(57)【要約】本発明は、生きた生物療法製品を含む腸溶性剤形を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生きた生物療法製品を含む経口投与可能な保存安定の腸溶性剤形であって、ｉ）抗酸化剤を含み、前記抗酸化剤がシステインであり、ｉｉ）炭酸ナトリウムまたは炭酸カルシウムを含まない、及び／またはｉｉｉ）マルトデキストリンを含まない、前記剤形。
【請求項２】
前記生きた生物療法製品の生細胞数（ＣＦＵ／ｇ）が、２℃〜８℃の温度で防湿包装に１２ヶ月間前記剤形を保存するとき、１ｌｏｇ以下しか減少しない、請求項１に記載の剤形。
【請求項３】
前記生きた製品が偏性嫌気性細菌を含む、請求項１または２に記載の剤形。
【請求項４】
前記生きた製品が単一株の細菌を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の剤形。
【請求項５】
前記生きた生物療法製品が本質的に非胞子形成細菌からなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の剤形。
【請求項６】
前記生きた生物療法製品が、Ｂｌａｕｔｉａ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、及び／またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅの種に属する細菌を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の剤形。
【請求項７】
前記生きた生物療法製品が、存在する場合のカプセルシェル及び存在する場合の腸溶性コーティングを除いて、１×１０３ＣＦＵ／ｇ〜１×１０１１ＣＦＵ／ｇのレベルで細菌を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の剤形。
【請求項８】
前記生きた生物療法製品が凍結乾燥物として存在する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の剤形。
【請求項９】
前記凍結乾燥物が、１または２以上の賦形剤をさらに含む、請求項８に記載の剤形。
【請求項１０】
１または２以上の賦形剤をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の剤形。
【請求項１１】
前記剤形が、凍結乾燥物と１または２以上の賦形剤とを含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の剤形。
【請求項１２】
前記剤形に含まれる前記凍結乾燥物が、前記生きた生物療法製品が約７５℃を超える、約５０℃を超える、約４０℃を超える、または約３０℃を超える温度に曝露されない凍結乾燥プロセスを介して調製されたものである、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の剤形。
【請求項１３】
有効量の生きた嫌気性細菌と抗酸化剤とを含む保存安定の剤形であって、コロニー形成単位（ＣＦＵ）における前記生きた嫌気性細菌の有効量が、約２℃〜約８℃の温度でアルミ／アルミブリスター包装に２１ヶ月間前記剤形を保存するとき、１ｌｏｇ以下しか減少しない、前記剤形。
【請求項１４】
有効量の生きた嫌気性細菌と抗酸化剤を含む胃保護剤形であって、コロニー形成単位（ＣＦＵ）における前記有効量の生きた嫌気性細菌が、以下のように決定されるシミュレートされた胃環境で１ｌｏｇ以下しか減少しない、前記剤形：
ａ．前記剤形をｐＨ１．２の酸性媒体に３０分間曝露し、
ｂ．前記剤形をｐＨ６．８の腸媒体に４５分間曝露し、
ｃ．前記（ａ）の曝露前に対して前記（ｂ）の曝露後の前記ＣＦＵを比較する。
【請求項１５】
前記抗酸化剤が、システインまたはその塩である、請求項１３に記載の剤形。
【請求項１６】
前記抗酸化剤が、アスコルビン酸またはその塩である、請求項１３または１４に記載の剤形。
【請求項１７】
前記生きた嫌気性細菌が、通性嫌気性細菌、偏性嫌気性細菌、または微好気性細菌を含む、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の剤形。
【請求項１８】
前記生きた嫌気性細菌が非胞子形成細菌である、請求項１３３〜１７７のいずれか１項に記載の剤形。
【請求項１９】
前記生きた嫌気性細菌が、Ｂｌａｕｔｉａ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅの種に属する、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の剤形。
【請求項２０】
前記有効量が、前記剤形の重量１グラムあたり約１×１０３〜約１×１０１３ＣＦＵを含む、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の剤形。
【請求項２１】
前記有効量が、前記剤形の重量１グラムあたり約１×１０６〜約１×１０１１ＣＦＵを含む、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の剤形。
【請求項２２】
生きた嫌気性細菌が約５０℃を超える温度に曝露されない、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の剤形。
【請求項２３】
前記剤形がカプセルである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の剤形。
【請求項２４】
前記剤形が、本質的に、腸溶性のカプセルである、請求項２３に記載の剤形。
【請求項２５】
生きた生物療法製品を含む経口投与可能な腸溶性剤形を調製するためのプロセスであって、
ｉ）生きた生物療法製品と任意選択で１または２以上の賦形剤とを提供すること、
ｉｉ−ａ）前記生きた生物療法製品と賦形剤とをカプセルに充填し、前記カプセルを閉じて、充填されたカプセルを提供すること、または
ｉｉ−ｂ）前記生きた生物療法製品と賦形剤とを含む錠剤コアを形成して錠剤コアを提供すること、を含み、
前記カプセルが本質的に腸溶性のカプセルであるか、または前記プロセスが、ｉｉｉ）前記充填されたカプセルもしくは錠剤コアに腸溶性コーティングを塗布することを含む、前記プロセス。
【請求項２６】
前記１または２以上の賦形剤が、抗酸化剤を含み、前記抗酸化剤がシステインであり、ｉｉ）炭酸ナトリウムもしくは炭酸カルシウムを含まず、及び／またはｉｉｉ）マルトデキストリンを含まない、請求項２５に記載のプロセス。
【請求項２７】
前記カプセルが本質的に腸溶性のカプセルであり、前記プロセスがコーティング、乾燥及び／またはバンディングステップを含まない、請求項２６に記載のプロセス。
【請求項２８】
前記生きた生物療法製品が、ステップｉ）、ｉｉ−ａ）、及び／またはｉｉ−ｂ）の間、約７５℃より高い、約５０℃より高い、約４０℃より高い、または約３０℃より高い温度に曝露されない、請求項２５または請求項２７に記載のプロセス。
【請求項２９】
ステップｉ）、ｉｉ−ａ）及び／またはｉｉ−ｂ）が、不活性環境下で操作される、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項３０】
ステップｉｉ〜ｂ）またはステップｉｉｉ）で得られた前記剤形を空気及び／または水分不透過性容器内に包装するステップをさらに含む、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生きた生物療法製品（live biotherapeutic product）を含む医薬品に関する。本発明はまた、そのような医薬品を製造するためのプロセス及びそのような製品を含むキットに関する。
【０００２】
ヒトの腸は、子宮内では無菌であると考えられているが、出生直後に母体及び環境の様々な微生物に曝露される。その後、微生物のコロニー形成及び遷移の動的な期間が生じる。これは、送達形態、環境、食事、及び宿主の遺伝子型等の因子に影響され、これらの因子の全てが、特に幼年期に腸内細菌叢の組成に影響を及ぼす。その後、細菌叢は安定化し、成人のようになる。ヒトの腸内細菌叢は、細菌の２つの主要な門であるバクテロイデス門及びフィルミクテス門に本質的に属する５００〜１０００種を超える様々な系統型を含む。ヒトの腸における細菌のコロニー形成から生じる共生関係の成功は、多種多様な代謝機能、構造的機能、保護機能、及び他の有益な機能をもたらしている。コロニー形成された腸の代謝活性の増強により、そうでなければ難消化性の食物成分が、宿主に重要な栄養源を提供する副産物の放出によって確実に分解されるようになる。同様に、腸内細菌叢の免疫学的重要性はよく認識されており、共生細菌の導入後に機能的に再構成される障害のある免疫系を有する無菌動物で例示されている。
【０００３】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの胃腸障害では、細菌叢組成の劇的な変化が記録されている。例えば、ＩＢＤ患者では、Ｅ．ｃｏｌｉの数が増大する一方でクロストリジウム属クラスターＸＩＶａ細菌のレベルが低下し、腸内の共生生物と病原性共生生物とのバランスの変化を示唆している。興味深いことに、この微生物の腸内毒素症は、Ｔエフェクター細胞集団の不均衡とも関連している。
【０００４】
ある特定の細菌株が哺乳動物の腸に及ぼし得る好影響の可能性が認識され、様々な疾患の治療及び治癒に使用するための様々な菌株が提案されている。生理学的状態を治療するための生きた細菌生物の使用の開示の例には、欧州特許第１２８０５４１号（刺激性腸症候群を含む一連の状態の治療における水素栄養生物の使用を開示する）、欧州特許第１４４８９９５号（炎症性疾患の治療におけるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎの使用を開示する）、欧州特許公開第２７６３６８５号（免疫調節剤としてのＲｏｓｅｂｕｒｉａ  ｈｏｍｉｎｉｓの使用を開示する）、欧州特許第３２０９３１０号（抗がん療法としてのＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍの使用を開示する）、及び欧州特許公開第３２０６７００号（重度の喘息を含む一連の自己免疫／炎症状態の治療におけるビフィドバクテリウム属の使用を開示する）が含まれる。
【０００５】
このような生物は、米国ＦＤＡによって生きた生物療法製品（「ＬＢＰ」）として分類されている医薬品のクラスで有効成分として使用される。２０１２年２月にＦＤＡによって発行され、２０１６年に更新されたガイダンス（業界向けガイダンス：生きた生物療法製品による早期臨床試験：化学、製造、及び管理情報）ＬＢＰは、次のような生物製品として定義されている：１）細菌などの生きた生物を含む；２）ヒトの疾患または状態の予防、治療、または治癒に適用可能である；３）ワクチンではない。さらに、ＦＤＡのガイダンス文書には、（プロバイオティクス製品とは異なり）ＬＢＰは規制機関による医薬品と同じ厳格な精査の対象であると記載されている。
【０００６】
ＬＢＰは、様々な病状に対して刺激的で革新的な治療法を提供するが、特に投与前の長期間の保存後に、有効成分が患者に実行可能に送達されるように製剤化することは依然として困難である。
【０００７】
当業者は、腸への送達を必要とする広く使用されてきた活性医薬成分（「ＡＰＩ」）は、例えば、ａ）胃の酸性環境で分解されることを回避するための、例えばオメプラゾール、エソメプラゾール及びパントプラゾールなどのプロトンポンプ阻害剤、またはｂ）胃への刺激作用を引き起こすことを回避するための、例えばアスピリンに気付くであろう。
【０００８】
当業者はまた、そのようなＡＰＩが長期間の保存の後でさえ確実に腸に送達されることを可能にするための製剤化アプローチに気付くであろう。そのようなアプローチの１つは、腸溶性コーティング錠、すなわち１または２以上の胃抵抗性材料の層でコーティングされた錠剤コア中にＡＰＩを製剤化することである。このような錠剤を患者に経口投与すると、腸溶性コーティング剤が胃の酸性媒体に溶解せず、したがって含まれるＡＰＩの胃での放出が防止される。しかしながら、錠剤が腸を通過し、そこで酸性度の低い媒体に遭遇すると、コーティングの溶解が起こり、ＡＰＩが放出される。実際、腸の特定の領域に送達されたときに最適な効果を示すＡＰＩについて、コーティングが特定のｐＨを有する媒体に曝露されたときにその中に含まれるＡＰＩを溶解及び放出するｐＨ依存性コーティングが開発された。例えば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）シリーズの腸溶性ポリマーはｐＨ５．５以上（Ｌ  ３０Ｄ−５５及びＬ１００−５５グレードの場合）、ｐＨ６．０以上（Ｌ１００及びＬ１２．５グレードの場合）、ならびにｐＨ７．０以上（Ｓ  １００、Ｓ  １２．５、及びＦＳ  ３０  Ｄグレードの場合）で溶解する。
【０００９】
これらのポリマーは、通常、錠剤コアをコーティングするために使用できる溶液または分散液として、または錠剤製造業者によって溶液または分散液に構成され、次いで錠剤コアをコーティングするために使用できる粉末として供給される。
【００１０】
腸送達用のＡＰＩを調製するための代替の、ただし関連する製剤アプローチは、カプセル、例えば、ソフトまたはハードゼラチンカプセルで製剤を提供し、次いで、カプセルを上述のような腸溶性ポリマーでコーティングすることである。さらに、コーティングされたカプセルからのＡＰＩの不注意な流出を防ぐために、２つの部品で形成されたカプセルをさらにバンドして、カプセルをしっかりと密封するのが一般的な方法である。
【００１１】
このようなアプローチは、商業規模で腸内送達用の特定のＡＰＩを製剤化するためにうまく採用されているが、より感度の高いＡＰＩ、特にＬＢＰに必ずしも適用できるとは限らないことが見出されている。
【００１２】
本開示は、生存可能な製品を製剤化することにおけるこの困難の主な理由の１つが、生きた細菌がさらされる過酷な条件であることを認識している。多くのＬＢＰまたはプロバイオティクス製剤では、細菌は凍結乾燥された形で提供される。これは、低温及び低圧を使用して乾燥した粉末製品を提供するプロセスである凍結乾燥によって達成され、細菌集団がそのような条件にさらされると、生存可能な生物が失われる。
【００１３】
細菌集団における生存可能な生物の喪失が最小限に抑えられるように凍結乾燥プロセスを最適化できたとしても、本開示は、さらなる細菌の喪失をもたらす可能性のある製剤プロセスにまだ他のステップがあることを認めている。
【００１４】
例えば、典型的には凍結乾燥後、得られた粉末は賦形剤とブレンドされる。混合装置によって加えられる剪断力は、細菌を不活化する可能性がある。さらに、嫌気性生物の場合、混合装置内の酸素の存在も生細胞の喪失を引き起こす可能性がある。
【００１５】
一部の用途では、ＬＢＰを腸に送達することが望ましい。当業者が認識するように、これは、例えば、ＬＢＰを含む錠剤コアまたは従来のカプセルに対して、耐胃性コーティング（複数可）を使用することによって達成することができる。このステップは、いくつかの実施形態において細菌の生存能力に著しく悪影響を与えることが見出された。
【００１６】
理論に拘束されることを望まないが、これは、腸溶性コーティングの適用中に使用される、生きた細菌を殺傷する溶媒（複数可）の剤形の内部（例えば、錠剤コアもしくはカプセルの内部）への侵入、及び／またはコーティングの乾燥中製品の高温への暴露によるものであることが本開示において考えられている。
【００１７】
本開示はまた、一旦製剤化されると、細菌集団の生存能力に対するリスクが依然として存在することを認識している。剤形の投与前に、それは、投与前に数年ではないにしても、数ヶ月間保存することができる。製剤への微妙な変更は、生細胞数に悪影響を与える可能性があり、例えば、大気中の水分の取り込み、またはＬＢＰとの賦形剤の不適合であり、これらの問題は、時間の経過とともに明らかとなる。
【００１８】
さらに、本開示は、製剤化された製品の投与が生細胞数も減少させる可能性があることを認めている。摂取されると、製品は腸に到達する前に胃の中で非常に酸性の環境に遭遇する。この段階を十分な数で生き残るために胃の環境から細菌を保護するための製品を製剤化することは、自然界に見られる対応する細菌と比較して、重要な治療上の利益を提供することができる。上で説明したように、腸溶性コーティングされたカプセルで提供されるＡＰＩの胃耐性を強化するための１つのアプローチは、カプセルをバンドすることである。しかしながら、ＬＢＰに関連して、バンドするプロセス（溶媒の使用及び／または乾燥のための高温を必要とする）は、細菌の生存率の低下に関連している。
【００１９】
腸溶性コーティングされた多くのプロバイオティクス製品が商品化されているが、問題の生物は通常、上述の効果の結果として生存可能な生物の減少を許容するために非常に多い細胞数で製剤化される。しかしながら、当業者は、そのようなアプローチは、定義された数の生物の信頼できる送達が規制当局によって要求されているＬＢＰなどの医薬品には許容されないことを認識するであろう。
【００２０】
さらに、多くのプロバイオティクス製剤は、Ｌ．ｃａｓｅｉなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌種などの自然に高い耐酸性を持つ細菌、またはＢ．ｃｌａｕｓｉｉなどのＢａｃｉｌｌｕｓ菌種などの保護胞子を形成でき、そのため、腸の比較的良性の環境で発芽することができる細菌に基づいている。しかしながら、多くのＬＢＰは本質的に耐酸性ではないか、または胞子形成しないため、より高いレベルの保護が必要である。
【００２１】
ＬＢＰを製剤化することの１つのさらなる困難は、多くの治療的に活性な生物が嫌気性であり、製品の調製中または保存中のいずれかでのそれらの生物の空気への曝露（例えば、それらの生物を含む製品の内部への空気の侵入から）が問題であり、生細胞数の減少をもたらす可能性がある。
【００２２】
したがって、実行可能な腸管送達のためにＬＢＰを含む医薬品を製造する試みがなされてきたが、本開示は、そのような剤形の商業規模の製造に課題が存在することを認識している。したがって、有効量のＬＢＰを薬学的に許容できる信頼性で患者に送達するために使用でき、商業規模で製造することができる製剤、及びそのような製剤を提供するためのプロセスが依然として必要とされている。
【００２３】
本発明の第１の態様によれば、生きた生物療法製品を含む経口投与可能な腸溶性剤形であって、ｉ）抗酸化剤を含み、抗酸化剤がシステインであり、ｉｉ）炭酸ナトリウムまたは炭酸カルシウムを含まない、及び／またはｉｉｉ）マルトデキストリンを含まない、剤形が提供される。
【００２４】
本発明者らは、賦形剤の上述の選択（または選択肢ｉｉ）またはｉｉｉ）の場合の回避）が、２℃〜８℃で保存された場合に、少なくとも１２ヶ月間保存安定（shelf stable）である剤形を有利かつ予想外に提供することを見出した。
【００２５】
本明細書で使用されるとき、保存安定という用語は、剤形が２℃〜８℃の温度で防湿包装に少なくとも１２ヶ月間保存される場合、剤形の生細胞数（カプセルシェル（存在する場合）または腸溶性コーティング（存在する場合）を除く、グラムあたりのＣＦＵ数）が３ｌｏｇ以下しか減少しないことを意味するために使用される。特定の実施形態では、剤形が２℃〜８℃の温度で防湿包装に少なくとも１２ヶ月間保存された場合、剤形の生細胞数は２ｌｏｇ以下しか減少しない。さらに特定の他の実施形態では、剤形が２℃〜８℃の温度で防湿包装に少なくとも１２ヶ月間保存された場合、剤形の生細胞数は１ｌｏｇ以下しか減少しない。本発明の実施形態では、５℃の温度で防湿包装に６ヶ月保存された場合、剤形の生細胞数は、３ｌｏｇ以下しか減少しない。特定の実施形態では、剤形の生細胞数は、６ヶ月の保存にわたって２ｌｏｇ以下しか減少せず、特定の他の実施形態では、剤形の生細胞数は、６ヶ月の保存にわたって１ｌｏｇ以下しか減少しない。特定の他の実施形態では、剤形の生細胞数は、６ヶ月の保存にわたって０．５ｌｏｇ以下しか減少しない。特定の他の実施形態では、剤形の生細胞数は、２１ヶ月の保存にわたって１ｌｏｇ以下しか減少しない。
【００２６】
本発明の剤形の特徴ｉ）に関して、多くの抗酸化剤が、医薬製剤の当業者に知られている。本発明者らは、以下の実施例に示されるように、システインは、治療的に活性な細菌の生細胞数を維持する際に、アスコルビン酸などの従来使用される抗酸化剤よりも優れていることを有利に発見した。
【００２７】
本発明の実施形態では、システインに加えて抗酸化剤を使用することができる。これらには、アルギニン、アスコルビン酸（及びその塩及びエステル、例えば、パルミチン酸アスコルビル、アスコルビン酸ナトリウム）、ブチル化ヒドロキシアニソールもしくはブチル化ヒドロキシトルエンなどのブチル化剤、クエン酸、エリソルビン酸、フマル酸、グルタミン酸、グルタチオン、リンゴ酸、メチオニン、モノチオグリセロール、ペンテチン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム（メタ重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸カリウムなど）、プロピオン酸、没食子酸プロピル、尿酸、ホルムアルデヒドスルホキシレートナトリウム、亜硫酸塩（例えば、亜硫酸ナトリウム）、チオ硫酸ナトリウム、二酸化硫黄、チモール、トコフェロール（遊離またはエステル化）、尿酸（及びその塩）、ならびにその塩及び／またはエステルが含まれる。
【００２８】
システインは特定の医薬品の製剤における抗酸化剤とみなされてきたが、ＬＢＰを含む剤形の製剤におけるその使用は知られていない。システインが殺菌効果を示すことが長年知られていることを考えると、システインがＬＢＰの長期安定化に寄与することができるという発見は驚くべきことである。これに関連して、Ｂｅｒｇｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９８２，  １５２（１），  ８１−８）の、特にシステインの静菌効果を要約したその記事の冒頭の段落を参照することができる。しかしながら、この効果にもかかわらず、システインはＬＢＰに対してその静菌効果を発揮せず、（上記のように）実際に本発明の剤形の安定性を増強することが以下の実施例で実証された。
【００２９】
本発明の特徴ｉｉ）（炭酸ナトリウムまたは炭酸カルシウムの除外）は、発明者が、薬学的に許容されるレベルのＬＢＰの患者への送達を可能にする製品安定性に寄与すると予想外に特定したさらなる製剤アプローチである。
【００３０】
様々なガス発生賦形剤が、従来、ＬＢＰの製剤化に使用されてきた。実際、そのような賦形剤の使用は、科学文献で明確に提唱されている。例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．による論文（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１７，  ５２，  ５１９−５３０）では、カプセル剤としての炭酸カルシウムの使用は、シミュレートされた胃の条件下及び冷蔵でのＬＢＰの生存を増強するために提唱された。Ｍａｊｋｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｐｏｌｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ２００３，  Ｖｏｌ．  １２／５３，  ＳＩ  ２，  ｐｐ．  ６４−６８）において、食事中のカルシウムを補うための炭酸カルシウムの使用が提案された。Ｈｙｐｅｒｂｉｏｔｉｃｓにより商品化されるＰＲＯ−１５という名前のプロバイオティクスの製品レポート（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｏｗｅｒｏｆｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ．ｃｏｍ／Ｈｙｐｅｒｂｉｏｔｉｃｓ−ＰＲＯ−１５．ｈｔｍｌ）には、その製品中の炭酸ナトリウムの使用は、「タブレット内及び腸内の崩壊錠の周囲のｐＨを制御するため」である。と記載されている。市販のプロバイオティック製剤（ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｖｉｎｇｗｅｌｌｎｅｓｓｂｌｏｇ．ｗｏｒｄｐｒｅｓｓ．ｃｏｍ／２０１３／０１／２３／ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ−ｐａｒａｄｏｘ／）をレビューする記事では、著者デビッドピーターソン博士は、「生存率を高めるために、プロバイオティクス冷蔵するだけでなく、耐酸性にすることが必要である」と説明する。多くの企業は耐酸性を使用していない。耐酸性を試みる他の人は、制酸剤である炭酸カルシウムを使用する。これは、胃酸の殺菌効果と胆汁及び膵液の放出の刺激を中和する。
【００３１】
これらの推奨事項に照らして、商品化されたＬＢＰ製品の大部分が炭酸ナトリウムまたは炭酸カルシウムなどのガス発生賦形剤を含むことは驚くべきことではない。このような製品の例としては、２〜３例挙げると、ＨｙｐｅｒｂｉｏｔｉｃｓのＰＲＯ−１５、Ｇｕｔｓ＆ＧｌｏｒｙのＰｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｐｏｗｅｒ  ６０カプセル、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ＨｅａｌｔｈのＰｒｏｂｉｏｔｉｃＣＤ、及びＫｙｏｄｏｐｈｉｌｕｓのＫｙｏｌｉｃなどがある。
【００３２】
これにもかかわらず、本発明者らは、酸と接触するとガスを発生する賦形剤を含めると、腸溶性剤形が胃を通過するとき、または  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験でのシミュレートされた（simulated）胃環境で、ＬＢＰの生存率に実際に有害な影響を与えることを予期せず発見した。理論に拘束されることを望まないが、これは、剤形が実際のまたはシミュレートされた胃の環境に曝されたときの微量の酸の侵入によるものであると考えられている。これがＬＢＰの不安定化の原因である場合、これは２つの理由で驚くべきことである。第一に、腸溶性剤形は、剤形が腸に到達するまで生物学的媒体の侵入を許さない材料から調製されることを考えると、胃環境からの酸性媒体の侵入は予想されないであろう。第二に、当業者が、胃環境からの少量の酸性媒体が、剤形が腸に入る前に剤形に入ることができると予想したとしても、彼または彼女は、上述の参考文献によって、炭酸ナトリウムまたは炭酸カルシウムなどの賦形剤の使用が酸性媒体によって引き起こされるＬＢＰの生存率の低下を実際に防ぐと教示されるであろう。しかしながら、いまではその逆が当てはまることが判明している。
【００３３】
したがって、本発明の実施形態では、本発明の剤形は、炭酸ナトリウム及び／または炭酸カルシウムを含まない。
【００３４】
本発明の第３の特徴（マルトデキストリンの除外）はまた、マルトデキストリンがＬＢＰと適合しない可能性があることを発明者が発見したので、ＬＢＰを含む保存安定剤形の提供に有益である。
【００３５】
上で説明したように、本発明の剤形は、経口投与可能な腸溶性剤形、すなわち、選択媒体（すなわち、腸環境）にのみ溶解することができ、したがってその内容物の胃への放出を防ぐことができるものである。本明細書に記載のそのような胃保護剤形は、有効量のＬＢＰ（すなわち、生きた嫌気性細菌）及び抗酸化剤を含むことができ、コロニー形成単位（ＣＦＵ）によるＬＢＰの有効量は、シミュレートされた胃の環境において１ｌｏｇ以下しか減少しない。胃保護特性は、例えば、（ａ）本明細書に記載の剤形をｐＨ１．２の酸性媒体に３０分間曝露すること、（ｂ）剤形をｐＨ６．８の腸媒体に４５分間曝露すること、及びｃ）暴露前に対して暴露後のＣＦＵを比較するによって決定することができる。
【００３６】
当業者は、経口投与可能な腸溶性剤形に精通しており、これらには、錠剤、カプセル、顆粒、及びアルギン酸塩カプセル化粒子などの他のマイクロまたはナノ製剤が含まれ、本発明の実施形態では、剤形は、これらのいずれかであってよい。場合によっては、腸溶性の錠剤またはカプセルが特に好ましい。
【００３７】
当業者はまた、剤形を腸溶性にするための技術に精通しているであろう。これは、典型的には、錠剤またはカプセルなどの剤形への腸溶性コーティングの適用によって達成され、腸溶性コーティングされた剤形は、本発明の実施形態を構成する。本発明で使用することができる腸溶性コーティング材料には、ｐＨ５．５以上で溶解するポリマー（例えば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ  ３０  Ｄ−５５及びＬ  １００−５５グレード）、ｐＨ６．０以上で溶解するポリマー（Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ  １００及びＬ１２．５グレードの場合）及び／またはｐＨ７．０以上で溶解するポリマー（Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ  １００、Ｓ  １２．５、及びＦＳ  ３０  Ｄグレードの場合）が含まれる。追加的または代替的に、本発明の剤形がカプセルを含む場合、腸溶的にコーティングされることに加えて、カプセルはまた、２つのカプセルの半分の間の接合部での胃媒体の侵入を防ぐためにバンドし得る。
【００３８】
代替の実施形態では、剤形は、本質的に腸溶性の剤形であり得る。本発明者らは、そのような剤形、特に本質的に腸溶性のカプセルの使用が、ＬＢＰを実行可能に製剤化するための非常に効果的かつ直接的なアプローチを提供することを見出した。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、「本質的に腸溶性のカプセル」という用語は、穏やかな酸性、中性、または塩基性のｐＨを有する媒体に曝露されたときに溶解し、したがって、カプセルの内容物を媒体に放出する、材料から形成される（部分的にまたは全体的のいずれか）カプセルを指すために使用される。本発明の実施形態では、本質的に腸溶性のカプセルは、約４．０以上、約４．５以上、約５．０以上、約５．５以上、約６．０以上、約６．５以上、または約７．０以上のｐＨを有する媒体に曝露されると、その内容物を放出する。同様に、「腸溶性」という用語は、約４．０以上、約４．５以上、約５．０以上、約５．５以上、約６．０以上、約６．５以上、または約７．０以上のｐＨを有する媒体に曝露されると溶解する材料を指すために使用される。
【００４０】
その本質的に腸溶性の特性のために、カプセルは、そうでなければＬＢＰに損傷を与える可能性のある充填後処理、例えば、コーティング、乾燥、及び／またはバンドすることを必要としない。したがって、本発明の実施形態では、本質的に腸溶性のカプセルは、連続的なコーティング（すなわち、カプセル全体を覆うもの）を含まず、及び／またはバンドされていない。
【００４１】
本質的に腸溶性のカプセルは、単層もしくは多層であり得、及び／または特定のｐＨで溶解する胃腸材料で全体的または部分的に形成され得る。多層の実施形態では、１または２以上の層は、特定のｐＨで溶解する腸溶性材料で形成することができる。
【００４２】
本質的に腸溶性のカプセルは、穏やかな酸性、中性、または塩基性のｐＨを有する媒体に曝露されたときにカプセルの全体的または部分的な溶解を可能にする任意の材料（複数可）で形成することができる。本発明の実施形態では、本質的に腸溶性のカプセルは、脂肪酸、ワックス、シェラック、プラスチック、植物繊維、腸溶性ポリマーまたはそれらの混合物から部分的または全体的に形成することができる。本発明で使用できる腸溶性材料（本質的に腸溶性の剤形、または代替の実施形態では腸溶性コーティングのいずれかを生成するため）には、メタクリレートポリマー、アクリル酸メチル−メタクリル酸コポリマー、メタクリル酸−メタクリル酸メチルコポリマー、ポリビニルアセテートフタレート、シェラック、アルギン酸ナトリウム、ゼイン、デキストリン、アミローススターチ及びスターチ誘導体、ならびにヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、セルロースアセテートスクシネート、セルロースアセテートトリメリテート、セルロースアセテートフタレートを含むセルロース及びセルロース誘導体、またはそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。可塑剤はまた、本質的に腸溶性のカプセルが形成される材料に含まれ得る。本質的に腸溶性のカプセルの製造に使用できる材料の例、及びそのようなカプセルを調製する方法は、欧州特許第２７２２１０４号に提供されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。本質的に腸溶性のカプセルの例は、ＥｎＴＲｉｎｓｉｃＤＤＴまたはＥＣＤＤＴの商品名でＣａｐｓｕｇｅｌによって提供されている。
【００４３】
本発明で使用されるカプセルは、それらがその中に含まれるＬＢＰの周りに腸溶性シールを提供するために閉じることができるという条件で、任意の形状、形態または構造をとることができる。例えば、カプセルは硬くても柔らかくてもよい。本発明の実施形態では、カプセルは、２つの部分からなるカプセルまたは複数の部分からなるカプセル（すなわち、２つ以上の部分を結合することによって閉じられるカプセル）である。
【００４４】
二液型カプセルまたは多液型カプセルの場合、カプセルの２つ以上の部分を機械的に結合することにより、カプセル部分を閉じることができる。ＬＢＰの周りにシールの形成をもたらす任意の形態の機械的相互作用を使用することができる。想定される機械的相互作用の例には、プッシュフィットカップリング、摩擦カップリング、及び／またはねじ式カップリングが含まれる。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、「生きた生物療法製品」または「ＬＢＰ」という用語は、生細菌を含み、疾患または状態の予防、治療、または治癒に有効であり、ワクチンではない製品を指す。
【００４６】
本発明の実施形態では、ＬＢＰは、嫌気性細菌からなるか、またはそれを含む。特定の実施形態では、ＬＢＰは、偏性嫌気性菌である細菌を含むか、またはそれからなる。上述のように、嫌気性細菌の製剤化は、従来の腸溶性製剤化アプローチを使用することは特に困難である。しかしながら、本発明者らは、そのような生物が本発明に従って実行可能に製剤化され得ることを見出した。
【００４７】
追加的または代替的に、本発明に従って製剤化することができる細菌は、水素栄養性であり得る。
【００４８】
本発明に従って製剤化することができる生物には、以下の属に属する生物が含まれる：エンテロコックス属（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｌｌｉｆｌａｖｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、もしくはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブラウティア属（例えば、Ｂｌａｕｔｉａ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｗｅｘｌｅｒａｅ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、もしくはＢｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ）、バクテロイデス属（例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、もしくはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｐｒｉｃｏｌａ）、フェカリバクテリウム属（例えば、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）、バリアトリカス属（例えば、Ｂａｒｉａｔｒｉｃｕｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ビフィドバクテリウム属（例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、もしくはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロセブリア属（例えば、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、もしくはＲｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、フラボニフラクター属（例えば、Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ  ｐｌａｕｔｉｉ）、アナエロツルンカス属（例えば、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ  ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ）、パラバクテロイデス属（例えば、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ、もしくはＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、エリシペラトクロストリジウム属（例えば、Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｍｏｓｕｍ）、メガスファエラ属（例えば、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ）、ペディオコッカス属（例えば、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉｉ）、ユーバクテリウム属（例えば、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｎｔｏｒｔｕｍ、ｆｉｓｓｉｃａｔｅｎａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｄｒｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ、もしくはＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ）、ルミノコッカス属（例えば、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｏｒｑｕｅｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｎａｖｕｓ、もしくはＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒｏｍｉｉ）、シュードフラボニフラクター属（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ  ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ）、クロストリジウム族（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｅｘｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｙｌｅｍｏｎａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｒｔｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｓｐｏｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｏｃｕｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍａｙｏｍｂｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｌｔｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂａｒｔｌｅｔｔｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ、もしくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｏｒｂｉｓｃｉｎｄｅｎｓ）、もしくはコプロコッカス属（例えば、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｍｅｓ、もしくはＣｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｔｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、もしくはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、アセチビブリオ属（例えば、Ａｃｅｔｏｖｉｂｒｉｏ  ｅｔｈａｎｏｌｇｉｇｎｅｎｓ）、ドレア属（例えば、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ）、またはラクノスピラ属。そのような生物の例には、欧州特許第１２８０５４１号、同第１４４８９９５号、及び同第３２０９３１０号、欧州特許公開番号第３２０６７００号、同第２７６３６８５号、及び英国特許出願第１４２３０８４．１号に開示されているものが含まれ、これらの内容は全て参照により本明細書に組み込まれる。本発明に従って製剤化することができる生物のさらなる例には、英国特許出願第１５１０４７０．６号、同第１５１０４６８．０号、同第１５１０４６９．８号、同第１５１０４６６．４号、及び同第１５１０４６７．２号に開示されるものが含まれ、これらの内容は全て参照により本明細書に組み込まれる。本発明の実施形態では、剤形は、クロストリジウムクラスターＩＶまたはＸＩＶａに属する生物を含まない。
【００４９】
本発明の実施形態では、ＬＢＰは、従来のプロバイオティクス細菌ではなく、例えば、それらは、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属に属さない、及び／または乳酸菌ではない。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ＬＢＰは、偏性嫌気性細菌を含むか、またはそれからなることができる。他の実施形態では、ＬＢＰは、通性嫌気性細菌及び／または微好気性細菌を含むか、またはそれらからなることができる。
【００５１】
例示的な実施形態では、ＬＢＰは、非胞子形成細菌を含むか、またはそれからなる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本発明の剤形は、特定の属の１または２以上の細菌株を含み、他の属からの細菌を含まないか、または別の属からのｄｅ  ｍｉｎｉｍｉｓ、または生物学的に無関係な量の細菌のみを含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本発明の剤形は、特定の種の１または２以上の細菌株を含み、他の種からの細菌を含まないか、または別の種からのｄｅ  ｍｉｎｉｍｉｓ、または生物学的に無関係な量の細菌のみを含む。
【００５４】
ある特定の実施形態では、本発明の剤形は、単一の細菌株または種を含み、他のいかなる細菌株または種も含まない。そのような組成物は、ｄｅ  ｍｉｎｉｍｉｓ、または生物学的に無関係な量のみの他の細菌株または種を含んでもよい。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本発明の剤形は、１つを超える細菌株を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、同じ種に由来する１つを超える株（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５を超える菌株）を含み、任意選択で、いずれかの他の種に由来する細菌を含まない。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、同じ種に由来する５０種未満の株（例えば４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、または３未満の菌株）を含み、任意選択で、いずれかの他の種に由来する細菌を含まない。いくつかの実施形態では、本発明の剤形は、同じ種に由来する１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１５、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、６〜３０、６〜１５、１６〜２５、または３１〜５０の株を含み、任意選択で、いずれかの他の種に由来する細菌を含まない。本発明は、前述の任意の組み合わせを含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、剤形は、微生物コンソーシアムを含む。例えば、いくつかの実施形態では、剤形は、微生物コンソーシアムの一部として特定の細菌株を含む。例えば、いくつかの実施形態では、剤形は、他の属からの１または２以上（例えば、少なくとも２、３、４、５、１０、１５または２０）の他の細菌株と組み合わせて存在する細菌株を含み、ｉｎ  ｖｉｖｏの腸内で、それと共に共生的に生きることができる。
【００５８】
例えば、いくつかの実施形態では、剤形は、異なる属からの細菌株と組み合わせた特定の細菌株を含む。いくつかの実施形態では、微生物コンソーシアムは、単一の生物、例えばヒトの糞便試料から得られた２つ以上の細菌株を含む。いくつかの実施形態では、微生物コンソーシアムは、自然界では一緒に見出されない。例えば、いくつかの実施形態では、微生物コンソーシアムは、少なくとも２つの異なる生物の糞便試料から得られた細菌株を含む。いくつかの実施形態では、２つの異なる生物は、同じ種、例えば、２つの異なるヒトに由来する。いくつかの実施形態では、２つの異なる生物は、乳児ヒト及び成人ヒトである。いくつかの実施形態では、２つの異なる生物は、ヒト及び非ヒト哺乳動物である。
【００５９】
ある特定の実施形態では、本発明は、細菌株の量が、剤形の重量１グラムあたり約１×１０３〜約１×１０１１コロニー形成単位である、上述の医薬剤形を提供する（カプセル本体（存在する場合）またはいずれかの腸溶性コーティング（存在する場合）を除く。
【００６０】
いくつかの態様において、本明細書に開示される医薬剤形は、１または２以上の薬学的に許容される賦形剤を含む。本明細書に開示される医薬組成物の目的のための例示的な薬学的に許容される賦形剤には、結合剤、崩壊剤、超崩壊剤、潤滑剤、希釈剤、充填剤、香味料、流動促進剤、吸着剤、可溶化剤、キレート剤、乳化剤、増粘剤、分散剤、安定剤、懸濁剤、吸着剤、造粒剤、保存剤、緩衝剤、着色剤、及び甘味料、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。結合剤の例には、微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルピロリドン、ポリビニルポリピロリドン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラトニア、キトサン、綿実油、デキストレート、デキストリン、エチルセルロース、ゼラチン、グルコース、ベヘン酸グリセリル、ガラクトマンナン多糖類、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチル、セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒプロメロース、イヌリン、ラクトース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、マルトデキストリン、メチルセルロース、ポロキサマー、ポリカルボフィル、ポリデキストロース、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリメタクリレート、アルギン酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン、スクロース、ヒマワリ油、植物油、トコフェルソラン、ゼイン、またはそれらの組み合わせが含まれる。崩壊剤の例には、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、低置換ヒドロキシプロピルセルロース（Ｌ−ＨＰＣ）、クロスカルメロースナトリウム、デンプングリコレートナトリウム、ラクトース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、メチルセルロース、ポラクリリンカリウム、アルギン酸ナトリウム、デンプン、またはそれらの組み合わせが含まれる。潤滑剤の例には、ステアリン酸、フマル酸ステアリルナトリウム、ベヘン酸グリセリル、ステアリン酸カルシウム、モノステアリン酸グリセリン、パルミトステアリン酸グリセリル、ラウリル硫酸マグネシウム、ミネラルオイル、パルミチン酸、ミリスチン酸、ポロキサマー、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ラウリルナトリウム硫酸塩、タルク、ステアリン酸亜鉛、安息香酸カリウム、ステアリン酸マグネシウム、またはそれらの組み合わせが含まれる。希釈剤の例には、タルク、アルギン酸アンモニウム、炭酸カルシウム、乳酸カルシウム、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、硫酸カルシウム、セルロース、酢酸セルロース、コーンスターチ、デキストレート、デキストリン、デキストロース、エリスリトール、エチルセルロース、フルクトース、フマル酸、グリセリルパルミトステアレート、イソマルト、カオリン、ラクチトール、ラクトース、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、マルトデキストリン、マルトース、マンニトール、微結晶性セルロース、ポリデキストロース、ポリメタクリレート、シメチコン、アルギン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ソルビトール、デンプン、スクロース、スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリン、トラガカント、トレハロース、キシリトール、またはそれらの組み合わせが含ま���る。
【００６１】
様々な有用な充填剤または希釈剤には、リン酸カルシウム、無水二塩基性、リン酸カルシウム、二塩基性二水和物、リン酸カルシウム三塩基性、硫酸カルシウム、セルロース粉末、ケイ化マイクロクリスタイリンセルロース、酢酸セルロース、圧縮性糖、菓子糖、デキストレート、デキストリン、デキストロース、フルクトース、カオリン、ラクチトール、ラクトース、ラクトース一水和物、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、マルトデキストリン、マルトース、マンニトール、マイクロクリスタイリンセルロース、ポリデキストロース、シメチコン、アルギン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ソルビトール、デンプン、アルファ化デンプン、スクロース、トレハロース及びキシリトール、またはそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
適切な潤滑剤の例には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、タルク、ベヘン酸グリセリル、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシドポリマー、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、オレイン酸ナトリウム、ステアリルフマル酸ナトリウム、ＤＬ−ロイシン、コロイド状シリカ、及び当該技術分野で知られている他のものが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、潤滑剤はステアリン酸マグネシウムである。
【００６３】
様々な有用な流動促進剤には、三塩基性リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、粉末、コロイド状二酸化ケイ素、ケイ酸マグネシウム、三ケイ酸マグネシウム、デンプン、及びタルク、またはそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００６４】
薬学的に許容される界面活性剤には、医薬剤形での使用に適した非イオン性とイオン性界面活性剤の両方が含まれるが、これらに限定されない。イオン性界面活性剤は、アニオン性、カチオン性、または双性イオン性界面活性剤のうちの１または２以上を含み得る。様々な有用な界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、モノオレエート、モノラウレート、モノパルミテート、モノステアレートまたはオリオキシエチレンソルビタンの別のエステル、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム（ＤＯＳＳ）、レシチン、ステアリン酸アルコール、セトステアリルアルコール、コレステロール、ポリオキシエチレンリシン油、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリド、及びポロキサマーが含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
特定の実施形態では、本発明は、前記細菌株が凍結乾燥されている、上述の医薬組成物を提供する。場合によっては、細菌株は、細菌株が約１００℃を超える、約７０℃を超える、約５０℃を超える、または約３０℃を超える温度に曝露されないプロセスで凍結乾燥される。
【００６６】
特定の実施形態では、本発明は、上述の医薬組成物であって、約２℃〜８℃の防湿容器に組成物を保存し、容器を相対湿度５０％の雰囲気に置いた場合、少なくとも約１年、１．５年、２年、２．５年、または３年の期間の後に、グラムあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）で測定するとき、細菌株の損失が、３ｌｏｇ未満、２ｌｏｇ未満、または１ｌｏｇ未満である、組成物を提供する。追加的または代替的に、本発明の実施形態では、組成物を５℃の防湿容器に保存し、容器を相対湿度５０％の雰囲気に置いた場合、６ヶ月の期間の後に、グラムあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）で測定するとき、細菌株の損失が、３ｌｏｇ未満、２ｌｏｇ未満、１ｌｏｇ未満、または０．５ｌｏｇ未満である。
【００６７】
特定の実施形態では、剤形は、剤形（カプセル本体（存在する場合）及び任意の腸溶性コーティング（存在する場合）を除く）の重量に対して、約１×０３〜約１×１０１３ＣＦＵ／ｇ、例えば、約１×１０４〜約１×１０１２ＣＦＵ／ｇ、約１×１０６〜約１×１０１１ＣＦＵ／ｇ、約１×１０８〜約１×１０１２ＣＦＵ／ｇ、または約１×１０８〜約１×１０１０ＣＦＵ／ｇの量でＬＢＰを含む。特定の実施形態では、剤形は、少なくとも１×１０１０ＣＦＵ／ｇ、少なくとも１×１０９ＣＦＵ／ｇ、少なくとも１×１０８ＣＦＵ／ｇ、少なくとも１×１０７ＣＦＵ／ｇ、または少なくとも１×１０６ＣＦＵ／ｇで含み得る。
【００６８】
上述のように、本発明の製品は、驚くべきことに、酸性媒体への曝露後に高レベルのＬＢＰ生存率を維持する。本発明の実施形態では、本発明の製品内に含まれるＬＢＰの細胞数は、シミュレートされた胃腸環境、すなわち、５０ｒｐｍのパドル攪拌で３０分間ｐＨ１．２の第１の媒体に曝露された後、１２０ｒｐｍのパドル攪拌で４５分間ｐＨ６．８の第２の媒体に曝され、生細胞数を３ｌｏｇ以下、２ｌｏｇ以下、または１ｌｏｇ以下減少させる。
【００６９】
ＬＢＰ生細胞計数（例えば、ＣＦＵ／ｇを決定するため）は、当業者に知られている技術を使用して実施することができる。例えば、ＣＦＵ列挙法は凍結乾燥ＬＢＰで実行できる。ＣＦＵ／ｇの決定がなされるとき、剤形（すなわち、カプセルシェル（存在する場合）及び腸溶性コーティング（存在する場合）を除く）に存在する組成物１グラムあたりのコロニー形成単位の数が決定される。
【００７０】
剤形に存在するＬＢＰは、共生的であり得る、すなわち、それは、ドナー（例えば、ヒトの乳児、小児、青年または成人）から得られる。
【００７１】
本発明の実施形態では、剤形は、生物学的に純粋な単一株の細菌を含む。本明細書で使用されるとき、「生物学的に純粋な」という用語は、ｄｅ  ｍｉｎｉｍｉｓのレベルまたは生物学的に無関係なレベルの他の細菌株を含む培養物を指す。特定の実施形態では、剤形は、他の細菌種の細菌細胞の総数の割合として、約１％未満、約０．５％未満、約０．２％未満、約０．１％未満、約０．０５％未満、約０．０２％未満、または約０．０１％未満を含む。
【００７２】
代替の実施形態では、本発明の剤形は、複数、例えば、２、３、４、５、または５つを超える菌株を含むことができる。
【００７３】
ＬＢＰに加えて、本発明の医薬品は、例えば、希釈剤、安定剤、成長刺激剤、充填剤、潤滑剤、流動促進剤などを含む１または２以上の賦形剤を含むことができる。
【００７４】
ＬＢＰ（及び上述の剤形の特徴ｉの場合、システイン）に加えて、本発明の剤形は、１または２以上の薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。このような適切な賦形剤の例は、医薬品添加剤ハンドブックに記載されている。治療的使用のための許容可能な賦形剤は、製薬分野でよく知られている。
【００７５】
好適な担体の例としては、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられる。
【００７６】
好適な希釈剤の例としては、エタノール、グリセロール、及び水が挙げられる。医薬担体、賦形剤または希釈剤の選択は、標準的な薬務に関して選択することができる。
【００７７】
剤形は、任意の適切な結合剤（複数可）、潤滑剤（複数可）、懸濁剤（複数可）、コーティング剤（複数可）、可溶化剤（複数可）を含むことができる。
【００７８】
好適な結合剤の例としては、デンプン、ゼラチン、天然糖、例えばグルコース、無水ラクトース、流動性ラクトース、ベータラクトース、トウモロコシ甘味料、天然及び合成のガム、例えばアカシア、トラガントまたはアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ならびにポリエチレングリコールが挙げられる。
【００７９】
好適な滑沢剤の例としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。
【００８０】
保存剤、安定剤、色素、及びさらには香味料を医薬組成物中に供給してもよい。
【００８１】
保存剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。
【００８２】
懸濁剤も使用できる。
【００８３】
本発明の実施形態では、ＬＢＰはマイクロカプセル化されていない。
【００８４】
本発明の実施形態では、本発明の製品は、糖、例えば単糖または二糖を含むことができる。追加的または代替的に、糖は還元糖または非還元糖であり得る。製品が還元糖を含むそのような実施形態では、非還元糖を製品から除外することができ、逆もまた同様である。本発明において賦形剤として使用することができる特定の糖の例には、スクロース及びトレハロースが含まれる。
【００８５】
本発明の医薬品は、プレバイオティクスをさらに含むことができる。「プレバイオティクス」という用語は、１つまたは限られた数の細菌の増殖及び／または活性を選択的に刺激することによってＬＢＰに有益に影響を与える非消化性成分を意味する。プレバイオティクスの例としては、オリゴ糖、フラクトオリゴ糖、及びガラクトオリゴ糖が挙げられる。
【００８６】
ＬＢＰ（及び任意選択で存在する任意の賦形剤のうちの１または２以上）は、凍結乾燥物の形態で提供することができる。凍結乾燥物は、凍結乾燥中にＬＢＰを保護するために、または凍結乾燥物に機能的特性を提供するために、ＬＢＰが一緒に凍結乾燥された他の賦形剤をさらに含み得る。凍結乾燥物に存在し得る賦形剤の例として、これらには、マンニトール、スキムミルク及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、スクロース、トレハロース及び／または上記で同定された他の糖の１つが含まれる。凍結乾燥媒体としてマンニトールとスクロースの混合物を使用することができる。
【００８７】
本発明の特定の実施形態では、ＬＢＰを含む凍結乾燥物はまた、抗酸化剤（例えば、システインまたはその塩）を含み得る。追加的または代替的に、アルギニン、アスコルビン酸（及びその塩及びエステル、例えば、パルミチン酸アスコルビル、アスコルビン酸ナトリウム）、ブチル化ヒドロキシアニソールもしくはブチル化ヒドロキシトルエンなどのブチル化剤、クエン酸、エリソルビン酸、フマル酸、グルタミン酸、グルタチオン、リンゴ酸、メチオニン、モノチオグリセロール、ペンテチン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム（メタ重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸カリウムなど）、プロピオン酸、没食子酸プロピル、尿酸、ホルムアルデヒドスルホキシレートナトリウム、亜硫酸塩（例えば、亜硫酸ナトリウム）、チオ硫酸ナトリウム、二酸化硫黄、チモール、トコフェロール（遊離またはエステル化）、尿酸（及びその塩）、ならびにその塩及び／またはエステルが存在し得る。そのような実施形態では、剤形の残りは抗酸化剤を含まなくてもよい。
【００８８】
実施形態で使用される抗酸化剤（例えば、システイン）は、塩として存在することができる。塩の例として、アセテート、アクリレート、アジペート、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、亜硫酸水素塩、酒石酸水素塩、臭化物、酪酸塩、ブチン−１，４−ジオエート、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、カプロン酸塩、カプリル酸塩、クロロ安息香酸塩、塩化物、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、デカン酸塩、ジグルコン酸塩、リン酸二水素、ジニトロ安息香酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヘキシン−１，６−ジオエート、ヒドロキシ安息香酸塩、γ−ヒドロキシ酪酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ヨウ化物、イソ酪酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、マンデル酸塩、メタリン酸塩、メタンスルホン酸塩、安息香酸メトキシ、安息香酸メチル、リン酸一水素、１−ナフタレンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、パルモエート、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ピロ硫酸塩、ピロリン酸塩、プロピオレート、フタル酸エステル、フェニルアセテート、フェニルブチレート、プロパンスルホネート、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、亜硫酸塩、コハク酸塩、スベリン酸、セバシン酸塩、スルホン酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシレート、ウンデコネート、及びキシレンスルホン酸塩などが挙げられる。
【００８９】
凍結乾燥物は、追加の賦形剤とブレンドすることができる。したがって、本発明の実施形態では、剤形は、ｉ）ＬＢＰを含む凍結乾燥物、及びｉｉ）１または２以上の追加の賦形剤を含む。１または２以上の追加の賦形剤もまた、凍結乾燥物中に提供することができる。
【００９０】
本発明の実施形態では、追加の賦形剤は、本明細書に開示される賦形剤のいずれか、例えば、本明細書に論じられる抗酸化剤の１または２以上、担体、希釈剤、結合剤、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤、安定剤、成長剤、刺激剤、充填剤、潤滑剤及び／または流動促進剤であり得る。
【００９１】
ＬＢＰの水分レベルが最小化される保存時にＬＢＰの生存率が維持されることが見出された。これは、水分の存在が酸性分解に対するＬＢＰの感受性を高めるためであると考えられる。したがって、本発明の製品において、本発明の剤形中のＬＢＰの水分含有量は、約１００００ｐｐｍ未満、約５０００ｐｐｍ未満、約２０００ｐｐｍ未満、約１０００ｐｐｍ未満、約５００ｐｐｍ未満、約２００ｐｐｍ未満、または約１００ｐｐｍ未満である。
【００９２】
本発明のさらなる態様によれば、生きた生物療法製品を含む経口投与可能な腸溶性剤形を調製するためのプロセスであって、ｉ）生きた生物療法製品及び任意選択で１または２以上の賦形剤を提供すること、ｉｉ−ａ）ＬＢＰと賦形剤をカプセルに充填し、カプセルを閉じて充填されたカプセルを提供すること、またはｉｉ−ｂ）ＬＢＰと賦形剤を含むカプセルが本質的に腸溶性のカプセルである錠剤コアを形成すること、または、プロセスがｉｉｉ）充填されたカプセルもしくは錠剤コアに腸溶性コーティングを塗布するステップを含む、プロセスが提供される。
【００９３】
本発明の実施形態では、１または２以上の賦形剤は、抗酸化剤を含み、抗酸化剤がシステインであり、ｉｉ）炭酸ナトリウムもしくは炭酸カルシウムを含まず、及び／またはｉｉｉ）マルトデキストリンを含まない。
【００９４】
本発明のプロセスにおいて、生きた生物療法製品は、細菌を単独で凍結乾燥することによって、または１つもしくは複数の賦形剤と組み合わせて凍結乾燥物を生成することによって提供することができる。本発明のプロセスのステップｉ）で提供される賦形剤（複数可）は、凍結乾燥物に含まれ得、及び／または凍結乾燥物から分離され得る。
【００９５】
上述のように、ＬＢＰと組み合わせた本質的に腸溶性のカプセルの使用は、ＬＢＰ生存率に悪影響を及ぼし得る従来の腸溶性コーティングプロセスステップの使用を回避できるので有利である。したがって、本発明のプロセスにおいて、閉じられた本質的に腸溶性のカプセルには、コーティング、乾燥及び／またはバンディングステップが施されていない。
【００９６】
また、本発明のプロセスにおいて、ＬＢＰは、５０℃、ステップｉ、ｉｉ−ａ）、及び／またはｉｉ−ｂ）の間、約５０℃より高い、約４０℃より高い、または約３０℃より高い温度に曝露されないようにできる。
【００９７】
上述のように、本発明の実施形態では、ＬＢＰは嫌気性細菌を含むことができる。したがって、そのような製品を調製するための本発明のプロセスにおいて、ステップｉ）、ｉｉ−ａ）及び／またはｉｉ−ｂ）は、不活性（すなわち、空気のない）環境で操作される。「空気のない環境」という用語は、本明細書では、約１００００ｐｐｍ未満、約５０００ｐｐｍ未満、約２０００ｐｐｍ未満、約１０００ｐｐｍ未満、約５００ｐｐｍ未満、約２００ｐｐｍ未満、または約１００ｐｐｍ未満の酸素を含む環境を意味するために使用される。当業者は、そのような媒体を製造するための技法、例えば、不活性ガス、例えば、窒素でフラッシュする技術を知っているであろう。
【００９８】
本発明の剤形は、１または２以上の剤形を含むことができる包装材料で提供することができる。例えば、この包装は、ブリスターパック等の金属（例えば、アルミニウム）またはプラスチック箔を含むことができる。さらに、製品は瓶に包装することができる。特定の種類の包装に関係なく、本発明の製品は、空気及び／または湿気不透過性の容器である包装材料内に包装することができる。いくつかの実施形態では、包装は、減圧下での包装を含むことができる。
【００９９】
本発明の実施形態では、医薬品は、製品及び使用説明書を含むキットの形態で提供される。使用説明書は、約２０℃未満、約１５℃未満、または約１０℃未満の温度で、例えば冷蔵下で、例えば約２〜８℃の温度で製品を保存するための指示を含むことができる。
【実施例】
【０１００】
本発明は以下の実施例においてさらに説明される。
【０１０１】
比較例１
Ｂｌａｕｔｉａ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｒｏｐｈｉｃａとマンニトール、スクロース、及びシステインを含む凍結乾燥物を炭酸カルシウムとブレンドし、システインとステアリン酸マグネシウムを温度管理されたクリーンルームで調製し、サイズ０の腸溶性カプセル薬物送達技術（ＥＣＤＤＴ）カプセル（Ｃａｐｓｕｇｅｌ（登録商標））に充填した。
【０１０２】
次に、腸溶性コーティングされたカプセルをシミュレートされた胃の状態（ｐＨ１．２の酸性媒体で１時間）に供し、細胞計数を行った。カプセルが破裂し、内容物が酸性媒体に分散した。その媒体中の生存可能なＬＢＰ細胞の計数が行われ、大幅な損失（カプセル化時に実行された細胞カウントに対して３ｌｏｇ以上）が発生したこと判明した。
【０１０３】
実施例２−本発明の製品の保存安定性
マンニトール、塩酸システイン、及びステアリン酸マグネシウムを秤量し、温度制御されたクリーンルームで一緒に混合した。次いで、得られたブレンドを、不活性雰囲気中、温度２５℃未満、相対湿度４０％未満の封じ込めモジュールに収容されたブレンダー内で、Ｂｌａｕｔｉａ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｒｏｐｈｉｃａ、マンニトール、スクロース、及びシステインを含む凍結乾燥物と混合した。次いで、得られたブレンドを封じ込めモジュール内のサイズ０腸溶性カプセルドラッグデリバリーテクノロジー（ＥＣＤＤＴ）カプセル（Ｃａｐｓｕｇｅｌ（登録商標））に充填し、得られたカプセルを水分／空気不透過性バッグ（ＰＥＴ／Ａｌｕ／ＰＡ／ＰＥ）に包装した。
【０１０４】
製品を２〜８℃で保存し、ｉ）カプセル化時、及びｉｉ）カプセル化後１３ヶ月で細胞計数を行った。カプセル化時で生細胞数は１．３×１０１１であり、１３ヶ月で、数は６．６×１０１０であった。カプセルあたりの生細胞数は、カプセル化時に４．７×１０１０、保存の１５ヶ月後に２．０×１０１０であった。細胞数の実質的な減少（１ｌｏｇ未満）は、１２か月を超える期間にわたって観察されなかったが、これは、製品の保存安定性を実証した。
【０１０５】
実施例３−本発明の製品の溶解
実施例２に従って調製された剤形は、米国薬局方＜７１１＞に従って、パドル攪拌下で酸性媒体（ｐＨ１．２）に２時間曝露された。カプセルの崩壊、破裂、または内容物放出の証拠は観察されなかった。次いで、製品をシミュレートされた腸媒体（ｐＨ６．８）に移し、カプセルを急速に崩壊させた。
【０１０６】
実施例４−本発明の剤形の胃保護特性
実施例２に従って調製された剤形は、パドル法を使用して酸性媒体（ｐＨ１．２）に３０分間曝露された。次いで、それらをシミュレートされた腸媒体（ｐＨ  ６．８）に４５分間移した。この実施例は、不活性雰囲気下で実行された（窒素による連続的なスパージング）。シミュレートされた腸媒体への製品の曝露は、カプセルからのＬＢＰの完全な放出をもたらし、細胞計数を行った。細胞数の実質的な減少（１ｌｏｇ未満）は観察されなかった。細胞計数も酸性媒体で実施され、ＬＢＰの放出は検出されず、本発明の剤形の胃保護効果が確認された。
【０１０７】
実施例５−アスコルビン酸を含むＭＲＸ５１８対システインを含むＭＲＸ５１８
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  を含む凍結乾燥物は、以下の組成を有するように調製された：
【表１】
2021527639.tif 000002
凍結乾燥物中のこれらの凍結乾燥賦形剤：Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍバイオマスの重量比は１：１であった。
【０１０８】
生細胞の計数は、凍結乾燥プロセスの前と後に実行され、結果は以下に示される。両方の製剤を同一の凍結乾燥サイクルにかけた：
【表２】
2021527639.tif 000003
凍結乾燥の前と後の生細胞数の同じ評価を別の場所で実施し、結果を以下に示す。同様に、両方の製剤を同一の凍結乾燥サイクルにかけた：
【表３】
2021527639.tif 000004
したがって、明らかなように、抗酸化剤としてのシステインの使用は、凍結乾燥サイクル中の生細胞数の損失の有意かつ予想外の減少を提供した。
【０１０９】
実施例６−Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  Ｇａｌｌｉｎａｒｕｍの長期安定性
次いで、システイン含有凍結乾燥物を、抗酸化剤を含まない賦形剤混合物とブレンドし、本質的に腸溶性のカプセル内にカプセル化した。次いで、得られた剤形をアルミ／アルミブリスター包装に包装し、２〜８℃の温度で１２ヶ月間保存した。
【０１１０】
生細胞計数は、ｉ）カプセル化後、ｉｉ）カプセル化後１２ヶ月、及びｉｉｉ）カプセル化後２１ヶ月の剤形で実施された。カプセル化後、１×１０１１ＣＦＵ／ｇ（カプセルあたり７×１０１０）の細胞数が観察された。１２か月の保存条件の後、４×１０１０ＣＦＵ／ｇ（カプセルあたり３×１０１０）の数が記録された。２１ヶ月の保存後に記録されたカプセルあたりのＣＦＵは３×１０１０であった。これは、製剤が凍結乾燥中にＬＢＰを保護するだけでなく、保存安定性のある剤形を提供することを可能にすることを実証する。
【０１１１】
この棚の保存は、自然界に自然に見られるような細菌には及ばないが、むしろ、本明細書に記載される本発明の製剤の機能である。
【国際調査報告】
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