(57)【要約】  本発明は、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ）により特徴づけられた増殖性細胞を阻害するため、例えば、高頻度ＭＳＩ（ＭＳＩ−Ｈ）により特徴づけられた増殖性疾患（癌など）を治療するために、ウェルナータンパク質（ＷＲＮ）に負の調節を行う方法を提供する。さらに、このような方法において使用される組成物も提供される。
2021527713.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする個体において増殖性疾患を治療する方法に使用するための薬剤であって、前記増殖性疾患は高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞で特徴づけられ、前記方法は、前記個体に前記薬剤を投与することを含んでなり、前記薬剤は増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させるために有効である、薬剤。
【請求項２】
ＷＲＮの阻害剤である、請求項１に記載の使用のための薬剤。
【請求項３】
ＷＲＮの阻害剤が小分子阻害剤である、請求項２に記載の使用のための薬剤。
【請求項４】
前記小分子阻害剤が式：
【化１】
2021527713.tif 000015
［式中、
Ｌ１は、Ｃ１−４アルキレンであり；
Ｌ２は、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＳＯ２、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、またはＯＣ（Ｏ）ＮＨであり；
Ｌ３は、Ｃ１−８アルキレンであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、またはＣ１−４ハロアルキルであり；かつ
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、Ｃ６−１２アリール、またはＣ６−１２アリール−Ｃ１−４アルキルであり、これらはそれぞれハロゲン、Ｃ１−４アルキル、またはＣ１−４ハロアルキルで場合により置換されていてもよい］
を有するか、またはその薬学上許容可能な塩である、請求項３に記載の使用のための薬剤。
【請求項５】
前記ＷＲＮの阻害剤が、ＷＲＮ阻害剤にコンジュゲートされた抗体を含んでなるＡＤＣである、請求項２に記載の使用のための薬剤。
【請求項６】
ＷＲＮ  ｍＲＮＡを標的とする阻害性核酸、または前記阻害性核酸をコードする核酸である、請求項１に記載の使用のための薬剤。
【請求項７】
前記阻害性核酸が小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなる、請求項６に記載の使用のための薬剤。
【請求項８】
薬剤が、増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性が低下するように増殖性細胞のゲノムを改変し得るヌクレアーゼ、または前記ヌクレアーゼをコードする核酸である、請求項１に記載の使用のための薬剤。
【請求項９】
前記ヌクレアーゼが内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部または近傍のゲノム配列を標的とする転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である、請求項８に記載の使用のための薬剤。
【請求項１０】
前記方法が、ａ）内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部もしくは近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を含んでなるｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸；およびｂ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、または前記ＲＧＥＮをコードする核酸を個体に投与することを含んでなる、請求項８に記載の使用のための薬剤。
【請求項１１】
前記ｇＲＮＡをコードする核酸がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれ、かつ／または前記ＲＧＥＮをコードする核酸がＡＡＶベクターに含まれる、請求項１０に記載の使用のための薬剤。
【請求項１２】
前記スペーサー配列が内因性ＷＲＮ遺伝子のコード領域内のゲノム配列に相補的である、請求項１０または１１に記載の使用のための薬剤。
【請求項１３】
前記増殖性細胞のゲノムが非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により改変される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１４】
前記方法が、ドナー核酸を含んでなるドナーテンプレートを個体に投与することをさらに含んでなり、前記ドナーテンプレートは、前記ドナー核酸が相同組換えによりＷＲＮ遺伝子座に挿入され得るように構成される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１５】
前記ドナー核酸が１以上の終止コドンをコードし、かつ、前記ドナーテンプレートは、前記ドナー核酸がＷＲＮ遺伝子のコード領域に挿入されるように構成される、請求項１４に記載の使用のための薬剤。
【請求項１６】
前記ドナー核酸が、連続的に存在する３つの翻訳フレームのそれぞれに３つの終止コドンをコードする、請求項１５に記載の使用のための薬剤。
【請求項１７】
前記ドナー核酸が、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるＷＲＮヘリカーゼドメインの突然変異をコードする、請求項１４に記載の使用のための薬剤。
【請求項１８】
前記ドナーテンプレートがＡＡＶベクターに含まれる、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１９】
前記ＲＧＥＮがＣａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはその機能的誘導体からなる群から選択される、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項２０】
前記ＲＧＥＮがＣａｓ９である、請求項１９に記載の使用のための薬剤。
【請求項２１】
前記ＲＧＥＮをコードする核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）配列である、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項２２】
前記のＲＧＥＮをコードするＲＮＡ配列が共有結合を介してｇＲＮＡに連結されている、請求項２１に記載の使用のための薬剤。
【請求項２３】
前記ＲＧＥＮをコードする核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列である、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項２４】
前記ＲＧＥＮをコードする核酸がリポソームまたは脂質ナノ粒子中に処方される、請求項１０〜２３のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項２５】
前記リポソームまたは脂質ナノ粒子が前記ｇＲＮＡを封入している、請求項２４に記載の使用のための薬剤。
【請求項２６】
前記ＲＧＥＮがｇＲＮＡとプレ複合体化されて、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項２７】
ドナー核酸を含んでなり、相同組換えによる増殖性細胞のゲノムへのドナー核酸の挿入が増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させるように構成されている核酸構築物である、請求項１に記載の使用のための薬剤。
【請求項２８】
前記核酸構築物がＡＡＶベクターである、請求項２７に記載の使用のための薬剤。
【請求項２９】
前記ＡＡＶベクターが、内因性ＷＲＮ遺伝子の領域と同一のまたは実質的に相同な配列を有する２つの相同アームを含んでなる、請求項２８に記載の使用のための薬剤。
【請求項３０】
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶクレードＦベクターである、請求項２８または２９に記載の使用のための薬剤。
【請求項３１】
ユビキチン化およびタンパク質分解のためのＷＲＮを標的とするタンパク質分解誘導キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）である、請求項１に記載の使用のための薬剤。
【請求項３２】
前記ＰＲＯＴＡＣが、リンカーを介してＷＲＮリガンドに連結されたＥ３ユビキチンリガーゼリガンドを含んでなる、請求項３１に記載の使用のための薬剤。
【請求項３３】
前記増殖性細胞がＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される１以上のＭＳＩ−Ｈマーカーを含んでなる、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項３４】
前記方法が増殖性細胞におけるＭＳＩ−Ｈの存在を同定するために前記個体からの増殖性細胞の集団において１以上のＭＳＩ−Ｈマーカーの存在を決定することをさらに含んでなる、請求項３３に記載の使用のための薬剤。
【請求項３５】
前記１以上のＭＳＩ−Ｈマーカーの存在を決定することが薬剤を投与する前に行われる、請求項３４に記載の使用のための薬剤。
【請求項３６】
前記増殖性細胞がＤＮＡミスマッチ修復を損なう突然変異を含んでなる、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項３７】
前記増殖性細胞がＭｕｔＳホモログにおける突然変異および／またはＭｕｔＬホモログにおける突然変異を含んでなる、請求項３６に記載の使用のための薬剤。
【請求項３８】
前記ＭｕｔＳホモログがＭＳＨ２、ＭＳＨ３、およびＭＳＨ６からなる群から選択され、かつ、前記ＭｕｔＬホモログがＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、およびＰＭＳ２からなる群から選択される、請求項３７に記載の使用のための薬剤。
【請求項３９】
前記増殖性細胞がＭＬＨ１、ＭＳＨ２、および／またはＰＭＳ２に突然変異を含んでなる、請求項３８に記載の使用のための薬剤。
【請求項４０】
前記方法が前記増殖性細胞における突然変異の存在を同定するために前記個体からの増殖性細胞の集団において突然変異の存在を決定することをさらに含んでなる、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項４１】
前記突然変異の存在を決定する工程が薬剤を投与する前に行われる、請求項４０に記載の使用のための薬剤。
【請求項４２】
前記増殖性細胞がＤＮＡ損傷の１以上のマーカーを含んでなる、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項４３】
前記ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーが高いｐ２１発現および高いγＨ２ＡＸ発現からなる群から選択される、請求項４２に記載の使用のための薬剤。
【請求項４４】
前記方法が前記増殖性細胞におけるＤＮＡ損傷の１以上のマーカーの存在を同定するために前記個体からの増殖性細胞の集団においてＤＮＡ損傷の１以上のマーカーの存在を決定することをさらに含んでなる、請求項４２または４３に記載の使用のための薬剤。
【請求項４５】
前記ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーの存在を決定する工程が薬剤を投与する前に行われる、請求項４４に記載の使用のための薬剤。
【請求項４６】
前記個体における増殖性細胞の量が薬剤の投与を受けない対応する個体に比べて減少する、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項４７】
前記増殖性細胞の増殖速度が薬剤の投与を受けない対応する個体に比べて低下する、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項４８】
前記増殖性細胞の少なくとも一部が細胞周期の停止を受けるように誘導される、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項４９】
前記増殖性細胞の少なくとも一部がアポトーシスを受けるように誘導される、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項５０】
前記増殖性疾患が癌である、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項５１】
前記癌が結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝胆道癌、尿路癌、脳癌、および皮膚癌からなる群から選択される、請求項５０に記載の使用のための薬剤。
【請求項５２】
前記方法が前記個体に前記増殖性疾患のための従来療法を投与することをさらに含んでなる、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項５３】
前記個体に抗ＰＤ−１療法を投与することを含んでなる、請求項５２に記載の使用のための薬剤。
【請求項５４】
前記個体が
（ａ）哺乳動物；
（ｂ）ヒト；または
（ｃ）獣医動物
である、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項５５】
増殖性疾患を有する個体を治療する方法に使用するための、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるために有効な薬剤であって、個体からの増殖性細胞の集団において高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ）、またはＭＳＩ−Ｈに関連するマーカーの存在を決定すること、前記増殖性細胞の集団においてＭＳＩ−ＨまたはＭＳＩ−Ｈに関連するマーカーの存在の決定に基づいて、前記個体に前記薬剤を投与することを含んでなる療法に前記個体が応答する見込みを決定すること、および前記個体が前記療法に応答することが予測される場合に、前記個体に前記薬剤を投与することを含んでなる、薬剤。
【請求項５６】
前記増殖性細胞の集団におけるＭＳＩ−Ｈの存在の決定が、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される１以上のＭＳＩマーカーの存在の決定を含んでなる、請求項５５に記載の使用のための薬剤。
【請求項５７】
前記ＭＳＩ−Ｈマーカーのうち少なくとも１つを有すると決定された増殖性細胞の集団における細胞の量がその増殖性疾患の所定の閾値を上回る場合に、前記個体が前記療法に応答すると予測される、請求項５５または５６に記載の使用のための薬剤。
【請求項５８】
（ａ）前記ＭＳＩ−Ｈマーカーのうち少なくとも１つを有すると決定された増殖性細胞の集団における細胞の量がその増殖性疾患の所定の閾値を下回る場合；または
（ｂ）前記増殖性細胞の集団がＭＳＩ−Ｈマーカーを有さないと決定される場合
に、前記個体が前記療法に応答しないと予測される、請求項５５または５６に記載の使用のための薬剤。
【請求項５９】
前記増殖性細胞の集団におけるＭＳＩ−Ｈに関連するマーカーの存在の決定が、ＤＮＡミスマッチ修復を損なう突然変異の存在を決定することを含んでなる、請求項５５に記載の使用のための薬剤。
【請求項６０】
前記突然変異がＭｕｔＳホモログにおける突然変異および／またはＭｕｔＬホモログにおける突然変異を含んでなる、請求項５９に記載の使用のための薬剤。
【請求項６１】
前記ＭｕｔＳホモログがＭＳＨ２、ＭＳＨ３、およびＭＳＨ６からなる群から選択され、かつ、前記ＭｕｔＬホモログがＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、およびＰＭＳ２からなる群から選択される、請求項６０に記載の使用のための薬剤。
【請求項６２】
前記突然変異がＭＬＨ１、ＭＳＨ２、および／またはＰＭＳ２における突然変異を含んでなる、請求項６１に記載の使用のための薬剤。
【請求項６３】
前記増殖性細胞の集団におけるＭＳＩ−Ｈに関連するマーカーの存在の決定が、ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーの存在を決定することを含んでなる、請求項５５に記載の使用のための薬剤。
【請求項６４】
前記ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーが高いｐ２１発現および高いγＨ２ＡＸ発現からなる群から選択される、請求項６３に記載の使用のための薬剤。
【請求項６５】
（ｉ）ＤＮＡミスマッチ修復を損なう少なくとも１つの突然変異、および／または（ｉｉ）ＤＮＡ損傷の少なくとも１つのマーカーを有すると決定された増殖性細胞の集団における細胞の量がその増殖性疾患の所定の閾値を上回る場合に、前記個体が前記療法に応答すると予測される、請求項５９〜６４のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項６６】
前記ＤＮＡミスマッチ修復を損なう少なくとも１つの突然変異が、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、および／またはＰＭＳ２における突然変異を含んでなり、かつ、前記のＤＮＡ損傷の少なくとも１つのマーカーが高いｐ２１発現および／または高いγＨ２ＡＸ発現を含んでなる、請求項６５に記載の使用のための薬剤。
【請求項６７】
（ａ）（ｉ）ＤＮＡミスマッチ修復を損なう少なくとも１つの突然変異および／もしくは（ｉｉ）ＤＮＡ損傷の少なくとも１つのマーカーを有すると決定された増殖性細胞の集団における細胞の量がその増殖性疾患の所定の閾値を下回る場合；または
（ｂ）前記増殖性細胞の集団がＤＮＡミスマッチ修復を損なう突然変異もＤＮＡ損傷マーカーも有さないと決定される場合
に、前記個体が前記療法に応答しないと予測される、請求項５９〜６４のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項６８】
増殖性疾患と診断された、または増殖性疾患であるとされた個体において、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ）およびＷＲＮのヘリカーゼ活性を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、
前記方法は
（ａ）前記個体からの生体サンプルをＭＳＩの存在およびＷＲＮのヘリカーゼ活性を検出するための１以上の試薬と接触させること；ならびに
（ｂ）（ｉ）ＭＳＩ−Ｈの存在；および（ｉｉ）ＷＲＮのヘリカーゼ活性を検出すること
を含んでなる、方法。
【請求項６９】
生体サンプルにおいてＭＳＩ−Ｈの存在を検出するための試薬が、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される１以上のＭＳＩマーカーの存在を検出するための試薬を含んでなる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
増殖性疾患と診断された、または増殖性疾患であるとされた個体において、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ）に関連するマーカーおよびＷＲＮのヘリカーゼ活性を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、
前記方法は、
（ａ）前記個体からの生体サンプルをＭＳＩ−Ｈに関連するマーカーの存在およびＷＲＮヘリカーゼのヘリカーゼ活性を検出するための１以上の試薬と接触させること；ならびに
（ｂ）（ｉ）ＭＳＩ−Ｈに関連するマーカーの存在；および（ｉｉ）ＷＲＮヘリカーゼのヘリカーゼ活性を検出すること
を含んでなる、方法。
【請求項７１】
生体サンプルにおいてＭＳＩ−Ｈに関連するマーカーの存在を検出するための試薬が、（ｉ）ＤＮＡミスマッチ修復を損なう１以上の突然変異および／または（ｉｉ）ＤＮＡ損傷の１以上の存在を検出するための試薬を含んでなる、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
ＤＮＡミスマッチ修復を損なう１以上の突然変異がＭｕｔＳホモログにおける突然変異および／またはＭｕｔＬホモログにおける突然変異を含んでなる、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＭｕｔＳホモログがＭＳＨ２、ＭＳＨ３、およびＭＳＨ６からなる群から選択され、かつ、前記ＭｕｔＬホモログがＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、およびＰＭＳ２からなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記１以上の突然変異がＭＬＨ１、ＭＳＨ２、および／またはＰＭＳ２における突然変異を含んでなる、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーが高いｐ２１発現および高いγＨ２ＡＸ発現からなる群から選択される、請求項７１〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記増殖性疾患が癌である、請求項５５〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記癌が結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝胆道癌、尿路癌、脳癌、および皮膚癌からなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記個体が
（ａ）哺乳動物；
（ｂ）ヒト；または
（ｃ）獣医動物
である、請求項５５〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
（ａ）内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部もしくは近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を含んでなるｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸；およびｂ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、または前記ＲＧＥＮをコードする核酸を含んでなる組成物であって、前記組成物の成分は、組成物の細胞への送達がその細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させ得るように構成される、組成物。
【請求項８０】
前記ｇＲＮＡをコードする前記核酸がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれ、かつ／または前記ＲＧＥＮをコードする前記核酸がＡＡＶベクターに含まれる、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８１】
前記スペーサー配列が内因性ＷＲＮ遺伝子のコード領域内のゲノム配列に相補的である、請求項７９または８０に記載の組成物。
【請求項８２】
ドナー核酸を含んでなるドナーテンプレートをさらに含んでなり、前記ドナー核酸が相同組換えによりＷＲＮ遺伝子座に挿入され得るように、前記ドナーテンプレートが構成される、請求項７９〜８１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８３】
前記ドナー核酸が１以上の終止コドンをコードし、かつ、前記ドナー核酸がＷＲＮ遺伝子のコード領域に挿入されるように、前記ドナーテンプレートが構成される、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８４】
前記ドナー核酸が、連続的に存在する３つの翻訳フレームのそれぞれに３つの終止コドンをコードする、請求項８３に記載の組成物。
【請求項８５】
前記ドナー核酸が、ＷＲＮヘリカーゼドメインに、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させる突然変異をコードする、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８６】
前記ドナーテンプレートがＡＡＶベクターに含まれる、請求項８２〜８５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８７】
前記ＲＧＥＮがＣａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはその機能的誘導体からなる群から選択される、請求項７９〜８６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８８】
前記ＲＧＥＮがＣａｓ９である、請求項８７に記載の組成物。
【請求項８９】
前記ＲＧＥＮをコードする核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）配列である、請求項７９〜８８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９０】
前記ＲＧＥＮをコードする前記ＲＮＡ配列が共有結合を介してｇＲＮＡに連結されている、請求項８９に記載の組成物。
【請求項９１】
前記ＲＧＥＮをコードする核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列である、請求項７９〜８８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９２】
前記ＲＧＥＮをコードする核酸がリポソームまたは脂質ナノ粒子中に処方される、請求項７９〜９１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９３】
前記リポソームまたは脂質ナノ粒子がｇＲＮＡを封入する、請求項９２に記載の組成物。
【請求項９４】
前記ＲＧＥＮがｇＲＮＡとプレ複合体化されて、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する、請求項７９〜８８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９５】
ドナー核酸を含んでなる核酸構築物を含んでなり、前記核酸構築物は、相同組換えによる増殖性細胞のゲノムへのドナー核酸の挿入が増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させるように構成される、組成物。
【請求項９６】
前記核酸構築物がＡＡＶベクターである、請求項９５に記載の組成物。
【請求項９７】
前記ＡＡＶベクターが、内因性ＷＲＮ遺伝子の領域と同一のまたは実質的に相同な配列を有する２つの相同アームを含んでなる、請求項９６に記載の組成物。
【請求項９８】
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶクレードＦベクターである、請求項９５〜９７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９９】
高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞において増殖を低下させるための方法であって、増殖性細胞におけるウェルナー症候群ＡＴＰ依存性ヘリカーゼ（ＷＲＮ）のヘリカーゼ活性を低下させることを含んでなる、方法。
【請求項１００】
前記増殖性細胞にＷＲＮの阻害剤を送達することを含んでなる、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ＷＲＮの阻害剤が小分子阻害剤である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記小分子阻害剤が式：
【化２】
2021527713.tif 000016
［式中、
Ｌ１は、Ｃ１−４アルキレンであり；
Ｌ２は、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＳＯ２、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、またはＯＣ（Ｏ）ＮＨであり；
Ｌ３は、Ｃ１−８アルキレンであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、またはＣ１−４ハロアルキルであり；かつ
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、Ｃ６−１２アリール、またはＣ６−１２アリール−Ｃ１−４アルキルであり、これらはそれぞれハロゲン、Ｃ１−４アルキル、またはＣ１−４ハロアルキルで場合により置換されていてもよい］
を有するか、またはその薬学上許容可能な塩である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ＷＲＮの阻害剤が、ＷＲＮ阻害剤にコンジュゲートされた抗体を含んでなる抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含んでなる、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０４】
ＷＲＮ  ｍＲＮＡを標的とする阻害性核酸、または前記阻害性核酸をコードする核酸を前記増殖性細胞に送達することを含んでなる、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０５】
前記阻害性核酸が小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなる、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性が低下するように増殖性細胞のゲノムを改変し得るヌクレアーゼ、または前記ヌクレアーゼをコードする核酸を前記増殖性細胞に送達することを含んでなる、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ヌクレアーゼが内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部または近傍のゲノム配列を標的とする転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
ａ）内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部もしくは近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を含んでなるｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸；およびｂ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、または前記ＲＧＥＮをコードする核酸を、前記増殖性細胞に送達することを含んでなる、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ｇＲＮＡをコードする核酸がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれ、かつ／または前記ＲＧＥＮをコードする核酸がＡＡＶベクターに含まれる、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記スペーサー配列が内因性ＷＲＮ遺伝子のコード領域内のゲノム配列に相補的である、請求項１０８または１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記増殖性細胞のゲノムが非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により改変される、請求項１０８〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
ドナー核酸を含んでなるドナーテンプレートを前記増殖性細胞に送達することをさらに含んでなり、前記ドナーテンプレートは、前記ドナー核酸が相同組換えによりＷＲＮ遺伝子座に挿入され得るように構成される、請求項１０８〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ドナー核酸が１以上の終止コドンをコードし、かつ、前記ドナーテンプレートは、前記ドナー核酸がＷＲＮ遺伝子のコード領域に挿入されるように構成される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記ドナー核酸が、連続的に存在する３つの翻訳フレームのそれぞれに３つの終止コドンをコードする、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記ドナー核酸が、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるＷＲＮヘリカーゼドメインの突然変異をコードする、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１６】
前記ドナーテンプレートがＡＡＶベクターに含まれる、請求項１１２〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ＲＧＥＮがＣａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはその機能的誘導体からなる群から選択される、請求項１０８〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記ＲＧＥＮがＣａｓ９である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記ＲＧＥＮをコードする核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）配列である、請求項１０８〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記のＲＧＥＮをコードするＲＮＡ配列が共有結合を介してｇＲＮＡに連結されている、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ＲＧＥＮをコードする核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列である、請求項１０８〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記ＲＧＥＮをコードする核酸がリポソームまたは脂質ナノ粒子中に処方される、請求項１０８〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記リポソームまたは脂質ナノ粒子がｇＲＮＡを封入する、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ＲＧＥＮがｇＲＮＡとプレ複合体化されて、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する、請求項１０８〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
ドナー核酸を含んでなる核酸構築物を前記増殖性細胞に送達することを含んでなり、前記核酸構築物は、相同組換えによる増殖性細胞のゲノムへのドナー核酸の挿入が増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させるように構成される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１２６】
前記核酸構築物がＡＡＶベクターである、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ＡＡＶベクターは、内因性ＷＲＮ遺伝子の領域と同一のまたは実質的に相同な配列を有する２つの相同アームを含んでなる、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶクレードＦベクターである、請求項１２６または１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
ユビキチン化およびタンパク質分解のためのＷＲＮを標的とするＰＲＯＴＡＣを前記増殖性細胞に送達することを含んでなる、請求項９９に記載の方法。
【請求項１３０】
前記ＰＲＯＴＡＣがリンカーを介してＷＲＮリガンドに連結されたＥ３ユビキチンリガーゼリガンドを含んでなる、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記増殖性細胞が、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される１以上のＭＳＩマーカーを含んでなる、請求項９９〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記増殖性細胞がＤＮＡミスマッチ修復を損なう突然変異を含んでなる、請求項９９〜１３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記増殖性細胞がＭｕｔＳホモログにおける突然変異および／またはＭｕｔＬホモログにおける突然変異を含んでなる、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記ＭｕｔＳホモログがＭＳＨ２、ＭＳＨ３、およびＭＳＨ６からなる群から選択され、かつ、前記ＭｕｔＬホモログがＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、およびＰＭＳ２からなる群から選択される、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記増殖性細胞がＭＬＨ１、ＭＳＨ２、および／またはＰＭＳ２に突然変異を含んでなる、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記増殖性細胞がＤＮＡ損傷の１以上のマーカーを含んでなる、請求項９９〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーが高いｐ２１発現および高いγＨ２ＡＸ発現からなる群から選択される、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記増殖性細胞における増殖の低下が、前記増殖性細胞における細胞周期の停止の誘導を含んでなる、請求項９９〜１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記増殖性細胞における増殖の低下が、前記増殖性細胞におけるアポトーシスの誘導を含んでなる、請求項９９〜１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
ｉｎ  ｖｉｖｏで実施される、請求項９９〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４１】
ｅｘ  ｖｉｖｏで実施される、請求項９９〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される、請求項９９〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記増殖性細胞が癌細胞である、請求項９９〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記癌が結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝胆道癌、尿路癌、脳癌、および皮膚癌からなる群から選択される、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記増殖性細胞が
（ａ）哺乳動物細胞；
（ｂ）ヒト細胞；または
（ｃ）獣医動物細胞
である、請求項９９〜１４４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ§１１９（ｅ）の下、２０１８年６月１５日に出願された米国仮出願第６２／６８５，８６６号の優先権の利益を主張するものであり、当該出願の開示全体を、ここに参照により取り込む。
【０００２】
本開示は、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ）を特徴とする増殖性細胞を抑制するため、例えば、高頻度ＭＳＩ（ＭＳＩ−Ｈ）を特徴とする増殖性疾患（癌など）を治療するためにウェルナータンパク質(Werner protein)（ＷＲＮ）を負に調節する方法に関する。そのような方法において使用される組成物がさらに提供される。
【背景技術】
【０００３】
癌は世界中の主要な死因である。治療アプローチ、例えば、化学療法の普及の制限は、それらの細胞障害性効果が癌細胞に限定されず、有害な副作用が正常組織内に生じ得るということである。結果として、癌細胞をより良く標的化するために新規な戦略が緊急に必要とされている。
【０００４】
合成致死は、２つ以上の遺伝子または対応する関連遺伝子産物タンパク質の対応する機能損失（例えば、１以上の染色体突然変異から生じる）の発現の欠陥の組合せが細胞死をもたらす場合に起こるが、１つの欠陥／機能損失では起こらない。例えば、遺伝子の１つ（または遺伝子産物）は細胞増殖に関与する可能性があるが、他の遺伝子（または遺伝子産物）が必須ではない遺伝子である可能性がある。合成致死の概念は、（遺伝子の１つだけが変異または欠失した場合に起こる生存、またはさらには細胞増殖とは対照的に）２つ以上の別々の遺伝子の突然変異の組合せが細胞死をもたらすショウジョウバエモデル系での研究に由来する。より最近では、癌細胞における、それらを合成致死アプローチに脆弱とする不適応な遺伝子変異を探究した研究がある。これらの腫瘍特異的遺伝子欠陥は脆弱性を作り出すことがあり、これがこのような腫瘍特異的ゲノム欠陥に対して合成致死性であり、正常細胞を温存しつつ腫瘍細胞死を誘導する標的化剤の使用を可能とする。
【０００５】
ＤＮＡ修復経路の破壊は、細胞にＤＮＡ損傷を蓄積させやすくする。様々なタイプの腫瘍が、癌が進行するにつれ、ＤＮＡ修復タンパク質に徐々に多くの突然変異を蓄積することが知られている。よって、ＤＮＡ修復機構に関与する経路は、合成致死に基づく細胞傷害性処置によって標的化し、調節不全の修復プロセスを自己に向けて、腫瘍死を誘導することができる。
【０００６】
癌に関連する合成致死(synthetic lethal)（ＳＬ）相互作用の同定は、生物学的発見の取り組みの重点分野である。腫瘍抑制遺伝子と創薬ターゲットの間のＳＬ相互作用を明らかに使用としている酵母スクリーンにおいて、ＲＥＣＱヘリカーゼであるＳｇｓ１は、そのスクリーンのいくつかの遺伝子とのＳＬであることが判明した。ヒト細胞を用いた同じ研究で、５つのヒトＲＥＣＱヘリカーゼのうちの１つであるＢｌｏｏｍ（ＢＬＭ）は、チェックポイントキナーゼ１および２とのＳＬであった(Srivas R, et al., Mol Cell 2016;63(3):514-25)。ＤＮＡ損傷修復(DNA damage repair)（ＤＤＲ）中、ＢＬＭは、相同組換え（ＨＲ）に関与する。ＲＥＣＱヘリカーゼは、３’から５’へＤＮＡを巻き戻すＤＮＡ依存性アデノシン三リン酸分解酵素である。ＢＬＭ、ウェルナー（ＷＲＮ）およびＲＥＣＱＬ４の３つのＲＥＣＱヘリカーゼが、それらの発現が変化または欠損した際に、オーバーラップするが症候的に異なるヒト症候群を引き起こす(de Renty C, Ellis NA. Ageing Res Rev 2017;33:36-51)。これらのヘリカーゼは、それらが細胞内で発現される時と場、それらのタンパク質−タンパク質相互作用、および翻訳後修飾などに基づいて、オーバーラップしつつ異なる機能を有し得ると示唆される。
【０００７】
およそ４００の細胞株を用いた別の研究（ＤＲＩＶＥ）には、ＷＲＮは広義には必須でないが、大腸、子宮内膜および胃の原発組織からのマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）細胞株がＷＲＮ  ｓｈＲＮＡに感受性であることが示され得るデータが含まれている(McDonald ER, 第3版, de Weck A, Schlabach MR, Billy E, Mavrakis KJ, Hoffman GR, et al., Cell 2017;170(3):577-92)。ＤＲＩＶＥデータから部分的に派生するＤｅｐＭａｐ研究も、ＭＳＩ細胞株におけるＷＲＮ必須性のパターンを見出している(Tsherniak A, Vazquez F, Montgomery PG, Weir BA, Kryukov G, Cowley GS, et al., Cell 2017;170(3):564-76)。この研究で試験した他のヒトＲＥＣＱヘリカーゼには、このＭＳＩ  ＳＬ相互作用を示したものはなかった。
【０００８】
ＤＲＩＶＥデータセットにおいて、同じ患者に由来する２つのＭＳＩ細胞株（ＤＬＤ−１およびＨＣＴ−１５）は、ＷＲＮノックダウンに感受性がなかった。ＤＬＤ−１細胞株は、ＭＳＨ６を発現しない。加えて、これらの細胞株は、１つのＷＴコピーと、イントロン４における１または２個のチミジンの欠失のためにＭＳＩ細胞株で低下していることが多い、ＨＲおよび非カノニカルＮＨＥＪなどのＤＤＲ経路に関与するタンパク質ＭＲＥ１１の正常な発現と、を有する (Koh KH, Kang HJ, Li LS, Kim NG, You KT, Yang E, et al., Lab Invest 2005;85(9):1130-8)。ホモ接合性チミジン欠失は、ＭＲＥ１１発現の低下をもたらす。
【０００９】
新たなＳＬ相互作用を同定するとともに、既存のＳＬ相互作用をさらに特徴付ける必要があり、これにより罹患したまたはそうでなければ異常な細胞を特徴とする様々な適応症に対して新規かつ有用な標的を可能とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本明細書に記載のいくつかの態様は、高頻度ＭＳＩを特徴とする増殖性細胞の増殖を低下させる方法、増殖性疾患の治療におけるそのような方法の使用、およびそのような方法において使用する組成物に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様において、本明細書は、それを必要とする個体において増殖性疾患を治療する方法に使用するための薬剤であって、前記増殖性疾患は高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ）を有する細胞が増殖することを特徴とし、前記方法は前記個体に前記薬剤を投与することを含んでなり、前記薬剤は増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させるために有効である、薬剤が提供される。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＷＲＮの阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＷＲＮの阻害剤は、小分子阻害剤である。
【００１２】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、小分子阻害剤は式：
【化１】
2021527713.tif 000003
［式中、
Ｌ１は、Ｃ１−４アルキレンであり；
Ｌ２は、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＳＯ２、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、またはＯＣ（Ｏ）ＮＨであり；
Ｌ３は、Ｃ１−８アルキレンであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、またはＣ１−４ハロアルキルであり；かつ
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、Ｃ６−１２アリール、またはＣ６−１２アリール−Ｃ１−４アルキルであり、これらはそれぞれハロゲン、Ｃ１−４アルキル、またはＣ１−４ハロアルキルで場合により置換されていてもよい］
を有するか、またはその薬学上許容可能な塩である。
【００１３】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ＷＲＮの阻害剤は、ＷＲＮ阻害剤にコンジュゲートされた抗体を含んでなるＡＤＣである。
【００１４】
上記の実施形態のいずれかに係る、いくつかの実施形態において、薬剤は、ＷＲＮ  ｍＲＮＡを標的とする阻害性核酸、または前記阻害性核酸をコードする核酸である。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなる。
【００１５】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、薬剤は、増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性が低下するように増殖性細胞のゲノムを改変し得るヌクレアーゼ、または前記ヌクレアーゼをコードする核酸である。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部または近傍のゲノム配列を標的とする転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。
【００１６】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法は、ａ）内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部または近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を含んでなるｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸；およびｂ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ(RNA-guided endonuclease)（ＲＧＥＮ）、または前記ＲＧＥＮをコードする核酸、を個体に投与することを含んでなる。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡをコードする核酸はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれ、かつ／またはＲＧＥＮをコードする核酸はＡＡＶベクターに含まれる。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、内因性ＷＲＮ遺伝子のコード領域内のゲノム配列に相補的である。いくつかの実施形態において、増殖性細胞のゲノムは、非相同末端結合(non-homologous end joining)（ＮＨＥＪ）により改変される。
【００１７】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法は、ドナー核酸を含んでなるドナーテンプレートを個体に投与することをさらに含んでなり、前記ドナーテンプレートは、前記ドナー核酸が相同組換えによりＷＲＮ遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は１以上の終止コドンをコードし、かつ、前記ドナーテンプレートは、前記ドナー核酸がＷＲＮ遺伝子のコード領域に挿入されるように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、連続的に存在する３つの翻訳フレームのそれぞれに３つの終止コドンをコードする。
【００１８】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるＷＲＮヘリカーゼドメインの突然変異をコードする。
【００１９】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターに含まれる。
【００２０】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはその機能的誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮはＣａｓ９である。
【００２１】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードする核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）配列である。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードするＲＮＡ配列は、共有結合を介してｇＲＮＡに連結されている。
【００２２】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードする核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列である。
【００２３】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子中に処方される。いくつかの実施形態において、リポソームまたは脂質ナノ粒子は、ｇＲＮＡを封入する。
【００２４】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮは、ｇＲＮＡとプレ複合体化されて、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。
【００２５】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、薬剤は、ドナー核酸を含んでなる核酸構築物であり、核酸構築物は、相同組換えによる増殖性細胞のゲノムへのドナー核酸の挿入が、増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させるように構成される。いくつかの実施形態において、核酸構築物は、ＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、内因性ＷＲＮ遺伝子の領域と同一のまたは実質的に相同な配列を有する２つの相同アームを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶクレードＦベクターである。
【００２６】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、薬剤は、ユビキチン化およびタンパク質分解のためのＷＲＮを標的とするタンパク質分解誘導キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）である。いくつかの実施形態において、ＰＲＯＴＡＣは、リンカーを介してＷＲＮリガンドに連結されたＥ３ユビキチンリガーゼリガンドを含んでなる。
【００２７】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される１以上のＭＳＩ−Ｈマーカーを含んでなる。いくつかの実施形態において、この方法は、増殖性細胞におけるＭＳＩ−Ｈの存在を同定するために前記個体由来の増殖性細胞の集団において１以上のＭＳＩ−Ｈマーカーの存在を決定することをさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、１以上のＭＳＩ−Ｈマーカーの存在を決定する工程が、薬剤を投与する前に行われる。
【００２８】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＤＮＡミスマッチ修復を損なう突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭｕｔＳホモログにおける突然変異および／またはＭｕｔＬホモログにおける突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＭｕｔＳホモログは、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、およびＭＳＨ６からなる群から選択され、かつ、ＭｕｔＬホモログは、ＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、およびＰＭＳ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、および／またはＰＭＳ２における突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、この方法は、増殖性細胞における突然変異の存在を同定するために、前記個体由来の増殖性細胞の集団において突然変異の存在を決定することをさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、突然変異の存在を決定する工程は、薬剤を投与する前に行われる。
【００２９】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーは、高いｐ２１発現および高いγＨ２ＡＸ発現からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、この方法は、増殖性細胞においてＤＮＡ損傷の１以上のマーカーの存在を同定するために、前記個体由来の増殖性細胞の集団においてＤＮＡ損傷の１以上のマーカーの存在を決定することをさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーの存在を決定する工程は、薬剤を投与する前に行われる。
【００３０】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、前記個体における増殖性細胞の量は、薬剤の投与を受けない対応する個体に比べて減少する。
【００３１】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞の増殖速度は、薬剤の投与を受けない対応する個体に比べて低下する。
【００３２】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞の少なくとも一部は、細胞周期の停止を受けるように誘導される。
【００３３】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞の少なくとも一部は、アポトーシスを受けるように誘導される。
【００３４】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性疾患は、癌である。いくつかの実施形態において、癌は、結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝胆道癌、尿路癌、脳癌、および皮膚癌からなる群から選択される。
【００３５】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法は、増殖性疾患のための従来療法を前記個体に投与することをさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、この方法は、抗ＰＤ−１療法を前記個体に投与することを含んでなる。
【００３６】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、前記個体は、（ａ）哺乳動物；（ｂ）ヒト；または（ｃ）獣医動物（veterinary animal）である。
【００３７】
本明細書では、別の態様において、個体由来の増殖性細胞の集団において高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ）、またはＭＳＩ−Ｈに関連するマーカーの存在を決定すること、前記増殖性細胞の集団においてＭＳＩ−ＨまたはＭＳＩ−Ｈに関連するマーカーの存在の決定に基づいて、薬剤を前記個体に投与することを含んでなる療法に前記個体が応答する見込みを決定すること、および前記個体が前記療法に応答することが予測される場合に、前記薬剤を前記個体に投与することを含んでなる、増殖性疾患を有する個体を治療する方法に使用するための、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるために有効な薬剤が提供される。いくつかの実施形態において、増殖性細胞の集団におけるＭＳＩ−Ｈの存在の決定は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される１以上のＭＳＩマーカーの存在を決定することを含んでなる。いくつかの実施形態において、前記ＭＳＩ−Ｈマーカーのうち少なくとも１つを有すると決定された増殖性細胞の集団における細胞の量が、その増殖性疾患の所定の閾値を上回る場合に、前記個体は前記療法に応答すると予測される。いくつかの実施形態において、（ａ）前記ＭＳＩ−Ｈマーカーのうち少なくとも１つを有すると決定された増殖性細胞の集団における細胞の量がその増殖性疾患の所定の閾値を下回る場合；または（ｂ）前記増殖性細胞の集団がＭＳＩ−Ｈマーカーを有さないと決定される場合に、前記個体は前記療法に応答しないと予測される。
【００３８】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞の集団におけるＭＳＩ−Ｈに関連するマーカーの存在の決定は、ＤＮＡミスマッチ修復を損なう突然変異の存在の決定を含んでなる。いくつかの実施形態において、突然変異は、ＭｕｔＳホモログにおける突然変異および／またはＭｕｔＬホモログにおける突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＭｕｔＳホモログはＭＳＨ２、ＭＳＨ３、およびＭＳＨ６からなる群から選択され、かつ、ＭｕｔＬホモログはＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、およびＰＭＳ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、突然変異は、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、および／またはＰＭＳ２における突然変異を含んでなる。
【００３９】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞の集団におけるＭＳＩ−Ｈに関連するマーカーの存在の決定は、ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーの存在を決定することを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーは、高いｐ２１発現および高いγＨ２ＡＸ発現からなる群から選択される。
【００４０】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、（ｉ）ＤＮＡミスマッチ修復を障害する少なくとも１つの突然変異および／もしくは（ｉｉ）ＤＮＡ損傷の少なくとも１つのマーカーを有すると決定された増殖性細胞の集団における細胞の量がその増殖性疾患の所定の閾値を上回る場合に、前記個体は前記療法に応答すると予測される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡミスマッチ修復を損なう少なくとも１つの突然変異は、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、および／またはＰＭＳ２における突然変異を含んでなり、かつ、ＤＮＡ損傷の少なくとも１つのマーカーは、高いｐ２１発現および／または高いγＨ２ＡＸ発現を含んでなる。
【００４１】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、（ａ）（ｉ）ＤＮＡミスマッチ修復を損なう少なくとも１つの突然変異および／もしくは（ｉｉ）ＤＮＡ損傷の少なくとも１つのマーカーを有すると決定された増殖性細胞の集団における細胞の量がその増殖性疾患の所定の閾値を下回る場合；または（ｂ）前記増殖性細胞の集団がＤＮＡミスマッチ修復を損なう突然変異もＤＮＡ損傷マーカーも有さないと決定される場合に、前記個体は前記療法に応答しないと予測される。
【００４２】
本明細書では、別の態様において、増殖性疾患と診断されたまたは増殖性疾患であるとされた個体において、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ）およびＷＲＮのヘリカーゼ活性を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、（ａ）前記個体からの生体サンプルをＭＳＩの存在およびＷＲＮのヘリカーゼ活性を検出するための１以上の試薬と接触させること；ならびに（ｂ）（ｉ）ＭＳＩ−Ｈの存在；および（ｉｉ）ＷＲＮのヘリカーゼ活性を検出することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、生体サンプルにおいてＭＳＩ−Ｈの存在を検出するための試薬は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される１以上のＭＳＩマーカーの存在を検出するための試薬を含んでなる。
【００４３】
本明細書では、別の態様において、増殖性疾患と診断されたまたは増殖性疾患であるとされた個体において、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ）に関連するマーカーおよびＷＲＮのヘリカーゼ活性を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、（ａ）前記個体からの生体サンプルをＭＳＩ−Ｈに関連するマーカーの存在およびＷＲＮヘリカーゼのヘリカーゼ活性を検出するための１以上の試薬と接触させること；ならびに（ｂ）（ｉ）ＭＳＩ−Ｈに関連するマーカーの存在；および（ｉｉ）ＷＲＮヘリカーゼのヘリカーゼ活性を検出することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、生体サンプルにおいてＭＳＩ−Ｈに関連するマーカーの存在を検出するための試薬は、（ｉ）ＤＮＡミスマッチ修復を損なう１以上の突然変異、および／または（ｉｉ）ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーの存在を検出するための試薬を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡミスマッチ修復を損なう１以上の突然変異は、ＭｕｔＳホモログにおける突然変異および／またはＭｕｔＬホモログにおける突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＭｕｔＳホモログはＭＳＨ２、ＭＳＨ３、およびＭＳＨ６からなる群から選択され、かつ、ＭｕｔＬホモログはＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、およびＰＭＳ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、１以上の突然変異は、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、および／またはＰＭＳ２における突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーは、高いｐ２１発現および高いγＨ２ＡＸ発現からなる群から選択される。
【００４４】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性疾患は、癌である。いくつかの実施形態において、癌は、結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝胆道癌、尿路癌、脳癌、および皮膚癌からなる群から選択される。
【００４５】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、前記個体は、（ａ）哺乳動物；（ｂ）ヒト；または（ｃ）獣医動物である。
【００４６】
本明細書では、別の態様において、（ａ）内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部もしくは近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を含んでなるｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸；およびｂ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、またはＲＧＥＮをコードする核酸を含んでなる組成物であって、組成物の細胞への送達がその細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させ得るように組成物の成分が構成される、組成物が提供される。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡをコードする核酸はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれ、かつ／またはＲＧＥＮをコードする核酸はＡＡＶベクターに含まれる。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、内因性ＷＲＮ遺伝子のコード領域内のゲノム配列に相補的である。
【００４７】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、組成物は、ドナー核酸を含んでなるドナーテンプレートをさらに含んでなり、ドナーテンプレートは、ドナー核酸が相同組換えによりＷＲＮ遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は１以上の終止コドンをコードし、かつ、ドナーテンプレートは、ドナー核酸がＷＲＮ遺伝子のコード領域に挿入されるように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、連続的に存在する３つの翻訳フレームのそれぞれに３つの終止コドンをコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるＷＲＮヘリカーゼドメインの突然変異をコードする。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターに含まれる。
【００４８】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはその機能的誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮはＣａｓ９である。
【００４９】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードする核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）配列である。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードするＲＮＡ配列は、共有結合を介してｇＲＮＡに連結されている。
【００５０】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードする核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列である。
【００５１】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子中に処方される。いくつかの実施形態において、リポソームまたは脂質ナノ粒子は、ｇＲＮＡを封入する。
【００５２】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮは、ｇＲＮＡとプレ複合体化されて、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。
【００５３】
本明細書では、別の態様において、ドナー核酸を含んでなる核酸構築物を含んでなり、核酸構築物が、相同組換えによる増殖性細胞のゲノムへのドナー核酸の挿入が増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させるように構成される、組成物が提供される。いくつかの実施形態において、核酸構築物は、ＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、内因性ＷＲＮ遺伝子の領域と同一のまたは実質的に相同な配列を有する２つの相同アームを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶクレードＦベクターである。
【００５４】
本明細書では、別の態様において、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞において増殖を低下させるための方法であって、増殖性細胞におけるウェルナー症候群ＡＴＰ依存性ヘリカーゼ（ＷＲＮ）のヘリカーゼ活性を低下させることを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、この方法は、ＷＲＮの阻害剤を増殖性細胞に送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＷＲＮの阻害剤は、小分子阻害剤である。いくつかの実施形態において、小分子阻害剤は式：
【化２】
2021527713.tif 000004
［式中、
Ｌ１は、Ｃ１−４アルキレンであり；
Ｌ２は、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＳＯ２、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、またはＯＣ（Ｏ）ＮＨであり；
Ｌ３は、Ｃ１−８アルキレンであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、またはＣ１−４ハロアルキルであり；かつ
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、Ｃ６−１２アリール、またはＣ６−１２アリール−Ｃ１−４アルキルであり、これらはそれぞれハロゲン、Ｃ１−４アルキル、またはＣ１−４ハロアルキルで場合により置換されていてもよい］
を有するか、またはその薬学上許容可能な塩である。
【００５５】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ＷＲＮの阻害剤は、ＷＲＮ阻害剤にコンジュゲートされた抗体を含んでなる抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含んでなる。
【００５６】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法は、ＷＲＮ  ｍＲＮＡを標的とする阻害性核酸、または前記阻害性核酸をコードする核酸を増殖性細胞に送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなる。
【００５７】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法は、増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性が低下するように増殖性細胞のゲノムを改変し得るヌクレアーゼ、または前記ヌクレアーゼをコードする核酸を増殖性細胞に送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部または近傍のゲノム配列を標的とする転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。
【００５８】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法は、ａ）内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部もしくは近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を含んでなるｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸；およびｂ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、またはＲＧＥＮをコードする核酸を増殖性細胞に送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡをコードする核酸はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれ、かつ／またはＲＧＥＮをコードする核酸はＡＡＶベクターに含まれる。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、内因性ＷＲＮ遺伝子のコード領域内のゲノム配列に相補的である。いくつかの実施形態において、増殖性細胞のゲノムは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により改変される。
【００５９】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法は、ドナー核酸を含んでなるドナーテンプレートを増殖性細胞に送達することをさらに含んでなり、ドナーテンプレートは、ドナー核酸が相同組換えによりＷＲＮ遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は１以上の終止コドンをコードし、かつ、ドナーテンプレートは、ドナー核酸がＷＲＮ遺伝子のコード領域に挿入されるように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、連続的に存在する３つの翻訳フレームのそれぞれに３つの終止コドンをコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるＷＲＮヘリカーゼドメインの突然変異をコードする。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターに含まれる。
【００６０】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはその機能的誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮはＣａｓ９である。
【００６１】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードする核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）配列である。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードするＲＮＡ配列は、共有結合を介してｇＲＮＡに連結されている。
【００６２】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードする核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列である。
【００６３】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子中に処方される。いくつかの実施形態において、リポソームまたは脂質ナノ粒子は、ｇＲＮＡを封入する。
【００６４】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮは、ｇＲＮＡとプレ複合体化されて、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。
【００６５】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法は、ドナー核酸を含んでなる核酸構築物を増殖性細胞に送達することを含んでなり、核酸構築物が、相同組換えによる増殖性細胞のゲノムへのドナー核酸の挿入が増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させるように構成される。いくつかの実施形態において、核酸構築物は、ＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、内因性ＷＲＮ遺伝子の領域と同一のまたは実質的に相同な配列を有する２つの相同アームを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶクレードＦベクターである。
【００６６】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法は、ユビキチン化およびタンパク質分解のためのＷＲＮを標的とするＰＲＯＴＡＣを増殖性細胞に送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＰＲＯＴＡＣは、リンカーを介してＷＲＮリガンドに連結されたＥ３ユビキチンリガーゼリガンドを含んでなる。
【００６７】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される１以上のＭＳＩマーカーを含んでなる。
【００６８】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＤＮＡミスマッチ修復を損なう突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭｕｔＳホモログにおける突然変異および／またはＭｕｔＬホモログにおける突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＭｕｔＳホモログはＭＳＨ２、ＭＳＨ３、およびＭＳＨ６からなる群から選択され、かつ、ＭｕｔＬホモログはＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、およびＰＭＳ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、および／またはＰＭＳ２に突然変異を含んでなる。
【００６９】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーは、高いｐ２１発現および高いγＨ２ＡＸ発現からなる群から選択される。
【００７０】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞における増殖の低下は、増殖性細胞における細胞周期の停止の誘導を含んでなる。
【００７１】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞における増殖の低下は、増殖性細胞におけるアポトーシスの誘導を含んでなる。
【００７２】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法はｉｎ  ｖｉｖｏで実施される。
【００７３】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法はｅｘ  ｖｉｖｏで実施される。
【００７４】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。
【００７５】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、癌細胞である。いくつかの実施形態において、癌は、結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝胆道癌、尿路癌、脳癌、および皮膚癌からなる群から選択される。
【００７６】
上記の実施形態のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、（ａ）哺乳動物細胞；（ｂ）ヒト細胞；または（ｃ）獣医動物細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、ｓｉＲＮＡ処理後のＷＲＮ、ＢＬＭ、およびＭＬＨ１転写産物発現の変化を示す一連のグラフを表す。
【図２】図２は、ＭＳＩ細胞株はＷＲＮノックダウンを受けやすいが、ＭＳＳ細胞株はそうではないことを示す一連のグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、ＷＲＮノックダウンがＭＳＩ細胞においてγＨ２ＡＸおよびｐ２１レベルを上昇させることを示す一連の蛍光顕微鏡写真を表す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、γＨ２ＡＸおよびｐ２１陽性細胞のパーセンテージを定量する一連のグラフを表す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＷＲＮノックダウンがＭＳＩ細胞の細胞周期を変化させることを示す一連のグラフを表す。
【図４Ａ】図４Ａは、ＷＲＮ  ｍＲＮＡの５’ＵＴＲまたはエキソン８に対するｓｉＲＮＡを示す概略図を表す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、５’ＵＴＲ  ｓｉＲＮＡを用いたウエスタンブロットの結果を表す。
【図４Ｃ−１】図４Ｃ−１は、ＷＲＮヘリカーゼドメインがＭＳＩ細胞において増殖表現型のＷＲＮノックダウン欠損を救済することを表す一連のグラフである。
【図４Ｃ−２】図４Ｃ−２は、ＷＲＮヘリカーゼドメインがＭＳＩ細胞において増殖表現型のＷＲＮノックダウン欠損を救済することを表す一連のグラフである。
【図５】図５は、理論に縛られるものではないが、提案されるＷＲＮ−ＭＳＩ  ＳＬ相互作用モデルを表す。
【図６Ａ】図６Ａは、Ａ５４９細胞における、ＭＳＨ２を用いた二重ｓｉＲＮＡ実験の結果を示す一連のグラフを表す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、Ａ５４９細胞における、ＭＳＨ２を用いた二重ｓｉＲＮＡ実験の結果を示す一連のグラフを表す。
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、ＷＲＮおよびＢＬＭノックダウンレベルを表すグラフである。
【図８Ａ−８Ｂ】図８Ａおよび図８Ｂは、ＭＬＨ１およびＭＲＥ１１再発現細胞株がＭＳＩ細胞においてＷＲＮノックダウン表現型を救済しないことを表す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＭＬＨ１およびＭＲＥ１１再発現細胞株がＭＳＩ細胞においてＷＲＮノックダウン表現型を救済しないことを表す。
【図９】図９は、ＷＲＮノックダウン後のＲＫＯ細胞およびＳＷ６２０細胞の免疫蛍光を示す一連の蛍光顕微鏡写真である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＷＲＮ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞のフローサイトメトリードットプロットを表す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＷＲＮ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞のフローサイトメトリードットプロットを表す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ｓｉＲＮＡ耐性ＷＲＮおよび相対的カスパーゼ活性を示すＲｅｓｃｕｅ細胞株を表す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ｓｉＲＮＡ耐性ＷＲＮおよび相対的カスパーゼ活性を示すＲｅｓｃｕｅ細胞株を表す。
【図１２】図１２は、ＭＳＩ細胞株とＭＳＳ細胞株のＮＳＣ化合物の効果を示す一連のグラフを表す。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
本発明者らは、候補アプローチを用いて、ＷＲＮが合成致死であり得るゲノム突然変異パートナーを検討した。ＭＭＲタンパク質の発現は、機能欠失型突然変異またはプロモーターの過剰メチル化によって低減され得る。ＭＭＲ欠陥細胞および腫瘍は、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を示す。
【００７９】
本発明者らは、ＷＲＮとＭＳＩ、特にＭＳＩ−ｈｉｇｈとの間にＳＬ相互作用が存在すると決定付けた。興味深いことに、ＷＲＮは、ヘリカーゼドメインに加えてエキソヌクレアーゼドメインを有する唯一のＲＥＣＱである。ＷＲＮのヘリカーゼドメインにおける突然変異はＷＳ症状をもたらさないが、エキソヌクレアーゼドメインにおける突然変異はもたらす(Kamath-Loeb AS, Zavala-van Rankin DG, Flores-Morales J, Emond MJ, Sidorova JM, Carnevale A, et al., Sci Rep 2017;7:44081 doi 10.1038/srep44081)。対照的に、救済実験を用い、本発明者らは、ＭＳＩ細胞株において機能的ＷＲＮヘリカーゼドメインが生存力の維持に重要であることを示す。この研究では、本発明者らは、ＭＳＩを有する細胞はそれらの生存をＷＲＮに依存していることを見出し、ＷＲＮヘリカーゼドメインを抑制すること（例えば、薬を飲むことによる）またはそうでなければＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させることは、ＭＳＩ、特に、ＭＳＩ−ｈｉｇｈを特徴とする腫瘍を有する癌患者を治療するために有益であり得ることを示唆する。ＷＳ症状はＷＲＮエキソヌクレアーゼの機能不全から生じるので、ＷＲＮエキソヌクレアーゼ活性に影響を及ぼすことなくＷＲＮヘリカーゼ活性を選択的に標的とする療法は、潜在的な有害標的外副作用を最小としつつ標的細胞における合成致死を誘導するために有利であり得る。それにもかかわらず、両方のドメイン、すなわち、ヘリカーゼドメインおよびエキソヌクレアーゼドメインに影響を与える（例えば、ＷＲＮの発現を低下させる、またはＷＲＮを分解する、またはそうでなければその発現または活性（ヘリカーゼ活性を含む）を低下させることによる）治療アプローチが扱いやすい。
【００８０】
定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される総ての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者の１人に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に参照されている総ての特許、出願、公開出願および他の刊行物は、特に明記しない限り、それらの全内容が参照により明示的に組み込まれる。本明細書においてある用語について複数の定義が存在する場合には、特に明記しない限り、この部分のものが優先する。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「１つの(a)」または「１つの(an)」は、１または１以上を意味し得る。
【００８２】
「約」は、本明細書に照らして読む場合に、その平易で通常の意味を有し、例えば、測定可能な値に言及する場合に使用することができ、明示された値からの±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、いっそうより好ましくは±ｌ％、さらにより好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味し得る。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「対象」または「個体」は、処置、観察または実験の対象である動物を指す。「動物」は、冷血および温血脊椎動物および無脊椎動物、例えば、魚類、貝、爬虫類、特に、哺乳動物を含んでなる。「哺乳動物」は、限定されるものではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、霊長類、例えば、サル、チンパンジー、および類人猿、特に、ヒトを含んでなる。
【００８４】
「核酸」または「核酸分子」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により作製されたフラグメント、ならびに連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより作製されたフラグメントなどのポリヌクレオチドを指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）もしくは天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドの鏡像異性形）、または両方の組合せであるモノマーから構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジン塩基またはプリン塩基部分に変化を有し得る。糖修飾は、例えば、１以上のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基での置換を含むか、または糖はエーテルもしくはエステルとして官能基化することもできる。さらに、糖部分全体をアザ糖および炭素環式糖類似体などの立体的および電子的に類似の構造で置換することもできる。塩基部分における修飾の例としては、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、または他の周知の複素環式置換基が含まれる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのような結合の類似体によって連結され得る。ホスホジエステル結合の類似体としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデートなどが含まれる。用語「核酸分子」はまた、ポリアミド骨格に結合した天然に存在するまたは修飾された核酸塩基を含んでなる、いわゆる「ペプチド核酸」を含んでなる。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、融合タンパク質をコードする核酸配列が提供される。いくつかの実施形態において、核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡである。
【００８５】
「コードする(“Coding for” or “encoding”)」は本明細書で使用され、定義されたアミノ酸配列などの他の高分子の合成のためのテンプレートとして機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列の特性を指す。よって、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生体系におけるタンパク質を産生する場合には、そのタンパク質をコードする。
【００８６】
ポリペプチドを「コードする」核酸には、互いに縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードする総ての核酸が含まれる。
【００８７】
「ベクター」または「発現ベクター」は、細胞内で異種核酸の発現を提供するための調節エレメントを有する細胞に異種核酸を導入するために使用される核酸を含む。ベクターとしては、限定されるものではないが、プラスミド、ミニサークル、酵母、およびウイルスゲノムが含まれる。いくつかの実施形態において、ベクターは、プラスミド、ミニサークル、酵母、またはウイルスゲノムである。いくつかの実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスである。いくつかの実施形態において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、大腸菌などの細菌系でのタンパク質発現のためのものである。本明細書で使用される場合、用語「発現」または「タンパク質発現」は、転写されたＲＮＡ分子のタンパク質分子への翻訳を指す。タンパク質発現は、その時間的、空間的、発生的、または形態的な質ならびに定量的または定性的指標を特徴とし得る。いくつかの実施形態において、１または複数のタンパク質は、それらのタンパク質がリガンドの存在下で二量体化するために配置されるように発現される。
【００８８】
本明細書で使用される場合、用語「調節エレメント」は、遺伝子調節活性を有するＤＮＡ分子、例えば、操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の転写および／または翻訳に影響を与える能力を有するものを指す。プロモーター、リーダー、イントロンおよび転写終結領域などの調節エレメントは、遺伝子調節活性を有し、生細胞における遺伝子の全体的発現に不可欠な役割を果たすＤＮＡ分子である。よって、植物で機能する単離された調節エレメント、例えば、プロモーターは、遺伝子工学の方法によって植物の表現型を改変するために有用である。
【００８９】
「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、本明細書で特定されるアミノ酸配列に関して、配列をアラインし、必要に応じて、配列同一性の一部として保存的置換を考慮せずに最大配列同一性パーセントを得るためにギャップを導入した後に、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および／またはシグナル伝達ドメインのそれぞれに関して、参照配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアなどの公開されているコンピューターソフトウエアを用い、当技術分野の技術範囲内にある様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含んでなる、アラインメント評価のための適当なパラメーターを決定することができる。例えば、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータープログラム(Altschul; et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996))を用いて生成されたアミノ酸配列同一性％値はいくつかの検索パラメーターを使用し、そのほとんどはデフォルト値に設定されている。デフォルト値に設定されないもの（例えば、調整可能なパラメーター）は、以下の値：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワードスレッシュホールド（Ｔ）＝１１およびスコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を用いて設定する。
【００９０】
「アルキル」は、示された炭素原子数を有する（すなわち、Ｃ１−６は、１〜６個の炭素を意味する）直鎖または分岐鎖、飽和、脂肪族ラジカルを指す。アルキルは、Ｃ１−２、Ｃ１−３、Ｃ１−４、Ｃ１−５、Ｃ１−６、Ｃ１−７、Ｃ１−８、Ｃ１−９、Ｃ１−１０、Ｃ２−３、Ｃ２−４、Ｃ２−５、Ｃ２−６、Ｃ３−４、Ｃ３−５、Ｃ３−６、Ｃ４−５、Ｃ４−６およびＣ５−６などの任意の炭素数を含み得る。例えば、Ｃ１−６アルキルとしては、限定されるものではないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシルなどが含まれる。アルキルはまた、２０個までの炭素原子を有するアルキル基、例えば、限定されるものではないが、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなども指し得る。
【００９１】
「アルキレン」は、示された炭素原子数を有し（すなわち、Ｃ１−６は、１〜６個の炭素を意味する）、少なくとも２つの他の基で連結している直鎖または分岐鎖、飽和、脂肪族ラジカル、すなわち、二価炭化水素基を指す。アルキレンに連結されているこれらの２つの部分は、アルキレン基の同じ原子または異なる原子に連結されていてもよい。例えば、直鎖アルキレンは、ｎが１、２、３、４、５または６である−（ＣＨ２）ｎ−の二価ラジカルであり得る。代表的なアルキレン基としては、限定されるものではないが、メチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、ペンチレンおよびヘキシレンが含まれる。
【００９２】
「アルケニル」は、少なくとも２個の炭素原子および少なくとも１つの二重結合を有し、かつ、示された炭素原子数を有する（すなわち、Ｃ２−６は、２〜６個の炭素を意味する）直鎖または分岐鎖炭化水素を指す。アルケニルは、Ｃ２、Ｃ２−３、Ｃ２−４、Ｃ２−５、Ｃ２−６、Ｃ２−７、Ｃ２−８、Ｃ２−９、Ｃ２−１０、Ｃ３、Ｃ３−４、Ｃ３−５、Ｃ３−６、Ｃ４、Ｃ４−５、Ｃ４−５、Ｃ５、Ｃ５−６、およびＣ６などの任意の炭素数を含み得る。アルケニル基は、限定されるものではないが、１、２、３、４、５またはそれを超える好適な任意の二重結合数を有し得る。アルケニル基の例としては、限定されるものではないが、ビニル（エテニル）、プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブテニル、ブタジエニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、イソペンテニル、１，３−ペンタジエニル、１，４−ペンタジエニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、１，３−ヘキサジエニル、１，４−ヘキサジエニル、１，５−ヘキサジエニル、２，４−ヘキサジエニル、または１，３，５−ヘキサトリエニルが含まれる。
【００９３】
「アルキニル」は、少なくとも２個の炭素原子および少なくとも１つの三重結合を有し、かつ示された炭素原子数を有する（すなわち、Ｃ２−６は、２〜６個の炭素を意味する）直鎖炭化水素または分岐鎖炭化水素のいずれかを指す。アルキニルは、Ｃ２、Ｃ２−３、Ｃ２−４、Ｃ２−５、Ｃ２−６、Ｃ２−７、Ｃ２−８、Ｃ２−９、Ｃ２−１０、Ｃ３、Ｃ３−４、Ｃ３−５、Ｃ３−６、Ｃ４、Ｃ４−５、Ｃ４−６、Ｃ５、Ｃ５−６、およびＣ６などの任意の炭素数を含み得る。アルキニル基の例としては、限定されるものではないが、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、イソブチニル、ｓｅｃ−ブチニル、ブタジイニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、イソペンチニル、１，３−ペンタジイニル、１，４−ペンタジイニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、１，３−ヘキサジイニル、１，４−ヘキサジイニル、１，５−ヘキサジイニル、２，４−ヘキサジイニル、または１，３，５−ヘキサトリイニルが含まれる。
【００９４】
「ヒドロキシアルキル」または「アルキルヒドロキシ」は、水素原子の少なくとも１つがヒドロキシ基で置換されている、上記で定義されるような、アルキル基を指す。アルキル基に関しては、ヒドロキシアルキル基またはアルキルヒドロキシ基は、Ｃ１−Ｃ６など、好適な任意の炭素原子数を有し得る。典型的なヒドロキシアルキル基としては、限定されるものではないが、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル（ヒドロキシが１位または２位にある場合）、ヒドロキシプロピル（ヒドロキシが１位、２位または３位にある場合）、ヒドロキシブチル（ヒドロキシが１位、２位、３位または４位にある場合）、ヒドロキシペンチル（ヒドロキシが１位、２位、３位、４位または５位にある場合）、ヒドロキシヘキシル（ヒドロキシが１位、２位、３位、４位、５位または６位にある場合）、１，２−ジヒドロキシエチルなどが含まれる。
【００９５】
「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を指す。
【００９６】
「ハロアルキル」は、水素原子の一部または総てがハロゲン原子で置換された、上記で定義されるような、アルキルを指す。アルキル基に関しては、ハロアルキル基は、Ｃ１−Ｃ６など、好適な任意の炭素原子数を有し得る。例えば、ハロアルキルとしては、トリフルオロメチル、フルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチルなどが含まれる。場合によっては、用語「ペルフルオロ」は、総ての水素がフッ素で置換された化合物またはラジカルを定義するために使用することができる。例えば、ペルフルオロメチルは、１，１，１−トリフルオロメチルを指す。
【００９７】
「アリール」は、好適な任意の環原子数および好適な任意の環数を有する芳香環系を指す。アリール基は、好適な任意の環原子数、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個の環原子、ならびに６〜１０環員、６〜１２環員、または６〜１４環員を含み得る。アリール基は、単環式、縮合して二環式基もしくは三環式基を形成したもの、または結合により連結してビアリール基を形成したものであり得る。代表的アリール基としては、フェニル、ナフチルおよびビフェニルが含まれる。他のアリール基としては、メチレン連結基を有する、ベンジルが含まれる。いくつかのアリール基は、フェニル、ナフチルまたはビフェニルなど、６〜１２環員を有する。他のアリール基は、フェニルまたはナフチルなど、６〜１０環員を有する。他のいくつかのアリール基は、フェニルなど、６環員を有する。アリール基は、置換型であっても非置換型であってもよい。
【００９８】
「アリール−アルキル」は、アルキル成分およびアリール成分を有するラジカルを指し、このアルキル成分はアリール成分を結合点に連結している。アルキル成分は、アルキル成分が、アリール成分に、かつ、結合点に連結するように少なくとも二価のアルキレンであること以外は、上記で定義される通りである。アルキル成分は、Ｃ０−６、Ｃ１−２、Ｃ１−３、Ｃ１−４、Ｃ１−５、Ｃ１−６、Ｃ２−３、Ｃ２−４、Ｃ２−５、Ｃ２−６、Ｃ３−４、Ｃ３−５、Ｃ３−６、Ｃ４−５、Ｃ４−６およびＣ５−６など、任意の炭素数を含み得る。場合によっては、アルキル成分は存在しなくてもよい。アリール成分は、上記で定義される通りである。アリール−アルキル基の例としては、限定されるものではないが、ベンジルおよびフェニルエチルが含まれる。
【００９９】
細胞増殖を低下させる方法
本明細書では、一態様において、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を有する増殖性細胞において増殖を低下させる方法であって、増殖性細胞においてウェルナー症候群ＡＴＰ依存性ヘリカーゼ（ＷＲＮ）のヘリカーゼ活性を低下させることを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＩＳＨ−ｈｉｇｈと互換的に使用される高頻度ＭＳＩ（ＭＳＩ−Ｈ）を有することを特徴とする。細胞は、当技術分野で公知のいずれかの方法に従って（例えば、Dudley, Jonathan C., et al., Clinical Cancer Research, 22(4): 813-820, 2016参照）、ＭＳＩまたはＭＳＩ−Ｈとして特徴付けることができる。ＭＳＩ−Ｈは、腫瘍を高頻度のＭＳＩを有すると分類するために使用される。腫瘍は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイを用いてＭＳＩまたはＭＳＩ−ｈｉｇｈとして分類することができる。Ｄｕｄｌｅｙら（前掲）において述べられているように、腫瘍は、（ｉ）正常に比べて、腫瘍で５つのマイクロサテライト遺伝子座の参照パネルから少なくとも２つのマイクロサテライト遺伝子座の大きさに変化がある（通常は縮小）場合（ここで、参照パネルは、２つのモノヌクレオチド遺伝子座（ＢＡＴ−２５およびＢＡＴ−２６）および３つのジヌクレオチド遺伝子座（Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０）を含む「ベセスダパネル」、もしくは５つのモノヌクレオチド遺伝子座（ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＮＲ−２１、ＮＲ−２４、およびＭＯＮＯ−２７）を含むＰｒｏｍｅｇａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＭＳＩ分析システムであり得る）；または（ｉｉ）正常に比べて腫瘍で、５つを超えるマイクロサテライト遺伝子座の参照パネルから３０％を超えるマイクロサテライト遺伝子座の大きさに変化がある場合に、ＰＣＲによってＭＳＩ−Ｈとして分類される。ＭＳＩ−Ｈ表現型は、ミスマッチ修復遺伝子ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭｘｃＳＨ６、およびＰＭＳ２における生殖系列欠陥に関連しており、ＨＮＰＣＣ／Ｌｙｎｃｈ症候群を有する患者からの腫瘍に見られる主要な表現型である。腫瘍は、ＩＨＣ検査で、４つを超えるミスマッチ修復遺伝子のうち少なくとも１つに関してタンパク質発現の欠損を示す場合に、ＭＳＩ−Ｈとして分類される。細胞も同様に、腫瘍に関して本明細書に記載されている試験を用いてＭＳＩ−Ｈとして分類することができる。
【０１００】
いくつかの実施形態において、腫瘍または細胞は、腫瘍組織または細胞と正常組織または細胞の両方から「ベセスダパネル」（ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０）の５つのマイクロサテライト遺伝子座を増幅するためのＰＣＲを用いてＭＳＩ−Ｈとして分類され、腫瘍または細胞は、正常組織または細胞に比べて腫瘍組織または細胞からのマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも２つの大きさに変化がある場合に、ＭＳＩ−Ｈとして分類される。いくつかの実施形態において、マイクロサテライト遺伝子座の大きさの変化は縮小変化である。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、腫瘍または細胞は、腫瘍組織または細胞と正常組織または細胞の両方からＰｒｏｍｅｇａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＭＳＩ分析系（ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＮＲ−２１、ＮＲ−２４、およびＭＯＮＯ−２７）の５つのマイクロサテライト遺伝子座を増幅するためのＰＣＲを用いてＭＳＩ−Ｈとして分類され、この場合、腫瘍または細胞は、正常組織または細胞に比べて腫瘍組織または細胞からのマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも２つの大きさに変化がある場合に、ＭＳＩ−Ｈとして分類される。いくつかの実施形態において、マイクロサテライト遺伝子座の大きさの変化は縮小変化である。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、腫瘍は、腫瘍組織と正常組織の両方で、ＭＭＲタンパク質ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、および／またはＰＭＳ２の発現レベルを決定するためのＩＨＣを用いてＭＳＩ−Ｈとして分類され、この場合、腫瘍は、正常組織に比べて腫瘍組織で、ＭＭＲタンパク質の少なくとも１つに関してタンパク質発現の欠損がある場合に、ＭＳＩ−Ｈとして分類される。いくつかの実施形態において、タンパク質発現の欠損は、少なくとも２０％の低下（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれを超える低下）である。
【０１０３】
これに対して、腫瘍は、（ｉ）正常に比べて腫瘍で、５つのマイクロサテライト遺伝子座の参照パネルから１つのマイクロサテライト遺伝子座の大きさに変化がある場合（ここで、参照パネルは、「ベセスダパネル」もしくはＰｒｏｍｅｇａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＭＳＩ分析系であり得る）；または（ｉｉ）正常に比べて腫瘍で、５つを超えるマイクロサテライト遺伝子座の参照パネルから３０％未満のマイクロサテライト遺伝子座の大きさの変化がある場合に、ＰＣＲによりＭＳＩ−Ｌと分類される。ＭＳＩ−Ｌ腫瘍は、ＭＳＩ−Ｈ腫瘍とは潜在的に異なる分子病因を有する明瞭なミューテーター表現型を表すと思われる(Thibodeau, 1998; Wu et al., 1999, Am J Hum Genetics 65:1291-1298)。細胞は同様に、腫瘍に関する本明細書に記載の試験を用いてＭＳＩ−Ｌとして分類することができる。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、霊長類細胞、例えば、ヒト細胞である。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、獣医動物細胞である。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、癌細胞である。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、循環腫瘍細胞である。
【０１０５】
本明細書では、いくつかの実施形態において、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞において増殖を低下させるための方法であって、増殖性細胞においてＷＲＮのヘリカーゼ活性が低下するように、増殖性細胞にＷＲＮの阻害剤を送達することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＷＲＮ阻害剤は、増殖性細胞においてＷＲＮのエキソヌクレアーゼ活性を低下させない。いくつかの実施形態において、ＷＲＮ阻害剤は、小分子阻害剤である。いくつかの実施形態において、ＷＲＮ阻害剤は、ＷＲＮ阻害剤にコンジュゲートされた抗体を含んでなる抗体薬物複合体（ＡＤＣ）である。いくつかの実施形態において、ＡＤＣにおける抗体は、ＡＤＣを増殖性細胞に標的化する。
【０１０６】
本明細書では、いくつかの実施形態において、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞において増殖を低下させるための方法であって、増殖性細胞においてＷＲＮのヘリカーゼ活性が低下するように、増殖性細胞にＷＲＮの小分子阻害剤を送達することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、小分子ＷＲＮ阻害剤は、増殖性細胞においてＷＲＮのエキソヌクレアーゼ活性を低下させない。いくつかの実施形態において、小分子阻害剤は、式：
【化３】
2021527713.tif 000005
［式中、
Ｌ１は、Ｃ１−４アルキレンであり；
Ｌ２は、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＳＯ２、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、またはＯＣ（Ｏ）ＮＨであり；
Ｌ３は、Ｃ１−８アルキレンであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５は互いに独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、またはＣ１−４ハロアルキルであり；かつ
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、Ｃ６−１２アリール、またはＣ６−１２アリール−Ｃ１−４アルキルであり、これらはそれぞれハロゲン、Ｃ１−４アルキル、またはＣ１−４ハロアルキルで場合により置換されていてもよい］
を有するか、またはその薬学上許容可能な塩である。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ｃ１−４アルキレンである。Ｌ１のＣ１−４アルキレンは、メチレン（ＣＨ２）、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、またはｓｅｃ−ブチレンであり得る。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、ＣＨ２である。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、Ｌ２は、ＯＣ（Ｏ）である。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、Ｌ３は、Ｃ１−８アルキレンである。いくつかの実施形態において、Ｌ３は、Ｃ１−６アルキレンである。Ｌ３のＣ１−８アルキレンは、メチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、ペンテニレン、２，２−ジメチルプロピレン（ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２）、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、またはオクチレンであり得る。いくつかの実施形態において、Ｌ３は、ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２である。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ独立に、Ｈまたはハロゲンである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、Ｈまたはハロゲンである。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれハロゲンである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれハロゲンである。ハロゲンは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩであり得る。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれＣｌである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれＣｌである。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、フェニル、またはベンジルであり、これらはそれぞれハロゲン、Ｃ１−４アルキル、またはＣ１−４ハロアルキルで場合により置換されていてもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ３は、Ｃ１−６アルキルである。Ｒ３のＣ１−６アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、またはヘキシルであり得る。いくつかの実施形態において、Ｒ３は、エチルである。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、小分子阻害剤は、ＮＳＣ  ６１７１４５およびＮＳＣ  １９６３０からなる群から選択される。ＮＳＣ  ６１７１４５は下式を有し、
【化４】
2021527713.tif 000006
ＮＳＣ  １９６３０は下式を有する。
【化５】
2021527713.tif 000007
【０１１３】
いくつかの実施形態において、小分子阻害剤は、ＮＳＣ  ６１７１４５、ＮＳＣ  １９６３０、およびＭＬ−２１６以外である。ＭＬ−２１６は下式を有する。
【化６】
2021527713.tif 000008
【０１１４】
本明細書では、いくつかの実施形態において、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞において増殖を低下させるための方法であって、増殖性細胞においてＷＲＮのヘリカーゼ活性が低下するように、増殖性細胞を、ＷＲＮ阻害剤にコンジュゲートされた抗体を含んでなるＡＤＣと接触させることを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＡＤＣは、増殖性細胞においてＷＲＮのエキソヌクレアーゼ活性を低下させない。いくつかの実施形態において、ＡＤＣにおける抗体は、ＡＤＣを増殖性細胞に標的化する。
【０１１５】
本明細書では、別の態様において、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞において増殖を低下させるための方法であって、増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性が低下するように増殖性細胞のゲノムを改変し得るヌクレアーゼ、または前記ヌクレアーゼをコードする核酸を、増殖性細胞に送達することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、ゲノムに対する改変は、増殖性細胞においてＷＲＮのエキソヌクレアーゼ活性を低下させない。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部または近傍のゲノム配列を標的とする転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）であり、その方法は、内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部もしくは近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を含んでなるｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸を、増殖性細胞に送達することをさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞のゲノムは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により改変される。
【０１１６】
本明細書では、いくつかの実施形態において、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞において増殖を低下させるための方法であって、増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性が低下するように内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部もしくは近傍のゲノム配列を標的とするＴＡＬＥＮもしくはＺＦＮ、または前記ＴＡＬＥＮもしくはＺＦＮをコードする核酸を、増殖性細胞に送達することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、増殖性細胞におけるＷＲＮのエキソヌクレアーゼ活性は低下されない。
【０１１７】
本明細書では、いくつかの実施形態において、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞において増殖を低下させるための方法であって、増殖性細胞においてＷＲＮのヘリカーゼ活性が低下するように、ａ）内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部もしくは近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を含んでなるｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸；およびｂ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、または前記ＲＧＥＮをコードする核酸を、増殖性細胞に送達することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、増殖性細胞におけるＷＲＮのエキソヌクレアーゼ活性は低下されない。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡをコードする核酸はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれ、かつ／またはＲＧＥＮをコードする核酸はＡＡＶベクターに含まれる。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、内因性ＷＲＮ遺伝子のコード領域内のゲノム配列に相補的である。いくつかの実施形態において、増殖性細胞のゲノムは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により改変される。
【０１１８】
ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸およびＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸を、増殖性細胞に送達することを含んでなる本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法は、ドナー核酸を含んでなるドナーテンプレートを増殖性細胞に送達することをさらに含んでなり、ドナーテンプレートは、ドナー核酸が相同組換えによりＷＲＮ遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は１以上の終止コドンをコードし、かつ、ドナーテンプレートは、ドナー核酸がＷＲＮ遺伝子のコード領域に挿入されるように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、連続的に存在する３つの翻訳フレームに３つの終止コドンをコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるＷＲＮヘリカーゼドメインの突然変異をコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるＷＲＮヘリカーゼドメインの欠失をコードする。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターに含まれる。
【０１１９】
ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸およびＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸を、増殖性細胞に送達することを含んでなる本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはその機能的誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮはＣａｓ９である。
【０１２０】
ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸およびＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸を、増殖性細胞に送達することを含んでなる本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法は、ＲＧＥＮをコードする核酸を増殖性細胞に送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードする核酸は、ｍＲＮＡなどのリボ核酸（ＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、この方法は、増殖性細胞にｇＲＮＡを送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードするＲＮＡは、共有結合を介してｇＲＮＡに連結されている。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードする核酸は、ＤＮＡプラスミドなどのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子中に処方される。いくつかの実施形態において、リポソームまたは脂質ナノ粒子は、ｇＲＮＡを封入する。
【０１２１】
ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸およびＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸を、増殖性細胞に送達することを含んでなる本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法は、増殖性細胞にＲＧＥＮを送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、この方法は、ｇＲＮＡを増殖性細胞に送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮは、ｇＲＮＡとプレ複合体化されて、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。
【０１２２】
本明細書では、別の態様において、ＭＳＩを有する増殖性細胞において増殖を低下させるための方法であって、ドナー核酸を含んでなる核酸構築物を増殖性細胞に送達することを含んでなる方法が提供され、この核酸構築物は、相同組換えによる増殖性細胞のゲノムへのドナー核酸の挿入が増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させるように構成される。いくつかの実施形態において、この改変は、増殖性細胞においてＷＲＮエキソヌクレアーゼ活性を低下させない。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は１以上の終止コドンをコードし、かつ、ドナーテンプレートは、ドナー核酸がＷＲＮ遺伝子のコード領域に挿入されるように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、連続的に存在する３つの翻訳フレームのそれぞれに３つの終止コドンをコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるＷＲＮヘリカーゼドメインの突然変異をコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるまたは排除するＷＲＮヘリカーゼドメインの欠失をコードする。いくつかの実施形態において、核酸構築物は、ＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、内因性ＷＲＮ遺伝子の領域と同一のまたは実質的に相同な（例えば、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同のいずれかの）配列を有する２つの相同アームを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶクレードＦベクターである。
【０１２３】
ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞において増殖を低下させるための本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される１以上（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つのいずれか）のＭＳＩマーカーを含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される１つのＭＳＩマーカーを含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される２つのＭＳＩマーカーを含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される３つのＭＳＩマーカーを含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される４つのＭＳＩマーカーを含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される５つのＭＳＩマーカーを含んでなる。
【０１２４】
ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞において増殖を低下させるための本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＤＮＡミスマッチ修復を損なう１以上の突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、１以上の突然変異は、ＭｕｔＳホモログにおける突然変異および／またはＭｕｔＬホモログにおける突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＭｕｔＳホモログは、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、およびＭＳＨ６からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＭｕｔＬホモログは、ＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、およびＰＭＳ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、およびＰＭＳ２から選択される少なくとも１つのＭＭＲタンパク質に突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＬＨ１に突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＳＨ２に突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＳＨ６に突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＰＭＳ２に突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＬＨ１に突然変異およびＭＳＨ２に突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＬＨ１に突然変異およびＭＳＨ６に突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＬＨ１における突然変異およびＰＭＳ２における突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＳＨ２における突然変異およびＭＳＨ６における突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＳＨ２における突然変異およびＰＭＳ２における突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＳＨ６における突然変異およびＰＭＳ２における突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＬＨ１における突然変異、ＭＳＨ２における突然変異、およびＭＳＨ６における突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＬＨ１における突然変異、ＭＳＨ２における突然変異、およびＰＭＳ２における突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＬＨ１における突然変異、ＭＳＨ６における突然変異、およびＰＭＳ２における突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＳＨ２における突然変異、ＭＳＨ６における突然変異、およびＰＭＳ２における突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＬＨ１における突然変異、ＭＳＨ２における突然変異、ＭＳＨ６における突然変異、およびＰＭＳ２における突然変異を含んでなる。
【０１２５】
ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞において増殖を低下させるための本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーは、高いｐ２１発現および高いγＨ２ＡＸ発現からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、高いｐ２１発現を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、高いγＨ２ＡＸ発現を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、高いｐ２１発現および高いγＨ２ＡＸ発現を含んでなる。
【０１２６】
ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞において増殖を低下させるための本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞における増殖の低下は、増殖性細胞における細胞周期の停止の誘導を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、Ｇ１において停止されるように誘導される。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、Ｇ２において停止されるように誘導される。
【０１２７】
ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞において増殖を低下させるための本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞における増殖の低下は、増殖性細胞におけるアポトーシスの誘導を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、カスパーゼ活性を増強するように誘導される。
【０１２８】
ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞において増殖を低下させるための本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法はｉｎ  ｖｉｖｏで実施される。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、哺乳動物に存在する。いくつかの実施形態において哺乳動物は、霊長類、例えば、ヒトである。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、獣医動物に存在する。ＭＳＩを有する増殖性細胞において増殖を低下させるための本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法はｅｘ  ｖｉｖｏで実施される。ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞において増殖を低下させるための本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、哺乳動物に由来する。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、霊長類、例えば、ヒトである。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は獣医動物に由来する。
【０１２９】
ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞において増殖を低下させるための本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、癌細胞である。いくつかの実施形態において、癌としては、限定されるものではないが、結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝胆道癌、尿路癌、脳癌、および皮膚癌が含まれる。
【０１３０】
本明細書では、別の態様において、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞において増殖を低下させるための方法であって、増殖性細胞においてＷＲＮの発現および／または活性を低下させることを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、この方法は、増殖性細胞にＷＲＮの阻害剤を送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＷＲＮ阻害剤は、小分子阻害剤である。いくつかの実施形態において、ＷＲＮ阻害剤は、ＷＲＮ阻害剤にコンジュゲートされた抗体を含んでなる抗体薬物複合体（ＡＤＣ）である。いくつかの実施形態において、ＡＤＣにおける抗体は、ＡＤＣを増殖性細胞に標的化する。いくつかの実施形態において、この方法は、増殖性細胞においてＷＲＮの発現および／または活性を低下させるように増殖性細胞のゲノムを改変し得るヌクレアーゼ、またはヌクレアーゼをコードする核酸を、増殖性細胞に送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部または近傍のゲノム配列を標的とするＴＡＬＥＮまたはＺＦＮである。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼはＲＧＥＮであり、この方法は、内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部もしくは近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を含んでなるｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸を、増殖性細胞に送達することをさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、この方法は、ドナー核酸を含んでなるドナーテンプレートを増殖性細胞に送達することをさらに含んでなり、ドナーテンプレートは、ドナー核酸が相同組換えによりＷＲＮ遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は１以上の終止コドンをコードし、かつ、ドナーテンプレートは、ドナー核酸がＷＲＮ遺伝子のコード領域に挿入されるように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、連続的に存在する３つの翻訳フレームのそれぞれに３つの終止コドンをコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、その活性を低下させるＷＲＮの突然変異をコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、その活性を低下させるＷＲＮの欠失をコードする。
【０１３１】
本明細書では、別の態様において、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞において増殖を低下させるための方法であって、増殖性細胞においてＷＲＮの発現を低下させるように、ＷＲＮ  ｍＲＮＡを標的とする阻害性核酸、または前記阻害性核酸をコードする核酸を、増殖性細胞に送達することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなる。
【０１３２】
本明細書では、別の態様において、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞において増殖を低下させるための方法であって、ユビキチン化およびタンパク質分解のためのＷＲＮを標的とするタンパク質分解誘導キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）を増殖性細胞に送達することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＰＲＯＴＡＣは、リンカーを介してＷＲＮリガンドに連結されたＥ３ユビキチンリガーゼリガンドを含んでなる。
【０１３３】
操作細胞
本明細書では、一態様において、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する操作細胞、例えば、操作哺乳動物細胞（例えば、増殖性細胞（例えば、癌細胞））が提供され、この操作細胞は、対応する非改変細胞に比べてＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させるように改変されている。いくつかの実施形態において、操作細胞は、対応する非改変細胞に比べてＷＲＮエキソヌクレアーゼ活性が低下されない。いくつかの実施形態において、操作細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、霊長類細胞、例えば、ヒト細胞である。いくつかの実施形態において、操作細胞は、獣医動物細胞である。いくつかの実施形態において、操作細胞は、癌細胞である。いくつかの実施形態において、操作細胞は、循環腫瘍細胞である。
【０１３４】
本明細書では、いくつかの実施形態において、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有するインプット細胞を改変することにより作出された操作細胞が提供され、この改変は、インプット細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性が低下するようにインプット細胞のゲノムを改変し得るヌクレアーゼ、または前記ヌクレアーゼをコードする核酸を、インプット細胞に送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、このゲノム改変は、インプット細胞においてＷＲＮエキソヌクレアーゼ活性が低下されない。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部または近傍のゲノム配列を標的とする転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）であり、改変は、内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部もしくは近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を含んでなるｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸を、インプット細胞に送達することをさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、インプット細胞のゲノムは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により改変される。
【０１３５】
本明細書では、いくつかの実施形態において、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有するインプット細胞を改変することにより作出された操作細胞が提供され、この改変は、インプット細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性が低下するように、内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部もしくは近傍のゲノム配列を標的とするＴＡＬＥＮもしくはＺＦＮ、または前記ＴＡＬＥＮもしくはＺＦＮをコードする核酸を、インプット細胞に送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、この改変は、インプット細胞においてＷＲＮエキソヌクレアーゼ活性が低下されない。
【０１３６】
本明細書では、いくつかの実施形態において、ＭＳＩを有するインプット細胞を改変することにより作出された操作細胞が提供され、この改変は、インプット細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性が低下するように、ａ）内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部もしくは近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を含んでなるｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸；およびｂ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、またはＲＧＥＮをコードする核酸を、インプット細胞に送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、この改変は、インプット細胞においてＷＲＮエキソヌクレアーゼ活性が低下されない。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡをコードする核酸はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれ、かつ／またはＲＧＥＮをコードする核酸はＡＡＶベクターに含まれる。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、内因性ＷＲＮ遺伝子のコード領域内のゲノム配列に相補的である。いくつかの実施形態において、インプット細胞のゲノムは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により改変される。
【０１３７】
ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸およびＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸を、インプット細胞に送達することを含んでなる方法により作出された本明細書に記載の操作細胞のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法は、ドナー核酸を含んでなるドナーテンプレートをインプット細胞に送達することをさらに含んでなり、ドナーテンプレートは、ドナー核酸が相同組換えによりＷＲＮ遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は１以上の終止コドンをコードし、かつ、ドナーテンプレートは、ドナー核酸がＷＲＮ遺伝子のコード領域に挿入されるように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、連続的に存在する３つの翻訳フレームのそれぞれに３つの終止コドンをコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるＷＲＮヘリカーゼドメインの突然変異をコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるまたは排除するＷＲＮヘリカーゼドメインの欠失をコードする。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターに含まれる。
【０１３８】
ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸およびＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸を、インプット細胞に送達することを含んでなる方法により作出された本明細書に記載の操作細胞のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはその機能的誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮはＣａｓ９である。
【０１３９】
ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸およびＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸を、インプット細胞に送達することを含んでなる方法により作出された本明細書に記載の操作細胞のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法は、ＲＧＥＮをコードする核酸をインプット細胞に送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードする核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、この方法は、インプット細胞にｇＲＮＡを送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードするＲＮＡは、共有結合を介してｇＲＮＡに連結されている。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードする核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、ＤＮＡプラスミドである。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子中に処方される。いくつかの実施形態において、リポソームまたは脂質ナノ粒子は、ｇＲＮＡを封入する。
【０１４０】
ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸およびＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸を、インプット細胞に送達することを含んでなる方法により作出された本明細書に記載の操作細胞のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法は、インプット細胞にＲＧＥＮを送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、この方法は、インプット細胞にｇＲＮＡを送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮはｇＲＮＡとプレ複合体化されて、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。
【０１４１】
本明細書では、別の態様において、ＭＳＩを有するインプット細胞を改変することにより作出された操作細胞が提供され、この改変は、ドナー核酸を含んでなる核酸構築物をインプット細胞に送達することを含んでなり、核酸構築物は、相同組換えによるインプット細胞のゲノムへのドナー核酸の挿入がインプット細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させるように構成される。いくつかの実施形態において、この改変は、インプット細胞においてＷＲＮエキソヌクレアーゼ活性が低下されない。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は１以上の終止コドンをコードし、かつ、ドナーテンプレートは、ドナー核酸がＷＲＮ遺伝子のコード領域に挿入されるように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、連続的に存在する３つの翻訳フレームのそれぞれに３つの終止コドンをコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるＷＲＮヘリカーゼドメインの突然変異をコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるまたは排除するＷＲＮヘリカーゼドメインの欠失をコードする。いくつかの実施形態において、核酸構築物は、ＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、内因性ＷＲＮ遺伝子の領域と同一のまたは実質的に相同な（例えば、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同のいずれかの）配列を有する２つの相同アームを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶクレードＦベクターである。
【０１４２】
本明細書に記載の操作細胞のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、操作細胞は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される１以上（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つのいずれか）のＭＳＩマーカーを含んでなる。いくつかの実施形態において、操作細胞は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される１つのＭＳＩマーカーを含んでなる。いくつかの実施形態において、操作細胞は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される２つのＭＳＩマーカーを含んでなる。いくつかの実施形態において、操作細胞は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される３つのＭＳＩマーカーを含んでなる。いくつかの実施形態において、操作細胞は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される４つのＭＳＩマーカーを含んでなる。いくつかの実施形態において、操作細胞は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される５つのＭＳＩマーカーを含んでなる。
【０１４３】
本明細書に記載の操作細胞のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、操作細胞は、ＤＮＡミスマッチ修復を損なう１以上の突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、１以上の突然変異は、ＭｕｔＳホモログにおける突然変異および／またはＭｕｔＬホモログにおける突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＭｕｔＳホモログは、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、およびＭＳＨ６からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＭｕｔＬホモログは、ＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、およびＰＭＳ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作細胞は、ＭＬＨ１に突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、操作細胞は、ＭＳＨ２に突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、操作細胞は、ＰＭＳ２に突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、操作細胞は、ＭＬＨ１における突然変異およびＭＳＨ２における突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、操作細胞は、ＭＬＨ１における突然変異およびＰＭＳ２における突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、およびＰＭＳ２から選択される少なくとも１つのＭＭＲタンパク質に突然変異を含んでなる。
【０１４４】
本明細書に記載の操作細胞のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、操作細胞は、ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーは、高いｐ２１発現および高いγＨ２ＡＸ発現からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作細胞は、高いｐ２１発現を含んでなる。いくつかの実施形態において、操作細胞は、高いγＨ２ＡＸ発現を含んでなる。いくつかの実施形態において、操作細胞は、高いｐ２１発現および高いγＨ２ＡＸ発現を含んでなる。
【０１４５】
本明細書に記載の操作細胞のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、操作細胞は、細胞周期の停止の状態にある。いくつかの実施形態において、操作細胞は、Ｇ１で停止される。いくつかの実施形態において、操作細胞は、Ｇ２で停止される。
【０１４６】
本明細書に記載の操作細胞のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、操作細胞は、アポトーシスの状態にある。いくつかの実施形態において、操作細胞は、カスパーゼ活性が増強されている。
【０１４７】
本明細書に記載の操作細胞のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、操作細胞を作出するための改変は、ｉｎ  ｖｉｖｏで実施される。いくつかの実施形態において、操作細胞は、哺乳動物に存在する。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、霊長類、例えば、ヒトである。本明細書に記載の操作細胞のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、操作細胞を作出するための改変は、ｅｘ  ｖｉｖｏで実施される。本明細書に記載の操作細胞のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、操作細胞を作出するための改変は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。いくつかの実施形態において、操作細胞は、哺乳動物に由来する。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、霊長類、例えば、ヒトである。
【０１４８】
本明細書に記載の操作細胞のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、操作細胞は、癌細胞である。いくつかの実施形態において、癌は、限定されるものではないが、結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝胆道癌、尿路癌、脳癌、および皮膚癌が含まれる。
【０１４９】
本明細書では、別の態様において、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する操作細胞、例えば、操作哺乳動物細胞（例えば、増殖性細胞（例えば、癌細胞））が提供され、操作細胞は、対応する非改変細胞に比べてＷＲＮの発現および／または活性を低下させるように改変されている。いくつかの実施形態において、操作細胞は、ＭＳＩを有するインプット細胞を改変することにより作出され、この改変は、（ｉ）インプット細胞におけるＷＲＮの発現が低下するか、もしくは（ｉｉ）インプット細胞におけるＷＲＮの活性が低下するように、インプット細胞のゲノムを改変し得るヌクレアーゼ、または前記ヌクレアーゼをコードする核酸を、インプット細胞に送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、操作細胞は、ＭＳＩを有するインプット細胞を改変することにより作出され、この改変は、ドナー核酸を含んでなる核酸構築物をインプット細胞に送達することを含んでなり、核酸構築物は、相同組換えによるインプット細胞のゲノムへのドナー核酸の挿入が（ｉ）インプット細胞におけるＷＲＮの発現を低下させるか、または（ｉｉ）インプット細胞におけるＷＲＮの活性を低下させるように構成される。
【０１５０】
ゲノム編集の方法
本明細書では、一態様において、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する細胞（例えば、増殖性細胞（例えば、癌細胞））のゲノムを編集する、特に、ＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させるように細胞のゲノムを編集する方法が提供される。いくつかの実施形態において、細胞におけるＷＲＮエキソヌクレアーゼ活性が低下されない。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、霊長類細胞、例えば、ヒト細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、獣医動物細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、癌細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、循環腫瘍細胞である。
【０１５１】
本明細書では、いくつかの実施形態において、ＷＲＮヘリカーゼ活性が低下した操作細胞を作出するために、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する細胞のゲノムを編集する方法であって、細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性が低下するように細胞のゲノムを改変し得るヌクレアーゼ、または前記ヌクレアーゼをコードする核酸を、細胞に送達することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、細胞におけるＷＲＮエキソヌクレアーゼ活性は低下されない。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部または近傍のゲノム配列を標的とする転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）であり、この方法は、内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部もしくは近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を含んでなるｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸を、細胞に送達することをさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、細胞のゲノムは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により改変される。
【０１５２】
本明細書では、いくつかの実施形態において、ＷＲＮヘリカーゼ活性が低下した操作細胞を作出するために、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する細胞のゲノムを編集する方法であって、細胞においてＷＲＮのヘリカーゼ活性が低下するように、内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部または近傍のゲノム配列を標的とするＴＡＬＥＮもしくはＺＦＮ、または前記ヌクレアーゼをコードする核酸を、細胞に送達することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、細胞におけるＷＲＮエキソヌクレアーゼ活性は低下されない。
【０１５３】
本明細書では、いくつかの実施形態において、ＷＲＮヘリカーゼ活性が低下した操作細胞を作出するために、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する細胞のゲノムを編集する方法であって、細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させるように、ａ）内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部もしくは近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を含んでなるｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸；およびｂ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、またはＲＧＥＮをコードする核酸を、細胞に送達することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、細胞におけるＷＲＮエキソヌクレアーゼ活性は低下されない。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡをコードする核酸はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれ、かつ／またはＲＧＥＮをコードする核酸はＡＡＶベクターに含まれる。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、内因性ＷＲＮ遺伝子のコード領域内のゲノム配列に相補的である。いくつかの実施形態において、細胞のゲノムは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により改変される。
【０１５４】
ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸およびＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸を、細胞に送達することを含んでなる、細胞のゲノムを編集するための本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法は、ドナー核酸を含んでなるドナーテンプレートを細胞に送達することをさらに含んでなり、ドナーテンプレートは、ドナー核酸が相同組換えによりＷＲＮ遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は１以上の終止コドンをコードし、ドナーテンプレートは、ドナー核酸がＷＲＮ遺伝子のコード領域に挿入されるように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、連続的に存在する３つの翻訳フレームのそれぞれに３つの終止コドンをコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるＷＲＮヘリカーゼドメインの突然変異をコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるまたは排除するＷＲＮヘリカーゼドメインの欠失をコードする。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターに含まれる。
【０１５５】
ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸およびＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸を、細胞に送達することを含んでなる、細胞のゲノムを編集するための、本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはその機能的誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮはＣａｓ９である。
【０１５６】
ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸およびＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸を、細胞に送達することを含んでなる、細胞のゲノムを編集するための、本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法は、ＲＧＥＮをコードする核酸を細胞に送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードする核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、この方法は、細胞にｇＲＮＡを送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードするＲＮＡは、共有結合を介してｇＲＮＡに連結されている。いくつかの実施形態において、前記ＲＧＥＮをコードする核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、ＤＮＡプラスミドである。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子中に処方される。いくつかの実施形態において、リポソームまたは脂質ナノ粒子は、ｇＲＮＡを封入する。
【０１５７】
ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸およびＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸を、細胞に送達することを含んでなる、細胞のゲノムを編集するための、本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法は、細胞にＲＧＥＮを送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、この方法は、細胞にｇＲＮＡを送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮはｇＲＮＡとプレ複合体化されて、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。
【０１５８】
本明細書では、別の態様において、ＷＲＮヘリカーゼ活性が低下した操作細胞を作出するために、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する細胞のゲノムを編集する方法であって、ドナー核酸を含んでなる核酸構築物を細胞に送達することを含んでなる方法が提供され、核酸構築物は、相同組換えによる細胞のゲノムへのドナー核酸の挿入が細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させるように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は１以上の終止コドンをコードし、ドナーテンプレートは、ドナー核酸がＷＲＮ遺伝子のコード領域に挿入されるように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、連続的に存在する３つの翻訳フレームのそれぞれに３つの終止コドンをコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるＷＲＮヘリカーゼドメインの突然変異をコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるまたは排除するＷＲＮヘリカーゼドメインの欠失をコードする。いくつかの実施形態において、核酸構築物は、ＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、内因性ＷＲＮ遺伝子の領域と同一のまたは実質的に相同な（例えば、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同のいずれかの）配列を有する２つの相同アームを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶクレードＦベクターである。
【０１５９】
本明細書では、別の態様において、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する細胞（例えば、増殖性細胞（例えば、癌細胞））のゲノムを編集する、特に、ＷＲＮの発現および／または活性を低下させるように細胞のゲノムを編集する方法が提供される。いくつかの実施形態において、この方法は、（ｉ）細胞におけるＷＲＮの発現が低下するか、もしくは（ｉｉ）細胞におけるＷＲＮの活性が低下するように細胞のゲノムを改変し得るヌクレアーゼ、または前記ヌクレアーゼをコードする核酸を、細胞に送達することを含んでなる。いくつかの実施形態において、この方法は、ドナー核酸を含んでなる核酸構築物を細胞に送達することを含んでなり、核酸構築物は、相同組換えによる細胞のゲノムへのドナー核酸の挿入が（ｉ）細胞におけるＷＲＮの発現を低下させるか、または（ｉｉ）細胞におけるＷＲＮの活性を低下させるように構成される。
【０１６０】
治療方法
本明細書では、いくつかの実施形態において、それを必要とする個体において、疾患または病態を治療する方法であって、ここで、疾患または病態は、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する細胞で特徴づけられ、方法は、細胞においてＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させるために有効な薬剤を個体に投与することを含んでなる、方法が提供される。いくつかの実施形態において、個体への薬剤の投与は、細胞においてＷＲＮエキソヌクレアーゼ活性を低下させない。いくつかの実施形態において、疾患または病態は増殖性疾患であり、細胞はＭＳＩを有する増殖性細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は癌細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は循環腫瘍細胞である。
【０１６１】
本明細書では、別の態様において、それを必要とする個体において増殖性疾患を治療する方法であって、増殖性疾患は、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞で特徴づけられ、増殖性細胞においてＷＲＮのヘリカーゼ活性が低下するように、ＷＲＮの阻害剤を含んでなる医薬組成物を個体に投与することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＷＲＮ阻害剤は、増殖性細胞においてＷＲＮのエキソヌクレアーゼ活性を低下させない。いくつかの実施形態において、ＷＲＮ阻害剤は、小分子阻害剤である。いくつかの実施形態において、ＷＲＮ阻害剤は、ＷＲＮ阻害剤にコンジュゲートされた抗体を含んでなるＡＤＣである。いくつかの実施形態において、ＡＤＣにおける抗体は、ＡＤＣを増殖性細胞に標的化する。
【０１６２】
本明細書では、いくつかの実施形態において、それを必要とする個体において増殖性疾患を治療する方法であって、増殖性疾患は、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞で特徴づけられ、増殖性細胞においてＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下するように、ＷＲＮの小分子阻害剤を含んでなる医薬組成物を個体に投与することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、小分子ＷＲＮ阻害剤は、増殖性細胞においてＷＲＮのエキソヌクレアーゼ活性を低下させない。いくつかの実施形態において、小分子阻害剤は式：
【化７】
2021527713.tif 000009
［式中、
Ｌ１は、Ｃ１−４アルキレンであり；
Ｌ２は、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＳＯ２、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、またはＯＣ（Ｏ）ＮＨであり；
Ｌ３は、Ｃ１−８アルキレンであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、またはＣ１−４ハロアルキルであり；かつ
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、Ｃ６−１２アリール、またはＣ６−１２アリール−Ｃ１−４アルキルであり、これらはそれぞれハロゲン、Ｃ１−４アルキル、またはＣ１−４ハロアルキルで場合により置換されていてもよい］
を有するか、またはその薬学上許容可能な塩である。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ｃ１−４アルキレンである。Ｌ１のＣ１−４アルキレンは、メチレン（ＣＨ２）、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、またはｓｅｃ−ブチレンであり得る。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、ＣＨ２である。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、Ｌ２は、ＯＣ（Ｏ）である。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、Ｌ３は、Ｃ１−８アルキレンである。いくつかの実施形態において、Ｌ３は、Ｃ１−６アルキレンである。Ｌ３のＣ１−８アルキレンは、メチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、ペンテニレン、２，２−ジメチルプロピレン（ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２）、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、またはオクチレンであり得る。いくつかの実施形態において、Ｌ３は、ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２である。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ独立に、Ｈまたはハロゲンである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、Ｈまたはハロゲンである。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれハロゲンである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれハロゲンである。ハロゲンはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩであり得る。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれＣｌである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれＣｌである。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、フェニル、またはベンジルであり、これらはそれぞれハロゲン、Ｃ１−４アルキル、またはＣ１−４ハロアルキルで場合により置換されていてもよい。いくつかの実施形態において、Ｒ３は、Ｃ１−６アルキルである。Ｒ３のＣ１−６アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、またはヘキシルであり得る。いくつかの実施形態において、Ｒ３はエチルである。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、小分子阻害剤は、ＮＳＣ  ６１７１４５およびＮＳＣ  １９６３０からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、小分子阻害剤は、ＮＳＣ  ６１７１４５、ＮＳＣ  １９６３０、およびＭＬ−２１６以外である。
【０１６９】
本明細書では、いくつかの実施形態において、それを必要とする個体において増殖性疾患を治療する方法であって、増殖性疾患は、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞で特徴づけられ、増殖性細胞においてＷＲＮのヘリカーゼ活性が低下するように、ＷＲＮ阻害剤にコンジュゲートされた抗体を含んでなるＡＤＣを含んでなる医薬組成物を個体に投与することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＡＤＣは、増殖性細胞においてＷＲＮのエキソヌクレアーゼ活性を低下させない。いくつかの実施形態において、ＡＤＣにおける抗体は、ＡＤＣを増殖性細胞に標的化する。
【０１７０】
本明細書では、別の態様において、それを必要とする個体において増殖性疾患を治療する方法であって、増殖性疾患は、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞で特徴づけられ、増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性が低下するように増殖性細胞のゲノムを改変し得るヌクレアーゼ、または前記ヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなる医薬組成物を個体に投与することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、増殖性細胞におけるＷＲＮエキソヌクレアーゼ活性は低下されない。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部または近傍のゲノム配列を標的とする転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）であり、この方法は、内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部もしくは近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を含んでなるｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸を個体に投与することをさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞のゲノムは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により改変される。
【０１７１】
本明細書では、いくつかの実施形態において、それを必要とする個体において増殖性疾患を治療する方法であって、増殖性疾患は、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞で特徴づけられ、増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性が低下するように、内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部または近傍のゲノム配列を標的とするＴＡＬＥＮもしくはＺＦＮ、または前記ヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなる医薬組成物を個体に投与することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、増殖性細胞におけるＷＲＮエキソヌクレアーゼ活性は低下されない。
【０１７２】
本明細書では、いくつかの実施形態において、それを必要とする個体において増殖性疾患を治療する方法であって、増殖性疾患は、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）を有する増殖性細胞で特徴づけられ、増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させるように、ａ）内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部もしくは近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を含んでなるｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸；およびｂ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、またはＲＧＥＮをコードする核酸を含んでなる医薬組成物を個体に投与することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、増殖性細胞におけるＷＲＮエキソヌクレアーゼ活性は低下されない。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡをコードする核酸はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれ、かつ／または前記ＲＧＥＮをコードする核酸はＡＡＶベクターに含まれる。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、内因性ＷＲＮ遺伝子のコード領域内のゲノム配列に相補的である。いくつかの実施形態において、増殖性細胞のゲノムは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により改変される。
【０１７３】
ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸およびＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸を、個体に投与することを含んでなる本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法は、ドナー核酸を含んでなるドナーテンプレートを個体に投与することをさらに含んでなり、ドナーテンプレートは、ドナー核酸が相同組換えによりＷＲＮ遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は１以上の終止コドンをコードし、ドナーテンプレートは、ドナー核酸がＷＲＮ遺伝子のコード領域に挿入されるように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、連続的に存在する３つの翻訳フレームのそれぞれに３つの終止コドンをコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるＷＲＮヘリカーゼドメインの突然変異をコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるまたは排除するＷＲＮヘリカーゼドメインの欠失をコードする。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターに含まれる。
【０１７４】
ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸およびＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸を、個体に投与することを含んでなる本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはその機能的誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮはＣａｓ９である。
【０１７５】
ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸およびＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸を、個体に投与することを含んでなる本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法は、ＲＧＥＮをコードする核酸を個体に投与することを含んでなる。いくつかの実施形態において、前記ＲＧＥＮをコードする核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、この方法は、ｇＲＮＡを個体に投与することを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードするＲＮＡは、共有結合を介してｇＲＮＡに連結されている。いくつかの実施形態において、前記ＲＧＥＮをコードする核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、ＤＮＡプラスミドである。いくつかの実施形態において、前記ＲＧＥＮをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子中に処方される。いくつかの実施形態において、リポソームまたは脂質ナノ粒子は、ｇＲＮＡを封入する。
【０１７６】
ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸およびＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸を、個体に投与することを含んでなる本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法は、ＲＧＥＮを個体に投与することを含んでなる。いくつかの実施形態において、この方法は、ｇＲＮＡを個体に投与することを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮはｇＲＮＡとプレ複合体化されて、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。
【０１７７】
本明細書では、別の態様において、それを必要とする個体において増殖性疾患を治療する方法であって、増殖性疾患は、ＭＳＩを有する増殖性細胞で特徴づけられ、ドナー核酸を含んでなる核酸構築物を含んでなる医薬組成物を個体に投与することを含んでなる方法が提供され、核酸構築物は、相同組換えによる増殖性細胞のゲノムへのドナー核酸の挿入が増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させるように構成される。いくつかの実施形態において、ＷＲＮエキソヌクレアーゼ活性は、増殖性細胞において低下されない。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は１以上の終止コドンをコードし、ドナーテンプレートは、ドナー核酸がＷＲＮ遺伝子のコード領域に挿入されるように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、連続的に存在する３つの翻訳フレームのそれぞれに３つの終止コドンをコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるＷＲＮヘリカーゼドメインの突然変異をコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるまたは排除するＷＲＮヘリカーゼドメインの欠失をコードする。いくつかの実施形態において、核酸構築物は、ＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、内因性ＷＲＮ遺伝子の領域と同一のまたは実質的に相同な（例えば、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同のいずれかの）配列を有する２つの相同アームを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶクレードＦベクターである。
【０１７８】
増殖性疾患を治療するための本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される１以上（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つのいずれか）のＭＳＩマーカーを含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される１つのＭＳＩマーカーを含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される２つのＭＳＩマーカーを含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される３つのＭＳＩマーカーを含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される４つのＭＳＩマーカーを含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される５つのＭＳＩマーカーを含んでなる。いくつかの実施形態において、この方法は、増殖性細胞においてＭＳＩの存在を特定するために、個体からの増殖性細胞の集団において１以上のＭＳＩマーカーの存在を決定することをさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、１以上のＭＳＩマーカーの存在を決定する工程は、医薬組成物を投与する前に行われる。
【０１７９】
増殖性疾患を治療するための本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＤＮＡミスマッチ修復を損なう１以上の突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、１以上の突然変異は、ＭｕｔＳホモログにおける突然変異および／またはＭｕｔＬホモログにおける突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＭｕｔＳホモログは、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、およびＭＳＨ６からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＭｕｔＬホモログは、ＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、およびＰＭＳ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＬＨ１に突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＳＨ２に突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＰＭＳ２に突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＬＨ１における突然変異およびＭＳＨ２における突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＬＨ１における突然変異およびＰＭＳ２における突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、およびＰＭＳ２から選択される少なくとも１つのＭＭＲタンパク質に突然変異を含んでなる。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、この方法は、増殖性細胞において１以上の突然変異の存在を特定するために、個体からの増殖性細胞の集団において１以上の突然変異の存在を決定することをさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、１以上の突然変異の存在を決定する工程は、医薬組成物を投与する前に行われる。
【０１８１】
増殖性疾患を治療するための本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーは、高いｐ２１発現および高いγＨ２ＡＸ発現からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、高いｐ２１発現を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、高いγＨ２ＡＸ発現を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞は、高いｐ２１発現および高いγＨ２ＡＸ発現を含んでなる。いくつかの実施形態において、この方法は、増殖性細胞においてＤＮＡ損傷の１以上のマーカーの存在を特定するために、個体からの増殖性細胞の集団においてＤＮＡ損傷の１以上のマーカーの存在を決定することをさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーの存在を決定する工程は、医薬組成物を投与する前に行われる。
【０１８２】
増殖性疾患を治療するための本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、個体における増殖性細胞の量は、医薬組成物の投与を受けていない対応する個体に比べて減少する。
【０１８３】
増殖性疾患を治療するための本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞の増殖速度は、医薬組成物の投与を受けていない対応する個体に比べて低下する。
【０１８４】
増殖性疾患を治療するための本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞の少なくとも一部は、細胞周期の停止を受けるように誘導される。いくつかの実施形態において、増殖性細胞の少なくとも一部は、Ｇ１において停止されるように誘導される。いくつかの実施形態において、増殖性細胞の少なくとも一部は、Ｇ２において停止されるように誘導される。
【０１８５】
増殖性疾患を治療するための本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性細胞の少なくとも一部は、アポトーシスを受けるように誘導される。いくつかの実施形態において、増殖性細胞の少なくとも一部は、カスパーゼ活性を増強するように誘導される。
【０１８６】
増殖性疾患を治療するための本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、個体は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、霊長類、例えば、ヒトである。増殖性疾患を治療するための本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、個体は獣医動物である。
【０１８７】
増殖性疾患を治療するための本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、増殖性疾患は、癌である。いくつかの実施形態において、癌としては、限定されるものではないが、結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胆管道癌、尿路癌、脳癌、および皮膚癌が含まれる。
【０１８８】
増殖性疾患を治療するための本明細書に記載の方法のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この方法は、増殖性疾患のための従来療法を個体に投与することをさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、従来療法は、抗ＰＤ−１療法である。
【０１８９】
本明細書では、別の態様において、それを必要とする個体において疾患または病態を治療する方法であって、ここで、疾患または病態は、ＭＳＩを有する細胞で特徴づけられ、方法は、細胞においてＷＲＮの発現および／または活性を低下させるために有効な薬剤を個体に投与することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＷＲＮの阻害剤である。いくつかの実施形態において、薬剤は、小分子阻害剤である。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＷＲＮ阻害剤にコンジュゲートされた抗体を含んでなるＡＤＣである。いくつかの実施形態において、薬剤は、（ｉ）増殖性細胞におけるＷＲＮの発現が低下するか、または（ｉｉ）増殖性細胞におけるＷＲＮの活性（例えば、ＷＲＮのヘリカーゼ活性）が低下するように、増殖性細胞のゲノムを改変し得るヌクレアーゼ、または前記ヌクレアーゼをコードする核酸である。いくつかの実施形態において、薬剤は、ドナー核酸を含んでなる核酸構築物であり、核酸構築物は、相同組換えによる増殖性細胞のゲノムへのドナー核酸の挿入が（ｉ）増殖性細胞におけるＷＲＮの発現を低下させるか、または（ｉｉ）増殖性細胞におけるＷＲＮの活性を低下させるように構成される。
【０１９０】
本明細書では、別の態様において、それを必要とする個体において増殖性疾患を治療する方法であって、増殖性疾患は、ＭＳＩを有する増殖性細胞で特徴づけられ、増殖性細胞においてＷＲＮの発現が低下するように、ＷＲＮ  ｍＲＮＡを標的とする阻害性核酸、または前記阻害性核酸をコードする核酸を含んでなる医薬組成物を個体に投与することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなる。
【０１９１】
本明細書では、別の態様において、それを必要とする個体において増殖性疾患を治療する方法であって、増殖性疾患は、ＭＳＩを有する増殖性細胞で特徴づけられ、ユビキチン化およびタンパク質分解のためのＷＲＮを標的とするタンパク質分解誘導キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）を含んでなる医薬組成物を個体に投与することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＰＲＯＴＡＣは、リンカーを介してＷＲＮリガンドに連結されたＥ３ユビキチンリガーゼリガンドを含んでなる。
【０１９２】
診断方法
本明細書では、別の態様において、増殖性疾患と診断された個体が、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるために有効な薬剤を個体に投与することを含んでなる療法に応答し得るかを予測するための方法であって、個体からの増殖性細胞の集団においてＭＳＩ、またはＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）に関連するマーカーの存在を決定すること、および増殖性細胞の集団におけるＭＳＩ、またはＭＳＩに関連するマーカーの存在の決定に基づき、その個体がその療法に応答する見込みを決定することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、増殖性細胞の集団は、癌細胞を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞の集団は、循環腫瘍細胞を含んでなる。いくつかの実施形態において、個体は、哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、ヒト）である。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。いくつかの実施形態において、個体は獣医動物である。
【０１９３】
本明細書では、別の態様において、増殖性疾患と診断された個体が、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるために有効な薬剤を個体に投与することを含んでなる療法に応答し得るかを予測するための方法であって、個体からの増殖性細胞の集団においてＭＳＩの存在を決定すること、および増殖性細胞の集団におけるＭＳＩの存在の決定に基づき、その個体がその療法に応答する見込みを決定することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、増殖性細胞の集団におけるＭＳＩの存在の決定が、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される１以上のＭＳＩマーカーの存在の決定を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＭＳＩマーカーのうち少なくとも１つを有すると決定された増殖性細胞の集団における細胞の量がその増殖性疾患の所定の閾値を上回る場合に、その個体はその療法に応答すると予測される。いくつかの実施形態において、（ａ）ＭＳＩマーカーのうち少なくとも１つを有すると決定された増殖性細胞の集団における細胞の量がその増殖性疾患の所定の閾値を下回る場合；または（ｂ）増殖性細胞の集団がＭＳＩマーカーを有さないと決定される場合に、その個体はその療法に応答しないと予測される。いくつかの実施形態において、増殖性疾患は、癌である。いくつかの実施形態において、癌としては、限定されるものではないが、結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝胆道癌、尿路癌、脳癌、および皮膚癌が含まれる。いくつかの実施形態において、個体は、哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、ヒト）である。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。いくつかの実施形態において、個体は獣医動物である。
【０１９４】
本明細書では、別の態様において、増殖性疾患と診断された個体が、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるために有効な薬剤を個体に投与することを含んでなる療法に応答し得るかを予測するための方法であって、個体からの増殖性細胞の集団においてＭＳＩに関連するマーカーの存在を決定すること、および増殖性細胞の集団におけるＭＳＩに関連するマーカーの存在の決定に基づき、その個体がその療法に応答する見込みを決定することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、増殖性細胞の集団におけるＭＳＩに関連するマーカーの存在の決定は、ＤＮＡミスマッチ修復を損なう突然変異の存在の決定を含んでなる。いくつかの実施形態において、突然変異は、ＭｕｔＳホモログにおける突然変異および／またはＭｕｔＬホモログにおける突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＭｕｔＳホモログは、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、およびＭＳＨ６からなる群から選択され、ＭｕｔＬホモログは、ＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、およびＰＭＳ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、突然変異は、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、および／またはＰＭＳ２における突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、突然変異は、ＭＬＨ１およびＭＳＨ２における突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、突然変異は、ＭＬＨ１およびＰＭＳ２における突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、突然変異は、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、およびＰＭＳ２から選択される少なくとも１つのＭＭＲタンパク質における突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性細胞の集団におけるＭＳＩに関連するマーカーの存在の決定は、ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーの存在の決定を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーは、高いｐ２１発現および高いγＨ２ＡＸ発現からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、（ｉ）ＤＮＡミスマッチ修復を損なう少なくとも１つの突然変異および／または（ｉｉ）ＤＮＡ損傷の少なくとも１つのマーカーを有すると決定された増殖性細胞の集団における細胞の量がその増殖性疾患の所定の閾値を上回る場合に、その個体はその療法に応答すると予測される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡミスマッチ修復を損なう少なくとも１つの突然変異は、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、および／またはＰＭＳ２における突然変異を含んでなり、ＤＮＡ損傷の少なくとも１つのマーカーは、高いｐ２１発現および／または高いγＨ２ＡＸ発現を含んでなる。いくつかの実施形態において、（ａ）（ｉ）ＤＮＡミスマッチ修復を損なう少なくとも１つの突然変異および／もしくは（ｉｉ）ＤＮＡ損傷の少なくとも１つのマーカーを有すると決定された増殖性細胞の集団における細胞の量がその増殖性疾患の所定の閾値を下回る場合；または（ｂ）増殖性細胞の集団がＤＮＡミスマッチ修復を損なう突然変異もＤＮＡ損傷マーカーも有さないと決定された場合に、その個体はその療法に応答しないと予測される。いくつかの実施形態において、増殖性疾患は、癌である。いくつかの実施形態において、癌としては、限定されるものではないが、結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝��道癌、尿路癌、脳癌、および皮膚癌が含まれる。いくつかの実施形態において、個体は、哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、ヒト）である。いくつかの実施形態において、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態において、個体は獣医動物である。
【０１９５】
本明細書では、別の態様において、増殖性疾患と診断されたまたは増殖性疾患であるとされた個体において、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）（またはＭＳＩ−Ｈ）およびＷＲＮのヘリカーゼ活性を検出するための方法であって、（ａ）前記個体からの生体サンプルをＭＳＩおよびＷＲＮのヘリカーゼ活性の存在を検出するための１以上の試薬と接触させること；ならびに（ｂ）（ｉ）ＭＳＩの存在；および（ｉｉ）ＷＲＮのヘリカーゼ活性を検出することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、生体サンプルにおいてＭＳＩの存在を検出するための試薬は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される１以上のＭＳＩマーカーの存在を検出するための試薬を含んでなる。いくつかの実施形態において、増殖性疾患は、癌である。いくつかの実施形態において、癌としては、限定されるものではないが、結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝胆道癌、尿路癌、脳癌、および皮膚癌が含まれる。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、癌細胞を含んでなる。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、循環腫瘍細胞を含んでなる。いくつかの実施形態において、個体は、哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、ヒト）である。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。いくつかの実施形態において、個体は獣医動物である。
【０１９６】
本明細書では、別の態様において、増殖性疾患と診断されたまたは増殖性疾患であるとされた個体において、ＭＳＩ（またはＭＳＩ−Ｈ）に関連するマーカーおよびＷＲＮのヘリカーゼ活性を検出するための方法であって、（ａ）前記個体からの生体サンプルをＭＳＩに関連するマーカーおよびＷＲＮのヘリカーゼ活性の存在を検出するための１以上の試薬と接触させること；および（ｂ）（ｉ）ＭＳＩに関連するマーカーの存在；および（ｉｉ）ＷＲＮのヘリカーゼ活性を検出することを含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態において、生体サンプルにおいてＭＳＩに関連するマーカーの存在を検出するための試薬は、（ｉ）ＤＮＡミスマッチ修復を損なう１以上の突然変異および／または（ｉｉ）ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーの存在を検出するための試薬を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡミスマッチ修復を損なう１以上の突然変異は、ＭｕｔＳホモログにおける突然変異および／またはＭｕｔＬホモログにおける突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＭｕｔＳホモログは、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、およびＭＳＨ６からなる群から選択され、ＭｕｔＬホモログは、ＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、およびＰＭＳ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、１以上の突然変異は、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、および／またはＰＭＳ２における突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、１以上の突然変異は、ＭＬＨ１およびＭＳＨ２における突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、１以上の突然変異は、ＭＬＨ１およびＰＭＳ２における突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、この突然変異は、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、およびＰＭＳ２から選択される少なくとも１つのＭＭＲタンパク質における突然変異を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーは、高いｐ２１発現および高いγＨ２ＡＸ発現からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、増殖性疾患は、癌である。いくつかの実施形態において、癌としては、限定されるものではないが、結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝胆道癌、尿路癌、脳癌、および皮膚癌が含まれる。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、癌細胞を含んでなる。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、循環腫瘍細胞を含んでなる。いくつかの実施形態において、個体は、哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、ヒト）である。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。いくつかの実施形態において、個体は獣医動物である。
【０１９７】
組成物
本明細書では、一態様において、（ａ）内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部もしくは近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を含んでなるｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸；およびｂ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、またはＲＧＥＮをコードする核酸を含んでなる組成物が提供され、この組成物の成分は、細胞への組成物の送達がその細胞においてＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させ得るように構成される。いくつかの実施形態において、細胞への組成物の送達は、その細胞においてＷＲＮエキソヌクレアーゼ活性を低下させない。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡをコードする核酸はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれ、かつ／またはＲＧＥＮをコードする核酸はＡＡＶベクターに含まれる。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、内因性ＷＲＮ遺伝子のコード領域内のゲノム配列に相補的である。いくつかの実施形態において、この組成物は、ドナー核酸を含んでなるドナーテンプレートをさらに含んでなり、ドナーテンプレートは、ドナー核酸が相同組換えによりＷＲＮ遺伝子座に挿入され得るように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は１以上の終止コドンをコードし、ドナーテンプレートは、ドナー核酸がＷＲＮ遺伝子のコード領域に挿入されるように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、連続的に存在する３つの翻訳フレームのそれぞれに３つの終止コドンをコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるＷＲＮヘリカーゼドメインの突然変異をコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるまたは排除するＷＲＮヘリカーゼドメインの欠失をコードする。いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートは、ＡＡＶベクターに含まれる。
【０１９８】
ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸およびＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸を含んでなる、本明細書に記載の組成物のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはその機能的誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮはＣａｓ９である。
【０１９９】
ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸およびＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸を含んでなる、本明細書に記載の組成物のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この組成物は、ＲＧＥＮをコードする核酸を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードする核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、この組成物は、ｇＲＮＡを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードするＲＮＡは、共有結合を介してｇＲＮＡに連結されている。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードする核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、ＤＮＡプラスミドである。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子中に処方される。いくつかの実施形態において、リポソームまたは脂質ナノ粒子は、ｇＲＮＡを封入する。
【０２００】
ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸およびＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸を含んでなる、本明細書に記載の組成物のいずれかによれば、いくつかの実施形態において、この組成物は、ＲＧＥＮを含んでなる。いくつかの実施形態において、この組成物は、ｇＲＮＡを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＲＧＥＮはｇＲＮＡとプレ複合体化されて、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。
【０２０１】
本明細書では、別の態様において、ドナー核酸を含んでなる核酸構築物を含んでなる組成物が提供され、核酸構築物は、相同組換えによる増殖性細胞のゲノムへのドナー核酸の挿入が増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させるように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は１以上の終止コドンをコードし、ドナーテンプレートは、ドナー核酸がＷＲＮ遺伝子のコード領域に挿入されるように構成される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、連続的に存在する３つの翻訳フレームのそれぞれに３つの終止コドンをコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるＷＲＮヘリカーゼドメインの突然変異をコードする。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるまたは排除するＷＲＮヘリカーゼドメインの欠失をコードする。いくつかの実施形態において、核酸構築物は、ＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、内因性ＷＲＮ遺伝子の領域と同一のまたは実質的に相同な（例えば、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同のいずれかの）配列を有する２つの相同アームを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶクレードＦベクターである。
【０２０２】
核酸
ゲノム標的核酸またはガイドＲＮＡ
本開示は、関連のポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチドまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ）の活性を標的核酸内の特定の標的配列に向け得るゲノム標的核酸を提供する。いくつかの実施形態において、ゲノム標的核酸は、ＲＮＡである。ゲノム標的ＲＮＡは、本明細書では「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と呼ばれる。ガイドＲＮＡは、少なくとも対象とする標的核酸配列にハイブリダイズするスペーサー配列とＣＲＩＳＰＲリピート配列を有する。タイプＩＩシステムにおいて、ｇＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも有する。タイプＩＩガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ＣＲＩＳＰＲリピート配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列は互いにハイブリダイズして二本鎖を形成する。タイプＶガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ｃｒＲＮＡが二本鎖を形成する。両システムとも、この二本鎖は、ガイドＲＮＡと部位特異的ポリペプチドが複合体を形成するように部位特異的ポリペプチドと結合する。ゲノム標的核酸は、その部位特異的ポリペプチドとの会合のために前記複合体に標的特異性を与える。よって、ゲノム標的核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を指示する。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、ゲノム標的核酸は、ダブル分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ゲノム標的核酸は、シングル分子ガイドＲＮＡである。ダブル分子ガイドＲＮＡは、２つのＲＮＡ鎖を有する。第１の鎖は、５’から３’方向に、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列および最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列を有する。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列に相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列および任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を有する。タイプＩＩシステムのシングル分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’方向に、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列、シングル分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列および任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を有する。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長部は、ガイドＲＮＡに付加的機能性（例えば、安定性）に寄与するエレメントを有し得る。シングル分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲリピートと最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を連結してヘアピン構造を形成する。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長部は、１以上のヘアピンを有する。タイプＶシステムのシングル分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’方向に、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列およびスペーサー配列を有する。
【０２０４】
例示的ゲノム標的核酸は、ＷＯ２０１８００２７１９に記載されている。
【０２０５】
ドナーＤＮＡまたはドナーテンプレート
ＤＮＡエンドヌクレアーゼなどの部位特異的ポリペプチドは、核酸、例えば、ゲノムＤＮＡに二本鎖切断または一本鎖切断を導入することができる。二本酸切断は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同依存修復(homology-dependent repair)（ＨＤＲ）または非相同末端結合または代替的非相同末端結合(alternative non-homologous end joining)（Ａ−ＮＨＥＪ）またはマイクロホモロジー媒介末端結合(microhomology-mediated end joining)（ＭＭＥＪ）を刺激し得る。ＮＨＥＪは、相同テンプレートを必要とせずに、切断された標的核酸を修復することができる。この結果、標的核酸の切断部位に小さな欠失または挿入（インデル(indels)）が生じ、遺伝子発現の破壊または変化に至ることがある。相同組換え(homologous recombination)（ＨＲ）としても知られるＨＤＲは、相同修復テンプレート、またはドナーが利用可能な場合に起こり得る。
【０２０６】
相同ドナーテンプレートは、標的核酸切断部位に隣接している配列に相同な配列を有する。一般には、姉妹染色分体が修復テンプレートとして細胞によって使用される。しかしながら、ゲノム編集の目的では、修復テンプレートは、多くの場合、プラスミド、二重鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルス核酸などの外因性核酸として供給される。外因性ドナーテンプレートを用いる場合、隣接相同領域の間に付加的核酸配列（例えば、導入遺伝子）または改変（例えば、一塩基または多塩基変化または欠失）を、その付加的核酸配列または変更された核酸配列も標的遺伝子座に組み込まれるように導入することが一般的である。ＭＭＥＪは、切断部位に小さな欠失および挿入が起こり得るという点でＮＨＥＪと同様の遺伝的結果をもたらす。ＭＭＥＪは、有利な末端結合ＤＮＡ修復結果を導くために、切断部位に隣接する数塩基対の相同配列を使用する。場合によっては、ヌクレアーゼ標的領域内に存在し得るマイクロホモロジーの分析に基づいて、可能性のある修復結果を予測することも可能である。
【０２０７】
よって、場合によっては、相同組換えは、標的核酸切断部位に外因性のポリヌクレオチド配列を挿入するために使用される。外因性のポリヌクレオチド配列は、本明細書では、ドナーポリヌクレオチド（またはドナーまたはドナー配列またはポリヌクレオチドドナーテンプレート）とも呼ばれる。いくつかの実施形態において、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドコピー、またはドナーポリヌクレオチドコピーの一部が標的核酸切断部位に挿入される。いくつかの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、外因性のポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸切断部位には天然に存在しない配列である。
【０２０８】
二本鎖切断が起こる細胞の核内に外因性のＤＮＡ分子が十分な濃度で供給される場合、その外因性ＤＮＡは、ＮＨＥＪ修復プロセス中に二本鎖切断部に挿入され、従って、そのゲノムに恒久的に付加され得る。これらの外因性ＤＮＡ分子は、いくつかの実施形態において、ドナーテンプレートと呼ばれる。ドナーテンプレートが、本明細書に記載の１以上のシステム成分のコード配列を、任意選択により、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ配列および／またはスプライスアクセプター配列などの関連のある調節配列とともに含む場合、これらの１以上のシステム成分は、ゲノム中に組み込まれた核酸から発現され、その細胞の寿命の間、恒久的に発現されるようになり得る。さらに、ドナーＤＮＡテンプレートの組込み核酸は、細胞が分裂する際に娘細胞に伝達され得る。
【０２０９】
二本鎖切断のいずれかの側のＤＮＡ配列と相同性を有する隣接ＤＮＡ配列（相同アームと呼ばれる）を含む、十分な濃度のドナーＤＮＡテンプレートが存在すれば、そのドナーＤＮＡテンプレートはＨＤＲ経路を介して組み込まれ得る。相同アームは、ドナーテンプレートと二本鎖切断のいずれかの側の配列の間の相同組換えのための基質として働く。これは、二本鎖切断のいずれかの側の配列が非改変ゲノムの場合と変わらないエラーフリーのドナーテンプレートの挿入をもたらし得る。
【０２１０】
ＨＤＲによる編集のために供給されるドナーは著しく異なるが、一般に、ゲノムＤＮＡへのアニーリングを可能とする小さなまたは大きな隣接相同アームとともに意図される配列を含有する。導入される遺伝子変異に隣接する相同領域は、３０ｂｐ以下、またはプロモーター、ｃＤＮＡなどを含有し得る数キロベースのカセットといった大きさであり得る。一本鎖および二本鎖両方のオリゴヌクレオチドドナーが使用可能である。これらのオリゴヌクレオチドの大きさは、１００ｎｔ未満から数ｋｂを超える範囲であるが、さらに長いｓｓＤＮＡも作製および使用が可能である。ＰＣＲアンプリコン、プラスミド、およびミニサイクルを含む二本鎖ドナーが使用される場合が多い。一般に、ＡＡＶベクターはドナーテンプレートの極めて有効な送達手段であることが分かっているが、個々のドナーのパッケージング限界は＜５ｋｂである。ドナーの活発な転写はＨＤＲを３倍にし、このことはプロモーターを含めると転写が増し得ることを示す。逆に、ドナーのＣｐＧメチル化は、遺伝子発現およびＨＤＲを低下させ得る。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、ドナーＤＮＡは、例えば、トランスフェクション、ナノ粒子、マイクロインジェクション、またはウイルス形質導入などの様々な異なる方法によって、ヌクレアーゼとともにまたは単独で供給することができる。いくつかの実施形態において、ＨＤＲのドナーの利用度を引き上げるために、ある範囲のテザリングオプションを使用することができる。例として、ドナーとヌクレアーゼの連結、近傍に結合するＤＮＡ結合タンパク質との連結、またはＤＮＡ末端結合もしくは修復に関与するタンパク質との連結が挙げられる。
【０２１２】
ＮＨＥＪまたはＨＤＲによるゲノム編集に加え、ＮＨＥＪ経路とＨＲの両方を使用する部位特異的遺伝子挿入も実施可能である。組合せアプローチは、おそらくイントロン／エキソン境界を含む、特定の状況下で適用可能である。ＮＨＥＪは、イントロン内の連結に有効であることが実証でき、エラーフリーＨＤＲはコード領域内により良く適合しているといえる。
【０２１３】
部位特異的ポリペプチドまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸
いくつかの実施形態において、ゲノム編集の方法およびそのための組成物は、部位特異的ポリペプチドまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を使用し得る。部位特異的ポリペプチドをコードする核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。部位特異的ポリペプチドをコードする核酸配列がＲＮＡである場合、それはｇＲＮＡ配列に共有結合していてもよいし、または別個の配列として存在していてもよい。いくつかの実施形態において、その核酸配列に代わりに部位特異的ポリペプチドまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼのペプチド配列を使用することができる。
【０２１４】
ベクター
別の態様において、本開示は、開示のゲノム標的核酸をコードするヌクレオチド配列を有する核酸、開示の部位特異的ポリペプチド、および／または開示の方法の実施形態を行うために必要な任意の核酸またはタンパク質性分子を提供する。いくつかの実施形態において、このような核酸は、ベクター（例えば、組換え発現ベクター）である。
【０２１５】
企図される発現ベクターとしては、限定されるものではないが、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）および他の組換えベクターが含まれる。真核生物標的細胞のために企図される他のベクターとしては、限定されるものではないが、ベクターｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。真核生物標的細胞のために企図される他のベクターとしては、限定されるものではないが、ベクターｐＣＴｘ−１、ｐＣＴｘ−２、およびｐＣＴｘ−３が含まれる。他のベクターも、それらが宿主細胞と互換性がある限り使用可能である。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、ベクターは、１以上の転写および／または翻訳制御エレメントを有する。使用する宿主／ベクター系に応じて、発現ベクターにおいて、構成的および誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含むいくつかの好適な転写および翻訳制御エレメントのいずれかを使用することができる。いくつかの実施形態において、ベクターは、ウイルス配列またはＣＲＩＳＰＲ装置の成分または他のエレメントを不活化する自己不活化ベクターである。
【０２１７】
好適な真核生物プロモーター（すなわち、真核細胞で機能的なプロモーター）の限定されない例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、前期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の長い末端反復（ＬＴＲ）、ヒト延長因子−１プロモーター（ＥＦ１）、ニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）に融合されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーを有するハイブリッド構築物、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１遺伝子座プロモーター（ＰＧＫ）、およびマウスメタロチオネイン−Ｉに由来するものが含まれる。
【０２１８】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼとともに使用されるガイドＲＮＡを含む小ＲＮＡを発現させるためには、例えば、Ｕ６およびＨ１を含む、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどの種々のプロモーターが有利であり得る。このようなプロモーターの使用の増強に関する記述およびそのためのパラメーターは当技術分野で公知であり、付加的な情報およびアプローチが一様に記載されている；例えば、Ma, H. et al., Molecular Therapy - Nucleic Acids 3, e161 (2014) doi:10.1038/mtna.2014.12。
【０２１９】
発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターも含み得る。発現ベクターはまた、発現を増幅するための適当な配列も含み得る。発現ベクターはまた、部位特異的ポリペプチドに融合された非天然タグ（例えば、ヒスチジンタグ、血球凝集素タグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列を含むこともでき、従って、融合タンパク質を生じる。
【０２２０】
いくつかの実施形態において、プロモーターは、誘導プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、エストロゲン受容体調節性プロモーターなど）である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、構成プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター）である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、空間調節型および／または時間調節型プロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞種特異的プロモーターなど）である。いくつかの実施形態において、ベクターは、ゲノムの、ゲノム内に存在する内因性プロモーター下に挿入された後にその遺伝子が発現されるならば、宿主細胞で発現させる少なくとも１つの遺伝子に対するプロモーターを含まない。
【０２２１】
部位特異的ポリペプチドまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ
ＮＨＥＪおよび／またはＨＤＲによる標的ＤＮＡの改変は、例えば、突然変異、欠失、変更、組込み、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子タグ付加、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、転座および／または遺伝子突然変異をもたらし得る。ゲノムＤＮＡに非天然核酸を組み込むプロセスは、ゲノム編集の一例である。
【０２２２】
部位特異的ポリペプチドは、ゲノム編集においてＤＮＡを切断するために使用されるヌクレアーゼである。部位特異的ポリペプチドは、１以上のポリペプチド、またはそのポリペプチドをコードする１以上の核酸として細胞または患者に投与され得る。
【０２２３】
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムに関して、部位特異的ポリペプチドは、そのポリペプチドが向けられる標的ＤＮＡ内の部位を特定するガイドＲＮＡに、順番に、結合し得る。本明細書におけるＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、エンドヌクレアーゼ、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。このようなＲＮＡ誘導型部位特異的ポリペプチドはまた、本明細書では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、またはＲＧＥＮとも呼ばれる。
【０２２４】
例示的部位特異的ポリペプチドは、ＷＯ２０１８００２７１９に記載されている。
【０２２５】
標的配列の選択
いくつかの実施形態において、遺伝子編集の特定の適用を助長または強化するために特定の参照遺伝子座に関して５’境界および／または３’境界の位置の変化が使用され、これは、本明細書でさらに記載および説明されるように、一部は、その編集のために選択されたエンドヌクレアーゼ系に依存する。
【０２２６】
このような標的配列選択の第１の限定されない態様では、多くのエンドヌクレアーゼ系が、ＣＲＩＳＰＲタイプＩＩまたはタイプＶエンドヌクレアーゼの場合には、ＤＮＡ切断部位に隣接する特定の位置にＰＡＭ配列モチーフが必要なことなど、切断のための潜在的標的部位の初期選択を先導する規則または基準を持つ。
【０２２７】
標的配列の選択または最適化の別の限定されない態様では、標的配列と遺伝子編集エンドヌクレアーゼの特定の組合せに関する「標的外」活性の頻度（すなわち、選択された標的配列以外の部位で起こるＤＳＢの頻度）が、標的活性の頻度と比較して評価される。いくつかの場合では、所望の遺伝子座で適正に編集されていた細胞は、他の細胞と比較して選択優位性を有し得る。限定されないが、選択優位性の実例としては、複製速度の増進、持続性、特定の条件に対する耐性、患者への導入後のｉｎ  ｖｉｖｏにおける生着成功率の増進または持続性、およびこのような細胞の維持または増加数または生存率に関連する他の特性の獲得が含まれる。他の場合では、所望の遺伝子座で適正に編集されていた細胞は、適正に編集されていた細胞の識別、選別またはそうでなければ選択のために使用される１以上のスクリーニング法によって正の選択を行うことができる。選択優位性および有向選択法はいずれも、修正に関連する表現型を利用することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、意図される細胞集団を選択または精製するために使用される新たな表現型を作り出す第２の改変を作出するために細胞に２回以上の編集を行うことができる。このような第２の改変は、選択可能またはスクリーニング可能なマーカーの第２のｇＲＮＡを加えることによって作出することができる。いくつかの場合、細胞は、ｃＤＮＡおよびまた選択マーカーを含むＤＮＡフラグメントを用いて所望の遺伝子座で適正に編集することができる。
【０２２８】
複数の実施形態において、特定の場合において、選択優位性が適用可能な場合であれ、有向選択が適用される場合であれ、標的配列の選択は、適用の有効性を高めるため、および／または所望の標的以外の部位における望まれない変更の可能性を低減するために標的外頻度を考慮することによっても先導される。本明細書および当技術分野においてさらに記載および例示されるように、標的外活性の発生は、標的部位と種々の標的外部位の間の類似性および相違、ならびに使用される特定のエンドヌクレアーゼを含むいくつかの因子によって影響を受ける。標的外活性の予測を補助する生物情報科学的ツールが利用可能であり、多くの場合、このようなツールはまた、最も可能性の高い標的外活性部位を特定するために使用することもでき、これを次に、実験設定下で標的外活性と標的活性の相対頻度を評価するために評定することができ、それにより、より高い相対標的活性を有する配列の選択が可能となる。このような技術の実例は本明細書に示され、他のものは当技術分野で公知である。
【０２２９】
標的配列選択の別の態様は、相同組換えイベントに関連する。相同性領域を共通に持つ配列は、介在配列の欠失をもたらす相同組換えイベントの中心として働き得る。このような組換えイベントは、染色体および他のＤＮＡ配列の複製の通常の過程でも、二本酸切断（ＤＳＢ）の修復の場合など、ＤＮＡ配列が合成される他の場合でも起こり、この二本酸切断は、通常の細胞複製周期でも常に起こるが、様々なイベントの発生（例えば、ＵＶ光およびＤＮＡ切断の他の誘導物質）または特定の薬剤（様々な化学誘導物質）の存在によっても増強され得る。多くのこのような誘導物質はゲノム内で無差別にＤＳＢを引き起こし、ＤＳＢは、正常細胞でも常に誘導され、修復されている。修復中、元の配列は完全に忠実に再構築可能であるが、場合によっては、ＤＳＢ部位に小さな挿入または欠失（「インデル」と呼ばれる）が導入される。
【０２３０】
ＤＳＢはまた、選択された染色体の位置に指定のまたは優先的な遺伝子改変イベントを引き起こすことができる本明細書に記載のエンドヌクレアーゼ系の場合と同様に、特定の位置に特異的に誘導され得る。ＤＮＡ修復（ならびに複製）に関して相同配列が組換えを受ける傾向は、いくつかの状況で利用でき、「ドナー」ポリヌクレオチドの使用を介して提供される、対象とする配列を所望の染色体の位置に挿入するために相同性により指定される修復が使用されるＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集システムの適用の基礎となる。
【０２３１】
１０塩基対以下といった少ないものであり得る小さな「マイクロホモロジー」領域であり得る特定の配列間の相同性領域もまた、所望の欠失をもたらすために使用することができる。例えば、近傍配列とマイクロホモロジーを示す部位に単一のＤＳＢが導入される。このようなＤＳＢの通常の修復過程で、高頻度で生じる結果は、ＤＳＢおよび同時に起こる細胞修復過程によって促進される組換えの結果としての介在配列の欠失である。
【０２３２】
しかしながらいくつかの状況において、相同性領域内での標的配列の選択は、遺伝子融合（欠失がコード領域内にある場合）を含む、ずっと大きな欠失を生じる場合もあり、これは、特定の状況を考えれば、望ましい場合も望ましくない場合もあり得る。
【０２３３】
標的化組込み
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、標的細胞（例えば、ＭＳＩ−Ｈである増殖性細胞）のゲノムの特定の位置に、本明細書に記載されるようなドナー核酸を導入する工程を用い、これは「標的化組込み」と呼ばれる。いくつかの実施形態において、標的化組込みは、ゲノムＤＮＡに二本鎖切断を生じるために配列特異的ヌクレアーゼを使用することによって可能となる。
【０２３４】
いくつかの実施形態において使用されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、最適なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓデザインを同定するために多数のゲノム標的が迅速にスクリーニングできるという利点を有する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、会合したＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）をＤＮＡの特定の配列に標的化する、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれるＲＮＡ分子を使用する。この標的化は、ｓｇＲＮＡとｓｇＲＮＡのおよそ２０ｂｐの標的配列内のゲノム配列との間のワトソン・クリック塩基対形成により起こる。標的部位に結合すると、ＣａｓヌクレアーゼはゲノムＤＮＡの両鎖を切断して二本鎖切断を作り出す。特定のＤＮＡ配列を標的とするためにｓｇＲＮＡのデザインに要される唯一のことは、標的配列がｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、そのゲノム配列に相補的なプロトスペーサー隣接モチーフ(protospacer adjacent motif)（ＰＡＭ）配列を含まなければならないということである。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの場合、ＰＡＭ配列はＮＲＧ（ここで、ＲはＡまたはＧであり、Ｎは任意の塩基である）、またはより限定されたＰＡＭ配列ＮＧＧである。よって、総てのＰＡＭモチーフに隣接する２０ｂｐの配列を配置することによって、ゲノムのいずれの領域を標的とするｓｇＲＮＡ分子でもｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでデザインすることができる。ＰＡＭモチーフは、真核生物のゲノムにまさに平均１５ｂｐで存在する。しかしながら、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法によってデザインされたｓｇＲＮＡは細胞において様々な効率で二本鎖切断を作出すると思われ、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法を用いて一連のｓｇＲＮＡ分子の切断効率を予測することはできない。ｓｇＲＮＡはｉｎ  ｖｉｔｒｏで迅速に合成可能であるので、これは、最も効率的な切断を生じるｓｇＲＮＡを同定するために、所与のゲノム領域の、可能性のある総てのｓｇＲＮＡ配列の迅速スクリーニングを可能とする。一般に、細胞において所与のゲノム領域内の一連のｓｇＲＮＡを調べると、０〜９０％の間の一連の切断効率が見られる。所与のｓｇＲＮＡに存在し得る標的外を決定するためにはまた、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏアルゴリズムならびに実験室内実験も使用可能である。ほとんどの真核生物ゲノムでは、ｓｇＲＮＡの２０ｂｐの認識配列との完全な一致は基本的に１回だけ見られるが、ｓｇＲＮＡとの１以上の塩基対のミスマッチを有するゲノムでは、複数のさらなる位置が存在する。これらの部位は、それらのミスマッチの数または場所に基づいては予測不能である場合が多い多様な頻度で切断され得る。また、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析によって同定されなかった付加的標的外部位における切断も起こりうる。よって、最も有利な標的外プロフィールを有するｓｇＲＮＡを同定するために関連の細胞種で複数のｓｇＲＮＡをスクリーニングすることは、治療的使用のために最適なｇＲＮＡを選択する重要な要素である。有利な標的外プロフィールは、実際の標的外部位の数およびこれらの部位における切断頻度だけはなく、これらの部位のゲノムの場所も考慮する。例えば、機能的に重要な遺伝子、特に、癌遺伝子または抗癌遺伝子近傍のまたはその内部の標的外部位は、既知の機能を有さない遺伝子間領域の部位よりも有利でないと考え��れる。よって、最適なｓｇＲＮＡの同定は、単に生物のゲノム配列のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析では予測できず、実験的試験を必要とする。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析は、試験するガイドの数を狭めるのに役立ち得るが、高い標的切断を有するガイドを予測することまたは低い望ましい標的外切断を有するガイドを予測することはできない。所与のｓｇＲＮＡがＣａｓ酵素による切断を促進する能力は、ゲノムＤＮＡのその特定の部位の接近性に関連する可能性があり、この接近性はその領域のクロマチン構造によって決定され得る。休止中の分化細胞のゲノムＤＮＡの大部分は高濃縮ヘテロクロマチンに存在するが、活発に転写される領域は、より開放されたクロマチン状態で存在し、この状態は、Ｃａｓタンパク質のようなタンパク質などの大分子に対する接近性がより高いことが知られている。活発に転写される遺伝子内であっても、一部の特定のＤＮＡ領域は結合した転写因子または他の調節タンパク質の有無によって他の領域よりも接近性が高い。ゲノム内、または特定のゲノム遺伝子座もしくはゲノム遺伝子座の領域内の部位を予測することはできないので、関連の細胞種で実験的に決定することが必要とされる。いくつかの部位が挿入の潜在的部位として選択されれば、このような部位に、例えば、実験的試験を用いてまたは用いずに、それらの選択部位から上流または下流に数ヌクレオチド移動させることにより、いくつかのバリエーションを加えることができる。
【０２３５】
核酸改変
いくつかの実施形態において、細胞に導入されたポリヌクレオチドは、本明細書にさらに記載され、また、当技術分野で公知のように、例えば、活性、安定性もしくは特異性を高めるため、送達を変更するため、宿主細胞における自然免疫応答を軽減するため、または他の強化のために単独でまたは組み合わせて使用可能な１以上の改変を有する。
【０２３６】
特定の実施形態において、改変されたポリヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムにおいて使用され、この場合、ガイドＲＮＡ（シングル分子ガイドまたはダブル分子ガイド）および／または細胞に導入されるＣａｓもしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡが下記のように改変し得る。このような改変ポリヌクレオチドは、いずれの１以上のゲノム遺伝子座を編集するためにも、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムで使用することができる。
【０２３７】
このような使用の限定されない例示のためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムを用いれば、ガイドＲＮＡの改変は、シングル分子ガイドまたはダブル分子であり得るガイドＲＮＡ、およびＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼを有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１ゲノム編集複合体の形成または安定性を高めるために使用することができる。ガイドＲＮＡの改変はまた、またはその代わりに、ゲノム編集複合体とゲノム内の標的配列との相互作用の開始、安定性または速度を高めるために使用することもでき、これは例えば標的活性を高めるために使用することができる。ガイドＲＮＡの改変はまた、またはその代わりに、特異性、例えば、標的部位におけるゲノム編集の相対速度を他の（標的外）部位における効果に比べて高めるために使用することができる。
【０２３８】
改変はまた、またはその代わりに、例えば、細胞に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）による分解に対するその耐性を高め、それにより、その細胞におけるその半減期を延長させることによってガイドＲＮＡの安定性を高めるために使用することができる。ガイドＲＮＡの半減期を延長する改変は、ＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼを生成するために翻訳される必要のあるＲＮＡを介して編集される細胞に導入される実施形態において特に有用であり得、これは、エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡと同時に導入されるガイドＲＮＡの半減期の延長は、ガイドＲＮＡおよびコードされるＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼがその細胞に共存する時間を延長するために使用できるからである。
【０２３９】
改変はまた、またはその代わりに、細胞に導入されたＲＮＡが自然免疫応答を惹起する見込みまたは程度を引き下げるために使用することもできる。以下に、また当技術分野で記載されているように、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に関して十分に特徴付けられているこのような応答は、ＲＮＡの半減期の短縮および／またはサイトカインもしくは免疫応答に関連する他の因子の惹起に関連する傾向がある。
【０２４０】
また、細胞に導入されたエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡに対して、限定されるものではないが、ＲＮＡの安定性を高める改変（例えば、細胞に存在するＲＮアーゼによるその分解を増強することによる）、結果として生じる産物（すなわち、エンドヌクレアーゼ）の翻訳を高める改変、および／または細胞に導入されたＲＮＡが自然免疫応答を惹起する見込みまたは程度を引き下げる改変を含む、１以上のタイプの改変を行うことができる。
【０２４１】
前記およびその他などの改変の組合せも同様に使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１の場合、例えば、ガイドＲＮＡに対する１以上のタイプの改変を行うことができ（上記に例示されたものを含む）、および／またはＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡに対して１以上のタイプの改変を行うことができる（上記に例示されたものを含む）。
【０２４２】
例示的改変核酸はＷＯ２０１８００２７１９に記載されている。
【０２４３】
送達
いくつかの実施形態において、例えば本開示のゲノム標的核酸および／または部位特異的ポリペプチドをコードする核酸などの本明細書で提供される方法において使用されるいずれかの核酸分子は、細胞への送達のための送達ビヒクル中に封入されるか、または送達ビヒクルの表面上にある。企図される送達ビヒクルとしては、限定されるものではないが、ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、およびミセルが含まれる。当技術分野に記載されるように、このようなビヒクルと所望の細胞種または場所との優先的な相互作用を増強するために様々な標的化部分を使用することができる。
【０２４４】
本開示の複合体、ポリペプチド、および核酸の細胞への導入は、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿法、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿法、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達などによって起こり得る。
【０２４５】
例示的送達方法および試薬はＷＯ２０１８００２７１９に記載されている。
【０２４６】
発明のさらなる実施形態としては、以下の実施形態１〜１４５が含まれる。
【０２４７】
実施形態１  マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を有する増殖性細胞において増殖を低下させるための方法であって、増殖性細胞においてウェルナー症候群ＡＴＰ依存性ヘリカーゼ（ＷＲＮ）のヘリカーゼ活性を低下させることを含んでなる、方法。
【０２４８】
実施形態２  増殖性細胞にＷＲＮの阻害剤を送達することを含んでなる、実施形態１の方法。
【０２４９】
実施形態３  ＷＲＮの阻害剤が小分子阻害剤である、実施形態２の方法。
【０２５０】
実施形態４  小分子阻害剤が式：
【化８】
2021527713.tif 000010
［式中、
Ｌ１は、Ｃ１−４アルキレンであり；
Ｌ２は、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＳＯ２、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、またはＯＣ（Ｏ）ＮＨであり；
Ｌ３は、Ｃ１−８アルキレンであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、またはＣ１−４ハロアルキルであり；かつ
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、Ｃ６−１２アリール、またはＣ６−１２アリール−Ｃ１−４アルキルであり、これらはそれぞれハロゲン、Ｃ１−４アルキル、またはＣ１−４ハロアルキルで場合により置換されていてもよい］
を有するか、またはその薬学上許容可能な塩である、実施形態３の方法。
【０２５１】
実施形態５  ＷＲＮの阻害剤がＷＲＮ阻害剤にコンジュゲートされた抗体を含んでなる抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含んでなる、実施形態２の方法。
【０２５２】
実施形態６  ＷＲＮ  ｍＲＮＡを標的とする阻害性核酸、または前記阻害性核酸をコードする核酸を増殖性細胞に送達することを含んでなる、実施形態１の方法。
【０２５３】
実施形態７  阻害性核酸が小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなる、実施形態６の方法。
【０２５４】
実施形態８  増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性が低下するように増殖性細胞のゲノムを改変し得るヌクレアーゼ、または前記ヌクレアーゼをコードする核酸を増殖性細胞に送達することを含んでなる、実施形態１の方法。
【０２５５】
実施形態９  ヌクレアーゼが内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部または近傍のゲノム配列を標的とする転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である、実施形態８の方法。
【０２５６】
実施形態１０  ａ）内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部もしくは近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を含んでなるｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸；およびｂ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、またはＲＧＥＮをコードする核酸を増殖性細胞に送達することを含んでなる、実施形態８の方法。
【０２５７】
実施形態１１  ｇＲＮＡをコードする核酸がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれ、かつ／またはＲＧＥＮをコードする核酸がＡＡＶベクターに含まれる、実施形態１０の方法。
【０２５８】
実施形態１２  スペーサー配列が内因性ＷＲＮ遺伝子のコード領域内のゲノム配列に相補的である、実施形態１０または１１の方法。
【０２５９】
実施形態１３  増殖性細胞のゲノムが非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により改変される、実施形態１０〜１２のいずれか1つの方法。
【０２６０】
実施形態１４  ドナー核酸を含んでなるドナーテンプレートを増殖性細胞に送達することをさらに含んでなり、ドナーテンプレートは、ドナー核酸が相同組換えによりＷＲＮ遺伝子座に挿入され得るように構成される、実施形態１０〜１２のいずれか1つの方法。
【０２６１】
実施形態１５  ドナー核酸が１以上の終止コドンをコードし、かつ、ドナーテンプレートは、ドナー核酸がＷＲＮ遺伝子のコード領域に挿入されるように構成される、実施形態１４の方法。
【０２６２】
実施形態１６  ドナー核酸が連続的に存在する３つの翻訳フレームのそれぞれに３つの終止コドンをコードする、実施形態１５の方法。
【０２６３】
実施形態１７  ドナー核酸が、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるＷＲＮヘリカーゼドメインの突然変異をコードする、実施形態１４の方法。
【０２６４】
実施形態１８  ドナーテンプレートがＡＡＶベクターに含まれる、実施形態１４〜１７のいずれか１つの方法。
【０２６５】
実施形態１９  ＲＧＥＮがＣａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはその機能的誘導体からなる群から選択される、実施形態１０〜１８のいずれか１つの方法。
【０２６６】
実施形態２０  ＲＧＥＮがＣａｓ９である、実施形態１９の方法。
【０２６７】
実施形態２１  ＲＧＥＮをコードする核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）配列である、実施形態１０〜２０のいずれか１つの方法。
【０２６８】
実施形態２２  ＲＧＥＮをコードするＲＮＡ配列が共有結合を介してｇＲＮＡに連結されている、実施形態２１の方法。
【０２６９】
実施形態２３  ＲＧＥＮをコードする核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列である、実施形態１０〜２０のいずれか１つの方法。
【０２７０】
実施形態２４  ＲＧＥＮをコードする核酸がリポソームまたは脂質ナノ粒子中に処方される、実施形態１０〜２３のいずれか１つの方法。
【０２７１】
実施形態２５  リポソームまたは脂質ナノ粒子がｇＲＮＡを封入する、実施形態２４の方法。
【０２７２】
実施形態２６  ＲＧＥＮがｇＲＮＡとプレ複合体化されて、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する、実施形態１０〜２０のいずれか１つの方法。
【０２７３】
実施形態２７  ドナー核酸を含んでなる核酸構築物を増殖性細胞に送達することを含んでなり、核酸構築物は、相同組換えによる増殖性細胞のゲノムへのドナー核酸の挿入が増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させるように構成される、実施形態１の方法。
【０２７４】
実施形態２８  核酸構築物がＡＡＶベクターである、実施形態２７の方法。
【０２７５】
実施形態２９  ＡＡＶベクターが、内因性ＷＲＮ遺伝子の領域と同一のまたは実質的に相同な配列を有する２つの相同アームを含んでなる、実施形態２８の方法。
【０２７６】
実施形態３０  ＡＡＶベクターがＡＡＶクレードＦベクターである、実施形態２８または２９の方法。
【０２７７】
実施形態３１  ユビキチン化およびタンパク質分解のためのＷＲＮを標的とするタンパク質分解誘導キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）を増殖性細胞に送達することを含んでなる、実施形態１の方法。
【０２７８】
実施形態３２  ＰＲＯＴＡＣがリンカーを介してＷＲＮリガンドに連結されたＥ３ユビキチンリガーゼリガンドを含んでなる、実施形態３１の方法。
【０２７９】
実施形態３３  増殖性細胞がＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される１以上のＭＳＩマーカーを含んでなる、実施形態１〜３２のいずれか１つの方法。
【０２８０】
実施形態３４  増殖性細胞がＤＮＡミスマッチ修復を損なう突然変異を含んでなる、実施形態１〜３３のいずれか１つの方法。
【０２８１】
実施形態３５  増殖性細胞がＭｕｔＳホモログにおける突然変異および／またはＭｕｔＬホモログにおける突然変異を含んでなる、実施形態３４の方法。
【０２８２】
実施形態３６  ＭｕｔＳホモログがＭＳＨ２、ＭＳＨ３、およびＭＳＨ６からなる群から選択され、かつ、ＭｕｔＬホモログがＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、およびＰＭＳ２からなる群から選択される、実施形態３５の方法。
【０２８３】
実施形態３７  増殖性細胞がＭＬＨ１、ＭＳＨ２、および／またはＰＭＳ２に突然変異を含んでなる、実施形態３６の方法。
【０２８４】
実施形態３８  増殖性細胞がＤＮＡ損傷の１以上のマーカーを含んでなる、実施形態１〜３７のいずれか１つの方法。
【０２８５】
実施形態３９  ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーが高いｐ２１発現および高いγＨ２ＡＸ発現からなる群から選択される、実施形態３８の方法。
【０２８６】
実施形態４０  増殖性細胞における増殖の低下が増殖性細胞における細胞周期の停止を含んでなる、実施形態１〜３９のいずれか１つの方法。
【０２８７】
実施形態４１  増殖性細胞における増殖の低下が増殖性細胞におけるアポトーシスの誘導を含んでなる、実施形態１〜３９のいずれか１つの方法。
【０２８８】
実施形態４２  ｉｎ  ｖｉｖｏで実施される、実施形態１〜４１のいずれか１つの方法。
【０２８９】
実施形態４３  ｅｘ  ｖｉｖｏで実施される、実施形態１〜４１のいずれか１つの方法。
【０２９０】
実施形態４４  ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される、実施形態１〜４１のいずれか１つの方法。
【０２９１】
実施形態４５  増殖性細胞が癌細胞である、実施形態１〜４４のいずれか１つの方法。
【０２９２】
実施形態４６  癌が結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝胆道癌、尿路癌、脳癌、および皮膚癌からなる群から選択される、実施形態４５に記載の方法。
【０２９３】
実施形態４７  増殖性細胞が（ａ）哺乳動物細胞；（ｂ）ヒト細胞；または（ｃ）獣医動物細胞である、実施形態１〜４６のいずれか１つの方法。
【０２９４】
実施形態４８  それを必要とする個体において増殖性疾患を治療する方法であって、増殖性疾患は、ＭＳＩを有する増殖性細胞で特徴づけられ、増殖性細胞においてＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させるために有効な薬剤をその個体に投与することを含んでなる、方法。
【０２９５】
実施形態４９  個体にＷＲＮの阻害剤を投与することを含んでなる、実施形態４８の方法。
【０２９６】
実施形態５０  ＷＲＮの阻害剤が小分子阻害剤である、実施形態４９の方法。
【０２９７】
実施形態５１  小分子阻害剤が式：
【化９】
2021527713.tif 000011
［式中、
Ｌ１は、Ｃ１−４アルキレンであり；
Ｌ２は、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＳＯ２、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、またはＯＣ（Ｏ）ＮＨであり；
Ｌ３は、Ｃ１−８アルキレンであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、またはＣ１−４ハロアルキルであり；かつ
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、Ｃ６−１２アリール、またはＣ６−１２アリール−Ｃ１−４アルキルであり、これらはそれぞれハロゲン、Ｃ１−４アルキル、またはＣ１−４ハロアルキルで場合により置換されていてもよい］
を有するか、またはその薬学上許容可能な塩である、実施形態５０の方法。
【０２９８】
実施形態５２  ＷＲＮの阻害剤がＷＲＮ阻害剤にコンジュゲートされた抗体を含んでなるＡＤＣである、実施形態４９の方法。
【０２９９】
実施形態５３  ＷＲＮ  ｍＲＮＡを標的とする阻害性核酸、または前記阻害性核酸をコードする核酸を個体に投与することを含んでなる、実施形態４８の方法。
【０３００】
実施形態５４  阻害性核酸が小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなる、実施形態５３の方法。
【０３０１】
実施形態５５  増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性が低下するように増殖性細胞のゲノムを改変し得るヌクレアーゼ、または前記ヌクレアーゼをコードする核酸を個体に投与することを含んでなる、実施形態４８の方法。
【０３０２】
実施形態５６  ヌクレアーゼが内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部または近傍のゲノム配列を標的とする転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である、実施形態５５の方法。
【０３０３】
実施形態５７  ａ）内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部もしくは近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を含んでなるｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードする核酸；およびｂ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、またはＲＧＥＮをコードする核酸を個体に投与することを含んでなる、実施形態５５の方法。
【０３０４】
実施形態５８  ｇＲＮＡをコードする核酸がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれ、かつ／またはＲＧＥＮをコードする核酸がＡＡＶベクターに含まれる、実施形態５７の方法。
【０３０５】
実施形態５９  スペーサー配列が内因性ＷＲＮ遺伝子のコード領域内のゲノム配列に相補的である、実施形態５７または５８の方法。
【０３０６】
実施形態６０  増殖性細胞のゲノムが非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により改変される、実施形態５７〜５９のいずれか１つの方法。
【０３０７】
実施形態６１  ドナー核酸を含んでなるドナーテンプレートを個体に投与することをさらに含んでなり、ドナーテンプレートは、ドナー核酸が相同組換えによりＷＲＮ遺伝子座に挿入され得るように構成される、実施形態５７〜５９のいずれか１つの方法。
【０３０８】
実施形態６２  ドナー核酸が１以上の終止コドンをコードし、かつ、ドナーテンプレートは、ドナー核酸がＷＲＮ遺伝子のコード領域に挿入されるように構成される、実施形態６１の方法。
【０３０９】
実施形態６３  ドナー核酸が連続的に存在する３つの翻訳フレームのそれぞれに３つの終止コドンをコードする、実施形態６２の方法。
【０３１０】
実施形態６４  ドナー核酸は、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるＷＲＮヘリカーゼドメインの突然変異をコードする、実施形態６１の方法。
【０３１１】
実施形態６５  ドナーテンプレートがＡＡＶベクターに含まれる、実施形態６１〜６４のいずれか１つの方法。
【０３１２】
実施形態６６  ＲＧＥＮがＣａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはその機能的誘導体からなる群から選択される、実施形態５７〜６５のいずれか１つの方法。
【０３１３】
実施形態６７  ＲＧＥＮがＣａｓ９である、実施形態６６の方法。
【０３１４】
実施形態６８  ＲＧＥＮをコードする核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）配列である、実施形態５７〜６７のいずれか１つの方法。
【０３１５】
実施形態６９  ＲＧＥＮをコードするＲＮＡ配列が共有結合を介してｇＲＮＡに連結されている、実施形態６８の方法。
【０３１６】
実施形態７０  ＲＧＥＮをコードする核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列である、実施形態５７〜６７のいずれか１つの方法。
【０３１７】
実施形態７１  ＲＧＥＮをコードする核酸がリポソームまたは脂質ナノ粒子中に処方される、実施形態５７〜７０のいずれか１つの方法。
【０３１８】
実施形態７２  リポソームまたは脂質ナノ粒子がｇＲＮＡを封入する、実施形態７１の方法。
【０３１９】
実施形態７３  ＲＧＥＮがｇＲＮＡとプレ複合体化されて、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する、実施形態５７〜６７のいずれか１つの方法。
【０３２０】
実施形態７４  ドナー核酸を含んでなる核酸構築物を個体に投与することを含んでなり、核酸構築物は、相同組換えによる増殖性細胞のゲノムへのドナー核酸の挿入が増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させるように構成される、実施形態４８の方法。
【０３２１】
実施形態７５  核酸構築物がＡＡＶベクターである、実施形態７４の方法。
【０３２２】
実施形態７６  ＡＡＶベクターが内因性ＷＲＮ遺伝子の領域と同一のまたは実質的に相同な配列を有する２つの相同アームを含んでなる、実施形態７５の方法。
【０３２３】
実施形態７７  ＡＡＶベクターがＡＡＶクレードＦベクターである、実施形態７５または７６の方法。
【０３２４】
実施形態７８  ユビキチン化およびタンパク質分解のためのＷＲＮを標的とするＰＲＯＴＡＣを個体に投与することを含んでなる、実施形態４８の方法。
【０３２５】
実施形態７９  ＰＲＯＴＡＣが、リンカーを介してＷＲＮリガンドに連結されたＥ３ユビキチンリガーゼリガンドを含んでなる、実施形態７８の方法。
【０３２６】
実施形態８０  増殖性細胞がＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される１以上のＭＳＩマーカーを含んでなる、実施形態４８〜７９のいずれか１つの方法。
【０３２７】
実施形態８１  増殖性細胞においてＭＳＩの存在を同定するために、個体からの増殖性細胞の集団において１以上のＭＳＩマーカーの存在を決定することをさらに含んでなる、実施形態８０の方法。
【０３２８】
実施形態８２  １以上のＭＳＩマーカーの存在を決定する工程が薬剤を投与する前に行われる、実施形態８１の方法。
【０３２９】
実施形態８３  増殖性細胞がＤＮＡミスマッチ修復を損なう突然変異を含んでなる、実施形態４８〜８２のいずれか１つの方法。
【０３３０】
実施形態８４  増殖性細胞がＭｕｔＳホモログにおける突然変異および／またはＭｕｔＬホモログにおける突然変異を含んでなる、実施形態８３の方法。
【０３３１】
実施形態８５  ＭｕｔＳホモログがＭＳＨ２、ＭＳＨ３、およびＭＳＨ６からなる群から選択され、かつ、ＭｕｔＬホモログがＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、およびＰＭＳ２からなる群から選択される、実施形態８４の方法。
【０３３２】
実施形態８６  増殖性細胞がＭＬＨ１、ＭＳＨ２、および／またはＰＭＳ２に突然変異を含んでなる、実施形態８５の方法。
【０３３３】
実施形態８７  増殖性細胞における突然変異の存在を同定するために、個体からの増殖性細胞の集団における突然変異の存在を決定することをさらに含んでなる、実施形態８３〜８６のいずれか１つの方法。
【０３３４】
実施形態８８  突然変異の存在を決定する工程が薬剤を投与する前に行われる、実施形態８７の方法。
【０３３５】
実施形態８９  増殖性細胞がＤＮＡ損傷の１以上のマーカーを含んでなる、実施形態４８〜８８のいずれか１つの方法。
【０３３６】
実施形態９０  ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーが高いｐ２１発現および高いγＨ２ＡＸ発現からなる群から選択される、実施形態８９の方法。
【０３３７】
実施形態９１  増殖性細胞においてＤＮＡ損傷の１以上のマーカーの存在を同定するために、個体からの増殖性細胞の集団においてＤＮＡ損傷の１以上のマーカーの存在を決定することをさらに含んでなる、実施形態８９または９０の方法。
【０３３８】
実施形態９２  ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーの存在を決定する工程が薬剤を投与する前に行われる、実施形態９１の方法。
【０３３９】
実施形態９３  個体における増殖性細胞の量が薬剤の投与を受けない対応する個体と比較した場合に減少する、実施形態４８〜９２のいずれか１つの方法。
【０３４０】
実施形態９４  増殖性細胞の増殖速度が薬剤の投与を受けない対応する個体と比較した場合に低下する、実施形態４８〜９３のいずれか１つの方法。
【０３４１】
実施形態９５  増殖性細胞の少なくとも一部が細胞周期の停止を受けるように誘導される、実施形態４８〜９４のいずれか１つの方法。
【０３４２】
実施形態９６  増殖性細胞の少なくとも一部がアポトーシスを受けるように誘導される、実施形態４８〜９５いずれか１つの方法。
【０３４３】
実施形態９７  増殖性疾患が癌である、実施形態４８〜９６のいずれか１つの方法。
【０３４４】
実施形態９８  癌が結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝胆道癌、尿路癌、脳癌、および皮膚癌からなる群から選択される、実施形態９７の方法。
【０３４５】
実施形態９９  個体に増殖性疾患のための従来療法を投与することをさらに含んでなる、実施形態４８〜９８のいずれか１つの方法。
【０３４６】
実施形態１００  個体に抗ＰＤ−１療法を投与することを含んでなる、実施形態９９の方法。
【０３４７】
実施形態１０１  個体が（ａ）哺乳動物；（ｂ）ヒト；または（ｃ）獣医動物である、実施形態４８〜１００のいずれか１つの方法。
【０３４８】
実施形態１０２  増殖性疾患と診断された個体がＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるために有効な薬剤を個体に投与することを含んでなる療法に応答し得るかを予測するための方法であって、個体からの増殖性細胞の集団においてＭＳＩ、またはＭＳＩに関連するマーカーの存在を決定すること、および増殖性細胞の集団におけるＭＳＩまたはＭＳＩに関連するマーカーの存在の決定に基づき、その個体がその療法に応答する見込みを決定することを含んでなる、方法。
【０３４９】
実施形態１０３  増殖性細胞の集団におけるＭＳＩの存在の決定がＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される１以上のＭＳＩマーカーの存在を決定することを含んでなる、実施形態１０２の方法。
【０３５０】
実施形態１０４  ＭＳＩマーカーの少なくとも１つを有すると決定された増殖性細胞の集団における細胞の量がその増殖性疾患の所定の閾値を上回る場合に、その個体はその療法に応答すると予測される、実施形態１０２または１０３の方法。
【０３５１】
実施形態１０５  ＭＳＩマーカーの少なくとも１つを有すると決定された増殖性細胞の集団における細胞の量がその増殖性疾患の所定の閾値を下回る場合；または増殖性細胞の集団がＭＳＩマーカーを有さないと決定された場合に、その個体はその療法に応答しないと予測される、実施形態１０２または１０３の方法。
【０３５２】
実施形態１０６  増殖性細胞の集団におけるＭＳＩに関連するマーカーの存在の決定がＤＮＡミスマッチ修復を損なう突然変異の存在を決定することを含んでなる、実施形態１０２の方法。
【０３５３】
実施形態１０７  突然変異がＭｕｔＳホモログにおける突然変異および／またはＭｕｔＬホモログにおける突然変異を含んでなる、実施形態１０６の方法。
【０３５４】
実施形態１０８  ＭｕｔＳホモログがＭＳＨ２、ＭＳＨ３、およびＭＳＨ６からなる群から選択され、かつ、ＭｕｔＬホモログがＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、およびＰＭＳ２からなる群から選択される、実施形態１０７の方法。
【０３５５】
実施形態１０９  突然変異がＭＬＨ１、ＭＳＨ２、および／またはＰＭＳ２における突然変異を含んでなる、実施形態１０８の方法。
【０３５６】
実施形態１１０  増殖性細胞の集団におけるＭＳＩに関連するマーカーの存在の決定がＤＮＡ損傷の１以上のマーカーの存在を決定することを含んでなる、実施形態１０２の方法。
【０３５７】
実施形態１１１  ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーが高いｐ２１発現および高いγＨ２ＡＸ発現からなる群から選択される、実施形態１１０の方法。
【０３５８】
実施形態１１２  （ｉ）ＤＮＡミスマッチ修復を損なう少なくとも１つの突然変異および／または（ｉｉ）ＤＮＡ損傷の少なくとも１つのマーカーを有すると決定された増殖性細胞の集団における細胞の量がその増殖性疾患の所定の閾値を上回る場合に、その個体はその療法に応答すると予測される、実施形態１０６〜１１１のいずれか１つの方法。
【０３５９】
実施形態１１３  ＤＮＡミスマッチ修復を損なう少なくとも１つの突然変異がＭＬＨ１、ＭＳＨ２、および／またはＰＭＳ２における突然変異を含んでなり、かつ、ＤＮＡ損傷の少なくとも１つのマーカーが高いｐ２１発現および／または高いγＨ２ＡＸ発現を含んでなる、実施形態１１２の方法。
【０３６０】
実施形態１１４  （ｉ）ＤＮＡミスマッチ修復を損なう少なくとも１つの突然変異および／または（ｉｉ）ＤＮＡ損傷の少なくとも１つのマーカーを有すると決定された増殖性細胞の集団における細胞の量がその増殖性疾患の所定の閾値を下回る場合；または増殖性細胞の集団がＤＮＡミスマッチ修復を損なう突然変異もＤＮＡ損傷マーカーも有さないと決定された場合に、その個体はその療法に応答しないと予測される、実施形態１０６〜１１１の方法。
【０３６１】
実施形態１１５  増殖性疾患と診断されたまたは増殖性疾患であるとされた個体において、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）およびＷＲＮのヘリカーゼ活性を検出するための方法であって、（ａ）前記個体からの生体サンプルをＭＳＩの存在およびＷＲＮのヘリカーゼ活性を検出するための１以上の試薬と接触させること；ならびに（ｂ）（ｉ）ＭＳＩの存在；および（ｉｉ）ＷＲＮのヘリカーゼ活性を検出することを含んでなる、方法。
【０３６２】
実施形態１１６  生体サンプルにおいてＭＳＩの存在を検出するための試薬が、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６、およびＤ１７Ｓ２５０からなる群から選択される１以上のＭＳＩマーカーの存在を検出するための試薬を含んでなる、実施形態１１５の方法。
【０３６３】
実施形態１１７  増殖性疾患と診断されたまたは増殖性疾患であるとされた個体において、ＭＳＩに関連するマーカーおよびＷＲＮのヘリカーゼ活性を検出するための方法であって、（ａ）前記個体からの生体サンプルをＭＳＩに関連するマーカーの存在およびＷＲＮヘリカーゼのヘリカーゼ活性を検出するための１以上の試薬と接触させること；および（ｂ）（ｉ）ＭＳＩに関連するマーカーの存在；および（ｉｉ）ＷＲＮヘリカーゼのヘリカーゼ活性を検出することを含んでなる、方法。
【０３６４】
実施形態１１８  生体サンプルにおいてＭＳＩに関連するマーカーの存在を検出するための試薬が、（ｉ）ＤＮＡミスマッチ修復を損なう１以上の突然変異および／または（ｉｉ）ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーの存在を検出するための試薬を含んでなる、実施形態１１７の方法。
【０３６５】
実施形態１１９  ＤＮＡミスマッチ修復を損なう１以上の突然変異が、ＭｕｔＳホモログにおける突然変異および／またはＭｕｔＬホモログにおける突然変異を含んでなる、実施形態１１８の方法。
【０３６６】
実施形態１２０  ＭｕｔＳホモログがＭＳＨ２、ＭＳＨ３、およびＭＳＨ６からなる群から選択され、かつ、ＭｕｔＬホモログがＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＰＭＳ１、およびＰＭＳ２からなる群から選択される、実施形態１１９の方法。
【０３６７】
実施形態１２１  １以上の突然変異がＭＬＨ１、ＭＳＨ２、および／またはＰＭＳ２における突然変異を含んでなる、実施形態１２０の方法。
【０３６８】
実施形態１２２  ＤＮＡ損傷の１以上のマーカーが高いｐ２１発現および高いγＨ２ＡＸ発現からなる群から選択される、実施形態１１８〜１２１のいずれか１つの方法。
【０３６９】
実施形態１２３  増殖性疾患が癌である、実施形態１０２〜１２２のいずれか１つの方法。
【０３７０】
実施形態１２４  癌が結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝胆道癌、尿路癌、脳癌、および皮膚癌からなる群から選択される、実施形態１２３の方法。
【０３７１】
実施形態１２５  個体が（ａ）哺乳動物；（ｂ）ヒト；または（ｃ）獣医動物である、実施形態１０２〜１２４のいずれか１つの方法。
【０３７２】
実施形態１２６  （ａ）内因性ＷＲＮ遺伝子座の内部もしくは近傍のゲノム配列に相補的なスペーサー配列を含んでなるｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡをコードする核酸；およびｂ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、またはＲＧＥＮをコードする核酸を含んでなる組成物であって、前記組成物の成分は、組成物の細胞への送達がその細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させ得るように構成される、組成物。
【０３７３】
実施形態１２７  ｇＲＮＡをコードする核酸がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれ、かつ／またはＲＧＥＮをコードする核酸がＡＡＶベクターに含まれる、実施形態１２６の組成物。
【０３７４】
実施形態１２８  スペーサー配列が内因性ＷＲＮ遺伝子のコード領域内のゲノム配列に相補的である、実施形態１２６または１２７の組成物。
【０３７５】
実施形態１２９  ドナー核酸を含んでなるドナーテンプレートをさらに含んでなり、ドナーテンプレートは、ドナー核酸が相同組換えによりＷＲＮ遺伝子座に挿入され得るように構成される、実施形態１２６〜１２８のいずれか１つの組成物。
【０３７６】
実施形態１３０  ドナー核酸は１以上の終止コドンをコードし、かつ、ドナーテンプレートは、ドナー核酸がＷＲＮ遺伝子のコード領域に挿入されるように構成される、実施形態１２９の組成物。
【０３７７】
実施形態１３１  ドナー核酸が連続的に存在する３つの翻訳フレームのそれぞれに３つの終止コドンをコードする、実施形態１３０の組成物。
【０３７８】
実施形態１３２  ドナー核酸が、ＷＲＮヘリカーゼ活性を低下させるＷＲＮヘリカーゼドメインの突然変異をコードする、実施形態１２９の組成物。
【０３７９】
実施形態１３３  ドナーテンプレートがＡＡＶベクターに含まれる、実施形態１２９〜１３２のいずれか１つの組成物。
【０３８０】
実施形態１３４  ＲＧＥＮがＣａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはその機能的誘導体からなる群から選択される、実施形態１２６〜１３３のいずれか１つの組成物。
【０３８１】
実施形態１３５  ＲＧＥＮがＣａｓ９である、実施形態１３４の組成物。
【０３８２】
実施形態１３６  前記ＲＧＥＮをコードする核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）配列である、実施形態１２６〜１３５のいずれか１つの組成物。
【０３８３】
実施形態１３７  ＲＧＥＮをコードするＲＮＡ配列が共有結合を介してｇＲＮＡに連結されている、実施形態１３６の組成物。
【０３８４】
実施形態１３８  前記ＲＧＥＮをコードする核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列である、実施形態１２６〜１３５のいずれか１つの組成物。
【０３８５】
実施形態１３９  前記ＲＧＥＮをコードする核酸がリポソームまたは脂質ナノ粒子中に処方される、実施形態１２６〜１３６のいずれか１つの組成物。
【０３８６】
実施形態１４０  リポソームまたは脂質ナノ粒子がｇＲＮＡを封入する、実施形態１３９の組成物。
【０３８７】
実施形態１４１  ＲＧＥＮがｇＲＮＡとプレ複合体化されて、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する、実施形態１２６〜１３５のいずれか１つの組成物。
【０３８８】
実施形態１４２  ドナー核酸を含んでなる核酸構築物を含んでなり、核酸構築物は、相同組換えによる増殖性細胞のゲノムへのドナー核酸の挿入が増殖性細胞におけるＷＲＮのヘリカーゼ活性を低下させるように構成される、組成物。
【０３８９】
実施形態１４３  核酸構築物がＡＡＶベクターである、実施形態１４２の組成物。
【０３９０】
実施形態１４４  ＡＡＶベクターが内因性ＷＲＮ遺伝子の領域と同一のまたは実質的に相同な配列を有する２つの相同アームを含んでなる、実施形態１４３の組成物。
【０３９１】
実施形態１４５  ＡＡＶベクターがＡＡＶクレードＦベクターである、実施形態１４２〜１４４のいずれか１つの組成物。
【０３９２】
本開示を特定の選択肢に関して上記してきた。しかしながら、上記以外の他の選択肢も本開示の範囲内に等しく存在し得る。本開示の範囲内には、上記以外の種々の方法工程が提供され得る。本明細書に記載される種々の特徴および工程は、そうした記載以外の他の組合せとしてもよい。
【０３９３】
本明細書における複数および／または単数の用語の使用に関して、当業者は、文脈および／または適用に適当であるように、複数から単数に、および／または、単数から複数に変換することができる。本明細書では明瞭とするために、様々な単数／複数の置換が明示的に示され得る。
【０３９４】
一般に、本明細書で、特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本体）で使用される用語は、通常「オープンな」用語として意図される（例えば、「含む」という用語は「限定されるものではないが含む」と解釈されるべきであり、「有する」という用語は「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「含有する」という用語は「限定されるものではないが含有する」と解釈されるべきなどである）ことは当業者に理解されるであろう。
【０３９５】
加えて、開示の特徴または態様がマーカッシュ群の用語で記載される場合、当業者は、それにより、その開示がそのマーカッシュ群の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関しても記載されることを認識するであろう。
【０３９６】
ある態様のある選択肢のいずれの特徴も、本明細書で同定される総ての態様および選択肢に適用可能である。さらに、ある態様のある選択肢のいずれの特徴も独立に、何らかの点で本明細書に記載される他の選択肢と部分的にまたは全部を組み合わせることができ、例えば、１つ、２つ、または３つ以上の選択肢を全部または部分的に組み合わせることができる。さらに、ある態様のある選択肢のいずれの特徴も、他の態様または選択肢に対して任意選択とされ得る。様々な例の選択肢および実装形態に関して上記されているが、個々の選択肢の１以上において記載される様々な特徴、態様および機能性は、それらの適用可能性において、それらがともに記載されている特定の選択肢に限定されず、そのような選択肢が記載されていてもいなくても、また、そのような特徴が記載の選択肢の一部であるとして示されていてもいなくても、単独でまたは種々の組合せで本願の他の選択肢の１以上に適用され得ると理解されるべきである。よって、本願の幅および範囲は、上記の例の選択肢のいずれによっても限定されるべきではない。
【０３９７】
本明細書に引用される総ての参照文献は、参照によりそれらの全内容が本明細書に組み込まれる。参照により本明細書に組み込まれる刊行物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示に矛盾する限りにおいて、本明細書はこのようないずれの矛盾した資料に取って代わり、かつ／またはそれらに優先することが意図される。参照により本明細書に組み込まれる刊行物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示に矛盾する限りにおいて、本明細書はこのようないずれの矛盾した資料に取って代わり、かつ／またはそれらに優先することが意図される。
【０３９８】
本開示の１以上の実施形態の詳細は、添付する下記の説明に示す。本開示の実施または試験においては、本明細書に記載されるものと類似または等価のいずれの材料および方法も使用可能である。本開示の他の特徴、目的および利点は、その説明から明らかとなる。説明では、文脈がそうではないこと明示しない限り、単数形は複数も含む。そうではないことが定義されない限り、本明細書で使用される総ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、本明細書が優先する。
【０３９９】
本明細書に記載の実施例および実施形態は単に例示を目的とするものであり、それらに照らしての種々の改変または変更が当業者には示唆され、本明細書および添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に含まれると理解される。本明細書に引用されている総ての刊行物、特許、および特許出願は、目的を問わず、引用することによりそれらの全内容が本明細書の一部とされる。
【０４００】
それとともに示される本開示のいくつかの実施形態を以下の限定されない例によってさらに説明する。
【実施例】
【０４０１】
実施例１：ＷＲＮ合成致死（ＳＬ）相互作用
本実施例は、ＲＥＣＱヘリカーゼであるＷＲＮのＳＬ相互作用を示し、そのようなＳＬ相互作用を別のＲＥＣＱヘリカーゼであるＢＬＭと比較する。
【０４０２】
材料および方法
ＢＬＭおよびＷＲＮと、ＰＡＲＰ、ＭＬＨ１、ＦＢＸＷ７およびＡＴＭなどの臨床上関連のあるＤＤＲタンパク質の間で存在し得るＳＬ相互作用を試験した（表１）。
【表１】
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【０４０３】
増殖アッセイにおいて３つのアプローチを使用した。第１は、同質遺伝子ＨＡＰ１親およびＢＬＭまたはＷＲＮ  ＣＲＩＳＰＲノックアウト（ＫＯ）細胞株を市販のツールの化合物で処理することであった。第２は、ＨＡＰ１親およびＷＲＮ／ＢＬＭ  ＫＯ細胞を潜在的ＳＬパートナーのｓｉＲＮＡでトランスフェクトするかまたはＷＲＮおよびＢＬＭ  ｓｉＲＮＡを潜在的ＳＬパートナーのＫＯ細胞にトランスフェクトすることであった。最後に、ｓｉＲＮＡを個々に、また一緒に共トランスフェクトすることを含む二重ｓｉＲＮＡ実験を行った。
【０４０４】
細胞株：  ＨＡＰ１同質遺伝子細胞株はＨｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｒｙ（ＢＬＭ；ＨＺＧＨＣ０００６２９ｃ００７、ＷＲＮ；ＨＺＧＨＣ０００４３２ｃ００１）から入手した。他の株は総てＡＴＣＣから入手した。レンチウイルス感染を用い、ｐＬＶｂｓｄ−ＥＦ１ａ−ＨＡベクターにクローニングすることにより安定細胞株を作出した。クローニングおよびレンチウイルス粒子の生成はＢｉｏｓｉｅｔｔｉａ  Ｉｎｃ．で行った。細胞を６ウェルプレートに播種した（２２５，０００細胞／ウェル）。翌日、細胞に、ＷＲＮ救済実験ではＭＯＩ  ５、ＭＬＨ１およびＭＲＥ１１救済実験ではＭＯＩ  １０でウイルスおよびポリブレン（８μｇ／ｍｌ）を感染させた。４８時間後、感染細胞を選択するために、１０μｇ／ｍｌのブラストサイジンを含有する培地に細胞を播種した。
【０４０５】
トランスフェクション：  ｓｉＲＮＡはＬｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した（表２）。
【表２】
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【０４０６】
細胞を５ｎＭの陰性対照ｓｉＲＮＡ番号１（カタログ番号４３９０８４２）または関連のｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。Ｋｉｆ１１は分裂中の細胞で必須の遺伝子である。細胞を計数し、２４ウェルプレートに播種した（５０，０００細胞／ウェル）。およそ８時間後、それらの細胞をｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。３〜４日後、対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞を計数し、９６ウェルプレートに３反復で播種した（５００〜１０００細胞／ウェル）。残りの細胞を、ＲＴＰＣＲを用いたノックダウンの程度を決定するために使用した。遺伝子標的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞を、ノックダウンの最初の４日に見られた効果を維持するために、対照ｓｉＲＮＡ細胞に対して計算した容量で播種した。翌日、これらの細胞を再びトランスフェクトし、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭ装置で４〜５日モニタリングした。
【０４０７】
ＲＴ−ＰＣＲ：  ＴａｑｍａｎプローブはＬｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した（表３）。ＲＮＡｅａｓｙ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ；７４１０６）を用いてＲＮＡを単離した。逆転写反応（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１１７５６５００）で１００ｎｇのＲＮＡを使用した。得られたｃＤＮＡを２倍希釈し、販売者のマニュアルに従い、ＰＰＩＡに対する内部遺伝子対照プローブ（ＶＩＣ）および標的遺伝子プローブ（ＦＡＭ）を含有するｔａｑｍａｎ遺伝子発現マスターミックス（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；４３６９０１６）に加えた。
【表３】
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【０４０８】
結果
３種類のｓｉＲＮＡ標的ＭＬＨ１は、それぞれＢＬＭおよびＷＲＮ転写産物上のＢＬＭおよびＷＲＮ  ｓｉＲＮＡと同様に、ＭＬＨ１転写産物の効率的なノックダウンを示した（図１）。ＭＭＲの際、ＭＳＨ２はＭＳＨ６との複合体で存在し、ＭＬＨ１はＰＭＳ２との複合体で存在する(Li GM. Cell Res 2008;18(1):85-98)。ＭＳＨ２またはＭＬＨ１発現が低下すると、ＭＳＨ６およびＰＭＳ２は不安定化し、このことはＭＳＨ２およびＭＬＨ１が、ＤＮＡミスマッチを検出するタンパク質複合体のコア成分であることを示唆する。従って、本発明者らは、ＭＳＨ２とＷＲＮの二重ノックダウンが相乗作用して合成致死をもたらすかどうかを評価した。ＭＳＨ２とＷＲＮを用いた二重ｓｉＲＮＡは合成致死をもたらさなかった（図６Ａおよび図６Ｂ）。加えて、ＰＭＳ１およびＰＭＳ２増殖協同作用の欠如をもたらさなかった（図６Ａおよび図６Ｂ）。
【０４０９】
実施例２：ＭＭＲ欠陥細胞株はＷＲＮノックダウン感受性である
ＭＬＨ１および他のＭＭＲタンパク質のタンパク質発現はいくつかの結腸直腸癌細胞株では失われている。本実施例では、ＭＭＲ欠陥／ＭＳＩ細胞株がＭＭＲ正常／マイクロサテライト安定（ＭＳＳ）細胞株に比べてＷＲＮ感受性であったかどうかを調べる。
【０４１０】
材料および方法
増殖および生存アッセイ：  核に赤色蛍光タンパク質を発現させて生細胞の計数を可能とするために、細胞株にＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄレンチウイルス（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；４４７６）を感染させた。細胞を計数し、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭ装置でモニタリングした。
【０４１１】
他の実験も上記と同様に行った。
【０４１２】
結果
５種類のＭＭＲ欠陥／ＭＳＩ細胞株、ＨＣＴ１１６、ＬｏＶｏ、ＲＫＯ、ＳＷ４８、およびＬＳ１７４Ｔは、７日または１０日生存アッセイで、ＷＲＮノックダウン感受性であることが判明した（図２、上の列）。これに対し、ＭＭＲ正常／ＭＳＳ細胞株ＳＷ６２０、ＳＷ９４８、およびＴ８４はＷＲＮノックダウンに非感受性であることが判明した（図２、下の列）。ＲＴ−ＰＣＲを用いてノックダウンレベルを確認した（図７Ａおよび図７Ｂ）。二重ｓｉＲＮＡ実験では、ＭＳＨ２はＷＲＮとのＳＬではなかったが（図６Ａ）、ＭＳＨ２に突然変異を有する細胞株ＬｏＶｏは、ＷＲＮノックダウン感受性である（図２）。このＭＳＨ２突然変異細胞株の感受性はまた、ＷＲＮが下流ＭＳＩとのＳＬであり得ることも示唆する。
【０４１３】
ＭＲＥ１１に同型接合突然変異を有するいくつかのＭＳＩ細胞株はＷＲＮノックダウン感受性であることが従前に示されたので、本発明者らは、ＷＲＮがＭＲＥ１１とのＳＬであったかどうかを試験した。ＭＳＨ６を発現せず、ＭＲＥ１１のＷＴコピーを１つだけ有する、ＤＬＤ−１細胞におけるＭＲＥ１１のノックダウンは、これらの細胞をＷＲＮ欠損感受性としなかった（データは示されていない）。さらに、ＷＲＮ感受性ＭＳＩ細胞株におけるＭＲＥ１１の再発現（図８Ａ）は、ＷＲＮ  ｓｉＲＮＡ表現型を救済しなかった（図８Ｂ）。ＷＲＮ表現型は、ＭＬＨ１の再発現によって救済することができなった。理論に縛られるものではないが、再発現は、ＭＭＲを回復させ、かつ／またはＭＳＩを戻すには十分でなかった可能性がある。ＭＭＲ正常細胞は６−チオグアニンに感受性であり、ＭＭＲ欠陥細胞は耐性である(Yan T, Berry SE, Desai AB, Kinsella TJ., Clin Cancer Res 2003;9(6):2327-34)。ＭＬＨ１再発現細胞は、６−ＴＧにより感受性が高いことが判明し（図８Ｃ）、このことは、ＭＭＲは救済できたがＷＲＮ  ｓｉＲＮＡ表現型は救済できなかったことを示す。
【０４１４】
実施例３：ＷＲＮノックダウンはＤＳＢを増し、ＭＳＩ細胞の細胞周期を変化させる
本実施例では、ＷＲＮノックダウンが、ＭＳＩ細胞における、二本鎖ＤＮＡ切断および細胞周期にどのような影響を及ぼすかを調べる。
【０４１５】
材料および方法
抗体：  ＷＲＮ（Ｂｅｔｈｙｌ  ｌａｂｓ；Ａ３００−２３９Ａ）、チューブリン（ＬｉＣＯＲ；９２６−４２２１１）、γＨ２ＡＸ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；０５−６３６）、ｐ２１（ａｂｃａｍ；ａｂ１０９５２０）、ホスホ−Ｈ３  ４８８（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；３４６５５）。
【０４１６】
免疫蛍光：  細胞を９６ウェルプレートに播種し（２０００細胞／ウェル）、３．７％ホルムアルデヒドで固定する前に、２４時間、４８時間および７２時間トランスフェクトした。一次抗体とともに一晩インキュベートする前に、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを用いて細胞に透過処理を施した。高コンテンツＩＮＣＥＬＬイメージャーを用いて画像を採集した。
【０４１７】
フローサイトメトリー：  細胞を６ウェルプレートに播種し（１００，０００〜１５０，０００細胞／ウェル）、４８時間および７２時間トランスフェクトした。Ｓ期の細胞を検出するために、本発明者らはＣｌｉｃｋ−ｉＴ  ＥｄＵキット（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃ１０４２５）を使用した。細胞を１０μＭ  ＥｄＵとともに２時間インキュベートした。Ｍ期の細胞を検出するためには、トランスフェクト細胞を３．７％ホルムアルデヒドで固定し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで透過処理を施し、抗ホスホＨ３抗体とともにインキュベートした。ＤＮＡ含量を測定するために、分析前にＤＲＡＱ７（Ａｂｃａｍ；ａｂ１０９２０２）を細胞に加えた。
【０４１８】
他の実験も上記と同様に行った。
【０４１９】
結果
ＷＲＮノックダウンがＭＳＩ細胞の生存率の喪失を誘導するメカニズムを理解するために、２４時間、４８時間および７２時間でトランスフェクト細胞を採取し、γＨ２ＡＸ抗体およびｐ２１抗体を用いて染色した。対照ｓｉＲＮＡに比べ、ＷＲＮ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたより多くのＨＣＴ１１６細胞（図３Ａ）およびＲＫＯ細胞（図９）が、γＨ２ＡＸとｐ２１の両方に陽性染色を示した。他方、ＳＷ６２０（ＭＳＳ）細胞はγＨ２ＡＸレベルに変化を示さなかった（図９）。３細胞株総ての抗体染色の定量を図３Ｂに示す。ｐ２１は、ＴＰ５３に突然変異を有するＳＷ６２０細胞では検出されなかった。ｐ２１はｐ５３標的遺伝子であるので、理論に縛られるものではないが、このことはｐ２１の検出が不能であることを説明し得る。ｐ２１は、Ｇ１からＳへのチェックポイントで働いて細胞周期を調節する。興味深いことに、ＤＬＤ−１細胞以外のほとんどのＭＳＩ細胞株は、ＴＰ５３に関してＷＴであるが、ＭＳＳ細胞株はＴＰ５３に関してほとんどが変異型である(Ahmed D, Eide PW, Eilertsen IA, Danielsen SA, Eknaes M, Hektoen M, et al., Oncogenesis 2013; 2:e71 doi 10.1038/oncsis.2013.35)。
【０４２０】
ＭＳＩ細胞におけるＷＲＮ欠損後のｐ２１レベルの大幅な増加が、これらの細胞における細胞周期変化の測定を促した。フローサイトメトリー分析により、ｐ２１の上昇レベルと一致して、Ｓ期に入る細胞の減少が明らかとなった。Ｍ期にあり、かつ、２Ｎ  ＤＮＡを有する細胞の減少も見られたが、４Ｎ  ＤＮＡを有する細胞の増加も見られた（図３Ｃ、図１０Ａ、および図１０Ｂ）。４Ｎ細胞の増加は、細胞が有糸分裂を通していないことと一致している。要約すると、ＷＲＮ発現の低下がＤＳＢの増加を引き起こし、これは次に増殖を緩慢にする細胞周期の変化に至る。
【０４２１】
実施例４：ＷＲＮヘリカーゼドメインはＭＳＩ細胞においてＷＲＮノックダウン表現型を救済することができる
本実施例では、ＷＲＮ  ＭＳＩ  ＳＬ相互作用にどのドメインが必要とされるかを示す。
【０４２２】
材料および方法
ｓｉＲＮＡ耐性野生型（ＷＴ）、エキソヌクレアーゼ死滅（Ｅ８４Ａ）、ヘリカーゼ死滅（Ｋ５７７Ｒ）および酵素的に死滅（Ｅ８４Ａ／Ｋ５７７Ｒ）ＷＲＮを構成的に発現する細胞株を作出した。次に、これらの細胞を５’ＵＴＲまたはＷＲＮ  ｍＲＮＡのエキソン８内に対するｓｉＲＮＡでトランスフェクトした（図４Ａ）。ＷＲＮのｓｉＲＮＡ耐性プールを、５’ＵＴＲ  ｓｉＲＮＡを用いたウエスタンブロットにより検出したところ、このシステムは意図されたとおりに機能することを示した（図４Ｂおよび図１１Ｂ）。
【０４２３】
他の実験も上記と同様に行った。
【０４２４】
結果
両方のｓｉＲＮＡでのノックダウンは陰性対照細胞株の増殖を低下させた。５’ＵＴＲ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞では、ＷＴおよびエキソヌクレアーゼ死滅ＷＲＮで部分的からほぼ完全な救済が見られた（図４Ｃ）。これに対し、ヘリカーゼ死滅および酵素的に死滅ＷＲＮは、５’ＵＴＲ  ｓｉＲＮＡで見られた増殖の欠如を救済しなかった。また、ＷＲＮノックダウンはＨＣＴ  １１６細胞においてカスパーゼ３および７の相対活性を高めたことも判明した（図１１Ａ）。増殖の救済と一致して、ＷＴおよびエキソヌクレアーゼ死滅ＷＲＮは、５’ＵＴＲ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞においてカスパーゼ活性の上昇を救済したが、ヘリカーゼ死滅突然変異体は救済しなかった。これらの結果は、ＷＲＮのヘリカーゼ活性がＷＲＮ  ＳＬ相互作用を駆動することを示す。
【０４２５】
これらの結果は、ＭＳＩを有する細胞がＷＲＮに依存することを示した（図５、グレーの四角）。理論に縛られるものではないが、ＷＲＮ  ＭＳＩ相互作用を説明するために以下のモデルが提案される。ＤＮＡ複製、ＷＲＮを含まないＭＳＩ細胞は複製を再開できず、それらのテロメアを維持する（図５）。ＭＳＩの他、ＭＬＨ１の欠損も染色体内テロメア配列挿入(intrachromosomal telomere sequence insertions)（ＴＳＩ）を増加させることが報告されている(Jia P, Chastain M, Zou Y, Her C, Chai W., Nucleic Acids Res 2017;45(3):1219-32)。ＭＳＩ、ＴＳＩ、停止した複製点およびより短いテロメアの組合せが、少なくとも部分的にはより多い二本鎖切断によって示される修復不能のＤＮＡ損傷をもたらす。ＤＳＢの蓄積は、ｐ２１細胞の休止およびアポトーシス細胞死を引き起こす。
【０４２６】
実施例５：ＭＳＩ対ＭＳＳ細胞株に対するＮＳＣ化合物の効果
本実施例では、ＭＳＩを有することで特徴づけられる細胞株に対する既知のＷＲＮの小分子阻害剤の効果を試験する。
【０４２７】
材料および方法
核に赤色蛍光タンパク質を発現させて生細胞を計数するために、細胞株にＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄレンチウイルス（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番後４４７６）を感染させた。高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を有する２つの細胞株ＨＣＴ１１６およびＲＫＯと、２つのマイクロサテライト安定（ＭＳＳ）細胞株ＳＷ６２０およびＳＷ９４８を、ＷＲＮ阻害剤ＮＳＣ１９６３０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍカタログ番号６８１６４７）およびＮＳＣ６１７１４５（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＳＭＬ１００５）で以下のように処理した。細胞を計数し、９６ウェルプレートに３反復で播種した（ＭＳＩに対しては５００細胞／ウェルおよびＭＳＳに対しては１０００細胞／ウェル）。翌日、細胞を化合物で処理し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭ装置で６日間モニタリングした。最終時点からの細胞計数値を用いてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７でＩＣ５０値を計算した。
【０４２８】
結果
ＭＳＩ細胞株に対するＮＳＣ１９６３０およびＮＳＣ６１７１４５の効果を図１２に示す。従前に記載したｓｉＲＮＡ処理を用いた実験（例えば、図２）に一致して、ＭＳＩ細胞株を小分子に曝すと細胞の増殖の低下が起こった。ＭＳＳ細胞株ＳＷ６２０およびＳＷ９４８からのデータは阻害剤に対する感受性の違いを示し、これはおそらくいくつかの細胞株におけるより高い濃度での非ＭＳＩ関連効果または標的外効果を示唆する。
【０４２９】
実施例６：結腸癌ヒト異種移植マウスモデルにおけるＷＲＮノックダウンの効果
本実施例では、ヒト結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６に由来するマウスでの異種移植腫瘍におけるＷＲＮ発現ノックダウンの効果を試験する。
【０４３０】
材料および方法
ＷＲＮ  ｓｈＲＮＡ細胞株の作出：対照ｓｈＲＮＡまたは３種類の誘導ＷＲＮ  ｓｈＲＮＡを発現させるために、ＨＣＴ１１６細胞にポリブレン（８μｇ／ｍｌ）の存在下でレンチウイルスをＭＯＩ  ５で感染させた。レンチウイルス粒子はＤｈａｒｍａｃｏｎから購入した（カタログ番号Ｖ３ＳＨ７６６９−２２５８１５１１２、Ｖ３ＳＨ７６６９−２２５８７２５６５、Ｖ３ＳＨ７６６９−２２６１１０６９３）。ピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）を用いた抗生物質選択の後、限界希釈を用いてクローンを選択した。ｓｈＲＮＡあたり１０クローンを、ＷＲＮタンパク質のノックダウン（ウエスタン）ならびにドキシサイクリン（０．５μｇ／ｍｌ）の存在下および不在下での生存率で特徴づけた。類似の増殖曲線を示した２つの対照ｓｈＲＮＡおよび８つのｓｈＲＮＡを、ＷＲＮ転写産物ノックダウン（ＲＴＰＣＲ）および生存率でさらに特徴づけた。１つの対照および２つのＷＲＮ  ｓｈＲＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏ移植のために選択した。
【０４３１】
雌ＳＣＩＤマウスを入手し（例えば、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから）、例えば、１ケージ当たりマウス５個体を収容した。食物および水は自由に摂らせた。マウスは試験開始前に少なくとも５日間、動物施設に馴化させる。動物は、例えば、１２時間明：１２時間暗のスケジュールの光周期（０６：００時間に点灯）で試験した。試験は総てＩｄｅａｙａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅの所内動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)および実験動物の管理と使用に関する指針(Care and Use of Laboratory Animals Guidelines)としてのＮＩＨ指針に準じて実施する。
【０４３２】
異種移植片を作出するために、例えば、１または３×１０６のヒト結腸癌ＨＣＴ−１１６（ＡＴＣＣ）由来の生腫瘍細胞またはＨＣＴ−１１６  ｓｈＷＲＮ細胞の懸濁液を、６〜８週齢マウスの側腹部に皮下注射する。注射容量は例えば０．１ｍＬとし、ＨＢＳＳおよびマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の１：１混合物から構成される。腫瘍サイズは例えばおよそ２００〜２５０ｍｍ３で合わせる。腫瘍のサイズを合わせた当日または２４時間後に療法を開始する。各試験群は例えば８〜１０個体を含む。腫瘍は例えば週に２〜３回測定する。例えば電子カリパスで腫瘍の長さ（Ｌ）と幅（Ｗ）の測定値を得、下式：Ｖ＝Ｌ×Ｗ２／２に従って体積を計算する。
【０４３３】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＨＣＴ−１１６  ｓｈＷＲＮ細胞からのＷＲＮのノックダウンを特徴づけるために、動物にドキシサイクリンの用量を増加して投与する。ドキシサイクリンヒクラートを例えば、注射用の０．９％塩化ナトリウムで再構成し、所定の間隔で腹腔内に投与する。投与後の定義された時間に腫瘍を採取し、ＰＣＲまたはウエスタンブロットによりＷＲＮノックダウンを判定する。ＨＣＴ−１１６細胞に対する持続的ＷＲＮノックダウンの効果を判定するために、腫瘍のサイズを合わせ、所定の日数、ドキシサイクリンを投与する。
【０４３４】
腫瘍体積が最大、例えば２０００ｍｍ３に達するか、または皮膚潰瘍もしくは他の病的状態の提示か、どちらか早く起こる方でマウスを安楽死させる。総ての群について、腫瘍体積を全動物セットが試験に残らせる期間だけプロットする。動物が試験を離脱しなければならない場合、残りの動物をそれらが定義されたエンドポイントに達するまで、腫瘍成長に関してモニタリングする。
【０４３５】
パーセンテージとして表される最大腫瘍成長阻害（ＴＧＩｍａｘ）は、試験品で処置した群と薬物で処置した対照群の平均腫瘍体積間の最大相違を示す。パーセンテージとして表される腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）は、試験品処置群の腫瘍が１ｃｍ３に達する平均期間を対照群と比較した場合の差である。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験からのデータは、例えば、ＴＧＩｍａｘに対する事後ボンフェローニ補正、ＴＧＤに対してはマンテル・コックスのログランク検定を用いて、２元配置ＡＮＯＶＡを使用して分析する（例えば、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用）。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ−１】
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【図４Ｃ−２】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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