(57)【要約】  本明細書では、アミノ酸配列ＧｎＳＧｍＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号２）を含む融合ポリペプチドが報告されており、ここで、Ｘ１は、セリン、トレオニンおよびプロリンを除く、任意のアミノ酸残基であることができ、Ｘ２およびＸ３は、互いに独立して任意のアミノ酸残基であることができ、ｎ＝１、２、３または４であり、かつｍ＝３、４または５である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のポリペプチドドメイン、ペプチドリンカー、および第２のポリペプチドドメインを含む線状融合ポリペプチドであって、
前記第１のポリペプチドドメインのＣ末端が、ペプチド結合を介して前記ペプチドリンカーのＮ末端に共役しており、前記ペプチドリンカーのＣ末端が、ペプチド結合を介して前記第２のポリペプチドドメインのＮ末端に共役しており、
前記ペプチドリンカーが、Ｃ末端セリンアミノ酸残基のないＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーであり、
前記第２のポリペプチドドメインが、そのＮ末端に、セリン、トレオニン、またはプロリンを除く任意のアミノ酸残基を含み、
前記第１または前記第２のポリペプチドドメインが、抗体Ｆｃ領域ポリペプチドであり、それぞれの他のポリペプチドが、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨ−ＣＨ１対、ＶＬ−ＣＬ対、ＶＨ−ＣＬ対、ＶＬ−ＣＨ１対、受容体もしくはその細胞外ドメイン、リガンドの受容体結合部分、酵素、成長因子、インターロイキン、サイトカイン、またはケモカインからなる群から選択される、線状融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記線状融合ポリペプチドが、アミノ酸配列
ＧｎＳＧｍＸ１（配列番号２）
を含み、ＧｎＳＧｍが、ｎ＝３または４およびｍ＝３または４のペプチドリンカーであり、
Ｘ１が、前記第２のポリペプチドのＮ末端アミノ酸残基である、請求項１に記載の線状融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記第２のポリペプチドがそのＮ末端にセリンまたはトレオニンまたはプロリンを有する融合ポリペプチドと比較して、前記線状融合ポリペプチドが、低減したＯ−グリコシル化を有する、請求項１または２に記載の線状融合ポリペプチド。
【請求項４】
その少なくとも１つが、請求項１〜３のいずれか一項に記載の線状融合ポリペプチドである、少なくとも２つのポリペプチド
を含む、多量体分子。
【請求項５】
前記多量体分子が、抗体である、請求項４に記載の多量体分子。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸分子を含む、真核細胞。
【請求項８】
低減したレベルのＯ−グリコシル化を有する線状融合ポリペプチドを製造する方法であって：
−前記融合ポリペプチドが発現する条件下で、請求項７に記載の宿主細胞を培養すること、および
−前記真核細胞または前記培養培地から前記融合ポリペプチドを回収し、
それにより、低減したレベルのＯ−グリコシル化を有する融合ポリペプチドを製造すること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えポリペプチド製造の分野にある。より詳細には、本明細書では、特に融合ポリペプチドの組換え産生において、翻訳後修飾が少なくなり、それによって生成物の不均一性が少なくなる新たなペプチドリンカーが報告されている。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
真核細胞において組換えにより産生された多重特異性抗体の導入により、多数の異なる分子フォーマットが開発された。これらのうちのいくつかでは、異なる、非天然に会合したドメインがリンカーを使用して互いに融合するドメインアーキテクチャが使用される。該融合ポリペプチドの組換え産生が意図される場合、このリンカーは、例えば、ペプチドリンカーのようなコード可能なリンカーである必要がある。
【０００３】
ペプチドリンカーは、異なるポリペプチドドメインを接続するために採用される合成アミノ酸配列である。ペプチドリンカーは、概して、アミノ酸の線状鎖からなり、この２０個の天然のアミノ酸は、ペプチド結合によって接続されている単量体の構築ブロックである。該ペプチドリンカーは、１〜５０個のアミノ酸残基長を有することができ、ほとんどの場合、３〜２５個のアミノ酸残基長が選択される。ペプチドリンカーは、反復アミノ酸配列を含有することができる。該ペプチドリンカーは、リンカーによって接続されたモジュールが、ドメインが正しく折りたたまれ、適切に提示されることを可能にすることによって、該モジュールの生物学的活性を実行することができることを確保する機能を有する。たいていは、該ペプチドリンカーは、グリシン残基、グルタミン残基、および／またはセリン残基が豊富であると指定されている合成ペプチドリンカーである。これらの残基は、ＧＧＧＳまたはＧＧＧＧＳ（それぞれ配列番号１６および１７）のような最大５個アミノ酸の小さな反復単位で配置されている。この小さな反復単位は、２〜５回反復して、例えば、（ＧＧＧＳ）２または（ＧＧＧＧＳ）２のような多量体単位を形成することができる。
【０００４】
残念ながら、真核生物の宿主細胞におけるペプチドリンカーを含む融合ポリペプチドの組換え産生の際に、ペプチドリンカー内のアミノ酸残基は、インビボの翻訳後修飾のための基質として機能する可能性がある。翻訳後修飾が加わると、組換えにより産生された融合ポリペプチドの不均一性が増す。したがって、翻訳後修飾の追加を低減させるか、または排除さえする新たなペプチドリンカーは、より均質な融合ポリペプチド調製物の組換え産生を可能にするであろう。
【０００５】
Ｓｐａｈｒらの刊行物（ＭＡｂｓ  ９（２０１７）８１２−８１９（非特許文献１））において、ＧＧＧＧＰ（配列番号１８）リンカーにおけるヒドロキシプロリンが報告された。
【０００６】
Ｓｈｉ，Ｙ．は、ＰＰ２Ａに焦点を当てて、プロテインセリン／トレオニンホスファターゼの３つの主要なクラスの機序の理解を前進させる生化学的調査および構造的調査について報告した（Ｃｅｌｌ  １３９（２００９）４６８−４８４（非特許文献２））。
【０００７】
Ｂａｓｌｅ，Ｅらは、内在性アミノ酸のタンパク質化学修飾について報告した（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１７（２０１０）２１３−２２７（非特許文献３））。
【０００８】
ＷＯ２００３／０６２２７６（特許文献１）において、可撓性のあるポリペプチドリンカー分子を介して連結されたサイトカインのリガンド結合ドメインを含むポリペプチド変異体が開示された。
【０００９】
ＷＯ２０１１／１６１２６０（特許文献２）は、抗癌融合タンパク質を開示した。
【００１０】
ＷＯ２０１２／０８８４６１（特許文献３）は、アミノ酸配列ＧＳＧがないリンカーペプチドが、該リンカーペプチドを含むポリペプチドへの翻訳後修飾の追加を低減させまたは排除することを開示した。
【００１１】
ＷＯ２０１４／０８５６２１（特許文献４）は、ライソゾーム病を処置するのに有用な治療用融合タンパク質およびこのような疾患を処置するための方法を開示した。
【００１２】
ＷＯ２０１５／０９１１３０（特許文献５）は、真核細胞にポリペプチドをコードする核酸をトランスフェクトし、それにより該ポリペプチドが１個以上の人工グリコシル化部位の導入によって（野生型ポリペプチドと比較して）修飾されたステップ、トランスフェクトした細胞を培養培地中培養するステップ、および該ポリペプチドを該培養培地から回収し、それにより単量体ポリペプチドの収量（１回の精製ステップ後に決定）が、野生型ポリペプチドと比較して少なくとも１００％増すステップを含む、可溶性形態におけるポリペプチドを組換え産生するための方法を開示した。
【００１３】
ＷＯ２０１６／１１５５１１（特許文献６）は、ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド組成物を開示した。
【００１４】
ＷＯ２０１１／１６１２６０（特許文献２）は、可溶性ｈＴＲＡＩＬタンパク質配列の機能的断片であるドメイン（ａ）、およびアポトーシス促進性エフェクターペプチドの配列であるドメイン（ｂ）を含む融合タンパク質を開示した。
【００１５】
ＷＯ２０１６／１２０２１６（特許文献７）は、抗原に特異的な少なくともＶＨ鎖およびＶＬ鎖によって形成されるｓｃＦｖを含む少なくとも１個の細胞外結合ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするポリペプチドを開示し、該細胞外結合ドメインは、少なくとも１個のｍＡｂ特異的エピトープを含む。
【００１６】
Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．らは、組換えタンパク質におけるＯ−キシロシル化がグリシン−セリンリンカーの共通モチーフに向けられていることを開示した（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ  １０２（２０１３）３９２０−３９２４（非特許文献４））。
【００１７】
Ｗｅｎ，Ｄ．らは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１７）リンカーを含有する操作されたタンパク質におけるＯ−キシロシル化の調査を開示した（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８５（２０１３）４８０５−４８１２（非特許文献５））。
【００１８】
Ｐｅｔｅｒ−Ｋａｔａｌｉｎｉｃ，Ｊ．は、細胞表面および細胞外タンパク質がＯ−グリコシル化されており、ここで、タンパク質におけるＯ−グリコシル化の最も豊富な種類が、ａグリコシド結合によるタンパク質鎖におけるセリンまたはトレオニンへのＧａｌＮＡｃ結合であることを開示した（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．４０５（２００５）１３９−１７１（非特許文献６））。
【００１９】
Ｐｌｏｍｐ，Ｒ．らは、ヒト免疫グロブリンＧ３のヒンジ領域のＯ−グリコシル化を開示した（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔ．１４（２０１５）１３７３−１３８４（非特許文献７））。
【００２０】
米国特許第９．４０９，９６０号（特許文献８）は、アミノ酸配列ＧＳＧがないリンカーペプチドが、該リンカーペプチドを含むポリペプチドへの翻訳後修飾の追加を低減させまたは排除する、リンカーペプチドおよび該リンカーペプチドを含むポリペプチドを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】ＷＯ２００３／０６２２７６
【特許文献２】ＷＯ２０１１／１６１２６０
【特許文献３】ＷＯ２０１２／０８８４６１
【特許文献４】ＷＯ２０１４／０８５６２１
【特許文献５】ＷＯ２０１５／０９１１３０
【特許文献６】ＷＯ２０１６／１１５５１１
【特許文献７】ＷＯ２０１６／１２０２１６
【特許文献８】米国特許第９．４０９，９６０号
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】ＭＡｂｓ  ９（２０１７）８１２−８１９
【非特許文献２】Ｃｅｌｌ  １３９（２００９）４６８−４８４
【非特許文献３】Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１７（２０１０）２１３−２２７
【非特許文献４】Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ  １０２（２０１３）３９２０−３９２４
【非特許文献５】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８５（２０１３）４８０５−４８１２
【非特許文献６】Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．４０５（２００５）１３９−１７１
【非特許文献７】Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔ．１４（２０１５）１３７３−１３８４
【発明の概要】
【００２３】
概要
本発明は、少なくとも部分的に、少なくともＣ末端セリン残基がないか、または純粋なグリシンリンカーをもたらすすべてのセリン残基さえもないグリシン−セリンペプチドリンカーが、翻訳後修飾が含まれている融合ポリペプチドに対する翻訳後修飾の追加を低減させるかまたは排除さえするという発見に基づいている。これを達成するために、ペプチドリンカーのＣ末端にあるポリペプチドは、そのＮ末端に存在するセリン残基、トレオニン残基、またはプロリン残基を含まないものとし、すなわち、ペプチドリンカーの後の最初のアミノ酸残基は、セリン残基、トレオニン残基、またはプロリン残基であってはならない。
【００２４】
より具体的には、本明細書で報告するペプチドリンカーは、リン酸基または炭水化物部分のような翻訳後修飾を、このようなペプチドリンカーを含む融合ポリペプチドに追加する酵素の能力を低減させるか、または排除さえし、例えば、キシロシルトランスフェラーゼがキシロースをセリン残基に連結させる能力を低減させる。
【００２５】
したがって、本明細書で報告するペプチドリンカーを融合ポリペプチドに含めることにより、組換えで（真核細胞において）産生した融合ポリペプチド組成物および調製物の均一性を高めることができる。
【００２６】
本発明の一態様は、アミノ酸配列
ＧｙＸ１（配列番号４）
であって、Ｘ１が、セリン、トレオニン、およびプロリンを除く任意のアミノ酸残基であることができ、かつ
ｙが、３〜２５の整数であって３〜２５を含む整数である、アミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである。
【００２７】
一実施形態では、該融合ポリペプチドは、アミノ酸配列
ＧｙＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号５）
であって、Ｘ１が、セリン、トレオニン、およびプロリンを除く任意のアミノ酸残基であることができ、
Ｘ２およびＸ３が、互いに独立して任意のアミノ酸残基であることができ、かつ
ｙが、３〜２５の整数であって３〜２５を含む整数である、アミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである。
【００２８】
一実施形態では、ｙは、４〜２０のかつ４〜２０を含む整数である。
【００２９】
一実施形態では、ｙは、５〜１５のかつ５〜１５を含む整数である。
【００３０】
本発明の一態様は、アミノ酸配列
ＧｎＳＧｍＸ１（配列番号１）
であって、Ｘ１が、セリン、トレオニン、およびプロリンを除く任意のアミノ酸残基であることができ、
ｎ＝１、２、３または４であり、かつ
ｍ＝３、４または５である、アミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである。
【００３１】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該融合ポリペプチドは、アミノ酸配列
ＧｎＳＧｍＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号２）
であって、Ｘ１が、セリン、トレオニン、およびプロリンを除く任意のアミノ酸残基であることができ、
Ｘ２およびＸ３が、互いに独立して任意のアミノ酸残基であることができ、
ｎ＝１、２、３または４であり、かつ
ｍ＝３、４または５である、アミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである。
【００３２】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該融合ポリペプチドは、少なくとも３つのドメインを含み、
ここで、該３つのドメインの各々は、その他の２つのドメインとは独立して、長さが少なくとも１０アミノ酸残基のポリペプチドであり、かつ
該ドメインは、ペプチド結合を介して互いに共役している。
【００３３】
本発明のすべての態様の一実施形態において、第１のドメインのＣ末端は、ペプチド結合を介して第２のドメインのＮ末端に共役しており、第２のドメインのＣ末端は、ペプチド結合を介して第３のドメインのＮ末端に共役している。
【００３４】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該融合ポリペプチドは、組換え融合ポリペプチドである。
【００３５】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該融合ポリペプチドは、真核細胞において産生される。
【００３６】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該融合ポリペプチドは、配列番号１のＳまたはＸ１において翻訳後修飾を有さない。
【００３７】
本発明のすべての態様の一実施形態において、線状融合ポリペプチドは、配列番号１のＸ１において翻訳後修飾を有さない。
【００３８】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該翻訳後修飾は、リン酸化（リン酸基の付加）および／またはグリコシル化（炭水化物部分の付加）である。本発明のすべての態様の一実施形態において、該グリコシル化は、キシロシル化である（該炭水化物部分はキシロースである）。本発明のすべての態様の一実施形態において、該グリコシル化は、グルコシル化である（該炭水化物部分はグルコースである）。
【００３９】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該融合ポリペプチドは、以下：
ＧｎＳＧｍＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号６）
を含む融合ポリペプチドであって、
Ｘ１が、セリン、トレオニン、またはプロリンであり、
Ｘ２およびＸ３が、互いに独立して任意のアミノ酸残基であることができ、
ｎ＝１、２、３または４であり、かつ
ｍ＝３、４または５である、融合ポリペプチド
と比較して、残基Ｓおよび／またはＸ1における低減した翻訳後修飾を有する。
【００４０】
本発明のすべての態様の一実施形態において、ｎは３であり、かつｍは３または４である。本発明のすべての態様の１つの好ましい実施形態において、ｎは３であり、かつｍは４である。
【００４１】
本発明のすべての態様の一実施形態において、ｎは４であり、かつｍは４または５である。本発明のすべての態様の１つの好ましい実施形態において、ｎは４であり、かつｍは５である。
【００４２】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該融合ポリペプチドは、アミノ酸配列
ＧｐＳＧｎＳＧｍＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号３）
であって、Ｘ１が、セリン、トレオニン、およびプロリンを除く任意のアミノ酸残基であることができ、
Ｘ２およびＸ３が、互いに独立して任意のアミノ酸残基であることができ、
ｎが、３または４であり、
ｍ＝３、４、または５であり、かつ
ｐ＝３または４である、アミノ酸配列を含む。
【００４３】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該融合ポリペプチドは、抗体Ｆｃ領域ポリペプチドをさらに含み／少なくとも１つのドメインは、抗体Ｆｃ領域ポリペプチドである。
【００４４】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該第１または／および第３のドメインは、抗体Ｆｃ領域ポリペプチドである。
【００４５】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該融合ポリペプチドは、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ｓｃＦｖとして、ｓｃＦａｂ、ＶＨ−ＣＨ１対、ＶＬ−ＣＬ対、ＶＨ−ＣＬ対、ＶＬ−ＣＨ１対、受容体またはその細胞外ドメイン、リガンドの受容体結合部分、酵素、成長因子、インターロイキン、サイトカイン、またはケモカインをさらに含む。
【００４６】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該融合ポリペプチドは、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ｓｃＦｖとして、ｓｃＦａｂ、ＶＨ−ＣＨ１対、ＶＬ−ＣＬ対、ＶＨ−ＣＬ対、ＶＬ−ＣＨ１対、受容体またはその細胞外ドメイン、リガンドの受容体結合部分、酵素、成長因子、インターロイキン、サイトカイン、およびケモカインからなる群から選択される少なくとも１つのドメインをさらに含む。
【００４７】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該融合ポリペプチドは単量体である。
【００４８】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該融合ポリペプチドは線状融合ポリペプチドである。
【００４９】
本発明の別の態様は、少なくとも２つのポリペプチドを含む多量体分子であって、該ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、本明細書で報告する融合ポリペプチドである、多量体分子である。
【００５０】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該少なくとも２つのポリペプチドは、１つ以上のジスルフィド結合によって互いに共役している。
【００５１】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該多量体分子は抗体である。
【００５２】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該多量体分子は二重特異性抗体である。
【００５３】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該多量体分子は、少なくとも１つの抗体軽鎖をさらに含む。
【００５４】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該多量体分子は、少なくとも１つの抗体重鎖をさらに含む。
【００５５】
本発明の別の態様は、本明細書で報告する少なくとも１つの融合ポリペプチドまたは本明細書で報告する多量体分子、および場合により医薬として許容され得る担体を含む医薬製剤である。
【００５６】
本発明のさらなる態様は、本明細書で報告する融合ポリペプチドをコードする核酸分子である。
【００５７】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該核酸分子は発現カセット内にある。
【００５８】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該核酸分子はベクター内にある。
【００５９】
また、本発明の態様は、本明細書で報告する多量体分子のポリペプチドをコードする核酸分子のセットである。
【００６０】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該核酸分子の各々は、発現カセット内にある。
【００６１】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該核酸分子の各々は、ベクター内にある。
【００６２】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該核酸分子は、同じベクター上にある。
【００６３】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該核酸分子は、異なるベクター上にある。
【００６４】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該核酸分子は、２つのベクター上にある。
【００６５】
本明細書で報告するさらなる態様は、本明細書で報告する核酸分子または本明細書で報告する核酸分子のセットを含む真核細胞である。
【００６６】
本発明の別の態様は、アミノ酸配列
ＧｙＸ１（配列番号４）
であって、Ｘ１が、セリン、トレオニン、およびプロリンを除く、任意のアミノ酸残基であることができ、
ｙが、３〜２５の整数であって３〜２５を含む整数である、アミノ酸配列を含むペプチドリンカーである。
【００６７】
本発明の別の態様は、アミノ酸配列
ＧｙＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号５）
であって、Ｘ１が、セリン、トレオニン、およびプロリンを除く任意のアミノ酸残基であることができ、
Ｘ２およびＸ３が、互いに独立して任意のアミノ酸残基であることができ、かつ
ｙが、３〜２５の整数であって３〜２５を含む整数である、アミノ酸配列を含むペプチドリンカーである。
【００６８】
一実施形態では、ｙは、４〜２０のかつ４〜２０を含む整数である。
【００６９】
一実施形態では、ｙは、５〜１５のかつ５〜１５を含む整数である。
【００７０】
本発明の別の態様は、アミノ酸配列
ＧｎＳＧｍＸ１（配列番号１）
であって、Ｘ１が、セリン、トレオニン、およびプロリンを除く任意のアミノ酸残基であることができ、
ｎ＝１、２、３または４であり、かつ
ｍ＝３、４または５である、アミノ酸配列を含むペプチドリンカーである。
【００７１】
本発明の別の態様は、アミノ酸配列
ＧｎＳＧｍＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号２）
であって、Ｘ１が、セリン、トレオニン、およびプロリンを除く任意のアミノ酸残基であることができ、
Ｘ２およびＸ３が、互いに独立して任意のアミノ酸残基であることができ、
ｎ＝１、２、３または４であり、かつ
ｍ＝３、４または５である、アミノ酸配列を含むペプチドリンカーである。
【００７２】
本発明の別の態様は、アミノ酸配列
ＧｐＳＧｎＳＧｍＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号３）
であって、Ｘ１が、セリン、トレオニン、およびプロリンを除く任意のアミノ酸残基であることができ、
Ｘ２およびＸ３が、互いに独立して任意のアミノ酸残基であることができ、
ｎ＝１、２、３または４であり、
ｍ＝３、４、または５であり、かつ
ｐ＝３または４である、アミノ酸配列を含むペプチドリンカーである。
【００７３】
本発明の別の態様は、以下のステップを含む融合ポリペプチドを製造するための方法である：
−融合ポリペプチドが発現する条件下で本発明による真核細胞を培養すること、および
−真核細胞または培養培地から融合ポリペプチドを回収すること。
それにより、融合ポリペプチドを製造すること。
【００７４】
本発明の別の態様は、以下を含む、翻訳後修飾のレベルが低減した融合ポリペプチドを製造する方法である：
−融合ポリペプチドが発現する条件下で請求項３８に記載の宿主細胞を培養すること、および
−真核細胞または培養培地から融合ポリペプチドを回収し、
それにより、翻訳後修飾のレベルが低減した融合ポリペプチドを製造すること。
【００７５】
本発明のさらなる態様は、本発明のペプチドリンカーを含むように融合タンパク質を遺伝子操作すること、および融合ポリペプチドを真核細胞によって発現させ、それにより、安定化融合ポリペプチドを製造することを含む、安定化融合ポリペプチドを製造する方法である。
【００７６】
また、本発明の態様は、本発明による方法によってつくられた組成物である。
【００７７】
本発明のさらなる態様は、本発明による組成物を対象に投与することを含む、本発明による融合ポリペプチドまたは本発明による多量体分子による処置から利益を得るであろう対象を処置する方法である。
【００７８】
本発明のさらなる態様は、疾患または障害の処置のための本発明による組成物の使用である。
【００７９】
また、本発明の態様は、薬剤の製造のための本発明による組成物の使用である。
【００８０】
本発明の態様はさらに、薬剤としての使用のための、本発明による融合ポリペプチド、または本発明による多量体分子である。
【００８１】
また、本発明の態様は、薬剤の製造における本発明による融合ポリペプチドまたは本発明による多量体分子の使用である。
【００８２】
本発明の最終的な態様は、有効量の本発明による融合ポリペプチドまたは本発明による多量体分子を、処置を必要とする個体に投与することを含む、該個体を処置する方法である。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
発明の実施形態の詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的に、Ｃ末端セリン残基がないグリシン−セリンペプチドリンカーの使用が、特にペプチドリンカーが、融合ポリペプチドに含まれているとき、該ペプチドリンカーへの翻訳後修飾の追加を低減させるかまたは排除さえするという発見に基づいている。これを達成するために、ペプチドリンカーのＣ末端のポリペプチドはまた、そのＮ末端に存在するセリン、トレオニン、またはプロリンを含まないものとする。
【００８４】
より具体的には、本明細書で報告するペプチドリンカーは、リン酸基または炭水化物部分のような二次修飾を、このようなペプチドリンカーを含む融合ポリペプチドに連結する酵素の能力を低減させ、例えば、キシロースをポリペプチドに連結するキシロシルトランスフェラーゼの能力を低減させる。
【００８５】
したがって、融合ポリペプチドにおいて本明細書で報告するようなペプチドリンカーを使用することにより、組換えで（真核細胞において）産生した融合ポリペプチド組成物および調製物の均一性を高めることができる。
【００８６】
ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  Ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）に与えられる。重鎖および軽鎖のすべての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）において説明されるＫａｂａｔ番号付けシステムにより番号付けすることができ、本明細書では「Ｋａｂａｔによる番号付け」と称される。具体的には、Ｋａｂａｔ，ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）のＫａｂａｔ番号付けシステム（６４７〜６６０ページを参照されたい）は、カッパアイソタイプおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用し、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックス番号付けシステム（６６１〜７２３ページを参照されたい）は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３であって、本明細書では、この場合には、「Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け」と称することによってさらに明確にしている）に使用される。
【００８７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数形を含む。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のこのような細胞および当技術分野で公知のその等価物などを含む。同様に、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では相互交換可能に使用することができる。
【００８８】
また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する」という用語は、相互交換可能に使用することができることにも留意されたい。
【００８９】
当業者にとって、例えば、ペプチドリンカーまたは融合ポリペプチドのアミノ酸配列を、対応するコード核酸配列へと変換する手順および方法は周知である。それゆえ、核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列を、同様に、該核酸配列によってコードされるペプチドリンカーまたは融合ポリペプチドのアミノ酸配列を特徴とする。
【００９０】
組換えＤＮＡ技術の使用は、核酸の生成誘導体を可能にする。このような誘導体は、例えば、置換、変更、交換、欠失または挿入によって、個々のまたはいくつかのヌクレオチド位置で修飾することができる。該修飾または誘導体化は、例えば、部位特異的突然変異誘発によって行うことができる。このような修飾は、当業者によって容易に行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（１９９９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８５）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）。
【００９１】
本発明を行うために有用な方法および技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ〜ＩＩＩ（１９９７）、Ｇｌｏｖｅｒ，Ｎ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｄ．，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ  ＩおよびＩＩ（１９８５），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（ｅｄ．），Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ−ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９８６）、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，ら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＨＳＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ；Ｎ．Ｙ．，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）、Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．，ｅｄ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）において説明されている。
【００９２】
「約」という用語は、その後に続く数値の±２０％の範囲を表す。一実施形態において、約という用語は、その後に続く数値の±１０％の範囲を表す。一実施形態において、約という用語は、その後に続く数値の±５％の範囲を表す。
【００９３】
「抗体」という用語は、本明細書で最も広義に使用され、抗体構造が所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含むがこれらに限定されない種々の抗体構造を包含する。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖から構成された、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメインまたは重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それに続いて３つの定常重ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメインまたは軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）を有し、それに続いて定常軽（ＣＬ）ドメインを有する。
【００９４】
ある特定の実施形態において、融合ポリペプチドの少なくとも１つのドメインは、抗体フラグメントである。「抗体フラグメント」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保有するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、および単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の抗体フラグメントの総説については、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（２００５）１１２６−１１３６を参照されたい。
【００９５】
一実施形態において、該抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメント、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントであり、特にＦａｂフラグメントである。インタクトな抗体をパパイン分解することにより、２つの同一の抗原結合フラグメント、いわゆる、各々が、重鎖および軽鎖可変ドメイン（それぞれＶＨおよびＶＬ）、ならびに、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、および重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む「Ｆａｂ」フラグメントが生成される。「Ｆａｂフラグメント」という用語はしたがって、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖フラグメントと、を含む抗体フラグメントを指す。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域から１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における残基の付加だけ、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を保持するＦａｂ’フラグメントである。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂフラグメント）と、Ｆｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボでの半減期が長くなったＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントの考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
【００９６】
別の実施形態において、該抗体フラグメントは、ダイアボディ、トリアボディ、またはテトラボディである。ダイアボディとは、二価または二重特異性であることができる、２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントである。例えば、欧州特許第４０４，０９７号、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディはまた、Ｈｕｄｓｏｎら．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）においても説明されている。
【００９７】
さらなる実施形態において、該抗体フラグメントは、一本鎖Ｆａｂフラグメントである。「一本鎖Ｆａｂフラグメント」または「ｓｃＦａｂ」とは、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、およびペプチドリンカーからなるポリペプチドであり、該抗体ドメインおよび該リンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向において、以下の順序：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１、またはｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの１つを有する。特に、該ペプチドリンカーは、少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは３２〜５０個のアミノ酸のポリペプチドである。該一本鎖Ｆａｂフラグメントは、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化する。加えて、これらの一本鎖Ｆａｂフラグメントは、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによると、可変重鎖の位置４４および可変軽鎖の位置１００）を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によって、さらに安定化し得る。
【００９８】
一実施形態において、該抗体フラグメントは、ドメインクロスオーバーを有するＦａｂフラグメントである。本明細書で使用する「ドメインクロスオーバー」という用語は、抗体重鎖ＶＨ−ＣＨ１フラグメントとその対応する同族抗体軽鎖との対において、すなわち抗体結合アームにおいて（すなわちＦａｂフラグメントにおいて）、少なくとも１つの重鎖ドメインが、対応する軽鎖ドメインによって置換され、およびその逆も真であるという点で、ドメイン配列が、天然配列から逸脱していることを表す。ドメインクロスオーバーには３つの一般的な種類があり、（ｉ）ＣＨ１とＣＬドメインのクロスオーバーであって、ＶＬ−ＣＨ１ドメイン配列を持つドメインクロスオーバー軽鎖およびＶＨ−ＣＬドメイン配列を持つドメインクロスオーバー重鎖フラグメント（またはＶＨ−ＣＬ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン配列を有する完全長抗体重鎖）をもたらすもの、（ｉｉ）ＶＨおよびＶＬドメインのドメインクロスオーバーであって、ＶＨ−ＣＬドメイン配列を有するドメインクロスオーバー軽鎖およびＶＬ−ＣＨ１ドメイン配列を有するドメインクロスオーバー重鎖フラグメントをもたらすもの、ならびに（ｉｉｉ）完全な軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）および完全なＶＨ−ＣＨ１重鎖フラグメントのドメインクロスオーバー（「Ｆａｂクロスオーバー」）であって、ＶＨ−ＣＨ１ドメイン配列を有するドメインクロスオーバー軽鎖およびＶＬ−ＣＬドメイン配列を有するドメインクロスオーバー重鎖フラグメントをもたらすものがある（上述のすべてのドメイン配列は、Ｎ末端からＣ末端への方向で示されている）。
【００９９】
本明細書で使用する場合、対応する重および軽鎖ドメインに関して「互いに置き換えられた」という用語は、上述のドメインクロスオーバーを指す。そのため、ＣＨ１およびＣＬドメインが「互いに置き換えられた」とき、該用語は、項目（ｉ）の下で言及したドメインクロスオーバー、ならびに結果として生じる重鎖ドメイン配列および軽鎖ドメイン配列を指す。したがって、ＶＨならびにＶＬが「互いに置き換えられた」とき、項目（ｉｉ）の下で言及したドメインクロスオーバーを指し、ならびにＣＨ１およびＣＬドメインが「互いに置き換えられ」かつＶＨ１およびＶＬドメインが「互いに置き換えられた」とき、項目（ｉｉｉ）の下で言及したドメインクロスオーバーを指す。ドメインクロスオーバーを含む二重特異性抗体は、例えば、ＷＯ２００９／０８０２５１、ＷＯ２００９／０８０２５２、ＷＯ２００９／０８０２５３、ＷＯ２００９／０８０２５４およびＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８（２０１１）１１１８７−１１１９２において報告されている。
【０１００】
本発明による融合ポリペプチドはまた、先の項目（ｉ）の下で言及したＣＨ１およびＣＬドメインのドメインクロスオーバー、または項目（ｉｉ）の下で言及したＶＨおよびＶＬドメインのドメインクロスオーバーを含む、Ｆａｂフラグメントを含むこともできる。同じ抗原（複数可）に特異的に結合するＦａｂフラグメントは、同じドメイン配列になるように構築される。この故に、ドメインクロスオーバーを有する１つを超えるＦａｂフラグメントが多重特異性抗体に含まれている場合、該Ｆａｂフラグメント（複数可）は、同じ抗原に特異的に結合する。
【０１０１】
「単離された」融合ポリペプチドは、その自然環境の構成要素から分離されたものである。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって決定されるように、９５％または９９％超の純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法の総説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ８４８（２００７）７９−８７を参照されたい。
【０１０２】
「単離された」核酸は、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞内に含まれている核酸分子を含むが、該核酸分子は、染色体外に存在するか、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【０１０３】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、該集団を構成する個々の抗体は、同一であり、および／または同じエピトープを結合するが、例えば、天然の突然変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の製造中に生じる、起こり得る変異型抗体は例外であり、このような変異型は概して、少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して向かう異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向かう。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な集合から得られたような抗体の特徴を示し、いかなる詳細な方法によっても抗体の産生を必要とするものとして解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない種々の技術によって作製されてもよい。
【０１０４】
抗体の「クラス」は、該抗体の重鎖によって保持される定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。５種類の主なクラスの抗体、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２へとさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、σ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
【０１０５】
「Ｎ結合型オリゴ糖」という用語は、アスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合によって、アスパラギンアミノ酸残基においてペプチド骨格に結合しているオリゴ糖を表す。Ｎ結合型オリゴ糖はまた、「Ｎ−グリカン」とも呼ばれる。すべてのＮ結合型オリゴ糖は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の共通の五糖コアを有している。該すべてのＮ結合型オリゴ糖は、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース、およびシアル酸のような末梢糖の存在および枝（アンテナとも呼ばれる）の数が異なる。場合により、この構造はまた、コアフコース分子および／またはキシロース分子を含むこともできる。Ｎ結合型オリゴ糖は、アスパラギン側鎖またはアルギニン側鎖の窒素に結合している。Ｎ−グリコシル化モチーフ、すなわちＮ−グリコシル化部位は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒコンセンサス塩基配列を含み、ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である。したがって、Ｎ−グリコシル化部位のアミノ酸残基は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒコンセンサス塩基配列中の任意のアミノ酸残基であることができ、ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である。一実施形態において、Ｎ−グリコシル化部位のアミノ酸残基は、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。
【０１０６】
「Ｏ結合型オリゴ糖」という用語は、トレオニンアミノ酸残基またはセリンアミノ酸残基においてペプチド骨格に結合しているオリゴ糖を表す。一実施形態において、Ｏ−グリコシル化部位のアミノ酸残基は、ＳｅｒまたはＴｈｒである。
【０１０７】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体を抗原に結合させることに関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、概して、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ，Ｔ．Ｊ．ら，Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（２００７），９１頁を参照されたい）抗原結合特異性を与えるために、単一のＶＨまたはＶＬドメインで十分な場合がある。さらに、特定の抗原を結合する抗体は、抗原を結合する抗体のＶＨまたはＶＬドメインを使用して、それぞれ、相補的なＶＬまたはＶＨドメインのライブラリをスクリーニングすることで単離してもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（１９９３）８８０−８８７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２（１９９１）６２４−６２８）を参照されたい。
【０１０８】
本明細書で使用する場合、「翻訳後修飾」という用語は、概して、翻訳後にポリペプチドに対して行われる修飾を表す。翻訳後修飾の非限定的な例は、酢酸塩、リン酸塩、脂質、または炭水化物のような官能基の、細胞内の（すなわち、インビボでの）ポリペプチドへの結合である。
【０１０９】
より詳細には、「翻訳後修飾」という用語は、生合成後のポリペプチド内でのアミノ酸残基の共有結合修飾を表す。翻訳後修飾は、既存の官能基を修飾するか、または新たな官能基を導入することにより、アミノ酸側鎖上で発生することができる。異なるタンパク質新生アミノ酸の公知の翻訳後修飾は、例えば、
Ａｌａ：Ｎ−アセチル化
Ａｒｇ：脱イミノ化、メチル化
Ａｓｎ：脱アミド化、Ｎ結合型グリコシル化
Ａｓｐ：異性化
Ｃｙｓ：ジスルフィド結合の形成、酸化、Ｎ−アセチル化
Ｇｌｎ：環化
Ｇｌｕ：環化、ガンマカルボキシル化
Ｇｌｙ：Ｎ−ミリストイル化、Ｎ−アセチル化
Ｈｉｓ：リン酸化
Ｌｙｓ：アセチル化、ユビキチン化、メチル化、ヒドロキシ化
Ｍｅｔ：Ｎ−アセチル化、酸化
Ｐｒｏ：ヒドロキシル化およびその後のさらなる修飾
Ｓｅｒ：リン酸化、Ｏ結合型グリコシル化
Ｔｈｒ：リン酸化、Ｏ結合型グリコシル化、Ｎ−アセチル化
Ｔｒｐ：酸化
Ｔｙｒ：リン酸化
Ｖａｌ：Ｎ−アセチル化
である。
【０１１０】
本明細書で使用する「グリコシル化」という用語は、１つ以上の炭水化物部分（複数可）の、ポリペプチドで内のアミノ酸残基への共有結合を表す。典型的には、グリコシル化とは、細胞または細胞抽出物の細胞内環境内で発生することができる翻訳後事象である。グリコシル化という用語は、例えば、グリコシル化のためのコンセンサス部位での１つ以上の炭水化物部分の付加を含む。グリコシル化の一例は、ポリペプチドへの１つ以上のキシロース残基の付加を包含する。例えば、キシロース付加のためのコンセンサス塩基配列は、配列［Ｄ／Ｅ  ＧＳＧ  Ｄ／Ｅ］を含む。「Ｏ−グリコシル化」という用語は、セリンまたはトレオニンの酸素のような、ポリペプチド内のアミノ酸残基の側鎖の酸素原子への１つ以上の炭水化物部分（複数可）の共有結合を表す。
【０１１１】
「リン酸化」という用語は、リン酸基（ＰＯ４）の、ポリペプチド内でのアミノ酸残基への共有結合を表す。典型的には、リン酸化は、細胞または細胞抽出物の細胞内環境内で発生することができる翻訳後事象である。リン酸化という用語は、例えば、セリンの遊離ヒドロキシル基へのリン酸基の付加を含む。
【０１１２】
ポリペプチドの均一性は、該ポリペプチドが治療上使用されることになる場合、重要である。驚くべきことに、本明細書で実証するように、融合ポリペプチドにおけるペプチドリンカーのアミノ酸配列の変更は、該ペプチドリンカーのＣ末端での翻訳後修飾を低減させまたは排除することが発見された。翻訳後に付加される修飾の低減または排除でさえ、ポリペプチドの均一性を改善する。
【０１１３】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって互いに共役した１０個以上（最多６５０個）の天然アミノ酸残基を含む重合体を表す。
【０１１４】
本明細書で使用する「アミノ酸」という用語は、アラニン（Ａｌａ（３文字表記）またはＡ（１文字表記））、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）を含む。
【０１１５】
本明細書で使用する場合、「ペプチドリンカー」という用語は、２つのポリペプチド配列を接続または連結する、例えば、２つのポリペプチドドメインを一緒に融合させる合成アミノ酸配列を表す。さらに、ペプチドリンカーはそれ自体、第３のドメインを表す。したがって、本発明によるペプチドリンカーを含む融合ポリペプチドは、少なくとも３つのドメイン、すなわち、第１（第１のポリペプチド）のドメイン、第２（ペプチドリンカー）のドメイン、および第３（第２のポリペプチド）のドメインを含む。本明細書で使用する場合、「合成」という用語は、天然ではないアミノ酸配列を表す。したがって、一実施形態において、本発明によるペプチドリンカーは、合成ペプチドリンカーである。
【０１１６】
本発明のペプチドリンカーは、ペプチド結合を介して２つのアミノ酸配列を接続する。本発明の態様の一実施形態において、本発明のペプチドリンカーは、第１の生物学的活性のあるポリペプチド（第１のドメイン）を第２のポリペプチド（第３のドメイン）に直鎖状配列で接続する。本発明の態様の別の実施形態において、該ペプチドリンカーは、２つの生物学的活性のあるポリペプチドを接続する。
【０１１７】
融合ポリペプチドの文脈において、「直鎖状配列」または「配列」は、配列内で互いに隣接する残基が融合ポリペプチドの一次構造において連続している、アミノ末端からカルボキシル末端への方向（Ｎ→Ｃ末端方向）における融合ポリペプチド内のアミノ酸の順序を表す。
【０１１８】
本明細書で使用する場合、「共役した」、「連結した」、「融合した」、または「融合」という用語は、相互交換可能に使用することができる。これらの用語は、組換え手段による２つ以上のポリペプチドまたはドメインを一緒に結合させることを指す。本明細書で使用する場合、「遺伝的に融合した」、「遺伝的に連結された」または「遺伝的融合」という用語は、真核細胞内で融合ポリペプチドをコードする単一の核酸分子の組換え発現を経た、２つ以上のポリペプチドの個々のペプチド骨格を介した該ポリペプチドの共直鎖状の共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｌｉｎｋａｇｅ）または共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）を表す。このような遺伝子融合は、単一の連続した遺伝子配列の発現をもたらす。好ましい遺伝子融合はインフレームであり、すなわち、２つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が融合して、元のＯＲＦの正しいリーディングフレームを維持する様式で、連続したより長いＯＲＦを形成する。したがって、得られる組換え融合ポリペプチドは、元のＯＲＦ（これらのセグメントは、天然には互いに共役していない）によってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のポリペプチドドメインを含む単一のポリペプチドである。
【０１１９】
本発明のペプチドリンカーは、現に特許請求されたペプチドリンカーに少なくともＣ末端セリンアミノ酸残基がないという点で、および次のその後の後続のアミノ酸残基がセリン、トレオニンまたはプロリンアミノ酸残基であってはならないという点で、当技術分野の従来のＧｌｙ／Ｓｅｒ（ＧＳ）ペプチドリンカーとは異なる。
【０１２０】
本明細書で使用する場合、「ｇｌｙ−ｓｅｒリンカー」または「ＧＳペプチドリンカー」という用語は、グリシン残基およびセリン残基からなるポリペプチドを表す。例示的なｇｌｙ／ｓｅｒペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含む。本発明のすべての態様の一実施形態において、該ペプチドリンカーは、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、および／または付加を有し、かつＣ末端セリン残基がないＧＳペプチドリンカーを含むか、またはそれからなる。
【０１２１】
本発明の態様の一実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、「キメラ」ポリペプチドである。このようなキメラ融合ポリペプチドは、本発明によるペプチドリンカー（第２のドメイン）によって自然界では天然に連結されていない第２のアミノ酸配列（第３のドメイン）に連結された第１のアミノ酸配列（第１のドメイン）を含む。別個のタンパク質に存在することができるか、または同じタンパク質に存在するが互いに離れていることがある第１および第３のドメインポリペプチドのアミノ酸配列は、新たな配置で融合ポリペプチドにおいて一緒になる。キメラ融合ポリペプチドは、例えば、ドメインが所望の関連性でコードされているポリヌクレオチドを創出および翻訳することによって創出することができる。例示的なキメラ融合ポリペプチドには、本発明のペプチドリンカーを含む融合ポリペプチドが含まれる。
【０１２２】
本発明のペプチドリンカーを含む融合ポリペプチドは、単量体または多量体のいずれかであることができる。例えば、一実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、二量体または四量体である。
【０１２３】
本発明の態様の一実施形態において、本発明の融合ポリペプチドの二量体は、本発明の２つの同一の単量体融合ポリペプチドを含むホモ二量体である。
【０１２４】
本発明の態様の別の実施形態において、本発明の融合ポリペプチドの二量体は、その少なくとも１つが本発明による融合ポリペプチドである２つの非同一の単量体サブユニットを含むヘテロ二量体である。
【０１２５】
本発明の態様の別の実施形態において、本発明の融合ポリペプチドの四量体は、その少なくとも１つが本発明による融合ポリペプチドである少なくとも３つの非同一の単量体サブユニットを含むヘテロ四量体である。
【０１２６】
本発明による１つ以上のペプチドリンカーを含むことに加えて、ある特定の実施形態において、融合ポリペプチドは、該融合ポリペプチド内の他の位置に１つ以上の従来のＧＳペプチドリンカーを含むことができる。
【０１２７】
本発明の態様による融合ポリペプチドは、少なくとも１つの生物学的活性のある部分を含む。生物学的活性のある部分は、分子を所望の部位または細胞に局在させまたはこれらを標的とすること、機能を実行すること、生物学的状況において作用または反応を実行することのうちの１つ以上が可能である部分を指す。例えば、「生物学的活性のある部分」という用語は、生物学的な系の構成要素（例えば、血清中または細胞の表面上または細胞マトリックス中のタンパク質）に結合し、その結合が生物学的効果（例えば、結合する活性のある部分および／または構成要素における変化によって測定されるようなもの（例えば、細胞または対象において結合する活性のある部分および／もしくは構成要素の開裂、シグナルの伝達、または生物学的応答の増強もしくは阻害））をもたらす生物学的活性のある分子またはその部分を指す。
【０１２８】
例示的な生物学的活性のある部分は、例えば、（例えば、ターゲティング部分として作用するための、または生物学的応答を付与する、誘導するもしくは遮断するための）抗体分子またはその部分の抗原結合フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、またはＶＬドメイン）、受容体のリガンド結合部分またはリガンドの受容体結合部分、およびＦｃ領域ポリペプチド、完全なＦｃ領域、ｓｃＦｃドメイン、酵素などを含む。加えて、本明細書で使用する場合、「生物学的活性のある部分」という用語は、例えば、単量体の形態で単独で存在するときには活性を有さないかもしれないが、二量体分子の状況で第２の部分と対形成したときには生物学的活性を有する部分を含む。
【０１２９】
本発明の態様の一実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、その融合ドメインの少なくとも１つにおいて結合部位を含むか、または結合部位は、融合ポリペプチド中のドメインの融合によって得られる。「結合ドメイン」または「結合部位」という用語は、本明細書で使用する場合、標的分子（例えば、抗原、リガンド、受容体、基質または阻害剤）との特異的相互作用を媒介するポリペプチドの部分、領域、または部位を表す。例示的な結合ドメインには、抗原結合部位（例えば、ＶＨもしくはＶＬドメインまたはこれらの対）またはこのような結合部位を含む分子（例えば、抗体）、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメイン、または触媒ドメインが含まれる。
【０１３０】
本発明の態様の一実施形態において、該融合ポリペプチドは、標的に特異的に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含む（有する）。本発明の態様の一実施形態において、該結合ドメインは、抗原結合部位を含むか、またはそれからなる（例えば、可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメイン、または抗体由来の少なくとも６つのＣＤＲ、または単離されたＶＨもしくはＶＬもしくは３つのＣＤＲのみを含むその少なくともその機能的な部分を含む。本発明の態様の一実施形態において、該結合ドメインは、ターゲティング部分として機能する。
【０１３１】
本発明の態様の一実施形態において、該融合ポリペプチドは、修飾された抗体鎖または修飾された抗体である。本明細書で使用する場合、「修飾された抗体鎖」および「修飾された抗体」という用語は、例えば、天然ドメインの構造、配列または数を変化させることによって、天然ではないように変更した抗体鎖または抗体の合成形態を含む。例えば、ｓｃＦｖ分子およびこれに類するものに結合した重鎖分子を含む。加えて、「修飾された抗体」という用語は、多価形態の抗体（例えば、三価、四価など、同じ抗原の３つ以上のコピーに結合する抗体）を含む。
【０１３２】
本発明のすべての態様の一実施形態において、該融合ポリペプチドは、Ｆｃ領域、またはそのドメイン、またはＦｃ領域ポリペプチドを含む。
【０１３３】
「抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）」という用語は、Ｆｃ受容体結合によって媒介される機能であり、本明細書に報告する抗体による標的細胞のエフェクター細胞の存在下での溶解を指す。ＡＤＣＣは、一実施形態において、ＣＤ１９発現赤血球（例えば、組換えヒトＣＤ１９を発現するＫ５６２細胞）の調製物を、単球またはＮＫ（ナチュラルキラー）細胞のように、新鮮に単離されたＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）またはバフィーコートから精製されたエフェクター細胞のようなエフェクター細胞の存在下で、本明細書に報告する融合ポリペプチドを含む抗体で処理することによって測定される。標的細胞は、５１Ｃｒで標識され、その後、抗体とともにインキュベートされる。標識した細胞は、エフェクター細胞とともにインキュベートされ、その上清は、放出された５１Ｃｒについて分析される。対照には、標的内皮細胞とエフェクター細胞とであるが、該融合ポリペプチドを含む抗体とではないインキュベーションが含まれる。ＡＤＣＣを媒介する初期段階を誘導する抗体の能力は、ＦｃγＲＩおよび／もしくはＦｃγＲＩＩＡを組換え発現する細胞または（本質的にＦｃγＲＩＩＩＡを発現する）ＮＫ細胞のようなＦｃγ受容体発現細胞への該抗体の結合を測定することによって調査される。一実施形態において、ＮＫ細胞上でのＦｃγＲへの結合が測定される。
【０１３４】
「エフェクター機能」は、抗体のクラスにより異なっている抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節、ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。
【０１３５】
Ｆｃ受容体結合依存性エフェクター機能は、抗体のＦｃ領域と造血細胞上の特殊な細胞表面受容体であるＦｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用によって媒介されることができる。Ｆｃ受容体は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属しており、抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）を介して、免疫複合体の食作用による抗体被覆病原体の除去と、対応する抗体で被覆された赤血球および他の種々の細胞標的（例えば、腫瘍細胞）の溶解との両方を媒介することが示されてきた（例えば、Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｌ，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．４９（１９９１）５１１−５２４を参照されたい）。ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプに対するその特異性によって規定される。ＩｇＧ抗体についてのＦｃ受容体は、ＦｃγＲと称される。Ｆｃ受容体結合は、例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ｊ．Ｐ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（１９９１）４５７−４９２、Ｃａｐｅｌ，Ｐ．Ｊ．，ら，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４（１９９４）２５−３４、ｄｅ  Ｈａａｓ，Ｍ．，ら，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６（１９９５）３３０−３４１、およびＧｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．，ら，Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７６（１９９８）２３１−２４８において説明されている。
【０１３６】
ＩｇＧ抗体のＦｃ領域についての受容体（ＦｃγＲ）の架橋は、食作用、抗体依存性細胞障害作用、および炎症性メディエーターの放出、ならびに免疫複合体のクリアランスおよび抗体産生の調節を含む、広範な種々のエフェクター機能を惹起する。ヒトにおいて、以下のＦｃγＲの３つのクラスが特徴づけられてきた。
【０１３７】
ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、高い親和性で単量体ＩｇＧを結合し、マクロファージ、単球、好中球および好酸球上に発現する。アミノ酸残基Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７およびＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）の少なくとも１つにおけるＦｃ領域ＩｇＧの修飾は、ＦｃγＲＩへの結合を低減させる。ＩｇＧ１およびＩｇＧ４へと置換された位置２３３〜２３６のＩｇＧ２残基は、ＦｃγＲＩへの結合を１０３倍低減させ、抗体感作赤血球に対するヒト単球応答を排除した（Ａｒｍｏｕｒ，Ｋ．Ｌ．，ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（１９９９）２６１３−２６２４）。
【０１３８】
ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、複合体化したＩｇＧを中等度から低い親和性で結合し、広範に発現する。この受容体は、ＦｃγＲＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢの２つのサブタイプへと分けることができる。ＦｃγＲＩＩＡは、殺滅に関与する多くの細胞（例えば、マクロファージ、単球、好中球）上で認められ、殺滅プロセスを活性化することができるようである。ＦｃγＲＩＩＢは、抑制性プロセスにおいて役割をになっているようであり、Ｂ−細胞、マクロファージ上で、ならびにマスト細胞および好酸球上で認められる。Ｂ細胞上では、ＦｃγＲＩＩＢは、さらなる免疫グロブリン産生、および、例えばＩｇＥクラスへのアイソタイプ切り替えを抑制するように機能しているようである。マクロファージ上では、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡを経て媒介される食作用を抑制するように作用する。好酸球およびマスト細胞上では、Ｂ型は、ＩｇＥのその別個の受容体への結合を経て、これらの細胞の活性化を抑制するのを助けることができる。ＦｃγＲＩＩＡに対する結合の低減は、アミノ酸残基Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２、およびＫ４１４（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）の少なくとも１つに突然変異があるＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体について認められる。
【０１３９】
ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、中等度から低い親和性でＩｇＧを結合し、２つのタイプとして存在する。ＦｃγＲＩＩＩＡは、ＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球、ならびにいくつかの単球およびＴ細胞上に認められ、ＡＤＣＣを媒介する。ＦｃγＲＩＩＩＢは、好中球上で多量に発現している。ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の低減は、例えば、アミノ酸残基Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８およびＤ３７６（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）の少なくとも１つにおける突然変異があるＩｇＧＦｃ領域を含む抗体について認められる。
【０１４０】
Ｆｃ受容体に対するヒトＩｇＧ１上の結合部位のマッピング、上述の突然変異部位、ならびにＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＡへの結合を測定するための方法は、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１−６６０４において説明されている。
【０１４１】
薬剤、例えば、医薬製剤の「有効量」は、所望の治療結果または予防結果を達成するために必要な薬用量および所要期間で有効な量を指す。
【０１４２】
本明細書で使用する「Ｆｃ受容体」という用語は、該受容体と会合した細胞質ＩＴＡＭ配列の存在を特徴とする活性化受容体を指す（例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．ａｎｄ  Ｂｏｌｌａｎｄ，Ｓ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９（２００１）２７５−２９０を参照されたい）。このような受容体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡである。「ＦｃγＲの結合がない」という用語は、１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で、本明細書で報告する抗体のＮＫ細胞への結合が、ＷＯ２００６／０２９８７９において報告された抗ＯＸ４０Ｌ抗体ＬＣ．００１について認められる結合の１０％以下であることを表す。
【０１４３】
本明細書での「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。該用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異Ｆｃ領域とを含む。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、または存在していなくてもよい。Ｆｃ領域は、２つのＦｃ領域ポリペプチドの二量体である。
【０１４４】
抗体のＦｃ領域は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、Ｃ３活性化、およびＦｃ受容体結合に直接関与している。補体系に対する抗体の影響は、ある特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ領域における規定の結合部位によって引き起こされる。このような結合部位は、最新技術で公知であり、例えば、Ｌｕｋａｓ，Ｔ．Ｊ．，ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（１９８１）２５５５−２５６０、Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ，Ｒ．ａｎｄ  Ｃｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（１９７９）９０７−９１７、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，ら，Ｎａｔｕｒｅ  ２８８（１９８０）３３８−３４４、Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．，ら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２０００）９９５−１００４、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．，ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００）４１７８−４１８４、Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ．，ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２００１）１２１６１−１２１６８、Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．，ら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８６（１９９５）３１９−３２４、および欧州特許第０３０７４３４号において説明されている。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１およびＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３の抗体は通常、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、およびＣ３活性化を示すのに対し、ＩｇＧ４は、補体系を活性化せず、Ｃ１ｑを結合せず、Ｃ３を活性化しない。
【０１４５】
「抗体のＦｃ領域」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン開裂に基づいて規定される。一実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域である。一実施形態において、Ｆｃ領域は、突然変異Ｓ２２８Ｐおよび／またはＬ２３５Ｅ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含むヒトＩｇＧ４サブクラスのものである。一実施形態において、Ｆｃ領域は、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、および場合によりＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含むヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。
【０１４６】
本明細書で使用する場合、「Ｆｃ領域ポリペプチド」という用語は、抗体のパパイン開裂部位のすぐ上流のヒンジ領域において始まり（すなわち、ＩｇＧの残基２１６であって、重鎖定常領域の最初の残基が１１４となる）、Ｃ末端で終わる単一の免疫グロブリン重鎖の部分を表す。したがって、完全なＦｃ領域ポリペプチドは、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。本明細書で使用する場合、「Ｆｃ領域」という用語は、天然抗体のＦｃ領域に類似する二量体化したＦｃ領域ポリペプチド（例えば、従来の２ポリペプチド鎖フォーマットで作製されたか、または一本鎖Ｆｃ領域として作製されたもの）を表す。
【０１４７】
本明細書で使用する場合、「Ｆｃ領域ポリペプチド部分」という用語は、Ｆｃ領域ポリペプチドのアミノ酸配列、またはＦｃ領域ポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、Ｆｃ領域ポリペプチド部分は、ヒンジ（例えば、上部、中間、および／または下部のヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、またはその変異体、部分、もしくはフラグメントのうちの少なくとも１つを含む。他の実施形態において、Ｆｃ領域ポリペプチド部分は、完全なＦｃ領域ポリペプチド（すなわち、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン）を含む。一実施形態において、Ｆｃ領域ポリペプチド部分は、ＣＨ３ドメイン（またはその部分）に融合したヒンジドメイン（またはその部分）を含む。別の実施形態において、Ｆｃ領域ポリペプチド部分は、ＣＨ３ドメイン（またはその部分）に融合したＣＨ２ドメイン（またはその部分）を含む。別の実施形態において、Ｆｃ領域ポリペプチド部分は、ＣＨ３ドメインまたはその部分からなる。別の実施形態において、Ｆｃ領域ポリペプチド部分は、ヒンジドメイン（またはその部分）およびＣＨ３ドメイン（またはその部分）からなる。別の実施形態において、Ｆｃ領域ポリペプチド部分は、ＣＨ２ドメイン（またはその部分）およびＣＨ３ドメインからなる。別の実施形態において、Ｆｃ領域ポリペプチド部分は、ヒンジドメイン（またはその部分）およびＣＨ２ドメイン（またはその部分）からなる。一実施形態において、Ｆｃ領域ポリペプチド部分は、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または部分）がない。
【０１４８】
一実施形態において、Ｆｃ領域ポリペプチドは、本明細書では新生児受容体（ＦｃＲｎ）結合パートナーと称される、ＦｃＲｎ結合に必要とされる当技術分野で公知のＦｃ領域の少なくとも一部を含む。ＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎ受容体によって特異的に結合し、その結果、ＦｃＲｎ結合パートナーのＦｃＲｎ受容体による能動輸送をもたらすことができる分子またはその部分である。特異的に結合するとは、生理学的条件下で比較的安定している複合体を形成する２つの分子を指す。特異的結合は、通常中等度〜多量の容量とともに低い親和性を有する非特異的結合とは区別されるように、高い親和性かつ少量〜中等度の容量を特徴とする。
【０１４９】
典型的には、結合は、親和定数ＫＡが１０６Ｍ−１より高いとき、またはより好ましくは１０８Ｍ−１より高いときに特異的であると見なされる。
【０１５０】
ＦｃＲｎ受容体は、ヒトを含むいくつかの哺乳動物種から単離されてきた。ヒトＦｃＲｎ、サルＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ、およびマウスＦｃＲｎの配列は公知である（Ｓｔｏｒｙ，ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０（１９９４）２３７７）。ＦｃＲｎ受容体は、比較的低いｐＨでＩｇＧ（ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥのような他の免疫グロブリンクラスではない）を結合し、ＩｇＧを管腔から漿膜への方向で細胞を貫通して能動輸送し、次に間質液中で認められる比較的高いｐＨでＩｇＧを放出する。
【０１５１】
ＦｃＲｎ結合パートナーは、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃ領域、およびＦｃＲｎ受容体の完全な結合領域を含む他のフラグメントを含む、ＦｃＲｎ受容体が特異的に結合することができる分子を包含する。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ領域の部分は、Ｘ線結晶学に基づいて説明されてきた（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら．Ｎａｔｕｒｅ  ３７２（１９９４）３７９）。ＦｃとＦｃＲｎとの主な接触領域は、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの接合部の近くである。Ｆｃ−ＦｃＲｎ接触はすべて、単一のＩｇ重鎖ポリペプチド内にある。ＦｃＲｎ結合パートナーには、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃ領域、単一のＦｃ領域ポリペプチド、およびＦｃＲｎの完全な結合領域を含むＩｇＧの他のフラグメントが含まれる。主な接触部位には、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１、および３１４と、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５〜３８７、４２８、および４３３〜４３６が含まれる。
【０１５２】
本発明の融合ポリペプチドは、本発明の少なくとも１つのペプチドリンカーを含む。一実施形態において、融合ポリペプチドは、１〜１０個のペプチドリンカーを含む。一実施形態において、２個以上のペプチドリンカーが、本発明の融合ポリペプチド内に存在する。別の実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、本発明の１個、２個、３個、または４個のペプチドリンカーを含む。
【０１５３】
本発明のペプチドリンカーは、所与の位置で１回発生することができるか、または同じ融合ポリペプチド内の異なる位置で複数回発生することができる。
【０１５４】
本発明のペプチドリンカーは、Ｃ末端セリンアミノ酸が除去されるか、または融合ポリペプチド由来の次の後続のアミノ酸残基がセリンアミノ酸残基、トレオニンアミノ酸残基またはプロリンアミノ酸残基ではないという条件で、グリシン残基によって置き換えられるように、当技術分野のものから改変される。
【０１５５】
本発明のペプチドリンカーは、様々な長さのものであることができる。一実施形態において、本発明のペプチドリンカーは、長さが約６〜約７５アミノ酸である。別の実施形態において、本発明のペプチドリンカーは、長さが約６〜約５０アミノ酸である。別の実施形態において、本発明のペプチドリンカーは、長さが約１０〜約４０アミノ酸である。別の実施形態において、本発明のペプチドリンカーは、長さが約１５〜約３５アミノ酸である。別の実施形態において、本発明のペプチドリンカーは、長さが約１５〜約２０アミノ酸である。別の実施形態において、本発明のペプチドリンカーは、長さが約１５アミノ酸である。
【０１５６】
本発明のペプチドリンカーの位置（複数可）は、それが接続する融合ポリペプチドのドメインに応じて変えることができる。ペプチドリンカーを含む融合ポリペプチドの異なる具体例が本明細書に開示されているが、少なくともペプチドリンカーが組換え融合ポリペプチド内に現に配置されているところならどこにでも、ペプチドリンカーを配置することできることは理解されることになる。ペプチドリンカーは、タンパク質工学で非常に頻繁に使用されるので、合成生物学の標準的な組立て部品になっている。
【０１５７】
ペプチドリンカーについての現在の当技術分野で認められている用途のいくつかの例としては、ｓｃＦｖ分子（Ｆｒｅｕｎｄら，ＦＥＢＳ  ３２０（１９９３）９７）、一本鎖免疫グロブリン分子（Ｓｈｕｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（１９９３）７９９５）、ミニボディ（Ｈｕｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６（１９９６）３０５５）、ＣＨ２ドメイン欠失抗体（Ｍｕｅｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８７（１９９０）５７０２）、一本鎖二重特異性抗体（Ｓｃｈｅｒｔｚら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５（２００５）２８８２）、完全長ＩｇＧ様二重特異性抗体（Ｍａｒｖｉｎら，Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｉｎ．２６（２００５）６４９、Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎら，ＭＡｂｓ  １（２００９）１２８、Ｒｏｕｔｔら，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌｌ．２３（２００６）２２１）、ｓｃＦｖ融合タンパク質（Ｄｅｇｒｅｅら，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ．８６（２００２）８１１）、タンパク質フラグメント相補性アッセイの開発（Ｒｅｍｙら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４２（２００８）１３７）、およびｓｃＦｃ分子におけるもの（ＷＯ２００８／１４３９５４）が挙げられる。
【０１５８】
ペプチドリンカーは、他のポリペプチドと融合させるために使用されるポリペプチドのＮ末端またはＣ末端（または両方）に結合することができる。
【０１５９】
別の実施形態において、本発明のペプチドリンカーは、２つの生物学的活性のあるポリペプチド（各々がドメインである）を遺伝的に融合させるために使用することができ、ここで、各ポリペプチドは、生物学的活性のみを有する。
【０１６０】
別の実施形態において、本発明のペプチドリンカーは、２つのポリペプチドを互いに融合させるために使用され、ここで、いずれのポリペプチドも単独では生物学的活性を有さないが、遺伝的に融合したとき、生物学的に活性がある。
【０１６１】
例えば、一実施形態において、本発明のペプチドリンカーを使用して、以下のようにｓｃＦｖ分子においてＶＨおよびＶＬを遺伝的に融合させることができる：Ａ−Ｌ−Ｂであって、Ａは、ＶＨもしくはＶＬであり、Ｂは、ＶＨもしくはＶＬであり、かつＬは、本発明によるペプチドリンカーであり、またはＡ−Ｌ−Ｂ−Ｌであって、Ａは、ＶＨもしくはＶＬであり、Ｂは、ＶＨもしくはＶＬであり、かつＬは、本発明によるペプチドリンカーである。
【０１６２】
別の実施形態において、ペプチドリンカーを使用して、生物学的活性のあるポリペプチドを以下のように完全なＦｃ領域、Ｆｃ領域ポリペプチド、Ｆｃ領域ポリペプチド部分、またはｓｃＦｃ領域に遺伝的に融合させることができる：Ｃ−Ｌ−Ｆｃであって、Ｃは生物学的活性のあるポリペプチドであり、Ｌは本発明によるペプチドリンカーであり、かつＦｃはＦｃ領域（例えば、一本鎖または従来の２つのポリペプチド鎖）、Ｆｃ領域ポリペプチド、Ｆｃ領域ポリペプチド部分、またはｓｃＦｃ領域である。例えば、一実施形態において、Ｃは、ｓｃＦｖ分子を含み（例えば、ＶＨ−Ｌ−ＶＬまたはＶＬ−Ｌ−ＶＨを含み、Ｌはペプチドリンカーである）、Ｆｃは、Ｆｃ領域ポリペプチド（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン）またはｓｃＦｃ領域からなり、したがってｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質またはｓｃＦｖ−ｓｃＦｃ融合タンパク質を形成する。別の実施形態において、Ｃは、ｓｃＦｖ分子を含む（例えば、ＶＨ−Ｌ−ＶＬまたはＶＬ−Ｌ−ＶＨを含み、Ｌはペプチドリンカーであり、かつＦｃはＣＨ３ドメインであり、したがってミニボディを形成する。別の実施形態において、Ｃは、２つの直列ｓｃＦｖ分子と、ＣＨ３ドメインであるＦｃ領域ポリペプチド部分とを含み、それにより、四価のミニボディを形成する。
【０１６３】
四価のミニボディはまた、以下のフォーマットを使用して形成することもできる。Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｌ−Ｆｃ−Ｌ−Ａ−Ｌ−Ｂであって、ＡおよびＢは各々、ＶＨドメインまたはＶＬドメインのうちの１つであり、Ｌは、本発明によるペプチドリンカーであり、Ｆｃは、ＣＨ３ドメインまたはｓｃＦｃ領域である。
【０１６４】
別の実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、以下のフォーマットを有することができる。Ｄ−Ｌ−Ａ−Ｌ−Ｂであって、Ｄは完全な抗体分子であり、Ｌは本発明によるペプチドリンカーであり、ＡおよびＢは各々、ＶＨドメインまたはＶＬドメインである。このような構築物は、Ｃ末端の四価抗体分子を生じる。
【０１６５】
別の実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、以下のフォーマットを有することができる。Ａ−Ｌ−Ｂ−Ｌ−Ｄ、ここで、Ｄは完全な抗体分子であり、Ｌは本発明によるペプチドリンカーであり、ＡおよびＢは各々、ＶＨドメインまたはＶＬドメインである。このような構築物は、Ｎ末端の四価抗体分子を生じる。このような構築物において、該分子のＡ−Ｌ−Ｂ（ｓｃＦｖ）部分は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれかに遺伝的に融合することができる。
【０１６６】
別の実施形態において、本発明のペプチドリンカーを使用して、ＣＨ３ドメインをヒンジ領域に融合させることができる。別の実施形態において、本発明のペプチドリンカーを使用して、ＣＨ３ドメインをＣＨ１ドメインに融合させることができる。さらに別の実施形態において、本発明によるペプチドリンカーは、ヒンジ領域とＣＨ２ドメインとの間のスペーサーとして作用することができる。本発明によるペプチドリンカーにとって好ましい位置は、Ｆｃ領域またはＦｃ領域ポリペプチドとｓｃＦｖまたはＦａｂとの間である。
【０１６７】
１つを超える結合部位がポリペプチドにおいて含まれる場合、このような分子が、単一特異性または多重特異性であることができる、すなわち、結合部位は同じであることができるか、または異なることができることは理解されることになる。
【０１６８】
ペプチドリンカーは、当技術分野で公知の技術を使用して、ポリペプチド配列内に導入することができる。修飾は、ＤＮＡ配列分析によって確認することができる。プラスミドＤＮＡを使用して、産生されるポリペプチドの安定した産生のために宿主細胞を形質転換することができる。
【０１６９】
本発明の融合ポリペプチドは、少なくとも１つの生物学的活性のあるポリペプチド（ドメイン）を含む。このようなポリペプチドは、単一分子として生物学的活性があることができるか、または別のポリペプチドとの会合を必要とすることができる（例えば、ペプチドリンカーを介して第２のポリペプチドと連結されるとき、またはポリペプチド二量体中に存在するとき）。
【０１７０】
一実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、生物学的活性のあるポリペプチド（ドメイン）を１つだけ含む（生物学的活性のあるポリペプチドに関しては単量体であるが、ポリペプチド鎖の数に関しては単量体または二量体であることができる分子を創出する）。別の実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、生物学的活性のある１つを超えるポリペプチド（ドメイン）、例えば、生物学的活性のある２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多数のポリペプチドを含む。
【０１７１】
本明細書で使用する場合、「生物学的活性のあるポリペプチド」という用語は、化学的手段によってポリペプチドに付加されることができる化学的エフェクター部分（例えば、毒性部分、検出可能な部分およびこれらに類するもの）を含むことを意味しない。
【０１７２】
本発明の一実施形態において、生物学的活性のあるポリペプチドは、本発明によるペプチドリンカーを介して、Ｆｃ領域ポリペプチドまたはその一部のＮ末端に作動可能に連結されている。別の実施形態において、生物学的活性のあるポリペプチドは、本発明によるペプチドリンカーを介して、Ｆｃ領域ポリペプチドのＣ末端に作動可能に連結されている。
【０１７３】
他の実施形態において、２つ以上の生物学的活性のあるポリペプチドは、（例えば、本発明によるペプチドリンカーを介して）互いに直列に連結されている。一実施形態において、生物学的活性のあるポリペプチドの直列アレイは、本発明によるペプチドリンカーを介して、Ｆｃ領域ポリペプチドまたはその一部のＣ末端またはＮ末端のいずれかに作動可能に連結されている。
【０１７４】
一実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、抗原結合部位（例えば、抗体、抗体変異体、または抗体フラグメントの抗原結合部位）、リガンドの受容体結合部分、または受容体のリガンド結合部分のうちの少なくとも１つを含む。
【０１７５】
一実施形態において、生物学的活性のあるポリペプチドは、抗原結合部位を含む。
【０１７６】
ある特定の実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、生物学的効果を媒介する標的分子に特異的な少なくとも１つの結合部位を有する。一実施形態において、結合部位は、細胞の活性化または阻害を調節する（例えば、細胞表面受容体に結合し、活性化シグナルまたは阻害シグナルの伝達をもたらすことによる）。一実施形態において、結合部位は、細胞の死をもたらすシグナルの伝達を開始することができ（例えば、細胞シグナル誘導経路による、補体固定または結合分子上にあるペイロード（例えば、毒性ペイロード）への曝露による）、または対象の疾患もしくは障害を調節する（例えば、細胞殺滅を媒介もしくは促進することによる、フィブリン血餅の溶解を促進するか、もしくは血餅形成を促進することによる、または生物学的に利用可能な物質の量を調節することによる（例えば、対象におけるＴＮＦのようなリガンドの量を増強するかもしくは低減させることによる））。別の実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、低減または除去のために標的となる抗原、例えば、細胞表面抗原または可溶性抗原に特異的な少なくとも１つの結合部位を有する。
【０１７７】
別の実施形態において、本発明の融合ポリペプチドの標的分子（例えば、抗原）への結合は、例えば、組織由来または循環由来の標的分子の低減または排除をもたらす。
【０１７８】
別の実施形態において、融合ポリペプチドは、標的分子に特異的な少なくとも１つの結合部位を有し、標的分子の存在を検出するために（例えば、汚染物質を検出するか、容態もしくは障害を診断するために）使用することができる。
【０１７９】
さらに別の実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、分子が対象の特定部位（例えば、腫瘍細胞、免疫細胞、または血餅）を標的とする少なくとも１つの結合部位を含む。
【０１８０】
ある特定の実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、２つ以上の生物学的活性のあるポリペプチドを含むことができる。一実施形態において、生物学的活性のあるポリペプチドは同一である。別の実施形態において、生物学的活性のあるポリペプチドは異なる。
【０１８１】
ある特定の詳細な実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、多重特異性であり、例えば、分子の第１の分子またはエピトープに結合する少なくとも１つの結合部位と、第２の分子または第１の分子の第２のエピトープに結合する少なくとも１つの第２の結合部位とを有する。本発明の多重特異性結合分子は、少なくとも２つの結合部位を含むことができる。ある特定の実施形態において、本発明の多重特異性結合分子の少なくとも１つの結合部位は、抗体の抗原結合領域またはその抗原結合フラグメント（例えば、抗体フラグメントまたは抗原結合フラグメント）である。
【０１８２】
以下の実施例および図面は、本発明の理解を助けるために提供されており、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲において明らかにされている。本発明の趣旨から逸脱することなく、明らかにされている手順を改変することができることは理解される。
【０１８３】
実施例の概観：
融合タンパク質１  ＨＣ１−Ｆ：
融合タンパク質１は、Ｎ末端からＣ末端への方向で第１の非ＩｇＧタンパク質を第２の非ＩｇＧタンパク質およびＩｇＧ重鎖ドメインと接続する２つのペプチドリンカーを含む。融合タンパク質１は、リンカー
2021526026.tif 000002
のＣ末端セリン残基のリン酸化を有することが認められた（図１〜図８参照）。また、リン酸化のほかに、キシロシル化も存在する。該リン酸化は、＋７９Ｄａの質量シフトをもたらす。該キシロシル化は、＋１３２Ｄａの質量シフトをもたらす。図１は、脱グリコシル化および還元されたＨＣ１−Ｆのデコンボリューションされた総質量スペクトルを示す。予想されたＨＣ１−Ｆに加えて、ＨＣ１−Ｆの強力な＋７９Ｄａ産物変異体の存在を示す別のピークが見られる。修飾が配列番号９のリンカーにおいて存在することは、ＨＣ１−Ｆのトリプシン消化物をＬＣ−ＭＳ分析に供することによって確認された。図３は、ＨＣ１−Ｆの（Ａ）非修飾（溶離時間３６．５分）および（Ｂ）＋７９．９７Ｄａ修飾（溶離時間３７．６分）のトリプシン分解グリシン−セリンリンカーペプチド
2021526026.tif 000003
のイオン電流抽出（ＥＩＣ）のクロマトグラム（ｚ＝２および３）を示す。ＨＣ１−Ｆの三重プロトン化した非修飾および＋７９．９７Ｄａ修飾したトリプシン消化グリシン−セリンリンカーペプチドの衝突誘導性解離を伴うイオントラップＭＳ／ＭＳ分析、ならびに三重プロトン化した修飾したペプチドの電子移動／高エネルギー衝突解離を伴うＭＳ／ＭＳ分析を使用することにより、追加の７９．９７ＤａがペプチドリンカーのＣ末端セリン残基に局在することが確認された（図４を参照されたい）。このことは、合成ポリペプチドのスパイクおよび酵素的脱リン酸化によってさらに確認された（図５および図６）。サーモリシンによる消化およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより、リン酸化は融合タンパク質１のグリシン−セリンリンカーＩに特異的に局在することができた（図７および図８を参照されたい）。
【０１８４】
ＨＣ１−Ｆ融合タンパク質の不均一性を低減させるために、翻訳後修飾は、ペプチドリンカーの末端セリン残基を異なる残基で置き換えるが、プロリンまたはトレオニンでは置き換えず、好ましくはグリシンで置き換えることによって除去されるか、または該残基を単に欠失させることによって除去されるが、ただし、次の残基、すなわちペプチドリンカーに融合したポリペプチドの最初の残基もまた、セリン残基、トレオニン残基、またはプロリン残基ではないことを条件とする。
【０１８５】
融合タンパク質２  ＨＣ２−Ｆ：
融合タンパク質２は、抗体重鎖のＣ末端を抗体軽鎖の短縮されたＮ末端と接続する１つのペプチドリンカーを含む。ＨＣ２−Ｆは、リンカー
2021526026.tif 000004
におけるセリン残基のＯ−グリコシル化で発現することがわかった（図９〜１３参照）。図９は、還元後のＨＣ２−ＦのＯ−キシロシル化およびＯ−グリコシル化ならびにＵＨＲ−ＱＴＯＦ−ＥＳＩ−ＭＳによる分析を示す。ＨＣ２−Ｆから得られた図１０のイオン抽出クロマトグラムにおいて、Ｏ−グリカンを、グリシンセリンリンカーを含むペプチド
2021526026.tif 000005
において同定した。ＥＴｈｃＤ／ＨＣＤ  ＭＳ２を使用して、ＧＳ−ペプチドリンカーのＣ末端セリン残基でのＧａｌＮＡｃ（＋２０３Ｄａ）およびＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｎｅｕ５Ａｃ（＋６５６Ｄａ）の局在を確認した（図１１および図１２）。図１３は、ＨＣ２−Ｆについて、非修飾およびＯ−キシロシル化ペプチドの合計に対する、配列番号１０のＨＣペプチドフラグメントのＯ−グリカンの相対的定量を示す。
【０１８６】
ＨＣ２−Ｆ融合タンパク質の不均一性を低減させるために、ペプチドリンカーの末端セリン残基を別の残基で置き換えるが、プロリンもしくはトレオニンでは置き換えず、好ましくはグリシンで置き換えることにより、または該残基を単に欠失させることにより、翻訳後修飾を除去するが、ただし、次の残基、すなわちペプチドリンカーに融合したポリペプチドの最初の残基もまた、セリン残基、トレオニン残基、またはプロリン残基ではないことを条件とする。
【０１８７】
融合タンパク質３  ＬＣ３−Ｆ：融合タンパク質３は、抗体軽鎖を抗体Ｆｃ領域と接続する１つのペプチドリンカーを含む。ＬＣ３−Ｆは、リンカー
2021526026.tif 000006
のトレオニン残基のＯ−グリコシル化で発現することがわかった（図１４〜図１６参照）。図１４Ｂは、ＨＥＫ細胞内で産生したＬＣ３−ＦのＮ−脱グリコシル化後のＯ−グリコシル化、およびこのインタクトなタンパク質のＵＨＲ−ＱＴＯＦ−ＥＳＩ−ＭＳによる分析を示す。修飾ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−２ＮｅｕＡｃ（＋９４８Ｄａ）は、約２０％になることが定量される。図１４Ｃは、Ｎ−脱グリコシル化、脱シアル化後のインタクトなＬＣ３−Ｆおよびこのインタクトなタンパク質の、および無傷のタンパク質のＵＨＲ−ＱＴＯＦ−ＥＳＩ−ＭＳによる分析を示す。図１４Ｄは、Ｎ−脱グリコシル化、脱シアル化後のＬＣ３−Ｆの鎖ＡにＯ−グリコシル化が局在していること、および還元型融合タンパク質３のＵＨＲ−ＱＴＯＦ−ＥＳＩ−ＭＳによる分析を示す。
【０１８８】
図１５は、ＬＣ３−Ｆについてエンドプロテアーゼ消化物（アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）；ＯｐｅＲＡＴＯＲ；Ｇｅｎｏｖｉｓ由来）のデコンボリューションした質量スペクトルを示す。図１６は、脱シアル化後のＬＣ３−ＦについてのＸＩＣ、およびＯｐｅＲＡＴＯＲプロテアーゼあり（上のＸＩＣ）またはなし（下のＸＩＣ）でのトリプシン消化物を示す。フラグメントの質量は、ヒンジ領域のトレオニン残基のＯ−グリコシル化に対応する。Ｎ末端トレオニン残基に対してＯ−グリコシル化を局在させるＯｐｅＲＡＴＯＲプロテアーゼで消化した脱シアル化トリプシン分解ペプチドのＭＳ／ＭＳ（図１７）。
【０１８９】
ＬＣ３−Ｆ融合タンパク質の不均一性を低減させるために、ペプチドリンカーに融合したポリペプチドの最初の残基、すなわちトレオニン残基をプロリンまたはセリンではなく、好ましくはグリシンで置き換えることにより、翻訳後修飾を除去する。
【０１９０】
ＬＣ３−Ｆの変異体において、リンカーの末端のトレオニン残基が省略されており、グリシン残基によって置換されているので、リンカーはアミノ酸配列
2021526026.tif 000007
を含む。図２１は、Ｎ−脱グリコシル化後のＬＣ３−Ｆの変異体、およびインタクトなタンパク質のＵＨＲ−ＱＴＯＦ−ＥＳＩ−ＭＳによる分析を示す。図２２は、Ｎ−脱グリコシル化、還元後のＬＣ３−Ｆの変異体、およびＵＨＲ−ＱＴＯＦ−ＥＳＩ−ＭＳによる分析を示す。ＬＣ３−Ｆの変異体にはＯ−グリコシル化は存在しない。
【０１９１】
融合タンパク質４  ＨＣ４−Ｆ：
融合タンパク質４は、非ＩｇＧタンパク質を抗体Ｆｃ領域と接続するペプチドリンカーを含む。ＨＣ４−Ｆは、リンカー
2021526026.tif 000008
のセリン残基のＯ−フコシル化で発現することがわかった（図１８〜図１９参照）。図１８は、サーモリシン消化後のＨＣ４−Ｆについて、Ｏ−フコシル化（＋１４６Ｄａ）が存在し、ペプチドマッピング（ＸＩＣ）により、ペプチド
2021526026.tif 000009
に局在することができることを示す。図１９は、ＨＣ４−Ｆについて、修飾された合成ペプチド（２７〜３１０ｎＭ）
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をトリプシン消化物へとスパイクした結果を示す。修飾された合成ペプチドは、修飾されたＨＣ４−Ｆトリプシン分解ペプチド
2021526026.tif 000011
と共溶離し、曲線下面積を増大させる。スパイクのないＸＩＣ（上）およびスパイクのレベルが上昇しているＸＩＣ（下）を示す。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳトリプシン分解ペプチドマッピングによって、Ｏ−フコシル化は末端セリン残基に局在していた（図２０）。ＨＣ４−Ｆ融合タンパク質の不均一性を低減させるために、ペプチドリンカーの末端セリン残基を別の残基で置き換えるが、プロリンもしくはトレオニンでは置き換えず、好ましくはグリシンで置き換えることにより、または該残基を単に欠失させることにより、翻訳後修飾を除去するが、次の残基、すなわちペプチドリンカーに融合したポリペプチドの最初の残基もまたセリンではないことを条件とする。
【０１９２】
具体的な実施形態：
１．アミノ酸配列
ＧｙＸ１（配列番号４）
であって、Ｘ１が、セリン、トレオニン、およびプロリンを除く、任意のアミノ酸残基であることができ、
ｙが、３〜２５の整数であって３〜２５を含む整数である、アミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
【０１９３】
２．アミノ酸配列
ＧｙＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号５）
であって、Ｘ１が、セリン、トレオニン、およびプロリンを除く任意のアミノ酸残基であることができ、
Ｘ２およびＸ３が、互いに独立して任意のアミノ酸残基であることができ、かつ
ｙが、３〜２５の整数であって３〜２５を含む整数である、アミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の融合ポリペプチド。
【０１９４】
３．ｙが、４〜２０の整数であって４〜２０を含む整数である、実施形態１〜２のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド。
【０１９５】
４．ｙが、５〜１５の整数であって５〜１５を含む整数である、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド。
【０１９６】
５．アミノ酸配列
ＧｎＳＧｍＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号２）
であって、Ｘ１が、セリン、トレオニン、およびプロリンを除く任意のアミノ酸残基であることができ、
Ｘ２およびＸ３が、互いに独立して任意のアミノ酸残基であることができ、
ｎ＝１、２、３または４であり、かつ
ｍ＝３、４または５である、アミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
【０１９７】
６．実施形態１〜５のいずれか１つに記載の融合ポリペプチドであって、少なくとも３つのドメインを含む融合ポリペプチドであって、
ここで、該３つのドメインの各々は、その他の２つのドメインとは独立して、長さが少なくとも１０アミノ酸残基のポリペプチドであり、かつ
該ドメインは、ペプチド結合を介して互いに共役している。
【０１９８】
７．前記第１のドメインのＣ末端がペプチド結合を介して前記第２のドメインのＮ末端に共役しており、かつ前記第２のドメインのＣ末端がペプチド結合を介して前記第３のドメインのＮ末端に共役している、実施形態６に記載の融合ポリペプチド。
【０１９９】
８．前記融合ポリペプチドが組換え融合ポリペプチドである、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド。
【０２００】
９．前記融合ポリペプチドが真核細胞で産生される、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド。
【０２０１】
１０．前記融合ポリペプチドが、それぞれ、配列番号０１、または配列番号０２、または配列番号０４のＳまたはＸ１において翻訳後修飾を有さない、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド。
【０２０２】
１１．線状融合ポリペプチドが、配列番号０１、または配列番号０２、または配列番号０４のＸ１において翻訳後修飾を有さない、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド。
【０２０３】
１２．前記翻訳後修飾がリン酸化（リン酸基の付加）および／またはグリコシル化（炭水化物部分の付加）である、実施形態１０〜１１のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド。
【０２０４】
１３．前記グリコシル化がキシロシル化である（前記炭水化物部分がキシロースである）、実施形態１２に記載の融合ポリペプチド。
【０２０５】
１４．前記グリコシル化がグルコシル化である（前記炭水化物部分がグルコースである）、実施形態１２に記載の融合ポリペプチド。
【０２０６】
１５．前記融合ポリペプチドが、以下：
ＧｐＳＧｎＳＧｍＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号６）
を含む融合ポリペプチドであって、
Ｘ１が、セリン、トレオニン、またはプロリンであり、
Ｘ２およびＸ３が、互いに独立して任意のアミノ酸残基であることができ、
ｎ＝１、２、３または４であり、
ｐ＝ｎまたはｐ＝１、２、３もしくは４であり、かつ
ｍ＝３、４または５である、融合ポリペプチド
と比較して、残基Ｓおよび／またはＸ1における低減した翻訳後修飾を有する、実施形態５〜１４のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド。
【０２０７】
１６．ｎ＝３およびｍ＝３または４である、実施形態５〜１５のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド。
【０２０８】
１７．ｎ＝３およびｍ＝４である、実施形態５〜１５のいずれか１つによる融合ポリペプチド。
【０２０９】
１８．ｎ＝４およびｍ＝４または５である、実施形態５〜１５のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド。
【０２１０】
１９．ｎ＝４およびｍ＝５である、実施形態５〜１５のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド。
【０２１１】
２０．前記融合ポリペプチドが、アミノ酸配列
ＧｐＳＧｎＳＧｍＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号３）
であって、Ｘ１が、セリン、トレオニン、およびプロリンを除く任意のアミノ酸残基であることができ、
Ｘ２およびＸ３が、互いに独立して任意のアミノ酸残基であることができ、
ｎ＝１、２、３または４であり、
ｍ＝３、４、または５であり、かつ
ｐ＝３または４である、アミノ酸配列を含む、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド。
【０２１２】
２１．前記融合ポリペプチドが、抗体Ｆｃ領域ポリペプチドをさらに含む／少なくとも１つのドメインが、抗体Ｆｃ領域ポリペプチドである、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド。
【０２１３】
２２．前記第１または／および前記第３のドメインが、抗体Ｆｃ領域ポリペプチドである、実施形態６〜２１のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド。
【０２１４】
２３．前記融合ポリペプチドが、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ＶＨ−ＣＨ１対、ＶＬ−ＣＬ対、ＶＨ−ＣＬ対、ＶＬ−ＣＨ１対、その受容体もしくは細胞外ドメイン、リガンドの受容体結合部分、酵素、成長因子、インターロイキン、サイトカイン、またはケモカインをさらに含む、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド／前記融合ポリペプチドの少なくとも１つのドメインが、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ｓｃＦｖとして、ｓｃＦａｂ、ＶＨ−ＣＨ１対、ＶＬ−ＣＬ対、ＶＨ−ＣＬ対、ＶＬ−ＣＨ１対、受容体またはその細胞外ドメイン、リガンドの受容体結合部分、酵素、成長因子、インターロイキン、サイトカイン、およびケモカインからなる群から選択される、実施形態２〜１８のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド。
【０２１５】
２４．前記融合ポリペプチドが単量体である、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド。
【０２１６】
２５．前記融合ポリペプチドが線状融合ポリペプチドである、実施形態１〜２４のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド。
【０２１７】
２６．その少なくとも１つが、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の融合ポリペプチドである、少なくとも２つのポリペプチド
を含む、多量体分子。
【０２１８】
２７．前記少なくとも２つのポリペプチドが、１つ以上のジスルフィド結合によって互いに共役している、実施形態２６に記載の多量体分子。
【０２１９】
２８．前記多量体分子が抗体である、実施形態２６〜２７のいずれか１つに記載の多量体分子。
【０２２０】
２９．前記多量体分子が二重特異性抗体である、実施形態２６〜２８のいずれか１つに記載の多量体分子。
【０２２１】
３０．少なくとも１つの抗体軽鎖をさらに含む、実施形態２６〜２９のいずれか１つに記載の多量体分子。
【０２２２】
３１．少なくとも１つの抗体重鎖をさらに含む、実施形態２６〜３０のいずれか１つに記載の多量体分子。
【０２２３】
３２．実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の少なくとも１つの融合ポリペプチド、または実施形態２６〜３１のいずれか１つに記載の多量体分子と、場合により医薬として許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
【０２２４】
３３．実施形態１〜２６のいずれか１つに記載の融合ポリペプチドをコードする、核酸分子。
【０２２５】
３４．前記核酸分子が発現カセット内にある、実施形態３３に記載の核酸分子。
【０２２６】
３５．前記核酸分子がベクター内にある、実施形態３４〜３５のいずれか１つに記載の核酸分子。
【０２２７】
３６．実施形態２６〜３１のいずれか１つに記載の多量体分子のポリペプチドをコードする、核酸分子のセット。
【０２２８】
３７．前記核酸分子の各々が発現カセット内にある、実施形態３６に記載の核酸分子のセット。
【０２２９】
３８．前記核酸分子の各々がベクター内にある、実施形態３６〜３７のいずれか１つに記載の核酸分子のセット。
【０２３０】
３９．前記核酸分子が同じベクター上にある、実施形態３６〜３７のいずれか１つに記載の核酸分子のセット。
【０２３１】
４０．前記核酸分子が異なるベクター上にある、実施形態３６〜３７のいずれか１つに記載の核酸分子のセット。
【０２３２】
４１．前記核酸分子が２つのベクター上にある、実施形態３６〜３７のいずれか１つに記載の核酸分子のセット。
【０２３３】
４２．実施形態３３に記載の核酸分子または実施形態３６に記載の核酸分子のセットを含む、真核細胞。
【０２３４】
４３．アミノ酸配列
ＧｙＸ１（配列番号４）
であって、Ｘ１が、セリン、トレオニン、およびプロリンを除く、任意のアミノ酸残基であることができ、
ｙが、３〜２５の整数であって３〜２５を含む整数である、アミノ酸配列を含むペプチドリンカー。
【０２３５】
４４．アミノ酸配列
ＧｙＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号５）
であって、Ｘ１が、セリン、トレオニン、およびプロリンを除く任意のアミノ酸残基であることができ、
Ｘ２およびＸ３が、互いに独立して任意のアミノ酸残基であることができ、かつ
ｙが、３〜２５の整数であって３〜２５を含む整数である、アミノ酸配列を含むペプチドリンカー。
【０２３６】
４５．ｙが４〜２０の整数であって４〜４０を含む整数である、実施形態４３〜４４のいずれか１つに記載のペプチドリンカー。
【０２３７】
４６．ｙが５〜１５までの整数であって５〜１５を含む整数である、実施形態４３〜４５のいずれか１つに記載のペプチドリンカー。
【０２３８】
４７．アミノ酸配列
ＧｎＳＧｍＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号１）
であって、Ｘ１が、セリン、トレオニン、およびプロリンを除く任意のアミノ酸残基であることができ、
Ｘ２およびＸ３が、互いに独立して任意のアミノ酸残基であることができ、
ｎ＝１、２、３または４であり、かつ
ｍ＝３、４または５である、アミノ酸配列を含むペプチドリンカー。
【０２３９】
４８．アミノ酸配列
ＧｐＳＧｎＳＧｍＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号３）
であって、Ｘ１が、セリン、トレオニン、およびプロリンを除く任意のアミノ酸残基であることができ、
Ｘ２およびＸ３が、互いに独立して任意のアミノ酸残基であることができ、
ｎ＝１、２、３または４であり、
ｍ＝３、４、または５であり、かつ
ｐ＝３または４である、アミノ酸配列を含むペプチドリンカー。
【０２４０】
４９．ｎ＝３およびｍ＝３または４である、実施形態４７〜４８のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド。
【０２４１】
５０．ｎ＝３およびｍ＝４である、実施形態４７〜４９のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド。
【０２４２】
５１．ｎ＝４およびｍ＝４または５である、実施形態４７〜４８のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド。
【０２４３】
５２．ｎ＝４およびｍ＝５である、実施形態４７〜４８および５１のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド。
【０２４４】
５３．以下のステップを含む、融合ポリペプチドを製造するための方法：
−前記融合ポリペプチドが発現する条件下で、実施形態４２に記載の真核細胞を培養するステップ、および
−真核細胞または培養培地から融合ポリペプチドを回収すること、
それにより、融合ポリペプチドを製造すること。
【０２４５】
５４．翻訳後修飾のレベルが低減した融合ポリペプチドを製造する方法であって、以下を含む方法：
−前記融合ポリペプチドが発現する条件下で、実施形態４２に記載の宿主細胞を培養するステップ、および
−真核細胞または培養培地から融合ポリペプチドを回収し、
それにより、翻訳後修飾のレベルが低減した融合ポリペプチドを製造すること。
【０２４６】
５５．実施形態４３〜５２のいずれか１つのペプチドリンカーを含むように融合タンパク質を遺伝子操作すること、および前記融合ポリペプチドを真核細胞によって発現させ、それにより安定化融合ポリペプチドを製造することを含む、安定化融合ポリペプチドを製造する方法。
【０２４７】
５６．実施形態５３〜５５のいずれか１つに記載の方法により作製された組成物。
【０２４８】
５７．実施形態３２〜５６のいずれか１つに記載の組成物を、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の融合ポリペプチドまたは実施形態２６〜３１のいずれか１つに記載の多量体分子による処置から利益を得るであろう対象に投与することを含む、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の融合ポリペプチドまたは実施形態２６〜３１のいずれか１つに記載の多量体分子による処置から利益を得るであろう対象を処置する方法。
【０２４９】
５８．疾患または障害の処置のための、実施形態３２または５６のいずれか１つに記載の組成物の、使用。
【０２５０】
５９．薬剤の製造のための、請求項３２または５６のいずれか１つに記載の組成物の、使用。
【０２５１】
６０．薬剤として使用するための、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド、または実施形態２６〜３１のいずれか１つに記載の多量体分子。
【０２５２】
６１．薬剤の製造における、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の融合ポリペプチド、または実施形態２６〜３１のいずれか１つによる多量体分子の、使用。
【０２５３】
６２．処置を必要とする個体を処置する方法であって、前記個体に有効量の実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の融合ポリペプチドまたは実施形態２６〜３１のいずれか１つに記載の多量体分子を投与することを含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【０２５４】
（図１）図１は、ヒト胎児由来腎臓細胞において一過性に発現する、抗体重鎖定常ドメインと非抗体ポリペプチド（ＨＣ１−Ｆ）とを含む融合タンパク質の総質量測定を示す。脱グリコシル化および還元されたＨＣ１−Ｆのデコンボリューションされた質量スペクトルを示す。予想されたＨＣ１−Ｆに加えて、ＨＣ１−Ｆの強力な＋７９Ｄａ産物変異体の存在を示す別のピークが見られる。＋１３２Ｄａキシロース産物変異体による低めの強度のシグナルも存在した。
（図２）図２は、ＨＣ１−Ｆの概略図を図示する。ＨＣ１−Ｆは、２つの標準的なグリシン−セリン［（Ｇ４Ｓ）２］リンカーＩおよびＩＩによってＩｇＧ重鎖定常ドメインに融合した２つの１０ｋＤａ超の非ＩｇＧタンパク質からなる。
（図３）図３は、ＨＣ１−Ｆの（Ａ）非修飾（溶離時間３６．５分）および（Ｂ）＋７９．９７Ｄａ修飾（溶離時間３７．６分）のトリプシン分解グリシン−セリンリンカーペプチド
2021526026.tif 000012
のイオン電流抽出（ＥＩＣ）のクロマトグラム（ｚ＝２および３）を示す。積分されたＥＩＣクロマトグラムの相対的な比較により、該修飾が５．５％（Ｏ−キシロースの１．１％を含む）になることが定量された。ＭＡ：手動で積分されたピーク、ＮＬ：正規化された強度レベル。
（図４Ａ）図４は、ＨＣ１−Ｆの（Ａ）非修飾および（Ｂ）＋７９．９７Ｄａ修飾したトリプシン消化グリシン−セリンリンカーペプチドの衝突誘導か要りによって得られたイオントラップＭＳ／ＭＳデータ、ならびに（Ｃ）三重プロトン化した修飾されたポリペプチドの電子移動／高エネルギー衝突解離によるＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。追加の７９．９７Ｄａは、Ｃ末端のセリン残基に局在している。
（図４Ｂ）図４Ａの説明を参照のこと。
（図４Ｃ）図４Ａの説明を参照のこと。
（図５）図５は、トリプシン消化物への合成ホスホペプチドのスパイクの効果を示す。ＨＣ１−Ｆの非修飾および＋７９．９７Ｄａ修飾したトリプシン消化リンカーペプチド
2021526026.tif 000013
のイオン電流抽出クロマトグラム（ｚ＝２および３）であって、（Ａ）無添加であり、（Ｂ）０．５μＭ、および（Ｃ）１．０μＭのスパイクされた合成ホスホペプチド
2021526026.tif 000014
が添加されている。スパイクされた試料は、リン酸化ペプチドのピーク面積の増加を実証し、修飾されたトリプシン分解ペプチドの正しい同定を与えている。ＮＬ：正規化された強度レベル。
（図６）図６は、ＨＣ１−Ｆの修飾されたトリプシン消化リンカーペプチドのアルカリホスファターゼによる酵素的脱リン酸化の結果を示す。非修飾および＋７９．９７Ｄａ修飾トリプシン分解リンカーペプチド
2021526026.tif 000015
のイオン電流抽出クロマトグラム（ｚ＝２および３）であって、（Ａ）アルカリホスファターゼとともにインキュベートされたもの、および（Ｂ）アルカリホスファターゼなしでインキュベートされたもの（対照反応）である。修飾されたトリプシン分解ペプチドは、酵素的脱リン酸化後にもはや検出不可能であった。ＮＬ：正規化された強度レベル。
（図７Ａ）図７は、特異的リン酸化が、グリシン−セリンリンカーＩのものであることを示す。（Ａ）ＨＣ１−Ｆの、非修飾の（溶離時間１２．５分）およびリン酸化された（溶離時間１３．５分）サーモリシン消化グリシン−セリンリンカーＩペプチド
2021526026.tif 000016
のイオン電流抽出クロマトグラム（ＥＩＣ）（ｚ＝２）。積分されたＥＩＣクロマトグラムの相対的な比較により、該修飾が１１．３％（ＧＳＧモチーフにＯ−キシロースを含む１．４％を含む（データ非表示））になることが定量された。二重プロトン化された非修飾のおよび修飾されたサーモリシン消化グリシン−セリンリンカーＩペプチドのＯｒｂｉｔｒａｐ  ＨＣＤ−ＭＳ／ＭＳデータをそれぞれ（Ｂ）および（Ｃ）に示す。＋７９．９７Ｄａ修飾は、Ｃ末端のセリン残基に局在している。ＭＡ：手動で積分されたピーク、ＮＬ：正規化された強度レベル。
（図７Ｂ）図７Ａの説明を参照のこと。
（図７Ｃ）図７Ａの説明を参照のこと。
（図８Ａ）図８は、チャイニーズハムスター卵巣細胞において安定して発現しているＨＣ１−Ｆのリンカーリン酸化を示す。（Ａ）非修飾の（溶離時間１５．６分）およびリン酸化された（溶離時間１６．８５分）サーモリシン消化グリシン−セリンリンカーＩペプチド
2021526026.tif 000017
のイオン電流抽出（ＥＩＣ）クロマトグラム（ｚ＝２）。リン酸化ペプチドは、０．４％になることが定量された。（Ｂ）二重プロトン化した修飾されたサーモリシン消化ペプチドのＨＣＤ−ＭＳ／ＭＳデータ。ＭＡ：手動で積分されたピーク、ＮＬ：正規化された強度レベル。
（図８Ｂ）図８Ａの説明を参照のこと。
（図９）図９は、ＵＨＲ−ＱＴＯＦ−ＥＳＩ−ＭＳよる還元および分析後の、融合タンパク質２（ＣＨＯ細胞内で産生、ＨＣ２−Ｆ）のＯ−キシロシル化およびＯ−グリコシル化を示す。
（図１０）図１０は、ＨＣ２−Ｆを用いて得た。Ｆｃ−Ｎ−グリカンによって誘導される主なシグナル（保持時間１６分、６２〜６６分）。グリシンセリンリンカーを含むペプチド
2021526026.tif 000018
について同定されたＯ−グリカン（保持時間４３〜４６分）。
（図１１）図１１は、ＨＣ２−Ｆについて、Ｏ−グリカンによる図１０のＯ−グリコシル化を含むペプチドフラグメントのＭＳ／ＭＳ、およびペプチド同定を示す。
（図１２）図１２は、ＨＣ２−Ｆについて、配列番号１０のペプチドについてのＭＳ／ＭＳの結果を示す。ＥＴｈｃＤ／ＨＣＤ  ＭＳ２を用いて、ＧＳ−ペプチドリンカーのＣ末端セリン残基に、ＧａｌＮＡｃ（＋２０３Ｄａ）およびＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｎｅｕ５Ａｃ（＋６５６Ｄａ）を局在させることができた。それに加えて、いくつかのＯ−キシロースヒット（＋１３２Ｄａ）を、該ペプチドリンカーにおける他のセリン残基に局在させることができた。
（図１３）図１３は、ＨＣ２−Ｆについて、非修飾のおよびＯ−キシロシル化したペプチドの合計に対する、配列番号１０のＨＣペプチドフラグメントのＯ−グリカンの相対的定量化を示す。
（図１４Ａ）図１４Ａは、インタクトなタンパク質のＵＨＲ−ＱＴＯＦ−ＥＳＩ−ＭＳによる分析後の、融合タンパク質３（ＬＣ３−Ｆ、ＨＥＫ細胞内で産生）のＯ−グリコシル化を示す。図１４Ｂは、ＨＥＫ細胞内で産生されたＬＣ３−Ｆを含むＮ−脱グリコシル化したインタクトなタンパク質のデコンボリューションした質量スペクトルを示し、図１４Ｃは、ＬＣ−３Ｆを含むＮ−脱グリコシル化および脱シアル化したインタクトなタンパク質のデコンボリューションした質量スペクトルを示し、図１４Ｄは、ＬＣ３−ＦのＮ−脱グリコシル化および還元の、デコンボリューションした質量スペクトルを示す。Ｎ−脱グリコシル化したインタクトなタンパク質またはＬＣ−３Ｆの注釈付き変異体について決定された分子量が列挙されている（注釈：Ｂ：＋３６４．８Ｄａ（ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ）、＋６５６．８Ｄａ（ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｎｅｕ５Ａｃ）、＋９４８．２Ｄａ（ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−２Ｎｅｕ５Ａｃ）、＋１３１３．１Ｄａ（２ｘＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｎｅｕ５Ａｃ）、＋１６０２．２Ｄａ（ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｎｅｕ５ＡｃおよびＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−２Ｎｅｕ５Ａｃ）、＋１８９６．７（２ｘＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−２Ｎｅｕ５Ａｃ）。Ｃ：＋３６５．７Ｄａ（ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ）、＋７３１．０Ｄａ（２ｘＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ）および鎖Ａ（Ｃ：＋３６５．５Ｄａ（ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ）、＋７２９．８Ｄａ（２ｘＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ））。ＧａｌＮＡｃ（四角）、Ｇａｌ（丸）、およびＮｅｕ５Ａｃ（ひし形）。修飾ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−２ＮｅｕＡｃ（＋９４８Ｄａ）は、約２０％になることが定量される。
（図１４Ｂ）図１４Ａの説明を参照のこと。
（図１４Ｃ）図１４Ａの説明を参照のこと。
（図１４Ｄ）図１４Ａの説明を参照のこと。
（図１５）図１５は、ＬＣ３−Ｆについて、ＯｐｅＲＡＴＯＲ消化物のデコンボリューションされた質量スペクトルを示す。フラグメントの質量は、ヒンジ領域のトレオニン残基のＯ−グリコシル化に相応する。ＯｐｅＲＡＴＯＲは、アッカーマンシア・ムシニフィラに由来し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現する。該酵素にはＨｉｓタグが含まれており、分子量は４２ｋＤａである。
（図１６）図１６は、脱シアル化後のＬＣ３−ＦについてのＸＩＣ、およびＯｐｅＲＡＴＯＲプロテアーゼあり（上のＸＩＣ）またはなし（下のＸＩＣ）でのトリプシン消化物を示す。Ｏ−グリコシル化（＋３６５．１３Ｄａ＝ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ）は、次の配列（下線付き）
2021526026.tif 000019
、すなわちＧＳペプチドリンカーのＣ末端のトレオニン残基に局在していることがわかる（ペプチドマッピング（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）で同定）。Ｏ−グリコシル化したトレオニン残基において消化されたＯ−グリコシル化トリプシン分解ペプチド
2021526026.tif 000020
および非修飾トリプシン分解ペプチド
2021526026.tif 000021
のＸＩＣが示されている。＋５９．０１＝カルボキシメチル化。
（図１７）図１７は、ＬＣ３−Ｆについて、Ｎ末端トレオニン残基に対してＯ−グリコシル化（＋３６５．１３Ｄａ＝ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ）を局在させるＯｐｅＲＡＴＯＲプロテアーゼで消化した脱シアル化トリプシン分解ペプチドのＭＳ／ＭＳを示す。＋５９．０１＝カルボキシメチル化。
（図１８）図１８は、サーモリシン消化後の融合タンパク質４（ＨＣ４−Ｆ）について、Ｏ−フコシル化（＋１４６Ｄａ）が存在し、ペプチドマッピング（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により、ペプチド
2021526026.tif 000022
に局在することができることを示す。修飾された（下のＸＩＣ、２．０６％）および非修飾の（上のＸＩＣ）サーモリシン消化ペプチドフラグメントのＸＩＣを示す。
（図１９−１）図１９は、ＨＣ４−Ｆについて、修飾された合成ペプチド（２７〜３１０ｎＭ）
2021526026.tif 000023
をトリプシン消化物へとスパイクした結果を示す。修飾された合成ペプチドは、修飾されたＨＣ４−Ｆトリプシン分解ペプチド
2021526026.tif 000024
と共溶離し、曲線下面積を増大させる。スパイクのないＸＩＣ（上）およびスパイクのレベルが上昇しているＸＩＣ（下）を示す。
（図１９−２）図１９−１の説明を参照のこと。
（図２０−１）図２０は、ＨＣ４−Ｆについて、Ｏ−フコシル化（＋１４６Ｄａ）をＣ末端のセリン残基に局在させるトリプシン分解ペプチドのＭＳ／ＭＳ結果を示す。
（図２０−２）図２０−１の説明を参照のこと。
（図２１−１）図２１は、ＬＣ３−Ｆの変異体について、Ｎ−脱グリコシル化後の質量スペクトル（上：完全スケール、下：ズーム）、およびインタクトなタンパク質のＵＨＲ−ＱＴＯＦ−ＥＳＩ−ＭＳによる分析を示す。アミノ酸配列
2021526026.tif 000025
を含むリンカーを有するＬＣ３−Ｆの変異体にはＯ−グリコシル化は存在しない。
（図２１−２）図２１−１の説明を参照のこと。
（図２２−１）図２２は、ＬＣ３−Ｆの変異体について、Ｎ−脱グリコシル化後の質量スペクトル（上：完全スケール、下：ズーム）、および還元タンパク質のＵＨＲ−ＱＴＯＦ−ＥＳＩ−ＭＳによる分析を示す。アミノ酸配列
2021526026.tif 000026
を含むリンカーを有するＬＣ３−Ｆの変異体にはＯ−グリコシル化は存在しない。
（図２２−２）図２２−１の説明を参照のこと。
【実施例】
【０２５５】
試料の概観：
融合タンパク質１  ＨＣ１−Ｆ：リンカー
2021526026.tif 000027
のセリン残基がリン酸化されている（図１〜８参照）
融合タンパク質２  ＨＣ２−Ｆ：リンカー
2021526026.tif 000028
のセリン残基がＯ−グリコシル化されている（図９〜１３参照）
融合タンパク質３  ＬＣ３−Ｆ：リンカー
2021526026.tif 000029
のトレオニン残基がＯ−グリコシル化されている（図１４〜１７参照）
融合タンパク質４  ＨＣ４−Ｆ：リンカー
2021526026.tif 000030
のセリン残基がＯ−フコシル化されている（図１８〜２０参照）
【０２５６】
融合タンパク質４の変異体  ＨＣ４−Ｆ：アミノ酸配列
2021526026.tif 000031
を含むリンカーにＯ−グリコシル化がない（図２１〜２２参照）。
【０２５７】
ウシ腸粘膜由来のトリプシン、サーモリシン、ノイラミニダーゼ、およびアルカリホスファターゼは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈに注文した。
【０２５８】
合成ペプチド（９８％ＨＰＬＣ純度）は、Ｂｉｏｓｙｎｔａｎ  ＧｍｂＨで合成した。
【０２５９】
ＰＮＧアーゼＦは、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，Ｃｕｓｔｏｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈから入手した。
【０２６０】
ＯｐｅＲＡＴＯＲプロテアーゼは、Ｇｅｎｏｖｉｓ  ＡＢ（Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）から入手した（ＯｐｅＲＡＴＯＲは、Ｓ／Ｔグリコシル化部位のＮ末端でＯ−グリコシル化したタンパク質を消化するＯ−プロテアーゼである；ＯｐｅＲＡＴＯＲがその酵素活性を発揮するには、Ｏ−グリカンの存在が必要である）。
【実施例１】
【０２６１】
酵素消化物
ＵＨＲ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦ−ＭＳ
融合タンパク質は、ＰＮＧアーゼＦを用いて脱グリコシル化し（ノイラミニダーゼの存在下または非存在下）、１００ｍＭ  ＴＣＥＰ中で還元し、２％ギ酸（ｖ／ｖ）を含む４０％アセトニトリルを移動相として使用するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５  ５×２５０ｍｍカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのＨＰＬＣにより脱塩した。合計質量は、ＴｒｉＶｅｒｓａ  ＮａｎｏＭａｔｅ  ｓｏｕｒｃｅ（Ａｄｖｉｏｎ）が装備されたｍａＸｉｓ  ４Ｇ  ＵＨＲ−ＱＴＯＦ  ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ）でのＥＳＩ−ＱＴＯＦ  ＭＳによって測定した。較正は、ＥＳＩ−Ｌ低濃度チューニングミックス（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実行した。結果を視覚化するために、ソフトウェアツールを使用してｍ／ｚスペクトルを、デコンボリューションされた質量スペクトルに変換した。
【０２６２】
ＯｐｅＲＡＴＯＲ消化物
融合タンパク質は、ＰＮＧアーゼＦでＮ−脱グリコシル化し、ノイラミニダーゼで脱シアル化した後、還元、変性、およびカルボキシメチル化し、最後に販売業者が示すように、Ｏ−グリカン特異的エンドプロテアーゼで消化した（ＯｐｅＲＡＴＯＲ、Ｇｅｎｏｖｉｓ  ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）。この消化物は、ＵＨＲ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦ−ＭＳによって分析した。
【実施例２】
【０２６３】
ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳペプチドマッピング
融合タンパク質を、６Ｍグアニジン−ＨＣｌと２０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）とを含む０．３ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８で、３７℃で１時間変性させおよび還元した。その後、４０ｍＭヨード酢酸（Ｃ１３：９９％）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、室温、暗所で１５分間インキュベートすることにより、融合タンパク質をアルキル化した。この反応混合物にさらに２０ｍＭ  ＤＴＴを添加することにより、過剰のヨード酢酸を不活化した。アルキル化した融合タンパク質を、ＮＡＰ５ゲルろ過カラムを使用して緩衝液交換した。その後、融合タンパク質を５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５中のトリプシンで３７℃で１６時間タンパク質分解して消化した（ＯｐｅＲＡＴＯＲプロテアーゼを含むかまたは含まない）。ギ酸を０．４％（ｖ／ｖ）まで添加することにより、反応を停止させた。サーモリシンによる消化は、２５ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ８．３中で２５℃で３０分間行い、ＥＤＴＡを８ｍＭまで添加することにより停止させた。消化した試料は、−８０℃で保存し、ＴｒｉＶｅｒｓａ  ＮａｎｏＭａｔｅ（Ａｄｖｉｏｎ）およびＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｌｉｔｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へ連結したＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いるＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。約２．４μｇの消化された融合タンパク質を５μＬの容積で注入した。クロマトグラフィー分離は、６０μＬ／分の流量を用いるＡｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ３００  Ｃ１８カラム、１×１５０ｍｍ、１．７μｍ、３００Å（Ｗａｔｅｒｓ）での逆相により行った。移動相ＡおよびＢには、ＵＰＬＣ等級の水およびアセトニトリルにそれぞれ０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸が含まれていた。５０℃のカラム温度を使用し、９０分にわたって１％〜４０％の移動相Ｂの勾配の後、２分間で９９％の移動相Ｂに上昇させ、１％移動相Ｂで６分間の再平衡化ステップを適用した。移動相Ａの２回の注入は、試料間のキャリーオーバーを防ぐために５０分間の勾配を使用して試料注入の間に行った。ＴｒｉＶｅｒｓａ  ＮａｎｏＭａｔｅを使用して、溶離液をポストカラムに分け、ナノリットルのフロー部分を質量分析計に送った。
【０２６４】
Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計を使用して高分解能ＭＳスペクトルを取得し、動的排除を備えたイオントラップ内のＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳフラグメントの並行検出を可能にした（繰り返し回数１、排除時間１５秒（±１０ｐｐｍ））。Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎは、データ依存モードで使用した。
【０２６５】
ＭＳ設定は次のとおりとした：フルＭＳ（ＡＧＣ：２×１０５、分解能：６×１０４、ｍ／ｚ範囲：３００〜２０００、最大注入時間：１００ミリ秒）、ＭＳ／ＭＳ（ＡＧＣ：１×１０４、最大注入時間：１００ミリ秒、分離幅：２Ｄａ）。正規化された衝突エネルギーは、３５％、活性化ｐ：０．２５、分離幅：２Ｄａに設定した。
【０２６６】
ＨＣＤ  ＭＳ／ＭＳスペクトルのみを取得する方法については、ＯｒｂｉｔｒａｐフルＭＳ走査で、最も多量のイオンで最大２０のＨＣＤ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳ／ＭＳスペクトルを得た。ＭＳ／ＭＳ実験のＡＧＣは、最大注入時間５００ミリ秒で５×１０４に設定した。正規化された衝突エネルギーは、２０％に設定し、ＨＣＤ断片形成イオンは、１５×１０３の分解設定でＯｒｂｉｔｒａｐにおいて検出した。他のすべての設定は、ＣＩＤ断片形成のみを使用する方法について説明したとおりとした。
【０２６７】
データ依存性断片形成技術としてＨＣＤおよびＥＴＤに基づく補完的なＥＴｈｃＤ法には、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計で取得したフル走査ＭＳと、イオントラップおよびＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計でのＥＴＤおよびＨＣＤフラグメントイオンスペクトルの併行検出が含まれた。可能な限り多くのデータ依存性ＭＳ／ＭＳ走査を使用して、固定周期時間をフル走査に設定した。
【０２６８】
フルＭＳ：ＣＩＤおよびＨＣＤの場合と同じ設定。
【０２６９】
ＨＣＤについて、ＭＳ／ＭＳ設定は、先に列挙したのと同じとした。
【０２７０】
ＥＴＤ、ＭＳ／ＭＳについて、設定は次のとおりとした。反応時間は５０ミリ秒に、ＥＴＤ試薬標的：１×１０６、最大注入時間：２００ミリ秒に設定した。ＥＴＤ補足的活性化を有効にした。補足的活性化衝突エネルギーは、２５％に設定した。ＡＧＣ標的は１×１０４に設定し、前駆体分離幅は２Ｄａとし、最大注入時間は２５０ミリ秒に設定した。
【０２７１】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータの分析および翻訳後修飾（ＰＴＭ）の同定は、前処理オプションおよびＰｅｐＦｉｎｄｅｒソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いるＰＥＡＫＳ  ｓｔｕｄｉｏ  ６．０および７．５ソフトウェア（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）を使用して行った。手動のデータ解釈および定量化はＸＣａｌｉｂｕｒソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行った。ＧＰＭＡＷ（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅデータ）を使用して理論上の質量を計算し、ＸＩＣは、８ｐｐｍの質量許容誤差を使用して最も強い同位体質量で生成した。
【実施例３】
【０２７２】
合成ペプチドのスパイク
修飾されたペプチドの計算量に基づいて、ある特定の量の合成ペプチドをトリプシン消化物へとスパイクした。スパイクした合成ペプチドを含むまたは含まない２．４μｇのトリプシン消化物を、先に説明したようにＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。
【実施例４】
【０２７３】
酵素的脱リン酸化
＋７９．９７Ｄａ修飾トリプシン分解リンカーペプチドの酵素的脱リン酸化は、約６２μｇのトリプシン消化物を凍結乾燥させることによって行った。ペプチドを２５μＬの１００ｍＭトリスＨＣｌ、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、ｐＨ８．０中に再懸濁し、２５０単位のアルカリホスファターゼとともに３７℃で１時間インキュベートした。消化した試料は、−８０℃で保存した。ＭＳ分析は、先に説明したように行った。
【０２７４】
実施形態は、本明細書に概して説明されているように、例示的なものであることは容易に理解されることになる。いくつかの実施形態の提示された発明を実施するための形態および提示された実施例は、本開示の範囲を制限することを意図するものではなく、単に種々の実施形態を代表するものとする。その上、本明細書に開示する方法のステップまたは行為の順序は、本開示の範囲から逸脱することなく、当業者によって変えることができる。言い換えれば、実施形態の適切な操作のためにステップまたは行為の具体的な順序が必要とされない限り、具体的なステップまたは行為の順序または使用は改変することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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