(57)【要約】  ストレス関連障害および癌の治療のための材料および方法を本明細書に開示する。本開示は、コルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）のある領域に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。本開示は、ストレス関連障害または癌などのＨＰＡ軸活性化に関連する障害を治療する方法も提供し、治療を必要とする対象に、障害を治療するのに有効な量で本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸１〜２１を含むコルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）の領域に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
配列番号１２〜１７に記載の６つのＣＤＲのセットを含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１または請求項２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸１〜１５を含むＣＲＨの領域に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
配列番号４〜９に記載の６つのＣＤＲのセットを含む、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項５または請求項６に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
配列番号１０に記載の軽鎖可変領域を含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
モノクローナル抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
ヒト化抗体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
ＩｇＧである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
前記抗原結合フラグメントがＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
前記ｓｃＦｖが、配列番号２２または配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
対象におけるストレスに対するコルチコステロン応答を阻害する方法であって、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを、ストレスに対する前記コルチコステロン応答を阻害するのに有効な量で前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１５】
ストレス関連障害の治療を必要とする対象における前記ストレス関連障害を治療する方法であって、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントを、前記障害を治療するのに有効な量で前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
前記ストレス関連障害が、不安、うつ病、アルツハイマー病、心的外傷後ストレス障害、全般性不安障害、大うつ病、神経性食欲不振症、心的外傷後ストレス障害、副腎障害、メタボリックシンドローム、１型糖尿病、サルコペニアおよび多発性硬化症からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
コルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）に対する免疫応答の誘導を必要とする対象において前記コルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、前記対象において免疫応答を誘導するＣＲＨのアミノ末端ペプチドフラグメントを有効な量で前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１８】
ＣＲＨの前記アミノ末端フラグメントが、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＲＨの前記アミノ末端フラグメントが、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ペプチドフラグメントがＴ細胞反応性エピトープに結合される、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｔ細胞反応性エピトープが、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、熱帯熱マラリア原虫、インフルエンザウイルスまたはＢ型肝炎ウイルス由来の抗原ペプチドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象にアジュバントを投与することをさらに含む、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ストレス関連障害の治療を必要とする対象における前記ストレス関連障害を治療する方法であって、配列番号１のアミノ末端ペプチドフラグメントを前記対象における前記障害を治療するのに有効な量で前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２４】
癌の治療を必要とする対象における前記癌を治療する方法であって、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２５】
前記対象に癌免疫療法を投与することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記癌免疫療法が抗ＰＤ１抗体および抗ＣＴＬＡ４抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記癌が癌腫、黒色腫、肉腫、骨髄腫、白血病、またはリンパ腫である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌が脳癌、乳癌、または結腸癌である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
癌の治療を必要とする対象における前記癌を治療する方法であって、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体および抗ＰＤ１抗体を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３１】
免疫応答の誘導を必要とする対象において前記免疫応答を誘導する方法であって、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３２】
免疫応答を誘導することは、前記対象における少なくともＸ％のＴ細胞数の増加を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
免疫応答を誘導することは、前記対象における少なくともＸ％のＢ細胞数の増加を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
視床下部下垂体副腎（ＨＰＡ）軸の阻害を必要とする対象における前記視床下部下垂体副腎（ＨＰＡ）軸を阻害する方法であって、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体を前記対象に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＣＡ１９５５６３の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明におけるある特定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年６月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／６８３，３６９号、２０１８年１２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／７７７，５７２号、および２０１９年５月６日に出願された米国仮特許出願第６２／８４３，６７７号に対する優先権の利益を主張し、それらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本開示は、視床下部下垂体副腎（ＨＰＡ）軸の活性化に関連する障害（例えば、ストレス関連障害および癌）の治療のための、コルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）ペプチドフラグメント、抗ＣＲＨ抗体、ならびにそのようなペプチドフラグメントおよび抗体の使用に関する。
【０００４】
電子的に提出された資料の参照による組込み
本出願は、本開示の別個の部分として、その全体が参照により組み込まれるコンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：５２９７８＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：１５，１３２バイト、作成日：２０１９年６月７日）を含む。
【背景技術】
【０００５】
コルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）は、ストレス刺激に対する神経内分泌反応および行動反応の中心的なコーディネーターである。ＣＲＨは、硬骨魚類や四足類の前の時代から、５億５０００万年にわたり、脊椎動物の系統で進化的に保存されてきた。種を超えたこの保存は、ストレス刺激に対する脊椎動物の反応におけるＣＲＨの重要性を強調する。
【０００６】
ＣＲＨは、視床下部下垂体副腎（ＨＰＡ）軸の活性化を制御するために、その受容体ＣＲＨＲ１を介して信号を送る。視床下部の室傍核（ＰＶＮ）からＣＲＨが放出されると、下垂体前葉のＣＲＨＲ１受容体に作用し、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）の放出を引き起こし、副腎を刺激してグルココルチコイド（ＧＣ）、すなわちヒトにおけるコルチゾールおよびげっ歯類におけるコルチコステロンを生成し、放出する。グルココルチコイドは全身に自由に拡散し、ほとんどすべての脊椎動物の細胞型で発現する高親和性ミネラルコルチコイド（ＭＲ）受容体および低親和性グルココルチコイド（ＧＲ）受容体に作用する。ＭＲおよびＧＲシグナル伝達は、グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）を介した転写の調節による長年の影響に加えて、多くの細胞型で両方の迅速な機能的応答を引き起こす。ＧＲ受容体およびＭＲ受容体の活性化への応答は、ストレッサーを克服するために体を準備する資源の動員および細胞適応となる。
【０００７】
ストレス刺激がない場合、ＰＶＮは視床下部の視交叉上核（ＳＣＮ）から入力を受け取り、メラトニンレベルに応答して、これらの入力に基づいて１日中ＣＲＨ放出を変化させる。ＣＲＨ放出のこれらの日々の変動は、次に、ＧＣ放出の概日リズムを生み出し、ＧＣのピークレベルは、覚醒レベルおよび睡眠に戻る前のトラフレベルに存在する。
【０００８】
ＨＰＡ軸への影響に加えて、ＣＲＨおよびＣＲＨＲ１は、新皮質、海馬、扁桃体、青斑核など、認知と不安に関係する脳の多くの領域で広く発現する。ＣＲＨは不安に領域特異的な影響を与えることが示されており、神経調節物質として最もよく記述されており、ＣＲＨＲ１発現ニューロンの活性を増大させるが、古典的な神経伝達物質としては機能しない。
【発明の概要】
【０００９】
一態様では、本開示は、配列番号１のアミノ酸１〜２１を含むコルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）の領域に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１２〜１７または配列番号４〜９に記載の６つのＣＤＲのセットを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１９または配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１８または１０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧである。いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、ＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２２または配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む。
【００１１】
ＨＰＡ軸活性化に関連する障害（例えば、ストレス関連障害または癌）を治療する方法が企図される。例えば、いくつかの実施形態では、ストレス関連障害を治療する方法が本明細書に記載される。これに関して、この方法は、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを、治療を必要とする対象に障害を治療するのに有効な量で投与することを含む。例示的なストレス関連障害としては、不安、うつ病、アルツハイマー病、心的外傷後ストレス障害、全般性不安障害、大うつ病、神経性食欲不振症、心的外傷後ストレス障害、副腎障害、メタボリックシンドローム、１型糖尿病、サルコペニアおよび多発性硬化症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
対象においてコルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）に対する免疫応答を誘導する方法も企図される。これに関して、この方法は、対象において免疫応答を誘導するのにＣＲＨのアミノ末端ペプチドフラグメントを、有効な量で治療を必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＨのアミノ末端フラグメントは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ＣＲＨのアミノ末端フラグメントは、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ペプチドフラグメントは、Ｔ細胞反応性エピトープ（例えば、破傷風トキソイド）に結合される。場合により、この方法は、対象にアジュバントを投与することをさらに含む。
【００１３】
また、対象における障害を治療するのにＣＲＨのアミノ末端ペプチドフラグメントを、有効な量で対象に投与することを含む、治療を必要とする対象においてストレス関連障害を治療する方法が企図される。
【００１４】
免疫療法と組み合わせて本明細書に記載の抗ＣＲＨ抗体を対象に投与することを含む、治療を必要とする対象において癌を治療する方法も企図される。いくつかの実施形態では、免疫療法剤は、チェックポイント阻害剤である。いくつかの実施形態では、免疫療法剤は、抗ＰＤ１抗体である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、コルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）のアミノ末端フラグメント（配列番号２および３）のワクチン接種がマウスにおいて抗ＣＲＨ抗体を生成したことを示す棒グラフである（ｙ軸−相対吸光度；ｘ軸−血清希釈）。図１Ａでは、グラフの５本の棒の最初のセットはマウスＩ４４であり、グラフの５本の棒の２番目のセットはマウスＩ４５であり、５本の棒の最後のセットはマウスＩ４６である。図１Ｂでは、４本の棒の最初のセットはマウス９６であり、４本の棒の２番目のセットはマウス９７から、４本の棒の３番目のセットはマウス９８から、４本の棒の４番目のセットはマウス９９からであり、５番目のセットは４本の棒はマウス１００からであり、４本の棒の６番目のセットはマウス１４４からであり、４本の棒の７番目のセットはマウス１４６からである。
【図２】単離されたモノクローナル抗体のＣＲＨへの親和性を示すグラフである。
【図３Ａ】図３Ａおよび図３Ｂは、急性ストレスに対する抗ＣＲＨ抗体の効果を示すグラフである（ｙ軸−コルチコステロン（ｎｇ／ｍＬ）；ｘ軸−血漿吸引時間）。
【図３Ｂ】図３Ａおよび図３Ｂは、急性ストレスに対する抗ＣＲＨ抗体の効果を示すグラフである（ｙ軸−コルチコステロン（ｎｇ／ｍＬ）；ｘ軸−血漿吸引時間）。
【図４】抗ＣＲＨ抗体Ｂを注射したマウスの写真を含み、抗ＣＲＨ抗体Ｂの投与によりクッシング病のマウスモデルの発毛を促進したことを示す。
【図５】抗ＣＲＨ抗体ＡおよびＢの可変領域配列、ならびに抗体の生成に使用したＮ末端ＣＲＨペプチドの配列を示す。
【図６】生成された抗ＣＲＨＳｃＦｖのＣＲＨへの結合を試験するＥＬＩＳＡ結合アッセイの結果を棒グラフで示す。非形質移入されたＨＥＫ−２９３細胞のライセート、抗体Ａ可変領域を含むＳｃＦｖをコードするＤＮＡコンストラクトが形質移入された細胞のライセート、非形質移入された細胞のライセート、および抗体Ｂ可変領域（ｘ軸）を含むＳｃＦｖをコードするＤＮＡコンストラクトが形質移入された細胞のライセート（ｘ軸）について相対吸光度（ｙ軸）を示す。
【図７】抗ＣＲＨ抗体Ｂのマウス可変領域と、抗体のヒト化のための同様のヒト可変フレームワークの配列比較を示す。ＣＤＲを強調表示する。
【図８】抗体ＢがインビトロでＣＲＨ誘導サイクリックＡＭＰの増加を低下させたことを棒グラフで示す。
【図９】抗体Ｂ（抗ＣＲＨで処置された軽度のストレス下のマウスがコルチコステロンレベルを低下させる用量反応効果を実証したことをグラフで示す。
【図１０】実施例１０に記載の慢性変動ストレス実験のためのプロトコルを示す。
【図１１Ａ】抗体Ｂ（抗ＣＲＨ）による処置が慢性ストレス下のマウスのコルチコステロン応答を低下させたことを示すグラフである。
【図１１Ｂ】抗体Ｂで処置したマウスが体重増加を大幅に増加させたことを示すグラフである。
【図１１Ｃ】図１１Ｃおよび図１１Ｄは、抗体Ｂ（抗ＣＲＨ）による処置がマウスの腸間膜脂肪または皮下脂肪の増加をもたらさなかったことを示すグラフである。
【図１１Ｄ】図１１Ｃおよび図１１Ｄは、抗体Ｂ（抗ＣＲＨ）による処置がマウスの腸間膜脂肪または皮下脂肪の増加をもたらさなかったことを示すグラフである。
【図１１Ｅ】図１１Ｅ、図１１Ｆおよび図１１Ｇは、抗体Ｂ（抗ＣＲＨ）による治療が脾臓細胞充実性を大幅に増加させ、白血球集団をシフトさせてＢ細胞の割合を増加させ、Ｔ細胞の割合を減少させたことを示すグラフである。
【図１１Ｆ】図１１Ｅ、図１１Ｆおよび図１１Ｇは、抗体Ｂ（抗ＣＲＨ）による治療が脾臓細胞充実性を大幅に増加させ、白血球集団をシフトさせてＢ細胞の割合を増加させ、Ｔ細胞の割合を減少させたことを示すグラフである。
【図１１Ｇ】図１１Ｅ、図１１Ｆおよび図１１Ｇは、抗体Ｂ（抗ＣＲＨ）による治療が脾臓細胞充実性を大幅に増加させ、白血球集団をシフトさせてＢ細胞の割合を増加させ、Ｔ細胞の割合を減少させたことを示すグラフである。
【図１１Ｈ】図１１Ｈおよび図１１Ｉは、抗体Ｂ（抗ＣＲＨ）処置により、マウスの脾臓中の炎症性単球細胞およびＮＫ細胞を大幅に減少させたことを示すグラフである。
【図１１Ｉ】図１１Ｈおよび図１１Ｉは、抗体Ｂ（抗ＣＲＨ）処置により、マウスの脾臓中の炎症性単球細胞およびＮＫ細胞を大幅に減少させたことを示すグラフである。
【図１２】図１２Ａおよび図１２Ｂは、抗体Ｂで処置されたマウスにおいて脳ＲＮＡ転写物が大幅に変化することを示す。図１２Ａは、大幅に変化した遺伝子を示すボルケーノプロットである。図１２Ｂは、加重相関ネットワーク（ＷＧＣＮ）分析の結果により関連する変化した遺伝子のネットワークが明らかになることを示すグラフである。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜図１３Ｑは、実施例１２で実施した免疫プロファイリングの結果を示す。図１３Ａ〜Ｂは、抗体Ｂによる処置により、生脾臓細胞の量が大幅に増加し、脾臓重量が増加傾向にあることを示すグラフである。図１３Ｂ〜Ｑ：さらに、これらの生脾臓細胞の中で、Ｂ細胞の割合が大幅に増加し、Ｔ細胞の割合が減少し、図１３Ｏ〜ＱのＮＫ細胞、および図１３Ｌ〜Ｎの炎症性単球（図１３Ｇおよび図１３Ｊ）ではＢ細胞とＴ細胞の両方の絶対数が増加することがわかった。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜図１３Ｑは、実施例１２で実施した免疫プロファイリングの結果を示す。図１３Ａ〜Ｂは、抗体Ｂによる処置により、生脾臓細胞の量が大幅に増加し、脾臓重量が増加傾向にあることを示すグラフである。図１３Ｂ〜Ｑ：さらに、これらの生脾臓細胞の中で、Ｂ細胞の割合が大幅に増加し、Ｔ細胞の割合が減少し、図１３Ｏ〜ＱのＮＫ細胞、および図１３Ｌ〜Ｎの炎症性単球（図１３Ｇおよび図１３Ｊ）ではＢ細胞とＴ細胞の両方の絶対数が増加することがわかった。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜図１３Ｑは、実施例１２で実施した免疫プロファイリングの結果を示す。図１３Ａ〜Ｂは、抗体Ｂによる処置により、生脾臓細胞の量が大幅に増加し、脾臓重量が増加傾向にあることを示すグラフである。図１３Ｂ〜Ｑ：さらに、これらの生脾臓細胞の中で、Ｂ細胞の割合が大幅に増加し、Ｔ細胞の割合が減少し、図１３Ｏ〜ＱのＮＫ細胞、および図１３Ｌ〜Ｎの炎症性単球（図１３Ｇおよび図１３Ｊ）ではＢ細胞とＴ細胞の両方の絶対数が増加することがわかった。
【図１３Ｄ】図１３Ａ〜図１３Ｑは、実施例１２で実施した免疫プロファイリングの結果を示す。図１３Ａ〜Ｂは、抗体Ｂによる処置により、生脾臓細胞の量が大幅に増加し、脾臓重量が増加傾向にあることを示すグラフである。図１３Ｂ〜Ｑ：さらに、これらの生脾臓細胞の中で、Ｂ細胞の割合が大幅に増加し、Ｔ細胞の割合が減少し、図１３Ｏ〜ＱのＮＫ細胞、および図１３Ｌ〜Ｎの炎症性単球（図１３Ｇおよび図１３Ｊ）ではＢ細胞とＴ細胞の両方の絶対数が増加することがわかった。
【図１３Ｅ】図１３Ａ〜図１３Ｑは、実施例１２で実施した免疫プロファイリングの結果を示す。図１３Ａ〜Ｂは、抗体Ｂによる処置により、生脾臓細胞の量が大幅に増加し、脾臓重量が増加傾向にあることを示すグラフである。図１３Ｂ〜Ｑ：さらに、これらの生脾臓細胞の中で、Ｂ細胞の割合が大幅に増加し、Ｔ細胞の割合が減少し、図１３Ｏ〜ＱのＮＫ細胞、および図１３Ｌ〜Ｎの炎症性単球（図１３Ｇおよび図１３Ｊ）ではＢ細胞とＴ細胞の両方の絶対数が増加することがわかった。
【図１３Ｆ】図１３Ａ〜図１３Ｑは、実施例１２で実施した免疫プロファイリングの結果を示す。図１３Ａ〜Ｂは、抗体Ｂによる処置により、生脾臓細胞の量が大幅に増加し、脾臓重量が増加傾向にあることを示すグラフである。図１３Ｂ〜Ｑ：さらに、これらの生脾臓細胞の中で、Ｂ細胞の割合が大幅に増加し、Ｔ細胞の割合が減少し、図１３Ｏ〜ＱのＮＫ細胞、および図１３Ｌ〜Ｎの炎症性単球（図１３Ｇおよび図１３Ｊ）ではＢ細胞とＴ細胞の両方の絶対数が増加することがわかった。
【図１３Ｇ】図１３Ａ〜図１３Ｑは、実施例１２で実施した免疫プロファイリングの結果を示す。図１３Ａ〜Ｂは、抗体Ｂによる処置により、生脾臓細胞の量が大幅に増加し、脾臓重量が増加傾向にあることを示すグラフである。図１３Ｂ〜Ｑ：さらに、これらの生脾臓細胞の中で、Ｂ細胞の割合が大幅に増加し、Ｔ細胞の割合が減少し、図１３Ｏ〜ＱのＮＫ細胞、および図１３Ｌ〜Ｎの炎症性単球（図１３Ｇおよび図１３Ｊ）ではＢ細胞とＴ細胞の両方の絶対数が増加することがわかった。
【図１３Ｈ】図１３Ａ〜図１３Ｑは、実施例１２で実施した免疫プロファイリングの結果を示す。図１３Ａ〜Ｂは、抗体Ｂによる処置により、生脾臓細胞の量が大幅に増加し、脾臓重量が増加傾向にあることを示すグラフである。図１３Ｂ〜Ｑ：さらに、これらの生脾臓細胞の中で、Ｂ細胞の割合が大幅に増加し、Ｔ細胞の割合が減少し、図１３Ｏ〜ＱのＮＫ細胞、および図１３Ｌ〜Ｎの炎症性単球（図１３Ｇおよび図１３Ｊ）ではＢ細胞とＴ細胞の両方の絶対数が増加することがわかった。
【図１３Ｉ】図１３Ａ〜図１３Ｑは、実施例１２で実施した免疫プロファイリングの結果を示す。図１３Ａ〜Ｂは、抗体Ｂによる処置により、生脾臓細胞の量が大幅に増加し、脾臓重量が増加傾向にあることを示すグラフである。図１３Ｂ〜Ｑ：さらに、これらの生脾臓細胞の中で、Ｂ細胞の割合が大幅に増加し、Ｔ細胞の割合が減少し、図１３Ｏ〜ＱのＮＫ細胞、および図１３Ｌ〜Ｎの炎症性単球（図１３Ｇおよび図１３Ｊ）ではＢ細胞とＴ細胞の両方の絶対数が増加することがわかった。
【図１３Ｊ】図１３Ａ〜図１３Ｑは、実施例１２で実施した免疫プロファイリングの結果を示す。図１３Ａ〜Ｂは、抗体Ｂによる処置により、生脾臓細胞の量が大幅に増加し、脾臓重量が増加傾向にあることを示すグラフである。図１３Ｂ〜Ｑ：さらに、これらの生脾臓細胞の中で、Ｂ細胞の割合が大幅に増加し、Ｔ細胞の割合が減少し、図１３Ｏ〜ＱのＮＫ細胞、および図１３Ｌ〜Ｎの炎症性単球（図１３Ｇおよび図１３Ｊ）ではＢ細胞とＴ細胞の両方の絶対数が増加することがわかった。
【図１３Ｋ】図１３Ａ〜図１３Ｑは、実施例１２で実施した免疫プロファイリングの結果を示す。図１３Ａ〜Ｂは、抗体Ｂによる処置により、生脾臓細胞の量が大幅に増加し、脾臓重量が増加傾向にあることを示すグラフである。図１３Ｂ〜Ｑ：さらに、これらの生脾臓細胞の中で、Ｂ細胞の割合が大幅に増加し、Ｔ細胞の割合が減少し、図１３Ｏ〜ＱのＮＫ細胞、および図１３Ｌ〜Ｎの炎症性単球（図１３Ｇおよび図１３Ｊ）ではＢ細胞とＴ細胞の両方の絶対数が増加することがわかった。
【図１３Ｌ】図１３Ａ〜図１３Ｑは、実施例１２で実施した免疫プロファイリングの結果を示す。図１３Ａ〜Ｂは、抗体Ｂによる処置により、生脾臓細胞の量が大幅に増加し、脾臓重量が増加傾向にあることを示すグラフである。図１３Ｂ〜Ｑ：さらに、これらの生脾臓細胞の中で、Ｂ細胞の割合が大幅に増加し、Ｔ細胞の割合が減少し、図１３Ｏ〜ＱのＮＫ細胞、および図１３Ｌ〜Ｎの炎症性単球（図１３Ｇおよび図１３Ｊ）ではＢ細胞とＴ細胞の両方の絶対数が増加することがわかった。
【図１３Ｍ】図１３Ａ〜図１３Ｑは、実施例１２で実施した免疫プロファイリングの結果を示す。図１３Ａ〜Ｂは、抗体Ｂによる処置により、生脾臓細胞の量が大幅に増加し、脾臓重量が増加傾向にあることを示すグラフである。図１３Ｂ〜Ｑ：さらに、これらの生脾臓細胞の中で、Ｂ細胞の割合が大幅に増加し、Ｔ細胞の割合が減少し、図１３Ｏ〜ＱのＮＫ細胞、および図１３Ｌ〜Ｎの炎症性単球（図１３Ｇおよび図１３Ｊ）ではＢ細胞とＴ細胞の両方の絶対数が増加することがわかった。
【図１３Ｎ】図１３Ａ〜図１３Ｑは、実施例１２で実施した免疫プロファイリングの結果を示す。図１３Ａ〜Ｂは、抗体Ｂによる処置により、生脾臓細胞の量が大幅に増加し、脾臓重量が増加傾向にあることを示すグラフである。図１３Ｂ〜Ｑ：さらに、これらの生脾臓細胞の中で、Ｂ細胞の割合が大幅に増加し、Ｔ細胞の割合が減少し、図１３Ｏ〜ＱのＮＫ細胞、および図１３Ｌ〜Ｎの炎症性単球（図１３Ｇおよび図１３Ｊ）ではＢ細胞とＴ細胞の両方の絶対数が増加することがわかった。
【図１３Ｏ】図１３Ａ〜図１３Ｑは、実施例１２で実施した免疫プロファイリングの結果を示す。図１３Ａ〜Ｂは、抗体Ｂによる処置により、生脾臓細胞の量が大幅に増加し、脾臓重量が増加傾向にあることを示すグラフである。図１３Ｂ〜Ｑ：さらに、これらの生脾臓細胞の中で、Ｂ細胞の割合が大幅に増加し、Ｔ細胞の割合が減少し、図１３Ｏ〜ＱのＮＫ細胞、および図１３Ｌ〜Ｎの炎症性単球（図１３Ｇおよび図１３Ｊ）ではＢ細胞とＴ細胞の両方の絶対数が増加することがわかった。
【図１３Ｐ】図１３Ａ〜図１３Ｑは、実施例１２で実施した免疫プロファイリングの結果を示す。図１３Ａ〜Ｂは、抗体Ｂによる処置により、生脾臓細胞の量が大幅に増加し、脾臓重量が増加傾向にあることを示すグラフである。図１３Ｂ〜Ｑ：さらに、これらの生脾臓細胞の中で、Ｂ細胞の割合が大幅に増加し、Ｔ細胞の割合が減少し、図１３Ｏ〜ＱのＮＫ細胞、および図１３Ｌ〜Ｎの炎症性単球（図１３Ｇおよび図１３Ｊ）ではＢ細胞とＴ細胞の両方の絶対数が増加することがわかった。
【図１３Ｑ】図１３Ａ〜図１３Ｑは、実施例１２で実施した免疫プロファイリングの結果を示す。図１３Ａ〜Ｂは、抗体Ｂによる処置により、生脾臓細胞の量が大幅に増加し、脾臓重量が増加傾向にあることを示すグラフである。図１３Ｂ〜Ｑ：さらに、これらの生脾臓細胞の中で、Ｂ細胞の割合が大幅に増加し、Ｔ細胞の割合が減少し、図１３Ｏ〜ＱのＮＫ細胞、および図１３Ｌ〜Ｎの炎症性単球（図１３Ｇおよび図１３Ｊ）ではＢ細胞とＴ細胞の両方の絶対数が増加することがわかった。
【図１４】抗体Ｂによる処置がＧＬ２６１頭蓋内マウス神経膠腫モデルの生存率を増加させたことを示すグラフである。
【図１５】抗体Ｂは、１μＭコーティングでＵＣＮ１−３と交差反応性がなく、１０μＭでコーティングされたＵＣＮ２に対して少量の反応性があることを実証する直接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図１６】ＵＣＮ２ペプチドに対する抗体ＢのＫｄ＝４．０Ｅ−９の解離定数を算出するＯｃｔｅｔレッドバイオレイヤー干渉法を示す。この親和性は、ＣＲＦペプチドに対する抗体Ｂの親和性の４０００分の１である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本開示は、抗コルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）抗体のインビボ投与が急性ストレスに対するコルチコステロン応答を阻害するという発見に一部基づいている。
【００１７】
コルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）は、１９６アミノ酸のプレプロホルモン（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＥＡＷ８６８９７．１）に由来する４１アミノ酸のペプチド（ＳＥＥＰＰＩＳＬＤＬＴＦＨＬＬＲＥＶＬＥＭＡＲＡＥＱＬＡＱＱＡＨＳＮＲＫＬＭＥＩＩ（配列番号１））である。ＣＲＨは、ストレスに反応して視床下部の室傍核（ＰＶＮ）から分泌される。ＣＲＨ産生の増加は、アルツハイマー病および大うつ病に関連していることが観察されており（Ｒａａｄｓｈｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．１５２（９）：１３７２−６，１９９５）、常染色体劣性視床下部コルチコトロピン欠乏症は、低血糖を含む複数の（かつ潜在的に致命的な）代謝結果をもたらす。
【００１８】
実施例１に記載されるように、ＣＲＨペプチドフラグメント（例えば、アミノ末端フラグメント）を使用して、能動免疫によってインビボで抗ＣＲＨ抗体を生成した。これに関して、対象においてＣＲＨに対する免疫応答を生成するための（例えば、抗ＣＲＨ抗体を生成するための）ＣＲＨペプチドフラグメントの使用が具体的に企図される。本明細書で使用される「アミノ末端フラグメント」という用語は、配列番号１のＣＲＨのＮ末端で一続きのアミノ酸を保持し、Ｃ末端で一続きのアミノ酸を欠く、ＣＲＨの切断型を意味する。いくつかの実施形態では、ＣＲＨペプチドフラグメントは、配列番号１に記載のアミノ酸配列の３０アミノ酸またはそれ以下を含むペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＨペプチドフラグメントは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のアミノ酸の長さであるペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＨペプチドフラグメントは、２５アミノ酸未満の長さである。いくつかの実施形態では、ＣＲＨペプチドフラグメントは、１０アミノ酸の長さである。様々な態様では、ＣＲＭペプチドフラグメントは、配列番号１の最初の３０アミノ酸以下を含むアミノ末端ＣＲＭペプチドフラグメントである。いくつかの実施形態では、ＣＲＨペプチドフラグメントは、配列番号１のアミノ酸１〜１５（すなわち、配列番号２）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＨペプチドフラグメントは、配列番号１のアミノ酸１〜２１（すなわち、配列番号３）を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ＣＲＨペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％（または少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＨペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％（または少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、または９９％）同一である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＣＲＨペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはオボアルブミン（ＯＶＡ）に結合される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ＣＲＨペプチドフラグメントは、アジュバントとともに投与される。本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、ペプチドと組み合わせて使用される場合、ペプチドに対して誘導される免疫応答を増大させるか、さもなければ変化させる化合物を指す。免疫応答の改変には、抗体および／または細胞性免疫応答の特異性の強化または拡大が含まれ得る。あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｖｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．「Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（第２版）」に記載されている任意のアジュバントを含めることは、本開示の範囲内で想定される。既知のアジュバントの例としては、完全フロイントアジュバント（死菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含有する免疫応答の非特異的刺激物質）、不完全フロイントアジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。他の既知のアジュバントとしては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）化合物（ｔｈｕｒ−ＭＤＰおよびｎｏｒ−ＭＤＰなど）、ムラミルトリペプチドホスファチジルエタノールアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、ＲＩＢＩアジュバント（Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｍｏｎｔ．、細菌から抽出された３種の成分を含む）、２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルジョンに溶解したトレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）が挙げられる。ＭＦ−５９、Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）、および主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）抗原は、他の既知のアジュバントである。
【００２２】
抗体
本開示はまた、抗ＣＲＨ抗体を提供する。「抗体」という用語は、無傷の免疫グロブリン分子（完全長の重鎖および／または軽鎖を有するポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、および／またはヒトバージョンを含む）を指す。抗体は、当該技術分野で知られている任意の種類の抗体、すなわち免疫グロブリンであり得る。例示的な実施形態では、抗体は、クラスまたはアイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭの抗体である。例示的な実施形態では、本明細書に記載の抗体は、１つ以上のα重鎖、Δ重鎖、ε重鎖、γ重鎖、および／またはμ重鎖を含む。例示的な実施形態では、本明細書に記載の抗体は、１つ以上のκまたは軽鎖を含む。例示的な態様では、抗体は、ＩｇＧ抗体であり、任意選択で、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の４種のヒトサブクラスの１種である。また、いくつかの実施形態における抗体は、モノクローナル抗体である。他の実施形態では、抗体はポリクローナル抗体である。いくつかの態様では、抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体である。抗体に関して使用される場合、「ヒト化」という用語は、非ヒト供給源由来の少なくともＣＤＲ領域を有し、元の供給源抗体よりも真のヒト抗体により類似した構造および免疫機能を有するように操作されている抗体を指す。例えば、ヒト化は、マウス抗体などの非ヒト抗体からヒト抗体フレームワークへのＣＤＲの移植を含み得る。ヒト化は、非ヒト配列をよりヒト配列らしくするアミノ酸置換を選択することも含み得る。
【００２３】
いくつかの態様では、抗体は、ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体である。Ｈｕｍａｎｅｅｒｉｎｇテクノロジーは、非ヒト抗体を操作されたヒト抗体に変換する。Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（商標）抗体は親和性が高く、ヒト生殖細胞系抗体配列と非常に類似している。例えば、Ｔｏｍａｓｅｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ，，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３２：２２３−２３５（２０１４）を参照されたい。
【００２４】
本明細書で使用される「特異的に結合する」とは、抗体（または抗原結合フラグメント）が他のタンパク質よりも抗原（ＣＲＨペプチド）に優先的に結合することを意味する。いくつかの実施形態では、「特異的に結合する」とは、抗体が他のタンパク質よりも抗原に対してより高い親和性を有することを意味する。抗原に特異的に結合する抗体は、１×１０−７Ｍ以下、２×１０−７Ｍ以下、３×１０−７Ｍ以下、４×１０−７Ｍ以下、５×１０−７Ｍ以下、６×１０−７Ｍ以下、７×１０−７Ｍ以下、８×１０−７Ｍ以下、９×１０−７Ｍ以下、１×１０−８Ｍ以下、２×１０−８Ｍ以下、３×１０−８Ｍ以下、４×１０−８Ｍ以下、５×１０−８Ｍ以下、６×１０−８Ｍ以下、７×１０−８Ｍ以下、８×１０−８Ｍ以下、９×１０−８Ｍ以下、１×１０−９Ｍ以下、２×１０−９Ｍ以下、３×１０−９Ｍ以下、４×１０−９Ｍ以下、５×１０−９Ｍ以下、６×１０−９Ｍ以下、７×１０−９Ｍ以下、８×１０−９Ｍ以下、９×１０−９Ｍ以下、１×１０−１０Ｍ以下、２×１０−１０Ｍ以下、３×１０−１０Ｍ以下、４×１０−１０Ｍ以下、５×１０−１０Ｍ以下、６×１０−１０Ｍ以下、７×１０−１０Ｍ以下、８×１０−１０Ｍ以下、９×１０−１０Ｍ以下、１×１０−１１Ｍ以下、２×１０−１１Ｍ以下、３×１０−１１Ｍ以下、４×１０−１１Ｍ以下、５×１０−１１Ｍ以下、６×１０−１１Ｍ以下、７×１０−１１Ｍ以下、８×１０−１１Ｍ以下、９×１０−１１Ｍ以下、１×１０−１２Ｍ以下、２×１０−１２Ｍ以下、３×１０−１２Ｍ以下、４×１０−１２Ｍ以下、５×１０−１２Ｍ以下、６×１０−１２Ｍ以下、７×１０−１２Ｍ以下、８×１０−１２Ｍ以下、または９×１０−１２Ｍ以下の抗原に対する結合親和性を有し得る。本開示の文脈において、エンドポイントとして上記の値を有する範囲が企図されることが理解されるであろう。例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントは、約１×１０−７Ｍ〜約９×１０−１２Ｍの親和性または１×１０−９〜約９×１０−１２の親和性で配列番号１のＣＲＨに結合し得る。
【００２５】
いくつかの実施形態または任意の実施形態では、抗体（または抗原結合フラグメント）は、１×１０−７Ｍ以下、１×１０−８Ｍ以下、１×１０−９Ｍ以下、１×１０−１０Ｍ以下、１×１０−１１Ｍ以下、１×１０−１２Ｍ以下、もしくは１×１０−９〜１×１０−１０の範囲、もしくは１×１０−１２〜約１×１０−１３の範囲の親和性（Ｋｄ）で配列番号１のＣＲＨまたはその天然に存在する変異体に結合する。親和性は、親和性ＥＬＩＳＡアッセイおよび表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）アッセイを含む様々な技術を使用して決定される。
【００２６】
いくつかの実施形態または任意の実施形態では、抗体（またはその抗原結合フラグメント）は、上記の親和性のいずれかで、配列番号１のアミノ酸１〜２１を含むＣＲＨペプチドに結合する。あるいは、またはさらに、抗体（またはその抗原結合フラグメント）は、上記の親和性のいずれかで、配列番号１のアミノ酸１〜１５を含むＣＲＨペプチドに結合する。
【００２７】
「ＣＤＲ」は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖および軽鎖の各可変領域には３つのＣＤＲがあり、可変領域ごとにＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる。本明細書で使用される「６つのＣＤＲのセット」という用語は、抗原に結合することができる、軽鎖可変領域および重鎖可変領域で生じる３つのＣＤＲのグループを指す。ＣＤＲの正確な境界は、システムによって定義が異なっている。Ｋａｂａｔによって記述されたシステム（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７）および（１９９１））は、抗体の任意の可変領域に適用可能な明確な残基番号付けシステムを提供するだけでなく、３つのＣＤＲを定義する正確な残基境界も提供する。これらのＣＤＲは、ＫａｂａｔのＣＤＲと呼ばれることがある。Ｃｈｏｔｈｉａとその共同研究者（Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）およびＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３（１９８９））は、ＫａｂａｔＣＤＲ内の特定のサブ部分が、そのアミノ酸配列のレベルではかなりの多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格の立体構造をとることを見出した。これらのサブ部分は、Ｌ１、Ｌ２とＬ３、またはＨ１、Ｈ２とＨ３と命名され、「Ｌ」と「Ｈ」はそれぞれ軽鎖と重鎖の領域を示す。これらの領域はＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲと呼ばれることがあり、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複する境界を有する。Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複するＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−１３９（１９９５））およびＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６２（５）：７３２４５（１９９６））によって記載されている。さらに他のＣＤＲ境界の定義は、上記のシステムの１つに厳密には従わない場合があるが、それにもかかわらず、ＫａｂａｔのＣＤＲと重複しており、しかし、特定の残基もしくは残基のグループ、または全ＣＤＲでさえも抗原結合に大きな影響を与えないという予測または実験結果の観点から、短縮または延長されることができる。本明細書で使用する方法は、これらのシステムのいずれかに従って定義されたＣＤＲを利用することができるが、好ましい実施形態では、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａが定義したＣＤＲを使用する。
【００２８】
ＣＤＲは、例えば、目的のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを構築し、好適な宿主細胞で発現させることによって得られる。このようなポリヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、抗体産生細胞のｍＲＮＡをテンプレートとして使用して可変領域を合成することによって調製される（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２：１０６（１９９１）；Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ，“Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（編），ｐａｇｅ  １６６，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（編），ｐａｇｅ  １３７，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．（１９９５）を参照されたい）。
【００２９】
様々な態様では、抗体（またはその抗原結合フラグメント）は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３から選択されるＣＤＲに対して少なくとも７５％の同一性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の同一性）を有する少なくとも１つのＣＤＲ配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号４に示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号５に示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号６に示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号７に示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号８に示される配列を有し、およびＣＤＲ−Ｌ３は配列番号９に示される配列を有する。様々な態様では、抗ＣＲＨ抗体は、２つのＣＤＲ、３つのＣＤＲ、４つのＣＤＲ、５つのＣＤＲ、または６つすべてのＣＤＲを含む。好ましい実施形態では、抗ＣＲＨ抗体は、以下のような６つのＣＤＲのセットを含む：配列番号４のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５のＣＤＲ−Ｈ２、配列番号６のＣＤＲ−Ｈ３、配列番号７のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号９のＣＤＲ−Ｌ３。
【００３０】
様々な態様では、抗体（またはその抗原結合フラグメント）は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３から選択されるＣＤＲに対して少なくとも７５％の同一性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の同一性）を有する少なくとも１つのＣＤＲ配列を含み、ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号１２に示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号１３に示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号１４に示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号１５に示される配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号１６に示される配列を有し、およびＣＤＲ−Ｌ３は配列番号１７に示される配列を有する。様々な態様では、抗ＣＲＨ抗体は、２つのＣＤＲ、３つのＣＤＲ、４つのＣＤＲ、５つのＣＤＲ、または６つすべてのＣＤＲを含む。好ましい実施形態では、抗ＣＲＨ抗体は、以下のような６つのＣＤＲのセットを含む：配列番号１２のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１３のＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１４のＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１５のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１６のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１７のＣＤＲ−Ｌ３。
【００３１】
いくつかの実施形態または任意の実施形態では、抗体は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号１１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。様々な態様では、配列番号１０または１１と比較した配列の違いは、対応する配列のＣＤＲ領域の外側にある。いくつかの実施形態または任意の実施形態では、抗体（または抗原結合フラグメント）は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態または任意の実施形態では、抗体（または抗原結合フラグメント）は、配列番号２２に記載のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態または任意の実施形態では、抗体（または抗原結合フラグメント）は、配列番号２３に記載のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態または任意の実施形態では、抗体は、配列番号１８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号１９に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一性）を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。様々な態様では、配列番号１８または１９と比較した配列の違いは、対応する配列のＣＤＲ領域の外側にある。いくつかの実施形態または任意の実施形態では、抗体（またはその抗原結合フラグメント）は、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。
【００３３】
本明細書に記載の抗ＣＲＨ抗体の抗原結合フラグメントも企図される。抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの抗原結合部位を有する抗体の任意の部分であり得、および抗原結合フラグメントは、抗原結合フラグメントがＣＲＨを認識する能力を保持するより大きな構造（「抗体産物」）の一部であり得る。参照を容易にするために、抗原結合フラグメントを含むこれらの抗体産物は、本明細書の「抗原結合フラグメント」の開示に含まれる。抗原結合フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ‘）２、単一特異性または二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ３、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、二重特異性ダイアボディ、三重特異性トライアボディ、ミニボディ、ＩｇＮＡＲのフラグメント（例えば、Ｖ−ＮＡＲ）、ｈｃＩｇＧのフラグメント（例えば、ＶｈＨ）、ビス−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ発現ライブラリーによって発現されるフラグメントなどが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な態様では、抗原結合フラグメントは、ドメイン抗体、ＶｈＨドメイン、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＶＨドメイン、ＶＬドメインなどである。しかし、本開示の抗体フラグメントは、これらの例示的なタイプの抗体フラグメントに限定されない。例示的な態様では、抗原結合フラグメントはＦａｂフラグメントである。例示的な態様では、抗原結合フラグメントは、２つのＦａｂフラグメントを含む。例示的な態様では、抗原結合フラグメントは、リンカーを介して連結された２つのＦａｂフラグメントを含む。例示的な態様では、抗原結合フラグメントは、２つのＦａｂフラグメントを含むか、またはこれらを含むミニボディである。例示的な態様では、抗原結合フラグメントは、リンカーを介して連結された２つのＦａｂフラグメントを含むか、またはこれらを含むミニボディである。ミニボディは、当該技術分野で既知である。例えば、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５６：３０５５−３０６１（１９９６）を参照されたい。例示的な態様では、抗原結合フラグメントは、リンカーを介して連結された２つのＦａｂフラグメントを含むか、またはこれらを含むミニボディであり、任意選択で、アルカリホスファターゼドメインを含む。
【００３４】
ドメイン抗体は、抗体の機能的結合ユニットを含み、抗体の重鎖（ＶＨ）または軽鎖（ＶＬ）のいずれかの可変領域に対応し得る。ドメイン抗体は、約１３ｋＤａ、または完全な抗体の約１０分の１の分子量を有し得る。ドメイン抗体は、本明細書に記載されているものなどの完全な抗体に由来し得る。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒトＦｃドメインに付着している。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃエフェクター機能を活性化しない。
【００３６】
抗体または抗原結合フラグメントの生成方法
抗体を作製する好適な方法は当該技術分野で知られている。例えば、標準的なハイブリドーマ法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（編）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）、およびＣＡ．Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．（編）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．第５版，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２００１））に記載されている。本開示の方法で使用するためのモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して調製することができる。これらには、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって最初に記述されたハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７、１９７５）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２、１９８３；Ｃｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８０：２０２６−２０３０、１９８３）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＮＹ，ｐｐ  ７７−９６，（１９８５）が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、他の方法、例えば、ＥＢＶハイブリドーマ法（Ｈａｓｋａｒｄ  ａｎｄ  Ａｒｃｈｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７４（２）、３６１−６７（１９８４）、およびＲｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１，１４０−６７（１９８６））、およびバクテリオファージベクター発現システム（例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１２７５−８１（１９８９）を参照されたい）は当該技術分野で知られている。さらに、非ヒト動物において抗体を産生する方法は、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、および同第５，７１４，３５２号、ならびに米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６Ａ１号に記載されている。抗体はまた、リンパ球集団においてインビボ産生を誘導することによって、またはＯｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８６：３８３３−３８３７；１９８９）、ならびにＷｉｎｔｅｒ  ＧおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ（Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９，１９９１）に開示されているように、組換え免疫グロブリンライブラリーまたは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって産生され得る。抗体または抗原結合フラグメントの完全な配列が知られている場合、組換えタンパク質を産生する方法を使用することができる。たとえば、“Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５（２）：１３５−１４６（２００８）を参照されたい。いくつかの実施形態では、抗体（または抗原結合フラグメント）は、インビボで生成される場合、細胞培養物または生体試料から単離される。
【００３７】
ファージディスプレイを使用して、本開示の抗体を生成することもできる。これに関して、抗体の抗原結合可変（Ｖ）ドメインをコードするファージライブラリーは、標準的な分子生物学および組換えＤＮＡ技術を使用して生成することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）を参照されたい。所望の特異性を有する可変領域をコードするファージが、所望の抗原への特異的結合のために選択され、完全抗体または部分抗体が、選択された可変ドメインを含むように再構成される。再構成された抗体をコードする核酸配列は、ハイブリドーマ産生に使用される骨髄腫細胞などの好適な細胞株に導入され、モノクローナル抗体の特徴を有する抗体が細胞によって分泌されるようになる（例えば、上記のＪａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，上記のＨｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，、および米国特許第６，２６５，１５０号を参照されたい）。関連する方法は、米国特許第５，４０３，４８４号、米国特許第５，５７１，６９８号、米国特許第５，８３７，５００号、米国特許第５，７０２，８９２号にも記載されている。これらの技術は、米国特許第５，７８０，２７９号、米国特許第５，８２１，０４７号、米国特許第５，８２４，５２０号、米国特許第５，８５５，８８５号、米国特許第５，８５８，６５７号、米国特許第５，８７１，９０７号、米国特許第５，９６９，１０８号、米国特許第６，０５７，０９８号、および米国特許第６，２２５，４４７号に記載されている。
【００３８】
抗体は、特定の重鎖および軽鎖の免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックであるトランスジェニックマウスによって産生され得る。そのような方法は当該技術分野で知られており、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号および同第５，５６９，８２５号、ならびに上記のＪａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．に記載されている。
【００３９】
ヒト化抗体を生成するための方法は当該技術分野で周知であり、例えば、上記のＪａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６１号、欧州特許第０２３９４００Ｂ１号、および英国特許第２１８８６３８号に詳述されている。ヒト化抗体は、米国特許第５，６３９，６４１号、およびＰｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２３５、９５９−９７３（１９９４）に記載されている抗体レサーフェシング技術を使用して生成することもできる。好ましいキメラまたはヒト化抗体は、ヒト定常領域を有し、一方、抗体の可変領域、または少なくともＣＤＲは、非ヒト種に由来する。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野で周知である。（米国特許第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６２号を参照されたい。）
【００４０】
「キメラ抗体」の産生のために開発された技術、例えば、適切な抗原特異性および生物活性を有する分子を得るためのヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングを使用することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５））。あるいは、一本鎖抗体の産生について記述された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を適合させて、ＣＲＨ特異的一本鎖抗体を産生することができる。
【００４１】
同様に、ＣＤＲを単離するために当該技術分野で知られている技術を使用して、ＣＤＲを含む組成物が生成される。モノクローナル抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域の１つ、２つ、および／または３つのＣＤＲを含む組成物を生成することができる。例示的な抗体のＣＤＲは、本明細書において、配列番号４〜９および１２〜１７として提供される。ヌクレオチド配列およびポリペプチド配列をクローニングし、発現させるための技術は、当該技術分野で十分に確立されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照されたい）。増幅されたＣＤＲ配列は、適切なプラスミドに結合される。１、２、３、４、５、および／または６つのクローニングされたＣＤＲを含むプラスミドは、任意選択で、ＣＤＲに結合した領域をコードするさらなるポリペプチドを含有する。
【００４２】
化学的に構築される二重特異性抗体は、ヘテロ二官能性試薬であるスクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）−プロピオネート（ＳＰＤＰ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）などの化学物質によって異種ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントを化学的に架橋することで調製できる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、無傷の抗体からそれぞれパパインまたはペプシンで分解することにより得ることができる（Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６−７０１（１９８４）；Ｔｉｔｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８：４０１８−２２（１９８７））。
【００４３】
抗体がどのように産生されているかに関係なく、ＣＲＨのエピトープに結合する能力について抗体を試験する方法は、当該技術分野で知られており、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）、および競合阻害アッセイ（例えば、以下のＪａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，および米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６号を参照されたい）。
【００４４】
抗体分子の抗原結合またはイディオタイプを含む抗体フラグメントは、当該技術分野で知られている技術によって生成することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体分子のペプシン分解によって生成され得、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得、２つのＦａｂ’フラグメントは、抗体分子をパパインと還元剤で処理することによって生成され得る。本開示は、抗原結合フラグメントを生成する酵素的方法に限定されず、抗原結合フラグメントは、好適な宿主細胞においてフラグメントをコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される組換え抗原結合フラグメントであり得る。
【００４５】
合成ペプチドを介して抗体軽鎖のＶドメインに結合した抗体重鎖の可変（Ｖ）ドメインを含む切断型Ｆａｂフラグメントからなる一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）は、常套の組換えＤＮＡ技術を使用して生成され得る（例えば、上記のＪａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌを参照されたい）。同様に、ジスルフィド安定化可変領域フラグメント（ｄｓＦｖ）は、組換えＤＮＡ技術によって調製され得る（例えば、Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４（１９９４）を参照されたい）。
【００４６】
組換え抗体フラグメント、例えば、ｓｃＦｖは、異なる標的抗原に対する高い結合アビディティおよび特異性の安定した多量体オリゴマーに構築されるように操作され得る。そのようなダイアボディ（ダイマー）、トリアボディ（トリマー）またはテトラボディ（テトラマー）は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｋｏｒｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ．２００１  １８：９５−１０８，（２００１）およびＴｏｄｏｒｏｖｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２４８：４７−６６，（２００１）を参照されたい。
【００４７】
検出方法
試料中のＣＲＨの存在を検出したり、ＣＲＨの量を測定したりすることが望ましいときがある。これに関して、本開示は、試料中のＣＲＨの量を測定するために、本明細書に記載の抗体またはそのフラグメントを使用する方法を提供する。ＣＲＨの測定値を決定するために、哺乳動物対象由来の生体試料を、免疫複合体を形成させるのに十分な時間、本明細書に記載の抗ＣＲＨ抗体（またはその抗原結合フラグメント）と接触させる。次に、試料中の抗体とＣＲＨの間に形成された免疫複合体が検出される。生体試料中のＣＲＨの量は、抗体とＣＲＨの間に形成される免疫複合体の量を測定することによって任意選択で定量化される。例えば、抗体が検出可能な標識を有する場合、抗体を定量的に測定することができ、または二次抗体を使用して免疫複合体を定量化することができる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、生体試料は、組織試料、細胞試料、または血液、唾液、血清、または血漿などの生体液試料を含む。
【００４９】
抗体を試験試料とともにインキュベートするための条件は多様である。インキュベーション条件は、アッセイで使用される形式、使用される検出方法、およびアッセイで使用される抗体の種類と性質によって異なる。当業者は、一般に利用可能な免疫学的アッセイ形式のいずれか１つが、本開示の抗体（またはそのフラグメント）を使用するように容易に適合され得ることを認識するであろう。このようなアッセイの例は、Ｃｈａｒｄ、Ｔ．，Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８６）；Ｂｕｌｌｏｃｋ、Ｇ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ  Ｖｏｌ．１（１９８２），Ｖｏｌ．２（１９８３），Ｖｏｌ．３（１９８５）；Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．，Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８５）に見いだすことができる。上記の方法で使用される試験試料は、アッセイ形式、検出方法の性質、およびアッセイされる試料として使用される組織、細胞、または液体に基づいて変化する。
【００５０】
本明細書に記載のアッセイは、例えば、動物研究、臨床試験、または個々の患者の治療のモニタリングにおいて、特定の治療レジームの有効性を評価するのに役立ち得る。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ＣＲＨまたは抗ＣＲＨ抗体（もしくはそのフラグメント）は、固体支持体に付着しており、結合は、ＣＲＨと固体支持体上の抗体（またはそのフラグメント）との間の複合体を検出することによって検出される。抗体（またはそのフラグメント）は、任意選択で検出可能な標識を含み、結合は、ＣＲＨ−抗体複合体中の標識を検出することによって検出される。
【００５２】
ＣＲＨ−抗体複合体の存在または不在の検出は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して達成される。例えば、標的分子（例えば、抗体）と相互作用するＣＲＨペプチドのレポーター遺伝子転写アッセイから得られる転写物は、通常は、直接的または間接的に検出可能な生成物（例えば、β−ガラクトシダーゼ活性およびルシフェラーゼ活性）をコードする。無細胞結合アッセイの場合、構成成分の１つは通常、検出可能なラベルが含まれているか、またはラベルに結合されている。直接検出（放射能、発光、光学密度、もしくは電子密度など）または間接検出（ＦＬＡＧエピトープなどのエピトープタグ、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素タグ）を提供するラベルなど、種々のラベルを使用できる。標識は抗体に結合させることも、抗体の構造に組み込むこともできる。
【００５３】
ラベルおよび他のアッセイ成分の性質に応じて、様々な方法を使用してラベルを検出することができる。例えば、標識は、固体基質に結合している間、または固体基質から分離した後に検出することができる。標識は、光学密度もしくは電子密度、放射性放出、非放射エネルギー移動によって直接検出されることができるか、または抗体複合体、またはストレプトアビジン・ビオチン複合体で間接的に検出されることができる。ラベルを検出するための方法は、当該技術分野で周知である。
【００５４】
医薬組成物
本明細書に記載のすべてのタンパク質ベースの治療法（例えば、抗体）について、遺伝子発現構築物の送達による投与が一実施形態として企図される。任意の好適なベクターを使用して、本明細書に記載のタンパク質ベースの治療薬をコードするポリヌクレオチドを宿主に導入することができる。文献に記載されている例示的なベクターとしては、レンチウイルスベクターを含むがこれらに限定されない複製欠損レトロウイルスベクター［Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（１）：８１１−８１６（１９９８）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓｃｒｉｐ  Ｍａｇａｚｉｎｅ，Ｏｃｔｏｂｅｒ，１９９８，ｐｐ．４３  ４６．］；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター［米国特許第５，４７４，９３５号、米国特許第５，１３９，９４１号、米国特許第５，６２２，８５６号、米国特許第５，６５８，７７６号、米国特許第５，７７３，２８９号、米国特許第５，７８９，３９０号、米国特許第５，８３４，４４１号、米国特許第５，８６３，５４１号、米国特許第５，８５１，５２１号、米国特許第５，２５２，４７９号、Ｇｎａｔｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｍｅｄ．，４５：８７  ９８（１９９７）］；アデノウイルス（ＡＶ）ベクター［例えば、米国特許第５，７９２，４５３号、米国特許第５，８２４，５４４号、米国特許第５，７０７，６１８号、米国特許第５，６９３，５０９号、米国特許第５，６７０，４８８号、米国特許第５，５８５，３６２号、Ｑｕａｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：２５８１  ２５８４（１９９２）；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  Ｐｅｒｒｉｃａｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９０：６２６  ６３０（１９９２）；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ、６８：１４３  １５５（１９９２）を参照されたい］；アデノウイルスアデノ随伴ウイルスキメラ（例えば、米国特許第５，８５６，１５２号を参照されたい）またはワクシニアウイルスもしくはヘルペスウイルス（例えば、米国特許第５，８７９，９３４号、米国特許第５，８４９，５７１号、米国特許第５，８３０，７２７号、米国特許第５，６６１，０３３号、米国特許第５，３２８，６８８号を参照されたい）；リポフェクチン媒介遺伝子導入（ＢＲＬ）；リポソームベクター［例えば、米国特許第５，６３１，２３７号（Ｓｅｎｄａｉウイルスタンパク質を含むリポソーム）を参照されたい］；およびそれらの組み合わせが挙げられる。前述の文書のすべては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。複製欠損アデノウイルスベクターは、好ましい実施形態を構成する。
【００５５】
本明細書に記載の抗ＣＲＨ抗体またはその抗原結合フラグメント（もしくはＣＲＨペプチドフラグメント）を含む医薬組成物も企図される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、例えば、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解または放出の速度、吸着または浸透を改変、維持または保存するための製剤材料を含む。そのような実施形態では、好適な製剤材料としては、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、プロリン、メチオニン、もしくはリシンなど）；抗菌剤；酸化防止剤（還元剤、酸素／フリーラジカルスカベンジャー、およびキレート剤（例えば、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、亜硫酸ナトリウム、もしくは亜硫酸水素ナトリウム）など）；緩衝剤（ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、もしくは他の有機酸など）；増量剤（マンニトールもしくはグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、もしくはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖；二糖；および他の炭水化物（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど）；着色剤、香味剤、および賦形剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、もしくは過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールもしくはソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベートなど、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパルなど）；安定性向上剤（ショ糖もしくはソルビトールなど）；張度増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは、塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム、マンニトール、ソルビトールなど）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または補助薬が挙げられるが、これらに限定されない。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１８版、（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ、編）、１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい。
【００５６】
本明細書に記載の特定の製剤材料の選択は、例えば、意図された投与経路、送達形式、および所望の投与量によって推進され得る。例えば、上記のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳを参照されたい。医薬組成物中の主要なビヒクルまたは担体は、本質的に水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、好適なビヒクルまたは担体は、注射用水、生理食塩水、または人工脳脊髄液であり得、非経口投与用の組成物で一般的な他の材料が補充されている可能性がある。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。特定の実施形態では、医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、ソルビトールまたはその好適な代替物をさらに含み得る。特定の実施形態では、組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を、任意選択の製剤化剤（上記のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ）と混合することによって凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で保存用に調製され得る。さらに、いくつかの実施形態では、抗体または（その抗原結合フラグメント）は、スクロースなどの適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として調製され得る。
【００５７】
本発明の医薬組成物は、非経口送達のために選択することができる。あるいは、組成物は、吸入のために、または経口などの消化管を介した送達のために選択され得る。そのような薬学的に許容される組成物の調製は当業者の範囲内である。製剤成分は、好ましくは、投与部位に許容される濃度で存在する。特定の実施形態では、緩衝液は、組成物を生理学的ｐＨまたはわずかに低いｐＨ、典型的には約５〜約８のｐＨ範囲内に維持するために使用される。
【００５８】
非経口投与が企図される場合、組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望の抗体またはフラグメントを含む、パイロジェンを含まない非経口的に許容される水溶液の形態で提供され得る。非経口注射に特に好適なビヒクルは、抗体またはフラグメントが適切に保存された無菌の等張液として調製されている無菌の蒸留水である。特定の実施形態では、移植可能な薬物送達デバイスは、所望の抗体（またはその抗原結合フラグメント）を導入するために使用され得る。
【００５９】
追加の医薬組成物は、例えば、持続送達製剤または制御送達製剤中に抗原結合タンパク質を含むことは、当業者には明らかであろう。リポソーム担体、生体侵食性微粒子または多孔質ビーズ、および蓄積注射などの他の様々な持続送達手段または制御送達手段を調製するための技術も当業者に知られている。例えば、参照により組み込まれ、医薬組成物の送達のための多孔質ポリマー微粒子の制御放出を記載している国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照されたい。徐放性調製物は、成形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスを含み得る。徐放性マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号および欧州特許出願公開第ＥＰ０５８４８１号に開示されており、その各々が参照により組み込まれる）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ、１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，上記）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第ＥＰ１３３９８８号）が挙げられる。徐放性組成物はまた、当技術分野で知られているいくつかの方法のいずれかによって調製することができるリポソームを含み得る。例えば、参照により組み込まれる、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：３６８８−３６９２；欧州特許出願公開第ＥＰ０３６６７６号、同ＥＰ０８８０４６号および同ＥＰ１４３９４９号を参照されたい。
【００６０】
抗体製剤の実施形態は、１種以上の防腐剤をさらに含み得る。
【００６１】
使用される抗体含有医薬組成物の治療有効量は、例えば、治療状況および目的に依存するであろう。当業者は、治療のための適切な投与量レベルが、送達される分子、抗体が使用されている適応症、投与経路、および患者のサイズ（患者の体重、体表面、または臓器の大きさ）、および／または状態（年齢および全身の健康）にある程度依存して変化することを理解するであろう。
【００６２】
本明細書に記載の組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の一般的経路によるものである。医薬組成物は、任意の従来の方法によって、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、くも膜下腔内、眼内、眼球後、肺内（例えば、期間放出）によって、経口、舌下、経鼻、肛門、膣内、もしくは経皮送達によって、または特定の部位での外科的移植、例えば、脾膜下、脳下、もしくは角膜内に埋め込まれることによって、対象に導入され得る。治療は、単回投与または一定期間にわたる複数回投与からなり得る。いくつかの実施形態では、組成物は、局所投与を介して脳に送達される。
【００６３】
治療法
本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、ＣＲＨペプチドフラグメント、および医薬組成物は、ＣＲＨ調節不全または視床下部下垂体副腎（ＨＰＡ）軸の活性化に関連する障害（例えば、ストレス関連障害および／または癌）を治療または予防するのに有用である。ＨＰＡ軸には、視床下部、下垂体、および神経内分泌系を形成する副腎の３つの内分泌腺間の正および負のフィードバック相互作用が含まれる。内分泌腺から放出されるホルモンは、ストレスへの反応、消化などの身体プロセスの調節、免疫系、気分と感情、セクシュアリティおよびエネルギーの保存と消費を制御する。ＨＰＡ軸は、数種類の精神病や神経精神病において、ならびにアルコール依存症や脳卒中において調節不全になる。ＨＰＡ軸バイオマーカーの例としては、ＡＣＴＨおよびコルチゾールが挙げられる。コルチゾールはコルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）の分泌を阻害し、ＡＣＴＨ分泌のフィードバック阻害になる。この通常のフィードバックループは、ヒトが慢性的なストレスに曝されると崩壊することがあり得、うつ病の根本的な原因となり得る。
【００６４】
慢性的な心理的ストレスおよびＨＰＡ軸の摂動は、アルツハイマー病、不安障害、大うつ病、心的外傷後ストレス障害、中毒、メタボリックシンドローム、骨粗鬆症およびサルコペニアを含むがこれらに限定されない多くの疾患および状態に関連している。さらに、慢性ストレス、ＨＰＡ軸機能障害、およびコルチゾールの上昇は、老化の負の生理学的結果に関する促進剤として関係している。本明細書に記載の抗ＣＲＨ抗体を、治療を必要とする対象に投与することによるこれらの障害／状態の１つ以上の治療が具体的に企図される。
【００６５】
「治療」または「治療すること」とは、患者を苦しめる網膜関連疾患に関連する１つ以上の症状、例えば、治療中の疾患に関連する症状の少なくとも改善を意味し、改善は、例えば、パラメータの大きさの少なくとも低減を指すために広義で使用される。したがって、治療はまた、患者がもはや障害または障害を特徴付ける少なくとも症状を患わないように、病的状態もしくはそれに関連する少なくとも症状が完全に阻害される、例えば、発生が予防される、もしくは停止される、例えば、終了する状況を含む。場合によっては、「治療」、「治療すること」などは、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患もしくはその症状を完全もしくは部分的に予防するという観点から予防的であり得、かつ／または疾患および／もしくは疾患に起因する副作用の部分的もしくは完全な治癒の観点から治療的であり得る。「治療」は、対象における疾患の任意選択の治療であり得、（ａ）疾患にかかりやすい可能性があるが、それを有するとまだ診断されていない対象において、疾患が生じることを予防すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること、または（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患の退縮を引き起こすことを含む。治療は、様々な異なる物理的発現、例えば、遺伝子発現の調節、神経新生の増加、組織または器官の再生などをもたらし得る。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化または低減する進行中の治療が、いくつかの実施形態では行われる。そのような治療は、罹患した組織の機能が完全に失われる前に実施され得る。主題の療法は、疾患の症候性段階中に、場合によっては疾患の症候性段階後に投与されてもよい。「予防する」という用語は、病気を１００％阻害することを意味するものではない。
【００６６】
慢性ストレスは、多くの行動的および生理学的病的状態と関連している。心理的ストレスは、全般性不安障害、パニック障害、大うつ病、アルツハイマー病、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）を含むがこれらに限定されない、多くの行動状態または精神状態の一因となる。慢性ストレスはまた、心臓血管および免疫学的に有害な影響を与えることが示されている。ＣＲＨは、ＨＰＡストレス反応の主なコーディネーターであり、不安、依存症、大うつ病、ＰＴＳＤの動物モデルに強く関係している。さらに、アルツハイマー病のストレスおよびＣＲＨは、アミロイドとタウの両病状の強力な促進剤であり、ＣＲＨは、アルツハイマー病の前臨床モデルにおいてアミロイド病状を促進する。したがって、本開示は、不安、うつ病、アルツハイマー病、心的外傷後ストレス障害、全般性不安障害、大うつ病、神経性食欲不振症、心的外傷後ストレス障害、副腎障害、メタボリックシンドローム、１型糖尿病、サルコペニア、および多発性硬化症を治療または予防する方法が企図される。
【００６７】
ＣＲＨは癌組織および細胞株で検出されており、ＭＣＦ７乳癌細胞の細胞運動性および浸潤性を刺激し得る（Ａｎｄｒｏｕｌｉｄａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ，８：３０，２００９）。したがって、本開示は、癌の治療を必要とする対象における癌を治療する方法を企図する。例示的な癌としては、これらに限定されないが、食道癌、膵臓癌、転移性膵臓癌、膵臓の転移性腺癌、膀胱癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、線維性癌、神経膠腫、悪性神経膠腫、びまん性内在性橋グリオーマ、再発性小児脳腫瘍、腎細胞癌、転移性腎明細胞癌、腎臓癌、前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、ＩＶ期前立腺癌、転移性黒色腫、黒色腫、悪性黒色腫、皮膚の再発性黒色腫、黒色腫脳転移、ＩＩＩＡ期皮膚黒色腫、ＩＩＩＢ期皮膚黒色腫、ＩＩＩＣ期皮膚黒色腫、ＩＶ期皮膚黒色腫、頭頸部の悪性黒色腫、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、扁平上皮非小細胞肺癌、乳癌、再発性転移性乳癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、進行Ｂ細胞ＮＨＬ、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を含むＨＬ、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、寛解期の成人骨髄性白血病；Ｉｎｖ（１６）（ｐ１３．１ｑ２２）を伴う成人急性骨髄性白血病；ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１；ｔ（１６；１６）（ｐ１３．１；ｑ２２）を伴う成人急性骨髄性白血病；ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１；ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）を伴う成人急性骨髄性白血病；ＲＵＮＸ１−ＲＵＮＸ１Ｔ１；ｔ（９；１１）（ｐ２２；ｑ２３）を伴う成人急性骨髄性白血病；ＭＬＬＴ３−ＭＬＬ；ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ１２）を伴う成人急性前骨髄球性白血病；ＰＭＬ−ＲＡＲＡ；アルキル化剤関連急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、リヒター症候群、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、成人神経膠芽腫、再発性神経膠芽腫、再発性小児横紋筋肉腫、再発性ユーイング肉腫／末梢性原始神経外胚葉性腫瘍、再発性神経芽細胞腫、再発性骨肉腫、結腸直腸癌、ＭＳＩ陽性結腸直腸癌；ＭＳＩ陰性結腸直腸癌、上咽頭非角化型癌、再発性上咽頭未分化癌、子宮頸部腺癌、子宮頸部腺扁平上皮癌、子宮頸部扁平上皮癌、再発性子宮頸癌、ＩＶＡ期子宮頸癌、ＩＶＢ期子宮頸癌、肛門管扁平上皮癌、転移性肛門管癌、再発性肛門管癌、再発性頭頸部癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、卵巣癌、結腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、進行ＧＩ癌、胃腺癌、食道胃接合部腺癌、骨腫瘍、軟部肉腫、骨肉腫、胸腺癌、尿路上皮癌、再発性メルケル細胞癌、ＩＩＩ期メルケル細胞癌、ＩＶ期メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、ならびに再発性菌状息肉症およびセザリー症候群からなる群から選択される癌が挙げられる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＲＨ抗体は、結腸癌、乳癌、または脳癌に罹患している対象に投与される。
【００６９】
本明細書の方法は、腫瘍の負担を軽減し、および／または対象における転移を軽減し、および／または癌が寛解した後の腫瘍の再発を軽減または予防すると企図される。様々な実施形態では、本方法は、腫瘍サイズを１０％、２０％、３０％以上低減させる。様々な実施形態では、本方法は、腫瘍サイズを１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％低減させる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、１つ以上の用量の抗体または抗原結合フラグメント（またはＣＲＨペプチドフラグメント）は、ストレスに対するコルチコステロン応答を低減または阻害するのに有効な量および時間で投与され、ストレス関連障害を治療または予防し、癌を治療し、腫瘍量を減少させ、またはＣＲＨペプチドフラグメントの場合はＣＲＨに対する免疫応答を誘導する。例えば、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント（またはＣＲＨペプチドフラグメント）の１回以上の投与は、任意選択で、例えば、約１週間〜約２４ヶ月（例えば、約１ヶ月〜約１２ヶ月、約１ヶ月〜約１８ヶ月、約１ヶ月〜約９ヶ月、または約１ヶ月〜約６ヶ月、または約１ヶ月〜約３ヶ月）の治療期間にわたって行われる。いくつかの実施形態では、対象は、本明細書に記載の抗体またはそのフラグメント（またはＣＲＨペプチド）の１回以上の用量を例えば、約１ヶ月〜約１２ヶ月（５２週）（例えば、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、もしくは約１１ヶ月）の治療期間にわたって投与される。
【００７１】
特定の対象のために選択された治療レジメンに応じて、抗体または抗原結合フラグメント（またはＣＲＨペプチドフラグメント）の複数回投与を一定の間隔で投与することが有利であり得る。いくつかの実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、１年（１２ヶ月、５２週間）以内（例えば、９ヶ月以内、６ヶ月以内、または３ヶ月以内）の期間にわたって定期的に投与される。これに関して、抗体またはそのフラグメントは、ヒトに、約３日に１回、または約７日に１回、または２週間に１回、または３週間に１回、または４週間に１回、または５週間に１回、または６週間に１回、または７週間に１回、または８週間に１回、または９週間に１回、または１０週間に１回、または１１週間に１回、または１２週間に１回、または１３週間に１回、または１４週間に１回、または１５週間に１回、または１６週間に１回、または１７週間に１回、または１８週間に１回、または１９週間に１回、または２０週間に１回、または２１週間に１回、または２２週間に１回、または２３週間に１回、または６ヶ月に１回、または１２ヶ月に１回投与される。
【００７２】
様々な実施形態では、約５０ミリグラム〜約１，０００ミリグラムの抗体またはその抗原結合フラグメント（またはＣＲＨペプチドフラグメント）を含む１回以上の用量が、対象（例えば、ヒト対象）に投与される。例えば、用量は、少なくとも約５ｍｇ、少なくとも約１５ｍｇ、少なくとも約２５ｍｇ、少なくとも約５０ｍｇ、少なくとも約６０ｍｇ、少なくとも約７０ｍｇ、少なくとも約８０ｍｇ、少なくとも約９０ｍｇ、少なくとも約１００ｍｇ、少なくとも約１２０ｍｇ、少なくとも約１５０ｍｇ、少なくとも約２００ｍｇ、少なくとも約２１０ｍｇ、少なくとも約２４０ｍｇ、少なくとも約２５０ｍｇ、少なくとも約２８０ｍｇ、少なくとも約３００ｍｇ、少なくとも約３５０ｍｇ、少なくとも約４００ｍｇ、少なくとも約４２０ｍｇ、少なくとも約４５０ｍｇ、少なくとも約５００ｍｇ、少なくとも約５５０ｍｇ、少なくとも約６００ｍｇ、少なくとも約６５０ｍｇ、少なくとも約７００ｍｇ、少なくとも約７５０ｍｇ、少なくとも約８００ｍｇ、少なくとも約８５０ｍｇ、少なくとも約９００ｍｇ、少なくとも約９５０ｍｇ、または最大約１，０００ｍｇの抗体を含み得る。これらのエンドポイントのいずれかおよびすべての間の範囲、例えば、約５０ｍｇ〜約８０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約２７０ｍｇ、約７５ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約１５０ｍｇ、約１４０ｍｇ〜約２１０ｍｇ、または約１５０ｍｇ〜約２００ｍｇ、または約１８０ｍｇ〜約２７０ｍｇも企図される。用量は、週に複数回（例えば、週に２回または３回）、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回などの任意の間隔で投与される。
【００７３】
いくつかの実施形態では、１回以上の用量は、対象の体重１キログラムあたり（ｍｇ／ｋｇ）約０．１〜約５０ミリグラム（例えば、約５〜約５０ミリグラム）、または約１〜約１００ミリグラムの抗体（またはその抗原結合フラグメントもしくはＣＲＨペプチドフラグメント）を含み得る。例えば、用量は、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約６０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約６５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約８０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約８５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約９０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約９５ｍｇ／ｋｇ、または最大約１００ｍｇ／ｋｇを含み得る。これらのエンドポイントのいずれかおよびすべての間の範囲、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ／ｋｂ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ．ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇも企図される。
【００７４】
併用療法
様々な実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＲＨ抗体またはそのフラグメントは、ＨＰＡ軸活性化に関連する状態または障害（例えば、癌）を治療するために有用な追加の治療薬と組み合わせて投与される。
【００７５】
２種の治療剤の同時投与は、薬剤がそれらの治療効果を発揮している期間に重複がある限り、薬剤が同じ時間に、または同じ経路によって投与される必要はない。同時または連続的な投与が企図され、および異なる日または週の投与も企図される。
【００７６】
追加の治療薬は、他の治療薬、例えば、サイトカイン、成長因子、他の阻害剤、および癌または免疫障害の治療に有用な抗原を標的に対する抗体、例えば、ＣＴＬＡ−４に対する抗体であるイピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ）；ＶＥＧＦ−Ａに対する抗体であるベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ＥＧＦＲに作用するチロシンキナーゼ阻害剤であるエルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  ａｎｄ  ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；経口Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤であるダサチニブ（ＳＰＲＹＣＥＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ）；ＩＬ−２１；ペグ化ＩＦＮ−α２ｂ；チロシンキナーゼ阻害剤であるアキシチニブ（ＩＮＬＹＴＡ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．）；ＭＥＫ阻害剤（Ｐｈｉｌｉｐｓ  ａｎｄ  Ａｔｋｉｎｓ、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７（１）：３９−４６（２０１５）、参照により本明細書に組み込まれる）であるトラメチニブ（ＭＥＫＩＮＩＳＴ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）であり得る。
【００７７】
抗ＣＲＨ抗体または抗体フラグメントおよび追加の治療薬は、同じ製剤で同時に与えられ得ることが企図される。抗ＣＲＨ抗体および追加の治療薬は、別個の製剤で同時に投与されることがさらに企図され、同時とは、薬剤が互いの３０分以内に与えられることを指す。
【００７８】
別の態様では、抗ＣＲＨ抗体またはそのフラグメントは、追加の治療薬の投与の前に投与される。事前投与とは、追加の治療薬での治療の１週間前から追加の治療薬の投与の３０分前までの範囲内での抗ＣＲＨ抗体の投与を指す。抗ＣＲＨ抗体は、追加の治療薬の投与に続いて投与されることがさらに企図される。その後の投与とは、追加の治療薬の投与後３０分から追加の治療薬の投与後１週間までの投与を述べることを意味する。
【００７９】
適宜、他の補助療法が施され得ることがさらに企図される。例えば、必要に応じて、患者に外科療法、化学療法、細胞傷害剤、光線力学療法または放射線療法を施すこともできる。
【００８０】
本開示の抗体とともに使用することが企図される化学療法剤および他の薬剤としては、表Ｉに列挙されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
【表１−１】
2021527081.tif 000003
【表１−２】
2021527081.tif 000004
【表１−３】
2021527081.tif 000005
【００８１】
キット
医薬組成物は調製されると、液剤、懸濁剤、ゲル剤、乳剤、固形剤、結晶剤として、または脱水粉末または凍結乾燥粉末として、滅菌バイアルに保存され得る。特定の実施形態では、そのような製剤は、すぐに使用可能な形態、または投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥形態）のいずれかで保存され得る。本発明はまた、単回投与ユニットを生成するためのキットを提供する。本開示のキットは、各々、乾燥タンパク質を含有する第１の容器と水性製剤を含有する第２の容器の両方を含み得る。特定の実施形態では、単一チャンバーおよび複数チャンバーのプレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ）を含むキットが提供される。
【００８２】
本開示の態様をさらに説明するために以下の実施例を提供するが、本開示を特定の用途または動作理論に限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００８３】
実施例１−能動免疫による抗ＣＲＨ抗体の生成
野生型マウスに、２００μＬの完全フロイントアジュバントに乳化させた２００μｇのＮ末端ＣＲＨペプチドフラグメント（ペプチドＡ：ＳＥＥＰＰＩＳＬＤＬＴＦＨＬＬ（配列番号１または配列番号２のアミノ酸１〜１５）またはペプチドＢ：ＳＥＥＰＰＩＳＬＤＬＴＦＨＬＬＲＥＶＬＥＭ（配列番号１または配列番号３のアミノ酸１〜２１）のいずれか）を皮下注射し、続いて不完全フロイントアジュバントに乳化させた２００μｇのペプチドの追加免疫を２回、２週間間隔で腹腔内注射した。最終ブーストに続いて、血清を収集し、直接ＥＬＩＳＡによって抗ＣＲＨ力価についてアッセイした。図１を参照されたい。
【００８４】
実施例２−急性ストレスのモデルにおけるＮ末端ＣＲＨペプチドフラグメントの効果
マウス群（ｎ＝１７）に、ＣＲＨ−ＯＶＡワクチンまたはＯＶＡのみのいずれかを投与し、実施例１に記載のように２回の追加ブーストを投与した。次いで、マウスを９０分間の急性拘束ストレスに曝した。血漿を３時点で採取し、ラジオイムノアッセイによってコルチコステロンレベルについてアッセイした。ＣＲＨ活性ワクチンおよび対照は、急性ストレスに対するコルチコステロン応答を同程度にブロックした。
【００８５】
実施例３−抗ＣＲＨモノクローナル抗体の親和性
本明細書に記載のＮ末端ＣＲＨペプチドに結合する抗体は、ＣＲＨに対して高い親和性を示す。配列番号２に結合する抗ＣＲＨ抗体（抗体Ａ）は、標的に対してピコモルレベルの親和性を示した（Ｋｄは１×１０−１２未満）。配列番号３（抗体Ｂ）に結合する抗ＣＲＨ抗体は、標的に対してナノモルレベルの親和性を示した（Ｋｄ＝２．０９×１０−８）。
【００８６】
実施例４−抗ＣＲＨ抗体は急性ストレスに対するコルチコステロン応答をブロックする
野生型マウス群（ｎ＝９）に、３０分間の拘束ストレスに曝す１２時間前に、２５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＲＨ抗体Ａまたは生理食塩水のいずれかを腹腔内注射した。血漿を４時点（０、３０、９０、および１５０分）で採取し、ラジオイムノアッセイによってコルチコステロンレベルについてアッセイした。より大きい野生型マウス群（ｎ＝１０）を利用したことを除いて、同じ実験を抗ＣＲＨ抗体Ｂで繰り返した。図４Ｂに示すように、抗ＣＲＨ抗体Ｂは急性ストレスに対するコルチコステロン応答をブロックした。抗体Ｂの投与により、３０分でコルチコステロンのレベルが少なくとも４分の１に低下し、拘束ストレスを取り除いた時点で、コルチコステロンのレベルは対照マウスにおいて最高であった。
【００８７】
実施例５−クッシング病の動物モデルにおける抗ＣＲＨ抗体による発毛の促進
野生型マウスにＡＡＶ８−ＣＲＨを脳室内に注射した結果、脳内でＣＲＨが過剰発現し、クッシング様表現型（すなわち、脱毛、皮膚の赤み、肥満）を誘発した。図５に示すように、抗ＣＲＨ抗体Ｂ（０．３ｍｇ）を１回腹腔内注射すると、観察された脱毛が元に戻った。
【００８８】
実施例６−一本鎖可変フラグメントがＣＲＨを結合する
ＳｃＦｖコンストラクトは、ＡＡＶベクターを介して脳に送達されることが可能であるという利点を提供する。リンカーペプチドによって結合された、抗体Ａおよび抗体Ｂの重可変領域および軽可変領域から構成されるＳｃＦｖのＤＮＡコンストラクトを生成した。抗体Ａおよび抗体ＢのｓｃＦｖのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２２および２３に記載する。次いで、ＤＮＡコンストラクトをヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３ｔ細胞にトランスフェクトし、４８時間インキュベートした。次いで、細胞を溶解し、直接ＣＲＨ  ＥＬＩＳＡによってＣＲＨ結合について分析した。図６に示すように、結果として得られるＳｃＦｖは、抗体Ａまたは抗体Ｂに結合したＣＲＨの重可変領域と軽可変領域を含む。
【００８９】
実施例７−抗ＣＲＨ抗体のヒト化
図７は、抗ＣＲＨ抗体Ｂの可変領域と同様のヒト可変フレームワークとの比較を示す。強調表示されているのは、抗体Ｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）である。抗体Ｂの可変領域のフレームワークは、抗体ＢのＣＤＲを変えることなく、ヒトフレームワークの可変領域と適合するように変えることができる。
【００９０】
実施例８−抗ＣＲＨ抗体はインビトロでＣＲＨＲ１活性化をブロックした
ＣＲＨＲ１安定過剰発現Ｈ４神経膠腫細胞を、ＰＢＳ中で合成ＣＲＨ（Ｂａｃｈｅｍ）または精製抗体Ｂ（ＱＥＤ  ｂｉｏ）の組み合わせとともに１０分間インキュベートした。処理後、細胞を０．１Ｍ  ＨＣｌおよび１％Ｔｒｉｔｏｎで溶解し、競合ＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＥＭＳＣＡＭＰＬ）によりサイクリックＡＭＰレベルについて分析した。図８に示すように、抗体Ｂは、ＣＲＨ誘発性サイクリックＡＭＰの増加を低下させることができた。
【００９１】
実施例９−抗ＣＲＨ抗体はインビボでコルチコステロンレベルを低下させた
野生型（Ｃ３Ｂ６Ｈ）マウスを２ヶ月間単独飼育した（軽度のストレス）。次いで、マウスを様々な用量の抗体Ｂで処置し（１群あたりｎ＝４、雄雌均衡）、３０分間の急性拘束ストレスに曝した。図９に示すように、抗体Ｂで処置したマウスは、明確な用量反応型の効果プロファイルを示し（左）、低用量（１．５ｍｇ／ｋｇ）の抗体Ｂでも、２ヶ月間単独飼育したマウスのベースラインコルチコステロンレベルを下げることができた。
【００９２】
実施例１０−慢性変動ストレス
２．５ヶ月齢の野生型（Ｃ３Ｂ６）マウスを２週間の慢性変動ストレスに曝した。毎日２種のストレッサーを各１時間ずつ。マウスを２５ｍｇ／ｋｇの抗体ＢまたはマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（上記のｎ数、雄雌均衡）で処置した。図１０を参照されたい。
【００９３】
図１１Ａに示すように、抗体Ｂによる処置は、２．５週間の処置後および２週間の慢性変動ストレス（ＣＶＳ）後にコルチコステロン応答を抑制した。抗体Ｂによる処置も、ストレスを受けたマウスの体重増加を大幅に増加させた（体重増加は２．５ヶ月齢のマウスに適している）。図１０Ｂを参照されたい。抗体Ｂ処置は皮下脂肪を増加させず、腸間膜（内臓）脂肪レベルを大幅に減少させた。図１０Ｃおよび図１０Ｄを参照されたい。
【００９４】
抗体Ｂによる処置により、脾臓の細胞性が大幅に増加し、白血球集団をシフトさせて、Ｂ細胞の割合を増加させ、Ｔ細胞の割合を減少させる（図１０Ｅ、Ｆ、およびＧ）。図１０Ｈおよび１０Ｉに示すように、抗体Ｂ処置により、脾臓中の炎症性単球細胞およびＮＫ細胞が大幅に減少した。
【００９５】
実施例１１−脳ＲＮＡトランスクリプトミクス分析
マウス（ｎ＝６Ｍ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス）を抗体ＢまたはマウスＩｇＧ１対照抗体のいずれかで２．５週間、２５ｍｇ／ｋｇの初回腹腔内注射に続いて１２．５ｍｇ／ｋｇの週１回の腹腔内注射で処置した。
【００９６】
２．５週間の終わりに、筋肉、肝臓、脾臓、および脂肪をマウスから収集した。収集した臓器は、ドライアイス上で冷却したイソペンタンで瞬間凍結させた。抗体Ｂで処置した組織および対照組織を、乳鉢と乳棒を使用して液体窒素下で微粉砕し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）試薬で全ＲＮＡを抽出した。オンカラムＤＮａｓｅ処置を施したＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙカラム上でＲＮＡのクリーンアップを行った。その後、ＴＵＲＢＯ  ＤＮＡフリーキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してＤＮａｓｅ処置を行った。ＲＮＡをＱｕｂｉｔ４蛍光光度計とＲＮＡ  ＨＳアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して定量化した。ＲＮＡの品質をＦｒａｇｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＣＥ  ＳｙｓｔｅｍおよびＳｔａｎｄａｒｄ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＲＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓキット（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）を使用して決定した。１マイクログラムの全ＲＮＡをｐｏｌｙＡで濃縮し、ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してライブラリー調製を行った。ライブラリーは、ライブラリー定量化キット（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して定量化した。ライブラリーのサイズは、高感度ＮＧＳフラグメント分析キット（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）を使用して決定した。ライブラリーは、ライブラリーの準備および配列決定によるバッチの影響を最小限に抑え、試料あたり３０〜５０Ｍの読み取りデータを達成する戦略でプールした。
【００９７】
得られたＦＡＳＴＱファイルは、ＳＴＡＲを使用してマウスゲノムに対して整列させた（Ｄｏｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。その後の分析は、Ｒバージョン３．５．１内で行なった。差次的遺伝子発現分析は、ＤＥＳｅｑ２で行う。各組織内の処置群と対照群の間の遺伝子発現レベルの変化を比較して、差次的に発現する遺伝子を見いだした。加重遺伝子共発現ネットワーク解析（ＷＧＣＮＡ）を行い、試料全体で同様の発現パターンを有する遺伝子のモジュールを決定した（Ｌａｎｇｆｅｌｄｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｒｖａｔｈ，２００７，２００８）。署名されたハイブリッドネットワークは、脳、筋肉、肝臓、脾臓、脂肪組織に対してそれぞれ６、４、６、４、７のソフトパワー設定（β）を使用してＷＧＣＮＡで検出した。抗体処置群と有意に相関するモジュールからのモジュール内ハブ遺伝子の同定を調べ、重要なモジュール内の遺伝子のネットワーク経路および遺伝子オントロジーを、ＷＧＣＮＡパッケージに関連付けられたＲｉｃｈｍｅｎｔを使用して分析した。ネットワークは、各モジュールに属する遺伝子の上位２０％を使用して、Ｒ内のｇｅｏｍｎｅｔパッケージを使用して視覚化した。図１２を参照されたい。
【００９８】
実施例１２−免疫プロファイリング
上記の実施例１１（抗体Ｂによる２．５週間後の処置）で記載と同じマウスからの脾臓を、すりガラススライドで処理し、濾過（７０ミクロン）して、単一細胞懸濁液を作製した。赤血球を塩化アンモニウム−カリウム溶解緩衝液で、氷上で５分間溶解し、残りの細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄してから染色した。試料あたり１×１０６個の細胞を死細胞の排除のために修正可能ライブ／デッド・近赤外サーモフィッシャー（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で染色した。細胞をＦｃブロック（２．４Ｇ２；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに氷上で５分間インキュベートした後、次の抗体を適切な濃度で、氷上で３０分間染色した：ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＲＭ４−５；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ８ａ−ＰＥ−Ｃｙ７（５３−６．７；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３ｅ−ＢＶ６０５（１４５−２Ｃ１１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＮＫ１．１−ＡＰＣ（ＰＫ１３６；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１９−ＢＶ７１１（６Ｄ５；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｌｙ６Ｇ−ＢＶ４２１（１Ａ８；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｌｙ６Ｃ−ＰＥ（ＨＫ１．４；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１１ｂ−ＡＦ４８８（Ｍ１／７０；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（ｖ１０．５．０；Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して分析する前に、試料を１回洗浄した。図１３に示すように、抗体Ｂで処置すると、Ｂ細胞およびＴ細胞が増加し、生脾細胞の量が大幅に増加する。
【００９９】
実施例１３−抗体Ｂによる処置により、ＧＬ２６１頭蓋内マウス神経膠腫モデルにおける生存が増加する。
１：１のＰＢＳ：メチルセルロース溶液中の１０，０００個のＧＬ２６１細胞を、８〜１２週齢の成体雌Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウス（１群あたりＮ＝８）に定位注射を使用して、頭蓋骨の３ｍｍ下およびブレグマの外側２ｍｍの点に２．５ｕＬの容量で頭蓋内注射した。次いで、ＵＦＩＡＣＵＣ２０１６０７９６６に記載されているように、人道的エンドポイントへの進行についてマウスをモニターした。処置したマウスに、腫瘍移植の５日後に４００ｕｇの抗ＰＤ１抗体、４００μｇの抗体Ｂ、またはその両方（Ｃｌｏｎｅ  ＲＭＰ１−１４、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を腹腔内注射し、次いで、５日ごとに２００μｇの抗ＰＤ１および２００μｇの抗体Ｂを計５投与量で投与した。図１４に示すように、抗体Ｂ（および抗体Ｂと抗ＰＤ１抗体の組み合わせ）による処置により、ＧＬ２６１頭蓋内マウス神経膠腫モデルの生存を高め、未処置の動物より２倍超長く生存した。
【０１００】
実施例１４−抗体ＢはＣＲＦに特異的
１ｕＭ（左）または１０ｕＭ（右）のＣＲＦまたはＣＲＦファミリー神経ペプチドウロコルチン（ＵＣＮ）１、ＵＣＮ２、またはＵＣＮ３をポリカーボネート９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングした直接ＥＬＩＳＡ。次いで、抗体Ｂを１３．３３ｎＭで添加し、２時間インキュベートした後、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合検出抗体を添加した。次いで、ＴＭＢ試薬を使用してＥＬＩＳＡを発色させ、分光光度計を使用して４５０ｎＭで読み取った。
【０１０１】
ＯｃｔｅｔレッドＢＬＩ：ストレプトアビジンプローブをＵＣＮ２−ＢＴＮと結合させ、次いで種々の濃度の抗体Ｂを用いて結合定数と解離定数を測定した。
【０１０２】
直接ＥＬＩＳＡは、１ｕＭコートでＵＣＮ１〜３と抗体Ｂの交差反応性を示さず、１０ｕＭでコーティングしたＵＣＮ２に対して少量の反応性を示した（図１５）。
【０１０３】
図１６に示すように、Ｏｃｔｅｔレッドバイオレイヤー干渉法は、ＵＣＮ２ペプチドに対する抗体Ｂの解離定数Ｋｄ＝４．０Ｅ−９を算出した。この親和性は、ＣＲＦペプチドに対する抗体Ｂの親和性の４０００分の１未満である。ＣＲＦとＵＣＮ２はインビボで同様の５００ｐＭ〜２ｎＭ濃度で作用するため、インビボでＵＣＮ２と抗体Ｂの間でかなりの量の標的結合が発生するとは仮定しないであろう。
【０１０４】
本文書全体は、統一された開示として関連することを意図しており、この文書の同じ文、または段落、またはセクションで特徴の組み合わせが合わせて見られない場合でも、本明細書に記載される特徴のすべての組み合わせが企図されることを理解されたい。さらに、本開示は、追加の態様として、上記で具体的に言及される変形例よりも範囲が狭い本発明のすべての実施形態を含む。「ａ」または「ａｎ」で記載または特許請求される態様に関して、文脈がより限定された意味を明確に要求しない限り、これらの用語は「１つ以上」を意味することを理解されたい。セット内の１つ以上として記載される要素に関して、セット内のすべての組み合わせが企図されることを理解されたい。本開示の態様が特徴を「含む」と記載される場合、実施形態もその特徴「からなる」または「から本質的になる」と企図される。
【０１０５】
本明細書で言及されるすべての出版物、特許、および特許出願は、各々の個別の出版物または特許出願が参照によって組み込まれることが具体的かつ個別に示されるように、参照によって本明細書に組み込まれる。前述の出版物、特許、および特許出願は、理解を明確にするために、例示および実施例によってある程度詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、本発明の教示に照らして、それらに対するある特定の変更および修正が可能であることは当業者には容易に明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１３Ｉ】
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【図１３Ｊ】
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【図１３Ｋ】
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【図１３Ｌ】
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【図１３Ｍ】
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【図１３Ｎ】
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【図１３Ｏ】
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【図１３Ｐ】
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【図１３Ｑ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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