(57)【要約】  本開示は、ＲＳＶ感染症、その症状および関連する病態ならびに場合によっては、発病の過程においてシアル酸含有レセプターと結合しないか、または主としてそれと結合しないウイルス性病原体によって引き起こされるか、もしくはもたらされる感染症の処置または予防のための組成物、薬剤および方法に使用するための分子を提供する。特に、本開示は、（シアル酸含有糖タンパク質および細胞表面シアル酸レセプターを含む）細胞表面にあるシアル酸（特に、シアロ複合糖質）に対して親和性（またはそれと結合する能力）を有する分子が、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）と関連づけられる症状、感染症、疾患および／または状態の処置および／または予防に有用性を見出したという発見に基づくものである。
2021514987.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）と関連づけられる症状、感染症、疾患および／または状態の処置および／または予防に使用するための、シアル酸結合分子。
【請求項２】
ＲＳＶ感染症を中和または阻止することに使用するための、シアル酸結合分子。
【請求項３】
細胞をＲＳＶに対して非許容性にするインビトロ方法であって、シアル酸結合分子と細胞表面シアル酸／シアロ複合糖質の間の結合を可能にする条件下で、ＲＳＶ感染に対して感受性または脆弱性である細胞をシアル酸結合分子と接触させるステップまたはインキュベーションするステップを含む方法。
【請求項４】
粘膜投与用であり、ＲＳＶと関連づけられる疾患および／または状態の処置および／または予防に使用するための、組成物であって、シアル酸結合分子を含む組成物。
【請求項５】
ＲＳＶ感染症の予防に予防的に使用するための、シアル酸結合分子。
【請求項６】
シアル酸結合分子がシアリダーゼ活性を示さない、請求項１、２および５に記載の使用のための、請求項１、２および５に記載のシアル酸結合分子、請求項３に記載の方法または請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
シアル酸結合分子が、ヘパリンともヘパリン硫酸とも結合しない、および／またはヘパリンもしくはヘパリン硫酸と結合するタンパク質のＧＡＧ結合ドメインを含まない、請求項１、２、５および６に記載の使用のための、請求項１、２、５および６に記載のシアル酸結合分子、請求項３または６に記載の方法あるいは請求項４または６に記載の組成物。
【請求項８】
シアル酸結合分子が、１つ以上の炭水化物結合モジュールを含む、請求項１、２、５、６または７に記載の使用のための請求項１、２、５、６または７に記載のシアル酸結合分子、請求項３、６または７に記載の方法あるいは請求項４、６または７に記載の組成物。
【請求項９】
シアル酸結合分子が、１つ以上のファミリー４０炭水化物結合モジュールを含む、請求項１、２、５、６または７に記載の使用のための請求項１、２、５、６または７に記載のシアル酸結合分子、請求項３、６または７に記載の方法あるいは請求項４、６または７に記載の組成物。
【請求項１０】
シアル酸結合分子が、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ＮａｎＨシアリダーゼのシアル酸結合ドメインおよび／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＮａｎＡシアリダーゼのシアル酸結合ドメインを含む、請求項１、２、５、６または７に記載の使用のための請求項１、２、５、６または７に記載のシアル酸結合分子、請求項３、６または７に記載の方法あるいは請求項４、６または７に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ＮａｎＨシアリダーゼが、配列番号１または２のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の使用のための請求項１０に記載のシアル酸結合分子、請求項１０に記載の方法または請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＮａｎＡシアリダーゼが、配列番号３または４のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の使用のための請求項１０に記載のシアル酸結合分子、請求項１０に記載の方法または請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
シアル酸結合分子が、Ｓｐ２ＣＢＭ、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ、Ｖｃ４ＣＢＭ、Ｖｃ２ＣＢＭまたはＶｃ２ＣＢＭＴＤである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用のための請求項１〜１２のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法または請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
シアル酸結合分子が、１つ以上の改変ファミリー４０炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ４０）を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用のための請求項１〜１３のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法あるいは請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
１つ以上の改変ＣＢＭ４０が、参照配列に対して１つ以上の変異を含む、請求項１４に記載の使用のための請求項１４に記載のシアル酸結合分子、請求項１４に記載の方法または請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
参照配列が、
（ｉ）野生型ファミリー４０ＣＢＭ配列；
（ｉｉ）Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅの野生型ＣＢＭ４０配列；
（ｉｉｉ）Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅのＮａｎＨシアリダーゼ配列；
（ｉｖ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの野生型ＣＢＭ４０配列；
（ｖ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＮａｎＡシアリダーゼ配列；
（ｖｉ）配列番号１の配列；
（ｖｉｉ）配列番号２の配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号３の配列；および
（ｉｘ）配列番号４の配列
からなる群から選択される、請求項１５に記載の使用のための請求項１５に記載のシアル酸結合分子、請求項１５に記載の方法または請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
変異が、
（ｉ）１つ以上のアミノ酸置換；
（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸除去；
（ｉｉｉ）１つ以上のアミノ酸付加／挿入；
（ｉｖ）１つ以上のアミノ酸／配列反転；および
（ｖ）１つ以上のアミノ酸／配列重複
からなる群から選択される、請求項１５または１６のいずれか１項に記載の使用のための請求項１５または１６のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子、請求項１５または１６のいずれか１項に記載の方法あるいは請求項１５または１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
シアル酸結合分子が、改変オリゴマー形成ドメインを含む、請求項１４、１５、１６または１７のいずれか１項に記載の使用のための請求項１４、１５、１６または１７のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子、請求項１４、１５、１６または１７のいずれか１項に記載の方法あるいは請求項１４、１５、１６または１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
改変オリゴマー形成ドメインが、参照配列に対して１つ以上の変異を含む、請求項１８のいずれか１項に記載の使用のための請求項１８のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子、請求項１８の請求項に記載の方法または請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
参照配列が、
（ｉ）野生型Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａシュードアミニダーゼ配列；
（ｉｉ）受託番号Ｑ９Ｌ６Ｇ４として寄託されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａシュードアミニダーゼアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号５の配列；および
（ｉｖ）配列番号６の配列
からなる群から選択される、請求項１９のいずれか１項に記載の使用のための請求項１９のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子、請求項１９の請求項に記載の方法または請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
シアル酸結合分子が、以下の構造：
CBM1(V239A V246G A162P)--CBM2(V239A V246G A162P)--TD(S342D R403K)
を含み、
CBM1およびCBM2がCBM40配列由来であり、TDが三量体形成ドメインである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の使用のための請求項１〜２０のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法あるいは請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）と関連づけられる症状、感染症、疾患および／または状態の処置および／または予防に使用するための、以下の配列：
GAMVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDPKAPAFYNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKGRARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALTPEEVQKRSGGGSGVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDPKAPAFYNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKGRARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALTPEEVQKRSGGSLGVPDFESDWFDVSSNSLYTLSHGLQRSPRRVVVEFARSSSPSTWNIVMPSYFNDGGHKGSGAQVEVGSLNIKLGTGAAVWGTGYFGGIDNSATTRFATGYYRVRAWI
を含むシアル酸結合分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＳＶ感染症、その症状および関連する病態ならびに場合によっては、発病の過程においてシアル酸含有レセプターと結合しないか、または主としてそれと結合しないウイルス性病原体によって引き起こされるか、もしくはもたらされる感染症の処置または予防のための組成物、薬剤および方法に使用するための分子を提供する。
【背景技術】
【０００２】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、気道感染症を引き起こす合胞体ウイルスである。これは、ヒトおよび動物において疾患を引き起こし、下気道感染症の主原因であり、とりわけ、子供および高齢者にリスクがある。（ヒトＲＳＶ（ＨＲＳＶ）と呼ばれることの多い型を含む）ＲＳＶの感染は、防御免疫を誘導するが、研究により、応答は長期にはわたらず（または持続性ではなく）、複数回の感染の症例は珍しくないことが示されている。
他の多くの呼吸器病原体とは異なり、ＲＳＶは、細胞侵入および感染のためにシアロ複合糖質（ｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）とは結合しない3。しかしながら、呼吸器上皮細胞表面複合糖質の末端グリカンとしてシアル酸が遍在し最も多数を占める性質のため、シアル酸結合分子をＲＳＶなどの病原体に対する処置の基礎として活用することができれば有利であろう。
【発明の概要】
【０００３】
本開示は、（シアル酸含有糖タンパク質および細胞表面シアル酸レセプターを含む）細胞表面にあるシアル酸（特に、シアロ複合糖質）に対して親和性（またはそれと結合する能力）を有する分子が、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）と関連づけられる症状、感染症、疾患および／または状態の処置および／または予防に有用性を見出したという発見に基づくものである。
本開示は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）と関連づけられる症状、感染症、疾患および／または状態の処置および／または予防に使用するためのシアル酸結合分子を提供する。
ＲＳＶと関連づけられる症状、感染症、疾患および／または状態の処置および／または予防に使用するための薬剤の製造におけるシアル酸結合分子の使用がさらに提供される。
本開示はまた、ＲＳＶの症状、疾患、感染症または状態を処置または予防する方法であって、それを必要とする対象に治療有効量のシアル酸結合分子を投与するステップを含む、方法を提供する。
本開示はまた、ＲＳＶ感染症と関連づけられる症状、疾患および／または状態を処置または予防する方法に使用するための、シアル酸結合分子ならびにシアル酸結合分子を含む薬剤および方法も提供する。
【０００４】
本明細書全体をとおして、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および／または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、特定の特徴を「含む」本発明の態様および実施形態を指すために使用される。当然のことながら、これらの用語は、関連する特徴「から本質的になる」または関連する特徴「からなる」態様および／または実施形態も包含する場合もある。
ＲＳＶは、リポタンパク質被膜および直鎖状のマイナスセンスＲＮＡゲノムを含む中程度のサイズ（１２０〜２００ｎｍ）のエンベロープウイルスである。ゲノムは、Ｆ、Ｇ、およびＳＨリポタンパク質をコードする。Ｆ（融合）およびＧ（接着）リポタンパク質（または糖タンパク質）は、宿主細胞膜を標的とし、感染の最初の段階を制御する。これらもＲＳＶ分離株間で高度に保存されている。特に、Ｇタンパク質は、気道の繊毛細胞を標的とし、Ｆタンパク質は、ビリオン膜を標的細胞膜と融合させる。接着（Ｇ）および融合（Ｆ）糖タンパク質に対するモノクローナル抗体とのウイルスの反応性に基づいて、ＲＳＶは、２つの抗原サブグループ、ＡおよびＢに分類される。本明細書中で使用される場合、「ＲＳＶ」という用語は、ＲＳＶのすべての株、形態および抗原バリアントを含み、ヒト（Ｈ）または動物ＲＳＶのすべての形態、株およびバリアントを含む。
ＲＳＶは、発病の過程においてシアル酸と結合または関連しない病原体であるため、ＲＳＶは、宿主細胞のシアル酸（または細胞表面シアロ複合糖質）とは結合しない。したがって、シアル酸結合分子（例えば、ＣＢＭ４０分子（および下で定義されるその他のもの）など）が、発病の過程において細胞表面シアル酸（シアロ複合糖質）を利用しないウイルス性病原体（またはシアル酸との結合が、病原体が細胞と結合する、コロニー形成する、もしくは細胞に進入／感染する主要な手段ではない病原体）の処置に有用性があるという発見は、完全に予想外である。
【０００５】
細胞表面シアル酸／シアロ複合糖質と病原体の結合を阻止することができる薬剤としてシアル酸結合分子が使用されてきた先行技術の開示に関して、シアル酸結合分子の有用性は、シアル酸結合分子および病原体の両方がシアル酸と結合するという事実が元であるが、これは、ＲＳＶには当てはまらない。ＲＳＶはシアル酸と結合しないため、シアル酸結合分子が細胞へのＲＳＶ侵入を阻止するために使用できるであろうことを当業者は認識しないであろう。
理論に縛られることを望まないが、細胞表面シアル酸／シアロ複合糖質と結合したとき、シアル酸結合分子が、Ｇおよび／またはＦ  ＲＳＶタンパク質が宿主細胞上の標的に到達するのを妨げることが示唆される。これが、結果として、ＲＳＶがコロニー形成し、細胞に感染するのを妨げる。さらに、下で提示されるデータ（特に、実施例６で提示されるデータを参照）は、ＲＳＶウイルスの表面が、シアル酸で終わる糖タンパク質を含むことを示しているため、シアル酸結合分子が、これらの糖タンパク質と（シアル酸要素を介して）結合することができ、さらにＲＳＶと宿主細胞の間の結合を阻害することが示唆される。
【０００６】
シアル酸結合タンパク質が免疫系を刺激または調節するために使用可能であること、および刺激または調節された免疫応答が、（発病の過程においてシアル酸と結合しないか、または主としてシアル酸と結合しない病原体を含む）多くの異なる病原体の病態に影響を与えることもあることが確かめられてきた可能性もあるが、当業者は、依然としてシアル酸に対して親和性を有する分子（例えば、ＣＢＭ４０型分子などのＣＢＭ）がＲＳＶ感染を物理的に阻止する、妨げるまたは中和するために使用できるという発見には至っていないであろう。
しかしながら、シアル酸結合分子がＲＳＶ感染症を中和または阻止するために使用できるという結果は、ＲＳＶ感染症を中和または阻止することに使用するためのシアル酸結合分子の提供にまで本開示を拡大する。そのような使用は、インビトロまたはインビボ方法に利用されてもよい。
本開示は、ＲＳＶ感染症を中和または阻止するための薬剤の製造のためのシアル酸結合分子の使用をさらに提供する。
【０００７】
本開示はまた、治療有効量のシアル酸結合分子を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、ＲＳＶ感染症を中和または阻止する方法に関する。
あるいは、本開示は、細胞をＲＳＶに対して非許容性にするために使用することができる方法を提供する（「非許容性」という用語は、ウイルスの接着もしくはコロニー形成および／またはそれに続く感染およびウイルス複製に抵抗する細胞を意味する）。そのような方法（インビトロまたはインビボにおける方法であってもよい）は、ＲＳＶ感染に対して感受性または脆弱性である細胞を、本明細書に記載されているシアル酸結合分子と接触させるステップまたはインキュベーションするステップを含んでもよい。接触させるステップまたはインキュベーションするステップは、ＲＳＶと接触させる前に、細胞をシアル酸結合分子と接触させるステップまたはインキュベーションするステップを含んでもよい。さらにまたは代替的に、細胞をシアル酸結合分子と接触させるステップまたはインキュベーションするステップは、細胞がＲＳＶと接触しているのと同時に、シアル酸結合分子が細胞と接触しているよう延長されてもよい。
理論に縛られることを望まないが、インキュベーションの期間中、シアル酸含有細胞表面レセプターにシアル酸結合分子が結合することになり、ＲＳＶ自体は細胞表面のシアル酸部分（シアロ複合糖質）とは結合しないが、驚くべきことに、シアル酸結合分子と細胞表面シアル酸含有レセプター／シアロ複合糖質の間の結合がＲＳＶの細胞との結合を阻害するか、または妨げることがわかった。これは、ひいては、ＲＳＶの細胞感染および細胞内ＲＳＶ複製を妨げる。
【０００８】
本開示において報告されている発見は、シアル酸との結合親和性を有する分子の製剤化および投与ならびに続くＲＳＶ感染症の処置および／または予防におけるこれらの製剤の使用に重大な関係がある。例えば、シアル酸結合分子（例えば、ＣＢＭおよび／またはＣＢＭ４０型分子）が、ＲＳＶ感染を予防する（または中和する）ために使用できるという発見は、粘膜投与に適した製剤としてのシアル酸結合分子の使用を可能にする。
粘膜投与用のシアル酸結合分子含有製剤は、
（ｉ）宿主細胞とのＲＳＶの結合を妨げる；および／または
（ｉｉ）ＲＳＶを阻止もしくは中和する
ために使用されてもよい。
明記したとおり、「阻止する」または「中和する」という用語は、宿主細胞のシアル酸含有レセプター／シアロ複合糖質と結合し、（驚くべきことに）ＲＳＶの細胞との結合（およびそれに続く感染）を阻止することがわかったシアル酸結合分子の阻止または中和効果を指す。
したがって、本開示は、ＲＳＶと関連づけられる疾患および／または状態の処置および／または予防に使用するためのシアル酸結合分子を含む、粘膜投与用の組成物を提供する。
【０００９】
「粘膜投与」という用語は、例えば、呼吸器表面および同種のものを含む、任意の粘膜表面へ投与するために製剤化された組成物を含むことに留意すべきである。この用語は、吸入によって投与するために製剤化された組成物も含む。粘膜投与に適した（または粘膜投与用に製剤化された）組成物は、鼻腔内に投与されることが意図される組成物を含んでもよい。
したがって、粘膜投与用の組成物は、任意のタイプの粘膜投与に使用するのに適した賦形剤、希釈剤および／またはバッファーとともに製剤化されてもよい。
粘膜（例えば、鼻腔内）投与用の組成物は、投与されるシアル酸結合分子の溶液および／またはエアロゾル分散用もしくは飲用水に分散させるための（同じものを含む）粒子を含んでもよい。分散させられる場合、そのような組成物は、望ましくは、例えば、鼻腔への保持を可能にするために範囲１０〜２００μｍの粒径を有するべきであり、これは、必要に応じて、適した粒度の粉末の使用または適切なバルブの選択によって達成することができる。その他の適した組成物としては、鼻に近づけた容器から鼻孔を通して急速に吸入することによる投与のための範囲２０〜５００μｍの粒径を有する粗粉末、および水性もしくは油性溶液または懸濁液中に０．２〜５％ｗ／ｖの活性化合物を含む点鼻薬が挙げられる。粘膜投与用の組成物は、液体スプレーの形態で提供されてもよい。
【００１０】
一実施形態において、本開示は、免疫応答の刺激または調節によるＲＳＶの処置および／または予防に関連していなくてもよい。
本開示は、予防的に使用するためのシアル酸結合分子をさらに提供してもよい。特に、本明細書に記載されているシアル酸分子は、ＲＳＶ感染症を予防するために予防的に使用されてもよい。
予防の方法またはＲＳＶ感染症を予防する方法は、それを必要とする対象に本開示の組成物を投与するステップを含んでもよい。明記したとおり、本開示の組成物は、粘膜（例えば、鼻腔内）投与用に製剤化された組成物を含んでもよい。
本明細書中で使用される場合およびＲＳＶ感染症を予防する任意の方法において、「それを必要とする対象」は、ＲＳＶ感染症にかかりやすい、感染しやすい、または発症するリスクがある任意の対象であってもよい。対象は、新生児、乳児または小児である場合もある。対象は、高齢者である場合もある。対象は、免疫不全の対象である場合もある。対象は、１つ以上の基礎にあるまたは慢性の健康問題、特に、気道および／または呼吸に影響を及ぼす問題を有する場合もある。例えば、対象は、喘息を患っている場合もある。
【００１１】
本明細書全体をとおして、本発明者らは、「シアル酸結合分子」という用語を使用し、この用語は、あらゆる有用なシアル酸結合分子を包含する。有用なシアル酸結合分子は、いかなる形態をとってもよく、および／または分子もしくは化合物のいかなるクラスに属してもよく（例えば、それらは、タンパク質、ペプチド、炭水化物、抗体および同種のものであってもよい）、「シアル酸」という用語は、Ｎ−、またはＯ−置換ノイラミン酸のすべての形態を包含し、そのすべての合成、天然および／または改変型を含む。シアル酸は、細胞表面分子、糖タンパク質および糖脂質の構成成分として見られる場合もある。ほとんどの場合、シアル酸は、細胞膜に接続した糖鎖および／またはタンパク質の終端（末端領域）に存在する。例えば、ヒト上気道の一部の細胞は、α−２，６−結合シアル酸レセプターを含み、上気道および下気道の他の細胞は、α−２，３−結合シアル酸レセプターを含む。シアル酸ファミリーは、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９におけるアセチル化、グリコリル化（ｇｌｙｃｏｌｙｌａｔｉｏｎ）、ラクトン化およびメチル化の結果として生じることもある多数（およそ５０）の誘導体を包含する。すべてのそのような誘導体は、「シアル酸」という用語に包含されることになる。
【００１２】
さらに、シアル酸は、ＧａｌおよびＧａｌＮＡｃとのα（２，３）またはα（２，６）あるいは別のシアル酸とのα（２，８）またはα（２，９）結合が見られる。したがって、「シアル酸」という用語は本明細書全体をとおして使用されるが、これが、すべてのその誘導体、類似体またはバリアント（天然に存在するか、または合成的に形成されたかのいずれか）ならびに同じものを含む単量体、二量体、三量体、オリゴマー、重合体またはコンカテマーを包含することを理解することが重要である。
したがって、本開示のシアル酸結合分子（および本明細書に記載されるとおりに使用するための）は、上記のシアル酸のすべての形態および（おそらく、細胞表面レセプターの一部として）細胞、例えば、哺乳動物細胞の表面に存在するあらゆる形態のシアル酸を含む、シアル酸に対して親和性を示す部分を含む。これらのシアル酸のさまざまな形態は、まとめて「シアル酸部分」と呼ばれる場合もある。
本開示のシアル酸結合分子は、シアル酸に対して親和性を示すため、それらは、１つ以上のシアル酸部分と結合する／連結する、および／または関連づけられる場合もある。したがって、「シアル酸結合分子」という用語は、シアル酸部分と結合するか、そうでなければ、連結する、もしくは関連づけられる能力を保持するシアル酸結合分子全体の任意のフラグメントをさらに包含してもよい。
【００１３】
使用するためのシアル酸結合分子は、単一のシアル酸結合分子（例えば、単量体または一価の分子）、あるいは、２つ以上のシアル酸結合分子、例えば、高分子または多価の分子を含んでもよく、この２つ以上の分子は、同じであっても、または異なってもよい。
使用するためのシアル酸結合分子は、「炭水化物結合モジュール」（ＣＢＭ）として知られている１つ以上のシアル酸結合分子を含んでも、それらから本質的になっても、またはそれらからなってもよい。使用するのに適したＣＢＭは、シアル酸に対して親和性を示す。ＣＢＭは、複数のファミリーに分類され、ファミリー４０ＣＢＭ（ＣＢＭ４０）のメンバーと分類されるＣＢＭが有用な場合もある。ファミリー４０ＣＢＭは、およそ２００残基の分子を含み、ＧＨ３３シアリダーゼのＮ末端に見られることが多い。それらがＧＨ３３シアリダーゼのβ−プロペラに挿入されているのが見つかる場合もある。
本開示は、シアル酸結合要素を含む分子、例えば、より大きな分子の使用を含む場合もある。明記したとおり、そのシアル酸結合要素（すなわち、シアル酸結合分子）自体は、ＣＢＭ、例えば、ＣＢＭ４０を含んでもよい（それからなるか、またはそれから本質的になってもよい）。（非限定）例として、本開示の分子（例えば、シアル酸結合分子）は、シアル酸と結合する能力を示すことができるだけでなく、１つ以上の他の機能を有してもよい。例えば、本分子は、酵素活性を有してもよい。例えば、有用な分子は、（本明細書に記載される）ＣＢＭを含み、いくらかのシアリダーゼ活性を示してもよい。
【００１４】
有用なシアル酸結合分子は、酵素部分およびシアル酸結合部分を含む融合タンパク質であってもよく、この場合、シアル酸結合部分は、本明細書に記載されるＣＢＭを含む。そのような場合には、酵素部分は、シアル酸結合部分と融合されてもよい。明記したとおり、任意の有用な融合タンパク質の酵素部分は、シアリダーゼ活性を含んでもよい（もしくはそれを有するか、またはそれを示してもよい）。
一実施形態において、本明細書に記載されているさまざまな使用のためのシアル酸結合タンパク質またはＣＢＭは、酵素（例えば、シアリダーゼ）活性を有する分子（例えば、融合タンパク質）の一部として提供されなくても、またはそれに含まれなくてもよい。さらにまたは代替的に、シアル酸結合分子は、（ｉ）ヘパリンともヘパリン硫酸（ｈｅｐａｒｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）とも結合しなくてもよく、および／または（ｉｉ）ヘパリンもしくはヘパリン硫酸部分と結合するタンパク質のＧＡＧ結合ドメインを含まなくてもよい。
したがって、本開示は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）と関連づけられる疾患および／または状態の処置および／または予防に使用するためのＣＢＭまたはＣＢＭ４０を提供する。
【００１５】
ＲＳＶと関連づけられる疾患および／または状態の処置および／または予防に使用するための薬剤の製造におけるＣＢＭまたはＣＢＭ４０の使用がさらに提供される。
本開示はまた、ＲＳＶ感染症を処置または予防する方法であって、それを必要とする対象に治療有効量のＣＢＭまたはＣＢＭ４０を投与するステップを含む、方法を提供する。
本開示はまた、ＲＳＶ感染症と関連づけられる疾患および／または状態を処置または予防する方法に使用するためのＣＢＭまたはＣＢＭ４０を含むシアル酸結合分子および薬剤および方法を提供する。
本開示はまた、ＲＳＶ感染症を中和または阻止することに使用するための、ＣＢＭまたはＣＢＭ４０を提供する。
本開示は、ＲＳＶ感染症を中和または阻止するための薬剤の製造のためのＣＢＭおよび／またはＣＢＭ４０の使用をさらに提供する。
本開示は、治療有効量のＣＢＭおよび／またはＣＢＭ４０を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、ＲＳＶ感染症を中和または阻止する方法に関する。
【００１６】
あるいは、本開示は、細胞をＲＳＶに対して非許容性にするために使用することができる方法を提供する（「非許容性」という用語は、ウイルスの接着もしくはコロニー形成および／またはそれに続く感染およびウイルス複製に抵抗する細胞を意味する）。そのような方法（インビトロまたはインビボ方法であってもよい）は、ＲＳＶ感染に対して感受性または脆弱性である細胞を、本開示のＣＢＭおよび／またはＣＢＭ４０と接触させるステップまたはインキュベーションするステップを含んでもよい。
粘膜投与用のＣＢＭおよび／またはＣＢＭ４０含有製剤は、
（ｉ）宿主細胞とのＲＳＶの結合を妨げる；および／または
（ｉｉ）ＲＳＶを阻止もしくは中和する
ために使用されてもよい。
本開示は、ＲＳＶと関連づけられる疾患および／または状態の処置および／または予防に使用するためのＣＢＭおよび／またはＣＢＭ４０を含む、粘膜投与用の組成物を提供する。明記したとおり、粘膜投与用の組成物は、任意のタイプの粘膜投与に使用するのに適した賦形剤、希釈剤および／またはバッファーとともに製剤化されてもよい。
本開示は、予防的に使用するためのＣＢＭまたはＣＢＭ４０をさらに提供することができる。特に、本明細書に記載されているＣＢＭまたはＣＢＭ４０は、ＲＳＶ感染症を予防するために予防的に使用されてもよい。
【００１７】
明記したとおり、本開示の組成物は、粘膜（例えば、鼻腔内）投与用に製剤化された組成物を含んでもよい。
使用するための例となる炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）は、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ＮａｎＨシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（ＶｃＣＢＭ：ＣＢＭ４０）および／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＮａｎＡシアリダーゼの対応する（または一致する）ドメイン（ＳｐＣＢＭ：またＣＢＭ４０）を含んでもよい。当然、その他の微生物に存在する類似または一致するシアル酸結合モジュールも、「ＣＢＭ」という用語の範囲内に包含されることになる。
【００１８】
例となるＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ＮａｎＨシアリダーゼアミノ酸配列は、受託番号（ｕｍｂｅｒ）Ａ５Ｆ７Ａ４として寄託され、配列番号１（７８１アミノ酸）として下で再現されている。
MRFKNVKKTA LMLAMFGMAT SSNAALFDYN ATGDTEFDSP AKQGWMQDNT NNGSGVLTNA
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N
配列番号１のＣＢＭ領域は、アミノ酸残基２５〜２１６であり、この配列は、配列番号２であってもよい。
【００１９】
例となるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＮａｎＡシアリダーゼアミノ酸配列は、受託番号Ｐ６２５７５として寄託され、配列番号３（１０３５アミノ酸）として下で再現されている。
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AFFLGLFTLG KKREQ
配列番号３のＣＢＭ領域は、アミノ酸残基１２１〜３０５であり、この配列は、配列番号４であってもよい。
【００２０】
したがって、本開示のさまざまな態様および実施形態においてシアル酸結合分子として使用するためのＣＢＭは、配列番号１、２、３もしくは４の配列を有するタンパク質もしくはペプチドまたはそれ由来の配列フラグメントを含んでもよく、これは、シアル酸と結合する能力を有する分子をコード化する（言い換えると、配列番号１、２、３または４のフラグメントのシアル酸結合分子コード化部分）。
有用なシアル酸結合分子は、（配列番号１によって示される）Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの（シアリダーゼをコードする）ｎａｎＨ遺伝子または別の生物に存在する対応するもしくは一致する遺伝子（例えば、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの対応する／一致するｎａｎＡシアリダーゼ遺伝子：配列番号３を参照）のシアル酸結合ドメインによってコードされるタンパク質部分を含んでもよい。
使用するためのシアル酸結合分子は、配列番号１および２のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ分子のおよそ残基１、５、１０、１５、２５または３０（すなわち、１〜３０またはその間の任意のアミノ酸残基）からおよそ残基１５０、１７５、２００、２１０、２１６、２２０〜７８１（その間の任意の残基を含む、１５０〜７８１までの任意の残基まで）を含んでもよい。例えば、使用するためのシアル酸結合分子は、上の配列番号１の残基２５〜およそ残基２１６と対応する配列を有するペプチドを含んでもよい。
【００２１】
さらなる適したシアル酸結合分子は、配列番号３または４の配列を有するタンパク質もしくはペプチドまたはそのシアル酸結合フラグメントを含んでもよい。例えば、有用なシアル酸結合分子は、（シアリダーゼをコードする）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｎａｎＡ遺伝子のシアル酸結合ドメインによってコードされるタンパク質部分を含んでもよい。例えば、使用するためのシアル酸結合分子は、配列番号３および４のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅシアリダーゼ分子のおよそ残基８０、９０、１００、１１０、１２０、１２１〜１３０（すなわち、その間の任意の残基を含む、およそ残基８０〜１３０の任意の残基）からおよそ残基２５０、２７５、３００、３０５、３１０、３２０〜１０３５まで（すなわち、およそその間の任意の残基を含む、およそ２５０〜１０３５の任意の残基まで）を含んでもよい。例えば、使用するためのシアル酸結合分子は、上の配列番号３の残基１２１〜およそ残基３０５と対応する配列を有するペプチドを含んでもよい。
【００２２】
使用するためのシアル酸結合分子は、１つ以上のＣＢＭを含んでもよい。例えば、適したシアル酸結合分子は、単一のＣＢＭ、例えば、単一のＶｃＣＢＭまたは単一のＳｐＣＢＭを含んでもよい。あるいは、使用するためのシアル酸結合分子は、多数または複数（すなわち２つ以上）のＣＢＭを含んでもよい。多数のＣＢＭを含むシアル酸結合分子は、「多価シアル酸結合分子」または「多価ＣＢＭ」と呼ばれる場合もある。多価ＣＢＭは、例えば、２つ以上（例えば、３、４、５もしくは６つ）のＶｃＣＢＭまたは２つ以上のＳｐＣＢＭを含んでもよい。多価ＣＢＭは、異なるＣＢＭ、例えば、１つ以上のＶｃＣＢＭと１つ以上のＳｐＣＢＭの混合物を含んでもよい。
使用のためのシアル酸結合分子は、オリゴマー形成ドメインをさらに含んでもよい。適したオリゴマー形成ドメインは、自己会合して、多量体構造、例えば、三量体を形成する能力を示してもよい。使用するためのオリゴマー形成ドメインは、上記のオリゴマー形成特性を有する任意の分子または任意のその機能的フラグメントを含んでもよい。例えば、１つ以上（例えば、２つ）のシアル酸結合分子（例えば、ＣＢＭ）は、オリゴマー形成ドメインと結合、連結または融合されてもよく、得られるシアル酸結合分子：：オリゴマー形成ドメイン「融合物」は、その後、（１つ以上の他のそのような「融合物」とともに）細胞成長および／または活性を調節するため、および／または本明細書中で開示されている任意の疾患および／または状態を処置もしくは予防するための分子として使用されてもよい。
【００２３】
適したオリゴマー形成ドメインは、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａシュードアミニダーゼ由来であってもよい。例となるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａシュードアミニダーゼ配列のアミノ酸配列は、受託番号ＰＡＯ５７９として寄託され、配列番号５（４３８アミノ酸）として下で再現されている。
MNTYFDIPHR LVGKALYESY YDHFGQMDIL SDGSLYLIYR RATEHVGGSD GRVVFSKLEG
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配列番号５のオリゴマー形成ドメインは、アミノ酸残基３３３〜４３８であり、この配列は、配列番号６であってもよい。
【００２４】
したがって、使用するためのオリゴマー形成ドメインは、配列番号５によって示されるＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａシュードアミニダーゼ三量体形成ドメイン（ＰａＴＤ）のおよそ残基２５０、２７５、３００、３１０、３２０、３３３、３４０〜３５０（すなわち、およそその間の任意の残基を含む、およそ残基２５０〜およそ残基３５０）からおよそ残基４００、４１０、４２０、４３０または４３８（すなわち、およそその間の任意の残基までを含む、およそ残基４００残基４３８のおよそ任意の残基まで）を含んでもよい。例えば、有用なシアル酸結合分子は、配列番号６の残基３３３〜４３８を含むオリゴマー形成ドメインを利用してもよい。
使用するためのシアル酸結合分子は、図１に示される１つ以上のＣＢＭベースの分子を含んでもよい。例えば、適したシアル酸結合分子は、任意にオリゴマー形成ドメイン（ＰａＴＤまたはそのオリゴマー形成フラグメントなど）と融合された、結びつけられた、または結合された２つ以上のＶｃＣＢＭを含んでもよい（それから本質的になっても、またはそれからなってもよい）。シアル酸結合分子は、２つの融合した（または結びつけられた）ＶｃＣＢＭを含んでも、それからなっても、またはそれから本質的になってもよく、これは、さらに、オリゴマー形成ドメインと融合される（例えば、図１に示される分子Ｖｃ２ＣＢＭＴＤを参照）。
【００２５】
使用するためのその他のシアル酸結合ドメインは、任意にオリゴマー形成ドメイン（ＰａＴＤまたはそのオリゴマー形成フラグメントなど）と融合された、結びつけられた、または結合された２つ以上のＳｐＣＢＭを含んでもよい。使用するためのシアル酸結合分子は、２つの融合した（または結びつけられた）ＳｐＣＢＭを含んでも、それからなっても、またはそれから本質的になってもよく、これは、さらに、オリゴマー形成ドメインと融合される（例えば、図１に示される分子Ｓｐ２ＣＢＭＴＤを参照）。
「シアル酸結合分子」、「ＣＢＭ」および／または「ＣＢＭ４０」という用語は、本明細書に記載されている任意の分子の改変型を含んでもよい。さらに、「改変された」という用語は、参照配列に対して１つ以上の変異を含む分子を包含する。
「参照配列」は、任意の野生型ＣＢＭ配列であってもよい。例えば、参照配列は、野生型ファミリー４０ＣＢＭ配列、例えば、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ＮａｎＨシアリダーゼまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＮａｎＡシアリダーゼの野生型ＣＢＭ配列を含んでも、それから本質的になっても、またはそれからなってもよい（その他の微生物に存在する類似または一致するＣＢＭ（ＣＢＭ４０を含む）が「ＣＢＭ」および／またはＣＢＭ参照配列という用語の範囲内に包含されることが認識されるべきである）。（本明細書に記載されるとおりの有用な多価ＣＢＭを包含する）有用なシアル酸結合分子が由来してもよい参照配列は、本明細書に記載されている特定の配列（例えば、配列番号１、２、３、４および５）のいずれかを含んでもよい。
【００２６】
例えば、使用するための改変ＣＢＭ配列は、一定のまたは特定の野生型ＣＢＭ由来であってもよい。有用な改変ＣＢＭ配列は、１つ以上の変異を含む野生型ＣＢＭ配列を含んでもよい。
１つ以上の変異は、機能的であってもよい。変異は、例えば、使用するためのＣＢＭの一次配列全体を変える場合もあるが、ＣＢＭの特性を（実質的に）変えない場合もあり、したがって、改変ＣＢＭの配列は、由来する野生型配列と異なる場合もあるが、改変ＣＢＭの全体的な機能は野生型ＣＢＭのものと（実質的に）一致する。あるいは、１つ以上の変異は、個々に（および／または独立して）あるいはまとめて（例えば、相乗的に）野生型ＣＢＭ（例えば、改変ＣＢＭが由来する野生型ＣＢＭ）の生理的、生物学的、免疫学的および／または薬理学的特性の１つ以上を調節しても（向上させても、または抑制／阻害しても）よい。特に、１つ以上の変異は、以下であってもよい。
（ｉ）ＣＢＭの免疫原性（もしくは抗原性）を変えてもよく；および／または
（ｉｉ）（ＣＢＭもしくは改変ＣＢＭを含む任意の多量体分子の）効力を変えてもよく（例えば、向上させてもよく）および／または
（ｉｉｉ）それらは、ＣＢＭの熱安定性を調節してもよい（例えば、向上させてもよい）；および／または
（ｉｖ）それらは、ＣＢＭの溶解性を調節してもよい（例えば、向上させてもよい）；および／または
（ｖ）それらは、分子の生体内半減期を調節してもよい（例えば、向上させてもよい）
【００２７】
「変異」は、野生型ＣＢＭ分子に対するいかなる変更を含んでもよい。例えば、「変異」という用語は、例えば、以下を含んでもよい。
（ｉ）１つ以上のアミノ酸置換（ここでは、１つ以上の野生型アミノ酸が別の（異なる）アミノ酸で置き換えられるか、または変えられ、「置換」という用語は、保存的アミノ酸置換を含むであろう）；および／または
（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸除去（ここでは、１つ以上の野生型アミノ酸残基が除去される）；および／または
（ｉｉｉ）１つ以上のアミノ酸付加／挿入（ここでは、追加のアミノ酸残基が野生型（もしくは参照）一次配列に付加される）；および／または
（ｉｖ）１つ以上のアミノ酸／配列反転（通常、ここでは、一次配列中の２つ以上連続的なアミノ酸が反転される；および／または
（ｖ）１つ以上のアミノ酸／配列重複（ここでは、一次アミノ酸配列のアミノ酸もしくはその一部（例えば、一続きの５〜１０アミノ酸）が繰り返される）
【００２８】
したがって、有用な改変ＣＢＭ（すなわち、本明細書に記載の医学的使用および方法に使用するためのＣＢＭ）は、本明細書に記載されている１つ以上の変異を含んでもよい。
非限定例として、以下は、本明細書に記載されているさまざまな実施形態に使用するための（例えば、ＲＳＶ感染症などを処置または予防する方法に使用するため）六量体シアル酸結合分子を作製するために使用されてもよい（「ＨＥＸ」単位と呼ばれる）個々の単位を表す。それぞれの場合において、ＨＥＸ単位は、２つの改変ＣＢＭ（ＣＢＭ１およびＣＢＭ２と示される）を含み、それぞれのＣＢＭに導入された特定の変異は括弧内に特定されている。「−−−−」記号は、（一方のＣＢＭを別のＣＢＭと、またはＣＢＭをオリゴマー形成ドメインと連結する）アミノ酸リンカーを示すことに留意すべきである。したがって、六量体シアル酸結合分子は、いくつか（例えば、３つ）のＨＥＸ単位から構成されてもよい。それぞれの場合において、（「ＴＤ」と示される）オリゴマー形成ドメインは、その単位を合わせて三量体として結合する。任意の所与の六量体は、上に、(および下に見出しＨＥＸ１、ＨＥＸ２、ＨＥＸ３、ＨＥＸ４、ＨＥＸ５、ＨＥＸ６およびＨＥＸ１７として)記載されている単位の同一のコピーを含んでもよいが、当業者は、さらなる選択肢が利用可能であることを理解するであろう。例えば、ＨＥＸ単位は、それぞれが異なる変異（本明細書において詳述されている選択肢から選択される１つ以上である変異）を有する２つのＣＢＭから構成されてもよい。
【００２９】
(i) HEX1
CBM1 (L170T V239A V246G I286A Y292E)-----CBM2 (L170T V239A V246G I286A Y292E)-----TD (S342D L348D R403K)
(ii) HEX2
CBM1 (V239A V246G I286A Y292E)----CBM2 (V239A V246G I286A Y292E)----TD (S342D R403K)
(iii) HEX3
CBM1 (V239A V246G I286A)-----CBM2 (V239A V246G I286A)-----TD (S342D R403K)
(iv) HEX4
CBM1 (V239A V246G)-----CBM2 (V239A V246G)-----TD (S342D)
(v) HEX5
CBM1 (V239A V246G)-----CBM2 (V239A V246G)-----TD (R403K)
(vi) HEX6
CBM1 (V239A V246G)-----CBM2 (V239A V246G)-----TD (S342D R403K)
(vii) HEX17
CBM1 (V239A V246G A162P)-----CBM2 (V239A V246G A162P)-----TD (S342D R403K)
【００３０】
なお、ＨＥＸ６およびＨＥＸ１７は、追加のA162P変異を除いて一致する。このプロリン変異（残基１６２にある野生型アラニンの置換）は、熱安定性を向上させることが示された（単一のＣＢＭ  Ｔｍが３〜４℃だけ）。プロリン変異の使用に関するさらなる情報は、一般的なアプローチを記載しているFu 2009, ’Increasing protein stability by improving beta-turns’（DOI 10.1002/prot.22509）から導き出すことができる。プロリン変異は、ＣＢＭ分子の予測される免疫原性に影響を及ぼさず（増加または低下させず）、他の変異、ＮもしくはＣ末端またはリガンド結合部位の近くに位置しない。むしろ予想外にも、熱安定性の中程度の向上を超えて、A162P変異が、インビボ実験において、特に、３×Ｈｅｘ６単位を含む六量体分子を使用して行われたそうした同じ実験と比較して著しい向上を示す六量体ＣＢＭ（すなわち、３×ＨＥＸ１７単位を含む分子）をもたらすことが確認された。例えば、改変分子（特に、３×ＨＥＸ１７単位を含む分子）は、例えば、ＩＬ−８を含む、炎症促進サイトカインに対する調節を示す。実際に、３×ＨＥＸ１７単位を含む分子によるＩＬ−８の産生に対する調節効果（特に、阻害効果）は、他の試験された改変分子を超えて向上した。
【００３１】
Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（別名「ＳｐＯｒｉｇ」）アミノ酸配列と比較した、ＨＥＸ６およびＨＥＸ１７分子のアミノ酸配列は以下である。
SpOrig GAMVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDAKAPAFYNLFSVSSAT
HEX6   GAMVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDAKAPAFYNLFSVSSAT
Hex17  GAMVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDPKAPAFYNLFSVSSAT
SpOrig KKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKG
HEX6   KKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKG
Hex17  KKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKG
SpOrig RVRLYVNGVLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALT
HEX6   RARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALT
Hex17  RARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALT
SpOrig PEEVQKRSGGGSGVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDAKAPAF
HEX6   PEEVQKRSGGGSGVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDAKAPAF
Hex17  PEEVQKRSGGGSGVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDPKAPAF
SpOrig YNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTV
HEX6   YNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTV
Hex17  YNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTV
SpOrig EKPTAELPKGRVRLYVNGVLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIR
HEX6   EKPTAELPKGRARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIR
Hex17  EKPTAELPKGRARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIR
SpOrig NLTVYNRALTPEEVQKRSGGALGVPDFESDWFSVSSNSLYTLSHGLQRSPRRVVVEFARS
HEX6   NLTVYNRALTPEEVQKRSGGSLGVPDFESDWFDVSSNSLYTLSHGLQRSPRRVVVEFARS
Hex17  NLTVYNRALTPEEVQKRSGGSLGVPDFESDWFDVSSNSLYTLSHGLQRSPRRVVVEFARS
SpOrig SSPSTWNIVMPSYFNDGGHKGSGAQVEVGSLNIRLGTGAAVWGTGYFGGIDNSATTRFAT
HEX6   SSPSTWNIVMPSYFNDGGHKGSGAQVEVGSLNIKLGTGAAVWGTGYFGGIDNSATTRFAT
Hex17  SSPSTWNIVMPSYFNDGGHKGSGAQVEVGSLNIKLGTGAAVWGTGYFGGIDNSATTRFAT
SpOrig GYYRVRAWI
HEX6   GYYRVRAWI
Hex17  GYYRVRAWI
【００３２】
したがって、本開示のさまざまな態様および実施形態（使用、使用するためのシアル酸結合分子、方法および薬剤）は、
（ｉ）１つ以上のＶｃＣＢＭ；
（ｉｉ）１つ以上のＳｐＣＢＭ；
（ｉｉｉ）１つ以上の改変ＣＢＭ；
（ｉｖ）ＨＥＸ１７分子；および
（ｉｉｉ）多価ＣＢＭ
からなる群から選択されるシアル酸結合分子を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるシアル酸結合分子を利用してもよい。
【００３３】
したがって、本開示は、ＲＳＶ感染症の処置および／または予防に使用するための
Ｓｐ２ＣＢＭ；
ＨＥＸ１７；
Ｖｃ２ＣＢＭ；および／または
Ｖｃ４ＣＢＭ；
を提供する。
ＲＳＶ感染症の処置および／または予防に使用するための薬剤の製造におけるＶｃ２ＣＢＭまたはＶｃ４ＣＢＭの使用がさらに提供される。
本開示はまた、ＲＳＶ感染症の処置および／または予防に使用するための薬剤の製造におけるＨＥＸ１７の使用も提供する。
【００３４】
本開示はまた、ＲＳＶを処置または予防する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の
ＨＥＸ１７；
Ｓｐ２ＣＢＭ；
Ｖｃ２ＣＢＭ；および／または
Ｖｃ４ＣＢＭ
を投与するステップを含む、方法に関する。
誤解を避けるために、ＨＥＸ１７は、上記のとおりの多価改変ＣＢＭである。Ｖｃ２ＣＢＭは、合わせて連結されたか、結びつけられたか、または結合された２つのＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ＮａｎＨシアリダーゼＣＢＭ単位を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。例となるＶｃ２ＣＢＭ配列は、以下を含んでも、それから本質的になっても、またはそれからなってもよい。
GAMALFDYNATGDTEFDSPAKQGWMQDNTNNGSGVLTNADGMPAWLVQGIGGRAQWTYSLSTNQHAQASSFGWRMTTEMKVLSGGMITNYYANGTQRVLPIISLDSSGNLVVEFEGQTGRTVLATGTAATEYHKFELVFLPGSNPSASFYFDGKLIRDNIQPTASKQNMIVWGNGSSNTDGVAAYRDIKFEIQGDALNGSMALFDYNATGDTEFDSPAKQGWMQDNTNNGSGVLTNADGMPAWLVQGIGGRAQWTYSLSTNQHAQASSFGWRMTTEMKVLSGGMITNYYANGTQRVLPIISLDSSGNLVVEFEGQTGRTVLATGTAATEYHKFELVFLPGSNPSASFYFDGKLIRDNIQPTASKQNMIVWGNGSSNTDGVAAYRDIKFEIQGD
【００３５】
Ｖｃ４ＣＢＭは、合わせて連結されたか、結びつけられたか、または結合された４つのＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ＮａｎＨシアリダーゼＣＢＭ単位を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。例となるＶｃ４ＣＢＭ配列は、以下の配列を含んでも、それから本質的になっても、またはそれからなってもよい。
GAMALFDYNATGDTEFDSPAKQGWMQDNTNNGSGVLTNADGMPAWLVQGIGGRAQWTYSLSTNQHAQASSFGWRMTTEMKVLSGGMITNYYANGTQRVLPIISLDSSGNLVVEFEGQTGRTVLATGTAATEYHKFELVFLPGSNPSASFYFDGKLIRDNIQPTASKQNMIVWGNGSSNTDGVAAYRDIKFEIQGDALNGSMALFDYNATGDTEFDSPAKQGWMQDNTNNGSGVLTNADGMPAWLVQGIGGRAQWTYSLSTNQHAQASSFGWRMTTEMKVLSGGMITNYYANGTQRVLPIISLDSSGNLVVEFEGQTGRTVLATGTAATEYHKFELVFLPGSNPSASFYFDGKLIRDNIQPTASKQNMIVWGNGSSNTDGVAAYRDIKFEIQGDLQALGMALFDYNATGDTEFDSPAKQGWMQDNTNNGSGVLTNADGMPAWLVQGIGGRAQWTYSLSTNQHAQASSFGWRMTTEMKVLSGGMITNYYANGTQRVLPIISLDSSGNLVVEFEGQTGRTVLATGTAATEYHKFELVFLPGSNPSASFYFDGKLIRDNIQPTASKQNMIVWGNGSSNTDGVAAYRDIKFEIQGDGGNSGMALFDYNATGDTEFDSPAKQGWMQDNTNNGSGVLTNADGMPAWLVQGIGGRAQWTYSLSTNQHAQASSFGWRMTTEMKVLSGGMITNYYANGTQRVLPIISLDSSGNLVVEFEGQTGRTVLATGTAATEYHKFELVFLPGSNPSASFYFDGKLIRDNIQPTASKQNMIVWGNGSSNTDGVAAYRDIKFEIQGD
【００３６】
Ｓｐ２ＣＢＭは、合わせて連結されたか、結びつけられたか、または結合された２つのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＮａｎＡシアリダーゼ単位を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。例となるＳｐ２ＣＢＭ配列は、２コピーの以下の配列を含んでも、それから本質的になっても、またはそれからなってもよい。
GSMVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDAKAPAFYNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKGRVRLYVNGVLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALTPEEVQKRS
２コピーの上記の配列は、本明細書に記載されているペプチドリンカー配列のいずれか１つを介して連結されてもよい。例えば、Ｓｐ２ＣＢＭ配列は、以下を含んでも、それから本質的になっても、またはそれからなってもよい。
GSMVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDAKAPAFYNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKGRVRLYVNGVLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALTPEEVQKRS[xxxxx][xxxxxxxxxx][xxxxxxxxxxxxxxx]GSMVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDAKAPAFYNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKGRVRLYVNGVLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALTPEEVQKRS
ここで、[xxxxx]、[xxxxxxxxxx]および[xxxxxxxxxxxxxxx]は、下で概略を述べるとおりのリンカーペプチド配列の選択肢を表す。両ＣＢＭ配列は、本明細書に記載されている５、１０または１５アミノ酸リンカー配列の１つによって連結されるであろう。
【００３７】
Ｖｃ２ＣＢＭおよびＶｃ４ＣＢＭは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのシアリダーゼをコードするｎａｎＨ遺伝子のファミリー４０シアル酸結合ドメイン（ＣＢＭ）に基づくタンデムリピート多価タンパク質として示される場合もある。Ｓｐ２ＣＢＭは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのシアリダーゼをコードするｎａｎＡ遺伝子のファミリー４０シアル酸結合ドメイン（ＣＢＭ）に基づくタンデムリピート多価タンパク質として示される場合もある。
（本明細書に記載の使用および方法のための）本開示の分子は、ＰＣＲベースのクローニング技術を使用して形成されてもよく、このタイプの多価分子の形成に適した方法は、例えば、Connaris et al, 2009 (Enhancing the Receptor Affinity of the Sialic Acid-Binding Domain of Vibrio cholerae Sialidase through Multivalency; J. Biol. Chem; Vol.284(11); pp 7339-7351)に記載されている。例えば、ＨＥＸ１７、Ｖｃ２ＣＢＭ、Ｖｃ４ＣＢＭおよびＳｐ２ＣＢＭのようなものを含む多価ＣＢＭ分子は、アミノ酸／ペプチドリンカーによって連結された複数のＣＢＭを含むコンストラクトとして作製されてもよい。それぞれのＣＢＭ（例えば、ＶｃＣＢＭ）は、例えば、５、１０または１５アミノ酸を含むペプチドによって別のものと連結されてもよい。例として任意の１つ以上の以下のペプチドが、２つ以上のＣＢＭを連結するために使用されて、多価ＣＢＭが生成されてもよい。
（ｉ）５アミノ酸リンカー：      ALXGS
LQALG
GGXSG
GGALG
GGGGS
（ｉｉ）１０アミノ酸リンカー：  ALXGSGGGSG
LQALGGGGSL
（ｉｉｉ）１５アミノ酸リンカー：ALXGSGGGSGGGGSG
ここで、「X」は、任意のアミノ酸である。
【００３８】
例となるＶｃ４ＣＢＭは、以下の形態をとってもよい。
【化１】
2021514987.tif 000003
【００３９】
この概略図は、以降、一般式１と呼ぶこととする。
したがって、Ｖｃ４ＣＢＭ分子は、上記の一般式１と一致してもよく、この場合、ペプチドリンカーＡ、Ｂおよび／またはＣは、上で（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）として提示されたリンカーの選択肢から選択される。「ＶｃＣＢＭ４０」という用語は、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ（ＮａｎＨシアリダーゼ）由来の完全なファミリー４０ＣＢＭだけでなく、それ由来のシアル酸結合フラグメントも含むことに留意すべきである。実際に、一般式１で示されるＶｃＣＢＭ単位のそれぞれは、
（ｉ）Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ＮａｎＨシアリダーゼＣＢＭ；および
（ｉｉ）そのＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ＮａｎＨシアリダーゼＣＢＭシアル酸結合フラグメント
からなる群から選択されてもよい。
【００４０】
したがって、一般式１で示される分子のＶｃＣＢＭ単位のそれぞれは、同じであっても、または異なってもよい。
さらに、本明細書に記載されているさまざまな使用、方法および薬剤が本明細書に記載されている１つ以上のシアル酸結合分子を利用してもよいことに留意すべきである。例えば、２つ以上の異なるシアル酸結合分子は、対象に、一緒、同時または別々に投与されてもよい。
本開示は、本明細書に記載のさまざまな使用、薬剤および方法に使用するための組成物を提供することができる。したがって、本明細書に記載されている任意のシアル酸結合分子が、使用のために製剤化されてもよい。例えば、シアル酸結合分子は、治療用または医薬組成物として製剤化されてもよい。さまざまな組成物は、本明細書に記載されている１つ以上のシアル酸結合分子を含んでもよく、任意の所与の処置は、これらの組成物の１つ以上の投与（一緒、同時または別々）が必要とされる場合もある。
【００４１】
本発明による医薬組成物、特に粘膜または鼻腔内投与用のそれらの製剤は、医薬品に通例使用される物質を含み、例えば、Remington’s The Sciences and Practice of Pharmacy, 22nd Edition (Pharmaceutical Press 2012)および／またはHandbook of Pharmaceutical Excipients, 7th edition (compiled by Rowe et al, Pharmaceutical Press, 2012)に記載されているとおりに従来どおり調製されてもよく、これらの文献および参考文献のすべての内容全体を参照により組み込んだものとする。
【００４２】
任意の適切な量のシアル酸結合分子（例えば、ＣＢＭ４０を含む、本明細書に記載されている任意のＣＢＭタイプの分子）が使用されてもよい。例えば、シアル酸結合分子を含む組成物（例えば、Ｓｐ２ＣＢＭまたはＶｃ２ＣＢＭＴＤなどのＣＢＭ）が静脈内投与されるか、または粘膜（例えば、鼻腔内）投与されるかのいずれにせよ、シアル酸結合分子の用量は、約０．１μｇ〜約１０００μｇの間のいずれかで含んでもよい。例えば、約（例えば、＋／−０．５μｇ）０．１μｇ、０．５μｇ、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、１１μｇ、１２μｇ、１３μｇ、１４μｇ、１５μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇまたは９５０μｇのシアル酸結合分子の用量が使用されてもよい。これらの量は、任意の適した体積の賦形剤、希釈剤またはバッファー中において提供されてもよい。例えば、シアル酸結合分子の量は、約１μｌ〜約５ｍｌの間のいずれかで賦形剤、希釈剤またはバッファー中において提供されてもよい。例えば、シアル酸結合分子の必要とされる量は、約５μｌ、１０μｌ、１５μｌ、２０μｌ、２５μｌ、３０μｌ、３５μｌ、４０μｌ、４５μｌ、５０μｌ、５５μｌ、６０μｌ、６５μｌ、７０μｌ、７５μｌ、８０μｌ、８５μｌ、９０μｌ、９５μｌ、１００μｌ、２００μｌ、３００μｌ、４００μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌまたは４ｍｌと組み合わされてもよい（または製剤化されてもよい）。１ｍｌ（賦形剤、希釈剤またはバッファー）当たり０．１〜１ｍｇ（シアル酸結合タンパク質）の濃度が最も有用な場合もある。
本発明は、以下のことを示す以下の図を参照して詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】多価ＣＢＭ型の構成単位およびそれらのシアル酸に対する親和性を示す図である。ａ、ＶｃＣＢＭ、球として描かれるα−２，３−シアリルラクトースを伴うＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ（ＰＤＢ：１ｗ０ｐ）の残基２５〜２１６。ｂ、ＳｐＣＢＭ、α−２，３−シアリルラクトース（ＰＤＢ：４ｃ１ｗ）を伴うＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＮａｎＡシアリダーゼの残基１２１〜３０５。ｃ、ＴＤ、三量体形成ドメイン、虹色のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａシュードアミニダーゼ（ＰＤＢ：２ｗ３８）の残基３３３〜４３８；単色のその他の２つの単量体。ｄ、多価型：それらの分子量、価数および２５℃における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって求められるα２，３−シアリルラクトースに対する結合親和性（ＶｃＣＢＭ、Ｖｃ２ＣＢＭおよびＶｃ３ＣＢＭに関するＫD値は、以前に報告されている7）。タンデムリピートＣＢＭ、およびＴＤと融合したオリゴマーＣＢＭは、５−アミノリンカーによって連結される。
【図２−１】ＲＳＶ感染哺乳動物細胞株におけるｍＣＢＭ４０の予防効果を示すグラフである。Ｈｅｐ２：ＮＰｒｏ細胞を、さまざまな量（０．１〜１００μｇ／ウェル）のＳｐ２ＣＢＭＴＤまたはＶｃ２ＣＢＭＴＤのいずれかとともにＲＳＶ（各ウェル当たり１．５×１０3ＰＦＵ）の添加前に１時間インキュベーションした。感染後２４ｈ、４８ｈ、７２ｈおよび９０ｈの時点で測定した、未処理の感染細胞と比較したＳｐ２ＣＢＭＴＤ（ａ〜ｄ）、およびＶｃ２ＣＢＭＴＤ（ｅ〜ｈ）処理細胞に関する感染細胞の吸光度示数を示す。バーは、６回の反復からの平均吸光度変化±ＳＤを示す。すべての値は、以下のとおりに示される統計結果とともに平均±ＳＤとして示す：*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、および****ｐ＜０．０００１。
【図２−２】ＲＳＶ感染哺乳動物細胞株におけるｍＣＢＭ４０の予防効果を示すグラフである。Ｈｅｐ２：ＮＰｒｏ細胞を、さまざまな量（０．１〜１００μｇ／ウェル）のＳｐ２ＣＢＭＴＤまたはＶｃ２ＣＢＭＴＤのいずれかとともにＲＳＶ（各ウェル当たり１．５×１０3ＰＦＵ）の添加前に１時間インキュベーションした。感染後２４ｈ、４８ｈ、７２ｈおよび９０ｈの時点で測定した、未処理の感染細胞と比較したＳｐ２ＣＢＭＴＤ（ａ〜ｄ）、およびＶｃ２ＣＢＭＴＤ（ｅ〜ｈ）処理細胞に関する感染細胞の吸光度示数を示す。バーは、６回の反復からの平均吸光度変化±ＳＤを示す。すべての値は、以下のとおりに示される統計結果とともに平均±ＳＤとして示す：*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、および****ｐ＜０．０００１。
【図２−３】ＲＳＶ感染哺乳動物細胞株におけるｍＣＢＭ４０の予防効果を示すグラフである。Ｈｅｐ２：ＮＰｒｏ細胞を、さまざまな量（０．１〜１００μｇ／ウェル）のＳｐ２ＣＢＭＴＤまたはＶｃ２ＣＢＭＴＤのいずれかとともにＲＳＶ（各ウェル当たり１．５×１０3ＰＦＵ）の添加前に１時間インキュベーションした。感染後２４ｈ、４８ｈ、７２ｈおよび９０ｈの時点で測定した、未処理の感染細胞と比較したＳｐ２ＣＢＭＴＤ（ａ〜ｄ）、およびＶｃ２ＣＢＭＴＤ（ｅ〜ｈ）処理細胞に関する感染細胞の吸光度示数を示す。バーは、６回の反復からの平均吸光度変化±ＳＤを示す。すべての値は、以下のとおりに示される統計結果とともに平均±ＳＤとして示す：*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、および****ｐ＜０．０００１。
【図２−４】ＲＳＶ感染哺乳動物細胞株におけるｍＣＢＭ４０の予防効果を示すグラフである。Ｈｅｐ２：ＮＰｒｏ細胞を、さまざまな量（０．１〜１００μｇ／ウェル）のＳｐ２ＣＢＭＴＤまたはＶｃ２ＣＢＭＴＤのいずれかとともにＲＳＶ（各ウェル当たり１．５×１０3ＰＦＵ）の添加前に１時間インキュベーションした。感染後２４ｈ、４８ｈ、７２ｈおよび９０ｈの時点で測定した、未処理の感染細胞と比較したＳｐ２ＣＢＭＴＤ（ａ〜ｄ）、およびＶｃ２ＣＢＭＴＤ（ｅ〜ｈ）処理細胞に関する感染細胞の吸光度示数を示す。バーは、６回の反復からの平均吸光度変化±ＳＤを示す。すべての値は、以下のとおりに示される統計結果とともに平均±ＳＤとして示す：*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、および****ｐ＜０．０００１。
【図３−１】ＲＳＶ感染哺乳動物細胞株におけるｍＣＢＭ４０の効果を示すグラフである。Ｈｅｐ２：ＮＰｒｏ細胞を、細胞に添加する前にＲＳＶ（各ウェル当たり１．５×１０3ＰＦＵ）を伴う、さまざまな量（０．１〜１００μｇ／ウェル）のＳｐ２ＣＢＭＴＤまたはＶｃ２ＣＢＭＴＤのいずれかとともにインキュベーションした。感染後２４ｈ、４８ｈ、７２ｈおよび９０ｈの時点で測定した、未処理の感染細胞と比較したＳｐ２ＣＢＭＴＤ（ａ〜ｄ）、およびＶｃ２ＣＢＭＴＤ（ｅ〜ｈ）処理細胞に関する感染細胞の吸光度示数を示す。バーは、６回の反復からの平均吸光度変化±ＳＤを示す。すべての値は、以下のとおりに示される統計結果とともに平均±ＳＤとして示す：*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、および****ｐ＜０．０００１。
【図３−２】ＲＳＶ感染哺乳動物細胞株におけるｍＣＢＭ４０の効果を示すグラフである。Ｈｅｐ２：ＮＰｒｏ細胞を、細胞に添加する前にＲＳＶ（各ウェル当たり１．５×１０3ＰＦＵ）を伴う、さまざまな量（０．１〜１００μｇ／ウェル）のＳｐ２ＣＢＭＴＤまたはＶｃ２ＣＢＭＴＤのいずれかとともにインキュベーションした。感染後２４ｈ、４８ｈ、７２ｈおよび９０ｈの時点で測定した、未処理の感染細胞と比較したＳｐ２ＣＢＭＴＤ（ａ〜ｄ）、およびＶｃ２ＣＢＭＴＤ（ｅ〜ｈ）処理細胞に関する感染細胞の吸光度示数を示す。バーは、６回の反復からの平均吸光度変化±ＳＤを示す。すべての値は、以下のとおりに示される統計結果とともに平均±ＳＤとして示す：*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、および****ｐ＜０．０００１。
【図３−３】ＲＳＶ感染哺乳動物細胞株におけるｍＣＢＭ４０の効果を示すグラフである。Ｈｅｐ２：ＮＰｒｏ細胞を、細胞に添加する前にＲＳＶ（各ウェル当たり１．５×１０3ＰＦＵ）を伴う、さまざまな量（０．１〜１００μｇ／ウェル）のＳｐ２ＣＢＭＴＤまたはＶｃ２ＣＢＭＴＤのいずれかとともにインキュベーションした。感染後２４ｈ、４８ｈ、７２ｈおよび９０ｈの時点で測定した、未処理の感染細胞と比較したＳｐ２ＣＢＭＴＤ（ａ〜ｄ）、およびＶｃ２ＣＢＭＴＤ（ｅ〜ｈ）処理細胞に関する感染細胞の吸光度示数を示す。バーは、６回の反復からの平均吸光度変化±ＳＤを示す。すべての値は、以下のとおりに示される統計結果とともに平均±ＳＤとして示す：*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、および****ｐ＜０．０００１。
【図３−４】ＲＳＶ感染哺乳動物細胞株におけるｍＣＢＭ４０の効果を示すグラフである。Ｈｅｐ２：ＮＰｒｏ細胞を、細胞に添加する前にＲＳＶ（各ウェル当たり１．５×１０3ＰＦＵ）を伴う、さまざまな量（０．１〜１００μｇ／ウェル）のＳｐ２ＣＢＭＴＤまたはＶｃ２ＣＢＭＴＤのいずれかとともにインキュベーションした。感染後２４ｈ、４８ｈ、７２ｈおよび９０ｈの時点で測定した、未処理の感染細胞と比較したＳｐ２ＣＢＭＴＤ（ａ〜ｄ）、およびＶｃ２ＣＢＭＴＤ（ｅ〜ｈ）処理細胞に関する感染細胞の吸光度示数を示す。バーは、６回の反復からの平均吸光度変化±ＳＤを示す。すべての値は、以下のとおりに示される統計結果とともに平均±ＳＤとして示す：*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、および****ｐ＜０．０００１。
【図４−１】ＲＳＶ感染哺乳動物細胞株におけるｍＣＢＭ４０の治療効果を示すグラフである。Ｈｅｐ２：ＮＰｒｏ細胞を、ＲＳＶ（各ウェル当たり１．５×１０3ＰＦＵ）とともにインキュベーションした後、感染後２４ｈ、４８ｈまたは７２ｈの時点にさまざまな量（０．１〜１００μｇ／ウェル）のＳｐ２ＣＢＭＴＤまたはＶｃ２ＣＢＭＴＤのいずれかを添加した。感染後９０ｈの時点で測定した、未処理の感染細胞と比較したＳｐ２ＣＢＭＴＤ（ａ〜ｃ）、およびＶｃ２ＣＢＭＴＤ（ｄ〜ｆ）処理細胞に関する感染細胞の吸光度示数を示す。バーは、６回の反復からの平均吸光度変化±ＳＤを示す。すべての値は、以下のとおりに示される統計結果とともに平均±ＳＤとして示す：*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、および****ｐ＜０．０００１。
【図４−２】ＲＳＶ感染哺乳動物細胞株におけるｍＣＢＭ４０の治療効果を示すグラフである。Ｈｅｐ２：ＮＰｒｏ細胞を、ＲＳＶ（各ウェル当たり１．５×１０3ＰＦＵ）とともにインキュベーションした後、感染後２４ｈ、４８ｈまたは７２ｈの時点にさまざまな量（０．１〜１００μｇ／ウェル）のＳｐ２ＣＢＭＴＤまたはＶｃ２ＣＢＭＴＤのいずれかを添加した。感染後９０ｈの時点で測定した、未処理の感染細胞と比較したＳｐ２ＣＢＭＴＤ（ａ〜ｃ）、およびＶｃ２ＣＢＭＴＤ（ｄ〜ｆ）処理細胞に関する感染細胞の吸光度示数を示す。バーは、６回の反復からの平均吸光度変化±ＳＤを示す。すべての値は、以下のとおりに示される統計結果とともに平均±ＳＤとして示す：*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、および****ｐ＜０．０００１。
【図４−３】ＲＳＶ感染哺乳動物細胞株におけるｍＣＢＭ４０の治療効果を示すグラフである。Ｈｅｐ２：ＮＰｒｏ細胞を、ＲＳＶ（各ウェル当たり１．５×１０3ＰＦＵ）とともにインキュベーションした後、感染後２４ｈ、４８ｈまたは７２ｈの時点にさまざまな量（０．１〜１００μｇ／ウェル）のＳｐ２ＣＢＭＴＤまたはＶｃ２ＣＢＭＴＤのいずれかを添加した。感染後９０ｈの時点で測定した、未処理の感染細胞と比較したＳｐ２ＣＢＭＴＤ（ａ〜ｃ）、およびＶｃ２ＣＢＭＴＤ（ｄ〜ｆ）処理細胞に関する感染細胞の吸光度示数を示す。バーは、６回の反復からの平均吸光度変化±ＳＤを示す。すべての値は、以下のとおりに示される統計結果とともに平均±ＳＤとして示す：*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、および****ｐ＜０．０００１。
【図４−４】ＲＳＶ感染哺乳動物細胞株におけるｍＣＢＭ４０の治療効果を示すグラフである。Ｈｅｐ２：ＮＰｒｏ細胞を、ＲＳＶ（各ウェル当たり１．５×１０3ＰＦＵ）とともにインキュベーションした後、感染後２４ｈ、４８ｈまたは７２ｈの時点にさまざまな量（０．１〜１００μｇ／ウェル）のＳｐ２ＣＢＭＴＤまたはＶｃ２ＣＢＭＴＤのいずれかを添加した。感染後９０ｈの時点で測定した、未処理の感染細胞と比較したＳｐ２ＣＢＭＴＤ（ａ〜ｃ）、およびＶｃ２ＣＢＭＴＤ（ｄ〜ｆ）処理細胞に関する感染細胞の吸光度示数を示す。バーは、６回の反復からの平均吸光度変化±ＳＤを示す。すべての値は、以下のとおりに示される統計結果とともに平均±ＳＤとして示す：*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、および****ｐ＜０．０００１。
【図５】抗原性ペプチドのＰｒｏＰｒｅｄ予測を示す図である。Ａ．ＳｐＣＢＭ配列。Ｂ．ＰａＴＤ配列。予測されるバインダーは青で色づけされ、それぞれの結合領域の最初の残基は赤で示されている。Ｎｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ（緑のバー）およびＰｒｏｉｍｍｕｎｅ（紫のバー）によって予測される抗原性ペプチドを配列の下に示す。
【図６】野生型および変異ドメインの発現試験を示す図である。レーン１、Ｍ１２標準物質；レーン２、ＷＴＳｐＣＢＭ；レーン３〜１１、Ｉｍ１５〜Ｉｍ２３；レーン１２〜１５、Ｉｍ２４〜Ｉｍ２７；レーン１６、ＷＴ  ＰａＴＤ。Ａ）全細胞抽出物、Ｂ）可溶性抽出物。
【図７】ＳｐＣＢＭ構造におけるペプチド１６７〜１８１の位置を示す図である。
【図８】バリアントＩｍ２８〜Ｉｍ３４の発現およびＮｉ−ＮＴＡプルダウンを示す図である。
【図９】六量体構造上のＨＥＸ１７変異の部位を示す図である。個々のＳｐＣＢＭ（ｐｄｂコード４ｃ１ｘ）およびＰａＴＤ（ｐｄｂコード２ｗ３８）の結晶構造を組み合わせて六量体（すなわち、１分子当たり６コピーのＳｐＣＢＭおよび３コピーのＰａＴＤ）を作ることによってＨＥＸ１７の四次構造のモデルを作った。結合したリガンド（α２，３−シアリルラクトース）の位置を棒状（オレンジ）に示している。変異の位置も以下のように示す：青、Ａ１６２Ｐ変異の部位；水色、他の２つのＣＢＭ変異の部位；マゼンダ、ＴＤ変異の部位。
【図１０】ＩＬ−８刺激を示すグラフである。１０μｇの生物学的製剤（Ｈｅｘ１７）の添加によってＡ５４９細胞を刺激した。２４または４８ｈの時点において細胞上清を採取し、ＩＬ−８含有量をＥＬＩＳＡによって求めた。対照と処理細胞との間の統計的有意性を、Ｔｕｋｅｙ多重比較検定を使用した一元配置分散分析法を用いて判断した。
【図１１Ａ】炎症性メディエーターの多重分析を示すグラフである。１０μｇの生物学的製剤（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（別名ＳｐＯｒｉｇ）、ＨＥＸ６またはＨＥＸ１７）の添加によってＡ５４９細胞を刺激した。６ｈ、２４または４８ｈの時点において細胞上清を採取し、ヒトＣｙｔｏｋｉｎｅ  １２−ｐｌｅｘアッセイを使用して炎症性メディエーターを分析した。対照および／またはＷＴ六量体と六量体バリアントとの間の統計的有意性を、一元配置分散分析法（Ｔｕｋｅｙ多重比較検定）を使用して判断した。
【図１１Ｂ】炎症性メディエーターの多重分析を示すグラフである。１０μｇの生物学的製剤（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（別名ＳｐＯｒｉｇ）、ＨＥＸ６またはＨＥＸ１７）の添加によってＡ５４９細胞を刺激した。６ｈ、２４または４８ｈの時点において細胞上清を採取し、ヒトＣｙｔｏｋｉｎｅ  １２−ｐｌｅｘアッセイを使用して炎症性メディエーターを分析した。対照および／またはＷＴ六量体と六量体バリアントとの間の統計的有意性を、一元配置分散分析法（Ｔｕｋｅｙ多重比較検定）を使用して判断した。
【図１１Ｃ】炎症性メディエーターの多重分析を示すグラフである。１０μｇの生物学的製剤（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（別名ＳｐＯｒｉｇ）、ＨＥＸ６またはＨＥＸ１７）の添加によってＡ５４９細胞を刺激した。６ｈ、２４または４８ｈの時点において細胞上清を採取し、ヒトＣｙｔｏｋｉｎｅ  １２−ｐｌｅｘアッセイを使用して炎症性メディエーターを分析した。対照および／またはＷＴ六量体と六量体バリアントとの間の統計的有意性を、一元配置分散分析法（Ｔｕｋｅｙ多重比較検定）を使用して判断した。
【図１１Ｄ】炎症性メディエーターの多重分析を示すグラフである。１０μｇの生物学的製剤（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（別名ＳｐＯｒｉｇ）、ＨＥＸ６またはＨＥＸ１７）の添加によってＡ５４９細胞を刺激した。６ｈ、２４または４８ｈの時点において細胞上清を採取し、ヒトＣｙｔｏｋｉｎｅ  １２−ｐｌｅｘアッセイを使用して炎症性メディエーターを分析した。対照および／またはＷＴ六量体と六量体バリアントとの間の統計的有意性を、一元配置分散分析法（Ｔｕｋｅｙ多重比較検定）を使用して判断した。
【図１１Ｅ】炎症性メディエーターの多重分析を示すグラフである。１０μｇの生物学的製剤（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（別名ＳｐＯｒｉｇ）、ＨＥＸ６またはＨＥＸ１７）の添加によってＡ５４９細胞を刺激した。６ｈ、２４または４８ｈの時点において細胞上清を採取し、ヒトＣｙｔｏｋｉｎｅ  １２−ｐｌｅｘアッセイを使用して炎症性メディエーターを分析した。対照および／またはＷＴ六量体と六量体バリアントとの間の統計的有意性を、一元配置分散分析法（Ｔｕｋｅｙ多重比較検定）を使用して判断した。
【図１１Ｆ】炎症性メディエーターの多重分析を示すグラフである。１０μｇの生物学的製剤（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（別名ＳｐＯｒｉｇ）、ＨＥＸ６またはＨＥＸ１７）の添加によってＡ５４９細胞を刺激した。６ｈ、２４または４８ｈの時点において細胞上清を採取し、ヒトＣｙｔｏｋｉｎｅ  １２−ｐｌｅｘアッセイを使用して炎症性メディエーターを分析した。対照および／またはＷＴ六量体と六量体バリアントとの間の統計的有意性を、一元配置分散分析法（Ｔｕｋｅｙ多重比較検定）を使用して判断した。
【図１２】インフルエンザ菌株ＰＲ８により致死的攻撃をした場合のＣＢＭ処置マウスおよび未処置マウスの生存パーセンテージを示すグラフである。ＣＢＭ２、ＣＢＭ３およびＣＢＭ４は、それぞれＨＥＸ１７、ＨＥＸ６およびＷＴ（ＳｐＯｒｉｇ）を表す。ＣＢＭを単回投与した動物には、ＰＲ８による致死的攻撃の１日前に１００μｇのＣＢＭを与え、反復投与された動物にはＰＲ８攻撃の３日および１日前に２×０．１μｇのＣＢＭを与えた。
【図１３】ＰＲ８感染中のＣＢＭ処置マウスおよび未処置マウスの臨床スコアを示すグラフである。ＣＢＭ２、ＣＢＭ３およびＣＢＭ４は、それぞれＨＥＸ１７、ＨＥＸ６およびＷＴ（ＳｐＯｒｉｇ）を表す。１〜５の上昇する臨床スコアは、それぞれ症状のない（１）から昏睡および死亡（５）を示す。
【図１４】ＰＲ８感染中のＣＢＭ処置マウスおよび未処置マウスの体重減少パーセンテージを示すグラフである。ＣＢＭ２、ＣＢＭ３およびＣＢＭ４は、それぞれＨｅｘ１７、Ｈｅｘ６およびＷＴ（ＳｐＯｒｉｇ）を表す。
【図１５】ＰＲ８攻撃マウス試験からの２１日目の肺ホモジネートおよび血清組織の抗ｍＣＢＭ抗体分析を示すグラフである。ＷＴ六量体と六量体バリアントとの間の統計的有意性を、一元配置分散分析法（Ｔｕｋｅｙ多重比較検定）を使用して判断した。
【図１６Ａ】Ｓｐ２ＣＢＭＴＤのＲＳＶとの相互作用を示すためのＥＬＩＳＡ結果のグラフである。
【図１６Ｂ】Ｖｃ２ＣＢＭＴＤのＲＳＶとの相互作用を示すためのＥＬＩＳＡ結果のグラフである。
【図１７Ａ】ＧＦＰ−Ｓｐ２ＣＢＭＴＤおよびＶｃ２ＣＢＭＴＤのＲＳＶとの結合を示すためのアッセイのイメージである。対照アッセイには使用されるＰＢＳ。
【図１７Ｂ】ＧＦＰ−Ｓｐ２ＣＢＭＴＤおよびＶｃ２ＣＢＭＴＤのＲＳＶとの結合を示すためのアッセイのイメージである。対照アッセイには使用されるＰＢＳ。
【図１７Ｃ】ＧＦＰ−Ｓｐ２ＣＢＭＴＤおよびＶｃ２ＣＢＭＴＤのＲＳＶとの結合を示すためのアッセイのイメージである。対照アッセイには使用されるＰＢＳ。
【図１８Ａ−１８Ｂ】Ｓｐ２ＣＢＭＴＤおよびＳｐ２ＣＢＭＴＤ−Ｒ２７４Ｑ（０．１μｇおよび１０ｎｇ）のＲＳＶとの間の相互作用を示すためのＥＬＩＳＡ結果のグラフである。
【図１９Ａ】Ｓｐ２ＣＢＭＴＤのノイラミニダーゼ処理したＲＳＶとの相互作用を示すためのＥＬＩＳＡ結果のグラフである。
【図１９Ｂ】Ｖｃ２ＣＢＭＴＤのノイラミニダーゼ処理したＲＳＶとの相互作用を示すためのＥＬＩＳＡ結果のグラフである。
【図２０Ａ】３’−ＳＬ処理したＳｐ２ＣＢＭＴＤとＲＳＶの間の相互作用を示すためのデータのグラフである。
【図２０Ｂ】３’−ＳＬ処理したＶｃ２ＣＢＭＴＤとＲＳＶの間の相互作用を示すためのデータのグラフである。
【図２１Ａ】ＣＢＭ（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ）によるＲＳＶからの哺乳動物細胞（Ｈｅｐ２：ＮＰｒｏ細胞）の保護が、細胞がノイラミニダーゼを使用して処理された後に低下することを示すデータのグラフである。
【図２１Ｂ】ＣＢＭ（Ｖｃ２ＣＢＭＴＤ）によるＲＳＶからの哺乳動物細胞（Ｈｅｐ２：ＮＰｒｏ細胞）の保護が、細胞がノイラミニダーゼを使用して処理された後に低下することを示すデータのグラフである。
【図２２】（パネルＡ〜Ｆ）：ＲＳＶ感染哺乳動物細胞株におけるｍＣＢＭ４０の効果を示すグラフである。Ｈｅｐ２：ＮＰｒｏ細胞を、細胞に添加する前にＲＳＶ（各ウェル当たり１．５×１０3ＰＦＵ）を伴う、さまざまな量（０．１〜１００μｇ／ウェル）のＶｃ４ＣＢＭまたはＨＥＸ１７のいずれかとともにインキュベーションした。感染後２４ｈ、４８ｈ、および７２ｈの時点で測定した、未処理の感染細胞と比較したＶｃ４ＣＢＭ（Ａ、ＣおよびＥ）、およびＨＥＸ１７（Ｂ、ＤおよびＦ）処理細胞に関する感染細胞の吸光度示数を示す。バーは、６回の反復からの平均吸光度変化±ＳＤを示す。すべての値は、以下のとおりに示される統計結果とともに平均±ＳＤとして示す：*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、および****ｐ＜０．０００１。
【図２３】ウイルスのみの感染細胞と比較した、感染後４８ｈの時点におけるＣＢＭ処理した感染ＭｕｃｉｌＡｉｒインサートのＲＳＶ−Ｂウイルスゲノムコピー数定量のグラフである。Ａ）Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ、Ｂ）Ｖｃ２ＣＢＭＴＤ。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
方法および結果
【実施例】
【００４５】
（実施例１）
ＣＢＭ４０タンパク質、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ、Ｖｃ２ＣＢＭＴＤおよびＶｃ４ＣＢＭ（エンドトキシンを含まない）をConnaris et al (2014)1に記載されているとおりに作製した。Ｈｅｘ１７を上記のとおり作製した。哺乳動物細胞株Ｈｅｐ２：ＮＰｒｏ（ＩＦＮに応答するだけで、ＩＦＮを産生しないＢＶＤＶ  Ｎ末端プロテアーゼフラグメント、Ｎｐｒｏを構成的に過剰発現するよう設計された細胞株）をＡＴＣＣ4から購入した。細胞を、Ｔ７５フラスコにおいて、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ（１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む）中に維持し、３７℃および５％ＣＯ2でインキュベーションした。ＲＳＶ−Ａ２株を、ＳＦ−ＤＭＥＭ中、１．５×１０4ＰＦＵ／ｍｌに対応する１０-2の希釈物に調製した。
感染試験のために、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中の１００μＬの細胞（２．５×１０5細胞／ウェル）を播き、細胞が８０〜９０％の培養密度に達するまで、３７℃および５％ＣＯ2で２４ｈインキュベーションした。ＣＢＭ４０タンパク質（１００μＬ、ＳＦ−ＤＭＥＭ中の１０ｍｇ／ｍｌ原液の１０倍段階希釈）は、ＲＳＶ（１００μＬ、各ウェル当たり１．５×１０3ＰＦＵ、ＳＦ−ＤＭＥＭ中）感染前に細胞に添加するか、細胞に添加する前にＲＳＶと氷上で１時間混合するか、またはＲＳＶ感染後に細胞に添加するかのいずれかとした。それぞれの場合において、ＣＢＭ４０および／またはＲＳＶを除去前に１時間そのまま置いた。その後、細胞を３００μＬのＡＶＩＣＥＬで覆い、プレートを３７℃および５％ＣＯ2で２４、４８、７２、または９０ｈのいずれかインキュベーションしたまま置いた。
【００４６】
感染後の細胞中のＲＳＶのレベルを求めるために、ＡＶＩＣＥＬを除去し、細胞をＰＢＳ中の１０％ＰＦＡで室温において１０分固定した後、マウス抗ＲＳＶ  Ｆ一次抗体（１：２００希釈、Ｓｅｒｏｔｅｃ）に続いてヤギ抗・マウスＨＲＰ  ＩｇＧ抗体（１：２０００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いて免疫染色した。ＲＳＶの存在を、発色基質ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）を使用して検出した。波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した（基準として使用される波長６２０ｎｍ）。
統計分析。一元配置分散分析法およびダネットの多重比較検定を使用して群比較を行った。すべての分析にＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用した。ｐ＜０．０５の検定を統計学的に有意と考えた。別に明記されない限り、すべての値は、以下のとおり示される統計結果とともに平均±ＳＤとして示す：*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、および****ｐ＜０．０００１。
概要
図２、３、４および２２に結果の概要を示す。
１．ｍＣＢＭ４０の単回投与は、Ｈｅｐ２：ＮＰｒｏ哺乳動物細胞株においてＲＳＶに先立って、またはそれと同時に与えられる場合、細胞とのＲＳＶの接着を低減または阻害するようであった。
２．ＲＳＶと同時に与えられる場合、最大０．１〜１ｍｇ／ｍｌ濃度のすべてのｍＣＢＭ４０が、細胞が感染後最大９０ｈ試験された場合、予防的な投薬と比較して、ＲＳＶ感染の低下に有意な効果を有したようであった。
３．ＲＳＶ感染の２４ｈ後のｍＣＢＭ４０の投与は、最高用量で与えられた場合にウイルス感染の低下を示した。最高用量のＶｃ２ＣＢＭＴＤは、ＲＳＶ投与後２４ｈ、４８ｈおよび７２ｈの時点で与えられた場合に、Ｈｅｐ２：ＮＰｒｏ哺乳動物細胞株中のＲＳＶレベルに有利な影響を及ぼすようであった。
４．試験したｍＣＢＭ４０のうち、Ｖｃ２ＣＢＭＴＤが哺乳動物細胞株におけるＲＳＶ感染に対して最も有効なようであった。
参考文献
2021514987.tif 000004
【００４７】
（実施例２）
Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ：免疫原性領域の予測
Ｎｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａインシリコスクリーニング
インシリコＴ細胞エピトープスクリーニングは、４つの顕著な免疫原性集団および２つの境界の免疫原性集団を特定した。
顕著：
ドメイン    残基範囲        配列
ＳｐＣＢＭ  ２４５〜２５４  GVLSRTSLRS
ＰａＴＤ    ３４０〜３４９  WFSVSSNSLY
ＰａＴＤ    ３５１〜３５９  LSHGLQRSP
ＰａＴＤ    ３９８〜４０６  GSLNIRLGT
境界：
ドメイン    残基範囲        配列
ＳｐＣＢＭ  １６７〜１７８  FYNLFSVSSATK
ＳｐＣＢＭ  ２３９〜２５１  VRLYVNGVLSRTS
【００４８】
ＰｒｏｉｍｍｕｎｅヒトドナーＴ細胞増殖アッセイ
Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ調査は、抗原性が高い２つの領域および抗原性が中程度の２つの領域を強調した。
抗原性が高い：
ドメイン    残基範囲        配列
ＳｐＣＢＭ  ２３６〜２５０  KGRVRLYVNGVLSRT
ＰａＴＤ    ３９２〜４０６  GAQVEVGSLNIRLGT
抗原性が中程度：
ドメイン    残基範囲        配列
ＳｐＣＢＭ  １６７〜１８１  FYNLFSVSSATKKDE
ＰａＴＤ    ３３８〜３５２  SDWFSVSSNSLYTLS
【００４９】
ＰｒｏＰｒｅｄインシリコ解析
さらなるインシリコツール、オンラインＰｒｏＰｒｅｄサーバ4も使用した。ＰｒｏＰｒｅｄサーバの結果を図５に示す。Ｎｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ／Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅエピトープの相対的な位置も強調され、３つの方法間で妥当な一致を示している。ＰｒｏＰｒｅｄは、上で挙げたエピトープに加えて、ＳｐＣＢＭドメインに別の１つの免疫原性エピトープを強く予測した。
ドメイン    残基範囲        配列
ＳｐＣＢＭ  ２８６〜２９４  IRNLTVYNR
個々のＣＢＭおよびＴＤドメインにある変異
免疫原性を低下させるであろう変異の設計を導くために、ＰｒｏＰｒｅｄを使用して、これらのペプチドの各残基をすべて代替残基に替える影響を試験した。アレルバインダー（ａｌｌｅｌｅ  ｂｉｎｄｅｒ）の予測される数を最も減少させたものが確認された。ＳｐＣＢＭおよびＴＤドメインの両方の結晶構造はわかっているため、タンパク質構造を明らかに妨害するであろう変異を導入する可能性を低下させるようこれらの変異のモデルも作った。
【００５０】
初めに、ＳｐＣＢＭに９つの単一の変異およびＰａＴＤに４つの単一の変異を導入し、それを以下に列挙する（「Ｉｍ」は、免疫原性変異体の略である）。
2021514987.tif 000005
注：Ｉｍ１〜Ｉｍ１４（示さず）は、Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅデータが利用可能になる前にコドン最適化されていないバックグラウンドに変異誘発によって導入された。
【００５１】
ＷＴおよび変異コンストラクトの合成
ＷＴ  ＳｐＣＢＭ、ＷＴ  ＰａＴＤおよびバリアントＩｍ１５〜Ｉｍ２７をコードする遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ発現のためにコドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔによって合成した。その遺伝子を、その後、６Ｈｉｓタグ付きタンパク質としての発現のために社内でｐＨＩＳＴＥＶベクターにクローン化した。
発現および生物物理学的キャラクタリゼーション
溶解性を評価するために最初の発現試験を実施した。結果は、すべてが発現したが、すべてが溶解性な訳ではなかったことを示している（図６）。注：溶解性（またはその欠如）が必ずしも有用性の予測因子ではない。当業者は、タンパク質を製造または生産するとき、特定のプロセスには、（封入体および同種のものから）容易に精製されるため、不溶性材料の使用が必要とされることを理解するであろう。下流のプロトコルは、その後、溶解性などの特徴を調節するためにタンパク質を再構築してもよい。
【００５２】
発現試験の結果は、以下のことを示している。
・Ｉｍ１６（L170A）は、不溶性であるか、または非常に難溶性である
・Ｉｍ２５（ＴＤ、S345D）は、不溶性である
・Ｉｍ１５（Y168W）およびＩｍ１７（L170T）は、低下した溶解性を有する
・Ｉｍ１８（V173G）およびＩｍ２２（I286A）は、わずかに低下している。
・残りは、可溶性発現を示す。
１３の可溶性タンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に続く６Ｈｉｓタグを除去するためのＴＥＶ消化、その後、リバースＩＭＡＣ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ＩＭＡＣ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。
精製された１０のドメイン（ＷＴＳｐ、Ｉｍ１９、Ｉｍ２０、Ｉｍ２１、Ｉｍ２２、Ｉｍ２３、ＷＴＴＤ、Ｉｍ２４、Ｉｍ２６およびＩｍ２７）は、以下によってさらに特徴づけられた。
（ｉ）融解温度（Ｔｍ）を測定するためのＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ
（ｉｉ）三次構造をＷＴと比較するための近紫外円二色性（ＣＤ）
（ｉｉｉ）溶液中のオリゴマー状態を調べるための動的光散乱（ＤＬＳ）
（ｉｖ）シアリルラクトースに対する結合親和性を測定するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
（ｖ）ＩＬ−８サイトカイン刺激の測定
【００５３】
その結果の概要を表１に示す。
【表１】
2021514987.tif 000006
表１．ＷＴドメインおよびそれらのバリアントの生物物理学的キャラクタリゼーションの定性的概要。色分けは、（緑’、オレンジおよび黄色を含む）緑から赤であり、ここでは、緑は、バリアントがその特定の特徴に関してそのＷＴ対応物とよく類似していることを示し、淡緑色（緑’）または黄色は、差の程度の増加を示す。赤またはオレンジは、顕著な差を示す。Ｎ／Ａ：タンパク質の溶解性／純度が不十分なため、これらのキャラクタリゼーションが実施されなかった。Ｎ／Ｄ：未決定。
【００５４】
Ｓｐペプチド１６７〜１８１：
Ｉｍ１５、Ｉｍ１６、Ｉｍ１７、Ｉｍ１８はすべて、不溶性または難溶性である（明記したとおり、これは、必ずしもタンパク質の有用性に影響を与える訳ではない）。これらは、「中程度に」抗原性の領域１６７〜１８１（FYNLFSVSSATKKDE）にある。この領域は、明らかに変化に非常に影響されやすい。
前の結果は、L170（およびI286）に隣接したM156FがＴｍを約４℃上昇させることを示している。
【００５５】
したがって、これはL170Tと組み合わせることができるであろう。M156Fは、予測される免疫原性を増加させない。
M185Iは、Ｔｍを５℃上昇させ、L170に平行する（図７）。この変異も含むことができるであろう。なお、M156Fのように、M185Iは予測される免疫原性を増加させないが、予測されるアレルバインダーの数をわずかに減少させる。
Ｓｐペプチド２３６〜２５０：
Ｉｍ１９、Ｉｍ２０、Ｉｍ２１はすべて、ＷＴと同様に挙動した。これらは、「高度に」抗原性の領域２３６〜２５０（KGRVRLYVNGVLSRT）にある。
トレオニン変異（Ｉｍ２０、V239T）よりもＩｍ１９（V239A）を選択した。予測される免疫原性に差はないが、Ｉｍ１９は、ＷＴ  Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ  Ｔｍおよび近紫外スペクトルとより一致している。これは、Ｉｍ２１（V246G）と組み合わされるであろう。
【００５６】
Ｓｐペプチド２８６〜２９４：
Ｉｍ２２（I286A）は、ＷＴと大まかに類似しているが、Ｉｍ２３（Y292E）は、低いリガンド親和性を示すようである。この領域、２８６〜２９４IRNLTVYNRは、Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅによってはフラグが立たなかったが、ＰｒｏＰｒｅｄによっては免疫原性であると強く予測されている。
Ｉｍ２２がＷＴよりも低いＴｍを有するいくつかの指標がある。この残基は、M156に隣接しているため、M156Fが含まれた場合、異なるように挙動する可能性がある。
ＴＤペプチド３３８〜３５２：
Ｉｍ２４（S342D）およびＩｍ２６（L348D）は、ＷＴ三量体形成ドメインと類似の特徴を示すが、Ｉｍ２６のＴｍの低下がいくらか示唆される。これらは、「中程度に」抗原性の領域３３８〜３５２SDWFSVSSNSLYTLSにある。ＷＴ配列は、９つのアレルと結合することが予測されたが、Ｉｍ２４は、２つのアレルを予測し、Ｉｍ２４／Ｉｍ２６二重変異体は、１つのアレルを予測する。
ＴＤペプチド３９２〜４０６：
Ｉｍ２７（R403K）は、ＷＴと類似している。これは、「高度に」抗原性の領域３９２〜４０６GAQVEVGSLNIRLGTの一部である。この変異が導入されると、予測されるアレルは、２１から３に減少する。
【００５７】
複数の変異の組み合わせＩｍ２８〜３４の合成
以下の変異を導入した。
ｉ）M156F/L170T
ｉｉ）M156F/L170T/M185I：ＰｒｏＰｒｅｄにおいて、この領域に関して予測されるアレルは、ＷＴの３１からこの組み合わせの１９に減少している。
ｉｉｉ）V239A/V246G：ＰｒｏＰｒｅｄにおいて、この領域に関するアレルは、４４から３に減少している。
ｉｖ）I286A/Y292E：ＰｒｏＰｒｅｄにおいて、アレルは、４１から１に減少している。
ｖ）V239A/V246G/I286A/Y292Eは、先行する前の二重のものを組み合わせている。
ｖｉ）M156F/L170T/M185I/V239A/V246G/I286A/Y292Eは、すべてのＳｐ変異を組み合わせている
ｖｉｉ）ＴＤ：S342D/L348D/R403K：予測されるアレルは、ＴＤペプチド３３８〜３５２に関しては９から１に減少しており、ペプチドＴＤペプチド３９２〜４０６に関するアレルは、２１から３に減少している。この三重変異体は、すべてのＴＤ変異体を組み合わせている。これらはすべて、表面に露出し、ＴＤのＮ末端の遠位にあるため、六量体型のＳｐＣＢＭを妨げないことが予想されるであろう。
【００５８】
コンストラクトは、Ｉｍ２８〜Ｉｍ３４と呼ぶ。
（ＳｐＣＢＭ）バリアント  変異
Im28                    M156F/L170T
Im29                    M156F/L170T/M185I
Im30                    V239A/V246G
Im31                    I286A/Y292E
Im32                    V239A/V246G/I286A/Y292E
Im33                    M156F/L170T/M185I/V239A/V246G/I286A/Y292E
（ＰａＴＤ）バリアント    変異
Im34                    S342D/L348D/R403K
【００５９】
２．５  Ｉｍ２８〜Ｉｍ３４の発現および生物物理学的キャラクタリゼーション
単一の変異と同様に、組み合わせＩｍ２８〜Ｉｍ３４をＧｅｎｅＡｒｔによって合成し、発現解析のためにｐＨＩＳＴＥＶにサブクローニングした。Ｈｉｓタグ付き可溶性抽出物に対するニッケルビーズプルダウンも実施した（図８）。
六量体型
六量体コンストラクトＨＥＸ１〜ＨＥＸ１７の設計
六量体型（ＨＥＸ１〜ＨＥＸ１７と呼ぶ）をコードする遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔによって合成した。
Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ
2021514987.tif 000007
【００６０】
タンデム型ＣＢＭコピーの反復配列を合成することに関連する問題を回避するために六量体型を２つの部分で合成した。第１の遺伝子は、第１のＣＢＭを含み、第２の部分は、第２のＣＢＭプラスＴＤを包含した。これらは、その後、同時にｐＨＩＳＴＥＶにクローン化して、発現時に三量体を形成するＳｐ２ＣＢＭＴＤコンストラクトを作り出すことができた。
第１の六量体、ＨＥＸ１は、ＣＢＭに変異L170T/V239A/V246G/I286A/Y292EおよびＴＤにS342D/L348D/R403Kを含んでいた。
個々のドメインの溶解性データは、ＨＥＸ１が可溶性ではなさそうであったことを示した（繰り返すが、必ずしも分子の有用性を反映する訳ではない）。さらなるコンストラクト、ＨＥＸ３を合成した。なおＨＥＸ２には、ＨＥＸ３と同じ変異が含まれたが、Y292Eが追加された。
【００６１】
ＨＥＸ３を合成し、ｐＨＩＳＴＥＶベクターにサブクローニングした。発現は、すべての試験条件（変動する温度、ＩＰＴＧ濃度、誘導時の細胞密度、熱ショックあり、またはなし）下において不溶性であった。同じ３つの変異（V239A  V246G  I286A）を含むＣＢＭのみのドメインは、可溶性である。二重変異体（V239A  V246G）は、ＷＴと極めて類似して挙動する。よって、I286Aを含まず、一方または両方のいずれかのＴＤ変異を含むさらなるバリアント（ＨＥＸ４、ＨＥＸ５およびＨＥＸ６）を設計し、ＰＣＲ／ライゲーションによって構築した。
ＨＥＸ６に対する研究の間、ＨＥＸ６変異の異なる組み合わせを含むいくつかの他のバージョンを設計した（ＨＥＸ７〜ＨＥＸ１６の番号を付けた；特徴づけされていない）。
ＨＥＸ１７は、追加のA162P変異とともにＨＥＸ６変異を含む。このプロリン変異は、単一のＣＢＭ  Ｔｍを３〜４℃上昇させることが示された。プロリン変異は、他の変異、ＮもしくはＣ末端またはリガンド結合部位に近くない。
【００６２】
六量体バリアントのキャラクタリゼーション
発現、精製およびキャラクタリゼーションの結果を表２に示す。これらの結果に基づいて、ＨＥＸ６およびＨＥＸ１７を前に進めた。六量体上のＨＥＸ１７変異の位置を図９に示す。
【表２】
2021514987.tif 000008
表２．六量体Ｓｐ２ＣＢＭＴＤバリアントの生物物理学的キャラクタリゼーションの定性的概要。色分けは、緑から赤であり、ここでは、緑は、バリアントがその特定の特徴に関してそのＷＴ対応物とよく類似していることを示し、淡緑色（緑’）または黄色は、差の程度の増加を示す。赤またはオレンジは、顕著な差を示す。Ｎ／Ａ：タンパク質の溶解性／純度が不十分なため、これらのキャラクタリゼーションが実施されなかった。Ｎ／Ｄ：未決定。
【００６３】
（実施例３）
炎症性メディエーター。
目的：経時的に炎症性メディエーターのレベルを分析することによってｍＣＢＭ処理ヒト肺上皮細胞（Ａ５４９）の自然免疫応答を評価すること。
Ｓｐ２ＣＢＭＴＤの哺乳動物細胞への投与は、インビトロおよびインビボの両方において炎症促進応答を刺激した1、2。これが改変六量体シアル酸結合分子を用いても依然として観察されるかどうかを判断するために、１０μｇの生物学的製剤（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（別名ＳｐＯｒｉｇ）、ＨＥＸ６（すなわち、３×ＨＥＸ６単位を含むシアル酸結合分子）またはＨＥＸ１７（すなわち、３×ＨＥＸ１７単位を含むシアル酸結合分子）の添加によって哺乳動物Ａ５４９細胞を刺激し、投与後の特定の時点に細胞培養培地を採取した。炎症性メディエーターの濃度をＥＬＩＳＡおよび多重アッセイの両方によって測定した。
【００６４】
ヒト１×Ｍｏｕｓｅ  ＣＸＣＬ１／ＫＣ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を使用したヒトＩＬ−８（試験のための基準サイトカイン）応答。刺激したＡ５４９細胞からのＩＬ−８の濃度レベルを図１０に示す。Ａ５４９細胞が改変六量体ＨＥＸ１７により刺激されると、ＩＬ−８レベルがＳｐ２ＣＢＭＴＤ（別名ＳｐＯｒｉｇ）刺激細胞と比較した場合よりも有意に低いことが明らかである。
ヒトＣｙｔｏｋｉｎｅ  １２−ｐｌｅｘアッセイ（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｐｒｏ（商標）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用した炎症性メディエーター応答。図１１は、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（ＷＴ、別名ＳｐＯｒｉｇ）、ＨＥＸ６およびＨＥＸ１７（バリアント）によるＡ５４９細胞刺激後の特定の時点（６ｈ、２４ｈ、４８ｈ）における培養培地からの１２の炎症性メディエーターの分析を示す。分析に先立って、サンプルを解凍し、ヒトＨＳ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−１２  ｐｌｅｘアッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する前にＰＢＳ中で１：４に希釈した。このデータは、以下のことを示している。
・ＨＥＸ１７は、ＳｐＯｒｉｇおよびＨＥＸ６と比較して、試験したほぼすべてのサイトカインのレベルに影響を及ぼしている。ＳｐＯｒｉｇおよびＨＥＸ６と比較した場合に、４８ｈの時点で分析物ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−ガンマの観察された濃度（ｐｇ／ｍｌ）が有意に低下している。
・４８ｈの時点の対照と比較した場合、ＨＥＸ１７は、ＩＬ−５、およびＶＥＧＦ（まだ確認されていない）を除く試験したすべてのサイトカインのレベルを増加させたようである。
・ＨＥＸ６は、４８ｈの時点においてＳｐＯｒｉｇと比較してＩＬ−６刺激の低下のみを示した。
【００６５】
（実施例４）
インビボにおけるＰＲ８マウスデータ。
試験の目的は、致死性インフルエンザ感染症のマウスモデルにおいてＳｐ２ＣＢＭＴＤ（ＳｐＯｒｉｇ）およびそのバリアントの効力を評価することであった。単独で病的状態または大量死を引き起こすかどうかを評価するために各候補タンパク質をインフルエンザ感染症でない状態でも投与した。
生存、臨床スコアおよび体重減少。
この結果は、ＣＢＭ２（ＨＥＸ１７）、ＣＢＭ３（ＨＥＸ６）またはＣＢＭ４（ＷＴ、ＳｐＯｒｉｇ）のいずれも、単独でいかなる明白な病的状態または大量死も引き起こさなかったことを示している。ＰＲ８インフルエンザウイルスによる致死的攻撃の１日前のＣＢＭ２（ＨＥＸ１７）、ＣＢＭ３（ＨＥＸ６）およびＣＢＭ４（ＷＴ、ＳｐＯｒｉｇ）のいずれかの単回の１００μｇ用量の投与がＰＲ８感染から保護し、最大の効力はＨＥＸ１７（１００％生存）で見られ、続いて、ＳｐＯｒｉｇ、次にＨＥＸ６であった（図１２）。臨床スコアも、ＳｐＯｒｉｇおよびＨＥＸ６と比較してＨＥＸ１７で低かった（図１３）。生き延びた単回高用量処置群のマウスはすべて、ピーク感染時に体重が減少したが、未処置の感染マウスとは対照的にすぐに回復した（図１４）。
【００６６】
ＰＲ８攻撃マウス試験からの肺ホモジネートおよび血清組織の抗ｍＣＢＭ抗体分析。
この試験の目的は、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（ＳｐＯｒｉｇ）の改変されたバリアントの改変された免疫原性エピトープがＰＲ８攻撃試験のマウスにおいて抗体レベルの低下を示せるかどうかを判定することであった（エピトープは、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合情報に基づいて改変されたことに留意すべきである）。これに関して、ＰＲ８攻撃試験から生き延びたマウスを２１日目に選別し、肺および血清を採取し、ＥＬＩＳＡ方式で被覆抗原ＳｐＯｒｉｇ（１μｇ／ウェル）に対する抗ｍＣＢＭ抗体、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＭに関して試験した。図１５に示したデータは、以下のことを示した。
・改変タンパク質ＨＥＸ１７は、ＳＰＯＲＩＧと比較してマウス肺ＩｇＭレベルの有意な（ｐ＜０．０５）低下を示した。ＨＥＸ６処置については生き残っているマウスが１匹のみのため、ＨＥＸ１７およびＳｐＯｒｉｇのデータのみを統計分析した。
・ＳｐＯｒｉｇと比較して改変ＣＢＭで処置したマウスにおいて抗体レベルのわずかな低下傾向（肺ＩｇＡおよびＩｇＭ）のいくつかの指標がある。
【００６７】
（実施例５）
以下の実験の目的は、無細胞系においてＣＢＭ（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤおよびＶｃ２ＣＢＭＴＤ）とヒトＲＳＶの間に直接的な相互作用があるかどうかを判断することである。ＥＬＩＳＡ実験を以下のとおり設計した。
実験１
９６ウェルプレートを、さまざまな濃度のＲＳＶ（株タイプＡ２）、ＣＢＭ、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤおよびＶｃ２ＣＢＭＴＤならびにＰＢＳ（ビヒクル、陰性対照）で４℃において一晩プレコートした。ウェルをブロッキングバッファー（ＢＢ、１％ｗ／ｖ  ＢＳＡを含むＰＢＳ）でブロッキングした。さまざまな濃度のＣＢＭをＢＢ中で希釈し、その後、コーティング抗原を除去し、プレートを吸い取った後のウェルに添加した。そのプレートを、室温で１ｈインキュベーションしたまま置いた。その後、ウェルを洗浄バッファー（ＷＢ、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を加えたＰＢＳ）で洗浄した後、一次抗体（ウサギ抗ＳｐＣＢＭ抗体またはウサギ抗ＶｃＣＢＭ抗体、ＢＢ中で１：５０００希釈、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）を添加し、室温で１〜２ｈインキュベーションしたまま置いた。ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（ＢＢ中で１：２５００希釈、Ｓｉｇｍａ）を二次抗体として使用し、基質にＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）を使用した。ＲＳＶとのＣＢＭの結合は、ＴＭＢ（ＨＲＰに対する基質）との反応後の処理ウェル対未処理対照ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度（バックグラウンド基準として６２０ｎｍ）を比較することによって判定した。
この結果は、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤおよびＶｃ２ＣＢＭＴＤがともにＲＳＶと用量依存的な様式で直接的に相互作用することを示している（図１６ＡおよびＢを参照）。
【００６８】
実験２
９６ウェルプレートを、コーティング抗原として１０μｇのＧＦＰ−Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ、ＧＦＰ−Ｖｃ２ＣＢＭＴＤ、ＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ−R274Q（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤのシアル酸結合変異体）または３２０００ＰＦＵ  ＲＳＶのいずれかおよびＰＢＳ（ビヒクル、陰性対照）でプレコートした。ウェルを関連タンパク質とともに室温で１ｈインキュベーションした。ＧＦＰ蛍光結合のイメージを、１０倍の対物レンズを備えた顕微鏡（ＥＶＯＳ  ＦＬ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ＳｙｓｔｅｍのＧＦＰチャネルにおいて）を使用して記録した。
この結果は、ＧＦＰ−Ｓｐ２ＣＢＭＴＤおよびＧＦＰ−Ｖｃ２ＣＢＭＴＤがともにＲＳＶと直接結合することができることを示している。ＲＳＶとのごくわずかな結合がシアル酸結合変異体ＧＦＰ−Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ−R274Qで観察された（図１７Ａ〜Ｅを参照）
【００６９】
（実施例６）
以下の実験の目的は、ＣＢＭ（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤおよびＶｃ２ＣＢＭＴＤ）とＲＳＶの間の相互作用がシアル酸で終わるウイルス表面糖タンパク質とＣＢＭの結合に基づくという所見を裏付けることである。したがって、３つのＥＬＩＳＡ実験を設計した。
実験１
野生型Ｓｐ２ＣＢＭＴＤおよび変異Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ−R274Q（シアル酸結合変異体）の両方を実施例５の実験１に記載されているＥＬＩＳＡの形式で使用した。この結果は、野生型Ｓｐ２ＣＢＭＴＤが同じ濃度の変異Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ−R274Qと比較してはるかに高い親和性でＲＳＶと結合することを示している（図１８ＡおよびＢを参照）。
【００７０】
実験２
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（Ｓｉｇｍａ）のノイラミニダーゼ（Ｎｕ）は、細胞表面シアル化複合糖質から末端のシアル酸を切断することができるグリコシダーゼであり、α−２，３、α−２，６、α−２，８結合Ｇａｌ、ＧｌｃＮａｃ、ＧａｌＮＡｃ、ＡｃＮｅｕ、ＧｌｃＮｅｕ、オリゴ糖、糖脂質または糖タンパク質に対して結合特異性を有する。これがウイルス表面糖タンパク質に対して当てはまるかどうかを試験するために、ＣＢＭの添加に先立ってノイラミニダーゼを用いておよび用いずにＲＳＶを処理した。実施例５の実験１と同様のＥＬＩＳＡ実験を計画した。９６ウェルプレートを、さまざまな濃度のＲＳＶ、ＣＢＭ（陽性対照として）およびＰＢＳ（陰性対照として）でプレコートした。一部のＲＳＶコーティングウェルに対しては、ノイラミニダーゼ（３０ｍＵ／ウェル）を１ｈ添加し、続いてＣＢＭ（１００ｎｇまたは１０ｎｇ）を添加した。ＣＢＭの結合は、計画１に記載されているとおり抗ＣＢＭ抗体に続いて検出抗ＩｇＧ・ＨＲＰを使用して評価した。
この結果は、ノイラミニダーゼ処理をしていない場合、前に観察されたとおり、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤおよびＶｃ２ＣＢＭＴＤがともにＲＳＶと用量依存的な様式で相互作用することを示す（下、および実施例５の実験１）。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤの存在下においてＲＳＶをノイラミニダーゼ処理した後、相互作用は、ある程度消失するが、相互作用パートナーとしてＶｃ２ＣＢＭＴＤを使用した場合ほぼ完全に消失する（図１９ＡおよびＢを参照）。
このデータは、ＲＳＶ表面糖タンパク質がシアル化されていることのエビデンスを示し、このことは、ＲＳＶ感染においてＣＢＭが直接抗ウイルスの役割を果たす可能性を示唆する。
【００７１】
実験３：
競合リガンドがＣＢＭのシアル酸結合部位をブロックし、ＲＳＶとのＣＢＭの相互作用を妨げる可能性があるかどうかを判断するために、ＣＢＭ（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤおよびＶｃ２ＣＢＭＴＤ、１００ｎｇ／ウェル）を、異なる濃度のα２，３シアリルラクトース（３’−ＳＬ、１０ｍＭ、１００ｍＭ、Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ）とともに室温で１ｈプレインキュベーションした。この混合物を、対照（ＰＢＳ、ＣＢＭのみ）とともにＲＳＶ（３２０００ＰＦＵ／ウェル）でコーティングした９６ウェルプレートに添加した。ＣＢＭを、実施例５のとおりのＥＬＩＳＡ実験のとおりにウェルに添加した。この試験における反復回数はｎ＝３とした、未処理データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して一元配置分散分析法によって分析した。＜０．０５のｐ値を統計学的に有意と考慮した（*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１；****ｐ＜０．０００１）。
この結果は、競合シアロシド、３’−ＳＬがＲＳＶとＳｐ２ＣＢＭＴＤおよびＶｃ２ＣＢＭＴＤの間の相互作用を用量依存的な様式で低下させることが可能であることを示している（図２０ＡおよびＢを参照）。
【００７２】
（実施例７）
ＣＢＭ（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤおよびＶｃ２ＣＢＭＴＤ）によるＲＳＶからの哺乳動物Ｈｅｐ２：ＮＰｒｏ細胞の保護が、細胞がノイラミニダーゼを使用して処理された後に低下することを実証するためにインビトロ試験に着手した。
この実験は、９６ウェルプレートに接着したＨｅｐ２：ＮＰｒｏ細胞を、ノイラミニダーゼを伴いまたは伴わすに３７℃、５％ＣＯ2で１ｈ、続いてＣＢＭ（１００μｇ／ウェル）とともにさらに１ｈ、最後に、ＲＳＶ（３０００ＰＦＵ／ウェル）を添加して１ｈインキュベーションすることによって設計した。その後、プレートをＡＶＩＣＥＬ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ）培地で覆い、３７℃、５％ＣＯ2で９６ｈインキュベーションしたまま置いた。ＲＳＶ感染細胞を、マウス抗ＲＳＶ  Ｆ抗体（１：２００希釈、ＭＣＡ４９０、ＢｉｏＲａｄ）、続いて抗マウスＩｇＧ・ＨＲＰ二次抗体（１：２０００希釈、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して細胞に感染したＲＳＶの量を評価することによって判定した。ＲＳＶ感染性の阻害は、ＴＭＢ（ＨＲＰに対する基質）との反応後のノイラミニダーゼ処理ウェル対未処理対照ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度（バックグラウンド基準として６２０ｎｍ）を比較することによって判断した。反復ｎ＝４、未処理データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して一元配置分散分析法によって分析した。＜０．０５のｐ値を統計学的に有意と考慮した（*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１；****ｐ＜０．０００１）。
【００７３】
ＲＳＶのみの対照に対する、この結果は、ノイラミニダーゼ処理細胞と未処理細胞の間にいかなる感染性の差も示していない（グラフの最初の２つのバー）。しかしながら、細胞のノイラミニダーゼ処理後の両ＣＢＭからの細胞の保護は、低下している（グラフの４番目のバー）が、初めにＣＢＭ、続いてＲＳＶにより処理した細胞と同じ程度までではなく、これは、Ｖｃ２ＣＢＭＴＤでより明白である。このデータは、ＣＢＭも細胞表面シアル酸を標的とすることによってＲＳＶから細胞を保護することを示唆する（図２１ＡおよびＢを参照）。
【００７４】
（実施例８）
ヒト呼吸器上皮のインビトロ３Ｄモデルを使用したＲＳＶ−Ｂ感染に対する操作された炭水化物結合モジュールタンパク質（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤおよびＶｃ２ＣＢＭＴＤ）の有用性。
この試験の目的は、ヒト呼吸器上皮の３ＤモデルにおけるＲＳＶ複製時のｍＣＢＭ４０、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤおよびＶｃ２ＣＢＭＴＤの効果を評価することである。このアッセイは、鼻、気管または気管支の生検試料から新たに単離された初代ヒト上皮細胞で構成されるヒト気道上皮の完全に分化した、すぐに使える３ＤモデルであるＭｕｃｉｌＡｉｒ（商標）（Ｅｐｉｔｈｅｌｉｘ）を使用して実施した。感染試験のために、ＲＳＶ−Ｂ株（１０6ゲノムコピー／ｍｌ  ＲＳＶ、Ｇｅｎｅｖａ臨床株、２０１７）を使用し、０日目に（ＰＢＳにより）予め洗浄したＭｕｃｉｌＡｉｒインサートの頂端側につけた。ｍＣＢＭ処理（ｎ＝３）については、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤおよびＶｃ２ＣＢＭＴＤ（１０μｇまたは１００μｇ用量）は、ウイルス感染の１時間前の単回投与として、またはｂ）ウイルス感染の１日および１時間前の反復投与としてのいずれかで頂端につけた。両処理計画では、感染後（ｐ．ｉ）３．５ｈの時点でｍＣＢＭにさらに曝露した。未処理の感染ＭｕｃｉｌＡｉｒ（ｎ＝２）を対照として使用した。感染後３．５ｈの時点、その後、感染後２４、４８および９６ｈの時点で頂端洗浄液（２００μＬ）を採取した。
【００７５】
ウイルスゲノムコピー数は、ＱＩＡａｍｐＲ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用したウイルスＲＮＡ抽出のために２０μＬの頂端洗浄液を使用して求めた。ウイルスＲＮＡは、５μＬのウイルスＲＮＡおよび２つのＲＳＶ−Ｂ特異的プライマーを使用したＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して定量した。測定値のデータを希釈係数に対して補正し、１ｍｌ当たりのゲノムコピー数として示した。Ｐｒｉｓｍ  ６．０  ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して統計分析を実施した。２セットのデータを比較するために独立スチューデントｔ検定を使用した、この場合、*ｐ＜０．０５である。
【００７６】
概要
Ｓｐ２ＣＢＭＴＤおよびＶｃ２ＣＢＭＴＤはともに、ＲＳＶ感染したヒト気道上皮細胞の頂端のウイルス量を減少させることが示された。減少の程度は、ｍＣＢＭのタイプおよび投与される用量の数により左右された。感染したＭｕｃｉｌＡｉｒインサートをＳｐ２ＣＢＭＴＤに曝露しても、データのばらつきのためウイルス複製に対して有意な効果は示されなかったが、ウイルス感染対照と比較して、最高用量（１００μｇ）の感染後４８ｈの時点の２用量後（図２３Ａを参照）、および感染後９６ｈの時点の３用量後にわずかな減少が観察された。１０μｇの投与計画を使用するよりもＶｃ２ＣＢＭＴＤ（１００μｇ）への曝露が、両投与計画ともＲＳＶウイルス複製を低減するのにより有効であった。統計学的に有意ではないが、感染後４８ｈの時点におけるウイルス量の減少は、１ｌｏｇよりも大きな減少が観察された（図２３Ｂ）。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ−１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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