(57)【要約】  本明細書において、３分子または多分子生物発光複合体のアセンブリのための組成物及び方法が提供される。特に、生物発光複合体が、（例えば、別個のまたはジペプチドもしくはトリペプチドとして融合された）２つ以上のペプチドタグ及びポリペプチド構成要素が相互作用する際に形成される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２３との４０％を超えるが、１００％未満の配列同一性ならびに配列番号６、配列番号９、及び／または配列番号２９との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが配列番号２５からなる第２のペプチド及び配列番号１７からなるポリペプチド相補体と接触する場合に、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質の存在下で生成される生物発光シグナルが、前記ペプチド及び前記セレンテラジン基質のみにより生成される生物発光シグナルと比較した場合に実質的に増加する、前記ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが前記第２のペプチド及び前記ポリペプチド相補体と会合する場合に、前記生物発光シグナルが実質的に増加する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号６及び／または配列番号９のペプチドと比較して１つ以上の形質の増強を示し、前記形質が、前記第２のペプチド及び前記ポリペプチド相補体に対する親和性、発現、溶解性、安定性、ならびに前記第２のペプチド及び前記ポリペプチド相補体と組み合わされた場合の生物発光活性から選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記アミノ酸配列が、天然に存在するタンパク質またはその断片でない、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸配列が、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、及び／またはペプトイドアミノ酸を含有する、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載のペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項７】
請求項１に記載のペプチド及び追加のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記追加のアミノ酸配列が、関心対象のタンパク質、相互作用要素、共局在要素、及び結合部分からなる群から選択される、請求項７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記追加のアミノ酸配列が、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から選択される結合部分である、請求項８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
前記追加のアミノ酸配列が、第１の相互作用ポリペプチド及び第２の相互作用ポリペプチドの接触に際して、前記第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成するように構成されている前記第１の相互作用ポリペプチドである、請求項８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記追加のアミノ酸配列が、第１の共局在ポリペプチドであって、細胞内区画、細胞、組織、または生物内で第２の共局在ポリペプチドと共に共局在するように構成されている前記第１の共局在ポリペプチドである、請求項８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
前記追加のアミノ酸配列が、関心対象のタンパク質であり、薬物標的候補である、請求項８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項７に記載の融合ポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項１４】
配列番号２５との４０％を超えるが、１００％未満の配列同一性ならびに配列番号７及び／または配列番号１０との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが配列番号２３からなる第２のペプチド及び配列番号１７からなるポリペプチド相補体と接触する場合に、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質の存在下で生成される生物発光シグナルが、前記ペプチド及び前記セレンテラジン基質のみにより生成される生物発光シグナルと比較した場合に実質的に増加する、前記ペプチド。
【請求項１５】
前記ペプチドが前記第２のペプチド及び前記ポリペプチド相補体と会合する場合に、前記生物発光シグナルが実質的に増加する、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１６】
配列番号７及び／または配列番号１０のペプチドと比較して１つ以上の形質の増強を示し、前記形質が、前記第２のペプチド及び前記ポリペプチド相補体に対する親和性、発現、溶解性、安定性、ならびに前記第２のペプチド及び前記ポリペプチド相補体と組み合わされた場合の生物発光活性から選択される、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１７】
前記アミノ酸配列が、天然に存在するタンパク質またはその断片でない、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１８】
前記アミノ酸配列が、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、及び／またはペプトイドアミノ酸を含有する、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項１９】
請求項１４に記載のペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項２０】
請求項１４に記載のペプチド及び追加のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
【請求項２１】
前記追加のアミノ酸配列が、関心対象のタンパク質、相互作用要素、共局在要素、及び結合部分からなる群から選択される、請求項２０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２２】
前記追加のアミノ酸配列が、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から選択される結合部分である、請求項２１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２３】
前記追加のアミノ酸配列が、第１の相互作用ポリペプチド及び第２の相互作用ポリペプチドの接触に際して、前記第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成するように構成されている前記第１の相互作用ポリペプチドである、請求項２１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２４】
前記追加のアミノ酸配列が、第１の共局在ポリペプチドであって、細胞内区画、細胞、組織、または生物内で第２の共局在ポリペプチドと共に共局在するように構成されている前記第１の共局在ポリペプチドである、請求項２１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２５】
前記追加のアミノ酸配列が、関心対象のタンパク質であり、薬物標的候補である、請求項２１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２６】
請求項２０に記載の融合ポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項２７】
（ａ）配列番号２５との４０％を超えるが、１００％未満の配列同一性ならびに配列番号７及び／または配列番号１０との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチドと、
（ｂ）配列番号２３との４０％を超えるが、１００％未満の配列同一性ならびに配列番号６、配列番号９、及び配列番号２９との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチドと、を含む組成物であって、
前記第１のペプチドが前記第２のペプチド及び配列番号１７からなるポリペプチド相補体と接触する場合に、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質の存在下で生成される生物発光シグナルが、前記第１のペプチド及び／または前記第２のペプチドならびに前記セレンテラジン基質のみにより生成される生物発光シグナルと比較した場合に実質的に増加する、前記組成物。
【請求項２８】
前記第１のペプチドが前記第２のペプチド及び前記ポリペプチド相補体と会合する場合に、前記生物発光シグナルが実質的に増加する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記第１のペプチドが、配列番号７及び／または配列番号１０のペプチドと比較して１つ以上の形質の増強を示し、前記第２のペプチドが、配列番号６、配列番号、９及び配列番号２９のペプチドと比較して１つ以上の形質の増強を示し、前記形質が、前記第２のペプチド及び前記ポリペプチド相補体に対する親和性、発現、溶解性、安定性、ならびに前記第２のペプチド及び前記ポリペプチド相補体と組み合わされた場合の生物発光活性から選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
前記第１及び／または第２のペプチドの前記アミノ酸配列が、天然に存在するタンパク質またはその断片でない、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３１】
前記第１及び／または第２のペプチドの前記アミノ酸配列が、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、及び／またはペプトイドアミノ酸を含有する、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
請求項２７に記載の第１及び第２のペプチドをコードする配列を含む核酸を含む組成物。
【請求項３３】
請求項２７に記載の第１及び第２のペプチドならびに追加のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを含む組成物。
【請求項３４】
前記追加のアミノ酸配列が、関心対象のタンパク質、相互作用要素、共局在要素、及び結合部分からなる群から選択される、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記追加のアミノ酸配列が、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から選択される結合部分である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記追加のアミノ酸配列が、第１の相互作用ポリペプチド及び第２の相互作用ポリペプチドの接触に際して、前記第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成するように構成されている前記第１の相互作用ポリペプチドである、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３７】
前記追加のアミノ酸配列が、第１の共局在ポリペプチドであって、細胞内区画、細胞、組織、または生物内で第２の共局在ポリペプチドと共に共局在するように構成されている前記第１の共局在ポリペプチドである、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３８】
前記追加のアミノ酸配列が、関心対象のタンパク質であり、薬物標的候補である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３９】
請求項３３に記載の組成物をコードする配列を含む核酸を含む組成物。
【請求項４０】
配列番号１７との４０％を超えるが、１００％未満の配列同一性ならびに配列番号５、配列番号８、及び／または配列番号２７との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが配列番号２３からなる第１のペプチド及び配列番号２５からなる第２のペプチドと接触する場合に、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質の存在下で生成される生物発光シグナルが、前記ペプチド及び前記セレンテラジン基質のみにより生成される生物発光シグナルと比較した場合に実質的に増加する、前記ポリペプチド。
【請求項４１】
前記ポリペプチドが前記第１及び第２のペプチドと会合する場合に、前記生物発光シグナルが実質的に増加する、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記ポリペプチドが、配列番号５及び／または配列番号８のポリペプチドと比較して１つ以上の形質の増強を示し、前記形質が、前記第１及び／または第２のペプチドに対する親和性、発現、溶解性、安定性、ならびに前記第１及び第２のペプチドと組み合わされた場合の生物発光活性から選択される、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記アミノ酸配列が、天然に存在するタンパク質またはその断片でない、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
前記アミノ酸配列が、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、及び／またはペプトイドアミノ酸を含有する、請求項４３に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
請求項４０に記載のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項４６】
請求項４０に記載のポリペプチド及び追加のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
【請求項４７】
前記追加のアミノ酸配列が、関心対象のタンパク質、相互作用要素、共局在要素、及び結合部分からなる群から選択される、請求項４６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４８】
前記追加のアミノ酸配列が、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から選択される結合部分である、請求項４７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４９】
前記追加のアミノ酸配列が、第１の相互作用ポリペプチド及び第２の相互作用ポリペプチドの接触に際して、前記第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成するように構成されている前記第１の相互作用ポリペプチドである、請求項４７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５０】
前記追加のアミノ酸配列が、第１の共局在ポリペプチドであって、細胞内区画、細胞、組織、または生物内で第２の共局在ポリペプチドと共に共局在するように構成されている前記第１の共局在ポリペプチドである、請求項４７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５１】
前記追加のアミノ酸配列が、関心対象のタンパク質であり、薬物標的候補である、請求項４７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５２】
請求項４６に記載の融合ポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項５３】
配列番号５１及び／または３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号５、配列番号８、及び配列番号２７との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが配列番号２３からなる第１のペプチド及び配列番号２５からなる第２のペプチドと接触する場合に、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質の存在下で生成される生物発光シグナルが、前記ペプチド及び前記セレンテラジン基質のみにより生成される生物発光シグナルと比較した場合に実質的に増加する、前記ポリペプチド。
【請求項５４】
前記ポリペプチドが前記第１及び第２のペプチドと会合する場合に、前記生物発光シグナルが実質的に増加する、請求項５３に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
前記ポリペプチドが、配列番号５及び／または配列番号８のポリペプチドと比較して１つ以上の形質の増強を示し、前記形質が、前記第１及び／または第２のペプチドに対する親和性、発現、溶解性、安定性、ならびに前記第１及び第２のペプチドと組み合わされた場合の生物発光活性から選択される、請求項５３に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
前記アミノ酸配列が、天然に存在するタンパク質またはその断片でない、請求項５３に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
前記アミノ酸配列が、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、及び／またはペプトイドアミノ酸を含有する、請求項５６に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
請求項５３に記載のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項５９】
請求項５３に記載のポリペプチド及び追加のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
【請求項６０】
前記追加のアミノ酸配列が、関心対象のタンパク質、相互作用要素、共局在要素、及び結合部分からなる群から選択される、請求項５９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６１】
前記追加のアミノ酸配列が、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から選択される結合部分である、請求項６０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６２】
前記追加のアミノ酸配列が、第１の相互作用ポリペプチド及び第２の相互作用ポリペプチドの接触に際して、前記第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成するように構成されている前記第１の相互作用ポリペプチドである、請求項６０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６３】
前記追加のアミノ酸配列が、第１の共局在ポリペプチドであって、細胞内区画、細胞、組織、または生物内で第２の共局在ポリペプチドと共に共局在するように構成されている前記第１の共局在ポリペプチドである、請求項６０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６４】
前記追加のアミノ酸配列が、関心対象のタンパク質であり、薬物標的候補である、請求項６０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６５】
請求項５９に記載の融合ポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項６６】
（ａ）配列番号１７、２１、または３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号５及び／または配列番号８との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドと、
（ｂ）配列番号２３との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号６及び／または配列番号９との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチドと、
（ｃ）配列番号２５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号７及び／または配列番号１０との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチドと、を含む生物発光複合体であって、
前記生物発光複合体が、前記ポリペプチドのみの存在下、前記第１のペプチドのみの存在下、前記第２のペプチドのみの存在下、ならびに前記ポリペプチド、前記第１のペプチド、及び前記第２のペプチドのうちの任意の２つの存在下でのセレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質と比較した場合に実質的に増加した生物発光を、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質の存在下で生成する、前記生物発光複合体。
【請求項６７】
前記第１のペプチドが第１のペプチドタグであり、前記第２のペプチドが第２のペプチドタグであり、前記第１及び第２のペプチドタグが、それぞれ関心対象の分子、関心対象のペプチド、関心対象のタンパク質、相互作用要素、共局在要素、または結合部分からなる群から独立して選択される部分に連結される、請求項６６に記載の生物発光複合体。
【請求項６８】
前記第１のペプチドタグまたは前記第２のペプチドタグが薬物または候補薬物に連結され、他方のペプチドタグが薬物標的または薬物標的候補に連結され、前記生物発光複合体からの前記生物発光の強度が、前記薬物または候補薬物の前記薬物標的または薬物標的候補に対する親和性と相関する、請求項６７に記載の生物発光複合体。
【請求項６９】
前記第１のペプチドタグが第１の相互作用要素に連結され、前記第２のペプチドタグが第２の相互作用要素に連結され、前記生物発光複合体からの前記生物発光の強度が、分析される条件下での前記第１の相互作用要素の前記第２の相互作用要素に対する親和性と相関する、請求項６７に記載の生物発光複合体。
【請求項７０】
前記第１のペプチドタグが第１の共局在要素に連結され、前記第２のペプチドタグが第２の共局在要素に連結され、実質的に増加した生物発光が、分析される条件下での前記第１の共局在要素及び前記第２の共局在要素の共局在を示すが、必ずしも相互作用を示すわけではない、請求項６７に記載の生物発光複合体。
【請求項７１】
（ａ）（ｉ）配列番号２３との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号６及び配列番号９との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチドと、
（ｉｉ）配列番号２５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号７及び配列番号１０との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチドと、
（ｉｉｉ）配列番号１７、２１、及び／または３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号５及び／または配列番号８との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド構成要素であって、前記第１のペプチドタグ、前記第２のペプチドタグ、及び前記ポリペプチド構成要素が、第１の分子実体及び第２の分子実体の相互作用に際して生物発光複合体を生成するように構成されている、前記ポリペプチド構成要素と、
（ｉｖ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質と、を組み合わせることと、
（ｂ）発光を検出することであって、前記ポリペプチド構成要素及びセレンテラジンまたはセレンテラジン類似体のみにより生成される発光のレベルと比較してより高いレベルの発光が、前記ポリペプチド構成要素ならびに前記第１及び第２のペプチドの生物発光複合体の形成を示す、前記発光を検出することと、を含む方法。
【請求項７２】
前記ポリペプチド構成要素ならびに前記第１及び第２のペプチドのうちの１つ以上が、細胞内で発現される、細胞に外来性に添加される、及び／または試料に添加される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
第１の分子実体と第２の分子実体との間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）前記第１の分子実体を、配列番号２３との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号６及び／または配列番号９との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチドタグでタグ付けすることと、
（ｂ）前記第２の分子実体を、配列番号２５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号７及び／または配列番号１０との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチドタグでタグ付けすることと、
（ｃ）前記タグ付けされた第１の分子実体及び前記タグ付けされた第２の分子実体を組み合わせることと、
（ｄ）配列番号１７、配列番号２１、及び／または配列番号３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号５及び／または配列番号８との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド構成要素を添加することであって、前記第１のペプチドタグ、前記第２のペプチドタグ、及び前記ポリペプチド構成要素が、前記第１の分子実体及び前記第２の分子実体の相互作用に際して生物発光複合体を生成するように構成されている、前記添加することと、
（ｅ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質を添加することと、
（ｆ）前記生物発光複合体により生成された発光シグナルを検出することであって、前記発光シグナルの大きさが、前記第１の分子実体と前記第２の分子実体との間の相互作用の強さと相関する、前記検出することと、を含む前記方法。
【請求項７４】
前記第１の分子実体及び／または前記第２の分子実体が、関心対象のタンパク質または関心対象のペプチドであり、タグ付けすることが、前記第１の分子実体及び／または前記第２の分子実体の前記第１のペプチドタグ及び／または前記第２のペプチドタグとの融合物を作製することを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記第１の分子実体及び／または前記第２の分子実体が、低分子であり、タグ付けすることが、前記第１の分子実体及び／または前記第２の分子実体を直接または間接的に前記第１のペプチドタグ及び／または前記第２のペプチドタグと連結することを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記第１の分子実体及び前記第２の分子実体のうちの一方が薬物または候補薬物であり、他方が薬物標的または薬物標的候補であり、前記生物発光シグナルが、前記薬物または候補薬物の薬物標的または薬物標的候補である他方への結合を示す、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
前記タグ付けされた第１の分子実体及び前記タグ付けされた第２の分子実体を組み合わせることが、一方もしくは両方を細胞内で発現させること、及び／または一方もしくは両方を細胞に添加することを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
第１のタンパク質またはペプチド実体と第２のタンパク質またはペプチド実体との間の細胞内での相互作用を検出する方法であって、
（ａ）前記第１のタンパク質またはペプチド実体、ならびに配列番号２３との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号６及び配列番号９との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチドタグを含む融合物を前記細胞内で発現させることと、
（ｂ）前記第２のタンパク質またはペプチド実体、ならびに配列番号２５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号７及び／または配列番号１０との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチドタグを含む融合物を前記細胞内で発現させることと、
（ｃ）配列番号１７、２１、及び／または３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号５及び／または配列番号８との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド構成要素を、前記細胞内で発現させることであって、前記第１のペプチドタグ、前記第２のペプチドタグ、及び前記ポリペプチド構成要素が、前記第１のタンパク質またはペプチド実体及び前記第２のタンパク質またはペプチド実体の相互作用に際して生物発光複合体を生成するように構成されている、前記発現させることと、
（ｄ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質を前記細胞に添加することと、
（ｅ）前記生物発光複合体により生成された発光シグナルを検出することであって、前記発光シグナルの大きさが、前記第１のタンパク質またはペプチド実体と前記第２のタンパク質またはペプチド実体との間の相互作用の強さと相関する、前記検出することと、を含む前記方法。
【請求項７９】
第１の分子実体及び第２の分子実体の共局在を検出する方法であって、
（ａ）前記第１の分子実体を、配列番号２３との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号６及び／または配列番号９との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチドタグでタグ付けすることと、
（ｂ）前記第２の分子実体を、配列番号２５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号７及び／または配列番号１０との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチドタグでタグ付けすることと、
（ｃ）前記タグ付けされた第１の分子実体及び前記タグ付けされた第２の分子実体を同一系内で組み合わせることと、
（ｄ）前記系にポリペプチド構成要素を添加することであって、前記ポリペプチド構成要素が、配列番号１７、２１、及び／または３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号５及び配列番号８との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第１のペプチドタグ、前記第２のペプチドタグ、及び前記ポリペプチド構成要素が、前記第１の分子実体及び前記第２の分子実体の共局在に際して生物発光複合体を生成するように構成されている、前記添加することと、
（ｅ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質を前記系に添加することと、
（ｆ）前記生物発光複合体により生成された発光シグナルを検出することであって、バックグラウンドを超える発光シグナルの存在が、前記系内での前記第１の分子実体及び前記第２の分子実体の共局在を示し、及び／または前記発光シグナルの大きさが、前記系内での前記第１の分子実体及び前記第２の分子実体の共局在の量と相関する、前記検出することと、を含む前記方法。
【請求項８０】
前記系が、細胞、組織、器官、生物体全体、生化学試料、非細胞性試料を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記第１の分子実体及び／または前記第２の分子実体が、関心対象のタンパク質または関心対象のペプチドであり、タグ付けすることが、前記第１の分子実体及び／または前記第２の分子実体の前記第１のペプチドタグ及び／または前記第２のペプチドタグとの融合物を作製することを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記第１の分子実体及び／または前記第２の分子実体が、低分子であり、タグ付けすることが、前記第１の分子実体及び／または前記第２の分子実体を直接または間接的に前記第１のペプチドタグ及び／または前記第２のペプチドタグと連結することを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記タグ付けされた第１の分子実体及び前記タグ付けされた第２の分子実体を組み合わせることが、一方もしくは両方を前記系内で発現させること、及び／または一方もしくは両方を前記系に添加することを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
第１のタンパク質またはペプチド実体と第２のタンパク質またはペプチド実体の細胞内での共局在を検出する方法であって、
（ａ）前記第１のタンパク質またはペプチド実体、ならびに配列番号２３との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号６及び／または配列番号９との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチドタグを含む融合物を前記細胞内で発現させることと、
（ｂ）前記第２のタンパク質またはペプチド実体、ならびに配列番号２５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号７及び／または配列番号１０との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチドタグを含む融合物を前記細胞内で発現させることと、
（ｃ）配列番号１７、２１、及び／または３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号５及び／または配列番号８との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド構成要素を、前記細胞内で発現させることであって、前記第１のペプチドタグ、前記第２のペプチドタグ、及び前記ポリペプチド構成要素が、前記第１のタンパク質またはペプチド実体及び前記第２のタンパク質またはペプチド実体の共局在に際して生物発光複合体を生成するように構成されている、前記発現させることと、
（ｄ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質を前記細胞に添加することと、
（ｅ）前記生物発光複合体により生成された発光シグナルを検出することであって、バックグラウンドを超える発光シグナルの存在が、前記細胞内での前記第１のタンパク質またはペプチド実体及び前記第２のタンパク質またはペプチド実体の共局在を示し、及び／または前記発光シグナルの大きさが、系内での前記第１のタンパク質またはペプチド実体及び前記第２のタンパク質またはペプチド実体の共局在の量と相関する、前記検出することと、を含む前記方法。
【請求項８５】
（ａ）配列番号２３との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号６及び／または配列番号９との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチドタグにコンジュゲートされた第１の結合部分と、
（ｂ）配列番号２５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号７及び／または配列番号１０との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチドタグにコンジュゲートされた第２の結合部分と、を含むキット。
【請求項７８】
前記第１の結合部分が、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から独立して選択される、請求項７７に記載のキット。
【請求項７９】
前記第１及び第２の結合部分が、同一の標的実体上の抗原、エピトープ、または配列に結合するように構成された一次結合部分である、請求項７８に記載のキット。
【請求項８０】
前記第１及び第２の結合部分が、一次結合部分上の抗原、エピトープ、または配列に結合するように構成された二次結合部分である、請求項７８に記載のキット。
【請求項８１】
配列番号１７、２１、及び／または３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号５及び／または配列番号８との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド試薬を更に含む、請求項７８に記載のキット。
【請求項８２】
セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体を更に含む、請求項８１に記載のキット。
【請求項８３】
標的分子を検出する方法であって、前記標的分子が、第１の抗原、エピトープ、または配列及び別個の第２の抗原、エピトープ、または配列を呈し、前記方法が、
（ａ）前記標的分子を含有する試料を、（ｉ）前記第１の抗原、エピトープ、または配列を認識する第１の一次結合部分及び（ｉｉ）前記第２の抗原、エピトープまたは配列を認識する第２の一次結合部分と接触させること、ならびに前記第１及び第２の一次結合部分が前記第１及び第２の抗原、エピトープ、または配列に結合するのを可能にすることと、
（ｂ）前記試料を、（ｉ）第１のペプチドタグにコンジュゲートされた第１の二次結合部分及び（ｉｉ）第２のペプチドタグにコンジュゲートされた第２の二次結合部分と接触させることであって、前記第１の二次結合部分が、前記第１の一次結合部分を認識し、前記第２の二次結合部分が前記第２の一次結合部分を認識し、前記第１または第２のペプチドタグが、配列番号２３との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号６及び／または配列番号９との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第１または第２のペプチドタグの他方が配列番号２５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号７及び／または配列番号１０との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記接触させること、及び前記第１及び第２の二次結合部分が前記第１及び第２の一次結合部分に結合するのを可能にすることと、
（ｃ）前記試料を、配列番号１７、２１、及び／または３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号５及び／または配列番号８との１００％未満の配列同一性を有するポリペプチド構成要素と接触させることであって、前記第１のペプチドタグ、前記第２のペプチドタグ、及び前記ポリペプチド構成要素が、相互作用する際に生物発光複合体を生成するように構成されている、前記接触させることと、
（ｄ）前記試料を、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質と接触させることと、
（ｅ）前記生物発光複合体により生成された発光シグナルを検出することであって、バックグラウンドを超える発光シグナルの存在が、前記標的分子の存在を示し、及び／または前記発光シグナルの大きさが、前記試料内での標的分子の量と相関する、前記検出することと、を含む前記方法。
【請求項８４】
前記結合部分が、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から独立して選択される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記標的分子が、タンパク質、核酸、または低分子である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記試料が、インビトロまたはインビボに存在する、請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
標的分子を検出する方法であって、前記標的分子が、第１の抗原、エピトープ、または配列及び別個の第２の抗原、エピトープ、または配列を呈し、前記方法が、
（ａ）前記試料を、（ｉ）第１のペプチドタグにコンジュゲートされた第１の結合部分及び（ｉｉ）第２のペプチドタグにコンジュゲートされた第２の結合部分と接触させることであって、前記第１の二次結合部分が前記第１の抗原、エピトープ、または配列を認識し、前記第２の結合部分が前記第２の抗原、エピトープ、または配列を認識し、前記第１または第２のペプチドタグが、配列番号２３との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号６及び／または配列番号９との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第１または第２のペプチドタグの他方が、配列番号２５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号７及び／または配列番号１０との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記接触させること、ならびに前記第１及び第２の結合部分が、前記第１及び第２の抗原、エピトープ、または配列に結合するのを可能することと、
（ｃ）前記試料を、配列番号１７、２１、及び／または３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号５及び／または配列番号８との１００％未満の配列同一性を有するポリペプチド構成要素と接触させることであって、前記第１のペプチドタグ、前記第２のペプチドタグ、及び前記ポリペプチド構成要素が、相互作用する際に生物発光複合体を生成するように構成されている、前記接触させることと、
（ｄ）前記試料を、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質と接触させることと、
（ｅ）前記生物発光複合体により生成された発光シグナルを検出することであって、バックグラウンドを超える発光シグナルの存在が、前記標的分子の存在を示し、及び／または前記発光シグナルの大きさが、前記試料内での標的分子の量と相関する、前記検出することと、を含む前記方法。
【請求項８８】
前記結合部分が、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から独立して選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記標的分子が、タンパク質、核酸、または低分子である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記試料が、インビトロ試料、インビボ試料、または生化学試料である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
配列番号３５との４０％を超えるが、１００％未満の配列同一性ならびに配列番号２０５及び配列番号２０６との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むβ９／β１０様ジペプチドであって、前記ペプチドが配列番号１７、２１、及び／または３０２からなるポリペプチド相補体と接触する場合に、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質の存在下で生成される生物発光シグナルが、前記ペプチド及び前記セレンテラジン基質のみにより生成される生物発光シグナルと比較した場合に実質的に増加する、前記β９／β１０様ジペプチド。
【請求項９２】
前記ペプチドが前記ポリペプチド相補体と会合する場合に、前記生物発光シグナルが実質的に増加する、請求項９１に記載のβ９／β１０様ジペプチド。
【請求項９３】
前記ペプチドが、配列番号２０５及び／または配列番号２０６のペプチドと比較して１つ以上の形質の増強を示し、前記形質が、前記ポリペプチド相補体に対する親和性、発現、溶解性、安定性、及び前記ポリペプチド相補体と組み合わされた場合の生物発光活性から選択される、請求項９１に記載のβ９／β１０様ジペプチド。
【請求項９４】
前記アミノ酸配列が、天然に存在するタンパク質またはその断片でない、請求項９１に記載のβ９／β１０様ジペプチド。
【請求項９５】
前記アミノ酸配列が、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、及び／またはペプトイドアミノ酸を含有する、請求項９４に記載のβ９／β１０様ジペプチド。
【請求項９６】
請求項９１に記載のβ９／β１０様ジペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項９７】
請求項９１に記載のβ９／β１０様ジペプチド及び追加のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
【請求項９８】
前記追加のアミノ酸配列が、関心対象のタンパク質、相互作用要素、共局在要素、及び結合部分からなる群から選択される、請求項９７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９９】
前記追加のアミノ酸配列が、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から選択される結合部分である、請求項９８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１００】
前記追加のアミノ酸配列が、第１の相互作用ポリペプチド及び第２の相互作用ポリペプチドの接触に際して、前記第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成するように構成されている前記第１の相互作用ポリペプチドである、請求項９８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０１】
前記追加のアミノ酸配列が、第１の共局在ポリペプチドであって、細胞内区画、細胞、組織、または生物内で第２の共局在ポリペプチドと共に共局在するように構成されている前記第１の共局在ポリペプチドである、請求項９８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０２】
前記追加のアミノ酸配列が、関心対象のタンパク質であり、薬物標的候補である、請求項９８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０３】
請求項９７に記載の融合ポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項１０４】
第１の分子実体と第２の分子実体との間の相互作用を検出するための競合アッセイを実行する方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号２３との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号６及び配列番号９との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチドタグでタグ付けされた前記第１の分子実体を含むトレーサーと、
（ｉｉ）配列番号２５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号７及び配列番号１０との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチドタグでタグ付けされた前記第２の分子実体と、
（ｉｉｉ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質と、
（ｉｖ）配列番号１７、２１、及び／または３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号５及び／または配列番号８との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド構成要素と、
（ｖ）タグ付けされていない第１の分子実体を含有すると疑われる試料と、を組み合わせることであって、
前記第１のペプチドタグ、前記第２のペプチドタグ、及び前記ポリペプチド構成要素が、生物発光複合体を生成し、前記セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質の存在下で生物発光シグナルを生成するように構成されている、前記組み合わせることと、
（ｂ）前記生物発光複合体により生成された前記生物発光シグナルを検出することと、
（ｃ）前記試料の存在下で生成された前記生物発光シグナルを、前記試料の非存在下で生成された対照生物発光シグナルと比較することであって、前記生物発光シグナルの減少が、前記試料におけるタグ付けされていない第１の分子実体の存在または量を示す、前記比較することと、を含む前記方法。
【請求項１０５】
前記第１の分子実体が低分子またはペプチドである、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記第２の分子実体が、薬物標的または薬物標的候補である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
（ａ）配列番号７８８または配列番号７８９のポリペプチド断片に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含むポリペプチド構成要素と、
（ｂ）配列番号７８８または配列番号７８９の相補的な部分に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドと、を含むシステムまたはキットであって、
セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質の存在下で、前記ポリペプチド構成要素ならびに１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドから組み立てられた生物発光複合体により生成される生物発光シグナルが、前記ポリペプチド構成要素または１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチド、ならびに前記セレンテラジン基質のみにより生成される生物発光シグナルと比較した場合に実質的に増加する、前記システムまたはキット
【請求項１０８】
前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９０に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９４に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む、請求項１０７に記載のシステムまたはキット。
【請求項１０９】
前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９５に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む、請求項１０７に記載のシステムまたはキット。
【請求項１１０】
前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９２に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９６に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む、請求項１０７に記載のシステムまたはキット。
【請求項１１１】
前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９３に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９７に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む、請求項１０７に記載のシステムまたはキット。
【請求項１１２】
前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９０に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９８に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む、請求項１０７に記載のシステムまたはキット。
【請求項１１３】
前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９９に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む、請求項１０７に記載のシステムまたはキット。
【請求項１１４】
前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９２に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号８００に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む、請求項１０７に記載のシステムまたはキット。
【請求項１１５】
前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９３に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号８０１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む、請求項１０７に記載のシステムまたはキット。
【請求項１１６】
前記ポリペプチド構成要素が前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドと会合する場合に、前記生物発光シグナルが実質的に増加する、請求項１０７に記載のシステムまたはキット。
【請求項１１７】
ポリペプチド構成要素及び／または１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、天然に存在する配列またはその断片でないアミノ酸配列を含む、請求項１０７に記載のシステムまたはキット。
【請求項１１８】
ポリペプチド構成要素及び／または１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、及び／またはペプトイドアミノ酸を含む、請求項１１７に記載のシステムまたはキット。
【請求項１１９】
前記ポリペプチド構成要素及び／または１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、１つ以上の追加のアミノ酸配列との融合物として存在する、請求項１０７に記載のシステムまたはキット。
【請求項１２０】
前記追加のアミノ酸配列が、関心対象のタンパク質、相互作用要素、共局在要素、及び結合部分からなる群から選択される、請求項１１９に記載のシステムまたはキット。
【請求項１２１】
前記追加のアミノ酸配列が、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から選択される結合部分である、請求項１１９に記載のシステムまたはキット。
【請求項１２２】
前記追加のアミノ酸配列が、第１の相互作用ポリペプチド及び第２の相互作用ポリペプチドの接触に際して、前記第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成するように構成されている前記第１の相互作用ポリペプチドである、請求項１１９に記載のシステムまたはキット。
【請求項１２３】
前記追加のアミノ酸配列が、第１の共局在ポリペプチドであって、細胞内区画、細胞、組織、または生物内で第２の共局在ポリペプチドと共に共局在するように構成されている前記第１の共局在ポリペプチドである、請求項１１９に記載のシステムまたはキット。
【請求項１２４】
前記追加のアミノ酸配列が、関心対象のタンパク質であり、薬物標的候補である、請求項１１９に記載のシステムまたはキット。
【請求項１２５】
請求項１０７〜１２４のいずれか１項に記載のシステムまたはキットのポリペプチド構成要素ならびに１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドを含む生物発光複合体。
【請求項１２６】
配列番号７８８または配列番号７８９に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む２つ以上のペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチド構成要素を含むシステムまたはキットであって、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質の存在下で、生物発光複合体により生成される生物発光シグナルが、前記ポリペプチドまたは１つ以上の相補的なペプチド及び前記セレンテラジン基質のみにより生成される生物発光シグナルと比較した場合に実質的に増加する前記システムまたはキット。
【請求項１２７】
配列番号７９０に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するポリペプチド構成要素、ならびに配列番号７９４に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に有する１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、及び／またはトリペプチドを含む、請求項１２６に記載のシステムまたはキット。
【請求項１２８】
前記ポリペプチドが、配列番号７９１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチドが、配列番号７９５に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む、請求項１２６に記載のシステムまたはキット。
【請求項１２９】
前記ポリペプチドが、配列番号７９２に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチドが、配列番号７９６に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む、請求項１２６に記載のシステムまたはキット。
【請求項１３０】
前記ポリペプチドが、配列番号７９３に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチドが、配列番号７９７に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む、請求項１２６に記載のシステムまたはキット。
【請求項１３１】
前記ポリペプチドが、配列番号７９０に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチドが、配列番号７９８に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む、請求項１２６に記載のシステムまたはキット。
【請求項１３２】
前記ポリペプチドが、配列番号７９１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチドが、配列番号７９９に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む、請求項１２６に記載のシステムまたはキット。
【請求項１３３】
前記ポリペプチドが、配列番号７９２に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチドが、配列番号８００に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む、請求項１２６に記載のシステムまたはキット。
【請求項１３４】
前記ポリペプチドが、配列番号７９３に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチドが、配列番号８０１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む、請求項１２６に記載のシステムまたはキット。
【請求項１３５】
前記ポリペプチドが前記１つ以上の相補的なペプチドと会合する場合に、前記生物発光シグナルが実質的に増加する、請求項１２６に記載のシステムまたはキット。
【請求項１３６】
ポリペプチド及び／または１つ以上の相補的なペプチドが、天然に存在する配列またはその断片でないアミノ酸配列を含む、請求項１２６に記載のシステムまたはキット。
【請求項１３７】
ポリペプチド及び／または１つ以上の相補的なペプチドが、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、及び／またはペプトイドアミノ酸を含む、請求項１３６に記載のシステムまたはキット。
【請求項１３８】
前記ポリペプチド及び／または１つ以上の相補的なペプチドが、１つ以上の追加のアミノ酸配列との融合物として存在する、請求項１２６に記載のシステムまたはキット。
【請求項１３９】
前記追加のアミノ酸配列が、関心対象のタンパク質、相互作用要素、共局在要素、及び結合部分からなる群から選択される、請求項１３８に記載のシステムまたはキット。
【請求項１４０】
前記追加のアミノ酸配列が、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から選択される結合部分である、請求項１３８に記載のシステムまたはキット。
【請求項１４１】
前記追加のアミノ酸配列が、第１の相互作用ポリペプチド及び第２の相互作用ポリペプチドの接触に際して、前記第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成するように構成されている前記第１の相互作用ポリペプチドである、請求項１３８に記載のシステムまたはキット。
【請求項１４２】
前記追加のアミノ酸配列が、第１の共局在ポリペプチドであって、細胞内区画、細胞、組織、または生物内で第２の共局在ポリペプチドと共に共局在するように構成されている前記第１の共局在ポリペプチドである、請求項１３８に記載のシステムまたはキット。
【請求項１４３】
前記追加のアミノ酸配列が、関心対象のタンパク質であり、薬物標的候補である、請求項１３８に記載のシステムまたはキット。
【請求項１４４】
（ａ）（ｉ）配列番号７８８または配列番号７８９のポリペプチド断片に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含むポリペプチド構成要素と、
（ｉｉ）配列番号７８８または配列番号７８９の相補的な部分に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドと、
（ｉｉｉ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質と、を組み合わせることと、
（ｂ）発光を検出することであって、前記ポリペプチド構成要素及びセレンテラジンまたはセレンテラジン類似体のみにより生成される発光のレベルと比較してより高いレベルの発光が、前記ポリペプチド構成要素及び前記１つ以上の相補的なペプチドの生物発光複合体の形成を示す、前記発光を検出することと、を含む方法。
【請求項１４５】
前記ポリペプチド構成要素ならびに前記第１及び第２のペプチドのうちの１つ以上が、細胞内で発現される、細胞に外来性に添加される、及び／または試料に添加される、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
（ｉ）前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９０に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９４に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、
（ｉｉ）前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９５に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、
（ｉｉｉ）前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９２に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９６に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、
（ｉｖ）前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９３に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９７に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、
（ｖ）前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９０に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９８に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、
（ｖｉ）前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド及び／またはポリペプチドが、配列番号７９９に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、
（ｖｉｉ）前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９２に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド及び／またはポリペプチドが、配列番号８００に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、または
（ｖｉｉｉ）前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９３に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド及び／またはポリペプチドが、配列番号８０１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４７】
（ａ）（ｉ）配列番号７８８または配列番号７８９の全長に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む２つ以上のペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチド構成要素と、
（ｉｉ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質と、を組み合わせることと、
（ｂ）発光を検出することであって、前記ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチド構成要素、ならびにセレンテラジンまたはセレンテラジン類似体により生成される発光のレベルと比較してより高いレベルの発光が、前記ペプチド及びポリペプチド構成要素の生物発光複合体の形成を示す、前記発光を検出することと、を含む方法。
【請求項１４８】
前記ポリペプチド構成要素ならびに前記第１及び第２のペプチドのうちの１つ以上が、細胞内で発現され、細胞に外来性に添加され、及び／または試料に添加される、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
（ｉ）前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９０に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９４に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、
（ｉｉ）前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９５に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、
（ｉｉｉ）前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９２に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９６に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、
（ｉｖ）前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９３に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９７に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、
（ｖ）前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９０に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９８に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、
（ｖｉ）前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド及び／またはポリペプチドが、配列番号７９９に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、
（ｖｉｉ）前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９２に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド及び／またはポリペプチドが、配列番号８００に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、または
（ｖｉｉｉ）前記ポリペプチド構成要素が、配列番号７９３に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、前記１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド及び／またはポリペプチドが、配列番号８０１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５０】
第１の分子実体と第２の分子実体との間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）前記第１の分子実体を第１のペプチド、ジペプチド、またはトリペプチドタグでタグ付けすることと、
（ｂ）前記第２の分子実体を第２のペプチド、ジペプチド、またはトリペプチドタグでタグ付けすることと、
（ｃ）前記タグ付けされた第１の分子実体及び前記タグ付けされた第２の分子実体を組み合わせること、及び／または前記タグ付けされた第１の分子実体及び前記タグ付けされた第２の分子実体が互いに接触することを可能にすることと、
（ｄ）ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチド構成要素を添加することであって、前記第１のペプチド、ジペプチド、またはトリペプチドタグ、前記第２のペプチド、ジペプチド、またはトリペプチドタグ、ならびに前記ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチド構成要素が、配列番号７８８または７８９の全体との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を集合的に含み、集合して、生物発光複合体を形成することができる、前記添加することと、
（ｅ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質を添加することと、
（ｆ）前記生物発光複合体により生成された発光シグナルを検出することであって、前記発光シグナルの大きさが、前記第１の分子実体と前記第２の分子実体との間の相互作用の強さと相関する、前記検出することと、を含む前記方法。
【請求項１５１】
前記第１の分子実体及び／または前記第２の分子実体が、関心対象のタンパク質または関心対象のペプチドであり、タグ付けすることが、前記第１の分子実体及び／または前記第２の分子実体の前記第１のタグ及び／または前記第２のタグとの融合物を作製することを含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記第１の分子実体及び／または前記第２の分子実体が、低分子であり、タグ付けすることが、前記第１の分子実体及び／または前記第２の分子実体を直接または間接的に前記第１のタグ及び／または前記第２のタグと連結することを含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５３】
前記第１の分子実体及び前記第２の分子実体のうちの一方が薬物または候補薬物であり、他方が薬物標的または薬物標的候補であり、前記生物発光シグナルが、前記薬物または候補薬物の薬物標的または薬物標的候補である他方への結合を示す、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５４】
前記タグ付けされた第１の分子実体及び前記タグ付けされた第２の分子実体を組み合わせることが、一方もしくは両方を細胞内で発現させること、及び／または一方もしくは両方を細胞に添加することを含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５５】
第１のタンパク質またはペプチド実体と第２のタンパク質またはペプチド実体との間の細胞内での相互作用を検出する方法であって、
（ａ）前記第１のタンパク質またはペプチド実体及び配列番号７８８または７８９の第１の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチド、ジペプチド、またはトリペプチドタグを含む融合物を前記細胞内で発現させることと、
（ｂ）前記第２のタンパク質またはペプチド実体及び配列番号７８８または７８９の第２の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチド、ジペプチド、またはトリペプチドタグを含む融合物を前記細胞内に発現させることと、
（ｃ）配列番号７８８または７８９の第３の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチド構成要素を前記細胞内に発現させることであって、前記第１のタグ、前記第２のタグ、及び前記構成要素が、配列番号７８８または７８９の全体との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含み、前記第１のタンパク質またはペプチド実体及び前記第２のタンパク質またはペプチド実体の相互作用に際して生物発光複合体を生成するように構成されている、前記発現させることと、
（ｄ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質を前記細胞に添加することと、
（ｅ）前記生物発光複合体により生成された発光シグナルを検出することであって、前記発光シグナルの大きさが、前記第１のタンパク質またはペプチド実体と前記第２のタンパク質またはペプチド実体との間の相互作用の強さと相関する、前記検出することと、を含む前記方法。
【請求項１５６】
第１の分子実体及び第２の分子実体の共局在を検出する方法であって、
（ａ）前記第１の分子実体を、配列番号７８８または７８９の第１の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチド、ジペプチド、またはトリペプチドタグでタグ付けすることと、
（ｂ）前記第２の分子実体を、配列番号７８８または７８９の第２の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチド、ジペプチド、またはトリペプチドタグでタグ付けすることと、
（ｃ）前記タグ付けされた第１の分子実体及び前記タグ付けされた第２の分子実体を同一系内で組み合わせることと、
（ｄ）ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチド構成要素を前記系に添加することであって、前記構成要素が、配列番号７８８または７８９の第３の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有し、前記第１のタグ、前記第２のタグ、及び前記構成要素が、配列番号７８８または７８９の全体との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含み、前記第１のペプチドタグ、前記第２のペプチドタグ、及び構成要素が、前記第１の分子実体及び前記第２の分子実体の共局在に際して、生物発光複合体を生成するように構成されている、前記添加することと、
（ｅ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質を前記系に添加することと、
（ｆ）前記生物発光複合体により生成された発光シグナルを検出することであって、バックグラウンドを超える発光シグナルの存在が、前記系内での前記第１の分子実体及び前記第２の分子実体の共局在を示し、及び／または前記発光シグナルの大きさが、前記系内での前記第１の分子実体及び前記第２の分子実体の共局在の量と相関する、前記検出することと、を含む前記方法。
【請求項１５７】
前記系が、細胞、組織、器官、生物体全体、生化学試料、非細胞性試料を含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
前記第１の分子実体及び／または前記第２の分子実体が、関心対象のタンパク質または関心対象のペプチドであり、タグ付けすることが、前記第１の分子実体及び／または前記第２の分子実体の前記第１のタグ及び／または前記ペプチドタグとの融合物を作製することを含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５９】
前記第１の分子実体及び／または前記第２の分子実体が、低分子であり、タグ付けすることが、前記第１の分子実体及び／または前記第２の分子実体を直接または間接的に前記第１のタグ及び／または前記第２のタグと連結することを含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１６０】
前記タグ付けされた第１の分子実体及び前記タグ付けされた第２の分子実体を組み合わせることが、一方もしくは両方を前記系内で発現させること、及び／または一方もしくは両方を前記系に添加することを含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１６１】
第１のタンパク質またはペプチド実体と第２のタンパク質またはペプチド実体の細胞内での共局在を検出する方法であって、
（ａ）前記第１のタンパク質またはペプチド実体及び配列番号７８８または７８９の第１の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチド、ジペプチド、またはトリペプチドタグを含む融合物を前記細胞内で発現させることと、
（ｂ）前記第２のタンパク質またはペプチド実体及び配列番号７８８または７８９の第２の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチド、ジペプチド、またはトリペプチドタグを含む融合物を前記細胞内に発現させることと、
（ｃ）配列番号７８８または７８９の第３の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有する１つ以上のペプチド、ジペプチド、トリペプチド、またはポリペプチド構成要素を前記細胞内に発現させることであって、前記第１のタグ、前記第２のタグ、及び前記構成要素が、配列番号７８８または７８９の全体との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含み、前記第１のタグ、前記第２のタグ、及び前記構成要素が、前記第１のタンパク質またはペプチド実体及び前記第２のタンパク質またはペプチド実体の共局在に際して生物発光複合体を生成するように構成されている、前記発現させることと、
（ｄ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質を前記細胞に添加することと、
（ｅ）前記生物発光複合体により生成された発光シグナルを検出することであって、バックグラウンドを超える発光シグナルの存在が、前記細胞内での前記第１のタンパク質またはペプチド実体及び前記第２のタンパク質またはペプチド実体の共局在を示し、及び／または前記発光シグナルの大きさが、系内での前記第１のタンパク質またはペプチド実体及び前記第２のタンパク質またはペプチド実体の共局在の量と相関する、前記検出することと、を含む前記方法。
【請求項１７０】
標的分子を検出する方法であって、前記標的分子が、第１の抗原、エピトープ、または配列及び別個の第２の抗原、エピトープ、または配列を呈し、前記方法が、
（ａ）前記標的分子を含有する試料を、（ｉ）前記第１の抗原、エピトープ、または配列を認識する第１の一次結合部分及び（ｉｉ）前記第２の抗原、エピトープ、または配列を認識する第２の一次結合部分と接触させること、ならびに前記第１及び第２の一次結合部分が前記第１及び第２の抗原、エピトープ、または配列に結合するのを可能にすることと、
（ｂ）前記試料を、（ｉ）第１のタグにコンジュゲートされた第１の二次結合部分及び（ｉｉ）第２のタグにコンジュゲートされた第２の二次結合部分と接触させることであって、前記第１の二次結合部分が、前記第１の一次結合部分を認識し、前記第２の二次結合部分が、前記第２の一次結合部分を認識し、前記第１または第２のタグが、配列番号７８８または７８９の第１及び第２の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記接触させることと、
（ｃ）前記第１及び第２の二次結合部分が前記第１及び第２の一次結合部分に結合するのを可能にすることと、
（ｄ）前記試料を、配列番号７８８または７８９の第３の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有する１つ以上のペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチド構成要素と接触させることであって、前記第１のタグ、前記第２のタグ、及び前記構成要素が、配列番号７８８または７８９の全体との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含み、前記第１のタグ、前記第２のタグ、及び前記構成要素が、相互作用する際に生物発光複合体を生成するように構成されている、前記接触させることと、
（ｄ）前記試料を、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質と接触させることと、
（ｅ）前記生物発光複合体により生成された発光シグナルを検出することであって、バックグラウンドを超える発光シグナルの存在が、前記標的分子の存在を示し、及び／または前記発光シグナルの大きさが、前記試料内での標的分子の量と相関する、前記検出することと、を含む前記方法。
【請求項１７１】
前記結合部分が、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から独立して選択される、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
前記標的分子が、タンパク質、核酸、または低分子である、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７３】
前記試料が、インビトロまたはインビボに存在する、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７４】
標的分子を検出する方法であって、前記標的分子が、第１の抗原、エピトープ、または配列及び別個の第２の抗原、エピトープ、または配列を呈し、前記方法が、
（ａ）前記試料を、（ｉ）第１のタグにコンジュゲートされた第１の結合部分及び（ｉｉ）第２のタグにコンジュゲートされた第２の結合部分と接触させることであって、前記第１の二次結合部分が、前記第１の抗原、エピトープ、または配列を認識し、前記第２の結合部分が、前記第２の抗原、エピトープ、または配列を認識し、前記第１のタグが、配列番号７８８または７８９の第１の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のタグが、配列番号７８８または７８９の第１の部分を有するアミノ酸配列を含む、前記接触させることと、
（ｂ）前記第１及び第２の結合部分が前記第１及び第２の抗原、エピトープ、または配列に結合するのを可能にすることと、
（ｃ）前記試料を、配列番号７８８または７８９の第３の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するペプチド、ジペプチド、トリペプチド、またはポリペプチド構成要素と接触させることであって、前記第１のタグ、前記第２のタグ、及び前記構成要素が、配列番号７８８または７８９の全体との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含み、前記第１のタグ、前記第２のタグ、及び前記構成要素が、相互作用する際に生物発光複合体を生成するように構成されている、前記接触させることと、
（ｄ）前記試料を、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質と接触させることと、
（ｅ）前記生物発光複合体により生成された発光シグナルを検出することであって、バックグラウンドを超える発光シグナルの存在が、前記標的分子の存在を示し、及び／または前記発光シグナルの大きさが、前記試料内での標的分子の量と相関する、前記検出することと、を含む前記方法。
【請求項１７５】
前記結合部分が、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から独立して選択される、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
前記標的分子が、タンパク質、核酸、または低分子である、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７７】
前記試料が、インビトロ試料、インビボ試料、または生化学試料である、請求項１７４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において、３分子または多分子生物発光複合体のアセンブリのための組成物及び方法が提供される。特に、生物発光複合体が、（例えば、別個のまたはジペプチドもしくはトリペプチドとして融合された）２つ以上のペプチドタグ及びポリペプチド構成要素が相互作用する際に形成される。
【背景技術】
【０００２】
生物学的プロセス及び分析物検出は、分子、高分子、及び分子複合体間の共局在及び相互作用に依存する。かかるプロセスを理解するため、及び研究用途、臨床用途、及び他の実用的用途のためにそれらを操作する技術及び化合物を開発するために、これらの共局在／相互作用を検出及びモニタリングするために利用できるツールを持つことが必要である。特に、生理的条件下での（例えば、タンパク質の相互作用をモニタリングするための正常な発現レベルでの）、または複雑な試料マトリックス（例えば、血液試料、環境試料）内でのこれらの相互作用の研究には、高い感度が必要とされる。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書において、３分子または多分子生物発光複合体のアセンブリのための組成物及び方法が提供される。特に、生物発光複合体が、（例えば、別個のまたはジペプチドもしくはトリペプチドとして融合された）２つ以上のペプチドタグ及びポリペプチド構成要素が相互作用する際に形成される。
【０００４】
本明細書の実施形態の開発の間に実施された実験は、集合的にルシフェラーゼベースの配列の長さ（または７５％超の長さ、８０％超の長さ、８５％超の長さ、９０％超の長さ、９５％超の長さ、またはそれ以上）に及ぶ（またはルシフェラーゼベースの配列に対する少なくとも４０％超（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む）相補的なポリペプチド（複数可）及びペプチド（複数可）からの、適切な基質（例えば、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質）の存在下で発光を生成することができる生物発光複合体のアセンブリを実証する。幾つかの実施形態では、「相補的な」ポリペプチド（複数可）及びペプチド（複数可）は、各々がルシフェラーゼベースの配列の一部に相当する別個の分子である。構造的補完により、それらは集合して、生物発光複合体を形成する。
【０００５】
幾つかの実施形態では、相補的なポリペプチド（複数可）及びペプチド（複数可）は、集合して、生物発光複合体を形成する、ルシフェラーゼベースの配列の断片である。幾つかの実施形態では、断片は、ルシフェラーゼベースの配列の全長を集合的に含む。幾つかの実施形態では、断片は、ルシフェラーゼベースの配列の全長の少なくとも７５％（例えば、７５％超の長さ、８０％超の長さ、８５％超の長さ、９０％超の長さ、９５％超の長さ、またはそれ以上）を集合的に含む。
【０００６】
幾つかの実施形態では、相補的なポリペプチド（複数可）及びペプチド（複数可）は、個々がルシフェラーゼベースの配列の対応する一部に対する少なくとも４０％（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、またはそれ以上）の配列同一性を含み、集合して、生物発光複合体を形成する、当該ルシフェラーゼベースの配列の一部のバリアントである。幾つかの実施形態では、相補的なポリペプチド（複数可）及びペプチド（複数可）は、ルシフェラーゼベースの配列全体に対する少なくとも４０％（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含み、集合して、生物発光複合体を形成する、ルシフェラーゼベースの配列の一部のバリアントである。幾つかの実施形態では、断片は、ルシフェラーゼベースの配列の全長を集合的に含む。幾つかの実施形態では、相補的なポリペプチド（複数可）及びペプチド（複数可）は、ルシフェラーゼベースの配列の全長の少なくとも７５％（例えば、７５％超の長さ、８０％超の長さ、８５％超の長さ、９０％超の長さ、９５％超の長さ、またはそれ以上）を集合的に含む。
【０００７】
ルシフェラーゼベースの配列の例としては、配列番号１、配列番号３、配列番号７８８、及び配列番号７８９が挙げられる。本明細書における幾つかの実施形態は、ルシフェラーゼベースの配列（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号７８８、及び配列番号７８９）またはそのバリアント（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超の配列同一性）の断片であるポリペプチド構成要素、ならびに集合的にルシフェラーゼベースの配列の残部に及ぶ１つ以上の相補的なペプチド（複数可）及び／またはポリペプチド（複数可）を提供する。例えば、ルシフェラーゼベースの配列が１７０アミノ酸残基の長さである場合、例示的なポリペプチド構成要素は、例えば、１０２、１２４、１３３、または１４８アミノ酸の長さであり得、相補的な１、２、３、４、５以上の相補的なペプチドは、残りの６８、４６、３７、または２２アミノ酸に相当し得る。幾つかの実施形態では、各ポリペプチド構成要素は、ルシフェラーゼベースの配列の対応する部分に対する少なくとも４０％（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、またはそれ以上）の配列同一性を個々に含む。
【０００８】
幾つかの実施形態では、（ａ）配列番号７８８または配列番号７８９のポリペプチド断片に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含むポリペプチド構成要素、ならびに（ｂ）配列番号７８８または配列番号７８９の相補的な部分に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドを含むシステムまたはキットであって、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質の存在下で、当該ポリペプチド構成要素及び１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドから組み立てられた生物発光複合体により生成される生物発光シグナルが、当該ポリペプチド構成要素または１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチド、ならびにセレンテラジン基質のみにより生成される生物発光シグナルと比較した場合に実質的に増加する、当該システムまたはキットが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号７９０に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドは、配列番号７９４に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号７９１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドは、配列番号７９５に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号７９２に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドは、配列番号７９６に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号７９３に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドは、配列番号７９７に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号７９０に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドは、配列番号７９８に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号７９１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドは、配列番号７９９に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号７９２に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドは、配列番号８００に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号７９３に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドは、配列番号８０１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素が１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドと会合する場合に、生物発光シグナルが実質的に増加する。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素及び／または１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドは、天然に存在する配列またはその断片でないアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素及び／または１つ以上の相補的なペプチドは、ジペプチド、トリペプチド及び／またはポリペプチドは、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、及び／またはペプトイドアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素及び／または１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドは、１つ以上の追加のアミノ酸配列との融合物として存在する。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、関心対象のタンパク質、相互作用要素、共局在要素、及び結合部分からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から選択される結合部分である。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、第１の相互作用ポリペプチド及び第２の相互作用ポリペプチドの接触に際して、当該第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成するように構成されている当該第１の相互作用ポリペプチドである。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、第１の共局在ポリペプチドであって、細胞内区画、細胞、組織、または生物内で第２の共局在ポリペプチドと共に共局在するように構成された当該第１の共局在ポリペプチドである。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、関心対象のタンパク質であり、薬物標的候補である。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるシステムまたはキットのポリペプチド構成要素及び１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドを含む生物発光複合体が本明細書において提供される。
【０００９】
幾つかの実施形態では、配列番号７８８または配列番号７８９に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む２つ以上のペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチド構成要素を含むシステムまたはキットであって、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質の存在下で、生物発光複合体により生成される生物発光シグナルが、当該ポリペプチドまたは１つ以上の相補的なペプチド及びセレンテラジン基質のみにより生成される生物発光シグナルと比較した場合に実質的に増加する、当該システムまたはキットが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、システムまたはキットは、配列番号７９０に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するポリペプチド構成要素、ならびに配列番号７９４に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に有する１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、及び／またはトリペプチドを含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号７９１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチドは、配列番号７９５に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号７９２に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチドは、配列番号７９６に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号７９３に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチドは、配列番号７９７に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号７９０に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチドは、配列番号７９８に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号７９１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチドは、配列番号７９９に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号７９２に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチドは、配列番号８００に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号７９３に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチドは、配列番号８０１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチドが１つ以上の相補的なペプチドと会合する場合に、生物発光シグナルが実質的に増加する。幾つかの実施形態では、ポリペプチド及び／または１つ以上の相補的なペプチドは、天然に存在する配列またはその断片でないアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド及び／または１つ以上の相補的なペプチドは、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、及び／またはペプトイドアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド及び／または１つ以上の相補的なペプチドは、１つ以上の追加のアミノ酸配列との融合物として存在する。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、関心対象のタンパク質、相互作用要素、共局在要素、及び結合部分からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から選択される結合部分である。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、第１の相互作用ポリペプチド及び第２の相互作用ポリペプチドの接触に際して、当該第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成するように構成されている当該第１の相互作用ポリペプチドである。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、第１の共局在ポリペプチドであって、細胞内区画、細胞、組織、または生物内で第２の共局在ポリペプチドと共に共局在するように構成された当該第１の共局在ポリペプチドである。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、関心対象のタンパク質であり、薬物標的候補である。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるシステムまたはキットの２つ以上のペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチド構成要素を含む生物発光複合体が本明細書において提供される。
【００１０】
幾つかの実施形態では、（ａ）（ｉ）配列番号７８８または配列番号７８９のポリペプチド断片に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含むポリペプチド構成要素、（ｉｉ）配列番号７８８または配列番号７８９の相補的な部分に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチド、及び（ｉｉｉ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質を組み合わせること、ならびに（ｂ）発光を検出することであって、当該ポリペプチド構成要素及びセレンテラジンまたはセレンテラジン類似体のみにより生成される発光のレベルと比較してより高いレベルの発光が、当該ポリペプチド構成要素及び当該１つ以上の相補的なペプチドの生物発光複合体の形成を示す、当該発光を検出すること、を含む方法が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素ならびに第１及び第２のペプチドのうちの１つ以上は、細胞内で発現される、細胞に外来性に添加される、及び／または試料に添加される。幾つかの実施形態では、（ｉ）ポリペプチド構成要素が、配列番号７９０に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９４に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、（ｉｉ）ポリペプチド構成要素が、配列番号７９１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９５に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、（ｉｉｉ）ポリペプチド構成要素が、配列番号７９２に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９６に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、（ｉｖ）ポリペプチド構成要素が、配列番号７９３に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９７に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、（ｖ）ポリペプチド構成要素が、配列番号７９０に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９８に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、（ｖｉ）ポリペプチド構成要素が、配列番号７９１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド及び／またはポリペプチドが、配列番号７９９に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、（ｖｉｉ）ポリペプチド構成要素が、配列番号７９２に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド及び／またはポリペプチドが、配列番号８００に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、または（ｖｉｉｉ）ポリペプチド構成要素が、配列番号７９３に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド及び／またはポリペプチドが、配列番号８０１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む。
【００１１】
幾つかの実施形態では、（ａ）（ｉ）配列番号７８８または配列番号７８９の全長に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む２つ以上のペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチド構成要素、ならびに（ｉｉ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質を組み合わせること、ならびに（ｂ）発光を検出することであって、当該ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチド構成要素、ならびにセレンテラジンまたはセレンテラジン類似体により生成される発光のレベルと比較してより高いレベルの発光が、当該ペプチド及びポリペプチド構成要素の生物発光複合体の形成を示す、当該発光を検出すること、を含む方法が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素ならびに第１及び第２のペプチドのうちの１つ以上は、細胞内で発現される、細胞に外来性に添加される、及び／または試料に添加される。幾つかの実施形態では、（ｉ）ポリペプチド構成要素が、配列番号７９０に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９４に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、（ｉｉ）ポリペプチド構成要素が、配列番号７９１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９５に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、（ｉｉｉ）ポリペプチド構成要素が、配列番号７９２に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９６に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、（ｉｖ）ポリペプチド構成要素が、配列番号７９３に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９７に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、（ｖ）ポリペプチド構成要素が、配列番号７９０に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、配列番号７９８に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、（ｖｉ）ポリペプチド構成要素が、配列番号７９１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド及び／またはポリペプチドが、配列番号７９９に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、（ｖｉｉ）ポリペプチド構成要素が、配列番号７９２に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド及び／またはポリペプチドが、配列番号８００に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含むか、または（ｖｉｉｉ）ポリペプチド構成要素が、配列番号７９３に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含み、１つ以上の相補的なペプチド、ジペプチド、トリペプチド及び／またはポリペプチドが、配列番号８０１に対する４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含む。
【００１２】
幾つかの実施形態では、第１の分子実体と第２の分子実体との間の相互作用を検出する方法であって、（ａ）当該第１の分子実体を第１のペプチド、ジペプチド、またはトリペプチドタグでタグ付けすること、（ｂ）当該第２の分子実体を第２のペプチド、ジペプチド、またはトリペプチドタグでタグ付けすること、（ｃ）タグ付けされた第１の分子実体及びタグ付けされた第２の分子実体を組み合わせること、及び／またはタグ付けされた第１の分子実体及びタグ付けされた第２の分子実体が互いに接触することを可能にすること、（ｄ）ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチド構成要素を添加することであって、当該第１のペプチド、ジペプチド、またはトリペプチドタグ、当該第２のペプチド、ジペプチド、またはトリペプチドタグ、ならびに当該ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチド構成要素が、配列番号７８８または７８９の全体との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を集合的に含み、集合して、生物発光複合体を形成することができる、当該添加すること、（ｅ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質を添加すること、ならびに（ｆ）当該生物発光複合体により生成された発光シグナルを検出することであって、当該発光シグナルの大きさが、当該第１の分子実体と当該第２の分子実体との間の相互作用の強さと相関する、当該検出すること、を含む当該方法が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、第１の分子実体及び／または第２の分子実体は、関心対象のタンパク質または関心対象のペプチドであり、タグ付けすることは、第１の分子実体及び／または第２の分子実体の第１のタグ及び／または第２のタグとの融合物を作製することを含む。幾つかの実施形態では、第１の分子実体及び／または第２の分子実体は、低分子であり、タグ付けすることは、第１の分子実体及び／または第２の分子実体を直接または間接的に第１のタグ及び／または第２のタグと連結することを含む。幾つかの実施形態では、第１の分子実体及び第２の分子実体のうちの一方は薬物または候補薬物であり、他方は薬物標的または薬物標的候補であり、生物発光シグナルは、当該薬物または候補薬物の薬物標的または薬物標的候補である他方への結合を示す。幾つかの実施形態では、タグ付けされた第１の分子実体及びタグ付けされた第２の分子実体を組み合わせることは、一方もしくは両方を細胞内で発現させること、及び／または一方もしくは両方を細胞に添加することを含む。
【００１３】
幾つかの実施形態では、第１のタンパク質またはペプチド実体と第２のタンパク質またはペプチド実体との間の細胞内での相互作用を検出する方法であって、（ａ）当該第１のタンパク質またはペプチド実体及び配列番号７８８または７８９の第１の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチド、ジペプチド、またはトリペプチドタグを含む融合物を当該細胞内で発現させること、（ｂ）当該第２のタンパク質またはペプチド実体及び配列番号７８８または７８９の第２の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチド、ジペプチド、またはトリペプチドタグを含む融合物を当該細胞内に発現させること、（ｃ）配列番号７８８または７８９の第３の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチド構成要素を細胞内に発現させることであって、当該第１のタグ、当該第２のタグ、及び当該構成要素が、配列番号７８８または７８９の全体との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含み、当該第１のタンパク質またはペプチド実体及び当該第２のタンパク質またはペプチド実体の相互作用に際して生物発光複合体を生成するように構成されている、当該発現させること、（ｄ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質を細胞に添加すること、ならびに（ｅ）当該生物発光複合体により生成された発光シグナルを検出することであって、当該発光シグナルの大きさが、当該第１のタンパク質またはペプチド実体と当該第２のタンパク質またはペプチド実体との間の相互作用の強さと相関する、当該検出すること、を含む当該方法が本明細書において提供される。
【００１４】
幾つかの実施形態では、第１の分子実体及び第２の分子実体の共局在を検出する方法であって、（ａ）当該第１の分子実体を、配列番号７８８または７８９の第１の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチド、ジペプチド、またはトリペプチドタグでタグ付けすること、（ｂ）当該第２の分子実体を、配列番号７８８または７８９の第２の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチド、ジペプチド、またはトリペプチドタグでタグ付けすること、（ｃ）タグ付けされた第１の分子実体及びタグ付けされた第２の分子実体を同一系内で組み合わせること、（ｄ）ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチド構成要素を当該系に添加することであって、当該構成要素が、配列番号７８８または７８９の第３の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有し、当該第１のタグ、当該第２のタグ、及び当該構成要素が、配列番号７８８または７８９の全体との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含み、当該第１のペプチドタグ、当該第２のペプチドタグ、及び当該構成要素が、当該第１の分子実体及び当該第２の分子実体の共局在に際して、生物発光複合体を生成するように構成されている、当該添加すること、（ｅ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質を当該系に添加すること、ならびに（ｆ）当該生物発光複合体により生成された発光シグナルを検出することであって、バックグラウンドを超える発光シグナルの存在が、当該系内での当該第１の分子実体及び当該第２の分子実体の共局在を示し、及び／または当該発光シグナルの大きさが、当該系内での当該第１の分子実体及び当該第２の分子実体の共局在の量と相関する、当該検出すること、を含む当該方法が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、系は、細胞、組織、器官、生物体全体、生化学の非細胞性試料を含む。幾つかの実施形態では、第１の分子実体及び／または第２の分子実体は、関心対象のタンパク質または関心対象のペプチドであり、タグ付けすることは、第１の分子実体及び／または第２の分子実体の第１のタグ及び／またはペプチドタグとの融合物を作製することを含む。幾つかの実施形態では、第１の分子実体及び／または第２の分子実体は、低分子であり、タグ付けすることは、第１の分子実体及び／または第２の分子実体を直接または間接的に第１のタグ及び／または第２のタグと連結することを含む。幾つかの実施形態では、タグ付けされた第１の分子実体及びタグ付けされた第２の分子実体を組み合わせることは、一方もしくは両方を系内で発現させること、及び／または一方もしくは両方を系に添加することを含む。
【００１５】
幾つかの実施形態では、第１のタンパク質またはペプチド実体及び第２のタンパク質またはペプチド実体の細胞内での共局在を検出する方法であって、（ａ）当該第１のタンパク質またはペプチド実体及び配列番号７８８または７８９の第１の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチド、ジペプチド、またはトリペプチドタグを含む融合物を当該細胞内で発現させること、（ｂ）当該第２のタンパク質またはペプチド実体及び配列番号７８８または７８９の第２の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチド、ジペプチド、またはトリペプチドタグを含む融合物を当該細胞内に発現させること、（ｃ）配列番号７８８または７８９の第３の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有する１つ以上のペプチド、ジペプチド、トリペプチド、またはポリペプチド構成要素を細胞内に発現させることであって、当該第１のタグ、当該第２のタグ、及び当該構成要素が、配列番号７８８または７８９の全体との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含み、当該第１のタグ、当該第２のタグ、及び当該構成要素が、当該第１のタンパク質またはペプチド実体及び当該第２のタンパク質またはペプチド実体の共局在に際して生物発光複合体を生成するように構成されている、当該発現させること、（ｄ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質を細胞に添加すること、ならびに（ｅ）生物発光複合体により生成された発光シグナルを検出することであって、バックグラウンドを超える発光シグナルの存在が、当該細胞内での当該第１のタンパク質またはペプチド実体及び当該第２のタンパク質またはペプチド実体の共局在を示し、及び／または当該発光シグナルの大きさが、系内での当該第１のタンパク質またはペプチド実体及び当該第２のタンパク質またはペプチド実体の共局在の量と相関する、当該検出すること、を含む当該方法が本明細書において提供される。
【００１６】
幾つかの実施形態では、標的分子を検出する方法であって、当該標的分子が、第１の抗原、エピトープ、または配列及び別個の第２の抗原、エピトープ、または配列を呈し、当該方法が、（ａ）標的分子を含有する試料を、（ｉ）当該第１の抗原、エピトープ、または配列を認識する第１の一次結合部分及び（ｉｉ）当該第２の抗原、エピトープまたは配列を認識する第２の一次結合部分と接触させること、ならびに当該第１及び第２の一次結合部分が当該第１及び第２の抗原、エピトープ、または配列に結合するのを可能にすること、（ｂ）当該試料を、（ｉ）第１のタグにコンジュゲートされた第１の二次結合部分及び（ｉｉ）第２のタグにコンジュゲートされた第２の二次結合部分と接触させることであって、当該第１の二次結合部分が、当該第１の一次結合部分を認識し、当該第２の二次結合部分が、当該第２の一次結合部分を認識し、当該第１または第２のタグが、配列番号７８８または７８９の第１及び第２の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、当該接触させること、（ｃ）当該第１及び第２の二次結合部分が当該第１及び第２の一次結合部分に結合するのを可能にすること、（ｄ）当該試料を、配列番号７８８または７８９の第３の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有する１つ以上のペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチド構成要素と接触させることであって、当該第１のタグ、当該第２のタグ、及び当該構成要素が、配列番号７８８または７８９の全体との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含み、当該第１のタグ、当該第２のタグ、及び当該構成要素が、相互作用する際に生物発光複合体を生成するように構成されている、当該接触させること、（ｄ）当該試料を、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質と接触させること、ならびに（ｅ）当該生物発光複合体により生成された発光シグナルを検出することであって、バックグラウンドを超える発光シグナルの存在が、標的分子の存在を示し、及び／または当該発光シグナルの大きさが、当該試料内での標的分子の量と相関する、当該検出すること、を含む当該方法が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、結合部分は、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から独立して選択される。幾つかの実施形態では、標的分子は、タンパク質、核酸、または低分子である。幾つかの実施形態では、試料は、インビトロまたはインビボに存在する。
【００１７】
幾つかの実施形態では、標的分子を検出する方法であって、当該標的分子が、第１の抗原、エピトープ、または配列及び別個の第２の抗原、エピトープ、または配列を呈し、当該方法が、（ａ）試料を、（ｉ）第１のタグにコンジュゲートされた第１の結合部分及び（ｉｉ）第２のタグにコンジュゲートされた第２の結合部分と接触させることであって、当該第１の二次結合部分が、当該第１の抗原、エピトープ、または配列を認識し、当該第２の結合部分が、当該第２の抗原、エピトープ、または配列を認識し、当該第１のタグが、配列番号７８８または７８９の第１の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該第２のタグが、配列番号７８８または７８９の第１の部分を有するアミノ酸配列を含む、当該接触させること、（ｂ）当該第１及び第２の結合部分が当該第１及び第２の抗原、エピトープ、または配列に結合するのを可能にすること、（ｃ）試料を、配列番号７８８または７８９の第３の部分との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するペプチド、ジペプチド、トリペプチド、またはポリペプチド構成要素と接触させることであって、当該第１のタグ、当該第２のタグ、及び当該構成要素が、配列番号７８８または７８９の全体との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を集合的に含み、当該第１のタグ、当該第２のタグ、及び当該構成要素が、相互作用する際に生物発光複合体を生成するように構成されている、当該接触させること、（ｄ）当該試料を、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質と接触させること、ならびに（ｅ）当該生物発光複合体により生成された発光シグナルを検出することであって、バックグラウンドを超える発光シグナルの存在が、標的分子の存在を示し、及び／または当該発光シグナルの大きさが、当該試料内での標的分子の量と相関する、当該検出すること、を含む当該方法が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、結合部分は、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から独立して選択される。幾つかの実施形態では、標的分子は、タンパク質、核酸、または低分子である。幾つかの実施形態では、試料は、インビトロ試料、インビボ試料、または生化学試料である。
【００１８】
幾つかの実施形態では、表１、表９、または表１０に列挙されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、表１、表９、または表１０に列挙される単一のペプチド、ジペプチド、トリペプチド、またはポリペプチドが提供される（例えば、試薬として、タグとして、など）。幾つかの実施形態では、表１、表９、または表１０に列挙される１対（２つ）または１組（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）のペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが提供される。特に、相補的であり、互いに（例えば、促進される、促進されない）相互作用をする際に生物発光複合体を形成することができるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドの対または組が提供される。
【００１９】
幾つかの実施形態では、表１、表９、または表１０に列挙されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドのうちの１つ以上との少なくとも４０％（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが、本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、表１、表９、または表１０に列挙されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドのうちの１つ以上との少なくとも４０％（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有する単一のペプチド、ジペプチド、トリペプチド、またはポリペプチドが提供される（例えば、試薬として、タグとして、など）。幾つかの実施形態では、表１、表９、または表１０に列挙されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドのうちの１つ以上との少なくとも４０％（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有する１対（２つ）または１組（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）のペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドが提供される。特に、相補的であり、互いに（例えば、促進される、促進されない）相互作用をする際に生物発光複合体を形成することができるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドの対または組が提供される。
【００２０】
幾つかの実施形態では、配列番号７９０、７９１、７９２、または７９３のうちの１つとの４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含むポリペプチドが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、単独で、または生物発光複合体の形成のための相補的なペプチド（複数可）、ジペプチド（複数可）、及び／またはトリペプチドとの対／組として提供される。幾つかの実施形態では、本明細書におけるポリペプチドの関心対象のタンパク質、相互作用要素、共局在要素などとの融合物が提供される。幾つかの実施形態では、ポリペプチド及びその融合物をコードする核酸及びベクターが提供される。
【００２１】
幾つかの実施形態では、配列番号８１７、８１８、８１９、１３、１５、２３、または２５を含むペプチドが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、配列番号８１７、８１８、８１９、１３、１５、２３、または２５のうちの１つとの４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を含むペプチドが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、ペプチドは、単独で、または生物発光複合体の形成のための相補的なポリペプチド及び／または他のペプチド（複数可）、ジペプチド（複数可）、及び／またはトリペプチドとの対／組として提供される。幾つかの実施形態では、本明細書におけるペプチドの関心対象のタンパク質、相互作用要素、共局在要素などとの融合物が提供される。幾つかの実施形態では、ペプチド及びその融合物をコードする核酸及びベクターが提供される。幾つかの実施形態では、関心対象の分子及び／または関心対象のタンパク質は、本明細書におけるペプチドでタグ付けされる。
【００２２】
幾つかの実施形態では、配列番号８１７及び８１８を含むβ６〜７様ジペプチドが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、配列番号８１７及び８１８との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するβ６〜７様ジペプチドが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、ジペプチドは、単独で、または生物発光複合体の形成のための相補的なポリペプチド及び／または他のペプチド（複数可）、ジペプチド（複数可）、及び／またはトリペプチドとの対／組として提供される。幾つかの実施形態では、ジペプチド及びその融合物をコードする核酸及びベクターが提供される。幾つかの実施形態では、関心対象の分子及び／または関心対象のタンパク質は、本明細書におけるジペプチドでタグ付けされる。
【００２３】
幾つかの実施形態では、配列番号８１８及び８１９を含むβ７〜８様ジペプチドが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、配列番号８１８及び８１９との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するβ７〜８様ジペプチドが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、ジペプチドは、単独で、または生物発光複合体の形成のための相補的なポリペプチド及び／または他のペプチド（複数可）、ジペプチド（複数可）、及び／またはトリペプチドとの対／組として提供される。幾つかの実施形態では、ジペプチドは、単独で、または生物発光複合体の形成のための相補的なポリペプチド及び／または他のペプチド（複数可）、ジペプチド（複数可）、及び／またはトリペプチドとの対／組として提供される。幾つかの実施形態では、ジペプチド及びその融合物をコードする核酸及びベクターが提供される。幾つかの実施形態では、関心対象の分子及び／または関心対象のタンパク質は、本明細書におけるジペプチドでタグ付けされる。
【００２４】
幾つかの実施形態では、配列番号８１９／２３または８１９／２５を含むβ８〜９様ジペプチドが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、番号８１９／２３または８１９／２５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するβ８〜９様ジペプチドが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、ジペプチドは、単独で、または生物発光複合体の形成のための相補的なポリペプチド及び／または他のペプチド（複数可）、ジペプチド（複数可）、及び／またはトリペプチドとの対／組として提供される。幾つかの実施形態では、ジペプチドは、単独で、または生物発光複合体の形成のための相補的なポリペプチド及び／または他のペプチド（複数可）、ジペプチド（複数可）、及び／またはトリペプチドとの対／組として提供される。幾つかの実施形態では、ジペプチド及びその融合物をコードする核酸及びベクターが提供される。幾つかの実施形態では、関心対象の分子及び／または関心対象のタンパク質は、本明細書におけるジペプチドでタグ付けされる。
【００２５】
幾つかの実施形態では、配列番号２３／１３、２３／１５、２５／１３、または２５／１５を含むβ９〜１０様ジペプチドが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、配列番号２３／１３、２３／１５、２５／１３、または２５／１５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するβ８〜９様ジペプチドが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、ジペプチドは、単独で、または生物発光複合体の形成のための相補的なポリペプチド及び／または他のペプチド（複数可）、ジペプチド（複数可）、及び／またはトリペプチドとの対／組として提供される。幾つかの実施形態では、ジペプチドは、単独で、または生物発光複合体の形成のための相補的なポリペプチド及び／または他のペプチド（複数可）、ジペプチド（複数可）、及び／またはトリペプチドとの対／組として提供される。幾つかの実施形態では、ジペプチド及びその融合物をコードする核酸及びベクターが提供される。幾つかの実施形態では、関心対象の分子及び／または関心対象のタンパク質は、本明細書におけるジペプチドでタグ付けされる。
【００２６】
幾つかの実施形態では、配列番号８１７〜８１９を含むβ６〜８様トリペプチドが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、配列番号８１７〜８１９との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するβ６〜８様トリペプチドが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、トリペプチドは、単独で、または生物発光複合体の形成のための相補的なポリペプチド及び／または他のペプチド（複数可）、ジペプチド（複数可）、及び／またはトリペプチドとの対／組として提供される。幾つかの実施形態では、トリペプチドは、単独で、または生物発光複合体の形成のための相補的なポリペプチド及び／または他のペプチド（複数可）、ジペプチド（複数可）、及び／またはトリペプチドとの対／組として提供される。幾つかの実施形態では、トリペプチド及びその融合物をコードする核酸及びベクターが提供される。幾つかの実施形態では、関心対象の分子及び／または関心対象のタンパク質は、本明細書におけるトリペプチドでタグ付けされる。
【００２７】
幾つかの実施形態では、配列番号８１８／８１９／２３または８１８／８１９／２５を含むβ７〜９様トリペプチドが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、配列番号８１８／８１９／２３または８１８／８１９／２５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するβ７〜９様トリペプチドが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、トリペプチドは、単独で、または生物発光複合体の形成のための相補的なポリペプチド及び／または他のペプチド（複数可）、ジペプチド（複数可）、及び／またはトリペプチドとの対／組として提供される。幾つかの実施形態では、トリペプチドは、単独で、または生物発光複合体の形成のための相補的なポリペプチド及び／または他のペプチド（複数可）、ジペプチド（複数可）、及び／またはトリペプチドとの対／組として提供される。幾つかの実施形態では、トリペプチド及びその融合物をコードする核酸及びベクターが提供される。幾つかの実施形態では、関心対象の分子及び／または関心対象のタンパク質は、本明細書におけるトリペプチドでタグ付けされる。
【００２８】
幾つかの実施形態では、配列番号８１９／２３／１３、８１９／２３／１５、８１９／２５／１３、または８１９／２５／１５を含むβ８〜１０様トリペプチドが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、配列番号８１９／２３／１３、８１９／２３／１５、８１９／２５／１３、または８１９／２５／１５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するβ７〜９様トリペプチドが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、トリペプチドは、単独で、または生物発光複合体の形成のための相補的なポリペプチド及び／または他のペプチド（複数可）、ジペプチド（複数可）、及び／またはトリペプチドとの対／組として提供される。幾つかの実施形態では、トリペプチドは、単独で、または生物発光複合体の形成のための相補的なポリペプチド及び／または他のペプチド（複数可）、ジペプチド（複数可）、及び／またはトリペプチドとの対／組として提供される。幾つかの実施形態では、トリペプチドは、単独で、または生物発光複合体の形成のための相補的なポリペプチド及び／または他のペプチド（複数可）、ジペプチド（複数可）、及び／またはトリペプチドとの対／組として提供される。幾つかの実施形態では、トリペプチド及びその融合物をコードする核酸及びベクターが提供される。幾つかの実施形態では、関心対象の分子及び／または関心対象のタンパク質は、本明細書におけるトリペプチドでタグ付けされる。
【００２９】
幾つかの実施形態では、配列番号２３との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）配列同一性ならびに配列番号６及び配列番号９との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、当該ペプチドが配列番号２５からなる第２のペプチド及び配列番号１７、配列番号２１、または配列番号３０２からなるポリペプチド相補体と接触する場合にセレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質の存在下で生成される生物発光シグナルが、当該ペプチド及びセレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質のみにより生成される生物発光シグナルと比較した場合に実質的に増加する、当該ペプチドが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、生物発光シグナルは、ペプチドが第２のペプチド及びポリペプチド相補体と会合する場合に実質的に増加する。幾つかの実施形態では、ペプチドは、配列番号６及び／または配列番号９のペプチドと比較して１つ以上の形質の増強を示し、ここで、当該形質は、第２のペプチド及びポリペプチド相補体に対する親和性、発現、溶解性、安定性、及び／または第２のペプチド及びポリペプチド相補体と組み合わされた場合の生物発光活性から選択される。幾つかの実施形態では、アミノ酸配列は、天然に存在するタンパク質でなく（例えば、配列番号１でない）、天然に存在するタンパク質の変異体バージョンでなく（例えば、配列番号３でない）、天然に存在するタンパク質の断片でなく（例えば、配列番号５〜７でない）、かつ天然に存在するタンパク質の変異体バージョンの断片でない（例えば、配列番号８〜１０のうちの１つでない）。幾つかの実施形態では、アミノ酸配列は、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、及び／またはペプトイドアミノ酸を含有する。幾つかの実施形態では、ペプチドは、リンカー、反応性部分、検出要素（例えば、フルオロフォア）、相互作用／結合要素などに化学的にコンジュゲートされる。
【００３０】
幾つかの実施形態では、前の段落に記載されたペプチド及び追加のアミノ酸配列または化合物（例えば低分子薬物）を含む融合ポリペプチド（例えば、遺伝子融合（または代替的に、化学的コンジュゲーションもしくは合成による生成））が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、関心対象のタンパク質、相互作用要素、共局在要素、及び／または結合部分からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アフィマー、精製されたタンパク質（例えば、分析物または分析物に結合するタンパク質）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から選択される結合部分である。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、第１の相互作用ポリペプチド及び第２の相互作用ポリペプチドの接触に際して、当該第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成するように構成されている当該第１の相互作用ポリペプチドである。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、第１の共局在ポリペプチドであって、細胞内区画、細胞、組織、または生物内で第２の共局在ポリペプチドと共に共局在するように構成された当該第１の共局在ポリペプチドである。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、関心対象のタンパク質であり、薬物標的候補である。
【００３１】
幾つかの実施形態では、配列番号２５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号７及び配列番号１０との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、当該ペプチドが配列番号２３からなる第２のペプチド及び配列番号１７、配列番号２１、または配列番号３０２からなるポリペプチド相補体と接触する場合に、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質の存在下で生成される生物発光シグナルが、当該ペプチド及びセレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質のみにより生成される生物発光シグナルと比較した場合に実質的に増加する、当該ペプチドが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、生物発光シグナルは、ペプチドが第２のペプチド及びポリペプチド相補体と会合する場合に実質的に増加する。幾つかの実施形態では、ペプチドは、配列番号７及び／または配列番号１０のペプチドと比較して１つ以上の形質の増強を示し、ここで、当該形質は、第２のペプチド及びポリペプチド相補体に対する親和性、発現、溶解性、安定性、ならびに第２のペプチド及びポリペプチド相補体と組み合わされた場合の生物発光活性から選択される。幾つかの実施形態では、アミノ酸配列は、天然に存在するタンパク質でなく（例えば、配列番号１でない）、天然に存在するタンパク質の変異体バージョンでなく（例えば、配列番号３でない）、天然に存在するタンパク質の断片でなく（例えば、配列番号５〜７でない）、かつ天然に存在するタンパク質の変異体バージョンの断片でない（例えば、配列番号８〜１０のうちの１つでない）。幾つかの実施形態では、アミノ酸配列は、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、及び／またはペプトイドアミノ酸を含有する。幾つかの実施形態では、ペプチドは、リンカー、反応性部分、検出要素（例えば、フルオロフォア）、相互作用／結合要素などに化学的にコンジュゲートされる。
【００３２】
幾つかの実施形態では、前の段落に記載されたペプチド及び追加のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド（例えば、遺伝子融合物、合成により生成された融合物、化学的コンジュゲート、酵素コンジュゲートなど）が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、関心対象のタンパク質、相互作用要素、共局在要素、及び結合部分からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から独立して選択される結合部分である。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、第１の相互作用ポリペプチド及び第２の相互作用ポリペプチドの接触に際して、当該第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成するように構成されている当該第１の相互作用ポリペプチドである。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、第１の共局在ポリペプチドであって、細胞内区画、細胞、組織、または生物内で第２の共局在ポリペプチドと共に共局在するように構成された当該第１の共局在ポリペプチドである。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、関心対象のタンパク質であり、薬物標的候補である。
【００３３】
幾つかの実施形態では、（ａ）配列番号２５との４０％超（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）であるが、１００％未満の配列同一性ならびに配列番号７及び配列番号１０との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチド、ならびに（ｂ）配列番号２３との４０％超（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）であるが、１００％未満の配列同一性、ならびに配列番号６、配列番号９、及び配列番号２９との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含む組成物であって、当該第１のペプチドが当該第２のペプチド及び配列番号１７、配列番号２１、または配列番号３０２からなるポリペプチド相補体と接触する場合に、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質の存在下で生成される生物発光シグナルが、当該第１のペプチド及び／または当該第２のペプチドならびにセレンテラジン基質のみにより生成される生物発光シグナルと比較した場合に実質的に増加する、当該組成物が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、生物発光シグナルは、第１のペプチドが第２のペプチド及びポリペプチド相補体と会合する場合に実質的に増加する。幾つかの実施形態では、第１のペプチドは、配列番号７及び／または配列番号１０のペプチドと比較して１つ以上の形質の増強を示し、第２のペプチドは、配列番号６、配列番号９、及び配列番号２９のペプチドと比較して１つ以上の形質の増強を示し、ここで、当該形質は、第２のペプチド及びポリペプチド相補体に対する親和性、発現、溶解性、安定性、ならびに第２のペプチド及びポリペプチド相補体と組み合わされた場合の生物発光活性から選択される。幾つかの実施形態では、第１及び／または第２のペプチドのアミノ酸配列は、天然に存在するタンパク質またはその断片ではない。幾つかの実施形態では、第１及び／または第２のペプチドのアミノ酸配列は、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、及び／またはペプトイドアミノ酸を含有する。
【００３４】
幾つかの実施形態では、前の段落に記載された第１及び第２のペプチドならびに追加のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを含む組成物が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、関心対象のタンパク質、相互作用要素、共局在要素、及び結合部分からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から独立して選択される結合部分である。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、第１の相互作用ポリペプチド及び第２の相互作用ポリペプチドの接触に際して、当該第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成するように構成されている当該第１の相互作用ポリペプチドである。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、第１の共局在ポリペプチドであって、細胞内区画、細胞、組織、または生物内で第２の共局在ポリペプチドと共に共局在するように構成された当該第１の共局在ポリペプチドである。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、関心対象のタンパク質であり、薬物標的候補である。
【００３５】
幾つかの実施形態では、配列番号１７、配列番号２１、または配列番号３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号５及び配列番号８との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、当該ポリペプチドが配列番号２３からなる第１のペプチド及び配列番号２５からなる第２のペプチドと接触する場合に、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質の存在下で生成される生物発光シグナルが、当該ペプチド及びセレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質のみにより生成される生物発光シグナルと比較した場合に実質的に増加する、当該ポリペプチドが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、生物発光シグナルは、ポリペプチドが第１及び第２のペプチドと会合する場合に実質的に増加する。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５及び／または配列番号８のポリペプチドと比較して１つ以上の形質の増強を示し、ここで、当該形質は、第１及び／または第２のペプチドに対する親和性、発現、溶解性、安定性、ならびに第１及び第２のペプチドと組み合わされた場合の生物発光活性から選択される。幾つかの実施形態では、アミノ酸配列は、天然に存在するタンパク質でなく（例えば、配列番号１でない）、天然に存在するタンパク質の変異体バージョンでなく（例えば、配列番号３でない）、天然に存在するタンパク質の断片でなく（例えば、配列番号５〜７でない）、かつ天然に存在するタンパク質の変異体バージョンの断片でない（例えば、配列番号８〜１０のうちの１つでない）。幾つかの実施形態では、アミノ酸配列は、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、及び／またはペプトイドアミノ酸を含有する。
【００３６】
幾つかの実施形態では、前の段落に記載されたポリペプチド及び追加のアミノ酸配列、核酸配列、または他の融合または付加された分子を含む融合ポリペプチド（例えば、遺伝子融合物、合成により生成された融合物、化学的コンジュゲート、酵素コンジュゲートなど）が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、追加の配列または他の分子は、関心対象のタンパク質、相互作用要素、共局在要素、及び結合部分からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、追加の配列または他の分子は、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から選択される結合部分である。幾つかの実施形態では、追加の配列または他の融合もしくは付加された分子は、第１の相互作用ポリペプチド及び第２の相互作用ポリペプチドの接触に際して、当該第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成するように構成されている当該第１の相互作用ポリペプチドである。幾つかの実施形態では、追加の配列または他の融合もしくは付加された分子は、第１の共局在ポリペプチドであって、細胞内区画、細胞、組織、または生物内で第２の共局在ポリペプチドと共に共局在するように構成された当該第１の共局在ポリペプチドである。幾つかの実施形態では、追加の配列または他の融合もしくは付加された分子は、関心対象のタンパク質であり、かつ薬物標的候補である。
【００３７】
幾つかの実施形態では、配列番号１７、配列番号２１、及び／または配列番号３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号５及び配列番号８との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、当該ポリペプチドが配列番号２３からなる第１のペプチド及び配列番号２５からなる第２のペプチドと接触する場合に、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質の存在下で生成される生物発光シグナルが、当該ペプチド及びセレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質のみにより生成される生物発光シグナルと比較した場合に実質的に増加する、当該ポリペプチドが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、生物発光シグナルは、ポリペプチドが第１及び第２のペプチドと会合する場合に実質的に増加する。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５及び／または配列番号８のポリペプチドと比較して１つ以上の形質の増強を示し、ここで、当該形質は、第１及び／または第２のペプチドに対する親和性、発現、溶解性、安定性、ならびに第１及び第２のペプチドと組み合わされた場合の生物発光活性から選択される。幾つかの実施形態では、アミノ酸配列は、天然に存在するタンパク質でなく（例えば、配列番号１でない）、天然に存在するタンパク質の変異体バージョンでなく（例えば、配列番号３でない）、天然に存在するタンパク質の断片でなく（例えば、配列番号５〜７でない）、かつ天然に存在するタンパク質の変異体バージョンの断片でない（例えば、配列番号８〜１０のうちの１つでない）。幾つかの実施形態では、アミノ酸配列は、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、及び／またはペプトイドアミノ酸を含有する。
【００３８】
幾つかの実施形態では、前の段落に記載されたペプチド及び追加のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド（例えば、遺伝子融合物、合成により生成された融合物、化学的コンジュゲート、酵素コンジュゲートなど）が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、関心対象のタンパク質、相互作用要素、共局在要素、及び結合部分からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から独立して選択される結合部分である。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、第１の相互作用ポリペプチド及び第２の相互作用ポリペプチドの接触に際して、当該第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成するように構成されている当該第１の相互作用ポリペプチドである。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、第１の共局在ポリペプチドであって、細胞内区画、細胞、組織、または生物内で第２の共局在ポリペプチドと共に共局在するように構成された当該第１の共局在ポリペプチドである。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、関心対象のタンパク質であり、薬物標的候補である。
【００３９】
幾つかの実施形態では、配列番号３５との４０％超（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）であるが、１００％未満の配列同一性ならびに配列番号２０５及び配列番号２０６との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むβ９／β１０様ジペプチドであって、当該ペプチドが配列番号１７、配列番号２１、または配列番号３０２からなるポリペプチド相補体と接触する場合に、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質の存在下で生成される生物発光シグナルが、当該ペプチド及びセレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質のみにより生成される生物発光シグナルと比較した場合に実質的に増加する、当該β９／β１０様ジペプチドが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、ジペプチド（例えば、β9／β10様ジペプチド）は、本明細書に記載されるポリペプチド構成要素（例えば、β1〜8様ポリペプチド）と、促進（例えば、相互作用要素による）なしに会合する（例えば、生物発光複合体を形成する）。他の実施形態では、ジペプチド（例えば、β9／β10様ジペプチド）及び本明細書に記載されるポリペプチド構成要素（例えば、β1〜8様ポリペプチド）は、促進（例えば、相互作用要素による）がなければ生物発光複合体を形成しないが、適切な相互作用要素による促進があれば会合する（例えば、生物発光複合体を形成する）。幾つかの実施形態では、生物発光シグナルは、ペプチドがポリペプチド相補体と会合する場合に実質的に増加する。幾つかの実施形態では、ペプチドは、配列番号２０５及び／または配列番号２０６のペプチドと比較して１つ以上の形質の増強を示し、ここで、当該形質は、ポリペプチド相補体に対する親和性、発現、溶解性、安定性、及びポリペプチド相補体と組み合わされた場合の生物発光活性から選択される。幾つかの実施形態では、アミノ酸配列は、天然に存在するタンパク質またはその断片ではない。幾つかの実施形態では、アミノ酸配列は、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、及び／またはペプトイドアミノ酸を含有する。
【００４０】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるβ９／β１０様ジペプチド及び追加のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド（例えば、遺伝子融合物、合成により生成された融合物、化学的コンジュゲート、酵素コンジュゲートなど）が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、関心対象のタンパク質、相互作用要素、共局在要素、及び結合部分からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列または他の融合もしくは付加された分子は、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から選択される結合部分である。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列または他の融合もしくは付加された分子は、第１の相互作用ポリペプチド及び第２の相互作用ポリペプチドの接触に際して、当該第２の相互作用ポリペプチドと複合体を形成するように構成されている当該第１の相互作用ポリペプチドである。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列または他の融合もしくは付加された分子は、第１の共局在ポリペプチドであって、細胞内区画、細胞、組織、または生物内で第２の共局在ポリペプチドと共に共局在するように構成されている当該第１の共局在ポリペプチドである。幾つかの実施形態では、追加のアミノ酸配列または他の融合もしくは付加された分子は、関心対象のタンパク質であり、かつ薬物標的候補である。
【００４１】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチド、ポリペプチド、及び／または融合ポリペプチドをコードする核酸及び／またはベクターが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチド、ポリペプチド、及び／または融合ポリペプチドをコードする核酸及び／またはベクターを発現する細胞が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチド、ポリペプチド、及び／または融合ポリペプチドの合成製造が提供される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチド、ポリペプチド、及び／または融合ポリペプチドは、追加の部分（例えば、相互作用要素、共局在要素、関心対象のタンパク質、関心対象の分子など）に化学的にコンジュゲートされる。
【００４２】
幾つかの実施形態では、（ａ）配列番号１７、配列番号２１、または配列番号３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号５及び配列番号８との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）配列番号２３との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号６及び配列番号９との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチド、ならびに（ｃ）配列番号２５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号７及び配列番号１０との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含む生物発光複合体であって、当該生物発光複合体が、当該ポリペプチドのみの存在下、当該第１のペプチドのみの存在下、当該第２のペプチドのみの存在下、ならびに当該ポリペプチド、当該第１のペプチド、及び当該第２のペプチドのうちの任意の２つの存在下でのセレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質と比較した場合に実質的に増加した生物発光を、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質の存在下で生成する、当該生物発光複合体が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、第１のペプチドは第１のペプチドタグであり、ここで、第２のペプチドは第２のペプチドタグであり、当該第１及び第２のペプチドタグは、それぞれ関心対象の分子、関心対象のペプチド、関心対象のタンパク質、相互作用要素、共局在要素、または結合部分からなる群から独立して選択される部分に連結される。幾つかの実施形態では、第１のペプチドタグまたは第２のペプチドタグが薬物または候補薬物に連結され、他方のペプチドタグが薬物標的または薬物標的候補に連結され、ここで、生物発光複合体からの生物発光の強度は、当該薬物または候補薬物の当該薬物標的または薬物標的候補に対する親和性と相関する。幾つかの実施形態では、第１のペプチドタグは第１の相互作用要素に連結され、第２のペプチドタグは第２の相互作用要素に連結され、ここで、生物発光複合体からの生物発光の強度は、試験される条件下での当該第１の相互作用要素の当該第２の相互作用要素に対する親和性と相関する（例えば、幾つかの実施形態では、第１のペプチド、第２のペプチド、ポリペプチド構成要素、及び基質の組み合わせは、相互作用要素間での相互作用の非存在下で生物発光複合体を形成しない（かつ、（例えば、バックグラウンドを超える）顕著な光出力を生成しない））。幾つかの実施形態では、第１のペプチドタグは、第１の共局在要素に連結され、第２のペプチドタグは、第２の共局在要素に連結され、ここで、実質的に増加した生物発光は、試験される条件下での当該第１の共局在要素及び当該第２の共局在要素の共局在を示すが、必ずしも相互作用を示すわけではない。
【００４３】
幾つかの実施形態では、本明細書において提供されるペプチド及びポリペプチドは、より大きな（例えば、既存の）タンパク質の断片ではない。他の実施形態では、本明細書において提供される１つ以上のペプチド及び／またはポリペプチドは、より大きな（例えば、既存の）タンパク質の断片である。
【００４４】
幾つかの実施形態では、（ａ）（ｉ）配列番号２３との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号６及び配列番号９との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチド、（ｉｉ）配列番号２５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号７及び配列番号１０との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチド、（ｉｉｉ）配列番号１７、配列番号２１、または配列番号３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号５及び配列番号８との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド構成要素であって、当該第１のペプチドタグ、当該第２のペプチドタグ、及び当該ポリペプチド構成要素が、第１の分子実体及び第２の分子実体の相互作用に際して生物発光複合体を生成するように構成されている、当該ポリペプチド構成要素、ならびに（ｉｖ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質を組み合わせること、ならびに（ｂ）発光を検出することであって、当該ポリペプチド構成要素及びセレンテラジンまたはセレンテラジン類似体のみにより生成される発光のレベルと比較してより高いレベルの発光が、当該ポリペプチド構成要素ならびに当該第１及び第２のペプチドの生物発光複合体の形成を示す、当該発光を検出すること、を含む方法が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素ならびに第１及び第２のペプチドのうちの１つ以上は、細胞内で発現される、細胞に外来性に添加される、及び／または試料に添加される。
【００４５】
幾つかの実施形態では、第１の分子実体と第２の分子実体との間の相互作用を検出する方法であって、（ａ）当該第１の分子実体を、配列番号２３との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号６及び配列番号９との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチドタグでタグ付けすること、（ｂ）当該第２の分子実体を、配列番号２５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号７及び配列番号１０との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチドタグでタグ付けすること、（ｃ）タグ付けされた第１の分子実体及びタグ付けされた第２の分子実体を組み合わせること、（ｄ）配列番号１７、配列番号２１、または配列番号３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号５及び配列番号８との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド構成要素を添加することであって、当該第１のペプチドタグ、当該第２のペプチドタグ、及び当該ポリペプチド構成要素が、当該第１の分子実体及び当該第２の分子実体の相互作用に際して生物発光複合体を生成するように構成されている、当該添加すること、（ｅ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質を添加すること、ならびに（ｆ）生物発光複合体により生成される発光シグナルを検出することであって、当該発光シグナルの大きさが、当該第１の分子実体と当該第２の分子実体との間の相互作用（複数可）の数、強さ、好ましさ、及び／または安定性と相関する（例えば、比例する、正比例する、など）、当該検出すること、を含む当該方法が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、得られる生物発光複合体の触媒効率、基質回転率、及び／または特異的活性は、第１の分子実体と第２の分子実体との間の相互作用（複数可）の数、強さ、好ましさ、及び／または安定性と相関する（例えば、比例する、正比例する、など）。幾つかの実施形態では、第１の分子実体及び／または第２の分子実体は、関心対象のタンパク質または関心対象のペプチドであり、タグ付けすることは、第１の分子実体及び／または第２の分子実体の第１のペプチドタグ及び／または第２のペプチドタグとの融合物（または合成的コンジュゲーション）を作製することを含む。幾つかの実施形態では、第１の分子実体及び／または第２の分子実体は、低分子であり、タグ付けすることは、第１の分子実体及び／または第２の分子実体を直接または間接的に第１のペプチドタグ及び／または第２のペプチドタグと連結することを含む。幾つかの実施形態では、第１の分子実体及び第２の分子実体のうちの一方は薬物または候補薬物であり、他方は薬物標的または薬物標的候補であり、生物発光シグナルは、当該薬物または候補薬物の薬物標的または薬物標的候補である他方への結合を示す。幾つかの実施形態では、タグ付けされた第１の分子実体及びタグ付けされた第２の分子実体を組み合わせることは、一方もしくは両方を細胞内で発現させること、及び／または一方もしくは両方を細胞に添加することを含む。幾つかの実施形態では、タグ付けされた第１の分子実体及びタグ付けされた第２の分子実体を組み合わせることは、インビトロ、非細胞性試料中などで実行される。幾つかの実施形態では、薬物または候補薬物の薬物標的または薬物標的候補に対する親和性は、本明細書におけるシステム及び方法を使用して非標識の薬物標的または薬物標的候補を系内に希釈することによって決定される。幾つかの実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｆ）のうちの２つ以上が同時に実行される。幾つかの実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｆ）のうちの２つ以上が個別に実行される。
【００４６】
幾つかの実施形態では、第１の分子実体と第２の分子実体との間の相互作用を検出するための競合アッセイを実行する方法であって、（ａ）（ｉ）配列番号２３との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号６及び配列番号９との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチドタグでタグ付けされた第１の分子実体を含むトレーサー、（ｉｉ）配列番号２５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号７及び配列番号１０との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチドタグでタグ付けされた第２の分子実体、（ｉｉｉ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質、（ｉｖ）配列番号１７、配列番号２１、または配列番号３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号５及び配列番号８との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド構成要素、ならびに（ｖ）タグ付けされていない第１の分子実体を含有すると疑われる試料を組み合わせることであって、当該第１のペプチドタグ、当該第２のペプチドタグ、及び当該ポリペプチド構成要素が、生物発光複合体を生成し、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質の存在下で生物発光シグナルを生成するように構成されている、当該組み合わせること、（ｂ）当該生物発光複合体により生成された生物発光シグナルを検出すること、ならびに（ｃ）当該試料の存在下で生成された当該生物発光シグナルを、当該試料の非存在下で生成された対照生物発光シグナルと比較することであって、当該生物発光シグナルの減少が、当該試料におけるタグ付けされていない第１の分子実体の存在または量を示す、当該比較すること、を含む当該方法が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、第１の分子実体は、低分子またはペプチド（例えば、薬物または候補薬物）である。幾つかの実施形態では、第２の分子実体は、薬物標的または薬物標的候補（例えば、タンパク質）である。
【００４７】
幾つかの実施形態では、第１のタンパク質、ペプチド、または分子実体と第２のタンパク質、ペプチド、または分子実体との間の細胞内での相互作用を検出する方法であって、（ａ）当該第１のタンパク質、ペプチド、または分子実体、ならびに配列番号２３との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号６及び配列番号９との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチドタグを含む融合物（例えば、遺伝子融合物、合成融合物、化学的コンジュゲーションなど）を、当該細胞内で発現させること（または細胞もしくは他の系（例えば、非細胞性試料）に添加すること）、（ｂ）当該第２のタンパク質、ペプチド、または分子実体、ならびに配列番号２５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号７及び配列番号１０との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチドタグを含む融合物（例えば、遺伝子融合物、合成融合物、化学的コンジュゲーションなど）を、当該細胞内で発現させること（または細胞もしくは他の系（例えば、非細胞性試料）に添加すること）、（ｃ）配列番号１７、配列番号２１、または配列番号３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号５及び配列番号８との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド構成要素を、当該細胞内で発現させること（または細胞もしくは他の系（例えば、非細胞性試料）に添加すること）であって、当該第１のペプチドタグ、当該第２のペプチドタグ、及び当該ポリペプチド構成要素が、当該第１のタンパク質、ペプチド、または分子実体及び当該第２のタンパク質、ペプチド、または分子実体の相互作用に際して生物発光複合体を生成するように構成されている、当該発現させること、（ｄ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質を細胞に添加すること、ならびに（ｅ）生物発光複合体により生成された発光シグナルを検出することであって、当該発光シグナルの大きさが、当該第１のタンパク質、ペプチド、または分子実体と当該第２のタンパク質、ペプチド、または分子実体との間の相互作用の強さと相関する、当該検出すること、を含む当該方法が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｅ）のうちの２つ以上が同時に実行される。幾つかの実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｅ）のうちの２つ以上が個別に実行される。
【００４８】
幾つかの実施形態では、第１の分子実体及び第２の分子実体の共局在を検出する方法であって、（ａ）当第１の分子実体を、配列番号２３との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号６及び配列番号９との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチドタグでタグ付けすること、（ｂ）当該第２の分子実体を、配列番号２５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号７及び配列番号１０との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチドタグでタグ付けすること、（ｃ）タグ付けされた第１の分子実体及びタグ付けされた第２の分子実体を同一系内で組み合わせること、（ｄ）当該系にポリペプチド構成要素を添加することであって、当該ポリペプチド構成要素が、配列番号１７、配列番号２１、または配列番号３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号５及び配列番号８との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該第１のペプチドタグ、当該第２のペプチドタグ、及び当該ポリペプチド構成要素が、当該第１の分子実体及び当該第２の分子実体の共局在に際して生物発光複合体を生成するように構成されている、当該添加すること、（ｅ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質を当該系に添加すること、ならびに（ｆ）当該生物発光複合体により生成された発光シグナルを検出することであって、バックグラウンドを超える発光シグナルの存在が、当該系内での当該第１の分子実体及び当該第２の分子実体の共局在を示し、及び／または当該発光シグナルの大きさが、当該系内での当該第１の分子実体及び当該第２の分子実体の共局在の量と相関する、当該検出すること、を含む当該方法が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、系は、細胞、組織、器官、または生物体全体を含む。幾つかの実施形態では、第１の分子実体及び／または第２の分子実体は、関心対象のタンパク質または関心対象のペプチドであり、タグ付けすることは、第１の分子実体及び／または第２の分子実体の、第１のペプチドタグ及び／または第２のペプチドタグとの融合物（例えば、遺伝子融合物、合成融合物、化学的コンジュゲーション、酵素コンジュゲーションなど）を作製することを含む。幾つかの実施形態では、第１の分子実体及び／または第２の分子実体は、低分子であり、タグ付けすることは、第１の分子実体及び／または第２の分子実体を直接または間接的に第１のペプチドタグ及び／または第２のペプチドタグと連結することを含む。幾つかの実施形態では、タグ付けされた第１の分子実体及びタグ付けされた第２の分子実体を組み合わせることは、インビトロ、非細胞性試料中などで実行される。幾つかの実施形態では、タグ付けされた第１の分子実体及びタグ付けされた第２の分子実体を組み合わせることは、一方もしくは両方を系内で発現させること、及び／または一方もしくは両方を系に添加することを含む。幾つかの実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｆ）のうちの２つ以上が同時に実行される。幾つかの実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｆ）のうちの２つ以上が個別に実行される。
【００４９】
幾つかの実施形態では、第１のタンパク質、ペプチド、または分子実体及び第２のタンパク質、ペプチド、または分子実体の細胞内での共局在を検出する方法であって、（ａ）当該第１のタンパク質またはペプチド実体、ならびに配列番号２３との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号６及び配列番号９との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチドタグを含む融合物を当該細胞内で発現させること、（ｂ）当該第２のタンパク質またはペプチド実体、ならびに配列番号２５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号７及び配列番号１０との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチドタグを含む融合物を細胞内で発現させること、（ｃ）配列番号１７、配列番号２１、及び／または配列番号３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号５及び配列番号８との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド構成要素を細胞内で発現させることであって、当該第１のペプチドタグ、当該第２のペプチドタグ、及び当該ポリペプチド構成要素が、当該第１のタンパク質またはペプチド実体及び当該第２のタンパク質またはペプチド実体の共局在に際して生物発光複合体を生成するように構成されている、当該発現させること、（ｄ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質を細胞に添加すること、ならびに（ｅ）生物発光複合体により生成された発光シグナルを検出することであって、バックグラウンドを超える発光シグナルの存在が、当該細胞内での当該第１のタンパク質またはペプチド実体及び当該第２のタンパク質またはペプチド実体の共局在を示し、及び／または当該発光シグナルの大きさが、系内での当該第１のタンパク質またはペプチド実体及び当該第２のタンパク質またはペプチド実体の共局在の量と相関する、当該検出すること、を含む当該方法が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｅ）のうちの２つ以上が同時に実行される。幾つかの実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｅ）のうちの２つ以上が個別に実行される。
【００５０】
幾つかの実施形態では、（ａ）配列番号２３との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号６及び配列番号９との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のペプチドタグにコンジュゲートされた第１の結合部分、ならびに（ｂ）配列番号２５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号７及び配列番号１０との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のペプチドタグにコンジュゲートされた第２の結合部分を含むキットが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、第１及び第２の結合部分は、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から独立して選択される。幾つかの実施形態では、第１及び第２の結合部分は、同一標的実体の抗原、エピトープ、または配列に結合するように構成された一次結合部分である。幾つかの実施形態では、第１及び第２の結合部分は、一次結合部分の抗原、エピトープ、または配列に結合するように構成された二次結合部分である。幾つかの実施形態では、キットは、配列番号１７、配列番号２１、及び／または配列番号３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号５及び配列番号８との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド試薬を更に含む。幾つかの実施形態では、キットは、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体を更に含む。
【００５１】
幾つかの実施形態では、標的分子を検出する方法であって、当該標的分子が、第１の抗原、エピトープ、または配列及び別個の第２の抗原、エピトープ、または配列を呈し、当該方法が、（ａ）標的分子を含有する試料を、（ｉ）当該第１の抗原、エピトープ、または配列を認識する第１の一次結合部分及び（ｉｉ）当該第２の抗原、エピトープまたは配列を認識する第２の一次結合部分と接触させること、ならびに当該第１及び第２の一次結合部分が当該第１及び第２の抗原、エピトープ、または配列に結合するのを可能にすること、（ｂ）当該試料を、（ｉ）第１のペプチドタグにコンジュゲートまたは融合された第１の二次結合部分及び（ｉｉ）第２のペプチドタグにコンジュゲートまたは融合された第２の二次結合部分と接触させることであって、当該第１の二次結合部分が当該第１の一次結合部分を認識し、当該第２の二次結合部分が当該第２の一次結合部分を認識し、当該第１または第２のペプチドタグが配列番号２３との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列（ならびに配列番号６及び配列番号９との１００％未満の配列同一性）を含み、当該第１または第２のペプチドタグの他方が配列番号２５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性（ならびに配列番号７及び配列番号１０との１００％未満の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む、当該接触させること、ならびに当該第１及び第２の二次結合部分が当該第１及び第２の一次結合部分に結合するのを可能にすること、（ｃ）当該試料を、配列番号１７、配列番号２１、及び／または配列番号３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性（ならびに配列番号５及び配列番号８との１００％未満の配列同一性）を有するポリペプチド構成要素と接触させることであって、当該第１のペプチドタグ、当該第２のペプチドタグ、及び当該ポリペプチド構成要素が、相互作用に際して生物発光複合体を生成するように構成されている、当該接触させること、（ｄ）当該試料を、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質と接触させること、ならびに（ｅ）当該生物発光複合体により生成された発光シグナルを検出することであって、バックグラウンドを超える発光シグナルの存在が、標的分子の存在を示し、及び／または当該発光シグナルの大きさが、当該試料内での標的分子の量と相関する、当該検出すること、を含む当該方法が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、結合部分は、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から独立して選択される。幾つかの実施形態では、標的分子は、タンパク質、ペプチド、核酸、化学物質または薬物である。幾つかの実施形態では、試料は、インビトロまたはインビボに存在する。
【００５２】
幾つかの実施形態では、標的分子を検出する方法であって、当該標的分子が、第１の抗原、エピトープ、または配列及び別個の第２の抗原、エピトープ、または配列を呈し、当該方法が、（ａ）当該試料を、（ｉ）第１のペプチドタグにコンジュゲートまたは融合された第１の結合部分及び（ｉｉ）第２のペプチドタグにコンジュゲートまたは融合された第２の結合部分と接触させることであって、当該第１の結合部分が当該第１の抗原、エピトープ、または配列を認識し、当該第２の結合部分が当該第２の抗原、エピトープ、または配列を認識し、当該第１または第２のペプチドタグが配列番号２３との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性（ならびに配列番号６及び配列番号９との１００％未満の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、当該第１または第２のペプチドタグの他方が配列番号２５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性（ならびに配列番号７及び配列番号１０との１００％未満の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む、当該接触させること、ならびに当該第１及び第２の結合部分が当該第１及び第２の抗原、エピトープ、または配列に結合するのを可能にすること、（ｃ）当該試料を、配列番号１７、配列番号２１、及び／または配列番号３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性（ならびに配列番号５及び配列番号８との１００％未満の配列同一性）を有するポリペプチド構成要素と接触させることであって、当該第１のペプチドタグ、当該第２のペプチドタグ、及び当該ポリペプチド構成要素が、相互作用に際して生物発光複合体を生成するように構成されている、当該接触させること、（ｄ）当該試料を、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質と接触させること、ならびに（ｅ）当該生物発光複合体により生成された発光シグナルを検出することであって、バックグラウンドを超える発光シグナルの存在が、標的分子の存在を示し、及び／または当該発光シグナルの大きさが、当該試料内での標的分子の量と相関する、当該検出すること、を含む当該方法が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、結合部分は、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、及び／または組換え抗体）、抗体断片、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ／ＧのＩｇ結合ドメイン、プロテインＬ、プロテインＬのＩｇ結合ドメイン、プロテインＭ、プロテインＭのＩｇ結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）からなる群から独立して選択される。幾つかの実施形態では、標的分子は、タンパク質、ペプチド、核酸、化学物質または薬物である。幾つかの実施形態では、試料は、インビトロまたはインビボに存在する。
【００５３】
幾つかの実施形態では、（ａ）（ｉ）配列番号３５との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号２０５及び配列番号２０６との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド構成要素、（ｉｉ）配列番号１７、配列番号２１、及び／または配列番号３０２との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上）の配列同一性ならびに配列番号５及び配列番号８との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド構成要素、ならびに（ｉｉｉ）セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質を組み合わせることであって、当該ペプチド構成要素及びポリペプチド構成要素が、相互作用に際して生物発光複合体を生成するように構成されている、当該組み合わせること、ならびに（ｂ）発光を検出することであって、当該ポリペプチド構成要素及びセレンテラジンまたはセレンテラジン類似体のみにより生成される発光のレベルと比較してより高いレベルの発光が、当該ポリペプチド構成要素の当該ペプチドとの生物発光複合体の形成を示す、当該発光を検出すること、を含む方法が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、ペプチドは、第１の相互作用要素との融合物（例えば、遺伝子融合物、合成融合物、化学的コンジュゲート、酵素コンジュゲートなど）であり、ポリペプチド構成要素は、第２の相互作用要素との融合物（遺伝子融合物、合成融合物、化学的コンジュゲート、酵素コンジュゲートなど）であり、ここで、ペプチド及びポリペプチド構成要素は、相互作用要素の相互作用に際して生物発光複合体を形成するが、相互作用要素間の相互作用の非存在下では生物発光複合体を形成しない。幾つかの実施形態では、ペプチド及びポリペプチド構成要素は、促進（例えば、相互作用要素による）の非存在下で生物発光複合体を形成する。幾つかの実施形態では、ペプチドは、関心対象のタンパク質、ペプチド、または分子（例えば、相互作用要素でない）との融合物またはコンジュゲート（例えば、遺伝子融合物、合成融合物、化学的コンジュゲート、酵素コンジュゲートなど）であり、及び／またはポリペプチド構成要素は、関心対象のタンパク質、ペプチド、または分子（例えば、相互作用要素でない）との融合物またはコンジュゲート（例えば、遺伝子融合物、合成融合物、化学的コンジュゲート、酵素コンジュゲートなど）である。幾つかの実施形態では、ペプチド構成要素及びポリペプチド構成要素は、共局在（例えば、試料内での、細胞内での、組織内での、対象内での、など）に際して、相互作用要素による促進なしに生物発光複合体を形成する。幾つかの実施形態では、ペプチド構成要素及びポリペプチド構成要素は、相互作用要素により促進される際に生物発光複合体を形成するが、促進なしでは生物発光複合体を形成しない。
【００５４】
特許または出願ファイルは、少なくとも１つのカラーで製作された図面を含有する。カラー図面を有する本特許または特許出願刊行物のコピーは、要請及び必要な手数料の支払いに応じて特許庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】β９及びβ１０部分を欠くポリペプチド（ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８；配列番号１７）が、ＬｇＢｉＴ（配列番号１１）と比較して減少したバックグラウンド発光を示し、β９及びβ１０に相当するペプチドによる補完により活性化されることを実証するグラフである。
【図２】それぞれβ９及びβ１０に相当する別個のペプチドによるＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号１７）の活性化を実証するグラフである。
【図３】例示的なＬｇＴｒｉｐ  ２０９８変異体の相対的安定性を示すグラフである。
【図４】ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８変異体の４２位でのアミノ酸部位飽和の相対的発光活性を示すグラフである。
【図５】ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８変異体の４２位でのアミノ酸変化の相対的安定性を示すグラフである。
【図６】ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８変異体の（Ａ）４位、（Ｂ）３０位、及び（Ｃ）１０６位でのアミノ酸変化の相対的発光活性を示すグラフである。
【図７Ａ】ＬｇＴｒｉｐ  ３０９２変異体の１０１位でのアミノ酸変化の相対的発光活性を示すグラフである。
【図７Ｂ】ＬｇＴｒｉｐ  ３０９２変異体の１１７位でのアミノ酸変化の相対的発光活性を示すグラフである。
【図７Ｃ】ＬｇＴｒｉｐ  ３０９２変異体の１２７位でのアミノ酸変化の相対的発光活性を示すグラフである。
【図７Ｄ】ＬｇＴｒｉｐ  ３０９２変異体の１２０位でのアミノ酸変化の相対的発光活性を示すグラフである。
【図７Ｅ】ＬｇＴｒｉｐ  ３０９２変異体の（Ｅ）１２６位でのアミノ酸変化の相対的発光活性を示すグラフである。
【図８】ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（ＷＴ）（配列番号３１）、ＬｇＴｒｉｐ  ３０９２（配列番号１９）、及びＬｇＢｉＴ（配列番号１１）の３７℃での相対的安定性を示すグラフである。
【図９】ＬｇＴｒｉｐバリアントの（Ａ）４２℃及び（Ｂ）６０℃での相対的安定性を示すグラフである。
【図１０Ａ】様々なＬｇＴｒｉｐバリアントのＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）の希釈を示すグラフである。
【図１０Ｂ】様々なＬｇＴｒｉｐバリアントのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号２５）の希釈を示すグラフである。
【図１０Ｃ】様々なＬｇＴｒｉｐバリアントのＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６及びＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６に対する親和性を示すグラフである。
【図１１】様々なＬｇＴｒｉｐバリアントの６０℃での（Ａ）安定性（半減期）及び（Ｂ）相対的安定性を示すグラフである。
【図１２】（Ａ）ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ中で分析された、及び（Ｂ）ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）アッセイ緩衝液中で分析された、ＮａｎｏＬｕｃ（配列番号３）ならびにＬｇＢｉＴ（配列番号１１）及びＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ、配列番号２５）と比較したＬｇＴｒｉｐバリアントのＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）及びＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ、配列番号２５）の存在下での動力学的プロファイルを示すグラフである。
【図１３】ラパマイシンにより誘導されたＦＲＢ／ＦＫＢＰ複合体の形成による以下の様々な３分子システムの促進される補完を示すグラフである：（Ａ）ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号２５）、ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５（配列番号２３）、及びＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）、ならびに（Ｂ）ＳｍＢｉＴ（配列番号１３）、ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５（配列番号２３）、及びＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）。
【図１４】（Ａ）ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ及び（Ｂ）Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＬＢ）中での３７℃でのＬｇＢｉＴ（配列番号１１）及びＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（ＷＴ）（配列番号３１）の安定性を比較するグラフである。
【図１５】６０℃でのＬｇＢｉＴ（配列番号１１）、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及びＮａｎｏＬｕｃ（配列番号３１）の安定性を比較するグラフである。（Ａ）経時変化及び（Ｂ）半減期。
【図１６】（Ａ）ＮａＣｌの存在下及び（Ｂ）ＮａＣｌへの２６時間の曝露後のＬｇＢｉＴ（配列番号１１）、ＮａｎｏＬｕｃ（配列番号３）、ならびにＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及びＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（ＷＴ）（配列番号３１）を比較するグラフである。
【図１７】（Ａ）尿素の存在下及び（Ｂ）尿素への２６時間の曝露後のＬｇＢｉＴ（配列番号１１）、ＮａｎｏＬｕｃ（配列番号３）、ならびにＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及びＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（ＷＴ）（配列番号３１）バリアントを比較するグラフである。
【図１８】（Ａ）様々なｐＨでの、及び（Ｂ）異なるｐＨへの２６時間の曝露後のＬｇＢｉＴ（配列番号１１）、ＮａｎｏＬｕｃ（配列番号３）、ならびにＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及びＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（ＷＴ）（配列番号３１）バリアントを比較するグラフである。
【図１９】ＬｇＢｉＴ（配列番号１１）及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）の自家発光を比較するグラフである。
【図２０】ＬｇＢｉＴ（配列番号１１）＋ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ、配列番号２５）、ＬｇＢｉＴ（配列番号１１）＋ｐｅｐ２６３（配列番号３５）（β９／β１０ジペプチド）、及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）＋ｐｅｐ２６３（β９／β１０ジペプチド）（配列番号３５）の発光を比較するグラフである：（Ａ）ＲＬＵ及び（Ｂ）シグナル／バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）。
【図２１】ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）の、それぞれＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号２５）及びＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５（配列番号２３）との促進される補完である：（Ａ）アッセイシステムの概略図、（Ｂ）ＲＬＵ、及び（Ｃ）シグナル／バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）。
【図２２】様々なＳｍＴｒｉｐ１０配列のＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及びＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）に対する親和性を比較するグラフ及び表である。
【図２３】ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）の標準的な方向性の（ｐｅｐ２６３）（配列番号３５）及び逆の方向性の（ｐｅｐ３２６）（配列番号１７９）ジペプチドによる活性化を比較するグラフ及び表である。
【図２４】ＨｉＢｉＴまたはＳｍＢｉＴ配列を含むジペプチドによる相補体ポリペプチドの活性化を示すグラフ及び表である。ＨｉＢｉＴ配列  ｐｅｐ２６３（配列番号３５）を有するジペプチドまたはＳｍＢｉＴ配列  ｐｅｐ２７４（配列番号１４７）を有するジペプチド。
【図２５】（Ａ）ポリペプチド構成要素（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６と比較して付加または欠失を有する）のＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）及び様々なβ１０様ペプチド（ＳｍＴｒｉｐ１０ペプチド）との様々な組み合わせの補完により得られた発光を示すグラフである。（Ｂ）ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及びＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）の様々なβ１０様ペプチド（ＳｍＴｒｉｐ１０ペプチド）との補完により得られた発光を示すグラフである。
【図２６Ａ】ポリペプチド構成要素とβ９鎖に相当するペプチドとの間に、またはβ９とβ１０様ペプチドとの間に（ベースとなるルシフェラーゼ配列と比較して）重複を有するポリペプチド／ペプチド組み合わせにより生成された発光を示すグラフである。
【図２６Ｂ】ポリペプチド構成要素とβ９鎖に相当するペプチドとの間に、またはβ９とβ１０様ペプチドとの間に（ベースとなるルシフェラーゼ配列と比較して）重複を有するポリペプチド／ペプチド組み合わせにより生成された発光を示すグラフである。
【図２６Ｃ】ポリペプチド構成要素とβ９鎖に相当するペプチドとの間に、またはβ９とβ１０様ペプチドとの間に（ベースとなるルシフェラーゼ配列と比較して）重複を有するポリペプチド／ペプチド組み合わせにより生成された発光を示すグラフである。
【図２７】（Ａ）一定濃度のＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及びＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号２５）の存在下での様々なβ９様ペプチド（ＳｍＴｒｉｐ９ペプチド）の希釈物、及び（Ｂ）一定濃度のＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及び様々なβ９様ペプチド（ＳｍＴｒｉｐ９ペプチド）の存在下でのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号２５）の希釈物により得られた発光を示す図及び表である。
【図２８】一定濃度のＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及びＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）の存在下での様々なβ１０様ペプチド（ＳｍＴｒｉｐ  １０ペプチド）の希釈物により得られた発光を示す図及び表である。
【図２９】一定濃度の様々なβ１０様ペプチド（ＳｍＴｒｉｐ１０ペプチド）及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）ポリペプチド構成要素の存在下でのβ９様ペプチドである（Ａ）ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）及び（Ｂ）ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８７（配列番号１４８）の希釈を示す図及び表である。
【図３０】構築物の方向性（β９−ＦＫＢＰ、ＦＫＢＰ−β９、β１０−ＦＫＢＰ、ＦＫＢＰ−β１０、β９−ＦＲＢ、ＦＲＢ−β９、β１０−ＦＲＢ、またはＦＲＢ−β１０）のＨＥＫ２９３細胞における促進される補完に対する効果を示すグラフである。
【図３１】構築物の方向性（β９−ＦＫＢＰ、ＦＫＢＰ−β９、β１０−ＦＫＢＰ、ＦＫＢＰ−β１０、β９−ＦＲＢ、ＦＲＢ−β９、β１０−ＦＲＢ、またはＦＲＢ−β１０）のＥ．ｃｏｌｉ細胞における促進される補完に対する効果を示すグラフである。
【図３２】様々なβ１０様ペプチドのＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及びＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）との算出されたＫｄ値を示すグラフである。
【図３３】ポリペプチド構成要素ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）とβ９様ペプチドとの間の異なる分割位置を有する構成要素の組み合わせによる発光を示すグラフ及び表である。
【図３４】様々なＬｇＴｒｉｐポリペプチド構成要素とＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）との間の配列ギャップ及び／または重複部分を有する構成要素の組み合わせによる発光を示すグラフである。
【図３５】β９様ペプチド（ＳｍＴｒｉｐ９ペプチド）とポリペプチド構成要素ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）との間の配列におけるギャップ及び／または重複部分を有するＮａｎｏＴｒｉｐ構成要素の組み合わせによる、ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ、配列番号２５）の存在下での発光を示すグラフである。
【図３６】β９様ペプチド（ＳｍＴｒｉｐ９ペプチド）の長さの、β９様ペプチド親和性ならびにＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及びＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６による最大光出力に対する影響の生化学的解析を示す表である。
【図３７】β９様ペプチド（ＳｍＴｒｉｐ９ペプチド）の長さの、ＨｉＢｉＴ親和性ならびにＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及びＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号２５）による最大光出力に対する影響の生化学的解析を示す表である。
【図３８】β９様ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）点変異体のＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及びＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号２５）とのＫｄ及びＢｍａｘを示す表である。
【図３９】様々な溶解性タグの、β９様ペプチドのＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及びＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ８６（配列番号２５）との親和性に対する効果を示す表である。
【図４０】様々なＣ末端延長配列のβ９様またはβ１０様ペプチド親和性及び最大光出力に対する効果を示す表である。β９様ペプチド希釈物（ｐｅｐ２８６（配列番号３７）、ｐｅｐ２９２（配列番号１５３）、ｐｅｐ２９７（配列番号１５７）、ｐｅｐ３０２（配列番号１６１））及びβ１０様ペプチドであるＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ、配列番号２５）が示される。
【図４１】ＦＲＢ−β１０構築物のリンカー長さ（１５、１０、または５Ｇｌｙ／Ｓｅｒ残基）、リンカー組成（Ａｌａ−Ｉｌｅを含有または非含有）、ヘキサヒスチジンタグの含有、及びβ１０組成（ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号２５）またはＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（配列番号１５０））のＥ．ｃｏｌｉ溶解物におけるＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）との促進される補完に対する効果を示すグラフである。
【図４２】ＦＲＢ−β１０構築物のリンカー長さ（１５、１０、または５Ｇｌｙ／Ｓｅｒ残基）、リンカー組成（Ａｌａ−Ｉｌｅを含有または非含有）、ヘキサヒスチジンタグの含有、及びβ１０組成（ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号２５）またはＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（配列番号１５０））のＨＥＫ溶解物におけるＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）との促進される補完に対する効果を示すグラフである。
【図４３】β９配列の短縮及び延長ならびに構築物の方向性（β９−ＦＫＢＰまたはＦＫＢＰ−β９）の、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）を含有するＥ．ｃｏｌｉ溶解物におけるＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（β１０）（配列番号２５）との促進される補完に対する効果を示すグラフである。
【図４４】β９配列の短縮及び延長ならびに構築物の方向性（β９−ＦＫＢＰまたはＦＫＢＰ−β９）の、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）を含有するＥ．ｃｏｌｉ溶解物におけるＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（β１０）（配列番号１５０）との促進される補完に対する効果を示すグラフである。
【図４５】β９配列の短縮、延長及び構築物の方向性（β９−ＦＫＢＰまたはＦＫＢＰ−β９）の、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）を含有するＥ．ｃｏｌｉ溶解物におけるＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（β１０）（配列番号２５）との促進される補完に対する効果を示すグラフである。
【図４６】β９配列の短縮、延長及び構築物の方向性（β９−ＦＫＢＰまたはＦＫＢＰ−β９）の、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）を含有するＥ．ｃｏｌｉ溶解物におけるＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（β１０）（配列番号１５０）との促進される補完に対する効果を示すグラフである。
【図４７】β９配列の短縮、延長及び構築物の方向性（β９−ＦＫＢＰまたはＦＫＢＰ−β９）の、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）を含有するＥ．ｃｏｌｉ溶解物におけるＦＲＢ−β１０（ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号２５）またはＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（配列番号１５０））による誘導倍率（促進される補完／自発的補完）に対する効果を示すグラフである（図４５及び４６の要約）。
【図４８】β９配列の短縮及び延長ならびに構築物の方向性（β９−ＦＫＢＰまたはＦＫＢＰ−β９）の、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）を含有するＨＥＫ２９３溶解物におけるＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号２５）により促進される補完に対する効果を示すグラフである。
【図４９】β９配列の短縮及び延長ならびに構築物の方向性（β９−ＦＫＢＰまたはＦＫＢＰ−β９）の、ＨＥＫ２９３溶解物におけるＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（配列番号１５０）により促進される補完に対する効果を示すグラフである。（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１））。
【図５０】β９配列の短縮、延長、及び構築物の方向性（β９−ＦＫＢＰまたはＦＫＢＰ−β９）の、ＨＥＫ２９３溶解物におけるＦＲＢ−β１０（ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号２５）またはＳｍＴｒｉｐ１０ｐｅｐ２８９（配列番号１５０））による誘導倍率（促進される補完／自発的補完）に対する効果を示すグラフである（図４８及び４９の要約）。（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１））。
【図５１Ａ】ペプチドでタグ付けされた結合部分を使用する例示的なタンパク質−タンパク質相互作用アッセイまたは分析物検出アッセイを示す概略図である。
【図５１Ｂ】ペプチドでタグ付けされた結合部分を使用する例示的なタンパク質−タンパク質相互作用アッセイまたは分析物検出アッセイを示す概略図である。
【図５１Ｃ】ペプチドでタグ付けされた結合部分を使用する例示的なタンパク質−タンパク質相互作用アッセイまたは分析物検出アッセイを示す概略図である。
【図５１Ｄ】ペプチドでタグ付けされた結合部分を使用する例示的なタンパク質−タンパク質相互作用アッセイまたは分析物検出アッセイを示す概略図である。
【図５１Ｅ】本明細書に記載される構成要素及び試薬を使用した以下の例示的な免疫アッセイを示す概略図である：直接免疫アッセイ。
【図５１Ｆ】本明細書に記載される構成要素及び試薬を使用した以下の例示的な免疫アッセイを示す概略図である：間接免疫アッセイ。
【図５１Ｇ】本明細書に記載される構成要素及び試薬を使用した以下の例示的な免疫アッセイを示す概略図である：競合直接免疫アッセイ。
【図５１Ｈ】本明細書に記載される構成要素及び試薬を使用した以下の例示的な免疫アッセイを示す概略図である：競合間接免疫アッセイ。
【図５２】例示的な多重化３分子ラテラルフローアッセイの概略図である。かかるアッセイは、例えば、病原体の検出において有用である。
【図５３】例示的な多重化３分子ラテラルフローアッセイの概略図である。かかるアッセイは、例えば、抗ウイルス抗体の検出において有用である。
【図５４】例示的な抗体検出アッセイの概略図である。
【図５５】例示的なビーズベースのアッセイの概略図である。
【図５６】例示的な核酸検出アッセイの概略図である。
【図５７】構築物内のリンカーにＡＩ（Ａｌａ−Ｉｌｅ）ジペプチドがない（**で表される）Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物におけるＦＲＢ−ＦＫＢＰにより促進される補完を示すグラフである。（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１））。
【図５８】構築物内のリンカーにＡＩ配列ジペプチドがない（**で表される）ＨＥＫ２９３溶解物（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）を含有する）におけるＦＲＢ−ＦＫＢＰにより促進される補完を示すグラフである。
【図５９】Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）を含有する）におけるＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６及びＣ末端が延長されたＦＫＢＰ−ＳｍＴｒｉｐ９ペプチドによるＦＲＢ−ＦＫＢＰによる発光複合体形成の促進を示すグラフである。
【図６０】Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物におけるＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９及びＣ末端が延長されたＦＫＢＰ−ＳｍＴｒｉｐ９ペプチドによるＦＲＢ−ＦＫＢＰによる発光複合体形成の促進を示すグラフである。（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１））。
【図６１】ＨＥＫ２９３溶解物におけるＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６及びＣ末端が延長されたＦＫＢＰ−ＳｍＴｒｉｐ９ペプチドによるＦＲＢ−ＦＫＢＰによる発光複合体形成の促進を示すグラフである。（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１））。
【図６２】Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物におけるＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６及びＦＫＢＰ融合物におけるＳｍＴｒｉｐ９ペプチド配列の短縮及び延長によるＦＲＢ−ＦＫＢＰによる発光複合体形成の促進を示すグラフである。（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）を含有する）。
【図６３】Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物におけるＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９及びＦＫＢＰ融合物におけるＳｍＴｒｉｐ９ペプチド配列の短縮及び延長によるＦＲＢ−ＦＫＢＰによる発光複合体形成の促進を示すグラフである。（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１））。
【図６４】ＨＥＫ２９３溶解物におけるＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６及びＦＫＢＰ融合物におけるＳｍＴｒｉｐ９ペプチド配列の短縮及び延長によるＦＲＢ−ＦＫＢＰによる発光複合体形成の促進を示すグラフである。（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１））。
【図６５】ＨＥＫ２９３溶解物におけるＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６及びＦＫＢＰ融合物におけるＳｍＴｒｉｐ９ペプチド配列の短縮及び延長によるＦＲＢ−ＦＫＢＰによる発光複合体形成の促進を示すグラフである。（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１））。
【図６６】Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物におけるＦＫＢＰ−ＳｍＴｒｉｐ９溶解性バリアント及びＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６によるＦＲＢ−ＦＫＢＰによる発光複合体形成の促進を示すグラフである。（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１））。
【図６７】Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物におけるＦＫＢＰ−ＳｍＴｒｉｐ９溶解性バリアント及びＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９によるＦＲＢ−ＦＫＢＰによる発光複合体形成の促進を示すグラフである。（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１））。
【図６８】ＨＥＫ２９３溶解物におけるＦＫＢＰ−ＳｍＴｒｉｐ９溶解性バリアント及びＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６によるＦＲＢ−ＦＫＢＰによる発光複合体形成の促進を示すグラフである。（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１））。
【図６９】ＨＥＫ２９３溶解物におけるＦＫＢＰ−ＳｍＴｒｉｐ９溶解性バリアント及びＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９によるＦＲＢ−ＦＫＢＰによる発光複合体形成の促進を示すグラフである。（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１））。
【図７０】Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物におけるＦＫＢＰ−ＳｍＴｒｉｐ９溶解性バリアント及びＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６によるＦＲＢ−ＦＫＢＰによる発光複合体形成の促進を示すグラフである。（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１））。
【図７１】Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物におけるＦＫＢＰ−ＳｍＴｒｉｐ９溶解性バリアント及びＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９によるＦＲＢ−ＦＫＢＰによる発光複合体形成の促進を示すグラフである。（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１））。
【図７２】ＨＥＫ２９３溶解物におけるＦＫＢＰ−ＳｍＴｒｉｐ９溶解性バリアント及びＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６によるＦＲＢ−ＦＫＢＰによる発光複合体形成の促進を示すグラフである。（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１））。
【図７３】ＨＥＫ２９３溶解物におけるＦＫＢＰ−ＳｍＴｒｉｐ９溶解性バリアント及びＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９によるＦＲＢ−ＦＫＢＰによる発光複合体形成の促進を示すグラフである。（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１））。
【図７４】Ｃ末端延長を有する合成ＳｍＴｒｉｐ９溶解性バリアントの親和性及びＢｍａｘを列挙する表である。（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１））。
【図７５】Ｃ末端延長を有する合成ＳｍＴｒｉｐ９溶解性バリアントの親和性及びＢｍａｘを列挙する表である。（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１））。
【図７６】異なるブロッキングをされた末端を有する合成ＳｍＴｒｉｐ９バリアントのＫｄ及びＢｍａｘを列挙する表である。（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１））。
【図７７Ａ】合成ＳｍＴｒｉｐ９ペプチドの溶解性を列挙する表である。
【図７７Ｂ】合成ＳｍＴｒｉｐ９ペプチドの溶解性を列挙する表である。
【図７８Ａ】ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）のＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ）／ＬｇＴｒｉｐ融合物（配列番号２１０及び２１２）に対する親和性を示すグラフである。
【図７８Ｂ】ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ７５９（配列番号４９６）の様々なＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ）／ＬｇＴｒｉｐ融合物に対する親和性を示すグラフである。
【図７９】漸増する界面活性剤濃度への１８時間の曝露後の生物発光を示すグラフである。ＮａｎｏＬｕｃ（配列番号３）、ＬｇＢｉＴ（配列番号１１）、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）。
【図８０】漸増する界面活性剤濃度の存在下での酵素活性を示すグラフである。ＮａｎｏＬｕｃ（配列番号３）、ＬｇＢｉＴ（配列番号１１）、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）。
【図８１】ＬｇＢｉＴ（配列番号１１）及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）によるＦＲＢ−ＦＫＢＰにより促進される生物発光複合体形成の可逆性を実証するグラフである。
【図８２】一定のＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）の存在下での様々なＳｍＴｒｉｐ１０ペプチドの希釈の結果を列挙する表である。
【図８３】一定のＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）希釈物の存在下での様々なＳｍＴｒｉｐ１０ペプチドの希釈の結果を列挙する表である。
【図８４】ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２６３（配列番号３５）及びＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号２５）またはＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６＋ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）によるＡｎｔａｒｅｓ型融合物（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６）からの生物発光を示すグラフである。
【図８５】ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２６３（配列番号３５）及びＳｍＴｒｉｐ  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ、配列番号２５）またはＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ、配列番号２５）＋ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）によるＡｎｔａｒｅｓ型融合物（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６）（配列番号５１）からの発光スペクトルを示すグラフである。
【図８６】ＬｇＢｉＴ（配列番号１１）及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）のジペプチドｐｅｐ２６３（配列番号３５）の存在下での「暗」ジペプチド２７２（配列番号１４６）による希釈を示すグラフである。
【図８７】ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及びＬｇＢｉＴ（配列番号１１）での、暗ジペプチド２７２（配列番号１４６）及び２７３（配列番号２９８）による阻害を比較するグラフである。
【図８８】暗ＢｉＴ１６７（配列番号３００）によるＬｇＢｉＴ（配列番号１１）及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）の阻害を示すグラフである。
【図８９】ＦＫＢＰ−ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ４３４（配列番号２３０）バリアントのＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及びＦＲＢ−ＨｉＢｉＴ（配列番号２５）との補完によるＥ．ｃｏｌｉ溶解物における発光複合体形成のＦＲＢ−ＦＫＢＰによる促進を示すグラフである。
【図９０】ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ４３４（配列番号２３０）バリアントのＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及びＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）との補完によるＥ．ｃｏｌｉ溶解物における発光複合体形成のＦＲＢ−ＦＫＢＰによる促進を示すグラフである。
【図９１】（Ａ）ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ４３５（配列番号２３１）及びＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ４３４（配列番号２３０）バリアントのＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及びＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ、配列番号２５）との補完によるＨＥＫ２９３溶解物における発光複合体形成のＦＲＢ−ＦＫＢＰ促進を示すグラフである。（Ｂ）ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ４３５（配列番号２３１）及びＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ４３４（配列番号２３０）バリアントのＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及びＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（配列番号１５０）との補完によるＨＥＫ２９３溶解物における発光複合体形成のＦＲＢ−ＦＫＢＰ促進を示すグラフである。
【図９２】ＳｍＴｒｉｐ９  ８２３及び８４０によるＦＲＢ−ＦＫＢＰアッセイ法の結果を示す表
【図９３】合成ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ４３５（配列番号２３１）及びＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ４３４（配列番号２３０）バリアントのＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）とのＫｄ及びＢｍａｘを列挙する表である。
【図９４】内因的にタグ付けされた（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により）ＧＡＰＤＨを検出するための生物発光試薬としてのｐｅｐ２６３（配列番号３５）またはｐｅｐ３３１（配列番号３０１）とのｗｔ  ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）を実証するグラフである。
【図９５Ａ】例示的なＳｍＴｒｉｐ１０化学的コンジュゲートである。曝露された溶媒、またはタンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子上の保護されたシステイン標的、もしくはシステインなどのチオールとの反応のためのマレイミド、もしくはリジンなどのアミンとの反応のためのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）を用いて準備されているタンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子へのジスルフィド結合形成のためのＮ末端システイン修飾を有するＳｍＴｒｉｐ１０の例である。
【図９５Ｂ】例示的なＳｍＴｒｉｐ１０化学的コンジュゲートである。タンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子に別々に導入された歪みのない、または歪みアルキン標的との銅触媒ありまたは銅なしの１，３−双極子環状付加反応（「クリック」）のためのＮ末端アジドリジン修飾を有する例示的なＳｍＴｒｉｐ１０である。
【図９５Ｃ】例示的なＳｍＴｒｉｐ１０化学的コンジュゲートである。タンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子の求核基（例えば、リジン、他の一級アミン）への一般的な結合のためのＮ末端Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）を有する例示的なＳｍＴｒｉｐ１０である。求核基は、未修飾タンパク質／オリゴ／低分子に存在し得るか、またはこのコンジュゲーションのために化学的に付加され得る。
【図９５Ｄ】例示的なＳｍＴｒｉｐ１０化学的コンジュゲートである。タンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子に化学的または生物学的に別々に導入されたアジド、ジアゾ、またはテトラジン標的との銅触媒ありまたは銅なしの１，３−双極子環状付加反応（「クリック」）のためのＮ末端プロパルギルグリシン修飾を有する例示的なＳｍＴｒｉｐ１０である。
【図９５Ｅ】例示的なＳｍＴｒｉｐ１０化学的コンジュゲート。銅触媒ありまたは銅なしの１，３−双極子環状付加反応（「クリック」）のためのＮ末端プロパルギルグリシン修飾及びＣ末端フルオロフォア（例えば、ＢＯＤＩＰＹ色素）を有する例示的なＳｍＴｒｉｐ１０である。
【図９６Ａ】例示的なＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６化学的コンジュゲートである。（Ａ）タンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子に化学的または生物学的に別々に導入された歪みのない、または歪みアルキン標的との銅触媒ありまたは銅なしの１，３−双極子環状付加反応（「クリック」）のためのＣ末端アジドリジン修飾を有するＳｍＴｒｉｐ９−２８６の例である。
【図９６Ｂ】例示的なＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６化学的コンジュゲートである。タンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子に化学的または生物学的に別々に導入されたアジド、ジアゾ、テトラジン標的との銅触媒ありまたは銅なしの１，３−双極子環状付加反応（「クリック」）のためのＣ末端プロパルギルグリシン修飾を有するＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６の例である。
【図９６Ｃ】例示的なＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６化学的コンジュゲートである。曝露された溶媒、またはタンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子上の保護されたシステイン標的、もしくはマレイミドハンドルもしくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて準備されているタンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子へのジスルフィド結合形成のためのＣ末端システイン修飾を有するＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６の例である。
【図９６Ｄ】例示的なＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６化学的コンジュゲートである。Ｃ末端システイン修飾及びＮ末端ＢＯＤＩＰＹ色素を有するＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６の例である。色素は、ＢＯＤＩＰＹに限定されず、任意のフルオロフォア、ＢＲＥＴパートナー、またはＦＲＥＴ色素／クエンチャーパートナーであり得るである。色素は、Ｃ末端に準備されたコンジュゲーションハンドルの任意の他の組み合わせにより組み込まれ得る。
【図９６Ｅ】例示的なＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６化学的コンジュゲートである。タンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子の求核標的（例えば、リジン）またはタンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子への一般的なコンジュゲーションのためのＣ末端Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）を有するＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６の例である。
【図９６Ｆ】例示的なＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６化学的コンジュゲートである。タンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子の求核標的（すなわち、リジン）またはタンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子への一般的なコンジュゲーションのためのＣ末端Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）を有するＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６の例である。
【図９７Ａ】例示的なＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１化学的コンジュゲートである。Ｃ末端アジドリジン修飾及びＮ末端ＢＯＤＩＰＹ色素を有するＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１の例である。色素は、ＢＯＤＩＰＹに限定されず、任意のフルオロフォア、ＢＲＥＴパートナー、またはＦＲＥＴ色素／クエンチャーパートナーであり得る。色素は、Ｃ末端に準備されたコンジュゲーションハンドルの任意の他の組み合わせにより組み込まれ得る。
【図９７Ｂ】例示的なＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１化学的コンジュゲートである。タンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子に化学的または生物学的に別々に導入された歪みのない、または歪みアルキン標的との銅触媒ありまたは銅なしの１，３−双極子環状付加反応（「クリック」）のためのＣ末端アジドリジン修飾を有するＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１の例である。
【図９７Ｃ】例示的なＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１化学的コンジュゲートである。タンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子に化学的または生物学的に別々に導入されたアジド、ジアゾ、テトラジン標的との銅触媒ありまたは銅なしの１，３−双極子環状付加反応（「クリック」）のためのＣ末端プロパルギルグリシン修飾を有するＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１の例である。
【図９７Ｄ】例示的なＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１化学的コンジュゲートである。曝露された溶媒、またはタンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子上の保護されたシステイン標的、もしくはマレイミドハンドルもしくはＮＨＳエステルを用いて準備されているタンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子へのジスルフィド結合形成のためのＣ末端システイン修飾を有するＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１の例である。
【図９７Ｅ】例示的なＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１化学的コンジュゲートである。タンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子の求核標的（すなわち、リジン）への一般的なコンジュゲーションのためのＣ末端Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）を有するＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１の例である。
【図９７Ｆ】例示的なＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１コンジュゲートである。タンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子の求核標的（すなわち、リジン）への一般的なコンジュゲーションのためのＣ末端Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）を有するＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１の例である。
【図９８Ａ】例示的なＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２４化学的コンジュゲートである。Ｃ末端アジドリジン修飾及びＮ末端ＢＯＤＩＰＹ色素を有するＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２４の例である。色素は、ＢＯＤＩＰＹに限定されず、任意のフルオロフォア、ＢＲＥＴパートナー、またはＦＲＥＴ色素／クエンチャーパートナーであり得る。色素は、Ｃ末端のコンジュゲーションハンドルの任意の他の組み合わせにより組み込まれ得る。
【図９８Ｂ】例示的なＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２４化学的コンジュゲートである。タンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子に化学的または生物学的に別々に導入された歪みのない、または歪みアルキン標的との銅触媒ありまたは銅なしの１，３−双極子環状付加反応（「クリック」）のためのＣ末端アジドリジン修飾を有するＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２４の例である。
【図９８Ｃ】例示的なＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２４化学的コンジュゲートである。タンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子に化学的または生物学的に別々に導入されたアジド、ジアゾ、テトラジン標的との銅触媒ありまたは銅なしの１，３−双極子環状付加反応（「クリック」）のためのＣ末端プロパルギルグリシン修飾を有するＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２４の例である。
【図９８Ｄ】例示的なＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２４化学的コンジュゲートである。曝露された溶媒、またはタンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子上の保護されたシステイン標的、もしくはマレイミドハンドルもしくはＮＨＳエステルを用いて準備されているタンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子へのジスルフィド結合形成のためのＣ末端システイン修飾を有するＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２４の例である。
【図９８Ｅ】例示的なＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２４化学的コンジュゲートである。タンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子の求核標的（すなわち、リジン）への一般的なコンジュゲーションのためのＣ末端Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）を有するＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２４の例である。
【図９８Ｆ】例示的なＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２４化学的コンジュゲートである。タンパク質／ペプチド／ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド／低分子の求核標的（すなわち、リジン）への一般的なコンジュゲーションのためのＣ末端Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）を有するＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２４の例である。
【図９９Ａ】例示的なペプチド−オリゴマープローブである。反応性アジド基を示すペプチドが、反応性アルキン基を示すオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされて、例示的なペプチド−オリゴマープローブが形成される。５’末端アルキン官能性を含有するＤＮＡオリゴマーに銅触媒「クリック」１，３−環状付加によりコンジュゲートされたＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（ｗ／アジド基）のペプチド−オリゴマーコンジュゲートである。
【図９９Ｂ】例示的なペプチド−オリゴマープローブである。反応性アジド基を示すペプチドが、反応性アルキン基を示すオリゴヌクレオチドに結合されて、例示的なペプチド−オリゴマープローブが形成される。３’末端アルキン官能性を含有するＤＮＡオリゴマーに銅触媒「クリック」１，３−環状付加によりコンジュゲートされたＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ）（ｗ／アジド基）のペプチド−オリゴマーコンジュゲートである。
【図１００】ＳｍＴｒｉｐ９のＧ１４７部位飽和バリアントのスクリーニングを示すグラフである。
【図１０１】ＳｍＴｒｉｐ９のＫ１４８部位飽和バリアントのスクリーニングを示すグラフである。
【図１０２】ＳｍＴｒｉｐ９のＭ１４９部位飽和バリアントのスクリーニングを示すグラフである。
【図１０３】ＳｍＴｒｉｐ９のＬ１５０部位飽和バリアントのスクリーニングを示すグラフである。
【図１０４】ＳｍＴｒｉｐ９のＦ１５１部位飽和バリアントのスクリーニングを示すグラフである。
【図１０５】ＳｍＴｒｉｐ９のＲ１５２部位飽和バリアントのスクリーニングを示すグラフである。
【図１０６】ＳｍＴｒｉｐ９のＶ１５３部位飽和バリアントのスクリーニングを示すグラフである。
【図１０７】ＳｍＴｒｉｐ９のＴ１５４部位飽和バリアントのスクリーニングを示すグラフである。
【図１０８】ＳｍＴｒｉｐ９のＩ１５５部位飽和バリアントのスクリーニングを示すグラフである。
【図１０９】ＳｍＴｒｉｐ９のＮ１５６部位飽和バリアントのスクリーニングを示すグラフである。
【図１１０】ＳｍＴｒｉｐ９のＳ１５７部位飽和バリアントのスクリーニングを示すグラフである。
【図１１１】ＳｍＴｒｉｐ９のＷ１５８部位飽和バリアントのスクリーニングを示すグラフである。
【図１１２】ＳｍＴｒｉｐ９のＫ１４９部位飽和バリアントのスクリーニングを示すグラフである。
【図１１３】Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物におけるＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ４３５／４３４でのＦＲＢ−ＦＫＢＰにより促進される補完の結果の表である。
【図１１４】Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物におけるＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ４３５／４３４でのＦＲＢ−ＦＫＢＰにより促進される補完の結果の表である。
【図１１５】Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物におけるＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ４３５／４３４でのＦＲＢ−ＦＫＢＰにより促進される補完の結果の表である。
【図１１６】組み合わせのＳｍＴｒｉｐ９バリアントでのＦＲＢ−ＦＫＢＰ促進型補完アッセイ法の結果の表である。
【図１１７】組み合わせのＳｍＴｒｉｐ９バリアントでのＦＲＢ−ＦＫＢＰ促進型補完アッセイ法の結果の表である。
【図１１８】組み合わせのＳｍＴｒｉｐ９バリアントでのＦＲＢ−ＦＫＢＰ促進型補完アッセイ法の結果の表である。
【図１１９】組み合わせのＳｍＴｒｉｐ９バリアントでのＦＲＢ−ＦＫＢＰ促進型補完アッセイ法の結果の表である。
【図１２０】組み合わせのＳｍＴｒｉｐ９バリアントでのＦＲＢ−ＦＫＢＰ促進型補完アッセイ法の結果の表である。
【図１２１】組み合わせのＳｍＴｒｉｐ９バリアントでのＦＲＢ−ＦＫＢＰ促進型補完アッセイ法の結果の表である。
【図１２２Ａ】組み合わせのＳｍＴｒｉｐ９バリアントでのＦＲＢ−ＦＫＢＰ促進型補完アッセイ法の結果の表である。
【図１２２Ｂ】組み合わせのＳｍＴｒｉｐ９バリアントでのＦＲＢ−ＦＫＢＰ促進型補完アッセイ法の結果の表である。
【図１２３】ＳｍＴｒｉｐ９合成ペプチドのＫｄ及びＢｍａｘの表である。
【図１２４】ＳｍＴｒｉｐ９合成ペプチドのＫｄ及びＢｍａｘの表である。
【図１２５】ＳｍＴｒｉｐ９合成ペプチドのＫｄ及びＢｍａｘの表である。
【図１２６】ＳｍＴｒｉｐ９合成ペプチドのＫｄ及びＢｍａｘの表である。
【図１２７】ＳｍＴｒｉｐ９合成ペプチドのＫｄ及びＢｍａｘの表である。
【図１２８】ＳｍＴｒｉｐ９合成ペプチドのＫｄ及びＢｍａｘの表である。
【図１２９】ＳｍＴｒｉｐ９合成ペプチドのＫｄ及びＢｍａｘの表である。
【図１３０】ＳｍＴｒｉｐ９合成ペプチドのＫｄ及びＢｍａｘの表である。
【図１３１Ａ】合成ＳｍＴｒｉｐ９ペプチドの溶解性の表である。
【図１３１Ｂ】合成ＳｍＴｒｉｐ９ペプチドの溶解性の表である。
【図１３１Ｃ】合成ＳｍＴｒｉｐ９ペプチドの溶解性の表である。
【図１３２】ＳｍＴｒｉｐ９合成ペプチド及びｐｅｐ２８９の生化学的共希釈（ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏ−ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）のグラフである。
【図１３３】ＳｍＴｒｉｐ９合成ペプチド及びｐｅｐ２８９の生化学的共希釈のグラフである。
【図１３４】ＳｍＴｒｉｐ９及びＳｍＴｒｉｐ１０合成ペプチドの生化学的共希釈のグラフである。
【図１３５】ｐｅｐ５２１及び代替的ＳｍＴｒｉｐ１０合成ペプチドの生化学的共希釈のグラフである。
【図１３６】ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６テンプレートからの鎖除去（精製）のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルである。
【図１３７Ａ】ペプチドの様々な組み合わせとの鎖除去タンパク質のグラフである。
【図１３７Ｂ】ペプチドの様々な組み合わせとの鎖除去タンパク質のグラフである。
【図１３７Ｃ】ペプチドの様々な組み合わせとの鎖除去タンパク質のグラフである。
【図１３７Ｄ】ペプチドの様々な組み合わせとの鎖除去タンパク質のグラフである。
【図１３８Ａ】ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６テンプレートからの６、７、８、９、または１０鎖除去（精製）のグラフである。
【図１３８Ｂ】ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６テンプレートからの６、７、８、９、または１０鎖除去（精製）のグラフである。
【図１３９Ａ】ジペプチド希釈物のＫｄ及びＢｍａｘ値のグラフである。
【図１３９Ｂ】ジペプチド希釈物のＫｄ及びＢｍａｘ値のグラフである。
【図１３９Ｃ】ジペプチド希釈物のＫｄ及びＢｍａｘ値のグラフである。
【図１３９Ｄ】ジペプチド希釈物のＫｄ及びＢｍａｘ値のグラフである。
【図１３９Ｅ】ジペプチド希釈物のＫｄ及びＢｍａｘ値のグラフである。
【図１４０】３分子プロテインＧ及びＴＮＦａ融合タンパク質を使用した、抗ＴＮＦａ生物学的薬剤であるＲｅｍｉｃａｄｅ、Ｈｕｍｉｒａ、及びＥｎｂｒｅｌの溶液ベースの均一定量アッセイを開発するために取られたアプローチを示す概略図である。
【図１４１】溶液ベースの均一アッセイにおける、ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１−プロテインＧ（配列番号２６８）及びＴＮＦａ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）融合タンパク質を精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）と共に用いる促進される補完によるＴＮＦａ阻害剤用量反応の定量的解析を示すグラフである。
【図１４２】溶液ベースの均一アッセイを使用した、ヒト血清及び尿が含まれる複雑な試料マトリックスの存在下での、ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１−プロテインＧ（配列番号２６８）及びＴＮＦａ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）融合タンパク質を精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）と共に用いる促進される補完による１０ｎＭのインフリキシマブの定量的解析を示すグラフである。
【図１４３】溶液ベースの均一アッセイにおける、ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１−プロテインＧ（配列番号２６８）及びＴＮＦａ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）融合タンパク質を精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）と共に用いる促進される補完による、１００ｐＭのインフリキシマブを示すシグナル生成の結合動態を示すグラフである。
【図１４４】溶液ベースの均一アッセイにおける、異なるＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ（Ｘ）−プロテインＧバリアント及びＴＮＦａ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）融合タンパク質を精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）と共に用いる促進される補完による、１０ｎＭのインフリキシマブを示すシグナル生成を示すグラフである。
【図１４５】ＳｍＴｒｉｐ９−プロテインＧ融合タンパク質及びＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９−ＥＧＦＲ（配列番号１５０）を発現するＨＥＫ２９３細胞を使用した、抗ＥＧＦＲ生物学的薬剤であるパニツムマブ及びセツキシマブの細胞ベースの均一定量アッセイを開発するために取られたアプローチを示す概略図である。
【図１４６】細胞ベースの均一アッセイにおける、ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１−プロテインＧ（配列番号２６８）融合タンパク質及びＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９−ＥＧＦＲ（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）を発現する細胞を精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）と共に用いる促進される補完によるパニツムマブの定量化を示すグラフである。
【図１４７】細胞ベースの均一アッセイにおける、ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１−プロテインＧ（配列番号２６８）融合タンパク質及びＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９−ＥＧＦＲ（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）を発現する細胞を用いる促進される補完による、セツキシマブを測定するシグナル生成のリアルタイム結合動態を示すグラフである。
【図１４８】細胞ベースの均一アッセイにおける、精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）と組み合わせた異なるＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ（Ｘ）−プロテインＧバリアント及びＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９−ＥＧＦＲ（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）を発現する細胞により促進される補完による、１ｎＭのパニツムマブを示すシグナル生成を示すグラフである。
【図１４９】細胞ベースの均一アッセイにおける、精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）と組み合わせた異なるＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ（Ｘ）−プロテインＧバリアント及びＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９−ＥＧＦＲ（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）を発現する細胞により促進される補完によるパニツムマブ用量反応の定量化を示すグラフである。
【図１５０】溶液ベースの均一アッセイにおける、Ｈａｌｏｔａｇ−ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１（配列番号２６８）及びＨａｌｏＴａｇ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（配列番号１５０）により化学的に標識されたペア抗体を使用したヒトＩＬ−１ベータの定量化を示すグラフである。ＮａｎｏＴｒｉｐにより化学的に標識されたペア抗体を使用したヒトトロポニンのリアルタイム結合動態である。
【図１５１】溶液ベースの均一アッセイにおける、Ｈａｌｏｔａｇ−ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１（配列番号２６８）及びＨａｌｏＴａｇ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（配列番号１５０）により化学的に標識されたペア抗体を使用したヒトトロポニンの定量化のためのリアルタイム結合動態を示すグラフである。
【図１５２】タンパク質を特定の細胞内区画に誘導する原因となる特殊なペプチドが、ＬｇＢｉＴ−ＨａｌｏＴａｇに融合された。（Ａ）ＬｇＢｉＴ−膜センサー：ＬｇＢｉＴは緑色であり、核は青色である。（Ｂ）ＬｇＢｉＴ−核センサー：ＬｇＢｉＴは緑色であり、核は青色である。（Ｃ）ＬｇＢｉＴ−ミトコンドリアセンサー：ＬｇＢｉＴは緑色であり、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒは赤色であり、核は青色である。（Ｄ）ＬｇＢｉＴ−ＥＲセンサー：ＬｇＢｉＴは緑色であり、ＥＲマーカーは赤色であり、核は青色である。
【図１５３】転移アッセイ。ＰＯＩは、ＨｉＢｉＴで内因的にタグ付けされる。刺激に際してＰＯＩは、異なる細胞内区画、例えば、核に転移する。ＬｇＢｉＴ−核センサーは、ＨｉＢｉＴがＬｇＢｉＴに接触し、発光シグナルをもたらすため、この転移事象を検出するために使用され得る。
【図１５４】野生型ＬｇＢｉＴセンサーを用いる膜転移アッセイである。ＰＫＣα−ＨｉＢｉＴ細胞株が、野生型ＬｇＢｉＴ−膜センサーで形質移入された。ＬｇＢｉＴとＨｉＢｉＴとの間の強い相互作用により、自発的な補完が発生し、これによりＰＭＡ刺激に対する反応をもたらさない。
【図１５５】ＬｇＢｉＴ*センサーを用いる膜転移アッセイ。ＰＫＣα−ＨｉＢｉＴ細胞株が、ＬｇＢｉＴ*−膜センサーをコードする異なる量のＤＮＡで形質移入された。ＰＭＡ処理に際して、ＰＫＣα−ＨｉＢｉＴは形質膜に移動し、そこでＬｇＢｉＴ＊−膜センサーは留まる。ＨｉＢｉＴとＬｇＢｉＴ*との間のアセンブリは、発光シグナルを生成し、シグナルは、膜上のＰＫＣα−ＨｉＢｉＴの量と比例する。アッセイは、感度が高く、かつ頑強である。ＰＭＡの希釈は、センサーの投入量に関係なく同程度のＥＣ50（ＥＣ50＝２．０ｎＭ）をもたらした。応答倍率は、センサーの投入量に応じて、１２倍〜１９倍の間で異なる。
【図１５６】ＬｇＢｉＴ*センサーを用いる核転移アッセイ。ｐ６５−ＨｉＢｉＴ細胞株は、ＬｇＢｉＴ*核センサーをコードするＤＮＡで形質移入された。ＴＮＦαの添加は、ＬｇＢｉＴ*核センサーが局在する核にｐ６５をリクルートする。ＨｉＢｉＴとＬｇＢｉＴ*との間で補完が起こり、光が生成される。シグナル強度は、核におけるｐ６５の濃度を反映する。ＴＮＦαの希釈は、４の応答倍率を有する０．７ｎｇ／ｍＬのＥＣ50をもたらした。リアルタイム測定により、刺激に際して核においてｐ６５が最大蓄積に到達するのに３０分必要とすることが示された。
【図１５７Ａ】ＬｇＢｉＴ変異体のＨｉＢｉＴとの親和性及びＢｍａｘを示す（Ａ）グラフである。
【図１５７Ｂ】ＬｇＢｉＴ変異体のＨｉＢｉＴとの親和性及びＢｍａｘを示す（Ｂ）表である。
【図１５８】ＬｇＢｉＴ変異体溶解物のＨｉＢｉＴに対する親和性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
定義
本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法及び材料を、本明細書に記載される実施形態の実施または試験に使用することができるが、幾つかの好ましい方法、組成物、装置、及び材料が本明細書に記載される。しかしながら、本発明の材料及び方法を記載するにあたり、本発明は、本明細書に記載される特定の分子、組成物、方法論、またはプロトコールに限定されないことを理解すべきである。なぜならば、これらは定型的な実験及び最適化により変更され得るためである。また本明細書において使用される用語は、特定のバージョンまたは実施形態の記載のみを目的としており、本明細書に記載される実施形態の範囲を限定することを意図するものではないことを理解すべきである。
【００５７】
特に定義しない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。しかしながら、矛盾する場合、定義を含めた本発明の明細書が優先する。従って、本明細書に記載される実施形態に関連して以下の定義が適用される。
【００５８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈で明確に指示されない限り、複数形の参照を含む。従って、例えば、「ペプチド」についての言及は、１つ以上のペプチド及び当業者に公知のその等価物についての言及となる、などである。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「及び／または」という用語は、列挙された品目のいずれか１つずつを含め、列挙される品目のあらゆる組み合わせを含む。例えば、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、及びＡＢＣを包含し、これらの各々は、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」という記載により個別に記載されたとみなされる。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語及びその言語的変化形は、記載された特徴（複数可）、構成要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などが存在し、追加の特徴（複数可）、構成要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などの存在が除外されないことを意味する。逆に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語及びその言語的変化形は、記載された特徴（複数可）、構成要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などが存在することを意味し、通常付随する不純物を除いて、記載されていない特徴（複数可）、構成要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などはいずれも除外される。「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という表現は、記載された特徴（複数可）、構成要素（複数可）、方法ステップ（複数可）など、及び組成物、システム、または方法の基本的な性質に実質的に影響を及ぼさない任意の追加の特徴（複数可）、構成要素（複数可）、方法ステップ（複数可）などを意味する。本明細書における多数の実施形態が、オープンランゲージ「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用して記載される。かかる実施形態は、複数のクローズドな「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」及び／または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」実施形態を包含し、代替的に、これらはかかるランゲージを使用して特許請求または記載され得る。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「実質的に」という用語は、記載された特性、パラメータ、及び／または値が正確に達成される必要はなく、例えば、許容誤差、測定誤差、測定精度限界、及び当業者に公知の他の要因を含む偏差または変動が、特徴が提供することを意図した効果を排除しない量で起こり得ることを意味する。実質的に存在しない特性または特徴（例えば、実質的に非発光性）とは、ノイズの範囲内であるか、バックグラウンドより低いか、使用されているアッセイの検出能力未満であるか、または顕著な特性（例えば、生物発光タンパク質または生物発光複合体の発光強度）のほんの小数（例えば、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、０．００１％未満、０．００００１％未満、０．０００００１％未満、０．００００００１％未満）である、特性または特徴であり得る。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「生物発光」という用語は、酵素、タンパク質、タンパク質複合体、または他の生体分子（例えば、生物発光複合体）により触媒されるか、または可能にされる化学反応による光の生成及び放出を指す。典型的な実施形態では、生物発光主体（例えば、生物発光タンパク質または生物発光複合体）の基質が、当該生物発光主体によって不安定な形態に変換され、その後に当該基質が発光する。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「相補的」という用語は、２つ以上の構造要素（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸、低分子など）の、お互いにハイブリダイズするか、二量体化するか、または別様に複合体を形成することができるという特徴を指す。例えば、「相補的なペプチド及びポリペプチド」は、集合して、複合体を形成することができる。相補的な構成要素は、複合体（例えば、相互作用要素から）を形成するために、例えば、構成要素を補完に適した立体構造にするための補助（促進）、構成要素を補完に適した近位に配置するための補助（促進）、相補的な構成要素を共局在させるための補助（促進）、相補性のための相互作用エネルギーを低下させるための補助（促進）、互いに対する不十分な親和性を克服するための補助（促進）などを必要とし得る。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「複合体」という用語は、直接的及び／または間接的に互いに接触している分子（例えば、ペプチド、ポリペプチドなど）の集合体または凝集体を指す。一態様では、「接触」またはより具体的には「直接的な接触」は、２つ以上の分子が十分に近接しており、その結果、ファンデルワールス力、水素結合、イオン性相互作用、及び疎水性相互作用などの非共有結合的な引力相互作用が分子の相互作用を占めることを意味する。かかる態様では、分子（例えば、ペプチド及びポリペプチド）の複合体は、当該複合体が（例えば、その構成分子の非凝集状態または非複合体化状態と比較して）熱力学的に好まれるようなアッセイ条件下で形成される。本明細書で使用する場合、「複合体」という用語は、別途記載のない限り、２つ以上の分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせ）の集合体を指す。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「非発光性」という用語は、可視スペクトルにおける検出可能な量の光を（例えば、基質の存在下で）放出しないという特徴を示す実体（例えば、ペプチド、ポリペプチド、複合体、タンパク質など）を指す。例えば、実体は、所与のアッセイにおいて検出可能な発光を示さない場合に非発光性であると称され得る。本明細書で使用する場合、「非発光性」という用語は、「実質的に非発光性」という用語と同義である。幾つかの実施形態では、任意の発光が特定のアッセイに干渉するバックグラウンドを生じないほどに十分小さい場合、実体は「非発光性」であるとみなされる。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「非発光性ペプチド」及び「非発光性ポリペプチド」という用語は、標準条件（例えば、生理的条件、アッセイ条件など）下で典型的な機器（例えば、ルミノメーターなど）を用いて顕著なシグナル（例えば、発光複合体）と比較した場合に、（例えば、基質の存在下で）実質的に発光を示さないか、またはノイズより低い量（例えば、１００分の１、２００分の１、５００分の１、１×１０3分の１、１×１０4分の１、１×１０5分の１、１×１０6分の１、１×１０7分の１など）を示すペプチド及びポリペプチドを指す。幾つかの実施形態では、かかる非発光性ペプチド及びポリペプチドは、本明細書に記載される基準条件により集合し、生物発光複合体を形成する。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「相互作用要素」という用語は、非発光性要素を集合させて、生物発光複合体を形成するのを補助または促進する部分を指す。幾つかの実施形態では、１対の相互作用要素（「相互作用対」とも称される）は、１対の非発光性要素（例えば、非発光性ペプチド）に付着され、２つの相互作用要素間の引力相互作用により生物発光複合体の形成が促進される。しかしながら、本発明は、かかる機序に限定されるものではなく、当該機序の理解は本発明を実施するのに必要とされない。相互作用要素は、任意の好適な機序（例えば、非発光性要素を近接させる、非発光性要素を安定な相互作用に適した立体構造にする、複合体形成のための活性化エネルギーを減少させる、それらの組み合わせなど）により生物発光複合体の形成を促進し得る。相互作用要素は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、低分子、補因子、核酸、脂質、炭水化物、抗体などであり得る。相互作用対は、２つの同一の相互作用要素（すなわち、同種の対）または２つの異なる相互作用要素（すなわち、異種の対）からなってもよい。異種の対の場合、相互作用要素は、同一種類の部分（例えば、ポリペプチド）であってもよく、または２つの異なる種類の部分（例えば、ポリペプチド及び低分子）であってもよい。相互作用対による複合体形成が調査される幾つかの実施形態では、相互作用対は、「標的対」または「関心対象の対」と称され得、個々の相互作用要素は、「標的要素」（例えば、「標的ペプチド」、「標的ポリペプチド」など）または「関心対象の要素」（例えば、「関心対象のペプチド」、「関心対象のポリペプチド」など）と称される。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「低親和性」という用語は、生理的条件もしくはアッセイ条件よりかなり高い（例えば、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍以上）濃度であるか、または付着された要素（例えば、相互作用要素）の第２の複合体の形成による促進がある場合を除き、実体間の顕著な複合体形成をもたらすには弱すぎる２つ以上（例えば、３つ）の実体間の分子間相互作用を記述する。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「高親和性」という用語は、生理的条件またはアッセイ条件下で、付着された要素（例えば、相互作用要素）の第２の複合体の形成による促進なしに、検出可能な複合体形成を引き起こすのに十分な強さである２つ以上（例えば、３つ）の実体間の分子間相互作用を記述する。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「共局在要素」という用語は、非発光性要素の共局在を促進する部分を指す。幾つかの実施形態では、１組の非発光性要素が、非発光性要素が十分な濃度で共局在する場合に複合体を形成するのに十分な親和性を有する。かかる実施形態では、１組（例えば、１対）の共局在要素（「共局在対とも称される」）は、１対の非発光性要素（例えば、非発光性ペプチド）に付着され、２つの共局在要素の（例えば、細胞内区画内、組織内、溶液内、固体マトリックス支持体上などでの）共局在は、非発光性要素の共局在を促進し、これにより、生物発光複合体の形成を促進する。しかしながら、本発明は、かかる機序に限定されるものではなく、当該機序の理解は本発明を実施するのに必要とされない。幾つかの実施形態では、発光複合体に自己集合する非発光性要素の能力により、共局在要素は、複合体形成を促進するために直接的に相互作用する必要がない。共局在要素は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、低分子、補因子、核酸、脂質、炭水化物、抗体などであり得る。共局在対は、２つの同一の共局在要素（すなわち、同種の対）または２つの異なる共局在要素（すなわち、異種の対）からなってもよい。異種の対の場合、共局在要素は、同一種類の部分（例えば、ポリペプチド）であってもよく、または２つの異なる種類の部分（例えば、ポリペプチド及び低分子）であってもよい。共局在対の局在化が調査される幾つかの実施形態では、共局在対は、「標的対」または「関心対象の対」と称され得、個々の共局在要素は、「標的要素」（例えば、「標的ペプチド」、「標的ポリペプチド」など）または「関心対象の要素」（例えば、「関心対象のペプチド」、「関心対象のポリペプチド」など）と称される。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「セレンテラジン」という用語は、天然に存在する（「天然の」）セレンテラジンを指す。本明細書で使用する場合、「セレンテラジン類似体」または「セレンテラジン誘導体」という用語は、ＷＯ２００３／０４０１００；米国特許出願第１２／０５６０７３号（段落［００８６］）；米国特許第８，６６９，１０３号；ＷＯ２０１２／０６１５２９、米国特許公開第２０１７／０２３３７８９号、及び米国特許公開第２０１８／００３００５９号（これらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において開示されるものに加えて、フリマジン、セレンテラジン−ｎ、セレンテラジン−ｆ、セレンテラジン−ｈ、セレンテラジン−ｈｃｐ、セレンテラジン−ｃｐ、セレンテラジン−ｃ、セレンテラジン−ｅ、セレンテラジン−ｆｃｐ、ビスデオキシセレンテラジン（「セレンテラジン−ｈｈ」）、セレンテラジン−ｉ、セレンテラジン−ｉｃｐ、セレンテラジン−ｖ、及び２−メチルセレンテラジンが含まれる、セレンテラジンの合成類似体（例えば、誘導体またはバリアント）及び天然類似体を指す。幾つかの実施形態では、セレンテラジン類似体としては、例えば、米国特許出願第１２／０５６０７３号；米国公開第２０１２／０７０７８４９号；米国公開第２０１４／００９９６５４（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるものなどのプロ基質が挙げられる。
【００７２】
本明細書で使用する場合、「既存のタンパク質」という用語は、特定の事象または日付の前に物理的に存在していたアミノ酸配列を指す。「既存のタンパク質の断片でないペプチド」は、当該ペプチドの設計及び／または合成の前に物理的に存在していた（例えば、合成のまたは天然に存在する）タンパク質の断片または部分配列でない短いアミノ酸鎖である。
【００７３】
本明細書で使用する場合、「断片」という用語は、より大きな実体の全体（例えば、タンパク質、ポリペプチド、酵素など）の切断もしくは「断片化」から生じるペプチドもしくはポリペプチド、またはそれらと同一の配列を有するように調製されたペプチドもしくはポリペプチドを指す。従って、断片は、実体の全体（例えば、タンパク質、ポリペプチド、酵素など）の部分配列であり、当該実体の全体から作製及び／または設計される。既存のタンパク質全体の部分配列ではないペプチドまたはポリペプチドは、断片ではない（例えば、既存のタンパク質の断片ではない）。「既存の生物発光タンパク質の断片でない」ペプチドまたはポリペプチドは、（１）当該ペプチドまたはポリペプチドの設計及び／また合成の前に物理的に存在しており、（２）高い生物発光活性を示すタンパク質（例えば、天然または合成）の部分配列ではないアミノ酸鎖である。
【００７４】
本明細書で使用する場合、「部分配列」という用語は、別のより大きなペプチドまたはポリペプチドの一部との１００％の配列同一性を有するペプチドまたはポリペプチドを指す。部分配列は、より長いアミノ酸鎖の一部と完全に配列が一致する。
【００７５】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及びアミノ酸類似体を指し、特に明記しない限り、全てがＤ及びＬ立体異性体である（それらの構造がかかる立体異性体形態を可能にする場合）。
【００７６】
天然アミノ酸としては、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、及びバリン（ＶａｌまたはＶ）が挙げられる。
【００７７】
非天然アミノ酸としては、ペンタフルオロフェニルアラニン（「Ｚ」）、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、ナフチルアラニン（「ｎａｐｈ」）、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、三級ブチルグリシン（「ｔＢｕＧ」）、２，４−ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン（「ｈＰｒｏ」または「ｈｏｍｏＰ」）、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン（「３Ｈｙｐ」）、４−ヒドロキシプロリン（「４Ｈｙｐ」）、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルアラニン（「ＭｅＡｌａ」または「Ｎｉｍｅ」）、Ｎ−メチルグリシンが含まれるＮ−アルキルグリシン（「ＮＡＧ」）、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシンが含まれるＮ−アルキルペンチルグリシン（「ＮＡＰＧ」）、Ｎ−メチルバリン、ナフチルアラニン、ノルバリン（「Ｎｏｒｖａｌ」）、ノルロイシン（「Ｎｏｒｌｅｕ」）、オクチルグリシン（「ＯｃｔＧ」）、オルニチン（「Ｏｒｎ」）、ペンチルグリシン（「ｐＧ」または「ＰＧｌｙ」）、ピペコリン酸、チオプロリン（「ＴｈｉｏＰ」または「ｔＰｒｏ」）、ホモリジン（「ｈＬｙｓ」）、及びホモアルギニン（「ｈＡｒｇ」）が挙げられるが、これらに限定されない。非天然の反応性アミノ酸は、例えば、Ｂｏｕｔｕｒｅｉｒａ，Ｏ．ａｎｄ  Ｇ．Ｊ．Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ（２０１５）「Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．」  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  １１５（５）：２１７４−２１９５（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００７８】
「アミノ酸類似体」という用語は、Ｃ末端カルボキシ基、Ｎ末端アミノ基、及び側鎖生理活性基のうちの１つ以上が可逆的もしくは不可逆的に、化学的にブロックされているか、または別様に別の生理活性基に修飾されている天然または非天然アミノ酸を指す。例えば、アスパラギン酸−（β−メチルエステル）は、アスパラギン酸のアミノ酸類似体であり、Ｎ−エチルグリシンは、グリシンのアミノ酸類似体であり、アラニンカルボキサミドは、アラニンのアミノ酸類似体である。他のアミノ酸類似体としては、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システイン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システインスルホキシド、及びＳ−（カルボキシメチル）−システインスルホンが挙げられる。アミノ酸類似体は、様々な保護基を有するアミノ酸を含み得る（Ｉｓｉｄｒｏ−Ｌｌｏｂｅｔ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．「Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ−Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ．」  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １０９（６）：２４５５−２５０４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
【００７９】
本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語は、ペプチドアミド結合（−−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−−）により主鎖を介して連結された２つ以上のアミノ酸のポリマー化合物を指す。「ペプチド」という用語は、通常、短いアミノ酸ポリマー（例えば、３０個より少ないアミノ酸を有する鎖）を指し、一方、「ポリペプチド」という用語は、通常、より長いアミノ酸ポリマー（例えば、３０個超のアミノ酸を有する鎖）を指す。
【００８０】
本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、「ジペプチド」という用語は、２つのペプチドセグメント（例えば、直接的または間接的に融合／付着された（例えば、リンカー（例えば、ペプチドリンカー（例えば、１〜１０個のアミノ酸（例えば、単一のグリシン）））を介して）、ルシフェラーゼの２つのβ鎖に相当する（例えば、ＯｇＬｕｃルシフェラーゼポリペプチドのβ９及びβ１０鎖に相当する「β９／β１０ジペプチド」））を含むペプチドまたは小さなポリペプチド（例えば、７０個未満のアミノ酸、６０個未満のアミノ酸、５０個未満のアミノ酸など）を指す。
【００８１】
本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、「トリペプチド」という用語は、３つのペプチドセグメント（例えば、直接的または間接的に融合／付着された（例えば、リンカー（例えば、ペプチドリンカー（例えば、１〜１０個のアミノ酸（例えば、単一のグリシン）））を介して）、ルシフェラーゼの３つのβ鎖に相当する（例えば、ＯｇＬｕｃルシフェラーゼポリペプチドのβ８〜１０鎖に相当する「β８〜１０トリペプチド」）を含むペプチドまたは小さなポリペプチド（例えば、１００個未満のアミノ酸、９０個未満のアミノ酸、８０個未満のアミノ酸など）を指す。
【００８２】
本明細書で使用する場合、「ペプチド模倣体」及び「ペプチド類似物」という用語は、タンパク質またはペプチドに由来する配列を模倣するペプチド様分子またはポリペプチド様分子を指す。ペプチド模倣体は、アミノ酸類似体、ペプトイドアミノ酸、及び／または非アミノ酸構成要素を、それらのみ、またはアミノ酸（例えば、天然または非天然アミノ酸）との組み合わせのいずれかで含有し得る。ペプチド模倣体の例としては、化学修飾ペプチド／ポリペプチド、ペプトイド（側鎖がα炭素ではなくペプチド骨格の窒素原子に付加されている）、βペプチド（アミノ基がα炭素ではなくβ炭素に結合されている）などが挙げられる。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「ペプトイド」という用語は、α炭素ではなくペプチド骨格の窒素原子が側鎖で官能化されているペプチド模倣体のクラスを指す。
【００８４】
本明細書で使用する場合、「人工」という用語は、人によって設計または調製され、かつ天然に存在しない組成物または系を指す。例えば、人工ペプチド、人工ペプトイド、または人工核酸は、非天然配列を含むもの（例えば、天然に存在するタンパク質またはその断片との１００％の同一性を有さないペプチド）である。
【００８５】
本明細書で使用する場合、「保存的」アミノ酸置換は、ペプチドまたはポリペプチドにおけるアミノ酸の、同様の化学的性質、例えば、サイズまたは電荷を有する別のアミノ酸との置換を指す。本開示の目的では、以下の８つの群の各々が、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）及びグリシン（Ｇ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、及びバリン（Ｖ）、
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）、
７）セリン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ）、ならびに
８）システイン（Ｃ）及びメチオニン（Ｍ）。
【００８６】
天然に存在する残基は、共通する側鎖の性質に基づいて、例えば、以下のクラスに分類され得る：極性正電荷（または塩基性）（ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、及びアルギニン（Ｒ））、極性負電荷（または酸性）（アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ））、極性中性（セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ））、非極性脂肪族（アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ））、非極性芳香族（フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ））、プロリン及びグリシン、ならびにシステイン。本明細書で使用する場合、「半保存的」アミノ酸置換は、ペプチドまたはポリペプチドにおけるアミノ酸の、同一クラス内の別のアミノ酸との置換を指す。
【００８７】
幾つかの実施形態では、特に明記しない限り、保存的または半保存的アミノ酸置換は、天然の残基と同様の化学的性質を有する天然に存在しないアミノ酸残基も包含し得る。これらの非天然の残基は、通常、生物学的系における合成ではなく化学的なペプチド合成によって組み込まれる。これらとしては、ペプチド模倣体、及び他の反転形態または逆形態のアミノ酸部分が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書における実施形態は、幾つかの実施形態では、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及び／またはアミノ酸類似体に限定され得る。
【００８８】
非保存的置換は、１つのクラスのメンバーの、別のクラスのメンバーとの交換を伴い得る。
【００８９】
本明細書で使用する場合、「配列同一性」という用語は、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸など）が同一の単量体サブユニットの配列組成を有する程度を指す。「配列類似性」という用語は、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸など）が類似のポリマー配列を有する程度を指す。例えば、類似のアミノ酸とは、同一の生物物理学的特性を共有するものであり、例えば、酸性（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び非荷電極性（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）ファミリーに分類され得る。「配列同一性パーセント」（または「配列類似性パーセント」）は、（１）２つの最適にアラインメントした配列を比較ウインドウ（例えば、より長い配列の長さ、より短い配列の長さ、指定されたウインドウ）にわたって比較することと、（２）同一の（類似の）単量体を含む位置（例えば、同一のアミノ酸が両方の配列に見出される位置、類似のアミノ酸が両方の配列に見出される位置）の数を決定して、一致した位置の数を得ることと、（３）一致した位置の数を比較ウインドウ（例えば、より長い配列の長さ、より短い配列の長さ、指定されたウインドウ）内の位置の総数で割ることと、（４）結果に１００を乗じて配列同一性パーセントまたは配列類似性パーセントを得ることと、により算出される。例えば、ペプチドＡ及びペプチドＢが両方とも２０アミノ酸長であり、１つの位置を除いて同一のアミノ酸を有する場合、ペプチドＡ及びペプチドＢは９５％の配列同一性を有する。同一でない位置でのアミノ酸が同一の生物物理学的特性（例えば、両方が酸性である）を共有する場合、ペプチドＡ及びペプチドＢは１００％の配列類似性を有することとなる。別の例として、ペプチドＣが２０アミノ酸長であり、ペプチドＤが１５アミノ酸長であり、ペプチドＤにおける１５アミノ酸のうち１４アミノ酸がペプチドＣの一部のアミノ酸と同一である場合、ペプチドＣ及びペプチドＤは７０％の配列同一性を有するが、ペプチドＤはペプチドＣの最適な比較ウインドウに対して９３．３％の配列同一性を有する。本明細書における「配列同一性パーセント」（または「配列類似性パーセント」）を算出する目的上、アラインメントされた配列における任意のギャップはその位置でのミスマッチとして処理される。
【００９０】
参照配列番号との特定の配列同一性パーセントまたは類似性（例えば、少なくとも７０％）を有すると本明細書に記載されるいずれのペプチド／ポリペプチドも、その参照配列に対して最大数の置換（または末端欠失）を有すると表現され得る。例えば、配列番号Ｚ（例えば、１００個のアミノ酸）との少なくともＹ％の配列同一性（例えば、９０％）を有する配列は、配列番号Ｚと比較してＸまでの置換（例えば、１０個）を有し得、従って、配列番号Ｚと比較してＸ（例えば、１０個）以下の置換を有するとも表現され得る。
【００９１】
本明細書で使用する場合、「野生型」という用語は、遺伝子または遺伝子産物（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなど）であって、天然に存在する供給源から単離されたその遺伝子または遺伝子産物の特性（例えば、配列）を有し、集団において最も頻繁に観察される当該遺伝子または遺伝子産物を指す。対照的に、「変異体」または「バリアント」という用語は、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に配列における改変を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。「天然に存在するバリアント」は、天然に存在するが、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に改変された配列を有する遺伝子または遺伝子産物であることに注意すべきであり、それらは最も頻繁に出現する配列でない。「人工バリアント」は、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に改変された配列を有し、天然に存在しない遺伝子または遺伝子産物である。バリアント遺伝子または遺伝子産物は、自然界に存在するが、遺伝子または遺伝子産物の最もよく見られるバリアントでない天然に存在する配列、またはヒトもしくは実験的介入により作製された「合成物」であり得る。
【００９２】
本明細書で使用する場合、「生理的条件」という用語は、生細胞と適合可能な任意の条件、例えば、生細胞と適合可能な温度、ｐＨ、塩分、化学組成の主に水性である条件などを包含する。
【００９３】
本明細書で使用する場合、「試料」という用語は最も広義に使用される。ある意味では、この用語は、任意の供給源から得られる検体または培養液、ならびに生物試料及び環境試料が含まれることを意味する。生体試料は、動物（ヒトを含む）から取得され得、液体、固体、組織、及び気体を包含する。生体試料には、血漿、血清などの血液製剤が含まれる。試料は、細胞溶解物、または本明細書に記載される酵素、ペプチド、及び／またはポリペプチドの精製された形態も指し得る。細胞溶解物には、溶解剤により溶解された細胞、またはウサギ網状赤血球もしくはコムギ胚芽溶解物などの溶解物が含まれ得る。試料には、無細胞発現系も含まれ得る。環境試料には、表面物質、土壌、水、結晶、及び工業試料などの環境物質が含まれる。しかしながら、かかる例は、本発明に適用可能な試料の種類を限定すると解釈されるべきではない。
【００９４】
本明細書で使用する場合、「融合物」、「融合ポリペプチド」、及び「融合タンパク質」という用語は、第１の関心対象のタンパク質またはポリペプチド（例えば、実質的に非発光性のペプチド）であって、第２の異なるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質（例えば、相互作用要素）に連結された当該第１の関心対象のタンパク質またはポリペプチドを含有するキメラタンパク質を指す。
【００９５】
本明細書で使用する場合、「コンジュゲートされた」及び「コンジュゲーション」という用語は、（例えば、合成後及び／または合成製造中の）２つの分子実体の共有結合を指す。ペプチドまたは低分子タグのタンパク質または低分子への化学的（例えば、「化学的に」コンジュゲートされる）または酵素的な付着は、コンジュゲーションの例である。
【００９６】
「結合部分」という用語は、異なるエピトープまたは抗原結合ドメインと独立して抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインを指す。結合部分は、抗体、抗体断片、標的リガンドに結合する受容体ドメイン、免疫グロブリンに結合するタンパク質（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、プロテインＭ）、免疫グロブリンに結合するタンパク質（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、プロテインＭ）の結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、ペプチド核酸、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、アフィマー、精製されたタンパク質（分析物自体または分析物に結合するタンパク質のいずれか）、及びタンパク質の分析物結合ドメイン（複数可）などであり得る。表Ａは、本明細書における方法、システム、及びアッセイ（例えば、免疫測定法）において単一でまたは様々な組み合わせで使用され得る例示的な結合部分のリストを提供する。
表Ａ：例示的な結合部分
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【００９７】
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、抗体分子全体またはその断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、及びＦ（ａｂ´）2、可変軽鎖、可変重鎖、Ｆｖなどの断片）を指し、当該抗体分子全体またはその断片は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体または組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などであり得る。本明細書で使用する場合、抗体または他の実体が、抗原またはエピトープと「特異的に結合」またはそれを「特異的に認識」する場合、当該抗体または他の実体は、タンパク質及び／または高分子の複雑な混合物中の当該抗原を優先的に認識し、当該抗原またはエピトープを呈さない他の実体と比べて実質的により高い親和性で当該抗原またはエピトープに結合する。このことに関して、「実質的により高い親和性」とは、所望のアッセイまたは測定装置を使用して複数の実体から区別される抗原またはエピトープの検出を可能にするのに十分なほど高い親和性を意味する。典型的には、それは、少なくとも１０7Ｍ-1（例えば、１０7Ｍ-1未満、１０8Ｍ-1未満、１０9Ｍ-1未満、１０10Ｍ-1未満、１０11Ｍ-1未満、１０12Ｍ-1未満、１０13Ｍ-1未満など）の結合定数（Ｋａ）を有する結合親和性を意味する。ある特定のかかる実施形態では、抗体は、異なる抗原がその特定のエピトープを含む限り、当該異なる抗原と結合することができる。ある特定の例では、例えば、異なる種由来の相同タンパク質は、同一のエピトープを含み得る。
【００９８】
本明細書で使用する場合、「抗体断片」という用語は、抗原結合領域または可変領域の少なくとも一部を含む、全長抗体の一部を指す。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、可変軽鎖、可変重鎖、ダイアボディ、及びインタクトな抗体の可変領域の少なくとも一部を保持する他の抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。ある特定の実施形態では、抗体断片は、組換えＤＮＡ技術または化学的ポリペプチド合成により生成されたインタクトな抗体の酵素または化学的切断（例えば、抗体のパパイン消化及びペプシン消化）により生成される。例えば、「Ｆａｂ」断片は、１つの軽鎖ならびに１つの重鎖のＣH1及び可変領域を含む。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。「Ｆａｂ´」断片は、１つの軽鎖及び、ＣH1ドメインとＣH2ドメインとの間に延在する追加の定常領域を含む１つの重鎖を含む。鎖間のジスルフィド結合が、Ｆａｂ´断片の２つの重鎖間で形成されて、「Ｆ（ａｂ´）2」分子が形成され得る。「Ｆｖ」断片は、重鎖及び軽鎖の両方由来の可変領域を含むが、定常領域を欠く。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片は、抗原結合領域を有する単一ポリペプチド鎖を形成するための可動性リンカーによって連結された重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。例示的な一本鎖抗体は、ＷＯ８８／０１６４９ならびに米国特許第４，９４６，７７８号及び同５，２６０，２０３号（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。ある特定の例では、単一の可変領域（例えば、重鎖可変領域または軽鎖可変領域）は、抗原を認識し、それに結合する能力を有し得る。他の抗体断片が当業者により理解されるであろう。
【００９９】
本明細書で使用する場合、「ペプチドタグ」という用語は、別の実体（例えば、関心対象のタンパク質、関心対象の分子、相互作用要素、共局在要素など）に付着（例えば、合成後または合成中に）または融合され得るペプチドを指す。ペプチドタグは、別の実体に付着されても、されなくてもよい。本明細書で使用する場合、ペプチドタグは、典型的には、適切な条件下で別のペプチドタグ及びポリペプチドと生物発光複合体を形成することができる。ペプチドタグが別の実体に付着される実施形態では、ペプチドタグは、別の分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸、他の低分子、または他の高分子）に化学的にコンジュゲートされるか、別の分子の一部となるように化学合成されるか、または別のペプチドもしくはポリペプチド分子に遺伝子融合される、などである。
【０１００】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド構成要素」という用語は、「生物発光複合体のポリペプチド構成要素」という用語と同義的に使用される。本明細書で使用する場合、ポリペプチド構成要素は、典型的には、適切な条件下で１対のペプチドタグと生物発光複合体を形成することができる。
【０１０１】
本明細書で使用する場合、「Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ」（「ＯｇＬｕｃ」）という用語は、深海エビであるＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ  ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓにより生成されるか、またはそれに由来するルシフェラーゼとの顕著な配列同一性、構造的保存、及び／またはそれらの機能活性を有する発光ポリペプチドを指す。特に、ＯｇＬｕｃポリペプチドは、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼタンパク質複合体の成熟１９ｋＤａサブユニット（例えば、シグナル配列を有さない）、例えば、１０個のβ鎖（β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、β８、β９、β１０）を含む配列番号１（ＷＴ  ＯｇＬｕｃ）及び３（ＮａｎｏＬｕｃ）との顕著な配列同一性、構造的保存、及び／またはそれの機能活性を有する発光ポリペプチドを指し、セレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体などの基質を利用して、発光を生成する。
【０１０２】
本明細書で使用する場合、「β９様ペプチド」という用語は、ＯｇＬｕｃポリペプチドのβ（ベータ）９鎖との顕著な配列同一性、構造的保存、及び／またはそれの機能活性を含むペプチド（またはペプチドタグ）を指す。特に、β９様ペプチドは、β９鎖を欠くＯｇＬｕｃポリペプチドを構造的に補完して、β９様ペプチドの非存在下でのＯｇＬｕｃポリペプチドと比較して増強された複合体の発光をもたらすことができるペプチドである。他の「βＸ様ペプチド」は、同様に命名され得る（例えば、β１様、β２様、β３様、β４様、β５様、β６様、β７様、β８様、β９様）。
【０１０３】
本明細書で使用する場合、「β１０様ペプチド」という用語は、ＯｇＬｕｃポリペプチドのβ（ベータ）１０鎖との顕著な配列同一性、構造的保存、及び／またはそれの機能活性を含むペプチド（またはペプチドタグ）を指す。特に、β１０様ペプチドは、β１０鎖を欠くＯｇＬｕｃポリペプチドを構造的に補完して、β１０様ペプチドの非存在下でのＯｇＬｕｃポリペプチドと比較して増強された複合体の発光をもたらすことができるペプチドである。他の「βＸ様ペプチド」は、同様に命名され得る（例えば、β１様、β２様、β３様、β４様、β５様、β６様、β７様、β８様、β９様）。
【０１０４】
本明細書で使用する場合、「β1〜8様ポリペプチド」という用語は、ＯｇＬｕｃポリペプチドのβ（ベータ）１〜８鎖に対する配列類似性及び構造類似性を有するが、β（ベータ）９及び１０鎖を欠くポリペプチドを指す。他の「βY〜Z様ポリペプチド」は、同様に命名され得る（例えば、β1〜4様ポリペプチド、β2〜8様ポリペプチド、β5〜10様ポリペプチドなど）。
【０１０５】
本明細書で使用する場合、「ＮＡＮＯＬＵＣ」という用語は、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより商用に製造され、配列番号３に相当する人工ルシフェラーゼまたは生物発光性ポリペプチドを指す。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、「ＬｇＢｉＴ」という用語は、例えば、生物発光複合体を形成するための２分子補完において有用であり、配列番号１１に相当するβ1〜9様ポリペプチドに相当するポリペプチドを指す。
【０１０７】
本明細書で使用する場合、「ＳｍＢｉＴ」という用語は、例えば、生物発光複合体を形成するための２分子補完において有用であるが、ＬｇＢｉＴに対する低親和性を有し（例えば、複合体形成のために促進を必要とする）、配列番号１３に相当するβ10様ペプチドに相当するペプチドを指す。
【０１０８】
本明細書で使用する場合、「ＨｉＢｉＴ」という用語は、例えば、生物発光複合体を形成するための２分子補完において有用であるが、ＬｇＢｉＴに対する低親和性を有し（例えば、複合体形成のために促進を必要とする）、配列番号１５に相当するβ10様ペプチドに相当するペプチドを指す。ＨｉＢｉＴは、互換的に使用され得る用語である「ＳｍＨｉＴｒｉｐ１０」（配列番号２５）及び「ｐｅｐ８６」（ＳｍＴｒｉｐ１０、ｐｅｐ８６などとも言う）と同じ配列を有する。
【０１０９】
本明細書で使用する場合、「ＬｇＴｒｉｐ」という用語は、配列番号１７に相当し、例えば、生物発光複合体を形成するためのβ9様及びβ10様ペプチドとの３分子補完または生物発光複合体を形成するためのβ9〜10様ジペプチドとの２分子補完において有用であるβ1〜8様ポリペプチドに相当するポリペプチドを指す。ＬｇＴｒｉｐバリアントとしては、以下が挙げられる：ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（Ｈｉｓタグあり：配列番号３１、Ｈｉｓタグなし：配列番号３０４）及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（Ｈｉｓタグあり：配列番号５１、Ｈｉｓタグなし：配列番号３０２）。
【０１１０】
本明細書で使用する場合、「ＳｍＴｒｉｐ１０」は、例えば、生物発光複合体を形成するための３分子補完において有用であるβ10様ペプチドに相当するペプチドを指す。
【０１１１】
本明細書で使用する場合、「ＳｍＴｒｉｐ９」は、例えば、生物発光複合体を形成するための３分子補完において有用であるβ9様ペプチドに相当するペプチドを指す。
【０１１２】
詳細な説明
本明細書において、３分子または多分子生物発光複合体のアセンブリのための組成物及び方法が提供される。特に、生物発光複合体は、（例えば、別個のまたはジペプチドもしくはトリペプチドとして融合された）２つ以上のペプチドタグ及びポリペプチド構成要素が相互作用する際に形成される。
【０１１３】
本明細書の実施形態の開発の間に実施された実験は、２つの低分子ペプチド要素（例えば、β１０様ペプチド及びβ９様ペプチド）及び１つのポリペプチド要素（例えば、β1〜8様ポリペプチド）を含む３分子ルシフェラーゼが、集合して、発光複合体を形成することを実証する。本明細書の実施形態の開発の間に実施された実験は、ルシフェラーゼの５つまでの断片（またはかかる断片のバリアント）、例えば、ポリペプチド断片（またはそのバリアント）及び１つ以上のペプチド、ジペプチド、またはトリペプチド断片（またはかかる断片のバリアント）からの生物発光複合体の形成を更に実証する。
【０１１４】
市販のＮＡＮＯＬＵＣルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、１０個のβ（ベータ）鎖（β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、β８、β９、β１０）を含む。米国特許第９，７９７，８８９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、β1〜9様ポリペプチド及びβ10様ペプチドを含む補完システムの開発及び使用を記載している（米国特許第９，７９７，８８９号における実際のポリペプチド及びペプチド配列は、ＮＡＮＯＬＵＣ及び野生型天然ＯｇＬｕｃにおける対応する配列と異なる）。
【０１１５】
本明細書の実施形態の開発の間に実施された実験において、β1〜9様ポリペプチドは、β９鎖の除去により更に分割された。残存する部分（β1〜8様ポリペプチド）は、本明細書においてＬｇＴｒｉｐ  ２０９８と称される（配列番号１７、または配列番号：３１（Ｈｉｓタグを有する））。実験により、ＬｇＴｒｉｐならびにβ９鎖（ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５、配列番号２３）及びβ１０鎖（ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６；高親和性２分子システムに使用するために最適化されたβ１０配列であるＨｉＢｉＴ、配列番号１５）に対応する２つのペプチドから発光複合体を再構成することが試みられた。実験により、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて不十分に発現されたＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号１７、または配列番号：３１（Ｈｉｓタグを有する））は、不安定であり、表面失活に感受性であったことが実証された。本明細書における実施形態の開発の間に、増強された安定性、増強された発現、増強された活性、増強された分子相互作用などのうちの１つ以上（例えば、全て）を示し、β９鎖（例えば、β９様ペプチド（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５；配列番号２３））及びβ１０鎖（例えば、β１０様ペプチド（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６、ＨｉＢｉＴ、配列番号２５））に対応するペプチドと生物発光複合体を再構成するためのシステムに使用することができる人工バリアントを開発するための実験が実施された。本明細書の実施形態の開発の間に実施された実験は、例えば、ＬｇＴｒｉｐ  ３０９２（配列番号１９）またはＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）が、好適なβ９様ペプチド（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５、配列番号２３）及びβ１０様ペプチド（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６、ＨｉＢｉＴ、配列番号２５）と発光複合体を形成することができることを実証する。本明細書における実施形態の開発の間に、発光複合体の再構成について増強された特性を有する人工ポリペプチド構成要素（例えば、配列番号１９、２１、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、及びそれらの追加のバリアント）及びペプチドタグ（例えば、表１に列挙されるペプチド及びその追加のバリアント）を開発するための実験が実施された。
【０１１６】
本明細書の実施形態の開発の間に実施された更なる実験は、本明細書に記載されるＮＡＮＯＬＵＣベース、ＮａｎｏＢｉＴベース、及びＮａｎｏＴｒｉｐベースのシステム、ポリペプチド、及びペプチドに由来する、他のポリペプチド構成要素（例えば、β1〜5様、β1〜6様、β1〜7様など）、及び相補的なペプチド（例えば、β6様、β7様、β8様、β9様、β10様）、ジペプチド（例えば、β6〜7様、β7〜8様、β8〜9様、β9〜10様）、トリペプチド（例えば、β6〜8様、β7〜9様、β8〜10様）、ポリペプチド（例えば、β6〜10様、β6〜9様、β7〜10様など）の対応する組み合わせを含む構築物を使用して、ＮＡＮＯＬＵＣベースの生物発光複合体が形成され得ることを実証する。本明細書の実施形態の開発の間に実施された実験は、ルシフェラーゼ構築物（例えば、配列番号７８８または７８９との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれらの間の範囲）の配列同一性を含む全長ルシフェラーゼポリペプチド）の全長を集合的に含む２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つなど）のペプチド及びポリペプチド構成要素からの生物発光複合体の形成を実証する。
【０１１７】
幾つかの実施形態では、２つのペプチドタグ（例えば、β９様ペプチド（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）及びβ１０様ペプチド（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０））及びポリペプチド構成要素（例えば、β1〜8様ポリペプチド（例えば、ＬｇＴｒｉｐ））からの生物発光複合体のアセンブリのための組成物及び方法が本明細書において提供される。
【０１１８】
幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素（例えば、β1〜5様、β1〜6様、β1〜7様、またはβ1〜8様ポリペプチド）ならびに相補的なペプチド（複数可）（例えば、β6様、β7様、β8様、β9様、β10様）、ジペプチド（複数可）（例えば、β6〜7様、β7〜8様、β8〜9様、β9〜10様）、トリペプチド（例えば、β6〜8様、β7〜9様、β8〜10様）、及び／またはポリペプチド（複数可）（例えば、β6〜10様、β6〜9様、β7〜10様など）からの生物発光複合体のアセンブリのための組成物及び方法が本明細書において提供される。
【０１１９】
幾つかの実施形態では、ペプチドタグ及びポリペプチド構成要素のうちの１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つなど）は、既存のタンパク質の断片でない（例えば、既知のポリペプチド配列の構造的に相補的な部分配列でない）。しかしながら、他の実施形態では、ペプチドタグ及びポリペプチド構成要素のうちの１つ以上は、既知または既存のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの断片であり得る。ある特定の実施形態では、（生物発光複合体の）ポリペプチド構成要素の生物発光活性は、２つのペプチドタグによる構造的補完により増強される（例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１０2倍、１０3倍、１０4倍、１０5倍、１０6倍、またはそれ以上）。幾つかの実施形態では、例えば、分子相互作用（例えば、タンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ、タンパク質−ＲＮＡ相互作用、ＲＮＡ−ＤＮＡ、タンパク質−低分子、ＲＮＡ−低分子、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＰＮＡ−ＤＮＡ、ＰＮＡ−ＲＮＡなど）を検出及びモニタリングするための生物発光複合体に集合することができるペプチド（ペプチドタグ）／ポリペプチド要素が、本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様ペプチド（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）は、相互作用要素に融合されるか、または別様に連結される。特定の実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチド構成要素は、分子相互作用を検出／モニタリングする目的の場合、相互作用要素間の相互作用による促進なしでは完全な生物発光複合体を形成しない。しかしながら、相互作用要素のお互いに対する（または標的分子もしくは複合体に対する）相互作用（例えば、結合）により、生物発光複合体の形成が促進される。幾つかの実施形態では、生物発光複合体からの生物発光シグナル（または基質の存在下でこのようなシグナルを生成する能力）は、相互作用要素による複合体の形成のレポーターとして機能する。相互作用複合体が形成される場合、生物発光複合体が形成され、生物発光シグナルが検出／測定／モニタリングされる（例えば、基質の存在下で）。相互作用複合体を形成することができない場合（例えば、好ましくない条件により、相互作用要素間の不安定な相互作用により、不適合な相互作用要素により）、生物発光複合体が形成されず、生物発光シグナルが生成されない（例えば、基質の存在下で）。幾つかの実施形態では、生物発光複合体からの生物発光シグナル（または基質の存在下でこのようなシグナルを生成する能力）は、相互作用要素の標的への結合のレポーターとして機能する。標的への結合が発生する場合、生物発光複合体が形成され、生物発光シグナルが検出／測定／モニタリングされる（例えば、基質の存在下で）。標的へ結合することができない場合（例えば、好ましくない条件により、相互作用要素と標的との間の不安定な相互作用により、標的の非存在により）、生物発光複合体が形成されず、生物発光シグナルが生成されない。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、相互作用要素は、２つの関心対象の分子（例えば、関心対象のタンパク質（複数可）、関心対象の低分子（複数可）など）である。例えば、アッセイは、２つの関心対象の分子の相互作用を検出するために、それぞれを別個のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）に係留することによって実行され得る。関心対象の分子が相互作用する場合（例えば、一過性に相互作用する、安定的に相互作用する、など）、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグが好適な立体構造で近接し、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグと生物発光複合体のポリペプチド構成要素との間で生物発光複合体が形成される（かつ生物発光シグナルが生成／検出される（例えば、基質の存在下で））。関心対象の分子間が相互作用しない場合、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグが近接せず、及び／または生物発光複合体のポリペプチド構成要素との複合体形成を促進するような配向で配置されず、生物発光複合体が形成されず、生物発光シグナルが（基質の存在下で）生成されない。かかる実施形態は、インヒビターの複合体形成に対する効果、変異の複合体形成に対する効果、条件（例えば、温度、ｐＨなど）の複合体形成に対する効果、低分子（例えば、治療薬候補）の標的分子との相互作用などを研究するために使用され得る。
【０１２１】
幾つかの実施形態では、相互作用要素による促進なしに生物発光複合体に集合することができるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様ペプチド（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）が提供される。かかる実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチド構成要素が同一の試料内、細胞内区画内、細胞内、組織内などに同時に存在する（例えば、共局在する）場合、生物発光複合体が形成される。幾つかの実施形態では、分子要素（例えば、タンパク質（複数可）、核酸（複数可）、低分子（複数可）、脂質、炭水化物、細胞構造など）の共局在を（例えば、分子相互作用なしに）検出及びモニタリングするのに使用するための生物発光複合体に集合することができるペプチド／ジペプチド／トリペプチド（タグ）／ポリペプチド要素が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、生物発光複合体は、β１様配列〜β１０様配列の全体に集合的に及ぶペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチド構成要素から形成される。幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグは、共局在要素に融合または別様に連結される。特定の実施形態では、特に共局在を（例えば、分子相互作用なしに）検出／モニタリングするために、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチド構成要素は、促進なしに（例えば、相互作用要素なしに）生物発光複合体を形成することができる。共局在要素（例えば、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグに融合される）の共局在（例えば、同一細胞内、同一表面上、同一細胞内区画、同一組織内など）に際して、（ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチド構成要素からの）生物発光複合体の形成が、共局在要素の相互作用の有無にかかわらず促進される。幾つかの実施形態では、生物発光複合体からの生物発光シグナル（または基質の存在下でこのようなシグナルを生成する能力）は、共局在要素の共局在のレポーターとして機能する。共局在要素が共局在する場合、ポリペプチド構成要素及び共局在要素に融合されたペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグの生物発光複合体が形成され、生物発光シグナルが検出／測定／モニタリングされる（例えば、基質の存在下で）。共局在要素が共局在しない場合、生物発光複合体が形成されず、生物発光シグナルが生成されない（例えば、基質の存在下で）。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、共局在対は、２つの関心対象の分子（例えば、関心対象のタンパク質（複数可）、関心対象の低分子（複数可）など）を含む。例えば、アッセイは、２つの関心対象の分子の共局在（例えば、細胞内、細胞内区画内、組織内などでの）を検出するために、それぞれを別個のジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）に係留することによって実行され得る。関心対象の分子が共局在する場合、ペプチドタグが好適な立体構造で近接し、生物発光複合体がポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）と共に形成され、生物発光シグナルが生成／検出される（例えば、基質の存在下で）。関心対象の分子が共局在しない場合、ポリペプチド構成要素及びペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグが相互作用して、複合体を形成せず、生物発光シグナルが生成されない（例えば、基質の存在下で）。かかる実施形態は、様々な条件下での関心対象の分子の共局在を研究するために使用され得る。
【０１２３】
幾つかの実施形態では、試料中の分析物（例えば、低分子、ペプチド、タンパク質、抗体、核酸など）を検出するための、ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）を含むシステム、アッセイ、及び装置が提供される。幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグは、標的分析物、複数の標的分析物、標的分析物により結合される二次分析物を認識する検出／結合作用物質（例えば、結合部分、結合配列など）、一次結合作用物質に結合する二次結合作用物質などに係留または融合される。幾つかの実施形態では、上述の検出／結合作用物質に係留／融合されたペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグの様々な組み合わせが、試料中の分析物を検出／定量化／同定するためのアッセイ及び装置において使用される。アッセイ及び装置において有用である例示的なシステムは、例えば、図５１〜５６に示され、本明細書に記載される。
【０１２４】
幾つかの実施形態では、ジペプチド（例えば、β９／β１０様ジペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β1〜8様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）からの生物発光複合体のアセンブリのための組成物及び方法が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、ジペプチド及びポリペプチド構成要素は、既存のタンパク質の断片でない（例えば、既知のポリペプチド配列の構造的に相補的な部分配列でない）。しかしながら、他の実施形態では、ジペプチド及び／またはポリペプチド構成要素は、既知または既存のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの断片であり得る。ある特定の実施形態では、（生物発光複合体の）ポリペプチド構成要素の生物発光活性は、ジペプチドによる構造的補完により増強される（例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１０2倍、１０3倍、１０4倍、１０5倍、１０6倍、またはそれ以上）。幾つかの実施形態では、β1〜8様ポリペプチドは、β1〜9様ポリペプチドより弱いバックグラウンド発光を示す。幾つかの実施形態では、β1〜8様ポリペプチドは、β1〜9様ポリペプチドと比較して増加した熱安定性及び化学安定性を示す。
【０１２５】
幾つかの実施形態では、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及びポリペプチド構成要素の以下の組み合わせのいずれかを含むものが挙げられるがそれらに限定されない生物発光複合体が本明細書において提供される：
●β１〜５様ポリペプチド＋β６様ペプチド＋β７様ペプチド＋β８様ペプチド＋β９様ペプチド＋β１０様ペプチド、
●β１〜５様ポリペプチド＋β６様ペプチド＋β７様ペプチド＋β８様ペプチド＋β９／１０様ジペプチド、
●β１〜５様ポリペプチド＋β６様ペプチド＋β７／８様ジペプチド＋β９／１０様ジペプチド、
●β１〜５様ポリペプチド＋β６／７／８様トリペプチド＋β９／１０様ジペプチド、
●β１〜５様ポリペプチド＋β６様ペプチド＋β７／８／９様トリペプチド＋β１０様ペプチド、
●β１〜６様ポリペプチド＋β７様ペプチド＋β８様ペプチド＋β９様ペプチド＋β１０様ペプチド、
●β１〜６様ポリペプチド＋β７様ペプチド＋β８様ペプチド＋β９／１０様ジペプチド、
●β１〜６様ポリペプチド＋β７／８様ジペプチド＋β９／１０様ジペプチド、
●β１〜６様ポリペプチド＋β６／７／８様ジペプチド＋β９様ペプチド＋β１０様ペプチド、
●β１〜６様ポリペプチド＋β７／８／９様トリペプチド＋β１０様ペプチド、
●β１〜７様ポリペプチド＋β８様ペプチド＋β９様ペプチド＋β１０様ペプチド、
●β１〜７様ポリペプチド＋β８様ペプチド＋β９／１０様ジペプチド、
●β１〜７様ポリペプチド＋８／９様ジペプチド＋β１０様ペプチド、
●β１〜７様ポリペプチド＋β８／９／１０様トリペプチド、
●β１〜８様ポリペプチド＋β９様ペプチド＋β１０様ペプチド、
●β１〜８様ポリペプチド＋β９／１０様ジペプチド、
●β１〜５様ポリペプチド＋β６〜１０様ポリペプチド、
●β１〜５様ポリペプチド＋β６〜９様ポリペプチド＋β１０様ペプチド、及び
●β１〜５様ポリペプチド＋β７〜１０様ポリペプチド＋β６様ペプチド。
上記の組み合わせは限定するものではなく、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及びポリペプチド構成要素の他の組み合わせは本明細書の範囲内である。
【０１２６】
幾つかの実施形態では、β１〜５様ポリペプチドは、配列番号７８８の１〜１０２位を含む。幾つかの実施形態では、β１〜６様ポリペプチドは、配列番号７８８の１〜１２４位を含む。幾つかの実施形態では、β１〜７様ポリペプチドは、配列番号７８８の１〜１３３位を含む。幾つかの実施形態では、β１〜８様ポリペプチドは、配列番号７８８の１〜１４８位を含む。
【０１２７】
幾つかの実施形態では、１組のβ５〜１０様ペプチド／ジペプチド／トリペプチド／ポリペプチドは、配列番号７８８または７８９の１０３〜１７０位を集合的に含む。幾つかの実施形態では、１組のβ６〜１０様ペプチド／ジペプチド／トリペプチド／ポリペプチドは、配列番号７８８または７８９の１２５〜１７０位を集合的に含む。幾つかの実施形態では、１組のβ７〜１０様ペプチド／ジペプチド／トリペプチド／ポリペプチドは、配列番号７８８または７８９の１３４〜１７０位を集合的に含む。幾つかの実施形態では、１組のβ８〜１０様ペプチド／ジペプチド／トリペプチド／ポリペプチドは、配列番号７８８または７８９の１４９〜１７０位を集合的に含む。
【０１２８】
幾つかの実施形態では、生物発光複合体の１つ以上の構成要素は、本明細書に記載されるベースとなるルシフェラーゼ（例えば、ＯｇＬｕｃ、ＮＡＮＯＬＵＣ、配列番号７８８、配列番号７８９など）の部分的なベータ鎖に及ぶ。ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及びポリペプチド構成要素間の分割は、ベータ鎖間の分割点で見られ得るか、または本明細書における配列により特定される分割点から−１位、−２位、−３位−、４位、−５位、＋１位、＋２位、＋３位、＋４位、＋５位以上の位置で生じ得る。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるベースとなるルシフェラーゼ（例えば、ＯｇＬｕｃ、ＮＡＮＯＬＵＣ、配列番号７８８、配列番号７８９など）の全配列に及ぶペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及びポリペプチド構成要素は、構成要素の分割点がベータ鎖の間にない場合であっても生物発光複合体を形成することができる。
【０１２９】
例えば、β５とβ６との間の分割位置は、配列番号７８８の１０２位と１０３位との間に存在し得、または幾つかの実施形態では、かかる分割位置は、その位置の前後５残基までの位置（例えば、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位の後）に存在し得る。幾つかの実施形態では、β６とβ７との間の分割位置は、配列番号７８８の１２４位と１２５位との間に存在し得、または幾つかの実施形態では、かかる分割位置は、その位置の前後５残基までの位置（例えば、１１８位、１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、１２３位、１２５位、１２６位、１２７位、１２８位、１２９位の後）に存在し得る。幾つかの実施形態では、β７とβ８との間の分割位置は、配列番号７８８の１３３位と１３４位との間に存在し得、または幾つかの実施形態では、かかる分割位置は、その位置の前後５残基までの位置（例えば、１２７位、１２８位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位の後）に存在し得る。幾つかの実施形態では、β８とβ９との間の分割位置は、配列番号７８８の１４８位と１４９位との間に存在し得、または幾つかの実施形態では、かかる分割位置は、その位置の前後５残基までの位置（例えば、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位の後）に存在し得る。
【０１３０】
幾つかの実施形態では、ベースとなるルシフェラーゼ（例えば、ＯｇＬｕｃ、ＮＡＮＯＬＵＣ、配列番号７８８、配列番号７８９など）の配列内で連続的に隣接する２つのペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及びポリペプチド構成要素は、ベースとなる配列のその対応する部分の全てのアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、ベースとなる配列における分割点に隣接した１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上）のアミノ酸は、対応するペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチド構成要素に存在しない。
【０１３１】
幾つかの実施形態では、以下のうちの１つとの４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）の配列同一性を含むペプチドが本明細書において提供される：
●β６様  −  ＧＶＴＰＮＫＬＮＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧ（配列番号８０２）、
●β７様  −  ＫＫＩＴＴＴＧＴＬ（配列番号８０３）、
●β８様  −  ＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＴＰＤ（配列番号８０４）、
●β９様  −  ＧＳＭＬＦＲＶＴＩＮＳ（配列番号８０５）、
●β１０様（高親和性）−  ＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ（配列番号８０６）、及び
●β１０様（低親和性）−  ＶＴＧＹＲＬＦＥＥＩＬ（配列番号８０７）。
【０１３２】
幾つかの実施形態では、以下のうちの１つとの４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）の配列同一性を含むペプチドが本明細書において提供される：
●β６／７様  −  ＧＶＴＰＮＫＬＮＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＴＴＧＴＬ（配列番号８０８）、
●β７／８様  −  ＫＫＩＴＴＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＴＰＤ（配列番号８０９）、
●β８／９様  −  ＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＴＰＤＧＳＭＬＦＲＶＴＩＮＳ（配列番号８１０）、
●β９／１０様（高親和性）−  ＧＳＭＬＦＲＶＴＩＮＳＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ（配列番号８１１）、及び
●β９／１０様（低親和性）−  ＧＳＭＬＦＲＶＴＩＮＳＶＴＧＹＲＬＦＥＥＩＬ（配列番号８１２）。
【０１３３】
幾つかの実施形態では、以下のうちの１つとの４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）の配列同一性を含むトリペプチドが本明細書において提供される：
●β６／７／８様  −  ＧＶＴＰＮＫＬＮＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＴＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＴＰＤ（配列番号８１３）、
●β７／８／９様  −  ＫＫＩＴＴＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＴＰＤＧＳＭＬＦＲＶＴＩＮＳ（配列番号８１４）、
●Β８／９／１０様（高親和性）−  ＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＴＰＤＧＳＭＬＦＲＶＴＩＮＳＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ（配列番号８１５）、及び
●Β８／９／１０様（低親和性）−  ＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＴＰＤＧＳＭＬＦＲＶＴＩＮＳＶＴＧＹＲＬＦＥＥＩＬ（配列番号８１６）。
【０１３４】
幾つかの実施形態では、以下のうちの１つとの４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）の配列同一性を含むポリペプチドが本明細書において提供される：
●β１〜５様  −  ＭＶＦＴＬＤＤＦＶＧＤＷＥＱＴＡＡＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＬＱＮＬＡＶＳＶＴＰＩＭＲＩＶＲＳＧＥＮＡＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＡＤＱＭＡＱＩＥＥＶＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＰＹＧＴＬＶＩＤ（配列番号７９０）、
●β６〜１０様（高親和性）−  ＧＶＴＰＮＫＬＮＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＴＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＴＰＤＧＳＭＬＦＲＶＴＩＮＳＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ（配列番号７９４）、
●β６〜１０様（低親和性）−  ＧＶＴＰＮＫＬＮＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＴＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＴＰＤＧＳＭＬＦＲＶＴＩＮＳＶＴＧＹＲＬＦＥＥＩＬ（配列番号７９８）、
●β６〜９様  −  ＧＶＴＰＮＫＬＮＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＴＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＴＰＤＧＳＭＬＦＲＶＴＩＮＳ（配列番号８２９）、
●β７〜１０様（高親和性）−  ＫＫＩＴＴＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＴＰＤＧＳＭＬＦＲＶＴＩＮＳＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ（配列番号７９５）、及び
●β７〜１０様（低親和性）−  ＫＫＩＴＴＴＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＴＰＤＧＳＭＬＦＲＶＴＩＮＳＶＴＧＹＲＬＦＥＥＩＬ（配列番号７９９）。
【０１３５】
幾つかの実施形態では、（例えば、１組のペプチド／ポリペプチドまたは生物発光複合体などの）ポリペプチド構成要素は、配列番号７８８、７８９、７９０、７９１、７９２、及び７９３のうちの１つとの４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）の配列同一性を含む。
【０１３６】
幾つかの実施形態では、（例えば、１組のペプチド／ポリペプチドまたは生物発光複合体などの）ペプチド／ジペプチド／トリペプチド構成要素（例えば、タグ）は、配列番号７９４、７９５、７９６、７９７、７９８、７９９、８００、及び８０１のうちの１つとの４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）の配列同一性を集合的に含む。
【０１３７】
幾つかの実施形態では、構成要素の組及び上記に列挙されたペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及びポリペプチドの複合体が本明細書において提供される。特定の実施形態では、ベースとなるルシフェラーゼ配列の１０個全てのベータ鎖に及ぶ構成要素の組が選択される。
【０１３８】
幾つかの実施形態では、本明細書における２つのペプチドタグによるシステム（例えば、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）ペプチド、β１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及びポリペプチド構成要素（（例えば、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド））と共に使用するために記載される相互作用、共局在、検出、ならびに他の方法、アッセイ、及び技術は、本明細書に記載されるジペプチドシステム（例えば、β９／１０様ジペプチド及びポリペプチド構成要素）と共に用いるのにも有用である。幾つかの実施形態では、ジペプチドは、ポリペプチド構成要素に対する高親和性を有し、かかる実施形態では、ジペプチド及びポリペプチド構成要素が促進なしに接触する（例えば、共局在する、試料に添加される、など）と、生物発光複合体が形成される。幾つかの実施形態では、ジペプチドは、ポリペプチド構成要素に対する低親和性を有し、かかる実施形態では、ジペプチド及びポリペプチド構成要素が促進なしに接触する（例えば、共局在する、試料に添加される、など）と、生物発光複合体が形成されない。本明細書における２つのペプチドタグによるシステム（例えば、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）ペプチド、β１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド））のように、様々な親和性のジペプチド／ポリペプチド対が、異なる用途のために選択され得る。幾つかの実施形態では、２つの構成要素による補完システムのためのシステム、方法、及びアッセイは、米国特許第９，７９７，８９０号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されており、全てのかかるシステム、方法、及びアッセイは、本明細書に記載されるジペプチド／ポリペプチドシステムと共に用いるのに有用である。
【０１３９】
幾つかの実施形態では、本明細書における２つのペプチドタグによるシステム（例えば、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）ペプチド、β１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及びポリペプチド構成要素（（例えば、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド））と共に使用するために記載される相互作用、共局在、検出、ならびに他の方法、アッセイ、及び技術は、本明細書に記載されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及びポリペプチドの任意の好適な組み合わせを含むシステムと共に用いるのにも有用である。幾つかの実施形態では、構成要素は、互いに対して高親和性を有し、かかる実施形態では、構成要素が促進なしに接触する（例えば、共局在する、試料に添加される、など）と、生物発光複合体が形成される。幾つかの実施形態では、構成要素のうちの１つ以上は、他の構成要素のうちの１つ以上に対する低親和性を有し、かかる実施形態では、構成要素が促進なしに接触する（例えば、共局在する、試料に添加される、など）と、生物発光複合体が形成されない。本明細書における２つのペプチドタグによるシステム（例えば、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）ペプチド、β１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド））のように、本明細書に記載される様々な親和性を有する他のシステムが、異なる用途のために提供され得る。幾つかの実施形態では、２つの構成要素による補完システムのためのシステム、方法、及びアッセイは、米国特許第９，７９７，８９０号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されており、全てのかかるシステム、方法、及びアッセイは、本明細書に記載される様々なペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及びポリペプチドシステムと共に用いるのに有用である。
【０１４０】
幾つかの実施形態では、互換的なペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）の相補的なパネルであって、可変的な親和性及びそれらからの生物発光複合体の形成による発光（例えば、高親和性／高発光、中程度の親和性／高発光、低親和性／中程度の発光など）を有する当該相補的なパネルが、本明細書において提供される。ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチド構成要素の異なる組み合わせを利用することにより、低い親和性、発光、発現レベル、安定性、溶解性、及び他の可変的特性から、より高い親和性、発光、発現レベル、安定性、溶解性、及び他の可変的特性までの範囲に及ぶ様々な組を含む適応性のあるシステムを提供する。この適応性は、分析物、分子相互作用、共局在、及び／または他の特性の検出／モニタリング／同定／定量化が、研究される特定の関心対象の分子（複数可）及び／または条件に対して微調整されることを可能にし、検出／モニタリング／同定／定量化され得る分子相互作用及び／または共局在の範囲を非常に高いまたは低い親和性を有する相互作用を含むように拡張する。本明細書において、非発光性要素及び非発光性要素のパネルを開発及び試験する方法が更に提供される。
【０１４１】
幾つかの実施形態では、本明細書におけるタグ（例えば、ペプチドタグ）の小さいサイズに起因して（例えば、より大きいポリペプチド及びタンパク質と比較して）、それらは変性に対して耐性を示す（それらは機能に必要とされる三次構造を有さない）。
【０１４２】
幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチド構成要素は、研究される分子または関心対象のタンパク質に基づいて選択され得る。幾つかの実施形態では、異なるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、生物発光複合体の形成をもたらすために、異なる強さ、持続時間、及び／または安定性の相互作用複合体（例えば、相互作用要素の複合体）を必要とし得る。幾つかの実施形態では、非常に安定した相互作用複合体が、検出可能な生物発光シグナル（例えば、基質の存在下で）を生成するために必要とされる。他の実施形態では、弱いまたは一過性の相互作用複合体であっても、生物発光複合体の形成をもたらす。更に他の実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチド構成要素が共局在する限り、生物発光複合体は相互作用複合体の非存在下で形成される。幾つかの実施形態では、相互作用複合体の強さまたは程度は、得られる生物発光シグナルの強さに正比例する。幾つかのペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ／ポリペプチド構成要素の組は、高いミリモルの解離定数（例えば、Ｋd＞１００ｍＭ）で相互作用複合体と組み合わされる場合に検出可能なシグナルを生成する。他のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ／ポリペプチド構成要素の組は、検出可能なシグナルを有する生物発光複合体を生成するために、低いミリモル（例えば、Ｋd＜１００ｍＭ）、マイクロモル（例えば、Ｋd＜１ｍＭ）、ナノモル（例えば、Ｋd＜１μＭ）、または更にはピコモル（例えば、Ｋd＜１ｎＭ）の解離定数を有する相互作用対を必要とする。
【０１４３】
幾つかの実施形態では、本明細書におけるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及び／またはポリペプチド構成要素は、既存のタンパク質（例えば、既存の生物発光タンパク質）の断片でない。幾つかの実施形態では、複合体を形成するために使用されるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチド構成要素のいずれも、既存のタンパク質（例えば、同一の既存のタンパク質、既存の生物発光タンパク質など）の断片でない。幾つかの実施形態では、互いに集合して、生物発光複合体を形成するペプチドタグ（例えば、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）及びβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド；β９／β１０様ジペプチド、など）もポリペプチド構成要素（例えば、β1〜8様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）も、既存のタンパク質（例えば、同一の既存のタンパク質、既存の生物発光タンパク質など）の断片でない。幾つかの実施形態では、本発明の実施形態に使用するための生物発光複合体のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグまたはポリペプチド構成要素は、既存のタンパク質の部分配列でない。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される実施形態に使用するための非発光性要素は、既存のタンパク質の構造的に相補的な部分配列を含まない。
【０１４４】
幾つかの実施形態では、本明細書におけるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）は、単独では非発光性または実質的に非発光性である（例えば、基質の存在下または非存在下で）。幾つかの実施形態では、本明細書におけるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグは、ポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）の非存在下で互いに会合する場合、非発光性または実質的に非発光性である（例えば、基質の存在下または非存在下で）。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、単独では非発光性または実質的に非発光性である（例えば、基質の存在下または非存在下で）。幾つかの実施形態では、単一のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素は、第２または第３または第４のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグの非存在下で非発光性または実質的に非発光性である（例えば、基質の存在下または非存在下で）。ある特定の実施形態では、好適な条件（例えば、生理的条件）に置かれる場合に、複数のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチド構成要素は、相互作用して、生物発光複合体を形成し、基質の存在下で生物発光シグナルを生成する。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、相互作用要素及び／または共局在要素ならびにペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグは、付着、融合、連結、結合などされる。典型的な実施形態では、第１のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及び第１の相互作用要素（または第１の共局在要素）が互いに付着され、第２のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及び第２の相互作用要素（または第２の共局在要素）が互いに付着される。ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグの相互作用要素（または共局在要素）への付着は、任意の好適な機序、化学作用、リンカーなどにより達成され得る。相互作用要素（または共局在要素）及びペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグは、典型的には共有結合により付着されるが、２つの要素の非共有結合性の連結も提供される。幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及び相互作用要素（または共局在要素）は、直接的に結合され、他の実施形態では、それらはリンカーにより結合される。幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及び相互作用要素（または共局在要素）は、遺伝子／組換え融合物として提供される。幾つかの実施形態では、本明細書におけるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグで（例えば、内因性の制御調節下で）内因的にタグ付けすることは、本明細書に記載されるツールによる正常な細胞機能のモニタリングを可能にする。例えば、関心対象のタンパク質は、高親和性β９／β１０様ジペプチドで内因的にタグ付けされ得（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して）、次いで、ＬｇＴｒｉｐ（またはそのバリアント）による自発的な補完が細胞、動物、溶解物などにおいてモニタリングされる。他の実施形態では、ペプチドタグ及び相互作用要素（または共局在要素）は、化学修飾／化学的コンジュゲーション、例えば、ネイティブケミカルライゲーションによって、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション、「無痕跡型」Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション、アミドカップリング、活性化エステルを用いる方法、リジン、チロシン及びシステイン残基を標的とする方法、イミン結合形成（オルトボロン酸を用いるかまたは用いない）、ボロン酸／ジオール相互作用、ジスルフィド結合形成、銅を用いる／銅なしのアジド、ジアゾ、テトラジン「クリック」ケミストリー、ＵＶにより促進されるチオールエンコンジュゲーション、ジアジリンによる光標識、ディールス・アルダー環付加、メタセシス反応、鈴木クロスカップリング、チアゾリジンカップリング（ステップ−４）、ストレプトアビジン／ビオチン補完、ＨａｌｏＴａｇ／クロロアルカン基質補完などによって連結される。幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及び相互作用要素（または共局在要素）は、合成により生成される（例えば、固相合成、液相合成など）。幾つかの実施形態では、相互作用要素（または共局在要素）は、任意の適切な手段により生成される（例えば、合成によりまたは組換えにより）か、または取得される（例えば、粗製溶解物、抽出されたタンパク質、精製されたタンパク質などから）。
【０１４６】
相互作用要素（または共局在要素）がペプチドまたはポリペプチドである幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及び相互作用要素（または共局在要素）は、単一のアミノ酸鎖内に含有される。幾つかの実施形態では、単一のアミノ酸鎖は、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及び相互作用要素（または共局在要素）を含むか、それらからなるか、または本質的にそれらからなる。幾つかの実施形態では、単一のアミノ酸鎖は、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ、相互作用要素（または共局在要素）、任意により、１つ以上のＮ末端配列、Ｃ末端配列、調節エレメント（例えば、プロモーター、翻訳開始部位など）、及びリンカー配列を含むか、それらからなるか、または本質的にそれらからなる。幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及び相互作用要素（または共局在要素）は、融合ポリペプチド内に含有される。幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及び相互作用要素（または共局在要素）の第１の融合物ならびにペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及び相互作用要素（または共局在要素）の第２の融合物が、別々に発現されるが、他の実施形態では、相互作用（または共局在）及びペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグの両方を含むか、またはそれらからなる融合タンパク質が発現される。
【０１４７】
幾つかの実施形態では、第１のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及び第１の相互作用要素を含む第１の融合タンパク質ならびに第２のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及び第２の相互作用要素を含む第２の融合タンパク質は、同一細胞内で発現される。幾つかの実施形態では、第１のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及び第１の共局在要素を含む第１の融合タンパク質ならびに第２のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及び第２の共局在要素を含む第２の融合タンパク質は、同一細胞内で発現される。幾つかの実施形態では、第１及び第２の融合タンパク質は、細胞から精製及び／または単離される。幾つかの実施形態では、融合タンパク質の相互作用及び／または共局在は、細胞内で分析される。幾つかの実施形態では、融合タンパク質の相互作用及び／または共局在は、細胞の溶解物中で分析される。他の実施形態では、第１及び第２の融合タンパク質は、別個の細胞で発現され、シグナル検出のために（例えば、精製及び／または単離後に、細胞または細胞の一部の融合後に、一方の細胞から他方への融合タンパク質の転移により、または１つ以上の融合タンパク質の細胞外培地への分泌により）組み合わされる。幾つかの実施形態では、１つ以上の融合タンパク質は、細胞溶解物（例えば、ウサギ網状赤血球溶解物）中でまたは無細胞系中で発現される。幾つかの実施形態では、１つ以上の融合タンパク質は、ウイルスまたは他の細胞性病原体のゲノムから発現される。幾つかの実施形態では、（第１及び第２の融合タンパク質との）複合体形成のためのポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）及び任意の他のペプチド／ジペプチド／トリペプチド構成要素（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）は、タグを含有する融合タンパク質の一方または両方と同一の細胞または細胞溶解物中で発現される。幾つかの実施形態では、（第１及び第２の融合タンパク質内の）ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグとの複合体形成のためのペプチド／ジペプチド／トリペプチド／ポリペプチド構成要素は、ペプチドタグを含有する融合タンパク質の一方または両方と異なる細胞または細胞溶解物中で発現される。幾つかの実施形態では、（第１及び第２の融合タンパク質内の）ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグとの複合体形成のためのペプチド／ジペプチド／トリペプチド／ポリペプチド構成要素は、ペプチドタグを含有する融合タンパク質を含む細胞、細胞溶解物、または他の試料に添加される。
【０１４８】
幾つかの実施形態では、本明細書におけるシステム（例えば、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ、ペプチド／ジペプチド／トリペプチド／ポリペプチド構成要素、基質、ベクターなど）及び方法は、試料の解析（例えば、共局在、分子相互作用、標的の検出／定量化／同定／モニタリングなど）において有用である。幾つかの実施形態では、本明細書におけるシステムの構成要素のうちの１つ以上は、試料に添加及び／または提供されるか、または試料内で発現される。本明細書における実施形態において有用で得る好適な試料としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：血液、血漿、血清、尿、唾液、細胞、細胞溶解物、組織、組織ホモジネート、精製された核酸、便、膣分泌物、脳脊髄液、尿膜腔液、水、バイオフィルム、土壌、粉塵、食品、飲料、農産物、植物など。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）、融合ポリペプチド、融合タンパク質などをコードする核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ベクターなどが提供される。かかる核酸及びベクターは、発現、形質転換、遺伝子導入、注入などに使用され得る。
【０１５０】
幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及び相互作用要素、共局在要素、または結合作用物質は、リンカーにより結合される。幾つかの実施形態では、リンカーは、シグナル要素及び相互作用要素または共局在要素を結合すると共に所望の量の要素間の空間／距離を提供する。幾つかの実施形態では、リンカーは、シグナル要素及び相互作用要素の両方が同時にそれらのそれぞれの複合体（例えば、発光複合体及び相互作用複合体）を形成するのを可能にする。幾つかの実施形態では、リンカーは、相互作用要素が発光複合体の形成を促進するのを支援する。幾つかの実施形態では、相互作用複合体が形成されると、各ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグをそれらのそれぞれの相互作用要素に結合するリンカーは、ペプチドタグを生物発光複合体を形成するのに適切な距離及び立体構造に配置する。幾つかの実施形態では、相互作用要素または共局在要素及びペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグは、リンカーにより近位に保持される（例えば、４モノマー単位未満）。幾つかの実施形態では、リンカーは、ペプチドタグと相互作用要素との間の所望の量の距離（例えば、１、２、３、４、５、６・・・１０・・・２０、またはそれ以上のモノマー単位）を提供する（例えば、立体的問題によるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグと相互作用要素または共局在要素との間の望ましくない相互作用を予防するために、相互作用複合体の形成に際した非発光性要素の適切な配向を可能にするために、相互作用複合体から発光複合体への複合体形成の伝播を可能にするために、など）。ある特定の実施形態では、リンカーは、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグと相互作用要素との間の適切な付着化学作用を提供する。リンカーは、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及び相互作用要素または共局在要素を製造する合成プロセスを改善し得る（例えば、それらが単一の単位として合成されるのを可能にする、２つの要素の合成後の結合を可能にする、など）。
【０１５１】
幾つかの実施形態では、リンカーは、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）またはポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）を相互作用要素または共局在要素に連結、結合、または係留することができる任意の好適な化学部分である。幾つかの実施形態では、リンカーは、１つ以上の繰り返しまたは非繰り返しモノマー単位のポリマー（例えば、核酸鎖、アミノ酸鎖、炭素含有ポリマー鎖、炭素鎖など）である。ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及び相互作用要素、共局在要素、または結合作用物質が融合タンパク質の一部である場合、リンカー（存在する場合）は、通常、アミノ酸鎖である。ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及び相互作用要素、共局在要素、または結合作用物質が個々の要素の発現後に互いに係留される場合、リンカーは、いずれの末端にも、ペプチドタグ及び相互作用要素または共局在要素それぞれの官能基と反応性である官能基（または反応性基）を有する任意の化学部分を含み得る。シグナル要素、ならびに相互作用要素、共局在要素、及び／または結合作用物質を係留することができる任意の好適な部分が、リンカーとして有用であり得る。
【０１５２】
多種多様なリンカーが使用され得る。幾つかの実施形態では、リンカーは、単一の共有結合である。幾つかの実施形態では、リンカーは、１〜２０個の非水素原子（例えば、Ｃ、Ｎ、Ｐ、Ｏ、及びＳ）を有する直鎖または分岐鎖、環式または複素環式、飽和または不飽和の構造を含み、アルキル、エーテル、チオエーテル、イミン、カルボン酸、アミン、エステル、カルボキシアミド、スルホンアミド、ヒドラジド結合、及び芳香族または複素環式芳香族結合の任意の組み合わせから構成される。幾つかの実施形態では、リンカーは、２０個の非水素原子より長い（例えば、２１個の非水素原子、２５個の非水素原子、３０個の非水素原子、４０個の非水素原子、５０個の非水素原子、１００個の非水素原子など）。幾つかの実施形態では、リンカーは、Ｃ、Ｎ、Ｐ、Ｏ、及びＳの群から選択される（水素原子に加えて）１〜５０個の非水素原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の非水素原子）を含む。
【０１５３】
本明細書における実施形態の範囲は、利用可能なリンカーの種類によって限定されない。ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ、ポリペプチド構成要素、及び相互作用要素、共局在要素、または結合作用物質は、直接連結される（例えば、単一の共有結合からなるリンカー）か、または好適なリンカーを介して連結されるかのいずれかである。実施形態は、いかなる特定のリンカー基にも限定されない。種々のリンカー基が企図され、好適なリンカーは、限定されるものではないが、アルキル基、メチレン炭素鎖、エーテル、ポリエーテル、アルキルアミドリンカー、ペプチドリンカー、修飾ペプチドリンカー、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）リンカー、ストレプトアビジン−ビオチンまたはアビジン−ビオチンリンカー、ポリアミノ酸（例えば、ポリリジン）、官能化ＰＥＧ、多糖類、グリコサミノグリカン、樹枝状ポリマー（ＷＯ９３／０６８６８及びＴｏｍａｌｉａらによるＡｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２９：１３８−１７５（１９９０）（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる））、ＰＥＧ−キレート剤ポリマー（Ｗ９４／０８６２９、ＷＯ９４／０９０５６、及びＷＯ９６／２６７５４（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる））、オリゴヌクレオチドリンカー、リン脂質誘導体、アルケニル鎖、アルキニル鎖、ジスルフィド、またはこれらの組み合わせを含み得る。幾つかの実施形態では、リンカーは、切断可能である（例えば、酵素的に（例えば、ＴＥＶプロテアーゼ部位）、化学的に、光誘導性、など）。
【０１５４】
幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）、認識要素、相互作用要素、共局在要素、結合作用物質、分析物、基質などは、固体表面またはマトリックスに（例えば、任意の好適な化学作用により）付着されるか、またはそれらに含有される。幾つかの実施形態では、１つ以上のシステム構成要素は、固体表面またはマトリックスに（例えば、任意の好適な化学作用により）付着されるか、またはそれらに含有され、他の構成要素は、固体表面またはマトリックスに添加される（例えば、溶液中で（例えば、試料中で））。好適な固体表面としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ビーズ（例えば、磁気ビーズ）、チップ、チューブ、プレート、粒子、膜、紙など。幾つかの実施形態では、固体表面／マトリックスは、任意の好適な材料、例えば、Ａｈｌｓｔｒｏｍ  ＣｙｔｏＳｅｐ、ニトロセルロース、酢酸セルロース  、セルロース（例えば、Ｗｈａｔｍａｎ  ＦＴＡ−ＤＭＰＫ−Ａ、Ｂ、及びＣカード；Ｗｈａｔｍａｎ  ＥＴ  ３１Ｃｈｒ；Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓａｖｅｒ  ９０３カード；Ｗｈａｔｍａｎ  グレード１濾紙；Ｗｈａｔｍａｎ  ＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ；Ａｈｌｓｔｒｏｍ  ２２６検体収集用紙など）、Ｎｏｖｉｐｌｅｘ  Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｅｐ  Ｃａｒｄｓ、ポリプロピレンメンブレン、ＰＶＤＦ、ニトロセルロースメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｈｉ  Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ）、ポリテトラフルオロエチレン膜、セルロース混合エステル、ガラス繊維媒体（例えば、Ｗｈａｔｍａｎ  ユニフィルタープレート、ガラス繊維フィルターメンブレン、Ａｇｉｌｅｎｔ  乾燥マトリクススポッティングカード、Ａｈｌｓｔｒｏｍ  グレード８９５０など）、プラスチック（例えば、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエーテルスルホン、ポリ（メタクリレート）、アクリルポリマー、ポリテトラフルオロエチレンなど）、天然及び合成ポリマー（例えば、ポリマーの混合物、ブロックコポリマーなど）、糖（例えば、プルラン、トレハロース、マルトース、スクロース、セルロースなど）、ポリアミド（例えば、天然（例えば、羊毛、絹など）、合成（例えば、アラミド、ナイロンなど）など）、金属（例えば、アルミニウム、カドミウム、クロム、コバルト、銅、鉄、マンガン、ニッケル、プラチナ、パラジウム、ロジウム、銀、金、スズ、チタン、タングステン、バナジウム、亜鉛など）、合金（例えば、アルミニウム合金（例えば、Ａｌ−Ｌｉ、アルメル、ジュラルミン、マグノックス、Ｚａｍａｋなど）、鉄合金（例えば、鋼、ステンレス鋼、外科用ステンレス鋼、ケイ素鋼、工具鋼、鋳鉄、鏡鉄など）、コバルト合金（例えば、ステライト、タロナイトなど）、ニッケル合金（例えば、洋銀、クロメル、ミューメタル、モネルメタル、ニクロム、Ｎｉｃｒｏｓｉｌ、Ｎｉｓｉｌ、ニチノールなど）、銅合金（例えば���ベリリウム銅、ビロン、黄銅、青銅、リン青銅、コンスタンタン、白銅、ベルメタル、デバルダ合金、鍍金合金、洋白、ノルディック・ゴールド、王金、トゥンバガなど）、銀合金（例えば、スターリング銀など）、スズ合金（例えば、Ｂｒｉｔａｎｎｉｕｍ、ピューター、はんだなど）、金合金（エレクトラム、ホワイトゴールドなど）、アマルガムなど）、ＥＬＩＳＰｏｔプレート、免疫アッセイプレート、組織培養プレートなどから作製される。
【０１５５】
幾つかの実施形態では、既存のルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、米国特許出願第２０１０／０２８１５５２号及び米国特許出願第２０１２／０１７４２４２号（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるような高感度Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ）の任意の部分に対する１００％未満の配列同一性及び／または類似性を有するペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及び発光複合体のポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）が提供される。ある特定の実施形態は、配列番号１（例えば、野生型Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの全配列）及び／または配列番号３（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣの全配列）の全体または一部（例えば、８アミノ酸以上、ペプチドについて約２５アミノ酸未満）との１００％未満の配列同一性を有するペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチド構成要素の生物発光複合体の形成を伴う。ある特定の実施形態は、配列番号１（例えば、野生型Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの全配列）及び／または配列番号３（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣの全配列）の全体または一部（例えば、８アミノ酸以上、ペプチドについて約２５アミノ酸未満）との１００％未満であるが、４０％超（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超）の配列同一性を有するペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチド構成要素からの生物発光複合体の形成を伴う。幾つかの実施形態では、配列番号１（例えば、野生型Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの全配列）及び／または配列番号３（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣの全配列）の一部（例えば、８アミノ酸以上、ペプチドについて約２５アミノ酸未満）との１００％未満の配列類似性を有するペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチド構成要素が提供される。幾つかの実施形態では、配列番号１（例えば、野生型Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの全配列）及び／または配列番号３（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣの全配列）の一部（例えば、８アミノ酸以上、ペプチドについて約２５アミノ酸未満）との１００％未満であるが、４０％超（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超）の配列類似性を有するペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチド構成要素が提供される。幾つかの実施形態では、配列番号１（例えば、野生型Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの全配列）及び／または配列番号３（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣの全配列）の約２５アミノ酸以下の部分との１００％未満の配列同一性及び／または類似性を有するペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグが提供され、ここで、かかるペプチドのうちの２つは、適切な条件（例えば、相互作用対により安定化される、共局在要素により近接する、など）下で組み合わされる場合に、配列番号１（例えば、野生型Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの全配列）及び／または配列番号３（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣの全配列）の別の部分との１００％未満であるが、４０％超（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超）の配列同一性及び／または類似性を有するポリペプチド構成要素と生物発光複合体を形成する。幾つかの実施形態では、配列番号１（例えば、野生型Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの全配列）及び／または配列番号３（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣの全配列）の約２５アミノ酸以下の部分との１００％未満の配列同一性及び／または類似性を有するペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグが提供され、ここで、１対のかかるペプチドタグは、適切な条件（例えば、相互作用対により安定化される、共局在要素により近接する、など）下で組み合わされる場合に、配列番号１（例えば、野生型Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの全配列）及び／または配列番号３（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣの全配列）の別の部分との１００％未満であるが、４０％超（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超）の配列同一性及び／または類似性を有するポリペプチド構成要素と生物発光複合体を形成する。幾つかの実施形態では、配列番号１（例えば、野生型Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの全配列）及び／または配列番号３（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣの全配列）の約２５アミノ酸以下の部分との１００％未満であるが、４０％超（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超）の配列同一性及び／または類似性を有するペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグが提供され、ここで、１対のかかるペプチドは、適切な条件下（例えば、相互作用対により安定化される、共局在要素により近接する、など）で組み合わされる場合に、配列番号１（例えば、野生型Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの全配列）及び／または配列番号３（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣの全配列）の別の部分との１００％未満であるが、４０％超（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超）の配列同一性及び／または類似性を有するポリペプチドと生物発光複合体を形成する。同様に、配列番号１（例えば、野生型Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの全配列）及び／または配列番号３（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣの全配列）の一部との１００％未満であるが、４０％超（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超）の配列同一性または類似性を有するポリペプチド構成要素が提供され、ここで、かかるポリペプチド構成要素は、適切な条件下で組み合わされる場合に、配列番号１（例えば、野生型Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの全配列）及び／または配列番号３（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣの全配列）の別の部分との１００％未満であるが、任意により４０％超（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超）の配列同一性及び／または類似性を有する１対のペプチドタグと生物発光複合体を形成する。幾つかの実施形態では、配列番号６、配列番号７、配列番号９、及び／または配列番号１０との１００％未満の配列同一性または類似性を有するペプチドタグが提供される。幾つかの実施形態では、配列番号６、配列番号７、配列番号９及び／または配列番号１０との１００％未満であるが、４０％超（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超）の配列同一性または類似性を有するペプチドタグが提供される。幾つかの実施形態では、配列番号２３、配列番号２５、及び／または配列番号２９との１００％未満の配列同一性または類似性を有するペプチドタグが提供される。幾つかの実施形態では、配列番号２３、配列番号２５、及び／または配列番号２９との１００％未満であるが、４０％超（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超）の配列同一性または類似性を有するペプチドタグが提供される。幾つかの実施形態では、配列番号５及び／または配列番号８との１００％未満の配列同一性または類似性を有するポリペプチド構成要素が提供される。幾つかの実施形態では、配列番号１７及び／または配列番号２７との１００％未満の配列同一性または類似性を有するポリペプチド構成要素が提供される。幾つかの実施形態では、配列番号５、配列番号８、及び／または配列番号２７との１００％未満であるが、４０％超（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超）の配列同一性または類似性を有するポリペプチド構成要素が提供される。幾つかの実施形態では、配列番号１７との１００％未満であるが、４０％超（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超）の配列同一性または類似性を有するポリペプチド構成要素が提供される。
【０１５６】
幾つかの実施形態では、本明細書における組、キット、またはシステムの１つ以上（例えば、全て）のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、ルシフェラーゼ（例えば、配列番号１、配列番号３など）の一部との１００％の配列同一性を含む。
【０１５７】
幾つかの実施形態では、本発明の実施形態において有用であるペプチドタグ（例えば、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）及びβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、β９／β１０様ジペプチド、など）としては、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２９由来の１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または追加を有するペプチドが挙げられる。幾つかの実施形態では、ペプチドタグは、配列番号１３との少なくとも４０％（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超）の配列同一性または類似性を含む。幾つかの実施形態では、ペプチドタグは、配列番号１３と比較して６以下（例えば、６、５、４、３、２、１、またはそれらの間の範囲）の置換（例えば、保存的置換、半保存的置換、非保存的置換など）を含む。幾つかの実施形態では、ペプチドタグは、配列番号２５との少なくとも４０％（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超）の配列同一性または類似性を含む。幾つかの実施形態では、ペプチドタグは、配列番号２５と比較して６以下（例えば、６、５、４、３、２、１、またはそれらの間の範囲）の置換（例えば、保存的置換、半保存的置換、非保存的置換など）を含む。幾つかの実施形態では、ペプチドタグは、配列番号２３との少なくとも４０％（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超）の配列同一性または類似性を含む。幾つかの実施形態では、ペプチドタグは、配列番号２３と比較して６以下（例えば、６、５、４、３、２、１、またはそれらの間の範囲）の置換（例えば、保存的置換、半保存的置換、非保存的置換など）を含む。幾つかの実施形態では、ペプチドタグは、配列番号２５との少なくとも４０％（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超）の配列同一性または類似性を含む。幾つかの実施形態では、ペプチドタグは、配列番号２５と比較して６以下（例えば、６、５、４、３、２、１、またはそれらの間の範囲）の置換（例えば、保存的置換、半保存的置換、非保存的置換など）を含む。
【０１５８】
幾つかの実施形態では、本発明の実施形態において有用であるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）としては、本明細書において、及び本明細書において提供される表において開示されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及びポリペプチドが挙げられる。幾つかの実施形態では、本発明の実施形態において有用であるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、本明細書において、及び本明細書において提供される表において開示されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及びポリペプチドと比較して１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または追加を含む。幾つかの実施形態では、本発明の実施形態において有用であるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、本明細書において、及び本明細書において提供される表において開示されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド及びポリペプチドとの少なくとも４０％（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超）の配列同一性または類似性を含む。
【０１５９】
幾つかの実施形態では、本明細書における実施形態において有用であるジペプチド及びトリペプチドは、本明細書に記載され、及び／または本明細書における表に列挙されるペプチドの任意の好適な組み合わせを含む。
【０１６０】
幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）またはポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、１つ以上の追加の要素（例えば、認識要素、相互作用要素、共局在要素、検出可能な要素（例えば、フルオロフォア（例えば、ＢＲＥＴを促進するための））、関心対象のタンパク質、ＨＡＬＯＴＡＧなど）に連結（例えば、化学的に）または融合される。幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグまたはポリペプチド構成要素は、ｃｙＯＦＰ（例えば、米国特許第９，９０８，９１８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のものなどのＡｎｔａｒｅｓ構築物における）または他の蛍光タンパク質（例えば、ＢＲＥＴを促進するための）に連結または融合される。幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグまたはポリペプチド構成要素は、ポリペプチド構成要素の追加の要素との化学的コンジュゲーションを促進するための１つ以上の化学修飾及び／または非天然アミノ酸もしくはアミノ酸類似体を含む。幾つかの実施形態では、アクセプター蛍光タンパク質に融合された単一のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグまたはポリペプチド構成要素が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、２つ以上のペプチド／ジペプチド／トリペプチド及び／またはポリペプチド構成要素が、アクセプター蛍光タンパク質に融合される（例えば、サンドイッチ融合物）。幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグまたはポリペプチド構成要素が、２つ以上のアクセプター蛍光タンパク質に融合される（例えば、サンドイッチ融合物）。幾つかの実施形態では、ＬｇＴｒｉｐポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるβ1〜8様ポリペプチド）が、単一の蛍光タンパク質（例えば、ｃｙＯＦＰ）に融合されるか、またはサンドイッチ融合物において２つの蛍光タンパク質（例えば、２コピーのｃｙＯＦＰ）の間に配置される。
【０１６１】
幾つかの実施形態では、本発明において有用であるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）に、追加の要素（例えば、認識要素、相互作用要素など）への化学的コンジュゲーションのための好適な反応性基が組み込まれる。これらの反応性基は、Ｎ末端、Ｃ末端、または配列内に存在し得る。これらの反応性基は、リンカーでペプチドに任意により付着され得る。場合によっては、反応性基を有するこれらのペプチド／ジペプチド／トリペプチドは、標準的な合成を使用して合成され得、所望の基を有する非天然アミノ酸に組み込まれ得る。場合によっては、反応性基は、天然アミノ酸に存在し得る（例えば、システインのスルフヒドリル）。反応性基を有するペプチドタグと反応することが意図される追加のエレメントは、タンパク質、抗体、核酸、または低分子、例えば、薬物またはフルオロフォアまたは表面であり得る。ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグには、生体直交化学またはクリックケミストリーを使用して化学的または生物学的に追加の要素に導入された反応パートナーと特異的に反応するように設計されている反応性基が組み込まれ得る。例示的なクリック反応は、ペプチドタグがアルキンまたはアジドを有し、追加の要素が相補的な基を有する銅触媒クリック反応である。適切な銅触媒の存在下でこれらの２つの化学種を混合することにより、ペプチドがトリアゾールを介して追加の要素への共有結合的にコンジュゲートされる。多数の他の生体直交反応が報告されており（例えば、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．“Ｆｉｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｒｉｇｈｔ（Ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．”ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９（３）：５９２−６０５．）、相補的な反応種を組み込んだペプチドタグ及び追加のエレメントは、本発明の実施形態である。
【０１６２】
本発明の別の実施形態は、天然アミノ酸と反応する反応性基を有するペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及び／またはポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）である。例示的な反応性基としては、システインとの反応のためのマレイミド及びリジンとの反応のためのスクシンイミジルエステルが挙げられる。反応性基のより網羅的なリストは、Ｋｏｎｉｅｖ，Ｏ．ａｎｄ  Ａ．Ｗａｇｎｅｒ（２０１５）．“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｂｏｎｄ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．”Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｒｅｖ  ４４：５４９５−５５５１に見出され得る。これらの反応性基は、ペプチド合成により、またはペプチドタグの他の化学修飾によりペプチド／ジペプチド／トリペプチド／ポリペプチドに化学的または生物学的に導入され得る。幾つかの実施形態では、ペプチドタグは、ペプチド／ジペプチド／トリペプチド／ポリペプチドそれ自身が反応性基と反応することを防止する保護形態（Ｉｓｉｄｒｏ−Ｌｌｏｂｅｔ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．“Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ−Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ．”Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １０９（６）：２４５５−２５０４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））で存在する。これらの反応性基は、選択的な様式で、またはランダムな様式でタンパク質と反応し得、１種のコンジュゲートまたはコンジュゲートの混合物を生じる。幾つかの実施形態では、既定の単一のコンジュゲートまたは混合物のいずれかは、本発明において成功裡に使用され得る。
【０１６３】
追加の要素（例えば、認識要素、相互作用要素など）への化学的コンジュゲーションに好適な反応性基を有する本明細書に記載されるペプチド（例えば、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）及びβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、β９／β１０様ジペプチド、など）の例を、図９５〜９８に示す。反応性基及びペプチド／ジペプチド／トリペプチド／ポリペプチドの他の組み合わせは、本明細書の範囲内である。
【０１６４】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、検出可能な要素、例えば、フルオロフォアまたは蛍光タンパク質に融合またはコンジュゲートされる。かかる実施形態では、生物発光複合体を形成するための補完及び結果として生じる生物発光は、ＢＲＥＴ及び付着された検出可能な要素（例えば、フルオロフォアまたは蛍光タンパク質）の励起／それからの放出をもたらす。かかる実施形態では、生物発光複合体は、ＢＲＥＴエネルギードナーであり、複合体の構成要素（例えば、ペプチドタグまたはポリペプチド構成要素）に付着された検出可能な要素（例えば、フルオロフォアまたは蛍光タンパク質）は、ＢＲＥＴエネルギーアクセプターである。
【０１６５】
本明細書に記載される３分子／多分子補完システムによるＢＲＥＴシステムに使用するための好適なフルオロフォアとしては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：キサンテン誘導体（例えば、フルオレセイン、ローダミン、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、エオシン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄなど）、シアニン誘導体（例えば、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニンなど）、ナフタレン誘導体（例えば、ダンシル及びＰｒｏｄａｎ誘導体）、オキサジアゾール誘導体（例えば、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾキサジアゾール、ベンゾオキサジアゾールなど）、ピレン誘導体（例えば、カスケードブルー）、オキサジン誘導体（例えば、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０など）、アクリジン誘導体（例えば、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンエローなど）、アリールメチン誘導体（例えば、オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーンなど）、テトラピロール誘導体（例えば、ポルフィン、フタロシアニン、ビリルビンなど）、ＣＦ色素（Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＯＵＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤＹＬＩＧＨＴ  ＦＬＵＯＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｅｒｃｅ）、ＡＴＴＯ及びＴＲＡＣＹ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）、ＤＹ及びＭＥＧＡＳＴＯＫＥＳ（Ｄｙｏｍｉｃｓ）、ＳＵＬＦＯ  ＣＹ色素（ＣＹＡＮＤＹＥ、ＬＬＣ）、ＳＥＴＡＵ  ＡＮＤ  ＳＱＵＡＲＥ  ＤＹＥＳ（ＳＥＴＡ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓ）、ＱＵＡＳＡＲ及びＣＡＬ  ＦＬＵＯＲ色素（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳＵＲＥＬＩＧＨＴ  ＤＹＥＳ（ＡＰＣ、ＲＰＥ、ＰｅｒＣＰ、フィコビリソーム）（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＰＣ、ＡＰＣＸＬ、ＲＰＥ、ＢＰＥ（Ｐｈｙｃｏ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）、自家蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ）、量子ドット・ナノクリスタルなど。幾つかの実施形態では、フルオロフォアは、米国特許出願第１３／６８２，５８９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のものなどのローダミン類似体（例えば、カルボキシローダミン類似体）である。
【０１６６】
他の実施形態では、本明細書に記載されるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、検出可能な要素、例えば、フルオロフォアまたは蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）及びそれらのバリアント）に融合またはコンジュゲートされる。他の実施形態では、本明細書に記載されるペプチドタグまたはポリペプチド構成要素は、米国特許第９，９０８，９１８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のものなどのシアン励起性赤橙色蛍光タンパク質（ＣｙＯＦＰ）に融合またはコンジュゲートされる。幾つかの実施形態では、米国特許第９，９０８，９１８号に記載されているＣｙＯＦＰ及びＢＲＥＴシステムは、本明細書に記載されるペプチドタグ及び／またはポリペプチド構成要素と共に用いるのに有用である（例えば、ＣｙＯＦＰ−（β9様ペプチド）、ＣｙＯＦＰ−（β10様ペプチド）、ＣｙＯＦＰ−（β1〜8様ポリペプチド）、ＣｙＯＦＰ−（β9〜10様ペプチド）、ＣｙＯＦＰ−（β9様ペプチド）−ＣｙＯＦＰ、ＣｙＯＦＰ−（β10様ペプチド）−ＣｙＯＦＰ、ＣｙＯＦＰ−（β1〜8様ポリペプチド）−ＣｙＯＦＰ、ＣｙＯＦＰ−（β9〜10様ペプチド）−ＣｙＯＦＰなど）。幾つかの実施形態では、本明細書におけるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及び／またはポリペプチド構成要素に連結されたＣｙＯＦＰを含むかかるシステムは、本明細書において「Ａｎｔａｒｅｓ構築物」または「Ａｎｔａｒｅｓシステム」と称され得る。かかるＢＲＥＴシステムは、特定のイメージング用途に特に有用である（Ｓｃｈａｕｂ，Ｆ．Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）“Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ−ＮａｎｏＬｕｃ  ＢＲＥＴ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒｓ  Ｅｎａｂｌｅ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７５（２３）：５０２３−５０３３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
【０１６７】
他の実施形態では、本明細書に記載されるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、構成的ＢＲＥＴシステム（例えば、Ａｎｔａｒｅｓ様システム）に使用するためのフルオロフォアに（例えば、直接的にまたはリンカーにより）連結される。構成的ＢＲＥＴシステムでは、発光スペクトルは、生物発光スペクトルからフルオロフォアのスペクトルにシフトされる（例えば、より良好な感度、散乱の低減、所望の発光波長などのために）。他の実施形態では、本明細書に記載されるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及び／またはポリペプチド構成要素は、機能的センサー（例えば、細胞／細胞内／細胞間プロセスをモニタリングするための（例えば、カルシウム流量または電圧を検出するための（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）．“Ｆｉｖｅ  ｃｏｌｏｕｒ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｂｒｉｇｈｔ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｕｒ  ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ．”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ７：１３７１８．；Ｉｎａｇａｋｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）．“Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｖｏｌｔａｇｅ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉ−ｐｕｒｐｏｓｅ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｗｉｄｅ  ｒａｎｇｅ  ｏｆ  ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ．”Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ７：４２３９８（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）））、イメージングのための、光遺伝学のための、など）として有用である。
【０１６８】
幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）のうちの２つ以上は、複数の立体構造をとることができる単一の相互作用要素に付着される。ある立体構造では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチドは、発光複合体を形成することができない。立体構造の変化に際して、すなわち、刺激に応答して、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグは、生物発光複合体を形成することができる立体構造となる。一例として、ＳｍＴｒｉｐ９ペプチド及びＳｍＴｒｉｐ１０ペプチドは、ＬｇＴｒｉｐ及びフリマジンの存在下であってもそれらが発光複合体を形成しないようにカルモジュリンにコンジュゲートされ得る。カルシウムへの曝露に際して、カルモジュリンの構造変化により、ＳｍＴｒｉｐ９ペプチド及びＳｍＴｒｉｐ１０ペプチドが、ＬｇＴｒｉｐの添加によりフリマジンの存在下で生物発光性である複合体がもたらされる配置に戻される。カルシウム及び他の刺激（ｐＨ、電圧など）に対する多数の他のバイオセンサーが、文献で知られている。
【０１６９】
幾つかの実施形態では、本明細書におけるシステムは、多重化可能な分析物検出に有用である。幾つかの実施形態では、本発明において有用であるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）は、相互作用要素及びレポーター要素の両方にコンジュゲートされる。幾つかの実施形態では、相互作用要素は抗体などであり、レポーター要素は低分子フルオロフォアである。幾つかの実施形態では、異なる病原体（例えばジカウイルス、デングウイルスなど）に対する抗体が、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９ペプチド）及び異なり、かつ識別可能な波長を有するフルオロフォアにコンジュゲートされる。この実施形態では、抗体のその抗原への結合に際して形成される発光複合体が、生物発光共鳴エネルギー移動により、結合されたフルオロフォアの発光波長で発光する。これは、抗体が全て同一のウェル、装置などに存在するのを可能にし、検出された抗原が何であるかが、形成された発光複合体により発光される光の色により決定されるのを可能にする。
【０１７０】
幾つかの実施形態では、本発明の実施形態において有用であるポリペプチド構成要素（例えば、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）としては、配列番号５及び／または配列番号８由来の１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または追加を有するポリペプチドが挙げられる。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号１１との少なくとも４０％（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超）の配列同一性または類似性を含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号１１と比較して１００以下（例えば、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、またはそれらの間の範囲）の置換（例えば、保存的置換、半保存的置換、非保存的置換など）を含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号１７との少なくとも４０％（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超）の配列同一性または類似性を含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号１７と比較して１００以下（例えば、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、またはそれらの間の範囲）の置換（例えば、保存的置換、半保存的置換、非保存的置換など）を含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号１７、配列番号２１、及び／または配列番号３０２との少なくとも４０％（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超）の配列同一性または類似性を含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号１７、配列番号２１、及び／または配列番号３０２と比較して１００以下（例えば、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、またはそれらの間の範囲）の置換（例えば、保存的置換、半保存的置換、非保存的置換など）を含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号７８８との少なくとも４０％（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超）の配列同一性または類似性を含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号７８８と比較して１００以下（例えば、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、またはそれらの間の範囲）の置換（例えば、保存的置換、半保存的置換、非保存的置換など）を含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号７８９との少なくとも４０％（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％���、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超）の配列同一性または類似性を含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号７８９と比較して１００以下（例えば、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、またはそれらの間の範囲）の置換（例えば、保存的置換、半保存的置換、非保存的置換など）を含む。
【０１７１】
幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、１つ以上の追加の要素（例えば、認識要素、相互作用要素、共局在要素、検出可能な要素（例えば、フルオロフォア（例えば、ＢＲＥＴを促進するための））、関心対象のタンパク質、ＨＡＬＯＴＡＧなど）に連結（例えば、化学的に）または融合される。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、ｃｙＯＦＰ（例えば、米国特許第９，９０８，９１８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のものなどのＡｎｔａｒｅｓ構築物における）または他の蛍光タンパク質（例えば、ＢＲＥＴを促進するための）に連結または融合される。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、ポリペプチド構成要素の追加の要素との化学的コンジュゲーションを促進するための１つ以上の化学修飾及び／または非天然アミノ酸もしくはアミノ酸類似体を含む。
【０１７２】
幾つかの実施形態では、ペプチドタグ（例えば、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）及びβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、β９／β１０様ジペプチド、など）及び／またはペプチド構成要素は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号５１、配列番号３０２（またはこれらの任意の組み合わせ）のうちの１つ以上（例えば、全て）と同一でなく、及び／またはそれらの正確な部分配列でない。他の実施形態では、ペプチドタグ及び／またはペプチド構成要素は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、及び／または配列番号２９、配列番号５１、配列番号３０２（またはこれらの任意の組み合わせ）のうちの１つ以上（例えば、全て）と同一であり、及び／またはそれらの正確な部分配列である。
【０１７３】
幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素（例えば、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、配列番号３の一部に相当し、それとの高い配列同一性（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９９％超、１００％）を含む。例えば、幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号３の１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、または１２位〜１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５２位、１５３位（例えば、１位〜１４８位）に相当し、それとの高い配列同一性（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９９％超、１００％）を含む。
【０１７４】
幾つかの実施形態では、ペプチドタグ（β１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド）は、配列番号３の一部に相当し、それとの高い配列同一性（例えば、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、１００％）を含む。例えば、幾つかの実施形態では、ペプチドタグは、配列番号３の１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６３位、または１６４位〜１６６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、または１７１位（例えば、位１６０位〜１１７位）に相当し、それとの高い配列同一性（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９９％超、１００％）を含む。
【０１７５】
幾つかの実施形態では、ペプチドタグ（β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）ペプチド）は、配列番号３の一部に相当し、それとの高い配列同一性（例えば、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、１００％）を含む。例えば、幾つかの実施形態では、ペプチドタグは、配列番号３の１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５２位、１５３位〜１５４位、１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６３位、または１６４位に相当し、それとの高い配列同一性（例えば、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９９％超、１００％）を含む。
【０１７６】
幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素（例えば、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド））、第１のペプチドタグ（β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）ペプチド）、及び第２のペプチドタグ（β１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド）は、合わせて配列番号３の少なくとも９０％の長さに相当し、それとの高い配列同一性（例えば、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、１００％）を含む。
【０１７７】
幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、配列番号１及び／または配列番号３と比較して１つ以上の置換を含む。例えば、幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号３またはその一部（例えば、配列番号１１、配列番号１７など）との４０％以上（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）の配列同一性を含むが、配列番号１７と比較して４位、３０位、４２位、及び／または１０６位での１つ以上の置換を含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号１７と比較してＥ４Ｄ置換を含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号１７と比較して３０位でのＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹを含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号１７と比較して４２位でのＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、またはＶを含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号１７と比較して１０６位でのＤ、Ｋ、またはＱを含む。
【０１７８】
幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、配列番号１９、２１、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、及び１３１（またはそれらのβ１〜５様、β１〜６様、もしくはβ１〜７様部分）のうちの１つ以上との７０％以上（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれらの間の範囲）の配列同一性及び／または配列類似性を含む人工配列である。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号１９、２１、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、及び１３１（またはそれらのβ１〜５様、β１〜６様、もしくはβ１〜７様部分）のうちの１つの全体または一部（例えば、５０アミノ酸、６０アミノ酸、７０アミノ酸、８０アミノ酸、９０アミノ酸、１００アミノ酸、１１０アミノ酸、１２０アミノ酸、１３０アミノ酸、１４０アミノ酸以上、またはそれらの間の範囲）を含む人工配列である。幾つかの実施形態では、ポリペプチド構成要素は、配列番号１９、２１、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、及び１３１（またはそれらのβ１〜５様、β１〜６様、もしくはβ１〜７様部分）のうちの１つからなる配列である。
【０１７９】
幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）は、表１、表９、表１０に列挙するペプチド配列またはそれらのジペプチド／トリペプチド組み合わせのうちの１つ以上との７０％以上（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれらの間の範囲）の配列同一性及び／または配列類似性を含む人工配列である。幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ構成要素は、表１、表９、表１０に列挙するペプチド配列またはそれらのジペプチド／トリペプチド組み合わせのうちの１つの全体または一部（例えば、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸以上、またはそれらの間の範囲）を含む人工配列である。幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ構成要素は、表１、表９、表１０に列挙するペプチド配列またはそれらのジペプチド／トリペプチド組み合わせのうちの１つからなる配列である。
【０１８０】
幾つかの実施形態では、本明細書における範囲内の生物発光複合体のペプチド／ジペプチド／トリペプチド構成要素のうちの１つ以上は、本明細書において、ペプチド／ジペプチド／トリペプチド（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）と称されるが、相互作用要素、共局在要素、結合作用物質、関心対象のタンパク質、関心対象の分子、または任意の他の部分に付着されない。幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチド構成要素の一方または両方は、別の要素に融合または別様に係留されることなくポリペプチド及び他のペプチド／ジペプチド／トリペプチド構成要素と相互作用して、発光複合体を形成する。
【０１８１】
幾つかの実施形態では、発光複合体のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）、共局在要素、及び／または相互作用要素は、合成ペプチド／ポリペプチド、１つ以上の非天然アミノ酸を含有するペプチド／ポリペプチド、１つ以上のアミノ酸類似体を含有するペプチド／ポリペプチド、ペプチド／ポリペプチド類似物、コンジュゲート型合成ペプチド（例えば、官能基（例えば、フルオロフォア、発光基質など）にコンジュゲートされた）などを含む。
【０１８２】
本明細書において、基礎研究、医学研究、分子診断学などが含まれる種々の分野において有用である組成物及び方法が提供される。本明細書に記載される試薬及びアッセイは任意の特定用途に限定されず、任意の有用な用途は本発明の範囲内であるとみなされるべきであるが、以下は、本明細書にて特許請求される本発明を利用する例示的なアッセイ、キット、分野、実験構成などである。
【０１８３】
本明細書における実施形態を利用する典型的用途は、タンパク質の二量体化（例えば、ヘテロ二量体、ホモ二量体）、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ＲＮＡ相互作用、タンパク質−ＤＮＡ相互作用、抗体（または他の認識要素）の標的への結合、核酸ハイブリダイゼーション、タンパク質−低分子相互作用のモニタリング／検出、分析物の定量化もしくは検出、または分子実体の任意の他の組み合わせを伴う。例示的な実施形態では、関心対象の第１の実体が、第１のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）に付着され、関心対象の第２の実体が、第２のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）に付着される。検出可能なシグナルが、特定のアッセイ条件下で（例えば、発光複合体のポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）及びセレンテラジンまたはセレンテラジン類似体基質の存在下で）生成される場合、第１及び第２の実体の相互作用及び／または共局在が推測される。かかるアッセイは、任意の好適な条件下（例えば、インビトロ、インビボ、生体内原位置、動物全体など）で分子相互作用及び／または局在化をモニタリングするのに有用であり、例えば、創薬、分子経路の解明、複合体アセンブリの平衡または動態側面の研究、高スループットスクリーニング、近接センサーなどにおいて有用である。
【０１８４】
幾つかの実施形態では、本明細書において提供されるシステム及び方法は、分析物、複数の分析物、分析物の共局在、及び／または分析物の分子相互作用の検出、定量化、解析、特徴付けなどに有用である。幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）は、分析物に係留／融合される。幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグは、標的分析物に結合する認識要素物質に係留／融合される。
【０１８５】
本明細書における実施形態において有用である（例えば、分析される）好適な分析物としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）、タンパク質（例：細菌抗原、ウイルス抗原、バイオマーカー、抗体など）、低分子、毒素、バイオマーカー、環境汚染物または食品汚染物、界面活性剤、病原体（例えば、ウイルス抗原及びタンパク質、細菌抗原及びタンパク質など）、薬物（例えば、治療薬、依存性薬物など）、ビタミン、サイトカイン、抗体（例えば、自己抗体、感染症曝露、治療薬物モニタリング、抗ＨＬＡ移植拒絶など）、細胞、細胞受容体タンパク質、バイオマーカーベースの診断薬、セルフリー核酸及び非セルフリー核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）、核酸のＳＮＰ、抽出核酸、非増幅核酸試料、ゲノムＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、細菌の耐性遺伝子、免疫複合体（例えば、抗原：抗体複合体；抗原：補体複合体など）、血糖、ホルモン、代謝産物、微生物、寄生生物、酵素、転写因子、金属イオン／重金属など。
【０１８６】
本明細書における実施形態において有用である（例えば、ペプチドタグに融合／係留される、分析物に結合する、など）好適な認識要素または結合部分としては、以下のものが挙げられるが、それれらに限定されない：抗体（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、動物由来抗体、自己抗体、生物学的製剤など）、抗体可変重鎖、抗体可変軽鎖、抗体結合断片（Ｆａｂ）［Ｆ（ａｂ）´２］、ラクダ科動物抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単量体タンパク質、受容体ドメイン、アフィボディ、モノボディ、天然及び誘導体化核酸アプタマー（例えば、ＲＮＡアプタマー、ＤＮＡアプタマー、化学修飾アプタマーなど）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、プロテインＡ、Ｇ、Ｌ、Ｍ、及び／またはそれらのドメイン、配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブなど）、低分子薬物、抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、ＤＡＲＰｉｎ、ナノボディ、アフィマー、Ａｄｈｉｒｏｎ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ、ファージ、磁気粒子（例えば、直接的に標識されたか、またはタグ付けされた認識要素により標識された）、直接的に標識されたか、またはタグ付けされた認識要素、ストレプトアビジン、抗原により標識されたナノ粒子（例えば、ポリスチレンナノ球体など）など。
【０１８７】
幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、オリゴヌクレオチド認識要素または結合部分に連結される。かかる構築物は、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）補完法及び／または検出において有用であり得る。例示的なペプチド／オリゴマープローブを、図９９に示す。かかる例示的な構築物では、反応性基（例えば、アジド基（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端、内部など）または本明細書における他の反応性基）を含むペプチド／ジペプチド／トリペプチドが、相補的な反応性基（例えば、アルキン基（例えば、５’側末端、３’側末端、内部など）または本明細書における他の反応性基）を含むオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる。例示的な実施形態では、ペプチド−オリゴヌクレオチドプローブは、構成要素及び試薬（例えば、オリゴヌクレオチド（１ｍｇ、１６１ｎｍｏｌ、水中）、酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（４０ｕＬ、水中１Ｍ）；塩酸アミノグアニジン（８ｕＬ、水中５０ｍＭ）、ペプチド（２．８ｍｇ、１．９３ｕｍｏｌ、ＤＭＳＯ中）、銅（ＩＩ）・ＴＢＴＡ溶液（１：１の水／ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）；アスコルビン酸溶液（水中５０ｍＭ）、最終容量３００ｕＬ、１：１の水：ＤＭＳＯ）を組み合わせること、ボルテックスすること及び６０℃で３０分間加熱すること、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＮＡＰ−５カラムを使用して濾過すること、緩衝液をＲＮアーゼ及びＤＮアーゼを含まないＴＥ緩衝液に交換すること、ならびに−２０℃で保存することによって調製される。分子相互作用がモニタリング／検出される実施形態では、お互いに対して親和性を有するペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチド構成要素が選択され、その結果、付随する第１及び第２の実体の相互作用（例えば、結合）に際してシグナルの顕著な増加が検出可能／測定可能となる。幾つかの実施形態では、一方または両方（またはそれ以上）のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグが、付随する第１及び第２の実体間の相互作用（例えば、結合）の非存在下ではバックグラウンド発光のみが検出されるほどに、他方のペプチドタグ及び／またはポリペプチド構成要素に対する十分に低い親和性を有する。他の実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチド構成要素は、付随する第１及び第２の実体間の相互作用の非存在下で複合体を形成して、シグナルを生成するが、当該シグナルは、付随する第１及び第２の実体の相互作用（例えば、結合）に際して増加する（例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１０2倍、１０3倍、１０4倍、１０5倍、１０6倍以上、またはそれらの間の範囲）。
【０１８８】
共局在がモニタリング／検出される実施形態では、お互いに対して親和性を有するペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）が選択され、その結果、付随する第１及び第２の実体の相互作用（例えば、結合）の非存在下であっても発光複合体からのシグナルが検出可能／測定可能となる。かかる実施形態では、付随する第１及び第２の実体が共局在する場合（例えば、同一組織内、同一細胞内、同一細胞内区画内などにおいて）、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチド構成要素は、第１及び第２の実体が互いに相互作用するか否かにかかわらず、複合体を形成して、シグナルを放出する（セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体の存在下で）。幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグのうちの２つ以上（例えば、両方とも、全て）は、付随する第１及び第２の実体間の相互作用（例えば、結合）の非存在下で発光が検出されるほどに他の構成要素に対する十分に高い親和性を有する。幾つかの実施形態では、第１及び第２の実体の相互作用に際してシグナルの顕著な増加は、検出されない。他の実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチド構成要素は、付随する第１及び第２の実体間の相互作用の非存在下で複合体を形成して、シグナルを生成するが、当該シグナルは、付随する第１及び第２の実体の相互作用（例えば、結合）に際して増加する（例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１０2倍、１０3倍、１０4倍、１０5倍、１０6倍以上、またはそれらの間の範囲）。
【０１８９】
幾つかの実施形態では、既知の特性（例えば、スペクトル特性、相互親和性など）を有するペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）が、関心対象の相互作用対の親和性を解明するため、またはその相互作用を理解するために使用される。他の実施形態では、十分に特徴付けられた相互作用対が、１組のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチド構成要素の１つ以上の要素の特性（例えば、スペクトル特性、相互親和性など）を決定するために使用される。幾つかの実施形態では、既知の特性（例えば、スペクトル特性、相互親和性など）を有するペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチド構成要素が、関心対象の共局在対の（例えば、所望の条件下での）共局在を特徴付け／モニタリングするために使用される。
【０１９０】
本明細書に記載される実施形態は、薬剤スクリーニング及び／または薬剤開発において有用であり得る。例えば、低分子薬物または低分子の全ライブラリーの、１つ以上の関連する条件（例えば、生理的条件、疾患状態など）下での関心対象の標的タンパク質（例えば、治療標的）との相互作用がモニタリングされる。かかるアッセイは、候補薬物（または候補のライブラリー）に付着された第１のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）、及び治療標的に付着された第２のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）を含み得、ポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）及び基質の存在下での発光により候補及び標的の相互作用及び／または共局在が示される。
【０１９１】
本明細書における幾つかの実施形態は、診断現場または犯罪現場において、薬物（例えば、ヒトにおける依存性薬物）をモニタリングするだけでなく、生体試料での患者の治療薬モニタリングをするのに有用である。例えば、分析薬物を認識する、２つのペプチド／ジペプチド／トリペプチドにタグ付けされた結合部分（例えば、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチドに別々にタグ付けされた結合部分）は、かかる実施形態を容易にする。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるシステムにおけるペプチド／ジペプチド／トリペプチドにタグ付けされた標的を利用する、試料中のタグ付けされていない標的を同定するための競合的置換アッセイは、本明細書における実施形態において有用である。幾つかの実施形態は、例えば、特定の薬物または他の特定の汚染物質（例えば、低分子汚染物質）により汚染されている土壌試料、上水道など、環境汚染を検出するのに有用である。
【０１９２】
他の実施形態では、薬物（例えば、低分子薬物）または薬物（例えば、低分子）の全ライブラリーの、２つの実体間（例えば、受容体及びリガンド、タンパク質−タンパク質など）の相互作用を増強または阻害する能力が分析される（例えば、生物発光シグナルの増加または減少により）。幾つかの実施形態では、薬剤スクリーニング応用が、数千もしくは数万種の異なる分子の標的への結合の検出を可能にするため、またはそれらの分子の他の実体の結合に対する効果を試験するために、高スループットフォーマットで実施される。
【０１９３】
幾つかの実施形態では、生体（例えば、細菌、酵母、真核生物、哺乳動物、霊長類、ヒトなど）及び／または細胞における分子相互作用の検出が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、相互作用（標的）ポリペプチドに融合されたペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）が細胞または生物体全体において共発現され、シグナルが、ポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）及び基質（例えば、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体）の存在下で検出され、ここで、当該シグナルは、相互作用複合体の形成と相関する。幾つかの実施形態では、細胞が、ペプチドタグ及び相互作用要素を含む融合物をコードするベクター（複数可）で一過性に及び／または安定的に形質転換または形質移入される。幾つかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲが、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及び相互作用要素を含む融合物を発現する細胞を作製するために利用される。幾つかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲにより作製された融合物（例えば、細胞内標的及び本明細書に記載されるペプチド／ジペプチド／トリペプチドまたはポリペプチドの融合物）が、内因性のタンパク質（例えば、融合されていない細胞内標的）と入れ替わり、内因性のタンパク質と同様の様式で調節される。幾つかの実施形態では、かかる内因的なタグ付けが、特に、複雑な系、例えば、生細胞、生物体全体などにおける内因的にタグ付けされたタンパク質のレベルをモニタリングするために使用される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるアッセイを実施するのに必要な融合物（例えば、ペプチドタグ及び相互作用要素を含む融合物）をコードするトランスジェニック生物が作製される。他の実施形態では、ベクターが、生物体全体に注入される。
【０１９４】
幾つかの実施形態では、生体（例えば、細菌、酵母、真核生物、哺乳動物、霊長類、ヒトなど）及び／または細胞における分子共局在の検出が本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、共局在（標的）ポリペプチドに融合されたペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）が細胞または生物体全体において共発現され、シグナルが、ポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）及び基質（例えば、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体）の存在下で検出され、ここで、当該シグナルは、共局在要素の共局在と相関する。幾つかの実施形態では、細胞が、ペプチドタグ及び共局在要素を含む融合物をコードするベクター（複数可）で一過性に及び／または安定的に形質転換または形質移入される。幾つかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲが、ペプチドタグ及び共局在要素を含む融合物を発現する細胞を作製するために利用される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるアッセイを実施するのに必要な融合物（例えば、ペプチドタグ及び共局在要素を含む融合物）をコードするトランスジェニック生物が作製される。他の実施形態では、ベクターが、生物体全体に注入される。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、細胞が、１つ以上のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）、ポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）、またはそれらの（例えば、細胞内標的との）融合物を発現するように遺伝子導入技術または他の遺伝子操作技術を使用して操作される。例えば、細胞は、１つ以上のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（ポリペプチド構成要素）またはその（例えば、細胞内標的との）融合物を発現するようにＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）などの遺伝子編集方法を使用して遺伝子操作され得る。本明細書で使用する場合、「ＣＲＩＳＰＲ」または「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９」という用語は、ゲノムの特定の区間を標的とし、正確な位置でＤＮＡを編集するようにプログラムされ得る様々なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９及びＣＲＩＳＰＲ−ＣＰＦ１（及び他の）システムを指す。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集システムは、原核生物のＩＩ型のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）適応免疫系由来のＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９ヌクレアーゼに基づく（例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６（２０１２）、Ｇａｓｉｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｔ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０９，Ｅ２５７９（２０１２）、Ｇａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４６８：６７（２０１０）、Ｄｅｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，６４：４７５（２０１０）、Ｈｏｒｖａｔｈ  ａｎｄ  Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２７：１６７（２０１０）、Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９，４６７（２０１１）、Ｂｈａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，４５，２７３（２０１１）、及びＣｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９：８１９−８２３（２０１３）（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムは、真核細胞における関心対象の特定の遺伝子の標的改変を可能にするように開発されている（例えば、Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）、Ｘｉａｏ−Ｊｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．，５２（５）：２８９−９６（２０１５）、米国特許第８，６９７，３５９号、Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，２４（９）：１５２６−１５３３（２０１４）、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，３３（５）：１４７０−１４７９（２０１５）、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２３（３）：５７０−  ５７７（２０１５）、及び米国特許出願第２０１４／００６８７９７号（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。遺伝子編集のためにＣＲＩＳＰＲ技術を利用する方法は、例えば、Ｂａｒｒａｎｇｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１５，１７���９−１７１２（２００７）、Ｂｏｌｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５１，２５５１−２５６１（２００５）、Ｂｒｏｕｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１，９６０−９６４（２００８）、Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７１，６０２−６０７（２０１１）；Ｇａｓｉｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）、Ｈａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １３９，９４５−９５６（２００９）、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，８１６−８２１（２０１２）、Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｄｉｒｅｃｔ  ２００６，１：７（２００６）、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８２３−８２６（２０１３）、Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２，１８４３−１８４５（２００８）、Ｍｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ６０，１７４−１８２（２００５）；Ｐｏｕｒｃｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５１，６５３−６６３（２００５）、及びＳａｐｒａｎａｕｓｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９，ｇｋｒ６０６−ｇｋｒ９２８２（２０１１）（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）において記載されている。
【０１９６】
幾つかの実施形態では、１つ以上のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）が、タンパク質タグとして用いられる（例えば、細胞内で、動物個体内で）。かかる実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（複数可）に対する相補的な構成要素（例えば、ポリペプチド構成要素、他のペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ、基質）が、タグ付けされたタンパク質の存在を検出／定量化するために系（例えば、細胞、動物など）に（例えば、試薬の一部として）加えられる。
【０１９７】
幾つかの実施形態では、本明細書における小さいサイズのペプチドタグ（例えば、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）及びβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド）が、タンパク質のタグ付けに有用である。
【０１９８】
幾つかの実施形態では、本明細書における生物発光複合体の構成要素（例えば、本明細書におけるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）、ポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、好適な緩衝液中に長期間存在するのに十分安定である（例えば、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体（例えば、フリマジン）基質の存在下で）。ある特定の実施形態では、本明細書における生物発光複合体の構成要素（例えば、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ、ポリペプチド構成要素など）は、補完構成要素の非存在下で最小限の検出可能な発光を示す（例えば、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体（例えば、フリマジン）基質の存在下であっても）。幾つかの実施形態では、タンパク質のタグ付けに必要な基準を満たすために最適化された緩衝液条件が利用される。
【０１９９】
本明細書において提供される組成物及び方法、ならびにそれらに基づく任意の技法または技術は、種々の用途及び分野において有用である。
【０２００】
本明細書において、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）ならびにそれらから形成される生物発光複合体の設計及び／または最適化のための方法が提供される。本明細書に記載される実施形態と適合する非発光性対／群及び／またはそのパネルの設計のための任意の好適な方法は、本明細書の範囲内である。幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチド構成要素ならびにその組み合わせの特性は、置換（例えば、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体の置換など）により最適化され、かかる特徴としては、構造安定性（例えば、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグまたはポリペプチド構成要素の構造安定性、複合体の構造安定性など）、発現、粘着性（例えば、チューブ、ウェルなどへの）、明るさ（またはそれらから形成される複合体）、生物発光複合体の他の構成要素に対する親和性、溶解性、熱及び化学安定性、弱い自家発光などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０１】
ある特定の実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、個々が発光せず、会合に際して発光を示すように新たに設計される。かかる実施形態では、非発光性要素間の相互作用の強さは、生物発光複合体の形成を促進する相互作用要素の非存在下では、生物発光シグナルを生成するのに不十分である。他の実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチド構成要素及び／またはそれらの生物発光複合体は、例えば、生物発光タンパク質を出発点として使用して合理的に設計される。例えば、かかる方法は、以下を含み得る：（ａ）３つ以上の関連するタンパク質の配列をアラインメントすること、（ｂ）当該関連するタンパク質のコンセンサス配列を決定すること、（ｃ）当該コンセンサス配列が決定されたものに関連する生物発光タンパク質の断片（例えば、１つ以上のペプチド／ジペプチド／トリペプチド及びポリペプチド）を提供することであって、当該断片が、それぞれ実質的に非発光性であるが、当該断片の相互作用に際して発光を示す、当該提供すること、及び（ｄ）会合していない場合の発光の欠如及び非発光性対の会合に際した発光について断片を試験すること。幾つかの実施形態では、断片は、１つ以上の位置で変異導入される（例えば、インビトロで、インシリコで、など）、ここで、当該変異は、断片の配列を変化させ、特性の最適化をもたらす。
【０２０２】
幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグは、「暗ペプチド（ｄａｒｋ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」、すなわち他のペプチドタグ及びポリペプチド構成要素と（例えば、低親和性または高親和性により）複合体を形成するが、ほとんどまたは全く発光を生成しないものである。幾つかの実施形態では、高親和性暗ペプチド／ジペプチド／トリペプチドは、バイオセンサーのための、または阻害剤を測定するための逆補完法またはシグナル獲得型アッセイにおいて有用である。幾つかの実施形態では、低親和性暗ペプチド／ジペプチド／トリペプチドは、高親和性明ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグの複合体への結合の検出のために、当該複合体のバックグラウンド発光を減少させるために使用される。
【０２０３】
幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグは、「クエンチャーペプチド」、すなわちクエンチャー部分（例えば、ＤＡＢ）を含有するものであり、クエンチャーは、ポリペプチド構成要素（例えば、補完ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグとは無関係に生成されるシグナル）及び／または生物発光複合体の一方または両方により生成される光／エネルギーを吸収する。
【０２０４】
幾つかの実施形態では、本明細書における発光複合体は、複合体とフルオロフォア（例えば、低分子フルオロフォア、蛍光タンパク質（例えば、ｃｙＯＦＰ））との間のＢＲＥＴを利用するシステム、方法、アッセイ、装置などにおいて有用である。幾つかの実施形態では、フルオロフォア（例えば、低分子フルオロフォア、蛍光タンパク質（例えば、ｃｙＯＦＰ））は、分析物、細胞内標的などに連結または融合される。幾つかの実施形態では、フルオロフォア（例えば、低分子フルオロフォア、蛍光タンパク質（例えば、ｃｙＯＦＰ））は、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及び／またはポリペプチド構成要素に連結または融合される。幾つかの実施形態では、エネルギーが、生物発光複合体からエネルギーアクセプターに伝達される。ある特定の実施形態では、エネルギーアクセプターは、フルオロフォアまたは他の検出可能な発色団である。好適なフルオロフォアとしては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：キサンテン誘導体（例えば、フルオレセイン、ローダミン、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、エオシン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄなど）、シアニン誘導体（例えば、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニンなど）、ナフタレン誘導体（例えば、ダンシル及びＰｒｏｄａｎ誘導体）、オキサジアゾール誘導体（例えば、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾキサジアゾール、ベンゾオキサジアゾールなど）、ピレン誘導体（例えば、カスケードブルー）、オキサジン誘導体（例えば、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０など）、アクリジン誘導体（例えば、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンエローなど）、アリールメチン誘導体（例えば、オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーンなど）、テトラピロール誘導体（例えば、ポルフィン、フタロシアニン、ビリルビンなど）、ＣＦ色素（Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＯＵＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤＹＬＩＧＨＴ  ＦＬＵＯＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｅｒｃｅ）、ＡＴＴＯ及びＴＲＡＣＹ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）、ＤＹ及びＭＥＧＡＳＴＯＫＥＳ（Ｄｙｏｍｉｃｓ）、ＳＵＬＦＯ  ＣＹ色素（ＣＹＡＮＤＹＥ、ＬＬＣ）、ＳＥＴＡＵ  ＡＮＤ  ＳＱＵＡＲＥ  ＤＹＥＳ（ＳＥＴＡ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓ）、ＱＵＡＳＡＲ及びＣＡＬ  ＦＬＵＯＲ色素（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳＵＲＥＬＩＧＨＴ  ＤＹＥＳ（ＡＰＣ、ＲＰＥ、ＰｅｒＣＰ、フィコビリソーム）（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＰＣ、ＡＰＣＸＬ、ＲＰＥ、ＢＰＥ（Ｐｈｙｃｏ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）、自家蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ）、量子ドット・ナノクリスタルなど。幾つかの実施形態では、フルオロフォアは、米国特許出願第１３／６８２，５８９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のものなどのローダミン類似体（例えば、カルボキシローダミン類似体）である。幾つかの実施形態では、フルオロフォアは、低分子フルオロフォアであり、フルオロフォアに関して述べている本明細書における実施形態は、低分子フルオロフォアとして読まれ得るか、またはそれに限定され得る。幾つかの実施形態では、フルオロフォアは、蛍光タンパク質（例えば、ｃｙＯＦＰ、ＧＦＰ、ＣＦＰなど）であり、フルオロフォアに関して述べている本明細書における実施形態は、蛍光タンパク質（例えば、ｃｙＯＦＰ、ＧＦＰ、ＣＦＰなど）として読まれ得るか、またはそれに限定され得る。
【０２０５】
各種の実施形態では、本明細書に記載される生物発光複合体及びその構成要素は、種々の異なる免疫アッセイコンセプトにおいて有用である。例えば、幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）は、特定の分析物の検出方法を提供するために、一次または二次抗体に係留／融合される。別の例として、ペプチドタグは、抗体結合タンパク質（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）に係留／融合され、特定の分析物に結合した特異的抗体を検出するために使用される（例えば、ここで当該分析物は、相補的なペプチドタグに結合されている）。別の例として、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグは、ストレプトアビジンに係留／融合され、特定の分析物に結合した特異的なビオチン化抗体を検出するために使用される（例えば、ここで当該分析物は、相補的なペプチドタグに結合されている）。更に別の例として、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグは、一次及び二次抗体に係留／融合され、ここで、当該一次抗体は特定の分析物を認識し、当該二次抗体は当該一次抗体を認識する。更に別の例として、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグは、分析物に係留／融合され、競合サンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットで使用される。分析物に係留／融合／コンジュゲートされたペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグは、当該分析物と結合することができる抗体を検出するためにも使用され得る。
【０２０６】
本明細書における種々の実施形態は、免疫アッセイによる低分子検出において有用である。例示的実施形態は、本明細書に記載される第１のペプチド／ジペプチド／トリペプチドで直接的に標識された（例えば、標的低分子と同一または類似の）低分子及び本明細書に記載されるペプチド／ジペプチド／トリペプチドに融合または連結された、標的低分子に対する結合部分の使用を含む。ポリペプチド構成要素及び基質（例えば、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体）の存在下で、生物発光シグナルが系により生成される。システムが試料（例えば、生体試料、環境試料など）に曝露される際に、低分子標的が当該試料中に存在する場合、生物発光シグナルが低減される（標識低分子が競合により複合体から離れ、場合によっては、低分子標的の定量化が可能となる）。かかるアッセイの代替的構成も本明細書の範囲内である。幾つかの実施形態では、標的低分子は、毒素（例えば、マイコトキシンなど）、代謝産物（例えば、アミノ酸、グルコース分子、脂肪酸、ヌクレオチド、コレステロール、ステロイドなど）、ビタミン（例えば、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、アスコルビン酸、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＨ、またはビタミンＫなど）、補酵素または補因子（例えば、補酵素Ａ、補酵素Ｂ、補酵素Ｍ、補酵素Ｑ、シチジン三リン酸、アセチル補酵素Ａ、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、ニコチンアミドアデニン（ＮＡＤ＋）、ヌクレオチドアデノシン一リン酸、ヌクレオチドアデノシン三リン酸、グルタチオン、ヘム、リポアミド、モリブドプテリン、３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸、ピロロキノリンキノン、テトラヒドロビオプテリンなど）、バイオマーカーまたは抗原（例えば、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、フェリチン、葉酸、ヘモグロビン、アルカリホスファターゼ、トランスフェリン、アポリポタンパク質Ｅ、ＣＫ、ＣＫＭＢ、副甲状腺ホルモン、インスリン、コレステロールエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）、サイトカイン、シトクロムｃ、アポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質ＡＩＩ、アポリポタンパク質ＢＩ、アポリポタンパク質Ｂ−１００、アポリポタンパク質Ｂ４８、アポリポタンパク質ＣＩＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｅ、トリグリセリド、ＨＤコレステロール、ＬＤＬコレステロール、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ、パラオキソナーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ＣＥＡ、ＨＥＲ−２、膀胱腫瘍抗原、チログロブリン、アルファフェトプロテイン、ＰＳＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１９．９、ＣＡ１５．３、レプチン、プロラクチン、オステオポンチン、ＣＤ９８、ファシン、トロポニンＩ、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＣＤ３３、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＡなど）、薬物（カンナビノイド（例えば、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、カンナビジオール（ＣＢＤ）、及びカンナビノール（ＣＢＮ）など）、オピオイド（例えば、ヘロイン、アヘン、フェンタニールなど）、刺激剤（例えば、コカイン、アンフェタミン、メタンフェタミンなど）、クラブドラッグ（例えば、ＭＤＭＡ、フルニトラゼパム、γ‐ヒドロキシ酪酸など）、解離性薬物（例えば、ケタミン、フェンシクリジン、サルビア、デキストロメトルファンなど）、幻覚剤（例えば、ＬＳＤ、メスカリン、プシロシビンなど）など）、爆発物（例えば、２，４，６−トリニトロトルエン（ＴＮＴ）及びヘキサヒドロ−１，３，５−トリニトロ−１，３，５−トリアジン（ＲＤＸ）、硝酸ペンタエリスリトール（ＰＥＴＮ）など）、毒性化学物質（例えば、タブン（ＧＡ）、サリン（ＧＢ）、ソマン（ＧＤ）、シクロサリン（ＧＦ）、２−（ジメチルアミノ）エチル＝Ｎ，Ｎ−ジメチルホスホロアミドフルオリダート（ＧＶ）、ＶＥ、ＶＧ、ＶＭ、ＶＰ、ＶＲ、ＶＳ、またはＶＸ神経ガス）などである。
【０２０７】
本明細書に記載されるシステム及び方法は、多種多様な用途及び形態において有用である。以下は、本明細書に記載されるシステムを利用する方法及び形態の非網羅的、例示的な例である。
【０２０８】
●幾つかの実施形態では、従来の遺伝子導入により融合物として発現されるか、またはＣＲＩＳＰＲにより内因的にタグ付けされたタンパク質として発現されるＳｍＴｒｉｐペプチドにより標識されたタンパク質を用いる、動的なタンパク質−タンパク質相互作用の解析のための細胞内の２つのタンパク質によるシステムが本明細書において提供される。ＬｇＴｒｉｐが、ＬｇＴｒｉｐを発現する安定細胞株を提供するＬｇＴｒｉｐの同時形質移入またはＬｇＴｒｉｐを当該検出試薬中に提供すること、及びそれをＳｍＴｒｉｐにより標識されたタンパク質を発現する溶解された細胞に添加することのいずれかにより検出試薬として使用され得る（図５１Ａ）。
【０２０９】
●幾つかの実施形態では、従来の遺伝子導入により融合物として発現されるか、またはＣＲＩＳＰＲにより作製された内因的にタグ付けされたタンパク質として発現されるＳｍＴｒｉｐにより標識されたタンパク質及びＬｇＴｒｉｐにより標識されたタンパク質を用いる、動的なタンパク質−タンパク質相互作用の解析のための細胞内の３つのタンパク質によるシステムが本明細書において提供される（図５１Ｂ）。
【０２１０】
●幾つかの実施形態では、シグナル獲得型アッセイのための結合部分Ａ及び結合部分Ｂ（表Ａを参照のこと。精製された遺伝子融合物または化学的にコンジュゲートされたＳｍＴｒｉｐ９もしくはＳｍＴｒｉｐ１０ペプチド）を用いる分析物Ｘを測定するための標的特異的アッセイが本明細書において提供される（例えば、診断試験、非細胞性など）（図５１Ｃ）。
【０２１１】
●幾つかの実施形態では、シグナル損失による分析物測定のための標的特異的競合アッセイが本明細書において提供される（例えば、診断試験、非細胞性など）（図５１Ｄ）。かかるシステムは、タグ付けされた標的分析物と結合して、検出試薬の一部として提供され得るＬｇＴｒｉｐ及びセレンテラジン基質またはセレンテラジン類似体の存在下で、光を生成する精製された結合部分Ａ（例えば、合成ＳｍＴｒｉｐ９またはＳｍＴｒｉｐ１０ペプチドを含む、精製された遺伝子融合物または化学的コンジュゲート）を使用する。試料分析物Ｘの存在下で、ＳｍＴｒｉｐ９またはＳｍＴｒｉｐ１０ペプチドは、当該試料分析物Ｘと競合して、試料中の試料分析物の存在に特異的な、かつ分析物の濃度と比例したシグナルの損失を引き起こす。
【０２１２】
●幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）のうちの２つまたは３つが、同一標的分析物上の近位であるが、重複しない（相互に排他的な、または別個の）エピトープに対する認識要素に連結（または融合）される。発光複合体から（例えば、基質の存在下で）生成されるシグナルは、標的分析物の存在を示す。
【０２１３】
●幾つかの実施形態では、本明細書におけるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、免疫アッセイまたは様々なフォーマットにおいて有用である。本明細書におけるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ及びポリペプチド構成要素を用いる免疫アッセイは、全長抗体に限定されず、抗体断片または抗体でない結合部分（例えば、ＤＡＲＰｉｎ、アプタマー、アフィマーなど）も用い得る。例示的な直接免疫アッセイ（図５１Ｅを参照のこと）において、分析物に対する２つのモノクローナルまたは組換え抗体（ｍＡｂまたはｒＡｂｓ）が、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）及びβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチドタグで標識され、発光複合体のポリペプチド構成要素（例えば、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、検出試薬の一部として（例えば、基質と共に）含まれる。例示的な間接免疫アッセイ（図５１Ｆを参照のこと）では、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）及びβ１０様（ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチドタグで標識された汎用試薬が、分析物に特異的な任意の対での抗体系（例えば、ｍＡｂまたはｒＡｂ＋Ｂｉｏｔｉｎ−ｐＡｂ、Ｂｉｏｔｉｎ−ｍＡｂ、またはＢｉｏｔｉｎ−ｒＡｂなど）と組み合わせて使用され、発光複合体のポリペプチド構成要素は、検出試薬の一部として（例えば、基質と共に）含まれる。例示的な競合直接免疫アッセイ（図５１Ｇを参照のこと）は、１つの抗体を第１のペプチドタグ（β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド）で標識し、分析物を第２のペプチドタグ（β１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）またはβ９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）ペプチド）で標識することによって提供され、発光複合体のポリペプチド構成要素（例えば、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、検出試薬の一部として（例えば、基質と共に）含まれ、シグナル損失は、非標識の標的分析物の存在を示す。競合間接免疫アッセイ（図５１Ｈを参照のこと）を提供するために、１つの抗体が第１のペプチドタグ（β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド）で標識され、汎用結合試薬（例えば、ストレプトアビジン）が第２のペプチドタグ（β１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）またはβ９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）ペプチド）で標識され、分析物が一般結合試薬（例えば、ビオチン）に対する結合部分で標識され、発光複合体のポリペプチド構成要素が、検出試薬の一部として（例えば、基質と共に）含まれ、シグナル損失は、非標識の試験分析物の存在を示す。本明細書に記載される他のペプチド／ジペプチド／トリペプチド／ポリペプチド組み合わせを利用する代替的免疫アッセイは、本発明の範囲内である。
【０２１４】
●幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）で標識された認識要素を、（例えば、発光複合体の基質に加えて）検出試薬の構成要素としてのポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）と共に使用する均一アッセイが本明細書において提供される。
【０２１５】
●幾つかの実施形態では、ペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９、ＳｍＴｒｉｐ１０など）で標識され、及び／またはポリペプチド構成要素で標識された（例えば、ＬｇＴｒｉｐバリアント）認識要素を利用する均一アッセイが本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、均一アッセイは、単一の分析物または複数の分析物の検出／定量化のために提供される。
【０２１６】
●幾つかの実施形態では、本明細書におけるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）が、サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、標的の増幅なし、増幅あり、など）において有用である。
【０２１７】
●幾つかの実施形態では、本明細書におけるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）が、液／溶液相または固相中の分析物（複数可）の検出において有用である。
【０２１８】
●幾つかの実施形態では、本明細書におけるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）が、表面ベースのアッセイ（例えば、プレートベース（例えば、マイクロタイタープレート）、紙ベース（例えば、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓａｖｅｒ  ９０３カード）、プラスチックベース、スワブベース、キュベットベース、膜ベース（例えば、ＰＶＤＦ、ニトロセルロースなど）などにおいて有用である。
【０２１９】
●幾つかの実施形態では、本明細書におけるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）が、ラテラルフローベースの方法及び他の毛細管駆動型ベースの方法において有用である。幾つかの実施形態では、かかるラテラルフローアッセイは、分析物（例えば、病原体）の多重化された検出／同定／特徴付けを可能にする。幾つかの実施形態では、ラテラルフローアッセイは、本明細書に記載される免疫アッセイを実行するのに有用である。
○直接免疫アッセイにおいて３分子抗体融合物を使用する、病原体の検出及び同定のための例示的な多重化された３分子ラテラルフローアッセイを、図５２に示す。この例では、各々がペプチドタグ（例えば、β１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド）に融合された１組のモノクローナルまたは組換え抗体（ｍＡｂまたはｒＡｂｓ）が液体試料に添加され、当該試料が、各々がペプチドタグ（例えば、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）ペプチド）に融合され、検出窓内のレーンに固定化され、かつ各々が当該液体試料中のｍＡｂまたはｒＡｂｓの１つと同一標的上の別個のエピトープを認識するｍＡｂまたはｒＡｂｓの第２の組を含む検出窓の上を通過する。液体試料がポリペプチド構成要素及び基質（例えば、検出窓にプレロードされる、試料と共に添加される、別々に装置に添加される、など）の存在下で検出窓を通過する場合、特定のレーンの発光は、標的上の別個のエピトープへのｍＡｂまたはｒＡｂｓの結合を示し、これにより、標的の検出及び同定を提供する。本明細書におけるシステム及び方法を利用する上記したアッセイ及びその代替例は、様々な検出パネル（例えば、呼吸器パネル：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、泌尿器パネル：Ｅ．Ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、食品媒介パネル：Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅ．Ｃｏｌｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、排水管理：大腸菌型パネル、１種の細菌内での菌株同定のためのパネル、など）を提供すること、及び他の用途（例えば、毒素検出）のために有用であり得る。
○直接免疫アッセイにおける３分子抗体融合物を使用した（例えば、疾患診断のための）抗ウイルス抗体の検出及び同定のための例示的な多重化された３分子ラテラルフローアッセイを、図５３に示す。この例では、試料が、ラテラルフローデバイスに添加され、コンジュゲーションゾーン（例えば、パッド）に流入する。コンジュゲーションゾーンは、第１のペプチドタグ（例えば、β１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド）に係留または融合された、汎用抗体結合作用物質（例えば、プロテインＬ）を含む。抗体が試料中に存在する場合、それらは標識された抗体結合作用物質により結合される。デバイスの検出窓は、各々が第２のペプチドタグ（例えば、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）ペプチド）に係留または融合された別個の固定化されたウイルス抗原を含む別個のレーンを含む。標識された抗体がコンジュゲーションゾーンから検出窓に流入する際に、抗体が適切な抗原に結合し、ペプチドタグを近位にさせ、ポリペプチド構成要素及び基質（例えば、検出窓にプレロードされる、試料と共に添加される、デバイスに別々に添加される、など）の存在下で発光シグナルを生成させる。かかるデバイス及びアッセイは、単一のデバイス／アッセイを使用して複数のウイルス及びウイルス感染の検出及び識別を可能にするであろう。例えば、ジカ熱、デング熱、及びチクングニア熱の全てが、単一の試験を使用して独立して検出され得る。
【０２２０】
●幾つかの実施形態では、上記のラテラルフローアッセイの細部は、溶液相アッセイ（例えば、マップと共に提供されるウェル中の結合部分の組み合わせを用いる）のためのプレートベースの形態で実施される。幾つかの実施形態では、かかるアッセイは、多重化されたドットブロット／スポットアレイアッセイ形態で実行される。幾つかの実施形態では、特定の形態（例えば、ラテラルフロー）で本明細書に記載されるいずれの多重化されたアッセイも、本明細書に記載されるか、または当分野において理解される代替の形態（例えば、ドットブロット、スポットアレイなど）でも実行され得る。
【０２２１】
●幾つかの実施形態では、本明細書におけるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、エアロゾルベースの検出（例えば、（１）細胞を溶解するためのプロテアーゼ、（２）検出試薬を噴霧する、（３）可視化して、検出／定量化する）において有用である。
【０２２２】
●幾つかの実施形態では、本明細書におけるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、核酸の等温増幅と共に用いるのに有用である。
【０２２３】
●幾つかの実施形態では、本明細書におけるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、核酸の高速サイクリングＰＣＲ検出と共に用いるのに有用である。
【０２２４】
●幾つかの実施形態では、本明細書におけるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、タンパク質−タンパク質相互作用（例えば、２つのタンパク質間、３つのタンパク質間など）の検出において有用である。
●幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるアッセイ及び方法の解析は、据置型または携帯型の装置及びリーダー、ルミノメータープレートリーダーまたはハンドヘルドリーダー、スマートフォンカメラまたはＣＣＤカメラなどを使用して実行される。
【０２２５】
●幾つかの実施形態では、分析物は、認識要素を介したシグナルの獲得によって、ルミノメーターまたはイメージングベースの技術により検出／定量化される。
【０２２６】
●幾つかの実施形態では、分析物は、競合的置換を介したシグナルの損失によって、ルミノメーターまたはイメージングベースの技術により検出／定量化／測定される。
【０２２７】
●幾つかの実施形態では、本明細書におけるシステム及び方法は、遺伝子学的にまたは化学的コンジュゲーションによる各認識要素上の複数のタグを可能にし、これにより、認識要素当たりペプチドタグのモル比を増加させることによってシグナル増幅を提供する。
【０２２８】
●幾つかの実施形態では、本明細書におけるシステム及び方法は、不均一溶液中の天然タンパク質の検出において有用である。
【０２２９】
●幾つかの実施形態では、本明細書におけるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、核酸検出において有用であり、例えば、ペプチドによりタグ付けされた相補的な認識要素が、核酸標的配列に直列にハイブリダイズする。
【０２３０】
●幾つかの実施形態では、抗体（例えば、分析物としての抗体）の検出のためのアッセイが本明細書において提供される。かかるアッセイの１つを、図５４に示す。第１のペプチドタグ（例えば、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）ペプチド）は、抗体結合タンパク質（例えば、プロテインＬ）に融合または係留され、第２のペプチドタグ（例えば、β１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド）は、抗体が特異的な分析物に融合または係留され、発光複合体のポリペプチド構成要素（例えば、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、検出試薬の一部として（例えば、基質と共に）含まれ、試料中の分析物に特異的な抗体の存在は、複合体形成及び発光をもたらす。
【０２３１】
●幾つかの実施形態では、本明細書におけるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、検出／定量化のために生物発光またはＢＲＥＴを利用するＦＩＳＨ様の用途において有用である。
●幾つかの実施形態では、本明細書におけるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、例えば、核酸の増幅なしの検出による核酸（例えば、一本鎖及び／または二本鎖ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）の検出において有用である。例えば、図５６に図示するように、１対のペプチドタグでラベル付けされた核酸プローブが、核酸標的上の近くの位置にハイブリダイズされる場合に、当該核酸標的との相補性により促進される発光複合体の形成を可能にする。かかるアッセイは、固体表面上で実行され得るか、溶液中で実行され得るか、単一の核酸標的に対して実行され得るか、または多重化され得る（例えば、アレイを使用して）。
【０２３２】
●幾つかの実施形態では、本明細書におけるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、ラボオンチップ及び／またはマイクロ流体用途において有用である。
【０２３３】
●幾つかの実施形態では、本明細書におけるシステム及び方法は、免疫アッセイなどの不均一アッセイ（例えば、均一免疫アッセイ解析と組み合わされたＰＣＲ増幅）において有用である。
【０２３４】
幾つかの実施形態では、ペプチドタグが生物発光複合体を形成できるようにするために化学的事象（例えば、ブロッキング部分の除去）または酵素的事象（例えば、タンパク質切断）が必要とされるペプチド／ジペプチド／トリペプチドベースのセンサーが提供される。例えば、ブロッキングされたジペプチド（例えば、生物発光複合体を形成できない）を補完が可能な２つのブロッキングされていないペプチドに切断するために、プロテアーゼが必要とされる。
【０２３５】
幾つかの実施形態では、本明細書におけるペプチド／ジペプチド／トリペプチドタグ（例えば、β６様、β７様、β８様、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）、及び／またはβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド、及び／またはそれらのジペプチド及びトリペプチド）及びポリペプチド構成要素（例えば、β１〜５様、β１〜６様、β１〜７様、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）は、アッセイ感度の増加のために磁気濃縮を利用するビーズベースのアッセイと共に用いるのに有用である。かかるアッセイの１つを、図５５に示す。かかるアッセイにおいて、磁性粒子が、第１のペプチドタグ（例えば、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）ペプチド）及び分析物上の第１のエピトープに対して作られた第１の結合作用物質にコンジュゲートされ、非磁性粒子（例えば、ポリスチレン粒子）が、第２のペプチドタグ（例えば、β１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチド）及び分析物上の当該第１のエピトープまたは第２のエピトープに対して向けられた第２の結合作用物質にコンジュゲートされる。ビーズは、発光複合体のポリペプチド構成要素（例えば、β１〜８様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチド）と共に試料と組み合わされる。磁気ビーズ及びそれに結合した試料の任意の成分または他の試薬を捕捉するために、磁気分離が使用される。次いで、磁気的に捕捉された要素の発光が、発光複合体の基質の存在下で検出される。分析物が試料中に存在する場合、磁性ビーズ及び非磁性ビーズの両方が捕捉され、発光複合体の捕捉をもたらす。分析物の非存在下では、非磁性ビーズは捕捉されず、発光複合体は形成されない。上記の用途及び形態は、例示であり、限定するものではない。本明細書における説明と適合する他の実施形態は、本発明の範囲内である。本明細書において、市販のルシフェラーゼであるＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）及び／またはＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ  ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ由来の天然ルシフェラーゼの一部に対する構造的相関性（しかし必ずしも配列同一性でない）及び機能的相関性を有するペプチド、ジペプチド、及びポリペプチド、ならびにそれらの補完により形成される生物発光複合体を含むシステム及びそれらを利用する方法が記載される。特に、β1〜8様（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）ポリペプチドと、β9様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）及びβ10様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチドまたはβ9/10様ジペプチドとの間の補完に関する詳細説明が提供される。しかしながら、本明細書における実施形態は、β1〜8様ポリペプチド（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）と、β9様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）及びβ10様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチドまたはβ9/10様ジペプチドとの間の補完に限定されない。幾つかの実施形態では、市販のルシフェラーゼであるＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）及び／またはＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ  ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ由来の天然ルシフェラーゼの一部に対する構造的相関性（しかし必ずしも配列同一性でない）及び機能的相関性を有するペプチド、ジペプチド、及びポリペプチドが提供される。例えば、β1〜5様ポリペプチドとβ6〜10様ポリペプチドとの間、β1〜2様ジペプチドとβ3〜10様ポリペプチドとの間、β1様ペプチドとβ2様ペプ���ドとβ3〜10様ポリペプチドとの間、β7〜8様ジペプチドとβ9〜10/1〜6様ポリペプチド融合物との間、β1〜7様ポリペプチドとβ8様、β9様、及びβ10様ペプチドとの間、及び／またはβ1〜6様ポリペプチドとβ7様、β8様、β9様、及びβ10様ペプチドとの間の補完のためのシステム及び方法が本明細書において提供される。
【０２３６】
幾つかの実施形態では、本明細書におけるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、及び／またはポリペプチドは、転移アッセイにおいて有用である。幾つかの実施形態では、転移アッセイは、以下の２つの構成要素から構成される：相補的なポリペプチドセンサー（例えば、ＬｇＴｒｉｐベース、ＬｇＢｉＴベースなど）及びペプチド／ジペプチド／トリペプチドによりタグ付けされた関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）。特定の細胞内区画、例えば、形質膜、核、ミトコンドリア、及び小胞体（ＥＲ）に局在する種々のＬｇＢｉＴセンサーが作製された（図１５２）。これらのＬｇＢｉＴセンサーは、遺伝子導入または安定細胞株の確立により細胞に導入され得る。ＰＯＩは、ポリペプチド（例えば、ＬｇＢｉＴ）に相補的なペプチド／ジペプチド／トリペプチドで内因的にタグ付けされる。刺激下で、ＰＯＩは、ポリペプチド（例えば、ＬｇＢｉＴ）センサーが存在する異なる細胞内区画に転移し、補完が起こり、これにより、ペプチド／ポリペプチド複合体（例えば、ＨｉＢｉＴ・ＬｇＢｉＴ）のアセンブリがもたらされ、発光シグナルが生じる（図１５３）。従って、ＰＯＩの転移活性は、発光出力により定量的に測定される。転移アッセイの実施形態の開発の間に実施された実験を、実施例８９に記載する。
【実施例】
【０２３７】
実施例１
（ＬｇＢｉＴ）の更に切断されたバージョンはペプチドにより活性化される
ＬｇＢｉＴの発光（バックグラウンド及び相補的なＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号１５、２５）の存在下）を、全長ルシフェラーゼのβ１０及びβ９鎖の両方を欠く更に切断されたポリペプチド（ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８、配列番号１７）と比較した（バックグラウンド及び相補的なｐｅｐ２６３（配列番号３５）の存在下）（図１）。
【０２３８】
ＬｇＢｉＴ（配列番号１１）またはＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号１７）を保有するＥ．ｃｏｌｉ  ＫＲＸ株を、５０ｍＬの容量で単一のコロニーから３０℃（２７５ｒｐｍ）にてＬＢ＋ａｍｐ（５０ｕｇ／ｍＬ）中で２０時間増殖させた。これらの培養物から同じ培地で１００倍希釈物を作成し、培養物を３７℃（２７５ｒｐｍ）で３時間増殖させ、次いで、２５℃まで冷却した後、ラムノース（タンパク質過剰発現の誘導剤）を０．２％の最終濃度に添加した。次いで、培養物を２５℃（２７５ｒｐｍ）で２２時間増殖させ（誘導させ）、この時点で培養物を収集し、得られたペレットを処理するまで−２０℃で保存した。細胞を溶解するために、ペレットを−２０℃から取り出し、５０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に再懸濁し、３回の連続的な凍結融解サイクル（−７０℃〜２２℃）を与え、遠心分離して、可溶性画分を生成し、次いで、分析するまで保冷した（氷上）。溶解物及びペプチド（複数可）（２５ｎｍの最終濃度）を、２５℃で１０分間一緒にインキュベートした後、ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）試薬の添加した。試薬の添加後、プレートを３５℃で更に５分間インキュベートし、発光（ＲＬＵ）を測定するために、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ５００プレートリーダーを使用して経時的に読み取った。
【０２３９】
本明細書の実施形態の開発の間に実施された実験は、ＬｇＢｉＴ（配列番号１１）及びＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号１７）の両方が若干のバックグラウンド発光を生成するが、レベルはＬｇＢｉＴではるかにより高いことを実証する。データは、ＬｇＢｉＴ及びＬｇＴｒｉｐ  ２０９８の両方が、それらのそれぞれの相補的なペプチドの存在下でより多くの発光を生成することを示す。ペプチド存在下でのシグナル増加の大きさは、ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８でより大きい。これらのデータは、更に切断されたＬｇＢｉＴ（及びＡ５１Ｇ置換を有するもの）が、ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８に存在しないβ１０及びβ９ベータ鎖に相当する単一の相補的なペプチドにより活性化されることを実証する。
【０２４０】
実施例２
ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８は、別個のβ９ペプチド及びβ１０様ペプチドの対により活性化される
ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）の発光を、全長ルシフェラーゼ（ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号２５）及びＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５（配列番号２３））のβ１０及びβ９部分に相当する別個のペプチドの存在下で経時的にモニタリングした（図２）。実施例１と同様の実験プロトコルを使用したが、１０倍濃縮された溶解物を使用し、ペプチドＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６及びＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５を５００ｎＭで使用し、０．００１％のＰｒｉｏｎｅｘを反応物に添加した。本明細書の実施形態の開発の間に実施された実験は、ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）がＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６及びＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５の添加により活性化されることを実証する。ペプチドが添加されていないか、またはペプチドのうちの１つのみが添加された対照は、プレートリーダーのバックグラウンドに近かった。
【０２４１】
実施例３
ＬｇＴｒｉｐ変異誘発（ラウンド１（発光））
配列決定に使用した一晩培養物を、培養物（３ｍｌの培地＋０．１％ラムノース＋０．１５％グルコース中３０ｕｌの細胞）を播種するために使用した。細胞を一晩２５℃で２０時間増殖させた。１０ｕｌの細胞を、２５０ｕｌのＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＬＢ）中に希釈し、５分間溶解させた。溶解物を混合し、次いで、ＰＬＢ溶解緩衝液（０．３ＸのＰＬＢ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．００１Ｕ／ｍｌのＲＱ１  ＤＮアーゼ）中に１：１００で（１０ｕｌを９９０ｕｌ中に）希釈した。５０ｕｌの希釈した溶解物を、５０ｕｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋２ｕＭのｐｅｐ２６３（ＳｍＴｒｉｐ９−１０ジペプチド）（配列番号３５）と１ｕＭの最終濃度（ジペプチド飽和濃度）で組み合わせた。試料を５分間インキュベートし、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ＋（ＧＭＭ＋）ルミノメーター上で読み取り、ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）（表２）に正規化した。
2021526832.tif 000003
【０２４２】
実施例４
ＬｇＴｒｉｐ変異誘発（ラウンド１（安定性））
本明細書における実施形態の開発の間に、ＨｉｓＬｉｎｋにより精製したＬｇＴｒｉｐ変異体の安定性を決定するための実験が実施された。ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）、ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（ＲＨ）（配列番号３１）（カラム精製したＬｇＴｒｉｐ  ２０９８）、＃１０、＃１４、＃１６、＃１９、＃２２、＃３５、＃３８、＃３９、及び＃４２ポリペプチド（表３）を、ＰＬＢ溶解緩衝液中に１：１０００で（２ｕｌを２ｍｌに）希釈した。１００ｕｌの各試料を、９６ウェルＰＣＲトレイのウェルのうちの１つの列に移した。試料を３７℃でインキュベートし、アリコートを様々な時点で取り出した。熱処理が完了したら、試料を氷上に配置した。全ての試料を処理したら、ＰＣＲトレイを室温に平衡化させた。試料を混合し、次いで、ＰＬＢ溶解緩衝液中に１：１００で（５ｕｌを４９５ｕｌ緩衝液中に）希釈した。５０ｕｌの各試料を、５０ｕｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液試薬＋２ｕＭのｐｅｐ２６３と組み合わせた。プレートを５分間インキュベートし、次いでＧＭＭ＋上で読み取った。結果を図３に示す。安定性の試験により、ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）の４２位が、更なる解析のための関心対象の位置として特定された。
2021526832.tif 000004
【０２４３】
実施例５
４２位での部位飽和（発光）
本明細書における実施形態の開発の間に、ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）の４２位のアミノ酸の個性を最適化するための実験が実施された（図４）。各試料についてＥ．Ｃｏｌｉ培養物（３ｍｌ）を調製し、ＬＢ培地＋１００ｕｇ／ｍｌアンピシリン中で３７℃で一晩増殖させた。次いで、培養物を、四重反復で誘導培地（ＬＢ＋アンピシリン＋０．１％ラムノース）中に２０Ｘの濃度（２００μｌ中１０μｌ）で希釈した。試料を３７℃で６時間増殖させた。次いで、試料を、０．３ＸのＰＬＢ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、及び０．００１Ｕ／ｍｌのＲＱ１  ＤＮアーゼにより溶解した（１０μｌの細胞を２５０μｌの溶解緩衝液中に溶解）。次いで、５０μｌの溶解物を、５０μｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０μＭフリマジン＋２０ｎＭのジペプチド２６３（配列番号３５）と組み合わせた。試料をＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒルミノメーター上で測定した。ＲＬＵ値を、ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）に正規化した（図４）。
【０２４４】
実施例６
精製されたＬｇＴｒｉｐの４２位変異体の３７℃安定性
本明細書における実施形態の開発の間に、ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８の４２位変異体の安定性を決定するための実験が実施された（図５）。ポリペプチドを、ＴＢＳ＋０．０１％ＢＳＡ中２０ｎＭに希釈した。各試料の１００μｌアリコートを、三重反復で２００μｌ薄壁ＰＣＲチューブにロードした。試料をサーマルサイクラーで３７℃でインキュベートした。試料を様々な時点で取り出し、氷上に配置し、次いで、室温に平衡化させた。試料を、ＰＬＢ溶解緩衝液（０．３ＸのＰＬＢ＋２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５））中に０．２ｎＭに（５μｌを４９５μｌ中に）希釈した。５０μｌの希釈した各試料を、５０μｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液中の５０μＭのフリマジン＋６μＭのｐｅｐ２６３（配列番号３５）と組み合わせた。試料を１０分間インキュベートし、次いで、ＧＭＭ＋上で読み取った。半減期を非線形回帰により計算した（図５）。
【０２４５】
実施例７
ＬｇＴｒｉｐの部位飽和
本明細書における実施形態の開発の間に、ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）の様々な位置でのアミノ酸の個性を最適化するための実験が実施された（図６）。各試料についてＥ．Ｃｏｌｉ培養物（３ｍｌ）を調製し、ＬＢ培地＋１００ｕｇ／ｍｌアンピシリン中で３７℃で一晩増殖させた。次いで、培養物を、四重反復で誘導培地（ＬＢ＋アンピシリン＋０．１％ラムノース）中に２０Ｘの濃度（２００μｌ中１０μｌ）に希釈した。試料を３７℃で６時間増殖させた。次いで、試料を、０．３ＸのＰＬＢ＋２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）＋０．００１Ｕ／ｍｌのＤＮアーゼにより溶解した（１０μｌの細胞を２５０μｌの溶解緩衝液中に溶解）。次いで、５０μｌの溶解物を、５０μｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０μＭのフリマジン  ＋２０ｎＭのジペプチド２６３（配列番号３５）と組み合わせた。試料をＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒルミノメーター上で測定した。ＲＬＵ値をＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）に正規化した（図６）。
【０２４６】
実施例８
ＬｇＴｒｉｐ  ３０９２テンプレートに対する変異
本明細書における実施形態の開発の間に、ＬｇＴｒｉｐ  ３０９２（配列番号１９）バリアントと比較した様々なアミノ酸置換の効果を決定するための実験が実施された（表４）。各試料についてＥ．Ｃｏｌｉ培養物（３ｍｌ）を調製し、ＬＢ培地＋１００ｕｇ／ｍｌアンピシリン中で３７℃で一晩増殖させた。次いで、培養物を、四重反復で誘導培地（ＬＢ＋アンピシリン＋０．１％ラムノース）中に２０Ｘの濃度（２００μｌ中１０μｌ）に希釈した。試料を３７℃で６時間増殖させた。次いで、試料を、０．３ＸのＰＬＢ＋２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）＋０．００１Ｕ／ｍｌのＤＮアーゼにより溶解した（１０μｌの細胞を２５０μｌの溶解緩衝液中に溶解）。次いで、５０μｌの溶解物を、５０μｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０μＭのフリマジン＋２ｎＭのジペプチド２６３（配列番号３５）と組み合わせた。変異体の溶解物を、ＰＬＢ中に１：１００で更に（５μｌを４９５μｌ中に）希釈した。５０μｌの希釈された溶解物を、５０μｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０μＭのフリマジン＋６μＭのｐｅｐ２６３または５０μｌのＴＢＳ＋２０μＭのＬＣＳ（フリマジン）＋６μＭのｐｅｐ２６３（配列番号３５）に添加した。試料を、１０分のインキュベーション後にＧＭＭ＋上で測定した。ＲＬＵ値をＬｇＴｒｉｐ  ３０９２（配列番号１９）に正規化した。
2021526832.tif 000005
【０２４７】
実施例９
ＬｇＴｒｉｐ  ３０９２テンプレートの部位飽和
本明細書における実施形態の開発の間に、ＬｇＴｒｉｐ  ３０９２（配列番号１９）の様々な位置でのアミノ酸の個性を最適化するための実験が実施された。各試料についてＥ．Ｃｏｌｉ培養物（３ｍｌ）を調製し、ＬＢ培地＋１００ｕｇ／ｍｌアンピシリン中で３７℃で一晩増殖させた。次いで、培養物を、四重反復で誘導培地（ＬＢ＋アンピシリン＋０．１％ラムノース）中に２０Ｘの濃度（２００μｌ中１０μｌ）に希釈した。試料を３７℃で６時間増殖させた。次いで、試料を、０．３ＸのＰＬＢ＋２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）＋０．００１Ｕ／ｍｌのＤＮアーゼにより溶解した（１０μｌの細胞を２５０μｌの溶解緩衝液中に溶解）。次いで、５０μｌの溶解物を、５０μｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０μＭのフリマジン＋２ｎＭのジペプチド２６３（１ｎＭ最終濃度）と組み合わせた。試料をＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒルミノメーター上で測定した。ＲＬＵ値をＬｇＴｒｉｐ  ３０９２に正規化した（図７）。
【０２４８】
実施例１０
ＬｇＢｉＴと比較したＬｇＴｒｉｐ  ２０９８及びＬｇＴｒｉｐ  ３０９２の安定性
本明細書における実施形態の開発の間に、ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）及びＬｇＴｒｉｐ  ３０９２（配列番号３３）の位置の安定性をＬｇＢｉＴ（配列番号１１）と比較するための実験が実施された（図８）。精製されたＬｇＴｒｉｐ  ２０９８、ＬｇＴｒｉｐ  ３０９２、及びＬｇＢｉＴ試料を、ＴＢＳ＋０．０１％ＢＳＡ中に２０ｎＭに希釈した。１００μｌの各試料を、２００μｌ薄壁ＰＣＲチューブに分取した。試料をサーマルサイクラーで３７℃でインキュベートした。試料を様々な時点で取り出し、氷上に配置した。試料を室温に平衡化し、次いで、ＰＬＢ溶解緩衝液（０．３ＸのＰＬＢ＋２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中に０．２ｎＭまで（５μｌを４９５μｌ中に）希釈した。５０μｌの各試料を、５０μｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液中の５０μＭのフリマジン＋６μＭのｐｅｐ２６３（配列番号３５）で希釈した。試料を１０分間インキュベートし、次いで、ＧＭＭ＋上で読み取った（図８）。
【０２４９】
実施例１１
４２℃及び６０℃でのＬｇＴｒｉｐバリアントの安定性
本明細書における実施形態の開発の間に、４２℃及び６０℃でのＬｇＴｒｉｐバリアントの安定性を比較するための実験が実施された（図９）。ＬｇＴｒｉｐバリアント試料を、ＴＢＳ＋０．０１％ＢＳＡ中に２０ｎＭまで希釈した。１００μｌのアリコートを、２００μｌ薄壁ＰＣＲチューブに添加した。試料を、サーマルサイクラーで４２℃または６０℃にてインキュベートした。試料を様々な時点で取り出し、氷上に配置した。試料を室温に平衡化し、次いで、各々をＰＬＢ溶解緩衝液（０．３ＸのＰＬＢ＋２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５））中に０．２ｎＭまで（５μｌを４９５μｌ中に）希釈した。５０μｌの希釈した各試料を、５０μｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液中の５０ｕＭのフリマジン＋６μＭのｐｅｐ２６３（配列番号３５）と組み合わせた。試料を１０分間インキュベートし、次いで、ＧＭＭ＋上で読み取った（図９）。
【０２５０】
実施例１２
ＬｇＴｒｉｐバリアントのＳｍＴｒｉｐ９及びＳｍＴｒｉｐ１０との親和性
本明細書における実施形態の開発の間に、様々なＬｇＴｒｉｐバリアントのＳｍＴｒｉｐ９様ペプチド及びＳｍＴｒｉｐ１０様ペプチド（図１０）に対する親和性を決定するための実験が実施された。
【０２５１】
ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）の希釈のために、精製されたＬｇＴｒｉｐ試料を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．００５％のＩＧＥＰＡＬ中に２ｎＭまで希釈した。ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．００５％のＩＧＥＰＡＬ＋２０μＭのフリマジン＋２００μＭのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＳｍＨｉＴｒｉｐ、配列番号２５）を含有するアッセイ試薬を調製した。４ｕＭのＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）をアッセイ試薬に添加し、次いで、フリマジン＋２００μＭのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ、配列番号１５）を含有するアッセイ試薬中に５００μｌ対５００μｌで連続希釈した。２５ｕｌの各ペプチド希釈物を、２５ｕｌの希釈されたＬｇＴｒｉｐ溶液に添加した。発光を１０及び１５分の時点でプレートリーダー上で読み取った。
【０２５２】
ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＳｍＨｉＴｒｉｐ、配列番号２５）の希釈のために、精製されたＬｇＴｒｉｐ試料を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．００５％のＩＧＥＰＡＬ中に２ｎＭまで希釈した。ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．００５％のＩＧＥＰＡＬ＋２０μＭのフリマジン＋４μＭのＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）を含有するアッセイ試薬を調製した。次いで、２００ｕＭのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＳｍＨｉＴｒｉｐ、配列番号２５）をアッセイ試薬に添加し、次いで、フリマジン＋４μＭのＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）を含有するアッセイ試薬中に５００μｌ対５００μｌで連続希釈した。２５ｕｌの各ペプチド希釈物を、２５ｕｌの希釈されたＬｇＴｒｉｐ溶液に添加した。発光を１０及び１５分の時点でプレートリーダー上で読み取った。
【０２５３】
実施例１３
ＬｇＴｒｉｐバリアントの安定性（６０℃）
本明細書における実施形態の開発の間に、６０℃でのＬｇＴｒｉｐバリアントの安定性を比較するための実験が実施された（図１１）。精製されたＬｇＴｒｉｐ変異体を、ＴＢＳ＋０．０１％ＢＳＡ中２０ｎＭに希釈した。１００μｌの各試料を、２００μｌ薄壁ＰＣＲチューブに分取した。試料をサーマルサイクラーで６０℃でインキュベートし、次いで、様々な時点で取り出し、氷上に配置し、室温に平衡化し、次いで、ＰＬＢ溶解緩衝液（０．３ＸのＰＬＢ＋２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５））中に０．２ｎＭまで（５μｌを４９５μｌ中に）希釈した。５０μｌの希釈した各試料を、５０μｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液中の５０μＭのフリマジン＋６μＭのｐｅｐ２６３（配列番号３５）と組み合わせた。試料を１０分間インキュベートし、次いで、ＧＭＭ＋上で読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍの非線形回帰機能を使用して半減期を計算した（プラトーを０に設定した１相性減衰）。
【０２５４】
実施例１４
ＬｇＢｉＴ及びＬｇＴｒｉｐバリアントの動態プロファイルの比較
本明細書における実施形態の開発の間に、様々なＬｇＴｒｉｐバリアントの動態プロファイルを、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（配列番号３）及びＬｇＢｉＴ（配列番号１１）／ＨｉＢｉＴ（ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６）（配列番号２５）の２つの構成要素によるシステムと比較するための実験が実施された（図１２）。ＮａｎｏＬｕｃ、ＬｇＢｉＴ、ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）、ＬｇＴｒｉｐ  ３０９２（配列番号３３）、及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．００５％のＩＧＥＰＡＬ中に２０μＭまで希釈した。試料を１：１００（２μｌを１９８μｌ中に希釈）、次いで、１：１０００（１０ｍｌ中１０μｌ）で、または１０Ｅ-5希釈し、合わせて０．２ｎＭ最終濃度まで希釈した。ＬｇＢｉＴポリペプチドに、２００ｎＭのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＳｍＨｉＴｒｉｐ、配列番号２５）を添加した。ＬｇＴｒｉｐバリアントに、２００μＭのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＳｍＨｉＴｒｉｐ、配列番号２５）及び２０μＭのＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）を添加した。試料を１５分間インキュベートし、５０ｕｌの各酵素／ペプチド希釈物を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋２０μＭのＬｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＬＣＳ、Ｐｒｏｍｅｇａ  カタログ番号Ｎ２０５）またはＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０μＭのフリマジンのいずれかと組み合わせ、ＧＭＭ＋ルミノメーター上で直ちに読み取った。
【０２５５】
実施例１５
３分子システムによるタンパク質−タンパク質相互作用の検出
本明細書における実施形態の開発の間に、タンパク質−タンパク質相互作用の検出における３分子補完システムの使用を実証するための実験が実施された（図１３）。ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５及びＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（図１３Ａ）またはＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５及びＳｍＢｉＴ（図１３Ｂ）の各１つに融合されたＦＲＢ及びＦＫＢＰを含有する溶解物を、精製されたＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）に添加した。ＦＲＢ／ＦＫＢＰ複合体の形成を、ラパマイシンにより誘導し、３分子システムの促進された補完を発光によりモニタリングした。
【０２５６】
細胞及び溶解物の調製。各ＦＲＢ−ＦＫＢＰ構築物の培養物を、ＬＢ＋１００ｕｇ／ｍｌアンピシリン中で一晩増殖させた。培養物を、ＬＢ＋０．１％のラムノース＋０．１５％のグルコース＋１００ｕｇ／ｍｌアンピシリン中に生じさせ（３ｍｌ中３０μｌの培養物）、２５℃で２４時間増殖させた。２００μｌの１０Ｘ  Ｆａｓｔｂｒｅａｋ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、２ｍｌの培養物＋０．００１Ｕ／ｍｌのＲＱ１  ＤＮアーゼに添加した。培養物を、回転混合器上で４℃にて３０分間インキュベートし、次いで、４℃にて３５００ｒｐｍで３０分間遠心した。清澄化された溶解物を取り出し、新しいチューブに入れ、凍結させ、−７０℃で保存した。
【０２５７】
アッセイ。溶解物を解凍し、ＴＢＳ＋０．１％のＢＳＡ中に１：１０で希釈し、適切な溶解物を組み合わせた。溶解物を分割し、３０ｎＭのラパマイシンをアリコートの１つに添加した。２５μｌの各溶解物を２５μｌのＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）と組み合わせ、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ中に２００ｎＭまで希釈し、１時間インキュベートした。５０μｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０μＭのフリマジンを添加し、発光をＧＭＭ＋上で読み取った。
【０２５８】
実施例１６
ランダムライブラリー調製及びスクリーニング
バリアントＬｇＴｒｉｐポリペプチドのランダムライブラリー（テンプレートとしてＬｇＴｒｉｐ  ２０９８を使用した）（配列番号３１）を作製し、β９／β１０ジペプチド（配列番号３５）（ｐｅｐ２６３）との補完についてスクリーニングした。
【０２５９】
ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３２）由来のテンプレートＤＮＡを、水中に１０ｕｇ／ｍｌまで希釈した。Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ（商標）ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（６３０７０−ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を使用して、変異体のランダムライブラリーを調製した。ライブラリーの増幅産物をバンドから単離し、ＷＩＺＡＲＤ  ＳＶ  Ｇｅｌ及びＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａ９２８１、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して精製し、ｐＦ４Ａｇにクローニングし、ＫＲＸコンピテント細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）に形質転換し、ＬＢアガロースプレートに蒔いた。コロニーを採取し、ＬＢ＋アンピシリンを含む９６ウェルプレートのウェルに入れ、試料を振盪しながら３７℃で一晩増殖させた。一晩培養物を誘導培地（ＬＢ＋０．１％のラムノース＋０．１５％のグルコース＋１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリン）中に１：２０で希釈し、培養物を３７℃で２〜６時間増殖させた。１０ｕｌの細胞を、２５０ｕｌのＰＬＢ溶解緩衝液（０．３ＸのＰＬＢ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、０．００１Ｕ／ｍｌのＤＮアーゼ）に添加した。５０ｕｌの細胞溶解物を、５０ｕｌのアッセイ緩衝液（ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０ｕＭのフリマジン＋０．２ｎＭのｐｅｐ２６３）と組み合わせた。プレートを試薬添加後５分間インキュベートし、次いで、試料をＣｌａｒｉｏＳｔａｒルミノメーター上で読み取った。テンプレートクローンと比較して改善された発光を有したクローンを、更なるスクリーニングに選択した。
【０２６０】
約６，０００個のＬｇＴｒｉｐ  ２０９８ベースのバリアントクローンを更にスクリーニングし、好ましい変異部位を部位飽和変異誘発により評価した。飽和変異誘発後に好ましい変異を組み合わせて、ＬｇＴｒｉｐ  ３０９２（配列番号１９）からＬｇＴｒｉｐクローンを得た。ＬｇＴｒｉｐ  ３０９２（配列番号１９）をテンプレートとして使用してスクリーニングを繰り返し、得られたクローンは、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）であった。
【０２６１】
実施例１７
ＬｇＴｒｉｐクローンの精製
ＬｇＴｒｉｐ変異体の５０ｍｌの培養物を、ＬＢ＋０．１％のラムノース＋０．１５％のグルコース＋アンピシリン中で生じさせた。培養物を遠心し、４．５ｍｌのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）＋０．００１Ｕ／ｍｌのＤＮアーゼ中に再懸濁した。５００ｕｌのＦａｓｔＢｒｅａｋ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｖ８５７１）を添加し、試料を回転混合器上で４℃にて１時間インキュベートした。試料を遠心して、溶解物を清澄化し、上澄みを新しいチューブに移した。ＨｉｓＬｉｎｋ（商標）Ｓｐｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、５００ｕｌのＨｉｓＬｉｎｋ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｖ８８２１）を試料に添加し、回転混合器上で４℃にて２時間インキュベートし、ＨｉｓＬｉｎｋ洗浄／結合緩衝液で洗浄し、溶出緩衝液で溶出させた。Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カラムを使用して、緩衝液をＴＢＳに交換した。
【０２６２】
実施例１８
安定性比較
本明細書における実施形態の開発の間に、ＬｇＢｉＴ（配列番号１１）及びＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）の経時的な活性の安定性を比較するための実験が実施された（図１４）。精製されたＬｇＴｒｉｐ  ２０９８及びＬｇＢｉＴを、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡまたは０．３ＸのＰＬＢ＋２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中で２０ｎＭまで希釈した。１００μｌの各試料を、２００μｌ薄壁ＰＣＲチューブに分取した。試料をサーマルサイクラー中で３７℃にてインキュベートし、様々な時点で取り出し、氷上に配置した。試料を室温に平衡化し、次いで、各試料をＰＬＢ溶解緩衝液（０．３ＸのＰＬＢ＋２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５））中に０．２ｎＭまで（５μｌを４９５μｌ中に）希釈した。５０μｌの希釈した各試料を、５０μｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液中の５０μＭのフリマジン＋６μＭのｐｅｐ２６３（配列番号３５）と組み合わせた。試料を１０分間インキュベートし、次いで、ＧＭＭ＋上で読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍの非線形回帰機能を使用して半減期を計算した（プラトーを０に設定した１相性減衰）。
【０２６３】
実施例１９
ＴＢＳ＋最小限のＢＳＡ担体におけるＬｇＴｒｉｐの安定性
本明細書における実施形態の開発の間に、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）（配列番号３）、ＬｇＢｉＴ（配列番号１１）、及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）のＴＢＳ及び最小限のＢＳＡ担体中での経時的な活性の安定性を決定するための実験が実施された（図１５）。ＮａｎｏＬｕｃ、ＬｇＢｉＴ、及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ中に２０ｎＭまで希釈した。１００μｌの各々を２００μｌ薄壁ＰＣＲチューブに分取した。試料をサーマルサイクラーで６０℃にてインキュベートし、様々な時点で取り出し、氷上に配置した。試料を室温に平衡化し、ＰＬＢ溶解緩衝液（０．３ＸのＰＬＢ＋２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中に０．２ｎＭまで（５μｌを４９５μｌ中に）希釈した。５０μｌの希釈した各試料を、５０μｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液中の５０μＭのフリマジン＋６μＭのｐｅｐ２６３（配列番号３５）と組み合わせた。試料を１０分間インキュベートし、次いで、ＧＭＭ＋上で読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍの非線形回帰機能を使用して半減期を計算した（プラトーを０に設定した１相性減衰）。
【０２６４】
実施例２０
活性に対する塩の効果
本明細書における実施形態の開発の間に、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）（配列番号３）、ＬｇＢｉＴ（配列番号１１）、ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）、及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）の活性に対する塩濃度の効果を決定するための実験が実施された（図１６）。
【０２６５】
塩の存在下での活性を試験するために、各酵素をＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に１ｕＭまで希釈し、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に２ｎＭまで更に希釈した。４ｕＭのｐｅｐ  ２６３（配列番号３５）を、ＬｇＢｉＴ、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）、及びＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）に添加し、３０分間インキュベートした。２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中の５ＭのＮａＣｌを出発点として２倍希釈系列を各々のために調製した。１０ｕＭのフリマジンを希釈系列の各試料に添加し、５ｕｌの各酵素または酵素＋ｐｅｐ２６３（配列番号３５）を、基質を添加した４５ｕｌの各混合物と組み合わせた。プレートを３分間インキュベートし、次いで、ＧＭＭ＋上で読み取った。
【０２６６】
塩への長期曝露の効果を試験するために、各酵素を１ｕＭまで希釈し、２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中の５ＭのＮａＣｌを出発点として２倍希釈系列を調製した。２ｕｌの各酵素を、１９８ｕｌのＮａＣｌ希釈物に添加した（１０ｎＭ最終濃度の各酵素）。添加物「なし」対照は、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌであった。試料を２６時間インキュベートした。インキュベーション後、試料を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に１：１０，０００で希釈した（１０ｕｌを９９０ｕｌ中に２回）。４ｕＭのｐｅｐ２６３（配列番号３５）を、２回目の希釈物中のＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）、及びＬｇＢｉＴ（配列番号１１）に添加した。５０ｕｌの各試料を、５０ｕｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０ｕＭのフリマジンと組み合わせた。プレートを３分間インキュベートし、次いで、ＧＭＭ＋上で読み取った。
【０２６７】
実施例２１
活性に対する尿素の効果
本明細書における実施形態の開発の間に、ＮａｎｏＬｕｃ（配列番号３）、ＬｇＢｉＴ（配列番号１１）、ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）、及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）の活性に対する尿素濃度の効果を決定するための実験が実施された（図１７）。
【０２６８】
尿素の存在下での活性を試験するために、各酵素をＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に１ｕＭまで希釈し、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に２ｎＭまで更に希釈した。４ｕＭのｐｅｐ２６３（配列番号３５）を、ＬｇＢｉＴ（配列番号１１）、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）、及びＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）に添加し、３０分間インキュベートした。２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中の１０Ｍの尿素を出発点として２倍希釈系列を各々のために調製した。１０ｕＭのフリマジンを希釈系列の各試料に添加し、５ｕｌの各酵素または酵素＋ｐｅｐ２６３（配列番号３５）を、基質を添加した４５ｕｌの各混合物と組み合わせた。プレートを３分間インキュベートし、次いで、ＧＭＭ＋上で読み取った。
【０２６９】
尿素への長期曝露の効果を試験するために、各酵素を１ｕＭまで希釈し、２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中の１０Ｍの尿素を出発点として２倍希釈系列を調製した。２ｕｌの各酵素を、１９８ｕｌの尿素希釈物に添加した（１０ｎＭ最終濃度の各酵素）。添加物「なし」対照は、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌであった。試料を２６時間インキュベートした。インキュベーション後、試料を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に１：１０，０００で希釈した（１０ｕｌを９９０ｕｌ中に２回）。４ｕＭのｐｅｐ２６３（配列番号３５）を、２回目の希釈物中のＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）、及びＬｇＢｉＴ（配列番号１１）に添加した。５０ｕｌの各試料を、５０ｕｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０ｕＭのフリマジンと組み合わせた。プレートを３分間インキュベートし、次いで、ＧＭＭ＋上で読み取った。
【０２７０】
結果は、ＮａｎｏＬｕｃ及びＮａｎｏＢｉＴが、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６と比較して尿素による不活性化に対してより感受性であり、一方でＬｇＴｒｉｐ  ２０９８が尿素により最も影響を受けないことを実証する。曝露の結果は、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６、ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８、及びＬｇＢｉＴが、尿素による長期の処理に際して活性を取り戻すことを実証し、これらのポリペプチドの活性が混在タンパク質により悪い影響を受け得ること、これらの汚染物質の変性が活性を増強することを示す。
【０２７１】
実施例２２
活性に対するｐＨの効果
本明細書における実施形態の開発の間に、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）（配列番号３）、ＬｇＢｉＴ（配列番号１１）、ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（ＷＴ）（配列番号３１）、及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）の活性に対するｐＨの効果を決定するための実験が実施された（図１８）。
【０２７２】
２５ｍＭの以下の各々を含有するユニバーサル緩衝液を調製した：クエン酸ナトリウム、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳ、及び０．５％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中のチオ尿素。緩衝液を２０ｍｌの８つのアリコートに分割し、ＮａＯＨまたはＨＣｌを添加して、ｐＨ希釈系列を作成した。
【０２７３】
ｐＨの活性に対する効果を試験するために、各酵素を１ｕＭまで希釈し、次いで、３ｍｌのＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に０．４ｎＭまで希釈した。４ｕＭのｐｅｐ２６３（配列番号３５）を、ＬｇＢｉＴ、ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８、及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６に添加した。試験される各ｐＨ緩衝液（表５）についてアッセイ試薬（２０ｕｌのフリマジンを９８０ｕｌの緩衝液中に添加）。１０ｕｌの各酵素／ペプチド希釈物を、５０ｕｌのアッセイ試薬と組み合わせた。プレートを３分間インキュベートし、ＧＭＭ＋上で読み取った。
2021526832.tif 000006
【０２７４】
異なるｐＨへの長期曝露の効果を試験するために、各酵素をＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に１ｕＭまで希釈し、次いで、各緩衝液中に２０ｎＭまで希釈した。Ｔ＝０：試料を混合し、次いで、２００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に１：１０で希釈し、４℃で保存した。Ｔ＝８：試料を混合し、次いで、２００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に１：１０で希釈し、４℃で保存した。Ｔ＝２４：試料を混合し、次いで、２００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に１：１０で希釈し、４℃で保存した。アッセイを実行するために、ＬｇＴｒｉｐ及びＬｇＢｉＴを、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋４ｕＭのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８６（配列番号３５）中に１：１０で希釈し、ＮａｎｏＬｕｃを、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に希釈した。４０ｕｌの各試料を４０ｕｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋４０ｕＭのフリマジンで希釈し、３分間インキュベートし、次いで、ＧＭＭ＋上で読み取った。
【０２７５】
結果は、ＬｇＴｒｉｐが幅広いｐＨ範囲に耐性があることを示す。
【０２７６】
実施例２３
自家発光
本明細書における実施形態の開発の間に、ＬｇＢｉＴ（配列番号１１）及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）の自家発光を比較するための実験が実施された。各々を、ＤＰＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ中に３ｕＭに希釈した。各々の３倍系列希釈を、ＤＰＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ中に調製し（３００ｕｌ対７００ｕｌ）、９６ウェルプレートのウェル中に配置した。プレートの最後の列は、フリマジン対照を含有した（ｎ＝１２）。５０ｕｌの各希釈物（または対照）を、５０ｕｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０ｕＭフリマジンと組み合わせ、３分間インキュベートし、次いで、ＧＭＭ＋上で読み取った。ＬｇＴｒｉｐ（すなわち、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６）は、ＬｇＢｉＴと比較して顕著に減少した自家発光を示した（図１９）。
【０２７７】
実施例２４
ＬｇＴｒｉｐのβ９／β１０ジペプチドとの補完
本明細書における実施形態の開発の間に、β９／β１０ジペプチド（例えば、ｐｅｐ２６３）（配列番号３５）の、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）またはＬｇＢｉＴ（配列番号１１）のいずれかと生物発光複合体を形成する能力を決定するための実験が実施された。かかる複合体の発光を、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６のβ９／β１０ジペプチドとの複合体及びＬｇＢｉＴのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＳｍＨｉＴｒｉｐ、配列番号２５）またはジペプチドであるｐｅｐ２６３（配列番号３５）のいずれかとの複合体の発光と比較した（図２０）。ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＳｍＨｉＴｒｉｐ、配列番号２５）及びｐｅｐ２６３（配列番号３５）を、Ｈ2Ｏ中に２ｎＭまで希釈した。各ペプチドの３Ｘ希釈系列を、３００ｎＭから始めてＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ中に調製した。２００ｎＭのＬｇＴｒｉｐ  ３５４６及びＬｇＢｉＴの溶液を、ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０ｕＭのフリマジン（ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）試薬）中に調製した。５０ｕｌの各希釈物を、５０ｕｌの各ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）試薬と組み合わせ、発光を５分のインキュベーション後に読み取った。シグナル／バックグラウンドを、ペプチド依存的なＲＬＵの量をバックグラウンド測定値で除算することによって計算した。結果は、ジペプチドがＨｉＢｉＴより約２〜３倍高いＫdを有することを実証し、これは低いペプチド濃度でのより低いＲＬＵを説明する。ＬｇＢｉＴのバックグラウンドは、シグナル対バックグラウンドを減少させる。ＬｇＢｉＴ／ジペプチド及びＬｇＴｒｉｐ／ジペプチドのＲＬＵ値は、等しかった。
【０２７８】
実施例２５
ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６のＳｍＴｒｉｐ１０及びＳｍＴｒｉｐ９との補完の比較
本明細書における実施形態の開発の間に、ラパマイシンにより誘導されるＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５に結合されたＦＫＢＰのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６に結合されたＦｒｂへの結合により促進される、ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）のそれぞれ、ＳｍＴｒｉｐ１０及びＳｍＴｒｉｐ９ペプチドとの補完を実証するための実験が実施された（図２１）。ＦＫＢＰ−ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５、ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６−Ｆｒｂ、及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６またはＬｇＴｒｉｐ  ２０９８を、ＨＥＫ２９３細胞に一過性に形質移入した（ウェル当たり２０，０００個の細胞／９６ウェルプレート）。試料を、ラパマイシンの系列希釈物（ＦＫＢＰ／Ｆｒｂ複合体形成を引き起こすため）及び１０μＭのフリマジンに曝露し、発光を測定した。結果は、ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６のＬｇＴｒｉｐ  ３５４６に対する親和性が、ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８と比較して約１０倍低いことを実証する。
【０２７９】
実施例２６
様々なＳｍＴｒｉｐ１０配列の親和性
本明細書における実施形態の開発の間に、様々なＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８６（ＨｉＢｉＴ、配列番号２５）配列とＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）／ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）との間の発光複合体を形成する実験が実施された（図２２）。酵素をＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に２００ｎＭまで希釈し、系列希釈物（１００ｕｌを９００ｕｌ中に）を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に調製（２ｎＭにするために２回）し、２ｎＭの試料を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に１：１０で（５００ｕｌを４．５ｍｌ中に）希釈した。各ＳｍＴｒｉｐ１０様ペプチドの２倍希釈系列を、１００ｕＭから始めてＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋２０ｕＭのＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）中に調製した。５０ｕｌの希釈されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）を５０ｕｌのペプチド希釈物と組み合わせ、室温にて１０分間インキュベートした。１００ｕｌのＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋２０ｕＭのフリマジンを各試料に添加し、試料を１０分間インキュベートし、次いで、ＧＭＭ＋上で読み取った。
【０２８０】
実施例２７
逆ジペプチド
本明細書における実施形態の開発の間に、逆のベータ鎖順序（例えば、β９−β１０対β１０−β９）を有するジペプチドの相補体ポリペプチドを活性化する能力を比較するための実験が実施された（図２３）。ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及びＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）をＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に２００ｎＭまで希釈し、各々の系列希釈物をＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に調製した（１００ｕｌを９００ｕｌに添加）した。２ｎＭの試料をＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に１：１０で（５００ｕｌを４．５ｍｌ中に）希釈した。各ジペプチド（ｐｅｐ３２６（配列番号１７９）及びｐｅｐ２６３（配列番号３５））の２０ｕＭ貯蔵液を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に調製した。各ペプチドの２倍系列希釈物を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に調製した（２５０ｕｌを２５０ｕｌに添加）。５０ｕｌの希釈されたＬｇＴｒｉｐ  ２０９８及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６を５０ｕｌの各ペプチド系列と組み合わせ、室温にて２０分間インキュベートした。ＴＢＳ（２０ｕＭ）中１００ｕｌのＬＣＳ（Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ  カタログ番号Ｎ２０５）を添加し、試料を３分間インキュベートし、次いで、ＧＭＭ＋上で読み取った。
【０２８１】
実施例２８
ＳｍＴｒｉｐ９（配列番号２３）及びＳｍＴｒｉｐ１０構成要素としてのＳｍＨｉＴｒｉｐ（配列番号２５）またはＳｍＢｉＴ（配列番号１３）のいずれかから構成されるジペプチドの比較
本明細書における実施形態の開発の間に、ＳｍＨｉＴｒｉｐ（配列番号２５）またはＳｍＢｉＴ（配列番号１３）配列を含むジペプチドの相補体ポリペプチドを活性化する能力を比較するための実験が実施された（図２４）。ＬｇＢｉＴ、ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８及びＬｇＴｒｉｐ  ２８９９（配列番号３６４）を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ中に２００ｎＭまで希釈した。ポリペプチドを、ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０ｕＭフリマジン中に１：１００で更に希釈した（３ｍｌ中３０ｕｌ）。Ｐｅｐ２６３（配列番号３５）及びｐｅｐ２７４（配列番号１４７）を、ＴＢＳ＋０．０１の％ＢＳＡ中に５ｕＭまで希釈した。５０ｕｌの各ＬｇＢｉＴ／ＬｇＴｒｉｐ希釈物を、５０ｕｌのペプチド希釈物と組み合わせ、５分間インキュベートし、次いで、ＧＭＭ＋上で読み取った。
【０２８２】
実施例２９
ＬＧＴｒｉｐ  ３５４６のＣ末端の付加／欠失
本明細書における実施形態の開発の間に、Ｃ末端の付加／欠失及び／またはペプチドタグへの対応する付加／欠失の補完及び発光に対する効果を決定するための実験が実施された（図２５）。例示的な試験されたペプチド及びポリペプチドを、表６に列挙する。
2021526832.tif 000007
【０２８３】
付加／欠失ポリペプチドを５０ｍｌの培養物に増殖させ、ペレット化し、１０ｍｌの１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）＋０．００１Ｕ／ｍｌのＤＮアーゼ中に再懸濁した。１ｍｌのＦａｓｔｂｒｅａｋ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及び１ｍｌのＨｉｓＬｉｎｋ  Ｒｅｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を添加し、回転シェーカ上で４℃にて３時間インキュベートした。樹脂を沈殿させ、試料を１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）＋１０ｍＭのイミダゾールで４回洗浄した。ポリペプチドを５００ｕｌのＨｉｓＬｉｎｋ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒに２回溶出させた。Ｔｈｅｒｍｏ透析チューブを使用して、１Ｘ  ＴＢＳに平衡化させた。
【０２８４】
酵素をＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に２００ｎＭまで希釈し、系列希釈物をＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に調製した（１００ｕｌを９００ｕｌに入れた）。２ｎＭの試料を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に１：１０で希釈した（５００ｕｌを４．５ｍｌに入れた）。ＳｍＴｒｉｐ９様ペプチド及びＳｍＴｒｉｐ１０様ペプチドを、表７に従ってポリペプチド相補体と組み合わせ、室温にて１０分間インキュベートした。１００ｕｌのＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋２０ｕＭフリマジンを添加し、１０分間インキュベートし、次いで、ＧＭＭ＋上で読み取った。
2021526832.tif 000008
【０２８５】
実施例３０
ポリペプチド／ペプチド及び／またはペプチド／ペプチドの重複
本明細書における実施形態の開発の間に、ポリペプチド構成要素とβ鎖に相当するペプチドとの間の、または２つのペプチド間の配列重複を決定するための実験が実施された（図２６）。かかる実験では、ポリペプチド構成要素及びペプチドまたは２つのペプチドは、それぞれ、ベースとなるルシフェラーゼにおける同一のアミノ酸に相当するアミノ酸を含む。
【０２８６】
ポリペプチドを、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に２００ｎＭまで希釈した。系列希釈物を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に調製した（１００ｕｌを９００ｕｌに添加）した。２ｎＭの各ポリペプチド試料を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に１：１０で（５００ｕｌを４．５ｍｌ中に）希釈した。ポリペプチド及びペプチドを組み合わせた、すなわち、表８に従って、５０ｕｌの各ＬｇＴｒｉｐ変異体を５０ｕｌのペプチドと組み合わせた。反応物を室温にて１０分間インキュベートした。次に、１００ｕｌのＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋２０ｕＭのフリマジンを添加し、反応物を更に１０分間インキュベートしてからＧＭＭ＋ルミノメーター上で読み取った。
2021526832.tif 000009
【０２８７】
実施例３１
β９ペプチドの個性は、β１０ペプチドの親和性を変化させる
本明細書における実施形態の開発の間に、ポリペプチド構成要素とβ鎖に相当するペプチドとの間の、または２つのペプチド間の配列重複を決定するための実験が実施された（図２７）。これらの結果は、β９鎖ペプチド（ＳｍＴｒｉｐ９）の配列がβ１０鎖ペプチド（ＳｍＴｒｉｐ１０）の親和性に影響を与え得ることを示す。
【０２８８】
ＳｍＴｒｉｐ９の希釈
ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に２００ｎＭまで希釈し、系列希釈物を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に調製した（１００ｕｌを９００ｕｌに添加）した。２ｎＭのポリペプチド試料を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に１：１０で（５００ｕｌを４．５ｍｌ中に）希釈した。
【０２８９】
各ＳｍＴｒｉｐ９ペプチドの２倍希釈系列を、２０ｕＭから始めてＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋１００ｕＭのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号２５）中に調製した。５０ｕｌの希釈されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）を、５０ｕｌの各ペプチド希釈物と組み合わせた。反応物を室温にて１０分間インキュベートした。１００ｕｌのＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋２０ｕＭのフリマジンを添加し、反応物を更に１０分間インキュベートし、ＧＭＭ＋上で読み取った。
【０２９０】
ＳｍＴｒｉｐ１０の希釈
ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に２００ｎＭまで希釈し、系列希釈物を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に調製した（１００ｕｌを９００ｕｌに添加）した。２ｎＭのポリペプチド試料を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に１：１０で（５００ｕｌを４．５ｍｌ中に）希釈した。
【０２９１】
ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号２５）の２倍希釈系列を、１００ｕＭから始めてＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋２０ｕＭのＳｍＴｒｉｐ９様ペプチド中に調製した。５０ｕｌの希釈されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６を、５０ｕｌの各ペプチド希釈物と組み合わせた。反応物を室温にて１０分間インキュベートした。１００ｕｌのＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋２０ｕＭのフリマジンを添加し、反応物を更に１０分間インキュベートし、ＧＭＭ＋上で読み取った。
【０２９２】
結果（図２７）
ＳｍＴｒｉｐ  ９ペプチドバリアントを、一定のＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号１５）の存在下で希釈し（図２７ａ）、次いで、ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６を、飽和量の各ＳｍＴｒｉｐ９バリアントペプチドの存在下で希釈した。（図２７ｂ）これは、ＳｍＴｒｉｐ１０配列の親和性がＳｍＴｒｉｐ９配列に応じて変化し得ることを示す。実験は、β９様ペプチド（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）の個性が、β１０様ペプチド（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）のポリペプチド構成要素に対する親和性に影響を与え得ることを実証する。ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２９３（配列番号１５４）及びＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２９４（配列番号１５５）配列は、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）のＣ末端との重複を有し、ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）（重複なし）と比較して親和性の減少を示すが、ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＳｍＨｉＴｒｉｐ、配列番号２５）のＬｇＴｒｉｐ  ３５４６に対する親和性も減少させる。ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２９８（配列番号１５８）及びＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２９９（配列番号１５９）は、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６のＣ末端及びＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＳｍＨｉＴｒｉｐ、配列番号２５）のＮ末端との配列重複を有し、ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ）のＬｇＴｒｉｐ  ３５４６に対する親和性を減少させる。
【０２９３】
実施例３２
β１０ペプチド構成要素のポリペプチド及びβ９ペプチドに対する親和性に対するβ１０ペプチドの個性の効果。
本明細書における実施形態の開発の間に、ポリペプチド構成要素とβ鎖に相当するペプチドとの間の、または２つのペプチドの間の配列重複または配列ギャップが、β１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチドの親和性にどのくらい影響を与えるかを決定するための実験が実施された（図２８）。ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に２００ｎＭまで希釈し、系列希釈物を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に調製した（１００ｕｌを９００ｕｌに添加）した。２ｎＭのポリペプチド試料を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に１：１０で（５００ｕｌを４．５ｍｌ中に）希釈した。各ＳｍＴｒｉｐ１０様ペプチドの２倍希釈系列を、１００ｕＭから始めてＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋２０ｕＭのＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）中に調製した。５０ｕｌの希釈されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６を、５０ｕｌの各ペプチド希釈物と組み合わせた。反応物を室温にて１０分間インキュベートした。１００ｕｌのＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋２０ｕＭのフリマジンを添加し、反応物を更に１０分間インキュベートし、ＧＭＭ＋上で読み取った。
【０２９４】
実施例３３
様々な飽和β１０様ペプチドの存在下でのβ９様ペプチドの親和性の測定
本明細書における実施形態の開発の間に、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）と共に一定濃度の様々なβ１０様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ１０）ペプチドの存在下で、β９様（例えば、ＳｍＴｒｉｐ９）ペプチドの親和性がどのくらい影響を受けるかを決定するための実験が実施された（図２９）。ポリペプチド構成要素ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に２００ｎＭまで希釈し、系列希釈物を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に調製し（１００ｕｌを９００ｕｌに添加）（２ｎＭにするために２回）、２ｎＭの試料を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に１：１０で（５００μｌを４．５ｍｌ中に）希釈した。各β９様ペプチド（ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）及びＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８７（配列番号１４８））の２倍希釈系列を、２０ｕＭから始めてＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋１００ｕＭの各ＳｍＴｒｉｐ１０様ペプチド中に調製した。５０ｕｌの希釈されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）を、５０ｕｌの各ペプチド希釈物と組み合わせた。反応物を室温にて１０分間インキュベートし、１００ｕｌのＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋２０ｕＭのフリマジンを添加し、反応物を更に１０分間インキュベートし、次いで、ＧＭＭ＋上で読み取った。
【０２９５】
実施例３４
ＨＥＫ２９３細胞における促進される補完に対する構築物方向性の効果
本明細書における実施形態の開発の間に、ペプチドタグに対する相互作用要素（ＦＲＢ及びＦＫＢＰ）の方向性の、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）との補完に対する効果を決定するための実験が実施された（図３０）。１００，０００のＲＬＵを超える非誘導性シグナルは、見かけの応答倍率を減少させるバックグラウンド汚染の存在を示す。
【０２９６】
ＨＥＫ２９３細胞を、５％のＣＯ2下で３７℃にて一晩増殖させた。細胞を、ＦｕＧＥＮＥプロトコールを使用して、ウェル１つ当たり３ｕｇのＤＮＡ（ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５−ＦＫＢＰ、ＦＫＢＰ−ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５、ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６−ＦＫＢＰ、ＦＫＢＰ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６、ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５−ＦＲＢ、ＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５、ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６−ＦＲＢ、またはＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６構築物）で形質移入した。細胞をＤＰＢＳで洗浄した。１ｍｌのＤＰＢＳを添加し、細胞を約１０分間−８０℃で凍結させ、室温にて解凍した。溶解物を遠心分離により１０分間清澄化し、ＴＢＳ＋２００ｎＭのＬｇＴｒｉｐ（＋／−３０ｎＭのＲＡＰ）中に１：１０で希釈し、室温にて３０分間インキュベートした。５０ｕｌの各試料を５０ｕｌのＴＢＳ＋２０ｕＭのフリマジンと組み合わせ、発光を５分時点で読み取った。
【０２９７】
実施例３５
Ｅ．ｃｏｌｉにおける促進される補完に対する構築物方向性の効果
本明細書における実施形態の開発の間に、ペプチドタグに対する相互作用要素（ＦＲＢ及びＦＫＢＰ）の方向性の、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）との補完に対する効果を決定するための実験が実施された（図３１）。
【０２９８】
各構築物の一晩培養物を、ＬＢ＋１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリン中に調製した。培養物を誘導培地（ＬＢ＋アンピシリン＋０．１％のラムノース＋０．１５％のグルコース）中に１：１００で希釈し、細胞を２５℃で２０時間増殖させ、ＰＬＢ溶解緩衝液（０．３Ｘ  ＰＬＢ、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、０．００１Ｕ／ｕｌのＲＱ１  ＤＮアーゼ、２５０ｕｌの細胞、７５０ｕｌのＰＬＢ）で１５分間溶解させた。細胞を、２００ｎＭのＬｇＴｒｉｐ  ３５４６及び＋／−３０ｎＭのＲＡＰを含有するＣＯ2非依存培地＋１０％のＦＢＳ中に５倍希釈した。反応物を室温にて３０分間インキュベートし、等しい容量のＮａｎｏＧｌｏ＋５０ｕＭのフリマジンと組み合わせ（５０ｕｌ対５０ｕｌ）、５分間インキュベートし、次いで、ＧＭＭ＋上で読み取った。
【０２９９】
実施例３６
様々なβ１０様ペプチドのＫｄ測定
本明細書における実施形態の開発の間に、様々なβ１０様ペプチドのＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及びＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）とのＫｄ値を測定するための実験が実施された（図３２）。２０ｕＭのＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）の溶液を、ＴＢＳ＋０．００５％＋０．０１％のＢＳＡ中に調製した。ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＳｍＨｉＴｒｉｐ、配列番号２５）、ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８８（配列番号１４９）、ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（配列番号１５０）、及びＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２９０（配列番号１５１）の３倍系列希釈物を調製した（１００ｕＭから始めて１５０ｕｌを３５０ｕｌのＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋ｐｅｐ２８６溶液に添加）。２０ｎＭのＬｇＴｒｉｐ  ３５４６溶液をＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ中に調製し、次いで、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ中に１：１０で希釈した。２５ｕｌの各ペプチド溶液を、２．５ｕｌのＬｇＴｒｉｐ  ３５４６溶液と組み合わせた。反応物を１０分間インキュベートし、２８ｕｌのＴＢＳ＋２０ｕＭのＬＣＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ  カタログ番号Ｎ２０５）を添加し、１０分間インキュベートし、次いで、ＧＭＭ＋上で読み取った。この実験は、配列番号２５のＮ末端への「Ｖ」または「ＶＳ」の付加が、ＳｍＴｒｉｐ１０様ペプチドの親和性をＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ）と比較して増加させることを示す。
【０３００】
実施例３７
ポリペプチド／β９分割位置のルシフェラーゼの光出力に対する効果
本明細書における実施形態の開発の間に、ポリペプチド構成要素とＳｍＴｒｉｐ９様ペプチドとの間での分割位置の移動の効果を解析するための実験が実施された（図３３）。異なるＣ末端延長または欠失を有するポリペプチド構成要素を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に０．２ｎＭまで希釈し、５０ｕＭのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号２５）を各々に添加した。ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）を、ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６＋ＬｇＴｒｉｐ溶液中に１０ｕＭまで添加し、試料を１０分間インキュベートした。ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋２０ｕＭのフリマジンの検出試薬を１：１で添加し、発光を読み取った。全ての合成ＳｍＴｒｉｐ９ペプチドは、Ｎ末端溶解性タグであるＳＳＷＫＲを含有した。
【０３０１】
実施例３８
ＬｇＴｒｉｐのＣ末端とＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６との間の配列ギャップ及び重複部分のルシフェラーゼの光出力に対する効果
本明細書における実施形態の開発の間に、ポリペプチド構成要素とＳｍＴｒｉｐ９様ペプチドとの間のギャップ及び／または重複部分の効果を解析するための実験が実施された（図３４）。異なるＣ末端延長または欠失を有するポリペプチド構成要素を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に０．２ｎＭまで希釈し、５０ｕＭのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号２５）を各々に添加した。１０ｕＭのＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６を、ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６＋ＬｇＴｒｉｐ溶液に添加し、反応物を１０分間インキュベートした。ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋２０ｕＭのフリマジンの検出試薬を１：１で添加し、発光を読み取った。
【０３０２】
ＳｍＴｒｉｐ９配列のＬｇＴｒｉｐ  ３５４６及びＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ）とのギャップ及び重複部分のルシフェラーゼ光出力に対する効果
本明細書における実施形態の開発の間に、ＳｍＴｒｉｐ９様ペプチドとポリペプチド構成要素（例えば、ＬｇＴｒｉｐ）及び／またはＳｍＴｒｉｐ１０様ペプチドとの間のギャップ及び／または重複部分の効果を解析するための実験が実施された（図３５）。ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）をＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に０．２ｎＭまで希釈し、５０ｕＭのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号２５）を各々に添加した。ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）を、ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６＋ＬｇＴｒｉｐ溶液中に１０ｕＭまで添加し、試料を１０分間インキュベートした。ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋２０ｕＭのフリマジンの検出試薬を１：１で添加し、発光を読み取った。全ての合成ＳｍＴｒｉｐ９ペプチドは、Ｎ末端溶解性タグであるＳＳＷＫＲを含有した。
【０３０３】
実施例４０
ＳｍＴｒｉｐ９ペプチド長バリアントの生化学的分析（Ｋｄ及びＢｍａｘ）
本明細書における実施形態の開発の間に、異なる長さのＳｍＴｒｉｐ９ペプチドのＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及びＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＳｍＨｉＴｒｉｐ；配列番号１５）との補完を解析するための実験が実施された（図３６〜３７）。
【０３０４】
ＳｍＴｒｉｐ９の希釈（図３６）
ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）ポリペプチドを、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に０．２ｎＭまで希釈した。１００ｕＭのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に調製した。各ＳｍＴｒｉｐ９様ペプチドの２０ｕＭ溶液を、ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６溶液に添加した。ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６溶液を希釈剤として使用して各ＳｍＴｒｉｐ９ペプチド溶液の２倍系列希釈物を調製した。ペプチド希釈物及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６溶液を１：１で組み合わせ、１０分間インキュベートした。ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋２０ｕＭのフリマジンの検出試薬を添加し（１：１）、発光を検出した。
【０３０５】
ＨｉＢｉＴ（ＳｍＴｒｉｐ１０）の希釈（図３７）
ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）ポリペプチドを、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に０．２ｎＭまで希釈した。試験される各ＳｍＴｒｉｐ９様ペプチドについて２０ｕＭのＳｍＴｒｉｐ９様ペプチド溶液を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に調製した。ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６の１００ｕＭ溶液を、各ＳｍＴｒｉｐ９様ペプチド溶液に添加した。各ＳｍＴｒｉｐ９様ペプチド溶液を希釈剤として使用してＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６の２倍系列希釈物を調製した。ペプチド希釈物及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６溶液を１：１で組み合わせ、１０分間インキュベートした。ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋２０ｕＭのフリマジンの検出試薬を添加し（１：１）、発光を検出した。
【０３０６】
実施例４１
ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６点変異体の生化学的親和性及びＢｍａｘ
本明細書における実施形態の開発の間に、ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）点変異体のＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及びＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＳｍＨｉＴｒｉｐ、配列番号２５）に対する親和性を解析するための実験が実施された。ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６ポリペプチドを、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に０．２ｎＭまで希釈した。１００ｕＭのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に調製した。各ＳｍＴｒｉｐ９様ペプチドの２０ｕＭ溶液を、ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６溶液に添加した。ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６溶液を希釈剤として使用して各ＳｍＴｒｉｐ９様ペプチド溶液の２倍系列希釈物を調製した。等しい容量のペプチド希釈物及びＬｇＴｒｉｐ溶液を組み合わせ、１０分間インキュベートした。ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋２０ｕＭのフリマジンの検出試薬を添加し（１：１、ｖｏｌ：ｖｏｌ）、発光を検出して、各ＳｍＴｒｉｐ９様ペプチドのＫｄ及びＢｍａｘを決定した（図３８）。
【０３０７】
実施例４２
ＳｍＴｒｉｐ９溶解性タグの生化学的親和性及びＢｍａｘに対する効果
本明細書における実施形態の開発の間に、代替の溶解性タグを有するＳｍＴｒｉｐ９様ペプチドの親和性を解析するための実験が実施された（図３９）。ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に０．２ｎＭまで希釈した。１００ｕＭのＳｍＴｒｉｐ１０／ｐｅｐ８６溶液を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に調製した。各ＳｍＴｒｉｐ９様ペプチドの２０ｕＭ溶液を、ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６溶液中に調製した。ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６溶液を希釈剤として使用して各ＳｍＴｒｉｐ９様ペプチドの２倍系列希釈物を調製した。等しい容量のペプチド希釈物をＬｇＴｒｉｐ  ３５４６溶液と組み合わせ、反応物を１０分間インキュベートした。ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋２０ｕＭのフリマジンの検出試薬を反応物に添加し（１：１、ｖｏｌ：ｖｏｌ）、発光を１０分のインキュベーション後に読み取った。
【０３０８】
実施例４３
Ｃ末端延長配列
本明細書における実施形態の開発の間に、Ｃ末端延長配列を有するＳｍＴｒｉｐ９様ペプチドの親和性を解析するための実験が実施された（図４０）。
【０３０９】
ＳｍＴｒｉｐ９ペプチドの希釈
ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）ポリペプチドを、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に０．２ｎＭまで希釈した。１００ｕＭのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に調製した。各ＳｍＴｒｉｐ９様ペプチドの２０ｕＭ溶液を、ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６溶液に添加した。ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６溶液を希釈剤として使用して各ＳｍＴｒｉｐ９様ペプチド溶液の２倍系列希釈物を調製した。ペプチド希釈物及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６溶液を１：１で組み合わせ、１０分間インキュベートした。ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋２０ｕＭのフリマジンの検出試薬を添加し（１：１）、発光を検出した。
【０３１０】
ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ）の希釈
ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）ポリペプチドを、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に０．２ｎＭまで希釈した。試験されるＳｍＴｒｉｐ９様ペプチドについて２０ｕＭのＳｍＴｒｉｐ９様ペプチド溶液を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に調製した。ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号２５）の１００ｕＭ溶液を、各ＳｍＴｒｉｐ９様ペプチドの溶液に添加した。各ＳｍＴｒｉｐ９様ペプチド溶液を希釈剤として使用してＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６の２倍系列希釈物を調製した。ペプチド希釈物及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６溶液を１：１で組み合わせ、１０分間インキュベートした。ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋２０ｕＭのフリマジンの検出試薬を添加し（１：１）、発光を検出した。
【０３１１】
実施例４４
ＫＲＸ  Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物におけるＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０バリアント及びＦＫＢＰが融合されたＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５を使用したＦＲＢ−ＦＫＢＰにより促進される補完の測定
ＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０バリアント、ＦＫＢＰ−ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５、及びＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５−ＦＫＢＰの一晩培養物を、グリセロールストックからＬＢ＋１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリン中で増殖させた。細胞をＬＢ＋０．１５％のグルコース＋０．１％のラムノース＋アンピシリン中に１：１００で希釈し、２５℃で２０時間振盪した。培養物をＰＬＢ中に１：４で希釈し、室温にて１５分インキュベートして、細胞を溶解した。ＳｍＴｒｉｐ９／ＳｍＴｒｉｐ１０ペプチド組み合わせを、１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合した。混合物を、３０ｎＭのラパマイシン含有または非含有のＰＬＢ＋２００ｎＭのＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）中に１：５で希釈し、反応物を室温にて３０分間インキュベートした。各反応物を、５０ｕｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０ｕＭのフリマジンと組み合わせ、発光を５分時点で測定した。誘導倍率（＋ラパマイシンでのシグナル／−ラパマイシンでのシグナル）の結果を、図４１に示す。ＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０バリアントペプチド構築物は、異なるリンカー長、リンカーの内容（アラニン−イソロイシンを含有または非含有）を有し、ヘキサヒスチジンタグを含有したか、または欠いた。
【０３１２】
実施例４５
ＨＥＫ溶解物におけるＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０バリアント及びＦＫＢＰが融合されたＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５を使用したＦＲＢ−ＦＫＢＰにより促進される補完の測定
ＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０バリアント、ＦＫＢＰ−ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５、及びＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５−ＦＫＢＰの一晩培養物を、５％のＣＯ2下で３７℃にて増殖させた。細胞を、ウェル１つ当たり１ｕｇのＤＮＡ（ＦＫＢＰまたはＦＲＢ構築物）でＦｕＧＥＮＥプロトコールを使用して形質移入した。細胞を１ｍｌのＤＰＢＳで洗浄した。１ｍｌのＤＰＢＳを添加し、培養物を−８０℃で１０分間凍結させた。培養物を室温にて解凍して、細胞を溶解した。溶解物を遠心分離により１０分間清澄化し、ＰＬＢ中で２倍希釈した。ＳｍＴｒｉｐ９／ＳｍＴｒｉｐ１０ペプチド組み合わせを、１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合した。混合物を、３０ｎＭのラパマイシン含有または非含有のＰＬＢ＋２００ｎＭのＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）中に１：５で希釈し、反応物を室温にて３０分間インキュベートした。各反応物を５０ｕｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０ｕＭのフリマジンと組み合わせ、発光を５分の時点で測定した。誘導倍率（＋ラパマイシンでのシグナル／−ラパマイシンでのシグナル）の結果を、図４２に示す。ＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０バリアントペプチド構築物は、異なるリンカー長、リンカーの内容（アラニン−イソロイシンを含有または非含有）を有し、ヘキサヒスチジンタグを含有したか、または欠いた。
【０３１３】
実施例４６
ＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ）／ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ）及び両方の方向性でＦＫＢＰに融合されたＳｍＴｒｉｐ９配列を使用した、ＫＲＸ  Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物におけるＦＲＢ−ＦＫＢＰにより促進される補完の測定
ＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ、配列番号２５）またはＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）及びＦＫＢＰに融合されたＳｍＴｒｉｐ９様ペプチド配列について一晩培養物を、ＬＢ＋１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリン中でグリセロールストックから増殖させた。細胞をＬＢ＋０．１５％のグルコース＋０．１％のラムノース＋アンピシリン中に１：１００で希釈し、２５℃で２０時間振盪した。培養物をＰＬＢ中に１：４で希釈し、溶解するために室温にて１５分インキュベートした。ＳｍＴｒｉｐ９／ＳｍＴｒｉｐ１０ペプチド組み合わせを、１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合した。混合物を、３０ｎＭのラパマイシン含有または非含有のＰＬＢ＋２００ｎＭのＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）中に１：５で希釈し、反応物を室温にて３０分間インキュベートした。各反応物を、５０ｕｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０ｕＭのフリマジンと組み合わせ、発光を５分時点で測定した。結果を図４３〜４７に示す。
【０３１４】
実施例４７
ＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ）／ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ）及び両方の方向性でＦＫＢＰに融合されたＳｍＴｒｉｐ９配列を使用した、ＨＥＫ溶解物におけるＦＲＢ−ＦＫＢＰにより促進される補完の測定
ＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ、配列番号２５）またはＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）及びＦＫＢＰに融合されたＳｍＴｒｉｐ９様ペプチド配列について一晩培養物を、５％のＣＯ2下で３７℃にて増殖させた。細胞を、ウェル１つ当たり１ｕｇのＤＮＡ（ＦＫＢＰまたはＦＲＢ構築物）でＦｕＧＥＮＥプロトコールを使用して形質移入した。細胞を１ｍｌのＤＰＢＳで洗浄した。１ｍｌのＤＰＢＳを添加し、培養物を−８０℃で１０分間凍結させた。培養物を室温にて解凍して、細胞を溶解した。溶解物を遠心分離により１０分間清澄化し、ＰＬＢ中で２倍希釈した。ＳｍＴｒｉｐ９／ＳｍＴｒｉｐ１０ペプチド組み合わせを、１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合した。混合物を、３０ｎＭのラパマイシン含有または非含有のＰＬＢ＋２００ｎＭのＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）中に１：５で希釈し、反応物を室温にて３０分間インキュベートした。各反応物を、５０ｕｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０ｕＭのフリマジンと組み合わせ、発光を５分時点で測定した。結果を図４８〜５０に示す。
【０３１５】
実施例４８
ＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ）／ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ）及びＦＫＢＰに融合されたＳｍＴｒｉｐ９配列を使用した、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物におけるＦＲＢ−ＦＫＢＰにより促進される補完の測定
ＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ、配列番号２５）またはＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）及びＦＫＢＰに融合されたＳｍＴｒｉｐ９様ペプチド配列について一晩培養物を、ＬＢ＋１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリン中でグリセロールストックから増殖させた。細胞をＬＢ＋０．１５％のグルコース＋０．１％のラムノース＋アンピシリン中に１：１００で希釈し、２５℃で２０時間振盪した。培養物をＰＬＢ中に１：４で希釈し、溶解するために室温にて１５分インキュベートした。ＳｍＴｒｉｐ９／ＳｍＴｒｉｐ１０ペプチド組み合わせを、１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合した。混合物を、３０ｎＭのラパマイシン含有または非含有のＰＬＢ＋２００ｎＭのＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）中に１：５で希釈し、反応物を室温にて３０分間インキュベートした。各反応物を、５０ｕｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０ｕＭのフリマジンと組み合わせ、発光を５分時点で測定した。結果を図５７、５９、６０、６２〜６３、６６〜６７、及び７０〜７１に示す。図５７において、**は、ＳｍＴｒｉｐ９ペプチドまたはＳｍＴｒｉｐ１０ペプチドのすぐ上流のリンカーにおいてアラニン−イソロイシン（ＡＩ）が除去されていることを示す。以降の全ての図において、ＦＫＢＰまたはＦＲＢのそれぞれＳｍＴｒｉｐ９ペプチドまたはＳｍＴｒｉｐ１０ペプチドとの融合物のＣ末端に、アラニン−イソロイシンは存在しない。
【０３１６】
実施例４９
ＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ）／ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ）及びＦＫＢＰに融合されたＳｍＴｒｉｐ９配列を使用した、ＨＥＫ２９３溶解物におけるＦＲＢ−ＦＫＢＰにより促進される補完の測定
ＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ、配列番号２５）またはＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）及びＦＫＢＰに融合されたＳｍＴｒｉｐ９様ペプチド配列について一晩培養物を、５％のＣＯ2下で３７℃にて増殖させた。細胞を、ウェル１つ当たり３ｕｇのＤＮＡ（ＦＫＢＰまたはＦＲＢ構築物）でＦｕＧＥＮＥプロトコールを使用して形質移入した。細胞を１ｍｌのＤＰＢＳで洗浄した。１ｍｌのＤＰＢＳを添加し、培養物を−８０℃で１０分間凍結させた。培養物を室温にて解凍して、細胞を溶解した。溶解物を遠心分離により１０分間清澄化し、ＰＬＢ中で２倍希釈し。ＳｍＴｒｉｐ９／ＳｍＴｒｉｐ１０ペプチド組み合わせを、１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合した。混合物を、３０ｎＭのラパマイシン含有または非含有のＰＬＢ＋２００ｎＭのＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）中に１：５で希釈し、反応物を室温にて３０分間インキュベートした。各反応物を、５０ｕｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０ｕＭのフリマジンと組み合わせ、発光を５分時点で測定した。結果を図５８、６１、６４〜６５、６８〜６９、及び７２〜７３に示す。図５８において、**は、ＳｍＴｒｉｐ９ペプチドまたはＳｍＴｒｉｐ１０ペプチドのすぐ上流のリンカーにおいてアラニン−イソロイシン（ＡＩ）が除去されていることを示す。以降の全ての図において、ＦＫＢＰまたはＦＲＢのそれぞれＳｍＴｒｉｐ９ペプチドまたはＳｍＴｒｉｐ１０ペプチドとの融合物のＣ末端に、アラニン−イソロイシンは存在しない。
【０３１７】
実施例５０
異なるＳｍＴｒｉｐ９配列の生化学的解析（Ｋｄ及びＢｍａｘ）
結果を図７４〜７６に示す。
【０３１８】
ＳｍＴｒｉｐ９様ペプチドの希釈物
ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に０．２ｎＭまで希釈した。１００ｕＭのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＳｍＨｉＴｒｉｐ、配列番号２５）を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に調製した。各ＳｍＴｒｉｐ９様ペプチドの２０ｕＭ溶液を、ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６溶液中に調製した。ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６溶液を希釈剤として使用して各ＳｍＴｒｉｐ９様ペプチドの２倍系列希釈物を調製した。ペプチド希釈物を、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）溶液と１：１で組み合わせ、１０分間インキュベートした。ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋２０ｕＭのフリマジン（Ｆｚ）の検出試薬を１：１で添加した。発光を１０分時点で読み取った。
【０３１９】
ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ）の希釈物
ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に０．２ｎＭまで希釈した。２０ｕＭのＳｍＴｒｉｐ９様ペプチド溶液を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に調製した。ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６を、各ＳｍＴｒｉｐ９様ペプチド溶液中に１００ｕＭまで添加した。ＳｍＴｒｉｐ９様ペプチド溶液を希釈剤として使用して、各ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号２５）の２倍系列希釈物を調製した。ペプチド希釈物を、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）溶液と１：１で組み合わせ、１０分間インキュベートした。ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋２０ｕＭのフリマジン（Ｆｚ）の検出試薬を１：１で添加した。発光を１０分時点で読み取った。
【０３２０】
実施例５１
合成ＳｍＴｒｉｐ９ペプチドの溶解性
別途注記のない限り、末端がブロッキングされた（Ｎ末端アセチル化及びＣ末端アミド化）合成ペプチドは、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ２．０により合成された。ペプチドをヌクレアーゼ非含有水中に約１ｍＭまで溶解させ、ローテーターで４℃にて３０分間混合した。最大速度での１０分間の遠心分離の後、ペプチドを水中に１：５０で希釈し、ＮａｎｏＤｒｏｐで定量化した。ペプチドを使用まで−２０℃で保存した。ペプチドは、ペプチドが２２℃の水浴で解凍され、４℃に維持され、−２０℃で凍結された３回の凍結／解凍サイクル後に、それらが溶解状態のままであった場合、可溶性であるとみなされた。合成ペプチドの溶解性を図７７に示す。
【０３２１】
実施例５２
循環置換されたＬｇＢｉＴ
ＳｍＴｒｉｐ９／ｐｅｐ２８６のＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ）−ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６融合物に対する親和性及びＢｍａｘ
ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）の前に融合されたＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＳｍＨｉＴｒｉｐ、配列番号２５）配列を含む融合ポリペプチドが作製され、ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６  ＨｉＢｉＴ−ＬｇＴｒｉｐ融合物のＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）との複合体形成及び発光をモニタリングするための実験が実施された（図７８）。
【０３２２】
一晩培養物を、グリセロールストックからＬＢ＋１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリン中で増殖させた。細胞を、ＬＢ＋０．１５％のグルコース＋０．１％のラムノース＋アンピシリン中に１：１００で希釈し、２５℃で２０時間振盪した。８００μｌの培養物をＦａｓｔＢｒｅａｋ中で溶解し、各ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６−ＬｇＴｒｉｐ融合物をＨｉｓＬｉｎｋプロトコールを使用して精製した。ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）の１０ｕＭから始めた２倍系列希釈物を、０．２ｎＭのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６−ＬｇＴｒｉｐ融合物（ＡＴＧ  ３７４５（配列番号２１１）またはＡＴＧ  ３７４６（配列番号２１３））を含有するＴＢＳ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋０．０１％のＢＳＡ中に作製した。反応を室温にて１０分間プレインキュベートした。２０ｕＭのフリマジン（Ｆｚ）を含有するＴＢＳ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋０．０１％のＢＳＡを試料に１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で添加した。発光を１０分の時点でＧｌｏＭａｘ（登録商標）ルミノメーター上で読み取った。
【０３２３】
様々なＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ）−ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６融合物に対するＳｍＴｒｉｐ９／ｐｅｐ７５９の親和性
誘導された細胞培養物のペレットから、ペレットを、１Ｘ  ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡを使用して元の培養容量の１／１０に再懸濁した（例えば、５０ｍＬの培養物は５ｍＬ中に再懸濁することとなった）。溶解緩衝液を、１００部のＦａｓｔ  Ｂｒｅａｋ（登録商標）Ｂｕｆｆｅｒ、１０部のＲＱ１  ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼ、及び１部の１ＭのＤＴＴを使用して調製した（例えば、６５０μＬのＦａｓｔ  Ｂｒｅａｋ（登録商標）Ｂｕｆｆｅｒ＋６５μＬのＲＱ１  ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼ、及び６．５μＬの１ＭのＤＴＴ、または同じ縮尺）。１５ｍＬのチューブ中で１部の溶解緩衝液を、９部の細胞懸濁液に添加した（例えば、３３．３μＬの溶解緩衝液＋３００ｕＬの懸濁液）。混合しながら（ロータリーシェーカーを使用して）４℃で３０分間インキュベートした。ｐｅｐ７５９の４μＭ溶液を、１Ｘ  ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ中に調製した。５０ｕＬの４μＭのｐｅｐ７５９を、９６ウェルプレート内の５０μＬの各溶解物に三重反復で添加した。５０μＬの各溶解物を、個別に５０μＬの１Ｘ  ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ緩衝液と三重反復で混合した。ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）試薬を、１００部のＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液を１部のフリマジンと混合することにより調製した（例えば、１０ｍＬの緩衝液＋１００ｕＬのフリマジン）。１００ｕＬのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）試薬を各ウェルに添加した。発光を、Ｇｌｏｍａｘ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ機器のキネティクスモードを使用して測定した。発光測定値を約２９分後に比較した。ｐｅｐ７５９を含有する試料の発光測定値を、ｐｅｐ７５９を含有しない同一の溶解物の対応する測定値で除算した。結果を図７８Ｂに示す。データを生成するために２バッチの培養物を使用した。一方は、５０ｍＬの培養物の誘導によるもの（右側、ＡＴＧ−４８０８からＡＴＧ−４６３２まで）であり、他方は、３ｍＬの培養物の誘導によるものであった（左側、ＡＴＧ−４８１５から始めてＡＴＧ−３７４６まで）であった。幾つかの構築物は、両方の試験（ＡＴＧ−２６２３、ＡＴＧ−３７４５、ＡＴＧ−３７４６、ＡＴＧ−４６３２）に存在した。
【０３２４】
実施例５３
界面活性剤希釈物
本明細書における実施形態の開発の間に、ＮａｎｏＬｕｃ（配列番号３）、ＬｇＢｉＴ（配列番号１１）、及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）のジペプチドであるｐｅｐ２６３（配列番号３５）との複合体に対する様々な界面活性剤の影響を決定するための実験が実施された。
【０３２５】
曝露実験
５００ｕｌの２０ｍＭのＳＤＳまたは２ｍＭのＣＤＴＡまたは５％のＴｅｒｇｉｔｏｌを、ディープウェルプレートに添加した。各界面活性剤の３倍系列希釈物を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ中に調製した（１５０ｕｌを３５０ｕｌに添加）。１００ｕｌの各希釈物を、１００ｕｌの２ｎＭのＮａｎｏＬｕｃ、ＬｇＢｉＴ、またはＬｇＴｒｉｐのいずれかと組み合わせ、試料を１８時間インキュベートした。試料をＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ中に１：１００で（５ｕｌを４９５ｕｌ中に）希釈した。５０ｕｌの各試料を、ＮａｎｏＬｕｃについて５０ｕｌのＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋２０ｕＭのフリマジン（Ｆｚ）と、またはＬｇＢｉＴ及びＬｇＴｒｉｐについてＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋２０ｕＭのフリマジン（Ｆｚ）＋２ｕＭのｐｅｐ２６３と三重反復で組み合わせた。試料の発光を、試薬添加の３分後にＧＭＭ＋上で読み取った。ＬｇＢｉＴ、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６及びＮａｎｏＬｕｃの界面活性剤への長期曝露の結果を図７９に示す。
【０３２６】
活性実験
２０ｍｌの２０ｕＭのＦｚを、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ中に調製した。２ｍｌの２０ｍＭのＳＤＳ及び２ｍＭのＣＤＴＡ及び５％のＴｅｒｇｉｔｏｌを、ディープウェルプレートに添加した。２０ｕＭのＦｚを各試料に添加した（８ｕｌ）。各界面活性剤の２倍系列希釈物を、２０ｕＭのＦｚ溶液中に調製した（１ｍｌ対１ｍｌ）。ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ中の４００ｐＭのＮａｎｏＬｕｃの溶液を調製した。ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ中の４００ｐＭのＬｇＢｉＴ＋１ｕＭのｐｅｐ２６３（配列番号３５）の溶液を調製した。ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ中の４００ｐＭのＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）＋１ｕＭ  ｐｅｐ２６３（配列番号３５）の溶液を調製した。５０ｕｌの各酵素溶液を５０ｕｌの界面活性剤希釈物と組み合わせ、ルミノメーターに配置し、室温での３分のインキュベーション後に読み取った。界面活性剤の存在下でのＬｇＢｉＴ、ＬｇＴｒｉｐ、及びＮａｎｏＬｕｃ活性の結果を、図８０に示す。
【０３２７】
実施例５４
ＦＲＢ−ＦＫＢＰにより促進される複合体形成の可逆性
本明細書における実施形態の開発の間に、生物発光複合体形成の可逆性を実証するための実験が実施された。培地をＨＥＫ２９３細胞のＴ７５培養フラスコから吸引した。細胞を１０ｍｌのＤＰＢＳで洗浄し、３ｍｌのＴｒｙｐｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｔｒｙｐｓｉｎを添加することによりトリプシン処理した。３７℃での３分のインキュベーション後、ピペットで細胞を混合しながら１０ｍｌの増殖培地（ＤＭＤＭ＋１０％のＦＢＳ）をフラスコに添加した。細胞を２００ｒｐｍで５分間ペレット化した。培地を吸引し、新鮮な培地と交換した。細胞をＴ２０細胞カウンターで計数し、２００，０００細胞／ｍｌまで希釈した。３ｍｌの細胞懸濁液を、６ウェルプレートの各ウェルに添加した。細胞を、５％のＣＯ2下で３７℃にて一晩増殖させた。細胞を形質移入するために、各構築物についてＤＮＡを１００ｎｇ／ｕｌの濃度に希釈し、各構築物について３．３ｕｇのＤＮＡを１５５ｕｌの最終容量のＯｐｔｉＭＥＭ中に添加した（ＦＫＢＰ−ＳｍＢｉＴ、ＦＲＢ−ＬｇＢｉＴ、ＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ）、ＦＫＢＰ−ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５）。９．９ｕｌのＦｕｇｅｎｅＨｄを希釈されたＤＮＡに添加し、１５分間インキュベートした。次いで、１５０ｕｌの各ＤＮＡ複合体を、６ウェルプレートに蒔かれた細胞に添加した。細胞を、５％のＣＯ2下で３７℃にて一晩増殖させた。培地を吸引した後に、一度、細胞をＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  カタログ番号１４１９０）で洗浄し、次いで、新鮮な１ｍｌのＤＰＢＳ中で−８０℃にて凍結させた。次いで、細胞を溶解するために試料を解凍した。ＮａｎｏＢｉＴ（ＦＫＢＰ−ＳｍＢｉＴ＋ＦＲＢ−ＬｇＢｉＴ）及びＮａｎｏＴｒｉｐ（ＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ）＋ＦＫＢＰ−ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２４５＋２００ｎＭの精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１））について、ＦＲＢ及びＦＫＢＰ構築物を組み合わせ、３０ｎＭのラパマイシンと共に３０分間インキュベートした。ＦＫ５０６の希釈系列を１０ｍＭから始めてＤＭＳＯ中に調製した。３倍系列希釈を、ＤＭＳＯで実行した（３０ｕｌを７０ｕｌに添加）。２００ｕｌの各ＦＲＢ−ＦＫＢＰ組み合わせを、９６ウェルＰＣＲトレイの８ウェルに等分した。２ｕｌのＦＫ５０６希釈系列を添加したら、各試料を３７℃で６時間インキュベートした。５０ｕｌの各試料を５０ｕｌのＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋２０ｕＭのフリマジン（Ｆｚ）と組み合わせ、３分間インキュベートし、ＧＭＭ＋上読み取った。結果を図８１に示す。
【０３２８】
実施例５５
ＳｍＴｒｉｐ１０ペプチドでのＬｇＴｒｉｐ／ＳｍＴｒｉｐ９の希釈
本明細書における実施形態の開発の間に、ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）及びＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）の様々なＳｍＴｒｉｐ１０ペプチドでの希釈物を解析するための実験が実施された。データを、ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ）の値に正規化した。ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＨｉＢｉＴ）は、ＳｍＨｉＴｒｉｐ１０（配列番号２５）である。
【０３２９】
ペプチド貯蔵液を水中に２５０ｕＭまで希釈した。ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）溶液（最終反応物中１０ｕＭ）をＯｐｔｉＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ中に調製した。各ＳｍＴｒｉｐ１０ペプチドの２倍系列希釈を、ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６を含有するＯｐｔｉＭＥＭ溶液中に実行した。ＳｍＴｒｉｐ１０ペプチドの最高濃度は、１５ｕＭ（最終反応物中）であった。ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）の１０Ｘ貯蔵液（１ｎＭ）をＯｐｔｉＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ中に調製し、１０ｕｌを９０ｕｌのＳｍＴｒｉｐ１０ペプチド希釈物の各々に添加した。試料を、５００ｒｐｍに設定されたオービタルシェーカーで３０分間インキュベートした。２ｍｌの検出試薬（ＯｐｔｉＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ＋２０ｕｌの１ＭのＤＴＴ＋８０ｕｌの５ｍＭのフリマジン）を調製した。１０ｕｌの検出試薬を各ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６：ペプチド溶液に添加し、プレートをオービタルシェーカーに配置した。プレートを５分及び１０分の時点で読み取った。４つのプレートの各々のＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＳｍＨｉＴｒｉｐ、配列番号２５）及びＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（配列番号１５０）を対照として使用した。結果を図８２〜８３の表に示す。
【０３３０】
実施例５６
Ａｎｔａｒｅｓ構築物
本明細書における実施形態の開発の間に、本明細書に記載されるシステムの構成要素に連結された１つ以上のＣｙＯＦＰ蛍光タンパク質を含むＡｎｔａｒｅｓ  ＢＲＥＴシステムに対応した本明細書に記載される補完システムを実証するための実験が実施された。
【０３３１】
試料を、ＨｉｓＬｉｎｋ  Ｒｅｓｉｎを使用して精製した。１０ｍｌの１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１ｍｌのＦａｓｔＢｒｅａｋ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ、及び５０ｕのＤＮアーゼを添加し、試料を４５分間回転混合器に配置し、次いで、７，０００ｒｐｍで２０分間遠心した。次に、１ｍｌのＨｉｓＬｉｎｋ樹脂を各試料に添加し、試料を５ｍｌの結合洗浄緩衝液で３回洗浄し、３００ｕｌの溶出緩衝液で溶出し、ＴＢＳに対して透析した（２時間、ＴＢＳの交換、更に２時間）。試料を、ＴＢＳ＋０．０１％ＢＳＡ中１００ｎＭに希釈し、次いで、４ｕｌを９９６ｕｌのＴＢＳ＋０．０１％ＢＳＡに添加することによって０．４ｎＭまで更に希釈した。３００ｕｌを７００ｕｌに移すことによって３倍系列希釈物を調製した。１０ｍｌの２ｕＭのジペプチドｐｅｐ２６３（配列番号３５）をＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ中に調製した。１０ｍｌの４００ｐＭのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号２５）をＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ中に調製した。１０ｍｌの１ｕＭのＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）及び１０ｕＭのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６を調製した。５０ｕｌの各酵素を、ＴＢＳまたはジペプチド溶液のいずれかと（全ての試料を２つのプレート上で三重重複で）組み合わせた。ＬｇＢｉＴ及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６試料を有するＡｎｔａｒｅｓ融合物を、ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６＋ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６と組み合わせた。試料を室温で１時間インキュベートした。１００ｕｌの２０ｕｍのフリマジンを、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋２ｍＭのＡＴＴに添加した。プレートを３分間インキュベートし、次いで、ＧＭＭ＋上で読み取った。結果を図８４〜８５のグラフに示す。
【０３３２】
実施例５７
「暗」ジペプチド２７２
本明細書における実施形態の開発の間に、０．１ｎＭのｐｅｐ  ２６３の存在下でのＬｇＢｉＴ（配列番号１１）及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）での「暗」ジペプチド２７２（配列番号１４６）の希釈系列を比較するための実験が実施された。ＬｇＢｉＴ及びＬｇＴｒｉｐ  ３４５６をＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ及び＋／−０．４ｎＭのジペプチドｐｅｐ２６３（配列番号３５）中に２００ｎＭまで希釈し、１０分間インキュベートした。ジペプチドｐｅｐ２７２の３倍希釈系列を４０ｎＭから始めて調製した（この濃度ではＬｇＢｉＴが高濃度での阻害を示したため、Ｋｄ値を計算することができず、ＬｇＢｉＴについてＫｄ値を取得するために新たな希釈系列を４ｎＭのｐｅｐ２７２から始めて作成した）。５０ｕｌのペプチド希釈系列をアッセイプレートに添加し、続いて、５０ｕｌのＬｇＢｉＴ及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６希釈物を加えた。試料を室温にて１時間インキュベートした。１００ｕｌのＮａｎｏＧｌｏ＋５０ｕＭのフリマジン（Ｆｚ）の添加後、プレートを５分間インキュベートし、発光をＧＭＭ＋上で読み取った。結果を図８６に示す。
【０３３３】
実施例５８
暗ジペプチドであるｐｅｐ２７２及びｐｅｐ２７３の比較
ＬｇＢｉＴ（配列番号１１）及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）を、＋／−０．４ｎＭのジペプチドｐｅｐ２６３（配列番号３５）または＋／−０．４ｎＭのジペプチドｐｅｐ２６４（配列番号２９９）を含有するＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ中に２００ｎＭまで希釈し、１０分間インキュベートした。ジペプチドｐｅｐ２７２（配列番号１４６）及びジペプチドｐｅｐ２７３（配列番号２９８）の３倍希釈系列を、ｐｅｐ２７２についてジペプチドｐｅｐ２６３希釈物を希釈剤として、及びｐｅｐ２７３についてジペプチドｐｅｐ２６４希釈物を希釈剤として使用して４０ｎＭから始めて調製した。５０ｕｌのＬｇＢｉＴ及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６希釈物を、５０ｕｌのｐｅｐ２７２／２７３の希釈系列と組み合わせ、室温にて２時間インキュベートした。１００ｕｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０ｕＭのＦｚの添加後、プレートを５分間室温にてインキュベートし、発光をＧＭＭ＋上で読み取った。結果を図８７に示す。
【０３３４】
実施例５９
ＤａｒｋＢｉＴ  ｐｅｐ１６７
２００ｎＭのＬｇＢｉＴ（配列番号１１）及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）を含有する溶液を調製した。０．２ｎＭのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＳｍＨｉＴｒｉｐ、配列番号２５）をＬｇＢｉＴ溶液に添加し、２００ｎＭのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６を含有する１ｕＭのＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ２８６（配列番号３７）をＬｇＴｒｉｐ  ３５４６溶液に添加した。ＤａｒｋＢｉＴ（ｐｅｐ１６７）（配列番号３００）の希釈物を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ中に１２ｕＭから始めて調製した。５０ｕｌのＤａｒｋＢｉＴ希釈物を、５０ｕｌのＬｇＢｉＴまたはＬｇＴｒｉｐ  ３５４６／ｐｅｐ１６７希釈物と組み合わせ、１時間インキュベートした。１００ｕｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０ｕＭのフリマジン（Ｆｚ）の添加後、プレートを１０分インキュベートし、発光をＧＭＭ＋上で読み取った。結果を図８８に示す。
【０３３５】
実施例６０
Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物におけるＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ４３５／４３４バリアントを用いるＦＲＢ−ＦＫＢＰにより促進される補完
グリセロールストックから培養物をＬＢ＋１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリン中で一晩増殖させ、細胞をＬＢ＋０．１５％のグルコース＋０．１％のラムノース＋アンピシリン中に１：１００で希釈した。２５℃で２０時間の振盪後、細胞をＰＬＢ中に１：４で希釈し、溶解するために室温にて１５分インキュベートした。関心対象のＳｍＴｒｉｐ９／ＳｍＴｒｉｐ１０ペプチド組み合わせの溶解物を１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合し、３０ｎＭのラパマイシンを含有または非含有のＰＬＢ＋２００ｎＭのＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）中に１：５で希釈した。試料を室温で３０分間インキュベートし、５０ｕＭのフリマジンを含有するＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液と１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で組み合わせた。発光を５分時点で読み取った。結果を図８９〜９０に示す。
【０３３６】
実施例６１
ＦＲＢ−ＦＫＢＰにより促進される補完
ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ４３５及びｐｅｐ４３４バリアントを用いるＨＥＫ溶解物におけるＦＲＢ−ＦＫＢＰにより促進される補完
６００，０００個の細胞を、６ウェルプレートの各ウェルのＤＭＥＭ＋１％のＦＢＳ中に添加した。細胞を５％のＣＯ2下で３７℃にて一晩増殖させ、ウェル１つ当たり３μｇのＤＮＡ（ＦＫＢＰまたはＦＲＢ構築物）でＦｕＧＥＮＥプロトコールを使用して形質移入した。５％のＣＯ2下、３７℃での一晩のインキュベーション後、細胞をＤＰＢＳで洗浄した。吸引後、１ｍｌの新鮮なＤＰＢＳを各ウェルに添加し、プレートを−８０℃で約１０分間凍結させた。プレートを室温にて解凍して、細胞を溶解し、１０分遠心分離し、上澄みを除去することにより溶解物を清澄化した。溶解物をＰＬＢ中に２倍に希釈し、関心対象のＳｍＴｒｉｐ９／ＳｍＴｒｉｐ１０ペプチド組み合わせを、１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合した。次いで、混合物を３０ｎＭのラパマイシンを含有または非含有のＰＬＢ＋２００ｎＭのＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）中に１：５で希釈した。試料を室温で３０分間インキュベートし、５０ｕＭのフリマジンを含有するＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液と１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で組み合わせた。発光を５分時点で読み取った。結果を図９１に示す。
【０３３７】
ＳｍＴｒｉｐ９  ８２３及び８４０を用いるＦＲＢ−ＦＫＢＰアッセイ法
ＦＫＢＰ−ＳｍＴｒｉｐ９バリアント及びＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０の培養物を、ＬＢ＋１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリン中で３７℃にて一晩増殖させた。細胞を０．１５％のグルコース、０．１％のラムノース、及び１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ中に１：２０で希釈した。培養物を振盪しながら２５℃で約２０時間誘導した。ＰＬＢアッセイ試薬を、４４４ｎＭのＬｇＴｒｉｐ  ３５４６、９０倍に希釈されたＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０培養物、＋／−３５ｎＭラパマイシンにより調製した。９０マイクロリットルのアッセイ試薬を、９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに添加した。ＦＫＢＰ＿ＳｍＴｒｉｐ９培養物をＰＬＢ中に１：１０で希釈し、１０ｕｌをアッセイプレートに添加した。試料を室温にて３０分インキュベートした。５０ｕＭのフリマジンを含有する１００マイクロリットルのＮａｎｏＧｌｏを、アッセイプレートウェルに添加し、発光を５分後にＧｌｏＭａｘ上で読み取った。結果を図９２に示す。
【０３３８】
実施例６２
ｐｅｐ４３４及びｐｅｐ４３５バリアントのＫｄの決定
ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）を、ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に０．２ｎＭまで希釈した。ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中の１００ｕＭのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（配列番号２５）を用いて各ＳｍＴｒｉｐ９様ペプチドの２０ｕＭ溶液を調製した。１００ｕＭのＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６溶液を希釈剤として使用して各ＳｍＴｒｉｐ９様ペプチドの２倍系列希釈を実行した。ペプチド希釈物をＬｇＴｒｉｐ  ３５４６溶液と１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で組み合わせ、１０分インキュベートした。ＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ＋２０ｕＭのフリマジン（Ｆｚ）の検出試薬を、ＬｇＴｒｉｐ／ペプチド溶液に１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で添加し、発光を１０分時点で読み取った。結果を図９３に示す。
【０３３９】
実施例６３
ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６を使用した、ＣＲＩＳＰＲによりタグ付けされたジペプチド−ＧＡＰＤＨの検出
本明細書における実施形態の開発の間に、ＬｇＴｒｉｐ  ２０９８（配列番号３１）及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）の両方が、内因的にタグ付けされたＧＡＰＤＨ（ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ８６（ＳｍＨｉＴｒｉｐ、配列番号２５）によりタグ付けされる）を検出するための生物発光試薬として有用であることを実証するための実験が実施された。
【０３４０】
内因性ＧＡＰＤＨの示されたペプチドとのＣ末端融合物を発現させるためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＨｅＬａ細胞を編集した。編集されたＨｅＬａ細胞を、単色の白色アッセイプレートのウェル当たり約２０，０００個の細胞密度で１００μｌのＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳ中に蒔いた。次いで、細胞を、ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）ＨｉＢｉＴ  Ｌｙｔｉｃ  Ｂｕｆｆｅｒ及び２００ｎＭのＬｇＴｒｉｐを含有する１００μｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）ＨｉＢｉＴ  Ｌｙｔｉｃ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の存在下で１０分間インキュベートした。発光をＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒを使用して０．５ｓの積分時間で記録した。相対的な細胞数を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ（登録商標）Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して製造者のプロトコールに従って決定した。データを細胞数に正規化した平均の相対発光量として、標準偏差として表されるばらつきと共に示す。
【０３４１】
結果を図９４に示す。
【０３４２】
実施例６４
ＳｍＴｒｉｐ９の部位飽和スクリーニング
本明細書における実施形態の開発の間に、ＳｍＴｒｉｐ９における有益なアミノ酸置換を同定するための実験が実施された。
【０３４３】
遺伝子部位飽和ライブラリーを、ＳｍＴｒｉｐ９における示された位置にランダム化されたコドンを有するプライマーを使用して作製した。ＫＲＸ  Ｅ．ｃｏｌｉをプールされた遺伝子バリアントで形質転換し、ＬＢ＋アンピシリン寒天上に蒔き、３７℃で一晩増殖させた。個々のコロニーを採取し、ＬＢ＋１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する９６ウェル培養プレートに入れた。培養物を振盪しながら３７℃で一晩増殖させた。細胞を０．１５％のグルコース、０．１％のラムノース、及び１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ中に１：２０で希釈した。培養物を振盪しながら２５℃で約２０時間誘導した。アッセイ試薬を、４４４ｎＭのＬｇＴｒｉｐ（配列番号５１）、９０倍に希釈されたＦＲＢ−ＶＳ−ＨｉＢｉＴ培養物、及び＋／−３５ｎＭのラパマイシンを、０．３ｘのＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＬＢ）及びＤＮアーゼを含有する２５ｍＭのＨＥＰＥＳに添加することによって調製した。９０マイクロリットルのアッセイ試薬を、９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに添加した。ＦＫＢＰ＿ＳｍＴｒｉｐ９培養物をＰＬＢ中に１：１０で希釈し、１０ｕｌをアッセイプレートに添加した。試料を室温にて３０分インキュベートした。５０ｕＭのフリマジンを含有する１００マイクロリットルのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標））緩衝液を、アッセイプレートウェルに添加し、発光を５分後にＧｌｏＭａｘ（登録商標）ルミノメーター上で読み取った。
【０３４４】
結果を図１００〜１１２に示す。
【０３４５】
実施例６５
Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物におけるＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ４３５／４３４
バリアントを用いるＦＲＢ−ＦＫＢＰにより促進される補完
ＦＫＢＰ＿ＳｍＴｒｉｐ９バリアント及びＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０の培養物を、ＬＢ＋１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリン中で３７℃にて一晩増殖させた。細胞を０．１５％のグルコース、０．１％のラムノース、及び１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ中に１：２０で希釈した。培養物を振盪しながら２５℃で約２０時間誘導した。培養物をＰＬＢ中に１：４で希釈し、室温にて１５分インキュベートして、細胞を溶解した。関心対象の組み合わせについてＳｍＴｒｉｐ９及びＳｍＴｒｉｐ１０希釈物を１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合した。混合物を、３０ｎＭのラパマイシン含有または非含有のＰＬＢ＋２００ｎＭのＬｇＴｒｉｐ中に１：５で希釈した。試料を室温にて３０分インキュベートした。５０ｕＭのフリマジンを含有する５０マイクロリットルのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標））緩衝液を、アッセイプレートウェルに添加し、発光を５分後にＧｌｏＭａｘ（登録商標）ルミノメーター上で読み取った。結果を図１１３〜１１５に示す。
【０３４６】
実施例６６
組み合わせのＳｍＴｒｉｐ９バリアントを用いたＦＲＢ−ＦＫＢＰ促進型補完アッセイ法
ＦＫＢＰ＿ＳｍＴｒｉｐ９バリアント及びＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０の培養物を、ＬＢ＋１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリン中で３７℃にて一晩増殖させた。細胞を０．１５％のグルコース、０．１％のラムノース、及び１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ中に１：２０で希釈した。培養物を振盪しながら２５℃で約２０時間誘導した。ＰＬＢアッセイ試薬を、４４４ｎＭのＬｇＴｒｉｐ、９０倍に希釈されたＦＲＢ−ＳｍＴｒｉｐ１０培養物、＋／−３５ｎＭラパマイシンにより調製した。９０マイクロリットルのアッセイ試薬を、９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに添加した。ＦＫＢＰ＿ＳｍＴｒｉｐ９培養物をＰＬＢ中に１：１０で希釈し、１０ｕｌをアッセイプレートに添加した。試料を室温にて３０分インキュベートした。５０ｕＭのフリマジンを含有する１００マイクロリットルのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標））緩衝液を、アッセイプレートウェルに添加し、発光を５分後にＧｌｏＭａｘ（登録商標）ルミノメーター上で読み取った。結果を図１１６〜１２２に示す。
【０３４７】
実施例６７
ＳｍＴｒｉｐ９合成ペプチドのＫｄ及びＢｍａｘの決定
ＬｇＴｒｉｐをＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ中に０．２ｎＭまで希釈し、ｐｅｐ２８９を２５ｕＭまで添加した。この溶液を、ＳｍＴｒｉｐ９ペプチドの５倍連続希釈系列の希釈剤として使用した。試料を室温にて１０分平衡化し、アッセイプレートに三重反復で等分した。２０ｕＭのフリマジンを含有するＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌを、１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）比率で試料に添加した。プレートを１０分インキュベートし、発光を読み取った。飽和ＳｍＴｒｉｐ９（２５ｕＭ）及びＶＳ−ＨｉＢｉＴの希釈物を用いることを除いて同一のプロトコールに従って、ＶＳ−ＨｉＢｉＴのＫｄを決定した。結果を図１２３〜１３０に示す。
【０３４８】
実施例６８
合成ＳｍＴｒｉｐ９ペプチドの溶解性の決定
別途注記のない限り、末端がブロッキングされた（Ｎ末端アセチル化及びＣ末端アミド化）合成ペプチドを、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ２．０から注文した。ペプチドをヌクレアーゼ非含有水中に溶解し、−２０℃で保存した。貯蔵液を２２℃の水浴内で解凍し、遠心分離し、使用まで４℃に維持した。結果を図１３１に示す。
【０３４９】
実施例６９
ＳｍＴｒｉｐ９合成ペプチド及びｐｅｐ２８９の生化学的共希釈（ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏ−ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）
ＬｇＴｒｉｐを、０．３ｘのＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＬＢ）及びＤＮアーゼを含有する２５ｍＭのＨＥＰＥＳ中に２００ｎＭまで希釈した。ＳｍＴｒｉｐ９ペプチド及びｐｅｐ２８９を１００ｕＭまで希釈し、ＰＬＢ中に６倍連続共希釈した。試料を室温にて１０分インキュベートした。ほとんどの濃縮された試料を、ＰＬＢ中に５０〜１００倍希釈した。試料をアッセイプレートに三重反復で等分し、ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０ｕＭのフリマジンと１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合した。発光をＣｌａｒｉｏＳｔａｒまたはＧｌｏＭａｘ（登録商標）機器で１０分後に読み取った。結果を図１３２〜１３３に示す。
【０３５０】
実施例７０
ＳｍＴｒｉｐ９及びＳｍＴｒｉｐ１０合成ペプチドの生化学的共希釈
ＬｇＴｒｉｐを、０．３ｘのＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＬＢ）及びＤＮアーゼを含有する２５ｍＭのＨＥＰＥＳ中に２００ｎＭまで希釈した。ＳｍＴｒｉｐ９及びＳｍＴｒｉｐ１０ペプチドを１００ｕＭまで希釈し、ＰＬＢ中に６倍連続共希釈した。試料を室温にて１０分インキュベートした。ほとんどの濃縮された試料を、ＰＬＢ中に５０〜１００倍希釈した。試料をアッセイプレートに三重反復で等分し、ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０ｕＭのフリマジンと１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合した。発光をＣｌａｒｉｏＳｔａｒまたはＧｌｏＭａｘ（登録商標）機器で１０分後に読み取った。結果を図１３４に示す。
【０３５１】
実施例７１
ｐｅｐ５２１及び代替のＳｍＴｒｉｐ１０合成ペプチドの生化学的共希釈
ＬｇＴｒｉｐを、０．３ｘのＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＬＢ）及びＤＮアーゼを含有する２５ｍＭのＨＥＰＥＳ中に２００ｎＭまで希釈した。ＳｍＴｒｉｐ１０ペプチド及びｐｅｐ５２１を１００ｕＭまで希釈し、ＰＬＢ中に６倍連続共希釈した。試料を室温にて１０分インキュベートした。ほとんどの濃縮された試料を、ＰＬＢ中に５０〜１００倍希釈した。試料をアッセイプレートに三重反復で等分し、ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０ｕＭのフリマジンと１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合した。発光をＣｌａｒｉｏＳｔａｒまたはＧｌｏＭａｘ（登録商標）機器で１０分後に読み取った。結果を図１３５に示す。
【０３５２】
実施例７２
ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６テンプレートからの鎖の除去（精製）
各クローンからの単一コロニーを、ＬＢ＋１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリン中で３７℃にて１８時間増殖させた。一晩培養物を、５０ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ＋０．１％のラムノース＋１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリン中に１：１００で希釈した。１５℃での４８時間の増殖後、細胞をペレット化し、１０ｍｌの１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）＋０．００１Ｕ／ｍｌのＤＮアーゼ中に再懸濁した。１ｍｌのＦａｓｔＢｒｅａｋ（登録商標）Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを各試料に添加し、次いで、試料を４℃で１時間回転混合器でインキュベートした。１０分間の７，０００ＲＰＭの遠心分離により清澄化された溶解物を調製した。
【０３５３】
ＭａｇｎｅＨｉｓ精製システムを使用した鎖の精製：３００ｕｌのＭａｇｎｅＨｉｓ樹脂（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各試料に添加し、次いで、試料を２０回混合し、磁気スタンドに配置した。上澄みを除去し、樹脂をカラム洗浄緩衝液で２回洗浄した。試料を６００ｕｌの溶出緩衝液中に溶出させた。次いで、ＴＢＳと交換するために、試料を透析装置に配置した。鎖が除去されたタンパク質の同定は、図１３６に図示するように、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより観察された。
【０３５４】
実施例７３
鎖除去タンパク質とペプチドの様々な組み合わせ
２００μｌのＯｐｔｉＭＥＭ＋１０％のＦＢＳを、マルチウェルプレートの複数ウェルに添加した。ペプチドの組み合わせを、１０μＭの最終濃度に添加し、各々を別個に各鎖除去タンパク質と共に分析した。各鎖除去タンパク質を、ＯｐｔｉＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ中に２０ｎＭ（ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６について２ｎＭ）まで希釈した。２０μｌの各鎖除去ペプチドを指定のペプチド組み合わせに添加し、試料を混合し、白色アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６００）のウェルに三重反復で４５μｌに等分した。室温での１５分のインキュベーション後、５μｌの検出試薬（１００ｕＭのＦｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＬＣＳ  Ｎ２０５））を各試料に添加した。試料を３０秒間オービタルシェーカーに配置し、次いで、発光を１時間の間、２分毎に測定した。発光は、キネティクス測定でのピーク高さとして報告される。バックグラウンドは、ＯｐｔｉＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ＋検出試薬である。
【０３５５】
図１３７に示すように、７、８、９、１０鎖が除去されたタンパク質では、別個のペプチドとして添加される場合、バックグラウンドを超えるシグナルはなかった。３つのペプチド組み合わせのうちの２つは、バックグラウンドを超える約２倍のシグナルもたらした（（８＋９）ジペプチド＋７＋１０）または（（７＋８）ジペプチド＋９＋１０）。３つのペプチド組み合わせのうちの１つは、バックグラウンドを超える約１０倍のシグナルをもたらした（（（９＋１０）ジペプチド＋７＋８）。（１０＋９）＋（７＋８）の２つのジペプチド組み合わせは、バックグラウンドを超える約４．５対数のシグナルをもたらした。最大のシグナルもたらしたペプチド組み合わせが最も高い親和性を有する可能性が高い。より低い親和性の組み合わせは、促進型補完アッセイにおいて光を生成し得る。図１３７Ｄは、代替の分割位置（例えば、ベータ鎖中間）を有するペプチドは、生物発光複合体を形成することができることを実証する。
【０３５６】
実施例７４
ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６テンプレートからの６、７、８、９、または１０鎖の除去（精製）
４００μｌのＯｐｔｉＭＥＭ＋１０％のＦＢＳを、ディープウェル９６ウェルプレートの複数ウェルに添加した。ペプチド組み合わせを、１０μＭの最終濃度に添加し、各ペプチドを別個にＡＴＧ−３９２９またはＬｇＴｒｉｐと共に解析した。次いで、ペプチド溶液を分割した。ペプチドアリコートの１つに、２０ｕｌの２０ｎＭのＡＴＧ−３９２９または２ｎＭのＬｇＴｒｉｐのいずれかを、指定のペプチド組み合わせとなるよう添加し、試料を混合し、４５μｌの＋／−ペプチドの試料を白色アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６００）のウェルに三重反復で等分した。室温での１５分のインキュベーション後、５μｌの検出試薬（ＯｐｔｉＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＬＣＳ  Ｎ２０５）中１００ｕＭのＦｚ）を各試料に添加した。試料を５分間オービタルシェーカーに配置した。各試料のバックグラウンドは、ＯｐｔｉＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ＋ペプチド希釈物＋検出試薬である。
【０３５７】
図１３８に示すように、（９＋１０）＋（７＋８）＋６鎖を含有する試料ＡＴＧ−３９２９は、バックグラウンドを超える約２倍のシグナルを示す。一方、２つのペプチド（６＋７＋８）＋（９＋１０）を含有する試料は、バックグラウンドを超える約３００倍のシグナルを示した。
【０３５８】
３つを超えるペプチドを含有する試料では自発的な補完が見られないことに注意されたい。ペプチドの親和性が光を生成するのに十分高くない可能性がある。ペプチドが融合パートナーによる促進型補完によって集合される場合、シグナルを得ることが可能である可能性がある。
【０３５９】
実施例７５
ジペプチド希釈物
ジペプチドを５ｕＭまで希釈し、０．２ｎＭのＬｇＴｒｉｐを含有するＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌを希釈剤として使用して５倍に連続希釈した。試料を室温にて１０分インキュベートし、アッセイプレートのウェルに三重反復で添加した。２０倍希釈したＬｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを含有する１対１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）のＴＢＳ＋０．０１％のＢＳＡ＋０．０１％のＴｅｒｇｉｔｏｌを試料に添加し、１０分後にプレートをＧｌｏＭａｘルミノメーター上で読み取った。図１３９Ａ〜Ｂは、ジペプチド希釈物からのＫｄ及びＢｍａｘ値を示す。
【０３６０】
哺乳動物細胞における２分子ＮａｎｏＴｒｉｐの応答倍率
増殖培地を、コンフルエントな細胞のフラスコから除去した。（ＨＥＫ２９３及びＨｅｌａ）。細胞を１０ｍｌのＤＰＢＳで洗浄し、次いで、３ｍｌのＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｔｒｙｐｓｉｎを細胞に添加した。細胞を３７℃で３分間インキュベートした。１０ｍｌの増殖培地を添加し、次いで、細胞を２００ＲＣＦで５分間遠心した。培地を交換し、細胞を１０ｍｌの増殖培地中に再懸濁した。細胞を計数し、２００，０００個／ｍｌに希釈した。１００ｕｌの細胞を白色アッセイプレートの各ウェルに蒔き、ＣＯ2下、３７℃で一晩増殖させた。その翌日、ＬｇＴｒｉｐ（３５４６）及び様々なジペプチドのＦＲＢ及びＦＫＢＰとの各方向性での融合物の１００ｎｇ／ｕｌのＤＮＡを組み合わせた。２６３の試料は、キャリアＤＮＡ中に１：１０の希釈または１０ｎｇ／ｕｌから始めた。次いで、ＤＮＡ試料を、キャリアＤＮＡ中に連続希釈した（１０ｕｌ〜９０μｌを１００ｎｇ／ｕｌのキャリアＤＮＡに添加）。次に、２０ｕｌの各ＤＮＡ希釈物を、８３ｕｌのＯｐｔｉＭＥＭに添加した。試料を混合し、次いで、６．６ｕｌのＶｉａｆｅｃｔ形質移入試薬を各試料に添加した。試料を室温で２０分間インキュベートし、次いで、各ＦＲＢ−ＦＫＢＰ方向性について５ｕｌの形質移入複合体を６つのウェルの細胞に添加した。次いで、プレートをＣＯ2下、３７℃で一晩増殖させた。その翌日、ラパマイシン（ＲＡＰ）を各試料について３つのウェルに１００ｎＭの最終濃度に添加した。試料を１分間オービタルシェーカーに配置し、次いで、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１００ｕｌのＮａｎｏＧｌｏ＋５０ｕＭのＦｚを各試料（＋ＲＡＰ及び−ＲＡＰ）に添加し、次いで、試料を５分間オービタルシェーカーに配置した。発光測定値を、Ｇｌｏｍａｘ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒルミノメーターを使用して得た。応答倍率は、＋ＲＡＰ試料からのＲＬＵ値を−ＲＡＰ試料からのＲＬＵ値で除算することにより計算した。結果を図１３９Ｃ〜Ｅに示す。ＬｇＴｒｉｐに対するより低い親和性を有するジペプチド融合物は、より高い親和性を有する試料と比較してより高い応答倍率を示す。
【０３６１】
実施例７６
３分子融合タンパク質を使用した抗ＴＮＦａ生物学的薬剤の３分子定量アッセイの開発
インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）、及びエタナーセプト（Ｅｎｂｒｅｌ）は、全てヒトＴＮＦａと結合し、また全てヒトＩｇＧ１  Ｆｃを含有するＴＮＦａ阻害剤である。３つのＴＮＦａ阻害剤全ての定量アッセイを、ＴＮＦａ阻害剤に対する結合構成要素として機能するＳｍＴｒｉｐ９−またはＳｍＴｒｉｐ１０−プロテインＧ及びＴＮＦａ融合タンパク質を発現させ、精製することによって開発した（図１４０）。プロテインＧ融合タンパク質は、ＴＮＦａ阻害剤の保存されたＩｇＧ１  Ｆｃ領域に結合する。阻害剤は、ＴＮＦａ融合タンパク質に結合し、ＳｍＴｒｉｐ９及びＳｍＴｒｉｐ１０を近接させる。ＬｇＴｒｉｐの存在下では、生物発光複合体が形成され、存在するＴＮＦａ阻害剤の量と比例するシグナルが生成される。プロテインＧ及びＴＮＦａのＮ末端またはＣ末端に４ｇｌｙ−ｓｅｒまたは１５ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーのいずれかと共に発現されるＳｍＴｒｉｐ９またはＳｍＴｒｉｐ１０を用いて全てのレポータータグ構成が試験された。全ての方向性をスクリーニングすることにより得られた最適な組み合わせは、ＳｍＴｒｉｐ９−１５ｇｌｙ／ｓｅｒ−プロテインＧとＴＮＦａ−１５ｇｌｙ／ｓｅｒ−ＳｍＴｒｉｐ１０との組み合わせであった。
【０３６２】
融合タンパク質を作製する方法
ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１（配列番号２６８）配列に続いて１５グリシン−セリンリピートのリンカーで構成されてプロテインＧのＮ末端に融合された融合タンパク質を発現させ、精製した。ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（配列番号１５０）配列で構成され、１５グリシン−セリンリピートのリンカーにより分離されてヒトＴＮＦａのＣ末端に融合された第２の融合タンパク質を発現させ、精製した。ＫＲＸ形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のグリセロールストックからの画線培養プレートを、アンピシリン（１００ｕｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレートで作成し、３７℃で一晩インキュベートさせた。単一コロニーを３ｍｌのＳＯＣ培地＋ＡＭＰに播種し、３７℃で振盪しながら（２７５ｒｐｍ）一晩インキュベートした。細胞を溶解し、プラスミドＤＮＡを回収した。ＳｈｕｆｆｌｅコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を、１００ｎｇのプラスミドＤＮＡで形質転換し、予熱された選択プレート上に塗布し、３０℃で一晩インキュベートさせた。コロニーを選択し、アンピシリンを含有するＬＢの５０ｍｌの容量に播種した。培養物を３７℃振盪しながら一晩インキュベートした後、アンピシリンを含有する５００ｍＬのＬＢ培地に１：１００で希釈した。これらのフラスコを、ＯＤ６００が０．６〜０．８に達するまで振盪しながら３７℃でインキュベートさせた。細胞を、１ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧを加えることにより誘導し、振盪しながら２５℃で一晩インキュベートさせた。細胞を収集し、遠心分離し、４℃で混合しながら、５０ｍＬの抽出及び溶解緩衝液中に再懸濁した。３サイクルの凍結／解凍を実行し、続いて、ＲＱ１  ＤＮアーゼを加えた。溶解物全体を５０ｍＬの厚壁遠心チューブに移し、４℃にて１０，０００×ｇで３０分間遠心した。２０ｍＭのイミダゾール／３５０ｍＭのＮａＣｌを添加した後、ニッケルカラムにロードした。融合タンパク質を洗浄し、増加する濃度のイミダゾールによる５ステップの溶出プロセスでカラムから溶出させた。試料をＴＢＳに対して透析し、最終的なストックタンパク質をＴＢＳ中５０％のグリセロール中に−２０℃で保存した。
【０３６３】
実施例７７
ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１−プロテインＧ及びＴＮＦａ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９融合タンパク質を使用した、ＴＮＦａ阻害剤であるインフリキシマブ、アダリムマブ、及びエタナーセプトの均一定量解析
本明細書における実施形態の開発の間に、ＮａｎｏＴｒｉｐ融合タンパク質の均一アッセイにおいてＴＮＦａ阻害剤を定量する能力を決定するための実験が実施された。結果は、ＬｇＴｒｉｐと組み合わせたプロテインＧ及びＴＮＦａ  ＮａｎｏＴｒｉｐ融合タンパク質が、インフリキシマブ、アダリムマブ、及びエタナーセプトの定量化について高い感度及び広い範囲を示すことを示す。
【０３６４】
ＴＮＦａ阻害剤の２倍貯蔵液をアッセイ緩衝液中に作成し、用量反応を生じさせるために１：２で連続希釈し、５０ｕｌ／ウェルを非結合表面処理された９６ウェルの単色の白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６００）に添加した。精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）（最終濃度１ｕＭ）＋ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１−プロテインＧ（配列番号２６８）（最終濃度１０ｎＭ）＋ＴＮＦａ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（配列番号１５０）（最終濃度１０ｎＭ）の２Ｘマスターミックスをアッセイ緩衝液中に作成し、５０ｕｌ／ウェルを添加した。プレートを室温にて９０分間インキュベートさせた。アッセイ緩衝液中のＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅの５Ｘ貯蔵液を作成し、１０ｕＭの最終濃度となるよう２５ｕｌ／ウェルをプレートに添加し、約５分間インキュベートさせ、発光をＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒを使用して測定した。アッセイ緩衝液は、ＰＢＳ中０．０１％のＢＳＡの最終濃度までＰＢＳ（ｐＨ７．０）中に希釈されたＢｌｏｃｋｅｒ  ＢＳＡ（１０％）（Ｔｈｅｒｍｏ）からなった。試料を三重反復／プレートで試験し、ｎ＝３の独立した実験を行った。図１４１に示すように、データを、検出限界（ＬＯＤ）、定量限界（ＬＯＱ）、及び定量上限（ＵＬＯＱ）について解析した。
【０３６５】
実施例７８
ヒト血清及び尿素などの複雑な試料マトリックス中のインフリキシマブの均一定量解析
本明細書における実施形態の開発の間に、均一アッセイにおける正常ヒトＩｇＧ除去血清、プールされた正常ヒトＡＢ血清、及びプールされた正常ヒト尿という複雑な試料マトリックスの存在下でのインフリキシマブを定量化するＮａｎｏＴｒｉｐ融合タンパク質の能力を決定するための実験が実施された。結果は、予測したように、ＮａｎｏＴｒｉｐシステムが、内因性のＩｇＧを除いて尿の存在によっても血清タンパク質の存在によってもほとんど影響を受けなかったことを示す。
【０３６６】
アッセイ緩衝液で希釈することにより、試験されるヒト試料マトリックスの存在下で２０ｎＭのインフリキシマブを含有する２Ｘ貯蔵液を作成し、５０ｕｌ／ウェルを非結合表面処理された９６ウェルの単色の白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６００）に添加した。精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）（最終濃度１ｕＭ）＋ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１−プロテインＧ（配列番号２６８）（最終濃度１０ｎＭ）＋ＴＮＦａ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（配列番号１５０）（最終濃度１０ｎＭ）の２Ｘマスターミックスをアッセイ緩衝液中に作成し、５０ｕｌ／ウェルを添加した。プレートを室温にて９０分間インキュベートさせた。アッセイ緩衝液中のＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅの５Ｘ貯蔵液を作成し、１０ｕＭの最終濃度となるよう２５ｕｌ／ウェルをプレートに添加し、約５分間インキュベートさせ、発光をＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒを使用して測定した。アッセイ緩衝液は、ＰＢＳ中０．０１％のＢＳＡの最終濃度までＰＢＳ（ｐＨ７．０）中に希釈されたＢｌｏｃｋｅｒ  ＢＳＡ（１０％）（Ｔｈｅｒｍｏ）からなった。試料を三重反復で試験した。図１４２に示すように、データをシグナル／バックグラウンドとして示す。
【０３６７】
実施例７９
溶液相均一アッセイにおける１００ｐＭのインフリキシマブ存在下でのＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１−プロテインＧ（配列番号２６８）及びＴＮＦａ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）融合タンパク質の精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）との促進された補完によるシグナル生成の動態解析。
本明細書における実施形態の開発の間に、溶液相均一アッセイにおいて１００ｐＭのインフリキシマブを定量化するプロテインＧ／ＴＮＦａ  ＮａｎｏＴｒｉｐシステムの結合動態を決定するための実験が実施された。結果は、シグナル生成が即時かつ持続的であることを示し、ＳｍＴｒｉｐ９及びＳｍＴｒｉｐ１０融合タンパク質に対するＬｇＴｒｉｐだけでなく、インフリキシマブに対する融合タンパク質の急速な結合動態を示す。
【０３６８】
インフリキシマブの２倍貯蔵液（１００ｐＭ最終濃度）をアッセイ緩衝液中に作成し、５０ｕｌ／ウェルを非結合表面処理された９６ウェルの単色の白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６００）に添加した。精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）（最終濃度１ｕＭ）＋ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１−プロテインＧ（配列番号２６８）（最終濃度１０ｎＭ）＋ＴＮＦａ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（配列番号１５０）（最終濃度１０ｎＭ）の２Ｘマスターミックスをアッセイ緩衝液中に作成し、５０ｕｌ／ウェルを添加した。アッセイ緩衝液中のＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅの５Ｘ貯蔵液を作成し、１０ｕＭの最終濃度となるよう２５ｕｌ／ウェルをプレートに添加した。全ての試薬を添加し、プレートを直ちにＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒに配置し、発光を経時的に読み取った。アッセイ緩衝液は、ＰＢＳ中０．０１％のＢＳＡの最終濃度までＰＢＳ（ｐＨ７．０）中に希釈されたＢｌｏｃｋｅｒ  ＢＳＡ（１０％）（Ｔｈｅｒｍｏ）からなった。試料を三重反復で試験した。
【０３６９】
結果を図１４３に示す。
【０３７０】
実施例８０
ＳｍＴｒｉｐ９−プロテインＧバリアントの、溶液相均一アッセイにおけるＴＮＦａ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）融合タンパク質及び精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）との促進される補完によりインフリキシマブを測定するそれらの能力についての試験
本明細書における実施形態の開発の間に、プロテインＧとの融合タンパク質として発現される他のＳｍＴｒｉｐ９バリアントの、溶液相均一アッセイにおいてＴＮＦａ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）融合タンパク質及び精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）との促進される補完によりインフリキシマブを測定する能力を決定するための実験が実施された。結果は、試験されたＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ（ｘ）−プロテインＧバリアントの全てがシグナルを生成することができたことを示す。
【０３７１】
インフリキシマブの２倍貯蔵液（１０ｎＭ最終濃度）をアッセイ緩衝液中に作成し、５０ｕｌ／ウェルを非結合表面処理された９６ウェルの単色の白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６００）に添加した。精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）（最終濃度１ｕＭ）＋ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ（ｘ）−プロテインＧ（最終濃度１０ｎＭ）＋ＴＮＦａ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（配列番号１５０）（最終濃度１０ｎＭ）の２Ｘマスターミックスをアッセイ緩衝液中に作成し、５０ｕｌ／ウェルを添加した。プレートを室温にて９０分間インキュベートさせた。アッセイ緩衝液中のＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅの５Ｘ貯蔵液を作成し、１０ｕＭの最終濃度となるよう２５ｕｌ／ウェルをプレートに添加し、約５分間インキュベートさせ、発光をＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒを使用して測定した。アッセイ緩衝液は、ＰＢＳ中０．０１％のＢＳＡの最終濃度までＰＢＳ（ｐＨ７．０）中に希釈されたＢｌｏｃｋｅｒ  ＢＳＡ（１０％）（Ｔｈｅｒｍｏ）からなった。試料を三重反復で試験した。結果を図１４４に示す。
【０３７２】
実施例８１
ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ（Ｘ）−プロテインＧバリアント及びＴＮＦａ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９融合タンパク質を使用したインフリキシマブの均一定量試験
本明細書における実施形態の開発の間に、異なるＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ（Ｘ）−プロテインＧバリアントの、溶液相均一アッセイにおいてＴＮＦａ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）融合タンパク質及び精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）との促進される補完によりインフリキシマブを定量化する能力を実証するための実験が実施された。結果は、全てのＳｍＴｒｉｐ９バリアントがインフリキシマブを定量化することができたことを示す。
【０３７３】
インフリキシマブの２倍貯蔵液（１０ｎＭ最終濃度）をアッセイ緩衝液中に作成し、５０ｕｌ／ウェルを非結合表面処理された９６ウェルの単色の白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６００）に添加した。精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）（最終濃度１ｕＭ）＋ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ（ｘ）−プロテインＧ（最終濃度１０ｎＭ）＋ＴＮＦａ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（配列番号１５０）（最終濃度１０ｎＭ）の２Ｘマスターミックスをアッセイ緩衝液中に作成し、５０ｕｌ／ウェルを添加した。プレートを室温にて９０分間インキュベートさせた。アッセイ緩衝液中のＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅの５Ｘ貯蔵液を作成し、１０ｕＭの最終濃度となるよう２５ｕｌ／ウェルをプレートに添加し、約５分間インキュベートさせ、発光をＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒを使用して測定した。アッセイ緩衝液は、ＰＢＳ中０．０１％のＢＳＡの最終濃度までＰＢＳ（ｐＨ７．０）中に希釈されたＢｌｏｃｋｅｒ  ＢＳＡ（１０％）（Ｔｈｅｒｍｏ）からなった。試料を三重反復で試験した。
【０３７４】
実施例８２
３分子融合タンパク質を使用した細胞ベースのアッセイでの抗ＥＧＦＲ生物学的薬剤の３分子定量アッセイの開発。
本発明者らは、相分離または界面化学様アッセイに相当する、パニツムマブ及びセツキシマブの細胞ベースの定量アッセイを開発した。ＥＧＦＲ阻害剤の保存されたヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域に結合する精製されたＳｍＴｒｉｐ９−プロテインＧ融合タンパク質を使用すると、阻害剤は、細胞表面に発現されるＳｍＴｒｉｐ１０−ＥＧＦＲ融合タンパク質に結合し、ＳｍＴｒｉｐ９及びＳｍＴｒｉｐ１０を近接させる。ＬｇＴｒｉｐの存在下では、生物発光複合体が形成され、存在するＥＧＦＲ阻害剤の量と比例するシグナルが生成される。プロテインＧのＮ末端もしくはＣ末端に、またはＥＧＦＲのＮ末端に４ｇｌｙ−ｓｅｒまたは１５ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーのいずれかと共に発現されるＳｍＴｒｉｐ９またはＳｍＴｒｉｐ１０を用いて全てのレポータータグ構成が試験された。全ての方向性をスクリーニングすることにより得られた最適な組み合わせは、ＳｍＴｒｉｐ９−４ｇｌｙ／ｓｅｒ−プロテインＧとＥＧＦＲ−１５ｇｌｙ／ｓｅｒ−ＳｍＴｒｉｐ１０との組み合わせであった。
【０３７５】
結果を図１４５に示す。
【０３７６】
実施例８３
ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１−プロテインＧ（配列番号２６８）融合タンパク質及びＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９−ＥＧＦＲ（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）を発現する細胞を精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）と共に細胞ベースの均一アッセイに用いる、促進される補完によるパニツムマブの定量化。
本明細書における実施形態の開発の間に、ＮａｎｏＴｒｉｐ融合タンパク質の、細胞ベースの均一アッセイにおいてＥＧＦＲ阻害剤パニツムマブを定量化する能力を決定するための実験が実施された。結果は、ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１−プロテインＧ（配列番号２６８）精製タンパク質、ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９−ＥＧＦＲ（配列番号１５０）を発現する細胞、及びＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）が、パニツムマブの定量化について高い感度及び広い範囲を示すことを示す。
【０３７７】
ＨＥＫ２９３細胞を、加湿された組織培養インキュベーター内で３７℃／５％のＣＯ2下、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補足した増殖培地（ＤＭＥＭ）に維持した。一過性のリバーストランスフェクションを、最初にＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９−ＥＧＦＲ（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）の発現構築物をキャリアＤＮＡ（ＰＧＥＭ−３ＺＦ（−））を含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に１：１０の質量比で希釈することにより実行した。形質移入試薬：ＤＮＡ複合体を、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ形質移入試薬を１：３の比率で（１ｍＬのＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ当たり１ｍｇのＤＮＡ）添加し、続いて、室温にて１５分インキュベーションすることによって調製した。次いで、得られた形質移入試薬：ＤＮＡ複合体を、増殖培地中のＨＥＫ２９３細胞懸濁液（２×１０5細胞／ｍｌ）と１：２０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比率で混合し、続いて、加湿された組織培養インキュベーター内で３７℃／５％のＣＯ2下で１８〜２０時間インキュベーションした。
【０３７８】
ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９−ＥＧＦＲ（配列番号１５０）融合タンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを使用して収集し、増殖培地で洗浄し、４．５×１０5細胞／ｍｌの濃度でＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に再懸濁した。５０ｕｌの細胞／ウェル（２０，０００細胞／ウェル）を、非結合表面処理された９６ウェルの単色の白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６００）に添加した。パニツムマブの４Ｘ貯蔵液をＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に作成し、用量反応を生じさせるためにＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に連続希釈し、２５ｕｌ／ウェルを添加した。精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）（最終濃度１ｕＭ）＋ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１−プロテインＧ（配列番号２６８）（最終濃度５ｎＭ）の４ＸマスターミックスをＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に作成し、２５ｕｌ／ウェルを添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートさせた。アッセイ緩衝液中のＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅの５Ｘ貯蔵液を作成し、１０ｕＭの最終濃度となるよう２５ｕｌ／ウェルをプレートに添加し、発光をＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒ上で測定した。試料を三重反復で試験した。Ｎ＝３の独立した実験。
【０３７９】
結果を図１４６に示す。
【０３８０】
実施例８４
細胞ベースの均一アッセイにおける漸増用量のセツキシマブの存在下での精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）と組み合わせた精製されたＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１−プロテインＧ（配列番号２６８）融合タンパク質及びＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９−ＥＧＦＲ（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）を発現するＨＥＫ２９３細胞の促進される補完によるシグナル生成のリアルタイム結合動態解析。
本明細書における実施形態の開発の間に、細胞ベースの均一アッセイにおいてセツキシマブを定量化するためのプロテインＧ／ＥＧＦＲ  ＮａｎｏＴｒｉｐシステムの結合動態を決定するための実験が実施された。結果は、ルシフェラーゼ複合体の形成により発光シグナルが時間と共に増加することを示す。またシグナル生成は、用量依存的でもある。
【０３８１】
ＨＥＫ２９３細胞を、加湿された組織培養インキュベーター内で３７℃／５％のＣＯ2下、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補足した増殖培地（ＤＭＥＭ）に維持した。一過性のリバーストランスフェクションを、最初にＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９−ＥＧＦＲ（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）の発現構築物をキャリアＤＮＡ（ＰＧＥＭ−３ＺＦ（−））を含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に１：１０の質量比で希釈することにより実行した。形質移入試薬：ＤＮＡ複合体を、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ形質移入試薬を１：３の比率で（１ｍＬのＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ当たり１ｍｇのＤＮＡ）添加し、続いて、室温にて１５分インキュベーションすることによって調製した。次いで、得られた形質移入試薬：ＤＮＡ複合体を、増殖培地中のＨＥＫ２９３細胞懸濁液（２×１０5細胞／ｍｌ）と１：２０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比率で混合し、続いて、加湿された組織培養インキュベーター内で３７℃／５％のＣＯ2下で１８〜２０時間インキュベーションした。
【０３８２】
ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９−ＥＧＦＲ融合タンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを使用して収集し、増殖培地で洗浄し、４．５×１０5細胞／ｍｌの濃度でＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に再懸濁した。５０ｕｌの細胞／ウェル（２０，０００細胞／ウェル）を、非結合表面処理された９６ウェルの単色の白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６００）に添加した。セツキシマブの４Ｘ貯蔵液をＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に作成し、２５ｕｌ／ウェルを添加した。精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）（最終濃度１０ｕＭ）＋ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１−プロテインＧ（配列番号２６８）（最終濃度７８０ｐＭ）の４ＸマスターミックスをＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に作成し、２５ｕｌ／ウェルを添加した。アッセイ緩衝液中のＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅの５Ｘ貯蔵液を作成し、１０ｕＭの最終濃度となるよう２５ｕｌ／ウェルをプレートに添加した。全ての試薬を添加し、プレートを直ちにＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒに配置し、発光を経時的に読み取った。試料を三重反復で試験した。
【０３８３】
結果を図１４７に示す。
【０３８４】
実施例８５
ＳｍＴｒｉｐ９−プロテインＧバリアントの、細胞ベースの均一アッセイにおける精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）と組み合わせたＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９−ＥＧＦＲ（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）を発現する細胞との促進される補完によりパニツムマブを測定するそれらの能力についての試験。
本明細書における実施形態の開発の間に、プロテインＧとの融合タンパク質として発現される他のＳｍＴｒｉｐ９バリアントの、細胞ベースの均一アッセイにおいて精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）と組み合わせたＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９−ＥＧＦＲ（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）を発現する細胞との促進される補完によりパニツムマブを測定する能力を決定するための実験が実施された。結果は、試験されたＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ（ｘ）−プロテインＧバリアントの全てがシグナルを生成することができたことを示す。
【０３８５】
ＨＥＫ２９３細胞を、加湿された組織培養インキュベーター内で３７℃／５％のＣＯ2下、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補足した増殖培地（ＤＭＥＭ）に維持した。一過性のリバーストランスフェクションを、最初にＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９−ＥＧＦＲ（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）の発現構築物をキャリアＤＮＡ（ＰＧＥＭ−３ＺＦ（−））を含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に１：１０の質量比で希釈することにより実行した。形質移入試薬：ＤＮＡ複合体を、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ形質移入試薬を１：３の比率で（１ｍＬのＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ当たり１ｍｇのＤＮＡ）添加し、続いて、室温にて１５分インキュベーションすることによって調製した。次いで、得られた形質移入試薬：ＤＮＡ複合体を、増殖培地中のＨＥＫ２９３細胞懸濁液（２×１０５細胞／ｍｌ）と１：２０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比率で混合し、続いて、加湿された組織培養インキュベーター内で３７℃／５％のＣＯ2下で１８〜２０時間インキュベーションした。
【０３８６】
ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９−ＥＧＦＲ（配列番号１５０）融合タンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを使用して収集し、増殖培地で洗浄し、４．５×１０5細胞／ｍｌの濃度でＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に再懸濁した。５０ｕｌの細胞／ウェル（２０，０００細胞／ウェル）を、非結合表面処理された９６ウェルの単色の白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６００）に添加した。パニツムマブ（最終濃度１ｎＭ）の４Ｘ貯蔵液をＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に作成し、２５ｕｌ／ウェルを添加した。精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）（最終濃度１ｕＭ）＋ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ（Ｘ）−プロテインＧ（最終濃度１０ｎＭ）の４ＸマスターミックスをＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に作成し、２５ｕｌ／ウェルを添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートさせた。アッセイ緩衝液中のＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅの５Ｘ貯蔵液を作成し、１０ｕＭの最終濃度となるよう２５ｕｌ／ウェルをプレートに添加し、発光をＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒ上で測定した。試料を三重反復で試験した。Ｎ＝３の独立した実験。結果を図１４８に示す。
【０３８７】
実施例８６
ＳｍＴｒｉｐ９−プロテインＧバリアントの、細胞ベースの均一アッセイにおける精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）と組み合わせたＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９−ＥＧＦＲ（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）を発現する細胞との促進される補完によりパニツムマブを測定するそれらの能力についての試験。
本明細書における実施形態の開発の間に、プロテインＧとの融合タンパク質として発現される他のＳｍＴｒｉｐ９バリアントの、細胞ベースの均一アッセイにおいて精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）と組み合わせたＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９−ＥＧＦＲ（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）を発現する細胞との促進される補完によりパニツムマブを測定する能力を決定するための実験が実施された。結果は、試験されたＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ（ｘ）−プロテインＧバリアントの全てが用量反応解析においてパニツムマブを定量化することができたことを示す。
【０３８８】
ＨＥＫ２９３細胞を、加湿された組織培養インキュベーター内で３７℃／５％のＣＯ2下、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補足した増殖培地（ＤＭＥＭ）に維持した。一過性のリバーストランスフェクションを、最初にＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９−ＥＧＦＲ（ＶＳ−ＨｉＢｉＴ、配列番号１５０）の発現構築物をキャリアＤＮＡ（ＰＧＥＭ−３ＺＦ（−））を含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に１：１０の質量比で希釈することにより実行した。形質移入試薬：ＤＮＡ複合体を、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ形質移入試薬を１：３の比率で（１ｍＬのＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ当たり１ｍｇのＤＮＡ）添加し、続いて、室温にて１５分インキュベーションすることによって調製した。次いで、得られた形質移入試薬：ＤＮＡ複合体を、増殖培地中のＨＥＫ２９３細胞懸濁液（２×１０5細胞／ｍｌ）と１：２０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比率で混合し、続いて、加湿された組織培養インキュベーター内で３７℃／５％のＣＯ2下で１８〜２０時間インキュベーションした。
【０３８９】
ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９−ＥＧＦＲ（配列番号１５０）融合タンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを使用して収集し、増殖培地で洗浄し、４．５×１０5細胞／ｍｌの濃度でＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に再懸濁した。５０ｕｌの細胞／ウェル（２０，０００細胞／ウェル）を、非結合表面処理された９６ウェルの単色の白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６００）に添加した。パニツムマブ（最終濃度１ｎＭ）の４Ｘ貯蔵液をＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に作成し、２５ｕｌ／ウェルを添加した。精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）（最終濃度１ｕＭ）＋ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ（Ｘ）−プロテインＧ（最終濃度１０ｎＭ）の４ＸマスターミックスをＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に作成し、２５ｕｌ／ウェルを添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートさせた。アッセイ緩衝液中のＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅの５Ｘ貯蔵液を作成し、１０ｕＭの最終濃度となるよう２５ｕｌ／ウェルをプレートに添加し、発光をＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒ上で測定した。試料を三重反復で試験した。結果を図１４９に示す。
【０３９０】
実施例８７
ＮａｎｏＴｒｉｐで化学的に標識されたペア抗体を使用したヒトＩＬ−１ベータの定量化
本明細書における実施形態の開発の間に、ＮａｎｏＴｒｉｐペプチドと化学的にコンジュゲートされているペアモノクローナル抗体の、ヒトＩＬ−１ベータを定量化するための使用を実証するための実験が実施された。このモデルシステムは、異なるエピトープでＩＬ−１ベータを認識する２つのモノクローナルマウス抗体からなる。ＨａｌｏＴａｇ−ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１（配列番号２６８）が一方の抗体に化学的にコンジュゲートされ、ＨａｌｏＴａｇ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（配列番号１５０）が他方の抗体に化学的にコンジュゲートされた。ＩＬ−１ベータの存在下で、２つの抗体は、ＩＬ−１ベータに結合し、これにより、２つのタグを近接させる。ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）の添加により補完が完成し、発光シグナルが生成される。
【０３９１】
ＨａｌｏＴａｇ−ＳｍＴｒｉｐ９及びＨａｌｏＴａｇ−ＳｍＴｒｉｐ１０融合タンパク質が、発現され、精製される。抗ＩＬ−１ベータマウスモノクローナル抗体５０８Ａ  ４Ａ２クローン（Ｔｈｅｒｍｏ）は、ＨａｌｏＴａｇ−ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１（配列番号２６８）で標識され、抗ＩＬ−１ベータマウスモノクローナル抗体クローン  ５０８Ａ  ７Ｇ８（Ｔｈｅｒｍｏ）は、ＨａｌｏＴａｇ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（配列番号１５０）で標識される。非標識の抗体を、最初にＺｅｂａカラムを使用して１０ｍＭのＮａＨＣＯ3（ｐＨ８．５）に緩衝液交換をすることにより調製する。次いで、抗体を２０倍過剰のＨａｌｏＴａｇ（登録商標）Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｅｓｔｅｒ（Ｏ４）Ｌｉｇａｎｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で下準備し、室温にて２時間インキュベートさせる。緩衝液交換を、Ｚｅｂａカラムを使用して２回行って、遊離リンカーを除去する。下準備した抗体を、４倍過剰のＨａｌｏＴａｇ−ＳｍＴｒｉｐ９またはＨａｌｏＴａｇ−ＳｍＴｒｉｐ１０と共に混合しながら４℃で一晩インキュベートする。ＨａｌｏＬｉｎｋ（登録商標）Ｒｅｓｉｎを使用して、任意の遊離ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）融合タンパク質を除去する。
【０３９２】
組換えヒトＩＬ−１ベータの２Ｘ貯蔵液をアッセイ緩衝液中に作成し、用量反応を生じさせるために１：２で連続希釈し、５０ｕｌ／ウェルを非結合表面処理された９６ウェルの単色の白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６００）に添加した。精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）（最終濃度１ｕＭ）＋ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１により標識された４Ａ２クローン（配列番号２６８）（最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９により標識された７Ｇ８クローン（配列番号１５０）（最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）の２Ｘマスターミックスをアッセイ緩衝液中に作成し、５０ｕｌ／ウェルを添加した。アッセイ緩衝液中のＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅの５Ｘ貯蔵液を作成し、１０ｕＭの最終濃度となるよう２５ｕｌ／ウェルをプレートに添加し、発光をＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒ上で測定した。アッセイ緩衝液は、ＰＢＳ中０．０１％のＢＳＡの最終濃度までＰＢＳ（ｐＨ７．０）中に希釈されたＢｌｏｃｋｅｒ  ＢＳＡ（１０％）（Ｔｈｅｒｍｏ）からなった。試料を三重反復で試験した。示されるデータは、２０分の時点で読み取られたシグナルである。
【０３９３】
結果を図１５０に示す。
【０３９４】
実施例８８
ＮａｎｏＴｒｉｐで化学的に標識されたペア抗体を使用したヒトトロポニンのリアルタイム結合動態
本明細書における実施形態の開発の間に、ＮａｎｏＴｒｉｐペプチドと化学的にコンジュゲートされているペアモノクローナル抗体の、ヒトトロポニンを定量化するための使用を実証するための実験が実施された。このモデルシステムは、異なるエピトープでトロポニンを認識する２つのモノクローナルマウス抗体からなる。ＨａｌｏＴａｇ−ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１（配列番号２６８）が一方の抗体に化学的にコンジュゲートされ、ＨａｌｏＴａｇ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（配列番号１５０）が他方の抗体に化学的にコンジュゲートされた。トロポニンの存在下で、２つの抗体は、トロポニンに結合し、これにより、２つのタグを近接させる。ＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）の添加により補完が完成し、発光シグナルが生成される。
【０３９５】
ＨａｌｏＴａｇ−ＳｍＴｒｉｐ９及びＨａｌｏＴａｇ−ＳｍＴｒｉｐ１０融合タンパク質が、発現され、精製される。抗トロポニンマウスモノクローナル抗体１０−Ｔ７９Ｃ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）は、ＨａｌｏＴａｇ−ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９（配列番号１５０）により標識され、抗トロポニンマウスモノクローナル抗体１０−Ｔ７９Ｆ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）は、ＨａｌｏＴａｇ−ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１（配列番号２６８）により標識される。非標識の抗体を、最初にＺｅｂａカラムを使用して１０ｍＭのＮａＨＣＯ3（ｐＨ８．５）に緩衝液交換をすることにより調製する。次いで、抗体を２０倍過剰のＨａｌｏＴａｇ（登録商標）Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｅｓｔｅｒ（Ｏ４）Ｌｉｇａｎｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で下準備し、室温にて２時間インキュベートさせる。緩衝液交換を、Ｚｅｂａカラムを使用して２回行って、遊離リンカーを除去する。下準備した抗体を、４倍過剰のＨａｌｏＴａｇ−ＳｍＴｒｉｐ９またはＨａｌｏＴａｇ−ＳｍＴｒｉｐ１０と共に混合しながら４℃で一晩インキュベートする。ＨａｌｏＬｉｎｋ（登録商標）Ｒｅｓｉｎを使用して、任意の遊離ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）融合タンパク質を除去する。
【０３９６】
組換えヒトトロポニンの２倍貯蔵液（最終濃度１ｕｇ／ｍｌ）をアッセイ緩衝液中に作成し、５０ｕｌ／ウェルを非結合表面処理された９６ウェルの単色の白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６００）に添加した。精製されたＬｇＴｒｉｐ  ３５４６（配列番号５１）（最終濃度１ｕＭ）＋ＳｍＴｒｉｐ９  ｐｅｐ５２１により標識された１０−Ｔ７９Ｆクローン（最終濃度１ｕｇ／ｍｌ）（配列番号２６８）＋ＳｍＴｒｉｐ１０  ｐｅｐ２８９により標識された１０−Ｔ７９Ｃクローン（配列番号１５０）（最終濃度１ｕｇ／ｍｌ）の２Ｘマスターミックスをアッセイ緩衝液中に作成し、５０ｕｌ／ウェルを添加した。アッセイ緩衝液中のＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅの５Ｘ貯蔵液を作成し、１０ｕＭの最終濃度となるよう２５ｕｌ／ウェルをプレートに添加し、発光をＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒを使用してリアルタイムで測定した。アッセイ緩衝液は、ＰＢＳ中０．０１％のＢＳＡの最終濃度までＰＢＳ（ｐＨ７．０）中に希釈されたＢｌｏｃｋｅｒ  ＢＳＡ（１０％）（Ｔｈｅｒｍｏ）からなった。試料を三重反復で試験した。
【０３９７】
結果を図１５１に示す。
【０３９８】
実施例８９
転移アッセイ
ＨｉＢｉＴは、ＬｇＢｉＴポリペプチド（ＫD＝１ｎＭ）及び他の類似の相補的なポリペプチドに対する非常に高い親和性を示す。２つの断片間の強い相互作用は、なんらの刺激なしに補完を駆動し（図１５４）、このことは転移アッセイに適さない。転移アッセイの２つの構成要素（例えば、ペプチド及びポリペプチド）の間の最適な親和性を決定するための研究が実施された。最適な親和性は、２８０ｎＭ〜１３００ｎＭの範囲であることが分かった。ＬｇＢｉＴ*と称される、ＬｇＢｉＴ（Ｅ１１Ｋ／Ｉ４４Ｍ／Ｎ１３５Ｖ／Ｌ１５０Ｓ）の四重変異は、そのＨｉＢｉＴとの相互作用を約１０００分の１に低減し（ＫD＝１２９６ｎＭ）、ＨｉＢｉＴ／ＬｇＢｉＴ*対を転移アッセイに適したものにする。２つの異なる転移アッセイが設計され、試験された。
【０３９９】
膜転移アッセイが、ＰＭＡ刺激下でのＰＫＣαの細胞質ゾルから形質膜への転移を測定するために開発された。ＰＫＣαは、ＨｅＬａ細胞内でＣ末端がＨｉＢｉＴで内因的にタグ付けされた。編集された細胞のクローンが単離され、最も高い発光シグナルを有する最も良好なクローンがアッセイを実行するために選択された。ＬｇＢｉＴ*−膜センサーが、形質移入法を使用してクローンに導入された。ＰＭＡの添加は、ＰＫＣα−ＨｉＢｉＴを形質膜に動員し、そこでＨｉＢｉＴがＬｇＢｉＴ*に接触して、光を生成する。ＰＭＡの希釈物は、形質移入されたＬｇＢｉＴ*の量に応じて１２〜１９倍の反応の増加をもたらした（図１５５）。
【０４００】
ＴＮＦα刺激下でのｐ６５の細胞質ゾルから核への移動の測定を使用した核転移アッセイが開発された。核転移アッセイは、膜転移アッセイと同様に準備された。具体的には、ｐ６５がＨｅＬａ細胞内でＣ末端が内因的にタグ付けされ、ＬｇＢｉＴ*核センサーが形質移入法によりｐ６５−ＨｉＢｉＴ細胞株に導入された。ＴＮＦα処理は、ｐ６５−ＨｉＢｉＴの核への転移を促進し、そこでＨｉＢｉＴとＬｇＢｉＴ*との間で補完が起こり、発光シグナルをもたらす。アッセイは、リアルタイムでのタンパク質転移の測定を可能にする。図１５６Ｂに示すように、ＴＮＦα刺激に際してｐ６５が核に移動するのに約３０分かかり、このことは文献における発見と一貫している。
【０４０１】
実施例９０
ＬｇＢｉＴ変異体のＫｄ及びＢｍａｘ値のＨｉＢｉＴとの比較
ＨｉＢｉＴペプチドの溶液を、ＯｐｔｉＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ中に１．２２ｕＭから始めて調製した。ペプチド希釈物をＯｐｔｉＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ中に３倍で連続希釈した（３００ｕｌを７００ｕｌに）。精製されたＬｇＢｉＴまたはＬｇＢｉＴ変異体をＯｐｔｉＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ中に２ｎＭの濃度まで希釈した。９０ｕｌのペプチド溶液を、１０ｕｌのＬｇＢｉＴ希釈物を組み合わせた（０．２ｎＭのＬｇＢｉＴ最終濃度）。試料をオービタルシェーカーで３０分間インキュベートし、次いで、１１ｕｌのＯｐｔｉＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ中１００ｕＭのフリマジンを添加した。試料を５分間オービタルシェーカーに配置し、次いで、発光をＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ＋ルミノメーターを使用して読み取った。Ｂｍａｘ及びＫｄを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにより非線形回帰（１サイト特異的結合）を使用して計算した（図１５７Ａ〜Ｂ）。
【０４０２】
実施例９１
ＬｇＢｉＴ変異体溶解物のＨｉＢｉＴに対する親和性
ＬｇＢｉＴ及び各ＬｇＢｉＴ変異体の３７℃一晩培養物を増殖させた。各培養物をＬＢ＋０．１％のラムノース及び０．１５％のグルコース中に１：１００で希釈した。２５℃で２０時間増殖させた。各培養物の溶解物を、等しい容量の誘導された培養物をＰＬＢ溶解緩衝液で希釈することによって調製した。（ＰＬＢ溶解緩衝液は、０．３Ｘ  ＰＬＢ＋２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）である）。次いで、各溶解物をＰＬＢ溶解緩衝液中に１０，０００倍で希釈した。合成ＨｉＢｉＴペプチドの希釈系列を、ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）アッセイ緩衝液＋５０ｕＭのフリマジン中に３００ｎＭから始めて調製した。５０ｕｌの各希釈された溶解物を、５０ｕｌのペプチド／ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）希釈物と組み合わせた。試料を３分間インキュベートし、次いで、試料の発光をＧｌｏＭａｘ（登録商標）ｍｕｌｔｉ＋ルミノメーター上で読み取った（図１５８）。
【０４０３】
配列
以下のポリペプチド配列は、それぞれＮ末端メチオニン残基または対応するＡＴＧコドンを含むが、Ｎ末端メチオニン残基または対応するＡＴＧコドンを欠くポリペプチド配列も本明細書の範囲内であり、参照により本明細書に組み込まれる。
【０４０４】
以下のペプチド配列（及び表１のペプチド配列）は、それぞれＮ末端メチオニン残基を欠くが、Ｎ末端メチオニン残基を含むペプチド配列も本明細書の範囲内であり、参照により本明細書に組み込まれる。
【０４０５】
本明細書に記載される幾つかの実施形態は、表１内のＨｉｓタグが付けられた（またはＨｉｓタグが付けられていない）配列に言及するが、表１に記載されているか、または列挙されていないかのいずれかである配列のＨｉｓタグが付けられていない（またはＨｉｓタグが付けられた）バージョンを利用する代替実施形態は、本明細書の範囲内である。
表１：例示的なペプチド、ジペプチド、及びポリペプチド配列。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【表１−２０】
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【表１−２１】
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【表１−２２】
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【表１−２３】
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【表１−２４】
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【表１−２５】
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【表１−２６】
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【表１−２７】
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【表１−２８】
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【表１−２９】
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【表１−３０】
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【表１−３１】
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【表１−３２】
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【表１−３３】
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【表１−３４】
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【表１−３５】
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【表１−３６】
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【表１−３７】
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【表１−３８】
2021526832.tif 000047
【表１−３９】
2021526832.tif 000048
【表１−４０】
2021526832.tif 000049
【表１−４１】
2021526832.tif 000050
【表１−４２】
2021526832.tif 000051
【表１−４３】
2021526832.tif 000052
表９：例示的なペプチド配列。
【表２−１】
2021526832.tif 000053
【表２−２】
2021526832.tif 000054
【表２−３】
2021526832.tif 000055
【表２−４】
2021526832.tif 000056
【表２−５】
2021526832.tif 000057
【表２−６】
2021526832.tif 000058
2021526832.tif 000059
2021526832.tif 000060
表１１：例示的なポリペプチド
名称                ポリペプチド構築物の説明
ＡＴＧ−２６２３    ＬｇＢｉＴ−６Ｈｉｓ
ＡＴＧ−３７４５    ＨｉＢｉＴ−８Ｈｉｓ−ＬｇＴｒｉｐ
ＡＴＧ−３７４６    ６Ｈｉｓ−ＨｉＢｉＴ−４ＧＳ−ＬｇＴｒｉｐ
ＡＴＧ−４６３２    ＨｉＢｉＴ−４ＧＳ−ＬｇＴｒｉｐ−６Ｈｉｓ
ＡＴＧ−４８０８    ＶＳ−ＨｉＢｉＴ−０ＧＳ−ＬｇＴｒｉｐ
ＡＴＧ−４８０９    ＶＳ−ＨｉＢｉＴ−４ＧＳ−ＬｇＴｒｉｐ
ＡＴＧ−４８１０    ＶＳ−ＨｉＢｉＴ−８ＧＳ−ＬｇＴｒｉｐ
ＡＴＧ−４８１１    ＶＳ−ＨｉＢｉＴ−１２ＧＳ−ＬｇＴｒｉｐ
ＡＴＧ−４８１２    ＶＳ−ＨｉＢｉＴ−１６ＧＳ−ＬｇＴｒｉｐ
ＡＴＧ−４８１３    ＶＳ−ＨｉＢｉＴ−２０ＧＳ−ＬｇＴｒｉｐ
ＡＴＧ−４８１４    ＨｉＢｉＴ−２０ＧＳ−ＬｇＴｒｉｐ
ＡＴＧ−４８１５    ＬｇＴｒｉｐ−０ＧＳ−ＶＳ−ＨｉＢｉＴ
ＡＴＧ−４８１６    ＬｇＴｒｉｐ−４ＧＳ−ＶＳ−ＨｉＢｉＴ
ＡＴＧ−４８１７    ＬｇＴｒｉｐ−８ＧＳ−ＶＳ−ＨｉＢｉＴ
ＡＴＧ−４８１８    ＬｇＴｒｉｐ−８ＧＳ−ＨｉＢｉＴ
ＡＴＧ−４８１９    ＶＳ−ＨｉＢＩＴ−０ＧＳ−ＬｇＴｒｉｐ−６Ｈｉｓ
ＡＴＧ−４８２０    ＶＳ−ＨｉＢｉＴ−４ＧＳ−ＬｇＴｒｉｐ−６Ｈｉｓ
ＡＴＧ−４８２１    ＶＳ−ＨｉＢｉＴ−８ＧＳ−ＬｇＴｒｉｐ−６Ｈｉｓ
ＡＴＧ−４８２２    ＶＳ−ＨｉＢｉＴ−１２ＧＳ−ＬｇＴｒｉｐ−６Ｈｉｓ
ＡＴＧ−４８２３    ＶＳ−ＨｉＢｉＴ−１６ＧＳ−ＬｇＴｒｉｐ−６Ｈｉｓ
ＡＴＧ−４８２４    ＨｉＢｉＴ−２０ＧＳ−ＬｇＴｒｉｐ−６Ｈｉｓ
ＡＴＧ−４８２５    ＶＳ−ＨｉＢｉＴ−２０ＧＳ−ＬｇＴｒｉｐ−６Ｈｉｓ
ＡＴＧ−４８２６    ６Ｈｉｓ−ＬｇＴｒｉｐ−０ＧＳ−ＶＳ−ＨｉＢｉＴ
ＡＴＧ−４８２７    ６Ｈｉｓ−ＬｇＴｒｉｐ−４ＧＳ−ＶＳ−ＨｉＢｉＴ
ＡＴＧ−４８２８    ６Ｈｉｓ−ＬｇＴｒｉｐ−８ＧＳ−ＨｉＢｉＴ
ＡＴＧ−４８２９    ６Ｈｉｓ−ＬｇＴｒｉｐ−８ＧＳ−ＶＳ−ＨｉＢｉＴ
【図１】
2021526832.tif 000061
【図２】
2021526832.tif 000062
【図３】
2021526832.tif 000063
【図４】
2021526832.tif 000064
【図５】
2021526832.tif 000065
【図６】
2021526832.tif 000066
【図７Ａ】
2021526832.tif 000067
【図７Ｂ】
2021526832.tif 000068
【図７Ｃ】
2021526832.tif 000069
【図７Ｄ】
2021526832.tif 000070
【図７Ｅ】
2021526832.tif 000071
【図８】
2021526832.tif 000072
【図９】
2021526832.tif 000073
【図１０Ａ】
2021526832.tif 000074
【図１０Ｂ】
2021526832.tif 000075
【図１０Ｃ】
2021526832.tif 000076
【図１１】
2021526832.tif 000077
【図１２】
2021526832.tif 000078
【図１３】
2021526832.tif 000079
【図１４】
2021526832.tif 000080
【図１５】
2021526832.tif 000081
【図１６】
2021526832.tif 000082
【図１７】
2021526832.tif 000083
【図１８】
2021526832.tif 000084
【図１９】
2021526832.tif 000085
【図２０】
2021526832.tif 000086
【図２１】
2021526832.tif 000087
【図２２】
2021526832.tif 000088
【図２３】
2021526832.tif 000089
【図２４】
2021526832.tif 000090
【図２５】
2021526832.tif 000091
【図２６Ａ】
2021526832.tif 000092
【図２６Ｂ】
2021526832.tif 000093
【図２６Ｃ】
2021526832.tif 000094
【図２７】
2021526832.tif 000095
【図２８】
2021526832.tif 000096
【図２９】
2021526832.tif 000097
【図３０】
2021526832.tif 000098
【図３１】
2021526832.tif 000099
【図３２】
2021526832.tif 000100
【図３３】
2021526832.tif 000101
【図３４】
2021526832.tif 000102
【図３５】
2021526832.tif 000103
【図３６】
2021526832.tif 000104
【図３７】
2021526832.tif 000105
【図３８】
2021526832.tif 000106
【図３９】
2021526832.tif 000107
【図４０】
2021526832.tif 000108
【図４１】
2021526832.tif 000109
【図４２】
2021526832.tif 000110
【図４３】
2021526832.tif 000111
【図４４】
2021526832.tif 000112
【図４５】
2021526832.tif 000113
【図４６】
2021526832.tif 000114
【図４７】
2021526832.tif 000115
【図４８】
2021526832.tif 000116
【図４９】
2021526832.tif 000117
【図５０】
2021526832.tif 000118
【図５１Ａ】
2021526832.tif 000119
【図５１Ｂ】
2021526832.tif 000120
【図５１Ｃ】
2021526832.tif 000121
【図５１Ｄ】
2021526832.tif 000122
【図５１Ｅ】
2021526832.tif 000123
【図５１Ｆ】
2021526832.tif 000124
【図５１Ｇ】
2021526832.tif 000125
【図５１Ｈ】
2021526832.tif 000126
【図５２】
2021526832.tif 000127
【図５３】
2021526832.tif 000128
【図５４】
2021526832.tif 000129
【図５５】
2021526832.tif 000130
【図５６】
2021526832.tif 000131
【図５７】
2021526832.tif 000132
【図５８】
2021526832.tif 000133
【図５９】
2021526832.tif 000134
【図６０】
2021526832.tif 000135
【図６１】
2021526832.tif 000136
【図６２】
2021526832.tif 000137
【図６３】
2021526832.tif 000138
【図６４】
2021526832.tif 000139
【図６５】
2021526832.tif 000140
【図６６】
2021526832.tif 000141
【図６７】
2021526832.tif 000142
【図６８】
2021526832.tif 000143
【図６９】
2021526832.tif 000144
【図７０】
2021526832.tif 000145
【図７１】
2021526832.tif 000146
【図７２】
2021526832.tif 000147
【図７３】
2021526832.tif 000148
【図７４】
2021526832.tif 000149
【図７５】
2021526832.tif 000150
【図７６】
2021526832.tif 000151
【図７７Ａ】
2021526832.tif 000152
【図７７Ｂ】
2021526832.tif 000153
【図７８Ａ】
2021526832.tif 000154
【図７８Ｂ】
2021526832.tif 000155
【図７９】
2021526832.tif 000156
【図８０】
2021526832.tif 000157
【図８１】
2021526832.tif 000158
【図８２】
2021526832.tif 000159
【図８３】
2021526832.tif 000160
【図８４】
2021526832.tif 000161
【図８５】
2021526832.tif 000162
【図８６】
2021526832.tif 000163
【図８７】
2021526832.tif 000164
【図８８】
2021526832.tif 000165
【図８９】
2021526832.tif 000166
【図９０】
2021526832.tif 000167
【図９１Ａ】
2021526832.tif 000168
【図９１Ｂ】
2021526832.tif 000169
【図９２】
2021526832.tif 000170
【図９３】
2021526832.tif 000171
【図９４】
2021526832.tif 000172
【図９５Ａ】
2021526832.tif 000173
【図９５Ｂ】
2021526832.tif 000174
【図９５Ｃ】
2021526832.tif 000175
【図９５Ｄ】
2021526832.tif 000176
【図９５Ｅ】
2021526832.tif 000177
【図９６Ａ】
2021526832.tif 000178
【図９６Ｂ】
2021526832.tif 000179
【図９６Ｃ】
2021526832.tif 000180
【図９６Ｄ】
2021526832.tif 000181
【図９６Ｅ】
2021526832.tif 000182
【図９６Ｆ】
2021526832.tif 000183
【図９７Ａ】
2021526832.tif 000184
【図９７Ｂ】
2021526832.tif 000185
【図９７Ｃ】
2021526832.tif 000186
【図９７Ｄ】
2021526832.tif 000187
【図９７Ｅ】
2021526832.tif 000188
【図９７Ｆ】
2021526832.tif 000189
【図９８Ａ】
2021526832.tif 000190
【図９８Ｂ】
2021526832.tif 000191
【図９８Ｃ】
2021526832.tif 000192
【図９８Ｄ】
2021526832.tif 000193
【図９８Ｅ】
2021526832.tif 000194
【図９８Ｆ】
2021526832.tif 000195
【図９９Ａ】
2021526832.tif 000196
【図９９Ｂ】
2021526832.tif 000197
【図１００】
2021526832.tif 000198
【図１０１】
2021526832.tif 000199
【図１０２】
2021526832.tif 000200
【図１０３】
2021526832.tif 000201
【図１０４】
2021526832.tif 000202
【図１０５】
2021526832.tif 000203
【図１０６】
2021526832.tif 000204
【図１０７】
2021526832.tif 000205
【図１０８】
2021526832.tif 000206
【図１０９】
2021526832.tif 000207
【図１１０】
2021526832.tif 000208
【図１１１】
2021526832.tif 000209
【図１１２】
2021526832.tif 000210
【図１１３】
2021526832.tif 000211
【図１１４】
2021526832.tif 000212
【図１１５】
2021526832.tif 000213
【図１１６−１】
2021526832.tif 000214
【図１１６−２】
2021526832.tif 000215
【図１１６−３】
2021526832.tif 000216
【図１１７】
2021526832.tif 000217
【図１１８】
2021526832.tif 000218
【図１１９】
2021526832.tif 000219
【図１２０】
2021526832.tif 000220
【図１２１】
2021526832.tif 000221
【図１２２Ａ】
2021526832.tif 000222
【図１２２Ｂ】
2021526832.tif 000223
【図１２３】
2021526832.tif 000224
【図１２４】
2021526832.tif 000225
【図１２５】
2021526832.tif 000226
【図１２６】
2021526832.tif 000227
【図１２７】
2021526832.tif 000228
【図１２８】
2021526832.tif 000229
【図１２９】
2021526832.tif 000230
【図１３０】
2021526832.tif 000231
【図１３１Ａ】
2021526832.tif 000232
【図１３１Ｂ】
2021526832.tif 000233
【図１３１Ｃ】
2021526832.tif 000234
【図１３２】
2021526832.tif 000235
【図１３３】
2021526832.tif 000236
【図１３４】
2021526832.tif 000237
【図１３５】
2021526832.tif 000238
【図１３６】
2021526832.tif 000239
【図１３７Ａ】
2021526832.tif 000240
【図１３７Ｂ】
2021526832.tif 000241
【図１３７Ｃ】
2021526832.tif 000242
【図１３７Ｄ】
2021526832.tif 000243
【図１３８Ａ】
2021526832.tif 000244
【図１３８Ｂ】
2021526832.tif 000245
【図１３９Ａ】
2021526832.tif 000246
【図１３９Ｂ】
2021526832.tif 000247
【図１３９Ｃ】
2021526832.tif 000248
【図１３９Ｄ】
2021526832.tif 000249
【図１３９Ｅ】
2021526832.tif 000250
【図１４０】
2021526832.tif 000251
【図１４１】
2021526832.tif 000252
【図１４２】
2021526832.tif 000253
【図１４３】
2021526832.tif 000254
【図１４４】
2021526832.tif 000255
【図１４５】
2021526832.tif 000256
【図１４６】
2021526832.tif 000257
【図１４７】
2021526832.tif 000258
【図１４８】
2021526832.tif 000259
【図１４９】
2021526832.tif 000260
【図１５０】
2021526832.tif 000261
【図１５１】
2021526832.tif 000262
【図１５２】
2021526832.tif 000263
【図１５３】
2021526832.tif 000264
【図１５４】
2021526832.tif 000265
【図１５５】
2021526832.tif 000266
【図１５６】
2021526832.tif 000267
【図１５７Ａ】
2021526832.tif 000268
【図１５７Ｂ】
2021526832.tif 000269
【図１５８】
2021526832.tif 000270
【配列表】
2021526832000001.app