(57)【要約】  環状RNAを遺伝子工学で作り変えるための方法および構築物が開示される。環状RNAを作製するためのベクターが開示され、該ベクターは、互いに操作可能に連結され以下の順序で整列される以下の要素：a.)5'相同性アーム、b.)3'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む3'グループIイントロン断片、c.)任意に5'スペーサー配列、d.)タンパク質コーディングまたはノンコーディング領域、e.)任意に3'スペーサー配列、f.)5'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む5'グループIイントロン断片およびg.)3'相同性アームを含み、該ベクターは、真核細胞内で翻訳可能であるまたは生物学的に活性である環状RNAの産生を可能にする。別の態様において、該ベクターは、3'スペーサー配列ではなく5'スペーサー配列を含み得る。さらに別の態様において、該ベクターは、5'スペーサー配列ではなく3'スペーサー配列を含み得る。該ベクターにより産生される環状RNAを精製する方法および該ベクターにより産生される環状RNAにおけるヌクレオシド改変の使用も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに操作可能に連結され、以下の順序で整列される以下の要素：
a)5'相同性アーム、
b)3'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む3'群Iイントロン断片、
c)5'スペーサー配列、
d)内部リボソーム進入部位(IRES)、
e)タンパク質コーディング領域またはノンコーディング領域、
f)3'スペーサー配列、
g)5'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む5'群Iイントロン断片、および
h)3'相同性アーム
を含み、
真核細胞内で翻訳可能であるまたは生物学的に活性である環状RNAの産生を可能にする、環状RNAを作製するためのベクター。
【請求項２】
3'群Iイントロン断片および5'群Iイントロン断片が、シアノバクテリウム アナベナ(Cyanobacterium Anabaena)種プレtRNA-Leu遺伝子またはT4ファージTd遺伝子由来である、請求項１記載のベクター。
【請求項３】
3'群Iイントロン断片および5'群Iイントロン断片がシアノバクテリウム アナベナ種プレtRNA-Leu遺伝子由来である、請求項２記載のベクター。
【請求項４】
3'群Iイントロン断片および5'群Iイントロン断片がT4ファージTd遺伝子由来である、請求項２記載のベクター。
【請求項５】
IRESが、タウラ症候群ウイルス、サシガメ(Triatoma)ウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルス、シミアンウイルス40、ヒアリ(Solenopsis invicta)ウイルス1、ムギクビレアブラムシウイルス、細網内皮症ウイルス、ヒト(fuman)ポリオウイルス1、チャバネアオカメムシ腸管ウイルス、カシミールハチウイルス、ヒトライノウイルス2、ヒメヨコバイ(Homalodisca coagulata)ウイルス-1、ヒト免疫不全ウイルス1型、ヒメヨコバイウイルス-1、ヒメトビPウイルス(Himetobi P virus)、C型肝炎ウイルス、A型肝炎ウイルス、GB型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、ヒトエンテロウイルス71、ウマ鼻炎ウイルス(Equine rhinitis virus)、ウスジロエダシャク(Ectropis obliqua)ピコルナ様ウイルス、脳心筋炎ウイルス(EMCV)、ショウジョウバエCウイルス、アブラナ科トバモ(Crucifer tobamo)ウイルス、クリケット麻痺(Cricket paralysis)ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス1、黒色女王蜂児ウイルス、アブラムシ致死性麻痺ウイルス(Aphid lethal paralysis virus)、トリ脳脊髄炎ウイルス、急性麻痺ウイルス、ハイビスカス退緑輪点ウイルス(Hibiscus chlorotic ringspot virus)、古典的ブタ熱ウイルス、ヒトFGF2、ヒトSFTPAl、ヒトAMLl/RUNXl、ショウジョウバエアンテナペディア(antennapedia)、ヒトAQP4、ヒトAT1R、ヒトBAG-1、ヒトBCL2、ヒトBiP、ヒトc-IAPl、ヒトc-myc、ヒトeIF4G、マウスNDST4L、ヒトLEF1、マウスHIF1α、ヒトn.myc、マウスGtx、ヒトp27kipl、ヒトPDGF2/c-sis、ヒトp53、ヒトPim-1、マウスRbm3、ショウジョウバエリーパー(reaper)、イヌスカンパー(Scamper)、ショウジョウバエUbx、サリウイルス(Salivirus)、コサウイルス(Cosavirus)、パレコウイルス、ヒトUNR、マウスUtrA、ヒトVEGF-A、ヒトXIAP、ショウジョウバエヘアレス(hairless)、酵母(S. cerevisiae)TFIID、酵母YAP1、ヒトc-src、ヒトFGF-1、サルピコマウイルス(picomavirus)、カブクリンクルウイルス(Turnip crinkle virus)、eIF4Gに対するアプタマー、コクサッキーウイルスB3(CVB3)またはコクサッキーウイルスA(CVB1/2)のIRES配列から選択される、請求項１記載のベクター。
【請求項６】
IRESが、コクサッキーウイルスB3(CVB3)由来のIRES配列である、請求項１記載のベクター。
【請求項７】
IRESが、脳心筋炎ウイルス(EMCV)由来のIRES配列である、請求項１記載のベクター。
【請求項８】
タンパク質コーディング領域またはノンコーディング領域が、真核生物タンパク質または原核生物タンパク質をコードするタンパク質コーディング領域である、請求項１記載のベクター。
【請求項９】
タンパク質コーディング領域またはノンコーディング領域が、ヒトタンパク質または非ヒトタンパク質をコードするタンパク質コーディング領域である、請求項１記載のベクター。
【請求項１０】
タンパク質コーディング領域が抗体をコードする、請求項８または９記載のベクター。
【請求項１１】
ヒトタンパク質または非ヒトタンパク質が、hFIX、SP-B、VEGF-A、ヒトメチルマロニル-CoAムターゼ(hMUT)、CFTR、癌自己抗原、および遺伝子編集酵素様Cpf1、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)および転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)から選択される、請求項９記載のベクター。
【請求項１２】
タンパク質が治療用途のためのタンパク質である、請求項８〜１１いずれか記載のベクター。
【請求項１３】
抗体がヒト抗HIV抗体である、請求項１０記載のベクター。
【請求項１４】
抗体が二重特異性抗体である、請求項１０記載のベクター。
【請求項１５】
二重特異性抗体が、CD3およびCLDN6に結合するかまたはCD19およびCD22に結合する、請求項１４記載のベクター。
【請求項１６】
タンパク質が診断用途のためのタンパク質である、請求項９記載のベクター。
【請求項１７】
タンパク質コーディング領域が、ガウシアルシフェラーゼ(Gluc)、ホタルルシフェラーゼ(Fluc)、高感度(enhanced)緑色蛍光タンパク質(eGFP)、ヒトエリスロポイエチン(hEPO)またはCas9エンドヌクレアーゼをコードする、請求項９記載のベクター。
【請求項１８】
各相同性アームが約5〜50ヌクレオチド長である、請求項１記載のベクター。
【請求項１９】
各相同性アームが約9〜19ヌクレオチド長である、請求項１記載のベクター。
【請求項２０】
各スペーサー配列が少なくとも10ヌクレオチド長である、請求項１記載のベクター。
【請求項２１】
各スペーサー配列が少なくとも15ヌクレオチド長である、請求項１記載のベクター。
【請求項２２】
各スペーサー配列が少なくとも30 ヌクレオチド長である、請求項１記載のベクター。
【請求項２３】
少なくとも1つのスペーサー配列がポリA配列である、請求項１記載のベクター。
【請求項２４】
少なくとも1つのスペーサー配列がポリA-C配列である、請求項１記載のベクター。
【請求項２５】
5'相同性アームの上流に配置されるRNAポリメラーゼプロモーターをさらに含む、請求項１記載のベクター。
【請求項２６】
RNAポリメラーゼプロモーターが、T7ウイルス、T6ウイルス、SP6ウイルス、T3ウイルスまたはT4ウイルス由来のRNAポリメラーゼプロモーターである、請求項１記載のベクター。
【請求項２７】
ベクターが、約500〜約10,000ntの範囲のサイズを有する環状RNAを転写するために使用される、請求項１記載のベクター。
【請求項２８】
IRESがコクサッキーウイルスB3(CVB3)IRESであり、コーディング領域がガウシアルシフェラーゼ(Gluc)をコードし、スペーサー配列がポリA-Cである、請求項１記載のベクター。
【請求項２９】
3'イントロン断片が、3'スプライシング部位ジヌクレオチドおよび任意に隣接する天然のエキソンに対応する配列を含む3'-近位群Iイントロン由来配列を含み、5'イントロン断片が、5'スプライシング部位ジヌクレオチドおよび任意に隣接するエキソンに対応する配列を含む5'-近位群Iイントロン由来配列を含む、請求項１記載のベクター。
【請求項３０】
請求項１記載のベクターにより産生される環状RNA。
【請求項３１】
少なくとも約1kbである、請求項３０記載の環状RNA。
【請求項３２】
請求項３０記載の環状RNAを細胞にトランスフェクトする工程を含む、細胞中でタンパク質を発現させる方法。
【請求項３３】
環状RNAが、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを使用して細胞にトランスフェクトされる、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
環状RNAがナノ担体を使用して細胞にトランスフェクトされる、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
ナノ担体が脂質、ポリマーまたは脂質-ポリマーハイブリッドである、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
環状RNAがコクサッキーウイルスB3 IRESを含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３７】
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)系において、環状RNAを、トリス-EDTAまたはクエン酸バッファ中のサイズ排除カラムを通して進ませる工程を含む、請求項３１記載の環状RNAを精製する方法。
【請求項３８】
RNAが、約0.01〜5mL/分の流速、約4〜7の範囲のpHでトリス-EDTAまたはクエン酸バッファ中のサイズ排除カラムを通して進む、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
互いに操作可能に連結され、以下の順序で整列される以下の要素：
a)5'相同性アーム、
b.)3'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む3'群Iイントロン断片、
c.)5'スペーサー配列、
d.)内部リボソーム進入部位(IRES)、
e.)タンパク質コーディング領域またはノンコーディング領域、
f.)5'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む5'群Iイントロン断片、および
g.)3'相同性アーム
を含み、
真核細胞内で翻訳可能である環状RNAの産生を可能にする、環状RNAを作製するためのベクター。
【請求項４０】
互いに操作可能に連結され、以下の順序で整列される以下の要素：
a.)5'相同性アーム、
b.)3'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む3'群Iイントロン断片、
c.)内部リボソーム進入部位(IRES)、
d.)タンパク質コーディング領域またはノンコーディング領域、
e.)3'スペーサー配列、
f.)5'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む5'群Iイントロン断片、および
g.)3'相同性アーム
を含み、
真核細胞内で翻訳可能である環状RNAの産生を可能にする、環状RNAを作製するためのベクター。
【請求項４１】
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)系において、環状RNAをトリス-EDTAまたはクエン酸バッファ中のサイズ排除カラムを通して進ませる工程、および該環状RNAをサイズ排除カラムを通して進ませた後に、該環状RNAをホスファターゼで処理し、それにより精製された環状RNAを産生する工程を含む、環状RNAを精製する方法。
【請求項４２】
ホスファターゼ処理の後にRNase R処理が続く、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
精製された環状RNAがナノ粒子に製剤化される、請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
環状RNAを約4〜8の範囲のpHでサイズ排除カラムを通して進ませる、請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
環状RNAを約0.01〜5.0mL/分の流速でサイズ排除カラムを通して進ませる、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
互いに操作可能に連結され、以下の順序で整列される以下の要素：
a)5'相同性アーム、
b)3'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む3'群Iイントロン断片、
c)5'スペーサー配列、
d)タンパク質コーディング領域またはノンコーディング領域、
e)3'スペーサー配列、
f)5'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む5'群Iイントロン断片、および
g)3'相同性アーム
を含むベクターから転写される前駆RNAから環状RNAを作製する方法であって、
RNA環状化が起こる温度でマグネシウムイオンおよびグアノシン(quanosine)ヌクレオチドまたはヌクレオシドの存在下で該前駆RNAをインキュベートする工程を含む、方法。
【請求項４７】
ベクターが、5'スペーサー配列とタンパク質コーディング領域の間に内部リボソーム進入部位(IRES)をさらに含む、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
前駆RNAのヌクレオシドが未改変である、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
前駆RNAが少なくとも1つのヌクレオシド改変を含む、請求項４６記載の方法。
【請求項５０】
前駆RNAのヌクレオシドの100%までが改変される、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも1つのヌクレオシド改変がウリジン改変またはアデノシン改変である、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
少なくとも1つのヌクレオシド改変が、N6-メチルアデノシン(m6A)、プソイドウリジン(Ψ)、N1-メチルプソイドウリジン(m1Ψ)および5-メトキシウリジン(5moU)から選択される、請求項４９記載の方法。
【請求項５３】
前駆RNAが、メチルプソイドウリジン(m1Ψ)で改変される、請求項４９記載の方法。
【請求項５４】
請求項４９記載の方法により産生される環状RNA。
【請求項５５】
請求項５４記載の環状RNAを細胞にトランスフェクトする工程を含む、細胞においてタンパク質を発現させる方法。
【請求項５６】
人工ヌクレオシドを、前駆RNAをコードするベクターの転写の際に前駆RNAに組み込む工程、および該前駆RNAを環状化して環状RNAを形成する工程を含む、高められた翻訳効率を有する環状RNAを作製する方法。
【請求項５７】
人工ヌクレオシドを、前駆RNAをコードするベクターの転写の際に前駆RNAに組み込む工程、および該前駆RNAを環状化して環状RNAを形成する工程を含む、高められたタンパク質発現安定性を有する環状RNAを作製する方法。
【請求項５８】
人工ヌクレオシドを、前駆RNAをコードするベクターの転写の際に前駆RNAに組み込む工程、および該前駆RNAを環状化して環状RNAを形成する工程を含む、低減された免疫原性を有する環状RNAを作製する方法。
【請求項５９】
人工ヌクレオシドが、少なくとも1つの改変されたウリジンまたはアデノシンヌクレオシドを含む、請求項５６〜５８記載の方法。
【請求項６０】
類似のヌクレオチド三リン酸に対して過剰濃度のヌクレオチド一リン酸を使用して、スプリント(splint)ライゲーション前駆RNAを合成する工程を含む、環状RNAを作製する方法。
【請求項６１】
ヌクレオチドがグアノシン一リン酸である、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
互いに操作可能に連結され、以下の順序で整列される以下の要素：
a)5'相同性アーム、
b)3'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む3'群Iイントロン断片、
c)任意の5'スペーサー配列、
d)任意の内部リボソーム進入部位(IRES)、
e)タンパク質コーディング領域またはノンコーディング領域、
f)任意の3'スペーサー配列、
g)5'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む5'群Iイントロン断片、および
h)3'相同性アーム
を含み、
真核細胞内で翻訳可能である環状RNAの産生を可能にする、環状RNAを作製するためのベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、2019年5月22日に出願された米国仮特許出願第62/851,548号、2019年1月10日に出願された米国仮特許出願第62/791,028号および2018年6月6日に出願された米国仮特許出願第62/681,617号の利益を主張する。上記出願の全教示は、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
ASCIIテキストファイルにおける資料の参照による援用
本願は、本願と同時に提出される以下のASCIIテキストファイル
a)ファイル名：00502311003_FinalSequenceListing.txt；2019年6月4日に作成され、55KBのサイズ
に含まれる配列表を参照により援用する。
【０００３】
政府支援
本発明は、国防高等研究計画局のW32P4Q-13-1-0011および国立衛生研究所の5R01HL125428の下、政府支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
背景
メッセンジャーRNA(mRNA)は、ある範囲の治療的および工学的用途に広い可能性を有する。しかしながら、その使用についての1つの基本的な制限は、生物学系における比較的短いその半減期である。したがって、全長RNAメッセージからのタンパク質発現の持続時間を延長する必要性がある。
【発明の概要】
【０００５】
概要
ある局面において、環状RNA(circRNA)を作製するためのベクターが本明細書において提供される。
【０００６】
いくつかの態様において、該ベクターは、互いに操作可能に連結される以下の要素を含み、いくつかの態様において、以下の順序：a.)5'相同性アーム、b.)3'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む3'群Iイントロン断片、c.)タンパク質コーディングまたはノンコーディング領域、d.)5'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む5'群Iイントロン断片、およびe.)3'相同性アームで整列される。ある態様において、該ベクターは、真核細胞内で翻訳可能であるおよび/または生物学的に活性である環状RNAの産生を可能にする。いくつかの態様において、生物学的に活性なRNAは、例えばmiRNAスポンジまたは長いノンコーディングRNAである。
【０００７】
いくつかの態様において、該ベクターは、互いに操作可能に連結され、以下の順序で整列される以下の要素：a.)5'相同性アーム、b.)3'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む3'群Iイントロン断片、c.)任意に5'スペーサー配列、d.)任意に内部リボソーム進入部位(IRES)、e.)タンパク質コーディングまたはノンコーディング領域、f.)任意に3'スペーサー配列、g.)5'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む5'群Iイントロン断片、およびh.)3'相同性アームを含む。ある態様において、該ベクターは、真核細胞内で翻訳可能であるおよび/または生物学的に活性である環状RNAの産生を可能にする。
【０００８】
いくつかの態様において、該ベクターは、互いに操作可能に連結され、以下の順序で整列される以下の要素：a.)5'相同性アーム、b.)3'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む3'群Iイントロン断片、c.)5'スペーサー配列、d.)内部リボソーム進入部位(IRES)、e.)タンパク質コーディングまたはノンコーディング領域、f.)5'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む5'群Iイントロン断片、およびg.)3'相同性アームを含む。いくつかの態様において、該ベクターは、真核細胞内で翻訳可能であるおよび/または生物学的に活性である環状RNAの産生を可能にする。
【０００９】
いくつかの態様において、該ベクターは、互いに操作可能に連結され、以下の順序で整列される以下の要素：a.)5'相同性アーム、b.)3'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む3'群Iイントロン断片、c.)5'スペーサー配列、d.)タンパク質コーディングまたはノンコーディング領域、e.)3'スペーサー配列、f.)5'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む5'群Iイントロン断片、およびg.)3'相同性アームを含む。いくつかの態様において、該ベクターは、真核細胞内で翻訳可能であるおよび/または生物学的に活性である環状RNAの産生を可能にする。
【００１０】
いくつかの態様において、該ベクターは、互いに操作可能に連結され、以下の順序で整列される以下の要素：a.)5'相同性アーム、b.)3'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む3'群Iイントロン断片、c.)内部リボソーム進入部位(IRES)、d.)タンパク質コーディングまたはノンコーディング領域、e.)3'スペーサー配列、f.)5'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む5'群Iイントロン断片、およびg.)3'相同性アームを含む。いくつかの態様において、該ベクターは、真核細胞内で翻訳可能であるおよび/または生物学的に活性である環状RNAの産生を可能にする。
【００１１】
いくつかの態様において、該ベクターは、互いに操作可能に連結され、以下の順序で整列される以下の要素：a.)5'相同性アーム、b.)3'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む3'群Iイントロン断片、c.)タンパク質コーディングまたはノンコーディング領域、d.)3'スペーサー配列、e.)5'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む5'群Iイントロン断片、およびf.)3'相同性アームを含む。いくつかの態様において、該ベクターは、真核細胞内で翻訳可能であるおよび/または生物学的に活性である環状RNAの産生を可能にする。
【００１２】
いくつかの態様において、該ベクターは、互いに操作可能に連結され、以下の順序で整列される以下の要素：a.)5'相同性アーム、b.)3'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む3'群Iイントロン断片、c.)5'スペーサー配列、d.)タンパク質コーディングまたはノンコーディング領域、e.)5'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む5'群Iイントロン断片、およびf.)3'相同性アームを含む。いくつかの態様において、該ベクターは、真核細胞内で翻訳可能であるおよび/または生物学的に活性である環状RNAの産生を可能にする。
【００１３】
いくつかの態様において、該ベクターは、互いに操作可能に連結され、以下の順序で整列される以下の要素：a.)5'相同性アーム、b.)3'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む3'群Iイントロン断片、c.)内部リボソーム進入部位(IRES)、d.)タンパク質コーディングまたはノンコーディング領域、e.)5'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む5'群Iイントロン断片、およびf.)3'相同性アームを含む。いくつかの態様において、該ベクターは、真核細胞内で翻訳可能であるおよび/または生物学的に活性である環状RNAの産生を可能にする。
【００１４】
いくつかの態様において、該ベクターは、互いに操作可能に連結され、以下の順序で整列される以下の要素：a.)5'相同性アーム、b.)3'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む3'群Iイントロン断片、c.)5'スペーサー配列、d.)内部リボソーム進入部位(IRES)、e.)タンパク質コーディングまたはノンコーディング領域、f.)3'スペーサー配列、g.)5'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む5'群Iイントロン断片、およびg.)3'相同性アームを含む。いくつかの態様において、該ベクターは、真核細胞内で翻訳可能であるおよび/または生物学的に活性である環状RNAの産生を可能にする。
【００１５】
一態様において、3'群Iイントロン断片および/または5'群Iイントロン断片は、シアノバクテリウム アナベナ(Cyanobacterium Anabaena)種プレtRNA-Leu遺伝子またはT4ファージTd遺伝子由来である。
【００１６】
一態様において、3'群Iイントロン断片および/または5'群Iイントロン断片は、シアノバクテリウム アナベナ種プレtRNA-Leu遺伝子由来である。
【００１７】
別の態様において、存在する場合、IRES配列は、タウラ症候群ウイルス、サシガメ(Triatoma)ウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルス、シミアンウイルス40、ヒアリ(Solenopsis invicta)ウイルス1、ムギクビレアブラムシウイルス、細網内皮症ウイルス、ヒト(fuman)ポリオウイルス1、チャバネアオカメムシ腸管ウイルス、カシミールハチウイルス、ヒトライノウイルス2、ヒメヨコバイ(Homalodisca coagulata)ウイルス-1、ヒト免疫不全ウイルス1型、ヒメヨコバイウイルス-1、ヒメトビPウイルス(Himetobi P virus)、C型肝炎ウイルス、A型肝炎ウイルス、GB型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、ヒトエンテロウイルス71、ウマ鼻炎ウイルス(Equine rhinitis virus)、チャシャクガピコルナ様ウイルス、脳心筋炎ウイルス(EMCV)、ショウジョウバエCウイルス、アブラナ科トバモ(Crucifer tobamo)ウイルス、クリケット麻痺(Cricket paralysis)ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス1、黒色女王蜂児ウイルス、アブラムシ致死性麻痺ウイルス(Aphid lethal paralysis virus)、トリ脳脊髄炎ウイルス、急性麻痺ウイルス、ハイビスカス退緑輪点ウイルス(Hibiscus chlorotic ringspot virus)、古典的ブタ熱ウイルス、ヒトFGF2、ヒトSFTPAl、ヒトAMLl/RUNXl、ショウジョウバエアンテナペディア(antennapedia)、ヒトAQP4、ヒトAT1R、ヒトBAG-1、ヒトBCL2、ヒトBiP、ヒトc-IAPl、ヒトc-myc、ヒトeIF4G、マウスNDST4L、ヒトLEF1、マウスHIF1α、ヒトn.myc、マウスGtx、ヒトp27kipl、ヒトPDGF2/c-sis、ヒトp53、ヒトPim-1、マウスRbm3、ショウジョウバエリーパー(reaper)、イヌスカンパー(Scamper)、ショウジョウバエUbx、ヒトUNR、マウスUtrA、ヒトVEGF-A、ヒトXIAP、サリウイルス(Salivirus)、コサウイルス、パレコウイルス、ショウジョウバエヘアレス(hairless)、酵母(S. cerevisiae)TFIID、酵母YAP1、ヒトc-src、ヒトFGF-1、サルピコマウイルス(picomavirus)、カブクリンクルウイルス(Turnip crinkle virus)、eIF4Gに対するアプタマー、コクサッキーウイルスB3(CVB3)またはコクサッキーウイルスA(CVB1/2)のIRES配列である。さらに別の態様において、IRESは、コクサッキーウイルスB3(CVB3)のIRES配列である。さらなる態様において、IRESは脳心筋炎ウイルスのIRES配列である。
【００１８】
一態様において、タンパク質コーディング領域は、真核生物または原核生物起源のタンパク質をコードする。別の態様において、タンパク質コーディング領域は、ヒトタンパク質または非ヒトタンパク質をコードする。いくつかの態様において、タンパク質コーディング領域は、1つ以上の抗体をコードする。例えば、いくつかの態様において、タンパク質コーディング領域はヒト抗体をコードする。一態様において、タンパク質コーディング領域は、hFIX、SP-B、VEGF-A、ヒトメチルマロニル-CoAムターゼ(hMUT)、CFTR、癌自己抗原、およびさらなる遺伝子編集酵素様Cpf1、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)から選択されるタンパク質をコードする。別の態様において、タンパク質コーディング領域は、治療用途のタンパク質をコードする。一態様において、タンパク質コーディング領域にコードされるヒト抗体は、抗HIV抗体である。一態様において、タンパク質コーディング領域にコードされる抗体は二重特異性抗体である。一態様において、二重特異性抗体はCD19およびCD22に特異的である。別の態様において、二重特異性抗体はCD3およびCLDN6に特異的である。一態様において、タンパク質コーディング領域は、診断用途のタンパク質をコードする。一態様において、タンパク質コーディング領域は、ガウシアルシフェラーゼ(Gluc)、ホタルルシフェラーゼ(Fluc)、高感度(enhanced)緑色蛍光タンパク質(eGFP)、ヒトエリスロポイエチン(hEPO)またはCas9エンドヌクレアーゼをコードする。
【００１９】
一態様において、5'相同性アームは約5〜50ヌクレオチド長である。別の態様において、5'相同性アームは約9〜19ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、5'相同性アームは少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18または19ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、5'相同性アームは、50、45、40、35、30、25または20ヌクレオチド長以下である。いくつかの態様において、5'相同性アームは5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18または19ヌクレオチド長である。
【００２０】
一態様において、3'相同性アームは約5〜50ヌクレオチド長である。別の態様において、3'相同性アームは約9〜19ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、3'相同性アームは、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18または19ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、3'相同性アームは、50、45、40、35、30、25または20ヌクレオチド長以下である。いくつかの態様において、3'相同性アームは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18または19ヌクレオチド長である。
【００２１】
一態様において、5'スペーサー配列は少なくとも10ヌクレオチド長である。別の態様において、5'スペーサー配列は少なくとも15ヌクレオチド長である。さらなる態様において、5'スペーサー配列は少なくとも30ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、5'スペーサー配列は、少なくとも7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25または30ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、5'スペーサー配列は100、90、80、70、60、50、45、40、35または30ヌクレオチド長以下である。いくつかの態様において、5'スペーサー配列は20〜50ヌクレオチド長である。ある態様において、5'スペーサー配列は10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50ヌクレオチド長である。一態様において、5'スペーサー配列はポリA配列である。別の態様において、5'スペーサー配列はポリA-C配列である。
【００２２】
一態様において、3'スペーサー配列は少なくとも10ヌクレオチド長である。別の態様において、3'スペーサー配列は少なくとも15ヌクレオチド長である。さらなる態様において、3'スペーサー配列は少なくとも30ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、3'スペーサー配列は、少なくとも7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25または30ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、3'スペーサー配列は、100、90、80、70、60、50、45、40、35または30ヌクレオチド長以下である。いくつかの態様において、3'スペーサー配列は20〜50ヌクレオチド長である。ある態様において、3'スペーサー配列は、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50ヌクレオチド長である。一態様において、3'スペーサー配列はポリA配列である。別の態様において、5'スペーサー配列はポリA-C配列である。
【００２３】
一態様において、ベクターはさらに、RNAポリメラーゼプロモーターを含む。別の態様において、RNAポリメラーゼプロモーターは、T7ウイルスRNAポリメラーゼプロモーター、T6ウイルスRNAポリメラーゼプロモーター、SP6ウイルスRNAポリメラーゼプロモーター、T3ウイルスRNAポリメラーゼプロモーターまたはT4ウイルスRNAポリメラーゼプロモーターである。
【００２４】
一態様において、ベクターは、約500〜約10,000ヌクレオチドの範囲のサイズを有する環状RNAを転写するために使用される。いくつかの態様において、環状RNAは、少なくとも500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500または5,000ヌクレオチドのサイズである。いくつかの態様において、環状RNAは、10,000、9,000、8,000、7,000、6,000、5,000または4,000ヌクレオチドのサイズ以下である。
【００２５】
別の態様において、IRESは、コクサッキーウイルスB3(CVB3)由来のIRES配列であり、タンパク質コーディング領域はガウシアルシフェラーゼ(Gluc)をコードし、スペーサー配列はポリA-Cである。
【００２６】
いくつかの態様において、IRESは、存在する場合、少なくとも約50ヌクレオチド長である。一態様において、ベクターは、天然の配列を含むIRESを含む。一態様において、ベクターは、合成配列を含むIRESを含む。
【００２７】
一態様において、本発明は、環状RNAを作製するためのベクターに関し、該ベクターは、互いに操作可能に連結され、以下の順序で整列される以下の要素：a.)5'相同性アーム、b.)3'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む3'群Iイントロン断片、c.)5'スペーサー配列、d.)内部リボソーム進入部位(IRES)、e.)タンパク質コーディングまたはノンコーディング領域、f.)5'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む5'群Iイントロン断片、およびg.)3'相同性アームを含む。いくつかの態様において、該ベクターは、真核細胞内で翻訳可能であるおよび/または生物学的に活性である環状RNAの産生を可能にする。
【００２８】
一態様において、本発明は、環状RNAを作製するためのベクターに関し、該ベクターは、互いに操作可能に連結され、以下の順序で整列される以下の要素：a.)5'相同性アーム、b.)3'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む3'群Iイントロン断片、c.)内部リボソーム進入部位(IRES)、d.)タンパク質コーディングまたはノンコーディング領域、e.)スペーサー(例えば第2のスペーサー)配列、f.)5'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む5'群Iイントロン断片、およびg.)3'相同性アームを含む。いくつかの態様において、該ベクターは、細胞、例えば真核細胞内で翻訳可能であるおよび/または生物学的に活性である環状RNAの産生を可能にする。
【００２９】
ある態様において、本明細書に提供されるベクターはマルチクローニングサイト(MCS)を含まない。
【００３０】
一態様において、本発明は、環状RNAに関する。ある態様において、環状RNAは、本明細書に提供されるベクターにより産生される環状RNAである。いくつかの態様において、環状RNAは、以下の順序でa.)5'スペーサー配列、b.)内部リボソーム進入部位(IRES)、c.)タンパク質コーディングまたはノンコーディング領域、およびd.)3'スペーサー配列を含む。いくつかの態様において、環状RNAはさらに、3'スプライシング部位ジヌクレオチドの3'である3'群Iイントロン断片の一部を含む。いくつかの態様において、環状RNAはさらに、5'スプライシング部位ジヌクレオチドの5'である5'群Iイントロン断片の一部を含む。いくつかの態様において、環状RNAは、少なくとも500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000または4500ヌクレオチドである。一態様において、環状RNAは少なくとも約10ntである。一態様において、環状RNAは約500ntまたは500nt未満である。一態様において、環状RNAは少なくとも約1kbである。環状RNAは、未改変であり得るか、部分的に改変され得るかまたは完全に改変され得る。一態様において、環状RNAは少なくとも1つのヌクレオシド改変を含む。一態様において、環状RNAのヌクレオシドの100%までが改変される。一態様において、少なくとも1つのヌクレオシド改変は、ウリジン改変またはアデノシン改変である。一態様において、少なくとも1つのヌクレオシド改変は、 N6-メチルアデノシン(m6A)、プソイドウリジン(Ψ)、N1-メチルプソイドウリジン(m1Ψ)および5-メトキシウリジン(5moU)から選択される。一態様において、前駆RNAはメチルプソイドウリジン(m1Ψ)により改変される。
【００３１】
別の態様において、本発明は細胞においてタンパク質を発現させる方法に関し、該方法は、環状RNAを細胞にトランスフェクトする工程を含む。一態様において、該方法は、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを使用してトランスフェクトする工程を含む。別の態様において、環状RNAは、ナノ担体を使用して細胞にトランスフェクトされる。さらに別の態様において、ナノ担体は、脂質、ポリマーまたは脂質-ポリマーハイブリッドである。一態様において、環状RNAはコクサッキーウイルスB3 IRESを含む。
【００３２】
一態様において、本発明は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)系において、環状RNAをトリス-EDTAまたはクエン酸バッファ中のサイズ排除カラムを通して進ませる工程を含む、環状RNAを精製する方法に関する。別の態様において、RNAは、約4〜7の範囲のpH、約0.01〜5mL/分の流速で、トリス-EDTAまたはクエン酸バッファ中のサイズ排除カラムを通して進む。一態様において、HPLCは、イントロン断片、ニックが入った線状RNA、直鎖および環状連鎖物(linear and circular concatenations)、ならびにインビトロ転写およびスプライシング反応により生じる不純物の1つ以上を除去する。
【００３３】
一態様において、前駆RNAが本明細書に提供される。ある態様において、前駆RNAは、本明細書に提供されるベクターのインビトロ転写により産生される環状RNAである。いくつかの態様において、前駆RNAは、以下の順序で、a.)5'相同性アーム、b.)3'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む3'群Iイントロン断片、c.)5'スペーサー配列、d.)内部リボソーム進入部位(IRES)、e.)タンパク質コーディングまたはノンコーディング領域、f.)3'スペーサー配列、f.)5'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む5'群Iイントロン断片、およびg.)3'相同性アームを含む。前駆RNAは、未修飾であり得るか、部分的に修飾され得るかまたは完全に修飾され得る。一態様において、前駆RNAは、少なくとも1つのヌクレオシド改変を含む。一態様において、前駆RNAのヌクレオシドの100%までが改変される。一態様において、少なくとも1つのヌクレオシド改変はウリジン改変またはアデノシン改変である。一態様において、少なくとも1つのヌクレオシド改変は、N6-メチルアデノシン(m6A)、プソイドウリジン(Ψ)、N1-メチルプソイドウリジン(m1Ψ)および5-メトキシウリジン(5moU)から選択される。一態様において、前駆RNAはメチルプソイドウリジン(m1Ψ)で改変される。
【００３４】
別の態様において、本発明は、環状RNAを精製する方法に関し、該方法は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)系において、環状RNA(例えば本明細書に提供される環状RNA)をトリス-EDTAまたはクエン酸バッファ中のサイズ排除カラムを通して進ませる工程、および環状RNAをサイズ排除カラムを通して進ませた後、環状RNAをホスファターゼで処理し、それにより精製された環状RNAを産生する工程を含む。一態様において、ホスファターゼ処理の後にRNase R処理が続く。一態様において、精製された環状RNAは、ナノ粒子に調製される。一態様において、環状RNAは、約4〜8の範囲のpHでサイズ排除カラムを通して進む。一態様において、環状RNAは、約0.01〜5.0mL/分の流速でサイズ排除カラムを通して進む。
【００３５】
いくつかの態様において、本明細書の方法において有用なHPLCは、約4〜約7.5のpHを有する塩を含む水性バッファ、例えばリン酸バッファを含み得る。
【００３６】
さらに別の態様において、本発明は、前駆RNAから環状RNAを作製する方法に関し、該方法は、本明細書に提供されるベクターを使用する工程を含む。いくつかの態様において、該方法は、a.)ベクターのインビトロ転写により前駆RNAを合成する工程、およびb.)RNA環状化が起こる温度(例えば20℃〜60℃)でマグネシウムイオンおよびグアノシン(quanosine)ヌクレオチドまたはヌクレオシドの存在下で前駆RNAをインキュベートする工程を含む。いくつかの態様において、ベクターは、互いに操作可能に連結され、以下の順序で整列される以下の要素：a)5'相同性アーム、b)3'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む3'群Iイントロン断片、c)5'スペーサー配列、d)タンパク質コーディングまたはノンコーディング領域、e)3'スペーサー配列、f)5'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む5'群Iイントロン断片、およびg)3'相同性アームを含み、該ベクターは、真核細胞内で翻訳可能である環状RNAの産生を可能にする。一態様において、該方法はさらに、5'スペーサー配列とタンパク質コーディング領域の間に内部リボソーム進入部位(IRES)を含む。
【００３７】
一態様において、本発明は、本明細書に提供されるベクターのインビトロ転写により生成される前駆RNA から環状RNAを作製するための方法に関する。いくつかの態様において、該方法は、RNA環状化が起こる温度(例えば20℃〜60℃)でマグネシウムイオンおよびグアノシン(quanosine)ヌクレオチドまたはヌクレオシドの存在下で、前駆RNAをインキュベートする工程を含む。いくつかの態様において、前駆RNAのヌクレオシドは改変されない。前駆RNAは、未改変であり得るか、部分的に改変され得るかまたは完全に改変され得る。一態様において、前駆RNAは天然に存在し得る。一態様において、前駆RNAは、少なくとも1つのヌクレオシド改変を含む。一態様において、前駆RNAのヌクレオシドの100%までが改変される。一態様において、少なくとも1つのヌクレオシド改変はウリジン改変またはアデノシン改変である。一態様において、少なくとも1つのヌクレオシド改変は、N6-メチルアデノシン(m6A)、プソイドウリジン(Ψ)、N1-メチルプソイドウリジン(m1Ψ)および5-メトキシウリジン(5moU)から選択される。一態様において、前駆RNAは、メチルプソイドウリジン(m1Ψ)で改変される。
【００３８】
一態様において、本発明は、本明細書に開示されるベクターおよび/または方法により産生される環状RNAに関する。一態様において、本発明は、本明細書に提供される環状RNA(例えば本明細書に開示されるベクター、前駆RNAおよび/または方法により産生される環状RNA)を含む組成物、例えば医薬組成物に関する。
【００３９】
一態様において、本発明は、細胞中でタンパク質を発現する方法に関し、該方法は、本明細書に提供される環状RNAを細胞にトランスフェクトする工程を含む。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「前駆RNA」は、インビトロ転写により(例えば本明細書に提供されるベクターから)生成される線状RNA分子をいう。この前駆RNA分子は、circRNA配列の全体、およびRNAを環状化するために必要なスプライシング配列(イントロン断片および相同性アーム)を含む。これらのスプライシング配列(イントロン断片および相同性アーム)は、環状化の際に前駆RNAから除去され、circRNA + 2つのイントロン/相同性アーム線状RNA断片を生じる。前駆RNAは、未改変であり得るか、部分的に改変され得るかまたは完全に改変され得る。一態様において、前駆RNAは天然に存在するヌクレオチドのみを含む。
【００４１】
一態様において、本発明は、高められた翻訳効率を有する環状RNAを作製する方法に関し、該方法は、前駆RNAをコードするベクターの転写の際に人工ヌクレオシドを前駆RNAに組み込む工程および前駆RNAを環状化して環状RNAを形成する工程を含む。
【００４２】
別の態様において、本発明は、高められたタンパク質発現安定性を有する環状RNAを作製する方法に関し、該方法は、前駆RNAをコードするベクターの転写の際に人工ヌクレオシドを前駆RNAに組み込む工程および前駆RNAを環状化して環状RNAを形成する工程を含む。
【００４３】
さらに別の態様において、本発明は、低減された免疫原性を有する環状RNAを作製する方法に関し、該方法は、前駆RNAをコードするベクターの転写の際に人工ヌクレオシドを前駆RNAに組み込む工程および前駆RNAを環状化して環状RNAを形成する工程を含む。
【００４４】
いくつかの態様において、本明細書に提供されるベクターは、正しい条件(例えば本明細書に提供される条件)下でcircRNAに自己スプライシングされる前駆RNAを転写するために使用され得る。一態様において、このcircRNAの長さは約200〜約10,000ヌクレオチド長である。
【００４５】
一態様において、本明細書に提供されるベクターは、前駆RNAをコードする領域の上流(例えば5'相同性アームの上流)にRNAポリメラーゼプロモーターを含む。いくつかの態様において、該プロモーターは、T7ファージRNAポリメラーゼ酵素により認識され得る。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
図面の簡単な説明
前述のものは、添付の図面において示されるように、例示態様の以下のより具体的な記載から明らかであり、図面中、同様の参照記号は、異なる図面を通じて同じ部分を指す。図面は、必ずしも一定の度合いで作られておらず、その代り、態様の例示に重きが置かれる。
【００４７】
特許または出願ファイルは、カラーで仕上げられる少なくとも1つの図面を含む。カラー図面(1つまたは複数)を有する本特許または特許出願公開公報の複製は、請求および必要な費用の支払いに応じて事務局により提供される。
【図１−１】図1Aは、順序を変えられた(permuted)イントロン-エキソン構築物設計およびスプライシングの機構の例を示す概略図である。T4ファージTd遺伝子の群I触媒性イントロンは、リボザイム折り畳みに必須の構造要素を保存するような様式で二分される。エキソン断片2(E2)は、エキソン断片1(E1)の上流に連結され、約1.1kbの長さのコーディング領域は、エキソン-エキソン接合部に挿入される。スプライシングの際に、グアノシンヌクレオチドの3'ヒドロキシル基は、5'スプライシング部位でトランスエステル化反応に参加する。5'イントロン断片を切除し、中間体の末端で遊離ヒドロキシル基は、3'スプライシング部位で第2のトランスエステル化に参加し、介在領域の環状化および3'イントロンの切断が生じる。
【図１−２】図1Bは、相同性アーム設計のための前駆RNA二次構造のRNA Fold予想を示す。色は塩基対形成の可能性を示し、赤色はより高い可能性を示す。相同性アームなしでは、前駆体分子の末端の間で塩基対形成が起こるとは予想されない。矢印は付加された相同性アームを指す。図1Cは、スプライシングに対する相同性アームの効果を示すアガロースゲルを示す。示されるように、推定circRNAは、より重い前駆RNAよりも高い分子量で進む。(-)：相同性アームなし。Weak：弱い相同性アーム、9nt。Strong：強い相同性アーム、19nt。
【図１−３】図1Dは、前駆RNA環状化のアガロースゲル確認を示す。C：環状化条件に供された前駆RNA(強い相同性アームあり)。C+R：RNase Rにより消化されたレーンC。C+R+H：オリゴヌクレオチドガイド(guided)RNase Hにより消化されたレーンC+R。U：環状化条件に供されない前駆RNA。U+H：オリゴヌクレオチドガイドRNase Hにより消化されたレーンU。図1Eは、図1DのレーンC+Rに示される試料のスプライシング接合部にわたるRT-PCRのサンガー配列決定出力を示す。
【図１−４】図1Fは、設計されたスペーサーの情況における前駆RNA二次構造のRNAFold予想を示す。リボザイム機能に重要であるかもしれない二次構造は、黒い矢印で同定される。図1Gは、スプライシングに対するスペーサーの効果を示すアガロースゲルを示す。(-)：スペーサーなし。D：破壊性(disruptive)スペーサー。P1：許容(permissive)スペーサー1。P2：許容スペーサー2。
【図１−５】図1Hは、内部ホモロジー領域設計のための前駆RNA二次構造のRNAFold予想を示す。黒色の矢印で示される有意な内部ホモロジー(Anabaena 1.0)および導入された内部ホモロジー(Anabaena 2.0)の欠如。相同性アームと、スプライシングリボザイムを含む内部ホモロジー領域との間の領域として示される「スプライシングバブル(Splicing bubble)」。図1Iは、スプライシングに対する内部ホモロジーの効果を示すアガロースゲルを示す。
【図１−６】図1Jは、最適化されたT4ファージスプライシング反応と最適化されたAnabaenaスプライシング反応を比較するアガロースゲルを示す。Anabaenaイントロンの半分は、ほぼ等しい長さを有するものであり、より強い相同性アームにも関わらず、T4ファージイントロンの半分と比較して、スプライシング後に会合したままである可能性はより低い。
【図２−１】図2Aは、例示的な遺伝子工学で作り変えられた自己スプライシング前駆RNA設計の要素を示す概略図である。デノボに遺伝子工学で作り変えられた前駆RNAから作製されたある範囲のタンパク質コーディングcircRNAについての環状化効率および翻訳の評価。
【図２−２】図2Bは、環状化および再環状化(R-)後の、EMCV IRESおよびガウシアルシフェラーゼ(GLuc)、ヒトエリスロポイエチン(hEpo)、EGFP、ホタルルシフェラーゼ(FLuc)、またはCas9コーディング領域を含む可変挿入物を含む前駆RNAのアガロースゲルを示す。CircRNAは、RNase R分解(R+)により富化された。図2Cは、分光測光法により評価される場合のRNase Rを用いた20μgのスプライシング反応の処理由来のおおよそのcircRNA収率を示す棒グラフである(データは平均+SD、n=3として表される)。
【図２−３】図2Dは、GLucをコードするcircRNAでのトランスフェクションの24時間後のHEK293細胞の上清中の発光を示す棒グラフである(データは平均+SD、n=4、*p<0.05として表される)。図2Eは、hEpoをコードするcircRNAでのトランスフェクションの24時間後のHEK293細胞の上清中のヒトエリスロポエチンの発現を示す棒グラフである(データは平均+SD、n=4、*p<0.05として表される)。
【図２−４】図2Fは、EGFPをコードするcircRNAでのトランスフェクションの24時間後のHEK293細胞におけるGFP蛍光を示す。図2Gは、FLucをコードするcircRNAでのトランスフェクションの24時間後のHEK293細胞の溶解物中の発光を示す棒グラフである(データは平均+SD、n=4、*p<0.05として表される)。
【図２−５】図2Hは、GFP陰性細胞集団の出現により表される、sgGFP単独(circCas9-)でのトランスフェクションの4日後のHEK293-EF1a-GFP細胞におけるGFP切除(ablation)を示すFACS分析を示すグラフである。図2Iは、GFP陰性細胞集団の出現により示される、Cas9をコードするcircRNA(circCas9+)でのトランスフェクションの4日後のHEK293-EF1a-GFP細胞におけるGFP切除を示すFACS分析を示すグラフである。
【図３−１】図3Aは、GLuc(左のバー、黒色)およびFLuc(右のバー、灰色)情況におけるウイルス性5'UTR IRES配列のパネルを含むcircRNAでのトランスフェクションの24時間後のHEK293細胞の上清中の発光を示す棒グラフである(データは平均+SD、n=4として表される)。図3Bは、GLucコーディング領域および機能性IRESを含むcircRNAでのトランスフェクションの24時間後のHEK293細胞の上清中の発光を示す棒グラフである。IRESをスプライシング接合部から分離するポリA(30)またはポリAC(30)スペーサー配列の付加の効果を測定する。(-)：スペーサーなし。pAC：アデノシンおよびシトシンからなる30ntスペーサー。pA：アデノシンからなる30ntスペーサー(データは平均+SD、n=4、*p<0.05として表される)。
【図３−２】図3Cは、b)におけるIRESによる最も効果的なcircRNAでのトランスフェクションの24時間後のHEK293(左、黒色)およびHeLa(右、灰色)細胞の上清中の発光を示す棒グラフである(データは平均+SD、n=4として表される)。図3Dは、線状GLuc RNA(上)およびCVB3-GLuc-pACスプライシング反応物(下)のHPLCクロマトグラムを示すグラフである。
【図３−３】図3Eは、異なる方法により精製されたCVB3-GLuc-pACのアガロースゲルを示す。C：スプライシング反応物。+R：RNase Rで処理したスプライシング物反応。+G,R：ゲル抽出し、次いでRNase Rで処理したスプライシング物反応。+H,R：HPLC精製され、次いでRNase Rで処理したスプライシング物反応。図3Fは、図3Eに示される異なる方法で精製されたCVB3-GLuc-pACスプライシング反応物のトランスフェクションの24時間後のHEK293細胞の上清中の発光を示す(データは平均+SD、n=4、*p<0.05として表される)。図3Gは、図3DのデータについてのHPLC画分のアガロースゲルを示す。左から右に：画分1、2、3、4、5。
【図３−４】図3Hは、CVB3-GLuc-pAC circRNAまたは改変もしくは未改変線状GLuc mRNAでのトランスフェクションの24時間後のHEK293(左)およびHeLa(右)細胞の上清中の発光を示す棒グラフである(データは平均+SD、n=4 HEK293、n=3 HeLa、*p<0.05として表される)。図3Iは、CVB3-GLuc-pAC circRNAまたは改変もしくは未改変線状GLuc mRNAでのトランスフェクションの24時間後に開始した、および6日間連続したHEK293細胞の上清中の発光を示すグラフである(データは平均+SD、n=4 HEK293として表される)。
【図３−５】図3Jは、CVB3-GLuc-pAC circRNAまたは改変もしくは未改変線状GLuc mRNAをトランスフェクトされたHEK293(左)およびHeLa(右)細胞により6日間にわたり産生された相対累積発光を示すグラフである(データは平均+SD、n=4 HEK293、n=3 HeLa、*p<0.05として表される)。図3Kは、CVB3-GLuc-pAC circRNAまたは改変もしくは未改変線状GLuc mRNAでのトランスフェクションの24時間後に開始した、および6日間連続したHeLa細胞の上清中の発光を示すグラフである(データは平均+SD、n=3 HeLaとして表される)。
【図４】図4Aは、最適化されたスペーサーおよび相同性アームを含む順序を変えられた群Iイントロンを使用したRNA環状化効率に対する挿入物長さの効果を示す。1.2：1200nt circRNA。2.4：2400nt circRNA。4.8：4800nt circRNA。図4Bは、異なる遺伝子工学で作り変えられた配列を含む前駆分子のスプライシング効率のゲル定量を示す棒グラフである。WHA：弱い相同性アーム。SHA：強い相同性アーム。DS：破壊性スペーサー。PS：許容スペーサー。Ana：Anabaena塩基。IH：内部ホモロジー。
【図５−１】図5Aは、長さにより整列された異なる介在コーディング領域を含むcircRNAにおけるスプライシング効率およびニック形成のゲル定量(ImageJ)を示す棒グラフである。非前駆体(環状、ニック) 対 前駆RNAの比として表されるスプライシング効率。ニックRNA 対 ニックなしの長いRNA(前駆体、環状)の比として表されるニック形成。図5Bは、スプライシングに対する5'および3'スプライシング部位を含む小さな欠損の効果を示すアガロースゲルを示す。
【図５−２】図5Cは、GLucをコードし、EMCV IRESまたはスプライシング部位を欠損した同じ前駆RNAを含むcircRNAでのトランスフェクションの24時間後のHEK293細胞の上清中の発光を示す棒グラフである(データは平均+SD、n=4として表される)。
【図６−１】図6Aは、circRNAの情況における機能性について試験された付加的IRES配列および推定IRES配列を示す棒グラフである。
【図６−２】図6Bは、スプライシング接合部での前駆RNA二次構造のRNAFold予想の概略図である。IRES、コーディング領域およびイントロンは除いている。
【図６−３】図6Cは、図3BのIRESによる最も効果的なcircRNAでのトランスフェクションの24時間後のMin6細胞の上清中の発光を示す棒グラフである(データは平均+SD、n=4として表される)。図6Dは、図3BのIRESによる最も効果的なcircRNAでのトランスフェクションの24時間後のA549細胞の上清中の発光を示す棒グラフである(データは平均+SD、n=4として表される)。
【図７−１】図7A〜7J。図7A〜Fは、circRNAの設計、合成および精製の例を示す。図7A)前駆RNA設計および自己スプライシングの概観。色は、使用したRNAの異なる領域を示す。
【図７−２】図7B)この図で導入および使用されるRNAの概略。Δスプライシング部位(ΔS)は、両方のスプライシング部位を含む小さな欠失以外は前駆RNAと同一である。
【図７−３】図7C)スプライシング、RNase R消化、HPLC精製およびオリゴヌクレオチドガイドRNase H消化後の前駆RNAを示すアガロースゲル。環状RNAはRNase Hにより1つの主要なバンドに消化され、ΔSは2つの主要なバンドに消化され、環状化が確認される。図7D)circRNAに適用される累積精製法を示すアガロースゲル。+RNase R：RNase Rのみで消化された未精製circRNA。+HPLC：HPLC精製され、次いでRNase Rで消化された未精製circRNA。+Phos：HPLC精製され、次いでホスファターゼで処理され、次いでRNase Rで消化された未精製circRNA。
【図７−４】図7E)図7D)に記載されるような異なるcircRNA調製物をトランスフェクトされた293細胞からの細胞生存能力、GLuc発現安定性およびサイトカイン放出。細胞生存能力はトランスフェクションの3日後に評価した。サイトカイン放出はトランスフェクションの24時間後に評価した(データは平均+SD、n=3、ns=有意でない、p<0.05、ND=検出されない、として表される)。
【図７−５】図7F)図7D)に記載される異なるcircRNA調製物をトランスフェクトされたA549細胞からの細胞生存能力、circRNA発現安定性およびサイトカイン放出。細胞生存能力はトランスフェクションの3日後に評価した。サイトカイン放出はトランスフェクションの24時間後に評価した(データは平均+SD、n=3、ND=検出されない、*p<0.05として表される)。
【図７−６】図7G〜Jは、Δスプライシング部位(ΔS)特徴付けを示す。図7G)この図で導入および使用されるRNAの概略。ΔSは、スプライシング部位を欠失した線状circRNA前駆体である(xで印をつける)。ΔSは、ポリアデニル化され、ホスファターゼで処理される。図7H)分子量およびバンドを割り当てる(assign)ために使用されるラダーを示すアガロースゲル。ΔSは検出可能に環状化しない。図7I)circRNAまたはΔSを用いた293細胞のトランスフェクションの24時間後のGLuc発現(データは平均+SD、n=3として表される)。図7J)circRNAまたはΔSを用いた293細胞のトランスフェクション後3日にわたるGLucタンパク質産生安定性(データは平均+SD、n=3として表される)。
【図８−１】図8A〜G。図8A〜Fは、スプライシング反応物分画および免疫原性の評価を示す。図8A)この図で導入および使用されるRNAの概略。HMW：高分子量；この画分は直鎖および環状連鎖物を含む。
【図８−２】図8B)上：未精製スプライシング反応物のHPLCクロマトグラム。下：精製画分のアガロースゲル。前駆RNAの適切な分離は困難であったので、代わりにΔSを使用した。図8C)図8B)に記載されるような異なるHPLC画分を用いたA549細胞のトランスフェクションの24時間後のサイトカイン放出(データは平均+SD、n=3、*p<0.05として表される)。
【図８−３】図8D) b)に記載されるような異なるHPLC画分を用いたA549細胞のトランスフェクションの36時間後の細胞生存能力(データは平均+SD、n=3、*p<0.05として表される)。図8E)示されるRNAを使用したA549細胞のトランスフェクションの18時間後のRIG-IおよびIFN-β1転写産物誘導。3p-hpRNAは、5'三リン酸ヘアピンRNAであり、RIG-Iの特異的なアゴニストである(データは平均+SD、n=3、*p<0.05として表される)。図8F)RNase R消化されたスプライシング反応物または後期circRNA画分を用いたA549細胞のトランスフェクションの18時間後のRIG-IおよびIFN-β1転写産物誘導(データは平均+SD、n=3、*p<0.05として表される)。
【図８−４】図8Gは、図7Dに記載されるような異なるcircRNA調製物を用いたA549(左)および293(右)細胞のトランスフェクション後の培養培地中で評価されたさらなるサイトカインを示す(データは平均+SD、n=3として表される)。ほとんどの場合、これらの分析物は極めて低いレベルで検出され、有意差の観察は妨げられた。
【図８−５】図8Gは、図7Dに記載されるような異なるcircRNA調製物を用いたA549(左)および293(右)細胞のトランスフェクション後の培養培地中で評価されたさらなるサイトカインを示す(データは平均+SD、n=3として表される)。ほとんどの場合、これらの分析物は極めて低いレベルで検出され、有意差の観察は妨げられた。
【図８−６】図8Gは、図7Dに記載されるような異なるcircRNA調製物を用いたA549(左)および293(右)細胞のトランスフェクション後の培養培地中で評価されたさらなるサイトカインを示す(データは平均+SD、n=3として表される)。ほとんどの場合、これらの分析物は極めて低いレベルで検出され、有意差の観察は妨げられた。
【図９−１】図9A〜O。図9A〜Fは、線状mRNAに関連するcircRNAの免疫原性の決定を示す。図9A)この図で導入および使用されるRNAの概略。線状mRNAは、構造特異的免疫応答を誘起し得るIRESまたは他の構造化した特徴を含まない。図9B)m1Ψを用いたcircRNA前駆体の連続的改変を示すアガロースゲル。
【図９−２】図9C)精製された、未改変および改変RNAを示すアガロースゲル。m1Ψを用いた改変は、見かけ上の分子量を低減する。図9D)未改変circRNAまたはm1Ψ-circRNAを用いた293またはA549細胞のトランスフェクションの24時間後のGLuc発現(データは平均+SD、n=3として表される)。
【図９−３】図9E)未改変もしくはm1Ψ線状mRNAまたはcircRNAを用いてトランスフェクトした293細胞からの細胞生存能力、GLuc発現安定性およびサイトカイン放出。細胞生存能力はトランスフェクションの3日後に評価した。サイトカイン放出はトランスフェクションの24時間後に評価した(データは平均+SD、n=3、ns=有意でない、p<0.05、ND=検出されない、として表される)。
【図９−４】図9F)未改変もしくはm1Ψ線状mRNAまたはcircRNAを用いてトランスフェクトしたA549細胞からの細胞生存能力、GLuc発現安定性およびサイトカイン放出。細胞生存能力はトランスフェクションの3日後に評価した。サイトカイン放出はトランスフェクションの24時間後に評価した(データは平均+SD、n=3、ND=検出されない、*p<0.05として表される)。図9G)は、GLuc活性(RLU)を示す。
【図９−５】図9H)図9Hに示されるような異なるHPLC画分を用いたA549細胞のトランスフェクション後の培養培地中で評価したさらなるサイトカイン(データは平均+SD、n=3、*p<0.05として表される)。図9I、293細胞(左)のモックトランスフェクションの36時間後またはトランスフェクションなしの細胞生存能力および293細胞のモックトランスフェクションの24時間後またはトランスフェクションなしの転写産物誘導(右；トランスフェクションなしに対する誘導倍率；データは平均+SD、n=2、ns=有意でないとして表される)。
【図９−６】図9J)MessengerMaxを用いたモックトランスフェクションの24時間後またはトランスフェクションなしのA549細胞によるIL-6およびRANTES分泌(データは平均+SD、n=3として表される)。図9K)トランスフェクトされた総RNAのパーセンテージとしての、合成RIG-Iリガンド(3p-hpRNA)を含む精製されたcircRNAを用いたA549細胞のトランスフェクションの24時間後のRIG-IおよびIFN-β1転写産物誘導(データは平均+SD、n=3、*p<0.05として表される)。
【図９−７】図9L)示されるRNAを用いたHeLa細胞のトランスフェクションの24時間後のRIG-IおよびIFN-β1転写産物誘導(データは平均+SD、n=3、*p<0.05として表される)。
【図９−８】図9M)20ngの示されるRNAを用いた150,000 A549細胞のトランスフェクションの2〜8時間後の転写産物誘導の時間経過(データは平均+SD、n=2として表される)。
【図９−９】図9N)示されるRNAを用いた80%コンフルエントでのRAW264.7細胞のトランスフェクションの24時間後のGLuc発現(左)。2日にわたるGLuc発現安定性(右：データは平均+SD、n=3として表される)。示されるRNAを用いたRAW264.7細胞のトランスフェクションの24時間後の転写産物誘導(データは平均+SD、n=2として表される)。図9O)EMCV IRESを含みGFPをコードする環状RNA(circGFP)の分析。circGFP環状化および精製されたcircGFPを示すアガロースゲル(左)。40ngのcircRNAを用いた20,000 A549細胞のリバーストランスフェクションの36時間後のA549細胞生存能力(右)。示されるRNAを用いたA549細胞のリバーストランスフェクションの24時間後の転写産物誘導(下；データは平均+SD、n=2、ns=有意でないとして表される)。
【図１０−１】図10A〜I。図10A〜Fは、TLRのCircRNA回避を示す。図10A)TLR実験のために導入および使用したRNAの概略。線状化circRNAは、イントロンおよび相同性アームの両方を包含する欠失のために、スプライシングされたcircRNAと同じ配列要素の全てを含む。
【図１０−２】図10B)ヌル(null)対照に対する示されるRNAを用いたTLRレポーター細胞のトランスフェクションの36時間後のSEAP発現(データは平均+SD、n=3、ns=有意でない、*p<0.05)。
【図１０−３】図10C)ヌル対照に対する後期circRNA画分を用いたTLR8レポーター細胞のトランスフェクションの36時間後のSEAP発現。(-)：ヌクレオシドを含まない培地。C：シチジン(3.5mM)を含む培地。U：ウリジン(3.5mM)を含む培地；(データは平均+SD、n=3、ns=有意でない、*p<0.05として表される)。図10D)TLRニックRNA実験のために導入および使用されたRNAの概略。図10E)代替的なcircRNAニック形成戦略を示すアガロースゲル。
【図１０−４】図10F)ヌル対照に対する示されるRNAを用いたTLRレポーター細胞のトランスフェクションの36時間後のSEAP発現(データは平均+SD、n=3、*p<0.05として表される)。
【図１０−５】図10G〜Iは、スプリント(splint)ライゲーション最適化を示す。図10G)スプリントライゲーション前駆RNA設計およびスプライシングの概観。
【図１０−６】図10H)ライゲーションのために使用される異なるスプリント。注意すべきことに、これらの最適化は、線状化のためのNaeI制限切断部位を含むプラスミドを用いて行い、インビトロ転写の間に望ましくないRNA副生成物形成を生じた(リガーゼ(-)およびスプリント(-)条件における異質のバンドとして見られる)。この部位は、図9A〜Fおよび図10A〜Fにおいて使用されるGLucおよびhEpoスプリントライゲーションについてXbaIに換えた。OH：オーバーハング(5'、3')；Tm：融点。図10I)は、環状化条件の最適化を示す。
【図１１−１】図11A〜F。図11A〜Dは、インビボにおけるhEpo circRNA特徴付けを示す。図11A)MessengerMaxと複合体された350ngの未改変もしくはm1Ψ線状mRNAまたはcircRNAの内臓脂肪組織への注射の6時間後の血清hEpo発現(データは分子量に対して表される、平均+SD、n=3)。図11B)42時間にわたる血清中の相対的hEpo発現(データは平均+SD、n=3として表される)。
【図１１−２】図11C)350ngの示されるRNAの内臓脂肪への注射の6時間後に血清中で検出されたサイトカイン(データは平均+SD、n=3、*p<0.05として表される)。
【図１１−３】図11D)MessengerMaxと複合体化された改変されたホタルルシフェラーゼmRNAの注射により示される注射部位。
【図１１−４】図11Eは、未改変もしくはm1Ψ線状mRNAまたはcircRNAを用いてトランスフェクトした293細胞からの細胞生存能力、GLuc発現安定性およびサイトカイン放出を示す。細胞生存能力はトランスフェクションの3日後に評価した。サイトカイン放出はトランスフェクションの24時間後に評価した(データは平均+SD、n=3、ns=有意でない、p<0.05、ND=検出されない、として表される)。
【図１１−５】図11Fは、未改変もしくはm1Ψ線状mRNAまたはcircRNAを用いた293およびA549細胞のトランスフェクション後の培養培地中で評価されたさらなるサイトカインを示す(図9E、9F参照；データは平均+SD、n=3として表される)。ほとんどの場合、これらの分析物は、極めて低いレベルで検出され、有意差の観察は妨げられた。
【図１１−６】図11Fは、未改変もしくはm1Ψ線状mRNAまたはcircRNAを用いた293およびA549細胞のトランスフェクション後の培養培地中で評価されたさらなるサイトカインを示す(図9E、9F参照；データは平均+SD、n=3として表される)。ほとんどの場合、これらの分析物は、極めて低いレベルで検出され、有意差の観察は妨げられた。
【図１１−７】図11Fは、未改変もしくはm1Ψ線状mRNAまたはcircRNAを用いた293およびA549細胞のトランスフェクション後の培養培地中で評価されたさらなるサイトカインを示す(図9E、9F参照；データは平均+SD、n=3として表される)。ほとんどの場合、これらの分析物は、極めて低いレベルで検出され、有意差の観察は妨げられた。
【図１２−１】図12A〜I。図12A〜Fは、LNP-circRNA特徴付けを示す。図12A)LNP-circRNAのCryo-TEM画像。図12B)等モル量のLNP-5moU-mRNAまたは未改変LNP-circRNA(左)を用いた293細胞のトランスフェクションの24時間後のhEpo発現および3日にわたるhEpoタンパク質発現安定性(右；データは平均+SD、n=3として表される)。図12C)LNP-5moU-mRNAまたは未改変LNP-circRNAを用いたA549細胞のトランスフェクションの24時間後のRIG-IおよびIFN-β1転写産物誘導。TR：トランスフェクション試薬+200ng RNA (MessengerMax)；LNP(1x)：200ng LNP-RNA；LNP(2x)：400ng LNP-RNA；L：5moU-mRNA；C：circRNA(データは平均+SD、n=3、ns=有意でない、p<0.05として表される)。
【図１２−２】図12D)ヌル対照に対するc)に示されるRNAを用いたTLRレポーター細胞のトランスフェクションの48時間後のSEAP発現(データは平均+SD、n=3として表される)。図12E)1.5ピコモルのLNP-5moU-mRNAまたは未改変LNP-circRNAの内臓脂肪への注射の6時間後の血清hEpo発現(データは平均+SD、n=5 線状5moU、環状；n=3 モックとして表される)。図12F)LNP-RNAを用いた注射後42時間にわたる血清中の相対hEpo発現(データは平均+SD、n=5線状5moU、環状；n=3 モックとして表される)。
【図１２−３】図12G)図9Gに示される線状RNAのアガロースゲル。図12H)異なる濃度のウリジンの存在または非存在下でのヌル対照に対するa)に示されるテイル有り線状RNAを用いたTLR8レポーター細胞のトランスフェクションの36時間後のSEAP発現(データは平均+SD、n=2として表される)。図12I)さらなる陽性対照を含む図10Fからの完全データ。
【図１３】図13は、未精製hEpoスプライシング反応物のHPLCクロマトグラムのグラフを示す。
【図１４】図14A〜Dは、インビトロにおけるhEpo circRNA特徴付けを示す。図14A)精製された、未改変または改変RNAを示すアガロースゲル。図14B)等モル量のm1Ψ-mRNAまたは未改変circRNAを用いた293細胞のトランスフェクションの24時間後のhEpo発現(データは平均+SD、n=3として表される)。図14C)等重量の未改変もしくはm1Ψ線状mRNAまたはcircRNAを用いてトランスフェクトした293細胞からの細胞生存能力、hEpoタンパク質産生安定性および24時間タンパク質発現。細胞生存能力はトランスフェクションの36時間後に評価した(データは平均+SD、n=3として表される)。図14D)等重量の未改変もしくはm1Ψ線状mRNAまたはcircRNAを用いてトランスフェクトしたA549細胞からの細胞生存能力、hEpoタンパク質産生安定性および24時間タンパク質発現。細胞生存能力はトランスフェクションの36時間後に評価した(データは平均+SD、n=3として表される)。
【図１５−１】図15は、等重量の示されるRNAの腹腔内注射の6時間後の血清中で検出されたさらなるサイトカインを示す(図10F参照；データは平均+SD、n=3として表される)。ほとんどの場合、これらの分析物は極めて低いレベルで検出され、有意差の観察は妨げられた。
【図１５−２】図15は、等重量の示されるRNAの腹腔内注射の6時間後の血清中で検出されたさらなるサイトカインを示す(図10F参照；データは平均+SD、n=3として表される)。ほとんどの場合、これらの分析物は極めて低いレベルで検出され、有意差の観察は妨げられた。
【図１５−３】図15は、等重量の示されるRNAの腹腔内注射の6時間後の血清中で検出されたさらなるサイトカインを示す(図10F参照；データは平均+SD、n=3として表される)。ほとんどの場合、これらの分析物は極めて低いレベルで検出され、有意差の観察は妨げられた。
【図１５−４】図15は、等重量の示されるRNAの腹腔内注射の6時間後の血清中で検出されたさらなるサイトカインを示す(図10F参照；データは平均+SD、n=3として表される)。ほとんどの場合、これらの分析物は極めて低いレベルで検出され、有意差の観察は妨げられた。
【図１６】図16A〜Dは、インビボにおけるLNP-RNA特徴付けを示す。図16A)LNP-RNAの物理化学的特性(データは平均±SD、n=3として表される)。図16B)cKK-E12 LNPに調製された、改変されたホタルルシフェラーゼmRNAの注射により示される注射部位。6および24時間に検出された発光は、内臓脂肪への局所的な送達を示す。図16C)cKK-E12 LNPに調製された、750ngの示されるRNAの腹腔内注射の6時間後の血清中で検出されたサイトカイン(データは平均+SD、n=3として表される)。図16D)cKK-E12 LNPに調製された750ngの示されるRNAの腹腔内注射の24時間後の内臓脂肪組織内の転写産物誘導(データは平均+SD、n=3として表される)。図16E)0.1mg/kg 5moU-mRNAまたは未改変circRNAの静脈内注射の6時間後の肝臓由来の血清hEpo発現(左)および42時間にわたる相対的hEpo発現(右；データは分子量に対して表される、平均+SD、n=3)。
【図１７】図17は、インビトロ転写の直後のT4ファージ順序を変えられたイントロン、EMCV IRES、GLucリーディングフレームおよび強い相同性アームを含む前駆RNAの環状化を示す。前駆RNAは、示される温度で加熱して、氷上で冷却して、次いで55℃でスプライシングした。
【図１８−１】図18A〜18Cは前駆RNAの環状化を示す。図18Aは、異なるGTP濃度でのT4またはアナベナ(Anabaena)の順序を変えられたイントロン、EMCV IRES、GLucリーディングフレーム、強い相同性アームおよび5'スペーサーを含む前駆RNAの環状化を示す。図18Bは、異なる濃度のRNAでの図18Aに記載される前駆RNAの環状化を示す。
【図１８−２】図18Cは、種の相互交換を除外するための3つの代替的なプロトコルを使用した完全スプライシングにより生じた最も上および最も下の主要なバンドのゲル抽出を示す。
【図１９】図19は、293細胞中144時間にわたるスペーサーまたは線状mRNAなしのEMCV-circRNAからのGLucの安定性および発現のグラフを示す。
【図２０−１】図20A〜20D。図20A)HeLa細胞中144時間にわたるスペーサーなしおよびUTRありまたはなしのEMCV-circRNAからのGLucの安定性および発現。図20B)293細胞中144時間にわたるスペーサーなしおよびUTRありまたはなしのEMCV-circRNAからのGLucの安定性および発現。
【図２０−２】図20C)5'スペーサー有りおよび異なるUTRありまたはなしのCVB3-circRNAからのGLucの発現。Trilink：Trilinkから購入した5mC/偽改変線状mRNA。図20D)T4の順序を変えられたイントロン、EMCV IRES、GLucリーディングフレーム、強い相同性アーム、異なるUTRありまたはなしの5'スペーサーを含む前駆RNAの環状化。R：RNase R消化。
【図２１−１】図21A〜21G。図21A〜21D)293およびHeLa細胞における5'スペーサーありおよび異なるIRES配列ありのcircRNAからのGLucの発現。
【図２１−２】図21A〜21G。図21A〜21D)293およびHeLa細胞における5'スペーサーありおよび異なるIRES配列ありのcircRNAからのGLucの発現。
【図２１−３】21E〜21F)293およびHeLa細胞における5'スペーサーありおよび異なるIRES配列またはUTRありのcircRNAからのGLucの発現。CircRNAは、そうではないと示されない限り、CVB3 IRESを含む。Trilink：Trilinkから購入された5mC/偽改変線状mRNA。
【図２１−４】21G)293細胞における異なるRNA種のStemFectトランスフェクション試薬および脂質ナノ粒子(LNP)送達の比較。
【図２２】図22A〜22B。図22A〜22B)293およびHeLa細胞におけるアナベナ(Anabaena)の順序を変えられたイントロン、5'スペーサーを有する、異なるポリN配列ありまたはなしのCVB3-circRNAからのGLucの発現。
【図２３】図23A〜23B。図23A)293細胞における5'スペーサーおよび示されるIRESを有するcircRNAからのGLucの発現に対する順序を変えられたイントロン配列情況の効果の比較。図23B)T4の順序を変えられたイントロン、5'スペーサーおよび異なるIRES配列または線状mRNAを含むcircRNAからのGLucの血清発現。RNAは、肝臓ホーミング(homing)LNPに調製され、静脈内注射された。注射の6時間後に血清を回収した。
【図２４】図24は、HeLa細胞における5'および3'スペーサーならびにCVB3 IRESを有するcircRNAを含むプラスミドからのGLucの発現を示す。基本のプラスミドはCVB3 IRESを含まない。dスプライシング部位は転写後の環状化を排除するための変異したスプライシング部位を含む。
【図２５】図25A〜25B。図25A)アナベナ(Anabaena)の順序を変えられたイントロン、GLucリーディングフレーム、強い相同性アーム、5'および3'スペーサー、ならびに示されるIRESを含む前駆RNAの環状化。図25B)アナベナ(Anabaena)の順序を変えられたイントロン、FLucリーディングフレーム、強い相同性アーム、5'および3'スペーサー、ならびに示されるIRESを含む前駆RNAの環状化。
【図２６】図26A〜26B。図26A)HeLa細胞。図26B)A594細胞。示されるcircRNA調製物のトランスフェクション後のRIG-IおよびIFNB1の誘導倍率。全ての調製物は、アナベナ(Anabaena)の順序を変えられたイントロン、GLucリーディングフレーム、強い相同性アーム、5'および3'スペーサー、ならびにCVB3 IRESを有するcircRNAを含む。未精製：全スプライシング物反応。GMP：GTPに対して12.5倍のGMPの存在下で転写されるCircRNA前駆体。3phpRNA：三リン酸ヘアピンRNA陽性対照。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
詳細な説明
例示態様の説明を以下にする。
【００４９】
本明細書で記載する場合、外因性circRNAは、全長RNAメッセージからのタンパク質発現の持続時間を延長するように開発された。第1に、スプライシングを補助する遍在的な付属(accessory)配列を合理的に設計することにより、Cas9などのタンパク質をコードする広範囲のRNAをインビトロで効率的に環状化するように、自己スプライシングイントロンを遺伝子工学で作り変えた。機能的タンパク質は真核細胞においてこれらのcircRNAから産生され、異なる内部リボソーム進入部位(IRES)および内部ポリアデノシントラクト(tract)を組み込む翻訳は最大化された。高速液体クロマトグラフィーで精製された遺伝子工学で作り変えられたcircRNAは、産生されるタンパク質の量および産生の安定性の両方に関して、別格のタンパク質産生の質を示した。真核細胞における確固たる(robust)かつ安定なタンパク質発現のための外因性circRNAの使用を容易にし、circRNAを線状mRNAの有望な代替物にする方法および組成物が本明細書に提供される。
【００５０】
真核細胞に対して内因性の環状RNA(circRNA)は、それらの普及率(prevalence)および潜在的な生物学的機能の範囲のために興味の増大を引き出している(Barrett, S. P. & Salzman, J., 「Circular RNAs: analysis, expression and potential functions」, Development, 143(11):1838-1847 (2016))。ほとんどのcircRNAは、逆スプライシング(backsplicing)により作製され、コーディングされない役割を実現すると思われる(Barrett, S. P. & Salzman, J., 「Circular RNAs: analysis, expression and potential functions」, Development, 143(11):1838-1847 (2016)；Chen, L. & Yang, L., 「Regulation of circRNA biogenesis」, RNA Biology, 12(4):381-388 (2015)；Jeck, W. R. and Sharpless, N. E., 「Detecting and characterizing circular RNAs」, Nat. Biotechnol., 32:453-461 (2014)；Wang, Y. & Wang, Z., 「Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs」, RNA, 21(2):172-179 (2014)；Hansen, T. B. et al., 「Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges」, Nature, 495(7441):384-388 (2013)；Li, Z. et al., 「Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus」, Nature Structural & Molecular Biology, 22(3):256-264 (2015))。しかしながら、ショウジョウバエに対して内因性であるいくつかのcircRNAはタンパク質に翻訳され得ることが示唆されている(Legnini, I. et al., 「Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis」, Molecular Cell, 66(1):22-37.e9 (2017); Pamudurti, N. R. et al., 「Translation of CircRNAs」, Molecular Cell, 66(1) (2017))。
【００５１】
タンパク質コーディング能力を有することに加えて、内因性circRNAは、エクソヌクレアーゼ媒介性の分解に必要な遊離末端を欠き、内因性circRNAはRNA代謝回転のいくつかの機構に対して抵抗性になり、それらの線状mRNA対応物と比較して内因性circRNAの寿命が延長される(Chen, L. & Yang, L., 「Regulation of circRNA biogenesis」, RNA Biology, 12(4):381-388 (2015); Enuka, Y. et al., 「Circular RNAs are long-lived and display only minimal early alterations in response to a growth factor」, Nucleic Acids Research, 44(3):1370-1383 (2015))。この理由のために、環状化は、一般的に短い半減期を欠点としてもつmRNAの安定化を可能にし得、そのために種々の適用における外因性mRNAの全体的な効力を向上し得る(Kaczmarek, J. C. et al., 「Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality」, Genome Medicine, 9(1) (2017); Fink, M. et al., 「Improved translation efficiency of injected mRNA during early embryonic development」, Developmental Dynamics, 235(12):3370-3378 (2006)；Ferizi, M., et al., 「Stability analysis of chemically modified mRNA using micropattern-based single-cell arrays」, Lab Chip, 15(17):3561-3571 (2015))。しかしながら、長いインビトロで転写される(IVT)RNAの効率的な環状化、circRNAの精製およびcircRNAからのタンパク質の適切な発現は、それらのタンパク質コーディング潜在能力が実現され得る前に克服されなければならない重大な障害である。本明細書で記載する場合、一態様において、細胞、例えば真核細胞における協力かつ永続性のあるタンパク質発現のための外因性circRNAを作製するための遺伝子工学的アプローチが提示される。
【００５２】
略語
GFP 緑色蛍光タンパク質
ORF オープンリーディングフレーム
IRES 内部リボソーム進入部位
UTR 非翻訳領域
HEK ヒト胚性腎臓
IRES 内部リボソーム進入部位
EMCV 脳心筋炎ウイルス、ピコルナウイルス
PIE 順序を変えられたイントロン-エキソンスプライシング部位
【００５３】
一態様において、本発明は、環状RNAを作製するためのベクターに関し、該ベクターは、互いに操作可能に連結され、以下の順序で整列される以下の要素：a.)5'相同性アーム、b.)3'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む3'群Iイントロン断片、c.)任意に5'スペーサー配列、d.)任意に内部リボソーム進入部位(IRES)、e.)タンパク質コーディングまたはノンコーディング領域、f.)任意に3'スペーサー配列、g.)5'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む5'群Iイントロン断片、およびh.)3'相同性アームを含み、該ベクターは、真核細胞内で翻訳可能であるおよび/または生物学的に活性である環状RNAの産生を可能にする。
【００５４】
本明細書で使用する場合、要素の銘(lettering)(例えば「a.)〜h.)」)は、単に明確化の目的のために使用される。また、代替的な態様において、要素が異なる配列で整列され得ることおよび/または1つ以上の要素が省略され得ることが可能であることが理解される。
【００５５】
本明細書で使用する場合、ベクターの要素は、それらが前駆RNAを形成するように転写され得、次いで前駆RNAが本明細書に提供される方法を使用して環状RNAに環状化され得るように、ベクター上に配置される場合、「操作可能に連結される」。
【００５６】
一態様において、本発明は、circRNAを作製するためのベクター(例えばプラスミド)に関し、該ベクターは、互いに操作可能に連結され、以下の順序で整列される以下の要素：a.)5'相同性アーム、b.)3'群Iイントロン断片、c.)任意の5'スペーサー配列、d.)任意の内部リボソーム進入部位(IRES)、e.)タンパク質コーディングまたはノンコーディング領域、f.)任意の3'スペーサー配列、g.)5'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む5'群Iイントロン断片、およびh.)3'相同性アームを含み、該ベクターは、真核細胞内で翻訳可能であるまたは生物学的に活性であるcircRNAの産生を可能にする。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「相同性アーム」は、1)RNA中の別の配列、例えば別の相同性アームの少なくとも約75%(例えば少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、約100%)と塩基対を形成することが予想され、2)少なくとも7nt長および250nt以下であり、3)3'イントロン断片の前かつそれに接近して配置されるかもしくはその中に含まれる、および/または5'イントロン断片の後かつそれに接近して配置されるかもしくはその中に含まれ、任意に4)RNA中の意図されない配列(例えば非相同性アーム配列)と50%未満(例えば45%未満、40%未満、35%未満、30%未満、25%未満)の塩基対を有することが予想される、任意の連続配列である。「強い相同性アーム」は、RNA中の別の相同性アームと塩基対を形成する際に50℃より高いTmを有する相同性アームをいう。
【００５８】
本明細書で使用する場合、3'群Iイントロン断片は、3'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む天然の群Iイントロンの3'近位断片、および任意に少なくとも1ヌクレオチド長(例えば少なくとも5ヌクレオチド長、少なくとも10ヌクレオチド長、少なくとも15ヌクレオチド長、少なくとも20ヌクレオチド長、少なくとも25ヌクレオチド長、少なくとも50ヌクレオチド長)の隣接するエキソン配列に対して少なくとも75%(例えば少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%)相同である連続配列である。一態様において、含まれる隣接するエキソン配列は天然のエキソンの長さと同程度である。いくつかの態様において、5'群Iイントロン断片は、5'スプライシング部位ジヌクレオチドを含む天然の群Iイントロンの5'近位断片および任意に少なくとも1ヌクレオチド長(例えば少なくとも5ヌクレオチド長、少なくとも10ヌクレオチド長、少なくとも15ヌクレオチド長、少なくとも20ヌクレオチド長、少なくとも25ヌクレオチド長、少なくとも50ヌクレオチド長)の隣接するエキソン配列に対して少なくとも75% (例えば少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、100%)相同である連続配列である。一態様において、含まれる隣接するエキソン配列は、天然のエキソンの長さと同程度である。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「スペーサー」は、1)例えばIRES、コーディングもしくはノンコーディング領域またはイントロンからの近位の構造への干渉を回避することが予想される、2)少なくとも7ヌクレオチド長(および任意に100ヌクレオチド以下)である、3)3'イントロン断片の下流およびそれに隣接しておよび/または5'イントロン断片の上流およびそれに隣接して配置される、および/または4)以下：a)少なくとも5nt長の非構造領域、b)別のスペーサーなどの遠位(すなわち隣接しない)配列に対して少なくとも5nt長の塩基対を形成することが予想される領域、および/またはc)スペーサーの配列に対して範囲が限定される少なくとも7nt長の構造領域の1つ以上を含む、任意の連続ヌクレオチド配列をいう。
【００６０】
本明細書で使用する場合、配列に関して「干渉する」は、IRESまたは群Iイントロン由来配列などのRNA中の他の構造の折り畳みを変化させると予想されるかまたは経験的に決定される配列(1つまたは複数)をいう。
【００６１】
本明細書で使用する場合、RNAに関して「非構造(unstructured)」は、RNAFoldソフトウェアまたは同様の予想ツールによって、それ自身または同じRNA分子中の他の配列と構造(例えばヘアピンループ)を形成すると予想されないRNA配列をいう。
【００６２】
本明細書で使用する場合、RNAに関して「構造(structured)」は、RNAFoldソフトウェアまたは同様の予想ツールによって、それ自身または同じRNA分子中の他の配列と構造(例えばヘアピンループ)を形成すると予想されるRNA配列をいう。
【００６３】
いくつかの態様において、スペーサー配列は、例えば少なくとも10ヌクレオチド長、少なくとも15ヌクレオチド長または少なくとも30ヌクレオチド長であり得る。いくつかの態様において、スペーサー配列は、少なくとも7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25または30ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、スペーサー配列は、100、90、80、70、60、50、45、40、35または30ヌクレオチド長以下である。いくつかの態様において、スペーサー配列は20〜50ヌクレオチド長である。ある態様において、スペーサー配列は、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50ヌクレオチド長である。
【００６４】
スペーサー配列は、ポリA配列、ポリA-C配列、ポリC配列もしくはポリU配列であり得るか、またはスペーサー配列は、IRESに依存して特異的に遺伝子工学で作り変えられ得る。本明細書で記載される場合、スペーサー配列は、2つの(1)環状化を促進するおよび(2)イントロンおよびIRESを正しく折り畳むことにより機能性を促進する機能を有し得る。より具体的に、スペーサー配列は、本明細書で記載される場合、1)近位のイントロンおよびIRES構造の折り畳みに関して不活性である；2)イントロンおよびIRESの二次構造を十分に分離する；および3)「スプライシングバブル」の形成を促進するためにスペーサー-スペーサー相補性の領域を含むような3つの優先事項を有するように遺伝子工学で作り変えられた。一態様において、ベクターは、多くのあり得るIRESおよびコーディングまたはノンコーディング領域および2つのスペーサー配列と適合性である。
【００６５】
いくつかの態様において、RNA折りたたみコンピューターソフトウェア、例えばRNAFoldは、スペーサーを含むベクターの種々の要素の設計を誘導するために利用され得る。
【００６６】
いくつかの態様において、環状RNAを作製するためのベクター中の1つ以上の要素は、例えばIRESおよびイントロン断片要素を含む天然の配列と少なくとも75%の配列同一性を含む。いくつかの態様において、タンパク質コーディング領域またはノンコーディング領域は、天然に存在するヌクレオチド配列ではない。いくつかの態様において、タンパク質コーディング領域は天然または合成のタンパク質をコードする。
【００６７】
いくつかの態様において、コーディングまたはノンコーディング領域は天然または合成の配列であり得る。いくつかの態様において、コーディング領域は、キメラ抗原受容体、免疫調節タンパク質および/または転写要素をコードし得る。いくつかの態様において、ノンコーディング領域は、例えばリンパ球の挙動などの細胞の挙動を変化し得る配列をコードし得る。いくつかの態様において、ノンコーディング配列は、細胞性RNA配列に対してアンチセンスである。
【００６８】
一態様において、ベクターは、3'スペーサー配列ではなく5'スペーサー配列を含み得る。別の態様において、ベクターは、5'スペーサー配列ではなく3'スペーサー配列を含み得る。別の態様において、ベクターは、5'スペーサー配列も3'スペーサー配列も含み得ない。別の態様において、ベクターは、IRES配列を含まない。さらなる態様において、ベクターは、IRES配列、5'スペーサー配列または3'スペーサー配列を含まない。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「ベクター」は、(例えばPCRを使用して)合成される、またはウイルス、プラスミドもしくはクローニングおよび/または発現目的で外来DNA断片が挿入され得るもしくは挿入されている高等生物の細胞から採取されるDNAの断片を意味する。いくつかの態様において、ベクターは、生物中で安定に維持され得る。ベクターは、例えば複製起点、選択可能マーカーまたはレポーター遺伝子、例えば抗生物質耐性もしくはGFP、および/またはマルチクローニングサイト(MCS)を含み得る。該用語は、線状DNA断片(例えばPCR産物、線状化されたプラスミド断片)、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミド、細菌性人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)などを含む。一態様において、本明細書に提供されるベクターはマルチクローニングサイト(MCS)を含む。別の態様において、本明細書に提供されるベクターはMCSを含まない。
【００７０】
群Iイントロン自己スプライシング配列の例としては、限定されないが、T4バクテリオファージ遺伝子tdまたはシアノバクテリウム アナベナ種プレtRNA-Leu遺伝子由来の自己スプライシング順序を変えられたイントロン-エキソン配列が挙げられる。
【００７１】
タンパク質コーディング領域は、真核生物または原核生物起源のタンパク質をコードし得る。いくつかの態様において、タンパク質は、治療用途または診断用途の任意のタンパク質であり得る。例えばタンパク質コーディング領域は、ヒトタンパク質または抗体をコードし得る。いくつかの態様において、タンパク質は限定されないが、hFIX、SP-B、VEGF-A、ヒトメチルマロニル-CoAムターゼ(hMUT)、CFTR、癌自己抗原、およびさらなる遺伝子編集酵素様Cpf1、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)から選択され得る。いくつかの態様において、ベクターまたはcircRNAは、タンパク質コーディング配列を欠く。いくつかの態様において、前駆RNAは、プラスミドとcircRNAの間の必要な中間体である。
【００７２】
5'および3'相同性アームは、合成配列であり得、機能においては同様であるが、内部ホモロジー領域とは異なる。相同性アームは、例えば約5〜50ヌクレオチド長、約9〜19ヌクレオチド長、例えば約5、約10、約20、約30、約40または約50ヌクレオチド長であり得る。別の態様において、相同性アームは9ヌクレオチド長であり得る。さらなる態様において、相同性アームは19ヌクレオチド長であり得る。いくつかの態様において、相同性アームは、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18または19ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、相同性アームは、50、45、40、35、30、25または20ヌクレオチド長以下である。いくつかの態様において、相同性アームは5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50ヌクレオチド長である。
【００７３】
いくつかの態様において、ベクターはIRES配列を含む。IRES配列は、限定されないが、タウラ症候群ウイルス、サシガメ(Triatoma)ウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルス、シミアンウイルス40、ヒアリウイルス1、ムギクビレアブラムシウイルス、細網内皮症ウイルス、ヒト(fuman)ポリオウイルス1、チャバネアオカメムシ腸管ウイルス、カシミールハチウイルス、ヒトライノウイルス2、ヒメヨコバイ(Homalodisca coagulata)ウイルス-1、ヒト免疫不全ウイルス1型、ヒメヨコバイウイルス-1、ヒメトビ(Himetobi)Pウイルス、C型肝炎ウイルス、A型肝炎ウイルス、GB型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、ヒトエンテロウイルス71、ウマ鼻炎(Equine rhinitis)ウイルス、ウスジロエダシャク(Ectropis obliqua)ピコルナ様ウイルス、脳心筋炎ウイルス(EMCV)、ショウジョウバエCウイルス、アブラナ科トバモ(Crucifer tobamo)ウイルス、クリケット麻痺(Cricket paralysis)ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス1、黒色女王蜂児ウイルス、アブラムシ致死性麻痺(Aphid lethal paralysis)ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、急性麻痺ウイルス、ハイビスカス退緑輪点ウイルス、古典的ブタ熱ウイルス、ヒトFGF2、ヒトSFTPAl、ヒトAMLl/RUNXl、ショウジョウバエアンテナペディア(antennapedia)、ヒトAQP4、ヒトAT1R、ヒトBAG-1、ヒトBCL2、ヒトBiP、ヒトc-IAPl 、ヒトc-myc、ヒトeIF4G、マウスNDST4L、ヒトLEF1、マウスHIF1α、ヒトn.myc、マウスGtx、ヒトp27kipl、ヒトPDGF2/c-sis、ヒトp53、ヒトPim-1、マウスRbm3、ショウジョウバエリーパー(reaper)、イヌスカンパー(Scamper)、ショウジョウバエUbx、ヒトUNR、マウスUtrA、ヒトVEGF-A、ヒトXIAP、ショウジョウバエヘアレス(hairless)、酵母(S. cerevisiae)TFIID、酵母YAP1、ヒトc-src、ヒトFGF-1、サルピコマウイルス(picomavirus)、カブクリンクルウイルス、eIF4Gに対するアプタマー、コクサッキーウイルスB3(CVB3)またはコクサッキーウイルスA(CVB1/2)のIRES配列から選択され得る。野生型IRES配列はまた、本発明において改変され得、有効であり得る。いくつかの態様において、IRES配列は約50ヌクレオチド長である。
【００７４】
いくつかの態様において、細胞内でタンパク質を発現させるために、環状RNAは、例えばリポフェクションまたはエレクトロポレーションを使用して細胞内にトランスフェクトされ得る。別の態様において、環状RNAは、ナノ担体を使用して細胞にトランスフェクトされる。ナノ担体は、例えば脂質、ポリマーまたは脂質-ポリマーハイブリッドであり得る。
【００７５】
環状RNAは、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)系においてRNAをトリス-EDTAまたはクエン酸バッファ中のサイズ排除カラムを通して進ませる方法により精製され得る。一態様において、RNAは、約4〜7の範囲のpH、約0.01〜5mL/分の流速でトリス-EDTAまたはクエン酸バッファ中のサイズ排除カラムを通して進ませる。
【００７６】
ある態様において、鋳型として、本明細書に提供されるベクター(例えば5'相同性アームの上流に配置されるRNAポリメラーゼプロモーターを有する本明細書に提供されるベクター)を使用して、インビトロ転写を実行することにより前駆RNAを作製する方法が本明細書に提供される。
【００７７】
いくつかの態様において、ヌクレオチド、ヌクレオシドまたは本明細書に記載されるインビトロ転写反応において化学的に改変されたヌクレオチドもしくはヌクレオシドの使用は、類似のヌクレオチド三リン酸に対し過剰濃度である。「過剰濃度」は、5'末端ヌクレオチドを変化させる目的で、具体的には5'三リン酸モチーフの含入を防ぐことによりcircRNA調製物の免疫原性を低減するため、または必要な5'一リン酸モチーフを含むことにより前駆体分子の酵素的環状化を可能にするために、類似のヌクレオチド三リン酸の濃度よりも高いものと定義される。
【００７８】
いくつかの態様において、過剰に使用されるヌクレオチドは、グアノシン一リン酸(GMP)である。他の態様において、過剰に使用されるヌクレオチドは、GDP、ADP、CDP、UDP、AMP、CMP、UMP、グアノシン、アデノシン、シチジン、ウリジンまたは任意の化学的に改変されたヌクレオチドもしくはヌクレオシドである。いくつかの態様において、過剰は約10倍過剰である。いくつかの態様において、過剰は約12.5倍過剰である。
【００７９】
一態様において、ヌクレオチド、ヌクレオシドまたは化学的に改変されるヌクレオチドもしくはヌクレオシドは、インビトロ転写反応において類似のヌクレオチド三リン酸の少なくとも約10x過剰の濃度で使用される。
【００８０】
いくつかの態様において、インビトロ転写反応において類似のヌクレオチド三リン酸の少なくとも約10x過剰のヌクレオチド、ヌクレオシドまたは化学的に改変されるヌクレオチドもしくはヌクレオシドの存在下で合成された前駆RNAから生じるcircRNAは、次いでHPLCにより精製され、最小の免疫原性を達成する。
【００８１】
医薬組成物/投与
本開示の態様において、本明細書に記載されるおよび/または本明細書に記載されるベクターおよび/または方法を使用して産生されるcircRNA産物は、組成物、例えば医薬組成物において提供され得る。
【００８２】
そのため、いくつかの態様において、本発明は、組成物、例えばcircRNA (circRNA産物)および薬学的に許容され得る担体を含む組成物にも関する。一局面において、本開示は、本明細書に記載されるcircRNAの有効量および薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物を提供する。本開示の医薬組成物は、本明細書で記載される場合、1つ以上の薬学的または生理学的に許容され得る担体、賦形剤または希釈剤と組み合わせたcircRNAを含み得る。いくつかの態様において、本開示の医薬組成物は、本明細書で記載される場合、1つ以上の薬学的または生理学的に許容され得る担体、賦形剤または希釈剤と組み合わせたcircRNA発現細胞、例えば複数のcircRNA発現細胞を含み得る。
【００８３】
いくつかの態様において、薬学的に許容され得る担体は、被験体に対して無毒性である有効成分以外の医薬組成物中の成分であり得る。
【００８４】
薬学的に許容され得る担体としては、限定されないが、バッファ、賦形剤、安定化剤または保存剤が挙げられ得る。薬学的に許容され得る担体の例は、塩、バッファ、糖類、酸化防止剤、水性もしくは非水性の担体、保存剤、湿潤剤、界面活性剤もしくは乳化剤、またはそれらの組合せなどの、生理学的に適合性である溶媒、分散媒体、コーディング、抗菌および抗真菌剤、等張性剤および吸収遅延剤等である。医薬組成物中の薬学的に許容され得る担体(1つまたは複数)の量は、担体(1つまたは複数)の活性、および安定性および/または最小の酸化などの製剤の所望の特徴に基づいて実験的に決定され得る。
【００８５】
いくつかの態様において、かかる組成物は、例えば酢酸、クエン酸、ヒスチジン、ホウ酸、蟻酸、コハク酸、リン酸、炭酸、リンゴ酸、アスパラギン酸、トリスバッファ、HEPPSO、HEPES、中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水などのバッファ；グルコース、スクロース、マンノース、またはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；酸化防止剤；EDTAまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント(例えば水酸化アルミニウム)；抗菌および抗真菌剤；ならびに保存剤を含み得る。
【００８６】
ある態様において、本開示の組成物は、非経口または非経口でない投与の種々の手段のために製剤化され得る。一態様において、組成物は、注入または静脈内投与のために製剤化され得る。本明細書に開示される組成物は、例えば滅菌液体製剤、例えば所望のpHに緩衝化され得る等張性水溶液、エマルジョン、懸濁液、分散液、または粘性組成物として提供され得る。経口投与に適した製剤としては、液体溶液、カプセル剤、サシェ、錠剤、ロゼンジ、およびトローチ剤、適切な液体およびエマルジョン中の散剤液体懸濁液が挙げられ得る。
【００８７】
一局面において、本開示は、疾患または障害、例えば癌を有するかまたは発症するリスクのある被験体の治療のための、本明細書に記載されるcircRNAを含む組成物の治療有効量を投与することに関する。別の局面において、本開示は、機能性遺伝子の喪失に関連する疾患を有する被験体の治療のための、本明細書に記載されるcircRNAを含む組成物の治療有効量を投与することに関する。
【００８８】
いくつかの態様において、治療は、circRNAからタンパク質への翻訳の延長を意図する。
【００８９】
本開示の医薬組成物は、治療(または予防)される疾患に適した様式で投与され得る。投与の量および頻度は、被験体の状態、ならびに被験体の疾患の型および重症度などの要因により決定されるが、適切な用量は、臨床試験により決定され得る。
【００９０】
用語「治療する(treat)」または「治療(treatment)」は、治療的治療をいい、目的は、望ましくない生理学的変化もしくは疾患を遅延(軽減)すること、または治療の間に有益もしくは望ましい臨床結果を提供することである。有益または望ましい臨床結果としては、検出可能であるかまたは検出可能でないかのいずれにせよ、症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の安定化された(すなわち悪化しない)状態、疾患進行の遅延もしくは遅らせること、疾患状態の改善もしくは一時的緩和、および/または寛解(部分的または全体的のいずれにせよ)が挙げられる。「治療」はまた、被験体が治療を受けていなかった場合の予想される生存と比較した生存の延長を意味し得る。治療を必要とする被験体としては、望ましくない生理学的変化または疾患を既に有する被験体、および生理学的変化または疾患を有する傾向がある被験体が挙げられる。
【００９１】
本明細書において交換可能に使用される「治療有効量」または「有効量」は、必要な用量および期間で、所望の治療結果を達成するために有効な量をいう。治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに治療剤または治療剤の組合せが個体において所望の応答を誘発する能力などの要因に応じて変化し得る。有効な治療剤または治療剤の組合せの例示的な指標としては、例えば患者の満足のいく状態の向上、疾患負荷の低減、疾患の進行の抑止もしくは遅延、および/または体内の他の場所への疾患の進行の非存在が挙げられる。
【００９２】
本明細書で使用する場合、用語「被験体」は動物をいう。用語「被験体」および「患者」は、本明細書において交換可能に使用され得る。このような「被験体」としては、疾患について治療されているまたは疾患を予防されている患者などのヒトが挙げられる。
【００９３】
本明細書で使用する場合、用語「スプライシング部位ジヌクレオチド」は、スプライシング部位と接する2つのヌクレオチドをいう。
【００９４】
いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、任意の分類に属する動物被験体を治療するために使用され得る。かかる動物の例としては、哺乳動物、例えばマウス、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタまたはウマ)が挙げられる。哺乳動物は、サル、ヒトおよび類人猿(ape)であり得る。一態様において、哺乳動物はヒトである。
【００９５】
本発明の態様の情況において有用な送達系としては、組成物の送達が、治療部位の感作の前および感作を引き起こすのに十分な時間で起こるような徐放性、遅延放出、および持続放出の送達系が挙げられ得る。組成物は他の治療剤または療法と合わせて使用され得る。かかる系は、組成物の投与の反復を回避し得、それにより被験体および医師に対する利便性が高められ、本発明の特定の組成物態様に特に適切であり得る。
【００９６】
放出送達系は、ポリマーベース系、例えばポリ(ラクチド-グリコリド)、コポリオキサレート、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ無水物を含む。薬物を含む前述のポリマーの微小カプセルは、例えば米国特許第5,075,109号に記載される。送達系はまた、ステロール、例えばコレステロール、コレステロールエステル、ならびに脂肪酸または中性脂肪、例えばモノ-ジ-およびトリグリセリドを含む脂肪である非ポリマー系；サイラスティック(sylastic)系；ペプチドベース系；ヒドロゲル放出系；ワックスコーティング；従来の結合剤および賦形剤を用いた圧縮錠剤；部分融合埋没物等を含む。いくつかの態様において、脂質ナノ粒子またはポリマーは、RNAの組織への送達を含む本明細書に記載される治療用circRNAのための送達ビヒクルとして使用される。
【００９７】
ある態様において、組成物の投与は、例えば、エアゾール吸入、注射、注入、摂取、輸血、埋め込みまたは移植によるものを含む非経口または非経口でない投与により任意の様式で実施され得る。例えば、本明細書に記載される組成物は、経動脈、皮内、皮下、腫瘍内、骨髄内、結節内、筋内、静脈内(i.v.)注射により、鼻腔内、鞘内または腹腔内で患者に投与され得る。一局面において、本開示の組成物は、静脈内投与される。一局面において、本開示の組成物は、皮内または皮下注射により被験体に投与される。該組成物は、例えば腫瘍、リンパ節、組織、臓器または感染の部位に直接注射され得る。
【００９８】
一態様において、投与は、1日、2日、3日、4日、5日、6日、1週間、2週間、3週間、1か月、5週間、6週間、7週間、2か月、3か月、4か月、5か月、6か月またはそれ以上の後に反復され得る。治療の反復経過も、慢性投与と同様に可能である。反復投与は、同じ用量または異なる用量であり得る。
【００９９】
いくつかの態様において、組成物は、例えば6か月以上の期間で1週間に1回などの維持療法により本発明の方法において投与され得る。
【０１００】
一態様において、細胞は、導入の4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15日後に本明細書に記載されるcircRNAを一過的に発現し得る。circRNAの一過的な発現は、送達方法により影響を受け得る。一態様において、circRNAはエレクトロポレーションにより細胞に形質導入される。一態様において、circRNAは、当該技術分野で公知の脂質トランスフェクション法により細胞に導入される。
【０１０１】
いくつかの態様において、本明細書に記載されるcircRNAは、他の公知の薬剤および療法と組み合わせて使用され得る。本明細書で使用する場合、「組み合わせて」投与される、は、2つ(またはそれ以上)の異なる治療を、被験体の治療の経過の間に被験体に送達し、例えば2以上の治療は、被験体が疾患を有すると診断された後および疾患が治癒されるかもしくは排除される、または治療が他の理由で停止される前に送達されることを意味する。いくつかの態様において、1つの治療の送達は、第2の送達が開始する際に依然として行われるので、投与に関する重複がある。本明細書において、これは時々、「同時(simultaneous)」または「同時(concurrent)送達」と称される。他の態様において、1つの治療の送達は、他の治療の送達が開始する前に終了する。いずれかの場合のいくつかの態様において、治療は、組み合された投与であるためにより効果的である。例えば、第2の治療はより効果的であり、例えばより少ない第2の治療により同等の効果が見られるか、または第2の治療は、第1の治療の非存在下で第2の治療が投与された場合に見られるよりも高い程度まで症状を低減するか、または第1の治療により類似の情況が見られる。いくつかの態様において、送達は、症状の低減または障害に関連する他のパラメーターが、他の治療の非存在下で送達される1つの治療により観察されるものよりも大きくなるようなものである。2つの治療の効果は部分的に相加的、全体的に相加的または相加的よりも大きくあり得る。送達は、送達される第1の治療の効果が、第2の治療が送達される場合に依然として検出可能であるようなものであり得る。
【０１０２】
さらなる態様において、本明細書に記載される組成物は、手術、放射線、化学療法、抗体または他の薬剤と組み合わせた治療計画において使用され得る。
【実施例】
【０１０３】
実施例
実施例1
外来RNA環状化のための３つの一般的な戦略がある: 臭化シアンまたは類似の縮合剤を使用する化学的方法、RNAまたはDNAリガーゼを使用する酵素的方法、および自己スプライシングイントロンを使用するリボザイム的方法(Petkovic, S. & Muller, S., "RNA circularization strategies in vivo and in vitro," Nucleic Acids Research, 43(4):2454-2465 (2015); Beadudry, D. & Perreault, J., "An efficient strategy for the synthesis of circular RNA molecules," Nucleic Acids Research, 23(15):3064-3066 (1995); Micura, R., "Cyclic Oligoribonucleotides (RNA) by Solid-Phase Synthesis, " Chemistry - A European Journal, 5(7):2077-2082 (1999))。順序を変えられた（permuted）群I触媒イントロンを使用するリボザイム的方法は、長いRNAの環状化に、より適用可能であると報告され、補因子としてGTPおよびMg2+の添加のみを必要とする。(Petkovic, S. & Muller, S., "RNA circularization strategies in vivo and in vitro," Nucleic Acids Research, 43(4):2454-2465 (2015))。この順序を変えられたイントロン-エキソン(PIE)スプライシング戦略は、半イントロン配列が側方に位置する融合した部分エキソンからなる(Puttaraju, M. & Been, M., "Group I permuted intron-exon (PIE) sequences self-splice to produce circular exons," Nucleic Acids Research, 20(20):5357-5364 (1992))。インビトロでは、これらの構築物は、群I触媒イントロンに特徴的な二重トランスエステル化反応を受けるが、エキソンは既に融合しているので、共有結合的に5'から3'連結している環として切除される(図1A) (Petkovic, S. & Muller, S., "RNA circularization strategies in vivo and in vitro, " Nucleic Acids Research, 43(4):2454-2465 (2015))。この戦略をタンパク質コード環状RNAを作製するための開始点として使用して、順序を変えられた群I触媒イントロンの3'および5'イントロンの間の全長脳心筋炎ウイルス(EMCV)IRESを含む1.1kb配列、ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼ(GLuc)メッセージ、およびPIE構築物のエキソン断片(E1およびE2)に対応する２つの短い領域を、T4ファージのチミジル酸シンターゼ(Td)遺伝子に挿入した(図1A、表1)(Ford, E. & Ares, M., "Synthesis of circular RNA in bacteria and yeast using RNA cyclase ribozymes derived from a group I intron of phage T4, " Proceedings of the National Academy of Sciences, 91(8):3117-3121 (1994))。本質的に、より短いRNAの環状化のために以前に記載されるとおりに、前駆RNAをランオフ（run-off）転写により合成し、次いで、マグネシウムイオンおよびGTPの存在下で加熱し、環状化を促進した(Ford, E. & Ares, M., "Synthesis of circular RNA in bacteria and yeast using RNA cyclase ribozymes derived from a group I intron of phage T4," Proceedings of the National Academy of Sciences, 91(8):3117-3121 (1994))。しかし, スプライシング産物は得られなかった。スプライシング部位の間の長い介在領域が、スプライシング部位が互いに相互作用し、安定な複合体を形成する能力を低減し得、スプライシング効率を低減し得ると推測された。実際、ネイティブの群Iイントロンの5'および3'スプライシング部位の間の介在領域は、平均して300〜500ヌクレオチド長であり、我々が構築した遺伝子操作されたRNAの介在領域は、2〜4倍長かった(Vicens, Q., et al., "Toward predicting self-splicing and protein-facilitated splicing of group I introns, " RNA, 14(10):2013-2029 (2008))。従って、完全に相補的な「相同性アーム」9(弱い)または19(強い)ヌクレオチド長を、設計し、5'および3'スプライシング部位を互いに近接させる目的で、前駆RNAの5'および3'末端に配置した(図1B、表1)。これらの相同性アームの付加により、前駆RNAバ��ドの消失により評価した場合、スプライシング効率が、弱い相同性アームについては、0%〜16%に増大し、強い相同性アームについては、48%に増大した(図1C)。主要なスプライシング産物が環状であったことを確実にするために、スプライシング反応物を、RNase Rで処理した(図1D)。RNase R処理したスプライシング反応物の推定スプライシング接合部にわたる配列決定により、連結されたエキソンが明らかになり、RNase R処理したスプライシング反応物のオリゴヌクレオチド標的化RNase Hでの消化により、RNase H消化した直鎖前駆体により２つのバンドが生じるのとは対照的に、１つのバンドが生じた(図1Dおよび図1E)。これらのデータは、circRNAがこれらのスプライシング反応の主要な産物であること、およびアガロースゲル電気泳動により、環状スプライシング産物の、直鎖前駆体分子、ニックの入った環、スプライシング中間体、および切除されたイントロンからの単純かつ効果的な分離が可能になることを示す。
【０１０４】
自己スプライシング前駆RNAからのcircRNA生成の効率のさらなる改善のために、成功裡の環状化に影響し得る他の要素を考察した。3'PIEスプライシング 部位はIRESの近位にあり、両方の配列は高度に構造化している（structured）ので、IRES内の配列は、長距離の接触を介して3'スプライシング部位で近位にまたは5'スプライシング部位で遠位にのいずれかで、スプライシングリボザイムのフォールディングに干渉し得ると仮定された。これらの構造を独立にフォールディングさせるために、3'PIEスプライシング部位とIRESの間の一連のスペーサーを設計し、いずれがスプライシングを許容するまたは破壊する（disrupt）かを予測した(図1F、表1)。許容性スペーサーは、リボザイム活性に重要であり得るイントロン配列内に存在する二次構造を保存するために設計され、破壊性スペーサーは、両方のイントロンハーフ、特に5'ハーフ内の配列を破壊するために設計された。スプライシングを許容すると予測されるスペーサー配列の付加により、スプライシング効率は、46%から87%に上昇し(P1およびP2)、破壊性スペーサー配列の付加により、スプライシングは完全に排除された(図1G)。相同性アームおよび合理的に設計されたスペーサーの両方を含むこの改善された構築物は、5kb長にほぼ等しいRNAを環状化し得た(図4)。アナベナ属プレ-tRNA由来の代替的な群I触媒イントロンの使用も、調査された(Puttaraju, M. & Been, M., "Group I permuted intron-exon (PIE) sequences self-splice to produce circular exons," Nucleic Acids Research, 20(20):5357-5364 (1992))。順序を変えられたT4ファージイントロンスプライシング反応の効率を増大させるために使用された同じ最適化技術を、適用した。興味深いことに、我々の最適化の間、T4触媒イントロンからアナベナ属触媒イントロンへの交換により、IRESとコード領域の3'末端の間の短いストレッチの内部ホモロジーの弱化が生じ得、これが、単離された「スプライシングバブル」の形成を補助し得たことが注目された(図1H)。この内部ホモロジーの強化により、順序を変えられたアナベナ属触媒イントロンを使用して、スプライシング効率が84%から95%へとさらに増大した(図1Hおよび図1I、表1)。アナベナ属触媒イントロンの使用により、T4触媒イントロンに比べて、circRNAニック形成の37%の低減を生じた(図1Iおよび図1J)。増大したスプライシング効率およびインタクトのcircRNA産出のために、遺伝子操作されたアナベナ属PIE系は、遺伝子操作されたT4 PIE系よりも全体的に優れていることが示された(図1J)。
【０１０５】
エキソン2とGLucコード配列の間の内部ホモロジーにより、最適化されたアナベナ属PIE系は、非GLuc介在領域と不適合となった。circRNA構築物を種々の長い介在RNA配列の効率的な環状化に適合させるために、一対のスペーサー配列を、順序を変えられた触媒群Iイントロンスプライシング効力に影響するパラメーターの理解に基づいて、デノボ設計した。これらのスペーサー配列を、以下の３つの優先順位でもって遺伝子操作した：1)近位のイントロン構造およびIRES構造のフォールディングに関して不活性であること; 2)イントロン構造およびIRES二次構造を十分に分離すること;ならびに3)「スプライシングバブル」の形成を促進するために、スペーサー-スペーサー相補性の領域を含むこと(図2A、表1)。前駆体分子の5'および3'末端の相同性アームも含まれた。これらの配列の間に、EMCV IRESならびにガウシアルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、eGFP、ヒトエリスロポエチン、およびCas9エンドヌクレアーゼを含む５つの異なるタンパク質に対するコード領域を挿入した。５つ全てのRNA配列の環状化を達成した(図2B、表1); 環状化効率は、段階的に設計した構築物の環状化効率に一致し(図1J)、挿入物の間で高度に再現性があったが、サイズに依存もし、長いRNAsは環状化の効率が低かった (図5A)。さらに、長いcircRNAは、マグネシウムイオンの存在下で、ニック形成する傾向がより高く、インビトロ転写およびRNase R消化の間およびその後にニックの入ったcircRNAの蓄積が生じ、これにより、RNase R処理試料の全収率および純度が低減したことが見出された(図2Bおよび図2C、図5A)。RNase Rは、耐性のアナベナ属イントロン(図2B、底のバンド)または環状連鎖物（concatenation）を完全には消化しなかった(図2B、最も上のバンド)。
【０１０６】
内因性のcircRNAは、少量のタンパク質を生成し得ることが示されている(Legnini, I. et al., "Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis," Molecular Cell, 66(1):22-37.e9 (2017)).遺伝子操作されたcircRNAsがタンパク質を生成する能力の評価手段として、各構築物のRNase R消化スプライシング反応物をヒト胚性腎臓細胞(HEK293)にトランスフェクトした。ガウシアまたはホタルルシフェラーゼcircRNAのトランスフェクションにより、発光により測定した場合、機能的タンパク質の確固たる（robust）生成を生じた(図2Dおよび図2G)。同様に、ヒトエリスロポエチンを、エリスロポエチンcircRNAのトランスフェクション由来の細胞培養培地中に検出し、EGFP蛍光を、EGFP circRNAのトランスフェクションから観察した(図2Eおよび図2F)。Cas9 circRNA とGFPに対するsgRNAのGFPを構成的に発現するHEK293細胞への共トランスフェクションにより、sgRNAのみの対照に比べて、細胞の97%までで蛍光が消失した（ablated）(図2Hおよび図2I)。スプライシング反応物のRNase R消化はいつも完了しているわけではなく、前駆RNAは機能的IRESを含むので、GLuc構築物のスプライシング部位欠失変異体を、タンパク質発現に対する不純物の潜在的寄与を測定するために、作製した。RNase-R消化スプライシング反応物に対して等しい重量でトランスフェクトされた場合、このスプライシング部位欠失変異体は、わずかに検出可能なレベルのタンパク質を生成した(図5Bおよび図5C)。
【０１０７】
現存する直鎖mRNA技術の信頼できる代替物としての外来circRNAを確立するために、タンパク質発現を最大にすることが望ましい。IRESにより媒介されるCap-非依存的翻訳は、細胞背景に依存して種々のレベルの効率を示し得、バイシストロニック直鎖mRNAに含まれた場合、cap依存的翻訳よりも効率が低いと一般的に考えられている(Borman, A. M. et al., "Comparison of Picornaviral IRES-Driven Internal Initiation of Translation in Cultured Cells of Different Origins," Nucleic Acids Research, 25(5):925-932 (1997))。同様に、ポリAテイルは、ポリアデニル酸結合タンパク質の作用により、直鎖mRNAにおいて翻訳開始効率を安定化し改善する(Imataka, H., "A newly identified N-terminal amino acid sequence of human eIF4G binds poly(A)-binding protein and functions in poly(A)-dependent translation," The EMBO Journal, 17.24:7480-489 (1998); Kahvejian, A. et al., "Mammalian poly(A)-binding protein is a eukaryotic translation initiation factor, which acts via multiple mechanisms," Genes & Development, 19(1):104-113 (2005))。しかし、異なるIRES配列の効率およびcircRNAの背景内のポリAトラクトの含入は、調査されてこなかった。EMCV IRESを、公知または推定のIRES、ならびにいくつかの他の推定IRES配列を含むいくつかのウイルス転写物由来の5'UTR配列と交換した(表1、図6A)(Weingarten-Gabbay, S. et al., "Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes," Science, 351(6270) (2016))。コクサッキーウイルスB3(CVB3)由来のIRESは、HEK293細胞中で、一般に採用されるEMCV IRESよりも1.5倍より効果的であったことが見出された (図3A)。IRESの直後のコード領域内を含めてIRESに近位の二次構造は、IRESフォールディングおよび翻訳開始を破壊する可能性を有するので、選択されたウイルスIRES配列を、ホタルルシフェラーゼの背景で試験した。CVB3 IRESは他の全てよりもなお優れており、その一方で、いくつかの他のIRES、最も顕著には、ポリオウイルスIRESの効力は、劇的に変化した(図3B)。内部ポリA配列またはポリACスペーサー対照のIRES配列への付加を試験し、遺伝子操作されたcircRNAからのバックグラウンドレベルを超えるタンパク質生成を駆動する能力が、タンパク質発現を変更することを示した。両方の配列は、全ての構築物において発現を改善し、これは、おそらく、安定な構造を維持すると予測されるIRES配列の開始とエキソン-エキソンスプライシング接合部の間のより大きく非構造化した分離のためであることが見出された(図3B、図6B)。このより大きな程度の非構造化した分離は、開始因子のIRES構造への結合を妨げる立体障害を低減し得る。EMCVおよびポリオウイルスIRESの場合において、ポリA配列は、非構造化したポリACスペーサーで見られる改善を超えて発現を改善させた。これは、ポリアデニル酸結合タンパク質の会合がIRES効率を増強させ得ることを示唆し得る。各IRESについて最も効果的なポリAまたはポリAC構築物を選択した後、ヒト子宮頸部腺癌(HeLa)、ヒト肺癌(A549)、および不死化マウス膵臓β細胞(Min6)を含む種々の細胞型においてIRES効力を調査した。jIRES効力は型に依存して変化したが、CVB3 IRESは、試験した全ての型において優れていた(図3C、図6Cおよび図6D)。
【０１０８】
circRNA調製物の純度は、circRNAからのタンパク質生成の最大化のために、および先天的な細胞性免疫応答を回避するために必須の別の要素である。HPLCによるdsRNAの除去により、免疫活性化は排除され、直鎖ヌクレオシド改変IVT mRNAの翻訳が改善されることが示された(Kariko, K. et al., "Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA," Nucleic Acids Research, 39(21):e142-e142 (2011))。しかし、IVTおよび環状化反応の副産物からのcircRNAの精製のための大規模に実現可能な方法は報告されておらず、該副産物は、dsRNAおよび三リン酸RNAを含み、これらは、RNAセンサーにかみ合い得、細胞性免疫応答を誘導し得る(Kariko, K. et al., "Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA," Nucleic Acids Research, 39(21):e142-e142 (2011))。ニックの入ったcircRNAの完全な回避は、プロセシングの間の穏やかな分解のために、できない（untenable）が、実質的に純粋な(90%環状、10%ニックの入った)circRNAを、スプライシング反応開始物質の少量についてはゲル抽出を使用して、大量については、サイズ排除HPLCを使用して得た(図3Dおよび図3E)。両方の場合において、精製の後に、RNase R処理を行い、大多数の分解RNAを除去した。ゲル抽出またはHPLC精製circRNAのタンパク質発現とRNase-R消化スプライシング反応を比較した場合、HPLC精製は、RNAse-R消化単独を凌ぐ優れた精製方法であることが見出された(図3Eおよび図3F)。
【０１０９】
外来circRNA翻訳効率が直鎖mRNAの翻訳効率と同等であるかどうか、およびcircRNAタンパク質生成が安定性において差異を示すかどうかは、不明である。HPLC精製された遺伝子操作されたcircRNAを使用して、ガウシアルシフェラーゼコードcircRNA(CVB3-GLuc-pAC)の安定性および効力を、等モル量の古典的な非改変5'メチルグアノシンキャップされ3'ポリAテイル付きの直鎖GLuc mRNA、および市販のヌクレオシド改変直鎖GLuc mRNA(Trilink)と比較した。トランスフェクションの24時間後の発光により評価されるタンパク質生成により、circRNAは、HEK293細胞中でこの初期の時点において、非改変直鎖mRNAより811.2%多いタンパク質を生成したことが明らかになった(図3H)。興味深いことに、circRNAはまた、改変されたmRNAよりも54.5%多いタンパク質を生成し、これは、ヌクレオシド改変は、circRNAからの確固たるタンパク質生成に必要というわけではないことを示した。同様の結果は、HeLa細胞において得られた(図3H)。6日にわたって収集された発光データは、circRNAからのタンパク質生成は、HEK293細胞中で、直鎖mRNAからのタンパク質生成に比べて、延ばされ、circRNAは、80時間のタンパク質生成半減期を示し、非改変および改変された直鎖mRNAからのタンパク質生成の半減期は、それぞれ、約43および45時間であった(図3I)。発現または安定性の増大のために、circRNAはまた、その寿命の間に、非改変および改変された直鎖mRNAの両方よりも実質的に多いタンパク質を生成した(図3Jおよび図3K)。HeLa細胞において、circRNAは、116時間のタンパク質生成半減期を示し、非改変および改変された直鎖mRNAからのタンパク質生成の半減期は、それぞれ、約44および49時間であった(図3I)。これにより、また、非改変および改変された直鎖mRNAの両方に比べて、その寿命にわたってcircRNAからの実質的に多いタンパク質生成を生じた(図3Jおよび図3K)。
【０１１０】
外来mRNAから安定なタンパク質生成を得ることは、mRNAバイオテクノロジーの長年にわたる目標であった。環状RNAをこの目的に適合させる可能性は、低いcircRNA生成効率、精製の困難さ、および弱いタンパク質発現により抑えられてきた。実際、これらの障害は、circRNAからのタンパク質生成の安定性が十分に評価され得る前に克服されなければならない。本明細書に記載される相同性アームおよびスペーサーを含んだベクターを使用するモジュール状の順序を変えられた群1触媒イントロン系の系により、広範囲の長いRNAの効率的な環状化が可能になる。さらに、最適化されたcircRNAは大量のタンパク質を生成し得ること、および該circRNAはHPLCにより、効果的に精製され得ることが示された。最後に、circRNAは、非改変および改変された直鎖RNAよりも長い持続時間の間、より多くの量のタンパク質を生成し得ることが示され、これは、circRNAが、治療的タンパク質の安定な発現のために、mRNAに対する代替としての可能性を保持する証拠を提供した。
【０１１１】
図17の結果は、最適状態に及ばない構築物を用いたRNA環状化が、温度の上昇により促進され得るが、分解の増大というという犠牲を払うことを示す。
【０１１２】
図18A〜Cの結果は、環状化がGTP濃度に感受性であり、RNA濃度に非感受性であり、ゲル上の２つのバンドは入れ代わらないことを示し(それぞれ、A、B、C)；これはまた、強い相同性アーム/5'スペーサー環状化の例である。
【０１１３】
図19の結果は、非最適化circRNA構築物-スペーサーなし、強い相同性アームからの低いタンパク質発現を示し；circRNA発現/安定性に対する精製の重要性を示すものである。
【０１１４】
図20AおよびBの結果は、UTRが、circRNAからの発現を改善し得ることを示す。図20Cの結果は、5'スペーサーと組み合わせて使用した場合、UTRの付加という発現利益が消失することを示し、UTRはスペーサーとして作用し得ることを示唆する。図20Dの結果は、全て同じスペーサー/相同性アームを使用するUTR含有構築物の効率的な環状化を示す。
【０１１５】
図21A〜Gの結果は、異なるIRESまたはスペーサー配列を使用する発現アッセイを示す。図EおよびF中のpA/UTR条件は、EMCV IRESを使用し、いくつかの場合、CVB3 IRESのレベルまで発現を改善し得る。図Gは、トランスフェクション試薬およびナノ粒子の比較を示し;ここでは違いは見られない。
【０１１６】
図22AおよびBの結果は、(現在の設計したスペーサーに加えて)異なる5'または3'スペーサーの付加により発現が調節され得ることを示す。
【０１１７】
図23AおよびBの結果は、イントロンは、種々の程度まで種々のIRES配列からの翻訳に干渉し得;アナベナ属は、CVB3/polioV IRESにより少なく干渉し、T4ファージは、EMCVにより少なく干渉することを示す。図23Bは、種々のIRESのインビボ評価を示す(LNPを介するマウス肝臓)。
【０１１８】
図24の結果は、哺乳動物細胞中でcircRNA前駆体分子の転写を促進するプラスミドが、スプライシング部位を欠失した同じcircRNA前駆体分子の転写を促進するプラスミドに比べて、増大したタンパク質翻訳を示さないことを示し、環状化は哺乳動物細胞中では生じないことを示唆する。
【０１１９】
図25Aおよび25Bの結果は、ガウシア（gaussian）またはホタルルシフェラーゼコード領域のいずれかと共にIRES配列のパネルを含む構築物の環状化効率-効率は、挿入物を変更したにも関わらず一致することを示す。これらの構築物は全て、同じスプライシング配列を有する(スペーサー、相同性アーム、および内部ホモロジーにより画定される(該内部ホモロジーは、スペーサーの一部である。
【０１２０】
図26Aおよび26Bの結果は、(グアノシン三リン酸を超えて過剰に)グアノシン一リン酸をインビトロ転写反応にスパイク（spiking in）することにより、circRNA調製物の免疫原性が低下することを示す。グアノシン一リン酸は、感受性の細胞についてHPLCと組み合わせて最も使用されている。
【０１２１】
材料および方法
クローニングおよび突然変異誘発
タンパク質コード群I自己スプライシングイントロン、およびIRES配列を、化学的に合成し(Integrated DNA Technologies)、NEBuilder HiFi DNA Assemblyキット(New England Biolabs)を使用するGibsonアセンブリにより、T7 RNA ポリメラーゼプロモーターを含むPCR線状化プラスミドベクターにクローニングした。スペーサー領域、相同性アーム、および他の軽微な変更を、Q5 Site Directed Mutagenesis Kit (New England Biolabs)を使用して導入した。
【０１２２】
circRNA設計、合成、および精製
RNA構造を、RNAFoldを使用して予測した(Vicens, Q. et al., "Toward predicting self-splicing and protein-facilitated splicing of group I introns," RNA, 14(10):2013-2029 (2008))。改変された直鎖GLuc mRNAを、Trilink Biotechnologiesから得た。非改変直鎖mRNAまたはcircRNA前駆体を、T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs)を使用して、線状化プラスミドDNA鋳型からインビトロ転写により合成した。インビトロ転写の後、反応物を、DNase I (New England Biolabs)で20分間処理した。DNase処理の後、非改変直鎖mRNAを、MEGAclear Transcription Clean-upキット(Ambion)を使用してカラム精製した。次いで、RNAを、70℃で5分間加熱し、直ちに、氷上に3分間配置し、その後、RNAを、製造業者の指示書に従って、mRNAキャップ-2'-O-メチルトランスフェラーゼ(NEB)およびワクシニアキャッピング酵素(NEB)を使用してキャップした。ポリアデノシンテイルを、製造業者の指示書に従って大腸菌ポリAポリメラーゼ(NEB)を使用して、キャップされた直鎖転写物に付加し、十分に処理されたmRNAを、カラム精製した。circRNAについては、DNase処理の後、さらなるGTPを、2mMの終濃度まで添加し、次いで、反応物を、55℃で15分間加熱した。次いで、RNAを、カラム精製した。いくつかの場合、精製されたRNAを再環状化し：RNAを、70℃で5分間加熱し、次いで、直ちに、氷上に3分間配置し、その後、マグネシウムを含むバッファ(50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT、pH7.5; New England Biolabs)と共に、GTPを、2mMの終濃度まで添加した。次いで、RNAを、55℃で8分間加熱し、次いで、カラム精製した。circRNAを富化するために、20μgのRNAを、水で希釈し(86uL最終容量)、次いで、65℃で3分間加熱し、氷上で3分間冷却した。20U RNase Rおよび10uLの10x RNase R バッファ(Epicenter)を添加し、反応物を、37℃で15分間インキュベートし、さらなる10U RNase Rを、反応の中の（through the reaction）中間点で添加した。RNase R消化RNAを、カラム精製した。RNAを、E-ゲルEX 1〜2%プログラムを使用して、E-ゲルiBase (Invitrogen)上のプレキャスト2% E-ゲルEX アガロースゲル (Invitrogen)上で分離した。他のアガロースゲル系を使用すると、十分なcircRNA分離は、得られなかった。バンドを、ブルーライト透視を使用して可視化し、ImageJを使用して定量化した。ゲル抽出については、circRNAに対応するバンドを、ゲルから切り出し、次いで、Zymoclean Gel RNA Extraction Kit (Zymogen)を使用して抽出した。高速液体クロマトグラフィーについては、30μgのRNAを、65℃で3分間加熱し、次いで、氷上に3分間配置した。RNAを、Agilent 1100 Series HPLC (Agilent)上の5μmの粒径および200Åの孔径を有する4.6x300mm サイズ排除カラム(Sepax Technologies;部品番号: 215980P-4630)を通してランした。RNAは、0.3mL/分の流量でRNase-フリーTEバッファ(10mM Tris、1mM EDTA、pH:6)中をランした。RNAを、260nmのUV吸光度で検出したが、UV検出なしで回収した。得られたRNA画分を、5M 酢酸アンモニウムで沈殿させ、水で再懸濁し、次いで、いくつかの場合、上記されるように、RNase Rで処理した。
【０１２３】
RNase Hニック形成分析
RNase RでcircRNAについて富化し、次いで、カラム精製したスプライシング反応物を、5倍モル過剰のDNAプローブ(表1)の存在下で65℃で5分間加熱し、次いで、室温でアニーリングした。反応物を、提供された反応バッファ中37Cで15分間RNase H (New England Biolabs)で処理した。RNAを、消化の後、カラム精製した。
【０１２４】
逆転写およびcDNA合成
スプライシング接合部配列決定について、RNase RでcircRNAについて富化し、次いで、カラム精製したスプライシング反応物を、65℃で5分間加熱し、氷上で3分間冷却し、二次構造を標準化した。逆転写反応を、推定circRNAの内部の領域に特異的なプライマーを使用して、製造業者の推奨どおりにSuperscript IV (Invitrogen)を用いて実施した。配列決定のためのPCR 産物を、Q5ポリメラーゼ(New England Biolabs)およびスプライシング接合部にわたる一対のプライマーを使用して合成した。
【０１２５】
組織培養およびトランスフェクション
HEK293、HEK293-GFP、HeLa、およびA549細胞を、37℃および5% CO2で10%加熱不活性化ウシ胎仔血清(hiFBS, Gibco)およびペニシリン/ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地(4500mg/Lグルコース)中で培養した。Min6培地に、さらに、5% hiFBS、20mM HEPES (Gibco) および50μM β-メルカプトエタノール(BioRad)を補充した. 細胞を、2〜3日毎に継代した。Cas9以外の図2に示される全てのcircRNAデータセットについて、40〜100ngのRNase R処理スプライシング反応物またはHPLC精製されたcircRNAを、製造業者の指示書に従ってLipofectamine MessengerMax (Invitrogen)を使用して、96ウェルプレートのウェルあたり10,000 HEK293細胞/100uLに逆トランスフェクトした。Cas9について、100ngのインビトロ転写したsgRNAを、MessengerMaxを使用して24ウェルプレートのウェルあたり50,000 HEK293-GFP細胞/500uLに、単独で逆トランスフェクトしたか、または150ngのRNase R処理Cas9スプライシング反応物と共トランスフェクトした。図3に示される全てのRNAデータセットについて、等モル量の各RNAを、MessengerMaxを使用して96ウェルプレートのウェルあたり10,000 HEK293、HeLa、またはA549細胞/100uLに逆トランスフェクトした。Min6細胞を、60〜80%のコンフルエンシーで96ウェルプレート形式で、トランスフェクトした。
【０１２６】
タンパク質発現分析
発光アッセイのために、細胞および培地を、トランスフェクション後24時間で回収した。ガウシアルシフェラーゼからの発光を検出するために、10〜20uLの組織培養培地を、平底白色壁（white-walled）プレート(Corning)に移した。25uLの安定化剤を含むBioLux Gaussia Luciferase試薬(New England Biolabs)を、各試料に添加し、発光を、45秒後に、Infinite 200Pro Microplate Reader (Tecan)上で測定した。ホタルルシフェラーゼからの発光を検出するために、100uLのBright-Glo Luciferase試薬(Promega)を、各ウェルに添加し、混合し、5分間インキュベートした。次いで、100uLの培養培地およびルシフェラーゼ試薬混合物を、平底白色壁プレートに移し、上記されるように、発光を検出した。GFP蛍光を、トランスフェクションの24時間後に検出し、画像を、EVOS FL細胞イメージャ(Invitrogen)を使用して取得した。エリスロポエチンを、トランスフェクションの24時間後の細胞培養上清を使用し、試料を、使用前に1:200希釈した以外は製造業者の指示書に本質的に従って、固相サンドイッチELISA(R&D Systems)により検出した。
【０１２７】
フローサイトメトリー
CRISPR-Cas9媒介GFP除去（ablation）を、トランスフェクションの96時間後フローサイトメトリーにより検出した。HEK293-GFPおよびHEK293対照細胞を、トリプシン処理し、10%ウシ胎仔血清およびペニシリン/ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地(4500mg/Lグルコース)中に懸濁した。次いで、細胞を、FACSバッファ(PBS、5%加熱不活性化ウシ胎仔血清)中で2回洗浄し、製造業者の指示書に従ってSytox Blue Dead Cell Stain (Thermo Fisher)を含むFACSバッファ、またはGFPおよびブランク対照についてはFACSバッファ単独に再懸濁した。蛍光を、BD FACSCelestaフローサイトメーター(BD Biosciences)上で10,000事象について検出した。データを、Flowjo (Flowjo LLC)において分析した。
【０１２８】
統計
結果の統計分析を、等しくない分散と仮定して、両側かつ対応のないWelchのt検定により実施した。差は、p<0.05の場合に、有意とみなした。個々の実験の統計的な詳細を、図の説明に示す。
【０１２９】
実施例2
環状RNA(circRNA)は、安定性が増大した連続的な構造を有し、種々の細胞性タンパク質との相互作用に必要な末端モチーフを欠失している一本鎖RNAのクラスである。本明細書において、非改変外来circRNAが、細胞性RNAセンサーを回避し得、それにより、RIG-Iおよびトール様受容体(TLR)コンピテント（competent）細胞およびマウスにおいて、免疫応答の誘発を回避することを示す。circRNA調製物の免疫原性およびタンパク質発現安定性は、純度に依存し、少量の夾雑した直鎖RNAにより確固たる細胞性免疫応答が導かれることが見出される。非改変circRNAは、一部TLR検知の回避によるが、インビトロで非改変直鎖mRNAより免疫原性が低く、ウリジン改変直鎖mRNAにより誘導されるものと同様のサイトカイン応答を誘発する。さらに、circRNAのウリジン改変は、内部リボソーム進入部位(IRES)媒介翻訳を破壊し、サイトカイン応答に対して有意な効果を有さないことが見出された。最後に、データは、インビボでの外来circRNA送達および翻訳の最初の証明を示し、データは、circRNA翻訳が、非改変およびウリジン改変直鎖mRNAに比べて、脂肪組織に拡大されることを示す。
【０１３０】
導入
CircRNAは、ある範囲のタンパク質コードおよび非コード機能を有するRNAのクラスである(Legnini, I. et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis. Mol. Cell 66, 22-37.e9 (2017); Li, Z. et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 256-264 (2015); Hansen, T. B. et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature 495, 384-388 (2013);およびBarrett, S. P. & Salzman, J. Circular RNAs: analysis, expression and potential functions. Development 143, 1838-1847 (2016)。真核生物細胞は、バックスプライシングによりcircRNAを生じ、一方、D型肝炎ウイルスおよび植物ウイロイドなどのウイルス病原体のゲノムもまた環状であり得る(Chen, L.-L. & Yang, L. Regulation of circRNA biogenesis. RNA Biol. 12, 381-388 (2015); Jeck, W. R. & Sharpless, N. E. Detecting and characterizing circular RNAs. Nat. Biotechnol. 32, 453-461 (2014); Wang, Y. & Wang, Z. Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs. RNA 21, 172-179 (2014); Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J. & Kleinschmidt, A. K. Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 3852-3856 (1976); Kos, A., Dijkema, R., Arnberg, A. C., van der Meide, P. H. & Schellekens, H. The hepatitis delta (delta) virus possesses a circular RNA. Nature 323, 558-560 (1986); Chen, Y. G. et al. Sensing Self and Foreign Circular RNAs by Intron Identity. Mol. Cell 67, 228-238.e5 (2017))。細胞が、RIG-1を外来circRNAの細胞質センサーとして使用する内因性circRNAと外来circRNAを区別するためのスプライシング依存性機構を進化させたことが最近提唱された(Chen, Y. G. et al. Sensing Self and Foreign Circular RNAs by Intron Identity. Mol. Cell 67, 228-238.e5 (2017))。circRNAは、RIG-I活性化に古典的に必要とされる三リン酸モチーフを含まないが、RIG-Iは、宿主核タンパク質の全くないcircRNAと一過的に相互作用し得、それにより、古典的なRIG-I媒介抗ウイルス応答が導かれ得ることが示唆された(Chen, Y. G. et al. Sensing Self and Foreign Circular RNAs by Intron Identity. Mol. Cell 67, 228-238.e5 (2017); Loo, Y. M. & Gale, M., Jr. Immune signaling by RIG-I-like receptors. - PubMed - NCBI. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21616437. (Accessed: 7th May 2018)). しかし、circRNAのRIG-I媒介性認識の機構は、不明なままである。RIG-Iに加えて、circRNAは、エンドソームTLR3、7および8などの他のRNAセンサーと相互作用することもあり得、これらは、直鎖ssRNAおよびdsRNAモチーフ、ならびにウリジンおよびグアノシンウリジンリッチ断片などのRNA分解産物に応答してシグナル伝達を活性化することが示されている(Tanji, H. et al. Toll-like receptor 8 senses degradation products of single-stranded RNA. Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 109-115 (2015); Zhang, Z. et al. Structural Analysis Reveals that Toll-like Receptor 7 Is a Dual Receptor for Guanosine and Single-Stranded RNA. Immunity 45, 737-748 (2016); Bell, J. K., Askins, J., Hall, P. R., Davies, D. R. & Segal, D. M. The dsRNA binding site of human Toll-like receptor 3. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 8792-8797 (2006);およびTatematsu, M., Nishikawa, F., Seya, T. & Matsumoto, M. Toll-like receptor 3 recognizes incomplete stem structures in single-stranded viral RNA. Nat. Commun. 4, 1833 (2013))。外来RNAに対する先天的な細胞性免疫応答を低減するために、プソイドウリジン(Ψ)、N1-メチルプソイドウリジン(m1Ψ)、および5-メトキシウリジン(5moU)などのヌクレオシド改変が、直鎖 mRNAにおける使用のために開発された(Svitkin, Y. V. et al. N1-methyl-pseudouridine in mRNA enhances translation through eIF2α-dependent and independent mechanisms by increasing ribosome density. (Nucleic Acids Res. 45, 6023-6036 (2017); Karikoe, K., Muramatsu, H., Ludwig, J. & Weissman, D. Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA. Nucleic Acids Res. 39, e142 (2011); Karikoe, K. et al. Incorporation of Pseudouridine Into mRNA Yields Superior Nonimmunogenic With Increased Translational Capacity and Biological Stability. Mol. Ther. 16, 1833 (2008))。これらの改変は、直鎖mRNAがTLRおよびRIG-Iを活性化するのを妨げることが示された(Karikoe, K., Buckstein, M., Ni, H. & Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity 23, 165-175 (2005); Durbin, A. F., Wang, C., Marcotrigiano, J. & Gehrke, L. RNAs Containing Modified Nucleotides Fail To Trigger RIG-I Conformational Changes for Innate Immune Signaling. MBio 7, (2016))。N6-メチルアデノシン(m6A)でのRNA改変は、内因性の直鎖およびcircRNAにおいてキャップ非依存的翻訳を媒介することが示された(Meyer et al. 2015; Yang et al. 2017)。TLRのcircRNA免疫原性に対する寄与、ならびに外来circRNA翻訳、安定性、および免疫原性に対するヌクレオシド改変の効果は、まだ報告されていない。
【０１３１】
最近、circRNAを、哺乳動物細胞中での安定なタンパク質生成のために開発した(Wesselhoeft, R. A., Kowalski, P. S. & Anderson, D. G. Engineering circular RNA for potent and stable translation in eukaryotic cells. Nat. Commun. 9, 2629 (2018))。本明細書に記載されるように、インビトロおよびインビボでの外来circRNAの免疫原性および翻訳能力（translatability）を、調査し、タンパク質生成適用のためのcircRNAの潜在的有用性を決定した。本明細書において、外来circRNAが、RIG-IおよびTLRコンピテント細胞において、細胞性免疫応答を刺激しないことを示した。さらに、直鎖mRNAとは違って、IRES依存性circRNAは、タンパク質発現および免疫原性の点でm1Ψでの改変からは、またはタンパク質発現の点でm6Aでの改変からは、利益を受けないことが示される。circRNAは、脂質ナノ粒子媒介性送達に適合し、 RNA媒介性先天的免疫応答を刺激することなくインビボで効果的に翻訳されるが、circRNAからのタンパク質発現は、脂肪組織において、ウリジン改変直鎖mRNAからのタンパク質発現よりも（that）高い安定性を示すことが見出された。
【０１３２】
結果
外来circRNAの精製により免疫原性が除去される
以前に報告された最適化された順序を変えられたイントロン-エキソン(PIE)スプライシング法を使用して、コクサッキーウイルスB3内部リボソーム進入部位(CVB3 IRES)、ガウシアルシフェラーゼ(GLuc)メッセージ、2つの設計したスペーサー配列、PIE構築物のエキソン断片に対応する2つの短い領域、ならびに順序を変えられたアナベナ属プレ-tRNA群Iイントロンの3'および5'イントロン断片を含むcircRNA前駆体を、ランオフ転写により合成した(図7A〜B)(Wesselhoeft, R. A., Kowalski, P. S. & Anderson, D. G. Engineering circular RNA for potent and stable translation in eukaryotic cells. Nat. Commun. 9, 2629 (2018); Puttaraju, M. & Been, M. Group I permuted intron-exon (PIE) sequences self-splice to produce circular exons. Nucleic Acids Res. 20, 5357-5364 (1992))。GTPおよびMg2+の存在下で、これらの前駆RNA分子は、群I触媒イントロンに特有の二重トランスエステル化反応を受けるが、エキソンは既に融合しているので、2つのイントロン断片の間の領域は、5'から3'共有結合した環として、切除される(図7A)(Puttaraju, M. & Been, M. Group I permuted intron-exon (PIE) sequences self-splice to produce circular exons. Nucleic Acids Res. 20, 5357-5364 (1992))。環状産物が得られたことを確認するために、スプライシング反応物を、3'から5'RNAエキソヌクレアーゼであるRNase Rで処理し、推定circRNAバンドの富化を観察した(図7C)(Suzuki, H. et al. Characterization of RNase R-digested cellular RNA source that consists of lariat and circular RNAs from pre-mRNA splicing. Nucleic Acids Res. 34, e63-e63 (2006))。RNase R処理スプライシング反応物のHPLCによる続いての精製、および次いでのオリゴヌクレオチド標的化RNase Hでの消化により、スプライシング部位ヌクレオチド以外は全てcircRNA前駆体と同じ配列要素を含むRNase H消化直鎖前駆RNAにより2つの主要なバンドが生じるのとは対照的に、単一の主要なバンドを生じ(図7C、ΔS)、環状性を確認した。circRNAを含むスプライシング反応物は、293細胞にトランスフェクション後に、ポリアデニル化ホスファターゼ処理直鎖前駆体に比べて、タンパク質生成およびタンパク質生成の発現安定性の改善を示した(図7G〜I)。
【０１３３】
circRNAの免疫原性を探査するために、2つの細胞株(ヒト胚性腎臓、293;ヒト肺癌、A549)を選択し、これらは、非精製のcircRNAスプライシング反応物のトランスフェクションの際に、特異な細胞生存能力およびGLuc発現安定性応答を誘発することが観察されていた(図7EおよびF)。環状化プロトコルの後、これらのスプライシング反応物は、circRNA、切除された三リン酸化イントロン、直鎖および環状連鎖物、ならびにそれらのいくつかは三リン酸化されている直鎖RNAおよびcircRNAの両方の分解産物を含むと予測される。スプライシング反応は、本明細書で使用される環状化条件下で、ほぼ完了まで進行するが、いくつかの三リン酸化直鎖前駆RNAも存在する。次いで、いくつかの工程を、適用し、精製を非精製スプライシング反応物に適用し、ゲル電気泳動によりcircRNA富化を確認し：RNase RをcircRNAの富化に適用し、HPLCを、非環状成分の除去に適用し、ホスファターゼを、残存三リン酸の除去に適用した(図7D)。トランスフェクトされたRNAに対する先天的な細胞性免疫応答の程度を決定するために、培養培地への広範囲のサイトカインおよびケモカインの放出、ならびにcircRNAからのタンパク質発現安定性および細胞生存能力をモニタリングした。
【０１３４】
スプライシング反応物のRNase R消化は、非トランスフェクト対照に比べて、A549細胞におけるサイトカイン放出の除去が不十分であったことが見出された(図7F、図8G)。HPLC精製の追加は、サイトカイン放出の除去にさらに不十分であったが、我々は、非精製スプライシング反応物に比べてのIL-6の有意な低減およびIFN-α1の有意な増大に注目し、これは、RNase RおよびHPLCを組み合わせると、いくつかの免疫原性RNA種が枯渇され得、他の種は富化され得ることを示唆した(図7F)。HPLC精製の追加は、サイトカイン放出の除去にさらに不十分であったが、非精製スプライシング反応物に比べてIL-6の低減が注目された(図7F)。興味深いことに、HPLC精製の後かつRNase R消化の前のホスファターゼ処理の追加は、我々がA549細胞中で評価した全ての上方制御されたサイトカインの発現を劇的に低減し、分泌されたMCP1、IL-6、IFN-α1、TNF-α、およびIP-10は、検出可能でないまたはトランスフェクトされていないベースラインレベルまで低減した(図7F)。293細胞中の実質的なサイトカイン放出は、観察されず、これは、これらの細胞の3日タンパク質発現安定性表現型が、circRNA純度の程度により比較的影響を受けないという観察、および293細胞がいくつかの重要なRNAセンサーを発現しないことを示す以前の報告と一致した(図7E、図8G)(Hornung, V. et al. Quantitative expression of toll-like receptor 1-10 mRNA in cellular subsets of human peripheral blood mononuclear cells and sensitivity to CpG oligodeoxynucleotides. J. Immunol. 168, 4531-4537 (2002))。対照的に、増大したcircRNA純度により、トランスフェクトされたA549細胞においてGLuc発現安定性が改善し、完全に精製されたcircRNAは、トランスフェクトされた293細胞の安定性表現型と同様の安定性表現型を示した(図7EおよびF)。同様に、増大したcircRNA純度の傾向により、トランスフェクションの3日後のA549細胞の生存能力が改善され、293細胞の生存能力は、ほとんど影響されないままであり、これは、circRNA純度が増大するにつれて、293細胞中の炎症性シグナル伝達が欠損し、A549細胞中の炎症性シグナル伝達が低下することと一致した(図7EおよびF)。合わせると、これらの結果は、circRNA純度が、その免疫原性潜在能力に強く影響し、十分に精製されたcircRNAが、非精製のまたは不完全に精製されたスプライシング反応物よりも有意に低い免疫原性を有することを示す。circRNAからのタンパク質生成の安定性はまた、circRNA純度および夾雑したRNA種に対するトランスフェクトされた細胞型の感受性に依存する。スプライシング反応物または十分に精製されたcircRNAでのA549細胞のトランスフェクション後最初の8時間以内のRIG-I、IFN-β1、IL-6およびRANTES 転写物誘導をモニタリングする時間経過実験は、circRNAに対する一過性の応答を示さなかった(図S2F)。精製されたcircRNAは、同様に、RAW264.7マウスマクロファージ中で、前炎症性転写物を誘導しなかった(図S2G)。これらの所見を別の合成circRNA構築物に一般化するために、我々は、EMCV IRESおよびEGFPコード領域を含む精製されたcircRNAでのA549細胞のトランスフェクションに応答する前炎症性転写物の誘導を試験し、再度、実質的な誘導は観察されなかった(図S2H)。これらのデータは、スプライシング反応物の非環状成分は、以前の試験で観察された免疫原性の原因であり、circRNAは、RIG-Iに対する天然のリガンドではないことを示す。
【０１３５】
スプライシング反応物の非環状成分は免疫原性に寄与する
circRNAスプライシング反応物中の免疫原性の原因を調査するために、スプライシング反応物の各成分を、HPLCで精製し、A549細胞のトランスフェクションの際のサイトカイン放出および細胞生存能力を評価した(図8AおよびB)。適切に純粋な直鎖前駆RNAをスプライシング反応物から得ることには困難さがあったので、スプライシング部位欠失変異体の形態の前駆RNA(ΔS)(図8B、底の右)を、別個に合成し精製した。さらに、circRNAピークを、2つの画分に分割し、ニックの入ったRNAピーク重複に対して対照をとった(図8B)。確固たるIL-6、RANTES、およびIP-10放出を、スプライシング反応物に存在するほとんどの種および前駆RNAに応答して観察した(図8C、図9G)。初期のcircRNA画分により、他の非circRNA画分と同等のサイトカイン応答が誘発され、これは、比較的少量の直鎖RNA夾雑物でさえ、A549細胞中で実質的な細胞性免疫応答を誘導し得ることを示した。後期のcircRNA画分により、非トランスフェクト対照からのサイトカイン応答を超えるサイトカイン応答は誘発されなかった。サイトカイン放出の観察と一致することに、トランスフェクションの36時間後のA549細胞の生存能力は、全ての他の画分に比べて、後期のcircRNA画分について有意に高かった(図8D)。
【０１３６】
circRNAが、自己制御フィードバックループにおいてRIG-I転写を誘導し得ることが以前に報告されたので、RIG-IおよびIFN-β1転写物誘導を、後期のcircRNA HPLC画分でのA549細胞のトランスフェクションの際に分析した(Chen, Y. G. et al. Sensing Self and Foreign Circular RNAs by Intron Identity. Mol. Cell 67, 228-238.e5 (2017))。前駆RNAおよび非精製スプライシング反応物に比較して後期circRNA画分についてのRIG-IおよびIFN-β1転写物の両方の有意に弱い誘導を、観察した(図8E)。さらに、スプライシング反応物のRNase R処理単独は、この効果の除去に十分ではなかったが(図8F)、精製されたcircRNAの非常に少量のRIG-Iリガンド3p-hpRNAでの夾雑により、実質的なRIG-I転写が誘導されたことが見出された(図9I)。HeLa細胞において、RNase R消化スプライシング反応物のトランスフェクションにより、RIG-IおよびIFN-β1が誘導されたが、精製されたcircRNAのトランスフェクションによっては、誘導されなかったが、HeLa細胞は、夾雑したRNA種に対してA549細胞よりも感受性が低いことが見出された(図9L)。これらのデータは、スプライシング反応物の非環状成分が、以前の研究で観察された免疫原性の原因であること、およびcircRNAが、RIG-Iに対する内因性のリガンドではないことを示唆する。
【０１３７】
circRNAのヌクレオシド改変は破壊的である
5-メチルシチジン(m5C)、N6-メチルアデノシン(m6A)、およびプソイドウリジン(Ψ)などのヌクレオシド改変は、リボヌクレオチドとエンドソームTLR3、7、および8ならびにRIG-Iなどの細胞性RNAセンサーの相互作用を妨げることにより、インビトロおよびいくつかの背景においてインビボで直鎖mRNAの免疫原性を低減させることが報告されている(Karikoe, K., Buckstein, M., Ni, H. & Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity 23, 165-175 (2005); Durbin, A. F., Wang, C., Marcotrigiano, J. & Gehrke, L. RNAs Containing Modified Nucleotides Fail To Trigger RIG-I Conformational Changes for Innate Immune Signaling. MBio 7, (2016))。N6-メチルアデノシン(m6A)は、直鎖RNAに対する、および別個に内因性のcircRNAに対する内部リボソーム進入および翻訳を媒介することが報告されている(Meyer et al. 2015; Yang et al. 2017)。これらの改変のインビボでのmRNAの有用性に対する効果は、一定ではない（variable）こともあるが、これは、肝臓に対して送達されるΨ-mRNAが、免疫原性を低減していないか、またはタンパク質生成を改善していないからである(Kauffman, K. J. et al. Efficacy and immunogenicity of unmodified and pseudouridine-modified mRNA delivered systemically with lipid nanoparticles in vivo. Biomaterials 109, 78-87 (2016))。最近、m1Ψの組み込みが、mRNAの免疫原性を低減し、タンパク質発現をΨの組み込みより高い程度まで改善することが報告された(Svitkin, Y. V. et al. N1-methyl-pseudouridine in mRNA enhances translation through eIF2α-dependent and independent mechanisms by increasing ribosome density. Nucleic Acids Res. 45, 6023-6036 (2017)およびAndries, O. et al. N(1)-methylpseudouridine-incorporated mRNA outperforms pseudouridine-incorporated mRNA by providing enhanced protein expression and reduced immunogenicity in mammalian cell lines and mice. J. Control. Release 217, 337-344 (2015))。ヌクレオシド改変のcircRNA翻訳効率および免疫原性に対する効果は、試験されていない。circRNA精製についての以前の困難性のために、非改変直鎖mRNAの免疫原性に対する精製されたcircRNAの免疫原性もまた、評価されていない。従って、A549および293細胞中の非改変およびm1Ψ-改変された直鎖mRNAに対する精製された非改変およびm1Ψ-改変されたcircRNAのGLucタンパク質発現安定性およびサイトカイン放出プロフィールの評価が求められていた(図9A)。
【０１３８】
PIE法を使用してm1Ψ-circRNAを環状化する初期の試みは、不成功であり、これは、PIE構築物前駆体中でのウリジンのm1Ψによる完全な置換は、リボザイム活性を破壊し（abolish）、部分的な置換は、スプライシング効率を劇的に低減させたからであった(図9B)。T4 RNAリガーゼIおよびスプリント（splint）オリゴヌクレオチドを使用するcircRNA調製の代替的な方法は、前駆RNAの末端をライゲーションの近位にするように設計された(図10G)(Sonja Petkovic, S. M. RNA circularization strategies in vivo and in vitro. Nucleic Acids Res. 43, 2454 (2015))。最適化されたスプリントオリゴヌクレオチドおよびアニーリング条件を使用して、1.5kb前駆RNAの40%環状化効率が得られた(図10HおよびI)。ウリジンのm1Ψでの完全な置換により、この方法を使用しての環状化は妨げられず、十分に改変された環状産物が得られた(図9C)。
【０１３９】
293およびA549細胞のm1Ψ-circRNAでのトランスフェクションの際、タンパク質発現は観察されなかったので、改変されたcircRNAからのタンパク質発現の安定性は決定されなかった(図9D)。非改変circRNAは、HEK293およびA549細胞において、非改変および改変された直鎖mRNAの両方に比べて増大したタンパク質発現安定性を示した(図9EおよびF)。興味深いことに、非改変直鎖mRNAは、キャッピング、ホスファターゼ処理、およびRIG-Iリガンドを除去するためのHPLC精製に関わらず、免疫応答性A549細胞において、非改変circRNAよりも大きなサイトカイン応答を誘発したことが見出された。対照的に、m1Ψ-circRNAおよびm1Ψ-mRNAの両方は、サイトカイン放出プロフィールを有意には変化させなかった(図9F、図11E)。A549細胞の生存能力は、非改変直鎖mRNAのトランスフェクションの際に低減したが、非改変circRNAまたはいずれのm1Ψ-RNAでも低減しなかった(図9F)。図S7A〜Fのデータと一致することに、トランスフェクションの24時間後の293サイトカイン放出およびトランスフェクションの3日後の細胞生存能力において、有意な差異は検出されなかった(図9E、図11E)。これらの実験は、circRNAがキャップされポリアデニル化された直鎖mRNAよりも免疫原性が低いこと、およびcircRNAのヌクレオシド改変が先天的な免疫センサーに対する保護には不要であることを示す。
【０１４０】
circRNAはトール様受容体による検出を回避する
キャップされポリアデニル化された直鎖mRNAがサイトカイン分泌を誘発し得たが、circRNAは誘発しなかったので、種々のRNAがレポーター細胞株内でTLRを活性化する能力を、調査した。TLR3、7、および8は、エンドソーム内でRNAを検出し、炎症性カスケードを開始することが公知である(Takumi Kawasaki, T. K. Toll-Like Receptor Signaling Pathways. Front. Immunol. 5, (2014))。TLR3は、dsRNAおよびウイルスssRNA中のステム構造に結合し、TLR7およびヒトTLR8は、ssRNAおよびヌクレオシド分解産物 (TLR7についてグアノシンおよびTLR8についてウリジン)に結合し、両方のリガンドは、TLR活性化に必要である(Tanji, H. et al. Toll-like receptor 8 senses degradation products of single-stranded RNA. Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 109-115 (2015); Zhang, Z. et al. Structural Analysis Reveals that Toll-like Receptor 7 Is a Dual Receptor for Guanosine and Single-Stranded RNA. Immunity 45, 737-748 (2016); Bell, J. K., Askins, J., Hall, P. R., Davies, D. R. & Segal, D. M. The dsRNA binding site of human Toll-like receptor 3. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 8792-8797 (2006);およびTatematsu, M., Nishikawa, F., Seya, T. & Matsumoto, M. Toll-like receptor 3 recognizes incomplete stem structures in single-stranded viral RNA. Nat. Commun. 4, 1833 (2013))。直鎖および環状RNAの間の構造および配列の差異について対照をとるために、circRNAの線状化版を構築した。この構築物は、スプライシングされたcircRNAの全ての構成要素を含み、イントロンおよび相同性アーム配列の欠失により作製された(線状化RNA、図10A、図12G)。全ての線状化RNAを、さらに、ホスファターゼ(キャップRNAの場合、キャッピングの後)で処理し、HPLCで精製した。TLR7レポーター細胞において、線状化または環状RNAに対する応答が見られなかったが、TLR3およびTLR8レポーター細胞の両方は、キャップ線状化RNA、ポリアデニル化線状化RNA、ニックの入ったcircRNA画分、および初期circRNA画分により活性化された(図10B)。興味深いことに、後期circRNA画分は、m1Ψ-mRNAと同様に、いずれの細胞株においてもTLR-媒介応答を誘発しなかった(図10B)。しかし、シチジンではなくウリジンのcircRNAでトランスフェクトされたTLR8レポーター細胞の培地への添加により、この効果は部分的に逆転し、SEAP分泌を生じ、これは、TLR8活性化に必要な2つのRNA分解シグナルの1つのトランス添加により、TLR8によるcircRNA検出の消失を補償し得ることを示した(図10C、図12H)。
【０１４１】
次に、精製されたcircRNAを、以下の2つの方法を使用して線状化した:マグネシウムイオンの存在下でのcircRNAの加熱処理、およびDNAオリゴヌクレオチドガイドRNase H消化(図10D)。両方の方法により、大部分の全長直鎖RNAと、少量のインタクトのcircRNAを生じたが、加熱処理により、より高い割合のより低い分子量の直鎖RNA分解産物を生じた(図10E)。加熱およびRNase Hの両方により分解されたcircRNAのトランスフェクションにより、TLR8レポーター細胞においてSEAP分泌が促進された(図4F)。インビトロ転写された線状化RNAによるTLR3の活性化に関わらず、分解されたまたはインタクトの条件について、TLR3およびTLR7レポーター細胞中で、活性化は観察されなかった(図4F、図12I)。これらの結果は、circRNAがTLRによる検出を回避し得ること、およびTLR8回避が環状コンホメーションの結果であることを示す。
【０１４２】
外来circRNAはインビボで翻訳可能である
非改変およびm1Ψ-改変されたヒトエリスロポエチン(hEpo)直鎖mRNAおよびcircRNAの翻訳および免疫原性を、最初に試験し、ここで、直鎖mRNAは、コード領域を除いては図9Aに示されたものと同一であった(図13、図14A)。m1Ψ-mRNAおよび非改変circRNAの等モルトランスフェクションにより、293細胞において確固たるタンパク質発現を生じた(図14B)。hEpo直鎖mRNAおよびcircRNAは、293およびA549細胞の等重量トランスフェクションの際に、GLuc直鎖mRNAおよびcircRNAに比べて、同様の相対的タンパク質発現パターンおよび細胞生存能力を示した(図14CおよびD)。マウスにおいて、hEpoは、hEpo circRNAまたは直鎖mRNAの内臓脂肪への注入の後、血清中で検出された(図11AおよびD)。非改変circRNAの注入後に検出されたhEpoは、非改変またはm1Ψ-mRNAからのものよりゆっくりと減衰し、注入後42時間にまだ存在した(図11B)。非精製circRNAスプライシング反応物または非改変直鎖mRNAの注入の際に、血清hEpo中で迅速な低減(図11B)が観察された。非精製スプライシング反応物の注入は、さらに、精製されたcircRNAを含む他のRNAでは観察されなかった血清中で検出可能なサイトカイン応答を生じた(図11C、図15)。
【０１４３】
circRNAは脂質ナノ粒子に適合性である
脂質ナノ粒子は、mRNAの組織への送達を含む治療的RNAのための送達ビヒクルとしての使用についての有意な可能性を示す(Oberli, M. A. et al. Lipid Nanoparticle Assisted mRNA Delivery for Potent Cancer Immunotherapy. Nano Lett. 17, 1326-1335 (2017); Yanez Arteta, M. et al. Successful reprogramming of cellular protein production through mRNA delivered by functionalized lipid nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 115, E3351-E3360 (2018);およびKaczmarek, J. C., Kowalski, P. S. & Anderson, D. G. Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality. Genome Med. 9, 60 (2017))。インビボでのcircRNA送達のための脂質ナノ粒子の効力を評価するために、精製されたcircRNAを、イオン化可能なリピドイド（lipidoid）cKK-E12と共にナノ粒子に製剤化した(Dong, Y. et al. Lipopeptide nanoparticles for potent and selective siRNA delivery in rodents and nonhuman primates. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 3955-3960 (2014); およびKauffman, K. J. et al. Optimization of Lipid Nanoparticle Formulations for mRNA Delivery in Vivo with Fractional Factorial and Definitive Screening Designs. Nano Lett. 15, 7300-7306 (2015))。これらの粒子は、5-メトキシウリジンで改変された市販の対照直鎖mRNAを含む粒子のもの(5moU、図12A、表2)と同様の平均サイズ、多分散性指数（polydispersity index）、および封入（encapsulation）効率を有する一様な多層構造を形成した。LNPに封入された精製されたhEpo circRNAは、5moU-mRNAに比べて、293細胞への添加の際に確固たる発現を示した(図12B、左)。この市販のmRNAは、circRNAに比べて、以前に使用されたm1Ψ-mRNAと同様に機能した（perform）(図14C)。293細胞中でのLNP-RNAからのタンパク質発現安定性は、5moU-mRNAおよびcircRNAの両方についての減衰がわずかに遅れることを除いては、トランスフェクション試薬により送達されるRNAからのものと同様であった(図12B、右)。LNP中の封入により、インビトロでのRIG-I/IFN-β1誘導またはTLR活性化は変更されず、非改変circRNAは、5moU-mRNAと同様の様式で免疫センサーを活性化しなかった(図12CおよびD)。
【０１４４】
マウスにおいて、LNP-RNAを、内臓脂肪組織に局所的に注入した(図16B)。circRNAからの血清hEPo発現は、より低かったが、LNP-RNAの内臓脂肪への注入または肝臓への静脈内送達の6時間後の5moU-mRNAからのものと同等であった(図12E、図16E)。非改変LNP-circRNAの脂肪注入後に検出された血清hEpoは、LNP-5moU-mRNAからのものよりゆっくりと減衰し、発現減衰の遅れが、インビトロで注目されたものと同様に血清中に存在した(図12F)；しかし、LNP-circRNAの静脈内注入後に検出された血清hEpoは、LNP-5moU-mRNAからのものと同じ速度で減衰した(図16E)。血清サイトカインの増大は、観察されず、またはLNP-5moU-mRNAもしくはLNP-circRNAの注入後の局所RIG-I、TNF-α、もしくはIL-6転写物誘導は、観察されなかった(図16CおよびD)。
【表１】
2021526792.tif 000002
LNP-RNAの物理化学的特性(データは、平均±SDとして表される、n=3)。
【０１４５】
考察
この仕事において、外来circRNAがRNAセンサーを回避すること、および発現が、マウス脂肪組織への注入後に、直鎖mRNAに比べて延長されることが示された。circRNAの免疫原性を試験した以前の研究により、外来circRNAが関連する宿主スプライシング要素の非存在のために、RIG-Iにより媒介される強い先天的な細胞性免疫応答を誘発することが提唱されたが(Chen et al. 2017)、circRNAがTLRおよびRIG-Iを含むいくつかの公知の細胞性RNAセンサーを活性化しないことが、この研究において見出された(Chen, Y. G. et al. Sensing Self and Foreign Circular RNAs by Intron Identity. Mol. Cell 67, 228-238.e5 (2017))。これらの一致しない結果は、おそらく、circRNA調製物中の不純物の結果である。以前の研究は、RNase Rにより精製されたcircRNAを使用した(Chen, Y. G. et al. Sensing Self and Foreign Circular RNAs by Intron Identity. Mol. Cell 67, 228-238.e5 (2017))。本研究は、RNase Rでの処理が、純粋なcircRNAを得るには十分ではなく、複数の耐性RNA種を富化し、これは、circRNAおよび構造化した3'末端を有する直鎖RNAを含むことを見出した。さらに、少量の夾雑直鎖RNAでさえ、このいくつかは、三リン酸を有し得、HPLC精製の後に存在し得るのであるが、確固たる細胞性免疫応答を誘発するのに十分である(図9C)。circRNAのHPLC精製は、特有の困難性を示すが、これは、ニックの入ったcircRNAおよびインタクトのcircRNAは、分子量において等しく、これらのそれぞれのピークは、部分的に重なるからである。三リン酸化前駆RNAの分解産物はまた、circRNAピーク内で独立しており（separate）、従って、穏やかなcircRNA調製が必要とされる。ホスファターゼ処理、二価カチオンの存在下での加熱への曝露の最小化、および厳密なHPLCピークの選択により、これらの危険（hazard）は低減され得る。本明細書で記載する精製プロトコルを使用して、circRNAは、circRNA-関連宿主スプライシング要素の非存在に関わらず、スプライシング反応の他の成分と対照的に、TLRおよびRIG-Iコンピテント細胞からの、またはマウス脂肪組織からの実質的な先天的な免疫応答を誘発しないことが見出された。本明細書で記載する精製プロトコルを使用して、circRNAは、スプライシング反応の他の成分と対照的に、TLRおよびRIG-Iコンピテント細胞からの、またはマウス脂肪組織からの実質的な先天的な免疫応答を誘発しないことが見出された。さらに、精製されたcircRNAからのタンパク質生成は、非精製circRNAからのものよりも有意に安定であり、精製されたcircRNAのトランスフェクションにより、大いに改善された細胞生存能力を生じ(図7F、図8D)、この両方は、非環状夾雑物から生じる抗ウイルス応答の指標である(Loo, Y. M. & Gale, M., Jr. Immune signaling by RIG-I-like receptors. - PubMed - NCBI. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21616437. (Accessed: 7th May 2018))。ヌクレオシド改変、特にウリジン改変は、RNAセンサーによる検出を妨げることにより、直鎖mRNA免疫原性を低減すると報告されており、該RNAセンサーは、いくつかの組織型におけるRNA機能に重要であり得る(Karikoe, K., Buckstein, M., Ni, H. & Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity 23, 165-175 (2005); Durbin, A. F., Wang, C., Marcotrigiano, J. & Gehrke, L. RNAs Containing Modified Nucleotides Fail To Trigger RIG-I Conformational Changes for Innate Immune Signaling. MBio 7, (2016))。本明細書で記載する構築物を用いて、インビトロおよび脂肪組織において、非改変mRNAに比べてm1Ψ-mRNAからの増大したタンパク質発現安定性を、観察した(図9E、11B)。これは、免疫回避の二次的な結果であり得るか、または改変の無関係の一次的効果であり得る。circRNA前駆体分子のm1Ψでの改変は、PIE構築物におけるスプライシングおよび酵素的に環状化されたRNAにおける翻訳に干渉し、これは、m1Ψが、リボザイムのフォールディングおよびIRES構造を有意に変更することを示唆した。
【０１４６】
RNAのm6Aでの改変により、生存細胞における内因性の直鎖および環状RNAの、ならびに細胞溶解物における外来直鎖RNAのキャップ非依存的翻訳が促進されることが示されている(Meyer et al. 2015; Yang et al. 2017)。我々は、アデノシンのm6Aでの部分的な置換が、生存細胞における外来のインタクトのまたは線状化circRNAからの翻訳を駆動するのに十分ではなかったことを見出し、これは、核RNA結合タンパク質のm6A依存性翻訳の補助への関与を示す以前の報告と一致した(図9F、G)(Lin et al. 2016)。
【０１４７】
直鎖mRNAとは違って、circRNAは、スプライシングおよび翻訳について、順序を変えられた群IイントロンおよびIRESを含むフォールディングしたRNA構造に大きく依存する。circRNA前駆体分子のm1Ψおよびm6Aでの改変は、PIE構築物におけるスプライシングおよび酵素的に環状化されたRNAにおける翻訳に干渉し、これは、改変により、これらの構造要素のフォールディングが有意に変化することを示唆した(図9B、D、F、G)。
【０１４８】
Ψの組み込みにより、塩基スタッキング相互作用が増強されることが示され、これは、構造変化を導き得る;しかし、他のヌクレオシド改変が、リボザイム構造およびIRES構造とより適合性であり得、安定性の間の改変されたcircRNA翻訳の研究を可能にすることがあり得る(Davis, D. R. Stabilization of RNA stacking by pseudouridine. Nucleic Acids Res. 23, 5020 (1995))。改変された直鎖mRNAがTLRによる検出を回避し得ることは公知であるが、非改変circRNAが同じ特性を示すとの発見は驚くべきであった。最近、TLR7およびTLR8のリガンドが、ssRNAの短いストレッチおよびヌクレオシドを含むRNAの分解産物として報告された(Tanji, H. et al. Toll-like receptor 8 senses degradation products of single-stranded RNA. Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 109-115 (2015); Zhang, Z. et al. Structural Analysis Reveals that Toll-like Receptor 7 Is a Dual Receptor for Guanosine and Single-Stranded RNA. Immunity 45, 737-748 (2016))。これらの分解産物は、おそらく、RNAが内在化した直後に、エンドソーム内でヌクレアーゼにより生成される(Roers, A., Hiller, B. & Hornung, V. Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System. Immunity 44, 739-754 (2016))。circRNAの連続的な構造により、エンドソームヌクレアーゼに対する耐性がcircRNAに付与され得、これらの検出体の回避が生じ得る。この場合において、エンドソームヌクレアーゼは、主にエキソヌクレアーゼで構成されると予測されるが、これは、エンドヌクレアーゼの存在により、circRNA分解が生じると予測されるからである。この仮定と一致することに、2つの協同的（cooperative）TLR8リガンドの1つであるウリジンのTLR8レポーター細胞の培地への添加により、circRNAの免疫回避特性は部分的に排除され得、これは、分解産物の欠乏および従ってヌクレアーゼ耐性は、実際に、circRNAによるTLR8回避の原因であり得ることが示唆された。しかし、分解産物には、まだTLR3に対するリガンドとして明らかにされていないものはなく、circRNAも、TLR3活性化線状化circRNAと同じdsRNAモチーフを含むにも関わらず、TLR3過剰発現293細胞の背景において回避するようである。RNA分解産物が、TLR8と同様の様式で二量体化界面でTLR3に結合することは可能であり得る(Roers, A., Hiller, B. & Hornung, V. Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System. Immunity 44, 739-754 (2016))。線状化circRNAによるTLR3活性化の差異もまた観察され、インビトロ転写された線状化circRNAは、TLR3媒介応答を誘発し、精製されたcircRNAの分解により生成された線状化circRNAは誘発しなかった(図10BおよびF)。加熱またはRNase HのいずれかによるcircRNAの分解により、確固たるTLR3活性化に必要とされるdsRNA構造が破壊されることはあり得る。
【０１４９】
トランスフェクション試薬と複合体したかまたはLNP内のcircRNAの脂肪内注入により、m1Ψ-mRNAまたは5moU-mRNAからのものよりも安定なhEpo発現が生じた(図11Bおよび図12F)。しかし、circRNAからのhEpo生成は、24時間で293細胞におけるm1Ψ-mRNAまたは5moU-mRNAの等モルトランスフェクションからのものの2倍に近いことが観察されていたが、インビボでのcircRNAからのhEpo発現は、比較的低減されていた。いくつかの要素は、この結果を生じ得る。CVB3 IRESは、そのヒト細胞株中での翻訳を駆動する能力に基づいてcircRNAにおける使用のために元々選択された(Wesselhoeft, R. A., Kowalski, P. S. & Anderson, D. G. Engineering circular RNA for potent and stable translation in eukaryotic cells. Nat. Commun. 9, 2629 (2018))。従って、マウス脂肪または肝臓組織は、CVB3 IRES媒介翻訳について理想の細胞型ではないかもしれない。IRES配列はまた、翻訳開始因子について、m7Gキャップを保持する内因性の転写物と競合するに違いない。従って、ウイルスIRES配列を翻訳を開始するために使用するcircRNAは、転写物密度に比べて開始因子密度の高い細胞中でより効果的であり得る。他のIRES配列が種々の組織においてcircRNAから翻訳を駆動する能力の包括的な特徴づけが、必要である。
【０１５０】
LNPにより肝臓に静脈内送達されたcircRNAからのタンパク質発現安定性は、5moU-mRNAからのものに比べて増強されなかったが、6時間でのcircRNAからの発現の相対的規模は、脂肪組織から得られたものと同等であった(図12Eおよび図16E)。この結果は、一般的なRNA代謝回転速度またはエンドヌクレアーゼ活性、配列特異的翻訳阻害または分解、およびRNA安定化タンパク質の存在または非存在を含むいくつかの因子に依存し得る組織特異的安定性を強調する。circRNA内のmiRNA結合部位の評価および変更または配列特異的分解モチーフの欠乏（depletion）により、さらに、選択された組織におけるcircRNA安定性および発現が増強され得る。
【０１５１】
血清サイトカインの増大を、非精製スプライシング反応物を注入されたマウスにおいて検出したが、非改変mRNA、m1Ψ-mRNA/5moU-mRNA、またはcircRNAを注入されたマウスにおいて、かかる応答は、検出されなかった。インビトロ結果と一致することに、非改変mRNAおよび非精製スプライシング反応物の注入の際に、hEpo発現の迅速な低下が観察されたが、m1Ψ-mRNA/5moU-mRNAおよびcircRNAの注入後の血清hEpoは、比較的安定なままであり、これは、m1Ψ-mRNA/5moU-mRNAおよびcircRNAは、インビボでRNA分解を生じる実質的な免疫応答を誘発しなかったことを示した。circRNAのLNPへの製剤化は、免疫センサー相互作用を変えず、LNP-RNA注入後の血清サイトカインレベルおよび局所前炎症性転写物レベルの分析により、LNP送達されたcircRNAに対する免疫応答は明らかにならなかった。
【０１５２】
いくつかの組織におけるcircRNAの増大した発現安定性およびcircRNAがヌクレオシド改変の必要なく免疫センサーを回避する能力は、circRNAの治療的タンパク質の発現のためのベクターとしての可能性を示すと考えられる。
【０１５３】
方法:
RNA設計、合成、および精製
直鎖mRNAまたはcircRNA前駆体を、改変された直鎖または環状RNAについてウリジンをN1-メチルプソイドウリジン(Trilink Biotechnologies)と完全に置換して、T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs (NEB))を使用して、線状化プラスミドDNA鋳型からランオフインビトロ転写により合成した。インビトロ転写の後、反応物を、DNase I(NEB)で15分間処理した。DNase 処理の後、RNAを、MEGAclear Transcription Clean-upキット(Ambion)を使用してカラム精製した。次いで、RNAを、70℃で3分間加熱し、直ちに、氷上に2分間配置し、その後、直鎖RNAを、製造業者の指示書に従ってmRNAキャップ-2'-O-メチルトランスフェラーゼ(NEB)およびワクシニアキャッピング酵素(NEB)を使用してキャップした。ポリアデノシンテイルを、製造業者の指示書に従って大腸菌ポリAポリメラーゼ(NEB)を使用してキャップされた直鎖転写物に付加し、十分に処理されたmRNAを、カラム精製した。circRNAについて、GTPを、マグネシウムを含むバッファ(50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT、pH7.5; NEB)と共に2mMの終濃度まで添加し、次いで、反応物を、55℃で8分間加熱した。次いで、RNAをカラム精製した。いくつかの場合、circRNAを、RNase Rで消化し:20μgのRNAを、水で希釈し(86uL最終容量)、次いで、70℃で3分間加熱し、氷上で2分間冷却した。20U RNase Rおよび10uLの10x RNase Rバッファ(Applied Biological Materials)を添加し、反応物を、37℃で15分間インキュベートし；さらなる10U RNase Rを、反応の中の中間点で添加した。RNase R消化RNAを、カラム精製した。いくつかの場合、RNAを、ホスファターゼ(CIP、NEB)で処理し:20ugのRNAを、上記されるように、希釈し、加熱し、冷却し、次いで、Cutsmartバッファ(NEB)を、20UのCIPと共に1Xの終濃度まで添加した。反応物を、37℃で15分間インキュベートした。ホスファターゼ処理RNAを、カラム精製した。RNAを、50%ホルムアミド中に希釈し、70℃で3分間変性させ、次いで、室温まで冷却した。次いで、RNAを、E-ゲルEX 1〜2%プログラムを使用してE-ゲルiBase(Invitrogen)上のプレキャスト2% E-ゲルEXアガロースゲル(Invitrogen)上で分離し;ssRNA Ladder(NEB)を、標準として使用した。バンドを、ブルーライト透視を使用して可視化し、ImageJを使用して定量化した。高速液体クロマトグラフィーについて、30μgのRNAを、65℃で3分間加熱し、次いで、氷上に2分間配置した。RNAを、Agilent 1100 Series HPLC (Agilent)上で5μmの粒径および2000Åの孔径を有する4.6x300mmサイズ排除カラム(Sepax Technologies; 部品番号: 215980P-4630)を通してランした。RNAを、RNase-フリーTEバッファ(10mM Tris、1mM EDTA、pH:6)中で0.3mL/分の流量でランさせた。 RNAを、260nmのUV吸光度で検出したが、UV検出なしで回収した。得られたRNA画分を、5M酢酸アンモニウムで沈澱させ、水で再懸濁し、次いで、いくつかの場合、上記されるようにさらなる酵素処理に供した。5moU-改変されたホタルルシフェラーゼおよびhEpo mRNAを、Trilink Biotechnologiesから得た。
【０１５４】
スプリントライゲーション
スプリント媒介ライゲーションのための直鎖前駆体を、前駆RNAの5'および3'末端に短いアダプター配列を付加した以外は、PIE環状化circRNAと同じ配列特徴の全てを有するように設計した。これらのアダプター配列は、環状化に使用したスプリントとホモロジーを共有した(最適化されたスプリント: 5'-GTTTGTGGTTCGTGCGTCTCCGTGCTGTTCTGTTGGTGTGGG-3' (配列番号：33)。スプリント ライゲーション前駆RNAを、10倍過剰のGMPをインビトロ転写反応物に添加した以外は、以前に記載されるように合成した。25ugの精製された前駆RNAを、90uL反応物中5uMの濃度のDNAスプリントの存在下で、70℃で5分間加熱した。反応物を、室温まで冷却させ、次いで、T4 RNA Ligase I Buffer (NEB)を、1Xの終濃度まで添加した。ATPを、1mMの終濃度まで添加した。50UのT4 RNA Ligase I (NEB)を添加した。反応物を、37℃で30分間インキュベートし、次いで、カラム精製した。
【０１５５】
RNase Hニック形成
RNase Rを用いてcircRNAについて富化され、次いで、カラム精製されるか、またはHPLCにより精製されたスプライシング反応物を、5倍モル過剰のDNAプローブ(5'-TTGAACCCAGGAATCTCAGG-3'(配列番号：34))の存在下で70℃で5分間加熱し、次いで、室温でアニーリングした。反応物を、提供された反応バッファ中で37℃で15分間、RNase H(New England Biolabs)で処理した。RNAを、消化の後カラム精製した。
【０１５６】
組織培養、トランスフェクション、および細胞生存能力
293およびA549細胞 RAW264.7細胞(ATCC)ならびにHEK-BlueマウスTLR3、マウスTLR7、ヒトTLR8、Null1、ならびにNull2細胞(Invivogen)を、37℃および5% CO2で、10%加熱不活性化ウシ胎仔血清(hiFBS, Gibco)およびペニシリン/ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地(4500mg/Lグルコース)中で培養した。HEK293およびHeLa細胞は、マイコプラスマについて試験して陰性であった。細胞を、2〜3日毎に継代した。293およびA549 細胞について、40ngのRNAを、製造業者の指示書に従ってLipofectamine MessengerMax (Invitrogen)を使用して、96ウェルプレートのウェルあたり10,000細胞/100uLに逆トランスフェクト（reverse transfect）した。HEK-Blue細胞について、100ngのRNAを、Lipofectamine MessengerMaxを使用して、96ウェルプレートのウェルあたり40,000細胞/100uLに逆トランスフェクトした。RNA採取およびqPCRの前にトランスフェクトされたA549 細胞について、200ngのRNAを、Lipofectamine MessengerMaxを使用して、24ウェルプレートのウェルあたり100,000細胞に逆トランスフェクトした。タンパク質発現が複数の時点で評価された実験について、各時点で培地を完全に除去し、交換した。SEAP活性またはサイトカインが分析された実験について、培地を、トランスフェクションおよび評価の間で交換しなかった。全てのトランスフェクション実験について、RNAを、70℃で3分間加熱し、直ちに氷上に2分間配置し、その後、トランスフェクション試薬と複合体化した。トランスフェクションの36〜72時間後の細胞生存能力を、MultiToxキット(Promega)を使用して評価した。TLRレポーターおよびヌル細胞によるSEAP分泌を検出するために、培地を、トランスフェクションの36〜48時間後に回収し、 HEK-Blue Detection試薬(Invivogen)と1Xの終濃度にて合わせた。培地および検出試薬を、37℃で一晩インキュベートし、次いで、640nmの吸光度を、Infinite 200Pro Microplate Reader(Tecan)上で測定した。R848、ポリI:C、および3p-hpRNAを、Invivogenから得た。
【０１５７】
タンパク質発現分析
発光アッセイのために、培地を、トランスフェクションの24時間後に回収した。ガウシアルシフェラーゼからの発光を検出するために、20uLの組織培養培地を、平底白色壁プレート(Corning)に移した。25uLの安定化剤を含むBioLuxガウシアルシフェラーゼ試薬(New England Biolabs)を、各試料に添加し、発光を、45秒後にInfinite 200Pro Microplate Reader (Tecan)上で測定した。ヒトエリスロポエチンを、製造業者の指示書に本質的に従って固相サンドイッチELISA(R&D Systems)により検出した。図1、3および5においてサイトカインを、Fireplex免疫アッセイ(Abcam)により検出した。図2および6においてサイトカインを、個々のまたはマルチプレックス免疫アッセイ(Eve Technologies)により検出した。
【０１５８】
逆転写およびqPCR
細胞を洗浄し、RNAを、マウス脂肪組織から抽出されたRNAについて、製造業者の指示書に従ってRNeasy Mini Plusキット(Qiagen)またはRNeasy Lipid Kit (Qiagen)を使用して、トランスフェクションの24時間後に、回収し精製した。全RNAからの第1鎖cDNAの合成を、ランダムヘキサマー (Thermo Fisher Scientific)を使用してHigh-Capacity cDNA Reverse Transcription Kitを用いて行った。遺伝子特異的TaqManプライマーを、アッセイオンデマンド（Assay-on-Demand）(Thermo Fisher Scientific)として購入した;ヒトプライマー:GAPDH(Hs99999905_m1)、DDX58(Hs01061436_m1)、IFN-β1(Hs01077958_s1);マウスプライマー:Gapdh(Mm99999915_g1)、Ddx58(Mm01216853_m1)、Il-6(Mm00446190_m1)、Tnf(Mm00443258_m1)。qPCR反応を、LightCycler 480 Probe Master Mix (Roche)およびLightCycler 480装置(Roche)を使用して行った。各試料について、閾サイクル値(Ct)を、比較Ct法（comparative Ct method）に従って処理した。遺伝子発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子GAPDHの発現に対して標準化した。
【０１５９】
動物実験
全ての動物実験を、MIT動物実験委員会（Animal Care and Use Committee）のガイドライン下で行った。処置群または対照群にランダムに割り当てた30〜35g C57Bl/6雌マウスに、右下乳房脂肪パッドおよび腹膜を通して内臓脂肪に、MessengerMaxと複合体化した350ngのRNAもしくは50μLの総容量中の1.5ピコモルのLNP-RNAを注入したか、または尾静脈注入により0.1mg/kg LNP-RNAを静脈内注入した。血液試料を、示された時点で、尾の出血または心臓の穿刺を介してBD Microtainerチューブに回収した。血清を回収するために、血液を、15〜30分間凝固させ、続いて、2000xgで室温で5分間遠心分離した。2uLの血清中のヒトエリスロポエチンを、以前に記載されるように検出した。脂肪組織を回収するために、マウスを、屠殺し、全下部内臓脂肪組織を除去（remove）し、続いてのRNA単離のために、液体窒素中で凍結した。
【０１６０】
脂質ナノ粒子製剤
LNPを、以前に記載されるとおりにシリンジポンプを使用して、マイクロ流体（microfluidic）デバイスにおいて1:3の容量比でエタノールと水相を混合することにより調製した。簡単に、エタノール相を、イオン化可能なリピドイドcKK-E12、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE, Avanti)、コレステロール(Sigma)、および1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ-(ポリエチレングリコール)-2000](アンモニウム塩)(C14-PEG 2000, Avanti)の35:16:46.5:2.5のモル比の混合物を可溶化することにより調製した。水相を、直鎖mRNAまたはcircRNAを有する10mMクエン酸バッファ(pH 3)中で調製した。LNPを、RTで2hの間Slide-A-LyzerTM G2 Dialysis Cassettes, 20,000 MWCO (Thermo Fisher)中でPBSに対して透析した。LNPナノ粒子に封入されたmRNAの濃度を、製造業者のプロトコルに従ってQuant-iT RiboGreenアッセイ(Thermo Fisher)を使用して分析した。LNPへのmRNA封入の効率を、1% (v/v) Triton X-100の非存在下および存在下での測定を比較することにより計算した。ナノ粒子サイズ、多分散性(PDI)、およびζ-電位を、Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, UK)を使用して動的光散乱(DLS)により分析した。LNP流体力学的直径は、体積加重モードにおいて報告され、3つの独立した測定の平均である。
【０１６１】
CRYO-TEM
低温（Cryogenic）透過型電子顕微鏡(Cryo-TEM)のために、試料を、Gatan Cryo Plunge III (Cp3)上で調製した。簡単に、3 uLの試料を、連続的な炭素フィルムでコートされたレース状の銅グリッド上に滴下し、液体エタン中で凍結した。続いて、凍結されたグリッドを、Gatan 626シングルティルトクライオホルダー上にマウントした。画像化を、200kVで稼動するJEOL 2100 FEG 顕微鏡を10,000〜60,000の倍率で使用して行った。全ての画像を、低線量条件下でGatan 2kx2k UltraScan CCDカメラを使用して記録した。
【０１６２】
データ分析および統計
図10および12のTLRデータについて、TLRレポーター細胞において測定された吸光度を、mTLR3およびhTLR8について、5つのNF-κBおよびAP-1結合部位に融合したIFN-β最小プロモーター（minimal promoter）の制御下のSEAPを有するプラスミドのみを含むヌルレポーター細胞、またはmTLR7について、5つのNF-κBおよびAP-1結合部位に融合したIL-12p40最小プロモーターの制御下のSEAPを有するプラスミドのみを含むヌルレポーター細胞において測定された吸光度に標準化した(Invivogen)。全ての複数日GLucおよびhEpoデータについて、発現を、各条件について初日の発現に対して表す。結果の統計分析を、等しくない分散を仮定して、両側かつ対応のない（two-tailed unpaired）Welchのt検定により行った。差は、p<0.05の場合、有意とみなした。全ての研究について、示されたデータは、1つの独立した実験の代表である。
【０１６３】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
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【表３−１２】
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【表３−１３】
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【表３−１４】
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【表３−１５】
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【表３−１６】
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【表３−１７】
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【表３−１８】
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【表３−１９】
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【表３−２０】
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【表３−２１】
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【表３−２２】
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【表３−２３】
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【表３−２４】
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【表３−２５】
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【表３−２６】
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【表３−２７】
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【表３−２８】
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【表３−２９】
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【０１６４】
Wesselhoeft, R.A., et al., 「RNA Circularization Diminishes Immunogenicity and Can Extend Translation Duration In Vivo」, Molecular Cell, vol. 74, 508-520ページ (2019)は、その全体において参照により本明細書に援用される。
【０１６５】
本明細書に引用される全ての特許、公開出願および参照文献の教示は、それらの全体において参照により援用される。
【０１６６】
例示態様が具体的に示され、記載されるが、添付の特許請求の範囲に包含される態様の範囲から逸脱することなく、形態および詳細における種々の変更が本発明においてなされ得ることが当業者には理解されよう。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【図９−８】
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【図９−９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１１−７】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021526792.tif 000119
2021526792.tif 000120
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