(57)【要約】  本発明は、各ペプチドのＮ末端が、非ペプチジル環化架橋要素によって、内部アミノ酸側鎖チオール官能基に共有結合しているアミリノミメティックペプチド類似体及びその誘導体に関する。チオエーテル環化アミリノミメティック類似体及びその誘導体は、置換、挿入、欠失、及び修飾を含む１つ以上の改変を含んでもよい。また、チオエーテル環化アミリノミメティック類似体及びその誘導体は、任意選択的に、例えば追加のペンダントカルボキシレート部分を任意選択的に有する少なくとも１４個の炭素原子のアルキル鎖のような、血清アルブミン結合要素を含んでもよく、又は、例えばＨＳＡ、非標的化ｍＡｂ、若しくはＦｃなどの、半減期延長生物学的部分を含んでもよい。更に、本発明は、アミリン受容体の調節に応答する、上記の類似体及びその誘導体の組成物と、病態の治療方法とに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ（配列番号５３）：
【化１】
2021522231.tif 000115
（式中、
ｎは１又は２であり；
Ｚ２は、直接結合、セリン、又はグリシンであり、
Ｚ４は、Ｔ又は
【化２】
2021522231.tif 000116
であり、
Ｚ５は、Ａ、β−アラニン、
【化３】
2021522231.tif 000117
であり、
Ｚ６は、Ｔ又は
【化４】
2021522231.tif 000118
であり、
Ｚ１０は、Ｑ又はＥであり、
Ｚ１１は、Ｒ又はＫであり、前記Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２によって置換されたものであり、
Ｚ１２は、Ｌ又は
【化５】
2021522231.tif 000119
であり、
Ｚ１６は、Ｌ又は
【化６】
2021522231.tif 000120
であり、
Ｚ２５は、Ｐ又はＫであり、前記Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【化７】
2021522231.tif 000121
によって置換されたものであり、前記ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、前記ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在し、
Ｚ２６は、Ｉ又はＫであり、前記Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【化８】
2021522231.tif 000122
によって置換されたものであり、前記ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、前記ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在し、
Ｘは、ＡＴＺ１０Ｚ１１Ｚ１２ＡＮＦＺ１６ＶＨＳＳＮＮＦＧＺ２５Ｚ２６ＬＰＺ２９ＴＮＶＧＺ３４（配列番号５４）、又はＶＬＧＲＬＳＱＥＬＨＲＬＱＴＹＰＲＴＮＴＧＳ（配列番号５５）であり、
Ｚ２９は、Ｐ又はＫであり、前記Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【化９】
2021522231.tif 000123
によって置換されたものであり、前記ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、前記ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在し、
Ｚ３４は、Ｓ又はＫであり、前記Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【化１０】
2021522231.tif 000124
によって置換されたものであり、前記ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、前記ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在する。）
の化合物、及びその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｚ２が、直接結合であり、
Ｚ５が、β−アラニン、
【化１１】
2021522231.tif 000125
であり、
Ｚ６が、Ｔである、
請求項１に記載の化合物及びその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
Ｚ１６が、Ｌであり、
Ｚ２５が、Ｐ又はＫであり、前記Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【化１２】
2021522231.tif 000126
によって置換されたものであり、前記ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、前記ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在し、
Ｚ２６が、Ｉ又はＫであり、前記Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【化１３】
2021522231.tif 000127
によって置換されたものであり、前記ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、前記ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在し、
Ｚ２９が、Ｐ又はＫであり、前記Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【化１４】
2021522231.tif 000128
によって置換されたものであり、前記ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、前記ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在し、
Ｚ３４が、Ｓ又はＫであり、前記Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【化１５】
2021522231.tif 000129
によって置換されたものであり、前記ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、前記ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在する、
請求項１に記載の化合物及びその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
Ｚ２が、直接結合であり、
Ｚ５が、β−アラニン、
【化１６】
2021522231.tif 000130
であり、
Ｚ６が、Ｔである、
請求項３に記載の化合物及びその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
Ｚ１１が、Ｒ又はＫであり、前記Ｋのε−アミンが、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２によって置換されたものであり、
Ｚ２５は、Ｐ又はＫであり、前記Ｋのε−アミンが、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３又は
【化１７】
2021522231.tif 000131
によって置換されたものであり、前記ｍＡｂが、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、前記ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在し、
Ｚ２６が、Ｉ又はＫであり、前記Ｋのε−アミンが、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【化１８】
2021522231.tif 000132
によって置換されたものであり、前記ｍＡＢが、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、前記ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在し、
Ｚ２９が、Ｐ又はＫであり、前記Ｋのε−アミンが、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３によって置換されたものであり、
Ｚ３４が、Ｓ又はＫであり、前記Ｋのε−アミンが、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３によって置換されたものである、
請求項３に記載の化合物及びその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
Ｚ２が、直接結合であり、
Ｚ５が、β−アラニン、
【化１９】
2021522231.tif 000133
であり、
Ｚ６が、Ｔである、
請求項５に記載の化合物及びその薬学的に許容される塩。
【請求項７】
Ｚ１２が、
【化２０】
2021522231.tif 000134
である、請求項５に記載の化合物及びその薬学的に許容される塩。
【請求項８】
【化２１】
2021522231.tif 000135
【化２２】
2021522231.tif 000136
【化２３】
2021522231.tif 000137
【化２４】
2021522231.tif 000138
【化２５】
2021522231.tif 000139
【化２６】
2021522231.tif 000140
【化２７】
2021522231.tif 000141
からなる群（それぞれ上から順に、配列番号４〜４２）から選択される、請求項５に記載の化合物及びその薬学的に許容される塩。
【請求項９】
前記化合物が、配列番号４〜４２からなる群から選択されるか、又はその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物と、
薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
疾患又は障害の治療又は予防を、それを必要とする対象に行う方法であって、前記疾患又は障害が、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに湿疹からなる群から選択され、
有効量の請求項１０に記載の医薬組成物を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１２】
食物摂取の低減を、それを必要とする対象に行う方法であって、有効量の請求項１０に記載の医薬組成物を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１３】
アミリン受容体活性の調節を、それを必要とする対象に行う方法であって、有効量の請求項１０に記載の医薬組成物を、それを必要とする前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１４】
前記アミリン受容体が、ＡＭＹ１Ｒ、及び／又はＡＭＹ２Ｒ、及び／又はＡＭＹ３Ｒを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アミリン受容体が、ＡＭＹ１Ｒである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アミリン受容体が、ＡＭＹ３Ｒである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記医薬組成物が、注射により投与される、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記医薬組成物が、少なくとも１つの抗糖尿病薬と組み合わせて投与される、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗糖尿病薬が、グルカゴン様ペプチド−１受容体調節因子である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記医薬組成物が、リラグルチドと組み合わせて投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含むキットであって、好ましくは、リラグルチド及び注射用デバイスを更に含む、前記キット。
【請求項２２】
請求項１０に記載の医薬組成物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１８年４月２５日に出願された米国特許仮出願第６２／６６２，４９２号に対する優先権の利益を主張するものであり、その特許仮出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれている配列表を含む。当該ＡＳＣＩＩのコピーは、２０１９年４月１６日に作成され、ファイル名はＰＲＤ３４７１ＷＯＰＣＴ１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、そのサイズは５５．７４７バイトである。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、アミリン、プラムリンチド、及びダバリンチドのチオエーテル環化類似体、並びにそれらの誘導体（本明細書では「アミリノミメティックペプチド」と呼ぶ）に関し、これらは、アミリン受容体のアゴニストとして機能し、そのため、肥満、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び脂質異常症などの代謝疾患及び障害の治療に有用である。
【背景技術】
【０００４】
アミリンは、カルシトニン（ＣＴ）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、アドレノメデュリン（ＡＭ）、及びインテルメジン（ＡＭ２）を含む、ペプチドのカルシトニンファミリーの、構造的に関連するメンバーである、自然に生じる３７アミノ酸含有ペプチドである。アミリンは、胃腸管への栄養素流入に応じて膵臓内で合成され、膵臓によって分泌される。循環系に放出された後、アミリンは、中枢神経系の後脳エリアの嘔吐中枢領域に主に位置する特定のクラスＢのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）と、高い親和性を伴って結合する。したがって、アミリンは、胃内容排出を阻害し、グルカゴンの放出を阻害し、満腹感を誘発することによって、グルコース恒常性を調節する役割を果たす中枢作用性神経内分泌ホルモンである（Ｈａｙ  ＤＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ  ２０１５；６７：５６４−６００においてレビューされている）。アミリンは、カルシトニン受容体（ＣＴＲ）及び受容体修飾タンパク質（ＲＡＭＰ１、ＲＡＭＰ２、及びＲＡＭＰ３）からなるヘテロ二量体構造である、３つの標的受容体サブタイプ（ＡＭＹ１Ｒ、ＡＭＹ２Ｒ、及びＡＭＹ３Ｒ）と生体外で相互作用することが明らかになっている（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｌｏｓ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９９９；５６：２３５−４２）。ＣＴＲとこれらのＲＡＭＰとの関連付けは、ＣＴＲ単独でのものと比較して、アミリン親和性の増加を与え、アミリン受容体を（ＣＴに優先して）選択する薬理学的基礎を提供する（Ｂｏｗｅｒ  ＲＬ  ａｎｄ  Ｈａｙ  ＤＬ，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２０１６；１７３：１８８３−９８）。アミリンが、特にＡＭＹ１Ｒ及びＡＭＹ３Ｒとの、親和性が高く／強力な相互作用に関与することが一般的に受け入れられているが、全ての受容体サブタイプにおける同時アゴニズムは、薬理学的利益のためには必ずしも必要とされない場合がある。（Ｈａｙ  ＤＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２０１８；１７５：３−１７；Ｈａｙ  ＤＬ，Ｈｅａｄａｃｈｅ  ２０１７；５７：８９−９６）。
【０００５】
膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）としても知られているヒトアミリンは、それ自身を医薬品としては適さないものとする、いくつかの物理化学的特性を有するが、例えば最も顕著には、その低い水溶性、並びに自己凝集傾向及び表面への付着傾向が挙げられる。３つの特異的残基変異（Ａ２５Ｐ、Ｓ２８Ｐ、及びＳ２９Ｐ）をアミリン配列に組み込むことによって、プラムリンチド、すなわち等能性アミリン類似体を開発した（Ｙｏｕｎｇ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｒｅｓ  １９９６；３７：２３１−４８）。これらの変異は、アミリンに対する改善された物理化学特性（凝集傾向の低減）を付与する。プラムリンチドは、肥満の対象の食物摂取（Ｓｍｉｔｈ  ＳＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２００７；２９３：Ｅ６２０−７）及び体重（Ａｒｏｎｎｅ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ  Ｍｅｔａｂ  ２００７；９２：２９７７−８３）を低減する。プラムリンチドは、１型糖尿病の成人患者の治療用に、インスリン治療と並行して行われる補助的療法として承認されており、かつ、２型糖尿病の成人患者用には、インスリン単独、又はインスリンをメトホルミン及び／若しくはスルホニル尿素と同時に用いる治療と並行して行われる補助的療法として承認されている（Ｐｕｌｌｍａｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｓｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｉｓｋ  Ｍａｎａｇ  ２００６；２：２０３−１２）。ダバリンチドは、関連する合成ペプチドであり、長さが３２アミノ酸であり、その構造は、プラムリンチド及びサケカルシトニンの一次配列のキメラである。したがってダバリンチドは、ヒトアミリンのアミロイド形成性残基を欠いている（Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９０；８７：５０３６−４０）。ダバリンチドは、アミリン受容体及びカルシトニン受容体の両方において非常に強力なアゴニストであり、ラットにおける食物摂取の低減及び体重の低減における天然の（ラット）アミリンよりも向上した薬理学的特性を示している（Ｍａｃｋ  ＣＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ  ２０１０；３４：３８５−９５）。アミリン、プラムリンチド及びダバリンチドはそれぞれ、生体内で極めて短い半減期（０．７５時間未満）を有し、これは、治療における実用性を制限するものである（Ｒｏｔｈ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎ  Ｅｎｄｏｃ  Ｍｅｔａｂ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００８；８：３１７−２４；Ｍａｃｋ  ＣＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｏｂｅｓ  Ｍｅｔａｂ  ２０１１；１３：１１０５−１３）。プラムリンチドの場合、この短い半減期のため、臨床上の有効性を達成するためには、毎日、複数回投与するというレジメンが必要となる。したがって、改善された代謝安定性及び薬物動態プロファイルを有する、アミリンアゴニストペプチド又はその誘導体を得ることが望ましい。
【０００６】
ペプチドの半減期を延長するために使用される１つの技術は、例えばアルブミン、好適なｍＡｂ若しくはその抗原結合フラグメント、又はｍＡｂ由来の結晶化フラグメントドメイン（Ｆｃ）タンパク質のような生物担体との共役反応を伴う。このような生体共役化学反応は、生物担体分子上の選択的に反応性のスルフヒドリル官能基と、対象となるペプチドに改変された相補的な求電子性部位との反応によって行われる。ペプチド分子に組み込まれたマレイミド官能基は、生体共役化学反応のための好適な求電子物質として機能しているが、その結果得られる生体共役反応により形成された物質は、生体内で逆共役反応（レトロマイケル反応）を受けて、生物担体からペプチドが失われる。したがって、反応性ハロアセトアミド誘導体化ペプチドへのカップリングによって形成される、より安定なチオアセトアミド結合を使用して、この逆共役の可能性を回避する。しかしながら、ブロモアセトアミド共役反応に必要とされる条件は、ジスルフィド含有アミリン類似体と共に使用して、それらの選択的な生体共役反応を成功裏に得ることが、アンヒンダードジスルフィド環の反応性ゆえにできない。このような試みられた化学反応は、同時の環開口反応及びそれに併発する関連する副反応をもたらす。完全な状態のジスルフィドループは、受容体活性化及び生物学的機能に必要とされる決定的に重要な分子的特徴であることが、長い間認識されてきた（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＡＮ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８９；８６：９６６２−９６６６；Ｃｏｒｎｉｓｈ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９８；２７４：Ｅ８２７−Ｅ８３３；Ｂｏｗｅｒ  ＲＬ  ａｎｄ  Ｈａｙ  ＤＬ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１６；１７３：１８８３−１８９８）。本明細書では、プラムリンチド及びダバリンチドのシステインジスルフィド結合のためのＮ末端環状チオエーテル置換が、予想外にアミリン受容体アゴニスト活性を維持し、生物共役化学反応に向かって安定であることが特定される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１つの一般的な態様では、本発明は、新規のアミリノミメティック化合物に関する。また、本明細書では、プラムリンチド又はダバリンチドのアミリノミメティック誘導体、及びアミリノミメティックペプチドに結合されたモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートも提供される。
【０００８】
一態様では、本発明は、式Ｉの化合物又はその誘導体（配列番号５３）によって表され：
【０００９】
【化１】
2021522231.tif 000002
（式中、
ｎは、１又は２であり、
Ｚ２は、直接結合、セリン、又はグリシンであり、
Ｚ４は、Ｔ又は
【００１０】
【化２】
2021522231.tif 000003
であり、
Ｚ５は、Ａ、β−アラニン、
【００１１】
【化３】
2021522231.tif 000004
であり、
Ｚ６は、Ｔ又は
【００１２】
【化４】
2021522231.tif 000005
であり、
Ｚ１０は、Ｑ又はＥであり、
Ｚ１１は、Ｒ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２によって置換されたものであり、
Ｚ１２は、Ｌ又は
【００１３】
【化５】
2021522231.tif 000006
であり、
Ｚ１６は、Ｌ又は
【００１４】
【化６】
2021522231.tif 000007
であり、
Ｚ２５は、Ｐ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【００１５】
【化７】
2021522231.tif 000008
によって置換されたものであり、ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在し、
Ｚ２６は、Ｉ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【００１６】
【化８】
2021522231.tif 000009
によって置換されたものであり、ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在し、
Ｘは、ＡＴＺ１０Ｚ１１Ｚ１２ＡＮＦＺ１６ＶＨＳＳＮＮＦＧＺ２５Ｚ２６ＬＰＺ２９ＴＮＶＧＺ３４（配列番号５４）、又はＶＬＧＲＬＳＱＥＬＨＲＬＱＴＹＰＲＴＮＴＧＳ（配列番号５５）であり、
Ｚ２９は、Ｐ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【００１７】
【化９】
2021522231.tif 000010
によって置換されたものであり、ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在し、
Ｚ３４は、Ｓ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【００１８】
【化１０】
2021522231.tif 000011
によって置換されたものであり、ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在する）、
及びその薬学的に許容される塩である。
【００１９】
特定の実施形態では、本発明は、式Ｉの化合物又はその誘導体によって表され、（式中、
ｎは、１又は２であり、
Ｚ２は、直接結合であり、
Ｚ４は、Ｔ又は
【００２０】
【化１１】
2021522231.tif 000012
であり、
Ｚ５は、β−アラニン、
【００２１】
【化１２】
2021522231.tif 000013
であり、
Ｚ６は、Ｔであり、
Ｚ１０は、Ｑ又はＥであり、
Ｚ１１は、Ｒ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２によって置換されたものであり、
Ｚ１２は、Ｌ又は
【００２２】
【化１３】
2021522231.tif 000014
であり、
Ｚ１６は、Ｌ又は
【００２３】
【化１４】
2021522231.tif 000015
であり、
Ｚ２５は、Ｐ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【００２４】
【化１５】
2021522231.tif 000016
によって置換されたものであり、ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在し、
Ｚ２６は、Ｉ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【００２５】
【化１６】
2021522231.tif 000017
によって置換されたものであり、ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在し、
Ｘは、ＡＴＺ１０Ｚ１１Ｚ１２ＡＮＦＺ１６ＶＨＳＳＮＮＦＧＺ２５Ｚ２６ＬＰＺ２９ＴＮＶＧＺ３４（配列番号５４）、又はＶＬＧＲＬＳＱＥＬＨＲＬＱＴＹＰＲＴＮＴＧＳ（配列番号５５）であり、
Ｚ２９は、Ｐ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【００２６】
【化１７】
2021522231.tif 000018
によって置換されたものであり、ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在し、
Ｚ３４は、Ｓ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【００２７】
【化１８】
2021522231.tif 000019
によって置換されたものであり、ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在する）、
及びその薬学的に許容される塩である。
【００２８】
特定の実施形態では、本発明は、式Ｉの化合物又はその誘導体によって表され、（式中、
ｎは、１又は２であり、
Ｚ２は、直接結合又はセリンであり、
Ｚ４は、Ｔ又は
【００２９】
【化１９】
2021522231.tif 000020
であり、
Ｚ５は、Ａ、β−アラニン、
【００３０】
【化２０】
2021522231.tif 000021
であり、
Ｚ６は、Ｔ又は
【００３１】
【化２１】
2021522231.tif 000022
であり、
Ｚ１０は、Ｑ又はＥであり、
Ｚ１１は、Ｒ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２によって置換されたものであり、
Ｚ１２は、Ｌ又は
【００３２】
【化２２】
2021522231.tif 000023
であり、
Ｚ１６は、Ｌであり、
Ｚ２５は、Ｐ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【００３３】
【化２３】
2021522231.tif 000024
によって置換されたものであり、ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在し、
Ｚ２６は、Ｉ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【００３４】
【化２４】
2021522231.tif 000025
によって置換されたものであり、ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在し、
Ｘは、ＡＴＺ１０Ｚ１１Ｚ１２ＡＮＦＺ１６ＶＨＳＳＮＮＦＧＺ２５Ｚ２６ＬＰＺ２９ＴＮＶＧＺ３４（配列番号５４）、又はＶＬＧＲＬＳＱＥＬＨＲＬＱＴＹＰＲＴＮＴＧＳ（配列番号５５）であり、
Ｚ２９は、Ｐ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【００３５】
【化２５】
2021522231.tif 000026
によって置換されたものであり、ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、ｍＡｂ上に２つの同一の式ＩＩの化合物が存在し、
Ｚ３４は、Ｓ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【００３６】
【化２６】
2021522231.tif 000027
によって置換されたものであり、ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在する）、
及びその薬学的に許容される塩である。
【００３７】
特定の実施形態では、本発明は、式Ｉの化合物又はその誘導体によって表され、（式中、
ｎは、１又は２であり、
Ｚ２は、直接結合であり、
Ｚ４は、Ｔ又は
【００３８】
【化２７】
2021522231.tif 000028
であり、
Ｚ５は、β−アラニン、
【００３９】
【化２８】
2021522231.tif 000029
であり、
Ｚ６は、Ｔであり、
Ｚ１０は、Ｑ又はＥであり、
Ｚ１１は、Ｒ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２によって置換されたものであり、
Ｚ１２は、Ｌ又は
【００４０】
【化２９】
2021522231.tif 000030
であり、
Ｚ１６は、Ｌであり、
Ｚ２５は、Ｐ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【００４１】
【化３０】
2021522231.tif 000031
によって置換されたものであり、ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、ｍＡｂ上に２つの同一の式ＩＩの化合物が存在し、
Ｚ２６は、Ｉ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【００４２】
【化３１】
2021522231.tif 000032
によって置換されたものであり、ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在し、
Ｘは、ＡＴＺ１０Ｚ１１Ｚ１２ＡＮＦＺ１６ＶＨＳＳＮＮＦＧＺ２５Ｚ２６ＬＰＺ２９ＴＮＶＧＺ３４（配列番号５４）、又はＶＬＧＲＬＳＱＥＬＨＲＬＱＴＹＰＲＴＮＴＧＳ（配列番号５５）であり、
Ｚ２９は、Ｐ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【００４３】
【化３２】
2021522231.tif 000033
によって置換されたものであり、ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在し、
Ｚ３４は、Ｓ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【００４４】
【化３３】
2021522231.tif 000034
によって置換されたものであり、ｍＡｂが、任意選択で、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在する）、
及びその薬学的に許容される塩である。
【００４５】
特定の実施形態では、本発明は、式Ｉの化合物又はその誘導体によって表され、（式中、
ｎは、１又は２であり、
Ｚ２は、直接結合又はセリンであり、
Ｚ４は、Ｔ又は
【００４６】
【化３４】
2021522231.tif 000035
であり、
Ｚ５は、Ａ、β−アラニン、
【００４７】
【化３５】
2021522231.tif 000036
であり、
Ｚ６は、Ｔ又は
【００４８】
【化３６】
2021522231.tif 000037
であり、
Ｚ１０は、Ｑ又はＥであり、
Ｚ１１は、Ｒ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２によって置換されたものであり、
Ｚ１２は、Ｌ又は
【００４９】
【化３７】
2021522231.tif 000038
であり、
Ｚ１６は、Ｌであり、
Ｚ２５は、Ｐ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３又は
【００５０】
【化３８】
2021522231.tif 000039
によって置換されたものであり、ｍＡｂが、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在し、
Ｚ２６は、Ｉ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【００５１】
【化３９】
2021522231.tif 000040
によって置換されたものであり、ｍＡｂが、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在し、
Ｘは、ＡＴＺ１０Ｚ１１Ｚ１２ＡＮＦＺ１６ＶＨＳＳＮＮＦＧＺ２５Ｚ２６ＬＰＺ２９ＴＮＶＧＺ３４（配列番号５４）、又はＶＬＧＲＬＳＱＥＬＨＲＬＱＴＹＰＲＴＮＴＧＳ（配列番号５５）であり、
Ｚ２９は、Ｐ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３によって置換されたものであり、
Ｚ３４は、Ｓ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３によって置換されたものである）、
及びその薬学的に許容される塩である。
【００５２】
特定の実施形態では、本発明は、式Ｉの化合物又はその誘導体によって表され、（式中、
ｎは、１又は２であり、
Ｚ２は、直接結合であり、
Ｚ４は、Ｔ又は
【００５３】
【化４０】
2021522231.tif 000041
であり、
Ｚ５は、β−アラニン、
【００５４】
【化４１】
2021522231.tif 000042
であり、
Ｚ６は、Ｔであり、
Ｚ１０は、Ｑ又はＥであり、
Ｚ１１は、Ｒ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２によって置換されたものであり、
Ｚ１２は、Ｌ又は
【００５５】
【化４２】
2021522231.tif 000043
であり、
Ｚ１６は、Ｌであり、
Ｚ２５は、Ｐ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３又は
【００５６】
【化４３】
2021522231.tif 000044
によって置換されたものであり、ｍＡｂが、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在し、
Ｚ２６は、Ｉ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【００５７】
【化４４】
2021522231.tif 000045
によって置換されたものであり、ｍＡｂが、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在し、
Ｘは、ＡＴＺ１０Ｚ１１Ｚ１２ＡＮＦＺ１６ＶＨＳＳＮＮＦＧＺ２５Ｚ２６ＬＰＺ２９ＴＮＶＧＺ３４（配列番号５４）、又はＶＬＧＲＬＳＱＥＬＨＲＬＱＴＹＰＲＴＮＴＧＳ（配列番号５５）であり、
Ｚ２９は、Ｐ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３によって置換されたものであり、
Ｚ３４は、Ｓ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３によって置換されたものである）、
及びその薬学的に許容される塩である。
【００５８】
特定の実施形態では、本発明は、式Ｉの化合物又はその誘導体によって表され、（式中、
ｎは、１又は２であり、
Ｚ２は、直接結合又はセリンであり、
Ｚ４は、Ｔ又は
【００５９】
【化４５】
2021522231.tif 000046
であり、
Ｚ５は、Ａ、β−アラニン、
【００６０】
【化４６】
2021522231.tif 000047
であり、
Ｚ６は、Ｔ又は
【００６１】
【化４７】
2021522231.tif 000048
であり、
Ｚ１０は、Ｑ又はＥであり、
Ｚ１１は、Ｒ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２によって置換されたものであり、
Ｚ１２は、
【００６２】
【化４８】
2021522231.tif 000049
であり、
Ｚ１６は、Ｌであり、
Ｚ２５は、Ｐ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３又は
【００６３】
【化４９】
2021522231.tif 000050
によって置換されたものであり、ｍＡｂが、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、ｍＡｂ上に２つの同一の式ＩＩの化合物が存在し、
Ｚ２６は、Ｉ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、
【００６４】
【化５０】
2021522231.tif 000051
によって置換されたものであり、ｍＡｂが、式Ｉの第２の化合物への別のチオエーテル結合を介して置換され、その結果、ｍＡｂ上に２つの同一の式Ｉの化合物が存在し、
Ｘは、ＡＴＺ１０Ｚ１１Ｚ１２ＡＮＦＺ１６ＶＨＳＳＮＮＦＧＺ２５Ｚ２６ＬＰＺ２９ＴＮＶＧＺ３４（配列番号５４）、又はＶＬＧＲＬＳＱＥＬＨＲＬＱＴＹＰＲＴＮＴＧＳ（配列番号５５）であり、
Ｚ２９は、Ｐ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３によって置換されたものであり、
Ｚ３４は、Ｓ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ３によって置換されたものである）、
及びその薬学的に許容される塩である。
【００６５】
ある特定の実施形態では、化合物は、配列番号４〜４２、又はその薬学的に許容される塩からなる群から選択される。
【００６６】
ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、リンカーを介して、アミリノミメティックペプチドのリジン残基において、アミリノミメティックペプチドに共有結合している。リンカーの非限定的な例には、２〜２４個のＰＥＧ単位のａａ  ＰＥＧ鎖、（ＯＥＧ（０−４）−γ−Ｇｌｕ）、（ＯＥＧ（１−４））、又は２〜１０個の炭素原子を含有するアルキル鎖が挙げられ、このリンカーは、それに限定されないが、例えばアセチルなどの基を含んでもよい。
【００６７】
ある特定の実施形態では、式Ｉ中のＺ２５、Ｚ２６、Ｚ２９、及びＺ３４のうちの１つのみがリジンであり、リジンは、リンカーを介して、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの改変システイン残基に共有結合している。
【００６８】
本発明の別の実施形態は、式Ｉの化合物、又は配列番号４〜４２からなる群から選択される化合物と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物である。
【００６９】
ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４７、４８、４９、５０、５１、及び５２のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号４３のポリペプチド配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号４５のポリペプチド配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。ある特定の実施形態では、単離されたモノクローナル抗体は、Ｆｃ部分を更に含む。ある特定の実施形態では、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号４４のポリペプチド配列を有する重鎖（ＨＣ）と、配列番号４６のポリペプチド配列を有する軽鎖（ＬＣ）とを含む。
【００７０】
また、アミリノミメティックペプチドに結合されたモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートも提供され、このモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４７、４８、４９、５０、５１、及び５２のポリペプチド配列をそれぞれ有する、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、好ましくは、このモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４３のポリペプチド配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号４５のポリペプチド配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含み、より好ましくは、このモノクローナル抗体は、配列番号４４のポリペプチド配列を有する重鎖（ＨＣ）と、配列番号４６のポリペプチド配列を有する軽鎖（ＬＣ）とを含み、アミリノミメティックペプチドは、配列番号４〜２８からなる群から選択されるポリペプチド配列、又はその薬学的に許容される塩を含み、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミリノミメティックペプチドの残基２５、２６、２９、又は３４、好ましくはアミリノミメティックペプチドのリジン残基２５又は２６において、直接又はリンカーを介して、アミリノミメティックペプチドに共役化される。
【００７１】
また、本発明のコンジュゲートの生成方法も提供される。本方法は、アミリノミメティックペプチドの側鎖又はその側鎖上のリンカー、好ましくはアミリノミメティックペプチドのリジン残基の側鎖上に導入される求電子物質、好ましくはブロモアセトアミドを、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの配列番号４９のシステイン残基のスルフヒドリル基と反応させ、それにより、アミリノミメティックペプチドとモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントとの間に共有結合を創出することを含む。
【００７２】
本発明は、本発明のコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。
【００７３】
疾患又は障害の治療又は予防をそれを必要とする対象に行う方法も提供され、当該疾患又は障害は、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに湿疹からなる群から選択される。本方法は、有効量の本発明の医薬組成物の投与を、それを必要とする対象に行うことを含む。
【００７４】
また、食物摂取の低減をそれを必要とする対象に行う方法も提供される。本方法は、有効量の本発明の医薬組成物の投与をそれを必要とする対象に行うことを含む。
【００７５】
また、アミリン受容体活性の調節をそれを必要とする対象に行う方法も提供される。本方法は、有効量の本発明の医薬組成物の投与を、それを必要とする対象に行うことを含む。
【００７６】
また、アミリン受容体活性の調節を、それを必要とする対象において行う方法も提供され、このアミリン受容体は、ＡＭＹ１Ｒ、ＡＭＹ２Ｒ、及び／又はＡＭＹ３Ｒを含む。本方法は、有効量の本発明の医薬組成物の投与を、それを必要とする対象に行うことを含む。
【００７７】
また、アミリン受容体活性の調節を、それを必要とする対象において行う方法も提供され、このアミリン受容体はＡＭＹ１Ｒである。
【００７８】
また、アミリン受容体活性の調節を、それを必要とする対象において行う方法も提供され、このアミリン受容体はＡＭＹ３Ｒである。
【００７９】
本方法は、有効量の本発明の医薬組成物の投与を、それを必要とする対象に行うことを含む。
【００８０】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、注射により投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの抗糖尿病薬と組み合わせて投与される。抗糖尿病薬は、例えば、グルカゴン様ペプチド−１受容体調節因子であり得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、リラグルチドと組み合わせて投与される。
【００８１】
本発明のコンジュゲートを含み、好ましくは、リラグルチド及び注射用デバイスを更に含むキットも提供される。
【００８２】
また、本発明の医薬組成物の生成方法も提供される。本方法は、コンジュゲートを薬学的に許容される担体と組み合わせて、医薬組成物を得ることを含む。
【００８３】
本発明の更なる態様、特徴、及び利点は、「発明の詳細な説明」及び「特許請求の範囲」を読むことにより、より良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
上記の概要、及び本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良く理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
背景技術において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載する。これら参照文献の各々は、その全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいかなる発明に対しても、先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
【００８６】
特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。
【００８７】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意すべきである。
【００８８】
特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は、０．９〜１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は、０．９〜１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用する場合、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。
【００８９】
別途記載のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、直列の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用するだけで、本明細書に記載した特定の手順に対して非常に多くの同等物を認識するか、又は確認することができよう。このような等価物は、本発明によって包含されることが意図される。
【００９０】
本明細書で使用する場合、用語「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有する（contains）」、若しくは「含有する（containing）」、又はそれらの任意の他の変形形態は、明記される整数又は整数群を含むが、任意の他の整数又は整数群を除外することを示唆しないと理解され、非独占又は無制限であることが意図される。例えば、一連の要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、明示的に列挙されない、又はそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置に本来存在しない他の要素を含んでもよい。更に、明示的に反対に明記されない限り、「又は」は包括的な又はを指すものであり、排他的な又はを指すものではない。例えば、条件Ａ又はＢは、Ａが真であり（又は存在する）かつＢが偽である（又は存在しない）場合、Ａが偽であり（又は存在しない）かつＢが真である（又は存在する）場合、並びにＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）場合、のいずれか１つによって充足される。
【００９１】
好ましい発明の構成要素の寸法又は特徴を指すときに本明細書で使用される用語「約」、「およそ」、「概ね」、「実質的に」などの用語は、当業者には理解されるように、記載の寸法／特徴が厳密な境界又はパラメータではなく、また機能的に同じ又は類似する、それらからのわずかな相違を除外しないことを示すことも理解されたい。最小値では、数値パラメータを含むこのような参照は、当該技術分野において受け入れられている数学的及び工業的原理（例えば、四捨五入、測定、又は他の系統的誤差、製造公差など）を使用すると、最小有効数字は変化しない変形形態を含むであろう。
【００９２】
「同一の」又は「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列（例えば、アミリノミメティック３−３６ポリペプチド配列、抗体の軽鎖又は重鎖配列）との関連において、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、又は本開示を考慮して当該技術分野において既知の方法を使用した目視検査によって測定されるとき、最大一致について比較され、整列される場合、同一であるか、又は同一であるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドの指定された割合を有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。
【００９３】
配列比較のために、典型的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて、サブシーケンス座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列（複数可）の配列同一性パーセントを計算する。
【００９４】
比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視検査（一般的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照されたい）によって行うことができる。
【００９５】
配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウェアは、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）を通じて公的に入手可能である。
【００９６】
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの更なる指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「対象」は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用するとき、用語「哺乳動物」とは、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、これらに限定されるものではないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなど、より好ましくはヒトが挙げられる。
【００９８】
本発明の方法に関して用語「投与」は、本発明のコンジュゲート、又はその形成物、組成物、若しくは薬剤を使用することにより、本明細書に記載の症候群、障害、又は疾患を、治療学的又は予防学的に、予防する、治療する、又は寛解させる方法を意味する。このような方法は、有効量の当該コンジュゲート、その形成物、組成物、若しくは薬剤を、治療過程中の異なる時点で、又は併用形式で同時に、投与することを含む。本発明の方法は、既知の治療的処置レジメンを全て包含するものとして理解されるものである。
【００９９】
「有効量」という用語は、研究者、獣医、医師、又は他の臨床医が探求している、組織系、動物、又はヒトにおいて生物学的又は医学的反応（治療される症候群、障害、若しくは疾患、又は治療される症候群、障害、若しくは疾患の症状を予防する、治療する、又は寛解させることを含む）を引き出す活性コンジュゲート又は医薬用薬剤の量を意味する。
【０１００】
本明細書で使用するとき、用語「組成物」は、特定の成分を特定の量で含む生成物、並びに、直接的又は間接的に特定の成分の特定の量の組み合わせから生じる任意の生成物を包含するものとする。
【０１０１】
本明細書で使用するとき、用語「結合された」は、２つ以上の物体を一緒に接合又は接続することを指す。化学化合物又は生物学的化合物を指す場合、結合されたとは、２つ以上の化学化合物又は生物学的化合物間の共有結合による接続を指し得る。非限定的な例として、本発明の抗体は、目的のペプチド（例えば、本発明のアミリノミメティックペプチド）と結合されて抗体結合ペプチドを形成することができる。ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、リンカーにより本発明のペプチドと共有結合され得る。リンカーは、例えば、最初に抗体又はペプチドに共有結合により接続され、次いでペプチド又は抗体に共有結合により接続され得る。抗体結合ペプチドは、抗体をペプチドに共役化するように設計された特定の化学反応によって形成することができる。一例として、ｍＡｂ結合アミリノミメティックペプチドコンジュゲートは、共役反応によって形成することができる。共役反応は、例えば、求電子基（例えば、ブロモアセトアミド又はマレイミド）を、ｍＡｂ上のシステイン残基のスルフヒドリル基と反応させることを含み得る。求電子基は、例えば、アミリノミメティックペプチドのアミノ酸残基の側鎖上に導入することができる。求電子基とスルフヒドリル基との反応により、共有結合チオエーテル結合が形成される。
【０１０２】
本明細書で使用するとき、用語「リンカー」は、抗体をペプチドに共有結合により結合する共有結合体又は原子鎖を含む化学モジュールを指す。リンカーとしては、例えば、ペプチドリンカー、炭化水素リンカー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）リンカー、多糖類リンカー、ポリエステルリンカー、ＰＥＧと埋め込まれた複素環とからなるハイブリッドリンカー、及び炭化水素鎖を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１０３】
本明細書で使用するとき、用語「コンジュゲート」は、薬学的に活性な部分に共有結合した抗体又はそのフラグメントを指す。「共役化された」という用語は、本発明の抗体又はそのフラグメントが、直接的に又はリンカーを介して間接的に、薬学的活性部分（好ましくは治療用ペプチド）に共有結合で連結されている又は共有結合で接続されていることを指す。非限定的な例として、抗体は、本発明のモノクローナル抗体であってもよく、薬学的に活性な部分は、目的のアミリノメティックペプチドなどの治療用ペプチドであり得る。
【０１０４】
抗体
本明細書で抗体との関連において、用語「非標的化」が用いられた場合には、生体内で任意の標的に特異的に結合しない抗体を指す。本明細書で、「標的に特異的に結合する」抗体という用語が用いられた場合には、１×１０−８Ｍ以下、好ましくは５×１０−９Ｍ以下、１×１０−９Ｍ以下、５×１０−１０Ｍ以下、又は１×１０−１０Ｍ以下のＫＤで標的抗原に結合する抗体を指す。用語「ＫＤ」は、Ｋｄ対Ｋａの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指す。抗体のＫＤ値は、本開示を考慮して当該技術分野における方法を用いて決定することができる。例えば、抗体のＫＤは、バイオセンサーシステム、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムを使用することによって、又はＯｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６システムなどのバイオレイヤー干渉法技術を使用することによってなど、表面プラズモン共鳴を使用することによって決定することができる。抗体のＫＤの値が小さいほど、抗体が標的抗原に結合する親和性が高い。
【０１０５】
モノクローナル抗体（全体又はそのフラグメント）は、半減期延長部分として使用することができる。モノクローナル抗体は、生体内で利用され、生体内での使用に特徴付けられた、十分に研究されているタンパク質であり、したがって、生体内でのそれらの半減期の延長を可能にする機構及び生体内でのそれらの除去のための機構は十分に理解されている。加えて、モノクローナル抗体の２つの「アーム」の空間的分離及び提示は、治療部分（すなわち、治療用ペプチド）の有効な二価提示に有利であり得る。毒素又は他の小分子薬物がモノクローナル抗体に化学的に連結されている治療薬が開発されているが、典型的には、特定の抗原に結合し、かつ抗原を優先的に発現した抗体−薬物コンジュゲートを目的の組織／細胞に標的化するモノクローナル抗体を利用し、典型的には、薬物／小分子は、抗体の抗原結合に影響を及ぼさない様式で抗体に結合される。
【０１０６】
治療用ペプチド−ｍＡｂコンジュゲートについて、半減期延長モノクローナル抗体による抗原特異的結合は所望されない。このため、任意の標的に特異的に結合することが予想されない重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）可変（Ｖ）ドメイン対が、本発明の結合可能な非標的化モノクローナル抗体を調製するために使用される。結合可能な非標的化モノクローナル抗体を得るために、システイン残基を、選択された非標的抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つに改変する。薬学的に活性な部分（例えば、治療用ペプチド／化合物）は、非標的化モノクローナル抗体の改変システイン残基への薬学的に活性な部分の共役化を可能にする適切な化学的部分を含有することができる。
【０１０７】
本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、広義の意味を有し、非ヒト（例えば、マウス、ラット）、ヒト、ヒト適合化、ヒト化、及びキメラモノクローナル抗体、抗体フラグメント、二重特異性又は多重特異性抗体、二量体、四量体、又は多量体抗体、並びに単鎖抗体を含む。
【０１０８】
いずれの脊椎動物種の抗体軽鎖も、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて２つの明確に異なるタイプ、すなわちカッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの一方に割り当てられ得る。したがって、本発明の抗体は、κ又はλ軽鎖定常ドメインを含有することができる。特定の実施形態によると、本発明の抗体は、マウス又はヒト抗体からの重鎖及び／又は軽鎖定常領域を含む。重及び軽定常ドメインに加えて、抗体は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域からなる抗原結合領域を含有し、これらのそれぞれは３つのドメイン（すなわち相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含有する。軽鎖可変領域ドメインは、代替的にＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＲＤ３と称され、重鎖可変領域ドメインは、代替的にＨＣＤＲ１、ＨＣＲＤ２、及びＨＣＤＲ３と称される。
【０１０９】
免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて５つの主なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＧは、ヒトにおいて約２３日間の血清半減期を有する５種類の免疫グロブリンの中で最も安定している。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に更に下位分類される。４つのＩｇＧサブクラスのそれぞれは、エフェクター機能として既知の異なる生物学的機能を有する。これらのエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用によって、又はＣ１ｑの結合及び補体の固定によって媒介される。ＦｃγＲへの結合は、抗体依存性細胞媒介性細胞溶解をもたらし得るが、補体因子への結合は、補体媒介性細胞溶解をもたらし得る。治療用ペプチドの半減期を延長する能力に利用される本発明の抗体は、エフェクター機能を有さない又は最小限のエフェクター機能を有するが、ＦｃＲｎに結合する能力を保持し、その結合は、抗体が生体内での半減期の延長を有する主要な手段であり得る。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、本発明は、完全ヒトＩｇ生殖系列Ｖ遺伝子配列を有する軽鎖可変領域、及び配列番号４９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を除く完全ヒトＩｇ生殖系列Ｖ遺伝子配列を有する重鎖可変領域を含む、単離された抗体又はその抗原結合フラグメント、並びにそれに共役化された薬学的に活性な部分（例えば本発明のアミリノミメティックペプチド）を含むコンジュゲートに関し、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、生体内で任意のヒト抗原に特異的に結合しない。本開示において、本発明の実施形態による抗体又はその抗原結合フラグメントに関して、語句「抗体又はその抗原結合フラグメント及びそれに共役化された薬学的に活性な部分を含むコンジュゲート」は、「薬学的に活性な部分に共役化された抗体又はその抗原結合フラグメント」と互換的に使用される。
【０１１１】
本明細書で使用するとき、用語「抗原結合フラグメント」は、例えば、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄａｂ）ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、１つ以上のＣＤＲを含む抗体の一部から形成される多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、又は抗原に結合するが完全な抗体構造を含まない任意の他の抗体フラグメントなどの抗体フラグメントを指す。抗原結合フラグメントは、親抗体又は親抗体フラグメントが結合する同じ抗原に結合することができる。特定の実施形態によると、抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、及びＦｄセグメント（すなわち、Ｆａｂフラグメントに含まれる重鎖の部分）を含む。他の特定の実施形態によると、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）を含む。
【０１１２】
本明細書で使用するとき、用語「単鎖抗体」は、約１５〜約２０個のアミノ酸の短いペプチドによって接続される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、この分野における従来の単鎖抗体を指す。本明細書で使用するとき、用語「単一ドメイン抗体」は、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含むか、又は重鎖可変領域のみを含む、この分野における従来の単一ドメイン抗体を指す。
【０１１３】
語句「単離された抗体又は抗体フラグメント」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体又は抗体フラグメントを指す（例えば、標的抗原に特異的に結合する単離された抗体は、標的抗原に特異的に結合しない抗体を実質的に含まない）。更に、単離された抗体又は抗体フラグメントは、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まない場合がある。
【０１１４】
抗体可変領域は、３つの「抗原結合部位」によって中断された「フレームワーク」領域からなる。抗原結合部位は、様々な用語を用いて定義される：（ｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）、これは、配列特異性に基づいてＶＨ内に３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及びＶＬ内に３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １３２：２１１−５０，１９７０；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）「超可変領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」、ＶＨ内の３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ内の３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）は、Ｃｈｕｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１−１７，１９８７）により定義される構造において超可変性である、抗体可変ドメインの領域を指す。他の用語には、「ＩＭＧＴ−ＣＤＲ」（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐａｒａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：５５−７７，２００３）及び「Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｕｓａｇｅ（ＳＤＲＵ）」（Ａｌｍａｇｒｏ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  １７：１３２−４３，２００４）が含まれる。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、抗原結合部位の標準的番号付け及び定義を提供する。ＣＤＲ、ＨＶ、及びＩＭＧＴ概要説明の対応関係が、Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐａｒａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：５５−７７，２００３に記載されている。
【０１１５】
「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」は、抗原結合部位として定義されたものを除く、可変領域の残りの配列である。抗原結合部位は上述のような様々な用語によって定義され得るため、フレームワークの正確なアミノ酸配列は抗原結合部位がどのように定義されたかによる。
【０１１６】
本発明の一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号５０、配列番号５１及び配列番号５２のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、それぞれ配列番号４７、配列番号４８及び配列番号４９のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を有する重鎖可変領域とを含む。
【０１１７】
別の実施形態では、単離された抗体は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域を更に含む。ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、他のＩｇＧサブタイプと比較して、ＦｃγＲ及び補体因子に結合する能力が低減されている。好ましくは、Ｆｃ領域は、エフェクター機能を排除する置換を有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含有する。したがって、単離された抗体は、次の置換のうちの１つ以上を含有する修飾されたヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域を有するＦｃ領域を更に含む：残基２３３におけるグルタミン酸の代わりにプロリンを使用、残基２３４におけるフェニルアラニンの代わりにアラニン又はバリンを使用、及び残基２３５（ＥＵ番号付け、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２）におけるロイシンの代わりにアラニン又はグルタメートを使用。残基２９７（ＥＵ番号付け）においてＡｓｎの代わりにＡｌａを使用することによって、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域におけるＮ連結グリコシル化部位を除去することは、残留エフェクター活性が排除されることを確実にする別の方法である。
【０１１８】
好ましくは、本発明の抗体は、ジスルフィド結合及び様々な非共有結合相互作用によって一緒に接合された二量体として存在し得る。したがって、本発明の抗体に有用なＦｃ部分は、重鎖二量体形成を安定させ、半ＩｇＧ４  Ｆｃ鎖の形成を防止する、２２８（ＥＵ番号付け）における位置でのプロリンに対するセリンなどの置換を含有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり得る。
【０１１９】
別の実施形態では、重鎖のＣ末端Ｌｙｓ残基は、組換えにより生成されたモノクローナル抗体に一般的に見られるように除去される。
【０１２０】
「ヒト抗体」とは、フレームワーク及び抗原結合部位の両方がヒト起源の配列に由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する抗体を指す。抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もヒト起源の配列に由来する。
【０１２１】
ヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合のヒト起源の配列に「由来する」重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を含む。そのような系は、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、及び本明細書に記載されるヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するマウスなど、トランスジェニックの非ヒト動物を含む。「ヒト抗体」は、例えばフレームワーク又は抗原結合部位内に天然に存在する体細胞突然変異、又は意図的な置換の導入により、ヒト生殖系列又は再編成された免疫グロブリン配列と比較した場合に、アミノ酸の相違を含有し得る。典型的には、ヒト抗体は、アミノ酸配列において、ヒト生殖系列又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。一部の場合では、「ヒト抗体」は、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６：５７−８６，２０００に記載されるヒトフレームワーク配列分析から得られたコンセンサスフレームワーク配列、又は例えばＳｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７：３８５−９６，２０１０、及び国際特許出願公開第２００９／０８５４６２号に記載される、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに組み込まれた合成ＨＣＤＲ３を含有し得る。抗原結合部位が非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。
【０１２２】
単離されたヒト化抗体は合成であり得る。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来するものであるが、合成ＣＤＲ及び／若しくは合成フレームワークを組み込んだファージディスプレイなどの系を用いて生成され得るか、又は生体外での突然変異誘発を行って抗体の特性を改善することができ、生体内のヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しない抗体を得ることができる。
【０１２３】
本明細書で使用されるとき、用語「組換え抗体」は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニック若しくは染色体導入動物（例えばマウス）又はそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリから単離された抗体、並びにヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライスすることを伴う任意の他の手段により調製、発現、創出、又は単離された抗体、あるいはＦａｂアーム交換を用いて生体外で生成される抗体などの組換え手段により調製、発現、創出、又は単離される全ての抗体を含む。
【０１２４】
本明細書で使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ技術、単一リンパ球遺伝子クローニング技術、又は組換えＤＮＡ法によって作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウス又はラットから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマによって生成され得、ヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、用語「ｍａｂ」は、配列番号４３を含む可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号４５を含む可変軽鎖（ＶＬ）配列とを有するモノクローナル抗体を指す。ある特定の実施形態では、ｍＡｂは、配列番号４４を含む重鎖（ＨＣ）配列と、配列番号４６を含む軽鎖（ＬＣ）配列とを有する完全ヒトモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、配列番号４４の位置４４６のリジン残基は、任意選択で欠落している。
【０１２６】
本明細書で使用するとき、用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ以上の種に由来する抗体を指す。軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、多くの場合、所望の特異性、親和性、及び能力を有する１つの種の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）に由来する抗体の可変領域に対応し、一方で定常領域は、その種における免疫応答の誘発を回避するために、別の種の哺乳動物（例えば、ヒト）に由来する抗体の配列に対応する。
【０１２７】
本明細書で使用するとき、用語「多重特異性抗体」は、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む抗体を指し、複数の第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対して結合特異性を有するか、又は任意の既知の結合特異性を欠く生殖系列配列を含み、複数の第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対して結合特異性を有するか、又は任意の既知の結合特異性を欠く生殖系列配列を含み、この第１及び／又は第２の免疫グロブリン可変ドメインは、任意に、共役化された薬学的に活性な部分（例えば、治療用ペプチド）を含む。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質（又は多量体タンパク質のサブユニット）上にある。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、重複するか、又は実質的に重複する。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、重複しないか、又は実質的に重複しない。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質（又は異なる多量体タンパク質のサブユニット）上にある。ある実施形態では、第１及び第２の免疫グロブリン可変ドメインは、同一の共役化された薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、第１及び第２の免疫グロブリン可変ドメインは、異なる薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、第１の免疫グロブリン可変ドメインのみが、共役化された薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、第２の免疫グロブリン可変ドメインのみが、共役化された薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、多重特異性抗体は、第３、第４、又は第５の免疫グロブリン可変ドメインを含む。ある実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体分子、三重特異性抗体、又は四重特異性抗体分子である。
【０１２８】
本明細書で使用するとき、用語「二重特異性抗体」は、２つ以下のエピトープ又は２つの抗原に結合し、かつ／又は２つの共役化された薬学的に活性な部分（例えば、同じ又は異なる薬学的に活性な部分）を含む、多重特異性抗体を指す。二重特異性抗体は、第１のエピトープに対して結合特異性を有するか、又は任意の既知の結合特異性を欠く生殖系列配列を含む第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列、及び第２のエピトープに対して結合特異性を有するか、又は任意の既知の結合特異性を欠く生殖系列配列を含む第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列を特徴とし、この第１及び／又は第２の免疫グロブリン可変ドメインは、任意に、共役化された薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質（又は多量体タンパク質のサブユニット）上にある。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、重複するか、又は実質的に重複する。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質（又は異なる多量体タンパク質のサブユニット）上にある。ある実施形態では、第１及び第２の免疫グロブリン可変ドメインは、同一の共役化された薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、第１及び第２の免疫グロブリン可変ドメインは、異なる薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、第１の免疫グロブリン可変ドメインのみが、共役化された薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、第２の免疫グロブリン可変ドメインのみが、共役化された薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対して結合特異性を有するか、又は任意の既知の結合特異性を欠く生殖系列配列を含む第１の重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列、及び第２のエピトープに対して結合特異性を有するか、又は任意の既知の結合特異性を欠く生殖系列配列を含む第２の重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列を含み、この第１及び／又は第２の重鎖可変ドメインは、任意に、共役化された薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、第１及び第２の重鎖可変ドメインは、同一の共役化された薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、第１及び第２の重鎖可変ドメインは、異なる薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、第１の重鎖可変ドメインのみが、共役化された薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、第２の重鎖可変ドメインのみが、共役化された薬学的に活性な部分を含む。
【０１２９】
本明細書で使用されるとき、「完全長抗体」は、２つの完全長抗体重鎖と２つの完全長抗体軽鎖とを有する抗体を意味する。完全長抗体重鎖（ＨＣ）は、周知の重鎖可変ドメイン及び定常ドメインＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる。完全長の抗体軽鎖（ＬＣ）は、周知の軽鎖可変ドメイン及び定常ドメインＶＬ及びＣＬからなる。完全長の抗体は、一方又は両方の重鎖のいずれかにおいて、Ｃ末端リジン（Ｋ）を欠いていてもよい。
【０１３０】
用語「Ｆａｂアーム」又は「半分子」は、抗原に特異的に結合する一対の重鎖−軽鎖を意味する。
【０１３１】
完全長二重特異性抗体は、例えば、生体外での無細胞環境において又は共発現を使用してかのいずれかで、異なる特異性を有する２つの抗体半分子のヘテロ二量体形成を好むように各半分子における重鎖ＣＨ３界面に置換を導入することによって、２つの単一特異性二価抗体間でのＦａｂアーム交換（又は半分子交換）を使用して生成され得る。Ｆａｂアーム交換反応は、ジスルフィド結合異性化反応及びＣＨ３ドメインの解離−会合の結果である。親単一特異性抗体のヒンジ領域における重鎖ジスルフィド結合は減少する。親単一特異性抗体のうち１つの得られた遊離システインは、第２の親単一特異性抗体分子のシステイン残基と重鎖内ジスルフィド結合を形成し、同時に、親抗体のＣＨ３ドメインは、解離−会合により解放及び再形成する。ＦａｂアームのＣＨ３ドメインは、ホモ二量体形成よりヘテロ二量体形成を好むように改変されてもよい。得られた生成物は、それぞれ異なるエピトープに結合することができる、２つのＦａｂアーム又は半分子を有する二重特異性抗体である。
【０１３２】
抗体に関して本明細書で使用されるとき、「ホモ二量体形成」は、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２つの重鎖の相互作用を指す。抗体に関して本明細書で使用されるとき、「ホモ二量体」は、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２つの重鎖を有する抗体を指す。
【０１３３】
抗体に関して本明細書で使用されるとき、「ヘテロ二量体形成」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２つの重鎖の相互作用を指す。抗体に関して本明細書で使用されるとき、「ヘテロ二量体」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２つの重鎖を有する抗体を指す。
【０１３４】
「ノブインホール（knob-in-hole）」戦略（例えば、ＰＣＴ国際公開第２００６／０２８９３６号を参照のこと）を使用して、完全長二重特異性抗体を生成することができる。簡潔に、ヒトＩｇＧにおけるＣＨ３ドメインの界面を形成する選択されたアミノ酸は、ヘテロ二量体形成を促進するために、ＣＨ３ドメイン相互作用に影響を及ぼす位置において変異され得る。小さな側鎖を有するアミノ酸（ホール）が、第１の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入され、大きな側鎖を有するアミノ酸（ノブ）が、第２の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入される。２つの抗体の共発現後に、ヘテロ二量体が、「ホール」を有する重鎖と「ノブ」を有する重鎖との優先的な相互作用の結果として形成される。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３置換の対は、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける修飾された位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾された位置として表す）。
【０１３５】
他の戦略、例えば、１つのＣＨ３表面における正に荷電した残基及び第２のＣＨ３表面における負に荷電した残基を置換することによる静電的相互作用を使用する重鎖ヘテロ二量体形成の促進が、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、同第２００９／０１８２１２７号、同第２０１０／０２８６３７号、又は同第２０１１／０１２３５３２号に記載されるように使用されてもよい。他の戦略では、ヘテロ二量体形成は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号に記載されるように、次の置換により促進することができる：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける修飾された位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾された位置として表す）。
【０１３６】
上述された方法に加えて、二重特異性抗体は、国際特許出願公開第２０１１／１３１７４６号に記載される方法に従って、生体外での無細胞環境において、２つの単一特異的ホモ二量体抗体のＣＨ３領域中に非対称な突然変異を導入し、ジスルフィド結合を異性化させる還元条件下において、２つの親単一特異性ホモ二量体抗体から二重特異性ヘテロ二量体抗体を形成することにより生成され得る。この方法において、第１の単一特異性二価抗体及び第２の単一特異性二価抗体は、ヘテロ二量体の安定性を促進するＣＨ３ドメインにおいてある特定の置換を有するように改変されるが、これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合を異性化させるのに十分な還元条件下において共にインキュベートされ、それにより、Ｆａｂアーム交換により二重特異性抗体が生成される。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る例示的な還元剤は、２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ−システイン、及びベータ−メルカプトエタノールであり、好ましくは、２−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも２０℃の温度において、少なくとも２５ｍＭの２−ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５〜８、例えば、ｐＨ７．０又はｐＨ７．４において、少なくとも９０分のインキュベートが使用されてもよい。
【０１３７】
本明細書全体を通して、抗体の定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、特に明示的に指定しない限り、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１），に記載されるＥＵインデックスに従って行われる。
【０１３８】
コンジュゲート
別の一般的な態様では、本発明は、ペプチドに結合された抗体がペプチド単独と比較して延長／増加した半減期を有するように部位特異的様式で、合成の治療用ペプチド（例えば、アミリノミメティックペプチド）などの薬学的に活性な部分に共有結合により共役化された、本発明の抗体を含むコンジュゲートに関する。本発明はまた、医薬組成物及びその使用方法に関する。このコンジュゲートは、とりわけ、肥満、２型糖尿病、メタボリックシンドローム（すなわち、シンドロームＸ）、インスリン抵抗性、耐糖能異常（例えば、耐糖能）、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに湿疹などの疾患又は障害を予防する、治療する又は緩解させるのに有用である。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、薬学的に活性な部分に共役化されて、薬学的に活性な部分の半減期を延長／増加させることができる少なくとも１つのシステイン残基置換を含むように修飾される。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのシステイン残基置換は、抗体の相補性決定領域に含まれる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのシステイン残基置換は、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）にある。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのシステイン残基置換はＨＣＤＲ３にあり、ＨＣＤＲ３は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む抗体は、薬学的に活性な部分に共役化することができる、少なくとも１つの追加のシステイン置換を有する。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、薬学的に活性な部分は、リンカーを含み得る。リンカーは、薬学的に活性な部分への抗体の共役化を可能にするように化学的に修飾され得る。リンカーとしては、例えば、ペプチドリンカー、炭化水素リンカー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）リンカー、多糖類リンカー、ポリエステルリンカー、ＰＥＧ及び埋め込まれた複素環からなるハイブリッドリンカー、又は炭化水素鎖を挙げることができるが、これらに限定されない。ＰＥＧリンカーは、例えば、２〜２４個のＰＥＧ単位を含み得る。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、目的の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの薬学的に活性な部分（例えば、治療用ペプチド（複数可））に共役化される。好ましい実施形態では、非標的化モノクローナル抗体は、目的の２つの薬学的に活性な部分に共役化される。モノクローナル抗体が目的の少なくとも２つの薬学的に活性な部分に共役化されるある特定の実施形態では、目的の薬学的に活性な部分は、同じ薬学的に活性な部分であり得るか、又は異なる薬学的に活性な部分であり得る。
【０１４２】
本発明の抗体を本発明の薬学的に活性な部分と共役化させる方法は、当該技術分野において既知である。簡潔に、本発明の抗体は、還元剤（例えば、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）を用いて還元され、精製され（例えば、タンパク質Ａ吸着又はゲル濾過によって）、薬学的に活性な部分と共役化され得る（例えば、共役化を可能にする条件下で凍結乾燥ペプチドを還元抗体に提供することによって）。共役反応後、コンジュゲートは、イオン交換クロマトグラフィ又は疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって、タンパク質Ａ吸着の最終精製工程により精製することができる。ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、ＨＩＣ方法を利用して還元される前に精製することができる。共役化方法のより詳細な説明については、例えば、実施例１０３及びＤｅｎｎｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ４：１９７−２２４（２０１５）を参照されたい。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、アミリノミメティックペプチドは、アミド化、脂質化、及びＰＥＧ化からなる群から選択される１つ以上のプロセスによって修飾されている式Ｉのアミリノミメティックペプチドの誘導体、又はその薬学的に許容される塩である。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、コンジュゲートは、アミリノミメティックペプチドに共役化されたモノクローナル抗体又はそのフラグメントを含み、このアミリノミメティックペプチドは、配列番号４〜２８からなる群から選択される。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、リンカーを介して、アミリノミメティックペプチドのリジン残基において、アミリノミメティックペプチドに共有結合している。リンカーは、例えば、２〜２４個のＰＥＧ単位のＰＥＧ鎖、２〜１０個の炭素原子を含有するアルキル鎖、又は結合からなる群から選択されるリンカーを含み得る。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、式Ｉ中のＺ２５、Ｚ２６、Ｚ２９、及びＺ３４のうちの１つのみがリジンであり、リジンは、リンカーを介して、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの改変システイン残基に共有結合している。好ましい実施形態では、本発明の一実施形態によるモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミリノミメティックペプチドの残基２５又は２６において、アミリノミメティックペプチドに共役化される。別の好ましい実施形態では、ブロモアセトアミドなどの求電子物質は、アミリノミメティックの残基２５又は２６におけるリジンのアミノ側鎖などのアミリノミメティックの側鎖上に導入され、求電子物質は、モノクローナル抗体又はそのフラグメントのＣＤＲ、好ましくはＨＣＤＲ３に改変されたＣｙｓ残基のスルフヒドリル基と部位特異的に反応し、それにより、アミリノミメティックペプチドとモノクローナル抗体又はそのフラグメントとの間に共有結合による連結を創出する。より好ましくは、アミリノミメティックペプチドは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、及び配列番号２８からなる群から選択される。一実施形態では、求電子物質は、アミリノミメティックの側鎖上に直接導入される。別の実施形態では、求電子物質は、リンカーを介してアミリノミメティックの側鎖上に導入される。
【０１４７】
また、本発明のコンジュゲートを含み、薬学的に許容される担体を更に含む医薬組成物も提供される。
【０１４８】
また、本明細書では、プラムリンチド又はダバリンチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を示すアミリノミメティックペプチドも提供される。２つの類似体間の配列同一性を決定する方法の一例として、２つのペプチド、すなわちプラムリンチド（配列番号２）と（配列番号４）とを整列させる。
【０１４９】
【化５１】
2021522231.tif 000052
プラムリンチド（配列番号２）
【０１５０】
【化５２】
2021522231.tif 000053
（配列番号４）
【０１５１】
プラムリンチドに対する類似体の配列同一性は、整列させた残基の総数から、異なる残基の数を減算して（すなわち、整列させた同一残基の数）、プラムリンチドの残基の総数で除算したものである。この例では、異なる残基は、存在しないＫ１及びＣ２である。ここで、Ｎ３は置換されているが、その元の位置に保持されている。したがって、この例では、配列同一性は、（３７−２）／３７×１００である。
【０１５２】
本発明による化合物が、ｍＡｂに結合されたアミリノミメティックペプチドである場合、そのｍＡｂは、それに結合された当該ペプチドの２つのコピーを有することになるということが予想される。当業者であれば、反応生成物が部分的な共役反応生成物を含んでもよく、結果として、ｍＡｂに結合された１つのアミリノミメティックペプチドが得られることが理解される。かかるモノ結合化合物及びジ結合化合物、並びにそれらの混合物は全て、本発明の範囲内に包含されると理解される。
【０１５３】
アミリノミメティックペプチド
プラムリンチド及び／又はダバリンチドは、その食欲及び食物摂取を抑制する役割を考慮すると、肥満症の治療に有効であり得る。しかしながら、治療剤としてのプラムリンチド及び／又はダバリンチドの治療的有用性は、その急速な代謝及び短い循環半減期によって制限される。したがって、本発明は、広義には、アミリノミメティックペプチドの半減期を延長し、生体内でのペプチドの代謝を低減する、修飾されたプラムリンチド及び／又はダバリンチドコンジュゲートに関する。
【０１５４】
本発明の特定の実施形態では、修飾されたプラムリンチド及び／又はダバリンチドペプチドは、アミリノミメティックペプチドである。用語「アミリノミメティックペプチド」、「アミリノミメティック類似体」、及び「アミリノミメティックペプチド類似体」は、互換的に使用することができる。
【０１５５】
本明細書に記載のペプチド配列は、通常の慣習に従って記載され、ペプチドのＮ末端領域は左側にあり、Ｃ末端領域は右側にある。アミノ酸の異性体形態は既知であるが、別途明示的に示されない限り、示されるのはアミノ酸のＬ型である。本発明の分子を説明する際の便宜上、様々なアミノ酸の従来の及び非従来の略語（１文字及び３文字コードの両方）及び機能部分が使用される。これらの略語は当業者にはよく知られているが、明確にするために、以下に列記する：Ａ＝Ａｌａ＝アラニン；Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン；Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン；Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸；βＡ＝βＡｌａ＝βアラニン；Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン；ｈＣ＝ｈＣｙｓ＝ホモシステイン；Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸；Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン；Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン；Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン；Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン；Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン；Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン；Ｎｌｅ＝ノルロイシン；Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン；Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン；Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン；Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン；Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン；Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン、及びＶ＝Ｖａｌ＝バリン。
【０１５６】
本明細書で使用される追加のアミノ酸略称には、以下のものがある：ＡＣＰＣ＝２−アミノシクロペンタンカルボン酸；β−Ａｉｂ＝β−アミノイソ酪酸＝３−アミノ−２−メチルプロピオン酸；β−ｈＡ＝β−ｈＡｌａ＝β−ホモアラニン＝３−アミノ酪酸；α−ＭｅＬ＝α−ＭｅＬｅｕ＝α−メチルロイシン；β３−ｈＰ＝β３−ｈＰｒｏ＝β３−ホモプロリン；β−ｈＴ＝β−ｈＴｈｒ＝β−ホモトレオニン；
【０１５７】
便宜上、本発明のアミリノミメティックペプチドを命名する際に使用されるアミノ酸残基の番号付け規則は、プラムリンチド及び／又はダバリンチドのものに従う。プラムリンチド及び／又はダバリンチドの対応する位置における天然残基に対して、ペプチドに導入された特定のアミノ酸置換は、適切なアミノ酸コード、続いて置換の位置によって示される。したがって、アミリノミメティックペプチド中の「ｈＣ７」は、プラムリンチドの対応する天然のＣｙｓ７残基が、ホモシステインに置換されたペプチドを指す。同様に、アミリノミメティックペプチド中の「Ｋ（Ａｃ）２６」は、ε−アミン上でＣＨ３Ｃ（Ｏ）−で置換されたリジンが、プラムリンチドの対応する天然Ｉｌｅ２６残基を置換しているペプチドを指す。アミリノミメティックペプチド内で生じる更なるアミノ酸置換は、この規則に従って記載され、当業者によってこのようなものとして認識されるであろう。
【０１５８】
また便宜上、本発明のアミリノミメティックペプチドに使用される命名規則は、サイクルに関与するアミノ残基を、サイクルに関与するＮ末端残基から出発して左から右方向に、それらの間の連結基（複数可）と共に組み込む。全ての場合において、サイクルのＮ末端アミノ酸残基は、そのα−アミノ官能基を介してアセチル連結基に連結し、これは次に、アミリノミメティックペプチドの位置７におけるアミノ酸の側鎖残基に接続する。したがって、「シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７）」は、天然のＬｙｓ１及びＣｙｓ２残基が配列から欠失しているアミリノミメティックペプチドのサイクルを記述するために使用され、Ａｓｎ３のα−アミノ官能基はアセチル残基でアシル化され、そのメチル基は、ｈＣｙｓ７残基の側鎖にチオエーテル結合を介して更に結合される。同様に、「シクロ−（Ｓ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７）」は、天然のＬｙｓ１残基が欠失しているアミリノミメティックペプチドのサイクルを記述するために使用され、天然のＣｙｓ２残基は、そのα−アミノ官能基がアセチル基によってアシル化されたＳｅｒ２によって置換され、上記のアセチル基は、ｈＣｙｓ７残基の側鎖にチオエーテル結合によって連結されている。
【０１５９】
リジン残基は、更なる誘導体化のために便利な機能性ハンドルを提供するために、アミリノミメティック配列の様々な位置に組み込まれ得る。リジン残基は、直接的又は間接的のいずれかでモノクローナル抗体に結合されるように修飾され得る。モノクローナル抗体への間接的結合において、リジン残基は、アミリノミメティックペプチドがモノクローナル抗体に結合されることを可能にするリンカーを含むように修飾され得る。当業者であれば、関連するオルソロガスもそのように効果的に使用することができ、本明細書において企図されることを認識するであろう。
【０１６０】
ペプチド配列に現れる「Ｋ（γ−Ｇｌｕ）」という用語は、その側鎖ε−アミノ基が、グルタミン酸のγ−カルボキシル基によってアシル化されているリシニル残基を表す。
【０１６１】
用語「Ｋ（Ａｃ）」は、その側鎖ε−アミノ基が、アセチル基で置換されているリシニル残基を表す。
【０１６２】
用語「Ｋ（Ａｌｌｏｃ）」は、その側鎖ε−アミノ基が、アリルオキシカルボニル基で置換されているリシニル残基を表す。
【０１６３】
用語「Ｋ（ＯＥＧ２−Ｐａｌ）」は、その側鎖ε−アミノ基が、１７−アミノ−１０−オキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９−アザヘプタデカン酸で置換されており、１７−アミノ基は、１７−アミノ基とパルミチン酸とのアミド結合によって、パルミチン酸で更に置換されている、リシニル残基を表す。
【０１６４】
用語「（ＯＥＧ）２」は、アミド連結（すなわち、１７−アミノ−１０−オキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９−アザヘプタデカン酸）を介して連続して一緒に連結された２つのＯＥＧ単位を表す。
【０１６５】
用語「Ｋ（ＯＥＧ）２」は、その側鎖ε−アミノ基が、１７−アミノ−１０−オキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９−アザヘプタデカン酸によってアシル化されているリシニル残基を表す。
【０１６６】
用語「Ｋ（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ」は、その側鎖ε−アミノ基が、（２２Ｓ）−２２−アミノ−１０，１９−ジオキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９，１８−ジアザトリコサン二酸によって、その１−カルボン酸官能基を介してアシル化されており、その２２−アミノ基が、パルミチンサンによって、更にアミド化されているリシニル残基を表す。
【０１６７】
用語「ｄＰＥＧｘ」は、１つの末端部においてプロパン酸に連結され、遠位端上に末端アミノ官能基を含有する、ｘ個のエチレングリコール単位を含有し、更に官能化され得る、別個のオリゴマーを指す。
【０１６８】
用語「Ｋ（ｄＰＥＧ１２）」は、その側鎖ε−アミノ基が、１−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６−ドデカオキサノナトリアコンタン−３９−酸によって、その３９−カルボン酸官能基を介してアシル化されているリシニル残基を表す。
【０１６９】
用語、「Ｋ（ｄＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）」は、その側鎖εアミノ基が、１−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６−ドデカノキサントラントリアコンタン−３９−酸により、その３９−カルボン酸官能基を介してアシル化されているリシニル酸であって、当該酸が、その１−アミン基上で、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ基でアミド化されているリシニル酸を表す。
【０１７０】
半減期延長部分
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントに加えて、本発明のコンジュゲートは、例えば共有結合の相互作用を介して、薬学的に活性な部分（例えば、アミリノメティックペプチド）の半減期を延長するための１つ以上の他の部分を組み込むことができる。例示的な他の半減期延長部分としては、アルブミン、アルブミン変異体、アルブミン結合タンパク質、及び／又はドメイン、トランスフェリン、並びにそれらのフラグメント及び類似体が挙げられるが、これらに限定されない。所望の特性のために、本発明のコンジュゲートに組み込むことができる追加の半減期延長部分としては、例えば、ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２０，０００などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、様々に異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、例えば、ラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、及びドコサン二酸などが挙げられ、更に、ポリリジン、オクタン、及び炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖、又は多糖類）を挙げることができる。これらの部分は、タンパク質足場コード配列との直接融合体であってもよく、標準的なクローニング及び発現技術によって生成されてもよい。あるいは、組換えにより及び化学的に生成された本発明のコンジュゲートに、周知の化学結合方法を用いてその部分を結合させることができる。
【０１７１】
周知の方法を用いて、システイン残基を分子のＣ−末端に組み込み、ＰＥＧ化した基をシステインに結合させることによって、ＰＥＧ化部分を、例えば、本発明のペプチド分子に付加してもよい。
【０１７２】
更なる部分を組み込んだ本発明のペプチド分子を、いくつかの周知のアッセイによって、官能性について比較することができる。例えば、目的の治療用ペプチドの生物学的又は薬物動態学的活性は、単独で、又は本発明によるコンジュゲートにおいて、既知の生体外又は生体内アッセイを使用して分析評価して、比較することができる。
【０１７３】
医薬組成物
別の一般的な態様では、本発明は、本発明のコンジュゲート及び化合物、並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、薬学的に許容される担体と一緒に本発明のコンジュゲートを含む生成物を意味する。本発明のコンジュゲート及び化合物、並びにそれらを含む組成物は、本明細書で言及される治療用途のための薬剤の製造にも有用である。
【０１７４】
本明細書で使用するとき、用語「担体」は、あらゆる賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、バッファー、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、ミクロスフェア、リポソーム封入体、又は医薬製剤で使用するための技術分野では公知の他の材料を指す。担体、賦形剤又は希釈剤の特性は、特定の用途の投与経路によって決まる点は理解されよう。本明細書で使用するところの「医薬上許容できる担体」なる用語は、本発明による組成物の効果又は本発明による組成物の生物活性を妨げない無毒性材料を指す。特定の実施形態によると、本開示を考慮して、抗体の医薬組成物での使用に好適ないずれの医薬上許容できる担体も、本発明において使用することができる。
【０１７５】
本発明において使用するための薬学的に許容される酸性／アニオン性の塩としては、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、酒石酸水素塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストル酸塩、エシル酸塩、フマル酸塩、グリセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘキシルレソルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル臭化物、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムコ酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、及びトリエチオジドが挙げられるが、これらに限定されない。また、有機酸又は無機酸としては、ヨウ化水素酸、過塩素酸、硫酸、リン酸、プロピオン酸、グリコール酸、メタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、シュウ酸、２−ナフタレンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サッカリン酸又はトリフルオロ酢酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７６】
薬学的に許容され得る塩基性／カチオン性の塩としては、アルミニウム、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トロメタン、又は「ＴＲＩＳ」としても知られる）、アンモニア、ベンザチン、ｔ−ブチルアミン、カルシウム、クロロプロカイン、コリン、シクロへキシルアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、リチウム、Ｌ−リジン、マグネシウム、メグルミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ピペリジン、カリウム、プロカイン、キニーネ、ナトリウム、トリエタノールアミン、又は亜鉛が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７７】
本発明の一部の実施形態では、約０．００１〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約０．０１〜約５０ｍｇ／ｍＬ、又は約０．１〜約２５ｍｇ／ｍＬの量で本発明のコンジュゲートを含む医薬製剤が提供される。医薬製剤は、約３．０〜約１０、例えば、約３〜約７、又は約５〜約９のｐＨを有してもよい。製剤は更に、緩衝系、防腐剤（複数可）、等張化剤（複数可）、キレート剤（複数可）、安定化剤、及び界面活性剤（複数可）からなる群から選択される、少なくとも１種の成分を含み得る。
【０１７８】
薬学的に許容可能な担体を有する薬学的活性成分の製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（例えば、２１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）及びそれ以降の任意の改訂版）にあるように、当該技術分野において既知である。追加成分の非限定的な例としては、緩衝剤、希釈剤、溶媒、張度調節剤、防腐剤、安定剤、及びキレート剤が挙げられる。１種以上の薬学的に許容される担体は、本発明の医薬組成物を製剤化する際に使用され得る。
【０１７９】
本発明の一実施形態では、医薬組成物は液体製剤である。液体製剤の好ましい例は、水性製剤、すなわち、水を含む製剤である。液体製剤は、溶液、懸濁液、エマルション、マイクロエマルション、ゲルなどを含んでもよい。水性製剤は、典型的には、少なくとも５０％ｗ／ｗの水、又は少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％ｗ／ｗの水を含む。
【０１８０】
一実施形態では、医薬組成物は、例えば注射デバイス（例えば注射器又は注入ポンプ）を介して注射することができる注射剤として製剤化され得る。注射は、例えば、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内に送達され得る。
【０１８１】
別の実施形態では、医薬組成物は、固体製剤、例えば、そのまま使用することができるか、又は医師若しくは患者が使用前に溶媒及び／又は希釈剤を添加する、凍結乾燥又は噴霧乾燥組成物である。固体剤形としては、圧縮錠剤などの錠剤、及び／又はコーティングされた錠剤、並びにカプセル（例えば、硬又は軟ゼラチンカプセル）を挙げることができる。医薬組成物はまた、例えば、サッシェ、糖衣錠、粉末、顆粒、トローチ剤、又は再構成用の粉末の形態であってもよい。
【０１８２】
剤形は即時放出であってもよく、その場合、それらは水溶性若しくは分散性担体を含んでもよく、又は剤形は遅延放出、持続放出、又は変性放出であってもよく、その場合、それらは、胃腸管における剤形の溶解速度を調節する非水溶性ポリマーを含んでもよい。
【０１８３】
他の実施形態では、医薬組成物は、鼻腔内、口内、又は舌下に送達され得る。
【０１８４】
水性製剤のｐＨは、ｐＨ３〜ｐＨ１０であり得る。本発明の一実施形態では、製剤のｐＨは約７．０〜約９．５である。本発明の別の実施形態では、製剤のｐＨは約３．０〜約７．０である。
【０１８５】
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は緩衝剤を含む。緩衝剤の非限定的な例としては、アルギニン、アスパラギン酸、ビシン、シトレート、リン酸一水素二ナトリウム、フマル酸、グリシン、グリシルグリシン、ヒスチジン、リジン、マレイン酸、リンゴ酸、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、コハク酸塩、酒石酸、トリシン、及びトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、及びこれらの混合物が挙げられる。緩衝液は、個々に又は集合体中に、約０．０１〜約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在してもよい。これらの具体的な緩衝剤の各１種を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
【０１８６】
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は防腐剤を含む。緩衝剤の非限定的な例としては、塩化ベンゼトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、ブロノポール、ブチル４−ヒドロキシベンゾエート、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロヘキシジン、クロルフェネシン、ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、エチル４−ヒドロキシベンゾエート、イミド尿素、メチル４−ヒドロキシベンゾエート、フェノール、２−フェノキシエタノール、２−フェニルエタノール、プロピル４−ヒドロキシベンゾエート、デヒドロ酢酸ナトリウム、チオメロサール、及びこれらの混合物が挙げられる。防腐剤は、個々に又は集合体中に、約０．０１〜約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在してもよい。これらの具体的な防腐剤の各１種を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
【０１８７】
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は、等張剤を含む。本実施形態の非限定的な例としては、塩（塩化ナトリウムなど）、アミノ酸（グリシン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、及びスレオニンなど）、アルジトール（グリセロール、１，２−プロパンジオールプロピレングリコールなど）、１，３−プロパンジオール、及び１，３−ブタンジオールなど）、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００）、並びにこれらの混合物が挙げられる。等張剤の別の例としては、糖が挙げられる。糖の非限定的な例は、例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、アルファ及びベータ−ＨＰＣＤ、可溶性澱粉、ヒドロキシエチル澱粉、及びカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む、単糖類、二糖類、又は多糖類であり得る。等張剤の別の例は糖アルコールであり、「糖アルコール」という用語は、少なくとも１つの−ＯＨ基を有するＣ（４−８）炭化水素として定義される。糖アルコールの非限定的な例としては、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールが挙げられる。本段落に列記される各等張剤を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。等張剤は、個々に又は集合体中に、約０．０１〜約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在してもよい。これらの具体的な等張剤の各１種を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
【０１８８】
本発明の別の実施形態では、医薬組成物はキレート剤を含む。キレート剤の非限定的な例としては、クエン酸、アスパラギン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の塩、及びこれらの混合物が挙げられる。キレート剤は、個々に又は集合体中に、約０．０１〜約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在してもよい。これらの具体的なキレート剤の各１種を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
【０１８９】
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は安定剤を含む。安定剤の非限定的な例としては、１種以上の凝集阻害剤、１種以上の酸化阻害剤、１種以上の界面活性剤、及び／あるいは１種以上のプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。
【０１９０】
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は安定剤を含み、当該安定剤は、カルボキシ−／ヒドロキシセルロース及びそれらの誘導体（ＨＰＣ、ＨＰＣ−ＳＬ、ＨＰＣ−Ｌ、及びＨＰＭＣなど）、シクロデキストリン、２−メチルチオエタノール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ  ３３５０など）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、塩（塩化ナトリウムなど）、硫黄含有物質、例えばモノチオグリセロール）、又はチオグリコール酸である。安定剤は、個々に又は集合体中に、約０．０１〜約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在してもよい。これらの具体的な安定剤の各１種を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
【０１９１】
本発明の更なる実施形態では、医薬組成物は、１種以上の界面活性剤、好ましくは界面活性剤、少なくとも１種の界面活性剤、又は２種の異なる界面活性剤を含む。用語「界面活性剤」は、水溶性（親水性）部分及び脂溶性（親油性）部分からなる任意の分子又はイオンを指す。界面活性剤は、例えば、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、及び／又は双極性界面活性剤からなる群から選択され得る。界面活性剤は、個々に又は集合体中に、約０．１〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在してもよい。これらの具体的な界面活性剤の各１種を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
【０１９２】
本発明の更なる実施形態では、医薬組成物は、１種以上のプロテアーゼ阻害剤、例えば、ＥＤＴＡ、及び／又はベンズアミジン塩酸（ＨＣＩ）を含む。プロテアーゼ阻害剤は、個々に又は集合体中に、約０．１〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在してもよい。これらの具体的なプロテアーゼ阻害剤の各１種を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
【０１９３】
本発明の医薬組成物は、組成物の保管中にポリペプチド凝集体形成を減少させるのに十分な量のアミノ酸塩基を含み得る。用語「アミノ酸塩基」は、１種以上のアミノ酸（メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニンなど）、又はこれらの類似体を指す。任意のアミノ酸は、その遊離塩基形態又はその塩形態のいずれかで存在し得る。アミノ酸塩基の任意の立体異性体（すなわち、Ｌ、Ｄ、又はこれらの混合物）が存在し得る。アミノ酸塩基は、個々に又は他のアミノ酸塩基と組み合わせて、約０．０１〜約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在してもよい。これらの具体的なアミノ酸塩基の各１種を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
【０１９４】
また、本発明のコンジュゲート又はその医薬組成物の治療的有効量が、所望の効果に応じて変動することも当業者には明らかである。したがって、最適投与量は、当業者によって容易に決定されることができ、使用される具体的なコンジュゲート、投与方法、調製物の強度、及び病状の進行と共に変動するだろう。加えて、対象の年齢、体重、食事、及び投与時間を含む、治療される具体的な対象に関連する要因は、投与量を適切な治療的濃度に調節する必要性を生じさせるものである。
【０１９５】
全ての適応症に関して、本発明のコンジュゲートは、好ましくは、単一又は分割用量で（例えば、単一用量を２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の部分用量に分割することができる）、１日当たり約１μｇ〜約５０ｍｇの用量で、又は１用量当たり約０．０１〜約５００μｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０５〜約２５０μｇ／ｋｇ、最も好ましくは約５０μｇ／ｋｇ未満で末梢的に投与される。これらの範囲内の投与量は、当然ながら各アゴニストの効力によって変化し、当業者によって容易に決定される。したがって、上記の投与量は平均的な場合の例である。当然ながら、これよりも多いか又は少ない投与量範囲が有効である個々の例もあり得、かかる例も本発明の範囲内である。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、約１μｇ〜約５ｍｇの用量で、又は約０．０１〜約５００μｇ／ｋｇの用量で、より好ましくは約０．０５〜約２５０μｇ／ｋｇの用量で、最も好ましくは約５０μｇ／ｋｇ未満の用量で、約１μｇ〜約５ｍｇの用量の、又は約０．０１〜約５００μｇ／ｋｇの用量の、より好ましくは約０．０５〜約２５０μｇ／ｋｇの用量の、最も好ましくは、約５０μｇ／ｋｇ未満の用量の第２の治療薬（例えば、リラグルチド）と共に投与される。
【０１９７】
本発明のコンジュゲートの、薬学的に許容される塩としては、無機又は有機の酸又は塩基から形成される、従来の非毒性の塩又は第四級アンモニウム塩が挙げられる。かかる酸付加塩の例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、ドデシル硫酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩及び酒石酸塩が挙げられる。塩基性塩としては、アンモニウム塩、ナトリウム塩及びカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ジシクロヘキシルアミノ塩などの有機塩基との塩、並びにアルギニンなどのアミノ酸との塩が挙げられる。更に、塩基性の窒素含有基は、例えばハロゲン化アルキルによって四級化されてもよい。
【０１９８】
本発明の医薬組成物は、その使用目的を実現する任意の手段によって投与することができる。例としては、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的、口内又は眼内投与が挙げられる。経口経路により投与してもよい。非経口投与に適する製剤としては、例えば、水溶性の塩、酸性溶液、アルカリ性溶液、デキストロース水溶液、等張炭水化物溶液、及びシクロデキストリン包接錯体などの水溶性形態の活性コンジュゲートの水溶液が挙げられる。
【０１９９】
本発明はまた、薬学的に許容される担体を、本発明のコンジュゲートの任意のものと混合することを含む、医薬組成物の作製方法も包含する。加えて、本発明は、１種以上の薬学的に許容される担体を、本発明のコンジュゲートの任意のものと混合することによって作製される医薬組成物を含む。
【０２００】
更に、本発明のコンジュゲートは、１種以上の多形結晶形態又は非晶質形態を有してもよく、したがって、これらも本発明の範囲に含まれることが意図される。加えて、コンジュゲートは、例えば水と溶媒和物（すなわち水和物）を形成しても又は一般的な有機溶媒と溶媒和物を形成してもよい。本明細書で使用されるとき、用語「溶媒和物」は、本発明のコンジュゲートと１つ以上の溶媒分子との物理的会合体を意味する。この物理的会合は、水素結合など、イオン結合及び共有結合の度合いの変化を伴う。特定の場合において、例えば１つ以上の溶媒分子が結晶質固体の結晶格子に組み込まれているとき、この溶媒和物は分離することができるようになる。用語「溶媒和物」は、溶液相溶媒和物と、分離可能な溶媒和物の両方を包含するものとする。適切な溶媒和物の非限定的な例としては、エタノラート、メタノラートなどが挙げられる。
【０２０１】
本発明は、本発明のコンジュゲートの多形体及び溶媒和物を、その範囲内に包含することを意図する。ゆえに、本発明の治療方法における「投与」という用語には、本発明のコンジュゲート、あるいは具体的に開示されていなくとも、明らかに本発明の範囲内に含まれるであろう多形体又はその溶媒和物を用いて、本明細書に記載の症候群、障害、又は疾患を治療する、寛解させる、又は予防する手段が包含される。
【０２０２】
別の実施形態では、本発明は、薬剤として使用するための本発明のコンジュゲートに関する。
【０２０３】
本発明は、本発明のコンジュゲートのプロドラッグを、その範囲内に含む。一般的には、そのようなプロドラッグは、生体内で必要なコンジュゲートに容易に転換可能な、コンジュゲートの官能性誘導体である。したがって、本発明の治療方法において、用語「投与」は、具体的に開示されるコンジュゲートを用いた、又は具体的に開示されなくてもよいが、患者への投与後に生体内で特定のコンジュゲートに転換するコンジュゲートを用いた、記載される様々な障害の治療を包含するものとする。好適なプロドラッグ誘導体の選択及び調製に関する従来の手順は、例えば、「Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」（Ｅｄ．Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５）に記載されている。
【０２０４】
更に、本発明の範囲内で、任意の元素が、特に本発明のコンジュゲートに関して言及される場合、天然に存在するか又は合成により生成されたかのいずれにせよ、また自然存在比であるか又は同位体濃縮形態のいずれにせよ、当該元素の全ての同位体及び同位体の混合物を含むものとすることが意図される。例えば、水素への言及には、その範囲内に、１Ｈ、２Ｈ（Ｄ）、及び３Ｈ（Ｔ）が含まれる。同様に、炭素及び酸素への言及には、それらの範囲内に、１２Ｃ、１３Ｃ及び１４Ｃ、並びに１６Ｏ及び１８Ｏがそれぞれ含まれる。かかる同位体は、放射性同位体であってもよく、又は非放射性同位体であってもよい。本発明の放射標識コンジュゲートは、３Ｈ、１１Ｃ、１８Ｆ、１２２Ｉ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、及び８２Ｂｒからなる群から選択される放射性同位体を含んでもよい。好ましくは、放射性同位元素は、３Ｈ、１１Ｃ、及び１８Ｆからなる群から選択される。
【０２０５】
本発明の一部のコンジュゲートは、アトロプ異性体として存在してもよい。アトロプ異性体は、一重結合周りの回転が障害されることにより生じる立体異性体であり、回転に対する立体歪みによる干渉が、配座異性体の単離を可能にする程度に十分高いものである。かかる配座異性体及びその混合物は全て、本発明の範囲内に包含されると理解される。
【０２０６】
本発明によるコンジュゲートが少なくとも１つの立体中心を有する場合、結果としてそれらのコンジュゲートはエナンチオマー又はジアステレオマーとして存在し得る。かかる異性体及びその混合物は全て、本発明の範囲内に包含されると理解される。
【０２０７】
本発明によるコンジュゲートの調製プロセスにより立体異性体混合物が生じる場合、これらの異性体は、分取クロマトグラフィなどの従来法により分離することができる。コンジュゲートはラセミ体として調製され得るか、又は個々のエナンチオマーをエナンチオ選択的合成、又は分解のいずれかにより調製することができる。コンジュゲートは、標準的な方法により、その成分であるエナンチオマーに分解することができるが、そのような方法には、例えば（−）−ジ−ｐ−トルオイル−Ｄ−酒石酸及び／又は（＋）−ジ−ｐ−トルオイル−Ｌ−酒石酸のような光学的に活性な酸と共に塩を形成することによりジアステレオマー対を形成した後、分別結晶化及び遊離塩基の再生を行うといったものがある。コンジュゲートはまた、ジアステレオマーのエステル又はアミドを形成した後、クロマトグラフィ分離を行い、キラル補助基を除去することにより、分解することもできる。あるいは、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）又はＳＦＣを介したキラルカラムを使用して、コンジュゲートを分解してもよい。場合によっては、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおいて、複雑な多重線及びピーク積分をもたらす１Ｈ  ＮＭＲにより観察可能な、コンジュゲートの回転異性体が存在し得る。
【０２０８】
本発明のコンジュゲートを調製するためのプロセスのいずれの間も、関連する分子のいずれかにおける感受性基又は反応性基を保護することが必要及び／又は望ましい場合がある。これは、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｅｄ．Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９７３、及びＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ＆  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９１（それらのそれぞれは、全ての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるものなど、従来の保護基によって達成され得る。保護基は、その後の好都合な段階において、当該技術分野で周知の方法を用いて除去することができる。
【０２０９】
使用方法
本発明は、アミリン受容体媒介症候群、障害、又は疾患を予防する、治療する、又は寛解させることを、それを必要とする対象に行う方法に関し、本方法は、有効量の本発明のコンジュゲート、化合物、又は医薬組成物の投与を、それを必要とする対象に行うことを含む。
【０２１０】
本発明は、障害、疾患、若しくは病態、又は当該障害、疾患、若しくは病態の任意の１つ以上の症状を予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させることを、それを必要とする対象に行う方法も提供し、本方法は、有効量の本発明のコンジュゲート、化合物、又は医薬組成物の投与を、それを必要とする対象に行うことを含む。
【０２１１】
特定の実施形態によると、疾患障害、又は病態は、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム（すなわち、シンドロームＸ）、インスリン抵抗性、耐糖能異常（例えば、耐糖能）、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに／又は湿疹からなる群から選択される。
【０２１２】
特定の実施形態によれば、治療有効量は、以下の効果のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上を実現するのに十分である治療量を指す：（ｉ）治療される疾患、障害、若しくは病態、又はそれに関連する症状の重症度を低減する、又は寛解させること、（ｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の期間を短縮すること、（ｉｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の進行を防止すること、（ｉｖ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の退縮を生じさせること、（ｖ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状の進展又は発症を予防すること、（ｖｉ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状の再発を防止すること、（ｖｉｉ）治療される疾患、障害、若しくは病態、又はそれに関連する症状を有する対象の入院を減少させること、（ｖｉｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状を有する対象の入院期間を短縮させること、（ｉｘ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状を有する対象の生存率を高めること、（ｘｉ）治療される対象の疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状を阻害又は軽減すること、及び／又は（ｘｉｉ）別の治療の予防又は治療効果を強化又は改善すること。
【０２１３】
治療有効量又は用量は、治療される疾患、障害又は病態、投与手段、標的部位、対象の生理学的状態（例えば、年齢、体重、健康状態を含む）、対象がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、及び、治療が予防的なものであるか治療的なものであるか、などの様々な因子によって異なり得る。治療用量は、安全性及び効能を最適化するために最適に漸増される。
【０２１４】
本明細書で使用される場合、「治療する（treat）」、「治療すること（treating）」、及び「治療（treatment）」という用語は全て、疾患、障害、又は病態に関連する少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善又は逆転を指すものであり、これは対象において必ずしも認識されるとは限らないが、対象において認識可能な場合もある。「治療する」、「治療する」、及び「治療」という用語はまた、疾患、障害、又は病態の退縮を生じる、その進行を防止する、又は少なくともその進行を遅らせることを指す場合もある。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、疾患、障害、若しくは病態に関連する１つ以上の症状の緩和、進展若しくは発症の予防、又はその期間の短縮を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態の再発の防止を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態を有する対象の生存率の向上を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、対象における疾患、障害、又は病態の消失を指す。
【０２１５】
一実施形態では、本発明は、肥満、又は肥満の任意の１つ以上の症状を予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させることを、それを必要とする対象に行う方法を提供し、本方法は、有効量の本発明のコンジュゲート、化合物、又は医薬組成物の投与を、それを必要とする対象に行うことを含む。一部の実施形態では、対象の体重は、本明細書に記載の本発明のコンジュゲート、化合物、医薬組成物、形態、若しくは薬剤のいずれかの投与前の対象の体重に対して、又は本明細書に記載の本発明のコンジュゲート、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれも受けていない対照対象と比較して、例えば、約０．０１〜約０．１％、約０．１〜約０．５％、約０．５〜約１％、約１〜約５％、約２〜約３％、約５〜約１０％、約１０〜約１５％、約１５〜約２０％、約２０〜約２５％、約２５〜約３０％、約３０〜約３５％、約３５〜約４０％、約４０〜約４５％、又は約４５〜約５０％低減される。
【０２１６】
一部の実施形態では、体重の低減は、約１週間、約２週間、約３週間、約１ヶ月間、約２ヶ月間、約３ヶ月間、約４ヶ月間、約５ヶ月間、約６ヶ月間、約７ヶ月間、約８ヶ月間、約９ヶ月間、約１０ヶ月間、約１１ヶ月間、約１年間、約１．５年間、約２年間、約２．５年間、約３年間、約３．５年間、約４年間、約４．５年間、約５年間、約６年間、約７年間、約８年間、約９年間、約１０年間、約１５年間、又は約２０年間維持される。
【０２１７】
本発明は、症候群、障害、若しくは疾患、又は当該症候群、障害、若しくは疾患のうちのいずれか１つ又は２つ以上の症状を予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させることを、それを必要とする対象に行う方法であって、当該症候群、障害、又は疾患が、肥満、Ｉ型若しくはＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム（すなわち、シンドロームＸ）、インスリン抵抗性、耐糖能異常（例えば、耐糖能）、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／又は脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに湿疹からなる群から選択される、方法を提供し、本方法は、有効量の本発明のコンジュゲート、化合物、又は医薬組成物の投与を、それを必要とする対象に行うことを含む。
【０２１８】
本明細書で使用される場合、メタボリックシンドロームは、高血糖（例えば、高空腹時血糖）、高血圧、異常コレステロールレベル（例えば、低ＨＤＬレベル）、異常トリグリセリドレベル（例えば、高トリグリセリド）、大腰線（すなわち、腰部周囲）、腹部領域の脂肪の増加、インスリン抵抗性、耐糖能、高いＣ反応性タンパク質レベル（すなわち、前炎症状態）、及び血漿プラスミノゲン活性化因子阻害剤−１及びフィブリノーゲンレベル（すなわち、血栓状態）の任意の１つ以上を有する対象を指す。
【０２１９】
本発明は、食物摂取の低減を、それを必要とする対象に行う方法を提供し、本方法は、有効量の本発明のコンジュゲート、化合物、又は医薬組成物の投与を、それを必要とする対象に行うことを含む。一部の実施形態では、対象の食物摂取は、本明細書に記載の本発明のコンジュゲート、化合物、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれかの投与前の対象の食物摂取に対して、又は本明細書に記載の本発明のコンジュゲート、化合物、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれも受けていない対照対象と比較して、例えば、約０．０１〜約０．１％、約０．１〜約０．５％、約０．５〜約１％、約１〜約５％、約２〜約３％、約５〜約１０％、約１０〜約１５％、約１５〜約２０％、約２０〜約２５％、約２５〜約３０％、約３０〜約３５％、約３５〜約４０％、約４０〜約４５％、又は約４５〜約５０％低減される。
【０２２０】
一部の実施形態では、食物摂取の低減は、約１週間、約２週間、約３週間、約１ヶ月間、約２ヶ月間、約３ヶ月間、約４ヶ月間、約５ヶ月間、約６ヶ月間、約７ヶ月間、約８ヶ月間、約９ヶ月間、約１０ヶ月間、約１１ヶ月間、約１年間、約１．５年間、約２年間、約２．５年間、約３年間、約３．５年間、約４年間、約４．５年間、約５年間、約６年間、約７年間、約８年間、約９年間、約１０年間、約１５年間、又は約２０年間維持される。
【０２２１】
本発明は、糖化ヘモグロビン（Ａ１Ｃ）を低減することを、それを必要とする対象に行う方法を提供し、本方法は、有効量の本発明のコンジュゲート、化合物、又は医薬組成物の投与を、それを必要とする対象に行うことを含む。一部の実施形態では、対象のＡ１Ｃは、本明細書に記載の本発明のコンジュゲート、化合物、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれかの投与前の対象のＡ１Ｃに対して、又は本明細書に記載の本発明のコンジュゲート、化合物、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれも受けていない対照対象と比較して、例えば、約０．００１〜約０．０１％、約０．０１〜約０．１％、約０．１〜約０．２％、約０．２〜約０．３％、約０．３〜約０．４％、約０．４〜約０．５％、約０．５〜約１％、約１〜約１．５％、約１．５〜約２％、約２〜約２．５％、約２．５〜約３％、約３〜約４％、約４〜約５％、約５〜約６％、約６〜約７％、約７〜約８％、約８〜約９％、又は約９〜約１０％低減される。
【０２２２】
他の実施形態では、空腹時血糖レベルを低減することを、それを必要とする対象に行う方法を提供し、本方法は、有効量の本発明のコンジュゲート、化合物、又は医薬組成物の投与を、それを必要とする対象に行うことを含む。空腹時血糖レベルは、本明細書に記載の本発明のコンジュゲート、化合物、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれかの投与前の対象の空腹時血糖レベルに対して、又は本明細書に記載の本発明のコンジュゲート、化合物、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれかを受けていない対照対象と比較して、約１４０〜約１５０ｍｇ／ｄＬ未満、約１４０〜約１３０ｍｇ／ｄＬ未満、約１３０〜約１２０ｍｇ／ｄＬ未満、約１２０〜約１１０ｍｇ／ｄＬ未満、約１１０〜約１００ｍｇ／ｄＬ未満、約１００〜約９０ｍｇ／ｄＬ未満、又は約９０〜約８０ｍｇ／ｄＬ未満まで低減され得る。
【０２２３】
本発明は、アミリン受容体活性の調節を、それを必要とする対象に行う方法を提供し、本方法は、有効量の本発明のコンジュゲート、化合物、又は医薬組成物の投与を、それを必要とする対象に行うことを含む。本明細書で使用される場合、「調節する」とは、受容体活性を増加又は減少させることを指す。
【０２２４】
一部の実施形態では、有効量の本発明のコンジュゲート若しくは化合物、又はその形態、組成物、若しくは薬剤は、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、又は１日８回、それを必要とする対象に投与される。他の実施形態では、有効量の本発明のコンジュゲート若しくは化合物、又はその形態、組成物、若しくは薬剤は、２日に１回、週に１回、週に２回、週に３回、週に４回、週に５回、週に６回、１ヶ月に２回、１ヶ月に３回、又は１ヶ月に４回、それを必要とする対象に投与される。
【０２２５】
本発明の別の実施形態は、疾患、障害、若しくは症候群、又は当該疾患、障害、若しくは症候群のいずれかの１つ以上の症状を予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させることを、それを必要とする対象に行う方法を提供し、本方法は、併用療法で、有効量の本発明のコンジュゲート、化合物、又は医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、併用療法は、第２の治療薬である。ある特定の実施形態では、併用療法は、外科療法である。
【０２２６】
本明細書で使用するとき、用語「併用される」は、対象への２種以上の療法の投与との関連において、複数の療法の使用を指す。
【０２２７】
本明細書で使用されるとき、併用療法は、有効量の本発明のコンジュゲート若しくは化合物、又はその形態、組成物、若しくは薬剤と同時に、１種以上の追加の治療薬、又は１種以上の外科療法を、それを必要とする対象に施すことを指す。一部の実施形態では、１つ以上の追加の治療薬又は外科療法は、有効量の本発明のコンジュゲートと同日に投与され得るが、他の実施形態では、１つ以上の追加の治療薬又は外科療法は、有効量の本発明のコンジュゲート又は化合物と同じ週又は同じ月に投与され得る。
【０２２８】
ある特定の実施形態では、疾患又は障害は、肥満、ＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び脂質異常症からなる群から選択され、第２の治療薬は抗糖尿病薬であり得る。ある特定の実施形態では、抗糖尿病薬は、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体調節因子であり得る。
【０２２９】
本発明はまた、併用療法を用いて、本明細書に記載の疾患、障害、症候群、又は症状のいずれかを予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させることを、それを必要とする対象に行うことも企図し、併用療法は、有効量の本発明のコンジュゲート、化合物、又は医薬組成物を、以下の治療薬のうちの任意の１種以上と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含む：ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）阻害剤（例えば、シタグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチン、アログリプチンなど）；ＧＬＰ−１受容体アゴニスト（例えば、エキセナチド及びリキシセナチドなどの、短時間作用型ＧＬＰ−１受容体アゴニスト；中間作用型ＧＬＰ−１受容体アゴニスト（例えば、リラグルチド）；長期放出型エキセナチド、アルビグルチド、デュラグルチドなどの長時間作用型ＧＬＰ−１受容体アゴニスト；ナトリウム−グルコース共輸送体−２（ＳＧＬＴ−２）阻害剤（例えば、カナグリフォジン、ダパグリフォジン、エンパグリフォジンなど）；胆汁酸封鎖剤（例えば、コレセベラムなど）；ドーパミン受容体アゴニスト（例えば、ブロモクリプチン急速放出）；ビグアニド（例えば、メトホルミンなど）；インスリン；オキシントモジュリン；スルホニル尿素（例えば、クロルプロパミド、グリメピリド、グリピジド、グリブリド、グリベンクラミド、グリボルヌリド、グリソキセピド、グリクロピラミド、トラザミド、トルブタミド、アセトヘキサミド、カブタミドなど）；及びチアゾリジンジオン（例えば、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、ロベグリタゾン、シグリタゾン、ダルグリタゾン、エングリタゾン、ネトグリタゾン、リボグリタゾン、トログリタゾンなど）。一部の実施形態では、追加の治療薬（複数可）の用量は、本発明のコンジュゲート又は化合物と組み合わせて与えられる場合に低減される。一部の実施形態では、本発明のコンジュゲート又は化合物と組み合わせて使用される場合、追加の治療薬（複数可）は、それぞれが単独で使用される場合よりも低い用量で使用され得る。
【０２３０】
疾患又は障害が、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム（すなわち、シンドロームＸ）、インスリン抵抗性、耐糖能異常（例えば、耐糖能）、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに湿疹からなる群から選択される、ある特定の実施形態では、第２の治療薬はリラグルチドであり得る。
【０２３１】
本発明は、併用療法を用いて、本明細書に記載の疾患、障害、症候群、又は症状のいずれかを予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させることを、それを必要とする対象に行うことを企図し、併用療法は、有効量の本発明のコンジュゲート、化合物、又は医薬組成物を、外科療法と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、外科治療は、肥満手術（例えば、ルーワイ法による胃バイパス手術などの胃バイパス手術；スリーブ胃切除術；調節可能な胃バンド手術；十二指腸スイッチを伴う胆すい消化回避術；胃内バルーン；胃縫縮術、及びこれらの組み合わせ）であり得る。
【０２３２】
１つ若しくは２つ以上の追加の治療薬又は外科療法が、有効量の本発明のコンジュゲート又は化合物と同日に投与される実施形態では、本発明のコンジュゲート又は化合物は、追加の治療薬又は外科療法の前、後、又は同時に投与され得る。「併用される」という用語の使用は、治療が対象に投与される順序を限定しない。例えば、第１の治療薬（例えば、本明細書に記載される組成物）を、対象への第２の治療薬の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）に、同時に、又はその後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間後）に、投与することができる。
【０２３３】
本発明の更なる実施形態は、好ましくは残基１０と１７との間のペプチド領域において、アミリンアゴニストペプチドの更なるタンパク質分解安定化修飾の組み込みを含む。このようなタンパク質分解安定化修飾としては、１つ以上の、非タンパク新生アミノ酸、Ｃ−α−アルキル化アミノ酸、相同アミノ酸、又は合成アミノ酸などによる、アミノ酸置換が挙げられるが、これらに限定されない。２つ以上のこのようなタンパク質分解安定化修飾の組み合わせが、本明細書で企図される。
【０２３４】
本発明の更なる実施形態では、チオエーテル環化アミリノミメティックペプチド又はその誘導体は、半減期延長部分で誘導体化される少なくとも１つのアミノ酸残基を含有する。このような半減期延長部分は、上記の位置において適切に変異した残基上への共役化を介して、好適な（耐性）部位に導入される。半減期延長部分の例としては、パルミチン酸又は類似の脂肪酸などのアルブミン結合脂質、及びＨＳＡ、ｍＡｂ、又はＦｃコンジュゲートなどのタンパク質生体コンジュゲートが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３５】
本発明の更なる実施形態は、チオエーテル環化アミリンペプチドの物理化学的特性を改善するために導入されるアミノ酸置換及び／又はペプチド修飾が挙げられる。特定の例では、天然のアミリンアミノ酸残基は、ペプチドのｐＩを低減する残基に変異されてもよく、それによって、投与がより容易となるように製剤可能であり、同時に、アミリン受容体効力が維持される。他の例では、水溶性官能基（ポリエチレングリコールなどであるがこれらに限定されない）による誘導体化が、好適な配合ビヒクル中のチオエーテル環化アミリン類似体の溶解度を改善する手段として企図される。
【０２３６】
実施形態
本発明は以下の非限定的な実施形態も提供する。
【０２３７】
実施形態１は、アミリノミメティックペプチドに結合されたモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートであって、アミリノミメティックペプチドが、式Ｉ（配列番号５３）によって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり：
【０２３８】
【化５３】
2021522231.tif 000054
（式中、
ｎは、１又は２であり、
Ｚ２は、直接結合、セリン、又はグリシンであり、
Ｚ４は、Ｔ又は
【０２３９】
【化５４】
2021522231.tif 000055
であり、
Ｚ５は、Ａ、β−アラニン、
【０２４０】
【化５５】
2021522231.tif 000056
であり、
Ｚ６は、Ｔ又は
【０２４１】
【化５６】
2021522231.tif 000057
であり、
Ｚ１０は、Ｑ又はＥであり、
Ｚ１１は、Ｒ又はＫであり、Ｋのε−アミンが、任意選択で−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２によって置換されたものであり、
Ｚ１２は、Ｌ又は
【０２４２】
【化５７】
2021522231.tif 000058
であり、
Ｚ１６は、Ｌ又は
【０２４３】
【化５８】
2021522231.tif 000059
であり、
Ｚ２５は、Ｐ又はＫであり、
Ｚ２６は、Ｉ又はＫであり、
Ｘは、ＡＴＺ１０Ｚ１１Ｚ１２ＡＮＦＺ１６ＶＨＳＳＮＮＦＧＺ２５Ｚ２６ＬＰＺ２９ＴＮＶＧＺ３４（配列番号５４）、又はＶＬＧＲＬＳＱＥＬＨＲＬＱＴＹＰＲＴＮＴＧＳ（配列番号５５）であり、
Ｚ２９は、Ｐ又はＫであり、
Ｚ３４は、Ｓ又はＫである）
その誘導体が、アミド化、グリコシル化、カルバミル化、硫酸化、リン酸化、環化、脂質化、及びＰＥＧ化からなる群から選択される１つ以上のプロセスによって修飾されている式Ｉの化合物である、コンジュゲートである。
【０２４４】
実施形態２は、アミリノミメティックペプチドが、アミド化、脂質化、及びＰＥＧ化からなる群から選択される１つ又は２つ以上のプロセスによって修飾されている式Ｉのアミリノミメティックペプチドの誘導体、又はその薬学的に許容される塩である、実施形態１に記載のコンジュゲートである。
【０２４５】
実施形態３は、アミリノミメティックペプチドが、式Ｉによって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、式中、
Ｚ２は、直接結合であり、
Ｚ５は、β−アラニン、
【０２４６】
【化５９】
2021522231.tif 000060
であり、
Ｚ６は、Ｔである、実施形態１に記載のコンジュゲートである。
【０２４７】
実施形態４は、アミリノミメティックペプチドが、式Ｉによって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、式中、
Ｚ１６は、Ｌであり、
Ｚ１２は、
【０２４８】
【化６０】
2021522231.tif 000061
である、実施形態１に記載のコンジュゲートである。
【０２４９】
実施形態５は、アミリノミメティックペプチドが、式Ｉによって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、式中、
Ｚ１１は、Ｒであり、
Ｚ１２は、
【０２５０】
【化６１】
2021522231.tif 000062
である、実施形態１に記載のコンジュゲートである。
【０２５１】
実施形態６は、アミリノミメティックペプチドが、配列番号４〜２８からなる群から選択される、実施形態１に記載のコンジュゲートである。
【０２５２】
実施形態７は、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが、リンカーを介して、アミリノミメティックペプチドのリジン残基において、アミリノミメティックペプチドに共有結合している、実施形態１〜６のいずれか１つに記載のコンジュゲートである。
【０２５３】
実施形態８は、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号４７、４８、４９、５０、５１、及び５２のポリペプチド配列をそれぞれ有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のコンジュゲートである。
【０２５４】
実施形態９は、単離されたモノクローナル抗体が、配列番号４３のポリペプチド配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号４５のポリペプチド配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む、実施形態８に記載のコンジュゲートである。
【０２５５】
実施形態１０は、Ｆｃ部分を更に含む、実施形態９に記載のコンジュゲートである。
【０２５６】
実施形態１１は、配列番号４４のポリペプチド配列を有する重鎖（ＨＣ）と、配列番号４６のポリペプチド配列を有する軽鎖（ＬＣ）とを含む、実施形態１０に記載のコンジュゲートである。
【０２５７】
実施形態１２は、アミリノミメティックペプチドの側鎖、好ましくはアミリノミメティックペプチドのリジン残基のアミノ側鎖上の、求電子物質、好ましくはブロモアセトアミド誘導体化リンカーを、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの配列番号４９のシステイン残基のスルフヒドリル基と反応させ、それにより、アミリノミメティックペプチドとモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントとの間に共有結合による連結を創出することを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のコンジュゲートの生成方法である。
【０２５８】
実施形態１３は、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物である。
【０２５９】
実施形態１４は、肥満の治療又は予防を、それを必要とする対象に行う方法であって、有効量の実施形態１３に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法である。
【０２６０】
実施形態１５は、有効量の薬学的組成物の投与をそれを必要とする対象に行うことが、医薬組成物の投与前の対象の体重と比較して、約５〜約１０％、約１０〜約１５％、約１５〜約２０％、又は約２０〜約２５％の体重減少をもたらす、実施形態１４に記載の方法である。
【０２６１】
実施形態１６は、疾患又は障害の治療又は予防を、それを必要とする対象に行う方法であって、当該疾患又は障害が、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに湿疹からなる群から選択され、有効量の実施形態１３に記載の医薬組成物を、治療又は予防を必要とする対象に投与することを含む方法である。
【０２６２】
実施形態１７は、当該疾患又は障害が肥満である、実施形態１６に記載の方法である。
【０２６３】
実施形態１８は、当該疾患又は障害がＩ型糖尿病である、実施形態１６に記載の方法である。
【０２６４】
実施形態１９は、当該疾患又は障害がＩＩ型糖尿病である、実施形態１６に記載の方法である。
【０２６５】
実施形態２０は、当該疾患又は障害がメタボリックシンドロームである、実施形態１６に記載の方法である。
【０２６６】
実施形態２１は、当該疾患又は障害が腎疾患である、実施形態１６に記載の方法である。
【０２６７】
実施形態２２は、当該疾患又は障害が非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、実施形態１６に記載の方法である。
【０２６８】
実施形態２３は、当該疾患又は障害が非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である、実施形態１６に記載の方法である。
【０２６９】
実施形態２４は、食物摂取の低減をそれを必要とする対象に行う方法であって、有効量の実施形態１３に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法である。
【０２７０】
実施形態２５は、有効量の医薬組成物の投与を、それを必要とする対象に行うことが、医薬組成物の投与前の対象の食物摂取と比較して、約５〜約１０％、約１０〜約１５％、約１５〜約２０％、約２０〜約２５％、約２５〜約３０％、約３０〜約３５％、約３５〜約４０％、約４０〜約４５％、又は約４５〜約５０％の食物摂取の低減をもたらす、実施形態２４に記載の方法である。
【０２７１】
実施形態２６は、アミリン受容体活性の調節を、それを必要とする対象に行う方法であって、有効量の実施形態１３に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法である。
【０２７２】
実施形態２７は、医薬組成物が、注射により投与される、実施形態１４〜２６のいずれか１つに記載の方法である。
【０２７３】
実施形態２８は、注射剤が、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内に送達される、実施形態２７に記載の方法である。
【０２７４】
実施形態２９は、医薬組成物が、第２の治療薬と組み合わせて投与される、実施形態１４〜２８のいずれか１つに記載の方法である。
【０２７５】
実施形態３０は、疾患又は障害が、肥満、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び脂質異常症からなる群から選択され、第２の治療薬が少なくとも１つの抗糖尿病薬である、実施形態２９に記載の方法である。
【０２７６】
実施形態３１は、当該抗糖尿病薬が、グルカゴン様ペプチド−１受容体調節因子である、実施形態３０に記載の方法である。
【０２７７】
実施形態３２は、第２の治療薬がリラグルチドである、実施形態２９に記載の方法である。
【０２７８】
実施形態３３は、医薬組成物が、毎日、毎週、又は毎月、それを必要とする対象に投与される、実施形態１４〜３２のいずれか１つに記載の方法である。
【０２７９】
実施形態３４は、医薬組成物が、１日に１回、２回、３回、４回、５回、又は６回投与される、実施形態３３に記載の方法である。
【０２８０】
実施形態３５は、医薬組成物が、週に１回、２回、３回、４回、５回、又は６回投与される、実施形態３３に記載の方法である。
【０２８１】
実施形態３６は、医薬組成物が、月に１回、２回、３回、又は４回投与される、実施形態３３に記載の方法である。
【０２８２】
実施形態３７は、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載のコンジュゲート又は実施形態１３の医薬組成物を含むキットであり、好ましくはキットは、有効量の第２の治療薬を更に含み、より好ましくは、キットは、有効量のリラグルチドを更に含む。
【０２８３】
実施形態３８は、キットが注入デバイスを更に含む、実施形態３７に記載のキットである。
【０２８４】
実施形態３９は、配列番号４〜４２からなる群から選択される化合物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物の製造方法である。
【０２８５】
合成
本発明の化合物又はコンジュゲートは、当業者に知られる一般的な合成法に従って合成することができる。以下の合成の説明は、例示目的のためのものであり、決して本発明の限定を意図するものではない。
【０２８６】
本発明のチオエーテル環化アミリノミメティックペプチド又は誘導体は、アミノ酸間の連続するペプチド連結を形成するための様々な既知の従来の手順によって合成することができ、自動化されたペプチド合成装置、従来のベンチ合成、又は両方のアプローチの組み合わせを使用して、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９６３，８５，２１４９−２１５４）により一般的に説明されるように、優先的に固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により行われる。ペプチド合成のための従来の手順は、１つのアミノ酸残基の遊離アミノ基（その他の反応性官能基は好適に保護されている）と別のアミノ酸の遊離カルボキシル基（その反応性官能基も好適に保護されている）との間の縮合を伴う。ペプチド結合形成に通常利用される縮合剤の例としては、１−ヒドロキシベンズトリアゾール（ＨＯＢＴ）又はエチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセテート（Ｏｘｙｍａ  Ｐｕｒｅ）を有する又は有しないジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、２−（１Ｈ−７−アザベンズトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンズトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＯｘｉｍ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）ブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒｏＰ）などが挙げられる。
【０２８７】
自動化されたペプチド合成方法は、Ｙｕ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，５７，４７８１−４７８４）により説明され、Ｐａｌａｓｅｋ（Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，２００７，１３，１４３−１４８）により近年改良されたように、好ましくはマイクロ波加熱を適用することにより、室温（ｒｔ）又は高温で行われ得る。
【０２８８】
本発明の化合物（Ｃ末端アミド）は、好適に保護されたＮ−α−ＦＭＯＣ保護されたアミノ酸のカルボキシ末端が、好適な結合剤を使用して従来の固相樹脂上に結合される、Ｎ−α−ＦＭＯＣ保護されたアミノ酸法を用いて、便利に調製することができる。好適な従来の市販の固相樹脂としては、ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂、ＲｉｎｋアミドＡＭ樹脂、Ｔｅｎｔａｇｅｌ  Ｓ  ＲＡＭ  Ｒｅｓｉｎ、ＦＭＯＣ−ＰＡＬ−ＰＥＧ  ＰＳ樹脂、ＳｐｈｅｒｉＴｉｄｅ  Ｒｉｎｋアミド樹脂、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ  Ｒｉｎｋ樹脂、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂、ＴＧ  Ｓｉｅｂｅｒ樹脂などが挙げられる。次いで、樹脂結合されたＦＭＯＣ−アミノ酸は、ＤＭＦ又はＮＭＰのいずれか中２０％ピペリジンへの曝露によって脱保護されてもよく、その処理は、ＦＭＯＣ保護基を選択的に除去する役割を果たす。次いで、追加のＦＭＯＣ保護されたアミノ酸は、続いて順次結合及び脱保護され、それによって所望の樹脂結合された、保護されたペプチドを生成する。ある特定の場合では、ＦＭＯＣ脱保護条件に耐えるであろうペプチド配列中の別のアミンに対して直交反応性保護基を利用することが必要であり得る。４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）又は４−メトキシトリチル（Ｍｍｔ）などの保護基は、いずれも１％ＴＦＡ／ＤＣＭ処理によって除去可能であるか、又は好ましくはアリルオキシカルボニル（ａｌｌｏｃ；Ｐｄ（ＰＰｈ３）４／ＰｈＳｉＨ３処理により除去可能）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロへキサ−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ；２〜３％ヒドラジン／ＤＭＦで処理することによって除去可能）、及び１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロへキサ−１−イリデン）−３−メチルブチル（ｉｖＤｄｅ；２〜３％ヒドラジン／ＤＭＦで処理することによって除去可能）が、そのような場合に効果的に使用され得る。
【０２８９】
従来のペプチド合成方法では、アルファアミノ酸の反応性側鎖は、一般的に、結合及び脱保護プロトコルに対してそれらを不活性にするために、好適な保護基で合成を通して保護される。アミノ酸側鎖のための複数の保護基が当該技術分野において既知であるが、本明細書では、以下の保護基が最も好ましい：セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、及びチロシンにはｔｅｒｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）；アスパラギン、グルタミン、システイン、ホモシステイン、及びヒスチジンにはトリチル（Ｔｒｔ）；トリプトファンと、リジンのε−アミノ基とにはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）；及びアルギニンには２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）。これらの保護基は、高濃度のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などの強酸処理により除去される。
【０２９０】
ＳＰＰＳが完了すると、樹脂結合された側鎖保護されたペプチドは、脱保護され、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、水、フェノール、及びアニソールなどの様々な組み合わせのカルボカチオン掃去剤と共に、主に（ＴＦＡ）からなる切断カクテルを使用して、樹脂から同時に切断される。次いで、ペプチド／カクテル濾液を冷エーテルで沈殿させることにより、粗固体ペプチドを単離する。次いで、このようにして得られた粗ペプチドを、アセトニトリル又はエタノールなどの有機共溶媒を含む主に水性の溶媒系中に低濃度（約５ｍｇ／ｍＬ未満）で溶解する。溶液のｐＨを７を超えて上昇させると、次にペプチドは分子内環化反応を経て、本発明の対応する粗チオエーテル環化アミリン類似体を形成する。このように形成されたチオエーテル環化アミリン類似体は、当該技術分野において一般的に既知の精製技術を使用して精製することができる。本明細書で使用されるペプチド精製の好ましい方法は、逆相高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）である。次いで、精製されたペプチドは、液体クロマトグラフィ／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によって特徴付けられる。
【０２９１】
本明細書に記載の以下の実施例及び実施形態は例示の目的のみであって、それらを考慮した様々な修正又は変更が当業者に提示され、本出願の趣旨及び範囲、並びに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが理解される。本明細書で引用される全ての発行物、特許、及び特許出願は、全ての目的においてそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９２】
略語
以下及び本明細書全体を通して、以下の略語が使用され得る。
【０２９３】
【表１−１】
2021522231.tif 000063
【０２９４】
【表１−２】
2021522231.tif 000064
【実施例】
【０２９５】
実施例１：チオエーテル環化アミリノミメティックペプチドの合成（スキーム１）
ステップＡ：樹脂結合されたＣ末端アミドペプチドの合成
保護されたペプチジル樹脂は、スキーム１に示されるように、上述のＦＭＯＣ戦略を使用して、０．１ｍｍｏｌスケールで、低充填Ｒｉｎｋアミド樹脂、好ましくはＦＭＯＣ−ＰＡＬ−ＰＥＧ  ＰＳ樹脂（約０．１６〜０．２ｍｅｑ／ｇ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより供給される）を使用して、ＣＥＭ  Ｌｉｂｅｒｔｙ  Ｂｌｕｅ  Ｍｉｃｒｏｗａｖｅペプチド合成装置で合成された。標準的なＦＭＯＣ保護されたアミノ酸（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｐｏｒｅ）、Ｂａｃｈｅｍ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、又はＣｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘにより供給）は、結合剤としてＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ、及び４分間約９０℃の反応温度を使用する樹脂充填に対して５倍過剰で結合された。ＦＭＯＣ−Ａｒｇ（Ｐｄｆ）−ＯＨを、それぞれ９０℃で４分間二重結合し、ＦＭＯＣ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを、室温で４分間、続いて５０℃で８分間の２段階プロトコルを用いて結合した。１回のＦＭＯＣ脱保護を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン（脱保護溶液）を使用して、９０℃で１．５分間行った。
【０２９６】
工程Ｂ：樹脂結合されたペプチドのブロモアセチル化の手順（スキーム２）
ＦＭＯＣ脱保護されたペプチド樹脂（０．１ｍｍｏｌ）を、５０℃で５分間マイクロ波反応器内で、ＤＭＦ（５ｍＬ）中のブロモ酢酸無水物（６〜２０当量）の溶液で処理し、その時点までに、反応は、Ｋａｉｓｅｒニンヒドリン試験により完了であると概ね判定された。結合が不完全であると決定された場合には、結合は新しい試薬で繰り返された。
【０２９７】
ステップＣ：樹脂からのペプチド切断手順
ＳＰＰＳが完了したら、樹脂をＤＭＦで、次いでＤＣＭで十分に洗浄し、乾燥させた。次いで、樹脂を、ＴＦＡ／水／ＴＩＰＳ／（９５：２．５：２．５）（Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ａ）、又はより好ましくはＴＦＡ／水／フェノール／ＴＩＰＳ（８８：５：５：２）（Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｂ）のいずれかからなる切断カクテル（１０ｍＬ／０．１ｍｍｏｌスケール）で処理し、マイクロ波反応器内で、３８℃で４０分間加熱した後、濾過した。樹脂をＴＦＡで洗浄し、合わせた濾液を窒素流下で約２．５ｍＬの体積に濃縮し、ペプチドを、冷ジエチルエーテル（４０ｍＬ）を添加することにより沈殿させた。ペプチド／エーテル懸濁液を遠心分離し、エーテル層をデカントした。ペプチドペレットをエーテルに再懸濁し、遠心分離し、デカントし、このプロセスを３回繰り返した。このようにして得られた粗ペプチドを穏やかな窒素流下で乾燥させた。
【０２９８】
ステップＤ：ペプチド環化（チオエーテル形成）手順
粗システイン含有又はホモシステイン含有ペプチドを、４ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で脱酸素化ＭｅＣＮ／水（５０〜６０％ＭｅＣＮ）又はＥｔＯＨ／水（５０〜６０％ＥｔＯＨ）に溶解した。次いで、固体ＮａＨＣＯ３、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液、又はトリス緩衝剤の１Ｍ水溶液（ｐＨ  ７．５）のいずれかを添加して、ペプチド溶液のｐＨを、約７〜９に上昇させた。得られた溶液を室温で３〜１６時間撹拌した。典型的には、環化は、分析ＬＣ／ＭＳによって判定すると、１時間以内に完了した。
【０２９９】
ステップＥ：ペプチド精製手順
環化反応混合物を、ＴＦＡを添加することによりｐＨ  １．５〜３に酸性化し、溶液を濃縮して、有機共溶媒（ＭｅＣＮ又はＥｔＯＨ）の大部分をわずかな濁りが生じる点まで除去した。混合物を均質にするために必要に応じて最小限の量の共溶媒を添加し戻し、次いで、得られた溶液を、複数回の注入で分取ＨＰＬＣによって直接精製した。精製は、以下から選択される逆相Ｃ１８又はＣ８カラムを使用して、Ａｇｌｉｅｎｔ  ＰｒｅｐＳｔａｒ  ＨＰＬＣシステム又はＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣ  ２０２０  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍのいずれかで実行された：Ｖａｒｉａｎ  Ｐｕｒｓｕｉｔ  ＸＲ  Ｃ１８（２１×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）；Ｖａｒｉａｎ  Ｐｕｒｓｕｉｔ  ＸＲジフェニル（３０×１００ｍｍ、１００Å、５μｍ）；Ｚｏｒｂａｘ  ３００  ＳＢ−Ｃ８（２１×２５０ｍｍ、３００Å、５μｍ）；Ｗａｔｅｒｓ  Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｔ３  Ｃ１８（１９×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｌａｒｉｓ  ５  Ｃ１８−Ａ（３０×２５０ｍｍ、１８０Å、５μｍ）。移動相は、緩衝剤Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）、及び初期濃度１０〜２０％Ｂから最終濃度４０〜９０％Ｂの範囲の緩衝剤Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ＴＦＡ）の勾配溶出からなり、実行時間は３６〜８０分間の範囲であった。ＵＶ検出は、２２０及び２５４ｎｍで監視した。生成物含有画分は、上記からの適切なカラムタイプ（４．６×２５０ｍｍ、３００Å、５μｍ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムで分析ＨＰＬＣによって分析した。純粋な画分を合わせ、濃縮して有機相の大部分を除去した後、凍結乾燥させた。引き続きＴＦＡ／ＨＣＩ塩交換が、Ａｎｄｒｕｓｈｃｈｅｎｋｏ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，２００６，１３，３７−４３）によって説明されている手順に従って、２ｍＭ  ＨＣＩからの３重凍結乾燥によって、実行された。
【０３００】
【化６２】
2021522231.tif 000065
（式中、ＬＧは、脱離基である）
Ｘは、ＡＴＺ１０Ｚ１１Ｚ１２ＡＡＮＦＬＨＳＳＮＮＦＧＺ２５Ｚ２６ＬＰＺ２９ＴＮＶＧＺ３４又はＶＬＧＲＬＳＱＥＬＨＲＬＱＴＹＰＲＴＮＴＧＳ
＊アミノ酸が保護される
スキーム１：チオエーテル環化アミリノミメティックペプチドの合成：アミリン／プラムリンチド／ダバリンチド類似体
【０３０１】
実施例２：脂質付加されたアミリノミメティックペプチドの合成（スキーム２）
ステップＡ：標準的なＲｉｎｋアミド樹脂上に構築されたペプチド配列に誘導体化されたリジン残基を導入するための手順
誘導体化の所望の点より前の時点で作製され、実施例１Ａに記載されるように調製された樹脂結合Ｃ末端アミドペプチドに、Ｄｄｅ−Ｌｙｓ（ＦＭＯＣ）−ＯＨ又はｉｖＤｄｅ−Ｌｙｓ（ＦＭＯＣ）−ＯＨのいずれかと、次いでＦＭＯＣ−ＯＥＧ−ＯＨ（１つ又は２つの単位がタンデムに結合したもの）が順次連結され、その後、任意選択的に、実施例１Ａに記載されるようなＤＩＣ／Ｏｘｙｍａカップリング法を使用して、マイクロ波条件下（手動又はＬｉｂｅｒｔｙ  Ｂｌｕｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上）でＦＭＯＣ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕを連結した。ＦＭＯＣ脱保護後、樹脂を、親油性酸［例えば、パルミチン酸］（５〜１０当量）、ＤＩＣ（５〜１０当量）、及びＨＯＢＴ又はＯｘｙｍａ（５〜１０当量）のＤＭＦ溶液中で、マイクロ波条件下、９０℃で１０分間処理した。次いで、反応物を排出し、樹脂をＤＭＦで洗浄した。スキーム２は、位置Ｚ２５における脂質付加リジンの導入を示す。当業者であれば、同様のアプローチがＺ２６、Ｚ２９、又はＺ３４で脂質付加リジンをもたらすことを認識するであろう。
【０３０２】
【化６３】
2021522231.tif 000066
＊アミノ酸が保護される
スキーム２：誘導体化されたリジン残基をアミリノミメティックペプチドに導入する手順
【０３０３】
ステップＢ：Ｄｄｅ保護又はｉｖＤｄｅ保護されたリシニルペプチドを脱保護するための手順
誘導体化されたリシニルペプチド樹脂を、９０℃で３．５分間、マイクロ波条件下でＤＭＦ（６ｍＬ／０．１ｍｍｏｌ樹脂）中３％ヒドラジンの溶液で処理した。反応物を排出し、この手順を更に２回繰り返した。反応物を排出し、樹脂をＤＭＦで、次いでＤＣＭで十分に洗浄した。
【０３０４】
ステップＣ：ＦＭＯＣ−Ｌｙｓ（Ｐａｌ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−ＯＨ残基を直接組み込むための手順
パルミトイル化−γ−Ｇｌｕ−リシニル残基が配列に組み込まれる場合、ＦＭＯＣ−Ｌｙｓ（Ｐａｌ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ−ＯＨ（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ又はＡｃｔｉｖｅＰｅｐｔｉｄｅから入手可能）を、実施例１Ａに記載される手順で直接使用することができる。
【０３０５】
実施例３：ＢｒＡｃ−ｄＰＥＧｘ−誘導体化アミリノミメティックペプチドの合成（スキーム３）
Ｚ２５、Ｚ２６、Ｚ２９、又はＺ３４のうちの１つがＫ（ＮＨ２）（７μｍｏｌ）である、実施例１Ｅから得たチオエーテル環化ペプチドと、ＤＭＡ（０．３ｍＬ）中のＢｒＡｃ−ｄＰＥＧｘ−ＯＴＦＰ（３当量）との溶液を、ＤＩＥＡ（７当量）で処理し、得られた溶液をｒｔで撹拌した。実施例１Ｅに説明されているように、反応（約１時間）が完了すると、混合物をＴＦＡで酸性化し、水（０．１％ＴＦＡ）で希釈し、逆相クロマトグラフィにより精製した。スキーム３は、位置Ｚ２５における脂質付加リジンの導入を示す。当業者であれば、同様のアプローチがＺ２６、Ｚ２９、又はＺ３４でＢｒＡｃ−ｄＰＥＧｘ−誘導体化リジンをもたらすことを認識するであろう。
【０３０６】
【化６４】
2021522231.tif 000067
＊アミノ酸が保護される
ＬＧは脱離基である
スキーム３：ＢｒＡｃ−ｄＰＥＧｘ−誘導体化アミリノミメティックペプチドの合成手順
【０３０７】
実施例４：チオエーテル環化アミリノミメティックペプチド−ｍＡｂコンジュゲートの合成
ｍＡｂの発現及び精製
完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、哺乳類発現宿主において組換えにより発現され、当該技術分野において既知の標準的な方法を用いて細胞培養上清から精製することができる。例えば、それぞれが分泌を可能にする適切なシグナルペプチドを含む、ｍＡｂの軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）をコードするｃＤＮＡ配列を、標準的な分子生物学的方法を使用して別個の哺乳類発現ベクター又は単一の発現ベクターにクローニングすることができる。使用される発現ベクターは、ｐＥＥ１２．４、ｐｃＤＮＡ（商標）３．１（＋）、又はｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３などの市販のもの、又は類似の機能性を有する任意のカスタム発現ベクターであり得る。そのようなベクターでは、ｍＡｂの重鎖及び軽鎖の転写はそれぞれ、ｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターなどの既知の有効なプロモーターのいずれかによって駆動される。トランスフェクショングレードのプラスミドＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔなどの標準的な方法を用いて、別々のＬＣ発現構築物及びＨＣ発現構築物のため、又はＬＣ及びＨＣの両方を発現する単一の構築物のために調製される。
【０３０８】
精製プラスミドＤＮＡは、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘトランスフェクション試薬などの脂質をベースとするトランスフェクション試薬（製造業者の指示に従う）でトランスフェクションするために調製され、次いで、ＣＨＯ−Ｓ又はＨＥＫ  ２９３−Ｆなどの標準的な哺乳類発現宿主細胞株にトランスフェクトされる。ｍＡｂ  ＬＣ及びＨＣが別個の発現構築物によってコードされる場合、２つの構築物は同時にトランスフェクトされる。トランスフェクションの前及び後に、哺乳類細胞を、維持するために、又は標準的な細胞培養法に従ってｍＡｂ発現のために培養され、それにより、細胞密度は、使用する培養培地を維持するための範囲であり、遵守される他の細胞培養条件は、利用される特定の哺乳類宿主細胞株によって決定される。これらのパラメータは、典型的には、細胞株が得られたベンダー、又は科学文献に記載されている。例えば、ＣＨＯ−Ｓ細胞をＣＨＯ  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）培地に懸濁状態で維持し、３７℃及び８％のＣＯ２に設定された加湿インキュベータ内で１２５ＲＰＭで振盪し、細胞濃度が１．５〜２．０×１０６細胞／ｍＬであるときに分割する。
【０３０９】
ｍＡｂを発現する一過性にトランスフェクトされた哺乳類細胞からの細胞培養上清を、トランスフェクションの数日後に採取し、遠心分離により清澄化し、濾過する。ＣＨＯ−Ｓ細胞の発現持続時間は、典型的には４日間であるが、調節することができ、異なる哺乳類宿主細胞株に関して異なり得る。大規模トランスフェクション（１０リットル超）は、Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅなどの濃縮装置を使用して１０倍濃縮される。タンパク質Ａ樹脂にｍＡｂを結合させ、樹脂を洗浄し、低ｐＨ緩衝液を使用してタンパク質を溶出させる標準的な方法を利用して、ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅなどのタンパク質Ａ親和性カラムを使用して、ｍＡｂを清澄化された上清から精製する。ｐＨ  ７の緩衝液を含有するチューブへの溶出によって直ちにタンパク質画分を中和し、ピーク画分をプールし、濾過し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ  ７．２に対して一晩、４℃で透析する。透析後、ｍＡｂを再度濾過し（０．２μフィルター）、タンパク質濃度を、２８０ｎｍでの吸光度によって決定する。精製ｍＡｂタンパク質の品質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及び分析サイズ排除ＨＰＬＣによって評価され、内毒素レベルは、カブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）アッセイを使用して測定される。精製ｍＡｂを４℃で貯蔵する。
【０３１０】
一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からのＭＳＣＢ９７の発現及び精製
ＭＳＣＢ９７を、製造者の推奨に従ってＭＳＣＢ９７発現構築物の精製プラスミドＤＮＡを用いて、細胞を一過性にトランスフェクトすることにより、ＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；カタログ番号Ａ２９１２７）において発現させた。簡潔に、ＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ（商標）細胞を、３７℃、８％のＣＯ２及び１２５ＲＰＭに設定された振盪インキュベータ内で、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２９１００）中の懸濁液中に維持した。トランスフェクションの日に、１ｍＬ当たり６．０×１０６個の細胞数にまで希釈することができるように細胞を継代し、細胞生存率を９８％以上に維持する。一過性トランスフェクションは、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯトランスフェクションキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ａ２９１３１）を使用して行った。トランスフェクトされる希釈細胞の１ｍＬごとに、１マイクログラムのプラスミドＤＮＡを使用し、ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ錯形成培地に希釈する。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬を、１：３比（ｖ／ｖ、ＤＮＡ：試薬）で使用しＯｐｔｉＰＲＯ（商標）にも希釈する。希釈したＤＮＡ及びトランスフェクション試薬を１分間組み合わせ、ＤＮＡ／脂質コンジュゲートを形成させ、次いで細胞に添加した。一晩インキュベートした後、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）フィード及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯエンハンサを細胞に添加した。培養上清を採取する前に、細胞を３２℃で５日間振盪しながら培養した。
【０３１１】
一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ（商標）細胞からの培養上清を、遠心分離（３０分、６０００ｒｐｍ）を通じて清澄化した後、濾過すること（０．２μ  ＰＥＳ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ）によって採取した。最初に、Ｐａｌｌ  Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ  Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎシステムを使用して、大規模トランスフェクション（５〜２０リットル）を１０倍濃縮した。１０×ＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）、ｐＨ  ７．２を、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣクロマトグラフィシステムを使用して、樹脂１ｍＬ当たり約２０ｍｇのタンパク質の相対濃度で、平衡化した（ＤＰＢＳ、ｐＨ  ７．２）ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）上に充填する前に、１×最終濃度まで上清に添加した。充填後、カラムを１０カラム体積のＤＰＢＳ、ｐＨ  ７．２で洗浄した。タンパク質を０．１ＭのＮａ−酢酸（ｐＨ  ３．５）１０カラム体積で溶出させた。タンパク質画分は、溶出画分体積の２０％の２．０Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７）を入れたチューブに溶出することによって直ちに中和した。ピーク画分をプールし、必要に応じて、追加のＴｒｉｓを用いてｐＨを約５．５に調整した。精製タンパク質を濾過し（０．２μ）、濃度を、ＢｉｏＴｅｋ  ＳｙｎｅｒｇｙＨＴ（商標）分光光度計で、２８０ｎｍでの吸光度により決定した。精製タンパク質の品質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び分析サイズ排除ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣシステム）により評価した。内毒素レベルを、濁度滴定ＬＡＬアッセイ（Ｐｙｒｏｔｅｌｌ（登録商標）−Ｔ、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ）を用いて測定した。
【０３１２】
ＭＳＣＢ９７のアミリノミメティックペプチドへの共役化
精製ｍＡｂ（１．２ｍＬ、１９ｍｇ／ｍＬ）に、４当量のＴＣＥＰ、続いてＥＤＴＡ（１００ｍＭ；１２μＬ）を添加した。室温で２時間後、ＬＣＭＳ分析では、位置Ｃ１０２のジスルフィド付加物が完全に還元されたことが示された。還元されたｍＡｂを、Ｚｅｂｒａ脱塩スピンカラム（７×１０ｍＬ、７Ｋ  ＭＷＣＯ、トリス酢酸１００ｍＭ、ｐＨ  ５．６と予備平衡済）で処理し、遊離システイン／ＧＳＨを除去した。この還元されたｍＡＢに、Ｍｉｌｌｉ  Ｑグレードの水（７当量対ｍＡｂ、３０〜３５ｍｇ／ｍＬ）中の、実施例３で得られたブロモアセチル化アミリノミメティックペプチドの溶液を添加した後、ＥＤＴＡ（１００ｍＭ；１３．５μＬ）を添加した。１Ｍのトリス酢酸緩衝液（ｐＨが約９）を滴下して、反応物のｐＨを７．９に調整した。穏やかに撹拌しながら室温で一晩、反応を進行させた。次いで、反応物を飽和（ＮＨ４）２ＳＯ４（１０％ｖ／ｖ）で希釈し、粗コンジュゲートを、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＴＯＳＯＨ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＨＩＣ）によって精製し、直線勾配（４０〜１００％Ｂ／Ａ、溶媒Ａ：５％  ｉ−ＰｒＯＨ，１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．０；溶媒Ｂ：２０％  ｉ−ＰｒＯＨ、１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．０）で溶出した。タンパク質Ａ吸着（ＰＢＳ緩衝液）及び溶出（ＮａＯＡｃ、ｐＨ３．５）により最終精製を行った。生成物のｐＨを、２．５Ｍのトリス（ｐＨ７．７；１０ｖ％）で６に調整し、ＰＢＳに対して透析して、最終サンプルを得た。
【０３１３】
実施例５：ペプチド及びペプチド−生体コンジュゲートの分析及び特性判定
方法Ａ精製したペプチドを、ＷＡＴＥＲ  Ａｔｌａｎｔｉｃｓ  Ｔ３  Ｃ１８（４．６×２５０ｍｍ、３００Å、５μｍ）カラムを使用して、ＨＰ１１００シリーズＨＰＬＣで構成されたＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｓｅｒｉｅｓ  １１００  ＭＳＤシステムでＬＣ／ＭＳにより分析した。ペプチドの極性／非極性性質に応じて、２つの線形勾配（緩衝液Ａ：水＋０．１％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ：ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ）のうちの１つを、１ｍＬ／分の流量及び３５℃のカラム温度で使用した［方法Ａ１：１５〜６０％のＢを、２２分かけて；方法Ａ２：４０〜９０％のＢを、２２分かけて］。電子噴霧分析（ＥＳ−ＡＰＩ、陽性イオンスキャン）により各ペプチドの質量分析が提供された。全ての場合において、複数の荷電種が観察され、１／３［Ｍ＋３］＋及び１／４［Ｍ＋４］＋＋イオンが特徴のある、最も顕著に観察されたイオンであった。全ての生成物は、許容可能な限度内で、予想される複数の荷電イオンをもたらした。ペプチドの質量スペクトル分析の結果及び観察されたＬＣ保持時間（ＲＴ）を表１に示す。
【０３１４】
方法Ｂ：精製ペプチドを、ＹＭＣ−ＰＡＣＫ−ＯＤＳ−Ａ（４．６×２５０ｍｍ、２００Å，５μｍ）カラムを使用して、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  １０ＡＶＰシステムでＨＰＬＣにより分析した。線状溶媒勾配（２０〜８０％のＢを３０分かけて）を１ｍＬ／分の流量で使用した（緩衝液Ａ：水＋０／０５％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ：ＭｅＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ）。Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  Ｇ２  ＴｏＦ分光計（ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＥ、陽イオンスキャン）上で質量スペクトルを得た。全ての場合において、複数の荷電種が観察され、１／３［Ｍ＋３］＋及び１／４［Ｍ＋４］＋イオンが特徴のある、最も顕著に観察されたイオンであった。全ての生成物は、許容可能な限度内で、予想される複数の荷電イオンをもたらした。ペプチドの質量スペクトル分析の結果及び観察されたＬＣ保持時間（ＲＴ）を表１に示す。
【０３１５】
方法Ｃ：精製アミリノミメティックペプチド−ｍＡｂコンジュゲートを、ＭＡｂＰａｃ  ＨＩＣ−１０（４．６×１０００ｍｍ、１０００Å、５μｍ）カラムを使用して、ＨＰ  １１００シリーズＨＰＬＣを用いて構成されたＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｓｅｒｉｅｓ  １１００  ＭＳＤシステム上の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって分析した。線状溶媒勾配（０〜１００％のＢを３０分かけて）を、０．５ｍＬ／分の流量で使用した（緩衝液Ａ：５％  ｉ−ＰｒＯＨ、１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ  ６．０；緩衝液Ｂ  ２０％  ｉ−ＰｒＯＨ、１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ  ６．０）。Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  Ｇ２−ＸＳ  ＱＴｏＦ分光計（ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳ、陽イオンスキャン）上で、インタクトの質量測定値を得た。アミリノミメティックペプチド−ｍＡｂコンジュゲート及び共役化方法の分析特性評価の結果を表１に示す。
【０３１６】
【表２】
2021522231.tif 000068
【０３１７】
実施例６：ヒトカルシトニン／ＲＡＭＰ３受容体ｃＡＭＰアッセイ（ＡＭＹ３Ｒアッセイ）
生体外におけるアミリノミメティック類似体の効力を試験するために使用される方法は、ヒトカルシトニンＧ−タンパク質連結受容体の修飾を介し、その受容体活性化修飾タンパク質３（ＣＴＲ／ＲＡＭＰ３）との相互作用を通じて、アデニル酸シクラーゼによって産生されたｃＡＭＰを測定するように設計された細胞系アッセイであった。ヒトＡＭＹ３Ｒトランスフェクトされた１３２１Ｎ１星状細胞（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）におけるｃＡＭＰの産生は、アミリノミメティック類似体及び対照によって用量依存的に誘導され、ＬＡＮＣＥ  ＦＲＥＴ系競合ｃＡＭＰイムノアッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で測定した。
【０３１８】
細胞を、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、２．５μｇ／ｍＬピューロマイシン及び８００μｇ／μＬのＧ４１８中で培養した。アッセイのために、培地を除去し、ＰＢＳ及びバーゼン液で洗浄して細胞を持ち上げることによって細胞を回収した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。細胞を４５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。細胞を、１Ｘ  ＨＢＳＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．１％ＢＳＡ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、１．０ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）（Ｓｉｇｍａ）に、細胞０．５×１０６個／ｍＬで再懸濁し、１０μＬの懸濁した細胞を、３８４ウェル白色オプチプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の各ウェルに、細胞最終密度５０００個／ウェルになるように添加した。アミリン類似体及び対照の希釈物を、１Ｘ  ＨＢＳＳ、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡで調製し、各サンプルを１０μＬ／ウェルで、指定されたウェルに添加した。プレートを室温で３０分間振盪しながらインキュベートした。次いで、各アッセイプレートに、２０μＬ／ウェルのＬＡＮＣＥ  ｃＡＭＰ検出試薬混合物（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を添加し、室温で２時間〜２４時間、振盪しながらインキュベートした。プレートをＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーで、ＬＡＮＣＥ  Ｕｌｔｒａ  ｃＡＭＰ  Ｋｉｔに含まれる製造業者推奨事項に基づくプロトコルを用いて読み取った。全ての試料は４つ組で測定された。Ｅｕｄｅａｎ  Ｓｈａｗによって設計された、Ｃｒｕｃｉｂｌｅ  社内データ分析ソフトウェアを使用してデータを分析して、未加工のｃＡＭＰ値対ログ化合物濃度をプロットすることによって、ＥＣ５０、ＬｏｇＥＣ５０，ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ（ｎＨ）、頂部及び底部などのパラメータを得た。データには、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｒ＆Ｄの非臨床統計及び計算部門によって実装される、Ｒ環境内での非線形重み付き最小二乗法を使用して、４−Ｐモデルを当てはめた（Ｏｐｅｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  ｈｔｔｐ：／／ｃｒａｎ．ｕｓ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）。
【０３１９】
同じアッセイにおいて対照として使用されたプラムリンチドに対する、本発明のアミリノミメティック類似体の効力を以下の表２に示す。
【０３２０】
【表３】
2021522231.tif 000069
【０３２１】
実施例７：ヒトカルシトニン／ＲＡＭＰ１複合体
ｃＡＭＰアッセイ（ＡＭＹ１Ｒアッセイ）
ヒトＣＴＲ又はＣＴＲ／ＲＡＭＰ１複合体（ＡＭＹ１Ｒ）の調節後のｃＡＭＰ産生を測定するように設計された細胞系アッセイを用いて、生体外でのアミリノミメティック類似体の効力及び選択性を評価した。ヒトＣＴＲ又はＡＭＹ１Ｒに一過性にトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞におけるｃＡＭＰの産生が、アミリノミメティック類似体及び対照によって、用量依存的に誘導され、ＨＴＲＦ  ｃＡＭＰキット（ＣｉｓＢｉｏ  ｃＡＭＰ  Ｄｙｎａｍｉｃ  ｋｉｔ，カタログ番号：６２ＡＭ４ＰＥＣ）を使用して測定した。
【０３２２】
ＨＡタグを付加したヒトカルシトニン受容体をコードしているプラスミドを、ＥｃｏＲＶ及びＸｈｏＩを使用して、シグナルペプチド３ｘＨＡを有するシグナルペプチドの直後に、そのＮ末端にタグ付けしたヒトＣＴＲ  ＯＲＦ（ＥＮＳＴ０００００４２６１５１．５）を、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）にサブクローニングすることによって生成した。フラグタグ付けしたヒトＲＡＭＰ１をコードしているプラスミドを、ＥｃｏＲＶ及びＸｈｏＩを使用して、フラグタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号６６））を有するシグナルペプチドの直後に、Ｎ−末端にタグ付けしたヒトＲＡＭＰ１  ＯＲＦ（ＥＮＳＴ０００００２５４６６１．４）を、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）にサブクローニングすることによって生成した。
【０３２３】
ＣＯＳ−７細胞を、１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ＃ＳＨ３００７０．０３）及び１％のペニシリン−ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃１５１４０１２２）を含有するＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃１１９６５０９２）中で培養し、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｅ２３１２）を用いて、３８４ウェルのポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた白色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３５６６６３）中で、トランスフェクトした。各条件について、ＤＮＡ（μｇ）：Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（μＬ）の混合比は１：３であり、細胞１０，０００個／ウェルを、４０μＬで、１０μＬのＤＮＡ：Ｆｕｇｅｎｅ混合物の上に添加した。プレートを、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃で４８時間インキュベートした。ＣＴＲ：ＲＡＭＰ１のｃＤＮＡトランスフェクション比（２：９）を、アミリン−１受容体（ＡＭＹ１Ｒ）の形成に適するように最適化した。トランスフェクトされたＣＴＲ  ｃＤＮＡの量は、カルシトニン及びアミリン受容体の発現が著しく異ならない（ＨＡタグに対して酵素結合免疫吸着検定法によって評価される）ように最適化した。
【０３２４】
アッセイの日、培養培地を、カルシウム及びマグネシウムと、２０ｍＭのＨＥＰＥＳと、０．１％の脂肪酸を含まないＢＳＡとを有するＨＢＳＳを含有する、ｐＨ  ７．４のアッセイ緩衝液と置き換え、３７℃で１時間細胞をスタービングさせた。次いで、アッセイ緩衝液を、５００μＭ  ＩＢＭＸを含有する新たなアッセイ緩衝液と置き換え、化合物をアッセイ緩衝液（ＩＢＭＸを含まないもの）に添加した。プレートを室温で３０分間振盪しながらインキュベートした。ｃＡＭＰを、製造元のプロトコル（ＣｉｓＢｉｏ  ｃＡＭＰ  Ｄｙｍａｎｉｃ  ｋｉｔ、カタログ番号：６２ＡＭ４ＰＥＣ）に従って検出した。蛍光は、３３７ｎｍの励起と、２６０及び６６５ｎｍの放射とを用いてＰＨＥＲＡｓｔａｒプレートリーダーで読み取られた。データを、プラムリンチドの最大応答で正規化した。Ｅｍａｘ及びＥＣ５０の決定は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７．０．における４−パラメータロジスティック用量応答式を使用して、曲線適合プログラムで分析されたアゴニスト応答曲線から実行された。提示されるデータは、各化合物について４つ組で実施される３回の独立した実験を表すものである。データは平均値として表される。プラムリンチド（配列番号２）のＡＭＹ１Ｒ効力に対する化合物のＡＭＹ１Ｒ効力は、倍率変化として表される。ＣＴＲにおける化合物の効力に対するＡＭＹ１Ｒにおけるそれらの効力も、倍率差として提示される（表３）。
【０３２５】
細胞表面受容体の発現判定については、ｃＡＭＰアッセイに使用したものと同じトランスフェクションからの細胞を、９６ウェルプレートに播種し、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ＋１％のＦＢＳでブロッキングした。ラット抗ＨＡペルオキシダーゼ（クローン３Ｆ１０、Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃１２０１３８１９００１）を、０．５ｍｇ／Ｌで３０分間適用した。ブロッキング緩衝液及びＰＢＳで洗浄した後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ基質（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）及びＰＨＥＲＡｓｔａｒプレートリーダーを用いて、化学発光を検出した。
【０３２６】
【表４】
2021522231.tif 000070
【０３２７】
実施例８：生体内での有効性試験
胃排出：リーンＣ５７ＢＩ／６Ｎマウスにおけるアセトアミノフェン（ＡＡＰ）吸収
雄のリーンＣ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）を、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。１２時間の光／暗サイクルの温度制御された部屋の、ＡｌｐｈａＤｒｉ床敷を有する各ケージに１匹のマウスを収容した。マウスには水を自由に摂取させ、通常の食餌（Ｌａｂ  Ｄｉｅｔ  Ｃａｔ：５Ｋ７５）で維持した。実験開始の少なくとも１週間前に、動物を施設に馴化させた。
【０３２８】
投与前日、マウスを、個々の体重に基づいて１０匹の動物のコホートに分けた。翌日午後５：００〜６：００、動物には食物を与えず、皮下投与を介して、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ（３ｎｍｏｌ／ｍＬ）の用量で、ビヒクル（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）又は試験化合物のいずれかで処置した。１８時間後、アセトアミノフェン（ＡＡＰ）懸濁混合物［ＡＡＰ（１０ｍｇ／ｍＬ）、ＨＰＭＣ（５ｍｇ／ｍＬ）、アカシアガム（５０ｍｇ／ｍＬ）］を、経口経管栄養法によって動物に投与した（１０ｍＬ／ｋｇ）。全血試料（尾部、約２５μＬ）を、５分、１０分、１５分、３０分、及び６０分時点で、ＤＭＰＫ−Ｃ乾燥血液スポットカードに採集した。血液ドットカードを完全に乾燥させ、標準的な技術によるＬＣ／ＭＳ分析を実施するまで、乾燥剤を入りの個別の袋に入れた。ＰｒｉｓｍにおけるＤｕｎｎｅｔｔの事後検定を用いて、一方向ＡＮＯＶＡを使用して、統計分析を実行した。全てのデータは平均として提示される。
【０３２９】
食物を絶ったリーンＣ５７ＢＬ６Ｎマウスにおける食物摂取:急性投与
雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）をＴａｃｏｎｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。１２時間の光／暗サイクルの温度制御された部屋の、ＡｌｐｈａＤｒｉ床敷を有する各ケージに１匹のマウスを収容した。マウスには水を自由に摂取させ、通常の食餌（Ｌａｂ  Ｄｉｅｔ  Ｃａｔ：５Ｋ７５）で維持した。実験開始７２時間以上前に、動物をＢｉｏＤＡＱケージ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）に馴化させた。
【０３３０】
ＢｉｏＤＡＱケージに馴化させたら、個体の体重と、前２４時間にわたる個々の食物摂取とに基づいて、マウスを１０匹の動物のコホートに分けた。午後４：００〜５：００に、動物の体重を量り、皮下投与を介して、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ（３ｎｍｏｌ／ｍＬ）の用量で、ビヒクル（ＰＢＳ、ｐＨ  ７．４）又は試験化合物のいずれかで処置した。その後一晩（１６〜１８時間）食事を与えずに、その後４８時間連続的に、各ケージの食物重量の変化を、ＢｉｏＤＡＱ自動監視システムによって記録した。ホッパー及びケージの周囲の領域からバキュームで屑を毎日除去した。必要に応じて食料を補充した。投与後１２〜４８時間にわたる、ビヒクルに対する平均累積食物摂取量の割合を計算した。その結果を表４に報告する。ＰｒｉｓｍにおけるＤｕｎｎｅｔｔの事後検定を用いて、双方向ＡＮＯＶＡを使用して、統計分析を実行した。全てのデータは平均として提示される。
【０３３１】
【表５】
2021522231.tif 000071
ＮＤ＝決定されず
＊ｐ＜０．０５  ＊＊ｐ＜０．０１  ＊＊＊ｐ＜０．００１  §ｐ＜０．０００１
【０３３２】
実施例９：オスのＣ５７ＢＬ６ＮマウスにおけるＰＫ調査
オスのＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６〜８週齢、Ｔａｃｏｎｉｃ）を、１２時間の光／暗サイクルを有する温度制御された室内に、ＡｌｐｈａＤｒｉ床敷を用いて単独収容し、自由にＬａｂＤｉｅｔ５Ｋ７５げっ歯類食餌を食べ、飲用水を飲めるようにした。餌を食べた後の体重に基づいて、マウスをグループ化した（Ｎ＝３）。化合物をＰＢＳ中に配合（１ｎｍｏｌ／ｍＬ）し、１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で皮下投与した。全血試料（尾部、約５０μＬ）を、４時間後、２４時間後、７２時間後、９６時間後、７日後の時点で、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ完全プロテアーゼ阻害剤及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＤＰＰＩＶ阻害剤、２．５μＬ）を入れた、ＥＤＴＡコーティングされたＳａｒｓｔｅｄｔ  Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（登録商標）チューブに採集し、氷上に置いた。最後の採血（７日後）は、５００μＬ（２５μＬのプロテアーゼ阻害剤カクテル）の目標体積で行われた排尿終末時採血であった。次に試料を、４℃で１０分間、遠心分離（回転速度は１０，０００ｒｐｍ）した。次いで、血漿を９６ウェルのプレート（ウェル１箇所につき、血漿約２５μＬ）に移し、これを生物分析実施まで、−８０℃で保管した。
【０３３３】
定量化用のサロゲートペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイを用いて、血漿サンプルを分析した。このアッセイでは、免疫親和性キャプチャを用いて、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体によって分析物を血漿から抽出し、続いてプロテアーゼ消化（トリプシン又はペプシン）と逆相ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。複数反応モニタリング（ＭＲＭ）ＭＳ分析を、ポジティブ電子噴霧モードで操作されたＡＰＩ５０００トリプル四重極質量分析計で行った。アミリノミメティック配列のＮ末端領域由来のペプチドを、活性コンジュゲートの定量化のスロゲートとして監視した一方で、ｍＡｂのＦｃ領域上に位置するペプチドを、ｍＡｂの総レベルのスロゲートとして監視した。標準曲線及び品質管理サンプルは、血漿中のアミリノミメティックコンジュゲートの参照標準をスパイクすることによって調製し、試験サンプルと同じ手順を用いて同時に処理した。データを表５に示す。
【０３３４】
【表６】
2021522231.tif 000072
＊除去フェーズ中に採取された、制限された時点でのサンプリングから推定
【０３３５】
当業者は、広い発明概念から逸脱することなく前述の実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本説明によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。
【０３３６】
引用した全ての文献は、参照により本明細書に援用される。
【０３３７】
本発明の例示的なアミリノミメティック配列又はそのコンジュゲートは、以下を含む：
【０３３８】
配列番号１
名称：アミリン（１−３７）
構造式：
【０３３９】
【化６５】
2021522231.tif 000073
【０３４０】
配列番号２
名称：プラムリンチド（１−３７）
構造式：
【０３４１】
【化６６】
2021522231.tif 000074
【０３４２】
配列番号３
名称：ダバリンチド（１−３２）
構造式：
【０３４３】
【化６７】
2021522231.tif 000075
【０３４４】
配列番号４
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−Ｃ７）］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３４５】
【化６８】
2021522231.tif 000076
【０３４６】
配列番号５
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），Ｋ（Ａｃ）２６］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３４７】
【化６９】
2021522231.tif 000077
【０３４８】
配列番号６
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−Ａ５］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３４９】
【化７０】
2021522231.tif 000078
【０３５０】
配列番号７
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−Ａ５，Ｋ（Ａｃ）２６］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３５１】
【化７１】
2021522231.tif 000079
【０３５２】
配列番号８
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−Ａ５，Ｋ（Ａｌｌｏｃ）２６］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３５３】
【化７２】
2021522231.tif 000080
【０３５４】
配列番号９
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−Ｃ７），β−Ａ５，Ｋ（Ａｃ）２６］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３５５】
【化７３】
2021522231.tif 000081
【０３５６】
配列番号１０
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−Ｃ７），β−Ａ５，Ｋ（Ａｌｌｏｃ）２６］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３５７】
【化７４】
2021522231.tif 000082
【０３５８】
配列番号１１
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−Ｃ７），Ａｂｕ５，Ｋ（Ａｃ）２６］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３５９】
【化７５】
2021522231.tif 000083
【０３６０】
配列番号１２
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），Ａｂｕ５，Ｋ（Ａｃ）２６］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３６１】
【化７６】
2021522231.tif 000084
【０３６２】
配列番号１３
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），（Ｓ）−β−Ａｉｂ５−，Ｋ（Ａｃ）２６］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３６３】
【化７７】
2021522231.tif 000085
【０３６４】
配列番号１４
称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），（Ｒ）−β−Ａｉｂ５，Ｋ（ＡｃＡ）２６］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３６５】
【化７８】
2021522231.tif 000086
【０３６６】
配列番号１５
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−ｈＡ５，Ｋ（Ａｃ）２６］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３６７】
【化７９】
2021522231.tif 000087
【０３６８】
配列番号１６
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−ｈＰ５，Ｋ（Ａｃ）２６］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３６９】
【化８０】
2021522231.tif 000088
【０３７０】
配列番号１７
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），｛ピロリジニル−（３Ｓ）−カルボキシル｝５，Ｋ（Ａｃ）２６］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３７１】
【化８１】
2021522231.tif 000089
【０３７２】
配列番号１８
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），｛（１Ｒ，２Ｒ）−ＡＣＰＣ｝５，Ｋ（Ａｃ）２６］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３７３】
【化８２】
2021522231.tif 000090
【０３７４】
配列番号１９
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−ｈＴ４，Ｋ（Ａｃ）２６］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３７５】
【化８３】
2021522231.tif 000091
【０３７６】
配列番号２０
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−Ｃ７），β−ｈＴ４，Ｋ（Ａｃ）２６］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３７７】
【化８４】
2021522231.tif 000092
【０３７８】
配列番号２１
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−ｈＴ６，Ｋ（Ａｃ）２６］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３７９】
【化８５】
2021522231.tif 000093
【０３８０】
配列番号２２
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−Ｃ７），β−ｈＴ６，Ｋ（Ａｃ）２６］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３８１】
【化８６】
2021522231.tif 000094
【０３８２】
配列番号２３
名称：［シクロ−（Ｓ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−Ａ５，Ｋ（Ａｃ）２６］−プラムリンチド２−３７
構造式：
【０３８３】
【化８７】
2021522231.tif 000095
【０３８４】
配列番号２４
名称：［シクロ−（Ｓ２−ＣＯＣＨ２−Ｃ７），β−Ａ５，Ｋ（Ａｃ）２６］−プラムリンチド２−３７
構造式：
【０３８５】
【化８８】
2021522231.tif 000096
【０３８６】
配列番号２５
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−Ａ５，Ｋ（Ａｃ）２５］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３８７】
【化８９】
2021522231.tif 000097
【０３８８】
配列番号２６
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−Ａ５，Ｋ（Ａｃ）２９］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３８９】
【化９０】
2021522231.tif 000098
【０３９０】
配列番号２７
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−Ａ５，Ｋ（Ａｃ）３４］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３９１】
【化９１】
2021522231.tif 000099
【０３９２】
配列番号２８
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−Ａ５］−ダバリンチド３−３２
構造式：
【０３９３】
【化９２】
2021522231.tif 000100
【０３９４】
配列番号２９
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−Ａ５，Ｋ（ＯＥＧ２−Ｐａｌ）２６］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３９５】
【化９３】
2021522231.tif 000101
【０３９６】
配列番号３０
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−Ａ５，Ｋ（ＯＥＧ２−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）２６］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３９７】
【化９４】
2021522231.tif 000102
【０３９８】
配列番号３１
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−Ａ５，α−ＭｅＬ１２，Ｋ（ｄＰＥＤ１２−ＡｃＢｒ）２６］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０３９９】
【化９５】
2021522231.tif 000103
【０４００】
配列番号３２
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−Ａ５，ｈＲ１１，Ｋ（ｄＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）２６］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０４０１】
【化９６】
2021522231.tif 000104
【０４０２】
配列番号３３
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−Ａ５，Ｅ１０，Ｋ（ｄＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）２６］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０４０３】
【化９７】
2021522231.tif 000105
【０４０４】
配列番号３４
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−Ａ５，α−Ｍｅｌ１２，Ｋ（ｄＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）２５］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０４０５】
【化９８】
2021522231.tif 000106
【０４０６】
配列番号３５
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−Ａ５，ｈＲ１１，Ｋ（ｄＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）２５］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０４０７】
【化９９】
2021522231.tif 000107
【０４０８】
配列番号３６
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−Ａ５，Ｅ１０，Ｋ（ｄＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）２５］−プラムリンチド３−３７
構造式：
【０４０９】
【化１００】
2021522231.tif 000108
【０４１０】
配列番号３７
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−Ａ５，α−Ｍｅｌ１２，Ｋ（ｄＰＥＧ１２）２６］−プラムリンチド３−３７  ｍＡｂホモ二量体コンジュゲート
構造式：
【０４１１】
【化１０１】
2021522231.tif 000109
【０４１２】
配列番号３８
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−Ａ５，ｈＲ１１，Ｋ（ｄＰＥＧ１２）２６］−プラムリンチド３−３７  ｍＡｂホモ二量体コンジュゲート
構造式：
【０４１３】
【化１０２】
2021522231.tif 000110
【０４１４】
配列番号３９
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−Ａ５，Ｅ１０，Ｋ（ｄＰＥＧ１２２６］−プラムリンチド３−３７  ｍＡｂホモ二量体結合体
構造式：
【０４１５】
【化１０３】
2021522231.tif 000111
【０４１６】
配列番号４０
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−Ａ５，α−Ｍｅｌ１２，Ｋ（ｄＰＥＧ１２）２５］−プラムリンチド３−３７  ｍＡｂホモ二量体コンジュゲート
構造式：
【０４１７】
【化１０４】
2021522231.tif 000112
【０４１８】
配列番号４１
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−Ａ５，ｈＲ１１，Ｋ（ｄＰＥＧ２５］−プラムリンチド３−３７  ｍＡｂホモ二量体コンジュゲート
構造式：
【０４１９】
【化１０５】
2021522231.tif 000113
【０４２０】
配列番号４２
名称：［シクロ−（Ｎ３−ＣＯＣＨ２−ｈＣ７），β−Ａ５，Ｅ１０，Ｋ（ｄＰＥＧ１２）２５］−プラムリンチド３−３７  ｍＡｂホモ二量体コンジュゲート
構造式：
【０４２１】
【化１０６】
2021522231.tif 000114
【０４２２】
配列番号４３
名称：ＭＳＣＢ９７  ＶＨ（重鎖可変領域）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＰＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＹＤＧＣＹＧＥＬＤＦＷＧＱＧＴＶＴＶＳＳ
【０４２３】
配列番号４４
名称：ＭＳＣＢ９７  ＨＣ（重鎖）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＡＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＹＤＧＣＹＧＥＬＤＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
【０４２４】
配列番号４５
名称：ＭＳＣＢ９７  ＶＬ（軽鎖可変領域）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【０４２５】
配列番号４６
名称：ＭＳＣＢ９７  ＬＣ（軽鎖）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０４２６】
配列番号４７
名称：ＭＳＣＢ９７  ＨＣＤＲ１
ＳＹＡＭＳ
【０４２７】
配列番号４８
名称：ＭＳＣＢ９７  ＨＣＤＲ２
ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ
【０４２８】
配列番号４９
名称：ＭＳＣＢ９７  ＨＣＤＲ３
ＹＤＧＣＹＧＥＬＤＦ
【０４２９】
配列番号５０
名称：ＭＳＣＢ９７  ＬＣＤＲ１
ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ
【０４３０】
配列番号５１
名称：ＭＳＣＢ９７  ＬＣＤＲ２
ＤＡＳＮＲＡＴ
【０４３１】
配列番号５２
名称：ＭＳＣＢ９７  ＬＣＤＲ３
ＱＱＲＳＮＷＰＬＴ
【配列表】
2021522231000001.app
【国際調査報告】
2021522231.tif 000142
2021522231.tif 000143
2021522231.tif 000144
2021522231.tif 000145