(57)【要約】  本開示は、特に肝細胞におけるＰＣＳＫ９の発現を低下させるのに有用なオリゴヌクレオチド、組成物及び方法に関する。開示されたＰＣＳＫ９の発現を低下させるオリゴヌクレオチドは２本鎖又は１本鎖でよく、より強いヌクレアーゼ耐性及び低い免疫原性など、改善された特性のために修飾することができる。開示されたＰＣＳＫ９の発現を低下させるオリゴヌクレオチドは、肝臓の肝細胞など特定の細胞又は臓器を標的とする標的化リガンドを含んでもよく、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、及び／或いはそれらの１つ又は複数の症状又は合併症を治療するのに用いることができる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＳＫ９の発現を低下させるためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号１１９３〜１２３２、１２５７〜１２６５及び１２６９〜１２７１のいずれか１つに示される配列を含むアンチセンス鎖を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１１５３〜１１９２、１２４８〜１２５６及び１２６６〜１２６８のいずれか１つに示される配列を含むセンス鎖を更に含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記アンチセンス鎖が、配列番号１１９３〜１２３２、１２５７〜１２６５及び１２６９〜１２７１のいずれか１つに示される配列からなる、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記センス鎖が、配列番号１１５３〜１１９２、１２４８〜１２５６及び１２６６〜１２６８のいずれか１つに示される配列からなる、請求項２又は３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
ＰＣＳＫ９の発現を低下させるためのオリゴヌクレオチドであって、１５〜３０ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号１２３３〜１２４４のいずれか１つに示されるＰＣＳＫ９の標的配列に相補的な領域を有し、前記相補的な領域が、連続する少なくとも１５のヌクレオチド長である、オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記相補的な領域が、前記ＰＣＳＫ９の標的配列に完全に相補的である、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記アンチセンス鎖が、１９〜２７ヌクレオチド長である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記アンチセンス鎖が、２１〜２７ヌクレオチド長である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
１５〜４０ヌクレオチド長のセンス鎖を更に含み、前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖と２重鎖領域を形成する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記センス鎖が、１９〜４０ヌクレオチド長である、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記２重鎖領域が、少なくとも１９ヌクレオチド長である、請求項９又は１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記２重鎖領域が、少なくとも２１ヌクレオチド長である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記ＰＣＳＫ９に相補的な領域が、連続する少なくとも１９のヌクレオチド長である、請求項５〜１２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ＰＣＳＫ９に相補的な領域が、連続する少なくとも２１のヌクレオチド長である、請求項５〜１３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記センス鎖が、配列番号１１５３〜１１９２、１２４８〜１２５６及び１２６６〜１２６８のいずれか１つに示される配列を含む、請求項９〜１４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記アンチセンス鎖が、配列番号１１９３〜１２３２、１２５７〜１２６５及び１２６９〜１２７１のいずれか１つに示される配列を含む、請求項５〜１５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記センス鎖が、配列番号１１５３〜１１９２、１２４８〜１２５６及び１２６６〜１２６８のいずれか１つに示される配列からなる、請求項９〜１６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記アンチセンス鎖が、配列番号１１９３〜１２３２、１２５７〜１２６５及び１２６９〜１２７１のいずれか１つに示される配列からなる、請求項５〜１７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
前記センス鎖が、その３’末端にＳ1−Ｌ−Ｓ2で示されるステムループを含み、Ｓ1はＳ2に相補的であり、ＬはＳ1及びＳ2間に３〜５ヌクレオチド長のループを形成する、請求項９〜１８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
ＰＣＳＫ９の発現を低下させるためのオリゴヌクレオチドであって、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、
前記アンチセンス鎖が、２１〜２７ヌクレオチド長であり、ＰＣＳＫ９に相補的な領域を有し、
前記センス鎖が、その３’末端にＳ1−Ｌ−Ｓ2で示されるステムループを含み、Ｓ1はＳ2に相補的であり、ＬはＳ1及びＳ2間に３〜５ヌクレオチド長のループを形成し、
前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖が、少なくとも１９ヌクレオチド長の２重鎖構造を形成するが、共有結合していない、
オリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
前記相補的な領域が、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡの連続する少なくとも１９のヌクレオチドに完全に相補的である、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
Ｌが、テトラループである、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
Ｌが、４ヌクレオチド長である、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
Ｌが、ＧＡＡＡで示される配列を含む、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
前記アンチセンス鎖が、２７ヌクレオチド長であり、前記センス鎖が、２５ヌクレオチド長である、請求項９〜１８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
前記アンチセンス鎖及びセンス鎖が、２５ヌクレオチド長の２重鎖領域を形成する、請求項２５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
前記アンチセンス鎖に２ヌクレオチド長の３’オーバーハング配列を更に含む、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
それぞれ２１〜２３ヌクレオチド長の範囲のアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む、請求項９〜１８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
１９〜２１ヌクレオチド長の範囲の２重鎖構造を含む、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
１以上のヌクレオチド長の３’オーバーハング配列を含み、前記３’オーバーハング配列が、前記アンチセンス鎖、前記センス鎖、又は前記アンチセンス鎖及びセンス鎖に存在する、請求項２８又は２９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
２ヌクレオチド長の３’オーバーハング配列を含み、前記３’オーバーハング配列が、前記アンチセンス鎖に存在し、前記センス鎖が２１ヌクレオチド長であり、前記アンチセンス鎖が２３ヌクレオチド長であり、前記センス鎖及びアンチセンス鎖が、２１ヌクレオチド長の２重鎖を形成する、請求項２８又は２９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
前記修飾ヌクレオチドが、２’修飾を含む、請求項３２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
前記２’修飾が、２’−アミノエチル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、及び２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−ｄ−アラビノ核酸から選択される修飾である、請求項３３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
前記オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが修飾されている、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含む、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合が、ホスホロチオアート結合である、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
前記アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドの糖の４’炭素が、ホスフェート類似体を含む、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
前記ホスフェート類似体が、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートである、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが、１つ以上の標的化リガンドに結合している、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
各標的化リガンドが、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド又は脂質を含む、請求項４０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
各標的化リガンドが、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む、請求項４１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
前記ＧａｌＮＡｃ部分が、１価のＧａｌＮＡｃ部分、２価のＧａｌＮＡｃ部分、３価のＧａｌＮＡｃ部分、又は４価のＧａｌＮＡｃ部分である、請求項４２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
前記ステムループのＬの４つまでのヌクレオチドが、それぞれ１価のＧａｌＮＡｃ部分に結合している、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
前記標的化リガンドが、アプタマーを含む、請求項４０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４６】
請求項１〜４５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド及び賦形剤を含む、組成物。
【請求項４７】
オリゴヌクレオチドを対象に送達する方法であって、前記対象に請求項４６に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４８】
対象における高コレステロール血症の１つ以上の症状、アテローム性動脈硬化、及び／又はそれらの１つ以上の症状若しくは合併症を減少させる方法であって、前記対象に請求項４６に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４９】
ＰＣＳＫ９の発現を低下させるためのオリゴヌクレオチドであって、１５〜５０ヌクレオチド長のセンス鎖及び１５〜３０ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖と２重鎖領域を形成し、前記センス鎖が、配列番号１〜４５３、９０７〜１０２９、１１５３〜１１９２、１２４８〜１２５６及び１２６６〜１２６８のいずれか１つに示される配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号４５４〜９０６、１０３０〜１１５２、１１９３〜１２３２、１２５７〜１２６５及び１２６９〜１２７１から選択される相補配列を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項５０】
ＰＣＳＫ９の発現を低下させるためのオリゴヌクレオチドであって、表４で示される表の列から選択される一対のセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む、オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１８年４月１８日に出願され、名称が「高コレステロール血症及び関連状態を治療するため、ＰＣＳＫ９を標的とするオリゴヌクレオチド」の米国仮出願第６２／６５９６９３号、及び２０１９年３月１９日に出願され、名称が「高コレステロール血症及び関連状態を治療するため、ＰＣＳＫ９を標的とするオリゴヌクレオチド」の米国仮出願第６２／８２０５５８号の利益を主張するものであり、これらの全文は参照により本明細書に組み入れられたものとする。
【０００２】
本願はオリゴヌクレオチド及びその使用、特に高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、及び／或いはそれらの１つ又は複数の症状又は合併症の治療に関連する使用に関する。
【０００３】
配列表の参照
本願は電子書式で配列表を併せて出願している。本配列表は、２５７キロバイトのサイズで、２０１９年４月１日に作成したＤ０８００７００１５ＷＯ００−ＳＥＱ−ＺＪＧ．ｔｘｔのファイルとして提供する。電子書式の配列表の情報はその全体が参照により本明細書に組み入れられたものとする。
【背景技術】
【０００４】
コレステロールは動物細胞により生成される脂質の主要な３種類のうちの１つであり、細胞膜を構成する。コレステロールは水不溶性であり、血漿のタンパク質粒子（リポタンパク質）内で輸送される。任意のリポタンパク質（例えば、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）及び高密度リポタンパク質（ＨＤＬ））は、コレステロールを運ぶことができるが、非ＨＤＬコレステロール（最も具体的にはＬＤＬ−コレステロール）の濃度上昇は、アテローム性動脈硬化及び冠状動脈性心疾患（例えば、冠動脈疾患）のリスクを上昇させる。このタイプのコレステロール上昇は高コレステロール血症として知られている。高コレステロール血症は動脈壁のプラーク堆積につながる場合があり、これはアテローム性動脈硬化として知られている。プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン−９（ＰＣＳＫ９としても知られる）はセリンプロテアーゼであり、原形質膜で肝臓及び肝外のＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）発現を制御することにより、血漿ＬＤＬコレステロール濃度を間接的に調節する。ＰＣＳＫ９タンパク質の発現減少はＬＤＬＲ受容体の発現を上昇させ、これにより血漿ＬＤＬコレステロールを減少させ、その結果、高コレステロール血症及び／又はアテローム性動脈硬化、並びにこれらから生じる合併症を減少させる。
【発明の概要】
【０００５】
本開示の態様は、対象における高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、及び／或いはそれらの１つ又は複数の症状又は合併症を治療するオリゴヌクレオチド、並びに関連方法に関する。いくつかの実施形態において、対象におけるＰＣＳＫ９の発現を選択的に阻害する強力なＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが開発されている。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドはＰＣＳＫ９活性を低下させるのに有用であり、これにより高コレステロール血症（高濃度低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）−コレステロール）、アテローム性動脈硬化、及び／或いはそれらの１つ又は複数の症状又は合併症を減少させるか、又は予防する。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡの主要領域（ホットスポットと呼ぶ）が本明細書で特定されており、このようなオリゴヌクレオチド系手法を用いた標的化に特に適している（実施例１参照）。
【０００６】
本開示の１つの態様は、ＰＣＳＫ９の発現を低下させるオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは配列番号４５４〜９０６、１０３０〜１１５２、１１９３〜１２３２、１２５７〜１２６５又は１２６９〜１２７１のいずれか１つの配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは配列番号１〜４５３、９０７〜１０２９、１１５３〜１１９２、１２４８〜１２５６又は１２６６〜１２６８のいずれか１つの配列を含むセンス鎖を更に含む。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は配列番号４５４〜９０６、１０３０〜１１５２、１１９３〜１２３２、１２５７〜１２６５又は１２６９〜１２７１のいずれか１つの配列からなる。いくつかの実施形態において、センス鎖は配列番号１〜４５３、９０７〜１０２９、１１５３〜１１９２、１２４８〜１２５６又は１２６６〜１２６８のいずれか１つの配列からなる。本開示の１つの態様はＰＣＳＫ９の発現を低下させるオリゴヌクレオチドを提供し、このオリゴヌクレオチドは１５〜３０ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は配列番号１２３３〜１２４４のいずれか１つに示されるＰＣＳＫ９の標的配列に相補的な領域を有する。いくつかの実施形態において、相補的な領域は連続する少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０又は少なくとも２１のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、相補的な領域はＰＣＳＫ９の標的配列に完全に相補的である。いくつかの実施形態において、相補的な領域は連続する少なくとも１９のヌクレオチド長である。
【０００７】
いくつかの実施形態において、センス鎖は配列番号１〜４５３、９０７〜１０２９又は１１５３〜１１９２のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態において、センス鎖は配列番号１〜４５３、９０７〜１０２９又は１１５３〜１１９２のいずれか１つの配列からなる。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は配列番号４５４〜９０６、１０３０〜１１５２又は１１９３〜１２３２のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は配列番号４５４〜９０６、１０３０〜１１５２又は１１９３〜１２３２のいずれか１つの配列からなる。
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は１９〜２７ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は２１〜２７ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは１５〜４０ヌクレオチド長のセンス鎖を更に含み、センス鎖はアンチセンス鎖と２重鎖領域を形成する。いくつかの実施形態において、センス鎖は１９〜４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、２重鎖領域は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１又は少なくとも２２のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は２７ヌクレオチド長であり、センス鎖は２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖及びセンス鎖は２５ヌクレオチド長の２重鎖領域を形成する。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、それぞれが２１〜２３ヌクレオチド長の範囲内である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは１９〜２１ヌクレオチド長の２重鎖構造を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは１つ又は複数のヌクレオチド長の３’オーバーハング配列を含み、この３’オーバーハング配列はアンチセンス鎖、センス鎖、又はアンチセンス鎖及びセンス鎖に存在する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス鎖に２ヌクレオチド長の３’オーバーハング配列を更に含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは２ヌクレオチド長の３’オーバーハング配列を含み、この３’オーバーハング配列はアンチセンス鎖に存在し、センス鎖及びアンチセンス鎖が２１ヌクレオチド長の２重鎖を形成するように、センス鎖は２１ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は２３ヌクレオチド長である。
【０００８】
本開示の別の態様は、ＰＣＳＫ９の発現を低下させるオリゴヌクレオチドを提供し、このオリゴヌクレオチドはアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。アンチセンス鎖は２１〜２７ヌクレオチド長であり、ＰＣＳＫ９に相補的な領域を有する。センス鎖はその３’末端にＳ1−Ｌ−Ｓ2と示されるステムループを含み、Ｓ1はＳ2に相補的であり、ＬはＳ1及びＳ2の間に３〜５ヌクレオチド長のループを形成する。アンチセンス鎖及びセンス鎖は少なくとも１９のヌクレオチド長の２重鎖構造を形成するが、共有結合はしてしない。いくつかの実施形態において、センス鎖はその３’末端にＳ1−Ｌ−Ｓ2と示されるステムループを含み、Ｓ1はＳ2に相補的であり、ＬはＳ1及びＳ2の間に３〜５ヌクレオチド長のループを形成する。いくつかの実施形態において、相補的な領域はＰＣＳＫ９ｍＲＮＡの連続する少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０又は少なくとも２１のヌクレオチドに完全に相補的である。いくつかの実施形態において、Ｌはテトラループである。いくつかの実施形態において、Ｌは４ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ＬはＧＡＡＡと示される配列を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは２’修飾を含む。いくつかの実施形態において、この２’修飾は２’−アミノエチル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル及び２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−ｄ−アラビノ核酸から選択される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチドが修飾される。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態において、この少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合はホスホロチオアート結合である。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドの糖の４’炭素は、ホスフェート類似体を含む。いくつかの実施形態において、ホスフェート類似体はオキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートである。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、１つ又は複数の標的化リガンドに結合する。いくつかの実施形態において、各標的化リガンドは炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド又は脂質を含む。いくつかの実施形態において、各標的化リガンドはＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む。いくつかの実施形態において、このＧａｌＮＡｃ部分は１価のＧａｌＮＡｃ部分、２価のＧａｌＮＡｃ部分、３価のＧａｌＮＡｃ部分又は４価のＧａｌＮＡｃ部分である。いくつかの実施形態において、ステムループのＬの４までのヌクレオチドは、それぞれ１価のＧａｌＮＡｃ部分に結合する。他の実施形態において、２価、３価又は４価のＧａｌＮＡｃ部分は単一のヌクレオチド、例えばステムループのＬのヌクレオチドにおける単一のヌクレオチドに結合する。いくつかの実施形態において、標的化リガンドはアプタマーを含む。
【００１０】
本開示の別の態様は、本開示のオリゴヌクレオチド及び賦形剤を含む組成物を提供する。本開示の別の態様は、対象に本開示の組成物を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、高コレステロール血症（高濃度低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）−コレステロール）、アテローム性動脈硬化、冠状動脈性心疾患（例えば、冠動脈疾患）、狭心症、息切れ、発汗、悪心、眩暈、息切れ、不整脈、心臓の動悸、脳卒中（つまり、脳への血流及び酸素が不十分であることに起因する脳細胞の死）、脱力感、錯乱、発話困難、眩暈、歩行若しくは直立困難、視朦、顔、腕及び足のしびれ、激しい頭痛、意識消失、末梢動脈疾患、及び／又は腎障害（例えば、慢性腎疾患）の程度又は重症度を減少させるか、又は予防する。本開示の別の態様は、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、及び／或いはそれらの１つ又は複数の症状又は合併症を治療する方法を提供する。
【００１１】
本開示の別の態様は、ＰＣＳＫ９の発現を低下させるオリゴヌクレオチドを提供し、このオリゴヌクレオチドは１５〜４０ヌクレオチド長のセンス鎖及び１５〜３０ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を含む。センス鎖はアンチセンス鎖と２重鎖領域を形成し、センス鎖は配列番号１〜４５３、９０７〜１０２９、１１５３〜１１９２、１２４８〜１２５６又は１２６６〜１２６８のいずれか１つの配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号４５４〜９０６、１０３０〜１１５２、１１９３〜１２３２、１２５７〜１２６５又は１２６９〜１２７１から選択される相補配列を含む。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは表４の行から選択される一対のセンス及びアンチセンス鎖を含む。
【００１２】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、特定の実施形態を説明するものであり、記載要件と共に、本明細書で開示される組成物及び方法に関する特定の態様の非限定的な例を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｈｕｈ−７細胞において５７６のＰＣＳＫ９オリゴヌクレオチドのスクリーニングを行った後、残存するＰＣＳＫ９ｍＲＮＡの割合を示すグラフである。ＮＭ＿１７４９３６．３における各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に相当するヌクレオチド配列部位をＸ軸に示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｈｕｈ−７細胞において５７６のＰＣＳＫ９オリゴヌクレオチドのスクリーニングを行った後、残存するＰＣＳＫ９ｍＲＮＡの割合を示すグラフである。ＮＭ＿１７４９３６．３における各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に相当するヌクレオチド配列部位をＸ軸に示す。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｈｕｈ−７細胞において２つの異なる濃度（０．１ｎＭ及び１ｎＭ）により９６のＰＣＳＫ９オリゴヌクレオチドから、ＰＣＳＫ９オリゴヌクレオチドのスクリーニングを行った後、残存するｍＲＮＡの割合を示す一連のグラフである。Ｘ軸のＨの数字は、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の５’末端に位置するＰＣＳＫ９ｍＲＮＡの位置を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｈｕｈ−７細胞において２つの異なる濃度（０．１ｎＭ及び１ｎＭ）により９６のＰＣＳＫ９オリゴヌクレオチドから、ＰＣＳＫ９オリゴヌクレオチドのスクリーニングを行った後、残存するｍＲＮＡの割合を示す一連のグラフである。Ｘ軸のＨの数字は、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の５’末端に位置するＰＣＳＫ９ｍＲＮＡの位置を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、Ｈｕｈ−７細胞において２つの異なる濃度（０．１ｎＭ及び１ｎＭ）により９６のＰＣＳＫ９オリゴヌクレオチドから、ＰＣＳＫ９オリゴヌクレオチドのスクリーニングを行った後、残存するｍＲＮＡの割合を示す一連のグラフである。Ｘ軸のＨの数字は、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の５’末端に位置するＰＣＳＫ９ｍＲＮＡの位置を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、Ｈｕｈ−７細胞において２つの異なる濃度（０．１ｎＭ及び１ｎＭ）により９６のＰＣＳＫ９オリゴヌクレオチドから、ＰＣＳＫ９オリゴヌクレオチドのスクリーニングを行った後、残存するｍＲＮＡの割合を示す一連のグラフである。Ｘ軸のＨの数字は、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の５’末端に位置するＰＣＳＫ９ｍＲＮＡの位置を示す。
【図３】図３は、ニックが入ったテトラループ構造を有する２本鎖オリゴヌクレオチドの非限定例を示す模式図であり、この構造は４つのＧａｌＮＡｃ部分（ダイアモンド形）に結合している。
【図４】図４は、単一の修飾パターンを有する１２の異なる塩基配列のＰＣＳＫ９テトラループ結合体を用い、マウスのハイドロダイナミックインジェクション（ＨＤＩ）モデルで行ったスクリーニングの結果を示すグラフである。左端に示すＰＢＳは対照として用いた。
【図５Ａ】図５Ａは、異なる塩基配列のＰＣＳＫ９オリゴヌクレオチドを用い、Ｈｕｈ−７細胞におけるスクリーニングを行った結果を示すグラフである。図５Ａは、４０のニックが入ったテトラループ構造のスクリーニング後、残存するＰＣＳＫ９ｍＲＮＡの割合を示すグラフである。同じ修飾パターンを用い、オリゴヌクレオチドを２つの異なる濃度（０．０３ｎＭ及び０．１ｎＭ；図５Ａに「フェーズＴ２」と呼ぶ）で試験した。
【図５Ｂ】図５Ｂは、異なる塩基配列のＰＣＳＫ９オリゴヌクレオチドを用い、マウスＨＤＩモデルにおけるスクリーニングを行った結果を示すグラフである。図５Ｂは、３つの異なる修飾パターンを用い、皮下投与量が２ｍｇ／ｋｇのマウスＨＤＩモデルにおけるヒト特異的ＰＣＳＫ９テトラループ結合体のスクリーニングを示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、異なる塩基配列のＰＣＳＫ９オリゴヌクレオチドを用い、マウスＨＤＩモデルにおけるスクリーニングを行った結果を示すグラフである。図５Ｃは、皮下投与量が１ｍｇ／ｋｇであることを除いて図５Ｂと同じ試験を示す（１及び２ｍｇ／ｋｇで投与された対照を除く）。２つの異なる修飾パターンを用いた。ＰＢＳを対照として用い、左に示す。
【図６Ａ】図６Ａは、異なる修飾パターンを有する３つの異なるＰＣＳＫ９テトラループ結合体を用い、３つの異なる濃度でマウスハイドロダイナミックインジェクション（ＨＤＩ）モデルにおいてスクリーニングを行った結果を示すグラフである。左端に示すＰＢＳを対照として用いた。
【図６Ｂ】図６Ｂは、異なる修飾パターンを有する３つの異なるＰＣＳＫ９テトラループ結合体を用い、３つの異なる濃度でマウスハイドロダイナミックインジェクション（ＨＤＩ）モデルにおいてスクリーニングを行った結果を示すグラフである。左端に示すＰＢＳを対照として用いた。
【図７Ａ】図７Ａは、非ヒト霊長類においてテトラループ結合体でＰＣＳＫ９オリゴヌクレオチドの生体内活性評価を行った結果を示すグラフである。候補配列を異なる修飾で試験した。図７Ａは、２つの異なる修飾パターンを有する候補ＰＣＳＫ９テトラループ結合体を用い、残存するＰＣＳＫ９及び低下するＬＤＬ−Ｃを分析した結果を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、非ヒト霊長類においてテトラループ結合体でＰＣＳＫ９オリゴヌクレオチドの生体内活性評価を行った結果を示すグラフである。候補配列を異なる修飾で試験した。３０日におけるオリゴヌクレオチドの血漿ＰＣＳＫ９低下能は、ＰＣＳＫ９ＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【図７Ｃ】図７Ｃは、非ヒト霊長類においてテトラループ結合体でＰＣＳＫ９オリゴヌクレオチドの生体内活性評価を行った結果を示すグラフである。候補配列を異なる修飾で試験した。９０日におけるオリゴヌクレオチドの血漿ＰＣＳＫ９低下能は、ＰＣＳＫ９ＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【図７Ｄ】図７Ｄは、非ヒト霊長類においてテトラループ結合体でＰＣＳＫ９オリゴヌクレオチドの生体内活性評価を行った結果を示すグラフである。候補配列を異なる修飾で試験した。血清ＬＤＬ濃度も図７Ｄに示すように測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
いくつかの態様によれば、本開示は高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、及び／或いはそれらの１つ又は複数の症状又は合併症を治療するため、細胞、特に肝臓の細胞（例えば、肝細胞）におけるＰＣＳＫ９の発現を低下させるのに有効な、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドを提供する。従って、関連する態様において、本開示は高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、及び／或いはそれらの１つ又は複数の症状又は合併症を治療する方法を提供し、これらの方法は肝臓におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を選択的に低下させることに関与する。特定の実施形態において、本明細書で提供されるＰＣＳＫ９を標的とするオリゴヌクレオチドは、対象における高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、及び／或いはそれらの１つ又は複数の症状又は合併症を治療するため、標的組織の選択された細胞（例えば、肝臓の肝細胞）に送達するように設計される。
定義された用語の説明を含めた本開示のさらなる態様を以下に記載する。
【００１５】
Ｉ．定義
およそ：本明細書で使用するとき、目的の１つ又は複数の値に適用される「およそ」又は「約」という用語は、記載された基準値に類似の値を指す。特定の実施形態において、「およそ」又は「約」という用語は、他に明記されない限り、或いは文脈から明らかでない限り、明記された基準値のいずれの方向にも２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれ以下に含まれる値の範囲（以上又は未満）を指す（当該数字が可能な値の１００％を超える場合は除く）。
【００１６】
投与する：本明細書で使用するとき、「投与する」又は「投与」という用語は、（例えば、対象の状態を治療するため）薬理的に有用な方法で対象に物質（例えば、オリゴヌクレオチド）を提供することを意味する。
【００１７】
アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）：本明細書で使用するとき、「アシアロ糖タンパク質受容体」又は「ＡＳＧＰＲ」という用語は、大きな４８ｋＤａ（ＡＳＧＰＲ−１）及び小さな４０ｋＤａサブユニット（ＡＳＧＰＲ−２）により形成され、２つの部分からなるＣ型レクチンを指す。ＡＳＧＰＲは主に肝細胞の類洞表面に発現し、末端ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン残基を含有する循環糖タンパク質（アシアロ糖タンパク質）の結合、内在化及びその後のクリアランスで主な役割を有する。
【００１８】
アテローム性動脈硬化：本明細書で使用するとき、「アテローム性動脈硬化」という用語は、通常（脂肪、コレステロール、カルシウム、及び他の物質から作られる）プラークの蓄積による動脈（例えば、冠状動脈、頸動脈、末梢動脈、及び／又は腎動脈）の狭窄に関わる病気を指す。いくつかの実施形態において、冠状動脈の狭窄は狭心症、息切れ、発汗、悪心、眩暈、息切れ、不整脈、及び／又は動悸などの症状を引き起こす場合がある。いくつかの実施形態において、頸動脈の狭窄は、脳卒中（つまり、脳への血流及び酸素が不十分であることに起因する脳細胞の死）につながる場合があり、並びに／或いは脱力感、錯乱、発話困難、眩暈、歩行若しくは直立困難、視朦、顔、腕及び足のしびれ、激しい頭痛、及び／又は意識消失などの症状を引き起こす場合がある。いくつかの実施形態において、末梢動脈の狭窄は腕又は足のしびれ又は痛みにつながる場合がある。いくつかの実施形態において、腎動脈の狭窄（腎臓の血流が低下する）は慢性腎疾患につながる場合がある。アテローム性動脈硬化の合併症は、冠動脈疾患、脳卒中、末梢動脈疾患、及び腎障害（例えば、慢性腎疾患）を含む場合がある。
【００１９】
相補的：本明細書で使用するとき、「相補的」という用語は、（例えば、相対する核酸における、又は単一の核酸鎖の相対する領域における２つのヌクレオチドの）ヌクレオチド間の構造的関係を指し、ヌクレオチドが互いに塩基対を形成することを可能にする。例えば、相対する核酸のピリミジンヌクレオチドに相補的な１つの核酸であるプリンヌクレオチドは、互いに水素結合を形成することにより共に塩基対合することができる。いくつかの実施形態において、相補的ヌクレオチドは、ワトソン−クリック法又は安定した２重鎖を形成する他の方法で塩基対合することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるように、２つの核酸は互いに相補的なヌクレオチド配列を有し、相補的な領域を形成することができる。
【００２０】
デオキシリボヌクレオチド：本明細書で使用するとき、「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドと比較して、その五炭糖の２’位に水素を有するヌクレオチドを指す。修飾デオキシリボヌクレオチドは、２’位以外の１つ又は複数の原子が修飾されるか又は置換されるデオキシリボヌクレオチドであり、糖、ホスフェート基又は塩基における修飾又は置換、或いは糖、ホスフェート基又は塩基の修飾又は置換を含む。
【００２１】
２本鎖オリゴヌクレオチド：本明細書で使用するとき、「２本鎖オリゴヌクレオチド」という用語は、実質的に２重形態であるオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、２本鎖オリゴヌクレオチドの２重鎖領域の相補的塩基対合は、共有結合していない核酸鎖におけるヌクレオチドの逆平行配列間に形成される。いくつかの実施形態において、２本鎖オリゴヌクレオチドの２重鎖領域の相補的塩基対合は、共有結合している核酸鎖におけるヌクレオチドの逆平行配列間に形成される。いくつかの実施形態において、２本鎖オリゴヌクレオチドの２重鎖領域の相補的塩基対合は、折り畳まれた（例えばヘアピンにより）単一の核酸鎖から形成され、共に塩基対合するヌクレオチドの相補的逆平行配列を提供する。いくつかの実施形態において、２本鎖オリゴヌクレオチドは共有結合していない２つの核酸鎖を含み、互いに完全に２重である。しかしながら、いくつかの実施形態において、２本鎖オリゴヌクレオチドは、例えば片側又は両末端にオーバーハングを有し、部分的に２重であり、共有結合していない２つの核酸鎖を含む。いくつかの実施形態において、２本鎖オリゴヌクレオチドは部分的に相補的であるヌクレオチドの逆平行配列を含み、従って１つ又は複数のミスマッチを有する場合があり、これらは内部ミスマッチ又は末端ミスマッチを含んでよい。
【００２２】
２重鎖：本明細書で使用するとき、「２重鎖」という用語は、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）に関して、ヌクレオチドの２つの逆平行配列の相補的塩基対合により形成される構造を指す。
【００２３】
賦形剤：本明細書で使用するとき、「賦形剤」という用語は、組成物に含まれる場合がある非治療薬を指し、例えば所望の濃度又は安定効果を提供するか、或いは所望の濃度又は安定効果に寄与する。
【００２４】
肝細胞：本明細書で使用するとき、「肝細胞」（"hepatocyte" or "hepatocytes"）という用語は、肝臓の実質組織の細胞を指す。これらの細胞は肝重のおよそ７０〜８５％を構成し、凝固因子の血清アルブミン、フィブリノゲン、及びプロトロンビン群（因子３及び４を除く）を作る。肝細胞系細胞用マーカーは、トランスサイレチン（Ｔｔｒ）、グルタミン合成酵素（Ｇｌｕ１）、肝細胞核因子１ａ（Ｈｎｆ１ａ）、及び肝細胞核因子４ａ（Ｈｎｆ４ａ）を含むがこれらに限定されない。成熟肝細胞用マーカーは、シトクロムＰ４５０（Ｃｙｐ３ａ１１）、フマリルアセト酢酸加水分解酵素（Ｆａｈ）、グルコース６−ホスフェート（Ｇ６ｐ）、アルブミン（Ａｌｂ）、及びＯＣ２−２Ｆ８を含むがこれらに限定されない。例えば、Ｈｕｃｈ他，（２０１３），Ｎａｔｕｒｅ，４９４（７４３６）：２４７−２５０を参照のこと。肝細胞マーカーに関わる内容は、参照により本明細書に組み入れられたものとする。
【００２５】
高コレステロール血症：本明細書で使用するとき、「高コレステロール血症」という用語は、血液中における高濃度コレステロール（例えば、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）−コレステロール）の存在を指す。コレステロールは動物細胞により作られる脂質の主要な３種類のうちの１つであり、細胞膜を構成する。コレステロールは水不溶性であり、血漿のタンパク質粒子（リポタンパク質）内で輸送される。任意のリポタンパク質（例えば、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）及び高密度リポタンパク質（ＨＤＬ））は、コレステロールを運ぶことができるが、非ＨＤＬコレステロール（特に具体的にはＬＤＬ−コレステロール）の濃度上昇は、アテローム性動脈硬化及び冠状動脈性心疾患（例えば、冠動脈疾患）のリスクを上昇させる。
【００２６】
ループ：本明細書で使用するとき、「ループ」という用語は、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）の２つの逆平行領域の横に位置する対をなさない領域を指し、逆平行領域は互いに十分に相補的である。従って、適当なハイブリダイゼーション条件下（例えば、リン酸緩衝液中、細胞中）、この対をなさない領域の横に位置する２つの逆平行領域はハイブリダイズして２重鎖（「ステム」と呼ぶ）を形成する。
【００２７】
修飾ヌクレオチド間結合：本明細書で使用するとき、「修飾ヌクレオチド間結合」という用語は、ホスホジエステル結合を含む基準のヌクレオチド間結合と比較して、１つ又は複数の化学修飾を有するヌクレオチド間結合を指す。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは天然に存在しない結合である。通常、修飾ヌクレオチド間結合は、修飾ヌクレオチド間結合が存在する核酸に１つ又は複数の所望の特性を与える。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解性、生物学的利用能、生物活性、免疫原性低下等を改善することができる。
【００２８】
修飾ヌクレオチド：本明細書で使用するとき、「修飾ヌクレオチド」という用語は、相当する基準のヌクレオチドと比較し、１つ又は複数の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。基準のヌクレオチドはアデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド、アデニンデオキシリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、シトシンデオキシリボヌクレオチド、及びチミジンデオキシリボヌクレオチドから選択される。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは天然に存在しないヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドはその糖、核酸塩基及び／又はホスフェート基に１つ又は複数の化学修飾を有する。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、相当する基準のヌクレオチドに結合する１つ又は複数の化学部分を有する。通常、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドが存在する核酸に１つ又は複数の所望の特性を与える。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解性、生物学的利用能、生物活性、免疫原性低下等を改善することができる。特定の実施形態において、修飾ヌクレオチドは、リボース環の２’位における２’−Ｏ−メチル又は２’−Ｆ置換を含む。
【００２９】
ニックが入ったテトラループ構造：「ニックが入ったテトラループ構造」は、別々のセンス（パッセンジャー）及びアンチセンス（ガイド）鎖の存在を特徴とするＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの構造である。この２つの鎖が２重鎖を形成するように、センス鎖はアンチセンス鎖に相補的な領域を有する。少なくとも１つの鎖、一般的にセンス鎖がこの２重鎖を越えて伸長し、この伸長はテトラループ及びテトラループに隣接するステム領域を形成する２つの自己相補的な配列を含有する。テトラループは、少なくとも１つの鎖の自己相補的な配列により形成され、横に位置するステム領域を安定させるように構成される。
【００３０】
オリゴヌクレオチド：本明細書で使用するとき、「オリゴヌクレオチド」という用語は、例えば１００ヌクレオチド未満の長さの短い核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び／又は例えば修飾リボヌクレオチドを含む修飾ヌクレオチドを含むことができる。オリゴヌクレオチドは１本鎖又は２本鎖でよい。オリゴヌクレオチドは２重鎖領域を有しても有さなくてもよい。一連の非限定的な例として、オリゴヌクレオチドは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ダイサー基質干渉ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖ｓｉＲＮＡ、又は１本鎖ｓｉＲＮＡでよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、２本鎖オリゴヌクレオチドはＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。
【００３１】
オーバーハング：本明細書で使用するとき、「オーバーハング」という用語は、末端の塩基対合していないヌクレオチドを指す。１つの鎖又は領域に由来し、この１つの鎖又は領域と２重鎖を形成する相補鎖の末端を越えて伸長する。いくつかの実施形態において、オーバーハングは２本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端で２重鎖領域を越えて伸長する１つ又は複数の対をなさないヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、オーバーハングは、２本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖又はセンス鎖における３’又は５’オーバーハングである。
【００３２】
ホスフェート類似体：本明細書で使用するとき、「ホスフェート類似体」という用語は、ホスフェート基の静電気的及び／又は立体的特性を模倣する化学部分を指す。いくつかの実施形態において、ホスフェート類似体は、酵素的除去の影響を頻繁に受ける５’−ホスフェートの代わりに、オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに配置される。いくつかの実施形態において、５’ホスフェート類似体はホスファターゼ抵抗性結合を含有する。ホスフェート類似体の例としては、５’メチレンホスホネート（５’−ＭＰ）及び５’−（Ｅ）−ビニルホスホネート（５’−ＶＰ）などの５’ホスホネートが挙げられる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドの糖の４’炭素位にホスフェート類似体（「４’ホスフェート類似体」と呼ぶ）を有する。４’ホスフェート類似体の一例はオキシメチルホスホネートであり、オキシメチル基の酸素原子は糖部分（例えば、その４’炭素）又はその類似体に結合する。例えば、２０１７年９月１日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４９９０９、２０１６年９月２日に出願された米国仮出願第６２／３８３，２０７号、及び２０１６年９月１２日に出願された米国仮出願第６２／３９３，４０１号を参照のこと。ホスフェート類似体に関するそれぞれの内容は、参照により本明細書に組み入れられたものとする。他の修飾はオリゴヌクレオチドの５’末端に対して開発されている（例えば、国際公開第２０１１／１３３８７１号；米国特許第８，９２７，５１３号明細書；及びＰｒａｋａｓｈ他（２０１５年），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４３（６）：２９９３−３０１１を参照のこと。ホスフェート類似体に関するそれぞれの内容は参照により本明細書に組み入れられたものとする）。
【００３３】
プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン−９（ＰＣＳＫ９）：本明細書で使用するとき、「プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン−９」（ＰＣＳＫ９、神経アポトーシス調節転換酵素１であるＮＡＲＣ−１、及び高コレステロール血症常染色体優性３であるＨＣＨＯＬＡ３としても知られる）という用語は、ＰＣＳＫ９タンパク質をコードする遺伝子を指す。
【００３４】
発現低下：本明細書で使用するとき、遺伝子の「発現低下」という用語は、適当な基準細胞又は対象と比較して、遺伝子がコードするＲＮＡ転写産物又はタンパク質量が減少する、及び／或いは細胞又は対象における遺伝子の活性量が減少することを指す。例えば、２本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ配列に相補的なアンチセンス鎖を有するもの）で細胞を処理すると、２本鎖オリゴヌクレオチドで処理されない細胞と比較して、ＲＮＡ転写産物、タンパク質及び／又は酵素活性（例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子によりコードされる）量を減少させることができる。同様に、本明細書で使用する「発現低下」は、遺伝子（例えば、ＰＣＳＫ９）の発現低下をもたらす作用を指す。
【００３５】
相補的な領域：本明細書で使用するとき、「相補的な領域」という用語は、ヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ内の標的ヌクレオチド配列）の逆平行配列に十分に相補的な核酸のヌクレオチド配列を指し（例えば、２本鎖オリゴヌクレオチド）、適当なハイブリダイゼーション条件下、例えばリン酸緩衝液中、細胞中等で、ヌクレオチドの２つの配列間でハイブリダイゼーションが生じる。相補的な領域はヌクレオチド配列（例えば、ｍＲＮＡ又はその部分内に存在する標的ヌクレオチド配列）に完全に相補的であることができる。例えば、ｍＲＮＡに存在するヌクレオチド配列に完全な相補性を有する相補的な領域は、ｍＲＮＡにおける該当配列に、任意のミスマッチ又はギャップを有さず、相補的であるヌクレオチドの連続した配列を有する。或いは、相補的な領域はヌクレオチド配列（例えば、ｍＲＮＡ又はその部分に存在するヌクレオチド配列）に部分的に相補的であることができる。例えば、相補的な領域が適当なハイブリダイゼーション条件下で、引き続きｍＲＮＡとハイブリダイズすることができるのであれば、ｍＲＮＡに存在するヌクレオチド配列に部分的な相補性を有する相補的な領域は、ｍＲＮＡ中の該当配列と比較して、ｍＲＮＡ中の該当配列に相補的であるが、１つ又は複数のミスマッチ又はギャップ（例えば、１、２、３又はそれ以上のミスマッチ又はギャップ）を含有するヌクレオチドの連続する配列を有する。
【００３６】
リボヌクレオチド：本明細書で使用するとき、「リボヌクレオチド」という用語は、その五炭糖としてリボースを有するヌクレオチドを指し、その２’位にヒドロキシ基を含有する。修飾リボヌクレオチドは２’位以外の原子に１つ又は複数の修飾又は置換を有するリボヌクレオチドであり、リボース、ホスフェート基又は塩基における修飾又は置換、或いはリボース、ホスフェート基又は塩基の修飾又は置換を含む。
【００３７】
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド：本明細書で使用するとき、「ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド」という用語は、（ａ）センス鎖（パッセンジャー）及びアンチセンス鎖（ガイド）を有する２本鎖オリゴヌクレオチドであって、アンチセンス鎖又はアンチセンス鎖の一部が標的ｍＲＮＡの切断でアルゴノート２（Ａｇｏ２）エンドヌクレアーゼにより用いられる２本鎖オリゴヌクレオチド、或いは（ｂ）単一のアンチセンス鎖を有する１本鎖オリゴヌクレオチドであって、アンチセンス鎖（又はアンチセンス鎖の一部）が標的ｍＲＮＡの切断でＡｇｏ２エンドヌクレアーゼにより用いられる１本鎖オリゴヌクレオチドのどちらかを指す。
【００３８】
鎖：本明細書で使用するとき、「鎖」という用語は、ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合）により共に結合したヌクレオチドの連続する単一の配列を指す。いくつかの実施形態において、鎖は例えば５’末端及び３’末端の２つの自由端を有する。
【００３９】
対象：本明細書で使用するとき、「対象」という用語は、マウス、ウサギ、及びヒトを含む任意のほ乳類を意味する。１つの実施形態において、対象はヒト又は非ヒト霊長類である。「個体」又は「患者」という用語は、「対象」と同じ意味で用いることができる。
【００４０】
合成：本明細書で使用するとき、「合成」という用語は、人工的に合成されるか（例えば、機械（例えば、固相核酸合成装置）を用いて）、或いはそれ以外の正常に分子を産生する天然源（例えば、細胞又は有機体）由来ではない核酸又は他の分子を指す。
【００４１】
標的化リガンド：本明細書で使用するとき、「標的化リガンド」という用語は、他の物質の標的を目的の組織又は細胞とするため、目的の組織又は細胞の同族分子（例えば受容体）に選択的に結合し、更に別の物質と結合できる分子（例えば、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド又は脂質）を指す。例えば、いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、オリゴヌクレオチドの標的を目的の特異的組織又は細胞とすることを目的として、オリゴヌクレオチドに結合することができる。いくつかの実施形態において、標的化リガンドは細胞表面受容体に選択的に結合する。従って、いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドに結合したときの標的化リガンドは、細胞表面に発現する受容体への選択的結合、並びに細胞によるオリゴヌクレオチド、標的化リガンド及び受容体を含む複合体のエンドソーム内在化により、特定の細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を促進する。いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、オリゴヌクレオチドが細胞で標的化リガンドから放出されるように、細胞内在化後又は細胞内在化中に切断されるリンカーを介してオリゴヌクレオチドに結合する。
【００４２】
テトラループ：本明細書で使用するとき、「テトラループ」という用語は、隣接する２重鎖の安定性を上昇させるループを指し、この２重鎖はヌクレオチドのフランキング配列をハイブリダイゼーションすることにより形成される。安定性の上昇は、隣接するステム２重鎖の融解温度（Ｔm）の上昇として検出可能であり、この温度は無作為に選択されたヌクレオチドの配列からなる同等の長さの一連のループから、平均として予測される隣接するステム２重鎖のＴmより高い。例えば、テトラループは、１０ｍＭのＮａＨＰＯ4における少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも５６℃、少なくとも５８℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、又は少なくとも７５℃の融解温度を少なくとも２塩基対長の２重鎖を含むヘアピンに与えることができる。いくつかの実施形態において、テトラループはスタッキング相互作用により、隣接するステム２重鎖の塩基対を安定させることができる。また、テトラループ中のヌクレオチド間の相互作用は、非ワトソンクリック塩基対、スタッキング相互作用、水素結合、及び接触相互作用を含むが、これらに限定されない（Ｃｈｅｏｎｇ他，Ｎａｔｕｒｅ  １９９０年  ８月．１６；３４６（６２８５）：６８０−２；Ｈｅｕｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｄｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１  ７月．１２；２５３（５０１６）：１９１−４）。いくつかの実施形態において、テトラループは３〜６ヌクレオチドを含むか、３〜６ヌクレオチドからなり、通常４〜５ヌクレオチドである。特定の実施形態において、テトラループは、修飾されていても、されていなくてもよい（例えば、標的部分に結合していてもしていなくてもよい）３、４、５又は６ヌクレオチドを含むか、或いはからなる。１つの実施形態において、テトラループは４ヌクレオチドからなる。任意のヌクレオチドはテトラループで用いることができ、このようなヌクレオチドの標準的なＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ記号は、Ｃｏｒｎｉｓｈ−Ｂｏｗｄｅｎ（１９８５年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３０２１−３０３０に記載されるように用いることができる。例えば、文字「Ｎ」は任意の塩基がその位置にあることを意味するのに用いることができ、文字「Ｒ」はＡ（アデニン）又はＧ（グアニン）がその位置にあることを示すのに用いることができ、「Ｂ」はＣ（シトシン）、Ｇ（グアニン）又はＴ（チミン）がその位置にあることを示すのに用いることができる。テトラループの例としては、ＵＮＣＧファミリーのテトラループ（例えば、ＵＵＣＧ）、ＧＮＲＡファミリーのテトラループ（例えば、ＧＡＡＡ）、及びＣＵＵＧテトラループ（Ｗｏｅｓｅ他，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９０年  １１月；８７（２１）：８４６７−７１；Ａｎｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９１  １１月．１１；１９（２１）：５９０１−５）が挙げられる。ＤＮＡテトラループの例としては、ｄ（ＧＮＮＡ）ファミリーのテトラループ（例えば、ｄ（ＧＴＴＡ））、ｄ（ＧＮＲＡ）ファミリーのテトラループ、ｄ（ＧＮＡＢ）ファミリーのテトラループ、ｄ（ＣＮＮＧ）ファミリーのテトラループ、及びｄ（ＴＮＣＧ）ファミリーのテトラループ（例えば、ｄ（ＴＴＣＧ））が挙げ��れる。例えば、Ｎａｋａｎｏ他．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（４８），１４２８１−１４２９２，２００２年．ＳＨＩＮＪＩ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｉｐｐｏｎ  Ｋａｇａｋｋａｉ  Ｋｏｅｎ  Ｙｏｋｏｓｈｕ  ＶＯＬ．７８ｔｈ；ＮＯ．２；ＰＡＧＥ．７３１（２０００年）を参照のこと。その関係する開示について、参照により本明細書に組み入れられたものとする。いくつかの実施形態において、テトラループはニックが入ったテトラループ構造内に含有される。
【００４３】
治療：本明細書で使用するとき、「治療」という用語は、現在の状態（例えば、疾患、障害）に関する対象の健康及び／又は生活状態を改善する目的で、或いはある状態を発症する可能性を予防するか、又は減少させるため、例えば対象に治療薬（例えば、オリゴヌクレオチド）を投与することにより、必要とする対象にケアを提供する行為を指す。いくつかの実施形態において、治療は、対象が経験する状態（例えば、疾患、障害）の少なくとも１つの兆候、症状又は要因の頻度又は重症度の低下に関わる。
【００４４】
ＩＩ．オリゴヌクレオチド系阻害剤
ｉ．ＰＣＳＫ９を標的とするオリゴヌクレオチド
強力なオリゴヌクレオチドが、異種のｍＲＮＡ（ヒト及びアカゲザル、（例えば、実施例１を参照））を含むＰＣＳＫ９ｍＲＮＡの検査、並びに生体外及び生体内検査により本明細書で特定されている。このようなオリゴヌクレオチドは、ＰＣＳＫ９活性を低下させ、その結果として高コレステロール血症（高濃度低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）−コレステロール）、アテローム性動脈硬化、冠状動脈性心疾患（例えば、冠動脈疾患）、狭心症、息切れ、発汗、悪心、眩暈、息切れ、不整脈、心臓の動悸、脳卒中（つまり、脳への血流及び酸素が不十分であることに起因する脳細胞の死）、脱力感、錯乱、発話困難、眩暈、歩行若しくは直立困難、視朦、顔、腕及び足のしびれ、激しい頭痛、意識消失、末梢動脈疾患、及び／又は腎障害（例えば、慢性腎疾患）を減少させるか、又は予防することにより、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、及び／或いはそれらの１つ又は複数の症状又は合併症を有する対象で治療的有用性を達成することができる。例えば、表４にも分類されるように、配列番号１〜４５３、９０７〜１０２９、１１５３〜１１９２、１２４８〜１２５６及び１２６６〜１２６８のいずれか１つの配列を含む又はからなるセンス鎖、並びに配列番号４５４〜９０６、１０３０〜１１５２、１１９３〜１２３２、１２５７〜１２６５及び１２６９〜１２７１から選択される相補配列を含む又はからなるアンチセンス鎖を有する強力なＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが本明細書で提供される（例えば、配列番号１の配列を含むセンス鎖、及び配列番号４５４の配列を含むアンチセンス鎖）。本明細書に記載するように、配列は複数の異なる構造（又は型）に分類することができる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡの特定領域は、他の領域よりオリゴヌクレオチド系阻害に適しているため、標的化のホットスポットであることが発見されている。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９のホットスポット領域は配列番号１２３３〜１２４４のいずれか１つの配列からなる。これらのＰＣＳＫ９ｍＲＮＡの領域は、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ発現を阻害する目的のため、本明細書で記載されるように、オリゴヌクレオチドを用いて標的化することができる。
従って、いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、細胞のｍＲＮＡを標的化し、その発現を阻害することを目的に、（例えば、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡのホットスポット内の）ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡに相補的な領域を有するように設計される。この相補的な領域は一般的に、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡに対するオリゴヌクレオチド（又はその鎖）のアニーリングが十分に可能である好適な長さ及び塩基であり、その発現を阻害する。
【００４６】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜４５３又は９０７〜１０２９のいずれかの配列に少なくとも部分的な相補性を有する相補的な領域を（例えば、２本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖に）含み、上記配列はＰＣＳＫ９ｍＲＮＡのホットスポット領域内に位置する特定の配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜４５３又は９０７〜１０２９のいずれかの配列に完全な相補性を有する相補的な領域を（例えば、２本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖に）含む。いくつかの実施形態において、配列番号１〜４５３又は９０７〜１０２９のいずれかの配列の連続するヌクレオチドに相補的であるオリゴヌクレオチドの相補的な領域は、アンチセンス鎖の全長に及ぶ。いくつかの実施形態において、配列番号１〜４５３又は９０７〜１０２９のいずれかの配列の連続するヌクレオチドに相補的であるオリゴヌクレオチドの相補的な領域は、アンチセンス鎖の全長の一部に及ぶ（例えば、アンチセンス鎖の３’末端の２つのヌクレオチドを除くすべて）。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号１１５３〜１１９２の配列の１〜１９ヌクレオチドに及ぶヌクレオチドの連続する範囲に少なくとも部分的（例えば、完全に）な相補性を有する相補的な領域を（例えば、２本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖に）含む。
いくつかの実施形態において、相補的な領域は少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４又は少なくとも２５のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、１２〜３０（例えば、１２〜３０、１２〜２２、１５〜２５、１７〜２１、１８〜２７、１９〜２７又は１５〜３０）ヌクレオチド長の範囲のＰＣＳＫ９ｍＲＮＡに相補的な領域を有する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチド長のＰＣＳＫ９ｍＲＮＡに相補的な領域を有する。
いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡに相補的な領域は、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡの該当配列と比較して、１つ又は複数のミスマッチを有する場合がある。オリゴヌクレオチドの相補的な領域は、適当なハイブリダイゼーション条件下、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する能力を維持するという条件で、１まで、２まで、３まで、４まで等のミスマッチを有してよい。或いは、オリゴヌクレオチドの相補的な領域は、適当なハイブリダイゼーション条件下、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する能力を維持するという条件で、１のみ、２のみ、３のみ、又は４のみのミスマッチを有してよい。いくつかの実施形態において、相補的な領域に２つ以上のミスマッチがあれば、適当なハイブリダイゼーション条件下、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する能力をオリゴヌクレオチドが維持するという条件で、これらのミスマッチは連続して（例えば、連続的に２、３、４又はそれ以上）位置するか、或いは相補的な領域に散在する場合がある。
更に、いくつかの実施形態において、本明細書で提供される２本鎖オリゴヌクレオチドは、表４に分類されるように、配列番号１〜４５３、９０７〜１０２９、１１５３〜１１９２、１２４８〜１２５６及び１２６６〜１２６８のいずれか１つの配列を有するセンス鎖、並びに配列番号４５４〜９０６、１０３０〜１１５２、１１９３〜１２３２、１２５７〜１２６５及び１２６９〜１２７１から選択される相補配列を含むアンチセンス鎖を含むか、又はからなる（例えば、配列番号１の配列を含むセンス鎖及び配列番号４５４の配列を含むアンチセンス鎖）。
【００４７】
ｉｉ．オリゴヌクレオチド構造
本開示の方法にはＰＣＳＫ９ｍＲＮＡを標的化するのに有用なＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ等を含むオリゴヌクレオチドの各種構造がある。本明細書又は他に記載する構造のいずれかは、本明細書に記載する配列を取り込むか、又は本明細書に記載する配列を標的とするための骨格として用いることができる（例えば、配列番号１２３３〜１２４４に説明されるものなど、ＰＣＳＫ９のホットポット配列、或いは配列番号１〜４５３、９０７〜１０２９及び１１５３〜１１９２のいずれか、又は配列番号４５４〜９０６、１０３０〜１１５２及び１１９３〜１２３２のいずれかの配列を含むか、又はからなるセンス又はアンチセンス鎖）。（例えば、ＲＮＡｉ経路により）ＰＣＳＫ９の発現を標的化する２本鎖オリゴヌクレオチドは、一般的に互いに２重鎖を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を有する。いくつかの実施形態において、センス及びアンチセンス鎖は共有結合していない。しかしながら、いくつかの実施形態において、センス及びアンチセンス鎖は共有結合している。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９の発現を低下させる２本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を行う。例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの１〜５ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する１９〜２５ヌクレオチドサイズの各鎖を用いて開発されている（例えば、米国特許第８，３７２，９６８号明細書を参照のこと）。ダイサー酵素により処理されて活性なＲＮＡｉ産物を生じるより長いオリゴヌクレオチドも開発されている（例えば、米国特許第８，８８３，９９６号明細書を参照のこと）。さらなる研究により、伸長した２本鎖オリゴヌクレオチドを作製しており、１つの鎖が熱力学的に安定するテトラループ構造を含む構造である２重鎖標的化領域を越えて、少なくとも１つの鎖の少なくとも１つの末端が伸長する（例えば、米国特許第８，５１３，２０７号明細書及び第８，９２７，７０５号明細書、並びに国際公開第２０１００３３２２５号を参照のこと。これらのオリゴヌクレオチドの開示について、本明細書に参照により組み入れられたものとする）。このような構造は１本鎖伸長（分子の片側又は両側）並びに２本鎖伸長を含んでよい。
いくつかの実施形態において、いずれも１７〜４０ヌクレオチド長の範囲である分かれたセンス及びアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドに、本明細書に記載の配列を組み込むことができるか、又は上記オリゴヌクレオチドを用いて本明細書に記載の配列を標的化することができる。いくつかの実施形態において、このような配列を組み込んでいるオリゴヌクレオチドは、センス鎖の３’伸長内にテトラループ構造、及び分かれたアンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドの末端オーバーハングを有する。いくつかの実施形態において、２ヌクレオチドのこの末端オーバーハングはＧＧである。通常、アンチセンス鎖の２つの末端ＧＧヌクレオチドの１つ又は両方が標的に相補的ではない。
いくつかの実施形態において、このような配列を組み込んでいるオリゴヌクレオチドは、いずれも２１〜２３ヌクレオチド長の範囲であるセンス及びアンチセンス鎖を有する。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、センス、アンチセンス、又はセンス及びアンチセンス鎖の両方に与えられ、１又は２ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは２３ヌクレオチドのガイド鎖及び２１ヌクレオチドのパッセンジャー鎖を有する。パッセンジャー鎖の３’末端及びガイド鎖の５’末端は平滑末端を形成し、ガイド鎖は２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは２１〜２３ヌクレオチド長の範囲でよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはセンス及び／又はアンチセンス鎖の３’末端に（例えば、１、２又は３ヌクレオチド長の）オーバーハングを有してよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、２１ヌクレオチドのガイド鎖を含んでよく、これは標的ＲＮＡ及び相補的パッセンジャー鎖にアンチセンスである。両鎖がアニーリングして１９ｂｐの２重鎖、及び３’末端のどちらか又は両方に２ヌクレオチドのオーバーハングを形成する。例えば、米国特許第９０１２１３８号明細書、米国特許第９０１２６２１号明細書、及び米国特許第９１９３７５３号明細書を参照のこと。それぞれの関係する開示に関する内容は本明細書に組み入れられたものとする。
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドはアンチセンス−センス２重鎖を越えて伸長する領域を含む３６ヌクレオチドのセンス鎖を有する。伸長領域はステム−テトラループ構造を有し、ステムは６塩基対２重鎖であり、テトラループは４ヌクレオチドを有する。これらの実施形態のいくつかにおいて、テトラループヌクレオチドの３又は４つは、それぞれ１価ＧａｌＮａｃリガンドに結合する。
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは２５ヌクレオチドのセンス鎖及び２７ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、オリゴヌクレオチドはダイサー酵素が作用すると、成熟ＲＩＳＣに組み込まれるアンチセンス鎖となる。
【００４９】
本明細書で開示される組成物及び方法と共に使用する他のオリゴヌクレオチド設計としては、１６マーｓｉＲＮＡ（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ（ｅｄ．），Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６年を参照のこと）、ｓｈＲＮＡ（例えば、１９ｂｐ以下のステムを有する；例えば、Ｍｏｏｒｅ他Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１０年；６２９：１４１−１５８を参照のこと）、平滑(blunt)ｓｉＲＮＡ（例えば、長さ１９ｂｐ；例えば、Ｋｒａｙｎａｃｋ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，ＲＮＡ  Ｖｏｌ．１２，ｐ１６３−１７６（２００６年）を参照のこと）、非対称ｓｉＲＮＡ（ａｉＲＮＡ；例えば、Ｓｕｎ他，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６，１３７９−１３８２（２００８年）を参照のこと）、非対称短鎖２本鎖ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｃｈａｎｇ他，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９年  ４月；１７（４）：７２５−３２を参照のこと）、フォーク型ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｈｏｈｊｏｈ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ５５７，ｉｓｓｕｅｓ１−３；１月  ２００４年，ｐ１９３−１９８を参照のこと）、１本鎖ｓｉＲＮＡ（Ｅｌｓｎｅｒ；Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３０，１０６３（２０１２年））、ダンベル型環状ｓｉＲＮＡ（例えば、Ａｂｅ他Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２９：１５１０８−１５１０９（２００７年）を参照のこと）、及び低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ(small internally segmented interfering RNA)（ｓｉｓｉＲＮＡ；例えば、Ｂｒａｍｓｅｎ他，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００７年  ９月；３５（１７）：５８８６−５８９７を参照のこと）が挙げられる。上述の参考文献はそれぞれ、関連する開示についてその全体が参照により組み入れられたものとする。いくつかの実施形態で用いられ、ＰＣＳＫ９の発現を低下又は阻害するオリゴヌクレオチド構造のさらなる非限定的な例としては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び短鎖ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ他，Ｅｍｂｏ  Ｊ．，２００２年，２１（１７）：４６７１−４６７９を参照のこと；また米国特許出願第２００９００９９１１５号を参照のこと）である。
【００５０】
ａ．アンチセンス鎖
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＰＣＳＫ９を標的とするオリゴヌクレオチドは、配列番号４５４〜９０６、１０３０〜１１５２又は１１９３〜１２３２のいずれか１つの配列を含むか、或いはからなるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは配列番号４５４〜９０６、１０３０〜１１５２又は１１９３〜１２３２のいずれか１つの配列の連続する少なくとも１２（例えば、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２又は少なくとも２３）のヌクレオチドを含むか、又はからなるアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態において、２本鎖オリゴヌクレオチドは、４０までのヌクレオチド長（例えば、４０まで、３５まで、３０まで、２７まで、２５まで、２１まで、１９まで、１７まで又は１２までのヌクレオチド長）のアンチセンス鎖を有してよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１２のヌクレオチド長（例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１９、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２５、少なくとも２７、少なくとも３０、少なくとも３５又は少なくとも３８ヌクレオチド長）のアンチセンス鎖を有してよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは１２〜４０（例えば、１２〜４０、１２〜３６、１２〜３２、１２〜２８、１５〜４０、１５〜３６、１５〜３２、１５〜２８、１７〜２２、１７〜２５、１９〜２７、１９〜３０、２０〜４０、２２〜４０、２５〜４０又は３２〜４０）ヌクレオチド長の範囲のアンチセンス鎖を有してよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を有してよい。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、「ガイド鎖」と呼ぶことができる。例えば、アンチセンス鎖がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に関与し、アルゴノートタンパク質に結合することができるか、或いは１つ又は複数の類似の因子、及び標的遺伝子の直接サイレンシングに関与するか、又は結合することができるなら、ガイド鎖と呼ぶことができる。いくつかの実施形態において、ガイド鎖に相補的なセンス鎖は、「パッセンジャー鎖」と呼ぶことができる。
【００５１】
ｂ．センス鎖
いくつかの実施形態において、本明細書に開示され、ＰＣＳＫ９を標的とするオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜４５３、９０７〜１０２９及び１１５３〜１１９２のいずれか１つのセンス鎖配列を含むか、又はからなる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜４５３、９０７〜１０２９及び１１５３〜１１９２のいずれか１つの配列の連続する少なくとも１２（例えば、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２又は少なくとも２３）のヌクレオチドを含むか、又はからなるセンス鎖を有する。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは４０までのヌクレオチド長（例えば、４０まで、３６まで、３０まで、２７まで、２５まで、２１まで、１９まで、１７まで又は１２までのヌクレオチド長）のセンス鎖（又はパッセンジャー鎖）を有してよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１２のヌクレオチド長（例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１９、少なくとも２１、少なくとも２５、少なくとも２７、少なくとも３０、少なくとも３６又は少なくとも３８のヌクレオチド長）のセンス鎖を有してよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１２〜４０ヌクレオチド長の範囲（例えば、１２〜４０、１２〜３６、１２〜３２、１２〜２８、１５〜４０、１５〜３６、１５〜３２、１５〜２８、１７〜２１、１７〜２５、１９〜２７、１９〜３０、２０〜４０、２２〜４０、２５〜４０又は３２〜４０）のセンス鎖を有してよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０ヌクレオチド長のセンス鎖を有してよい。
いくつかの実施形態において、センス鎖はその３’末端にステムループ構造を含む。いくつかの実施形態において、センス鎖はその５’末端にステムループ構を含む。いくつかの実施形態において、ステムは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４塩基対長の２重鎖である。いくつかの実施形態において、ステムループは分解（例えば、酵素分解）から分子をより良好に保護し、標的細胞に送達する標的化性を促進する。例えば、いくつかの実施形態において、ループはオリゴヌクレオチドの遺伝子発現阻害活性に実質的に作用することなく修飾を行うことができるヌクレオチドを添加する。特定の実施形態において、センス鎖がＳ1−Ｌ−Ｓ2と示されるステムループを（例えば、その３’末端に）含むオリゴヌクレオチドが本明細書で提供され、Ｓ1はＳ2に相補的であり、Ｌは１０までのヌクレオチド長（例えば、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド長）のループをＳ1及びＳ2間に形成する。図３はこのようなオリゴヌクレオチドの非限定的な例を示す。
いくつかの実施形態において、ステムループのループ（Ｌ）は（例えば、ニックが入ったテトラループ構造内の）テトラループである。テトラループはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びそれらの組合せを含有することができる。通常、テトラループは４〜５ヌクレオチドを有する。
【００５２】
ｃ．２重鎖長
いくつかの実施形態において、センス及びアンチセンス鎖間で形成される２重鎖は、少なくとも１２（例えば、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０又は少なくとも２１）のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、センス及びアンチセンス鎖間で形成される２重鎖は、１２〜３０ヌクレオチド長（例えば、１２〜３０、１２〜２７、１２〜２２、１５〜２５、１８〜３０、１８〜２２、１８〜２５、１８〜２７、１８〜３０、１９〜３０又は２１〜３０ヌクレオチド長）の範囲である。いくつかの実施形態において、センス及びアンチセンス鎖間で形成される２重鎖は１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、センス及びアンチセンス鎖間で形成される２重鎖は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の全長に及ばない。いくつかの実施形態において、センス及びアンチセンス鎖間の２重鎖はセンス又はアンチセンス鎖どちらかの全長に及ぶ。特定の実施形態において、センス及びアンチセンス鎖間の２重鎖はセンス鎖及びアンチセンス鎖両方の全長に及ぶ。
【００５３】
ｄ．オリゴヌクレオチド末端
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、センス鎖又はアンチセンス鎖のどちらか、或いはセンス及びアンチセンス鎖の両方に３’オーバーハングを有するようなセンス及びアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、他の５’末端と比較して、熱力学的に不安定である１つの５’末端を有する。いくつかの実施形態において、センス鎖の３’末端に平滑末端、及びアンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングを含む非対称オリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の３’オーバーハングは、１〜８ヌクレオチド長（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８ヌクレオチド長）である。
通常、ＲＮＡｉに関するオリゴヌクレオチドは、アンチセンス（ガイド）鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有する。しかしながら、他のオーバーハングも可能である。いくつかの実施形態において、オーバーハングは１〜６ヌクレオチド、任意に１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜６、３〜５、３〜４、４〜６、４〜５、５〜６ヌクレオチド、又は１、２、３、４、５若しくは６ヌクレオチド長の３’オーバーハングである。しかしながら、いくつかの実施形態において、オーバーハングは１〜６ヌクレオチド、任意に１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜６、３〜５、３〜４、４〜６、４〜５、５〜６ヌクレオチド、又は１、２、３、４、５若しくは６ヌクレオチド長の５’オーバーハングである。
いくつかの実施形態において、センス及び／又はアンチセンス鎖の３’末端又は５’末端の１つ又は複数（例えば、２、３、４）の末端ヌクレオチドは修飾される。例えば、いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端の１又は２末端ヌクレオチドは修飾される。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端の最後のヌクレオチドが修飾され、例えば２’修飾、例えば２’−Ｏ−メトキシエチルを含む。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端の最後の１又は２末端ヌクレオチドは標的に相補的である。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端の最後の１又は２ヌクレオチドは標的に相補的でない。いくつかの実施形態において、センス又はアンチセンス鎖の５’末端及び／又は３’末端は逆（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）キャップヌクレオチドを有する。
【００５４】
ｅ．ミスマッチ
いくつかの実施形態において、センス及びアンチセンス鎖間に１つ又は複数（例えば、１、２、３又は４）のミスマッチがある。センス及びアンチセンス鎖間に２つ以上のミスマッチがあれば、連続して（例えば、連続する２、３又はそれ以上）位置するか、或いは相補的な領域に散在する場合がある。いくつかの実施形態において、センス鎖の３’末端は１つ又は複数のミスマッチを含有する。１つの実施形態において、２つのミスマッチがセンス鎖の３’末端に組み込まれる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドにおけるセンス鎖の３’末端部分の塩基ミスマッチ又は断片の不安定化は、場合によってはダイサーによる処理を促進することで、ＲＮＡｉの合成２重鎖の有効性を改善した。
【００５５】
ｉｉｉ．１本鎖オリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態において、本明細書に記載するようなＰＣＳＫ９の発現を低下させるオリゴヌクレオチドは１本鎖である。このような構造は１本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを挙げることができるが、これに限定されない。最近では１本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの活性について研究が行われている（例えば、Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍａｙ  ２０１６），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．２４（５），９４６−９５５を参照のこと）。しかしながら、いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは核酸塩基配列を有する１本鎖オリゴヌクレオチドである。これは５’から３’方向で書かれる場合、特定の核酸の標的断片の逆相補体を含み、好適に修飾されて、（例えば、ギャップマーとして）細胞におけるその標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨ媒介切断を誘導するか、又は（例えば、ミックスマーとして）細胞における標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。本開示で使用するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば米国特許第９，５６７，５８７号明細書に示すものを含む、当業者に公知の任意の好適な方法で修飾することができる。（例えば、核酸塩基（ピリミジン、プリン）の長さ、糖部、及び核酸塩基の複素環部分の変化を含む）アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾に関するその開示について、本明細書に参照により組み入れられたものとする。更に、アンチセンス分子は、特異的標的遺伝子の発現を低下させるために、何十年も利用されている（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ他；Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇｓ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５７：８１−１０５を参照のこと）。
【００５６】
ｉｖ．オリゴヌクレオチド修飾
オリゴヌクレオチドは様々な方法で修飾することができ、特異性、安定性、送達、生物学的利用能、ヌクレアーゼ分解耐性、免疫原性、塩基対合特性、ＲＮＡ分布及び細胞取り込み、並びに治療又は研究使用に関する他の特徴を改善又は制御する。例えば、Ｂｒａｍｓｅｎ他，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００９年，３７，２８６７−２８８１；Ｂｒａｍｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｊｅｍｓ（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３（２０１２年）：１−２２）を参照のこと。従って、いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチドは１つ又は複数の好適な修飾を含むことができる。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドはその塩基（つまり核酸塩基）、糖（例えば、リボース、デオキシリボース）、又はホスフェート基に修飾を有する。
オリゴヌクレオチドにおける修飾数及びこれらのヌクレオチド修飾の位置は、オリゴヌクレオチドの特性に影響する。例えば、オリゴヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）又は類似の担体にオリゴヌクレオチドを結合することにより、又はＬＮＰ又は類似の担体でオリゴヌクレオチドを包含することにより、生体内で送達することができる。しかしながら、オリゴヌクレオチドがＬＮＰ又は類似の担体により保護されない場合（例えば、「ネイキッド（ｎａｋｅｄ）送達」）、その修飾されるヌクレオチドの少なくとも一部に有利である場合がある。従って、本明細書で提供されるいずれかのオリゴヌクレオチドの特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドのすべて又は実質的にすべてのヌクレオチドが修飾される。特定の実施形態において、半分を超えるヌクレオチドが修飾される。特定の実施形態において、半分未満のヌクレオチドが修飾される。通常、ネイキッド送達では、すべてのヌクレオチドは、そのヌクレオチドの糖基の２’位で修飾される。これらの修飾は可逆的又は不可逆的でよい。通常、２’位修飾は２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル等である。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、所望の性質（例えば、酵素分解からの保護、生体内投与後に所望の細胞を標的にする能力、及び／又は熱力学的安定性）を引き起こすのに十分な多数及びタイプの修飾ヌクレオチドを有する。
【００５７】
ａ．糖修飾
いくつかの実施形態において、修飾糖（本明細書では糖類似体とも呼ぶ）は、修飾デオキシリボース又はリボース部分を含み、例えば１つ又は複数の修飾は糖の２’、３’、４’及び／又は５’炭素位で起こる。いくつかの実施形態において、修飾糖はロック核酸（「ＬＮＡ」）（例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎ他（１９９８年），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５４，３６０７−３６３０を参照のこと)、アンロック核酸（「ＵＮＡ」）（例えば、Ｓｎｅａｄ他（２０１３年），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２，ｅ１０３を参照のこと)、並びに架橋型核酸（「ＢＮＡ」）（例えば、Ｉｍａｎｉｓｈｉ  ａｎｄ  Ｏｂｉｋａ（２００２年），Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６５３−１６５９を参照のこと）に存在するものなど、非天然の別の炭素構造を含むこともできる。Ｋｏｓｈｋｉｎ他、Ｓｎｅａｄ他、及びＩｍａｎｉｓｈｉ  ａｎｄ  Ｏｂｉｋａの糖修飾に関連する開示に関して、本明細書に参照により組み入れられたものとする。
いくつかの実施形態において、糖におけるヌクレオチド修飾は、２’修飾を含む。いくつかの実施形態において、２’修飾は２’−アミノエチル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、又は２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−ｄ−アラビノ核酸でよい。通常、修飾は２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、又は２’−Ｏ−メトキシエチルである。しかしながら、オリゴヌクレオチドで使用するために開発されている多様な２’位修飾は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドで利用することができる。例えば、Ｂｒａｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００９年，３７，２８６７−２８８１を参照のこと。いくつかの実施形態において、糖の修飾は糖環の修飾を含み、糖環の１つ又は複数の炭素の修飾を含んでよい。例えば、ヌクレオチドの糖の修飾は、糖の２’炭素及び１’炭素又は４’炭素間の結合を含んでよい。例えば、この結合はエチレン又はメチレン架橋を含んでよい。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは２’炭素と３’炭素が結合していない非環状糖を有する。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、例えば糖の４’位にチオール基を有する。
いくつかの実施形態において、３’末端基（例えば、３’−ヒドロキシ）は、ホスフェート基であるか、或いは例えばリンカー、アダプター若しくは標識を結合するため、又は他の核酸へのオリゴヌクレオチドの直接ライゲーションのため、使用することができる他の基である。
【００５８】
ｂ．５’末端ホスフェート
オリゴヌクレオチドの５’末端ホスフェート基は、アルゴノート２との相互作用を強化することができるか、又はいくつかの状況において強化する。しかしながら、５’−ホスフェート基を含むオリゴヌクレオチドは、ホスファターゼ又は他の酵素により分解される場合があり、生体内での生物学的利用能が限定されることがある。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、このような分解に耐性がある５’ホスフェートの類似体を含む。いくつかの実施形態において、ホスフェート類似体はオキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートでよい。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端は天然の５’−ホスフェート基の静電気的及び立体的特性を模倣する化学部分に結合する（「ホスフェート模倣体」）（例えば、Ｐｒａｋａｓｈ他（２０１５年），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１５年  Ｍａｒ  ３１；４３（６）：２９９３−３０１１を参照のこと。ホスフェート類似体に関する内容は参照により本明細書に組み入れられたものとする）。５’末端に結合することができる多くのホスフェート模倣体が開発されている（例えば、米国特許第８，９２７，５１３号明細書を参照のこと。ホスフェート類似体に関する内容は参照により本明細書に組み入れられたものとする）。他の修飾はオリゴヌクレオチドの５’末端に関して開発されている（例えば、国際公開第２０１１／１３３８７１号を参照のこと。ホスフェート類似体に関する内容は参照により本明細書に組み入れられたものとする）。特定の実施形態において、ヒドロキシ基がオリゴヌクレオチドの５’末端に結合する。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは糖の４’炭素位にホスフェート類似体を有する（「４’−ホスフェート類似体」と呼ぶ）。例えば、２０１７年９月１日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４９９０９号、２０１６年９月２日に出願され、名称が４’−ホスフェート類似体及びそれを含むオリゴヌクレオチドである米国仮出願第６２／３８３，２０７号、及び２０１６年９月１２日に出願され、名称が４’−ホスフェート類似体及びそれを含むオリゴヌクレオチドである米国仮出願第６２／３９３，４０１号を参照のこと。ホスフェート類似体に関するそれぞれの内容は、参照により本明細書に組み入れられたものとする。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは５’末端ヌクレオチドに４’−ホスフェート類似体を含む。いくつかの実施形態において、ホスフェート類似体はオキシメチルホスホネートであり、オキシメチル基の酸素原子は糖部分（例えば、その４’炭素）又はその類似体に結合している。他の実施形態において、４’−ホスフェート類似体はチオメチルホスホネート又はアミノメチルホスホネートであり、チオメチル基の硫黄原子又はアミノメチル基の窒素原子は糖部分の４’炭素又はその類似体に結合する。特定の実施形態において、４’−ホスフェート類似体はオキシメチルホスホネートである。いくつかの実施形態において、オキシメチルホスホネートは式−Ｏ−ＣＨ2−ＰＯ（ＯＨ）2又は−Ｏ−ＣＨ2−ＰＯ（ＯＲ）2により表され、Ｒは独立してＨ、ＣＨ3、アルキル基、ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ、ＣＨ2ＯＣＯＣ（ＣＨ3）3、ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2Ｓｉ（ＣＨ3）3、又は保護基から選択される。特定の実施形態において、このアルキル基はＣＨ2ＣＨ3である。より典型的には、Ｒは独立してＨ、ＣＨ3、又はＣＨ2ＣＨ3から選択される。
【００５９】
ｃ．修飾ヌクレオシド間結合
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは修飾ヌクレオシド間結合を含んでよい。いくつかの実施形態において、ホスフェート修飾又は置換により、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４又は少なくとも５）の修飾ヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドを得ることができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つは、１〜１０（例えば、１〜１０、２〜８、４〜６、３〜１０、５〜１０、１〜５、１〜３又は１〜２）の修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の修飾ヌクレオチド間結合を含む。
修飾ヌクレオチド間結合はホスホロジチオアート結合、ホスホロチオアート結合、ホスホトリエステル結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオノアルキルホスホトリエステル結合、ホスホロアミダイト結合、ホスホネート結合又はボラノホスフェート結合であってよい。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるいずれか１つのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合はホスホロチオアート結合である。
【００６０】
ｄ．塩基修飾
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の修飾核酸塩基を有する。いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基（本明細書では塩基類似体とも呼ぶ）は、ヌクレオチド糖部分の１’位に結合する。特定の実施形態において、修飾核酸塩基は窒素を含む塩基である。特定の実施形態において、修飾核酸塩基は窒素原子を含有しない。例えば、米国特許出願公開第２００８０２７４４６２号を参照のこと。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドはユニバーサル塩基を含む。しかしながら、特定の実施形態において、修飾ヌクレオチドは核酸塩基を含有しない（無塩基）。
いくつかの実施形態において、ユニバーサル塩基は、修飾ヌクレオチドにおけるヌクレオチド糖部分の１’位、又はヌクレオチド糖部分が置換されたものの同等の位置にある複素環部分であり、２重鎖に存在する場合、実質的に２重鎖構造を変化させることなく、２種以上の塩基に向かいあって位置することができる。いくつかの実施形態において、標的核酸に完全に相補的である基準の１本鎖核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）と比較して、ユニバーサル塩基を含有する１本鎖核酸は標的核酸と２重鎖を形成し、相補的核酸と形成される２重鎖より低いＴmを有する。しかしながら、いくつかの実施形態において、ユニバーサル塩基がある塩基で置き換えられて単一のミスマッチが生成された基準の１本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含有する１本鎖核酸は標的核酸と２重鎖を形成し、ミスマッチ塩基を含む核酸と形成される２重鎖より高いＴmを有する。
ユニバーサル結合ヌクレオチドの非限定的な例としては、イノシン、１−β−Ｄ−リボフラノシル−５−ニトロインドール、及び／又は１−β−Ｄ−リボフラノシル−３−ニトロピロールが挙げられる（Ｑｕａｙ他の米国特許出願公開第２００７０２５４３６２号；Ｖａｎ  Ａｅｒｓｃｈｏｔ他，Ａｎ  ａｃｙｃｌｉｃ  ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄａｚｏｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ａｓ  ａｍｂｉｇｕｏｕｓ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９５年  １１月  １１；２３（２１）：４３６３−７０；Ｌｏａｋｅｓ他，３−Ｎｉｔｒｏｐｙｒｒｏｌｅ  ａｎｄ  ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ａｓ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ＰＣＲ.  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９５年  ７月  １１；２３（１３）：２３６１−６；Ｌｏａｋｅｓ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，５−Ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ａｓ  ａｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９４  Ｏｃｔ  １１；２２（２０）：４０３９−４３。前述の文献それぞれの塩基修飾に関する開示に関して、本明細書に参照により組み入れられたものとする）。
【００６１】
ｅ．可逆的修飾
標的細胞に達する前に生体内環境からオリゴヌクレオチドを保護するために特定の修飾を行うことができるが、標的細胞の細胞質基質に達した時点で、オリゴヌクレオチドの有効性又は活性が低下している場合がある。分子が細胞外で所望の特性を保持するように可逆的修飾を行うことができ、その後細胞の細胞基質環境に入ると除去される。例えば、細胞内酵素の作用により、又は細胞内の化学的条件により（例えば、細胞内グルタチオンによる還元により）可逆的修飾を除去することができる。
いくつかの実施形態において、可逆的に修飾されたヌクレオチドはグルタチオン感受性部分を含む。通常、核酸分子は環状ジスルフィド部分を用いて化学的に修飾されており、ヌクレオチド間ジホスフェート結合により生じる負電荷をマスクし、細胞取り込み及びヌクレアーゼ耐性を改善させる。Ｔｒａｖｅｒｓａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（「Ｔｒａｖｅｒｓａ」）に元々付与された米国特許出願公開第２０１１／０２９４８６９号、Ｓｏｌｓｔｉｃｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｌｔｄ．（「Ｓｏｌｓｔｉｃｅ」）のＰＣＴ公報ＷＯ２０１５／１８８１９７号、Ｍｅａｄｅ他，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４年，３２：１２５６−１２６３（「Ｍｅａｄｅ」）、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ  ＣｏｒｐのＰＣＴ公報ＷＯ２０１４／０８８９２０号を参照のこと。それぞれのこのような修飾の開示に関し、参照により組み入れられたものとする。このヌクレオチド間ジホスフェート結合の可逆的修飾は、細胞質基質（例えば、グルタチオン）の還元環境により細胞内で切断されるように設計される。初期の例としては、細胞内で切断できることが報告された中和ホスホトリエステル修飾が挙げられる（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ他Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３年，１２５：９４０−９５０）。
いくつかの実施形態において、このような可逆的修飾は、オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ及び他の厳しい環境条件（例えば、ｐＨ）に露出される生体内投与中（例えば、血液及び／又は細胞のリソソーム／エンドソーム部分の通過）の保護を行う。細胞外空間と比べグルタチオン濃度が高い細胞の細胞質基質に放出されると、この修飾は除去され、その結果オリゴヌクレオチドが切断される。不可逆的化学修飾を用いて利用できる選択肢と比較して、可逆的なグルタチオン感受性部分を用い、目的のオリゴヌクレオチドに立体的により大きな化学基を導入することができる。これらの大きな化学基は細胞質基質で除去されるためであり、従って細胞の細胞質基質内部でオリゴヌクレオチドの生物活性を妨げない。結果として、これらの大きな化学基は、ヌクレアーゼ耐性、親油性、電荷、熱安定性、特異性、及び免疫原性低下など、様々な利点をヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに与えるように設計することができる。いくつかの実施形態において、グルタチオン感受性部分の構造はその放出の動態を変更するように設計することができる。
いくつかの実施形態において、グルタチオン感受性部分はヌクレオチドの糖に結合する。いくつかの実施形態において、グルタチオン感受性部分は修飾ヌクレオチドの糖の２’炭素に結合する。いくつかの実施形態において、グルタチオン感受性部分は、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドである場合、糖の５’炭素に位置する。いくつかの実施形態において、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドである場合、グルタチオン感受性部分は糖の３’炭素に位置する。いくつかの実施形態において、グルタチオン感受性部分はスルホニル基を含む。例えば、名称が可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含む組成物及びその使用であり、国際特許公開ＷＯ２０１８／０３９３６４号として２０１６年８月２３日に出願され、２０１８年３月１日に公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４８２３９を参照のこと。その内容の関係する開示について参照により本明細書に組み入れられたものとする。
【００６２】
ｖ．標的化リガンド
いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチドの標的を１つ若しくは複数の細胞又は１つ若しくは複数の臓器とすることが望ましい。このような手段は他の臓器における望ましくない効果を回避するのを助けるか、或いはオリゴヌクレオチドの効果がない細胞、組織又は臓器へのオリゴヌクレオチドの過度な損失を避けることができる。従って、いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、特定の組織、細胞又は臓器の標的化を容易にするように、例えば肝臓へのオリゴヌクレオチドの送達を容易にするように修飾することができる。特定の実施形態において、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、肝臓の肝細胞にオリゴヌクレオチドを送達するのを容易にするように修飾することができる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは１つ又は複数の標的化リガンドに結合するヌクレオチドを含む。
【００６３】
標的化リガンドは、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質又はタンパク質の一部（例えば、抗体又は抗体断片）或いは脂質を含んでよい。いくつかの実施形態において、標的化リガンドはアプタマーである。例えば、標的化リガンドは、腫瘍血管系又は神経膠腫細胞を標的とするのに用いられるＲＧＤペプチド、腫瘍血管系又はストーマを標的とするＣＲＥＫＡペプチド、ＣＮＳ血管系に発現するトランスフェリン受容体を標的とするトランスフェリン、ラクトフェリン又はアプタマー、或いは神経膠腫細胞におけるＥＧＦＲを標的とする抗ＥＧＦＲ抗体でよい。特定の実施形態において、標的化リガンドは１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ部分である。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの１つ又は複数の（例えば、１、２、３、４、５又は６）ヌクレオチドは、それぞれ別々の標的化リガンドに結合する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの２〜４ヌクレオチドは、それぞれ別々の標的化リガンドに結合する。いくつかの実施形態において、標的化リガンドが歯ブラシの毛のようであるように、オリゴヌクレオチドが歯ブラシのようであるように、センス又はアンチセンス鎖のどちらかの末端で標的化リガンドが２〜４ヌクレオチドに結合する（例えば、リガンドが２〜４ヌクレオチドのオーバーハング或いはセンス又はアンチセンス鎖の５’又は３’末端の伸長に結合する）。例えば、オリゴヌクレオチドはセンス鎖の５’又は３’末端にステムループを含んでよく、ステムループの１、２、３又は４ヌクレオチドは、例えば２０１６年６月２３日に公開された国際特許出願公開ＷＯ２０１６／１００４０１号に記載のように、標的化リガンドに個別に結合することができる。関連内容は参照により本明細書に組み入れられたものとする。
いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９の発現を低下させるオリゴヌクレオチドの標的を対象の肝臓の肝細胞とすることが望ましい。任意の好適な肝細胞を標的とする部分はこの目的のために用いることができる。
【００６４】
ＧａｌＮＡｃは、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に対する高親和性リガンドであり、この受容体は主に肝細胞の類洞表面に発現し、末端ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン残基を含有する循環糖タンパク質（アシアロ糖タンパク質）の結合、内在化及びその後のクリアランスで主要な役割を有する。本開示のオリゴヌクレオチドへのＧａｌＮＡｃ部分の結合（間接又は直接）を用いて、これらのオリゴヌクレオチドの標的をこれらの肝細胞に発現するＡＳＧＰＲとすることができる。
いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチドは１価ＧａｌＮＡｃに直接又は間接的に結合する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは１個超の１価ＧａｌＮＡｃに直接又は間接的に結合する（つまり、２、３又は４個の１価ＧａｌＮＡｃ部分に結合し、通常３又は４個の１価ＧａｌＮＡｃ部分に結合する）。いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチドは１つ又は複数の２価ＧａｌＮＡｃ、３価ＧａｌＮＡｃ又は４価ＧａｌＮＡｃ部分に結合する。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの１つ又は複数の（例えば、１、２、３、４、５又は６）ヌクレオチドは、それぞれＧａｌＮＡｃ部分に結合する。いくつかの実施形態において、ステムループのループ（Ｌ）の２〜４ヌクレオチドは、それぞれ別々のＧａｌＮＡｃに結合する。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分が歯ブラシの毛のようであるように、オリゴヌクレオチドが歯ブラシのようであるように、センス又はアンチセンス鎖のどちらかの末端で標的化リガンドが２〜４ヌクレオチドに結合する（例えば、リガンドが２〜４ヌクレオチドのオーバーハング或いはセンス又はアンチセンス鎖の５’又は３’末端の伸長に結合する）。例えば、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の５’又は３’末端のどちらかにステムループを含んでよく、ステムのループの１、２、３又は４ヌクレオチドは個別にＧａｌＮＡｃ部分に結合してよい。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分はセンス鎖のヌクレオチドに結合する。例えば、４つのＧａｌＮＡｃ部分がセンス鎖のテトラループのヌクレオチドに結合することができ、各ＧａｌＮＡｃ部分は１つのヌクレオチドに結合する。
【００６５】
適当な方法又は化学（例えば、クリックケミストリー）により、ヌクレオチドに標的化リガンドを連結することができる。いくつかの実施形態において、標的化リガンドはクリックリンカーを用いてヌクレオチドに結合する。いくつかの実施形態において、アセタール系リンカーは、本明細書に記載のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのあるヌクレオチドに標的化リガンドを結合するのに用いられる。アセタール系リンカーは、例えば２０１６年６月２３日に公開された国際特許出願公開ＷＯ２０１６１００４０１号に開示されており、このようなリンカーに関する内容は、参照により本明細書に組み入れられたものとする。いくつかの実施形態において、リンカーは不安定なリンカーである。しかしながら、他の実施形態において、リンカーはかなり安定している。いくつかの実施形態において、２重鎖伸長（３、４、５又は６までの塩基対長）が、標的化リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ部分）及び２本鎖オリゴヌクレオチド間に提供される。
【００６６】
ＩＩＩ．製剤
様々な製剤がオリゴヌクレオチドの使用を容易にするために開発されている。例えば、製剤を用い、対象又は細胞環境にオリゴヌクレオチドを送達させることができ、この製剤は分解を最小限にするか、送達及び／又は取り込みを促進するか、或いは製剤中のオリゴヌクレオチドに他の有益な特性を与える。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるものは、ＰＣＳＫ９の発現を低下させるオリゴヌクレオチド（例えば、１本鎖又は２本鎖オリゴヌクレオチド）を含む組成物である。対象の標的細胞の隣接する環境に又は全身的に投与されるときに、オリゴヌクレオチドの十分な部分が細胞に侵入してＰＣＳＫ９の発現を低下させるように、このような組成物を好適に形成することができる。様々な好適なオリゴヌクレオチド製剤のいずれかを用い、本明細書に開示するようなＰＣＳＫ９の低下のためにオリゴヌクレオチドを送達させることができる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液、リポソーム、ミセル構造及びカプシドで調製される。いくつかの実施形態において、そのままの(naked)オリゴヌクレオチド又はその結合体は、水又は水溶液（例えば、ｐＨ調整した水）中で調製される。いくつかの実施形態において、そのままの(naked)オリゴヌクレオチド又はその結合体は塩基性緩衝水溶液（例えば、ＰＢＳ）中で調製される。
【００６７】
カチオン性脂質を用いたオリゴヌクレオチド製剤は、細胞へのオリゴヌクレオチドのトランスフェクションを促進することができる。例えば、リポフェクチン、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリカチオン性分子（例えば、ポリリシン）などのカチオン性脂質を用いることができる。好適な脂質としては、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮＣ３８８（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、ボルダー、コロラド州）、又はＦｕＧｅｎｅ６（ロシュ）が挙げられ、すべてメーカーの指示に従って使用することができる。
従って、いくつかの実施形態において、製剤は脂質ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態において、賦形剤はリポソーム、脂質、脂質複合体、マイクロスフェア、微粒子、ナノスフェア又はナノ粒子を含む。或いは必要としている対象の細胞、組織、臓器、又は身体に投与するために別の方法で調製することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，２０１３年を参照のこと）。
【００６８】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される製剤は賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、賦形剤は、組成物の安定性、吸収、溶解性及び／又は活性成分の治療効果を改善させる。いくつかの実施形態において、賦形剤は緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス塩基、又は水酸化ナトリウム）或いは溶剤（例えば、緩衝液、ペトロラタム、ジメチルスルホキシド、又は鉱油）である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはその保存期間を延長するために凍結乾燥した後、使用（例えば、対象への投与）前に溶液にする。従って、本明細書に記載のいずれか１つのオリゴヌクレオチドを含む組成物の賦形剤は、リオプロテクタント（例えば、マンニトール、ラクトース、ポリエチレングリコール又はポリビニルピロリドン）、或いは崩壊温度調整剤（例えば、デキストラン、フィコール又はゼラチン）でよい。
【００６９】
いくつかの実施形態において、医薬組成物はその投与の意図される経路に適合するように調製される。投与経路の例としては、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、及び直腸投与が挙げられる。通常、投与経路は静脈内又は皮下である。
注射での使用に好適な医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性）又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製用滅菌粉末が挙げられる。静脈内又は皮下投与について、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、パーシッパニー、ニュージャージー州）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。担体は例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）を含有する溶媒又は分散媒、並びに好適なそれらの混合物でよい。多くの場合、組成物に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、及び塩化ナトリウムを含むことが好ましい。上記列挙した成分の１つ又は組合せを有する選択された溶媒に、必要量のオリゴヌクレオチドを包含させた後、必要に応じてろ過滅菌することにより、滅菌注射溶液を調製することができる。
【００７０】
いくつかの実施形態において、活性成分の割合は全組成の質量又は体積の約１％から約８０％以上でよいが、組成物は少なくとも約０．１％以上の治療薬（例えば、ＰＣＳＫ９の発現を低下させるオリゴヌクレオチド）を含有してよい。溶解性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品の保存期間、並びに他の薬理的事項などの因子は、このような医薬製剤を調製する当業者に予期されるものであり、結果として様々な投与量及び治療計画が望ましい。
多くの実施形態において、本明細書で開示されるいずれかのオリゴヌクレオチドは肝臓を標的とした送達を対象とするが、他の組織の標的化も考慮される。
【００７１】
ＩＶ．使用方法
ｉ．細胞におけるＰＣＳＫ９の発現低下
いくつかの実施形態において、細胞におけるＰＣＳＫ９の発現を低下させる目的のため、本明細書で開示されるいずれか１つのオリゴヌクレオチドの有効量を細胞に送達する方法を提供する。本明細書で提供される方法は、任意の適当な細胞型で有用である。いくつかの実施形態において、細胞はＰＣＳＫ９を発現する任意の細胞である（例えば、肝臓、肺、腎臓、脾臓、精巣、脂肪、及び腸細胞）。いくつかの実施形態において、細胞は対象から得られる初代細胞であり、細胞がその天然の表現型特性を実質的に維持するように、限られた数の継代を経てよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドが送達されるのは、生体外又は試験管内の細胞である（つまり、培養下の細胞又は細胞が存在する有機体に送達することができる）。具体的な実施形態において、肝細胞のみで、又は主に肝細胞でＰＣＳＫ９の発現を低下させる目的のため、本明細書で開示されるいずれか１つのオリゴヌクレオチドの有効量を細胞に送達する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドを含有する溶液の注射、オリゴヌクレオチドで覆われた粒子のボンバードメント、オリゴヌクレオチドを含有する溶液に細胞又は有機体を曝露すること、或いはオリゴヌクレオチドの存在下における細胞膜のエレクトロポレーションを含む適当な核酸送達方法を用いて、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドを導入することができる。脂質媒介担体輸送、化学媒介輸送、リン酸カルシウムなどのカチオン性リポソームトランスフェクションなど、オリゴヌクレオチドを細胞に送達する他の適当な方法を用いることができる。
【００７２】
細胞又は対象の１つ又は複数の特性を評価する適当なアッセイ、或いはＰＣＳＫ９の発現を示す分子（例えば、ＲＮＡ、タンパク質）を評価する生化学的技術により、阻害の結果を確認することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドがＰＣＳＫ９の発現レベルを低下させる程度は、発現レベルを比較すること（例えば、適当な対照に対するＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ又はタンパク質レベル（例えば、オリゴヌクレオチドが送達されていない、又は陰性対照が送達されている細胞又は細胞群におけるＰＣＳＫ９の発現レベル））により評価される。いくつかの実施形態において、対照レベルを毎回測定する必要がないように、ＰＣＳＫ９の発現の適当な対照レベルは所定のレベル又は値としてよい。所定のレベル又は値は様々な形式をとることができる。いくつかの実施形態において、所定のレベル又は値は、中央値又は平均値などの単一のカットオフ値であることができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの投与は、細胞におけるＰＣＳＫ９の発現レベルを低下させる。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９の発現レベルの低下は、ＰＣＳＫ９の適当な対照レベルと比較して、１％以下、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下、４５％以下、５０％以下、５５％以下、６０％以下、７０％以下、８０％以下又は９０％以下の低下でよい。適当な対照レベルは、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドと接触していない細胞又は細胞群におけるＰＣＳＫ９の発現レベルでよい。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法により細胞にオリゴヌクレオチドを送達する効果は、特定の時間後に評価される。例えば、ＰＣＳＫ９レベルは、細胞へのオリゴヌクレオチドの導入から少なくとも８時間、１２時間、１８時間、２４時間；又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７若しくは１４日間後、細胞で分析することができる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは導入遺伝子状で送達され、この遺伝子は細胞において本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドが（例えば、ｓｈＲＮＡ状で）発現するように設計される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは導入遺伝子を用いて送達され、この導入遺伝子は任意の本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドが発現するように設計される。導入遺伝子はウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス又は単純ヘルペスウイルス）或いは非ウイルスベクター（例えば、プラスミド又は合成ｍＲＮＡ）を用いて送達させることができる。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は対象に直接投入することができる。
【００７４】
ｉｉ．治療方法
本開示の態様は、対象における高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、及び／或いはそれらの１つ又は複数の症状又は合併症を治療するため、ＰＣＳＫ９の発現を低下させる方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法は本明細書で開示されるいずれか１つのオリゴヌクレオチドの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含んでよい。いくつかの実施形態において、このような治療は、例えば高コレステロール血症（高濃度低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）−コレステロール）、アテローム性動脈硬化、冠状動脈性心疾患（例えば、冠動脈疾患）、狭心症、息切れ、発汗、悪心、眩暈、息切れ、不整脈、心臓の動悸、脳卒中（つまり、脳への血流及び酸素が不十分であることに起因する脳細胞の死）、脱力感、錯乱、発話困難、眩暈、歩行若しくは直立困難、視朦、顔、腕及び足のしびれ、激しい頭痛、意識消失、末梢動脈疾患、及び／又は腎障害（例えば、慢性腎疾患）を減少させるか、又は予防するために用いることができる。いくつかの実施形態において、このような治療は、例えば高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、及び／或いはそれらの１つ又は複数の症状又は合併症に伴う１つ又は複数の症状を治療又は予防するために用いることができる。
従って、いくつかの実施形態において、本開示は、冠状動脈性心疾患（例えば、冠動脈疾患）、狭心症、息切れ、発汗、悪心、眩暈、息切れ、不整脈、心臓の動悸、脳卒中（つまり、脳への血流及び酸素が不十分であることに起因する脳細胞の死）、脱力感、錯乱、発話困難、眩暈、歩行若しくは直立困難、視朦、顔、腕及び足のしびれ、激しい頭痛、意識消失、末梢動脈疾患、及び／又は腎障害（例えば、慢性腎疾患）を含む高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、及び／或いはそれらの１つ又は複数の症状又は合併症のリスクを有する（又は影響を受けやすい）対象を治療する方法を提供する。
特定の態様において、本開示は治療薬（例えば、オリゴヌクレオチド又はベクター又はそれをコードする導入遺伝子）を対象に投与することにより、本明細書に記載するような対象における疾患、障害、症状又は状態を予防する方法を提供する。いくつかの実施形態において、治療を受けるべき対象は、例えば肝臓におけるＰＣＳＫ９タンパク質量を低下させることで治療的に恩恵を受ける対象である。
【００７５】
本明細書に記載される方法は、通常オリゴヌクレオチドの有効量、つまり所望の治療結果を生じることができる量を対象に投与することを含む。治療的に許容可能な量は、疾患又は障害を治療することができる量でよい。いずれか１つの対象への適当な投与量は、対象の大きさ、身体表面積、年齢、投与される特定の組成物、組成物の活性成分、投与の時間及び経路、全体的な健康、並びに併用投与される他の薬剤を含む特定の要因によって決まる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物のいずれか１つは、経腸（例えば、経口、胃栄養チューブ、十二指腸栄養チューブ、胃造瘻又は直腸による)、非経口（例えば、皮下注射、静脈注射又は注入、動脈内注射又は注入、筋肉内注射）、局所（例えば、経皮、吸入、点眼薬又は粘膜による）、或いは標的臓器（例えば、対象の肝臓）への直接注射により対象に投与される。通常、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは静脈内又は皮下投与される。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの投与は、０．１ｍｇ／ｋｇから２５ｍｇ／ｋｇの用量範囲（例えば、１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ）で行われる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの投与は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの用量範囲又は０．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの用量範囲で行われる。
非限定的な一連の例として、本開示のオリゴヌクレオチドは、通常１年に１回、１年に２回、１年に４回（３か月に１回）、隔月（２か月に１回）、月１回、又は週１回投与される。
いくつかの実施形態において、治療を受ける対象はヒト（例えば、ヒトの患者）又は非ヒト霊長類又は他のほ乳類である。対象の他の例としては、イヌ及びネコなどの飼い慣らされた動物；ウマ、畜牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びニワトリなどの家畜；並びにマウス、ラット、モルモット及びハムスターなどの動物が挙げられる。
【実施例】
【００７６】
実施例１：ヒト及びマウスセルベースアッセイを用いたＰＣＳＫ９のオリゴヌクレオチド阻害剤の開発
ヒト及びマウスベースアッセイを用いて、ＰＣＳＫ９の発現を阻害する候補オリゴヌクレオチドを開発した。最初に、コンピュータによるアルゴリズムを用いて、ＰＣＳＫ９を阻害する候補オリゴヌクレオチド配列（２５〜２７マー）を生成した。その後、セルベースアッセイ及びＰＣＲアッセイを用いて、ＰＣＳＫ９発現低下能について候補オリゴヌクレオチドを評価した。
このコンピュータによるアルゴリズムは、ヒトＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ（配列番号１２４５、表１）に相補的なオリゴヌクレオチドを示し、その特定配列はアカゲザルＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ（配列番号１２４６、表１）にも相補的であった。
【表１】
2021521796.tif 000003
【００７７】
アルゴリズムが示したオリゴヌクレオチドのうち、５７６のオリゴヌクレオチドをＨｕｈ−７セルベースアッセイにおける実験評価の候補として選択した。このアッセイでは、ＰＣＳＫ９を安定して発現するＨｕｈ−７ヒト肝臓細胞に、これらのオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。トランスフェクション後のある期間、細胞を維持した後、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）のｑＰＣＲアッセイを用いて残留ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡレベルを調査した。３’アッセイ及び５’アッセイである２つのｑＰＣＲアッセイを用いて、それぞれＨＥＸ（ハウスキーピング遺伝子−ＳＦＲＳ９）及びＦＡＭプローブにより測定して、ｍＲＮＡレベルを決定した。５７６のオリゴヌクレオチドを用いたセルベースアッセイの結果を図１Ａ及び１Ｂに示す。ｍＲＮＡ残存率は、図１Ｂにおける５’アッセイ（丸形）及び３’アッセイ（ひし形）のそれぞれについて示す。ｍｏｃｋトランスフェクション対照と比較し、残存するｍＲＮＡの割合が最も低いオリゴヌクレオチドをヒットと見なした。ヒトゲノムに対する相補性が低いオリゴヌクレオチドを陰性対照として用いた。
これらのオリゴヌクレオチドの活性及び位置に基づき、ヒトＰＣＳＫ９ｍＲＮＡにおけるホットスポットを定義した。対照と比較し、どちらのアッセイでもｍＲＮＡレベルが３５％以下となる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに関し、ヒトＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ配列におけるホットスポットを特定した。従って、ヒトＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿１７４９３６．３）内の以下のホットスポット：７４６〜７８３、２６０２〜２６３９、２７３７〜２７９２、２８８０〜２９２３、２９５６〜２９９６、３０１５〜３０７５、３０９９〜３１７８、３１９０〜３２４４、３２９７〜３３５９、３６４９〜３４４６、３４５７〜３４９９、及び３５３２〜３７１５を特定した。
【００７８】
ホットスポットの配列を表２に示す。
【表２】
2021521796.tif 000004
【００７９】
用量反応分析
最初のＨｕｈ−７セルベースアッセイで評価された５７６のオリゴヌクレオチドのうち、ＰＣＳＫ９レベル低下能に基づき、特に活性な９６のオリゴヌクレオチドをヒットとして選択し、２次スクリーニングに付した（図２Ａ及び２Ｂ）。
この２次スクリーニングにおいて、１次スクリーニングと同じアッセイを用いたが、２つの異なる濃度０．１ｎＭ及び１ｎＭで候補オリゴヌクレオチドを試験した（図２Ａ及び２Ｂ）。標的ｍＲＮＡレベルは、一般的に、すべての試料で安定した発現基準を提供するハウスキーピング遺伝子のスプライシング因子であるアルギニン／セリンリッチ９（ＳＦＲＳ９）基づいて標準化され、図２Ａ及び２Ｂに示すｍＲＮＡ率を生成する。図２Ａ及び２Ｂそれぞれで試験したオリゴヌクレオチドは、ｍｏｃｋトランスフェクション対照と比較して示す。９６のオリゴヌクレオチドはすべて、Ｍ１で示される同じ修飾パターンを有し、このパターンはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを兼ね備える。試験する９６のオリゴヌクレオチドの配列を表３に示す。
【００８０】
【表３】
2021521796.tif 000005
センス及びアンチセンスの配列番号列は、ハイブリダイズして各オリゴヌクレオチドを産生するセンス鎖及びそれぞれのアンチセンス鎖を相対的順序で示す。例えば、配列番号３５のセンス鎖は配列番号４８８のアンチセンス鎖とハイブリダイズする。試験する各オリゴヌクレオチドは同じ修飾パターンを有する。
【００８１】
この段階で、試験によって最も強力な配列を選択し、更に分析した。この選択された配列をニックが入ったテトラループ結合体構造の形式（２２マーのガイド鎖を有する３６マーのパッセンジャー鎖）に変換した。一般的なテトラループ結合体構造については図３を参照のこと。４つのＧａｌＮＡｃ部分をセンス鎖におけるテトラループのヌクレオチドに結合させた。この結合はクリックリンカーを用いて実施した。使用するＧａｌＮＡｃを以下に示した。
【化１】
2021521796.tif 000006
Ｎ−アセチル−ｂ−Ｄ−ガラクトサミン（ＣＡＳ番号：１４１３１−６０−３）
その後、これらのオリゴヌクレオチドを前述の通りに試験した。生体外でＨｕｈ−７細胞を用い、生体内でマウスＨＤＩモデルを用いて、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ発現低下能について２つの濃度で各オリゴヌクレオチドを評価した。
【００８２】
生体内マウススクリーニング及び生体外ヒト細胞株スクリーニング
マウス肝細胞においてＰＣＳＫ９の発現を低下させる活性を維持しながら、送達特性を向上させるテトラループ及び修飾パターンを特定するため、上記生体外実験のデータを評価した。図４に示すように、幅広い修飾を有する１２のヒトＰＣＳＫ９テトラループ結合体を３ｍｇ／ｋｇの濃度でマウスに皮下投与した。テトラループ結合体を動物に皮下投与した後、３日目に尾静脈（静脈内）注射により動物１匹あたりＰＢＳに懸濁した２ｍｌのヒトＰＣＳＫ９プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＰＣＳＫ９、合計１６μｇ）を投与した。マウスを投与後４日目に安楽死させた。肝臓試料を得、ＲＮＡを抽出してＲＴ−ｑＰＣＲによりＰＣＳＫ９ｍＲＮＡレベルを評価した。ＰＢＳ対照ｍＲＮＡと比較し、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ率をこれらの測定値に基づき決定した。
更なるテトラループ配列をヒトＨｕｈ−７細胞において２つの異なる濃度で試験した（テトラループ形成物で０．０３ｎＭ及び０．１ｎＭ；「フェーズＴ２」と呼ぶ）（図５Ａ）。試験する４０のテトラループオリゴヌクレオチドから（図５Ａに示す）、２１の異なる塩基配列を選択し、さらなる生体内試験のため、５’−ＭＯＰ／ＧａｌＮＡｃ結合体とした（図５Ｂ及び５Ｃ）。ヒトＰＣＳＫ９の発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＰＣＳＫ９、合計１６μｇ）のハイドロダイナミックインジェクション（ＨＤＩ）により、ヒトＰＣＳＫ９ｍＲＮＡを一時的に発現するＣＤ−１マウスにＰＣＳＫ９オリゴヌクレオチドを皮下投与した。投与後４日目にマウスを安楽死させた。肝臓試料を得、ＲＮＡを抽出してＲＴ−ｑＰＣＲによりＰＣＳＫ９ｍＲＮＡレベルを評価した。ＰＢＳ対照ｍＲＮＡと比較して、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ率をこれらの測定値に基づき決定した。図５Ｂ〜５Ｃに示すように、異なる濃度（１ｍｇ／ｋｇ及び２ｍｇ／ｋｇ）を候補分子に用いた。センス配列の配列番号１１８２及びアンチセンス配列の配列番号１２２２の候補は図５Ｂ及び図５Ｃからわかる。
異なる修飾パターンを有する３つの異なるＰＣＳＫ９テトラループ結合体を用いて、３つの異なる濃度（０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇ）で、上記のマウスＨＤＩモデルにおいて特定のＰＣＳＫ９オリゴヌクレオチドの更なる試験を実施した。結果を図６Ａ及び６Ｂに示す。
【００８３】
生体内非ヒト霊長類スクリーニング
更なる研究を実施して、非ヒト霊長類においてテトラループ結合体を用いてＰＣＳＫ９ｍＲＮＡのＫＤを評価した。カニクイザル（１群当たりｎ＝４）に単回投与で３又は６ｍｇ／ｋｇを皮下投与した。臨床的観察を毎日記録し、血液試料を投与前に３回、３６日まで１週間に２回、９０日まで１週間に１回採取した。血清試料を標準ＬＦＴパネル（ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、及びＧＧＴ）、並びにＬＤＬ−ｃ、ＨＤＬ−ｃ、トータルコレステロール、及びＴＧについて分析した。３組の配列（センス及びアンチセンス）：Ｓ１２６６−ＡＳ１２６９、Ｓ１２６７−ＡＳ１２７０、及びＳ１２６８−ＡＳ１２７１を試験し、結果を図７Ａ〜７Ｃに示す。３組の配列は、すべて投与前レベルと比較して、ＰＣＳＫ９の血漿レベルを低下させることができた。
【００８４】
材料及び方法
トランスフェクション
最初のスクリーニングについて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（登録商標）を用いて、効率的なトランスフェクションのためにオリゴヌクレオチドを複合させた。オリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉＭＡＸ及びＯｐｔｉ−ＭＥＭを室温で２０分間共にインキュベーションした後、トランスフェクション前に、プレート１ウェル当たりこの混合物を５０μＬ添加した。活発に継代培養している細胞のフラスコから培地を吸引し、細胞をトリプシンの存在下、３７℃で３〜５分間インキュベーションした。細胞がフラスコに付着しなくなった後、（ペニシリン及びストレプトマイシンを含まない）細胞増殖培地を添加して、トリプシンを中和し、細胞を懸濁させた。１０μＬアリコートを取り、細胞を血球計で数えて、細胞を１ミリリットル単位で計量した。９６ウェルトランスフェクションプレートに希釈した細胞懸濁液を添加した。オリゴヌクレオチドはすでにプレート中のＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に含有されている。その後、トランスフェクションプレートを２４時間３７℃でインキュベーションした。インキュベーションを２４時間行った後、各ウェルから培地を吸引した。
その後のスクリーニング及び実験、例えば２次スクリーニングのため、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸを用いて、リバーストランスフェクションのためにオリゴヌクレオチドを複合させた。ＯｐｔｉＭＥＭ培地でＲＮＡｉＭＡＸ及びｓｉＲＮＡを１５分間混合することにより複合体を作製した。トランスフェクション混合物をマルチウェルプレートに移し、細胞懸濁液をウェルに添加した。インキュベーションを２４時間行った後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、その後上記のように処理した。
【００８５】
ハイドロダイナミックインジェクション（ＨＤＩ）
ＣＤ−１雌マウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。すべてのマウスをＤｉｃｅｒｎａ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＡＡＬＡＣ及びＩＡＣＵＣ認証動物施設で管理した。動物を適当な数の試験群に分割し、その群に割り当てられた試験物を投与した。動物にＰＣＳＫテトラループ結合体を皮下投与した。テトラループ結合体の皮下投与後３日で、尾静脈への静脈注射により、動物１匹当たりＰＢＳで懸濁した２ｍｌのｈＰＣＳＫ９プラスミドを動物に投与した。ＣＯ2窒息により４日目にマウスを犠牲にし、肝組織を採取した。２つの４ｍｍパンチ生検を行うことにより肝組織を採取し、メーカーのプロトコールに従ってＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、ｑ−ＲＴ  ＰＣＲを行った。ヒトＰＣＳＫ９（ＮＭ＿１７４９３６．３）遺伝子（ｈＰＣＳＫ９）をコードするｐｃＤＮＡ３．１−ｈＰＣＳＫ９プラスミドをＧｅｎｅｗｉｚにより合成した。
【００８６】
ｃＤＮＡ合成
バイオラッドのｉＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ｑＰＣＲ試料調製緩衝液を用いて、細胞を５分間溶解した。その後、すべてのＲＮＡを含有する上清を−８０℃で保管するか、又はＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、１０マイクロリットルで反応させ、逆転写を行った。その後、ｃＤＮＡをヌクレアーゼフリー水で５０μＬに希釈し、マルチプレックスの５’−エンドヌクレアーゼアッセイ及びＳＳｏＦａｓｔ  ｑＰＣＲマスターミックス（バイオラッドラボラトリーズ）を用いた定量ＰＣＲに使用した。
【００８７】
ｑＰＣＲアッセイ
各標的について、ｍＲＮＡレベルを２つの５’ヌクレアーゼアッセイにより計量した。一般に、いくつかのアッセイで各標的についてスクリーニングした。選択される２つのアッセイは、優れた効率、検出下限、及び目的の遺伝子（ＧＯＩ）の広い５’→３’範囲を兼ね備えていた。異なる蛍光色素分子をそれぞれのプローブで用いると、１つのＧＯＩに対して、両方のアッセイを１つの反応で同時に行うことができた。従って、同じｑＰＣＲで同時に行うか、又は「マルチプレックス」で行う場合、アッセイバリデーションにおける最後の工程で、選択されたアッセイの効率を決定することができた。
両方のアッセイのための線状化プラスミドを１０倍希釈物で組み合わせ、ｑＰＣＲを実施した。各アッセイの効率は上記のように決定した。効率は９０〜１１０％で認められた。
線状化プラスミド標準を用いてマルチプレックス反応を評価しながら、テンプレートとしてｃＤＮＡを用い、目的の標的のＣq値も評価した。この場合、ｃＤＮＡは非形質導入細胞からＣｏｒｂｅｔｔ（水中約５ｎｇ／μｌ）で単離されたＲＮＡ由来であった。このように、この試料ｃＤＮＡで観察されたＣq値は、９６ウェルプレートのトランスフェクションで予測されたＣq値を表すものであった。Ｃq値が３０より大きい場合、目的の遺伝子の発現レベルがより高い他の細胞株を探索した。各ヒト及びマウス系からＣｏｒｂｅｔｔでハイスループット法により単離したすべてのＲＮＡのライブラリを生成し、許容できる標的発現レベルに関してスクリーニングするのに用いた。
【００８８】
オリゴヌクレオチド命名の説明
本明細書に記載されるすべてのオリゴヌクレオチドは、ＳＮ1−ＡＳＮ2−ＭＮ3で示される。以下の名称では、
・Ｎ1：センス鎖配列の配列識別子番号
・Ｎ2：アンチセンス鎖配列の配列識別子番号
・Ｎ3：修飾パターンの参照番号であり、各番号がオリゴヌクレオチドにおける修飾ヌクレオチドのパターンを表す
が適用される。例えば、Ｓ１−ＡＳ４５４−Ｍ１は配列番号１に示されるセンス配列、配列番号４５４に示されるアンチセンス配列を有するオリゴヌクレオチドを表し、Ｍ１の修飾パターンを有する。
【００８９】
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【表４−１１】
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【表４−１２】
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【表４−１３】
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【表４−１４】
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【表４−１５】
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【表４−１６】
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【表４−１７】
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【表４−１８】
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【表４−１９】
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【表４−２０】
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【表４−２１】
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【表４−２２】
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【表４−２３】
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【表４−２４】
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【表４−２５】
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【表４−２６】
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【表４−２７】
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【表４−２８】
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【表４−２９】
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【表４−３０】
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【表４−３１】
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【表４−３２】
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【００９０】
本明細書に例として記載する開示は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素又は複数の要素、限定又は複数の限定が無い限り、好適に実施することができる。従って、例えば本明細書の各例において、「含む」、「本質的にからなる」及び「からなる」という用語のいずれかは、他の２つの用語のいずれかで置き換えることができる。使用されている用語及び表現は、説明のために用いられ、限定するものではない。記載される特徴の任意の均等物又はそれらの一部を除外する用語及び表現を使用することは意図していないが、様々な修飾がクレームされる発明の範囲内で可能であることが認識される。従って、本発明は好ましい実施形態により具体的に開示されているが、本明細書で開示される任意の特徴、修飾及び概念の変化は当業者によるものであること、このような修飾及び変化は明細書や添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
また、本発明の特徴又は態様がマーカッシュ群又は代替の他の群の観点から記載される場合、当業者は、本発明がマーカッシュ群又は他の群における任意の個別の要素又は要素の下位群の観点から記載されることを認識するであろう。
いくつかの実施形態において、配列表の配列はオリゴヌクレオチド又は他の核酸の構造を記載する際に参照することができることが理解されるであろう。このような実施形態において、実際のオリゴヌクレオチド又は他の核酸は、特定の配列と本質的に同じ又は類似の相補的性質を保持しながら、特定の配列と比較して、１つ又は複数の別のヌクレオチド（例えば、ＤＮＡヌクレオチドのＲＮＡ対応物又はＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡ対応物）、及び／或いは１つ又は複数の修飾ヌクレオチド、及び／或いは１つ又は複数の修飾ヌクレオチド間結合、及び／或いは１つ又は複数の他の修飾を有してよい。
本発明を記載する文脈（特に以下のクレームの文脈）における「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語並びに類似の指示対象の使用は、他に本明細書で指示がない限り、又は文脈により明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を含むように解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は他に明記されない限り、オープンな用語（つまり、「含むが限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書の値の範囲の記載は、本明細書で他に指示されない限り、範囲内の各別々の値を個別に言及する省略表現法とすることを単に意図しており、各別々の値はそれが本明細書に個別に列挙されたかのように、本明細書に組み込まれる。ここに記載されるすべての方法は、他に本明細書で指示がない限り、又は文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。ここで挙げられるいずれか及びすべての例、又は例示的な用語（例えば、「など」）の使用は、他で主張されない限り、本発明を単に更に明らかにすることを意図しており、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書の用語は、本発明を実施するのに必須である任意の非クレーム要素を指すものとして解釈されるべきではない。
本発明の実施形態は本明細書に記載される。これらの実施形態の変更は、前述の記載により当業者に明らかになる。
【００９１】
本発明者は当業者が必要に応じて上記変更を行うことを考えており、本発明者は本発明が本明細書に具体的に記載されている以外に実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法令により認められる通り、ここに添付される特許請求の範囲に記載される対象のすべての修飾及び均等物を含む。更に、すべての可能性のある変更における上記要素の任意の組合せは、他に本明細書で指示がない限り、又は文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。当業者は通常の実験を用い、本明細書に記載される発明の特定の実施形態における多くの均等物を認識し、又は解明することができる。このような均等物は以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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