(57)【要約】  本発明は、タンパク質抗原および莢膜多糖のコンジュゲート、より詳細には、Hla、ClfA、SpA、および莢膜多糖のコンジュゲートを含む、ブドウ球菌抗原を含む免疫原性組成物を提供する。アジュバントを添加した製剤も提供される。本発明は、ブドウ球菌感染、特に黄色ブドウ球菌感染症の予防および治療に使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
a. ClfA抗原；
b. Hla抗原；
c. SpA抗原；および
d. ブドウ球菌莢膜多糖
を含む、免疫原性組成物。
【請求項２】
莢膜多糖がキャリアタンパク質にコンジュゲート（conjugate）している、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
莢膜多糖類が黄色ブドウ球菌血清型5型および／または8型莢膜多糖である、請求項1または2に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
莢膜多糖が請求項1に記載の抗原(a)〜(c)のうち1つとコンジュゲートしている、請求項1〜3のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
組成物が黄色ブドウ球菌血清型5型莢膜多糖および8型莢膜多糖を含む、請求項1〜4のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
組成物が、Hla抗原にコンジュゲートした黄色ブドウ球菌血清型5型莢膜多糖、および／またはClfA抗原にコンジュゲートした8型莢膜多糖を含む、請求項1〜5のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれか１項に記載の免疫原性組成物であって、
a. ClfA抗原が、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号2と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％同一なアミノ酸配列を含むClfAタンパク質、またはその免疫原性断片である；
b. Hla抗原が、配列番号3のアミノ酸配列、または配列番号3と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列を含むHlaタンパク質、またはその免疫原性断片である；および／または
c. SpA抗原が、配列番号13もしくは配列番号26のアミノ酸配列、または配列番号13もしくは配列番号26と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％同一なアミノ酸配列を含むSpAタンパク質、またはその免疫原性断片である、
前記免疫原性組成物。
【請求項８】
ClfA抗原が配列番号2のアミノ酸配列のP116S及びY118A（または、配列番号2と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％同一なアミノ酸配列中の同等な位置の置換）から選択される、少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、必要に応じて配列番号5〜7もしくは32のいずれか1つの配列を含む、請求項1〜7のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
ClfA抗原が、D/E-X-N-Z-S/T（配列番号28）およびK-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号29）から選択される１以上のPglBコンセンサス配列を含み、このXおよびZは個別に、プロリン以外の任意のアミノ酸である、請求項7または8に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記コンセンサス配列が、配列番号2のアミノ酸残基313-342の間の１以上のアミノ酸の位置に付加されているか、もしくはそのアミノ酸に代えて置換されており、必要に応じて、I337の位置のアミノ酸に代えて置換されている、または、配列番号2と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％同一なアミノ酸配列中の同等な位置に、付加されているか、もしくはそのアミノ酸に代えて置換されており、必要に応じて、I337と同等の位置のアミノ酸に代えて置換されている、請求項9に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
XがQ（グルタミン）であり、ZがA（アラニン）である（たとえば、K-D-Q-N-A-T-K、（配列番号31）である）、請求項9または10に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
ClfA抗原が配列番号7または配列番号32の配列を含むか、またはその配列からなる、請求項11に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
Hla抗原が、配列番号3のH35の位置、または配列番号3と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置に、アミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が必要に応じてHからLへの置換である、請求項1〜12のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
Hla抗原が、D/E-X-N-Z-S/T（配列番号28）およびK-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号29）から選択される１以上のPglBコンセンサス配列を含み、このXおよびZが個別に、プロリン以外の任意のアミノ酸である、請求項1〜13のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記コンセンサス配列が、配列番号3のアミノ酸配列、または配列番号3と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列の、１以上のアミノ酸に付加されているか、またはそのアミノ酸に代えて置換されている、請求項14に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記コンセンサス配列が、配列番号3のK131の位置、または配列番号3と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置のアミノ酸に代えて置換されている、請求項14に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
XがQ（グルタミン）であり、ZがR（アルギニン）である（たとえば、K-D-Q-N-R-T-K（配列番号30））、請求項14〜16のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
Hla抗原が、配列番号11または配列番号12の配列を含むか、またはその配列からなる、請求項17に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
SpA抗原が、(a) VH3への結合を阻害または減少させる、ドメインE、D、A、BもしくはCのVH3結合サブドメインにおける１以上のアミノ酸置換、および(b) IgG Fcへの結合を阻害または減少させる、ドメインE、D、A、BもしくはCのIgG Fc結合サブドメインにおける１以上のアミノ酸置換を含む、請求項1〜18のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
請求項1〜19のいずれか１項に記載の免疫原性組成物であって、SpA抗原が、(i) 配列番号14のアミノ酸位置34および35、または配列番号14と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインE；配列番号15のアミノ酸位置39および40、または配列番号15と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインD；配列番号16のアミノ酸位置36および37、または配列番号16と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインA；配列番号17のアミノ酸位置36および37、または配列番号17と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインB；および／もしくは、配列番号18のアミノ酸位置36および37、または配列番号18と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインCを含む、ならびに／または、(ii) 配列番号14のアミノ酸位置7および8、または配列番号14と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインE；配列番号15のアミノ酸位置12および13、または配列番号15と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインD；配列番号16のアミノ酸位置9および10、または配列番号16と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインA；配列番号17のアミノ酸位置9および10、または配列番号17と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインB；および／もしくは、配列番号18のアミノ酸位置9および10、または配列番号18と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインCを含む、免疫原性組成物。
【請求項２１】
前記アミノ酸置換が、グルタミンに対するリジン置換、および／またはアスパラギン酸に対するアラニン置換である、請求項20に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
SpA抗原が、配列番号15のアミノ酸位置4および5、または配列番号15と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置に、アミノ酸置換を有するドメインDを含む、請求項1〜21のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
前記アミノ酸置換が、グルタミンからリジン、および／またはグルタミンからアルギニン、たとえばQQからKRへの置換である、請求項22に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
前記SpA抗原が、配列番号19〜23、26もしくは27のアミノ酸配列、または配列番号19〜23、26もしくは27と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列を含む、請求項1〜23のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
前記免疫原性組成物が、(i) 配列番号7または配列番号32のアミノ酸配列を含むClfA抗原；(ii) 配列番号11または配列番号12のアミノ酸配列を含むHla抗原；(iii) 配列番号27のアミノ酸配列を含むSpA抗原；(iv) 黄色ブドウ球菌血清型5型莢膜多糖、および(v)黄色ブドウ球菌血清型8型莢膜多糖、を含む、請求項1〜24のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】
ClfA抗原が黄色ブドウ球菌血清型8型莢膜多糖とコンジュゲートし、Hla抗原が黄色ブドウ球菌血清型5型莢膜多糖とコンジュゲートしている、請求項25に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７】
前記ClinfA-CP8およびHla-CP5コンジュゲートがバイオコンジュゲートである、請求項26に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８】
組成物がアジュバントを含む、請求項1〜27のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９】
アジュバントがサポニンおよびリポ多糖を含む、請求項28に記載の免疫原性組成物。
【請求項３０】
アジュバントが、リポソームの形態で、サポニン、リポ多糖を含む、請求項29に記載の免疫原性組成物。
【請求項３１】
ステロールをさらに含む、請求項29または30に記載の免疫原性組成物。
【請求項３２】
サポニンが、キラヤ（Quillaja Saponaria Molina）の樹皮に由来する、免疫学的に活性なサポニン画分である、請求項29〜31のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３３】
サポニンがQS21である、請求項32に記載の免疫原性組成物。
【請求項３４】
リポ多糖がリピドA誘導体である、請求項29〜33のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３５】
リポ多糖が3D-MPLである、請求項34に記載の免疫原性組成物。
【請求項３６】
ステロールがコレステロールである、請求項31〜35のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３７】
免疫原性組成物が、ヒト用量あたり25μgのレベルのQS21を含む、請求項29〜36のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３８】
免疫原性組成物が、ヒト用量あたり25μgのレベルの3D-MPLを含む、請求項29〜37のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３９】
請求項1〜27のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、および製薬上許容される賦形剤または担体を含む、ワクチン。
【請求項４０】
請求項28〜38のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、および製薬上許容される賦形剤または担体を含む、ワクチン。
【請求項４１】
ブドウ球菌感染を予防または治療する方法に使用するための、請求項1〜27のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、または請求項39に記載のワクチンであって、前記組成物がアジュバントと組み合わせて投与される、免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項４２】
免疫原性組成物が、対象への投与前にアジュバントと混合される、請求項41に記載の使用のための免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項４３】
アジュバントが、請求項29〜36のいずれか1つにおいて定義されるものである、請求項41または42に記載の使用のための免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項４４】
アジュバントが、ヒト用量あたり25μgのレベルの3D-MPL、およびヒト用量あたり25μgのレベルのQS21を含む、請求項43に記載の使用のための免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項４５】
(i) 請求項1〜27のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、または請求項39に記載のワクチンを含む第1の容器；および(ii) アジュバントを含む第2の容器、を含むキット。
【請求項４６】
アジュバントが、請求項29〜36のいずれか1つにおいて定義されるものである、請求項45に記載のキット。
【請求項４７】
アジュバントが、ヒト用量あたり25μgのレベルの3D-MPL、およびヒト用量あたり25μgのレベルのQS21を含む、請求項46に記載のキット。
【請求項４８】
ブドウ球菌感染を予防または治療する方法であって、請求項1〜27のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、または請求項39に記載のワクチンを、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項４９】
前記対象にアジュバントを投与することをさらに含む、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
前記アジュバントが免疫原性組成物と同時に投与される、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
アジュバントが、請求項29〜36のいずれか1つにおいて定義されるものである、請求項49または50に記載の方法。
【請求項５２】
ブドウ球菌感染を予防または治療する方法であって、請求項28〜38のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、または請求項40に記載のワクチンを、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項５３】
請求項1〜40のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチンを製造する方法であって、抗原および、必要に応じてアジュバントを、製薬上許容される賦形剤と混合するステップを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ブドウ球菌感染症、特に黄色ブドウ球菌（S. aureus）感染症の予防および治療のための免疫原性組成物に関する。本発明は、ブドウ球菌抗原、より詳細にはHla、ClfA、SpA、および莢膜多糖コンジュゲート（conjugate、複合体）を含む免疫原性組成物を提供する。アジュバントを添加した製剤も与えられ、ブドウ球菌感染の予防および治療におけるそのような製剤の使用も同様に提供される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
黄色ブドウ球菌（S. aureus）は、米国および欧州において、血流、下気道、皮膚および軟部組織の感染症の主因となるグラム陽性球菌である。また、世界的に骨感染症の主要な原因であり、これらの感染症は有痛性、衰弱性であって、治療が困難である。
【０００３】
黄色ブドウ球菌の治療は、黄色ブドウ球菌の多数の菌株による抗生物質耐性の発現に起因して、厳しさを増しつつある。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）は、病院内で蔓延しているが、市中感染型MRSA株は世界中に広がり、大きな世界的課題となっている。MRSAは、すべての市中感染および院内感染の過半で見いだされる。近年、最後の頼りの抗生物質であるバンコマイシンにも耐性を有し、実質的に治療不可能なMRSA株が出現している。
【０００４】
現在認可されたワクチンは存在しない。抗生物質耐性の問題、ならびに黄色ブドウ球菌感染は免疫回避能力がよく発達しているため、将来の感染に対する免疫が与えられないことから、ワクチンの必要性が特に切実となっている。黄色ブドウ球菌の免疫回避特性は、効果的なワクチンの開発をいっそう困難にしている。免疫回避のメカニズムは完全には解明されていないが、少なくとも一部は、免疫グロブリン（Ig）のFcγおよびVH3型B細胞受容体のFab部分に結合する黄色ブドウ球菌表面分子である、ブドウ球菌プロテインA（SpA）に起因する。SpAとB細胞受容体との相互作用は、感染時のB細胞の発生に影響を与え、適応免疫応答の発現を妨げる。SpAのIg Fcへの結合は、多形核白血球によるブドウ球菌のオプソニン化貪食クリアランスを妨げる。
【０００５】
したがって、ブドウ球菌の疾患を予防するためのワクチンの必要性が急務となっている。莢膜多糖（CPS）コンジュゲート（conjugate、コンジュゲート）、個別のタンパク質抗原、およびリポタイコ酸に対するモノクローナル抗体（mAb）を含めて、いくつかのワクチンが臨床試験で検討されている。しかしながら、いずれもさまざまな開発段階で失敗しており、これまでに市場に出た黄色ブドウ球菌に対するワクチンはない。
【０００６】
黄色ブドウ球菌のCPS、ClfAおよびMntCを含む多成分ワクチン（Anderson et al 2012, Hum Vaccine Immunother 8: 1585-1594）は、PhIヒト治験で検討されてきた。PhIにおいて、ワクチンはオプソニン抗CP抗体および抑制性抗ClfA抗体を誘導したので、続いて待機的脊椎固定手術患者における予防的使用を目的としたPhIIbの有効性試験で検討されたが、PhIIb治験は有用性なしとして中止された。
【０００７】
しかしながら、黄色ブドウ球菌に対するワクチンは、PhIII治験において、防御効果を有すると認められるものはいまだに存在しない。シュードモナス（Pseudomonas）細胞外タンパク質Aと結合した黄色ブドウ球菌5型および8型莢膜多糖のコンジュゲートを含むワクチン（StaphVAX-Nabi Biopharmaceuticals）は臨床試験で検討され、WO 03/61558に記載のように、PhIおよびPhIIでは安全性が実証されたが、PhIIIでは必要なエンドポイントを達成することができなかった。
【０００８】
同様に、IsdBタンパク質抗原に基づくワクチン（V710ワクチン；Kuklin et al, Infect Immun, 2006, 74: 2215-23）も、心臓胸部の黄色ブドウ球菌感染症で実施されたPhIII治験において、有効性のエンドポイントを達成することができなかった。
【０００９】
したがって、ブドウ球菌感染症、より詳細には黄色ブドウ球菌感染症に対する有効なワクチンが引き続き必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
発明の概要
本発明は、ブドウ球菌抗原を含む免疫原性組成物を提供する。ある態様において、免疫原性組成物は、(a) ClfA抗原；(b) Hla抗原；(c) SpA抗原；および／または(d) ブドウ球菌莢膜多糖のうち2つ以上を含む。ClfA抗原、Hla抗原およびSpA抗原は、好ましくはブドウ球菌抗原であり、黄色ブドウ球菌抗原が適切である。
【００１１】
ある実施形態において、免疫原性組成物は、ClfA抗原；Hla抗原；SpA抗原；およびブドウ球菌莢膜多糖を含む。莢膜多糖は、黄色ブドウ球菌血清型5型および／または8型の莢膜多糖であることが適切であるといえる。好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、ClfA抗原；Hla抗原；SpA抗原；黄色ブドウ球菌血清型5型からの莢膜多糖、および黄色ブドウ球菌血清型8型からの莢膜多糖を含む。
【００１２】
ある実施形態において、莢膜多糖はキャリアタンパク質にコンジュゲート（conjugate、複合）している。莢膜多糖タンパク質は、上記の抗原(a) - (c)のうちの1つとコンジュゲートしていてもよい。好ましい実施形態において、組成物は、Hla抗原とコンジュゲートした黄色ブドウ球菌血清型5型莢膜多糖、および／またはClfA抗原とコンジュゲートした8型莢膜多糖を含む。
【００１３】
ある実施形態において、ClfA抗原は、配列番号2に記載のアミノ酸配列、または配列番号2と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列、またはそれらの免疫原性断片を含むClfAタンパク質である。
【００１４】
ClfA抗原は、配列番号2のアミノ酸配列を基準として（または、配列番号2と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列において同等の位置に）、P116SおよびY118Aから選択される、少なくとも1つのアミノ酸置換を含んでいてもよく、必要に応じて、配列番号5〜7または32のいずれか1つの配列を含んでいてもよい。
【００１５】
ClfA抗原は、D/E-X-N-Z-S/T（配列番号28）およびK-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号29）から選択される、１以上のコンセンサス配列を含んでいてもよい。XおよびZは個別に、プロリン以外の任意のアミノ酸である。前記のコンセンサス配列は、配列番号2のアミノ酸残基313-342の間の１以上のアミノ酸の位置に付加されるか、もしくはその１以上のアミノ酸と置換されうる。必要に応じてアミノ酸位置I337と置換されていてもよく、あるいは、配列番号2と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置に付加もしくは置換してもよい。ある実施形態において、XはQ（グルタミン酸）であり、ZはA（アラニン）である（たとえばK-D-Q-N-A-T-K、配列番号31）。
【００１６】
好ましい実施形態において、ClfA抗原は、配列番号7または配列番号32の配列を含むか、またはその配列からなる。
【００１７】
ある実施形態において、Hla抗原は、配列番号3に記載のアミノ酸配列、または配列番号3と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列、またはそれらの免疫原性断片を有するHlaタンパク質である。
【００１８】
Hla抗原は、配列番号3のH35の位置に、または配列番号3と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置に、アミノ酸置換を含んでいてもよい。ある実施形態において、前記アミノ酸置換は、必要に応じてH→Lである。
【００１９】
Hla抗原は、D/E-X-N-Z-S/T（配列番号28）およびK-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号29）から選択される、１以上のコンセンサス配列を含むことができるが、このXおよびZは個別に、プロリン以外の任意のアミノ酸である。前記のコンセンサス配列は、配列番号3に記載のアミノ酸配列、または配列番号3と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列の、１以上のアミノ酸の位置に付加されるか、またはそのアミノ酸と置換されうる。ある実施形態において、前記コンセンサス配列は、配列番号3のK131の位置で、または配列番号3と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置で、そのアミノ酸と置換されている。ある実施形態において、XはQ（グルタミン酸）であり、ZはR（アルギニン）である（たとえばK-D-Q-N-R-T-K、配列番号30）。
【００２０】
好ましい実施形態において、Hla抗原は、配列番号11または配列番号12の配列を含むか、またはその配列からなる。
【００２１】
ある実施形態において、SpA抗原は、配列番号13、配列番号26もしくは配列番号27と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列、またはそれらの免疫原性断片を含むSpAタンパク質である。
【００２２】
SpA抗原は、(a)ドメインE、D、A、BもしくはCのVH3結合サブドメインの中に、VH3との結合を阻害または減少させる、１以上のアミノ酸置換を、ならびに(b) ドメインE、D、A、BもしくはCのIgG Fc結合サブドメインの中に、IgG Fcとの結合を阻害または減少させる、１以上のアミノ酸置換を含むことができる。
【００２３】
ある実施形態において、SpA抗原は、(i)配列番号14のアミノ酸34位および35位の位置、または配列番号14と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置に、アミノ酸置換を有するドメインE；配列番号15のアミノ酸39位および40位の位置、または配列番号15と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置に、アミノ酸置換を有するドメインD；配列番号16の36位および37位の位置、または配列番号16と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置に、アミノ酸置換を有するドメインA；配列番号17のアミノ酸36位および37位の位置、または配列番号17と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置に、アミノ酸置換を有するドメインB；および/もしくは配列番号18のアミノ酸36位および37位の位置、または配列番号18と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置に、アミノ酸置換を有するドメインCを含み；ならびに/または(ii) 配列番号14のアミノ酸7位および8位の位置、または配列番号14と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置に、アミノ酸置換を有するドメインE；配列番号15のアミノ酸12位および13位の位置、または配列番号15と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置に、アミノ酸置換を有するドメインD；配列番号16の9位および10位の位置、または配列番号16と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置に、アミノ酸置換を有するドメインA；配列番号17のアミノ酸9位および10位の位置、または配列番号17と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同
一なアミノ酸配列内の同等の位置に、アミノ酸置換を有するドメインB；および/もしくは配列番号18のアミノ酸9位および10位の位置、または配列番号18と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置に、アミノ酸置換を有するドメインCを含む。ある実施形態において、前記アミノ酸置換は、グルタミンからリジンへの置換、および／またはアスパラギン酸からアラニンへの置換である。代表的な配列は配列番号19〜23、24および25である。
【００２４】
ある実施形態において、SpA抗原は、配列番号15のアミノ酸4位および5位の位置、または配列番号15と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置に、アミノ酸置換を有するドメインDを含む。前記アミノ酸置換は、グルタミンからリジン、および／またはグルタミンからアルギニン、たとえばQQからKRへの置換であることが適当であるといえる（たとえば、配列番号24および配列番号25）。
【００２５】
ある実施形態において、SpA抗原は、配列番号19〜23、26もしくは27のアミノ酸配列、または配列番号19〜23、26もしくは27と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態において、SpA抗原は、配列番号27のアミノ酸配列を含む。
【００２６】
ある実施形態において、免疫原性組成物は、(i) 配列番号7もしくは配列番号32のアミノ酸配列を含むClfA抗原；(ii) 配列番号11もしくは配列番号12のアミノ酸配列を含むHla抗原；(iii) 配列番号27のアミノ酸配列を含むSpA抗原；(iv) 黄色ブドウ球菌血清型5型莢膜多糖、および(v) 黄色ブドウ球菌血清型8型莢膜多糖を含む。ClfA抗原は、黄色ブドウ球菌血清型8型莢膜多糖と結合していてもよく、Hla抗原は、黄色ブドウ球菌血清型5型莢膜多糖と結合していてもよい。前記のClfA-CP8およびHla-CP5コンジュゲートは、バイオコンジュゲート（bioconjugate、生物学的複合体）であることが適切であるといえる。
【００２７】
ある実施形態において、免疫原性組成物は、(i) 配列番号7もしくは配列番号32のアミノ酸配列を含むClfA抗原；(ii) 配列番号11もしくは配列番号12のアミノ酸配列を含むHla抗原；(iii) 配列番号27のアミノ酸配列を含むSpA抗原；(iv) Hla抗原に結合した黄色ブドウ球菌血清型5型莢膜多糖、および(v) ClfA抗原に結合した黄色ブドウ球菌血清型8型莢膜多糖を含む。好ましくは、前記ClfA-CP8およびHla-CP5コンジュゲートは、バイオコンジュゲートである。免疫原性組成物はさらに追加して、本明細書に記載のアジュバントを含むことができる。
【００２８】
本発明のある態様は、本発明の免疫原性組成物および製薬上許容される賦形剤もしくは担体を含む、ワクチンを提供する。
【００２９】
本発明のある態様は、(i) 本発明の免疫原性組成物もしくはワクチンを含む第1の容器；および(ii) アジュバントを含む第2の容器、を含むキットを提供する。
【００３０】
本発明のある態様は、ブドウ球菌感染、たとえば黄色ブドウ球菌感染を予防または治療する方法に使用するための、本発明の免疫原性組成物またはワクチンを提供する。ある実施形態において、前記免疫原性組成物またはワクチンは、アジュバントと組み合わせて投与される。
【００３１】
本発明のある態様において、本発明の免疫原性組成物はアジュバントを含む。別の態様において、免疫原性組成物は、アジュバントと組み合わせて投与するためのものである。アジュバントは、免疫原性組成物と同時に投与してもよく、たとえば、アジュバントは投与前に免疫原性組成物と混合してもよい。
【００３２】
ある実施形態において、アジュバントはサポニンおよびTLR4アゴニストを、適切には、リポソームの形で含む。ある実施形態において、アジュバントはさらにステロールを含む。サポニンは、キラヤ（Quillaja Saponaria Molina）の樹皮から得られる免疫学的に活性のあるサポニン画分、好ましくはQS21、とすることができる。ある実施形態において、TLR4アゴニストはリポ多糖である。リポ多糖は、リピドA誘導体、好ましくは3D-MPLとすることができる。ステロールはコレステロールとすることができる。ある実施形態において、アジュバントは、ヒト用量当り25μgのレベルのQS21、および／またはヒト用量当り25μgのレベルの3D-MPLを含む（たとえば、AS01E）。
【００３３】
ある態様において、本発明は、ブドウ球菌感染、たとえば黄色ブドウ球菌感染、を予防または治療する方法を提供し、その方法は、本発明の免疫原性組成物またはワクチンを、それを必要とする対象に投与することを含む。方法はさらに、前記対象にアジュバントを投与することを含んでいてもよい。アジュバントは、免疫原性組成物と同時に投与してもよく、たとえば、アジュバントを、投与前に免疫原性組成物と混合してもよい。
【００３４】
さらに他の態様において、本発明は、特許請求の範囲のいずれか１項に記載の免疫原性組成物もしくはワクチンを作製する方法を提供するが、その方法は、抗原、および、必要に応じてアジュバントを、製薬上許容される賦形剤と混合するステップを含む。
【００３５】
本発明のさらに他の態様は、本発明の免疫原性組成物の抗原をコードするポリヌクレオチドを提供する。このようなポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。本発明のベクターまたはポリヌクレオチドを含む宿主細胞も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】マウスにおけるワクチン特異的IgG。アジュバント無添加ワクチン、およびAlum/TLR7もしくはAS01Eを用いたアジュバント添加ワクチンで免疫化したナイーブマウスにおける抗原特異的IgG抗体価（抗CP5 (1A)、抗CP8 (1B)、抗Hla (1C)、抗ClfA (1D)、および抗SpA (1E)）。それぞれの符号は、30匹のマウス群を識別するが、これらのマウスは1日目および29日目に、AS01 （三角）、Alum/TLR7（丸）またはアジュバントなし（四角）で、10μg（白抜き符号）または1μg（黒塗り符号）により免疫化された。Y軸：GMT（95％信頼区間（CI））。1回目および2回目の免疫化後のさまざまな時点で、採血を行った。IgG抗体価のGMT、および分析された採血時点がそれぞれYおよびX軸上に記録されている。点線 = LLOQ/2：定量下限半値。それぞれの時点について30個体のBALB/c血清をLuminexにより分析した。
【図１Ｂ】マウスにおけるワクチン特異的IgG。アジュバント無添加ワクチン、およびAlum/TLR7もしくはAS01Eを用いたアジュバント添加ワクチンで免疫化したナイーブマウスにおける抗原特異的IgG抗体価（抗CP5 (1A)、抗CP8 (1B)、抗Hla (1C)、抗ClfA (1D)、および抗SpA (1E)）。それぞれの符号は、30匹のマウス群を識別するが、これらのマウスは1日目および29日目に、AS01 （三角）、Alum/TLR7（丸）またはアジュバントなし（四角）で、10μg（白抜き符号）または1μg（黒塗り符号）により免疫化された。Y軸：GMT（95％信頼区間（CI））。1回目および2回目の免疫化後のさまざまな時点で、採血を行った。IgG抗体価のGMT、および分析された採血時点がそれぞれYおよびX軸上に記録されている。点線 = LLOQ/2：定量下限半値。それぞれの時点について30個体のBALB/c血清をLuminexにより分析した。
【図１Ｃ】マウスにおけるワクチン特異的IgG。アジュバント無添加ワクチン、およびAlum/TLR7もしくはAS01Eを用いたアジュバント添加ワクチンで免疫化したナイーブマウスにおける抗原特異的IgG抗体価（抗CP5 (1A)、抗CP8 (1B)、抗Hla (1C)、抗ClfA (1D)、および抗SpA (1E)）。それぞれの符号は、30匹のマウス群を識別するが、これらのマウスは1日目および29日目に、AS01 （三角）、Alum/TLR7（丸）またはアジュバントなし（四角）で、10μg（白抜き符号）または1μg（黒塗り符号）により免疫化された。Y軸：GMT（95％信頼区間（CI））。1回目および2回目の免疫化後のさまざまな時点で、採血を行った。IgG抗体価のGMT、および分析された採血時点がそれぞれYおよびX軸上に記録されている。点線 = LLOQ/2：定量下限半値。それぞれの時点について30個体のBALB/c血清をLuminexにより分析した。
【図１Ｄ】マウスにおけるワクチン特異的IgG。アジュバント無添加ワクチン、およびAlum/TLR7もしくはAS01Eを用いたアジュバント添加ワクチンで免疫化したナイーブマウスにおける抗原特異的IgG抗体価（抗CP5 (1A)、抗CP8 (1B)、抗Hla (1C)、抗ClfA (1D)、および抗SpA (1E)）。それぞれの符号は、30匹のマウス群を識別するが、これらのマウスは1日目および29日目に、AS01 （三角）、Alum/TLR7（丸）またはアジュバントなし（四角）で、10μg（白抜き符号）または1μg（黒塗り符号）により免疫化された。Y軸：GMT（95％信頼区間（CI））。1回目および2回目の免疫化後のさまざまな時点で、採血を行った。IgG抗体価のGMT、および分析された採血時点がそれぞれYおよびX軸上に記録されている。点線 = LLOQ/2：定量下限半値。それぞれの時点について30個体のBALB/c血清をLuminexにより分析した。
【図１Ｅ】マウスにおけるワクチン特異的IgG。アジュバント無添加ワクチン、およびAlum/TLR7もしくはAS01Eを用いたアジュバント添加ワクチンで免疫化したナイーブマウスにおける抗原特異的IgG抗体価（抗CP5 (1A)、抗CP8 (1B)、抗Hla (1C)、抗ClfA (1D)、および抗SpA (1E)）。それぞれの符号は、30匹のマウス群を識別するが、これらのマウスは1日目および29日目に、AS01 （三角）、Alum/TLR7（丸）またはアジュバントなし（四角）で、10μg（白抜き符号）または1μg（黒塗り符号）により免疫化された。Y軸：GMT（95％信頼区間（CI））。1回目および2回目の免疫化後のさまざまな時点で、採血を行った。IgG抗体価のGMT、および分析された採血時点がそれぞれYおよびX軸上に記録されている。点線 = LLOQ/2：定量下限半値。それぞれの時点について30個体のBALB/c血清をLuminexにより分析した。
【図２Ａ】アジュバント無添加ワクチン、およびAlum/TLR7もしくはAS01Eを用いたアジュバント添加ワクチンにより誘導された、マウスにおけるワクチン特異的CD4 T細胞応答の程度および性質。2回目の免疫化の12日後に屠殺した1匹のマウスの脾細胞を、in vitroでワクチンタンパク質（2A：SpAmut、1μg/ml；2B：Hlamut、10μg/ml；2C：ClfAmut、10μg/ml）により刺激するか、または刺激せずに、染色してICSにより分析した。IL-2、TNF、IL-4/IL-13、IFN-γまたはIL-17Aを産生するCD4+CD44high T細胞が確認された。上のグラフ：CD4+CD44high≧CYT+。下のグラフ：CD4+CD44high≧IFN-γ。未刺激細胞の応答を刺激細胞の応答から差し引いた。程度：ワクチンタンパク質の刺激に反応して、分析したサイトカインのうち少なくとも1つを産生するCD4+CD44high T細胞の割合。性質：少なくともIFN-γを産生するがIL-4/IL-13を産生しないCD4+CD44high T細胞の割合。％幾何平均割合の二元配置分散分析、p<0.05を示す：＊ワクチン（アジュバントあり、またはなし）と対照群：＊アジュバント添加ワクチンとアジュバント無添加ワクチン；＊AS01E添加ワクチンとAlum/TLR7添加ワクチン;＊ワクチン10μgとワクチン1μg。
【図２Ｂ】アジュバント無添加ワクチン、およびAlum/TLR7もしくはAS01Eを用いたアジュバント添加ワクチンにより誘導された、マウスにおけるワクチン特異的CD4 T細胞応答の程度および性質。2回目の免疫化の12日後に屠殺した1匹のマウスの脾細胞を、in vitroでワクチンタンパク質（2A：SpAmut、1μg/ml；2B：Hlamut、10μg/ml；2C：ClfAmut、10μg/ml）により刺激するか、または刺激せずに、染色してICSにより分析した。IL-2、TNF、IL-4/IL-13、IFN-γまたはIL-17Aを産生するCD4+CD44high T細胞が確認された。上のグラフ：CD4+CD44high≧CYT+。下のグラフ：CD4+CD44high≧IFN-γ。未刺激細胞の応答を刺激細胞の応答から差し引いた。程度：ワクチンタンパク質の刺激に反応して、分析したサイトカインのうち少なくとも1つを産生するCD4+CD44high T細胞の割合。性質：少なくともIFN-γを産生するがIL-4/IL-13を産生しないCD4+CD44high T細胞の割合。％幾何平均割合の二元配置分散分析、p＜0.05を示す：＊ワクチン（アジュバントあり、またはなし）と対照群：＊アジュバント添加ワクチンとアジュバント無添加ワクチン；＊AS01E添加ワクチンとAlum/TLR7添加ワクチン;＊ワクチン10μgとワクチン1μg。
【図２Ｃ】アジュバント無添加ワクチン、およびAlum/TLR7もしくはAS01Eを用いたアジュバント添加ワクチンにより誘導された、マウスにおけるワクチン特異的CD4 T細胞応答の程度および性質。2回目の免疫化の12日後に屠殺した1匹のマウスの脾細胞を、in vitroでワクチンタンパク質（2A：SpAmut、1μg/ml；2B：Hlamut、10μg/ml；2C：ClfAmut、10μg/ml）により刺激するか、または刺激せずに、染色してICSにより分析した。IL-2、TNF、IL-4/IL-13、IFN-γまたはIL-17Aを産生するCD4+CD44high T細胞が確認された。上のグラフ：CD4+CD44high≧CYT+。下のグラフ：CD4+CD44high≧IFN-γ。未刺激細胞の応答を刺激細胞の応答から差し引いた。程度：ワクチンタンパク質の刺激に反応して、分析したサイトカインのうち少なくとも1つを産生するCD4+CD44high T細胞の割合。性質：少なくともIFN-γを産生するがIL-4/IL-13を産生しないCD4+CD44high T細胞の割合。％幾何平均割合の二元配置分散分析、p＜0.05を示す：＊ワクチン（アジュバントあり、またはなし）と対照群：＊アジュバント添加ワクチンとアジュバント無添加ワクチン；＊AS01E添加ワクチンとAlum/TLR7添加ワクチン;＊ワクチン10μgとワクチン1μg。
【図３Ａ】事前暴露されたウサギにおけるワクチン特異的IgG。AS01Eアジュバントもしくは緩衝液添加ワクチン、または無添加ワクチンの、2回の注射を受けた事前暴露されたウサギにおける、抗CP5 (3A)、抗CP8 (3B)、抗Hla (3C)、抗ClfA (3D)、および抗SpA (3E)の幾何平均抗体価。Pre：1回目の投与前、1wp1：1回目投与の1週間後、2wp1：1回目投与の2週間後、4wp1：1回目投与の4週間後、2wp2：2回目投与の2週間後、4wp2：2回目投与の4週間後、5wp2：2回目投与の5週間後。LLOQ2点線：定量下限の半値。三角：1μg用量；丸：10μg用量；四角：50μg用量。白抜き符号：アジュバントなし、黒塗り符号：AS01E。緩衝液対照は黒塗り菱形で示す。灰色の点線はアッセイで用いられた最低希釈度の逆数を示す。
【図３Ｂ】事前暴露されたウサギにおけるワクチン特異的IgG。AS01Eアジュバントもしくは緩衝液添加ワクチン、または無添加ワクチンの、2回の注射を受けた事前暴露されたウサギにおける、抗CP5 (3A)、抗CP8 (3B)、抗Hla (3C)、抗ClfA (3D)、および抗SpA (3E)の幾何平均抗体価。Pre：1回目の投与前、1wp1：1回目投与の1週間後、2wp1：1回目投与の2週間後、4wp1：1回目投与の4週間後、2wp2：2回目投与の2週間後、4wp2：2回目投与の4週間後、5wp2：2回目投与の5週間後。LLOQ2点線：定量下限の半値。三角：1μg用量；丸：10μg用量；四角：50μg用量。白抜き符号：アジュバントなし、黒塗り符号：AS01E。緩衝液対照は黒塗り菱形で示す。灰色の点線はアッセイで用いられた最低希釈度の逆数を示す。
【図３Ｃ】事前暴露されたウサギにおけるワクチン特異的IgG。AS01Eアジュバントもしくは緩衝液添加ワクチン、または無添加ワクチンの、2回の注射を受けた事前暴露されたウサギにおける、抗CP5 (3A)、抗CP8 (3B)、抗Hla (3C)、抗ClfA (3D)、および抗SpA (3E)の幾何平均抗体価。Pre：1回目の投与前、1wp1：1回目投与の1週間後、2wp1：1回目投与の2週間後、4wp1：1回目投与の4週間後、2wp2：2回目投与の2週間後、4wp2：2回目投与の4週間後、5wp2：2回目投与の5週間後。LLOQ2点線：定量下限の半値。三角：1μg用量；丸：10μg用量；四角：50μg用量。白抜き符号：アジュバントなし、黒塗り符号：AS01E。緩衝液対照は黒塗り菱形で示す。灰色の点線はアッセイで用いられた最低希釈度の逆数を示す。
【図３Ｄ】事前暴露されたウサギにおけるワクチン特異的IgG。AS01Eアジュバントもしくは緩衝液添加ワクチン、または無添加ワクチンの、2回の注射を受けた事前暴露されたウサギにおける、抗CP5 (3A)、抗CP8 (3B)、抗Hla (3C)、抗ClfA (3D)、および抗SpA (3E)の幾何平均抗体価。Pre：1回目の投与前、1wp1：1回目投与の1週間後、2wp1：1回目投与の2週間後、4wp1：1回目投与の4週間後、2wp2：2回目投与の2週間後、4wp2：2回目投与の4週間後、5wp2：2回目投与の5週間後。LLOQ2点線：定量下限の半値。三角：1μg用量；丸：10μg用量；四角：50μg用量。白抜き符号：アジュバントなし、黒塗り符号：AS01E。緩衝液対照は黒塗り菱形で示す。灰色の点線はアッセイで用いられた最低希釈度の逆数を示す。
【図３Ｅ】事前暴露されたウサギにおけるワクチン特異的IgG。AS01Eアジュバントもしくは緩衝液添加ワクチン、または無添加ワクチンの、2回の注射を受けた事前暴露されたウサギにおける、抗CP5 (3A)、抗CP8 (3B)、抗Hla (3C)、抗ClfA (3D)、および抗SpA (3E)の幾何平均抗体価。Pre：1回目の投与前、1wp1：1回目投与の1週間後、2wp1：1回目投与の2週間後、4wp1：1回目投与の4週間後、2wp2：2回目投与の2週間後、4wp2：2回目投与の4週間後、5wp2：2回目投与の5週間後。LLOQ2点線：定量下限の半値。三角：1μg用量；丸：10μg用量；四角：50μg用量。白抜き符号：アジュバントなし、黒塗り符号：AS01E。緩衝液対照は黒塗り菱形で示す。灰色の点線はアッセイで用いられた最低希釈度の逆数を示す。
【図４Ａ】ワクチンはマウスにおいてin vitro Hla活性を中和する機能的IgGを誘導する。アジュバントなし、またはAlum/TLR7もしくはAS01Eアジュバントのいずれか一方の存在下で、指定の用量のワクチンにより、マウス（10匹/群）を免疫化した。プール血清の中和抗体価をそれぞれの時点で測定し、3回の独立した実験の中央値（赤および青の四角および星印）として示した。バーの上下の値はそれぞれ最大および最小の抗体価を示す。白抜き符号：10μg用量；黒塗り符号；1μg用量。四角：アジュバントなし；三角：AS01Eアジュバント；丸：Alum/TLR7アジュバント。灰色の点線はアッセイで使用された最低希釈度の逆数を示す。
【図４Ｂ】ワクチンは事前暴露されたウサギにおいてin vitro Hla活性を中和する機能的IgGを誘導する。Hla中和抗体価および分析された採血時点をそれぞれy軸およびx軸上に記録する。灰色の点線は、アッセイで使用された最低希釈度の逆数を示す。任意の力価3を非反応に割り当てた。三角：1μg用量；丸：10μg用量；四角：50μg用量。白抜き符号：アジュバントなし、黒塗り符号：AS01E。緩衝液対照は黒塗り菱形として示す。
【図５Ａ】ワクチンはマウスにおいてin vitro ClfA活性を中和する機能的IgGを誘導する。3回の独立したin vivo実験において、アジュバントなし、またはAlum/TLR7もしくはAS01Eアジュバントのいずれか一方の存在下で、指定の用量のワクチンにより、マウス（10匹/群）を免疫化した。3回のin vivo実験のプール血清の中和抗体価をそれぞれの時点で測定し、中央値として示した。バーの上下の値はそれぞれ最大および最小の抗体価を示す。白抜き符号：10μg用量；黒塗り符号；1μg用量。四角：アジュバントなし；三角：AS01Eアジュバント；丸：Alum/TLR7アジュバント。灰色の点線はアッセイで使用された最低希釈度の逆数を示す。
【図５Ｂ】ワクチンは事前暴露されたウサギにおいてin vitro ClfA活性を中和する機能的IgGを誘導する。個々の血清の中和抗体価をワクチン接種前、4wp1および2wp2の時点で測定した。2wp2時点でのみ、中和活性が、95％信頼区間（CI）で幾何平均（GMT）として表される。灰色の点線は、アッセイに使用された最低希釈度の逆数を示す。任意の力価2を非反応に割り当てた。三角：10μg用量；丸：10μg用量；四角：50μg用量。白抜き符号：アジュバントなし、黒塗り符号：AS01E。緩衝液対照は黒塗り菱形として示す。
【図６Ａ】ワクチンは事前暴露されたウサギにおいて血清型5型（図6A）および8型（図6B）黄色ブドウ球菌菌株に対するOPK活性を有する抗体を誘導する。12個体の血清のOPK力価を、ワクチン接種前および2wp2の時点で測定した。GMTは95％信頼区間（CI）で表される。三角：アジュバントなし。丸：AS01Eアジュバント。菱形：緩衝液のみ。
【図６Ｂ】ワクチンは事前暴露されたウサギにおいて血清型5型（図6A）および8型（図6B）黄色ブドウ球菌菌株に対するOPK活性を有する抗体を誘導する。12個体の血清のOPK力価を、ワクチン接種前および2wp2の時点で測定した。GMTは95％信頼区間（CI）で表される。三角：アジュバントなし。丸：AS01Eアジュバント。菱形：緩衝液のみ。
【図７】事前暴露されたウサギにおいてワクチン接種は、より高い親和性を有する抗Hla抗体を増加させる。抗体解離パーセントを、個々の血清において、ワクチン接種前、2wp1および2wp2の時点でアッセイした。GMTは95％信頼区間（CI）で表される。三角：アジュバントなし。丸：AS01Eアジュバント。菱形：緩衝液のみ。
【図８】事前暴露されたウサギにおいてワクチン接種は、より高い親和性を有する抗SpAmut抗体を増加させる。抗体解離パーセントを、個々の血清において、ワクチン接種前、2wp1および2wp2の時点でアッセイした。GMTは95％信頼区間（CI）で表される。三角：アジュバントなし。丸：AS01Eアジュバント。菱形：緩衝液のみ。
【図９】事前暴露されたウサギにおいてワクチン接種は、より高い親和性を有する抗ClfA抗体を増加させる。抗体解離パーセントを、個々の血清において、ワクチン接種前、2wp1および2wp2の時点でアッセイした。GMTは95％信頼区間（CI）で表される。三角：アジュバントなし。丸：AS01Eアジュバント。菱形：緩衝液のみ。
【図１０】事前暴露されたウサギにおいてワクチン接種は、より高い親和性を有する抗CP5抗体を増加させる。抗体解離パーセントを、個々の血清において、ワクチン接種前、2wp1および2wp2の時点でアッセイした。GMTは95％信頼区間（CI）で表される。三角：アジュバントなし。丸：AS01Eアジュバント。菱形：緩衝液のみ。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
定義
用語
キャリアタンパク質：抗原（たとえば、糖抗原）と共有結合してコンジュゲート（たとえば、バイオコンジュゲート）を形成するタンパク質。キャリアタンパク質は、結合した抗原に関してT細胞による細胞性免疫を活性化する。
【００３８】
コンジュゲート（conjugate、複合体）：キャリアタンパク質と共有結合した糖（たとえば、莢膜多糖）。
【００３９】
バイオコンジュゲート（bioconjugate、生物学的複合体）：糖合成に必要な酵素、キャリアタンパク質、および宿主細胞でのコンジュゲーション（conjugation、複合）に必要な酵素を発現させることにより、組換え技術で作製されるコンジュゲートである。このコンジュゲートは、N-結合型タンパク質グリコシル化、すなわち、酵素作用によって標的タンパク質のポリペプチド鎖のアスパラギン残基に糖鎖分子を付加して糖がキャリアタンパク質にN-結合することによって形成される。
【００４０】
プロリン（pro、P）以外の任意のアミノ酸：アラニン（ala、A）、アルギニン（arg、R）、アスパラギン（asn、N）、アスパラギン酸（asp、D）、システイン（cys、C）、グルタミン（gln、Q）、グルタミン酸（glu、E）、グリシン（gly、G）、ヒスチジン（his、H）、イソロイシン（ile、I）、ロイシン（leu、L）、リジン（lys、K）、メチオニン（met、M）、フェニルアラニン（phe、F）、セリン（ser、S）、スレオニン（thr、T）、トリプトファン（trp、W）、チロシン（tyr、Y）、およびバリン（val、V）からなる一群から選択されるアミノ酸を指す。
【００４１】
ClfA：黄色ブドウ球菌に由来するクランピング因子A
【００４２】
Hla：黄色ブドウ球菌に由来する、α毒素としても知られるαヘモリシン
【００４３】
ClfA：黄色ブドウ球菌に由来するブドウ球菌プロテインA
【００４４】
CP：莢膜多糖
【００４５】
LPS：リポ多糖
【００４６】
還元末端：多糖の還元末端は、グリコシド結合に関与せず、したがって鎖状形態に変換可能な、遊離のアノマー炭素を有する単糖である。
【００４７】
本明細書で使用される「バイオコンジュゲート」という用語は、宿主細胞という基礎環境において作製される、タンパク質（たとえば、キャリアタンパク質）と抗原（たとえば、糖）とのコンジュゲートを指しており、宿主細胞機構が抗原とタンパク質を結び付ける（たとえば、N-結合）。
【００４８】
本明細書で使用される「有効な量」という用語は、治療薬（たとえば、本発明の免疫原性組成物またはワクチン）を対象に投与する状況において、１以上の予防および／または治療効果のある、治療薬の量を指す。ある実施形態において、「有効な量」は、以下の効果のうち1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ以上を達成するのに十分な治療薬の量を指す：(i) 細菌感染症またはそれに関連する症状の重症度を軽減または改善する；(ii) 細菌感染症またはそれに関連する症状の持続期間を短縮する；(iii) 細菌感染症またはそれに関連する症状の進行を予防する；(iv) 細菌感染症またはそれに関連する症状の軽減を引き起こす；(v) 細菌感染症またはそれに関連する症状の発現もしくは発症を予防する；(vi) 細菌感染症またはそれに関連する症状の再発を予防する；(vii) 細菌感染症に関連する臓器不全を軽減する；(viii) 細菌感染症にかかっている対象の入院加療を減少させる；(ix) 細菌感染症にかかっている対象の入院期間を短縮する；(x) 細菌感染症にかかっている対象の生存率を高める；(xi) 対象において細菌感染を排除する；(xii) 対象において細菌の複製を抑制し、または減少させる；および／または(xiii) 別の治療法の１以上の予防効果または治療効果を増強または改善する。
【００４９】
本明細書で使用される「対象」という用語は、動物、より詳細には霊長類などの動物（たとえば、ヒト）を指す。
【００５０】
本明細書で使用される「免疫原性断片」という用語は、宿主動物、たとえばヒトにおいて、その断片に特異的な液性および／または細胞性免疫応答を引き起こすことができる、抗原全体より小さい一部分である。タンパク質の断片は、当業者に公知の技術、たとえば組換え技術、タンパク質消化、または化学合成によって作製することができる。ポリペプチドの内部断片または末端断片は、（末端断片用には）ポリペプチドをコードする核酸の一方の末端から、または（内部断片用には）その両端から、１以上のヌクレオチドを除去することによって作製することができる。典型的には、断片は、全長配列のうち少なくとも10、20、30、40、または50個の連続したアミノ酸を含む。しかしながら、断片は、100個以上、200個以上、300個以上、または400個以上のアミノ酸長であってもよい。断片は、N末端およびC末端のいずれか一方、または両端から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40もしくは50個のアミノ酸を除去または付加することによって、容易に修飾することができる。
【００５１】
本明細書で使用される「保存的アミノ酸置換」という用語は、その位置においてアミノ酸残基のサイズ、極性、電荷、疎水性または親水性に、ほとんど、またはまったく影響がなく、免疫原性の減少をもたらすことのないような、天然アミノ酸残基の非天然残基による置換を含む。たとえば、これらは、以下のグループ内の置換とすることができる：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。ポリペプチドの配列に対する保存的はアミノ酸の改変（および対応する、コードするヌクレオチドに対する改変）は、親ポリペプチドと類似した機能的性質および化学的性質を有するポリペプチドを作製することができる。
【００５２】
本明細書で使用される「欠失」という用語は、タンパク質配列から１以上のアミノ酸残基を除去することである。
【００５３】
本明細書で使用される「挿入」という用語は、タンパク質配列に１以上の非天然アミノ酸残基を付加することである。
【００５４】
本明細書で使用される「アミノ酸...の間」（たとえば、「アミノ酸313-342の間」）に関しては、アミノ酸配列のN末端から引き続いて数えたアミノ酸番号を指しており、たとえば、「配列番号2のアミノ酸313-342の間」は、配列番号2の313番目と342番目のアミノ酸の間のアミノ酸配列内の任意の位置を指す。
【００５５】
「配列同一性」に関しては、基準配列の全長にわたって、またはクエリ配列の全長にわたって計算することができる。配列アラインメントツールには、Clustal Omega (www(.)ebi(.)ac(.)ac(.)uk)、MUSCLE (www(.)ebi(.)ac(.)uk)、またはT-coffee (www(.)tcoffee(.)org)があるが、これに限定されない。ある態様において、使用される配列アラインメントツールはClustal Omega (www(.)ebi(.)ac(.)ac(.)uk)である。
【００５６】
発明の説明
SpA抗原
野生型SpA（ブドウ球菌プロテインA）は、細胞壁に固定された表面タンパク質であって、肺感染、敗血症、および膿瘍発症にきわめて重要な毒性因子であり、ほとんどの黄色ブドウ球菌臨床分離株で発現される。野生型SpAは、ヒトIgGのFc部分に結合し、VH3含有B細胞受容体に結合し、フォン・ヴィレブランド因子にそのA1ドメインにおいて結合し、TNFα受容体1にも結合する。SpAとB細胞受容体との相互作用は、B細胞の発生に影響を与え、適応免疫応答および自然免疫応答に影響を及ぼすのに対して、SpAとIgGのFcγとの結合は、多形核白血球による、ブドウ球菌のオプソニン貪食クリアランスを阻害する。成熟SpAのN末端部分は、4つまたは5つの56〜61残基のIg結合ドメインで構成されるが、これらは短いリンカーで連結された三重らせん状の束に折りたたまれており、E、D、A、B、およびCの順に構成される。これらのドメインは、アミノ酸レベルで約80％の同一性を示し、56から61残基の長さで、タンデムリピートとして構築されている。C末端領域は、非常に繰り返しが多いが可変性のあるオクタペプチドである「Xr」、およびSpAの細胞壁アンカー構造に隣接するドメインである「Xc」で構成される。
【００５７】
NCTC 8325株において、SpAはSAOUHSC_00069であり、配列番号4のアミノ酸配列（GI:88193885）を有する。Newman株において、SpAは nwmn_0055 (GI:151220267)である。配列番号4の有用な断片は、アミノ酸37〜325（配列番号13）である。この断片は、5つのSpA Ig結合ドメイン（天然では、配列番号14、15、16、17および18のそれぞれの配列で、N末端からC末端までE、D、A、B、Cの順に配置されている）をすべて含有し、SpAの最も露出したドメインを含む。また、抗原のヒトタンパク質との類似性を低下させる。他の有用な断片は、SpAがB細胞スーパー抗原として機能する場合に起こり得る、過剰なB細胞の増殖を防ぐために、天然のA、B、C、Dおよび／またはEドメインのうち1つ、2つ、3つ、または4つを削除してもよい。他の有用な断片は、天然のA、B、C、Dおよび／またはEドメインのうち1つ、2つ、3つ、または4つのみを含んでいてもよく、たとえば、SpA(A)ドメインのみを含むがB〜Eドメインは含まない、またはSpA(D)ドメインのみを含むが、A、B、CまたはEドメインは含まない、などである。したがって、本発明で有用なSpA抗原は、1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのIgG結合ドメインを含むことができる。
【００５８】
ある実施形態において、本発明のSpA抗原は、配列番号13を認識する抗体を誘導することが可能であり（たとえば、ヒトに投与された場合）、および／または、(a)配列番号13に対して50％以上の同一性（たとえば、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99. 5％またはそれ以上）を有する；および／または(b)配列番号13の少なくとも「n」個の連続アミノ酸の断片、または配列番号13と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％または99％同一なアミノ酸配列を含み、ここで、「n」は7以上(たとえば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250またはそれ以上）である、アミノ酸配列を含むことができる。これらのSpA抗原は、配列番号13のバリアントを含む。(b)の好ましい断片は、配列番号13由来のエピトープ、または配列番号13と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％または99％同一なアミノ酸配列を含む。他の好ましい断片は、配列番号13の少なくとも1つのエピトープを保持しつつ、配列番号13のC末端から１以上のアミノ酸（たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25個またはそれ以上）を、および／または配列番号13のN末端から１以上のアミノ酸（たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25個またはそれ以上）を欠いている。個々のIgG結合ドメインは、単独で、または組み合わせて、有用な免疫原となりうる。
【００５９】
抗原が1種類のSpAドメイン（たとえば、SpA(A)ドメイン、SpA(D)ドメインまたはSpA(E)ドメイン）のみを含む場合、単一のポリペプチド鎖の中に、このドメインの複数のコピー、たとえば、複数のSpA(D)ドメインを含んでいてもよい。また、1種類のSpAドメインおよび別のタンパク質もしくはポリペプチドを含んでいてもよい。したがって、本発明の抗原は、SpA(D)ドメインのような１種類のSpAドメインのみを含む融合タンパク質であってもよい。
【００６０】
本発明で使用されるSpA抗原を、ヒトIgGのFcγ部分および／またはVH3含有ヒトB細胞受容体のFab部分に対する親和性が低下するように、配列番号13に対して変異させることができる。これは、たとえば、WO2011/005341、WO12/003474およびWO2015/144653のガイダンスに従うことによって達成され、評価されうる。したがって、野生型SpAの少なくとも１つのGln-Glnジペプチドを変異させることができる（たとえば、Lys-Lysへ；他の可能な変異としては、Arg-Arg、Arg-Lys、Lys-Arg、Ala-Ala、Ser-Ser、Ser-Thr、Thr-Thrなどが挙げられる）、および／または、野生型SpAの少なくとも１つのAsp-Aspジペプチドを変異させることができる（たとえば、Ala-Alaへ；他の可能な変異としては、Lys-Lys、Arg-Arg、Lys-Arg、Arg-Lys、His-His、Val-Valなどが挙げられる）。これらの変異の標的配列は、配列番号4のアミノ酸43、44、70、71、96、97、104、105、131、132、162、163、189、190、220、221、247、248、278、279、305および／または306に対応する残基である。
【００６１】
抗原内の個々のドメインは、配列番号4に対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上のアミノ酸で変異していてもよい（たとえば、Gln-GlnおよびAsp-Asp配列に関しては上記を参照されたいが、ドメインDの残基3および／または24、ドメインAの残基46および／または53での変異を開示するWO2011/005341も参照されたい）。そのような変異は、配列番号13を認識する抗体を誘導する抗原の能力を除去するべきではないが、上記のように、抗原のIgGおよび／または他のヒトタンパク質（ヒト血液タンパク質など）への結合を減少させるか、または除去することができる。ある実施形態において、変異型SpA抗原は、配列番号4の43、44、70、71、96、97、104、105、131、132、162、163、189、190、220、221、247、248、278、279、305および／または306位に対応するアミノ酸の位置において、少なくとも1つ、より詳細には少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19個、さらには特に20個のアミノ酸に変異を有する、配列番号13を含むか、またはそれらからなる配列を有する。これらの位置について有用な置換は、上記に記載されている。たとえば、SpAドメインEは、配列番号1のアミノ酸残基43、44、70および／または71に対応する位置で変異させることができる（たとえば、配列番号19）。SpAドメインDは、配列番号4のアミノ酸残基96、97、104、105、131および／または132に対応する位置で変異させることができる（たとえば、配列番号20または24）。SpAドメインAは、配列番号4のアミノ酸残基162、163、189および／または190に対応する位置で変異させることができる（たとえば、配列番号21）。SpAドメインBは、配列番号4のアミノ酸残基220、221、247および／または248に対応する位置で変異させることができる（たとえば、配列番号22）。SpAドメインCは、配列番号4のアミノ酸残基278、279、305および／または306に対応する位置で変異させることができる（たとえば、配列番号23）。配列番号4の43、44、96、97、104、105、162、163、220、221、278および／または279位に対応する位置の変異は、ヒトIgGのFcγ部分への結合を減少させるかまたは除去し、一方、配列番号4の70、71、131、132、189、190、247、248、305および／または306位に対応する位置の変異は、VH3含有ヒトB細胞受容体のFab部分への結合を減少させるかまたは除去すると考えられている。
【００６２】
したがって、SpA抗原は、好ましくは、(a) VH3への結合を阻害または減少させるSpAドメインE、D、A、BまたはCのVH3結合サブドメインにおける１以上のアミノ酸置換、および(b) IgG Fcへの結合を阻害または減少させるSpAドメインE、D、A、BまたはCのIgG Fc結合サブドメインにおける１以上のアミノ酸置換を含む。E/D、D/A、A/B、およびB/Cドメインの境界は、Kim et al, 2014.Vaccine 32: 464-469に記載のドメインを基本とすることができる。
【００６３】
ある実施形態において、SpA抗原は、配列番号14のアミノ酸7位および8位に、または配列番号14と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインE；配列番号15のアミノ酸12位および13位に、または配列番号15と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインD；配列番号16のアミノ酸9位および10位に、または配列番号16と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインA；配列番号17のアミノ酸9位および10位に、または配列番号17と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインB；および／または配列番号18のアミノ酸9位および10位に、または配列番号18と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインCを含む。好ましくは、前記アミノ酸置換は、たとえば配列番号19〜24のような、グルタミンからリジンへの置換である。好ましい実施形態において、SpA抗原はさらに、配列番号15のアミノ酸4位および5位におけるアミノ酸置換、たとえば、KRのような、グルタミンからリジンもしくはアルギニンへの置換を有するドメインDを含む（たとえば、配列番号24または配列番号25）。
【００６４】
ある実施形態において、SpA抗原は、配列番号14のアミノ酸34位および35位に、または配列番号14と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインE；配列番号15のアミノ酸39位および40位に、または配列番号15と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインD；配列番号16のアミノ酸36位および37位に、または配列番号16と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインA；配列番号17のアミノ酸36位および37位に、または配列番号17と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインB；および／または配列番号18のアミノ酸36位および37位に、または配列番号18と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインCを含む。好ましくは、前記アミノ酸置換は、たとえば配列番号19〜24のような、アスパラギン酸からアラニンへの置換である。
【００６５】
本発明の典型的なSpA抗原は、配列番号26、より好ましくは配列番号27の配列を含むか、またはその配列からなるといえる。他の典型的なSpA抗原は、配列番号26または配列番号27に対して50％以上（たとえば、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％％以上）の同一性を有するものとすることができる；および／または、配列番号26または配列番号27の少なくとも「n」個の連続するアミノ酸の断片を含むものであってもよく、ここで、「n」は7以上（たとえば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250またはそれ以上）である。
【００６６】
ClfA抗原
宿主の細胞外マトリックス成分への細菌の付着は、細菌感染における重要な初期段階である。クランピング因子A（ClfA）は、病原性に必要であり、細菌が宿主の防御機構を回避するのに役立つ、重要な黄色ブドウ球菌付着因子である。ClfAは、ECM内のフィブリノーゲンに結合して、宿主組織の付着と細菌定着を助け、さらに細胞のクランピング、およびフィブリノーゲン内の細菌細胞のコーティングを引き起こし、細菌表面上のオプソニン沈着を損なうことによって免疫回避を促進する。
【００６７】
ClfAは、ほとんどすべての黄色ブドウ球菌菌株に存在する。ClfAは重要な病原性因子であり、敗血症性関節炎や心内膜炎の発病に関与している。ClfAは、フィブリノーゲンのγ鎖のC末端に結合し、それによってフィブリノーゲン溶液中で細菌の凝集を誘導することができる。黄色ブドウ球菌上のClfAの発現は、マクロファージおよび好中球の両者による貪食を阻害する。好中球において、これはフィブリノーゲン依存性およびフィブリノーゲン非依存性メカニズムの両者によるものである。これに対して、血小板は、凝集をもたらすGPIIb/IIIaとの相互作用を介して、ClfAを発現する細菌によって活性化される。これはフィブリノーゲンが存在する場合に最も効率的に実行されるが、血小板活性化のためのフィブリノーゲン非依存性の経路も存在する。
【００６８】
ClfAは520アミノ酸のN末端Aドメイン（フィブリノーゲン結合領域）を含むが、これは、N1、N2およびN3の3つの別々に折り畳まれたサブドメインを含んでいる。Aドメインの後には、セリン-アスパラギン酸ジペプチドリピート領域、ならびに細胞壁および膜貫通領域が続き、この領域は、ソルターゼが促進する細胞壁へのアンカリングのためのLPDTGモチーフを含む。Aドメイン（サブドメインN1〜3）のアミノ酸配列を配列番号1に示す。AドメインのサブドメインN2N3のアミノ酸配列を配列番号2に示す。
【００６９】
ある実施形態において、本発明のClfA抗原は、配列番号1もしくは配列番号2と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％または99％同一なアミノ酸配列を含むか、または配列番号1もしくは配列番号2の免疫原性断片および／またはバリアント（たとえば、配列番号5〜7）、または配列番号1もしくは配列番号2と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％または99％同一なアミノ酸配列である。ある実施形態において、本発明のClfA抗原は、全長配列のうち少なくとも約15個、少なくとも約20個、少なくとも約40個、少なくとも約60個、少なくとも約100個、少なくとも約300個、または少なくとも約400個の連続するアミノ酸残基を含む、配列番号2または配列番号5〜8の免疫原性断片を含んでいてもよく、このポリペプチドは、前記アミノ酸配列に特異的な免疫応答を引き起こすことができる。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本発明のClfA抗原は、ClfAのサブドメインN1、N2およびN3（配列番号1）、または配列番号1と少なくとも80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％同一なアミノ酸配列を含む（またはそれらからなる）ものとすることができる。他の実施形態において、本発明の改変ClfA抗原は、サブドメインN2およびN3（配列番号2）、または配列番号2と少なくとも80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％同一なアミノ酸配列を含む（またはそれらからなる）ものとすることができる。
【００７１】
したがって、本発明は、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号2と少なくとも80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％同一なアミノ酸配列（たとえば、配列番号5）を含む（またはそれからなる）ClfA抗原を提供する。ある実施形態において、ClfA抗原は、D/E-X-N-Z-S/T（配列番号28）およびK-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号29）から選択される、１以上のグリコシルトランスフェラーゼ酵素、たとえばPglBのコンセンサス配列を含み、ここで、XおよびZは個別に、プロリン以外の任意のアミノ酸である。ある実施形態において、コンセンサス配列は、K-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号28）であるが、このXはQ（グルタミン）であり、ZはR（アルギニン）であって、たとえば、K-D-Q-N-R-T-K（配列番号30）である。好ましい実施形態において、コンセンサス配列はK-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号29）であり、このXはQ（グルタミン）であり、ZはA（アラニン）であって、たとえば、K-D-Q-N-A-T-K（配列番号31）である。ClfA抗原は、クローニングを目的として、N末端セリンの付加によってさらに改変されてもよい（たとえば、配列番号7）。ClfA抗原は、下記のように、フィブリノーゲン結合を阻害する変異を含むようにさらに改変されてもよい（たとえば、配列番号5〜7）。
【００７２】
ある実施形態において、本発明のClfA抗原は、配列番号2と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％または99％同一なアミノ酸配列を含み、この配列は、１以上のアミノ酸（たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12個のアミノ酸）の欠失および／または付加および／または置換によって改変された、配列番号2のバリアントである。アミノ酸置換は、保存的であっても、非保存的であってもよい。ある態様において、アミノ酸置換は保存的である。置換、欠失、付加、またはそれらの任意の組み合わせは、バリアントが免疫原性ポリペプチドである限り、単一のバリアントに組み込まれてもよい。ある実施形態において、本発明のClfA抗原は、1〜10、5〜10、1〜5、1〜3、1〜2、または1個のアミノ酸が、任意の組み合わせで、置換、欠失、または付加されているバリアントに由来してもよい。たとえば、本発明のClfA抗原は、追加のN末端セリンを含むという点で、配列番号2のバリアントであるアミノ酸配列に由来するといえる（たとえば、配列番号7）。
【００７３】
ある実施形態において、本発明は、B細胞エピトープまたはT細胞エピトープを含む断片および／またはバリアントを含む。そのようなエピトープは、たとえばPSIPREDプログラム（David Jones, Brunel Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, UKより）を用いた2次元構造予測と、JamesonおよびWolf（CABIOS 4:181-186 [1988]）に記載の方法に基づいて計算された抗原性インデックスとの組み合わせを用いて予測することができる。
【００７４】
本発明のある実施形態において、（たとえば、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号2と少なくとも80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％同一なClfAアミノ酸配列を有する）ClfAアミノ酸配列の１以上のアミノ酸（たとえば、1〜7つのアミノ酸、たとえば1つのアミノ酸）は、D/E-X-N-Z-S/T（配列番号28）またはK-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号29）（たとえば、K-D-Q-N-A-T-K（配列番号31））のコンセンサス配列によって置換されている。たとえば、ClfAアミノ酸配列（たとえば、配列番号2または5）内の単一のアミノ酸を、D/E-X-N-Z-S/T（配列番号28）またはK-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号29）（たとえば、K-D-Q-N-A-T-K（配列番号31））のコンセンサス配列で置換することができる。あるいはまた、ClfAアミノ酸配列（たとえば、配列番号2、または配列番号2と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％または99％同一なClfAアミノ酸配列）内の2、3、4、5、6または7つのアミノ酸を、D/E-X-N-Z-S/T（配列番号28）またはK-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号29）（たとえば、K-D-Q-N-A-T-K（配列番号31））のコンセンサス配列で置換してもよい。
【００７５】
ある実施形態において、コンセンサス配列は、配列番号2の１以上のアミノ酸残基313〜340に（たとえば、１以上のアミノ酸残基330〜340の代わりに、またはアミノ酸残基Q327、D329、P331またはI337、好ましくはI337の代わりに）、または、配列番号2と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、または99％同一なアミノ酸配列中の同等の位置に、付加または置換されている（たとえば、配列番号5〜7）。
【００７６】
D/E-X-N-Z-S/T（配列番号28）およびK-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号29）から選択されるコンセンサス配列の導入は、ClfA抗原をグリコシル化することを可能にする。したがって、本発明はまた、ClfA抗原がグリコシル化されている、本発明のClfA抗原を提供する。
【００７７】
ClfAのフィブリノーゲン結合活性は、ClfAが病原性因子として作用するために必要とされるので、ClfA抗原は、in vivoで投与できるように、フィブリノゲン結合活性を低減または除去するように改変されていてもよい。そのような改変ClfA抗原は、WO2011/007004に記載の変異のうちの1つ、たとえば、配列番号2の残基P116およびY118に対応するアミノ酸の1つ、または好ましくは両方における変異、たとえばP116Sおよび/またはY118Aを有することができる。代表的な配列は、配列番号5〜7のものである。ある実施形態において、ある態様では、本発明のClfA抗原は、配列番号2の配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む（またはその配列からなる）が、前記のアミノ酸配列は、アミノ酸置換P116SおよびY118Aを含んでおり、たとえば配列番号5〜7または32である。
【００７８】
ある実施形態において、たとえば、配列番号7のように、成熟抗原のN末端に、追加のアミノ酸残基（たとえば、セリンまたはアラニン）が付加されている。そのような残基は、リーダー配列のより効率的な切断を導くという利点を有する。
【００７９】
ある態様において、本発明のClfA抗原は、配列番号2の配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む（またはその配列からなる）が、前記アミノ酸配列は、アミノ酸置換P116SおよびY118A、K-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号29）コンセンサス配列を含んでおり、このXおよびZは個別にプロリン以外の任意のアミノ酸であって（好ましくはK-D-Q-N-A-T-K（配列番号31）、たとえば配列番号6）、必要に応じて、N末端に追加のセリン残基を有してもよい（たとえば、配列番号7）。ある実施形態において、本発明のClfA抗原は、配列番号1、2または5〜7から選択されるアミノ酸配列と少なくとも97％、98％、99％または100％同一なアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、本発明のClfA抗原は、配列番号 1、2または5〜7から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００８０】
Hla抗原
Hlaは重要な分泌型ブドウ球菌毒素である。Hlaは、ヒト赤血球などの細胞の膜に脂質二重層貫通孔を作り、細胞溶解をもたらす。
【００８１】
ある実施形態において、本発明のHla抗原は、配列番号3のアミノ酸配列、または配列番号3と少なくとも80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列を含む（またはその配列からなる）。
【００８２】
ある実施形態において、Hla抗原は、配列番号3のH48およびG122の位置、または配列番号3と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％または99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有し、前記置換は、それぞれHからCおよびGからC（たとえば、H48CおよびG122C）である（たとえば配列番号10〜12）。前記の置換は、Hla抗原にジスルフィド架橋を導入するのに役立つが、それは組換え生産されたときにタンパク質の安定性および収率を改善することができる。
【００８３】
したがって、本発明のHla抗原は、ジスルフィド架橋を欠いたHla、たとえば野生型または無毒化Hla（たとえば、HlaH35L、たとえば配列番号8）と比べて、凝集傾向の低下を示す可能性がある。たとえば、本発明の好適な改変Hla抗原は、実施例に記載されているように、野生型HlaまたはHlaH35Lより低い凝集性を示すものとすることができる（たとえば、ウェスタンブロット上で検出可能であるか、またはクロマトグラフィー技術、たとえばIMACもしくはサイズ排除クロマトグラフィーにより測定される）。たとえば、好適な改変Hla抗原は、0％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、もしくは5％の凝集レベル；約0％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.05％、0.1％、0.5％、1％もしくは5％の凝集レベル；0.0005％未満、0.001％未満、0.005％未満、0.01％未満、0.05％未満、0.1％未満、0.5％未満、1％未満もしくは5％未満の凝集レベル；野生型、無毒化（たとえばHlaH35L）Hlaもしくは他の架橋Hlaの凝集レベルの10％未満、20％未満、30％未満、40％未満、50％未満、60％未満、70％未満、80％未満もしくは90％未満の凝集レベルを示しうる（本明細書に記載の方法のいずれかを用いて測定される）。たとえば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはIMACを使用する場合、Hlaモノマーを表すピークは、野生型HlaまたはHlaH35Lまたは架橋を減らすように改変されていない他のHlaよりも高くなりうる、および/または、凝集したHlaを表すピークは低くなりうる。
【００８４】
本発明のHla抗原は、ジスルフィド架橋を欠いたHla、たとえば、野生型または無毒化Hla（たとえば、Hla H35L、たとえば配列番号8）よりも高い全収率で製造することができる。全収率がそれより低い場合、改変Hla抗原は、ジスルフィド架橋を欠いたHla、たとえば野生型または無毒化Hla（たとえば、Hla H35L、たとえば配列番号8）よりもHlaモノマーの収率が高い状態で製造される可能性がある。たとえば、改変Hla抗原の収量は、野生型、無毒化（たとえば、HlaH35L）Hlaまたは他の架橋Hlaと比較して、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、110％、120％、150％、200％もしくはそれ以上、または約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、110％、120％、150％、200％もしくはそれ以上増加させることができる。 タンパク質の収量は、以下に記載されるように測定することができる。
【００８５】
ある実施形態において、本発明のHla抗原は、配列番号3の免疫原性断片および/もしくはバリアント、または配列番号3と少なくとも80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％同一なアミノ酸配列とすることができる。ある実施形態において、本発明のHla抗原は、配列番号3の免疫原性断片、または配列番号3と少なくとも80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一なアミノ酸配列を含むことができるが、これは、全長配列のうち少なくとも約15個、少なくとも約20個、少なくとも約40個、または少なくとも約60個の連続するアミノ酸残基を含み、このポリペプチドは、前記アミノ酸配列に特異的な免疫応答を引き起こす能力を有する。
【００８６】
ある実施形態において、本発明のHla抗原は、１以上のアミノ酸（たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12個のアミノ酸）の欠失および/または付加および/または置換によって改変された配列番号3のバリアントである、配列番号3と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％または99％同一なアミノ酸配列に由来していてもよい。アミノ酸置換は、保存的であっても、非保存的であってもよい。ある態様において、アミノ酸置換は保存的である。置換、欠失、付加、またはそれらの任意の組み合わせは、そのバリアントが免疫原性ポリペプチドである限り、単一のバリアントに組み込むことができる。ある実施形態において、本発明の改変Hla抗原は、1〜10、5〜10、1〜5、1〜3、1〜2または1つのアミノ酸が、任意の組み合わせで、置換、欠失、もしくは付加されているバリアントから得られる。たとえば、本発明の改変Hla抗原は、N末端に1つもしくは2つの追加のアミノ酸、たとえば最初のN末端S、を有するという点で、配列番号3または8〜11のいずれかのバリアントである、アミノ酸配列に由来するものとすることができる（たとえば配列番号12）。改変Hla抗原は、それに加えて、またはその代わりに、C末端に1つまたは複数の追加のアミノ酸、たとえば1、2、3、4、5、または6個のアミノ酸を有していてもよい。そのような追加のアミノ酸には、精製に役立つペプチドタグを含めることができ、たとえばGSHRHRなどが挙げられる（たとえば配列番号12）。
【００８７】
ある実施形態において、本発明は、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを含む断片および／またはバリアントを含む。そのようなエピトープは、たとえばPSIPREDプログラム（David Jones, Brunel Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, UK）を用いた2次元構造予測と、Jameson and Wolf（CABIOS 4:181-186 [1988]）により記載された方法に基づいて計算された抗原性インデックスとの組み合わせを用いて予測することができる。
【００８８】
Hlaは毒素であるため、in vivoで投与する前に解毒する（すなわち、防御に適した用量で提供されたときに、哺乳動物、たとえばヒトに対して無毒な状態にする）必要がある。Hlaの細胞溶解活性は、Menzies and Kernodle(Menzies and Kernodle，1994，Infect Immunect 62，1843-1847）に記載のように、細孔形成に関与するアミノ酸残基の変異によって低下させることができる。本発明のHla抗原は、遺伝子的に（すなわち、変異によって）無毒化されていてもよい。それに加えて、および／または、その代わりに、本発明のHla抗原は、たとえば、黄色ブドウ球菌莢膜多糖とのコンジュゲーションによって無毒化することができる。遺伝子的に無毒化された配列は、毒性を低減するために、ヒトへの投与後に抗Hla防御抗体および/または中和抗体を誘導する能力を保持しながら、脂質二重層貫通孔を形成する能力、膜透過、細胞溶解、およびヒト赤血球などの細胞に対する細胞溶解活性などの望ましくない活性を除去することができる。たとえば、本明細書に記載のように、Hla抗原は、その免疫原性エピトープを依然として維持しながら生物学的に不活性となるように改変することができる。
【００８９】
本発明のHla抗原は、１以上の点変異によって遺伝子的に無毒化されてもよい。たとえば、細孔形成に関与する残基は、Hlaの溶解活性に関与している。ある態様において、本発明の改変Hla抗原は、MenziesおよびKernodle（Menzies and Kernodle, 1994, Infect Immun 62, 1843-1847）に記載されているようなアミノ酸置換、たとえば、H35、H48、H114および/またはH259をリジンのような別のアミノ酸で置換することによって無毒化することができる。たとえば、本発明の改変Hla抗原は、配列番号3のアミノ酸配列（または配列番号3と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、または99％同一なアミノ酸配列中の同等の位置）に対して、H35L、H114L、またはH259Lから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含んでいてもよい。好ましくは、改変Hla抗原は、H35L置換を含む（たとえば、配列番号8〜12）。
【００９０】
本明細書で言及されるアミノ酸番号は、配列番号3のアミノ酸に対応するが、上記のように、当業者であれば、アラインメントにより、配列番号3と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、または99％同一なアミノ酸配列において同等なアミノ酸位置を決定することができる。
【００９１】
本発明のHla抗原の溶血活性は、たとえばMenzies and Kernodle, 1994, Infect Immun 62, 1843-1847に記載の方法によってアッセイし、特徴付けることができる。in vitro溶血アッセイは、野生型Hlaに対する改変Hla抗原の溶血（たとえば、細胞溶解）活性を測定するために使用してもよい。溶血阻害アッセイを使用して、本発明の改変Hla抗原に対して上昇した抗血清の、Hlaによる溶血を阻害する能力を測定することがしてもよく、（典型的には）抗（改変Hla）抗血清と抗（野生型Hla）抗血清とを比較してもよい。たとえば、本発明の好適な改変Hla抗原は、野生型Hlaよりも低い溶血活性を示すものとしてもよい（たとえば、in vitro溶血アッセイで測定される）。たとえば、適切な改変Hla抗原は、（それぞれの測定値を個別に参照して）野生型Hlaの比活性の約0％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％の比活性、または10％未満の比活性を有していてもよい（比活性はin vitro溶血アッセイによって測定される）。本発明の適切な改変Hla抗原はまた、宿主への投与後に、（たとえば、溶血阻害アッセイにより）野生型Hlaによる溶血を阻害する抗体を宿主に産生させ、免疫原性（たとえば、野生型Hlaに対する抗体の産生を誘導する）、および/または防御性（たとえば、すでに存在する感染症による感染から宿主を防御するか、または既存の感染を制限する、免疫応答を誘導する）を有するものであってもよい。アッセイは、実施例に記載されているように使用することができる。
【００９２】
本発明のある実施形態において、改変Hlaアミノ酸配列（たとえば、配列番号3のアミノ酸配列を有するか、または配列番号3と少なくとも80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％同一なHlaアミノ酸配列を有する、たとえば配列番号8もしくは配列番号10）の１以上のアミノ酸（たとえば、1〜7つのアミノ酸、たとえば1つのアミノ酸）は、たとえばPglBなどのグリコシルトランスフェラーゼのためのD/E-X-N-Z-S/T（配列番号28）またはK-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号29）（たとえばK-D-Q-N-R-T-K（配列番号30））コンセンサス配列によって置換されている。たとえば、Hlaアミノ酸配列（たとえば、配列番号3）中の単一のアミノ酸を、D/E-X-N-Z-S/T（配列番号28）またはK-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号29）（たとえば、K-D-Q-N-R-T-K（配列番号30））コンセンサス配列で置換することができる（たとえば、配列番号９または配列番号11〜12）。あるいはまた、Hlaアミノ酸配列（たとえば、配列番号3、または配列番号3と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％または99％同一なHlaアミノ酸配列）中の2、3、4、5、6または7つのアミノ酸は、D/E-X-N-Z-S/T（配列番号28）またはK-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号29）（たとえば、K-D-Q-N-R-T-K（配列番号30））のコンセンサス配列で置換されていてもよい。
【００９３】
ある実施形態において、D/E-X-N-Z-S/T（配列番号28）およびK-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号29）（たとえば、K-D-Q-N-R-T-K（配列番号30））から選択されるコンセンサス配列（1つもしくは複数）が、配列番号3のアミノ酸K131に相当する位置において、または配列番号1と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、または99％同一なアミノ酸配列（たとえば、配列番号9および11〜12）内の同等の位置に、付加または置換されている。好ましい実施形態において、前記コンセンサス配列は、配列番号3のK131に相当するアミノ酸に代えて置換されている。
【００９４】
D/E-X-N-Z-S/T（配列番号28）およびK-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号29）から選択されるコンセンサス配列（1つもしくは複数）の導入は、Hla抗原をグリコシル化することを可能にする。したがって、本発明はまた、グリコシル化された本発明のHla抗原を提供する。特定の実施形態において、コンセンサス配列は、Hlaアミノ酸配列の特定の領域、たとえば、タンパク質の表面構造内に、タンパク質のN末端もしくはC末端において、および/または、ジスルフィド架橋によって安定化されたループ内に、導入される。本発明のある態様において、コンセンサス配列（1つもしくは複数）の位置は、グリコシル化の改善、たとえば収率の増加をもたらす。
【００９５】
このようなグリコシル化部位の導入は、たとえば、抗原の一次構造に新たなアミノ酸を追加する（すなわち、グリコシル化部位は、すべて、または部分的に、追加される）、またはグリコシル化部位を作製するために抗原の中の既存のアミノ酸を変異させる（すなわち、アミノ酸は抗原に追加されないが、抗原から選択されたアミノ酸を、グリコシル化部位を形成するように変異させる）ことによって達成することができる。当業者であれば、抗原のアミノ酸配列が、当技術分野で知られているアプローチ、たとえば、抗原をコードする核酸配列の改変を含む組換えアプローチを用いて、容易に改変され得ることを認識するであろう。
【００９６】
ある実施形態において、Hla抗原は、そのアミノ酸配列が、D/E-X-N-Z-S/T（配列番号28）およびK-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号29）から選択される１以上のコンセンサス配列を含むように、さらに改変することができるが、このXおよびZは個別に、プロリン以外の任意のアミノ酸である（たとえば、配列番号30）。これらの配列は、本明細書に記載のように、クローニング目的でN末端セリンおよび／またはアラニンを挿入することによって改変することができる。これらの配列は、解毒変異、たとえば本明細書に記載の解毒変異の任意の１つ、またはすべてを含むようにさらに改変されていてもよい。好ましい解毒変異は、配列番号3のH35Lである。
【００９７】
したがって、ある実施形態において、本発明は、D/E-X-N-Z-S/T（配列番号28）およびK-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号29）から選択される１以上のコンセンサス配列を含むアミノ酸配列を有するHla抗原を提供し、このXおよびZは個別に、プロリン以外の任意のアミノ酸であり、これらは、配列番号3のHlaアミノ酸配列、または配列番号3と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％または99％同一なHlaアミノ酸配列（たとえば、配列番号9または10）に、組換えにより導入されたものである。
【００９８】
好ましい実施形態において、本発明のHla抗原は、配列番号11のアミノ酸配列を含む（またはそのアミノ酸配列からなる）。ある実施形態において、本発明の改変Hla抗原は、N末端セリンおよび/またはアラニンを有する（すなわち、N末端にS残基が付加されている）配列番号3または8〜11のうちいずれか1つのアミノ酸配列を含む（またはそのアミノ酸配列からなる）。ある実施形態において、本発明の改変Hla抗原は、配列番号12のアミノ酸配列を含む（またはそのアミノ酸配列からなる）。
【００９９】
ある実施形態において、本発明のHla抗原は、「ペプチドタグ」または「タグ」、すなわち、改変Hla抗原の単離および／または同定を可能にするアミノ酸の配列をさらに含む。たとえば、本発明の改変Hla抗原にタグを付加することは、その抗原の精製、ひいてはタグ付き改変Hla抗原を含むコンジュゲートワクチンの精製に有用である。本明細書で使用することができる代表的なタグには、ヒスチジン（HIS）タグがあるが、それに限定されない。ある実施形態において、タグはヘキサヒスチジンタグである。別の実施形態において、タグは、HRタグ、たとえばHRHRタグである。特定の実施形態において、本明細書で使用されるタグは、たとえば抗原が精製された後など、もはや必要とされなくなると、たとえば化学物質による除去または酵素的手段による除去などのように、除去することが可能である。必要に応じて、ペプチドタグは、アミノ酸配列のC末端に位置する。必要に応じて、ペプチドタグは、アミノ酸配列のC末端に6つのヒスチジン残基を含む。必要に応じて、ペプチドタグは、アミノ酸配列のC末端に4つのHR残基（HRHR）を含んでいてもよい。ペプチドタグは、1つ、2つ、または3つ以上の追加のアミノ酸残基、たとえばアラニン残基、セリン残基および／またはグリシン残基、たとえばGSを含んでいてもよく、またはそれが先行していてもよい。ある態様において、本発明の改変Hla抗原は、配列番号3の配列と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含み（またはそのアミノ酸配列からなり）、前記アミノ酸配列は、XおよびZが個別に、プロリン以外の任意のアミノ酸であるD/E-X-N-Z-S/T（配列番号28）コンセンサス配列（たとえば、K-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号29）またはK-D-Q-N-R-T-K（配列番号30））、ならびにH35L、H48CおよびG122Cから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、ならびにアミノ酸配列のＣ末端におけるGSHRHRペプチドタグを含む。必要に応じて、本発明の改変Hla抗原は、配列番号3または9〜12と少なくとも97％、98％、99％または100％同一なアミノ酸配列を有する。
【０１００】
ある実施形態において、成熟タンパク質のN末端に、セリン残基および／またはアラニン残基、たとえばSAまたはS、好ましくはSが付加されている（たとえば配列番号12）。そのような1つの残基または複数の残基は、リーダー配列のより効率的な切断をもたらすという利点を有する。
【０１０１】
ある態様において、本発明のHla抗原は、配列番号3の配列と少なくとも97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含み（またはそのアミノ酸配列からなり）、前記アミノ酸配列は、アミノ酸置換G122C、H48CおよびH35L、配列番号3のK131位に相当するアミノ酸に代えて置換されたK-D-Q-N-R-T-K（配列番号30）、そのアミノ酸配列のC末端にあるHRHRタグ（配列番号32）（たとえば、配列番号11または配列番号12）を含む。
【０１０２】
好ましい実施形態において、前記Hla抗原は、配列番号11のアミノ酸配列を含む（またはその配列からなる）。好ましい実施形態において、前記Hla抗原は、配列番号12のアミノ酸配列を含む（またはその配列からなる）。
【０１０３】
多糖抗原
黄色ブドウ球菌株の75％が5型もしくは8型の莢膜多糖のいずれかを発現しているので、CP5およびCP8を含むワクチンは、循環黄色ブドウ球菌株の大部分に対する防御をもたらす可能性がある。
【０１０４】
したがって、本発明の組成物は、黄色ブドウ球菌由来の細菌性莢膜糖を含む。黄色ブドウ球菌由来の細菌性莢膜糖は、黄色ブドウ球菌血清型5型または8型の莢膜糖から選択することができる。
【０１０５】
本発明のある実施形態において、抗原は、黄色ブドウ球菌由来の細菌性莢膜糖の反復単位である。本発明の実施形態において、抗原は、黄色ブドウ球菌血清型5型または8型に由来する細菌性莢膜糖の反復単位を含む。
【０１０６】
本発明の実施形態において、抗原は、黄色ブドウ球菌血清型8型に由来する細菌性莢膜糖の反復単位を含む。この実施形態において、抗原は下記を含む：
【化１】
2021514387.tif 000002
【０１０７】
本発明の実施形態において、抗原は、黄色ブドウ球菌血清型5型に由来する細菌性莢膜糖の反復単位を含む。本発明のこの実施形態において、抗原は下記を含む：
【化２】
2021514387.tif 000003
【０１０８】
ある実施形態において、抗原は多糖である。ある実施形態において、抗原は2つ以上の単糖、たとえば、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20個、またはそれ以上の単糖を含む。ある実施形態において、抗原は、20、15、12、10、9、または8個以下の単糖を含む多糖である。
【０１０９】
ある実施形態において、前記莢膜多糖抗原は、キャリアタンパク質とコンジュゲートする。本発明のコンジュゲートを以下に記載する。
【０１１０】
コンジュゲート
本発明はまた、本明細書に記載の莢膜糖を、キャリアタンパク質に連結、たとえば共有結合的に連結したコンジュゲート（たとえばバイオコンジュゲート）を提供する。ある実施形態において、キャリアタンパク質は、本発明のHlaタンパク質である。ある実施形態において、このタンパク質は、本発明のClfAタンパク質である。
【０１１１】
ある実施形態において、キャリアタンパク質は、化学的コンジュゲーション法を用いて得られる化学的連結を介して多糖抗原に共有結合される（すなわち、コンジュゲートは、化学的コンジュゲーションによって生成される）。
【０１１２】
ある実施形態において、化学的コンジュゲーション法は、カルボジイミド化学、還元的アミノ化、シアニル化反応（たとえば、CDAP化学）、マレイミド化学、ヒドラジド化学、エステル化学、およびN-ヒドロキシスクシンイミド化学からなる群から選択される。コンジュゲートは、US200710184072（Hausdorff）US4365170（Jennings）およびUS4673574（Anderson）に記載されているような直接還元的アミノ化法によって調製することができる。他の方法は、EP-0-161-188、EP-208375およびEP-0-477508に記載されている。あるいはまた、コンジュゲーション法は、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（CDAP）による単糖の活性化によって、シアン酸エステルを形成してもよい。そのようなコンジュゲートは、PCT公開出願WO 93/15760 Uniformed Services University、およびWO95/08348およびWO96/29094に記載されている。Chu C. et al Infect. Immunity, 1983 245 256も参照されたい。
【０１１３】
一般に、改変ClfAタンパク質上の次のようなタイプの化学基は、カップリング／コンジュゲーションのために使用することができる：
Ａ）カルボキシル（たとえば、アスパラギン酸またはグルタミン酸を介する）。ある実施形態において、この基は、糖上のアミノ基に直接結合するか、またはカルボジイミド化学、たとえばEDACを用いて、リンカー上のアミノ基に連結される。
Ｂ）アミノ基（たとえばリジンを介する）。ある実施形態において、この基は、糖上のカルボキシル基に直接連結されるか、またはカルボジイミド化学、たとえばEDACを用いてリンカー上のカルボキシル基に連結される。別の実施形態において、この基は、糖上の、CDAPまたはCNBrで活性化されたヒドロキシル基に直接連結されるか、またはリンカー上のそのような基に連結される；アルデヒド基を有する糖またはリンカーに連結される；スクシンイミドエステル基を有する糖またはリンカーに連結される。
Ｃ）スルフィドリル（たとえば、システインを介する）。ある実施形態において、この基は、ブロモアセチル化またはクロロアセチル化糖に連結されるか、またはマレイミド化学によってリンカーに連結される。ある実施形態において、この基は、ビスジアゾベンジジンにより活性化／修飾される。
Ｄ）ヒドロキシル基（たとえば、チロシンを介する）。ある実施形態において、この基は、ビスジアゾベンジジンにより活性化／修飾される。
Ｅ）イミダゾリル基（たとえば、ヒスチジンを介する）。ある実施形態において、この基は、ビスジアゾベンジジンにより活性化／修飾される。
Ｆ）グアニジル基（たとえば、アルギニンを介する）。
Ｇ）インドリル基（たとえば、トリプトファンを介する）。
【０１１４】
一般に、糖上で以下の基がカップリングに使用できる：OH、COOHまたはNH2。アルデヒド基は、たとえば、過ヨウ素酸塩、酸加水分解、過酸化水素などのさまざまな処理後に生成することができる。
【０１１５】
直接結合アプローチ：
糖-OH + CNBrまたはCDAP -----> シアン酸エステル+ NH2-タンパク質  ----> コンジュゲート
糖-アルデヒド + NH2-タンパク質 ----> シッフ塩基 + NaCNBH3 ----> コンジュゲート
糖-COOH + NH2-タンパク質 + EDAC ----> コンジュゲート
糖-NH2 + COOH-タンパク質 + EDAC ----> コンジュゲート
【０１１６】
スペーサー（リンカー）を介した間接結合アプローチ
糖-OH + CNBrまたはCDAP ---> シアン酸エステル + NH2----NH2 ----> 糖----NH2 + COOH-タンパク質 + EDAC -----> コンジュゲート
糖-OH + CNBrまたはCDAP ----> シアン酸エステル+ NH2-----SH -----> 糖----SH  + SH-タンパク質（露出したシステインを有する天然タンパク質、またはタンパク質のアミノ基をたとえばSPDPにより修飾した後に得られる） -----> 糖-S-S-タンパク質
糖-OH + CNBrまたはCDAP ---> シアン酸エステル + NH2----SH -------> 糖----SH + マレイミド-タンパク質（アミノ基の修飾） ----> コンジュゲート
糖-OH + CNBrまたはCDAP ---> シアン酸エステル + NH2-----SH ---> 糖-SH + ハロアセチル化-タンパク質 ----> コンジュゲート
糖-COOH + EDAC + NH2-----NH2 ---> 糖------NH2 + EDAC + COOH-タンパク質 ----> コンジュゲート
糖-COOH + EDAC+ NH2----SH  -----> 糖----SH + SH-タンパク質（露出したシステインを有する天然タンパク質、またはタンパク質のアミノ基をたとえばSPDPにより修飾した後に得られる） -----> 糖-S-S-タンパク質
糖-COOH + EDAC+ NH2----SH  -----> 糖----SH + マレイミド-タンパク質（アミノ基の修飾） ----> コンジュゲート
糖-COOH + EDAC + NH2----SH ---> 糖-SH + ハロアセチル化-タンパク質 ----> コンジュゲート
糖-アルデヒド + NH2-----NH2 ----> 糖---NH2 + EDAC + COOH-タンパク質 ----> コンジュゲート
注記：上記EDACの代わりに、任意の適当なカルボジイミドを使用することができる。
【０１１７】
ある実施形態において、抗原はキャリアタンパク質に直接結合される。
【０１１８】
ある実施形態において、抗原はリンカーを介してキャリアタンパク質に結合される。必要に応じて、リンカーは、4〜12個の炭素原子を有するリンカー、二官能性リンカー、末端に1または2個の反応性アミノ基を含むリンカー、B-プロピオンアミド、ニトロフェニルエチルアミン、ハロアシルハライド、6-アミノカプロン酸、およびADHからなる群から選択される。したがって、活性化された糖は、キャリアタンパク質上のアミノ基に直接、またはスペーサー（リンカー）基を介して、結合することができる。たとえば、スペーサーは、シスタミンもしくはシステアミンであってもよく、チオエーテル結合を介してキャリアに結合することができるチオール化多糖を与えることができ、このチオエーテル結合は、（たとえば、GMBS（4-マレイミド酪酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル）を用いて）マレイミドで活性化されたキャリアタンパク質、または（たとえば、SIAB（(4-ヨードアセチル)アミノ安息香酸スクシンイミジル）、もしくはSIA（ヨード酢酸スクシンイミジル）、もしくはSBAP（3-(ブロモアセトアミド)プロピオン酸スクシンイミジル）を用いて）ハロアセチル化されたキャリアタンパク質との反応後に得られる。ある実施形態において、（必要に応じて、CDAP化学よって作製された）シアン酸エステルは、ヘキサンジアミンまたはADH（アジピン酸ジヒドラジド）と組み合わされ、アミノ誘導体化された糖は、カルボジイミド（たとえば、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDACまたはEDC））化学を用いて、タンパク質キャリア上のカルボキシル基を介して、キャリアタンパク質とコンジュゲートする。そのようなコンジュゲートは、PCT公開特許公報WO93/15760 Uniformed Services University、ならびにWO95/08348およびWO96/29094に記載されている。
【０１１９】
ある実施形態において、抗原が連結されるキャリアタンパク質上のアミノ酸残基は、アスパラギン残基ではなく、この場合、コンジュゲートは、典型的には化学的コンジュゲーションによって生成される。ある実施形態において、抗原が連結されるキャリアタンパク質上のアミノ酸残基は、Ala、Arg、Asp、Cys、Gly、Glu、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、TyrおよびValからなる群から選択される。必要に応じて、アミノ酸は、末端アミン基を含むアミノ酸、リジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、チロシン、ヒスチジンまたはトリプトファンである。必要に応じて、抗原は、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アルギニンまたはトリプトファンから選択される、キャリアタンパク質上のアミノ酸に共有結合する。
【０１２０】
ある実施形態において、抗原は、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アルギニンまたはトリプトファンから選択される、キャリアタンパク質上のアミノ酸（たとえば、アスパラギン）に連結される。ある実施形態において、抗原が連結されるキャリアタンパク質上のアミノ酸残基は、アスパラギン残基である。ある実施形態において、抗原が連結されるキャリアタンパク質上のアミノ酸残基は、D/E-X-N-Z-S/T（配列番号28）およびK-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号29）コンセンサス配列の一部である（たとえば、D/E-X-N-Z-S/T（配列番号28）およびK-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号29）コンセンサス配列中のアスパラギン）。
【０１２１】
本発明は、黄色ブドウ球菌の莢膜糖（たとえば莢膜多糖）に結合した、本明細書に記載のClfAまたはHlaタンパク質を含むバイオコンジュゲートを提供する。特定の実施形態において、バイオコンジュゲートは、本明細書に記載のClfAまたはHlaタンパク質、および黄色ブドウ球菌血清型CP5またはCP8の莢膜糖（たとえば莢膜多糖）から選択される抗原を含む。ある実施形態において、バイオコンジュゲートは、本発明のClfA抗原、および黄色ブドウ球菌血清型CP8の莢膜糖（たとえば莢膜多糖）に由来する抗原を含む。ある実施形態において、バイオコンジュゲートは、本発明のHla抗原、および黄色ブドウ球菌血清型CP5の莢膜糖（たとえば莢膜多糖）に由来する抗原を含む。
【０１２２】
宿主細胞を用いてバイオコンジュゲートを作製する方法は、たとえば、WO 2003/074687、WO 2006/119987およびWO2011/138361に記載されている。
【０１２３】
バイオコンジュゲートは、下記を含む宿主細胞において作製することができる：１以上のグリコシルトランスフェラーゼをコードする、１以上の核酸；オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸；本発明のポリペプチドをコードする核酸；ならびに、必要に応じて、ポリメラーゼをコードする核酸（たとえば、wzy）。
【０１２４】
本発明のバイオコンジュゲートを作製するために使用することができる宿主細胞には、古細菌、原核宿主細胞、および真核宿主細胞が含まれる。本発明のバイオコンジュゲートの生産に使用するための代表的な原核宿主細胞には、大腸菌属（Escherichia）の種、赤痢菌属（Shigella）の種、クレブシエラ属（Klebsiella）の種、キサントモナス（Xanthomonas）属の種、サルモネラ属（Salmonella）の種、エルシニア属（Yersinia）の種、ラクトコッカス属（Lactococcus）の種、ラクトバチルス属（Lactobacillus）の種、シュードモナス属（Pseudomonas）の種、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）の種、ストレプトミセス属（Streptomyces）の種、ストレプトコッカス属（Streptococcus）の種、ブドウ球菌属（Staphylococcus）の種、バチルス属（Bacillus）の種、およびクロストリジウム属（Clostridium）の種があるが、それに限定されない。特定の実施形態において、宿主細胞は大腸菌（E. coli）である。
【０１２５】
ある実施形態において、本発明のバイオコンジュゲートを生産するために使用される宿主細胞は、異種核酸、たとえば、１以上のキャリアタンパク質をコードする異種核酸、および／または１以上のタンパク質をコードする異種核酸、たとえば、１以上のタンパク質をコードする遺伝子、を含むように操作されている。特定の実施形態において、グリコシル化経路（たとえば、原核生物および／または真核生物のグリコシル化経路）に関与するタンパク質をコードする異種核酸を、宿主細胞に導入することができる。そのような核酸は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、エピメラーゼ、フリッパーゼ、ポリメラーゼ、および／またはグリコシルトランスフェラーゼなどであるがそれに限定されない、タンパク質をコードしていてもよい。異種核酸（たとえば、キャリアタンパク質をコードする核酸、および／または他のタンパク質、たとえばグリコシル化に関与するタンパク質、をコードする核酸）は、エレクトロポレーション、ヒートショックによる化学的形質転換、自然形質転換、ファージ形質導入、およびコンジュゲーションなどの方法を用いて、宿主細胞に導入することができる。特定の実施形態において、異種核酸は、プラスミドを用いて宿主細胞に導入され、たとえば、異種核酸は、プラスミド（たとえば、発現ベクター）によって宿主細胞内で発現される。別の特定の実施形態において、異種核酸は、国際特許出願PCT/EP2013/068737（WO14/037585として公開）に記載の挿入方法を用いて宿主細胞に導入される。
【０１２６】
（たとえば、組換え技術を用いて）さらなる改変を宿主細胞に導入することができる。たとえば、競合または干渉する可能性のあるグリコシル化経路の一部をなしているタンパク質をコードする（たとえば、宿主細胞に組換え導入される、グリコシル化に関与する１以上の異種遺伝子と、競合または干渉する）宿主細胞核酸（たとえば、遺伝子）を、宿主細胞バックグラウンド（ゲノム）において、それらを不活性／機能不全にするように、欠失させるか、または改変することができる（すなわち、欠失／改変される宿主細胞核酸は、機能的なタンパク質をコードしないか、またはまったくタンパク質をコードしない）。宿主細胞のゲノムから核酸を欠失させる場合、核酸は、望ましい配列、たとえば、糖タンパク質の生産に有用な配列によって置換されていてもよい。
【０１２７】
宿主細胞において欠失させることができる（そして、場合によっては、他の望ましい核酸配列で置換することができる）代表的な遺伝子には、糖脂質生合成に関与する宿主細胞の遺伝子、たとえば、waaL（たとえば、Feldman et al. 2005, PNAS USA 102:3016-3021を参照されたい）、リピドAコア生合成クラスター（waa）、ガラクトースクラスター（gal）、アラビノースクラスター（ara）、コロン酸（colonic acid）クラスター（wc）、莢膜多糖クラスター、ウンデカプレノール-ピロリン酸生合成遺伝子（たとえば、uppS（ウンデカプレニルピロリン酸シンターゼ）、uppP（ウンデカプレニルジホスファターゼ））、Und-Pリサイクリング遺伝子、ヌクレオチド活性化糖生合成に関与する代謝酵素、腸内細菌共通抗原クラスター、およびgtrABSクラスターのようなプロファージO抗原修飾クラスターなどがある。
【０１２８】
このような改変原核宿主細胞は、抗原、たとえば、本発明のポリペプチドに結合した糖抗原を含むバイオコンジュゲートを生産することができる酵素をコードする核酸を含む。このような宿主細胞は、糖抗原の生産に特異的な核酸を自然に発現していてもよいが、宿主細胞はこのような核酸を発現するように作られていてもよく、すなわち、特定の実施形態において、前記の核酸は、宿主細胞に対して異種性である。糖抗原の生産に特異的な前記核酸のうちの１以上は、宿主細胞に対して異種性であり、宿主細胞のゲノムに組み込まれていてもよい。宿主細胞は、タンパク質のN-グリコシル化において活性な酵素をコードする核酸を追加して含んでいてもよく、たとえば、宿主細胞は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸、および／または他のグリコシルトランスフェラーゼをコードする１以上の核酸をさらに含んでいてもよい。
【０１２９】
莢膜多糖遺伝子クラスターを含む核酸配列を、宿主細胞に挿入することができる。たとえば、宿主細胞に挿入される莢膜多糖遺伝子クラスターは、下記のように、ブドウ球菌株（たとえば、黄色ブドウ球菌）由来の莢膜多糖遺伝子クラスターであってもよい。
【０１３０】
宿主細胞は、ハイブリッド多糖を生産することができる遺伝機構（たとえば、グリコシルトランスフェラーゼ、フリッパーゼ、ポリメラーゼ、および／またはオリゴサッカリルトランスフェラーゼ）、ならびに抗原を本発明のポリペプチドに連結することができる遺伝機構をコードする核酸を含む、および／または、含むように改変することができる。
【０１３１】
黄色ブドウ球菌の莢膜多糖は、グラム陰性細菌におけるO多糖合成のポリメラーゼ依存性経路との相同性を共有する保存された経路によって、細菌の膜担体脂質ウンデカプレニルピロリン酸上で構築（assemble）される。O抗原の構築（assenbly）は、DPドナーからウンデカプレニルリン酸への糖リン酸の移動によって開始される。脂質結合O抗原は、さまざまなグリコシルトランスフェラーゼの連続的な作用により、内膜の細胞質側で構築される。その後、糖脂質はペリプラズム腔に移動（flip）して重合する。O抗原リガーゼWaaLをオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBに置き換えることによって、重合したO抗原をリピドAコアではなくタンパク質キャリアに転移させることができる。
【０１３２】
宿主細胞はさらに、多糖の反復単位を生成するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。好ましくは、前記反復単位は、還元末端にヘキソースを含まず、前記の多糖反復単位は、還元末端にヘキソースを含むドナーの多糖反復単位に由来する。
【０１３３】
宿主細胞は、ウンデカプレニルピロリン酸（Und-PP）上にヘキソース単糖誘導体を構築するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含んでいてもよい。ある態様において、ヘキソース単糖誘導体をUnd-PP上に構築するグリコシルトランスフェラーゼは、宿主細胞に対して異種性であり、および／または１以上のグリコシルトランスフェラーゼをコードする１以上の遺伝子に対して異種性である。前記グリコシルトランスフェラーゼは、たとえば、大腸菌属（Escherichia）の種、赤痢菌属（Shigella）の種、クレブシエラ属（Klebsiella）の種、キサントモナス（Xanthomonas）属の種、サルモネラ属（Salmonella）の種、エルシニア属（Yersinia）の種、エロモナス属（Aeromonas）の種、フランシセラ属（Francisella）の種、ヘリコバクター属(Helicobacter)の種、プロテウス属（Proteus）の種、ラクトコッカス属（Lactococcus）の種、ラクトバチルス属（Lactobacillus）の種、シュードモナス属（Pseudomonas）の種、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）の種、ストレプトミセス属（Streptomyces）の種、ストレプトコッカス属（Streptococcus）の種、エンテロコッカス属(Enterococcus)の種、ブドウ球菌属（Staphylococcus）の種、バチルス属（Bacillus）の種、クロストリジウム属（Clostridium）の種、リステリア属（Listeria）の種、またはカンピロバクター属（Campylobacter）の種に由来することができる。通常、ヘキソース単糖誘導体をUnd-PP上に構築するグリコシルトランスフェラーゼは、wecAであり、必要に応じて、大腸菌に由来する（wecAは、UDP-GlcNacからGlcNacをUndP上に構築することができる）。ヘキソース単糖は、グルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノトール、フコースおよびマンノースからなる群から選択することができる（たとえばガラクトース）。
【０１３４】
宿主細胞は、Und-PP上に構築されたヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる、１以上のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含むことができる。たとえば、前記の、ヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる１以上のグリコシルトランスフェラーゼは、Shigella boyedii由来のガラクトシルトランスフェラーゼ（wfeD）、大腸菌（E. coli）O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ（wbeY）、または大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ（wfdK）とすることができる。wfdKおよびwbeYなどのGalfトランスフェラーゼは、Galf（ガラクトフラノース）をUDP-Galfから-GlcNac-P-ウンデカプレニルに転移させることができる。好ましくは、前記のヘキソース単糖誘導体に単糖を付加することができる１以上のグリコシルトランスフェラーゼは、大腸菌O28由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ（wbeY）および大腸菌O167由来のガラクトフラノシルトランスフェラーゼ（wfdK）である。
【０１３５】
宿主細胞は、ドナー多糖反復単位をヘキソース単糖誘導体上に構築するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含んでいてもよい。ドナー多糖反復単位をヘキソース単糖誘導体上に構築するグリコシルトランスフェラーゼは、ドナー多糖の最初の反復単位の還元末端に存在するヘキソース単糖を、ヘキソース単糖誘導体に付加することができるグリコシルトランスフェラーゼを含んでいてもよい。典型的なグリコシルトランスフェラーゼとしては、ガラクトシルトランスフェラーゼ（wciP）、たとえば、大腸菌O21由来のwciPが挙げられる。
【０１３６】
ドナー多糖の反復単位をヘキソース単糖誘導体上に構築するグリコシルトランスフェラーゼは、ドナー多糖の最初の反復単位の還元末端に存在するヘキソース単糖に隣接する単糖を、ドナー多糖の最初の反復単位の還元末端に存在するヘキソース単糖に付加することができるグリコシルトランスフェラーゼを含む。典型的なグリコシルトランスフェラーゼとしては、グルコシルトランスフェラーゼ（wciQ）、たとえば、大腸菌O21由来のwciQが挙げられる。
【０１３７】
宿主細胞は、黄色ブドウ球菌CP5またはCP8遺伝子クラスターから選択される、多糖の反復単位を合成するためのグリコシルトランスフェラーゼを含んでいてもよい。黄色ブドウ球菌CP5およびCP8は、P. aeruginosa O11抗原合成遺伝子と類似した構造を有しているため、これらの遺伝子を大腸菌単糖合成遺伝子と組み合わせて、反復する三糖単位からなるウンデカプレニルピロリン酸結合型CP5またはCP8ポリマーを合成することができる。
【０１３８】
CP5またはCP8の糖の反復単位の合成に十分なグリコシルトランスフェラーゼは、黄色ブドウ球菌CP5またはCP8由来のcapH、capI、capJおよび/またはcapKを含む。必要に応じて、宿主細胞はまた、黄色ブドウ球菌CP5またはCP8由来のcapD、capE、capF、capG、capL、capM、capN、capO、capPを含む。あるいは、宿主細胞はまた、P. aeruginosa O11由来のwbjB、wbjC、wbjD、wbjE、wbjF、wbjL、wbpM、wzzおよび/またはwzx、ならびに大腸菌O16由来のwecB、wecCを含む。
【０１３９】
CP5糖の反復単位の合成に十分なグリコシルトランスフェラーゼは、黄色ブドウ球菌CP5由来のcapH、capI、capJおよび/またはcapKを含む。必要に応じて、宿主細胞はまた、黄色ブドウ球菌CP5由来のcapD、capE、capF、capG、capL、capM、capN、capO、capPを含む。あるいは、宿主細胞はまた、P. aeruginosa O11由来のwbjB、wbjC、wbjD、wbjE、wbjF、wbjL、wbpM、wzzおよび/またはwzx、ならびに大腸菌O16由来のwecB、wecCを含む。
【０１４０】
宿主細胞は、ヘキソース単糖誘導体上でドナー多糖反復単位を構築するグリコシルトランスフェラーゼを含みうるが、これは、ドナー多糖の最初の反復単位の還元末端に存在するヘキソース単糖を、ヘキソース単糖誘導体に付加することができるグリコシルトランスフェラーゼを含む。
【０１４１】
N結合型タンパク質グリコシル化、すなわち標的タンパク質のポリペプチド鎖のアスパラギン残基への炭水化物分子の付加は、小胞体において、脂質キャリア（ドリコールリン酸）から、新生タンパク質の保存配列Asn-X-Ser/Thr（この場合、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸である）内のアスパラギン残基への、あらかじめ構築されたオリゴ糖の転移を担うオリゴサッカリルトランスフェラーゼ酵素コンジュゲート（OST）によって達成される。
【０１４２】
細菌である食物媒介性病原体カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）もまた、それ自身のグリコシル化機構を有しているという事実によって、そのタンパク質をNグリコシル化することができる（Wacker et al. Science. 2002; 298(5599):1790-3）。この反応を担う機構は、（タンパク質グリコシル化のための）"pgl"と呼ばれるクラスターによってコードされている。
【０１４３】
C.ジェジュニのグリコシル化機構を大腸菌に移して、大腸菌細胞により発現される組換えタンパク質のグリコシル化を可能にすることができる。これまでの研究から、Nグリコシル化を行うことができる大腸菌株を作製する方法が明らかになっている（たとえば、Wacker et al. Science. 2002; 298 (5599):1790-3；Nita-Lazar et al. Glycobiology. 2005; 15(4):361-7；Feldman et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005; 102(8):3016-21；Kowarik et al. EMBO J. 2006; 25(9):1957-66：Wacker et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103(18):7088-93；国際公開特許公報番号WO2003/074687、WO2006/119987、WO 2009/104074、およびWO/2011/06261、およびWO2011/138361を参照されたい）。最適化された特性を有するPglB変異体は、WO2016/107818に記載されている。好ましい変異体は、PglBcuo N311V-K482R-D483H-A669Vである。
【０１４４】
オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、Nグリコシル化コンセンサスモチーフ、たとえば、Asn-X-Ser(Thr)、このXはPro以外の任意のアミノ酸とすることができる；またはAsp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)（XおよびZは個別にPro以外の任意の天然アミノ酸から選択される）を含む新生ポリペプチド鎖のアスパラギン残基に、脂質と結合したオリゴ糖を転移させる（WO 2006/119987を参照されたい）。たとえば、WO 2003/074687およびWO 2006/119987を参照されたい。
【０１４５】
宿主細胞は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸は、宿主細胞にとって本来あるものであってもよいし、上記のように遺伝学的アプローチを用いて宿主細胞に導入してもよい。好ましくは、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター、具体的にはカンピロバクター・ジェジュニ由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼである（すなわち、pglB；たとえばWacker et al. 2002, Science 298:1790-1793を参照されたい；たとえばNCBI Gene ID: 3231775, UniProt Accession No. O86154も参照されたい）。
【０１４６】
したがって、黄色ブドウ球菌の莢膜多糖のバイオコンジュゲートは、下記を含む原核宿主細胞内で生産することができる：(i)黄色ブドウ球菌由来の莢膜多糖クラスターに由来するグリコシルトランスフェラーゼであって、このグリコシルトランスフェラーゼが前記宿主細胞のゲノムに組み込まれている、前記グリコシルトランスフェラーゼ；(ii)オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸（たとえば、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）由来のpglB）であって、前記のオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸が、プラスミド媒介性である、および／または宿主細胞のゲノムに組み込まれている、前記核酸；および(iii)本発明のポリペプチドであって、そのポリペプチドがプラスミド媒介性であるか、または宿主細胞ゲノムに組み込まれている、前記ポリペプチド。宿主細胞のwaaL遺伝子は、機能的に不活性化されていても、欠失していてもよく、たとえば、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸、たとえばC.ジェジュニpglBによって置換されていてもよい。
【０１４７】
莢膜多糖の多糖およびオリゴ糖を生産するために、ポリメラーゼ（たとえば、wzy）が宿主細胞に導入される（すなわち、ポリメラーゼは宿主細胞にとって異種である）。黄色ブドウ球菌CP5およびCP8の生産のために、宿主細胞に導入されるポリメラーゼは、黄色ブドウ球菌CP5またはCP8の莢膜多糖遺伝子クラスター（cap5J/cap8I）に由来するwzy遺伝子である。
【０１４８】
最後に、フリッパーゼ（wzxまたはホモログ）を宿主細胞に導入する（すなわち、フリッパーゼは宿主細胞にとって異種である）。フリッパーゼは、野生型反復単位および／またはそれに対応する遺伝子組換え（ハイブリッド）反復単位を、宿主細胞（たとえば大腸菌）の細胞質からペリプラズムに転位させる。したがって、宿主細胞は、フリッパーゼ(wzx)をコードする核酸を含んでいてもよい。好ましくは、黄色ブドウ球菌の莢膜多糖生合成経路のフリッパーゼが宿主細胞に導入される。宿主細胞に導入されるフリッパーゼは、黄色ブドウ球菌CP5またはCP8の莢膜多糖遺伝子クラスターに由来するcapK遺伝子とすることができる。宿主細胞に導入することができる他のフリッパーゼは、たとえば、カンピロバクター・ジェジュニに由来するフリッパーゼ（たとえば、pglK）である。
【０１４９】
本発明のバイオコンジュゲートは、たとえば、クロマトグラフィー（たとえば、イオン交換、陽イオン交換、陰イオン交換、アフィニティー、およびサイズ分画カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の相違によって、またはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製することができる。たとえば、Saraswat et al. 2013, Biomed. Res. Int. ID#312709 (p. 1-18)を参照されたい；また、WO 2009/104074に記載の方法も参照されたい。さらに、バイオコンジュゲートは、精製を容易にするために、本明細書に記載されているか、または別に当技術分野で知られている、異種ポリペプチド配列と融合させることができる。たとえば、Hlaタンパク質は、陽イオン交換による精製のために、HRHRタグのようなペプチドタグを組み込んでいてもよい（たとえば、配列番号12）。特定のバイオコンジュゲートを精製するために使用される実際の条件は、ある程度は、合成戦略、ならびにバイオコンジュゲートの正味の電荷、疎水性、および／または親水性などの要因によって決まるので、当業者には明らかであろう。
【０１５０】
本発明のさらに他の態様は、糖に連結されたClfAまたはHla抗原を含む（またはその抗原からなる）バイオコンジュゲートを製造する方法であって、前記方法は、（i）本発明の宿主細胞を、タンパク質の生産に適した条件下（ならびに、必要に応じて、糖の生産に適した条件下）で培養すること、および（ii）前記宿主細胞によって生産されたバイオコンジュゲートを単離することを含む。
【０１５１】
本発明のさらに他の態様は、本発明の方法によって生産されるバイオコンジュゲートであって、前記バイオコンジュゲートは、ClfAまたはHla抗原に連結された黄色ブドウ球菌多糖を含む。
【０１５２】
免疫原性組成物およびワクチン
本発明の免疫原性組成物は、対象への投与前に医薬組成物に製剤化することができる。ある態様によれば、本発明は、本発明の免疫原性組成物、および製薬上許容される賦形剤または担体を含む、医薬組成物を提供する。
【０１５３】
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物、および製薬上許容される賦形剤または担体を含む、ワクチンを提供する。
【０１５４】
また、本明細書に記載の本発明の免疫原性組成物およびワクチンとともに使用するためのアジュバント組成物も提供される。この組成物は、アジュバント、および製薬上許容される賦形剤または担体を含む。
【０１５５】
当業者は、製薬上許容される賦形剤または担体を選択することができる。たとえば、製薬上許容される賦形剤または担体には、緩衝剤を含めることができるが、緩衝剤は、たとえばトリス（トリメタミン）、リン酸塩（たとえばリン酸ナトリウム）、酢酸塩、ホウ酸塩（たとえばホウ酸ナトリウム）、クエン酸塩、グリシン、ヒスチジン、およびコハク酸塩（たとえばコハク酸ナトリウム）などであって、塩化ナトリウム、ヒスチジン、リン酸ナトリウムまたはコハク酸ナトリウムが適切である。製薬上許容される賦形剤には、塩、たとえば、塩化ナトリウム、塩化カリウムまたは塩化マグネシウムを含めることができる。必要に応じて、製薬上許容される賦形剤は、溶解性および／または安定性を安定化する、少なくとも１つの成分を含む。可溶化剤／安定化剤の例としては、界面活性剤、たとえば、ラウリルサルコシンおよび／またはポリソルベート（たとえば、TWEEN(商標)80）がある。また、安定化剤の例としては、ポロキサマー（たとえば、ポロキサマー124、ポロキサマー188、ポロキサマー237、ポロキサマー338およびポロキサマー407）が挙げられる。製薬上許容される賦形剤には、非イオン性界面活性剤、たとえば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート80（TWEEN(商標)80）、ポリソルベート60（TWEEN(商標)60）、ポリソルベート40（TWEEN(商標)40）、およびポリソルベート20（TWEEN(商標)20）、またはポリオキシエチレンアルキルエーテルを含めることができる（ポリソルベート80が好適である）。他の可溶化剤／安定化剤としては、アルギニン、およびガラス形成ポリオール（たとえば、スクロース、トレハロースなど）が挙げられる。製薬上許容される賦形剤は、防腐剤、たとえばフェノール、2-フェノキシエタノール、またはチオマーサルであってもよい。他の製薬上許容される賦形剤としては、糖類（たとえば、ラクトース、スクロース）、およびタンパク質（たとえば、ゼラチンおよびアルブミン）がある。製薬上許容される担体としては、水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、およびグリセロール水溶液が挙げられる。多数の製薬上許容される賦形剤および担体が、たとえば、E. W. Martin によるRemington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. Easton, PA, 5th Edition (975)に記載されている。
【０１５６】
ある実施形態において、組成物は緩衝剤を含む。液体製剤のpHは、組成物の成分、および対象への投与に必要な適合性を考慮して調整される。液体混合物のpHは、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも5.8、少なくとも6であることが適切である。液体混合物のpHは、9未満、8未満、7.5未満、または7未満とすることができる。他の実施形態において、液体混合物のpHは、4〜9の間、5〜8の間、たとえば5.5〜8の間である。
【０１５７】
適切な緩衝剤は、酢酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、マレイン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、およびトリスから選択することができる。ある実施形態において、緩衝剤は、Na/Na2PO4、Na/K2PO4またはK/K2PO4などのリン酸緩衝液である。
【０１５８】
緩衝剤は、少なくとも6mM、少なくとも10mM、または少なくとも40mMの量で液体混合物中に存在することができる。緩衝剤は、100mM未満、60mM未満、または40mM未満の量で液体混合物中に存在することができる。
【０１５９】
ある実施形態において、本発明の組成物は、細胞の歪みまたは溶解を避けるために、製薬上許容される浸透圧を有する。製薬上許容される浸透圧は、一般に、溶液がほぼ等張性または軽度の高張性を示す浸透圧を有することを意味する。適切には、再構成されたときの本発明の組成物は、250〜750 mOsm/kgの範囲の重量モル浸透圧濃度を有し、たとえば、重量モル浸透圧濃度は280〜500 mOsm/kgの範囲などのように、250〜550 mOsm/kgの範囲とすることができる。
【０１６０】
浸透圧は、たとえば、市販の浸透圧計、たとえばAdvanced Instruments Inc. (USA)から入手可能なAdvanced（登録商標）Model 2020を使用することによって測定することができる。
【０１６１】
「等張化剤」は、生理学的に許容され、製剤と接触している細胞膜を横切る水の正味の流れを防止するために、製剤に適切な張性を付与する化合物である。いくつかの実施形態において、組成物に使用される等張化剤は、塩（または塩の混合物）である。しかしながら、他の実施形態において、組成物は非イオン性等張化剤を含有し、組成物中の塩化ナトリウムの濃度は、100mM未満、たとえば80mM未満、たとえば50mM未満、たとえば40mM未満、30mM未満、特に20mM未満である。組成物のイオン強度は、100mM未満、たとえば80mM未満、たとえば50mM未満、たとえば40mM未満、または30mM未満であってもよい。
【０１６２】
特定の実施形態において、非イオン性等張化剤は、ポリオール、たとえばソルビトールである。ソルビトールの濃度は、たとえば、約3％〜約15％（w/v）の間、たとえば、約4％〜約10％（w/v）の間とすることができる。免疫学的に活性なサポニン画分およびTLR4アゴニストを含有し、等張化剤が塩またはポリオールであるアジュバントが、WO2012/080369に記載されている。
【０１６３】
ある実施形態において、本発明の組成物は、さらに、１以上の塩、たとえば塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、グルタミン酸一ナトリウム、およびアルミニウム塩（たとえば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム）、またはそのようなアルミニウム塩の混合物）を含む。他の実施形態において、本発明の組成物は塩を含有しない。
【０１６４】
本発明はまた、本発明の抗原を製薬上許容される賦形剤または担体と混合するステップを含む、本発明の免疫原性組成物またはワクチンの製造方法を提供する。
【０１６５】
免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の、本発明のタンパク質またはコンジュゲート（たとえば、バイオコンジュゲート）、ならびに他の任意の成分を含む。「免疫学的に有効な量」とは、その量を単回投与または一連の投与の一部として個体に投与することが、治療または予防に有効であることを意味する。この量は、治療を受ける個体の健康状態や体調、年齢、求められる防御の程度、ワクチンの剤型、およびその他の関連要因などに応じて異なる。その量は、日常的な試験で決定することができる比較的広い範囲に収まると予想される。
【０１６６】
ワクチン調製は、概して、Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach” (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York)に記載されている。リポソーム内でのカプセル化は、Fullerton、米国特許第4,235,877号によって記載されている。
【０１６７】
本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、投与のための指示書とともに、容器、パック、またはディスペンサーの中に含めることができる。本発明は、(i) 本発明の免疫原性組成物またはワクチンを含む第1の容器；および(ii) 本明細書に記載のアジュバントを含む第2の容器、を含むキットを提供する。
【０１６８】
アジュバント
ある実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、アジュバントを含むか、またはアジュバントと組み合わせて投与される。本発明の免疫原性組成物と組み合わせて投与するためのアジュバントは、前記免疫原性組成物もしくはワクチンの投与前に、または前記免疫原性組成物もしくはワクチンと併用して、または前記免疫原性組成物もしくはワクチンの投与後に投与することができる。ある実施形態において、前記アジュバントは、投与前に免疫原性組成物と混合される。
【０１６９】
アジュバントは、たとえば、リンパ球の動員、Bおよび／またはT細胞の刺激、およびマクロファージの刺激などの、いくつかのメカニズムによって免疫応答を増強することができる。ある実施形態において、アジュバントは、TH1またはTH2型のいずれかの応答、好ましくはTH1型の応答の、優先的な誘導因子であるように選択される。高レベルのTh1型サイトカインは、所定の抗原に対する細胞性免疫応答の誘導を優先する傾向があり、一方、高レベルのTh2型サイトカインは、抗原に対する液性免疫応答の誘導を優先する傾向がある。Th1型とTh2型の免疫応答の区別が絶対的なものではないことを思い起こすことは重要である。実際には、個体が、主にTh1型であるか、または主にTh2型であると表現される免疫応答を維持することになる。しかしながら、MosmannおよびCoffmanによってマウスCD4 +ve T細胞クローンで説明されたことに関して、サイトカインのファミリーを考慮することは好都合であることが多い（Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties.  Annual Review of Immunology, 7, p145-173）。従来、Th1型応答は、Tリンパ球によるINFγおよびIL-2サイトカインの産生と関連している。Th1型免疫応答の誘導に直接関連することが多い他のサイトカイン、IL-12などは、T細胞によって産生されない。対照的に、Th2型応答は、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10の分泌に関連する。主にTh1型応答を促進する適切なアジュバント系には、以下のものがある：モノホスホリルリピドAまたはその誘導体、特に3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドA（3D-MPL）（その調製については、GB2202011Aを参照されたい）；リポソーム中のMPL、たとえば3D-MPL、およびサポニンQS21、たとえばコレステロールおよびDPOCを含むリポソーム；ならびに、モノホスホリルリピドA、たとえば3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドAと、アルミニウム塩（たとえばリン酸アルミニウムもしくは水酸化アルミニウム）または油中水型エマルジョンのいずれかとを合わせた組み合わせ。このような組み合わせでは、抗原および3D-MPLは、同じ微粒子構造に含まれていてもよく、抗原性シグナルおよび免疫刺激シグナルのより効率的な送出を可能にする。研究から、3D-MPLが、ミョウバンに吸着された抗原の免疫原性をさらに高めることができることが示されている（Thoelen et al. Vaccine (1998)  16:708-14;  EP 689454-B1）。
【０１７０】
ある実施形態において、アジュバントは、TLR4アゴニストおよび免疫学的に活性なサポニンの両者を含む。ある実施形態において、TLR4アゴニストはリポ多糖である。サポニンは、QS21のような、キラヤ（Quillaja Saponaria Molina）の樹皮に由来するサポニンの活性画分を含むことが適当である。適切なリポ多糖は、3D-MPLなどのリピドA誘導体である。特定の実施形態において、リポ多糖は3D-MPLであり、免疫学的に活性なサポニンはQS21である。ある実施形態において、前記アジュバント組成物は、リポソーム製剤中にリポ多糖および免疫学的に活性なサポニンを含む。本実施形態の一形態において、アジュバントは、基本的に3D-MPLおよびQS21から構成され、必要に応じて、好ましくはコレステロールであるステロールを含むことが適切である。
【０１７１】
リポソームのサイズは、リン脂質組成物およびその調製に使用される方法に応じて、30 nmから数μmまでさまざまとなりうる。本発明の特定の実施形態において、リポソームのサイズは、50 nm〜500 nmの範囲であり、さらに他の実施形態では、50 nm〜200 nmの範囲である。好ましくは、リポソームは、安定であるべきであり、濾過による滅菌を可能にするために、約100 nmの直径を有するべきである。
【０１７２】
本発明において有用となりうる他のTLR4アゴニストには、グルコピラノシル脂質アジュバント（GLA）があり、これはたとえば、WO2008/153541もしくはWO2009/143457、または文献、Coler RN et al. (2011) Development and Characterization of Synthetic Glucopyranosyl Lipid Adjuvant System as a Vaccine Adjuvant. PLoS ONE 6(1): e16333. doi:10.1371/journal.pone.0016333、およびArias MA et al. (2012) Glucopyranosyl Lipid Adjuvant (GLA), a Synthetic TLR4 Agonist, Promotes Potent Systemic and Mucosal Responses to Intranasal Immunization with HIVgp140. PLoS ONE 7(7): e41144. doi:10.1371/journal.pone.0041144に記載されている。WO2008/153541またはWO2009/143457は、本発明において有用となりうるTLR4アゴニストを定義する目的で、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７３】
グラム陰性細菌のディープラフ型変異株から抽出されたLPSの酸加水分解によって得られる4'-モノホスホリルリピドA(MPL)は、LPSのアジュバント特性を保持しながら、(ニワトリ受精卵における致死量で評価されるように)1000倍を超える毒性の減少を示す (Johnson et al. 1987 Rev. Infect. Dis. 9 Suppl:S512-S516)。LPSは、典型的には、中程度の強度の鉱酸溶液(たとえば0.1M HCl)中で約30分間還流される。このプロセスは、1位における脱リン酸化、および6'位における脱糖鎖化（decarbohydration）をもたらし、MPLを生じる。
【０１７４】
MPLのマイルドなアルカリ加水分解によって得られる3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)は、さらに毒性が低下している一方で、やはりアジュバント性を維持している。US4,912,094(Ribi Immunochemicals)を参照されたい。アルカリ加水分解は、典型的には、クロロホルム／メタノールの混合物のような有機溶媒中で、pH 10.5の0.5M炭酸ナトリウムのような弱塩基の水溶液で飽和させることによって行われる。3D-MPLの調製に関するこれ以上の情報は、たとえば、US4,912,094およびWO02/078637 (Corixa Corporation)に記載されている。
【０１７５】
キラヤサポニンは、樹木であるQuillaja saponariaの樹皮から抽出されたトリテルペン配糖体の混合物である。未精製サポニンは動物用アジュバントとして広く使用されている。Quil-Aは、キラヤサポニン原料の部分精製水性抽出物である。Quil Aは、南米の樹木キラヤ（Quillaja Saponaria Molina）から単離されたサポニン標品であって、1974年にDalsgaardらによって初めてアジュバント活性を有することが明らかにされた（“Saponin adjuvants”, Archiv. fuer die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254）。Quil Aに伴う毒性を持たずにアジュバント活性を保持するQuil Aの精製フラグメントがHPLCによって単離されており（EP 0 362 278）、それはたとえば、QS7およびQS21である（QA7およびQA21としても知られている）。QS-21は、キラヤの樹皮に由来する天然サポニンであって、CD8+細胞傷害性T細胞（CTL）、Th1細胞、および主要なIgG2a抗体応答を誘導し、本発明との関連において好ましいサポニンである。QS21は、毒性のない、Quil AのHPLC精製画分であり、その製造方法は、（QA21として）米国特許第5,057,540号に開示されている。好ましくは、アジュバントは、実質的に純粋な形でQS21を含み、すなわち、QS21は、少なくとも90％の純度、たとえば少なくとも95％の純度、または少なくとも98％の純度を有する。
【０１７６】
リポ多糖およびキラヤサポニンを組み合わせて含むアジュバントは、すでに、たとえばEP0671948において開示されている。本特許では、リポ多糖（3D-MPL）をキラヤサポニン（QS21）と組み合わせたときの強い相乗効果が実証された。WO2007/068907に記載のように、アジュバント組成物中で、免疫刺激剤としてリポ多糖とキラヤサポニンとを組み合わせることによって、ヒト用量における免疫刺激剤の量が少量の場合であっても、すぐれたアジュバント特性を達成することができる。
【０１７７】
特定の実施形態において、QS21は、たとえばコレステロールなどの外因性ステロールによって抑制（quench）されている、反応原性の低い組成物として提供される。QS21が外因性コレステロールで抑制される、反応原性の低い組成物のいくつかの特定の形態が存在する。特定の実施形態において、サポニン／ステロールは、リポソーム構造の形をとる（WO 96/33739、実施例１）。この実施形態において、リポソームは、適切には室温で非結晶である中性脂質、たとえばホスファチジルコリン、たとえば、卵黄ホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン（DOPC）またはジラウリルホスファチジルコリンを含むことが適切である。また、リポソームは、飽和脂質で構成されるリポソームのために、リポソーム-サポニン構造の安定性を高める、限られた量の荷電脂質を含んでいてもよい。こうした場合、荷電脂質の量は、リポソーム組成物の1〜20％w/wが適切であり、5〜10％w/wであることが好ましい。このような荷電脂質の適切な例としては、ホスファチジルグリセロールおよびホスファチジルセリンが挙げられる。中性リポソームは、5％w/w未満の荷電脂質、たとえば3％w/w未満または1％w/w未満の荷電脂質を含むことが適切である。リン脂質に対するステロールの割合は、1〜50％（mol/mol）であり、20〜25％であることが適切である。
【０１７８】
適切なステロールとしては、β-シトステロール、スティグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール、およびコレステロールが挙げられる。ある特定の実施形態において、アジュバント組成物は、ステロールとしてコレステロールを含む。これらのステロールは、当技術分野でよく知られており、たとえば、コレステロールは、動物性脂肪中に見出される天然由来のステロールとして、Merck Index, 11th Edn、341頁に開示されている。
【０１７９】
活性サポニン画分がQS21である場合、QS21：ステロールの比は、典型的には1:100から1:1(w/w)、適切には1:10から1:1(w/w)、好ましくは1:5から1:1(w/w)の範囲となる。 過剰なステロールが存在することが適切であり、QS21:ステロールの比は少なくとも1:2(w/w)である。ある実施形態において、QS21:ステロールの比は1:5(w/w)である。ステロールは、コレステロールが好適である。
【０１８０】
3D-MPLは、GlaxoSmithKline Biologicals S.A.からMPLの名称で販売されており、本明細書を通じてMPLまたは3D-MPLと呼ばれている。たとえば、米国特許第4,436,727号；第4,877,611号；第4,866,034号および第4,912,094号を参照されたい。3D-MPLは、主にIFN-g（Th1）表現型を有するCD4+ T細胞応答を促進する。3D-MPLは、GB 2 220 211 Aに開示された方法に従って製造することができる。化学的には、3、4、5または6アシル化鎖を有する3-脱アシル化モノホスホリルリピドAの混合物である。好ましくは、本発明の組成物において、小粒子3D-MPLが使用される。小粒子3D-MPLは、0.22μmのフィルターを通して無菌濾過することができるような粒子径を有する。そのような標品は、WO 94/21292に記載されている。
【０１８１】
適切なアジュバント組成物は、リポソームが（WO 96/33739に記載のように）最初にMPLなしで調製され、次いでMPLが、好適には100nm以下の小粒子として、または0.22μm膜を通す無菌濾過を受け入れられる粒子として添加されるものである。したがって、MPLは小胞膜の中には含まれていない(MPL outとして知られている)。MPLが小胞膜の内側に含まれている(MPL inとして知られている)組成物もまた、本発明の一態様を形成する。抗原は、小胞膜の内側に含まれていてもよいし、小胞膜の外側に含まれていてもよい。
【０１８２】
12 gの最大バッチサイズのために、MPL液体バルクの調製は、無菌ガラス容器内でキャリーオーバーされる。MPLの分散は、以下のステップで構成される：注射用蒸留水にMPL粉末を懸濁させる：加熱（熱処理）によって大きな凝集体を脱凝集させる；マイクロ流動化（microfluidisation）により100nmから200nmの間に粒子径を減少させる；Sartoclean Pre-filterユニット、0.8/0.65μm、で標品をプレ濾過する；室温にて標品を無菌濾過する（Sartobran Pユニット、0.22μm）。
【０１８３】
MPL粉末は、安定した水性コロイド分散（無菌濾過に適したサイズのMPL粒子）をもたらすマイクロ流動化によって凍結乾燥される。粒子の粗い10 mg/ml懸濁液を得るために、凍結乾燥されたMPL粉末を注射用蒸留水に分散させる。懸濁液はその後、撹拌条件下で熱処理を受ける。室温に冷却した後、粒子径を小さくするためにマイクロ流動化プロセスを開始する。マイクロ流動化は、流路の最小量（サイクル数：nmin）に対して一定の圧力で、マイクロ流動化インタラクションチャンバーを通して分散液を連続的に循環させることによって、Microfluidics装置M110EHを使用して実施される。サイクル数を表すマイクロ流動化の持続時間は、測定された流量および分散容量に基づいて計算される。所定の装置、所定の圧力で、結果として得られる流量は、インタラクションチャンバーごとにさまざまであり、特定のインタラクションチャンバーのライフサイクルの全体にわたって変動する可能性がある。本実施例において、使用されるインタラクションチャンバーは、F20Y Microfluidicsタイプのものである。マイクロ流動化効率は、圧力 - 流量の2つの組み合わせに関連付けられるので、処理時間は、バッチごとに変動しうる。1サイクルに必要な時間は、流量に基づいて計算される。考慮すべき流量は、装置にMPLを導入する直前に注射用蒸留水で測定された流量である。1サイクルとは、MPLの全量が一度に装置を通過するのに必要な時間（分単位）と定義される。nサイクルを得るために必要な時間は、以下のように計算される：
n×処理するMPL量（ml）／流量（ml/min）
【０１８４】
したがって、サイクル数は、それに応じて合わせられる。実行するサイクルの最小の総計（nmin）は、使用される好ましい装置およびインタラクションチャンバーに対して記載されている。実行するサイクルの総計は、nminサイクル後に実行された粒径測定の結果によって決定される。過去のデータに基づいて、粒径限界（dlim）が定められる。測定は、光子相関分光法（PCS）技術によって実現され、dlimは単一ピークの結果（Zaverage）として表される。この限界に基づいて、マイクロ流動化はnminサイクル後に停止することができる。この限界を超えると、満足のいく粒径減少が得られるまで、マイクロ流動化は、最大でさらに50サイクル継続される。
【０１８５】
マイクロ流動化後すぐに濾過が行われない場合、分散されたMPLは、濾過領域への移行のために準備され、+2〜+8℃で保存される。
【０１８６】
マイクロ流動化の後、分散液を注射用蒸留水で希釈し、層流下で0.22μmフィルターを通して無菌濾過する。最終的なMPL濃度は1 mg/ml（0.80〜1.20 mg/ml）である。
【０１８７】
MPLを含むリポソームの製造工程において、DOPC（ジオレイルホスファチジルコリン）、コレステロール、およびMPLをエタノールに溶解する。真空下で溶媒を蒸発させて脂質膜を形成する。pH6.1のリン酸緩衝生理食塩水（9mM Na2HPO4、41mM KH2PO4、100mM NaCl）を添加し、混合物をプレホモジナイズに続いて15,000psiでの高圧ホモジナイズに供する（約15〜20サイクル）。これにより、無菌（クラス100）エリアにおいて0.22μmメンブレンを通して無菌濾過されたリポソームが生成される。滅菌された生成物は、次に、滅菌されたガラス容器に分配され、低温室（+2〜+8℃）で保存される。
【０１８８】
このようにして製造されたリポソームは、膜内にMPLを含む（WO 96/33739の「MPL in」の実施形態）。
【０１８９】
QS21は望ましい濃度になるように水溶液に添加される。
【０１９０】
アジュバントAS01は、3D-MPL、ならびにQS21をコレステロールにより抑制された形で、含有しており、WO 96/33739に記載のように作製された。より詳細には、AS01アジュバントは、基本的に、WO 96/33739の実施例1.1として調製された。AS01Bアジュバントは、リポソームを含み、リポソームはまた、ジオレイルホスファチジルコリン（DOPC）、コレステロールおよび3D-MPL（1000μgのDOPC、250μgのコレステロールおよび50μgの3D-MPL、それぞれの値はワクチン用量あたり）、QS21（50μg/用量）を含み、リン酸NaCl緩衝液および水を0.5mlの容量となるように含む。
【０１９１】
AS01Eアジュバントは、AS01Bと同じ成分からなるが、より低い濃度であって、500μgのDOPC、125μgのコレステロール、25μgの3D-MPL、および25μgのQS21、リン酸NaCl緩衝液および水を0.5mlの容量となるように含む。
【０１９２】
好ましい実施形態において、本発明で使用されるアジュバントはAS01Eである。
【０１９３】
投与方法
ある態様において、本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、筋肉内投与経路によって投与される。筋肉内投与は、大腿部または上腕部への投与とすることができる。注射は、典型的には針（たとえば、皮下注射針）を介して行われる。典型的な筋肉内用量は、後述するように、0.5 mlである。
【０１９４】
用量
各免疫原性組成物またはワクチン用量中のコンジュゲート抗原の量は、典型的なワクチンにおいて有意な、有害な副作用なしに免疫防御反応を誘導する量として選択される。こうした量は、どの特異的免疫原が採用され、それがどのように提示されるかによって異なる。各タンパク質抗原の含有量は、典型的には、1〜200μgの範囲であるが、1〜100μgの範囲が適切であり、5〜50μgの範囲が適切である。それぞれの糖抗原の含有量は、典型的には0.1〜50μgの範囲であるが、0.1〜10μgの範囲が適切であり、1〜5μgの範囲が適切となる。
【０１９５】
ヒト用に適した量である用量は、一般的に0.25〜1.5 mlであるが、皮膚への投与にはもっと少ない量の0.05 ml〜0.2 mlを用いることができる。ある実施形態において、ヒト用量は0.5 mlである。さらに他の実施形態では、ヒト用量は0.5 mlよりも高く、たとえば0.6、0.7、0.8、0.9または1 mlである。さらに他の実施形態において、ヒト用量は、1ml〜1.5mlの間である。別の実施形態において、より詳細には、免疫原性組成物が小児集団用である場合、ヒト用量は、0.25〜0.5 mlのように0.5 ml未満であってもよい。
【０１９６】
免疫原性組成物が3D-MPLおよびQS21を含むアジュバントを含んでいる場合、QS21および3D-MPLは、免疫原性組成物のヒト用量あたり同じ最終濃度で存在することが好ましい。ある実施形態において、免疫原性組成物のヒト用量は、約25μg、たとえば20〜30μgのレベルで3D-MPLを含み、21〜29μg、または22〜28μg、または23〜27μg、または24〜26μg、または25μgのレベルで3D-MPLを含むことが適切である。ある実施形態において、免疫原性組成物のヒト用量は、約25μg、たとえば20〜30μgのレベルでQS21を含むが、21〜29μg、または22〜28μg、または23〜27μg、または24〜〜26μg、または25μgのレベルでQS21を含むことが好適である。好ましい実施形態において、免疫原性組成物のヒト用量は、最終レベルが25μgの3D-MPL、および25μgのQS21を含む。別の実施形態において、免疫原性組成物のヒト用量は、最終レベルが50μgの3D-MPL、および50μgのQS21を含む。
【０１９７】
免疫原性組成物が3D-MPLおよびQS21を含むアジュバント組成物と組み合わせて使用するためのものである場合、QS21および3D-MPLは、好ましくは、アジュバント組成物のヒト用量あたり同じ最終濃度で存在する。ある実施形態において、アジュバント組成物のヒト用量は、約25μg、たとえば20〜30μgのレベルで3D-MPLを含み、21〜29μg、または22〜28μg、または23〜27μg、または24〜26μg、または25μgのレベルで3D-MPLを含むことが適切である。ある実施形態において、ヒト投与に適した量のアジュバント組成物のヒト用量は、約25μg、たとえば20〜30μgのレベルでQS21を含み、21〜29μg、または22〜28μg、または23〜27μg、または24〜26μg、または25μgのレベルでQS21を含むことが適切である。好ましい実施形態において、アジュバント組成物のヒト用量は、最終レベルが25μgの3D-MPLおよび25μgのQS21のを含む。別の実施形態において、アジュバント組成物のヒト用量は、最終レベルが50μgの3D-MPLおよび50μgのQS21のを含む。
【０１９８】
アジュバントが、液状の抗原組成物と組み合わせて用いるために液状である場合、アジュバント組成物は、想定されるヒト用量の最終容量の約半分であり、ヒト投与に適した量、たとえば、想定されるヒト用量が0.7mlの場合は360μl、または想定されるヒト用量が0.5mlの場合は250μlの量で存在することとなる。アジュバント組成物は、ワクチンの最終的なヒト用量を提供するために、抗原組成物と組み合わせて希釈される。そのような用量の最終容量は、当然、アジュバント組成物の最初の容量およびアジュバント組成物に添加される抗原組成物の量に応じて異なってくる。別の実施形態において、液体アジュバントは、凍結乾燥された抗原組成物を再構成するために使用される。この実施形態では、アジュバント組成物のヒト用量の適量は、ヒト用量の最終容量にほぼ等しい。液体アジュバント組成物は、凍結乾燥抗原組成物の入ったバイアルに添加される。最終的なヒト用量は、0.5〜1.5mlの間で変動しうる。特定の実施形態において、ヒト用量は0.5 mlである。
【０１９９】
予防的および治療的使用
本発明は、本発明の免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与することを含む、対象の細菌感染を治療および／または予防する方法を提供する。特定の実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、対象（たとえば、ヒト対象）のブドウ球菌属細菌による感染の予防に使用される。黄色ブドウ球菌は、さまざまな哺乳動物（ウシ、イヌ、ウマ、およびブタを含む）に感染するが、本発明で使用するのに好ましい対象はヒトである。
【０２００】
特定の実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ブドウ球菌属の種、より詳細には黄色ブドウ球菌による感染を治療または予防するために使用される。たとえば、本発明の免疫原性組成物は、院内感染を含む黄色ブドウ球菌感染を予防するために使用することができる。
【０２０１】
また、本発明の免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与することを含む、ブドウ球菌属細菌、より詳細には黄色ブドウ球菌に対する免疫応答を対象において誘導する方法も提供される。ある実施形態において、前記対象は、投与時点で細菌感染を有する。別の実施形態において、前記対象は、投与時点で細菌感染を有していない。本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、ブドウ球菌属の種、より詳細には黄色ブドウ球菌に対する免疫応答を誘導するために使用することができる。
【０２０２】
また、本発明の免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与することを含む、ブドウ球菌属細菌、より詳細には黄色ブドウ球菌に対するオプソニン作用抗体の産生を、対象において誘導する方法も提供される。ある実施形態において、前記対象は、投与時点で細菌感染を有する。別の実施形態において、前記対象は、投与時点で細菌感染を有していない。
【０２０３】
また、本発明の免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与することを含む、対象においてブドウ球菌Hla、ClfA、および/またはSpAの活性を中和し、または低下させることができる抗体の産生を誘導する方法も提供される。前記Hla活性は、ヒト赤血球を溶解する能力であるとすることができる（溶血）。前記ClfA活性は、ヒトフィブリノーゲンに結合する能力であるとすることができる。前記SpA活性は、免疫グロブリン（Ig）のFcγおよびVH3型B細胞受容体のFab部分に結合する能力とすることができる。
【０２０４】
また、本発明の免疫原性組成物またはワクチンを宿主に投与することを含む、ブドウ球菌感染、より詳細には黄色ブドウ球菌感染に対してヒト宿主を免疫化する方法も提供される。
【０２０５】
また、ブドウ球菌属細菌、より詳細には黄色ブドウ球菌に対する免疫応答を対象において誘導する方法も提供されるが、その方法は、治療もしくは予防に有効な量の、本発明の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む。
【０２０６】
また、本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、疾患の治療および／または予防の方法、たとえば、ブドウ球菌感染、より詳細には黄色ブドウ球菌感染によって引き起こされる疾患の治療または予防の方法において使用するために提供される。
【０２０７】
また、本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、ブドウ球菌感染、より詳細には黄色ブドウ球菌感染によって引き起こされる疾患の治療または予防のための薬剤の製造において提供される。
【０２０８】
また、疾患を治療および／または予防する方法、たとえばブドウ球菌感染、より詳細には黄色ブドウ球菌感染によって引き起こされる疾患を治療または予防する方法に使用するための薬剤を製造するために、本発明の免疫原性組成物またはワクチンの使用が提供される。
【０２０９】
また、本発明の免疫原性組成物またはワクチンを含む、ブドウ球菌感染、より詳細には黄色ブドウ球菌感染を治療または予防するための医薬品も提供される。
【０２１０】
また、本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、ブドウ球菌属細菌、より詳細には黄色ブドウ球菌に対する対象の免疫応答を誘導する方法に使用するために提供される。
【０２１１】
また、本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、ブドウ球菌属細菌、より詳細には黄色ブドウ球菌に対する対象のオプソニン作用抗体の産生を誘導する方法に使用するために提供される。
【０２１２】
また、本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、本発明の免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与することを含む、対象においてブドウ球菌Hla、ClfAおよび/またはSpAの活性を中和し、または低下させることができる抗体の産生を誘導する方法に使用するために提供される。前記Hla活性は、ヒト赤血球を溶解する能力とすることができる（溶血）。前記ClfA活性は、ヒトフィブリノーゲンに結合する能力とすることができる。前記SpA活性は、免疫グロブリン（Ig）のFcγおよびVH3型B細胞受容体のFab部分に結合する能力とすることができる。
【０２１３】
本特許明細書の中で引用されたすべての参考文献または特許出願は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２１４】
本発明の態様は、次の番号を付した項目に要約される：
1. a. ClfA抗原；
b. Hla抗原；
c. SpA抗原；および
d. ブドウ球菌莢膜多糖
を含む、免疫原性組成物。
2. 莢膜多糖がキャリアタンパク質にコンジュゲートしている、第１項に記載の免疫原性組成物。
3. 莢膜多糖類が黄色ブドウ球菌血清型5型および／または8型莢膜多糖である、第1項または第2項に記載の免疫原性組成物。
4. 莢膜多糖が第１項の抗原(a)〜(c)のうち1つとコンジュゲートしている、第1項〜第3項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
5. 組成物が黄色ブドウ球菌血清型5型莢膜多糖および8型莢膜多糖を含む、第1項〜第4項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
6. 組成物が、Hla抗原にコンジュゲートした黄色ブドウ球菌血清型5型莢膜多糖、および／またはClfA抗原にコンジュゲートした8型莢膜多糖を含む、第1項〜第5項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
7. 第1項〜第6項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物であって、
a. ClfA抗原が、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号2と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％同一なアミノ酸配列を含むClfAタンパク質、またはその免疫原性断片である；
b. Hla抗原が、配列番号3のアミノ酸配列、または配列番号3と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列を含むHlaタンパク質、またはその免疫原性断片である；および／または
c. SpA抗原が、配列番号13もしくは配列番号26のアミノ酸配列、または配列番号13もしくは配列番号26と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％同一なアミノ酸配列を含むSpAタンパク質、またはその免疫原性断片である、
前記免疫原性組成物。
8. ClfA抗原が配列番号2のアミノ酸配列のP116S及びY118A（または、配列番号2と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％同一なアミノ酸配列中の同等な位置の置換）から選択される、少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、必要に応じて配列番号5〜7もしくは32のいずれか1つの配列を含む、第1項〜第7項のいずれか１項に記載の組成物。
9. ClfA抗原が、D/E-X-N-Z-S/T（配列番号28）およびK-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号29）から選択される１以上のPglBコンセンサス配列を含み、このXおよびZは個別に、プロリン以外の任意のアミノ酸である、第7項または第8項に記載の免疫原性組成物。
10. 前記コンセンサス配列が、配列番号2のアミノ酸残基313-342の間の１以上のアミノ酸の位置に付加されているか、もしくはそのアミノ酸に代えて置換されており、必要に応じて、I337の位置のアミノ酸に代えて置換されている、または、配列番号2と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％同一なアミノ酸配列中の同等な位置に、付加されているか、もしくはそのアミノ酸に代えて置換されており、必要に応じて、I337と同等の位置のアミノ酸に代えて置換されている、第9項に記載の免疫原性組成物。
11. XがQ（グルタミン）であり、ZがA（アラニン）である（たとえば、K-D-Q-N-A-T-K、配列番号31）、第9項または第10項に記載の免疫原性組成物。
12. ClfA抗原が配列番号7または配列番号32の配列を含むか、またはその配列からなる、第11項に記載の免疫原性組成物。
13. Hla抗原が、配列番号3のH35の位置、または配列番号3と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置に、アミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換が必要に応じてHからLへの置換である、第1項〜第12項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
14. Hla抗原が、D/E-X-N-Z-S/T（配列番号28）およびK-D/E-X-N-Z-S/T-K（配列番号29）から選択される１以上のPglBコンセンサス配列を含み、このXおよびZが個別に、プロリン以外の任意のアミノ酸である、第1項〜第13項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
15. 前記コンセンサス配列が、配列番号3のアミノ酸配列、または配列番号3と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列の、１以上のアミノ酸に付加されているか、またはそのアミノ酸に代えて置換されている、第14項に記載の免疫原性組成物。
16. 前記コンセンサス配列が、配列番号3のK131の位置、または配列番号3と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置のアミノ酸に代えて置換されている、第14項に記載の免疫原性組成物。
17. XがQ（グルタミン）であり、ZがR（アルギニン）である（たとえば、K-D-Q-N-R-T-K（配列番号30））、第14項〜第16項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
18. Hla抗原が、配列番号11または配列番号12の配列を含むか、またはその配列からなる、第17項に記載の免疫原性組成物。
19. SpA抗原が、(a) VH3への結合を阻害または減少させる、ドメインE、D、A、BもしくはCのVH3結合サブドメインにおける１以上のアミノ酸置換、および(b) IgG Fcへの結合を阻害または減少させる、ドメインE、D、A、BもしくはCのIgG Fc結合サブドメインにおける１以上のアミノ酸置換を含む、第1項〜第18項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
20. 第1項〜第19項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物であって、SpA抗原が、(i) 配列番号14のアミノ酸位置34および35、または配列番号14と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインE；配列番号15のアミノ酸位置39および40、または配列番号15と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインD；配列番号16のアミノ酸位置36および37、または配列番号16と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインA；配列番号17のアミノ酸位置36および37、または配列番号17と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインB；および／もしくは、配列番号18のアミノ酸位置36および37、または配列番号18と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインCを含む、ならびに／または、(ii) 配列番号14のアミノ酸位置7および8、または配列番号14と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインE；配列番号15のアミノ酸位置12および13、または配列番号15と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインD；配列番号16のアミノ酸位置9および10、または配列番号16と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインA；配列番号17のアミノ酸位置9および10、または配列番号17と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同
一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインB；および／もしくは、配列番号18のアミノ酸位置9および10、または配列番号18と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置にアミノ酸置換を有するドメインCを含む、免疫原性組成物。
21. 前記アミノ酸置換が、グルタミンに対するリジン置換および／またはアスパラギン酸に対するアラニン置換である、第20項に記載の免疫原性組成物。
22. SpA抗原が、配列番号15のアミノ酸位置4および5、または配列番号15と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列内の同等の位置に、アミノ酸置換を有するドメインDを含む、第1項〜第21項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
23. 前記アミノ酸置換が、グルタミンからリジン、および／またはグルタミンからアルギニン、たとえばQQからKRへの置換である、第22項に記載の免疫原性組成物。
24. 前記SpA抗原が、配列番号19〜23、26もしくは27のアミノ酸配列、または配列番号19〜23、26もしくは27と少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％もしくは99％同一なアミノ酸配列を含む、第1項〜第23項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
25. 前記免疫原性組成物が、(i) 配列番号7または配列番号32のアミノ酸配列を含むClfA抗原；(ii) 配列番号11または配列番号12のアミノ酸配列を含むHla抗原；(iii) 配列番号27のアミノ酸配列を含むSpA抗原；(iv) 黄色ブドウ球菌血清型5型莢膜多糖、および(v)黄色ブドウ球菌血清型8型莢膜多糖、を含む、第1項〜第24項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
26. ClfA抗原が黄色ブドウ球菌血清型8型莢膜多糖とコンジュゲートし、Hla抗原が黄色ブドウ球菌血清型5型莢膜多糖とコンジュゲートしている、第25項に記載の免疫原性組成物。
27. 前記ClinfA-CP8およびHla-CP5コンジュゲートがバイオコンジュゲートである、第26項に記載の免疫原性組成物。
28. 組成物がアジュバントを含む、第1項〜第27項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
29. アジュバントがサポニンおよびリポ多糖を含む、第28項に記載の免疫原性組成物。
30. アジュバントが、リポソームの形態で、サポニン、リポ多糖を含む、第29項に記載の免疫原性組成物。
31. ステロールをさらに含む、第29項または第30項に記載の免疫原性組成物。
32. サポニンが、キラヤ（Quillaja Saponaria Molina）の樹皮に由来する、免疫学的に活性なサポニン画分である、第29項〜第31項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
33. サポニンがQS21である、第32項に記載の免疫原性組成物。
34. リポ多糖がリピドA誘導体である、第29項〜第33項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
35. リポ多糖が3D-MPLである、第34項に記載の免疫原性組成物。
36. ステロールがコレステロールである、第31項〜第35項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
37. 免疫原性組成物が、ヒト用量あたり25μgのレベルのQS21を含む、第29項〜第36項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
38. 免疫原性組成物が、ヒト用量あたり25μgのレベルの3D-MPLを含む、第29項〜第37項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
39. 第1項〜第27項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、および製薬上許容される賦形剤または担体を含む、ワクチン。
40. 第28項〜第38項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、および製薬上許容される賦形剤または担体を含む、ワクチン。
41. ブドウ球菌感染を予防または治療する方法に使用するための、第1項〜第27項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、または第39項に記載のワクチンであって、前記組成物がアジュバントと組み合わせて投与される、免疫原性組成物またはワクチン。
42. 免疫原性組成物が、対象への投与前にアジュバントと混合される、第41項に記載の使用のための免疫原性組成物またはワクチン。
43. アジュバントが、第29項〜第36項のいずれか1つにおいて定義されるものである、第41項または第42項に記載の使用のための免疫原性組成物またはワクチン。
44. アジュバントが、ヒト用量あたり25μgのレベルの3D-MPLおよびヒト用量あたり25μgのレベルのQS21を含む、第43項に記載の使用のための免疫原性組成物またはワクチン。
45. (i) 第1項〜第27項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、または第39項に記載のワクチンを含む第1の容器；および(ii) アジュバントを含む第2の容器、を含むキット。
46. アジュバントが、第29項〜第36項のいずれか1つにおいて定義されるものである、第45項に記載のキット。
47. アジュバントが、ヒト用量あたり25μgのレベルの3D-MPL、およびヒト用量あたり25μgのレベルのQS21を含む、第46項に記載のキット。
48. ブドウ球菌感染を予防または治療する方法であって、第1項〜第27項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、または第39項に記載のワクチンを、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
49. 前記対象にアジュバントを投与することをさらに含む、第48項に記載の方法。
50. 前記アジュバントが免疫原性組成物と同時に投与される、第49項に記載の方法。
51. アジュバントが、第29項〜第36項のいずれか1つにおいて定義されるものである、第49項または第50項に記載の方法。
52. ブドウ球菌感染を予防または治療する方法であって、第28項〜第38項のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、または第40項に記載のワクチンを、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
53. 項目のうちいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチンを製造する方法であって、抗原および、必要に応じてアジュバントを、製薬上許容される賦形剤と混合するステップを含む、前記方法。
【実施例】
【０２１５】
実施例１：ワクチン組成物および製剤
ワクチン成分
1つのグリコシル化部位、H35L/H48C/G122C変異、およびC末端HRHRタグ（配列番号12、FlgLシグナル配列を用いて発現される）を含むHlamutに連結された、6〜20個の反復単位を含むCP5のバイオコンジュゲートは、黄色ブドウ球菌莢膜多糖CP5、131位にグリコシル化部位およびC末端ヒスチジン-アルギニン-ヒスチジン-アルギニンタグを有する黄色ブドウ球菌キャリアタンパク質HlaH35L-H48C-G122C、ならびにカンピロバクター・ジェジュニのオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBcuo N311V-K482R-D483H-A669Vをコードするプラスミドで形質転換した大腸菌細胞のフェッドバッチ発酵によって作製した。
【０２１６】
PglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V、および黄色ブドウ球菌CP8（W3110 waaL::pglBcuo N311V-K482R-D483H-A669V; O16::O11_ wbjB-wbpM; ΔrmlB-wecG; wecA-wzzE::CP8_p2636(CCW)_Cat）を発現し、ClfAmutをコードするプラスミドで形質転換された、大腸菌細胞のフェドバッチ醗酵によって、1つのグリコシル化部位およびP116S/Y118A変異を有するClfA N2/N3ドメイン(配列番号7)を含むClfAmutに連結された、5〜16個の反復単位を含むCP8のバイオコンジュゲートを作製した。
【０２１７】
さまざまな製剤中で、バイオコンジュゲートの安定性を検討した。バッチごとに3つの異なる製剤の安定性を、上記の表に報告されている分析パネルの一部を適用して、-80℃（長期）、+4℃（中間）および+25℃で、3ヶ月まで検討し、タンパク質および多糖の安定性に関して、含有量、純度、凝集、分解を評価した。
【０２１８】
CP5-HlaおよびCP8-ClfAバイオコンジュゲートは、4℃および-80℃で少なくとも3ヶ月間、25℃で最大3ヶ月間安定であった。
【０２１９】
SpAバリアント（SpAKR-KKAA、本明細書ではSpAmutと表示され、配列番号27の配列を含有し、WO2015/144653に記載される）は、IgG結合部分（IgG結合ドメインEDABC）を含んでおり、そのIgG結合部分は5つのIgBDのそれぞれにおいて4つの重要残基にアミノ酸置換（グルタミンおよびアスパラギン酸がそれぞれリジンおよびアラニンに変化）を有するが、それは、IgGおよびIgMの結合を著しく阻害するものであり、さらにIgG結合部分のQ70およびQ71に対応する2つの免疫グロブリン結合残基（全長タンパク質のQ96およびQ97）にもアミノ酸置換を有し、それぞれリジン70およびアルギニン71に変異していた（K70およびR71）。SpAmutは、表面プラズモン共鳴実験により、ヒトIgGおよびIgMに対する検出可能な親和性を持たないことが示され、その分子はワクチンとしての使用にとってより安全なものとなった。SpAmutは、市販の大腸菌BL21（DE3）株を用いた細菌バッチ発酵によって組換え型として発現された。
【０２２０】
加速安定性試験は、4つの適当な製剤緩衝液中で、4℃、室温および37℃にて、3日間、10日間および30日間、保存した後に、タンパク質の分析のために、SDS-PAGEおよびSE-UPLCを使用して行った。
【０２２１】
SpAmutは、4℃で3ヶ月まで安定であり、25℃で10日まで安定であり、37℃では4日まで安定であった。
【０２２２】
ワクチン製剤
マウス免疫化試験のための製剤を、アジュバント無添加で、ならびにAS01E（リポソーム組成物中3D-MPL + QS21、上記）およびAlum/TLR7（AlOHに吸着したTLR7アゴニスト、WO2011/027222、Example 20、WO2012/031140、およびBagnoliら、Bagnoli et al, PNAS, 2015, 112: 3680-3685に記載）によるアジュバント添加で、調製した。3つの成分（CP5-Hla、CP8-ClfA、SpAmut）を、タンパク質含有量に基づいて、各成分ごとに200μg/mlの濃度（2倍濃縮、ここでは最終的な高用量に関して2Xと呼ぶ）で、同一バイアル中で製剤化した。さまざまな最終製剤を得るために、3つの混合成分を含むバイアル2Xを、免疫化の前に、臨床混合アプローチによって、製剤緩衝液（10mM NaH2PO4、150mM NaCl pH 6.5）またはアジュバント（2倍濃縮、アジュバントの最終用量に関して）で再構成した。求める最終タンパク質濃度である100μg/ml（10μg/100μlに相当する）となるように、1容のバイアル2Xを、同等量のAS01B（AS01Eと比較して2倍濃縮）、または、Alum/TLR7（2倍濃縮、20μg/用量のAlum/TLR7）、または、その代わりに、アジュバント無添加群用の製剤緩衝液で、再構成することによって、高タンパク質用量が得られた。中程度および低タンパク質用量は、その代わりに、最終タンパク質濃度である10μg/ml（1μg/100μlに相当する）および1μg/ml（0.1μg/100μlに相当する）となるように同等量のAS01B（2X）またはAlum/TLR7（2X）で最終的な再構成をする前に、バイアル2Xを製剤緩衝液でそれぞれ1対10および1対20にあらかじめ希釈するステップで得られた。製剤緩衝液は対照群の希釈剤として使用された。適合性試験は、ミックス2Xを有するバイアルについて、ならびにアジュバントまたはプラセボによる希釈工程後、の両方の場合について、製剤の短期安定性を評価するために実施された（2〜8℃の保存条件で24時間まで）。以下のパラメータを評価することによって、広範な分析パネルを適用し、製剤の特性を評価した：
1. 物理化学的（目視検査、pH、浸透圧）
2. 抗原同一性（タンパク質および糖の両者の、それぞれの単一成分のウエスタンブロット）
3. 総タンパク質含有量（μBCA）
4. 無菌性（プレート増殖による微生物汚染）
5. AS01粒径（DLS）
6. Alum/TLR7回収率(RP-HPLC)
【０２２３】
前臨床試験で評価対象とされた抗原/アジュバントまたはプラセボの組み合わせには、大きな不適合性は認められなかった。
【０２２４】
実施例２：AS01EまたはALUM/TLR7をアジュバントとして添加したワクチンに対するマウスおよび事前暴露ウサギにおける免疫原性
ワクチン製剤を使用して、異なる動物種を免疫化した：
i) ナイーブマウス、これは、ワクチン成分に特異的なIgGおよびT細胞応答の両方のin vivo誘導を検討するためである。これらの研究において、ワクチンは、アジュバント無添加で、またはAS01EもしくはAlum/TLR7をアジュバントとして添加して、異なる接種用量でテストした。
ii) 黄色ブドウ球菌に事前暴露されたウサギ、これは、ワクチン成分に特異的なIgGが既存レベルで存在しているモデルにおいて、ワクチンに対する反応を評価するためである。この研究において、AS01Eをアジュバントとして、またはアジュバント無添加で、さまざまな用量でワクチンをテストした。ウサギ細胞上にアゴニスト受容体がないため、このモデルではAlum /TLR7アジュバントは使用できなかった。
【０２２５】
特異的な免疫応答は以下の方法で評価した：
a) ルミネックス（Luminex）技術を用いて、ワクチン接種後の異なる時点でマウスおよびウサギの免疫血清中の抗原特異的IgGを測定する。
b) 免疫接種を受けたマウスの脾臓におけるワクチン抗原に特異的なCD4+ T細胞の存在を評価する。
c) マウスおよびウサギの血清中に存在する抗体が、2つのタンパク質成分である野生型Hla抗原およびClfA抗原の生物学的活性を中和する能力を測定する。
【０２２６】
研究の概要を表1に示す。
【０２２７】
【表１】
2021514387.tif 000004
2021514387.tif 000005
【０２２８】
マウスの免疫化
5週齢の雌のマウスに、緩衝液または試験用製剤の100μlを2回28日間隔でIMルートで投与した（それぞれの後脚大腿四頭筋に50μl）。血液サンプルは、1回目の注射の前（0日目）、1回目の注射の1週間後、2週間後および4週間後（1wp1、2wp1、4wp1）、ならびに第2回目の注射の1週間後、2週間後、4週間後、8週間後、12週間後および16週間後（1wp2、2wp2、4wp2、8wp2、12wp2、16wp2）に採取した。実験のばらつきを評価するために、実験を3回繰り返した。統計分析は各群のプールされたサンプルについて行った。3回の実験で使用したマウスの総数とともに研究の概要を表2に示す。
【０２２９】
【表２】
2021514387.tif 000006
【０２３０】
ワクチン特異的IgGの評価
マウスおよびウサギにおいてワクチン特異的IgGを評価するための血清学的分析は、ルミネックス技術による多重アッセイに基づいて行った。この技術は、黄色ブドウ球菌に対するワクチンで免疫化された対象のヒト血清中の抗体を測定するために使用されている（Raedler et. al, Clin Vaccine Immuno 2009, 16: 739-49）。
【０２３１】
このアッセイは、3種類のSA組換えタンパク質（SPAmut、ClfAmut、Hlamut）、および異なる血清型の2種類の莢膜多糖（CP5およびCP8）でコーティングされた磁気ビーズを用いて、5つの抗原を同時に（5重）分析する。タンパク質抗原は、N-ヒドロキシスルホスクシンイミドで促進されるカルボジイミド(EDC)によるコンジュゲーション化学を用いて、微粒子の遊離カルボキシル基に共有結合される。CP5およびCP8は、ビオチンヒドラジド（BH）およびEDCを用いてビオチン化され、精製され、その後、ストレプトアビジンビーズに結合される。
【０２３２】
HlaH35R+ClfAmut+CP5-TT+CP8-TT+SpAmut-10μg/Alum/TLR7で免疫した5匹のマウスからD12ポスト2で採取した高免疫血清をプールして、5価標準血清を調製した。100 RLU/mlの任意の力価を5価標準に割り当てた。
【０２３３】
アッセイは、以下の基準にしたがって設定した。
5つの抗原間の交差反応性は、単一設定と多重設定で得られたシグナルの比較では認められなかった。
アッセイの特異性は、多重事前吸着試験により確認された。
アッセイ内およびアッセイ間の、アッセイの再現性（それぞれ、％CV＜10％および20％）。
標準血清および被検血清で得られた 5PL MFI 曲線の直線範囲における直線性評価：R2値＞0.9。
各抗原の検出下限（LLOD、下表を参照されたい）は、ブラック（black）サンプルからの平均RLUとして決定した。
定量下限（LLOQ、下表を参照されたい）：1:1000の最低限度までの希釈（Minimum Required Diliution、MDR）を用いて、許容できる精度（スパイク実験ではCV<20％）で測定することができた、より低い力価。
【０２３４】
2021514387.tif 000007
【０２３５】
試料試験のために、最大5つの漸増希釈液を独立して調製し、十分量の結合微粒子とともに96ウェルプレートに加えた。各希釈液を2連でテストした。抗原特異的抗体は、抗マウスIgGフィコエリトリン標識二次抗体によって明らかにし、MFIはLuminex 200 Readerを用いて測定した。
【０２３６】
解析は、異なる時点で各群について３回の実験によって行った。各抗原および用量に関する実験間の生物学的変動を評価するために、混合計画二元配置分散分析（2-way mixed ANOVA）を適用した（「群」および「実験」を固定効果、「個々のマウス」を変量効果とした）。用量0.1μgのClfAmutとHlamut（p値=0.001）を除き、有意な群-実験相互作用は観察されなかった。
【０２３７】
マウス試験（図1、0.1μg投与時のデータは示されていない）の総合的な結果から、以下のことが示された：
すべてのワクチン成分はマウスにおいて免疫原性を示した。対照群（10、11および12）は、5つの抗原のいずれに対しても検出可能な抗体を示さなかった。同様に、Hlamut抗原を除いて、免疫前の血清中に検出可能なIgGは測定されなかったが、Hlamut抗原に関する推定力価の14％はLLOQをわずかに超えていた。
アジュバントを含有しないワクチンに対する反応は、アジュバントを含むワクチンに対する反応よりも常に劣っていた。
アジュバントの有無にかかわらず、すべての群で有意な用量効果が認められた(一元配置分散分析（1-way ANOVA）を適用し、Tukeyの "Honest Significant Difference "を用いて多重比較のための調整を行った)。より詳細には：
アジュバントなし：2回目の免疫化後の全抗原について0.1μg < 1μg < 10μg（p値<0.01、Tukeyの事後検定）。
AS01E：任意の時点でのClfAmut、HLAmutおよびSpAmutについて0.1μg < 1μg < 10μg（p値<0.05、Tukeyの事後検定）；CP8については0.02μg < 0.2μg≦2μg（多糖ベースの用量）（p値<0.05、Tukeyの事後検定）。CP5の場合2回目の免疫化後0.02μg＝0.2μg＞2μg（p値＜0.0001、Tukeyの事後試験）。
Alum/TLR7: ClfAmutおよびSpAmutについては、いずれの時点でも0.1μg＜1μg≧10μg（p値＜0.05、Tukeyの事後試験）。一方、CP5については2回目の免疫化後に0.02μg＝0.2μg＞2μg（多糖ベース）（p値＜0.05 Tukeyの事後検定）、CP8については任意の時点で0.02μg＜0.2μg＞2μg（p値＜0.05、Tukeyの事後検定）、HLAmutついては最終的に0.1μg＜1μg≦10μg。
最高のIgG力価を得るためには2回の免疫化が必要であった（p値<0.01、Tukeyの事後試験）。
【０２３８】
事前暴露ウサギの選択と試験デザイン
合計350羽のウサギをELISA法でスクリーニングし、ワクチンに含まれる3種類のタンパク質抗原および2種類の多糖に対する既存の抗体を血清中において測定した。ELISA分析から、吸光度A450nm = 0.2が1/100希釈でのIgG反応を測定するための検出限界であり、すべてのウサギが少なくとも1つの抗原に対して陽性であることが示された。
【０２３９】
表3に示す試験デザインに沿ってウサギ群を構成するために、84羽のウサギの選抜を行った。
【０２４０】
【表３】
2021514387.tif 000008
【０２４１】
350羽のウサギを、ELISA結果がA450nmで0.2より大となる抗原の数（すなわち5つ、4つ、3つ、2つ、または≦1つの抗原についてELISA＞0.2となる）に基づいて5つのサブグループ（層）に分けた。「5抗原陽性」または「4抗原陽性」の2つの層のそれぞれに属するすべてのウサギ（合計n=35）を試験に含めるように選択し、7つの実験群（各群に対して合計n=5）に無作為に割り付けた。その他の必要なウサギは、「３抗原陽性」層（n=102）から選んだが、そこでは追加的な選択基準を適用した。3抗原陽性群では、ClfA 陽性のウサギ（n=64）のみを本試験の対象とし、その中でHla抗原およびSpA抗原の両方のELISA結果が四分位間範囲内となるウサギのみを本試験の対象とした（n=51）。51羽のウサギのうち 49羽を無作為に選択し、7試験群（各群につき合計n=7）の1つに割り付けた。
【０２４２】
ウサギの免疫化
抗原の最終用量および注射量に応じて適切な濃縮および希釈ステップを用いて、事前暴露ウサギでテストされるワクチン製剤を調製するために、上記と同じ臨床混合アプローチを用いた。
【０２４３】
事前暴露されたウサギ（12〜14週齢の雄）に、1日目および29日目の28日間隔で、製剤緩衝液のみの投与（対照群）または6種類の試験用ワクチン製剤のうち1種類を2回、IM経路で投与した。血液サンプルは、1回目の注射前（0日目）、1回目の注射の1週間後、2週間後、および4週間後（1wp1、2wp1、4wp1）、ならびに2回目の注射の2週間後および５週間後（2wp2、5wp2）に採取した。
【０２４４】
ワクチン特異的IgGの評価
ウサギにおけるワクチン特異的IgGの測定に使用したアッセイは、上記のLumunexで5重で実施した。ウサギアッセイは96ウェルの形態で構築した。
【０２４５】
5つの抗原すべてに対する高度免疫1価ウサギポリクローナル血清をプールすることによって、5価標準血清を調製した。すべての抗原に対して50000 RLU/mlの任意力価を5価標準に割り当てた。
【０２４６】
アッセイは、上記の基準に従って設定された。アッセイ間の再現性を測定した（%CV <15%）。直線性評価は、R2値＞0.9が得られた。LODおよびLOQは下記に報告される。
【０２４７】
2021514387.tif 000009
【０２４８】
試料試験のために、8連続の3倍希釈（1:100から始まる）を自動的に調製し、適切な量の結合微粒子を有する96ウェルのシングルプレート上にロードした。抗原特異的抗体は、抗ウサギFab2 IgGによって明らかにした。フィコエリトリン標識二次抗体およびMFIは、Luminex Flexmap 3D Readerを用いて測定した。各サンプル／抗原のIgG力価は、5PL曲線から得られたすべての有効な個々の力価の中央値を推定することによって測定された。
【０２４９】
1回目の免疫化の4週間後、および2回目の免疫化の2週間後における抗ClfAmut、抗Hlamut抗CP5、抗CP8および抗SpAmutの幾何平均力価（GMT）は、7つのグループすべてにおいて接種前より統計的に有意な増加を示した（図3）。2回目の免疫化の2週間後の抗体価は1回目の免疫化後よりも高かった。2回目の免疫化の2週間後に、すべてのワクチン接種群は、抗体価があらゆる時点で緩衝液対照群と同様であったHlamutを除く全ての抗原について、緩衝液対照群と比較して統計的に有意に高い抗体反応を示した。2回目の接種後、アジュバント群と非アジュバント群の間でGMTは有意差を示さなかった。
【０２５０】
実施例３：機能性抗体の分析
免疫されたマウスおよびウサギから得られた血清を、in vitroで野生型のHlaおよびClfA活性を中和することができる機能性抗体の存在について検討した。
【０２５１】
Hla活性の阻害 - マウス
Hla誘導性溶血を阻害するワクチン特異的抗体の能力は、既述の方法を改変して実施されたin vitro赤血球（RBC）ベースの溶血中和アッセイで評価された（Bagnoli et al, PNAS 2015、112: 3680-3685）。アルファヘモリシン中和アッセイは、各免疫群について3回の異なる繰り返し実験からの、それぞれ10個の血清からなる3つのプールを用いて行った。中和力価は、Hlaの毒性を50％だけ中和する血清の希釈度として定義された有効希釈（ED50）を計算して求めた。
【０２５２】
各時点での各群について、ED50は、中和曲線の非線形回帰による4パラメータロジスティック（4PL）の変曲点パラメータの推定によって評価した。
【０２５３】
得られた結果を図4Aに示す。以下のことが示された。
アジュバント非存在下および0.1μgアジュバント群において、機能性抗体が検出されなかったことを示した（データは示されていない）。
Hlaの中和は、1μgおよび10μgのアジュバントを用いた2回の免疫化後に観察された。
10μgの製剤は1μgの製剤と比較して統計的に有意に高い中和力価を誘導した（p≦0.05 Wilcoxon検定）。
【０２５４】
ClfA活性の阻害 - マウス
ワクチンがClfA活性を阻害することができる機能性抗体を誘発したかどうかを評価するために、ClfA 結合阻害アッセイを構築した。このアッセイは、フィブリノーゲンへのClfAの結合を阻害する抗体の能力をELISAベースで測定するものである。抗体がClfAに効率的に結合すると、フィブリノーゲンとの相互作用が阻害される。血清力価は、フィブリノーゲン結合の50％の減少をもたらす血清希釈度の逆数として定義される（ED50）。阻害曲線のカーブフィッティング分析には4パラメータロジスティック（4PL）非線形回帰モデルを使用し、ED50は4PL変曲点の推定によって評価された。
【０２５５】
ナイーブマウスにおいてワクチン製剤により誘発された血清に、ClfA結合アッセイを適用した。
【０２５６】
1回目の免疫化の4週間後（4wp1）、および2回目の免疫化の1-2-4-8-12-16週間後（1wp2、2wp2、...）に採取した血清を分析した。
【０２５７】
得られた結果を図5Aに示す。
【０２５８】
各群からの血清をプールし（各10匹のマウス）、さまざまな時点で各プールについて中和力価（ED50）を測定した。分析は、さまざまな時点において各群について3回の独立したマウス免疫化実験で行った。結果を図5Aに示すが、図において、各ドットは３回の独立した実験の中央値を表す；バーの上端および下端はそれぞれ最大値および最小値を表す。
【０２５９】
得られた結果は、以下を示す。
0.1μg用量、およびアジュバント非存在下において、ClfA中和が測定されなかったことを示した（データは示されていない）。
ClfAの中和は、1または10μgについて2つのアジュバントのいずれを用いても観察された。
10μgの用量（ClfAの含有量と称される）を有する製剤は、1μgの製剤と比較して統計的に有意に高い中和力価を誘導した。(p値Wilcoxon検定≦0.05)
用量10μgでは、AS01Eが1wおよび2wp2でAlum/TLR7を上回った（p値Wilcoxon検定≦0.05）。
【０２６０】
マウスの血清についてすでに説明したアッセイを用いて、in vitroで野生型のHlaおよびClfA活性を中和することができる機能性抗体の存在について、免疫したウサギから得られた血清を検査した。
【０２６１】
Hla活性の阻害 - ウサギ
ウサギは、表3に示すように処置した。すべての動物を、1回目の注射前（0日目）、1回目の注射の1週間後、2週間後および4週間後（1wp1、2wp1、4wp1）、ならびに2回目の注射の2週間後および5週間後（2wp2、5wp2）に採血した。中和アッセイは、上記のさまざまな時点で単一サンプルの血清に対して実施した。
【０２６２】
各時点での幾何平均力価は、95％信頼区間（CI）を含めて記述的に要約した。GMTおよび95%信頼区間は、スチューデントのt分布に基づいて対数変換された力価の平均値について計算された信頼限界を逆変換することによって計算された（図4B）。破線は、各ウサギ血清の測定のために設定された必要最小限の希釈を表す。
【０２６３】
免疫前と比較した力価：
ワクチン接種後の各時点におけるワクチン接種前からの幾何平均倍数上昇を、対数変換された力価に基づいて計算した。対数変換前と対数変換後の力価の差を分析するために、対応のあるスチューデントt検定を使用した。
2wp1において、タンパク質含有量が10μg以上のすべてのグループで、免疫前と比較して高い力価を誘導する（すべてのp値<0.017）。
2wp2において、すべての免疫化群は免疫前と比較して高い力価を誘導する（すべてのp値<0.005）。
【０２６４】
緩衝液群と比較した力価：
各時点での免疫化群と緩衝液群との対比較をウェルチのスチューデントt検定を用いて行った。
2wp1において、アジュバント添加された50μg用量のみが緩衝液群と比較して高い力価を誘導する（すべてのp値<0.003）。
2wp2において、すべての免疫化群は、アジュバント無添加の1μg用量を除いて、緩衝液と比較して高い力価を誘導する（すべてのp値<0.013）。
【０２６５】
1回目の免疫化後と2回目の免疫化後の対比：
50μg、10μg+AS01E、50μg+AS01Eにおいて、2wp1と2wp2との間に有意差（p値＜0.025、ウェルチのスチューデントt-検定）が観察された。
【０２６６】
ClfA活性の阻害 - ウサギ
ClfA結合阻害アッセイは、事前暴露されたウサギにおいて、ワクチン製剤によって誘発された血清に適用した。濃度は、阻害曲線の非線形回帰によって、4パラメータロジスティック（4PL）の変曲点パラメータを推定することにより決定した。
【０２６７】
免疫前、1回目の免疫化の4週間後（4wp1）、2回目の免疫化の2週間後（2wp2）に採取された血清を分析した。
【０２６８】
各群（それぞれウサギ12羽）から血清を採取し、各個のウサギについてさまざまな時点で中和力価（ED50）を測定した。
【０２６９】
各時点での幾何平均力価を95％信頼区間（CI）を含めて記述的に要約した。GMTおよび95%信頼区間は、スチューデントのt分布に基づいて対数変換された力価の平均値について計算された信頼限界を逆変換して算出した（図5B）。
【０２７０】
ウサギ血清を用いて得られた中和結果を図5Bに示す。
免疫前、4wp1および緩衝液群の血清において、抗ClfA機能活性を示さなかった。
ClfA中和活性を誘導するためには、2回の投与が必要である。
アジュバントを含む10μgの用量は、アジュバントなし、またはアジュバントを含む50μgの用量と同等に機能する。
全体として中和力価は、マウス血清で測定されたものよりもはるかに低い。
【０２７１】
実施例４：ワクチン接種マウスにおけるCD4 T細胞応答とワクチンタンパク質との対比
SAに対する宿主免疫応答を引き起こす病原体特異的CD4+ T細胞の潜在的な役割については、よく知られている。したがって、Alum/TLR7またはAS01EをアジュバントとしたワクチンがマウスにおいてT細胞応答を誘導する能力についても検討した。
【０２７２】
より詳細には、本研究の目的は以下の通りとした：
ワクチンによりマウスを免疫化することが、ワクチンタンパク質に対するT細胞応答を引き起こしうるかどうかを調べる（大きさの程度）。
応答のTh1、Th2、またはTh17の分極化（polarization）を検討する（質）。
ワクチン製剤にアジュバントを含めることが、T細胞応答の大きさを改善し、および／または、その質に影響を及ぼすかどうかを評価する。
T細胞応答の大きさ、および質について、AS01アジュバントとAlum/TLR7アジュバントとを比較する。
【０２７３】
この目的のために、5週齢のBALB/c雌マウスに、1日目と29日目に2回の免疫化（をIM 経路で行ったそれぞれの後脚大腿四頭筋に50μl）。各成分10μgまたは1μg（タンパク質ベース）からなる製剤、ワクチン-10およびワクチン-1の2回投与を、単独で、またはAlum/TLR7もしくはAS01Eアジュバントとともに、行った。対照群には、PBS、Alum/TLR7またはAS01Eを単独で注射した。実験の変動性を評価するために、実験を3回繰り返した。3回の実験で使用したマウスの総数に対する試験の概要を表4に示す。
【０２７４】
【表４】
2021514387.tif 000010
【０２７５】
ワクチン特異的CD4 T細胞応答の誘導は、2回目の免疫化の12日後（d12p2）にそれぞれ1匹のマウスから分離された後、抗CD28および抗CD49d mAb（各2μg/ml）により、単独で、または各ワクチンタンパク質とともに（HlamutおよびClfAmutは10μg/ml、SpAmutは1μg/mlにて）、37℃で16時間in vitro処理された、脾細胞の細胞内サイトカイン染色（ICS）によって評価した。ブレフェルジンA（Brefeldin A）、5μg/mlを、インキュベーションの最後の4時間の間、添加した。次いで、細胞をLive/Dead NearIr（Invitrogen）で染色し、Cytofix/Cytoperm（BD）により固定して透過処理し、Perm/Washバッファー（BD）で洗浄し、抗CD16/CD32 Fcブロック（BD）で室温にて20分間インキュベートして、以下のmAb、抗CD3-BV605、抗CD4-BV510、抗CD8-PE-CF594、抗CD44-V450、抗IFNγ-BV785、抗IL-2-PE Cy5、抗TNF-AF488、抗IL-17A-PE Cy7、抗IL-4-PerCP eFluor710、および抗IL-13-PerCP eFluor710により室温にて20分間染色し、Perm/Washバッファーで2回洗浄してから、PBS中に懸濁した。
【０２７６】
サンプルをLSRIIフローサイトメーター（BD Biosciences）で取得し、CD4 T細胞応答をFlowJoソフトウェア（TreeStar）を用いて分析した。
【０２７７】
IL-2、TNF、IL-4/IL-13、IFN-γまたはIL-17Aを産生するCD4+CD44highT細胞を、ゲーティング戦略にしたがって同定した。
【０２７８】
T細胞応答の大きさは、ワクチンタンパク質によるin vitro刺激に反応して、分析したサイトカインのうち少なくとも1つを産生するCD4+CD44high T細胞の頻度（％）を測定して計算した（CD4+CD44high T細胞≧1サイトカイン+）。
【０２７９】
CD4 T細胞応答の質（Th1、Th2またはTh17の分極化）は、IFN-γは産生するがIL-4/IL-13は産生しない（≧IFN-γ+、Th1）、IL-4/IL-13は産生するがIFN-γは産生しない（≧IL-4/IL-13+、Th2）、または少なくともIL-17A（≧IL-17A+、Th17）を産生する、CD4+CD44high T細胞の頻度（％）を測定して評価した。
【０２８０】
ブールのゲート分析を適用し、刺激された細胞の応答から培地処理された細胞の応答を差し引いた。
【０２８１】
結果の分析のために、グループ（9つのグループ）、実験（3回の実験）、および相互作用グループ*実験を固定効果として含め、異種分散モデルを使用して、log10 CD4+CD44highパーセンテージに二元配置分散分析を当てはめた（グループ間で同一の分散は想定されなかった）。このモデルは、グループの幾何平均およびその95％信頼区間（CI）、ならびに幾何平均比およびその95％信頼区間（CI）を推定するために使用された。
【０２８２】
2倍を超える幾何平均比は、それらの95％信頼区間に1が含まれない場合、有意差があるとみなされた（p＜0.05）。
【０２８３】
得られた結果を図2に示す。そこで統計的に有意な差が示されている。それらは以下のように要約することができる。
ワクチン製剤にアジュバントを含めることは、対照群と比較して有意に高いワクチン特異的T細胞の頻度を得るために必要であった。
AS01は、いずれのタンパク質抗原でもAlum/TLR7を上回った。
AS01をアジュバントとしたワクチンのみが、各抗原に特異的なIFN-γを産生するCD4+ T細胞を誘導した（Th1の分極化を示す）が、一方、Alum/TLR7をアジュバントとしたワクチンは、SpAmut特異的なTh1のみを、有意に低い頻度で誘導した。
非常に低い頻度のTh2およびTh17は、AS01アジュバントワクチンでのみ測定された。
1または10μgのアジュバントなしのワクチンによる免疫化後には、T細胞応答の大きさおよび質に大きな違いは観察されなかった。
【０２８４】
実施例５：動物モデルにおける防御：皮膚感染モデル
黄色ブドウ球菌感染に対するin vivoでの防御における、5Ag/AS01E ワクチン（AS01Eをアジュバントとして添加した、SpAmut、ClfAmut-CP8 バイオコンジュゲートおよび Hlamut - CP5 バイオコンジュゲートを含む）の有効性を評価するために、黄色ブドウ球菌感染のマウスモデルで実験を行った。実験はまた、5Ag/AS01EワクチンとSpAを欠いた4Ag/AS01Eワクチンとを比較し、5Agワクチン中のアジュバントAS01Eの効果を、水酸化アルミニウム(Al(OH)3)をアジュバントとした5Agワクチンと比較した。使用したマウスモデルは、皮膚感染モデルおよび腎膿瘍モデルとした。
【０２８５】
実験デザインおよびプロトコール
CD1マウス雌5週齢を用いた。各モデルについて3回の実験を順次行った。膿瘍モデルでの3回の同一の実験（Sa-5Ag-7、Sa-5Ag-8、Sa-5Ag-9）、および皮膚モデルでの3回の同一実験（Sa-5Ag-10、Sa-5Ag-11、Sa-5Ag-12）の、合計6回の実験を行った。皮膚モデルにおいて、各群は10匹のマウスで構成されたので、各モデルにおいて各群合計30匹のマウスをテストした。
【０２８６】
マウスは、1ヶ月間隔で（0日目と30日目）投与される、異なるワクチン製剤またはPBSのうち1つの2回の筋肉内注射（IM、それぞれの足に30μl）を受けた。
【０２８７】
最後の注射の3週間後（51日目）に、皮下（SC、皮膚モデル）感染経路を用いて、マウスを、適切な亜致死量のUSA300細菌に感染させた。50μlのSA USA300（理論値3X107 CFU/マウス）株を接種した。
【０２８８】
皮膚モデルにおいて、感染5日後に関連病変部位を評価し、感染7日後に採取し、ホモジナイズして、CFU値を決定した。
【０２８９】
【表５】
2021514387.tif 000011
【０２９０】
【表６】
2021514387.tif 000012
【０２９１】
材料および方法
−80℃で保存するための細菌アリコートの調製
20mlの新鮮なTryptic Soy Broth（TSB）（37℃で一晩または使用前に少なくとも1時間予熱した）を、50mlのディスポーザブルチューブ中で、融解した細菌（オールドストック）0.3mlと混合した。初発OD600nmは0.03とし、OD600nm = 0.55となるまで細菌を増殖させた。この細菌懸濁液2mlをクライオバイアルに分注し、-80℃で保存した。
【０２９２】
増殖条件
上記のように調製した-80℃冷凍庫からの細菌ストック（黄色ブドウ球菌USA300）を37℃のウォーターバスで10分間融解した。20mlの新鮮なTryptic Soy Broth（TSB）（37℃で一晩または使用する少なくとも1時間前に予温した）を0.3mlの融解した細菌と混合した。初発OD600nmは0.03とし、50mlのディスポーザブルチューブで細菌を増殖させた。細菌を、最終OD600nmが0.6となるまで、37℃にて150rpmで撹拌して約2.0時間インキュベートした後、4500rpm、10分、4℃で遠心分離した。上清を除去し、ペレットを同量のPBS中に再懸濁し、再度4500rpm、10分、4℃で遠心分離した。上清を再び除去し、細菌ペレットを2mlのPBS中に再懸濁した（約5x109cfu/ml）。この時点で、細菌濃度が50μl中3x107cfu/マウスとなるように最終希釈液を作製した。100μlの最終細菌懸濁液を希釈し、10-5および10-6希釈液をTryptic Soy Agar（TSA）プレート上に蒔いて、CFUを計数した。
【０２９３】
黄色ブドウ球菌による皮下感染のin vivoモデル
感染前日に、麻酔（ゾラゼパム＋チレタミナ／キシラジン）をかけたマウスを電気カミソリおよび脱毛クリームを用いて背位で剃毛した。脱毛クリームは37℃の水でそっと取り除いた。前記のように調製した細菌を、ゾラゼパム＋チレタミナ／キシラジンで麻酔したマウスに皮下接種した（50μl／動物）。動物は、疾患の臨床症状のための専用スコアシートを用いて毎日経過観察した。感染後5日目に、寸法を測定するために、デジタルカメラで病変の写真を撮影した。感染後7日目にマウスを屠殺し，円形メス（8mm）を用いて病変部の皮膚を切除した；より大きな病変部にはハサミを用いて確実に病変部全体を取り出した。摘出した皮膚をホモジナイズして、CFU数を測定した。10-8まで10倍希釈液を調製し、10μlのスポットを（2連で）TSAプレート上に蒔いた。
【０２９４】
モデルの読み取り
・5日目の皮膚病変部：ImageJソフトウェアにより測定され、mm2で表される。
・感染後毎日登録された臨床スコア。
・感染後7日目のCFU数（CFU/サンプルとして表される）。
【０２９５】
結果
5Ag+AS01E ワクチンは、皮膚病変の予防およびCFU数の減少に有効であった。
【０２９６】
皮膚感染後５日目に、5Ag+AS01E ワクチンを接種したマウスはいずれも皮膚病変を示さなかった。5Ag+Al(OH)3によるワクチン接種を受けたマウスは17％（5/30）が皮膚病変を示したのに対して、4Ag+AS01EおよびPBSにより接種されたマウスはそれぞれ60％（18/30）および100％（30/30）が皮膚病変を示した。結果を表7〜9に示す。
【０２９７】
感染後7日目のCFU GMは、SpA抗原を含まないSAワクチン製剤（Sa-4Ag+AS01E）では、SpA抗原を含むSAワクチン製剤（Sa-5Ag+AS01E）に比べてほぼ3倍（2.84倍）高く、その差は、統計的に有意であった（両ワクチン群間のCFU GMワクチン群比の95％CIは値1を含んでいなかった）（表7および8）。
【０２９８】
皮膚における細菌の生菌レベルには、AS01Eをアジュバントとした、またはAl(OH)3をアジュバントとした、2種類のSa-5Agワクチン製剤の間で差が認められたが、その差は統計的に有意ではなかった。アジュバントとしてAl(OH)3を添加したSa-5Agワクチン製剤[Sa-5Ag+Al(OH)3]は、アジュバントとしてAS01Eを添加したSa-5Agワクチン製剤(Sa-5Ag+AS01E)と比較して、CFU GMが1.6倍高く、CFU GMワクチン群比の95％CIは値1を含んでいた(表7および8)。
【０２９９】
PBS単独群において、感染後７日目の皮膚における細菌の生菌レベルは、評価したワクチン製剤のいずれで観察されたレベルよりも有意に高かった。PBS群のCFU GMは、ワクチン製剤で観察されたCFU GMよりも40.32〜114.48倍高かった（表7および8）。
【０３００】
2標本中央値検定を用いて実施した、2群の中央値の探索的ペアワイズ比較において、SpAを含むワクチン製剤と含まないワクチン製剤の間に有意な差が認められ（p<0.0001）、AS01Eを含むSa-5Agワクチン製剤とAl(OH)3を含むSa-5Agワクチン製剤の間に有意な差が認められた（p=0.0206）。
【０３０１】
【表７】
2021514387.tif 000013
【０３０２】
【表８】
2021514387.tif 000014
【０３０３】
【表９】
2021514387.tif 000015
【０３０４】
皮下膿瘍にも細菌が存在することから、皮膚病変を示さなかったマウスにおいてもCFUを測定することができた。マウスの一部が病変を示さず、その群の残りのマウスが病変を示した2つのワクチン製剤（すなわち、5Ag+Al(OH)3群および4Ag+AS01E群）では、皮膚におけるCFU数の平均値および中央値は、病変部のないマウスの方が病変部を有するマウスより低かった。各ワクチン群について、病変部の有無によるCFU数の記述統計（平均値、中央値、最小値、最大値）を表10に示す。
【０３０５】
【表１０】
2021514387.tif 000016
【０３０６】
実施例６：動物モデルにおける防御：腎膿瘍モデル
上記の実施例5に記載したように、黄色ブドウ球菌感染に対するin vivoでの防御における５Ag/AS01Eワクチンの有効性を評価するために、全身感染のモデルとして腎膿瘍マウスで実験を行った。
【０３０７】
プロトコールおよび試験デザイン
CD1マウス雌5週齢を用いた。各モデルについて、3回の実験を順次行った。膿瘍モデルにおいて３回の同一の実験（Sa-5Ag-7、Sa-5Ag-8、Sa-5Ag-9）、合計６回の実験を行った。各群は12匹のマウスで構成されたので、各モデルにおいて合計36匹のマウスをテストした。
【０３０８】
マウスは、1ヶ月間隔で（0日目と30日目）投与される、異なるワクチン製剤またはPBSのうち1つの2回の筋肉内注射（IM、それぞれの足に30μl）を受けた。
【０３０９】
最後の注射の3週間後（51日目）に、静脈内（IV、腎膿瘍モデル）感染経路を用いて、マウスを、適切な亜致死量のUSA300細菌に感染させた。
【０３１０】
100μlのSA USA300（理論値3X107 CFU/マウス）株を接種した。
【０３１１】
感染したマウスを感染4日後に屠殺し、腎臓を採取し、ホモジナイズして、CFU数をカウントした。
【０３１２】
【表１１】
2021514387.tif 000017
【０３１３】
【表１２】
2021514387.tif 000018
【０３１４】
材料および方法
−80℃で保存するための細菌アリコートの調製
20mlの新鮮なTryptic Soy Broth（TSB）（37℃で一晩または使用前に少なくとも1時間予熱した）を、50mlのディスポーザブルチューブ内で、融解した細菌（オールドストック）0.3mlと混合した。初発OD600nmは0.03とし、OD600nm = 0.55となるまで細菌を増殖させた。この細菌懸濁液2mlをクライオバイアルに分注し、-80℃で保存した。
【０３１５】
増殖条件
上記のように調製した-80℃冷凍庫からの細菌ストック（黄色ブドウ球菌USA300）を37℃のウォーターバスで10分間融解した。20mlの新鮮なTryptic Soy Broth（TSB）（37℃で一晩または使用する少なくとも1時間前に予温した）を0.3mlの融解した細菌と混合した。初発OD600nmは0.03とし、50mlのディスポーザブルチューブで細菌を増殖させた。細菌を、最終OD600nmが0.6となるまで、37℃にて150rpmで撹拌して約2.0時間インキュベートした。細菌を4500rpm、10分、4℃で遠心分離した。上清を除去し、ペレットを同量のPBS中に再懸濁し、再度4500rpm、10分、4℃で遠心分離した。上清を再び除去し、細菌ペレットを2mlのPBS中に再懸濁した（約5x109cfu/ml）。この時点で、細菌濃度が100μl中1x107cfu/マウスとなるように最終希釈液を作製した。100μlの最終細菌懸濁液を希釈し、10-5および10-6希釈液をTryptic Soy Agar（TSA）プレート上に蒔いて、CFUを計数した。
【０３１６】
黄色ブドウ球菌による皮下感染のin vivoモデル
尾静脈を膨らませるために赤外線ランプを用いてマウスを温めた。上記のように調製した細菌を尾静脈に静脈内接種した（100μl/動物）。動物は、疾患の臨床症状を、専用のスコアシートを用いて毎日経過観察した。感染後4日目に、マウスを屠殺し、腎臓を回収した。摘出した腎臓をホモジナイズし、CFU数を測定した（2ml PBS）。10-8までの十倍希釈液を調製し、10μlのスポットを（2連で）TSAプレート上に蒔いた。
【０３１７】
モデルの読み取り
・感染後毎日登録された臨床スコア。
・感染後4日目のCFU数（CFU/サンプルとして表される）。
【０３１８】
結果
5Ag+AS01Eワクチンは、対照と比較して細菌感染を減少させるのにきわめて効果的であった。感染後4日目に採取した腎臓の生菌レベルは、CFU幾何平均（GM）で評価すると、SpA抗原を含まないワクチン製剤（Sa-4Ag+AS01E）では、SpAを含むSAワクチン製剤（Sa-5Ag+AS01E）より6.6倍高く、その差は統計的に有意であった。CFU GMは、アジュバントとしてAl(OH)3を添加したSA-5Agワクチン製剤（Sa-5Ag+Al(OH)3）では、アジュバントとしてAS01Eを添加したSA-5Agワクチン製剤（Sa-5Ag+AS01E）より2倍近く（1.78倍）高かったが、この差は統計的に有意ではなかった。PBS単独群において、感染後4日目の腎臓における生菌レベルは、試験で評価されたいずれのGSK Saワクチン製剤で観察されたレベルよりも、少なくとも４倍高かった。結果を表13に示す。
【０３１９】
【表１３】
2021514387.tif 000019
【０３２０】
［配列表］
2021514387.tif 000020
2021514387.tif 000021
2021514387.tif 000022
2021514387.tif 000023
2021514387.tif 000024
【図１Ａ】
2021514387.tif 000025
【図１Ｂ】
2021514387.tif 000026
【図１Ｃ】
2021514387.tif 000027
【図１Ｄ】
2021514387.tif 000028
【図１Ｅ】
2021514387.tif 000029
【図２Ａ】
2021514387.tif 000030
【図２Ｂ】
2021514387.tif 000031
【図２Ｃ】
2021514387.tif 000032
【図３Ａ】
2021514387.tif 000033
【図３Ｂ】
2021514387.tif 000034
【図３Ｃ】
2021514387.tif 000035
【図３Ｄ】
2021514387.tif 000036
【図３Ｅ】
2021514387.tif 000037
【図４Ａ】
2021514387.tif 000038
【図４Ｂ】
2021514387.tif 000039
【図５Ａ】
2021514387.tif 000040
【図５Ｂ】
2021514387.tif 000041
【図６Ａ】
2021514387.tif 000042
【図６Ｂ】
2021514387.tif 000043
【図７】
2021514387.tif 000044
【図８】
2021514387.tif 000045
【図９】
2021514387.tif 000046
【図１０】
2021514387.tif 000047
【配列表】
2021514387000001.app
【国際調査報告】
2021514387.tif 000048
2021514387.tif 000049
2021514387.tif 000050
2021514387.tif 000051
2021514387.tif 000052