(57)【要約】本発明は真皮内コラーゲンの分解に関与するマトリクスメタロプロテイナーゼ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）の発現及び活性を抑制することができる、ＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２を高濃度で含む皮膚しわ改善能又は皮膚弾力増進能に優れた神経幹細胞培養液の製造方法に関するものである。本発明による高濃度のＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２及び低濃度の多様なマトリクスメタロプロテイナーゼを有効成分として含む神経幹細胞培養液はコラーゲンの生成を抑制するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性を抑制することにより、コラーゲンとエラスチンの合成を回復させるので、皮膚しわ改善又は皮膚弾力増進用組成物として有用である。【選択図】  図２４
2021526027.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の段階を含む、ＴＩＭＰ−１（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  １）及びＴＩＭＰ−２（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ２）を有効成分として含む皮膚しわ改善能又は皮膚弾力増進能が向上した神経幹細胞培養液の製造方法：
（ａ）脳の脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）から分離した成体神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＮＳＣｓ）を不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ）させる段階と、
（ｂ）前記不死化神経幹細胞を非誘導性培地で培養して培養液を収得する段階。
【請求項２】
前記神経幹細胞培養液は、ＴＩＭＰ−３又はＴＩＭＰ−４をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の神経幹細胞培養液の製造方法。
【請求項３】
前記神経幹細胞培養液は、ＭＭＰ−１（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１）、ＭＭＰ−２（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２）、ＭＭＰ−３（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−３）及びＭＭＰ−９（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９）の発現又は活性を抑制することを特徴とする、請求項１に記載の神経幹細胞培養液の製造方法。
【請求項４】
前記神経幹細胞培養液は、皮膚組職のコラーゲン又はエラスチンを回復させることを特徴とする、請求項１に記載の神経幹細胞培養液の製造方法。
【請求項５】
前記神経幹細胞培養液は、皮膚組職の活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）の生成を抑制するか又はＤＮＡ損傷を復旧することを特徴とする、請求項１に記載の神経幹細胞培養液の製造方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡ損傷の復旧は、Ｒａｄ５０、Ｒａｄ５１又はＸＲＣＣ４の活性増加によってなされることを特徴とする、請求項５に記載の神経幹細胞培養液の製造方法。
【請求項７】
前記非誘導性培地は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むことを特徴とする、請求項１に記載の神経幹細胞培養液の製造方法。
【請求項８】
ＴＩＭＰ−１（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  １）及びＴＩＭＰ−２（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ２）を含む神経幹細胞培養液を有効成分として含む、皮膚しわ改善用又は皮膚弾力増進用化粧料組成物。
【請求項９】
前記神経幹細胞培養液は、ＴＩＭＰ−３又はＴＩＭＰ−４をさらに含むことを特徴とする、請求項８に記載の化粧料組成物。
【請求項１０】
前記神経幹細胞培養液は、ＭＭＰ−１（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１）、ＭＭＰ−２（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２）、ＭＭＰ−３（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−３）、ＭＭＰ−９（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９）、ＭＭＰ−７（Ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ）、ＭＭＰ−１０（Ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）及びＭＭＰ−１３（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）を低濃度で含むことを特徴とする、請求項８に記載の化粧料組成物。
【請求項１１】
前記神経幹細胞は、脳の脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）由来のものであることを特徴とする、請求項８に記載の化粧料組成物。
【請求項１２】
前記神経幹細胞培養液は、ＭＭＰ−１（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１）、ＭＭＰ−２（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２）、ＭＭＰ−３（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−３）及びＭＭＰ−９（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９）の発現又は活性を抑制することを特徴とする、請求項８に記載の化粧料組成物。
【請求項１３】
前記神経幹細胞培養液は、皮膚組職のコラーゲン又はエラスチンを回復させることを特徴とする、請求項８に記載の化粧料組成物。
【請求項１４】
前記神経幹細胞培養液は、皮膚組職の活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）の生成を抑制するか又はＤＮＡ損傷を復旧することを特徴とする、請求項８に記載の化粧料組成物。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ損傷の復旧は、Ｒａｄ５０、Ｒａｄ５１又はＸＲＣＣ４の活性増加によってなされることを特徴とする、請求項１４に記載の化粧料組成物。
【請求項１６】
前記神経幹細胞培養液は、ｇａｍｍａＨ２ＡＸをＤＮＡ損傷程度を把握するマーカーとして使うことを特徴とする、請求項８に記載の化粧料組成物。
【請求項１７】
前記化粧料は、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファウンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、パック、せっけん、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディーローション、ボディークレンザー、洗顔剤、トリートメント、美容液、美容パック、軟膏剤、ゲル剤、リニメント剤、液剤、パッチ及び噴霧剤からなる群から選択されるいずれか１種の剤形であることを特徴とする、請求項８に記載の化粧料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は高濃度のＴＩＭＰ−１（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  １）、ＴＩＭＰ−２（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ２）及び低濃度の多様なマトリクスメタロプロテイナーゼを有効成分として含む皮膚しわ改善能又は皮膚弾力増進能に優れた神経幹細胞培養液の製造方法に関するもので、より詳しくは真皮内コラーゲンの分解に関与する多様な種類のマトリクスメタロプロテイナーゼ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）の発現を減少させるとともに活性を抑制することができるＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２を高濃度に含む神経幹細胞培養液の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は外部環境から人体を保護し、多様な生理的機能を担当する。皮膚は、大別して総３個の層である表皮、真皮及び皮下脂肪層から構成されている。表皮は主に角質を形成する細胞とメラニン色素を生成するメラニン細胞とから構成され、真皮は主にコラーゲン及びエラスチン弾力線維から構成されている結合組織と基質からなっており、筋肉、毛嚢、血管、神経などがその中に含まれる。
【０００３】
皮膚老化の原因はお年の増加につれて発生する内部的原因と外部環境などによって誘発される外部的原因とがある。皮膚しわの形成と密接な連関があるコラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）は皮膚の線維芽細胞で生成されて真皮の９０％を構成し、年齢及び紫外線のような外部刺激によって減少すると知られている（S.D. Shapiro., Curr. Opin. Cell Biol.,10, 1996; Naylor EC et al., Maturitas,2011）。老化が進行するか外部紫外線に持続的に露出されるとき、コラーゲンを含む結合組織を分解するマトリクスメタロプロテイナーゼ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｒｐｏｔｅｉｎａｓｅ）の発現及び活性の増加によって皮膚の真皮組職内のコラーゲン分解を促進させることがコラーゲンの含量が低下する原因と知られている（A. Mauviel., J Cell. Biochem.,1993; T Quan et al., J Investig Dermatol Symp Proc. 2009）。ここで、マトリクスメタロプロテイナーゼの発現調節は転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ）ＡＰ−１とＮＦｋＢがマトリクスメタロプロテイナーゼ遺伝子のプローモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）に作用すると知られている（G.J. Fisher & J.J. Voorhees., J Investig Dermatol Symp Proc.,1998; K. Abeyama et al., J Clin. Invest. 2000）。また、組職内コラーゲンの恒常性維持の際、マトリクスメタロプロテイナーゼの活性を抑制するＴＩＭＰ（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）の均衡が重要に作用する。
【０００４】
ＴＩＭＰ（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）は１型、２型、３型、４型が存在し、生体内に存在するマトリクスメタロプロテイナーゼの抑制剤の役割をする。この中で、ＴＩＭＰ−１は、コラゲナーゼタイプＩＶのうち、９２ｋＤａのＭＭＰ−９の潜伏型（ｐｒｏ  ｆｏｒｍ）及びＭＭＰ−１と結合してＭＭＰを非可逆的に抑制すると知られており、ＴＩＭＰ−２は、コラゲナーゼタイプＩＶのうち、７２ｋＤａのＭＭＰ−２の潜伏型（ｐｒｏ  ｆｏｒｍ）と活性型（ａｃｔｉｖｅ  ｆｏｒｍ）と全部結合し、特に全てのマトリクスメタロプロテイナーゼの活性型を抑制すると報告されている（Y.A. Declerck et al., Biochem. J. 1993; W. Bode et al., Ann. NY Acad Sci. 1999）。
【０００５】
また、エラスチン（ｅｌａｓｔｉｎ）はしわ生成に関与する重要な線維組職であり、コラーゲンとともに皮膚弾力に関与すると知られており、エラスチンの分解はエラスターゼという酵素の影響によって調節されると知られている（J.H. Chung et al., J. Invest. Dermatol., 117, 2001）。
【０００６】
したがって、本発明者らは皮膚しわの改善及び防止と皮膚弾力の増進が可能な組成物を開発しようと鋭意努力した結果、成体幹細胞である神経幹細胞を培養して、皮膚内のコラーゲン合成の阻害及び分解を促進する多様なマトリクスメタロプロテイナーゼの機能を非可逆的に抑制するＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２が高濃度で存在し、多様なマトリクスメタロプロテイナーゼが低濃度で存在する神経幹細胞の培養液組成物を製造することができることを確認し、本発明を完成することになった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、コラーゲンの生成を抑制するマトリクスメタロプロテイナーゼを低濃度で含み、マトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性を抑制して、コラーゲンとエラスチンの合成を回復させることができるＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２を高濃度で含む皮膚しわ改善能又は皮膚弾力増進能が向上した神経幹細胞培養液の製造方法及び前記培養液を含む化粧料組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明は、（ａ）脳の脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）から分離した成体神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＮＳＣｓ）を不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ）させる段階と、（ｂ）前記不死化神経幹細胞を非誘導性培地で培養して培養液を収得する段階とを含む、ＴＩＭＰ−１（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  １）及びＴＩＭＰ−２（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ２）を有効成分として含む皮膚しわ改善能又は皮膚弾力増進能が向上した神経幹細胞培養液の製造方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は、ＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２を含む神経幹細胞の培養液を有効成分として含む皮膚しわ改善用又は皮膚弾力増進用化粧料組成物を提供する。
【００１０】
また、本発明は、ＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２を含む神経幹細胞の培養液を用いた皮膚しわ改善又は皮膚弾力増進方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、皮膚しわ改善又は皮膚弾力増進に使うためのＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２を含む神経幹細胞の培養液の用途を提供する。
【００１２】
また、本発明は、皮膚しわ改善用又は皮膚弾力増進用化粧料組成物の製造に使うためのＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２を含む神経幹細胞の培養液の用途を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】神経幹細胞培養液でヒト体細胞を処理するとき、細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）がないことをＷＳＴ−１で確認した図である。
【図２】神経幹細胞培養液でＵＶＢに露出されたヒト体細胞を処理するとき、ＵＶＢによって増加した活性酸素種（ＲＯＳ；ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）が減少することを蛍光マイクロプレートリーダー（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）で測定した図である。
【図３】神経幹細胞培養液でＵＶＢに露出されたヒト体細胞を処理するとき、ＵＶＢによって増加した活性酸素種（ＲＯＳ；ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）が減少することを蛍光顕微鏡（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で分析した図である。
【図４】神経幹細胞培養液でＵＶＢに露出されたヒト体細胞を処理するとき、ＵＶＢによってコラーゲン（ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現が抑制されることをｑＰＣＲで確認した図である。
【図５】神経幹細胞培養液でＵＶＢに露出されたヒト体細胞を処理するとき、ＵＶＢによってコラーゲン（ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現が抑制されることをウェスタンブロット法で確認した図である。
【図６】神経幹細胞培養液でＵＶＢに露出されたヒト体細胞を処理するとき、ＵＶＢによってコラーゲン（ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進するマトリクスメタロプロテイナーゼの活性が抑制されることをザイモグラフィー（ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）で確認した図である。
【図７】神経幹細胞培養液でＵＶＢに露出されたヒト体細胞を処理するとき、ＵＶＢによって減少したコラーゲン（ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ）が再び増加することを確認した図である。
【図８】神経幹細胞培養液内でマトリクスメタロプロテイナーゼの活性を抑制するＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２を確認した図である。
【図９】組み換えタンパク質ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２及び神経幹細胞培養液をＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２抗体でブロッキングした（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ）後、マトリクスメタロプロテイナーゼの活性抑制を確認した図である。
【図１０】神経幹細胞培養液でＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ−１マウスを処理するとき、ＵＶＢによって増加したしわが再び減少することを肉眼で確認した図である。
【図１１】神経幹細胞培養液でＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ−１マウスを処理するとき、ＵＶＢによって増加したしわが再び減少することをしわ部位面積の測定で確認した図である。
【図１２】神経幹細胞培養液でＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ−１マウスを処理するとき、ＵＶＢによって増加したＲＯＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）が減少することを確認した図である。
【図１３】神経幹細胞培養液でＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ−１マウスを処理するとき、ＵＶＢによって減少した真皮内コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）及びエラスチン（ｅｌａｓｔｉｎ）が再び増加することを確認した図である。
【図１４】神経幹細胞培養液でＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ−１マウスを処理するとき、ＵＶＢによって真皮内コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現が減少することを免疫蛍光染色で確認した図である。
【図１５】神経幹細胞培養液でＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ−１マウスを処理するとき、ＵＶＢによって真皮内コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現が抑制されることを確認した図である。
【図１６】神経幹細胞培養液でＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ−１マウスを処理するとき、ＵＶＢによって真皮内コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進するマトリクスメタロプロテイナーゼの活性が抑制されることを確認した図である。
【図１７】神経幹細胞培養液がマトリクスメタロプロテイナーゼの発現を調節する転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ）のうちＮＦｋＢによって調節されることを確認した図である。
【図１８】神経幹細胞培養液でＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ−１マウスを処理するとき、転写因子の減少によって真皮内コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の生成が回復されることを確認した図である。
【図１９】神経幹細胞培養液でＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ−１マウスを処理するとき、ＵＶＢによって誘発されるＤＮＡ損傷（ｄａｍａｇｅ）をＤＮＡ回復酵素（ｒｅｐａｉｒ  ｅｎｚｙｍｅｓ）の一つであるＲａｄ５０によって回復することをウェスタンブロット法で確認した図である。
【図２０】神経幹細胞培養液でＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ−１マウスを処理するとき、ＵＶＢによって誘発されるＤＮＡ損傷（ｄａｍａｇｅ）程度をγＨ２ＡＸで確認した図である。
【図２１】神経幹細胞培養液と脂肪幹細胞培養液のそれぞれの老化抑制及びしわ生成抑制の効果を比較したもので、（ａ）は細胞毒性を確認した図、（ｂ）はそれぞれの培養液処理時のマトリクスメタロプロテイナーゼ遺伝子のＲＮＡ発現水準を確認した図である。
【図２２】（ａ）は神経幹細胞培養液と脂肪幹細胞培養液のそれぞれ内で放出されるＭＭＰ−１の量を比較した図、（ｂ）はそれぞれの培養液でＵＶＢに露出されたヒト体細胞を処理した後、マトリクスメタロプロテイナーゼタンパク質の量を確認した図である。
【図２３】神経幹細胞培養液と脂肪幹細胞培養液内に存在する（ａ）全体タンパク質の量及び（ｂ）ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２の量を比較した図である。
【図２４】神経幹細胞培養液と脂肪幹細胞培養液のそれぞれでＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ−１マウスを処理するとき、（ａ）はＵＶＢによって生成されたしわの抑制程度を肉眼で確認した図、（ｂ）はしわ部位の面積を測定して比較した図である。
【図２５】神経幹細胞培養液と脂肪幹細胞培養液のそれぞれでＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ−１マウスを処理するとき、（ａ）はＵＶＢによって真皮内コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現抑制の比較を示した図、（ｂ）は真皮内コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の生成又は復元を比較した図である。
【図２６】神経幹細胞培養液と脂肪幹細胞培養液のそれぞれでＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ−１マウスを処理するとき、ＵＶＢによって減少した真皮内コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）及びエラスチン（ｅｌａｓｔｉｎ）の増加程度を比較した図である。
【図２７】神経幹細胞培養液と脂肪幹細胞培養液のそれぞれでＵＶＢが露出された雌性ＳＫＨ−１マウスを処理するとき、ＵＶＢによって真皮内コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現の減少を免疫蛍光染色で確認した図である。
【図２８】神経幹細胞培養液と脂肪幹細胞培養液のそれぞれでＵＶＢに露出された雌性ＳＫＨ−１マウスを処理するとき、（ａ）はＵＶＢによって誘発されるＤＮＡ損傷（ｄａｍａｇｅ）をＤＮＡ回復酵素（ｒｅｐａｉｒ  ｅｎｚｙｍｅｓ）の一つであるＲａｄ５０によって回復することをウェスタンブロット法で比較した図、（ｂ）及び（ｃ）はＵＶＢによって誘発されるＤＮＡ損傷（ｄａｍａｇｅ）程度をγＨ２ＡＸで比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術的及び科学的用語は本発明が属する技術分野で熟練した専門家によって通常的に理解されるものと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用する命名法は当該技術分野でよく知られて通常的に使われるものである。
【００１５】
本発明では、ヒト脳の脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）から抽出した神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＮＣＳｓ）を培養して収得した外胚葉由来の神経幹細胞培養液で紫外線（ＵＶＢ）に露出されたヒト線維芽細胞（ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）とマウスを処理した。その後、紫外線（ＵＶＢ）に露出されたヒト線維芽細胞及びマウス皮膚組職において真皮内コラーゲンの分解に関与するＭＭＰ−２（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ２）、ＭＭＰ−９（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ９）及びＭＭＰ−１（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  １）の発現及び活性が神経幹細胞培養液によって抑制されることを確認し、このようなマトリクスメタロプロテイナーゼの抑制によってコラーゲンの合成が復旧又は促進されることを確認した。また、前記コラーゲン合成の復旧及び促進によって皮膚しわの改善又は皮膚弾力の増進のための有効成分としてＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２が高濃度で神経幹細胞培養液に含まれていることを確認した。
【００１６】
したがって、本発明は、一観点で、（ａ）脳の脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）から分離した成体神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＮＳＣｓ）を不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ）させる段階と、（ｂ）前記不死化神経幹細胞を非誘導性培地で培養して培養液を収得する段階とを含む、ＴＩＭＰ−１（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  １）及びＴＩＭＰ−２（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ２）を有効成分として含む皮膚しわ改善能又は皮膚弾力増進能が向上した神経幹細胞培養液の製造方法に関するものである。
【００１７】
本発明において、前記培養液を製造するための神経幹細胞はその種類に制限されない。好ましくは胎児由来の成体幹細胞であり、本発明の具体的な実施例では、胎児脳の脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）から抽出した神経幹細胞を使って神経幹細胞培養液を製造した。
【００１８】
本発明において、神経幹細胞培養液とは、外胚葉幹細胞の一種である神経幹細胞を継代培養して収得した細胞から放出される成分を含む物質である。
【００１９】
本発明において、前記神経幹細胞培養液は、ＴＩＭＰ−３又はＴＩＭＰ−４をさらに含むことを特徴とすることができる。
【００２０】
本発明において、前記神経幹細胞培養液は、ＭＭＰ−１（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１）、ＭＭＰ−２（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２）、ＭＭＰ−３（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−３）及びＭＭＰ−９（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９）の発現又は活性を抑制することを特徴とすることができる。
【００２１】
本発明の具体的な実施例では、神経幹細胞培養液内のＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２成分がマトリクスメタロプロテイナーゼ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）の発現及び活性を阻害して、しわの改善及び防止と皮膚弾力の増進に及ぶ影響を確認するために、神経幹細胞培養液から得た上澄み液をサイトカインアレイ及びウェスタンブロット法で確認した。
【００２２】
また、本発明の具体的な実施例では、神経幹細胞培養液内のＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２成分が活性型マトリクスメタロプロテイナーゼを抑制して、しわ生成の改善及び皮膚弾力の増進に関与することをゼラチンザイモグラフィー（ｇｅｌａｔｉｎ  ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）で確認した。
【００２３】
本発明の具体的な実施例では、神経幹細胞培養液、組み換えタンパク質ＴＩＭＰ−１又はＴＩＭＰ−２をそれぞれ又は一緒に処理するか、抗体によってそれぞれ又は一緒にブロッキングした後、コラゲナーゼタイプＩＶのうち、９２ｋＤａのＭＭＰ−９及び７２ｋＤａのＭＭＰ−２潜伏型（ｐｒｏ  ｆｏｒｍ）と活性型（ａｃｔｉｖｅ  ｆｏｒｍ）に結合してマトリクスメタロプロテイナーゼの活性を抑制することを確認した。
【００２４】
本発明では、神経幹細胞培養液内のＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２成分のしわ生成改善及び皮膚弾力増進の効果を確認するために、雌性ＳＫＨ−１マウスの背中に、１週から４週まではＵＶＢ（３０ｍＪ／ｃｍ）を３回／１週で処理した後、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）及び神経幹細胞培養液を背中にそれぞれ２００μｌ（ｖ／ｖ）ずつ塗布した。その後、５週から１２週まではＵＶＢ（３０ｍＪ／ｃｍ）を１回／１週で処理した後、ＰＢＳ及び神経幹細胞培養液を２００μｌ（ｖ／ｖ）ずつ塗布した。
【００２５】
本発明において、前記神経幹細胞培養液は、皮膚組職のコラーゲン又はエラスチンを回復させることを特徴とすることができる。
【００２６】
本発明において、前記神経幹細胞培養液は、皮膚組職の活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）の生成を抑制するか又はＤＮＡ損傷を復旧することを特徴とすることができる。
【００２７】
本発明で使う用語、‘しわ改善’は皮膚のしわ及び弾力に係る能力を維持又は強化させることを意味する。皮膚の構造のうち真皮層に存在する膠原線維（ｃｏｌｌａｇｅｎ：コラーゲン）と弾力線維（ｅｌａｓｔｉｎ：エラスチン）がその役割をする主要タンパク質であり、皮膚弾力を担う。コラーゲンの生合成は皮膚の内外的影響を受けることになる。具体的に、皮膚内的要因としては、自然老化によって細胞活性が減少し、コラーゲン線維が減少し、外的要因としては、紫外線の過量照射及びストレスなどによって生成された活性酸素種がタンパク質のチオール基（ｔｈｉｏｌ：−ＳＨ）と反応して酵素の活性を阻害するか、コラーゲン、エラスチンなどを分解させる酵素（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１：ＭＭＰ−１）であるコラゲナーゼの発現を増加させて皮膚のしわを増加させるとともに弾力を減少させる結果を引き起こす。
【００２８】
本発明の神経幹細胞培養のための培地は当該分野に知られた基本培地を制限なしに使うことができる。基本培地は人為的に合成して製造することができ、商業的に製造された培地を使うこともできる。商業的に製造される培地の例を挙げれば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、α−ＭＥＭ（α−Ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｇ−ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）及びＩｓｏｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍなどがあるが、これに限定されるものではなく、最も好ましくはＤＭＥＭ培地であることができる。
【００２９】
また、前記基本培地は５〜１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを含むことが好ましく、本発明の具体的な実施例ではＤＭＥＭ培地で培養した。
【００３０】
本発明において、前記非誘導性培地は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ペニシリン／ストレプトマイシン）を含むことを特徴とすることができる。
【００３１】
本発明の組成物は通常的に使われるどの方法でも製造することができ、神経幹細胞を単離、培養及び分離する過程は本発明の方法に限定されず、当該分野で通常的に行われる方法で実施することができる。
【００３２】
上述したように、本発明による外胚葉由来の神経幹細胞培養液はＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２を有効成分として含むので、マトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性型マトリクスメタロプロテイナーゼを抑制して、しわの改善及び防止と皮膚弾力の増進のための組成物として使うことができる。
【００３３】
したがって、本発明は、他の観点で、ＴＩＭＰ−１（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  １）及びＴＩＭＰ−２（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ２）を含む神経幹細胞の培養液を有効成分として含む皮膚しわ改善用又は皮膚弾力増進用の化粧料組成物に関するものである。
【００３４】
本発明において、前記神経幹細胞の培養液は、ＴＩＭＰ−３又はＴＩＭＰ−４をさらに含むことを特徴とすることができる。
【００３５】
また、前記神経幹細胞の培養液は、ＭＭＰ−１（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１）、ＭＭＰ−２（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２）、ＭＭＰ−３（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−３）、ＭＭＰ−９（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９）、ＭＭＰ−７（Ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ）、ＭＭＰ−１０（Ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）及びＭＭＰ−１３（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）を低濃度で含むことを特徴とすることができる。
【００３６】
本発明において、前記神経幹細胞は脳の脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）から抽出された神経幹細胞を不死化させて得る細胞である。本発明の具体的な実施例では、胎児の脳の脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）から分離した成体神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＮＳＣｓ）を用い、これを不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌ）させて細胞を得た。これをＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、及び１％ペニシリンストレプトマイシンが含まれた非誘導性培地で培養して非接着性細胞を除去した。前記過程で培養された神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＮＳＣｓ）を継代培養する過程で培養液を収得し、これを遠心分離し、上澄み液を濾過して収得した。
【００３７】
本発明において、前記神経幹細胞の培養液は、ＭＭＰ−１（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１）、ＭＭＰ−２（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２）、ＭＭＰ−３（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−３）及びＭＭＰ−９（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９）の発現又は活性を抑制することを特徴とすることができる。
【００３８】
本発明において、前記神経幹細胞培養液は、皮膚組職のコラーゲン又はエラスチンを回復させることを特徴とすることができる。
【００３９】
また、本発明において、前記神経幹細胞培養液は、皮膚組職の活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）の生成を抑制するか又はＤＮＡ損傷を復旧することを特徴とすることができる。
【００４０】
前記ＤＮＡ損傷の復旧は、神経幹細胞培養液によってＤＮＡ回復酵素であるＲａｄ５０、Ｒａｄ５１又はＸＲＣＣ４の活性が向上することによってＤＮＡ損傷を復旧することができる。また、神経幹細胞培養液は、ｇａｍｍａＨ２ＡＸをＤＮＡ損傷程度を把握するマーカーとして使うことを特徴とする。
【００４１】
本発明において、‘化粧料組成物’は前記神経幹細胞培養液又は神経幹細胞抽出物を含む組成物であり、その剤形はどの形態でも可能である。このような剤形の例として、前記化粧料組成物を用いて製造した化粧料は、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファウンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、パック、せっけん、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディーローション、ボディークレンザー、洗顔剤、トリートメント、美容液、美容パック、軟膏剤、ゲル剤、リニメント剤、液剤、パッチ及び噴霧剤からなる群から選択されるいずれか１種の剤形であることを特徴とすることができる。
【００４２】
本発明の目的を達成するために、このような剤形の中でどの剤形にも製造されて商用化することができ、前記例に限定されない。
【００４３】
化粧料組成物に製剤化される場合、前記神経幹細胞培養液の含量は、化粧料組成物の総重量に対して、０．０００１〜５０重量％であり、好ましくは０．０１〜１０重量％である。最小限の紫外線による皮膚損傷の改善効果を達成することができるように、神経幹細胞培養液の含量は前記最小値以上であることが好ましく、過量添加による使用感低下及び各種の剤形への適用可能性を考慮して、神経細胞培養液の含量は前記最大値以下であることが好ましい。ここで、神経細胞培養液の含量は剤形又は化粧料組成物に含有される成分の含量によって前記範囲内で適宜調節することが好ましい。
【００４４】
本発明の化粧品組成物に含まれる成分は、有効成分以外に、化粧品組成物に通常的に用いられる成分を含み、例えば抗酸化剤、安定化剤、溶解剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常的な補助剤、そして担体を含む。
【００４５】
本発明の剤形がペースト、クリーム又はゲルの場合には、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク又は酸化亜鉛などを用いることができる。
【００４６】
本発明の剤形がパウダー又はスプレーの場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、珪酸カルシウム又はポリアミドパウダーを用いることができ、特にスプレーの場合には、追加的にクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタン又はジメチルエーテルのような推進体を含むことができる。
【００４７】
本発明の剤形が溶液又は乳濁液の場合には、担体成分として、溶媒、溶解剤又は乳濁剤を用いる。担体成分は、例えば水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール又はソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【００４８】
本発明の剤形が懸濁液の場合には、担体成分として、水、エタノール又はプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天又はトラガカントなどを用いることができる。
【００４９】
本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングの場合には、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホサクシネートモノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体又はエトキシ化グリセロール脂肪酸エステルなどを用いることができる。
【００５０】
本発明は、さらに他の観点で、ＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２を含む神経幹細胞の培養液を用いた皮膚しわ改善又は皮膚弾力増進方法に関するものである。
【００５１】
本発明は、さらに他の観点で、皮膚しわ改善又は皮膚弾力増進に使うためのＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２を含む神経幹細胞の培養液の用途に関するものである。
【００５２】
本発明は、さらに他の観点で、皮膚しわ改善用又は皮膚弾力増進用化粧料組成物の製造に使うためのＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２を含む神経幹細胞の培養液の用途に関するものである。
【００５３】
実施例
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないというのは当該分野で通常の知識を有する者に明らかであろう。
【００５４】
実施例１：神経幹細胞培養液及び神経幹細胞抽出物生産
【００５５】
胎児脳の脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）から分離した成体神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＮＳＣｓ）を不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ）させて細胞を得た。
【００５６】
具体的には、１４週になった胎児神経細胞組職を０．１％コラゲナーゼと０．１％ヒアルロニダーゼ溶液で３７℃で１時間処理し、０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡで２〜３分処理して単一細胞に分離した後、ＣＤ４５−／ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４−マーカーを用いてＦＡＣＳによって分離した。これをＮ−２ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ、０．２ｍｇ／ｍｌヘパリン、２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ）、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＬＩＦが添加されたヒトニューロスフェア（ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）培養培地で培養した。１０〜１４日経過の後、形成されたニューロスフェア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）をコラゲナーゼで処理して単一細胞に分離し、レトロウイルスベクター（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）を用いてｖ−ｍｙｃ遺伝子を形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）し、選別（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）して得た細胞をＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンが含まれた非誘導性培地で培養した（Flax JD et al., Nature Biotechnology, 16, 1998; Lim H-C et al., Neuroscience Letters 435:175-180, 2008）。１５０ｍｍの培養皿（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈｓ）に前記細胞５×１０５個を分株し、培養培地１５ｍｌを添加した後、３７℃、５％ＣＯ２培養器で培養し、８０％の細胞密集度（ｃｅｌｌ  ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に到達したとき、培養液を収得した。ここで、培養培地はＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１％ペニシリンストレプトマイシンが含まれた非誘導性培地であり、培養の後、非接着性細胞は除去した。このような過程で培養された神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＮＳＣｓ）を継代培養する過程で培養液を収得し、これを遠心分離し、上澄み液を濾過した。
【００５７】
実施例２：神経幹細胞培養液のヒト体細胞に対する細胞毒性確認
【００５８】
ヒト体細胞５×１０３個を９６−ウェルプレート（９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に接種し、細胞密集度（ｃｅｌｌ  ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）が８０〜９０％に到達するとき、神経幹細胞培養液を２４時間処理した。ＷＳＴ−１を入れ、マイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）を用いて４５０ｎｍで測定して神経幹細胞培養液の細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を確認した。
【００５９】
その結果、神経幹細胞培養液はヒト体細胞増殖に影響がないことを確認した（図１）。
【００６０】
実施例３：神経幹細胞培養液によるＵＶＢによって増加する細胞内活性酸素種抑制確認
【００６１】
ヒト体細胞５×１０３個を黒い９６−ウェルプレート（９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に接種し、細胞密集度（ｃｅｌｌ  ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）が８０〜９０％に到達するとき、血清のない（ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ）ＤＭＥＭで２４時間培養した。その後、神経幹細胞培養液で２４時間処理し、ヒト体細胞をＵＶＢ（３０ｍＪ／ｃｍ２）に露出させた後、１０％血清が添加されたＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。ＵＶＢによって増加する細胞内活性酸素種（ＲＯＳ；ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）を神経幹細胞培養液が抑制するかを確認するために、１０μＭジヒドロエチジウム（ｄｉｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｕｍ、ＤＨＥ）溶液を入れ、３７℃で３０分間処理し、蛍光マイクロプレートリーダー（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）を用いて測定した。
【００６２】
その結果、神経幹細胞培養液はヒト体細胞でＵＶＢによって増加する細胞内活性酸素種の減少に効果があることを確認した（図２）。
【００６３】
また、２４−ウェルプレート（２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）にカバースリップ（ｃｏｖｅｒ  ｓｌｉｐ）を用いてヒト体細胞を接種し、細胞密集度（ｃｅｌｌ  ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）が８０〜９０％に到達するとき、血清のない（ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ）ＤＭＥＭで２４時間培養した。その後、神経幹細胞培養液を２４時間処理し、ヒト体細胞をＵＶＢ（３０ｍＪ／ｃｍ２）に露出させた後、１０％血清が添加されたＤＭＥＭで２４時間培養した。ＵＶＢによって増加する細胞内活性酸素種（ＲＯＳ；ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）に神経幹細胞培養液が及ぶ影響を確認するために、１０μＭジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）溶液を入れ、蛍光顕微鏡（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて分析した。
【００６４】
その結果、神経幹細胞培養液はヒト体細胞でＵＶＢによって増加する細胞内活性酸素種の減少に効果があることを確認した（図３）。
【００６５】
実施例４：神経幹細胞培養液によるヒト体細胞でマトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性抑制確認
【００６６】
ヒト体細胞がＵＶＢに露出されればコラーゲン（ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解が促進される。したがって、本実施例では、このようなコラーゲン（ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性を確認した。
【００６７】
ヒト体細胞を１００ｍｍ培養皿に接種し、細胞密集度（ｃｅｌｌ  ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）が８０〜９０％に到達するとき、血清のない（ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ）ＤＭＥＭで２４時間培養した。その後、神経幹細胞培養液を２４時間処理し、ヒト体細胞をＵＶＢ（３０ｍＪ／ｃｍ２）に露出させた後、１０％血清が添加されたＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。ＵＶＢに露出されるとき、コラーゲン（ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進させるマトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性に対する神経幹細胞培養液の効果をｑＰＣＲ（図４）、ウェスタンブロット法（図５）及びザイモグラフィー（ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）（図６）を用いて測定した。
【００６８】
その結果、神経幹細胞培養液はＵＶＢによってコラーゲン（ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進させる役割をするマトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性を抑制することを確認した（図４〜６）。
【００６９】
実施例５：神経幹細胞培養液のＵＶＢによるコラーゲン分解抑制確認
【００７０】
ヒト体細胞がＵＶＢに露出されればコラーゲン（ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解が促進され、このようなコラーゲン（ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解促進にはマトリクスメタロプロテイナーゼが関与することを実施例４で確認した。したがって、本実施例では、神経幹細胞培養液によってマトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性を抑制して、コラーゲン（ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ）の合成が促進されることを確認した。
【００７１】
実施例４と同様な方法で細胞を準備し、神経幹細胞培養液で２４時間処理して、ＵＶＢによってコラーゲン分解を促進させるのに関与するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性を抑制した。その後、神経幹細胞培養液によってマトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性が抑制されるコラーゲン（ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ）をウェスタンブロット法で測定した。
【００７２】
その結果、神経幹細胞培養液がＵＶＢによって促進されるコラーゲン分解に関与するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性を抑制すれば、コラーゲン（ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ）の合成が促進されることを確認した（図７）。
【００７３】
実施例６：マトリクスメタロプロテイナーゼの活性抑制に関与する神経幹細胞培養液内の有効成分（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）ＴＩＭＰ−１／２確認
【００７４】
ヒト体細胞を１５０ｍｍ培養皿に接種し、細胞密集度（ｃｅｌｌ  ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）が８０〜９０％に到達するとき、血清のない（ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ）ＤＭＥＭで培養した。４８時間培養して培養液を収得し、タンパク質量が２００μｇになるように試料を準備した後、神経幹細胞培養液内の成分をサイトカインアレイ、特にＲａｙＢｉｏ社のＨｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙによって分析した。
【００７５】
その結果、神経幹細胞培養液内にＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２が存在することをＨｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙによって確認し、もう一度ウェスタンブロット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ）で確認した（図８）。
【００７６】
その後、ヒト体細胞を１００ｍｍ培養皿に接種し、細胞密集度（ｃｅｌｌ  ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）が８０〜９０％に到達するとき、血清のない（ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ）ＤＭＥＭで２４時間培養した。その後、神経幹細胞培養液及び組み換えタンパク質ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２をそれぞれ又は一緒に２４時間処理し、ヒト体細胞をＵＶＢ（３０ｍＪ／ｃｍ２）に露出させた後、１０％血清が添加されたＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。ＵＶＢによって促進されるマトリクスメタロプロテイナーゼの活性を神経幹細胞培養液が抑制するかを分析した。
【００７７】
その結果、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２が含有された神経幹細胞培養液はＵＶＢによって増加するマトリクスメタロプロテイナーゼの活性を抑制することを確認した（図９）。
【００７８】
実施例７：ＳＫＨ−１マウスにおいて神経幹細胞培養液によるしわ生成抑制確認
【００７９】
７−１：しわ生成抑制効果
【００８０】
雌性ＳＫＨ−１マウスを１２週間ＵＶＢ（３０ｍＪ／ｃｍ２／１回）に露出させ、神経幹細胞培養液で処理した後、１２週にマウスを犠牲（ｓａｃｒｉｆｉｃｅ）させた。神経幹細胞培養液で処理した群（ｇｒｏｕｐ）でのしわ生成抑制及びしわ改善効果をシリコンレプリカ（ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｒｅｐｌｉｃａ）で分析した。
【００８１】
その結果、神経幹細胞培養液で処理したマウスでしわ生成の抑制及び防止及びしわ改善の効果を現すことを確認した（図１０及び図１１）。
【００８２】
７−２：ＲＯＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）減少効果
【００８３】
実施例７−１のように組職を準備し、ＵＶＢによって生成されるＲＯＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）に神経幹細胞培養液が及ぶ影響をＤＨＥ染色で分析した。
【００８４】
その結果、神経幹細胞培養液で処理したマウスで、ＵＶＢによって促進されるＲＯＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）が減少する効果を現すことを確認した（図１２）。
【００８５】
７−３：コラーゲン及びエラスチン回復効果
【００８６】
実施例７−１のように組職を準備し、マウス皮膚組職を４％ホルムアルデヒドに固定し、組職をパラフィンに埋め込んで製作した後、３μｍの厚さに切断した組職をスライドに付けた。その後、ＵＶＢによって減少するコラーゲン及びエラスチンをＭａｓｓｏｎ’ｓ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色及びＶｅｒｈｏｅｆｆ’ｓ  ｅｌａｓｔｉｎ染色でそれぞれ分析した。
【００８７】
その結果、神経幹細胞培養液で処理したマウスでＵＶＢによって減少するコラーゲン及びエラスチンが回復することを確認した（図１３）。
【００８８】
実施例８：ＳＫＨ−１マウスにおいて神経幹細胞培養液によるＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９減少確認
【００８９】
８−１：ＵＶＢによって増加するＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の減少
【００９０】
実施例７−１のように組職を準備し、マウス皮膚組職を４％ホルムアルデヒドに固定し、組職をパラフィンで製作した後、３μｍの厚さに切断した組職をスライドに付け、パラフィン除去及び再水和過程（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚｅ  ａｎｄ  ｒｅｈｙｄｒａｔｅ）を実施した。その後、抗原回復（ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ；ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ６．０）及び０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００処理を実施し、正常ロバ血清（ｎｏｒｍａｌ  ｄｏｎｋｅｙ  ｓｅｒｕｍ）でブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、１次抗体を１：１００で２４時間処理した。その後、２次抗体を用いて１時間処理し、ＤＡＰＩ染色を５分間実施した。ベクタシールド封入剤（ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）を用いてスライドに固定させた後、共焦点顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で確認した。
【００９１】
その結果、神経幹細胞培養液で処理したマウスにおいてＵＶＢによって増加するＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９が減少することを確認した（図１４）。
【００９２】
８−２：ＵＶＢによって増加するマトリクスメタロプロテイナーゼを調節する転写因子ＮＦｋＢ
【００９３】
実施例７−１のように組職を準備し、マウス皮膚組職においてＵＶＢによって促進される真皮内コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解に関与するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性、そして前記マトリクスメタロプロテイナーゼを調節する転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ）の発現をウェスタンブロット法で確認した（図１５〜図１７）。また、神経幹細胞培養液がマトリクスメタロプロテイナーゼ及びマトリクスメタロプロテイナーゼを調節する転写因子によってコラーゲン生成に及ぶ影響を調査した（図１８）。
【００９４】
その結果、神経幹細胞培養液で処理したマウスにおいてＵＶＢによって増加するＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の発現（図１５）と活性（図１６）が減少することを確認した。また、このようなマトリクスメタロプロテイナーゼを調節する転写因子であるＮＦｋＢも減少することを確認し（図１７）、これによって真皮内のコラーゲンが再び回復することを確認した（図１８）。
【００９５】
実施例９：神経幹細胞培養液によるＤＮＡ損傷抑制及び回復確認
【００９６】
実施例７−１のように組職を準備し、実施例８−１と同様な方法で組職を染色し、ＵＶＢによって誘発されるＤＮＡ損傷（ｄａｍａｇｅ）程度をγＨ２ＡＸで確認した。また、神経幹細胞培養液がＤＮＡ損傷に及ぶ影響を確認するために、ＤＮＡ回復酵素（ｒｅｐａｉｒ  ｅｎｚｙｍｅｓ）の一つであるＲａｄ５０をウェスタンブロット法で確認した。
【００９７】
その結果、神経幹細胞培養液で処理したマウスにおいてＵＶＢによって誘発されるＤＮＡ損傷（ｄａｍａｇｅ）が復旧された。このとき、ＤＮＡ回復酵素（ｒｅｐａｉｒ  ｅｎｚｙｍｅｓ）の一つであるＲａｄ５０によって損傷されたＤＮＡが復旧されることを確認した（図１９及び図２０）。
【００９８】
実施例１０：神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液生産
【００９９】
神経幹細胞培養液（ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ；ＮＳＣ−ＣＭ）と脂肪幹細胞培養液（ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ；ＡＳＣ−ＣＭ）の製造のために、１５０ｍｍ培養皿（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈｓ）に前記それぞれの細胞５×１０５個を分株し、培養培地１５ｍｌを添加した後、３７℃、５％ＣＯ２培養器で培養し、８０％細胞密集度（ｃｅｌｌ  ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に到達するとき、培養液を収得した。このとき、神経幹細胞培養培地は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１％ペニシリンストレプトマイシンを使い、脂肪幹細胞培養培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｒｉｅｎｔ  ＭｉｘｔｕｒｅＦ−１２）、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１％ペニシリンストレプトマイシンが含まれた非誘導性培地を使った。培養の後、非接着性細胞は除去した。このような過程で培養された神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＮＳＣｓ）及び脂肪幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＡＳＣ）を継代培養する過程で培養液を収得し、これを遠心分離し、上澄み液を濾過した。また、それぞれの培養液が細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）がないことをＷＳＴ−１で確認した（図２１ａ）。
【０１００】
実施例１１：ｉｎ  ｖｉｔｒｏで神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液によるマトリクスメタロプロテイナーゼの発現抑制比較
【０１０１】
１１−１：マトリクスメタロプロテイナーゼの発現確認
【０１０２】
ヒト体細胞がＵＶＢに露出されればコラーゲン（ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解が促進される。したがって、本実施例では、このようなコラーゲン（ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現を確認し、それぞれの幹細胞培養液内に存在するＭＭＰ−１を確認した。
【０１０３】
ヒト体細胞を１００ｍｍ培養皿に接種し、細胞密集度（ｃｅｌｌ  ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）が８０〜９０％に到達するとき、血清のない（ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ）ＤＭＥＭで２４時間培養した。その後、神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液を２４時間処理し、ヒト体細胞をＵＶＢ（３０ｍＪ／ｃｍ２）に露出させた後、１０％血清が添加されたＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。ＵＶＢに露出されるとき、コラーゲン（ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進させるマトリクスメタロプロテイナーゼの発現に対する神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液の効果をｑＰＣＲ（図２１ｂ）及びウェスタンブロット法（図２２ｂ）で測定した。
【０１０４】
その結果、神経幹細胞培養液内でＵＶＢによってコラーゲン（ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進させる役割をするマトリクスメタロプロテイナーゼの発現をもっと大きく抑制することを確認した。
【０１０５】
１１−２：しわ生成抑制関連因子比較
【０１０６】
本実施例では、コラーゲン（ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を促進させる役割をするマトリクスメタロプロテイナーゼ及びこれらの活性を阻害する因子（ＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２）が神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液内に存在するかを確認した。それぞれの培養液内のタンパク質総量をＢｒａｄ−ｆｏｒｄ（図２３ａ）によって確認し、その後、ＲａｙＢｉｏ(R)  Ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｒｒａｙでＭＭＰ−１、−２、−３、−７、−９、−１０及び−１３の濃度を分析した（図２２ａ）。また、それぞれの培養液で処理し、ついでマトリクスメタロプロテイナーゼの発現をウェスタンブロット法（図２３ｂ）で分析した。
【０１０７】
その結果、神経幹細胞培養液内にはコラーゲンの分解を促進させるＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９の含量がずっと少なく、さらにマトリクスメタロプロテイナーゼの活性を抑制させるＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２の含量が脂肪幹細胞培養液より高かった。そして、他のＭＭＰ−７、ＭＭＰ−１０及びＭＭＰ−１３の含量はそれぞれの培養液内にほぼ同一に存在することを確認した。したがって、神経幹細胞培養液内の主要マトリクスメタロプロテイナーゼの含量が低いので、コラーゲン保護能力がより良いと予測することができる。
【０１０８】
実施例１２：ｉｎ  ｖｉｖｏで神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液の効果比較
１２−１：ＳＫＨ−１マウスにおいて神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液によるしわ生成抑制確認
【０１０９】
雌性ＳＫＨ−１マウスを１２週間ＵＶＢに（１週〜４週は３０ｍＪ／ｃｍ２／３回、５週〜１２週は３０ｍＪ／ｃｍ２／１回）露出させ、神経幹細胞培養液で処理した後、１２週にマウスを犠牲（ｓａｃｒｉｆｉｃｅ）させた。神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液で処理した群（ｇｒｏｕｐ）でしわ生成抑制及びしわ改善効果をｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｒｅｐｌｉｃａで分析した。
【０１１０】
その結果、脂肪幹細胞培養液に比べ、神経幹細胞培養液で処理したマウスにおいてしわ生成の抑制及び防止及びしわ改善効果がもっと大きく高いことを確認した（図２５ａ及び図２５ｂ）。
【０１１１】
１２−２：ＳＫＨ−１マウスにおいて神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液によるコラーゲン及びエラスチン回復効果
【０１１２】
実施例７のように組職を準備し、マウス皮膚組職を４％ホルムアルデヒドに固定し、組職をパラフィンに埋め込んで製作した後、３μｍの厚さに切断した組職をスライドに付けた。その後、ＵＶＢによって減少するコラーゲン及びエラスチンをＭａｓｓｏｎ’ｓ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色及びＶｅｒｈｏｅｆｆ’ｓ  ｅｌａｓｔｉｎ染色によってそれぞれ分析した。
【０１１３】
その結果、脂肪幹細胞培養液に比べ、神経幹細胞培養液で処理したマウスにおいてＵＶＢによって減少するコラーゲン及びエラスチンがより大きく回復することを確認した（図２６）。
【０１１４】
実施例１３：ｉｎ  ｖｉｖｏで神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液によるマトリクスメタロプロテイナーゼの発現抑制比較
【０１１５】
実施例７−１のように組職を準備し、マウス皮膚組職を４％ホルムアルデヒドに固定し、組職をパラフィンに埋め込んで製作した後、３μｍの厚さに切断した組職をスライドに付け、パラフィン除去及び再水和過程（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚｅ  ａｎｄ  ｒｅｈｙｄｒａｔｅ）を実施した。その後、抗原回復（ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ；ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ６．０）及び０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００処理を実施し、正常ロバ血清（ｎｏｒｍａｌ  ｄｏｎｋｅｙ  ｓｅｒｕｍ）でブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、１次抗体を１：１００で２４時間処理した。その後、２次抗体を用いて１時間処理し、ＤＡＰＩ染色を５分間実施した。ベクタシールド封入剤（ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）を用いてスライドに固定させた後、共焦点顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で確認した。
【０１１６】
その結果、脂肪幹細胞培養液に比べ、神経幹細胞培養液で処理したマウスにおいてＵＶＢによって増加するＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９がより大きく減少することを確認した（図２７）。
【０１１７】
実施例１４：神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液によるＤＮＡ損傷抑制及び回復確認
【０１１８】
実施例７−１のように組職を準備し、実施例８−１と同様な方法で組職を染色し、ＵＶＢによって誘発されるＤＮＡ損傷（ｄａｍａｇｅ）程度をγＨ２ＡＸで確認した。また、神経幹細胞培養液及び脂肪幹細胞培養液がＤＮＡ損傷に及ぶ影響を確認するために、ＤＮＡ回復酵素（ｒｅｐａｉｒ  ｅｎｚｙｍｅｓ）の一つであるＲａｄ５０をウェスタンブロット法で確認した。
【０１１９】
その結果、脂肪幹細胞培養液に比べ、神経幹細胞培養液で処理したマウスにおいてＵＶＢによって誘発されるＤＮＡ損傷（ｄａｍａｇｅ）が復旧された。このとき、ＤＮＡ回復酵素（ｒｅｐａｉｒ  ｅｎｚｙｍｅｓ）の一つであるＲａｄ５０によって、損傷されたＤＮＡがより大きく復旧されることを確認した（図２８）。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明による低濃度の多様なマトリクスメタロプロテイナーゼ及び高濃度のＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２を有効成分として含む神経幹細胞培養液はコラーゲンの生成を抑制するマトリクスメタロプロテイナーゼの発現及び活性を抑制してコラーゲンとエラスチンの合成を回復させるので、皮膚しわ改善又は皮膚弾力増進用組成物として有用である。
【０１２１】
以上で本発明の内容のうち特定の部分を詳細に記述したが、当該分野の通常の知識を有する者にとってこのような具体的技術は単に好適な実施様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求範囲及びその等価物によって定義されると言える。
【図１】
2021526027.tif 000003
【図２】
2021526027.tif 000004
【図３】
2021526027.tif 000005
【図４】
2021526027.tif 000006
【図５】
2021526027.tif 000007
【図６】
2021526027.tif 000008
【図７】
2021526027.tif 000009
【図８】
2021526027.tif 000010
【図９】
2021526027.tif 000011
【図１０】
2021526027.tif 000012
【図１１】
2021526027.tif 000013
【図１２】
2021526027.tif 000014
【図１３】
2021526027.tif 000015
【図１４】
2021526027.tif 000016
【図１５】
2021526027.tif 000017
【図１６】
2021526027.tif 000018
【図１７】
2021526027.tif 000019
【図１８】
2021526027.tif 000020
【図１９】
2021526027.tif 000021
【図２０】
2021526027.tif 000022
【図２１】
2021526027.tif 000023
【図２２】
2021526027.tif 000024
【図２３】
2021526027.tif 000025
【図２４】
2021526027.tif 000026
【図２５】
2021526027.tif 000027
【図２６】
2021526027.tif 000028
【図２７】
2021526027.tif 000029
【図２８】
2021526027.tif 000030
【国際調査報告】
2021526027.tif 000031
2021526027.tif 000032
2021526027.tif 000033
2021526027.tif 000034
2021526027.tif 000035
2021526027.tif 000036