(57)【要約】（ａ）ＲＮＡ分子内の標的配列に特異的に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む配列と、（ｂ）第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列と第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列とを含む融合タンパク質をコードする配列とを含む組成物であって、第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドも第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドも有意なＤＮＡヌクレアーゼ活性を含まず、第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドおよび第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドが同一ではなく、かつ第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドがＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む、組成物が開示される。本開示の組成物を作製する方法およびそれを使用する方法も提供される。例えば、本開示の組成物を対象における疾患または障害の処置において使用することができる。本開示の例示的な疾患または障害は、遺伝性およびエピジェネティックな疾患または障害を含む。
2021526858.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドまたはその一部と（ｂ）第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドとを含むＲＮＡによりガイドされる標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質をコードする核酸配列を含む組成物であって、前記第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドが、ｇＲＮＡ配列によってガイドされると標的ＲＮＡに結合し、前記第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドが、ＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む、組成物。
【請求項２】
前記第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドまたはその一部が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドまたはその一部である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドまたはその一部が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃおよびＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄからなる群から選択され、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドが、ネイティブな活性、低下した活性またはヌル活性を有する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドが、ＲＮＡと会合する様式でＲＮＡに結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドが、ＲＮＡを切断する様式でＲＮＡと会合する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記核酸配列が、プロモーターを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記プロモーターが、構成的プロモーターまたは組織特異的プロモーターである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記核酸配列がｇＲＮＡ配列をさらに含み、前記ｇＲＮＡ配列が、ＲＮＡ分子内の標的配列に特異的に結合するスペーサー配列および前記第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドに特異的に結合する足場配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記スペーサー配列が、ＣＵＧ（配列番号１８）、ＣＣＵＧ（配列番号１９）、ＣＡＧ（配列番号８０）、ＧＧＧＧＣＣ（配列番号８１）、およびこれらの組合せからなる群から選択される配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つのリピートを含む配列を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記核酸配列が、前記ｇＲＮＡ配列の発現を駆動するプロモーターを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記プロモーターが、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ポリメラーゼＩＩＩプロモーターが、Ｕ６プロモーターである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記プロモーターが、ｔＲＮＡプロモーターである、請求項１または９に記載の組成物。
【請求項１４】
前記融合タンパク質が、ＮＬＳ、ＮＥＳまたはタグを含む、請求項１または９に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１または８に記載の組成物を含むベクター。
【請求項１６】
アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、およびデンドリマーからなる群から選択される、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
請求項１５に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１８】
前記第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドが、ＲＮＡｓｅ１、ＲＮＡｓｅ４、ＲＮＡｓｅ６、ＲＮＡｓｅ７、ＲＮＡｓｅ８、ＲＮＡｓｅ２、ＲＮＡｓｅ６ＰＬ、ＲＮＡｓｅＬ、ＲＮＡｓｅＴ２、ＲＮＡｓｅ１１、ＲＮＡｓｅＴ２様、ＮＯＢ１、ＥＮＤＯＶ、ＥＮＤＯＧ、ＥＮＤＯＤ１、ｈＦＥＮ１、ｈＳＬＦＮ１４、ｈＬＡＣＴＢ２、ＡＰＥＸ２、ＡＮＧ、ＨＲＳＰ１２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＲＩＤＡ、ＰＤＬ６、ＮＴＨＬ、ＫＩＡＡ０３９１、ＡＰＥＸ１、ＡＧＯ２、ＥＸＯＧ、ＺＣ３Ｈ１２Ｄ、ＥＲＮ２、ＰＥＬＯ、ＹＢＥＹ、ＣＰＳＦ４Ｌ、ｈＣＧ＿２００２７３１、ＥＲＣＣ１、ＲＡＣ１、ＲＡＡ１、ＲＡＢ１、ＤＮＡ２、ＦＬＪ３５２２０、ＦＬＪ１３１７３、ＥＲＣＣ４、Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ）、Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ）、Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ、Ｈ１１９Ｎ）、Ｒｎａｓｅ１（Ｈ１１９Ｎ）、Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ）、Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ、Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ）、Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ）、ＴＥＮＭ１、ＴＥＮＭ２、ＲＮＡｓｅＫ、ＴＡＬＥＮ、およびＺＮＦ６３８からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
（ａ）ＲＮＡ分子内の標的配列に特異的に結合するスペーサー配列および第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドに特異的に結合する足場配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列、
（ｂ）第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドと第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列とを含む融合タンパク質をコードする核酸配列と
を含む組成物であって、
前記第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドも前記第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドも有意なＤＮＡヌクレアーゼ活性を含まず、
前記第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドおよび前記第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドが同一ではなく、かつ
前記第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドが、ＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む、
組成物。
【請求項２０】
標的ＲＮＡ分子または前記ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現のレベルを改変するための方法であって、請求項１９に記載の組成物と前記ＲＮＡ分子を、前記融合タンパク質またはその一部の前記ＲＮＡ分子への結合に適した条件下で接触させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、分子生物学を対象とし、より詳細には、ＲＮＡ分子の発現および活性を改変するための組成物および方法を対象とする。
関連出願
【０００２】
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年６月８日出願の米国特許出願第６２／６８２，２７１号の優先権を主張するものである。２０１８年６月８日出願の米国特許出願第６２／６８２，２７６号の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の組み込み
【０００３】
２０１９年６月６日に作成された７７３ＫＢサイズの「ＬＯＣＮ＿００２＿００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５」という名称のテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現または活性を改変するための標的ＲＮＡ分子に特異的に結合する方法について長年にわたるが満たされていない必要性が当技術分野において存在する。本開示は、ＲＮＡ分子を配列特異的な様式で特異的に標的とし、さらにＤＮＡ配列の改変を排除する組成物および方法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、（ａ）ＲＮＡ分子内の標的配列に特異的に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む配列と、（ｂ）第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列と第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列とを含む融合タンパク質をコードする配列を含む組成物であって、第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドも第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドも有意なＤＮＡヌクレアーゼ活性を含まず、第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドと第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドが同一ではなく、かつ第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドが、ＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む、組成物を提供する。
【０００６】
本開示は、（ａ）第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列またはその一部と、（ｂ）第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列とを含むＲＮＡによりガイドされる標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質をコードする配列を含む組成物であって、第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドが、ｇＲＮＡ配列によってガイドされた標的ＲＮＡに結合し、第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドが、ＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む、組成物も提供する。
【０００７】
本開示は、（ａ）第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列またはその一部と、（ｂ）第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列とを含む標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質をコードする配列を含む組成物であって、第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドが、ｇＲＮＡ配列を有さない標的ＲＮＡに結合し、第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドが、ＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む、組成物をさらに提示する。
【０００８】
本開示の組成物の一部の実施形態では、標的配列は、少なくとも１つのリピート配列を含む。
【０００９】
本開示の組成物の一部の実施形態では、ｇＲＮＡを含む配列は、ｇＲＮＡを真核細胞において発現させることができるプロモーターをコードする配列をさらに含む。
【００１０】
本開示の組成物の一部の実施形態では、真核細胞は、動物細胞である。一部の実施形態では、動物細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、動物細胞は、ヒト細胞である。
【００１１】
本開示の組成物の一部の実施形態では、プロモーターは、構成的に活性なプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼの発現を駆動することができるプロモーターから単離されるまたはそれに由来する。一部の実施形態では、プロモーター配列は、Ｕ６プロモーターから単離されるまたはそれに由来する。一部の実施形態では、プロモーターは、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の発現を駆動することができるプロモーターから単離されたまたはそれに由来する配列である。一部の実施形態では、プロモーターは、アラニンｔＲＮＡプロモーター、アルギニンｔＲＮＡプロモーター、アスパラギンｔＲＮＡプロモーター、アスパラギン酸ｔＲＮＡプロモーター、システインｔＲＮＡプロモーター、グルタミンｔＲＮＡプロモーター、グルタミン酸ｔＲＮＡプロモーター、グリシンｔＲＮＡプロモーター、ヒスチジンｔＲＮＡプロモーター、イソロイシンｔＲＮＡプロモーター、ロイシンｔＲＮＡプロモーター、リシンｔＲＮＡプロモーター、メチオニンｔＲＮＡプロモーター、フェニルアラニンｔＲＮＡプロモーター、プロリンｔＲＮＡプロモーター、セリンｔＲＮＡプロモーター、トレオニンｔＲＮＡプロモーター、トリプトファンｔＲＮＡプロモーター、チロシンｔＲＮＡプロモーター、またはバリンｔＲＮＡプロモーターから単離されるまたはそれに由来する。一部の実施形態では、プロモーターは、バリンｔＲＮＡプロモーターから単離されるまたはそれに由来する。
【００１２】
本開示の組成物の一部の実施形態では、ｇＲＮＡを含む配列は、標的ＲＮＡ配列に特異的に結合するスペーサー配列をさらに含む。一部の実施形態では、スペーサー配列は、標的ＲＮＡ配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８７％、９０％、９５％、９７％、９９％またはその間の任意のパーセンテージの相補性を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列は、標的ＲＮＡ配列に対して１００％の相補性を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列は、２０ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、スペーサー配列は、２１ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、スペーサー配列は、配列
【化１】
2021526858.tif 000003
を含むまたはそれからなる。
【００１３】
本開示の組成物の一部の実施形態では、ｇＲＮＡを含む配列は、標的ＲＮＡ配列に特異的に結合するスペーサー配列をさらに含む。一部の実施形態では、スペーサー配列は、標的ＲＮＡ配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８７％、９０％、９５％、９７％、９９％またはその間の任意のパーセンテージの相補性を有する。
【００１４】
一部の実施形態では、スペーサー配列は、標的ＲＮＡ配列に対して１００％の相補性を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列は、２０ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、スペーサー配列は、２１ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、スペーサー配列は、配列ＧＵＧＡＵＡＡＧＵＧＧＡＡＵＧＣＣＡＵＧ（配列番号１４）、ＣＵＧＧＵＧＡＡＣＵＵＣＣＧＡＵＡＧＵＧ（配列番号１５）、またはＧＡＧＡＴＡＴＡＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣ（配列番号１６）を含むまたはそれからなる。
【００１５】
本開示の組成物の一部の実施形態では、ｇＲＮＡを含む配列は、標的ＲＮＡ配列に特異的に結合するスペーサー配列をさらに含む。一部の実施形態では、スペーサー配列は、標的ＲＮＡ配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８７％、９０％、９５％、９７％、９９％またはその間の任意のパーセンテージの相補性を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列は、標的ＲＮＡ配列に対して１００％の相補性を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列は、２０ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、スペーサー配列は、２１ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、スペーサー配列は、配列ＣＵＧ（配列番号１８）、ＣＣＵＧ（配列番号１９）、ＣＡＧ（配列番号８０）、ＧＧＧＧＣＣ（配列番号８１）またはこれらの任意の組合せの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つのリピートを含む配列を含むまたはそれからなる。
【００１６】
本開示の組成物の一部の実施形態では、ｇＲＮＡを含む配列は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質に特異的に結合する足場配列をさらに含む。一部の実施形態では、足場配列は、ステムループ構造を含む。一部の実施形態では、足場配列は、９０ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、足場配列は、９３ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、足場配列は、配列ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１３）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、足場配列は、配列ＧＧＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵ（配列番号１７）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、足場配列は、配列
【化２】
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を含むまたはそれからなる。
【００１７】
本開示の組成物の一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲＮＡ分子内の第２の配列に結合しないまたは選択的には結合しない。
【００１８】
本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡゲノムまたはＲＮＡトランスクリプトームは、ＲＮＡ分子を含む。
【００１９】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合性部分を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む。一部の実施形態では、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性は、低下しているまたは阻害されている。一部の実施形態では、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性は、増加しているまたは誘導されている。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、ネイティブなＤＮＡヌクレアーゼ活性を含み、ネイティブなＤＮＡヌクレアーゼ活性は阻害されている。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、変異を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメインは、変異を含む。一部の実施形態では、変異は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質をコードする核酸に存在する。一部の実施形態では、変異は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質をコードするアミノ酸に存在する。一部の実施形態では、変異は、置換、挿入、欠失、フレームシフト、逆位、または転位を含む。一部の実施形態では、変異は、ヌクレアーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン内の結合性部位、ヌクレアーゼドメイン内の活性部位、またはヌクレアーゼドメイン内の少なくとも１つの必須アミノ酸残基の欠失を含む。
【００２０】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃｐｆ１ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合性部分を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む。一部の実施形態では、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性は、低下しているまたは阻害されている。一部の実施形態では、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性は、増加しているまたは誘導されている。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、ネイティブなＤＮＡヌクレアーゼ活性を含み、ネイティブなＤＮＡヌクレアーゼ活性は阻害されている。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、変異を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメインは、変異を含む。一部の実施形態では、変異は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質をコードする核酸に存在する。一部の実施形態では、変異は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質をコードするアミノ酸に存在する。一部の実施形態では、変異は、置換、挿入、欠失、フレームシフト、逆位、または転位を含む。一部の実施形態では、変異は、ヌクレアーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン内の結合性部位、ヌクレアーゼドメイン内の活性部位、またはヌクレアーゼドメイン内の少なくとも１つの必須アミノ酸残基の欠失を含む。
【００２１】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃａｓ１３ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合性部分を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＣａｓＲｘ／Ｃａｓ１３ｄポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合性部分を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む。一部の実施形態では、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性は、低下しているまたは阻害されている。一部の実施形態では、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性は、増加しているまたは誘導されている。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、ネイティブなＤＮＡヌクレアーゼ活性を含み、ネイティブなＤＮＡヌクレアーゼ活性は阻害されている。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、変異を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメインは、変異を含む。一部の実施形態では、変異は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質をコードする核酸に存在する。一部の実施形態では、変異は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質をコードするアミノ酸に存在する。一部の実施形態では、変異は、置換、挿入、欠失、フレームシフト、逆位、または転位を含む。一部の実施形態では、変異は、ヌクレアーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン内の結合性部位、ヌクレアーゼドメイン内の活性部位、またはヌクレアーゼドメイン内の少なくとも１つの必須アミノ酸残基の欠失を含む。
【００２２】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＰｕｍｉｌｉｏおよびＦＢＦ（ＰＵＦ）タンパク質を含むまたはそのＲＮＡ結合性部分を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｐｕｍｉｌｉｏに基づくアセンブリ（ＰＵＭＢＹ）タンパク質を含むまたはそのＲＮＡ結合性部分を含む。
【００２３】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ結合活性のために多量体形成を必要としない。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、多量体複合体の単量体ではない。一部の実施形態では、多量体タンパク質複合体は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質を含まない。
【００２４】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ分子内の標的配列に選択的に結合する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ分子内の第２の配列に対する親和性を含まない。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ分子内の第２の配列に対して高い親和性を含まずそれに選択的に結合しない。
【００２５】
本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡゲノムまたはＲＮＡトランスクリプトームは、ＲＮＡ分子を含む。
【００２６】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、終点を含めて、２アミノ酸から１３００アミノ酸の間を含む。
【００２７】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）またはタグをコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列に対して３’側に位置する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃ末端にＮＬＳを含む。
【００２８】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、第１のＮＬＳをコードする第１の配列および第２のＮＬＳをコードする第２の配列をさらに含む。一部の実施形態では、第１のＮＬＳをコードする配列または第２のＮＬＳをコードする配列は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列に対して３’側に位置する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃ末端に第１のＮＬＳまたは第２のＮＬＳを含む。
【００２９】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡと会合する様式でＲＮＡに結合する。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡを切断する様式でＲＮＡと会合する。
【００３０】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡｓｅを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ１を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ１は、配列番号２０を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ４を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ４は、配列番号２１を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ６を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ６は、配列番号２２を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ７を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ７は、配列番号２３を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ８を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ８タンパク質は、配列番号２４を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ２を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ２タンパク質は、配列番号２５を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ６ＰＬを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ６ＰＬタンパク質は、配列番号２６を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅＬを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅＬタンパク質は、配列番号２７を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅＴ２を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅＴ２タンパク質は、配列番号２８を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ１１を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ１１タンパク質は、配列番号２９を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅＴ２様を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅＴ２様タンパク質は、配列番号３０を含むまたはそれからなる。
【００３１】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型ＲＮＡｓｅを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ）ポリペプチドは、配列番号１１６を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ））ポリペプチドは、配列番号６６を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドは、配列番号１１８を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドは、配列番号１１９を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドは、配列番号１２０を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ、Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ））ポリペプチドは、配列番号１２１を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ））ポリペプチドは、配列番号１２２を含むまたはそれからなる。
【００３２】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＮＯＢ１ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＮＯＢ１ポリペプチドは、配列番号３１を含むまたはそれからなる。
【００３３】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、エンドヌクレアーゼを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、エンドヌクレアーゼＶ（ＥＮＤＯＶ）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＮＤＯＶタンパク質は、配列番号３２を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、エンドヌクレアーゼＧ（ＥＮＤＯＧ）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＮＤＯＧタンパク質は、配列番号３３を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、エンドヌクレアーゼＤ１（ＥＮＤＯＤ１）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＮＤＯＤ１タンパク質は、配列番号３４を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ヒトフラップエンドヌクレアーゼ−１（ｈＦＥＮ１）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ｈＦＥＮ１タンパク質は、配列番号３５を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＤＮＡ修復エンドヌクレアーゼＸＰＦ（ＥＲＣＣ４）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＲＣＣ４タンパク質は、配列番号６４を含むまたはそれからなる。
【００３４】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、エンドヌクレアーゼＩＩＩ様タンパク質１（ＮＴＨＬ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＮＴＨＬポリペプチドは、配列番号１２３を含むまたはそれからなる。
【００３５】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ヒトＳｃｈｌａｆｅｎ１４（ｈＳＬＦＮ１４）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ｈＳＬＦＮ１４ポリペプチドは、配列番号３６を含むまたはそれからなる。
【００３６】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ヒトベータ−ラクタマーゼ様タンパク質２（ｈＬＡＣＴＢ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ｈＬＡＣＴＢ２ポリペプチドは、配列番号３７を含むまたはそれからなる。
【００３７】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）エンドデオキシリボヌクレアーゼ（ＡＰＥＸ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）エンドデオキシリボヌクレアーゼ（ＡＰＥＸ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＡＰＥＸ２ポリペプチドは、配列番号３８を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＡＰＥＸ２ポリペプチドは、配列番号３９を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、脱プリンまたは脱ピリミジン部位リアーゼ（ＡＰＥＸ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＡＰＥＸ１ポリペプチドは、配列番号１２５を含むまたはそれからなる。
【００３８】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、アンジオゲニン（ＡＮＧ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＡＮＧポリペプチドは、配列番号４０を含むまたはそれからなる。
【００３９】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、熱応答性タンパク質１２（ＨＲＳＰ１２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＨＲＳＰ１２ポリペプチドは、配列番号４１を含むまたはそれからなる。
【００４０】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ジンクフィンガーＣＣＣＨ型含有１２Ａ（ＺＣ３Ｈ１２Ａ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＺＣ３Ｈ１２Ａポリペプチドは、配列番号４２を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＺＣ３Ｈ１２Ａポリペプチドは、配列番号４３を含むまたはそれからなる。
【００４１】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、反応性中間体イミンデアミナーゼＡ（ＲＩＤＡ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＩＤＡポリペプチドは、配列番号４４を含むまたはそれからなる。
【００４２】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ホスホリパーゼＤファミリーメンバー６（ＰＤＬ６）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＰＤＬ６ポリペプチドは、配列番号１２６を含むまたはそれからなる。
【００４３】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ミトコンドリアリボヌクレアーゼＰ触媒サブユニット（ＫＩＡＡ０３９１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＫＩＡＡ０３９１ポリペプチドは、配列番号１２７を含むまたはそれからなる。
【００４４】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、アルゴノート２（ＡＧＯ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。本開示の組成物の一部の実施形態では、ＡＧＯ２ポリペプチドは、配列番号１２８を含むまたはそれからなる。
【００４５】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ミトコンドリアヌクレアーゼＥＸＯＧ（ＥＸＯＧ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＸＯＧポリペプチドは、配列番号１２９を含むまたはそれからなる。
【００４６】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ジンクフィンガーＣＣＣＨ型含有１２Ｄ（ＺＣ３Ｈ１２Ｄ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＺＣ３Ｈ１２Ｄポリペプチドは、配列番号１３０を含むまたはそれからなる。
【００４７】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、小胞体から核へのシグナル伝達２（ＥＲＮ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＲＮ２ポリペプチドは、配列番号１３１を含むまたはそれからなる。
【００４８】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ぺロタｍＲＮＡサーベイランスおよびリボソームレスキュー因子（ＰＥＬＯ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＰＥＬＯポリペプチドは、配列番号１３２を含むまたはそれからなる。
【００４９】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＹＢＥＹメタロペプチダーゼ（ＹＢＥＹ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＹＢＥＹポリペプチドは、配列番号１３３を含むまたはそれからなる。
【００５０】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、切断およびポリアデニル化特異的因子４様（ＣＰＳＦ４Ｌ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＣＰＳＦ４Ｌポリペプチドは、配列番号１３４を含むまたはそれからなる。
【００５１】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ｈＣＧ＿２００２７３１ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ｈＣＧ＿２００２７３１は、配列番号１３５を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ｈＣＧ＿２００２７３１ポリペプチドは、配列番号１３６を含むまたはそれからなる。
【００５２】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、除去修復交差相補群１（ＥＲＣＣ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＲＣＣ１ポリペプチドは、配列番号１３７を含むまたはそれからなる。
【００５３】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質１アイソフォーム（ＲＡＣ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＡＣ１ポリペプチドは、配列番号１３８を含むまたはそれからなる。
【００５４】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、リボヌクレアーゼＡＡ１（ＲＡＡ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＡＡ１ポリペプチドは、配列番号１３９を含むまたはそれからなる。
【００５５】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｒａｓ関連タンパク質（ＲＡＢ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＡＢ１ポリペプチドは、配列番号１４０を含むまたはそれからなる。
【００５６】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＤＮＡ複製ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ２（ＤＮＡ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＤＮＡ２ポリペプチドは、配列番号１４１を含むまたはそれからなる。
【００５７】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＦＬＪ３５２２０ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＦＬＪ３５２２０ポリペプチドは、配列番号１４２を含むまたはそれからなる。
【００５８】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＦＬＪ１３１７３ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＦＬＪ１３１７３ポリペプチドは、配列番号１４３を含むまたはそれからなる。
【００５９】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、テニューリン膜貫通タンパク質（ＴＥＮＭ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、テニューリン膜貫通タンパク質１（ＴＥＮＭ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＴＥＮＭ１ポリペプチドは、配列番号１４４を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、テニューリン膜貫通タンパク質２（ＴＥＮＭ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＴＥＮＭ２ポリペプチドは、配列番号１４５を含むまたはそれからなる。
【００６０】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、リボヌクレアーゼカッパ（ＲＮＡｓｅＫ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅＫポリペプチドは、配列番号２０４を含むまたはそれからなる。
【００６１】
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質を、処置することを必要とする対象を処置するための方法であって、標的ＲＮＡを融合タンパク質または融合タンパク質をコードする配列と接触させることを含む方法において使用する。
【００６２】
本特許または出願のファイルは、カラーで製作された少なくとも１つの図面を含有する。カラーの図面（複数可）を伴う本特許または特許出願公開のコピーは、要請し、必要な料金を支払えば、特許庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１Ａ〜Ｂは、本開示の組成物の例示的な実施形態の概略図である。（Ａ）エンドヌクレアーゼと融合したＲＮＡ標的化Ｃａｓ９系は、疾患を引き起こすＲＮＡを標的とし、それを切断する。（Ｂ）エンドヌクレアーゼと融合したＲＮＡ標的化Ｃａｓ９系がＣＵＧ単位のリピートで構成される反復ＲＮＡを標的とし、それを切断する、筋強直性ジストロフィー１型の状況での（Ａ）の適用を示す。ＲＮＡ標的化Ｃａｓ９系の非存在下では、ＣＵＧ単位のリピートで構成される反復ＲＮＡは、スプライシング因子ＭＢＮＬに結合し、機能障害性ＲＮＡスプライシングによる病変を引き起こす。この反復ＲＮＡの切断により、疾患が好転する。
【００６４】
【図２】図２は、ＲＮＡ分子を標的とすることによって遺伝子疾患を処置するための例示的なモジュラー治療プラットフォームを示す概略図である。
【００６５】
【図３】図３Ａ〜Ｂは、（Ａ）ＲＮＡエンドヌクレアーゼ／Ｃａｓ９融合物の発現を駆動するサイトメガロウイルスプロモーターを含む２つのプラスミド系を含む「高発現」対照系（「ｐｏｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ」とも称される）および（Ｂ）ＲＮＡエンドヌクレアーゼ／Ｃａｓ９融合物の発現を駆動する低発現プロモーター（ｐＥＦＳ）を含む単一のプラスミド系を含む「低発現」対照系（「Ｐ１３」とも称される）を示す概略図の対である。
【００６６】
【図４Ａ】図４Ａは、例示的なＲＮＡエンドヌクレアーゼ−Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  Ｃａｓ９融合タンパク質（左）および例示的なＲＮＡエンドヌクレアーゼ−Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９融合タンパク質を含むベクター（右）を示す概略図の対である。
【００６７】
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａに示されているＣ．ｊｅｊｕｎｉ  Ｃａｓ９またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９のいずれかを含む種々の融合タンパク質の、反復ＲＮＡ分子を切断する能力を示すグラフである。
【００６８】
【図５Ａ】図５Ａは、例示的なＲＮＡエンドヌクレアーゼ−Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  Ｃａｓ９融合タンパク質（左）および例示的なＲＮＡエンドヌクレアーゼ−Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９融合タンパク質を含むベクター（右）を示す概略図の対である。
【００６９】
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａに示されているＣ．ｊｅｊｕｎｉ  Ｃａｓ９またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９のいずれかを含む種々の融合タンパク質の、ルシフェラーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を切断する能力を示すグラフである。
【００７０】
【図６】図６は、図４Ｂ、図５Ｂ、および図９に示されているエンドヌクレアーゼの略語一覧（key）を提示する表である。
【００７１】
【図７Ａ】図７Ａは、例示的なＲＮＡエンドヌクレアーゼ−Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  Ｃａｓ９融合タンパク質を示す概略図である。
【００７２】
【図７Ｂ】図７Ｂは、表２に示されている種々のＮＳ５標的化スペーサー配列を含有するｓｇＲＮＡを有するＥ４３  ＣｊｅＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合物の存在下およびＥ６７  ＣｊｅＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合物の存在下の両方でのＺｉｋａ  ＮＳ５の発現レベルの変化を示すグラフである。Ｚｉｋａ  ＮＳ５発現が、対照（ラムダ）スペーサー配列を含有するｓｇＲＮＡが負荷されたエンドヌクレアーゼと比べた倍率変化として示されている。
【００７３】
【図８Ａ】図８Ａは、Ｚｉｋａ  ＮＳ５標的化スペーサー配列を含有するｓｇＲＮＡを負荷したＣｊｅＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合物をトランスフェクトした細胞の蛍光顕微鏡画像である。
【００７４】
【図８Ｂ】図８Ｂは、適当なＺｉｋａ  ＮＳ５標的化ｓｇＲＮＡを負荷したＣｊｅＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合物の存在下での、非Ｚｉｋａ  ＮＳ５標的化ｓｇＲＮＡを負荷したＣｊｅＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合物と比較したＺｉｋａ  ＮＳ５の発現の変化を示すグラフである。
【００７５】
【図９】図９は、種々の例示的な融合タンパク質（アノテートされたエンドヌクレアーゼと融合したＳｐｙＣａｓ９）の切断効率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
本開示は、ＲＮＡ分子に選択的に結合し、必要に応じてそれを切断する、ＲＮＡによりガイドされる融合タンパク質を提供する。本開示は、ＲＮＡによりガイドされる融合タンパク質を含むベクター、組成物および細胞を提供する。本開示は、本開示のＲＮＡによりガイドされる融合タンパク質、ベクター、組成物および細胞を使用して、疾患または障害を処置する方法を提供する。
ガイドＲＮＡ
【００７７】
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）という用語と単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）という用語は、本開示全体を通して互換的に使用される。
【００７８】
本開示のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、スペーサー配列および足場配列で構成され得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、連続したスペーサー配列および足場配列を含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。一部の実施形態では、スペーサー配列と足場配列は連続していない。一部の実施形態では、足場配列は、「ダイレクトリピート」（ＤＲ）配列を含む。ＤＲ配列は、スペーサー配列が散在する、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座（細菌ゲノムまたはプラスミドに天然に存在する）内の反復配列を指す。関連するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の配列が分かっている場合には、対応するＣａｓタンパク質のＤＲ配列を推測することができることが周知である。一部の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡまたは単一ガイドＲＮＡをコードする配列は、リンカー配列によって分離されたスペーサー配列と足場配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、リンカー配列は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個またはその間の任意の数のヌクレオチドを含み得るまたはそれからなり得る。一部の実施形態では、リンカー配列は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個またはその間の任意の数のヌクレオチドを含み得る。
【００７９】
本開示のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、天然に存在しないヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする配列は、改変または合成されたＲＮＡヌクレオチドを含むまたはそれからなる。例示的な改変されたＲＮＡヌクレオチドとしては、これだけに限定されないが、プソイドウリジン（Ψ）、ジヒドロウリジン（Ｄ）、イノシン（Ｉ）、および７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、ヒポキサンチン、キサンチン、キサントシン、７−メチルグアニン、５、６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシトシン（hydropxymethylcytosine）、イソグアニン、およびイソシトシンが挙げられる。
【００８０】
本開示のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、標的配列内の改変されたＲＮＡに結合し得る。本開示のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、標的配列内の改変されたＲＮＡに結合し得る。例示的なエピジェネティック的にまたは転写後に改変されたＲＮＡとしては、これだけに限定されないが、２’−Ｏ−メチル化（２’−ＯＭｅ）（リボース部分の遊離の２’−ＯＨの酸素に存在する２’−Ｏ−メチル化）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、および５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）が挙げられる。
【００８１】
本開示の組成物の一部の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、非コードＣ／Ｄボックス核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列をコードする少なくとも１つの配列を含む。一部の実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡと相補的である少なくとも１つの配列を含み、ここで、ＲＮＡ分子の標的配列は、少なくとも１つの２’−ＯＭｅを含む。一部の実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡと相補的である少なくとも１つの配列を含み、ここで、標的ＲＮＡと相補的である少なくとも１つの配列は、ボックスＣモチーフ（ＲＵＧＡＵＧＡ）およびボックスＤモチーフ（ＣＵＧＡ）を含む。
【００８２】
本開示のスペーサー配列は、ＲＮＡ分子の標的配列に結合する。本開示のスペーサー配列は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含み得る。本開示のスペーサー配列は、ＲＮＡ分子の標的配列に対して十分な相補性を有して前記標的配列に選択的に結合する配列を含むまたはそれからなる。ＲＮＡ分子の標的配列に結合すると、スペーサー配列は、足場配列および融合タンパク質の１つまたは複数をＲＮＡ分子へガイドする。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列に対して十分な相補性を有して前記標的配列に選択的に結合する配列は、標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６、９７％、９８％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージ同一性を有する。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列に対して十分な相補性を有して前記標的配列に選択的に結合する配列は、標的配列に対して１００％の同一性を有する。
【００８３】
本開示の足場配列は、本開示の第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドに結合する。本開示の足場配列は、トランス作用性ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み得る。本開示の足場配列は、ＲＮＡ分子の標的配列に対して十分な相補性を有して前記標的配列に選択的に結合する配列を含むまたはそれからなる。ＲＮＡ分子の標的配列に結合すると、足場配列は、融合タンパク質をＲＮＡ分子へガイドし得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列に対して十分な相補性を有して前記標的配列に選択的に結合する配列は、標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６、９７％、９８％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージ同一性を有する。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列に対して十分な相補性を有して前記標的配列に選択的に結合する配列は、標的配列に対して１００％の同一性を有する。その代わりに、またはそれに加えて、一部の実施形態では、本開示の足場配列は、本開示の融合タンパク質の第１のＲＮＡ結合性タンパク質または第２のＲＮＡ結合性タンパク質に結合する配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示の足場配列は、二次構造または三次構造を含む。例示的な二次構造としては、これだけに限定されないが、へリックス、ステムループ、バルジ、テトラループおよびシュードノットが挙げられる。例示的な三次構造としては、これだけに限定されないが、Ａ形態のへリックス、Ｂ形態のへリックス、およびＺ形態のへリックスが挙げられる。例示的な三次構造としては、これだけに限定されないが、ねじれたまたはらせん状になったステムループが挙げられる。例示的な三次構造としては、これだけに限定されないが、ねじれたまたはらせん状になったシュードノットが挙げられる。一部の実施形態では、本開示の足場配列は少なくとも１つの二次構造または少なくとも１つの三次構造を含む。一部の実施形態では、本開示の足場配列は、１つまたは複数の二次構造または１つまたは複数の三次構造を含む。
【００８４】
本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、本開示のＲＮＡ分子内のテトラループモチーフに選択的に結合する。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、テトラループモチーフを含む。一部の実施形態では、テトラループモチーフは、ＧＡＡＡ、ＧＵＧＡ、ＧＣＡＡまたはＧＡＧＡである配列の１つまたは複数を含むまたはそれからなる「ＧＲＮＡ」モチーフである。
【００８５】
本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列に結合するガイドＲＮＡまたはその一部は、ＲＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質または第２のＲＮＡ結合性タンパク質に結合するガイドＲＮＡまたはその一部は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質または第２のＲＮＡ結合性タンパク質に共有結合により結合する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質または第２のＲＮＡ結合性タンパク質に結合するガイドＲＮＡまたはその一部は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質または第２のＲＮＡ結合性タンパク質に非共有結合により結合する。
【００８６】
本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、終点を含めて、１０個から１００個の間のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、終点を含めて、１０個から３０個の間のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個または３０個のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、２０ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、２１ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示の足場配列は、終点を含めて、１０個から１００個の間のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示の足場配列は、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７６個、８０個、８７個、９０個、９５個、１００個またはその間の任意の数のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示の足場配列は、終点を含めて、８５個から９５個の間のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示の足場配列は、８５ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示の足場配列は、９０ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示の足場配列は、９３ヌクレオチドを含むまたはそれからなる。
【００８７】
本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含まない。
【００８８】
本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と相補的な配列を含まない。
【００８９】
本開示の治療用組成物または医薬組成物は、ＰＡＭｍｅｒオリゴヌクレオチドを含まない。他の実施形態では、必要に応じて、非治療用組成物または非医薬組成物は、ＰＡＭｍｅｒオリゴヌクレオチドを含み得る。「ＰＡＭｍｅｒ」という用語は、ガイドヌクレオチド配列プログラマブルＲＮＡ結合性タンパク質と相互作用することができるＰＡＭ配列を含むオリゴヌクレオチドを指す。ＰＡＭｍｅｒの非限定的な例は、参照により本明細書に組み込まれるO'Connell  et  al.  Nature  516,  pages  263-266  (2014)に記載されている。ＰＡＭ配列は、約２〜約１０個のヌクレオチドを含むプロトスペーサー隣接モチーフを指す。ＰＡＭ配列は、それらが相互作用するガイドヌクレオチド配列プログラマブルＲＮＡ結合性タンパク質に対して特異的であり、また、当技術分野で公知である。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＰＡＭは、配列５’−ＮＧＧ−３’を有し、ここで、「Ｎ」は、任意の核酸塩基であり、その後に、２つのグアニン（「Ｇ」）核酸塩基が続く。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａのＣａｓ９は、標準的なＰＡＭ配列５’−ＮＧＧ−３’を認識するが、ＰＡＭ５’−ＹＧ−３’（「Ｙ」はピリミジンである）を認識するように操作されており、したがって、可能なＣａｓ９標的の範囲を増加させる。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａのＣｐｆ１ヌクレアーゼは、５’−ＴＴＴＮ−３’または５’−ＹＴＮ−３’であるＰＡＭを認識する。
【００９０】
本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、プロトスペーサーフランキング配列（ＰＦＳ）と相補的な配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部がＰＦＳと相補的な配列を含むものを含め、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含み得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部がＰＦＳと相補的な配列を含むものを含め、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質またはそのＲＮＡ結合性部分をコードする配列を含み得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、ＰＦＳと相補的な配列を含まない。
【００９１】
本開示の組成物の一部の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡ配列は、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーター配列を含む。一部の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡ配列を含むベクターは、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーター配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーターは、構成的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーター配列は、誘導性プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーター配列（the  promoter  is  a  sequence）は、組織特異的かつ／または細胞型特異的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ハイブリッドまたは組換えプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ガイドＲＮＡを哺乳動物細胞において発現させることができるプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ガイドＲＮＡをヒト細胞において発現させることができるプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ガイドＲＮＡを発現させ、ガイドＲＮＡを細胞の核に制限することができるプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ヒトＲＮＡポリメラーゼプロモーターまたはヒトＲＮＡポリメラーゼプロモーターをコードする配列から単離されたもしくはそれに由来する配列である。一部の実施形態では、プロモーターは、Ｕ６プロモーターまたはＵ６プロモーターをコードする配列から単離されたもしくはそれに由来する配列である。一部の実施形態では、プロモーターは、ヒトｔＲＮＡプロモーターまたはヒトｔＲＮＡプロモーターをコードする配列から単離されたもしくはそれに由来する配列である。一部の実施形態では、プロモーターは、ヒトバリンｔＲＮＡプロモーターまたはヒトバリンｔＲＮＡプロモーターをコードする配列から単離されたもしくはそれに由来する配列である。
【００９２】
本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーターは、調節エレメントをさらに含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーター配列を含むベクターは、調節エレメントをさらに含む。一部の実施形態では、調節エレメントは、ガイドＲＮＡの発現を増強するものである。例示的な調節エレメントとしては、これだけに限定されないが、エンハンサーエレメント、イントロン、エクソン、またはこれらの組合せが挙げられる。
【００９３】
本開示の組成物の一部の実施形態では、本開示のベクターは、ガイドＲＮＡをコードする配列、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーター配列および調節エレメントをコードする配列のうちの１つまたは複数を含む。本開示の組成物の一部の実施形態では、ベクターは、本開示の融合タンパク質をコードする配列をさらに含む。
融合タンパク質
【００９４】
本開示の融合タンパク質は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質および第２のＲＮＡ結合性タンパク質を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードする配列に沿って、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列に対して５’側に位置する。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードする配列に沿って、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列に対して３’側に位置する。
【００９５】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子に結合することができるタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子に選択的に結合することができ、ＤＮＡ分子には結合しない、哺乳動物ＤＮＡ分子には結合しない、またはいかなるＤＮＡ分子にも結合しないタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子に結合し、ＲＮＡ分子の破壊（ｂｒｅａｋ）を誘導することができるタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子に結合し、ＲＮＡ分子の破壊を誘導することができ、ＤＮＡ分子には結合しない、哺乳動物ＤＮＡ分子には結合しない、またはいかなるＤＮＡ分子にも結合しないタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子に結合し、ＲＮＡ分子の破壊を誘導することができ、ＤＮＡ分子には結合せず、その破壊も誘導しない、哺乳動物ＤＮＡ分子には結合せず、その破壊も誘導しない、または、いかなるＤＮＡ分子にも結合せず、その破壊も誘導しないタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。
【００９６】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＤＮＡヌクレアーゼ活性を有さないタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。
【００９７】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＤＮＡヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であって、本開示の組成物をＲＮＡ分子と接触させるかまたは本開示の細胞もしくは対象に導入したときにＤＮＡヌクレアーゼ活性によりＤＮＡ分子の破壊が誘導されない、哺乳動物ＤＮＡ分子の破壊が誘導されない、またはいかなるＤＮＡ分子の破壊も誘導されない、タンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。
【００９８】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＤＮＡヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であって、ＤＮＡヌクレアーゼ活性が不活化されており、本開示の組成物をＲＮＡ分子と接触させるかまたは本開示の細胞もしくは対象に導入したときにＤＮＡヌクレアーゼ活性によりＤＮＡ分子の破壊が誘導されない、哺乳動物ＤＮＡ分子の破壊が誘導されない、またはいかなるＤＮＡ分子の破壊も誘導されない、タンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、本開示の組成物をＲＮＡ分子と接触させるかまたは本開示の細胞もしくは対象に導入したときにＤＮＡヌクレアーゼ活性によりＤＮＡ分子の破壊が誘導されない、哺乳動物ＤＮＡ分子の破壊が誘導されない、またはいかなるＤＮＡ分子の破壊も誘導されないレベルまでＤＮＡヌクレアーゼ活性を不活化するまたは低下させる変異を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＤＮＡヌクレアーゼ活性を不活化するまたは低下させる変異を含み、変異は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする核酸配列またはアミノ酸配列に対する置換、逆位、転位、挿入、欠失、またはこれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数を含む。
【００９９】
本開示の組成物の一部の実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡによりガイドされる融合タンパク質の第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓタンパク質を含む。一部の実施形態では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質を含む。本開示の例示的なＣａｓ９タンパク質は、これだけに限定されないが、細菌または古細菌を含めた、任意の種から単離され得るまたはそれに由来し得る。本開示の例示的なＣａｓ９タンパク質は、これだけに限定されないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒａｎｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ  ＣＦ８９−１２、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ  ｓｔｒ．Ｆ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ  ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ  ｓｔｒ．ＤＳＭ  １６５１１、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、ａ  Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、ａｎ  Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  Ｂ５１０、ａ  Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ  ｇｌｏｂｕｓ  ｓｔｒ．Ｂｕｄｄｙ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ  ｔａｆｆｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ  ａｌｏｃｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ｓｔｒ．Ｐａｒｉｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、およびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａを含めた、任意の種から単離し得るまたはそれに由来し得る。
【０１００】
本開示の例示的な野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質は、アミノ酸配列：
【化３】
2021526858.tif 000005
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１０１】
ヌクレアーゼが不活化されたＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質は、１０位のアスパラギン酸（Ｄ）のアラニン（Ａ）による置換および８４０位のヒスチジン（Ｈ）のアラニン（Ａ）による置換を含み得る。本開示の例示的なヌクレアーゼが不活化されたＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質は、アミノ酸配列（Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａは太字で下線が引かれている）：
【化４】
2021526858.tif 000006
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１０２】
ヌクレアーゼが不活化されたＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインまたはその一部、ＨＮＨドメイン、ＤＮＡｓｅ活性部位、ββα−メタルフォールドまたはＤＮＡｓｅ活性部位を含むその一部またはこれらの任意の組合せの欠失を含み得る。
【０１０３】
他の例示的なＣａｓ９タンパク質またはその一部は、以下のアミノ酸配列を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１０４】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：
【化５−１】
2021526858.tif 000007
【化５−２】
2021526858.tif 000008
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１０５】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：
【化６】
2021526858.tif 000009
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１０６】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ  ＣＲＩＳＰＲ１  Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：
【化７−１】
2021526858.tif 000010
【化７−２】
2021526858.tif 000011
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１０７】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：
【化８】
2021526858.tif 000012
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１０８】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ．ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ  Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：
【化９】
2021526858.tif 000013
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１０９】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：
【化１０】
2021526858.tif 000014
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１１０】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ  Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：
【化１１】
2021526858.tif 000015
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１１１】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ  Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：
【化１２】
2021526858.tif 000016
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１１２】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ  Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：
【化１３】
2021526858.tif 000017
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１１３】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ  Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：
【化１４−１】
2021526858.tif 000018
【化１４−２】
2021526858.tif 000019
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１１４】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ  Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：
【化１５】
2021526858.tif 000020
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１１５】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＲＩＳＰＲ  ３  Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：
【化１６−１】
2021526858.tif 000021
【化１６−２】
2021526858.tif 000022
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１１６】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：
【化１７】
2021526858.tif 000023
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１１７】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ  Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：
【化１８−１】
2021526858.tif 000024
【化１８−２】
2021526858.tif 000025
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１１８】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ  Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：
【化１９】
2021526858.tif 000026
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１１９】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ  Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：
【化２０】
2021526858.tif 000027
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１２０】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ  Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：
【化２１−１】
2021526858.tif 000028
【化２１−２】
2021526858.tif 000029
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１２１】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ  Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：
【化２２】
2021526858.tif 000030
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１２２】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ  Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：
【化２３−１】
2021526858.tif 000031
【化２３−２】
2021526858.tif 000032
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１２３】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ  Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：
【化２４】
2021526858.tif 000033
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１２４】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ  Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：
【化２５−１】
2021526858.tif 000034
【化２５−２】
2021526858.tif 000035
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１２５】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ  Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：
【化２６】
2021526858.tif 000036
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１２６】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｏ．ｌａｎｅｕｓ  Ｃａｓ９であり得、アミノ酸配列：
【０１２７】
【化２７】
2021526858.tif 000037
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１２８】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓタンパク質またはその一部から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓタンパク質は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓタンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質を含む。本開示の例示的なＣｐｆ１タンパク質は、これだけに限定されないが、細菌または古細菌を含めた、任意の種から単離し得るまたはそれに由来し得る。本開示の例示的なＣｐｆ１タンパク質は、これだけに限定されないが、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６およびＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＮＤ２００６を含めた、任意の種から単離し得るまたはそれに由来し得る。本開示の例示的なＣｐｆ１タンパク質はヌクレアーゼが不活化されたものであり得る。
【０１２９】
本開示の例示的な野生型Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｎｏｖｉｃｉｄａ  Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）タンパク質は、アミノ酸配列：
【化２８】
2021526858.tif 000038
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１３０】
本開示の例示的な野生型Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＮＤ２００６  Ｃｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）タンパク質は、アミノ酸配列：
【化２９】
2021526858.tif 000039
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１３１】
本開示の例示的な野生型Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６  Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）タンパク質は、アミノ酸配列：
【化３０】
2021526858.tif 000040
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１３２】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓタンパク質は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓタンパク質またはその一部を含む。一部の実施形態では、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質またはその一部を含む。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質は、これだけに限定されないが、細菌または古細菌を含めた、任意の種から単離し得るまたはそれに由来し得る。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質は、これだけに限定されないが、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ  ｓｅｒｏｖａｒ  １／２ｂ（ｓｔｒａｉｎ  ＡＴＣＣ  ３５９６７／ＤＳＭ  ２０７５１／ＣＩＰ  １００１００／ＳＬＣＣ  ３９５４）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ  ＤＳＭ  １０７１０、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＤＳＭ  ４８４７、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ  ＷＢ４、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ  ＦＳＬ  Ｒ９−０３１７、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ  ＦＳＬ  Ｒ９−０３１７、ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＦＳＬ  Ｍ６−０６３５（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ  Ｆ０２７９、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＳＢ  １００３、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｒ１２１、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＤＥ４４２およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓを含めた、任意の種から単離し得るまたはそれに由来し得る。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質は、ＤＮＡヌクレアーゼが不活化されたものであり得る。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質としては、これだけに限定されないが、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄおよびそれらのオルソログが挙げられる。本開示の例示的なＣａｓ１３ｂタンパク質としては、これだけに限定されないが、本明細書ではそれぞれＣｓｘ２７およびＣｓｘ２８と称される亜型１および２が挙げられる。
【０１３３】
例示的なＣａｓ１３ａタンパク質としては、これだけに限定されないが、以下が挙げられる：
【表３−１】
2021526858.tif 000041
【表３−２】
2021526858.tif 000042
【０１３４】
本開示の例示的な野生型Ｃａｓ１３ａタンパク質は、アミノ酸配列：
【化３１】
2021526858.tif 000043
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１３５】
例示的なＣａｓ１３ｂタンパク質としては、これだけに限定されないが、以下が挙げられる：
【表４−１】
2021526858.tif 000044
【表４−２】
2021526858.tif 000045
【表４−３】
2021526858.tif 000046
【０１３６】
本開示の例示的な野生型Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ  ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ４３７６７  Ｃａｓ１３ｂ（ＢｚＣａｓ１３ｂ）タンパク質は、アミノ酸配列：
【化３２−１】
2021526858.tif 000047
【化３２−２】
2021526858.tif 000048
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１３７】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄは、ＶＩ−Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のエフェクターである。一部の実施形態では、ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、ＲＮＡを切る（cut）またはそれに結合することができる、ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡエンドヌクレアーゼ酵素である。一部の実施形態では、ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、１つまたは複数の高等真核生物および原核生物ヌクレオチド結合性（ＨＥＰＮ）ドメインを含み得る。一部の実施形態では、ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、野生型ＨＥＰＮドメインまたは変異型ＨＥＰＮドメインのいずれかを含み得る。一部の実施形態では、ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、ＲＮＡを切ることはできないが、ガイドＲＮＡをプロセシングすることができる変異型ＨＥＰＮドメインを含む。一部の実施形態では、ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、プロトスペーサーフランキング配列を必要としない。ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質のさらなる例および配列について、限定することなく、具体的な参照がなされる、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ公開第ＷＯ２０１９／０４０６６４号およびＵＳ２０１９／００６２７２４も参照されたい。
【０１３８】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ６０４９０００２５１：
【化３３】
2021526858.tif 000049
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１３９】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ５４６０００２７５：
【化３４】
2021526858.tif 000050
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１４０】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ４１１４０００３７４：
【化３５−１】
2021526858.tif 000051
【化３５−２】
2021526858.tif 000052
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１４１】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７２１０００６１９：
【化３６】
2021526858.tif 000053
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１４２】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ２００２０００４１１：
【化３７】
2021526858.tif 000054
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１４３】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１３５５２０００３１１：
【化３８】
2021526858.tif 000055
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１４４】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１００３７０００５２７：
【化３９】
2021526858.tif 000056
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１４５】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ２３８０００３２９：
【化４０−１】
2021526858.tif 000057
【化４０−２】
2021526858.tif 000058
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１４６】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ２６４３０００４９２：
【化４１】
2021526858.tif 000059
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１４７】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ８７４００００５７：
【化４２】
2021526858.tif 000060
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１４８】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ４７８１０００４８９：
【化４３】
2021526858.tif 000061
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１４９】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１２１４４０００３５２：
【化４４】
2021526858.tif 000062
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１５０】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ５５９００００４４８：
【化４５】
2021526858.tif 000063
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１５１】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ５２５０００３４９：
【化４６】
2021526858.tif 000064
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１５２】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７２２９０００３０２：
【化４７】
2021526858.tif 000065
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１５３】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ３２２７０００３４３：
【化４８】
2021526858.tif 000066
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１５４】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７０３００００４６９：
【化４９】
2021526858.tif 000067
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１５５】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ１７Ｅ０ｋ２１２０１４０９２０、ｃ８７００００４３：
【化５０】
2021526858.tif 000068
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１５６】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグｅｍｂ｜ＯＢＶＨ０１００３０３７．１、ヒト腸内メタゲノム配列（ＷＧＳコンティグｅｍｂ｜ＯＢＸＺ０１００００９４．１｜およびｅｍｂ｜ＯＢＪＦ０１００００３３．１｜にも見いだされる）：
【化５１】
2021526858.tif 000069
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１５７】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグｔｐｇ｜ＤＪＸＤ０１０００００２．１｜（培養されていないＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓアセンブリ、ＵＢＡ７０１３、ヒツジ腸内メタゲノム由来）：
【化５２−１】
2021526858.tif 000070
【化５２−２】
2021526858.tif 000071
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１５８】
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）の例示的なダイレクトリピート配列：コンティグｔｐｇ｜ＤＪＸＤ０１０００００２．１｜（培養されていないＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓアセンブリ、ＵＢＡ７０１３、ヒツジ腸内メタゲノム由来）（配列番号９５）は、核酸配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  ＤＲ：
【化５３】
2021526858.tif 000072
【０１５９】
（配列番号９６）
を含むまたはそれからなる。
【０１６０】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグＯＧＺＣ０１０００６３９．１（ヒト腸内メタゲノムアセンブリ）：
【化５４】
2021526858.tif 000073
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１６１】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグｅｍｂ｜ＯＨＢＭ０１０００７６４．１（ヒト腸内メタゲノムアセンブリ）：
【化５５】
2021526858.tif 000074
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１６２】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグｅｍｂ｜ＯＨＣＰ０１００００４４．１（ヒト腸内メタゲノムアセンブリ）：
【化５６−１】
2021526858.tif 000075
【化５６−２】
2021526858.tif 000076
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１６３】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグｅｍｂ｜ＯＧＤＦ０１００８５１４．１|（ヒト腸内メタゲノムアセンブリ）：
【化５７】
2021526858.tif 000077
【０１６４】
（配列番号１００）
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１６５】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグｅｍｂ｜ＯＧＰＮ０１００２６１０．１（ヒト腸内メタゲノムアセンブリ）：
【化５８−１】
2021526858.tif 000078
【化５８−２】
2021526858.tif 000079
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１６６】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグｅｍｂ｜ＯＢＬＩ０１０２０２４４およびｅｍｂ｜ＯＢＬＩ０１０３８６７９（ブタ腸内メタゲノム由来）由来：
【化５９】
2021526858.tif 000080
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１６７】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグＯＩＺＸ０１０００４２７．１：
【化６０−１】
2021526858.tif 000081
【化６０−２】
2021526858.tif 000082
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１６８】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグＯＣＴＷ０１１５８７２６６．１：
【化６１】
2021526858.tif 000083
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１６９】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグｅｍｂ｜ＯＧＮＦ０１００９１４１．１：
【化６２−１】
2021526858.tif 000084
【化６２−２】
2021526858.tif 000085
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１７０】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグｅｍｂ｜ＯＩＥＮ０１００２１９６．１：
【化６３】
2021526858.tif 000086
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１７１】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）：コンティグｅ−ｋ８７＿１１０９２７３６：
【化６４−１】
2021526858.tif 000087
【化６４−２】
2021526858.tif 000088
を含み得るまたはそれからなり得る。
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄメタゲノムヒット（タンパク質受託なし）の例示的なダイレクトリピート配列：コンティグｅ−ｋ８７＿１１０９２７３６（配列番号１０７）は、核酸配列：ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄダイレクトリピート１：ｇｔｇａｇａａｇｔｃ  ｔｃｃｔｔａｔｇｇｇ  ｇａｇａｔｇｃｔａｃ（配列番号１０８）を含むまたはそれからなる。
【０１７２】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  Ｇａ０１２９３０６＿１０００７３５：
【化６５】
2021526858.tif 000089
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１７３】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  Ｇａ０１２９３１７＿１００８０６７：
【化６６−１】
2021526858.tif 000090
【化６６−２】
2021526858.tif 000091
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１７４】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  Ｇａ０２２４４１５＿１００４８７９２：
【化６７】
2021526858.tif 000092
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１７５】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  １６０５８２９５８＿ｇｅｎｅ４９８３４：
【化６８−１】
2021526858.tif 000093
【化６８−２】
2021526858.tif 000094
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１７６】
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質の例示的なダイレクトリピート配列は、配列ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  １６０５８２９５８＿ｇｅｎｅ４９８３４（配列番号１１２）を含み得るまたはそれからなり得、これは、核酸配列：ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  ＤＲ：
【化６９】
2021526858.tif 000095
を含むまたはそれからなる。
【０１７７】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  ２５０ｔｗｉｎｓ＿３５８３８＿ＧＬ０１１０３００：
【化７０】
2021526858.tif 000096
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１７８】
例示的なＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列：
ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄ  ２５０ｔｗｉｎｓ＿３６０５０＿ＧＬ０１５８９８５：
【化７１−１】
2021526858.tif 000097
【化７１−２】
2021526858.tif 000098
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１７９】
Yan  et  al.(2018)  Mol  Cell.  70  (2):  327-339（doi:10.1016/j.molcel.2018.02.2018）およびKonermann  et  al.(2018)Cell  173  (3):  665-676（doi:10.1016/j.cell/2018.02.033）には、ＣａｓＲＸ／Ｃａｓ１３ｄタンパク質について記載されており、これらはどちらもその全体が参照により本明細書に組み込まれる。その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ公開第ＷＯ２０１８／１８３７０３号（ＣａｓＭ）および同第ＷＯ２０１９／００６４７１号（Ｃａｓ１３ｄ）も参照されたい。
【０１８０】
本開示の例示的な野生型Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、アミノ酸配列：
【０１８１】
Ｃａｓ１３ｄ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ  ＸＰＤ３００２）配列：
【化７２】
2021526858.tif 000099
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１８２】
本開示の例示的な野生型Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、アミノ酸配列：
【０１８３】
Ｃａｓ１３ｄ（コンティグｅ−ｋ８７＿１１０９２７３６）：
【化７３】
2021526858.tif 000100
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１８４】
Ｃａｓ１３ｄの例示的なダイレクトリピート配列（コンティグｅ−ｋ８７＿１１０９２７３６）（配列番号４６）は、核酸配列：Ｃａｓ１３ｄ（コンティグｅ−ｋ８７＿１１０９２７３６）ダイレクトリピート配列）：ＧＴＧＡＧＡＡＧＴＣＴＣＣＴＴＡＴＧＧＧＧＡＧＡＴＧＣＴＡＣ（配列番号４７）を含むまたはそれからなる。
【０１８５】
本開示の例示的な野生型Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、アミノ酸配列：
【０１８６】
Ｃａｓ１３ｄ（１６０５８２９５８＿ｇｅｎｅ４９８３４）：
【化７４−１】
2021526858.tif 000101
【化７４−２】
2021526858.tif 000102
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１８７】
Ｃａｓ１３ｄの例示的なダイレクトリピート配列（１６０５８２９５８＿ｇｅｎｅ４９８３４）（配列番号４８）は、核酸配列：
【０１８８】
Ｃａｓ１３ｄ（１６０５８２９５８＿ｇｅｎｅ４９８３４）ダイレクトリピート配列：
【化７５】
2021526858.tif 000103
を含むまたはそれからなる。
【０１８９】
本開示の例示的な野生型Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、アミノ酸配列：
【０１９０】
Ｃａｓ１３ｄ（コンティグｔｐｇ｜ＤＪＸＤ０１０００００２．１｜；培養されていないＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓアセンブリ、ＵＢＡ７０１３、ヒツジ腸内メタゲノム由来）：
【化７６−１】
2021526858.tif 000104
【化７６−２】
2021526858.tif 000105
を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１９１】
Ｃａｓ１３ｄの例示的なダイレクトリピート配列（コンティグｔｐｇ｜ＤＪＸＤ０１０００００２．１｜；培養されていないＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓアセンブリ、ＵＢＡ７０１３、ヒツジ腸内メタゲノム由来）（配列番号５０）は、核酸配列：Ｃａｓ１３ｄ（コンティグｔｐｇ｜ＤＪＸＤ０１０００００２．１｜；培養されていないＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓアセンブリ、ＵＢＡ７０１３、ヒツジ腸内メタゲノム由来）ダイレクトリピート配列：
【化７７】
2021526858.tif 000106
を含むまたはそれからなる。
ｇＲＮＡ標的配列
【０１９２】
本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質および／または第２のＲＮＡ結合性タンパク質に対応する配列モチーフを含む。
【０１９３】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、配列モチーフは、疾患または障害のシグネチャーである。
【０１９４】
本開示の配列モチーフは、ゲノム配列内に見いだされる外来または外因性配列の配列から単離し得るまたはそれに由来し得、したがって、本開示のｍＲＮＡ分子または本開示のＲＮＡ配列内に見いだされる外来または外因性配列の配列に翻訳される。
【０１９５】
本開示の配列モチーフは、疾患または障害を引き起こす、内因性配列内の変異を含み得るまたはそれからなり得る。変異は、配列の置換、逆位、欠失、挿入、転位、またはこれらの任意の組合せを含み得るまたはそれからなり得る。
【０１９６】
本開示の配列モチーフは、リピート配列を含み得るまたはそれからなり得る。一部の実施形態では、リピート配列は、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）に関連し得る。１つまたは複数の遺伝子座におけるＭＳＩは、本開示の細胞のＤＮＡミスマッチ修復機構が損なわれたことに起因する。ＤＮＡの超可変配列は、超可変配列を含むまたはそれからなる標的配列を含む本開示のｍＲＮＡに転写され得る。
【０１９７】
本開示の配列モチーフは、バイオマーカーを含み得るまたはそれからなり得る。バイオマーカーは、疾患または障害が発生するリスクを示すものであり得る。バイオマーカーは、健康な遺伝子（疾患または障害が発生することの確定可能なリスクが低いまたはリスクがない）を示すものであり得る。バイオマーカーは、編集された遺伝子を示すものであり得る。例示的なバイオマーカーとしては、これだけに限定されないが、一塩基多型（ＳＮＰ）、配列バリエーションまたは変異、エピジェネティックマーク、スプライスアクセプター部位、外因性配列、異種配列、およびこれらの任意の組合せが挙げられる。
【０１９８】
本開示の配列モチーフは、二次構造、三次構造または四次構造を含み得るまたはそれからなり得る。二次構造、三次構造または四次構造は、内因性または天然に存在するものであり得る。二次構造、三次構造または四次構造は、誘導されたまたは天然に存在しないものであり得る。二次構造、三次構造または四次構造は、内因性配列、外因性配列、または異種配列にコードされるものであり得る。
【０１９９】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、終点を含めて、２個から１００個の間のヌクレオチドまたは核酸塩基を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、終点を含めて、２個から５０個の間のヌクレオチドまたは核酸塩基を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、終点を含めて、２個から２０個の間のヌクレオチドまたは核酸塩基を含むまたはそれからなる。
【０２００】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は連続している。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は連続していない。例えば、ＲＮＡ分子の標的配列は、標的配列のヌクレオチド間に１つまたは複数の断続的なヌクレオチドが位置することに起因して連続していない１つまたは複数のヌクレオチドまたは核酸塩基を含み得るまたはそれからなり得る。
【０２０１】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、天然に存在するものである。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、天然に存在しないものである。例示的な天然に存在しない標的配列は、配列バリエーションもしくは変異、キメラ配列、外因性配列、異種配列、キメラ配列、組換え配列、改変もしくは合成されたヌクレオチドを含む配列またはこれらの任意の組合せを含み得るまたはそれからなり得る。
【０２０２】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、本開示のガイドＲＮＡに結合する。
【０２０３】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、本開示の第１のＲＮＡ結合性タンパク質に結合する。
【０２０４】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、本開示の第２のＲＮＡ結合性タンパク質に結合する。
ＲＮＡ分子
【０２０５】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、標的配列を含む。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、少なくとも１つの標的配列を含む。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、１つまたは複数の標的配列を含む。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、２つまたはそれよりも多くの標的配列を含む。
【０２０６】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、天然に存在するＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、天然に存在しない分子である。例示的な天然に存在しないＲＮＡ分子は、配列のバリエーションまたは変異、キメラ配列、外因性配列、異種配列、キメラ配列、組換え配列、改変または合成されたヌクレオチドを含む配列またはこれらの任意の組合せを含み得るまたはそれからなり得る。
【０２０７】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、ウイルスから単離されたまたはそれに由来する配列を含むまたはそれからなる。
【０２０８】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、原核生物から単離されたまたはそれに由来する配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、古細菌の種もしくは株または細菌の種もしくは株から単離されたまたはそれに由来する配列を含むまたはそれからなる。
【０２０９】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、真核生物から単離されたまたはそれに由来する配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、原生動物、寄生生物、原生生物、藻類、真菌、酵母、アメーバ、蠕虫、微生物、無脊椎動物、脊椎動物、昆虫、齧歯類、マウス、ラット、哺乳動物、または霊長類の種から単離されたまたはそれに由来する配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、ヒトから単離されたまたはそれに由来する配列を含むまたはそれからなる。
【０２１０】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、生物体またはウイルスゲノム由来のコード配列に由来する配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、一次ＲＮＡ転写物、メッセンジャーＲＮＡ前駆体（プレｍＲＮＡ）またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、プロセシングされていない遺伝子産物（例えば、転写物）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、転写後プロセシングを受けた遺伝子産物（例えば、５’キャップおよび３’ポリアデニル化シグナルを含む転写物）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、選択的スプライシングを受けた遺伝子産物（例えば、スプライスバリアント）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、非コード配列および／またはイントロン配列の除去を受けた遺伝子産物（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））を含むまたはそれからなる。
【０２１１】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、非コード配列（例えば、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ））に由来する配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、リボソームＲＮＡを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、小さなｎｃＲＮＡ分子を含むまたはそれからなる。本開示の例示的なスモールＲＮＡ分子としては、これだけに限定されないが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉（ｓｉＲＮＡ）、piwi相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、細胞外またはエキソソームＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、および低分子カハール体特異的ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）が挙げられる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、長いｎｃＲＮＡ分子を含むまたはそれからなる。本開示の例示的な長いＲＮＡ分子としては、これだけに限定されないが、Ｘ−不活性特異的転写物（Ｘｉｓｔ）およびＨＯＸ転写物アンチセンスＲＮＡ（ＨＯＴＡＩＲ）が挙げられる。
【０２１２】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子と本開示の組成物を細胞内空間内で接触させる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子と本開示の組成物を細胞質ゾル空間内で接触させる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子と本開示の組成物を核内で接触させる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子と本開示の組成物を小胞、細胞の膜に結合した区画、または細胞小器官において接触させる。
【０２１３】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子と本開示の組成物を細胞外空間内で接触させる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子と本開示の組成物をエキソソーム内で接触させる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子と本開示の組成物をリポソーム、ポリマーソーム、ミセルまたはナノ粒子内で接触させる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子と本開示の組成物を細胞外マトリックス内で接触させる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子と本開示の組成物を液滴中で接触させる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子と本開示の組成物をマイクロ流体液滴中で接触させる。
【０２１４】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、一本鎖配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、二本鎖配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、二本鎖配列は、２つのＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、二本鎖配列は、ＲＮＡ分子１つとＤＮＡ分子１つを含む。二本鎖配列がＲＮＡ分子１つとＤＮＡ分子１つを含む場合を含めた一部の実施形態では、本開示の組成物は、ＲＮＡ分子に選択的に結合し、必要に応じて、それを選択的に切る。
ＲＮＡ結合性エンドヌクレアーゼ
【０２１５】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡと会合する様式でＲＮＡに結合する。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡを切断する（cleave）様式でＲＮＡと会合する。
【０２１６】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅを含むまたはそれからなる。
【０２１７】
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ１を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ１タンパク質は、
【化７８】
2021526858.tif 000107
を含むまたはそれからなる。
【０２１８】
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ４を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ４タンパク質は、
【化７９】
2021526858.tif 000108
を含むまたはそれからなる。
【０２１９】
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ６を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ６タンパク質は、
【化８０】
2021526858.tif 000109
を含むまたはそれからなる。
【０２２０】
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ７を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ７タンパク質は、
【化８１】
2021526858.tif 000110
を含むまたはそれからなる。
【０２２１】
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ８を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ８タンパク質は、
【化８２】
2021526858.tif 000111
を含むまたはそれからなる。
【０２２２】
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ２を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ２タンパク質は、
【化８３】
2021526858.tif 000112
を含むまたはそれからなる。
【０２２３】
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ６ＰＬを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ６ＰＬタンパク質は、
【化８４】
2021526858.tif 000113
を含むまたはそれからなる。
【０２２４】
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅＬを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅＬタンパク質は、
【化８５】
2021526858.tif 000114
を含むまたはそれからなる。
【０２２５】
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅＴ２を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅＴ２タンパク質は、
【化８６】
2021526858.tif 000115
を含むまたはそれからなる。
【０２２６】
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ１１を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ１１タンパク質は、
【化８７−１】
2021526858.tif 000116
【化８７−２】
2021526858.tif 000117
を含むまたはそれからなる。
【０２２７】
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅＴ２様を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅＴ２様タンパク質は、
【化８８】
2021526858.tif 000118
を含むまたはそれからなる。
【０２２８】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型ＲＮＡｓｅを含むまたはそれからなる。
【０２２９】
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ）ポリペプチドは、
【化８９】
2021526858.tif 000119
を含むまたはそれからなる。
【０２３０】
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ））ポリペプチドは、
【化９０】
2021526858.tif 000120
を含むまたはそれからなる。
【０２３１】
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドは、
【化９１】
2021526858.tif 000121
を含むまたはそれからなる。
【０２３２】
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドは、
【化９２】
2021526858.tif 000122
を含むまたはそれからなる。
【０２３３】
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドは、
【化９３】
2021526858.tif 000123
を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ、Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ））ポリペプチドは、
【化９４】
2021526858.tif 000124
を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ））ポリペプチドは、
【化９５】
2021526858.tif 000125
を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、
【化９６】
2021526858.tif 000126
を含むまたはそれからなる変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ、Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。
【０２３４】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＮＯＢ１ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＮＯＢ１ポリペプチドは、
【化９７】
2021526858.tif 000127
を含むまたはそれからなる。
【０２３５】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、エンドヌクレアーゼを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、エンドヌクレアーゼＶ（ＥＮＤＯＶ）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＮＤＯＶタンパク質は、
【化９８】
2021526858.tif 000128
を含むまたはそれからなる。
【０２３６】
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、エンドヌクレアーゼＧ（ＥＮＤＯＧ）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＮＤＯＧタンパク質は、
【化９９】
2021526858.tif 000129
を含むまたはそれからなる。
【０２３７】
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、エンドヌクレアーゼＤ１（ＥＮＤＯＤ１）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＮＤＯＤ１タンパク質は、
【化１００】
2021526858.tif 000130
を含むまたはそれからなる。
【０２３８】
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ヒトフラップエンドヌクレアーゼ−１（ｈＦＥＮ１）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ｈＦＥＮ１ポリペプチドは、
【化１０１】
2021526858.tif 000131
を含むまたはそれからなる。
【０２３９】
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＤＮＡ修復エンドヌクレアーゼＸＰＦ（ＥＲＣＣ４）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＲＣＣ４ポリペプチドは、
【化１０２】
2021526858.tif 000132
を含むまたはそれからなる。
【０２４０】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、エンドヌクレアーゼＩＩＩ様タンパク質１（ＮＴＨＬ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＮＴＨＬポリペプチドは、
【化１０３】
2021526858.tif 000133
を含むまたはそれからなる。
【０２４１】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ヒトＳｃｈｌａｆｅｎ１４（ｈＳＬＦＮ１４）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ｈＳＬＦＮ１４ポリペプチドは、
【化１０４】
2021526858.tif 000134
を含むまたはそれからなる。
【０２４２】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ヒトベータ−ラクタマーゼ様タンパク質２（ｈＬＡＣＴＢ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ｈＬＡＣＴＢ２ポリペプチドは、
【化１０５】
2021526858.tif 000135
を含むまたはそれからなる。
【０２４３】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）エンドデオキシリボヌクレアーゼ（ＡＰＥＸ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）エンドデオキシリボヌクレアーゼ（ＡＰＥＸ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＡＰＥＸ２ポリペプチドは、
【化１０６−１】
2021526858.tif 000136
【化１０６−２】
2021526858.tif 000137
を含むまたはそれからなる。
【０２４４】
一部の実施形態では、ＡＰＥＸ２ポリペプチドは、
【化１０７】
2021526858.tif 000138
を含むまたはそれからなる。
【０２４５】
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、脱プリンまたは脱ピリミジン部位リアーゼ（ＡＰＥＸ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＡＰＥＸ１ポリペプチドは、
【化１０８】
2021526858.tif 000139
を含むまたはそれからなる。
【０２４６】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、アンジオゲニン（ＡＮＧ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＡＮＧポリペプチドは、
【化１０９−１】
2021526858.tif 000140
【化１０９−２】
2021526858.tif 000141
を含むまたはそれからなる。
【０２４７】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、熱応答性タンパク質１２（ＨＲＳＰ１２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＨＲＳＰ１２ポリペプチドは、
【化１１０】
2021526858.tif 000142
を含むまたはそれからなる。
【０２４８】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ジンクフィンガーＣＣＣＨ型含有１２Ａ（ＺＣ３Ｈ１２Ａ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＺＣ３Ｈ１２Ａポリペプチドは、
【化１１１】
2021526858.tif 000143
を含むまたはそれからなる。
【０２４９】
一部の実施形態では、ＺＣ３Ｈ１２Ａポリペプチドは、
【化１１２】
2021526858.tif 000144
を含むまたはそれからなる。
【０２５０】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、反応性中間体イミンデアミナーゼＡ（ＲＩＤＡ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＩＤＡポリペプチドは、
【化１１３】
2021526858.tif 000145
を含むまたはそれからなる。
【０２５１】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ホスホリパーゼＤファミリーメンバー６（ＰＤＬ６）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＰＤＬ６ポリペプチドは、
【化１１４】
2021526858.tif 000146
を含むまたはそれからなる。
【０２５２】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ミトコンドリアリボヌクレアーゼＰ触媒サブユニット（ＫＩＡＡ０３９１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＫＩＡＡ０３９１ポリペプチドは、
【化１１５】
2021526858.tif 000147
を含むまたはそれからなる。
【０２５３】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、アルゴノート２（ＡＧＯ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ＡＧＯ２ポリペプチドは、
【化１１６−１】
2021526858.tif 000148
【化１１６−２】
2021526858.tif 000149
を含むまたはそれからなる。
【０２５４】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ミトコンドリアヌクレアーゼＥＸＯＧ（ＥＸＯＧ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＸＯＧポリペプチドは、
【化１１７】
2021526858.tif 000150
を含むまたはそれからなる。
【０２５５】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ジンクフィンガーＣＣＣＨ型含有１２Ｄ（ＺＣ３Ｈ１２Ｄ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＺＣ３Ｈ１２Ｄポリペプチドは、
【化１１８】
2021526858.tif 000151
を含むまたはそれからなる。
【０２５６】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、小胞体から核へのシグナル伝達２（ＥＲＮ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＲＮ２ポリペプチドは、
【化１１９−１】
2021526858.tif 000152
【化１１９−２】
2021526858.tif 000153
を含むまたはそれからなる。
【０２５７】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ぺロタｍＲＮＡサーベイランスおよびリボソームレスキュー因子（ＰＥＬＯ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＰＥＬＯポリペプチドは、
【化１２０】
2021526858.tif 000154
を含むまたはそれからなる。
【０２５８】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＹＢＥＹメタロペプチダーゼ（ＹＢＥＹ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＹＢＥＹポリペプチドは、
【化１２１】
2021526858.tif 000155
を含むまたはそれからなる。
【０２５９】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、切断およびポリアデニル化特異的因子４様（ＣＰＳＦ４Ｌ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＣＰＳＦ４Ｌポリペプチドは、
【化１２２】
2021526858.tif 000156
を含むまたはそれからなる。
【０２６０】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ｈＣＧ＿２００２７３１ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ｈＣＧ＿２００２７３１ポリペプチドは、
【化１２３】
2021526858.tif 000157
を含むまたはそれからなる。
【０２６１】
一部の実施形態では、ｈＣＧ＿２００２７３１ポリペプチドは、
【化１２４】
2021526858.tif 000158
を含むまたはそれからなる。
【０２６２】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、除去修復交差相補群１（ＥＲＣＣ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＲＣＣ１ポリペプチドは、
【化１２５】
2021526858.tif 000159
を含むまたはそれからなる。
【０２６３】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質１アイソフォーム（ＲＡＣ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＡＣ１ポリペプチドは、
【化１２６】
2021526858.tif 000160
を含むまたはそれからなる。
【０２６４】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、リボヌクレアーゼＡＡ１（ＲＡＡ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＡＡ１ポリペプチドは、
【化１２７】
2021526858.tif 000161
を含むまたはそれからなる。
【０２６５】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｒａｓ関連タンパク質（ＲＡＢ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＡＢ１ポリペプチドは、
【化１２８】
2021526858.tif 000162
を含むまたはそれからなる。
【０２６６】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＤＮＡ複製ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ２（ＤＮＡ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＤＮＡ２ポリペプチドは、
【化１２９】
2021526858.tif 000163
を含むまたはそれからなる。
【０２６７】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＦＬＪ３５２２０ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＦＬＪ３５２２０ポリペプチドは、
【化１３０】
2021526858.tif 000164
を含むまたはそれからなる。
【０２６８】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＦＬＪ１３１７３ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＦＬＪ１３１７３ポリペプチドは、
【化１３１】
2021526858.tif 000165
を含むまたはそれからなる。
【０２６９】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、テニューリン膜貫通タンパク質（ＴＥＮＭ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、テニューリン膜貫通タンパク質１（ＴＥＮＭ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＴＥＮＭ１ポリペプチドは、
【化１３２】
2021526858.tif 000166
を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、テニューリン膜貫通タンパク質２（ＴＥＮＭ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＴＥＮＭ２ポリペプチドは、
【化１３３】
2021526858.tif 000167
を含むまたはそれからなる。本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、リボヌクレアーゼカッパ（ＲＮＡｓｅＫ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅＫポリペプチドは、
【化１３４】
2021526858.tif 000168
を含むまたはそれからなる。
【０２７０】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ポリペプチドまたはそのヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮポリペプチドは、
【化１３５−１】
2021526858.tif 000169
【化１３５−２】
2021526858.tif 000170
を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮポリペプチドは、
【化１３６】
2021526858.tif 000171
を含むまたはそれからなる。
【０２７１】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼポリペプチドまたはそのヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＺＮＦ６３８ポリペプチドまたはそのヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＺＮＦ６３８ポリペプチドポリペプチドは、
【化１３７−１】
2021526858.tif 000172
【化１３７−２】
2021526858.tif 000173
を含むまたはそれからなる。
【０２７２】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、一般にテロメラーゼ結合性タンパク質ＥＳＴ１Ａアイソフォーム３、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１２４３７５６．１としても公知のヒトＳＭＧ６タンパク質に由来するＰＩＮドメインを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ｈＳＭＧ６由来のＰＩＮは、本明細書では、Ｃａｓ融合タンパク質の形態で、内部対照として使用される。例えば、これだけに限定することなく、ＰＩＮ−ｄＳａｕＣａｓ９、ＰＩＮ−ｄＳａｕＣａｓ９ｄＨＮＨ、ＰＩＮ−ｄＳＰＣａｓ９、およびｄｃｊｅＣａｓ９−ＰＩＮを示す図９を参照されたい。
【０２７３】
本開示の組成物の一部の実施形態では、組成物は、（ａ）ＲＮＡ分子の内部に特異的に結合するｇＲＮＡを含む配列および（ｂ）ヌクレアーゼをコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型、ＩＡ型、ＩＢ型、ＩＣ型、ＩＤ型、ＩＥ型、ＩＦ型、ＩＵ型、ＩＩＩ型、ＩＩＩＡ型、ＩＩＩＢ型、ＩＩＩＣ型、ＩＩＩＤ型、ＩＶ型、ＩＶＡ型、ＩＶＢ型、ＩＩ型、ＩＩＡ型、ＩＩＢ型、ＩＩＣ型、Ｖ型、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質のいずれか１つから単離されるまたはそれに由来する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮまたはそのヌクレアーゼドメインから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはそのヌクレアーゼドメインから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。
融合タンパク質
【０２７４】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、組成物は、（ａ）第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列またはその一部と、（ｂ）第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列とを含む標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質をコードする配列を含み、ここで、第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドは、標的ＲＮＡに結合し、第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドは、ＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む。
【０２７５】
一部の実施形態では、標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質は、ＲＮＡによりガイドされる標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質である。ＲＮＡによりガイドされる標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質は、ＲＮＡ結合性ポリペプチドを標的ＲＮＡへガイドするｇＲＮＡに対応する少なくとも１つのＲＮＡ結合性ポリペプチドを含む。ＲＮＡによりガイドされる標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質としては、これだけに限定することなく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに基づくＲＮＡ結合性ポリペプチドまたはその一部であるＲＮＡ結合性ポリペプチドが挙げられる。
【０２７６】
一部の実施形態では、標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質は、ＲＮＡによりガイドされる標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質ではなく、したがって、対応するｇＲＮＡ配列を有さない標的ＲＮＡに結合することができる少なくとも１つのＲＮＡ結合性ポリペプチドを含む。そのようなガイドされないＲＮＡ結合性ポリペプチドとしては、限定することなく、ＰＵＦ（ＰｕｍｉｌｉｏおよびＦＢＦホモロジーファミリー）である少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質またはそのＲＮＡ結合性部分が挙げられる。この型のＲＮＡ結合性ポリペプチドを、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓなどのｇＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性タンパク質の代わりに使用することができる。ｍＲＮＡの安定性および翻訳の媒介に関与するＰＵＦタンパク質（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＰｕｍｉｌｉｏおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｆｅｍ−３結合因子に由来する）の独特のＲＮＡ認識方式は当技術分野で周知である。同じく当技術分野で公知のヒトＰｕｍｉｌｉｏ１のＰＵＦドメインは同族ＲＮＡ配列に密接に結合し、また、その特異性は改変することができる。ヒトＰｕｍｉｌｉｏ１のＰＵＦドメインは、８つの連続したＲＮＡ塩基を認識する８つのＰＵＦリピートを含有し、各リピートが一塩基を認識する。各リピート内の２つのアミノ酸側鎖は、対応する塩基のワトソン・クリック端を認識し、そのリピートの特異性が決定されるので、ＰＵＦドメインは、最大の８ｎｔのＲＮＡに特異的に結合するように設計することができる。Wang  et  al.,  Nat  Methods.  2009;  6  (11):  825-830。その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／０６８６２７も参照されたい。
【０２７７】
本開示のガイドされないＲＮＡ結合性融合タンパク質の一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＰＵＭＢＹ（Ｐｕｍｉｌｉｏに基づくアセンブリ）タンパク質である少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質またはそのＲＮＡ結合性部分を含む。ＲＮＡを標的とするためネイティブな形態および改変された形態で広く使用されているＲＮＡ結合性タンパク質ＰｕｍＨＤ（ＰＵＦファミリーのメンバーであるＰｕｍｉｌｉｏ相同性ドメイン）が操作されて、それぞれが１つのＲＮＡ塩基を標的とする４つの標準的なタンパク質モジュールのセットがもたらされた。これらのモジュール（すなわち、Ｐｕｍｉｌｉｏに基づくアセンブリに関してはＰｕｍｂｙ）を、所望の標的ＲＮＡに結合するように様々な組成および長さの鎖に連結することができる。そのようなＰｕｍｂｙ−ＲＮＡ相互作用の特異性は高く、Ｐｕｍｂｙ鎖の、標的配列から３つまたはそれよりも多くのミスマッチを有するＲＮＡ配列への結合は検出不可能である。Katarzyna  et  al.,  PNAS,  2016;  113  (19):  E2579-E2588。その全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／０２３８５９３も参照されたい。
【０２７８】
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＰｕｍｉｌｉｏおよびＦＢＦ（ＰＵＦ）タンパク質を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｐｕｍｉｌｉｏに基づくアセンブリ（ＰＵＭＢＹ）タンパク質を含む。一部の実施形態では、本開示のＰＵＦ１タンパク質は、
【化１３８】
2021526858.tif 000174
のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＰＵＦ３タンパク質は、
【化１３９】
2021526858.tif 000175
のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＰＵＦ４タンパク質は、
【化１４０】
2021526858.tif 000176
のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＰＵＦ５タンパク質は、
【化１４１】
2021526858.tif 000177
のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＰＵＦ６タンパク質は、
【化１４２−１】
2021526858.tif 000178
【化１４２−２】
2021526858.tif 000179
のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＰＵＦ７タンパク質は、
【化１４３】
2021526858.tif 000180
のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＰＵＦ８タンパク質は、
【化１４４】
2021526858.tif 000181
のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＰＵＦ９タンパク質は、
【化１４５】
2021526858.tif 000182
のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
【０２７９】
本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質またはそのＲＮＡ結合性部分の少なくとも１つは、ＰＰＲタンパク質である。ＰＰＲタンパク質（植物に由来するペンタトリコペプチドリピート（ＰＰＲ）モチーフを有するタンパク質）は、核にコードされ、ＲＮＡレベルで、細胞小器官（葉緑体およびミトコンドリア）、切り取り（cutting）、翻訳、スプライシング、ＲＮＡの編集、ＲＮＡ安定性に特異的に作用する遺伝子を排他的に制御する。ＰＰＲタンパク質は、一般には、３５アミノ酸のモチーフであり、ＰＰＲモチーフが約１０個の連続したアミノ酸である構造を有する。ＰＰＲモチーフの組合せをＲＮＡへの配列選択的結合に使用することができる。ＰＰＲタンパク質は、多くの場合、約１０リピートドメインのＰＰＲモチーフで構成される。ＰＰＲドメインまたはＲＮＡ結合性ドメインは、触媒として不活性になるように構成することができる。その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／０５８４０４。
【０２８０】
一部の実施形態では、本明細書に開示される融合タンパク質は、少なくとも２つのＲＮＡ結合性ポリペプチド間のリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、トリペプチドＧＧＳの１つまたは複数のリピートを含む。他の実施形態では、リンカーは、非ペプチドリンカーである。一部の実施形態では、非ペプチドリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ｃｏ−ポリ（エチレン／プロピレン）グリコール、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリウレタン、ポリホスファゼン、多糖、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルエチルエーテル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、ヘパリン、またはアルキルリンカーを含む。
【０２８１】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ結合活性のために多量体形成を必要としない。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、多量体複合体の単量体ではない。一部の実施形態では、多量体タンパク質複合体は、ＲＮＡ結合性タンパク質を含まない。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ分子内の標的配列に選択的に結合する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ分子内の第２の配列に対する親和性を含まない。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ分子内の第２の配列に対して高い親和性を含まずそれに選択的に結合しない。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、終点を含めて、２アミノ酸から１３００アミノ酸の間を含む。
【０２８２】
一部の実施形態では、本明細書に開示される融合タンパク質の少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、ＲＮＡ結合性タンパク質に対して３’側に位置する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、ＮＬＳをＣ末端に含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、第１のＮＬＳをコードする第１の配列および第２のＮＬＳをコードする第２の配列をさらに含む。一部の実施形態では、第１のＮＬＳまたは第２のＮＬＳは、ＲＮＡ結合性タンパク質に対して３’側に位置する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、第１のＮＬＳまたは第２のＮＬＳをＣ末端に含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、ＮＥＳ（核外輸送シグナル）または他のペプチドタグまたは分泌シグナルをさらに含む。
【０２８３】
一部の実施形態では、本明細書に開示される融合タンパク質は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質として少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質を含み、それと共に、ヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる第２のＲＮＡ結合性タンパク質を含む。
【０２８４】
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドは、第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドのＣ末端において第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドに対して作動可能に構成されている。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドは、第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドのＮ末端において第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドに対して作動可能に構成されている。例えば、そのような例示的な融合タンパク質の１つは、ＲＮＡｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ１９Ｄ、Ｈ１１９Ｎ、Ｋ４１Ｒ）がＳｐｙＣａｓ９のＮ末端に位置するように構成されたＥ９９であり、別の例示的な融合タンパク質、Ｅ１００は、ＲＮＡｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ１９Ｄ、Ｈ１１９Ｎ、Ｋ４１Ｒ）がＳｐｙＣａｓ９のＣ末端に位置するように構成されている。図６を参照されたい。
ベクター
【０２８５】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ベクターは、本開示のガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ベクターは、本開示のガイドＲＮＡを少なくとも１つ含む。一部の実施形態では、ベクターは、本開示のガイドＲＮＡを１つまたは複数含む。一部の実施形態では、ベクターは、本開示のガイドＲＮＡを２つまたはそれよりも多く含む。一部の実施形態では、ベクターは、本開示の融合タンパク質をさらに含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質と第２のＲＮＡ結合性タンパク質とを含む。
【０２８６】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、第１のベクターが本開示のガイドＲＮＡを含み、第２のベクターが本開示の融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、第１のベクターは、本開示のガイドＲＮＡを少なくとも１つ含む。一部の実施形態では、第１のベクターは、本開示のガイドＲＮＡを１つまたは複数含む。一部の実施形態では、第１のベクターは、本開示のガイドＲＮＡを２つまたはそれよりも多く含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質と第２のＲＮＡ結合性タンパク質とを含む。一部の実施形態では、第１のベクターと第２のベクターは同一である。一部の実施形態では、第１のベクターと第２のベクターは同一ではない。
【０２８７】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ベクターは、（ａ）本開示のＲＮＡ標的化融合タンパク質をコードする核酸配列と、（ｂ）標的ＲＮＡ配列とハイブリダイズするまたはそれに結合するＲＮＡ配列（またはスペーサー配列）を５’末端に含み、融合タンパク質のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質に結合することまたはそれと会合することができるＲＮＡ配列（または足場配列）を３’末端に含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列とを含む「２成分ＲＮＡ標的化系」の成分であるかまたはそれを含み、２成分ＲＮＡ標的化系は、ＰＡＭｍｅｒの非存在下で細胞内の標的ＲＮＡを認識し、それを変更する。一部の実施形態では、２成分系の配列は、単一のベクター内に存在する。一部の実施形態では、２成分系のスペーサー配列は、ＣＵＧ、ＣＣＵＧ、ＣＡＧ、およびＧＧＧＧＣＣからなる群から選択されるリピート配列を標的とする。
【０２８８】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のベクターは、ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、複製能力がない。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、単離されたものまたは組み換えられたものである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、自己相補的である。
【０２８９】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１またはＡＡＶ１２であるＡＡＶから単離されたまたはそれに由来する末端逆位反復配列またはカプシド配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、複製能力がない。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、単離されたものまたは組み換えられたもの（ｒＡＡＶ）である。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、自己相補的（ｓｃＡＡＶ）である。
【０２９０】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のベクターは、非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、ナノ粒子、ミセル、リポソームまたはリポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックスまたはデンドリマーを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ベクターは、発現ベクターまたは組換え発現系である。本明細書で使用される場合、「組換え発現系」という用語は、組換えによって形成されたある特定の遺伝子材料を発現させるための遺伝子構築物を指す。
【０２９１】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本明細書に提示される発現ベクター、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターは、これだけに限定することなく、発現制御エレメントを含む。「発現制御エレメント」は、本明細書で使用される場合、遺伝子などのコード配列の発現を調節する任意の配列を指す。例示的な発現制御エレメントとしては、これだけに限定されないが、プロモーター、エンハンサー、マイクロＲＮＡ、転写後調節エレメント、ポリアデニル化シグナル配列、およびイントロンが挙げられる。発現制御エレメントは、例えば、構成的、誘導性、抑制性、または組織特異的であり得る。「プロモーター」は、転写の開始および速度が制御されるポリヌクレオチド配列の領域である制御配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節性タンパク質および分子が結合することができる遺伝子エレメントを含有し得る。一部の実施形態では、プロモーターによる発現制御は、組織特異的である。非限定的な例示的なプロモーターとしては、ＣＭＶ、ＣＢＡ、ＣＡＧ、Ｃｂｈ、ＥＦ−１ａ、ＰＧＫ、ＵＢＣ、ＧＵＳＢ、ＵＣＯＥ、ｈＡＡＴ、ＴＢＧ、デスミン、ＭＣＫ、Ｃ５−１２、ＮＳＥ、シナプシン、ＰＤＧＦ、ＭｅｃＰ２、ＣａＭＫＩＩ、ｍＧｌｕＲ２、ＮＦＬ、ＮＦＨ、ｎβ２、ＰＰＥ、ＥＮＫ、ＥＡＡＴ２、ＧＦＡＰ、ＭＢＰ、およびＵ６プロモーターが挙げられる。「エンハンサー」は、活性化タンパク質が結合して、転写の尤度または頻度を増加させることができるＤＮＡの領域である。非限定的な例示的なエンハンサーおよび転写後調節エレメントとしては、ＣＭＶエンハンサーおよびＷＰＲＥが挙げられる。
【０２９２】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本明細書に提示される発現ベクター、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターは、これだけに限定することなく、「マルチシストロン性」または「ポリシストロン性」または「バイシストロン性」または「トリシストロン性」構築物の配置（configuration）のためのＩＲＥＳまたは２Ａペプチド部位を含む、すなわち、二重もしくは三重もしくは多重のコード領域またはエクソンなどのベクターエレメントを有し、したがって、単一の構築物から、ｍＲＮＡから２つまたはそれよりも多くのタンパク質を発現させる能力を有する。マルチシストロン性ベクターは、同じｍＲＮＡから２つまたはそれよりも多くの別々のタンパク質を同時に発現させる。マルチシストロン性配置を構築するために最も広く使用されている２つの戦略は、ＩＲＥＳまたは２Ａ自己切断部位を使用することである。「ＩＲＥＳ」は、ポリシストロニックベクター構築物に使用される、ウイルス、原核生物、または真核生物を起源とする配列内リボソーム進入部位またはその一部を指す。一部の実施形態では、ＩＲＥＳは、キャップ依存的に翻訳開始を可能にするＲＮＡエレメントである。「自己切断ペプチド」または「自己切断ペプチドをコードする配列」または「２Ａ自己切断部位」という用語は、リボソームスキッピングを促進するため、したがって、単一のプロモーターから２つのポリペプチドを生成するための部位を組み入れるためにベクター構築物内に使用される連結配列を指す。そのような自己切断ペプチドとしては、これだけに限定することなく、Ｔ２Ａペプチド、およびＰ２Ａペプチドまたは自己切断ペプチドをコードする配列が挙げられる。
【０２９３】
一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、またはレンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルス／レトロウイルスキメラベクター、単純ヘルペスウイルスＩもしくはＩＩベクター、パルボウイルスベクター、細網内皮症ウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、乳頭腫ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、または２つまたはそれよりも多くのウイルスベクターの好都合な側面が組み入れられた任意のハイブリッドもしくはキメラベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結した１つまたは複数の発現制御エレメントをさらに含む。一部の実施形態では、ベクターは、１つまたは複数の選択マーカーをさらに含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは低毒性を有する。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは宿主ゲノム内に組み入れられず、それにより、挿入変異誘発が引き起こされる確率が低くなる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、４．５ｋｂから４．７５ｋｂまでの範囲の総ポリヌクレオチドをコードし得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物、系、方法、およびキットのいずれかに使用することができる例示的なＡＡＶベクターとしては、ＡＡＶ１ベクター、改変ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、改変ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、改変ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ４ベクター、改変ＡＡＶ４ベクター、ＡＡＶ５ベクター、改変ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ６ベクター、改変ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、改変ＡＡＶ７ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ１０ベクター、改変ＡＡＶ．ｒｈ１０ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３ベクター、改変ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ４３ベクター、改変ＡＡＶ．ｒｈ４３ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１ベクター、および改変ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１ベクターおよび任意の組合せまたはその等価物を挙げることができる。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、インテグラーゼコンピテントレンチウイルスベクター（ＩＣＬＶ）である。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、導入遺伝子プラスミドベクターならびに関連するプラスミド（例えば、パッケージングプラスミド、ｒｅｖ発現プラスミド、エンベローププラスミド）と併せた導入遺伝子プラスミドベクターならびにウイルスまたはウイルス様侵入機構によって外因性核酸を細胞に導入することができるレンチウイルスに基づく粒子を指し得る。レンチウイルスベクターは、当技術分野で周知である（例えば、Trono  D.  (2002)  Lentiviral  vectors,  New  York:  Spring-Verlag  Berlin  HeidelbergおよびDurand    et  al.  (2011)  Viruses  3  (2):  132-159  doi:  10.3390/v3020132を参照されたい）。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物、系、方法、およびキットのいずれかに使用することができる例示的なレンチウイルスベクターとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１ベクター、改変ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１ベクター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）２ベクター、改変ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）２ベクター、スーティーマンガベイサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶＳＭ）ベクター、改変スーティーマンガベイサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶＳＭ）ベクター、アフリカミドリザルサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶＡＧＭ）ベクター、改変アフリカミドリザルサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶＡＧＭ）ベクター、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ベクター、改変ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ベクター、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ベクター、改変ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ベクター、ビスナ／マエディウイルス（ＶＮＶ／ＶＭＶ）ベクター、改変ビスナ／マエディウイルス（ＶＮＶ／ＶＭＶ）ベクター、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）ベクター、改変ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）ベクター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、または改変ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）を挙げることができる。
核酸
【０２９４】
本明細書に記載の遺伝子移入および発現技法における使用のための、本明細書に開示される融合タンパク質をコードする核酸配列が本明細書に提示される。必ずしも明記されていないが、本明細書に提示される配列を使用して、同じ生物学的性質を有するタンパク質を生じさせる発現産物ならびに実質的に同一の配列をもたらすことができることが理解されるべきである。これらの「生物学的に等価の」または「生物活性ある」または「等価の」ポリペプチドは、本明細書に記載の等価のポリヌクレオチドによってコードされる。これらは、デフォルトの条件下で実行される配列同一性方法を使用して比較した場合に、参照ポリペプチドに対して少なくとも６０％、あるいは少なくとも６５％、あるいは少なくとも７０％、あるいは少なくとも７５％、あるいは少なくとも８０％、あるいは少なくとも８５％、あるいは少なくとも９０％、あるいは少なくとも９５％あるいは少なくとも９８％同一の一次アミノ酸配列を有することができる。特定の実施形態の例として特定のポリペプチド配列が提示されている。同様の電荷を有する代替のアミノ酸を用いたアミノ酸への配列の改変。さらに、等価のポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドもしくはその相補物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドである、またはポリペプチドに関しては、参照コードポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。あるいは、等価のポリペプチドまたはタンパク質は、等価のポリヌクレオチドから発現されるものである。
【０２９５】
本明細書に開示される核酸配列（例えば、ポリヌクレオチド配列）は、当技術分野で周知の技法であるコドン最適化がなされたものであり得る。本明細書に開示される一部の実施形態では、例えば配列番号４６（Ｃａｓ１３ｄ）などの例示的なＣａｓ配列は、ヒト細胞における発現に関してコドン最適化されている。コドン最適化は、異なる細胞では特定のコドンの使用が異なるという事実を指す。このコドンの偏りは、細胞型における特定のｔＲＮＡの相対的な存在量の偏りに対応する。配列内のコドンを対応するｔＲＮＡの相対的な存在量と釣り合うように変更することにより、発現を増加させることが可能である。対応するｔＲＮＡが特定の細胞型において稀であることが分かっているコドンを故意に選択することによって発現を低減させることも可能である。哺乳動物細胞に関して、ならびに種々の他の生物体に関してコドン使用表が当技術分野で公知である。遺伝暗号に基づいて、例えばＣａｓタンパク質をコードする核酸配列を生成することができる。一部の実施形態では、そのような配列を、例えば、Ｃａｓタンパク質を発現する宿主細胞または開示されている方法が実施される細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞など）を使用するなど、宿主または標的細胞における発現に関して最適化する。特定の種についてのコドンの選好およびコドン使用表を使用して、その特定の種のコドン使用選好性（codon  usage  preference）を活用する、Ｃａｓタンパク質をコードする単離された核酸分子（例えば、その対応する野生型タンパク質に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％配列同一性を有するタンパク質をコードするものなど）を操作することができる。例えば、本明細書に開示されるＣａｓタンパク質を、目的の特定の生物体によって優先的に使用されるコドンを有するように設計することができる。一実施例では、Ｃａｓ核酸配列は、例えば、その対応する野生型または起源核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％配列同一性を有するものなど、ヒト細胞における発現に関して最適化されたものである。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣａｓタンパク質（ベクターの一部であり得る）をコードする単離された核酸分子は、真核細胞における発現に関してコドン最適化された少なくとも１つのＣａｓタンパク質コード配列、またはヒト細胞における発現に関してコドン最適化された少なくとも１つのＣａｓタンパク質コード配列を含む。一実施形態では、そのようなコドン最適化されたＣａｓコード配列は、その対応する野生型または起源配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％配列同一性を有する。別の実施形態では、真核細胞のコドン最適化された核酸配列は、その対応する野生型または起源タンパク質に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％配列同一性を有するＣａｓタンパク質をコードする。別の実施形態では、配列は異なるが同じＣａｓタンパク質配列をコードする核酸などの、機能的に等価の核酸を含有する種々のクローンを常套的に生成することができる。コード配列内のサイレント変異は、１つよりも多くのコドンが同じアミノ酸残基をコードし得る遺伝暗号の縮退（すなわち、重複性）に起因する。したがって、例えば、ロイシンはＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＴＡ、またはＴＴＧによってコードされ得る；セリンはＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、またはＡＧＣによってコードされ得る；アスパラギンはＡＡＴまたはＡＡＣによってコードされ得る；アスパラギン酸はＧＡＴまたはＧＡＣによってコードされ得る；システインはＴＧＴまたはＴＧＣによってコードされ得る；アラニンはＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、またはＧＣＧによってコードされ得る；グルタミンはＣＡＡまたはＣＡＧによってコードされ得る；チロシンはＴＡＴまたはＴＡＣによってコードされ得る；およびイソロイシンはＡＴＴ、ＡＴＣ、またはＡＴＡによってコードされ得る。標準の遺伝暗号を示す表は、種々の供給源に見いだすことができる（例えば、Stryer,  1988,  Biochemistry,3.sup.rd  Edition,  W.H.  5  Freeman  and  Co.,  NYを参照されたい）。
【０２９６】
「ハイブリダイゼーション」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対合、フーグスティーン結合、または任意の他の配列特異的様式で存在する。複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３つまたはそれよりも多くの鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断などのより広範囲にわたるプロセスのステップを構成し得る。
【０２９７】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、インキュベーション温度、約２５℃〜約３７℃；ハイブリダイゼーション緩衝液濃度、約６×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度、約０％〜約２５％；および洗浄溶液、約４×ＳＳＣ〜約８×ＳＳＣが挙げられる。中程度のハイブリダイゼーション条件の例としては、インキュベーション温度、約４０℃〜約５０℃；緩衝液濃度、約９×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度、約３０％〜約５０％；および洗浄溶液、約５×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣが挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、インキュベーション温度、約５５℃〜約６８℃；緩衝液濃度、約１×ＳＳＣ〜約０．１×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度、約５５％〜約７５％；および洗浄溶液、約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水が挙げられる。一般に、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は５分間から２４時間までであり、１回、２回、またはそれよりも多くの洗浄ステップを伴い、洗浄インキュベーション時間は、約１分間、２分間、または１５分間である。ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸緩衝液である。他の緩衝液系を使用したＳＳＣの等価物を使用することができることが理解される。
【０２９８】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較のためにアラインメントすることができる各配列内の位置を比較することによって決定することができる。比較される配列内の位置を同じ塩基またはアミノ酸が占めている場合、その分子は、その位置において相同である。配列間の相同性程度は、それらの配列が共有するマッチするまたは相同な位置の数に応じる。「関連しない」または「非相同的」配列は、本発明の配列の１つと４０％未満の同一性あるいは２５％未満の同一性を共有する。
細胞
【０２９９】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の細胞は、原核細胞である。
【０３００】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の細胞は、真核細胞である。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ウシ類、ネズミ類、ネコ類、ウマ類、ブタ類、イヌ類、サル類、またはヒトの細胞である。一部の実施形態では、細胞は、非ヒト霊長類細胞などの非ヒト哺乳動物細胞である。
【０３０１】
一部の実施形態では、本開示の細胞は、体細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、生殖細胞系列細胞である。一部の実施形態では、本開示の生殖細胞系列細胞は、ヒト細胞ではない。
【０３０２】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の細胞は、幹細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、胚性幹細胞である。一部の実施形態では、本開示の胚性幹細胞は、ヒト細胞ではない。一部の実施形態では、本開示の細胞は、複能性幹細胞または多能性幹細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、成体幹細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。
【０３０３】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、免疫細胞である。一部の実施形態では、本開示の免疫細胞は、リンパ球である。一部の実施形態では、本開示の免疫細胞は、Ｔリンパ球である（本明細書ではＴ細胞とも称される）。本開示の例示的なＴ細胞としては、これだけに限定されないが、ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびガンマデルタＴ細胞が挙げられる。一部の実施形態では、本開示の免疫細胞は、Ｂリンパ球である。一部の実施形態では、本開示の免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、本開示の免疫細胞は、抗原提示細胞である。
【０３０４】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、筋肉細胞である。一部の実施形態では、本開示の筋肉細胞は、筋芽細胞または筋細胞である。一部の実施形態では、本開示の筋肉細胞は、心筋細胞、骨格筋細胞または平滑筋細胞である。一部の実施形態では、本開示の筋肉細胞は、横紋筋細胞である。
【０３０５】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、上皮細胞である。一部の実施形態では、本開示の上皮細胞は、扁平上皮細胞、立方上皮細胞、円柱上皮細胞、重層上皮細胞、多列円柱上皮細胞または移行上皮細胞を形成する。一部の実施形態では、本開示の上皮細胞は、これだけに限定されないが、松果体、胸腺、下垂体、甲状腺、副腎、アポクリン腺、ホロクリン腺、部分分泌腺、漿液腺、粘液腺および脂腺を含めた腺を形成する。一部の実施形態では、本開示の上皮細胞は、これだけに限定されないが、肺、脾臓、胃、膵臓、膀胱、腸、腎臓、胆嚢、肝臓、喉頭または咽頭を含めた器官の外表面と接触している。一部の実施形態では、本開示の上皮細胞は、血管または静脈の外表面と接触している。
【０３０６】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、神経細胞である。一部の実施形態では、本開示の神経細胞は、中枢神経系のニューロンである。一部の実施形態では、本開示の神経細胞は、脳または脊髄のニューロンである。一部の実施形態では、本開示の神経細胞は、網膜のニューロンである。一部の実施形態では、本開示の神経細胞は、脳神経または視神経のニューロンである。一部の実施形態では、本開示の神経細胞は、末梢神経系のニューロンである。一部の実施形態では、本開示の神経細胞は、神経膠細胞またはグリア細胞である。一部の実施形態では、本開示のグリア細胞は、これだけに限定されないが、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、上衣細胞、およびミクログリアを含めた、中枢神経系のグリア細胞である。一部の実施形態では、本開示のグリア細胞は、これだけに限定されないが、シュワン細胞およびサテライト細胞を含めた、末梢神経系のグリア細胞である。
【０３０７】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、初代細胞である。
【０３０８】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、培養細胞である。
【０３０９】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕにある。
【０３１０】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、自家細胞または同種異系細胞である。
使用方法
【０３１１】
本開示は、本開示のＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現のレベルを改変する方法であって、組成物とＲＮＡ分子をガイドＲＮＡまたは融合タンパク質（またはその一部）の１つまたは複数がＲＮＡ分子に結合するのに適した条件下で接触させることを含む方法を提供する。
【０３１２】
本開示は、ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の活性を改変する方法であって、組成物とＲＮＡ分子をガイドＲＮＡまたは融合タンパク質（またはその一部）の１つまたは複数がＲＮＡ分子に結合するのに適した条件下で接触させることを含む方法を提供する。
【０３１３】
本開示は、本開示のＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現のレベルを改変する方法であって、組成物と、ＲＮＡ分子を含む細胞を、ガイドＲＮＡまたは融合タンパク質（またはその一部）の１つまたは複数がＲＮＡ分子に結合するのに適した条件下で接触させることを含む方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕにある。一部の実施形態では、組成物は、本開示のガイドＲＮＡおよび本開示の融合タンパク質を含む組成物を含むベクターを含む。一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶである。
【０３１４】
本開示は、ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の活性を改変する方法であって、組成物と、ＲＮＡ分子を含む細胞を、ガイドＲＮＡまたは融合タンパク質（またはその一部）の１つまたは複数がＲＮＡ分子に結合するのに適した条件下で接触させることを含む方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕにある。一部の実施形態では、組成物は、本開示のガイドＲＮＡまたは単一ガイドＲＮＡおよび本開示の融合タンパク質を含む組成物を含むベクターを含む。一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶである。
【０３１５】
本開示は、本開示のＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現のレベルを改変する方法であって、組成物とＲＮＡ分子をＲＮＡヌクレアーゼ活性に適した条件下で接触させることを含み、融合タンパク質によりＲＮＡ分子の破壊が誘導される、方法を提供する。
【０３１６】
本開示は、ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の活性を改変する方法であって、組成物とＲＮＡ分子をＲＮＡヌクレアーゼ活性に適した条件下で接触させることを含み、融合タンパク質によりＲＮＡ分子の破壊が誘導される、方法を提供する。
【０３１７】
本開示は、本開示のＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現のレベルを改変する方法であって、組成物と、ＲＮＡ分子を含む細胞を、ＲＮＡヌクレアーゼ活性に適した条件下で接触させることを含み、融合タンパク質によりＲＮＡ分子の破壊が誘導される、方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕにある。一部の実施形態では、組成物は、本開示のガイドＲＮＡおよび本開示の融合タンパク質を含む組成物を含むベクターを含む。一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶである。
【０３１８】
本開示は、ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の活性を改変する方法であって、組成物と、ＲＮＡ分子を含む細胞を、ＲＮＡヌクレアーゼ活性に適した条件下で接触させることを含み、融合タンパク質によりＲＮＡ分子の破壊が誘導される、方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕにある。一部の実施形態では、組成物は、本開示のガイドＲＮＡまたは単一ガイドＲＮＡおよび本開示の融合タンパク質を含む組成物を含むベクターを含む。一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶである。
【０３１９】
本開示は、疾患または障害を処置する方法であって、対象に本開示の組成物を治療有効量で投与することを含む方法を提供する。
【０３２０】
本開示は、疾患または障害を処置する方法であって、対象に本開示の組成物を治療有効量で投与することを含み、組成物が、本開示のガイドＲＮＡおよび本開示の融合タンパク質を含む組成物を含むベクターを含み、組成物により本開示のＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現のレベルが改変される、方法を提供する。
【０３２１】
本開示は、疾患または障害を処置する方法であって、対象に本開示の組成物を治療有効量で投与することを含み、組成物が、本開示のガイドＲＮＡおよび本開示の融合タンパク質を含む組成物を含むベクターを含み、組成物によりＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の活性が改変される、方法を提供する。
【０３２２】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の疾患または障害として、これだけに限定されないが、遺伝子疾患または障害が挙げられる。一部の実施形態では、遺伝子疾患または障害は、単一遺伝子疾患または障害である。一部の実施形態では、単一遺伝子疾患または障害は、常染色体優性疾患もしくは障害、常染色体劣性疾患もしくは障害、Ｘ染色体連鎖（Ｘ連鎖）疾患もしくは障害、Ｘ連鎖優性疾患もしくは障害、Ｘ連鎖劣性疾患もしくは障害、Ｙ連鎖疾患もしくは障害、またはミトコンドリア病もしくは障害である。一部の実施形態では、遺伝子疾患または障害は、多遺伝子疾患または障害である。一部の実施形態では、遺伝子疾患または障害は、多遺伝子疾患または障害である。一部の実施形態では、単一遺伝子疾患または障害は、これだけに限定されないが、ハンチントン病、神経線維腫症１型、神経線維腫症２型、マルファン症候群、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸がん、遺伝性多発性外骨腫症、フォン・ヴィルブランド病、および急性間欠性ポルフィリン症を含めた常染色体優性疾患または障害である。一部の実施形態では、単一遺伝子疾患または障害は、これだけに限定されないが、白皮症、中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症、嚢胞性線維症、鎌状赤血球症、テイ・サックス病、ニーマン・ピック病、脊髄性筋萎縮症、およびロバーツ症候群を含めた常染色体劣性疾患または障害である。一部の実施形態では、単一遺伝子疾患または障害は、これだけに限定されないが、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、血友病、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、レット症候群、および血友病Ａを含めたＸ連鎖疾患または障害である。一部の実施形態では、単一遺伝子疾患または障害は、これだけに限定されないが、レーベル遺伝性視神経症を含めたミトコンドリア障害である。
【０３２３】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の疾患または障害として、これだけに限定されないが、免疫疾患または障害が挙げられる。一部の実施形態では、免疫疾患または障害は、これだけに限定されないが、Ｂ細胞欠損症、Ｔ細胞欠損症、好中球減少症、無脾症、補体欠損症、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および医療介入に起因する免疫不全（医学的治療の故意の作用または有害作用としての免疫抑制）を含めた免疫不全症または障害である。一部の実施形態では、免疫疾患または障害は、これだけに限定されないが、アカラシア、アジソン病、成人スチル病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性蕁麻疹、軸索＆ニューロンニューロパチー（ＡＭＡＮ）、バロー病、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病（ＣＤ）、セリアック病、シャガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群（ＣＳＳ）もしくは好酸性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合性クリオグロブリン血症、エバンス症候群、線維筋痛症、線維化肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、妊娠性疱疹もしくは妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、化膿性汗腺炎（ＨＳ）（反対型ざ瘡）、低ガンマグロブリン血症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、間質性膀胱炎（ＩＣ）、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎（ＪＭ）、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス、ライム病  慢性、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）もしくはＭＭＮＣＢ、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、新生児ループス、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ（ＰＲ）、ＰＡＮＤＡＳ、傍腫瘍性小脳変性症（ＰＣＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルク症候群、毛様体扁平部炎（周辺部ぶどう膜炎）、パーソネージ・ターナー症候群、天疱瘡、末梢性ニューロパチー、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血（ＰＡ）、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、多腺性症候群Ｉ���、ＩＩ型、ＩＩＩ型、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球ろう（ＰＲＣＡ）、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、再発性多発性軟骨炎、レストレスレッグス症候群（ＲＬＳ）、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子精巣自己免疫、スティッフパーソン症候群（ＳＰＳ）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎（ＳＯ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群（ＴＨＳ）、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ぶどう膜炎、血管炎、白斑、フォークト・小柳・原田病、またはヴェグナー肉芽腫症を含めた自己免疫疾患または障害である。
【０３２４】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の疾患または障害として、これだけに限定されないが、炎症性疾患または障害が挙げられる。
【０３２５】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の疾患または障害として、これだけに限定されないが、代謝性疾患または障害が挙げられる。
【０３２６】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の疾患または障害として、これだけに限定されないが、変性または進行性疾患または障害が挙げられる。一部の実施形態では、変性または進行性疾患または障害として、これだけに限定されないが、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、および老化が挙げられる。
【０３２７】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の疾患または障害として、これだけに限定されないが、感染性疾患または障害が挙げられる。
【０３２８】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の疾患または障害として、これだけに限定されないが、小児もしくは発達疾患または障害が挙げられる。
【０３２９】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の疾患または障害として、これだけに限定されないが、循環器の疾患または障害が挙げられる。
【０３３０】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の疾患または障害として、これだけに限定されないが、増殖性疾患または障害が挙げられる。一部の実施形態では、増殖性疾患または障害は、がんである。一部の実施形態では、がんとして、これだけに限定されないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん、カポジ肉腫（軟部組織肉腫）、ＡＩＤＳ関連リンパ腫（リンパ腫）、ＣＮＳ原発リンパ腫（リンパ腫）、肛門がん、虫垂がん、消化管カルチノイド腫瘍、星状細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系（脳がん）、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん、ユーイング肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、脳腫瘍、乳がん、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、癌、心臓（Ｃａｒｄｉａｃ）（心臓（Ｈｅａｒｔ））腫瘍、胚芽腫、胚細胞性腫瘍、ＣＮＳ原発リンパ腫、子宮頸がん、胆管癌、脊索腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性新生物、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管癌、胚芽腫、子宮体がん（子宮がん）、上衣腫、食道がん、鼻腔神経芽細胞腫（頭頸部がん））、ユーイング肉腫（骨がん）、頭蓋外胚細胞性腫瘍、性腺外胚細胞性腫瘍、眼がん、小児期眼内黒色腫、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、卵管がん、骨の悪性線維性組織球腫、および骨肉腫、胆嚢がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）（軟部組織肉腫）、小児期消化管間質腫瘍、胚細胞性腫瘍、小児期頭蓋外胚細胞性腫瘍、性腺外胚細胞性腫瘍、卵巣胚細胞性腫瘍、精巣がん、妊娠性絨毛疾患、ヘアリー細胞白血病、頭頸部がん、心臓腫瘍、肝細胞（肝臓）がん、組織球増殖症、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん（頭頸部がん）、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍、膵臓神経内分泌腫瘍、カポジ肉腫（軟部組織肉腫）、腎臓（腎細胞）がん、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、喉頭がん（頭頸部がん）、白血病、口唇・口腔がん（頭頸部がん）、肝がん、肺がん（非小細胞および小細胞）、小児期肺がん、リンパ腫、男性乳がん、骨の悪性線維性組織球腫および骨肉腫、黒色腫、メルケル細胞癌（皮膚がん）、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部がん（頭頸部がん）、ＮＵＴ遺伝子の変化を伴う正中線癌、口のがん（Mouth  Cancer）（頭頸部がん）、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫（リンパ腫）、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物、鼻腔・副鼻腔がん（頭頸部がん）、鼻咽頭がん（頭頸部がん）、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口のがん（Oral  Cancer）、口唇・口腔がんおよび中咽頭がん、骨肉腫および骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、膵がん、膵臓神経内分泌腫瘍（膵島細胞腫瘍）、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん（頭頸部がん）、褐色細胞腫、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠期乳がん、中枢神経系（ＣＮＳ）原発リンパ腫、原発性腹膜がん、前立腺がん、直腸がん、再発性がん、腎細胞（腎臓）がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、小児期（軟部組織肉腫）、唾液腺がん（頭頸部が��）、肉腫、小児期横紋筋肉腫（軟部組織肉腫）、小児期血管腫瘍（軟部組織肉腫）、ユーイング肉腫（骨がん）、カポジ肉腫（軟部組織肉腫）、骨肉腫（骨がん）、子宮肉腫、セザリー症候群、リンパ腫、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、皮膚の扁平上皮癌、扁平上皮性頸部がん、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））がん、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、咽喉がん（頭頸部がん）、鼻咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、腎細胞がん、尿道がん、子宮肉腫、膣がん、血管腫瘍（軟部組織肉腫）、外陰がん、ウィルムス腫瘍ならびに他の小児期腎腫瘍が挙げられる。
【０３３１】
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、疾患または障害の診断を受けている。一部の実施形態では、本開示の対象は、疾患または障害の徴候または症状を少なくとも１つ示している。一部の実施形態では、対象は、疾患または障害が発生するリスクが予測されるバイオマーカーを有する。一部の実施形態では、バイオマーカーは、遺伝子変異である。
【０３３２】
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、女性である。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、男性である。一部の実施形態では、本開示の対象は、２つの染色体ＸＸまたはＸＹを有する。一部の実施形態では、本開示の対象は、２つの染色体ＸＸまたはＸＹおよび第３の染色体、ＸまたはＹのいずれかを有する。
【０３３３】
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、新生児、乳児、小児、成人、年配成人、または高齢成人である。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、少なくとも１日齢、２日齢、３日齢、４日齢、５日齢、６日齢、７日齢、８日齢、９日齢、１０日齢、１１日齢、１２日齢、１３日齢、１４日齢、１５日齢、１６日齢、１７日齢、１８日齢、１９日齢、２０日齢、２１日齢、２２日齢、２３日齢、２４日齢、２５日齢、２６日齢、２７日齢、２８日齢、２９日齢、３０日齢または３１日齢である。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、少なくとも１カ月齢、２カ月齢、３カ月齢、４カ月齢、５カ月齢、６カ月齢、７カ月齢、８カ月齢、９カ月齢、１０カ月齢、１１カ月齢または１２カ月齢である。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、少なくとも１歳、２歳、３歳、４歳、５歳、６歳、７歳、８歳、９歳、１０歳、１５歳、２０歳、２５歳、３０歳、３５歳、４０歳、４５歳、５０歳、５５歳、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳、９０歳、９５歳、１００歳またはその間の任意の年齢または部分年齢である。
【０３３４】
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、哺乳動物である。一部の実施形態では、本開示の対象は、非ヒト哺乳動物である。
【０３３５】
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、ヒトである。
【０３３６】
本開示の方法の一部の実施形態では、治療有効量は、単回用量の本開示の組成物を含む。一部の実施形態では、治療有効量は、少なくとも１用量の本開示の組成物を含む。一部の実施形態では、治療有効量は、１用量または複数用量の本開示の組成物を含む。
【０３３７】
本開示の方法の一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の徴候または症状を排除するものである。一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の徴候または症状の重症度を低下させるものである。
【０３３８】
本開示の方法の一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害を排除するものである。
【０３３９】
本開示の方法の一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の発症を防止するものである。一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の発症を遅延させるものである。一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の徴候または症状の重症度を低下させるものである。一部の実施形態では、治療有効量は、対象の予後を改善するものである。
【０３４０】
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に全身的に投与される。一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に静脈内経路によって投与される。一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に注射または注入によって投与される。
【０３４１】
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に局所的に投与される。一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に骨内、眼内、脳脊髄内または脊髄内経路によって投与される。一部の実施形態では、本開示の組成物は、中枢神経系の脳脊髄液に直接投与される。一部の実施形態では、本開示の組成物は、眼の組織または流体に直接投与され、眼構造の外側では生物学的利用能を有さない。一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に注射または注入によって投与される。
【０３４２】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡ結合性融合タンパク質を含む組成物を医薬組成物として製剤化する。簡単に述べると、本明細書に開示される使用のための医薬組成物は、必要に応じて免疫直交性でもある、融合タンパク質（複数可）または必要に応じてＡＡＶ内に含められた融合タンパク質（複数可）をコードするポリヌクレオチドを、１つまたは複数の薬学的にまたは生理的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。そのような組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含み得る。本開示の組成物は、経口投与、静脈内投与、局部投与、経腸投与、眼内投与、および／または非経口投与用に製剤化することができる。ある特定の実施形態では、本開示の組成物を静脈内投与用に製剤化する。
実施形態例：
【０３４３】
実施形態１．
（ａ）ＲＮＡ分子内の標的配列に特異的に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む配列と、
（ｂ）第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列と第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列とを含む、融合タンパク質をコードする配列と
を含む組成物であって、
第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドも第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドも有意なＤＮＡヌクレアーゼ活性を含まず、
第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドと第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドが同一ではなく、かつ
第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドが、ＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む、
組成物
または
第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドと第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む組成物であって、第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドが、ガイドされるＲＮＡ結合性ポリペプチドではなく、第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドと第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドが同一ではなく、かつ第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドが、ＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む、組成物。
実施形態２．標的配列が、少なくとも１つのリピート配列を含む、実施形態１に記載の組成物。
実施形態３．ｇＲＮＡを含む配列が、ｇＲＮＡを真核細胞において発現させることができるプロモーターを含む、実施形態１または２に記載の組成物。
実施形態４．真核細胞が、動物細胞である、実施形態３に記載の組成物。
実施形態５．動物細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態４に記載の組成物。
実施形態６．動物細胞が、ヒト細胞である、実施形態５に記載の組成物。
実施形態７．プロモーターが、構成的に活性なプロモーターである、実施形態１から６のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態８．プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの発現を駆動することができるプロモーターから単離されるまたはそれに由来する、実施形態１から７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態９．プロモーターが、Ｕ６プロモーターから単離されるまたはそれに由来する、実施形態８に記載の組成物。
実施形態１０．プロモーターが、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の発現を駆動することができるプロモーターから単離されるまたはそれに由来する、実施形態１から７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１１．プロモーターが、アラニンｔＲＮＡプロモーター、アルギニンｔＲＮＡプロモーター、アスパラギンｔＲＮＡプロモーター、アスパラギン酸ｔＲＮＡプロモーター、システインｔＲＮＡプロモーター、グルタミンｔＲＮＡプロモーター、グルタミン酸ｔＲＮＡプロモーター、グリシンｔＲＮＡプロモーター、ヒスチジンｔＲＮＡプロモーター、イソロイシンｔＲＮＡプロモーター、ロイシンｔＲＮＡプロモーター、リシンｔＲＮＡプロモーター、メチオニンｔＲＮＡプロモーター、フェニルアラニンｔＲＮＡプロモーター、プロリンｔＲＮＡプロモーター、セリンｔＲＮＡプロモーター、トレオニンｔＲＮＡプロモーター、トリプトファンｔＲＮＡプロモーター、チロシンｔＲＮＡプロモーター、またはバリンｔＲＮＡプロモーターから単離されるまたはそれに由来する、実施形態１０に記載の組成物。
実施形態１２．プロモーターが、バリンｔＲＮＡプロモーターから単離されるまたはそれに由来する、実施形態１０に記載の組成物。
実施形態１３．ｇＲＮＡを含む配列が、標的ＲＮＡ配列に特異的に結合するスペーサー配列を含む、実施形態１から１２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１４．スペーサー配列が、標的ＲＮＡ配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８７％、９０％、９５％、９７％、９９％またはその間の任意のパーセンテージの相補性を有する、実施形態１３に記載の組成物。
実施形態１５．スペーサー配列が、標的ＲＮＡ配列に対して１００％の相補性を有する、実施形態１３に記載の組成物。
実施形態１６．スペーサー配列が、２０ヌクレオチドを含むまたはそれからなる、実施形態１３から１５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１７．スペーサー配列が、２１ヌクレオチドを含むまたはそれからなる、実施形態１３から１５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１８．スペーサー配列が、配列
【化１４６】
2021526858.tif 000183
を含む、実施形態１７に記載の組成物。
実施形態１９．ｇＲＮＡを含む配列が、第１のＲＮＡ結合性タンパク質に特異的に結合する足場配列を含む、実施形態１から１８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２０．足場配列が、ステムループ構造を含む、実施形態１９に記載の組成物。
実施形態２１．足場配列が、９０ヌクレオチドを含むまたはそれからなる、実施形態１９または２０に記載の組成物。
実施形態２２．足場配列が、９３ヌクレオチドを含むまたはそれからなる、実施形態１９または２０に記載の組成物。
実施形態２３．足場配列が、配列
【化１４７】
2021526858.tif 000184
を含む、実施形態２２に記載の組成物。
実施形態２４．スペーサー配列が、配列
【化１４８】
2021526858.tif 000185
を含む、実施形態１６に記載の組成物。
実施形態２５．足場配列が、ステップ−ループ構造を含む、実施形態１９または２４に記載の組成物。
実施形態２６．足場配列が、８５ヌクレオチドを含むまたはそれからなる、実施形態２５に記載の組成物。
実施形態２７．足場配列が、配列
【化１４９】
2021526858.tif 000186
を含む、実施形態２６に記載の組成物。
実施形態２８．スペーサー配列が、配列ＣＵＧ（配列番号１８）、ＣＣＵＧ（配列番号１９）、ＣＡＧ（配列番号８０）、ＧＧＧＧＣＣ（配列番号８１）またはこれらの任意の組合せの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つのリピートの配列を含む、実施形態１６に記載の組成物。
実施形態２９．ｇＲＮＡを含む配列が、第１のＲＮＡ結合性タンパク質に特異的に結合する足場配列を含む、実施形態２８に記載の組成物。
実施形態３０．足場配列が、ステムループ構造を含む、実施形態２９に記載の組成物。
実施形態３１．足場配列が、９０ヌクレオチドを含むまたはそれからなる、実施形態２９または３０に記載の組成物。
実施形態３２．足場配列が、９３ヌクレオチドを含むまたはそれからなる、実施形態３０または３１に記載の組成物。
実施形態３３．足場配列が、配列
【化１５０】
2021526858.tif 000187
を含む、実施形態３２に記載の組成物。
実施形態３４．ｇＲＮＡが、ＲＮＡ分子内の第２の配列に結合しないまたは選択的には結合しない、実施形態１から３３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３５．ＲＮＡゲノムまたはＲＮＡトランスクリプトームが、ＲＮＡ分子を含む、実施形態３４に記載の組成物。
実施形態３６．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質を含む、実施形態１から３５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３７．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である、実施形態３６に記載の組成物。
実施形態３８．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合性部分を含む、実施形態３７に記載の組成物。
実施形態３９．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質が、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である、実施形態３６に記載の組成物。
実施形態４０．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、Ｃｐｆ１ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合性部分を含む、実施形態３９に記載の組成物。
実施形態４１．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質が、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である、実施形態３６に記載の組成物。
実施形態４２．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、Ｃａｓ１３ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合性部分を含む、実施形態４１に記載の組成物。
実施形態４３．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質が、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む、実施形態３６から４２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態４４．ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性が低下しているまたは阻害されている、実施形態４３に記載の組成物。
実施形態４５．ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性が増加しているまたは誘導されている、実施形態４３に記載の組成物。
実施形態４６．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質が、ネイティブなＤＮＡヌクレアーゼ活性を含み、ネイティブなＤＮＡヌクレアーゼ活性が阻害されている、実施形態３６から４５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態４７．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質が変異を含む、実施形態４６に記載の組成物。
実施形態４８．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメインが、変異を含む、実施形態４７に記載の組成物。
実施形態４９．変異が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質をコードする核酸に存在する、実施形態４７に記載の組成物。
実施形態５０．変異が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質をコードするアミノ酸に存在する、実施形態４７に記載の組成物。
実施形態５１．変異が、置換、挿入、欠失、フレームシフト、逆位、または転位を含む、実施形態４７から５０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５２．変異が、ヌクレアーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン内の結合性部位、ヌクレアーゼドメイン内の活性部位、またはヌクレアーゼドメイン内の少なくとも１つの必須アミノ酸残基の欠失を含む、実施形態４７から５０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５３．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＰｕｍｉｌｉｏおよびＦＢＦ（ＰＵＦ）タンパク質を含む、実施形態１から３５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５４．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、Ｐｕｍｉｌｉｏに基づくアセンブリ（ＰＵＭＢＹ）タンパク質を含む、実施形態５３に記載の組成物。
実施形態５５．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＲＮＡ結合活性のために多量体形成を必要としない、実施形態１から５４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５６．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、多量体複合体の単量体ではない、実施形態５５に記載の組成物。
実施形態５７．多量体タンパク質複合体が、第１のＲＮＡ結合性タンパク質を含まない、実施形態５５に記載の組成物。
実施形態５８．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＲＮＡ分子内の標的配列に選択的に結合する、実施形態１から５７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５９．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＲＮＡ分子内の第２の配列に対する親和性を含まない、実施形態５８に記載の組成物。
実施形態６０．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＲＮＡ分子内の第２の配列に対して高い親和性を含まずそれに選択的に結合しない、実施形態５８または５９に記載の組成物。
実施形態６１．ＲＮＡゲノムまたはＲＮＡトランスクリプトームが、ＲＮＡ分子を含む、実施形態６０に記載の組成物。
実施形態６２．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、終点を含めて、２アミノ酸から１３００アミノ酸の間を含む、実施形態１から６１のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態６３．第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列をさらに含む、実施形態１から６２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態６４．核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列が、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列に対して３’側に位置する、実施形態６３に記載の組成物。
実施形態６５．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、Ｃ末端にＮＬＳを含む、実施形態６４に記載の組成物。
実施形態６６．第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列が、第１のＮＬＳをコードする第１の配列および第２のＮＬＳをコードする第２の配列をさらに含む、実施形態１から６２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態６７．第１のＮＬＳをコードする配列または第２のＮＬＳをコードする配列が、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列に対して３’側に位置する、実施形態６６に記載の組成物。
実施形態６８．第１のＲＮＡ結合性タンパク質が、Ｃ末端に第１のＮＬＳまたは第２のＮＬＳを含む、実施形態６７に記載の組成物。
実施形態６９．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる、実施形態１から６８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態７０．第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列が、ＲＮＡｓｅを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態７１．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＲＮＡｓｅ１を含むまたはそれからなる、実施形態７０に記載の組成物。
実施形態７２．ＲＮＡｓｅ１タンパク質が、配列番号２０を含むまたはそれからなる、実施形態７１に記載の組成物。
実施形態７３．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＲＮＡｓｅ４を含むまたはそれからなる、実施形態７２に記載の組成物。
実施形態７４．ＲＮＡｓｅ４タンパク質が、（配列番号２１を含むまたはそれからなる、実施形態７３に記載の組成物。
実施形態７５．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＲＮＡｓｅ６を含むまたはそれからなる、実施形態７０に記載の組成物。
実施形態７６．ＲＮＡｓｅ６タンパク質が、配列番号２２を含むまたはそれからなる、実施形態７５に記載の組成物。
実施形態７７．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＲＮＡｓｅ７を含むまたはそれからなる、実施形態７０に記載の組成物。
実施形態７８．ＲＮＡｓｅ７タンパク質が、配列番号２３を含むまたはそれからなる、実施形態７７に記載の組成物。
実施形態７９．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＲＮＡｓｅ８を含むまたはそれからなる、実施形態７０に記載の組成物。
実施形態８０．ＲＮＡｓｅ８タンパク質が、配列番号２４を含むまたはそれからなる、実施形態７９に記載の組成物。
実施形態８１．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＲＮＡｓｅ２を含むまたはそれからなる、実施形態７０に記載の組成物。
実施形態８２．ＲＮＡｓｅ２タンパク質が、配列番号２５を含むまたはそれからなる、実施形態８１に記載の組成物。
実施形態８３．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＲＮＡｓｅ６ＰＬを含むまたはそれからなる、実施形態７０に記載の組成物。
実施形態８４．ＲＮＡｓｅ６ＰＬタンパク質が、配列番号２６を含むまたはそれからなる、実施形態８３に記載の組成物。
実施形態８５．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＲＮＡｓｅＬを含むまたはそれからなる、実施形態７０に記載の組成物。
実施形態８６．ＲＮＡｓｅＬタンパク質が、配列番号２７を含むまたはそれからなる、実施形態８５に記載の組成物。
実施形態８７．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＲＮＡｓｅＴ２を含むまたはそれからなる、実施形態７０に記載の組成物。
実施形態８８．ＲＮＡｓｅＴ２タンパク質が、配列番号２８を含むまたはそれからなる、実施形態８７に記載の組成物。
実施形態８９．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＲＮＡｓｅ１１を含むまたはそれからなる、実施形態７０に記載の組成物。
実施形態９０．ＲＮＡｓｅ１１が、配列番号２９を含むまたはそれからなる、実施形態８９に記載の組成物。
実施形態９１．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＲＮＡｓｅＴ２様を含むまたはそれからなる、実施形態７０に記載の組成物。
実施形態９２．ＲＮＡｓｅＴ２様タンパク質が、配列番号３０を含むまたはそれからなる、実施形態９１に記載の組成物。
実施形態９３．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＮＯＢ１ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態９４．ＮＯＢ１ポリペプチドが、配列番号３１を含むまたはそれからなる、実施形態９３に記載の組成物。
実施形態９５．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、エンドヌクレアーゼを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態９６．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、エンドヌクレアーゼＶ（ＥＮＤＯＶ）を含むまたはそれからなる、実施形態９５に記載の組成物。
実施形態９７．ＥＮＤＯＶタンパク質が、配列番号３２を含むまたはそれからなる、実施形態９６に記載の組成物。
実施形態９８．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、エンドヌクレアーゼＧ（ＥＮＤＯＧ）を含むまたはそれからなる、実施形態９５に記載の組成物。
実施形態９９．ＥＮＤＯＧタンパク質が、配列番号３３を含むまたはそれからなる、実施形態９８に記載の組成物。
実施形態１００．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、エンドヌクレアーゼＤ１（ＥＮＤＯＤ１）を含むまたはそれからなる、実施形態９５に記載の組成物。
実施形態１０１．ＥＮＤＯＤ１タンパク質が、配列番号３４を含むまたはそれからなる、実施形態１００に記載の組成物。
実施形態１０２．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ヒトフラップエンドヌクレアーゼ−１（ｈＦＥＮ１）を含むまたはそれからなる、実施形態９５に記載の組成物。
実施形態１０３．ｈＦＥＮ１タンパク質が、配列番号３５を含むまたはそれからなる、実施形態１０２に記載の組成物。
実施形態１０４．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ヒトＳｃｈｌａｆｅｎ１４（ｈＳＬＦＮ１４）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１０５．ｈＳＬＦＮ１４ポリペプチドが、配列番号３６を含むまたはそれからなる、実施形態１０４に記載の組成物。
実施形態１０６．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ヒトベータ−ラクタマーゼ様タンパク質２（ｈＬＡＣＴＢ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１０７．ｈＬＡＣＴＢ２ポリペプチドが、配列番号３７を含むまたはそれからなる、実施形態１０６に記載の組成物。
実施形態１０８．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）エンドデオキシリボヌクレアーゼ（ＡＰＥＸ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１０９．ＡＰＥＸ２ポリペプチドが、配列番号３８を含むまたはそれからなる、実施形態１０８に記載の組成物。
実施形態１１０．ＡＰＥＸ２ポリペプチドが、配列番号３９を含むまたはそれからなる、実施形態１０８に記載の組成物。
実施形態１１１．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、アンジオゲニン（ＡＮＧ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１１２．ＡＮＧポリペプチドが、配列番号４０を含むまたはそれからなる、実施形態１１１に記載の組成物。
実施形態１１３．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、熱応答性タンパク質１２（ＨＲＳＰ１２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１１４．ＨＲＳＰ１２ポリペプチドが、配列番号４１を含むまたはそれからなる、実施形態１１３に記載の組成物。
実施形態１１５．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ジンクフィンガーＣＣＣＨ型含有１２Ａ（ＺＣ３Ｈ１２Ａ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１１６．ＺＣ３Ｈ１２Ａポリペプチドが、配列番号４２を含むまたはそれからなる、実施形態１１５に記載の組成物。
実施形態１１７．ＺＣ３Ｈ１２Ａポリペプチドが、配列番号４３を含むまたはそれからなる、実施形態１１５に記載の組成物。
実施形態１１８．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、反応性中間体イミンデアミナーゼＡ（ＲＩＤＡ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１１９．ＲＩＤＡポリペプチドが、配列番号４４を含むまたはそれからなる、実施形態１１８に記載の組成物。
実施形態１２０．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ホスホリパーゼＤファミリーメンバー６（ＰＤＬ６）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１２１．ＰＤＬ６ポリペプチドが、（配列番号１２６を含むまたはそれからなる、実施形態１２０に記載の組成物。
実施形態１２２．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、エンドヌクレアーゼＩＩＩ様タンパク質１（ＮＴＨＬ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１２３．ＮＴＨＬポリペプチドが、配列番号１２３を含むまたはそれからなる、実施形態１２２に記載の組成物。
実施形態１２４．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ミトコンドリアリボヌクレアーゼＰ触媒サブユニット（ＫＩＡＡ０３９１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１２５．ＫＩＡＡ０３９１ポリペプチドが、配列番号１２７を含むまたはそれからなる、実施形態１２４に記載の組成物。
実施形態１２６．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、脱プリンまたは脱ピリミジン部位リアーゼ（ＡＰＥＸ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１２７．ＡＰＥＸ１ポリペプチドが、配列番号１２５を含むまたはそれからなる、実施形態１２６に記載の組成物。
実施形態１２８．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、アルゴノート２（ＡＧＯ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１２９．ＡＧＯ２ポリペプチドが、配列番号１２８を含むまたはそれからなる、実施形態１２８に記載の組成物。
実施形態１３０．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ミトコンドリアヌクレアーゼＥＸＯＧ（ＥＸＯＧ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１３１．ＥＸＯＧポリペプチドが、配列番号１２９を含むまたはそれからなる、実施形態１３０に記載の組成物。
実施形態１３２．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ジンクフィンガーＣＣＣＨ型含有１２Ｄ（ＺＣ３Ｈ１２Ｄ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１３３．ＺＣ３Ｈ１２Ｄポリペプチドが、配列番号１３０を含むまたはそれからなる、実施形態１３２に記載の組成物。
実施形態１３４．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、小胞体から核へのシグナル伝達２（ＥＲＮ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１３５．ＥＲＮ２ポリペプチドが、配列番号１３１を含むまたはそれからなる、実施形態１３４に記載の組成物。
実施形態１３６．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ぺロタｍＲＮＡサーベイランスおよびリボソームレスキュー因子（ＰＥＬＯ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１３７．ＰＥＬＯポリペプチドが、配列番号１３２を含むまたはそれからなる、実施形態１３６に記載の組成物。
実施形態１３８．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＹＢＥＹメタロペプチダーゼ（ＹＢＥＹ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１３９．ＹＢＥＹポリペプチドが、配列番号１３３を含むまたはそれからなる、実施形態１３８に記載の組成物。
実施形態１４０．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、切断およびポリアデニル化特異的因子４様（ＣＰＳＦ４Ｌ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１４１．ＣＰＳＦ４Ｌが、配列番号１３４を含むまたはそれからなる、実施形態１４０に記載の組成物。
実施形態１４２．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ｈＣＧ＿２００２７３１ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１４３．ｈＣＧ＿２００２７３１ポリペプチドが、配列番号１３５を含むまたはそれからなる、実施形態１４２に記載の組成物。
実施形態１４４．ｈＣＧ＿２００２７３１ポリペプチドが、配列番号１３６を含むまたはそれからなる、実施形態１４２に記載の組成物。
実施形態１４５．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、除去修復交差相補群１（ＥＲＣＣ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１４６．ＥＲＣＣ１ポリペプチドが、配列番号１３７を含むまたはそれからなる、実施形態１４５に記載の組成物。
実施形態１４７．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質１アイソフォーム（ＲＡＣ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１４８．ＲＡＣ１ポリペプチドが、配列番号１３８を含むまたはそれからなる、実施形態１４７に記載の組成物。
実施形態１４９．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、リボヌクレアーゼＡＡ１（ＲＡＡ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１５０．ＲＡＡ１ポリペプチドが、配列番号１３９を含むまたはそれからなる、実施形態１４９に記載の組成物。
実施形態１５１．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、Ｒａｓ関連タンパク質（ＲＡＢ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１５２．ＲＡＢ１ポリペプチドが、配列番号１４０を含むまたはそれからなる、実施形態１５１に記載の組成物。
実施形態１５３．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＤＮＡ複製ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ２（ＤＮＡ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１５４．ＤＮＡ２ポリペプチドが、配列番号１４１を含むまたはそれからなる、実施形態１５３に記載の組成物。
実施形態１５５．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＦＬＪ３５２２０ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１５６．ＦＬＪ３５２２０ポリペプチドが、配列番号１４２を含むまたはそれからなる、実施形態１５５に記載の組成物。
実施形態１５７．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＦＬＪ１３１７３ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１５８．ＦＬＪ１３１７３ポリペプチドが、（配列番号１４３を含むまたはそれからなる、実施形態１５７に記載の組成物。
実施形態１５９．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、ＤＮＡ修復エンドヌクレアーゼＸＰＦ（ＥＲＣＣ４）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１６０．ＥＲＣＣ４ポリペプチドが、配列番号６４を含むまたはそれからなる、実施形態１５９に記載の組成物。
実施形態１６１．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１６２．Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ）ポリペプチドが、配列番号１１６を含むまたはそれからなる、実施形態１６１に記載の組成物。
実施形態１６３．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１６４．Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ））ポリペプチドが、配列番号１１７を含むまたはそれからなる、実施形態１６３に記載の組成物。
実施形態１６５．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１６６．Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドが、配列番号１１８を含むまたはそれからなる、実施形態１６５に記載の組成物。
実施形態１６７．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１６８．Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドが、配列番号１１９を含むまたはそれからなる、実施形態１６７に記載の組成物。
実施形態１６９．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１７０．Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドが、配列番号１２０を含むまたはそれからなる、実施形態１６９に記載の組成物。
実施形態１７１．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１７２．Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ、Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ））ポリペプチドが、配列番号１２１を含むまたはそれからなる、実施形態１７１に記載の組成物。
実施形態１７３．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、変異型Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１７４．Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ））ポリペプチドが、配列番号１２２を含むまたはそれからなる、実施形態１７３に記載の組成物。
実施形態１７５．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、テニューリン膜貫通タンパク質１（ＴＥＮＭ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１７６．ＴＥＮＭ１ポリペプチドが、配列番号１４４を含むまたはそれからなる、実施形態１７５に記載の組成物。
実施形態１７７．第２のＲＮＡ結合性タンパク質が、テニューリン膜貫通タンパク質２（ＴＥＮＭ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる、実施形態６９に記載の組成物。
実施形態１７８．ＴＥＮＭ２ポリペプチドが、配列番号１４５を含むまたはそれからなる、実施形態１７７に記載の組成物。
実施形態１７９．（ａ）第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列またはその一部と、（ｂ）第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列とを含む標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質をコードする配列を含む組成物であって、第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドが、ｇＲＮＡ配列によってガイドされていない標的ＲＮＡに結合し、第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドが、ＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む、組成物。
実施形態１８０．第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドまたはその一部が、ＰＵＦ、ＰＵＭＢＹ、またはＰＰＲポリペプチド、またはその一部である、実施形態１７９に記載の組成物。
実施形態１８１．ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現のレベルを改変するための方法であって、実施形態１または１７９に記載の組成物とＲＮＡ分子を、融合タンパク質またはその一部のＲＮＡ分子への結合に適した条件下で接触させることを含む方法。
【実施例】
【０３４４】
（実施例１）
方法
ＨＥＫ−２９３細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を伴うＤＭＥＭ中で培養し、９０％〜１００％の集密度で継代した。細胞を、ＲＮＡ単離のために２４ウェルプレートのウェル当たり細胞１×１０５個で播種したか、またはルシフェラーゼアッセイのために９６ウェルプレートのウェル当たり細胞０．５×１０５個で播種した。ＲＮＡ単離を、ＲＮＡｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造者のプロトコールに従って行った。Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用してＲＮＡの質および濃度を推定した。ｃＤＮＡ調製を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用しランダムプライマーを用いて製造者のプロトコールに従って行った。ｑＰＣＲを、レポータープラスミド内のＣＴＧリピートに隣接する配列内のプライマーを用い、以下のプライマーを使用して行った：
【表５−１】
2021526858.tif 000188
【表５−２】
2021526858.tif 000189
【０３４５】
ＣＴＧリピートレポーターの相対的な存在量をＧＡＰＤＨに対する正規化によって決定した。次に、ＣＴＧ標的化ｓｇＲＮＡのレベルを非標的化ｓｇＲＮＡに対して正規化して、付随するデータパッケージに報告される最終的な値を生成した。
【表６】
2021526858.tif 000190
【０３４６】
ルシフェラーゼアッセイを、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅキットを用いて製造者の指示に従って行った。報告された値は、ホタルルシフェラーゼ発光の読み取りとウミシイタケルシフェラーゼ発光の読み取りの比である。
（実施例２）
反復ＲＮＡ分子およびｍＲＮＡ分子のＲＮＡによりガイドされる切断
【０３４７】
実験計画：アノテートされたＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するヒトタンパク質とＣａｓ９（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）との種々の融合物を構築した。上記の融合物をコードするプラスミドを、リピート含有プラスミドまたはルシフェラーゼアッセイプラスミド（ルシフェラーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列を含む）のいずれかと共トランスフェクトした。ＣＴＧリピート含有ＲＮＡのレベルを、ＲＮＡエンドヌクレアーゼ／Ｃａｓ９融合物を反復ＲＮＡと共トランスフェクトした条件下でｑＰＣＲを用いて測定した。ルシフェラーゼタンパク質のレベルを、ＲＮＡエンドヌクレアーゼ／Ｃａｓ９融合物をルシフェラーゼアッセイプラスミドと共トランスフェクトした条件下で発光アッセイを使用して測定した。全ての測定値を非標的化ｓｇＲＮＡ対照構築物に対して正規化した（図３Ａ〜５および図９）。
（実施例３）
ウイルスＲＮＡ分子のＲＮＡによりガイドされる切断
【０３４８】
Ａ５４９細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を伴うＤＭＥＭ中で培養し、９０％〜１００％の集密度で継代した。細胞を、ＲＮＡ単離のために２４ウェルプレートのウェル当たり細胞１×１０５個で播種したか、またはウェル当たり細胞０．５×１０５個で播種した。細胞に、遺伝子ＮＴＨＬ１（残基３１〜３１２、Ｅ４３）またはＣＰＳＦ４Ｌ（全長、Ｅ６７）と融合したＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  Ｃａｓ９（ＣｊｅＣａｓ９）をコードするプラスミドをＺｉｋａ  ＮＳ５  ＲＮＡ内の４つの部位のうちの１つをコードするプラスミドと共にトランスフェクトした。ＣｊｅＣａｓ９はＥＦＳプロモーターによって駆動し、一方、ガイドＲＮＡはＵ６プロモーターによって駆動した。ｓｇＲＮＡの配列を表１に示す。この試験に使用した構築物の配列を以下に提示する。
【０３４９】
ＲＮＡ単離を、ＲＮＡｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造者のプロトコールに従って行った。Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用してＲＮＡの質および濃度を推定した。ｃＤＮＡ調製を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用し、ランダムプライマーを用いて製造者のプロトコールに従って行った。ｑＰＣＲを以下の表２に列挙されているプライマーを用いて行った。
【０３５０】
図７は、Ｅ４３エンドヌクレアーゼおよびＥ６７エンドヌクレアーゼの両方の存在下で、表２に示されている種々のＮＳ５標的化スペーサー配列を含有するｓｇＲＮＡを用いて評価したＺｉｋａ  ＮＳ５の発現レベルを示す。Ｚｉｋａ  ＮＳ５発現が、対照（ラムダ）スペーサー配列を含有するｓｇＲＮＡが負荷されたエンドヌクレアーゼと比べた倍率変化として示されている。
【０３５１】
免疫蛍光顕微鏡法を使用して、ＣｊｅＣａｓ９と融合したＥ４３またはＥ６７エンドヌクレアーゼの存在下でのＺｉｋａ  ＮＳ５発現を可視化した。図８Ａは、Ｚｉｋａ  ＮＳ５標的化スペーサー配列を含有するｓｇＲＮＡを負荷したＣｊｅＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合物をトランスフェクトした細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。Ｚｉｋａ  ＮＳ５の発現は、適当なＺｉｋａ  ＮＳ５標的化ｓｇＲＮＡを負荷したＣｊｅＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合物の存在下では、非Ｚｉｋａ  ＮＳ５標的化ｓｇＲＮＡを負荷したＣｊｅＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合物と比較して著しく低減した（図８Ａおよび８Ｂ）。図６は、本開示の組成物に使用するための例示的なエンドヌクレアーゼの一覧である。
【０３５２】
【表１−１】
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【表１−２】
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【０３５３】
【表２】
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【０３５４】
Ｅ４３−ＣｊｅＣａｓ９およびｓｇＲＮＡプラスミドは、以下の配列を含み得るまたはそれからなり得る（Ｕ６：Ｎ＝ｓｇＲＮＡスペーサー、Ｅ４３、ＣｊｅＣａｓ９）：
【化１５１−１】
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【化１５１−２】
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【化１５１−３】
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【０３５５】
Ｅ６７−ＣｊｅＣａｓ９およびｓｇＲＮＡプラスミドは、以下の配列を含み得るまたはそれからなり得る（Ｕ６：Ｎ＝ｓｇＲＮＡスペーサー、Ｅ６７、ＣｊｅＣａｓ９）：
【化１５２−１】
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【化１５２−２】
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【化１５２−３】
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参照による組込み
【０３５６】
あらゆる相互参照されるまたは関連する特許または出願を含めた、本明細書において引用されているあらゆる文書は、明白に排除されるまたは他のやり方で限定される場合を除き、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。いずれの文書の引用も、それが本明細書に開示されるもしくは具体化されるあらゆる発明に対して先行技術であること、または、単独で、もしくは任意の他の参考文献（複数可）との任意の組合せで、あらゆるそのような発明を教示、示唆もしくは開示するものであることを認めるものではない。さらに、本文書における用語のいずれかの意味または定義が参照により組み込まれる文書における同じ用語のいずれかの意味または定義と矛盾する範囲では、本文書におけるその用語に割り当てられた意味または定義が支配するものとする。
他の実施形態
【０３５７】
本開示の特定の実施形態を例示し、記載したが、種々の他の変化および改変を本開示の主旨および範囲から逸脱することなく行うことができる。添付の特許請求の範囲は、本開示の範囲内に入るそのような変化および改変の全てを包含する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年3月10日(2021.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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