(57)【要約】  リポソームワクチン組成物は、リポソームの表面に提示されるβ−アミロイド（Ａβ）由来のペプチド抗原を含む。ワクチン組成物はまた、リポソーム内に封入されたユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドを含む。ワクチン組成物はまた、リポソームの一部を形成するものであってもよく、リポソームの表面上に少なくとも部分的に提示されてもよいアジュバントを含む。これらのワクチン組成物は、アミロイドベータ関連の疾患または状態、または対象の認知記憶能力の喪失を特徴とする、またはそれに関連する状態に関連する症状を治療、予防、該症状に対する防御免疫応答を誘導、あるいは該症状を軽減するために使用される。ワクチン組成物はキットとして提供されてもよい。リポソームワクチン組成物を製造するための関連する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含むリポソームワクチン組成物：
ａ．リポソームの表面に提示されるβ−アミロイド（Ａβ）由来のペプチド抗原
ｂ．Ｂ細胞による抗体産生を増強するヘルパーＴ細胞応答を刺激しうるリポソーム内に封入されたユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチド
ｃ．アジュバント。
【請求項２】
ユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドが、少なくとも３０％の疎水性アミノ酸を含む、請求項１に記載のリポソームワクチン組成物。
【請求項３】
リポソーム内に封入された少なくとも２つの異なるユニバーサルＴ細胞エピトープを含む、請求項１または２に記載のリポソームワクチン組成物。
【請求項４】
各ユニバーサルＴ細胞エピトープが、長さが３０アミノ酸以下、長さが２０アミノ酸以下、または長さが１０〜２０アミノ酸以下である、請求項１から３のいずれか一項に記載のリポソームワクチン組成物。
【請求項５】
リポソーム内に封入された２つ、３つ、または４つの異なるユニバーサルＴ細胞エピトープを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のリポソームワクチン組成物。
【請求項６】
ユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドが、少なくとも２つの異なるユニバーサルＴ細胞エピトープを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のリポソームワクチン組成物。
【請求項７】
ユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドが、２つ、３つ、または４つのユニバーサルＴ細胞エピトープを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のリポソームワクチン組成物。
【請求項８】
少なくとも２つのユニバーサルＴ細胞エピトープがリンカーによって結合されている、請求項３から７のいずれか一項に記載のリポソームワクチン組成物。
【請求項９】
リンカーが少なくとも２つのアミノ酸を含み、所望によりリンカーがアミノ酸ＶＶＲまたはＰＭＧＡＰを含むか、本質的になるか、またはそれからなっていてもよい、請求項８に記載のリポソームワクチン組成物。
【請求項１０】
ユニバーサルＴ細胞エピトープが以下から選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載のリポソームワクチン組成物：
ａ．ジフテリア毒素と破傷風毒素のユニバーサルＴ細胞エピトープの組み合わせ
ｂ．エプスタインバーウイルスと破傷風毒素のユニバーサルＴ細胞エピトープの組み合わせ
ｃ．エプスタインバーウイルス、破傷風毒素、キーホールリンペットヘモシアニンのユニバーサルＴ細胞エピトープの組み合わせ；または
ｄ．インフルエンザ血球凝集素、ジフテリア毒素、破傷風毒素、およびエプスタインバーウイルスのユニバーサルＴ細胞エピトープの組み合わせ。
【請求項１１】
ユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドが、配列番号１（ＳＡＴ４２）、配列番号２（ＳＡＴ４３）、配列番号３（ＳＡＴ４４）、配列番号４（ＳＡＴ４７）から選択されるアミノ酸配列を含む、本質的になる、またはそれからなる、請求項１から１０のいずれか一項に記載のリポソームワクチン組成物。
【請求項１２】
ユニバーサルＴ細胞エピトープが、配列番号５（ＳＡＴ６）、配列番号６（ＳＡＴ１３）、配列番号７（ＳＡＴ１５）、配列番号８（ＳＡＴ１７）から選択されるアミノ酸配列を含む、本質的になる、またはそれからなる、請求項１から１０のいずれか一項に記載のリポソームワクチン組成物。
【請求項１３】
以下を含むリポソームワクチン組成物：
ａ．Ａβのアミノ酸１〜１５を含む、本質的になる、またはそれからなる、リポソームの表面に提示されるテトラパルミトリル化β−アミロイド（Ａβ）由来ペプチド抗原
ｂ．リポソーム内に封入されたユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドであって、配列番号３（ＳＡＴ４４）および配列番号４（ＳＡＴ４７）から選択されるアミノ酸配列を含む、本質的になる、またはそれからなるペプチド
ｃ．アジュバント。
【請求項１４】
アジュバントがリポソームの一部を形成する、請求項１から１３のいずれか一項に記載のリポソームワクチン組成物。
【請求項１５】
アジュバントが、少なくとも部分的に、リポソームの表面に表示される、請求項１から１４のいずれか一項に記載のリポソームワクチン組成物。
【請求項１６】
アジュバントがモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のリポソームワクチン組成物。
【請求項１７】
ユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドが３０から６０アミノ酸の長さである、請求項１から１６のいずれか一項に記載のリポソームワクチン組成物。
【請求項１８】
対象におけるアミロイドベータ関連疾患または状態に関連する症状を治療、予防、該症状に対する防御免疫応答を誘導、あるいは該症状を軽減する際に使用するための、請求項１から１７のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
対象におけるアミロイドベータ関連疾患または状態に関連する症状を治療、予防、該症状に対する防御免疫応答を誘導、あるいは該症状を軽減するためのキットであって、請求項１から１７のいずれか一項に記載のリポソームワクチン組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗Ａベータ治療用ワクチン、ならびに疾患の治療および予防におけるそれらの使用に関する。該ワクチンは、Ａβ由来ペプチドＢ細胞抗原およびＴ細胞エピトープを含んでいる。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶を含む認知機能の喪失、および通常の日常活動を行う能力の喪失を特徴とする、壊滅的で進行性の変性疾患である。ＡＤは世界中で約４億人の患者に影響を及ぼしており、人口が高齢化するにつれてその数は急速に増加している。ＡＤ患者の脳における主な神経病理学的変化は、主に記憶および認知関連領域における神経細胞死である(非特許文献１：Soto、1999)。ＡＤの最も顕著な病理学的特徴の１つは、罹患した個人の脳にアミロイドベータ(Ａβ)プラークが豊富に存在することである(非特許文献１：Soto、1999)。Ａβプラークは、３９〜４３アミノ酸長のＡβペプチドによって形成されており、その本来の非病理学的形態においてランダムコイルコンフォメーションになっている。病的状態への移行中に、該ペプチドは主にβシート二次構造に変化し、自発的に凝集して不溶性の沈着物となる。
【０００３】
ＡＤに対して現在利用可能ないくつかの治療法は、主にその作用において症候性であると考えられている。長年にわたって治療法の開発に多大な努力が払われてきたにもかかわらず、ＡＤの疾患修飾治療は現在まで承認されていない。病気の脳における病的なＡβを中和する免疫療法を開発するための試みが長い間なされてきた(非特許文献２：Winblad, 2014)。ワクチンは、免疫系を刺激してわずかに異なるが非常に特異的な抗体のプールを生成するという利点を示すとともに、必要に応じて追加のワクチン接種によって応答をさらに呼び起こすことができる。しかしながら、Ａβに対する予防接種（ワクチン接種）アプローチには、いくつかの主要な問題がある。アミロイドベータはいわゆる自己抗原であり、人体は絶えずそれに曝されている。したがって、免疫寛容を破り、それに対する抗体反応を誘発することは非常に困難である。さらに、ＡＤ患者などの高齢者や病気の人は、免疫系が弱く、免疫細胞の数が少ないため、ワクチンに対して強い免疫反応を誘発することは非常に困難である。
【０００４】
これらの問題にもかかわらず、最初の研究では、完全長のＡβ１−４２ワクチン（ＡＮ１７９２）が抗体反応と有望な有効性を誘発し、プラセボ治療を受けた患者よりもワクチン接種を受けた患者の認知機能低下の速度が遅くなった（非特許文献３：Gilman, 2005）。しかし、治療を受けた患者の６％が髄膜脳炎を発症し、これは、全長Ａβ１−４２に対するＴ細胞性応答が原因と考えられる炎症反応であった(非特許文献４：Orgogozo, 2003)。
【０００５】
別の既知の抗ＡβワクチンであるＡＣＩ−２４には、Ａβのヒト配列１−１５と完全に同一の１５アミノ酸の配列が含まれている(特許文献１：WO2007/068411)。このペプチド抗原は、髄膜脳炎と出血を避けるとともに、Ａβに対する抗体を刺激することを目的として、リポソーム担体に結合されている(非特許文献５：Muhs, 2007、非特許文献６：Pihlgren, 2013)。抗原として機能するＡβ１−１５ペプチドの選択は、この配列がＢ細胞エピトープを含むが、完全長Ａβ１−４２の強力なＴ細胞反応部位を欠いているという理論的根拠に基づいており(非特許文献７：Monsonego、2003)、後者は、望ましくない炎症反応の原因であると考えられている。ＡＣＩ−２４は、Ａβ１−１５に特異的なＢ細胞受容体と、ＡＣＩ−２４ワクチンに存在するアジュバントであるモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）によって活性化されるトール様受容体４（ＴＬＲ４）の同時活性化を通じて作用することが示されている（非特許文献６：Pihlgren, 2013)。Ｂ細胞は、Ｂ細胞表面のＩｇ受容体を架橋することにより、増殖して免疫グロブリン（Ｉｇ）を産生するように活性化される。抗体産生を増加させるために、Ｔ細胞エピトープによって活性化されたＴヘルパー細胞によって２番目のシグナルが提供されうる。抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面にある主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子（ヒトではヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる）によって提示されるＴ細胞エピトープは、ＩＦＮγおよびＩＬ−４を産生可能な同族のＴヘルパー細胞の分化を促進する活性化されたＴ細胞とＢ細胞間のサイトカイン放出と共刺激シグナルは、抗体反応とクラススイッチを増加させる。一次ワクチン接種後、ナイーブＴ細胞が増殖し、エフェクター細胞に分化する。これらの細胞のごく一部は、長寿命のメモリーＴ細胞のプールを形成し、ワクチンの追加接種後に同族のペプチドに再遭遇すると急速に増殖しうる(非特許文献８：Sallusto、2010)。いわゆる「ユニバーサル」Ｔ細胞エピトープは、ヒト集団の大多数に存在するＴ細胞に特異的である。それらは一般に、人間が生涯にわたって通常さらされる抗原（破傷風、インフルエンザなど）に由来する。Ｔ細胞を活性化するＴ細胞エピトープの能力は、少なくとも以下の２つの相補的特性の結果である：ｉ）ＨＬＡ溝への結合の親和性、つまり結合の強さ、ならびにｉｉ）無差別的様式で異なるＨＬＡに結合する能力、つまりＨＬＡ分子の発現の違いに関して、非常に多様なヒト集団をカバーする能力。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００７／０６８４１１明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Soto C., Plaque busters: strategies to inhibit amyloid formation in Alzheimer’s disease. Molecular Medicine Today (vol 5), August 1999.
【非特許文献２】Winblad B., Graf A., Riviere M.E., Andreasen N., Ryan J.M., Active immunotherapy options for Alzheimer's disease. Alzheimers Res Ther. 2014 Jan 30;6(1):7.
【非特許文献３】Gilman S., Koller M., Black R.S., Jenkins L., Griffith S.G., Fox N.C., Eisner L., Kirby L., Boada Rovira M., Forette F., Orgogozo J.M., Clinical effect of Aβ immunization (AN1792) in patients with AD in an interrupted trial. Neurology 64, 1553-1562 (2005).
【非特許文献４】Orgogozo J.M., Gilman S., Dartigues J.F., Laurent B., Puel M., Kirby L.C., Jouanny P., Dubois B., Eisner L., Flitman S., Michel B.F., Boada M., Frank A., Hock C., Subacute meningoencephalitis in a subset of patients with AD after Abet42 immunization. Neurology 61: 46-54 (2003).
【非特許文献５】Muhs A., Hickman D.T., Pihlgren M., Chuard N., Giriens V., Meerschman C., van der Auwera I., van Leuven F., Sugawara M., Weingertner M.-C., Bechinger B., Greferath R., Kolonko N., Nagel-Steger L., Riesner D., Brady R.O., Pfeifer A., Nicolau C., Liposomal vaccines with conformation-specific amyloid peptide antigens define immune response and efficacy in APP transgenic mice. PNAS, 104 23:9810-9815 (2007).
【非特許文献６】Pihlgren M., Silva A.B., Madani R., Giriens V., Waeckerle-Men Y., Fettelschoss A., Hickman D.T., Lopez-Deber M.P., Ndao D.M., Vukicevic M., Buccarello A.L., Gafner V., Chuard N., Reis P., Piorkowska K., Pfeifer A., Kundig T.M., Muhs A., Johansen P., TLR4- and TRIF-dependent stimulation of B lymphocytes by peptide liposomes enables T cell-independent isotype switch in mice. Blood. Jan 3;121(1):85-94 (2013).
【非特許文献７】Monsonego A., Weiner H.L., Immunotherapeutic approaches to Alzheimer's disease. Science. 31;302(5646):834-8 (2003).
【非特許文献８】Sallusto F., Lanzavecchia A., Araki K., Ahmed R., From vaccines to memory and back. Immunity. Oct 29;33(4):451-63 (2010).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
良好な安全性プロファイルを維持しながら、免疫原性の高い抗Ａβワクチンを開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この必要性は、リポソームＡＣＩ−２４ワクチン内にユニバーサルＴ細胞エピトープを組み込むことによって満たされた。ＡＣＩ−２４ワクチンはリポソームの表面にＡβ１−１５を提示するため、リポソームの表面にユニバーサルＴ細胞エピトープを含めることは、ワクチンの有効性を改善するための最初の選択ルートとして発明者によって考えられた。しかしながら、驚くべきことに、リポソームの表面にユニバーサルＴ細胞エピトープを含めることは、ワクチンの効力を増加させる(または実質的に増加させる)ことができなかった。したがって、本明細書で説明されるように、改善された効力を提供することが示された封入アプローチが採用された。リポソームワクチン内へのユニバーサルＴ細胞エピトープの組み込みは、Ａβに指向されていないＴ細胞活性化を通じて良好な安全性プロファイルを維持しながら、ワクチンの有効性を増加させる（または実質的に増加させる）ことが本明細書に示されている。しかし、そのようなアプローチの開発にはいくつかの課題があった。第一に、本明細書で開発されたユニバーサルＴ細胞エピトープは疎水性である傾向があり、このことがリポソームへの封入を困難にしている。第二に、免疫原性を改善するために、複数のユニバーサルＴ細胞エピトープがしばしば組み合わされていた。しかしながら、ペプチドの長さが長くなると、ペプチド合成の収率と成功率は低下する。第三に、選択されたユニバーサルＴ細胞エピトープの電荷は、封入の効率と封入を確実にするために必要な実験条件に影響を与える。それは負に帯電したリポソーム膜による。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、示されたワクチンの最初の接種の２１日前（ＡＣＩ−２４．０４６）または７日前（プレブリーディング（prebleeding））（ＡＣＩ−２４、ＡＣＩ−２４．０４３、ＡＣＩ−２４．０４４）ならびに最初の接種の７、２１および３５日後のＣ５７ＢＬ／６マウスの血漿中のＥＬＩＳＡによるＡβ１−４２特異的ＩｇＧ抗体の分析を示す（矢印は接種の時点を示す）。結果は、グループあたりｎ＝５匹のマウスでのｎｇ／ｍＬの幾何平均＋／−９５％信頼区間（ＣＩ）として表される。Ｘ軸は治療／出血（bleeding）の日数を示し、Ｙ軸はｎｇ／ｍＬで表される抗体価を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、示されたワクチンの最初の接種の２１日前（ＡＣＩ−２４．０４６）または７日前（プレブリーディング（prebleeding））（ＡＣＩ−２４、ＡＣＩ−２４．０４３、ＡＣＩ−２４．０４４）ならびに最初の接種の２１日後のＣ５７ＢＬ／６マウスの血漿中のＥＬＩＳＡによるＡβ１−４２特異的ＩｇＧ抗体の分析を示す。結果は、グループあたり５匹のマウスでの幾何平均＋／−ｎｇ／ｍＬの９５％ＣＩとして表される。２１日目の異なるグループ間の統計的検定：Dunnの多重比較によるKruskal-Wallis検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。Ｘ軸は、示されたワクチンを接種されたグループからの個々の血漿を示し、Ｙ軸は、ｎｇ／ｍＬで表される抗体力価を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、示されたワクチンの最初の接種の２１日前または７日前（点線）および２１日後（太線）のＣ５７ＢＬ／６マウスの血漿中のＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡによるＡβ１−４２自己会合の阻害の分析を示す。結果は、グループあたり５匹のマウスのＡβ１−４２自己会合の阻害のパーセンテージの平均＋／−標準偏差として表される。Ｘ軸は血漿の段階希釈を示し、Ｙ軸はＡβ１−４２自己会合の阻害のパーセンテージを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、血漿の１／２５希釈物での２１日目の阻害のパーセンテージ（％）から−２１日目または−７日目の阻害の％（バックグラウンドプレブリード）を引いたものとして示されるＡβ１−４２自己会合の阻害を示す。Ｘ軸は、示されたワクチンで治療されたグループを示し、Ｙ軸は、バックグラウンドを差し引いた後のＡβ１−４２自己会合の阻害のパーセンテージを示す。
【図３】図３は、示されたワクチンの１回目の接種の２１日前（ＡＣＩ−２４．０４６）または７日前（ＡＣＩ−２４、ＡＣＩ−２４．０４３、ＡＣＩ−２４．０４４）ならびに接種２１日後の、ＥＬＩＳＡによるＣ５７ＢＬ／６マウスの血漿中のＡβ１−４２オリゴマー特異的ＩｇＧ抗体の分析を示す。結果は、グループあたり５匹のマウスでのｎｇ／ｍＬの幾何平均＋／−９５％ＣＩとして表される。２１日目のグループ間の統計的検定：Ｄｕｎｎの多重比較によるＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。Ｘ軸は示されたワクチンを接種されたグループを示し、Ｙ軸はｎｇ／ｍＬで表される抗体力価を示す。
【図４】図４は、示されたワクチンの最初の接種の７日後および２１日後のＣ５７ＢＬ／６マウスの血漿中のＥＬＩＳＡによるＩｇＧ抗体のＡβ１−４２アビディティの分析を示す。結果は、グループあたり５匹のマウスのアビディティインデックスの幾何平均＋／−９５％ＣＩとして表される。統計的検定：各グループの７日目から２１日目までのマンホイットニー検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。Ｘ軸は示されたワクチンを接種されたグループを示し、Ｙ軸はアビディティインデックスを示す。
【図５】図５は、ＡＣＩ−２４．０４６（ＳＡＴ４４、ｎ＝８）、ＡＣＩ−２４．０４５（ＳＡＴ４３、ｎ＝４）またはＡＣＩ−２４．０４３（ＳＡＴ４７、ｎ＝４）の最初の接種の前（１日目）および３回目の接種後１週間（６４日目）のカニクイザルの血清中のＭＳＤによるＡβオリゴマー特異的ＩｇＧ抗体の分析を示す。結果は、ＡＵ／ｍＬの幾何平均＋／−９５％ＣＩとして表される。Ｘ軸は、示されたワクチンを接種されたグループからの個々の血漿を示し、Ｙ軸は、ＡＵ／ｍＬで表される抗体力価を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、ＡＣＩ−２４およびＡＣＩ−２４．０４６（ＳＡＴ４４）ワクチンの３回目の接種の７日後（３６日目）のＣ５７ＢＬ／６マウスの血漿中のＥＬＩＳＡによるＡβ１−４２特異的ＩｇＧ抗体の分析を示す。結果は、グループあたりｎ＝１０匹のマウスでのｎｇ／ｍＬの幾何平均＋／−９５％ＣＩとして表される。Ｘ軸は各特定のグループの接種に使用されるワクチンを示し、Ｙ軸はｎｇ／ｍＬで表される抗体価を示す。統計的検定：ＡＣＩ−２４と指定されたワクチン間のマンホイットニー検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＡＣＩ−２４およびＡＣＩ−２４．０４３（ＳＡＴ４７）ワクチン（図６Ｂ）の３回目の接種の７日後（３６日目）のＣ５７ＢＬ／６マウスの血漿中のＥＬＩＳＡによるＡβ１−４２特異的ＩｇＧ抗体の分析を示す。結果は、グループあたりｎ＝１０匹のマウスでのｎｇ／ｍＬの幾何平均＋／−９５％ＣＩとして表される。Ｘ軸は各特定のグループの接種に使用されるワクチンを示し、Ｙ軸はｎｇ／ｍＬで表される抗体価を示す。統計的検定：ＡＣＩ−２４と指定されたワクチン間のマンホイットニー検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
したがって、本発明は、以下を含むリポソームワクチン組成物を提供する:
ａ．リポソームの表面に提示されるβ-アミロイド（Ａβ)由来ペプチドＢ細胞抗原；および
ｂ．リポソーム内に封入されたユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチド。
【００１２】
特に好ましいワクチン組成物は、リポソーム内に封入されたユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドを含むように改変されたＡＣＩ−２４ワクチンを含む。リポソームは担体の一例である。したがって、担体は、一般にリポソームであるが、リポソームによって達成されるのと同じ方法で表面にＡβ由来ペプチド抗原を提示するのに適した任意の担体であってよく(Ａβ由来ペプチド抗原は主にβ-シートコンフォメーションをとる)、ユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドを封入するものであってもよい。例としては、ベシクルや粒子体がある。
【００１３】
「ユニバーサルＴ細胞エピトープ」とは、ヒト集団の大部分に存在するＴ細胞に特異的なエピトープを意味する。それらは一般に、人間が生涯にわたって通常さらされる抗原に由来する。例には、日常的に投与されるワクチンに組み込まれる抗原が含まれる。具体的な例としては、破傷風、インフルエンザ、ジフテリアに含まれるＴ細胞エピトープ、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）などがある。Ｔ細胞を活性化するＴ細胞エピトープの「ユニバーサルな」能力は、少なくとも以下の２つの相補的な特性の結果である：ｉ）ＨＬＡ溝への結合の親和性、つまり、結合の強さ、ならびにｉｉ）無差別な様式でこのなるＨＬＡハロタイプに結合するその能力、つまり、ＨＬＡ分子の発現の違いに関して、非常に多様なヒト集団をカバーする能力。ユニバーサルＴ細胞エピトープは、ヒト集団に存在するＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の大部分に結合するものであってもよい。本発明のワクチン組成物に含まれるユニバーサルＴ細胞エピトープは、ＣＤ４  Ｔ細胞応答を刺激するものであってもよい。本発明のワクチン組成物に含まれるユニバーサルＴ細胞エピトープは、Ｂ細胞による（Ａβ特異的）抗体産生を増強するヘルパーＴ細胞応答を刺激するものであってもよい。
【００１４】
本発明のワクチン組成物に含まれるユニバーサルＴ細胞エピトープは、典型的には、固相合成によって合成される。したがって、いくつかの実施形態では、ユニバーサルＴ細胞エピトープは、固相合成によって合成される。このまたは他の封入の実施は、いくつかの非限定的な実施形態において、ユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドが、８５、８０、７５または７０アミノ酸以下の長さであることを意味する。十分な免疫原性を確保するためのＴ細胞エピトープペプチドの最小の長さは、典型的には、約１０アミノ酸である。したがって、ペプチドの最小の長さは、十分に免疫原性のＴ細胞エピトープが生成されることを確実にするために、典型的には約１０アミノ酸である。いくつかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも２０アミノ酸の長さである。他の実施形態では、ペプチドは３０から６０アミノ酸の長さである。このことは、ユニバーサルＴ細胞エピトープあたりの好ましい最小長と、少なくとも２つ、３つ、または４つの（リンクされた）ユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドの好ましさに基づいている。
【００１５】
本発明の有用性のあるユニバーサルＴ細胞エピトープは、典型的には疎水性であることが見出された。このことは、脂質との相互作用によって、リポソーム内でのそれらの合成、精製、および封入のためのさらなる課題を提供する。疎水性のパーセンテージは、疎水性アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ａｌａ、およびＰｒｏ）の総数を、ユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチド全体中のアミノ酸の総数で割って（ペプチド全体を考慮する場合）あるいは個々のＴ細胞エピトープ中のアミノ酸の総数で割って（それぞれのユニバーサルＴ細胞エピトープを個々に考慮する場合）、１００を掛けることにより計算される。本発明の目的にかなう疎水性アミノ酸は、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、バリン（Ｖａｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、プロリン（Ｐｒｏ）、およびアラニン（Ａｌａ）であると定義される。
【００１６】
したがって、一般に、ユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドは、少なくとも３０％の疎水性アミノ酸を含む。これは、ユニバーサルＴ細胞エピトープを構成するペプチド全体のアミノ酸の少なくとも３０％が疎水性アミノ酸であることを意味する。ユニバーサルＴ細胞エピトープを含むテストされたペプチドの大部分は、５０％までの疎水性アミノ酸を含んでいる。いくつかの例において、ペプチドは、少なくとも３５％、４０％、４５％、または５０％の疎水性アミノ酸を含んでいてもよい。
【００１７】
免疫原性のレベルを改善するために、ワクチン組成物は、リポソーム内に封入された少なくとも２つの異なるユニバーサルＴ細胞エピトープを含むことが好ましい。ペプチドの疎水性および合成の制約と組み合わせると、リポソームの容量によって、理想的には、各ユニバーサルＴ細胞エピトープは、典型的には長さが３０アミノ酸以下、好ましくは長さが２０アミノ酸以下であり、さらにより好ましくは長さが約１０〜２０アミノ酸の範囲である。本明細書でさらに説明するように、本発明者らは、免疫原性を保持しながら、より長いユニバーサルＴ細胞エピトープを１０〜２０アミノ酸の長さに効果的にトリミングできることを見出した。トリミングされたペプチドは、個々のＴ細胞エピトープの配列において、インシリコで予測されたＴ細胞エピトープのホットスポットに基づいて、最も免疫原性の短いサブ配列、典型的には長さが約１５アミノ酸を選択することによって設計された。ＥｐｉＶａｘ免疫原性スクリーニングプラットフォーム(http://www.epivax.comからアクセス)など、この分析の実行を支援するさまざまなソフトウェアプログラムを利用できる。さらなる例には、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（Hans- Georg Rammensee, Jutta Bachmann, Niels Nikolaus Emmerich, Oskar Alexander Bachor, Stefan Stevanovic: SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics (1999) 50: 213-219; access via http://www.svfpeithi.com参照）、ＳＶＭＨＣ（https://www.ncbi.nlm.nih.gOv/pubmed/16844990）、およびＩＥＢＤデータベース（Vita R, Overton JA, Greenbaum JA, Ponomarenko J, Clark JD, Cantrell JR, Wheeler DK, Gabbard JL, Hix D, Sette A, Peters B. The immune epitope database (IEDB) 3.0. Nucleic Acids Res. 2014 Oct 9. pii: gku938. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 25300482; access via http://www.iedb.org/）が含まれる。
【００１８】
いくつかの実施形態では、各ユニバーサルＴ細胞エピトープは、少なくとも３０％の疎水性アミノ酸を含む。これは、個々のユニバーサルＴ細胞エピトープのアミノ酸の少なくとも３０％が疎水性アミノ酸であることを意味する。特定のエピトープの場合、この数値は８０％もの疎水性アミノ酸であってもよい。いくつかの例において、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％の疎水性アミノ酸が存在してもよい。いくつかの実施形態では、最大値は８０％の疎水性アミノ酸であってもよく、このことは、最も広い範囲は３０％から８０％の疎水性アミノ酸であってもよいことを意味する。
【００１９】
改善された免疫原性と封入の実際的な課題とのバランスをとるために、ワクチン組成物は、担体内に封入された２つ、３つ、または４つの異なるユニバーサルＴ細胞エピトープを含んでいてもよい。多数の異なるユニバーサルＴ細胞エピトープが封入されている場合（特に３つまたは４つ）、それらは約１５アミノ酸などの約１０〜２０アミノ酸の長さにトリミングされることが好ましい。複数の異なるユニバーサルＴ細胞エピトープが封入された同じペプチドに含まれることが好ましい。したがって、複数の異なるユニバーサルＴ細胞エピトープを含む合成ペプチド構築物は、本発明の好ましい実施を表す。特定の実施形態では、ペプチドは、少なくとも２つの異なるユニバーサルＴ細胞エピトープを含む。より具体的な実施形態では、ペプチドは、２つ、３つ、または４つのユニバーサルＴ細胞エピトープを含む。少なくとも２つのユニバーサルＴ細胞エピトープが合成ペプチド構築物に含まれる場合、それらはリンカーによって結合されていてもよい。リンカーは、結合されたエピトープの免疫原性を損なわない方法で、ユニバーサルＴ細胞エピトープを互いに物理的に接続するために使用される。アミノ酸を互いに結合するための適切なリンカーは、当技術分野でよく知られている。好ましいリンカーは、それ自体がアミノ酸ベースのリンカー、すなわちペプチドリンカーである。したがって、それらはペプチド結合を介してユニバーサルＴ細胞エピトープを互いに結合できる。リンカーは、ユニバーサルＴ細胞エピトープの正しいプロセッシングを可能にするリンカーである。ＭＨＣクラスＩＩ分子による抗原提示には、エンドソーム−リソソームコンパートメントへの抗原の侵入が必要である。次に、これらの抗原は、タンパク質分解酵素によって処理され、タンパク質分解酵素においてはパパインファミリーのリソソームシステインプロテアーゼが重要なサブセットを構成する。生成されたペプチドはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞などのプロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に提示される（Lutzner and Kalbacher 2008）。したがって、好ましくは、リンカーは、パパインファミリーのリソソームシステインプロテアーゼの基質を含む。リンカーは、カテプシンＳ、カテプシンＢおよびカテプシンＬのうちの１つまたは複数の基質を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、リンカーは、少なくとも２つまたは少なくとも３つのアミノ酸を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸ＶＶＲ、ＴＶＧＬＲ、ＫＶＳＶＲ、ＰＭＧＡＰまたはＰＭＧＬＰを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなる。
【００２０】
したがって、２つのユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドは、次の形式の直鎖状ペプチドであってもよい。
［ユニバーサルＴ細胞エピトープ１］−［リンカー］−［ユニバーサルＴ細胞エピトープ２］
したがって、３つのユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドは、次の形式の直鎖状ペプチドであってもよい。
［ユニバーサルＴ細胞エピトープ１］−［リンカー］−［ユニバーサルＴ細胞エピトープ２］−［リンカー］−［ユニバーサルＴ細胞エピトープ３］
したがって、４つのユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドは、次の形式の直鎖状ペプチドであってもよい。
［ユニバーサルＴ細胞エピトープ１］−［リンカー］−［ユニバーサルＴ細胞エピトープ２］−［リンカー］−［ユニバーサルＴ細胞エピトープ３］−［リンカー］−［ユニバーサルＴ細胞エピトープ４］
【００２１】
リンカーは、リンクされたユニバーサルＴ細胞エピトープの各ペア間で同一である必要はないことに注意すべきである。したがって、例えば、ユニバーサルＴ細胞エピトープ１とユニバーサルＴ細胞エピトープ２との間のリンカーは、ユニバーサルＴ細胞エピトープ２とユニバーサルＴ細胞エピトープ３との間のリンカーとは異なル可能性がある。４つのユニバーサルＴ細胞エピトープの場合、３つのリンカーのそれぞれが異なる可能性があり、２つが同じで、３番目が異なる可能性がある（任意の順序）。いくつかの実施形態において、複数のリンカーがペプチドに含まれるいくつかの実施形態では、それらはすべて同一である。
【００２２】
本発明者らは、封入に適したペプチドを考案する際に、ユニバーサルＴ細胞エピトープの一連の供給源をスクリーニングした。いくつかの実施形態において、ユニバーサルＴ細胞エピトープは、ジフテリア毒素、破傷風毒素、エプスタインバーウイルス、インフルエンザ血球凝集素および/またはキーホールリンペットヘモシアニンに由来する。したがって、ユニバーサルＴ細胞エピトープの特定の好ましい組み合わせは、以下から選択される。
ａ．ジフテリア毒素と破傷風毒素のユニバーサルＴ細胞エピトープの組み合わせ
ｂ．エプスタインバーウイルスと破傷風毒素のユニバーサルＴ細胞エピトープの組み合わせ
ｃ．エプスタインバーウイルス、破傷風毒素、キーホールリンペットヘモシアニンのユニバーサルＴ細胞エピトープの組み合わせ、または
ｄ．インフルエンザ血球凝集素、ジフテリア毒素、破傷風毒素、およびエプスタインバーウイルスのユニバーサルＴ細胞エピトープの組み合わせ
【００２３】
このような組み合わせは、好ましくは、上で説明したリンカーフォーマットにて提供される。疑義を避けるために、組み合わせは、好ましくは特定された順序で含まれるが、それらは別の順序で含まれていてもよい。例えば、３つのユニバーサルＴ細胞エピトープＡ、Ｂ、およびＣがある場合、それらはＡＢＣ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、ＢＣＡ、ＣＡＢ、またはＣＢＡのいずれの順序にて含まれていてもよい。
【００２４】
複数の異なるユニバーサルＴ細胞エピトープを含む特定のペプチドは、本発明のさらなる態様を形成する。そのようなペプチドは、好ましくは、本発明のワクチン組成物に含まれる。したがって、本発明において有用なペプチドは、配列番号１（ＳＡＴ４２）、配列番号２（ＳＡＴ４３）、配列番号３（ＳＡＴ４４）、配列番号４（ＳＡＴ４７）から選択されるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。これらのペプチドの組成は、後で示す表２を参照してより詳細に説明される。
【００２５】
単一のユニバーサルＴ細胞エピトープを含む特定のペプチドもまた、本発明のさらなる態様を形成する。そのようなペプチドは、好ましくは、本発明のワクチン組成物に含まれる。したがって、本発明において有用なペプチドは、配列番号５（ＳＡＴ６）、配列番号６（ＳＡＴ１３）、配列番号７（ＳＡＴ１５）、配列番号８（ＳＡＴ１７）から選択されるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。これらのペプチドの組成は、後で示す表１を参照してより詳細に説明されている。必要に応じて、長さが１０〜２０アミノ酸にトリミングされたこれらのペプチドの組み合わせもまた、本発明のワクチン組成物に含まれ得る。組み合わされたペプチドは、好ましくは、本明細書で定義されるような１つ以上のリンカーによって結合される。
【００２６】
Ａβ由来ペプチド抗原はリポソームの表面に提示される。典型的には、これはリポソームの外面への挿入によるものである。リポソームの外表面への挿入は、リポソームの外面に挿入する部分へのＡβ由来ペプチド抗原の付着によって容易ならしめてもよい。リポソームは、表面にＡβ由来ペプチド抗原を提示するのに適切であり、また、ユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドを封入する任意のリポソームであってもよい。典型的には、該部分は、リポソームの脂質二重層への挿入を確実にするために疎水性部分を含む。該部分は、任意の適切な部分であってもよいが、好ましくは脂肪酸である。脂肪酸はパルミトイル残基を含んでいてもよい。ＡＣＩ−２４の場合のように、好ましい構造は、ペプチドのＮおよびＣ末端領域の２つのパルミトイル残基に結合したＡβ由来ペプチド抗原（ＡＣＩ−２４中のＡβ（１−１５））を含む。したがって、ペプチド抗原はテトラパルミトイル化される。これは、Ａβ由来ペプチド抗原のＮおよびＣ末端領域に２つのリジン残基を組み込むことによって促進されてもよい。当該リジン残基はパルミトイル化されている。
【００２７】
いくつかの実施形態では、リポソームは負の表面電荷を有する。リポソームは陰イオン性である。好ましくは、リポソームはリン脂質を含み、さらにより好ましくは、リン脂質は、ジミルシトイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）およびジミルシトイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）を含む。リポソームはさらにコレステロールを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、これらの３つの成分のモル比は９：１：７であってもよい。
【００２８】
したがって、最も好ましい構造は、リポソーム中に再構成されたＡβ由来ペプチド抗原を含む。したがって、本発明のこれらの組成物は、一般に、本明細書では「本発明のリポソームワクチン組成物」と称されてもよい。
【００２９】
Ａβ由来ペプチド抗原は、対象においてＢ細胞応答を誘導する。それは「Ｂ細胞抗原」である。すでに説明したように、Ａβプラークは３９〜４３アミノ酸長のＡβペプチドによって形成され、該Ａβペプチドは、その本来の非病理学的形態としてランダムコイルコンフォメーションになっている。病理学的状態への移行中に、それは主にβシートの二次構造に変化し、自発的に凝集して不溶性の沈着物となる。したがって、Ａβ由来ペプチド抗原は、本明細書では、Ａβの（最大）４３アミノ酸に由来するペプチド抗原として定義されるが、全長Ａβではない。より具体的には、Ａβ由来ペプチド抗原は、Ａβ（１−４２）の免疫優勢Ｂ細胞エピトープを含むが、Ａβ（１−４２）に見られるＴ細胞エピトープを欠いている。したがって、いくつかの実施形態では、Ａβ由来ペプチド抗原は、ＡβのＮ末端の１７個のアミノ酸に由来する１３から１５個の連続するアミノ酸を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。Ａβ由来ペプチド抗原は、より大きなペプチド分子との関連で提供されてもよく、その残りはＡβアミノ酸配列に由来しないことに留意されたい。例えば、ペプチドは、パルミトイル化を促進するためのリジン残基などの追加の残基を含むことができる。典型的には、これらの残基はペプチドのＮ末端とＣ末端に見られる。この文脈において、「本質的になる」という用語は、Ａβ由来ペプチド抗原がＡβのＮ末端の１７個のアミノ酸に由来する１３から１５個の連続するアミノ酸を含むが、パルミトイル化を促進する４つのリジン残基などの限られた数の追加の残基を含むことができることを意味する。好ましいＡβ由来ペプチド抗原は、「Ａβ（１〜１５）」（ＷＯ２００７／０６８４１１、ＡＣＩ−２４）と称されてもよいＡβのアミノ酸１〜１５を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００３０】
本発明の組成物に含まれるＡβ由来ペプチド抗原は、病理学的形態のＡβを複製する二次構造を採用する。好ましくは、Ａβ由来ペプチド抗原は、βシートコンフォメーションを含む二次構造を採用する。さらにより好ましくは、Ａβ由来ペプチド抗原は、リポソームの表面に表示されるとき、優先的にβシートコンフォメーションを採用する。
【００３１】
本発明の組成物は、典型的には、少なくとも１つのアジュバントを含む。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の組成物は、２つのアジュバントを含む。アジュバントの目的は、対象の免疫応答を増加または刺激することである。好ましくは、少なくとも１つのアジュバントは、（担体内に封入されるのとは対照的に）担体の一部である。したがって、少なくとも１つのアジュバントは、リポソームの一部を形成してもよい。それは脂質二重層の一部を形成してもよい。したがって、アジュバントは脂質ベースのアジュバントであってもよい。アジュバントは、少なくとも部分的に、リポソームの表面に提示されてもよい。このことは、脂質二重層のアジュバント形成部分の結果であってもよい。いくつかの実施形態では、リポソームの一部を形成する１つまたは複数のアジュバントを、封入されたアジュバントと組み合わせてもよい。他の実施形態において、リポソームの一部を形成する１つ以上のアジュバントは、リポソームを形成するときに、さらなるアジュバント（ミョウバンまたはＣｐＧなど）と混合されてもよい。担体（リポソーム）は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）を添加したアジュバントとして機能してもよく、該用語は、モノホスホリルヘキサアシルリピドＡのごときＭＰＬＡ−誘導体、３−デアシル（合成物）（３Ｄ−（６−アシル）ＰＨＡＤ(登録商標)）、ＰＨＡＤ(登録商標)（リン酸化ヘキサアシル二糖）、ＭＰＬを包含する。したがって、特定の実施形態によれば、組成物は、ＭＰＬＡをさらに含む。ＭＰＬＡは、典型的にはリポソーム形成中に添加される（本明細書でさらに説明するように）。したがって、好ましいリポソームは、ジミルシトイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミルシトイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、コレステロールおよびＭＰＬＡを含む。これらの４つの成分のモル比は、いくつかの実施形態において９：１：７：０．０５であってもよい。
【００３２】
本発明に従って使用できる他のアジュバントには、とりわけ、水酸化アルミニウム（ミョウバン）および／またはＣｐＧが含まれる。
【００３３】
本発明のワクチン組成物は、アミロイドベータ関連の疾患または状態、あるいは認知記憶能力の喪失を特徴とするまたはそれに関連する状態に関連する症状を治療、予防、あるいはこれらに対抗または改善する防御免疫応答を誘発するために対象に投与される。したがって、ワクチン組成物は、予防的および治療的用途の両方を有し得る。対象は哺乳類であり、典型的にはヒトである。
【００３４】
アミロイドベータ関連の疾患または状態は、アルツハイマー病（ＡＤ）のごとき神経障害であってもよい。本発明によるアミロイドベータ関連疾患または状態の他の例は、軽度の認知障害（ＭＣＩ）、ダウン症候群、心アミロイドーシス、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、多発性硬化症、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ＡＬＳ（筋栄養性側索硬化症）、成人発症型糖尿病、封入体筋炎（ＩＢＭ）、眼アミロイドーシス、緑内障、黄斑変性症、格子ジストロフィーおよび視神経炎を包含する。これらの状態の多くは、認知記憶能力の喪失を特徴とするか、それに関連している。したがって、本発明による認知記憶能力の喪失を特徴とする、またはそれに関連する状態は、ＡＤ、軽度認知障害（ＭＣＩ）、ダウン症候群、心アミロイドーシス、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、多発性硬化症、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）および封入体筋炎（ＩＢＭ）を包含する。
【００３５】
したがって、本発明は、アミロイドベータ関連の疾患または状態、または対象における認知記憶能力の喪失を特徴とする、またはそれに関連する状態に関連する症状を治療、予防、あるいはこれらに対抗または改善する防御免疫応答を誘発する方法であって、本発明のワクチン組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【００３６】
そのような方法はまた、本発明のワクチン組成物の医学的使用の形で表現され得る。したがって、本発明はまた、アミロイドベータ関連の疾患または状態、または対象における認知記憶能力の喪失を特徴とする、またはそれに関連する状態に関連する症状を治療、予防、あるいはこれらに対抗または改善する防御免疫応答を誘発することにおいて使用するための本発明のワクチン組成物を提供する。
【００３７】
同様に、本発明は、アミロイドベータ関連の疾患または状態、または対象における認知記憶能力の喪失を特徴とする、またはそれに関連する状態に関連する症状を治療、予防、あるいはこれらに対抗または改善する防御免疫応答を誘発することにおいて使用するための医薬の製造における本発明のワクチン組成物の使用を提供する。
【００３８】
本明細書のすべての実施形態は、そのような方法または医療用途に適用されるが、表現されている。本発明のワクチン組成物を対象に投与すると、病理学的形態のＡβに結合する、典型的にはポリクローナルＩｇＧ抗体が産生される。すでに説明したように、それらの病理学的形態のＡβはβシート多量体を含む。したがって、産生される抗体は「Ａβ特異的」抗体と称されてもよい。
【００３９】
抗体が標的抗原に結合する能力は、主に親和性と結合力という２つのパラメーターによって制御される。抗体の親和性は、抗体とその抗原の間の一価の相互作用の強さを測定する。抗体のアビディティは、抗原と抗体の間の複数の相互作用点を介した結合の強化を含む。ワクチン接種によって誘発されるポリクローナル血清の結合能力は、上記のパラメーターの両方に依存する（Siegrist, 2013）。親和性とアビディティを独立して評価することは非常に難しいため、それは一般にポリクローナル応答のアビディティと呼ばれる。本明細書でさらに詳細に説明されるように、実施例４（セクション４．２）参照、本発明者らは、ポリクローナル抗体を含む血清の、より低いおよびより高い濃度の抗原への全体的な結合が並行して評価されるＥＬＩＳＡアッセイを開発した（Martineau, 2010）。低コーティングシグナル（low coating signal）と高コーティングシグナル（high coating signal）（シグナルは結合した抗体の濃度を表す）の比率は、アビディティインデックスとして表される。より高いインデックススコア（１に近い）は、より低いインデックススコア（０に近い）と比較して、全体的な結合強度が改善されていることを示す。時間の経過に伴うアビディティインデックスの増加は、ワクチン誘発抗体の全体的なアビディティ成熟の指標を提供する。ユニバーサルＴ細胞エピトープを含む封入ペプチドを含む本発明のワクチン組成物を使用する接種は、ＡＣＩ−２４（ユニバーサルＴ細胞エピトープを含む封入ペプチドなし）を使用する接種と比較して改善された成熟効果をもたらすことが本明細書に示される（実施例４および図４を参照）。
【００４０】
本発明のワクチン組成物は、任意の適切な投与経路によって対象に投与してもよい。当業者が知っているように、ワクチン組成物は、局所、経口、直腸、鼻または非経口(静脈内、皮内、皮下、または筋肉内など)経路によって投与されてもよい。さらに、ワクチン組成物は、生分解性ポリマーなどの徐放性マトリックスに組み込まれてもよく、ポリマーは、送達が望まれる場所の近くまたは近くに移植される。しかしながら、好ましい実施形態では、ワクチン組成物は筋肉内または皮下に投与される。
【００４１】
本発明のワクチン組成物は、防御免疫応答を惹起するために対象に単回投与できる。しかしながら、いくつかの実施形態では、本発明のワクチン組成物は、同じ対象に複数回投与される。したがって、いわゆるプライムブーストレジメンを本発明に従って使用できる。ワクチンの投与は、典型的には、少なくとも１週間、多くの場合約１〜１２か月の介入期間によって分けられる。特定の仮説に拘束されることを望まないが、ＡＣＩ−２４へのユニバーサルＴ細胞エピトープの付加は、同族のＴ細胞エピトープに特異的な活性化Ｔ細胞からの第２のシグナルを提供することによって抗Ａβ抗体応答を増強する可能性が高い。本発明のワクチン組成物は、ＡＤなどのアミロイドベータ関連疾患または状態の予防および治療のための強力な新しい治療オプションを表す。いくつかの実施形態において、同じワクチン組成物が毎回投与される−同種のワクチン接種レジメン。同種ワクチン接種とは、プライム（最初の接種）とブースト（２回目以降の接種）の両方に同じワクチンを使用する予防接種レジメンをいう。
【００４２】
一方、異種プライムブースト接種では、一次接種と少なくとも一部のフォローアップ接種で異なるワクチンを使用する必要がある。いくつかの実施形態において、本発明のワクチン組成物は、Ａβタンパク質の任意の部分に由来するペプチド抗原を担持する他の「抗Ａβ」ワクチンとの異種プライムブーストの組み合わせで同じ対象に複数回投与され、それはＡβ（１−１５）領域の外側から誘導されたペプチド抗原を含んでもよい。いくつかの実施形態において、本発明のワクチン組成物は、本発明のリポソームワクチン組成物に含まれるものと同じペプチド抗原を担持する他の「抗Ａβ」ワクチンとの異種プライムブーストの組み合わせで同じ対象に複数回投与され、それはＡβ（１−１５）ペプチド抗原を含んでもよい。いくつかの実施形態において、好ましくはＡβ（１〜１５）ペプチド抗原を含む本発明のワクチン組成物は、対応するＡβ由来ペプチド抗原、好ましくはＡβ（１−１５）ペプチド抗原を保有する他の「抗Ａβ」ワクチンとの異種プライムブーストの組み合わせで同じ対象に複数回投与される。Ａβ由来抗原を含む本発明のワクチン組成物と一緒に異種プライムブーストワクチン接種で投与できる「抗Ａβ」ワクチンの例は、Ａβ（１−１５）−ＰＡＤＲＥワクチン（Agadjanyan et al。、2005; Ghochikyan et al。、2006）、Ａβ（１−１５）−ジフテリアトキソイド（ＤＴ）またはＣＲＭワクチン（WO2010016912）、リジン結合Ａβ（１−１５）のタンデムリピート（Maier etal。 、2006）、樹枝状Ａβ（１−１５）ワクチン（Seabrook et al。、2006）、Ａβ（１−１５）ＤＴコンジュゲート（Liu etal。2013）、バクテリオファージＱβコーティングタンパク質に結合したＡβ（１−６）（Windblad etal。2012）、Ａβ（１−７）−ＣＲＭ（Arai etal。2015）、ＮｔｅｒｍＡβ−ＫＬＨ（Schneeberger et al 2010）を包含するが、これらに限定されない。
【００４３】
本発明はさらに、本発明によるワクチン組成物を含むキットを提供する。したがって、アミロイドベータ関連の疾患または状態、または対象における認知記憶能力の喪失を特徴とする、またはそれに関連する状態に関連する症状を治療、予防、あるいはこれらに対抗または改善する防御免疫応答を誘発するためのキットであって、本明細書に記載の本発明の（リポソーム）ワクチン組成物を含むキットを提供する。このようなキットには、適切な使用説明書が付属していてもよい。使用説明書は、組成物の投与スケジュールを説明するものであってもよい。したがって、キットは、本発明のワクチン組成物の複数の（別々の）用量を含んでいてもよい。使用説明書は、特にワクチン組成物の用量の投与間の期間中の、組成物の貯蔵条件をさらに説明するものであってもよい。これらのキットを、本明細書に開示される本発明のすべての関連する方法に適用してもよい。
【００４４】
本発明はさらに、本発明のリポソームワクチン組成物を製造するための方法を提供する。このような方法は、以下のステップを含み得る:
ａ．脂質膜を得る
ｂ．ユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドを含む緩衝液中で脂質膜を再水和させる
ｃ．ユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドを封入するリポソームを再水和脂質フィルムから得て、封入されたユニバーサルＴ細胞エピトープを含むリポソームを含む溶液を得る
ｄ．溶液にβ−アミロイド（Ａβ）由来ペプチド抗原を添加し、リポソームの脂質二重層へのβ−アミロイド（Ａβ）由来ペプチド抗原の挿入を生じさせる条件下に溶液を維持する。
【００４５】
かかる方法が本明細書で例示され、その詳細は、本発明のこれらの態様に適用されてもよい。一般的に言えば、該方法は、薄い脂質膜の形成とそれに続く均質化および押し出しを含んでいてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、脂質フィルムは、脂質をエタノールに溶解し、次に真空下でエタノールを蒸発させることによって生成される。好ましい脂質成分は、本発明のリポソームワクチン組成物に関連して説明され、ＤＭＰＣ、ＤＭＰＧ、コレステロールおよびＭＰＬＡ（アジュバントとして）を含む。これらの成分のモル比は９：１：７：０．０５であってもよい。このようなモル比は、本発明のリポソームワクチン組成物にも適用可能である。脂質成分は、上昇した温度にて可溶化する必要があるかもしれない。上昇した温度は、４０℃と８０℃の間、例えば約６０℃であってもよい。
【００４６】
ステップｂにおいて、再水和に使用される緩衝液は、ユニバーサルＴ細胞エピトープを含むどのペプチドが使用されるかに依存してもよい。一般に、任意の適切な緩衝液を使用してもよい。いくつかの実施形態において、緩衝液は、酢酸ナトリウムまたはＰＢＳを含む。ＳＡＴ４２を封入する場合、緩衝液は酢酸ナトリウムであってもよい。ＳＡＴ４３、ＳＡＴ４４、またはＳＡＴ４７のいずれか１つまたは複数を封入する場合、バッファーはＰＢＳであってもよい。すべての場合において、５％ＤＭＳＯなどのＤＭＳＯをバッファーに加えてもよい。再水和は、サンプルを攪拌しながら行ってもよい。
【００４７】
ステップｃにおいて、リポソームは、ビーズの存在下でボルテックスすることによって得てもよい。任意の適切なビーズを用いてもよい。ビーズは、例えばガラスビーズであってもよい。このステップは、多層ベシクルを得るものであってもよく、続いて該多層ベシクルは脂質二重層を含むリポソームに変換される。この変換は、数回、５〜１５回、好ましくは１０回の凍結融解サイクルに依存するものであってもよい。凍結融解サイクルの後に均質化を行ってもよい。これに続いて、サイズベースの押し出しを行ってもよい。いくつかの実施形態において、リポソームは、直径（または最大寸法）約０．０８〜０．１μｍの細孔を通して押し出される。ポリカーボネート膜などの膜を介してこれを行ってもよい。押し出されたリポソームは、例えば、限外濾過などの濾過の形態を使用して濃縮してもよい。
【００４８】
ステップｄは、リポソームの脂質二重層へのβ−アミロイド（Ａβ）由来ペプチド抗原の挿入を生じさせる。必要な条件は、２５〜３５℃、例えば約３０℃の温度で、１０〜６０分、例えば約３０分撹拌することを含んでいてもよい。好ましいβ−アミロイド（Ａβ）由来ペプチド抗原は、Ａβ１−１５を含むテトラパルミトイル化ペプチドである。このペプチドは、テトラパルミトイル化ペプチドを得るためにいずれかの末端に２個のリジン残基を含む。リポソーム溶液中に注入する前に、該ペプチドをリン酸水素二ナトリウムに前もって溶解してもよい。
【００４９】
該方法は、最終ステップとして、ワクチン組成物を濾過することをさらに含んでもよい。これを無菌状態で行ってもよい。ろ過は、孔径０．２μｍの膜を介して行ってもよい。適切な膜は、シリンジフィルターの形で提供され得るポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を包含する。次いで、得られたワクチン組成物を、適切な条件下で、例えば冷蔵下（例えば、約５℃で）で使用するまで保存してもよい。
【００５０】
本発明のリポソームワクチン組成物を製造するための代替方法は、本明細書に例示されるように、クロスフロー注入に依存し得る。したがって、本発明はさらに、クロスフロー注入によって本発明のリポソームワクチン組成物を製造するための方法を提供する。これらの方法は、ＳＡＴ４４またはＳＡＴ４７を封入する組成物に特に適用できる。このような方法は、以下のステップを含み得る：
ａ．リポソームを形成する脂質（および脂質ベースの場合はアジュバント）を溶液中に溶解させる
ｂ．ユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドを溶液に溶解させる
ｃ．クロスフロー注入モジュールを用いて、ステップａおよびｂで得られた溶液を混合して、ユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドを封入する中間体リポソームを得る
ｄ．膜を通して中間体リポソームを押し出して、それらのサイズと多分散性を低減する
ｅ．クロスフロー注入モジュールを使用して、β−アミロイド（Ａβ）由来ペプチド抗原を含む溶液をステップｄで得られた溶液と混合し、リポソームの脂質二重層へのβ−アミロイド（Ａβ）由来ペプチド抗原の挿入を生じさせる。
【００５１】
かかる方法が本明細書で例示され、その詳細は、本発明のこれらの態様に適用されてもよい。一般的に、この方法は、クロスフロー注入を使用して、ユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドを封入し、β−アミロイド（Ａβ）由来のペプチド抗原をリポソームの脂質二重層に挿入するものである。
【００５２】
ステップａにおいて、脂質（本明細書に記載されるようなＭＰＬＡアジュバントなどのアジュバントを含んでもよい）を、典型的にはエタノールに溶解する。エタノールは、９０〜１００％エタノール、例えば９６％エタノールであってもよい。例えば４０℃と８０℃の間の温度、例えば約６０℃で加熱することにより溶解を促進してもよい。好ましい脂質成分は、本発明のリポソームワクチン組成物に関連して説明され、ＤＭＰＣ、ＤＭＰＧ、コレステロールおよびＭＰＬＡ（アジュバントとして）を含む。これらの成分のモル比は９：１：７：０．０５であってもよい。このようなモル比は、本発明のリポソームワクチン組成物にも適用可能である。
【００５３】
ステップｂにおいて、ユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドを溶解させる。いくつかの実施形態では、超音波処理などの攪拌の助けを借りて、適切な緩衝液（Ｈｉｓ−スクロース緩衝液など）にペプチドを溶解させてもよい。
【００５４】
ステップｃにおいて、ステップａおよびｂで得られた溶液を、クロスフロー注入モジュールを使用して混合し、ユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドを封入する中間体リポソームを得る。このステップの前に、ステップａおよびｂで得られた溶液を濾過してもよい。フィルターの適切な孔径は約０．２μｍである。溶液を任意の適切な濃度で使用してもよい。濾過後、溶液を、３０℃と６０℃の間の温度、例えば４０℃に加熱してもよい。リポソームは、クロスフローモジュール（２つの溶液が出会うところ）を介して２つの溶液（ステップａおよびｂで得られた）を注入することによってリポソームを形成する。これは、当業者によって容易に理解されるように、一般に特定の流量および温度で実行される（適切な温度は上記に記載されている）。いくつかの実施形態では、リポソーム形成に続いて、典型的には、エタノール濃度を低下させるために緩衝液を添加してもよい。
【００５５】
ステップｄにおいて、膜を通して中間体リポソームを押し出して、それらのサイズおよび多分散性を低減する。溶液中で形成されたリポソームは、ユニバーサルＴ細胞エピトープを含むペプチドを封入する。任意の適切な膜を使用できる。適切な細孔径は約１００ｎｍであってもよい。適切な膜タイプはポリカーボネート膜である。このステップは、任意の適切な温度で、好ましくは室温（例えば、約２５℃）にて行ってもよい。このステップに続いて、限外／ダイアフィルトレーションなどの濾過ステップを実行してエタノールを除去してもよい。カットオフ分子量約５００ｋＤの中空繊維膜などの任意の適切な膜をこのステップに使用してもよい。緩衝液交換ステップを行って、分散緩衝液としてもよい。好ましい分散緩衝液はＰＢＳである。ＰＢＳは適切なｐＨであってよく、例えば６から８の間、特に約６．９であってもよい。これには、５〜１５倍、例えば約１０倍の体積の交換が必要とされてもよい。ステップｅの前に、リポソームを分散緩衝液で所望の濃度に希釈してもよい。所望の濃度は０．１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲、例えば約１ｍｇ／ｍｌであってもよい。ステップｅの前に、リポソーム含有溶液を加熱して、適切な温度、例えば３０℃と６０℃の間、好ましくは約３５℃としてもよい。
【００５６】
ステップｅは、クロスフロー注入モジュールを使用して、β−アミロイド（Ａβ）由来ペプチド抗原を含む溶液をステップｄで得られた溶液と混合することを含む。本明細書で論じられるように、β−アミロイド（Ａβ）由来ペプチド抗原は、好ましくは脂質化（例えば、テトラパルミトイル化）され、この議論は、必要な変更を加えて適用される。混合する前に、典型的には、β−アミロイド（Ａβ）由来ペプチド抗原を、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４ ｐＨ１１．４緩衝液中のＢｅｔａ−ＯＧの１０％ ｗ／ｖ溶液のごとき適切な緩衝液に溶解する。典型的には、溶液を適切な温度、例えば３０℃と８０℃の間、例えば約６０℃に加熱する。β−アミロイド（Ａβ）由来ペプチド抗原の適切な濃度を確保するために、必要に応じて溶液をさらに希釈してもよい。適切な濃度は０．１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲、例えば約１ｍｇ／ｍｌであってもよい。典型的には、ｐＨは１１〜１２の範囲、例えば約１１、好ましくは１１．４に保たれる。クロスフロー注入モジュールを使用して、β−アミロイド（Ａβ）由来ペプチド抗原を含む溶液をステップｄで得られた溶液と混合することにより、リポソームの外側脂質二重層にβ−アミロイド（Ａβ）由来ペプチド抗原が挿入される。リポソームの脂質二重層へのβ−アミロイド（Ａβ）由来ペプチド抗原の挿入を容易にするために、混合物を適切な温度で一定時間インキュベートしてもよい。適切な時間は２０〜１２０分の範囲、例えば約３０分であってもよい。適切な温度は３０℃と６０℃の間、例えば約３０分であってもよい。攪拌（stirring）などの攪拌（agitation）をしながらインキュベーションを行ってもよい。
【００５７】
ステップｅに続いて、生成物を回収して、本発明の組成物に含めることができる。したがって、生成物を本発明のリポソームワクチン組成物中に処方してもよい。これには緩衝液からＢｅｔａ−ＯＧを除去するための限外／ダイアフィルトレーションステップが含まれてもよい。カットオフ分子量約５００ｋＤの中空繊維膜など、任意の適切な膜をこのステップに使用してもよい。限外／ダイアフィルトレーションは、最終バッファーへのバッファー交換ステップを含んでもよい。好ましい最終緩衝液はＨｉｓ−スクロース緩衝液であり、これは１０ｍＭのヒスチジン、２５０ｍＭのスクロースであってもよい。これには、５〜１５倍、例えば約１０倍体積の交換が必要とされてもよい。好ましい最終体積を達成するために、濃縮ステップを行ってもよい。最終（滅菌）濾過工程を行ってもよい。これにカートリッジフィルターを使用してもよい。約０．２μｍなどの任意の適切な孔径を有するフィルターを通して濾過工程を行ってもよい。ろ過を無菌状態で行ってもよい。次いで、得られたワクチン組成物を、使用するまで冷蔵（例えば約５℃で）のごとき適切な条件下で保存してもよい。
【００５８】
【表１】
2021521149.tif 000002
【００５９】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してさらに理解されるであろう。
【実施例１】
【００６０】
実施例１．新規なＴ細胞エピトープの設計
Ｔ細胞を活性化するＴ細胞エピトープの能力（免疫原性スコア）は、２つの補完的な特性の結果である：ｉ）ＨＬＡへの親和性およびｉｉ）異なるＨＬＡハプロタイプに無差別に結合する能力。免疫原性スコアが最も高いペプチドを選択する目的で、異なる起源のいくつかのＴ細胞エピトープのインシリコ評価（Epivax）を実施した。予備段階では、異なる起源（キーホールリンペットヘモシアニン−ＫＬＨ、ジフテリア毒素、インフルエンザウイルス、エプスタインバーウイルスおよびヘルペスウイルス）に由来する１０種の異なるペプチドを評価した。予測されるＨＬＡ親和性とＨＬＡハプロタイプカバレッジ（haplotype coverage）に基づいて、ヒトで免疫原性が高い可能性があるため、最高の免疫原性スコア（１０を超える）を持つペプチドを選択した（選択したペプチド配列を表１に示す）。
【表２】
2021521149.tif 000003
【００６１】
個々のペプチドのスクリーニング結果に続いて、異なる起源からの２つまたは３つの免疫原性Ｔ細胞エピトープ（ＳＡＴ４２、ＳＡＴ４３、およびＳＡＴ４４と命名）で構成される無差別ペプチドと、トリミングされたペプチド（ＳＡＴ４７およびＳＡＴ４３など）で構成される無差別ペプチドを組み合わせて設計した（表２）。インシリコで予測されたＴ細胞エピトープのホットスポットに基づいて、個々のＴ細胞エピトープの配列で最も免疫原性の高い１５−ｍｅｒペプチド配列を選択することによって、トリミングされたペプチドを設計した。目標は、ペプチド合成とワクチン封入プロセスの制約により、最終的な無差別ペプチドのサイズを増やすことなく免疫原性スコアを上げることであった。簡単に説明すると、ペプチド合成の収率および成功率は、ペプチドの長さ、特に長さが３０アミノ酸を超えると低下し、さらに、本明細書に開示されるＴ細胞エピトープペプチドと同様に、それらは主に疎水性残基から構成される。さらに、ペプチドの封入率は、ペプチドの長さが増加するにつれて低下する。これは、ペプチドの長さが増加するにつれて、リポソームの内腔にペプチドを収容する機会が減少するためである。これら４つの無差別Ｔ細胞エピトープのインシリコ免疫原性スコアは非常に高く、重要なことに、個々の成分ペプチドのスコアよりも高かったため、異なる起源のペプチドを組み合わせると、ＨＬＡ親和性とＨＬＡハプロタイプカバレッジを改善できることを確認した（無差別なＴ細胞エピトープ配列を表２に示す）。
【表３】
2021521149.tif 000004
【実施例２】
【００６２】
実施例２．ワクチンの合成および処方
ユニバーサルＴ細胞エピトープペプチドの合成と精製の一般的方法
Ｔ細胞ペプチドを、標準的なＦｍｏｃ化学を使用して、２−クロロトリチル樹脂上の線形固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって製造した。標準的なカップリング手順は、３．０当量のアミノ酸とカップリング試薬を使用して、ＤＭＦ中の３．０当量の塩基の存在下、室温で１時間行った。困難なカップリングシーケンスでは、反応時間を延長してダブルカップリングを実装した。アミノ酸カップリングの完了後、ピリジン中の５．０当量のＡｃ２Ｏを使用してアセチル化キャッピングステップを導入し、望ましくないペプチド鎖の伸長を中止した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを５分間使用してＦｍｏｃ基を除去した。ＳＰＰＳを終了した後、樹脂からの全体的な脱保護とペプチド切断を、標準的な切断カクテル（ＴＦＡ／ＴＩＳ  ／水）を使用して室温で２時間行った。樹脂を濾別し、ＴＦＡで洗浄した。続いて、粗生成物を１０倍過剰量の冷イソプロピルエーテル／ヘキサンで沈殿させ、ガラスフリットを使用して固体を濾別し、真空下で乾燥させた。粗ペプチドは、分取用ＨＰＬＣシステムで溶媒Ａ（水、０．１％ＴＦＡ）と溶媒Ｂ（アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ）のグラジエントを使用して、逆相Ｃ１８カラムで精製した。純度が９０％を超える目的のペプチドを含むＨＰＬＣフラクションを一緒にプールし、水で希釈してイオン交換を行った。所望のイオン交換画分を凍結乾燥した。最終ペプチドの同一性と純度を、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって特徴づけ、確認した。
【００６３】
ＡＣＩ−２４．０４３／ＡＣＩ−２４．０４４／ＡＣＩ−２４．０４５／ＡＣＩ−２４．０４６／ワクチンの調製（薄い脂質フィルム）
封入されたＴ細胞エピトープペプチドを含むワクチンを、薄膜法とそれに続く均質化および押し出しによって製造した。まず、それぞれ９：１：７：０．０５のモル比のＤＭＰＣ、ＤＭＰＧ（Lipoid、ドイツ）、コレステロールおよびモノホスホリルヘキサアシルリピドＡ、３−デアシル合成のまたは３Ｄ−（６−アシル）ＰＨＡＤTMを６０℃にてエタノール中に可溶化させた（Avanti Polar Lipids、USA）。薄い脂質膜を得るために、エタノールを真空ロータベーパー下で蒸発させた。
脂質フィルムは、これらのバッファーの１つで再水和された（封入されるＴ細胞エピトープペプチドによって異なる）。
・  ２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４（Fluka）、０．８ｍｇ／ｍＬ  Ｔ細胞エピトープペプチドＳＡＴ４２を含むＭｉｌｌｉＱ水中の５％ＤＭＳＯ（Sigma Aldrich）、または
・  ０．１ｘＰＢＳ  ｐＨ７．４、０．３〜０．４ｍｇ／ｍＬ  Ｔ細胞エピトープペプチドＳＡＴ４３、ＳＡＴ４４、またはＳＡＴ４７を含むＭｉｌｌｉＱ水中の５％ＤＭＳＯ（すべてSigma-Aldrich）。
溶液を１５分間穏やかに攪拌した。ガラスビーズの存在下でサンプルをさらに激しくボルテックスした。得られた多層ベシクルを１０回の凍結融解サイクル（液体窒素と３７℃の水浴）にかけ、均質化した後、孔径０．１／０．０８μｍのポリカーボネートメンブレン（Whatman、UK）に順次押し出した。均質化と押し出しの両方のステップを、ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ−Ｃ５（Avestin、カナダ）を使用して実行した。押し出されたリポソームを限外濾過によって濃縮し、緩衝液をダイアフィルトレーション（１０回交換）によってＰＢＳ  ｐＨ７．４に交換した。得られたリポソームをＰＢＳ  ｐＨ７．４で希釈し、３０℃に加熱してからＰａｌ１−１５を添加した。
テトラパルミトイル化ヒトペプチドＰａｌ１−１５（Bachem AG、スイス）を１％β−ＯＧ（Sigma-Aldrich、USA）を含むＭｉｌｌｉＱ水に溶解した１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ  １１．４に溶解し、３０℃のリポソーム溶液に注入し、３０分撹拌し、その後、限外濾過による濃縮ステップと、ダイアフィルトレーションによるＰＢＳ  ｐＨ７．４での希釈を行った。次に、得られたリポソームを、０．２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）メンブレンシリンジフィルターに通して滅菌ろ過し、５℃で保存した。
【００６４】
ＡＣＩ−２４．０４３ワクチンの調製（クロスフロー注入）
脂質（ＤＭＰＧ、ＤＭＰＣ、コレステロール、３Ｄ−（６−アシル）ＰＨＡＤTM（Avanti Polar Lipids、USA））を６０℃の加熱キャビネット内で９６％ＥｔＯＨに溶解した。脂質が完全に溶解した後、溶液を孔径０．２μｍのフィルターでろ過し、６０℃に加熱した注入システムに入れた。詳細には、適切な量のＡＣＩ−２４．０４３（ＳＡＴ４７）を、超音波処理を利用して室温でＥｔＯＨに分散させた（ＥｔＯＨ濃度は、典型的には、最終ＳＡＴ４７溶液の２％ ｖ／ｖである）。ペプチドを完全に分散させた後、Ｈｉｓ−スクロースバッファー（１０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭスクロース）を添加して、質量で１／５０の脂質に対する薬剤比を達成した。ＳＡＴ４７溶液を０．２μｍポアサイズフィルター（Ｓａｒｔｏｓｃａｌｅフィルター）でろ過してインジェクションバッファーボトルに入れ、４０℃に加熱した。リポソームは、脂質／エタノール溶液とインジェクションバッファーが混ざると、インジェクション部位で形成される。リポソーム形成の直後に、ＥｔＯＨ濃度を下げるために１０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭスクロースによるオンライン希釈ステップを行った。中間体リポソームを、室温で孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜（１パス）を通して押し出した。中空糸膜（ＭＷＣＯ：５００ｋＤ）を使用した限外／ダイアフィルトレーション（ＵＤＦ）を実行してＥｔＯＨを除去し、バッファーをＰＢＳ  ｐＨ６．９に交換した（１０倍の容量交換）。次に、分散バッファー（ＰＢＳ  ｐＨ６．９）を使用してＳＡＴ４７リポソームを総脂質濃度１ｍｇ／ｍＬに希釈し、３５℃まで温めた。Ｐａｌ１−１５を１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ１１．４バッファー中のベータＯＧの１０％ ｗ／ｖ溶液に６０℃で溶解し、同じバッファーでさらに希釈して最終濃度を１ｍｇ／ｍＬにした。ｐＨを１１．４に調整した。クロスフロー注入モジュールを使用してこれら２つの溶液を混合した後、リポソーム懸濁液をさらに３５℃で３０分間撹拌しながらインキュベートし、Ｐａｌ１−１５を完全に挿入した。中空糸膜（ＭＷＣＯ：５００ｋＤ）を使用した２番目のＵＤＦステップを実行して、ベータＯＧを除去し、バッファーを１０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭスクロースに交換した（１０倍の容量交換）。生成物を最終容量に濃縮し、０．２μｍのＡｃｒｏｄｉｓｃ  ｍＰＥＳシリンジフィルターでろ過した。
【００６５】
ＡＣＩ−２４．０４６ワクチンの調製（クロスフロー注入）
脂質（ＤＭＰＧ、ＤＭＰＣ、コレステロール、３Ｄ−（６−アシル）ＰＨＡＤTM（Avanti Polar Lipids、USA))を６０℃の加熱キャビネット内で９６％ＥｔＯＨに溶解した。脂質が完全に溶解した後、溶液を孔径０．２μｍのフィルターでろ過し、６０℃に加熱した注入システムに入れた。並行して、ＡＣＩ−２４．０４６（ＳＡＴ４４）をインジェクションバッファー（１０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭスクロース）に４０℃で溶解した。ＳＡＴ４４が完全に溶解した後、溶液を孔径０．２μｍのフィルター（Ｓａｒｔｏｓｃａｌｅ）でろ過し、４０℃に加熱したインジェクションバッファーボトルに入れた。リポソームは、脂質／エタノール溶液と注射バッファーが混ざると、インジェクション部位で形成される。リポソーム形成の直後に、ＥｔＯＨ濃度を下げるために１０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭスクロースによるオンライン希釈ステップを行った。中間体リポソームを、室温で１００ｎｍの孔径のポリカーボネート膜（１パス）を通して押し出した。中空糸膜（ＭＷＣＯ：５００ｋＤ）を使用した限外／ダイアフィルトレーション（ＵＤＦ）を実行してＥｔＯＨを除去し、バッファーをＰＢＳ  ｐＨ６．９に交換した（１０倍の容量交換）。次に、分散バッファー（ＰＢＳ  ｐＨ６．９）を使用してＳＡＴ４４リポソームを総脂質濃度１ｍｇ／ｍＬに希釈し、３５℃まで温めた。Ｐａｌ１−１５を１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ１１．４バッファー中のベータＯＧの１０％ｗ／ｖ溶液に６０℃で溶解し、同じバッファーでさらに希釈して最終濃度を１ｍｇ／ｍＬにした。ｐＨをチェックし、注意深く１１．４に戻した。注射モジュールを使用してこれらの２つの溶液を混合した後、リポソーム懸濁液をさらに撹拌しながら３５℃で３０分間インキュベートして、Ｐａｌ１−１５の挿入を完全にした。中空糸膜（ＭＷＣＯ：５００ｋＤ）を使用した２番目のＵＤＦステップを実行して、ベータＯＧを除去し、バッファーを１０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭスクロースに交換した（１０倍の容量交換）。生成物を最終容量で濃縮し、最後に０．２μｍのＡｃｒｏｄｉｓｃｍＰＥＳシリンジフィルターでろ過した。
【実施例３】
【００６６】
実施例３．概念実証（ＰｏＣ）  封入されたＴ細胞エピトープを有するワクチンのインビボ免疫原性の研究
異なるＴ細胞エピトープの封入が成功した後、ＡＣＩ−２４ワクチンと比較して高い免疫原性スコアＳＡＴ４２、ＳＡＴ４４およびＳＡＴ４７を有する封入されたＴ細胞エピトープを含むワクチン（それぞれＡＣＩ−２４．０４４、ＡＣＩ−２４．０４６およびＡＣＩ−２４．０４３ワクチン）の免疫原性を、インビボで試験した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＡＣＩ−２４、ＡＣＩ−２４．０４４（封入されたＳＡＴ４２を使用）、ＡＣＩ−２４．０４６（封入されたＳＡＴ４４を使用）、およびＡＣＩ−２４．０４３（封入されたＳＡＴ４７を使用）を、０、１４、および２８日目に、合計３回の皮下（ｓｃ）接種を行った。−２１日目（ＡＣＩ−２４．０４６）または−７日目（ＡＣＩ−２４、ＡＣＩ−２４．０４３、ＡＣＩ−２４．０４４）（プレブリード（prebleed））、７、２１、３５日目に血液サンプルを採取し、Ａβ１−４２特異的ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡにより測定した。
【００６７】
プレートを１０μｇ／ｍｌのヒトＡβ１−４２ペプチドフィルム（Bachem、スイス）で４℃にて一晩コーティングした。０．０５％ツイン２０／ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ／０．０５％ツイン／ＰＢＳでブロッキングした後、血漿の系列希釈液をプレートに加え、３７℃で２時間インキュベートした。洗浄後、プレートをアルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合抗マウスＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch、PA、USA）とともに３７℃で２時間インキュベートした。最終洗浄後、プレートをＡＰ基質（ｐＮＰＰ）とともに２．５時間インキュベートし、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して４０５ｎｍで読み取った。結果を、市販の抗体（６Ｅ１０、Biolegend、UK、カタログ番号８０３００２）の系列希釈物を参照して示す。図１Ａは、封入されたＴ細胞エピトープの有無にかかわらず、ＡＣＩ−２４ワクチンによって誘導されたＡβ１−４２特異的ＩｇＧ力価を経時的に示している。ＡＣＩ−２４ワクチンは７日目に最高のＡβ１−４２特異的ＩｇＧ力価を示したが、Ｔ細胞エピトープがＡＣＩ−２４ワクチンに封入された場合に、１回目の接種後、２回目と３回目の接種後に抗体価の増加が観察された。図１ｂの結果は、封入されたＴ細胞エピトープを含むＡＣＩ−２４ワクチンの接種が、ＡＣＩ−２４と比較して、Ａβ特異的抗体力価の増加を誘導し、ＡＣＩ−２４．０４３（封入されたＳＡＴ４７を伴う）を接種された群に関して統計学的に有意なものとなったことを示している。
【００６８】
封入されたＳＡＴ４２、ＳＡＴ４３、ＳＡＴ４４、またはＳＡＴ４７のワクチンを、カニクイザルの研究で試験した。ＡＣＩ−２４．０４４（封入されたＳＡＴ４２−２グループで合計８匹のサル）、ＡＣＩ−２４．０４６ワクチン（封入されたＳＡＴ４４−２グループで合計８匹のサル）の接種（１日目、２９日目および５７日目）、ＡＣＩ−２４．０４５ワクチン（封入されたＳＡＴ４３−４匹のサル）またはＡＣＩ−２４．０４３ワクチン（封入されたＳＡＴ４７−４匹のサル）にて、グループごとに４匹のサルに３か月のｓｃ接種を行った。最初の接種の前（１日目）と各接種の１週間後と３週間後（８、２２、３６、５０、６４、７８日目）に採血し、ＥＬＩＳＡによってＡβ１−４２特異的ＩｇＧ力価を測定した。
【００６９】
プレートを１０μｇ／ｍｌのヒトＡβ１−４２ペプチドフィルム（Bachem、スイス）にて４℃で一晩コーティングした。０．０５％ツイン２０／ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ／０．０５％ツイン２０／ＰＢＳでブロッキングした後、血清の２倍系列希釈液（８系）をプレートに加え、３７℃で２時間インキュベートした。洗浄後、プレートを西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗サルＩｇＧ抗体（ＫＰＬ、カタログ番号０７４  １１０２１）とともに３７℃で２時間インキュベートした。洗浄後、プレートを５０μｌのＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＨＲＰ基質）とともにインキュベートし、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して１時間後に４０５ｎｍで読み取った。結果を、標準として使用される陽性サルプールの段階希釈を参照して表す。
【００７０】
異なるＴ細胞エピトープを持つワクチンの免疫原性をＡＣＩ−２４ワクチンと比較した。表３は、３回目の接種から１週間後のＡＣＩ−２４ワクチンと比較したＡβ特異的抗体力価の倍数の増加を示している。試験したすべてのワクチン、ＡＣＩ−２４．０４６（ＳＡＴ４４）、ＡＣＩ−２４．０４３（ＳＡＴ４７）、ＡＣＩ−２４．０４５（ＳＡＴ４３）、およびＡＣＩ−２４．０４４（ＳＡＴ４２）は、ＡＣＩ−２４ワクチンによって誘発された力価と比較して少なくとも７倍の抗体力価の増加を誘導した（封入されたＳＡＴ４２を伴うＡＣＩ−２４．０４４）。ＡＣＩ−２４．０４３ワクチン（封入されたＳＡＴ４７を伴う）およびＡＣＩ−２４．０４６（封入されたＳＡＴ４４を伴う）は、３回目の接種の１週間後にＡＣＩ−２４と比較して有意に高いＡβ特異的抗体価を誘導した（表３）。ＡＣＩ−２４．０４３ワクチン（封入されたＳＡＴ４７を伴う）およびＡＣＩ−２４．０４６（封入されたＳＡＴ４４を伴う）は、それぞれ高いＥｐｉｖａｘスコア（それぞれ１４２．８９および５７．２）を有する。
【表４】
2021521149.tif 000005
【００７１】
薄い脂質フィルム法によって得られたＡＣＩ−２４．０４６（封入されたＳＡＴ４４）およびＡＣＩ−２４．０４３（封入されたＳＡＴ４７）に関するインビボでの結果（図１）が得られた後、クロスフロー注入法によって得られた同じワクチンのインビボでの免疫原性を試験した。ＡＣＩ−２４、ＡＣＩ−２４．０４６（封入されたＳＡＴ４４を伴う）またはＡＣＩ−２４．０４３（封入されたＳＡＴ４７を伴う）にて、０、１４、および２８日目に、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに合計３回の皮下（ｓｃ）接種を行った。血液サンプルを−７、７、２１、および３５日目に収集して、ＥＬＩＳＡによってＡβ１−４２特異的ＩｇＧ力価を測定した。図６の結果は、封入されたＴ細胞エピトープを含むＡＣＩ−２４ワクチンの接種が、ＡＣＩ−２４と比較してＡβ特異的抗体価の有意な増加を誘導したことを示す。
【実施例４】
【００７２】
実施例４．誘導されたＡβ特異的抗体の品質
４．１  ヒトＡβ１−４２自己会合のインビトロでの阻害
誘導されたＡβ特異的抗体の品質を、Ａβ１−４２の自己会合／凝集の阻害を測定することによってインビトロでテストした。このアッセイは、マウスの接種前および接種後の血漿が、ヒトＡβ１−４２の自然な自己会合素因を損なう能力に基づく。
【００７３】
標準的なＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍＬのＡβ１−４２にて４℃で一晩コーティングした。プレートを３００μＬの０．０５％ツイン２０／ＰＢＳで４回洗浄した。０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳを添加し、３７℃で１時間インキュベートすることにより飽和を達成した。洗浄後、４系の血漿２倍系列希釈液を、室温で２０分間撹拌しながらプレートに加えた。ビオチン化Ａβ１−４２を各ウェルに最終濃度０．１μｇ／ｍＬになるように添加し、撹拌しながら室温で２時間インキュベートした。血漿を含まないビオチン化Ａβ１−４２をＡβ１−４２自己会合の陽性対照として使用した（自己会合１００％、阻害０％と見なされる）。洗浄ステップの後、プレートをストレプトアビジン（R&DSystems, Canada, Ref.890803）に結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とともにインキュベートした。洗浄後、プレートをSure Blue Reserve TMB基質（Seracare, カタログ番号5120-0081）とともに１０分間インキュベートした。反応を、ベチル停止溶液（Bethyl Laboratories, Inc., カタログ番号E115）を用いて停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用してプレートを４５０ｎｍで読み取った。自己会合の阻害率を、血漿を含まないビオチン化Ａβ１−４２を陽性対照として参照として使用して計算した（０％阻害）。
【００７４】
結果は、Ｔ細胞エピトープを含むすべてのワクチンで２回接種した後に生成されたＡβ特異的抗体が、ＡＣＩ−２４によって誘導された抗体よりも効率的にＡβ１−４２の自己会合を損なうことを示した（図２Ａ）。出血前（pre-bleeding）の血漿は自己会合のバックグラウンド阻害を誘発するので、２１日目のパーセンテージを出血前の血漿のバックグラウンドを差し引くことによって正規化した。Ｔ細胞エピトープを含むすべてのＡＣＩ−２４ワクチンの接種によって生成されたＡβ１−４２特異的抗体は、ＡＣＩ−２４と比較して、Ａβ１−４２自己会合に対してより高い阻害を示した。この阻害は、ＡＣＩ−２４．０４６（カプセル化されたＳＡＴ４４を伴う）を接種されたグループで統計学的に有意となった（図２Ｂ）。
【００７５】
４．２Ａβオリゴマーを認識する抗体の生成
病理学的Ａβに結合するＣ５７ＢＬ／６マウスで誘導された抗体の特異性を評価するために、Ａβ１−４２−オリゴマー特異的ＩｇＧ応答をＥＬＩＳＡによって調べた。プレートを、前述のように４℃で一晩調製した１０μｇ／ｍｌのオリゴマーにてコーティングした（Adolfsson、2012）。０．０５％ツイン２０／ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ／０．０５％ツイン２０／ＰＢＳでブロッキングした後、血漿の系列希釈液をプレートに加え、３７℃で２時間インキュベートした。洗浄後、プレートをアルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合抗マウスＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch, カタログ番号115-055-164, PA, USA）とともに３７℃で２時間インキュベートした。最終洗浄後、プレートをＡＰ基質（ｐＮＰＰ）とともに２．５時間インキュベートし、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して４０５ｎｍで読み取った。結果を、市販の抗体（6E10, Biolegend, UK, カタログ番号803002）の系列希釈を参照して表す。
【００７６】
各サンプルを、Ａβ１−４２抗体価に基づいて、１／１００、１／４００、１／８００、または１／１６００希釈で開始する８つまたは４つの２倍系列希釈でテストした。図３の結果は、Ｔ細胞エピトープを含むすべてのＡＣＩ−２４ワクチンの接種が、ＡＣＩ−２４と比較して、Ａβ１−４２オリゴマー特異的抗体力価の増加を誘発し、ＡＣＩ−２４．０４３ワクチン（カプセル化されたＳＡＴ４７を伴う）を接種されたグループについて統計学的有意性に達したことを示す。接種の７日後および２１日後のＣ５７ＢＬ／６マウスで誘導された抗体のアビディティインデックス（avidity index）をＥＬＩＳＡアッセイによって調べた。標準ＥＬＩＳＡプレートの半分を１０μｇ／ｍＬのＡβ１−４２ペプチドフィルムにてコーティングし、残りの半分を１μｇ／ｍＬのＡβ１−４２ペプチドフィルムにて４℃で一晩コーティングした。０．０５％ツイン２０／ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ／０．０５％ツイン２０／ＰＢＳでブロッキングした後、８系の血漿２倍系列希釈液を両方のコーティング条件に加え、３７℃で２時間インキュベートした。洗浄ステップの後、プレートをアルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch, カタログ番号115-055-164, PA, USA）とともに３７℃で２時間インキュベートした。最終洗浄後、プレートをＡＰ基質（ｐＮＰＰ）とともに２．５時間インキュベートし、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して４０５ｎｍで読み取った。結果を、市販の抗体（6E10, Biolegend, UK, カタログ番号803002）の系列希釈を参照して示す。
【００７７】
アビディティインデックスを決定するために、１０μｇ／ｍＬのＡβ１−４２ペプチドで得られた標準曲線を使用して、両方のコーティングの各サンプルについてＡＵ／ｍＬを計算した。濃度の逆算には、０．６〜２．８のＯ．Ｄ．値を使用した。アビディティインデックスを、低いコーティング濃度（１μｇ／ｍＬのＡβ１−４２ペプチド）と飽和コーティング（１０μｇ／ｍＬのＡβ１−４２ペプチド）の抗体濃度の比率として計算する。
【００７８】
図４の結果は、Ｔ細胞エピトープを含むすべてのＡＣＩ−２４ワクチンの接種が、１回目と２回目の接種（それぞれ７日目と２１日目）の間にＡβ１−４２特異的抗体アビディティ成熟を誘導したことを示しており、それらはＡＣＩ−２４．０４４（カプセル化されたＳＡＴ４２を使用）およびＡＣＩ−２４．０４３（カプセル化されたＳＡＴ４７を使用）を接種されたグループにおいて統計学的有意性を達成した。
【００７９】
カニクイザルで誘導された抗体の病理学的Ａβに結合する特異性を評価するために、ＡＣＩ−２４．０４６（封入されたＳＡＴ４４を含む−２グループで合計８匹のサル）、ＡＣＩ−２４．０４５ワクチン（封入されたＳＡＴ４３−４匹のサル）またはＡＣＩ−２４．０４３ワクチン（封入されたＳＡＴ４７−４匹のサル）を接種されたカニクイザルの血清中の６４日目（３回目の接種の１週間後）のＡβ１−４２オリゴマー特異的ＩｇＧ力価をメソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）法により測定した。ＭＳＤストレプトアビジンプレートを４℃で５％のブロッカーＡ（ＭＳＤ、Ｒｅｆ。Ｒ９３ＢＡ−４）で一晩飽和させた。翌日、プレートを０．０５％ツイン２０／ＰＢＳで４回洗浄し、シェーカー上で３７℃で１時間、０．５μｇ／ｍｌのＰＢＳ中の２５μｌの捕捉抗体ビオチン化６Ｅ１０（Biolegend, Ref. 803008）でコーティングした。洗浄後、プレートを２５μｌのＡβ１−４２オリゴマー（Adolfsson、2012）とともにＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌで、シェーカー上で３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、サル血清の８つの２倍希釈液（１％スキムミルク／０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで１／５０に希釈を開始）とともにインキュベートした。サンプルをシェーカー上で３７℃で２時間インキュベートした。プレートを４回洗浄し、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（Jackson, Ref. 109-005-098）で標識した抗ヒトＩｇＧ検出抗体を添加し、１％スキムミルク／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３７℃で１時間希釈した。シェーカーで。４回洗浄した後、ＭＳＤ読み取りバッファーＴ  ２Ｘ（ＭＳＤ、Ｒｅｆ。Ｒ９２ＴＣ−２）を追加し、５分以内にプレートを読み取った。結果を、標準として使用されるサルプールの系列希釈を参照して表す。
【００８０】
結果は、試験したすべてのワクチンＡＣＩ−２４．０４６（カプセル化ＳＡＴ４４）、ＡＣＩ−２４．０４３（カプセル化ＳＡＴ４７）、およびＡＣＩ−２４．０４５（カプセル化ＳＡＴ４３）が、１日目と比較（最初の接種前）と比較して、６４日目（３回目の接種から１週間後）にＡβオリゴマーを認識できる抗体の増加を誘導したことを示した。図５参照。
【００８１】
文献
Adolfsson O., Pihlgren M., Toni N., Varisco Y., Buccarello A.L., Antoniello K., Lohmann S., Piorkowska K., Gafner V., Atwal J.K., Maloney J., Chen M., Gogineni A., Weimer R.M., Mortensen D.L., Friesenhahn M., Ho C., Paul R., Pfeifer A., Muhs A., Watts R.J., An effector-reduced anti-β-amyloid (Aβ) antibody with unique aβ binding properties promotes neuroprotection and glial engulfment of Aβ. J Neurosci. Jul 11;32(28):9677-89 (2012).
Agadjanyan M.G., Ghochikyan A., Petrushina I, Vasilevko V., Movsesyan N., Mkrtichyan M., Saing T. and Cribbs D.H., Prototype Alzheimer’s Disease Vaccine Using the Immunodominant B Cell Epitope from β-Amyloid and Promiscuous T Cell Epitope Pan HLA DR-Binding Peptide. J Immunol 174 (3) 1580-1586 (2005).
Arai H, Suzuki H, Yoshiyama T. Vanutide cridificar and the QS-21 adjuvant in Japanese subjects with mild to moderate Alzheimer's disease: results from two phase 2 studies. Curr Alzheimer Res. 12(3):242-54 (2015).
Ghochikyan A., Mkrtichyan M., Petrushina I., Movsesyan N., Karapetyan A., Cribbs D.H., Agadjanyan M.G., Prototype Alzheimer's disease epitope vaccine induced strong Th2-type anti-Abeta antibody response with Alum to Quil A adjuvant switch. Vaccine. 20;24(13):2275-82 (2006).
Gilman S., Koller M., Black R.S., Jenkins L., Griffith S.G., Fox N.C., Eisner L., Kirby L., Boada Rovira M., Forette F., Orgogozo J.M., Clinical effect of Aβ immunization (AN1792) in patients with AD in an interrupted trial. Neurology 64, 1553-1562 (2005). 
Liu B., Frost J.L., Sun J., Fu H., Grimes S., Blackburn P., Lemere C.A., MER5101, a novel Aβ1-15:DT conjugate vaccine, generates a robust anti-Aβ antibody response and attenuates Aβ pathology and cognitive deficits in APPswe/PS1ΔE9 transgenic mice.
J Neurosci. 33(16):7027-37 (2013).
Lutzner N., Kalbacher H., Quantifying Cathepsin S Activity in Antigen Presenting Cells Using a Novel Specific Substrate. J. Biol. Chem. Vol. 283 No. 52 p. 36185 (2008).
Maier M., Seabrook T.J., Lazo N.D., Jiang L., Das P., Janus C, Lemere C.A., Short amyloid-beta (Abeta) immunogens reduce cerebral Abeta load and learning deficits in an Alzheimer's disease mouse model in the absence of an Abeta-specific cellular immune response. J Neurosci. 3;26(18):4717-28 (2006).
Martineau P, chapter 41: Affinity Measurements by Competition ELISA, Pages 657−665, from book: Antibody engineering, Vol.1; R. Kontermann and S. Dubel (2010)
Monsonego A., Weiner H.L., Immunotherapeutic approaches to Alzheimer's disease. Science. 31;302(5646):834-8 (2003).
Muhs A., Hickman D.T., Pihlgren M., Chuard N., Giriens V., Meerschman C., van der Auwera I., van Leuven F., Sugawara M., Weingertner M.-C., Bechinger B., Greferath R., Kolonko N., Nagel-Steger L., Riesner D., Brady R.O., Pfeifer A., Nicolau C., Liposomal vaccines with conformation-specific amyloid peptide antigens define immune response and efficacy in APP transgenic mice. PNAS, 104 23:9810-9815 (2007).
Orgogozo J.M., Gilman S., Dartigues J.F., Laurent B., Puel M., Kirby L.C., Jouanny P., Dubois B., Eisner L., Flitman S., Michel B.F., Boada M., Frank A., Hock C., Subacute meningoencephalitis in a subset of patients with AD after Abet42 immunization. Neurology 61: 46-54 (2003).
Pihlgren M., Silva A.B., Madani R., Giriens V., Waeckerle-Men Y., Fettelschoss A., Hickman D.T., Lopez-Deber M.P., Ndao D.M., Vukicevic M., Buccarello A.L., Gafner V., Chuard N., Reis P., Piorkowska K., Pfeifer A., Kundig T.M., Muhs A., Johansen P., TLR4- and TRIF-dependent stimulation of B lymphocytes by peptide liposomes enables T cell-independent isotype switch in mice. Blood. Jan 3;121(1):85-94 (2013).
Sallusto F., Lanzavecchia A., Araki K., Ahmed R., From vaccines to memory and back. Immunity. Oct 29;33(4):451-63 (2010).
Schneeberger A., Mandler M., Mattner F., Schmidt W., AFFITOME(登録商標) technology in neurodegenerative diseases: the doubling advantage. Hum Vaccin. 11:948-52 (2010)
Seabrook T.J., Thomas K., Jiang L., Bloom J., Spooner E., Maier M., Bitan G., Lemere C.A., Dendrimeric Abeta1-15 is an effective immunogen in wildtype and APP-tg mice. Neurobiol Aging. 28(6):813-23 (2006).
Siegrist CA, Chapter 2: Vaccine Immunology, Pages 14-32 from book: Vaccine (6th Edition, 2013).n, Walter A. Orenstein and Paul)
Soto C., Plaque busters: strategies to inhibit amyloid formation in Alzheimer’s disease. Molecular Medicine Today (vol 5), August 1999. 
Winblad B., Graf A., Riviere M.E., Andreasen N., Ryan J.M., Active immunotherapy options for Alzheimer's disease. Alzheimers Res Ther. 2014 Jan 30;6(1):7. 
Winblad B., Andreasen N., Minthon L., Floesser A., Imbert G., Dumortier T., Maguire R.P., Blennow K., Lundmark J., Staufenbiel M., Orgogozo J.M., Graf A., Safety, tolerability, and antibody response of active Aβ immunotherapy with CAD106 in patients with Alzheimer's disease: randomised, double-blind, placebo-controlled, first-in-human study. Lancet Neurol. 11(7):597-604 (2012).
【００８２】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で具体的に言及されているすべての刊行物および特許は、本発明に関連するすべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
【００８３】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて本発明の様々な修正が、前述の説明および付随する図から当業者に明らかになるであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることを意図している。さらに、本明細書に記載の本発明のすべての態様および実施形態は、広く適用可能であり、必要に応じて本発明の他の態様から取られたものを含む、他のすべての一貫した実施形態と組み合わせることができると見なされる。
【００８４】
【図１Ａ】
2021521149.tif 000006
【図１Ｂ】
2021521149.tif 000007
【図２Ａ】
2021521149.tif 000008
【図２Ｂ】
2021521149.tif 000009
【図３】
2021521149.tif 000010
【図４】
2021521149.tif 000011
【図５】
2021521149.tif 000012
【図６Ａ】
2021521149.tif 000013
【図６Ｂ】
2021521149.tif 000014
【配列表】
2021521149000001.app
【国際調査報告】
2021521149.tif 000015
2021521149.tif 000016