(57)【要約】本発明は、ＳＴＩＮＧアゴニストを含む抗原性補強剤組成物及びワクチン組成物に関するものであって、本発明に係るＳＴＩＮＧアゴニストを含む抗原性補強剤組成物及びワクチン組成物は、様々な体内免疫反応を効果的に活性化させることができるだけでなく、結核菌の感染を大幅に減少させる効果を確認したので、結核菌だけでなく、他の病原菌のワクチンと一緒に使用すると、従来の感染予防用ワクチンの効果を著しく増加させ、様々な病原菌の感染を効果的に低減させることができるものと期待される。
2021535930.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅｓ  ａｇｏｎｉｓｔ）を有効成分として含む、抗原性補強剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）の組成物。
【請求項２】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ  ｄｉｇｕａｎｙｌａｔｅ）、ｃＧＡＭＰ、３’３’−ｃＧＡＭＰ、ｃ−ｄｉ−ＧＡＭＰ、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ、及び２’３’−ｃＧＡＭＰからなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項１記載の抗原性補強剤組成物。
【請求項３】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ  ｄｉｇｕａｎｙｌａｔｅ）、ｃＧＡＭＰ、３’３’−ｃＧＡＭＰ、ｃ−ｄｉ−ＧＡＭＰ、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ、２’３’−ｃＧＡＭＰ、１０（カルボキシメチル）９（１０Ｈ）アクリドン（ＣＭＡ）（１０−（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）９（１０Ｈ）ａｃｒｉｄｏｎｅ（ＣＭＡ））、５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（５，６−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｅｎｏｎｅ−４−ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ−ＤＭＸＡＡ）、メトキシイソフラボン（ｍｅｔｈｏｘｙｖｏｎｅ）、６、４’−ジメトキシフラボン（６、４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ）、４’−メトキシフラボン（４’−ｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ）、３’、６’−ジヒドロキシイソフラボン（３’、６’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ）、７、２’−ジヒドロキシフラボン（７、２’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ）、ダイゼン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）、ホルモノネチン（ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ）、レツシン７−メチルエーテル（ｒｅｔｕｓｉｎ  ７−ｍｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒ）とキサントン（ｘａｎｔｈｏｎｅ）からなる群から選択された一つ以上である請求項１記載の抗原性補強剤組成物。
【請求項４】
前記組成物は、ＭＰＬ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）とＧＬＡ−ＳＥ（Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ、ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ｎａｎｏ−ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）のうちの少なくとも一つの抗原性補強剤をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の抗原性補強剤組成物。
【請求項５】
前記抗原性補強剤は、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）に封入されているものであることを特徴とする請求項４記載の抗原性補強剤組成物。
【請求項６】
ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅｓ  ａｇｏｎｉｓｔ）と抗原を有効成分として含むことを特徴とする、ワクチン組成物。
【請求項７】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ  ｄｉｇｕａｎｙｌａｔｅ）、ｃＧＡＭＰ、３’３’−ｃＧＡＭＰ、ｃ−ｄｉ−ＧＡＭＰ、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ、及び２’３’−ｃＧＡＭＰからなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項６記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ  ｄｉｇｕａｎｙｌａｔｅ）、ｃＧＡＭＰ、３’３’−ｃＧＡＭＰ、ｃ−ｄｉ−ＧＡＭＰ、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ、２’３’−ｃＧＡＭＰ、１０（カルボキシメチル）９（１０Ｈ）アクリドン（ＣＭＡ）（１０−（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）９（１０Ｈ）ａｃｒｉｄｏｎｅ（ＣＭＡ））、５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（５，６−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｅｎｏｎｅ−４−ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄスルＤＭＸＡＡ）、メトキシイソフラボン（ｍｅｔｈｏｘｙｖｏｎｅ）、６、４’−ジメトキシフラボン（６、４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ）、４’−メトキシフラボン（４’−ｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ）、３’、６’−ジヒドロキシフラボン（３’、６’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ）、７、２’−ジヒドロキシフラボン（７、２’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ）、ダイゼン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）、ホルモノネチン（ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ）、レツシン７−メチルエーテル（ｒｅｔｕｓｉｎ  ７−  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒ）とキサントン（ｘａｎｔｈｏｎｅ）からなる群から選択された一つ以上である請求項６記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記組成物は、ＭＰＬ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）とＧＬＡ−ＳＥ（Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ、ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ｎａｎｏ−ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）のうちの少なくとも一つの抗原性補強剤をさらに含むことを特徴とする請求項６記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記抗原性補強剤は、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）に封入されているものであることを特徴とする請求項９記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記抗原は、結核菌特異的抗原であることを特徴とする請求項６記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
前記結核菌特異的な抗原は、ＥＳＡＴ−６であることを特徴とする請求項１１記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
前記ワクチン組成物は、結核菌の感染を予防するものであることを特徴とする請求項６記載のワクチン組成物。 
【請求項１４】
ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅｓ  ａｇｏｎｉｓｔ）と抗原を個体に投与する段階；を含むことを特徴とする感染症予防方法。 
【請求項１５】
請求項１４に記載のＭＰＬ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）とＧＬＡ−ＳＥ（Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ、ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ｎａｎｏ−ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）のうちの少なくとも一つの抗原性補強剤をさらに個体に投与する段階；を含む、感染症予防方法。 
【請求項１６】
請求項１４及び１５記載の前記感染症は結核である、感染症予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＴＩＮＧアゴニストを含む抗原性補強剤組成物、ワクチン組成物、及びこれを用いた感染症予防方法に関する。
また、本発明は、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び抗原性補強剤を含むワクチン組成物、及びこれを用いた感染症予防方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンの開発に当たって様々な戦略が用いられてきた。生菌又は弱毒化された菌から作られたワクチンは、非常に効果的ではあるが、回帰発症の恐れや、しばしば自己複製などの問題により、安定上の問題が頻繁に報告されている。死菌を用いたワクチンの場合でも、治療には効果的であるが、ＬＰＳのような毒性物質が含まれうるという問題点と、生菌が存在しうる可能性があるとして知られており（Ｒｙａｎ  ＥＪ ｅｔ  ａｌ．、２００１）、このような限界を克服するために開発されたＤＮＡワクチンもまた宿主のゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）上に挿入され、突然変異の発生率を高めたり（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ）、発がん遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ）としての可能性が浮上している。その一方、サブユニットワクチンの場合、精製された抗原を使用するため、他のワクチンより安定的といえる。しかし、このように精製された抗原は、しばしば免疫原性が乏しいため、これらの免疫原性を増進させてあげるために、強力な抗原性補強剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）が求められる。
一方、（ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ ｃｙｃｌｉｃ  ｄｉｇｕａｎｙｌａｔｅ）は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍにてセルロースの産生を調節する細胞内シグナル伝達物質として初めて解明された。このようなｃ−ｄｉ−ＧＭＰを介したシグナル伝達は、真核生物では、存在しておらず、細菌でのみ特徴的に存在するとして報告されている。細菌内のｃ−ｄｉ−ＧＭＰは、シグナル伝達の二次メッセンジャー（ｓｅｃｏｎｄ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ）としての役割も報告されているが、特に細菌の生存に重要なバクテリアの運動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）、接着性（ａｄｈｅｓｉｏｉｎ）、細胞間の相互作用（ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）、生物膜（ｂｉｏｆｉｌｍ）の形成、細胞外多糖類（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）合成などの生理学的機序を調節するとして知られている。重要なこととして、これらの細菌由来のｃ−ｄｉ−ＧＭＰが宿主の細胞質センサー（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｓｅｎｓｏｒ）であるスティング（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ＩＦＮ  ｇｅｎｅ；ＳＴＩＮＧ）のリガンド（ｌｉｇａｎｄ）として作用し、ＴＢＫ１−ＩＲＦ３を介したＴｙｐｅ  Ｉ  ＩＦＮの産生とＮＦ−κＢパラメータサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の産生を誘導すると報告されており、近来、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰのようなＳＴＩＮＧアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）が抗原特異的Ｔ細胞（ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ）と体液性免疫反応（ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を促進させることができるということが明らかになった。
したがって、本発明者等は、ＳＴＩＮＧアゴニストをワクチンの抗原性補強剤として使用可能であるか否かを確認するために、本実験を行った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、前記のような従来の技術上の問題点を解決すべく見出されたものであって、ＳＴＩＮＧアゴニストを有効成分として含む、抗原性補強剤組成物及び該組成物に抗原をさらに含むワクチン組成物を提供することをその目的とする。
しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で述べた課題に制限されず、言及されていないもう一つの課題は、以下の記載において当業界で通常の知識を有する者に明確に理解されることができるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅｓ  ａｇｏｎｉｓｔ）を有効成分として含む抗原性補強剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）組成物を提供する。
また、本発明は、ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅｓ  ａｇｏｎｉｓｔ）及び抗原を個体に投与する段階；を含む感染症予防方法を提供する。
【発明の効果】
【０００５】
本発明に係るＳＴＩＮＧアゴニストを含む抗原性補強剤組成物及びワクチン組成物は、様々な体内の免疫反応を効果的に活性化させることができるばかりでなく、結核菌の感染を大幅に減少させる効果が確認されたので、結核菌だけでなく、他の病原菌のワクチンと一緒に用いると、従来の感染予防用ワクチンの効果をより一層増進させ、様々な病原菌の感染を効果的に低減させることができるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】ｃ−ｄｉ−ＧＭＰの抗原性補強剤としての効能を検証するための実験デザインを示す図である。
【図１Ｂ】ＥＳＡＴ−６抗原に基づくＭＰＬ又はｃ−ｄｉ−ＧＭＰにより免疫機能が活性化されたマウスの脾臓細胞に、ＥＳＡＴ−６タンパク質による刺激後、ＩＦＮ−γ産生能が確認された結果を示す図である。
【図１Ｃ】免疫機能が活性化されたマウスにおいて、ＥＳＡＴ−６抗原特異的な抗体の産生が確認された結果を示す図である。
【図１Ｄ】免疫機能が活性化されたマウスの脾臓と肺組織に浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）したメモリーＴ細胞を解析した結果を示す図である。
【図２Ａ】多機能性Ｔ細胞の解析方法を示す図である。
【図２Ｂ】ＥＳＡＴ−６抗原に基づくＭＰＬ又はｃ−ｄｉ−ＧＭＰにより免疫機能が活性化されたマウスの肺と脾臓細胞において、ＥＳＡＴ−６タンパク質を用いた刺激により誘導される抗原特異的な多機能性Ｔ細胞の割合を示す図である。
【図３Ａ−Ｂ】ＥＳＡＴ−６抗原に基づくＭＰＬ又はｃ−ｄｉ−ＧＭＰにより免疫機能が活性化されたマウスに結核菌を感染させた後、１６週間後に肺組織を組織病理学的に解析した結果を示す図である。
【図３Ｃ】肺と脾臓の結核菌の細菌数を測定した結果を示す図である。
【図４Ａ】ｃ−ｄｉ−ＧＭＰと従来のＭＰＬ抗原性補強剤に対する相乗効果を確認するための実験デザインを示す図である。
【図４Ｂ】免疫機能が活性化されたマウスにおいて、Ｔ細胞の活性を解析した結果を示す図である。
【図４Ｃ】免疫機能が活性化されたマウスにおいて、ＥＳＡＴ−６抗原特異的な抗体の産生を時期別に確認した結果を示す図である。
【図４Ｄ】免疫化されたマウスにおいて、胚中心（ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ）関連Ｔ細胞とＢ細胞の割合を分析した結果を示した図である。
【図５Ａ】ＥＳＡＴ−６抗原に基づくＭＰＬ又はｃ−ｄｉ−ＧＭＰ／ＭＰＬで免疫機能が活性化されたマウスに結核菌を感染させた後、４週間後に肺組織を組織病理学的に解析した結果を示す図である。
【図５Ｂ】肺で増殖した結核菌の数を測定した結果を示す図である。
【図５Ｃ】免疫化が完了したマウスに結核菌を感染させた後、４週間後に肺と脾臓から細胞を生体外分離し、ＥＳＡＴ−６タンパク質による刺激を通じて抗原特異的多機能性Ｔ細胞を解析した結果を示す図である。
【図６】ＥＳＡＴ−６抗原に基づくｃ−ｄｉ−ＧＭＰ及び／又はＧＬＡ−ＳＥで免疫機能が活性化されたマウスの肺と脾臓細胞において、ＥＳＡＴ−６タンパク質による刺激により誘導される抗原特異的多機能性Ｔ細胞の割合を示す図である。
【図７】免疫機能が活性化されたマウスにおいて、Ｔ細胞の活性を解析した結果を示す図である。
【図８】ＥＳＡＴ−６抗原に基づくＧＬＡ−ＳＥ単独又はｃ−ｄｉ−ＧＭＰとＧＬＡ−ＳＥにより免疫機能が活性化されたマウスの肺と脾臓において、結核菌の数を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、本明細書に記載された様々な具体例が図面を参照にして記載される。以下の説明では、本発明を完全に理解するための様々な特異的な詳細事項、例えば、特異的な形態、組成物、及び工程などが記載されている。しかし、特定の具体例は、これらの特異的な詳細事項のうち一つ以上なしに、又は他の公知された方法及び形態と共に実行することができる。もう一つの例において、公知の工程及び製造技術は、本発明を不要に曖昧にしないようにするために、特定の詳細事項として記載されていない。「一つの具体例」又は「具体例」に対する本明細書の全体に亘る参照は、具体例と結びつけられて記載された特別な特徴、形状、組成、又は特性が、本発明の一つ以上の具体例に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体に亘る様々な位置で表現された「一つの具体例において」又は「具体例」の状況は、必ず本発明と同一の具体例を示すものではない。加えて、特別な特徴、形態、組成、又は特性は、一つ以上の具体例で何らかの適切な方法で組み合わせることができる。
明細書において断りがない限り、本明細書に使用されたすべての科学的及び技術的な用語は、本発明が属する技術分野において当業者によって通常、理解されるものと同じ意味を有する。
本発明は、ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅｓ  ａｇｏｎｉｓｔ）を有効成分として含む抗原性補強剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）組成物及びＳＴＩＮＧアゴニスト（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅｓ  ａｇｏｎｉｓｔ）と抗原を有効成分として含むワクチン組成物を提供する。
本発明の一具体例において、前記ＳＴＩＮＧアゴニストは、好ましくは、ＳＴＩＮＧシグナル伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）させることができるＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド断片、化合物などであり、さらに好ましくは、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ  ｄｉｇｕａｎｙｌａｔｅ）、ｃＧＡＭＰ、３’３’−ｃＧＡＭＰ、ｃ−ｄｉ−ＧＡＭＰ、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ、２’３’−ｃＧＡＭＰ、１０（カルボキシメチル）９（１０Ｈ）アクリドン（ＣＭＡ）（１０−（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）９（１０Ｈ）ａｃｒｉｄｏｎｅ（ＣＭＡ））、５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（５，６−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｅｎｏｎｅ−４−ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ―ＤＭＸＡＡ）、メトキシイソフラボン（ｍｅｔｈｏｘｙｖｏｎｅ）、６、４’−ジメトキシフラボン（６、４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ）、４’−メトキシフラボン（４’−ｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ）、３’、６’−ジヒドロキシフラボン（３’、６’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ）、７、２’−ジヒドロキシフラボン（７、２’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ）、ダイゼン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）、ホルモノネチン（ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ）、レツシン７−メチルエーテル（ｒｅｔｕｓｉｎ  ７−ｍｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒ）及びキサントン（ｘａｎｔｈｏｎｅ）などであるが、ＳＴＩＮＧに結合してシグナル伝達を活性化させることができる物質であれば、これに制限されない。
本発明のもう一つの具体例において、前記抗原性補強剤組成物は、従来知られている他の抗原性補強剤をさらに含むことができ、他の抗原性補強剤としては、好ましくは、モノホスホリルリピドＡ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ、ＭＰＬ）及びＧＬＡ−ＳＥ（Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ、ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ｎａｎｏ−ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）のうちの少なくとも一つを含むことができる。
本発明のもう一つの具体例において、前記抗原性補強剤は、好ましくは、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）に封入されていることができるが、体内に注入されやすい形であれば、これらに制限されない。
本発明のもう一つの具体例において、前記抗原は、病原菌の特異的な抗原であり、好ましくは、結核菌の特異的抗原であり、さらに好ましくはＥＳＡＴ−６抗原であるが、従来、サブユニットワクチンに用いれている抗原であれば、これに制限されない。
本発明のもう一つの具体例において、前記ワクチン組成物は、結核菌の感染を予防することを特徴とする。
本発明の組成物は、病原菌予防用効果を有する公知の有効成分を１種以上含有することができる。
また、本発明の組成物は、投与のために、前記に記載した有効成分の外に、追加で薬学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造することができる。薬学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、スクロース溶液、グリセロール、エタノール、及びこれらの成分のうち１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑油を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤に製剤化することができる。さらに、当分野の適正な方法、又は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（最新版）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡに開示されている方法を用いて、各疾患又は成分に応じて好ましく製剤化することができる。
本発明の組成物は、所望の方法に従って、経口投与又は非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内又は局所に適用）することができ、投与量は、投与対象の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度などによってその範囲が多様である。
また、本発明は、ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅｓ  ａｇｏｎｉｓｔ）及び抗原を個体に投与する段階；を含む感染性疾患、例えば、結核菌感染予防方法を提供する。
また、本発明は、前記の方法としてＭＰＬ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）及びＧＬＡ−ＳＥ（Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ、ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ｎａｎｏ−ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）のうちの少なくとも一つの抗原性補強剤をさらに投与する段階；をさらに含む感染性疾患、例えば、結核菌予防方法を提供する。
前記抗原性補強剤とＳＴＩＮＧアゴニストは、同時又は順次投与することができる。
また、前記抗原性補強剤とＳＴＩＮＧアゴニストを投与する場合、様々な結核菌の感染を効果的に予防することができ、特に抗原性補強剤を単独で用いる場合と比べて、脾臓及び／又は肺において多機能性Ｔ細胞の生成を大幅に増加させ、従来の抗原補強剤の効果を顕著に増加させることができるので、結核菌、例えば、高病原性結核菌、好ましい例として、ＨＮ８７８  ｓｔｒａｉｎの感染をより効果的に予防することができる。
前記個体は、ヒトを含む哺乳類であることが好ましく、感染性疾患、例えば結核菌感染の可能性がある個体であることができ、この場合、抗原は、結核抗原であることができる。
また、本発明は、ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅｓ  ａｇｏｎｉｓｔ）及び抗原の外にも、従来の感染症、例えば、結核予防のための物質と併用して処理することができる。
また、本発明は、ＳＴＩＮＧアゴニストの免疫抗原補強剤の用途；ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅｓ  ａｇｏｎｉｓｔ）及び抗原の感染症、例えば、結核予防の用途を提供する。
また、本発明は、ＳＴＩＮＧアゴニストの抗原性補強剤の製造のための用途；ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅｓ  ａｇｏｎｉｓｔ）及び抗原のワクチン製造のための用途を提供する。
【実施例】
【０００８】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単純に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨に基づいて、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないということは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明である。
実施例１：ＳＴＩＮＧアゴニストの抗原性補強剤としての役割を確認
ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅｓ（ＳＴＩＮＧ）ａｇｏｎｉｓｔ）を結核菌用抗原性補強剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）として使用可能であるか否かを確認するために、以下の実験を行った。
１．１． 実験動物
特異的病原体のない生後６週の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ、Ｉｎｃ．Ｓｈｉzｕｏｋａ、Ｊａｐａｎ）を用いて実験を行い、このマウスは、延世大学臨床医学研究センター内のＡＢＳＬ−３バイオハザード動物室の制限されたスペースで滅菌された販売用マウス飼料と水を提供し、飼育した。
１．２． 実験デザイン
ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅｓ（ＳＴＩＮＧ）ａｇｏｎｉｓｔ）の一種であるｃ−ｄｉ−ＧＭＰ（ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を単独で抗原性補強剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）として使用可能であるか否かを確認するために、動物実験を行った。具体的な実験方法は、図１Ａに示しており、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰの比較対照群としては、従来、抗原性補強剤として用いられているＴＬＲ４アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）であるモノホスホリルリピドＡ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ、ＭＰＬ）を用いた。それぞれの抗原性補強剤は、ＥＳＡＴ−６タンパク質と共に、又は、単独でジメチルジオクタデシルアンモニウム（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ、ＤＤＡ）リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）に製剤化（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）して使用した。
図１Ａに示すように、マウスを結核菌に感染させる１０週前に、ＭＰＬ／ＤＤＡ、ＥＳＡＴ−６＋ＭＰＬ／ＤＤＡ又はＥＳＡＴ−６＋ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ／ＤＤＡを３週間隔で計３回筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）注射でマウスに免疫機能を活性化させ、結核菌にマウスを感染させる前に、一部のマウスは安楽死させた後、脾臓と肺から脾臓細胞と肺細胞を分離し、生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）実験も行った。それぞれ分離した細胞は、通常の方法で継代及び培養した。免疫化する方法は、下記の実施例１．３において詳しく記載した。それから抗原刺激によるＩＦＮ−γ産生能とＥＳＡＴ−６タンパク質による免疫化により、脾臓と肺へ浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）されるメモリーＴ細胞の増加を確認した。また、近来、結核防御において重要であるとして報告されている多機能ＣＤ４＋Ｔ細胞の形成能力を調査した。また、結核菌感染後、１６週間目には脾臓と肺内の細菌数と肺における炎症程度を解析した。
１．３． 免疫化
実験に使用されたそれぞれのマウスに３週間隔で３回実験用ワクチン組成物を筋肉内注射し、免疫機能を活性化させた。前記実験用ワクチン組成物は、ＤＤＡリポソームを最終濃度が５ｍｇ／ｍＬになるように希釈した後、６５℃で熱を加え、超音波破砕（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を並行して溶解させた後に、それぞれの抗原性補強剤と体積が２：１になるように混合して製造した。マウス当たり注射される体積は、最終的には２００ｕｌになるようにし、注射当たり１ｕｇのＥＳＡＴ−６タンパク質が抗原として含まれるようにした。陰性対照群としては、抗原を含まないＭＰＬ／ＤＤＡ組成物を筋肉内に注射した。
１．４． ＥＳＡＴ−６抗原によるＩＦＮ−γ産生能を確認
従来、抗原性補強剤として使用されていたＭＰＬ／ＤＤＡ抗原性補強剤と比較し、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ／ＤＤＬ抗原性補強剤が免疫化させた抗原の免疫原性に影響を及ぼすか否かその効能を検証するために、それぞれのマウス実験群において、抗原特異的なＩＦＮ−γ産生能を解析した。実験のために、実施例１．２と同様の方法で獲得されたマウスの脾臓細胞を生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）上でＥＳＡＴ−６タンパク質を用いて刺激し、刺激された細胞において抗原特異的なＩＦＮ−γ産生能をＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）を用いて確認した。その結果は、図１Ｂに示した。
図１Ｂに示すように、ＥＳＡＴ−６タンパク質による刺激に対して、ＥＳＡＴ−６＋ＭＰＬ／ＤＤＡワクチン組成物とＥＳＡＴ−６＋ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ／ＤＤＡワクチン組成物を用いて免疫化された全実験群において、抗原特異的なＩＦＮ−γが産生されることが確認された。このうち、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰを抗原性補強剤として用いたＥＳＡＴ−６＋ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ／ＤＤＡワクチン組成物で免疫化された実験群において、従来のサプリメントと比較してＩＦＮ−γ産生能が有意に増加したことが確認された。
１．５． 抗原特異的な抗体産生能を確認
ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ／ＤＤＬ抗原性補強剤が抗原特異的な抗体産生能に影響を及ぼすか否かその効能を検証するために、計３回に亘った免疫化が、最終的に完了した時点で、それぞれのマウスの血清（ｓｅｒｕｍ）を分離して抗体の産生（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）程度を確認した。１μｇ／ｍｌの濃度のＥＳＡＴ−６タンパク質を９６ウェルプレートに添加した後、常温で２時間反応させ、それぞれのウェル（ｗｅｌｌ）をコーティングした後、コーティングされたウェルにそれぞれの実験群によるマウスの血清を添加した。また、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）が結合されている抗−ＩｇＧ（ｓｉｇｍａ）、抗−ＩｇＧ１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、又は抗−ＩｇＧ２ｃ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）をそれぞれのウェルに添加して反応させた後、ＥＬＩＳＡを用いて産生された抗原特異的な抗体の産生能を確認した。その結果は、図１Ｃに示した。
図１Ｃに示すように、Ｔｏｔａｌ  ＩｇＧと共にＴｈ２免疫（ｉｍｍｕｎｉｔｙ）と関連のあるＩｇＧ１、また、結核の防御に重要であるとして報告されているＴｈ１免疫と関連のあるＩｇＧ２ｃの両方において、従来の抗原性補強剤よりも向上された抗体産生能が確認された。
１．６．ｃ−ｄｉ−ＧＭＰを抗原性補強剤として用いたときに誘導されるＴ細胞の種類と数を確認
一般的に、結核菌に感染すると、結核菌抗原特異的Ｔ細胞が複製及び分化してエフェクターＴ細胞となり、このようなエフェクターＴ細胞は、免疫反応が消えると、ほとんど死滅し、一部は長く持続されるメモリーＴ細胞を形成するようになる。このように形成されたメモリーＴ細胞は、速い後天的防御免疫の形成とＴ細胞の記憶化を維持させる重要な役割をするとして知られている。したがって、ＭＰＬ又はｃ−ｄｉ−ＧＭＰを抗原性補強剤として使用して、ＥＳＡＴ−６タンパク質による免疫化が進行された時、メモリーＴ細胞に影響を及ぼすか否かを検証するために実験を行った。実験のために、実施例１．２と同様の方法で獲得されたマウスの脾臓細胞と肺細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、遠心分離し、遠心分離された細胞に抗−ＣＤ３−ＢＶ４２１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗−ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗−ＣＤ８−ＡＰＣ−Ｃｙ７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗−ＣＤ４４−ＰＥ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗−ＣＤ６２Ｌ−ＦＩＴＣ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗−ＣＤ１２７−ＡＰＣ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）などの抗体を処理した後、３０分間、４℃で反応させた。反応が完了した細胞は、ＰＢＳで数回洗浄して結合していない抗体を除去した後にフローサイトメーター（ＦＡＣＳ  ｖｅｒｓｅ、ＢＤ）を用いて、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ；ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４４＋ＣＤ１２７−）、エフェたクター／メモリーＴ細胞（Ｔｅｍ；ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４４＋ＣＤ１２７＋）、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ；ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４４＋ＣＤ１２７＋）、及びナイーブＴ細胞（Ｎａｉｖｅ；ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４４−ＣＤ１２７＋）を解析した。その結果は、図１Ｄに示した。
図１Ｄに示すように、ＭＰＬを抗原性補強剤として用いた場合より、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰを抗原性補強剤として用い、免疫化を進めた時、マウスの脾臓及び肺細胞の両方でＣＤ４＋／ＣＤ８＋のエフェたクター／メモリーＴ細胞が顕著に増加していることが確認された。
１．７．ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ抗原性補強剤を用いたときに誘導されるＴ細胞の活性を確認
多機能（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）Ｔ細胞（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及び／又はＩＬ−２の両方を分泌するＴ細胞）は、結核菌を防御するのに必要不可欠な免疫学的指標として報告されているので、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰを抗原性補強剤として用いたとき、多機能Ｔ細胞が産生されるか否かを確認した。実施例１．２と同様の方法で分離されたマウスの肺細胞と脾臓細胞をＥＳＡＴ−６タンパク質を用いて刺激した。また、生成されたサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）が細胞外に分泌されることを防止するために、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を細胞に処理した後、３７℃で１２時間反応させた後、ＰＢＳで２回洗浄した。洗浄された細胞に抗−ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗−ＣＤ８−ＡＰＣ−Ｃｙ７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗−ＣＤ４４−ｖ４５０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）などの抗体を処理した後、３０分間、４℃で反応させ、結合されていない抗体は、ＰＢＳで洗浄して除去した。そして、細胞の透過性（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）を高めるために、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を細胞に添加した後、４℃で３０分間反応させた後、ＰＢＳで再び洗浄し、洗浄された細胞に抗−ＩＦＮ−γ−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗−ＩＬ−２−ＰＥ−Ｃｙ７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗−ＴＮＦ−α−ＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）などの抗体をさらに処理し、４℃で３０分間反応させた。反応が完了した細胞は、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて数回洗浄した後、フローサイトメーターを介して解析し、その結果は、図２Ａに示した。また、フローサイトメーターを使用して解析された結果は、ＦｌｏｗＪｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いたｇａｔｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙに追加で解析し、その結果は、図２Ｂに示した。
図２Ｂに示すように、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ又はＭＰＬを抗原性補強剤として用いた場合、両方ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２の三種のサイトカインをいずれも分泌するＴ細胞が増加したことが確認され、特に肺細胞では、ＥＳＡＴ−６＋ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ／ＤＤＡ組成物により免疫化されたグループにおいて、抗原特異的な多機能Ｔ細胞の生成がＭＰＬを抗原性補強剤として用いた場合よりも有意に増加していることが確認された。これにより、従来のＭＰＬよりＳＴＩＮＧアゴニストの場合、結核菌の予防及び治療に不可欠な多機能性Ｔ細胞の生成を増加させることで、従来の抗原性補強剤に比べて効果的に結核菌の予防及び治療用ワクチンの使用が可能であることを確認することができた。
１．８．結核菌培養と空気感染
高病原性結核菌であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＨＮ８７８株を、７Ｈ９−ＯＡＤＣブロス（ｂｒｏｔｈ）で１５日間培養した。そして培養された菌を収集した後、６ｍｍガラスビーズでやさしくボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）しながら菌を破砕した。破砕された菌は、遠心分離して細胞凝集物を沈めた後、上澄み液を回収し、回収された上澄み液は、分割分注して−７０℃で保管した。保管された菌は、実験する際に解凍させた後、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１１  Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、ＵＳＡ）で順次希釈して培養し、菌の数を確認した。また、マウスに感染させるために、結核菌をｓｏｎｉｃ  ｂａｔｈで弱く音波処理した後にＰＢＳ（ｐＨ  ７．２）で希釈し、必要な数の結核菌を獲得した。結核菌の感染は、空気感染装置であるＧｌａｓ−Ｃｏｌ  ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ（Ｔｅｒｒｅ  Ｈａｕｔｅ、ＩＮ）を用いて、マウス当たり２００〜２５０個の結核菌に感染されるように吸入させて空気感染させた。
１．９．組織病理学的解析と結核菌感染抑制効果を確認
ｃ−ｄｉ−ＧＭＰを抗原性補強剤として用いた免疫化反応が結核菌感染抑制効果があることを確認するために、実施例１．８と同様の方法で、マウスを結核菌に感染させ、１６週間後に感染させたマウスを安楽死させ、それぞれのマウス実験群から肺組織を摘出した。また、１０％  ｎｅｕｔｒａｌ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｆｏｒｍａｌｉｎに保存した後、パラフィンに固定させた。固定された肺組織は、４〜５ｍｍの厚さで切片を作成し、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。その結果は、図３Ａに示した。そして染色された結果を利用して、炎症が現れた部分の面積をＩｍａｇｅＪ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて数値化した。その結果は、図３Ｂに示した。また、安楽死させたマウスの肺と脾臓についている結核菌をＰＢＳで抽出し、均質懸濁液を獲得し、それぞれの均質懸濁液を段階的に希釈した後、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１１  Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、ＵＳＡ）で培養し、感染した結核菌の数を確認し、感染した結核菌の数は、全体の肺又は脾臓組織当たりの平均ｌｏｇ１０ＣＦＵ±標準偏差で示した。その結果は、図３Ｃに示した。
図３Ｂに示すように、抗原性補強剤を用いて免疫機能が活性化されたマウスの肺組織では、抗原性補強剤のみを用いた陰性対照群に比べ炎症が減少し、特にＥＳＡＴ−６＋ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ／ＤＤＡワクチン組成物を用いて免疫機能が活性化された実験群が、ＥＳＡＴ−６＋ＭＰＬ／ＤＤＡワクチン組成物を用いて免疫機能が活性化された実験群より炎症が減少したことが確認された。
また、図３Ｃに示すように、抗原性補強剤のみを用いて免疫化された陰性対照群と比較し、ＥＳＡＴ−６＋ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ／ＤＤＡワクチン組成物を用いて免疫化された実験群において、感染した結核菌の数が有意に減少したことが確認された。これにより、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰを単独で抗原性補強剤として用い、高病原性結核菌ＨＮ８７８  ｓｔｒａｉｎの感染を効果的に予防することができることを確認することができた。
前記の結果を通じて、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ  ｄｉｇｕａｎｙｌａｔｅ）のようなＳＴＩＮＧアゴニストは、単独で抗原補強剤活性（ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ）を有するだけでなく、従来の抗原性補強剤であるＭＰＬと比較して、その効果が増大されたことを確認することができた。また、これにより、ＳＴＩＮＧアゴニストを単独で抗原性補強剤として使用して、さまざまな結核菌の感染を効果的に予防することができることを確認することができた。
実施例２：ＳＴＩＮＧアゴニストと抗原性補強剤の相乗効果を確認
ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅｓ（ＳＴＩＮＧ）ａｇｏｎｉｓｔ）と従来知られていた抗原性補強剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）であるＭＰＬを併用して使用する場合、相乗効果を確認するために以下の実験を行った。
２．１．実験動物
特異的病原体のない生後６週の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ、Ｉｎｃ．  Ｓｈｉｊｕｏｋａ、Ｊａｐａｎ）を用いて実験し、そのマウスは延世大学臨床医学研究センター内のＡＢＳＬ−３バイオハザード動物室の制限されたスペースで滅菌された販売用マウス飼料と水を提供し、飼育した。
２．２．実験デザイン
ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ（ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と従来知られていた抗原性補強剤を併用して使用する場合、相乗効果が現れるか否かを確認するために、動物実験を行った。具体的な実験方法は、図４Ａに示した。実験群は、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰとＭＰＬを一緒にＤＤＡリポソームに製剤化して使用した。
図４Ａに示すように、マウスを結核菌に感染させる１０週前に、それぞれのワクチン組成物を３週間隔で計３回筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）注射でマウスに免疫機能を活性化させ、結核菌にマウスを感染させる前に、一部のマウスは安楽死させた後、脾臓、肺から脾臓細胞と肺細胞を分離して生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）実験も行った。それぞれ分離された細胞は、通常の方法で継代と培養した。免疫化する方法は、下記の実施例２．３において詳しく記載した。それから抗原刺激によるＩＦＮ−γ産生能とＥＳＡＴ−６タンパク質による免疫化によって脾臓と肺へ浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）するメモリーＴ細胞の増加を確認した。また、近来、結核防御において重要であるとして報告されている多機能ＣＤ４＋Ｔ細胞の形成能力を調査した。また、結核菌感染後、４週間目には脾臓と肺内の細菌数と肺における炎症程度を解析した。
２．３．免疫化
実験に使用されたそれぞれのマウスに３週間隔で３回実験用ワクチン組成物を筋肉内注射し、免疫機能を活性化させた。前記実験用ワクチン組成物は、ＤＤＡリポソームを最終濃度が５ｍｇ／ｍＬになるように希釈した後、６５℃で熱を加え、超音波破砕（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を並行して溶解させた後、体積が２：１となるように混合して製造した。マウス当たり注射される体積は、最終的に２００ｕｌになるようにし、注射当たり１ｕｇのＥＳＡＴ−６タンパク質が抗原として含まれるようにした。陰性対照群としては、抗原を含まないＭＰＬ／ＤＤＡ組成物を筋肉内に注射した。
２．４．ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を確認
複合の抗原性補強剤がＴ細胞の活性に影響を及ぼすか否かを確認するために、Ｔ細胞の活性マーカーであるＣＤ４４、ＰＤ−１、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７を用いて、実施例１．１１と同様の方法でＴ細胞の活性を確認した。その結果は、図４Ｂに示した。
図４Ｂに示すように、単独で抗原性補強剤を使用した場合より、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰとＭＰＬを複合的に使用したとき、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、脾臓においてその数が増加し、ＣＤ４＋Ｔ細胞の場合には、脾臓と肺の両方でＣＤ４４＋ＰＤ−１＋ 、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ１２７−Ｔ細胞の数が顕著に増加していることが確認された。
２．５．抗原特異的な抗体産生能を確認
複合の抗原性補強剤が抗原特異的な抗体産生能に影響を及ぼすか否かその効能を検証するために、計３回に亘った免疫化が、最終的に完了した時点で、それぞれマウスの血清（ｓｅｒｕｍ）を分離して抗体の産生（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）程度を確認した。１μｇ／ｍｌの濃度のＥＳＡＴ−６タンパク質を９６ウェルプレートに添加した後、常温で２時間反応させて、それぞれのウェル（ｗｅｌｌ）をコーティングした後、コーティングされたウェルにそれぞれの実験群に応じたマウスの血清を添加した。また、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）が結合している抗−ＩｇＧ（ｓｉｇｍａ）、抗−ＩｇＧ１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、又は抗−ＩｇＧ２ｃ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）をそれぞれのウェルに添加して反応させた後、ＥＬＩＳＡを用いて産生された抗原特異的な抗体の産生能を確認した。その結果は、図４Ｃに示した。
図４Ｃに示すように、Ｔｏｔａｌ  ＩｇＧと併せてＴｈ２免疫（ｉｍｍｕｎｉｔｙ）と関連のあるＩｇＧ１、そして結核防御において重要であると報告されているＴｈ１免疫と関連のあるＩｇＧ２ｃの両方で単独で抗原性補強剤を使用した場合より、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰとＭＰＬを複合で抗原性補強剤を使用した場合の方が抗体産生が増加したことが確認されており、これによりバランスの取れた免疫反応が誘導されたことが確認することができた。
２．６．胚中心関連細胞を確認
胚中心（ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ；ＧＣ）は、２次リンパ組織（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｔｉｓｓｕｅ）Ｂ細胞の小胞（ｆｏｌｉｃｌｅ）に位置し、胚中心関連Ｂ細胞は、体細胞超変異（ｓｏｍａｔｉｃ  ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）とＢ細胞のメモリー（ｍｅｍｏｒｙ）形成などのような防御的な体液性免疫を調節するのに重要な機能的な成熟過程を経るとして知られている。また、ＣＤ４＋Ｔ  ｃｅｌｌの一種である濾胞性Ｔ細胞（ＴＦＨ ）は、Ｂ細胞の抗体反応を促進させることができる重要な細胞であり、ＴＦＨ細胞のＣＸＣＲ５遺伝子の発現は、ＴＦＨ細胞がＢ細胞区域に移動し、制御性Ｂ細胞との相互作用に重要な役割をするとして報告されている。したがって、体液性免疫を通じた高い親和性を有する数式因子（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）の持続的な定着のためには胚中心の免疫反応を誘導することができるＴＦＨ細胞の活性を促進させることが重要である。したがって、本発明の複合の抗原性補強剤がＴＦＨ細胞を活性化させることを確認するために、最終的に免疫機能が活性化されたマウスから脾臓細胞を分離し、胚中心関連細胞をフローサイトメーターを用いて確認した。その結果は、図４Ｄに示す。
図４Ｄに示すように、ＭＰＬを単独で抗原性補強剤として使用した実験群に比べ、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰとＭＰＬの複合で抗原性補強剤を用いた実験群の場合、ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＰＤ−１＋ＴＦＨ細胞とＢ２２０＋ＣＤ１３８＋形質細胞（ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌ）の数が有意に増加したことが確認された。これはｃ−ｄｉ−ＧＭＰによるＳＴＩＮＧシグナル伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）が媒介されて影響を及ぼすとみられる。その一方、胚中心関連細胞であるＣＤ４＋ＣＤ４４ｈｉＣＸＣＲ５＋ＧＬ７＋ＴＦＨ細胞（ＧＣ  ＴＦＨ ｃｅｌｌ）とＣＤ１９＋Ｂ２２０＋Ｆａｓ＋ＧＬ７＋Ｂ細胞（ＧＣ  Ｂ  ｃｅｌｌ）の場合には、わずかに増加したが、大差はないことを確認した。
２．７．結核菌培養及び空気感染
高病原性結核菌であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＨＮ８７８  ｓｔｒａｉｎを７Ｈ９−ＯＡＤＣ  ｂｒｏｔｈで１５日間培養した。また、培養された菌を収集した後、６ｍｍガラスビーズでやさしくボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）しながら菌を破砕した。破砕された菌は、遠心分離して細胞凝集物を沈めた後、上澄み液を回収し、回収された上澄み液は、分割分注して−７０℃で保管した。保管された菌は、実験する際に解凍させた後、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１１  Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、ＵＳＡ）で順次希釈して培養し、菌の数を確認した。また、マウスに感染させるために、結核菌をｓｏｎｉｃ  ｂａｔｈで弱く音波処理した後に、ＰＢＳ（ｐＨ  ７．２）で希釈し、必要な数の結核菌を獲得した。結核菌の感染は、空気感染装置であるＧｌａｓ−Ｃｏｌ  ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ（Ｔｅｒｒｅ  Ｈａｕｔｅ、ＩＮ）を用いて、マウス当たり２００〜２５０個の結核菌が感染し得るように吸入させて空気感染させた。
２．８．組織病理学的解析及び結核菌感染抑制効果を確認
ｃ−ｄｉ−ＧＭＰを抗原性補強剤として用いた免疫化反応が結核菌感染抑制効果があるか否かを確認するために、実施例２．７と同様の方法で、マウスを結核菌で感染させ、４週間後に感染させたマウスを安楽死させ、それぞれのマウス実験群から肺組織を摘出した。また、１０％中和ホルマリン（ｎｅｕｔｒａｌ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｆｏｒｍａｌｉｎ）に保存した後、パラフィンに固定させた。固定された肺組織は、４〜５ｍｍの厚さで切片を作製し、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＆ Ｅｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。その結果は、図５Ａに示した。また、安楽死させたマウスの肺に付いている結核菌をＰＢＳで抽出し、均質懸濁液を獲得し、それぞれの均質懸濁液を段階的に希釈した後、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１１  Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、ＵＳＡ）で培養し、感染した結核菌の数を確認し、感染した結核菌の数は全体の肺又は脾臓組織当たりの平均ｌｏｇ１０ＣＦＵ±標準偏差で示した。その結果は、図５Ｂに示した。
図５Ａに示すように、複合で抗原性補強剤を用いて免疫機能が活性化されたマウスの肺組織では、ＭＰＬ抗原性補強剤のみを用いた実験群に比べて炎症が減少したことが確認された。
また、図５Ｂに示すように、ＭＰＬ抗原性補強剤のみを用いた実験群に比べ、複合で抗原性補強剤を用いて免疫化された実験群において感染した結核菌の数が有意に減少したことが確認され、これにより、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰとＭＰＬを複合的に抗原性補強剤として使用する場合、単独で使用している場合より、高病原性結核菌ＨＮ８７８  ｓｔｒａｉｎの感染を効果的に予防することができることが確認された。
２．９．複合で抗原性補強剤を用いたときに誘導されるＴ細胞の活性を確認
多機能Ｔ細胞（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及び／又はＩＬ−２を全部分泌するＴ細胞）は、結核菌を防御するのに重要な免疫学的指標として報告されているので、複合で抗原性補強剤として用いたとき、多機能Ｔ細胞が産生されるか否かを確認した。免疫機能が活性化されたマウスを結核菌に感染させた後、４週間後に実施例２．２と同様の方法で分離されたマウスの肺細胞と脾臓細胞をＥＳＡＴ−６タンパク質を用いて刺激した。また、生成されたサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）が細胞外に分泌されることを防止するために、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を細胞に処理した上、３７℃で１２時間反応させた後、ＰＢＳで２回洗浄した。洗浄された細胞に抗−ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗−ＣＤ８−ＡＰＣ−Ｃｙ７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗−ＣＤ４４−ｖ４５０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）などの抗体を処理した後、３０分間、４℃で反応させ、結合されていない抗体は、ＰＢＳで洗浄して除去した。また、細胞の透過性（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）を高めるために、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を細胞に添加してから、４℃で３０分間反応させた後、ＰＢＳで再び洗浄し、洗浄された細胞に抗−ＩＦＮ−γ−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗−ＩＬ−２−ＰＥ−Ｃｙ７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗−ＴＮＦ−α−ＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）などの抗体をさらに処理し、４℃で３０分間反応させた。反応が完了した細胞は、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて数回洗浄した後にフローサイトメーターを介して解析し、解析された結果は、ＦｌｏｗＪｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅを利用したｇａｔｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙでさらに解析し、その結果は、図５Ｃに示した。
図５Ｃに示すように、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰとＭＰＬを複合的に抗原性補強剤として用いた場合、単独で抗原性補強剤を用いた実験群よりもＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α＋ＩＬ−２＋、ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α＋、ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋ＩＬ−２＋の多機能性Ｔ細胞が有意に増加していることが確認された。
前記の結果から、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰのようなＳＴＩＮＧアゴニストと一緒にＭＰＬのような従来の抗原性補強剤を複合的に使用する場合、その効果が顕著に増加したことが確認された。また、このことから、従来用いられていた抗原性補強剤にＳＴＩＮＧアゴニストを追加で用いると、さまざまな結核菌の感染を効果的に予防することができることが確認できた。
実施例３：ＳＴＩＮＧアゴニストと従来の抗原性補強剤の相乗効果を確認
ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅｓ（ＳＴＩＮＧ）ａｇｏｎｉｓｔ）と従来知られていた抗原性補強剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）であるＧＬＡ−ＳＥ（Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ、ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ｎａｎｏ−ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）を併用して使用した場合の相乗効果を確認するために、以下の実験を行った。
３．１．ＳＴＩＮＧアゴニスト及びＧＬＡ−ＳＥを用いたときに誘導されるＴ細胞の活性を確認
複合の抗原性補強剤がＴ細胞の活性に影響を及ぼすか否かを確認するために、単一の抗原性補強剤又は複合の抗原性補強剤により免疫機能が活性化されたマウスを結核菌に感染させる前に、脾臓及び肺を分離した。また、生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）においてＥＳＡＴ−６ペプチドプール（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｏｏｌ）又はタンパク質を処理した後に誘導される抗原及びＴ細胞の産生をフローサイトメーターを用いて確認した。実験方法の詳細は、実施例１．７に記載された方法と同様の方法で行った。その結果は、図６に示した。
図６に示すように、すべての実験群においてＧＬＡ−ＳＥを単独で免疫化された実験群に比べ、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰとＧＬＡ−ＳＥを複合で抗原性補強剤を用いて免疫化された実験群において、ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α＋の多機能Ｔ細胞の生成が顕著に増加していることが確認された。
また、加えて（１）陰性対照群、（２）結核菌（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）単独処理群、（３）ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  ｄｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ）単独処理群、（４）ＢＣＧ  ｐｒｉｍｅ、ＥＳＡＴ−６、及びＧＬＡ−ＳＥ処理群、（５）ＢＣＧ  ｐｒｉｍｅ、ＥＳＡＴ−６、ＧＬＡ−ＳＥとＳＴＩＮＧアゴニスト（ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ）処理群、（６）ＥＳＡＴ−６とＧＬＡ−ＳＥ処理群、（７）ＥＳＡＴ−６、ＳＴＩＮＧアゴニストとＧＬＡ−ＳＥ処理群の計７つの処理群に対して効能を検証するために、計３回に亘った免疫化が、最終的に完了した時点で、マウスを安楽死させた後、実施例１．５、１．７、及び１．１１と同様の方法でＴ細胞の活性を確認した。免疫化は、筋肉内注射を用いた。その結果は、図７に示した。
図７に示すように、単独複合抗原性補強剤を使用した場合より、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰとＧＬＡ−ＳＥを複合的に用いたとき、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２などのサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の分泌が増加されることが確認された。
前記の結果を通じて、ＧＬＡ−ＳＥ及びＳＴＩＮＧアゴニストを複合抗原性補強剤として用いると、さまざまな結核菌の感染を効果的に予防することができることを確認することができた。
３．２．ＳＴＩＮＧアゴニスト及びＧＬＡ−ＳＥを用いたとき、結核菌感染抑制効果を確認
複合の抗原性補強剤による免疫化反応が結核菌感染抑制効果があるか否かを確認するために、マウスを結核菌に感染させる１０週間前に（１）ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  ｄｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ）単独、（２）ＥＳＡＴ−６及びＧＬＡ−ＳＥ、（３）ＥＳＡＴ−６、ＳＴＩＮＧアゴニスト及びＧＬＡ−ＳＥのワクチン組成物を３週間隔で計３回筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）注射でマウスに免疫機能を活性化させ、実施例２．７と同様の方法で、マウスを結核菌に感染させ、４週間後に感染させたマウスを安楽死させ、それぞれのマウスの肺に付いている結核菌をＰＢＳで抽出し、均質懸濁液を獲得し、それぞれの均質懸濁液を段階的に希釈した後、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１１  Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ  、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、ＵＳＡ）で培養し、感染した結核菌の数を確認し、感染した結核菌の数は全体の肺又は脾臓組織当たり、平均ｌｏｇ１０ＣＦＵ±標準偏差で示した。その結果は、図８に示した。
図８に示すように、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰとＧＬＡ−ＳＥを複合の抗原性補強剤として同時に用いた場合は、ＧＬＡ−ＳＥを単独で抗原性補強剤として用いた実験群に比べ、感染した結核菌の数が有意に減少したことが確認された。これを通じてｃ−ｄｉ−ＧＭＰとＧＬＡ−ＳＥを複合的に抗原性補強剤として使用する場合、高病原性結核菌ＨＮ８７８  ｓｔｒａｉｎの感染を効果的に予防することができることが確認できた。
前記の結果を通じて、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰのようなＳＴＩＮＧアゴニストと一緒にＭＰＬ及びＧＬＡ−ＳＥなどのような従来の抗原性補強剤を複合的に使用した場合、その効果が顕著に増加したことが確認された。特に、近来、結核菌の予防と治療には、ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α＋の多機能Ｔ細胞の産生が不可欠であることが明らかになったが、本願発明のＳＴＩＮＧアゴニストは、他の従来の抗原性補強剤を単独で用いた場合より、脾臓及び／又は肺において多機能性Ｔ細胞の産生を大幅に増加させることが確認できた。前記の結果を通じて、従来用いられている抗原性補強剤にＳＴＩＮＧアゴニストを追加で用いると、従来、結核菌の予防及び治療効果が低い従来の抗原性補強剤の効果を著しく増加させることができるということを確認でき、これによりＳＴＩＮＧアゴニストを含む複合の抗原性補強剤は、様々な結核菌の感染を効果的に予防することができることが確認できた。
以上において、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、これらの具体的な技術は、単なる好ましい実施例に過ぎないものであり、これに本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項とその等価物によって定義されるといえるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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