(57)【要約】  本発明は医療の分野である。本発明は、新生児の呼吸停止による急性または亜急性の脳損傷の治療手段および方法を提供する。本発明では、アネキシンＡ１を含む組成物をそのような治療を必要とする対象に投与することによって、低酸素性虚血性脳症を効果的に治療し得ることが見出された。したがって、本発明は、アネキシンＡ１を含む組成物を早産新生児に投与することによる新生児の低酸素性虚血性脳症の治療に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アネキシンＡ１またはその等価物を含む、虚血事象による新生児低酸素脳症の治療用組成物であって、前記アネキシンＡ１またはその等価物を含む前記組成物は、虚血事象後２４時間以内に新生児に投与され、但し、前記組成物は、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、成体多能性幹細胞（ＭＡＰＣ）またはそれらに由来する細胞外小胞（ＥＶ）を含まず、前記等価物は、ヒトアネキシンＡ１、切断アネキシンＡ１、および少なくとも１つの他のヒトアネキシンとヒトアネキシンＡ１とのキメラからなる群より選択されることを特徴とする虚血事象による新生児低酸素脳症の治療用組成物。
【請求項２】
前記組成物は医薬上許容可能な担体を含む請求項１に記載の虚血事象による新生児低酸素脳症の治療用組成物。
【請求項３】
前記等価物は、アネキシンＡ１とアネキシンＡ５とを含むキメラである請求項１または２に記載の虚血事象による新生児低酸素脳症の治療用組成物。
【請求項４】
治療が静脈内投与を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の虚血事象による新生児低酸素脳症の治療用組成物。
【請求項５】
治療が虚血事象の１２時間以内に生じる請求項１〜４のいずれか１項に記載の虚血事象による新生児低酸素脳症の治療用組成物。
【請求項６】
前記アネキシンＡ１またはその等価物は、１μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される請求項１〜５のいずれか１項に記載の虚血事象による新生児低酸素脳症の治療用組成物。
【請求項７】
前記アネキシンＡ１またはその等価物は、１ボーラス／２４時間として非経口投与される請求項６に記載の虚血事象による新生児低酸素脳症の治療用組成物。
【請求項８】
前記アネキシンＡ１またはその等価物は、１時間当たり０．１μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ体重の用量の持続点滴として投与される請求項６に記載の虚血事象による新生児低酸素脳症の治療用組成物。
【請求項９】
前記組成物が無傷の細胞を含まない請求項１〜８のいずれか１項に記載の虚血事象による新生児低酸素脳症の治療用組成物。
【請求項１０】
前記細胞が幹細胞である請求項９に記載の虚血事象による新生児低酸素脳症の治療用組成物。
【請求項１１】
前記幹細胞が間葉幹細胞である請求項１０に記載の虚血事象による新生児低酸素脳症の治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医療分野に関する。本発明は、早産新生児の呼吸停止による急性または亜急性脳損傷の治療手段および方法を提供する。より詳細には、本発明は、低酸素性虚血性脳症の治療を提供する。
【背景技術】
【０００２】
周産期呼吸停止は、より適切には低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）と知られており、呼吸停止による急性または亜急性脳損傷の臨床および研究室の証拠によって特徴付けられる。この状態の一番の原因は、全身性の低酸素血症および／または脳血流（ＣＢＦ）の減少である。出産呼吸停止は、世界中のすべての新生児死亡のうちの８４０，０００または２３％で生じている［１，２，３］。
【０００３】
新生児低酸素性虚血性脳症は、不十分な酸素供給により、新生児の脳の細胞に損傷を引き起こす神経系疾患である。全身性の低酸素血症および脳血流（ＣＢＦ）の減少による脳の低酸素症および虚血は、新生児にて生じる灰質および白質の障害に伴う新生児ＨＩＥをもたらす主な理由である。新生児ＨＩＥは、新生児期における死亡を引き起こし得るか、または発達遅延、精神遅滞、または脳性麻痺（ＣＰ）と後に認められるものを生じ得る。たとえ異なる治療戦略が近年開発されたとしても、新生児ＨＩＥは、満期近い新生児、早期新生児および満期新生児において多くの死亡および罹患率をもたらす深刻な状態のままであり、したがって、依然として周産期医学の課題である。
【０００４】
低酸素虚血（ＨＩ）によって誘導される脳損傷を患う満期新生児は、現在、冷却治療で治療される。しかしながら、この治療は軽症でのみ効果的なものであり、早産新生児では、いずれの治療から除外される悪い転帰を伴う。
【０００５】
最近、本発明者らは、静脈内投与した間葉幹細胞（ＭＳＣ）、成体多能性幹細胞（ＭＡＰＣ）またはそれらに由来する細胞外小胞（ＥＶ）が、広範囲の低酸素虚血（ＨＩ）後の早産脳損傷の翻訳のヒツジモデルにおいて神経を保護したことを見出した［４］。そのような治療は、真核細胞の培養、および真核細胞またはそれに由来する生成物の対象への投与を必要とする。これは、特にそのような細胞を生きたまま投与する場合に、治療の安全に関する問題、並びに手順のコストおよび物流に懸念を生じる。
【０００６】
それ故に、より優れており、安全であり、信頼性のある、手頃なＨＩＥ治療が必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
アネキシンＡ１またはその等価物を含む組成物を投与することによって、低酸素性虚血性脳症を効果的に治療し得ることが見出された。それ故に、本発明は、アネキシンＡ１またはその等価物を含む、虚血事象による新生児低酸素脳症の治療用組成物に関し、アネキシンＡ１またはその等価物を含む組成物は、虚血事象後２４時間以内に新生児に投与され、但し、組成物は、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、成体多能性幹細胞（ＭＡＰＣ）またはそれらに由来する細胞外小胞（ＥＶ）を含まない。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】ＨＩ後７ｄの血管から脳柔組織へのアルブミン漏出（矢印）（＋）およびコントロールの血管内のアルブミン（−）の代表的な組織学的画像である。
【図１Ｂ】再灌流の７日後に、コントロールと比較して３４％の漏出増加がＨＩ処置動物にて見られた図である。これらの結果は、漏れやすい血管を示すアルブミン溢出のパーセンテージとして記載されている。
【図２Ａ】ＨＩ後の経時的な脳血管系（Ａ）のアネキシンＡ１免疫活性を示す図である。Ｘ軸は日（ｄ）、Ｙ軸はアネキシンＡ１免疫活性の相対スコアである。
【図２Ｂ】ＨＩ後の経時的な上衣ライニング（Ｂ）のアネキシンＡ１免疫活性を示す図である。Ｘ軸は日（ｄ）、Ｙ軸はアネキシンＡ１免疫活性の相対スコアである。
【図３】アネキシンＡ１が、ＦＰＲ１およびＦＰＲ２受容体によってＢＢＢ完全性を改善することを示す図である。０時間にて、ＯＧＤの開始前にベースラインＴＥＥＲを測定した。ＯＧＤから４時間後、細胞をアネキシンＡ１および／またはＦＰＲ阻害剤で処置し、処置後３、６、１２および２４時間にて追跡調査した。より詳細には、胎児のラット内皮細胞を４時間ＯＧＤ状態にし、再灌流の開始時に、組み換えアネキシンＡ１と、ＷＲＷ４と、シクロスポリンＨと（ＷＲＷ４およびシクロスポリンＨはＦＰＲ２およびＦＰＲ１アンタゴニスト）を含む組成物で処置した。処置後３ｈ、６ｈ、１２ｈおよび２４ｈにおいて、ＴＥＥＲ（Ω）を測定した。０時点は、実験の開始および実験状態の開始（ＯＧＤ前のＴＥＥＲ測定）を表す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
実施例１に記載の確立したＨＩＥの生体内ヒツジモデルシステムを採用した。ここでは、臍帯周囲の空気注入式血管閉塞栓を用いて臍帯を閉塞して、広範囲の一時的な低酸素虚血（ＨＩ）を誘導した。
【００１０】
本明細書に記載の実験研究は、血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性が、内皮細胞の密着接合タンパク質組成およびアルブミン溢出の変化を伴って、ＨＩ後４〜６時間で増加したことを示した。
【００１１】
ＨＩが脳柔組織へのアルブミン漏出を増加させ、この漏出が虚血事象後に連続的に増加したことを見出した。
【００１２】
これは、アルブミン染色の分析が動物当たり１０画像（２００ｘ倍率）の類似の大きさの血管で行われた本明細書に記載の実験から結論づけられた。ＢＢＢの完全性を評価するために、アルブミン溢出を、（＋）陽性アルブミン染色が血管の周囲の脳組織に存在する場合と、（−）アルブミンが  脳柔組織に存在しない場合とで記録した（図１）。
【００１３】
実験モデル（実施例１）では、再灌流の７日後に、コントロールと比較して、ＨＩ処置動物にて３４％の漏出増加が見られた（図１Ｂ）。これらの結果は、漏れやすい血管を示すアルブミン溢出のパーセンテージとして記載されている。これは図１Ａに示され、左のパネルは、ヒツジアルブミンの１００％が血管内に含まれているコントロールのヒツジの右のパネルと比較して、漏れやすい血管（１７％のアルブミンが血管の外側にある）を示す。その漏出は、再灌流の３日目に約２８％に、７日目に５６％にそれぞれ増加した。これらの実験から、ＨＩが血液脳関門（ＢＢＢ）の崩壊をもたらすと結論付けた。
【００１４】
ＢＢＢは、末梢系と、周皮細胞、ニューロン、星状膠細胞などの中枢神経系の細胞との間を、接着結合および輸送体構造を介して連絡する内皮細胞から構成される。この高度に分化した構造は、脳の恒常性を調整し、潜在的に有害な浸潤性免疫細胞および炎症性分子から中枢神経系（ＣＮＳ）を保護するのに極めて重要である。これらの血行性メディエーターの流入は、小グリアの活性化と、その後、発達する脳を傷つける炎症性サイトカインおよび反応性酸素種の分泌とによって、神経炎症を持続させる。
【００１５】
また、アネキシンＡ１と特異的に反応する抗体を用いて、胎児の脳切片上の免疫組織化学を実施した（実施例２）。アネキシンＡ１免疫活性（ＩＲ）の強度の定量化のために、アネキシンＡ１の免疫活性強度を評価する採点システム（１−３）を設計した。ここで、スコア１は小さい免疫活性、スコア２は中程度の免疫活性、スコア３は強い免疫活性である。採点を領域割合の分析によって補完し、Ｌｅｉｃａ  Ｑｗｉｎ  Ｐｒｏ  Ｖ３．５．１．ソフトウェア（Ｌｅｉｃａ，Ｒｉｊｓｗｉｊｋ，オランダ国）で決定した標準閾値強度を用いて、全領域に対する陽性染色のパーセンテージとして表した。また、アネキシンＡ１の陽性染色した脳室周囲領域の厚さをＩｍａｇｅＪ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ１．４８で測定した。小グリア細胞でのアネキシンＡ１免疫活性の評価を、細胞表現型およびアネキシンＡ１免疫活性と共局在化するＩＢＡ−１での隣接した切片の染色に基づいて決定した。
【００１６】
広範囲のＨＩから１日後、アネキシンＡ１免疫活性が、コントロールと比較して血管および上衣ライニング細胞にて顕著に減少した一方で、３日後および７日後にアネキシンＡ１の発現は正常化したことを見出した（図２Ａおよび図２Ｂ）。
【００１７】
ＢＢＢがＨＩに際だって侵されやすく、３日目でのアネキシンＡ１の発現増加にもかかわらず、血管外の内因性ヒツジアルブミンの存在の経時的な増加によって明らかなように、既に損傷が起きていると結論付けた。これは、多くても３日間、好ましくは４８時間、さらにより好ましくは２４または１２時間、６、５、４、３、２、または１時間またはそれ未満などの処置の機会を医師に残す。虚血事象後直ちに処置することが最も好ましい。
【００１８】
ＢＢＢ完全性に対する効果が、アネキシンＡ１によって仲介されるかどうかを評価するために、出生後３日目のラットの脳から単離した一次胎児内皮細胞（ＥＣ）のＢＢＢ完全性のための一般に認められているモデルを使用した。
【００１９】
内皮細胞（ＥＣ）の細胞単層を、半透性フィルターインサート（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、３４６０  Ｃｏｒｎｉｎｇ）で培養した。それぞれ、電圧測定用の銀−塩化銀ペレットと、電流通過用の銀ペレットとを含む２つのチョップスティック型電極を有するＥｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｖｏｌｔｏｈｍｍｅｔｅｒ（ＥＶＯＭ２）を用いて、以前に記載したバリア完全性のための確立された定量的読み出し（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら．，Ｊ．Ｌａｂ  Ａｕｔｏｍ．２０１５（２）１０７−１２６）として、経表皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定した。一方の電極を上部区画に、残りの電極をより下の区画に配置することによって、細胞層を横切る抵抗（Ω）の測定を半透膜で行った。測定をインサート当たり２連で実施し、数日間一貫して行い、培養から３０分後培地を変更し、すべての測定前および測定中、温度を３７℃に保持した。値がプラトーに達したら、膜はコンフルエンシーに達し、更なる実験を実施し得る（ベースライン測定）。
【００２０】
ＥＣがｔｒａｎｓｗｅｌｌ内でコンフルエンシーに達した際に、細胞を、酸素グルコース喪失（ＯＧＤ）または酸素正常状態にランダムに割り当てた。培養培地をグルコースおよびグルタミンがないＤＭＥＭ（Ａ１４４３００１  Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）と変更し、ＥＣを低酸素室の０％酸素に３７℃で４時間曝すことによって、ＯＧＤを実施した。酸素正常／ＯＧＤの４時間後、培地を培養培地に変更し、ＴＥＥＲを測定し（Ｔ０）、続いて以下の濃度および条件で処置した：アネキシンＡ１（３μＭ）、ＦＰＲ１／２受容体ブロッカーＷＲＷ４（１０μＭ）およびシクロスポリンＨ（１μＭ）。レチノイン酸（１０μＭ）をＢＢＢ完全性増大の陽性コントロールとして使用した（Ｌｅｏｎｉら．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０１３（１２３（１）４４３−４５４；，Ｌｉｐｐｍａｎｎら．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．２０１４（４）４１６０）。
【００２１】
続いて、酸素正常／ＯＧＤ後、１時間、３時間、６時間、１２時間および２４時間において、すべての群でのＴＥＥＲを測定した。この設定は、以下の処置群（ｎ＝２／実験）：（１）無処置、（２）アネキシンＡ１、（３）ＷＲＷ４、（４）ＷＲＷ４＋アネキシンＡ１、（５）シクロスポリンＨおよび（６）シクロスポリンＨ＋アネキシンＡ１になる。酸素正常コントロールは、培地を変更せずに正常な培養条件のままとした。細胞培養実験を繰り返して、再現性を調べた。
【００２２】
実験継続前、培養下の内皮細胞のベースラインＴＥＥＲ値は約１５０Ω／インサートであった。ＯＧＤ後１時間で、ＴＥＥＲ値はそれぞれの処置群で有意に減少した。その後、アネキシンＡ１処置はＴＥＥＲを着実に増加させ、値が１３０Ωでプラトーに達した（図３）。際だっていたのは、無処置またはシクロスポリンＨおよびＷＲＷ４でのＦＰＲ１またはＦＰＲ２受容体の阻害によって、ＴＥＥＲ値が１００〜１１０Ωまで連続的に低下した（図３）。
【００２３】
それ故に、ＢＢＢ回復の確立されたモデルを用いて、アネキシンＡ１が、酸素グルコース喪失後に内皮抵抗性および／またはバリア完全性を回復することが示された。要するに、これは、ＨＩ攻撃後直ちに、またはＨＩ攻撃後まもなく、ＢＢＢ完全性を強化することは、内因性修復メカニズムを刺激するによって脳損傷を防ぐことを示唆する。
【００２４】
それ故に、本発明は、アネキシンＡ１またはその等価物を含む、虚血事象による新生児低酸素脳症の治療用組成物であって、アネキシンＡ１またはその等価物を含む組成物は、虚血事象後２４時間以内に新生児に投与され、但し、組成物は、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、成体多能性幹細胞（ＭＡＰＣ）またはそれらに由来する細胞外小胞（ＥＶ）を含まない組成物に関する。アネキシンＡ１は、市販されているものであり得、好ましくはヒト起源由来である。ヒト組み換えアネキシンＡ１（Ｋｕｓｔｅｒｓら．，Ｐｌｏｓ  ｏｎｅ  １０（６）ｅ０１３０４８４  ＤＯＩ：１０．１３７１）などの組み換えアネキシンＡ１を使用することがさらにより好ましい。
【００２５】
好ましい実施形態では、上記用途の組成物は、医薬上許容可能な担体を含む。
【００２６】
アネキシンＡ１の等価物は、好ましくは、ヒトアネキシンＡ１、切断アネキシンＡ１または他のヒトアネキシンとのキメラまたはこれらの組み合わせからなる群より選択される。キメラは好ましくはアネキシンＡ１とアネキシンＡ５とを含む融合タンパク質である。さらに好ましい実施形態では、組成物は静脈内投与される。
【００２７】
上記の処置は、好ましくは、虚血事象の１２時間以内、好ましくは６時間以内、５、４、３、２、または１時間またはそれ未満、虚血事象後直ちに実施される。
【００２８】
好ましくは、アネキシンＡ１またはその等価物は、非経口で、１ボーラス／２４時間として１μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、または１時間当たり０．１μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ体重の持続点滴として、投与される。
【００２９】
本明細書で、治療薬の「治療に有効な量」とは、疾患および／または状態に罹るか、または罹りやすい対象に投与した際に、疾患、障害、および／または状態の１つまたは複数の症状を治療するか、診断するか、防ぐか、および／またはそれらの開始を遅らせるのに十分な量を意味する。当業者であれば、治療に有効な量は、少なくとも１つの単位用量を含む投薬計画によって典型的には投与されることを理解するものである。
【００３０】
本明細書で、「治療薬」は、対象に投与した際に、治療効果を有するか、および／または望ましい生物学的および／または薬理学的効果を誘発するいずれの剤も指す。
【００３１】
本明細書で、「治療する（ｔｒｅａｔ）」「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、特定の疾患、疾患、および／または状態の１つ以上の症状または特徴を、部分的にまたは完全に軽減するから、改善するか、緩和するか、妨げるか、防ぐか、それらの開始を遅らせるか、それらの重症度を減少させるか、かつ／または発生を減少させるのに使用されるいずれの方法も指す。
【００３２】
本明細書で、「早産」は、妊娠の正常な期間の終わりより前の子供の誕生を指す。ヒトでは、早産児は、妊娠３７週より前の出生児である。「満期」は、妊娠の正常な期間の終わりの、またはその後の子供の誕生を指す。ヒトでは、満期出生児とは、妊娠３７週またはその後の出生児である。
【実施例】
【００３３】
実施例１：生体内ヒツジモデル
実験手順および研究設計は、動物実験企業ガイドラインに従い、オランダ国のＡｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって承認された。テセル種妊娠雌羊の個々の胎児（ｎ＝３７）に、ランダムに閉塞栓を与えないか（ｎ＝１８）、または閉塞栓を与えた（ｎ＝１９）。
【００３４】
すべての胎児は、先に記載したように（Ｏｐｈｅｌｄｅｒｓら．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１６５（６）７５４−７６３）、１０２日間の妊娠期間（満期は妊娠期間の~１４７日）で計測された。簡潔に、一時的な広範囲の低酸素虚血の誘導のために、空気注入式血管閉塞栓を臍帯周囲に挿入した。さらに、血圧の測定およびＭＳＣ−ＥＶの投与ために、臍帯血管カテーテルを大腿動脈および上腕静脈に置いた。４日間の回復期間後、血管閉塞栓の急速な膨張によって、胎児の疑似閉塞または臍帯閉塞（ＵＣＯ）を２５分間行った。（疑似）ＵＣＯから１日後（ｎ＝１０）、３日後（ｎ＝８）または７日後（ｎ＝１９）、胎児を屠殺した。調査員を行う（疑似）臍帯閉塞、組織サンプリングおよび事後分析は、処置の割当が見えないように行った。
【００３５】
実施例２：試料調製、免疫組織化学および分析
固定後、側脳室、脳室周囲白質および大脳基底核を含む所定の領域をパラフィンに封入し、連続の冠状断面（４μＭ）をＬｅｉｃａ  ＲＭ２２３５ミクロトームで切断した。冠状断面を、ＢＢＢ漏出マーカーとしてのアルブミン、一般の小グリアマーカーとしてのイオン化カルシウム結合アダプター分子１（ＩＢＡ−１）、およびアネキシンＡ１について染色した。最初に、切片を脱パラフィン化し、水で戻した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）溶解した０．３％過酸化水素でのインキュベーションによって失活させた。抗原回復は、電子レンジを用いてクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.０）で組織を煮沸して行った。次に、一次ポリクローナルウサギ抗アネキシンＡ１（ＡＢ１３７７４５，Ａｂｃａｍ；１：１００）、抗アルブミン（ＮＹ１１５９０，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ；１：２０００）、抗ＩＢＡ−１（０１９−１９７４１，Ｗａｋｏ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；１：１０００）抗体で、４℃で、切片を一晩インキュベートした後、二次ポリクローナルブタ抗ウサギビオチン（Ｅ０３５３、Ｄａｋｏ；１：２００）でインキュベートした。Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣペルオキシダーゼｅｌｉｔｅ  キット（ＰＫ−６２００，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で、抗体特異的な染色を増大した後、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）染色を行った。Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンで核を染色した。
【００３６】
Ｌｅｉｃａ  Ｑｗｉｎ  Ｐｒｏ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．４．０．ソフトウェアを備えたＬｅｉｃａ  ＤＭ２０００顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ国）を用いて、デジタル画像を撮影した後、免疫組織化学染色の分析を行った。アネキシンＡ１およびＩＢＡ−１の画像を１００ｘの倍率で撮影した。所定の領域は、血管と、上衣ライニング細胞と、ＩＢＡ−１で染色した小グリア細胞を含む白質と、を含んでいた。Ｌｅｉｃａ  ＱＷｉｎ  Ｐｒｏ  Ｖ３．４ソフトウェアを画像処理に使用した。
【００３７】
アネキシンＡ１免疫活性の強度の定量化のために、アネキシンＡ１の免疫活性強度を評価する採点システム（１−３）を設計した。スコア１は小さい、スコア２は中程度、スコア３は強い免疫活性である。領域割合の分析によって採点を補完し、Ｌｅｉｃａ  Ｑｗｉｎ  Ｐｒｏ  Ｖ３．５．１．ソフトウェア（Ｌｅｉｃａ，Ｒｉｊｓｗｉｊｋ，オランダ国）で決定した標準閾値強度を用いて、全領域に対する陽性染色のパーセンテージとして表した。また、アネキシンＡ１の陽性染色した脳室周囲領域の厚さをＩｍａｇｅＪ  ソフトウェア  ｖｅｒｓｉｏｎ１．４８で測定した。ＢＢＢの評価のために、小グリア細胞でのアネキシンＡ１免疫活性を、細胞表現型、およびアネキシンＡ１免疫活性と共局在化するＩＢＡ−１での隣接した切片の染色に基づいて決定した。
【００３８】
アルブミン染色の分析を、動物当たり類似の大きさの血管の１０画像（２００ｘ倍）で行った。ＢＢＢの完全性を評価するために、アルブミン溢出を、（＋）陽性アルブミン染色が血管の周囲の脳組織に存在する場合と、（−）アルブミンが  脳柔組織に存在しない場合とで記録した（図１）。これらの結果を、漏れやすい血管を示すアルブミン溢出のパーセンテージとして示した。
【００３９】
実施例３：経皮内移動電気抵抗（ＴＥＥＲ）分析用の細胞の調製
以下の通り、細胞を単離し、培養した。出生後の３日目（Ｐ３）で頸部転位によって屠殺した余剰の仔ラットは、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから受け取った。出生後３日目の齧歯類の脳発達段階は、ヒト早産児と同等である（ＫｉｎｎｅｙおよびＶｏｌｐｅ；Ｎｅｕｒｏｌ．Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．２０１２，１０．１１５５／２０１２／２９５３８９．Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｍａｙ  ２３）。Ｂｅｒｎａｓら（Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１０  Ｊｕｌ；  ５（７）：  １２６５−１２７２．ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ２０１０  Ｊｕｎ  １０．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ.２０１０．７６）から細胞単離プロトコルを調整した。簡単に言うと、頭蓋骨から脳を切り出し、髄膜および大きい血管を除去した後、断片を減少するピペットチップに通過させることによって、組織を粉砕した。細胞懸濁液を５００μＭ濾過器に通すことによって、大きい断片を除いた。通過した細胞を３０μＭ濾過器で回収し、その後５１ｘ  ｇで１０分間遠心した。生じたペレットを、１０％熱不活性化胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（Ｆ７５２４，Ｓｉｇｍａ）、１％抗生物質−抗真菌薬溶液（Ａ５９５５，Ｓｉｇｍａ）、５０μｇ／ｍｌ内皮細胞増殖サプリメント（ＥＣＧＳ）（３５４００６，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１ｍｇ／ｍｌヘパリン（Ｌ６５１０，Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）およびヒドロコルチゾン５００ｎＭ（０７９０４，Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２−ｇｌｕｔａｍａｘ（１０５６５０１８，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）に再懸濁し、Ｉ型コラーゲンで予め被覆したＴ２５フラスコ（３５４２３６，Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。培養拡大が約１ヶ月間認められて、周皮細胞による最小のコンタミネーション（＜５％）（免疫細胞化学によって決定）を示す高度に密集した内皮細胞を得た。
【００４０】
細胞集団の純度を評価するために、培養の細胞のキャラクタリゼーションを免疫細胞化学によって実施した。ガラススライドで細胞を増殖させ、内皮細胞のマーカーとしてフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）（Ａ００８２，Ｄａｋｏ）、ｚｏｎａ−Ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ  １（ＺＯ−１）（６１−７３００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびオクルディン（７１−１５００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、周皮細胞のマーカーとしてα−平滑筋アクチン（α−ｓｍａ）ａｓマーカーｆｏｒ（Ａ５２２８，Ｓｉｇｍａ）について染色した。ｂｙインキュベーションｉｎ４％パラホルムアルデヒド（抗体）またはＭｅＯＨ（抗体）中でのインキュベート後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、正常ヤギ血清（ＮＧＳ）またはＦＢＳでブロッキングすることによって、細胞を固定した。次に、細胞を一次抗体（１：１００／２００）と４℃で一晩インキュベートした後、適切なａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ標識二次抗体（１：２００）とインキュベートした。ＤＡＰＩで核を染色し、カバースリップを蛍光封入剤（Ｄａｋｏ）を用いて封入した。
【００４１】
実施例４：経表皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）分析
内皮細胞（ＥＣ）の細胞単層を半透性フィルターインサート（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）（３４６０Ｃｏｒｎｉｎｇ）で培養した。それぞれ、電圧測定用の銀−塩化銀ペレットと、電流通過用の銀ペレットとを含む２つのチョップスティック型電極を有するＥｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｖｏｌｔ−ｏｈｍｍｅｔｅｒ（ＥＶＯＭ２）を用いて、バリア完全性の確立した定量的読み出しとして、ＴＥＥＲを測定した（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら．，Ｊ．Ｌａｂ  Ａｕｔｏｍ..Ｊ  Ｌａｂ  Ａｕｔｏｍ．２０１５Ａｐｒ；２０（２）：１０７−１２６、ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ２０１５Ｊａｎ１３．ＤＯＩ：１０．１１７７／２２１１０６８２１４５６１０２５）。一方の電極を上部区画に、残りの電極をより下の区画に配置することによって、細胞層を横切る抵抗（Ω）の測定を半透膜で行った。測定をインサート当たり２連で実施し、数日間一貫して行い、培養から３０分後培地を変更し、すべての測定前および測定中、温度を３７℃に保持した。値がプラトーに達したら、膜はコンフルエンシーに達し、更なる実験を実施し得る（ベースライン測定）。
【００４２】
ＥＣがｔｒａｎｓｗｅｌｌ内でコンフルエンシーに達した際に、細胞を、酸素グルコース喪失（ＯＧＤ）または酸素正常状態にランダムに割り当てた。培地をグルコースおよびグルタミンがないＤＭＥＭ（Ａ１４４３００１Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）に変更し、ＥＣを低酸素室の０％酸素に３７℃で４時間曝すことによって、ＯＧＤを実施した。酸素正常／ＯＧＤの４時間後、培地を培養培地に変更し、ＴＥＥＲを測定し（Ｔ０）、続いて以下の濃度および条件で処置した：アネキシンＡ１（３μＭ）、ＦＰＲ１／２受容体ブロッカーＷＲＷ４（１０μＭ）およびシクロスポリンＨ（１μＭ）。レチノイン酸（１０μＭ）をＢＢＢ完全性増大の陽性コントロールとして使用した（Ｌｅｏｎｉら．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０１３（１２３（１）４４３−４５４；Ｌｉｐｐｍａｎｎら．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．２０１４（４）４１６０）。
【００４３】
その後、酸素正常／ＯＧＤ後、１時間、３時間、６時間、１２時間および２４時間において、すべての群でのＴＥＥＲを測定した。この設定によって、以下の処置群（ｎ＝２／実験）：（１）無処置、（２）アネキシンＡ１、（３）ＷＲＷ４、（４）ＷＲＷ４＋アネキシンＡ１、（５）シクロスポリンＨおよび（６）シクロスポリンＨ＋アネキシンＡ１がもたらされた。酸素正常コントロールは、培地を変更せずに正常な培養条件のままとした。細胞培養実験を繰り返して、再現性を調べた。
【００４４】
実験継続前、培養下の内皮細胞のベースラインＴＥＥＲ値は約１５０Ω／インサートであった。ＯＧＤ後１時間で、ＴＥＥＲ値はそれぞれの処置群で有意に減少した。その後、アネキシンＡ１処置はＴＥＥＲを着実に増加させ、値が、１２時間から１３０Ωでプラトーに達した。際だっていたのは、無処置、またはシクロスポリンＨおよびＷＲＷ４でのＦＰＲ１またはＦＰＲ２受容体の阻害によって、ＴＥＥＲ値が１００〜１１０Ωまで連続的に低下した（図３）。
【００４５】
実施例５：統計学的分析
免疫組織化学：すべての値を、９５％の信頼区間（ＣＩ）または標準偏差（ＳＤ）で平均として示した。異なる実験の群の間の比較は分散分析（ＡＮＯＶＡ）で行った。
【００４６】
ＴＥＥＲ測定値からのデータを、それぞれ処置群当たりｎ＝２で実施した２つの独立した実験から得た。半透膜での内皮細胞層を横切る抵抗（Ω）は、半透膜の有効面積（ｃｍ２）の時間を測定した。これらの調整した抵抗測定値は、対応する平均の調整した抵抗測定に対する比として表した。結果として、正規化した値を異なる実験群の間で比較した。データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を用いて示し、対応のないサンプルのｔ−試験で有意性について試験した。
【００４７】
統計学的分析をＩＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２２．０（ＩＢＭ  Ｃｏｒｐ．，Ａｒｍｏｎｋ，ＮＹ，ＵＳＡ；ＳＰＳＳ）で実施した。図式設計をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を用いて実施した。正確なｐ値を記録し、統計学的有意性をｐ＜０．０５で許容した。
【００４８】
参考文献
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2. Perlman JM. Brain injury in the term infant. Semin Perinatol. Dec 2004;28(6):415-24.
3. Grow J, Barks JD. Pathogenesis of hypoxic-ischemic cerebral injury in the term infant: current concepts. Clin Perinatol. Dec 2002;29(4):585-602, v.
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6. Ludwig et al., Int. J. Biochem Cell Biol (2012) 44: 11-15.
7. Jellema et al., J. Neuroinflamm. (2013) 10: 13.
8. Kumar et al., Pediatrics (2008) 122(3): e722-727
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【国際調査報告】
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