、凝集、沈殿、および変性に対して耐性がある。実施形態では、治療用製剤は、対照製剤と比較して、より効果的に処理、精製、保存、注射、投薬、濾過、および遠心分離される。
【００５５】
実施形態では、治療用製剤は、高濃度の治療用タンパク質で患者に投与される。実施形態では、治療用製剤は、治療用賦形剤を欠く同様の製剤で経験されるよりも少ない注入量および／または少ない不快感で患者に投与される。実施形態では、治療用製剤は、治療用賦形剤を欠く同様の製剤で必要とされるよりも細いゲージの針または小さな注射器の力を使用して患者に投与される。実施形態では、治療用製剤は、デポ注射として投与される。実施形態では、治療用製剤は、体内での治療用タンパク質の半減期を延長する。
【００５６】
本明細書に開示される治療用製剤のこれらの特徴は、臨床状況、すなわち、典型的なＩＭ／ＳＣ目的の小口径針の使用、および許容範囲の注入量（例えば、２〜３ｍＬ）の使用、かつ、これらの条件で、有効量の製剤が、単一の注射部位で単一の注射で投与され得ることを含む、筋肉内注射の同意が患者から得られる状況において、筋肉内または皮下注射により、そのような製剤の投与を可能にする。対照的に、従来の製剤技術を使用した同等の投与量の治療用タンパク質の注射は、従来の製剤のより高い粘度によって制限されるため、従来の製剤のＳＣ／ＩＭ注射は、臨床状況では好適ではない。
【００５７】
この開示による治療用製剤は、改善された安定性に適う特定の有利な特性を有し得る。実施形態では、治療用製剤は、剪断分解、相分離、曇り、沈殿、酸化、脱アミド化、凝集、および／または変性に対して耐性がある。実施形態では、治療用製剤は、対照製剤と比較して、より効果的に処理、精製、保存、注射、投薬、濾過、および／または遠心分離される。
【００５８】
実施形態では、本明細書に開示される治療用製剤は、単量体損失に対して耐性があり、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）分析によって測定される。ＳＥＣ分析では、分析物のメインピークは、一般に、治療用タンパク質などの製剤の有効成分に関連しており、有効成分のこのメインピークは、単量体ピークと呼ばれる。単量体ピークは、凝集（二量体、三量体、オリゴマーなど）とは対照的に、単量体状態での活性成分の量を表す。本明細書に記載の賦形剤化合物とともに製剤化された治療用タンパク質の高濃度溶液は、シリンジまたはプレフィルドシリンジを使用して患者に投与することができる。したがって、治療用製剤の安定性は、経過時間後、単量体の相対量によって観察することができる。実施形態では、本明細書に開示される治療用製剤の安定性の改善は、賦形剤を含まない対照製剤中のパーセント単量体と比較して、一定の経過時間後、より高いパーセント単量体として測定され得る。実施形態において、本明細書に開示される治療用製剤の安定性の改善は、ストレスへの曝露後、賦形剤を含まない対照製剤（ストレス条件への曝露後）のパーセント単量体と比較して、より高いパーセント単量体として測定され得る。実施形態では、ストレス条件は、低温保存、高温保存、空気への曝露、気泡への曝露、剪断条件への曝露、または凍結／解凍サイクルへの曝露であり得る。
【００５９】
実施形態では、本発明の治療用製剤は、タンパク質粒子サイズの増加に耐性があり、動的光散乱（ＤＬＳ）分析によって測定される。ＤＬＳ分析では、治療用タンパク質の粒子サイズは、中央粒径として観察することができる。理想的には、治療用タンパク質の中央粒径は、比較的に変化しないはずである。したがって、中央粒径の増加は、凝集したタンパク質を表す可能性がある。したがって、治療用製剤の安定性は、経過時間後の中央粒径の相対的変化によって観察することができる。実施形態では、本明細書に開示される治療用製剤は、動的光散乱（ＤＬＳ）分析により測定されるように、多分散粒子サイズ分布を形成することに耐性がある。実施形態では、本発明の治療用製剤の安定性の改善は、一定の経過時間後、賦形剤を含まない対照製剤の中央粒径と比較して、中央粒径のより低いパーセント変化として測定され得る。実施形態では、本明細書に開示される治療用製剤の安定性の改善は、ストレス条件への曝露後、賦形剤を含まない対照製剤での中央粒径のパーセント変化と比較して、中央粒径のより低いパーセント変化として測定され得る。言い換えれば、実施形態では、改善された安定性は、粒子サイズの増加を防ぎ、光散乱によって測定される。実施形態では、ストレス条件は、低温保存、高温保存、空気への曝露、気泡への曝露、剪断条件への曝露、または凍結／解凍サイクルへの曝露であり得る。実施形態では、本明細書に開示される治療用製剤の安定性の改善は、賦形剤を含まない対照製剤における多分散の粒子サイズ分布と比較して、ＤＬＳにより測定される、より少ない多分散粒子サイズ分布として測定され得る。
【００６０】
実施形態では、本明細書に開示される治療用製剤は、濁度、光散乱、または粒子計数分析によって測定される、沈殿に対して耐性がある。実施形態では、本明細書に開示される治療用製剤の安定性の改善は、賦形剤を含まない対照製剤の濁度、光散乱、または粒子計数値と比較して、一定の経過時間後、より低い濁度、より低い光散乱、またはより少ない粒子数として測定され得る。実施形態では、本明細書に開示される治療用製剤の安定性の改善は、ストレス条件への曝露後、賦形剤を含まない対照製剤の濁度、光散乱、または粒子計数と比較して、より低い光散乱、またはより少ない粒子数として測定され得る。実施形態では、ストレス条件は、低温保存、高温保存、空気への曝露、気泡への曝露、剪断条件への曝露、または凍結／解凍サイクルへの曝露であり得る。
【００６１】
実施形態では、治療用賦形剤は、酸化的損傷に対して治療用タンパク質を安定化し、それによってその安定性を改善する抗酸化特性を有する。実施形態では、治療用製剤は、周囲温度でまたは冷蔵庫条件で、治療用タンパク質の効力の明らかな損失を伴うことなく、長期間保存される。実施形態では、治療用製剤は、それが必要になるまで、保存のために乾燥され、次いで、水などの適切な溶媒で再構築される。有利には、本明細書に記載されるように調製された製剤は、数ヶ月から数年までの長期間にわたって安定であり得る。例外的に長い期間の保存が望まれる場合、製剤は、タンパク質の変性を心配することなく、冷凍庫で保存することができる（後で再活性化される）。実施形態では、冷蔵を必要としない長期保存のために、製剤が調製され得る。
【００６２】
実施形態では、本明細書に開示される賦形剤化合物は、安定性改善量で治療用製剤に添加される。実施形態では、安定性改善量は、対照製剤と比較した場合、製剤の粘度を少なくとも１０％低減する賦形剤化合物の量である。本開示の適用上、対照製剤は、賦形剤化合物を欠く以外は、治療用製剤と重量ベースで実質的に同様なタンパク質活性成分を含む製剤である。実施形態では、安定性改善量は、対照製剤と比較した場合、製剤の分解を少なくとも３０％低減する賦形剤化合物の量である。実施形態では、安定性改善量は、対照製剤と比較した場合、製剤の分解を少なくとも５０％低減する賦形剤化合物の量である。実施形態では、安定性改善量は、対照製剤と比較した場合、製剤の分解を少なくとも７０％低減する賦形剤化合物の量である。実施形態では、安定性改善量は、対照製剤と比較した場合、製剤の分解を少なくとも９０％低減する賦形剤化合物の量である。
【００６３】
治療用製剤を調製する方法は、当業者によく知られていよう。本発明の治療用製剤は、例えば、治療用タンパク質が溶液に添加される前または後に、賦形剤化合物を製剤に添加することによって調製することができる。治療用製剤は、例えば、第１の（より低い）濃度で治療用タンパク質と賦形剤を組み合わせ、次いで濾過または遠心分離で処理して、第２の（より高い）濃度の治療用タンパク質を生成することによって生成することができる。治療用製剤は、カオトロープ、コスモトロープ、ヒドロトロープ、および塩を含む１つ以上の賦形剤化合物で作製することができる。治療用製剤は、カプセル化、分散、リポソーム、小胞形成などの技術を使用して、１つまたは複数の賦形剤化合物を用いて作製することができる。本明細書に開示される賦形剤化合物を含む治療用製剤を調製するための方法は、賦形剤化合物の組み合わせを含み得る。実施形態では、賦形剤の組み合わせは、より低い粘度、改善された安定性、または注射部位の疼痛の低減において利益を生むことができる。保存剤、界面活性剤、糖、スクロース、トレハロース、多糖、アルギニン、プロリン、ヒアルロニダーゼ、安定剤、緩衝液などを含む他の添加剤が、それらの製造中に治療用製剤に導入されてもよい。本明細書で使用される場合、薬学的に許容される賦形剤化合物は、無毒性であり、動物および／またはヒトへの投与に好適なものである。
【００６４】
４．非治療用製剤
一態様では、本明細書に開示される製剤および方法は、有効量の非治療用タンパク質および賦形剤化合物を含む、改善または低減された粘度の安定した液体製剤を提供する。実施形態では、製剤は、有効成分の許容可能な濃度および許容可能な粘度を提供しながら、安定性を改善する。実施形態では、製剤は、対照製剤と比較した場合、安定性の改善を提供する。本開示の適用上、対照製剤は、賦形剤化合物を欠く以外は、非治療用製剤とあらゆる点で乾燥重量ベースで同一であるタンパク質活性成分を含む製剤である。
【００６５】
液体タンパク質製剤の粘度は、様々な要因によって影響を受ける可能性があることが理解され、限定されないが、タンパク質自体の性質（例えば、酵素、構造タンパク質、加水分解の程度など）、そのサイズ、三次元構造、化学組成、および分子量、製剤中のその濃度、タンパク質以外の製剤の成分、望ましいｐＨ範囲、および製剤の保存条件、が含まれる。
【００６６】
実施形態では、非治療用製剤は、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬのタンパク質活性成分を含む。他の実施形態では、非治療用製剤は、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬのタンパク質活性成分を含む。他の実施形態では、非治療用製剤は、少なくとも２００ｍｇ／ｍＬのタンパク質活性成分を含む。さらに他の実施形態では、非治療用製剤溶液は、少なくとも３００ｍｇ／ｍＬのタンパク質活性成分を含む。一般に、本明細書に開示される賦形剤化合物は、約５〜約３００ｍｇ／ｍＬの量で非治療用製剤に添加される。実施形態では、賦形剤は、約１０〜約２００ｍｇ／ｍＬの量で添加される。実施形態では、賦形剤は、約２０〜約１００ｍｇ／ｍＬの量で添加される。実施形態では、賦形剤は、約２５〜約７５ｍｇ／ｍＬの量で添加される。
【００６７】
様々な分子量の賦形剤化合物は、製剤中のタンパク質活性成分と組み合わせる場合、特定の有利な特性のために選択される。賦形剤化合物を含む非治療用製剤の例を、以下に提供する。実施形態では、賦形剤化合物は、５０００Ｄａ未満の分子量を有する。実施形態では、賦形剤化合物は、１０００Ｄａ未満の分子量を有する。実施形態では、賦形剤化合物は、５００Ｄａ未満の分子量を有する。
【００６８】
実施形態では、本明細書に開示される賦形剤化合物は、粘度低下量で非治療用製剤に添加される。実施形態では、粘度低下量は、対照製剤と比較した場合、製剤の粘度を少なくとも１０％低減する賦形剤化合物の量である。本開示の適用上、対照製剤は、賦形剤化合物を欠く以外は、治療用製剤とあらゆる点で乾燥重量ベースで同一である、タンパク質活性成分を含む製剤である。実施形態では、粘度低下量は、対照製剤と比較した場合、製剤の粘度を少なくとも３０％低下させる賦形剤化合物の量である。実施形態では、粘度低下量は、対照製剤と比較した場合、製剤の粘度を少なくとも５０％低下させる賦形剤化合物の量である。実施形態では、粘度低下量は、対照製剤と比較した場合、製剤の粘度を少なくとも７０％低下させる賦形剤化合物の量である。実施形態では、粘度低下量は、対照製剤と比較した場合、製剤の粘度を少なくとも９０％低下させる賦形剤化合物の量である。
【００６９】
実施形態では、粘度低下量は、１００ｃＰ未満の粘度を有する非治療用製剤をもたらす。他の実施形態では、非治療用製剤は、５０ｃＰ未満の粘度を有する。他の実施形態では、非治療用製剤は、２０ｃＰ未満の粘度を有する。さらに他の実施形態では、非治療用製剤は、１０ｃＰ未満の粘度を有する。本明細書で使用される「粘度」という用語は、動粘度値を指す。
【００７０】
本開示による非治療用製剤は、製剤の安定性を改善する特定の有利な特性を有することができる。実施形態では、非治療用製剤は、剪断分解、相分離、曇り、酸化、脱アミド化、凝集、沈殿、および変性に対して耐性がある。実施形態では、治療用製剤は、対照製剤と比較して、より効果的に処理、精製、保存、ポンプ輸送、濾過、および遠心分離することができる。
【００７１】
実施形態では、非治療用賦形剤は、酸化的損傷に対して非治療用タンパク質を安定化し、それによってその安定性を改善する、抗酸化特性を有する。実施形態では、非治療用製剤は、周囲温度でまたは冷蔵庫条件で、非治療用タンパク質の効力の明らかな損失を伴うことなく、長期間保存される。実施形態では、非治療用製剤は、それが必要になるまで、保存のために乾燥され、次いで、水などの適切な溶媒で再構築することができる。有利には、本明細書に記載されるように調製された製剤は、数ヶ月から数年までの長期間にわたって安定である。例外的に長い期間の保存が望まれる場合、製剤は、タンパク質の変性を心配することなく、冷凍庫で保存される（後で再活性化される）。実施形態では、冷蔵を必要としない長期保存のために、製剤が調製される。
【００７２】
実施形態では、本明細書に開示される賦形剤化合物は、安定性改善量で非治療用製剤に添加される。実施形態では、安定性改善量は、対照製剤と比較した場合、製剤の分解を少なくとも１０％低減する賦形剤化合物の量である。本開示の適用上、対照製剤は、賦形剤化合物を欠く以外は、治療用製剤と重量ベースで実質的に同様なタンパク質活性成分を含む製剤である。実施形態では、安定性改善量は、対照製剤と比較した場合、製剤の分解を少なくとも３０％低減する賦形剤化合物の量である。実施形態では、安定性改善量は、対照製剤と比較した場合、製剤の分解を少なくとも５０％低減する賦形剤化合物の量である。実施形態では、安定性改善量は、対照製剤と比較した場合、製剤の分解を少なくとも７０％低減する賦形剤化合物の量である。実施形態では、安定性改善量は、対照製剤と比較した場合、製剤の分解を少なくとも９０％低減する賦形剤化合物の量である。
【００７３】
本明細書に開示される賦形剤化合物を含む非治療用製剤を調製する方法は、当業者によく知られていよう。例えば、非治療用タンパク質が溶液に添加される前または後に、賦形剤化合物を製剤に添加することができる。非治療用製剤は、第１の（より低い）濃度で生成され、次いで濾過または遠心分離で処理して、第２の（より高い）濃度を生成することができる。非治療用製剤は、カオトロープ、コスモトロープ、ヒドロトロープ、および塩を含む１つ以上の賦形剤化合物で作製することができる。非治療用製剤は、カプセル化、分散、リポソーム、小胞形成などの技術を使用して、１つまたは複数の賦形剤化合物を用いて作製することができる。保存剤、界面活性剤、安定剤などを含む他の添加剤を、それらの製造中に、非治療用製剤に導入することができる。
【００７４】
５．賦形剤化合物
いくつかの賦形剤化合物が本明細書に記載され、それぞれは、１つ以上の治療用または非治療用タンパク質を伴う使用に好適であり、それぞれは、高濃度のタンパク質を含むように製剤を構成することができる。以下に記載の賦形剤化合物のカテゴリのいくつかは：（１）ヒンダードアミン、（２）アニオン性芳香族、（３）官能化アミノ酸、（４）オリゴペプチド、（５）短鎖有機酸、（６）低分子量脂肪族ポリ酸、（７）ジオンおよびスルホン、（８）双性イオン性賦形剤、ならびに（９）水素結合性元素を含むクラウディング剤である。理論に束縛されることなく、本明細書に記載の賦形剤化合物は、他の方法では粒子間（すなわち、タンパク質間）相互作用に関与するであろう治療用タンパク質の特定の断片、配列、構造、または区域と関連すると考えられる。これらの賦形剤化合物と治療用または非治療用タンパク質との会合は、タンパク質間の相互作用を覆い隠すため、過剰な溶液粘度を引き起こすことなく、タンパク質を高濃度で製剤化できるようになる。実施形態では、賦形剤化合物は、より安定したタンパク質間相互作用をもたらすことができる。タンパク質間相互作用は、タンパク質拡散パラメータｋＤ、浸透圧の第２ビリアル係数Ｂ２２、または当業者によく知られている他の手法によって測定することができる。
【００７５】
賦形剤化合物は、有利には、水溶性であり得、したがって、水性ビヒクルとの使用に好適である。実施形態では、賦形剤化合物は、１ｍｇ／ｍＬ超の水溶性を有する。実施形態では、賦形剤化合物は、１０ｍｇ／ｍＬ超の水溶性を有する。実施形態では、賦形剤化合物は、１００ｍｇ／ｍＬ超の水溶性を有する。実施形態では、賦形剤化合物は、５００ｍｇ／ｍＬ超の水溶性を有する。実施形態では、共溶質またはヒドロトロープを賦形剤化合物と組み合わせて添加して、賦形剤化合物の溶解度を増加させることができる。例えば、特定の賦形剤は、治療用タンパク質を含む水溶液中の溶解度が限られていることがあり、低温保存条件では、この溶解度がさらに低くなる可能性がある。共溶質またはヒドロトロープを添加して、低温保存条件または周囲の室温または高温条件で、溶液中の賦形剤の溶解度を増加させることができる。共溶質およびヒドロトロープの例としては、安息香酸塩、ベンジルアルコール、フェニルアラニン、ニコチンアミド、プロリン、プロカイン、２，５−ジヒドロキシ安息香酸塩、チラミン、およびサッカリンが挙げられる。有利には、治療用タンパク質に関して、賦形剤化合物は、生物学的に許容可能であり、かつ非免疫原性である材料から得ることができ、したがって医薬用途に好適である。治療用の実施形態では、賦形剤化合物は、体内で代謝されて、生物学的に適合性で非免疫原性の副生成物をもたらし得る。
【００７６】
ａ．賦形剤化合物のカテゴリ１：ヒンダードアミン
治療用または非治療用タンパク質の溶液は、賦形剤化合物としてヒンダードアミン小分子を用いて製剤化され得る。本明細書で使用される場合、「ヒンダードアミン」という用語は、以下の例と一致する、少なくとも１つの嵩高いまたは立体障害の基を含む小分子を指す。ヒンダードアミンは、遊離塩基の形態で、プロトン化された形態で、またはその２つの組み合わせで使用できる。プロトン化された形態では、ヒンダードアミンは、塩化物イオン、水酸化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、フッ化物イオン、酢酸イオン、ギ酸イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、またはカルボン酸イオンなどのアニオン性対イオンと会合することができる。賦形剤化合物として有用なヒンダードアミン化合物は、第二級アミン、第三級アミン、第四級アンモニウム、ピリジニウム、ピロリドン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、またはグアニジニウム基を含むことができるため、賦形剤化合物は中性ｐＨの水溶液中でカチオン電荷を有する。ヒンダードアミン化合物はまた、環状芳香族、脂環式、シクロヘキシル、またはアルキル基などの、少なくとも１つの嵩高いまたは立体障害の基を含む。実施形態では、立体障害の基は、それ自体、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、グアニジニウム、ピリジニウム、または第四級アンモニウム基などのアミン基であり得る。理論に束縛されるものではないが、ヒンダードアミン化合物は、カチオンｐｉ相互作用によって、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンなどのタンパク質の芳香族部分と会合すると考えられている。実施形態では、ヒンダードアミンのカチオン性基は、タンパク質中の芳香族アミノ酸残基の電子豊富なｐｉ構造に親和性を有し得るため、それらが、タンパク質のこれらの部分を遮蔽することによって、そのような遮蔽されたタンパク質が会合および凝集する傾向を減少させる。
【００７７】
実施形態では、ヒンダードアミン賦形剤化合物は、イミダゾール、イミダゾリン、またはイミダゾリジン基、またはその塩、例えば、イミダゾール、１−メチルイミダゾール、４−メチルイミダゾール、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、ヒスタミン、４−メチルヒスタミン、アルファ−メチルヒスタミン、ベタヒスチン、ベータ−アラニン、２−メチル−２−イミダゾリン、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド、尿酸、尿酸カリウム、ベタゾール、カルノシン、アスパルテーム、サッカリン、アセスルファムカリウム、キサンチン、テオフィリン、テオブロミン、カフェイン、アンセリン、を含む化学構造を有する。実施形態では、ヒンダードアミン賦形剤化合物は、ジメチルエタノールアミン、ジメチルアミノプロピルアミン、トリエタノールアミン、ジメチルベンジルアミン、ジメチルシクロヘキシルアミン、ジエチルシクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルメチルアミン、ヘキサメチレンビグアニド、ポリ（ヘキサメチレンビグアニド）、イミダゾール、リジン、メチルグリシン、サルコシン、ジメチルグリシン、アグマチン、ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、フォリン酸ナトリウム塩、フォリン酸カルシウム塩、テトラメチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン、エタノールアミンリン酸、グルコサミン、塩化コリン、ホスホコリン、ナイアシンアミド、イソニコチンアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルニコチンアミド、ニコチン酸ナトリウム塩、イソニコチン酸塩、チラミン、３−アミノピリジン、２，４，６−トリメチルピリジン、３−ピリジンメタノール、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ビオチン、モルホリン、Ｎ−メチルピロリドン、２−ピロリジノン、ジピリダモール、プロカイン、リドカイン、ジシアンジアミド−タウリン付加物、２−ピリジルエチルアミン、６−ヒドロキシピリジン−２−カルボン酸、ジシアンジアミド−ベンジルアミン付加物、ジシアンジアミド−アルキルアミン付加物、ジシアンジアミド−シクロアルキルアミン付加物、およびジシアンジアミド−アミノメタンホスホン酸付加物、からなる群から選択される。実施形態では、ヒンダードアミン賦形剤化合物は、１−（１−アダマンチル）エチルアミン、１−アミノベンゾトリアゾール、２−ジメチルアミノエタノール、２−メチル−２−イミダゾリン、２−メチルイミダゾール、３−アミノベンズアミド、３−インドール酢酸、４−アミノピリジン、６−アミノ−１，３−ジメチルウラシル、アセチルコリン、硫酸アグマチン、塩化ベンザルコニウム、３−アミノ安息香酸エチル、スルファセタミド、アントラニル酸ブチル、アミノ馬尿酸、ベンズアミドオキシム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアミン、塩化ベルベリン、カスタノスペルミン、クレミゾール、サイクロセリン、フェニルセリン、ＤＬ−３−フェニルセリン、システアミン、シチジン、ジエタノールアミン、ジフェンヒドラミン、ＤＬ−ノルエピネフリン、ドーパミン、エムトリシタビン、エタノールアミン、グアンファシン、イソニコチンアミド、塩化リチウム、メグルミン、メチルシチジン、ミリスチルγピコリニウムクロリド、ナイアシンアミド、フェ���ルエチルアミン、ポリエチレンイミン、ピリドキシン、メシル酸ラサギリン、セロトニン、シネフリン、ネアミン、スペルミン、スペルミジン、１，３−ジアミノプロパン、アデノシン、リン酸クロロキン、シスタミン、ピリジルエチルアミン、テトラメチルエチレンジアミン、トリプタミン、チラミン、１−メチルイミダゾール、スペクチノマイシン、シクロヘキサンメチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルフェネチルアミン、フェネチルアミン、テトラエチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウムアセテート、ジシクロミン、ホルデニン、メチルアミノエチルピリジン、ニコチンアミドリボシド、１−ブチルイミダゾール、１−ヘキシルイミダゾール、１−メチルイミダゾール、２−エチルイミダゾール、２−Ｎ−ブチルイミダゾール、２−メチルイミダゾール、１−ドデシルイミダゾール、１または２位でＣ1〜Ｃ12炭化水素鎖でアルキル化された他のイミダゾール、プリジノールメタンスルホン酸、ヘミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルフェネチルアミン、ボグリボース、Ｎ−エチル−Ｌ−グルタミン、ニコチン、ピペラジン、デメクロサイクリン、およびそれらの塩、からなる群から選択される。実施形態では、ヒンダードアミン賦形剤化合物は、フェネチルアミン、ジフェンヒドラミン、Ｎ−メチルフェネチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルフェネチルアミン、β，３−ジヒドロキシフェネチルアミン、β，３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルフェネチルアミン、３−ヒドロキシフェネチルアミン、４−ヒドロキシフェネチルアミン、チロシノール、チラミン、Ｎ−メチルチラミン、およびホルデニンなどのフェネチルアミン官能基を有することができる。好ましくは、フェネチルアミン含有構造は、非向精神化合物である。
【００７８】
ヒンダードアミン構造の好適な塩は、塩化物、臭化物、酢酸塩、クエン酸塩、硫酸塩、およびリン酸塩であり得る。実施形態では、本開示に適ったヒンダードアミン化合物は、プロトン化アンモニウム塩として製剤化される。実施形態では、本開示に適ったヒンダードアミン化合物は、対イオンとして無機アニオンまたは有機アニオンを有する塩として製剤化される。
【００７９】
実施形態では、治療用または非治療用タンパク質の高濃度溶液は、賦形剤化合物として、カフェインと、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、またはベンゼンスルホン酸とを組み合わせて製剤化される。実施形態では、ヒンダードアミン賦形剤化合物は、体内で代謝されて、生物学的に適合性の副生成物を生じる。一部の実施形態では、ヒンダードアミン賦形剤化合物は、製剤中に約２５０ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で存在する。追加の実施形態では、ヒンダードアミン賦形剤化合物は、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤中に存在する。さらに追加の態様では、ヒンダードアミン賦形剤化合物は、製剤中に約２０〜約１２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【００８０】
実施形態では、このヒンダードアミンカテゴリの粘度低下賦形剤は、カフェインおよびテオフィリンなどのメチルキサンチンを含み得るが、それらの低い水溶性のために、それらの使用が、通常制限されている。一部の用途では、水溶性が低いにもかかわらず、これらの粘度低下賦形剤のより高濃度の溶液を有することが有利な場合がある。例えば、処理において、濃縮タンパク質溶液に添加することができる濃縮賦形剤溶液を有することが有利である場合があり、それによって、タンパク質を所望の最終濃度未満に希釈することなく、賦形剤を添加することができる。他の場合では、その低い水溶性にもかかわらず、最終的なタンパク質製剤の所望の粘度低下、安定性、張度などを達成するために、追加の粘度低下賦形剤が必要になる場合がある。実施形態では、高濃度の賦形剤溶液は、（ｉ）有効な粘度低下量よりも１．５〜５０倍高い濃度で、粘度低下賦形剤として、または（ｉｉ）文献で報告されている２９８Ｋでの純水への溶解度の１．５〜５０倍高い濃度で（例えば、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ；Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；Ｆｉｆｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａｐｒｉｌ  ３０，２０１３）に報告されている）、粘度低下賦形剤として製剤化され得る。
【００８１】
特定の共溶質は、これらの低溶解度の粘度低減賦形剤の溶解限度を大幅に高め、文献で報告されている溶解度値よりも数倍高い濃度での賦形剤溶液を可能にすることが見出されている。これらの共溶質は、ヒドロトロープの一般的なカテゴリに分類され得る。この用途の溶解度の最大の改善をもたらすことが見出された共溶質は、一般に、周囲温度および生理学的ｐＨで水に非常に溶けやすく（＞０．２５Ｍ）、ピリジンまたはベンゼン環のいずれかを含んでいた。共溶質として有用な化合物の例としては、アニリンＨＣｌ、イソナイアシンアミド、ナイアシンアミド、ｎ−メチルチラミンＨＣｌ、フェノール、プロカインＨＣｌ、レゾルシノール、サッカリンカルシウム塩、サッカリンナトリウム塩、アミノ安息香酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、パラヒドロキシ安息香酸ナトリウム、ナトリウムメタヒドロキシ安息香酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、スルファニル酸ナトリウム、パラヒドロキシベンゼンスルホン酸ナトリウム、シネフリン、およびチラミンＨＣｌが挙げられる。
【００８２】
実施形態では、特定のヒンダードアミン賦形剤化合物は、他の薬理学的特性を有することができる。例として、キサンチンは、ヒンダードアミンのカテゴリであり、一般に独立した薬理学的特性を有し、全身的に吸収された場合、刺激薬の特性および気管支拡張薬の特性が含まれる。代表的なキサンチンとしては、カフェイン、アミノフィリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、パラキサンチン、ペントキシフィリン、テオブロミン、テオフィリンなどが挙げられる。メチル化キサンチンは、心臓の収縮力、心拍数、および気管支拡張に影響を与えると理解されている。一部の実施形態では、キサンチン賦形剤化合物は、約３０ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で製剤中に存在する。
【００８３】
独立した薬理学的特性を有するヒンダードアミンの別のカテゴリは、局所注射用麻酔化合物である。局所注射用麻酔剤化合物は、（ａ）親油性芳香環、（ｂ）中間のエステルまたはアミド結合、および（ｃ）第二級または第三級アミンの３成分性分子構造を持つヒンダードアミンである。ヒンダードアミンのこのカテゴリは、ナトリウムイオンの流入を阻害することによって、神経伝導を遮断し、それによって局所麻酔を誘発すると理解されている。局所麻酔化合物の親油性芳香環は、炭素原子（例えば、ベンゼン環）から形成されてもよく、またはヘテロ原子（例えば、チオフェン環）を含んでもよい。代表的な局所注射用麻酔薬としては、アミロカイン、アルチカイン、ブピバカイン、ブタカイン、ブタニリカイン、クロロプロカイン、コカイン、シクロメチカイン、ジメトカイン、エディトカイン（ｅｄｉｔｏｃａｉｎｅ）、ヘキシルカイン、イソブカイン、レボブピバカイン、リドカイン、メタブテタミン、メタブトキシカイン、メピバカイン、メプリルカイン、プロポキシカイン、プリロカイン、プロカイン、ピペロカイン、テトラカイン、トリメカインなどが挙げられる。局所注射用麻酔化合物は、タンパク質治療用製剤において、粘度の低下、安定性の向上、注射時の疼痛の軽減など、複数の利点がある。一部の実施形態では、局所麻酔化合物は、製剤中に約５０ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で存在する。
【００８４】
実施形態では、独立した薬理学的特性を有するヒンダードアミンは、本明細書に記載の製剤および方法に従って、賦形剤化合物として使用される。一部の実施形態では、独立した薬理学的特性を有する賦形剤化合物は、薬理学的効果を有さない、および／または治療上有効ではない量で存在する。他の実施形態では、独立した薬理学的特性を有する賦形剤化合物は、薬理学的効果を有するおよび／または治療上有効である量で存在する。特定の実施形態では、独立した薬理学的特性を有するヒンダードアミンは、製剤粘度を低下させるように選択された別の賦形剤化合物と組み合わせて使用され、独立した薬理学的特性を有するヒンダードアミンは、その薬理活性の利点を与えるために使用される。例えば、局所注射用麻酔化合物を使用して、製剤の粘度を低下させ、製剤の注射時の疼痛を軽減することもできる。注射の疼痛の軽減は、麻酔特性によって引き起こされ得る。また、賦形剤により粘度が低下した場合、注射の力を下げる必要がある。あるいは、局所注射用麻酔化合物を使用して、製剤の粘度を低下させる別の賦形剤化合物と組み合わせながら、製剤の注射中に局所感覚を低下させるという望ましい薬理学的利点を与えることができる。
【００８５】
ｂ．賦形剤化合物のカテゴリ２：アニオン性芳香族
治療用または非治療用タンパク質の溶液は、アニオン性芳香族小分子化合物を賦形剤化合物として製剤化することができる。アニオン性芳香族賦形剤化合物は、フェニル、ベンジル、アリール、アルキルベンジル、ヒドロキシベンジル、フェノール、ヒドロキシアリール、ヘテロ芳香族基、または縮合芳香族基などの芳香族官能基を含むことができる。アニオン性芳香族賦形剤化合物はまた、カルボキシレート、オキシド、フェノキシド、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、またはスルフィドなどのアニオン性官能基を含むことができる。アニオン性芳香族賦形剤は、酸、ナトリウム塩、または他のものとして記載され得るが、賦形剤は、様々な塩の形態で使用され得ることが理解される。理論に束縛されるものではないが、アニオン性芳香族賦形剤化合物は、タンパク質のカチオン性部分と会合することができる嵩高い立体障害の分子であると考えられているため、タンパク質のこれらの部分を遮蔽し、それによって、タンパク質含有製剤を粘稠にするか安定性の問題を引き起こすタンパク質分子間の相互作用を減らすことができる。
【００８６】
実施形態では、アニオン性芳香族賦形剤化合物の例としては、サリチル酸、アミノサリチル酸、ヒドロキシ安息香酸、アミノ安息香酸、パラアミノ安息香酸、ベンゼンスルホン酸、ヒドロキシベンゼンスルホン酸、４−フェニル酪酸、ナフタレンスルホン酸、１，５−ナフタレンジスルホン酸、２，６−ナフタレンジスルホン酸、２，７−ナフタレンジスルホン酸、ヒドロキノンスルホン酸、スルファニル酸、バニリン酸、ホモバニリン酸、バニリン、バニリン−タウリン付加物、アミノフェノール、アントラニル酸、ケイ皮酸、メナジオン重亜硫酸ナトリウム、４−ヒドロキシ−３−メトキシケイ皮酸、カフェイン酸、クロロゲン酸、ゲンチシン酸、クマル酸、アデノシン一リン酸、インドール酢酸、尿酸カリウム、フランジカルボン酸、フラン−２−アクリル酸、２−フランプロピオン酸、フェニルピルビン酸ナトリウム、ヒドロキシフェニルピルビン酸ナトリウム、トリメトキシ安息香酸、ジヒドロキシ安息香酸、フェロセンカルボン酸、トリヒドロキシ安息香酸、ピロガロール、安息香酸、および前述の酸の塩などが挙げられる。実施形態では、アニオン性芳香族賦形剤化合物は、イオン化塩の形態で製剤化される。実施形態では、アニオン性芳香族化合物は、ヒドロキシ安息香酸ジメチルシクロヘキシルアンモニウムなどのヒンダードアミンの塩として処方される。実施形態では、アニオン性芳香族賦形剤化合物は、有機カチオンなどの様々な対イオンを用いて製剤化される。実施形態では、治療用または非治療用タンパク質の高濃度溶液は、アニオン性芳香族賦形剤化合物およびカフェインとともに製剤化される。実施形態では、アニオン性芳香族賦形剤化合物は、体内で代謝されて、生物学的に適合性の副生成物を生じる。
【００８７】
実施形態では、芳香族賦形剤化合物の例としては、フェノールおよびポリフェノールが含まれる。本明細書で使用される場合、「フェノール」という用語は、少なくとも１つのヒドロキシル基に結合した少なくとも１つの芳香族基または縮合芳香族基からなる有機分子を指し、「ポリフェノール」という用語は、２つ以上のフェノール基からなる有機分子を指す。このような賦形剤は、特定の状況下で、例えば、治療用または非治療用のＰＥＧ化タンパク質の高濃度溶液を含む製剤に使用して、溶液粘度を下げる場合に有利であり得る。フェノールの非限定的な例としては、ベンゼンジオールレゾルシノール（１，３−ベンゼンジオール）、カテコール（１，２−ベンゼンジオール）およびヒドロキノン（１，４−ベンゼンジオール）、ベンゼントリオールヒドロキシキノール（１，２，４−ベンゼントリオール）、ピロガロール、（１，２，３−ベンゼントリオール）、およびフロログルシノール（１，３，５−ベンゼントリオール）、ベンゼンテトロール１，２，３，４−ベンゼンテトロールおよび１，２，３，５−ベンゼンテトロール、ならびにベンゼンペンタオールおよびベンゼンヘキサオールが挙げられる。ポリフェノールの非限定的な例としては、タンニン酸、エラグ酸、没食子酸エピガロカテキン、カテキン、タンニン、エラジタンニン、およびガロタンニンが挙げられる。より一般的には、フェノールおよびポリフェノール化合物には、フラボノイド、リグナン、フェノール酸、およびスチルベンが含まれるが、これらに限定されない。フラボノイド化合物には、アントシアニン、カルコン、ジヒドロカルコン、ジヒドロフラバノール、フラバノール、フラバノン、フラボン、フラボノール、およびイソフラボノイドが含まれるが、これらに限定されない。フェノール酸には、ヒドロキシ安息香酸、ヒドロキシケイ皮酸、ヒドロキシフェニル酢酸、ヒドロキシフェニルプロパン酸、およびヒドロキシフェニルペンタン酸が含まれるが、これらに限定されない。他のポリフェノール化合物には、アルキルメトキシフェノール、アルキルフェノール、クルクミノイド、ヒドロキシベンズアルデヒド、ヒドロキシベンゾケトン、ヒドロキシシンナムアルデヒド、ヒドロキシクマリン、ヒドロキシフェニルプロペン、メトキシフェノール、ナフトキノン、ヒドロキノン、フェノールテルペン、レスベラトロール、およびチロソールが含まれるが、これらに限定されない。実施形態では、ポリフェノールは、タンニン酸である。実施形態では、フェノールは、没食子酸である。実施形態では、フェノールは、ピロガロールである。実施形態では、フェノールは、レゾルシノールである。理論に束縛されるものではないが、没食子酸、ピロガロール、レゾルシノールなどのフェノール化合物のヒドロキシル基は、ＰＥＧ鎖の骨格にあるエーテル酸素原子と水素結合を形成し、したがって、ＰＥＧの溶液構造を根本的に変えるフェノール／ＰＥＧ複合体を形成することで、溶液粘度を低下させる。タンニン酸などのポリフェノール化合物は、それらの粘度低下特性が、没食子酸、ピロガロール、およびレゾルシノールなどの、それらの各フェノール基のビルディングブロックに由来する。ポリフェノール化合物内のフェノール基の特定の構造は、複雑な挙動を引き起こす場合があり、フェノールの添加によって達成される粘度の低下が、より少量のそれぞれのポリフェノールの添加によって増強される。
【００８８】
ｃ．賦形剤化合物のカテゴリ３：官能化アミノ酸
治療用または非治療用タンパク質の溶液は、１つまたは複数の官能化アミノ酸を用いて製剤化することができ、単一の官能化アミノ酸または１つまたは複数の官能化アミノ酸を含むオリゴペプチドを、賦形剤化合物として使用することができる。実施形態では、官能化アミノ酸化合物は、加水分解または代謝されてアミノ酸を生じ得る分子（「アミノ酸前駆体」）を含む。実施形態では、官能化アミノ酸は、フェニル、ベンジル、アリール、アルキルベンジル、ヒドロキシベンジル、ヒドロキシアリール、ヘテロ芳香族基、または縮合芳香族基などの芳香族官能基を含むことができる。実施形態では、官能化アミノ酸化合物は、メチル化、エチル化、プロピル化、ブチル化、ベンジル化、シクロアルキル化、グリセリル化、ヒドロキシエチル化、ヒドロキシプロピル化、ＰＥＧ化、およびＰＰＧエステルなどのエステル化アミノ酸を含むことができる。実施形態では、官能化アミノ酸化合物は、アルギニンエチルエステル、アルギニンメチルエステル、アルギニンヒドロキシエチルエステル、およびアルギニンヒドロキシプロピルエステルからなる群から選択される。実施形態では、官能化アミノ酸化合物は、中性ｐＨでの水溶液中の荷電イオン化合物である。例えば、単一のアミノ酸は、酢酸塩や安息香酸塩のようなエステルを形成することによって誘導体化することができ、加水分解生成物は、どちらも天然素材である酢酸または安息香酸、加えてアミノ酸である。実施形態では、官能化されたアミノ酸賦形剤化合物は、体内で代謝されて、生物学的に適合性の副生成物を生じる。
【００８９】
ｄ．賦形剤化合物のカテゴリ４：オリゴペプチド
治療用または非治療用タンパク質の溶液は、賦形剤化合物としてオリゴペプチドを用いて製剤化することができる。実施形態では、オリゴペプチドは、その構造が荷電部分および嵩高い部分を有するように設計される。実施形態では、オリゴペプチドは、２〜１０個のペプチドサブユニットからなる。オリゴペプチドは、二官能性、例えば、非極性のものに結合したカチオン性アミノ酸、または非極性のものに結合したアニオン性アミノ酸であり得る。実施形態では、オリゴペプチドは、２〜５個のペプチドサブユニットからなる。実施形態では、オリゴペプチドは、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリリジン、ポリアルギニン、およびポリヒスチジンなどのホモペプチドである。実施形態では、オリゴペプチドは、正味のカチオン電荷を有する。他の実施形態では、オリゴペプチドは、Ｔｒｐ２Ｌｙｓ３などのヘテロペプチドである。実施形態では、オリゴペプチドは、ＡＢＡ反復パターンなどの交互的な構造を有することができる。実施形態では、オリゴペプチドは、アニオン性およびカチオン性アミノ酸の両方、例えば、Ａｒｇ−Ｇｌｕ、Ｌｙｓ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｇｌｕ、Ａｒｇ−Ａｓｐ、Ｌｙｓ−Ａｓｐ、Ｈｉｓ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ−Ａｒｇ、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ、Ｇｌｕ−Ｈｉｓ、Ａｓｐ−Ａｒｇ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ、Ａｓｐ−Ｈｉｓを含むことができる。理論に束縛されるものではないが、オリゴペプチドは、高粘度溶液と安定性の問題につながる分子間相互作用を低減するような方法でタンパク質と結合できる構造を備えている。例えば、オリゴペプチド−タンパク質の会合は、電荷間の相互作用であり、やや非極性のアミノ酸を残して、タンパク質周囲の水和層の水素結合を破壊し、したがって、粘度を低下させるか、または安定性を向上させる。一部の実施形態では、オリゴペプチド賦形剤は、約５０ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で組成物中に存在する。
【００９０】
ｅ．賦形剤化合物のカテゴリ５：短鎖有機酸
治療用または非治療用タンパク質の溶液は、賦形剤化合物として短鎖有機酸を用いて処方することができる。本明細書で使用される場合、「短鎖有機酸」という用語は、Ｃ2〜Ｃ6有機酸化合物およびその塩、エステル、アミド、またはラクトンを指す。このカテゴリには、飽和および不飽和カルボン酸、ヒドロキシ官能化カルボン酸、アミド、および直鎖状、分岐状、または環状カルボン酸が含まれる。実施形態では、短鎖有機酸の酸性基は、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸、またはそれらの塩である。
【００９１】
治療用または非治療用タンパク質の溶液は、例えば、賦形剤化合物として、ソルビン酸、吉草酸、プロピオン酸、カプロン酸、およびアスコルビン酸の酸または塩の形態の短鎖有機酸を用いて製剤化することができる。このカテゴリの賦形剤化合物の例には、ソルビン酸カリウム、グルコン酸カルシウム、グルクロン酸、乳酸カルシウム、２−ヒドロキシ乳酸、グリコール酸ナトリウム、グリコール酸カリウム、グリコール酸アンモニウム、バルプロ酸ナトリウム、タウリン、アセトヒドロキサム酸、アセトン重亜硫酸ナトリウム付加物、アセチルヒドロキシプロリン、カルシウムプロピオン酸、プロピオン酸マグネシウム、プロピオン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、およびそれらの塩が含まれる。
【００９２】
ｆ．賦形剤化合物のカテゴリ６：低分子量ポリ酸
治療用または非治療用タンパク質またはＰＥＧ化タンパク質の溶液は、溶液粘度の低下または安定性の改善を可能にする特定の賦形剤化合物を用いて製剤化することができ、このような賦形剤化合物は、低分子量のポリ酸である。低分子量ポリ酸は、有機ポリ酸または無機ポリ酸を含み得る。また、これらの低分子量ポリ酸賦形剤は、他の賦形剤と組み合わせて使用することもできる。
【００９３】
実施形態では、有機ポリ酸は、低分子量脂肪族ポリ酸として構造化され得る。本明細書で使用される場合、「低分子量脂肪族ポリ酸」という用語は、約１５００Ｄａ未満の分子量を有し、少なくとも２つの酸性基を有する有機脂肪族ポリ酸を指し、酸性基はプロトン供与部分であると理解される。酸性基の非限定的な例には、カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェート、スルホネート、スルフェート、ニトレート、ニトライト、が含まれる。低分子量脂肪族ポリ酸の酸性基は、カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェート、スルホネート、スルフェート、ニトレート、およびニトライトなどのアニオン性塩の形態であり得、それらの対イオンは、ナトリウム、カリウム、リチウム、およびアンモニウムイオンであり得る。本明細書に記載のＰＥＧ化タンパク質との相互作用に有用な低分子量脂肪族ポリ酸の具体例としては、シュウ酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、コハク酸、マレイン酸、酒石酸、グルタル酸、マロン酸、イタコン酸、メチルマロン酸、アゼライン酸、クエン酸、３，６，９−トリオキサウンデカン二酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、アスパラギン酸、ピロリドンカルボン酸、ピログルタミン酸、グルタミン酸、アレンドロン酸、メドロン酸、エチドロン酸およびその塩が挙げられる。
【００９４】
他の実施形態では、低分子量ポリ酸は、無機ポリ酸である。低分子量ポリ酸のそれらのアニオン性塩の形態でのさらなる例としては、リン酸塩（ＰＯ43-）、リン酸水素塩（ＨＰＯ42-）、リン酸二水素塩（Ｈ2ＰＯ4-）、硫酸塩、重硫酸塩（ＨＳＯ4-）、ピロリン酸塩（Ｐ2Ｏ74-）、ヘキサメタリン酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩（ＣＯ32-）、重炭酸塩（ＨＣＯ3-）が挙げられる。アニオン性塩の対イオンは、Ｎａ、Ｌｉ、Ｋ、またはアンモニウムイオンであり得る。
【００９５】
実施形態では、低分子量脂肪族ポリ酸はまた、第１の酸性基に隣接するヒドロキシル基、例えばグリコール酸、乳酸、およびグルコン酸ならびにそれらの塩が存在するアルファヒドロキシ酸であり得る。実施形態では、低分子量脂肪族ポリ酸は、例えばポリアクリル酸、ポリリン酸塩、ポリペプチドおよびそれらの塩など、３つ以上の酸性基を有するオリゴマー形態である。一部の実施形態では、低分子量脂肪族ポリ酸賦形剤は、組成物中に約５０ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で存在する。
【００９６】
ｇ．賦形剤化合物のカテゴリ７：ジオンおよびスルホン
効果的な粘度低下または安定化賦形剤は、２９８Ｋで少なくとも１ｇ／Ｌまで純水に可溶であり、ｐＨ７で正味の中性電荷を持ち、スルホン、スルホンアミド、またはジオン官能基を含む分子であり得る。好ましくは、分子は、１０００ｇ／モル未満、より好ましくは５００ｇ／モル未満の分子量を有する。粘度の低下および／または安定性の改善に有効なジオンおよびスルホンは、複数の二重結合を有し、水溶性であり、ｐＨ７で正味の電荷を持たないかアニオン性電荷を有し、強い水素結合ドナーではない。理論に束縛されるものではないが、二重結合の特性により、タンパク質との弱いｐｉスタッキング相互作用が可能になる。実施形態では、高タンパク質濃度で、および高濃度でのみ高粘度を発現するタンパク質では、荷電した賦形剤は、静電相互作用が長距離相互作用であるため、効果的ではない。溶媒和タンパク質の表面は、主に親水性であり、それらを水溶性にする。タンパク質の疎水性領域は、一般に３次元構造内で遮蔽されるが、構造は常に進化し、ほどけ、再び折り畳まれ（「呼吸（ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）」と呼ばれることもある）、隣接するタンパク質の疎水性領域が互いに接触して、疎水性相互作用による凝集につながる可能性がある。ジオンおよびスルホン賦形剤のｐｉスタッキング機能は、そのような「呼吸」中に露出され得る疎水性パッチを覆い隠すことができる。賦形剤の他の重要な役割は、近接するタンパク質間の疎水性相互作用と水素結合を破壊することであり、溶液の粘度を効果的に低下させる。この説明に当てはまるジオンおよびスルホン化合物には、ジメチルスルホン、エチルメチルスルホン、エチルメチルスルホニルアセテート、エチルイソプロピルスルホン、シクラミン酸ナトリウム、ビス（メチルスルホニル）メタン、メタンスルホンアミド、メチオニンスルホン、１，２−シクロペンタンジオン、１，３−シクロペンタンジオン、１，４−シクロペンタンジオン、およびブタン−２，３−ジオンが含まれる。
【００９７】
ｈ．賦形剤化合物のカテゴリ８：双性イオン性賦形剤
治療用または非治療用タンパク質の溶液は、安定性を向上させるか、粘度を下げるための賦形剤として、特定の双性イオン化合物を用いて製剤化することができる。本明細書で使用される場合、「双性イオン」という用語は、カチオン性荷電部分およびアニオン性荷電部分を有する化合物を指す。実施形態では、双性イオン性賦形剤化合物は、アミンオキシドである。実施形態では、反対の電荷は、２〜８個の化学結合によって互いに分離される。実施形態では、双性イオン性賦形剤化合物は、約５０〜約５００ｇ／モルの分子量を有するものなどの小分子であり得るか、または約５００〜約２０００ｇ／モルの分子量を有するものなどの中間分子量分子であり得るか、または約２０００〜約１００，０００ｇ／モルの分子量を有するポリマーなどの高分子量の分子であり得る。
【００９８】
双性イオン性賦形剤化合物の例としては、（３−カルボキシプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、１−アミノシクロヘキサンカルボン酸、ホモシクロロイシン、１−メチル−４−イミダゾール酢酸、３−（１−ピリジニオ）−１−プロパンスルホネート、４−アミノ安息香酸、アレンドロン酸、アミノエチルスルホン酸、アミノ馬尿酸、アスパルテーム、アミノトリス（メチレンホスホン酸）（ＡＴＭＰ）、カルコブトロール、カルテリドール、コカミドプロピルベタイン、コカミドプロピルヒドロキシスルタイン、クレアチン、シチジン一リン酸、ジアミノピメリン酸、ジエチレントリアミン五酢酸、ジメチルフェニルアラニン、メチルグリシン、サルコシン、ジメチルグリシン、双性イオン性ジペプチド（例えば：Ａｒｇ−Ｇｌｕ、Ｌｙｓ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｇｌｕ、Ａｒｇ−Ａｓｐ、Ｌｙｓ−Ａｓｐ、Ｈｉｓ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ−Ａｒｇ、Ｇｌｕ−Ｌｙｓ、Ｇｌｕ−Ｈｉｓ、Ａｓｐ−Ａｒｇ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ、Ａｓｐ−Ｈｉｓ）、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）（ＤＴＰＭＰ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン、エクトイン、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰ）、葉酸安息香酸混合物、葉酸ナイアシンアミド混合物、ゼラチン、ヒドロキシプロリン、イミノ二酢酸、イソグバシン、レシチン、ミリスタミンオキシド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、Ｎ−メチルアスパラギン酸、Ｎ−メチルプロリン、Ｎ−トリメチルリジン、オルニチン、オキソリン酸、リセドロン酸、アリルシステイン、Ｓ−アリル−Ｌ−システイン、ソマパシタン、タウリン、テアニン、トリゴネリン、ビガバトリン、エクトイン、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、ｏ−オクチルホスホリルコリン、ニコチンアミドモノヌクレオチド、トリグリシン、テトラグリシン、β−グアニジノプロピオン酸、５−アミノレブリン酸塩酸、ピコリン酸、リドフェニン、ホスホコリン、１−（５−カルボキシペンチル）−４−メチルピリジン−１−イウムブロミド、Ｌ−アンセリン硝酸塩、還元型Ｌ−グルタチオン、Ｎ−エチル−Ｌ−グルタミン、Ｎ−メチルプロリン、（Ｚ）−１−［Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−（２−アンモニオエチル）アミノ］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオラート（ＤＥＴＡ−ＮＯＮＯａｔｅ）、（Ｚ）−１−［Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ−（３−アンモニオプロピル）アミノ］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオラート（ＤＰＴＡ−ＮＯＮａｔｅ）、およびゾレドロン酸が挙げられる。
【００９９】
理論に束縛されるものではないが、双性イオン性賦形剤化合物は、タンパク質と相互作用することにより、例えば、電荷相互作用、疎水性相互作用、および立体相互作用により、粘度低下または安定化効果を発揮し、タンパク質を凝集に対してより抵抗性にするか、または、電解質の寄与、表面張力の低下、利用可能な非結合水の量の変化、もしくは比誘電率の変化などのタンパク質製剤中の水のバルク特性に影響を与える。
【０１００】
ｉ．賦形剤化合物のカテゴリ９：水素結合元素を含むクラウディング剤
治療用または非治療用タンパク質の溶液は、安定性を改善するか、または粘度を低下するための賦形剤として、水素結合元素を含むクラウディング剤を用いて製剤化することができる。本明細書で使用される場合、用語「クラウディング剤」は、溶液中にタンパク質を溶解するために利用可能な水の量を減少させ、有効なタンパク質濃度を増加させる製剤添加物を指す。実施形態では、クラウディング剤は、タンパク質の粒子サイズを減少させるか、または溶液中でのタンパク質のアンフォールディングの量を減少させることができる。実施形態では、クラウディング剤は、水素結合および水和効果によって水の構造化を引き起こす溶媒修飾剤として作用することができる。実施形態では、クラウディング剤は、溶液中のタンパク質間の分子間相互作用の量を低減することができる。実施形態では、クラウディング剤は、酸素、硫黄、または窒素原子に結合した水素などの少なくとも１つの水素結合ドナー元素を含む構造を有する。実施形態では、クラウディング剤は、約６〜約１１のｐＫａを有する少なくとも１つの弱酸性水素結合ドナー元素を含む構造を有する。実施形態では、クラウディング剤は、約２〜約５０個の水素結合ドナー元素を含む構造を有する。実施形態では、クラウディング剤は、ルイス塩基などの少なくとも１つの水素結合アクセプター元素を含む構造を有する。実施形態では、クラウディング剤は、約２〜約５０個の水素結合アクセプター元素を含む構造を有する。実施形態では、クラウディング剤は、約５０〜５００ｇ／モルの分子量を有する。実施形態では、クラウディング剤は、約１００〜３５０ｇ／モルの分子量を有する。他の実施形態では、クラウディング剤は、ラフィノース、イヌリン、プルラン、またはシニストリンなどの、５００ｇ／モル超の分子量を有し得る。
【０１０１】
水素結合元素を含むクラウディング剤賦形剤の例としては、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジオン、１５−クラウン−５、１８−クラウン−６、２−ブタノール、２−ブタノン、２−フェノキシエタノール、アセトアミノフェン、アラントイン、アラビノース、アラビトール、アセト酢酸ベンジル、ベンジルアルコール、クロロブタノール、コレスタノールテトラアセチル−ｂ−グルコシド、シンナムアルデヒド、シクロヘキサノン、デオキシリボース、ジエチルカーボネート、ジメチルカーボネート、ジメチルイソソルビド、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチロールエチレン尿素、ジメチルウラシル、エピラクトース、エリスリトール、エリスロース、乳酸エチル、エチルマルトール、炭酸エチレン、ホルムアミド、フコース、ガラクトース、ゲニステイン、ゲンチシン酸エタノールアミド、グルコノラクトン、グリセルアルデヒド、グリセロール、炭酸グリセロール、グリセロールホルマール、グリセロールウレタン、グリチルリチン酸、ゴシピン、ハーパゴシド、ヘデラコシドＣ、イコデキストリン、イジトール、イミダゾリドン、イノシトール、イヌリン、イソマルチトール、コウジ酸、ラクチトール、ラクトビオン酸、ラクトース、ラクツロース、リキソース、マデカソシド、マルトトリオース、マンギフェリン、マンノース、メレジトース、乳酸メチル、メチルピロリドン、モグロシドＶ、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−メチルアセトアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ−メチルプロピオンアミド、ペンタエリトリトール、ピノレジノールジグルコシド、ピラセタム、没食子酸プロピル、炭酸プロピレン、プシコース、プルラン、ピロガロール、キナ酸、ラフィノース、レバウディオシドＡ、ラムノース、リビトール、リボース、リブロース、サッカリン、セドヘプツロース、シニストリン、ソルケタール、スタキオース、スクラロース、タガトース、ｔ−ブタノール、テトラグリコール、トリアセチン、Ｎ−アセチル−ｄ−マンノサミン、ニストース、ケストース、ツラノース、アカルボース、Ｄ−サッカリン酸１，４−ラクトン、チオジガラクトシド、フコイダン、ヒドロキシサフロールイエローＡ、シキミ酸、ジオスミン、プラバスタチンナトリウム塩、Ｄ−アルトロース、Ｌ−グロンγラクトン、ネオマイシン、ルブソシドジヒドロアルテミシニン、フロログルシノール、ナリンギン、バイカレイン、ヘスペリジン、アピゲニン、ピロガロール、モリン、サルサレート、ケンフェロール、ミリセチン、３’，４’，７−トリヒドロキシイソフラボン、（±）−タキシフォリン、シリビン、ペルセイトールジフォルマル（ｐｅｒｓｅｉｔｏｌ  ｄｉｆｏｒｍａｌ）、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、スルファセタミド、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、２，５−ジヒドロキシ安息香酸エチル、スペクチノマイシン、レスベラトロール、ケルセチン、硫酸カナマイシン、１−（２−ピリミジル）ピペラジン、２−（２−ピリジル）エチルアミン、２−イミダゾリドン、ＤＬ−１，２−イソプロピリデングリセロール、メトホルミン、ｍ−キシリレンジアミン、デメク���サイクリン、トリプロピレングリコール、ツベイモシドＩ、ベルベナロシド、キシリトール、およびキシロースが挙げられる。
【０１０２】
６．タンパク質／賦形剤溶液：特性とプロセス
特定の実施形態では、ヒンダードアミン、アニオン性芳香族、官能化アミノ酸、オリゴペプチド、短鎖有機酸、低分子量脂肪族ポリ酸、ジオンおよびスルホン、双性イオン性賦形剤、ならびに水素結合性元素を含むクラウディング剤などの、上記の特定された賦形剤化合物またはその組み合わせ（以下、「賦形剤添加剤」）で製剤化された治療用または非治療用タンパク質の溶液は、タンパク質拡散相互作用パラメータｋDまたは第２ビリアル係数Ｂ22により測定される改善されたタンパク質間相互作用特性をもたらす。本明細書で使用される場合、上記の特定された賦形剤化合物またはそれらの組み合わせを使用する試験製剤によって達成される１つまたは複数のタンパク質間相互作用パラメータの「改善」は、賦形剤化合物または賦形剤添加剤を含まない同等の製剤を用いて試験製剤を同等の条件下で比較した場合、誘引性タンパク質間相互作用の減少を指し得る。このような改善は、プロセス全体またはその側面に適用される特定のパラメータを測定することで明らかにすることができ、パラメータは、プロセスに関係する任意の計量であり、変化を定量化し、以前の状態または対照と比較することができる。パラメータは、効率、コスト、収率、速度など、プロセス自体に関係し得る。処理中のタンパク質含有製剤の安定性を改善すると、収量が改善し、生物学的活性が増加し、製剤中の粒子の存在が減少するという利点がある。
【０１０３】
パラメータはまた、より大きなプロセスの特徴または側面に関係するプロキシパラメータでもあり得る。例として、ｋDまたはＢ22パラメータなどのパラメータは、プロキシパラメータと呼ぶことができる。ｋDとＢ22の測定は、業界の標準的な技術を使用して行うことができ、改善された溶液特性や溶液中のタンパク質の安定性などのプロセス関連パラメータの指標となり得る。理論に束縛されるものではないが、非常に負のｋD値は、タンパク質に強い誘引性の相互作用があることを示し、凝集、不安定性、およびレオロジーの問題につながり得ることが理解される。上記の特定された賦形剤化合物またはそれらの組み合わせの存在下で製剤化された場合、同じタンパク質は、より少ない負のｋD値、またはゼロ近くかもしくはそれ以上のｋD値の、改善されたプロキシパラメータを有することができ、この改善されたプロキシパラメータは、プロセス関連のパラメータの改善と関連している。
【０１０４】
実施形態では、ヒンダードアミン、アニオン性芳香族、官能化アミノ酸、オリゴペプチド、短鎖有機酸、低分子量脂肪族ポリ酸、ジオンおよびスルホン、双性イオン性賦形剤、ならびに水素結合性元素を含むクラウディング剤などの、上に記載の賦形剤化合物またはそれらの組み合わせのいくつかは、濾過、注射器、移送、ポンプ、混合、熱伝達による加熱または冷却、ガス移送、遠心分離、クロマトグラフィ、膜分離、遠心濃縮、接線流濾過、放射状流濾過、軸流濾過、凍結乾燥、およびゲル電気泳動などの処理方法を使用して、タンパク質含有溶液の製造、処理、無菌充填、精製、分析などのタンパク質関連プロセスを改善するために使用される。これらおよび関連するタンパク質関連プロセスでは、目的のタンパク質は、処理装置を通してそれを運ぶ溶液に溶解される。本明細書で「キャリア溶液」と呼ばれるそのような溶液は、細胞培養培地（例えば、目的の分泌タンパク質を含む）、宿主細胞の溶解後の溶解液（目的のタンパク質が溶解物中に存在する）、溶出溶液（クロマトグラフ分離後の目的のタンパク質を含む）、電気泳動溶液、処理装置内の導管を通して目的のタンパク質を運ぶための輸送溶液などを含み得る。目的のタンパク質を含むキャリア溶液は、タンパク質含有溶液またはタンパク質溶液とも呼ばれ得る。以下でより詳細に記載されるように、１つ以上の上記の特定された賦形剤化合物またはそれらの組み合わせを、タンパク質含有溶液に添加して、処理の様々な側面を改善することができる。本明細書で使用される場合、「改善する」、「改善」などの用語は、そのパラメータを、対照溶液で測定されたものと同じパラメータと比較した場合、キャリア溶液における目的のパラメータの有利な変化を指す。本明細書で使用される場合、「対照溶液」は、粘度低下賦形剤を欠いているが、それ以外はキャリア溶液と実質的に同様である溶液を意味する。本明細書で使用される「対照プロセス」、例えば、対照濾過プロセス、対照クロマトグラフィプロセスなどは、目的のタンパク質関連プロセスと実質的に同様であり、キャリア溶液の代わりに対照溶液を用いて行われるタンパク質関連プロセスである。
【０１０５】
例えば、タンパク質含有溶液が導管（例えば、フローチャンバー、配管または管類）を通して送り込まれるプロセスでは、粘度を低下させるために、上記の特定された賦形剤化合物またはそれらの組み合わせを添加することが有利である。上に記載のように、ポンピングプロセスの前または最中に、タンパク質溶液に粘度低下賦形剤を添加することで、溶液をポンピングするために必要な力および動力を実質的に低減することができる。流体は一般に、流れに対する抵抗、すなわち粘度を示し、流れを誘発および伝播させるために、この粘度を克服する力を流体に加えなければならないことが理解される。揚程Ｈと吐出量Ｑによるポンピングスケールに必要な動力Ｐを、次の式に示す。
Ｐ〜ＨＱ（式１）
【０１０６】
粘性流体は、ポンプの所要動力を増加させ、ポンプ効率を低下させ、ポンプ揚程と容量を減少させ、配管の摩擦抵抗を増加させる傾向がある。ポンピングの前または最中に、上記の粘度低下賦形剤をタンパク質溶液に追加すると、揚程（Ｈ、Ｅｑ．１）または容量（Ｑ、Ｅｑ．１）のいずれかまたは両方を減らすことにより、処理コストを大幅に削減できる。粘度の低下の利点は、例えば、スループットの改善、収率の改善、または処理時間の短縮によって明らかになる。さらに、導管を通る流体の伝達による摩擦損失は、そのような流体の輸送に関連するコストのかなりの部分を占める可能性がある。ポンピング前または最中に、上に記載の粘度低下賦形剤をタンパク質溶液に添加すると、ポンピングプロセスに伴う摩擦を低減することによって、処理コストを大幅に削減することができる。処理コストの測定は、粘度低下賦形剤を使用することで改善できる処理パラメータを表す。
【０１０７】
タンパク質溶液のこれらのプロセスおよび処理方法は、製造、処理、精製、および分析ステップ中の溶液中のタンパク質の粘度の低下、溶解度の改善、または安定性の改善により、効率を改善することができる。処理効率の測定または溶液中のタンパク質の粘度、溶解度、または安定性などの代理パラメータの測定は、粘度低下賦形剤を使用することによって改善することができる処理パラメータを表す。いくつかの異なる要因が、処理中のタンパク質の粘度、溶解度、および安定性に悪影響を及ぼすことが理解されている。例えば、タンパク質含有溶液は、製造および精製中にさまざまな物理的ストレッサーの影響を受け、限定されないが、ポンピング、混合、遠心分離、および濾過などを含む通常の処理操作を通してタンパク質溶液を操作することによって引き起こされる著しい剪断ストレスが含まれる。さらに、これらの処理ステップ中に、タンパク質が吸着され得る気泡が、流体内に混入してしまう可能性がある。そのような界面張力は、処理中に遭遇する通常の剪断ストレスと相まって、吸着されたタンパク質分子をアンフォールドし、凝集させる可能性がある。さらに、ポンプのキャビテーションイベント中や、製造中の限外濾過膜や透析濾過膜などの固体表面への曝露中に、著しいタンパク質のアンフォールディングが発生する可能性がある。そのようなイベントは、タンパク質の折りたたみと生成物の品質を損なう可能性がある。
【０１０８】
ニュートン流体の場合、流体の剪断速度をγ、流体の粘度をηとする所与のプロセススケールよって課せられる応力τは、次の式で示される。
τ＝γη（式２）
【０１０９】
溶液の粘度は、１つ以上の上記の賦形剤化合物またはそれらの組み合わせを用いてタンパク質溶液を製剤化することによって、低下させることができ、したがってタンパク質溶液が遭遇する剪断ストレスを低下させることができる。剪断ストレスの減少は、処理されている製剤の安定性を改善することができ、例えば、処理パラメータのより良いまたはより望ましい測定によって明らかになる。このような改善された処理パラメータには、タンパク質凝集体、粒子、または目視不可の粒子のレベルの低下、製品損失の減少、または全体的な収率の向上などの測定基準が含まれる。改善された処理パラメータの別の例として、タンパク質含有溶液の粘度を低下させることで、溶液の処理時間を短縮することができる。所与の単位操作の処理時間は、一般的に剪断速度と反比例する。したがって、所与の特性応力に対して、上記の賦形剤化合物またはその組み合わせの添加によるタンパク質溶液の粘度の低下は、剪断速度（γ、式２を参照）の増加に関連し、したがって、処理時間の短縮に関連する。さらに、上記の特定された賦形剤化合物またはそれらの組み合わせをいくつか添加すると、処理の異なる段階中でタンパク質溶液の安定性を改善することができる。
【０１１０】
処理中、溶液中のタンパク質は、所望のタンパク質活性成分、例えば、治療用または非治療用タンパク質であり得ることが理解される。本明細書に記載の賦形剤を使用してこのようなタンパク質活性成分の処理を容易にすることにで、タンパク質活性成分の収量もしくは生成速度を増加させ、または特定のプロセスの効率を改善し、またはエネルギー使用を減少させることなどができ、どの結果も、粘度低下賦形剤の使用によって改善された処理パラメータを表している。また、タンパク質の汚染物質は、特定の処理技術、例えば、バイオプロセスの発酵および精製ステップの最中に形成される可能性があることも理解される。汚染物質をより迅速に、より完全に、またはより効率的に除去することにより、所望のタンパク質、すなわち、タンパク質活性成分の処理を改善することもできる。これらの結果は、粘度低下賦形剤化合物または添加剤の使用によって改善された処理パラメータを表している。本明細書に記載されるように、本明細書に記載の特定の賦形剤は、溶液粘度を低下させ、タンパク質安定性を改善し、および／またはタンパク質溶解性を増大させることによって、所望のタンパク質活性成分の輸送を改善し、望ましくないタンパク質汚染物質の除去を改善することができる。粘度低下賦形剤または添加剤の使用によって改善された処理パラメータを表す両方の効果は、これらの賦形剤または添加剤が、タンパク質製造のプロセス全体を改善することを示している。ミスフォールディングしたタンパク質、微粒子、変性タンパク質、または溶液中の不安定化したタンパク質の他のアーティファクトの低減は、処理ステップ中の安定化賦形剤の使用によって達成することができる。
【０１１１】
治療用タンパク質の生成と精製のための特定のプラットフォームユニットの操作は、上記の特定された賦形剤化合物またはその組み合わせの有利な使用のさらなる例を提供し、および処理パラメータを改善するこれらの賦形剤または添加剤のさらなる例を提供する。例えば、以下に記載されるように、１つ以上の上記の特定された賦形剤化合物またはそれらの組み合わせを、これらの生成および精製プロセスに導入することで、分子の安定性および回収の大幅な改善、ならびに操作コストの減少が提供され得る。
【０１１２】
当該技術分野では、モノクローナル抗体のような治療用タンパク質を生成および精製するために幅広く実施されている技術は、一般に、発酵プロセスとそれに続く精製処理のための一連のステップからなっていることが理解される。発酵、または上流処理（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ、ＵＳＰ）は、治療用タンパク質を、バイオリアクターで、通常、細菌または哺乳動物の細胞株を使用して、増やすステップを含む。実施形態では、ＵＳＰは、図４に示されるようなステップを含み得る。実施形態では、精製または下流処理（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ、ＤＳＰ）は、図５に示されるようなステップを含み得る。
【０１１３】
図４に示すように、ＵＳＰは、マスター細胞バンク（ｍａｓｔｅｒ  ｃｅｌｌ  ｂａｎｋ、ＭＣＢ）からのバイアルを解凍するステップ１０２で開始され得る。ステップ１０４に示されるように、ＭＣＢを拡張して、ワーキングセルバンク（図示せず）を形成し、および／またはさらなる生成のためのワーキングストックを生成することができる。ステップ１０８および１１０に示されるように、細胞培養は、一連の播種および生成バイオリアクターで行い、バイオリアクター生成物１１２を生じ、それから、ステップ１１４に示されるように、所望の治療用タンパク質が採取され得る。採取１１４に続いて、生成物は、さらなる精製（すなわち、以下により詳細に記載され、図５に示されるようなＤＳＰ）に供され得るか、またはこれらの生成物は、通常、凍結することおよび約−８０℃の温度で保存することによって、バルクで保存され得る。
【０１１４】
実施形態では、細胞培養技術によるタンパク質生成は、上記の特定された賦形剤の使用によって改善することができ、プロセス関連パラメータの改善によって明らかになる。実施形態では、所望の賦形剤は、ＵＳＰ中に、細胞培養培地の粘度を少なくとも２０％低下させるのに有効な量で添加することができる。他の実施形態では、所望の賦形剤は、ＵＳＰ中に、細胞培養培地の粘度を少なくとも３０％低下させるのに有効な量で添加することができる。実施形態では、所望の賦形剤は、約１ｍＭ〜約４００ｍＭの量で細胞培養培地に添加され得る。実施形態では、所望の賦形剤は、約２０ｍＭ〜約２００ｍＭの量で細胞培養培地に添加され得る。実施形態では、所望の賦形剤は、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭの量で細胞培養培地に添加され得る。所望の賦形剤または賦形剤の組み合わせを、細胞培養液に直接添加するか、またはより複雑な補助培地の成分、例えば、別に製剤化され細胞培養培地に添加される栄養素を含む溶液または「給餌」溶液、として添加することができる。実施形態では、第２の賦形剤、例えば、粘度低下化合物を、直接的にまたは補助培地を介してのいずれかでキャリア溶液に添加することができ、第２の粘度低下化合物は、目的の特定のパラメータにさらなる改善を加える。
【０１１５】
以下に記載するように、１つまたは複数の上記の特定された賦形剤化合物またはそれらの組み合わせを使用することで改善し得る、ＵＳＰ中のプロセス関連のパラメータが数多くある。例えば、実施形態では、粘度低減賦形剤の使用は、播種増殖１０４、および細胞培養１０８および１１０などのステップ中の細胞増殖の速度および／または程度などのパラメータを改善することができ、および／またはさまざまなプロセスパラメータの改善と相関している。例えば、バイオリアクターの生成ステップ１１０などのステップで、上記の特定されたいくらかの賦形剤をＵＳＰプロセスに追加すると、細胞培養培地の粘度を下げることができ、続いて、熱伝達効率とガス伝達効率を向上させることができる。細胞培養プロセスでは、タンパク質発現を可能にするために細胞への酸素注入が必要であり、したがって、細胞への酸素の拡散が律速段階になる可能性があるため、溶液の粘度を下げることを通してガス伝達効率を改善することによって酸素取り込み速度を改善すると、タンパク質発現の速度もしくは量、および／またはその効率を改善することができる。この文脈において、酸素取り込み速度およびガス移動効率の速度などのパラメータは、プロキシパラメータと見なすことができ、それらの改善は、改善されたタンパク質発現または改善された処理効率のプロセスパラメータの改善と相関する。別の例として、粘度低下賦形剤の利用可能性は、例えば、播種増殖ステップ１０４中および細胞培養ステップ１０８および１１０中に、成長因子の溶解度（これらの物質が細胞でさらに利用可能になり、それによって細胞増殖が促進される改善された成長因子の溶解度を用いたタンパク質発現に必要である）などのプロキシパラメータを改善することによって、処理を改善することができる。
【０１１６】
実施形態では、ＵＳＰ中のタンパク質回収の量またはタンパク質回収の割合などのプロセスパラメータは、いくつかのメカニズムによりＵＳＰ中に粘度を低下させることによって改善することができる。例えば、完了した細胞培養からの採取１１４中の溶解ステップの終わりでの治療用タンパク質の採取は、より効率的であり得るか、または上記の特定された賦形剤の使用以外の方法で改善され得る。理論に束縛されるものではないが、発現したタンパク質の粘度を低下させることによって、これらの粘度低下賦形剤は、他の溶解成分から離れて治療用タンパク質の拡散効率を高めることができる。さらに、タンパク質含有上清からの膜および他の細胞デブリの分離は、粘度低下賦形剤を使用することで、より速い分離速度またはより高い上清純度でもって達成することができ、それによって、ＵＳＰ効率のプロセスパラメータが改善される。さらに、賦形剤が培地の粘度を低下させるため、粘度低下賦形剤を使用すると、遠心分離または濾過ステップを使用するタンパク質分離ステップを、より速く達成することができる。賦形剤はまた、治療用タンパク質溶液の安定性を改善することができるため、タンパク質の上流および下流処理は、これらの賦形剤の使用から利益を享受することができる。実施形態では、賦形剤は、処理中のタンパク質のストレス耐性を改善することができ、これは、処理ステップ中のタンパク質の凝集または変性の量を低減することができる。
【０１１７】
実施形態では、追加の利点として、上に記載の賦形剤化合物またはそれらの組み合わせ、例えば、粘度低減賦形剤の、細胞培養における使用は、タンパク質のミスフォールディングおよび凝集が低減されるため、ＵＳＰ中のタンパク質の収率などのプロセスパラメータを増加させ得る。細胞培養を、組換えタンパク質の最大収率が得られるように最適化すると、得られたタンパク質は、高度に濃縮された様式で発現され、ミスフォールディングが引き起こされる可能性があることが理解される。上記の特定された賦形剤化合物またはその組み合わせ、例えば粘度低下賦形剤、を追加すると、ミスフォールディングおよび凝集につながる誘引性のタンパク質間相互作用が減少し、それによって、採取１１４に利用可能な無傷の組換えタンパク質の量が増加する。
【０１１８】
例示的な実施形態では、図５に示される下流処理（ＤＳＰ）には、治療用タンパク質、例えば、モノクローナル抗体、バイオ医薬品、ワクチン、および他の生物製剤の回収および精製をもたらす一連のステップが含まれる。ＵＳＰの最後に、目的の治療用タンパク質は、宿主細胞から分泌されて、細胞培養液中に溶解され得る。治療用タンパク質はまた、ＵＳＰシーケンスの最後で、宿主細胞の溶解に続いて液体培地に溶解され得る。ＤＳＰは、それが溶解されている溶液（例えば、培養液または宿主細胞溶解液）から、目的のタンパク質を回収し、それを精製するために行われる。ＤＳＰの間に、（ｉ）様々な汚染物質（不溶性細胞デブリおよび粒子など）を培地から除去し、（ｉｉ）タンパク質生成物を抽出、沈殿、吸着または限外濾過のような技術を介して単離し、（ｉｉｉ）アフィニティークロマトグラフィ、沈殿または結晶化などの技術を介してタンパク質生成物を精製し、（ｉｖ）生成物をさらに磨き上げ（ｐｏｌｉｓｈ）、ウイルスを除去する。
【０１１９】
図５に示すように、細胞培養物採取２００（図４にも記載されている）からのフィードストックは、最初に、通常プロテインＡクロマトグラフィまたは他の類似のクロマトグラフィステップを含むアフィニティークロマトグラフィ２０４に供される。ウイルス不活化ステップ２０８では、通常、フィードストックが、低ｐＨで保持される必要がある。宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、電荷変異体、および凝集体などの不純物を除去するために、１つ以上の磨き上げクロマトグラフィステップ２１０および２１２が行われる。陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィは、最初の磨き上げクロマトグラフィステップ２１０として一般的に使用されるが、それに先行する、またはそれに続く第２のクロマトグラフィステップ２１２を伴ってもよい。第２のクロマトグラフィステップ２１２はさらに、宿主細胞関連の不純物（例えば、ＨＣＰまたはＤＮＡ）、あるいは凝集体などの産物関連不純物を除去する。陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィおよび疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）を、第２のクロマトグラフィステップ２１２として使用することができる。ウイルス除去を行うために、ウイルス濾過２１４が実行される。最終精製ステップ２１８は、限外濾過および透析濾過、ならびに製剤の調製を含み得る。
【０１２０】
概して上に記載したように、発酵プロセスに続く精製プロセスまたはＤＳＰには、（１）細胞培養物の採取、（２）クロマトグラフィ（例えば、プロテインＡクロマトグラフィ、ならびにイオン交換および疎水性相互作用クロマトグラフィを含むクロマトグラフィ磨き上げ精製ステップ）、（３）ウイルス不活化、および（４）濾過（例えば、ウイルス濾過、滅菌濾過、透析、およびタンパク質を濃縮し、タンパク質を製剤緩衝液に交換するための限外濾過もしくは透析濾過のステップ）が含まれる。実施例は、これらの精製プロセスに関連するプロセスパラメータを改善するために、上記の特定された賦形剤化合物またはそれらの組み合わせ、例えば、粘度低下賦形剤を使用することによる利点を説明するために、以下に提供される。上記の特定された賦形剤化合物またはそれらの組み合わせ、例えば、粘度低下賦形剤は、それをキャリア溶液に添加することによって、または他の方法で目的のタンパク質と賦形剤の可溶化もしくは安定化された形態での接触を改変することによって、ＤＳＰの任意の段階で導入され得ることが理解される。実施形態では、第２の賦形剤、例えば、粘度低下化合物は、ＤＳＰの間にキャリア溶液に添加されてもよく、第２の化合物は、目的の特定のパラメータに追加の改善を加える。
【０１２１】
（１）細胞培養物の採取：細胞培養物の採取には、一般に遠心分離とデプス濾過操作が含まれ、細胞デブリがタンパク質含有溶液から物理的に除去される。遠心分離ステップでは、粘度低下賦形剤の利点により、細胞破デブリからの可溶性タンパク質のより完全な分離を提供することができる。バッチ処理または連続処理によってなされても、遠心分離は、標的タンパク質の回収率を最大化するために、高密度相を可能な限り固める必要がある。実施形態では、上記の特定された賦形剤またはそれらの組み合わせの添加は、例えば、遠心分離プロセスの高密度相から流出するタンパク質含有分離液の収量を増加させることによって、タンパク質収量のプロセスパラメータを増加させ得る。デプス濾過ステップは、粘度で制限されるステップであるため、溶液の粘度を低下させる賦形剤を使用することによって、より効率的にすることができる。また、これらのプロセスは、タンパク質溶液に気泡を導入する可能性があり、剪断誘導性のストレスと相まって、精製される治療用タンパク質分子を不安定化させる可能性がある。上に記載のように、細胞培養物の採取前および／または最中に、タンパク質含有溶液に粘度低下賦形剤を添加すると、これらのストレスからタンパク質を保護し、それによってタンパク質凝集の可能性を低減し、定量化される製品回収のプロセスパラメータを改善することができる。
【０１２２】
（２）クロマトグラフィ：遠心分離または濾過による細胞培養物を採取後、通常、クロマトグラフィを使用して、発酵ブロスから治療用タンパク質を分離する。プロテインＡクロマトグラフィは、治療用タンパク質が抗体である場合に使用される。プロテインＡは、ＩｇＧ抗体に対して選択的であり、速い流速と容量で動的に結合する。陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィは、プロテインＡクロマトグラフィの費用対効果の高い代替手段として使用することができる。ＣＥＸを使用する場合は、動的結合容量を最適化するために、カラムに負荷する前に、供給液のｐＨを調整し、その電導度を下げる必要がある。模倣樹脂は、プロテインＡクロマトグラフィの代替物としても使用できる。これらの樹脂は、免疫グロブリン、例えばプロテインＧやプロテインＬのようなＩｇ結合タンパク質、合成リガンド、またはプロテインＡ様の多孔性ポリマーを結合するためのリガンドを提供する。
【０１２３】
ＤＳＰ中に、他のクロマトグラフィプロセスを使用することができる。イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）を使用して、以前のプロセス中に導入された不純物（細胞株からの浸出したプロテインＡ、エンドトキシンまたはウイルス、残留している宿主細胞タンパク質もしくはＤＮＡ、または培地成分など）を除去することができる。ＩＥＣは、ＣＥＸでも陰イオン交換クロマトグラフィでも、プロテインＡクロマトグラフィの直後に適用することができる。疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）は、凝集体を除去するための磨き上げステップとして一般的に使用されるＩＥＣを補完することができる。実施形態では、上記の特定された賦形剤を使用して、クロマトグラフィカラムの負荷ステップ中に、宿主細胞タンパク質の溶解度を増加させ、粘度を減少させることができる。実施形態では、上記の特定された賦形剤を使用して、クロマトグラフィカラムの負荷ステップおよび溶出ステップの間に、治療用タンパク質の溶解度を増加させ、その粘度を減少させることができる。
【０１２４】
タンパク質精製中のクロマトグラフィプロセスでは、（ａ）Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａクロマトグラフィカラムからの溶出中の低ｐＨ条件、（ｂ）クロマトグラフィ樹脂の孔隙内での、局所タンパク質濃度の上昇（しばしば、３００〜４００ｍｇ／ｍＬ程度）内、（ｃ）イオン交換クロマトグラフィ中の塩濃度の上昇、（ｄ）ＨＩＣカラムからの溶出中の塩析剤の濃度の上昇など、タンパク質製剤に厳しい条件が課せられる。上に記載のように、クロマトグラフィの前および／または最中に、タンパク質含有溶液に粘度低下賦形剤を添加すると、クロマトグラフィカラムを通過するタンパク質の移行が容易になるため、クロマトグラフィ処理ステップによって課せられる潜在的な損傷条件にさらされることが少なくなる。さらに、カラム孔隙内で局所タンパク質濃度が高くなると、この空間内に粘度の高い物質が生じ、カラムに大きな背圧がかかる。この背圧を緩和するために、通常、比較的大きな細孔を有する媒体が使用される。しかしながら、大孔径媒体の分解能は、小孔径媒体よりも低くなる。上に記載の粘度改変賦形剤を組み込むと、クロマトグラフィ媒体でより小さな細孔が使用できるようになる。実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィからの溶出ステップは、治療用タンパク質を、溶解度を低下させ、凝集を増加させ得る低ｐＨ条件に曝す。賦形剤を添加すると、標的タンパク質の溶解度を増加させることができるため、プロテインＡクロマトグラフィステップからの回収率が改善される。他の実施形態では、賦形剤の使用で、より高いｐＨでプロテインＡ樹脂から標的タンパク質を溶出することができるようになり、これにより、標的タンパク質に対する化学的ストレスが軽減され、その結果、処理中のタンパク質分解の量が低減されて、タンパク質収率のプロセスパラメータが改善される。
【０１２５】
（３）ウイルス不活化：ウイルス不活化プロセスは、通常、タンパク質溶液を、低ｐＨ、例えば、４より低いｐＨに長期間保持することを含む。ただし、この環境は、治療用タンパク質を不安定化する可能性がある。例えば、ウイルス不活化プロセスの前および／またはその最中に、粘度低下賦形剤を添加することによって、粘度低下賦形剤の存在下でタンパク質を製剤化すると、タンパク質の安定性もしくは溶解度、またはその正味の収率などのプロセスパラメータを改善することができる。
【０１２６】
（４）濾過：濾過プロセスには、ウイルス粒子を除去するためのウイルス濾過プロセス（ナノ濾過）、ならびにタンパク質溶液を濃縮するため、および緩衝液システムを交換するための、限外濾過／透析濾過プロセスが含まれる。
【０１２７】
（ａ）ウイルス濾過はウイルス粒子を除去することによってタンパク質溶液を精製し、組換えヒトモノクローナル抗体のサイズの２倍のオーダーで有り得る。したがって、ウイルス濾過用の濾過膜には、ナノサイズの細孔が必要とされ得る。タンパク質が小さな細孔サイズを通過しなければならず、結果として、この濾過ステップは、タンパク質にストレスを導入する可能性があり、タンパク質の凝集粒子による有意なレベルの膜の汚損を伴う。上に記載のように、例えば、濾過の前および／または最中に、粘度低下賦形剤を添加すると、協同拡散率が増加することによって、濾過システムの背圧などの測定可能なパラメータを減少させることができ、膜汚損の傾向を、それを引き起こすタンパク質間相互作用が緩和されることで、減少させることができる。最終結果として、タンパク質精製中のウイルス濾過ユニットの性能の改善を示すこれらのパラメータが改善される。
【０１２８】
（ｂ）限外濾過および透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）プロセスは、目的のタンパク質よりも小さい特徴的な分子量カットオフを有するフィルター膜に、タンパク質含有溶液を通過させることによって、タンパク質溶液を濃縮し、緩衝液システムを交換する。このステップでは、タンパク質溶液は、フィルターユニット内の高い剪断ストレス、タンパク質濃度の上昇、ＵＦ／ＤＦプロセス中に通常使用される疎水性膜へのタンパク質の吸着、にされされる。上に記載のように、例えば、ＵＦ／ＤＦプロセスの前および／または最中に、粘度低下賦形剤を添加すると、協同拡散率が増加することによって（例えば、ｋDの増加によって測定される）、濾過システムの背圧を減少させることができる。これは、膜全体の剪断ストレスを減らすだけでなく、フィルター膜からの逆拡散をも促進するため、膜界面での有効タンパク質濃度が低下し、透過流束が増加する。その結果、粘度低下賦形剤を使用すると、これらの濾過プロセス中のスループットの向上に関連するパラメータが改善され、生成物の損失が減少し、正味の収率が増加する。さらに、粘性流体を限外および透析フィルターに通すと、フィルター装置全体で大きな圧力降下が発生し、分離が非効率になる可能性がある。上に記載のように、粘度低下賦形剤の存在下でタンパク質溶液を製剤化すると、フィルター装置全体での圧力低下を大幅に減少させることができ、それによって、操作コストおよび処理時間の両方が低減することで、プロセスパラメータが改善する。
【０１２９】
添加された賦形剤を用いて、上流のタンパク質処理または下流の精製が完了した後、賦形剤は、原薬混合物の一部として残るか、またはタンパク質活性成分から分離され得る。緩衝液交換、イオン交換、限外濾過、および透析などの典型的な小分子分離法を使用して、タンパク質活性成分から賦形剤を分離することができる。上に概説したタンパク質精製プロセスに対する有益な効果に加えて、上記の特定された賦形剤の使用により、タンパク質の製造、処理、および精製で使用される機器を保護および維持することができる。例えば、タンパク質処理設備のクリーンアップ、滅菌、メンテナンスなどの設備関連のプロセスは、上記の特定された賦形剤の使用により、汚損の減少、変性の減少、粘度の低下、およびタンパク質の溶解度の改善の結果、促進され、これらのプロセスの改善に関連するパラメータも同様に改善される。
【０１３０】
上流および／または下流の処理を改善するための賦形剤化合物の使用について、本明細書に広く記載されているが、目的のパラメータを改善するなどの所望の効果を達成するために、賦形剤を組み合わせて一緒に添加され得ることが理解される。「賦形剤添加剤」という用語は、所望の効果または改善されたパラメータをもたらす単一の賦形剤化合物、または賦形剤化合物の組み合わせを指し、ここで、組み合わせは、所望の効果または改善されたパラメータの原因となる。
【実施例】
【０１３１】
材料：
●ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）、純度＞９９％、カタログ番号Ｇ５００９、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ
●ヒスチジン、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ
●下記の実施例に記載されているもの以外の材料は、特に指定しない限り、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。
【０１３２】
実施例１：賦形剤化合物および試験タンパク質を含む製剤の調製
製剤は、賦形剤化合物および試験タンパク質を使用して調製され、試験タンパク質は、治療用製剤で使用される治療用タンパク質または非治療用製剤で使用される非治療用タンパク質のいずれかを模擬するように意図されている。このような製剤は、以下の方法で粘度を測定するために、異なる賦形剤化合物を含む５０ｍＭの塩酸ヒスチジン中に調製した。最初に、１．９４ｇのヒスチジンを蒸留水に溶解し、１Ｍの塩酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）でｐＨを約６．０に調整し、次いでメスフラスコ中で蒸留水で２５０ｍＬの最終容量に希釈することによって、ヒスチジン塩酸を調製した。次いで、賦形剤化合物を、５０ｍＭのヒスチジンＨＣｌに溶解した。賦形剤のリストは、以下の実施例４、５、６、および７に提供されている。場合によっては、５０ｍＭヒスチジンＨＣｌに溶解する前に、賦形剤化合物をｐＨ６に調整した。この場合、最初に賦形剤化合物を脱イオン水に約５ｗｔ％で溶解し、塩酸または水酸化ナトリウムを使用して、ｐＨを約６．０に調整した。次いで、調製した塩溶液を約６５℃の対流式実験用オーブンに入れて、水を蒸発させ、固体の賦形剤を単離した。５０ｍＭのヒスチジンＨＣｌ中の賦形剤溶液を調製したら、試験タンパク質のウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）を、賦形剤溶液１ｍＬあたり約０．３３６ｇのＢＧＧの比率で溶解した。これにより、タンパク質の最終濃度が約２８０ｍｇ／ｍＬになった。賦形剤を含む５０ｍＭヒスチジンＨＣｌ中のＢＧＧの溶液を、２０ｍＬバイアル中に配合し、オービタルシェーカーテーブル上で１００ｒｐｍで一晩振盪させた。次いで、ＢＧＧ溶液を２ｍＬマイクロ遠心管に移し、ＩＥＣ  ＭｉｃｒｏＭａｘマイクロ遠心機で２３００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、粘度測定の前に、混入した空気を除去した。
【０１３３】
実施例２：粘度測定
実施例１に記載のように調製された製剤の粘度測定は、ＤＶ−ＩＩＴ  ＬＶコーンおよびプレート粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ、ＭＡ）を用いて行った。粘度計に、ＣＰ−４０コーンを備え付け、３ｒｐｍ、２５℃で操作した。製剤を、０．５ｍＬの容量で粘度計に負荷し、所定の剪断速度と温度で３分間インキュベートした後、２０秒間の測定収集時間が続いた。これに次いで、１分間の剪断インキュベーションとその後の２０秒間の測定収集期間からなる２つの追加ステップが続いた。次いで、収集された３つのデータポイントを平均し、サンプルの粘度として記録した。
【０１３４】
実施例３：タンパク質濃度の測定
実験溶液中のタンパク質の濃度は、ＵＶ／ＶＩＳ分光計（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ  ３５）で、２８０ｎｍの波長でタンパク質溶液の吸光度を測定することによって決定した。最初に、機器を、ｐＨ６の５０ｍＭのヒスチジン緩衝液で吸光度がゼロになるように較正した。次に、タンパク質溶液を、同じヒスチジン緩衝液で３００倍に希釈し、２８０ｎｍでの吸光度を記録した。溶液中のタンパク質の最終濃度は、１．２６４ｍＬ／（ｍｇ  ｘ  ｃｍ）の吸光係数値を使用して計算した。
【０１３５】
実施例４：ヒンダードアミンの賦形剤化合物を含む製剤
２８０ｍｇ／ｍＬのＢＧＧを含む製剤は、添加された賦形剤化合物を含むいくつかのサンプルを使用して、実施例１に記載のように調製した。これらの試験では、ジメチルシクロヘキシルアミン（ＤＭＣＨＡ）、ジシクロヘキシルメチルアミン（ＤＣＨＭＡ）、ジメチルアミノプロピルアミン（ＤＭＡＰＡ）、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）、ジメチルエタノールアミン（ＤＭＥＡ）、およびナイアシンアミドの塩酸塩が、ヒンダードアミン賦形剤化合物の例として試験された。また、ヒンダードアミン賦形剤化合物の例として、ＤＭＣＨＡのヒドロキシ安息香酸塩とタウリン−ジシアンジアミド付加物を試験した。各タンパク質溶液の粘度を、実施例２に記載のように測定し、結果を、以下の表１に提示し、添加された賦形剤化合物が、粘度を低下させる利点を示す。
【表１】
2021515766.tif 000003
【０１３６】
実施例５：アニオン性芳香族の賦形剤化合物を含む製剤
添加された賦形剤化合物を含むいくつかのサンプルを用いて、２８０ｍｇ／ｍＬのＢＧＧの製剤を、実施例１に記載のように調製した。各溶液の粘度を、実施例２に記載のように測定し、結果を下の表２に提示し、添加された賦形剤化合物が、粘度を低下させる利点を示す。
【表２】
2021515766.tif 000004
【０１３７】
実施例６：オリゴペプチドの賦形剤化合物を含む製剤
オリゴペプチド（ｎ＝５）は、ＮｅｏＢｉｏＬａｂ  Ｉｎｃ．（Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）により、純度９５％超で、Ｎ末端を遊離アミンとして、Ｃ末端を遊離酸として合成した。ジペプチド（ｎ＝２）は、ＬｉｆｅＴｅｉｎ  ＬＬＣ（Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、ＮＪ）によって９５％の純度で合成した。添加された賦形剤化合物として合成オリゴペプチドを含むいくつかのサンプルを用いて、実施例１に記載のように２８０ｍｇ／ｍＬのＢＧＧの製剤を調製した。各溶液の粘度を、実施例２に記載のように測定し、結果を下の表３に提示し、添加された賦形剤化合物が、粘度を低下させる利点を示す。
【表３】
2021515766.tif 000005
【０１３８】
実施例７：グアニルタウリンの賦形剤の合成
グアニルタウリンは、米国特許第２，２３０，９６５号に記載の方法に従って調製した。タウリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）３．５３部を１．４２部のジシアンジアミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）と混合し、均一な混合物が得られるまで、乳鉢と乳棒で粉砕した。次に、混合物をフラスコに入れ、２００℃で４時間加熱した。生成物を、さらに精製することなく使用した。
【０１３９】
実施例８：賦形剤化合物を含むタンパク質製剤
製剤は、賦形剤化合物および試験タンパク質を使用して調製され、試験タンパク質は、治療用製剤で使用される治療用タンパク質または非治療用製剤で使用される非治療用タンパク質のいずれかを模擬するように意図されている。そのような製剤を、以下の方法で粘度を測定するために、異なる賦形剤化合物を含む５０ｍＭ塩酸ヒスチジン緩衝液中に調製した。最初に、１．９４ｇのヒスチジンを蒸留水に溶解し、１Ｍの塩酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）でｐＨを約６．０に調整し、次いでメスフラスコ中で蒸留水で２５０ｍＬの最終容量に希釈することによって、ヒスチジン塩酸緩衝液を最初に調製した。次いで、賦形剤化合物を５０ｍＭのヒスチジンＨＣｌ緩衝液に溶解した。表４に、賦形剤化合物のリストを提供する。場合によっては、賦形剤化合物を５０ｍＭのヒスチジンＨＣｌ緩衝液に溶解し、モデルタンパク質を溶解する前に、得られた溶液のｐＨを、少量の水酸化ナトリウムまたは塩酸で調整してｐＨ６にした。場合によっては、５０ｍＭのヒスチジンＨＣｌに溶解する前に、賦形剤化合物をｐＨ６に調整した。この場合、最初に賦形剤化合物を脱イオン水に約５ｗｔ％で溶解し、塩酸または水酸化ナトリウムを使用して、ｐＨを約６．０に調整した。次いで、調製した塩溶液を約６５℃の対流式実験用オーブンに入れて、水を蒸発させ、固体の賦形剤を単離した。５０ｍＭのヒスチジンＨＣｌ中の賦形剤溶液を調製したら、試験タンパク質のウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）を、約２８０ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を達成する比率で溶解した。賦形剤を含む５０ｍＭヒスチジンＨＣｌ中のＢＧＧの溶液を、２０ｍＬバイアル中に配合し、オービタルシェーカーテーブル上で１００ｒｐｍで一晩振盪させた。次いで、ＢＧＧ溶液を２ｍＬマイクロ遠心管に移し、ＩＥＣ  ＭｉｃｒｏＭａｘマイクロ遠心機で２３００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、粘度測定の前に、混入した空気を除去した。
【０１４０】
上記のように調製された製剤の粘度測定は、ＤＶ−ＩＩＴ  ＬＶコーンおよびプレート粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ、ＭＡ）を用いて行った。粘度計に、ＣＰ−４０コーンを備え付け、３ｒｐｍ、２５℃で操作した。製剤を、０．５ｍＬの容量で粘度計に負荷し、所定の剪断速度と温度で３分間インキュベートした後、２０秒間の測定収集時間が続いた。これに次いで、１分間の剪断インキュベーションとその後の２０秒間の測定収集期間からなる２つの追加ステップが続いた。次いで、収集された３つのデータポイントを平均し、サンプルの粘度として記録した。賦形剤を含む溶液の粘度は、賦形剤を含まないモデルタンパク質溶液の粘度に正規化された。正規化された粘度は、賦形剤を含まないモデルタンパク質溶液の粘度に対する、賦形剤を含むモデルタンパク質溶液の粘度の比率である。
【表４】
2021515766.tif 000006
【０１４１】
実施例９：賦形剤の組み合わせおよび試験タンパク質を含む製剤の調製
製剤は、一次賦形剤化合物、二次賦形剤化合物および試験タンパク質を使用して調製され、試験タンパク質は、治療用製剤で使用される治療用タンパク質または非治療用製剤で使用される非治療用タンパク質のいずれかを模擬するように意図されている。一次賦形剤化合物は、以下の表５にリストされているように、アニオン性および芳香族の両方の官能性を有する化合物から選択された。二次賦形剤化合物は、以下の表５にリストされているように、ｐＨ６で非イオン性またはカチオン性電荷のいずれかを有し、およびイミダゾリン環またはベンゼン環のいずれかを有する化合物から選択された。これらの賦形剤の製剤は、以下の方法で粘度を測定するために、５０ｍＭのヒスチジン塩酸緩衝液中に調製された。最初に、１．９４ｇのヒスチジンを蒸留水に溶解し、１Ｍの塩酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）でｐＨを約６．０に調整し、次いでメスフラスコ中で蒸留水で２５０ｍＬの最終容量に希釈することによって、ヒスチジン塩酸を調製した。次いで、個々の一次または二次賦形剤化合物を、５０ｍＭのヒスチジンＨＣｌに溶解した。一次および二次賦形剤の組み合わせを、５０ｍＭのヒスチジンＨＣｌに溶解し、モデルタンパク質を溶解する前に、得られた溶液のｐＨを、少量の水酸化ナトリウムまたは塩酸で調整してｐＨ６にした。上記のように賦形剤溶液が調製されたら、試験タンパク質のウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）を、約２８０ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を達成する比率で各試験溶液に溶解した。賦形剤を含む５０ｍＭヒスチジンＨＣｌ中のＢＧＧの溶液を、２０ｍＬバイアル中に配合し、オービタルシェーカーテーブル上で１００ｒｐｍで一晩振盪させた。次いで、ＢＧＧ溶液を２ｍＬマイクロ遠心管に移し、ＩＥＣ  ＭｉｃｒｏＭａｘマイクロ遠心機で２３００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、粘度測定の前に、混入した空気を除去した。
【０１４２】
上記のように調製された製剤の粘度測定は、ＤＶ−ＩＩＴ  ＬＶコーンおよびプレート粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ、ＭＡ）を用いて行った。粘度計に、ＣＰ−４０コーンを備え付け、３ｒｐｍ、２５℃で操作した。製剤を、０．５ｍＬの容量で粘度計に負荷し、所定の剪断速度と温度で３分間インキュベートした後、２０秒間の測定収集時間が続いた。これに次いで、１分間の剪断インキュベーションとその後の２０秒間の測定収集時間からなる２つの追加ステップが続いた。次いで、収集された３つのデータポイントを平均し、サンプルの粘度として記録した。賦形剤を含む溶液の粘度は、賦形剤を含まないモデルタンパク質溶液の粘度に正規化され、以下の表５にまとめられている。正規化された粘度は、賦形剤を含まないモデルタンパク質溶液の粘度に対する、賦形剤を含むモデルタンパク質溶液の粘度の比率である。この実施例は、一次および二次賦形剤の組み合わせが、単一の賦形剤よりも良好な結果をもたらす可能性があることを示している。
【表５】
2021515766.tif 000007
【０１４３】
実施例１０：賦形剤の組み合わせおよび試験タンパク質を含む製剤の調製
製剤は、一次賦形剤化合物、二次賦形剤化合物および試験タンパク質を使用して調製され、試験タンパク質は、治療用製剤で使用される治療用タンパク質または非治療用製剤で使用される非治療用タンパク質を模擬するように意図されている。一次賦形剤化合物は、以下の表６にリストされているように、アニオン性および芳香族の両方の官能性を有する化合物から選択された。二次賦形剤化合物は、以下の表６にリストされているように、ｐＨ６で非イオン性またはカチオン性電荷のいずれかを有し、およびイミダゾリン環またはベンゼン環のいずれかを有する化合物から選択された。これらの賦形剤の製剤は、以下の方法で粘度を測定するために、蒸留水中に調製された。一次および二次賦形剤の組み合わせを、蒸留水に溶解し、モデルタンパク質を溶解する前に、得られた溶液のｐＨを、少量の水酸化ナトリウムまたは塩酸で調整してｐＨ６にした。蒸留水中の賦形剤溶液が調製されたら、試験タンパク質のウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）を、約２８０ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を達成する比率で溶解した。賦形剤を含む蒸留水中のＢＧＧの溶液を、２０ｍＬバイアル中に配合し、オービタルシェーカーテーブル上で１００ｒｐｍで一晩振盪させた。次いで、ＢＧＧ溶液を２ｍＬマイクロ遠心管に移し、ＩＥＣ  ＭｉｃｒｏＭａｘマイクロ遠心機で２３００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、粘度測定の前に、混入した空気を除去した。
【０１４４】
上記のように調製された製剤の粘度測定は、ＤＶ−ＩＩＴ  ＬＶコーンおよびプレート粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ、ＭＡ）を用いて行った。粘度計に、ＣＰ−４０コーンを備え付け、３ｒｐｍ、２５℃で操作した。製剤を、０．５ｍＬの容量で粘度計に負荷し、所定の剪断速度と温度で３分間インキュベートした後、２０秒間の測定収集時間が続いた。これに次いで、１分間の剪断インキュベーションとその後の２０秒間の測定収集時間からなる２つの追加ステップが続いた。次いで、収集された３つのデータポイントを平均し、サンプルの粘度として記録した。賦形剤を含む溶液の粘度は、賦形剤を含まないモデルタンパク質溶液の粘度に正規化され、以下の表６にまとめられている。正規化された粘度は、賦形剤を含まないモデルタンパク質溶液の粘度に対する、賦形剤を含むモデルタンパク質溶液の粘度の比率である。この実施例は、一次および二次賦形剤の組み合わせが、単一の賦形剤よりも良好な結果をもたらす可能性があることを示している。
【表６】
2021515766.tif 000008
【０１４５】
実施例１１：賦形剤化合物およびＰＥＧを含む製剤の調製
材料：すべての材料は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州から購入した。製剤は、賦形剤化合物およびＰＥＧを使用して調製され、ＰＥＧは、治療用製剤で使用される治療用ＰＥＧ化タンパク質を模擬するように意図されている。このような製剤は、等量のＰＥＧ溶液を賦形剤溶液と混合することによって調製された。どちらの溶液も、ｐＨ７．３の１０ｍＭのＴｒｉｓ、１３５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのｔｒａｎｓ−桂皮酸からなるＴｒｉｓ緩衝液で調製した。ＰＥＧ溶液は、３ｇのポリ（エチレンオキシド）平均分子量約１，０００，０００（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃  ３７２７８１）を９７ｇのＴｒｉｓ緩衝液と混合することによって調製した。完全に溶解させるために、混合物を一晩撹拌した。
【０１４６】
賦形剤溶液の調製の例は、次の通りである。Ｔｒｉｓ緩衝液中のクエン酸の約８０ｍｇ／ｍＬ溶液は、０．４ｇのクエン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ  ｃａｔ．＃２５１２７５）を５ｍＬのＴｒｉｓ緩衝液に溶解し、最小量の１０ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを７．３に調整した。ＰＥＧ賦形剤溶液は、０．５ｍＬのＰＥＧ溶液を０．５ｍＬの賦形剤溶液と混合することによって調製され、数秒間ボルテックスを使用することによって混合した。対照サンプルは、０．５ｍＬのＰＥＧ溶液を０．５ｍＬのＴｒｉｓ緩衝液と混合して調製した。
【０１４７】
実施例１２：賦形剤化合物およびＰＥＧを含む製剤の粘度測定
調製された製剤の粘度測定は、ＤＶ−ＩＩＴ  ＬＶコーンおよびプレート粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ、ＭＡ）を用いて行った。粘度計に、ＣＰ−４０コーンを備え付け、３ｒｐｍ、２５℃で操作した。製剤を、０．５ｍＬの容量で粘度計に負荷し、所定の剪断速度と温度で３分間インキュベートした後、２０秒間の測定収集時間が続いた。これに次いで、１分間の剪断インキュベーションとその後の２０秒間の測定収集期間からなる２つの追加ステップが続いた。次いで、収集された３つのデータポイントを平均し、サンプルの粘度として記録した。
【０１４８】
表７に提示される結果は、添加された賦形剤化合物が粘度を低下させる効果を示している。
【表７】
2021515766.tif 000009
【０１４９】
実施例１３：ＢＳＡ分子当たり１つのＰＥＧ鎖を有するＰＥＧ化ＢＳＡの調製
ビーカーに、２００ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔ．＃Ｐ４４１７）および４ｇのＢＳＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔ．＃Ａ７９０６）を添加し、磁気棒を用いて混合した。次に、４００ｍｇのメトキシポリエチレングリコールマレイミド、ＭＷ＝５，０００、（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔ．＃６３１８７）を添加した。反応混合物を、室温で一晩反応させた。翌日、２０滴の０．１ＭのＨＣｌを加えて反応を停止させた。反応生成物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣにより特徴付けられ、ＰＥＧ化ＢＳＡを明確に示した。反応混合物を、３０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有するＡｍｉｃｏｎ遠心管に入れ、数ミリリットルに濃縮した。次に、サンプルを、ｐＨが約６の５０ｍＭのヒスチジン緩衝液で２０倍に希釈し、続いて、高粘度の液体が得られるまで濃縮した。タンパク質溶液の最終濃度は、２８０ｎｍで吸光度を測定し、ＢＳＡの吸光係数０．６６７８を使用することによって取得した。結果は、溶液中のＢＳＡの最終濃度が３４２ｍｇ／ｍＬであることを示した。
【０１５０】
実施例１４：ＢＳＡ分子あたり複数のＰＥＧ鎖を有するＰＥＧ化ＢＳＡの調製
リン酸緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．２）中の５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ａ７９０６）の溶液は、０．５ｇのＢＳＡを１００ｍＬの緩衝液と混合することによって調製した。次に、１ｇのメトキシＰＥＧプロピオンアルデヒドＭｗ＝２０，０００（ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｐｌａｎｏ，  ＴＸ  ７５０２４）を添加し、続いて０．１２ｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ  １５６１５９）を添加した。反応を、室温で一晩進行させた。翌日、反応混合物をＴｒｉｓ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．３）で１３倍に希釈し、Ａｍｉｃｏｎ遠心管（ＭＷＣＯ  ３０ｋＤａ）を使用して、濃度が約１５０ｍｇ／ｍＬに達するまで濃縮した。
【０１５１】
実施例１５：リゾチーム分子あたり複数のＰＥＧ鎖を有するＰＥＧ化リゾチームの調製
リン酸緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．２）中の５ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｌ６８７６）の溶液は、０．５ｇのリゾチームを１００ｍＬの緩衝液と混合することによって調製した。次に、１ｇのメトキシＰＥＧプロピオンアルデヒドＭｗ＝５，０００（ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｌａｎｏ，ＴＸ  ７５０２４）を添加し、続いて０．１２ｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ  １５６１５９）を添加した。反応を、室温で一晩進行させた。翌日、反応混合物をリン酸緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．２）で４９倍に希釈し、Ａｍｉｃｏｎ遠心管（ＭＷＣＯ  ３０ｋＤａ）を使用して濃縮した。タンパク質溶液の最終濃度は、２８０ｎｍで吸光度を測定し、リゾチームの吸光係数２．６３を使用することによって取得した。溶液中のリゾチームの最終濃度は、１４０ｍｇ／ｍＬであった。
【０１５２】
実施例１６：ＢＳＡ分子当たり１つのＰＥＧ鎖を有するＰＥＧ化ＢＳＡの粘度に対する賦形剤の影響
賦形剤を含むＰＥＧ化ＢＳＡ（上記の実施例１３から）の製剤は、６または１２ミリグラムの賦形剤塩を０．３ｍＬのＰＥＧ化ＢＳＡ溶液に添加することによって調製した。溶液を穏やかに振盪することによって混合し、粘度を、Ａ１０チャネル（深さ１００ミクロン）を備えたＲｈｅｏＳｅｎｓｅ  ｍｉｃｒｏＶｉｓｃにより、５００ｓ-1の剪断速度で測定した。粘度計の測定は、周囲温度で完了した。表８に提示される結果は、添加された賦形剤化合物が粘度を低下させる効果を示している。
【表８】
2021515766.tif 000010
【０１５３】
実施例１７：ＢＳＡ分子あたり複数のＰＥＧ鎖を有するＰＥＧ化ＢＳＡの粘度に対する賦形剤の影響
賦形剤としてクエン酸Ｎａ塩を有するＰＥＧ化ＢＳＡ（上記の実施例１４から）の製剤は、８ミリグラムの賦形剤塩を０．２ｍＬのＰＥＧ化ＢＳＡ溶液に添加することによって調製した。溶液を穏やかに振盪することによって混合し、粘度を、Ａ１０チャネル（深さ１００ミクロン）を備えたＲｈｅｏＳｅｎｓｅ  ｍｉｃｒｏＶｉｓｃにより、５００ｓ-1の剪断速度で測定した。粘度計の測定は、周囲温度で完了した。表９に提示される結果は、添加された賦形剤化合物が粘度を低下させる効果を示している。
【表９】
2021515766.tif 000011
【０１５４】
実施例１８：リゾチーム分子あたり複数のＰＥＧ鎖を有するＰＥＧ化リゾチームの粘度に対する賦形剤の影響
賦形剤として酢酸カリウムを有するＰＥＧ化リゾチーム（上記の実施例１５から）の製剤は、６ミリグラムの賦形剤塩を０．３ｍＬのＰＥＧ化リゾチーム溶液に添加することによって調製した。溶液を穏やかに振盪することによって混合し、粘度を、Ａ１０チャネル（深さ１００ミクロン）を備えたＲｈｅｏＳｅｎｓｅ  ｍｉｃｒｏＶｉｓｃにより、５００ｓ-1の剪断速度で測定した。粘度計の測定は、周囲温度で完了した。表１０に提示される結果は、添加された賦形剤化合物が粘度を低下させる利点を示している。
【表１０】
2021515766.tif 000012
【０１５５】
実施例１９：賦形剤の組み合わせを含むタンパク質製剤
製剤は、賦形剤化合物または２つの賦形剤化合物と試験タンパク質の組み合わせを使用して調製され、試験タンパク質は、治療用製剤で使用される治療用タンパク質を模擬するように意図されている。これらの製剤は、以下の方法で粘度を測定するために、異なる賦形剤化合物を含む２０ｍＭのヒスチジン緩衝液中に調製した。賦形剤の組み合わせを、２０ｍＭのヒスチジンに溶解し、モデルタンパク質を溶解する前に、得られた溶液のｐＨを、少量の水酸化ナトリウムまたは塩酸で調整してｐＨ６にした。この実施例の賦形剤化合物を、以下の表１１に列挙する。賦形剤溶液が調製されたら、試験タンパク質のウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）を、約２８０ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を達成する比率で溶解した。賦形剤溶液中のＢＧＧの溶液を、５ｍＬ滅菌ポリプロピレンチューブ中に配合し、オービタルシェーカーテーブル上で８０〜１００ｒｐｍで一晩振盪させた。次いで、ＢＧＧ溶液を２ｍＬマイクロ遠心管に移し、ＩＥＣ  ＭｉｃｒｏＭａｘマイクロ遠心機で２３００ｒｐｍで約１０分間遠心分離して、粘度測定の前に、混入した空気を除去した。
【０１５６】
上記のように調製された製剤の粘度測定は、ＤＶ−ＩＩＴ  ＬＶコーンおよびプレート粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ、ＭＡ）を用いて行った。粘度計に、ＣＰ−４０コーンを備え付け、３ｒｐｍ、２５℃で操作した。製剤を、０．５ｍＬの容量で粘度計に負荷し、所定の剪断速度と温度で３分間インキュベートした後、２０秒間の測定収集時間が続いた。これに次いで、１分間の剪断インキュベーションとその後の２０秒間の測定収集期間からなる２つの追加ステップが続いた。次いで、収集された３つのデータポイントを平均し、サンプルの粘度として記録した。賦形剤を含む溶液の粘度は、賦形剤を含まないモデルタンパク質溶液の粘度に正規化され、結果を、以下の表１１に示す。正規化された粘度は、賦形剤を含まないモデルタンパク質溶液の粘度に対する、賦形剤を含むモデルタンパク質溶液の粘度の比率である。
【表１１】
2021515766.tif 000013
【０１５７】
実施例２０：粘度および注射時疼痛を軽減するための賦形剤を含むタンパク質製剤
製剤は、賦形剤化合物、第２の賦形剤化合物、および試験タンパク質を使用して調製され、試験タンパク質は、治療用製剤で使用される治療用タンパク質を模擬するように意図されている。第１の賦形剤化合物である賦形剤Ａは、局所麻酔特性を有する化合物の群から選択された。第１の賦形剤（賦形剤Ａ）、および第２の賦形剤（賦形剤Ｂ）を、表１２に列挙する。これらの製剤は、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液中で、賦形剤Ａと賦形剤Ｂを次のように使用して調製され、それらの粘度が測定され得るようにした。表１２に開示される量の賦形剤を、２０ｍＭのヒスチジンに溶解し、モデルタンパク質を溶解する前に、得られた溶液のｐＨを、少量の水酸化ナトリウムまたは塩酸で調整してｐＨ６にした。賦形剤溶液が調製されたら、試験タンパク質のウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）を、約２８０ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を達成する比率で賦形剤溶液に溶解した。賦形剤溶液中のＢＧＧの溶液を、５ｍＬ滅菌ポリプロピレンチューブ中に配合し、オービタルシェーカーテーブル上で８０〜１００ｒｐｍで一晩振盪させた。次いで、ＢＧＧ−賦形剤溶液を２ｍＬマイクロ遠心管に移し、ＩＥＣ  ＭｉｃｒｏＭａｘマイクロ遠心機で２３００ｒｐｍで約１０分間遠心分離して、粘度測定の前に、混入した空気を除去した。
【０１５８】
上記のように調製された製剤の粘度測定は、ＤＶ−ＩＩＴ  ＬＶコーンおよびプレート粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ、ＭＡ）を用いて行った。粘度計に、ＣＰ−４０コーンを備え付け、３ｒｐｍ、２５℃で操作した。製剤を、０．５ｍＬの容量で粘度計に負荷し、所定の剪断速度と温度で３分間インキュベートした後、２０秒間の測定収集時間が続いた。これに次いで、１分間の剪断インキュベーションとその後の２０秒間の測定収集期間からなる２つの追加ステップが続いた。次いで、収集された３つのデータポイントを平均し、サンプルの粘度として記録した。賦形剤を含む溶液の粘度は、賦形剤を含まないモデルタンパク質溶液の粘度に正規化され、結果を、以下の表１２に示す。正規化された粘度は、賦形剤を含まないモデルタンパク質溶液の粘度に対する、賦形剤を含むモデルタンパク質溶液の粘度の比率である。
【表１２】
2021515766.tif 000014
【０１５９】
実施例２１：賦形剤化合物およびＰＥＧを含む製剤
製剤は、賦形剤化合物およびＰＥＧを使用して調製され、ＰＥＧは、治療用製剤で使用される治療用ＰＥＧ化タンパク質を模擬することが意図されており、賦形剤化合物は、表１３に示される量で提供された。これらの製剤は、等量のＰＥＧ溶液を賦形剤溶液と混合することによって調製された。どちらの溶液も、脱イオン（ＤＩ）水で調製した。ＰＥＧ溶液は、１６．５ｇのポリ（エチレンオキシド）平均分子量約１００，０００（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃１８１９８６）を８３．５ｇのＤＩ水と混合することによって調製した。完全に溶解させるために、混合物を一晩撹拌した。
【０１６０】
賦形剤溶液は、この一般的な方法によって、以下の表１３に詳しく示されるように調製される。ＤＩ水中の水リン酸三カリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ  カタログ＃Ｐ５６２９）の約２０ｍｇ／ｍＬ溶液は、０．０５ｇのリン酸カリウムを、５ｍＬのＤＩ水に溶解して調製した。ＰＥＧ賦形剤溶液は、０．５ｍＬのＰＥＧ溶液を０．５ｍＬの賦形剤溶液と混合することによって調製され、数秒間ボルテックスを使用することによって混合した。対照サンプルは、０．５ｍＬのＰＥＧ溶液を０．５ｍＬのＤＩ水と混合して調製した。粘度を測定し、結果を以下の表１３に記録する。
【表１３】
2021515766.tif 000015
【０１６１】
実施例２２：賦形剤による改善されたタンパク質溶液の処理
０．２５ｇの固体ＢＧＧを４ｍＬの緩衝液と混合して、２つのＢＧＧ溶液を調製した。サンプルＡの場合：緩衝液は、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ＝６．０）であった。サンプルＢの場合：緩衝液は、１５ｍｇ／ｍＬのカフェイン（ｐＨ＝６）を含む２０ｍＭのヒスチジン緩衝液であった。固体ＢＧＧの溶解は、サンプルを、１００ｒｐｍに設定されたオービタルシェーカーに配置することによって行った。カフェイン賦形剤を含む緩衝液サンプルが、タンパク質をより速く溶解することが観察された。カフェイン賦形剤を含むサンプル（サンプルＢ）の場合、ＢＧＧの完全な溶解が１５分で達成された。カフェインを含まないサンプル（サンプルＡ）の場合、溶解には３５分を要した。次に、サンプルを、２つの別個の３０ｋＤａ分子量カットオフのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ４  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔに入れ、サンプルを２，５００ｒｐｍで１０分間隔で遠心分離した。遠心分離を１０分間実行するたびに、回収された濾液の容量を記録した。表１４の結果は、サンプルＢの濾液の回収が速いことを示している。さらに、サンプルＢは実行毎に濃縮が続いたが、サンプルＡは最大濃縮点に達し、サンプルのさらなる濃縮はもたらされなかった。
【表１４】
2021515766.tif 000016
【０１６２】
実施例２３：複数の賦形剤を含むタンパク質製剤
この例は、賦形剤としてのカフェインとアルギニンの組み合わせが、ＢＧＧ溶液の粘度低下に対してどのように有益な効果を有するかを示している。０．１８ｇの固体ＢＧＧと０．５ｍＬの２０ｍＭのヒスチジン緩衝液をｐＨ６で混合することによって、４つのＢＧＧ溶液を調製した。各緩衝液は、以下の表（表１５）に記載されるように、異なる賦形剤または賦形剤の組み合わせを含んだ。溶液の粘度は、前の実施例に記載されているように測定された。結果は、ヒンダードアミン賦形剤であるカフェインを、アルギニンなどの既知の賦形剤と組み合わせることができ、その組み合わせが個々の賦形剤自体よりも優れた粘度低下特性を持っていることを示している。
【表１５】
2021515766.tif 000017
【０１６３】
アルギニンを、ｐＨ６のヒスチジン緩衝液中のＢＧＧの２８０ｍｇ／ｍＬ溶液に添加した。表１６に示すように、５０ｍｇ／ｍＬを超えるレベルでは、アルギニンをさらに添加しても粘度はそれ以上低下しなかった。
【表１６】
2021515766.tif 000018
【０１６４】
カフェインを、ｐＨ６のヒスチジン緩衝液中のＢＧＧの２８０ｍｇ／ｍＬ溶液に添加した。表１７に示すように、１０ｍｇ／ｍＬを超えるレベルでは、カフェインをさらに添加しても粘度はそれ以上低下しなかった。
【表１７】
2021515766.tif 000019
【０１６５】
例２４：ＴＦＦ濃縮プロセス中のカフェインの効果
この実施例では、接線流濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＴＦＦ）を使用して、カフェインの存在下および非存在下で、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）溶液を濃縮した。ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）製造のラボスケールＴＦＦシステムを使用して実験を行った。システムには、３０ｋＤａ分子量カットオフのＵｌｔｒａｃｅｌ膜（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビレリカ、マサチューセッツ州）を含むＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  ＴＦＦカセットを取り付けた。名目膜表面積は、５０ｃｍ2であった。カセットへの供給圧送を３０ｐｓｉに維持し、保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）の圧力を１０ｐｓｉに維持した。濾液の流束は、その質量を時間の関数として測定することによって、実験の過程でモニターした。約１２グラムのＢＧＧを、１５ｍｇ／ｍＬのカフェイン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および２０ｍＭのヒスチジンを含む５００ｍＬの緩衝液に溶解し、ｐＨ６に調整した。対照サンプルは、１２グラムのＢＧＧを、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および２０ｍＭのヒスチジンを含む５００ｍＬの緩衝液に溶解し、ｐＨ６に調整して調製した。緩衝液成分は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＴＦＦ処理の前に、両方の溶液を０．２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルター（ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ）で濾過した。ＴＦＦ中の試験サンプルと対照サンプルのパフォーマンスは、物質移動係数によって測定した。物質移動係数は、次の方程式を使用して、各サンプルについて決定した（Ｊ．Ｈｕｎｇ，Ａ．Ｕ．Ｂｏｒｗａｎｋａｒ，Ｂ．Ｊ．Ｄｅａｒ，Ｔ．Ｍ．Ｔｒｕｓｋｅｔｔ，Ｋ．Ｐ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｈｉｇｈ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｂｌｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｉｅｓ．Ｊ．Ｍｅｍｂ．Ｓｃｉ．５０８，１１３−１２６  （２０１６））：
Ｊ＝ｋcｌｎ（Ｃw／Ｃb）                          （式３）
【０１６６】
式３は、濾液の近くの流束Ｊを表し、ｋcは、物質移動係数、Ｃwは、膜近傍のタンパク質濃度、Ｃbは、液体バルクの濃度であり、それによって、式３で物質移動係数ｋcの計算が可能になる。計算された流束Ｊのｌｎ（Ｃb）に対するグラフは、傾きが−ｋｃの線形プロットを与える。ここで、流束Ｊは、時間に対する濾液の質量の微分をとることによって計算され、Ｃbは、物質収支を使用して計算される。最良近似の物質移動係数を、表１８に示す。１５ｍｇ／ｍＬのカフェインの導入により、物質移動係数の値が、２２．５から２５．４Ｌｍ-2ｈｒ-1（ＬＭＨ）に約１３％増加した。
【表１８】
2021515766.tif 000020
【０１６７】
例２５：ＴＦＦ濃縮プロセス中のカフェインの効果
この実施例では、接線流濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＴＦＦ）を使用して、カフェインの存在下および非存在下で、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）溶液を濃縮した。ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）製造のラボスケールＴＦＦシステムを使用して実験を行った。システムには、３０ｋＤａ分子量カットオフのＵｌｔｒａｃｅｌ膜（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビレリカ、マサチューセッツ州）を含むＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  ＴＦＦカセットを取り付けた。名目膜表面積は、５０ｃｍ2であった。対照サンプルは、１４．６グラムのＢＧＧを、１５０ｍＭのＮａＣｌ、およびｐＨ６に調整された２０ｍＭのヒスチジンを含む５８２ｍＬの緩衝液に溶解することによって、初期ＢＧＧ濃度が、名目上２５．１ｍｇ／ｍＬになるように調製した。材料を、０．２μｍＰＥＳフィルター（ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ）で濾過し、次いでＴＦＦ装置で処理した。ポンプ速度は、供給圧が最初に３０ｐｓｉになるように調整し、保持液バルブは、保持液の圧力が最初に１０ｐｓｉになるように調整した。ポンプ速度または保持液バルブのいずれかを、４．１時間調整せずに材料を濃縮した。以下の表１９に示すように、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイにより、初期および最終濃度は、それぞれ２５．４±０．６および１５９±６ｍｇ／ｍＬと決定された。カフェイン含有サンプルは、１４．２ｇのＢＧＧを、１５ｍｇ／ｍＬのカフェイン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、およびｐＨ６に調整された２０ｍＭのヒスチジンを含む５６６ｍＬの緩衝液に溶解することによって、初期ＢＧＧ濃度が、名目上２５．１ｍｇ／ｍＬになるように調製した。材料を、０．２μｍＰＥＳフィルター（ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ）で濾過し、次いでＴＦＦ装置で処理した。ポンプ速度と保持液バルブは、以前のものと同一のレベルに設定した。以前と同様に、供給液と保持液の圧力は、それぞれ３０ｐｓｉと１０ｐｓｉであることが確認された。ポンプ速度または保持液バルブのいずれかを、４．１時間調整せずに材料を濃縮した。以下の表１９に示すように、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイにより、初期および最終濃度は、それぞれ２４．４±０．５および２２５±１０ｍｇ／ｍＬと決定された。ＴＦＦ処理中にカフェインを使用すると、対照と比較した場合、最終タンパク質濃度が、１５９から２２５ｍｇ／ｍＬに約４２％増加した。
【表１９】
2021515766.tif 000021
【０１６８】
実施例２６：ＢＧＧ溶液の除菌濾過中のカフェインの効果
ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）、Ｌ−ヒスチジン、およびカフェインは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州、各製品番号、Ｇ５００９、Ｈ６０３４およびＣ７７３１）から購入した。脱イオン（ＤＩ）水は、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）のＤｉｒｅｃｔ−Ｑ  ３  ＵＶ精製システムを使用して、水道水から生成された。０．２μｍポアの２５ｍｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，、カタログ番号６７８０−２５０２）から購入した。１−ｍＬ  Ｌｕｅｒ−Ｌｏｋシリンジは、Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ３０９６２８）から購入した。２０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）は、Ｌ−ヒスチジン、ＤＩ水を使用して調製し、１ＭのＨＣｌでｐＨ６．０に滴定した。ヒスチジン緩衝液を使用して、カフェインの１５ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。カフェインを含まない緩衝液およびカフェインを含む緩衝液を使用して、ＢＧＧを約２８０ｍｇ／ｍＬの最終濃度に再構成した。タンパク質濃度ｃは、以下の式を使用して計算した。
【数１】
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式中、ｍpは、タンパク質の質量、ｂは、添加された緩衝液の容量、およびνは、ＢＧＧの部分比容で、ここでは０．７４ｍＬ／ｇとした。各サンプルの粘度は、２３℃の温度で、２５０ｓ-1ノ剪断速度で、ｍｉｃｒｏＶｉｓｃレオメーター（ＲｈｅｏＳｅｎｓｅ、Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ、ＣＡ）を使用して測定した。ＢＧＧ溶液を滅菌フィルターに通すのに必要なエネルギーは、１００Ｎのロードセル（Ｉｎｓｔｒｏｎ、Ｎｅｅｄｈａｍ、ＭＡ、部品番号２５１９−１０３）を装着した引張圧縮試験機（Ｔｅｎｓｉｌｅ  Ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｓｔｅｒ（ＴＣＴ）、Ｉｎｓｔｒｏｎ、Ｎｅｅｄｈａｍ、ＭＡ、部品番号３３４３）を使用して測定した。シリンジのプランジャーは、５０ｍｍの距離を１５９ｍｍ／ｍｉｎの速度で押し下げた。エネルギー所要量は、ＴＣＴで測定された負荷対伸展曲線を積分することによって計算され、結果を、以下の表２０にまとめる。
【表２０】
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【０１６９】
実施例２７：プロテインＡクロマトグラフィの溶出を改善するための賦形剤
４つの精製された研究グレードのバイオシミラー抗体、イピリムマブ、ウステキヌマブ、オマリズマブ、およびトシリズマブは、Ｂｉｏｃｅｒｏｓ（Ｕｔｒｅｃｈｔ、オランダ）から購入した。これらは、分注４０ｍＭの酢酸ナトリウム水溶液、５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ５．５）で、それぞれ２０、２６、１５、および２３ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度の凍結した一定分量として提供された。測定前、タンパク質溶液を室温で解凍し、その後、０．２μｍポリエーテルスルホンフィルターを通して濾過した。濾過したタンパク質ストック溶液を、タンパク質ストック溶液と結合緩衝液の比が１：１になるように混合した。プロテインＡ樹脂への抗体の結合を促進するために使用される結合緩衝液は、脱イオン（ＤＩ）水中ｐＨ７．２で、０．１Ｍのリン酸ナトリウムおよび０．１５の塩化ナトリウムから構成された。ＤＩ水は、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）のＤｉｒｅｃｔ−Ｑ  ３  ＵＶ精製システムを使用して、水道水から生成された。これらの溶液は、ＰＩＥＲＣＥ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｔｅ  ｆｏｒ  ＩｇＧ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  カタログ＃４５２０２）を使用して、プロテインＡの結合と溶出の研究を行うために使用された。プレートには９６個のウェルがあり、それぞれに５０μＬのＰｒｏｔｅｉｎＡ樹脂が含まれた。２００μＬの結合緩衝液を各ウェルに加えることによって、樹脂を結合緩衝液で洗浄し、プレートを１０００×ｇで１分間遠心分離し、フロースルー液を廃棄した。その後のすべての遠心分離ステップは、１０００×ｇで１分間行った。この洗浄手順を、もう一度繰り返した。これらの最初の洗浄ステップに続いて、希釈されたタンパク質サンプル、すなわち、イピリムマブ、ウステキヌマブ、オマリズマブ、およびトシリズマブを含むサンプルを、プレートのウェルに添加した（ウェルあたり２００μＬ）。次いで、プレートをＤａｉｇｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）Ｌａｂｇｅｎｉｕｓオービタルシェーカー上に置き、２６０ｒｐｍで３０分間攪拌し、続いてプレートを遠心分離し、フロースルーを廃棄した。次いで、各ウェルに５００μＬの結合緩衝液を添加し、プレートを遠心分離し、フロースルーを廃棄することによって、ウェルを洗浄した。この洗浄ステップを、２回繰り返した。これらの洗浄ステップの後、異なる賦形剤が添加された溶出緩衝液を使用して、タンパク質をプレートから溶出した。各溶出について、ｐＨ７の１Ｍのリン酸ナトリウムからなる５０μＬの中和緩衝液を、コレクションプレートの各ウェルに添加し、次いで２００μＬの溶出緩衝液を、プレートの各ウェルに添加した。プレートを２６０ｒｐｍで１分間攪拌し、次いで遠心分離した。フロースルーを、分析のために回収した。この溶出ステップを、もう１回繰り返した。賦形剤を含まない対照緩衝液は、２０ｍＭのクエン酸を含み、ｐＨ２．６であった。プロテインＡ溶出緩衝液は、しばしばいくらかの量の塩を含むため、クエン酸緩衝液中の１００ｍＭのＮａＣｌの溶出緩衝液を、二次対照として調製した。
【０１７０】
表２１は、この実施例で使用される賦形剤溶液、それらの濃度、および溶出緩衝液の最終ｐＨを示す。Ｈｅｒｂ  Ｓｔｏｒｅ  ＵＳＡ（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）から購入したアスパルテーム、Ｃａｓｃａｄｅ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ、ＯＲ）から購入したトレハロース、およびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｍｔ．  Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、ＩＬ、製品番号Ｓ２４０６０）から購入したスクロースを除いて、すべての賦形剤は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。賦形剤を含むすべての溶出緩衝液は、適切な量の賦形剤を約１０ｍＬの無塩クエン酸緩衝液対照と混合することによって調製した。溶出緩衝液は、約１００ｍＭの賦形剤で調製した。しかし、すべての賦形剤がこのレベルで可溶性ではない。したがって、表２１に、使用したすべての賦形剤濃度を示す。各溶出緩衝液のｐＨは、必要に応じて、塩酸または水酸化ナトリウムを使用して約２．６±０．１に調整した。
【０１７１】
各タンパク質サンプルについて、ＨＰＬＣワークステーション（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ  １１００システム）に接続されたＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム（３０ｃｍ  ｘ  ４．６ｍｍ  ＩＤ、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ）を使用して、ＡＳＤ高性能サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）分析を行った。分離は、０．３５ｍＬ／分の流量で室温で行った。移動相は、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７の水性緩衝液であった。タンパク質濃度は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズのＧ１３１５Ｂダイオードアレイ検出器を使用して、２８０ｎｍでの吸光度によってモニターした。各タンパク質、すなわち、イピリムマブ、ウステキヌマブ、オマリズマブ、およびトシリズマブのプロテインＡ樹脂から溶出されたタンパク質の総量は、クロマトグラムを積分することによって推定した。各タンパク質、すなわち、イピリムマブ、ウステキヌマブ、オマリズマブ、およびトシリズマブの積算ピーク面積を表２２〜２５に示す。表２２〜２５はまた、実験のピーク面積を無塩および塩含有対照のピーク面積と比較している。１００％を超える値は、溶出緩衝液に、対照よりも多いタンパク質がプロテインＡ樹脂から回収されたことを示し、一方、１００％未満の値は、溶出緩衝液に、対照よりも少ないタンパク質がプロテインＡ樹脂から回収されたことを示す。
【表２１】
2021515766.tif 000024
【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【０１７２】
実施例２８：プロテインＡクロマトグラフィの溶出を改善するための賦形剤
この実施例で使用される試験タンパク質は、実施例２７のものと同一であり、すなわち、イピリムマブ、ウステキヌマブ、オマリズマブ、およびトシリズマブである。プロテインＡ結合および溶出の研究は、実施例２７のものと同一のプレートを使用して行った。プロテインＡプレートから抗体を負荷および溶出する方法は、溶出ステップを除いて、実施例２７のものと同一であった。実施例２７では、２回の溶出洗浄を行った。しかし、この実施例では、１回の洗浄のみ行った。実施例２７のように、溶出緩衝液は、２０ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ２．６）、対照緩衝液から調製された。賦形剤は、以下の表２６に記載されている。賦形剤はすべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。実施例２７と同一な方法で回収されたタンパク質を、ＨＰＬＣにより分析し、各タンパク質、すなわち、イピリムマブ、ウステキヌマブ、オマリズマブ、およびトシリズマブのタンパク質回収の結果を、以下の表２６〜３０に示す。
【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【０１７３】
実施例２９：プロテインＡクロマトグラフィカラムからのオマリズマブ溶出を改善する賦形剤
研究グレードのオマリズマブは、Ｂｉｏｃｅｒｏｓ（ユトレヒト、オランダ）から購入し、４０ｍＭの酢酸ナトリウム水溶液、５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ５．５）中に１５ｍｇ／ｍＬで凍結して提供された。実験前、タンパク質を室温で解凍し、０．２μｍポリエーテルスルホンフィルターで濾過した。濾過した材料を、１：１の比率で、ＤＩ水中の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）からなる結合緩衝液と混合した。水道水は、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ビレリカ、マサチューセッツ州）のＤｉｒｅｃｔ−Ｑ  ３  ＵＶ精製システムで精製して、ＤＩ水を生成した。プロテインＡ精製は、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ  ＨＰの１ｍＬカラム（シカゴ、イリノイ州、製品番号２９０４８５７６）を使用して行った。各実験では、最初に、カラムを１０ｍＬの結合緩衝液で平衡化した。平衡化後、３０ｍｇのタンパク質をＰｒｏｔｅｉｎＡカラムに負荷した。次いで、カラムを５ｍＬの結合緩衝液で洗浄した。カラムを洗浄した後、結合したオマリズマブを、以下の表３１に示されている賦形剤を含む溶出緩衝液の１つの画分を使用して、カラムから溶出した。溶出緩衝液は、示された賦形剤を、２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解することによって調製した。すべての溶出緩衝液を、ｐＨ４．０に調整した。５つの１ｍＬ画分を収集した。最後に、５ｍＬの１００ｍＭクエン酸塩（ｐＨ３．０）緩衝液でカラムを洗浄することによって、ＰｒｏｔｅｉｎＡを再生した。各ステップの流速は、１ｍＬ／ｍｉｎであり、Ｆｕｓｉｏｎ  １００注入ポンプ（Ｃｈｅｍｙｘ、Ｓｔａｆｆｏｒｄ、ＴＸ）で維持した。１０ｍＬ  ＮｏｒｍＪｅｃｔ  Ｌｕｅｒ  Ｌｏｋシリンジを使用した（Ｈｅｎｋｅ  Ｓａｓｓ  Ｗｏｌｆ、Ｔｕｔｔｌｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、参照番号４１００−０００Ｖ０）。
【０１７４】
溶出画分、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、およびＥ５は、高性能サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）分析により、総タンパク質含有量を測定した。ＳＥＣ分析は、ＨＰＬＣワークステーション（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ  １１００システム）に接続されたＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム（３０ｃｍ  ｘ  ４．６ｍｍ  ＩＤ、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ）を使用して行った。分離は、０．３５ｍＬ／分の流量で室温で行った。移動相は、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７の水性緩衝液であった。タンパク質濃度は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズのＧ１３１５Ｂダイオードアレイ検出器を使用して、２８０ｎｍでの吸光度によってモニターした。プロテインＡ樹脂から溶出されたタンパク質の総量は、クロマトグラムを積算することにより推定した。
【０１７５】
クエン酸は、プロテインＡクロマトグラフィで使用される一般的な賦形剤であるため、ここでは対照として使用した。対照サンプルの溶出画分は、沈殿相の形成によって明らかなように、４℃で一晩保存すると不溶性凝集物を示した。したがって、以下の表３１に報告するピーク面積は、溶出画分中の総可溶性タンパク質量を表している。我々は、不溶性凝集物が対照サンプルでのみ観察され、他のサンプルのいずれもそのような凝集物を示さなかったことに注目する。対照（クエン酸塩賦形剤を使用した）のピーク面積よりも大きいピーク面積から、試験賦形剤を使用すると、タンパク質がより効率的にカラムから分離できることが示される。
【表３１】
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【０１７６】
実施例３０：異なる量のカフェイン賦形剤を含むＢＧＧの製剤
製剤は、異なるモル濃度のカフェイン（以下の表３２に記載されている濃度で）および試験タンパク質を用いて調製され、試験タンパク質は、治療用製剤で使用される治療用タンパク質を模擬するように意図されている。この実施例の製剤は、以下の方法で粘度を測定するために、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液中に調製した。０および８０ｍＭのカフェインのストック溶液を、２０ｍＭのヒスチジン中に調製し、モデルタンパク質を溶解する前に、得られた溶液のｐＨを、少量の水酸化ナトリウムまたは塩酸で調整してｐＨ６にした。様々なカフェイン濃度の追加の溶液は、２つのストック溶液をさまざまな容量比で混ぜて調製され、以下の表３２に示される濃度で、一連のカフェイン含有溶液を提供した。これらの賦形剤溶液が調製されたら、試験タンパク質のウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）を、０．７ｍＬの各賦形剤溶液を、０．２５ｇの凍結乾燥したにＢＧＧ粉末に添加することによって、約２８０ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を達成する比率で各試験溶液に溶解した。ＢＧＧを含む溶液を、５ｍＬの滅菌ポリプロピレンチューブ中で調合し、オービタルシェーカーテーブル上で１００ｒｐｍで一晩振盪した。次いで、これらの溶液を２ｍＬマイクロ遠心管に移し、ＩＥＣ  ＭｉｃｒｏＭａｘマイクロ遠心機で２４００ｒｐｍで約５分間遠心分離して、粘度測定の前に、混入した空気を除去した。
【０１７７】
上に記載のように調製された製剤の粘度測定は、ｍｉｃｒｏＶｉｓｃ粘度計（ＲｈｅｏＳｅｎｓｅ、Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ、ＣＡ）で行った。粘度計は、深さが１００ミクロンのチャネルを有するＡ−１０チップを備え、２５０ｓ-1の剪断速度で、２５℃で操作された。粘度を測定するために、ピペットからすべての気泡を除去するように注意しながら、試験製剤を粘度計に負荷した。負荷されたサンプル製剤を含むピペットを機器に配置し、測定温度で約５分間インキュベートした。次いで、チャネルが、試験流体で完全に平衡化されるまで（安定した粘度の読みで示される）機器を稼働させ、その後、粘度をセンチポアズで記録した。得られた粘度結果を、以下の表３２に提示する。
【表３２】
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【０１７８】
実施例３１：脱イオン水中の共溶質の溶液の調製
水へのカフェインの溶解度を高めるために共溶質として使用された化合物は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）から入手され、ナイアシンアミド、プロリン、プロカインＨＣｌ、アスコルビン酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、リドカイン、サッカリン、アセスルファムＫ、チラミン、およびアミノ安息香酸が含まれた。各共溶質の溶液は、乾燥固体を脱イオン水に溶解することで調製し、場合によっては、必要に応じて、ｐＨを、５Ｍの塩酸または５Ｍの水酸化ナトリウムで、約６のｐＨから約８のｐＨの間の値に調整した。次いで、クラスＡのメスフラスコを使用して、溶液を、２５ｍＬまたは５０ｍＬのいずれかの最終容量に希釈し、溶解した化合物の質量および溶液の最終容量に基づいて濃度を記録した。調製した溶液は、いずれか希釈せずにまたは脱イオン水で希釈して使用した。
【０１７９】
実施例３２：カフェイン溶解度の試験
周囲温度（約２３℃）でのカフェインの溶解度に対する異なる共溶質の影響を、次の方法で評価した。乾燥カフェイン粉末（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）を、２０ｍＬガラスシンチレーションバイアルに加え、カフェインの質量を記録した。実施例３１に従って調製した１０ｍＬの共溶質溶液を、ある場合には、カフェイン粉末に加えた。他の場合では、共溶質溶液と脱イオン水のブレンドを、カフェイン粉末に添加し、最終添加量を１０ｍＬに維持した。乾燥カフェイン粉末の体積寄与は、これらの混合物のいずれにおいても無視できるものと見なした。小さな磁気攪拌棒をバイアルに投入し、溶液を、攪拌プレート上で約１０分間激しく混合した。約１０分後、バイアルで、乾燥カフェイン粉末の溶解が観察され、結果を以下の表３３に示す。これらの観察により、ナイアシンアミド、プロカインＨＣｌ、２，５−ジヒドロキシ安息香酸ナトリウム塩、サッカリンナトリウム塩、およびチラミンクロリド塩のすべてが、報告されているカフェインの溶解限度（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈによれば、室温で約１６ｍｇ／ｍＬ）の少なくとも約４倍に、カフェインの溶解を可能にした。
【表３３】
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【０１８０】
実施例３３：ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）のプロファイル
ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）（ＡｂｂＶｉｅ  Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）は、ＴＮＦ−アルファ遮断剤である治療用モノクローナル抗体アダリムマブの市販製剤であり、通常、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、中等度から重度の慢性乾癬および若年性特発性関節炎などの自己免疫疾患の炎症反応を減少させるために処方される。ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）は、０．８ｍＬの単回使用用量で販売されており、４０ｍｇのアダリムマブ、４．９３ｍｇの塩化ナトリウム、０．６９ｍｇのリン酸一ナトリウム二水和物、１．２２ｍｇのリン酸二ナトリウム二水和物、０．２４ｍｇのクエン酸ナトリウム、１．０４ｍｇのクエン酸一水和物、９．６ｍｇのマンニトール、および０．８ｍｇのポリソルベート８０を含んでいる。この製剤の粘度対濃度プロファイルを、以下の方法で作成した。３０ｋＤａ分子量カットオフのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５遠心濃縮器（ＥＭＤ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビレリカ、マサチューセッツ州）に約１５ｍＬの脱イオン水を満たし、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、膜をすすいだ。その後、残留水を除去し、２．４ｍＬのＨＵＭＩＲＡ（登録商標）液体製剤を濃縮チューブに添加し、２５℃で６０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離した。保持液の濃度は、１０μＬの保持液を１９９０μＬの脱イオン水で希釈し、希釈したサンプルの吸光度を２８０ｎｍで測定し、希釈係数と１．３９ｍＬ／ｍｇ−ｃｍの吸光係数を使用して濃度を計算した。濃縮サンプルの粘度は、Ａ０５チップ（ＲｈｅｏＳｅｎｓｅ、Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ、ＣＡ）を備えたｍｉｃｒｏＶｉｓｃ粘度計を使用して、２３℃で２５０ｓ-1の剪断速度で測定した。粘度測定後、サンプルを少量の濾液で希釈し、濃縮と粘度測定を繰り返した。このプロセスを使用して、以下の表３４に示されるように、異なるアダリムマブ濃度で粘度値を生成した。
【表３４】
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【０１８１】
実施例３４：粘度低下賦形剤とＨＵＭＩＲＡ（登録商標）の再製剤化
次の実施例は、ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）を粘度低下賦形剤と緩衝液中で再製剤化することによる、一般的なプロセスを記載する。約０．１５ｇのヒスチジンおよび０．７５ｇのカフェイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）を脱イオン水に溶解することによって、２０ｍＭのヒスチジン中で粘度低下賦形剤の溶液を調製した。得られた溶液のｐＨを、５Ｍの塩酸で約５に調整した。次いで、この溶液を、メスフラスコ中で、脱イオン水で５０ｍＬの最終容量に希釈した。得られた緩衝粘度低下賦形剤溶液を、次いで、高ｍＡｂ濃度でＨＵＭＩＲＡ（登録商標）を再製剤化化するために使用した。次に、約０．８ｍＬのＨＵＭＩＲＡ（登録商標）を、すすいだＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５遠心濃縮チューブ（３０ｋＤａの分子量カットオフ）に添加し、８〜１０分間、４０００ｒｐｍで、２５℃でＳｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴで遠心分離した。その後、上に記載のように調製した約１４ｍＬの緩衝粘度低下賦形剤溶液を、遠心濃縮器中の濃縮ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）に添加した。穏やかに混合した後、サンプルを４０００ｒｐｍ、２５℃で、約４０〜６０分間遠心分離した。保持液は、粘度低下賦形剤とともに緩衝液中で再製剤化されたＨＵＭＩＲＡ（登録商標）の濃縮サンプルであった。サンプルの粘度と濃度を測定し、場合によっては、少量の濾液で希釈して、より低い濃度で粘度を測定した。粘度測定は、前の実施例の濃縮ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）製剤の場合と同様に、ｍｉｃｒｏＶｉｓｃ粘度計を用いて完了した。濃度は、脱イオン水で希釈したＨＵＭＩＲＡ（登録商標）ストック溶液から作成された標準曲線を使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで決定した。粘度低下賦形剤とＨＵＭＩＲＡ（登録商標）の再製剤化により、再製剤化されていない市販緩衝液中で濃縮されたＨＵＭＩＲＡ（登録商標）の粘度値と比較して、以下の表３５に示されるように、３０％〜６０％の粘度低下をもたらした。
【表３５】
2021515766.tif 000038
【０１８２】
実施例３５：賦形剤としてカフェインを含むアダリムマブ溶液の改善された安定性
カフェイン賦形剤を含む、または含まないアダリムマブ溶液の安定性は、サンプルを２つの異なるストレス条件、撹拌および凍結解凍、に曝露した後に評価した。アダリムマブ薬物製剤ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）（ＡｂｂＶｉｅ）が使用され、実施例３３により詳しく記載されている特性を有する。ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）サンプルは、実施例３８に記載されているように、元の緩衝液中で２００ｍｇ／ｍＬのアダリムマブ濃度に濃縮した。この濃縮サンプルを、「サンプル１」と呼ぶ。第二のサンプルは、実施例４０に記載されているように、約２００ｍｇ／ｍＬのアダリムマブおよび１５ｍｇ／ｍＬの添加カフェインを用いて調製した。カフェインが添加されたこの濃縮サンプルを、「サンプル２」と呼ぶ。次のように、両方のサンプルを希釈剤で希釈して、アダリムマブの最終濃度を１ｍｇ／ｍＬにした。サンプル１の希釈剤は、元の緩衝液溶液で、サンプル２希釈剤は、２０ｍＭヒスチジン、１５ｍｇ／ｍＬカフェイン、ｐＨ＝５である。両方のＨＵＭＩＲＡ（登録商標）希釈液を、０．２２μｍシリンジフィルターで濾過した。層流フード内で、希釈したサンプルごとに、２ｍＬエッペンドルフチューブにそれぞれ３００μＬの３つのバッチを準備した。サンプルは、以下のストレス条件にさらされた。攪拌の場合、サンプルを、３００ｒｐｍで９１時間、オービタルシェーカーに配置した。凍結解凍の場合、サンプルを、条件ごとに−１７〜３０℃で平均６時間、７回繰り返した。表３６に、調製されたサンプルを示す。
【表３６】
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【０１８３】
実施例３６：動的光散乱（ＤＬＳ）による安定性の評価
Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ動的光散乱装置を使用して、実施例３５のサンプル中のアダリムマブ分子の流体力学的半径を測定し、凝集集団の形成の証拠を探した。表３７は、実施例３５に従って調製された６つのサンプルのＤＬＳ結果を示している。それらのいくつかは（１−Ａ、１−ＦＴ、２−Ａ、および２−ＦＴ）、ストレス条件にさらされた（「ストレスサンプル」）。その他は（１−Ｃおよび２−Ｃ）、ストレスを受けなかった。表３７、および付随する図１、２、および２のＤＬＳデータは、カフェインを含まないストレスサンプルにおけるモノクローナル抗体のマルチモーダルな粒子サイズ分布を示している。賦形剤としてのカフェインの不在下で、ストレスを受けたサンプル１−Ａと１−ＦＴは、ストレスを受けていないサンプル１−Ｃよりも有効径が大きく、さらに、直径が顕著に大きい第２の粒子の集団を示した。より大きな直径を有する粒子のこの新しいグループは、目視不可の粒子への凝集の証拠である。カフェインを含むストレスを受けたサンプル（サンプル２−Ａおよび２−ＦＴ）は、ストレスを受けていないサンプル２−Ｃと同様の粒径であり、１つの粒子の集団のみを呈する。これらの結果は、カフェインをこれらのサンプルに添加すると、凝集体または目視不可の粒子の形成が減少したことを示している。
【表３７】
2021515766.tif 000040
【０１８４】
表３８Ａおよび表３８Ｂは、実施例３６からのアダリムマブサンプルのＤＬＳ生データを表示し、粒子サイズ分布を示している。これらの表では、Ｇ（ｄ）は、強度重み付け差分サイズ分布である。Ｃ（ｄ）は、累積強度重み付け差分サイズ分布である。
【表３８】
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【表３９】
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【０１８５】
実施例３７：サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）による安定性の評価
サイズ排除クロマトグラフィを使用して、実施例３６に記載されたストレスを受けたおよびストレスを受けていないアダリムマブサンプルから、サイズが約０．１ミクロン未満の目視不可の粒子を検出した。ＳＥＣを実行するために、ガードカラムを備えたＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＰＡ）を使用し、溶出を２８０ｎｍでモニターした。実施例３６からのストレスを受けたおよびストレスを受けていない各サンプルの合計１０μＬを、ｐＨ６．２の緩衝液（１００ｍＭのリン酸、３２５ｍＭのＮａＣｌ）を用いて、０．３５ｍＬ／分の流速で、均一濃度で溶出した。アダリムマブ単量体の保持時間は、約９分であった。カフェイン賦形剤を含むサンプルでは、検出可能な凝集体は確認されず、３つのサンプルすべての単量体の量は一定のままであった。
【０１８６】
例３８：ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）製剤の粘度低下
モノクローナル抗体のトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、凍結乾燥粉末として受け取り、ＤＩ水で２１ｍｇ／ｍＬに再構成した。得られた溶液を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ４遠心濃縮チューブ（分子量カットオフ、３０ｋＤａ）で３５００ｒｐｍで１．５時間遠心分離することによって、そのまま濃縮した。適切な緩衝液でサンプルを２００倍に希釈し、１．４８ｍＬ／ｍｇの吸光係数を使用して２８０ｎｍで吸光度を測定することによって、濃度を測定した。粘度は、ＲｈｅｏＳｅｎｓｅ  ｍｉｃｒｏＶｉｓｃ粘度計を使用して測定した。
【０１８７】
賦形剤緩衝液は、サリチル酸とカフェインを単独または組み合わせて、ヒスチジンと賦形剤を蒸留水に溶解し、ｐＨを適切なレベルに調整して調製した。緩衝液システム１および２の条件を表３９にまとめる。
【表４０】
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【０１８８】
ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）溶液は、賦形剤緩衝液で、約１：１０の比率で希釈し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５（ＭＷＣＯ  ３０ｋＤａ）濃縮チューブで濃縮した。濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して決定し、ストックＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）サンプルから調製された標準検量線と比較した。粘度は、ＲｈｅｏＳｅｎｓｅ  ｍｉｃｒｏＶｉｓｃ粘度計を使用して測定した。以下の表４０に、様々なＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）溶液の濃度および粘度の測定が示され、緩衝液システム１および２は、表３９に記載されたものを参照している。
【表４１】
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【０１８９】
サリチル酸とカフェインの両方を含む緩衝液システム１は、対照サンプルと比較して、２１５ｍｇ／ｍＬにおいて、粘度が最大７６％低下した。カフェインだけを含む緩衝液システム２は、２００ｍｇ／ｍＬにおいて、粘度が最大５９％低下した。
【０１９０】
実施例３９：ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）製剤の粘度低下
ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（モノクローナル抗体ベバシズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより市販されている製剤）は、ヒスチジン緩衝液中の２５ｍｇ／ｍＬの溶液として受け取った。サンプルは、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ４遠心濃縮チューブ（ＭＷＣＯ  ３０ｋＤａ）で３５００ｒｐｍで濃縮された。粘度は、ＲｈｅｏＳｅｎｓｅ  ｍｉｃｒｏＶｉｓｃで測定し、濃度は、２８０ｎｍでの吸光度で決定した（吸光係数、１．６０５ｍＬ／ｍｇ）。賦形剤緩衝液は、２５ｍＭのヒスチジンＨＣｌとともに１０ｍｇ／ｍＬのカフェインを添加することによって調製した。ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）ストック溶液を賦形剤緩衝液で希釈し、次いでＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５遠心濃縮チューブ（ＭＷＣＯ  ３０ｋＤａ）で濃縮した。賦形剤サンプルの濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイにより決定し、粘度は、ＲｈｅｏＳｅｎｓｅ  ｍｉｃｒｏＶｉｓｃを使用して測定した。結果を、以下の表４１に示す。
【表４２】
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【０１９１】
ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）を１０ｍｇ／ｍＬのカフェインとともに２１３ｍｇ／ｍｌに濃縮した場合、対照ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）サンプルと比較して、最大７３％の粘度低下を示した。
【０１９２】
実施例４０：カフェイン、二次賦形剤および試験タンパク質を含む製剤の調製
製剤は、賦形剤化合物としてカフェイン、またはカフェインと第２の賦形剤化合物との組み合わせ、および試験タンパク質を使用して調製され、試験タンパク質は、治療用製剤で使用される治療用タンパク質を模擬するように意図されている。このような製剤は、以下の方法で粘度を測定するために、異なる賦形剤化合物を含む２０ｍＭのヒスチジン緩衝液中に調製した。賦形剤の組み合わせ（以下の表４２に記載された賦形剤ＡおよびＢ）を、２０ｍＭのヒスチジンに溶解し、モデルタンパク質を溶解する前に、得られた溶液のｐＨを、少量の水酸化ナトリウムまたは塩酸で調整してｐＨ６にした。賦形剤溶液が調製されたら、試験タンパク質のウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）を、約２８０ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を達成する比率で溶解した。賦形剤溶液中のＢＧＧの溶液を、２０ｍＬガラスシンチレーションバイアル中に配合し、オービタルシェーカーテーブル上で８０〜１００ｒｐｍで一晩振盪させた。次いで、ＢＧＧ溶液を２ｍＬマイクロ遠心管に移し、ＩＥＣ  ＭｉｃｒｏＭａｘマイクロ遠心機で２３００ｒｐｍで約１０分間遠心分離して、粘度測定の前に、混入した空気を除去した。
【０１９３】
上記のように調製された製剤の粘度測定は、ＤＶ−ＩＩＴ  ＬＶコーンおよびプレート粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ、ＭＡ）を用いて行った。粘度計に、ＣＰ−４０コーンを備え付け、３ｒｐｍ、２５℃で操作した。製剤を、０．５ｍＬの容量で粘度計に負荷し、所定の剪断速度と温度で３分間インキュベートした後、２０秒間の測定収集時間が続いた。これに次いで、１分間の剪断インキュベーションとその後の２０秒間の測定収集期間からなる２つの追加ステップが続いた。次いで、収集された３つのデータポイントを平均し、サンプルの粘度として以下の表４２に記録した。賦形剤を含む溶液の粘度は、賦形剤を含まないモデルタンパク質溶液の粘度に正規化された。正規化された粘度は、賦形剤を含まないモデルタンパク質溶液の粘度に対する、賦形剤を含むモデルタンパク質溶液の粘度の比率である。
【表４３】
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【０１９４】
実施例４１：ジメチルスルホンおよび試験タンパク質を含む製剤の調製
製剤は、ジメチルスルホン（Ｊａｒｒｏｗ  Ｆｏｒｍｕｌａｓ、Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）を賦形剤化合物および試験タンパク質として使用して調製し、試験タンパク質は、治療用製剤で使用される治療用タンパク質を模擬するように意図されている。このような製剤は、以下の方法で粘度を測定するために、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液中に調製した。ジメチルスルホンを、２０ｍＭのヒスチジンに溶解し、モデルタンパク質を溶解する前に、得られた溶液のｐＨを、少量の水酸化ナトリウムまたは塩酸で調整してｐＨ６にし、次いで０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過した。賦形剤溶液が調製されたら、試験タンパク質のウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）を、約２８０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。賦形剤溶液中のＢＧＧの溶液を、２０ｍＬガラスシンチレーションバイアル中に配合し、オービタルシェーカーテーブル上で８０〜１００ｒｐｍで一晩振盪させた。次いで、ＢＧＧ溶液を２ｍＬマイクロ遠心管に移し、ＩＥＣ  ＭｉｃｒｏＭａｘマイクロ遠心機で２３００ｒｐｍで約１０分間遠心分離して、粘度測定の前に、混入した空気を除去した。
【０１９５】
上記のように調製された製剤の粘度測定は、ＤＶ−ＩＩＴ  ＬＶコーンおよびプレート粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ、ＭＡ）を用いて行った。粘度計に、ＣＰ−４０コーンを備え付け、３ｒｐｍ、２５℃で操作した。製剤を、０．５ｍＬの容量で粘度計に負荷し、所定の剪断速度と温度で３分間インキュベートした後、２０秒間の測定収集時間が続いた。これに次いで、１分間の剪断インキュベーションとその後の２０秒間の測定収集期間からなる２つの追加ステップが続いた。次いで、収集された３つのデータポイントを平均し、サンプルの粘度として記録した。賦形剤を含む溶液の粘度は、賦形剤を含まないモデルタンパク質溶液の粘度に正規化された。表４３に記録されている正規化された粘度は、賦形剤を含まないモデルタンパク質溶液の粘度に対する、賦形剤を含むモデルタンパク質溶液の粘度の比率である。
【表４４】
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【０１９６】
実施例４２：緩衝液の調製
２０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、５０ｍＭのグリシン、３５ｍＭのカフェインの緩衝液は、０．３９２ｇのＭＥＳ一水和物、０．３７４ｇのグリシン、および０．６８２ｇのカフェインを、９０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ超純水に溶解することによって調製した。すべての内容物が溶解した後、溶液のｐＨを５．５に調整し、メスフラスコにＭｉｌｌｉ−Ｑ超純水を添加することによって、最終容量を１００ｍＬにした。次いで、緩衝液を、ボトルトップフィルター装置を使用して、０．２μｍのＰＥＳフィルターを通して真空濾過した。２０ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのグリシン、および３５ｍＭのカフェインを含む同様な緩衝液も、同様に調製した。
【０１９７】
２０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、１００ｍＭの塩化ナトリウム、５５ｍＭのマンニトールおよび０．１ｍＭのジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の対照緩衝液は、１．２１１ｇのＴＲＩＳ、２．９３８ｇの塩化ナトリウム、２．０９８ｇのマンニトールおよび０．０１９ｇのＤＴＰＡを、４５０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ超純水に溶解して調製した。すべての内容物が溶解した後、溶液のｐＨを７．０に調整し、メスフラスコにＭｉｌｌｉ−Ｑ超純水を添加することによって、容量を５００ｍＬに調整した。緩衝液を、ボトルトップフィルター装置を使用して、０．２μｍのＰＥＳフィルターを通して真空濾過した。
【０１９８】
実施例４３：イピリムマブ製剤
モノクローナル抗体イピリムマブのサンプルをＢｉｏｃｅｒｏｓ（オランダ）から取得し、分子量カットオフ３０ｋＤａのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５遠心濃縮チューブ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビレリカ、マサチューセッツ州）を使用して、緩衝液を、実施例４２の３つの調製された緩衝液に交換した。目標の最終タンパク質濃度は２０ｍｇ／ｍＬであり、最終濃度は、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、ウィヌースキ、バーモント州）を用いて２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）により測定した。タンパク質溶液の吸光度は、ブランク緩衝液の吸光度から差し引いた。ブランクを差し引いたタンパク質溶液の吸光度を、報告されている吸光係数で割り、次いでタンパク質の希釈係数（２０倍）を掛けて、最終的なタンパク質濃度を決定する。カフェインは２８０ｎｍでの吸光度測定に干渉するため、カフェインを含む溶液のタンパク質濃度は、Ａ２８０で測定されたタンパク質溶液に対する物質収支により決定した。これによって、質量に基づいて測定されたＡ２８０タンパク質溶液に近いおよその濃度が得られた。
【０１９９】
次いで、調製したタンパク質溶液を、３８４マイクロウェルプレート（Ａｕｒｏｒａ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ、ホワイトフィッシュ、モンタナ州）に加えた。各溶液を、ウェルあたり３５μＬで、３つのウェルに負荷した。次いで、マイクロウェルプレートをＳｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴ遠心分離機で４００×ｇで遠心分離して、封入されたエアポケットをすべて除去した。ＤＬＳ機器（ＤｙｎａＰｒｏ  ＩＩ  ＤＬＳプレートリーダー、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．、ゴレタ、カリフォルニア州）に入れる前に、事前にカットした感圧シーリングテープ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、マイクロウェルプレートの上部に貼り付け、蒸発を防止した。ＤＬＳ機器のサンプル区画を６５℃に保ち、タンパク質溶液の粒子サイズを９時間記録した。表４４は、１時間の測定における３つの異なる製剤におけるイピリムマブの半径サイズを示している。
【表４５】
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【０２００】
実施例４４：尿素変性によるタンパク質製剤の安定性の試験
尿素は、溶液中のタンパク質を変性させ、アンフォールディングさせることが知られている。この実施例のスクリーニング方法論は、ウステキヌマブなどの治療用タンパク質溶液に、特定の濃度の尿素を添加することが含まれていました。この試験例は、保護賦形剤が、尿素の存在下で治療用タンパク質のアンフォールディングを防止または減少させるという仮説に基づいており、アンフォールドしたタンパク質の量を測定することで、尿素の存在下で、タンパク質を安定化させるのに効果的な賦形剤を同定することが可能になる。タンパク質のアンフォールディングを追跡する１つの方法には、Ｓｙｐｒｏ  ｏｒａｎｇｅなどの外因性蛍光色素の使用が含まれる。Ｓｙｐｒｏ  ｏｒａｎｇｅは、アンフォールドしたタンパク質構造の疎水性領域に結合し、観察される蛍光シグナルの増加につながる。したがって、さまざまな賦形剤の存在下で、アンフォールドしたタンパク質−Ｓｙｐｒｏ  ｏｒａｎｇｅ複合体の蛍光強度の差異を測定すると、安定化の効果を特定することができる。
【０２０１】
以下の表４５に列挙されている、この実施例で使用されたすべての賦形剤は、最高の純度であり、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）またはＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（アナーバー、ミシガン州）から入手した。賦形剤のストック溶液は、各賦形剤を１００ｍｇ／ｍＬの濃度で２０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解することによって調製した。ヒスチジン緩衝液は、１．５５ｇのヒスチジンを０．５００ＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解し、１ＭのＨＣｌを使用してｐＨを６．０に調整することによって調製した。次いで、各賦形剤調製物（最終濃度が５ｍｇ／ｍＬ）を、ウステキヌマブ（最終濃度が１ｍｇ／ｍＬ）と混合することによって、賦形剤を含むタンパク質製剤を調製した。この実施例で使用するために、同じヒスチジン緩衝液に２７ｇの尿素を溶解し、１ＭのＨＣｌを使用してｐＨを６．０に調整することによって、９Ｍの尿素のストック溶液を準備した。次いで、この尿素ストック溶液を、最終濃度が６Ｍになるように添加して、試験溶液（賦形剤＋タンパク質＋尿素）を生成した。次いで、ストック溶液（５０００Ｘ）からのＳｙｐｒｏ  ｏｒａｎｇｅ色素を、最終濃度が２０Ｘになるようにそれぞれ添加した。混合物のｐＨを、再度チェックし、ｐＨ６．０であることを確認した。試験溶液を、室温で３０分間インキュベートした。２００μＬのサンプルを、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＣｅｌｌＳｔａｒブラックウェル透明フラットボトム９６ウェルプレートに移し、各サンプルの蛍光を、４８５ｎｍの励起フィルターと５９０／２０ｎｍの発光フィルターを備えたＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴプレートリーダーを使用して測定した。異なる試験製剤の蛍光強度を、対照製剤（タンパク質および尿素、いずれの賦形剤も含まない）のものと比較し、減少した蛍光を示すそれらの試験製剤は、安定化賦形剤を含んでいるものと考えた。以下の表４５に示すように、いくつかの賦形剤は、それらの蛍光が対照のものと比較した場合、対照と比較して増加した安定性を反映した。これらの結論は、タンパク質を安定化させる賦形剤の能力が、実験中に測定される蛍光を減少させる能力と相関することから、導き出された。安定化賦形剤は、タンパク質のアンフォールディングを防止または減少させ、タンパク質−Ｓｙｐｒｏ  ｏｒａｎｇｅ相互作用の減少につながり、続いて、蛍光強度の減少しとして現れることになる。これらのテストの結果は、以下の表４５にまとめられている。
【表４６】
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【０２０２】
実施例４５：低ｐＨでのタンパク質製剤の安定化
治療用タンパク質、特に抗体は、処理のさまざまな段階、特に精製およびウイルスの除去の最中に、低ｐＨの溶液条件に曝される。酸性のｐＨ条件へのこの暴露は、コンフォメーションの変化を引き起こし、続いてタンパク質のアンフォールディングと凝集につながる可能性がある。安定化賦形剤を同定するためのスクリーニング方法論には、酸性ｐＨでオマリズマブなどの治療用タンパク質をインキュベートすることが含まれる。保護性の賦形剤は、低ｐＨでの治療用タンパク質の変性を防止または減少させることから、アンフォールドしたタンパク質の量を測定すると、低ｐＨの存在下でタンパク質を安定化させるのに効果的な賦形剤を同定することができる。酸性ｐＨでの治療用タンパク質のアンフォールディングは、Ｓｙｐｒｏ  ｏｒａｎｇｅなどの外因性蛍光色素を使用して追跡することができる。この実施例で行ったように、Ｓｙｐｒｏ  ｏｒａｎｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）を添加すると、色素がアンフォールドしたタンパク質の疎水性領域に結合し、蛍光シグナルの増加につながる。したがって、異なる賦形剤の存在下で、アンフォールドしたタンパク質−Ｓｙｐｒｏ  ｏｒａｎｇｅの蛍光強度の差異を測定すれば、安定剤を特定することができるようになる。
【０２０３】
以下の表４６に列挙されている、この実施例で使用されたすべての賦形剤は、最高の純度であり、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）またはＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（アナーバー、ミシガン州）から入手した。賦形剤のストック溶液は、各賦形剤を１００ｍｇ／ｍＬの濃度で０．１５Ｍのグリシン緩衝液（ｐＨ２．６）に溶解することによって調製した。酸性化緩衝液は、１．６５ｇのヒスチジンを０．０９ＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解し、１ＭのＨＣｌを使用してｐＨを２．６に調整し、容量を０．１００Ｌにした。次いで、賦形剤調製物（最終濃度が５ｍｇ／ｍＬ）をウステキヌマブ（最終濃度が１ｍｇ／ｍＬ）と混合することによって、各賦形剤を含むタンパク質製剤を調製した。次いで、グリシン酸性化緩衝液を賦形剤−タンパク質混合物に加え、その後、ストック溶液（５０００Ｘ）からのＳｙｐｒｏ  ｏｒａｎｇｅ色素を、最終濃度が２０Ｘになるように添加した。２００μＬのサンプルを、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＣｅｌｌＳｔａｒブラックウェル透明フラットボトム９６ウェルプレートに移し、各サンプルの蛍光を、４８５ｎｍの励起波長と５９０／２０ｎｍの発光フィルター波長で、ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴプレートリーダーを使用して測定した。異なる試験製剤の蛍光強度を、対照製剤（タンパク質およびグリシン緩衝剤、いずれの賦形剤も含まない）のものと比較し、減少した蛍光を示すものは、安定化賦形剤を含んでいるものと考えた。表４６に示すように、いくつかの賦形剤は、それらの蛍光が対照のものと比較した場合、対照と比較して増加した安定性を反映した。これらの結論は、タンパク質を安定化させる賦形剤の能力が、実験中に測定される蛍光を減少させる能力と相関することから、導き出された。安定化賦形剤は、タンパク質のアンフォールディングを防止または減少させ、タンパク質−Ｓｙｐｒｏ  ｏｒａｎｇｅ相互作用の減少につながり、続いて、蛍光強度の減少しとして現れることになる。これらのテストの結果は、以下の表４６にまとめられている。
【表４７】
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【０２０４】
実施例４６：熱安定剤としての賦形剤の試験
治療用タンパク質は、温度の変動に頻繁にさらされ、三次および二次構造要素の変化につながる可能性がある。これは、タンパク質の凝集につながり、活性な天然タンパク質の量を減少させ得る。熱ストレスから保護する賦形剤は、この実施例において、以下の表４７に記載されている賦形剤の存在下または非存在下での熱劣化研究により特定された。以下の表４７に列挙されている、この実施例で使用されたすべての賦形剤は、最高の純度であり、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）またはＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（アナーバー、ミシガン州）から入手した。賦形剤のストック溶液は、各賦形剤を１００ｍｇ／ｍＬの濃度で２０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解することによって調製した。ヒスチジン緩衝液は、１．５５ｇのヒスチジンを０．５００ＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解し、１ＭのＨＣｌを使用してｐＨを６．０に調整することによって調製した。次いで、各賦形剤調製物（最終濃度が５ｍｇ／ｍＬ）を、ウステキヌマブ（最終濃度が１ｍｇ／ｍＬ）と混合することによって、賦形剤を含むタンパク質製剤を調製した。製剤を０．２ｍＬのマイクロ遠心管に一定分量入れ、加熱ブロック内で６５℃で１２０分間インキュベートした。一定分量を０、１５、３０、６０、９０、および１２０分に分取した。サンプルを、氷上で５分間急冷し、５０００ｒｐｍで１０分間遠沈した。次いで、上清を、ＴＳＫｇｅｌ  ＳＷ３０００カラム（３０ｃｍ  ｘ  ４．８ｍｍ  ＩＤ）および２８０ｎｍに設定したＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１３５１Ｂダイオードアレイ検出器が装着されたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムに負荷して、サンプルをサイズ排除ＨＰＬＣで分析した。５０ｍＭのリン酸緩衝液、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５の移動相を、０．３５ｍＬ／ｍｉｎの流速で使用した。単量体画分は、単量体のピーク面積を積分することによって計算し、積算ピーク面積の変化を、時間の関数としてプロットした。熱安定性は、２時間のインキュベーションの終了時に残留している単量体の割合と相関していた。
【表４８】
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【０２０５】
実施例４７：機械的剪断ストレスに対する安定剤としての賦形剤の試験
治療用タンパク質は、攪拌、攪拌などにより機械的ストレスにさらされることが多く、与えられた剪断ストレスは、タンパク質の凝集を引き起こす可能性がある。剪断ストレスに対する保護を提供する賦形剤は、試験賦形剤（下の表４８に列挙されている）の存在下で、治療用タンパク質溶液を攪拌し、凝集した粒子の数の変化を観察することによって特定した。以下の表４８に列挙されている、この実施例で使用されたすべての賦形剤は、最高の純度であり、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）またはＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（アナーバー、ミシガン州）から入手した。賦形剤のストック溶液は、各賦形剤を１００ｍｇ／ｍＬの濃度でＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解して調製した。次いで、最終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬの各賦形剤調製物を、最終濃度が２ｍｇ／ｍＬのオマリズマブと組み合わせることによって、賦形剤含有タンパク質製剤を調製した。サンプルを０．５ｍＬのクライオジェニックバイアル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に移し、オービタルシェーカーに固定した。次いで、それらを、３００ｒｐｍに設定された攪拌で、２２℃で７２時間インキュベートした。インキュベーション時間の最後に、１００μＬの各サンプルを９６ウェルプレートに移し、３５０ｎｍで吸光度を測定した。凝集の増加は、３５０ｎｍで光散乱の変化を観察し、それらの変化を、３５０ｎｍでの対照製剤（賦形剤を添加せずに、試験サンプルと同様に調製された）の光散乱と比較することによって測定した。本質的に保護的である賦形剤は、攪拌ステップ後、凝集の速度を遅くし、Ａ３５０の吸光度の値を下げるそれらの能力によって特定された。
【表４９】
2021515766.tif 000052
【０２０６】
実施例４８：賦形剤を含むタンパク質溶液の凍結−解凍安定性
以下の表４９に列挙されている、この実施例で使用されたすべての賦形剤は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）またはＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（アナーバー、ミシガン州）から入手した。試験賦形剤のストック溶液（表４９に列挙されている）は、各賦形剤を１００ｍｇ／ｍＬの濃度で２０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解することによって調製した。緩衝液は、１．５５ｇのヒスチジンを０．５００ＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解し、１ＭのＨＣｌを使用してｐＨを６．０に調整することによって調製した。次いで、最終濃度が５  ｍｇ／ｍＬの各賦形剤調製物を、最終濃度が５ｍｇ／ｍＬのオマリズマブと組み合わせることによって、賦形剤含有タンパク質製剤を調製した。０．４ｍＬの各製剤を９６ウェルポリプロピレンプレート（Ａｄｖａｎｇｅｎｅ、ＩＬ）内のウェルに移した。サンプルを、冷凍庫で−８０℃に凍結し、室温で少なくとも５サイクル解凍した後、１００μＬのサンプルを、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＣｅｌｌＳｔａｒブラックウェル透明フラットボトム９６ウェルプレートに移した。賦形剤の安定化の効果は、３５０ｎｍでの光散乱分析を使用してタンパク質凝集体の形成を測定し、それらの変化を、３５０ｎｍでの対照製剤（賦形剤を添加せずに、試験サンプルと同様に調製された）の光散乱と比較することによって分析した。本質的に保護的である賦形剤は、攪拌ステップ後、凝集の速度を遅くし、Ａ３５０の吸光度の値を下げるそれらの能力によって特定された。
【表５０】
2021515766.tif 000053
【０２０７】
実施例４９：ＤＬＳ拡散相互作用パラメータｋDによる賦形剤の試験
賦形剤とタンパク質溶液の配合に使用するために、２０ｍＭのヒスチジン塩酸（Ｈｉｓ  ＨＣｌ）緩衝液のストック溶液は、３．１ｇのヒスチジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）をタイプ１の超純水に溶解することによって調製した。得られた溶液を、１Ｍの塩酸を滴下することによってｐＨ６に滴定した。ｐＨ調整後、緩衝液を、メスフラスコ中で、タイプ１超純水で１Ｌの最終容量に希釈した。以下の表５０に列挙されている、この実施例で使用されたすべての賦形剤は、最高の純度であり、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）またはＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（アナーバー、ミシガン州）から入手した。
【０２０８】
表５０に記載されているタンパク質を使用して、タンパク質濃度が約４ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの範囲である一連の６つの試験タンパク質溶液を、すべてｐＨ６の２０ｍＭのＨｉｓ  ＨＣｌ緩衝液で調製した。３８４ウェルマイクロプレート（Ａｕｒｏｒａ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ、ホワイトフィッシュ、モンタナ州）では、１５μＬのタンパク質溶液を、表５０に記載の賦形剤を使用して、ｐＨ６の２０ｍＭのＨｉｓＨＣｌ緩衝液中で調製することで、各賦形剤を、６種類の異なるタンパク質濃度で試験した。タンパク質−賦形剤の組み合わせを含むマイクロプレートを、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴ遠心分離機で４００×ｇで遠心分離し、プレートシェーカーで振盪して、サンプルを十分に混合した。気泡を除去するために、２回目の遠心分離ステップを完了した。これらのタンパク質−賦形剤製剤の拡散相互作用パラメータ（ｋD）は、タンパク質−タンパク質相互作用（ＰＰＩ）に対する賦形剤の影響を調べる方法として、希薄溶液中での動的光散乱（ＤＬＳ）により測定した。ＤＬＳ研究を行うために、上記で準備したマイクロプレートを、ＤｙｎａＰｒｏ  ＩＩ  ＤＬＳプレートリーダー（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．、ゴレタ、カリフォルニア州）に負荷して、各サンプルの拡散係数を、２５℃で測定した。各賦形剤を含む試験溶液について、測定された拡散係数を、タンパク質濃度の関数としてプロットし、データの線形フィットの傾きをｋDとして記録した。より負のｋDは、より強い正味の誘引性ＰＰＩを示し、より正のｋ  Dはより強い正味反発性ＰＰＩを示した。表５０は、各賦形剤を含む試験溶液のｋD値を示し、各賦形剤のこれらの試験値は、対照溶液（ヒスチジン緩衝液にタンパク質を含むが、賦形剤は含まない）のｋD値と比較することができる。
【表５１】
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【０２０９】
例５０：粘度低下についての賦形剤の試験
Ｂｉｏｃｅｒｏｓ（オランダ）から取得したバイオシミラーモノクローナル抗体オマリズマブとウステキヌマブを、ｐＨ６の２０ｍＭのＨｉｓ  ＨＣｌ緩衝液に緩衝液交換し、分子量カットオフ３０ｋＤａのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５遠心濃縮チューブ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビレリカ、マサチューセッツ州）を使用して濃縮した。得られた濃縮製剤は、濃縮製剤を２０ｍＭのＨｉｓ  ＨＣｌで段階希釈し、１００μＬの各希釈液をＵＶ透明９６ハーフウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、オーストリア）に負荷して、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、ウィヌースキ、バーモント州）で２８０ｎｍの吸光度を測定することによって、タンパク質濃度について２８０ｎｍの吸光度によって、分析した。次いで、ブランクの光路長補正された吸光度測定値を、それぞれの吸光係数で割り、希釈係数を掛けて、タンパク質濃度を決定した。賦形剤溶液は、２０ｍＭのＨｉｓＨＣｌ（ｐＨ６）に望ましい最終濃度の１０Ｘで、または化合物の溶解度限度で調製し、必要に応じて、濃塩酸または水酸化ナトリウムで、ｐＨを６に調整した。次いで、濃縮タンパク質製剤を、３８４ウェルマイクロプレート（Ａｕｒｏｒａ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ、ホワイトフィッシュ、モンタナ州）に、以下の表５１に列挙されている賦形剤の、１０Ｘ賦形剤溶液（９部のタンパク質、１部の賦形剤溶液または緩衝液）と混合した。以下の表５１に列挙されている、この実施例で使用されたすべての賦形剤は、最高の純度であり、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）またはＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（アナーバー、ミシガン州）から入手した。各サンプルは同じ容量で希釈されているため、各サンプル中のタンパク質濃度は同じである。次いで、マイクロプレートを、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴ遠心分離機で４００×ｇで遠心分離し、プレートシェーカーで振盪した。振盪後、２μＬの２０ｍＭのＨｉｓ  ＨＣｌ中のポリエチレングリコール表面修飾金ナノ粒子（ｎａｎｏＣｏｍｐｏｓｉｘ、サンディエゴ、カリフォルニア州）の５倍希釈液を、各サンプルウェルに加えた。マイクロプレートをもう一度振盪して、サンプルに金ナノ粒子を混合し、次いでＤｙｎａＰｒｏ  ＩＩ  ＤＬＳプレートリーダー（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．、ゴレタ、カリフォルニア州）に配置して、金ナノ粒子の見かけの粒子サイズを２５℃で測定した。水中の金ナノ粒子の既知の粒子サイズに対する、タンパク質製剤中の金ナノ粒子の見かけの粒子サイズの比を使用して、Ｓｔｏｋｅｓ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎ方程式に従って、タンパク質製剤の粘度を決定した。この実施例では、金ナノ粒子の実際の半径に対する見かけの半径の比に、２５℃での水の粘度を掛けて、センチポアズ（ｃＰ）でのタンパク質製剤の粘度を計算した。これらのテストの結果は、以下の表５１にまとめられている。
【表５２】
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【０２１０】
実施例５１：インフリキシマブを用いた熱劣化アッセイ
ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）インフリキシマブは、Ｃｌｉｎｉｇｅｎ  Ｇｒｏｕｐから入手し、Ｊａｎｓｓｅｎ添付文書の指示に従って再構成し、５０ｍｇ／ｍｌのスクロースおよび０．０５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む５ｍＭのリン酸緩衝液（約ｐＨ７）中の１０ｍｇ／ｍＬのインフリキシマブ溶液を得た。次いで、再構成された薬剤製品を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）と１：１の容量で混合した。次いで、得られた溶液を、小規模の分取スケール陽イオン交換カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）に注入した。インフリキシマブをカラムに負荷した後、カラムを１０カラム容量の５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）で洗浄した。次いで、インフリキシマブを、５カラム容量の２５０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）を用いてカラムから溶出した。次いで、溶出したインフリキシマブを、分子量カットオフ３０ｋＤａのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビレリカ、マサチューセッツ州）遠心濃縮器を使用して、ｐＨ７の２０ｍＭリン酸緩衝液に緩衝液交換した。次いで、ｐＨ７の２０ｍＭリン酸緩衝液中の４または８ｍｇ／ｍＬインフリキシマブのストック溶液を、その後の試験で使用した。
【０２１１】
以下の表５２に列挙されている、この実施例で使用されたすべての賦形剤は、最高の純度であり、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）またはＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（アナーバー、ミシガン州）から入手した。ストックインフリキシマブ溶液を、２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７に製剤化された表５２に列挙されている賦形剤を含むストック賦形剤溶液と混合して、各サンプルでインフリキシマブの最終濃度を約２ｍｇ／ｍＬにした。インフリキシマブ溶液とストック賦形剤溶液を含むサンプルを、次いでＰＣＲチューブに、５つの１００μＬの一定分量で分注した。一定分量をドライバス（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｙｒｅｖｉｌｌｅ、ＮＪ）内で５５℃で１５分〜約３時間の範囲の異なる時間インキュベートして、熱ストレスを加えた。次いで、サンプルを、ドライバスから取り出して氷上に置き、熱凝集をクエンチした。次いで、これらのストレスを受けたサンプルは、単量体の含有量について、２８０ｎｍで吸光度をモニターするダイオードアレイ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣを使用して、高性能サイズ排除クロマトグラフィ（ＨＰ−ＳＥＣ）で分析した。ＨＰＬＣは、２５℃のカラム温度、１００ｍＭリン酸、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の移動相を用いて、０．３５ｍＬ／ｍｉｎの流速で、ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＳＷ３０００  ４．６ｍｍ  ｘ  ３０ｃｍカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、東京、日本）を通して操作した。各サンプルについて、単量体ピーク面積を、同一のストレスを受けていないサンプルから得られた単量体ピーク面積で割って、熱ストレスへの曝露後に残留している単量体のパーセントを求めた。次いで、ストレスを受けていないサンプルに残留している単量体をパーセントとして、インキュベーション時間の関数としてプロットし、データへの線形フィットの傾きの絶対値を、単量体の損失率として記録した。決定された単量体損失率は、次いで単量体損失率を、賦形剤を含まない緩衝液対照の単量体損失率で割ることによって正規化し、結果を以下の表５２に示す。
【表５３】
2021515766.tif 000056
【０２１２】
実施例５２：ニコチンアミドモノヌクレオチドおよびイタコン酸を用いた濃縮オマリズマブのＤＬＳ粘度測定
ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）は、Ｇｅｎｅｘ  Ｆｏｒｍｕｌａｓ（オーランド、フロリダ州）から購入した栄養サプリメントカプセルから収集され、イタコン酸は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。これらの物質は、以下の実験において賦形剤として使用された。
【０２１３】
Ｂｉｏｃｅｒｏｓ（オランダ）から取得したバイオシミラーモノクローナル抗体オマリズマブを、ｐＨ６の２０ｍＭのＨｉｓ  ＨＣｌ緩衝液に緩衝液交換し、３０ｋＤａ分子量カットオフのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５遠心濃縮チューブ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビレリカ、マサチューセッツ州）を使用して濃縮した。緩衝液は、１．５５ｇのヒスチジンを０．５ＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解し、１ＭのＨＣｌを使用してｐＨを６．０に調整することによって調製した。得られた濃縮製剤は、濃縮製剤を２０ｍＭのＨｉｓ  ＨＣｌで段階希釈し、１００μＬの各希釈液をＵＶ透明９６ハーフウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、オーストリア）に負荷して、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、ウィヌースキ、バーモント州）で２８０ｎｍの吸光度を測定することによって、タンパク質濃度についてＡ２８０によって、分析した。次いで、ブランクの光路長で補正された各サンプルのＡ２８０測定値を、それぞれの吸光係数で割り、希釈係数を掛けて、タンパク質濃度を決定した。ストック賦形剤溶液は、上に記載の賦形剤を、１Ｍまたは化合物の溶解度限度で使用して、２０ｍＭのＨｉｓＨＣｌ（ｐＨ６）に調製し、必要に応じて、濃塩酸または水酸化ナトリウムで、ｐＨを６に調整した。次いで、濃縮タンパク質製剤を、ストック賦形剤溶液または対照と、９部のタンパク質製剤：１部の賦形剤溶液または緩衝液（対照として）の割合で混合し、一定分量を、３８４ウェルマイクロプレート（Ａｕｒｏｒａ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ、ホワイトフィッシュ、モンタナ州）のウェルに添加した。次いで、マイクロプレートをＳｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴで４００×ｇで遠心分離し、プレートシェーカーで振盪した。マイクロプレートを振盪した後、２μＬの２０ｍＭのＨｉｓ  ＨＣｌ中の直径１００ｎｍを有するポリエチレングリコール表面修飾金ナノ粒子（ｎａｎｏＣｏｍｐｏｓｉｘ、サンディエゴ、カリフォルニア州）の５倍希釈液を、各サンプルウェルに添加した。マイクロプレートをもう一度振盪して、サンプルに金ナノ粒子を混合し、次いでそれをＤｙｎａＰｒｏ  ＩＩ  ＤＬＳプレートリーダー（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．、ゴレタ、カリフォルニア州）に配置して、金ナノ粒子の見かけの粒子サイズを２５℃で測定した。緩衝液（タンパク質なし）中の金ナノ粒子の見かけの粒子サイズに対する、タンパク質製剤中の金ナノ粒子の見かけの粒子サイズの比を使用して、Ｓｔｏｋｅｓ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎ方程式に従って、タンパク質製剤の粘度を決定した。この実施例では、金ナノ粒子の実際の半径に対する見かけの半径の比に、２５℃での水の粘度を掛けて、センチポアズ（ｃＰ）でのタンパク質製剤の粘度を計算した。２つの異なる賦形剤を使用した結果を、以下の表５３に示示す。
【表５４】
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【０２１４】
例５３：濃縮オマリズマブのＤＬＳ粘度測定
４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ジサイクロミン塩酸塩、プリジノールメタンスルホン酸、１−ブチルイミダゾール、１−ヘキシルイミダゾールはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）から購入し、本実施例では、賦形剤溶液を調製するのに使用した。Ｏ−（オクチルホスホリル）コリンは、１Ｍの溶液としてＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）から購入し、本実施例では、ストック賦形剤溶液として使用した。
【０２１５】
Ｂｉｏｃｅｒｏｓ（オランダ）から取得したモノクローナル抗体のオマリズマブのバイオシミラーの濃縮製剤を、実施例５２に記載のように調製し、実施例５２に記載のようにタンパク質濃度について分析した。上に記載の賦形剤を使用するストック賦形剤溶液は、２０ｍＭのＨｉｓＨＣｌ（ｐＨ６）緩衝液（実施例５２に記載のように調製）で１Ｍまたは化合物の溶解度限界で調製し、必要に応じて、濃塩酸または水酸化ナトリウムで、ｐＨを６に調整した。Ｏ−（オクチルホスホリル）コリンは、追加の調製なしで、ストック賦形剤として使用した。次いで、濃縮タンパク質製剤を、ストック賦形剤溶液または対照と、９部のタンパク質製剤：１部の賦形剤溶液または緩衝液（対照として）の割合で混合し、一定分量を、３８４ウェルマイクロプレート（Ａｕｒｏｒａ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ、ホワイトフィッシュ、モンタナ州）のウェルに添加した。次いで、マイクロプレートをＳｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴで４００×ｇで遠心分離し、プレートシェーカーで振盪した。マイクロプレートを振盪した後、２μＬの２０ｍＭのＨｉｓ  ＨＣｌ中の直径１００ｎｍを有するポリエチレングリコール表面修飾金ナノ粒子（ｎａｎｏＣｏｍｐｏｓｉｘ、サンディエゴ、カリフォルニア州）の５倍希釈液を、各サンプルウェルに添加した。マイクロプレートをもう一度振盪して、サンプルに金ナノ粒子を混合し、次いでそれをＤｙｎａＰｒｏ  ＩＩ  ＤＬＳプレートリーダー（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．、ゴレタ、カリフォルニア州）に配置して、金ナノ粒子の見かけの粒子サイズを２５℃で測定した。緩衝液（タンパク質なし）中の金ナノ粒子の見かけの粒子サイズに対する、タンパク質製剤中の金ナノ粒子の見かけの粒子サイズの比を使用して、Ｓｔｏｋｅｓ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎ方程式に従って、タンパク質製剤の粘度を決定した。この実施例では、金ナノ粒子の実際の半径に対する見かけの半径の比に、２５℃での水の粘度を掛けて、センチポアズ（ｃＰ）でのタンパク質製剤の粘度を計算した。５つの異なる賦形剤を使用した結果を、以下の表５４に示示す。
【表５５】
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【０２１６】
例５４：濃縮オマリズマブのＤＬＳ粘度測定
この実施例では、賦形剤のストック溶液を調製するために、次の薬剤：塩化テトラエチルアンモニウム、酢酸テトラメチルアンモニウム、１−メチルイミダゾール、１−ブチルイミダゾール、１−ヘキシルイミダゾール、２−エチルイミダゾール、２−メチルイミダゾール、およびスペクチノマイシンを使用し、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。トリグリシン、テトラグリシン、および２−ブチルイミダゾールは、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ（Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ、ＩＬ）から購入した。ホルデニンＨＣｌは、Ｂｕｌｋ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、ＮＶ）から購入した。
【０２１７】
Ｂｉｏｃｅｒｏｓ（オランダ）から取得したモノクローナル抗体のオマリズマブのバイオシミラーの濃縮製剤を、実施例５２に記載のように調製し、実施例５２に記載のようにタンパク質濃度について分析した。上に記載の賦形剤を使用するストック賦形剤溶液は、２０ｍＭのＨｉｓＨＣｌ（ｐＨ６）緩衝液（実施例５２に記載のように調製）で１Ｍまたは化合物の溶解度限界で調製し、必要に応じて、濃塩酸または水酸化ナトリウムで、ｐＨを６に調整した。次いで、濃縮タンパク質製剤を、ストック賦形剤溶液または対照と、９部のタンパク質：１部の賦形剤溶液または緩衝液（対照として）の割合で混合し、一定分量を、３８４ウェルマイクロプレート（Ａｕｒｏｒａ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ、ホワイトフィッシュ、モンタナ州）のウェルに添加した。次いで、マイクロプレートをＳｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴで４００×ｇで遠心分離し、プレートシェーカーで振盪した。マイクロプレートを振盪した後、２μＬの２０ｍＭのＨｉｓ  ＨＣｌ中の直径１００ｎｍを有するポリエチレングリコール表面修飾金ナノ粒子（ｎａｎｏＣｏｍｐｏｓｉｘ、サンディエゴ、カリフォルニア州）の５倍希釈液を、各サンプルウェルに添加した。マイクロプレートをもう一度振盪して、サンプルに金ナノ粒子を混合し、次いでそれをＤｙｎａＰｒｏ  ＩＩ  ＤＬＳプレートリーダー（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．、ゴレタ、カリフォルニア州）に配置して、金ナノ粒子の見かけの粒子サイズを２５℃で測定した。緩衝液（タンパク質なし）中の金ナノ粒子の見かけの粒子サイズに対する、タンパク質製剤中の金ナノ粒子の見かけの粒子サイズの比を使用して、Ｓｔｏｋｅｓ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎ方程式に従って、タンパク質製剤の粘度を決定した。この実施例では、金ナノ粒子の実際の半径に対する見かけの半径の比に、２５℃での水の粘度を掛けて、センチポアズ（ｃＰ）でのタンパク質製剤の粘度を計算した。１２の異なる賦形剤を使用した結果を、以下の表５５に示示す。
【表５６】
2021515766.tif 000059
【０２１８】
実施例５５：熱安定性を高める賦形剤
治療用タンパク質は、温度の変動にさらされることが多く、その三次および二次構造要素の変化につながる可能性がある。これは、タンパク質の凝集、および活性な天然種の減少につながる。熱ストレスから保護する賦形剤は、賦形剤の存在下または非存在下での熱劣化の研究で試験された。賦形剤ストックは、以下の表５６に列挙される賦形剤を、１００ｍｇ／ｍＬの濃度で２０ｍＭヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０に溶解することにって調製した（実施例５２に記載されるように調製）。各試験サンプルは、賦形剤ストックを、緩衝液に添加して、賦形剤の最終濃度が５ｍｇ／ｍＬになるようにし、ヒスチジン緩衝液中のウステキヌマブストックを２０ｍｇ／ｍＬから最終濃度の１ｍｇ／ｍＬへとタンパク質を希釈することによって（実施例５１に記載のように調製される）調製した。製剤を、０．２ｍＬマイクロ遠心管に一定分量入れ、ヒートブロック内で６５℃で１２０分間インキュベートした。一定分量を、０分、３０分、６０分、９０分、１２０分で回収した。次いで、サンプルを氷上で５分間急冷し、９０００ｒｐｍで１０分間遠沈した。これに続いて、上清のサンプルを、以下のように、ＳＥ−ＨＰＬＣで分析した：ＴＳＫｇｅｌ  ＳＷ３０００サイズ排除クロマトグラフィカラム（３０ｃｍ  ｘ  ４．８ｍｍ  ＩＤ）および２８０ｎｍでモニターするＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１３５１Ｂダイオードアレイ検出器が装着されたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムに、上清を負荷した。０．５％のリン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．５の移動相を、０．３５ｍＬ／ｍｉｎの流速で使用した。単量体画分は、単量体ピーク下のピーク面積を積分し、時間の関数としてプロットされた積算ピーク面積の変化によって計算した。熱安定性は、２時間のインキュベーションの最後に残留している単量体の分率と相関関係があり、対照（添加剤なし）と比較した単量体のパーセント増加を記録した。試験した７つの賦形剤の結果を、以下の表５６にまとめる。
【表５７】
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【０２１９】
実施例５６：ＡＤＣの熱安定性を改善する賦形剤
抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、小分子薬物の部位特異的送達を可能にする化学リンカーを介した、モノクローナル抗体への小分子の結合によって生成される治療用タンパク質である。結合リンカーと小分子の組み合わせは、そのタンパク質前駆体と比較して、ＡＤＣの化学的および物理的性質（電荷、疎水性など）を変更し、追加の安定性の懸念をもたらす。実施例５９のウステキヌマブ−ＦＩＴＣ化合物を、これらの試験のモデルＡＤＣ化合物として使用した。モデルＡＤＣを熱ストレスから保護する賦形剤は、賦形剤の存在下または非存在下での熱劣化の研究で試験された。賦形剤ストックは、以下の表５７に列挙される賦形剤を、１００ｍｇ／ｍＬの濃度で２０ｍＭヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０に溶解することにって調製した（実施例５２に記載されるように調製）。各試験サンプルは、賦形剤ストックを緩衝液に最終濃度が５ｍｇ／ｍＬになるように添加し、ヒスチジン緩衝液中のウステキヌマブ−ＦＩＴＣ（下記の実施例５９に記載）をウステキヌマブ−ＦＩＴＣの最終濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように添加することによって調製した。製剤を、０．２ｍＬマイクロ遠心管に一定分量入れ、ヒートブロックで６５℃で１２０分間インキュベートした。一定分量を、０分、３０分、６０分、９０分、１２０分で回収した。次いで、サンプルを氷上で５分間急冷し、９０００ｒｐｍで１０分間遠沈した。サンプルを、ＳＥ−ＨＰＬＣで分析し、上清をＴＳＫゲルＳＷ３０００サイズ排除クロマトグラフィカラム（３０ｃｍ  ｘ  ４．８ｍｍ  ＩＤ）とＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１３５１Ｂダイオードアレイ検出器を２８０ｎｍでモニターしたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムに負荷した。０．５％のリン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．５の移動相を、０．３５ｍＬ／ｍｉｎの流速で使用した。単量体画分は、単量体ピーク下のピーク面積を積分し、時間の関数としてプロットされた積算ピーク面積の変化によって計算し、対照（賦形剤なし）と比較したパーセント単量体の増加を記録した。熱安定性は、２時間のインキュベーションの終了時に残留している単量体の割合と相関していた。
【表５８】
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【０２２０】
実施例５７：凍結／解凍ストレスから保護する賦形剤
治療用タンパク質は、動態安定性を改善し、タンパク質の凝集や活性な天然種の減少につながり得る構造的摂動を最小限に抑えるために、しばしば低温で維持される。ある場合は、これは、製剤を使用するまで凍結することによってなされるかもしれない。しかし、凍結と解凍を繰り返す間の、低温、濃度勾配、および氷の形成は、タンパク質にストレスを与える可能性がある。熱ストレスから保護する賦形剤を、賦形剤の存在下または不在下での熱劣化研究によって試験し、特定した。賦形剤ストックは、実施例５２に記載されるように調製し、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０に１Ｍの濃度で、以下の表５８に列挙される賦形剤を溶解することによって調製した。各試験サンプルは、賦形剤ストックを、賦形剤の最終濃度が１００ｍＭになるように添加し、ヒスチジン緩衝液（実施例５０に記載されているように調製）中のウステキヌマブストックを２０ｍｇ／ｍＬから最終濃度の２ｍｇ／ｍＬへとタンパク質を希釈することによって調製した。対照も同じ方法で調製したが、添加剤ストックを加えなかった。次いで、製剤を、０．５ｍＬのクリオバイアルに一定分量入れ、−８０℃で１２０分間凍結した。次いで、室温に保たれた水浴を使用して、サンプルを解凍した。この凍結−解凍サイクルを６回繰り返した後、各サンプルを、０．２ｍＬマイクロ遠心管に一定分量入れ、９０００ｒｐｍで１０分間遠沈した。上清を、ＴＳＫゲルＳＷ３０００サイズ排除クロマトグラフィカラム（３０ｃｍ  ｘ  ４．８ｍｍ  ＩＤ）および２８０ｎｍでモニタ−するＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１３５１Ｂダイオードアレイ検出器が装着されたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムに負荷して、サンプルをＳＥ−ＨＰＬＣで分析した。０．５％のリン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．５の移動相を、０．３５ｍＬ／ｍｉｎの流速で使用した。単量体画分は、単量体ピーク下のピーク面積を積分し、時間の関数としてプロットされた積算ピーク面積の変化によって計算した。
【表５９】
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【０２２１】
例５８：加速劣化の研究
熱ストレスから保護する賦形剤は、賦形剤の存在下または非存在下での熱劣化の研究で試験された。賦形剤ストックは、実施例５２に記載されるように調製し、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０に１Ｍの濃度で、以下の表５９に列挙される賦形剤を溶解することによって調製した）。各試験サンプルは、賦形剤を、最終濃度が１００ｍＭになるように添加し、ヒスチジン緩衝液中のウステキヌマブストックを２０ｍｇ／ｍＬから最終濃度の２ｍｇ／ｍＬへとタンパク質を希釈することによって調製した。対照も同じ方法で調製したが、添加剤ストックを加えなかった。１ｍＬの各サンプルを、２ｍＬガラスバイアル（Ｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＰＡ）に一定分量入れ、４０℃で４週間インキュベートした。一定分量を、０、１、２、３、および４週間後に回収した。上清を、ＴＳＫｇｅｌ  ＳＷ３０００サイズ排除クロマトグラフィカラム（３０ｃｍ  ｘ  ４．８ｍｍ  ＩＤ）および２８０ｎｍでモニターするＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１３５１Ｂダイオードアレイ検出器が装着されたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムに負荷して、サンプルをＳＥ−ＨＰＬＣで分析した。０．５％のリン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．５の移動相を、０．３５ｍＬ／ｍｉｎの流速で使用した。単量体画分は、単量体ピーク下のピーク面積を積分し、時間の関数としてプロットされた積算ピーク面積の変化によって計算した。熱安定性は、４週間のインキュベーションの終了時に残留している単量体の割合と相関していた。
【表６０】
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【０２２２】
実施例５９：ウステキヌマブＦＩＴＣの合成
抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を代表するモデル化合物を、次のように合成した。ウステキヌマブは、４０ｍＭの酢酸ナトリウム水溶液、５０ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ５．５）中にｍＡｂ濃度が２６ｍｇ／ｍＬの凍結アリコートとして、Ｂｉｏｃｅｒｏｓ（Ｕｔｒｅｃｈｔ、オランダ）から購入した。サンプルを、ｐＨ９．２の炭酸緩衝液に緩衝液交換し、次いで無水ジメチルスルホキシドに溶解した５等量のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）とインキュベートして、ウステキヌマブの等量あたり１．６等量のＦＩＴＣを取り込んだ。ウステキヌマブに対するＦＩＴＣの平均モル比は、２８０ｎｍでの吸光度（タンパク質＋ＦＩＴＣを表す）および４９５ｎｍでの吸光度（ＦＩＴＣを表す）を測定することによって決定した。計算では、２８０ｎｍでのｍＡｂの吸光係数として１．６１Ｌ／ｇ．ｃｍ、ｍＡｂのＭＷとして１４８，６００、および４９５ｎｍでのＦＩＴＣの吸光係数として６８，０００Ｌ／ｇ．ｃｍを使用した。過剰の未反応ＦＩＴＣは、ｐＨ６の２０ｍＭのヒスチジン緩衝液を用いた透析により除去した。次に、ＭＷＣＯが３０ｋＤａのＡｍｉｃｏｎ遠心管を使用して、サンプルを１５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
【０２２３】
実施例６０：ウステキヌマブ−ＦＩＴＣの安定性
実施例５９のＡＤＣモデル化合物を、ｐＨ６の２０ｍＭヒスチジン緩衝液（実施例５２に記載されているように調製）でｍＡｂ濃度を１ｍｇ／ｍＬに希釈した。以下の表６０に列挙されている添加賦形剤を用いてサンプルを調製し、モデルＡＤＣ化合物を機械的剪断応力から保護するそれらの能力をテストした。２３℃で７２時間、３００ｒｐｍでシェーカーテーブルに配置して、サンプルに機械的ストレスを加えた。溶液にストレスを加えた後、ＡＤＣ複合体の粒子サイズを動的光散乱によって決定した。剪断後の対照サンプルの粒子半径は１４３ｎｍであり、ストレスを受けていないサンプル（半径５．５ｎｍ）と比較して有意な凝集を示している。賦形剤を含むサンプルは、ストレスを受けていない対照サンプル（半径５．５ｎｍ）と比較して、粒子半径の有意な増加を示さず、機械的剪断応力に対する保護効果を示した。結果を、以下の表６０に示す。
【表６１】
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【０２２４】
実施例６１：冷蔵保存中の水性緩衝液中のカフェイン溶解度に対する共溶質の影響
２５ｍＭのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６は、０．３８７ｇのヒスチジンをＭｉｌｌｉ−Ｑタイプ１水に溶解し、塩酸でｐＨ６に滴定し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で最終容量の１００ｍＬに希釈することによって調製した。次いで、緩衝液を使用して、５０ｍＭの共溶質溶液を調製し、以下の賦形剤：安息香酸ナトリウム、１−メチル−２−ピロリドン、プロリン、フェニルアラニン、アルギニン一塩酸、ベンジルアルコール、およびニコチンアミド、を使用した。約０．１ｇのカフェインを、得られた各溶液の一定分量の５ｍＬに溶解して、カフェイン濃度を２０ｍｇ／ｍＬにした。異なる容量比の共溶質を含む２０ｍｇ／ｍＬのカフェインと、賦形剤溶液を含むがカフェインを含まない対応する溶液を、９６ウェルマイクロプレートに３重に調製し、すべてのケースで総ウェル容量を３００μＬに維持した。次いで、得られたマイクロプレートを、マイクロプレートテープで密封し、温度を２〜５℃の範囲に維持して冷蔵庫で保存した。保存の過程で、ウェル内の沈殿の証拠についてマイクロプレートを目視で観察した。各条件について、最も早く観察された３つのウェルの沈殿を記録し、結果を以下の表６１にまとめる。
【表６２】
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【０２２５】
実施例６２：抗体溶液の粘度を低下させるための賦形剤の試験
２０ｍＭのヒスチジン−ＨＣｌ  ｐＨ６．０（Ｈｉｓ  ＨＣｌ）のストック緩衝液溶液は、１．５５ｇのヒスチジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）をタイプ１超純水に溶解することによって調製した。内容物を完全に溶解させ、塩酸溶液を使用して、ｐＨを６．０に調整した。ｐＨ調整後、メスフラスコで最終容量を０．５Ｌにした。すべての賦形剤は、Ｈｉｓ  ＨＣｌに溶解し、１０ｘ濃度（１Ｍ）または化合物の溶解限度で調製した。賦形剤溶液のｐＨを測定し、必要に応じてｐＨ６．０に調整した。
【０２２６】
この実施例では、０．１Ｍ以下の賦形剤濃度のタンパク質溶液の粘度を測定した。Ｂｉｏｃｅｒｏｓ  （オランダ）から購入したバイオシミラーモノクローナル抗体オマリズマブを、Ｈｉｓ  ＨＣｌに緩衝液交換し、予めすすいだ３０ｋＤａ分子量カットオフのＡｍｉｃｏｎ−１５遠心装置（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビレリカ、マサチューセッツ州）を使用して約２００ｍｇ／ｍＬに濃縮した。ポリエチレングリコールで表面修飾された金ナノ粒子（ｎａｎｏＣｏｍｐｏｓｉｘ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）の分散液を完全に混合し、Ｈｉｓ  ＨＣｌに５倍に希釈した。別のＰＣＲチューブで、２．１μＬの金ナノ粒子、５．３μＬの１０ｘ賦形剤溶液、および４７．６μＬの濃縮オマリズマブを組み合わせ、完全に混合した。各溶液を２５μＬの容量で２回、３８４ウェルプレート（Ａｕｒｏｒａ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ，Ｗｈｉｔｅｆｉｓｈ，ＭＴ）に移し、４００×ｇで１分間遠心分離した（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴ）。サンプルの蒸発を防ぐために、テープシールを使用した。次いで、プレートをＤｙｎａＰｒｏ  ＩＩ  ＤＬＳプレートリーダー（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．、ゴレタ、カリフォルニア州）に移して、２５℃で金ナノ粒子の見かけの粒子サイズを測定した。既知の半径の粒子サイズに対する測定された見かけの半径との比を計算し、ストークス・アインシュタイン方程式に従ってタンパク質製剤の粘度を決定した。
【０２２７】
この実施例では、希釈タンパク質溶液の拡散相互作用パラメータ（ｋD）を、０．１Ｍ以下の賦形剤の存在下で、ＤＬＳにより測定した。以前に調製した賦形剤原液から、０．２Ｍの賦形剤溶液を別々に調製した。ｋDを、０．１Ｍ賦形剤の存在下で１０ｍｇ／ｍＬ〜０．６ｍｇ／ｍＬの範囲の５つの異なるタンパク質濃度を使用して測定した。１５μＬのタンパク質溶液と１５μＬの０．２Ｍ賦形剤溶液（１：１混合液）を、３８４ウェルプレート（Ａｕｒｏｒａ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ、ホワイトフィッシュ、モンタナ州）で混合した。サンプルを負荷した後、ウェルプレートを、プレートシェーカー上で振盪して、内容物を５分間混合した。混合したら、ウェルプレートをＳｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴで４００×ｇで１分間遠心分離して、エアポケットを追い出した。次いで、ウェルプレートをＤｙｎａＰｒｏ  ＩＩ  ＤＬＳプレートリーダー（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．、ゴレタ、カリフォルニア州）に負荷し、各サンプルの拡散係数を２５℃で測定した。各賦形剤について、測定された拡散係数をタンパク質濃度の関数としてプロットし、データの線形フィットの傾きをｋDとして記録した。２つの異なる一連のテストについて、結果を、以下の表６２Ａおよび６２Ｂにまとめる。
【表６３】
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【表６４】
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【０２２８】
均等物
本発明の特定の実施形態が本明細書で開示されてきたが、上記の明細書は例示的であり、限定的ではない。本発明は、その好ましい実施形態を参照して特に示され説明されてきたが、添付の特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細においてそれに様々な変更を加え得ることが当業者によって理解される。本明細書を検討すれば、本発明の多くの変形が当業者に明らかになるであろう。特に明記しない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される、反応条件、成分の量などを表すすべての数字は、すべての場合において「約」という用語によって変更されるものとして理解されるべきである。したがって、特に明記しない限り、本明細書に記載される数値パラメータは、本発明より得られようと求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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