(57)【要約】本発明は、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）タンパク質に結合するモノクローナル抗体、ならびにそれらの使用方法を提供する。本発明の様々な実施形態では、抗体は、ＦＸＩＩおよび活性化形態のＦＸＩＩ（ＦＸＩＩａ）に結合する完全ヒト抗体である。一部の実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸＩＩ活性を阻害または中和するのに有用であり、したがって、ヒトの血栓症に関連する疾患、障害または状態を治療または予防する手段を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）に特異的に結合するその抗原結合断片の抗体であって、以下の特徴：
（ａ）完全ヒトモノクローナル抗体である、
（ｂ）活性化第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）に結合する、
（ｃ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定した場合、２５℃において、３．５ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で、ＦＸＩＩに結合する、
（ｄ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定した場合、３７℃において、１７ｎＭ未満のＫＤで、ＦＸＩＩに結合する、
（ｅ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定した場合、２５℃において、５ｎＭ未満、好ましくは２．５ｎＭ未満のＫＤで、ＦＸＩＩａに結合する、
（ｆ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定した場合、３７℃において、６．５ｎＭ未満、好ましくは２．５ｎＭ未満のＫＤで、ＦＸＩＩａに結合する、
（ｇ）機能的血漿アッセイによって測定した場合、２５０ｎＭ未満の濃度で、内因性経路によるトロンビン生成を遮断する、および
（ｈ）機能的血漿アッセイによって測定した場合、外因性経路によるトロンビン生成を遮断することなく、内因性経路によるトロンビン生成を遮断する、のうちの１つ以上を有する、抗体。
【請求項２】
前記抗体または抗原結合断片が、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）とを含み、前記ＨＣＶＲが、表１に列挙されたＨＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３】
表１に列挙されたＬＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
（ａ）配列番号４、２０、３６、および５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメインと、
（ｂ）配列番号６、２２、３８、および５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメインと、
（ｃ）配列番号８、２４、４０、および５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメインと、
（ｄ）配列番号１２、２８、４４、および６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメインと、
（ｅ）配列番号１４、３０、４６、および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメインと、
（ｆ）配列番号１６、３２、４８、および６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメインと、を含む、請求項２または３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
（ａ）配列番号４、６、８、１２、１４、および１６、（ｂ）配列番号２０、２２、２４、２８、３０、および３２、（ｃ）配列番号３６、３８、４０、４４、４６、および４８、ならびに（ｄ）配列番号５２、５４、５６、６０、６２、および６４、からなる群から選択されるＣＤＲを含む、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、および５０／５８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａに結合する抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその抗原結合断片が、ＨＣＶＲ内に含まれる３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、ＬＣＶＲ内に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）と、を含み、前記ＨＣＶＲが、
（ｉ）配列番号２、１８、３４、および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号２、１８、３４、および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号２、１８、３４、および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｉｖ）配列番号２、１８、３４、および５０からなる群から選択され、１２個以下のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列、を含み、
前記ＬＣＶＲが、
（ｉ）配列番号１０、２６、４２、および５８からなる群から選択されるアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号１０、２６、４２、および５８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号１０、２６、４２、および５８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｉｖ）配列番号１０、２６、４２、および５８からなる群から選択され、１０個以下のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列、を含む、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
配列番号２、１８、３４、および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
配列番号１０、２６、４２、および５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
配列番号２、１８、３４、および５０からなる群から選択されるＨＣＶＲ内に含まれる３つのＣＤＲと、配列番号１０、２６、４２、および５８からなる群から選択されるＬＣＶＲ内に含まれる３つのＣＤＲと、を含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、および５０／５８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１２】
（ａ）配列番号４、２０、３６、および５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメインと、
（ｂ）配列番号６、２２、３８、および５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメインと、
（ｃ）配列番号８、２４、４０、および５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメインと、
（ｄ）配列番号１２、２８、４４、および６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメインと、
（ｅ）配列番号１４、３０、４６、および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメインと、
（ｆ）配列番号１６、３２、４８、および６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメインと、を含む、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
（ａ）配列番号４、６、８、１２、１４、および１６、（ｂ）配列番号２０、２２、２４、２８、３０、および３２、（ｃ）配列番号３６、３８、４０、４４、４６、および４８、ならびに（ｄ）配列番号５２、５４、５６、６０、６２、および６４、からなる群から選択されるＣＤＲを含む、請求項１２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
配列番号２、１８、３４、および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
配列番号１０、２６、４２、および５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１６】
配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、および５０／５８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１７】
第ＸＩＩ因子への結合に対して、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と競合する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と同じエピトープに結合する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１９】
配列番号２、１８、３４、および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲの３つのＣＤＲと、配列番号１０、２６、４２、および５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲの３つのＣＤＲと、を含む、第ＸＩＩ因子のＦＸＩＩａおよびＦＸＩＩｂに対する切断を遮断する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体または希釈剤と、を含む、医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗体のＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２２】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗体のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載のポリヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載のベクターを発現する、宿主細胞。
【請求項２５】
抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体またはその抗原結合断片を産生する方法であって、前記抗体または断片の産生を可能にする条件下で、請求項２４に記載の宿主細胞を増殖させることと、そのように産生された前記抗体または断片を回収することと、を含む、方法。
【請求項２６】
許容される担体を含む医薬組成物として、前記抗体またはその抗原結合断片を製剤化することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
血栓の形成を予防する、または血栓形成のリスクがある対象を治療する方法であって、治療上有効量の請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項２８】
前記対象が、静脈血栓症、動脈血栓症、デバイス血栓症、血栓栓塞栓症、遺伝性血管浮腫、脳卒中、血栓性素因、心虚血、アテローム硬化性プラーク破裂、機械弁プロステーシスの使用、血液接触医療デバイスの使用、血液接触体外回路の使用、静脈血栓塞栓症、肺塞栓症、深部静脈血栓症、門脈血栓症、バッド・キアリ症候群、パジェット・シュレッター病、腎静脈血栓症、脳静脈洞血栓症、頸静脈血栓症、海綿静脈洞血栓症、肝動脈血栓症、下肢虚血、および心筋梗塞からなる群から選択される疾患、障害または状態を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記医薬組成物が、それを必要とする前記対象に、予防的または治療的に投与される、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記医薬組成物が、第２の治療剤と組み合わせて投与される、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２の治療剤が、抗凝固剤、直接トロンビン阻害剤、血栓溶解性薬、線維素溶解薬、抗血小板薬、抗炎症薬、降圧薬、第２の抗ＦＸＩＩ抗体、脂質低下薬、機械的血餅回収、カテーテル誘導血栓溶解、弾性ストッキング、および手術からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記医薬組成物が、皮下、静脈内、皮膚内、腹腔内、または筋肉内に投与される、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本発明は、２０１８年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／６８７，１４４号に対する優先権の利益を主張し、そのすべての内容が、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が、参照により本明細書に援用される。２０１９年６月１８日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、名称が１０４６３ＷＯ０１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズが２６，２８８バイトである。
【０００３】
本発明は、凝固因子ＸＩＩに特異的に結合する抗体および抗体の抗原結合断片、ならびにそれらの抗体を使用する治療および診断方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
凝固因子は、血小板とともに、血管損傷中の止血のプロセスに関連する血液成分である。これらの構成要素は、調節（すなわち、生産および／または活性）において不均衡が生じた場合、血栓症の駆動因子となり得ることが十分に確立されている。血栓性疾患は、主に（組織因子を介して）外因性経路における異常な活性化から生じると考えられていたが、より最近では、Ｆ１２欠損マウスおよび活性化ＦＸＩＩ（ＦＸＩＩａ）を標的とする分子を用いた前臨床研究によって、凝固の内因性経路（接触経路としても知られている）も関与していることが示唆された（Ｒｅｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２：２７１−８１；Ｌａｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．６：２２２ｒａ１７）。ＦＸＩＩａは接触経路の中心であり、ＦＸＩの切断を介して凝固を促進することができ、または血漿プレカリクレインの切断を介して炎症を促進することができる。したがって、ＦＸＩＩ活性の阻害は、接触経路の活性化に関連する血栓凝固および炎症の低減につながる可能性がある（Ｓｃｈｏｕｓｂｏｅ  ２００７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７５：１００７−１３；Ｄａｎｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ  ２０１６，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔａｔ．４２：６８２−８；Ｗｅｉｔｚ  ２０１６，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１４１  Ｓｕｐｐｌ．２：Ｓ４０−５）。当該技術分野で現在使用されている抗凝固剤、例えば、ヘパリンは、有効な抗血栓剤であるが、それらはまた、出血のリスクを増加させる。したがって、出血のリスクを増加させることなく、血栓症を予防する抗凝固剤を開発することが望ましい。
ＦＸＩＩに対するモノクローナル抗体は、当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許／公開第４９６３６５７号、同第５５００３４９号、同第８１１９１３７号、同第８７１５６７２号、同第９８５６３２６号、同第９８５６３２５号、同第９５１８１２７号、同第２０１３／００９５１０８号、同第２０１４／００７２５７２号、同第２０１４／００７２６００号、ならびにＷＯ２００６／０６６８７８、ＷＯ２０１３／０１４０９２、ＥＰ１８３０９２４Ｂ１、ＥＰ２７３４５５２２Ａ１、およびＥＰ２６２３１１０Ａ１に記載されている。
出血のリスクを増加させることなく、高親和性で（活性化された）ＦＸＩＩタンパク質に特異的に結合し、血栓症を予防する完全ヒト抗体は、様々なＦＸＩＩ関連疾患（例えば、血栓症、塞栓症、浮腫）の予防および治療において重要であり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第４９６３６５７号明細書
【特許文献２】米国特許第５５００３４９号明細書
【特許文献３】米国特許第８１１９１３７号明細書
【特許文献４】米国特許第８７１５６７２号明細書
【特許文献５】米国特許第９８５６３２６号明細書
【特許文献６】米国特許第９８５６３２５号明細書
【特許文献７】米国特許第９５１８１２７号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１３／００９５１０８号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２０１４／００７２５７２号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２０１４／００７２６００号明細書
【特許文献１１】国際公開第２００６／０６６８７８号
【特許文献１２】国際公開第２０１３／０１４０９２号
【特許文献１３】欧州特許第１８３０９２４号明細書
【特許文献１４】欧州特許出願公開第２７３４５５２２号明細書
【特許文献１５】欧州特許出願公開第２６２３１１０号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｒｅｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２：２７１−８１
【非特許文献２】Ｌａｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．６：２２２ｒａ１７
【非特許文献３】Ｓｃｈｏｕｓｂｏｅ  ２００７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７５：１００７−１３
【非特許文献４】Ｄａｎｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ  ２０１６，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔａｔ．４２：６８２−８
【非特許文献５】Ｗｅｉｔｚ  ２０１６，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１４１  Ｓｕｐｐｌ．２：Ｓ４０−５
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、凝固第ＸＩＩ因子タンパク質（ＦＸＩＩａ）の活性化形態に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態では、抗体はまた、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）のチモーゲン形態に結合する。特定の実施形態では、抗体は、高い親和性でＦＸＩＩおよびＦＸＩＩａ（「二重ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ結合剤」）にも結合する、完全ヒト抗体である。本発明の抗体は、とりわけ、ＦＸＩＩタンパク質の活性を阻害または中和するために有用である。特定の実施形態では、抗体は、対象においてＦＸＩＩ関連疾患または障害の少なくとも１つの症状または徴候を予防、治療、または寛解するのに有用である。特定の実施形態では、抗体は、ＦＸＩＩ関連の疾患または障害を有するか、またはリスクがある対象に、予防的または治療的に投与されてもよい。特定の好ましい実施形態において。特定の実施形態では、抗体は、対象において出血リスクを増加させることなく、血栓症を予防する。かかる抗体は、ＦＸＩＩ関連疾患または障害を有する対象において、投薬頻度を減らすとともに、それを必要とする対象に投与した場合、出血のリスクを増加させることなく抗凝固療法として使用することができる。
【０００８】
本発明の抗体は、全長（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体）であってもよく、または抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖ断片）のみを含んでいてもよく、機能性に影響を及ぼすように修飾されてもよく、例えば、宿主における持続性を増加させるために、または残存エフェクター機能を排除するように修飾されてもよい（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５−１９３３）。特定の実施形態では、抗体は、二重特異性であり得る。
【０００９】
第１の態様では、本発明は、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）および／または活性化第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）に特異的に結合する、単離された組換えモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。一部の実施形態では、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、抗体は、ＦＸＩＩおよびＦＸＩＩａに結合することができる「二重結合剤」である。
【００１０】
本発明の例示的な抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体を、本明細書の表１および２に列挙する。表１は、例示的な抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）、ならびに軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別子を示す。表２は、例示的な抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３の核酸配列識別子を示す。
【００１１】
本発明は、抗体またはその抗原結合断片を提供し、表１に列挙されたＨＣＶＲアミノ酸配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む。
【００１２】
本発明はまた、抗体またはその抗原結合断片を提供し、表１に列挙されたＬＣＶＲアミノ酸配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む。
【００１３】
本発明はまた、抗体またはその抗原結合断片を提供し、表１に列挙されたＬＣＶＲアミノ酸配列のうちのいずれかと対になっている表１に列挙されたＨＣＶＲアミノ酸配列のうちのいずれかを含む、ＨＣＶＲとＬＣＶＲとのアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む。特定の実施形態によると、本発明は、抗体またはその抗原結合断片を提供し、表１に列挙された例示的な抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体のうちのいずれかに含まれるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。特定の実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号２／１０（例えば、ｍＡｂ２６０３６）、１８／２６（例えば、ｍＡｂ２６０４８）、３４／４２（例えば、ｍＡｂ２６０４９）、または５０／５８（例えば、ｍＡｂ２６０７６）のうちの１つから選択される。
【００１４】
本発明はまた、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合断片を提供し、当該ＨＣＶＲは、１２個以下のアミノ酸置換を有する表１に列挙されたアミノ酸配列を含み、および／または当該ＬＣＶＲは、１０個以下のアミノ酸置換を有する表１に列挙されたアミノ酸配列を含む。例えば、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合断片を提供し、当該ＨＣＶＲは、配列番号２、１８、３４、および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のアミノ酸置換を有する。別の実施例では、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合断片を提供し、当該ＬＣＶＲは、配列番号１０、２６、４２、および５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換を有する。一実施形態では、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体またはその抗原結合断片を提供し、当該ＨＣＶＲは、配列番号２、１８、３４、および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、および／または当該ＬＣＶＲは、配列番号１０、２６、４２、および５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。
【００１５】
本発明はまた、抗体、またはその抗原結合断片を提供し、表１に列挙されたＨＣＤＲ１アミノ酸配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００１６】
本発明はまた、抗体またはその抗原結合断片を提供し、表１に列挙されたＨＣＤＲ２アミノ酸配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００１７】
本発明はまた、抗体またはその抗原結合断片を提供し、表１に列挙されたＨＣＤＲ３アミノ酸配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００１８】
本発明はまた、抗体またはその抗原結合断片を提供し、表１に列挙されたＬＣＤＲ１アミノ酸配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００１９】
本発明はまた、抗体またはその抗原結合断片を提供し、表１に列挙されたＬＣＤＲ２アミノ酸配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００２０】
本発明はまた、抗体またはその抗原結合断片を提供し、表１に列挙されたＬＣＤＲ３アミノ酸配列のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【００２１】
本発明はまた、抗体またはその抗原結合断片を提供し、表１に列挙されたＬＣＤＲ３アミノ酸配列のうちのいずれかと対をなす表１に列挙されたＨＣＤＲ３アミノ酸配列のうちのいずれかを含む、ＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列対（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む。特定の実施形態によると、本発明は、抗体またはその抗原結合断片を提供し、表１に列挙された例示的な抗ＦＸＩＩ抗体のうちのいずれかに含まれるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。特定の実施形態では、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、配列番号８／１６（例えばｍＡｂ２６０３６）、２４／３２（例えばｍＡｂ２６０４８）、４０／４８（例えばｍＡｂ２６０４９）、および５６／６４（例えばｍＡｂ２６０７６）からなる群から選択される。
【００２２】
本発明はまた、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合断片を提供し、当該ＨＣＶＲは、表１に列挙されたアミノ酸配列と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と、表１に列挙されたアミノ酸配列と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、表１に列挙されたアミノ酸配列と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と、を含む。特定の実施形態では、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合断片を提供し、当該ＬＣＶＲは、表１に列挙されたアミノ酸配列と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と、表１に列挙されたアミノ酸配列と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、表１に列挙されたアミノ酸配列と１アミノ酸異なるアミノ酸配列ＬＣＤＲ３と、を含む。例えば、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合断片を提供し、当該ＨＣＶＲは、配列番号４のアミノ酸配列または配列番号４と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１と、配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と、を含む。別の例示的な実施形態では、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合断片を提供し、当該ＬＣＶＲは、配列番号１２のアミノ酸配列または配列番号１２と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と、配列番号１４のアミノ酸配列または配列番号１４と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、配列番号１６のアミノ酸配列または配列番号１６と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含む。
【００２３】
本発明はまた、抗体またはその抗原結合断片を提供し、表１に列挙された例示的な抗体のうちのいずれかに含まれる６つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含む。特定の実施形態では、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列セットは、配列番号４−６−８−１２−１４−１６（例えば、ｍＡｂ２６０３６）、２０−２２−２４−２８−３０−３２（例えば、ｍＡｂ２６０４８）、３６−３８−４０−４４−４６−４８（例えば、ｍＡｂ２６０４９）、および５２−５４−５６−６０−６２−６４（例えば、ｍＡｂ２６０７６）からなる群から選択される。
【００２４】
関連する実施形態では、本発明は、抗体またはその抗原結合断片を提供し、表１に列挙された例示的な抗体のうちのいずれかによって定義されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲのアミノ酸配列対に含まれる６つのＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）のセットを含む。例えば、本発明は、抗体またはその抗原結合断片を含み、配列番号２／１０（例えば、ｍＡｂ２６０３６）、１８／２６（例えば、ｍＡｂ２６０４８）、３４／４２（例えば、ｍＡｂ２６０４９）、または５０／５８（例えば、ｍＡｂ２６０７６）からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対に含まれるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む。ＨＣＶＲアミノ酸配列およびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを特定するための方法および技術は、当該技術分野で周知であり、本明細書に開示される特定のＨＣＶＲアミノ酸配列および／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを特定するために使用することができる。ＣＤＲの境界を特定するために使用することができる例示的な規則には、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義が含まれる。一般的に言えば、Ｋａｂａｔ定義は、配列多様性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、構造ループ領域の位置に基づき、ＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔアプローチとＣｈｏｔｈｉａアプローチとの間の折衷である。例えば、Ｋａｂａｔ，”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８（１９９７）；ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９２６８−９２７２（１９８９）を参照されたい。公開データベースは、抗体内のＣＤＲ配列を特定するためにも利用可能である。
【００２５】
特定の実施形態では、本発明は、ＦＸＩＩおよび／またはＦＸＩＩａに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）とを含み、ＨＣＶＲは、（ｉ）配列番号２、１８、３４、および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号２、１８、３４、および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号２、１８、３４、および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、または（ｉｖ）１２個以下のアミノ酸置換を有する配列番号２、１８、３４、および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは、（ｉ）配列番号１０、２６、４２、および５８からなる群から選択されるアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号１０、２６、４２、および５８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号１０、２６、４２、および５８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、または（ｉｖ）１０個以下のアミノ酸置換を有する配列番号１０、２６、４２、および５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２６】
本発明は、修飾グリコシル化パターンを有する抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体を含む。一部の実施形態では、望ましくないグリコシル化部位を除去するための修飾、またはオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠失している抗体は、例えば、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）機能を増加させるために有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＪＢＣ  ２７７：２６７３３を参照）。他の用途において、ガラクトシル化の修飾は、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を修飾するために行うことができる。
【００２７】
特定の実施形態では、本発明は、ＦＸＩＩへのｐＨ依存性結合を示す抗体およびその抗原結合断片を提供する。例えば、本発明は、酸性ｐＨよりも中性ｐＨでより高い親和性でＦＸＩＩに結合する抗体およびその抗原結合断片を含む（すなわち、酸性ｐＨでの結合の低下）。
【００２８】
本発明はまた、ＦＸＩＩまたはＦＸＩＩａへの特異的結合に対して、ＨＣＶＲのＣＤＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含む抗体またはその抗原結合断片と競合する、抗体およびその抗原結合断片を提供し、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、それぞれ、表１に列挙されたＨＣＶＲ配列およびＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００２９】
本発明はまた、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａへの結合に対して、ＨＣＶＲのＣＤＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含む参照抗体またはその抗原結合断片と交差競合する抗体およびその抗原結合断片を提供し、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、それぞれ、表１に列挙されたＨＣＶＲ配列およびＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００３０】
本発明はまた、ＨＣＶＲの３つのＣＤＲおよびＬＣＶＲの３つのＣＤＲを含む参照抗体またはその抗原結合断片と同じエピトープに結合する抗体およびその抗原結合断片を提供し、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、それぞれ、表１に列挙されたＨＣＶＲ配列およびＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００３１】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、アゴニスト様式でＦＸＩＩおよび／またはＦＸＩＩａに特異的に結合してもよく、すなわち、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ結合および／または活性を増強または刺激してもよい。他の実施形態では、抗体は、アンタゴニスト様式でＦＸＩＩおよび／またはＦＸＩＩａに特異的に結合してもよく、すなわち、ＦＸＩＩ結合および／または活性を遮断してもよい。
【００３２】
本発明はまた、ＦＸＩへのＦＸＩＩａ結合を遮断する単離された抗体およびその抗原結合断片を提供する。一部の実施形態では、ＦＸＩへのＦＸＩＩａ結合を遮断する抗体またはその抗原結合断片は、ＦＸＩと同じＦＸＩＩａ上のエピトープに結合してもよく、またはＦＸＩと異なるＦＸＩＩａ上のエピトープに結合してもよい。
【００３３】
特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、二重特異性であり、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａの第１のエピトープに対する第１の結合特異性、およびＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａの第２のエピトープに対する第２の結合特異性を含み、第１のエピトープおよび第２のエピトープは、別個であり、重複していない。
【００３４】
特定の実施形態では、本発明は、以下の特徴のうちの１つ以上を有する、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する：（ａ）完全ヒトモノクローナル抗体である、（ｂ）活性化第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）に結合する、（ｃ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定した場合、２５℃において、３．５ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で、ＦＸＩＩに結合する、（ｄ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定した場合、３７℃において、１７ｎＭ未満のＫＤで、ＦＸＩＩに結合する、（ｅ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定した場合、２５℃において、５ｎＭ未満、好ましくは２．５ｎＭ未満のＫＤで、ＦＸＩＩａに結合する、（ｆ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定した場合、３７℃において、６．５ｎＭ未満、好ましくは２．５ｎＭ未満のＫＤで、ＦＸＩＩａに結合する、（ｇ）機能的血漿アッセイによって測定した場合、２５０ｎＭ未満の濃度で、内因性経路によるトロンビン生成を遮断する、および（ｈ）機能的血漿アッセイによって測定した場合、外因性経路によるトロンビン生成を遮断することなく、内因性経路によるトロンビン生成を遮断する。
【００３５】
第２の態様では、本発明は、抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体またはその一部をコードする核酸分子を提供する。例えば、本発明は、表１に列挙されたＨＣＶＲアミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子を提供する。特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されたＨＣＶＲ核酸配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【００３６】
本発明はまた、表１に列挙されたＬＣＶＲアミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子を提供する。特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されたＬＣＶＲ核酸配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【００３７】
本発明はまた、表１に列挙されたＨＣＤＲ１アミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子を提供する。特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されたＨＣＤＲ１核酸配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【００３８】
本発明はまた、表１に列挙されたＨＣＤＲ２アミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子を提供する。特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されたＨＣＤＲ２核酸配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【００３９】
本発明はまた、表１に列挙されたＨＣＤＲ３アミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子を提供する。特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されたＨＣＤＲ３核酸配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【００４０】
本発明はまた、表１に列挙されたＬＣＤＲ１アミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子を提供する。特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されたＬＣＤＲ１核酸配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【００４１】
本発明はまた、表１に列挙されたＬＣＤＲ２アミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子を提供する。特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されたＬＣＤＲ２核酸配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【００４２】
本発明はまた、表１に列挙されたＬＣＤＲ３アミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸分子を提供する。特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されたＬＣＤＲ３核酸配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【００４３】
本発明はまた、ＨＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、ＨＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に列挙された例示的な抗体のうちのいずれかによって定義される。
【００４４】
本発明はまた、ＬＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、ＬＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含み、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に列挙された例示的な抗体のうちのいずれかによって定義される。
【００４５】
本発明はまた、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子を提供し、ＨＣＶＲは表１に列挙されたＨＣＶＲアミノ酸配列のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは表１に列挙されたＬＣＶＲアミノ酸配列のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されたＨＣＶＲ核酸配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列、および表１に列挙されたＬＣＶＲ核酸配列のうちのいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。本発明のこの態様による特定の実施形態では、核酸分子は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲをコードし、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、ともに、表１に列挙された同じ抗ＦＸＩＩ抗体に由来する。
【００４６】
関連する態様では、本発明は、抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現することができる組換え発現ベクターを提供する。例えば、本発明は、上述の核酸分子のうちのいずれか、すなわち、表２に記載のＨＣＶＲ配列、ＬＣＶＲ配列、および／またはＣＤＲ配列のうちのいずれかをコードする核酸分子を含む、組換え発現ベクターを含む。特定の実施形態では、本発明は、発現ベクターを提供し、（ａ）ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａに結合する抗体のＨＣＶＲをコードする核酸配列を含む核酸分子であって、ＨＣＶＲは、表１に列挙された配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、核酸分子、かつ／または（ｂ）ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａに結合する抗体のＬＣＶＲをコードする核酸配列を含む核酸分子であって、ＬＣＶＲは、表１に列挙された配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、核酸分子、を含む。また、そのようなベクターが導入された宿主細胞、ならびに抗体または抗体断片の産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することによって、およびそのように産生された抗体および抗体断片を回収することによって、抗体またはその一部を産生する方法もまた含まれる。特定の実施形態では、宿主細胞は、哺乳類細胞または原核細胞を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。特定の実施形態では、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を産生する方法を提供し、この方法は、プロモーターに作動可能に連結された抗体またはその抗原結合断片のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲをコードする核酸配列を含む発現ベクターを、宿主細胞に導入することと、核酸配列の発現に好ましい条件下で宿主細胞を培養することと、抗体またはその抗原結合断片を、培養培地および／または宿主細胞から単離することと、を含む。単離された抗体またはその抗原結合断片は、先行技術で既知の方法のいずれかを使用して精製され得る。
【００４７】
第３の態様では、本発明は、治療上有効量のＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａに特異的に結合する少なくとも１つの組換えモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を提供する。関連する態様では、本発明は、抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体と第２の治療剤の組み合わせである組成物を特徴とする。一実施形態では、第２の治療剤は、抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体と有利に組み合わされる任意の薬剤である。抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体と有利に組み合わせることができる例示的な薬剤としては、限定されないが、ＦＸＩＩ活性に結合および／または阻害する他の薬剤（他の抗体またはその抗原結合断片などを含む）、ならびに／またはＦＸＩＩに直接結合しないが、それでもＦＸＩＩ関連疾患または障害の少なくとも１つの症状または徴候を治療または寛解する薬剤が挙げられる。本発明の抗ＦＸＩＩ抗体を含む追加の併用療法および共製剤は、本明細書の他箇所に開示されている。
【００４８】
第４の態様では、本発明は、本発明の抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体または抗体の抗原結合部分を使用して、対象におけるＦＸＩＩに関連する疾患または障害を治療するための治療方法を提供し、これらの治療方法は、本発明の抗体または抗体の抗原結合断片を含む治療上有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。治療される障害は、ＦＸＩＩ活性の阻害によって改善、寛解、阻止、または予防される任意の疾患または状態である。特定の実施形態では、本発明は、治療上有効量の本発明の抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体またはその抗原結合断片を、それを必要とする対象に投与することを含む、ＦＸＩＩ関連疾患または障害を予防または治療するための方法を提供する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＦＸＩＩ関連疾患または障害を有するか、またはそのリスクがある対象に、予防的または治療的に投与され得る。特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、第２の治療剤と組み合わせて、それを必要とする対象に投与される。第２の治療剤は、抗凝固剤、直接トロンビン阻害剤、血栓溶解性薬、線維素溶解薬、抗血小板薬、抗炎症薬、降圧薬、第２の抗ＦＸＩＩ抗体、脂質低下薬、機械的血餅回収、カテーテル誘導血栓溶解、弾性ストッキング、手術、および当該技術分野で既知の任意の他の薬物または療法からなる群から選択され得る。特定の実施形態では、第２の治療剤は、かかる副作用（複数可）が生じた場合、本発明の抗体またはその抗原結合断片に関連する可能性のある副作用（複数可）を相殺または低減するのに役立つ薬剤であり得る。抗体またはその断片は、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口、または筋肉内に投与され得る。抗体またはその断片は、対象の体重あたり約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。特定の実施形態では、本発明の抗体は、１０ｍｇ〜６００ｍｇを含む１回以上の用量で投与され得る。
【００４９】
本発明はまた、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ結合および／または活性の遮断から利益を受けるであろう疾患または障害の治療のための薬剤の製造における本発明の抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体またはその抗原結合断片の使用を含む。
【００５０】
他の実施形態は、後述の詳細な説明の精査から明らかとなるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
詳細な説明
本方法を説明する前に、本発明は、このような方法および条件が変化し得るため、特定の方法および記載された実験条件に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定することを企図するものではないことも理解されるべきである。
【００５２】
別段定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明の属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に説明されるものと類似のまたは等価の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をこれから説明する。本明細書に言及されているすべての刊行物は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００５３】
定義
「ＦＸＩＩ」という用語は、「第ＸＩＩ因子」とも呼ばれ、ハーゲマン因子としても知られている凝固第ＸＩＩ因子を指す。５９６アミノ酸のＦＸＩＩタンパク質は、第ＸＩＩａ因子のチモーゲン形態であり、アミノ末端の重鎖およびカルボキシ末端の軽鎖からなるβ−グロブリン血漿セリンプロテアーゼである。その重鎖は、２つのフィブロネクチン型ドメイン（Ｉ型およびＩＩ型）、２つの上皮増殖因子様ドメイン、クリングルドメイン、およびプロリンリッチ領域を含有し、その軽鎖は、プロテアーゼドメインを含有する。血液が負に荷電した物質または人工表面に曝露されると、接触活性化として知られている一連の反応を介してトロンビン生成およびフィブリン形成を引き起こす。第ＸＩＩ因子は、凝固カスケードにおいて第ＸＩ因子およびプレカリクレインを活性化する。第ＸＩＩ因子自体は、血漿カリクレイン、血小板または細菌ポリリン酸、細胞外ＤＮＡまたはＲＮＡ、肥満細胞から放出されるヘパリン、アミロイドペプチド、ミスフォールディングしたタンパク質凝集体、およびガラスなどの負に帯電した表面によって、第ＸＩＩａ因子へと活性化される。これが内因性経路の出発点である。全長ＦＸＩＩタンパク質のアミノ酸配列は、受入番号Ｐ００７４８．３としてＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔに提供されたアミノ酸配列によって例示される。全長ＦＸＩＩタンパク質のアミノ酸配列は、本明細書において、配列番号６５としても示されている。「ＦＸＩＩ」という用語は、組換えＦＸＩＩタンパク質またはその断片を含む。この用語はまた、例えば、ヒスチジンタグ、マウスもしくはヒトＦｃ、またはＲＯＲ１などのシグナル配列に結合したＦＸＩＩタンパク質またはその断片を包含する。
【００５４】
「抗体」という用語は、本発明で使用する場合、ジスルフィド結合によって相互連結された４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖、から構成されている免疫グロブリン分子、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）またはその抗原結合断片を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）および重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる）から構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ」または「ＶＬ」）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶLは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本発明の特定の実施形態では、抗体（もしくはその抗原結合断片）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよく、または天然にもしくは人工的に修飾されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。
【００５５】
１つ以上のＣＤＲ残基の置換、または１つ以上のＣＤＲの省略もまた、可能である。科学文献では、抗体の結合に関して、１つまたは２つのＣＤＲを省くことができることが記載されている。Ｐａｄｌａｎら（１９９５  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−１３９）は、公開されている結晶構造に基づいて、抗体とそれらの抗原との間の接触領域を分析し、ＣＤＲ残基の約５分の１〜３分の１のみが実際に抗原に接触すると結論付けた。Ｐａｄｌａｎはまた、１つまたは２つのＣＤＲが、抗原と接触するアミノ酸を有しない多くの抗体を見出した（Ｖａｊｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３２０：４１５−４２８も参照されたい）。
【００５６】
抗原に接触していないＣＤＲ残基は、以前の研究に基づいて、分子モデリングによっておよび／または経験的に、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲの外側に位置するＫａｂａｔ  ＣＤＲの領域から特定され得る（例えば、ＣＤＲＨ２の残基Ｈ６０〜Ｈ６５は、多くの場合必要ではない）。ＣＤＲまたはその残基（複数可）が省略される場合、それは通常、別のヒト抗体配列の対応する位置を占めるアミノ酸またはそのような配列のコンセンサスで置換される。ＣＤＲ内の置換のための位置および置換するアミノ酸は、経験的に選択することもできる。経験的な置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
【００５７】
本明細書に開示される完全ヒト抗ＦＸＩＩモノクローナル抗体は、対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域において、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含み得る。このような変異は、本明細書中に開示するアミノ酸配列を、例えば公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体およびその抗原結合断片を含み、ここで、１つ以上のフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基（複数可）に変異し、もしくは別のヒト生殖系列配列の対応する残基（複数可）に変異し、または対応する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換に変異する（このような配列変化を本明細書ではまとめて、「生殖系列変異」と称する）。当業者は、本明細書に開示する重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列変異またはこれらの組み合わせを含む多数の抗体および抗体結合断片を容易に産生することができる。ある特定の実施形態において、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基はすべて、抗体が由来した元の生殖系列配列において見出される残基へと再び変異する。他の実施形態において、ある特定の残基のみが元の生殖系列配列へと変異し戻され、例えば、変異した残基はＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内に、もしくは変異した残基はＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に認められ、または変異した残基は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内にのみ認められる。他の実施形態において、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基（複数可）の１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が本来由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（複数可）へ変異する。さらに、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば、ある特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基へ変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なるある特定の他の残基は、維持され、または異なる生殖系列配列の対応する残基へ変異する。いったん得られれば、１つ以上の生殖系列変異を含有する抗体および抗体結合断片は、結合特異性の改善、結合親和性の増加、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性の改善または増強（場合によって）、免疫原性の低下などの１つ以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的な様式で得られる抗体および抗体結合断片は、本発明の範囲内に包含される。
【００５８】
本発明はまた、１つ以上の保存的置換を有する本明細書に開示されるＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかのバリアントを含む、完全ヒト抗ＦＸＩＩモノクローナル抗体を含む。例えば、本発明は、本明細書に開示するＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかに対して、例えば１０個以下、８個以下、６個以下、または４個以下などの保存的アミノ酸置換を伴うＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＦＸＩＩ抗体を含む。
【００５９】
「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことが企図される。本発明のヒトｍＡｂは、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によってまたはインビボでの体細胞突変異によって導入された変異）によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列上に移植されたｍＡｂを含むことを意図するものではない。この用語は、非ヒト哺乳動物または非ヒト哺乳動物の細胞において組換え的に産生された抗体を含む。この用語は、ヒト対象から単離された、またはヒト対象において生成された抗体を含むよう企図されるものではない。
【００６０】
本明細書で使用される「組換え」という用語は、例えば、ＤＮＡスプライシングおよびトランスジェニック発現を含む組換えＤＮＡ技術として当該技術分野で既知の技術または方法によって生成、発現、単離または取得された本発明の抗体またはその抗原結合断片を指す。この用語は、非ヒト哺乳動物（トランスジェニック非ヒト哺乳動物、例えば、トランスジェニックマウスを含む）、または細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）発現系で発現された抗体、または組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体を指す。
【００６１】
「ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｓ（特異的に結合する）」または「ｂｉｎｄｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｔｏ（特異的に結合する）」などの用語は、抗体またはその抗原結合断片が、生理学的条件下で比較的安定な抗原と複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０−８Ｍ以下の平衡解離定数によって特徴付けることができる（例えば、より小さいＫＤは、より密接な結合を示す）。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定するための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。本明細書に記載されるように、ＦＸＩＩに特異的に結合する抗体は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって特定されている。そのうえ、本明細書で使用される場合、ＦＸＩＩの１つのドメインおよび１つ以上の追加の抗原に結合する多特異性抗体、またはＦＸＩＩの２つの異なる領域に結合する二重特異性抗体は、それにもかかわらず「特異的に結合する」抗体と見なされる。
【００６２】
「高親和性」抗体という用語は、ＫＤとして表されるＦＸＩＩに対する結合親和性が、少なくとも１０−８Ｍ、好ましくは１０−９Ｍ、より好ましくは１０−１０Ｍ、さらにより好ましくは１０−１１Ｍを有するｍＡｂを指し、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、または溶液親和性ＥＬＩＳＡによって測定される。
【００６３】
「遅い解離速度」、「Ｋｏｆｆ」または「ｋｄ」という用語は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって決定されるように、１×１０−３ｓ−１以下、好ましくは１×１０−４ｓ−１以下の速度定数でＦＸＩＩから解離する抗体を意味する。
【００６４】
抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」および同様の用語は、本明細書で使用される場合、天然の、酵素処理で入手可能な、合成の、または遺伝子操作された、抗原を特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合断片」または単に「抗体断片」という用語は、ＦＸＩＩタンパク質に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。
【００６５】
特定の実施形態では、本発明の抗体または抗体断片は、リガンドまたは治療部分（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）などの部分（「イムノコンジュゲート」）、第２の抗ＦＸＩＩ抗体、またはＦＸＩＩ関連疾患または障害の治療に有用な任意の他の治療部分にコンジュゲートされ得る。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体（Ａｂ）を実質的に含まない抗体を指すことが意図される（例えば、ＦＸＩＩおよび／もしくはＦＸＩＩａまたはその断片に特異的に結合する単離された抗体は、ＦＸＩＩまたはＦＸＩＩａ以外の抗原に特異的に結合するＡｂを実質的に含まない。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「遮断抗体」または「中和抗体」（または「ＦＸＩＩ活性を中和する抗体」もしくは「アンタゴニスト抗体」）は、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａへの結合がＦＸＩＩの少なくとも１つの生物学的活性の阻害をもたらす抗体を指すことが意図される。例えば、本発明の抗体は、内因性経路による凝固を防止または遮断し得る。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「表面プラズモン共鳴」という用語は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によるリアルタイム生体分子相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
【００６９】
「ＫＤ」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指すことが意図される。
【００７０】
「エピトープ」という用語は、パラトープとして知られている抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は２つ以上のエピトープを有してもよい。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域へ結合し得、異なる生物学的効果を有し得る。「エピトープ」という用語は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。それは、また、抗体が結合する抗原の領域を指す。エピトープは、構造的または機能的と定義され得る。機能的エピトープは概して、構造エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープは、立体構造的であってもよく、すなわち、非線状アミノ酸から構成され得る。特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的に活性のある表面群である決定基を含み得、特定の実施形態では、特異的三次元構造特徴および／または比電荷特徴を有し得る。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「交差競合する」という用語は、抗体またはその抗原結合断片が、抗原に結合し、別の抗体またはその抗原結合断片の結合を阻害または遮断することを意味する。この用語はまた、両方の配向における２つの抗体間の競合、すなわち、第２の抗体に結合して第２の抗体の結合を遮断する第１の抗体も含み、その逆も同様である。特定の実施形態では、第１の抗体および第２の抗体は、同じエピトープに結合し得る。あるいは、第１の抗体および第２の抗体は、異なっているが重複しているエピトープに結合することができるため、一方の結合が、例えば、立体障害を介して、第２の抗体の結合を阻害または遮断する。抗体間の交差競合は、当該技術分野で既知の方法によって、例えば、リアルタイム無標識バイオレイヤー干渉法アッセイによって測定され得る。２つの抗体間の交差競合は、自己結合（この場合、第１および第２の抗体は、同じ抗体である）によるバックグラウンドシグナルよりも低い第２の抗体の結合として表され得る。２つの抗体間の交差競合は、例えば、ベースラインの自己バックグラウンド結合（この場合、第１および第２の抗体は、同じ抗体である）よりも低い第２の抗体の結合％として表され得る。
【００７２】
「実質的な同一性」または「実質的に同一である」という用語は、核酸またはその断片を指す場合、適切なヌクレオチドの挿入または欠失を用いて別の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列させたとき、以下で考察するようにＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧＡＰなどの配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定した場合、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、約９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、特定の場合では、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。
【００７３】
ポリペプチドに適用される場合、「実質的な類似性」または「実質的に類似の」という用語は、２つのペプチド配列が、既定のギャップ重みを使用して、プログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによってなど最適に整列した場合、少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは、少なくとも９５％、９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないことになっている。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、類似性の割合または程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整してもよい。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸基の例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン、３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに７）含硫側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３  ４５に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有する任意の変化である（参照により本明細書に援用される）。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負以外の値を有する任意の変化である。
【００７４】
ポリペプチドに対する配列類似性は、典型的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失および他の修飾へ割り当てられた類似の測定値を使用して類似の配列と一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドのような密接に関連するポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の、配列相同性または配列同一性を決定するための既定パラメータとともに使用することができるＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧ第６．１版を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧ第６．１版におけるプログラムである、既定パラメータまたは推奨パラメータを備えたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列の間の最良重複の領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上記）。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメータを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０および（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照されたい（それぞれ参照により本明細書に援用される）。
【００７５】
「治療上有効量」という語句は、それが投与される所望の効果を生み出す量を意味する。正確な量は治療の目的に応じて異なり、既知の技術を使用して当業者によって確認可能であろう（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照されたい）。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、血栓症または塞栓症などのＦＸＩＩ関連の疾患または障害の改善、予防、および／または治療を必要とする動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。この用語は、かかる疾患または障害を有するか、またはそのリスクがあるヒト対象を含む。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、または「治療」という用語は、本発明の抗体などの治療剤を、それを必要とする対象に投与することによって、ＦＸＩＩ関連の疾患または障害の少なくとも１つの症状または徴候の重症度を低減または寛解することを指す。これらの用語は、疾患の進行または症状／徴候の悪化の阻害を含む。この用語はまた、疾患の良好な予後を含み、すなわち、対象は、本発明の抗体などの治療剤の投与時に、疾患がなくなる、または疾患を低減した可能性がある。治療剤は、対象に治療用量で投与され得る。
【００７８】
「予防する」、「予防すること」、または「予防」という用語は、本発明の抗体の投与時のＦＸＩＩ関連疾患もしくは障害の発現の阻害、またはかかる疾患もしくは障害の任意の症状もしくは徴候を指す。
【００７９】
抗体の抗原結合断片
特に明記しない限り、本明細書で使用される「抗体」という用語は、２つの免疫グロブリン重鎖と２つの免疫グロブリン軽鎖とを含む抗体分子（すなわち、「完全抗体分子」）、ならびにその抗原結合断片を包含するものと理解されるべきである。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」および同様の用語は、本明細書で使用される場合、天然の、酵素処理で入手可能な、合成の、または遺伝子操作された、抗原を特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の「抗原結合断片」または「抗体断片」という用語は、本明細書で使用される場合、ＦＸＩＩタンパク質に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、ＣＤＲを含有する断片、または単離されたＣＤＲを含み得る。特定の実施形態では、「抗原結合断片」という用語は、多特異性抗原結合分子のポリペプチド断片を指す。抗体の抗原結合断片は、例えば、抗体可変ドメインおよび（任意選択的に）定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現に関与するタンパク質消化技術または組換え遺伝子操作技術などの任意の好適な標準的技術を使用して、完全抗体分子から誘導され得る。かかるＤＮＡは既知であり、および／または例えば市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えばファージ−抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、または合成することができる。ＤＮＡは、例えば、１つ以上の可変ドメインおよび／もしくは定常ドメインを好適な配置へと配置するか、またはコドンを導入し、システイン残基を作成し、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失などするために、化学的に、または分子生物学技法を使用することによって配列決定および操作され得る。
【００８０】
抗原結合断片の非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基、または拘束ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位、が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小型モジュール型免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作された分子も、本明細書で使用する「抗原結合断片」という表現に包含される。
【００８１】
抗体の抗原結合断片は、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは、任意の大きさまたはアミノ酸組成物であり得、概して、１つ以上のフレームワーク配列に隣接しているかまたは１つ以上のフレームワーク配列とともにインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＬドメインと結合したＶＨドメインを有する抗体結合断片において、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、任意の好適な配置で互いに対して配置され得る。例えば、可変領域は二量体であり、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶLまたはＶL−ＶＬ二量体を含有し得る。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体のＶＨドメインまたはＶＬドメインを含み得る。
【００８２】
ある特定の実施形態において、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含み得る。本発明の抗体の抗原結合断片内に見出すことができる可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的な例示的な構成としては、（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３、および（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬ、が挙げられる。上に列挙した例示的な立体配置のいずれかを含む、可変ドメインおよび定常ドメインの任意の立体配置において、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接連結されていてもよく、または完全もしくは部分的ヒンジ領域もしくはリンカー領域によって連結されていてもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間の可撓性または半可撓性の結合をもたらす少なくとも２つの（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０またはそれより多数の）アミノ酸からなり得る。そのうえ、本発明の抗体の抗原結合断片は、互いとのおよび／または１つ以上の単量体ＶＨドメインもしくはＶＬドメイン（例えば、ジスルフィド結合（複数可）により）との非共有結合において、上に列挙した可変ドメイン立体配置および定常ドメイン立体配置のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。
【００８３】
完全抗体分子と同様に、抗原結合断片は、単一特異性または多特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多特異性抗原結合断片は、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、別個の抗原または同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体の型式を含む任意の多特異性抗体の型式は、当該技術分野で利用可能な通常の技術を使用して、本発明の抗体の抗原結合断片の文脈での使用に適合され得る。
【００８４】
ヒト抗体の調製
トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成するための方法は、当該技術分野で知られている。任意のこのような既知の方法は、ＦＸＩＩおよび／またはＦＸＩＩａに特異的に結合するヒト抗体を作製するために、本発明の文脈で使用され得る。
【００８５】
ＦＸＩＩおよび／またはＦＸＩＩａタンパク質に特異的に結合する抗体を生成するために、以下のうちのいずれか１つを含む免疫原を使用することができる。特定の実施形態では、本発明の抗体は、完全長の天然ＦＸＩＩまたはＦＸＩＩａタンパク質で（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ００７４８．３を参照のこと）またはタンパク質もしくはその断片をコードするＤＮＡで免疫化したマウスから得られる。あるいは、タンパク質またはその断片は、標準的な生化学的技術を使用して生成され、修飾され、免疫原として使用され得る。
【００８６】
一部の実施形態では、免疫原は、組換えＦＸＩＩタンパク質またはその断片であり得、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの任意の他の真核細胞もしくは哺乳類細胞において発現される。
【００８７】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１、ＲｅｇｅｎｅｒｏｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＶＥＬＯＣＩＭＵＮＥ（登録商標）を参照）またはモノクローナル抗体を生成するための任意の他の既知の方法を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、ＦＸＩＩに対して高親和性のキメラ抗体が最初に単離される。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、マウスが抗原刺激に対する応答においてヒト可変領域と、マウス定常領域と、を含む、抗体を産生するように、ヒト重鎖可変領域と、ヒト軽鎖可変領域と、を含む、ゲノムが内在性マウス定常領域座に動作可能に連結されたトランスジェニックマウスの生成を包含する。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに動作可能に連結する。次に、完全ヒト抗体を発現することができる細胞においてＤＮＡを発現させる。
【００８８】
概して、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに関心対象の抗原を負荷し、抗体を発現するマウスからリンパ細胞（Ｂ細胞など）を回収する。リンパ細胞を骨髄腫細胞株と融合させて不死化ハイブリドーマ細胞株を調製し得、関心対象の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定するためにこのようなハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択する。重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し得、重鎖および軽鎖の望ましいアイソタイプ定常領域へ連結することができる。このような抗体タンパク質は、ＣＨＯ細胞などの細胞において産生され得る。あるいは、抗原特異的キメラ抗体または軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡを抗原特異的リンパ球から直接単離することができる。
【００８９】
まず、ヒト可変領域とマウス定常領域とを有する高親和性キメラ抗体を単離する。以下の実験セクションと同様に、抗体は、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特徴付けされ、選択される。マウス定常領域は、本発明の完全ヒト抗体、例えば、野生型または修飾ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４を生成するために、所望のヒト定常領域と置換される。選択された定常領域は特異的用途に応じて変化し得るが、高親和性抗原結合特徴および標的特異性特徴は、可変領域に存在する。
【００９０】
生物学的等価物
本発明の抗ＦＸＩＩ抗体および抗体断片は、記載された抗体のものとは異なるが、ＦＸＩＩタンパク質に結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。そのようなバリアント抗体は、親配列と比較して、アミノ酸の１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、記載された抗体のものと本質的に等価である生物学的活性を示す。同様に、本発明の抗体をコードしているＤＮＡ配列は、開示された配列と比較して、ヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、本発明の抗体または抗体断片と本質的に生物学的に等価である抗体または抗体断片をコードする。
【００９１】
２つの抗原結合タンパク質または抗体は、例えば、それらが類似の実験条件下で単回用量または複数回用量のいずれかで同じモル用量で投与された場合に、吸収速度および吸収の程度が有意差を示さない医薬的等価物または医薬的代替物である場合、生物学的等価物と見なされる。いくつかの抗体は、これらの吸収の程度は等価であるが吸収速度は等価ではなく、吸収速度のこのような差が意図的であり、標識することに反映されているので生物学的に等価と見なされ得る場合、等価物または薬学的選択肢と見なされることになっており、例えば長期使用に及ぼす有効な身体薬剤濃度の達成に必須ではなく、研究した特定の薬剤製品にとって医学的に有意ではないと見なされる。
【００９２】
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、それらの安全性、純度、または有効性において臨床的に有意な差がない場合、生物学的に等価である。
【００９３】
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、免疫原性の臨床的に有意な変化または有効性の減退を含む有害作用のリスクの期待される上昇なしで参照生成物と生物学的生成物の間での切り替えなしで持続される療法と比較して、患者を１回以上切り替えられることができる場合、生物学的に等価である。
【００９４】
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、これらが両方とも、使用条件（複数可）についての共通の機序または作用機序によって、このような機序が既知である程度まで作用する場合、生物学的に等価である。
【００９５】
生物学的等価性は、インビボおよび／またはインビトロの方法によって実証され得る。生物学的等価性測定法には、例えば、（ａ）抗体またはその代謝産物の濃度が血液、血漿、血清または他の生物学的流体中で時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳類におけるインビボでの試験、（ｂ）ヒト生物学的利用能データと相関した、このデータを合理的に予測しているインビトロ試験、（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理学的効果が時間の関数として測定されるヒトまたは他の哺乳類におけるインビボ試験、および（ｄ）抗体の安全性、効能、または生物学的利用能もしくは生物学的等価性を確立する、十分に管理された臨床試験が含まれる。
【００９６】
本発明の抗体の生物学的に等価なバリアントは、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を作製すること、または生物活性に必要とされない末端もしくは内部の残基もしくは配列を欠失することによって構築され得る。例えば、生物学的活性にとって必須ではないシステイン残基は、再生の際の不必要または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、欠失または他のアミノ酸で置換することができる。他の文脈では、生物学的に等価な抗体は、抗体のバリアントを含み、抗体の特徴であるグリコシル化を修飾するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を排除または除去する変異、を含み得る。
【００９７】
Ｆｃバリアントを含む抗ＦＸＩＩ抗体
本発明の特定の実施形態によると、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を強化または減少させる１つ以上の変異を含むＦｃドメインを含む、抗ＦＸＩＩ抗体が提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３領域に変異を含む抗ＦＸＩＩ抗体を含み、変異（複数可）は、酸性環境で（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０の範囲のエンドソーム内で）、ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増加させる。そのような変異は、動物に投与したときに抗体の血清半減期の増加をもたらし得る。そのようなＦｃ修飾の非限定的な例には、例えば、２５０位（例えば、ＥまたはＱ）、２５０位および４２８位（例えば、ＬまたはＦ）、２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）での修飾、または４２８位および／もしくは４３３位（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／もしくは４３４位（例えば、Ａ、Ｗ、Ｈ、Ｆ、またはＹ［Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、またはＮ４３４Ｙ］）での修飾、または２５０位および／もしくは４２８位での修飾、または３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、および４３４位での修飾が含まれる。一実施形態では、修飾は４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の修飾、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の修飾、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）の修飾、２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）の修飾、２５０Ｑおよび４２８Ｌの修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）、３０７および／または３０８の修飾（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。さらに別の実施形態において、修飾は、２６５Ａ（例えば、Ｄ２６５Ａ）および／または２９７Ａ（例えば、Ｎ２９７Ａ）修飾を含む。
【００９８】
例えば、本発明は、以下からなる群から選択される変異の１つ以上の対または群を含むＦｃドメインを含む、抗ＦＸＩＩ抗体を含む：２５０Ｑおよび２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌおよび４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）；２５７Ｉおよび３１１Ｉ（例えば、Ｐ２５７ＩおよびＱ３１１Ｉ）；２５７Ｉおよび４３４Ｈ（例えば、Ｐ２５７ＩおよびＮ４３４Ｈ）；３７６Ｖおよび４３４Ｈ（例えば、Ｄ３７６ＶおよびＮ４３４Ｈ）；３０７Ａ、３８０Ａおよび４３４Ａ（例えば、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａ）；ならびに４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）。前述のＦｃドメイン変異、および本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の他の変異のすべての可能な組み合わせが、本発明の範囲内で企図される。
【００９９】
本発明はまた、キメラ重鎖定常（ＣＨ）領域を含む抗ＦＸＩＩ抗体を含み、キメラＣＨ領域は、２つ以上の免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ領域に由来するセグメントを含む。例えば、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１分子、ヒトＩｇＧ２分子、またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ３ドメインの一部または全部と組み合わされた、ヒトＩｇＧ１分子、ヒトＩｇＧ２分子、またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ２ドメインの一部または全部を含む、キメラＣＨ領域を含み得る。特定の実施形態によると、本発明の抗体は、キメラヒンジ領域を有するキメラＣＨ領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列（ＥＵ番号付けによる位置２２８〜２３６のアミノ酸残基）と組み合わされた、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵ番号付けによる位置２１６〜２２７のアミノ酸残基）を含み得る。特定の実施形態によると、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４上部ヒンジに由来するアミノ酸残基と、ヒトＩｇＧ２下部ヒンジに由来するアミノ酸残基と、を含む。本明細書に記載されるようなキメラＣＨ領域を含む抗体は、特定の実施形態では、抗体の治療特性または薬物動態学的特性に悪影響を与えることなく、修飾Ｆｃエフェクター機能を呈し得る。（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２４３５０４号を参照されたい。その全体参照によりが本明細書に援用される）。
【０１００】
抗体の生物学的特性
一般に、本発明の抗体は、ＦＸＩＩタンパク質に結合し、ＦＸＩＩａおよびＦＸＩＩｂへのその切断を防止することによって機能する。特定の実施形態では、抗体は、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）の活性化形態（「二重ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ結合剤」）に結合する。例えば、本発明は、表面プラズモン共鳴、例えば、本明細書の実施例３で定義されるアッセイ型式を使用して測定した場合、（例えば２５℃または３７℃で）約２０ｎＭ未満のＫＤを有するＦＸＩＩタンパク質に結合する抗体および抗体の抗原結合断片を含む。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、例えば、本明細書の実施例３に定義されるアッセイ型式、または実質的に類似のアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約２０ｎＭ未満、約１７ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満のＫＤで、ＦＸＩＩに結合する。
【０１０１】
本発明はまた、抗体およびその抗原結合断片を含み、例えば、本明細書の実施例３に定義されるアッセイ型式、または実質的に類似のアッセイを使用して、２５℃または３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約１分超の解離半減期（ｔ１／２）で、ヒトＦＸＩＩタンパク質に結合する。特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、例えば、本明細書の実施例３に定義されるアッセイ型式または実質的に類似のアッセイを使用して、２５℃または３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約５分超、約１０分超、約２０分超、約３０分超、約４０分超、約５０分超、約６０分超、または約７０分超のｔ１／２で、ＦＸＩＩタンパク質に結合する。
【０１０２】
本発明は、抗体および抗体の抗原結合断片を含み、例えば、本明細書の実施例３に定義されるアッセイ型式を使用して、表面プラズモン共鳴によって測定した場合、（例えば、２５℃または３７℃で）約９ｎＭ未満のＫＤで、ＦＸＩＩタンパク質に結合する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、例えば、本明細書の実施例３に定義されるアッセイ型式、または実質的に類似のアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約９ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約５００ｐＭ未満のＫＤで、ＦＸＩＩａに結合する。
【０１０３】
本発明はまた、抗体およびその抗原結合断片を含み、例えば、本明細書の実施例３に定義されるアッセイ型式、または実質的に類似のアッセイを使用して、２５℃または３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約１分超の解離半減期（ｔ１／２）で、ヒトＦＸＩＩａタンパク質に結合する。特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、例えば、本明細書の実施例３に定義されるアッセイ型式、または実質的に類似のアッセイを使用して、２５℃または３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約５分超、約１０分超、約２０分超、約３０分超、約４０分超、約５０分超、約６０分超、または約７０分超のｔ１／２で、ＦＸＩＩａタンパク質に結合する。
【０１０４】
本発明はまた、抗体およびその抗原結合断片を含み、例えば、本明細書の実施例５に記載のアッセイ型式、または実質的に類似のアッセイを使用して測定した場合、２５０ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、または１５０ｎＭ未満の濃度で内因性経路によるトロンビン生成を阻害する。特定の実施形態では、本発明は、抗体およびその抗原結合断片を含み、例えば、本明細書の実施例５に記載のアッセイ型式、または実質的に類似のアッセイを使用して測定した場合、外因性経路によるトロンビン生成を遮断することなく、内因性経路によるトロンビン生成を阻害する。
【０１０５】
一実施形態では、本発明は、ＦＸＩＩタンパク質に特異的に結合する単離された組換え抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体またはその断片は、以下の特徴のうちの１つ以上を示す：（ａ）完全ヒトモノクローナル抗体である、（ｂ）活性化第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）に結合する、（ｃ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定した場合、２５℃において、３．５ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で、ＦＸＩＩに結合する、（ｄ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定した場合、３７℃において、１７ｎＭ未満のＫＤで、ＦＸＩＩに結合する、（ｅ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定した場合、２５℃において、５ｎＭ未満、好ましくは２．５ｎＭ未満のＫＤで、ＦＸＩＩａに結合する、（ｆ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定した場合、３７℃において、６．５ｎＭ未満、好ましくは２．５ｎＭ未満のＫＤで、ＦＸＩＩａに結合する、（ｇ）機能的血漿アッセイによって測定した場合、２５０ｎＭ未満の濃度で、内因性経路によるトロンビン生成を遮断する、および（ｈ）機能的血漿アッセイによって測定した場合、外因性経路によるトロンビン生成を遮断することなく、内因性経路によるトロンビン生成を遮断する。
【０１０６】
本発明の抗体は、前述の生物学的特性のうちの１つ以上、またはそれらの任意の組み合わせを有し得る。本発明の抗体の他の生物学的特性は、本明細書の実施例を含む本開示の概説から、当業者には明らかであろう。
【０１０７】
エピトープマッピングおよび関連技術
本発明には、重鎖および軽鎖を含むＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａタンパク質分子の１つ以上の領域内に見出される１つ以上のアミノ酸と相互作用する抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体が含まれる。抗体が結合するエピトープは、ＦＸＩＩタンパク質分子（例えば、ドメインの直鎖エピトープ）の前述のドメインのうちのいずれかに位置する３つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上）のアミノ酸の単一の連続配列からなってもよい。あるいは、エピトープは、タンパク質分子（例えば、立体構造エピトープ）の前述のドメインのいずれか、または両方に位置する複数の非連続アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなってもよい。
【０１０８】
当業者に既知の様々な技術を使用して、抗体が、ポリペプチドまたはタンパク質内にある「１つ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを決定することができる。例示的な技術としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）に記載されている通常の交差遮断アッセイが挙げられる。他の方法としては、アラニン走査変異分析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：４４３−６３）、ペプチド切断分析、結晶学的研究、およびＮＭＲ分析が挙げられる。さらに、エピトープ切除、エピトープ抽出、および抗原の化学修飾などの方法を用いることができる（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．９：４８７−４９６）。抗体が相互作用するポリペプチドの内部にあるアミノ酸を同定するために用いることができる別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。一般的に言えば、水素／重水素交換法は、関心対象のタンパク質を重水素標識した後、抗体を重水素標識タンパク質へ結合させることを包含する。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移し、抗体複合体によって保護されているアミノ酸内の交換可能なプロトンは、界面の一部ではないアミノ酸内の交換可能なプロトンよりも遅い速度で重水素対水素の逆交換を受ける。結果として、タンパク質／抗体界面の一部を形成するアミノ酸は、重水素を保持し得、したがって、界面に含まれないアミノ酸と比較して、比較的により大きな質量を示す。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断および質量分析へ供し、それにより、抗体が相互作用する特異的アミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７：２５２−２５９；Ｅｎｇｅｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ−２６５Ａを参照されたい。
【０１０９】
「エピトープ」という用語は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、連続したアミノ酸、またはタンパク質の三次折り畳みによって並置された連続していないアミノ酸の両方から形成することができる。連続したアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒に曝露しても保持されるが、三次折り畳みによって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒で処理すると失われる。エピトープは、典型的には、固有の空間的立体構造中に、少なくとも３個、より一般的には、少なくとも５個、または８〜１０個のアミノ酸を含む。
【０１１０】
修飾支援プロファイリング（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ、ＭＡＰ）、別名、抗原構造ベース抗体プロファイリング（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ、ＡＳＡＰ）は、化学的または酵素的に修飾された抗原表面への各抗体の結合プロファイルの類似性に従って、同じ抗原を対象として多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分類する方法である（米国特許第２００４／０１０１９２０号を参照されたい、その全体が参照により本明細書に具体的に援用される）。各カテゴリは、別のカテゴリによって表されるエピトープとは明らかに異なるか、または部分的に重複する固有のエピトープを反映し得る。この技術は、特徴付けが遺伝的に異なる抗体に焦点を当てられるように、遺伝的に同一の抗体の迅速なフィルタリングを可能にする。ハイブリドーマスクリーニングに適用される場合、ＭＡＰは、所望の特徴を有するｍＡｂを産生する希少なハイブリドーマクローンの同定を容易にし得る。ＭＡＰを使用して、本発明の抗体を、異なるエピトープに結合する抗体の群に選別することができる。
【０１１１】
特定の実施形態では、本発明は、ＦＸＩＩａの重鎖および／または軽鎖内に見出される１つ以上のエピトープと相互作用する抗ＦＸＩＩ抗体ならびにその抗原結合断片を含む。エピトープ（複数可）は、ＦＸＩＩａの重鎖および／または軽鎖内に位置する３つ以上の（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上）のアミノ酸の１つ以上の連続した配列からなってもよい。あるいは、エピトープは、ＦＸＩＩａ内に位置する複数の連続していないアミノ酸（またはアミノ酸配列）からなっていてもよい。
【０１１２】
本発明は、表１に列挙された特定の例示的な抗体のうちのいずれかとして、同じエピトープまたはエピトープの一部に結合する抗ＦＸＩＩ抗体を含む。同様に、本発明はまた、ＦＸＩＩタンパク質またはその断片への結合に対して、表１に列挙された特定の例示的な抗体のうちのいずれかと競合する抗ＦＸＩＩ抗体を含む。例えば、本発明は、ＦＸＩＩタンパク質への結合に対して、表１に列挙された１つ以上の抗体と交差競合する抗ＦＸＩＩ抗体を含む。
【０１１３】
抗体が、参照抗ＦＸＩＩ抗体と同じエピトープに結合するか、またはエピトープへの結合に対して参照抗ＦＸＩＩ抗体と競合するかどうかは、当該技術分野で既知の通常の方法を使用することによって、容易に決定することができる。例えば、試験抗体が、本発明の参照抗ＦＸＩＩ抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体を、飽和条件下で、ＦＸＩＩタンパク質またはペプチドに結合させる。次に、ＦＸＩＩタンパク質分子に結合する試験抗体の能力を評価する。試験抗体が、参照抗ＦＸＩＩ抗体との飽和結合後にＦＸＩＩに結合することができる場合、試験抗体は、参照抗ＦＸＩＩ抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。その一方、試験抗体が、参照抗ＦＸＩＩ抗体との飽和結合後にＦＸＩＩに結合することができない場合、試験抗体は、本発明の参照抗ＦＸＩＩ抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合している可能性がある。
【０１１４】
抗体が、結合に対して、参照抗ＦＸＩＩ抗体と競合するかどうかを決定するために、上に記載の結合方法を、２つの方向から実施する。第１の方向性では、参照抗体を飽和条件下でＦＸＩＩタンパク質に結合させた後、試験抗体のＦＸＩＩ分子への結合を評価する。第２の方向性では、試験抗体を飽和条件下でＦＸＩＩタンパク質に結合させた後、参照抗体のＦＸＩＩ分子への結合を評価する。両方向で、第１の（飽和）抗体がＦＸＩＩ分子に結合することができる場合、試験抗体および参照抗体は、ＦＸＩＩへの結合に対して競合すると結論付けられる。当業者に理解されるように、結合に対して参照抗体と競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープに結合する必要はないが、重複するエピトープまたは隣接するエピトープに結合することによって、参照抗体の結合を、立体的に遮断し得る。
【０１１５】
２つの抗体は、それぞれ他方が抗原に結合することを競合的に阻害（遮断）する場合、同じまたは重複するエピトープに結合する。すなわち、競合結合アッセイで測定した場合、１倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍過剰量の一方の抗体は、他方の結合を、少なくとも５０％、しかし、好ましくは７５％、９０％、またはさらに９９％阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９０  ５０：１４９５−１５０２を参照されたい）。あるいは、一方の抗体の結合を低減または排除する抗原の本質的にすべてのアミノ酸変異が、他方の結合を低減または排除する場合、２つの抗体は、同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を低減または排除するいくつかのアミノ酸変異が、他方の結合を低減または排除する場合、２つの抗体は、重複するエピトープを有する。
【０１１６】
次いで、試験抗体の結合の観察された欠失が、実際に、参照抗体と同じエピトープへの結合によるものであるかどうか、または立体遮断（または別の現象）が、観察された結合の欠失の原因であるかどうか、を確認するために、さらなる通例の実験（例えば、ペプチド変異および結合分析）を実施することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、または当該技術分野で利用可能な任意の他の定量的もしくは定性的な抗体結合アッセイを使用して実施することができる。
【０１１７】
免疫結合体
本発明は、ＦＸＩＩ関連疾患または障害（例えば、血栓症）を治療するために治療部分（「イムノコンジュゲート」）にコンジュゲートされたヒト抗ＦＸＩＩモノクローナル抗体を包含する。本明細書で使用される場合、「イムノコンジュゲート」という用語は、放射性剤、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部分、酵素、ペプチドもしくはタンパク質、または治療剤に化学的もしくは生物学的に連結された抗体を指す。抗体は、その標的に結合することができる限り、分子に沿った任意の位置で放射性剤、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部分、酵素、ペプチド、または治療剤に連結され得る。イムノコンジュゲートの例としては、抗体薬物コンジュゲートおよび抗体−毒素融合タンパク質が挙げられる。一実施形態では、薬剤は、ＦＸＩＩタンパク質に対する第２の異なる抗体であり得る。抗ＦＸＩＩ抗体にコンジュゲートされ得る治療部分の種類は、治療されるべき状態、および達成されるべき所望の治療効果を考慮する。イムノコンジュゲートを形成するために好適な薬剤の例としては、当該技術分野で既知である（例えば、ＷＯ０５／１０３０８１を参照）。
【０１１８】
多特異性抗体
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性または多特異性であり得る。多特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、または２つ以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有し得る。例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９；Ｋｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８−２４４を参照されたい。
【０１１９】
本発明の多特異性抗原結合分子のいずれか、またはそのバリアントは、当業者に既知であるように、標準的な分子生物学的技法（例えば、組換えＤＮＡおよびタンパク質発現技術）を使用して構築され得る。
【０１２０】
一部の実施形態では、ＦＸＩＩ特異的抗体は、ＦＸＩＩタンパク質の異なるドメインに結合する可変領域が一緒に連結されて、単一結合分子内に二重ドメイン特異性を付与する二重特異性の型式（「二重特異性」）で生成される。適切に設計された二重特異性は、特異性および結合活性の両方を増加させることを通して、全体的なＦＸＩＩ−タンパク質阻害有効性を増強し得る。個々のドメイン（例えば、Ｎ末端ドメインのセグメント）に対する特異性を有する可変領域、または１つのドメイン内の異なる領域に結合することができる可変領域は、各領域が別個のエピトープに同時に結合すること、または１つのドメイン内の異なる領域に結合することを可能にする構造足場上で対になる。１つのドメインに対する特異性を有する結合剤由来の二重特異性重鎖可変領域（ＶＨ）の一例では、第２のドメインに対する特異性を有する一連の結合剤由来の軽鎖可変領域（ＶＬ）と組換えて、そのＶＨに対する元の特異性を破壊することなく、元のＶＨと対合することができる非同種のＶＬパートナーを特定する。このようにして、単一のＶＬセグメント（例えば、ＶＬ１）を、２つの異なるＶＨドメイン（例えば、ＶＨ１およびＶＨ２）と組み合わせて、２つの結合「アーム」（ＶＨ１−ＶＬ１およびＶＨ２−ＶＬ１）からなる二重特異性を生成することができる。単一のＶＬセグメントを使用すると、系の複雑さを低減し、それによって、二重特異性を生成するために使用するクローニング、発現、および精製プロセスを簡素化し、効率を増加させる（例えば、ＵＳＳＮ１３／０２２７５９およびＵＳ２０１０／０３１５２７を参照されたい）。
【０１２１】
あるいは、２つ以上のドメインおよび第２の標的（例えば、限定されないが、第２の異なる抗ＦＸＩＩ抗体など）に結合する抗体は、本明細書に記載の技術、または当業者に既知の他の技術を使用して、二重特異性の型式で調製され得る。異なる領域に結合する抗体可変領域は、単一の結合分子内に二重抗原特異性を付与するために、例えば、ＦＸＩＩの細胞外ドメイン上の関連部位に結合する可変領域と一緒に連結され得る。この性質の適切に設計された二重特異性は、二重の機能を果たす。細胞外ドメインに対する特異性を有する可変領域は、細胞外ドメイン以外に対する特異性を有する可変領域と組み合わされ、各可変領域が別個の抗原に結合することを可能にする構造足場上で対になる。
【０１２２】
本発明の文脈上で使用することができる例示的な二重特異性抗体の型式は、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇＣＨ３ドメインの使用が関与し、第１および第２のＩｇＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸が互いに異なり、少なくとも１つのアミノ酸の相違は、アミノ酸の相違を欠く二重特異性抗体と比較して、プロテインＡへの二重特異性抗体の結合を低減させる。一実施形態では、第１のＩｇＣＨ３ドメインはプロテインＡを結合し、第２のＩｇＣＨ３ドメインはＨ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる、ＥＵ番号付けではＨ４３５Ｒ）などのプロテインＡ結合を低減または消失させる変異を含有する。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによるものであり、ＥＵではＹ４３６Ｆ）をさらに含み得る。第２のＣＨ３内に見出され得るさらなる修飾としては、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵによればＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）、ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ、ＥＵによればＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）、ならびにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵによればＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）が挙げられる。上に記載の二重特異性抗体型式上のバリエーションは、本発明の範囲内であることが企図される。
【０１２３】
本発明の文脈で使用され得る他の例示的な二重特異性型式としては、例えば、ｓｃＦｖ系型式またはダイアボディ二重特異性型式、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ、クアドローマ、ノブズ−イントゥ−ホールズ、共通の軽鎖（例えば、ノブズ−イントゥ−ホールズを備えた共通の軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用型Ｆａｂ（ＤＡＦ）−ＩｇＧ、およびＭａｂ２二重特異性型式が含まれるが、これらに限定されない（上述の型式の総説については、例えば、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ  ４：６，１−１１およびそこに引用されている参考文献を参照されたい）。二重特異性抗体は、ペプチド／核酸結合を用いて構築することもでき、例えば、直交化学反応性を有する非天然アミノ酸を使用して、部位特異的抗体−オリゴヌクレオチド複合体を生成し、これが次に、規定される組成物、原子価および幾何学的形状を有する多量体複合体へと自己集合する。（例えば、Ｋａｚａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｅｐｕｂ：Ｄｅｃ．４，２０１２］を参照されたい）。
【０１２４】
治療用投与および製剤
本発明は、本発明の抗ＦＸＩＩ抗体またはその抗原結合断片を含む治療組成物を提供する。本発明による治療組成物は、好適な担体、賦形剤、および製剤に組み込まれる他の薬剤とともに投与され、改善された移入、送達、耐性などをもたらす。多数の適切な製剤は、すべての製薬化学者に既知の処方集に見出すことができる：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など）を含有する脂質（カチオン性またはアニオン性）、ＤＮＡ結合体、無水吸収ペースト、水中油エマルションおよび油中水エマルション、エマルションカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカーボワックスを含有する半固体混合物が含まれる。Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２：２３８−３１１も参照されたい。
【０１２５】
抗体の用量は、投与される対象の年齢およびサイズ、標的疾患、状態、投与経路などに応じて異なり得る。本発明の抗体が成人患者の疾患もしくは障害を治療するために、またはそのような疾患を予防するために使用される場合、通常約、本発明の抗体を、約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で投与することが有利である。病態の重症度に応じて、治療の頻度および期間を調整することができる。特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、約０．１ｍｇ〜約８００ｍｇ、約１ｍｇ〜約６００ｍｇ、約５ｍｇ〜約５００ｍｇ、または約１０ｍｇ〜約４００ｍｇの初期用量で投与され得る。特定の実施形態では、初期用量に続いて、初回用量とほぼ同じか、または初回用量未満の量で、２回目のもしくは複数回の後続用量の、抗体またはその抗原結合断片を投与され得、またはとほぼ同じか、またはそれ未満であり得る量で、後続用量は、少なくとも１日〜３日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、または少なくとも１４週間の間隔である。
【０１２６】
様々な送達系、例えば、リポソームにおける封入、微粒子、マイクロカプセル、変異体ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスが知られており、本発明の医薬組成物を投与するために使用され得る（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照されたい）。導入方法には、皮内経路、経皮経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。組成物は、例えば、注入もしくはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚内層（ｌｉｎｉｎｇｓ）（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収による任意の好都合な経路によって投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は全身または局所であり得る。医薬組成物はまた、小胞、特にリポソーム中で送達することもできる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３を参照されたい）。
【０１２７】
本発明の抗体を送達するためのナノ粒子の使用もまた、本明細書に企図される。抗体結合ナノ粒子は、治療用途および診断用途の両方に使用され得る。抗体結合ナノ粒子ならびに調製および使用方法は、Ａｒｒｕｅｂｏ，Ｍ．，２００９（“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”  ｉｎ  Ｊ．Ｎａｎｏｍａｔ．Ｖｏｌｕｍｅ  ２００９，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４３９３８９，２４  ｐａｇｅｓ，ｄｏｉ：１０．１１５５／２００９／４３９３８９）に詳細に記載されており、参照により本明細書に援用される。ナノ粒子は、開発され、標的細胞への医薬組成物中に含まれる抗体にコンジュゲートされ得る。薬物送達のためのナノ粒子は、例えば、米国特許第ＵＳ８２５７７４０号、または同第ＵＳ８２４６９９５号にも記載され、それぞれその全体が本明細書に援用される。
【０１２８】
ある特定の状況において、薬学的組成物は、徐放系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。さらに別の実施形態では、徐放系を組成物の標的の近傍に配置することができ、したがって、全身用量のほんの一部しか必要としない。
【０１２９】
注射可能な調製物としては、静脈内注射、皮下注射、頭蓋内注射、腹腔内注射および筋肉内注射、点滴などのための剤形が含まれ得る。これらの注射可能な調製物は、公的に既知の方法によって調製され得る。
【０１３０】
本発明の薬学的組成物は、標準的な針および注射器を用いて皮下にまたは静脈内に送達することができる。加えて、皮下送達に関して、ペン送達デバイスは、本発明の薬学的組成物を送達する上での適用を容易に有する。このようなペン送達デバイスは、再利用可能または使い捨て可能であり得る。再利用可能なペン送達デバイスは、概して、薬学的組成物を含有する交換可能なカートリッジを利用する。一度、カートリッジ内の薬学的組成物がすべて投与され、カートリッジが空になると、この空のカートリッジは容易に廃棄することができ、薬学的組成物を含有する新しいカートリッジと容易に交換することができる。次に、ペン送達デバイスは再利用することができる。使い捨てのペン送達デバイスにおいて、交換可能なカートリッジは存在しない。むしろ、使い捨てペン送達デバイスは、このデバイス内の貯蔵器の中に保持された薬学的組成物が事前に充填されている。一度、貯蔵器が薬学的組成物に関して空になると、デバイス全体が廃棄される。
【０１３１】
有益なことに、上記に記載される経口または非経口での使用のための薬学的組成物は、有効成分の用量に適合するために好適な単位用量の投薬形態へと調製される。このような単位用量の剤形には、例えば、錠剤、ピル、カプセル、注射（アンプル）、坐剤などが含まれる。含有される抗体の量は、概して、単位用量の剤形あたり約５〜約５００ｍｇであり、特に注射の形態では、抗体を約５〜約３００ｍｇ含有し、他の剤形については、約１０〜約３００ｍｇ含有することが好ましい。
【０１３２】
抗体の診断的使用
本発明の抗体は、凝固（血栓症および塞栓症を含む）もしくは浮腫（例えば、遺伝性血管浮腫）に関連する疾患もしくは障害もしくは状態の治療、および／または予防に有用で、ならびに／あるいはかかる疾患、障害もしくは状態に関連する少なくとも１つの症状の改善に有用である。特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片を、治療用量で、凝固または浮腫に関連する疾患または障害または状態を有する患者に投与され得る。特定の実施形態では、出血のリスクを増加させることなく、血栓症を予防するために、本発明の抗体またはその抗原結合断片を、それを必要とする対象に投与する。
【０１３３】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、静脈血栓症、動脈血栓症、デバイス血栓症、血栓栓塞栓症、遺伝性血管浮腫、脳卒中、血栓性素因、心虚血、アテローム硬化性プラーク破裂、機械弁プロステーシスの使用、血液接触医療デバイスの使用、血液接触体外回路の使用、静脈血栓塞栓症、肺塞栓症、深部静脈血栓症、門脈血栓症、バッド・キアリ症候群、パジェット・シュレッター病、腎静脈血栓症、脳静脈洞血栓症、頸静脈血栓症、海綿静脈洞血栓症、肝動脈血栓症、下肢虚血、および心筋梗塞からなる群から選択されるＦＸＩＩ関連疾患または障害のうちの少なくとも１つの症状または徴候を治療または予防するために有用である。
【０１３４】
本明細書ではまた、体外式膜型人工肺（人工心肺）を使用する対象などの血栓症のリスクがある対象に、本発明の１つ以上の抗体を予防的に使用することも企図される。本発明の抗体は、体外回路における人工肺およびチューブの血栓性閉塞を防止するために使用され得る。
【０１３５】
本発明のさらなる実施形態では、本抗体は、本明細書に開示される疾患、障害または状態に罹患している患者を治療するための医薬組成物または薬剤の調製のために使用される。本発明の別の実施形態では、本抗体は、本明細書に開示される疾患、障害または状態の治療または寛解に有用な任意の他の薬剤による補助療法または当業者に既知の任意の他の療法として使用される。
【０１３６】
併用療法
併用療法は、本発明の抗体および本発明の抗体と、または本発明の抗体の生物学的に活性な断片と有利に組み合わせ得る任意の追加の治療剤を含んでよい。本発明の抗体は、血栓症に関連する疾患または障害を治療するために、特に、血栓症を予防するために、または基礎疾患、障害または状態に起因する血栓症のリスクにある対象を治療するために使用される１つ以上の薬物または療法と相乗的に組み合わされ得る（本明細書の他箇所に記載される）。一部の実施形態では、本発明の抗体は、第２の治療剤と組み合わされて、当該疾患または状態のうちの１つ以上の症状を寛解し得る。
【０１３７】
疾患、障害または状態に応じて、本発明の抗体は、１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて使用することができ、限定されないが、抗凝固剤（例えば、ワルファリン、ヘパリン、フェニンジオン、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス）、トロンビン阻害剤（例えば、アルガトロバン、レピルジン、ビバリルジン、またはダビガトラン）、血栓溶解性薬、抗血小板薬（例えば、アスピリン）、降圧剤（例えば、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、β遮断剤、カルシウムチャネル遮断剤）、免疫抑制剤（例えば、ビンクリスチン、シクロスポリンＡ、またはメトトレキサート）、線維素溶解剤、コレステロール低下剤（例えば、スタチンまたはＰＣＳＫ９阻害剤、例えば、アリロクマブ）、抗炎症薬（例えば、コルチコステロイド、または非ステロイド性抗炎症薬）、第２の抗ＦＸＩＩ抗体、機械的血餅回収、カテーテル誘導血栓溶解、および外科手術を含む。
【０１３８】
本明細書で使用する場合、「と組み合わせて」という用語は、追加の治療活性成分（複数可）が、本発明の抗ＦＸＩＩ抗体の投与の前に、同時に、または後に投与され得ることを意味する。「と組み合わせて」という用語はまた、抗ＦＸＩＩ抗体と第２の治療剤との逐次投与または同時投与を含む。
【０１３９】
追加の治療活性成分（複数可）は、本発明の抗ＦＸＩＩ抗体の投与の前に、対象に投与され得る。例えば、第１の成分が、第２の成分の投与の１週間前、７２時間前、６０時間前、４８時間前、３６時間前、２４時間前、１２時間前、６時間前、５時間前、４時間前、３時間前、２時間前、１時間前、３０分前、または３０分未満前に投与される場合、第１の成分は、第２の成分の「前に」投与されると見なされ得る。他の実施形態では、追加の治療活性成分（複数可）は、本発明の抗ＦＸＩＩ抗体の投与後に、対象に投与され得る。例えば、第１の成分が、第２の成分の投与の３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後またはそれ以上後に投与される場合、第１の成分は、第２の成分の「後に」投与されると見なされ得る。さらに他の実施形態では、追加の治療活性成分（複数可）は、本発明の抗ＦＸＩＩ抗体の投与と同時に、対象に投与され得る。「同時」投与は、本発明の目的のために、例えば、抗ＦＸＩＩ抗体および追加の治療活性成分を、単一剤形で、対象に投与すること、または別個の剤形で、互いに約３０分以内もしくはそれ以下で、対象に投与することを含む。別個の剤形で投与される場合、各剤形は、同じ経路を介して投与されてもよい（例えば、抗ＦＸＩＩ抗体および追加の治療活性成分の両方が、静脈内など投与されてもよい）。あるいは、各剤形は、異なる経路を介して投与されてもよい（例えば、抗ＦＸＩＩ抗体が静脈内投与され、追加の治療活性成分が経口投与されてもよい）。いずれにしても、本開示の目的のために、成分を、同じ経路によって、単一剤形で、異なる剤形で投与すること、または異なる経路によって、異なる剤形で投与することは、すべて、「同時投与」と見なされる。本開示の目的のために、追加の治療活性成分の投与「前に」、「と同時に」、または「後に」（本明細書で上に定義したそれらの用語）抗ＦＸＩＩ抗体を投与することは、追加の治療活性成分と「組み合わせて」、抗ＦＸＩＩ抗体を投与することと見なされる。
【０１４０】
本発明には、本発明の抗ＦＸＩＩ抗体が、本明細書の他箇所に記載の追加の治療活性成分（複数可）のうちの１つ以上と共製剤化された医薬組成物が含まれる。
【０１４１】
抗体の診断的使用
本発明の抗体は、例えば、診断目的のために、試料中のＦＸＩＩを検出および／または測定するために使用してもよい。一部の実施形態は、ＦＸＩＩ関連疾患または障害を検出するためのアッセイにおいて、本発明の１つ以上の抗体の使用を企図する。ＦＸＩＩについての例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を、本発明の抗ＦＸＩＩ抗体と接触させることを含んでいてもよく、抗ＦＸＩＩ抗体は、検出可能な標識もしくはレポーター分子で標識されるか、または患者試料由来のＦＸＩＩを選択的に単離するための捕捉リガンドとして使用される。あるいは、非標識抗ＦＸＩＩ抗体は、それ自体が検出可能に標識された二次抗体と組み合わせて、診断用途に使用することができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓもしくは１２５Ｉなどの放射性同位体、またはフルオレセインイソチオシアネートもしくはローダミンなどの蛍光部分もしくは化学発光部分、またはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素であり得る。試料中のＦＸＩＩを検出または測定するために使用することができる具体的な例示的アッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が含まれる。
【０１４２】
本発明によるＦＸＩＩ診断アッセイにおいて使用することができる試料には、正常条件または病理学的条件下で、検出可能な量のＦＸＩＩタンパク質またはその断片を含有する患者から得ることのできる任意の組織または体液試料が含まれる。一般に、健常な患者（例えば、ＦＸＩＩと関連した疾患に罹患していない患者）から得られた特定の試料中のＦＸＩＩタンパク質のレベルは、ＦＸＩＩのベースラインレベルまたは標準レベルを最初に確立するために測定されるであろう。次いで、このＦＸＩＩのベースラインレベルを、ＦＸＩＩ関連の状態またはその状態に関連する症状を有することが疑われる個体から得られた試料において測定されたＦＸＩＩのレベルに対して比較することができる。
【０１４３】
ＦＸＩＩタンパク質に特異的な抗体は、追加の標識または部分を含有していなくてもよく、または、それらが、Ｎ末端またはＣ末端の標識または部分を含有していてもよい。一実施形態では、標識または部分は、ビオチンである。結合アッセイでは、標識の位置は（もしあれば）、ペプチドが結合する表面に対するペプチドの配向を決定し得る。例えば、表面がアビジンでコーティングされている場合、Ｎ末端ビオチンを含有するペプチドは、ペプチドのＣ末端部分が表面に対して遠位になるように配向される。
【実施例】
【０１４４】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作製および使用するかに関する完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが本発明と見なすことの範囲を限定することを企図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力はしてきたが、いくつかの実験上の誤差および偏差が考慮されるべきである。特に指示しない限り、部（ｐａｒｔｓ）は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、室温は約２５℃であり、気圧は大気圧またはそれに近い。
【０１４５】
実施例１：第ＸＩＩ因子／活性化第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ）タンパク質に対するヒト抗体の生成
ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａタンパク質に対するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいて生成された。マウスを、血漿精製ヒトＦＸＩＩおよびＦＸＩＩａタンパク質（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で免疫化した。
【０１４６】
抗ＦＸＩＩ抗体は、米国特許第７５８２２９８号（参照によりその全体が本明細書に具体的に援用される）に記載されているように、骨髄腫細胞に融合することなく、抗原陽性マウスＢ細胞から直接単離した。この方法を使用して、いくつかの完全ヒト抗ＦＸＩＩ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびヒト定常ドメインを有する抗体）を得、この様式で生成された例示的抗体を、ｍＡｂ２６０３６、ｍＡｂ２６０４８、ｍＡｂ２６０４９、およびｍＡｂ２６０７６と命名した。
【０１４７】
この実施例の方法に従って生成された例示的な抗体の生物学的特性を、以下に記載の実施例において詳細に記載する。
【０１４８】
実施例２：重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列および核酸配列
表１は、本発明の選択された抗ＦＸＩＩ抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を示す。
【表１】
2021527424.tif 000002
【０１４９】
対応する核酸配列識別子を表２に示す。
【表２】
2021527424.tif 000003
【０１５０】
本明細書で言及される抗体は、典型的には、完全ヒト可変領域を有するが、ヒトまたはマウス定常領域を有し得る。当業者に理解されるように、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換され得る（例えば、マウスＩｇＧ１Ｆｃを有する抗体は、ヒトＩｇＧ４を有する抗体に変換され得る等）が、いずれにしても、表２に示される数値識別子によって示される可変ドメイン（ＣＤＲを含む）は、同じままであり、抗原への結合特性は、Ｆｃドメインの性質にかかわらず同一であるか、または実質的に類似していると予測される。特定の実施形態では、マウスＩｇＧ１Ｆｃを有する選択された抗体は、ヒトＩｇＧ４Ｆｃを有する抗体に変換される。一実施形態では、ＩｇＧ４Ｆｃドメインは、米国特許出願第ＵＳ２０１０／０３３１５２７号に開示されている２つ以上のアミノ酸変化を含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ４Ｆｃは、二量体の安定化を促進するために、ヒンジ領域におけるセリンからプロリンへの変異（Ｓ１０８Ｐ）を含む。
【０１５１】
以下の実施例で使用される対照構築物
比較目的のために、以下の対照構築物（抗ＦＸＩＩ抗体）を本明細書に開示される実験に含めた：「比較対象１」は、米国特許第９，５１８，１２７号（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  ＧｍｂＨ）による抗体「３Ｆ７」のＶＨ／ＶＬ配列を有するヒトＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａに対するモノクローナル抗体であり、および「比較対象２」は、米国特許第９，５７４，０１３号（Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ  Ｕｎｉｖ．／Ａｒｏｎｏｒａ）による抗体「１５Ｈ８」のＶＨ／ＶＬ配列を有するヒトＦＸＩＩに対するヒトモノクローナル抗体である。
【０１５２】
実施例３：表面プラズモン共鳴によって決定される、ＦＸＩＩへの抗体結合
精製された抗ＦＸＩＩモノクローナル抗体に結合する異なるＦＸＩＩ試薬の平衡解離定数（ＫＤ）は、リアルタイム表面プラズモン共鳴ベースのＢｉａｃｏｒｅ４０００バイオセンサーを使用して決定された。すべての結合研究は、２５℃および３７℃で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３００ｍＭのＮａＣｌ、および０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ−Ｐ）の泳動用緩衝液中で行われた。ＢｉａｃｏｒｅＣＭ５センサーチップの表面を、最初にマウス抗ヒトＦｃ特異的モノクローナル抗体（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３９）とのアミンカップリングによって誘導体化して、抗ＦＸＩＩモノクローナル抗体を捕捉した。結合研究は、ヒトＦＸＩＩおよびＦＸＩＩａ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，それぞれＣａｔ＃１２１２および１２１２ａ）で行った。異なる濃度のｈＦＸＩＩおよびｈＦＸＩＩａ（５０ｎＭ〜３．１２５ｎＭ、２倍段階希釈）を、最初にＨＢＳ−Ｐ泳動用緩衝液において調製し、抗ヒトＦｃ捕捉抗ＦＸＩＩモノクローナル抗体の表面上に、３０μＬ／分の流量で３分間注入し、この間、モノクローナル抗体結合ＦＸＩＩ試薬の解離を、ＨＢＳ−Ｐ泳動用緩衝液中で５分間監視した。会合速度（ｋａ）および解離速度（ｋｄ）の定数は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ｃ曲線あてはめソフトウェアを使用して、リアルタイム結合センサーグラムを、物質移動限界（ｍａｓｓ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）を有する１：１結合モデルにあてはめることによって決定された。結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を、運動速度から以下のように計算した：
【数１】
2021527424.tif 000004
【０１５３】
２５℃および３７℃での本発明の異なる抗ｈＦＸＩＩモノクローナル抗体に結合するｈＦＸＩＩまたはｈＦＸＩＩａの結合動態パラメータを、表３〜６に示す。
【表３】
2021527424.tif 000005
【表４】
2021527424.tif 000006
【表５】
2021527424.tif 000007
【表６】
2021527424.tif 000008
【０１５４】
表３に示すように、抗体は、２５℃で、０．８８ｎＭ〜３．１２ｎＭの範囲のＫＤ値で、ｈＦＸＩＩに結合した。表４に示すように、抗体は、３７℃で、２．５３ｎＭ〜１６．８ｎＭの範囲のＫＤ値で、ｈＦＸＩＩに結合した。
【０１５５】
表５に示すように、抗体は、２５℃で、０．６１ｎＭ〜５．０７ｎＭの範囲のＫＤ値で、ｈＦＸＩＩａに結合した。表６に示すように、抗体は、３７℃で、１．７９ｎＭ〜８．２５ｎＭの範囲のＫＤ値で、ｈＦＸＩＩａに結合した。
【０１５６】
実施例４：オクテット交差競合アッセイ
抗ＦＸＩＩモノクローナル抗体のパネル間の結合競合は、ＯｃｔｅｔＨＴＸバイオセンサー（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｃｏｒｐ．）でのリアルタイム無標識バイオレイヤー干渉法アッセイを使用して決定した。実験は、プレートを１０００ｒｐｍの速度で振盪しながら、２５℃で、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（Ｏｃｔｅｔ  ＨＢＳ−Ｐ緩衝液）中で行われた。２つの抗体が、約０．４２〜０．５３ｎＭの抗ヒトＦＸＩＩモノクローナル抗体中で、ヒトＦＸＩＩ（ＥＲＬ）上のそれぞれのエピトープへの結合について、互いに競合することができたかどうかを評価するために、まず、チップを、５０μｇ／ｍＬの抗ヒトＦＸＩＩモノクローナル抗体（以降、ｍＡｂ−１と呼ぶ）溶液を含むウェルに３分間浸すことによって、抗ｈＦｃ抗体でコーティングされたＯｃｔｅｔバイオセンサーチップ（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｃｏｒｐ．，＃１８−５０６０）上に捕捉した。次いで、抗体を捕捉したバイオセンサーチップを、２００μｇ／ｍＬのブロッキングｍＡｂ溶液を含有するウェルに４分間浸すことによって、ｍＡｂアイソタイプの対照モノクローナル抗体（以降、ブロッキングｍＡｂと呼ぶ）で飽和させた。その後、バイオセンサーチップを、事前に２時間インキュベートされた２５ｎＭのｈＦＸＩＩおよび１μＭの第２の抗ヒトＦＸＩＩモノクローナル抗体（以降、ｍＡｂ−２と呼ぶ）の共複合体化溶液を含むウェルに浸した。バイオセンサーチップは、実験の各ステップ間に、オクテットＨＢＳ−Ｐ緩衝液で洗浄した。リアルタイム結合応答を、実験の過程中監視し、各ステップの終わりに結合応答を記録した。ｍＡｂ−１に結合する、ヒトＦＸＩＩと事前に複合体化されたｍＡｂ−２の応答を、バックグラウンド結合に対して修正し、比較し、異なる抗ＦＸＩＩモノクローナル抗体の競合／非競合挙動を決定した。
【表７】
2021527424.tif 000009
【０１５７】
表７は、結合の順序に関係なく、両方向で競合する抗体の関係を明示的に定義する。
【０１５８】
実施例５：抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体の阻害活性を決定するための機能的血漿アッセイ
この実施例は、選択された抗体の阻害活性を記載し、４回の機能的血漿アッセイによって決定された。エラグ酸によって誘発された１）活性化部分トロンボプラスチンの時間（ａＰＴＴ）、２）プロトロンビンの時間（ＰＴ）、３）トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）、および組織因子によって誘発された４）ＴＧＡ。ａＰＴＴ試験は、カルシウムおよびエラグ酸の添加後に凝固が形成される時間を測定することによって、凝固カスケードの内因性経路および共通経路のすべての凝固因子を評価するが、ＰＴ試験は、カルシウムおよび組織因子の添加後に凝固カスケードの外因性経路および共通経路のすべての凝固因子を評価する。エラグ酸によって誘発されるＴＧＡは、内因性経路および共通経路を介して生成されるトロンビンの速度および量を測定するが、組織因子によって誘発されるＴＧＡは、外因性経路および共通経路を介して生成されるトロンビンの速度および量を測定する。
【０１５９】
ａＰＴＴの測定
ａＰＴＴは、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ  ＳＴａｒｔ４止血分析器で、以下の方法で決定された：３７℃で合計５０μＬのプールされた正常ヒト血漿をキュベットに添加した。１分後、５μＬのＰＢＳ中の２倍段階希釈した試験物質（抗体または小分子阻害剤）をキュベットに添加し、５分間インキュベートさせた。次いで、５０μＬのＡＰＰＴ−ＸＬエラグ酸（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、３００秒間インキュベートした後、５０μＬの２０ｍＭ塩化カルシウム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加して、反応を開始した。試験物質濃度の測定された凝固時間を、ベースライン（薬物なし）血漿凝固時間に正規化し、試験物質の対数モル濃度に対してプロットした。Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いた非線形回帰（４パラメータロジスティクス）を使用して結果を分析して、倍加時間濃度を得た。
【０１６０】
ＰＴ決定
ＰＴは、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ  ＳＴａｒｔ４止血分析器で、以下の方法で決定された：３７℃で合計５０μｌのプールされた正常ヒト血漿をキュベットに添加した。１分後、５μＬのＰＢＳ中の２倍段階希釈した試験物質（抗体または小分子阻害剤）をキュベットに添加し、５分間インキュベートさせた。次いで、１００μｌの組織因子（ＴｒｉｎｉＣＬＯＴ  ＰＴ  Ｅｘｃｅｌ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ）を添加して、反応を開始した。試験物質濃度の測定された凝固時間を、ベースライン（薬物なし）血漿凝固時間に正規化し、試験物質の対数モル濃度に対してプロットした。Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いた非線形回帰（４パラメータロジスティクス）を使用して結果を分析して、倍加時間濃度を得た。
【０１６１】
エラグ酸を用いたＴＧＡの決定
トロンビン生成プロファイルを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｅｍｋｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅで、以下の方法で決定した：３７℃で、合計５５ｕｌのプールされた正常ヒト血漿を、マイクロプレートのウェルに添加した。次いで、ＰＢＳ中５μｌの２倍段階希釈された試験物質（抗体または小分子阻害剤）をマイクロプレートのウェルに添加し、３０分間インキュベートさせた。１５μｌのＡＰＰＴ−ＸＬエラグ酸（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＭＰ試薬中に希釈し、次いでウェルに添加し、４５分間インキュベートさせた。次いで、１５ｕｌのＦｌｕｏ  Ｆｌｕ  Ｃａｌ基質（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ）を添加して直ぐに、連続９０分間マイクロプレートを読み取った。測定されたリアルタイムトロンビン濃度値を、時間に対してプロットして、使用した試験物質の各濃度についてトロンボグラム（ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｍ）を得た。
【０１６２】
組織因子を用いたＴＧＡの決定
トロンビン生成プロファイルを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｅｍｋｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅで、以下の方法で決定した：３７℃で、合計５５ｕｌのプールされた正常ヒト血漿を、マイクロプレートのウェルに添加した。次いで、ＰＢＳ中５μｌの２倍段階希釈された試験物質（抗体または小分子阻害剤）をマイクロプレートのウェルに添加し、３０分間インキュベートさせた。１５μｌの組織因子ＰＰＰ試薬（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ）をウェルに添加して、４５分間インキュベートさせた。次いで、１５ｕｌのＦｌｕｏ  Ｆｌｕ  Ｃａｌ基質（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ）を添加して直ぐに、連続９０分間マイクロプレートを読み取った。測定されたリアルタイムトロンビン濃度値を、時間に対してプロットして、使用した試験物質の各濃度についてトロンボグラム（ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｍ）を得た。
【０１６３】
結果
用量反応曲線を生成して、血漿ａＰＴＴおよびＰＴに対する各薬物の効果を決定した。ＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体は、ａＰＴＴまたはＰＴに影響を及ぼさなかった。抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体（ｍＡｂ２６０３６、ｍＡｂ２６０４８、ｍＡｂ２６０４９、およびｍＡｂ２６０７６）は、ＰＴを増加させることなく、ａＰＴＴを延長した。臨床的に承認された抗凝固剤ＦＸａ阻害剤であるアピキサバンは、μＭ濃度で、ａＰＴＴとＰＴの両方を延長した。比較対象１は、ＰＴを増加させることなくａＰＴＴを延長した。凝固活性を阻害する薬物の効率は、任意の「倍加時間」濃度または、Ｃ２ｘｔ（凝固時間をベースライン値よりも２倍延長するために必要な薬物の濃度）によってインデックス化する。薬物のこれらの推定Ｃ２ｘｔ値（すなわち、「倍加時間線」を横切る曲線）を、表８に列挙する。
【表８】
2021527424.tif 000010
【０１６４】
抗体ｍＡｂ２６０３６、ｍＡｂ２６０４８およびｍＡｂ２６０４９は、２００ｎＭ以下でＣ２ｘｔに達したが、ｍＡｂ２６０７６は、２５０ｎＭを必要とした。すべての抗体について、試験された最大４ｕＭで、ＰＴ凝固時間を倍増することは見出されなかった。アピキサバンは、７ｕＭでａＰＴＴ  Ｃ２ｘｔに達し、これは、ＰＴ  Ｃ２ｘｔを達成するのに必要な３．５ｕＭの濃度よりも大きかった。比較対象１は、ａＰＴＴ  Ｃ２ｘｔに達するために２５０ｎＭを必要としたが、４ｕＭでもＰＴ  Ｃ２ｘｔに達しなかった。
【０１６５】
血漿をエラグ酸または組織因子によって誘発したとき、抗体を、トロンビン生成を阻害するそれらの能力について評価した（すなわち、トロンビンの検出までの延長時間＝遅延時間、トロンビンのピークの減少、および生成されたトロンビンの総量の減少＝内因性トロンビン生成能）。アイソタイプ対照は、トロンビン生成には影響を与えなかった。抗体は、１２５ｎＭでのトロンビン生成のわずかな減少を示したが、２５０ｎＭ以上の濃度でのトロンビン産生を著しくまたは完全に阻害し、これは、抗体が、次いでトロンビン生成を妨げる内因性経路の活性化を抑制することを示す。アピキサバンは、トロンビン生成の用量依存的減少を示したが、使用した最高用量（５００ｎＭ）でも、２倍の遅延時間または１／２のＥＴＰまたはピークに達することができなかった。比較対象１は、５００ｎＭでのほぼ完全な阻害で、トロンビン生成に対する用量依存的な効果を示した。組織因子によって誘発されたトロンビン生成は、対照アイソタイプ抗体の影響を受けなかった。抗体は、組織因子によって誘発されるトロンビン生成を阻害しなかった。組織因子によって誘発されると、アピキサバンは、用量依存的に、トロンビン生成を阻害した。比較対象１は、組織因子によって誘発されたトロンビン生成には影響を与えなかった。凝固をエラグ酸または組織因子によって活性化したときに、遅延時間を２倍延長し、トロンビンのピークおよびトロンビン生成の総量を半減するのに必要な試験物質の濃度を、表９に要約する。
【表９】
2021527424.tif 000011
【０１６６】
上記の結果は、例示した抗体が、外因性経路を阻害することなく、内因性経路によるトロンビン生成を阻害することを示す。
【０１６７】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて本発明の様々な修正は、前述の記載および添付の図から当業者には明らかであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
【配列表】
2021527424000001.app
【国際調査報告】
2021527424.tif 000012
2021527424.tif 000013
2021527424.tif 000014
2021527424.tif 000015
2021527424.tif 000016