(57)【要約】  本発明は、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの移植のための組成物および方法に関する。本発明によるＧＡＢＡ作動性ニューロンおよびそれを含む組成物は、対象の神経系における中枢性抑制を回復させる、または強化するための、ならびに神経機能の障害または異常に関連する神経学的状態、疾患および障害を治療するための細胞ベースの治療として使用することができる。好ましい実施形態では、移植組成物は、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、ＧＦＲ−αアゴニスト、および少なくとも１つの細胞死阻害剤を含み、ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、多能性幹細胞、複能性幹細胞、または前駆細胞を分化することによって作製される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物に投与するための移植組成物であって、前記移植組成物は、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団、ＧＦＲαアゴニストおよび少なくとも１つの細胞死阻害剤を含み、
前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞を、前記細胞がＧＡＢＡ作動性ニューロン表現型を得ることおよびＧＡＢＡを産生することを可能にする条件下で、インビトロで分化させることによって作製される、移植組成物。
【請求項２】
アポトーシス阻害剤および壊死阻害剤を含む、請求項１に記載の移植組成物。
【請求項３】
前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、前記多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞を、
ｉ．約０日目〜約７日目に少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤、
ｉｉ．約０日目〜約２１日目にソニックヘッジホッグ経路の活性化因子、
ｉｉｉ．約０日目〜約１４日目にｗｎｔ阻害剤、
ｉｖ．約７日目〜約１４日目にＢＭＰ阻害剤、
ｖ．約７日目〜約２１日目にＧＡＢＡ作動性種分化要因、ならびに
ｖｉ．約２１日目〜約２７日目にＢＤＮＦ、ＧＤＮＦおよびγセクレターゼ阻害剤を含む神経成熟成長因子の組み合わせ、
の存在下で培養することによって作製される、請求項１または２に記載の移植組成物。
【請求項４】
前記多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞は、約１４日目〜約２１日目の期間中にＢＭＰシグナル伝達を活性化する１つ以上の薬剤の存在下で培養される、請求項３に記載の移植組成物。
【請求項５】
ＢＭＰシグナル伝達を活性化する前記１つ以上の薬剤はＢＭＰ４を含む、請求項４に記載の移植組成物。
【請求項６】
前記多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞は、前記哺乳動物から得られる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の移植組成物。
【請求項７】
前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンは多能性幹細胞から作製される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の移植組成物。
【請求項８】
前記多能性幹細胞はｉＰＳＣである、請求項７に記載の移植組成物。
【請求項９】
前記ＧＦＲαアゴニストは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、アルテミン（ＡＲＴＮ）およびペルセフィン（ＰＳＰＮ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＮＧＦ、ＧＤＮＦ受容体内因性アゴニスト、ＢＴ１８、ＢＴ１３、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＣＮＴＦ、ＧＦＲα１アゴニスト、ＸＩＢ４０３５、Ｔｒｋ活性化因子、ＴｒｋＡアゴニスト、ガンボギンアミン、アミトリプチリン、ＴｒｋＢアゴニスト、Ｎ−アセチルセロトニン、アミトリプチリン、ＢＮＮ−２０ＢＮＮ−２７、デオキシゲズニン、７，８−ジヒドロキシフラボン、４’−ジメチルアミノ−７，８−ジヒドロキシフラボン、ジオスメチン、ＨＩＯＣ、ＬＭ２２Ａ−４、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ノルウォゴニン、Ｒ７（薬物）、および７，８，３’−トリヒドロキシフラボンからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の移植組成物。
【請求項１０】
前記ＧＦＲαアゴニストはＧＤＮＦである、請求項９に記載の移植組成物。
【請求項１１】
前記アポトーシス阻害剤は、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンＩＤＮ−８０６６、７０５３、７４３６  １９６５  ６５５６  Ｍ８６７  ＩＤＮ−５３７０  ＩＤＮ−７８６６プラルナカサンｚ−Ｖａｄ−ＦＭＫ、ＹＶＡＤ−ＦＭＫ、ｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ、Ａｃ−ＤＶＡＤ−ＦＭＫ  Ｑ−Ｖｄ−ＯＰｈ、ＣｒｍＡ（牛痘ウイルスタンパク質）、ｐ３５（バキュロウイルスタンパク質）、Ｚ−ＡＴＡＤ−ＦＭＫ、ＩＮＦ−４Ｅ、Ｚ−ＤＱＭＤ−ＦＭＫ、Ａｚ  １０４１７８０８、Ｚ−ＬＥＥＤ−ＦＭＫ、ＺＶＤＫ−ＦＭＫ、ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ、ＩＮｆ−３９、ベルナカサン、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、およびエムリカサンからなる群から選択されるカスパーゼ阻害剤；またはカルパイン阻害剤１、カルペプチン、Ｅ６４、ＭＤＬ２８１７０、ＭＧ１０１、アセチル−カルパスタチン、およびＰＤ１５０６０６からなる群から選択されるカスパーゼ活性化剤の阻害剤、のうちの１つ以上から選択される、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の移植組成物。
【請求項１２】
前記アポトーシス阻害剤は広域スペクトルカスパーゼ阻害剤である、請求項１０に記載の移植組成物。
【請求項１３】
前記アポトーシス阻害剤はＢｏｃ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンである、請求項１２に記載の移植組成物。
【請求項１４】
前記壊死阻害剤は、ＭＳ−１、ＩＭ−５４、ＧＳＫ−８７２、７−Ｃｌ−Ｏ−Ｎｅｃ１、ネクロスタチン−１、およびネクロスルホンアミドからなる群から選択される、請求項２〜１３のいずれか一項に記載の移植組成物。
【請求項１５】
前記壊死阻害剤はＭＬＫＬ阻害剤である、請求項１４に記載の移植組成物。
【請求項１６】
前記壊死阻害剤はネクロスルホンアミドである、請求項１５に記載の移植組成物。
【請求項１７】
多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞を、前記細胞がＧＡＢＡ作動性ニューロン表現型を得てＧＡＢＡを産生するように、
ｉ．約０日目〜約７日目に少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤、
ｉｉ．約０日目〜約２１日目にソニックヘッジホッグ経路の活性化因子、
ｉｉｉ．約０日目〜約１４日目にｗｎｔ阻害剤、
ｉｖ．約７日目〜約１４日目にＢＭＰ阻害剤、
ｖ．約７日目〜約２１日目にＧＡＢＡ作動性種分化要因、ならびに
ｖｉ．約２１日目〜約２７日目にＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、およびγセクレターゼ阻害剤を含む神経成熟成長因子の組み合わせ、
の存在下で、インビトロで培養することを含む、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団を産生する方法。
【請求項１８】
前記多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞は、約１４日目〜約２１日目の期間中にＢＭＰシグナル伝達を活性化する１つ以上の薬剤の存在下で培養される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＢＭＰシグナル伝達を活性化する１つ以上の薬剤はＢＭＰ４を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンは有糸分裂後である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、Ｎｋｘ２．１、ｖＧＡＴ、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７の転写物を発現する、請求項１〜１６もしくは２０のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、ＧＡＤ６５／６７、ＧｌｙＴ２、およびＶＧＡＴを発現する、請求項１〜１６もしくは２０〜２１のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団の少なくとも９５％がＧＡＤ６５を発現する、請求項１〜１６もしくは２０〜２２のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団の少なくとも９５％がＶＧＡＴを発現する、請求項１〜１６もしくは２０〜２３のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、インビボでＧＡＢＡを分泌することができる、請求項１〜１６もしくは２０〜２４のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤は、ヘスペレチン、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５２５３３４、ガルニセルチブ、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ５０５１２４、ＬＤＮ−１９３１８９、ＬＤＮ−１９３１８９  ＨＣｌ、ＲｅｐＳｏｘ、Ａ  ８３−０１、ＤＭＨ１、ＬＤＮ−２１２８５４、ＩＴＤ  １、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ−２０８、ＥＷ−７１９７、ＭＬ３４７、Ｋ０２２８８、Ａ  ７７−０１、ＳＩＳ３、ＬＤＮ−２１４１１７、Ｒ−２６８７１２、ピルフェニドン、ノギン、コーディン、グレムリン、ＤＡＮタンパク質、およびＧＤＦ３からなる群から選択される、請求項３〜１６もしくは２０〜２５のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項１７〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤はＬＤＮ１９３１８９およびＳＢ４３１５４２である、請求項２６に記載の移植組成物または方法。
【請求項２８】
前記ソニックヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子は、ソニックヘッジホッグ、ＧＳＡ１０、パルモルファミン、ＳＡＧ、およびＳＡＧ二塩酸塩からなる群から選択される、請求項３〜１６もしくは２０〜２７のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項１７〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ソニックヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子はＳＡＧである、請求項２８に記載の移植組成物または方法。
【請求項３０】
前記ｗｎｔ阻害剤は、ＩＣＧ−００１、サリノマイシン、ＩＷＲ−１、Ｗｎｔ−Ｃ５９、ＥＴＣ−１５９、ｉＣＲＴ３、ＩＷＰ２、ＩＷＰ−４、ピルビニウムパモ酸塩、ｉＣＲＴ１４、ＦＨ５３５、ＣＣＴ２５１５４５、ＫＹＡ１７９７Ｋ、オウゴニン、ＮＣＢ−０８４６、ヘキサクロロフェン、ＰＮＵ−７４６５４、Ｋｙ０２１１、トリプトニド、ＩＷＰ１２、アキシン、ＧＳＫ、ＷＡＹ３１６６０６、Ｓｈｉｚｏｋａｏｌ  Ｄ、ＢＣ２０５９、ＰＫＦ１１５−５８４、ＩＣＧ−０１、クェルセチン、ＤＣＡ、ＬＹ２０９０３１４、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ−２１６７６３、ＮＳＣ６６８０３６、ＱＳ１１、Ｇ００７−ＬＫ、およびＧ２４４ＬＭからなる群から選択される、請求項３〜１６もしくは２０〜２９のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項１７〜２９のいずれか一項に記載
の方法。
【請求項３１】
前記ｗｎｔ阻害剤はＩＷＰ２である、請求項３０に記載の移植組成物または方法。
【請求項３２】
前記ＢＭＰ阻害剤は、ヘスペレチン、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５２５３３４、ガルニセルチブ、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ５０５１２４、ＬＤＮ−１９３１８９、ＬＤＮ−１９３１８９  ＨＣｌ、ＲｅｐＳｏｘ、Ａ  ８３−０１、ＤＭＨ１、ＬＤＮ−２１２８５４、ＩＴＤ  １、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ−２０８、ＥＷ−７１９７、ＭＬ３４７、Ｋ０２２８８、Ａ  ７７−０１、ＳＩＳ３、ＬＤＮ−２１４１１７、Ｒ−２６８７１２、ピルフェニドン、ノギン、コーディン、グレムリン、ＤＡＮタンパク質、およびＧＤＦ３からなる群から選択される、請求項３〜１６もしくは２０〜３１のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項１７〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＢＭＰ阻害剤はＬＤＮ−１９３１８９である、請求項３２に記載の移植組成物または方法。
【請求項３４】
前記ＧＡＢＡ作動性種分化要因は、線維芽細胞成長因子からなる群から選択される、請求項３〜１６もしくは２０〜３３のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項１７〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＧＡＢＡ作動性種分化要因はＦＧＦ８である、請求項３４に記載の移植組成物または方法。
【請求項３６】
前記γセクレターゼ阻害剤は、ＤＡＰＴ、ＲＯ４９２９０９７、セマガセスタット、アバガセスタット、ジベンザゼピン、Ｌｙ４１１５７５、ＩＭＲ−１、Ｌ−６８５，４５８、ＦＬＩ−０６、クレニガセスタット、ニロガセスタット、ＭＫ−０７５２、ベガセスタット、ＢＭＳ２９９８９７、コンパウンドＷ、ＤＢＺ、フルリザン、ＪＬＫ６、ＭＲＫ５６０、およびＰＦ３０８４０１臭化水素酸塩からなる群から選択される、請求項３〜１６もしくは２０〜３５のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項１７〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記γセクレターゼ阻害剤はＤＡＰＴである、請求項３６に記載の移植組成物または方法。
【請求項３８】
前記多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞は、０日目から約２４時間の期間、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養される、請求項３〜１６もしくは２０〜３７のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項１７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１７〜３８のいずれか一項に記載の方法に従って産生される、細胞集団。
【請求項４０】
請求項１〜１６もしくは２０〜３８のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項１７〜３８のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団を、前記哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の神経系における中枢性抑制を回復させる、または強化する方法。
【請求項４１】
請求項１〜１６もしくは２０〜３８のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項１７〜３８のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団を、前記哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における神経学的状態、疾患もしくは障害、またはアロディニアを治療する方法。
【請求項４２】
対象における不十分な抑制性介在ニューロンの活性または興奮性ニューロン機能の増大を処置するための、請求項１〜１６もしくは２０〜３８のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項１７〜３８のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団。
【請求項４３】
対象における神経学的状態、疾患もしくは障害、またはアロディニアを治療するための、請求項１〜１６もしくは２０〜３８のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項１７〜３８のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団。
【請求項４４】
対象における神経学的状態、疾患もしくは障害、またはアロディニアを治療する薬物の製造のための、請求項１〜１６もしくは２０〜３８のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項１７〜３８のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団、の使用。
【請求項４５】
前記神経学的状態、疾患または障害は、神経変性疾患、神経学的損傷、または神経障害性疼痛から選択される、請求項４１に記載の方法、請求項１〜１６もしくは２０〜３８のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項４３に記載の使用のために請求項１７〜３８のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団、または請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
前記神経学的状態、疾患または障害は、慢性神経障害性疼痛、慢性炎症性疼痛、慢性機能障害性疼痛、てんかん、運動ニューロン疾患（ＡＬＳ、ＳＭＡ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、多発性硬化症、タウオパチー（進行性核上麻痺、ピック病、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、前頭側頭型認知症、ＡＬＳを伴うＦＴＬＤ）、ハンチントン病、アルコール離脱およびアルコール依存症、糖尿病誘発性脳損傷、頭部損傷、偏頭痛、頭痛、クラスター頭痛、脊髄傷害、虚血性障害、化学療法誘発性疼痛および化学療法誘発性神経障害、統合失調症、慢性うつ病、遅発性ジスキネジア、双極性疾患、および神経障害からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法、請求項１〜１６もしくは２０〜３６のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項４３に記載の使用のために請求項１７〜３８のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団、または請求項４４に記載の使用。
【請求項４７】
前記神経障害性疼痛は、坐骨神経痛、腰痛、癌性疼痛、糖尿病性疼痛、事故による外傷、脊髄損傷、末梢神経損傷に関連することを特徴とする、請求項４５に記載の方法、請求項１〜１６または２０〜３８のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項４５に記載の使用のために請求項１７〜３８のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団、または請求項４５に記載の使用。
【請求項４８】
前記移植組成物、前記治療有効量の細胞集団または前記薬物が、前記哺乳動物の中枢神経系に投与されるかまたは中枢神経系への投与のために製剤化される、請求項４０、４１、もしくは４５〜４７のいずれか一項に記載の方法、請求項１〜１６、もしくは２０〜３８のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項４２、４３、もしくは４５〜４７に記載の使用のために請求項１７〜３８のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団、または請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４９】
前記移植組成物、前記治療有効量の細胞集団または前記薬物は、前記哺乳動物の脊髄に注射されるか、または注射用に製剤化される、請求項４０、４１もしくは４５〜４７のいずれか一項に記載の方法、請求項１〜１６もしくは２０〜３８のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項４２、４３もしくは４５〜４７に記載の使用のために請求項１７〜３８のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団、または請
求項４４〜４７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５０】
前記注射は定位注射である、請求項４９に記載の方法、請求項１〜１６もしくは２０〜３８のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項４９に記載の使用のために請求項１７〜３８のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団、または請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記哺乳動物はヒトである、請求項４０、４１、もしくは４５〜５０のいずれか一項に記載の方法、請求項１〜１６、もしくは２０〜３８のいずれか一項に記載の移植組成物、または請求項４２、４３、もしくは４５〜５０に記載の使用のために請求項１７〜３８のいずれか一項に記載の方法に従って産生される治療有効量の細胞集団、または請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５２】
それを必要とする対象にＧＡＢＡ作動性ニューロンを送達する方法であって、
ａ）前記対象からの生検を得て、前記生検から細胞を単離する工程と、
ｂ）ステップａ）で単離された細胞からｉＰＳＣを作製する工程と、
ｃ）ステップｂ）で作製されたｉＰＳＣを、前記ｉＰＳＣをＧＡＢＡ作動性ニューロンに分化させる条件下で培養する工程であって、前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンがＧＡＢＡ作動性ニューロン表現型を発現し、ＧＡＢＡを産生するものであることと、
ｄ）前記対象への注射に好適な移植組成物を調製する工程であって、前記移植組成物は、ステップｃ）で作製されたＧＡＢＡ作動性ニューロン、ＧＦＲαアゴニスト、アポトーシス阻害剤、壊死阻害剤、および薬学的に許容される担体を含むものであることと、
ｅ）ステップｄ）で調製された移植組成物を前記対象に投与する工程と、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの移植のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性疼痛は、世界中で数十億人もの患者、家族、および介護者の生活の質に大きな影響をもたらしており、現在の治療では、ほとんどの患者の疼痛に適切に対処することができない。世界的には、慢性疼痛は、がん、心臓病、または糖尿病の費用と同様に、年間費用は数兆ドルであると推定されている。重要なことに、慢性疼痛に対する有効な治療の欠如は、例えば、２０００年以来、２０万を超える人々が処方されたオピオイドの過剰摂取で死亡しているオピオイドの蔓延のように、我々の社会に連鎖的な影響をもたらしてきた。重要なことに、慢性疼痛の発生率は、年齢とともに増加し、癌および糖尿病等の多くの加齢関連疾患と関連しているため、高齢化社会において、慢性疼痛は、明確なかつ満たされていない臨床上の課題である。神経障害性疼痛は、電気ショックと最も類似した性質の灼けるような、刃物で刺すような、およびズキズキする疼痛として現れ得る。
【０００３】
神経障害性疼痛（例えば、坐骨神経痛、腰痛、がん性疼痛、糖尿病性疼痛、偶発的傷害）は、概して、利用可能な治療に難治性であり、最前線の抗神経障害薬は、患者の約２５％のみに適切な疼痛緩和を提供する。モルヒネによる治療は、急性の状況においてある程度の疼痛緩和をもたらすか、または痛みから気をそらすことができるが、慢性的なモルヒネ治療計画は、無視することができない中毒および耐性の問題につながる。プレガバリンおよびノルトリプチリン等の非アヘン剤ではある程度の成功を収めているが、これらの薬物は様々な有効性を有し、疼痛の強度に適切に対応することができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｗｅｒｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０５：５８５６−５８６１（２００８）
【非特許文献２】Ｊａｅｎｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３２：５６７−５８２（２００８）
【非特許文献３】Ｈａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３３：２５０−２６４（２００８）
【非特許文献４】Ｂｒａｍｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２：１５１−１５９（２００８）
【非特許文献５】Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ５：１１１−１２３（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
神経障害性疼痛に寄与する分子的および生理学的機序に関する何十年という研究にもかかわらず、神経障害性疼痛の原因となる根本的な病理を治療するために何を標的にすべきかはまだ完全に明らかになっていない。慢性疾患を逆転させる、またはさらには解消することができる、より優れた、中毒性のない疼痛治療が必要である。
【０００６】
さらに、対象の神経系における中枢性抑制を回復または強化するための、ならびに低下したもしくは不十分な抑制性介在ニューロンの活性または増大した興奮性ニューロン機能に関連する神経学的状態、疾患および障害を治療するための細胞ベースの治療の提供は、満たされていないニーズに見合う。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下を提供する。
［１］哺乳動物に投与するための移植組成物であって、前記移植組成物は、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団、ＧＦＲαアゴニスト、アポトーシス阻害剤および壊死阻害剤を含み、前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞を、該細胞がＧＡＢＡ作動性ニューロン表現型を得ることおよびＧＡＢＡを産生することを可能にする条件下で、インビトロで分化させることによって作製される、移植組成物。
［２］ＧＦＲαアゴニストは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、アルテミン（ＡＲＴＮ）およびペルセフィン（ＰＳＰＮ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＮＧＦ、ＧＤＮＦ受容体内因性アゴニスト、ＢＴ１８、ＢＴ１３、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＣＮＴＦ、ＧＦＲα１アゴニスト、ＸＩＢ４０３５、Ｔｒｋ活性化剤、ＴｒｋＡアゴニスト、ガンボギンアミン、アミトリプチリン、ＴｒｋＢアゴニスト、Ｎ−アセチルセロトニン、アミトリプチリン、ＢＮＮ−２０ＢＮＮ−２７、デオキシゲズニン、７，８−ジヒドロキシフラボン、４’−ジメチルアミノ−７，８−ジヒドロキシフラボン、ジオスメチン、ＨＩＯＣ、ＬＭ２２Ａ−４、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ノルウォゴニン、Ｒ７（薬物）、および７，８，３’−ヒドロキシフラボンからなる群から選択される、［１］の移植組成物。
［３］ＧＦＲαアゴニストはＧＤＮＦである、［２］の移植組成物。
［４］ＧＤＮＦは、約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在する、［３］の移植組成物。
［５］ＧＤＮＦは、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、［４］の移植組成物。
［６］アポトーシス阻害剤は、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンＩＤＮ−８０６６、７０５３、７４３６  １９６５  ６５５６  Ｍ８６７  ＩＤＮ−５３７０  ＩＤＮ−７８６６プラルナカサンｚ−Ｖａｄ−ＦＭＫ、ＹＶＡＤ−ＦＭＫ、ｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ、Ａｃ−ＤＶＡＤ−ＦＭＫ  Ｑ−Ｖｄ−ＯＰｈ、ＣｒｍＡ（牛痘ウイルスタンパク質）、ｐ３５（バキュロウイルスタンパク質）、Ｚ−ＡＴＡＤ−ＦＭＫ、ＩＮＦ−４Ｅ、Ｚ−ＤＱＭＤ−ＦＭＫ、Ａｚ  １０４１７８０８、Ｚ−ＬＥＥＤ−ＦＭＫ、ＺＶＤＫ−ＦＭＫ、ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ、ＩＮｆ−３９、ベルナカサン、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、およびエムリカサンからなる群から選択されるカスパーゼ阻害剤；またはカルパイン阻害剤１、カルペプチン、Ｅ６４、ＭＤＬ２８１７０、ＭＧ１０１、アセチル−カルパスタチン、およびＰＤ１５０６０６からなる群から選択されるカスパーゼ活性化剤の阻害剤、のうちの１つ以上から選択される、［１］〜［５］のいずれか１つの移植組成物。
［７］アポトーシス阻害剤は、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンＩＤＮ−８０６６、７０５３、７４３６  １９６５  ６５５６  Ｍ８６７  ＩＤＮ−５３７０  ＩＤＮ−７８６６プラルナカサンｚ−Ｖａｄ−ＦＭＫ、ＹＶＡＤ−ＦＭＫ、ｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ、Ａｃ−ＤＶＡＤ−ＦＭＫ  Ｑ−Ｖｄ−ＯＰｈ、ＣｒｍＡ（牛痘ウイルスタンパク質）、ｐ３５（バキュロウイルスタンパク質）、Ｚ−ＡＴＡＤ−ＦＭＫ、ＩＮＦ−４Ｅ、Ｚ−ＤＱＭＤ−ＦＭＫ、Ａｚ  １０４１７８０８、Ｚ−ＬＥＥＤ−ＦＭＫ、ＺＶＤＫ−ＦＭＫ、ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ、ＩＮｆ−３９、ベルナカサン、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、およびエムリカサンからなる群から選択されるカスパーゼ阻害剤からなる群から選択される、［６］の移植組成物。
［８］アポトーシス阻害剤は広域スペクトルカスパーゼ阻害剤である、［６］の移植組成物。
［９］アポトーシス阻害剤はＢｏｃ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンである、［８］の移植組成物。
［１０］Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンは、約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在する、［９］の移植組成物。
［１１］Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンは、約２０μＭの濃度で存在す
る、［１０］の移植組成物。
［１２］壊死阻害剤は、ＭＳ−１、ＩＭ−５４、ＧＳＫ−８７２、７−Ｃｌ−Ｏ−Ｎｅｃ１、ネクロスタチン−１、ネクロスルホンアミドからなる群から選択される、［１］〜［１１］のいずれか１つの移植組成物。
［１３］壊死阻害剤は、ＭＳ−１、ＩＭ−５４、ＧＳＫ−８７２、７−Ｃｌ−Ｏ−Ｎｅｃ１、ネクロスタチン−１、ネクロスルホンアミドからなる群から選択される、［１２］の移植組成物。
［１４］壊死阻害剤はＭＬＫＬ阻害剤である、［１２］の移植組成物。
［１５］壊死阻害剤はネクロスルホンアミドである、［１４］の移植組成物。
［１６］ネクロスルホンアミドは、約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在する、［１５］の移植組成物。
［１７］ネクロスルホンアミドは、約５０ｎＭの濃度で存在する、［１６］の移植組成物。
［１８］多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞は、前記哺乳動物から得られる、［１］〜［１７］のいずれか１つの移植組成物。
［１９］ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、多能性幹細胞から作製される、［１］〜［１８］のいずれか１つの移植組成物。
［２０］多能性幹細胞はｉＰＳＣである、［１９］の移植組成物。
［２１］ｉＰＳＣは、哺乳動物から得られた生検から得られた細胞に由来する、［２０］の移植組成物。
［２２］生検から得られた細胞は、皮膚線維芽細胞である、［２１］の移植組成物。
［２３］ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、前記多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞を、
ｉ．約０日目〜約７日目に少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤、
ｉｉ．約０日目〜約２１日目にソニックヘッジホッグ経路の活性化剤、
ｉｉｉ約０日目〜約１４日目にｗｎｔ阻害剤、
ｉｖ．約７日目〜約１４日目にＢＭＰ阻害剤、
ｖ．約７日目〜約２１日目にＧＡＢＡ作動性種分化要因、ならびに
ｖｉ．約２１日目〜約２７日目にＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、およびγセクレターゼ阻害剤を含む神経成熟成長因子の組み合わせの存在下で培養することによって作製される、［１］〜［２２］のいずれか１つの移植組成物。
［２４］前記少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤は、ヘスペレチン、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５２５３３４、ガルニセルチブ、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ５０５１２４、ＬＤＮ−１９３１８９、ＬＤＮ−１９３１８９  ＨＣｌ、ＲｅｐＳｏｘ、Ａ  ８３−０１、ＤＭＨ１、ＬＤＮ−２１２８５４、ＩＴＤ  １、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ−２０８、ＥＷ−７１９７、ＭＬ３４７、Ｋ０２２８８、Ａ  ７７−０１、ＳＩＳ３、ＬＤＮ−２１４１１７、Ｒ−２６８７１２、ピルフェニドン、ノギン、コーディン、グレムリン、ＤＡＮタンパク質、およびＧＤＦ３からなる群から選択される、［２３］の移植組成物。
［２５］．前記少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９およびＳＢ４３１５４２である、［２４］の移植組成物。
［２６］ＬＤＮ１９３１８９は約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在し、ＳＢ４３１５４２は約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在する、［２５］の移植組成物。
［２７］ＬＤＮ１９３１８９は約１００ｎＭの濃度で存在し、ＳＢ４３１５４２は約１０μＭの濃度で存在する、［２６］の移植組成物。
［２８］前記ソニックヘッジホッグシグナル伝達の活性化剤は、ソニックヘッジホッグ、ＧＳＡ１０、パルモルファミン、ＳＡＧ、およびＳＡＧ二塩酸塩からなる群から選択される、［２３］〜［２７］のいずれか１つの移植組成物。
［２９］前記ソニックヘッジホッグシグナル伝達の活性化剤はＳＡＧである、［２８］の移植組成物。
［３０］ＳＡＧは、約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在する、［２９］の移植組成物。
［３１］ＳＡＧは、約０．１μＭの濃度で存在する、［３０］の移植組成物。
［３２］前記ｗｎｔ阻害剤は、ＩＣＧ−００１、サリノマイシン、ＩＷＲ−１、Ｗｎｔ−Ｃ５９、ＥＴＣ−１５９、ｉＣＲＴ３、ＩＷＰ２、ＩＷＰ−４、ピルビニウムパモ酸塩、ｉＣＲＴｌ４、ＦＨ５３５、ＣＣＴ２５１５４５、ＫＹＡ１７９７Ｋ、オウゴニン、ＮＣＢ−０８４６、ヘキサクロロフェン、ＰＮＵ−７４６５４、Ｋｙ０２ｌｌ、トリプトニド、ＩＷＰ１２、Ａｘｉｎ、ＧＳＫ、ＷＡＹ３１６６０６、Ｓｈｉｚｏｋａｏｌ  Ｄ、ＢＣ２０５９、ＰＫＦ１１５−５８４、ＩＣＧ−０１、クェルセチン、ＤＣＡ、ＬＹ２０９０３１４、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ−２１６７６３、ＮＳＣ６６８０３６、ＱＳ１１、Ｇ００７−ＬＫ、およびＧ２４４ＬＭからなる群から選択される、［２３］〜［３１］のいずれか１つの移植組成物。
［３３］前記ｗｎｔ阻害剤はＩＷＰ２である、［３２］の移植組成物。
［３４］ＩＷＰ２は、約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在する、［３３］の移植組成物。［３５］ＩＷＰ２は、約５μＭの濃度で存在する、［３４］の移植組成物。
［３６］前記ＢＭＰ阻害剤は、ヘスペレチン、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５２５３３４、ガルニセルチブ、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ５０５１２４、ＬＤＮ−１９３１８９、ＬＤＮ−１９３１８９  ＨＣｌ、ＲｅｐＳｏｘ、Ａ  ８３−０１、ＤＭＨ１、ＬＤＮ−２１２８５４、ＩＴＤ  １、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ−２０８、ＥＷ−７１９７、ＭＬ３４７、Ｋ０２２８８、Ａ  ７７−０１、ＳＩＳ３、ＬＤＮ−２１４１１７、Ｒ−２６８７１２、ピルフェニドン、ノギン、コーディン、グレムリン、ＤＡＮタンパク質、およびＧＤＦ３からなる群から選択される、［２３］〜［３５］のいずれか１つの移植組成物。
［３７］前記ＢＭＰ阻害剤はＬＤＮ−１９３１８９である、［３６］の移植組成物。
［３８］ＬＤＮ−１９３１８９は、約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在する、［３７］の移植組成物。
［３９］ＬＤＮ−１９３１８９は、約１００ｎＭの濃度で存在する、［３８］の移植組成物。
［４０］前記ＧＡＢＡ作動性種分化要因は、線維芽細胞成長因子からなる群から選択される、［２３］〜［３９］のいずれか１つの移植組成物。
［４１］前記ＧＡＢＡ作動性種分化要因はＦＧＦ８である、［４０］の移植組成物。
［４２］ＦＧＦ８は、約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在する、［４１］の移植組成物。［４３］ＦＧＦ８は、約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、［４２］の移植組成物。
［４４］前記γセクレターゼ阻害剤は、ＤＡＰＴ、ＲＯ４９２９０９７、セマガセスタット、アバガセスタット、ジベンザゼピン、Ｌｙ４ｌｌ５７５、ＩＭＲ−１、Ｌ−６８５，４５８、ＦＬＩ−０６、クレニガセスタット、ニロガセスタット、ＭＫ−０７５２、ベガセスタット、ＢＭＳ２９９８９７、コンパウンドＷ、ＤＢＺ、フルリザン、ＪＬＫ６、ＭＲＫ５６０、およびＰＦ３０８４０１４臭化水素酸塩からなる群から選択される、［２３］〜［４３］のいずれか１つの移植組成物。
［４５］前記γセクレターゼ阻害剤はＤＡＰＴである、［４４］の移植組成物。
［４６］ＤＡＰＴは、約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在する、［４５］の移植組成物。［４７］ＤＡＰＴは約２．５μＭの濃度で存在する、［４６］の移植組成物。
［４８］前記神経成熟成長因子の組み合わせは、約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在するＢＤＮＦと、約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在するＧＤＮＦと、約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在するＤＡＰＴと、を含む、［２３］の移植組成物。
［４９］前記神経成熟成長因子の組み合わせは、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在するＢＤＮＦと、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在するＧＤＮＦと、約２．５μＭの濃度で存在するＤＡＰＴと、含む、［４８］の移植組成物。
［５０］前記多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞は、０日目から約２４時間の期間、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養される、［２３］〜［４９］のいずれか１つの移植組成物。
［５１］前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンは有糸分裂後である、［１］〜［５０］のいずれか１つの移植組成物。
［５２］前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、Ｎｋｘ２．１、ｖＧＡＴ、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７の転写物を発現する、［１］〜［５１］のいずれか１つの移植組成物。
［５３］前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、ＧＡＤ６５／６７、ＧｌｙＴ２およびＶＧＡＴを発現する、［１］〜［５２］のいずれか１つの移植組成物。
［５４］前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団の少なくとも９５％がＧＡＤ６５を発現する、［１］〜［５３］のいずれか１つの移植組成物。
［５５］前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団の少なくとも９５％がＶＧＡＴを発現する、［１］〜［５４］のいずれか１つの移植組成物。
［５６］前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、インビボでＧＡＢＡを分泌することができる、［１］〜［５５］のいずれか１つの移植組成物。
［５７］前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、レシピエントの神経系と機能的に一体化することができる、［１］〜［５６］のいずれか１つの移植組成物。
［５８］薬学的に許容される担体をさらに含む、［１］〜［５７］のいずれか１つの移植組成物。
［５９］前記薬学的に許容される担体は、生理食塩水または水性緩衝液からなる群から選択される、［５８］の移植組成物。
［６０］前記組成物は、約１０００〜１０００万細胞／マイクロリットルの濃度でＧＡＢＡ作動性ニューロンを含む、［１］〜［５９］の移植組成物。
［６１］前記組成物は、１００，０００細胞／マイクロリットルの濃度でＧＡＢＡ作動性ニューロンを含む、［１］〜［６０］の移植組成物。
［６２］ＧＡＢＡ作動性ニューロンはヒト細胞である、［１］〜［６１］の移植組成物。［６３］哺乳動物の神経系における中枢性抑制を回復または強化する方法であって、［１］〜［６２］のいずれか１つの移植組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法。
［６４］哺乳動物における神経学的状態、疾患または障害を治療する方法であって、［１］〜［６２］のいずれか１つの移植組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法。
［６５］神経学的状態、疾患または障害は、不十分な抑制性介在ニューロンの活性によって特徴づけられる、［６４］の方法。
［６６］神経学的状態、疾患または障害は、神経変性疾患、神経学的損傷、または神経障害性疼痛から選択される、［６４］の方法。
［６７］前記神経学的状態、疾患または障害は、慢性神経障害性疼痛、慢性炎症性疼痛、慢性機能障害性疼痛、てんかん、運動ニューロン疾患（ＡＬＳ、ＳＭＡ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、多発性硬化症、タウオパチー（進行性核上麻痺、ピック病、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、前頭側頭型認知症、ＡＬＳを伴うＦＴＬＤ）、ハンチントン病、アルコール離脱およびアルコール依存症、糖尿病誘発性脳損傷、頭部損傷、偏頭痛、頭痛、クラスター頭痛、脊髄損傷、虚血性障害、化学療法誘発性疼痛および化学療法誘発性神経障害、統合失調症、慢性うつ病、遅発性ジスキネジア、双極性疾患、および神経障害からなる群から選択される、［６４］の方法。
［６８］哺乳動物における神経障害性疼痛を治療する方法であって、［１］〜［６２］のいずれか１つの移植組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法。
［６９］前記神経障害性疼痛は、坐骨神経痛、腰痛、癌性疼痛、糖尿病性疼痛、事故による外傷、脊髄損傷、末梢神経損傷に関連する、［６８］の方法。
［７０］哺乳動物におけるアロディニアを治療する方法であって、［１］〜［６２］のいずれか１つの移植組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法。
［７１］前記移植組成物は、哺乳動物の中枢神経系に投与される、［６３］〜［７０］のいずれか１つの方法。
［７２］前記投与は、前記哺乳動物の脊髄に前記移植組成物を注射することを含む、［６３］〜［７１］のいずれか１つの方法。
［７３］前記注射は定位注射である、［７２］の方法。
［７４］哺乳動物はヒトである、［６３］〜［７３］のいずれか１つの方法。
［７５］ＧＡＢＡ作動性ニューロンを、それを必要とする対象に送達する方法であって、ａ）前記対象からの生検を得ることおよび前記生検から細胞を単離することと、
ｂ）ステップａ）で単離された細胞からｉＰＳＣを作製することと、
ｃ）ステップｂ）で作製されたｉＰＳＣを、前記ｉＰＳＣをＧＡＢＡ作動性ニューロンに分化させる条件下で培養することであって、前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンがＧＡＢＡ作動性ニューロン表現型を発現し、ＧＡＢＡを産生する、培養することと、
ｄ）前記対象への注射に好適な移植組成物を調製することであって、前記移植組成物は、ステップｃ）で作製されたＧＡＢＡ作動性ニューロン、ＧＦＲαアゴニスト、アポトーシス阻害剤、壊死阻害剤、および薬学的に許容される担体を含む、調製することと、
ｅ）ステップｄ）で調製された移植組成物を前記対象に投与することと、を含む、方法。［７６］前記対象は、不十分な抑制性介在ニューロンの活性または増大した興奮性ニューロン機能を有する、［７５］の方法。
［７７］前記対象は、神経学的状態、疾患または障害を有する、［７５］の方法。
［７８］神経学的状態、疾患または障害は、不十分な抑制性介在ニューロンの活性によって特徴づけられる、［７７］の方法。
［７９］神経学的状態、疾患または障害は、神経変性疾患、神経学的損傷、または神経障害性疼痛から選択される［７７］の方法。
［８０］前記神経学的状態、疾患または障害は、慢性神経障害性疼痛、慢性炎症性疼痛、慢性機能障害性疼痛、てんかん、運動ニューロン疾患（ＡＬＳ、ＳＭＡ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、多発性硬化症、タウオパチー（進行性核上麻痺、ピック病、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、前頭側頭型認知症、ＡＬＳを伴うＦＴＬＤ）、ハンチントン病、アルコール離脱およびアルコール依存症、糖尿病誘発性脳損傷、頭部損傷、偏頭痛、頭痛、クラスター頭痛、脊髄損傷、虚血性障害、化学療法誘発性疼痛および化学療法誘発性神経障害、統合失調症、慢性うつ病、遅発性ジスキネジア、双極性疾患、および神経障害からなる群から選択される、［７７］の方法。
［８１］前記対象は神経障害性疼痛を有する、［７５］の方法。
［８２］前記神経障害性疼痛は、炎症、坐骨神経痛、腰痛、癌性疼痛、糖尿病性神経障害、事故による外傷、脊髄損傷、末梢神経損傷に関連する、［８１］の方法。
［８３］前記対象はアロディニアを有する、［７５］の方法。
［８４］前記移植組成物は、対象の中枢神経系に投与される、［７５］〜［８３］のいずれか１つの方法。
［８５］前記投与は、前記対象の脊髄に前記移植組成物を注射することを含む、［７５］〜［８４］のいずれか１つの方法。
［８６］該注射が、定位注射を介している、［８５］に記載の方法。
［８７］対象はヒトである、［７５］〜［８６］のいずれか１つの方法。
［８８］ＧＦＲαアゴニストは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、アルテミン（ＡＲＴＮ）およびペルセフィン（ＰＳＰＮ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＮＧＦ、ＧＤＮＦ受容体内因性アゴニスト、ＢＴ１８、ＢＴ１３、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＣＮＴＦ、ＧＦＲα１アゴニスト、ＸＩＢ４０３５、Ｔｒｋ活性化剤、ＴｒｋＡアゴニスト、ガンボギンアミン、アミトリプチリン、ＴｒｋＢアゴニスト、Ｎ−アセチルセロトニン、アミトリプチリン、ＢＮＮ−２０ＢＮＮ−２７、デオキシゲズニン、７，８−ジヒドロキシフラボン、４’−ジメチルアミノ−７，８−ジヒドロキシフラボン、ジオスメチン、ＨＩＯＣ、ＬＭ２２Ａ−４、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ノルウォゴニン、Ｒ７（薬物）、および７，８，３’−ヒドロキシフラボンからなる群から選択される、［７５］〜［８７］の方法。
［８９］ＧＦＲαアゴニストはＧＤＮＦである、［８８］の方法。
［９０］ＧＤＮＦは、約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在する、［８９］の方法。
［９１］ＧＤＮＦは、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、［９０］の方法。
［９２］アポトーシス阻害剤は、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンＩＤＮ
−８０６６、７０５３、７４３６  １９６５  ６５５６  Ｍ８６７  ＩＤＮ−５３７０  ＩＤＮ−７８６６プラルナカサンｚ−Ｖａｄ−ＦＭＫ、ＹＶＡＤ−ＦＭＫ、ｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ、Ａｃ−ＤＶＡＤ−ＦＭＫ  Ｑ−Ｖｄ−ＯＰｈ、ＣｒｍＡ（牛痘ウイルスタンパク質）、ｐ３５（バキュロウイルスタンパク質）、Ｚ−ＡＴＡＤ−ＦＭＫ、ＩＮＦ−４Ｅ、Ｚ−ＤＱＭＤ−ＦＭＫ、Ａｚ  １０４１７８０８、Ｚ−ＬＥＥＤ−ＦＭＫ、ＺＶＤＫ−ＦＭＫ、ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ、ＩＮｆ−３９、ベルナカサン、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、およびエムリカサンからなる群から選択されるカスパーゼ阻害剤；またはカルパイン阻害剤１、カルペプチン、Ｅ６４、ＭＤＬ２８１７０、ＭＧ１０１、アセチル−カルパスタチン、およびＰＤ１５０６０６からなる群から選択されるカスパーゼ活性化剤の阻害剤、のうちの１つ以上から選択される、［７５］〜［９１］のいずれか１つの方法。
［９３］アポトーシス阻害剤は、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンＩＤＮ−８０６６、７０５３、７４３６  １９６５  ６５５６  Ｍ８６７  ＩＤＮ−５３７０  ＩＤＮ−７８６６プラルナカサンｚ−Ｖａｄ−ＦＭＫ、ＹＶＡＤ−ＦＭＫ、ｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ、Ａｃ−ＤＶＡＤ−ＦＭＫ  Ｑ−Ｖｄ−ＯＰｈ、ＣｒｍＡ（牛痘ウイルスタンパク質）、ｐ３５（バキュロウイルスタンパク質）、Ｚ−ＡＴＡＤ−ＦＭＫ、ＩＮＦ−４Ｅ、Ｚ−ＤＱＭＤ−ＦＭＫ、Ａｚ  １０４１７８０８、Ｚ−ＬＥＥＤ−ＦＭＫ、ＺＶＤＫ−ＦＭＫ、ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ、ＩＮｆ−３９、ベルナカサン、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、およびエムリカサンからなる群から選択されるカスパーゼ阻害剤からなる群から選択される、［９２］の方法。
［９４］アポトーシス阻害剤は広域スペクトルカスパーゼ阻害剤である、［９３］の方法。
［９５］アポトーシス阻害剤はＢｏｃ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンである、［９４］の方法。
［９６］Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンは、約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在する、［９５］の方法。
［９７］Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンは、約２０μＭの濃度で存在する、［９６］の方法。
［９８］壊死阻害剤は、ＭＳ−１、ＩＭ−５４、ＧＳＫ−８７２、７−Ｃｌ−Ｏ−Ｎｅｃ１、ネクロスタチン−１、ネクロスルホンアミドからなる群から選択される、［７５］〜［９７］のいずれか１つの方法。
［９９］壊死阻害剤は、ＭＳ−１、ＩＭ−５４、ＧＳＫ−８７２、７−Ｃｌ−Ｏ−Ｎｅｃ１、ネクロスタチン−１、ネクロスルホンアミドからなる群から選択される、［９８］の方法。
［１００］壊死阻害剤は、ＭＬＫＬ阻害剤である、［９９］の方法。
［１０１］壊死阻害剤は、ネクロスルホンアミドである、［１００］の方法。
［１０２］ネクロスルホンアミドは、約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在する、［１０１］の方法。
［１０３］ネクロスルホンアミドは、約５０ｎＭの濃度で存在する、［１０２］の方法。［１０４］前記生検から得られた細胞は、皮膚線維芽細胞である、［２１］の方法。
［１０５］ステップｃ）で作製されるＧＡＢＡ作動性ニューロンは、前記ｉＰＳＣｓを、ｉ．約０日目〜約７日目に少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤、
ｉｉ．約０日目〜約２１日目にソニックヘッジホッグ経路の活性化剤、
ｉｉｉ約０日目〜約１４日目にｗｎｔ阻害剤、
ｉｖ．約７日目〜約１４日目にＢＭＰ阻害剤、
ｖ．約７日目〜約２１日目にＧＡＢＡ作動性種分化要因、ならびに
ｖｉ．約２１日目〜約２７日目にＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、およびγセクレターゼ阻害剤を含む神経成熟成長因子の組み合わせの存在下で培養することによって作製される、［１］〜［１０４］のいずれか１つの方法。
［１０６］前記少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤は、ヘスペレチン、ＳＢ４３１５４２、
ＳＢ５２５３３４、ガルニセルチブ、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ５０５１２４、ＬＤＮ−１９３１８９、ＬＤＮ−１９３１８９  ＨＣｌ、ＲｅｐＳｏｘ、Ａ  ８３−０１、ＤＭＨ１、ＬＤＮ−２１２８５４、ＩＴＤ  １、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ−２０８、ＥＷ−７１９７、ＭＬ３４７、Ｋ０２２８８、Ａ  ７７−０１、ＳＩＳ３、ＬＤＮ−２１４１１７、Ｒ−２６８７１２、ピルフェニドン、ノギン、コーディン、グレムリン、ＤＡＮタンパク質、およびＧＤＦ３からなる群から選択される、［１０５］の方法。［１０７］前記少なくとも２つのＳＭＡＤ阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９およびＳＢ４３１５４２である、［１０６］の方法。
［１０８］ＬＤＮ１９３１８９は約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在し、ＳＢ４３１５４２は約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在する、［１０７］の方法。
［１０９］ＬＤＮ１９３１８９は約１００ｎＭの濃度で存在し、ＳＢ４３１５４２は約１０μＭの濃度で存在する、［１０８］の方法。
［１１０］前記ソニックヘッジホッグシグナル伝達の活性化剤は、ソニックヘッジホッグ、ＧＳＡ１０、パルモルファミン、ＳＡＧ、およびＳＡＧ二塩酸塩からなる群から選択される、［１０５］〜［１０９］のいずれか１つの方法。
［１１１］前記ソニックヘッジホッグシグナル伝達の活性化剤はＳＡＧである、［１１０］の方法。
［１１２］ＳＡＧは、約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在する、［１１１］の方法。
［１１３］ＳＡＧは、約０．１μＭの濃度で存在する、［１１２］の方法。
［１１４］前記ｗｎｔ阻害剤は、ＩＣＧ−００１、サリノマイシン、ＩＷＲ−１、Ｗｎｔ−Ｃ５９、ＥＴＣ−１５９、ｉＣＲＴ３、ＩＷＰ２、ＩＷＰ−４、ピルビニウムパモ酸塩、ｉＣＲＴｌ４、ＦＨ５３５、ＣＣＴ２５１５４５、ＫＹＡ１７９７Ｋ、オウゴニン、ＮＣＢ−０８４６、ヘキサクロロフェン、ＰＮＵ−７４６５４、Ｋｙ０２１１、トリプトニド、ＩＷＰ１２、Ａｘｉｎ、ＧＳＫ、ＷＡＹ３１６６０６、Ｓｈｉｚｏｋａｏｌ  Ｄ、ＢＣ２０５９、ＰＫＦ１１５−５８４、ＩＣＧ−０１、クェルセチン、ＤＣＡ、ＬＹ２０９０３１４、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ−２１６７６３、ＮＳＣ６６８０３６、ＱＳ１１、Ｇ００７−ＬＫ、およびＧ２４４ＬＭからなる群から選択される、［１０５］〜［１１３］のいずれか１つの方法。
［１１５］前記ｗｎｔ阻害剤はＩＷＰ２である、［１１４］の方法。
［１１６］ＩＷＰ２は、約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在する、［１１５］の方法。
［１１７］ＩＷＰ２は、約５μＭの濃度で存在する、［１１６］の方法。
［１１８］前記ＢＭＰ阻害剤は、ヘスペレチン、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５２５３３４、ガルニセルチブ、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ５０５１２４、ＬＤＮ−１９３１８９、ＬＤＮ−１９３１８９  ＨＣｌ、ＲｅｐＳｏｘ、Ａ  ８３−０１、ＤＭＨ１、ＬＤＮ−２１２８５４、ＩＴＤ  １、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ−２０８、ＥＷ−７１９７、ＭＬ３４７、Ｋ０２２８８、Ａ  ７７−０１、ＳＩＳ３、ＬＤＮ−２１４１１７、Ｒ−２６８７１２、ピルフェニドン、ノギン、コーディン、グレムリン、ＤＡＮタンパク質、およびＧＤＦ３からなる群から選択される、［１０５］〜［１１７］のいずれか１つの方法。
［１１９］前記ＢＭＰ阻害剤はＬＤＮ−１９３１８９である、［１１８］の方法。
［１２０］ＬＤＮ−１９３１８９は、約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在する、［１１９］の方法。
［１２１］ＬＤＮ−１９３１８９は、約１００ｍＭの濃度で存在する、［１２０］の方法。
［１２２］前記ＧＡＢＡ作動性種分化要因は、線維芽細胞成長因子からなる群から選択される、［１０５］〜［１２１］のいずれか１つの方法。
［１２３］前記ＧＡＢＡ作動性種分化要因はＦＧＦ８である、［１２２］の方法。
［１２４］ＦＧＦ８は、約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在する、［１２４］の方法。
［１２５］ＦＧＦ８は、約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、［１２４］の方法。
［１２６］前記γセクレターゼ阻害剤は、ＤＡＰＴ、ＲＯ４９２９０９７、セマガセスタ
ット、アバガセスタット、ジベンザゼピン、Ｌｙ４１１５７５、ＩＭＲ−１、Ｌ−６８５，４５８、ＦＬＩ−０６、クレニガセスタット、ニロガセスタット、ＭＫ−０７５２、ベガセスタット、ＢＭＳ２９９８９７、コンパウンドＷ、ＤＢＺ、フルリザン、ＪＬＫ６、ＭＲＫ５６０、およびＰＦ３０８４０１４臭化水素酸塩からなる群から選択される、［１０５］〜［１２５］のいずれか１つの方法。
［１２７］前記γセクレターゼ阻害剤はＤＡＰＴである、［１２６］の方法。
［１２８］ＤＡＰＴは、約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在する、［１２７］の方法。
［１２９］ＤＡＰＴは、約２．５μＭの濃度で存在する、［１２８］の方法。
［１３０］前記神経成熟成長因子の組み合わせは、約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在するＢＤＮＦと、約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在するＧＤＮＦと、約１ｐＭ〜１００ｍＭの濃度で存在するＤＡＰＴと、を含む、［１０５］の方法。
［１３１］前記神経成熟成長因子の組み合わせは、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在するＢＤＮＦと、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在するＧＤＮＦと、約２．５μＭの濃度で存在するＤＡＰＴと、含む、［１０５］〜［１３０］のいずれか１つの方法。
［１３２］前記ｉＰＳＣは、０日目から約２４時間の期間、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養される、［１０５］〜［１３１］のいずれか１つの方法。
［１３３］前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンは有糸分裂後である、［７５］〜［１３２］のいずれか１つの方法。
［１３４］前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、Ｎｋｘ２．１、ｖＧＡＴ、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７の転写物を発現する、［７５］〜［１３３］のいずれか１つの方法。
［１３５］前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、ＧＡＤ６５／６７、ＧｌｙＴ２およびＶＧＡＴを発現する、［７５］〜［１３４］のいずれか１つの方法。
［１３６］ＧＡＢＡ作動性ニューロンの少なくとも９５％がＧＡＤ６５を発現する、［７５］〜［１３５］のいずれか１つの方法。
［１３７］前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団の少なくとも９５％がＶＧＡＴを発現する、［７５］〜［１３６］のいずれか１つの方法。
［１３８］前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、インビボでＧＡＢＡを分泌することができる、［７５］〜［１３７］のいずれか１つの方法。
［１３９］前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、レシピエントの神経系と機能的に一体化することができる、［７５］〜［１３８］のいずれか１つの方法。
［１４０］前記薬学的に許容される担体は、生理食塩水または水性緩衝液からなる群から選択される、［７５］〜［１３９］のいずれか１つの方法。
［１４１］前記組成物は、約１０００〜１０００万細胞／マイクロリットルの濃度でＧＡＢＡ作動性ニューロンを含む、［７５］〜［１４１］のいずれか１つの方法。
［１４２］前記組成物は、１００，０００細胞／マイクロリットルの濃度でＧＡＢＡ作動性ニューロンを含む、［１４１］の方法。
［１４３］対象における不十分な抑制性介在ニューロンの活性または増大した興奮性ニューロン機能を処理するための、［１］〜［６２］のいずれか１つの移植組成物。
［１４４］対象における神経学的状態、疾患または障害を治療するための、［１］〜［６２］のいずれか１つの移植組成物。
［１４５］神経学的状態、疾患または障害は、不十分な抑制性介在ニューロンの活性によって特徴づけられる、［１４４］による使用のための、［１］〜［６２］のいずれか１つの移植組成物。
［１４６］神経学的状態、疾患または障害は、神経変性疾患、神経学的損傷、または神経障害性疼痛から選択される、［１４４］による使用のための、［１］〜［６２］のいずれか１つの移植組成物。
［１４７］前記神経学的状態、疾患または障害は、慢性神経障害性疼痛、慢性炎症性疼痛、慢性機能障害性疼痛、てんかん、運動ニューロン疾患（ＡＬＳ、ＳＭＡ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、多発性硬化症、タウオパチー（進行性核上麻痺、ピック病、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、前頭側頭型認知症、ＡＬＳを伴うＦＴＬＤ）、ハン
チントン病、アルコール離脱およびアルコール依存症、糖尿病誘発性脳損傷、頭部損傷、偏頭痛、頭痛、クラスター頭痛、脊髄損傷、虚血性障害、化学療法誘発性疼痛および化学療法誘発性神経障害、統合失調症、慢性うつ病、遅発性ジスキネジア、双極性疾患、および神経障害からなる群から選択される、［１４４］による使用のための、［１］〜［６２］のいずれか１つの移植組成物。
［１４８］対象における神経障害性疼痛を治療するための、［１］〜［６２］のいずれか１つの移植組成物。
［１４９］前記神経障害性疼痛は、炎症、坐骨神経痛、腰痛、癌性疼痛、糖尿病性神経障害、事故による外傷、脊髄損傷、末梢神経損傷に関連する、［１４８］による使用のための、［１］〜［６２］のいずれか１つの移植組成物。
［１５０］対象におけるアロディニアを治療するための、［１］〜［６２］のいずれか１つの移植組成物。
［１５１］前記投与は、前記対象の脊髄に前記移植組成物を注射することを含む、［１４３］〜［１５０］のいずれか１つによる使用のための、［１］〜［６２］のいずれか１つの移植組成物。
［１５２］前記注射は定位注射による、［１５１］による使用のための、［１］〜［６２］のいずれか１つの移植組成物。
［１５３］対象はヒトである［１４３］〜［１５２］のいずれか１つによる使用のための、［１］〜［６２］のいずれか１つの移植組成物。
［１５４］対象における神経学的状態、疾患または障害の治療のための薬物の製造のための、［１］〜［６２］のいずれか１つの移植組成物の使用。
［１５５］神経学的状態、疾患または障害は、不十分な抑制性介在ニューロンの活性によって特徴づけられる、［１５４］の使用。
［１５６］神経学的状態、疾患または障害は、神経変性疾患、神経学的損傷、または神経障害性疼痛から選択される、［１５４］または［１５５］の使用。
［１５７］前記神経学的状態、疾患または障害は、慢性神経障害性疼痛、慢性炎症性疼痛、慢性機能障害性疼痛、てんかん、運動ニューロン疾患（ＡＬＳ、ＳＭＡ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、多発性硬化症、タウオパチー（進行性核上麻痺、ピック病、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、前頭側頭型認知症、ＡＬＳを伴うＦＴＬＤ）、ハンチントン病、アルコール離脱およびアルコール依存症、糖尿病誘発性脳損傷、頭部損傷、偏頭痛、頭痛、クラスター頭痛、脊髄損傷、虚血性障害、化学療法誘発性疼痛および化学療法誘発性神経障害、統合失調症、慢性うつ病、遅発性ジスキネジア、双極性疾患、および神経障害からなる群から選択される、［１５６］の使用。
［１５８］対象における神経障害性疼痛の治療のための薬物の製造のための、［１］〜［６２］のいずれか１つの移植組成物の使用。
［１５９］前記神経障害性疼痛は、炎症、坐骨神経痛、腰痛、癌性疼痛、糖尿病性神経障害、事故による外傷、脊髄損傷、末梢神経損傷に関連する、［１５８］の使用。
［１６０］対象におけるアロディニアの治療のための薬物の製造のための、［１］〜［６２］のいずれか１つの移植組成物の使用。
［１６１］前記薬物は、前記対象の中枢神経系への投与のために製剤化される、［１５４］〜［１６１］のいずれか１つに記載の使用。
［１６２］前記薬物は、前記対象の脊髄への注射のために製剤化される、［１５４］〜［１６１］のいずれか１つに記載の使用。
［１６３］前記注射は定位注射である、［１６２］の使用。
［１６４］対象はヒトである、［１５４］〜［１６３］のいずれか１つによる使用。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によるＧＡＢＡ作動性ニューロンおよびそれを含む組成物は、対象の神経系における中枢性抑制を回復または強化するための、ならびに神経機能障害または異常に関連する神経学的状態、疾患および障害を治療するための細胞ベースの治療に使用することがで
きる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ショウジョウバエは、損傷後にアロディニアを示す。（Ａ）損傷のない野生型動物は、≧４２℃の温度に反応して逃避行動を示す：この反応は、ｐａｉｎｌｅｓｓおよびＴｒｐＡ１に依存する（ｎ＝１２、１回の反復実験当たり１０匹の動物）。（Ｂ）この研究で用いた切断損傷。（Ｃ）損傷後のアロディニア反応（３８℃）の経時変化。（Ｄ）損傷の１４日後の温度に対する用量反応（ｎ＝９、１回の反復実験当たり１０匹の動物）。（Ｅ）Ｃａｎｔｏｎ  Ｓデータにおける損傷のない無傷の対照または損傷後７日の動物の平均移動速度を平均±ＳＥＭとして表す。＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意ではない、双方向ＡＮＯＶＡ、続いてＡ、Ｃ〜Ｄについてのチューキーの事後検定、およびＥについてのスチューデントのｔ検定。
【図２】損傷後のアロディニアには、ｐｐｋ＋感覚ニューロンにＴｒｐＡ１が必要である。（Ａ）ハエ脚におけるｐｐｋ＋感覚ニューロンの投射。（Ｂ）ラミン−ＧＦＰで標識した脚のｐｐｋ＋細胞体。（Ｃ）切断された脚からＶＮＣおよび脳へのｐｐｋ＋感覚ニューロンの投射。（Ｄ）ｐｐｋ＋感覚ニューロン中の不活性破傷風毒素（ｉＴＮＴ）の発現ではなく、活性破傷風毒素（ＴＮＴ）の発現が、全ての成体の熱侵害防御行動を阻止した（ｎ＝９匹の動物、１回の反復実験当たり１０匹の動物）。（Ｅ）ＴｒｐＡ１およびｐａｉｎｌｅｓｓ変異体は、熱アロディニア（３８℃）に耐性である。（Ｆ）損傷後のアロディニアには、ｐｐｋ＋感覚ニューロンにＴｒｐＡ１が特異的に必要である（ｎ＝９、１回の複製につき１０匹）。（Ｇ）ｐｐｋ＋感覚ニューロンにおけるＴｒｐＡ１の特異的な再導入は、アロディニア反応をレスキューする（ｎ＝９、１回の反復実験当たり１０匹の動物）。データは平均値±ＳＥＭとして表される。＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意ではない、ＡＮＯＶＡ、続いてチューキーの事後検定。
【図３】末梢損傷は、感覚性ニューロパチー、中枢感作、および侵害受容逃避回路の増強をもたらす。（Ａ〜Ｂ）（Ａ）無傷の中脚からの刺激（ｎ≧７）、（Ｂ）切断後７日の損傷脚における刺激（ｎ≧７）後の、ＤＬＭからの電気生理学的記録、巨大線維系の出力。（Ｃ）ｐｐｋ＋感覚性ニューロパチーは、脚切断後に観察される。（Ｄ）切断された脚における感覚性ニューロパチーの経時的な定量化（ｐｐｋ１＋投射長）（ｎ≧７）。（Ｅ）損傷後の成体の侵害受容の電気生理学的調製。（Ｆ〜Ｈ）脚の切断は、（Ｆ、Ｇ）逃避回路速度の増加（速度差をマゼンタで強調表示）、（Ｆ、Ｈ）逃避反応の持続時間の増加（損傷持続時間を緑色で強調表示）を伴って、逃避反応回路の対側感作をもたらす（ｎ≧９）。データは平均値±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、双方向ＡＮＯＶＡ、続いてＤについてのチューキーの事後検定、ならびにＧおよびＨについてのマン・ホイットニー・ウィルコクソン検定。
【図４】ＧＡＢＡゲート末梢活性：末梢神経損傷がＧＡＢＡ作動性機能を低下させる。（Ａ）ｐｐｋ＋感覚ニューロンの腹側神経索（ＶＮＣ）への投射。黄色のｐｐｋ−Ｇａｌ４＞ＵＡＳ−ＣＤ８−ＧＦＰ、緑色の抗ＧＡＢＡ、マゼンタのｎｃ８２対比染色は、抗ＧＡＢＡおよびｐｐｋ−Ｇａｌ４＞ＵＡＳ−ＣＤ８−ＧＦＰが共局在する腹部上面像、ならびに抗ＧＡＢＡおよびｐｐｋ−Ｇａｌ４＞ＵＡＳ−ＣＤ８−ＧＦＰが共局在する接線側面像を示している。（Ｂ）腹部上面像を拡大して示した、無傷の損傷のない動物および損傷のある動物（脚切断後７日）のＧＡＢＡおよびｎｃ８２について染色されたＶＮＣの損傷後のＧＡＢＡ免疫反応性の低下。（Ｃ）ｐｐｋ−Ｇａｌ４＞ＴＮＴを発現するハエのＧＡＢＡおよびｎｃ８２について染色されたＶＮＣ中のＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの画像。（Ｄ）核標識ラミン−ＧＦＰ（Ｇａｄ１−Ｇａｌ４＞ＵＡＳ−ラミン−ＧＦＰ）および活性カスパーゼ抗体によるＶＮＣの画像。（Ｅ）カスパーゼ阻害剤ｐ３５の異所性発現は、脚損傷後のＧＡＢＡ作動性細胞死を阻止する。（Ｆ〜Ｇ）ｐ３５（Ｇａｄ１−Ｇａｌ４＞ＵＡＳ−ｐ３５）のＧＡＢＡ作動性特異的発現は、（Ｆ）逃避回路速度、（Ｇ）逃避反応持続時間によって測定される逃避反応回路の対側感作をレスキューした（ｎ≧９）。（Ｈ）ＵＡＳ−ｐ３５のＧａｄ１−Ｇａｌ４駆動発現によるＧＡＢＡ作動性細胞死の阻止は、神経障害性アロディニア行動を防止する（ｎ＝９、１回の反復実験当たり１０匹の動物）。（Ｉ）ＧＡＢＡ受容体Ｄ−ＧＡＢＡ−Ｂ−Ｒ２の侵害受容感覚ニューロン特異的（ｐｐｋ−Ｇａｌ４）ノックダウンであって、それが、損傷のないハエにおいてアロディニア（３８℃）を引き起こすのに十分であることを示している（ｎ≧９、１回の反復実験当たり１０匹の動物）。データは平均値±ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、ｎｓ：有意ではない、双方向ＡＮＯＶＡ、続いてチューキーの事後検定。
【図５】純粋なＧＡＢＡ作動性ニューロンは、ｈｉＰＳＣから効率的に誘導することができる。（Ａ）末梢神経損傷がマウスにおける疼痛ゲートの抑制を誘導することを示す概略図。正常な疼痛の回復のための潜在的な臨床戦略は、紫色のｉＰＳＣ由来ＧＡＢＡニューロンの注射である。（Ｂ）内側基底核隆起型ＧＡＢＡ作動性ニューロンの誘導体の分化プロトコル。（Ｃ）分化中のＧＡＢＡニューロンの明視野画像。典型的なマーカー、核ＤＡＰＩ、ＴＵＢＢ３、ＧＡＤ６５／６７、および純度を示すマージチャネルを発現する成熟ＧＡＢＡ作動性ニューロンのＤＩＶ２８画像。（Ｄ）分化のＤＩＶ２５におけるｈｉＰＳＣ由来ＧＡＢＡニューロンのＦＡＣＳ解析。左：紫色のＴＵＢＢ３＋細胞を示すヒストグラム（灰色、アイソタイプ対照抗体）。中央：紫色のＧＡＤ６５発現細胞（灰色、アイソタイプ対照抗体）。右：ｈｉＰＳＣ由来ＧＡＢＡニューロン、ＧＡＤ６５に対するＴＵＢＢ３のドットプロット。（Ｅ）ｈｉＰＳＣに対するＧＡＢＡ作動性ニューロンのＲＮＡＳｅｑ正規化ＦＫＰＭ、ｎ＝３のｈｉＰＳＣおよびｎ＝４のＧＡＢＡニューロン（独立した分化由来）（Ｆ）ＨｉＰＳＣに対するＤＩＶ２５ニューロンで実施したプロテオミクス（群当たりｎ＝３）、正規化されたｉＢＡＱ強度のヒートマップ。（Ｊ）Ｋｉ６７の染色は、いくつかの増殖細胞がＤＩＶ２５に残っていることを示す。（Ｈ〜Ｉ）ＤＩＶ２５のニューロンの画像。（Ｈ）ＶＧＡＴを発現するニューロンおよび（Ｉ）はＧＡＢＡ免疫反応性である。
【図６】ヒトｉＰＳＣ由来のＧＡＢＡ作動性ニューロンは、インビトロで機能する。（Ａ）ＤＩＶ２５のＧＡＢＡ作動性ニューロンの培地中のＧＡＢＡ濃度。（Ｂ）イオンチャネル型グルタミン酸受容体サブユニット発現の正規化ＦＰＫＭ。（Ｃ）グルタミン酸およびＫＣｌを添加した後のカルシウム一過性の代表的な画像。（Ｄ）細胞によって示されるカルシウム一過性の定量化（ｎ＝５０）。
【図７】ヒトｉＰＳＣ由来のＧＡＢＡ作動性ニューロンの脊髄移植は、接触性アロディニアを緩和する。（Ａ）神経部分損傷（末梢神経障害性疼痛モデル）後のＬ１へのＧＡＢＡ作動性ニューロンの椎間板切除に基づく脊髄挿入の戦略の概略図およびインビボ実験のタイムライン。（Ｂ）神経損傷およびＧＡＢＡ作動性ニューロンの脊髄移植後の損傷マウスの正規化ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値。（ｎ＝２１のビヒクル、２９のＧＡＢＡ作動性ニューロン）、（Ｃ）２ヶ月時の神経損傷マウスに関する刺激反応曲線（ｎ＝１２のビヒクルおよびｎ＝１６のＧＡＢＡ作動性ニューロン）、（Ｄ〜Ｅ）オープンフィールドパラダイムを使用した実験後のマウスのオープンフィールド運動分析、および（Ｆ）同側修飾Ｂａｓｓｏマウスの歩行分析スケールスコア。これらの実験では、ｎ＝９のビヒクル、ｎ＝１３のＧＡＢＡ作動性ニューロン移植である。（Ｇ）アセトン冷アロディニア反応。（Ｈ）ナイーブマウスにおける実験後の正規化ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値。（ｎ＝１１）（Ｉ）神経損傷およびｉＳｅｎｓｏｒｙニューロン注射後の正規化フォン・フレイ閾値。ｎ＝７。Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉについてボンフェローニ補正を伴う反復測定ＡＮＯＶＡを用いて行った多重比較。ボンフェローニ補正を伴うＢについての双方向ＡＮＯＶＡ。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図８】ヒトｉＰＳＣ由来のＧＡＢＡ作動性移植片は生存し、内因性回路と統合する。（Ａ）神経部分損傷後のｈｉＰＳＣ由来ＧＡＢＡ作動性ニューロンの脊髄注射の概略図およびタイムライン（末梢神経障害性疼痛モデル）。（Ｂ〜Ｃ）注入された同側後角で、移植されたヒトＧＡＢＡ作動性ニューロンが同定され、ヒト核（赤色）、抗ＩＢ４（青色）、およびＣＧＲＰ（緑色）（Ｂ−Ｂ’‘）に対する抗体、またはヒト核（赤色）およびシナプシン（緑色）（Ｃ−Ｃ’‘）に対する抗体で染色される。（Ｄ〜Ｄ’‘）移植したヒト核（赤色）は、ＧＡＢＡ合成マーカーＧＡＤ６５／６７（緑色）と共局在する。（Ｅ〜Ｅ’‘）ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、ＴＵＢＢ３およびヒトＮＣＡＭの共局在化によって評価されるように、移植時のニューロン表現型を維持する。（Ｆ〜Ｆ’‘‘）ヒト細胞質（緑色）がマウス特異的バスーン（赤色）に並置され、これがマウスのシナプス前活性帯を標識し、推定上のマウス対ヒト移植片シナプスを示す。
【図８】ヒトｉＰＳＣ由来のＧＡＢＡ作動性移植片は生存し、１０週間後に内因性回路と統合することができる。（Ａ）細胞が広範囲に移動する。（Ｂ）細胞が後角内に位置する。（Ｃ）ヒトＮｕｃｌｅｉがＮｅｕＮと共局在する。（Ｄ）ヒトニューロン接着分子は、ＭＡＰ２と共局在する。（Ｅ）ヒト細胞質は、ＴＵＢＢ３と共局在する。（Ｆ）ＧＡＢＡは、ヒト細胞質陽性細胞に見られる。（Ｇ）ＧＡＤ６５／６７は、推定ヒトシナプスで見られる。（Ｈ）シナプス小胞に位置するヒト細胞は、ＶＧＡＴに対して陽性である。（Ｉ）ヒト細胞がマウスバスーン、ＲＩＭ２に並置される。（Ｊ）電位依存性カルシウムチャネル（ＶＧＣＣ）がヒト細胞に見られる。（Ｋ）リプリンは、推定ヒトシナプスで見られる。（Ｌ〜Ｎ）シナプシンに位置するヒト細胞質がゲフィリンに並置して位置することから、シナプス後発達が示唆される。（Ｏ）ＳＳＴがヒト細胞に見られる。（Ｐ）パルブアルブミンがヒト細胞に見られる。（Ｑ〜Ｒ）脊髄におけるヒト核ではなく、陽性対照マウス皮膚におけるＫｉ６７の染色。
【図１０】損傷は、腹側神経索（ＶＮＣ）および脳に持続的なアロディニアおよびｐｐｋ＋感覚ニューロンの投射を引き起こす。（Ａ〜Ｂ）（Ａ）損傷後１日、（Ｂ）損傷後７日の温度に対するアロディニアの用量反応（ｎ＝９、１回の反復実験当たり１０匹の動物）（Ｃ）ｐｐｋ−Ｇａｌ４（ｐｐｋ−Ｇａｌ４＞ＵＡＳ−ＣＤ８−ＧＦＰ）（黄色）によって駆動され、ｎｃ８２（マゼンタ）について共染色されたＣＤ８−ＧＦＰを発現するハエの脳および付随するＶＮＣと（Ｃ）腹部上面図、および（Ｄ）ＶＮＣの第２の葉の腹部上面像および接線側面像、ｎ＝６（Ｅ）ｐｐｋ−Ｇａｌ４＞ＵＡＳ−ＣＤ８−ＧＦＰハエの接続された脳、接着されたＶＮＣ、および腿節セグメントの一部（ＧＦＰは緑色）、ｎ＝５。
【図１１】末梢損傷は、侵害受容逃避回路の電気生理学的特性に変化を引き起こす。（Ａ〜Ｂ）巨大線維反応は、高次脳機能を必要とする。（Ａ）頭部を除去したハエの巨大線維ニューロンからの直接刺激（ｎ≧７）。（Ｂ）頭部を除去したハエの無傷の中脚からの刺激（ｎ≧７）。（Ｃ）損傷したハエの頭部からの下行刺激は、依然として反応潜時の短縮を示す（ｎ≧９）。（Ｄ）末梢損傷後の中枢ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン損失の画像；損傷のない動物および損傷のある動物からのＧＡＢＡ（緑色）およびｎｃ８２（マゼンタ）について染色されたＶＮＣの接線像（脚切断後７日）。（Ｅ〜Ｆ）（Ｅ）Ｃａｎｔｏｎ  Ｓ、およびｐｐｋ−Ｇａｌ４＞ＴＮＴを発現するハエの、同側および対側からの無傷のおよび損傷のあるＶＮＣにおける抗ＧＡＢＡ焦点の定量化。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１  Ｃについてのマン・ホイットニー−ウィルコクソン検定、ならびにＥおよびＦについてのスチューデントｔ検定。
【図１２】末梢損傷による、脳ではなくＶＮＣにおけるＧＡＢＡ免疫反応性の低下（Ａ〜Ｃ）。対照無傷ハエおよび損傷のあるハエにおいて、抗ＧＡＢＡ（緑色）で染色され、マゼンタの抗ｎｃ８２で共染色された、ＶＮＣおよび脳のＧＡＢＡ焦点の画像化および定量化。（Ａ）損傷のない動物および損傷のある動物からの第１のＶＮＣ葉の腹部上面像（Ｂ）損傷のない動物および損傷のある動物からの第３のＶＮＣ葉。（Ｃ）損傷のない動物および損傷のある動物からの脳、群当たりｎ≧７匹の動物。（Ｄ）核標識ラミン−ＧＦＰ（Ｇａｄ１−Ｇａｌ４＞ＵＡＳ−Ｌａｍｉｎ−ＧＦＰ）を発現するハエの第２のＶＮＣ葉におけるＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの定量化。（Ｅ）核標識ラミン−ＧＦＰを発現するハエの対照無傷および損傷ＶＮＣからのＧＡＢＡ／活性カスパーゼ二重陽性細胞の定量化（Ｆ）脚損傷後のＧＡＢＡ作動性細胞死をブロックするカスパーゼ阻害剤ｐ３５を発現するハエの第２のＶＮＣ葉におけるＧＡＢＡ焦点の定量化。（Ｇ）Ｇｒｄ、ＧＡＢＡ−Ｂ−Ｒ１、またはＧＡＢＡ−Ｂ−Ｒ３ではなくＲｄｌのノックダウンが、損傷のないハエにおいてアロディニアを引き起こす（ｎ≧９、１回の反復実験当たり１０匹のハエ）。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｎｓ：有意ではない、Ａ〜Ｃ、Ｄ〜Ｆについてのスチューデントのｔ検定、ＡＮＯＶＡ、続いてＧについてのチューキーの事後検定。
【図１３】ｈｉＰＳＣおよびｈｉＰＳＣ由来の感覚ニューロンと比較したＧＡＢＡ作動性ニューロンのＲＮＡＳｅｑ。（Ａ）ＲＮＡｓｅｑ試料の階層的クラスタリングにより、予想されるクラスターを得た。（Ｂ）ＲＮＡｓｅｑは、ＧＡＢＡの合成および放出に必要な全ての成分を発現するＧＡＢＡ作動性ニューロンを示す。（Ｃ）ＧＡＢＡニューロンは、ＡＭＰＡ型およびＮＭＤＡ型の両方を含む複数のイオンチャネル型グルタミン酸受容体を発現する。（Ｄ）多能性マーカーならびに細胞周期および増殖細胞マーカーのためにＧＡＢＡ作動性ニューロンが枯渇する。（Ｅ）ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、オリゴデンドロ細胞の転写マーカーについて濃縮されるが、オリゴデンドロ細胞の他のマーカー、または星状細胞もしくはミクログリアのマーカーを発現しない。（Ｆ）選択されたＧＡＢＡ合成遺伝子のｑＰＣＲによる検証。
【図１４】分化シグネチャおよびサブタイプ分類。（Ａ）ＧＡＢＡ作動性特定の異質性を示すＧＡＢＡ作動性分化の概略図。（Ｂ）半定量的に発現した発現を示すＲＮＡＳｅｑ（正規化）による分類マーカーの測定。（Ｃ）ニューロンは、この発達段階では主にＰＶＡＬＢ−ｖｅ／ＳＳＴ＋ｖｅ表現型であった。それらを複数の表現型に下位分類する。いくつかの明確に達成されたＣＧＥマーカーおよびサブタイプ分類が、ＣＧＥについて示される。
【図１５】ｈｉＰＳＣに対するＧＡＢＡ作動性ニューロンのプロテオミクス解析。（Ａ）主成分分析により、予想される試料のクラスタリングを得た。（Ｂ）プロテオミクスデータの火山プロット。（Ｃ）ＧＡＢＡ作動性ニューロンにおける差次的に発現した遺伝子のＲｅａｃｔｏｍｅ経路分析。（Ｄ）ＧＡＢＡ合成経路でｉＢＡＱ値を正規化した。（Ｅ）ＧＡＢＡ作動性マーカーＧＡＤ６５およびグリシン作動性マーカーＧｌｙＴ２の検証のウェスタンブロット。群あたりＮ＝３。
【図１６】移植片による行動学的特徴。（ａ）有意な鎮痛を示す３週目および４週目の刺激反応曲線。（ｂ）ＧＡＢＡ作動性移植片（左）、ナイーブ移植片（中）および感覚移植片（右）のデータ分布、（ｃ）感覚ニューロン移植の３週間後の刺激反応曲線。培地ではなく感覚ニューロン移植が痛覚過敏を引き起こした。（ｄ）ナイーブマウスへのＧＡＢＡ作動性ニューロンの注射は効果を示さなかった。
【図１７】神経障害性マウスにおける疼痛を緩和するためのＳＳＴ対ＰＡＶＢ（濃縮）ｈｉＰＳＣ−ＧＡＢＡニューロンの有効性。（Ａ〜Ｂ）３週目にＢＭＰ４で処理したまたは処理しなかったＤＩＶ２５のｈｉＰＳＣ−ＧＡＢＡニューロンにおける（Ａ）ＰＡＶＢおよび（Ｂ）ＳＳＴ発現のｑＰＣＲ分析。（Ｃ）ＢＭＰ４で処理したｈｉＰＳＣ−ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンは、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値によって評価されるように、神経損傷マウスで移植した場合により大きな鎮痛効果を示す；（Ｄ）移植したｉＧＡＢＡ作動性ＰＡＶＢ濃縮ニューロンは、移植後５週間後にそれぞれのベースライン対照と比較して有意な差を示さない（すなわち、疼痛はＳＮＩ動物において完全に正常に戻る）。ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値は、５０％足の引っ込め閾値である。（特に明記しない限り、治療培地と比較した２元配置ＡＮＯＶＡ、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、Ｐ＜０．０５＊、Ｐ＜０．０００１＊＊＊＊）
【発明を実施するための形態】
【００１０】
定義
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、単一の細胞だけでなく、細胞の集団（すなわち、１つより多く）も指す。集団は、１つの細胞型を含む純粋な集団、例えば、ニューロン細胞の集団または未分化幹細胞の集団であり得る。代替的に、集団は、１つより多くの細胞型を含んでもよく、例えば、混合細胞集団を含んでもよい。集団内の細胞の数を制限することを意図するのではなく、例えば、細胞の混合集団は、少なくとも１つの分化細胞を含み得る。一実施形態において、混合集団は、少なくとも１つの分化集団を含み得る。本発明では、細胞集団が含むことができる細胞型の数に制限はない。
【００１１】
本明細書で使用される場合、分化中の細胞系の細胞に関して使用される場合、「分化」という用語は、細胞が、１つの細胞型（例えば、複能性、全能性、または多能性の分化可能細胞）から標的分化細胞等の別の細胞型に分化するプロセスを指す。したがって、本明細書で使用される「細胞分化」という用語は、あまり特化していない細胞（例えば、幹細胞）が、より明確な形態および機能を有する（すなわち、より特化する）ように発達または成熟する特殊分化プロセスまたは経路を指す。
【００１２】
本明細書で使用される場合、「脱分化」または「脱分化した」という用語は、細胞に関して使用される場合、より明確な形態および機能、ならびに／または制限された自己再生および／または増殖能を有するより特化した細胞が、あまり特化しなくなり、より大きな自己再生および／または増殖能または分化能（例えば、複能性、多能性等）を獲得するプロセスを指す。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、脱分化細胞の一例である。したがって、脱分化は、細胞再プログラムのプロセスを指すことができる。
【００１３】
本明細書で使用される場合、細胞に関して「神経細胞分化を誘導する」という用語は、デフォルトの細胞型（遺伝子型および／または表現型）を非デフォルトの細胞型（遺伝子型および／または表現型）に変化させることを指す。したがって、細胞がニューロンの表現型を得ることができるように「細胞におけるニューロンの分化を誘導すること」または「細胞を分化させること」は、細胞がニューロン特性を有するように誘導すること、または細胞の本来の同一性とは異なるニューロン特性、例えば、遺伝子型（すなわち、ＰＣＲまたはマイクロアレイ等の遺伝子解析により決定される遺伝子発現の変化）および／または表現型（すなわち、β−ＩＩＩチューブリン等のタンパク質、またはβ−ＩＩＩチューブリン、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）、シナプシン、神経フィラメント−Ｌ、ネスチンおよびＮ−Ｃａｍ、Ｔｕｊ１、ＧＡＤ６５／６７、ＴＵｊ１、ＧｌｙＴ２およびＶＧＡＴのうちの２つ以上の組み合わせを含む複数のタンパク質の形態、機能および／または発現の変化）等を有する子孫細胞に分裂するように細胞を誘導することを含む。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「ニューロン」という用語は、成熟した有糸分裂後ニューロンの機能特性および／または表現型特性を示す神経系統の分化した系統コミット細胞、または成熟した有糸分裂後ニューロンのさらなる機能特性および／または表現型特性を示すために、インビボまたはインビトロのいずれかでさらなる成熟を必要とする神経系統の分化した系統コミット細胞を指す。ニューロンは、以下のマーカーのうちの１つ以上を発現することができる：β−ＩＩＩチューブリン、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）、シナプシン、神経フィラメント−Ｌ、ネスチンおよびＮ−Ｃａｍ、Ｔｕｊ１、ＧＡＤ６５／６７、ＴＵＪ１、ＧｌｙＴ２、およびＶＧＡＴ。「ＧＡＢＡ作動性ニューロン表現型」または「ＧＡＢＡ作動性ニューロン」は、成熟した有糸分裂後ニューロンの機能特性および／または表現型特性を示し、かつβ−ＩＩＩチューブリン、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）、シナプシン、神経フィラメント−Ｌ、ネスチンおよびＮ−Ｃａｍ、Ｔｕｊ１、ＧＡＤ６５／６７、ＴＵＪ１、ＧｌｙＴ２、およびＶＧＡＴのうちの１つ以上を発現し、ＧＡＢＡを産生する、神経系統の分化した系統コミット細胞を指す。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「阻害」、「阻害すること」、および「阻害」という用語は、活性または量の低減、減少、不活性化、下方制御、排除または抑制を指す。したがって、本明細書で使用される場合、「阻害剤」という用語は、分子の遺伝子もしくはタンパク質発現ならびに／または分子の活性および／もしくは機能に干渉する（すなわち、低減、減少、不活性化、下方制御、排除または抑制する）薬剤を指す。例えば、シグナル伝達分子またはシグナル伝達分子の経路を阻害すること（ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤等）に関して、阻害剤は、ＳＭＡＤシグナル伝達経路に関与する実体の遺伝子もしくはタンパク質発現、ならびに／またはシグナル伝達分子の活性および／もしくは機能、または分子
もしくは経路のシグナル伝達機能に干渉する薬剤を指す。同様に、ＢＭＰ、ｗｎｔ、γセクレターゼ等の阻害剤に関して、阻害剤は、ＢＭＰ、ｗｎｔ、γセクレターゼ等の発現または活性または機能に干渉する薬剤を指す。
【００１６】
本明細書で使用される場合、細胞を本発明によって定義される化合物と「接触させる」という用語は、「接触された」細胞を生成するために、化合物が細胞に接触することを可能にする場所に化合物を配置することを指す。接触させることは、任意の好適な方法を用いて達成され得る。例えば、一実施形態において、接触は、化合物を細胞の容器（例えば、試験管、バイアルまたは培養フラスコまたは培養皿等）に添加することによって行われる。接触させることは、化合物を細胞の培養物に添加することによっても達成され得る。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、全能性または多能性または複能性であり、胚性幹細胞、臓器から単離された幹細胞等の１つ以上の異なる細胞型に分化することができる細胞を指す。本明細書で使用される場合、「成体幹細胞」という用語は、出生後の生物に由来する幹細胞を指す。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「神経幹細胞」または「ＮＳＣ」または「神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）」または「神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ
ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）」は、インビボでニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイト、およびグリア細胞、ならびに培養中のニューロン細胞子孫およびグリア子孫になることができる細胞を指す。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「多能性」という用語は、任意の（または複数の）分化細胞型（複数可）に分化することができる細胞株を指す。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「複能性」という用語は、少なくとも２つの分化細胞型に分化することができる細胞株を指す。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「初代細胞」という用語は、培養物の非存在下で動物の組織（例えば、血液）または器官から直接得られる細胞である。典型的には、必ずしもそうではないが、初代細胞は、老化および／または増殖の停止の前に、インビトロで１０回以下の継代を経ることができる。
【００２２】
「誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または（ｉＰＳ細胞）」は、例えば、体細胞にあまり分化していない表現型を付与する外因性遺伝子を導入することによって、再プログラムまたは「脱分化」された体細胞に関する表記である。次いで、これらの細胞を誘導して、あまり分化していない子孫に分化させることができる。ＩＰＳ細胞は、２００６年に最初に発見されたアプローチの変形例を用いて導出された（Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，１：３９−４９（２００７））。例えば、一例では、ｉＰＳ細胞を作製するために、科学者は、皮膚細胞から開始して、その後、レトロウイルスを用いて細胞ＤＮＡに遺伝子を挿入する標準的な実験技法によって修飾した。一例では、挿入された遺伝子は、細胞を胚性幹細胞様状態に維持するために天然調節因子として一緒に作用することが知られているＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｆ４、およびｃ−ｍｙｃであった。これらの細胞は、文献に記載されている。例えば、非特許文献１〜４を参照されたい。そのような細胞は、特定の培養条件（特定の薬剤への曝露）によって作製されてもよく、また様々な異なる出発細胞型から作製されてもよい。非特許文献１〜４は全て、ＩＰＳＣの教示およびそれらの製造方法のために参照により組み込まれる。
【００２３】
ｉＰＳ細胞は、胚性幹細胞の多くの特徴を有する。例えば、それらは、生殖細胞株伝達および四倍体相補性を有するキメラを作製する能力を有し、それらはまた、３つの胚性胚
葉から様々な細胞型を含有する奇形腫を形成することもできる。他方では、一部の報告書に示されているように、それらは同一ではない場合がある。例えば、誘導多能性幹細胞および胚性幹細胞が遺伝子発現シグネチャによって区別され得ることを示す非特許文献５を参照されたい。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「細胞株」という用語は、初代細胞株、有限細胞株、連続細胞株、および形質転換細胞株を含むが、細胞が培養中に無限の回数の継代ができることを必要としない、インビトロで培養される細胞を指す。細胞株は、自発的に、または形質転換によって作製され得る。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「細胞培養」という用語は、細胞の任意のインビトロ培養を指す。「培養」という用語は、細胞を成長させるおよび／または維持するおよび／または操作するプロセスを指す。この用語には、連続した細胞株（例えば、不死化表現型を有する）、初代細胞培養物、有限細胞株（例えば、非形質転換細胞）、および卵母細胞および胚を含む、インビトロで維持される任意の他の細胞集団が含まれる。本明細書で使用される場合、「初代細胞培養物」および「初代培養物」という用語は、例えば、動物またはヒト由来の組織標本または生検から等、インビボで細胞から直接得られた細胞培養物を指す。これらの培養物は、成人ならびに胎児組織に由来し得る。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「培養培地」および「細胞培養培地」という用語は、インビトロでの細胞の成長（すなわち、細胞培養物、細胞株等）を支持するのに適した培地を指す。この用語は、任意の特定の培養培地に限定されることを意図するものではない。例えば、この定義は、維持培地だけでなく、細胞の分化または特殊分化のための他の培地も包含することが意図される。実際、この用語は、目的とする細胞培養物および細胞の成長に好適な任意の培養培地を包含することが意図される。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「キット」という用語は、材料を送達するための任意の送達システムを指す。細胞分化の文脈において、キットは、幹細胞を接触させるための材料の組み合わせを指してもよく、そのような送達システムは、適切な容器（試験管等）内の反応試薬（例えば、化合物、タンパク質、検出剤（プローブまたは抗体等）、および／または支持材料（例えば、緩衝液、細胞分化を行うための書面による指示書等）を、１つの場所から別の場所へ保管、輸送、または送達することを可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連する反応試薬（阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２およびＬＤＮ１９３１８９  ｗｎｔ阻害剤、ｂｍｐ阻害剤、アポトーシス阻害剤、壊死阻害剤）ならびに成長因子およびサイトカイン（例えば、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ））および／または支持材料を含有する１つ以上の収納容器（例えば、箱または袋等）を含む。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、人工環境、および人工環境内で生じるプロセスまたは反応を指す。インビトロ環境は、限定されないが、試験管および細胞培養物からなり得る。「インビボ」という用語は、天然環境（例えば、動物または細胞）、および天然環境内で生じるプロセスまたは反応を指す。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「マーカー」または「細胞マーカー」という用語は、特定の細胞または細胞型を同定する遺伝子またはタンパク質を指す。細胞のマーカーは、１つのマーカーに限定されなくてもよく、マーカーは、指定されたマーカー群が、細胞または細胞型を別の細胞または細胞型から識別し得るようなマーカーの「パターン」を指す場合もある。例えば、本発明のニューロンは、ニューロン、例えば、β−ＩＩＩチューブリン、ネスチン、Ｎ−Ｃａｍ、Ｔｕｊ１、ＧＡＤ６５／６７、ＴＵＪ１、ＧｌｙＴ２およびＶＧＡＴを区別する１つ以上のマーカーを発現する。
【００３０】
本明細書に開示される任意の細胞に関して作製される場合、「〜に由来する」または「〜から確立された」または「〜から分化した」という用語は、任意の操作、例えば、単細胞単離、インビボでの培養、例えば、タンパク質、化学物質、放射線、ウイルスによる感染を用いた処理および／または変異誘発、モルフォゲン等のＤＮＡ配列によるトランスフェクション、培養親細胞中に含まれる任意の細胞の選択（連続培養等による）等を用いて、細胞株、組織、または流体中の親細胞から得られた（例えば、単離された、精製された等）細胞を指す。誘導細胞は、成長因子、サイトカイン、サイトカイン治療の選択された進行、接着性、接着性の欠如、選別手順等への応答によって混合集団から選択され得る。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「神経変性障害」および「神経変性疾患」という用語は、この文書において互換的に使用され、異常な細胞死を特徴とする神経系（例えば、中枢神経系または末梢神経系）の疾患を意味する。神経変性病態の例として、アルツハイマー病、ダウン症候群、前頭側頭型認知症、進行性核上麻痺、ピック病、ニーマン・ピック病、パーキンソン病、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、ケネディ病（球脊髄性筋萎縮症とも称される）、および脊髄小脳失調症（例えば、１型、２型、３型（マチャド・ジョセフ病とも称される）、６型、７型、および１７型））、脆弱性Ｘ（レット）症候群、脆弱性ＸＥ精神遅滞、フリートライヒ運動失調症、筋緊張性ジストロフィー、脊髄小脳失調症８型、および脊髄小脳失調症１２型、アレキサンダー病、アルパース病、筋萎縮性側索硬化症（または運動ニューロン疾患）、遺伝性痙攣性対麻痺、ミトコンドリア病、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病（シュピールマイヤー・フォークト・シェーグレン・バッテン病とも称される）、カナバン病、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、虚血脳卒中、クラッベ病、レヴィー小体認知症、多発性硬化症、多系統萎縮症、ペリツェウス・メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、脊髄損傷、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、ならびに脊髄ろうが挙げられる。
【００３２】
「治療」、「治療すること」、「治療する」等の用語は、概して、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを指すために本明細書で使用される。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防するという観点から予防的であり得、かつ／または、疾患および／もしくは該疾患に起因する有害作用に対する部分的もしくは完全な安定化もしくは治癒という観点から治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患もしくは症状の素因があり得るが、まだそれを有すると診断されていない対象において疾患もしくは症状が発生するのを防止すること、（ｂ）疾患症状を抑制すること、すなわち、その発症を阻止すること、または（ｃ）疾患症状を軽減すること、すなわち、疾患もしくは症状の退行を引き起こすことを含む。
【００３３】
「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、診断、治療、または治療法が所望される任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。
【００３４】
当業者には理解されるように、任意のかつ全ての目的のために、特に、書面による説明を提供する点において、本明細書に開示される全ての範囲はまた、任意のかつ全ての可能な部分範囲およびそれの部分範囲の組み合わせを包含する。任意の列挙された範囲は、同じ範囲を少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１等に分割することを十分に説明し、かつ可能にするものとして容易に認識され得る。非限定的な例として、本明細書で論じられる各範囲は、下３分の１、中３分の１および上３分の１等に容易に分割することができる。当業者には理解されるように、「最大」、「少なくとも」、「より大きい」、「より少ない」等の全ての言語は、列挙される数を含み、上述のように、後に部分範囲に分割され得る範囲を指す。
【００３５】
本明細書（特許請求の範囲を含む）において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる」、または「含んでいる」という用語が使用される場合、それらは、記載される特徴、整数、ステップもしくは構成要素の存在を特定するものとして解釈されるべきであり、１つ以上の他の特徴、整数、ステップもしくは構成要素、またはそれらの群の存在を除外するものとして解釈されるべきではない。
【００３６】
本明細書において、先行技術として提供される特許文献または他の事項への言及は、その文献または事項が既知であったこと、またはそれが含有する情報が請求項のいずれかの優先権日の時点で周知の一般知識の一部であったことを認めるものと解釈されるべきではない。
【００３７】
ＧＡＢＡ作動性ニューロン移植組成物
侵害受容は、動物が潜在的に有害な刺激を検出して逃避することを可能にする感覚である。哺乳動物において、侵害受容感覚情報は、次いで「疼痛」が経験される中枢神経系において統合され、処理される。このシステムは５億年以上前に初めて進化し、侵害受容の遺伝的構造は強い選択的圧力を受けていると考えられる。ハエ幼虫の侵害防御行動パラダイムは、急性侵害受容のコアの保存された遺伝子構造を定義するための強力なツールとなっている。ハエ幼虫における急性または一過性の侵害受容感作を特徴付ける多くの研究が行われているが、慢性侵害受容状態の調査はまだ可能ではない。
【００３８】
神経障害性損傷は、非侵害性刺激が疼痛を引き起こす可能性がある慢性侵害受容感作をもたらす（「アロディニア」と称される）。疼痛疾患を治療するために標的とされ得る基礎となるコア機構を特定するために、本発明者らは、ショウジョウバエにおける神経障害性「疼痛」反応を調査した。驚くべきことに、本発明者らは、無傷の動物が、４２℃を超える温度に対して強い逃避反応を示したが、損傷後、動物は侵害温度よりも低い温度に対して侵害防御反応を示し始めた（すなわち、熱アロディニア）ことに気付いた。この反応の系統的な遺伝的解剖を通じて、本発明者らは、熱アロディニアが保存されたＴＲＰチャネルＴｒｐＡ１に依存し、中枢ＧＡＢＡ作動性抑制の喪失が必要であり、またアロディニアに十分であることを発見した。神経障害性疼痛の関連で脊髄抑制を回復させる治療的可能性の調査を通じて、本発明者らは、驚くべきことに、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）から作製される抑制性ＧＡＢＡ作動性ニューロン移植片は、神経障害性対象に移植されると、生存してレシピエントの神経系（例えば、中枢神経系）内に統合するだけでなく、重要なことに、副作用なしに神経障害性疼痛から長期にわたる寛解を提供したことを見出した。
【００３９】
本発明は、本発明によるＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団を含む薬学的組成物を提供する。別の態様において、本発明は、ＧＡＢＡ作動性ニューロンを作製するための方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、本明細書に記載の方法に従って産生されたＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団を含む医薬組成物を提供する。
【００４０】
医薬組成物は、概して、１つ以上の薬学的に許容されるおよび／または承認された担体、添加剤、抗生物質、防腐剤、アジュバント、希釈剤および／または安定剤を含み得る。そのような補助物質は、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等であり得る。好適な担体は、典型的には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体等の、大きく、緩徐に代謝される分子である。この医薬組成物は、マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースもしくはポリビニルピロリドン等の追加の添加剤、またはインビボ投与に適した抗酸化剤もしくは不活性ガス、安定剤もしくは組換えタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）等の他の添加物を含有することができる。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、哺乳動物、特にヒトに適切に投与されたときに、有害な、アレルギー性の、または他の好ましくない反応を生じない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または賦形剤は、任意の種類の無毒の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料または製剤補助剤を指す。
【００４２】
一態様において、本発明は、対象における疼痛の治療に使用するための、本発明によるＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団を含む薬学的組成物を提供する。好ましい実施形態において、疼痛は、神経障害性疼痛である。本発明はまた、本発明によるＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団を含む治療有効量の医薬組成物を投与するステップを含む疼痛を治療するための方法にも関する。好ましい実施形態において、疼痛は、神経障害性疼痛である。
【００４３】
本発明の別の態様は、神経変性疾患または中枢もしくは末梢神経系への損傷の治療に使用するための、本明細書に記載の本発明のＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団に関する。本発明はまた、上記のような治療有効量のニューロン集団を投与するステップを含む、神経変性疾患または中枢もしくは末梢神経系への損傷を治療するための方法に関する。
【００４４】
本発明の文脈において、「治療すること」または「治療」という用語は、本明細書で使用される場合、病理の発症を遅延もしくは予防すること、病理の症状の進行、増悪または悪化を逆転、緩和、阻害、減速もしくは停止すること、病理の症状の改善をもたらすこと、および／または病理を治癒することを目的とする方法を指す。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、意図される目的を達成するのに十分な、本明細書に記載の方法に従って調製される移植組成物の任意の量またはＧＡＢＡ作動性ニューロン（またはその集団もしくはその医薬組成物）の数を指す。有効な投薬量および投与計画は、対象の病理の性質に基づいて、適正な医療行為によって容易に決定することができ、病理の症状の程度、および対象となる組織または器官の損傷または変性の程度、ならびに対象の特徴（例えば、年齢、体重、性別、全般的な健康等）を含むがこれらに限定されない多くの要因に依存する。
【００４６】
一実施形態において、本発明は、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団、ＧＦＲαアゴニストおよび少なくとも１つの細胞死阻害剤を含み、前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞を、該細胞がＧＡＢＡ作動性ニューロン表現型を得ることおよびＧＡＢＡを産生することを可能にする条件下で、インビトロで分化させることによって作製される、移植組成物を対象とする。
【００４７】
一実施形態において、本発明は、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団、ＧＦＲαアゴニスト、アポトーシス阻害剤および壊死阻害剤を含み、前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞を、該細胞がＧＡＢＡ作動性ニューロン表現型を得ることおよびＧＡＢＡを産生することを可能にする条件下で、インビトロで分化させることによって作製される、移植組成物を対象とする。
【００４８】
治療のために、本明細書に記載され、かつ例示される方法に従って産生されるｉＰＳＣ由来ＧＡＢＡ作動性ニューロン、および本発明による医薬組成物は、任意の適切な経路を介して投与され得る。用量および投与の回数は、既知の様式で当業者によって最適化され得る。
【００４９】
例えば、投与量は、例えば、体重、投与経路、疾患の重症度等に応じて、例えば、１日１回、１週間に２回、１週間に１回、１ヶ月に２回、１ヶ月に１回、１年に１回、１年に
２回、２、３、４、または５ヶ月ごとに１回の投与頻度で、約１００、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００〜１０，０００，０００個の細胞またはそれ以上（またはそれらの間の任意の整数値）と様々であり得る。一実施形態において、好ましい用量は、１００，０００細胞／マイクロリットルである。別の実施形態において、本発明の組成物は２５０万個の細胞を含む。
【００５０】
本明細書に記載される細胞は、移植のために生理学的に適合性のある担体に懸濁させることができる。本明細書で使用される場合、「生理学的に適合性のある担体」という用語は、製剤の他の成分と適合し、そのレシピエントに有害ではない担体を指す。当業者は、生理学的に適合する担体に精通している。好適な担体の例として、細胞培養培地（例えば、イーグル基礎培地）、リン酸緩衝食塩水、ハンクス平衡塩溶液＋／−グルコース（ＨＢＳＳ）、および複数の電解質溶液、例えばＰｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（商標）Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）が挙げられる。
【００５１】
一実施形態において、移植組成物中のＧＦＲαアゴニストは、ＧＤＮＦ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＮＧＦ、ニュールツリン、アルテミン、ペルセフィン、ＧＤＮＦ受容体内因性アゴニスト、ＢＴ１８、ＢＴ１３、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＣＮＴＦ、ＧＦＲα１アゴニスト、ＸＩＢ４０３５、Ｔｒｋ活性化剤、ＴｒｋＡアゴニスト、ガンボギンアミン、アミトリプチリン、ＴｒｋＢアゴニスト、Ｎ−アセチルセロトニン、アミトリプチリン、ＢＮＮ−２０ＢＮＮ−２７、デオキシゲズニン、７，８−ジヒドロキシフラボン、４’−ジメチルアミノ−７，８−ジヒドロキシフラボン、ジオスメチン、ＨＩＯＣ、ＬＭ２２Ａ−４、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ノルウォゴニン、Ｒ７（薬物）、および７，８，３’−トリヒドロキシフラボンからなる群のいずれか１つ以上から選択される。一実施形態において、ＧＦＲαアゴニストは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、アルテミン（ＡＲＴＮ）、およびペルセフィン（ＰＳＰＮ）からなる群から選択される。好ましい実施形態において、ＧＦＲαアゴニストは、ＧＤＮＦである。
【００５２】
一実施形態において、移植組成物中のアポトーシス阻害剤は、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンＩＤＮ−８０６６、７０５３、７４３６  １９６５  ６５５６  Ｍ８６７  ＩＤＮ−５３７０  ＩＤＮ−７８６６プラルナカサンｚ−Ｖａｄ−ＦＭＫ、ＹＶＡＤ−ＦＭＫ、ｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ、Ａｃ−ＤＶＡＤ−ＦＭＫ  Ｑ−Ｖｄ−ＯＰｈ、ＣｒｍＡ（牛痘ウイルスタンパク質）、ｐ３５（バキュロウイルスタンパク質）、Ｚ−ＡＴＡＤ−ＦＭＫ、ＩＮＦ−４Ｅ、Ｚ−ＤＱＭＤ−ＦＭＫ、Ａｚ
１０４１７８０８、Ｚ−ＬＥＥＤ−ＦＭＫ、ＺＶＤＫ−ＦＭＫ、ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ、ＩＮｆ−３９、ベルナカサン、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、およびエムリカサンからなる群から選択されるカスパーゼ阻害剤；またはカルパイン阻害剤１、カルペプチン、Ｅ６４、ＭＤＬ２８１７０、ＭＧ１０１、アセチル−カルパスタチン、ＰＤ１５０６０６からなる群から選択されるカスパーゼ活性化剤の阻害剤、のうちの１つ以上から選択される。好ましい実施形態において、アポトーシス阻害剤は、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンである。
【００５３】
別の実施形態において、細胞生存を促進するために、本明細書に記載の方法に従って調製されるＧＡＢＡ作動性ニューロンまたはそれらが由来する細胞のＴＡＬＥＮＳ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、またはＲＮＡｉ等による遺伝子操作によって、カスパーゼ遺伝子および経路の直接阻害が達成され得る。
【００５４】
一実施形態において、移植組成物中の壊死阻害剤は、ＭＳ−１、ＩＭ−５４、ＧＳＫ−８７２、７−Ｃｌ−Ｏ−Ｎｅｃ１、ネクロスタチン−１、ネクロスルホンアミドのうちの
１つ以上から選択される。好ましい実施形態において、壊死阻害剤は、ネクロスルホンアミドである。
【００５５】
別の実施形態において、細胞生存を促進するために、本明細書に記載の方法に従って調製されるＧＡＢＡ作動性ニューロンまたはそれらが由来する細胞のＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、またはＲＮＡｉ等による遺伝子操作によって、壊死性遺伝子および経路の直接阻害が達成され得る。
【００５６】
別の実施形態において、本発明の移植組成物は、アマンタジン、メマンチン、ケタミン塩酸塩、ペチジン、トラマドール、メタドン、デキストロプロポキシフェン、亜酸化窒素、デキストロメトルファン、ＡＰ５、ＡＰ７、ＣＰＰｅｎｅ、セルフォテル、エタノール、ミノサイクリン、アトモキセチン、ＡＺＤ６７６５、アグマチン、クロロホルム、デキストラロルファン、デキストロルファン、ジフェニジン、ジゾシルピン、エチシクリジン、ガシクリジン、ケタミン（他の形態）、マグネシウム、メトキセチミン、ニトルメマンチン、ＰＤ−１３７８９９、フェンシクリジン、ロリシクリジン、テノシクリジン、チレタミン、ネラメキサン、エリプラドール、エトキサドロール、デキソキサドロール、ＷＭＳ−２５３９、ＮＥＦＡ、デルセミン、８Ａ−ＰＤＨＱ、アプチガネル、ＨＵ−２１１、ヒューペルジンＡ、イボガイン、レマセミド、リンコフィリン、ＧＡＢＡペンチン、ラパスチネル、ＮＲＸ−１０７４、７−クロロキヌレン酸、４−クロロキヌレニン、５，７−ジクロロキノキヌレン酸、キヌレン酸、ＴＫ−４０、１−アミノシクロプロパンカルボン酸、Ｌ−フェニルアラニン、およびキセノンからなる群から選択される１つ以上の興奮毒性誘発アポトーシスまたは壊死の阻害剤；ブピバカイン、リドカイン、コカイン、ラモトリジン、パラアルデヒド、スチリペントール、フェノバルビタール、プリミドン、メチルフェノバルビタール、ペントバルビタール、ベンゾジアゼピン（クロバザム、クロナゼパム、クロラゼプ酸、ジアゼパム、ミダゾラム、ロラゼパム、ニトラゼパム、テマゼパム、ニメタゼパム）臭化カリウム、フェルバメート、カルボキサミド（カルバマゼピン、オクスカルバゼピン、酢酸エスリカルバゼピン、バルプロ酸塩（バルプロ酸、バルプロ酸ナトリウム、ジバルプロエクスナトリウム、ビガバトリン、プロガビド、チアガビン、トピラメート、プレガバリン、エトイン、フェニトイン、メフェニトイン、フォスフェニルトイン、パラメタドン、トリメタジオン、エタジオン、ベカラミド、プリミドン、ブリバラセタム、エチラセタム、レベチラセタム、スレクトラセテム（Ｓｌｅｃｔｒａｃｅｔｅｍ）、エトスクシミド、フェンスクシミド、メスクシミド、アセタゾラミド、スルチアム、メタゾラミド、ゾニサミド、フェネトライド、フェナセミド、バルプロミド、バルノクタミド、ペランパネル、スチリペントール、ピロキシジン（Ｐｙｒｏｘｉｄｉｎｅ）、イソフルラン、レボフルラン、ＣＮＶ１０１４８０２、フナピド、プリロカイン、イオントカイン（Ｉｏｎｔｏｃａｉｎｅ）、レボブピバカイン、ブタニリカイン、カルチカイン、ジブカイン、エチドカイン、メピバカイン、プリロカイン、トリメカイン、アミロカイン、シクロメチルカイン、α−オイカイン、β−オイカイン、ヘキシルカイン、イソブカイン、ピペロカイン、オルトカイン、ベンゾカイン、ブタミベ（Ｂｕｔａｍｉｂｅ）、クロロプロカイン、ルカイン、ジメトカイン、メプリルカイン、ルカイン、ニトロカイン、オルトカイン、プロポキシカイン、ノボカイン、プロキシメタカイン、リゾカイン、テトラカイン、ラキサトリジン、三環系抗うつ薬（アミトリプチリン、ノルトリプチリン、ＤＳＰ−２２３０、メ��シリチン、フルピルチン、ジコノチド、またはアヘンおよびオピオイド、非ステロイド性抗炎症剤、パラセタモール、アセテナリジド、カプサイシン、メントール、大麻およびカニビノイドを含む末梢活性を阻害する任意の薬物から選択される１つ以上の興奮性の阻害剤を含むか、またはそれとともに投与され得る。
【００５７】
供給される必要がある前述のアゴニストおよび阻害剤のそれぞれの量は、当業者によって容易に決定され得る。例えば、カスパーゼもしくはカスパーゼシグナル伝達の阻害レベル、および／またはアポトーシスもしくは壊死の程度は、日常的なアッセイによって決定
され得る。移植組成物および方法（細胞培養培地およびキットを含むが、これらに限定されない）に使用されるＧＦＲαアゴニスト、アポトーシス阻害剤、および壊死阻害剤の濃度は、ニューロン細胞の生存率および機能を考慮して容易に確認され得、これらは両方とも、当業者に既知のアッセイを本明細書に記載のアッセイとともに使用して容易に評価され得、またそれに合うように調整され得る。
【００５８】
本発明の実施形態において、前述の阻害剤およびアゴニストは、ピコモル濃度からマイクロモル濃度までの濃度で存在してもよい。
【００５９】
別の実施形態において、本発明の移植組成物のＧＡＢＡ作動性ニューロンは、β−ＩＩＩチューブリン、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）、シナプシン、神経フィラメント−Ｌ、ネスチンおよびＮ−Ｃａｍ、Ｔｕｊ１、ＧＡＤ６５／６７、ＴＵＪ１、ＧｌｙＴ２およびＶＧＡＴのうちの１つ以上を発現する。好ましい実施形態において、ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、ＶＧＡＴを発現する。別の実施形態において、ＧＡＢＡ作動性ニューロンはＧｌｙｔ２ならびにＧＡＤ６５およびＧＡＤ６７を発現する。別の実施形態において、ＧＡＢＡ作動性ニューロンはＶＧＡＴ、Ｇｌｙｔ  ２ならびにＧＡＤ６５およびにＧＡＤ６７を発現する。
【００６０】
別の実施形態において、ＧＡＢＡ能性ニューロンはインビボでＧＡＢＡを産生する。別の実施形態において、ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、本明細書に示される実施例に記載される濃度でＧＡＢＡを分泌する。
【００６１】
別の態様において、本発明は、本発明の移植組成物の剤形を提供する。いくつかの実施形態において、これらの剤形は、すぐに投与できる組成物を含む。本明細書で使用される「すぐに投与できる」という用語は、薬物溶液が滅菌されており、直接静脈内注入または注射に好適であり、薬物溶液を患者に非経口投与する前に希釈または再構成の中間ステップが必要とされないことを意味する。薬物水溶液は、剤形の容器から非経口的に直接投与することができる。「すぐに投与できる」という用語は、「すぐに注入できる」または「すぐに注射できる」と同義である。
【００６２】
ＧＡＢＡ作動性ニューロンを調製する方法
【００６３】
本発明はまた、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの作製方法に関し、以下の態様および実施形態が、個別にまたは任意の好適な組み合わせのいずれかで併用されてもよい。
【００６４】
無数の治療用途において幹細胞由来の分化細胞の可能性があるため、培養中の幹細胞の分化を特定の体細胞運命へと導くことまたは促進することは大変に興味深いことである。ヒト幹細胞は、細胞置換療法および治療薬の細胞スクリーニングに大きな可能性を提供する。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）への体細胞リプログラミングの最近の進歩により、再生医療および疾患モデル化のための患者特異的細胞を作製することが可能となった。
【００６５】
現在、驚くべきことに、ＧＡＢＡ作動性ニューロン表現型に向かって分化または成熟中の細胞を、ＢＭＰシグナル伝達を活性化する薬剤と接触させることは、ＧＡＢＡ作動性ニューロン表現型に向けて前駆細胞の分化を促進し、そのような細胞は、ソマトスタチンの発現を減少させ、パルブアルブミンの発現を増加させることが分かっている。換言すると、ＢＭＰシグナル伝達を誘導するこれらの因子は、より好ましい抑制性の表現型を有するＧＡＢＡ作動性ニューロンに対して幹細胞または前駆細胞の分化を誘導または誘導する。したがって、幹細胞または前駆細胞の分化を抑制性ＧＡＢＡ作動性ニューロン表現型に向けるために、培養系においてＢＭＰシグナル伝達を増強する因子の使用が想定されている。
【００６６】
したがって、本発明の別の態様によれば、パルブアルブミンの発現が増加したＧＡＢＡ作動性ニューロンを産生するための方法が提供され、該方法は、細胞集団を、ＢＭＰシグナル伝達が誘導されない条件下で培養された細胞と比較してパルブアルブミンの発現が上昇したＧＡＢＡ作動性ニューロン表現型を有する細胞に分化させるのに十分な前記細胞集団において、ＢＭＰシグナル伝達を誘導するのに十分な時間および条件下で、ニューロン分化中の細胞集団を培養することを含む。
【００６７】
細胞内でＢＭＰシグナル伝達を誘導するいくつかの薬剤が知られているが、好ましい実施形態によれば、分化細胞集団は、細胞集団を、ＢＭＰシグナル伝達を誘導する１つ以上の薬剤と接触させることによって、細胞集団をＧＡＢＡ作動性ニューロン表現型および上昇したパルブアルブミンの発現を有する細胞に分化させるのに十分な前記細胞集団において、ＢＭＰシグナル伝達を誘導するのに十分な時間および条件下で培養される。好ましくは、１つ以上の薬剤は、ＢＭＰ  Ｉ型および／またはＩＩ型受容体（複数可）のカノニカルリガンドから選択され、いずれかまたは両方の受容体への結合を介してＢＭＰシグナル伝達を活性化する。別の実施形態において、１つ以上の薬剤は、ＢＭＰ  Ｉ型受容体（ＢＭＰＲ−Ｉ）およびＢＭＰ  Ｉ型受容体（ＢＭＰＲ−ＩＩ）に結合し、かつ／またはＳＭＡＤ１／５／８シグナル伝達経路を活性化する。
【００６８】
一実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達を誘導する１つ以上の薬剤はＢＭＰ４を含む。好ましい実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達を誘導する薬剤はＢＭＰ４である。別の実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達を誘導する１つ以上の薬剤は、ＳＪ０００２９１９４２、ＳＪ００００６３１８１、およびＳＪ０００３７０１７８、イソリキリチゲニン（ＳＪ０００２８６２３７）、ＢＭＰ増感剤（ＰＤ４０７８２４）、ＢＭＰ２、ＢＭＰ５、ＢＭＰ４  ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ共活性化剤ＦＫ５０６（タクロリムス）、およびＣＫ２．３（ＣＫ２阻害剤）、操作されたＢＭＰ、内因性ＢＭＰアンタゴニストノギンおよびコーディンの阻害剤（抗ノギン、抗コーディン抗体等の中和抗体を含む）、塩酸ファスジル、ロバスタチン、シムバスタチン（ＢＭＰ発現を増強することができる）、ペントキシフィリン、シルデナフィル、ロリプラム（ホスホジエステラーゼ阻害によりＢＭＰの効果を増強する）からなる群から選択されるベントロモルフィンからなる群から選択される。
【００６９】
別の実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達および／またはＳＭＡＤ１／５／８シグナル伝達を活性化する１つ以上の薬剤は、ＳＭＵＲＦ１（ＳＭＵＲＦ１の内因性阻害剤）を阻害する。
【００７０】
細胞集団を、ニューロン分化中の細胞に分化させるのに十分な網膜前駆細胞集団におけるＢＭＰシグナル伝達の誘導をもたらすために使用され得る薬剤（複数可）の濃度は、本明細書に記載される方法に従って当業者によって決定され得る。一実施形態において、細胞集団は、約１ｐＭ〜約１００μＭの濃度で存在するＢＭＰシグナル伝達を誘導する１つ以上の薬剤を含む細胞培養培地内で培養される。別の実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達を誘導する１つ以上の薬剤は、約５ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。より好ましくは、ＢＭＰシグナル伝達を誘導する１つ以上の薬剤は、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。好ましい実施形態において、ＢＭＰ４は、１０ｎｇ／ｍＬの量で存在する。
【００７１】
後により詳細に説明されるように、ｉＰＳＣの集団からＧＡＢＡ作動性ニューロンを調製するプロセスにおいて、本発明者らは驚くべきことに、ＧＡＢＡ作動性ニューロン表現型に向かってニューロンの分化または成熟中の細胞を、培養の約１４日目〜約２１日目の期間中にＢＭＰシグナル伝達を活性化する薬剤に曝露することにより、約１４日目〜約２
８日目、または約２１日目〜約２８日目の間、ソマトスタチンの５０％減少までに処理されなかったまたは処理された細胞と比較して、パルブアルブミン発現の６倍の増加を示したことを見出した。
【００７２】
さらに驚くべきことに、ＧＡＢＡ作動性ニューロン表現型に向かって分化または成熟中の細胞を、培養の約１４日目〜約２１日目の期間中にＢＭＰシグナル伝達を活性化する１つ以上の薬剤と接触させると、そのような細胞は、疼痛の治療のために治療的に用いられたときに、著しくより強力な長期鎮痛反応を示すことが見出されている。
【００７３】
したがって、別の実施形態において、ＧＡＢＡ作動性ニューロン表現型に向かって分化または成熟中の細胞は、培養の約１４日目〜約２１日目の期間中にＢＭＰシグナル伝達を活性化する１つ以上の薬剤と接触させられる。別の実施形態において、ＧＡＢＡ作動性ニューロン表現型に向かって分化または成熟中の細胞は、培養の約１４日目〜約２１日目の期間にわたってＢＭＰシグナル伝達を活性化する１つ以上の薬剤と接触させられる。好ましい実施形態において、１つ以上の薬剤は、ＢＭＰを含む。別の実施形態において、ＧＡＢＡ作動性ニューロン表現型に向かって分化または成熟中の細胞を、培養の約１４日目〜約２１日目にＢＭＰ４と接触させる。
【００７４】
一実施形態において、本発明のＧＡＢＡ能性ニューロンは、以下の手順に従って調製される：
ｈｉＰＳＣをＴｒｉｐＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で解離し、超低接着表面を有する結合プレート中の懸濁液で２週間増殖させて胚様体（ＥＢ）を形成させる。神経誘導のために、細胞をＳＭＡＤ阻害剤ＬＤＮ１９３１８９（１００ｎＭ、０日目〜１４日目）およびＳＢ４３１５４２（１０μＭ、０日目〜１０日目）で処理する。ＭＧＥ（内側基底核隆起）誘導ために、細胞をＷｎｔ阻害剤ＩＷＰ２（５ｐＭ、０日目〜７日目）、ＳＨＨ活性化剤ＳＡＧ（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト０．１ｐＭ、０日目〜２１日目）、および増殖因子ＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍＬ、８日目〜２１日目）で処理した。分化の初日に、ＲＯＣＫ阻害剤を加える。懸濁液中に２週間置いた後、ＥＢをポリオルニチン（ＰＬＯ）およびフィブロネクチン（ＦＮ）でコーティングした表面に移す。２１日目に、ＥＢを解離し、将来的な分化および成熟のために１０ｎｇ／ｍＬ  ＢＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍＬ  ＧＤＮＦ、および２．５μＭ  γセクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴを含む分化培地上のＰＬＯ／ＦＮコーティングプレートに再播種した。
【００７５】
前述の手順に従って、超低接着２４ウェルプレート（各ウェル＝１．９ｃｍ２）において、ｈｉＰＳＣを分化させるように誘導してもよい。最適な細胞密度は、ウェル当たり約６００，０００細胞である。ｄ１４に、フィブロネクチンでコーティングした１２ウェルプレートに胚様体を播種する（３．８ｃｍ２）。１ウェル当たりのＥＢの最適な数は約１０である。次いで、細胞を解離し、ｄ２１に再播種する（１２ウェルプレート）。最適な細胞密度は、ウェル当たり約３０，０００細胞である。当業者は、細胞またはＥＢの最適密度が、異なる形態およびサイズの培養容器（例えば、組織培養フラスコ、ペトリ皿等）に適用され得ることを容易に理解するであろう。
【００７６】
ＧＡＢＡの産生の確認は、ＧＡＢＡに関連する転写物の分析、およびＧＡＢＡの細胞培養培地への分泌を含む、本明細書に記載および例示される方法を使用して評価され得る。
【００７７】
治療方法
本発明の別の態様は、哺乳動物における神経学的状態、疾患または障害の治療に使用するための、本明細書に記載のＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団を含む本発明の移植組成物に関する。本発明はまた、哺乳動物における神経学的状態、疾患または障害を治療するための方法であって、治療有効量の本明細書に記載の移植組成物を、それを必要とする対象
に投与するステップを含む、方法に関する。本発明はまた、哺乳動物における神経学的状態、疾患または障害を治療するための薬物の製造のための、本明細書に記載の移植組成物、または本明細書に記載の方法に従って調製されるＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団の使用に関する。
【００７８】
本発明の文脈において、「治療すること」または「治療」という用語は、本明細書で使用される場合、病理の発症を遅延もしくは予防すること、病理の症状の進行、増悪または悪化を逆転、緩和、阻害、減速もしくは停止すること、病理の症状の改善をもたらすこと、および／または病理を治癒することを目的とする方法を指す。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、意図される目的を達成するのに十分な、本発明による移植組成物の任意の量を指す。有効な投薬量および投与計画は、対象の病理の性質に基づいて、適正な医療行為によって容易に決定することができ、病理の症状の程度、および対象となる組織または器官の損傷または変性の程度、ならびに対象の特徴（例えば、年齢、体重、性別、全般的な健康等）を含むがこれらに限定されない多くの要因に依存する。
【００８０】
治療のために、本発明による移植組成物は、任意の適切な経路を介して投与し得る。用量および投与の回数は、既知の様式で当業者によって最適化され得る。
【００８１】
一実施形態において、本発明は、哺乳動物における神経学的状態、疾患または障害を治療する方法を提供する。別の実施形態において、神経学的状態、疾患または障害は、抑制の回復または強化を必要とする興奮毒性に関連する。一実施形態において、神経学的状態、疾患または障害は、神経障害性疼痛（慢性神経障害性疼痛を含む）、慢性炎症性疼痛、慢性機能障害性疼痛、てんかん、運動ニューロン疾患（ＡＬＳ、ＳＭＡ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、多発性硬化症、タウオパチー（進行性核上麻痺、ピック病、ＣＢＤ、ＦＴＬＤ、ＡＬＳを伴うＦＴＬＤ）、ハンチントン病、アルコール離脱およびアルコール依存症、糖尿病誘発性脳損傷、頭部損傷、偏頭痛、頭痛、クラスター頭痛、脊髄損傷、虚血性障害、化学療法誘発性疼痛および化学療法誘発性神経障害、統合失調症、慢性うつ病、遅発性ジスキネジア、双極性疾患、および神経障害からなる群から選択される。
【００８２】
一実施形態において、本明細書に記載されるＧＡＢＡ作動性ニューロンまたは本明細書に記載されるＧＡＢＡ作動性ニューロンの移植組成物または集団は、対象の中枢神経系に投与される。一実施形態において、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの移植組成物または集団は、対象の脊髄に投与される。別の実施形態において、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの移植組成物または集団は、対象の脳に投与される。別の実施形態において、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの移植組成物または集団は、対象の後根神経節に投与される。
【００８３】
本発明が、哺乳動物における神経学的状態、疾患もしくは障害の治療に使用するための、または哺乳動物における神経学的状態、疾患もしくは障害の治療のための薬物の製造に使用するための、本明細書に記載のＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団を含む本発明の移植組成物、または本明細書に記載のＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団に関する場合、組成物または薬物は、対象の中枢神経系への投与のために製剤化され得る。一実施形態において、移植組成物または薬物は、対象の脊髄への投与のために製剤化される。別の実施形態において、移植組成物または薬物は、対象の脳への投与のために製剤化される。別の実施形態において、移植組成物または薬物は、対象の後根神経節への投与のために製剤化される。
【００８４】
一実施形態において、本発明は、治療有効量の本明細書に記載の方法に従って調製され
るＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団または本明細書に記載の移植組成物を前記対象に投与することを含む、それを必要とする対象において疼痛を治療する方法を提供する。一実施形態において、本発明は、対象における疼痛の治療のために、本明細書に記載の方法に従って調製されるＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団または本明細書に記載の移植組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、対象の疼痛の治療のための薬物の製造のために、本明細書に記載の方法に従って調製されるＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団または本明細書に記載の移植組成物の使用を提供する。好ましい実施形態において、疼痛は、神経障害性疼痛である。
【００８５】
一実施形態において、本発明は、治療有効量の本明細書に記載の方法に従って調製されるＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団または本明細書に記載の移植組成物を前記対象に投与することを含む、それを必要とする対象において神経興奮に関連する疾患または障害を治療することを含む方法を提供する。一実施形態において、本発明は、神経興奮に関連する疾患または障害の治療を必要とする対象において、その治療のために、本明細書に記載の方法に従って調製されるＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団または本明細書に記載の移植組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、神経興奮に関連する疾患または障害の治療を必要とする対象において、その治療のための薬物の製造のために、本明細書に記載の方法に従って調製されるＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団または本明細書に記載の移植組成物の使用を提供する。
【００８６】
キット
本発明は、本明細書に記載の移植組成物の調製のためのキットを提供する。一実施形態において、キットは、少なくとも１つのＧＦＲαアゴニスト、および少なくとも１つの細胞死阻害剤を、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団とともに提供する。一実施形態において、キットは、少なくとも１つのＧＦＲαアゴニスト、少なくとも１つのアポトーシス阻害剤、および少なくとも１つの壊死阻害剤を、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団とともに提供する。
【００８７】
別の実施形態において、このキットは、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの集団の代わりに、多能性幹細胞、または複能性幹細胞もしくは前駆細胞を、細胞を分化させてＧＡＢＡ作動性ニューロン表現型を得るためおよびＧＡＢＡを産生するための本明細書に記載の細胞培養試薬とともに含む。別の実施形態において、キットは、ＢＭＰシグナル伝達を活性化する１つ以上の薬剤をさらに含む。一実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達を誘導する１つ以上の薬剤はＢＭＰ４を含む。好ましい実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達を誘導する薬剤はＢＭＰ４である。別の実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達を誘導する１つ以上の薬剤は、ＳＪ０００２９１９４２、ＳＪ００００６３１８１、およびＳＪ０００３７０１７８、イソリキリチゲニン（ＳＪ０００２８６２３７）、ＢＭＰ増感剤（ＰＤ４０７８２４）、ＢＭＰ２、ＢＭＰ５、ＢＭＰ４  ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ共活性化剤ＦＫ５０６（タクロリムス）、およびＣＫ２．３（ＣＫ２阻害剤）、操作されたＢＭＰ、内因性ＢＭＰアンタゴニストノギンおよびコーディンの阻害剤（抗ノギン、抗コーディン抗体等の中和抗体を含む）、塩酸ファスジル、ロバスタチン、シムバスタチン（ＢＭＰ発現を増強することができる）、ペントキシフィリン、シルデナフィル、ロリプラム（ホスホジエステラーゼ阻害によりＢＭＰの効果を増強する）からなる群から選択されるベントロモルフィンからなる群から選択される。
【００８８】
別の実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達および／またはＳＭＡＤ１／５／８シグナル伝達を活性化する１つ以上の薬剤は、ＳＭＵＲＦ１（ＳＭＵＲＦ１の内因性阻害剤）を阻害する。
【００８９】
別の実施形態において、このキットは、本明細書に記載の方法に従って多能性幹細胞、
または複能性幹細胞もしくは前駆細胞からＧＡＢＡ作動性ニューロンを分化するための指示書、およびそのようなＧＡＢＡ作動性ニューロンを含む移植組成物の調製のための指示書をさらに含む。
【００９０】
阻害剤およびアゴニストに加えて、本発明のキットは以下のうちの１つ以上をさらに含み得る：培養培地、少なくとも１つの細胞培養培地サプリメント、１つ以上の遺伝子産物の発現を阻害または増加させるための薬剤、およびニューロン分化のマーカーの発現を検出するための少なくとも１つの薬剤。
【００９１】
好ましい実施形態において、キット内のＧＦＲαアゴニストは、ＧＤＮＦ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＮＧＦ、ニュールツリン、アルテミン、ペルセフィン、ＧＤＮＦ受容体内因性アゴニスト、ＢＴ１８、ＢＴ１３、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＣＮＴＦ、ＧＦＲα１アゴニスト、ＸＩＢ４０３５、Ｔｒｋ活性化剤、ＴｒｋＡアゴニスト、ガンボギンアミン、アミトリプチリン、ＴｒｋＢアゴニスト、Ｎ−アセチルセロトニン、アミトリプチリン、ＢＮＮ−２０ＢＮＮ−２７、デオキシゲズニン、７，８−ジヒドロキシフラボン、４’−ジメチルアミノ−７，８−ジヒドロキシフラボン、ジオスメチン、ＨＩＯＣ、ＬＭ２２Ａ−４、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ノルウォゴニン、Ｒ７（薬物）、および７，８，３’−トリヒドロキシフラボンからなる群のいずれか１つから選択される。一実施形態において、ＧＦＲαアゴニストは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、アルテミン（ＡＲＴＮ）、およびペルセフィン（ＰＳＰＮ）からなる群から選択される。好ましい実施形態において、ＧＦＲαアゴニストは、ＧＤＮＦである。
【００９２】
一実施形態において、移植組成物中のアポトーシス阻害剤は、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンＩＤＮ−８０６６、７０５３、７４３６  １９６５  ６５５６  Ｍ８６７  ＩＤＮ−５３７０  ＩＤＮ−７８６６プラルナカサンｚ−Ｖａｄ−ＦＭＫ、ＹＶＡＤ−ＦＭＫ、ｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ、Ａｃ−ＤＶＡＤ−ＦＭＫ  Ｑ−Ｖｄ−ＯＰｈ、ＣｒｍＡ（牛痘ウイルスタンパク質）、ｐ３５（バキュロウイルスタンパク質）、Ｚ−ＡＴＡＤ−ＦＭＫ、ＩＮＦ−４Ｅ、Ｚ−ＤＱＭＤ−ＦＭＫ、Ａｚ
１０４１７８０８、Ｚ−ＬＥＥＤ−ＦＭＫ、ＺＶＤＫ−ＦＭＫ、ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ、ＩＮｆ−３９、ベルナカサン、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、およびエムリカサンからなる群から選択されるカスパーゼ阻害剤；またはカルパイン阻害剤１、カルペプチン、Ｅ６４、ＭＤＬ２８１７０、ＭＧ１０１、アセチル−カルパスタチン、ＰＤ１５０６０６からなる群から選択されるカスパーゼ活性化剤の阻害剤、のうちの１つ以上から選択される。好ましい実施形態において、アポトーシス阻害剤は、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトンである。
【００９３】
別の実施形態において、細胞生存を促進するために、ＴＡＬＥＮＳ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、またはＲＮＡｉ等によるＧＡＢＡ作動性ニューロンの遺伝子操作によって、カスパーゼ遺伝子および経路の直接阻害が達成され得る。
【００９４】
一実施形態において、キット内の壊死阻害剤は、ＭＳ−１、ＩＭ−５４、ＧＳＫ−８７２、７−Ｃｌ−Ｏ−Ｎｅｃ１、ネクロスタチン−１、ネクロスルホンアミドのうちの１つ以上から選択される。好ましい実施形態において、壊死阻害剤は、ネクロスルホンアミドである。
【００９５】
別の実施形態において、細胞生存を促進するために、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、またはＲＮＡｉ等によるＧＡＢＡ作動性ニューロンの遺伝子操作によって、壊死性遺伝子および経路の直接阻害が達成され得る。
【００９６】
別の実施形態において、本発明の移植組成物は、アマンタジン、メマンチン、ケタミン塩酸塩、ペチジン、トラマドール、メタドン、デキストロプロポキシフェン、亜酸化窒素、デキストロメトルファン、ＡＰ５、ＡＰ７、ＣＰＰｅｎｅ、セルフォテル、エタノール、ミノサイクリン、アトモキセチン、ＡＺＤ６７６５、アグマチン、クロロホルム、デキストラロルファン、デキストロルファン、ジフェニジン、ジゾシルピン、エチシクリジン、ガシクリジン、ケタミン（他の形態）、マグネシウム、メトキセチミン、ニトルメマンチン、ＰＤ−１３７８９９、フェンシクリジン、ロリシクリジン、テノシクリジン、チレタミン、ネラメキサン、エリプラドール、エトキサドロール、デキソキサドロール、ＷＭＳ−２５３９、ＮＥＦＡ、デルセミン、８Ａ−ＰＤＨＱ、アプチガネル、ＨＵ−２１１、ヒューペルジンＡ、イボガイン、レマセミド、リンコフィリン、ＧＡＢＡペンチン、ラパスチネル、ＮＲＸ−１０７４、７−クロロキヌレン酸、４−クロロキヌレニン、５，７−ジクロロキノキヌレン酸、キヌレン酸、ＴＫ−４０、１−アミノシクロプロパンカルボン酸、Ｌ−フェニルアラニン、およびキセノンからなる群から選択される１つ以上の興奮毒性誘発アポトーシスまたは壊死の阻害剤；ブピバカイン、リドカイン、コカイン、ラモトリジン、パラアルデヒド、スチリペントール、フェノバルビタール、プリミドン、メチルフェノバルビタール、ペントバルビタール、ベンゾジアゼピン（クロバザム、クロナゼパム、クロラゼプ酸、ジアゼパム、ミダゾラム、ロラゼパム、ニトラゼパム、テマゼパム、ニメタゼパム）臭化カリウム、フェルバメート、カルボキサミド（カルバマゼピン、オクスカルバゼピン、エスリカルバゼピン）、酢酸、バルプロ酸塩（バルプロ酸、バルプロ酸ナトリウム、ジバルプロエクスナトリウム、ビガバトリン、プロガビド、チアガビン、トピラメート、プレガバリン、エトイン、フェニトイン、メフェニトイン、フォスフェニルトイン、パラメタドン、トリメタジオン、エタジオン、ベカラミド、プリミドン、ブリバラセタム、エチラセタム、レベチラセタム、スレクトラセテム（Ｓｌｅｃｔｒａｃｅｔｅｍ）、エトスクシミド、フェンスクシミド、メスクシミド、アセタゾラミド、スルチアム、メタゾラミド、ゾニサミド、フェネトライド、フェナセミド、バルプロミド、バルノクタミド、ペランパネル、スチリペントール、ピロキシジン（Ｐｙｒｏｘｉｄｉｎｅ）、イソフルラン、レボフルラン、ＣＮＶ１０１４８０２、フナピド、プリロカイン、イオントカイン（Ｉｏｎｔｏｃａｉｎｅ）、レボブピバカイン、ブタニリカイン、カルチカイン、ジブカイン、エチドカイン、メピバカイン、プリロカイン、トリメカイン、アミロカイン、シクロメチルカイン、α−オイカイン、β−オイカイン、ヘキシルカイン、イソブカイン、ピペロカイン、オルトカイン、ベンゾカイン、ブタミベ（Ｂｕｔａｍｉｂｅ）、クロロプロカイン、ルカイン、ジメトカイン、メプリルカイン、ルカイン、ニトロカイン、オルトカイン、プロポキシカイン、ノボカイン、プロキシメタカイン、リゾカイン、テトラカイン、ラキサトリジン、三環系抗うつ薬（アミトリプチリン、ノルトリプチリン、ＤＳＰ−２２３０��メキシリチン、フルピルチン、ジコノチド、またはアヘンおよびオピオイド、非ステロイド性抗炎症剤、パラセタモール、アセテナリジド、カプサイシン、メントール、大麻およびカニビノイドを含む末梢活性を阻害する任意の薬物から選択される１つ以上の興奮性の阻害剤を含む。
【００９７】
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書に記載の治療方法に従って使用される場合、キットを提供する。
【００９８】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の非限定的な実施例によって例示される。いくつかの態様では、実施例に記載される１つ以上の実施形態は、概して、上記の１つ以上の実施形態と組み合わせて適用可能であり得ることを理解されたい。
【実施例】
【００９９】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施態様には限定されない。
【０１００】
実験モデルと対象の詳細
動物
マウスは、ＡＲＣ（Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ、ＡＲＣ）から入手した１０週齢までの雄ＮＯＤ．ＰＲＫＤＳＣＩＤ  ＡＲＣであり、施設および設備に２週間馴化させた。全ての動物実験は、処置について盲検化されて実施され、治療群への割り付けは、行動データおよび健康状態について盲検化された実験者によって疑似ランダムに行われた。マウスを１２時間の明暗サイクルで飼育し、全ての段階で標準飼料および水を自由摂取させた。全てのマウスを特別な無菌施設内に維持し、全ての取り扱いおよび実験には無菌法を使用した。全ての行動は、１人の男性治験責任医師によって行われた。全ての実験は、Ａｎｉｍａｌ  ｅｔｈｉｃｓ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ９３８の下、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｙｄｎｅｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたものであった。実験デザインおよび記録は、ＡＲＲＩＶＥガイドラインによって規定され、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌガイドラインに準拠する。
【０１０１】
ショウジョウバエの系統
ハエは、１２／１２時間の明暗サイクル下、２５℃で、標準的なコーンミール、酵母、およびスクロース寒天培地で飼育した。Ｃａｎｔｏｎ  Ｓ（ＢＤＳＣ  ６４３４９）、ｐａｉｎｌｅｓｓ（ＥＰ（２）２４５１）（ＢＤＳＣ  ２７８９５）、ｐｐｋ−Ｇａｌ４（ＢＤＳＣ  ３２０７８）、ＵＡＳ−ＣＤ８−ＧＦＰ（ＢＤＳＣ  ５１３０）、ＵＡＳ−Ｄｃｒ２、ＵＡＳ−破傷風毒素（活性、ＢＤＳＣ  ２８８３８および不活性ＢＤＳＣ  ２８８３９）、ＵＡＳ−ｐ３５（ＢＤＳＣ  ５０７２）、およびＵＡＳ−ラミン−ＧＦＰ（ＢＤＳＣ  ７３７６）のハエは、ＢＤＳＣライブラリーから入手した。ｗｌｌｌ８（ＶＤＲＣ  ６００００）、ＵＡＳ−ＴｒｐＡｌ−ＲＮＡｉ（ＶＤＲＣ  ３７２４９）、ＵＡＳ−ＲＤＬ−ＲＮＡｉ（ＶＤＲＣ  ４１１０１）、ＵＡＳ−ＧＲＤ−ＲＮＡｉ（ＶＤＲＣ  ５３２９）、ＵＡＳ−Ｄ−ＧＡＢＡ−Ｂ−Ｒ１  −ＲＮＡｉ（ＶＤＲＣ  １０１４４０）、ＵＡＳ−Ｄ−ＧＡＢＡ−Ｂ−Ｒ２−ＲＮＡｉ（ＶＤＲＣ  １１０２６８およびＶＤＲＣ  １７８５）、ＵＡＳ−Ｄ−ＧＡＢＡ−Ｂ−Ｒ３−ＲＮＡｉ（ＶＤＲＣ  ５０１７６）、ＵＡＳ−ＬＣＣＨ３−ＲＮＡｉ（ＶＤＲＣ  ３７４０８）のハエは、ＶＤＲＣ  ＲＮＡｉライブラリーから入手した。
【０１０２】
ヒト多能性幹細胞株
ＡＴＣＣ−ＢＸＳ０１１６  ｈｉＰＳＣ株を本試験に使用した（ＡＴＣＣ、ＡＣＳ  １０３０）。
【０１０３】
実験方法
成体熱侵害受容アッセイ系
成体熱侵害受容アッセイ系は、透明なポリスチレンの試験チャンバー（高さ０．３ｃｍ、直径５．５ｃｍ、透明なプラスチックの蓋）、可変加熱素子（Ｍｏｄｅｌ  ＡＨＰ−１２００ＤＣＰ、部品番号９−３４ＫＢ−１−０Ａ１、ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｏｌｉｎｇ  Ａｍｅｒｉｃａ（ＴＥＣＡ）Ｃｏｒｐ．、ＩＬ，ＵＳＡ）、動画記録設定、および行動分析ソフトウェアから構成される。動画は、上から単一カメラで記録した（Ｃａｎｏｎ  ＥＯＳ，７００Ｄ、ｌ８−５５ｍｍレンズ）：動画は、１０匹のハエの行動軌跡を含む。
【０１０４】
ハエ損傷モデル
ｖａｎｎａｓはさみを使用して、右中脚を腿節部で切断した。ハエは、脚切断時に７日齢であり、１、７、および１４日後に試験を行った。１０匹のハエの各セットを、氷上で軽度に麻酔してから行動チャンバーに入れた。最初に表面を２５℃に設定した。ハエを試験チャンバーに順応させ、次いで、ベースラインの２５℃での応答を記録した。表面温度
を２分間２５℃に維持し、次いで２分間３０℃に上昇させ、次いで同様に２分間３５°Ｃ、２分間３８°Ｃ、最終的には１分間４２℃まで上昇させた。２９ｆｐｓ画像／秒に設定して装置の上に配置したビデオ録画カメラを使用して、ハエの観察を記録した。録画された動画を用いて処置を盲検化して、ジャンプ行動を手動でスコア化した。動く速度は、個々のハエを追跡するＣｔｒａｘソフトウェアおよびパッケージを使用して測定した。各実験で、３バッチの１０匹のハエを試験したところ、３つの独立した群（ｎ＝９）で結果が繰り返された。単一比較のためのｔ検定およびＡＮＯＶＡを用いて統計分析を行った後、多重比較のためのチューキーの事後検定を行った。
【０１０５】
電気生理学的記録
氷を用いてハエを麻酔し、腹側を下にしてワックス支持体に固定した。刺激器（定電圧型刺激アイソレータ、モデルＤＳ２Ａ−Ｍｋ．ＩＩ、Ｄｉｇｉｔｉｍｅｒ）に接続された２本のタングステン刺激電極を両眼に配置して巨大線維系（ＧＦＳ）を活性化した。同様に、２本のタングステン刺激電極を右（同側）または左（対側）脚のフェルミスセグメント（ｆｅｒｍｉｓ  ｓｅｇｍｅｎｔ）の中央にも配置して、脚を通るＧＦＳの侵害受容逃避を活性化した。目を通るＧＦＳの場合、最大刺激強度１５Ｖ未満でハエに２０回の単一刺激を与えた。脚刺激による侵害受容逃避の場合、最大刺激強度は６０Ｖ未満であった。全ての実験で、刺激持続時間を１０μｓで一定に維持した。タングステン接地電極をハエ腹部に配置した。（卓上電源ＰＳＵ  １３０−ＬＡＳＣＡＲを用いて）水酸化ナトリウム５Ｍ中で研磨したタングステン記録電極を、ハエの左背面の背縦走筋（ＤＬＭ）線維に配置して、シナプス後電位（ＰＳＰ）を記録した。各群の少なくとも９匹のハエのＰＳＰをＭｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ＡＣ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ、モデル１８００（Ａ−Ｍ  Ｓｙｓｔｅｍ）で記録し、０．５ｋＨｚでフィルタリングし、１ｋＨｚでデジタル化した。ＰＳＰは、ＡｘｏＧｒａｐｈソフトウェア（ＡｘｏＧｒａｐｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）を使用して分析した。脚を刺激することによって測定された反応が中枢神経系によって媒介されたかどうかを判定するために、ハエの頭部を除去して、記録のために同様の設定を用いた。マン・ホイットニーの順位和検定を用いて反応潜時および持続時間の差を決定した。
【０１０６】
免疫組織化学的研究および画像化
ハエの脳およびＶＮＣに対する免疫蛍光法を記載されるように行った。抗ＧＡＢＡ抗体（Ａ２０５２、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を１：５００の希釈率で使用し、ｎｃ８２抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ）を１：７５の希釈率で使用し、切断カスパーゼ−３抗体（Ａｓｐｌ７５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を１：５００の希釈率で使用した。二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒのＡｌｅｘａ  ４８８、Ａｌｅｘａ  ５５５およびＡｌｅｘａ
６４７）は、１／５００の希釈率で使用した。０．６μｍ間隔で４０Ｘ  ＮＡ  １．３０油浸対物レンズを備えたＬｅｉｃａ  ＤＭＩ  ６０００  ＳＰ８共焦点顕微鏡を使用して共焦点切片を撮像した。上面写真は、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ；ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂｏｖ／ｉ］／）で画像スタックの最大投影を行うことにより作製し、接線方向の側面画像は、ＩｍａｇｅＪおよびＬｅｉｃａ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｕｉｔｅ  Ｘ，ＬＡＳＸソフトウェアを使用して作製した。ＩｍａｇｅＪの３Ｄオブジェクトカウンタ機能を使用してＧＡＢＡ焦点を定量化した。脚の画像化は２．３４μｍ間隔の１６Ｘ／０．５ＩＭＭ対物レンズで行い、附節領域の画像は、同じ共焦点顕微鏡の、０．６μｍ間隔の４０Ｘ油浸対物レンズで取得した。ＩｍａｇｅＪを使用して、脚で保持された樹状突起の長さを測定することにより、脚のｐｐｋ＋ニューロンの神経障害を評価した。
【０１０７】
ＨｉＰＳＣの培養およびＧＡＢＡ介在ニューロンまたは感覚ニューロンへの分化
ｍＴＥＳＲｌ培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のマトリゲルでコーティングした表面上にＨｉＰＳＣを維持した。
【０１０８】
Ｋｉｍ  ＴＧ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２０１４に記載されるプロトコルを適合させたものを用いて、ＨｉＰＳＣをＧＡＢＡ介在ニューロンに分化させた。簡潔に述べると、ｈｉＰＳＣをＴｒｉｐＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で解離し、超低接着表面を有する結合プレート中の懸濁液で２週間増殖させて胚様体（ＥＢ）を形成させた。神経誘導のために、細胞をＳＭＡＤ阻害剤ＬＤＮ１９３１８９（１００ｎＭ、０日目〜１４日目）およびＳＢ４３１５４２（１０μＭ、０日目〜１０日目）で処理した。ＭＧＥ（内側基底核隆起）誘導ために、細胞をＷｎｔ阻害剤ＩＷＰ２（５μＭ、０日目〜７日目）、ＳＨＨ活性化剤ＳＡＧ（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト０．１μＭ、０日目〜２１日目）、および増殖因子ＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍＬ、８日目〜２１日目）で処理した。分化の初日にのみ、ＲＯＣＫ阻害剤を加える。懸濁液中に２週間置いた後、ＥＢをポリオルニチン（ＰＬＯ）およびフィブロネクチン（ＦＮ）でコーティングした表面に移した。２１日目に、ＥＢを解離し、将来的な分化および成熟のために１０ｎｇ／ｍＬ  ＢＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍＬ  ＧＤＮＦ、および２．５μＭ  γセクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴを含む分化培地上のＰＬＯ／ＦＮコーティングプレートに再播種した。
【０１０９】
マイトマイシンＣを省略したことを除いて、Ｙｏｕｎｇ  ＧＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１４に記載されるプロトコルに従って、感覚ニューロンでＨｉＰＳＣを分化させた。
【０１１０】
移植のための細胞調製
ＨｉＰＳＣ由来ＧＡＢＡ介在ニューロンを分化２５日目に解離し、１０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、２０μＭのＢｏｃ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトン（広域カスパーゼ阻害剤−アポトーシス阻害剤）および５０ｎＭのネクロスルホンアミド（ＭＬＫＬ阻害剤−壊死阻害剤）を含むハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）から作製された注入培地に、最終濃度１００，０００細胞／マイクロリットルで再懸濁した。
【０１１１】
オープンフィールド
マウスを、飼育ケージの中で、２つの上向きの照明光源で均一に照らされた暗室に馴化させた。携帯電話の露出計（Ｍｏｔｏｒｏｌａ）により、ボックスの各コーナーの光を測定した。各試験機会にマウスの行動を５分間記録した。次いで、Ｔｏｐｓｃａｎ行動分析ソフトウェアにより行動を分析した。
【０１１２】
ＳＮＩ改変Ｂａｓｓｏマウスのスケール
Ｂａｓｓｏの改変形態を用いて移植後の歩行運動を評価した。端的に述べると、マウスを足首の動き（３匹、動きなし＝０、時折動く＝１、頻繁に動く＝２、常に動く＝３）、足底接地（（３匹、接地しない＝０、時折接地する＝１、頻繁に接地する＝２、常に接地する＝３）、協調（（３匹、協調しない＝０、時折協調する＝１、頻繁に協調する＝２、常に＝３）、および足の回転（平行＝２、回転＝１、歩行せず＝０）についてスコア化した。マウスは、動画から両側でスコア化した。
【０１１３】
ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ
マウスを３つの別々の日に馴化させた。次いで、疼痛のベースライン評価のために、マウスを異なる３日間で試験した。ベースライン閾値は、試験の後半２日間の閾値の平均として定義されている。ｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメントを足蹠の腓腹部分に押し当て、各刺激閾値（０．０４〜２．０ｇ）で１０回適用した。１００％の反応に達するまで各フィラメントに対する反応を記録した。試験の５０％に反応を引き起こす最小フィラメントとして報告される。マウスは、神経部分損傷の６日後、およびその後は１週間ごとに評価した。
【０１１４】
アセトン
１ｍｌのインスリン注射器からの約３０ｕｌの放出を用いて、マウス後足にアセトンの液滴を塗布した。１分間の間に舐めるおよび噛むのに費やした時間を記録した。
【０１１５】
神経部分損傷
０．８Ｌ／分の酸素で３％イソフルランを用いてマウスを麻酔し、続いて維持のために２％イソフルランで麻酔した。麻酔の深さは、つま先反射および眼瞼反射の不在によって確認した。角膜への損傷を防ぐために眼には潤滑剤を与えた。皮膚をメスで切開し、筋肉を鈍的に切開して左坐骨神経を分離した。神経の脛骨および総腓骨部分をエチロン４−０ナイロン縫合糸材料（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で結紮し、腓腹神経に触れないように注意して神経の一部を除去した。次いで、創傷クリップ（Ｒｅｆｌｅｘ、ＦｉｎｅＳｃｉｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ）で切開を閉じた。皮下注射により、ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスに１日０．９％の生理食塩水（Ｐｆｉｚｅｒ）中２．５ｍｇ／ｋｇのエンロフロキサシン（Ｂａｙｔｒｉｌ、Ｂａｙｅｒ）を７日間与えた。運動行動を４〜５日後に評価し、疼痛行動を６日目に評価した。
【０１１６】
インビボ椎弓切除術および脊髄細胞注射
マウスを、腹腔内注射によりケタミン（Ｋｅｔａｍｉｌ）／キシラジンカクテル（１００ｍｇ／８ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。麻酔の深さは、つま先のピンチと眼瞼反射の不在によって定期的に監視される。呼吸速度、体温および粘膜再灌流も監視した。低体温および低酸素をそれぞれ防止するために、手技中に３７℃の加熱プレートで体温を維持し、酸素０．８〜１Ｌ／分を与えた。背面に沿って切開を行い、眼科用ｖａｎｎａｓばね式はさみ（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、慎重な椎弓根切開によりＬ１を除去する。後中心の脊髄動脈を目印として用いて損傷と同側に、定位固定装置（Ｋｏｐｆ）と、カスタム設計された針（ポイントスタイル４および３０度の角度を有する２９ゲージ、１．５インチ長）を備えたハミルトンシリンジとを使用して、腰椎後角を標的とする２μｌの注射を行った。簡潔に述べると、デジタル定位監視デバイスを使用して、硬膜が最初に穿刺されるまで針を前進させ、次いで下げた。２μｌの溶液をゆっくりと注入し、流出を防止するために５分間所定の位置に留置した。浅筋膜をＶｉｃｒｙｌ  ５−０逆三角針縫合糸（ジョンソンおよびジョンソン）を使用して縫合し、２〜３個の創傷クリップで切開を閉じた。ブピバカイン８ｍｇ／ｋｇ（Ｐｆｉｚｅｒ）を注射し、創傷縁の周囲で皮下／皮膚洗浄し、エンロフロキサシンを１０日間毎日与えた。手術の６日後に、疼痛行動を最初に評価した。実験期間中、マウスを毎日監視した。手技の直後に、４０℃に加温した生理食塩水（Ｐｆｉｚｅｒ）をマウスに与えた。手技後２時間ごとにマウスを監視し、完全回復するまで加温した。
【０１１７】
灌流
深く麻酔したマウスを、神経損傷の４週間後に屠殺した。胸部を開き、心臓を露出させ、翼付カテーテル（Ｇｒｉｅｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ）を左心室に挿入した。シリンジドライバを使用して、２５ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ７．４、Ｓｉｇｍａ）、続いて０．１Ｍ  ＰＢ中２５ｍｌの４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Ｓｉｇｍａ）をマウスに灌流した。脊椎組織を注射部位まで少なくとも２ｍｍ吻側および尾側で除去した。組織をＰＦＡ中で２〜４時間固定した後、３０％（ｗ／ｖ）スクロース中で一晩凍結保護した。得られた組織をクライオモールドに適合するように切断し、Ｏ．Ｃ．Ｔ（ＶＷＲ）に包埋して瞬間凍結した。クライオスタット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で脊髄を１６〜２０μｍに薄片化した。
【０１１８】
抗体染色
細胞を室温で１０％ホルマリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＨＴ５０１１）で１５分間固定し、列挙した抗体および希釈液を使用して、特定のニューロンマーカーについて
染色した。適切なＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１：５００）を使用し、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（１：５，０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号Ｈ３５７０）で核を可視化した。
【０１１９】
脊髄染色のために、凍結切片を２０分間室温に平衡化した。次いで、切片をＰＢＳ中で５分間３回すすいだ。スライドを室温のブロッキング溶液中で１時間ブロックした（ＰＢＳ、ウシ血清アルブミン（２％）、および０．３％のＴｒｉｔｏｎ×１００）。一次抗体をブロック溶液中で希釈して添加し、加湿チャンバー内で一晩、４℃でインキュベートした。列挙した希釈液に適切な二次抗体を添加した。最後に、スライドをＰＢＳ中でそれぞれ１５分間３回洗浄し、退色防止効果を有するマウント液Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄとともにカバーガラスで覆った。
【０１２０】
ＲＮＡ核外抽出
Ｆａｖｏｒｇｅｎ  Ｂｌｏｏｄ／Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡキット（Ｆａｖｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．）を使用することにより、全ＲＮＡをｈｉＰＳＣおよびＧＡＢＡ作動性ニューロン培養物から回収した。Ｏｎ−Ｃｏｌｕｍｎ  ＤＮａｓｅ  Ｉ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｓｅｔ（Ｓｉｇｍａ）を使用して溶液中のＤＮａｓｅでＲＮＡを処理し、試料当たり４０ＵのＲｉｂｏｓａｆｅ  ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｂｉｏｌｉｎｅ）で維持した。ＲＮＡの質および量を、吸光度分光法（Ｎａｎｏｄｒｏｐ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー、およびアガロースゲル電気泳動によって評価した。
【０１２１】
ｑＰＣＲ
定量化後、ｑＲＴ−ＰＣＲのためのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて１μｇのＲＮＡを逆転写した。ＳＹＢＲ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用して、合計２μｌのｃＤＮＡをｑＰＣＲに用いた。リアルタイムＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ＩＩ  （Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で実行した。全ての遺伝子のためのサイクリングプログラムは以下の通りである：
−１．９５℃  １０’初期変性ステップ
−２．９５℃  ３０’’
−３．５８℃  ３０’’
−４．７２℃  ３０’‘２に移動して３５サイクル
−５．融解曲線分析。
【０１２２】
プライマー配列は以下の通りである：
ＧＡＤ１  ＦＷＤ：ＣＡＣＡＡＧＧＣＧＡＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣ＿
ＧＡＤ１  ＲＶＲ：ＧＣＧＧＡＣＣＣＣＡＡＴＡＣＣＡＣＴＡＡＣ
ＧＡＤ２  ＦＷＤ：ＴＴＴＴＧＧＴＣＴＴＴＣＧＧＧＴＣＧＧＡＡ
ＧＡＤ２  ＲＶＲ：ＴＴＣＴＣＧＧＣＧＴＣＴＣＣＧＴＡＧＡＧ
ＶＧＡＴ  ＦＷＤ：ＡＣＧＴＣＣＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＴＣ
ＶＧＡＴ  ＲＶＲ：ＡＡＡＧＴＣＧＡＧＧＴＣＧＴＣＧＣＡＡＴ
ＳＳＴ  ＦＷＤ  ＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＡＣＧＧＡＧＡＡＴＧＡ
ＳＳＴ  ＲＶＲ  ＧＣＣＧＧＧＴＴＴＧＡＧＴＴＡＧＣＡＧＡ
ＳＯＸ  ６  ＦＷＤ：ＧＧＡＴＧＣＡＡＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＴＴＴ
ＳＯＸ６  ＲＶＲ：ＧＧＡＴＧＣＡＡＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＴＴＴ
カルレチニンＦＷＤ  ：ＡＣＴＴＴＧＡＣＧＣＡＧＡＣＧＧＡＡＡＴＧ
カルレチニンＲＶＲ  ：ＧＡＡＧＴＴＣＴＣＴＴＣＧＧＴＴＧＧＣＡＧ
カルビンジンＦＷＤ  ：ＧＧＣＴＣＣＡＴＴＴＣＧＡＣＧＣＴＧＡ
カルビンジンＲＶＲ  ：ＧＣＣＣＡＴＡＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＡＡＡＧＴＴ＿
ＴＵＢＢ３  ＦＷＤ：ＧＧＣＣＡＡＧＧＧＴＣＡＣＴＡＣＡＣＧ
ＴＵＢＢ３  ＲＶＲ：ＧＣＡＧＴＣＧＣＡＧＴＴＴＴＣＡＣＡＣＴＣ
ＬＨＸ６  ＦＷＤ：ＧＧＧＣＧＣＧＴＣＡＴＡＡＡＡＡＧＣＡＣ
ＬＨＸ６  ＲＶＲ：ＴＧＡＡＣＧＧＧＧＴＧＴＡＧＴＧＧＡＴＧＴ
ＯＬＩＧ２  ＦＷＤ：ＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＡＴＧＡＣＣＴＴＴＴＴ
ＯＬＩＧ２  ＲＶＲ：ＣＡＣＴＧＣＣＴＣＣＴＡＧＣＴＴＧＴＣＣ
ＮＫＸ２．１  ＦＷＤ：ＡＧＣＡＣＡＣＧＡＣＴＣＣＧＴＴＣＴＣ
ＮＫＸ２．１  ＲＶＲ：ＧＣＣＣＡＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＧＣＴＴＴＣＣ
ＰＡＸ６  ＦＷＤ：ＴＧＧＧＣＡＧＧＴＡＴＴＡＣＧＡＧＡＣＴＧ
ＰＡＸ６  ＲＶＲ：ＡＣＴＣＣＣＧＣＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＣＴＡ
【０１２３】
ＲＮＡ配列決定
Ｎｏｖｏｇｅｎｅは、同社の標準的なインハウス方法に従ってＲＮＡ配列決定を行った。ＩｌｌｕｍｉｎａのＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  ＲＮＡライブラリー調製キットを使用してライブラリー調製を行った。ＨｉＳｅｑ  ＰＥ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｋｉｔ  ｃＢｏｔ−ＨＳ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してインデックスコード化試料をクラスタリングし、得られたライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎｅ  ｈｉｓｅｑプラットフォーム上で配列決定し、１２５／１５０ＢＰ対のペアエンドリードを生成した。
【０１２４】
ＲＮＡ配列決定分析
アダプターを含むリード、ポリ−Ｎ、および低品質リードを除去することによりクリーンリードを得た。全ての下流データ解析は、クリーンデータに対して行った。Ｂｏｗｔｉｅ  ｖ２．２．３を使用してリファレンスゲノムのインデックスを生成し、ＴｏｐＨａｔ
ｖ２．０．１２を使用してペアエンドのクリーンリードをリファレンスゲノムに整列させた。ＨＴＳｅｑ  ｖ０．６．１を使用して、各遺伝子にマッピングされたリード数をカウントし、次いで、遺伝子長および遺伝子にマッピングされたリードカウント数に基づいてＦＰＫＭを計算した。生リードカウントをＲのＤＥＳｅｑ２パッケージに入力し、差異発現を評価した。ヒートマップによる視覚化のために、ＦＰＫＭを最大値ＦＰＫＭに正規化した。得られたｐ値をＢｅｎｊａｍａｎｉ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇによって調整し、０．０５未満の調整ｐ値を有する遺伝子を差次的に発現されたものとして評価した。
【０１２５】
フローサイトメトリー分析
細胞をＴｒｙＰＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で解離させ、１０％ホルマリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＨＴ５０１１）中で２０分間固定し、ブロッキング緩衝液（３％
ＢＳＡおよび０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含むＰＢＳ）とともにインキュベートした。ブロックされた細胞を、ブロッキング緩衝液中で３０分間、一次抗体（共役した抗β３チューブリン抗体−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｂｃａｍまたは抗ＧＡＤ６５抗体、Ａｂｃａｍ）とともにインキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、さらに３０分間、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４と共役した二次抗体（Ａｂｃａｍ）とともにインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を３％  ＢＳＡでＰＢＳ中に再懸濁し、分析した。ＧＡＤ−６５用のマウスＩｇＧアイソタイプ対照抗体を同じ条件下で使用した。非標識対照も対照として使用した。ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、取得した１０，０００の事象を収集した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用して生データを分析した。
【０１２６】
ＥＬＩＳＡ
ＤＩＶ２５のＧＡＢＡ作動性ニューロンを培地中に３日間放置した。培地を吸引し、ラ
ットγアミノ酪酸のＥＬＩＳＡ（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）を用いて試験した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用した４ポイントのロジスティック回帰を用いて、製造業者の指示に従って吸光度値を変換した。
【０１２７】
ＧＡＢＡ対誘導多能性幹細胞プロテオミクス
ＧＡＢＡニューロンは、本明細書に記載される方法によって誘導した。ＤＩＶ２５に、それらを氷冷リン酸緩衝生理食塩水中で３回穏やかに洗浄することによって溶解した。変性溶解緩衝液（４％  ＳＤＳ、２０ｍＭリン酸ナトリウム６．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、完全プロテアーゼ阻害剤（ＥＤＴＡ不含、Ｒｏｃｈｅ）、１０ｍＭ  ＮａＦ、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、２ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、６０ｍＭ  Ｂ−グリセロリン酸）をウェルに添加し、細胞スクレーパーを使用して掻き取り、試料を６５℃で１０分間加熱した。次いで、試料をＱ．Ｓｏｎｉｃａ  ８００で超音波処理した（３０秒の超音波処理オン／オフサイクル、合計１０分間の超音波処理、１８℃で８０％の振幅）。
【０１２８】
タンパク質の消化、ペプチド精製および定量化−トリスカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）を添加することによって、タンパク質（１００ｕｇ）を最終濃度１０ｍＭに還元した。ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ−Ｃ  （Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内で、タンパク質試料を１０００ｒｐｍで１０分間６５℃に加熱した。室温に冷却してから、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を最終濃度で画分に添加し、室温で３０分間インキュベートさせた。画分を緩衝液交換し、以前に記載されたＳＰ３法を用いてトリプシンで消化した（Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｈｕｇｈｅｓ  ＣＳ，Ｆｏｅｈｒ  Ｓ，Ｇａｒｆｉｅｌｄ  ＤＡ，Ｆｕｒｌｏｎｇ  ＥＥ，  Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ  ＬＭ，Ｋｒｉｊｇｓｖｅｌｄ  Ｊ．Ｍｏｌ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ．２０１４  Ｏｃｔ  ３０；１０：７５７．ｄｏｉ：１０．１５２５２／ｍｓｂ．２０１４５６２５）。．
【０１２９】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよびスペクトルの解析
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＥａｓｙＬＣ  １０００  ＵＨＰＬＣを使用して、４％（体積／体積）ギ酸中のペプチド（注入体積３μＬ、約１０００ｎｇのペプチド）を、１．９μｍの粒子を含む５０ｃｍ×７５μｍの逆相Ｃ１８カラム（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ  ＧｍｂＨ）に一体型エミッタで直接注入した。ペプチドは、３００ｎＬ分−１の流量で９０分間にわたって５％アセトニトリルから３０％アセトニトリルへの勾配で分離した。ペプチドを＋２．３ｋＶでエレクトロスプレーイオン化によりイオン化した。ＨＣＤフラグメンテーションを使用して、Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上でタンデム質量分析を実行した。使用したデータ依存的取得法により、勾配の任意の１点において、上位２０個の最も豊富なイオンのＭＳ／ＭＳスペクトルを取得した。全ての生のＭＳデータは、ＰＲＩＤＥパートナーリポジトリを介して、データセット識別子ＰＸＤ００ＸＸＸＸ、ユーザ名：ｒｅｖｉｅｗｅｒＸＸＸＸ＠ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ、パスワード：ＸＸＸＸＸで、ＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｔｅｏｍｅｃｅｎｔｒａｌ．ｐｒｏｔｅｏｍｅｘｃｈａｎｇｅ．ｏｒｇ）に寄託した。質量分析器によって生成された生データを、ＭａｘＱｕａｎｔを使用して分析した。ペプチドおよびタンパク質レベルの同定はどちらも、標的−デコイに基づく戦略を用いて１％の偽発見率に設定した。ペプチド同定のために検索エンジンに供給されたデータベースは、２０１７年９月３０日にダウンロードされたＨｕｍａｎ  Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースであった。前駆体イオンの質量公差を４．５ｐｐｍに設定し、ＭＳ／ＭＳ質量公差を２０  ｐｐｍに設定した。酵素をトリプシンに設定し（Ｃ末端からＲ／Ｋへの切断）、ミス切断は最大２回とした。Ｎ／Ｑの脱アミド化、Ｍの酸化、Ｎ末端ピロ−Ｅ／Ｑ、タンパク質Ｎ末端アセチル化を可変修飾として設定した。Ｃ上のＮ−エチルマレイミドを固定修飾として検索した。ＭａｘＱｕａｎｔからの出力は、上記と同じ識別子でＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅ  Ｃｏ
ｎｓｏｒｔｉｕｍにアップロードされている。
【０１３０】
タンパク質アッセイ
製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の指示に従ってビシンコニン酸タンパク質アッセイを使用して、試料タンパク質濃度を決定した。
【０１３１】
ウェスタンブロット
抽出されたヒト幹細胞タンパク質およびラダー１０μｇ（着色済みＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ  ２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号ＬＣ５９２５）を８〜１２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｓ５）で電気泳動させた（１時間、１５０Ｖ）。次いで、ニトロセルロース膜（Ｌｉ−Ｃｏｒ）に３５Ｖで１．５時間、分離したタンパク質のウェット式転写を行い、次いでＰＢＳ中の５％（ｗ／ｖ）乾燥脱脂乳中でブロックし、５％  ＢＳＡ、０．１％  ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ−２０、および０．０２％アジ化ナトリウムブロッキング緩衝液（ＴａｂｌｅＸＸＸ）に溶解した一次抗体中、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、ニトロセルロース膜を、適切なフルオロフォア共役二次抗体とともにインキュベートした（表を参照）。Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）赤外線イメージングシステム（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してブロットを可視化した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色（ＩｎｓｔａＢｌｕｅ  Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＩＳＢ１Ｌ）のために、１０μｇのタンパク質を、フィブロネクチンおよびマトリゲル対照とともに１５０Ｖで１時間電気泳動させ、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色液中で、室温で一晩インキュベートした。２時間の脱染後、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）赤外線イメージングシステムを使用してゲルを画像化した。
【０１３２】
データ解析
プロテオミクスデータをスチューデントｔ検定によって分析し、Ｂｅｎｊａｍａｎｉ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順を用いて偽発見について調整した。
【０１３３】
実施例１．神経障害性「疼痛」は、損傷に対する保存された反応である。
遺伝的に扱いやすい無脊椎動物における慢性的な「疼痛」を調査するために、発明者らは、成体のショウジョウバエにおける神経損傷モデルを確立した。ハエにおいて、≧４２℃の表面温度は、数分以内に強い侵害受容反応または死亡を引き起こす。この挙動を利用して、本発明者らは、侵害受容の閾値を調査するためにハエのホットプレート逃避パラダイムを開発した。野生型（Ｃａｎｔｏｎ  Ｓ）ショウジョウバエは、表面を２５〜３８℃に設定した場合、最小限の逃避反応を示した（図１Ａ、および図示せず）。しかしながら、動物を侵害性の熱（４２℃）に曝露した場合、損傷のないハエは強い侵害受容逃避反応を示し、動物は約３回の逃避反応／ハエ／分を示した（図１Ａ）。ショウジョウバエのＴｒｐＡファミリーメンバーであるＴｒｐＡ１（Ｎｅｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）およびｐａｉｎｌｅｓｓ（Ｎｅｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｔｒａｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）は、ハエの幼虫および成虫の急性熱侵害受容に必要であるため、本発明者らは、これらの受容体がこの反応にも関与しているかどうかを調べた。実際、ＴｒｐＡ１およびｐａｉｎｌｅｓｓの両方が、侵害性温度（４２℃）での急性逃避行動に必要であった（図１Ａ）。
【０１３４】
次に、本発明者らは、ハエを損傷させ、損傷によって熱逃避反応プロファイルが変化するかどうかを調べた。本発明者らは、野生型動物の右中脚を切断し（図１Ｂ）、動物を回復させ、次いで異なる温度での逃避反応を評価した。無傷の動物は、３８℃の表面に曝露されたときに最小限の逃避試行を示したが、切断後のハエは有意により多くの逃避行動を示した（図１Ｃ）。この反応は、損傷直後には見られなかったが、損傷から約７日後に最初に明らかになり、１４日を過ぎても持続した（図１Ｃ、図Ｓ１ＡおよびＢ）。損傷により侵害温度（４２℃）での逃避反応は変化せず、痛覚過敏反応であると考えられたが、侵
害温度よりも低い温度に対する感作（３８℃）に限定されており、「有痛性」の行動反応が非侵害性刺激によって誘発される熱アロディニアと一致していた（図１Ｄ、図Ｓ１ＡおよびＢ）。全体的な速度の分析は、脚切断後の動きに大きな変化を示さず、観察された表現型は、活性の一般的な差異によるものではないことを示した（図１Ｅ）。総合すると、これらのデータは、ショウジョウバエが重度の損傷に応答してアロディニアを示すことを示している。
【０１３５】
実施例２．アロディニアは、ｐｐｋ＋感覚ニューロン中のＴｒｐＡ１によって媒介される。
幼虫において、ｐｐｋ＋感覚ニューロンは、動物の体をタイル状に覆い、急性侵害熱反応を伝達する（Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。成体のハエにおいて、本発明者らは、ｐｐｋ＋ニューロンが脚の同様の感覚構造に組織化されており（図２Ａ）、ｐｐｋ＋細胞体は、脚に沿って位置し（図２Ｂ）、ｐｐｋ＋ニューロンは、末梢に、ならびに腹側神経索（ＶＮＣ）および脳に向かって投射を送る（図２Ｃ、図８Ｃ〜図Ｅ）ことを観察した。重要なことに、本発明者らがＵＡＳ破傷風毒素でｐｐｋ＋ニューロンからのシナプス出力を遮断したとき、動物は損傷後にアロディニアをもはや呈しなかった（図２Ｄ）が、それ以外の場合は同等の移動度を示した（図示せず）。さらに、対照動物は、損傷後３８℃まで感作性逃避反応を示したが、ｐａｉｎｌｅｓｓおよびＴｒｐＡ１変異動物の両方は、この影響に完全に耐性を有し（図２Ｅ）、４２℃では感作すら示さなかった。最後に、ｐｐｋ＋感覚ニューロン中でＴｒｐＡ１  ＲＮＡｉを駆動することは、アロディニアを抑制するのに十分であり（図２Ｆ）、ＴｒｐＡ１変異体バックグラウンド上でｐｐｋ＋感覚ニューロン中に特異的にＴｒｐＡ１を再導入することによって感作が完全にレスキューされた（図２Ｇ）。したがって、ハエにおいて、神経障害性アロディニアは、ｐｐｋ＋侵害受容感覚ニューロンで特異的に発現される保存された感覚受容性ＴＲＰチャネルＴｒｐＡ１を必要とする。
【０１３６】
実施例３．末梢神経障害性損傷は、中央機構を介してアロディニアを引き起こす
ハエは高温表面上に置かれたときに「ジャンプ」逃避反応を示し、この反応は損傷後の感作を示すため、次に、本発明者らは、脚の感覚ニューロンを活性化することが逃避反応回路を直接トリガーすることができるかどうかを調査した。本発明者らは、無傷のハエの中脚の侵害受容感覚子を刺激し、ショウジョウバエ逃避反応回路の最終ステップである背縦走筋（ＤＬＭ）からの細胞内記録によって逃避反応を評価した（図３Ａ）。無傷の脚の刺激は、強い逃避反応を引き起こした（図３Ａ）。巨大線維反応は、脳の関与なしに生じ得る（図９Ａ）。しかしながら、本発明者らは、逃避反応につながる脚の刺激が局所反射ではなく、高次脳機能を必要とすることを見出した（図９Ｂ）。興味深いことに、中脚の切断は非侵害性の熱に対する行動感作を引き起こしたが、本発明者らが損傷脚を直接刺激したときには反応を観察されなかった（図３Ｂ）。それと一致して、本発明者らは、損傷脚における近位ｐｐｋ＋感覚ニューロンの段階的神経障害を７日間にわたって確認し（図３Ｃ、Ｄで定量化）、哺乳動物における末梢神経切断後に、軸索切除されたニューロンの同様の変性損失が観察される（Ｔａｎｄｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【０１３７】
損傷脚の残りの部分は重度の感覚性ニューロパチーを示し、刺激に反応しなかったため、代わりに、本発明者らは、切断したハエの対側の損傷していない脚を刺激し、逃避反応の活性化を評価した（図３Ｅ）。驚くべきことに、損傷の７日後、本発明者らは、対向脚を刺激しているときに明らかな変化を観察し、全体的な逃避反応速度は０．２ｍｓ速く生じ（図３Ｆ、Ｇで定量化）、反応持続時間は０．２ｍｓ長く持続した（図３Ｆ、Ｈで定量化）。本発明者らが求心性感覚入力をバイパスして、下行逃避回路を直接刺激したときに、依然として全増強反応速度の５０％が観察されたため（０．１ミリ秒速い、図９Ｃ）、この侵害受容逃避回路の上行および下行成分の両方に損傷後の変化が生じたことになる。総合すると、これらのデータは、末梢損傷が、感覚性ニューロパチー、対側感作、および
侵害受容逃避回路の経験駆動型可塑性をもたらすことを示している。
【０１３８】
実施例４．中枢におけるＧＡＢＡ作動性抑制の喪失は神経障害性アロディニアを引き起こす
ｐｐｋ＋感覚ニューロンは、脚からショウジョウバエＣＮＳの「前角」に投射する（図２Ａ〜図２Ｃ、図８Ｃ〜図８Ｅ）。侵害受容ニューロン（ｐｐｋ＋）およびＧＡＢＡ作動性ニューロンを共標識することにより、本発明者らは、ＶＮＣにおけるこれらの２つの集団間の密接な相互作用を観察した。重要なことに、損傷の７日後、発明者らは、第２のＶＮＣ葉の同側および対側の両方の部分において、ＧＡＢＡ免疫反応性の劇的な約４０％の低下を観察した（図４Ａ〜図４Ｂ、図９Ｄ、横断面、９Ｅで定量化）：この損失は、主にＶＮＣ中線に沿って生じた。ＶＮＣの第１の葉および第３の葉においても、ＧＡＢＡ焦点の有意ながら軽度の低減が生じた（図１０Ａ〜図１０Ｂ）が、損傷した動物の脳においてＧＡＢＡ焦点の数の差は観察されなかった（図１０Ｃ）、すなわち、ＧＡＢＡ免疫反応性の喪失がＶＮＣに局在していた。ハエの脚にＧＡＢＡ作動性の核または投射が観察されなかったため、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの喪失は、これらの細胞の直接的な損傷に起因するものではなかった（図示せず）。ＴｒｐＡ１はＧＡＢＡ作動性焦点の喪失には必要なかったが（図示せず）、ｐｐｋ＋感覚ニューロン（ｐｐｋ−Ｇａｌ４駆動ＵＡＳ−破傷風毒素）からのシナプス出力を遮断することによりＶＮＣ  ＧＡＢＡ焦点の喪失が完全に妨げられ（図４Ｃ、９Ｆで定量化）、この損傷の神経障害性が確認された。
【０１３９】
カスパーゼの薬理学的阻害は、ＧＡＢＡ損失を防止し、げっ歯類における神経障害性疼痛の発生を抑制することができるため（Ｓｃｈｏｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、本発明者らは、ハエにおける中枢ＧＡＢＡの調節におけるカスパーゼの役割を評価した。インタクトな動物は、ＶＮＣにおいてほとんどＧＡＢＡ／活性カスパーゼ共標識を示さなかった（Ｇａｄ１−Ｇａｌ４＞＞ＵＡＳ−ラミン−ＧＦＰによって標識されたＧＡＢＡ能性ニューロン；図４Ｄ、１０Ｅで定量化）。損傷後、ＶＮＣ中のＧＡＢＡ作動性核の総数が劇的に減少した（１０Ｄで定量化）一方、Ｇａｄ１／活性カスパーゼ二重陽性細胞の数は有意に増加した（図４Ｄ、１０Ｅで定量化）。ＧＡＢＡ作動性細胞喪失がカスパーゼ依存性事象であるかどうかを直接試験するために、本発明者らは、ＧＡＢＡ作動性ニューロンにおいて特異的にカスパーゼ阻害剤ｐ３５の発現を駆動した（Ｇａｄ１−Ｇａｌ４＞ＵＡＳ−ｐ３５）。カスパーゼを遮断しても、ハエＶＮＣ中のＧＡＢＡ焦点のベースライン数は変化しなかったが、Ｇａｄ１＋ＧＡＢＡ作動性ニューロン中のｐ３５の異所性発現は、神経損傷後のＧＡＢＡ焦点の喪失を完全に阻止した（図４Ｅ、１０Ｆで定量化）。次に、本発明者らは、ＧＡＢＡ作動性（＋）細胞喪失を阻止することが、損傷した動物における全体的な侵害受容回路に機能的な結果をもたらしたかどうかを試験した。侵害受容逃避回路は、親対照株（ＵＡＳ−ｐ３５／＋）において反応潜時および持続時間の向上を示したが、ＧＡＢＡ作動性細胞死を抑制すると（Ｇａｄ１−Ｇａｌ４＞ＵＡＳ−ｐ３５）、損傷後の侵害受容逃避回路における全ての変化が完全に遮断された（図４Ｆ〜図４Ｇ）。重要なのは、親対照株は、脚切断後に神経障害性アロディニアを示したのに対し、カスパーゼ媒介性ＧＡＢＡ作動性細胞死を遮断することにより、この反応が完全に抑制されたことである（図４Ｈ）。逆に、代謝性ＧＡＢＡ−Ｂ−Ｒ２またはイオンチャネル型ＧＡＢＡ／グリシン受容体サブユニットであるディルドリン抵抗性（Ｒｄｌ）の侵害受容器特異的（ｐｐｋ−Ｇａｌ４）ＲＮＡｉノックダウンは、損傷のない動物において侵害温度よりも低い温度（３８℃）に反応してアロディニアを促進し、逃避行動を増強し得る（図４Ｉ、図１０Ｇ）。総合すると、これらのデータは、ハエにおいて、中枢ＧＡＢＡの喪失が必要であり、熱アロディニアに十分であることを示す。
【０１４０】
実施例５．ｉＰＳＣ由来のＧＡＢＡ作動性移植片は、神経障害性疼痛を治療的に処理することができる
本発明者らのハエ神経障害性研究は、神経障害性疼痛を駆動する基礎となる中心的な病
理として中枢性抑制の喪失を強調する。同様に、哺乳類の疼痛知覚において、ＧＡＢＡを産生する抑制性介在ニューロンは、脊髄における疼痛の中枢ゲーティングに重要な役割を果たす。この目的のために、本発明者らは、このアプローチの治療的な実行可能性を評価するための前臨床ＧＡＢＡ作動性移植プロトコルを開発した。細胞置換療法は、自己材料の移植を必要とするため、本発明者らは、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の潜在的有用性を調査した。
【０１４１】
ＧＡＢＡ作動性ニューロンを、上述のプロトコルによりインビトロでｈｉＰＳＣから分化させた（図５Ｂに示す）。ｈｉＰＳＣをＴｒｉｐＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で解離し、超低接着表面を有する結合プレート中の懸濁液で２週間増殖させて胚様体（ＥＢ）を形成させる。神経誘導のために、細胞をＳＭＡＤ阻害剤ＬＤＮ１９３１８９（１００ｎＭ、０日目〜１４日目）およびＳＢ４３１５４２（１０μＭ、０日目〜１０日目）で処理する。ＭＧＥ（内側基底核隆起）誘導ために、細胞をＷｎｔ阻害剤ＩＷＰ２（５μＭ、０日目〜７日目）、ＳＨＨ活性化剤ＳＡＧ（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト０．１μＭ、０日目〜２１日目）、および増殖因子ＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍＬ、８日目〜２１日目）で処理した。分化の初日に、ＲＯＣＫ阻害剤を加える。懸濁液中に２週間置いた後、ＥＢをポリオルニチン（ＰＬＯ）およびフィブロネクチン（ＦＮ）でコーティングした表面に移す。２１日目に、ＥＢを解離し、将来的な分化および成熟のために１０ｎｇ／ｍＬ  ＢＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍＬ  ＧＤＮＦ、および２．５μＭ  γセクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴを含む分化培地上のＰＬＯ／ＦＮコーティングプレートに再播種した。分化プロトコルは、２８日以内に、ｈｉＰＳＣのＧＡＢＡ作動性（ＧＡＤ６５／６７＋）ニューロン（ＴＵＢＢ３＋）への分化を効率的に促進した（図５Ｃ）。
【０１４２】
ＦＡＣＳによって、分化条件は、ＴＵＢＢ３発現プロファイルおよびＧＡＤ６５＋細胞の純粋集団における全体的なシフトを促進した（約９５％純粋、図５Ｄ）。移植材料の分子プロファイルをさらに特徴付けるために、ＤＩＶ２５のｈｉＰＳＣ由来のＧＡＢＡ作動性ニューロンおよび親ｈｉＰＳＣにおいてＲＮＡ配列決定を行った。ＧＡＢＡ作動性特異性を確認するために、ｈｉＰＳＣ由来感覚ニューロンのトランスクリプトームも分析した。分化したＧＡＢＡ作動性ニューロンは、ＧＡＢＡ特異的転写物およびソマトスタチンサブタイプマーカーを発現した（図５Ｅ、図１３Ｂ）。ＨｉＰＳＣ由来のＧＡＢＡ作動性ニューロンはまた、増殖または多能性マーカーを下方制御し（図５Ｅ、図１３Ｄ）、グルタミン酸受容体を上方制御し（図１３Ｃ）、おそらく未分化前駆細胞に起因してＯＬＩＧ２を発現した（図５Ｅ、図１３Ｅ）。分化したＧＡＢＡ作動性ニューロンは、主に、皮質または線条体ソマトスタチン（＋）ニューロンと最も密接に関連する外套下部ＭＧＥおよびＣＧＥ分化状態を示す。しかしながら、ある程度のレベルのＬＧＥ特異的転写物が観察された（図１４）。階層的クラスタリングによって実証され（図１３Ａ）およびｑＰＣＲによって検証されたように（図１３Ｆ）、生物学的反復実験内で再現性が強かった。質量分析法によって評価されたタンパク質の発現により、ｉＰＳＣ由来のＧＡＢＡ作動性ニューロン内における、シナプスおよびＧＡＢＡ作動性機構、ニューロンマーカーの発現、ならびに細胞周期成分の下方制御が明らかになった（図５Ｆ、図１５Ａ〜図１５Ｅ）。Ｒｅａｃｔｏｍｅ経路分析により、ＧＡＢＡ合成および放出機械の強力な濃縮があきらかになった（図１５Ｃ、図１５Ｄ）。さらに、ｈｉＰＳＣ由来のＧＡＢＡ作動性ニューロンは、増殖しておらず（図示せず）、Ｋｉ６７の発現を下方制御したが（図５Ｇ）、ＧＡＤ６５（図１５Ｅ）、およびグリシン作動性ニューロン特異的マーカーであるグリシン輸送体ＧｌｙＴ２（図１５Ｅ）、ＧＡＢＡ放出に必要なＧＡＢＡ輸送体（小胞ＧＡＢＡ／グリシン輸送体ＶＧＡＴ）（図５Ｈ）を発現し、ＧＡＢＡを産生した（図５Ｉ）。
【０１４３】
ｉＰＳＣ由来のＧＡＢＡ作動性（ｉＧＡＢＡ作動性）ニューロンはＧＡＢＡ作動性マーカーおよび機構を発現するため、本発明者らはＧＡＢＡ分泌を評価し、ＥＬＩＳＡによってｉＧＡＢＡ作動性ニューロンがＧＡＢＡを分泌することを確認した（図６Ａ）。さらに
、ｉＧＡＢＡ作動性ニューロンは、カイニン酸、ＮＭＤＡ、およびＡＭＰＡグルタミン酸受容体サブクラスのサブユニットを発現する（図６Ｂ）。細胞が応答性であるかどうかを試験するために、グルタミン酸で細胞を刺激し、カルシウムイメージングを行った。強力なカルシウム一過性を観察し、細胞の大部分はグルタミン酸および塩化カリウムの両方に応答した（図６Ｃ、図６Ｄ）。
【０１４４】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表２】
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【０１４５】
疼痛疾患を治療するためのｉＧＡＢＡ作動性ニューロンの翻訳可能性を評価するために、本発明者らは、神経障害性疼痛の神経部分損傷（ＳＮＩ）モデル（Ｄｅｃｏｓｔｅｒｄ
ａｎｄ  Ｗｏｏｌｆ，２０００）を行った後、ｉＧＡＢＡ作動性ニューロンを損傷マウスの脊髄の同側後角（腰膨大）に移植した（図６Ａ）。異種移植片反応を回避するために、本発明者らは免疫不全（ＮＯＤＳＣＩＤ）レシピエントを用いた。予想通り、ＳＮＩは６日以内にＮＯＤ  ｓｃｉｄマウスにおいて接触性アロディニアおよび冷アロディニアを引き起こした：ｖｏｎ  Ｆｒｅｙのライトタッチアッセイおよびアセトン反応によってそれぞれ評価された。移植後２週間から、（試験のエンドポイントである）２ヶ月まで持続した強力な鎮痛が観察された。これは、接触性アロディニアの低減および刺激反応曲線のシフトとして現れた（図７Ｂ〜図７Ｃ）。
【０１４６】
ＧＡＢＡ作動性ニューロンは運動回路にも関与するため、本発明者らは、オープンフィールド試験を用いて運動行動を評価した。動作の最大速度または平均移動速度のいずれにおいても、群間差は観察されなかった（図７Ｄ〜図７Ｅ）。さらに、改変されたＢａｓｓｏマウススケールを用いてマウスの歩行を評価した。ＳＮＩは、坐骨の運動神経／感覚神経の損傷が混在することに起因して、予想通り、歩行に影響を及ぼした。しかしながら、移植後に群間の歩行における肉眼的変化は観察されず、総合すると、運動行動への大きな干渉がないことが示唆される（図７Ｆ）。解剖学的に近接しているため、腰椎後角に移植されたＧＡＢＡ作動性ニューロンは、脊髄に位置する自律神経系の核に影響を及ぼす可能
性がある。しかしながら、マウスにおいて膀胱または排便に関する問題は観察されなかった。
【０１４７】
観察された影響が運動行動と無関係であることをさらに確認するために、ｉＧＡＢＡ作動性ニューロンをナイーブマウスに移植した。刺激反応および離脱閾値に変化は見られず、触覚感度の低下には神経損傷が必要であることが示唆された（図７Ｈおよび図１６）。また、これらの結果によって、移植片が、任意の刺激が認識される緊張性閾値（ｔｏｎｉｃ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を単純に増加させないことも確認された（図１６Ｂ）。最後に、本発明者らは、神経損傷後にｈｉＰＳＣ由来の感覚ニューロン（ｉＳｅｎｓｏｒｙニューロン）を後角に移植しても鎮痛をもたらすことができなかったため、治療の特異性を確認した（図７Ｉおよび図１６Ｃ）。総合すると、成熟したｉＧＡＢＡ作動性ニューロン移植片を用いて抑制を増強することにより、末梢誘発性神経障害性疼痛からの長期鎮痛が促進される。
【０１４８】
ニューロンが脊髄に生着する可能性を評価するために、細胞の生存率、組込み、およびシナプス統合の可能性を評価した（図８）。移植から３週間後、我々は、放射状移動を介して後角ラミナＩ（ＣＧＲＰ＋）およびＩＩ（ＩＢ４＋）、ならびに他の背側ラミナにおけるｈｉＰＳＣ由来のＧＡＢＡ作動性ニューロンを同定した（図８）。当初、ｉＧＡＢＡ作動性ニューロンは腹側または対側の脊髄に移動せず（図８）、ニューロンおよびＧＡＢＡ作動性マーカー発現を保持し、シナプス統合の可能性の初期の証拠を示した（図８）。しかしながら、１０週間後に実質的な移動が観察された。移植された細胞は、それらのヒトＮＣＡＭ１、ＭＡＰ２、ＴＵＢＢ３の共発現によって評価されたようにニューロン同一性を保持し、ＮｅｕＮを発現し、最終分化が示唆された（図９Ｃ〜図９Ｅ）。ｉＧＡＢＡ作動性ニューロンは、ＧＡＢＡに対して免疫反応性であり、ＶＧＡＴ、ＧＡＤ６５／６７、およびシナプシンの発現を保持し、移植されたｉＧＡＢＡ作動性ニューロンがＧＡＢＡを合成、パッケージ、および放出する能力を保持すること示唆された（図９Ｆ〜図９Ｈ）。加えて、マウスのシナプス前密度（バスーンを標的とするマウス特異的抗体を特徴とし、シナプス前タンパク質ＲＩＭ２と共局在する）が、ｉＧＡＢＡ作動性ニューロン（ヒト特異的細胞質抗体、ヒト細胞質を特徴とする）と直接並置しており、移植片とレシピエント組織との間にシナプスを形成する可能性が示唆されることが見出された（図９Ｉ）。ｉＧＡＢＡ作動性ニューロンは、重要なシナプス前タンパク質であるリプリンを発現し、汎電位依存性（ｐａｎ−ｖｏｌｔａｇｅ  ｇａｔｅｄ）カルシウムチャネル抗体に対して免疫反応性であった（図９Ｋ〜図９Ｌ）。最後に、抑制性シナプス後マーカーであるゲフィリンのヒトシナプシンへの並置が観察され、抑制性シナプスの存在が示唆された（図９Ｍ〜Ｎ）。注目すべきことに、移植された抑制性ニューロンは、主に、ソマトスタチンまたはパルブアルブミンサブクラスであった（図９Ｏ〜図９Ｐ）。重要なことに、奇形腫または他の関連する異常の形態学的証拠は観察されず、ｉＧＡＢＡ作動性ニューロンの増殖の証拠を特定することができなかった（細胞は活性細胞周期タンパク質Ｋｉ６７を発現しなかった）（図９Ｒ〜図９Ｓ）ため、この手技の安全性が強調される。
【０１４９】
実施例６。神経障害性マウスにおける疼痛を緩和するためのｈｉＰＳＣ−ＧＡＢＡニューロンの分化の増強。
【０１５０】
ｉＧＡＢＡ作動性ニューロンを、実施例５に記載の方法を適合させることによりした。ＧＡＢＡ作動性分化プロトコル中、３週目のみ（すなわち、約ＤＩＶ１４〜約ＤＩＶ２１）、４週目のみ（すなわち、約ＤＩＶ２１〜約ＤＩＶ２８）、または３週目および４週目（すなわち、約ＤＩＶ１４〜約ＤＩＶ２８）、ｈｉＰＳＣをＢＭＰ４に曝露した。分化（すなわち、ＤＩＶ２８）後、ｉＧＡＢＡ作動性ニューロンを、ソマトスタチン（ＳＳＴ）およびパルブアルブミン（ＰＶＡＬＢ）の発現について評価した。次いで、ＢＭＰ４処理細胞を、神経障害性疼痛を逆転する能力について試験し、前述のＳＮＩモデルを使用して
、非処理ｉＧＡＢＡ作動性ニューロンと比較した。
【０１５１】
驚くべきことに、４週目、または３週目および４週目ではなく、３週目中にｈｉＰＳＣをＢＭＰ４に曝露すると、ＰＡＶＢ発現の６倍の増加につながることが分かった。分化プロトコルにおける３週目および４週目のいずれかまたは両方の間のｈｉＰＳＣの曝露は、ｑＰＣＲによって示されるＳＳＴ発現の５０％の減少をもたらした（図１７Ａ、図１７Ｂ）。
【０１５２】
驚くべきことに、分化プロトコル（パルブアルブミン濃縮）の第３週の間にＢＭＰ４に曝露されたｉＧＡＢＡ作動性ニューロンをＳＮＩマウスに移植したときに、ＳＮＩマウスがＢＭＰ４に曝露されなかったｉＧＡＢＡ作動性ニューロンで処理した場合と比較して、損傷後５週間で有意により強力な長期鎮痛反応が観察されたことも分かった（図１７Ｃ）。実際、パルブアルブミン濃縮ｉＧＡＢＡ作動性ニューロンで処理した動物は、移植後５週間にそれぞれのベースライン対照と比較して有意な差を示さなかった（すなわち、疼痛はＳＮＩ動物において完全に正常に戻る）（図１７Ｃ）。
【０１５３】
神経障害性疼痛における重要な機構としての中枢脱抑制の中心的な役割を利用して、本発明者らは、ｈｉＰＳＣ由来のＧＡＢＡ作動性培養物を神経障害性哺乳動物の脊髄に移植して、長期持続性の疾患緩和を促進することができることを示す。本明細書に記載の研究では、ｈｉＰＳＣ由来のＧＡＢＡ作動性ニューロン移植に対する明らかな行動または生理学的有害反応は観察されなかった。さらに、ＧＡＢＡ作動性ニューロンは分裂しておらず、レシピエント動物に移植した際に、細胞周期および多能性マーカーを下方制御し、腫瘍または奇形腫を形成せず、有効性だけでなく、本発明の組成物および方法の安全性も明らかになった。
【０１５４】
総合すると、これらのデータは、中枢性抑制が、いくつかの形態の神経障害性疼痛にとって中心となる根源的な病理であり、抗神経障害性ＧＡＢＡ作動性移植片によって中枢性抑制トーンを強化することは、神経障害性疼痛からの長期的かつ潜在的に治癒的な緩和を促進することができることを示している。既存の鎮痛剤は数時間作用し、中には重篤な副作用をもたらすものもある。この治療法は、より長期的な鎮痛を提供し、副作用なしに神経障害性疼痛を効果的に緩和する単一の手技の可能性を表している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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