(57)【要約】  検体採取、画像取得、データ前処理、導出されるバイオマーカの計算、モデル化、分類、および解析のプロセスを自動化する能力により、臨床的意思決定および細胞変形の基礎調査に著しい影響を与えることができる。本開示は、３Ｄ細胞核形状モデリングと、ロバストな平滑面再構築および形状形態計測測度とを組み合わせて、何千もの細胞核および細胞核小体の３Ｄでの形態学的解析の、開始から終了までにわたる高度に並列的なパイプラインワークフローを作り出す。この手法は画像データ内の細胞形状を効率的かつ有益に評価することができ、生物医学コミュニティで検証、修正、転用することのできる再現可能な技法を表す。これにより、結果の再現可能性、方法の共同検証、および、広範な知識普及が促進される。
2021514468.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織を解析するための自動化された方法において、
生体試料の成分を染色する工程であって、前記生体試料が、少なくとも１つの細胞を含有する組織または細胞の培養物を含む、染色する工程と、
前記生体試料の画像データを受け取る工程であって、前記画像データが前記生体試料の３次元表現を提供する、画像データを受け取る工程と、
前記画像データ内の少なくとも１つの細胞の成分をラベル付する工程と、
前記画像データ内の、ラベル付けされた組織バイオマーカ、または細胞もしくは細胞内の細胞器官もしくは要素のそれぞれについて、染色体テリトリー、位相的会合性ドメイン（ＴＤＡ）、ラミナ会合性ドメイン（ＬＡＤ）、またはテロメアの境界を含め、所与の細胞核を画定する境界の数学的表現を構築する工程と、  
前記ラベル付けされた組織バイオマーカ、または細胞もしくは細胞内の細胞器官もしくは要素のそれぞれについて、前記ラベル付けされた組織バイオマーカ、または細胞もしくは細胞内の細胞器官もしくは要素の前記数学的表現を使用して、前記ラベル付けされた組織バイオマーカ、または細胞もしくは細胞内の細胞器官もしくは要素の形状およびサイズの測度である特徴を抽出する工程と、
細胞分類のためのモデルを２つ以上記憶する工程と、
前記ラベル付けされた組織バイオマーカ、または細胞もしくは細胞内の細胞器官もしくは要素の前記抽出された特徴を、前記記憶されているモデルと比較することによって、前記生体試料を分類する工程とを含む、方法。
【請求項２】
前記画像データを、３次元画像取得技法を使用して生成する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記成分をラベル付けする工程が、前記画像データを前記成分を表すボリュームに分割する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。 
【請求項４】
前記数学的表現を構築する工程が、反復的なラプラス・ベルトラミ固有投影および境界変形を使用することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ラベル付けされた組織バイオマーカ、または細胞もしくは細胞内の細胞器官もしくは要素から抽出される前記特徴が、ラベル付けされた組織バイオマーカ、または細胞もしくは細胞内の細胞器官もしくは要素の体積、ラベル付けされた組織バイオマーカ、または細胞もしくは細胞内の細胞器官もしくは要素の表面積、ラベル付けされた組織バイオマーカ、または細胞もしくは細胞内の細胞器官もしくは要素の平均曲率、ラベル付けされた組織バイオマーカ、または細胞もしくは細胞内の細胞器官もしくは要素の形状指数、ラベル付けされた組織バイオマーカ、または細胞もしくは細胞内の細胞器官もしくは要素の湾曲指数、および、ラベル付けされた組織バイオマーカ、または細胞もしくは細胞内の細胞器官もしくは要素のフラクタル次元のうち、決定に関わる１つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記生体試料を、ランダムフォレスト分類法を使用して分類する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記生体試料を、線形分類器、ｋ近傍法、決定木法、ニューラルネットワーク、およびサポートベクターマシンから成るグループから選択される分類方法を使用して分類する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記生体試料が３つ以上の細胞を含有する場合にのみ、前記生体試料を分類する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
フィブリラリン抗体、臭化エチジウム、および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールなどの、組織バイオマーカまたは細胞もしくは、細胞内細胞器官もしくは要素のためのラベルを使用して、前記生体試料の成分を染色する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記生体試料が細胞培養または細胞組織からのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
生体組織を解析するための自動化された方法において、
少なくとも１つの細胞を含有する、生体試料の成分を染色する工程と、
前記生体試料の画像データを受け取る工程であって、前記画像データが前記生体試料の３次元表現を提供する、画像データを受け取る工程と、 
前記画像データ内の少なくとも１つの細胞の成分をラベル付する工程と、
前記画像データ内の、ラベル付けされた細胞核のそれぞれについて、所与の細胞核を画定する境界の数学的表現を構築する工程と、 
前記ラベル付けされた細胞核のそれぞれについて、前記細胞核の前記数学的表現を使用して、前記ラベル付けされた細胞核の形状およびサイズの測度である特徴を抽出する工程と、
ラベル付けされた細胞核小体のそれぞれについて、所与の細胞核小体を画定する境界の数学的表現を構築する工程と、
前記ラベル付けされた細胞核小体のそれぞれから、前記細胞核小体の前記数学的表現を使用して、前記ラベル付けされた細胞核小体の形状およびサイズの測度である特徴を抽出する工程と、
細胞分類のためのモデルを２つ以上記憶する工程と、
前記ラベル付けされた細胞核および前記ラベル付けされた細胞核小体の前記抽出された特徴を、前記記憶されているモデルと比較することによって、前記生体試料を分類する工程とを含む、方法。
【請求項１２】
前記画像データを、共焦点顕微鏡を使用して生成する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記成分をラベル付けする工程が、前記画像データを前記成分を表すボリュームに分割する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記数学的表現を構築する工程が、反復的なラプラス・ベルトラミ固有投影および境界変形を使用する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ラベル付けされた細胞核から抽出される前記特徴が、ラベル付けされた細胞核の体積、ラベル付けされた細胞核の表面積、ラベル付けされた細胞核の平均曲率、ラベル付けされた細胞核の形状指数、ラベル付けされた細胞核の湾曲指数、およびラベル付けされた細胞核のフラクタル次元のうち、決定に関わる１つまたは複数を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ラベル付けされた細胞核小体から抽出される前記特徴が、対応する細胞核内の細胞核小体の数、ラベル付けされた細胞核小体の体積、ラベル付けされた細胞核小体の表面積、ラベル付けされた細胞核小体の平均曲率、ラベル付けされた細胞核小体の形状指数、ラベル付けされた細胞核小体の湾曲指数、およびラベル付けされた細胞核小体のフラクタル次元のうち、決定に関わる１つまたは複数を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記生体試料を、ランダムフォレスト分類法を使用して分類する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記生体試料を、線形分類器、ｋ近傍法、決定木法、ニューラルネットワーク、およびサポートベクターマシンから成るグループから選択される分類方法を使用して分類する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体試料が３つ以上の細胞を含有する場合にのみ、前記生体試料を分類する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
フィブリラリン抗体、臭化エチジウム、および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールなどを使用して前記生体試料の成分を染色する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記生体試料が細胞培養したものである、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、細胞および細胞内の形態モデリングと分類のための、細胞および組織の３次元画像解析に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織および細胞内の変形は、空間的および時間的な形態変化に影響する複雑な根本的生体機構によって統制されている。これらの過程を、細胞および細胞内構造体のサイズおよび形状の３次元的な変化の定量解析を通して理解することは、細胞組織の研究のみならず、癌などの病的状態の検出および治療にとって重要である。しかしながら、正確な形態解析が可能で、拡張可能で、雑音に強く、複数の母集団にわたって同時に十分に特異的であるべき３次元形状方法に対して、画像化データの次元数および品質、ならびに母集団内の細胞形状および細胞内形状の多様性の高さは、いくつかの課題を呈する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】『Ｒｏｂｕｓｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  Ｌａｐｌａｃｅ−Ｂｅｌｔｒａｍｉ  Ｅｉｇｅｎ−Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｏｕｎｄａｒｙ  Ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ』（Ｙｏｎｇｇａｎｇ  Ｓｈｉら）、ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｖｏｌ．２９、Ｎｏ．１２
【非特許文献２】『Ｄｉｓｃｒｅｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ−Ｇｅｏｍｅｔｒｙ  Ｏｐｅｒａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｉａｎｇｕｌａｔｅｄ  ２−Ｍａｎｉｆｏｌｄｓ』（Ｍ．  Ｍｅｙｅｒら）、Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ＩＩＩ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、２００３年、３５〜５７頁
【非特許文献３】『Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ３Ｄ  Ｐｏｉｎｔ  Ｃｌｏｕｄｓ  ｗｉｔｈｉｎ  Ｇｒａｐｈ−ｔｈｅｏｒｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ』（Ａ．Ｊａｇａｎｎａｔｈａｎ）（博士論文、Ｎｏｒｔｈｅａｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
よって、母集団について解析を行うための、高スループット能力をもち、ロバストな、細胞および細胞内の３次元形態計測技法に対する強い需要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この節では、本開示に関する背景情報を提供するが、この情報は必ずしも従来技術ではない。
【０００６】
ここで提供するのは本開示の全体的な概要であって、この概要は全範囲の包括的な開示ではなく、全ての特徴でもない。
【０００７】
生体細胞を解析するための自動化手法を提示する。この方法は、少なくとも１個の細胞を含む生体試料の成分を染色することと、生体試料の３次元表現を提供する、生体試料の画像データを受け取ることと、画像データ内の少なくとも１個の細胞の成分をラベル付けすることと、画像データ内のラベル付けされた各細胞核について、所与の細胞核を画定する境界の数学的表現を構築することと、ラベル付けされた各細胞核について、その細胞核の数学的表現を使用して、そのラベル付けされた細胞核の形状およびサイズの測度である特徴を抽出することと、ラベル付けされた各細胞核小体について、所与の細胞核小体を画定する境界の数学的表現を構築することと、その細胞核小体の数学的表現を使用して、そのラベル付けされた各細胞核小体から、そのラベル付けされた細胞核小体の形状およびサイズの測度である特徴を抽出することと、細胞分類のモデルを２つ以上記憶することと、ラベル付けされた細胞核およびラベル付けされた細胞核小体の抽出された特徴を、記憶されているモデルと比較することによって、生体試料を分類することとを含む。
【０００８】
画像データは、共焦点顕微鏡または別のタイプの画像化装置によって生成されてもよい。  
【０００９】
一実施形態では、反復的なラプラス・ベルトラミ固有投影および境界変形を使用して、数学的表現が構築される。  
【００１０】
いくつかの実施形態では、成分をラベル付けすることは、画像データを、成分を表すボリュームに分割することを含む。
【００１１】
ラベル付けされた細胞核から抽出される特徴には、ラベル付けされた細胞核の体積、ラベル付けされた細胞核の表面積、ラベル付けされた細胞核の平均曲率、ラベル付けされた細胞核の形状指数、ラベル付けされた細胞核の湾曲指数、およびラベル付けされた細胞核のフラクタル次元のうち、決定に関わる１つまたは複数が含まれるが、それに限定されない。 
【００１２】
ラベル付けされた各細胞核小体から抽出される特徴には、対応する細胞核内の細胞核小体の数、ラベル付けされた細胞核小体の体積、ラベル付けされた細胞核小体の表面積、ラベル付けされた細胞核小体の平均曲率、ラベル付けされた細胞核小体の形状指数、ラベル付けされた細胞核小体の湾曲指数、およびラベル付けされた細胞核小体のフラクタル次元のうち決定に関わる１つまたは複数が含まれるが、それに限定されない。 
【００１３】
一実施形態では、生体試料はランダムフォレスト分類法を使用して分類される。
【００１４】
他の実施形態では、生体試料は、線形分類器、ｋ近傍法、決定木法、ニューラルネットワーク、およびサポートベクターマシンから成るグループから選択される分類方法を使用して分類される。
【００１５】
本明細書に記載される説明から、さらなる適用可能性の領域が明らかになるであろう。発明の概要の中の説明および特定の例は、説明のみを目的とし、本開示の範囲を限定することは意図しない。
【００１６】
本明細書に記載の図面は、考え得る全ての実装形態ではなく選択された実施形態の説明のみを目的とし、本開示の範囲を限定することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】自動化された形態モデリングおよび分類の方法の概要を示す図である。
【図２】１つまたは複数の細胞を含む画像データを分割する方法例を示すフローチャートである。
【図３】細胞または、細胞内の細胞器官もしくは要素（例えば、細胞核、細胞核小体）の表面再構築を行うための方法例を示すフローチャートである。
【図４Ａ】線維芽細胞の細胞画像から分割された細胞核のバイナリマスク表現の３次元視覚化を示す、ロバストな平滑面再構築の画像である。
【図４Ｂ】細胞の再構築された平滑面のメッシュ表現の３次元視覚化を示す、ロバストな平滑面再構築の画像である。
【図４Ｃ】線維芽細胞の細胞画像から分割された細胞核内の分割された細胞核小体の３つのバイナリマスク表現の３次元視覚化を示す、ロバストな平滑面再構築の画像である。
【図４Ｄ】Ｚ軸に沿って色分けされた細胞核小体表面の３つのメッシュ表現の３次元視覚化を示す、ロバストな平滑面再構築の画像である。
【図５】２つの多様体から成る（局所）幾何学形状を、頂点ごとの局所座標枠に対する湾曲の定義を含めて示す図である。
【図６Ａ】ＬＯＮＩパイプラインのクライアントインタフェース内のワークフローの開始から終了までの例示的なグラフィック表現で、ネスティングされたモジュールグループを示す、開始から終了までにわたる検証済みのワークフロープロトコル概要を含む図である。
【図６Ｂ】ＬＯＮＩパイプラインのクライアントインタフェース内のワークフローの例示的なグラフィック表現で、３Ｄ形状モデリングの微調整を行うボリューム−形状グループの拡大図および、形態学的測度の抽出を行うモジュールを含む形態計測グループの拡大図を示す図である。
【図７Ａ】線維芽細胞の分類結果を、さまざまなサイズの細胞集合について平均ＡＵＣで示すグラフである。
【図７Ｂ】線維芽細胞の分類結果を、分類用の特徴を重要度スコアの順に上位１０まで示すグラフである（分類に適した、「平均」、「最小」、「最大」、「分散」の付く細胞核小体の特徴名のうち、ＰＣ３細胞の上位１０の中にも報告されているものは青色のフォントで示されている）。
【図８Ａ】ＰＣ３の分類結果を、さまざまなサイズの細胞集合について平均ＡＵＣで示すグラフである。
【図８Ｂ】ＰＣ３の分類結果を、分類用の特徴を重要度スコアの順に上位１０まで示すグラフである（分類に適した、「平均」、「最小」、「最大」、「分散」の付く細胞核小体の特徴名のうち、線維芽細胞の上位１０の中にも報告されているものは青色のフォントで示されている）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
いくつかの図面にわたって、対応する参照番号は対応する部分を示す。
【００１９】
ここで添付図面を参照しながら、実施形態の例について、より詳細に説明する。
【００２０】
組織および細胞の形態は、細胞分化、発生、増殖および疾病に関連する複雑な根本的生体機構によって統制されている。細胞の形の変化は、遺伝子の調節および発現などの、改変された機能的属性に関連するクロマチン構造の再編成を反映する。同時に、メカノバイオロジーにおける多くの研究によって、細胞の変形に用いられる幾何学的制約および機械的な力が逆に、細胞核およびクロマチンの動力学、遺伝子およびパスウェイの活性化に影響することが示されている。よって、細胞または細胞器官および要素の形態定量化は、４Ｄヌクレオームとして知られる空間的かつ時間的な枠組み内でのクロマチンとＤＮＡの構造の再編成の研究として、重要性を増している。４Ｄヌクレオームの文脈において関心の対象となる細胞構造体には、細胞核そのものだけではなく、細胞核小体および核小体会合性ドメイン（ＮＡＤ）、染色体テリトリー、位相的会合性ドメイン（ＴＤＡ）、ラミナ会合性ドメイン（ＬＡＤ）、ならびに、転写ファクトリ内のループドメインもまた含まれる。さらに、これらの過程を形態変化の定量解析を通して理解することは、例えば、癌などの病的状態の検出、理解、および治療について多くの医学的な意味もまた有する。本文献では、細胞、細胞内器官、要素、その他の細胞構造体のサイズおよび形状の定量的測度を包含する形を解析するために、細胞の形態計測をしばしば使用する。
【００２１】
細胞形状の特徴を２Ｄまたは疑似３Ｄで開発するために多くの努力が行われてきたが、いくつかの研究では、細胞核形状の記述および識別について、３Ｄ形態計測測度の方が２Ｄの特徴よりも良い結果を出す。しかしながら、ロバストな形態解析が可能で、人間による解読が容易になる３Ｄ形状記述子については、現時点ではまだ活発な調査が行われているところである。さらに、拡張可能で雑音に強く、複数の母集団にわたって同時に十分に特異的であるべき３次元形状解析に対して、取得したデータの次元数および体積、さまざまな画像取得条件、および、母集団内の細胞形状の大幅な多様性は、いくつかの課題を呈する。よって、母集団に関する解析を行うための、高スループット能力をもつロバストな３Ｄ細胞形態計測技法に対する強い需要が存在する。
【００２２】
本開示は２つの相補的な目的を有する。第１の目的は、細胞または細胞内器官および構成の形状記述のための３Ｄ形態計測メトリクスを査定して検証することである。まず、顕微鏡データから抽出した３Ｄマスクの表面を、ラプラス・ベルトラミ固有投影および、位相を維持した境界変形を使用して、再構築する。次に、内在的および外在的な幾何学メトリクスを計算する。これらは、３Ｄ形状の複雑性を特徴付け、観察された臨床的な表現型形質を識別するために導出されたシグネチャベクトル（形状バイオマーカ）として使用される。これらのメトリクスには、体積、表面積、平均曲率、湾曲性、形状指数、フラクタル次元が含まれる。推奨されるモデリングおよび解析の方法を使用して、細胞、細胞核、ならびにその他の細胞内器官および要素の形状定量化を行うことができる。
【００２３】
第２の目的は、健康な状態と疾病状態にある３Ｄ細胞および細胞内の形状表現型の関係を深く調査するためにカスタム化して拡張することができる、プロセス全体を実施する再現可能なパイプラインワークフローを開発することである。高スループットイメージング（ＨＴＩ）には、リキッドハンドリング、顕微鏡ベースの画像取得、画像処理、および、統計的データ解析の自動化を含むことができる。このワークは、この定義のうち最後の２つの側面に焦点をあてる。合理化された複数ステップのプロトコルが実施され、このプロトコルは、多様なツールセットに依存し、ＬＯＮＩパイプラインのワークフローに滑らかに接続する。このワークフローは現代の高スループットイメージング処理および解析の標準に適合し、妥当性および再現可能性に焦点をあてて、ほとんど自動化されている。
【００２４】
図１は、プロトコルの開始から終了までの俯瞰的な流れを示す。開始点として１１で、少なくとも１つの細胞を含む生体試料を、３次元画像取得技術を使用して画像化する。この技術には、顕微鏡検査法（例えば共焦点顕微鏡検査法、多光子顕微鏡検査法、ライトシート顕微鏡検査表、および超解像度顕微鏡検査法など）、断層法（例えば蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）断層撮像、ホログラフィック断層法、および光干渉断層法など）、または光音響画像化が含まれるが、それらに限定されない。一実施形態では、３Ｄ共焦点画像化は、６３ｘプラン／アポクロマート  １．４ｎａ  ＤＩＣ対物レンズ付きのＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０レーザ走査型共焦点顕微鏡を使用して行われる。顕微鏡画像化によって生体試料の画像データが生成され、この画像データは生体試料の３次元表現を提供する。生体試料は、下記で詳細に説明するように、分類を改善するために３〜２０個の細胞を含むことが好ましい。生体試料は組織または細胞培養から採取してもよいことが、理解される。
【００２５】
１２で、画像データを、生体試料内の細胞を含む異なる成分（すなわち細胞器官）を表す個別のボリュームに分割する。例えば、細胞内の細胞核の境界を、画像データ内でラベル付けする。同様に、各細胞核内の細胞核小体を、画像データ内でラベル付けする。細胞内の各成分要素に対して別々のマスク（すなわち、バイナリ画像）を生成してもよい。この実施形態例では、マスクは、ＮＩＦＴＩ（Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ）などの標準のファイル形式に変換される。分割することには、下記で詳細に説明するように、他のフィルタリングまたは信号処理が含まれてもよい。
【００２６】
画像データ内のラベル付けされた細胞または細胞内細胞器官および要素のそれぞれについて、１３で表面再構築を行う。つまり、所与の細胞核を画定する境界の数学的表現を構築する。その結果、ラベル付けされた各オブジェクトの境界面がポリゴンメッシュで表される。一実施形態例では、所与の細胞核の表面の数学的表現は、反復的なラプラス・ベルトラミ固有投影および境界変形法を使用して構築される。この表面再構築法の例に関するさらなる情報が、２０１０年１２月に発行された、ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｖｏｌ．２９、Ｎｏ．１２の『Ｒｏｂｕｓｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  Ｌａｐｌａｃｅ−Ｂｅｌｔｒａｍｉ  Ｅｉｇｅｎ−Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｏｕｎｄａｒｙ  Ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ』（Ｙｏｎｇｇａｎｇ  Ｓｈｉら）に記載されており、その全体が本明細書に組み込まれている。境界面の数学的表現を構築する他の方法もまた、本開示において企図されている。 
【００２７】
次に１４で、ラベル付けされた細胞または細胞内細胞器官もしくは要素のそれぞれについて、それらの細胞または細胞内細胞器官もしくは要素の表面境界の数学的表現から、特徴を抽出する。特徴は、ラベル付けされた細胞または細胞内細胞器官もしくは要素の形状およびサイズの測度である。例えば、ラベル付けされた細胞または細胞内細胞器官もしくは要素から抽出される特徴には、細胞または細胞内細胞器官もしくは要素の体積、細胞または細胞内細胞器官もしくは要素の表面積、細胞または細胞内細胞器官もしくは要素の平均曲率、細胞または細胞内細胞器官もしくは要素の形状指数、細胞または細胞内細胞器官もしくは要素の屈曲指数、および、細胞または細胞内細胞器官もしくは要素のフラクタル次元が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００２８】
この実施形態例では、特徴は、ラベル付けされた細胞核の形状およびサイズの測度である。例えば、ラベル付けされた細胞核から抽出される特徴には、細胞核の体積、細胞核の表面積、細胞核の平均曲率、細胞核の形状指数、細胞核の屈曲指数、および細胞核のフラクタル次元が含まれ得るが、これらに限定されない。特徴はまた、ラベル付けされた細胞核小体のそれぞれについて抽出されてもよい。ここでも、特徴はラベル付けされた細胞核小体の形状およびサイズの測度である。特徴の例には、ラベル付けされた細胞内の細胞核の数、細胞核小体の体積、細胞核小体の表面積、細胞核小体の平均曲率、細胞核小体の形状指数、細胞核小体の湾曲指数、および細胞核小体のフラクタル次元が含まれるが、これらに限定されない。他のタイプの特徴を抽出し、分類に使用してもよいことは、容易に理解される。   
【００２９】
最後に、ステップ１５で生体試料内の細胞を分類する。一実施形態では、細胞から抽出された幾何学的形態特徴を使用して、健康な細胞と癌性細胞を識別することができる。画像化の前に、分類のためのモデルを２つ以上決定する。抽出された特徴（すなわち、特徴ベクトルの形での特徴）を、記憶されているモデルと比較することによって、生体試料内の細胞を分類することができる。一実施形態では、細胞は、下記で詳細に説明するように、ランダムフォレスト分類法を使用して分類される。特定の分類法に言及するが、他の分類法も、とりわけ、線形分類器、ｋ近傍法、決定木法、ニューラルネットワーク、およびサポートベクターマシンを含めて、本開示の範囲に該当する。
【００３０】
一実施形態例を、下記で詳細に説明する。画像化の前に、生体試料の成分をラベル付けしてもよい（例えば、染色）。この実施形態例では、３種の異なる蛍光体で細胞をラベル付けした。ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）は細胞核の一般的な染色手段であり、フィブリラリン抗体（フィブリラリン）および臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）は共に細胞核小体の染色に使用される。フィブリラリンは一般的に使用される核小体ラベルであるが、検出される細胞核小体内の局所的な明暗度の変動が大きいためにマスク形状の抽出が困難になるので、形状モデリングの目的には特異的すぎることがわかった。凝集したクロマチン、細胞核小体、およびリボソームの染色には、臭化エチジウムを使用できることが判明した。臭化エチジウムを使用すると、細胞核小体形状の表現が全体的に改善されることがわかった。共局在を通して特定のフィブリラリンを臭化エチジウムと組み合わせ、下記で説明するように、核小体の位置が正確に検出されているか確認する。 
【００３１】
分割について、図２を参照しながらさらに詳細に説明する。２１に示すように、ラベル付けに基づいて、画像データを２つ以上のチャネルに分離することができる。この実施形態例では、チャネルを、それぞれＤＡＰＩ、フィブリラリン、ＥｔＢｒのチャネルを表すように、ｃ０、ｃ１、ｃ２とラベル付けされた個別のボリュームとして分離して保存した。次いで、それぞれのチャネル特定のボリュームを１０２４ｘ１０２４ｘＺの格子（Ｚ＝［１０，５０］）に再スライスし、局部的なサブボリュームによって顕微鏡の固有タイルサイズとの整合が容易になるようにした。全てのサブボリュームを（無損失で）変換し、マルチイメージの３Ｄ  ＴＩＦＦボリュームとして保存した。
【００３２】
２２で、全てのサブボリュームについて、３つ全ての次元での倍率および解像度を含め、附随する顕微鏡メタデータを元データから抽出し、画像の異方性に対処するために、さらに下流モジュールへ送った。２３で、各サブボリュームをさらに、グレースケール（例えば、８ビット解像度）に変換した。スペックル除去などのノイズリダクション方法をサブボリュームに適用してもよい。
【００３３】
２４で、ボリュームから細胞核および細胞核小体を分割する。例として、Ｆａｒｓｉｇｈｔツールキットに備わるものなどの細胞分割アルゴリズムをＤＡＰＩチャネルのサブボリュームに適用することによって、ＤＡＰＩチャネル内の細胞核の自動３Ｄ分割を行った。Ｆａｒｓｉｇｈｔツールキットを採用した理由はいくつかある。まず、２Ｄまたは３ＤでＤＡＰＩ染色された細胞核のために専用に作られたＣＬＩキットであり、非常に使いやすい。また、Ｆａｒｓｉｇｈｔツールキットは、ラベル付けされた訓練用集合および、そのデータについての実証済みの安定した結果を必要としない。細胞核分割のアルゴリズムは複数のステップを実施し、それらには、サブボリュームをバイナリ化するグラフカットアルゴリズム、細胞核をブロブマスクに変換するマルチスケールＬｏＧ（Ｌａｐｌａｃｉａｎ  ｏｆ  Ｇａｕｓｓｉａｎ）フィルタ、細胞核の輪郭を描くための高速クラスタリング、および、グラフカットとアルファ拡張を使用した細胞核輪郭の微調整が含まれる。分割の後、データを１６ビットの３Ｄ  ＴＩＦＦファイルに変換する。分割された各細胞核をマスクとして表現し、それぞれに独自のインデックスを与えた。他の細胞核分割法もまた、本開示の範囲に該当することは容易に理解される。
【００３４】
例として、Ｗｅｋａ  Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇソフトウェアパッケージを使用して、フィブリラリンチャネルおよび臭化エチジウムチャネルでも細胞核小体の自動３Ｄ分割を行った。この実施形態例では、Ｔｒａｉｎａｂｌｅ  Ｗｅｋａ  Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎプラグインを、ＩｍａｇｅＪに基づく画像処理・視覚化ソフトウェアパッケージであるＦｉｊｉとバンドルした。細胞核内の分割は、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）で染色された細胞核小体とフィブリラリンで染色された細胞核小体について別々に行った。Ｔｒａｉｎａｂｌｅ  Ｗｅｋａ  Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎプラグインは、ＩｍａｇｅＪエコシステムで最もポピュラーな分割ツールで、３Ｄ画像内の生物構造体のラベル付けに比較的簡単に使用することができる。細胞核内の複数の分割部分を細胞核内のオブジェクトへと切り離す目的で、ＤＡＰＩ細胞核マスクを使用して、ＥｔＢｒチャネルおよびフィブリラリンチャネル内に分割空間を画定した。訓練対象のチャネル内でサブボリュームの１０％を無作為抽出して使用して、各チャネルについて分類器モデルを作成した。次いで、ランダムフォレストアルゴリズムを使用して、チャネル内の全てのサブボリュームにモデルを適用した。その結果の確率マップから、細胞核小体マスクを作成した。次いで、各細胞核小体に独自にインデックス付けするために、“Ｆｉｎｄ  Ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ  Ｒｅｇｉｏｎｓ”ＩｍａｇｅＪ／Ｆｉｊｉプラグインを使用して、連結した要素のラベリングを行った。下記に説明する品質調整プロトコルを使用して、細胞核マスクについて、分割アーチファクトをフィルタリングした。最後に、ＥｔＢｒとフィブリラリンの両方の分割ボリュームを共局在アルゴリズムの入力として使用し、フィブリラリンの存在に基づいて、分割されたＥｔＢｒ染色細胞内小体を実証した。他の細胞核小体分割法もまた、本開示の範囲に該当することは容易に理解される。
【００３５】
非一様な染色は、しばしば偶発的な分割アーチファクトを引き起こし、結果のマスクが、例えば、「取手」、「穴」または、特異点を有する不規則な境界形状を含んで複雑になる。この問題は通常、ステップ２５に示すように、さまざまな位相修正技法を適用することにより解決される。細胞核マスクの例示的な後処理ステップには、ＭＡＴＬＡＢ関数のセットを使用した穴の塗りつぶしが含まれる。アーチファクトのフィルタリングは、例えば、特定されたオブジェクトの球面コンパクト性を測定して、そのオブジェクトの体積をボクセル数により推定し、タイルの縁部をまたぐか、または他のオブジェクトに連結しているオブジェクトを検出するＪａｖａアプリケーションなどの、他の方策を使用して行うこともできる。コンパクト性およびボクセル数のカットオフ値は、ほとんどのアーチファクトを除去するように経験的に選択した。このフィルタは、穴の塗りつぶし修正と併せて、より形態計測解析に適したマスクを生成するために役立った。この品質調整プロトコルによって、ジーナスゼロではない可能性のあるマスクが訂正または選別され、さらなる微調整のためにフラグ付けされた。最後に、２６で、品質調整を通したマスクを、ＮＩＦＴＩ形式などのニューロイメージングの形式に変換した。これらのマスクを、パイプラインワークフロー内で続いて、形状形態計測の解析に使用した。
【００３６】
ワークフローの形態計測的特徴抽出部への入力の役割をした集合は、上記のとおり、３Ｄ分割されて独自にラベル付けされたバイナリの細胞核マスクを表す、チャネルｃ０からのボリュームの集合から成り、この集合は、ｃ１を使用した共局在手順によってフィルタリングされた、各細胞についてのチャネルｃ２からの細胞核小体の３Ｄマスクを伴う。分割および品質調整済みの細胞核および細胞核小体の、圧縮ＮＩＦＴＩ形式（．ｎｉｉ．ｇｚ）のボリュームを、ボクセルマスクから三角形をした多様体へ変換し、開発したワークフローを使用して自動的に処理した。
【００３７】
細胞核および細胞核小体の３Ｄ形状をモデリングするために、顕微鏡データから抽出した３Ｄマスクの境界を、２次元の多様体（２次元球面Ｓ２と位相同型）としてモデリングした。これらはラプラス・ベルトラミ固有投影および、位相を維持した境界変形アルゴリズムを使用して、三角形をした表面として埋め込まれる。この手法について、図３と関連させながらさらに詳しく説明する。
【００３８】
分割処理から受け取った出力の中にオブジェクトが画定されている。３３で、各オブジェクトについて、オブジェクトのバイナリマスクの境界からメッシュ表現を構築する。メッシュ表現を構築する前に、３２で、マスクをバイナリ化する。境界はラプラス・ベルトラミ固有関数の部分空間に投影され、それにより、固有投影の測定歪みを計算することによって、疑似的な特徴の位置を自動的に特定することができる。ラプラス・ベルトラミ固有関数は内在的に定義され、パラメータ表現を一切必要とせずに境界面から簡単に計算することができる。これらの関数は等長不変なので、境界面のギザギザな性質に対して強く、これは生体形状解析には望ましい。ラプラス・ベルトラミ作用素の固有値の大きさはフーリエ解析の周波数に直観的に対応するので、再構築される表面の滑らかさを調整するための便利な機構が得られる。
【００３９】
次のステップは、この情報を使用したステップ３４のマスク変形処理であり、疑似的な特徴を除去しながらマスクの残り部分をそのまま残し、それにより、意図しないボリューム縮小を防ぐ。この変形処理は位相を維持し、マスクの境界面が多様体であるように良好に構成されている。ステップ３３および３４は、３５で収束するまで繰り返される。最後に３６で、方法は、マスク境界の固有投影として最終的な表面を生成し、この表面はジーナスゼロ位相を有する平滑な表面である。この、局部的細胞器官の境界の多様体表現によって、例えば、三日月形、多葉形、および折りたたまれた形を含め、形状位相が球体と位相同型である限り、全ての形状のアルゴリズム的な理解が容易になる。このステップの例示的な結果を図４に示す。このようにして、分割されたマスクから、反復的なマスクフィルタリング処理を使用して、ジーナスゼロの２次元多様体として、細胞核および細胞核小体のロバストな表面再構築を行った。この処理に関するさらなる詳細が、ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ２０１０の『Ｒｏｂｕｓｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  Ｌａｐｌａｃｅ−Ｂｅｌｔｒａｍｉ  Ｅｉｇｅｎ−Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｏｕｎｄａｒｙ  Ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ』（ＹＧ  Ｓｈｅｎら）に記載されており、その全体が本明細書に組み込まれている。
【００４０】
この実施形態例では、３Ｄ表面の幾何学的特徴を定量化する特徴として、６つの形状測度を使用する。これらの測度を計算するために、ジーナスゼロのソリッドの境界を表す三角形表面のモデルを使用して、主曲率（最小および最大）
【数１】
2021514468.tif 000003
を算出する。すると、形状の形態計測測度、すなわち平均曲率、形状指数、および屈曲度を、これらの主曲率で表すことができる。平均曲率は
【数２】
2021514468.tif 000004
と定義され、形状指数は
【数３】
2021514468.tif 000005
と定義され、屈曲度は
【数４】
2021514468.tif 000006
と定義される。表面の主曲率は、ヘッセ行列（第２基本形式）の固有値で、
【数５】
2021514468.tif 000007
について解かれ、ここでＩは単位行列である。Ｓが第２基本形式の表面Ｈ（Ｘ，Ｙ）であれば、
【数６】
2021514468.tif 000008
は不動点であり、ｐにおける接ベクトルの正規直交基底をｕ,ｖで示すと、主曲率は、形状テンソルとして知られる、対称ヘッセ行列
【数７】
2021514468.tif 000009
の固有値である。図５に示すように、
【数８】
2021514468.tif 000010
を表面
【数９】
2021514468.tif 000011
のパラメトリック表現とする。これは２変数の滑らかなベクトル値関数を表し、ｒｕとｒｖによって示される、ｕとｖに関する偏微分を伴う。すると、パラメトリックなｕ，ｖ平面内の所与の点（ｐ）のヘッセ係数Ｈｉ，ｊは、その点での第２の偏微分の、Ｓに対する法線への投影
【数１０】
2021514468.tif 000012
によって与えられ、ドット積演算子を使用して、
【数１１】
2021514468.tif 000013
のように計算することができる。
【００４１】
あとの３つの形状測度は、体積、表面積、およびフラクタル次元である。体積は閉じた境界面によって囲まれた３Ｄ空間の量であり、
【数１２】
2021514468.tif 000014
として表すことができ、ここでＩＤ（ｘ，ｙ，ｚ）は、興味対象の領域（Ｄ）の指示関数を表す。ｒ（ｕ，ｖ）が連続的微分可能関数で、パラメトリックなｕ，ｖ平面内の適切な領域Ｄにわたる表面に対する法線ベクトルが
【数１３】
2021514468.tif 000015
で示されるならば、
【数１４】
2021514468.tif 000016
であり、
【数１５】
2021514468.tif 000017
は、その領域境界のパラメトリックな表面表現である。すると、表面積は、
【数１６】
2021514468.tif 000018
として表すことができる。フラクタル次元の計算は、フラクタル縮小率
【数１７】
2021514468.tif 000019
および、置換部分の数Ｎに基づく。『Ｄｉｓｃｒｅｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ−Ｇｅｏｍｅｔｒｙ  Ｏｐｅｒａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｉａｎｇｕｌａｔｅｄ  ２−Ｍａｎｉｆｏｌｄｓ』（Ｍ．  Ｍｅｙｅｒら）Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ＩＩＩ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、２００３年、３５〜５７頁、および、『Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ３Ｄ  Ｐｏｉｎｔ  Ｃｌｏｕｄｓ  ｗｉｔｈｉｎ  Ｇｒａｐｈ−ｔｈｅｏｒｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ』（Ａ．Ｊａｇａｎｎａｔｈａｎ）（博士論文、Ｎｏｒｔｈｅａｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、２００５）に記載されるように、これらのメトリクスの高精度離散近似を使用して、メッシュ表現された表面でこれらの形状測度を計算した。
【００４２】
抽出された３Ｄ形態計測測度は、特徴ベクトルの特徴の役割をした。一実施形態では、特徴ベクトルは各細胞核の測度を含む。具体的には、各細胞核の特徴には、細胞核の体積、細胞核の表面積、細胞核の平均曲率、細胞核の形状指数、細胞核の屈曲指数、および細胞核のフラクタル次元が含まれる。次いで、特徴ベクトルを使用して、いくつかの機械学習分類器を、例えばオープンソースのＰｙｔｈｏｎパッケージｓｃｉｋｉｔ−ｌｅａｒｎ  ０．１７．０を使用して訓練する。分類アルゴリズムの挙動を改善するために、データの前処理には、ゼロ平均と単位分散への変数の標準化および、個々の標本をユニタリノルムへスケーリングするための正規化が含まれ、交差検証の各ステップで別々に、訓練用集合について計算される。
【００４３】
この実施形態例では、各細胞核について、形態計測測度を使用して細胞核小体データを総計した。例えば、細胞核ごとに検出された細胞核小体の数を、特徴ベクトルの個々の特徴として含めた。細胞核小体レベルの特徴を合成するために、さまざまな方法について調査した。それらには、カスタムな、細胞核レベルの相違メトリクスおよび、複数インスタンスの学習フレームワークが含まれる。最良の結果は、それぞれの形態計測測度の密度を推定することにより、各細胞核内の細胞核小体データを総計することによって得られた。各細胞核について、その中の細胞核小体にわたり、それぞれの形態計測測度について標本統計量（例えば、平均値、最小値、最大値、および高次モーメント）を計算した。これらの統計を使用して、対応する親の細胞核のシグネチャ特徴ベクトルを、全ての特徴ベクトルが同じ長さになるようにスケーリングした。これに応じて、各細胞核に少なくとも１つの細胞核小体が存在するように、内部に位置する細胞核小体がひとつも自動検出されなかった細胞核を、その後の解析から除外した。一般に、ひとつひとつの細胞の正しい分類（タイプ、ステージ、治療など）は、観察対象の細胞表現型の著しい母集団異種性に起因して、困難な課題である。例えば、同一の試料に「癌性」と「非癌性」の細胞表現型が絡み合い、密に混ざり合って含まれていたり、両方のクラスが、類似した形状またはサイズを呈するアポトーシス細胞を含んでいたりすることがある。試料の性質を考慮して、単一の細胞ではなく細胞集合の培養、標本作製および収集、分類を検討した。その根本的な理由は、アルゴリズムが試料内の少数の細胞の分類を誤ったとしても、大多数の細胞が正しく分類される限り、最終的な（細胞集合の）ラベルは正しく指定されることになるという観察に基づく。この方策を使用して、分類は、１組につき３〜１９個の範囲の細胞の小グループに対して行うのが好ましい。内部的交差検証の各フォールドの間、この小さな細胞集合を、反復回数１０００のブートストラップ法によって無作為化した。
【００４４】
ＬＯＮＩパイプラインはニューロイメージングおよび生物情報科学ではポピュラーなツールだが、細胞バイオイメージ解析のコミュニティではこれまで見落とされてきた。本開示ではＬＯＮＩパイプラインを使用して、複数ステップを合理化したプロトコルを実装した。このプロトコルはツールとソリューションの多様なセットに依存し、図６に示すように、ＬＯＮＩパイプラインのワークフローに継ぎ目なく接続する。俯瞰的に見ると、データの処理および解析のプロトコルの各ステップは入力と出力を提供する個別のモジュールとしてワークフロー内でラッピングされ、それにより、パイプラインはこれらの不可分モジュールを自動的に接続して管理することができる。その結果、分散型で大規模並列なプロトコル実装によって、何千もの細胞核および細胞核小体を同時に容易に処理することが可能になる。ワークフローは３Ｄオブジェクトの合計数、生物学的条件、または、実行中のインスタンスの数に依存しない。その理由は、ジョブスケジューリングとリソース割り当てとを含めたワークフロー設定が確定した後は、ワークフローの実行は完全に自動化されるからである。実行中、ワークフローは進捗に関するリアルタイム情報を研究者に提供し、研究者が個々のステップごとの中間結果を表示して、失敗したモジュールまたは特定のインスタンスを簡単に調べて再始動できるようにする。この実装形態は非常に柔軟性が高く、このワークフローに含まれる特定の規則に限定されるものではない。パラメータを調節し、また個々のモジュールを交換することによって、高いスループット能力を維持しながら広範囲のさまざまな実験に転用することができる。
【００４５】
このワークフローは、共有のために使用される形式、すなわち、１６ビットの３Ｄ  ＴＩＦＦファイルとして、３チャネルの１０２４×１０２４×Ｚの３Ｄボリュームでデータを使用できるように構成される。各ボリュームは並列で個別に処理されて、入力データを全て解析するためにいくつのプロセスが必要かをワークフローが自動的に定めるようになっている。さらに、並列化されたワークフローは、必要に応じて分岐および縮約を自動的に行う。例えば、前処理から分割までは、ワークフローの実行はＭ個のプロセスを開始し、ここでＭは入力ボリュームの数である。分割により複数の出力が生まれるので、このステップの後、ワークフローは自動的にＭ×［Ｎ１，Ｎ２，・・・，ＮＭ］個のプロセスを開始し、ここで、Ｎｘは入力ボリュームＸから分割されたオブジェクト（例えば細胞核）の数である。後処理ステップで、分割されたオブジェクトの一部はキュレーションモジュールによってフィルタリングされ、その後の解析から除外される。ワークフローはプロセスの数をキュレーションに合格するマスクの数にまで自動的に減らし、個々のマスクについて個別に３Ｄ形状モデリングおよび形態計測的特徴の抽出が行われ、これにより、実験の計算時間を効率的に減らしながら、クラスタ上で最大１２００までのジョブを同時に行うことができる。最後に、ワークフローは各個別のマスクから形態計測情報を収集し、結果表にまとめ、その結果表はさらに、分類アルゴリズムの入力として使用される。この能力によって、現代のコンピューテーションリソースを利用し、研究者を低レベルの設定の労務から解放し、実行プロセスの制御を簡単にし、プロセス全体にわたる再現可能性を向上させることができる。
【００４６】
形状形態計測のメトリクスを検証するために、メトリクスをまず、人工的に生成した３Ｄマスクに適用した。ｓｃｉｋｉｔ−ｉｍａｇｅ  Ｐｙｔｈｏｎライブラリを使用して、立方体、八面体、球体、楕円体、および、中心が線形に整列した３つの重なり合う球体を表現する３Ｄソリッドを作成した。これらのオブジェクトを全て処理し、結果の形状形態計測測度を比較した。具体的には、対応する形状パラメータ（例えば、半径、サイズ）を使用して計算された、解析的に導出される（期待される）体積および表面積と、処理パイプラインワークフローによって報告された、コンピュータ計算により導出される体積および表面積との間に密接な関係があるか確認することが望ましい。その結果、球体および楕円体などの細胞核に類似した形状では、コンピュータ計算エラーは２％以内であった。立方体および八面体などの、より幾何学的なオブジェクトでは、計算エラーは６％以内であった。後者で増加したエラーは、特異点（例えば、平滑だが弁別不可能な表面境界）を解決するために形状頂点に適用されるメッシュ平滑化によって説明できる。さまざまなタイプの３Ｄオブジェクトの間の形状の差異の検出を実証するために、重なり合う複数の球体を、外接する複数の楕円体と比較した。予想されるように、球体では、楕円体と比較して、平均曲率および屈曲度の測度は低く、形状指数の値は高くなった。球体、楕円体、および重なり合う球体を比較すると、形状形態計測測度の漸進的で単調な傾斜が観察された。このシミュレーションによって、３Ｄオブジェクトのサイズおよび形状の特性を境界形状に基づいて正確に測定する能力が確認された。この能力は、機械学習ベースのオブジェクト分類の基礎を形成する。  
【００４７】
選んだ形状形態計測測度を識別的な特徴として査定するために、単一の線維芽細胞核分類について、ＳＰＨＡＲＭ係数と比較した。線維芽細胞（新生児男性）をＡＴＣＣから購入し （ＢＪ  Ｆｉｂｒｏ−ｂｌａｓｔｓ  ＣＲＬ−２５２２  ｎｏｒｍａｌ）、Ｇ０／Ｇ１期  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ（血清飢餓）プロトコルにかけた。このプロトコルによって得られる画像の状態すなわち表現型は、血清飢餓（ＳＳ）および増殖（ＰＲＯＬＩＦ）によって同調させた細胞周期である。結果として、両方の手法で９６２の細胞マスクの処理に成功し、その内訳はＰＲＯＬＩＦで４６６、ＳＳで４９６であった。
【００４８】
方法を比較するために、細胞核のバイナリマスクを抽出した。形状形態計測測度を上記のとおりに計算した。ＳＰＨＡＲＭ係数を得るために、まず、ポピュラーなＳＰＨＡＲＭ−ＭＡＴツールボックス（ＣＡＬＤアルゴリズムを用いて表面再構築および球面パラメータ化を実施する）を使用し、続いて、オブジェクト表面を、球面調和に基づくｌ＝１３次（デフォルト設定）関数の完全集合へ展開し、最後に、対応する表面部分の間の距離の平方根を最小化するＳＨＲＥＣ法を使用することによって、『Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ３Ｄ  ｃｌｏｓｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅｓ』にＬ．Ｓｈｅｎらが記載したとおりにＳＰＨＡＲＭ形状記述子を計算し、それを分類のための特徴ベクトルとして使用した。
【００４９】
オープンソースのＰｙｔｈｏｎパッケージＳｃｉｋｉｔ−ｌｅａｒｎ  ０．１７．０を採用して、いくつかの一般的に使用されている機械学習分類方法を、各方法にデフォルトパラメータを使用し、該当する場合は同一のランダムシードを使用して、抽出した特徴ベクトルについてテストした。５フォールドの交差検証技法を使用し、メトリックとして受信者動作特性曲線の下の面積（ＡＵＣ）を使用して、性能を比較した。下記の表１に示すように、３Ｄ形状計測測度は、テスト対象の全てのアルゴリズムの使用において、ＳＰＨＡＲＭ係数に匹敵する識別的性能を実証するだけでなく、それらを上回る性能が見られる。
【００５０】
【表１】
2021514468.tif 000020
【００５１】
上記の細胞核および細胞核小体の両方の分割および形態計測的特徴抽出の後、線維芽細胞分類のデータ集合全体は、合計９６５の細胞核（ＳＳが４９８、ＰＲＯＬＩＦが４７０）および、２１８１の細胞核小体（ＳＳが１１５１、ＰＲＯＬＩＦが１０３０）で構成されていた。単一の分類器による最良の結果は、確率的勾配ブースティング分類器を使用して、ベース学習器１５００個、決定木の最大深度９、学習率０．０１、サブサンプリング率０．５、葉ノードの最小標本数３で達成された。ハイパーパラメータを、交差検証を併用したグリッドサーチで微調整した。これらの分類結果を評価するために、７フォールドの内部的・統計的な交差検証をランダムに１０回繰り返して、正解率、適合率、感度およびＡＵＣを測定した。その結果を、単一細胞および細胞９個の集合の分類について表２に示す。
【００５２】
【表２】
2021514468.tif 000021
【００５３】
図７Ａは、サイズが３〜１９である細胞集合について平均ＡＵＣ値を示す。細胞９個の集合で分類を行った場合は９５％、１５個以上の細胞集合では９８％の正解率が得られた。勾配ブースティング分類器はさらに、交差検証済みの特徴重要度を計算し、図７Ｂに示すとおりの結果が報告される。２つの細胞状態の間でどの測度が著しく異なるかをこれらの図から評価することができ、また、新規性のある研究仮説を提案し、予想されるデータを使用してテストできる可能性がある。ＳＳ線維芽細胞とＰＲＯＬＩＦを識別するためには、細胞核の形態計測的特徴（上位３つ）および細胞核小体の形態計測的特徴（上位１０のうち５つ）の両方が高い重要性をもつことが報告された。細胞核小体の形状形態計測の統計のうちモーメントが高いものは、おそらく標本サイズが小さすぎるために（ほとんどの細胞が細胞核あたり１〜３個しか細胞核小体をもたない）、分類にあまり寄与しないので、特徴の選択時に特徴リストから削除した。
【００５４】
悪性の癌細胞は、転移への進行の過程の間に、純粋上皮および純粋間葉によって囲まれた複数の中間的表現型状態の間で一連の可逆移行を経験する。前立腺癌におけるこれらの移行は、細胞核構造体の定量化可能な変化に関連する。前立腺癌細胞株Ｐ３の顕微鏡スライドを、上皮（ＥＰＩ）および間葉転換（ＥＭＴ）の２つの表現型状態で培養した。導出されたデータセットは、４５８個の細胞核（ＥＰＩが３１０、ＥＭＴが１４８）および、１１０１個の細胞核小体（ＥＰＩが６４９、ＥＭＴが４５２）マスクで構成されていた。２つのクラスの間の標本サイズの不均衡を、無作為一様サブサンプリングを使用して解決した。７フォールドの交差検証プロセスのそれぞれで、訓練用集合には最多で２５０個の細胞、テストデータには最多で４０個の別の細胞が存在していた。
【００５５】
この事例では、単一の分類器による最良の分類は、ランダムフォレストモデル（決定木の数１０００、決定木の最大深度１２、最良の分割を行うための最大の特徴数４０％）を適用した結果であった。ハイパーパラメータの微調整、正解度のメトリクス、交差検証手順は、上記の線維芽細胞実験で報告したものと同じとした。ここでも同様に、線維芽細胞の分類に対して、細胞９個の分類用集合は９５．４％の平均正解率を達成し、細胞が１５個以上の集合では９５．４％に向上した（表３参照）。図８Ａは、さまざまなサイズのグループのＡＵＣを示し、細胞集合のサイズが大きくなるにつれて分類の正解率が向上し、細胞が１３個の集合では９８％に達することがわかる。この実験ではさらに、分類器から報告された特徴の重要度も調査した。この分類における上位１０の重要な特徴には、細胞核の形状形態計測の特徴（上位１０のうち３つ、そのうち２つは線維芽細胞での上位２つ）および、細胞核小体の形状形態計測の特徴（上位５つ）が含まれていた。
【００５６】
【表３】
2021514468.tif 000022
【００５７】
本開示では、細胞タイプまたは治療状態の３Ｄモデリング、形態特徴の抽出、および分類のための、高スループットでほぼ自動化された（人間参加型）ソリューションを提供するプロトコルを提示する。２Ｄ投影を使用した他の研究と比較して、この手法は３Ｄ空間内でネイティブに動作し、また、根底にある実際の細胞核および細胞核小体の幾何学形態をよりよく表現して人間による解釈を簡単にする、内在的および外在的な形態計測的測度を利用する。ロバストな表面再構築によって３Ｄオブジェクト境界の正確な近似が可能になり、それを人工的なデータで検証した。本明細書で提案する形状計測測度は、別のポピュラーな手法を性能で上回り、さまざまな細胞タイプ、状態、さらにはドメインにわたってその汎用性を実証した。
【００５８】
最終的に得られる開始から終了までのプロトコルは並列性が高く、そのスループットは事実上、計算ノードの数によって制限されるので、人間の介入の必要を最小限に抑えながら何千ものオブジェクトを同時に処理することができる。このパイプラインワークフローは、さまざまなデータ処理および解析のステップに、バイオイメージ解析ソフトウェアの多様性を利用し、いくつかのオープンソースツールを統合する。ワークフローのモジュール性によって、再利用可能性が高まり、変更が容易になる。このことによって、細胞、細胞核の多様な配列の解析を必要とする他の目的または他の研究のために、同じワークフローを使用したり、それをカスタム化して拡張したりすることができる（例えば、新しいデータセットの仕様、特定の不可分モジュールの交換など）。ＬＯＮＩパイプラインを通したライブデモによって、使用の簡易さ、および並列データ処理の高い効率が実証される。
【００５９】
結果の再現可能性を促進し、オープンサイエンス的な開発を円滑化し、共同検証を可能にするために、公開共有されている２つの細胞株について３Ｄ画像化データを作成した。この３Ｄ画像化データセットは、このタイプの公開されているデータセットのうち最大級のひとつである（最多で１５００の細胞核マスクおよび最多で２７００の細胞核小体マスクを有する、３チャネルの元データを含む）。これらのデータについての、上皮性と間葉性のヒト前立腺癌細胞株の比較および、血清飢餓と増殖の線維芽細胞株の比較の分類結果により、３Ｄ形態計測を使用した細胞タイプの予測の正解率が、特に細胞の集合に適用したときに高いことが実証された。異なる実験には異なる分類アルゴリズムが最適であると思われるが、細胞核と細胞核小体の両方の形態計測測度が治療状態または細胞表現型の識別について重要な特徴であることが観察された。線維芽細胞の分類の場合、その結果は、細胞核形態計測、細胞核あたりの細胞核小体の数、および、さまざまな内部細胞小体の形態計測測度が重要であることを示す。ＰＣ３細胞では、上位の重要な分類特徴は、細胞核のサイズおよび形状に加えて、さまざまな細胞核小体の形態計測測度の分布のモーメントであった。興味深いことに、両方の細胞株について、上位１０の重要な形態計測的特徴の中には共通のものが３つあった。このことにより、この方法が、基準の組み合わせを使用して細胞を正しく分類するために細胞の形から妥当な情報を抽出するという、上記で報告された観察が確認され、実証される。
【００６０】
提案する手法は拡張可能で、さまざまな複雑で大規模な３Ｄ画像データを前処理することができ、かつ、細胞核および細胞核小体の形状に限定されない。この方法は、いくつかの変更によって、興味対象である他の細胞および細胞核要素に適用することができる。ロバストな平滑面再構築は、どのような３Ｄ形状にも、位相が球面様である限り、直接適用することができる。分子レベルの技法と併せて、この３Ｄ形状形態計測ワークフローは、４Ｄヌクレオームの、空間的かつ時間的な枠組みの中でのＤＮＡ構造の調査のために、強力な組み合わせを形成することができる。このワークフローの考え得る将来の適用例の一例は、非対称の細胞分裂である。幹細胞および前駆細胞は自己複製能力によって特徴付けられ、分化した子孫を生じる。統制された非対称分化によって、これらの過程の間に、あるバランスが得られ、このバランスは、成長期に細胞の多様性を生み出すため、および、成体組織の恒常性を維持するために不可欠である。このバランスを崩すと、幹細胞／前駆細胞プールの早期消耗、すなわち、異常成長につながることがある。多くの組織において、非対称分化の調節異常は癌と関連する。非対称分化の欠陥と前癌病変の間に偶発的な関連性が存在するか否かは知られていない。この形状解析パイプラインは、形態形成および前癌病変の４Ｄヌクレオーム位相の研究に役立つであろうと予想される。
【００６１】
検体採取、画像取得、データ前処理、導出されるバイオマーカの計算、モデル化、分類、および解析のプロセスを自動化する能力により、臨床的意思決定および細胞変改の基礎調査に著しい影響を与えることができる。これは、３Ｄ細胞核形状モデリングと、ロバストな平滑面再構築および形状形態計測測度とを組み合わせて、何千もの細胞核および細胞核小体の３Ｄでの形態学的解析の開始から終了までにわたる高度に並列的なパイプラインワークフローを作り出す、初めての試みであると思われる。この手法は画像データ内の細胞形状を効率的かつ有益に評価することができ、生物医学コミュニティで検証、修正、転用することのできる再現可能な技法を表す。これにより、結果の再現可能性、方法の共同検証、および、広範な知識普及が促進される。
【００６２】
本明細書に記載の技法の複数の部分は、１つまたは複数のプロセッサによって実行される１つまたは複数のコンピュータプログラムによって実施されてもよい。このコンピュータプログラムには、非一時的で有形のコンピュータ可読媒体に記憶された、プロセッサ実行可能命令が含まれる。このコンピュータプログラムはまた、記憶されたデータを含む。非一時的で有形のコンピュータ可読媒体の非限定的な例には、不揮発性メモリ、磁気記憶装置、光学記憶装置が含まれる。
【００６３】
上記の説明のいくつかの部分は、本明細書に記載されている技法を、情報に対する操作のアルゴリズムおよび記号表現の観点から提示する。これらのアルゴリズム記述および表現は、データ処理技術の当業者がその成果の内容を他の当業者に最も効果的に伝えるために使用する手段である。これらの操作は、機能または論理に即して記載されているが、コンピュータプログラムによって実施されることが理解される。さらに、時には、複数操作から成る編成を、一般性を失うことなくモジュールまたは機能名で呼ぶと便利であることが明らかになっている。
【００６４】
特に記述のない限り、本記載の全体にわたり、「処理」、「コンピュータ計算」、「計算」、「判断」、「表示」などの用語を使用した考察は、コンピュータシステムメモリもしくはレジスタなどの情報記憶装置、送信装置または表示装置内に物理的（電子的）数量として表現されたデータを操作および変換するコンピュータシステムまたは類似の電子コンピューティング装置の動作またはプロセスを指すことが、上記の考察から明らかである。
【００６５】
記載される技法の一定の態様には、本明細書にアルゴリズムの形で記載されるプロセスステップおよび命令を含む。留意すべきことは、記載されるプロセスステップおよび命令がソフトウェア、ファームウェア、またはハードウェアで具体化されてもよく、ソフトウェアで具体化される場合には、リアルタイムのネットワークオペレーティングシステムによって使用される多様なプラットフォームにダウンロードされて常駐し、それらのプラットフォームから操作されてもよいことである。
【００６６】
本開示はさらに、本明細書に記載の操作を行うための装置に関する。この装置は必要な目的のために専用に構築されていてもよいし、または、コンピュータプログラムによって選択的に有効化または再設定することのできるコンピュータを含み、そのコンピュータプログラムが、そのコンピュータによってアクセス可能なコンピュータ可読媒体に記憶されていてもよい。そのようなコンピュータプログラムは、有形のコンピュータ可読記憶媒体に記憶されていてもよく、それらの媒体は、フロッピーディスク、光ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、光磁気ディスクを含む任意のタイプのディスク、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、磁気もしくは光学カード、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、または電子的命令を記憶するために適した任意の媒体などであるが、これらに限定されず、それぞれがコンピュータシステムバスに結合される。さらに、本明細書で称するコンピュータは、単一のプロセッサを含んでもよいし、または、コンピューティング能力を向上させるためにマルチプロセッサ設計を採用したアーキテクチャであってもよい。
【００６７】
本明細書に提示されるアルゴリズムおよび操作は、元来、どのような特定のコンピュータまたは他の装置にも関係しない。また、さまざまなシステムを本明細書の教示によるプログラムと共に使用してもよく、必要な方法ステップを行うために、さらに専用化した装置を構築すると便利であることが明らかな場合もある。これらのさまざまなシステムに必要な構造は、等価な変形形態と共に、当業者には明らかになる。加えて、本開示の記載において、どのような特定のプログラミング言語も考慮されていない。本開示の技法を本明細書の記載のとおりに実施するために、さまざまなプログラミング言語を使用してもよいことが理解される。
【００６８】
上記の実施形態の記載は説明の目的で提供されており、網羅または本開示の制限を意図するものではない。特定の実施形態の個々の要素または特徴は一般に、その特定の実施形態に限定されず、該当する場合には、特に図示または記載されていなくても交換可能であり、選択された実施形態で使用することができる。また、特定の実施形態の個々の要素または特徴は、多数の様式に変形されてもよい。そのような変形形態は本開示からの逸脱とみなされるものではなく、そのような修正は全て本開示の範囲に含まれるものと意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際調査報告】
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