(57)【要約】  標的捕捉および配列決定を用いてｃｆＤＮＡまたはｃｔＤＮＡ患者試料中のゲノム変化を評価する組成物および方法が開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の標的捕捉試薬（Ｒ１）および第２の標的捕捉試薬（Ｒ２）を含む複数の標的捕捉試薬であって、
Ｒ１は、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１、および、場合により、結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ１を含み；
Ｒ２は、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２、および結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ２を含み；
結合対の第１のメンバーは、基質上に配置された結合対の第２のメンバーに結合することができ、
結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１の比率は、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率よりも大きい、複数の標的捕捉試薬。
【請求項２】
結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１の比率が、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率よりも、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍大きい、請求項１に記載の複数の標的捕捉試薬。
【請求項３】
Ｒ１の各々が第１の断片／第１の標的捕捉試薬（Ｆ１／Ｒ１）ハイブリッドを形成することができ、Ｒ２の各々が第２の断片／第２の標的捕捉試薬（Ｆ２／Ｒ２）ハイブリッドを形成することができ、
Ｆ１、Ｆ２、またはその両方は、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子からの対象間隔を含む、請求項１または２に記載の複数の標的捕捉試薬。
【請求項４】
Ｆ１が、高い配列決定深度事象を含み；
Ｆ２が、低い配列決定深度事象を含み、例えば、そのレベルが、１つ以上のバイオマーカー、例えば、腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）、またはマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）の決定と関連する、請求項３に記載の複数の標的捕捉試薬。
【請求項５】
第３の標的捕捉試薬（Ｒ３）をさらに含み、
Ｒ３が、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ３、および結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ３を含み；
結合対の第１のメンバーが、基質上に配置された結合対の第２のメンバーに結合することができ、
結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率は、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ３の比率よりも大きい、請求項１から４のいずれか一項に記載の複数の標的捕捉試薬。
【請求項６】
Ｒ３の各々が第３の断片／第１の標的捕捉試薬（Ｆ３／Ｒ３）ハイブリッドを形成することができ、
Ｆ３は、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子からの対象間隔を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の複数の標的捕捉試薬。
【請求項７】
試料を分析する方法であって、
複数の第１の断片／第１の標的捕捉試薬（Ｆ１／Ｒ１）ハイブリッドを基質と接触させて、Ｆ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体を形成すること；および
複数の第２の断片／第２の標的捕捉試薬（Ｆ２／Ｒ２）ハイブリッドを基質と接触させて、Ｆ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体を形成すること
を含み、基質に結合するＦ１／Ｒ１ハイブリッドの比率は、基質に結合するＦ２／Ｒ２ハイブリッドの比率よりも大きく、
それによって試料を分析する、試料を分析する方法。
【請求項８】
Ｆ１が、高い配列決定深度事象を含み；
Ｆ２が、低い配列決定深度事象を含み、例えば、そのレベルが、１つ以上のバイオマーカー、例えば、腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）、またはマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）の決定と関連する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｒ１の一部およびＲ２の一部が結合対の機能的な第１のメンバーを含み、結合対の第１のメンバーが基質上に配置された結合対の第２のメンバーに結合することができる、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ１の一部、Ｒ２の一部、またはその両方が、結合対の機能的な第１のメンバー、例えば、基質上に配置された結合対の第２のメンバーに結合することができないかまたはそれに対する結合親和性が低下している変化またはブロックされた第１のメンバーを欠く、請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ１が、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１、および結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ１を含み；
Ｒ２が、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２、および結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ２を含む、請求項７から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１の比率が、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率よりも大きい、請求項７から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１の比率が、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率よりも、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍大きい、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１の比率および結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率が、Ｆ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体およびＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体の形成時に、Ｆ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体中のＦ１の数およびＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体中のＦ２の数が、以下の関係：
（ｉ）Ｆ１の数が、Ｆ２の数より大きいかまたはＦ２の数と実質的に同じである；および／または
（ｉｉ）第１の対象間隔における変化を含むＦ１の数が、第２の対象間隔における変化を含むＦ２の数よりも大きいかまたは実質的に同じである
のうちの１つまたは両方を有するようなものである、請求項７から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｆ１の数が、Ｆ２の数よりも、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍大きい、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第１の対象間隔における変化を含むＦ１の数が、第２の対象間隔における変化を含むＦ２の数よりも、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍大きい、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
第１の対象間隔、第２の対象間隔、またはその両方が、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子由来である、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
第１の対象間隔における変化が、試料中の約０．１％に等しいかまたはそれより大きい（例えば、約０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、または０．９％に等しいかまたはそれより大きい、例えば、約０．１％〜０．９％、０．２％〜０．８％、０．３％〜０．７％、または０．４％〜０．６％の）突然変異対立遺伝子頻度で存在する、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
第２の対象間隔における変化が、試料中の約１％に等しいかまたはそれより大きい（例えば、約２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、または９％に等しいかまたはそれより大きい、例えば、約１％〜９％、２％〜８％、３％〜７％、または４％〜６％の）突然変異対立遺伝子頻度で存在する、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
Ｆ１、Ｆ２、またはその両方が、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子からの対象間隔を含む、請求項７から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
Ｆ１における対象間隔が第１の深度まで配列決定され、Ｆ２における対象間隔が第２の深度まで配列決定され、第１の深度が第２の深度よりも、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍大きい、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｆ１が、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子からの対象間隔を含み、対象間隔が、変化、例えば、体細胞性変化、例えば、がんにおける機能的変化を含む、請求項１４から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
対象間隔が、少なくとも約５，０００×深度まで配列決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
Ｆ２が、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子からの対象間隔を含み、対象間隔が、変化、例えば、体細胞性変化を含み、変化の決定が、１つ以上のゲノムシグネチャー、例えば、連続的／複雑なバイオマーカーを評価するために使用される、請求項７から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
対象間隔が、例えば、１つ以上のゲノムシグネチャー、例えば、連続的／複雑なバイオマーカーを評価するために、少なくとも約８００×であるが約５，０００×未満まで配列決定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
複数の第３の断片／第３の標的捕捉試薬（Ｆ３／Ｒ３）ハイブリッドを基質とさらに接触させて、Ｆ３／Ｒ３ハイブリッド／基質複合体を形成する、請求項７から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
Ｒ３が、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ３、および結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ３を含む、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率が、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ３の比率よりも大きい、請求項２６から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率が、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ３の比率よりも、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍大きい、請求項２６から２８のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項３０】
結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率および結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ３の比率が、Ｆ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体およびＦ３／Ｒ３ハイブリッド／基質複合体の形成時に、Ｆ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体中のＦ２の数およびＦ３／Ｒ３ハイブリッド／基質複合体中のＦ３の数が、以下の関係：
（ｉ）Ｆ２の数が、Ｆ３の数より大きい；および／または
（ｉｉ）第２の対象間隔における変化を含むＦ２の数が、第３の対象間隔における変化を含むＦ３の数よりも大きい
のうちの１つまたは両方を有するようなものである、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
Ｆ２の数が、Ｆ３の数よりも、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍大きい、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
第２の対象間隔における変化を含むＦ２の数が、第３の対象間隔における変化を含むＦ３の数よりも、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍大きい、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
第２の対象間隔、第３の対象間隔、またはその両方が、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子由来である、請求項３０から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
Ｆ１、Ｆ２、またはＦ３のうちの１つ、２つ、または全てが、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子からの対象間隔を含む、請求項２６から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
Ｆ２における対象間隔が第２の深度まで配列決定され、Ｆ３における対象間隔が第３の深度まで配列決定され、第２の深度が第３の深度よりも、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍大きい、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
Ｆ３が、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子からの対象間隔を含み、対象間隔が、生殖系列変化、例えば、生殖系列ＳＮＰを含む、請求項２６から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
対象間隔が、少なくとも約１００×深度であるが約８００×未満まで配列決定される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
対象から試料を提供することをさらに含む、請求項７から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
試料が、ＤＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡ、例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む、請求項７から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
試料が、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡを含む、請求項７から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ＲＮＡからｃＤＮＡを提供することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
試料から核酸を得ること、例えば、単離することをさらに含む、請求項７から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
試料中の核酸を断片化してＦ１およびＦ２を提供することをさらに含む、請求項７から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
Ｆ１を増幅して複数のＦ１を提供し、Ｆ２を増幅して複数のＦ２を提供することをさらに含む、請求項７から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
アダプター配列をＦ１およびＦ２に付着させて、アダプター化Ｆ１（ＡＦ１）およびアダプター化Ｆ２（ＡＦ２）を提供することをさらに含む、請求項７から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
ＡＦ１を増幅して複数のＡＦ１を提供し、ＡＦ２を増幅して複数のＡＦ２を提供することをさらに含む、請求項７から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
複数のＦ１をＲ１と接触させて複数のＦ１／Ｒ１ハイブリッドを提供し、複数のＦ２をＲ２と接触させて複数のＦ２／Ｒ２ハイブリッドを提供することをさらに含む、請求項７から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
複数のＡＦ１をＲ１と接触させて複数のＡＦ１／Ｒ１ハイブリッドを提供し、複数のＡＦ２をＲ２と接触させて複数のＡＦ２／Ｒ２ハイブリッドを提供することをさらに含む、請求項７から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
複数のＦ１／Ｒ１ハイブリッドを基質と接触させてＦ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体を形成することが、複数のＡＦ１／Ｒ１ハイブリッドを基質と接触させてＡＦ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体を形成することを含み；
複数のＦ２／Ｒ２ハイブリッドを基質と接触させてＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体を形成することが、複数のＡＦ２／Ｒ２ハイブリッドを基質と接触させてＡＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体を形成することを含む、請求項７から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
接触が溶液中で起こる、請求項４７から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
接触が固体表面上で起こる、請求項４７から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
結合対の第１のメンバーがビオチン部分を含み、結合対の第２のメンバーがストレプトアビジンまたはアビジン（または修飾バージョン、例えば、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎもしくはＣａｐｔＡｖｉｄｉｎ）部分を含む、請求項８から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
結合対の第１のメンバーがジゴキシゲニン部分を含み、結合対の第２のメンバーが抗ジゴキシゲニン抗体部分を含む、請求項８から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
結合対の第１のメンバーがＦＩＴＣ部分を含み、結合対の第２のメンバーが抗ＦＩＴＣ抗体部分を含む、請求項８から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
Ｒ１中の結合対の第１のメンバーが、リンカーを介してＦ１を捕捉する（例えば、ハイブリダイズする）Ｒ１中の部分（例えば、ヌクレオチド配列）にカップリングされ、Ｒ２中の結合対の第１のメンバーが、リンカーを介してＦ２を捕捉する（例えば、ハイブリダイズする）Ｒ２中の部分（例えば、ヌクレオチド配列）にカップリングされ、
場合により、リンカーは切断可能なリンカーである、請求項８から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
複数のＦ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体からＦ１を配列決定し、複数のＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体からＦ２を配列決定することをさらに含む、請求項７から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
Ｆ１が、例えば、Ｆ２より、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍大きい深度まで配列決定される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
試料を分析する方法であって、
ａ）複数の第１の断片／第１の標的捕捉試薬（Ｆ１／Ｒ１）ハイブリッドおよび複数の第２の断片／第２の標的捕捉試薬（Ｆ２／Ｒ２）ハイブリッドを提供することであって、
結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１の比率は、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率よりも大きく、
結合対の第１のメンバーは、基質上に配置された結合対の第２のメンバーに結合することができる、ハイブリッドを提供すること；
ｂ）複数のＦ１／Ｒ１ハイブリッドを基質と接触させて、Ｆ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体を形成し、複数のＦ２／Ｒ２ハイブリッドを基質と接触させて、Ｆ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体を形成することであって、
基質に結合するＦ１／Ｒ１ハイブリッドの比率は、基質に結合するＦ２／Ｒ２ハイブリッドの比率よりも大きい、複合体を形成すること；ならびに
ｃ）複数のＦ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体からＦ１を配列決定し、複数のＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体からＦ２を配列決定すること
を含み、Ｆ１はＦ２より大きな深度まで配列決定され、
それによって試料を分析する、試料を分析する方法。
【請求項５９】
Ｆ１が、高い配列決定深度事象を含み；
Ｆ２が、低い配列決定深度事象を含み、例えば、そのレベルが、１つ以上のバイオマーカー、例えば、腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）、またはマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）の決定と関連する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
試料を分析する方法であって、
１）対象からの試料、例えば、ゲノムＤＮＡ、例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む試料を提供すること；
２）試料から核酸を得ること、例えば、単離すること；
３）核酸を断片化して、複数の断片（Ｆ）を提供すること；
４）アダプター配列を複数の断片（Ｆ）に付着させて、複数のアダプター化断片（ＡＦ）を提供すること；
５）第１のＡＦ（ＡＦ１）を増幅して複数のＡＦ１を提供し、第２のＡＦ（ＡＦ２）を増幅して複数のＡＦ２を提供すること；
６）複数のＡＦ１を、各々がＡＦ１にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む第１の標的捕捉試薬（Ｒ１）と接触させて、複数のＡＦ１／Ｒ１ハイブリッドを提供し、複数のＡＦ２を、各々がＡＦ２にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む第２の標的捕捉試薬（Ｒ２）と接触させて、複数のＡＦ２／Ｒ２ハイブリッドを提供することであって、
Ｒ１の一部およびＲ２の一部は、結合対の機能的な第１のメンバーを含み、結合対の第１のメンバーは、基質上に配置された結合対の第２のメンバーに結合することができ、
Ｒ１の一部、Ｒ２の一部、またはその両方は、結合対の機能的な第１のメンバーを欠く、ハイブリッドを提供すること；
７）複数のＡＦ１／Ｒ１ハイブリッドを基質と接触させて、ＡＦ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体を形成し、複数のＡＦ２／Ｒ２ハイブリッドを基質と接触させて、ＡＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体を形成することであって、
基質に結合するＡＦ１／Ｒ１ハイブリッドの比率は、基質に結合するＡＦ２／Ｒ２ハイブリッドの比率よりも大きい、複合体を形成すること；ならびに
８）複数のＡＦ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体からのＡＦ１を配列決定し、複数のＡＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体からＡＦ２を配列決定すること
を含み、場合により、ＡＦ１は、ＡＦ２より、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍大きな深度まで配列決定され、
それによって試料を分析する、試料を分析する方法。
【請求項６１】
Ｆ１が、高い配列決定深度事象を含み；
Ｆ２が、低い配列決定深度事象を含み、例えば、そのレベルが、１つ以上のバイオマーカー、例えば、腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）、またはマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）の決定と関連する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
試料から複数の核酸分子を含むライブラリーを取得することをさらに含む、請求項７から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
ライブラリーを標的捕捉試薬と接触させて、選択された核酸分子を提供することをさらに含み、前記標的捕捉試薬が核酸分子とハイブリダイズし、それによってライブラリーキャッチを提供する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ライブラリーまたはライブラリーキャッチからの腫瘍核酸分子からの変化（例えば、体細胞性変化）を含む対象間隔についてのリードを取得することをさらに含み、それによって、例えば、次世代シークエンシング法によって、対象間隔についてのリードを取得する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
複数の遺伝子において対象間隔についてのリードを取得することを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
複数の遺伝子が、突然変異体形態の遺伝子を含み、例えば、突然変異体遺伝子が、細胞分裂、増殖もしくは生存に対する作用と関連するか、またはがんと関連する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
複数の遺伝子が、全エクソンシークエンシング（ＷＥＳ）のために、少なくとも約５０以上、約１００以上、約１５０以上、約２００以上、約２５０以上、約３００以上、約３５０以上、約４００以上、約４５０以上、約５００以上の遺伝子、もしくは約１，０００以上の遺伝子、または全ての遺伝子を含む、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項６８】
複数の遺伝子が、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子の少なくとも約５０以上、約１００以上、約１５０以上、約２００以上、約２５０以上、約３００以上、または全てを含む、請求項６４から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
対象間隔についてのリードの取得が、表１Ａ〜５Ａに記載の遺伝子の少なくとも約５０以上、約１００以上、約１５０以上、約２００以上、約２５０以上、約３００以上、または全てからの対象間隔の配列決定を含む、請求項６４から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
対象間隔が、約１００×より大きい、約２５０×より大きい、約５００×より大きい、約８００×より大きい、約１，０００×より大きい、約２，０００×より大きい、約３，０００×より大きい、約４，０００×より大きい、または約５，０００×より大きい平均深度まで配列決定される、請求項６４から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
対象間隔が、配列決定された遺伝子（例えば、エクソン）の約９５％超、約９７％超、または約９９％超で、約１００×より大きい、約２５０×より大きい、約５００×より大きい、約８００×より大きい、約１，０００×より大きい、約２，０００×より大きい、約３，０００×より大きい、約４，０００×より大きい、または約５，０００×より大きい平均深度まで配列決定される、請求項６４から７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
アラインメント法によって前記リードを整列させることをさらに含む、請求項６４から７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
ヌクレオチド位置について前記リードからヌクレオチド値を割り当てることをさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
試料中の１つ以上のゲノムシグネチャー、例えば、連続的／複雑なバイオマーカーを評価することをさらに含む、請求項７から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
試料が血液試料である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
体細胞性変化または生殖系列変化として試料中の変化を特徴づけることをさらに含む、請求項７から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
試料中の変化の接合性を決定することをさらに含む、請求項７から７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
試料、または試料の分析に応答して得られた試料に由来する対象を分類することをさらに含む、請求項７から７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
報告書、例えば、電子的な、ウェブベースの、または紙による報告書を、得られた試料に由来する対象に、または別の人もしくは団体、介護者、医師、がん専門医、病院、診療所、第三者支払人、保険会社もしくは政府機関に提供することをさらに含む、請求項７から７８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
【０００２】
本出願は、２０１８年６月１１日に出願された米国仮出願第６２／６８３，４６９号の利益を主張する。上記出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
配列表
【０００４】
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年６月６日に作成され、Ｆ２０３６−７０７２ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは８４０バイトである。
【０００５】
発明の分野
【０００６】
本発明は、ゲノム変化を評価するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００７】
がん細胞は、がんの発生および進行中に突然変異を蓄積する。これらの突然変異は、ＤＮＡ修復、複製、もしくは修飾の固有の機能異常、または外因性突然変異原への曝露の結果であり得る。ある種の突然変異は、がん細胞に増殖の利点を与え、がんが生じる組織の微小環境において正に選択される。有利な突然変異の選択は腫瘍形成に寄与するが、腫瘍新生抗原を生成し、その後の免疫認識の可能性もまた突然変異が発生するにつれて増加する可能性がある（ＧｕｂｉｎおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５０巻：１５８−９頁、２０１５年）。したがって、全突然変異量は、全エクソームシークエンシング（ＷＥＳ）によって測定した場合、例えば、がん免疫療法に対する持続的な反応を予測するために、患者の治療決定の指針として用いることができる。しかしながら、ゲノム研究を常套的臨床現場に翻訳することは、全エクソームシークエンシングが広く利用可能ではなく、費用がかかり、時間を要し、技術的に困難であるため、依然として問題がある。
【０００８】
したがって、患者試料からのゲノムまたはエクソームのサブセットを標的とするゲノムプロファイリングを含む新規な手法の必要性は依然として存在する。
【発明の概要】
【０００９】
一態様では、本発明は、第１の標的捕捉試薬（Ｒ１）および第２の標的捕捉試薬（Ｒ２）を含む、複数の標的捕捉試薬を特徴とし、
Ｒ１は、結合対（例えば、本明細書に記載される結合対）の機能的な第１のメンバーを含むＲ１、および、場合により、結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ１を含み；
Ｒ２は、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２、および結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ２を含み；
結合対の第１のメンバーは、基質上に配置された結合対の第２のメンバーに結合することができ、
結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１の比率は、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率よりも大きい。
【００１０】
複数の標的捕捉試薬の一部の実施形態では、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１の比率は、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率よりも、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍大きい。
【００１１】
複数の標的捕捉試薬の一部の実施形態では、Ｒ１の各々は、第１の断片／第１の標的捕捉試薬（Ｆ１／Ｒ１）ハイブリッドを形成することができ、Ｒ２の各々は、第２の断片／第２の標的捕捉試薬（Ｆ２／Ｒ２）ハイブリッドを形成することができ、Ｆ１、Ｆ２、またはその両方は、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子からの対象間隔を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、Ｆ１は、高い配列決定深度事象を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、Ｆ２は、低い配列決定深度事象を含む。他の実施形態では、低い配列決定深度事象のレベルは、１つ以上のバイオマーカー、例えば、腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）、またはマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）の決定と関連する。
【００１４】
一部の実施形態では、複数の標的捕捉試薬は、第３の標的捕捉試薬（Ｒ３）をさらに含み、
Ｒ３は、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ３、および結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ３を含み；
結合対の第１のメンバーは、基質上に配置された結合対の第２のメンバーに結合することができ、
結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率は、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ３の比率よりも（例えば、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍）大きい。
【００１５】
複数の標的捕捉試薬の一部の実施形態では、Ｒ３の各々は、第３の断片／第１の標的捕捉試薬（Ｆ３／Ｒ３）ハイブリッドを形成することができ、Ｆ３は、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子からの対象間隔を含む。
【００１６】
複数の標的捕捉試薬の一部の実施形態では、結合対（例えば、本明細書に記載される結合対）の機能的な第１のメンバーを含むＲ１の、結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ１に対する比は、約２％〜約５０％、例えば、約３％〜約４０％、約４％〜約３０％、約５％〜約２５％、約８％〜約２０％、約１０％〜約１５％、例えば、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、または約５０％である。
【００１７】
複数の標的捕捉試薬の一部の実施形態では、結合対（例えば、本明細書に記載される結合対）の機能的な第１のメンバーを欠くＲ１の、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１に対する比は、約２％〜約５０％、例えば、約３％〜約４０％、約４％〜約３０％、約５％〜約２５％、約８％〜約２０％、約１０％〜約１５％、例えば、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、または約５０％である。
【００１８】
複数の標的捕捉試薬の一部の実施形態では、結合対（例えば、本明細書に記載される結合対）の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の、結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ２に対する比は、約２％〜約５０％、例えば、約３％〜約４０％、約４％〜約３０％、約５％〜約２５％、約８％〜約２０％、約１０％〜約１５％、例えば、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、または約５０％である。
【００１９】
複数の標的捕捉試薬の一部の実施形態では、結合対（例えば、本明細書に記載される結合対）の機能的な第１のメンバーを欠くＲ２の、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２に対する比は、約２％〜約５０％、例えば、約３％〜約４０％、約４％〜約３０％、約５％〜約２５％、約８％〜約２０％、約１０％〜約１５％、例えば、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、または約５０％である。
【００２０】
複数の標的捕捉試薬の一部の実施形態では、結合対（例えば、本明細書に記載される結合対）の機能的な第１のメンバーを含むＲ３の、結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ３に対する比は、約２％〜約５０％、例えば、約３％〜約４０％、約４％〜約３０％、約５％〜約２５％、約８％〜約２０％、約１０％〜約１５％、例えば、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、または約５０％である。
【００２１】
複数の標的捕捉試薬の一部の実施形態では、結合対（例えば、本明細書に記載される結合対）の機能的な第１のメンバーを欠くＲ３の、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ３に対する比は、約２％〜約５０％、例えば、約３％〜約４０％、約４％〜約３０％、約５％〜約２５％、約８％〜約２０％、約１０％〜約１５％、例えば、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、または約５０％である。
【００２２】
複数の標的捕捉試薬の実施形態では、Ａ対Ｂの比は、約２％〜約５０％、例えば、約３％〜約４０％、約４％〜約３０％、約５％〜約２５％、約８％〜約２０％、約１０％〜約１５％、例えば、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、または約５０％であり、
Ａは、Ｒ１（例えば、結合対の機能的な第１のメンバーを含む）、および結合対（例えば、本明細書に記載される結合対）の機能的な第１のメンバーを欠くＲ２を含み；
Ｂは、Ｒ１（例えば、結合対の機能的な第１のメンバーを含む）、および結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２を含む。
【００２３】
複数の標的捕捉試薬の実施形態では、Ａ対Ｂの比は、約２％〜約５０％、例えば、約３％〜約４０％、約４％〜約３０％、約５％〜約２５％、約８％〜約２０％、約１０％〜約１５％、例えば、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、または約５０％であり、
Ａは、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１；および結合対（例えば、本明細書に記載される結合対）の機能的な第１のメンバーを欠くＲ２を含み；
Ｂは、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１；および結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２を含む。
【００２４】
ある実施形態では、複数の標的捕捉試薬の比は、実施例１に記載されるアッセイによって決定される。ある実施形態では、比は、第１の配列決定深度、例えば、本明細書に記載される、高い配列決定深度事象を含む１つ以上のサブゲノム間隔の配列決定深度に基づいて決定される。ある実施形態では、比は、第２の配列決定深度、例えば、異なるサブゲノム間隔の配列決定深度、例えば、低い配列決定深度事象を含む１つ以上のサブゲノム間隔に基づいて決定される。ある実施形態では、比は、第１の配列決定深度、例えば、本明細書に記載されるような、高い配列決定深度事象を含む１つ以上のサブゲノム間隔の配列決定深度；および第２の配列決定深度、例えば、異なるサブゲノム間隔、例えば、低い配列決定深度事象を含む１つ以上のサブゲノム間隔の配列決定深度に基づいて決定される。ある実施形態では、比は、第１の断片（Ｆ１）、例えば、高い配列決定深度事象を含むＦ１の配列決定深度に基づいて決定される。ある実施形態では、比は、第２の断片（Ｆ２）、例えば、低い配列決定深度事象を含むＦ２の配列決定深度に基づいて決定される。ある実施形態では、比は、Ｆ１の配列決定深度、例えば、高い配列決定深度事象を含むＦ１；およびＦ２の配列決定深度、例えば、低い配列決定深度事象を含むＦ２に基づいて決定される。
【００２５】
ある実施形態では、比は、１つ以上の遺伝子、例えば、予め選択された遺伝子の配列決定深度に基づいて決定される。ある実施形態では、比は、１つ以上の遺伝子またはサブゲノム間隔、例えば、予め選択された遺伝子または予め選択されたサブゲノム間隔の配列決定深度を決定することによって選択される。ある実施形態では、比は、１つ以上の遺伝子、例えば、予め選択された遺伝子または予め選択されたサブゲノム間隔の配列決定深度に基づいて、変化、例えば、増加または減少される。ある実施形態では、比は、１つ以上の遺伝子またはサブゲノム間隔の予め選択された配列決定深度を得るために、変化、例えば、増加または減少される。
【００２６】
ある実施形態では、複数の標的捕捉試薬は、結合対の機能的な第１のメンバーを含む標的捕捉試薬の、第１の配列決定深度を可能にする結合対の機能的な第１のメンバーを欠く標的捕捉試薬に対する、ある比を有する。ある実施形態では、複数の標的捕捉試薬は、結合対の機能的な第１のメンバーを含む標的捕捉試薬の、第２の配列決定深度を可能にする結合対の機能的な第１のメンバーを欠く標的捕捉試薬に対する、ある比を有する。ある実施形態では、第２の配列決定深度は、第１の配列決定深度以外である。ある実施形態では、第１の配列決定深度は、第２の配列決定深度よりも大きく、例えば、第２の配列決定深度よりも、少なくとも１．１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍大きい。ある実施形態では、第１の配列決定深度は、第２の配列決定深度よりも約１．１〜１０倍、約１．１〜９倍、約１．１〜８倍、約１．１〜７倍、約１．１〜６倍、約１．１〜５倍、約１．１〜４倍、約１．１〜３倍、約１．１〜２倍、約２〜１０倍、約３〜１０倍、約４〜１０倍、約５〜１０倍、約６〜１０倍、約７〜１０倍、約８〜１０倍、または約９〜１０倍大きい。ある実施形態では、第１の配列決定深度は、第２の配列決定深度よりも約１．１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍大きい。
【００２７】
ある実施形態では、第２の配列決定深度は、第１の配列決定深度よりも大きく、例えば、第１の配列決定深度よりも、少なくとも１．１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍大きい。ある実施形態では、第２の配列決定深度は、第１の配列決定深度よりも約１．１〜１０倍、約１．１〜９倍、約１．１〜８倍、約１．１〜７倍、約１．１〜６倍、約１．１〜５倍、約１．１〜４倍、約１．１〜３倍、約１．１〜２倍、約２〜１０倍、約３〜１０倍、約４〜１０倍、約５〜１０倍、約６〜１０倍、約７〜１０倍、約８〜１０倍、または約９〜１０倍大きい。ある実施形態では、第２の配列決定深度は、第１の配列決定深度よりも約１．１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍大きい。
【００２８】
ある実施形態では、第１の配列決定深度、例えば、Ｆ１配列決定深度は、例えば、実施例１に記載されているように、狭く高い配列決定深度である。
【００２９】
ある実施形態では、第２の配列決定深度、例えば、Ｆ２配列決定深度は、例えば、実施例１に記載されるように、広く中程度の配列決定深度である。
【００３０】
ある実施形態では、第１の配列決定深度、例えば、Ｆ２配列決定深度は、例えば、実施例１に記載されるように、狭く高い配列決定深度である。
【００３１】
ある実施形態では、第２の配列決定深度、例えば、Ｆ１配列決定深度は、例えば、実施例１に記載されるように、広く中程度の配列決定深度である。
【００３２】
ある実施形態では、Ｆ１は、高い配列決定深度事象を含む。ある実施形態では、高い配列決定深度事象は、実施可能な事象、例えば、本明細書に記載される実施可能な事象を含む。ある実施形態では、高い配列決定深度事象は、高い配列決定深度、例えば、低い配列決定深度事象よりも、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍大きい深度まで配列決定される配列（例えば、サブゲノム間隔配列）を含む。
【００３３】
ある実施形態では、Ｆ１は、低い配列決定深度事象を含まない。
【００３４】
ある実施形態では、Ｆ２は、低い配列決定深度事象を含む。ある実施形態では、低い配列決定深度事象は、ある事象を含む。ある実施形態では、低い配列決定深度事象のレベルは、１つ以上のバイオマーカー、例えば、腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）、またはその両方の決定と関連する。ある実施形態では、低い配列決定深度事象は、実施可能な事象、例えば、本明細書に記載される実施可能な事象を含む。ある実施形態では、低い配列決定深度事象は、実施可能な事象、例えば、本明細書に記載される実施可能な事象を含まない。ある実施形態では、低い配列決定深度事象は、低い配列決定深度、例えば、高い配列決定深度事象より１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍未満低い深度まで配列決定される配列（例えば、サブゲノム間隔配列）を含む。
【００３５】
ある実施形態では、Ｆ２は、高い配列決定深度事象を含まない。
【００３６】
ある実施形態では、複数の標的捕捉試薬、例えば、Ｒ１、Ｒ２および／またはＲ３は、限定的ではなく、例えば、約１００〜２０００×の過剰、例えば、モル過剰である。ある実施形態では、複数の標的捕捉試薬は、約１００×、２００×、３００×、４００×、５００×、６００×、７００×、８００×、９００×、１０００×、１１００×、１２００×、１３００×１４００×、１５００×、１６００×１７００×、１８００×、１９００×、または２０００×の過剰、例えば、モル過剰である。ある実施形態では、複数の標的捕捉試薬は、約１００〜１９００×、１００〜１８００×、１００〜１７００×、１００〜１６００×、１００〜１５００×、１００〜１４００×、１００〜１３００×、１００〜１２００×、１００〜１１００×、１００〜１０００×、１００〜９００×、１００〜８００×、１００〜７００×、１００〜６００×、１００〜５００×、１００〜４００×、１００〜３００×、１００〜２００×、２００〜２０００×、３００〜２０００×、４００〜２０００×、５００〜２０００×、６００〜２０００×、７００〜２０００×、８００〜２０００×、９００〜２０００×、１０００〜２０００×、１１００〜２０００×、１２００〜２０００×、１３００〜２０００×、１４００〜２０００×、１５００〜２０００×、１６００〜２０００×、１７００〜２０００×、１８００〜２０００×、または１９００〜２０００×の過剰、例えば、モル過剰である。
【００３７】
複数の標的捕捉試薬の実施形態では、（ｉ）第１のメンバーを含むＲ２の濃度；（ｉｉ）第１のメンバーを含まないＲ２の濃度；および（ｉｉｉ）Ｆ２の濃度は、第１のメンバーを含まないＲ２の、第１のメンバーを含むＲ２に対する比率が、第１のメンバーを含むＦ２−Ｒ２の複合体の数に影響を及ぼすようなものである。
【００３８】
複数の標的捕捉試薬の実施形態では、（ｉ）第１のメンバーを含むＲ１の濃度；（ｉｉ）第１のメンバーを含まないＲ１の濃度；および（ｉｉｉ）Ｆ１の濃度は、第１のメンバーを含まないＲ１の、第１のメンバーを含むＲ１に対する比率が、第１のメンバーを含むＦ１−Ｒ１の複合体の数に影響を及ぼすようなものである。
【００３９】
別の態様では、本明細書には、試料を分析する方法が開示され：
複数の第１の断片／第１の標的捕捉試薬（Ｆ１／Ｒ１）ハイブリッドを基質と接触させて、Ｆ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体を形成すること；および
複数の第２の断片／第２の標的捕捉試薬（Ｆ２／Ｒ２）ハイブリッドを基質と接触させて、Ｆ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体を形成すること
を含み、
基質に結合するＦ１／Ｒ１ハイブリッドの比率は、基質に結合するＦ２／Ｒ２ハイブリッドの比率よりも大きく、
それによって試料を分析する。
【００４０】
一部の実施形態では、Ｒ１の一部およびＲ２の一部は、結合対の機能的な第１のメンバーを含む。一部の実施形態では、結合対の第１のメンバーは、基質上に配置された結合対の第２のメンバーに結合することができる。
【００４１】
一部の実施形態では、Ｒ１の一部、Ｒ２の一部、またはその両方は、結合対の機能的な第１のメンバー、例えば、基質上に配置された結合対の第２のメンバーに結合することができないかまたはそれに対する結合親和性が低下している変化またはブロックされた第１のメンバーを欠く。
【００４２】
一部の実施形態では、Ｒ１は、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１、および結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ１を含み；Ｒ２は、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２、および結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ２を含む。
【００４３】
一部の実施形態では、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１の比率は、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率よりも大きい。
【００４４】
一部の実施形態では、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１の比率は、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率よりも、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍大きい。
【００４５】
一部の実施形態では、Ｆ１は、高い配列決定深度事象を含む。
【００４６】
一部の実施形態では、Ｆ２は、低い配列決定深度事象を含む。他の実施形態では、低い配列決定深度事象のレベルは、１つ以上のバイオマーカー、例えば、腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）、またはマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）の決定と関連する。
【００４７】
一部の実施形態では、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１の比率および結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率は、Ｆ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体およびＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体の形成時に、Ｆ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体中のＦ１の数およびＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体中のＦ２の数が、以下の関係：
（ｉ）Ｆ１の数は、Ｆ２の数より大きいかまたは実質的に同じである；および／または
（ｉｉ）第１の対象間隔における変化を含むＦ１の数は、第２の対象間隔における変化を含むＦ２の数よりも大きいかまたは実質的に同じである
のうちの１つまたは両方を有するようなものである。
【００４８】
一部の実施形態では、Ｆ１の数は、Ｆ２の数よりも、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍大きい
【００４９】
一部の実施形態では、第１の対象間隔における変化を含むＦ１の数は、第２の対象間隔における変化を含むＦ２の数よりも、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍大きい。
【００５０】
一部の実施形態では、第１の対象間隔、第２の対象間隔、またはその両方は、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子由来である。
【００５１】
一部の実施形態では、第１の対象間隔における変化は、試料中に、約０．０１〜２０％、例えば、約０．０２〜１９％、０．０３〜１８％、０．０４〜１７％、０．０５〜１６％、０．０６〜１５％、０．０７〜１４％、０．０８〜１３％、０．０９〜１２％、０．１〜１０％、０．２〜９％、０．３〜８％、０．４〜７％、０．５〜６％、０．６〜５％、０．７〜４％、０．８〜３％、０．９〜２％、１〜１．９％、１．１〜１．８％、１．２〜１．７％、１．３〜１．６％、または１．４〜１．５％の突然変異対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）で存在する。一部の実施形態では、第１の対象間隔は、試料中に、約０．１％に等しいかまたはそれより大きい（例えば、約０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％または０．９％に等しいかまたはそれより大きい、例えば、約０．１％〜０．９％、０．２％〜０．８％、０．３％〜０．７％、または０．４％〜０．６％の）突然変異対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）で存在する。一部の実施形態では、第１の対象間隔は、試料中に、約１％に等しいかまたはそれより大きい（例えば、約２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、または９％に等しいかもしくはそれより大きい、例えば、約１％〜９％、２％〜８％、３％〜７％、または４％〜６％の）突然変異対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）で存在する。
【００５２】
一部の実施形態では、Ｆ１、Ｆ２、またはその両方は、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子からの対象間隔を含む。
【００５３】
一部の実施形態では、Ｆ１における対象間隔は、第１の深度まで配列決定され、Ｆ２における対象間隔は、第２の深度まで配列決定され、第１の深度は、第２の深度よりも、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍大きい。
【００５４】
一部の実施形態では、Ｆ１は、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子からの対象間隔を含み、本対象間隔は、変化、例えば、体細胞性変化、例えば、がんにおける機能的変化を含む。
【００５５】
一部の実施形態では、対象間隔は、少なくとも約５，０００×深度まで配列決定される。
【００５６】
一部の実施形態では、Ｆ２は、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子からの対象間隔を含み、本対象間隔は、変化、例えば、体細胞性変化を含み、変化の決定は、１つ以上のゲノムシグネチャー、例えば、連続的／複雑なバイオマーカー、例えば、腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）、例えば、血液腫瘍遺伝子変異量（ｂＴＭＢ）を評価するために使用される。
【００５７】
一部の実施形態では、対象間隔は、例えば、１つ以上のゲノムシグネチャー、例えば、連続的／複雑なバイオマーカー、例えば、腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）、例えば、血液腫瘍遺伝子変異量（ｂＴＭＢ）を評価するために、少なくとも約８００×であるが約５，０００×未満まで配列決定される。
【００５８】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかは、複数の第３の断片／第３の標的捕捉試薬（Ｆ３／Ｒ３）ハイブリッドを基質と接触させて、Ｆ３／Ｒ３ハイブリッド／基質複合体を形成することをさらに含む。
【００５９】
一部の実施形態では、Ｒ３は、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ３、および結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ３を含む。
【００６０】
一部の実施形態では、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率は、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ３の比率よりも大きい。
【００６１】
一部の実施形態では、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率は、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ３の比率よりも、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍大きい。
【００６２】
複数の標的捕捉試薬の一部の実施形態では、結合対（例えば、本明細書に記載される結合対）の機能的な第１のメンバーを含むＲ１の、結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ１に対する比は、約２％〜約５０％、例えば、約３％〜約４０％、約４％〜約３０％、約５％〜約２５％、約８％〜約２０％、約１０％〜約１５％、例えば、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、または約５０％である。
【００６３】
複数の標的捕捉試薬の一部の実施形態では、結合対（例えば、本明細書に記載される結合対）の機能的な第１のメンバーを欠くＲ１の、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１に対する比は、約２％〜約５０％、例えば、約３％〜約４０％、約４％〜約３０％、約５％〜約２５％、約８％〜約２０％、約１０％〜約１５％、例えば、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、または約５０％である。
【００６４】
複数の標的捕捉試薬の一部の実施形態では、結合対（例えば、本明細書に記載される結合対）の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の、結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ２に対する比は、約２％〜約５０％、例えば、約３％〜約４０％、約４％〜約３０％、約５％〜約２５％、約８％〜約２０％、約１０％〜約１５％、例えば、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、または約５０％である。
【００６５】
複数の標的捕捉試薬の一部の実施形態では、結合対（例えば、本明細書に記載される結合対）の機能的な第１のメンバーを欠くＲ２の、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２に対する比は、約２％〜約５０％、例えば、約３％〜約４０％、約４％〜約３０％、約５％〜約２５％、約８％〜約２０％、約１０％〜約１５％、例えば、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、または約５０％である。
【００６６】
複数の標的捕捉試薬の一部の実施形態では、結合対（例えば、本明細書に記載される結合対）の機能的な第１のメンバーを含むＲ３の、結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ３に対する比は、約２％〜約５０％、例えば、約３％〜約４０％、約４％〜約３０％、約５％〜約２５％、約８％〜約２０％、約１０％〜約１５％、例えば、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、または約５０％である。
【００６７】
複数の標的捕捉試薬の一部の実施形態では、結合対（例えば、本明細書に記載される結合対）の機能的な第１のメンバーを欠くＲ３の、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ３に対する比は、約２％〜約５０％、例えば、約３％〜約４０％、約４％〜約３０％、約５％〜約２５％、約８％〜約２０％、約１０％〜約１５％、例えば、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、または約５０％である。
【００６８】
複数の標的捕捉試薬の実施形態では、Ａ対Ｂの比は、約２％〜約５０％、例えば、約３％〜約４０％、約４％〜約３０％、約５％〜約２５％、約８％〜約２０％、約１０％〜約１５％、例えば、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、または約５０％であり、
Ａは、Ｒ１（例えば、結合対の機能的な第１のメンバーを含む）、および結合対（例えば、本明細書に記載される結合対）の機能的な第１のメンバーを欠くＲ２を含み；
Ｂは、Ｒ１（例えば、結合対の機能的な第１のメンバーを含む）、および結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２を含む。
【００６９】
複数の標的捕捉試薬の実施形態では、Ａ対Ｂの比は、約２％〜約５０％、例えば、約３％〜約４０％、約４％〜約３０％、約５％〜約２５％、約８％〜約２０％、約１０％〜約１５％、例えば、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、または約５０％であり、
Ａは、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１；および結合対（例えば、本明細書に記載される結合対）の機能的な第１のメンバーを欠くＲ２を含み；
Ｂは、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１；および結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２を含む。
【００７０】
ある実施形態では、複数の標的捕捉試薬の比は、実施例１に記載されるアッセイによって決定される。ある実施形態では、比は、第１の配列決定深度、例えば、本明細書に記載される、高い配列決定深度事象を含む１つ以上のサブゲノム間隔の配列決定深度に基づいて決定される。ある実施形態では、比は、第２の配列決定深度、例えば、異なるサブゲノム間隔の配列決定深度、例えば、低い配列決定深度事象を含む１つ以上のサブゲノム間隔に基づいて決定される。ある実施形態では、比は、第１の配列決定深度、例えば、本明細書に記載されるような、高い配列決定深度事象を含む１つ以上のサブゲノム間隔の配列決定深度；および第２の配列決定深度、例えば、異なるサブゲノム間隔、例えば、低い配列決定深度事象を含む１つ以上のサブゲノム間隔の配列決定深度に基づいて決定される。ある実施形態では、比は、第１の断片（Ｆ１）、例えば、高い配列決定深度事象を含むＦ１の配列決定深度に基づいて決定される。ある実施形態では、比は、第２の断片（Ｆ２）、例えば、低い配列決定深度事象を含むＦ２の配列決定深度に基づいて決定される。ある実施形態では、比は、Ｆ１の配列決定深度、例えば、高い配列決定深度事象を含むＦ１；およびＦ２の配列決定深度、例えば、低い配列決定深度事象を含むＦ２に基づいて決定される。
【００７１】
ある実施形態では、比は、１つ以上の遺伝子、例えば、予め選択された遺伝子の配列決定深度に基づいて決定される。ある実施形態では、比は、１つ以上の遺伝子またはサブゲノム間隔、例えば、予め選択された遺伝子または予め選択されたサブゲノム間隔の配列決定深度を決定することによって選択される。ある実施形態では、比は、１つ以上の遺伝子、例えば、予め選択された遺伝子または予め選択されたサブゲノム間隔の配列決定深度に基づいて、変化、例えば、増加または減少される。ある実施形態では、比は、１つ以上の遺伝子またはサブゲノム間隔の予め選択された配列決定深度を得るために、変化、例えば、増加または減少される。
【００７２】
ある実施形態では、複数の標的捕捉試薬は、結合対の機能的な第１のメンバーを含む標的捕捉試薬の、第１の配列決定深度を可能にする結合対の機能的な第１メンバーを欠く標的捕捉試薬に対する、ある比を有する。ある実施形態では、複数の標的捕捉試薬は、結合対の機能的な第１のメンバーを含む標的捕捉試薬の、第２の配列決定深度を可能にする結合対の機能的な第１のメンバーを欠く標的捕捉試薬に対する、ある比を有する。ある実施形態では、第２の配列決定深度は、第１の配列決定深度以外である。ある実施形態では、第１の配列決定深度は、第２の配列決定深度よりも大きく、例えば、第２の配列決定深度よりも、少なくとも１．１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍大きい。ある実施形態では、第１の配列決定深度は、第２の配列決定深度よりも約１．１〜１０倍、約１．１〜９倍、約１．１〜８倍、約１．１〜７倍、約１．１〜６倍、約１．１〜５倍、約１．１〜４倍、約１．１〜３倍、約１．１〜２倍、約２〜１０倍、約３〜１０倍、約４〜１０倍、約５〜１０倍、約６〜１０倍、約７〜１０倍、約８〜１０倍、または約９〜１０倍大きい。ある実施形態では、第１の配列決定深度は、第２の配列決定深度よりも約１．１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍大きい。
【００７３】
ある実施形態では、第２の配列決定深度は、第１の配列決定深度よりも大きく、例えば、第１の配列決定深度よりも、少なくとも１．１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍大きい。ある実施形態では、第２の配列決定深度は、第１の配列決定深度よりも約１．１〜１０倍、約１．１〜９倍、約１．１〜８倍、約１．１〜７倍、約１．１〜６倍、約１．１〜５倍、約１．１〜４倍、約１．１〜３倍、約１．１〜２倍、約２〜１０倍、約３〜１０倍、約４〜１０倍、約５〜１０倍、約６〜１０倍、約７〜１０倍、約８〜１０倍、または約９〜１０倍大きい。ある実施形態では、第２の配列決定深度は、第１の配列決定深度よりも約１．１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍大きい。
【００７４】
ある実施形態では、第１の配列決定深度、例えば、Ｆ１配列決定深度は、例えば、実施例１に記載されているように、狭く高い配列決定深度である。
【００７５】
ある実施形態では、第２の配列決定深度、例えば、Ｆ２配列決定深度は、例えば、実施例１に記載されるように、広く中程度の配列決定深度である。
【００７６】
ある実施形態では、第１の配列決定深度、例えば、Ｆ２配列決定深度は、例えば、実施例１に記載されるように、狭く高い配列決定深度である。
【００７７】
ある実施形態では、第２の配列決定深度、例えば、Ｆ１配列決定深度は、例えば、実施例１に記載されるように、広く中程度の配列決定深度である。
【００７８】
ある実施形態では、複数の標的捕捉試薬、例えば、Ｒ１、Ｒ２および／またはＲ３は、限定的ではなく、例えば、約１００〜２０００×の過剰、例えば、モル過剰である。ある実施形態では、複数の標的捕捉試薬は、約１００×、２００×、３００×、４００×、５００×、６００×、７００×、８００×、９００×、１０００×、１１００×、１２００×、１３００×１４００×、１５００×、１６００×１７００×、１８００×、１９００×、または２０００×の過剰、例えば、モル過剰である。ある実施形態では、複数の標的捕捉試薬は、約１００〜１９００×、１００〜１８００×、１００〜１７００×、１００〜１６００×、１００〜１５００×、１００〜１４００×、１００〜１３００×、１００〜１２００×、１００〜１１００×、１００〜１０００×、１００〜９００×、１００〜８００×、１００〜７００×、１００〜６００×、１００〜５００×、１００〜４００×、１００〜３００×、１００〜２００×、２００〜２０００×、３００〜２０００×、４００〜２０００×、５００〜２０００×、６００〜２０００×、７００〜２０００×、８００〜２０００×、９００〜２０００×、１０００〜２０００×、１１００〜２０００×、１２００〜２０００×、１３００〜２０００×、１４００〜２０００×、１５００〜２０００×、１６００〜２０００×、１７００〜２０００×、１８００〜２０００×、または１９００〜２０００×の過剰、例えば、モル過剰である。
【００７９】
複数の標的捕捉試薬の実施形態では、（ｉ）第１のメンバーを含むＲ２の濃度；（ｉｉ）第１のメンバーを含まないＲ２の濃度；および（ｉｉｉ）Ｆ２の濃度は、第１のメンバーを含まないＲ２の、第１のメンバーを含むＲ２に対する比率が、第１のメンバーを含むＦ２−Ｒ２の複合体の数に影響を及ぼすようなものである。
【００８０】
複数の標的捕捉試薬の実施形態では、（ｉ）第１のメンバーを含むＲ１の濃度；（ｉｉ）第１のメンバーを含まないＲ１の濃度；および（ｉｉｉ）Ｆ１の濃度は、第１のメンバーを含まないＲ１の、第１のメンバーを含むＲ１に対する比率が、第１のメンバーを含むＦ１−Ｒ１の複合体の数に影響を及ぼすようなものである。
【００８１】
一部の実施形態では、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率、および結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ３の比率は、Ｆ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体およびＦ３／Ｒ３ハイブリッド／基質複合体の形成時に、Ｆ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体中のＦ２の数、およびＦ３／Ｒ３ハイブリッド／基質複合体中のＦ３の数が、以下の関係のうち１つまたは両方を有するようなものである：
（ｉ）Ｆ２の数がＦ３の数より大きい；および／または
（ｉｉ）第２の対象間隔における変化を含むＦ２の数が、第３の対象間隔における変化を含むＦ３の数よりも大きい。
【００８２】
一部の実施形態では、Ｆ２の数は、Ｆ３の数よりも、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍大きい。
【００８３】
一部の実施形態では、第２の対象間隔における変化を含むＦ２の数は、第３の対象間隔における変化を含むＦ３の数よりも、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍大きい。
【００８４】
一部の実施形態では、第２の対象間隔、第３の対象間隔、またはその両方は、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子由来である。
【００８５】
一部の実施形態では、Ｆ１、Ｆ２、またはＦ３のうちの１つ、２つまたは全ては、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子からの対象間隔を含む。
【００８６】
一部の実施形態では、Ｆ２における対象間隔は、第２の深度まで配列決定され、Ｆ３における対象間隔は、第３の深度まで配列決定され、第２の深度は、第３の深度よりも、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍大きい。
【００８７】
一部の実施形態では、Ｆ３は、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子からの対象間隔を含み、対象間隔は、生殖系列変化、例えば、生殖系列一塩基多型（ＳＮＰ）を含む。
【００８８】
一部の実施形態では、対象間隔は、少なくとも約１００×深度であるが約８００×未満まで配列決定される。
【００８９】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかは、対象から試料を提供することをさらに含む。一部の実施形態では、試料は、ＤＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡ、例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、試料は、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、本方法は、ＲＮＡからｃＤＮＡを提供することをさらに含む。
【００９０】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかは、例えば、試料から核酸を得ること、例えば、単離することをさらに含む。
【００９１】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかは、試料中の核酸を断片化してＦ１およびＦ２を提供することをさらに含む。
【００９２】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかは、複数のＦ１を提供するためにＦ１を増幅し、複数のＦ２を提供するためにＦ２を増幅することをさらに含む。
【００９３】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかは、アダプター配列をＦ１およびＦ２に付着させて、アダプター化Ｆ１（ＡＦ１）およびアダプター化Ｆ２（ＡＦ２）を提供することをさらに含む。
【００９４】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかは、ＡＦ１を増幅して複数のＡＦ１を提供し、ＡＦ２を増幅して複数のＡＦ２を提供することをさらに含む。
【００９５】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかは、複数のＦ１をＲ１と接触させて複数のＦ１／Ｒ１ハイブリッドを提供し、複数のＦ２をＲ２と接触させて複数のＦ２／Ｒ２ハイブリッドを提供することをさらに含む。
【００９６】
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法のいずれかは、複数のＡＦ１をＲ１と接触させて複数のＡＦ１／Ｒ１ハイブリッドを提供し、複数のＡＦ２をＲ２と接触させて複数のＡＦ２／Ｒ２ハイブリッドを提供することをさらに含む。
【００９７】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、複数のＦ１／Ｒ１ハイブリッドを基質と接触させてＦ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体を形成することが、複数のＡＦ１／Ｒ１ハイブリッドを基質と接触させてＡＦ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体を形成することを含み；複数のＦ２／Ｒ２ハイブリッドを基質と接触させてＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体を形成することが、複数のＡＦ２／Ｒ２ハイブリッドを基質と接触させてＡＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体を形成することを含む。
【００９８】
一部の実施形態では、接触は、溶液中または固体表面上で起こる。
【００９９】
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、結合対の第１のメンバーはビオチン部分を含み、結合対の第２のメンバーはストレプトアビジンまたはアビジン（または修飾バージョン、例えば、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎもしくはＣａｐｔＡｖｉｄｉｎ）部分を含む。
【０１００】
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、結合対の第１のメンバーはジゴキシゲニン部分を含み、結合対の第２のメンバーは抗ジゴキシゲニン抗体部分を含む。
【０１０１】
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、結合対の第１のメンバーはＦＩＴＣ部分を含み、結合対の第２のメンバーは抗ＦＩＴＣ抗体部分を含む。
【０１０２】
本明細書に開示される方法の一部の実施形態では、Ｒ１中の結合対の第１のメンバーは、リンカーを介してＦ１を捕捉する（例えば、ハイブリダイズする）Ｒ１中の部分（例えば、ヌクレオチド配列）にカップリングされる。一部の実施形態では、Ｒ２中の結合対の第１のメンバーは、リンカーを介してＦ２を捕捉する（例えば、ハイブリダイズする）Ｒ２中の部分（例えば、ヌクレオチド配列）にカップリングされる。一部の実施形態では、リンカーは切断可能なリンカーである。
【０１０３】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかは、複数のＦ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体からＦ１を配列決定し、複数のＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体からＦ２を配列決定することをさらに含む。一部の実施形態では、Ｆ１は、Ｆ２より、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍大きい深度まで配列決定される。
【０１０４】
さらに別の態様では、本開示は、試料を分析する方法を提供し、
ａ）複数の第１の断片／第１の標的捕捉試薬（Ｆ１／Ｒ１）ハイブリッドおよび複数の第２の断片／第２の標的捕捉試薬（Ｆ２／Ｒ２）ハイブリッドを提供することであって、
結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１の比率は、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率よりも大きく、
結合対の第１のメンバーは、基質上に配置された結合対の第２のメンバーに結合することができる、ハイブリッドを提供すること；
ｂ）複数のＦ１／Ｒ１ハイブリッドを基質と接触させて、Ｆ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体を形成し、複数のＦ２／Ｒ２ハイブリッドを基質と接触させて、Ｆ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体を形成することであって、
基質に結合するＦ１／Ｒ１ハイブリッドの比率は、基質に結合するＦ２／Ｒ２ハイブリッドの比率よりも大きい、複合体を形成すること；ならびに
ｃ）複数のＦ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体からＦ１を配列決定し、複数のＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体からＦ２を配列決定すること
を含み、Ｆ１はＦ２より大きな深度まで配列決定され、
それによって試料を分析する。
【０１０５】
ある態様では、本明細書には、試料を分析する方法が開示され、
１）対象からの試料、例えば、ゲノムＤＮＡ、例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む試料を提供すること；
２）試料から核酸を得ること、例えば、単離すること；、
３）核酸を断片化して、複数の断片（Ｆ）を提供すること；
４）アダプター配列を複数の断片（Ｆ）に付着させて、複数のアダプター化断片（ＡＦ）を提供すること；
５）第１のＡＦ（ＡＦ１）を増幅して複数のＡＦ１を提供し、第２のＡＦ（ＡＦ２）を増幅して複数のＡＦ２を提供すること；、
６）複数のＡＦ１を、各々がＡＦ１にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む第１の標的捕捉試薬（Ｒ１）と接触させて、複数のＡＦ１／Ｒ１ハイブリッドを提供し、複数のＡＦ２を、各々がＡＦ２にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む第２の標的捕捉試薬（Ｒ２）と接触させて、複数のＡＦ２／Ｒ２ハイブリッドを提供することであって；
Ｒ１の一部およびＲ２の一部は、結合対の機能的な第１のメンバーを含み、結合対の第１のメンバーは、基質上に配置された結合対の第２のメンバーに結合することができ、
Ｒ１の一部、Ｒ２の一部、またはその両方は、結合対の機能的な第１のメンバーを欠く、ハイブリッドを提供すること；
７）複数のＡＦ１／Ｒ１ハイブリッドを基質と接触させて、ＡＦ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体を形成し、複数のＡＦ２／Ｒ２ハイブリッドを基質と接触させて、ＡＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体を形成することであって、
基質に結合するＡＦ１／Ｒ１ハイブリッドの比率は、基質に結合するＡＦ２／Ｒ２ハイブリッドの比率よりも大きい、複合体を形成すること；ならびに
８）複数のＡＦ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体からのＡＦ１を配列決定し、複数のＡＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体からＡＦ２を配列決定すること
を含み、場合により、ＡＦ１は、ＡＦ２より、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍大きな深度まで配列決定され、
それによって試料を分析する。
【０１０６】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかは、試料から複数の核酸分子を含むライブラリーを取得することをさらに含む。
【０１０７】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかは、ライブラリーを標的捕捉試薬と接触させて、選択された核酸分子を提供することをさらに含み、前記標的捕捉試薬は核酸分子とハイブリダイズし、それにより、ライブラリーキャッチを提供する。
【０１０８】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかは、前記ライブラリーまたはライブラリーキャッチから、変化（例えば、体細胞性変化）を含む対象間隔についてのリードを取得することをさらに含み、それにより、例えば、次世代シークエンシング法によって、対象間隔についてのリードを取得する。
【０１０９】
一部の実施形態では、本方法は、複数の遺伝子において対象間隔についてのリードを取得することを含む。
【０１１０】
一部の実施形態では、複数の遺伝子は、突然変異体形態の遺伝子を含み、例えば、突然変異体遺伝子は、細胞分裂、増殖もしくは生存に対する作用と関連するか、またはがんと関連する。一部の実施形態では、複数の遺伝子は、全エクソンシークエンシング（ＷＥＳ）のために、少なくとも約５０以上、約１００以上、約１５０以上、約２００以上、約２５０以上、約３００以上、約３５０以上、約４００以上、約４５０以上、約５００以上の遺伝子、もしくは約１，０００以上の遺伝子、または全ての遺伝子を含む。
【０１１１】
一部の実施形態では、複数の遺伝子は、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子の少なくとも約５０以上、約１００以上、約１５０以上、約２００以上、約２５０以上、約３００以上、または全てを含む。
【０１１２】
一部の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、表１Ａ〜５Ａに記載された遺伝子の少なくとも約５０以上、約１００以上、約１５０以上、約２００以上、約２５０以上、約３００以上、または全てからの対象間隔を配列決定することを含む。
【０１１３】
一部の実施形態では、対象間隔は、約１００×より大きい、約２５０×より大きい、約５００×より大きい、約８００×より大きい、約１，０００×より大きい、約２，０００×より大きい、約３，０００×より大きい、約４，０００×より大きい、または約５，０００×より大きい平均深度まで配列決定される。
【０１１４】
一部の実施形態では、対象間隔は、配列決定された遺伝子（例えば、エクソン）の約９５％超、約９７％超、または約９９％超で、約１００×より大きい、約２５０×より大きい、約５００×より大きい、約８００×より大きい、約１，０００×より大きい、約２，０００×より大きい、約３，０００×より大きい、約４，０００×より大きい、または約５，０００×より大きい平均深度まで配列決定される。
【０１１５】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかは、アライメント法によって前記リードを整列させることをさらに含む。
【０１１６】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかは、ヌクレオチド位置についての前記リードからヌクレオチド値を割り当てることをさらに含む。
【０１１７】
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、１つ以上のゲノムシグネチャー、例えば、試料中の連続的／複雑なバイオマーカー、例えば、腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）、例えば、血液ＴＭＢ（ｂＴＭＢ）を評価する。
【０１１８】
一部の実施形態では、試料は血液試料であり、ｂＴＭＢが評価される。
【０１１９】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかは、体細胞性または生殖系列変化として、試料中の変化を特徴づけることをさらに含む。
【０１２０】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかは、試料中の変化の接合性を決定することをさらに含む。
【０１２１】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかは、試料、または試料の分析に応答して得られた試料に由来する対象を分類することをさらに含む。
【０１２２】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかは、報告書、例えば、電子的な、ウェブベースの、または紙による報告書を、得られた試料に由来する対象に、または別の人もしくは団体、世話人、医師、がん専門医、病院、診療所、第三者支払人、保険会社もしくは政府機関に提供することをさらに含む。
【０１２３】
本明細書に開示される組成物および方法のいずれかは、以下の実施形態のうちの１つ以上と組み合わせることができる。
【０１２４】
多重遺伝子解析
【０１２５】
本明細書に記載される方法および組成物は、例えば、本明細書に記載される遺伝子または遺伝子産物のセットから、対象間隔セットを評価するために使用することができる。
【０１２６】
ある種の実施形態では、遺伝子セットは複数の遺伝子を含み、これは、突然変異体形態で、細胞分裂、増殖、もしくは生存における作用と関連するか、またはがん、例えば、本明細書に記載されるがんと関連する。
【０１２７】
ある種の実施形態では、遺伝子セットは、少なくとも約５０以上、約１００以上、約１５０以上、約２００以上、約２５０以上、約３００以上、約３５０以上、約４００以上、約４５０以上、約５００以上、約５５０以上、約６００以上、約６５０以上、約７００以上、約７５０以上、または約８００以上の遺伝子、例えば、本明細書に記載される遺伝子を含む。一部の実施形態では、遺伝子セットは、表１Ａ〜５Ａに記載される選択された遺伝子の少なくとも約５０以上、約１００以上、約１５０以上、約２００以上、約２５０以上、約３００以上、または全てを含む。
【０１２８】
ある種の実施形態では、本方法は、試料から複数の腫瘍核酸分子を含むライブラリーを取得することを含む。一部の実施形態では、本方法は、ライブラリーを標的捕捉試薬と接触させて、選択された腫瘍核酸分子を提供することをさらに含み、前記標的捕捉試薬は、ライブラリーからの腫瘍核酸分子とハイブリダイズし、それにより、ライブラリーキャッチを提供する。一部の実施形態では、本方法は、ライブラリーまたはライブラリーキャッチから、腫瘍核酸分子からの変化（例えば、体細胞性変化）を含む、対象間隔についてのリードを取得することをさらに含み、それにより、例えば、次世代シークエンシング法によって、対象間隔についてのリードを取得する。ある種の実施形態では、本方法は、アライメント法、例えば、本明細書に記載されるアライメント法によって、対象間隔についてのリードを整列させることをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、例えば、本明細書に記載される突然変異コーリング法によって、対象間隔についてのリードからヌクレオチド位置についてのヌクレオチド値を割り当てることをさらに含む。
【０１２９】
一部の実施形態では、本方法は、以下のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、または全てを含む：
（ａ）試料から複数の腫瘍核酸分子を含むライブラリーを取得し；
（ｂ）ライブラリーを複数の標的捕捉試薬と接触させて、選択された腫瘍核酸分子を提供し、前記複数の標的捕捉試薬は、腫瘍核酸分子とハイブリダイズし、それによりライブラリーキャッチを提供し；
（ｃ）前記ライブラリーキャッチから、腫瘍核酸分子からの変化（例えば、体細胞性変化）を含む対象間隔についてのリードを獲得し、それにより、例えば、次世代シークエンシング法によって対象間隔についてのリードを取得し；
（ｄ）アライメント法、例えば、本明細書に記載されるアライメント法によって前記リードを整列させ；または
（ｅ）例えば、本明細書に記載される突然変異コーリング法によって、ヌクレオチド位置について前記リードからヌクレオチド値を割り当てる。
【０１３０】
ある種の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、対象間隔を、少なくとも約５０以上、約１００以上、約１５０以上、約２００以上、約２５０以上、約３００以上、約３５０以上、約４００以上、約４５０以上、約５００以上、約５５０以上、約６００以上、約６５０以上、約７００以上、約７５０以上、または約８００以上の遺伝子から配列決定することを含む。ある種の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、対象間隔を、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子の少なくとも約５０以上、約１００以上、約１５０以上、約２００以上、約２５０以上、約３００以上、または全部から配列決定することを含む。
【０１３１】
ある種の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、１００×以上の平均深度で配列決定することを含む。ある種の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、約２５０×以上の平均深度で配列決定することを含む。他の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、約５００×以上の平均深度で配列決定することを含む。ある種の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、約８００×以上の平均深度で配列決定することを含む。他の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、約１，０００×以上の平均深度で配列決定することを含む。他の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、約１，５００×以上の平均深度で配列決定することを含む。他の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、約２，０００×以上の平均深度で配列決定することを含む。他の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、約２，５００×以上の平均深度で配列決定することを含む。ある種の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、約３，０００×以上の平均深度で配列決定することを含む。ある種の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、約３，５００×以上の平均深度で配列決定することを含む。ある種の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、約４，０００×以上の平均深度で配列決定することを含む。ある種の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、約４，５００×以上の平均深度で配列決定することを含む。ある種の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、約５，０００×以上の平均深度で配列決定することを含む。ある種の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、約５，５００×以上の平均深度で配列決定することを含む。ある種の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、約６，０００×以上の平均深度で配列決定することを含む。
【０１３２】
一部の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、配列決定された遺伝子（例えば、エクソン）の約９９％を超えて、約１００×以上の平均深度で配列決定することを含む。ある種の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、配列決定された遺伝子（例えば、エクソン）の約９９％を超えて、約２５０×以上の平均深度で配列決定することを含む。他の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、配列決定された遺伝子（例えば、エクソン）の約９５％を超えて、約５００×以上の平均深度で配列決定することを含む。他の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、配列決定された遺伝子（例えば、エクソン）の約９５％を超えて、約８００×以上の平均深度で配列決定することを含む。他の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、配列決定された遺伝子（例えば、エクソン）の約９０％を超えて、約１，０００×以上の平均深度で配列決定することを含む。他の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、配列決定された遺伝子（例えば、エクソン）の約９０％を超えて、約２，０００×以上の平均深度で配列決定することを含む。他の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、配列決定された遺伝子（例えば、エクソン）の約９０％を超えて、約３，０００×以上の平均深度で配列決定することを含む。他の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、配列決定された遺伝子（例えば、エクソン）の約９０％を超えて、約３，５００×以上の平均深度で配列決定することを含む。他の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、配列決定された遺伝子（例えば、エクソン）の約９０％を超えて、約４，０００×以上の平均深度で配列決定することを含む。他の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、配列決定された遺伝子（例えば、エクソン）の約９０％を超えて、約４，５００×以上の平均深度で配列決定することを含む。他の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、配列決定された遺伝子（例えば、エクソン）の約９０％を超えて、約５，０００×以上の平均深度で配列決定することを含む。他の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、配列決定された遺伝子（例えば、エクソン）の約９０％を超えて、約５，５００×以上の平均深度で配列決定することを含む。他の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、配列決定された遺伝子（例えば、エクソン）の約９０％を超えて、約６，０００×以上の平均深度で配列決定することを含む。ある種の実施形態では、対象間隔についてのリードを取得することは、配列決定された遺伝子（例えば、エクソン）の約９９％を超えて、約１００×以上、約２５０×以上、約５００×以上、約１，０００×以上、約１，５００×以上、約２，０００×以上、約２，５００×以上、約３，０００×以上、約３，５００×以上、約４，０００×以上、約４，５００×以上、約５，０００×以上、約５，５００×以上、または約６，０００×以上の平均深度で配列決定することを含む。
【０１３３】
一部の実施形態では、本明細書に記載される対象間隔（例えば、コーディング対象間隔）セットの配列、例えば、ヌクレオチド配列は、本明細書に記載される方法によって提供される。ある種の実施形態では、配列は、合致した正常対照（例えば、野生型対照）、合致した腫瘍対照（例えば、原発性対転移性）、またはその両方を含む方法を使用することなしに提供される。
【０１３４】
試料
【０１３５】
本明細書に記載される方法および組成物は、多数の異なる供給源からの種々の試料タイプにおける対象間隔を評価するために使用することができる。
【０１３６】
一部の実施形態では、試料は、核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む。一部の実施形態では、試料は、腫瘍由来の１つ以上の核酸を含む。ある種の実施形態では、試料は、腫瘍由来の１つ以上の非核酸成分、例えば、細胞、タンパク質、炭水化物、または脂質をさらに含む。ある種の実施形態では、試料は、非腫瘍細胞または組織由来の１つ以上の核酸をさらに含む。ある種の実施形態では、試料は、固形腫瘍、血液がん、またはその転移性形態から取得される。一部の実施形態では、試料は、本明細書に記載されるように、がんを有する対象、またはがんを治療するための療法を受けたことがないか、がんを治療するための療法を受けているか、またはがんを治療するための療法を受けたことがある対象から得られる。
【０１３７】
一部の実施形態では、試料は、前がん状態の細胞もしくは悪性細胞；固形腫瘍、軟組織腫瘍もしくは転移性病変由来の細胞；外科的切除縁由来の組織もしくは細胞；組織学的に正常な組織；１つ以上の循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）；正常な隣接組織（ＮＡＴ）；血液試料；またはホルムアルデヒドもしくはパラホルムアルデヒド固定したパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料のうちの１つ以上を含む。ある種の実施形態では、試料は、血液試料である。ある種の実施形態では、試料は、血漿試料である。ある種の実施形態では、試料は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む。ある種の実施形態では、試料は、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む。ある種の実施形態では、試料は、脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む。ある種の実施形態では、試料は、尿を含む。ある種の実施形態では、試料は、胸水を含む。ある種の実施形態では、試料は、腹水を含む。ある種の実施形態では、試料は、ＦＦＰＥ試料である。ある種の実施形態では、試料は、切除、針生検、細針吸引物、または細胞診スメアを含む。
【０１３８】
標的捕捉試薬
【０１３９】
本明細書に記載される組成物および方法は、配列決定される標的核酸分子の選択のための標的捕捉試薬の、例えば、溶液ハイブリダイゼーションにおいて使用するための標的捕捉試薬の適切な選択によって、１つ以上の対象由来の試料からの、例えば、本明細書に記載されるがんからの多数の遺伝子および遺伝子産物の最適化された配列決定を提供する。標的捕捉試薬によって捕捉される標的核酸分子は、典型的には、基質によって回収される。一部の実施形態では、標的捕捉試薬によって捕捉される標的核酸分子は、例えば、基質に結合することによって回収される。一部の実施形態では、各々が異なる標的核酸分子を捕捉する、２つ以上の複数の標的捕捉試薬が使用される。
【０１４０】
一部の実施形態では、回収効率は、全標的核酸分子に対する、基質によって回収される（例えば、結合された）標的捕捉試薬により捕捉される標的核酸分子の比である。一部の実施形態では、少なくとも２つの複数の標的捕捉試薬は、異なる回収効率を有する。一部の実施形態では、回収効率は、標的対象間隔に従って調整される場合、配列決定深度に相関する。一部の実施形態では、回収効率は、標的対象間隔に関する配列決定深度に相関する。一部の実施形態では、標的捕捉試薬の回収効率は、機能的結合対を含む標的捕捉試薬の比率と相関される。
【０１４１】
したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、選択された核酸分子（例えば、ライブラリーキャッチ）を同定または単離するために、ライブラリーを、異なる回収効率を有する２つ、３つ、またはそれ以上の複数の標的捕捉試薬と接触させることを含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、本質的に同時におよび／または同じ試料容器（例えば、チューブ）内で異なる回収効率を有する２つ、３つ、またはそれ以上の複数の標的捕捉試薬と接触される。一部の実施形態では、標的核酸分子は、本質的に同時におよび／または同じ試料容器（例えば、チューブ）内で異なる回収効率を有する２つ、３つ、またはそれ以上の複数の標的捕捉試薬によって捕捉される。一部の実施形態では、異なる回収効率を有する２つ、３つ、またはそれ以上の複数の標的捕捉試薬によって捕捉された標的核酸分子は、実質的に同時におよび／または同じ試料容器（例えば、チューブ）中で基質によって回収される。
【０１４２】
一部の実施形態では、第１の複数の標的捕捉試薬は、結合対の機能的な第１のメンバーを含む標的捕捉試薬、および結合対の機能的な第１のメンバーを欠く標的捕捉試薬を含み、第２の複数の標的捕捉試薬は、結合対の機能的な第１のメンバーを含む標的捕捉試薬、および結合対の機能的な第１のメンバーを欠く標的捕捉試薬を含み、結合対の機能的な第１のメンバーは、基質上に配置された結合対の第２のメンバーに結合することができる。一部の実施形態では、第１の複数における結合対の機能的な第１のメンバーを含む標的捕捉試薬の比率は、第２の複数における結合対の機能的な第１のメンバーを含む標的捕捉試薬の比率より大きく、その結果、第１の複数の標的捕捉試薬の回収効率は、第２の複数の標的捕捉試薬の回収効率よりも大きい。
【０１４３】
２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の複数の標的捕捉試薬の任意の組合せを使用することができ、例えば、第１および第２の複数の標的捕捉試薬；第１および第３の複数の標的捕捉試薬；第１および第４の複数の標的捕捉試薬；第１および第５の複数の標的捕捉試薬；第２および第３の複数の標的捕捉試薬；第２および第４の複数の標的捕捉試薬；第２および第５の複数の標的捕捉試薬；第３および第４の複数の標的捕捉試薬；第３および第５の複数の標的捕捉試薬；第４および第５の複数の標的捕捉試薬；第１、第２および第３の複数の標的捕捉試薬；第１、第２および第４の複数の標的捕捉試薬；第１、第２および第５の複数の標的捕捉試薬；第１、第２、第３、および第４の複数の標的捕捉試薬；第１、第２、第３、第４、および第５の複数の標的捕捉試薬の組合せなどが挙げられる。
【０１４４】
一部の実施形態では、本方法は、
（ａ）試料からの複数の核酸分子（例えば、標的核酸分子）、例えば、試料、例えば、本明細書に記載される試料からの複数の腫瘍核酸分子を含むライブラリーを取得すること；
（ｂ）選択された核酸分子（例えば、ライブラリーキャッチ）を提供するために、ライブラリーを２つ、３つ、またはそれ以上の複数の標的捕捉試薬と接触させること；
（ｃ）核酸分子、例えば、前記ライブラリーまたはライブラリーキャッチからの腫瘍核酸分子からの対象間隔についてのリードを、例えば、配列決定を含む方法によって、例えば、次世代シークエンシング法を用いて取得すること；
（ｄ）アライメント法、例えば、本明細書に記載されるアライメント法によって前記リードを整列させること；ならびに
（ｅ）ヌクレオチド位置についての前記リードからヌクレオチド値を割り当てる（例えば、突然変異を、例えば、ベイズ法または本明細書に記載される方法でコールする）こと
を含む。
【０１４５】
一部の実施形態では、本方法は、ライブラリーを、少なくとも２つまたは３つの複数の標的捕捉試薬と接触させることを含み、各複数は、（複数における他の標的捕捉試薬とは対照的に）固有の回収効率を有する。例えば、各固有の複数の標的捕捉試薬は、固有の深度の配列決定をもたらすかまたはそれと相関する。
【０１４６】
ある実施形態では、本方法は、サブゲノム間隔に対応する核酸分子、および発現されたサブゲノム間隔に対応する核酸分子が各々得られるライブラリーを取得することを含む。ある実施形態では、本方法は、サブゲノム間隔に対応する核酸分子が得られる第１のライブラリーを取得し、発現されたサブゲノム間隔に対応する核酸分子が得られる第２のライブラリーを取得することを含む。ある実施形態では、標的捕捉試薬は、サブゲノム間隔と発現されたサブゲノム間隔の両方を含む核酸分子またはライブラリーキャッチを提供するために使用される。ある実施形態では、第１の標的捕捉試薬は、サブゲノム間隔を含む核酸分子またはライブラリーキャッチを提供するために使用され、第２の標的捕捉試薬は、発現されたサブゲノム間隔を含む核酸分子またはライブラリーキャッチを提供するために使用される。
【０１４７】
ある実施形態では、第１の複数の標的捕捉試薬の回収効率は、第２の複数の標的捕捉試薬の回収効率と少なくとも２、５、１０、２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍異なる。ある実施形態では、第１および第２の複数の標的捕捉試薬は、少なくとも２、５、１０、２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍異なる配列決定の深度を提供する。
【０１４８】
一部の実施形態では、本明細書で使用される配列決定深度のレベル（例えば、配列決定深度のＸ倍レベル）とは、二重リード、例えば、ＰＣＲ二重リードの検出および除去後のリード数（例えば、固有のリード）を指す。他の実施形態では、二重リードは、例えば、コピー数変化（ＣＮＡ）の検出をサポートするために評価される。
【０１４９】
一実施形態では、標的捕捉試薬は、１つ以上の再配列を含む対象間隔、例えば、ゲノム再配列を含むイントロンを含む対象間隔を選択する。このような実施形態では、標的捕捉試薬は、選択効率を増加させるために反復配列がマスクされるように設計される。再配列が公知の接合部配列を有する実施形態では、相補的な標的捕捉試薬を接合部配列に設計して、選択効率を増加させることができる。
【０１５０】
一部の実施形態では、本方法は、２つ以上の異なる標的カテゴリーを捕捉するように設計された標的捕捉試薬の使用を含み、各カテゴリーは異なる設計戦略を有する。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法（例えば、ハイブリッド捕捉方法）および組成物は、標的配列のサブセット（例えば、標的核酸分子）を捕捉し、標的配列の均一なカバレッジを提供する一方で、そのサブセットの外側のカバレッジを最小化する。一実施形態では、標的配列は、ゲノムＤＮＡからの全エクソーム、またはその選択されたサブセットを含む。別の実施形態では、標的配列は、大きな染色体領域、例えば、染色体アーム全体を含む。本明細書に開示される方法および組成物は、複雑な標的核酸配列（例えば、核酸ライブラリー）について異なる配列決定深度およびカバレッジパターンを達成するための異なる標的捕捉試薬を提供する。
【０１５１】
ある実施形態では、本方法は、１つまたは複数の核酸ライブラリー（例えば、ライブラリーキャッチ）の選択された核酸分子を提供することを含む。
例えば、本方法は、
複数の核酸分子、例えば、標的核酸分子（例えば、複数の腫瘍核酸分子および／または参照核酸分子を含む）を含む１つまたは複数のライブラリー（例えば、１つまたは複数の核酸ライブラリー）を提供すること；
例えば、溶液ベースの反応において、１つまたは複数のライブラリーを、２つ、３つ、またはそれ以上の複数の標的捕捉試薬（例えば、オリゴヌクレオチド標的捕捉試薬）と接触させて、複数の標的捕捉試薬／核酸分子ハイブリッドを含むハイブリダイゼーション混合物を形成すること；
例えば、前記ハイブリダイゼーション混合物を、ハイブリダイゼーション混合物から前記複数の標的捕捉試薬／核酸分子ハイブリッドを分離することを可能にする結合実体と接触させることによって、前記ハイブリダイゼーション混合物から複数の標的捕捉試薬／核酸分子ハイブリッドを分離すること
を含み、
それにより、ライブラリーキャッチ（例えば、１つまたは複数のライブラリーからの核酸分子の選択されたまたは濃縮されたサブグループ）を提供する。
【０１５２】
一実施形態では、第１、第２、または第３の複数の標的捕捉試薬の各々は、固有の回収効率を有する。一部の実施形態では、少なくとも２つ、または３つ全ての複数の標的捕捉試薬は、異なる回収効率値を有する。例えば、回復効率の値は、以下のうちの１つ以上から選択される：
（ｉ）第１の回収効率は、少なくとも約５，０００×もしくはそれより高い配列決定深度である値を有し、例えば、第２または第３の回収効率の値より大きい（例えば、第２の回収効率の値より約５〜１０倍（例えば、６〜７倍）大きい；または第３の回収効率の値より約４０〜６０倍（例えば、４５〜５０倍）大きい）回収効率の値を有する；
（ｉｉ）第２の回収効率は、少なくとも約８００×もしくはそれより高い配列決定深度である値を有し、例えば、第３の回収効率の値より大きい（例えば、第３の回収効率の値より約５〜１０倍（例えば、７〜９倍）大きい）回収効率の値を有する；または
（ｉｉｉ）第３の回収効率は、少なくとも約１００×もしくはそれより高い配列深度である値を有する。
【０１５３】
ある種の実施形態では、回収効率の値は、異なる標的捕捉試薬の微分表現、標的捕捉試薬サブセットの微分重なり、微分標的捕捉試薬パラメータ、異なる標的捕捉試薬の混合、および／または異なるタイプの標的捕捉試薬の使用のうちの１つ以上によって修飾される。例えば、回収効率の変動（例えば、各標的捕捉試薬／標的カテゴリーの相対的な配列カバレッジ）は、例えば、複数の標的捕捉試薬内および／または異なる複数の標的捕捉試薬間で、以下のうちの１つ以上を変化することによって調整することができる：
（ｉ）異なる標的捕捉試薬の微分表現−所定の標的（例えば、標的核酸分子）を捕捉するための標的捕捉試薬設計は、相対的な標的配列決定深度を増大／低下させるために、より多く／より少ないコピー数に含めることができる；
（ｉｉ）標的捕捉試薬サブセットの微分重なり−所定の標的（例えば、標的核酸分子）を捕捉するための標的捕捉試薬設計は、相対的な標的配列決定深度を増大／減少させるために、隣接する標的捕捉試薬間のより長いまたはより短い重複を含むことができる；
（ｉｉｉ）微分標的捕捉試薬パラメータ−所定の標的（例えば、標的核酸分子）を捕捉するための標的捕捉試薬設計は、捕捉効率を低下させ、相対的な標的配列決定深度を低くするために、配列修飾／より短い長さを含むことができる；
（ｉｖ）異なる標的捕捉試薬の混合−異なる標的セットを捕捉するように設計された標的捕捉試薬は、異なるモル比で混合して、相対的な標的配列決定深度を増大／低下させることができる；
（ｖ）異なる修飾された標的捕捉試薬の混合−異なる基質結合特性を有するように修飾された標的捕捉試薬は、異なるモル比で混合されて、相対的な標的配列決定深度を増大／低下させることができる；
（ｖｉ）異なるタイプのオリゴヌクレオチド標的捕捉試薬の使用−ある種の実施形態では、標的捕捉試薬は、以下を含むことができる：
（ａ）１つ以上の化学的に（例えば、非酵素的に）合成された（例えば、個別に合成された）標的捕捉試薬、
（ｂ）アレイで合成された１つ以上の標的捕捉試薬、
（ｃ）１つ以上の酵素的に調製された、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写された標的捕捉試薬、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）のいずれかの組合せ、
（ｅ）１つ以上のＤＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、天然に存在するまたは天然に存在しないＤＮＡオリゴヌクレオチド）、
（ｆ）１つ以上のＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、天然に存在するまたは天然に存在しないＲＮＡオリゴヌクレオチド）、
（ｇ）（ｅ）と（ｆ）の組合せ、または
（ｈ）上記のいずれかの組合せ。
【０１５４】
異なるオリゴヌクレオチドの組合せは、異なる比、例えば、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：１０、１：２０、１：５０；１：１００、１：１０００などから選択される比で混合することができる。一実施形態では、化学合成された標的捕捉試薬の、アレイで生成された標的捕捉試薬に対する比は、１：５、１：１０、または１：２０から選択される。ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドは、天然に存在するかまたは天然に存在しないものであり得る。ある種の実施形態では、標的捕捉試薬は、例えば、融解温度を上昇させるために、１つ以上の天然に存在しないヌクレオチドを含む。例示的な天然に存在しないオリゴヌクレオチドは、修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドを含む。例示的な修飾されたヌクレオチド（例えば、修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡヌクレオチド）には、限定されないが、ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分が２’酸素および４’炭素を接続する余分な架橋で修飾されているロックド核酸（ＬＮＡ）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）、例えば、ペプチド結合によって連結された反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位で構成されるＰＮＡ；低ＧＣ領域を捕捉するように修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド；二環式核酸（ＢＮＡ）；架橋されたオリゴヌクレオチド；修飾された５−メチルデオキシチジン；および２，６−ジアミノプリンが含まれる。他の修飾されたＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドは、当該技術分野において公知である。
【０１５５】
ある種の実施形態では、標的配列（例えば、標的核酸分子）の実質的な均一または均質なカバレッジが得られる。例えば、各標的捕捉試薬／標的カテゴリー内では、カバレッジの均一性は、標的捕捉試薬パラメータを、例えば、以下のうちの１つ以上によって修正することにより最適化することができる：
（ｉ）標的捕捉試薬表現または重なりの増加／減少は、同じカテゴリーの他の標的と比較して過小／過剰にカバーされている標的（例えば、標的核酸分子）のカバレッジを増大／低下させるために使用することができる；
（ｉｉ）低いカバレッジについて、標的配列（例えば、ＧＣ含量の高い配列）を捕捉することが困難な場合、標的捕捉試薬で標的化される領域を拡大して、例えば、隣接配列（例えば、高ＧＣ隣接配列）をカバーする；
（ｉｉｉ）標的捕捉試薬配列の修飾は、標的捕捉試薬の二次構造を低下させ、その回収効率を増大させるために使用することができる；
（ｉｖ）標的捕捉試薬の長さの修飾は、同じカテゴリー内の異なる標的捕捉試薬の融解ハイブリダイゼーション動力学を等化するために使用することができる；標的捕捉試薬の長さは、直接的に（様々な長さを有する標的捕捉試薬を生成することによって）または間接的に（一定の長さの標的捕捉試薬を生成し、標的捕捉試薬の末端を任意の配列で置換することによって）修飾することができる；
（ｖ）同じ標的領域（すなわち、フォワード鎖およびリバース鎖）に対して異なる配向の標的捕捉試薬の修飾は、異なる結合効率を有することができる。各標的に対して最適なカバレッジを提供するいずれかの配向を有する標的捕捉試薬を選択することができる；
（ｖｉ）各標的捕捉試薬上に存在する結合実体、例えば、捕捉タグ（例えば、ビオチン）の量の修飾は、その結合効率に影響し得る。特定の標的を標的とする標的捕捉試薬のタグレベルの増加／減少は、相対的な標的カバレッジを増大／低下させるために使用することができる；
（ｖｉｉ）異なる標的捕捉試薬に使用されるヌクレオチドタイプの修飾は、標的に対する結合親和性に影響を及ぼし、相対的な標的カバレッジを増大／減少させるために使用することができる；または
（ｖｉｉｉ）修飾されたオリゴヌクレオチド標的捕捉試薬を用いることは、例えば、より安定な塩基ペアリングを有することは、高いＧＣ含量に対して低いまたは通常のＧＣ含量の領域間の融解ハイブリダイゼーション動態を等化するために使用することができる。
【０１５６】
他の実施形態では、回収効率は、結合対の機能的な第１のメンバーを含む標的捕捉試薬、および結合対の機能的な第１のメンバーを欠く標的捕捉試薬の相対的存在量を調整することによって調整される。一部の実施形態では、結合対の第１のメンバーは、基質上に配置された結合対の第２のメンバーに結合することができ、その結果、結合対の第１のメンバーを含む標的捕捉試薬によって捕捉された標的核酸分子が、結合対の第２のメンバーを含む基質によって回収される。
【０１５７】
ある実施形態では、本方法は、腫瘍核酸分子、例えば、腫瘍細胞からの対象間隔を含む核酸分子を選択する標的捕捉試薬を含む複数の標的捕捉試薬の使用を含む。腫瘍核酸分子は、腫瘍細胞中に存在する任意のヌクレオチド配列、例えば、本明細書に記載されるように、腫瘍細胞またはがん細胞中に存在する突然変異した、野生型、参照またはイントロンヌクレオチド配列であり得る。一実施形態では、腫瘍核酸分子は、低頻度で現れる変化（例えば、１つ以上の突然変異）を含み、例えば、試料からの約５％以下の細胞が、それらのゲノムに変化を担持する。他の実施形態では、腫瘍核酸分子は、試料からの細胞の約１０％の頻度で現れる変化（例えば、１つ以上の突然変異）を含む。他の実施形態では、腫瘍核酸分子は、イントロン配列、例えば、本明細書に記載されるイントロン配列、腫瘍細胞中に存在する参照配列からのサブゲノム間隔を含む。
【０１５８】
他の実施形態では、本方法は、（例えば、ＰＣＲによって）ライブラリーキャッチを増幅することを含む。他の実施形態では、ライブラリーキャッチは増幅されない。
【０１５９】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される標的捕捉試薬、および本明細書に記載される個々の複数の標的捕捉試薬の組合せを特徴とする。標的捕捉試薬は、場合により、指示書、標準、バッファーもしくは酵素、または他の試薬を含むことができるキットの一部であり得る。
【０１６０】
アライメント
【０１６１】
本明細書に開示される方法は、配列決定法における性能を最適化するために、特に、多数の多様な遺伝子における多数の多様な遺伝的事象の大規模並列配列決定に依存する方法、例えば、試料、例えば、本明細書に記載されるがん由来の試料を分析する方法における、多重の、個別に調整された、アラインメント法またはアルゴリズムの使用を統合することができる。
【０１６２】
一部の実施形態では、リードを分析するために使用されるアラインメント法は、異なる遺伝子における多数の変異体の各々に個別にカスタマイズされずまたは調整されない。一部の実施形態では、異なる遺伝子における多数の変異体の少なくともサブセットに個別にカスタマイズされるかまたは調整される多重アラインメント法を用いて、リードを分析する。一部の実施形態では、異なる遺伝子における多数の変異体の各々に個別にカスタマイズされるかまたは調整される多重アラインメント法を用いて、リードを分析する。一部の実施形態では、調整は、配列決定される（１つ以上の）遺伝子（または他の対象間隔）、試料中の腫瘍タイプ、配列決定される変異体、または試料もしくは対象の特徴の関数であり得る。配列決定される多数の対象間隔に個別に調整されるアライメント条件の選択または使用は、速度、感受性および特異性の最適化を可能にする。本方法は、比較的多数の多様な対象間隔についてのリードのアラインメントが最適化される場合に、特に効果的である。
【０１６３】
一部の実施形態では、Ｘ個の固有の対象間隔の各々からのリードは、固有のアラインメント法を用いて整列され、固有の対象間隔（例えば、対象間隔または発現された対象間隔）は、他のＸ−１個の対象間隔とは異なることを意味し、固有のアラインメント法は、他のＸ−１個のアラインメント法とは異なることを意味し、Ｘは少なくとも２である。
【０１６４】
ある実施形態では、少なくともＸ個の遺伝子、例えば、表１Ａ〜５Ａからの少なくともＸ個の遺伝子からの対象間隔は、固有のアラインメント法を用いて整列され、Ｘは、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００に等しいかまたはそれより大きい。
【０１６５】
ある実施形態では、方法は、リードを分析するための、例えば、整列するためのアラインメント法を選択するかまたは使用することを含み、前記アラインメント法は、
（ｉ）腫瘍タイプ、例えば、前記試料における腫瘍タイプ；
（ｉｉ）配列決定される対象間隔（例えば、対象間隔または発現された対象間隔）が位置する遺伝子または遺伝子タイプ、例えば、変異体もしくは変異体タイプ、例えば、突然変異によって、または頻度の突然変異によって特徴づけられる遺伝子または遺伝子タイプ；
（ｉｉｉ）分析される部位（例えば、ヌクレオチド位置）；
（ｉｖ）評価される対象間隔（例えば、対象間隔または発現された対象間隔）内の変異体タイプ、例えば、置換；
（ｖ）試料タイプ、例えば、本明細書に記載される試料；ならびに
（ｖｉ）評価される前記対象間隔内または近傍の配列、例えば、前記対象間隔（例えば、対象間隔または発現された対象間隔）に対するミスアラインメントの予測傾向、例えば、前記対象間隔（例えば、対象間隔または発現された対象間隔）内または近傍における反復配列の存在
のうちの１つ以上もしくは全部の関数であり、それに応答して選択され、またはそのために最適化される。
【０１６６】
本明細書の他の箇所で言及されるように、一部の実施形態では、比較的多数の対象間隔についてのリードのアラインメントが最適化される場合、本方法は特に効果的である。したがって、ある実施形態では、少なくともＸ個の固有のアラインメント法を用いて、少なくともＸ個の固有の対象間隔についてのリードを分析し、固有とは他のＸ−１とは異なることを意味し、Ｘが、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００に等しいかまたはそれより大きい。
【０１６７】
ある実施形態では、表１Ａ〜５Ａからの少なくともＸ個の遺伝子からの対象間隔を分析し、Ｘは２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００に等しいかまたはそれより大きい。
【０１６８】
ある実施形態では、固有のアラインメント法は、少なくとも３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、または５００個の異なる遺伝子の各々において対象間隔に適用される。
【０１６９】
ある実施形態では、少なくとも２０、３０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０または１８０、２００、３００、４００、または５００個の遺伝子、例えば、表１Ａ〜５Ａからの遺伝子におけるヌクレオチド位置が、ヌクレオチド値に割り当てられる。ある実施形態では、固有のアラインメント法は、分析された前記遺伝子のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％の各々において対象間隔に適用される。
【０１７０】
本明細書に開示される方法は、困難なリード、例えば、再配列を有するリードの迅速であり効率的なアラインメントを可能にする。したがって、対象間隔（例えば、対象間隔または発現された対象間隔）についてのリードが、再配列を伴うヌクレオチド位置、例えば転座を含む実施形態では、本方法は、適切に調整され、以下を含むアラインメント法を使用することを含むことができる：
リードを含むアラインメントについて再配列参照配列を選択し、前記再配列参照配列が、再配列（一部の実施形態では、参照配列はゲノム再配列と同一ではない）とともに整列させ；および
リードを前記再配列参照配列と比較する、例えば、整列させること
を含む。
【０１７１】
一部の実施形態では、異なる方法、例えば、別の方法を用いて、困難なリードを整列させる。これらの方法は、比較的多数の多様な対象間隔についてのリードのアラインメントが最適化される場合に特に効果的である。一例として、試料を分析する方法は、
第１のパラメータセット（例えば、第１のマッピングアルゴリズムまたは第１の参照配列）下でのリードの比較、例えば、アラインメント比較を行うこと、および
前記リードが第１のアラインメント基準を満たすかどうかを決定すること（例えば、リードが、例えば、ミスマッチ数未満である、前記第１の参照配列と整列させることができる）、
前記リードが第１のアラインメント基準を満たさない場合、第２のパラメータセット（例えば、第２のマッピングアルゴリズムまたは第２の参照配列）下で第２のアラインメント比較を行うこと；および
場合により、前記リードが前記第２の基準を満たすか否かを決定すること（例えば、リードが、所定数未満のミスマッチを有する前記第２の参照配列と整列させることができる）
を含むことができ、前記第２のパラメータセットは、パラメータセット、例えば、前記第１のパラメータセットと比較して、変異体、例えば、再配列、例えば、挿入、欠失、または転座についてのリードとのアラインメントをもたらす可能性がより高い、例えば、前記第２の参照配列の使用を含む。
【０１７２】
これらおよび他のアラインメント法は、本明細書の他の箇所で、例えば、発明の詳細な説明の「アラインメント」と題するセクションで、より詳細に検討される。そのモジュールの要素は、腫瘍を分析する方法に含めることができる。実施形態では、「アラインメント」（発明の概要および／または発明の詳細な説明）と題するセクションからのアラインメント法は、「突然変異コーリング」（発明の概要および／または発明の詳細な説明）と題するセクションからの突然変異コーリング法、ならびに／または「標的捕捉試薬」（発明の概要）と題するセクションおよび／もしくは「標的捕捉試薬の設計および構築」および「標的捕捉試薬の競合」（発明の詳細な説明）と題するセクションからの標的捕捉試薬と組み合わされる。本方法は、「遺伝子選択」（発明の概要および／または発明の詳細な説明）と題するセクションからの対象間隔セットに適用することができる。
【０１７３】
突然変異コーリング
【０１７４】
本明細書に開示される方法は、配列決定方法における性能を最適化するために、特に、例えば、試料、例えば、本明細書に記載されるがんに由来する多数の多様な遺伝子における、多数の多様な遺伝的事象の大規模な並行配列決定に依存する方法において、カスタマイズされたまたは調整された突然変異コーリングパラメータの使用を統合することができる。
【０１７５】
理論に拘束されることを望まないが、一部の実施形態では、突然変異コーリングは、観察される非参照変化、例えば、本明細書に記載される変化について、予想される確率を決定すると考えられる。突然変異コーリングは、典型的には、コールされた変化が実際であり、配列決定もしくは分析プロセスのノイズまたは他のアーチファクトの結果ではないという十分な信頼性を提供するために確立された閾値に基づく。
【０１７６】
一部の実施形態では、多数の対象間隔の各々についての突然変異コーリングは、個別にカスタマイズされずまたは微調整されない。一部の実施形態では、多数の対象間隔の少なくともサブセットについての突然変異コーリングは、個別に、カスタマイズされるかまたは微調整される。一部の実施形態では、多数の対象間隔の各々についての突然変異コーリングは、個別に、カスタマイズされるかまたは微調整される。カスタマイズまたは調整は、本明細書に記載される１つ以上の因子、例えば、試料中のがんタイプ、配列決定されるべき対象間隔が位置する遺伝子、または配列決定されるべき変異体に基づくことができる。この選択、または配列決定すべき多数の対象間隔に微調整されたアラインメント条件の使用は、速度、感受性および特異性の最適化を可能にする。本方法は、比較的多数の多様な対象間隔についてのリードのアラインメントが最適化される場合に特に効果的である。
【０１７７】
一部の実施形態では、ヌクレオチド値は、固有のコーリング法によって、Ｘ個の固有の対象間隔の各々におけるヌクレオチド位置に対して割り当てられ、固有の対象間隔は、他のＸ−１個の対象間隔（例えば、サブゲノム間隔、発現されたサブゲノム間隔、またはその両方）とは異なることを意味し、固有のコーリング法は、他のＸ−１個のコーリング法とは異なることを意味し、Ｘは少なくとも２である。コーリング法は異なることができ、それにより、例えば、異なるベイズの事前値に依存することによって、固有であり得る。
【０１７８】
ある実施形態では、前記ヌクレオチド値の割り当ては、変異体、例えば、腫瘍タイプにおける前記ヌクレオチド位置での突然変異を示すリードを観察するという、以前の（例えば、文献の）期待値であるかまたはそれを表す値の関数である。
【０１７９】
ある実施形態では、本方法は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００ヌクレオチド位置についてのヌクレオチド値（例えば、突然変異をコールするため）を割り当てることを含み、各割り当ては、変異体、例えば、突然変異を示すリードを、腫瘍タイプにおける前記ヌクレオチド位置で観察するという従来の（例えば、文献の）期待値であるかまたは表す固有の（他の割り当ての値とは対照的である）値の関数である。
【０１８０】
ある実施形態では、前記ヌクレオチド値を割り当てることは、変異体が試料中に、ある頻度（例えば、１％、５％、１０％など）で存在する場合、および／または変異体が存在しない場合（例えば、塩基コーリングエラーのみに起因するリードにおいて観察される場合）、前記ヌクレオチド位置で前記変異体を示すリードを観察する確率を表す値のセットの関数である。
【０１８１】
ある実施形態では、本明細書に記載される突然変異コーリング法は、以下を含むことができる：
Ｘ個の対象間隔の各々におけるヌクレオチド位置の獲得：
（ｉ）Ｘ型腫瘍における前記ヌクレオチド位置で変異体、例えば、突然変異を示すリードを観察するという、以前の（例えば、文献の）期待値であるまたはそれを表す第１の値；
（ｉｉ）変異体が、ある頻度（例えば、１％、５％、１０％など）で試料中に存在する場合、および／または変異体が存在しない場合（例えば、塩基コーリングエラーのみに起因するリードにおいて観察される場合）、前記ヌクレオチド位置で前記変異体を示すリードを観察する確率を表す第２の値のセット；
前記値に応答して、例えば、本明細書に記載されるベイズ法によって、第１の値を用いた第２のセットにおける値間での比較を検討すること（例えば、突然変異の存在の事後確率を計算すること）によって、前記ヌクレオチド位置の各々についての前記リードからヌクレオチド値を割り当て（例えば、突然変異をコールし）、それによって前記試料を分析すること。
【０１８２】
ある実施形態では、本方法は、以下のうちの１つ以上または全てを含む：
（ｉ）少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００ヌクレオチド位置についてヌクレオチド値を割り当て（例えば、突然変異をコールし）、各割り当ては、固有の（他の割り当てとは対照的である）第１および／または第２の値に基づき；
（ｉｉ）（ｉ）の方法の割り当てであって、割り当ての少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、または５００は、変異体が、例えば、腫瘍タイプの細胞の５％未満、１０％未満または２０％未満に存在する確率の関数である第１の値を用いて行われる割り当て；
（ｉｉｉ）少なくともＸ個のヌクレオチド位置についてのヌクレオチド値を割り当てる（例えば、突然変異をコール）し、その各々が、腫瘍タイプ、例えば、前記試料の腫瘍タイプに存在する固有の（他のＸ−１個の割り当てと対照的である）確率を有する変異体と関連し、場合により、前記Ｘ個の割り当ての各々は、第１および／または第２の値（Ｘ＝２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、または５００）に基づき；
（ｉｖ）第１および第２のヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当て（例えば、突然変異をコールし）、前記第１のヌクレオチド位置における第１の変異体が腫瘍タイプ（例えば、前記試料の腫瘍タイプ）中に存在する可能性が、前記第２のヌクレオチド位置における第２の変異体が存在する可能性よりも、少なくとも２、５、１０、２０、３０、または４０倍高く、場合により、各割り当ては、固有の（他の割り当てに対照的である）第１および／または第２の値に基づき；
（ｖ）複数のヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当て（例えば、突然変異をコールし）、前記複数は、以下の確立パーセンテージ範囲：０．０１％未満またはそれに等しい；０．０１％より大きく、０．０２％未満またはそれに等しい；０．０２％より大きく、０．０３％未満またはそれに等しい；０．０３％より大きく、０．０４％未満またはそれに等しい；０．０４％より大きく、０．０５％未満またはそれに等しい；０．０５％より大きく、０．１％未満またはそれに等しい；０．１％より大きく、０．２％未満またはそれに等しい；０．２％より大きく、０．５％未満またはそれに等しい；０．５％より大きく、１．０％未満またはそれに等しい；１．０％より大きく、２．０％未満またはそれに等しい；２．０％より大きく、５．０％未満またはそれに等しい；５．０％より大きく、１０．０％未満またはそれに等しい；１０．０％より大きく、２０．０％未満またはそれに等しい；２０．０％より大きく、５０．０％未満またはそれに等しい；および５０％より大きく、１００．０％未満またはそれに等しい、のうちの１つ以上、例えば、少なくとも３、４、５、６、７、または全てに分類する変異体についての割り当てを含み、
確率範囲は、ヌクレオチド位置における変異体が腫瘍タイプ（例えば、前記試料の腫瘍タイプ）中に存在する確率の範囲、またはヌクレオチド位置における変異体が、予め選択されたタイプ（例えば、前記試料の腫瘍タイプ）について、試料中の細胞、試料からのライブラリー、またはそのライブラリーからのライブラリーキャッチの列挙されたパーセンテージ（％）で存在する確率の範囲であり、
場合により、各割り当ては、固有の第１および／または第２の値（例えば、列挙された確率範囲内の他の割り当てとは対照的である固有、または他の列挙された確率範囲の１つ以上もしくは全部についての第１および／または第２の値とは対照的である固有）に基づき；
（ｖｉ）少なくとも１、２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、９００、または１，０００ヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当て（例えば、突然変異をコールし）、各々は、独立して、前記試料中に５０％、４０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、または０．１％未満のＤＮＡに存在する変異体を有し、場合により、各々の割り当ては、固有の（他の割り当てに対称的である）第１および／または第２の値に基づき；
（ｖｉｉ）第１および第２のヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当て（例えば、突然変異をコールし）、前記試料のＤＮＡの第１の位置における変異体の可能性は、前記試料のＤＮＡの前記第２のヌクレオチド位置における変異体の可能性よりも、少なくとも２、５、１０、２０、３０、または４０倍高く、場合により、各々の割り当ては、固有の（他の割り当てに対照的である）第１および／または第２の値に基づき；
（ｖｉｉｉ）以下のうちの１つ以上または全部においてヌクレオチド値を割り当てる（例えば、突然変異をコールする）こと：
（１）前記試料からのライブラリー中の核酸、またはそのライブラリーからのライブラリーキャッチ中の核酸の、前記試料中の１％未満の細胞に存在する変異体を有する少なくとも１、２、３、４または５ヌクレオチド位置；
（２）前記試料からのライブラリー中の核酸、またはそのライブラリーからのライブラリーキャッチ中の核酸の、前記試料中の１〜２％の細胞に存在する変異体を有する少なくとも１、２、３、４または５ヌクレオチド位置；
（３）前記試料からのライブラリー中の核酸、またはそのライブラリーからのライブラリーキャッチ中の核酸の、前記試料中の２％より大きく、３％未満またはそれに等しい細胞に存在する変異体を有する少なくとも１、２、３、４または５ヌクレオチド位置；
（４）前記試料からのライブラリー中の核酸、またはそのライブラリーからのライブラリーキャッチ中の核酸の、前記試料中の３％より大きく、４％未満またはそれに等しい細胞に存在する変異体を有する少なくとも１、２、３、４または５ヌクレオチド位置；
（５）前記試料からのライブラリー中の核酸、またはそのライブラリーからのライブラリーキャッチ中の核酸の、前記試料中の４％より大きく、５％未満またはそれに等しい細胞に存在する変異体を有する少なくとも１、２、３、４または５ヌクレオチド位置；
（６）前記試料からのライブラリー中の核酸、またはそのライブラリーからのライブラリーキャッチ中の核酸の、前記試料中の５％より大きく、１０％未満またはそれに等しい細胞に存在する変異体を有する少なくとも１、２、３、４または５ヌクレオチド位置；
（７）前記試料からのライブラリー中の核酸、またはそのライブラリーからのライブラリーキャッチ中の核酸の、前記試料中の１０％より大きく、２０％未満またはそれに等しい細胞に存在する変異体を有する少なくとも１、２、３、４または５ヌクレオチド位置；
（８）前記試料からのライブラリー中の核酸、またはそのライブラリーからのライブラリーキャッチ中の核酸の、前記試料中の２０％より大きく、４０％未満またはそれに等しい細胞に存在する変異体を有する少なくとも１、２、３、４または５ヌクレオチド位置；
（９）前記試料からのライブラリー中の核酸、またはそのライブラリーからのライブラリーキャッチ中の核酸の、前記試料中の４０％より大きく、５０％未満またはそれに等しい細胞に存在する変異体を有する少なくとも１、２、３、４または５ヌクレオチド位置；
（１０）前記試料からのライブラリー中の核酸、またはそのライブラリーからのライブラリーキャッチ中の核酸の、前記試料中の５０％より大きく、１００％未満またはそれに等しい細胞に存在する変異体を有する少なくとも１、２、３、４または５ヌクレオチド位置；
場合により、各々の割り当ては、固有の第１および／または第２の値（例えば、列挙された範囲（例えば、１％未満の（１）の範囲）における他の割り当てとは対照的に固有であるか、または他の列挙された範囲の１つ以上もしくは全部における決定についての第１および／または第２の値とは対照的に固有である）に基づく；あるいは
（ｉｘ）Ｘ個のヌクレオチド位置の各々にヌクレオチド値を割り当て（例えば、突然変異をコールし）、各ヌクレオチド位置は、独立して、他のＸ−１個のヌクレオチド位置における変異体の可能性と比較して固有である可能性（変異体が前記試料のＤＮＡ中に存在する可能性）を有し、Ｘは、１、２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００に等しいかまたはそれより大きく、各割り当ては、固有の（他の割り当てとは対照的である）第１および／または第２の値に基づく。
【０１８３】
一部の実施形態では、「閾値」は、リードを評価するために使用され、リードから、例えば、遺伝子の特定の位置で突然変異をコールするヌクレオチド位置の値を選択する。一部の実施形態では、多数の対象間隔の各々についての閾値はカスタマイズまたは微調整される。カスタマイズまたは調整は、本明細書に記載される１つ以上の因子、例えば、試料中のがんタイプ、配列決定される対象間隔（サブゲノム間隔または発現されたサブゲノム間隔）が位置する遺伝子、または配列決定される変異体に基づくことができる。これは、配列決定されるべき多数の対象間隔の各々に微調整されるコーリングを提供する。一部の実施形態では、本方法は、比較的多数の多様なサブゲノム間隔が分析される場合に特に効果的である。
【０１８４】
したがって、別の実施形態では、本方法は、以下の突然変異コーリング法を含む：
Ｘ個の対象間隔の各々について、閾値を取得し、前記取得されたＸ個の閾値の各々は、他のＸ−１個の閾値と比較して固有であり、それにより、Ｘ個の固有の閾値を提供し；
前記Ｘ個の対象間隔の各々について、ヌクレオチド位置におけるヌクレオチド値を有するリード回数の関数である観察値をその固有の閾値と比較し、それにより、前記Ｘ個の対象間隔の各々にその固有の閾値を適用し；
場合により、前記比較の結果に応答して、ヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当て、
Ｘは、２に等しいかまたはそれより大きい。
【０１８５】
ある実施形態では、本方法は、ヌクレオチド値を、少なくとも２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００ヌクレオチド位置に割り当てることを含み、各々は、独立して、０．５、０．４、０．２５、０．１５、０．１０、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、または０．０１未満である確率の関数である第１の値を有する。
【０１８６】
ある実施形態では、本方法は、少なくともＸ個のヌクレオチド位置の各々にヌクレオチド値を割り当てることを含み、各々は、独立して、他のＸ−１個の第１の値と比較して固有である第１の値を有し、前記Ｘ個の第１の値の各々は、０．５、０．４、０．２５、０．１５、０．１０、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、または０．０１未満の確率の関数であり、Ｘは、１、２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００に等しいかまたはそれより大きい。
【０１８７】
ある実施形態では、少なくとも２０、３０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０または１８０、２００、３００、４００または５００個の遺伝子、例えば、表１Ａ〜５Ａからの遺伝子におけるヌクレオチド位置がヌクレオチド値に割り当てられる。ある実施形態では、固有の第１および／または第２の値は、分析された前記遺伝子の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％の各々において対象間隔に適用される。
【０１８８】
本方法の実施形態は、例えば、以下の実施形態から分かるように、比較的多数の対象間隔の閾値が最適化される場合に適用することができる。
【０１８９】
ある実施形態では、固有の閾値は、対象間隔、例えば、サブゲノム間隔、または発現されたサブゲノム間隔に、少なくとも３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００個の異なる遺伝子の各々において適用される。
【０１９０】
ある実施形態では、少なくとも２０、３０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０または１８０、２００、３００、４００または５００個の遺伝子、例えば表１Ａ〜５Ａからの遺伝子におけるヌクレオチド位置がヌクレオチド値に割り当てられる。ある実施形態では、固有の閾値は、分析された前記遺伝子の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％の各々においてサブゲノム間隔に適用される。
【０１９１】
ある実施形態では、表１Ａ〜５Ａからの少なくとも５、１０、２０、３０、または４０個の遺伝子におけるヌクレオチド位置は、ヌクレオチド値に割り当てられる。ある実施形態では、固有の閾値は、分析された前記遺伝子の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％の各々における対象間隔（例えば、サブゲノム間隔または発現されたサブゲノム間隔）に適用される。
【０１９２】
これらおよび他の突然変異コーリング法は、本明細書の他の箇所、例えば、「突然変異コーリング」と題するセクションでより詳細に検討される。そのモジュールの要素は、腫瘍を分析する方法に含めることができる。ある実施形態では、「突然変異コーリング」と題するセクションからのアライメント法は、「アライメント」（発明の概要および／または発明の詳細な説明）と題するセクションからのアラインメント法、および／また「標的捕捉試薬」（発明の概要）と題するセクションおよび／または「標的捕捉試薬の設計および構築」と「標的捕捉試薬の競合」（発明の詳細な説明）と題するセクションからの標的捕捉試薬と組み合わせられる。本方法は、「遺伝子選択」（発明の概要および／または発明の詳細な説明）と題するセクションからの対象間隔セットに適用することができる。
【０１９３】
ＳＧＺ分析
【０１９４】
ある種の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って評価される変化は、生殖系列変化である。ある種の実施形態では、生殖系列変化は、ＳＧＺアルゴリズム（例えば、Ｓｕｎら、ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．２０１８年；１４（２）：ｅ１００５９６５、および米国特許第９，７９２，４０３号に記載される）によって同定される。例えば、腫瘍遺伝子変異量を評価する場合、ＳＧＺアルゴリズムの使用を含む方法またはシステムによって、生殖系列変化を除外することができる。
【０１９５】
ある種の実施形態では、本方法は、対象由来の試料中の変異体を、体細胞性事象または生殖系列事象であるとして特徴づけることをさらに含み、本方法は、以下を含む：
ａ）複数の選択された対象間隔の各々、複数の選択された生殖系列ＳＮＰの各々、および変異体を配列決定し；
ｂ）以下：
ｉ）複数の選択された対象間隔の各々について、選択された対象間隔で正規化された配列カバレッジの値を含む配列カバレッジ入力（ＳＣＩ）であって、ＳＣＩは、対象間隔についてのリード数と、プロセス合致した対照についてのリード数との比較を含むＳＣＩ；
ｉｉ）複数の選択された生殖系列ＳＮＰの各々について、試料中のマイナー対立遺伝子頻度の値を含む、ＳＮＰ対立遺伝子頻度入力（ＳＡＦＩ）；および
ｉｉｉ）特徴づけられる前記変異体については、試料中の前記変異体の対立遺伝子頻度を含む変異体対立遺伝子頻度入力（ＶＡＦＩ）
を取得し；
ｃ）ＳＣＩとＳＡＦＩの関数として、
複数のゲノムセグメントの各々に対するゲノムセグメントの全コピー数（Ｃ）；
複数のゲノムセグメントの各々に対するゲノムセグメントマイナー対立遺伝子コピー数（Ｍ）；および
試料純度（ｐ）
についての値を取得し、ＳＣＩ、ＳＡＦＩ、Ｃ、Ｍ、ｐは、次のように互いに関連付けられる：
2021526825.tif 000002
ＳＣＩおよびＳＡＦＩをそれぞれｒｉｊおよびｆｉｋと表記する場合、
ｒｉｊはゲノムセグメント（Ｓｉ）内の対象間隔ｊの対数比（ＬＲ）であり、ＣｉはＳｉの全コピー数（Ｃ）であり、ｌｉはＳｉの長さであり、ｆｉｋはＳｉ内のＳＮＰ  ｋのマイナー対立遺伝子頻度であり、ＭｉはＳｉにおけるマイナー対立遺伝子（Ｍ）のコピー数であり、ならびにσｒｉおよびσｆｉはノイズパラメータであり；
ｄ）、変異体が体細胞性、サブクローン性体細胞性変異体、生殖系列、または識別不能であることを示す、突然変異タイプの値ｇを取得し、ｇ、ＶＡＦＩ、ｐ、Ｃ、およびＭは、以下により互いに関連付けられる。
2021526825.tif 000003
【０１９６】
一部の実施形態では、０であるかまたは０に近いｇの値は、変異体が体細胞性変異体であることを示し；１であるかまたは１に近いｇの値は、変異体が生殖系列変異体であることを示し；１未満であるが０を超えるｇの値は、識別不能な結果を示し；有意に０未満であるｇの値は、変異体がサブクローン性体細胞性変異体であることを示す。
【０１９７】
一部の実施形態では、試料純度（ｐ）は、全体的な純度値である。
【０１９８】
一部の実施形態では、Ｍの値が０に等しく、Ｃに等しくないことは、変異体の不存在を示し；Ｍの非ゼロ値がＣに等しいことは、変異体のホモ接合型を示し；Ｍの値が０に等しく、Ｃに等しいことは、変異体のホモ接合性の欠失を示し；Ｍの非ゼロ値がＣに等しくないことは、変異体のヘテロ接合性を示す。
【０１９９】
一部の実施形態では、複数の選択された対象間隔は、エクソンを含む。一部の実施形態では、変異体は、対象に存在する腫瘍タイプと正に関連する。一部の実施形態では、本方法は、試料中の変異体の接合性の指標を取得することをさらに含む。一部の実施形態では、突然変異型の値ｇは、対象が合致した正常対照を使用することなく取得される。一部の実施形態では、正規化前の平均配列決定深度は、少なくとも約１００×、２５０×、５００×、８００×、１，０００×、１，５００×、２，０００×、２，５００×、３，０００×、３，５００×、４，０００×、４，５００×、５，０００×、５，５００×、６，０００×、６，５００×、７，０００×、７，５００×、または８，０００×である。
【０２００】
腫瘍遺伝子変異量
【０２０１】
本明細書に記載される方法および組成物は、腫瘍遺伝子変異量を評価するために使用することができる。
【０２０２】
ある種の実施形態では、本方法は、試料（例えば、本明細書に記載される試料）からのサブゲノム間隔セットの配列を提供すること；および突然変異量荷の値を決定することを含み、その値は、サブゲノム間隔セットにおける変化の数の関数である。ある種の実施形態では、サブゲノム間隔セットは、遺伝子セット、例えば、全ゲノムまたはエクソームを含まない遺伝子セットからのものである。ある種の実施形態では、サブゲノム間隔セットは、コーディングサブゲノム間隔セットである。他の実施形態では、サブゲノム間隔セットは、１つ以上のコーディングサブゲノム間隔および１つ以上の非コーディングサブゲノム間隔を含む。ある種の実施形態では、突然変異量の値は、サブゲノム間隔セットにおける変化（例えば、体細胞性変化）の数の関数である。ある種の実施形態では、変化の数は、機能的変化、生殖系列変異、またはその両方の数を除外する。
【０２０３】
本明細書に記載される方法はまた、例えば、試料からの複数の腫瘍核酸分子を含むライブラリーを取得すること；ライブラリーを標的捕捉試薬と接触させて、ハイブリダイゼーションにより選択された腫瘍核酸分子を提供し、それによりライブラリーキャッチを提供すること；ライブラリーキャッチから腫瘍核酸分子からの変化を含むサブゲノム間隔についてのリードを取得すること；アラインメント法によりリードを整列させること；ヌクレオチド位置についてのリードからヌクレオチド値を割り当てること；および割り当てられたヌクレオチド位置セットからサブゲノム間隔セットを選択すること（ここで、サブゲノム間隔セットは、遺伝子セット由来である）のうちの１つ以上を含むことができる。
【０２０４】
ある種の実施形態では、突然変異量は、対象、例えば、本明細書に記載される対象由来の試料において測定される。ある種の実施形態では、突然変異量は、百分位として、例えば、参照集団からの試料における突然変異量の間で表される。ある種の実施形態では、参照集団は、対象と同じタイプのがんを有する患者を含む。他の実施形態では、参照集団は、対象と同じタイプの治療を受けているか、または受けたことがある患者を含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載される方法によって、例えば、表１Ａ〜５Ａに示される遺伝子セットにおける変化（例えば、体細胞性変化）のレベルを評価することによって得られる突然変異量は、全ゲノムまたはエクソーム突然変異量と相関する。
【０２０５】
変化のタイプ
【０２０６】
種々の変化（例えば、体細胞性変化）タイプは、本明細書に記載される方法またはシステムにおいて、ゲノム変化の分析のために評価および使用することができる。例えば、がんおよび／または腫瘍遺伝子変異量に関連するゲノム変化を分析することができる。理論に拘束されることを望まないが、一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、低い腫瘍含有量および／または低い量の腫瘍核酸を含む試料を分析するのに有用であると考えられる。
【０２０７】
体細胞性変化
【０２０８】
ある種の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って評価される変化は、体細胞性変化である。
【０２０９】
ある種の実施形態では、変化（例えば、体細胞性変化）は、コーディング短鎖変異体、例えば、塩基置換またはインデル（挿入または欠失）である。ある種の実施形態では、変化（例えば、体細胞性変化）は、点突然変異である。他の実施形態では、変化（例えば、体細胞性変化）は、再配列以外のもの、例えば、転座以外のものである。ある種の実施形態では、変化（例えば、体細胞性変化）は、スプライス変異体である。
【０２１０】
ある種の実施形態では、変化（例えば、体細胞性変化）は、サイレント突然変異、例えば、同義置換である。他の実施形態では、変化（例えば、体細胞性変化）は、非同義の一塩基変異体（ＳＮＶ）である。他の実施形態では、変化（例えば、体細胞性変化）は、パッセンジャー突然変異、例えば、細胞クローンの適応度に検出可能な影響がない変化である。ある種の実施形態では、変化（例えば、体細胞性変化）は、意義不明の変異体（ＶＵＳ）であり、例えば、変化であって、その病原性が確認され得ず、または除外され得ない。ある種の実施形態では、変化（例えば、体細胞性変化）は、がん表現型と関連するものとして同定されていない。
【０２１１】
ある種の実施形態では、変化（例えば、体細胞性変化）は、細胞分裂、増殖または生存における影響と関連しないかまたは関連することが知られていない。他の実施形態では、変化（例えば、体細胞性変化）は、細胞分裂、増殖または生存における影響と関連する。
【０２１２】
ある種の実施形態では、体細胞性変化の増加レベルは、体細胞性変化（例えば、再配列、点突然変異、インデル、またはそれらの任意の組合せ）のうちの１つ以上のクラスまたはタイプの増加レベルである。ある種の実施形態では、体細胞性変化の増加レベルは、１つのクラスまたはタイプの体細胞性変化の増加レベル（例えば、再配列のみ、点突然変異のみ、またはインデルのみ）である。ある種の実施形態では、体細胞性変化の増加レベルは、ある位置（例えば、ヌクレオチド位置、例えば、１つ以上のヌクレオチド位置）、またはある領域（例えば、ヌクレオチド領域、例えば、１つ以上のヌクレオチド領域）における体細胞性変化の増加レベルである。ある種の実施形態では、体細胞性変化の増加レベルは、体細胞性変化（例えば、本明細書に記載される体細胞性変化）の増加レベルである。
【０２１３】
機能的変化
【０２１４】
ある種の実施形態では、変化（例えば、体細胞性変化）は、サブゲノム間隔における機能的変化である。他の実施形態では、変化（例えば、体細胞性変化）は、サブゲノム間隔における公知の機能的変化ではない。例えば、腫瘍遺伝子変異量を評価する場合、変化（例えば、体細胞性変化）の数は、１つ以上の機能的変化を除外することができる。
【０２１５】
一部の実施形態では、機能的変化は、参照配列、例えば、野生型または非突然変異配列と比較して、細胞分裂、増殖または生存に影響を及ぼす変化、例えば、細胞分裂、増殖または生存を促進する変化である。ある種の実施形態では、機能的変化は、機能的変化のデータベース、例えば、ＣＯＳＭＩＣデータベース（ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｏｓｍｉｃ；Ｆｏｒｂｅｓら  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１５年；４３巻（Ｄ１）：Ｄ８０５−Ｄ８１１）に含めることによって同定される。他の実施形態では、機能的変化は、公知の機能的状態を有する変化であり、例えば、ＣＯＳＭＩＣデータベースにおける公知の体細胞性変化として生じる変化である。ある種の実施形態では、機能的変化は、可能性のある機能的状態、例えば、腫瘍抑制遺伝子におけるトランケーションを伴う変化である。ある種の実施形態では、機能的変化は、ドライバー突然変異であり、例えば、細胞生存または複製を増加させることによって、その微小環境におけるクローンに選択的利点を与える変化などである。他の実施形態では、機能的変化は、クローン性拡大を引き起こすことができる変化である。ある種の実施形態では、機能的変化は、（ａ）増殖シグナルにおける自己充足性；（ｂ）抗増殖シグナルに対する減少した、例えば非感受性；（ｃ）減少したアポトーシス；（ｄ）増加した複製可能性；（ｅ）持続した血管新生；または（ｆ）組織浸潤もしくは転移のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全てを引き起こすことができる変化である。
【０２１６】
ある種の実施形態では、機能的変化は、パッセンジャー突然変異ではなく、例えば、細胞クローンの適応度において検出可能な影響がない変化はない。ある種の実施形態では、機能的変化は、意義不明の変異体（ＶＵＳ）ではなく、例えば、変化ではなく、その病原性は、確認され得ず、除外され得ない。
【０２１７】
ある種の実施形態では、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子における複数（例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上）の機能的変化が除外される。ある種の実施形態では、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子における全ての機能的変化が除外される。ある種の実施形態では、表１Ａ〜５Ａに記載される複数の遺伝子における複数の機能的変化が除外される。ある種の実施形態では、表１Ａ〜５Ａに記載される全ての遺伝子における全ての機能的変化が除外される。
【０２１８】
生殖系列変化
【０２１９】
一部の実施形態では、変化は生殖系列変化である。他の実施形態では、変化は生殖系列変化ではない。一部の実施形態では、変化は、例えば、生殖系列変化と同一ではなく、または類似ではなく、例えば、それと区別される。例えば、腫瘍遺伝子変異量を評価する場合、変化の数は生殖系列変化の数を除外することができる。
【０２２０】
ある種の実施形態では、生殖系列変化は、一塩基多型（ＳＮＰ）、塩基置換、インデル（例えば、挿入または欠失）、またはサイレント変化（例えば、同義変化）である。
【０２２１】
ある種の実施形態では、生殖系列変化は、合致する正常な配列との比較を使用しない方法の使用によって同定される。他の実施形態では、生殖系列変化は、ＳＧＺアルゴリズムの使用を含む方法によって同定される。ある種の実施形態では、生殖系列変化は、生殖系列変化のデータベース、例えば、ｄｂＳＮＰデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；Ｓｈｅｒｒｙら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００１年；２９巻（１号）：３０８−３１１頁）に含めることによって同定される。他の実施形態では、生殖系列変化は、例えば、ＥｘＡＣデータベース（ｅｘａｃ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ；Ｅｘｏｍｅ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍら、「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ６０，７０６  ｈｕｍａｎｓ」、ｂｉｏＲｘｉｖ  ｐｒｅｐｒｉｎｔ．２０１５年１０月３０日）の２つ以上のカウントに含めることによって同定される。一部の実施形態では、生殖系列変化は、例えば、１０００ゲノムプロジェクトデータベース（ｗｗｗ．１０００ｇｅｎｏｍｅｓ．ｏｒｇ；ＭｃＶｅａｎら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１２年；４９１巻、５６−６５頁）に含めることによって同定される。一部の実施形態では、生殖系列変化は、例えば、ＥＳＰデータベース（Ｅｘｏｍｅ  Ｖａｒｉａｎｔ  Ｓｅｒｖｅｒ、ＮＨＬＢＩ  ＧＯ  Ｅｘｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＥＳＰ）、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）（ｅｖｓ．ｇｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ＥＶＳ／）に含めることによって同定される。
【０２２２】
遺伝子選択
【０２２３】
対象間隔、例えば、サブゲノム間隔、発現されたサブゲノム間隔、またはその両方、分析用に、例えば、遺伝子および他の領域のセットまたはグループについてのサブゲノム間隔のグループまたはセットは、本明細書に記載される。
【０２２４】
一部の実施形態では、本方法は、例えば、次世代シークエンシング法によって、取得された核酸試料からの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、もしくはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物からの対象間隔を配列決定することを含み、遺伝子は表１Ａ〜５Ａから選択される。
【０２２５】
一部の実施形態では、本方法は、例えば、次世代シークエンシング法によって、試料からの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００個、もしくはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物からの対象間隔を配列決定することを含み、遺伝子は表１Ａ〜５Ａから選択される。
【０２２６】
別の実施形態では、以下のセットまたはグループのうちの１つの対象間隔が分析される。例えば、腫瘍またはがん遺伝子もしくは遺伝子産物と関連する対象間隔、および参照（例えば、野生型）遺伝子または遺伝子産物は、試料からのサブゲノム間隔のグループまたはセットを提供することができる。
【０２２７】
ある実施形態では、本方法は、リード、例えば、配列、試料からの対象間隔セットを取得し、対象間隔は、以下のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７個または全てから選択され：
Ａ）表１Ａ〜５Ａによる突然変異または野生型遺伝子からの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００個、またはそれ以上の対象間隔、例えば、サブゲノム間隔、もしくは発現されたサブゲノム間隔、またはその両方；
Ｂ）少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００個、またはそれ以上の、腫瘍もしくはがんに関連する遺伝子または遺伝子産物からの対象間隔（例えば、陽性もしくは陰性の治療反応予測因子であるか、腫瘍もしくはがんの陽性または陰性の予後因子であるか、あるいは、腫瘍もしくはがんの、例えば表１Ａ〜５Ａによる遺伝子の鑑別診断を可能にする）；
Ｃ）表１Ａ〜５Ａから選択される遺伝子に存在するサブゲノム間隔の突然変異したまたは野生型の遺伝子もしくは遺伝子産物（例えば、一塩基多型（ＳＮＰ））からの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、またはそれ以上の対象間隔；
（Ｄ）（ｉ）薬物で治療されたがん患者のより良好な生存（例えば、パクリタキセルで治療された乳がん患者のより良好な生存）；（ｉｉ）パクリタキセル代謝；（ｉｉｉ）薬物に対する毒性；または（ｉｖ）薬物に対する副作用のうちの１つ以上と関連する、表１Ａ〜５Ａから選択される遺伝子に存在する対象間隔の突然変異したまたは野生型の遺伝子（例えば、一塩基多型（ＳＮＰ））からの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００個、またはそれ以上の対象間隔；
Ｅ）表１Ａ〜５Ａによる少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００個、またはそれ以上の遺伝子もしくは遺伝子産物を伴う複数の転座変化；
Ｆ）表１Ａ〜５Ａから選択される少なくとも５つの遺伝子であって、例えば、ある位置における対立遺伝子変動は腫瘍タイプと関連し、前記対立遺伝子変動は、前記腫瘍タイプの細胞の５％未満に存在する遺伝子；
Ｇ）表１Ａ〜５Ａから選択され、高ＧＣ領域に埋め込まれている少なくとも５つの遺伝子；あるいは
Ｈ）がん発生の遺伝的（例えば、生殖系列リスク）因子を示す少なくとも５つの遺伝子（例えば、遺伝子または遺伝子産物は表１Ａ〜５Ａから選択される）。
【０２２８】
さらに別の実施形態では、本方法は、試料から対象間隔セットについてのリード、例えば、配列を取得し、対象間隔は、表１Ａ〜１Ｃに記載される遺伝子の５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００個、または全てから選択される。
【０２２９】
さらに別の実施形態では、本方法は、試料から対象間隔セットについてのリード、例えば、配列を取得し、対象間隔は、表２Ａ〜２Ｂに記載される遺伝子の５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０個、または全てから選択される。
【０２３０】
さらに別の実施形態では、本方法は、試料から対象間隔セットについてのリード、例えば、配列を取得し、対象間隔は、表３Ａ〜３Ｃに記載される遺伝子の５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００個、または全てから選択される。
【０２３１】
さらに別の実施形態では、本方法は、試料から対象間隔セットについてのリード、例えば、配列を取得し、対象間隔は、表４Ａ〜４Ｂに記載される遺伝子の５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０個、または全てから選択される。
【０２３２】
サブゲノム間隔のこれらおよび他のセットおよびグループは、本明細書の他の箇所、例えば、「遺伝子選択」（概要および／または発明の詳細な説明）と題されるセクションにおいてより詳細に検討される。
【０２３３】
用途
【０２３４】
本明細書に開示される方法は、最適化された標的捕捉試薬（例えば、ベイト）ベースの選択、最適化されたアラインメント、および最適化された突然変異コーリングを含む、例えば、ゲノムのがん関連セグメントに適用されるような、多数の最適化された要素の統合を可能にする。本明細書に記載される方法は、がんごと、遺伝子ごとおよび部位ごとを基準に最適化され得る腫瘍のＮＧＳに基づく分析を提供する。これは、例えば、本明細書に記載される遺伝子／部位および腫瘍タイプに適用することができる。本方法は、所定の配列決定技術を用いて突然変異検出の感受性および特異性のレベルを最適化する。がんごと、遺伝子ごと、部位ごとの最適化は、臨床製品に不可欠な感受性／特異性の非常に高いレベル（例えば、両方とも９９％を超える）を提供する。
【０２３５】
理論に拘束されることを望まないが、一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、選択されたゲノム領域の検出における感受性の増加から恩恵を受ける一般的な配列決定応用に適用することができると考えられる。例えば、これらの用途には、限定されないが、有病率に基づいてカバレッジが増加した遺伝性がんパネル、特定の疾患経路を標的とした他の全エクソームシークエンシング（ＷＥＳ）検査、および実施可能な局所事象の候補の濃縮を伴う出生前検査が含まれる。
【０２３６】
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、例えば、変化タイプまたは分析の目的に基づいて、１つ以上のサブゲノム間隔についての配列決定深度を調節する（例えば、調整または最適化する）ために使用することができる。例えば、高感受性の体細胞性突然変異コーリングは、高い配列決定深度を必要とし得、腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）の評価は、中等度の配列決定深度を必要し得る。一部の実施形態では、少数のサブゲノム間隔をより高い配列決定深度まで配列決定し（例えば、体細胞性突然変異を分析するためである）、多数のサブゲノム間隔をより低い配列決定深度まで配列決定する（例えば、ＴＭＢを評価するためである）。
【０２３７】
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、組み合わせた生殖系列および体細胞性突然変異コーリングに使用することができる。例えば、体細胞性突然変異コーリングに（例えば、コーリングの感受性を高めるために）、高い配列決定の深度を必要とし得るが、生殖系列突然変異コーリングには必要ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載される標的捕捉試薬（例えば、ベイト）は、体細胞性突然変異に関連する対象間隔の回復を増加させ、生殖系列突然変異に関連する対象間隔の回復を低くするように、例えば、同時に、または単一の捕捉工程において、調節することができる。一部の実施形態では、標的捕捉試薬（例えば、ベイト）を調節することは、標的捕捉試薬（例えば、ベイト）の１つ以上（例えば、全て）の比を変化させることを含む。本明細書に記載される方法および組成物は、例えば、臨床的意義を有する生殖系列変異を分析するのに有用であり得る（例えば、ＢＲＣＡ１／２）。本明細書に記載される方法および組成物は、例えば、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タイピングを用いた組み合わせた体細胞性突然変異コーリングに、例えば、バックグラウンド突然変異率（ｐＣＶ）を決定するのに有用であり得る。
【０２３８】
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、大きなダイナミックレンジ遺伝子発現プロファイリングの最適化のために使用することができる。例えば、高い配列決定深度は、高発現遺伝子の分析に必要とされ得るが、低発現遺伝子の分析には必要ではない。一部の実施形態では、高い配列決定深度は、低発現遺伝子の分析に必要とされ得る。一部の実施形態では、高い配列決定深度は、高発現遺伝子についてではなく、低発現遺伝子を分析するために必要とされ得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される標的捕捉試薬（例えば、ベイト）は、高発現遺伝子に関連する対象間隔の回復を低下させ、低発現遺伝子に関連する対象間隔の回復を増加させるために、例えば、同時にまたは単一の捕捉工程において調節することができる。
【０２３９】
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、組み合わせたコピー数変化（ＣＮＡ）コーリングおよび体細胞性突然変異コーリングのために使用することができる。例えば、体細胞性突然変異をコールするため（例えば、コーリングの感受性を増加させるため）であるが、ＣＮＡをコールしないために、高い配列決定深度が必要とされ得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される標的捕捉試薬（例えば、ベイト）は、体細胞性突然変異に関連する対象間隔の回復を増加させ、例えば、同時に、または単一の捕捉工程において増幅された対象間隔の回復を低くするように調節することができる。
【０２４０】
一部の実施形態では、本方法は、ゲノム変化、例えば、体細胞性変化の評価に応答する治療を選択することをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、突然変異量、例えば、突然変異量レベルの増加または減少の評価に応答する治療を選択することをさらに含むことができる。一部の実施形態では、本方法は、ゲノム変化の評価に応答する治療を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、試料、またはゲノム変化の評価に応答して試料が誘導された対象を分類することをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、試料が得られる対象のために臨床治験の適格性を決定することをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、報告書、例えば、電子的な、ウェブベースの、または紙による報告書を、患者に、または別の人もしくは団体、世話人、医師、がん専門医、病院、診療所、第三者支払人、保険会社もしくは政府機関に生成および送達することをさらに含む。一部の実施形態では、報告書は、本明細書に記載される方法からの出力を含む。
【０２４１】
本明細書に記載される方法は、最適な治療および疾患管理の決定に情報を提供するために、常套的な実世界の試料からの次世代シークエンシング技術を用いて、妥当と考えられる（典型的には５０〜５００遺伝子の範囲であり得る）包括的な遺伝子セットについての、臨床的および調節グレードの包括的分析およびゲノム異常の解釈を提供する。
【０２４２】
本明細書に記載される方法は、最適な治療および疾患管理の決定に情報を提供するために、がん専門医／病理医が試料を送付し、腫瘍に関するゲノムおよび他の分子変化の包括的な分析および説明を受け取るためのワンストップショッピングを提供する。
【０２４３】
本明細書に記載される方法は、標準的に利用可能な試料を採取する、強固な実世界の臨床腫瘍学診断ツールを提供し、１つの検査では、腫瘍を駆動する可能性があり、がん専門医の治療決定に情報を与えるために有用であり得る異常の包括的な説明をがん専門医に提供するための包括的なゲノムおよび他の分子異常分析を提供する。
【０２４４】
本明細書に記載される方法は、例えば、臨床グレードの質を有する次世代シークエンシング（ＮＧＳ）による、患者のがんゲノムの包括的な分析を提供する。方法は、最も関連する遺伝子および潜在的な変化を含み、突然変異（例えば、インデルまたは塩基置換）、コピー数、再配列、例えば、転座、発現、およびエピジェネティックマーカーの分析のうちの１つ以上を含む。遺伝学的分析のアウトプットは、実施可能な結果の記述的報告と関連付けることができる。方法は、最新の一連の関連する科学的および医学的知識と使用を結びつける。
【０２４５】
一部の実施形態では、本方法は、ヒトの任意の疾患（例えば、がん）もしくは障害の診断、予防もしくは治療、または健康の評価のための情報を提供する目的で、ヒト由来の試料を分析する。一部の実施形態では、本方法は、臨床検査改善修正法案（ＣＬＩＡ）および／または米国病理学会（ＣＡＰ）によって提供されるガイドラインに従って行われる。一部の実施形態では、本方法は、ＣＬＩＡおよび／またはＣＡＰ認定施設において行われる。一部の実施形態では、本方法は、食品医薬品局（ＦＤＡ）、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）、品質システム規制（ＱＳＲ）、欧州委員会（ＣＥ）、例えば、ＣＥ体外診断（ＣＥ−ＩＶＤ）、中国食品医薬品局（ＣＦＤＡ）または他の規制機関によって提供されるガイドラインに従って行われる。一部の実施形態では、本方法は、ＦＤＡ、ＱＳＲ、ＣＥまたはＣＦＤＡ認定施設において行われる。一部の実施形態では、本方法は、ＱＳＲ認証施設において行われる。一部の実施形態では、本方法は、臨床グレードの試料、例えば、臨床診療、治験、または患者ケアの管理に適した試料を分析する。一部の実施形態では、試料は、レトロスペクティブ試料および／またはプロスペクティブ試料を含む。一部の実施形態では、レトロスペクティブ試料は、治療が投与される前または後に分析される試料を含むかまたは研究試料である。一部の実施形態では、プロスペクティブ試料は、治療で処理されていない対象由来の試料を含む。一部の実施形態では、プロスペクティブ試料を分析するための本明細書に記載される方法の使用は、試料が得られた、例えば、由来する対象に対する治療の結果の予測をもたらすことができる。
【０２４６】
一部の実施形態では、本方法は、例えば、本明細書に記載されるように、診断として使用される。一部の実施形態では、本方法は、コンパニオン診断においてまたはコンパニオン診断とともに使用される。一部の実施形態では、本方法は、補足的診断として使用される。
【０２４７】
一部の実施形態では、本方法の有効性は、精度、正確さ、感受性、特異性、報告可能な範囲、または参照区間のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、５個、または全て）の決定によって（例えば、ＣＬＩＡ規則に基づいて）確立される。一部の実施形態では、精度は、カバレッジおよび品質（例えば、Ｐｈｒｅｄスコア）、例えば、標的領域における公知の変異体（例えば、ＳＮＰ、インデル）によって決定される。ある種の実施形態では、正確さは、例えば、公知の変異体について、異なるオペレータと機器の間の配列複製およびカバレッジ分布によって決定される。ある種の実施形態では、特異性は、例えば、十分に特徴づけられた標的を有するいくつかの試料において、偽陽性率、偽変異体が特定のカバレッジ閾値で同定される程度によって決定される。ある種の実施形態では、感受性は、例えば、十分に特徴づけられた標的を有するいくつかの試料において、公知の変異体を検出する尤度検定によって決定される。ある種の実施形態では、報告可能な範囲は、例えば、反復領域、インデル、または対立遺伝子ドロップアウトを用いて、１つ以上の遺伝子のイントロンバッファーおよびエクソン領域により決定される。ある種の実施形態では、参照間隔は、例えば、影響を受けていない集団において、配列変動バックグラウンド測定によって決定される。
【０２４８】
一部の実施形態では、本方法は、検証済み試料抽出、ライブラリー調製、バーコード化、プール化、標的濃縮、またはバイオインフォマティクス（例えば、精度および感受性の高い変異体がどのようにコールするか）のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、５つ、または全て）の検討を含む設定（例えば、ＣＡＰ規則の下で）で実施される。
【０２４９】
本明細書に記載される方法は、患者ケアの質と効率の両方の増加を提供する。これには、ケアの標準はないか、または患者が確立されたラインの療法に不応性であるような、腫瘍が稀なであるかまたは十分に研究されていないタイプの場合の適用が含まれ、さらなる療法の選択または臨床治験への参加の合理的な根拠が有用であり得る。例えば、本方法は、いかなる療法時点でも、意思決定に情報を与えるために完全な「分子イメージ」および／または「分子サブ診断」を利用可能にすることによって、がん専門医が利益を得る選択を可能にする。この結果は、患者が臨床治験への登録に適格であるかどうかを判断するために用いることができる。
【０２５０】
本明細書に記載される方法は、例えば、電子的な、ウェブベースの、または紙形式で、患者にまたは別の人もしくは団体、例えば、世話人、例えば、医師、例えば、がん専門医、病院、診療所、第三者支払人、保険会社または政府機関に報告書を提供することを含むことができる。報告書は、本方法からのアウトプット、例えば、ヌクレオチド値の同定、変化、突然変異または野生型配列の存在もしくは不存在の指標、例えば、試料タイプの腫瘍と関連する対象間隔を含むことができる。報告書はまた、腫瘍遺伝子変異量のレベルに関する情報も含むことができる。報告書はまた、１つ以上の他のゲノムシグネチャー、例えば、連続的／複雑なバイオマーカー、例えば、マイクロサテライト不安定性のレベル、またはヘテロ接合性（ＬＯＨ）の存在もしくは不存在に関する情報を含むことができる。報告書はまた、疾患における、配列、例えば、変化、突然変異、または野生型配列の役割に関する情報を含むことができる。このような情報には、予後、耐性、または潜在的もしくは示唆される療法オプションに関する情報が含まれ得る。報告書は、療法オプションの可能性のある有効性、療法オプションの受容性、または療法オプションを患者、例えば、配列を有する患者に適用する妥当性に関する情報、試験で同定された変化、および実施形態では報告書で同定された変化を含むことができる。例えば、報告書は、患者への、薬物の投与、例えば、ある投薬量でまたは治療レジメンでの投与、例えば、他の薬物と組み合わせた投与に関する情報または推奨を含むことができる。ある実施形態では、本方法で同定された全ての突然変異が報告書で同定されるわけではない。例えば、報告書は、例えば、治療オプションを用いて、がんの発生、予後、病期、または治療に対する感受性と相関のレベルを有する遺伝子における突然変異に限定することができる。本明細書に特徴づけられる方法は、本方法を実施する実体による試料の受領から７、１４、または２１日以内に、例えば、本明細書に記載される実体への報告書の送達を可能にする。したがって、本発明に特徴づけられる方法は、例えば、試料の受領後の７、１４または２１日以内の迅速な応答時間を可能にする。
【０２５１】
本明細書に記載される方法はまた、組織学的に正常な試料、例えば、外科的切除縁からの試料を評価するために使用することができる。本明細書に記載される１つ以上の変化が検出される場合、組織は、例えば、悪性または前がんとして再分類することができ、および／または治療の経過を修飾することができる。
【０２５２】
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、がんでない用途、例えば、法医学的応用（例えば、歯科記録の使用に代わる、またはそれに加える同定）、父性検査、および疾患診断および予後、とりわけ、例えば、感染症、自己免疫疾患、嚢胞性線維症、ハンチントン病、アルツハイマー病において有用である。例えば、本明細書に記載される方法による遺伝的変化の同定は、特定の障害を発症する個体の存在またはリスクを示すことができる。
【０２５３】
システム
【０２５４】
別の態様では、本発明は、試料中のゲノム変化を評価するためのシステムを特徴とする。システムは、メモリに作動可能に接続された少なくとも１つのプロセッサを含み、実行時の少なくとも１つのプロセッサは、本明細書に記載されるように、試料を分析する方法を行うように構成されている。
【０２５５】
別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料は、以下に記載される。本明細書に記載される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、材料、方法、および実施例は、単に例示的であり、限定することを意図しない。
【０２５６】
本発明の他の特徴および利点は、発明の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０２５７】
【図１】ブロッカーなしの３つの遺伝子（ＥＧＦＲ、ＮＦ１およびＴＰ５３）に対するＡＴＭおよびＡＰＣの標的カバレッジを示すプロットである。ｙ軸はｌｏｇ２の比を示し、ｘ軸は遺伝子標的を示す。
【図２】他の全てのＮＨＣ標的領域と比較したＡＰＣ標的領域の観察されたカバレッジ対予想されるカバレッジ中央値を示すグラフである。
【図３】狭く高いカバレッジ（ＮＨＣ）標的とブロックされた低下したカバレッジの非ＮＨＣ標的との分離を示す、平均コンセンサス標的カバレッジを示すヒストグラムである。ｙ軸はカウントを示し、ｘ軸は標的配列決定深度を示す。
【発明を実施するための形態】
【０２５８】
本明細書に記載される方法は、標的の示差的配列決定深度が、異なる標的に対する標的捕捉試薬上の修飾（例えば、ビオチン化）のレベルを最適化することによって制御された方法で達成され得るという観察に、少なくとも部分的に基づいている。ある種の実施形態では、本方法は、サブクローン性突然変異を含む可能性が高いかまたはより臨床的に重要である特定のゲノム領域、エクソン、またはＲＮＡ転写物に対してより高い感受性を提供する。他の実施形態では、本方法は、体細胞性突然変異が評価される標的対、生殖系列ＳＮＰ対立遺伝子バランスを評価するために使用される標的に、より高い配列決定深度を提供する。
【０２５９】
理論に拘束されることを望まないが、一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、より低いコストでゲノム変化を評価するために同様の性能を達成することができると考えられる。
【０２６０】
本明細書に記載される方法は、より小さい遺伝子セットにおける高い配列決定深度で組織、血液、ＣＴＣ、ｃｆＤＮＡ、またはｃｔＤＮＡからの体細胞性突然変異を測定することができる標的捕捉試薬を提供することを可能にし、より低い配列決定深度でより大きなゲノム領域上のゲノムシグネチャー、例えば、連続的／複雑なバイオマーカー（例えば、腫瘍遺伝子変異量、例えば、血液腫瘍遺伝子変異量）を同時に測定することを可能にする。ある種の実施形態では、本明細書に記載される方法は、高い配列決定深度での体細胞性変化および低い配列決定深度での生殖系列変化コーリングを測定することを可能にする。ある種の実施形態では、本明細書に記載される方法は、高い配列決定深度で体細胞性変化を測定し、低い配列決定深度でコピー数または構造変異体（例えば、約１Ｋｂ〜３Ｍｂの長さ）を測定することを可能にする。他の実施形態では、この方法を使用して、ＲＮＡ配列決定またはｃＤＮＡ配列決定用途、または異なる遺伝子もしくは配列の存在量が供給源試料において示差的である他の用途における特定の遺伝子の配列決定深度を制御することができる。このような状況では、存在量の低い遺伝子の測定効率を改善するために、存在量の高い遺伝子の配列カバレッジを低下させる利点があり得る。理論に拘束されることを望まないが、一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、異なる標的全体にわたる配列決定カバレッジを正規化するために使用され得ると考えられ、いくつかの標的が標的捕捉試薬により、より効率的におよび／または特異的に捕捉されるが、他の標的は、標的捕捉試薬によりあまり効率的におよび／または特異的に捕捉されない（例えば、標的中の高いまたは低いＧＣ含有量、または２つの異なる標的間の類似性に起因する）。本明細書に記載される方法の他の有用性は、限定されないが、遺伝子発現プロファイリング、ＳＮＰの同定、およびコピー数変化（ＣＮＡ）の決定を含む。
【０２６１】
ハイブリッド捕捉手法を用いて示差的配列決定深度を得る上での課題の１つは、標的捕捉試薬が、典型的には、効率的な捕捉（例えば、標的捕捉の飽和を確実にするため）に必要とされる標的ＤＮＡに対して高いモル過剰であり、標的ＤＮＡのコピー数の定量的測定を可能にすることである（例えば、標的ＤＮＡの大部分が捕捉される場合、深度は、標的のコピー数にほぼ直線的に比例する）。この状況では、特定の標的捕捉試薬の相対量を増加または減少させることは、得られた配列決定深度に対して比較的小さな効果を有する。
【０２６２】
本明細書に記載される方法は、例えば、異なる標的に対する標的捕捉試薬上の修飾（例えば、ビオチン化）レベルを制御することによって、示差的配列深度を提供する。（標的捕捉試薬が過剰であるために）標的ＤＮＡの大部分が捕捉されると仮定すると、修飾された（例えば、ビオチン化された）特定の標的に対する標的捕捉試薬の相対量は、ハイブリッド捕捉反応によって保持される特定の標的ＤＮＡの量に直接影響を及ぼし得る。例えば、標的Ａの標的捕捉試薬が２５％ビオチン化され、標的Ｂの標的捕捉試薬が５０％ビオチン化されている場合、標的ＡのＤＮＡの相対量対標的ＢのＤＮＡの量は約１：２であると予想される。修飾されていない（例えば、ビオチン化されていない）標的捕捉試薬中で所定の比率で混合することによって、特定のタイプの標的捕捉試薬の修飾（例えば、ビオチン化）のレベルを低下することが容易であり、配列決定によって異なる標的の出力配列決定深度比を決定することが容易であるため、特定の標的の特異的な示差的配列決定深度を達成するために、反応を滴定することが望ましい。
【０２６３】
一部の実施形態では、特定のタイプの標的捕捉試薬上の修飾（例えば、ビオチン化）のレベルを増加させることは、異なる修飾、精製方法、または捕捉のための基質（例えば、溶液中対表面上）によって達成され得る。他の実施形態では、異なる標的の配列決定深度の均一性は、実施がより良好である標的捕捉試薬上の修飾（例えば、ビオチン化）のレベルを低下させ、および／または測定された標的配列決定深度の分布を強化するために、実施がより低い標的捕捉試薬の修飾（例えば、ビオチン化）のレベルを増加させることによって増加される。
【０２６４】
定義
【０２６５】
ある種の用語が最初に定義される。追加の用語は、明細書全体を通じて定義される。
【０２６６】
本明細書で使用される場合、冠詞「ある（ａ）」および「ある（ａｎ）」は、冠詞の文法的対象物の１つまたは１を超える（例えば、少なくとも１つ）を指す。
【０２６７】
「約」および「ほぼ」とは、一般的に、測定の性質または正確さを与えられる測定された量についての許容可能な誤差の程度を意味する。誤差の例示的な程度は、所定の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内であり、典型的には１０％以内であり、より典型的には５％以内である。
【０２６８】
「高い配列決定深度事象」という用語は、本明細書で使用される場合、配列（例えば、サブゲノム間隔配列）であって、例えば、少なくとも２０００×、２５００×、３０００×、３５００×、４０００×、４５００×、５０００×、５５００×、６０００×、６５００×、７０００×、７５００×、８０００×、８５００×、９０００×、９５００×、１００００×またはそれ以上の、高い配列決定深度まで配列決定されるものを指す。ある実施形態では、高い配列決定深度事象は、表現型（例えば、がん表現型、細胞分裂、増殖または生存における効果）と関連する。ある実施形態では、高い配列決定深度事象は、転帰（例えば、治療転帰、診断または予後）と相関を有する。ある実施形態では、高い配列決定深度事象は、望ましくない表現型、療法に対する反応の障害または可能性と相関（例えば、正の相関または負の相関）を有する遺伝的事象である。ある実施形態では、高い配列決定深度事象は、変化、例えば、腫瘍形成につながるかもしくはそれを引き起こす突然変異、または療法様式に対する応答性もしくは非応答性と相関する突然変異を含む。ある実施形態では、高い配列決定深度事象は、表１Ａ〜５Ａのいずれか１つに記載される遺伝子における遺伝的事象を含む。ある実施形態では、高い配列決定深度事象は、表３Ｃ、３Ｄ、３Ｅまたは５Ａに記載される遺伝子における遺伝的事象を含む。ある実施形態では、第１の断片（Ｆ１）は、高い配列決定深度事象と関連付けられる。ある実施形態では、高い配列決定深度事象は、Ｆ１にまたはＦ１内に存在する。ある実施形態では、Ｆ１は、高い配列決定深度事象を含む。ある実施形態では、第２の断片（Ｆ２）は、高い配列決定深度事象と関連しない。ある実施形態では、高い配列決定深度事象は、Ｆ２にまたはＦ２内に存在しない。ある実施形態では、Ｆ２は、高い配列決定深度事象を含まない。ある実施形態では、高い配列決定深度事象は、ある事象ではなく、そのレベルが、１つ以上のバイオマーカー、例えば、腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）、またはその両方の決定と関連する。ある実施形態では、高い配列決定深度事象は、実施可能な事象、例えば、本明細書に記載される実施可能な事象を含む。ある実施形態では、高い配列深度事象は、高い配列深度、例えば、低い配列深度事象よりも、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍大きい深度まで配列決定される配列（例えば、サブゲノム間隔配列）を含む。
【０２６９】
「低い配列決定深度事象」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、２０００×、１５００×、１０００×、９００×、８００×、７００×、６００×、５００×、４００×、３００×、２００×未満、またはそれより低い、低い配列決定深度まで配列決定される配列（例えば、サブゲノム間隔配列）を指す。ある実施形態では、低い配列決定深度事象は、表現型（例えば、がん表現型、細胞分裂、増殖または生存に対する効果）と関連しない。ある実施形態では、低い配列決定深度事象は、転帰（例えば、治療転帰、診断または予後）と相関を有しているかまたは有していない。ある実施形態では、低い配列決定深度事象は、望ましくない表現型、療法に対する反応の障害または可能性と相関（例えば、正の相関または負の相関）を有するかまたは有しない遺伝的事象である。ある実施形態では、低い配列決定深度事象は、表現型を伴わない変化、例えば、サイレント突然変異またはＳＮＰである。ある実施形態では、低い配列決定深度事象は、表１Ａ〜５Ａのいずれか１つに記載される遺伝子における遺伝的事象である。ある実施形態では、低い配列決定深度事象は、表３Ｃ、３Ｄ、３Ｅまたは５Ａに記載される遺伝子における遺伝的事象ではない。ある実施形態では、第２の断片（Ｆ２）は、低い配列決定深度事象と関連付けられる。ある実施形態では、低い配列決定深度事象は、Ｆ２にまたはＦ２内に存在する。ある実施形態では、Ｆ２は、低い配列決定深度事象を含む。ある実施形態では、第１の断片（Ｆ１）は、低い配列決定深度事象と関連しない。ある実施形態では、低い配列決定深度事象は、Ｆ１にまたはＦ１内に存在しない。ある実施形態では、Ｆ１は、低い配列決定深度事象を含まない。ある実施形態では、低い配列決定深度事象は、ある事象を含み、そのレベルが、１つ以上のバイオマーカー、例えば、腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）、またはその両方の決定に関連する。ある実施形態では、低い配列決定深度事象は、実施可能な事象、例えば、本明細書に記載される実施可能な事象を含む。ある実施形態では、低い配列決定深度事象は、実施可能な事象、例えば、本明細書に記載される実施可能な事象を含まない。ある実施形態では、低い配列深度事象は、低い配列深度、例えば、高い配列深度事象よりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍未満低い深度まで配列決定される配列（例えば、サブゲノム間隔配列）を含む。
【０２７０】
「実施可能な事象」または「実施可能性」という用語は、本明細書で使用される場合、表現型（例えば、がん表現型、細胞分裂、増殖または生存に対する効果）と関連する配列（例えば、サブゲノム間隔配列）を指す。ある実施形態では、実施可能な事象は、結果（例えば、治療結果、診断または予後）と相関を有する。ある実施形態では、実施可能な事象は、望ましくない表現型、療法に対する反応の障害または可能性と相関（例えば、正の相関または負の相関）を有する遺伝的事象である。ある実施形態では、実施可能な事象は、変化、例えば、腫瘍形成につながるかまたはそれを引き起こす突然変異、または療法様式に対する応答性もしくは非応答性と相関する突然変異である。ある実施形態では、実施可能な事象は、表１Ａ〜５Ａのいずれか１つに記載される遺伝子における遺伝的事象である。ある実施形態では、ＴＭＢまたはＭＳＩのレベルは、実施可能な事象と関連付けることができるが、ＴＭＢまたはＭＳＩのレベルを決定する場合に識別される１つ以上の変化は、実施可能であり得るかまたはあり得ない。
【０２７１】
ある実施形態では、実施可能な事象は、全内容が参照により本明細書に組み込まれるＨｅｄｌｅｙら、（２０１６年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６巻（５号）３１９−２９頁に記載される方法に基づいて決定することができる。ある実施形態では、実施可能な事象は、十分に特徴づけられた再発突然変異を含む。ある実施形態では、実施可能な事象は、細胞アッセイにおいて形質転換をもたらすことができる突然変異を含む。ある実施形態では、実施可能な事象は、化合物に対する細胞の感受性を変化させる、例えば、増大させることができる突然変異を含む。ある実施形態では、実施可能な事象は、病原性である突然変異を含む。
【０２７２】
「取得する」または「取得すること」という用語は、本明細書で使用される場合、物理的実体または値を「直接的に取得すること」または「間接的に取得すること」によって、物理的実体または値、例えば数値の所有を得ることを指す。「直接的に取得すること」とは、物理的実体または値を得るためのプロセス（例えば、合成方法または分析方法を行うこと）を行うことを意味する。「間接的に取得すること」とは、物理的実体または値を別の団体または供給源（例えば、物理的実体または値を直接的に取得した第三者研究所）から受け取ることを指す。物理的実体を直接的に取得することは、物理的物質、例えば、出発物質の物理的変化を含むプロセスを行うことを含む。例示的な変化には、２つ以上の出発物質から物理的実体を作製し、物質をせん断または断片化し、物質を分離または精製し、２つ以上の別々の実体を混合物に合わせ、共有結合もしくは非共有結合を切断または形成することを含む化学反応を行うことが含まれる。値を直接的に取得することには、試料または別の物質の物理的変化を含むプロセスを行い、例えば、物質、例えば、試料、被分析物、または試薬の物理的変化を含む分析プロセス（本明細書では「物理的分析」と称されることもある）を行い、分析法を行う方法が含まれ、例えば、方法は、以下：物質、例えば、被分析物、またはその断片もしくは他の誘導体を別の物質から分離または精製すること；被分析物、またはその断片もしくは他の誘導体を、別の物質、例えば、バッファー、溶媒、または反応物と組み合わせること；あるいは、被分析物、またはその断片もしくは他の誘導体の構造を、例えば、被分析物の第１の原子と第２の原子との間の共有結合または非共有結合を切断または形成することによって変化させ、または試薬、またはその断片もしくは他の誘導体の構造を、例えば、試薬の第１の原子と第２の原子との間の共有結合または非共有結合を切断または形成することによって変化させることのうちの１つ以上を含む。
【０２７３】
「配列を取得すること」または「リードを取得すること」という用語は、本明細書で使用される場合、配列またはリードを「直接的に取得すること」または「間接的に取得すること」によって、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の保有を得ることを指す。配列またはリードを「直接的に取得すること」とは、配列決定方法（例えば、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）法）を行うなどの、配列を得るためのプロセスを行うこと（例えば、合成方法または分析方法を行うこと）を意味する。配列またはリードを「間接的に取得すること」とは、別の団体または供給源（例えば、配列を直接的に取得した第三者研究所）から配列の情報もしくは知識を受け取るか、または配列を受け取ることを指す。取得された配列またはリードは、完全な配列、例えば、少なくとも１つのヌクレオチドを配列決定すること、または対象に存在するものとして本明細書に開示された変化のうちの１つ以上を同定し、配列を取得することを構成する情報もしくは知識を得ることは必要ではない。
【０２７４】
配列またはリードを直接的に取得することは、物理的物質、例えば、本明細書に記載される試料などの出発物質の物理的変化を含むプロセスを行うことを含む。例示的な変化には、２つ以上の出発物質から物理的実体を作製すること、ゲノムＤＮＡ断片などの物質をせん断または断片化すること；物質を分離または精製すること（例えば、組織から核酸試料を単離すること）；２つ以上の別々の実体を混合物に合わせること、共有結合または非共有結合を切断または形成することを含む化学反応を行うことが含まれる。値を直接的に取得することは、上述したように、試料または別の物質の物理的変化を含むプロセスを行うことを含む。断片のサイズ（例えば、断片の平均サイズ）は、２５００ｂｐ以下、２０００ｂｐ以下、１５００ｂｐ以下、１０００ｂｐ以下、８００ｂｐ以下、６００ｂｐ以下、４００ｂｐ以下、または２００ｂｐ以下であり得る。一部の実施形態では、断片（例えば、ｃｆＤＮＡ）のサイズは、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ（例えば、約１６０ｂｐ〜約１７０ｂｐ）である。一部の実施形態では、断片（例えば、ＦＦＰＥ試料由来のＤＮＡ断片）のサイズは、約１５０ｂｐ〜約２５０ｂｐである。一部の実施形態では、断片（例えば、ＦＦＰＥ試料中のＲＮＡから得られたｃＤＮＡ断片）のサイズは、約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐである。
【０２７５】
「試料を取得する」という用語は、本明細書で使用される場合、試料、例えば、本明細書に記載される試料の所持を、試料を「直接的に取得する」ことによって、または「間接的に取得する」ことによって得ることを指す。「試料を直接的に取得する」とは、試料を得るためのプロセスを行うこと（例えば、手術または摘出などの物理的方法を行うこと）を意味する。「試料を間接的に取得する」とは、別の団体または供給源（例えば、試料を直接的に取得した第三者研究所）から試料を受け取ることを意味する。試料を直接的に取得することは、物理的物質、例えば、組織、例えば、ヒト患者の組織、または以前に患者から単離された組織などの出発物質の物理的変化を含むプロセスを行うことを含む。例示的な変化には、出発物質から物理的実体を作製すること、組織を解剖または擦過すること；物質（例えば、試料組織または核酸試料）を分離または精製すること；２つ以上の別々の実体を混合物に合わせること；共有結合もしくは非共有結合を切断または形成することを含む化学反応を行うことが含まれる。試料を直接的に取得することは、例えば、上述したように、試料または別の物質の物理的変化を含むプロセスを行うことを含む。
【０２７６】
遺伝子または遺伝子産物（例えば、マーカー遺伝子または遺伝子産物）の「変化」または「変化した構造」とは、本明細書で使用される場合、正常または野生型遺伝子と比較して、遺伝子または遺伝子産物の完全性、配列、構造、量または活性に影響を与える、遺伝子または遺伝子産物内の突然変異または複数の突然変異の存在、例えば、突然変異を指す。変化は、正常もしくは健康な組織または細胞（例えば、対照）におけるその量、構造、および／または活性と比較した、がん組織もしくはがん細胞における量、構造、および／または活性であり得、がんなどの病状と関連する。例えば、がんに関連する変化、または抗がん療法に対する応答性を予測する変化は、正常、健康な組織または細胞と比較して、がん組織またはがん細胞において、変化されたヌクレオチド配列（例えば、突然変異）、アミノ酸配列、染色体転座、染色体内逆位、コピー数、発現レベル、タンパク質レベル、タンパク質活性、エピジェネティック修飾（例えば、メチル化またはアセチル化状態）、または翻訳後修飾を有することができる。例示的な突然変異は、限定されないが、点突然変異（例えば、サイレント、ミスセンス、またはナンセンス）、欠失、挿入、逆位、重複、増幅、転座、染色体間および染色体内再配列を含む。突然変異は、遺伝子のコード化領域または非コード化領域に存在し得る。ある種の実施形態では、変化（複数可）は、再配列、例えば、１つ以上のイントロンまたはその断片を含むゲノム再配列（例えば、５’−および／または３’−ＵＴＲにおける１つ以上の再配列）として検出される。ある種の実施形態では、変化は、表現型、例えば、がん性表現型（例えば、１つ以上のがんリスク、がん進行、がん治療またはがん治療に対する抵抗性）と関連する（または関連しない）。一実施形態では、変化（または腫瘍遺伝子変異量）は、がんの遺伝的なリスク因子、ポジティブな治療反応予測因子、ネガティブな治療反応予測因子、ポジティブな予後因子、ネガティブな予後因子、または診断因子のうちの１つ以上と関連する。
【０２７７】
本明細書で使用される場合、用語「インデル」は、細胞の核酸中の１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または両方を指す。ある種の実施形態では、インデルは、１つ以上のヌクレオチドの挿入と欠失の両方を含み、挿入と欠失の両方は、核酸上で近接する。ある種の実施形態では、インデルは、ヌクレオチドの総数の正味の変化をもたらす。ある種の実施形態では、インデルは、約１〜約５０ヌクレオチドの正味の変化をもたらす。
【０２７８】
「クローンプロファイル」という用語は、本明細書で使用される場合、対象間隔（またはそれを含む細胞）の１つ以上の配列、例えば、対立遺伝子またはシグネチャーの出現、同一性、変動性、分布、発現（サブゲノムシグネチャーの転写されたコピーの出現またはレベル）、または存在量、例えば、相対的存在量を指す。ある実施形態では、クローンプロファイルは、対象間隔についての複数の配列、対立遺伝子、またはシグネチャーが試料中に存在する場合、対象間隔（またはそれを含む細胞）についての、１つの配列、対立遺伝子、またはシグネチャーの相対的存在量の値である。例えば、ある実施形態では、クローンプロファイルは、対象間隔についての複数のＶＤＪまたはＶＪの組合せの１つ以上の相対的存在量に対する値を含む。ある実施形態では、クローンプロファイルは、対象間隔に対する選択されたＶセグメントの相対的存在量の値を含む。ある実施形態では、クローンプロファイルは、例えば、体細胞性高頻度突然変異から生じるような、対象間隔の配列内の多様性の値を含む。ある実施形態では、クローンプロファイルは、例えば、配列、対立遺伝子もしくはシグネチャーを含む発現されたサブゲノム間隔の出現またはレベルによって証明されるように、配列、対立遺伝子もしくはシグネチャーの発現の出現またはレベルに対する値を含む。
【０２７９】
「発現されたサブゲノム間隔」という用語は、本明細書で使用される場合、サブゲノム間隔の転写された配列を指す。ある実施形態では、発現されたサブゲノム間隔の配列は、それが転写されるサブゲノム間隔とは異なり、例えば、これは、いくつかの配列が転写されない場合があるからである。
【０２８０】
「突然変異対立遺伝子頻度」（ＭＡＦ）という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、試料中の、特定の遺伝子座における突然変異対立遺伝子の相対的頻度を指す。一部の実施形態では、突然変異対立遺伝子頻度は、分率またはパーセンテージとして表される。
【０２８１】
「シグネチャー」という用語は、本明細書で使用される場合、対象間隔の配列を指す。シグネチャーは、対象間隔における複数の可能性のうちの１つの出現を診断することができ、例えば、シグネチャーは、再構成された重鎖または軽鎖可変領域遺伝子における選択されたＶセグメントの出現；選択されたＶＪ接合点の出現、例えば、再構成された重鎖可変領域遺伝子における選択されたＶセグメントおよび選択されたＪセグメントの出現を診断することができる。ある実施形態では、シグネチャーは、複数の特定の核酸配列を含む。したがって、シグネチャーは、特定の核酸配列に限定されるものではなく、むしろ、対象間隔における第１の配列群または可能性と、対象間隔における第２の群の可能性とを区別することができるほど十分に固有であり、例えば、第１のＶセグメントと第２のＶセグメントとを区別することができ、例えば、様々なＶセグメントの使用の評価を可能にする。シグネチャーという用語は、特定の核酸配列である特定のシグネチャーという用語を含む。ある実施形態では、シグネチャーは、特定の事象、例えば、再配列事象を示すか、またはその生成物である。
【０２８２】
「サブゲノム間隔」という用語は、本明細書で使用される場合、ゲノム配列の一部を指す。ある実施形態では、サブゲノム間隔は、単一のヌクレオチド位置であり得、例えば、その位置での変異体は、腫瘍表現型と（正または負に）関連している。ある実施形態では、サブゲノム間隔は、１を超えるヌクレオチド位置を含む。そのような実施形態は、長さが少なくとも２、５、１０、５０、１００、１５０、または２５０ヌクレオチド位置の配列を含む。サブゲノム間隔は、全遺伝子、またはその一部、例えばコード化領域（またはその一部）、イントロン（またはその一部）、またはエクソン（またはその一部）を含むことができる。サブゲノム間隔は、天然に存在する、例えば、ゲノムＤＮＡ、核酸の断片の全部または一部を含むことができる。例えば、サブゲノム間隔は、配列決定反応に供されるゲノムＤＮＡの断片に対応し得る。実施形態では、サブゲノム間隔は、ゲノム供給源からの連続した配列である。実施形態では、サブゲノム間隔は、ゲノム中で近接していない配列を含み、例えば、ｃＤＮＡ中のサブゲノム間隔は、スプライシングの結果として形成されるエクソン−エクソン接合点を含み得る。
【０２８３】
ある実施形態では、サブゲノム間隔は、再配列された配列、例えば、ＶセグメントとＤセグメントとの連結、ＤセグメントとＪセグメントとの連結、ＶセグメントとＪセグメントとの連結、またはＪセグメントとクラスセグメントとの連結の結果として生じるＢ細胞またはＴ細胞における配列に対応する。
【０２８４】
ある実施形態では、サブゲノム間隔は、１つの配列によって表される。ある実施形態では、サブゲノム間隔は、１を超える配列によって表され、例えば、ＶＤ配列をカバーするサブゲノム間隔は、１を超えるシグネチャーによって表すことができる。
【０２８５】
ある実施形態では、サブゲノム間隔は、単一のヌクレオチド位置；遺伝子内領域または遺伝子間領域；エクソンもしくはイントロン、またはその断片、典型的にはエクソン配列またはその断片；コード化領域または非コード化領域、例えば、プロモーター、エンハンサー、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、もしくは３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、またはその断片；ｃＤＮＡまたはその断片；ＳＮＰ；体細胞性突然変異、生殖系列突然変異、またはその両方；変化、例えば、点突然変異または単一突然変異；欠失突然変異（例えば、インフレーム欠失、遺伝子内欠失、完全遺伝子欠失）；挿入突然変異（例えば、遺伝子内挿入）；逆位突然変異（例えば、染色体内逆位）；逆位重複突然変異；タンデム重複（例えば、染色体内のタンデム重複）；転座（例えば、染色体転座、非逆数転座）；再配列（例えば、ゲノム再配列（例えば、１つ以上のイントロンの再配列、１つ以上のエクソンの再配列、またはその組合せおよび／もしくは断片；再配列されたイントロンは５’および／または３’ＵＴＲを含み得る））；遺伝子コピー数の変化；遺伝子発現の変化；ＲＮＡレベルの変化；またはそれらの組合せを含むまたはそれからなる。「遺伝子のコピー数」とは、特定の遺伝子産物をコードする細胞内のＤＮＡ配列の数を指す。一般的に、所定の遺伝子について、哺乳動物は、各遺伝子のコピーを２つ有する。コピー数は、例えば、遺伝子増幅または重複によって増加させることができ、または欠失によって低下させることができる。
【０２８６】
「対象間隔」という用語は、本明細書で使用される場合、サブゲノム間隔または発現されたサブゲノム間隔を指す。ある実施形態では、サブゲノム間隔および発現されたサブゲノム間隔が対応し、これは、発現されたサブゲノム間隔が、対応するサブゲノム間隔から発現される配列を含むことを意味する。ある実施形態では、サブゲノム間隔および発現されたサブゲノム間隔は非対応であり、これは、発現されたサブゲノム間隔が、非対応のサブゲノム間隔から発現された配列を含まず、むしろ、異なるサブゲノム間隔に対応することを意味する。ある実施形態では、サブゲノム間隔および発現されたサブゲノム間隔は部分的に対応し、これは、発現されたサブゲノム間隔が、対応するサブゲノム間隔から発現される配列、および異なる対応するサブゲノム間隔から発現される配列を含むことを意味する。
【０２８７】
本明細書で使用される場合、用語「ライブラリー」とは、核酸分子の集合体を指す。一実施形態では、ライブラリーは、核酸分子の集合体、例えば、全ゲノム断片、サブゲノム断片、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ断片、またはそれらの組合せの集合体を含む。典型的には、核酸分子は、ＤＮＡ分子、例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである。核酸分子は、断片化された、例えば、せん断されたまたは酵素的に調製されたゲノムＤＮＡであり得る。核酸分子は、対象由来の配列を含み、また、対象に由来しない配列、例えば、アダプター配列、プライマー配列、または同定を可能にする他の配列、例えば「バーコード」配列を含み得る。一実施形態では、ライブラリー核酸分子の一部または全部は、アダプター配列を含む。アダプター配列は、一方または両方の端部に配置することができる。アダプター配列は、例えば、配列決定方法（例えば、ＮＧＳ法）、増幅、逆転写、またはベクターへのクローニングに有用であり得る。ライブラリーは、核酸分子、例えば、標的核酸分子（例えば、腫瘍核酸分子、参照核酸分子、またはそれらの組合せ）の集合体を含むことができる。ライブラリーの核酸分子は、単一の個体由来であり得る。ある実施形態では、ライブラリーは、１を超える対象（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０またはそれ以上の対象）由来の核酸分子を含むことができ、例えば、異なる対象由来の２つ以上のライブラリーを組み合わせて、１を超える対象由来の核酸分子を含むライブラリーを形成することができる。一実施形態では、対象は、がんまたは腫瘍を有する、またはそれを有するリスクがあるヒトである。
【０２８８】
「ライブラリーキャッチ」とは、ライブラリーのサブセット、例えば、標的捕捉試薬とのハイブリダイゼーションによって捕捉された生成物など、対象間隔について濃縮されたサブセットを指す。
【０２８９】
本明細書で使用される「標的捕捉試薬」とは、標的を捕捉することができる分子を指す。標的捕捉試薬（例えば、ベイトまたは標的捕捉オリゴヌクレオチド）は、標的核酸にハイブリダイズすることができ（例えば、それに相補的である）、それによって標的核酸の捕捉を可能にすることができる核酸分子、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含むことができる。一実施形態では、標的捕捉試薬は、ＤＮＡ分子（例えば、天然に存在するかまたは修飾されたＤＮＡ分子）、ＲＮＡ分子（例えば、天然に存在するかまたは修飾されたＲＮＡ分子）、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、標的捕捉試薬は、結合対の機能的な第１のメンバーをさらに含み、これは、例えば、基質上に配置された、結合対の第２のメンバーに結合することができる。他の実施形態では、標的捕捉試薬は、結合対の機能的な第１のメンバーを欠いており、例えば、結合対の第１のメンバーは、結合対の第１のメンバーと第２のメンバーとの間の親和性が低下または除去されるように、変化またはブロックされる。一実施形態では、標的捕捉試薬は、溶液相ハイブリダイゼーションに適している。結合対の機能的な第１のメンバーを含む標的捕捉試薬は、例えば、異なる比で、結合対の機能的な第１のメンバーを欠く標的捕捉試薬と混合して、異なる配列深度に相関し得る、基質による異なる効率の回収を達成することができる。一部の実施形態では、標的捕捉試薬は、例えば、結合対の第１のメンバー、例えば、結合対の機能的な第１のメンバーを含むことによって修飾される。一部の実施形態では、標的捕捉試薬は、修飾されず、例えば、結合対の機能的な第１のメンバーを含まず、または結合対の第１のメンバーが変化されているかもしくはブロックされている。
【０２９０】
結合対の第１のメンバーは、標的捕捉試薬に直接的または間接的に付着され得る任意の分子タグであり得、それは、機能的である場合、基質に特異的に結合することができる。結合対の第１のメンバーは、標的捕捉試薬配列上の親和性タグであり得る。ある種の実施形態では、結合対の第１のメンバーは、結合対の第２のメンバー、例えば、アビジン分子、またはハプテンもしくはその抗原結合断片に結合する抗体に結合することによって、ハイブリダイゼーション混合物から標的捕捉試薬／核酸分子ハイブリッドの分離を可能にする。結合対の例示的な第１のメンバーとしては、限定されないが、ビオチン分子、ハプテン、抗体、抗体結合断片、ペプチド、およびタンパク質が挙げられる。一部の実施形態では、基質は、ビーズを含む。
【０２９１】
「相補的」とは、２つの核酸鎖の領域間または同一核酸鎖の２つの領域間の配列相補性を指す。第１の核酸領域のアデニン残基は、残基がチミンまたはウラシルである場合、第１の領域と逆平行である第２の核酸領域の残基と特異的な水素結合（「塩基ペアリング」）を形成することができることが公知である。同様に、第１の核酸鎖のシトシン残基は、残基がグアニンである場合、第１の鎖と逆平行である第２の核酸鎖の残基と塩基ペアリングすることができることが公知である。核酸の第１の領域は、２つの領域が逆平行に配置されるとき、第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が第２の領域の残基と塩基ペアリングすることができる場合、同一または異なる核酸の第２の領域に相補的である。ある種の実施形態では、第１の領域は、第１の部分を含み、第２の領域は、第２の部分を含み、それにより、第１の部分および第２の部分が逆平行に配列される場合、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％は、第２の部分のヌクレオチド残基と塩基ペアリングすることができる。他の実施形態では、第１の部分の全てのヌクレオチド残基は、第２の部分のヌクレオチド残基と塩基ペアリングすることができる。
【０２９２】
用語「がん」および「腫瘍」は、本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、制御不能な増殖、不死化、転移能、急速な成長および増殖速度、およびある種の特徴的な形態学的特徴などの、がんを引き起こす細胞の典型的な特性を有する細胞の存在を指す。がん細胞は、多くの場合、腫瘍の形態であるが、このような細胞は、動物内に単独で存在することができ、または白血病細胞などの非腫瘍形成性がん細胞であり得る。これらの用語には、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、または転移性病変が含まれる。本明細書で使用される場合、用語「がん」は、前がん、ならびに悪性がんを含む。
【０２９３】
本明細書で使用される「可能性が高い」または「可能性が増加している」とは、アイテム、対象物、物または人が起こる確率が増加することを指す。したがって、一例において、治療に反応する可能性が高い対象は、参照対象または対象群と比較して、治療に反応する確率が増加している。
【０２９４】
「可能性は低い」とは、ある事象、アイテム、対象物、物または人が、ある参照に関して発生する確率が減少したことを指す。したがって、治療に反応する可能が低い対象は、参照対象または対象群と比較して、治療に反応する確率が減少している。
【０２９５】
「対照核酸分子」とは、非腫瘍細胞からの配列を有する核酸分子をいう。
【０２９６】
本明細書で用いる「次世代シークエンシング」または「ＮＧＳ」または「ＮＧシークエンシング」とは、個々の核酸分子（例えば、単一分子配列決定における）または個々の核酸分子のクローン的に拡大されたプロキシのいずれかのヌクレオチド配列を高処理量で（例えば、１０３、１０４、１０５またはそれ以上の分子が同時に配列決定される）決定する任意の配列決定方法を指す。一実施形態では、ライブラリー中の核酸種の相対的存在量は、配列決定実験によって生成されたデータ中のそれらの同族配列の相対的存在数をカウントすることによって推定することができる。次世代シークエンシング法は、該技術分野において公知であり、例えば、本明細書に参照により組み込まれるＭｅｔｚｋｅｒ，Ｍ．（２０１０年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １１巻：３１−４６頁に記載される。次世代シークエンシングは、試料中の核酸の５％未満または１％未満に存在する変異体を検出することができる。
【０２９７】
本明細書において言及される「ヌクレオチド値」は、ヌクレオチド位置を占めるかまたはそれに割り当てられたヌクレオチド（複数可）の同一性を表す。典型的なヌクレオチド値には、不足（例えば、欠失）；付加（例えば、１以上のヌクレオチドの挿入であって、その同一性が含まれ得るかまたは含まれ得ない）；または存在（占有される）；Ａ；Ｔ；Ｃ；またはＧが含まれる。他の値は、例えば、Ｙではない場合があり、ＹはＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣであり；ＡまたはＸであり得、ＸはＴ、Ｇ、またはＣのうちの１つまたは２つであり；ＴまたはＸであり得、ＸはＡ、Ｇ、またはＣのうちの１つまたは２つであり；ＧまたはＸであり得、ＸはＴ、Ａ、またはＣのうちの１つまたは２つであり；ＣまたはＸであり得、ＸはＴ、Ｇ、またはＡのうちの１つまたは２つであり；ピリミジンヌクレオチド；またはプリンヌクレオチドであり得る。ヌクレオチド値は、ヌクレオチド位置における１つ以上、例えば、２、３または４つの塩基（または本明細書に記載される他の値、例えば、不足または追加）の頻度であり得る。例えば、ヌクレオチド値は、ヌクレオチド位置において、Ａの頻度、およびＧの頻度を含み得る。
【０２９８】
「または」は、本明細書では、文脈が明確に別のことを示していない限り、用語「および／または」を意味するために使用され、用語「および／または」と互換的に使用される。本明細書のある箇所における用語「および／または」の使用は、文脈が明確に別のことを示していない限り、用語「または」の使用が用語「および／または」と置き換えられないことを意味しない。
【０２９９】
「一次対照」とは、試料中の正常な隣接組織（ＮＡＴ）組織以外の非腫瘍組織を指す。血液は、典型的な一次対照である。
【０３００】
本明細書で使用される「試料」とは、本明細書に記載されるように、目的とする供給源から得られたかまたはそれに由来する生物学的試料を指す。一部の実施形態では、目的とする供給源は、動物またはヒトなどの生物体を含む。試料の供給源は、新鮮な、凍結されたおよび／または保存された臓器、組織試料、生検、切除、スメア、または吸引物からの固形組織；血液または任意の血液成分；脳脊髄液、羊水、腹水または間質液などの体液；または対象の妊娠中または発達中の任意の時間点からの細胞であり得る。一部の実施形態では、試料の供給源は、血液または血液成分である。
【０３０１】
一部の実施形態では、試料は、生物学的組織または流体であるかまたはそれを含む。試料は、防腐剤、抗凝固剤、バッファー、固定剤、栄養剤、抗生物質などの、天然において組織と自然に混合されない化合物を含有することができる。一実施形態では、試料は、凍結試料として、またはホルムアルデヒドもしくはパラホルムアルデヒド固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織調製物として保存される。例えば、試料は、マトリックス、例えば、ＦＦＰＥブロックまたは凍結試料中に包埋することができる。別の実施形態では、試料は、血液または血液成分試料である。さらに別の実施形態では、試料は、骨髄吸引物試料である。別の実施形態では、試料は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む。理論に拘束されることを望まないが、一部の実施形態では、ｃｆＤＮＡは、アポトーシスまたはネクローシス細胞由来のＤＮＡであると考えられる。典型的には、ｃｆＤＮＡはタンパク質（例えば、ヒストン）に結合し、ヌクレアーゼによって保護される。ｃｆＤＮＡは、非侵襲的出生前検査（ＮＩＰＴ）、臓器移植、心筋症、マイクロバイオーム、およびがんのバイオマーカーとして用いることができる。別の実施形態では、試料は、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む。理論に拘束されることを望まないが、一部の実施形態では、ｃｔＤＮＡは、腫瘍細胞対非腫瘍細胞に由来するそれを識別することができる、遺伝的またはエピジェネティックな変化（例えば、体細胞性変化またはメチル化シグネチャー）を有するｃｆＤＮＡであると考えられる。別の実施形態では、試料は、循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）を含む。理論に拘束されることを望まないが、一部の実施形態では、ＣＴＣは、原発性または転移性腫瘍から循環に放出される細胞であると考えられる。一部の実施形態では、ＣＴＣアポトーシスは、血液／リンパ中のｃｔＤＮＡの供給源である。
【０３０２】
一部の実施形態では、生物学的試料は、骨髄；血液；血球；腹水；組織もしくは細針生検試料；細胞を含む体液；浮遊核酸；喀痰；唾液；尿；脳脊髄液、腹腔液；胸水；糞便；リンパ；婦人科液；皮膚スワブ；膣スワブ；口腔スワブ；鼻腔スワブ；洗浄液または乳管洗浄物もしくは気管支肺胞洗浄物などの洗浄物；吸引物；擦過物；骨髄標本；組織生検標本；手術標本；糞便、他の体液、分泌物、および／または排泄物；および／またはそこからの細胞などであるり得るかまたはそれを含み得る。一部の実施形態では、生物学的試料は、個体から得られた細胞であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、得られた細胞は、試料が得られた個体由来の細胞であるかまたはそれを含む。
【０３０３】
一部の実施形態では、試料は、任意の適切な手段によって目的とする供給源から直接得られる「一次試料」である。例えば、一部の実施形態では、一次生物学的試料は、生検（例えば、細針吸引または組織生検）、手術、体液（例えば、血液、リンパ液または糞便）の回収などから選択される方法によって得られる。一部の実施形態では、文脈から明らかであるように、用語「試料」は、一次試料を処理することによって（例えば、１つ以上の成分を除去することによって、および／または１つ以上の薬剤を添加することによって）、例えば、半透膜を用いてろ過することによって得られる調製物を指す。このような「処理された試料」は、例えば、試料から抽出された、または一次試料を、ｍＲＮＡの増幅もしくは逆転写、特定の成分の単離および／もしくは精製などの技術に供することによって得られた核酸またはタンパク質などを含み得る。
【０３０４】
ある実施形態では、試料は、腫瘍、例えば、腫瘍細胞または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）と関連する細胞である。一実施形態では、試料は、１つ以上の前がん細胞または悪性細胞を含む。ある実施形態では、試料は、血液学的悪性腫瘍（または異型前がん）、例えば、本明細書に記載される血液学的悪性腫瘍（または異型前がん）から取得される。ある種の実施形態では、試料は、固形腫瘍、軟組織腫瘍、または転移性病変から獲得される。他の実施形態では、試料は、外科的切除縁からの組織または細胞を含む。別の実施形態では、試料は、１つ以上の循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）（例えば、血液試料から獲得されたＣＴＣ）を含む。ある実施形態では、試料は、腫瘍と関連しない細胞、例えば、非腫瘍細胞または末梢血リンパ球である。
【０３０５】
本明細書で使用される「感受性」は、配列の不均質な集団における配列変異体を検出する方法の能力の尺度である。ある方法は、仮に配列変異体が試料中の配列の少なくともＦ％として存在する試料を与えたとして、本方法が、Ｃ％の信頼度で、その時間のＳ％、配列を検出することができた場合、Ｆ％の変異体に対してＳ％の感受性を有する。一例として、仮に変異体配列が試料中の配列の少なくとも５％として存在する試料を与えたとして、本方法は、９９％の信頼度で、１０回のうち９回、配列を検出することができた場合、５％の変異体に対して９０％の感受性を有する（Ｆ＝５％；Ｃ＝９９％；Ｓ＝９０％）。例示的な感受性は、Ｃ＝９０％、９５％、９９％、および９９．９％の信頼度レベルで、Ｆ＝１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％における配列変異体についてＳ＝９０％、９５％、９９％の感受性を含む。
【０３０６】
本明細書で使用される「特異性」は、真に存在する配列変異体を配列決定アーチファクトまたは他の密接に関連する配列から区別する方法の能力の尺度である。これは、偽陽性検出を回避する能力である。偽陽性検出は、試料調製中に目的とする配列に導入された誤差、配列決定誤差、または遺伝子ファミリーの偽遺伝子もしくは核酸分子のような密接に関連した配列の不注意な配列決定から生じ得る。ある方法は、仮に、ＸＴｒｕｅ配列が真に変異体であり、ＸＮｏｔ  ｔｒｕｅが真に変異体ではないＮＴｏｔａｌ配列の試料セットに適用された場合、真に変異体ではないもののうち少なくともＸ％を非変異体として選択するならば、Ｘ％の特異性を有する。例えば、ある方法は、仮に、５００個の配列が真に変異体であり、５００個が真に変異体ではない１，０００個の配列の試料セットに適用された場合、真に変異体ではない５００個の配列のうちの９０％を非変異体として選択するならば、９０％の特異性を有する。例示的特異性は、９０、９５、９８、および９９％を含む。
【０３０７】
本明細書で使用される「腫瘍核酸」とは、腫瘍またはがん由来の核酸分子を指す。典型的には、それは、ＤＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、腫瘍もしくはがん試料由来のものである。一部の実施形態では、腫瘍核酸試料は、精製または単離される（例えば、それは、その天然状態から除去される）。一部の実施形態では、腫瘍核酸はｃｆＤＮＡである。一部の実施形態では、腫瘍核酸は、ｃｔＤＮＡである。一部の実施形態では、腫瘍核酸は、ＣＴＣ由来のＤＮＡである。
【０３０８】
「対照核酸」または「参照核酸」とは、本明細書で使用される場合、対照または基準試料由来の核酸分子を指す。典型的には、それは、ＤＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ由来のｃＤＮＡであり、遺伝子または遺伝子産物の変化もしくは変動を含まない。ある種の実施形態では、参照または対照核酸試料は、野生型または非突然変異配列である。一部の実施形態では、参照核酸試料は、精製または単離される（例えば、それは、その天然状態から除去される）。他の実施形態では、参照核酸試料は、血液対照、正常な隣接組織（ＮＡＴ）、または同一もしくは異なる対象由来の任意の他の非がん性試料からのものである。一部の実施形態では、参照核酸試料は、正常なＤＮＡ混合物を含む。一部の実施形態では、正常なＤＮＡ混合物は、プロセス適合対照である。一部の実施形態では、参照核酸試料は、生殖系列変異体を有する。一部の実施形態では、参照核酸試料は、例えば、陰性対照として役立つ体細胞性変化を有さない。
【０３０９】
核酸分子を「配列決定すること」は、分子（例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、またはＲＮＡ分子に由来するｃＤＮＡ分子）中の少なくとも１ヌクレオチドの同一性を決定することを必要とする。実施形態では、分子中のヌクレオチドの全て未満の同一性が決定される。他の実施形態では、分子中のヌクレオチドの大部分または全部の同一性が決定される。
【０３１０】
本明細書で使用される「閾値」は、対象間隔（例えば、サブゲノム間隔または発現されたサブゲノム間隔）にヌクレオチド値を割り当てるために存在するのに必要なリード数の関数である値である。例えば、それは、サブゲノム間隔におけるそのヌクレオチド位置にそのヌクレオチド値を割り当てるのに必要とされる、ヌクレオチド位置で特定のヌクレオチド値、例えば、「Ａ」を有するリードの数の関数である。閾値は、例えば、多数のリード、例えば整数として（またはその関数として）、または値を有するリードの比率として表すことができる。例として、閾値がＸであり、「Ａ」のヌクレオチド値を有するＸ＋１個のリードが存在する場合、「Ａ」の値は、対象間隔の位置（例えば、サブゲノム間隔または発現されたサブゲノム間隔）に割り当てられる。閾値はまた、突然変異または変異体期待値、突然変異頻度、またはベイズ事前分布の関数として表すことができる。ある実施形態では、突然変異頻度は、ヌクレオチド値をコールするために、ある位置にヌクレオチド値、例えば、ＡまたはＧを有するリードの数または比率を必要とする。実施形態では、閾値は、突然変異期待値、例えば、突然変異頻度、および腫瘍タイプの関数であり得る。例えば、ヌクレオチド位置における変異体は、患者が第１の腫瘍タイプを有する場合には第１の閾値を、患者が第２の腫瘍タイプを有する場合には第２の閾値を有することができる。
【０３１１】
本明細書で使用される場合、「標的核酸分子」とは、核酸ライブラリーから単離することを望む核酸分子を指す。一実施形態では、標的核酸分子は、本明細書に記載されるように、腫瘍核酸分子、参照核酸分子、または対照核酸分子であり得る。
【０３１２】
「腫瘍核酸分子」または他の類似の用語（例えば、「腫瘍またはがん関連核酸分子」）は、本明細書で使用される場合、腫瘍細胞からの配列を有する核酸分子を指す。一実施形態では、腫瘍核酸分子は、がん性表現型に関連する変化（例えば、突然変異）を有する配列（例えば、ヌクレオチド配列）を有する対象間隔を含む。他の実施形態では、腫瘍核酸分子は、野生型配列（例えば、野生型ヌクレオチド配列）を有する対象間隔を含む。例えば、がん細胞に存在するヘテロ接合またはホモ接合の野生型対立遺伝子からの対象間隔。腫瘍核酸分子は、参照核酸分子を含むことができる。
【０３１３】
「参照核酸分子」または他の類似の用語（例えば、「対照核酸分子」）は、本明細書で使用される場合、がん性表現型と関連しない配列（例えば、ヌクレオチド配列）を有する対象間隔を含む核酸分子を指す。一実施形態では、参照核酸分子は、突然変異した場合にがん性表現型と関連する遺伝子または遺伝子産物の野生型または非突然変異ヌクレオチド配列を含む。基準核酸分子は、がん細胞または非がん細胞に存在することができる。
【０３１４】
「変異体」とは、本明細書で使用される場合、１を超える構造、例えば、多型遺伝子座における対立遺伝子を有することができるサブゲノム間隔で存在することができる構造を指す。
【０３１５】
「単離された」核酸分子は、核酸分子の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。ある種の実施形態では、「単離された」核酸分子は、核酸が由来する生物体のゲノムＤＮＡ中の核酸（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）に天然に隣接する配列（タンパク質をコードする配列など）を含まない。例えば、種々の実施形態では、単離された核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然に隣接する約５ｋＢ未満、約４ｋＢ未満、約３ｋＢ未満、約２ｋＢ未満、約１ｋＢ未満、約０．５ｋＢ未満、または約０．１ｋＢ未満のヌクレオチド配列を含むことができる。さらに、ＲＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子などの「単離された」核酸分子は、他の細胞材料または培地を実質的に含まないことができ、例えば、組換え技術によって生成される場合、または化学的に合成される場合など、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないことができる。
【０３１６】
「他の細胞材料または培地を実質的に含まない」という用語は、核酸分子の調製物を含み、この分子は、それが単離されるかまたは組換え的に生成される細胞の細胞成分から分離される。したがって、細胞材料を実質的に含まない核酸分子は、他の細胞材料または培地の約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、または約５％未満（乾燥重量）を有する核酸分子の調製物を含む。
【０３１７】
本明細書で使用される場合、「ＸはＹの関数である」とは、例えば、１つの変数Ｘが、別の変数Ｙと関連付けられることを意味する。一実施形態では、ＸがＹの関数である場合、ＸとＹとの間の因果関係が暗示され得るが、必ずしも存在しない。
【０３１８】
見出し、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｉ）などは、明細書および特許請求の範囲を読みやすくするためにのみ提示される。明細書または特許請求の範囲における見出しの使用は、工程または要素をアルファベット順もしくは数字順またはそれらが提示される順序で行うことを必要としない。明細書または特許請求の範囲における見出しの使用もまた、全ての工程または要素の実施を必要としない。
【０３１９】
標的捕捉試薬の競合
【０３２０】
ハイブリッド捕捉（例えば、溶液または固体相中）は、全ゲノムまたはトランスクリプトームライブラリーからの目的とする遺伝子を濃縮するために使用することができる。例えば、ハイブリダイゼーション反応は、５’ビオチン化標的捕捉試薬（例えば、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＲＮＡ））を使用して、標的領域にハイブリダイズし、その後、ストレプトアビジン被覆した常磁性ビーズに対するｄｓＤＮＡ捕捉複合体の親和性捕捉、オフ標的配列を除去するためのバッファーでのストリンジェント洗浄、および標的分子を増幅するための濃縮後ＰＣＲを行うことができる。一部の実施形態では、目標は、標的領域全体にわたってさえカバレッジを有することであるが、標的捕捉試薬セットにおける標的全体にわたるカバレッジの変動は、標的配列特異的であり得、高いＧＣまたはＡＴ含有量および反復配列は、捕捉効率の過剰または過小をもたらすことができる。インプット全ゲノムライブラリーにおける固有の標的の効率的な捕捉を駆動するために、過剰の冗長な（例えば＞５０×）、タイリング標的捕捉試薬（例えば、ベイト）が、典型的には捕捉反応において使用される。標的捕捉試薬の過剰および標的全体での捕捉効率の差により、標的あたりのカバレッジは、一般的に予測可能であり、試料タイプ全体で再現可能であるが、単に標的捕捉試薬の量を調整することによって高いおよび低いカバレッジに調整することはできない。
【０３２１】
ある種の用途（例えば、液体生検アッセイ）では、ゲノムライブラリー中に低頻度で存在し得る関心のある変化を有する領域に対して高い固有のカバレッジを有する必要がある。他の情報を与える領域（例えば、性別ＳＮＰ、試料同定ＳＮＰ、染色体コピー数コーリングのためのハプロタイピングＳＮＰ、もしくは腫瘍遺伝子変異量または他のゲノムシグネチャー、例えば、連続的／複雑なバイオマーカー）は、高いカバレッジを必要とせず、しばしば、標的捕捉試薬セット中の成分として捕捉され、過剰配列決定されるか、または別の反応中でより低い深度で配列決定される。ある種の実施形態では、同じ試料ライブラリーの多重反応を処理することは、限定されたライブラリー材料の使用において非効率的であり、アッセイワークフローに複雑さを加え、より高い配列決定コストを加える場合がある。
【０３２２】
本明細書に記載される方法は、例えば、非修飾の標的捕捉試薬および修飾された（例えば、５’ビオチン化された）標的捕捉試薬の組合せを使用して、標的ごとの特定の基準で標的カバレッジを調節する。ある種の実施形態では、標的捕捉試薬上の修飾（例えば、５’ビオチン）は、ゲノムライブラリー中のオン標的と非標的とを分離するためにのみ使用され、修飾されていない標的捕捉試薬を使用することにより、同じ反応条件を進行させることができるが、ゲノムライブラリーから引き出され、さらにその後に配列決定された標的の量は、修飾された標的捕捉試薬対非修飾の標的捕捉試薬の比によることがある。本明細書に記載される方法は、単一の標的捕捉試薬反応の使用を可能にし、低い、高い、および中間の標的カバレッジを有する単一の捕捉ライブラリーを有する。
【０３２３】
試料
【０３２４】
種々の組織が、本方法で使用される試料の供給源であり得る。ゲノムまたはサブゲノム核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、対象の試料（例えば、腫瘍細胞を含む試料、血液試料、血液成分試料、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む試料、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む試料、循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）を含む試料、または任意の正常対照（例えば、正常な隣接組織（ＮＡＴ））から単離され得る。
【０３２５】
一部の実施形態では、試料は、例えば、腫瘍由来の核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。一部の実施形態では、試料は、非核酸成分、例えば、細胞、タンパク質、炭水化物、または脂質、例えば、腫瘍由来のものをさらに含む。ある種の実施形態では、試料は、正常な細胞または組織由来の核酸をさらに含む。
【０３２６】
ある種の実施形態では、試料は、凍結試料として、またはホルムアルデヒドもしくはパラホルムアルデヒド固定したパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織調製物として保存される。例えば、試料は、マトリックス、例えば、ＦＦＰＥブロックまたは凍結試料に包埋することができる。ある種の実施形態では、試料は、血液試料である。ある種の実施形態では、組織試料は、血液成分試料である。ある種の実施形態では、試料は、血漿試料である。ある種の実施形態では、試料は、血清試料である。ある種の実施形態では、試料は、ｃｆＤＮＡ試料である。ある種の実施形態では、試料は、ｃｔＤＮＡ試料である。ある種の実施形態では、試料は、ＣＴＣ試料である。他の実施形態では、組織試料は、骨髄吸引物（ＢＭＡ）試料である。ある種の実施形態では、試料は、尿試料である。単離工程は、個々の染色体のフロー選別；および／または対象の試料（例えば、本明細書に記載される試料）のマイクロ解剖を含むことができる。
【０３２７】
他の実施形態では、試料は、１つ以上の前がん細胞または悪性細胞を含む。一部の実施形態では、試料は、固形腫瘍、軟組織腫瘍、または転移性病変から取得される。一部の実施形態では、試料は、血液学的悪性腫瘍または異型前がんから取得される。他の実施形態では、試料は、外科的切除縁からの組織または細胞を含む。ある種の実施形態では、試料は、腫瘍浸潤リンパ球を含む。試料は、組織学的に正常な組織であり得る。ある実施形態では、試料は、１つ以上の非悪性細胞を含む。
【０３２８】
ある種の実施形態では、ＦＦＰＥ試料は、以下の特性：（ａ）約１０ｍｍ２もしくはそれを超える、約２５ｍｍ２もしくはそれを超える、または約５０ｍｍ２もしくはそれを超える表面積を有し；（ｂ）約０．１ｍｍ３もしくはそれを超える、約０．２ｍｍ３もしくはそれを超える、約０．３ｍｍ３もしくはそれを超える、約０．４ｍｍ３もしくはそれを超える、約０．５ｍｍ３もしくはそれを超える、約０．６ｍｍ３もしくはそれを超える、約０．７ｍｍ３もしくはそれを超える、約０．８ｍｍ３もしくはそれを超える、約０．９ｍｍ３もしくはそれを超える、約１ｍｍ３もしくはそれを超える、約２ｍｍ３もしくはそれを超える、約３ｍｍ３もしくはそれを超える、約４ｍｍ３もしくはそれを超える、または約５ｍｍ３もしくはそれを超える試料体積を有し；（ｃ）約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、または約９０％以上の細胞性を有し；および／あるいは（ｄ）約１０，０００個以上、約２０，０００個以上、約３０，０００個以上、約４０，０００個以上、または約５０，０００個以上の有核細胞の数を有する、のうちの１つ、２つまたは全てを有する。
【０３２９】
一実施形態では、本方法は、試料、例えば、本明細書に記載される試料を取得することをさらに含む。試料は、直接的または間接的に取得することができる。ある実施形態では、試料は、例えば、単離または精製によって、ｃｆＤＮＡを含む試料から取得される。ある実施形態では、試料は、ｃｔＤＮＡを含む試料から、例えば、単離または精製によって取得される。ある実施形態では、試料は、悪性細胞と非悪性細胞（例えば、腫瘍浸潤リンパ球）の両方を含む試料から、例えば、単離または精製によって取得される。ある実施形態では、試料は、ＣＴＣを含む試料から、例えば、単離または精製によって取得される。
【０３３０】
他の実施形態では、本方法は、本明細書に記載される方法を用いて、試料、例えば、組織学的に正常な試料、例えば、外科的切除縁からの試料を評価することを含む。理論に拘束されることを望まないが、一部の実施形態では、組織学的に正常な組織（例えば、さもなければ組織学的に正常な組織の辺縁）から得られた試料は、本明細書に記載されるような変化をなお有し得ると考えられる。したがって、本方法は、検出された変化の存在に基づいて試料を再分類することをさらに含み得る。ある実施形態では、例えば、異なる対象由来の多重試料を同時に処理する。
【０３３１】
ある実施形態では、本方法は、単離された核酸試料を提供するために、試料から核酸を単離することを含む。ある実施形態では、本方法は、単離された対照核酸試料を提供するために、対照から核酸を単離することを含む。ある実施形態では、方法は、検出可能な核酸を含まない試料を拒絶することをさらに含む。
【０３３２】
ある実施形態では、本方法は、一次対照が利用可能であるかどうか、およびもし利用可能であれば、対照核酸（例えば、ＤＮＡ）を前記一次対照から単離することをさらに含む。ある実施形態では、本方法は、ＮＡＴが前記試料中に存在するか否かを決定することをさらに含む（例えば、一次対照試料が入手できない場合）。ある実施形態では、方法は、例えば、一次対照を伴わない試料中の前記ＮＡＴからの非腫瘍組織をマクロ解剖することによって、非腫瘍細胞について濃縮された部分試料を取得することをさらに含む。ある実施形態では、方法は、一次対照が利用できず、ＮＡＴが利用できないことを決定し、合致した対照なしで分析のために前記試料をマーキングすることをさらに含む。
【０３３３】
ある実施形態では、方法は、前記試料中の核酸収率の値を取得し、取得した値を参照基準と比較することを含み、例えば、前記取得した値が前記参照基準未満である場合、ライブラリー構築の前に核酸を増幅することをさらに含む。ある実施形態では、方法は、前記試料中の核酸断片のサイズの値を取得し、取得した値を参照基準、例えば、サイズ、例えば、平均サイズ、少なくとも３００、６００、または９００ｂｐのサイズと比較することをさらに含む。本明細書に記載されるパラメータは、この決定に応答して調整または選択することができる。
【０３３４】
ある種の実施形態では、本方法は、経年試料、例えば、経年ＦＦＰＥ試料から核酸を単離することを含む。経年試料は、例えば、１年、２年、３年、４年、５年、１０年、１５年、２０年、２５年、５０年、７５年、または１００年以上であり得る。
【０３３５】
核酸は、様々な大きさの試料から得ることができる。例えば、核酸は、５〜２００μｍまたはそれより大きい試料から単離することができる。例えば、試料は、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、７０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１５０μｍもしくは２００μｍまたはそれ以上を測定することができる。
【０３３６】
試料からのＤＮＡ単離のためのプロトコールは、当該技術分野において公知であり、例えば、国際特許出願公開第２０１２／０９２４２６号の実施例に提供される。ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒド固定したパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から核酸（例えば、ＤＮＡ）を単離するためのさらなる方法は、例えば、
Ｃｒｏｎｉｎ  Ｍ．ら、（２００４年）Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１６４巻（１号）：３５−４２頁；Ｍａｓｕｄａ  Ｎ．ら、（１９９９年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７巻（２２号）：４４３６−４４４３頁；ＳｐｅｃｈｔＫ．ら、（２００１年）Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１５８巻（２号）：４１９−４２９頁に開示され、Ａｍｂｉｏｎ  ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）全核酸単離プロトコール（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号ＡＭ１９７５、２００８年９月）、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６  ＦＦＰＥ  Ｐｌｕｓ  ＬＥＶ  ＤＮＡ  精製キットテクニカルマニュアル（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ＃ＴＭ３４９、２０１１年２月）、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）ＦＦＰＥ  ＤＮＡキットハンドブック（ＯＭＥＧＡ  ｂｉｏ−ｔｅｋ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ、製造番号Ｄ３３９９−００、Ｄ３３９９−０１、およびＤ３３９９−０２；２００９年６月）、ならびにＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  ＦＦＰＥ組織ハンドブック（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号３７６２５、２００７年１０月）が挙げられる。ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）全核酸単離キットは、高温でキシレンを使用して、パラフィン包埋した試料およびガラス繊維フィルターを可溶化し、核酸を捕捉する。Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６  ＦＦＰＥ  Ｐｌｕｓ  ＬＥＶ  ＤＮＡ精製キットは、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６装置とともに使用され、ＦＦＰＥ組織の１〜１０μｍの切片からゲノムＤＮＡを精製する。ＤＮＡは、シリカ被覆常磁性粒子（ＰＭＰ）を用いて精製され、低溶出量で溶出される。Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）ＦＦＰＥ  ＤＮＡキットは、ゲノムＤＮＡの単離にスピンカラムおよびバッファー系を使用する。ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  ＦＦＰＥ組織キットは、ゲノムおよびミトコンドリアＤＮＡの精製にＱＩＡａｍｐ（登録商標）  ＤＮＡマイクロ技術を使用する。血液からのＤＮＡ単離のためのプロトコールは、例えば、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６  ＬＥＶ血液ＤＮＡキットおよびＭａｘｗｅｌｌ  １６  Ｂｕｃｃａｌ  Ｓｗａｂ  ＬＥＶ  ＤＮＡ精製キット技術マニュアル（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ＃ＴＭ３３３、２０１１年１月１日）に開示されている。
【０３３７】
ＲＮＡ単離のためのプロトコールは、例えば、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６全ＲＮＡ精製キット技術会報（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ＃ＴＢ３５１、２００９年８月）に開示されている。
【０３３８】
単離された核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）は、常套的技術を実施することによって断片化またはせん断することができる。例えば、ゲノムＤＮＡは、物理的せん断法、酵素的切断法、化学的切断法、および当業者に周知である他の方法によって断片化することができる。核酸ライブラリーは、ゲノムの複雑性の全部または実質的に全部を含有することができる。これの関連で「実質的に全て」という用語は、手法の初期工程の間に、実際にはゲノム複雑性の何らかの望ましくない喪失が存在し得る可能性を指す。本明細書に記載される方法はまた、核酸ライブラリーがゲノムの一部である場合に、例えば、ゲノムの複雑性が設計により低下される場合に有用である。一部の実施形態では、ゲノムの任意の選択された部分は、本明細書に記載される方法とともに使用され得る。ある種の実施形態では、全エクソームまたはそのサブセットが単離される。
【０３３９】
ある種の実施形態では、本方法は、ライブラリー（例えば、本明細書に記載される核酸ライブラリー）を提供するために、試料から核酸を単離することをさらに含む。ある種の実施形態では、試料は、全ゲノム断片、サブゲノム断片、またはその両方を含む。単離された核酸は、核酸ライブラリーを調製するために使用することができる。全ゲノム断片またはサブゲノム断片からライブラリーを単離し、調製するためのプロトコールは、当該技術分野において公知である（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのゲノムＤＮＡ試料調製キット）。ある種の実施形態では、ゲノムまたはサブゲノムＤＮＡ断片は、対象の試料（例えば、本明細書に記載される試料）から単離される。一実施形態では、試料は、保存された標本、例えば、マトリックスに包埋された試料、例えば、ＦＦＰＥブロックまたは凍結試料である。ある種の実施形態では、単離工程は、個々の染色体のフロー選別；および／または試料の微小解剖を含む。ある種の実施形態では、核酸ライブラリーを生成するために使用される核酸の量は、５マイクログラム未満、１マイクログラム未満、または５００ｎｇ未満、２００ｎｇ未満、１００ｎｇ未満、５０ｎｇ未満、１０ｎｇ未満、５ｎｇ未満、または１ｎｇ未満である。
【０３４０】
さらに他の実施形態では、ライブラリーを生成するために使用される核酸は、ＲＮＡまたはＲＮＡ由来のｃＤＮＡを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、全細胞ＲＮＡを含む。他の実施形態では、ある種の豊富なＲＮＡ配列（例えば、リボソームＲＮＡ）が枯渇している。一部の実施形態では、全ＲＮＡ調製物中のポリ（Ａ）尾部ｍＲＮＡ画分が濃縮されている。一部の実施形態では、ｃＤＮＡは、ランダムプライムされたｃＤＮＡ合成法によって生成される。他の実施形態では、ｃＤＮＡ合成は、オリゴ（ｄＴ）含有オリゴヌクレオチドによってプライミングすることによって、成熟ｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾部で開始される。枯渇、ポリ（Ａ）濃縮、およびｃＤＮＡ合成の方法は、当業者に周知である。
【０３４１】
他の実施形態では、核酸は、物理的方法もしくは酵素的方法によって断片化またはせん断され、必要に応じて、合成アダプターに連結され、サイズ選択され（例えば、調製用ゲル電気泳動による）、増幅される（例えば、ＰＣＲによる）。ＤＮＡせん断のための代替の方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、国際特許出願公開第２０１２／０９２４２６号の実施例４に記載されている。例えば、代替のＤＮＡせん断法は、より自動化可能であり、および／またはより効率的であり得る（例えば、分解されたＦＦＰＥ試料を用いる）。ライブラリーの調製中にライゲーション工程を回避するために、ＤＮＡせん断法の代替物を使用することもできる。
【０３４２】
他の実施形態では、単離されたＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）は、断片化されるかまたはせん断される。一部の実施形態では、ライブラリーは、ゲノムＤＮＡの５０％未満、例えば、還元された表現であるゲノムＤＮＡのサブ画分、またはゲノムの画定された部分、例えば、他の手段によってサブ画分化されたものを含む。他の実施形態では、ライブラリーは、全てまたは実質的に全てのゲノムＤＮＡを含む。
【０３４３】
他の実施形態では、核酸の断片化されたおよびアダプター連結された群は、ハイブリッド選択の前に、明示的なサイズ選択または増幅なしに使用される。一部の実施形態では、核酸は、当業者に周知である特異的または非特異的な核酸増幅法によって増幅される。一部の実施形態では、核酸は、例えば、ランダムプライム鎖置換増幅などの全ゲノム増幅法によって増幅される。
【０３４４】
本明細書に記載される方法は、少量の核酸、例えば、供給源のＤＮＡまたはＲＮＡ量が制限されている場合に（例えば、全ゲノム増幅後でさえ）用いて行うことができる。一実施形態では、核酸は、核酸試料の約５μｇ、４μｇ、３μｇ、２μｇ、１μｇ、０．８μｇ、０．７μｇ、０．６μｇ、０．５μｇ、もしくは４００ｎｇ、３００ｎｇ、２００ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ、１ｎｇ、またはそれ未満を含む。例えば、典型的には、５０〜１００ｎｇのゲノムＤＮＡから開始することができる。しかしながら、ハイブリダイゼーション工程、例えば、溶液ハイブリダイゼーションの前に（例えば、ＰＣＲを用いて）ゲノムＤＮＡを増幅する場合には、より少ない量で開始することができる。したがって、ハイブリダイゼーション、例えば、溶液ハイブリダイゼーションの前にゲノムＤＮＡを増幅することは可能であるが、必須ではない。
【０３４５】
ある実施形態では、試料は、非がん細胞または非悪性細胞、例えば、腫瘍浸潤リンパ球からのＤＮＡ、ＲＮＡ（またはＲＮＡ由来のｃＤＮＡ）、またはその両方を含む。ある実施形態では、試料は、非がん細胞または非悪性細胞、例えば、腫瘍浸潤リンパ球からのＤＮＡ、ＲＮＡ（またはＲＮＡ由来のｃＤＮＡ）、またはその両方を含み、がん細胞または悪性細胞からのＤＮＡ、ＲＮＡ（またはＲＮＡ由来のｃＤＮＡ）、またはその両方を含まず、または本質的には含まない。
【０３４６】
ある実施形態では、試料は、がん細胞または悪性細胞からのＤＮＡ、ＲＮＡ（またはＲＮＡに由来するｃＤＮＡ）を含む。ある実施形態では、試料は、がん細胞または悪性細胞からのＤＮＡ、ＲＮＡ（またはＲＮＡ由来のｃＤＮＡ）を含み、非がん細胞または非悪性細胞、例えば、腫瘍浸潤リンパ球からのＤＮＡ、ＲＮＡ（またはＲＮＡ由来のｃＤＮＡ）、またはその両方を含まず、または本質的に含まない。
【０３４７】
ある実施形態では、試料は、非がん細胞または非悪性細胞、例えば、腫瘍浸潤リンパ球からのＤＮＡ、ＲＮＡ（またはＲＮＡ由来のｃＤＮＡ）、またはその両方、およびがん細胞または悪性細胞からのＤＮＡ、ＲＮＡ（またはＲＮＡ由来のｃＤＮＡ）、またはその両方を含む。
【０３４８】
ある種の実施形態では、試料は、がんを有する対象から取得される。例示的ながんには、限定されないが、Ｂ細胞がん、例えば、多発性骨髄腫、メラノーマ、乳がん、肺がん（非小細胞肺がんまたはＮＳＣＬＣなど）、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳または中枢神経系がん、末梢神経系がん、食道がん、子宮頸がん、子宮がんまたは子宮内膜がん、口腔または咽頭のがん、肝臓がん、腎臓がん、精巣がん、胆道がん、小腸がんまたは虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織のがん、腺がん、炎症性筋線維芽細胞腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、結腸がん、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、真性多血症、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、軟部肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、骨形成性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、髄様がん、肺がん、腎細胞がん、肝細胞がん、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫瘍、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、肝細胞がん、甲状腺がん、胃がん、頭頸部がん、小細胞がん、本態性血小板血症、免疫原性骨髄化生、好酸球増加症候群、全身性肥満細胞症、家族性過好酸球増加症、慢性好酸球性白血病、神経内分泌がん、カルシノイド腫瘍などが含まれる。
【０３４９】
ある実施形態では、がんは、血液学的悪性腫瘍（または異型前がん）である。本明細書で使用される場合、血液悪性腫瘍とは、造血またはリンパ組織の腫瘍、例えば、血液、骨髄、またはリンパ節に影響を与える腫瘍を指す。例示的な血液悪性腫瘍には、限定されないが、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、毛様細胞性白血病、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、または大顆粒リンパ球性白血病）、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫（例えば、古典的なホジキンリンパ腫または結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫）、菌状息肉症、非ホジキンリンパ腫（例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆体Ｂリンパ芽球性リンパ腫、またはマントル細胞リンパ腫）またはＴ細胞非ホジキンリンパ腫（菌状息肉症、未分化大細胞リンパ腫、または前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫））、原発性中枢神経系リンパ腫、セザリー症候群、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症）、慢性骨髄増殖性腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球増加症、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、または骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍が含まれる。本明細書で使用される「異型前がん」とは、まだ悪性ではないが、悪性になる準備が整っている組織を指す。
【０３５０】
一部の実施形態では、本明細書に記載される試料は、標本とも呼ばれる。
【０３５１】
一部の実施形態では、試料は、組織試料、血液試料または骨髄試料である。
【０３５２】
一部の実施形態では、血液試料は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ｃｆＤＮＡは、健康な組織、例えば、非疾患細胞、または腫瘍組織、例えば、腫瘍細胞からのＤＮＡを含む。一部の実施形態では、腫瘍組織由来のｃｆＤＮＡは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ｃｔＤＮＡ試料は、例えば、固形腫瘍、例えば、肺がん、乳がんまたは結腸がんを有する患者から得られる、例えば収集される。
【０３５３】
一部の実施形態では、試料、例えば、標本は、ホルマリン固定したパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）標本である。一部の実施形態では、ＦＰＰＥ標本は、限定されないが、コア針生検、細針吸引物、または滲出液細胞学から選択される標本を含む。一部の実施形態では、試料は、ＦＰＰＥブロック、ならびに１つのオリジナルのヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色スライドを含む。一部の実施形態では、試料は、染色されていないスライド（例えば、正に荷電された、焼き付けられていない、厚さ４〜５ミクロンのスライド；例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のこのようなスライド）および１つ以上のＨ＆Ｅ染色スライドを含む。
【０３５４】
一部の実施形態では、試料は、ＦＰＰＥブロックまたは染色されていないスライド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個またはそれ以上の染色されていないスライドおよび１つ以上のＨ＆Ｅスライドを含む。一部の実施形態では、試料は、例えば、本明細書に記載されるような標準的な固定方法を用いて、ホルマリン固定され、パラフィンブロックに包埋された組織を含む。
【０３５５】
一部の実施形態では、試料は、少なくとも１〜３０ｍｍ２、例えば、約５〜２５ｍｍ２の表面積を含む。一部の実施形態では、試料は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｍｍ２、例えば、５ｍｍ２の表面積を含む。一部の実施形態では、試料は、少なくとも５ｍｍ２の表面積を含む。一部の実施形態では、試料は、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ｍｍ２、例えば２５ｍｍ２の表面積を含む。一部の実施形態では、試料は、２５ｍｍ２の表面積を含む。
【０３５６】
一部の実施形態では、試料は、少なくとも１〜５ｍｍ３、例えば、約２ｍｍ３の表面積を含む。一部の実施形態では、約２ｍｍ３の表面積は、約８０ミクロン、例えば、少なくとも８０ミクロンまたはそれ以上の深度で約２５ｍｍ２の表面積を有する試料を含む。
【０３５７】
一部の実施形態では、試料は、例えば、腫瘍核を含む、腫瘍含有量を含む。一部の実施形態では、試料は、少なくとも５〜５０％、１０〜４０％、１５〜２５％、または２０〜３０％の腫瘍核を有する腫瘍含有量を含む一部の実施形態では、試料は、少なくとも２０％の腫瘍核の腫瘍含有量を含む。一部の実施形態では、試料は、約３０％の腫瘍核の腫瘍含有量を含む。一部の実施形態では、腫瘍核パーセントは、例えば、腫瘍細胞数を、核を有する全ての細胞の総数で割ることによって計算される。一部の実施形態では、試料が、例えば、肝細胞を含む肝臓試料である場合、より高い腫瘍含有量が必要とされ得る。一部の実施形態では、肝細胞は、例えば、他の、例えば、非肝細胞体細胞のＤＮＡコンテントの２倍（twice）、例えば、２倍（double）の核を有する。一部の実施形態では、例えば、本明細書に記載されるように、変化の検出の感受性は、試料の腫瘍含有量に依存し、例えば、より低い腫瘍含有量は、検出のより低い感受性をもたらすことができる。
【０３５８】
一部の実施形態では、ＤＮＡは、試料由来の有核細胞から抽出される。一部の実施形態では、試料は、例えば、試料が主に赤血球、過剰な細胞質を含む病変細胞、または線維化を伴う組織で構成される場合、低い有核細胞性を有する。一部の実施形態では、低い有核細胞性を有する試料は、ＤＮＡ抽出のために、より多くの、例えば、より大きな組織容積、例えば、２ｍｍ３より大きい組織容積を必要とすることができる。
【０３５９】
一部の実施形態では、ＦＰＰＥ試料、例えば、標本は、核酸の完全性を保存するために、標準的な固定方法を用いて調製される。一部の実施形態では、標準的な固定方法は、１０％中性緩衝ホルマリン、例えば、６〜７２時間を使用することを含む。一部の実施形態では、本方法は、ホランドのブインズ、Ｂ５、ＡＺＦなどの固定剤を含まない。一部の実施形態では、本方法は、脱灰を含まない。一部の実施形態では、本方法は、脱灰を含む。実施形態では、脱灰は、ＥＤＴＡを用いて行われる。一部の実施形態では、強酸、例えば、塩酸、硫酸またはピクリン酸は、脱灰に使用されない。
【０３６０】
一部の実施形態では、試料は、ＦＰＰＥブロックまたは染色されていないスライド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個またはそれ以上の染色されていないスライドおよび１つ以上のＨ＆Ｅスライドを含む。一部の実施形態では、試料は、例えば、本明細書に記載されるような標準的な固定方法を用いて、ホルマリン固定され、パラフィンブロックに包埋された組織を含む。
【０３６１】
一部の実施形態では、試料は、末梢全血または骨髄吸引物を含む。一部の実施形態では、試料、例えば、病変組織は、少なくとも２０％の有核要素を含む。一部の実施形態では、末梢全血試料または骨髄吸引物試料は、約２．５ｍｌの容積で回収される。一部の実施形態では、血液試料は、例えば、常温、例えば、４３〜９９°Ｆまたは６〜３７℃で、回収と同じ日に発送される。一部の実施形態では、血液試料は、凍結または冷蔵されない。
【０３６２】
一部の実施形態では、試料は、単離された、例えば、抽出された、核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。一部の実施形態では、単離された核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを、例えば、ヌクレアーゼを含まない水に含む。
【０３６３】
一部の実施形態では、試料は、血液試料、例えば、末梢全血試料を含む。一部の実施形態では、末梢全血試料は、例えば、チューブに、例えば、チューブあたり約８．５ｍｌの血液を有する２つのチューブに回収される。一部の実施形態では、末梢全血試料は、例えば、ＣＬＳＩ  Ｈ３−Ａ６に従って静脈穿刺によって回収される。一部の実施形態では、血液は、例えば、穏やかな反転によって、例えば、約８〜１０回、直ちに混合される。一部の実施形態では、反転は、例えば、手首の完全な、例えば、１８０°の旋回によって行われる。一部の実施形態では、血液試料は、例えば、常温、例えば、回収と同じ日に、４３〜９９°Ｆまたは６〜３７℃で発送される。一部の実施形態では、血液試料は、凍結または冷蔵されない。一部の実施形態では、回収された血液試料は、例えば、４３〜９９°Ｆまたは６〜３７℃で保持される。
【０３６４】
対象の選択
【０３６５】
一部の実施形態では、試料は、例えば、状態または疾患、例えば、過剰増殖性疾患（例えば、本明細書に記載される）または非がん性適応症を有する対象、例えば、患者から得られ、例えば、回収される。一部の実施形態では、疾患は、過剰増殖性疾患である。一部の実施形態では、過剰増殖性疾患は、がん、例えば、固形腫瘍または血液学的がんである。一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。一部の実施形態では、がんは、血液学的がん、例えば、白血病またはリンパ腫である。
【０３６６】
一部の実施形態では、患者は、標的療法、例えば、１つ以上の標的療法で以前に治療されている。一部の実施形態では、標的療法で以前に治療された患者については、標的療法後の試料、例えば、標本が得られる、例えば収集される。一部の実施形態では、標的療法後の試料は、標的療法の完了後に得られた、例えば回収された試料である。
【０３６７】
一部の実施形態では、患者は、以前に標的療法で治療されたことがない。一部の実施形態では、以前に標的療法で治療されたことがない患者については、試料は、切除、例えば、最初の切除、または再発、例えば、療法後の疾患再発、例えば、非標的療法後の疾患再発を含む。一部の実施形態では、試料は、原発腫瘍もしくは転移、例えば、転移生検であるか、またはその一部である。一部の実施形態では、試料は、隣接部位、例えば、腫瘍細胞と隣接する部位と比較して、腫瘍、例えば、腫瘍細胞の最大パーセントを有する部位、例えば、腫瘍部位から得られる。一部の実施形態では、試料は、隣接する部位、例えば、腫瘍細胞と隣接する部位と比較して最大の腫瘍焦点を有する部位、例えば、腫瘍部位から得られる。
【０３６８】
一部の実施形態では、疾患は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、メラノーマ、乳がん、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、または卵巣がんから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＮＳＣＬＣは、例えば、ＥＧＦＲ変化（例えば、エクソン１９欠失またはエクソン２１  Ｌ８５８Ｒ変化）、ＡＬＫ再配列、またはＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅを有するＮＳＣＬＣを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるメラノーマは、ＢＲＡＦ変化、例えば、Ｖ６００Ｅおよび／またはＶ６００Ｋを有するメラノーマを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される乳がんは、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）増幅を有する乳がんを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される結腸直腸がんは、野生型ＫＲＡＳ、例えば、コドン１２および／もしくは１３における突然変異の欠如、またはコドン２、３、および／もしくは４における突然変異の欠如を有する結腸直腸がんを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される結腸直腸がんは、野生型ＮＲＡＳを有する結腸直腸がん、例えば、コドン２、３、および／または４における突然変異の欠如を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される結腸直腸がんは、例えば、本明細書に記載されるような野生型ＫＲＡＳ、および、例えば、本明細書に記載されるような野生型ＮＲＡＳを有する結腸直腸がんを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される卵巣がんは、ＢＲＣＡ１および／またはＢＲＣＡ２変化を有する卵巣がんを含む。
【０３６９】
標的捕捉試薬の設計および構成
【０３７０】
一部の実施形態では、標的捕捉試薬は、標的分子に結合し、それによって標的分子の捕捉を可能にすることができる分子である。例えば、標的捕捉試薬は、ベイト、例えば、標的核酸分子、例えば、標的核酸にハイブリダイズすることができ（例えば、相補的であり）、それによって標的核酸の捕捉を可能にすることができるＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。一部の実施形態では、標的捕捉試薬、例えば、ベイトは、捕捉オリゴヌクレオチドである。ある種の実施形態では、標的核酸は、ゲノムＤＮＡ分子である。他の実施形態では、標的核酸は、ＲＮＡ分子、またはＲＮＡ分子に由来するｃＤＮＡ分子である。一実施形態では、標的捕捉試薬は、ＤＮＡ分子である。一実施形態では、標的捕捉試薬は、ＲＮＡ分子である。他の実施形態では、標的捕捉試薬は、標的捕捉試薬によって形成されたハイブリッドと標的捕捉試薬にハイブリダイズした核酸分子との結合および分離を可能にする結合対の第１のメンバーを含む。一実施形態では、標的捕捉試薬は、溶液相ハイブリダイゼーションに適している。一実施形態では、標的捕捉試薬は、固体相ハイブリダイゼーションに適している。一実施形態では、標的捕捉試薬は、溶液相と固体相ハイブリダイゼーションの両方に適している。
【０３７１】
典型的には、ＤＮＡ分子は、標的捕捉試薬配列として使用されるが、ＲＮＡ分子もまた使用され得る。一部の実施形態では、ＤＮＡ分子標的捕捉試薬は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）であり得る。
【０３７２】
一部の実施形態では、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖は、ＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖よりも安定であり、したがって、核酸の潜在的により良好な捕捉を提供する。ＲＮＡ標的捕捉試薬は、限定されないが、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用するＤＮＡ分子のデノボ化学合成および転写を含む、当該技術分野において公知である方法を使用して、本明細書の他の箇所に記載されるように作製することができる。一実施形態では、標的捕捉試薬配列は、例えば、鋳型としてヒトＤＮＡまたはプールされたヒトＤＮＡ試料を使用するＰＣＲなどの公知の核酸増幅方法を使用して生成される。次に、オリゴヌクレオチドをＲＮＡ標的捕捉試薬に変換することができる。一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写は、例えば、オリゴヌクレオチドの一端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を付加することに基づいて使用される。一実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、例えば、ＰＣＲまたは別の核酸増幅方法を用いて、例えば、各標的特異的プライマー対の１つのプライマーをＲＮＡプロモーター配列で尾引きすることによって、標的捕捉試薬配列を増幅または再増幅することにより標的捕捉試薬の末端に付加される。一実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、またはＴ３ポリメラーゼである。一実施形態では、ＲＮＡ標的捕捉試薬は、タグ、例えば、親和性タグで標識される。一実施形態では、ＲＮＡ標的捕捉試薬は、例えば、ビオチン化ＵＴＰを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって作製される。別の実施形態では、ＲＮＡ標的捕捉試薬は、ビオチンなしで生成され、次に、ビオチンは、当該技術分野において周知である方法、例えば、ソラレン架橋を用いてＲＮＡ分子に架橋される。一実施形態では、ＲＮＡ標的捕捉試薬は、ＲＮａｓｅ耐性ＲＮＡ分子であり、これは、例えば、転写中に修飾されたヌクレオチドを使用して、ＲＮａｓｅ分解に抵抗性であるＲＮＡ分子を生成することによって作製することができる。一実施形態では、ＲＮＡ標的捕捉試薬は、二本鎖ＤＮＡ標的の１本鎖のみに対応する。典型的には、このようなＲＮＡ標的捕捉試薬は、自己相補的ではなく、ハイブリダイゼーション駆動因子としてより効果的である。
【０３７３】
標的捕捉試薬は、標的捕捉試薬が参照配列の標的を選択するのに最適であるように、参照配列から設計することができる。一部の実施形態では、標的捕捉試薬配列は、混合塩基（例えば、縮重）を使用して設計される。例えば、混合塩基（複数可）は、両方の対立遺伝子（例えば、ＳＮＰと非ＳＮＰ；突然変異体と非突然変異体）を捕捉するように標的捕捉試薬配列を最適化するために、共通のＳＮＰまたは突然変異の位置（複数可）で標的捕捉試薬配列に含まれ得る。一部の実施形態では、全ての公知の配列変動（またはそのサブセット）は、混合された縮重オリゴヌクレオチドを用いるよりはむしろ、多重のオリゴヌクレオチド標的捕捉試薬を用いて標的化することができる。
【０３７４】
ある種の実施形態では、標的捕捉試薬は、長さが約１００ヌクレオチド〜３００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド（または複数のオリゴヌクレオチド）を含む。典型的には、標的捕捉試薬は、長さが約１３０ヌクレオチド〜２３０ヌクレオチド、または約１５０ヌクレオチド〜２００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド（または複数のオリゴヌクレオチド）を含む。他の実施形態では、標的捕捉試薬は、長さが約３００ヌクレオチド〜１０００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド（または複数のオリゴヌクレオチド）を含む。
【０３７５】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド中の標的核酸分子特異的配列は、長さが約４０〜１０００ヌクレオチド、約７０〜３００ヌクレオチド、約１００〜２００ヌクレオチドであり、典型的には、長さは約１２０〜１７０ヌクレオチドである。
【０３７６】
一部の実施形態では、標的捕捉試薬は、結合対の第１のメンバーを含む。結合対の第１のメンバーは、標的捕捉試薬上の親和性タグであり得る。一部の実施形態では、親和性タグは、ビオチン分子またはハプテンである。一部の実施形態では、結合対の第１のメンバーは、結合対の第２のメンバー、例えば、アビジン分子、またはハプテンもしくはその抗原結合断片に結合する抗体に結合することによって、ハイブリダイゼーション混合物から標的捕捉試薬／核酸分子ハイブリッドを分離することを可能にする。
【０３７７】
他の実施形態では、標的捕捉試薬中のオリゴヌクレオチドは、同じ標的核酸分子配列に対してフォワードおよびリバース相補配列を含み、それによって逆相補核酸分子特異的配列を有するオリゴヌクレオチドもまた逆相補ユニバーサル尾部を有する。これにより、同じ鎖である、すなわち、互いに相補的でないＲＮＡ転写物が生じ得る。
【０３７８】
他の実施形態では、標的捕捉試薬は、１つ以上の位置に縮重または混合塩基を含有するオリゴヌクレオチドを含む。さらに他の実施形態では、標的捕捉試薬は、単一の種または生物体群集の集団中に存在する多重のまたは実質的に全ての公知の配列変異体を含む。一実施形態では、標的捕捉試薬は、ヒト集団に存在する多重のまたは実質的に全ての公知の配列変異体を含む。
【０３７９】
他の実施形態では、標的捕捉試薬は、ｃＤＮＡ配列を含むかまたはｃＤＮＡ配列に由来する。他の実施形態では、標的捕捉試薬は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはクローン化ＤＮＡから増幅された増幅産物（例えば、ＰＣＲ産物）を含む。
【０３８０】
他の実施形態では、標的捕捉試薬は、ＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、このセットは、化学的、酵素的に修飾された、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡ分子を含み、限定されないが、より安定であり、ＲＮａｓｅに対して抵抗性であるものが含まれる。
【０３８１】
さらに他の実施形態では、標的捕捉試薬は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１０／００２９４９８号およびＧｎｉｒｋｅ，Ａ．ら（２００９年）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７巻（２号）：１８２−１８９頁に記載されている方法によって生成される。例えば、ビオチン化ＲＮＡ標的捕捉試薬は、マイクロアレイ上で最初に合成された、合成の長いオリゴヌクレオチドのプールを得て、および標的捕捉試薬配列を生成するためにオリゴヌクレオチドを増幅することによって製造することができる。一部の実施形態では、標的捕捉試薬は、標的捕捉試薬配列の一端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を付加し、およびＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡ配列を合成することによって生成される。一実施形態では、合成オリゴデオキシヌクレオチドのライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．などの供給業者から得ることができ、公知の核酸増幅法を用いて増幅することができる。
【０３８２】
したがって、上記の標的捕捉試薬を作製する方法が提供される。本方法は、例えば、１つ以上の標的捕捉試薬、例えば、標的特異的なベイトオリゴヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される１つ以上の突然変異捕捉、参照または制御オリゴヌクレオチド配列）を選択すること；標的捕捉試薬のプール、例えば、標的特異的なベイトオリゴヌクレオチド配列のプールを得ること（例えば、マイクロアレイ合成により、標的特異的なベイトオリゴヌクレオチド配列のプールを合成すること）；および場合により、標的捕捉試薬、例えば、標的特異的なベイトオリゴヌクレオチド配列を増幅することを含む。
【０３８３】
他の実施形態では、本方法は、１つ以上のビオチン化プライマーを用いてオリゴヌクレオチドを（例えば、ＰＣＲにより）増幅することをさらに含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、マイクロアレイに付着された各オリゴヌクレオチドの末端にユニバーサル配列を含む。本方法はさらに、オリゴヌクレオチドからユニバーサル配列を除去することを含み得る。このような方法はまた、オリゴヌクレオチドの相補鎖の除去、オリゴヌクレオチドのアニーリング、およびオリゴヌクレオチドの延長を含むことができる。これらの実施形態の一部では、オリゴヌクレオチドを（例えば、ＰＣＲにより）増幅する方法は、１つ以上のビオチン化プライマーを使用する。一部の実施形態では、本方法は、増幅されたオリゴヌクレオチドをサイズ選択することをさらに含む。
【０３８４】
一実施形態では、ＲＮＡ標的捕捉試薬が作製される。本方法は、本明細書に記載される方法に従って、標的捕捉試薬配列セットを生成し、標的捕捉試薬配列の一端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を付加し、およびＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡ配列を合成することを含む。ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、またはＴ３  ＲＮＡポリメラーゼから選択することができる。他の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、標的捕捉試薬配列を（例えば、ＰＣＲにより）増幅することによって、標的捕捉試薬配列の末端に付加される。標的捕捉試薬配列がゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡからの特異的プライマー対を用いてＰＣＲにより増幅される実施形態では、各対における２つの特異的プライマーのうちの１つの５’末端にＲＮＡプロモーター配列を付加することは、標準方法を用いてＲＮＡ標的捕捉試薬に転写することができるＰＣＲ産物をもたらす。
【０３８５】
他の実施形態では、標的捕捉試薬は、鋳型としてヒトＤＮＡまたはプールされたヒトＤＮＡ試料を用いて生成することができる。このような実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される。他の実施形態では、増幅されたオリゴヌクレオチドは、ローリングサークル増幅または超分岐ローリングサークル増幅によって再増幅される。また、同じ方法を使用して、鋳型としてヒトＤＮＡまたはプールされたヒトＤＮＡ試料を用いて標的捕捉試薬配列を生成することができる。同じ方法をまた使用して、限定されないが、制限消化、パルスフィールドゲル電気泳動、フロー選別、ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離法、選択的な動力学的再結合、染色体調製物の微小解剖、および当業者に公知である他の分画法を含む、他の方法によって得られるゲノムのサブ画分を用いて標的捕捉試薬配列を生成することができる。
【０３８６】
ある種の実施形態では、複数の標的捕捉試薬中の標的捕捉試薬（例えば、ベイト）の数は、１，０００未満である。他の実施形態では、複数の標的捕捉試薬中の標的捕捉試薬（例えば、ベイト）の数は、１，０００を超え、５，０００を超え、１０，０００を超え、２０，０００を超え、５０，０００を超え、１００，０００を超え、または５００，０００を超える。
【０３８７】
標的捕捉試薬配列の長さは、約７０ヌクレオチド〜１０００ヌクレオチドであり得る。一実施形態では、標的捕捉試薬長は、長さが約１００〜３００ヌクレオチド、１１０〜２００ヌクレオチド、または１２０〜１７０ヌクレオチドである。上述のものに加えて、長さにして約７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、および９００ヌクレオチドの中間オリゴヌクレオチド長が、本明細書に記載される方法に使用され得る。一部の実施形態では、約７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、または２３０塩基のオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【０３８８】
各標的捕捉試薬配列は、標的特異的な（例えば、核酸分子特異的な）標的捕捉試薬配列および一方または両方の末端上のユニバーサル尾部を含むことができる。本明細書で使用される場合、用語「標的捕捉試薬配列」は、標的特異的な標的捕捉試薬配列、または標的特異的な「標的捕捉試薬配列」およびオリゴヌクレオチドの他のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド全体を指すことができる。標的捕捉試薬中の標的特異的配列は、長さが約４０ヌクレオチド〜１０００ヌクレオチドである。一実施形態では、標的特異的配列は、長さが約７０ヌクレオチド〜３００ヌクレオチドである。別の実施形態では、標的特異的配列は、長さが約１００ヌクレオチド〜２００ヌクレオチドである。さらに別の実施形態では、標的特異的配列は、長さが約１２０ヌクレオチド〜１７０ヌクレオチド、典型的には長さが約１２０ヌクレオチドである。また、上述のものに加えて中間の長さを本明細書に記載される方法において使用することができ、例えば、標的特異的配列は、長さが約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、および９００ヌクレオチドであり、ならびに標的特異的配列の長さは上述の長さの間の長さである。
【０３８９】
一実施形態では、標的捕捉試薬は、長さが約５０〜２００ヌクレオチド（例えば、長さが約５０、６０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１９０、または２００ヌクレオチド）のオリゴマー（例えば、ＲＮＡオリゴマー、ＤＮＡオリゴマー、またはそれらの組合せで構成される）である。一実施形態では、各標的捕捉試薬オリゴマーは、標的特異的な標的捕捉試薬配列である、約１２０〜１７０個、または典型的には約１２０個のヌクレオチドを含む。標的捕捉試薬は、１つまたは両方の末端にさらなる非標的特異的なヌクレオチド配列を含むことができる。追加のヌクレオチド配列は、例えば、ＰＣＲ増幅用に、または標的捕捉試薬識別子として使用することができる。ある種の実施形態では、標的捕捉試薬は、本明細書に記載される結合対の第１のメンバー（例えば、ビオチン分子などの親和性タグ）をさらに含む。結合対の第１のメンバー、例えば、ビオチン分子は、標的捕捉試薬に、例えば、標的捕捉試薬の５’末端、３’末端、または内部（例えば、ビオチン化ヌクレオチドを取り込むことによって）に付着され得る。一実施形態では、ビオチン分子は、標的捕捉試薬の５’末端に付着される。
【０３９０】
１つの例示的な実施形態では、標的捕捉試薬は、長さ約１５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、そのうちの１２０ヌクレオチドは標的特異的な「標的捕捉試薬配列」である。他の３０ヌクレオチド（例えば、各末端の１５ヌクレオチド）は、ＰＣＲ増幅に使用されるユニバーサルな任意の尾部である。尾部は、ユーザが選択した任意の配列であり得る。例えば、合成オリゴヌクレオチドのプールは、標的特異的な標的捕捉試薬配列を示すＮ１２０を有する５’−ＡＴＣＧＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＴＮ１２０ＣＡＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＴＣＡ−３’（配列番号１）の配列のオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【０３９１】
本明細書中に記載される標的捕捉試薬配列は、エクソンおよび短い標的配列の選択に使用することができる。一実施形態では、標的捕捉試薬は、長さが約１００ヌクレオチド〜３００ヌクレオチドである。別の実施形態では、標的捕捉試薬は、長さが約１３０ヌクレオチド〜２３０ヌクレオチドである。さらに別の実施形態では、標的捕捉試薬は、長さが約１５０ヌクレオチド〜２００ヌクレオチドである。標的捕捉試薬中の標的特異的配列、例えば、エクソンおよび短い標的配列の選択は、長さが約４０ヌクレオチド〜１０００ヌクレオチドである。一実施形態では、標的特異的配列は、長さが約７０ヌクレオチド〜３００ヌクレオチドである。別の実施形態では、標的特異的配列は、長さが約１００ヌクレオチド〜２００ヌクレオチドである。さらに別の実施形態では、標的特異的配列は、長さが約１２０ヌクレオチド〜１７０ヌクレオチドである。
【０３９２】
一部の実施形態では、長いオリゴヌクレオチドは、標的配列を捕捉するのに必要なオリゴヌクレオチドの数を最小限にすることができる。例えば、エクソンあたり１つのオリゴヌクレオチドを使用することができる。ヒトゲノム中のタンパク質をコードするエクソンの平均および中央値の長さは、それぞれ約１６４および１２０塩基対であることが当該技術分野において公知である。より長い標的捕捉試薬配列は、より短いものよりもより特異的であり、より良好に捕捉することができる。結果として、オリゴヌクレオチド標的捕捉試薬配列あたりの成功率は、短いオリゴヌクレオチドよりも高い。一実施形態では、最小の標的捕捉試薬をカバーした配列は、例えば、エクソンサイズの標的では、１つの標的捕捉試薬のサイズ（例えば、１２０〜１７０塩基）である。標的捕捉試薬配列の長さを決定する際に、不必要に長い標的捕捉試薬が、標的に直接隣接するより望ましくないＤＮＡを捕捉することを考慮することもできる。より長いオリゴヌクレオチド標的捕捉試薬はまた、より短いものよりも、ＤＮＡ試料中の標的領域における多型に対してより耐性であり得る。典型的には、標的捕捉試薬配列は、参照ゲノム配列に由来する。実際のＤＮＡ試料中の標的配列が、例えば、それが一塩基多型（ＳＮＰ）を含む場合に、参照配列から逸脱する場合、それは、標的捕捉試薬に対してより効率的にハイブリダイズすることができず、したがって、標的捕捉試薬配列にハイブリダイズした配列において、過少表示され得るか、または完全に存在しないことがある。ＳＮＰによる対立遺伝子脱落は、例えば、１２０〜１７０塩基の単一ミスマッチが、それぞれ、多重増幅およびマイクロアレイ捕捉における典型的な標的捕捉試薬またはプライマー長さである２０または７０塩基の単一ミスマッチよりも、ハイブリッド安定性に影響を及ぼさない場合があるという理由で、より長い合成標的捕捉試薬分子では可能性が低い。
【０３９３】
ゲノム領域などの捕捉標的捕捉試薬の長さと比較して長い標的の選択には、標的捕捉試薬配列長は、典型的には、隣接配列の標的化を最小化する唯一の目的のために標的捕捉試薬配列の最大サイズを制限する必要がないことを除いて、上述の短い標的のための標的捕捉試薬と同じサイズ範囲である。あるいは、オリゴヌクレオチドは、はるかに広い窓（典型的には６００塩基）全体でタイル化することができる。この方法は、典型的なエクソンよりもはるかに大きい（例えば、約５００塩基）ＤＮＡ断片を捕捉するために用いることができる。結果として、はるかに望ましくない隣接非標的配列が選択される。
【０３９４】
標的捕捉試薬の合成
【０３９５】
標的捕捉試薬は、例えば、任意のタイプのオリゴヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ＤＮＡまたはＲＮＡ標的捕捉試薬（「オリゴ標的捕捉試薬」）は、個別に合成することができ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ標的捕捉試薬（例えば、「アレイベイト」）としてアレイ中で合成することができる。オリゴ標的捕捉試薬は、アレイフォーマットで提供されるか、または単離されたオリゴとして提供されるかにかかわらず、典型的には一本鎖である。標的捕捉試薬は、本明細書に記載される結合対の第１のメンバー（例えば、ビオチン分子などの親和性タグ）をさらに含むことができる。結合対の第１のメンバー、例えば、ビオチン分子は、標的捕捉試薬、例えば、標的捕捉試薬の５’末端または３’末端に、典型的には標的捕捉試薬の５’末端に付着され得る。標的捕捉試薬は、例えば、国際特許出願公開第第２０１２／０９２４２６号、または国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／０２１０８０号に記載されるように、当該技術分野において記載される方法によって合成することができ、それらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０３９６】
ハイブリダイゼーション条件
【０３９７】
本発明において特徴づけられる方法は、ライブラリー（例えば、核酸ライブラリー）を複数の標的捕捉試薬と接触させて、選択されたライブラリーキャッチを提供する工程を含む。接触工程は、溶液ハイブリダイゼーションにおいて行うことができる。一部の実施形態では、本方法は、溶液ハイブリダイゼーションの１回以上の追加ラウンドによってハイブリダイゼーション工程を繰り返すことを含む。一部の実施形態では、本方法は、さらに、ライブラリーキャッチを、同じかまたは異なる回収の標的捕捉試薬を用いた溶液ハイブリダイゼーションの１回以上の追加ラウンドに供することを含む。本明細書における方法での使用に適合させることができるハイブリダイゼーション法は、例えば、国際特許出願公開第２０１２／０９２４２６号に記載されているように、当該技術分野において報告されている。
【０３９８】
本発明のさらなる実施形態または特徴は、以下の通りである。
【０３９９】
ある種の実施形態では、本方法は、試料中のがん性表現型（例えば、本明細書に記載される遺伝子または遺伝子産物における変化の少なくとも１０、２０、３０、５０個またはそれ以上）に、例えば、正にまたは不に関連する変化の存在または不存在を決定することを含む。他の実施形態では、本方法は、ゲノムシグネチャー、例えば、連続的／複雑なバイオマーカー（例えば、腫瘍遺伝子変異量のレベル）を決定することを含む。他の実施形態では、本方法は、１つ以上のゲノムシグネチャー、例えば、連続的／複雑なバイオマーカー、例えば、マイクロサテライト不安定性のレベル、またはヘテロ接合性（ＬＯＨ）の存在もしくは不存在を決定することを含む。本方法は、ライブラリーキャッチを得るために、本明細書に記載される方法および標的捕捉試薬のいずれかに従って、溶液ベースの反応において試料中の核酸を接触させること；およびライブラリーキャッチの全部またはサブセットを（例えば、次世代シークエンシングによって）配列決定することを含み、それによって本明細書に記載される遺伝子または遺伝子産物における変化の存在または不存在を決定する。
【０４００】
ある種の実施形態では、標的捕捉試薬は、長さが約１００ヌクレオチド〜３００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド（または複数のオリゴヌクレオチド）を含む。典型的には、標的捕捉試薬は、長さが約１３０ヌクレオチド〜２３０ヌクレオチド、または約１５０ヌクレオチド〜２００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド（または複数のオリゴヌクレオチド）を含む。他の実施形態では、標的捕捉試薬は、長さが約３００ヌクレオチド〜１０００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド（または複数のオリゴヌクレオチド）を含む。
【０４０１】
他の実施形態では、標的捕捉試薬は、ｃＤＮＡ配列を含むか、またはｃＤＮＡ配列に由来する。一実施形態では、ｃＤＮＡは、ＲＮＡ配列、例えば、腫瘍またはがん細胞由来のＲＮＡ、例えば、腫瘍−ＦＦＰＥ試料、血液試料、または骨髄吸引試料から得られたＲＮＡから調製される。他の実施形態では、標的捕捉試薬は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはクローン化ＤＮＡから増幅された増幅生成物（例えば、ＰＣＲ生成物）を含む。
【０４０２】
一部の実施形態では、ライブラリー（例えば、核酸ライブラリー）は、核酸分子の集合体を含む。本明細書に記載されるように、ライブラリーの核酸分子は、標的核酸分子（例えば、腫瘍核酸分子、参照核酸分子および／または対照核酸分子；本明細書中は、それぞれ、第１、第２および／または第３の核酸分子とも呼ばれる）を含むことができる。ライブラリーの核酸分子は、単一の個体由来であり得る。一部の実施形態では、ライブラリーは、１を超える対象（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０またはそれ以上の対象）由来の核酸分子を含むことができ、例えば、異なる対象由来の２つ以上のライブラリーを組み合わせて、１を超える対象由来の核酸分子を有するライブラリーを形成することができる。一実施形態では、対象は、がんまたは腫瘍を有するヒト、またはそれを有するリスクがあるヒトである。
【０４０３】
一部の実施形態では、本方法は、１つまたは複数のライブラリー（例えば、１つまたは複数の核酸ライブラリー）を複数の標的捕捉試薬と接触させて、核酸の選択されたサブグループ、例えば、ライブラリーキャッチを提供する工程を含む。一実施形態では、接触工程は、固体支持体、例えばアレイにおいて行われる。ハイブリダイゼーションのための適切な固体支持体は、例えば、Ａｌｂｅｒｔ，Ｔ．Ｊ．ら（２００７年）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４巻（１１号）：９０３−５年；Ｈｏｄｇｅｓ，Ｅ．ら（２００７年）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３９巻（１２号）：１５２２−７頁；およびＯｋｏｕ，Ｄ．Ｔ．ら（２００７年）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４巻（１１号）：９０７−９頁に記載され、それらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。他の実施形態では、接触工程は、溶液ハイブリダイゼーションにおいて行われる。一部の実施形態では、本方法は、ハイブリダイゼーションの１回以上の追加ラウンドによってハイブリダイゼーション工程を繰り返すことを含む。一部の実施形態では、本方法は、さらに、ライブラリーキャッチを、標的捕捉試薬の同じまたは異なる集合体とのハイブリダイゼーションの１回以上の追加ラウンドに供することを含む。
【０４０４】
さらに他の実施形態では、本方法は、ライブラリーキャッチをジェノタイピングに供し、それによって、選択された核酸の遺伝子型を同定する工程をさらに含む。
【０４０５】
ある種の実施形態では、本方法は、以下：
ｉ）試料をフィンガープリントすること；
ｉｉ）試料中の遺伝子または遺伝子産物（例えば、本明細書に記載される遺伝子または遺伝子産物）の存在量を定量すること（例えば、試料中の転写物の相対的存在量を定量すること）；
ｉｉｉ）特定の対象（例えば、正常対照またはがん患者）に属する試料を同定すること；
ｉｖ）試料中の遺伝的形質（例えば、１つ以上の対象の遺伝的構成（例えば、民族性、人種、家族性形質））を同定すること；
ｖ）核酸試料中の倍数性を決定すること；試料中のヘテロ接合性の喪失を決定すること；
ｖｉ）本明細書に記載される変化、例えば、試料中のヌクレオチド置換、コピー数変化、インデル、または再配列の存在または不在を決定すること；
ｖｉｉ）試料中の腫瘍遺伝子変異量および／またはマイクロサテライト不安定性（および／または他の複雑なバイオマーカー）のレベルを決定すること；または
ｖｉｉｉ）試料中の腫瘍／正常細胞混合物のレベルを決定すること
のうちの１つ以上をさらに含む。
【０４０６】
異なるオリゴヌクレオチドの組合せは、異なる比、例えば、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：１０、１：２０、１：５０、１：１００、１：１０００などから選択される比で混合することができる。一実施形態では、アレイを生成する標的捕捉試薬（例えば、ベイト）に対する化学合成された標的捕捉試薬（例えば、ベイト）の比は、１：５、１：１０、または１：２０から選択される。ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドは、天然に存在するかまたは天然に存在しないものであり得る。ある種の実施形態では、標的捕捉試薬（例えば、ベイト）は、例えば、融解温度を上昇させるために、１つ以上の天然に存在しないヌクレオチドを含む。例示的な天然に存在しないオリゴヌクレオチドは、修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドを含む。例示的な修飾されたＲＮＡヌクレオチドは、ロックされた核酸（ＬＮＡ）であり、ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素および４’炭素を連結する余分な架橋で修飾される（Ｋａｕｒ，Ｈ；Ａｒｏｒａ，Ａ；Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ；Ｍａｉｔｉ，Ｓ；Ａｒｏｒａ，Ａ．；Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．；Ｍａｉｔｉ，Ｓ．（２００６年）．「Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ，Ｃｏｕｎｔｅｒｉｏｎ，ａｎｄ  Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ＤＮＡ  Ｄｕｐｌｅｘｅｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５巻（２３号）：７３４７−５５頁）。他の修飾された例示的なＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドには、限定されないが、ペプチド結合によって連結された反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位で構成されるペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍら（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ  ３６５巻（６４４６号）：５６６−８頁）；低ＧＣ領域を捕捉するように修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド；二環式核酸（ＢＮＡ）または架橋されたオリゴヌクレオチド；修飾された５−メチルデオキシチジン；および２，６−ジアミノプリンが挙げられる。他の修飾されたＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドは、当該技術分野において公知である。
【０４０７】
ある実施形態では、方法は、ライブラリー中の前記核酸断片のサイズが基準値未満またはそれに等しいライブラリーを取得することをさらに含み、前記ライブラリーは、ＤＮＡ単離とライブラリーの作製との間の断片化工程なしに作製される。
【０４０８】
ある実施形態では、方法は、核酸断片を取得することをさらに含み、前記核酸断片のサイズが基準値に等しいかまたはそれを超え、断片化された場合、このような核酸断片がライブラリーに作製される。
【０４０９】
ある実施形態では、方法は、複数のライブラリー核酸分子の各々を、例えば、識別可能な別個の核酸配列（バーコード）を複数の核酸分子の各々に付加することによって標識することをさらに含む。
【０４１０】
ある実施形態では、方法は、複数のライブラリー核酸分子の各々にプライマーを付着させることをさらに含む。
【０４１１】
ある実施形態では、方法は、複数の標的捕捉試薬を提供し、複数の標的捕捉試薬を選択することをさらに含み、前記選択は、１）患者特性、例えば、年齢、腫瘍の病期、前治療、または抵抗性；２）腫瘍タイプ；３）試料の特性；４）対照試料の特性；５）対照の存在またはタイプ；６）単離された腫瘍（または対照）核酸試料の特性；７）ライブラリー特性；８）試料中の腫瘍タイプと関連することが公知である突然変異；９）試料中の腫瘍タイプと関連することが公知でない突然変異；１０）配列を配列決定する（または配列にハイブリダイズするもしくはそれを回収する）能力、または突然変異を同定する能力、例えば、高いＧＣ領域または再配列を有する配列に関連する困難性；あるいは１１）配列決定される遺伝子、に応答する。
【０４１２】
ある実施形態では、方法は、例えば、前記試料中の少数の腫瘍細胞の決定に応答し、標的捕捉試薬、または複数の標的捕捉試薬を選択し、第２の遺伝子の核酸分子と比較して、第１の遺伝子の核酸分子を比較的高効率で捕捉することをさらに含み、例えば、第１の遺伝子における突然変異は、試料の腫瘍タイプについての腫瘍表現型と関連し、場合により、第２の遺伝子における突然変異は、試料の腫瘍タイプについての腫瘍表現型と関連しない。
【０４１３】
ある実施形態では、本方法は、ライブラリーキャッチ特性、例えば、核酸濃度についての値を取得し、取得した値を特徴についての参照基準と比較することをさらに含む。
【０４１４】
ある実施形態では、方法は、ライブラリー定量のための参照基準を満たすライブラリー特性の値を有するライブラリーを選択することをさらに含む。
【０４１５】
配列決定
【０４１６】
本発明はまた、核酸を配列決定する方法を含む。これらの方法において、ライブラリーからの核酸分子は、本明細書に記載された方法を用いて、例えば、溶液ハイブリダイゼーションを用いて単離され、それによってライブラリーキャッチを提供する。ライブラリーキャッチまたはそのサブグループを配列決定することができる。したがって、本発明で特徴づけられる方法は、ライブラリーキャッチを分析することをさらに含む。一実施形態では、ライブラリーキャッチは、配列決定方法、例えば、本明細書に記載される次世代シークエンシング法によって分析される。本方法は、溶液ハイブリダイゼーションによりライブラリーキャッチを単離し、核酸配列決定によりライブラリーキャッチを行うことを含む。ある種の実施形態では、ライブラリーキャッチは、再配列決定され得る。
【０４１７】
当該技術分野において公知である任意の配列決定方法を使用することができる。選択方法によって単離された核酸の配列決定は、典型的には、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を用いて行われる。本明細書で使用するのに適した配列決定法は、例えば、国際特許出願公開第２０１２／０９２４２６号に記載されるように、当該技術分野において報告されている。
【０４１８】
ある実施形態では、取得または分析されたリードの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％は、本明細書に記載される遺伝子、例えば、表１Ａ〜５Ａからの遺伝子に由来する対象間隔についてのものである。ある実施形態では、少なくとも０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、５．０、１０、１５、または３０メガ塩基、例えば、ゲノム塩基が配列決定される。ある実施形態では、本方法は、本明細書に記載される試料から得られたヌクレオチド配列リードを取得することを含む。ある実施形態では、リードは、ＮＧＳ配列決定法によって提供される。
【０４１９】
本明細書に開示される方法は、対象のゲノム、全エクソームまたはトランスクリプトームに存在する変化を検出するために使用することができ、ＤＮＡおよびＲＮＡ配列決定、例えば、標的ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列決定に適用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子の転写物は、配列決定される。他の実施形態では、本方法は、遺伝子または遺伝子産物のレベルの変化（例えば、増加または減少）、例えば、本明細書に記載される遺伝子または遺伝子産物の発現の変化の検出を含む。本方法は、場合により、標的ＲＮＡについて試料を濃縮する工程を含むことができる。他の実施形態では、本方法は、ある種の高存在量ＲＮＡ、例えば、リボソームＲＮＡまたはグロビンＲＮＡの試料を枯渇させる工程を含む。ＲＮＡ配列決定法は、単独で、または本明細書に記載されるＤＮＡ配列決定法と組み合わせて使用することができる。一実施形態では、本方法は、ＤＮＡ配列決定工程およびＲＮＡ配列決定工程を行うことを含む。本方法は、任意の順序で行うことができる。例えば、本方法は、ＲＮＡ配列決定により、本明細書に記載される変化の発現を確認すること、例えば、本発明のＤＮＡ配列決定法により検出された突然変異または融合の発現を確認することを含み得る。他の実施形態では、本方法は、ＲＮＡ配列決定工程、続いてＤＮＡ配列決定工程を行うことを含む。
【０４２０】
アライメント
【０４２１】
アラインメントは、リードを、位置、例えば、ゲノム位置と合致させるプロセスである。ミスアラインメント（例えば、ゲノム内の正しくない位置を短いリードから塩基対を配置すること）、例えば、実際のがん突然変異の周囲のリードの配列状況（例えば、反復配列の存在）のためミスアラインメントは、代替の対立遺伝子のリードが代替の対立遺伝子のリードの主な積み重ねからずれてしまう可能性があるため、突然変異検出の感受性の低下につながる場合がある。実際の突然変異が存在しない場合に問題となる配列の状況が生じた場合、ミスアラインメントは、参照ゲノム塩基の実際のリードを誤った位置に配置することによって、「突然変異した」対立遺伝子のアーチファクトによるリードを導入する可能性がある。多重の多重遺伝子解析のための突然変異コーリングアルゴリズムは、少量の突然変異に対してさえも感受性が高いはずであるため、これらのミスアラインメントは、偽陽性の発見率を増加させ／特異性を低下させることがある。
【０４２２】
本明細書で検討する場合、実際の突然変異に対する感受性の低下は、分析される遺伝子の予想される突然変異部位の周囲のアラインメントの質を（手動または自動化された方法で）評価することによって対処することができる。評価されるべき部位は、がん突然変異のデータベース（例えば、ＣＯＳＭＩＣ）から得ることができる。問題があるものとして同定された領域は、関連する配列状況においてより良い性能を与えるように選択されたアルゴリズムを使用することによって、例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメントなどの遅いがより正確なアラインメントアルゴリズムを使用するアラインメント最適化（または再アラインメント）によって、修正することができる。一般的なアラインメントアルゴリズムが問題を解決することができない場合、カスタマイズされたアラインメント手法は、例えば、置換を含む可能性が高い遺伝子についての最大差ミスマッチペナルティパラメータの調整；ある種の腫瘍タイプ（例えば、メラノーマにおけるＣ→Ｔ）に共通する特定の突然変異タイプに基づいた、特定のミスマッチペナルティパラメータの調整；またはある種の試料タイプに共通する特定の突然変異タイプ（例えば、ＦＦＰＥに共通する置換）に基づいた、特定のミスマッチペナルティパラメータの調整によって作製することができる。
【０４２３】
ミスアラインメントによる評価された遺伝子領域における特異性の低下（偽陽性率の上昇）は、配列決定された試料における全ての突然変異コーリングの手動または自動検査によって評価することができる。ミスアラインメントにより誤った突然変異コーリングを起こしやすいことが見出された領域は、上記と同じアラインメント修正を受けることができる。アルゴリズムによる修正が見つからない場合は、問題領域の「突然変異」を検査パネルから分類またはスクリーニングすることができる。
【０４２４】
本明細書に開示される方法は、特に、多数の多様な遺伝子の、例えば、試料由来の遺伝子の多数の多様な遺伝的事象の大規模並列配列決定に依存する方法において、再配列、例えば、インデルに関連する対象間隔の配列決定における性能を最適化するために、多重の、個別に調整された、アラインメント法またはアルゴリズムの使用を可能にする。一部の実施形態では、異なる遺伝子における多数の再配列の各々に個別にカスタマイズまたは調整される多重アラインメント法が、リードを分析するために使用される。実施形態では、調整は、配列決定される遺伝子（または他の対象間隔）、試料中の腫瘍タイプ、配列決定される変異体、または試料もしくは対象の特徴（のうちの１つ以上）の関数であり得る。この選択または配列決定すべき多数の対象間隔に微調整されたアラインメント条件の使用は、速度、感受性および特異性の最適化を可能にする。本方法は、比較的多数の多様な対象間隔についてのリードのアラインメントが最適化される場合に特に効果的である。実施形態では、本方法は、再配列のために最適化されたアライメント法の使用、および再配列に関連しない対象間隔のために最適化された他のアライメント法の使用を含む。
【０４２５】
一部の実施形態では、アライメントセレクターが使用される。本明細書で使用される「アラインメントセレクター」とは、アラインメント法の選択を可能にするまたは指向するパラメータ、例えば、対象間隔の配列決定を最適化することができるアラインメントアルゴリズムまたはパラメータを指す。アライメントセレクターは、関数、例えば、以下の１つ以上の関数に特異的であり得るかまたは関数として選択することができる：
１．配列状況、例えば、前記対象間隔についてのリードのミスアラインメントの傾向に関連する、対象間隔（例えば、評価されるヌクレオチド位置）の配列状況。例えば、ゲノムの他の箇所で反復される、評価される対象間隔内またはその近傍に配列要素が存在すると、ミスアラインメントを引き起こし、それによって性能を低下させる可能性がある。性能は、ミスアラインメントを最小にするアルゴリズムまたはアルゴリズムパラメータを選択することによって増大させることができる。この場合、アラインメントセレクターの値は、配列状況、例えば、ゲノム（または分析されるゲノムの部分）において少なくとも何回も反復される長さの配列の存在または不存在の関数であり得る。
２．分析される腫瘍タイプ。例えば、特定の腫瘍タイプは、欠失の増加率によって特徴づけることができる。したがって、インデルにより感受性であるアルゴリズムまたはアルゴリズムパラメータを選択することによって性能を増大させることができる。この場合、アライメントセレクターの値は、腫瘍タイプ、例えば、腫瘍タイプの識別子の関数であり得る。ある実施形態では、値は、腫瘍タイプ、例えば、固形腫瘍または血液悪性腫瘍（または異型前）の同一性である。
３．分析される遺伝子、または遺伝子タイプ、例えば、遺伝子、または遺伝子タイプを分析することができる。一例として、がん遺伝子は、しばしば、置換またはインフレームインデルによって特徴づけられる。したがって、性能は、これらの変異体に対して特に感受性であり、他の変異体に対して特異的であるアルゴリズムまたはアルゴリズムパラメータを選択することによって増大させることができる。腫瘍抑制因子は、しばしば、フレームシフトインデルによって特徴づけられる。したがって、性能は、これらの変異体に対して特に感受性であるアルゴリズムまたはアルゴリズムパラメータを選択することによって増大させることができる。したがって、性能は、対象間隔と合致するアルゴリズムまたはアルゴリズムパラメータを選択することによって増大させることができる。この場合、アラインメントセレクターの値は、遺伝子または遺伝子タイプの関数、例えば、遺伝子または遺伝子タイプの識別子であり得る。ある実施形態では、値は、遺伝子の同一性である。
４．分析される部位（例えば、ヌクレオチド位置）。この場合、アラインメントセレクターの値は、部位または部位タイプの関数、例えば、部位または部位タイプの識別子であり得る。ある実施形態では、値は、部位の同一性である。（例えば、その部位を含む遺伝子が別の遺伝子と高度に相同である場合、正常の／速い短いリードアラインメントアルゴリズム（例えば、ＢＷＡ）は、２つの遺伝子間の区別が困難であり得、より集約したアラインメント法（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）またはさらにアセンブリ（ＡＲＡＣＨＮＥ）を必要とする可能性がある。同様に、遺伝子配列が低複雑性領域（例えば、ＡＡＡＡＡＡ）を含む場合、より集約したアラインメント法が必要であり得る。
５．評価される対象間隔に関連する変異体または変異体タイプ。例えば、置換、挿入、欠失、転座または他の再配列。したがって、特定の変異体タイプにより感受性であるアルゴリズムまたはアルゴリズムパラメータを選択することによって、性能を増大させることができる。この場合、アライメントセレクターの値は、変異体タイプの関数、例えば、変異体タイプの識別子であり得る。ある実施形態では、値は、変異体タイプ、例えば置換の同一性である。
６．試料タイプ、例えば、本明細書に記載される試料。試料タイプ／品質は、誤差（非参照配列の誤った観察）率に影響を与える可能性がある。したがって、性能は、試料中の真の誤差率を正確にモデル化するアルゴリズムまたはアルゴリズムパラメータを選択することによって増大させることができる。この場合、アライメントセレクターの値は、試料タイプの関数、例えば、試料タイプの識別子であり得る。ある実施形態では、値は、試料タイプの同一性である。
【０４２６】
一般的に、インデル突然変異の正確な検出は、アラインメントにおけるエクササイズである。これは、本明細書において無効にされた配列決定プラットフォーム上の誤ったインデル速度が比較的低いからである（したがって、正確に整列されたインデルのほんの一握りの観察さえ、突然変異の強力な証拠となり得る）。しかしながら、インデルの存在下での正確なアライメントは、（特にインデルの長さが増加するにつれて）困難になることがある。例えば、置換の整列に関連する一般的な問題に加えて、インデル自体が、アラインメントに問題を引き起こす可能性がある（例えば、２ｂｐのジヌクレオチド反復配列の欠失は、容易に決定的に配置することができない）。感受性と特異性の両方は、見かけ上のインデルを含む短い（＜１５ｂｐ）リードを正しく配置しないことにより低下され得る。より大きなインデル（個々のリードの長さに大きさがより近づき、例えば、３６ｂｐのリード）は、リードがまったく整列しない場合があり、整列したリードの標準セットでインデルの検出が不可能になる。
【０４２７】
がん突然変異のデータベースは、これらの問題に対処し、性能を改善するために使用することができる。偽陽性のインデル発見を減らす（特異性を改善する）ために、一般に予測されるインデルの周囲の領域を、配列の状況による問題のあるアラインメントについて調べることができ、上記の置換と同様に対処することができる。インデル検出の感受性を改善するために、がんにおいて予測されるインデルに関する情報を使用するいくつかの異なる手法を使用することができる。例えば、予想されるインデルを含む短いリードをシミュレートし、アラインメントを試みることができる。アラインメントは、研究することができ、問題のあるインデル領域は、例えば、ギャップオープン／延長ペナルティを減少させることによって、または部分的なリード（例えば、リードの第１または第２の半分）を整列させることによって、アラインメントパラメータを調整することができる。
【０４２８】
あるいは、最初のアラインメントは、正常な参照ゲノムだけでなく、公知または可能性のあるがんインデル突然変異の各々を含む、ゲノムの代替バージョンでも試みることができる。この手法では、最初は整列ができず、または不正確に整列させたインデルのリードが、ゲノムの代替（突然変異）バージョンにうまく配置される。
【０４２９】
このようにして、インデルアラインメント（したがって、コーリング）は、期待されるがん遺伝子／部位に対して最適化され得る。本明細書で使用される場合、配列アラインメントアルゴリズムは、リード配列と参照配列との間の類似性を評価することによって生じる可能性が最も高いリード配列（例えば、次世代シークエンシングからの、例えば、短いリード配列）をゲノム中のどこからか同定するために使用される計算方法または手法を具体化する。種々のアルゴリズムを配列アラインメント問題に適用することができる。いくつかのアルゴリズムは、比較的ゆっくりとしたものもあるが、特異性は比較的高い。これらは、例えば、動的プログラミングに基づくアルゴリズムを含む。動的プログラミングは、複雑な問題をより簡単な工程に分解することによって解決する方法である。他の手法は比較的効率的であるが、典型的にはそれほど完全ではない。これらは、例えば、発見的アルゴリズムおよび大規模データベース検索のために設計された確率的方法を含む。
【０４３０】
アラインメントパラメータは、アラインメントアルゴリズムにおいて使用され、アルゴリズムの性能を調整して、例えば、リード配列と参照配列との間に最適な全体的または局所的アラインメントを生成する。アライメントパラメータは、マッチ、ミスマッチ、およびインデルの重み付けを与えることができる。例えば、低い重み付けは、より多くのミスマッチおよびインデルとのアライメントを可能にする。
【０４３１】
配列関係、例えば、反復配列（例えば、タンデム反復、散在反復）、低複雑性領域、インデル、偽遺伝子、またはパラログの存在は、アラインメント特異性に影響を及ぼし得る（例えば、ミスアラインメントを引き起こし得る）。本明細書で使用される場合、ミスアラインメントとは、ゲノム中の不正確な位置上の短いリードからの塩基対の配置を指す。
【０４３２】
アライメントの感受性は、アライメントアルゴリズムが選択される場合、またはアライメントパラメータが腫瘍タイプ、例えば、特定の突然変異または突然変異タイプを有する傾向のある腫瘍タイプに基づいて調整される場合、増大され得る。
【０４３３】
アラインメントの感受性は、アラインメントアルゴリズムが選択された場合、またはアラインメントパラメータが特定の遺伝子型（例えば、がん遺伝子、腫瘍抑制遺伝子）に基づいて調整された場合に増大され得る。がん関連遺伝子の異なるタイプの突然変異は、がん表現型に異なる影響を及ぼす可能性がある。例えば、変異がん遺伝子の対立遺伝子は、典型的には優性である。突然変異腫瘍抑制対立遺伝子は、典型的には劣性であり、これは、ほとんどの場合、腫瘍抑制遺伝子の両方の対立遺伝子が、影響が現れる前に影響を受けなければならないことを意味する。
【０４３４】
アラインメントの感受性は、アラインメントアルゴリズムが選択された場合、またはアラインメントパラメータが突然変異型（例えば、一塩基多型、インデル（挿入または欠失）、逆位、転座、タンデム反復）に基づいて調整された場合、調整され得る（例えば、増加され得る）。
【０４３５】
アライメントの感受性は、アライメントアルゴリズムが選択された場合、またはアライメントパラメータが突然変異部位（例えば、突然変異ホットスポット）に基づいて調整された場合、調整され得る（例えば、増加され得る）。突然変異ホットスポットとは、突然変異が正常な突然変異率の最大１００倍にもなるゲノム中の部位を指す。
【０４３６】
アライメントの感受性／特異性は、アライメントアルゴリズムが選択された場合、またはアライメントパラメータが試料タイプ（例えば、ｃｆＤＮＡ試料、ｃｔＤＮＡ試料、ＦＦＰＥ試料、またはＣＴＣ試料）に基づいて調整された場合、調整され得る（例えば、増加され得る）。
【０４３７】
一部の実施形態では、ＮＧＳリードは、公知の参照配列に整列させることができ、またはデノボでアセンブルさせることができる。例えば、ＮＧＳリードは、参照配列（例えば、野生型配列）に整列させることができる。ＮＧＳのための配列アラインメントの方法は、例えば、Ｔｒａｐｎｅｌｌ  Ｃ．およびＳａｌｚｂｅｒｇ  Ｓ．Ｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２００９年、２７巻：４５５−４５７頁に記載される。デノボアセンブリの例は、例えば、Ｗａｒｒｅｎ  Ｒ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２００７年、２３巻：５００−５０１頁；Ｂｕｔｌｅｒ  Ｊ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、２００８年、１８巻：８１０−８２０頁；Ｚｅｒｂｉｎｏ  Ｄ．Ｒ．およびＢｉｒｎｅｙ  Ｅ．、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、２００８年、１８巻：８２１−８２９頁に記載される。配列アライメントまたはアセンブリは、例えば、Ｒｏｃｈｅ／４５４およびＩｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａリードデータを混合する１つ以上のＮＧＳプラットフォームからのリードデータを使用して行うことができる。
【０４３８】
アラインメントの最適化は、例えば、国際特許出願公開第２０１２／０９２４２６号に記載されるように、当該技術分野において記載される。
【０４３９】
突然変異コーリング
【０４４０】
ベースコーリングとは、シークエンシング装置の生出力を指す。突然変異コーリングとは、配列決定されるヌクレオチド位置について、例えば、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣのヌクレオチド値を選択するプロセスを指す。典型的には、ある位置に対する配列決定リード（または塩基コーリング）は、１を超える値を提供し、例えば、いくつかのリードはＴを与え、いくつかはＧを与える。突然変異コーリングは、ヌクレオチド値、例えば、それらの値の１つを配列に割り当てるプロセスである。これを「突然変異」コーリングと呼ぶが、ヌクレオチド値を任意のヌクレオチド位置、例えば、突然変異対立遺伝子、野生型対立遺伝子、突然変異型もしくは野生型として特徴づけられていない対立遺伝子に対応する位置に、または可変性によって特徴づけられていない位置に割り当てるために、これを適用することができる。突然変異コーリングの方法には、以下：参照配列中の各位置の情報に基づいて独立したコーリングを行うこと（例えば、配列リードを検査すること；ベースコールと品質スコアを検査すること；観察された塩基の確率と潜在的な遺伝子型を与えられた品質スコアを計算すること；および遺伝子型を割り当てること（例えば、ベイズ則を用いる））；偽陽性を除去すること（例えば、リード深度が予想よりもはるかに低いかまたは高いＳＮＰを拒絶する深度閾値；小さなインデルによる偽陽性を除去するための局所的な再配置を用いること）；およびコーリングを精緻化するための連鎖不均衡（ＬＤ）／補定に基づく分析を行うことのうちの１つ以上が含まれ得る。
【０４４１】
特定の遺伝子型および位置に関連する遺伝子型尤度を計算する式は、例えば、Ｌｉ  Ｈ．およびＤｕｒｂｉｎ  Ｒ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０１０年；２６巻（５号）：５８９−９５頁に記載される。ある種のがんタイプにおける特定の突然変異に対する事前予測は、そのがんタイプからの試料を評価する際に使用することができる。このような尤度は、がん突然変異の公的データベース、例えば、がんにおける体細胞性突然変異カタログ（ＣＯＳＭＩＣ）、ＨＧＭＤ（ヒト遺伝子突然変異データベース）、ＳＮＰコンソーシアム、乳がん突然変異データベース（ＢＩＣ）、および乳がん遺伝子データベース（ＢＣＧＤ）から得ることができる。
【０４４２】
ＬＤ／補定に基づく分析の例は、例えば、Ｂｒｏｗｎｉｎｇ  Ｂ．Ｌ．およびＹｕ  Ｚ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００９年、８５巻（６号）：８４７−６１頁に記載される。低いカバレッジＳＮＰコーリング法の例は、例えば、Ｌｉ  Ｙ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００９年、１０巻：３８７−４０６頁に記載される。
【０４４３】
アラインメントの後、置換の検出は、コーリング法、例えば、ベイズ突然変異コーリング法を用いて行うことができ；これは、対象間隔の各々の塩基、例えば、評価される遺伝子のエクソンに適用され、代替の対立遺伝子の存在が観察される。この方法は、突然変異の存在下でのリードデータを観察する確率と、塩基コーリングエラーのみの存在下でのリードデータを観察する確率とを比較する。突然変異は、この比較が突然変異の存在を十分強力に支持するものである場合、コールすることができる。
【０４４４】
がんＤＮＡの分析において、５０％または１００％の頻度からの限られた逸脱に対処する方法が開発されている（例えば、ＳＮＶＭｉｘ−Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１０年３月１５日；２６巻（６号）：７３０−７３６頁）。しかしながら、本明細書に開示される方法は、試料ＤＮＡの１％〜１００％のいずれかの位置、特に５０％未満のレベルで、突然変異対立遺伝子の存在の可能性を考慮することを可能にする。この手法は、天然（多クローン性）腫瘍ＤＮＡの低純度ＦＦＰＥ試料における突然変異の検出に特に重要である。
【０４４５】
ベイズ突然変異検出手法の利点は、突然変異の存在の確率と塩基コーリングエラー単独の確率との比較が、その部位における突然変異の存在の事前予想によって重み付けできることである。所定のがんタイプについて頻繁に突然変異した部位で、代替の対立遺伝子のいくつかのリードが観察された場合、突然変異の証拠の量が通常の閾値を満たさないとしても、突然変異の存在を明確にコールすることがある。次に、この柔軟性を用いて、さらに稀な突然変異／より低い純度の試料に対する検出感受性を増加させるか、またはリードカバレッジの減少に対して検査をより頑健にすることができる。ゲノム中のランダムな塩基対ががんにおいて突然変異する可能性は約１ｅ−６である。典型的な多遺伝子性がんゲノムパネルの多くの部位における特異的な突然変異の可能性は、数桁も高いことがある。これらの可能性は、がん突然変異の公的データベース（例えば、ＣＯＳＭＩＣ）から導き出すことができる。インデルコーリングとは、典型的には、関連する信頼スコアまたは統計的証拠メトリックを含む、挿入または欠失によって参照配列と異なる配列決定データ中の塩基を見出すプロセスである。
【０４４６】
インデルコーリング法は、候補インデルを同定する工程、局所的再アラインメントを介して遺伝子型尤度を計算する工程、およびＬＤベースの遺伝子型推論およびコーリングを行う工程を含むことができる。典型的には、潜在的なインデル候補を得るためにベイズ手法を使用し、次に、これらの候補をベイズフレームワークにおける参照配列と一緒にテストする。
【０４４７】
候補インデルを生成するためのアルゴリズムは、例えば、ＭｃＫｅｎｎａ  Ａ．ら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０１０年；２０巻（９号）：１２９７−３０３頁；Ｙｅ  Ｋ．ら，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２００９年；２５巻（２１号）：２８６５−７１；Ｌｕｎｔｅｒ  Ｇ．およびＧｏｏｄｓｏｎ  Ｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０１１年；２１巻（６号）：９３６−９号；およびＬｉ  Ｈ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００９年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５巻（１６号）：２０７８−９頁に記載される。
【０４４８】
インデルコールおよび個人レベルの遺伝子型尤度を生成する方法は、例えば、ディンデルアルゴリズム（Ａｌｂｅｒｓ  Ｃ．Ａ．ら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０１１年；２１巻（６号）：９６１−７３頁）を含む。例えば、ベイズＥＭアルゴリズムを用いて、リードを分析し、最初のインデルコーリングを行い、各候補インデルについて遺伝子型尤度を生成し、次に、例えば、ＱＣＡＬＬ（Ｌｅ  Ｓ．Ｑ．およびＤｕｒｂｉｎ  Ｒ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０１１年；２１巻（６号）：９５２−６０頁）を用いて遺伝子型の補定を行うことができる。インデルを観察する事前の期待などのパラメータは、インデルのサイズまたは位置に基づいて調整する（例えば、増減または減少させる）ことができる。
【０４４９】
ある実施形態では、本方法で行われる突然変異コールの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％は、本明細書に記載される遺伝子または遺伝子産物、例えば、表１Ａ〜５Ａからの遺伝子または遺伝子産物からの対象間隔についてのものである。ある実施形態では、本明細書に記載される固有の閾値の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％は、本明細書に記載される遺伝子または遺伝子産物、例えば、表１Ａ〜５Ａからの遺伝子または遺伝子産物からの対象間隔についてのものである。ある実施形態では、注釈されたまたは第三者に報告された突然変異コールの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％は、本明細書に記載される遺伝子または遺伝子産物、例えば、表１Ａ〜５Ａからの遺伝子または遺伝子産物からの対象間隔についてのものであるである。
【０４５０】
ある実施形態では、ヌクレオチド位置に割り当てられた値は、場合により、説明注釈付きで、第三者に送信される。ある実施形態では、ヌクレオチド位置に割り当てられた値は、第三者に送信されない。ある実施形態では、複数のヌクレオチド位置に割り当てられた値は、場合により、説明注釈付きで、第三者に送信され、第２の複数のヌクレオチド位置に割り当てられた値は、第三者に送信されない。
【０４５１】
ある実施形態では、本方法は、例えば、バーコードデコンボリューションによって、１つ以上のリードを対象に割り当てることを含む。ある実施形態では、本方法は、例えば、バーコードデコンボリューションによって、腫瘍リードまたは対照リードとして１つ以上のリードを割り当てることを含む。ある実施形態では、本方法は、例えば、参照配列とのアラインメントによって、前記１つ以上のリードの各々をマッピングすることを含む。ある実施形態では、本方法は、コールされた突然変異を記憶することを含む。
【０４５２】
ある実施形態では、本方法は、コールされた突然変異に注釈を付けること、例えば、突然変異構造、例えば、ミスセンス突然変異、または機能、例えば、疾患表現型の指示でコールされた突然変異に注釈を付けることを含む。ある実施形態では、本方法は、腫瘍および対照核酸についてのヌクレオチド配列リードを取得することを含む。ある実施形態では、本方法は、例えば、ベイズコーリング法または非ベイズコーリング法を用いて、対象間隔（例えば、サブゲノム間隔、発現されたサブゲノム間隔、またはその両方）の各々について、ヌクレオチド値、例えば、変異体、例えば、突然変異をコールすることを含む。ある実施形態では、本方法は、少なくとも１つのＳＮＰを含む複数のリードを評価することを含む。ある実施形態では、本方法は、試料および／または対照リードにおけるＳＮＰ対立遺伝子比を決定することを含む。
【０４５３】
一部の実施形態では、本方法は、標的化されたサブゲノム領域のための配列決定／アラインメントアーチファクトのデータベースを構築することをさらに含む。ある実施形態では、データベースを使用して、誤った突然変異コーリングをフィルタリングし、特異性を改善することができる。ある実施形態では、データベースは、関連のない試料または細胞株を配列決定し、これらの正常試料のうちの１つ以上において、ランダム配列決定エラーのみのために予想よりも頻繁に現れる非参照対立遺伝子事象を記録することによって構築される。この手法は、生殖系列突然変動をアーチファクトとして分類することができるが、体細胞性突然変異に関する方法では受け入れ可能である。アーチファクトとして生殖系列変動のこの誤った分類は、所望であれば、公知の生殖系列変動（共通の変異体を除去する）およびただ１人の個体に現れるアーチファクト（稀な変動を除去する）についてこのデータベースをフィルタリングすることによって、改善され得る。
【０４５４】
突然変異コーリングの最適化は、例えば、国際特許出願公開第２０１２／０９２４２６号に記載されているように、当該技術分野において記載される。
【０４５５】
ＳＧＺアルゴリズム
【０４５６】
様々なタイプの変化、例えば、体細胞性変化および生殖系列突然変異は、本明細書に記載される方法（例えば、配列決定、アラインメント、または突然変異コーリング法）によって検出することができる。ある種の実施形態では、生殖系列突然変異は、ＳＧＺ（体細胞性−生殖系列−接合性）アルゴリズムを用いる方法によってさらに同定される。
【０４５７】
臨床現場では、合致した正常対照は、一般的には得られない。理論に拘束されることを望まないが、一部の実施形態では、十分に特徴づけられたゲノム変化は、解釈のために正常組織を必要としないが、少なくともいくつかの変化は、合致する正常対照がない場合には、それらが生殖系列であるかまたは体細胞性であるのか不明であると考えられる。ＳＧＺは、がん標本の次世代シークエンシングから同定された変異体の体細胞性対生殖系列起源およびホモ接合対ヘテロ接合またはサブクローン性状態を予測するための計算法である。
【０４５８】
ＳＧＺ法は、合致した正常対照を必要とせず、臨床現場で広範な適用を可能にする。ＳＧＺは、変化の対立遺伝子頻度（ＡＦ）をモデル化することによって同定された各変化の体細胞性対生殖系列の状態を、腫瘍含量、腫瘍倍数性、および局所コピー数を考慮に入れて予測する。予測の精度は、配列決定の深度とコピー数モデルの適合度に依存し、これは、がん関連遺伝子およびゲノムワイド一塩基多型（ＳＮＰ）を高深度に配列決定することによって達成することができる。コールは、ＳＮＰ  ＡＦのリード深度と局所変動に基づく統計を用いて行われる。
【０４５９】
一部の実施形態では、本方法は、対象、例えば、ヒト、例えば、がん患者由来の組織（例えば、腫瘍）または試料における変異体、例えば、突然変異を特徴づけることをさらに含み、
ａ）以下：
ｉ）配列カバレッジ入力（ＳＣＩ）であって、複数の選択された対象間隔、例えば、エクソンの各々について、選択された対象間隔における正規化された配列カバレッジの値を含むＳＣＩ；
ｉｉ）ＳＮＰ対立遺伝子頻度入力（ＳＡＦＩ）であって、複数の選択された生殖系列ＳＮＰの各々について、腫瘍または試料中の対立遺伝子頻度の値を含むＳＡＦＩ；
ｉｉｉ）変異体対立遺伝子頻度入力（ＶＡＦＩ）であって、腫瘍または試料における前記変異体、例えば、突然変異についての対立遺伝子頻度を含むＶＡＦＩ；
を取得すること；
ｂ）ＳＣＩおよびＳＡＦＩの関数として、以下：
複数のゲノムセグメントの各々についてのＣ、Ｃはゲノムセグメントの全コピー数である；
複数のゲノムセグメントの各々についてのＭ、Ｍはゲノムセグメントのマイナー対立遺伝子コピー数である；
ｐ、ｐは試料の純度である
についての値を取得すること；ならびに
ｃ）以下：
ｉ）変異体型、例えば、突然変異型の値、例えば、ｇであって、変異体、例えば、突然変異を示すものであって、体細胞性、サブクローン性体細胞性変異体、生殖系列、または識別不能であり、ＶＡＦＩ、ｐ、Ｃ、およびＭの関数である値；
ｉｉ）ＣおよびＭの関数として、腫瘍または試料における変異体、例えば、突然変異の接合性の指標
のうちの一方または両方を取得すること
を含む。
【０４６０】
ある実施形態では、対象からの非腫瘍組織を分析する必要なく、分析を行うことができる。ある実施形態では、分析は、対象由来の非腫瘍組織を分析することなく行われ、例えば、同一対象由来の非腫瘍組織は配列決定されない。
【０４６１】
ある実施形態では、ＳＣＩは、例えば、試料からの、対象間隔についてのリード数、および対照についてのリード数、例えば、プロセスが合致した対照の関数、例えば、その比のｌｏｇである値を含む。ある実施形態では、ＳＣＩは、例えば、少なくとも１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、または１０，０００個の対象間隔、例えば、エクソンについての値、例えば、ｌｏｇ  ｒ値を含む。ある実施形態では、ＳＣＩは、少なくとも１００個の対象間隔、例えば、エクソンについての値、例えば、ｌｏｇ  ｒ値を含む。ある実施形態では、ＳＣＩは、例えば、１，０００〜１０，０００、２，０００〜９，０００、３，０００〜８，０００、３，０００〜７，０００、３，０００〜６，０００、または４，０００〜５，０００個の対象間隔、例えば、エクソンについての値、例えば、ｌｏｇ  ｒ値を含む。ある実施形態では、ＳＣＩは、例えば、少なくとも１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、１，０００、２，０００、３，０００、または４，０００個の遺伝子からの対象間隔、例えば、エクソンについての値、例えば、ｌｏｇ  ｒ値を含む。
【０４６２】
ある実施形態では、ＳＣＩに含まれる値の少なくとも１つ、複数の、または実質的に全ては、ＧＣ含量との相関のために補正される。
【０４６３】
ある実施形態では、試料からの対象間隔、例えば、エクソンは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００個のリードを有する。ある実施形態では、試料からの複数の、例えば、少なくとも１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、または１０，０００個の対象間隔、例えば、エクソンは、多数のリードを有する。ある実施形態では、読みの数は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００個である。ある実施形態では、複数の生殖系列ＳＮＰは、少なくとも１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、または１５，０００個の生殖系列ＳＮＰを含む。
【０４６４】
ある実施形態では、複数の生殖系列ＳＮＰは、少なくとも１００個の生殖系列ＳＮＰを含む。ある実施形態では、複数の生殖系列ＳＮＰは、５００〜５，０００個、１，０００〜４，０００個、または２，０００〜３，０００個の生殖系列ＳＮＰを含む。ある実施形態では、対立遺伝子頻度は、マイナー対立遺伝子頻度である。ある実施形態では、対立遺伝子頻度は、代替対立遺伝子、例えば、ヒトゲノム参照データベースにおける標準的な対立遺伝子以外の対立遺伝子である。
【０４６５】
ある実施形態では、本方法は、試料中の複数の変異体、例えば、突然変異体を特徴づけることを含む。ある実施形態では、本方法は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００個の変異体、例えば、突然変異体を特徴づけることを含む。ある実施形態では、本方法は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５０個の異なる遺伝子において、変異体、例えば、突然変異体を特徴づけることを含む。
【０４６６】
ある実施形態では、本方法は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００個の変異体、例えば、突然変異体についてＶＡＦＩを取得することを含む。ある実施形態では、本方法は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００個の変異体、例えば、突然変異体について、工程ａ）、ｂ）、およびｃ）の１つ、２つまたは全部を行うことを含む。ある実施形態では、Ｃ、Ｍ、およびｐの値は、ゲノムワイドコピー数モデルをＳＣＩおよびＳＡＦＩの一方または両方に適合させることによって得られ、得られたものであり、または得ることができる。ある実施形態では、Ｃ、Ｍ、およびｐの値は、ＳＣＩおよびＳＡＦＩの複数のゲノムワイドコピー数モデル入力に適合する。ある実施形態では、ゲノムセグメントは、複数の対象間隔、例えば、エクソン、例えば、ＳＣＩ値が割り当てられた対象間隔を含む。
【０４６７】
ある実施形態では、ゲノムセグメントは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個の対象間隔、例えば、エクソンを含む。ある実施形態では、ゲノムセグメントは、１０〜１，０００、２０〜９００、３０〜７００、４０〜６００、５０〜５００、６０〜４００、７０〜３００、８０〜２００、８０〜１５０、または８０〜１２０、９０〜１１０、または約１００個の対象間隔、例えば、エクソンを含む。ある実施形態では、ゲノムセグメントは、１００〜１０，０００、１００〜５，０００、１００〜４，０００、１００〜３，０００、１００〜２，０００、または１００〜１，０００個の対象間隔、例えば、エクソンを含む。ある実施形態では、ゲノムセグメントは、ＳＡＦＩ値が割り当てられている１０〜１，０００、２０〜９００、３０〜７００、４０〜６００、５０〜５００、６０〜４００、７０〜３００、８０〜２００、８０〜１５０もしくは８０〜１２０、９０〜１１０、または約１００個のゲノムＳＮＰを含む。ある実施形態では、ゲノムセグメントは、ＳＡＦＩ値が割り当てられている１００〜１０，０００、１００〜５，０００、１００〜４，０００、１００〜３，０００、１００〜２，０００、または１００〜１，０００個のゲノムＳＮＰを含む。
【０４６８】
ある実施形態では、複数のゲノムセグメントの各々は、以下のいずれか１つまたは両方を有することによって特徴づけられる：
正規化された配列カバレッジの尺度、例えば、ｌｏｇ  ｒは、予め選択された量以下にしか相違せず、例えば、ゲノムセグメントの境界内の対象間隔、例えば、エクソンについてのｌｏｇ２ｒの値は、参照値以下にしか相違せず、または実質的に一定である；
生殖系列ＳＮＰのＳＮＰ対立遺伝子頻度は、予め選択された量以下にしか相違せず、例えば、ゲノムセグメントの境界内の対象間隔、例えば、エクソンの生殖系列ＳＮＰ対立遺伝子の値は、参照値以下にしか相違せず、または実質的に一定である。
【０４６９】
ある実施形態では、ゲノムセグメントに含まれるか、またはゲノムセグメントを形成するために組み合わされる対象間隔、例えば、エクソンの数は、ゲノムセグメントの数の少なくとも２、５、１０、１５、２０、５０、または１００倍である。ある実施形態では、対象間隔、例えば、エクソンの数は、ゲノムセグメントの数の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５倍である。
【０４７０】
ある実施形態では、ゲノムセグメントの境界が提供される。ある実施形態では、本方法は、対象間隔、例えば、エクソンのための配列を遺伝的セグメントにアセンブルさせることを含む。
【０４７１】
ある実施形態では、本方法は、本明細書に記載される方法、例えば、環状二分割法（ＣＢＳ）、ＨＭＭベースの方法、ウェーブレットベースの方法、または染色体に沿ったクラスター法を含む方法を用いて、対象間隔のための配列をアセンブルさせることを含む。
【０４７２】
ある実施形態では、ゲノムワイドコピー数モデルのＳＣＩへの適合は、以下の式を使用することを含む：
2021526825.tif 000004
ψは腫瘍倍数性である。
【０４７３】
ある実施形態では、ψ＝（ΣｉｌｉＣｉ）／Σｉｌｉであり、ｌｉをゲノムセグメントの長さとする。
【０４７４】
ある実施形態では、ゲノムワイドコピー数モデルのＳＡＦＩへの適合は、以下の式を使用することを含む：
2021526825.tif 000005
ＡＦは対立遺伝子頻度である。
【０４７５】
ある実施形態では、適合は、ギブスサンプリングを使用することを含む。ある実施形態では、適合は、例えば、マルコフ連鎖モンテカルロ（ＭＣＭＣ）アルゴリズム、例えば、ＡＳＣＡＴ（腫瘍の対立遺伝子特異的コピー数分析）、ＯｎｃｏＳＮＰ、またはＰＩＣＮＩＣ（がんにおける統合コピー数の予測）を使用することを含む。ある実施形態では、適合は、メトロポリス−ハスティングスＭＣＭＣを使用することを含む。ある実施形態では、適合は、非ベイズ手法、例えば、頻度論的手法を用いること、例えば、最小二乗適合を使用することを含む。
【０４７６】
ある実施形態では、ｇは、ＶＡＦＩ、ｐ、Ｃ、およびＭについての値の体細胞性／生殖系列の状態に関するモデルへの適合度を決定することによって決定される。ある実施形態では、本方法は、前記変異体、例えば、突然変異に対するヘテロ接合性の指標を取得することを含む。ある実施形態では、試料純度（ｐ）は、全体的な純度であり、例えば、全ゲノムセグメントに対して同じである。
【０４７７】
ある実施形態では、ｇの値は、以下によって取得される：
2021526825.tif 000006
ＡＦは対立遺伝子頻度である。
【０４７８】
ある実施形態では、０に近い、例えば、０と有意に異ならないｇの値は、その変異体が体細胞性変異体であることを示す。ある実施形態では、０である、または０に近い、例えば、０からある距離内のｇの値、例えば、０．４未満のｇの値は、変異体が体細胞性変異体であることを示す。ある実施形態では、１に近い、例えば、１と有意に異ならないｇの値は、変異体が生殖系列変異体であることを示す。ある実施形態では、１である、または１に近い、例えば、１からある距離内のｇの値、例えば、０．６を超えるｇの値は、変異体が生殖系列変異体であることを示す。ある実施形態では、ｇの値は、１未満であるが、０を超え、例えば、ｇが量で１未満であり、量で０を超えている場合、例えば、ｇが０．４〜０．６である場合、それは識別不能な結果を示す。
【０４７９】
ある実施形態では、０よりも有意に小さいｇの値は、サブクローン性体細胞性変異体を示す。
【０４８０】
ある実施形態では、ｇの値は、以下によって取得される：
2021526825.tif 000007
ＡＦは対立遺伝子頻度であり、Ｍ’＝Ｃ−Ｍ（例えば、Ｍが非マイナー対立遺伝子頻度である場合）であり、例えば、変異体は、ｇ＝１であれば生殖系列多型であり、変異体は、ｇ＝０であれば体細胞性突然変異である。
【０４８１】
ある実施形態では、体細胞性／生殖系列の状態は、例えば、試料の純度が約４０％未満、例えば、約１０％〜３０％、例えば、約１０％〜２０％、または約２０％〜３０％である場合に決定される。
【０４８２】
一実施形態では、Ｍの値が０に等しく、Ｃに等しくない場合、変異体、例えば、突然変異が存在しないこと、例えば、腫瘍に存在しないことを示す；Ｃに等しく、ゼロでないＭの値は、変異体、例えば、突然変異のホモ接合性を示し、例えば、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を伴う；０に等しく、Ｃに等しいＭの値は、変異体、例えば、突然変異のホモ接合型欠失を示し、例えば、腫瘍に存在しないことを示す；およびＣに等しくなく、ゼロでないＭの値は、変異体、例えば、突然変異のヘテロ接合性を示す。
【０４８３】
ある実施形態では、本方法は、前記変異体、例えば、突然変異に対する接合性の指標を取得することを含む。ある実施形態では、突然変異状態は、Ｍ＝Ｃ≠０の場合、ホモ接合体（例えば、ＬＯＨ）として決定される。ある実施形態では、突然変異状態は、Ｍ＝Ｃ＝０の場合、ホモ接合型欠失として決定される。ある実施形態では、突然変異状態は、ヘテロ接合性が０＜Ｍ＜Ｃであると決定される。ある実施形態では、突然変異は、Ｍ＝０およびＣ≠０の場合、腫瘍に存在しない。ある実施形態では、接合性は、例えば、試料純度が約８０％を超える場合、例えば、約９０％〜１００％、例えば、約９０％〜９５％、または約９５％〜１００％である場合に決定される。
【０４８４】
ある実施形態では、対照は、試料が由来する対象以外の対象由来の正倍体（例えば、二倍体）組織の試料であるか、または試料が由来する対象以外の１以上（例えば、少なくとも２、３、４、または５）の対象由来の混合正倍体（例えば、２倍体）組織の試料である。ある実施形態では、本方法は、選択された対象間隔の各々、および選択された生殖系列ＳＮＰの各々を、例えば、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって配列決定することを含む。ある実施形態では、正規化前の配列カバレッジは、少なくとも約１０×、２０×、３０×、５０×、１００×、２５０×、５００×、７５０×、８００×、９００×、１，０００×、１，５００×、２，０００×、２，５００×、３，０００×、３，５００×、４，０００×、４，５００×、５，０００×、５，５００×、６，０００×、６，５００×、７，０００×、７，５００×、８，０００×、８，５００×、９，０００×、９，５００×、または１０，０００×の配列決定深度である。
【０４８５】
ある実施形態では、対象は、抗がん療法を受けたことがある。ある実施形態では、対象は、抗がん療法を受けたことがあり、療法に抵抗性であるか、または疾患の進行を示す。ある実施形態では、対象は、ＦＤＡ、ＥＭＡ、もしくは他の規制機関により承認された治療剤；またはＦＤＡ、ＥＭＡ、もしくは他の規制機関により承認されていない治療剤から選択される抗がん療法を受けたことがある。ある実施形態では、対象は、臨床治験、例えば、第Ｉ相、第ＩＩ相、または第ＩＩＩ相臨床治験（またはこのような試験の米国外同等物）の過程で抗がん療法を受けたことがある。ある実施形態では、変異体は、対象に存在する腫瘍タイプ、例えば、治療の発生または治療に対する抵抗性と正に関連する。ある実施形態では、変異体は、対象に存在する腫瘍タイプと正に関連しない。ある実施形態では、変異体は、対象に存在する腫瘍タイプ以外の腫瘍と正に関連する。ある実施形態では、変異体は、対象に存在する腫瘍タイプと正に関連しない変異体である。
【０４８６】
ある実施形態では、本方法は、腫瘍における他の突然変異、例えば、試料中の腫瘍タイプに関連する他の突然変異、試料中の腫瘍タイプと関連しない他の突然変異、または試料中の腫瘍タイプ以外の腫瘍に関連する他の突然変異の存在、不存在、もしくは頻度；変異体の特徴づけ；対立遺伝子もしくは遺伝子；または腫瘍タイプ、例えば、腫瘍タイプの名称、腫瘍が原発性であるか二次性であるか；対象の特性；または治療代替物、推奨、またはオプションのうちの１つ以上についての記述子を、例えば、データベース、例えば、機械リード可能データベースに記憶するか、記述子を含む報告書を提出するか、または送信することができる。
【０４８７】
ある実施形態では、変異体の特徴づけに関する記述子は、接合性または生殖系列対体細胞性状態の記述子を含む。ある実施形態では、対象の特徴に関連する記述子は、対象の同一性；対象の年齢、性別、体重、もしくは他の類似の特徴、職業の１つ以上；対象の病歴、例えば、腫瘍もしくは他の障害の発生；対象の家族歴、例えば、変異体を共有するかまたは共有しない近親者；または対象の以前の治療歴、例えば、受けた治療、例えば、以前に投与された抗がん治療に対する反応、例えば、疾患抵抗性、反応性、または進行の記述子のうちの１つ以上を含む。
【０４８８】
ＳＧＺアルゴリズムはまた、Ｓｕｎら  ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．２０１８年；１４（２）：ｅ１００５９６５；Ｓｕｎら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１４年；７４巻（１９Ｓ）：１８９３−１８９３頁；国際出願公開第ＷＯ２０１４／１８３０７８号、米国特許第９，７９２，４０３号、および米国特許出願公開第２０１４／０３３６９９６号に記載され、これらの内容は全体として参照により組み込まれる。
【０４８９】
腫瘍遺伝子変異量
【０４９０】
本明細書に記載される方法および組成物は、腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）を評価するために使用することができる。
【０４９１】
用語「突然変異の量」、「突然変異量荷」、「突然変異荷重」、および「突然変異の荷重」は、本明細書において互換的に使用される。腫瘍との関連で、突然変異の荷重はまた、本明細書において「腫瘍遺伝子変異の量」、「腫瘍遺伝子変異量」、または「ＴＭＢ」とも呼ばれる。理論に拘束されることを望まないが、一部の実施形態では、ＴＭＢは、あるタイプのゲノムシグネチャー、例えば、連続的／複雑なバイオマーカーとみなすことができると考えられる。
【０４９２】
本明細書で使用される場合、用語「突然変異量」または「突然変異の量」は、遺伝子セット（例えば、遺伝子セットのコード化領域）における所定の単位あたり（例えば、１メガ塩基あたり）の変化（例えば、１つ以上の変化、例えば、１つ以上の体細胞性変化）のレベル、例えば、数を指す。突然変異量は、例えば、全ゲノムもしくはエクソームベースで、またはゲノムもしくはエクソームのサブセットに基づいて測定することができる。一部の実施形態では、ゲノムまたはエクソームのサブセットに基づいて測定される突然変異量は、全ゲノムまたはエクソーム突然変異量を決定するために外挿することができる。
【０４９３】
ある実施形態では、方法は、
ａ）試料からの対象間隔セット（例えば、コーディング対象間隔）の配列、例えば、ヌクレオチド配列を提供し、対象間隔セットは遺伝子セットからのものであり；
ｂ）突然変異量の値を決定し、値は、対象間隔セットにおける変化（例えば、１つ以上の変化）、例えば、体細胞性変化（例えば、１つ以上の体細胞性変化）の数の関数である
を含む。
【０４９４】
ある種の実施形態では、変化の数は、対象間隔における機能的変化を除外する。他の実施形態では、変化の数は、対象間隔における生殖系列変化を除外する。一部の実施形態では、変化の数は、対象間隔における機能的変化および対象間隔における生殖系列変化を除外する。
【０４９５】
ある種の実施形態では、対象間隔セットは、コーディング対象間隔を含む。他の実施形態では、対象間隔セットは、非コーディング対象間隔を含む。ある種の実施形態では、対象間隔セットは、コーディング対象間隔を含む。他の実施形態では、対象間隔セットは、１つ以上のコーディング対象間隔および１つ以上の非コーディング対象間隔を含む。ある種の実施形態では、対象間隔セットにおける対象間隔の約５％以上、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、または約９５％以上は、コーディング対象間隔である。他の実施形態では、対象間隔セットにおける対象間隔の約９０％以下、約８０％以下、約７０％以下、約６０％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、約１０％以下、または約５％以下は、非コーディング対象間隔である。
【０４９６】
他の実施形態では、対象間隔のセットは、全ゲノムまたは全エクソームを含まない。他の実施形態では、コーディング対象間隔セットは、全エクソームを含まない。
【０４９７】
ある種の実施形態では、遺伝子セットは、全ゲノムまたは全エクソームを含まない。他の実施形態では、遺伝子セットは、表１Ａ〜５Ａに示される１つ以上の遺伝子を含むかまたはそれからなる。
【０４９８】
ある種の実施形態では、値は、遺伝子セットの関数として表される。ある種の実施形態では、値は、遺伝子セットのコード化領域の関数として表される。他の実施形態では、値は、遺伝子セットの非コード化領域の関数として表される。ある種の実施形態では、値は、遺伝子セットのエクソンの関数として表される。他の実施形態では、値は、遺伝子セットのイントロンの関数として表される。
【０４９９】
ある種の実施形態では、値は、配列決定され遺伝子セットの関数として表される。ある種の実施形態では、値は、配列決定された遺伝子セットのコード化領域の関数として表される。他の実施形態では、値は、配列決定された遺伝子セットの非コード化領域の関数として表される。ある種の実施形態では、値は、配列決定された遺伝子セットのエクソンの関数として表される。他の実施形態では、値は、配列決定された遺伝子セットのイントロンの関数として表される。
【０５００】
ある種の実施形態では、値は、遺伝子セットの多数の位置における変化（例えば、体細胞性変化）の数の関数として表される。ある種の実施形態では、値は、遺伝子セットのコード化領域の多数の位置における変化（例えば、体細胞性変化）の数の関数として表される。他の実施形態では、値は、遺伝子セットの非コード化領域の多数の位置における変化（例えば、体細胞性変化）の数の関数として表される。ある種の実施形態では、値は、遺伝子セットのエクソンの多数の位置における変化（例えば、体細胞性変化）の数の関数として表される。他の実施形態では、値は、遺伝子セットのイントロンの多数の位置における変化（例えば、体細胞性変化）の数の関数として表される。
【０５０１】
ある種の実施形態では、値は、配列決定された遺伝子セットの多数の位置における変化（例えば、体細胞性変化）の数の関数として表される。ある種の実施形態では、値は、配列決定された遺伝子セットのコード化領域の多数の位置における変化（例えば、体細胞性変化）の数の関数として表される。他の実施形態では、値は、配列決定された遺伝子セットの非コード化領域の多数の位置における変化（例えば、体細胞性変化）の数の関数として表される。ある種の実施形態では、値は、配列決定された遺伝子セットのエクソンの多数の位置における変化（例えば、体細胞性変化）の数の関数として表される。他の実施形態では、値は、配列決定された遺伝子セットのイントロンの多数の位置における変化（例えば、体細胞性変化）の数の関数として表される。
【０５０２】
ある種の実施形態では、値は、単位あたりの変化（例えば、体細胞性変化）の数の関数として、例えば、メガ塩基あたりの体細胞性変化の数の関数として表される。
【０５０３】
ある種の実施形態では、値は、遺伝子セットのメガ塩基あたりの変化（例えば、体細胞性変化）の数の関数として表される。ある種の実施形態では、値は、遺伝子セットのコード化領域におけるメガ塩基あたりの変化（例えば、体細胞性変化）の数の関数として表される。他の実施形態では、値は、遺伝子セットの非コード化領域におけるメガ塩基あたりの変化（例えば、体細胞性変化）の数の関数として表される。ある種の実施形態では、値は、遺伝子セットのエクソンにおけるメガ塩基あたりの変化（例えば、体細胞性変化）の数の関数として表される。他の実施形態では、値は、遺伝子セットのイントロンにおけるメガ塩基あたりの変化（例えば、体細胞性変化）の数の関数として表される。
【０５０４】
ある種の実施形態では、値は、配列決定された遺伝子セットにおけるメガ塩基あたりの変化（例えば、体細胞性変化）の数の関数として表される。ある種の実施形態では、値は、配列決定された遺伝子セットのコード化領域におけるメガ塩基あたりの変化（例えば、体細胞性変化）の数の関数として表される。他の実施形態では、値は、配列決定された遺伝子セットの非コード化領域におけるメガ塩基あたりの変化（例えば、体細胞性変化）の数の関数として表される。ある種の実施形態では、値は、配列決定された遺伝子セットのエクソンにおけるメガ塩基あたりの変化（例えば、体細胞性変化）の数の関数として表される。他の実施形態では、値は、配列決定された遺伝子セットのイントロンにおけるメガ塩基あたりの変化（例えば、体細胞性変化）の数の関数として表される。
【０５０５】
ある種の実施形態では、突然変異量は、例えば、全突然変異量を得るために、大部分のゲノムに、例えば、エクソームまたは全ゲノムに外挿される。他の実施形態では、突然変異量は、大部分のエクソーム、例えば、全エクソームに外挿される。
【０５０６】
ある種の実施形態では、試料は、対象由来である。ある種の実施形態では、対象は、障害、例えば、がんを有する。他の実施形態では、対象は、療法、例えば、免疫療法を受けているかまたは受けたことがある。
【０５０７】
ある種の実施形態では、突然変異量は、百分位として、例えば、参照集団からの試料における突然変異量のうちで表される。ある種の実施形態では、参照集団は、対象と同じタイプのがんを有する患者を含む。他の実施形態では、参照集団は、対象と同じタイプの療法を受けているかまたは受けたことがある患者を含む。
【０５０８】
ある種の実施形態では、本方法は、
（ｉ）試料から複数の腫瘍核酸分子を含むライブラリーを取得すること；
（ｉｉ）ライブラリーを標的捕捉試薬と接触させて、選択された腫瘍核酸分子を提供し、前記標的捕捉試薬は、腫瘍核酸分子とハイブリダイズし、それによってライブラリーキャッチを提供すること；
（ｉｉｉ）例えば、次世代シークエンシング法により、前記ライブラリーキャッチ由来の腫瘍核酸分子からの変化（例えば、体細胞性変化）を含む対象間隔についてのリードを取得すること；
（ｉｖ）アライメント法により前記リードを整列させること；
（ｖ）ヌクレオチド位置についての前記リードからヌクレオチド値を割り当てること；
（ｖｉ）割り当てられたヌクレオチド位置セットから、対象間隔セットを選択すること（例えば、対象間隔をコードすること）であって、対象間隔セットは遺伝子セットに由来する、対象間隔セットを選択すること；ならびに
（ｖｉｉ）突然変異量の値を決定することであって、値は、対象間隔セットにおける変化（例えば、１つ以上の変化）、例えば、体細胞性変化（例えば、１つ以上の体細胞性変化）の数の関数である、突然変異量の値を決定すること
を含む。
【０５０９】
ある種の実施形態では、変化（例えば、体細胞性変化）の数は、対象間隔における機能的変化を除外する。他の実施形態では、変化の数は、対象間隔における生殖系列変化を除外する。ある種の実施形態では、変化（例えば、体細胞性変化）の数は、対象間隔における機能的変化および対象間隔における生殖系列変化を除外する。
【０５１０】
腫瘍遺伝子変異量を評価する他の方法は、その内容が全体として参照により組み込まれる国際出願公開第ＷＯ２０１７／１５１５２４号に記載される。
【０５１１】
遺伝子選択
【０５１２】
選択された遺伝子または遺伝子産物（本明細書では「標的遺伝子または遺伝子産物」とも称する）は、遺伝子内領域または遺伝子間領域を含む対象間隔を含むことができる。例えば、対象間隔は、エクソンもしくはイントロン、またはそれらの断片、典型的にはエクソン配列もしくはその断片を含むことができる。対象間隔は、コード化領域または非コード化領域、例えば、プロモーター、エンハンサー、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、もしくは３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、またはその断片を含み得る。他の実施形態では、対象間隔は、ｃＤＮＡまたはその断片を含む。他の実施形態では、対象間隔は、ＳＮＰ、例えば、本明細書に記載されるＳＮＰを含む。
【０５１３】
他の実施形態では、対象間隔は、ゲノム中の実質的に全てのエクソン、例えば、本明細書に記載される対象間隔の１つ以上（例えば、目的とする遺伝子または遺伝子産物（例えば、本明細書に記載されるがん性表現型に関連する遺伝子または遺伝子産物）からのエクソン）を含む。一実施形態では、対象間隔は、体細胞性突然変異、生殖細胞突然変異、またはその両方を含む。一実施形態では、対象間隔は、変化、例えば、点または単一の突然変異、欠失突然変異（例えば、インフレーム欠失、遺伝子内欠失、完全遺伝子欠失）、挿入突然変異（例えば、遺伝子内挿入）、逆位突然変異（例えば、染色体内逆位）、連結突然変異、連結挿入突然変異、逆位重複突然変異、タンデム重複（例えば、染色体内タンデム重複）、転座（例えば、染色体内転座、非相互転座）、再配列、遺伝子コピー数の変化、またはそれらの組合せを含む。ある種の実施形態では、対象間隔は、試料中の腫瘍細胞のゲノムのコード化領域の５％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％または０．００１％未満を構成する。他の実施形態では、対象間隔は、疾患に関与せず、例えば、本明細書に記載されるがん性表現型と関連しない。
【０５１４】
一実施形態では、標的遺伝子または遺伝子産物は、バイオマーカーである。本明細書で使用される場合、「バイオマーカー」または「マーカー」は、変化され得る遺伝子、ｍＲＮＡ、またはタンパク質であり、前記変化はがんと関連する。変化は、正常もしくは健康な組織または細胞（例えば、対照）におけるその量、構造、および／または活性と比較した、がん組織またはがん細胞における量、構造、および／または活性であり得、がんなどの病状と関連する。例えば、がんに関連するマーカー、または抗がん療法に対する反応性を予測するマーカーは、正常、健康な組織または細胞と比較して、がん組織またはがん細胞において、変化したヌクレオチド配列、アミノ酸配列、染色体転座、染色体内逆位、コピー数、発現レベル、タンパク質レベル、タンパク質活性、エピジェネティック修飾（例えば、メチル化もしくはアセチル化状態、または翻訳後修飾）を有することができる。さらに、「マーカー」は、がんなどの病状と関連する組織または細胞に存在する場合、構造が変化し、例えば、突然変異し（突然変異を含む）、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで野生型配列と、例えば、置換、欠失、または挿入により相違する分子を含む。
【０５１５】
一実施形態では、標的遺伝子または遺伝子産物は、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む。別の実施形態では、遺伝子または遺伝子産物は、小さな欠失、例えば、小さな遺伝子内欠失（例えば、インフレーム欠失またはフレームシフト欠失）を有する。さらに別の実施形態では、標的配列は、遺伝子全体の欠失から生じる。さらに別の実施形態では、標的配列は、小さな挿入、例えば、小さな遺伝子内挿入を有する。一実施形態では、標的配列は、逆位、例えば、染色体内逆位から生じる。別の実施形態では、標的配列は、染色体間転座から生じる。さらに別の実施形態では、標的配列は、タンデム重複を有する。一実施形態では、標的配列は、望ましくない特徴（例えば、高いＧＣ含量または反復要素）を有する。別の実施形態では、標的配列は、例えば、その反復性のために、それ自体ではうまく標的化することができないヌクレオチド配列の一部を有する。一実施形態では、標的配列は、選択的スプライシングから生じる。別の実施形態では、標的配列は、表１Ａ〜５Ａに従う遺伝子もしくは遺伝子産物、またはその断片から選択される。
【０５１６】
ある実施形態では、標的遺伝子もしくは遺伝子産物、またはその断片は、抗体遺伝子もしくは遺伝子産物、免疫グロブリンスーパーファミリー受容体（例えば、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）もしくはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）））遺伝子もしくは遺伝子産物、またはその断片である。
【０５１７】
ヒト抗体分子（およびＢ細胞受容体）は、少なくとも以下の３つの遺伝子座上の遺伝子によってコードされる定常領域（Ｃ）と可変領域（Ｖ）の両方を含む重鎖および軽鎖で構成される。
【０５１８】
１．免疫グロブリン重鎖の遺伝子セグメントを含む、第１４染色体上の免疫グロブリン重遺伝子座（ＩＧＨ＠）；
２．免疫グロブリン軽鎖の遺伝子セグメントを含む、第２染色体上の免疫グロブリンカッパ（κ）遺伝子座（ＩＧＫ＠）；
３．免疫グロブリン軽鎖の遺伝子セグメントを含む、第２２染色体上の免疫グロブリンラムダ（λ）遺伝子座（ＩＧＬ＠）。
【０５１９】
各重鎖および軽鎖遺伝子は、抗体タンパク質の可変領域に対する３つの異なるタイプの遺伝子セグメントの多重コピーを含む。例えば、免疫グロブリン重鎖領域は、５個の異なるクラスγ、δ、α、μおよびε、４４個の可変（Ｖ）遺伝子セグメント、２７個の多様性（Ｄ）遺伝子セグメント、および６個の結合（Ｊ）遺伝子セグメントのうちの１つを含むことができる。軽鎖はまた、多数のＶおよびＪ遺伝子セグメントを持つが、Ｄ遺伝子セグメントを持たない。ラムダ軽鎖は、７つの可能なＣ領域を有し、カッパ軽鎖は１つを有する。
【０５２０】
免疫グロブリン重遺伝子座（ＩＧＨ＠）は、ヒト第１４染色体上の領域であり、ヒト抗体（または免疫グロブリン）の重鎖の遺伝子を含む。例えば、ＩＧＨ遺伝子座には、ＩＧＨＶ（可変）、ＩＧＨＤ（多様性）、ＩＧＨＪ（結合）、およびＩＧＨＣ（定常）遺伝子が含まれる。免疫グロブリン重鎖をコードする例示的な遺伝子には、限定されないが、ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ１−１２、ＩＧＨＶ１−１４、ＩＧＨＶ１−１７、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−２４、ＩＧＨＶ１−４５、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ１−５８、ＩＧＨＶ１−６７、ＩＧＨＶ１−６８、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−３８−４、ＩＧＨＶ１−６９−２、ＩＧＨＶ２−５、ＩＧＨＶ２−１０、ＩＧＨＶ２−２６、ＩＧＨＶ２−７０、ＩＧＨＶ３−６、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−１３、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−１６、ＩＧＨＶ３−１９、ＩＧＨＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２２、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ３−２５、ＩＧＨＶ３−２９、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ３−３０−２、ＩＧＨＶ３−３０−３、ＩＧＨＶ３−３０−５、ＩＧＨＶ３−３２、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−３３−２、ＩＧＨＶ３−３５、ＩＧＨＶ３−３６、ＩＧＨＶ３−３７、ＩＧＨＶ３−３８、ＩＧＨＶ３−４１、ＩＧＨＶ３−４２、ＩＧＨＶ３−４３、ＩＧＨＶ３−４７、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−５０、ＩＧＨＶ３−５２、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−５４、ＩＧＨＶ３−５７、ＩＧＨＶ３−６０、ＩＧＨＶ３−６２、ＩＧＨＶ３−６３、ＩＧＨＶ３−６４、ＩＧＨＶ３−６５、ＩＧＨＶ３−６６、ＩＧＨＶ３−７１、ＩＧＨＶ３−７２、ＩＧＨＶ３−７３、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ３−７５、ＩＧＨＶ３−７６、ＩＧＨＶ３−７９、ＩＧＨＶ３−３８−３、ＩＧＨＶ３−６９−１、ＩＧＨＶ４−４、ＩＧＨＶ４−２８、ＩＧＨＶ４−３０−１、ＩＧＨＶ４−３０−２、ＩＧＨＶ４−３０−４、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ４−５５、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ４−６１、ＩＧＨＶ４−８０、ＩＧＨＶ４−３８−２、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ５−７８、ＩＧＨＶ５−１０−１、ＩＧＨＶ６−１、ＩＧＨＶ７−４−１、ＩＧＨＶ７−２７、ＩＧＨＶ７−３４−１、ＩＧＨＶ７−４０、ＩＧＨＶ７−５６、ＩＧＨＶ７−８１、ＩＧＨＶＩＩ−１−１、ＩＧＨＶＩＩ−１５−１、ＩＧＨＶＩＩ−２０−１、ＩＧＨＶＩＩ−２２−１、ＩＧＨＶＩＩ−２６−２、ＩＧＨＶＩＩ−２８−１、ＩＧＨＶＩＩ−３０−１、ＩＧＨＶＩＩ−３１−１、ＩＧＨＶＩＩ−３３−１、ＩＧＨＶＩＩ−４０−１、ＩＧＨＶＩＩ−４３−１、ＩＧＨＶＩＩ−４４−２、ＩＧＨＶＩＩ−４６−１、ＩＧＨＶＩＩ−４９−１、ＩＧＨＶＩＩ−５１−２、ＩＧＨＶＩＩ−５３−１、ＩＧＨＶＩＩ−６０−１、ＩＧＨＶＩＩ−６２−１、ＩＧＨＶＩＩ−６５−１、ＩＧＨＶＩＩ−６７−１、ＩＧＨＶＩＩ−７４−１、ＩＧＨＶＩＩ−７８−１、ＩＧＨＶＩＩＩ−２−１、ＩＧＨＶＩＩＩ−５−１、ＩＧＨＶＩＩＩ−５−２、ＩＧＨＶＩＩＩ−１１−１、ＩＧＨＶＩＩＩ−１３−１、ＩＧＨＶＩＩＩ−１６−１、ＩＧＨＶＩＩＩ−２２−２、ＩＧＨＶＩＩＩ−２５−１、ＩＧＨＶＩＩＩ−２６−１、ＩＧＨＶＩＩＩ−３８−１、ＩＧＨＶＩＩＩ−４４、ＩＧＨＶＩＩＩ−４７−１、ＩＧＨＶＩＩＩ−５１−１、ＩＧＨＶＩＩＩ−６７−２、ＩＧＨＶＩＩＩ−６７−３、ＩＧＨＶＩＩＩ−６７−４、ＩＧＨＶＩＩＩ−７６−１、ＩＧＨＶＩＩＩ−８２、ＩＧＨＶＩＶ−４４−１、ＩＧＨＤ１−１、ＩＧＨＤ１−７、ＩＧＨＤ１−１４、ＩＧＨＤ１−２０、ＩＧＨＤ１−２６、ＩＧＨＤ２−２、ＩＧＨＤ２−８、ＩＧＨＤ２−１５、ＩＧＨＤ２−２１、ＩＧＨＤ３−３、ＩＧＨＤ３−９、ＩＧＨＤ３−１０、ＩＧＨＤ３−１６、ＩＧＨＤ３−２２、ＩＧＨＤ４−４、ＩＧＨＤ４−１１、ＩＧＨＤ４−１７、ＩＧＨＤ４−２３、ＩＧＨＤ５−５、ＩＧＨＤ５−１２、ＩＧＨＤ５−１８、ＩＧＨＤ５−２４、ＩＧＨＤ６−６、ＩＧＨＤ６−１３、ＩＧＨＤ６−１９、ＩＧＨＤ６−２５、ＩＧＨＤ７−２７、ＩＧＨＪ１、ＩＧＨＪ１Ｐ、ＩＧＨＪ２、ＩＧＨＪ２Ｐ、ＩＧＨＪ３、ＩＧＨＪ３Ｐ、ＩＧＨＪ４、ＩＧＨＪ５、ＩＧＨＪ６、ＩＧＨＡ１、ＩＧＨＡ２、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２、ＩＧＨＧ３、ＩＧＨＧ４、ＩＧＨＧＰ、ＩＧＨＤ、ＩＧＨＥ、ＩＧＨＥＰ１、ＩＧＨＭ、およびＩＧＨＶ１−６９Ｄが含まれる。
【０５２１】
免疫グロブリンカッパ遺伝子座（ＩＧＫ＠）は、ヒト第２染色体上の領域であり、抗体（または免疫グロブリン）のカッパ（κ）軽鎖の遺伝子を含む。例えば、ＩＧＫ遺伝子座には、ＩＧＫＶ（可変）、ＩＧＫＪ（結合）、およびＩＧＫＣ（定常）遺伝子が含まれる。免疫グロブリンカッパ軽鎖をコードする例示的な遺伝子には、限定されないが、ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＫＶ１−６、ＩＧＫＶ１−８、ＩＧＫＶ１−９、ＩＧＫＶ１−１２、ＩＧＫＶ１−１３、ＩＧＫＶ１−１６、ＩＧＫＶ１−１７、ＩＧＫＶ１−２２、ＩＧＫＶ１−２７、ＩＧＫＶ１−３２、ＩＧＫＶ１−３３、ＩＧＫＶ１−３５、ＩＧＫＶ１−３７、ＩＧＫＶ１−３９、ＩＧＫＶ１Ｄ−８、ＩＧＫＶ１Ｄ−１２、ＩＧＫＶ１Ｄ−１３、ＩＧＫＶ１Ｄ−１６  ＩＧＫＶ１Ｄ−１７、ＩＧＫＶ１Ｄ−２２、ＩＧＫＶ１Ｄ−２７、ＩＧＫＶ１Ｄ−３２、ＩＧＫＶ１Ｄ−３３、ＩＧＫＶ１Ｄ−３５、ＩＧＫＶ１Ｄ−３７、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９、ＩＧＫＶ１Ｄ−４２、ＩＧＫＶ１Ｄ−４３、ＩＧＫＶ２−４、ＩＧＫＶ２−１０、ＩＧＫＶ２−１４、ＩＧＫＶ２−１８、ＩＧＫＶ２−１９、ＩＧＫＶ２−２３、ＩＧＫＶ２−２４、ＩＧＫＶ２−２６、ＩＧＫＶ２−２８、ＩＧＫＶ２−２９、ＩＧＫＶ２−３０、ＩＧＫＶ２−３６、ＩＧＫＶ２−３８、ＩＧＫＶ２−４０、ＩＧＫＶ２Ｄ−１０、ＩＧＫＶ２Ｄ−１４、ＩＧＫＶ２Ｄ−１８、ＩＧＫＶ２Ｄ−１９、ＩＧＫＶ２Ｄ−２３、ＩＧＫＶ２Ｄ−２４、ＩＧＫＶ２Ｄ−２６、ＩＧＫＶ２Ｄ−２８、ＩＧＫＶ２Ｄ−２９、ＩＧＫＶ２Ｄ−３０、ＩＧＫＶ２Ｄ−３６、ＩＧＫＶ２Ｄ−３８、ＩＧＫＶ２Ｄ−４０、ＩＧＫＶ３−７、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＫＶ３−２５、ＩＧＫＶ３−３１、ＩＧＫＶ３−３４、ＩＧＫＶ３Ｄ−７、ＩＧＫＶ３Ｄ−１１、ＩＧＫＶ３Ｄ−１５、ＩＧＫＶ３Ｄ−２０、ＩＧＫＶ３Ｄ−２５、ＩＧＫＶ３Ｄ−３１．  ＩＧＫＶ３Ｄ−３４、ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＫＶ５−２、ＩＧＫＶ６−２１、ＩＧＫＶ６Ｄ−２１、ＩＧＫＶ６Ｄ−４１、ＩＧＫＶ７−３、ＩＧＫＪ１、ＩＧＫＪ２、ＩＧＫＪ３、ＩＧＫＪ４、ＩＧＫＪ５、およびＩＧＫＣが含まれる。
【０５２２】
免疫グロブリンラムダ座（ＩＧＬ＠）は、ヒト第２２染色体上の領域であり、抗体（または免疫グロブリン）のラムダ軽鎖の遺伝子を含む。例えば、ＩＧＬ遺伝子座には、ＩＧＬＶ（可変）、ＩＧＬＪ（結合）、およびＩＧＬＣ（定常）遺伝子が含まれる。免疫グロブリンラムダ軽鎖をコードする例示的な遺伝子には、限定されないが、ＩＧＬＶ１−３６、ＩＧＬＶ１−４０、ＩＧＬＶ１−４１、ＩＧＬＶ１−４４、ＩＧＬＶ１−４７、ＩＧＬＶ１−５０、ＩＧＬＶ１−５１、ＩＧＬＶ１−６２、ＩＧＬＶ２−５、ＩＧＬＶ２−８、ＩＧＬＶ２−１１、ＩＧＬＶ２−１４、ＩＧＬＶ２−１８、ＩＧＬＶ２−２３、ＩＧＬＶ２−２８、ＩＧＬＶ２−３３、ＩＧＬＶ２−３４、ＩＧＬＶ３−１、ＩＧＬＶ３−２、ＩＧＬＶ３−４、ＩＧＬＶ３−６、ＩＧＬＶ３−７、ＩＧＬＶ３−９、ＩＧＬＶ３−１０、ＩＧＬＶ３−１２、ＩＧＬＶ３−１３、ＩＧＬＶ３−１５、ＩＧＬＶ３−１６、ＩＧＬＶ３−１７、ＩＧＬＶ３−１９、ＩＧＬＶ３−２１、ＩＧＬＶ３−２２、ＩＧＬＶ３−２４、ＩＧＬＶ３−２５、ＩＧＬＶ３−２６、ＩＧＬＶ３−２７、ＩＧＬＶ３−２９、ＩＧＬＶ３−３０、ＩＧＬＶ３−３１、ＩＧＬＶ３−３２、ＩＧＬＶ４−３、ＩＧＬＶ４−６０、ＩＧＬＶ４−６９、ＩＧＬＶ５−３７、ＩＧＬＶ５−３９、ＩＧＬＶ５−４５、ＩＧＬＶ５−４８、ＩＧＬＶ５−５２、ＩＧＬＶ６−５７、ＩＧＬＶ７−３５、ＩＧＬＶ７−４３、ＩＧＬＶ７−４６、ＩＧＬＶ８−６１、ＩＧＬＶ９−４９、ＩＧＬＶ１０−５４、ＩＧＬＶ１０−６７、ＩＧＬＶ１１−５５、ＩＧＬＶＩ−２０、ＩＧＬＶＩ−３８、ＩＧＬＶＩ−４２、ＩＧＬＶＩ−５６、ＩＧＬＶＩ−６３、ＩＧＬＶＩ−６８、ＩＧＬＶＩ−７０、ＩＧＬＶＩＶ−５３、ＩＧＬＶＩＶ−５９、ＩＧＬＶＩＶ−６４、ＩＧＬＶＩＶ−６５、ＩＧＬＶＩＶ−６６−１、ＩＧＬＶＶ−５８、ＩＧＬＶＶ−６６、ＩＧＬＶＶＩ−２２−１、ＩＧＬＶＶＩ−２５−１、ＩＧＬＶＶＩＩ−４１−１、ＩＧＬＪ１、ＩＧＬＪ２、ＩＧＬＪ３、ＩＧＬＪ４、ＩＧＬＪ５、ＩＧＬＪ６、ＩＧＬＪ７、ＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ４、ＩＧＬＣ５、ＩＧＬＣ６、およびＩＧＬＣ７が含まれる。
【０５２３】
Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）は、２つの部分：ｉ）１つのアイソタイプ（例えば、ＩｇＤまたはＩｇＭ）の膜結合免疫グロブリン分子で構成される。内在性膜ドメインの存在を除いて、これらは、それらの分泌型と同一であり得、およびｉｉ）シグナル伝達部分：ジスルフィド架橋によって一緒に結合されたＩｇ−α／Ｉｇ−β（ＣＤ７９）と呼ばれるヘテロダイマー。ダイマーの各核酸分子は、細胞膜を貫通し、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を持つ細胞質尾部を有する。
【０５２４】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、２つの異なるタンパク質鎖（すなわち、ヘテロダイマー）で構成される。Ｔ細胞の９５％では、アルファ（α）鎖とベータ（β）鎖からなり、Ｔ細胞の５％では、ガンマ（γ）鎖とデルタ（δ）鎖からなる。この比は、個体発生の間および罹患状態において変化し得る。Ｔ細胞受容体遺伝子はまた、固有の抗原受容体を各々の細胞に提供するために、リンパ球の発生中に再配列される、ベータ鎖とデルタ鎖に多重のＶ、ＤおよびＪ遺伝子断片（およびアルファ鎖とガンマ鎖にＶおよびＪ遺伝子断片）を含むという点において、免疫グロブリン遺伝子と類似している。
【０５２５】
Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子座（ＴＲＡ）は、ＴＣＲアルファ鎖の遺伝子を含むヒト第１４染色体上の領域である。例えば、ＴＲＡ遺伝子座は、例えば、ＴＲＡＶ（可変）、ＴＲＡＪ（結合）、およびＴＲＡＣ（定常）遺伝子を含む。Ｔ細胞受容体アルファ鎖をコードする遺伝子の例には、限定されないが、ＴＲＡＶ１−１、ＴＲＡＶ１−２、ＴＲＡＶ２、ＴＲＡＶ３、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ５、ＴＲＡＶ６、ＴＲＡＶ７、ＴＲＡＶ８−１、ＴＲＡＶ８−２、ＴＲＡＶ８−３、ＴＲＡＶ８−４、ＴＲＡＶ８−５、ＴＲＡＶ８−６、ＴＲＡＶ８−７、ＴＲＡＶ９−１、ＴＲＡＶ９−２、ＴＲＡＶ１０、ＴＲＡＶ１１、ＴＲＡＶ１２−１、ＴＲＡＶ１２−２、ＴＲＡＶ１２−３、ＴＲＡＶ１３−１、ＴＲＡＶ１３−２、ＴＲＡＶ１４ＤＶ４、ＴＲＡＶ１５、ＴＲＡＶ１６、ＴＲＡＶ１７、ＴＲＡＶ１８、ＴＲＡＶ１９、ＴＲＡＶ２０、ＴＲＡＶ２１、ＴＲＡＶ２２、ＴＲＡＶ２３ＤＶ６、ＴＲＡＶ２４、ＴＲＡＶ２５、ＴＲＡＶ２６−１、ＴＲＡＶ２６−２、ＴＲＡＶ２７、ＴＲＡＶ２８、ＴＲＡＶ２９ＤＶ５、ＴＲＡＶ３０、ＴＲＡＶ３１、ＴＲＡＶ３２、ＴＲＡＶ３３、ＴＲＡＶ３４、ＴＲＡＶ３５、ＴＲＡＶ３６ＤＶ７、ＴＲＡＶ３７、ＴＲＡＶ３８−１、ＴＲＡＶ３８−２ＤＶ８、ＴＲＡＶ３９、ＴＲＡＶ４０、ＴＲＡＶ４１、ＴＲＡＪ１、ＴＲＡＪ２、ＴＲＡＪ３、ＴＲＡＪ４、ＴＲＡＪ５、ＴＲＡＪ６、ＴＲＡＪ７、ＴＲＡＪ８、ＴＲＡＪ９、ＴＲＡＪ１０、ＴＲＡＪ１１、ＴＲＡＪ１２、ＴＲＡＪ１３、ＴＲＡＪ１４、ＴＲＡＪ１５、ＴＲＡＪ１６、ＴＲＡＪ１７、ＴＲＡＪ１８、ＴＲＡＪ１９、ＴＲＡＪ２０、ＴＲＡＪ２１、ＴＲＡＪ２２、ＴＲＡＪ２３、ＴＲＡＪ２４、ＴＲＡＪ２５、ＴＲＡＪ２６、ＴＲＡＪ２７、ＴＲＡＪ２８、ＴＲＡＪ２９、ＴＲＡＪ３０、ＴＲＡＪ３１、ＴＲＡＪ３２、ＴＲＡＪ３３、ＴＲＡＪ３４、ＴＲＡＪ３５、ＴＲＡＪ３６、ＴＲＡＪ３７、ＴＲＡＪ３８、ＴＲＡＪ３９、ＴＲＡＪ４０、ＴＲＡＪ４１、ＴＲＡＪ４２、ＴＲＡＪ４３、ＴＲＡＪ４４、ＴＲＡＪ４５、ＴＲＡＪ４６、ＴＲＡＪ４７、ＴＲＡＪ４８、ＴＲＡＪ４９、ＴＲＡＪ５０、ＴＲＡＪ５１、ＴＲＡＪ５２、ＴＲＡＪ５３、ＴＲＡＪ５４、ＴＲＡＪ５５、ＴＲＡＪ５６、ＴＲＡＪ５７、ＴＲＡＪ５８、ＴＲＡＪ５９、ＴＲＡＪ６０、ＴＲＡＪ６１、およびＴＲＡＣが含まれる。
【０５２６】
Ｔ細胞受容体ベータ遺伝子座（ＴＲＢ）は、ＴＣＲベータ鎖の遺伝子を含むヒト第７染色体上の領域である。例えば、ＴＲＢ遺伝子座は、例えば、ＴＲＢＶ（可変）、ＴＲＢＤ（多様性）、ＴＲＢＪ（結合）、およびＴＲＢＣ（定常）遺伝子を含む。Ｔ細胞受容体ベータ鎖をコードする例示的な遺伝子には、限定されないが、ＴＲＢＶ１、ＴＲＢＶ２、ＴＲＢＶ３−１、ＴＲＢＶ３−２、ＴＲＢＶ４−１、ＴＲＢＶ４−２、ＴＲＢＶ４−３、ＴＲＢＶ５−１、ＴＲＢＶ５−２、ＴＲＢＶ５−３、ＴＲＢＶ５−４、ＴＲＢＶ５−５、ＴＲＢＶ５−６、ＴＲＢＶ５−７、ＴＲＢＶ６−２、ＴＲＢＶ６−３、ＴＲＢＶ６−４、ＴＲＢＶ６−５、ＴＲＢＶ６−６、ＴＲＢＶ６−７、ＴＲＢＶ６−８、ＴＲＢＶ６−９、ＴＲＢＶ７−１、ＴＲＢＶ７−２、ＴＲＢＶ７−３、ＴＲＢＶ７−４、ＴＲＢＶ７−５、ＴＲＢＶ７−６、ＴＲＢＶ７−７、ＴＲＢＶ７−８、ＴＲＢＶ７−９、ＴＲＢＶ８−１、ＴＲＢＶ８−２、ＴＲＢＶ９、ＴＲＢＶ１０−１、ＴＲＢＶ１０−２、ＴＲＢＶ１０−３、ＴＲＢＶ１１−１、ＴＲＢＶ１１−２、ＴＲＢＶ１１−３、ＴＲＢＶ１２−１、ＴＲＢＶ１２−２、ＴＲＢＶ１２−３、ＴＲＢＶ１２−４、ＴＲＢＶ１２−５、ＴＲＢＶ１３、ＴＲＢＶ１４、ＴＲＢＶ１５、ＴＲＢＶ１６、ＴＲＢＶ１７、ＴＲＢＶ１８、ＴＲＢＶ１９、ＴＲＢＶ２０−１、ＴＲＢＶ２１−１、ＴＲＢＶ２２−１、ＴＲＢＶ２３−１、ＴＲＢＶ２４−１、ＴＲＢＶ２５−１、ＴＲＢＶ２６、ＴＲＢＶ２７、ＴＲＢＶ２８、ＴＲＢＶ２９−１、ＴＲＢＶ３０、ＴＲＢＶＡ、ＴＲＢＶＢ、ＴＲＢＶ５−８、ＴＲＢＶ６−１、ＴＲＢＤ１、ＴＲＢＤ２、ＴＲＢＪ１−１、ＴＲＢＪ１−２、ＴＲＢＪ１−３、ＴＲＢＪ１−４、ＴＲＢＪ１−５、ＴＲＢＪ１−６、ＴＲＢＪ２−１、ＴＲＢＪ２−２、ＴＲＢＪ２−２Ｐ、ＴＲＢＪ２−３、ＴＲＢＪ２−４、ＴＲＢＪ２−５、ＴＲＢＪ２−６、ＴＲＢＪ２−７、ＴＲＢＣ１、およびＴＲＢＣ２が含まれる。
【０５２７】
Ｔ細胞受容体デルタ遺伝子座（ＴＲＤ）は、ＴＣＲデルタ鎖の遺伝子を含むヒト第１４染色体上の領域である。例えば、ＴＲＤ遺伝子座は、例えば、ＴＲＤＶ（可変）、ＴＲＤＪ（結合）、およびＴＲＤＣ（定常）遺伝子を含む。Ｔ細胞受容体デルタ鎖をコードする例示的な遺伝子には、限定されないが、ＴＲＤＶ１、ＴＲＤＶ２、ＴＲＤＶ３、ＴＲＤＤ１、ＴＲＤＤ２、ＴＲＤＤ３、ＴＲＤＪ１、ＴＲＤＪ２、ＴＲＤＪ３、ＴＲＤＪ４、およびＴＲＤＣが含まれる。
【０５２８】
Ｔ細胞受容体γ遺伝子座（ＴＲＧ）は、ＴＣＲガンマ鎖の遺伝子を含むヒト第７染色体上の領域である。例えば、ＴＲＧ遺伝子座は、例えば、ＴＲＧＶ（可変）、ＴＲＧＪ（結合）、およびＴＲＧＣ（定常）遺伝子を含む。Ｔ細胞受容体ガンマ鎖をコードする例示的な遺伝子には、限定されないが、ＴＲＧＶ１、ＴＲＧＶ２、ＴＲＧＶ３、ＴＲＧＶ４、ＴＲＧＶ５、ＴＲＧＶ５Ｐ、ＴＲＧＶ６、ＴＲＧＶ７、ＴＲＧＶ８、ＴＲＧＶ９、ＴＲＧＶ１０、ＴＲＧＶ１１、ＴＲＧＶＡ、ＴＲＧＶＢ、ＴＲＧＪ１、ＴＲＧＪ２、ＴＲＧＪＰ、ＴＲＧＪＰ１、ＴＲＧＪＰ２、ＴＲＧＣ１、およびＴＲＧＣ２が含まれる。
【０５２９】
一実施形態では、標的遺伝子もしくは遺伝子産物、またはその断片は、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子または遺伝子産物のいずれかから選択される。
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【０５３０】
さらなる例示的な遺伝子は、例えば、その内容が全体として参照により組み込まれる国際出願公開第ＷＯ２０１２／０９２４２６号の表１〜１１に記載される。
【０５３１】
上述の方法の適用には、限定されないが、医学標本中の配列決定のための特定の遺伝子または複数の遺伝子の、全て公知である配列変異体（またはそのサブセット）を含むオリゴヌクレオチドのライブラリーを用いることが含まれる。
【０５３２】
他の実施形態
【０５３３】
あるいは、または本明細書に記載される方法と組み合わせて、一部の実施形態では、本方法は、（ａ）〜（ｈ）のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７つ、または全て）をさらに含む：
（ａ）例えば、本明細書に記載される複数の標的捕捉試薬を用いて、試料（例えば、血液試料）から核酸分子（例えば、ｃｆＤＮＡ）を提供し；
（ｂ）複数の異なるバーコード配列を含むバーコードを含むアダプターを核酸分子に付着させて、それによるタグ化された親核酸分子を生成し；
（ｃ）タグ化された親核酸分子を増幅して、増幅されたタグ化された子孫核酸分子を生成し；
（ｄ）増幅されたタグ化された子孫核酸分子を配列決定して、タグ化された親核酸分子の各々から複数の配列リードを生成し、複数の配列リードの各配列リードは、バーコード配列および核酸分子に由来する配列を含み；
（ｅ）複数の配列リードの配列リードを１つ以上の参照配列にマッピングし；
（ｆ）配列リードのバーコード配列に少なくとも基づいて、ｅ）においてマッピングされた配列リードをファミリーにグループ化し、ファミリーの各々は、同一のバーコード配列を含む配列リードを含み、それによってファミリーの各々は、同一のタグ化された親核酸分子から増幅された配列リードを含み；
（ｇ）１つ以上の参照配列における複数の対象間隔の各々で、各ファミリーにおいて配列リードを分解して、対象間隔で各ファミリーについての突然変異コールを生じさせ；
（ｈ）１つ以上の対象間隔で、１つ以上のゲノム異常、例えば、インデル、コピー数変動、トランスバージョン、転座、逆位、欠失、異数性、部分的異数性、倍数性、染色体不安定性、染色体構造変化、遺伝子融合、染色体融合、遺伝子トランケーション、遺伝子増幅、遺伝子重複、染色体損傷、ＤＮＡ損傷、核酸化学修飾の異常変化、エピジェネティックパターンの異常変化、核酸メチル化の異常変化、またはそれらの組合せを検出する。
【０５３４】
あるいは、または本明細書に記載される方法と組み合わせて、一部の実施形態では、本方法は、例えば、ゲノム変化（例えば、単一ヌクレオチド変異体）を定量するために、（ａ）〜（ｉ）のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８つ、または全て）をさらに含む：
（ａ）例えば、本明細書に記載される複数の標的捕捉試薬を用いて、試料（例えば、血液試料）から核酸分子（例えば、ｃｆＤＮＡ）を提供し；
（ｂ）別個のバーコード配列を含むバーコードを含むアダプターを前記核酸分子に付着させて、タグ化された親核酸分子を生成し；
（ｃ）タグ化された親核酸分子を増幅して、増幅されたタグ化された子孫核酸分子を生成し；
（ｄ）増幅されたタグ化された子孫核酸分子を配列決定して、各親核酸分子から複数の配列リードを生成し、各配列リードは、バーコード配列および核酸分子に由来する配列を含み；
（ｅ）各タグ化された親核酸分子から生成された複数の配列リードを、（ｉ）バーコード配列、および（ｉｉ）核酸に由来する配列の始まりにおける配列情報、核酸に由来する配列の終わりにおける配列情報、または配列リードの長さのうちの１つ以上に基づいてファミリーにグループ化し、各ファミリーは、タグ化された親核酸分子のうち、固有の核酸分子から増幅されたタグ化された子孫核酸分子の配列リードを含み；
（ｆ）各ファミリー内にグループ化された配列リードを互いに比較することにより、各ファミリーについてのコンセンサス配列を決定し、各コンセンサス配列は、タグ化された親核酸分子間のうち、固有の核酸分子に対応し；
（ｇ）１つ以上の対象間隔を含む１つ以上の参照配列を提供し；
（ｈ）前記１つ以上の対象間隔の所定の対象間隔にマッピングするコンセンサス配列を同定し；
（ｉ）ゲノム変化を含む所定の対象間隔にマッピングする多数のコンセンサス配列を計算し、それによって試料中のゲノム変化を定量する。
【０５３５】
あるいは、または本明細書に記載される方法と組み合わせて、一部の実施形態では、本方法は、（ａ）〜（ｈ）のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７つ、または全て）をさらに含む：
（ａ）例えば、本明細書に記載される複数の標的捕捉試薬を用いて、試料（例えば、血液試料）から核酸分子（例えば、ｃｆＤＮＡ）を提供し；
（ｂ）複数の核酸分子を複数のタグ化された親核酸分子に変換し、タグ化された親核酸分子の各々は、（ｉ）複数の核酸分子のうちの核酸分子からの配列、および（ｉｉ）１つ以上のバーコードを含む識別子配列を含み；
（ｃ）複数のタグ化された親核酸分子を増幅して、対応する複数の増幅された子孫核酸分子を生成し；
（ｄ）複数の増幅された子孫核酸分子を配列決定して、配列リードセットを生成し；
（ｅ）配列リードセットの配列リードを１つ以上の参照配列にマッピングし；
（ｆ）配列リードをファミリーにグループ化し、各ファミリーは、同一の識別子配列を含み、同じ開始位置および停止位置を有する配列リードを含み、各ファミリーは、同一のタグ化された親核酸分子から増幅された配列リードを含み；
（ｇ）１つ以上の参照配列における複数の対象間隔の各対象間隔で、各ファミリーにおいて配列リードを分解して、対象間隔で各ファミリーについての突然変異を生じさせ；または
（ｈ）ファミリーのうち、対象間隔で１つ以上の突然変異コールの頻度を決定する。
【０５３６】
あるいは、または本明細書に記載される方法と組み合わせて、一部の実施形態では、本方法は、例えば、コピー数変動を検出するために、（ａ）〜（ｆ）のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、５つ、または全て）をさらに含む：
（ａ）例えば、本明細書に記載される複数の標的捕捉試薬を用いて、試料（例えば、血液試料）から核酸分子（例えば、ｃｆＤＮＡ）を提供し；
（ｂ）核酸分子を配列決定し、各核酸分子は、複数の配列リードを生成し；
（ｃ）一連の精度、品質スコア、マッピングスコア閾値を満たさないリードを取り除き；
（ｄ）複数の配列リードを参照配列にマッピングし；
（ｅ）参照配列の複数の領域におけるマッピングされたリードまたは固有の配列リードを定量し；
（ｆ）ｉ）複数の領域における多数のリードを互いに正規化するか、もしくは複数の領域における多数の固有の配列リードを互いに正規化し；および／またはｉｉ）複数の領域における多数のリードもしくは複数の領域における多数の固有の配列リードを、対照試料から得られる数で処理することによって、複数の所定の領域のうちの１つ以上においてコピー数変動を決定する。
【０５３７】
あるいは、または本明細書に記載される方法と組み合わせて、一部の実施形態では、本方法は、例えば、コピー数変動を検出するために、（ａ）〜（ｈ）の１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７つ、または全て）をさらに含む：
（ａ）例えば、本明細書に記載される複数の標的捕捉試薬を用いて、試料（例えば、血液試料）から核酸分子（例えば、ｃｆＤＮＡ）を提供し；
（ｂ）核酸分子を配列決定し、各核酸分子は、複数の配列リードを生成し；
（ｃ）セット精度、品質スコア、マッピングスコア閾値を満たさないリードを取り除き；
（ｄ）配列決定から得られた配列リードを参照配列にマッピングし；
（ｅ）配列リードのうち、核酸分子に対応する固有の配列リードを決定し；
（ｆ）マッピング可能な各塩基位置における参照配列と比較して変異体を含むマッピングされた固有の配列リードのサブネットを同定し
（ｇ）マッピング可能な各塩基位置について、（ａ）参照配列と比較して変異体を含む多数のマッピングされた固有の配列リード対（ｂ）マッピング可能な各塩基位置についての全固有の配列リードの比を計算し；
（ｈ）基準試料から同様に導出された数で比を処理する。
【０５３８】
あるいは、または本明細書に記載される方法と組み合わせて、一部の実施形態では、方法は、（ａ）〜（ｈ）の１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７つ、または全て）をさらに含む：
（ａ）二重鎖タグを用いて、対象からの試料（例えば、血液試料）における二本鎖ＤＮＡ分子（例えば、ｃｆＤＮＡ）をタグ化し、二重鎖タグセットが、複数の異なる分子バーコードを含み、二重鎖タグセットの各二重鎖タグは、試料中の二本鎖ＤＮＡ分子のうちの二本鎖ＤＮＡ分子の相補鎖を示差的にタグ化して、タグ化された鎖を提供し、タグ化は、二本鎖ＤＮＡ分子と比較して、少なくとも１０倍過剰の二重鎖タグを用いて行われ、この過剰な二重鎖タグは、対象からの試料において二本鎖ＤＮＡ分子の少なくとも２０％をタグ化するには十分であり；
（ｂ）参照ゲノム中の１つ以上の遺伝子座セットにおける各遺伝子座について、例えば、本明細書に記載される複数の標的捕捉試薬を用いて、遺伝子座にマッピングされるタグ化された鎖のサブセットについてタグ化された鎖を選択的に濃縮して、濃縮されたタグ化された鎖を提供し；
（ｃ）対象由来の試料からの複数の未処理の配列リードを生成するために、濃縮されたタグ化された鎖の少なくとも一部を配列決定し；
（ｄ）複数の未処理の配列リードを複数のファミリーに分類し、各ファミリーは、同じ親ポリヌクレオチドから生成された未処理の配列リードを含み、分類は、（ｉ）親ポリヌクレオチドに関連する分子バーコード、ならびに（ｉｉ）親ポリヌクレオチドの未処理の配列の開始部分および／または終端部分からの情報に基づき；
（ｅ）複数のファミリーに分類された複数の未処理のリードを複数のコンセンサス配列リードに分解し、複数のコンセンサス配列リードの各コンセンサス配列リードは、（ｉ）１つ以上の遺伝子座セットにおける各遺伝子座についての複数のコンセンサス塩基を含み、および（ｉｉ）二本鎖ＤＮＡ分子の一本鎖を表し；
（ｆ）１つ以上の遺伝子座セットにおける各遺伝子座について、複数のコンセンサス配列リードにおいて相補鎖が検出される遺伝子座にマッピングする濃縮されたタグ化された鎖の第１の量的尺度を計算し；
（ｇ）１つ以上の遺伝子座セットにおける各遺伝子座について、複数のコンセンサス配列リードにおいて相補鎖のうちの１本鎖のみが検出される遺伝子座にマッピングする濃縮されたタグ化された鎖の第２の量的尺度を計算し；あるいは
（ｈ）１つ以上の遺伝子座セットにおける各遺伝子座について、複数のコンセンサス配列リードにおいていずれの相補鎖も検出されない遺伝子座にマッピングする濃縮されたタグ化された鎖の第３の量的尺度を計算し、第３の量的尺度は、少なくとも部分的には、第１および第２の量的尺度に基づいて計算され、それによって対象からの試料中の二本鎖ＤＮＡ分子を検出する。
【０５３９】
あるいは、または本明細書に記載される方法と組み合わせて、一部の実施形態では、本方法は、例えば、多重のゲノム領域について濃縮するために、（ａ）〜（ｂ）の１つまたは両方をさらに含む：
（ａ）本明細書に記載される複数の標的捕捉試薬：
（ｉ）第１の複数の標的捕捉試薬であって、第１の複数の標的捕捉試薬が、第１の複数の標的捕捉試薬の飽和点未満である第１の濃度で提供される、試料からの核酸の第１のゲノム領域セットに選択的にハイブリダイズする第１の複数の標的捕捉試薬、および
（ｉｉ）第２の複数の標的捕捉試薬であって、第２の複数の標的捕捉試薬が、第２の複数の標的捕捉試薬の飽和点またはそれを超える第２の濃度で提供される、試料からの核酸の第２のゲノム領域セットに選択的にハイブリダイズする第２の複数の標的捕捉試薬
と接触している試料から所定量の核酸をもたらし：ならびに
（ｂ）ゲノム領域の第１のセットおよびゲノム領域の第２のセットの試料から核酸を濃縮し、それによって濃縮された核酸を生成する。
【０５４０】
あるいは、または本明細書に記載される方法と組み合わせて、一部の実施形態では、本方法は、（ａ）〜（ｅ）の１つ以上（例えば、２、３、４つ、または全て）をさらに含む：
（ａ）複数の標的捕捉試薬混合物を提供し、複数の標的捕捉試薬混合物の各々は、第１のゲノム領域セットに選択的にハイブリダイズする第１の複数の標的捕捉試薬、および第２のゲノム領域セットに選択的にハイブリダイズする第２の複数の標的捕捉試薬を含み、
第１の複数の標的捕捉試薬は、複数の標的捕捉試薬混合物全体で異なる濃度であり、第２の複数の標的捕捉試薬は、複数の標的捕捉試薬混合物全体で同じ濃度であり；
（ｂ）複数の標的捕捉試薬混合物の各々を試料（例えば、血液試料）と接触させて、試料からの核酸を第１の複数の標的捕捉試薬および第２の複数の標的捕捉試薬を用いて捕捉し、各標的捕捉試薬混合物中の第２の複数の標的捕捉試薬は、第２の複数の標的捕捉試薬の飽和点またはそれを超える第１の濃度で提供され、試料からの核酸は、第１の複数の標的捕捉試薬および第２の複数の標的捕捉試薬によって捕捉され；
（ｃ）各標的捕捉試薬混合物で捕捉された核酸の一部を配列決定して、割り当てられた数の配列リード内に配列リードセットを生成し；
（ｄ）各標的捕捉試薬混合物についての第１の複数の標的捕捉試薬および第２の複数の標的捕捉試薬についての配列リード深度を決定し；または
（ｅ）第２のゲノム領域セットのリード深度を提供する、少なくとも１つの標的捕捉試薬混合物を同定し、
第２のゲノム領域セットのリード深度は、少なくとも０．０００１％のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）の遺伝的変異体の検出の感受性を提供する。
【０５４１】
あるいは、または本明細書に記載される方法と組み合わせて、一部の実施形態では、本方法は、（ａ）〜（ｃ）の１つ以上（例えば、２つまたは全部）をさらに含む：
（ａ）非固有にタグ化された細胞外ポリヌクレオチドの集団を生成するために、対象由来の生体試料から得られた細胞外ポリヌクレオチドの集団を非固有にタグ化し；
（ｂ）非固有にタグ化された細胞外ポリヌクレオチドの集団を配列決定して、非固有にタグ化された細胞外ポリヌクレオチド中のマッピング可能な位置で塩基コールを生成し；
（ｃ）マッピング可能な位置での塩基コールについて、塩基コールを有する固有分子の総数に対して、塩基コールを含有する固有分子の頻度を測定し、
複数の参照配列からの偏差のセット尺度を上回る、マッピング可能な位置で塩基コールを含有する固有分子の頻度は、マッピング可能な位置での稀な突然変異を示す。
【０５４２】
他の実施形態は、米国特許第９，５９８，７３１号、米国特許第９，８３４，８２２号、米国特許第９，８４０，７４３号、米国特許第９，９０２，９９２号、米国特許第９，９２０，３６６号、米国特許第９，８５０，５２３号、および米国特許第１０，０４１，１２７号に記載され、その各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０５４３】
本明細書に記載される方法の実施形態では、本方法における工程またはパラメータは、本方法における下流の工程またはパラメータを修飾するために使用される。
【０５４４】
ある実施形態では、試料の特徴を使用して、下流の工程またはパラメータを、前記試料からの核酸の単離；ライブラリーの構築；標的捕捉試薬（例えば、ベイト）の設計もしくは選択；ハイブリダイゼーション条件；配列決定；リードマッピング；突然変異コーリング法の選択；突然変異コーリング；または突然変異注釈のうちの１つ以上もしくは全体において修飾する。
【０５４５】
ある実施形態では、単離された腫瘍、または対照、核酸の特徴を使用して、下流の工程またはパラメータを、前記試料からの核酸の単離；ライブラリーの構築；標的捕捉試薬（例えば、ベイト）の設計もしくは選択；ハイブリダイゼーション条件；配列決定；リードマッピング；突然変異コーリング法の選択；突然変異コーリング；または突然変異注釈のうちの１つ以上もしくは全部において修飾する。
【０５４６】
ある実施形態では、ライブラリーの特徴を使用して、下流の工程またはパラメータを、前記試料からの核酸の再単離；その後のライブラリー構築；標的捕捉試薬（例えば、ベイト）の設計もしくは選択；ハイブリダイゼーション条件；配列決定；リードマッピング；突然変異コーリング法の選択；突然変異コーリング；または突然変異注釈のうちの１つ以上または全部において修飾する。
【０５４７】
ある実施形態では、ライブラリーキャッチの特徴を使用して、下流の工程またはパラメータを、前記試料からの核酸の再単離；その後のライブラリー構築；標的捕捉試薬（例えば、ベイト）の設計もしくは選択；ハイブリダイゼーション条件；配列決定；リードマッピング；突然変異コーリング法の選択；突然変異コーリング；または突然変異注釈のうちの１つ以上もしくは全部において修飾する。
【０５４８】
ある実施形態では、配列決定方法の特徴を使用して、下流の工程またはパラメータを、前記試料からの核酸の再単離；その後のライブラリー構築；標的捕捉試薬（例えば、ベイト）の設計もしくは選択；その後のハイブリダイゼーション条件の決定、その後の配列決定；リードマッピング；突然変異コーリング法の選択；突然変異コーリング；または突然変異注釈のうちの１つ以上もしくは全部において修飾する。
【０５４９】
ある実施形態では、マッピングされたリードの回収の特徴を使用して、下流の工程またはパラメータを、前記試料からの核酸の再単離；その後のライブラリー構築；標的捕捉試薬（例えば、ベイト）の設計もしくは選択；その後のハイブリダイゼーション条件の決定、その後の配列決定；その後のリードマッピング；突然変異コーリング法の選択；突然変異コーリング；または突然変異注釈のうちの１つ以上もしくは全部において修飾する。
【０５５０】
ある実施形態において、本方法は、試料特徴についての値、例えば、前記試料中の腫瘍細胞の比率についての値；前記試料の細胞性についての値；または試料の画像からの値を取得することを含む。実施形態において、本方法は、試料特性についての前記取得された値に応答して、試料からの核酸の単離、ライブラリー構築；標的捕捉試薬（例えば、ベイト）の設計もしくは選択；標的捕捉試薬（例えば、ベイト）／ライブラリー核酸分子ハイブリダイゼーション；配列決定；または突然変異コーリングについてのパラメータを選択することを含む。
【０５５１】
ある実施形態では、本方法は、前記試料に存在する腫瘍組織の量について値を取得すること、前記取得された値を参照基準と比較すること、および前記参照基準が満たされる場合、前記試料を受け入れること、例えば、前記試料が３０％、４０％または５０％を超える腫瘍細胞を含む場合、前記試料を受け入れることをさらに含む。ある実施形態では、方法は、参照基準を満たさない試料から、例えば、前記試料から腫瘍組織をマクロ解剖することによって、腫瘍細胞について濃縮された部分試料を取得することをさらに含む。
【０５５２】
ある実施形態では、本方法は、前記試料に存在する腫瘍核酸（例えば、ＤＮＡ）の量についての値を取得すること、前記取得された値を参照基準と比較すること、および前記参照基準が満たされた場合、前記試料を受け入れることをさらに含む。ある実施形態では、本方法は、参照基準を満たさない試料から、例えば、前記試料から腫瘍組織をマクロ解剖することによって、腫瘍核酸について濃縮された部分試料を得ることをさらに含む。
【０５５３】
ある実施形態では、方法は、対象に対して、腫瘍タイプ、遺伝子、および遺伝子変化（ＴＧＡ）の会合を提供することをさらに含む。ある実施形態では、方法は、複数の要素を有するデータベースを提供することをさらに含み、各要素はＴＧＡを含む。
【０５５４】
ある実施形態では、方法は、対象のＴＧＡを特徴づけることをさらに含み、前記ＴＧＡが、データベース、例えば、検証されたＴＧＡのデータベースに存在するかどうかを決定し；データベースからのＴＧＡに関する情報を前記対象からの前記ＴＧＡと関連付け；場合により、前記対象についての第２またはその後のＴＧＡが前記データベースに存在するかどうかを決定し、もしそうであれば、データベースからの第２またはその後のＴＧＡに関する情報を前記患者に存在する前記第２のＴＧＡと関連付けることを含む。ある実施形態では、本方法は、レポートを形成するために、ＴＧＡの存在または不存在、場合により、関連する注釈を記憶することをさらに含む。ある実施形態では、方法は、前記報告書をレシピエント団体に送信することを含む。
【０５５５】
ある実施形態では、方法は、対象のＴＧＡを特徴づけることをさらに含み、前記ＴＧＡが、データベース、例えば、検証されたＴＧＡのデータベースに存在するかどうかを決定し；または前記データベースに存在しないＴＧＡが、公知の臨床的に関連する遺伝子または変化を有するかどうか、またはもしそうであれば、前記データベースに前記ＴＧＡのためのエントリーを提供するかどうかを決定することを含む。ある実施形態では、本方法は、レポートを形成するために、対象からの試料のＤＮＡ中に見出される突然変異の存在または不存在を記憶することをさらに含む。
【０５５６】
本開示は、例えば、以下の番号付けされた実施形態のいずれかにおいて定義され得る。
【０５５７】
実施形態１．第１の標的捕捉試薬（Ｒ１）および第２の標的捕捉試薬（Ｒ２）を含む複数の標的捕捉試薬であって、
Ｒ１は、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１、および、場合により、結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ１を含み；
Ｒ２は、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２、および結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ２を含み；
結合対の第１のメンバーは、基質上に配置された結合対の第２のメンバーに結合することができ、
結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１の比率は、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率よりも大きい、複数の標的捕捉試薬。
【０５５８】
実施形態２．結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１の比率が、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率よりも、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍大きい、実施形態１の複数の標的捕捉試薬。
【０５５９】
実施形態３．Ｒ１の各々が第１の断片／第１の標的捕捉試薬（Ｆ１／Ｒ１）ハイブリッドを形成することができ、Ｒ２の各々が第２の断片／第２の標的捕捉試薬（Ｆ２／Ｒ２）ハイブリッドを形成することができ、
Ｆ１、Ｆ２、またはその両方は、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子からの対象間隔を含む、実施形態１または２の複数の標的捕捉試薬。
【０５６０】
実施形態４．Ｆ１が、高い配列決定深度事象を含み；
Ｆ２が、低い配列決定深度事象を含み、例えば、そのレベルが、１つ以上のバイオマーカー、例えば、腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）、またはマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）の決定と関連する、実施形態３の複数の標的捕捉試薬。
【０５６１】
実施形態５．第３の標的捕捉試薬（Ｒ３）をさらに含み、
Ｒ３が、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ３、および結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ３を含み；
結合対の第１のメンバーが、基質上に配置された結合対の第２のメンバーに結合することができ、
結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率は、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ３の比率よりも大きい、実施形態１から４のいずれか１つの複数の標的捕捉試薬。
【０５６２】
実施形態６．Ｒ３の各々が第３の断片／第１の標的捕捉試薬（Ｆ３／Ｒ３）ハイブリッドを形成することができ、
Ｆ３は、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子からの対象間隔を含む、実施形態１から５のいずれか１つの複数の標的捕捉試薬。
【０５６３】
実施形態７．試料を分析する方法であって、
複数の第１の断片／第１の標的捕捉試薬（Ｆ１／Ｒ１）ハイブリッドを基質と接触させて、Ｆ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体を形成すること；および
複数の第２の断片／第２の標的捕捉試薬（Ｆ２／Ｒ２）ハイブリッドを基質と接触させて、Ｆ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体を形成すること
を含み、基質に結合するＦ１／Ｒ１ハイブリッドの比率は、基質に結合するＦ２／Ｒ２ハイブリッドの比率よりも大きく、
それによって試料を分析する、試料を分析する方法。
【０５６４】
実施形態８．Ｆ１が、高い配列決定深度事象を含み；
Ｆ２が、低い配列決定深度事象を含み、例えば、そのレベルが、１つ以上のバイオマーカー、例えば、腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）、またはマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）の決定と関連する、実施形態７の方法。
【０５６５】
実施形態９．Ｒ１の一部およびＲ２の一部が結合対の機能的な第１のメンバーを含み、結合対の第１のメンバーが基質上に配置された結合対の第２のメンバーに結合することができる、実施形態７または８の方法。
【０５６６】
実施形態１０．Ｒ１の一部、Ｒ２の一部、またはその両方が、結合対の機能的な第１のメンバー、例えば、基質上に配置された結合対の第２のメンバーに結合することができないかまたはそれに対する結合親和性が低下している変化またはブロックされた第１のメンバーを欠く、実施形態７から９のいずれか１つの方法。
【０５６７】
実施形態１１．Ｒ１が、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１、および結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ１を含み；
Ｒ２が、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２、および結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ２を含む、実施形態７から１０のいずれか１つの方法。
【０５６８】
実施形態１２．結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１の比率が、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率よりも大きい、実施形態７から１１のいずれか１つの方法。
【０５６９】
実施形態１３．結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１の比率が、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率よりも、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍大きい、実施形態１１の方法。
【０５７０】
実施形態１４．結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１の比率および結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率が、Ｆ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体およびＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体の形成時に、Ｆ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体中のＦ１の数およびＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体中のＦ２の数が、以下の関係：
（ｉ）Ｆ１の数が、Ｆ２の数より大きいかまたはＦ２の数と実質的に同じである；および／または
（ｉｉ）第１の対象間隔における変化を含むＦ１の数が、第２の対象間隔における変化を含むＦ２の数よりも大きいかまたは実質的に同じである
のうちの１つまたは両方を有するようなものである、実施形態７から１３のいずれか１つの方法。
【０５７１】
実施形態１５．Ｆ１の数が、Ｆ２の数よりも、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍大きい、実施形態１４の方法。
【０５７２】
実施形態１６．第１の対象間隔における変化を含むＦ１の数が、第２の対象間隔における変化を含むＦ２の数よりも、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍大きい、実施形態１４または１５の方法。
【０５７３】
実施形態１７．第１の対象間隔、第２の対象間隔、またはその両方が、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子由来である、実施形態１４から１６のいずれか１つの方法。
【０５７４】
実施形態１８．第１の対象間隔における変化が、試料中の約０．１％に等しいかまたはそれより大きい（例えば、約０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、または０．９％に等しいかまたはそれより大きい、例えば、約０．１％〜０．９％、０．２％〜０．８％、０．３％〜０．７％、または０．４％〜０．６％の）突然変異対立遺伝子頻度で存在する、実施形態１４から１７のいずれか１つの方法。
【０５７５】
実施形態１９．第２の対象間隔における変化が、試料中の約１％に等しいかまたはそれより大きい（例えば、約２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、または９％に等しいかまたはそれより大きい、例えば、約１％〜９％、２％〜８％、３％〜７％、または４％〜６％の）突然変異対立遺伝子頻度で存在する、実施形態１４から１８のいずれか１つの方法。
【０５７６】
実施形態２０．Ｆ１、Ｆ２、またはその両方が、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子からの対象間隔を含む、実施形態７から１９のいずれか１つの方法。
【０５７７】
実施形態２１．Ｆ１における対象間隔が第１の深度まで配列決定され、Ｆ２における対象間隔が第２の深度まで配列決定され、第１の深度が第２の深度よりも、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍大きい、実施形態２０の方法。
【０５７８】
実施形態２２．Ｆ１が、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子からの対象間隔を含み、対象間隔が、変化、例えば、体細胞性変化、例えば、がんにおける機能的変化を含む、実施形態１４から２１のいずれか１つの方法。
【０５７９】
実施形態２３．対象間隔が、少なくとも約５，０００×深度まで配列決定される、実施形態１７の方法。
【０５８０】
実施形態２４．Ｆ２が、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子からの対象間隔を含み、対象間隔が、変化、例えば、体細胞性変化を含み、変化の決定が、１つ以上のゲノムシグネチャー、例えば、連続的／複雑なバイオマーカーを評価するために使用される、実施形態７から２３のいずれか１つの方法。
【０５８１】
実施形態２５．対象間隔が、例えば、１つ以上のゲノムシグネチャー、例えば、連続的／複雑なバイオマーカーを評価するために、少なくとも約８００×であるが約５，０００×未満まで配列決定される、実施形態２４の方法。
【０５８２】
実施形態２６．複数の第３の断片／第３の標的捕捉試薬（Ｆ３／Ｒ３）ハイブリッドを基質とさらに接触させて、Ｆ３／Ｒ３ハイブリッド／基質複合体を形成する、実施形態７〜２５のいずれか１つの方法。
【０５８３】
実施形態２７．Ｒ３が、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ３、および結合対の機能的な第１のメンバーを欠くＲ３を含む、実施形態２５または２６の方法。
【０５８４】
実施形態２８．結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率が、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ３の比率よりも大きい、実施形態２６から２７のいずれか１つの方法。
【０５８５】
実施形態２９．結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率が、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ３の比率よりも、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍大きい、実施形態２６〜２８のいずれかに１つの方法。
【０５８６】
実施形態３０．結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率および結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ３の比率が、Ｆ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体およびＦ３／Ｒ３ハイブリッド／基質複合体の形成時に、Ｆ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体中のＦ２の数およびＦ３／Ｒ３ハイブリッド／基質複合体中のＦ３の数が、以下の関係：
（ｉ）Ｆ２の数が、Ｆ３の数より大きい；および／または
（ｉｉ）第２の対象間隔における変化を含むＦ２の数が、第３の対象間隔における変化を含むＦ３の数よりも大きい
のうちの１つまたは両方を有するようなものである、実施形態２６から２９のいずれか１つの方法。
【０５８７】
実施形態３１．Ｆ２の数が、Ｆ３の数よりも、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍大きい、実施形態３０の方法。
【０５８８】
実施形態３２．第２の対象間隔における変化を含むＦ２の数が、第３の対象間隔における変化を含むＦ３の数よりも、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００倍大きい、実施形態３０または３１の方法。
【０５８９】
実施形態３３．第２の対象間隔、第３の対象間隔、またはその両方が、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子由来である、実施形態３０から３２のいずれか１つの方法。
【０５９０】
実施形態３４．Ｆ１、Ｆ２、またはＦ３のうちの１つ、２つ、または全てが、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子からの対象間隔を含む、実施形態２６から３３のいずれか１つの方法。
【０５９１】
実施形態３５．Ｆ２における対象間隔が第２の深度まで配列決定され、Ｆ３における対象間隔が第３の深度まで配列決定され、第２の深度が第３の深度よりも、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍大きい、実施形態３４の方法。
【０５９２】
実施形態３６．Ｆ３が、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子からの対象間隔を含み、対象間隔が、生殖系列変化、例えば、生殖系列ＳＮＰを含む、実施形態２６から３５のいずれか１つの方法。
【０５９３】
実施形態３７．対象間隔が、少なくとも約１００×深度であるが約８００×未満まで配列決定される、実施形態３６の方法。
【０５９４】
実施形態３８．対象から試料を提供することをさらに含む、実施形態７から３７のいずれか１つの方法。
【０５９５】
実施形態３９．試料が、ＤＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡ、例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む、実施形態７から３８のいずれか１つの方法。
【０５９６】
実施形態４０．試料が、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡを含む、実施形態７から３９のいずれか１つの方法。
【０５９７】
実施形態４１．ＲＮＡからｃＤＮＡを提供することをさらに含む、実施形態４０の方法。
【０５９８】
実施形態４２．試料から核酸を得ること、例えば、単離することをさらに含む、実施形態７から４１のいずれか１つの方法。
【０５９９】
実施形態４３．試料中の核酸を断片化してＦ１およびＦ２を提供することをさらに含む、実施形態７から４２のいずれか１つの方法。
【０６００】
実施形態４４．Ｆ１を増幅して複数のＦ１を提供し、Ｆ２を増幅して複数のＦ２を提供することをさらに含む、実施形態７から４３のいずれか１つの方法。
【０６０１】
実施形態４５．アダプター配列をＦ１およびＦ２に付着させて、アダプター化Ｆ１（ＡＦ１）およびアダプター化Ｆ２（ＡＦ２）を提供することをさらに含む、実施形態７から４４のいずれか１つの方法。
【０６０２】
実施形態４６．ＡＦ１を増幅して複数のＡＦ１を提供し、ＡＦ２を増幅して複数のＡＦ２を提供することをさらに含む、実施形態７から４５のいずれか１つの方法。
【０６０３】
実施形態４７．複数のＦ１をＲ１と接触させて複数のＦ１／Ｒ１ハイブリッドを提供し、複数のＦ２をＲ２と接触させて複数のＦ２／Ｒ２ハイブリッドを提供することをさらに含む、実施形態７から４６のいずれか１つの方法。
【０６０４】
実施形態４８．複数のＡＦ１をＲ１と接触させて複数のＡＦ１／Ｒ１ハイブリッドを提供し、複数のＡＦ２をＲ２と接触させて複数のＡＦ２／Ｒ２ハイブリッドを提供することをさらに含む、実施形態７から４７のいずれか１つの方法。
【０６０５】
実施形態４９．複数のＦ１／Ｒ１ハイブリッドを基質と接触させてＦ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体を形成することが、複数のＡＦ１／Ｒ１ハイブリッドを基質と接触させてＡＦ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体を形成することを含み；
複数のＦ２／Ｒ２ハイブリッドを基質と接触させてＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体を形成することが、複数のＡＦ２／Ｒ２ハイブリッドを基質と接触させてＡＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体を形成することを含む、実施形態７から４８のいずれか１つの方法。
【０６０６】
実施形態５０．接触が溶液中で起こる、実施形態４７から４９のいずれか１つの方法。
【０６０７】
実施形態５１．接触が固体表面上で起こる、実施形態４７から４９のいずれか１つの方法。
【０６０８】
実施形態５２．結合対の第１のメンバーがビオチン部分を含み、結合対の第２のメンバーがストレプトアビジンまたはアビジン（または修飾バージョン、例えば、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎもしくはＣａｐｔＡｖｉｄｉｎ）部分を含む、実施形態８から５１のいずれか１つの方法。
【０６０９】
実施形態５３．結合対の第１のメンバーがジゴキシゲニン部分を含み、結合対の第２のメンバーが抗ジゴキシゲニン抗体部分を含む、実施形態８から５１のいずれか１つの方法。
【０６１０】
実施形態５４．結合対の第１のメンバーがＦＩＴＣ部分を含み、結合対の第２のメンバーが抗ＦＩＴＣ抗体部分を含む、実施形態８から５１のいずれか１つの方法。
【０６１１】
実施形態５５．Ｒ１中の結合対の第１のメンバーが、リンカーを介してＦ１を捕捉する（例えば、ハイブリダイズする）Ｒ１中の部分（例えば、ヌクレオチド配列）にカップリングされ、Ｒ２中の結合対の第１のメンバーが、リンカーを介してＦ２を捕捉する（例えば、ハイブリダイズする）Ｒ２中の部分（例えば、ヌクレオチド配列）にカップリングされ、
場合により、リンカーは切断可能なリンカーである、実施形態８から５１のいずれか１つの方法。
【０６１２】
実施形態５６．複数のＦ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体からＦ１を配列決定し、複数のＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体からＦ２を配列決定することをさらに含む、実施形態７から５５のいずれか１つの方法。
【０６１３】
実施形態５７．Ｆ１が、Ｆ２より、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍大きい深度まで配列決定される、実施形態５６の方法。
【０６１４】
実施形態５８．試料を分析する方法であって、
ａ）複数の第１の断片／第１の標的捕捉試薬（Ｆ１／Ｒ１）ハイブリッドおよび複数の第２の断片／第２の標的捕捉試薬（Ｆ２／Ｒ２）ハイブリッドを提供することであって、
結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ１の比率は、結合対の機能的な第１のメンバーを含むＲ２の比率よりも大きく、
結合対の第１のメンバーは、基質上に配置された結合対の第２のメンバーに結合することができる、ハイブリッドを提供すること；
ｂ）複数のＦ１／Ｒ１ハイブリッドを基質と接触させて、Ｆ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体を形成し、複数のＦ２／Ｒ２ハイブリッドを基質と接触させて、Ｆ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体を形成することであって、
基質に結合するＦ１／Ｒ１ハイブリッドの比率は、基質に結合するＦ２／Ｒ２ハイブリッドの比率よりも大きい、複合体を形成すること；ならびに
ｃ）複数のＦ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体からＦ１を配列決定し、複数のＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体からＦ２を配列決定すること
を含み、Ｆ１はＦ２より大きな深度まで配列決定され、
それによって試料を分析する、試料を分析する方法。
【０６１５】
実施形態５９．Ｆ１が、高い配列決定深度事象を含み；
Ｆ２が、低い配列決定深度事象を含み、例えば、そのレベルが、１つ以上のバイオマーカー、例えば、腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）、またはマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）の決定と関連する、実施形態５８の方法。
【０６１６】
実施形態６０．試料を分析する方法であって、
１）対象からの試料、例えば、ゲノムＤＮＡ、例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む試料を提供すること；
２）試料から核酸を得ること、例えば、単離すること；
３）核酸を断片化して、複数の断片（Ｆ）を提供すること；
４）アダプター配列を複数の断片（Ｆ）に付着させて、複数のアダプター化断片（ＡＦ）を提供すること；
５）第１のＡＦ（ＡＦ１）を増幅して複数のＡＦ１を提供し、第２のＡＦ（ＡＦ２）を増幅して複数のＡＦ２を提供すること；
６）複数のＡＦ１を、各々がＡＦ１にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む第１の標的捕捉試薬（Ｒ１）と接触させて、複数のＡＦ１／Ｒ１ハイブリッドを提供し、複数のＡＦ２を、各々がＡＦ２にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む第２の標的捕捉試薬（Ｒ２）と接触させて、複数のＡＦ２／Ｒ２ハイブリッドを提供することであって、
Ｒ１の一部およびＲ２の一部は、結合対の機能的な第１のメンバーを含み、結合対の第１のメンバーは、基質上に配置された結合対の第２のメンバーに結合することができ、
Ｒ１の一部、Ｒ２の一部、またはその両方は、結合対の機能的な第１のメンバーを欠く、ハイブリッドを提供すること；
７）複数のＡＦ１／Ｒ１ハイブリッドを基質と接触させて、ＡＦ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体を形成し、複数のＡＦ２／Ｒ２ハイブリッドを基質と接触させて、ＡＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体を形成することであって、
基質に結合するＡＦ１／Ｒ１ハイブリッドの比率は、基質に結合するＡＦ２／Ｒ２ハイブリッドの比率よりも大きい、複合体を形成すること；ならびに
８）複数のＡＦ１／Ｒ１ハイブリッド／基質複合体からのＡＦ１を配列決定し、複数のＡＦ２／Ｒ２ハイブリッド／基質複合体からＡＦ２を配列決定すること
を含み、場合により、ＡＦ１は、ＡＦ２より、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍大きな深度まで配列決定され、
それによって試料を分析する、試料を分析する方法。
【０６１７】
実施形態６１．ＡＦ１が、高い配列決定深度事象を含み；
ＡＦ２が、低い配列決定深度事象を含み、例えば、そのレベルが、１つ以上のバイオマーカー、例えば、腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）、またはマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）の決定と関連する、実施形態６０の方法。
【０６１８】
実施形態６２．試料から複数の核酸分子を含むライブラリーを取得することをさらに含む、実施形態７から６１のいずれか１つの方法。
【０６１９】
実施形態６３．ライブラリーを標的捕捉試薬と接触させて、選択された核酸分子を提供することをさらに含み、前記標的捕捉試薬が核酸分子とハイブリダイズし、それによってライブラリーキャッチを提供する、実施形態６２の方法。
【０６２０】
実施形態６４．前記ライブラリーまたはライブラリーキャッチから腫瘍核酸分子からの、変化（例えば、体細胞性変化）を含む対象間隔についてのリードを取得することをさらに含み、それによって、例えば、次世代シークエンシング法によって、対象間隔についてのリードを取得する、実施形態６３の方法。
【０６２１】
実施形態６５．複数の遺伝子において対象間隔についてのリードを取得することを含む、実施形態６４の方法。
【０６２２】
実施形態６６．複数の遺伝子が、突然変異体形態の遺伝子を含み、例えば、突然変異体遺伝子が、細胞分裂、増殖もしくは生存に対する作用と関連するか、またはがんと関連する、実施形態６５の方法。
【０６２３】
実施形態６７．複数の遺伝子が、全エクソンシークエンシング（ＷＥＳ）のために、少なくとも約５０以上、約１００以上、約１５０以上、約２００以上、約２５０以上、約３００以上、約３５０以上、約４００以上、約４５０以上、約５００以上の遺伝子、もしくは約１，０００以上の遺伝子、または全ての遺伝子を含む、実施形態６５または６６の方法。
【０６２４】
実施形態６８．複数の遺伝子が、表１Ａ〜５Ａに記載される遺伝子の少なくとも約５０以上、約１００以上、約１５０以上、約２００以上、約２５０以上、約３００以上、または全てを含む、実施形態６４から６７のいずれか１つの方法。
【０６２５】
実施形態６９．対象間隔についてのリードの取得が、表１Ａ〜５Ａの遺伝子の少なくとも約５０以上、約１００以上、約１５０以上、約２００以上、約２５０以上、約３００以上、または全てからの対象間隔の配列決定を含む、実施形態６４から６８のいずれか１つの方法。
【０６２６】
実施形態７０．対象間隔が、約１００×より大きい、約２５０×より大きい、約５００×より大きい、約８００×より大きい、約１，０００×より大きい、約２，０００×より大きい、約３，０００×より大きい、約４，０００×より大きい、または約５，０００×より大きい平均深度まで配列決定される、実施形態６４から６９のいずれか１つの方法。
【０６２７】
実施形態７１．対象間隔が、配列決定された遺伝子（例えば、エクソン）の約９５％超、約９７％超、または約９９％超で、約１００×より大きい、約２５０×より大きい、約５００×より大きい、約８００×より大きい、約１，０００×より大きい、約２，０００×より大きい、約３，０００×より大きい、約４，０００×より大きい、または約５，０００×より大きい平均深度まで配列決定される、実施形態６４から７０のいずれか１つの方法。
【０６２８】
実施形態７２．アラインメント法によって前記リードを整列させることをさらに含む、実施形態６４から７１のいずれか１つの方法。
【０６２９】
実施形態７３．ヌクレオチド位置について前記リードからヌクレオチド値を割り当てることをさらに含む、実施形態７２の方法。
【０６３０】
実施形態７４．試料中の１つ以上のゲノムシグネチャー、例えば、連続的／複雑なバイオマーカーを評価することをさらに含む、実施形態７から７３のいずれか１つの方法。
【０６３１】
実施形態７５．試料が血液試料である、実施形態７４の方法。
【０６３２】
実施形態７６．体細胞性変化または生殖系列変化として試料中の変化を特徴づけることをさらに含む、実施形態７から７５のいずれか１つの方法。
【０６３３】
実施形態７７．試料中の変化の接合性を決定することをさらに含む、実施形態７から７６のいずれか１つの方法。
【０６３４】
実施形態７８．試料、または試料の分析に応答して得られた試料に由来する対象を分類することをさらに含む、実施形態７から７７のいずれか１つの方法。
【０６３５】
実施形態７９．報告書、例えば、電子的な、ウェブベースの、または紙による報告書を、得られた試料に由来する対象に、または別の人もしくは団体、介護者、医師、がん専門医、病院、診療所、第三者支払人、保険会社もしくは政府機関に提供することをさらに含む、実施形態７から７８のいずれか１つの方法。
【実施例】
【０６３６】
本発明は、以下の実施例によってさらに例証されるが、これらは限定的と解釈されるべきではない。本出願全体で引用される全ての参考文献、図面、配列表、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０６３７】
実施例１：無細胞ＤＮＡにおける変化の検出
【０６３８】
導入
【０６３９】
本実施例に記載される無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）アッセイは、例えば、約６０個または６０個を超える遺伝子における、例えば、置換、挿入および欠失の変化（インデル）の検出、コピー数変化（ＣＮＡｓ）の選択、ならびにがん患者の抗凝固末梢全血由来の血漿から単離された循環遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を用いる遺伝子再配列の選択のための次世代シークエンシングに基づくアッセイである。無細胞ＤＮＡの循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）画分の量が少ないため、標的捕捉含量は、高い感受性および特異性のために標的領域の狭く高い配列決定深度を達成するために制限される。この実施例に記載されるｃｆＤＮＡアッセイはまた、より大きな遺伝子パネル（＞３００遺伝子）を使用して、標的捕捉領域全体にわたって広い中程度のカバレッジを達成することにより、ゲノムシグネチャーに使用することができる。ほとんどの場合、狭い標的捕捉領域は、合理的な配列決定コストで高い感受性および特異性を達成するために、凝集標的サイズが０．１〜０．３Ｍｂに制限され、一方、ゲノムシグネチャーは、０．８〜１．０Ｍｂの最小凝集標的捕捉領域を必要とする。現在、標準的なｃｆＤＮＡアッセイへのゲノムシグネチャー分析の追加は、並列ワークフローを利用し、各々は２つの血管回収から始まり、単一アッセイの配列決定データ生成の２倍を必要とする。
【０６４０】
この実施例に記載される研究は、高い感受性および特異性を必要とする関連ゲノム変化と、ゲノムシグネチャーの検出とを組み合わせ、試験される患者あたり全２本の血液チューブのみを必要とするために、現在のｃｆＤＮＡアッセイワークフローを最適化することを目的として設計された。概説した実験は、＜２００Ｍリード対の配列決定データ標的内で狭く高い配列決定深度と広い中程度の配列決定深度の両方を達成することができる組合せアッセイのためのいくつかのオプションを評価するように設計された。組合せアッセイのワークフロー最適化を評価して、ｃｆＤＮＡアッセイの要件を満たすために各オプションを利用する可能性を評価した。
【０６４１】
この実施例に記載される研究は、組み合わせたアッセイ設計要件を達成するためのいくつかのオプションを評価した。第１のオプションは、同じライブラリー構築（「ＬＣ」）材料からの二重（並列）ハイブリッド捕捉（「ＨＣ」）手法を評価することであり、これには、他の考慮事項の中でも特に過剰増幅によってライブラリーの複雑性を有意に減少させることなく、二重ハイブリッド捕捉反応をサポートするのに最低限十分な量に達するように作り出すことができるＬＣポストＰＣＲアウトプット材料の量を増加させるための開発作業が含まれた（以下に詳述するように、このような第１のオプションに関連する活動、まとめて「パス１」とする）。第２のオプションは、ゲノム変化とゲノムシグネチャーの両方をコールするために広く高い配列決定深度でゲノムシグネチャー標的捕捉試薬を利用することを評価することであり、ゲノム変化およびゲノムシグネチャーコーリングの性能を保持するために配列負荷密度を最適化することを評価した（以下に詳述するように、このような第２のオプションに関連する活動、まとめて「パス２」とする）。
【０６４２】
第３のオプションは、５’ビオチン化プローブと非修飾のプローブ（抗標的捕捉試薬またはブロッキング標的捕捉試薬と呼ばれることがある）の組合せを使用して、特異的な標的ごとの基準により標的配列決定深度を調節する、複雑な標的捕捉試薬戦略を評価することであった。例えば、ビオチン化プローブ（例えば、５’ビオチン化プローブ）は、結合対（例えば、本明細書に記載される）の機能的な第１のメンバーを含む標的捕捉試薬である。別の例として、非修飾のプローブ（例えば、抗標的捕捉試薬、ブロッキングプローブ、ビオチン化されていないプローブ）は、結合対（例えば、本明細書に記載される）の機能的な第１のメンバーを欠く標的捕捉試薬である。この戦略は、ゲノムシグネチャーのための標的領域の残りの部分にわたって、特定の標的の狭き高い配列決定深度および広い中程度の配列決定深度を可能にする。実験は、単一のハイブリダイゼーション反応の能力を評価するように設計され、ゲノムライブラリーから引き出され、続いて配列決定された標的の量は、修飾および非修飾のプローブの比によって予め決定することができる。これは、パス２に概説されているような単一のＨＣ反応の使用を可能にするが、パス１で達成された低い、高い、および中間の標的配列決定深度を有する能力がある（以下に詳述するように、このような第３のオプションに関連する活動、まとめて「パス２Ｂ」とする）。
【０６４３】
結果：
パス１
【０６４４】
単一ライブラリー構成からの二重ハイブリッド捕捉
【０６４５】
ライブラリー構築プロトコールの最適化は、プロセス適格性評価で示されたように、ＬＣ出力のより高い効率および均一性をもたらした。この場合、２０ｎｇ〜１００ｎｇの範囲のＬＣ入力を表す１９２のＤＮＡ試料を、３つの別々のＬＣプレートにわたって実行し、狭くい高い配列決定深度（ＮＨＳＤ、０．３Ｍｂ）のための標的捕捉試薬と広い中程度の配列決定深度（ＷＭＳＤ、２Ｍｂ）のための標的捕捉試薬との同等の表現で捕捉した。以前の開発作業により、自動液体ハンドリングワークステーション上に設置された自動化ｃｆＤＮＡアッセイライブラリー構築プロトコールが、例示的な試料のＱＣ基準の評価を通じて、プロセス全体で実行されることにより、期待される臨床性能を満たすかまたは上回ることが確認された。低入力（≧２０〜５０ｎｇ）および高入力（≧５０〜１００ｎｇ）における１００％試料のライブラリー構築収率は、全て＞２μｇ  ＬＣ収率を達成し、ＮＨＳＤ標的捕捉試薬で捕捉された１００％試料は≧５０００×中央値の固有の配列決定深度を有し、ＷＭＳＤ標的捕捉試薬で捕捉された１００％試料は≧８００×中央値の固有の配列決定深度を有した。プロトコール最適化は、並列ハイブリッド捕捉反応のために十分なＬＣ出力を提供する必要な結果を達成した。展開後は、全投入濃度に対して同等のＬＣ収率分布であった。対照的に、最適化前のプロトコールは、ＬＣ入力によるＬＣ収率スケーリングにおいて、ｃｆＤＮＡアッセイにおいて使用される広範囲のＬＣ入力に対して２つのハイブリッド捕捉反応を有することが困難であることを例証した。
【０６４６】
酵素的に断片化された正常ヒトＤＮＡは、ｃｆＤＮＡアッセイライブラリー構築を受け、６複製は、各々２つのＨＣ反応に分割した。一方のＨＣ反応をＮＨＳＤ標的捕捉試薬を用いて行い、他方はＷＭＳＤ標的捕捉試薬を用いて行った。試料を試料あたりの標的１００Ｍリード対について、ＨｉＳｅｑ  ４０００フローセルに装填した。表６に概説されているように、１５０Ｍを超えるリード対を有する各試料は、ＮＨＳＤとＷＭＳＤ標的捕捉物の両方について、標的未処理、固有、および冗長の配列決定深度指定を達成し、単一のＬＣパスからの二重ＨＣがカバレッジ目標を達成したことを証明した。
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【０６４７】
１ＬＣ＞２ＨＣの変異体レベル性能評価
【０６４８】
変異体レベルの一致における単一ＬＣからの二重ＨＣをさらに評価するために、４３個の例示的な試料は、ゲノムシグネチャーのための短いヌクレオチド変異体、挿入／欠失、遺伝子再配列、およびＷＭＳＤ標的捕捉についてＮＨＳＤ標的捕捉を受けた。
１．ＡＬＫイントロン１９再配列（Ｎ＝５）
２．ＥＧＦＲエクソン１９欠失（Ｎ＝５）
３．ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ（Ｎ＝５）
４．ＲＥＴ再配列（Ｎ＝５）
５．ゲノムシグネチャー０．８８〜２７．２ｍｕｔ／ｍｂ（Ｎ＝２３）
【０６４９】
単一ライブラリーからの二重ＨＣの変異体レベルでの実験結果は、パス１が実施可能性を達成したことを示す。標的カバレッジプロファイルは、標的捕捉試薬セットと達成された変異体レベルの一致の両方について達成された。
【０６５０】
パス２
【０６５１】
単一ライブラリー構成からの単一ハイブリッド捕捉
【０６５２】
酵素的に断片化された正常ヒトＤＮＡは、ｃｆＤＮＡアッセイライブラリー構築を受け、６反復は、ＷＭＳＤ標的捕捉試薬セットを用いて行われた単一のＨＣ反応を受けた。この実験を用いて、単一の標的捕捉による並行アッセイからの２００Ｍリード量を配列決定することによって、広く高い配列決定深度（ＷＨＳＤ）が達成できるかどうかを決定した。試料ごとに、標的＜２００Ｍリード対について、試料をＨｉＳｅｑ  ４０００フローセルに装填した。表７に概説されているように、各試料は、ＮＨＳＤ標的捕捉についてではなく、ＷＭＳＤ標的捕捉についてのみ、標的未処理、固有、および冗長の配列決定深度指定を達成し、単一のＬＣパスからの二重ＨＣが、試料量あたり２００Ｍリード対での目標を達成しなかったことを示した。ＮＨＳＤ標的領域の冗長カバレッジは、組合せアッセイ性能要件に必要なデータを達成するのに十分に高くなかった。ｃｆＤＮＡアッセイ（約７００Ｍ＝約３０，０００×／約７５００×＊約１７０Ｍ）のための十分に冗長な配列決定深度を達成するためには約７００Ｍリードが必要であると推定され、これは、試料あたり２００Ｍリード対を超えないようにするための要件を十分に上回る。このパスについては、さらなるデータは収集しなかった。
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【０６５３】
パス２Ｂ
【０６５４】
カバレッジ調節のための複雑な標的捕捉試薬戦略
【０６５５】
実験１：ＮＨＳＤ標的捕捉試薬中に滴定されたＡＰＣおよびＡＴＭのためのブロッキング標的捕捉試薬の添加
【０６５６】
特異的な標的の捕捉性能に影響を与える非修飾の標的捕捉試薬の能力の概念評価の最初の証明として、２つの遺伝子であるＡＰＣおよびＡＴＭの過剰な非修飾の標的捕捉試薬を、１Ｘ−２Ｘのビオチン化標的捕捉試薬のＮＨＳＤ標的捕捉試薬中への滴定において添加した。表８および図１は、この実験の結果を示し、非修飾のブロッカーまたは抗標的捕捉試薬の添加により、特定の標的のカバレッジが低下し得るが、過剰の標的捕捉試薬に過剰のブロッカーを入れる効果は、全標的捕捉試薬量を一定に保ち、ブロッカー対標的捕捉試薬の比を調整した場合と同様に顕著ではなかったことを示す。
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【０６５７】
実験２：ＮＨＳＤ標的捕捉試薬中に滴定されたＡＰＣおよびＡＴＭのためのブロッキング標的捕捉試薬の添加
【０６５８】
実験２において、最終プール中の０．０３２ｐＭの全標的捕捉試薬量を一定に保ち、ビオチン化標的捕捉試薬対非ビオチン化標的捕捉試薬の比を滴定して、単一の遺伝子標的ＡＰＣに対する抗標的捕捉試薬戦略を例証した。遺伝子ＡＰＣの標的捕捉試薬（１６４個の標的捕捉試薬）は、ＮＨＳＤ標的捕捉試薬に添加された完全遺伝子サブプールであり、これは、ＡＰＣ遺伝子の標的試薬なしでＮＨＳＤ標的捕捉試薬を有する標的捕捉試薬セットバックボーンの作製を可能にした。１００％ビオチン化ＡＰＣ〜９９％ビオチン化されていない１％ビオチン化ＡＰＣの範囲を評価し、図２および表９に示されるように、観察された配列決定深度と予想される配列決定深度との広い範囲を示した。１００％ビオチン化ＡＰＣを有するＮＨＳＤ標的捕捉試薬を１００％ＡＰＣと比較し、標的捕捉試薬へのＡＰＣの再添加がＡＰＣ配列決定深度に有害作用を及ぼさないことを示した。標的捕捉試薬量を一定に保つことにより、抗標的捕捉試薬方法が成功し、より大きなスケールの試験が次の実験であり得ることを示す予測可能な配列決定深度抑制応答があった。
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【０６５９】
実験３：ＮＨＳＤ標的以外の標的に対するブロッキング標的捕捉試薬の添加
【０６６０】
実験３の目的は、単一ハイブリッド捕捉反応によって得られる狭く高い配列決定深度（ＮＨＳＤ）および広く中程度の配列決定深度（ＷＭＳＤ）を有するために、ＮＨＳＤ領域上で高い深度を得、非ＮＨＳＤ（本明細書ではＷＭＳＤ標的とも呼ばれる）領域上で低い深度を標的とするために、複雑な標的捕捉試薬戦略を継続することであった。
【０６６１】
標的捕捉試薬セットは、標的捕捉試薬の３つのサブプールを利用することによって、完全プロトタイプとして製剤化された。ＮＨＳＤ標的捕捉試薬（３７８０個の標的捕捉試薬、０．３Ｍｂ）を、ＮＨＳＤ／非ＮＨＳＤ標的比（１４％ＮＨＳＤ：８６％非ＮＨＳＤ）で、非修飾の標的捕捉試薬（全標的マイナスＮＨＳＤ標的、ビオチンなし、２２５６３個の標的捕捉試薬、１．７Ｍｂ）と組み合わせた。次に、この混合物を、完全な標的捕捉セット（２．０Ｍｂ、２６３４３）に滴定し、ビオチンの有無にかかわらず、非ＮＨＳＤ領域の比率を変化させた。（ＮＨＳＤ−ビオチン／非ビオチン）：非ＮＨＳＤビオチンの滴定系列を、１００、５０、３０、２０、１０、５、１、０％で行い、最初に、各成分の標的配列決定深度プロファイルを達成するのに必要な標的捕捉試薬の比を決定した。
【０６６２】
表１０および表１１に示される滴定の結果は、非ＮＨＳＤを減少させ、必要なＮＨＳＤを維持する能力を示す。１０％製剤（９０％非ビオチン〜１０％ビオチン）を例示的な試料に使用する製剤として選択した。滴定の配列決定深度の結果を表１０および１１に示す。図３は、ヒストグラムの形での１０％製剤についての実験３の結果を示す。図３に示されるように、ＮＨＳＤ（狭く高い配列決定深度）標的は、グラフの左側にある別個のグループを形成する非ＮＨＳＤ標的からグラフの右側にある別個のクラスターに分離する。ＮＨＳＤ標的は、非ＮＨＳＤ標的（本明細書ではＷＭＳＤ標的とも呼ばれる）と比較して、より高い配列決定深度を有する。この実験はまた、臨床試料を用いても行われ、同様の結果が得られた。
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【０６６３】
要約
【０６６４】
この実施例では、高感受性および高特異性を必要とするゲノム変化と、単一のアッセイに必要とするゲノムシグナリングとの組み合わせのための３つの異なるパスについての結果を記載し、要約する。この分析は、（ａ）単一のライブラリー構築後の並列ハイブリッド捕捉が、配列決定深度指定を達成し、特定のゲノムシグネチャー、ならびに単一のヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）、インデル、および再配列について変異体レベルの一致を維持すること、（ｂ）２００Ｍリード対が、高感受性および特異性に必要とされる広く高い配列決定深度を達成するのに十分な配列決定ではないこと、ならびに（ｃ）抗標的捕捉試薬手法を利用する予備データは、抗標的捕捉試薬戦略が、特定のゲノムシグネチャー領域上の規定された標的および広く中程度の配列決定深度で必要とされる高く狭い配列決定深度を達成するために使用され得ることを示唆し、単一のハイブリッド捕捉反応が、実施可能な配列決定深度内で性能指定を達成する組合せアッセイの目標を達成することを可能にすることを実証した。
【０６６５】
本明細書に記載される方法およびシステムに関連する追加の実施例は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／０９２４２６号および第ＷＯ２０１６／０９０２７３号に記載され、上述の刊行物および実施例の内容は、その全体が参照により組み込まれる。
【０６６６】
参照による組み込み
【０６６７】
本明細書に記載される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各々個々の刊行物、特許または特許出願が、参照により組み込まれるように具体的であり個別に示されたものとして、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。相反する場合、本出願は、本明細書中の任意の定義を含むが、制御される。
【０６６８】
また、それらの全体が、公開データベースのエントリーに相関する寄託番号を参照する任意のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列であり、例えば、ｔｉｇｒ．ｏｒｇのワールドワイドウェブ上のＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）、および／またはｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのワールドワイドウェブ上のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）によって維持されるものである。
【０６６９】
同等物
【０６７０】
当業者であれば、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を、常套的実験のみを用いて認識するか、または確認することができる。このよう同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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