(57)【要約】  ヒドロゲルチューブの中で細胞を培養し増殖させるための細胞増殖システムが本明細書に開示される。この細胞増殖システムは、細胞を増殖させることを可能にし、生産能力を高めつつも製造の時間及び費用を著しく低減することができる。【選択図】図１（１）
2021515581.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を増殖させるための細胞増殖システムであって、
少なくとも第１注入口及び少なくとも第２注入口を備える押出機を備えるキャップであって、前記第１注入口は、細胞溶液を前記押出機の中へ導入するために動作可能であり、前記第２注入口は、ヒドロゲル形成溶液を前記押出機の中へ導入するために動作可能であるキャップと、
前記キャップの前記押出機と流体連結した管状筐体であって、前記管状筐体は細胞適合性緩衝液を含む管状筐体と
を備えるシステム。
【請求項２】
前記管状筐体がメッシュをさらに含む請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記細胞溶液が、哺乳類の胚性幹細胞、哺乳類の人工多能性幹細胞、哺乳類のナイーブ多能性幹細胞、哺乳類の胚性幹細胞、哺乳類の人工多能性幹細胞及び哺乳類のナイーブ多能性幹細胞から分化した細胞、他の細胞型から初期化された哺乳類細胞、哺乳類の初代培養細胞、ヒト由来の臍静脈内皮細胞、癌細胞、Ｔ細胞、哺乳類の組織幹細胞、哺乳類細胞株、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞及びバクテリア細胞からなる群から選択される細胞を含む請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記ヒドロゲル形成溶液が、アルギン酸の酸形態ポリマー、アルギン酸ナトリウムポリマー、変性アルギン酸ポリマー、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるアルギン酸ポリマー材料を含むアルギン酸溶液である請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記アルギン酸溶液が、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）アルギン酸を含む請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
前記ヒドロゲル形成溶液が、ポリエチレングリコール、ポリ（ビニルアルコール）、及びこれらの組み合わせから選択される材料を含む請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記細胞適合性緩衝液が、カルシウムイオン及びバリウムイオンのうちの少なくとも１つを含む請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記細胞適合性緩衝液が、ＣａＣｌ２及びＢａＣｌ２のうちの少なくとも１つを含む請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
細胞の増殖方法であって、請求項１に記載の細胞増殖システムの中で細胞を培養する工程を備える方法。
【請求項１０】
前記細胞溶液及び前記ヒドロゲル形成溶液を細胞適合性溶液の中へと押し出す工程であって、前記細胞適合性溶液は、前記ヒドロゲル形成溶液内のポリマーを架橋して、ヒドロゲルファイバーを生成する工程と、
前記細胞溶液由来の細胞を含む前記ファイバーを、前記管状筐体の中の細胞培地又は細胞適合性緩衝液に懸濁させる工程と、
前記細胞を培養する工程と
を備える請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒドロゲル形成溶液が、アルギン酸ポリマーを約０．０１％〜約２０重量／体積％のアルギン酸ポリマーの濃度で溶液に懸濁させることにより調製されたアルギン酸溶液である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒドロゲル形成溶液が、ポリエチレングリコール、ポリ（ビニルアルコール）、及びこれらの組み合わせから選択されるポリマー材料を使用して調製される請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞適合性溶液が、カルシウムイオン及びバリウムイオンのうちの１以上を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヒドロゲルファイバーを溶解することを含む、前記ヒドロゲルファイバーから前記培養細胞を解放する工程をさらに備える請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヒドロゲルファイバーを溶解することが、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールテトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、及びアルギン酸可溶化液からなる群から選択される化学溶解剤を使用して前記ヒドロゲルファイバーを化学的に溶解することを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヒドロゲルファイバーを溶解することが、機械力を使用して前記ヒドロゲルファイバーを物理的に溶解することを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞溶液が、哺乳類の胚性幹細胞、哺乳類の人工多能性幹細胞、哺乳類のナイーブ多能性幹細胞、哺乳類の胚性幹細胞、哺乳類の人工多能性幹細胞及び哺乳類のナイーブ多能性幹細胞から分化した細胞、他の細胞型から初期化された哺乳類細胞、哺乳類の初代培養細胞、ヒト由来の臍静脈内皮細胞、癌細胞、Ｔ細胞、哺乳類の組織幹細胞、哺乳類細胞株、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞及びバクテリア細胞からなる群から選択される細胞を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞溶液由来の細胞を含む前記ファイバーが、カルシウムイオン及びバリウムイオンのうちの少なくとも１つを含む細胞適合性緩衝液に懸濁される請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞適合性緩衝液が、ＣａＣｌ２及びＢａＣｌ２のうちの少なくとも１つを含む請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年３月１６日出願の米国出願第６２／６４３，８９４号に基づく優先権を主張する。この出願は、参照によりその全体を本明細書に援用する。
【０００２】
本開示は、全体として、ヒドロゲルチューブの中で細胞を培養し増殖させるための細胞増殖システムを使用することに関する。特に、このシステムは、費用効率が高くかつ効率的なやり方での細胞の増殖を可能にする。１つの実施形態では、増殖のための細胞は、養子免疫治療のための初代ヒト由来Ｔ細胞である。
【背景技術】
【０００３】
養子免疫治療は、腫瘍縮小を媒介するために抗腫瘍活性を有する免疫細胞（例えばＴリンパ球）を患者に移すことを指す。基礎的な、橋渡し的及び臨床的な研究は、多くの癌、例えば黒色腫、子宮頸癌、リンパ腫、白血病を治療するために養子免疫治療が非常に有効であるということを示している。しかしながら、現行の細胞培養技術を用いてＴ細胞を製造するための費用は極めて高い。例えば、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病を患う小児及び若年成人を治療するための最近承認された改変Ｔ細胞の１回の用量には４７５，０００ドルかかる。
【０００４】
Ｔ細胞の２つの主要な供給源である、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ  Ｔ細胞）又は従来のＴ細胞受容体（ＴＣＲ  Ｔ細胞）を発現するＴ細胞を含めた遺伝子改変のＴリンパ球が、現在、養子免疫治療のために使用されている。ＴＩＬに基づく療法については、ＴＩＬは、患者の腫瘍から最初に単離され、次いでインビトロで活性化及び増殖されて、臨床的に関連する細胞数が生成され、これが、患者に注入されて戻される。臨床研究は、ＴＩＬが、黒色腫、胆管細胞癌及び子宮頸癌を患う患者において顕著な抗腫瘍反応を媒介することができるということを示している。ＣＡＲ  Ｔ細胞に基づく療法については、Ｔ細胞は、白血球除去を通して最初に患者から単離され、次いで腫瘍細胞の表面抗原を特異的に認識することができるＣＡＲを発現するように活性化及び改変され、臨床的に関連する数まで増殖され、患者に注入されて戻される。ＣＤ１９抗原を認識するＣＡＲ  Ｔ細胞（抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞）は、臨床研究において、Ｂ細胞白血病及びリンパ腫を治療する上で非常に大きな成功を成し遂げている。科学者らは、種々の固形腫瘍を治療するために、他の腫瘍抗原、例えばＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、及びＥｒｂＢを認識するＣＡＲを発現するＴ細胞を使用することを目下研究している。ＴＣＲ  Ｔ細胞に基づく療法は、腫瘍抗原を認識するＴＣＲがＴ細胞表面で発現されることを除いて、ＣＡＲ  Ｔ細胞治療と非常に類似している。ＮＹ−ＥＳＯ１、ＭＡＲＴ−１及びｇｐ１００抗原に特異的なＴＣＲ  Ｔ細胞は、臨床試験において、黒色腫及び肉腫を患う患者において優れた抗腫瘍反応を示した。
【０００５】
従来、Ｔ細胞を改変するために、ＴＣＲ又はＣＡＲについての遺伝子発現ベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス及びｍＲＮＡを用いて形質移入を通して細胞に送達される。現在、治療用Ｔ細胞を増殖させるために使用される３つの主要な培養システムが存在する。第１のものは、穏和に揺り動かされる気体透過性のプラスチック袋の中に含有される培地の中に細胞が懸濁されるＷＡＶＥバイオリアクタ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ジーイー・ヘスルケア・ライフサイエンシーズ））である。Ｔ細胞は、中程度の密度（約１×１０７細胞／ｍＬ）まで増殖することができ、２５リットル以下の培養体積が、この技術を用いて成し遂げることができる。しかしながら、揺り動かしによって発生される流体力学的ストレスがこのシステムにおいて培養されたＴ細胞にどのように影響を及ぼすかは知られていない。第２のものは、気体透過膜の底を有するボトルの中で培地に細胞が静的に懸濁されるＧ−Ｒｅｘバイオリアクタである。このシステムは、流体力学的ストレスはないが、しかしながら、１リットルのボトルの中で約１．４×１０９細胞の収量しか得られない。加えて、細胞成長反応速度論は、培養中に細胞がかき乱される（例えば細胞のサンプリング）か否かに依存する。第３のものは、細胞製造を十分に統合及び自動化することを目指すＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ培養システムである。このシステムは、Ｔ細胞を単離するための細胞分離カラムと細胞培養液容器とからなり、細胞は、撹拌された培地の中に懸濁され、形質導入され、増殖される。このシステムは、流体力学的ストレスを有し、その容積細胞収率は中程度（例えば約５×１０６細胞／ｍＬ）である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のことに基づき、製造原価を著しく低下させることができ、かつ養子免疫治療の幅広い応用のために製造能力を高めることができる細胞増殖システムを開発することは有利であろう。さらに、その増殖システムがスケールアップ生産（すなわち、単一のチューブの中での大量生産）又はスケールアウト生産（すなわち、各々１つが別のチューブとは独立に稼働する多数の小さいチューブ）のいずれかのために使用することができれば、さらに有利であろう。最後に、その細胞増殖システムが他のヒト及び哺乳類の細胞を増殖させるために使用することができれば有利であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、全体として、細胞増殖システム及びそのシステムの使用方法に関する。特に、そのシステムは、ヒドロゲルチューブの中で細胞を培養し増殖させることを可能にする。特に、この方法論は、費用効率が高くかつ効率的なやり方での細胞の増殖を可能にする。
【０００８】
１つの実施形態では、本開示は、細胞を増殖させるための細胞増殖システムに関する。当該システムは、少なくとも第１注入口及び少なくとも第２注入口を備える押出機を備えるキャップであって、この第１注入口は、細胞溶液を上記押出機の中へ導入するために動作可能であり、上記第２注入口は、ヒドロゲル形成溶液を上記押出機の中へ導入するために動作可能であるキャップと、上記キャップの押出機と流体連結した管状筐体であって、細胞適合性緩衝液を含む管状筐体とを備える。
【０００９】
別の実施形態では、本開示は、細胞の増殖方法に関する。当該方法は、上記の細胞増殖システムの中で細胞を培養する工程を備える。１つの実施形態では、当該方法は、上記細胞溶液及び上記ヒドロゲル形成溶液を細胞適合性溶液の中へと押し出す工程であって、この細胞適合性溶液は、上記ヒドロゲル形成溶液内のポリマーを架橋して、ヒドロゲルファイバーを生成する工程と、上記細胞溶液由来の細胞を含む上記ファイバーを、上記管状筐体の中の細胞培地又は細胞適合性緩衝液に懸濁させる工程と、上記細胞を培養する工程とを備える。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本開示の以下の詳細な説明を考慮するとき、本開示は、よりよく理解され、上記以外の特徴、態様及び利点が明らかになるであろう。このような詳細な説明は、以下の図面を参照する。
【００１１】
【図１（１）】図１Ａ〜１Ｅは、アルギン酸ヒドロゲルチューブ（ＡｌｇＴｕｂｅ）の中で培養されたＴ細胞を示す。図１Ａ及び１Ｂは、ＡｌｇＴｕｂｅを加工するための機構が２つのシリンジポンプ、特注のミクロ押出機及びＣａＣｌ２緩衝液を有することを示す。細胞溶液及びアルギン酸溶液は、それぞれミクロ押出機の中央チャネル及び側方チャネルの中へと圧送されて、同軸のコアシェルフローが生成され、このコアシェルフローは、ノズルを通ってＣａＣｌ２緩衝液の中へと押し出される。このシェルのアルギン酸フローは、Ｃａ２＋イオンによって架橋されて数秒のうちにアルギン酸ヒドロゲルチューブが生成される。
【図１（２）】図１Ａ〜１Ｅは、アルギン酸ヒドロゲルチューブ（ＡｌｇＴｕｂｅ）の中で培養されたＴ細胞を示す。図１Ｃは、ＡｌｇＴｕｂｅの設計原理を示す。細胞は、培養液容器の中の細胞培地に懸濁しているＡｌｇＴｕｂｅの中で懸濁しており培養される。このチューブは、細胞が互いに相互作用し増殖できる自由な微小空間を提供する。また、これらのチューブは、細胞を流体力学的ストレスから保護し、細胞塊を（半径方向直径で）４００ｐｍに制限し、効率的な物質輸送を確保する。細胞培地は、ヒドロゲルシェルの中を効率よく拡散できる。
【図１（３）】図１Ａ〜１Ｅは、アルギン酸ヒドロゲルチューブ（ＡｌｇＴｕｂｅ）の中で培養されたＴ細胞を示す。図１Ｄ及び１Ｅは、ＡｌｇＴｕｂｅの中で、Ｔ細胞が最初に会合して小さいクラスターを形成し、この小さいクラスターが、その後成長してチューブを満たすことを示す。スケールバー：２００ｐｍ。
【図１（４）】図１Ｆは、ＡｌｇＴｕｂｅ中に死んだＴ細胞が非常にわずかしかないことが生死細胞染色により示されることを描く。スケールバー：２００ｐｍ。
【図１（５）】図１Ｇは、６穴プレートの中での１本のＡｌｇＴｕｂｅの中の白い細胞塊の写真である。スケールバー：１ｃｍ。
【図２】図２Ａは、ヒドロゲルチューブを作製するための例示的なプロセスの概略を描く。図２Ｂは、ヒドロゲルチューブを作製するための例示的なデバイスの実験室機構を示す。図２Ｃは、図２Ｂのデバイスの押出機コンポーネントのクローズアップ図である。
【図３Ａ】図３Ａは、大スケール細胞生産において使用するための本開示の１つの実施形態の細胞増殖システム及びそのコンポーネントを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、大スケール細胞生産において使用するための本開示の１つの実施形態の細胞増殖システム及びそのコンポーネントを示す。
【図４】図４は、アルギン酸ヒドロゲルチューブの中に播種された細胞を示す。最初の２４時間で、細胞は小さい凝集体を形成し、その後で次の９日間にわたって急激な細胞成長が起こる。細胞密度とともに不透明性が増し、１０日目には、細胞はチューブを埋めつくし、（５〜１０）×１０８細胞／ｍＬの細胞密度に近づく。
【図５Ａ】図５Ａ〜図５Ｃは、本開示のプロセスで使用されるミクロ押出機を示す。図５Ａは、組み立てられたミクロ押出機の画像である。
【図５Ｂ】図５Ａ〜図５Ｃは、本開示のプロセスで使用されるミクロ押出機を示す。図５Ｂは、８つのＡｌｇＴｕｂｅを同時に押し出すための８つのノズルを備えるミクロ押出機の説明図である。
【図５Ｃ】図５Ａ〜図５Ｃは、本開示のプロセスで使用されるミクロ押出機を示す。図５Ｃは、８つのＡｌｇＴｕｂｅを同時に押し出すための８つのノズルを備えるミクロ押出機の写真である。
【図６Ａ】図６Ａ〜図６Ｄは、Ｔ細胞増殖のための培養培地及び活性化因子のスクリーニングを描く。図６Ａは、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）−ＸＦ  Ｔ細胞増殖培地（ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ）及び抗ＣＤ３／ＣＤ２８若しくは抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２活性化因子を用いて、又はＣＴＳＴＭ  ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ細胞増殖培地（ＣＴＳ）及び抗ＣＤ３／ＣＤ２８−Ｄｙｎａｂｅａｄｓ活性化因子を用いて、静的３Ｄ懸濁培養において成長した２日目のＴ細胞の顕微鏡写真である。細胞は１×１０６細胞／ｍＬで播種された。スケールバー：２００μｍ。
【図６Ｂ】図６Ａ〜図６Ｄは、Ｔ細胞増殖のための培地及び活性化因子のスクリーニングを描く。図６Ｂは、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）−ＸＦ  Ｔ細胞増殖培地（ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ）及び抗ＣＤ３／ＣＤ２８若しくは抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２活性化因子を用いて、又はＣＴＳＴＭ  ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ細胞増殖培地（ＣＴＳ）及び抗ＣＤ３／ＣＤ２８−Ｄｙｎａｂｅａｄｓ活性化因子を用いて、動的３Ｄ懸濁培養において成長した２日目のＴ細胞の顕微鏡写真である。細胞は１×１０６細胞／ｍＬで播種された。スケールバー：２００μｍ。
【図６Ｃ】図６Ａ〜図６Ｄは、Ｔ細胞増殖のための培地及び活性化因子のスクリーニングを描く。図６Ｃは、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）−ＸＦ  Ｔ細胞増殖培地（ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ）及び抗ＣＤ３／ＣＤ２８若しくは抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２活性化因子を用いて、又はＣＴＳＴＭ  ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ細胞増殖培地（ＣＴＳ）及び抗ＣＤ３／ＣＤ２８−Ｄｙｎａｂｅａｄｓ活性化因子を用いて、ＡｌｇＴｕｂｅの中で成長した２日目のＴ細胞の顕微鏡写真である。細胞は１×１０６細胞／ｍＬで播種された。スケールバー：２００μｍ。
【図６Ｄ】図６Ａ〜図６Ｄは、Ｔ細胞増殖のための培地及び活性化因子のスクリーニングを描く。図６Ｄは、累積細胞増殖倍率を示す。静的３Ｄ懸濁培養又は動的３Ｄ懸濁培養については、細胞は、それぞれ３日目、６日目、９日目及び１２日目に、機械的に解離され１×１０６細胞／ｍＬで複数のウェルに播種された。
【図７Ａ】図７Ａ〜図７Ｆは、異なるヒドロゲルのシェルの厚さ又は直径を有するＡｌｇＴｕｂｅの加工を示す。図７Ａは、シェル厚さを予測するために使用される方程式は、細胞溶液及びアルギン酸溶液の体積流量並びにチューブ外径に基づくということを提供する。
【図７Ｂ】図７Ａ〜図７Ｆは、異なるヒドロゲルのシェル厚さ又は直径を有するＡｌｇＴｕｂｅの加工を示す。図７Ｂは、実験によるシェル厚さが予測されたデータとよく合致することを示す。
【図７Ｃ】図７Ａ〜図７Ｆは、異なるヒドロゲルのシェル厚さ又は直径を有するＡｌｇＴｕｂｅの加工を示す。図７Ｃは、０日目の様々なシェル厚さ（２０μｍ、４０μｍ及び６０μｍ）を有するＡｌｇＴｕｂｅの中のＴ細胞の位相画像である。スケールバー：２００μｍ。
【図７Ｄ】図７Ａ〜図７Ｆは、異なるヒドロゲルのシェル厚さ又は直径を有するＡｌｇＴｕｂｅの加工を示す。図７Ｄは、０日目及び１４日目の様々な直径（４００μｍ、２５０μｍ及び１２０μｍ）を有するＡｌｇＴｕｂｅの中のＴ細胞の位相画像である。スケールバー：２００μｍ。
【図７Ｅ】図７Ａ〜図７Ｆは、異なるヒドロゲルのシェル厚さ又は直径を有するＡｌｇＴｕｂｅの加工を示す。図７Ｅは、様々なシェル厚さを有するＡｌｇＴｕｂｅの中での１４日目の増殖倍率及び体積収量を示す。
【図７Ｆ】図７Ａ〜図７Ｆは、異なるヒドロゲルのシェル厚さ又は直径を有するＡｌｇＴｕｂｅの加工を示す。図７Ｅ及び図７Ｆは、様々なシェル直径を有するＡｌｇＴｕｂｅの中での１４日目の増殖倍率及び体積収量を示す。
【図８Ａ】図８Ａ〜図８Ｈは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養における異なる提供者（番号１、番号２及び番号３）由来のＴ細胞の培養を示す。図８Ａは、ＡｌｇＴｕｂｅにおいて成長した提供者番号１由来のＴ細胞の顕微鏡写真である。スケールバー：２００μｍ。
【図８Ｂ】図８Ａ〜図８Ｈは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養における異なる提供者（番号１、番号２及び番号３）由来のＴ細胞の培養を示す。図８Ｂは、静的３Ｄにおいて成長した提供者番号１由来のＴ細胞の顕微鏡写真である。スケールバー：２００μｍ。
【図８Ｃ】図８Ａ〜図８Ｈは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養における異なる提供者（番号１、番号２及び番号３）由来のＴ細胞の培養を示す。図８Ｃは、動的３Ｄにおいて成長した提供者番号１由来のＴ細胞の顕微鏡写真である。スケールバー：２００μｍ。
【図８Ｄ】図８Ａ〜図８Ｈは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養における異なる提供者（番号１、番号２及び番号３）由来のＴ細胞の培養を示す。図８Ｄは、６穴プレートの中の白い細胞塊の写真である。スケールバー：１ｃｍ。
【図８Ｅ】図８Ａ〜図８Ｈは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養における異なる提供者（番号１、番号２及び番号３）由来のＴ細胞の培養を示す。図８Ｅは、６穴プレートの中の白い細胞塊の写真である。スケールバー：１ｃｍ。
【図８Ｆ】図８Ａ〜図８Ｈは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養における異なる提供者（番号１、番号２及び番号３）由来のＴ細胞の培養を示す。図８Ｆは、６穴プレートの中の白い細胞塊の写真である。スケールバー：１ｃｍ。
【図８Ｇ】図８Ａ〜図８Ｈは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養における異なる提供者（番号１、番号２及び番号３）由来のＴ細胞の培養を示す。図８Ｇは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養を用いた１４日間の培養の異なる日における細胞密度を示す。＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図８Ｈ】図８Ａ〜図８Ｈは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養における異なる提供者（番号１、番号２及び番号３）由来のＴ細胞の培養を示す。図８Ｈは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養を用いた１４日間の培養の異なる日における累積増殖倍率を示す。＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図９Ａ】図９Ａ〜図９Ｆは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養における提供者番号２由来のＴ細胞の培養を示す。図９Ａは、ＡｌｇＴｕｂｅにおいて増殖した提供者番号２由来のＴ細胞の顕微鏡写真である。スケールバー：２００μｍ。
【図９Ｂ】図９Ａ〜図９Ｆは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養における提供者番号２由来のＴ細胞の培養を示す。図９Ｂは、静的３Ｄにおいて増殖した提供者番号２由来のＴ細胞の顕微鏡写真である。スケールバー：２００μｍ。
【図９Ｃ】図９Ａ〜図９Ｆは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養における提供者番号２由来のＴ細胞の培養を示す。図９Ｃは、動的３Ｄにおいて増殖した提供者番号２由来のＴ細胞の顕微鏡写真である。スケールバー：２００μｍ。
【図９Ｄ】図９Ａ〜図９Ｆは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養における提供者番号２由来のＴ細胞の培養を示す。図９Ｄは、６穴プレートの中の白い細胞塊の写真である。スケールバー：１ｃｍ。
【図９Ｅ】図９Ａ〜図９Ｆは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養における提供者番号２由来のＴ細胞の培養を示す。図９Ｅは、６穴プレートの中の白い細胞塊の写真である。スケールバー：１ｃｍ。
【図９Ｆ】図９Ａ〜図９Ｆは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養における提供者番号２由来のＴ細胞の培養を示す。図９Ｆは、６穴プレートの中の白い細胞塊の写真である。スケールバー：１ｃｍ。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜図１０Ｆは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養における提供者番号３由来のＴ細胞の培養を示す。図１０Ａは、ＡｌｇＴｕｂｅにおいて成長した提供者番号２由来のＴ細胞の顕微鏡写真である。スケールバー：２００μｍ。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜図１０Ｆは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養における提供者番号３由来のＴ細胞の培養を示す。図１０Ｂは、静的３Ｄにおいて増殖した提供者番号２由来のＴ細胞の顕微鏡写真である。スケールバー：２００μｍ。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜図１０Ｆは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養における提供者番号３由来のＴ細胞の培養を示す。図１０Ｃは、動的３Ｄにおいて増殖した提供者番号２由来のＴ細胞の顕微鏡写真である。スケールバー：２００μｍ。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜図１０Ｆは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養における提供者番号３由来のＴ細胞の培養を示す。図１０Ｄは、６穴プレートの中の白い細胞塊の写真である。スケールバー：１ｃｍ。
【図１０Ｅ】図１０Ａ〜図１０Ｆは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養における提供者番号３由来のＴ細胞の培養を示す。図１０Ｅは、６穴プレートの中の白い細胞塊の写真である。スケールバー：１ｃｍ。
【図１０Ｆ】図１０Ａ〜図１０Ｆは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養における提供者番号３由来のＴ細胞の培養を示す。図１０Ｆは、６穴プレートの中の白い細胞塊の写真である。スケールバー：１ｃｍ。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜図１１Ｅは、細胞死、細胞周期、サイトカイン放出及びＤＮＡ損傷分析を示す。図１１Ａは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養における３日目、６日目、９日目、１２日目及び１４日目の死細胞の百分率（初期細胞に対して規格化されている）を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜図１１Ｅは、細胞死、細胞周期、サイトカイン放出及びＤＮＡ損傷分析を示す。図１１Ｂは、ヨウ化プロピジウム染色及びフローサイトメトリを用いて分析した、１４日間の培養の３日目のＧ１期、Ｓ期及びＧ２／Ｍ期にある細胞の百分率を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜図１１Ｅは、細胞死、細胞周期、サイトカイン放出及びＤＮＡ損傷分析を示す。図１１Ｃは、１４日目の細胞におけるＣＤ３＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の百分率を示す。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜図１１Ｅは、細胞死、細胞周期、サイトカイン放出及びＤＮＡ損傷分析を示す。図１１Ｄは、１４日目の培地の中のサイトカインを示す。
【図１１Ｅ】図１１Ａ〜図１１Ｅは、細胞死、細胞周期、サイトカイン放出及びＤＮＡ損傷分析を示す。図１１Ｅは、コメットアッセイを使用して定量された、各培養条件に対する１３８個の無作為に選択された核の中の尾部ＤＮＡの百分率を示す。＊＊＊：ｐ＜０．００１；＊：ｐ＜０．０５。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｃは、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ及び動的３Ｄにおいて培養された継代１代での１４日目の産物の中のＴ細胞サブタイプのフローサイトメトリ分析を示す。具体的に、図１２Ａ〜図１２Ｃは、ＡｌｇＴｕｂｅ（図１２Ａ）、静的３Ｄ（図１２Ｂ）及び動的３Ｄ（図１２Ｃ）における提供者番号１、番号２及び番号３由来のＣＤ３＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の百分率を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜図１３ＣはＤＮＡ損傷分析を示す。動的３Ｄ懸濁液及びＡｌｇＴｕｂｅの中で培養された６日目のＴ細胞における二本鎖ＤＮＡ切断及び一本鎖ＤＮＡ切断がコメットアッセイを用いて分析された。図１３Ａは、コメットの頭部及び尾部が核のインタクト（無傷）のＤＮＡ及び切断されたＤＮＡに対応することを示す。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜図１３ＣはＤＮＡ損傷分析を示す。動的３Ｄ懸濁液及びＡｌｇＴｕｂｅの中で培養された６日目のＴ細胞における二本鎖ＤＮＡ切断及び一本鎖ＤＮＡ切断がコメットアッセイを用いて分析された。図１３Ｂは各試料についての３０個の無作為に選択された核を示す。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜図１３ＣはＤＮＡ損傷分析を示す。動的３Ｄ懸濁液及びＡｌｇＴｕｂｅの中で培養された６日目のＴ細胞における二本鎖ＤＮＡ切断及び一本鎖ＤＮＡ切断がコメットアッセイを用いて分析された。図１３Ｃは各試料についての３０個の無作為に選択された核を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜図１４Ｇは、ＡｌｇＴｕｂｅの中での提供者番号１及び番号２由来のＴ細胞の長期培養を示す。図１４Ａは、継代３代のＡｌｇＴｕｂｅにおいて成長した提供者番号１由来のＴ細胞の顕微鏡写真である。スケールバー：２００μｍ。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜図１４Ｇは、ＡｌｇＴｕｂｅの中での提供者番号１及び番号２由来のＴ細胞の長期培養を示す。図１４Ｂは、６穴プレートの中での１本のＡｌｇＴｕｂｅの中の白い細胞塊の写真である。スケールバー：１ｃｍ。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜図１４Ｇは、ＡｌｇＴｕｂｅの中での提供者番号１及び番号２由来のＴ細胞の長期培養を示す。図１４Ｃは、継代１代、継代２代及び継代３代の１４日目の細胞密度を示す。
【図１４Ｄ】図１４Ａ〜図１４Ｇは、ＡｌｇＴｕｂｅの中での提供者番号１及び番号２由来のＴ細胞の長期培養を示す。図１４Ｄは、継代１代、継代２代及び継代３代の１４日目の増殖倍率を示す。
【図１４Ｅ】図１４Ａ〜図１４Ｇは、ＡｌｇＴｕｂｅの中での提供者番号１及び番号２由来のＴ細胞の長期培養を示す。図１４Ｅは、継代１代及び継代３代のＣＤ３＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の百分率を示す。
【図１４Ｆ】図１４Ａ〜図１４Ｇは、ＡｌｇＴｕｂｅの中での提供者番号１及び番号２由来のＴ細胞の長期培養を示す。図１４Ｆは、継代１代及び継代３代の１４日目の培地の中のサイトカインを示す。
【図１４Ｇ】図１４Ａ〜図１４Ｇは、ＡｌｇＴｕｂｅの中での提供者番号１及び番号２由来のＴ細胞の長期培養を示す。図１４Ｇは累積増殖倍率を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜図１５Ｄは、ＡｌｇＴｕｂｅの中でのＴ細胞の長期培養を示す。図１５Ａは、継代３代のＡｌｇＴｕｂｅの中で成長した提供者番号２由来のＴ細胞の顕微鏡写真である。スケールバー：２００μｍ。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜図１５Ｄは、ＡｌｇＴｕｂｅの中でのＴ細胞の長期培養を示す。図１５Ｂは、６穴プレートの中での１本のＡｌｇＴｕｂｅの中の白い細胞塊の写真である。スケールバー：１ｃｍ。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜図１５Ｄは、ＡｌｇＴｕｂｅの中でのＴ細胞の長期培養を示す。図１５Ｃは、提供者番号１由来の、継代３代のＡｌｇＴｕｂｅの中のＣＤ３＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞のフローサイトメトリ分析を示す。
【図１５Ｄ】図１５Ａ〜図１５Ｄは、ＡｌｇＴｕｂｅの中でのＴ細胞の長期培養を示す。図１５Ｄは、提供者番号２由来の、継代３代のＡｌｇＴｕｂｅの中のＣＤ３＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞のフローサイトメトリ分析を示す。
【図１６（１）】図１６Ａ〜図１６Ｆは、自動化されたＴ細胞増殖を示す。図１６Ａ〜図１６Ｃは、機械台、コントローラ、蛇腹状ボトル及び円錐形チューブからなるプロトタイプの細胞増殖システムを示す。培地は蛇腹状のプラスチックボトルの中に蓄えられ、このプラスチックボトルは、培地を円錐形チューブへと流すために圧迫され、又は円錐形チューブから培地を引き戻すために解放されることができた。コントローラは、圧迫速度及び解放速度、並びに圧迫と解放との間の間隔の継続時間についてプログラムされることができた。
【図１６（２）】図１６Ａ〜図１６Ｆは、自動化されたＴ細胞増殖を示す。図１６Ｄ〜図１６Ｆは、１日目に、Ｔ細胞が入ったＡｌｇＴｕｂｅが５０ｍＬ円錐形チューブ（図１６Ｄ）の中へ加工され、そこで細胞は１４日間増殖し（図１６Ｅ）、その後でＥＤＴＡ溶液を加えることにより収穫された（図１６Ｆ）ことを描く。プロセス全体は、閉じた５０ｍＬ円錐形チューブの中で完結した。３つの円錐形チューブを使用して、３人の提供者からＴ細胞を生成した。
【図１７（１）】図１７Ａ〜図１７Ｌは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来の内皮細胞（ＥＣ）の作製を描く。図１７Ａ及び１７Ｂは、機械台、コントローラ、蛇腹状ボトル及び５０ｍＬ円錐形チューブからなる本開示の細胞増殖システムを描く。培地は蛇腹状のプラスチックボトルの中に蓄えられ、このプラスチックボトルは、培地を円錐形チューブへと流すために圧迫され、又は円錐形チューブから培地を引き戻すために解放されることができた。コントローラは、圧迫速度及び解放速度、並びに圧迫と解放との間の間隔の継続時間についてプログラムされることができた。
【図１７（２）】図１７Ａ〜図１７Ｌは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来の内皮細胞（ＥＣ）の作製を描く。図１７Ｃ〜図１７Ｇは、０日目に、１．５％  ＨＡ溶液と混合された単一のｈＰＳＣ及び１．５％アルギン酸溶液は、それぞれ、手製のミクロ押出機の中央チャネル及び側方チャネルへと圧送され、ＣａＣｌ２緩衝液（１００ｍＭ）の中へと押し出されたことを示す（図１７Ｃ）。細胞は、Ｅ８培地の中で５日間培養され（図１７Ｄ）、次いでＥＣ分化培地の中でさらに５日間培養された（図１７Ｅ）。培地は連続的に灌流された。１０日目に、アルギン酸ヒドロゲルが０．５ｍＭ  ＥＤＴＡによって５分間溶解された。細胞塊は遠心分離によりペレットにされた。細胞塊は、Ａｃｃｕｔａｓｅ中、３７℃で１０分間インキュベーションすることにより単一の細胞へと解離された（図１７Ｆ）。抗ＳＳＥＡ４抗体でコーティングされた磁気ビーズが加えられ、磁気細胞分離器を用いて未分化ＳＳＥＡ４＋  ｈＰＳＣが沈降された（図１７Ｇ）。
【図１７（３）】図１７Ａ〜図１７Ｌは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来の内皮細胞（ＥＣ）の作製を描く。図１７Ｈ〜図１７Ｊは、１０日目の細胞の位相画像（図１７Ｈ）、生／死染色（図１７Ｉ）及びフローサイトメーター分析（図１７Ｊ）を示す。スケールバー、それぞれ２００μｍ及び１００μｍ。
【図１７（４）】図１７Ａ〜図１７Ｌは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来の内皮細胞（ＥＣ）の作製を描く。図１７Ｋは、１０日目の細胞の免疫染色を示す。スケールバー、それぞれ２００μｍ及び１００μｍ。
【図１７（５）】図１７Ａ〜図１７Ｌは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来の内皮細胞（ＥＣ）の作製を描く。図１７Ｌは、マトリゲルマトリクスとともに皮下に移植されたときに、ＥＣが良好な血管構造を生成したことを示す。この図ではＨ９を使用した。スケールバー、５０μｍ。
【図１８（１）】図１８Ａ〜図１８Ｈは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来の神経幹細胞（ＮＳＣ）の作製を描く。図１８Ａ及び図１８Ｂは、機械台、コントローラ、蛇腹状ボトル及び５０ｍＬ円錐形チューブからなる本開示の細胞増殖システムを描く。培地は蛇腹状のプラスチックボトルの中に蓄えられ、このプラスチックボトルは、培地を円錐形チューブへと流すために圧迫され、又は円錐形チューブから培地を引き戻すために解放されることができた。コントローラは、圧迫速度及び解放速度、並びに圧迫と解放との間の間隔の継続時間についてプログラムされることができた。
【図１８（２）】図１８Ａ〜図１８Ｈは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来の神経幹細胞（ＮＳＣ）の作製を描く。図１８Ｃに示すように、０日目に、１．５％  ＨＡ溶液と混合された単一のｈＰＳＣ及び１．５％アルギン酸溶液は、それぞれ、手製のミクロ押出機の中央チャネル及び側方チャネルへと圧送され、ＣａＣｌ２緩衝液（１００ｍＭ）の中へと押し出された。細胞は、Ｅ８培地の中で５日間培養され、次いでＮＳＣ誘導培地の中でさらに７日間培養された。培地は連続的に灌流された。１２日目に、アルギン酸ヒドロゲルが０．５ｍＭ  ＥＤＴＡによって５分間溶解された。細胞塊は遠心分離によりペレットにされた。細胞塊は、Ａｃｃｕｔａｓｅ中、３７℃で１０分間インキュベーションすることにより単一の細胞へと解離された。抗ＳＳＥＡ４抗体でコーティングされた磁気ビーズが加えられ、磁気細胞分離器を用いて未分化ＳＳＥＡ４＋  ｈＰＳＣが沈降された。上清中の精製された細胞は、新しい密閉されたチューブに移され、手術室へと運ばれた。ＮＳＣは、定位注入器を用いてラットの脳へと移植された。
【図１８（３）】図１８Ａ〜図１８Ｈは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来の神経幹細胞（ＮＳＣ）の作製を描く。図１８Ｄは、ＮＳＣマーカー、ＰＡＸ６及びＮＥＳＴＩＮに対する１２日目の細胞の免疫染色を示す。スケールバー、５０μｍ。図１８Ｅは、抗ＳＳＥＡ４磁気ビーズによって沈降された細胞がＯＣＴ３／４及びＮＡＮＯＧについて陽性であったことを示す。スケールバー、５０μｍ。図１８Ｆは、移植された皮質前駆体が移植後７日間ラットの脳の中で良好に生存し、移植後３０日でＨｕＮｕ＋及びＴＵＪ−１＋神経細胞になったことを示す。スケールバー、それぞれ４００μｍ及び５０μｍ。
【図１８（４）】図１８Ａ〜図１８Ｈは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来の神経幹細胞（ＮＳＣ）の作製を描く。
【図１９（１）】図１９Ａ〜図１９Ｈは、個別化細胞生産のための本開示の細胞増殖システムを描く。図１９Ａは、このシステムが機械台、コントローラ、蛇腹状ボトル及び５０ｍＬ円錐形チューブからなることを示す。
【図１９（２）】図１９Ａ〜図１９Ｈは、個別化細胞生産のための本開示の細胞増殖システムを描く。図１９Ｂは、当該システムを用いた細胞生産を示す写真である。
【図１９（３）】図１９Ａ〜図１９Ｈは、個別化細胞生産のための本開示の細胞増殖システムを描く。図１９Ｃ及び図１９Ｄは、１１日目のＤＡ前駆細胞の位相画像及び生／死染色である。スケールバー、２００μｍ。図１９Ｅ及び図１９Ｆは、ＤＡ前駆体マーカーＬＭＸ１Ａ及びＦＯＸＡ２に対する１１日目の細胞の免疫染色（図１９Ｅ）及びフローサイトメトリ分析（図１９Ｆ）を示す。スケールバー、１００μｍ。
【図１９（４）】図１９Ａ〜図１９Ｈは、個別化細胞生産のための本開示の細胞増殖システムを描く。図１９Ｇ及び図１９Ｈは、移植の６週間後、細胞は良好に生存し、ＤＡ神経細胞へと成熟したことを示す。スケールバー、それぞれ２００μｍ及び１００μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
特段の記載がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と類似又は等価ないずれの方法及び材料を本開示の実施又は試験で使用することができるが、その好ましい方法及び材料が以下に記載される。
【００１３】
本開示は、細胞を増殖させるための自動化可能な細胞増殖システムであって、生産能力を高めつつも製造の時間及び費用を著しく低減することができるシステムに関する。このシステムは、高収率、高収量及び高品質で細胞を製造するために、流体力学的ストレスを与えない培養微小環境で細胞を提供するように設計されている。ヒト由来の細胞を流体力学的ストレス下で培養することは細胞にとって非常に有害であり、これらの流体力学的ストレスを解消することは細胞生存率、成長速度、収率及び収量の著しい向上につながるということがこれまでに見いだされていた。高収率は、各患者に対して、培養体積を、従って製造費用を減少させることができる。さらには、培養体積の減少により、多数の患者のための自動化細胞生産用の微小のデバイスの開発が可能になる。
【００１４】
細胞増殖システム及びこのシステムを使用する細胞の増殖方法
全般に、本開示の方法は、培養液容器の中の細胞培地に懸濁しているミクロスケールヒドロゲルチューブを備える細胞増殖システムを加工して、その中で細胞を（その活性化因子と共に）培養する工程を備える（図１Ａ及び１Ｂ）。このヒドロゲルチューブは、細胞が互いに相互作用し増殖できる細胞に優しい微小空間を作り出す。その間、このヒドロゲルチューブは、培養容器の中でＴ細胞を流体力学的ストレスから保護する。さらに、ヒドロゲルチューブは、細胞塊を（通常、半径方向直径で４００μｍ未満に）制限し、培養全体の間の効率的な物質輸送を確保する（図１Ｃ）。加えて、本開示の細胞増殖システムは、単純で、拡張可能であり、明確で、再現性があり、費用効率が高く、現行の優良医薬品製造基準（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）に適合しているように設計されており、この細胞増殖システムは工業的に実行可能なものになっている。
【００１５】
本明細書に記載される方法及びシステムを使用して処理され、培養され、増殖されることができる細胞の非限定的な例としては、哺乳類細胞、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエＳ２細胞）、植物細胞、酵母細胞、及びバクテリア細胞が挙げられる。哺乳類細胞、とりわけヒト由来のＴ細胞を用いてより十分に記載されるが、本明細書に記載される方法及びシステムは、本開示から逸脱しない範囲で上記の種類の細胞のいずれと共に使用することもできるということを認識されたい。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「哺乳類細胞」は、ヒト由来の細胞及び動物由来の細胞の両方を指す。本開示の方法及びシステムにおいて使用するための特に好適な哺乳類細胞としては、哺乳類の胚性幹細胞、哺乳類の人工多能性幹細胞、哺乳類のナイーブ多能性幹細胞；哺乳類の胚性幹細胞、哺乳類の人工多能性幹細胞及び哺乳類のナイーブ多能性幹細胞から分化した細胞；他の細胞型から初期化された哺乳類細胞（例えば、ヒト由来の線維芽細胞から初期化されたヒトの神経細胞）、哺乳類の初代培養細胞（例えば、ヒト由来の臍静脈内皮細胞、癌細胞、Ｔ細胞）、哺乳類の組織幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、胎児神経幹細胞）、及び哺乳類細胞株（例えば、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）が挙げられる。
【００１７】
ミクロスケールヒドロゲルチューブは、当該技術分野で公知のように調製される。例として、１つの特定の実施形態では、このチューブは、アルギン酸ポリマー材料から調製される中空糸として調製される。このチューブを調製する際に使用するための好適なアルギン酸（アルギネート）ポリマー材料としては、任意の市販の又は手元で精製したアルギン酸ポリマー、例えばＳｉｇｍａ（シグマ）のアルギン酸の酸形態又はアルギン酸ナトリウム（＋Ｗ２０１５０２）、及び変性アルギン酸ポリマー、例えばメタクリレート変性アルギン酸、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。本明細書で使用する場合、「これらの組み合わせ」は、上記ポリマーの混合物及びポリマーブレンドを指す。さらに、いくつかの実施形態では、ヒアルロン酸等の他のポリマーを、アルギン酸ヒドロゲルに少量添加（ドープ）するために、上記アルギン酸ポリマーにブレンドし又は組み込んでもよい。上記チューブを形成するために、アルギン酸ポリマーは、最初に水又は細胞適合性緩衝液に溶解され、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）のアルギン酸を含むアルギン酸溶液が形成される。特に好適な態様では、次に、押出機を使用して上記チューブが調製されて細胞で充たされる。押出条件は、具体的な細胞生存及び成長に好適な当該技術分野で公知の条件になる。
【００１８】
アルギン酸ヒドロゲルチューブを用いて本明細書に記載されるが、他のヒドロゲル材料が上記チューブの作製での使用に好適である可能性があることを理解されたい。例えば、上記ヒドロゲルチューブは、ポリエチレングリコール、ポリ（ビニルアルコール）等、及びこれらの組み合わせなどの材料から作製することができよう。
【００１９】
例として、図２Ａ〜図２Ｃに示されるように、細胞を含む細胞溶液が第１注入口２００を経由して供給され、ヒドロゲル形成（例えば、アルギン酸）溶液が少なくとも第２注入口（図２Ａに注入口２０２として示される）を経由して供給される。細胞溶液を含む第１ストリーム及びアルギン酸溶液を含む第２ストリームの両方が、アルギン酸溶液の中のアルギン酸ポリマーを架橋することができるカルシウムイオン、又は他のイオン若しくは化学物質、例えばバリウムイオンを含有する細胞適合性溶液へと押し出される。この細胞適合性溶液により、アルギン酸ポリマーが即座に架橋することが可能になり、これによりアルギン酸溶液がゲル化してチューブが形成される。通常、チューブは、典型的には約１分〜約３０分の範囲の時間のうちに十分に架橋される。
【００２０】
通常、形成されるとき、上記チューブは、所望の特定の細胞及び細胞増殖量のためのサイズにされる。好適には、このチューブは、細胞塊をヒトの組織の拡散限界（例えば、通常半径方向直径で５００μｍ）未満に制限し、培養全体の間の効率的な物質輸送を確保する（図１Ｃ）。数多くの研究から、５００μｍを超える細胞凝集体は物質輸送、細胞増殖、生存率及び表現型の不良につながることが見出されている。このチューブは、典型的には数ミリメートル〜数メートルの範囲の長さを有することができる。加えて、上記ヒドロゲルチューブの外径及び内径は、数マイクロメートルから数ミリメートルまで変わることができる。
【００２１】
十分に架橋されてチューブが形成されると、細胞適合性溶液は取り除かれ、細胞培地が加えられて、架橋されたアルギン酸ヒドロゲルチューブの中で細胞がこれより培養される。いくつかの態様では、このファイバーは細胞を含むが、このファイバーは、細胞培養液容器又はバイオリアクタの中の細胞培地に懸濁している（管状筐体を有するバイオリアクタを備える例示的な細胞増殖システムが、後述する図３Ａに示されている）。この細胞培地は、細胞生存、成長、増殖及び分化を支えるために好適な、細胞培養液の分野で公知のいずれの培地であってもよい。通常、細胞培地は、限定はされないが、炭素源、窒素源、及び成長因子を含むことになる。アルギン酸ヒドロゲルチューブ内で細胞を培養する工程において使用するための具体的な細胞培地は、培養対象の細胞型に依ることになる。
【００２２】
細胞培養条件は、細胞の種類、細胞増殖量、及び所望の細胞数に応じて変わることになる。十分な細胞増殖及び所望の細胞数に到達すると、細胞は、継代されて、その後の成長及び増殖のラウンドのために、新しいアルギン酸ヒドロゲルチューブへ播種されることができる。あるいは、増殖した細胞は、その中空のチューブの中で最終の所望の細胞型へと分化されてもよい。
【００２３】
図３Ａに示されるように、当該細胞増殖システム３００は、いくつかの独特の特徴を有する。まず、システム３００は、管状筐体３０８と流体連結したキャップ（蓋）３０２を備える。システム３００のキャップ３０２（図３の右上に詳しく示されている）は、細胞溶液をキャップに導入するために動作可能である第１注入口３０３及びヒドロゲル形成溶液（例えば、アルギン酸溶液）をキャップに導入するために動作可能である第２注入口３０４を備える押出機３０５を有する。押出機３０５は、ヒドロゲルチューブ加工をスケールアップするために複数のヒドロゲルチューブを同時に加工するために、複数のノズル（例えば、２個〜数千個）を有して作製されてもよい。上記２つの溶液は押出機へと圧送（ポンプ輸送）され、圧送速度は、計算による流体力学モデリング及び実験によって算出されている。将来のユーザーは、チューブ寸法及び動作安定性を制御するための正確な圧送スケジュールを提供されるであろう。組み込み式キャップの利点は無菌性である。
【００２４】
管状筐体３０８は、最初にＣａＣｌ２溶液で満たされる。筐体３０８は、アルギン酸チューブ３１２のための支持体として働くメッシュ３１０を備える。図３Ａでは、メッシュ３１０は、軸方向配座で示されている。この配座は、当該システムを水平位置で運転するために設計されている。水平配座では、アルギン酸チューブは、程度の差はあれ軸方向に整列するが、完全な整列があることは非常に重要なことではない。当該システムが縦型で運転される場合、メッシュは、反応器の底３２０から約１／３のところに位置する円形のディスクである。このメッシュの目的は、ポンプ注入口／排出口を含む当該システムの区画をアルギン酸チューブから隔てることである。
【００２５】
増殖培地は、（１）とある成長構成要素及び／又は代謝廃棄物構成要素についての臨界レベルが引き金となるときに培地が圧送されて交換される半回分式、（２）増殖培地がバイオリアクタを通して連続的に圧送される灌流によって加えられることができるし、又は増殖培地は、（３）往復動ポンプによって、上げ潮／引き潮サイクルと呼ばれる連続サイクルでバイオリアクタへ及びバイオリアクタから圧送されることができる。増殖培地循環のこの方法は、チューブの周囲の条件ができるだけ均一にとどまることを確実にするために特別に設計されており、メッシュプラットフォームの使用に密接に結びついている。アルギン酸チューブは、（細胞密度が大きくなるにつれてわずかに変化する）中立浮力を有し、チューブは、上げ潮段階の間には増殖培地に懸濁した状態になり、引き潮段階の間にはメッシュへと崩れ落ちる。この上げ潮／引き潮アプローチの利点は、アルギン酸チューブがより均一な条件に曝露されること、すなわち、壊れやすいチューブを傷つけることなくチューブ間の流体の利用できないポケットが解消されて、バルク条件のばらつきが低減されることであり、これは、均一な細胞成長のためには必須である。引き潮サイクルの間、増殖培地は、バイオリアクタから、ｐＨ、ｄＯ及びグルコースセンサが取り付けられているポンプ容器へと圧送される。センサのうちのいずれか１つが設定値未満の値を検出した場合、増殖培地は使用後タンク３２０へと圧送され、上げ潮／引き潮サイクルが再開される前に新しい培地３２２と交換される。
【００２６】
図３Ａに示されるように、撮像ポート３３０は、単に壁の平坦な区画であり、可視及び近赤外範囲の光透過性を許容する高品質材料（石英はそのような材料である）から作製される。高解像度内視鏡３３２は、図４（右パネル）に示されるように、チューブの区画の画像を撮影することができる。これらの画像は、細胞を特定するために訓練されたニューラルネットワーク（ＮＮ）に供給される。このＮＮは、細胞密度を与える。この評価はチューブの中の細胞密度の二次元投影に基づくので、ＮＮ結果を細胞密度（細胞／ｍＬ）に関して解釈するために、較正曲線が使用される。この較正曲線は細胞特異的である。手短に言えば、その曲線は、細胞凝集及び成長モデルの鍵となるパラメータを定義するために、実験結果を使用して算出される。このモデルは、３次元の数学的像を提供し、２次元平面へのその像の射影が内視鏡画像と合致される。このＡＩ撮像の利点は、細胞密度の目立たず、連続的なリアルタイムモニタリングである。
【００２７】
バイオリアクタ３００は、増殖培地をモニタリングするために光ファイバー３４２がバイオリアクタの中へと挿入される際に通ることができるポート３４０も備える。ラマン分光法は、タンパク質及びサイトカイン等の複雑な分子の定性的及び（較正されれば）定量的な情報を提供する。ここでも、具体的な応用例に応じて、ラマン分光法を使用して、細胞生存率、アポトーシス、及び細胞の運命と相関する特定の分子の分泌をモニタリングすることができる。
【００２８】
細胞は、最後に、チューブを化学的に又は物理的に溶解させることによりチューブの中空空間から解放される。１つの態様では、チューブは、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールテトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、又はアルギン酸可溶化液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（シグマ・アルドリッチ）から入手できる）等の化学溶解剤を使用して溶解される。別の態様では、チューブは、機械力を使用して溶解される。チューブ内の細胞の生存時間は、典型的には数日から数か月にわたることができる。
【００２９】
上記細胞は、研究所実験室及び産業の両方において有用である。小スケール及び大スケールの細胞が、それぞれ実験室用途及び工業用途のための当該システムを用いて製造することができる。本開示の細胞増殖システムは、スケールアップ（単一のチューブの中での大量生産）又はスケールアウト（各１つが他から独立に運転される、多数の小さいチューブ）のいずれにも使用することができる。当該バイオリアクタは、個別化増殖用途（スケールアウト）には５０ｍＬの典型的な容積を有し、スケールアップ用途には１Ｌ以上の典型的な容積を有することになろう。
【００３０】
図３Ｂは、細胞生産をスケールアップするための例示的な細胞増殖システムを提供する。チューブ（約１リットル）は、約２００ｍＬのアルギン酸ヒドロゲルチューブを含んで、約１．０×１０１１細胞を生産することができる。培地は、当該システムの管状筐体へ、及び当該システムの管状筐体から圧送される。モジュール式であるので、この筐体は、その長さを増大させることにより、さらにスケールアップしてより多くの細胞を生産することができる。管状筐体は、縦型であってもよいし、横型（水平型）であってもよい。管状筐体の直径は、必要に応じて調整することができる。
【００３１】
細胞は、変性疾患及び損傷の治療、薬物スクリーニングにおいて使用するために、タンパク質等を発現させるために、サイズ及び数において効率よくかつ効果的に調製することができる。加えて、細胞は、タンパク質及びワクチンを製造するために使用することができる。さらに他の態様では、細胞は、組織工学のために使用することができる。
【００３２】
本開示のこれらの及び他の実施形態の種々の機能及び利点は、下記の実施例からより十分に理解されよう。その実施例は、本開示の恩恵を例証することを意図されており、本開示の全範囲を例示するものではない。
【実施例】
【００３３】
実施例１
この実施例では、初代Ｔ細胞をその活性化因子（例えば抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２抗体）と共に加工し、培養バイオリアクタの中の細胞培地に懸濁しているミクロスケールアルギン酸ヒドロゲルチューブ（ＡｌｇＴｕｂｅ）の中で培養した。最適化した培養条件の下で、ＡｌｇＴｕｂｅは、高い細胞生存率、低いＤＮＡ損傷、高い成長速度（１４日にわたる約３２０倍の増殖）、高純度（約９８％  ＣＤ３＋）及び高収率（約３．２×１０８細胞／ｍＬ）でＴ細胞を増殖させることを可能にし、これらの特徴はすべて、現行の手法に勝るかなりの利点をもたらす。さらに、増殖したＴ細胞は、高レベルのＴ細胞サイトカインを分泌し、これは増殖したＴ細胞の正常の機能を示す。このシステムは、養子免疫治療を成し遂げるために、製造原価を著しく下げ、Ｔ細胞の生産能力を高めることができる。
【００３４】
材料及び方法
細胞培養液：ＣＤ３＋  Ｔ細胞をＡｓｔａｒｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（アスターテ・バイオロジクス）（提供者番号１、カタログ番号１０１７−３５０３ＭＡ１７；提供者番号２、カタログ番号１０１７−３５３５ＡＰ１７；提供者番号３、カタログ番号１０５７−３３２５ＳＥ１６）から得た。ＣＤ３＋  Ｔ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）−ＸＦ  Ｔ細胞増殖培地（カタログ番号１０９８１、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ステムセル・テクノロジーズ））の中で、１００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２の存在下で抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２活性化因子（カタログ番号１０９７０、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともに成長させた。動的３Ｄ培養については、培養は、１５揺れ／分（ｒｐｍ）で揺り動かした。静的培養及び動的３Ｄ培養については、穏やかなピペット操作によって細胞凝集体を解離させ、３日目、６日目、９日目及び１２日目に１．０×１０６細胞／ｍＬの密度で複数のウェルに分割した。細胞を、５％ＣＯ２、２１％Ｏ２、３７℃の培養器の中で培養した。
【００３５】
ＡｌｇＴｕｂｅの中でのＴ細胞の培養：典型的な細胞培養液については、アルギン酸ヒドロゲルチューブの中の４０μＬの細胞溶液を６穴プレートの中の３ｍＬのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）−ＸＦ  Ｔ細胞増殖培地に懸濁させ、５％ＣＯ２、２１％Ｏ２、３７℃の培養器の中で培養した。細胞を継代するために、培地を取り除き、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを用いてアルギン酸ヒドロゲルチューブを５分間溶解させた。３００ｇで５分間遠心分離することによりＴ細胞を集め、次の継代又は分析のために穏やかなピペット操作によって単一の細胞へと解離させた。
【００３６】
細胞死及び細胞周期分析：死細胞を測定するために、３日目、６日目、９日目、１２日目及び１４日目に、それぞれＴ細胞培地を集めた。アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）は、すべての真核細胞及び原核細胞に存在する偏在性タンパク質である。それらは、細胞の細胞膜の損傷の際に直ちに培地に放出される。細胞培地の中のＡＫを、生物発光細胞毒性アッセイキット（カタログ番号ＪＭ−Ｋ３１２−５００、ＭＢＬ  ｍｅｄｉｃａｌ  ＆  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（エムビーエル・メディカルアンドバイオロジカル・ラボラトリーズ））を製品取扱説明書に従って用いて定量し、標準曲線を用いて規格化し、培養物の中の死細胞を算出した。６日目の試料を回収し、トリパンブルーを用いて生細胞をカウントした。単一の細胞を、フローサイトメトリを使用するヨウ化プロピジウム染色を伴う細胞周期分析のために７０％冷エタノールを用いて固定した。
【００３７】
フローサイトメトリ：Ｔ細胞を集め、単一の細胞へと解離させ、固定した。細胞を、以下の抗体（すべてＢｉｏｌｅｇｅｎｄ（バイオレジェンド）製）、ＰＥ抗ヒトＣＤ３（カタログ番号３１７３０８）、ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ４（カタログ番号３１７４０８）、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ８（カタログ番号３００９１２）で染色し、フローサイトメーター（Ｃｙｔｅｋ（サイテック）、ＢＤ）を用いて分析した。
【００３８】
コメットアッセイ：コメットアッセイを、ＣＯＭＥＴＡＳＳＡＹ（登録商標）２穴ＥＳ  Ｕｎｉｔ  ｗ／Ｓｔａｒｔｅｒキット（カタログ番号４２５０−０５０−ＥＳＫ−ＰＳ１、Ｔｒｅｖｉｇｅｎ（トレビジェン））を製品取扱説明書に従って用いて実施した。手短に言えば、単一の細胞（１．０×１０５／ｍＬ）を融解したＬＭＡｇａｒｏｓｅ（３７℃）と１：１０（ｖ／ｖ）の比で混合し、直ちにＣｏｍｅｔＳｌｉｄｅ（コメットスライド）に移し（５０ｐＬ）、次いでこのスライドを暗所で４℃に１０分間置き、アガロースヒドロゲルの薄層を形成させて細胞を包埋した。このスライドを、Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（溶解溶液）（カタログ番号４２５０−０５０−０１）に４℃で一晩浸漬して、細胞を溶解した。次いでこのスライドを、新しく調製した２００ｍＭ  ＮａＯＨ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ＞１３）を含有するＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（アルカリ性巻き戻し溶液）に４℃で、暗所で１時間浸漬した。次いで２００ｍＭ  ＮａＯＨ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ＞１３）を含有するＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（アルカリ性電気泳動溶液）の中で、２１ボルトで３０分間電気泳動を実施した。このスライドをｄＨ２Ｏに２回、各５分間浸漬し、次いで７０％エタノールに５分間浸漬した。次いでこのスライドを、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄを用いて室温で３０分間染色した。このスライドを、蛍光顕微鏡を用いて撮影した（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄの最大励起／発光は４９６ｎｍ／５２２ｎｍである）。Ｃｏｍｅｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（カタログ番号４２６０−０００−ＣＳ）を使用して、１試料あたり１３８個のコメットを評価した。
【００３９】
サイトカイン分析：Ｑｕａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｒｒａｙ  １（ＱＡＨ−ＣＹＴ−１−１、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ（レイバイオテック））を使用して、培地の中のサイトカイン分泌を製造業者の取扱説明書に従って定量した。結果を、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ  Ｑ  Ａｎａｌｙｚｅｒプログラムを使用して分析した。手短に言えば、ブロッキング緩衝液を用いて室温で３０分間アレイチップをブロックした。１００ｐＬの細胞培地を各ウェルに入れ、４℃で一晩インキュベーションした。十分な洗浄の後、ビオチン標識検出抗体を室温で２時間加えた。次いでＣｙ３等価染料結合ストレプトアビジンを室温で１時間加えた。このアレイを、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈによってスキャンし分析した。
【００４０】
統計解析：データを平均±標準偏差として提示する。２つのグループを比較するために対応のないｔ検定を使用し、３以上のグループを比較するために一元配置ＡＮＯＶＡを使用した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意であると考えた。
【００４１】
結果
ＡｌｇＴｕｂｅ  Ｔ細胞培養システム
ＡｌｇＴｕｂｅを加工するためにミクロ押出機を設計し製作した（図１Ａ〜図１Ｂ及び図５Ａ〜図５Ｃ）。ＡｌｇＴｕｂｅを加工するために、単一のＴ細胞、Ｔ細胞活性化因子（例えば抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２抗体）及び２％ヒアルロン酸ポリマーを含有する溶液、並びに１．５％アルギン酸ポリマーを含有する溶液を、それぞれ、ミクロ押出機の中央チャネル及び側方チャネルに圧送し、同軸のコアシェルフローを形成し、このコアシェルフローをＣａＣｌ２緩衝液の中へと押し出した。シェルのアルギン酸フローは、Ｃａ２＋イオンによって即座に架橋されて、アルギン酸ヒドロゲルチューブが生成した（図１Ａ〜図１Ｃ）。その後、このＣａＣｌ２緩衝液をＴ細胞培地に置き換え、細胞をチューブの中で成長させた。欠陥がないＡｌｇＴｕｂｅを加工するためには、細胞溶液及びアルギン酸溶液は、近い粘度を有する必要がある。この目的のために、ヒアルロン酸（ＨＡ）及びメチルセルロース（ＭＣ）溶液の両方が、細胞を懸濁させるために使用することができた。ＡｌｇＴｕｂｅの中で、単一のＴ細胞は、まず会合して小さい細胞クラスターを形成し、この細胞クラスターがその後成長してチューブを満たした（図１Ｄ、図１Ｅ及び図１Ｇ）。ＡｌｇＴｕｂｅの中のＴ細胞は、生／死染色による検出できない死細胞（図１Ｆ）によって示されるように、培養全体の間、非常に高い生存率を有していた。細胞を集めて継代するために、ＡｌｇＴｕｂｅは、細胞適合性エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）溶液（０．５ｍＭ、室温で５分間）を用いて溶解し、ミクロ細胞塊を放出することができ、このミクロ細胞塊は、以下の分析又は継代のために、穏やかな機械的なピペット操作により単一の細胞へと解離させることができた。
【００４２】
Ｔ細胞増殖のための培養培地及び活性化因子のスクリーニング
いくつかの培養培地及び活性化因子が、文献においてＴ細胞を増殖させるために成功裏に使用されてきた。これらには、活性化因子としての抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体でコーティングした磁気ナノ粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン））及び培地としてのＣＴＳＴＭ  ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ細胞増殖ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン））の使用、又は活性化因子としての四量体抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体又は四量体抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２抗体（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び培地としてのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）−ＸＦ  Ｔ細胞増殖培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の使用の組み合わせが挙げられる。まず、これらの培地及び活性化因子を、Ｔ細胞を培養するための最適の組み合わせを見出すために方向づけて比較した（図６Ａ〜図６Ｄ）。また、比較のために、これらの細胞を、静的３次元（３Ｄ）懸濁培養（すなわち、細胞が撹拌なしで培地に懸濁される静的３Ｄ）及び動的３Ｄ懸濁（すなわち、細胞が穏やかな揺り動かしとともに培地に懸濁される動的３Ｄ）で培養した。後者の２つの培養方法は、それぞれ、Ｇ−Ｒｅｘバイオリアクタ及びＷＡＶＥバイオリアクタ又はＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ培養システムを模倣するために使用した。３つの方法すべてについてＴ細胞を１．０×１０６細胞／ｍＬで播種し、１４日間培養した。静的３Ｄ培養については、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ培地及び抗ＣＤ３／ＣＤ２８活性化因子を用いた場合、Ｔ細胞は単一の細胞又は小さいクラスター（例えば直径が５０ｐｍ未満）として成長した。ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ培地及び抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２活性化因子を用いた場合、単一のＴ細胞及び直径が１００〜５００ｐｍの球形の細胞凝集体の両方が見出された。ＣＴＳＴＭ  ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）培地及びＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ３／ＣＤ２８活性化因子を用いた場合、Ｔ細胞は、単一の細胞及び大きい非球形の凝集体の両方として成長した（図６Ａ）。動的３Ｄ培養については、３つの培養条件下すべてでＴ細胞は凝集体として成長した。加えて、これらの凝集体は、静的３Ｄ培養における凝集体よりもはるかに大きかった（図６Ｂ）。ＡｌｇＴｕｂｅでは、Ｔ細胞は、最初は小さいクラスターを形成し（例えば最初の２４時間以内）、この小さいクラスターは、その後成長してチューブを満たした（図６Ｃ）。１４日目には、Ｔ細胞は、静的３Ｄ、動的３Ｄ及びＡｌｇＴｕｂｅにおいて、約５５倍、約２８倍、約２５０倍に増殖した。異なる培地及び活性化因子の間には有意差はなかった（図６Ｄ）。この実施例の残りの部分ではＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ及び抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２活性化因子を使用した。
【００４３】
チューブ直径及びヒドロゲルシェル厚さの調整
ＡｌｇＴｕｂｅの直径及びヒドロゲルシェル厚さは、ミクロ押出機のノズル直径、細胞溶液及びアルギン酸溶液の流量を調整することによって正確に制御することができた（図７Ａ及び図７Ｂ）。チューブの内径及び外径、シェル厚さ、細胞溶液及びアルギン酸溶液の体積流量と、単位時間あたりに加工されるチューブの長さとの関係は、図７Ａに示す方程式を用いて記述することができる。チューブの外径と押出機ノズルの内径とはほぼ等しかった。Ｔ細胞は、シェル厚さが６０μｍ、４０μｍ及び２０μｍのチューブ又は直径が４００μｍ、２５０μｍ及び１２０μｍのチューブにおいては、同様の形態（モルホロジー）、生存率、成長速度及び収率を有することが示された（図７Ｃ〜図７Ｆ）。６０μｍ以下のシェル厚さ及び４００μｍ以下の外径を有するＡｌｇＴｕｂｅがＴ細胞増殖にとって適切であると結論した。
【００４４】
ＡｌｇＴｕｂｅの中でＴ細胞を増殖させる際の最小の提供者間のばらつき
初代ヒト由来の細胞を培養することに関する重要な課題は、大きな提供者（ドナー）間のばらつきが存在することである。異なる提供者由来のＴ細胞を増殖させるためにＡｌｇＴｕｂｅを使用することができるかを検討した。３人の提供者由来のＴ細胞を並行して培養した（表１）。比較のために、細胞を静的３Ｄ及び動的３Ｄにおいても培養した。Ｔ細胞を１．０×１０６細胞／ｍＬで播種した。ＡｌｇＴｕｂｅでは、Ｔ細胞を継代も又は分割もせずに１４日間連続的に培養した。Ｔ細胞は、最初に小さいクラスターを（例えば２４時間以内に）形成し、この小さいクラスターは、その後成長してチューブを満たし、１４日目には（半径方向において）単分散性のファイバー状の細胞塊を生成した（図８Ａ及び図８Ｄ、図９Ａ及び図９Ｄ、並びに図１０Ａ及び図１０Ｄ）。Ｔ細胞は、６日目、９日目及び１４日目には、それぞれ約５１倍、１２３倍、３２０倍に増殖して、およそ０．５１×１０８細胞／ｍＬ、１．２×１０８細胞／ｍＬ、３．２×１０８細胞／ｍＬを与えた（図８Ｇ及び８Ｈ）。３人の提供者の間でほとんど差はなかった（図８Ａ〜図８Ｈ、図９Ａ〜図９Ｆ、及び図１０Ａ〜図１０Ｆ）。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
静的３Ｄ培養については、Ｔ細胞はすぐに凝集し、直径１００〜８００ｐｍの球形の細胞凝集体として成長した（図８Ｂ及び８Ｅ、図９Ｂ及び９Ｅ、並びに図１０Ｂ及び１０Ｅ）。この凝集により細胞成長は遅くなった。従って、成長速度を高めるために、３日目、６日目、９日目及び１２日目に凝集体を小さいクラスターへと機械的に解離させ、複数の試料へと分割した（例えば、分割後に１．０×１０６細胞／ｍＬで播種した）。この手順により、Ｔ細胞は、６日目、９日目及び１４日目に、それぞれ約１０倍、３５倍、５５倍に累積的に増殖した（図８Ｈ）。成し遂げることができた最大の細胞密度は約３．５×１０６細胞／ｍＬであった（図８Ｇ）。３人の提供者の間でほとんど差はなかった（図８Ａ〜図８Ｈ、図９Ａ〜図９Ｆ、及び図１０Ａ〜図１０Ｆ）。
【００４７】
動的３Ｄ培養では、Ｔ細胞は、著しく凝集するか又は集塊物を形成した（図８Ｃ及び図８Ｆ、図９Ｃ及び図９Ｆ、並びに図１０Ｃ及び図１０Ｆ）。成長速度を高めるために、３日目、６日目、９日目及び１２日目に凝集体を小さいクラスターへと機械的に解離させ、複数の試料へと分割した（例えば分割後に１．０×１０６細胞／ｍＬで播種した）。この手順により、Ｔ細胞は、６日目、９日目及び１４日目に、それぞれ約７倍、１７倍、２８倍に累積的に増殖した（図８Ｈ）。成し遂げることができた最大の細胞密度は約２．５×１０６細胞／ｍＬであった（図８Ｇ）。３人の提供者の間でほとんど差はなかった（図８Ａ〜図８Ｈ、図９Ａ〜図９Ｆ、及び図１０Ａ〜図１０Ｆ）。これらの結果は、３つの培養方法はすべて、Ｔ細胞を増殖させるために使用することができるが、しかしながらＡｌｇＴｕｂｅが有意に高い増殖倍率及び体積収量をもたらすということを示す。
【００４８】
ＡｌｇＴｕｂｅにおける低細胞死及び高細胞増殖
ＡｌｇＴｕｂｅの中のＴ細胞がより効率的に増殖する（図８Ｇ及び８Ｈ）理由を検討するために、１４日間の培養にそった細胞死を評価した。３日目、６日目、９日目、１２日目及び１４日目に培地を集め、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）をその培地中で測定して、死細胞を定量した。細胞の中に存在する偏在性タンパク質であるＡＫは、細胞膜の損傷の際に直ちに培地に放出される。死細胞の百分率（初期細胞に対して規格化した）は、ＡｌｇＴｕｂｅにおいては、他の２つの方法よりも有意に低かった。動的３Ｄ培養は、最も多くのＴ細胞死を有していた（図１１Ａ）。細胞周期分析により細胞増殖をさらに分析した。１４日間の培養の３日目には、ＡｌｇＴｕｂｅでおよそ３９％細胞、静的３Ｄで約４９％細胞、動的３Ｄで約５３％細胞がＧ１期にあり、これは、細胞増殖がＡｌｇＴｕｂｅ＞静的３Ｄ＞動的３Ｄの順であったことを示す（図１１Ｂ）。要するに、より少ない細胞死及びより高い細胞増殖が、ＡｌｇＴｕｂｅにおけるより高い細胞増殖及び収率につながる。
【００４９】
ＡｌｇＴｕｂｅにおける低Ｔ細胞サブタイプ富化
上記培養が細胞表現型を変化させるか又は特定のＴ細胞サブタイプを富化するかを検討するために、１４日間の培養の後の典型的なＴ細胞サブタイプを、免疫染色及びフローサイトメトリを使用して分析した（図１１Ｃ及び図１２Ａ〜図１２Ｃ）。ＡｌｇＴｕｂｅ及び静的３Ｄ培養の中のＣＤ３＋  Ｔ細胞の百分率は、もとの未培養細胞と非常に類似していた（例えば、提供者番号１、番号２及び番号３について、それぞれ９８％、９９％及び９９％）。動的３Ｄ培養は、ＣＤ３＋  Ｔ細胞を、提供者番号１、番号２及び番号３について、それぞれ８３％、８５％及び６１％に低下させた。ＡｌｇＴｕｂｅの中のＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率は、もとの未培養細胞に近かった（例えば、提供者番号１、番号２及び番号３について、それぞれ７５％、６０％、７５％）。動的３Ｄ培養は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を提供者番号１、番号２及び番号３について、それぞれ５９％、６７％及び６８％に低下させ、静的３Ｄ培養は、この３人の提供者についてわずか３２％、２２％、及び１８％のＣＤ４＋  Ｔ細胞しかもたらさなかった。ＡｌｇＴｕｂｅの中のＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、もとの未培養細胞に近かった（例えば、提供者番号１、番号２及び番号３について、それぞれ１６％、２９％、２２％）。静的３Ｄ培養は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を提供者番号１、番号２及び番号３について、それぞれ２５％、３９％及び４２％に上昇させ、動的３Ｄ培養は、この３人の提供者についてわずか３８％、２９％、及び４１％のＣＤ４＋  Ｔ細胞しかもたらさなかった。これらの結果は、静的３Ｄ及び動的３Ｄ培養は、Ｔ細胞表現型を変えるか又は特定のサブタイプを増やすが、ＡｌｇＴｕｂｅはそうではないということを示す。培養の間に表現型又はサブタイプが変わることは、治療用の細胞生産にとっては非常に望ましくないことである。
【００５０】
培養されたＴ細胞の正常なサイトカイン放出
１４日目の培地を集め、上記３つの方法の中で培養したＴ細胞が典型的なＴ細胞サイトカインを放出するかを評価するためにＨｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｒｒａｙにおいて使用した（図１１Ｄ）。すべての培養方法から得たＴ細胞は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターフェロン−ｙ（ＩＦＮ−ｙ）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の高産生によって特徴づけられる典型的なＴ細胞サイトカインプロファイルを示した。これらの結果は、ＡｌｇＴｕｂｅの中で増殖したＴ細胞が、機能性Ｔ細胞の重要な特性であるサイトカイン放出の点で、静的３Ｄ培養及び動的３Ｄ培養におけるＴ細胞と類似していることを示す。
【００５１】
ＡｌｇＴｕｂｅの中のＴ細胞の低いＤＮＡ損傷
ＡｌｇＴｕｂｅが培養細胞の遺伝子安定性を向上させることができるかを評価するために、コメットアッセイを使用して、６日目のＴ細胞のＤＮＡの一本鎖切断及び二本鎖切断を評価した（図１１Ｅ及び図１３Ａ〜図１３Ｃ）。コメットアッセイ（単細胞ゲル電気泳動）は、真核細胞におけるＤＮＡ鎖切断を測定するための簡単な方法である。単一のＴ細胞を顕微鏡スライド上でアガロースヒドロゲルに包埋し、洗浄剤及び高塩濃度を用いて溶解し、ＤＮＡの高次コイルループを含む核様体を生成した。電気泳動によりコメット（彗星）に似た構造が生じ、このコメットを蛍光顕微鏡によって記録した。コメットの頭部に対する尾部の強度はＤＮＡ切断の数に比例する。結果は、ＡｌｇＴｕｂｅの中で培養したＴ細胞は動的３Ｄ培養由来の細胞よりも有意に少ないＤＮＡ切断を有することを示し（図１１Ｅ及び図１３Ａ〜図１３Ｃ）、これは、細胞に優しいＡｌｇＴｕｂｅが培養されたＴ細胞の遺伝子安定性を向上させることができるということを示す。
【００５２】
ＡｌｇＴｕｂｅの中でのＴ細胞の長期培養
Ｔ細胞をＡｌｇＴｕｂｅの中で長期間培養できるかも評価した。Ｔ細胞をＡｌｇＴｕｂｅの中で３代の継代にわたって、全部で４２日間培養した（図１４Ａ〜図１４Ｇ及び図１５Ａ〜図１５ＤＦ）。継代３代でのＴ細胞は、継代１代での形態、生存率、細胞成長速度、収率、サブタイプ分布及びサイトカイン放出と非常に類似した形態、生存率、細胞成長速度、収率、サブタイプ分布及びサイトカイン放出を有していた。この結果は、多数のＴ細胞が必要である場合には、ＡｌｇＴｕｂｅを用いて長期培養を実施することができるということを示す。
【００５３】
ＡｌｇＴｕｂｅベースのデバイスでのＴ細胞の自動化生産
自動化されたＴ細胞生産のためのプロトタイプデバイス（図１６Ａ）を構築した。１日目に、各提供者由来のＴ細胞を含む３ミリリットルのＡｌｇＴｕｂｅを加工し、１つの密閉した５０ｍＬ円錐形チューブの中に収納し（図１６Ｄ）、このチューブでＴ細胞を１４日間増殖させた（図１６Ｅ）。１４日目に、ＥＤＴＡ溶液をこの円錐形チューブに圧送して、ＡｌｇＴｕｂｅを溶解し、下流での応用のために穏やかな遠心分離（例えば１００ｇで２分間）によって細胞塊を集めた（図１６Ｆ）。１４日間の培養の間、細胞培地を蛇腹状のプラスチックボトルの中に蓄えた。この蛇腹状のプラスチックボトルは、それぞれ、培地を円錐形チューブへと流すために圧迫されることができ、又は培地を円錐形チューブから引き戻すために解放されることができた（図１６Ａ〜図１６Ｃ）。圧迫速度及び解放速度、並びに圧迫と解放との間の間隔の継続時間は、コントローラによってプログラムし制御した（図１６Ａ）。ＡｌｇＴｕｂｅは細胞培地と同等の密度を有するため、ＡｌｇＴｕｂｅは、培地をバイオリアクタへと圧送したときには、培地に均一に懸濁し分散した。培地をバイオリアクタから引き戻したときには、ＡｌｇＴｕｂｅは、集まり互いに接触した。ＡｌｇＴｕｂｅのこの周期的な分散及び集まりは、培地の混合を高めるために設計された。Ｔ細胞はよく成長し、１４日目までに約３．０×１０８細胞／ｍＬを与えた（図１６Ｅ及び図１６Ｆ）。３人の提供者由来のＴ細胞を増殖させるために、３つの５０ｍＬ円錐形チューブを使用した。多くの提供者由来のＴ細胞を生産するために、より多くのチューブを使用することができよう。
【００５４】
考察
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）及びヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）等のヒト由来の細胞を３Ｄ懸濁培養を用いて培養する場合、課題は、制御されない細胞凝集である。ヒト由来の細胞は、通常、それらを凝集させる強い細胞−細胞相互作用を有する。懸濁した細胞は、大きい細胞集塊物を形成する傾向がある（すなわち、アグロメレーション）。アグロメレーションは、細胞凝集体サイズの不均一性につながり、細胞培養にとっては有害である。例えば、大きい細胞集塊物（例えば、４００μｍ超の直径）の中心に位置する細胞への栄養素、酸素及び成長因子の輸送、並びにそのような細胞からの代謝廃棄物の輸送は不十分になり、細胞増殖の鈍化、アポトーシス、及び表現型変化につながる。結果は、Ｔ細胞も３Ｄ懸濁培養において集塊物を生成するということを示した（図８Ａ〜図８Ｈ、図９Ａ〜図９Ｆ、及び図１０Ａ〜図１０Ｆ）。静的３Ｄ懸濁培養及び動的３Ｄ懸濁培養における観察された高い細胞死、遅い細胞増殖及び細胞表現型変化（図１１Ａ〜図１１Ｅ）が細胞アグロメレーションに由来したか否かは、将来、明らかにされる必要がある。
【００５５】
３Ｄ懸濁培養において物質輸送を高めて細胞アグロメレーションを低減するために、通常は、撹拌（又は典型的には７５〜１２０ｒｐｍの範囲の振盪若しくは揺動）が使用される。
【００５６】
しかしながら、撹拌は、細胞アグロメレーションを解消することができない。加えて、撹拌は、培地の流れ方向、速度、せん断力及び化学環境を含めた複雑な流体力学的条件を生成する。これらの条件は空間的にも時間的にも変化し、細胞死及び表現型変化、低い細胞生存率、成長及び収率を誘導する臨界ストレスがある（例えば容器壁に近い）場所を生じる。さらに、バイオリアクタの中の流体力学的条件は、インペラの形状、サイズ及び位置、バイオリアクタの形状及びサイズ、ｐＨ、温度及び酸素についてのプローブの位置、培地粘度、並びに撹拌速度を含めた多くの要因に敏感である。それらは、現在、あまりよくわかっておらず、制御することが困難である。加えて、異なる種類の細胞が流体力学的条件にどう応答するかは周知ではなく、研究が困難である。これらの知識ギャップは、培養の一貫性のなさ及び細胞生産をスケールアップする上での困難さを生じる。この実施例では、穏和な撹拌（例えば、ＷＡＶＥバイオリアクタを模倣するための約１５ｒｐｍ）を使用した。この穏和な撹拌は、静的３Ｄ培養と比べてより深刻な細胞アグロメレーションにつながった（図８Ａ〜図８Ｈ、図９Ａ〜図９Ｆ及び図１０Ａ〜図１０Ｆ）。流体力学的ストレスが、動的３Ｄ懸濁培養における観察された高い細胞死、遅い細胞増殖及び細胞表現型変化にも寄与した可能性がある（図１１Ａ〜図１１Ｅ）。
【００５７】
ＡｌｇＴｕｂｅは、細胞アグロメレーション及び流体力学的ストレスを同時に解消するように設計されている。第１に、ＡｌｇＴｕｂｅは、（半径方向直径で）単分散性の細胞塊を生成する。この細胞塊は、１００μｍ〜４００μｍのいずれの範囲にも正確に制御することができる。これは、すべての細胞への効率的な物質輸送を確保することができる（図７Ａ〜図７Ｆ）。第２に、ＡｌｇＴｕｂｅの中の細胞は、ヒドロゲルのシェルによって流体力学的ストレスから保護されている。これは、流体力学的条件によって誘導される負の効果を低減する。このＡｌｇＴｕｂｅからの保護は、培養体積をスケールアップしても、細胞成長速度を変えず、生産を自動化することを容易に成し遂げることができた。最後に、チューブは、細胞が互いに相互作用して増殖するための自由空間を提供し、これは現在の最高水準の約３０倍である極度に高い体積収量につながる（図８Ｇ及び図８Ｈ）。
【００５８】
チューブを加工するためにアルギン酸を使用することは、この技術を、拡張可能であり、費用効率が高く、優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）適合性で、工業的に実行可能なものにしている。ＧＭＰ適合性は、規制当局（例えば、ＦＤＡ）によって、治療用の細胞を生産するために要求される。高品質及び大量のアルギン酸が入手可能であり、価格も手頃である。アルギン酸は細胞にとって無毒であり、診療所で使用されてきた。アルギン酸は、大スケールのＡｌｇＴｕｂｅを加工するために、即座に架橋することができる。得られたヒドロゲルチューブは、機械的にも化学的にも安定であり、大スケールで、長期間にわたって細胞を培養することに好適である。加えて、上記チューブは、細胞適合性ＥＤＴＡ溶液を用いて簡単に溶解して生成物を放出させることができ、顕微鏡法を用いて細胞増殖をモニタリングできるほどに透明である。
【００５９】
ＡｌｇＴｕｂｅの概念的及び技術的な革新は、その高い培養効率につながる。他の培養方法よりもはるかにより高い増殖及び収率でＴ細胞を培養することが可能であった（図８Ｇ及び図８Ｈ）。例えば、Ｔ細胞は、１４日間の培養でＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ及び動的３Ｄ培養において、それぞれ３２０倍、５５倍、２８倍累積的に増殖した（図８Ｈ）。最大体積収量は、ＡｌｇＴｕｂｅ、静的３Ｄ及び動的３Ｄ培養において、それぞれ３．２×１０８細胞／ｍＬ、３．５×１０６細胞／ｍＬ、２．５×１０６細胞／ｍＬであった（図８Ｇ）。この高い増殖速度及び収率は、Ｔ細胞生産に大きな影響を与える。例えば、１人の患者のために必要とされるＴ細胞（例えば約１０９〜１０１０細胞）は、単に３〜３０ｍＬアルギン酸ヒドロゲルチューブを用いて生産することができ、このアルギン酸ヒドロゲルチューブは、１つの密閉した５０ｍＬ円錐形チューブの中に収容することができる。多くの患者のためのＴ細胞が、対応する数の５０ｍＬチューブを並行して用いて自動的に生産できる。生産を自動化することは、製造費用及びばらつきを顕著に低下させることができ、同時に、Ｔ細胞についての生産能力を高めることができ、養子免疫治療を広く利用可能で手頃なものにする。加えて、結果は、ＡｌｇＴｕｂｅの中で培養したＴ細胞がはるかに少ない表現型変化又はサブタイプ富化しか有さないことを示した（図１１Ｃ）。表現型変化は、生成物の有効性及び効力の大きいばらつきにつながる可能性がある。ＡｌｇＴｕｂｅの中のＴ細胞はＤＮＡ損傷がほとんどなく（図１１Ｅ）、これは、より良好な生成物の安全性及び品質を示す。さらに、Ｔ細胞を長期間培養してより多くの細胞を生成することができた（図１４Ａ〜図１４Ｇ）。要約すれば、当該ＡｌｇＴｕｂｅは、養子免疫治療を著しく進歩させ、養子免疫治療に取り組んでいる個々の研究所、研究機関、及びバイオテクノロジー会社にとって幅広い関心事となるであろう。
【００６０】
実施例２
この実施例では、拡張可能な内皮細胞（ＥＣ）生産のために細胞増殖システムを設計した。
【００６１】
材料及び方法：
ＡｌｇＴｕｂｅの中に入った２ｍＬのｈＰＳＣ溶液を、セプタムキャップ付きの５０ｍＬの円錐形の培養チューブに懸濁させた。ｈＰＳＣを、５％ＣＯ２、２１％Ｏ２で、Ｅ８培地中、３７℃で５日間培養した。Ｅ８培地を取り除いて、３日間ＥＣ分化培地と交換し、その後、２日間ＥＣ誘導培地と交換した。当該細胞増殖システムについては、培地は蛇腹状ボトルの中に蓄え、この蛇腹状ボトルは、周期的に、培地を５０ｍＬ培養チューブへと流すために圧迫され、又は培地を５０ｍＬ培養チューブから引き戻すために解放された。１０日目に、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液を加えることにより、ヒドロゲルチューブを溶解した。細胞塊は遠心分離によりペレットにした。細胞塊を、Ａｃｃｕｔａｓｅ中、３７℃で１０分間インキュベーションすることにより単一の細胞へと解離した。抗ＳＳＥＡ４抗体でコーティングした磁気ビーズを加え、磁気細胞分離器を用いて未分化ＳＳＥＡ４＋  ｈＰＳＣを沈降させた。上清を新しいチューブへと移した。細胞を３００ｇで５分間回転させることによってペレットにし、注入のために外科手術室に運んだ。
【００６２】
結果：
上記アルギン酸ヒドロゲルを足場として使用して、拡張可能なＥＣ生産のための例示的な細胞増殖システムを設計した（図１７Ａ及び１７Ｂ）。０日目に、１．５％  ＨＡ溶液と混合した単一のｈＰＳＣ及び１．５％アルギン酸溶液を、それぞれ、手製のミクロ押出機の中央チャネル及び側方チャネルへと圧送し、ＣａＣｌ２緩衝液（１００ｍＭ）へと押し出した。細胞は、Ｅ８培地の中で５日間培養し、ＥＣ分化培地の中でさらに５日間培養した。１０日目に、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を５分間加えることにより、アルギン酸ヒドロゲルを溶解した。チューブを１００ｇで３分間回転することにより、細胞塊をペレットにした。細胞塊を、３７℃で１０分間Ａｃｃｕｔａｓｅで処理することにより、単一の細胞へと解離させた。次いで抗ＳＳＥＡ４抗体でコーティングした磁気ビーズをチューブに加え、磁気細胞分離器を用いて未分化ＳＳＥＡ４＋  ｈＰＳＣを沈降させた（図１７Ｃ〜図１７Ｇ）。位相画像及び生／死細胞染色は、死細胞がほとんどないことを示した（図１７Ｈ及び図１７Ｉ）。フローサイトメーター分析及び免疫染色は、１０日目の細胞の８２．６％がＥＣであることを示した（図１７Ｊ及び図１７Ｋ）。マトリゲルマトリクスと共に皮下に移植したとき、ＥＣは、良好な血管構造を生成した（図１７Ｌ）。
【００６３】
実施例３
この実施例では、拡張可能な神経幹細胞（ＮＳＣ）生産のための例示的な細胞増殖システムを設計した。
【００６４】
材料及び方法：
ＡｌｇＴｕｂｅの中に入った２ｍＬのｈＰＳＣ溶液を、セプタムキャップ付きの５０ｍＬの円錐形の培養チューブに懸濁させた。ｈＰＳＣを、５％ＣＯ２、２１％Ｏ２で、Ｅ８培地中、３７℃で５日間培養した。培地は蛇腹状ボトルの中に蓄え、この蛇腹状ボトルは、周期的に、培地を５０ｍＬ培養チューブへと流すために圧迫され、又は培地を５０ｍＬ培養チューブから引き戻すために解放された。Ｅ８培地を取り除いて、７日間神経誘導培地と交換した。１２日目に、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液を加えることにより、ヒドロゲルチューブを溶解した。細胞塊を、遠心分離によりペレットにした。細胞塊を、Ａｃｃｕｔａｓｅ中、３７℃で１０分間インキュベーションすることにより単一の細胞へと解離した。抗ＳＳＥＡ４抗体でコーティングした磁気ビーズを加え、磁気細胞分離器を用いて未分化ＳＳＥＡ４＋  ｈＰＳＣを沈降させた。上清を新しいチューブへと移した。細胞をペレットにした。
【００６５】
結果：
上記アルギン酸ヒドロゲルを足場として使用して、拡張可能なＮＳＣ生産のための例示的な細胞増殖システムを設計した（図１８Ａ及び図１８Ｂ）。０日目に、１．５％  ＨＡ溶液と混合した単一のｈＰＳＣ及び１．５％アルギン酸溶液を、それぞれ、手製のミクロ押出機の中央チャネル及び側方チャネルへと圧送し、ＣａＣｌ２緩衝液（１００ｍＭ）へと押し出した。細胞は、Ｅ８培地の中で５日間培養し、ＮＳＣ誘導培地の中でさらに７日間培養した。１２日目に、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を５分間加えることにより、アルギン酸ヒドロゲルを溶解した。チューブを１００ｇで３分間回転することにより、細胞塊をペレットにした。細胞塊を、３７℃で１０分間Ａｃｃｕｔａｓｅで処理することにより、単一の細胞へと解離させた。次いで抗ＳＳＥＡ４抗体でコーティングした磁気ビーズをチューブに加え、磁気細胞分離器を用いて未分化ＳＳＥＡ４＋  ｈＰＳＣを沈降させた（図１８Ｃ）。位相画像及び生／死細胞染色は、死細胞がないか又は検出不能であることを示した（図１８Ｄ及び図１８Ｅ）。免疫染色及びフローサイトメトリ分析は、１２日目の細胞の９３．３％がＮＳＣであることを示した（図１８Ｆ及び１８Ｇ）。上清中の精製された細胞を新しい、密閉されたチューブへと移し、手術室へと運んだ。精製したＮＳＣを、定位注入器を用いてスプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ  ｄａｗｌｅｙ）ラットの線状体へと注入した。移植から７日後に、ラットの脳においてかなりの数のヒトの不明瞭な抗原陽性細胞が見出され、移植から３０日後に、ラットの脳の中で多数のＨｕＮｕ＋及びＴＵＪ−１＋細胞を見出した（図１８Ｈ）。
【００６６】
実施例４
この実施例では、個別化細胞生産のために例示的な細胞増殖システムを設計した。
【００６７】
材料及び方法：
単一の円錐形チューブの中での生産
０日目に、初期化因子（ｈＯＳＫＵＬ＋ＥＧＦＰ）を電気穿孔によって線維芽細胞に送達し、約２×１０７細胞／ｍＬヒドロゲルをＡｌｇＴｕｂｅへと密閉した５０ｍＬ円錐形チューブへと加工した。細胞を２０日間初期化し、１０日間増殖させ、ＤＡ前駆体へと１１日間分化させた。４１日目に、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを注入してチューブを溶解させた。次いでＡｃｃｕｔａｓｅを注入して、ファイバー状の細胞塊を単一の細胞へと解離させた。次いで抗ＳＳＥＡ４抗体でコーティングした磁気ビーズをチューブに加え、磁気細胞分離器を用いて未分化ＳＳＥＡ４＋  ｉＰＳＣを沈降させた。
【００６８】
移植片ＤＡ前駆体
すべての動物プロトコルは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｂｒａｓｋａ，Ｌｉｎｃｏｌｎ（ネブラスカ大学リンカーン校）のＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（動物実験委員会）によって承認を受けた。動物が関与するすべての実験手順は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｂｒａｓｋａ，ＬｉｎｃｏｌｎのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインに従って実施した。スプラーグドーリーラット（６〜８週齢、雌）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（チャールス・リバー）から入手した。動物は、移植の１日前に始めて、腹腔内へのシクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（エルシー・ラボラトリーズ）、番号Ｃ−６０００）注射を受けた。移植のために、動物を２〜４％イソフルランで麻酔した。４μＬ  ＰＢＳに懸濁した３×１０５細胞を、定位フレーム（ＲＷＤ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．（アールダブリューディー・ライフサイエンス））を用い、１０μＬ  Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ハミルトン・カンパニー）、米国）を使用して０．５μＬ／分で線条体（ＡＰ＋０．５ｍｍ；ＭＬ±３．０ｍｍ；ＤＶ−６ｍｍ）に注入した。６週間後、ラットをケタミン／キシラジンで麻酔し、ＰＢＳを灌流し、その後４％パラホルムアルデヒドを灌流した。固定後、Ｌｅｉｃａ凍結切片作製機を用いて脳を連続的に切開し（厚さ４０μｍ）、浮遊性の切片を抗体で染色した。
【００６９】
結果
上記の成功裏の研究に基づいて、一体的なｉＰＳＣ生成、増殖及び分化のための細胞増殖システムを設計した。このシステムは、機械台、コントローラ、蛇腹状ボトル及び５０ｍＬ円錐形チューブからなる（図１９Ａ）。培地は蛇腹状のプラスチックボトルの中に蓄えられ、このプラスチックボトルは、培地を円錐形チューブへと流すために圧迫され、又は円錐形チューブから培地を引き戻すために解放されることができた。コントローラは、圧迫速度及び解放速度、並びに圧迫と解放との間の間隔の継続時間についてプログラムされることができた（図１９Ａ）。ＡｌｇＴｕｂｅは細胞培地と同等の密度を有するため、ＡｌｇＴｕｂｅは、培地を円錐形チューブへと圧送したときには、培地に均一に懸濁し分散した。培地を円錐形チューブから引き戻したときには、ＡｌｇＴｕｂｅは、集まり互いに接触した。ＡｌｇＴｕｂｅのこの周期的な分散及び集まりは、培地の混合を高めるために設計された。０日目に、初期化因子を電気穿孔によって線維芽細胞に送達し、細胞をＡｌｇＴｕｂｅへと密閉した５０ｍＬ円錐形チューブへと加工した。細胞を２０日間初期化し、１０日間増殖させ、ＤＡ前駆体へと１１日間分化させた。４１日目に、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを円錐形チューブへと注入してＡｌｇＴｕｂｅを溶解させた。次いでＡｃｃｕｔａｓｅを注入して、細胞塊を単一の細胞へと消化した。次いで抗ＳＳＥＡ４抗体でコーティングした磁気ビーズを円錐形チューブに加え、磁気細胞分離器を用いて未分化ＳＳＥＡ４＋  ｉＰＳＣを沈降させた。精製した細胞を、定位注入器を用いてスプラーグドーリーラットの脳に移植した（図１９Ｂ）。生産の間に細胞死はほとんど起こらなかった（図１９Ｃ及び図１９Ｄ）。生産した細胞の約９０％がＬＭＸ１Ａ＋／ＦＯＸＡ２＋であった（図１９Ｅ及び図１９Ｆ）。移植から６週間後、これらの細胞はＨｕＮｕ染色によるとよく生存していた（図１９Ｇ）。この細胞は、高い百分率でＴＨ＋  ＤＡ神経細胞へと成熟した（図１９Ｈ）。
【図１（１）】
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【図１（２）】
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【図１（３）】
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【図１（４）】
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【図１（５）】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６（１）】
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【図１６（２）】
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【図１７（１）】
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【図１７（２）】
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【図１７（３）】
2021515581.tif 000070
【図１７（４）】
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【図１７（５）】
2021515581.tif 000072
【図１８（１）】
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【図１８（２）】
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【図１８（３）】
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【図１８（４）】
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【図１９（１）】
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【図１９（２）】
2021515581.tif 000078
【図１９（３）】
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【図１９（４）】
2021515581.tif 000080
【国際調査報告】
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