(57)【要約】  本明細書では、改変されたアミノ酸配列を有するグルコシルトランスフェラーゼが開示される。このような遺伝子操作された酵素は、減少した分子量を有する不溶性α−グルカン生成物を合成する。さらに、遺伝子操作されたグルコシルトランスフェラーゼが不溶性α−グルカンを生成するために使用される反応及び方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３、Ｐｒｏ−５５０、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ｔｒｐ−５７１、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、Ａｓｎ−５８１、Ｔｈｒ−５８５、又はＧｌｎ−６１６に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む非天然グルコシルトランスフェラーゼであって、
前記非天然グルコシルトランスフェラーゼが、１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを合成し、且つ前記不溶性α−グルカンの分子量が、前記置換位置で前記非天然グルコシルトランスフェラーゼと異なるのみの第２のグルコシルトランスフェラーゼによって合成される不溶性α−グルカンの分子量よりも小さい、非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２】
配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、又はＧｌｎ−６１６に対応する位置で、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項３】
（ｉ）アミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒ残基によるものであり；
（ｉｉ）アミノ酸残基Ｐｒｏ−５５０に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＩｌｅ残基によるものであり；
（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｓｅｒ−５５３に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、又はＴｙｒ残基によるものであり；
（ｉｖ）アミノ酸残基Ａｓｎ−５５７に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＳｅｒ残基によるものであり；
（ｖ）アミノ酸残基Ａｓｎ−５５８に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ａｓｐ又はＧｌｕ残基によるものであり；
（ｖｉ）アミノ酸残基Ｔｒｐ−５７１に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、又はＳｅｒ残基によるものであり；
（ｖｉｉ）アミノ酸残基Ａｓｎ−５７３に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、又はＴｒｐ残基によるものであり；
（ｖｉｉｉ）アミノ酸残基Ａｓｐ−５７５に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒ残基によるものであり；
（ｉｘ）アミノ酸残基Ｌｙｓ−５７８に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒ残基によるものであり；
（ｘ）アミノ酸残基Ａｓｎ−５８１に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ｐｒｏ又はＧｌｙ残基によるものであり；
（ｘｉ）アミノ酸残基Ｔｈｒ−５８５に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ｐｒｏ又はＧｌｙ残基によるものであり；且つ／又は
（ｘｉｉ）アミノ酸残基Ｇｌｎ−６１６に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒ残基によるものである、請求項１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項４】
２つ以上のアミノ酸置換を含み、前記置換の少なくとも１つが、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３、Ｐｒｏ−５５０、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ｔｒｐ−５７１、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、Ａｓｎ−５８１、Ｔｈｒ−５８５、又はＧｌｎ−６１６に対応する位置におけるものである、請求項１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項５】
配列番号６２のアミノ酸残基Ｐｒｏ−５５０、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ａｓｎ−５８１、又はＴｈｒ−５８５に対応する位置で、少なくとも１つのアミノ酸置を含み；
任意選択的に：
（ｉ）アミノ酸残基Ｐｒｏ−５５０に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＩｌｅ残基によるものであり；
（ｉｉ）アミノ酸残基Ａｓｎ−５５７に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＳｅｒ残基によるものであり；
（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ａｓｎ−５５８に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ａｓｐ又はＧｌｕ残基によるものであり；
（ｉｖ）アミノ酸残基Ａｓｎ−５８１に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ｐｒｏ又はＧｌｙ残基によるものであり；且つ／又は
（ｖ）アミノ酸残基Ｔｈｒ−５８５に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ｐｒｏ又はＧｌｙ残基によるものである、請求項４に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項６】
前記不溶性α−グルカンが、少なくとも約５０％のα−１，３グリコシド結合を含む、請求項１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項７】
前記不溶性α−グルカンが、少なくとも約９０％のα−１，３グリコシド結合を含む、請求項６に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項８】
前記不溶性α−グルカンが、約３００未満の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する、請求項６に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項９】
前記不溶性α−グルカンが、約１５０未満のＤＰｗを有する、請求項８に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１０】
前記不溶性α−グルカンが、約７５未満のＤＰｗを有する、請求項９に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１１】
配列番号４の残基５５〜９６０、配列番号６５の残基５４〜９５７、配列番号３０の残基５５〜９６０、配列番号２８の残基５５〜９６０、又は配列番号２０の残基５５〜９６０と少なくとも約９０％同一である触媒ドメインを含む、請求項６に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１２】
配列番号４、配列番号６５、配列番号３０、配列番号２８、又は配列番号２０と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１３】
前記不溶性α−グルカンの分子量が、前記第２のグルコシルトランスフェラーゼによって合成される不溶性α−グルカンの分子量よりも少なくとも約１０％小さい、請求項１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１４】
請求項１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、任意選択的に、１つ以上の調節配列が前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結し、且つ好ましくは、前記１つ以上の調節配列がプロモーター配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
水、スクロース、及び請求項１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼを含む反応組成物。
【請求項１６】
１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを生成する方法であって、
（ａ）少なくとも水、スクロース、及び請求項１に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させることであって、それにより、１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンが生成される、接触させること；及び
（ｂ）任意選択的に、工程（ａ）で生成された前記不溶性α−グルカンを単離すること
を含む、方法。
【請求項１７】
非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を作製する方法であって、前記方法が：
（ａ）（ｉ）配列番号４又は配列番号４の５５〜９６０位と少なくとも約４０％同一であるアミノ酸配列を含み、且つ（ｉｉ）１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを合成する親グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を同定すること；
及び
（ｂ）工程（ａ）で同定された前記ポリヌクレオチド配列を改変して、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３、Ｐｒｏ−５５０、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ｔｒｐ−５７１、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、Ａｓｎ−５８１、Ｔｈｒ−５８５、又はＧｌｎ−６１６に対応する位置において前記親グルコシルトランスフェラーゼの少なくとも１つのアミノ酸を置換し、
それにより、前記不溶性α−グルカンの分子量が、前記親グルコシルトランスフェラーゼによって合成される不溶性α−グルカンの分子量よりも小さい１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを合成する非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を提供すること
を含む、方法。
【請求項１８】
前記同定する工程が、
（ａ）ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで、
（ｂ）核酸ハイブリダイゼーション工程を含む方法を用いて、
（ｃ）タンパク質配列決定工程を含む方法を用いて、及び／若しくは
（ｄ）タンパク質結合工程を含む方法を用いて実施され、
且つ／又は前記改変する工程が、
（ｅ）ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで実施され、その後前記非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする前記ポリヌクレオチド配列の合成が行われるか、若しくは
（ｆ）前記親グルコシルトランスフェラーゼをコードする前記ポリヌクレオチド配列の物理的なコピーを使用して実施される、
請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国仮特許出願第６２／６４０，７０８号（２０１８年３月９日出願）及び同第６２／７９２，４４９号（２０１９年１月１５日出願）の利益を主張するものであり、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、酵素触媒反応の分野に含まれる。例えば、本開示は、改変されたアミノ酸配列を有するグルコシルトランスフェラーゼ酵素に関する。このような改変された酵素は、減少した分子量を有する生成物を合成する。
【０００３】
電子的に提出された配列表の参照
配列表の正式な写しは、約３１５キロバイトのサイズを有して本明細書と同時に提出される、２０１９年３月６日に作成された２０１９０３０６＿ＣＬ６６０７ＷＯＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔのファイル名を有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。このＡＳＣＩＩフォーマット文献に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
多糖類を様々な用途に使用することが望まれているため、研究者らは、生分解性であり、再生可能に供給される原料から経済的に製造することができる多糖類を探求してきた。このような多糖類の１つは、α−１，３−グルカン、すなわちα−１，３−グリコシド結合を有することを特徴とする不溶性グルカンポリマーである。このポリマーは、例えば、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）から単離されたグルコシルトランスフェラーゼ酵素を使用して調製されている（非特許文献１）。また、例えば、特許文献１は、酵素的に製造されたα−１，３−グルカンから紡糸繊維を調製することを開示している。様々な他のグルカン材料も、新規又は改良された用途を開発するために研究されてきた。例えば、特許文献２は、混合されたα−１，３及びα−１，６結合を有するいくつかの不溶性グルカンの酵素的合成を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７００００００号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１５／０２３２８１９号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】１Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４１：１４５１−１４６０，１９９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これら及び他の進展は、グルコシルトランスフェラーゼ酵素を用いた不溶性グルカンポリマーの生成においてなされてきた一方、このような酵素によって合成される不溶性グルカン生成物の分子量の調節に対して関心がほとんど向けられていないように見える。この技術的空白を解決するために、本明細書では、より低分子量の不溶性グルカン生成物を生成する改変されたアミノ酸配列を有するグルコシルトランスフェラーゼが開示される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一実施形態では、本開示は、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３、Ｐｒｏ−５５０、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ｔｒｐ−５７１、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、Ａｓｎ−５８１、Ｔｈｒ−５８５、又はＧｌｎ−６１６に対応する位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む非天然グルコシルトランスフェラーゼであって、非天然グルコシルトランスフェラーゼが、１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを合成し、且つ不溶性α−グルカンの分子量が、置換位置においてのみ非天然グルコシルトランスフェラーゼと異なる第２のグルコシルトランスフェラーゼによって合成される不溶性α−グルカンの分子量よりも小さい、非天然グルコシルトランスフェラーゼに関する。
【０００９】
別の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、任意選択的に、１つ以上の調節配列が、ヌクレオチド配列に作動可能に連結され、好ましくは、１つ以上の調節配列が、プロモーター配列を含む、ポリヌクレオチドに関する。
【００１０】
別の実施形態では、本開示は、水、スクロース、及び本明細書で開示される非天然グルコシルトランスフェラーゼを含む反応組成物に関する。
【００１１】
別の実施形態では、本開示は、１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを生成する方法であって、（ａ）少なくとも水、スクロース、及び本明細書で開示される非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させることであって、それにより、１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンが生成される接触させること；及び（ｂ）任意選択的に、工程（ａ）で生成された不溶性α−グルカンを単離することを含む方法に関する。
【００１２】
別の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を作製する方法であって、（ａ）（ｉ）配列番号４又は配列番号４の５５〜９６０位と少なくとも約４０％同一であるアミノ酸配列を含み、且つ（ｉｉ）１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを合成する親グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を同定すること；及び（ｂ）工程（ａ）で同定されたポリヌクレオチド配列を改変して、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３、Ｐｒｏ−５５０、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ｔｒｐ−５７１、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、Ａｓｎ−５８１、Ｔｈｒ−５８５、又はＧｌｎ−６１６に対応する位置において親グルコシルトランスフェラーゼの少なくとも１つのアミノ酸を置換し、それにより、不溶性α−グルカンの分子量が、親グルコシルトランスフェラーゼによって合成される不溶性α−グルカンの分子量よりも小さい１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを合成する非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を提供することを含む方法に関する。
【００１３】
配列の簡単な説明
【００１４】
【表１】
2021514681.tif 000002
【００１５】
【表２】
2021514681.tif 000003
【発明を実施するための形態】
【００１６】
全ての引用される特許及び非特許文献の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００１７】
別段の開示がなされていない限り、本明細書で使用される用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）の言及される特徴を包含するものとする。
【００１８】
存在する場合、特に記載しない限り、全ての範囲は、包括的であり、結合可能である。例えば、「１〜５」（すなわち１〜５）の範囲が挙げられる場合、挙げられた範囲は、範囲「１〜４」、「１〜３」、「１〜２」、「１〜２及び４〜５」、「１〜３及び５」などを含むものと解釈されるべきである。
【００１９】
用語「α−グルカン」、「α−グルカンポリマー」などは、本明細書では同じ意味で用いられる。α−グルカンは、α−グリコシド結合によって一緒に連結されたグルコースモノマー単位を含むポリマーである。典型的な実施形態では、本明細書のα−グルカンは、１００％のα−グリコシド結合、又は少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％のα−グリコシド結合を含む。本明細書のα−グルカンポリマーの例としては、α−１，３−グルカンが挙げられる。
【００２０】
用語「ポリα−１，３−グルカン」、「α−１，３−グルカン」、「α−１，３−グルカンポリマー」などは、本明細書では同じ意味で用いられる。α−１，３−グルカンは、グリコシド結合により互いに連結されるグルコースモノマー単位を含むポリマーであり、少なくとも約５０％のグリコシド結合がα−１，３である。特定の実施形態におけるα−１，３−グルカンは、少なくとも９０％又は９５％のα−１，３グリコシド結合を含む。本明細書のα−１，３−グルカンにおける他の結合の大部分又は全ては、典型的には、α−１，６であるが、いくつかの結合はまた、α−１，２及び／又はα−１，４であり得る。
【００２１】
用語「グリコシド結合（ｌｉｎｋａｇｅ）」、「グリコシド結合（ｂｏｎｄ）」、「結合」などは、本明細書で同じ意味で用いられ、糖化合物（オリゴ糖及び／又は多糖類）内の糖モノマーを連結する共有結合を指す。本明細書で使用される、用語「α−１，３−グリコシド結合」は、隣接したα−Ｄ−グルコース環上の炭素１及び３を介してα−Ｄ−グルコース分子を互いに連結する共有結合のタイプを指す。本明細書で使用される、用語「α−１，６−グリコシド結合」は、隣接したα−Ｄ−グルコース環上の炭素１及び６を介してα−Ｄ−グルコース分子を互いに連結する共有結合を指す。本明細書におけるグルカンポリマーのグリコシド結合は、「グリコシド結合」とも呼ぶことができる。本明細書では、「α−Ｄ−グルコース」を、「グルコース」と呼ぶこととなる。
【００２２】
本明細書のα−グルカンのグリコシド結合プロファイルは、当該技術分野で知られる任意の方法を使用して決定され得る。例えば、結合プロファイルは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法（例えば、１３Ｃ  ＮＭＲ及び／又は１Ｈ  ＮＭＲ）を使用する方法を用いて決定され得る。使用し得るこれらの方法及び他の方法は、例えば、Ｆｏｏｄ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓ．Ｗ．Ｃｕｉ，Ｅｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，Ｓ．Ｗ．Ｃｕｉ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ  ＬＬＣ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００５）に開示されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２３】
本明細書の大きいα−グルカンポリマーの「分子量」は、重量平均分子量（Ｍｗ）又は数平均分子量（Ｍｎ）として表すことができ、その単位は、ダルトン又はグラム／モルである。代わりに、大きいα−グルカンポリマーの分子量は、ＤＰｗ（重量平均重合度）又はＤＰｎ（数平均重合度）として表すことができる。オリゴ糖などのより小さいα−グルカンポリマーの分子量は、典型的には、「ＤＰ」（重合度）として提供される場合があり、これは、単にα−グルカン内に含まれるグルコースの数を指す。「ＤＰ」は、個々の分子基準でポリマーの分子量を特徴付けることもできる。高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又はゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるなど、これらの様々な分子量の測定値を算出するための様々な手法が当該技術分野で知られている。
【００２４】
本明細書の用語「スクロース」は、α−１，２−グリコシド結合によって連結されたα−Ｄ−グルコース分子及びβ−Ｄ−フルクトース分子から構成される非還元二糖を指す。スクロースは、一般に砂糖として知られている。代わりに、スクロースは、「α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−β−Ｄ−フルクトフラノシド」と呼ばれ得る。「α−Ｄ−グルコピラノシル」及び「グルコシル」は、本明細書では同じ意味で用いられる。
【００２５】
用語「グルコシルトランスフェラーゼ」、「グルコシルトランスフェラーゼ酵素」、「ＧＴＦ」、「グルカンスクラーゼ」などは、本明細書では同じ意味で用いられる。本明細書のグルコシルトランスフェラーゼの活性は、生成物であるα−グルカン及びフルクトースを製造するための基質スクロースの反応を触媒する。ＧＴＦ反応の他の生成物（副生成物）としては、グルコース、様々な可溶性グルコオリゴ糖及びロイクロースを挙げることができる。グルコシルトランスフェラーゼ酵素の野生型形態は、一般に、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）、シグナルペプチド（これは、典型的には、切断プロセスにより除かれる）、可変ドメイン、触媒ドメイン及びグルカン結合ドメインを含有する。本明細書のグルコシルトランスフェラーゼは、ＣＡＺｙ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  ＥｎＺｙｍｅｓ）データベース（Ｃａｎｔａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７：Ｄ２３３−２３８，２００９）によると、グリコシドヒドロラーゼファミリー７０（ＧＨ７０）の下に分類される。
【００２６】
本明細書の用語「グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン」は、グルコシルトランスフェラーゼ酵素にα−グルカン合成活性を付与するグルコシルトランスフェラーゼ酵素のドメインを指す。グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインは、典型的には、この活性を有する任意の他のドメインの存在を必要としない。
【００２７】
用語「酵素反応」、「グルコシルトランスフェラーゼ反応」、「グルカン合成反応」、「反応組成物」、「反応配合物」などは、本明細書では同じ意味で用いられ、通常、水、スクロース、少なくとも１種の活性グルコシルトランスフェラーゼ酵素、及び任意選択的に他の成分を最初に含む反応を指す。グルコシルトランスフェラーゼ反応が通常開始した後に、グルコシルトランスフェラーゼ反応にさらに存在し得る成分には、フルクトース、グルコース、ロイクロース、可溶性グルコオリゴ糖（例えば、ＤＰ２〜ＤＰ７）（これらは、使用されるグルコシルトランスフェラーゼに応じて生成物又は副生物と考えられ得る）、及び／又はＤＰ８以上（例えば、ＤＰ１００以上）の不溶性α−グルカン生成物が挙げられる。少なくとも８又は９の重合度（ＤＰ）を有するα−１，３−グルカンなどの特定のグルカン生成物は、非水溶性であるため、グルカン合成反応で溶解されず、むしろ溶液外に存在する（例えば、反応から沈殿したため）可能性があることが理解されるであろう。それは、水、スクロース及びグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程が実施されるグルカン合成反応中である。本明細書で使用される用語「好適な反応条件下」は、グルコシルトランスフェラーゼ酵素活性によってスクロースからα−グルカン生成物への変換を支援する反応条件を指す。
【００２８】
用語「体積によるパーセント」、「体積パーセント」、「体積％」、「ｖ／ｖ％」などは、本明細書では同じ意味で用いられる。溶液中の溶質の体積パーセントは、次式を用いて求めることができる：［（溶質の体積）／（溶液の体積）］×１００％。
【００２９】
用語「重量によるパーセント」、「重量パーセント（ｗｔ％）」、「重量−重量パーセント（％ｗ／ｗ）」などは、本明細書では同じ意味で用いられる。重量によるパーセントは、組成物、混合物又は溶液中に物質が含まれる場合に質量基準での物質の百分率を指す。
【００３０】
用語「水性条件」、「水性反応条件」、「水性状況」、「水性系」などは、本明細書では同じ意味で用いられる。本明細書の水性条件は、溶媒が例えば少なくとも約６０重量％水である溶液又は混合物を指す。本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ反応は、水性条件下で実施される。
【００３１】
「不溶性」、「水不溶性（ａｑｕｅｏｕｓ−ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ）」、「水不溶性（ｗａｔｅｒ−ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ）」（及び同様の用語）（例えば、８以上のＤＰを有するα−１，３−グルカン）であるグルカンは、水又は他の水性条件に溶解しない（又は認識できるほどに溶解しない）（ここで、水性条件は、任意選択的に、４〜９のｐＨ（例えば、ｐＨ６〜８）及び／又は約１〜８５℃（例えば、２０〜２５℃）の温度を有することをさらに特徴とする）。対照的に、「可溶性」、「水溶性（ａｑｕｅｏｕｓ−ｓｏｌｕｂｌｅ）」、「水溶性（ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ）」などである本明細書の特定のオリゴ糖などのグルカン（例えば、８未満のＤＰを有するα−１，３−グルカン）は、これらの条件下で認識できるほどに溶解する。
【００３２】
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸分子」などは、本明細書では同じ意味で用いられる。これらの用語はヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、任意選択的に、合成の、非天然の、又は改変されたヌクレオチド塩基を含有する一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡのポリマーであってもよい。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はそれらの混合物のうちの１つ以上のセグメントから構成されてもよい。
【００３３】
本明細書で使用する場合、用語「遺伝子」は、コード領域からＲＮＡ（ＲＮＡは、ＤＮＡポリヌクレオチド配列から転写される）を発現するＤＮＡポリヌクレオチド配列を指し、このＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（タンパク質をコードする）又は非タンパク質コードＲＮＡであり得る。遺伝子は、コード領域単独を指す場合があるか、又はコード領域の上流及び／若しくは下流の調節配列（例えば、プロモーター、５’非翻訳領域、３’転写ターミネーター領域）を含む場合がある。或いは、タンパク質をコードするコード領域は、本明細書では「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）と呼ばれる場合がある。「天然の」又は「内在性の」遺伝子は、それ自体の調節配列とともに天然に見出されるとおりの遺伝子を指し；そのような遺伝子は宿主細胞のゲノムの本来の場所に位置する。「キメラ」遺伝子は、天然には一緒に見出されることがない（すなわち、調節領域及びコード領域は互いに非相同である）調節配列及びコード配列を含む、天然遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列及びコード配列、又は同一起源に由来するが、天然に見出されるものと異なる方法で配列された調節配列及びコード配列を含む場合がある。「外来」又は「異種」遺伝子は、遺伝子導入によって宿主生物内に導入される遺伝子を指す場合がある。外来／異種遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新規な場所に導入された天然遺伝子又はキメラ遺伝子を含む場合がある。本明細書に開示される特定の実施形態におけるポリヌクレオチド配列は、異種である。「導入遺伝子」は、遺伝子導入手順（例えば、形質転換）によりゲノムに導入された遺伝子である。「コドン最適化」オープンリーディングフレームは、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するよう設計されたコドン使用頻度を有する。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、通常、定義された配列を有するアミノ酸残基の鎖と定義される。本明細書で使用する場合、ポリペプチドという用語は、用語「ペプチド」及び「タンパク質」と互換可能である。本明細書のポリペプチドに含有される典型的なアミノ酸としては（括弧書きで示されるそれぞれの３文字及び１文字コード）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）が挙げられる。
【００３５】
用語「異種」は、天然には対象位置に見出されないことを意味する。例えば、異種遺伝子は、天然には宿主生物内に見出されないが、遺伝子移入によって宿主生物中に導入される遺伝子であり得る。別の例として、キメラ遺伝子中に存在する核酸分子は、そのような核酸分子がキメラ遺伝子の他のセグメントと自然には関連しないため、異種として特徴付けることができる（例えば、プロモーターは、コード配列に対して異種であり得る）。
【００３６】
本明細書中の細胞又は生物に含まれる「非天然」のアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列は、そのような細胞又は生物の天然の（自然の）対応物に存在しない。このようなアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列は、細胞又は生物に対して異種であると言うこともできる。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「調節配列」は、遺伝子の転写開始部位の上流に位置するヌクレオチド配列（例えば、プロモーター）、５’非翻訳領域、イントロン及び３’非コード領域を指し、遺伝子から転写されるＲＮＡの転写、プロセシング若しくは安定性及び／又は翻訳に影響を及ぼす可能性がある。本明細書の調節配列は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ステムループ構造及び遺伝子発現の調節に関連する他の要素を含む場合がある。本明細書の１つ以上の調節要素は、本明細書のコード領域に対して異種であってもよい。
【００３８】
本明細書中で使用する「プロモーター」は、遺伝子からのＲＮＡの転写を制御することができるＤＮＡ配列を意味する。一般に、プロモーター配列は、遺伝子の転写開始部位の上流にある。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してよいし、自然界で見出される様々なプロモーターに由来する様々な要素から構成されてよいし、さらに合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。あらゆる状況下のほとんどの時点で遺伝子が細胞内で発現することを誘発するプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と呼ばれる。或いは、プロモーターは、誘導可能であってもよい。本明細書の１つ以上のプロモーターは、本明細書のコード領域にとって異種であってもよい。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「強力なプロモーター」は、単位時間当たり比較的多数の生成開始を指示できるプロモーター及び／又は細胞内の遺伝子の平均転写レベルよりも高いレベルの遺伝子転写を駆動するプロモーターを指す。
【００４０】
本明細書中で使用される用語「３’非コーディング配列」、「転写ターミネーター」、「ターミネーター」などは、コーディング配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これには、ポリアデニル化認識配列、及びｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードする他の配列が含まれる。
【００４１】
本明細書で使用する場合、第１の核酸配列は、第１の核酸配列の一本鎖形が好適なアニーリング条件（例えば、温度、溶液イオン強度）下で第２の核酸配列にアニーリングできる場合は第２の核酸配列に「ハイブリダイズする」ことができる。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、よく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）で例証されており、この文献、特に１１章及び表１１．１が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４２】
用語「ＤＮＡ操作技術」は、ＤＮＡポリヌクレオチド配列の配列が改変される任意の技術を指す。改変されているＤＮＡポリヌクレオチド配列は改変のための基質自体として使用できるが、ＤＮＡポリヌクレオチド配列は所定の技術のために物理的に所有されている必要はない（例えば、コンピューター内に保存された配列を操作技術のための基礎として使用することができる）。ＤＮＡ操作技術は、より長い配列内で１つ以上のＤＮＡ配列を欠失及び／又は変異させるために使用することができる。ＤＮＡ操作技術の例としては、組換えＤＮＡ技術（制限及びライゲーション、分子クローニング）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び合成ＤＮＡ法（例えば、オリゴヌクレオチド合成及びライゲーション）が挙げられる。合成ＤＮＡ技術に関して、ＤＮＡ操作技術は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでＤＮＡポリヌクレオチドを観察する工程、ＤＮＡポリヌクレオチドの所望の改変（例えば、１つ以上の欠失）を決定する工程、及び所望の改変を含有するＤＮＡポリヌクレオチドを合成する工程を必要とする場合がある。
【００４３】
本明細書の用語「ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ」は、例えばコンピューターなどの情報記憶及び／又はプロセシング装置内又は上で；コンピューターソフトウェア又はシミュレーションを使用して実施又は生成されること、すなわちバーチャルリアリティを意味する。
【００４４】
ポリヌクレオチドに関して本明細書で使用する用語「上流」及び「下流」は、それぞれ、「５’」及び「３’」を指す。
【００４５】
本明細書で使用する場合、用語「発現」は、（ｉ）コード領域からのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ又は非タンパク質コーディングＲＮＡ）の転写、及び／又は（ｉｉ）ｍＲＮＡからのポリペプチドの翻訳を指す。ポリヌクレオチド配列のコード領域の発現は、特定の実施形態では、上方制御又は下方制御することができる。
【００４６】
本明細書で使用する場合、用語「作動可能に連結された」は、一方の機能が他方の機能によって影響されるような２つ以上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、コード配列と作動可能に連結されている。すなわち、コード配列は、プロモーターの転写調節下にある。コード配列は、例えば、１つ（例えば、プロモーター）又は複数（例えば、プロモーター及びターミネーター）の調節配列と作動可能に連結することができる。
【００４７】
本明細書でプラスミド、ベクター、又はコンストラクトなどのＤＮＡ配列を特徴付けるために本明細書で使用する場合の用語「組換え」は、例えば化学合成による、及び／又は遺伝子工学技術による核酸の分離セグメントの操作による、２つのさもなければ分離した配列のセグメントの人工的組合せを指す。
【００４８】
本明細書で使用する場合、用語「形質転換」は、任意の方法によって核酸分子を宿主生物又は宿主細胞に移すことを指す。生物／細胞中に形質転換された核酸分子は、生物／細胞中で自律的に複製するか、又は生物／細胞のゲノム中に組み込まれるか、又は複製若しくは組込みなしに細胞中に一過的に存在するものであってもよい。プラスミド及び直鎖状ＤＮＡ分子などの、形質転換のために好適な核酸分子の非限定的な例は、本明細書に開示されている。形質転換核酸配列を含有する本明細書に記載の宿主生物／細胞は、例えば、「トランスジェニック」、「組換え」、「形質転換された」、「遺伝子操作された」、「形質転換体」、及び／又は「外因性遺伝子発現のために改変された」と称することができる。
【００４９】
ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に関して本明細書で使用する用語「配列同一性」、「同一性」などは、特定の比較ウィンドウにわたって最高一致のために整列させたときに同一である、２つの配列内の核酸残基又はアミノ酸残基を指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」、「同一性パーセント」などは、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定される数値を指すが、このとき、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適整列のための参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して付加又は欠失（すなわちギャップ）を含む可能性がある。パーセンテージは、両方の配列内で同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が発生する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得、そのマッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列との間の配列同一性を計算するとき、ＤＮＡ配列のＴ残基は、ＲＮＡ配列のＵ残基と整列し、ＲＮＡ配列のＵ残基と「同一である」と見なされ得ることは理解されるであろう。第１及び第２のポリヌクレオチドの「相補性パーセント」を決定するために、例えば、（ｉ）第１ポリヌクレオチドと第２ポリヌクレオチドの相補配列（又はその逆）間の同一性パーセント、及び／又は（ｉｉ）標準的なワトソン・クリック塩基対を作り出すことになる第１及び第２ポリヌクレオチド間の塩基のパーセンテージを決定することによってこれを得ることができる。
【００５０】
同一性パーセントは、全てが参照により本明細書に組み込まれる：１）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ：ＮＪ（１９９４）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；及び、５）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に記載されるものを含むが、これらに限定されない任意の既知の方法によって容易に決定することができる。
【００５１】
同一性パーセントを決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最良の一致を付与するように設計される。同一性及び類似性を決定する方法は、例えば、公的に入手可能なコンピュータープログラムにコード化されている。配列アラインメント及び同一性パーセントの算出は、例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイートのＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて実施することができる。配列の多重アラインメントは、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖアラインメント法を含む、様々な種類のアルゴリズムを包含するＣｌｕｓｔａｌアラインメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２）により記載され、また、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイートのＭＥＧＡＬＩＧＮ  ｖ８．０  プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）に見出される）を用いて行うことができる。多重アラインメントの場合、デフォルト値はＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０及びＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応し得る。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用したタンパク質配列のペアワイズアラインメント及び同一性パーセントの計算のためのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５及びＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５であり得る。核酸の場合には、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４及びＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４であり得る。さらに、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法を使用することができ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２）：４６７３−４６８０，１９９４によって記載される）、これはＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭＥＧＡＬＩＧＮ  ｖ８．０プログラムにおいて見出される。多重アラインメント（タンパク質／核酸）のデフォルトパラメータは、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０／１５、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２／６．６６、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０／３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢであり得る。
【００５２】
本明細書には、様々なポリペプチドアミノ酸配列及びポリヌクレオチド配列が特定の実施形態の特徴として開示されている。本明細書で開示される配列と少なくとも約７０〜８５％、８５〜９０％、又は９０％〜９５％同一であるこれらの配列のバリアントを使用又は参照することができる。或いは、バリアントアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列は、本明細書で開示される配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有し得る。本明細書のバリアントアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列は、開示した配列と同一の機能／活性又は開示した配列の少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の機能／活性を有する。メチオニンで始まらない、本明細書に開示される任意のポリペプチドアミノ酸配列は、典型的には、アミノ酸配列のＮ末端に少なくとも開始メチオニンをさらに含み得る。対照的に、メチオニンで始まる本明細書に開示される任意のポリペプチドアミノ酸配列は、任意選択的に、そのようなメチオニン残基を欠く可能性がある。
【００５３】
用語「〜と整列する」、「〜に対応する」などは、本明細書において同じ意味で用いられ得る。本明細書のいくつかの実施形態は、配列番号６２の少なくとも１つの特定のアミノ酸残基に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含むグルコシルトランスフェラーゼに関する。（１）クエリ配列が対象配列と整列し得る場合（例えば、この場合、アラインメントは、クエリ配列及び対象配列［又は対象配列の部分配列］が少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％同一であることを示す）、及び（２）クエリアミノ酸位置が（１）のアラインメントにおいて対象アミノ酸位置と一直線に整列する（一直線に一列に並ぶ）場合、グルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置又はその部分配列は、（例えば、触媒ドメイン又は触媒ドメインに加えてグルカン結合ドメイン）（このようなアミノ酸位置又は配列を「クエリ」位置又は配列と呼ぶことができる）、配列番号６２の特定のアミノ酸残基（そのようなアミノ酸位置又は配列を「対象」位置又は配列と呼ぶことができる）に対応するように特徴付けることができる。一般に、開示された本明細書に記載される任意のアラインメントアルゴリズム、ツール及び／又はソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴＰ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＶ、Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｏｍｅｇａ、ＥＭＢＯＳＳ）を用いて、対象配列（配列番号６２又は配列番号６２の部分配列）とクエリアミノ酸配列とを整列させて、同一性パーセントを決定することができる。まさにさらなる例として、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＯＳＳ［例えば、バージョン５．０．０以降］，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７，２０００）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実行されるようなニードルマン−ヴンシュアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３，１９７０）を使用して、クエリ配列を本明細書の対象配列と整列させることができる。このようなＥＭＢＯＳＳアラインメントのパラメータは、例えば、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５、ＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスを含み得る。
【００５４】
本明細書の配列番号６２の特定のアミノ酸残基のナンバリング（例えば、Ｌｅｕ−５１３、Ｐｒｏ−５５０、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ｔｒｐ−５７１、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、Ａｓｎ−５８１、Ｔｈｒ−５８５、Ｇｌｎ−６１６）は、配列番号６２の全長アミノ酸配列に関するものである。配列番号６２の最初のアミノ酸（すなわち１位、Ｍｅｔ−１）は、シグナルペプチドの開始点である。別段の開示がなされていなければ、本明細書の置換は、配列番号６２の全長アミノ酸配列に関する。
【００５５】
本明細書の「非天然グルコシルトランスフェラーゼ」（「変異体」、「バリアント」、「改変された」及び同様の用語は、このようなグルコシルトランスフェラーゼを記載するために同様に用いられる）は、配列番号６２の特定のアミノ酸残基に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。このような少なくとも１つのアミノ酸置換は、典型的には、非天然グルコシルトランスフェラーゼの天然対応物（親）において同じ位置で一般に（自然に）存在するアミノ酸残基に代わるものである（すなわち配列番号６２が位置についての基準として使用されるが、本明細書のアミノ酸置換は、非天然グルコシルトランスフェラーゼの天然対応物に関する）（別の方法として、非天然グルコシルトランスフェラーゼの配列を配列番号６２と整列させる場合、特定の位置での置換が存在するかどうかを決定することは、それ自体、配列番号６２におけるそれぞれのアミノ酸残基に依存せず、むしろ非天然グルコシルトランスフェラーゼの天然対応物内の対象位置に存在するアミノ酸に依存する）。天然対応物のグルコシルトランスフェラーゼにおいて関連した位置で一般に存在するアミノ酸は、アラインメントがなされる配列番号６２の特定のアミノ酸残基と同じである（又は保存されている）ことが多い（しかし、常にではない）。非天然グルコシルトランスフェラーゼは、任意選択的に、その天然対応物配列に対して他のアミノ酸変化（変異、欠失及び／又は挿入）を有し得る。
【００５６】
本明細書の置換／アラインメントを説明することは、有益であり得る。配列番号１２（ＧＴＦ  ０５４４）は、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ）のグルコシルトランスフェラーゼの切断型である。配列番号１２のＬｅｕ−１９３は、配列番号６２のＬｅｕ−３７３に対応することに留意されたい（アラインメントは示さず）。例えば、配列番号１２が１９３位で変異されて、Ｌｅｕ残基を異なる残基（例えば、Ｇｌｎ）で置換する場合、配列番号１２の１９３位で変異したバージョンは、配列番号６２のＬｅｕ−３７３に対応する位置でアミノ酸置換を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼに相当すると言うことができる。
【００５７】
用語「単離された」は、天然に存在しない形態又は環境にある物質（又はプロセス）を意味する。単離された物質の非限定的例としては、（１）天然に存在しない任意の物質（例えば、本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼ）、（２）限定されないが、自然界では結合している天然に存在する成分の１つ以上若しくは全部から少なくとも部分的に取り出される任意の宿主細胞、酵素、バリアント、核酸、タンパク質、ペプチド、補因子若しくは炭水化物／糖などの任意の物質；（３）天然に見出される物質に対して人の手により改変された任意の物質（例えば、本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼ）；又は（４）その物質の量を、それが自然に結合している他の成分に対して増加させることによって修飾された任意の物質が挙げられる。本明細書で開示される実施形態（例えば、酵素及び反応組成物）は、合成物／人工物（人間の介入／関与がないならば製造できない）であり、且つ／又は天然に存在しない特性を有すると考えられる。
【００５８】
本明細書で使用される「増加した」という用語は、増加した量又は活性が比較される量又は活性より少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、５０％、１００％、又は２００％多い量又は活性を指すことができる。用語「増加した」、「上昇した」、「増強された」、「より多い」、「改善された」などの用語は、本明細書では同じ意味で用いられる。これらの用語は、例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの「過剰発現」又は「上方制御」を特徴付けるために使用することができる。
【００５９】
グルコシルトランスフェラーゼ酵素を用いた不溶性グルカンポリマーの生成において進展がなされてきた一方、このような酵素によって合成される不溶性グルカン生成物の分子量の調節に対して関心がほとんど向けられていないように見える。この技術的空白を解決するために、本明細書では、より低分子量の不溶性グルカン生成物を生成する改変されたアミノ酸配列を有するグルコシルトランスフェラーゼが開示される。
【００６０】
本開示のある種の実施形態は、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３、Ｐｒｏ−５５０、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ｔｒｐ−５７１、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、Ａｓｎ−５８１、Ｔｈｒ−５８５、又はＧｌｎ−６１６に対応する位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む非天然グルコシルトランスフェラーゼであって、非天然グルコシルトランスフェラーゼが、α−１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを合成し、且つ不溶性α−グルカンの分子量が、置換位置においてのみ非天然グルコシルトランスフェラーゼと異なる第２のグルコシルトランスフェラーゼによって合成される不溶性α−グルカンの分子量よりも小さい、非天然グルコシルトランスフェラーゼに関する。したがって、概して、α−１，３グリコシド結合を有するより低分子量の不溶性α−グルカンを合成することができる変異体グルコシルトランスフェラーゼ酵素が本明細書で開示される。
【００６１】
本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、α−１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを合成する。いくつかの態様では、このようなα−グルカンのグリコシド結合の少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６９％、７０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％は、α−１，３結合であり得る。不溶性α−グルカンの結合プロファイルは、任意選択的に、これらの値のいずれか２つの間の範囲を有するものとして特徴付けることができる。例えば、３０％〜９９．５％のα−１，３結合を有するこれらの態様のいずれかにおける他の結合は、α−１，６であってもよく、且つ／又はα−１，４若しくはα−１，２結合のいずれも含まなくてもよい。
【００６２】
いくつかの態様における不溶性α−グルカンは、例えば、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又は０．５％未満のα−１，２又はα−１，４グリコシド結合を有し得る。別の実施形態では、不溶性α−グルカンは、α−１，３、及び任意選択的にα−１，６結合のみを有する（すなわち、α−１，２又はα−１，４結合がない）。不溶性α−グルカンが５０％のα−１，３グリコシド結合を含む態様では、そのようなグルカンは、典型的には、アルテルナン（交互のα−１，３及びα−１，６結合）を含まない。
【００６３】
いくつかの態様における不溶性α−グルカンは、直鎖／非分枝鎖（分枝点がない）であり得る。或いは、本明細書の不溶性α−グルカンでは、分枝が存在し得る。例えば、不溶性α−グルカンは、ポリマー中の結合のパーセントとして約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又は０．５％未満の分枝点を有し得る。
【００６４】
ある種の実施形態では、不溶性α−グルカンは、約３００未満のＤＰｗ又はＤＰｎでの分子量を有し得る。例えば、ＤＰｗ又はＤＰｎは、約、又は約３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、若しくは１１未満であり得る。不溶性α−グルカンの分子量は、これらの値のいずれか２つの間の範囲（例えば、１１〜２５、１２〜２５、１１〜２２、１２〜２２、１１〜２０、１２〜２０、２０〜３００、２０〜２００、２０〜１５０、２０〜１００、２０〜７５、３０〜３００、３０〜２００、３０〜１５０、３０〜１００、３０〜７５、５０〜３００、５０〜２００、５０〜１５０、５０〜１００、５０〜７５、７５〜３００、７５〜２００、７５〜１５０、７５〜１００、１００〜３００、１００〜２００、１００〜１５０、１５０〜３００、１５０〜２００、２００〜３００）として任意選択的に表され得る。本明細書の分子量は、本明細書の実施例（下記）において開示されるか又は例えば、米国特許出願公開第２０１７／０００２３３５号明細書、同第２０１５／００６４７４８号明細書、又は同第２０１５／０２３２８１９号明細書において開示されるとおりの方法を含む、任意の好適な方法に従って測定され得る。
【００６５】
本明細書のα−グルカンは、本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ反応の条件（例えば、ｐＨ４〜８、下記を参照されたい）などの非苛性水性系で不溶性である。一般に、本明細書における水性系中のグルカンポリマーの溶解度は、その結合プロファイル、分子量及び／又は分枝度に関連する。例えば、≧９５％の１，３結合を有するα−１，３−グルカンは、一般に、８以上のＤＰｗで２０℃の水性条件において不溶性である。一般に、分子量が増大するにつれて、α−１，３−グルカンの不溶性に必要なα−１，３結合の割合が減少する。
【００６６】
前述の結合プロファイル及び／又は分子量プロファイルのいずれかを、例えば本明細書において組み合わせて、本開示の非天然グルコシルトランスフェラーゼの不溶性α−グルカン生成物を適切に特徴付けることができる。
【００６７】
非天然グルコシルトランスフェラーゼは、例えば、非天然グルコシルトランスフェラーゼが、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３、Ｐｒｏ−５５０、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ｔｒｐ−５７１、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、Ａｓｎ−５８１、Ｔｈｒ−５８５、又はＧｌｎ−６１６に対応する位置で少なくとも１つアミノ酸置換を含むという点を除いて、本開示のとおりに不溶性α−グルカンを生成することができる以下の刊行物に開示される任意のグルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含み得る：米国特許第７００００００号明細書及び同第８８７１４７４号明細書；並びに米国特許出願公開第２０１５／０２３２８１９号明細書及び同第２０１７／０００２３３５号明細書（これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの態様では、このような非天然グルコシルトランスフェラーゼは、（ｉ）前述の置換の少なくとも１つを有し、且つ（ｉｉ）少なくとも１つの置換を有しないそれぞれの対応物／親グルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００６８】
いくつかの態様では、非天然グルコシルトランスフェラーゼは、（ｉ）配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３、Ｐｒｏ−５５０、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ｔｒｐ−５７１、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、Ａｓｎ−５８１、Ｔｈｒ−５８５、又はＧｌｎ−６１６に対応する位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、且つ（ｉｉ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２６、２８、３０、３４又は５９と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。これらのアミノ酸配列の大部分を有するグルコシルトランスフェラーゼの不溶性α−グルカン生成物に関する特定の情報が表２において提供される。
【００６９】
【表３】
2021514681.tif 000004
【００７０】
いくつかの態様では、非天然グルコシルトランスフェラーゼは、（ｉ）配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３、Ｐｒｏ−５５０、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ｔｒｐ−５７１、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、Ａｓｎ−５８１、Ｔｈｒ−５８５、又はＧｌｎ−６１６に対応する位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、且つ（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸残基５５〜９６０、配列番号６５の残基５４〜９５７、配列番号３０の残基５５〜９６０、配列番号２８の残基５５〜９６０又は配列番号２０の残基５５〜９６０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％同一であるグルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含むか又はそれからなる。このような非天然グルコシルトランスフェラーゼは、例えば、非水溶性であるα−グルカンを生成し、且つ少なくとも約５０％（例えば、≧９０％又は≧９５％）のα−１，３結合を含むことができると考えられる。例えば、配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７位を有するグルコシルトランスフェラーゼは、１００％のα−１，３結合を有するα−１，３−グルカンを生成できる（データは示さず、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／０００２３３５号明細書の表６を参照されたい）ことに留意されたい。配列番号６５（ＧＴＦ７５２７）、３０（ＧＴＦ２６７８）、４（ＧＴＦ６８５５）、２８（ＧＴＦ２９１９）及び２０（ＧＴＦ２７６５）は、それぞれの野生型対応物と比較して、シグナルペプチドドメイン及び可変ドメインの全部分又は実質的部分が欠如するグルコシルトランスフェラーゼをそれぞれ表すことにさらに留意されたい。したがって、これらのグルコシルトランスフェラーゼ酵素の各々は、後にグルカン結合ドメインが続く触媒ドメインを有する。これらの酵素中の触媒ドメイン配列のおよその位置は、次のとおりである：７５２７（配列番号６５の残基５４〜９５７）、２６７８（配列番号３０の残基５５〜９６０）、６８５５（配列番号４の残基５５〜９６０）、２９１９（配列番号２８の残基５５〜９６０）、２７６５（配列番号２０の残基５５〜９６０）。ＧＴＦ２６７８、６８５５、２９１９及び２７６５の（およその）触媒ドメインのアミノ酸配列は、ＧＴＦ７５２７のおよその触媒ドメイン配列（すなわち配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７）とそれぞれ約９４．９％、９９．０％、９５．５％及び９６．４％の同一性を有する。これらの特定のグルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ２６７８、６８５５、２９１９及び２７６５）の各々は、１００％のα−１，３結合及び少なくとも４００のＤＰｗを有するα−１，３−グルカンを生成できる（データは示さず、米国特許出願公開第２０１７／０００２３３５号明細書の表４を参照されたい）。この活性及び前述の触媒ドメインの関連性（高い同一性パーセント）に基づいて、本明細書で開示される少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに有する前述の触媒ドメインの１つを有する本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、少なくとも約５０％（例えば、≧９０％又は≧９５％）のα−１，３結合を含む比較的小さい分子���の不溶性α−グルカンを生成できると考えられる。
【００７１】
いくつかの態様では、非天然グルコシルトランスフェラーゼは、（ｉ）配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３、Ｐｒｏ−５５０、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ｔｒｐ−５７１、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、Ａｓｎ−５８１、Ｔｈｒ−５８５、又はＧｌｎ−６１６に対応する位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、且つ（ｉｉ）配列番号６２、又は配列番号４（その開始メチオニンを有しない）、又は配列番号４の５５〜９６０位（およその触媒ドメイン）などのその部分配列と少なくとも約４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６９％、７０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【００７２】
特定の態様における非天然グルコシルトランスフェラーゼは、触媒ドメインのみを有する必要があると考えられているが、非天然グルコシルトランスフェラーゼは、より広範なアミノ酸配列内に含まれ得る。例えば、触媒ドメインは、そのＣ末端でグルカン結合ドメインに連結していてもよく、且つ／又はそのＮ末端で可変ドメイン及び／若しくはシグナルペプチドに連結していてもよい。
【００７３】
非天然グルコシルトランスフェラーゼにおけるアミノ酸置換は、配列番号６２における対応する位置に関して本明細書で概して開示されるが、このような置換は、代わりに、便宜的に、単に非天然グルコシルトランスフェラーゼ自体の配列におけるその位置番号に関して記載され得る。
【００７４】
非天然グルコシルトランスフェラーゼのさらなる別の例は、本明細書に開示されるもの、並びにＮ末端及び／又はＣ末端に１〜３００（又はその間の任意の整数［例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０］）個の残基を含むもののいずれでもあり得る。そのような追加の残基は、例えば、そのグルコシルトランスフェラーゼ酵素が由来する対応する野生型配列由来であるか、又は（Ｎ末端又はＣ末端での）エピトープタグ、又は（Ｎ末端での）異種シグナルペプチドなどの異種配列であってもよい。本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、典型的には、Ｎ末端シグナルペプチドを欠き、このような酵素は、任意選択的に、そのシグナルペプチドが分泌プロセス中に除去された場合、成熟したものとして特徴付けることができる。
【００７５】
本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、例えば、細菌などの任意の微生物源に由来し得る。細菌グルコシルトランスフェラーゼの例は、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）種、又はラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種に由来するものである。ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種の例としては、Ｓ．サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｓ．ソブリナス（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、Ｓ．デンチロウセッティ（Ｓ．ｄｅｎｔｉｒｏｕｓｅｔｔｉ）、Ｓ．ダウネイ（Ｓ．ｄｏｗｎｅｉ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ）、Ｓ．ガロリティカス（Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、及びＳ．サングイニス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）が挙げられる。ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）種の例としては、Ｌ．メセンテロイデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、Ｌ．アメリビオスム（Ｌ．ａｍｅｌｉｂｉｏｓｕｍ）、Ｌ．アルゲンチナム（Ｌ．ａｒｇｅｎｔｉｎｕｍ）、Ｌ．カルノスム（Ｌ．ｃａｒｎｏｓｕｍ）、Ｌ．シトレウム（Ｌ．ｃｉｔｒｅｕｍ）、Ｌ．クレモリス（Ｌ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、Ｌ．デキストラニカム（Ｌ．ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）及びＬ．フルクトサム（Ｌ．ｆｒｕｃｔｏｓｕｍ）が挙げられる。ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種の例としては、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．デルブリュキイ（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、Ｌ．ヘルベチクス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、Ｌ．サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．クルバツス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、Ｌ．プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．サケイ（ｓａｋｅｉ）、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｌ．ブフネリ（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、Ｌ．フェルメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）及びＬ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）が挙げられる。
【００７６】
本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、例えば、適切に遺伝子操作された微生物株の発酵によって作製することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株（例えば、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、並びにアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属（例えば、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ））及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属（例えば、Ｔ．レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））（例えば、Ａｄｒｉｏ及びＤｅｍａｉｎ，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ４：１１７−１３９，２０１４を参照されたい（この文献は、参照により本明細書に組み込まれる））などの微生物種を用いる発酵による組換え酵素の製造は、当該技術分野でよく知られている。非天然グルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、典型的には、酵素のための発現カセットを形成するために異種プロモーター配列と連結され、且つ／又はそれに合うようにコドン最適化される。そのような発現カセットは、当該技術分野でよく知られる方法を使用して、好適なプラスミドに組み込まれ得るか、又は微生物宿主染色体中に組み込まれ得る。発現カセットは、アミノ酸をコードする配列に続いて転写ターミネーターヌクレオチド配列を含み得る。発現カセットは、プロモーター配列とグルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸コード配列との間に、グルコシルトランスフェラーゼ酵素の直接的な分泌のために設計されたシグナルペプチド（例えば、異種シグナルペプチド）をコードするヌクレオチド配列も含み得る。発酵の終わりに、細胞を適宜破壊してもよく（一般に、分泌のためのシグナルペプチドが採用されない場合）、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、沈殿、濾過、及び／又は濃縮などの方法を使用して単離することができる。或いは、グルコシルトランスフェラーゼを含む溶解物又は抽出物をさらに単離することなしに使用することができる。グルコシルトランスフェラーゼが分泌される（すなわち、それが発酵ブロス中に存在する）場合、それは、発酵ブロスから単離されたものとして、又は発酵ブロスに含まれるものとして任意選択的に使用され得る。グルコシルトランスフェラーゼ酵素の活性は、スクロースのグルカンポリマーへのその変換率を測定するなどの生化学的分析によって確認することができる。
【００７７】
本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３、Ｐｒｏ−５５０、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ｔｒｐ−５７１、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、Ａｓｎ−５８１、Ｔｈｒ−５８５、又はＧｌｎ−６１６に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含み得る。いくつかの態様では、非天然グルコシルトランスフェラーゼは、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、又はＧｌｎ−６１６に対応する位置で、少なくとも１つのアミノ酸置を含む。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒ残基によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸残基Ｐｒｏ−５５０に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＩｌｅ残基（例えば、Ｌｅｕ又はＶａｌ）によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸残基Ｓｅｒ−５５３に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、又はＴｙｒ残基によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸残基Ａｓｎ−５５７に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＳｅｒ残基（例えば、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、又はＴｈｒ）によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸残基Ａｓｎ−５５８に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ａｓｐ又はＧｌｕ残基（例えば、Ａｓｐ）によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸残基Ｔｒｐ−５７１に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、又はＳｅｒ残基（例えば、Ｖａｌ、Ａｓｐ、又はＣｙｓ）によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸残基Ａｓｎ−５７３に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、又はＴｒｐ残基によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸残基Ａｓｐ−５７５に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒ残基によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｙｓ−５７８に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒ残基によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸残基Ａｓｎ−５８１に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｐｒｏ又はＧｌｙ残基（例えば、Ｐｒｏ）によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸残基Ｔｈｒ−５８５に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ｐｒｏ又はＧｌｙ残基（例えば、Ｐｒｏ）によるものであり得る。いくつかの態様では、配列番号６２のアミノ酸残基Ｇｌｎ−６１６に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒ残基によるものであり得る。
【００７８】
好適な置換部位及びこれらの部位での特定の置換の例としては、例えば、不溶性α−１，３−グルカン生成物の分子量（ＤＰｗ）が約、又は少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、又は８５％減少することと関連する、実施例１の表３（下記）で列挙されるものを挙げることができる。表３に列挙された前述の置換は、列挙された配列番号６２における残基位置番号に対応するものである。
【００７９】
本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、例えば、本明細書で開示されるアミノ酸置換の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又はそれ以上を含み得る。例えば、本明細書に開示されるアミノ酸置換のうちの２つ以上を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼは、（ｉ）配列番号６２のアミノ酸残基Ｐｒｏ−５５０、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ａｓｎ−５８１、若しくはＴｈｒ−５８５、及び／又は（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、若しくはＧｌｎ−６１６に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含み得る。置換位置の例は、Ｐ５５０（Ｌ）及びＮ５５７（Ｉ）、Ｐ５５０（Ｌ）及びＮ５８１（Ｐ）、Ｎ５５７（Ｉ）及びＮ５８１（Ｐ）、Ｓ５５３（Ｃ）及びＮ５５８（Ｄ）、Ｓ５５３（Ｃ）及びＤ５７５（Ｖ）、Ｓ５５３（Ｃ）及びＴ５８５（Ｐ）、Ｎ５５８（Ｄ）及びＴ５８５（Ｐ）、Ｄ５７５（Ｖ）及びＴ５８５（Ｐ）、Ｎ５５８（Ｄ）及びＤ５７５（Ｖ）、Ｐ５５０（Ｖ）及びＳ５５３（Ｒ）、Ｐ５５０（Ｖ）及びＮ５８１（Ｐ）、Ｐ５５０（Ｖ）及びＴ５８５（Ｐ）、Ｓ５５３（Ｒ）及びＮ５８１（Ｐ）、Ｓ５５３（Ｒ）及びＴ５８５（Ｐ）、Ｎ５８１（Ｐ）及びＴ５８５（Ｐ）、Ｐ５５０（Ｌ）及びＳ５５３（Ｆ）、Ｐ５５０（Ｌ）及びＮ５８１（Ｐ）、Ｓ５５３（Ｆ）及びＮ５８１（Ｐ）、Ｐ５５０（Ｖ）及びＮ５５７（Ｅ）、Ｐ５５０（Ｖ）及びＴ５８５（Ｐ）、Ｎ５５７（Ｅ）及びＴ５８５（Ｐ）であり、置換アミノ酸残基は、例として補足的に列挙され；前述の位置の対のいずれかに加える１つ以上の置換は、任意選択的に、適宜位置Ｐ５５０（Ｌ、Ｖ）、Ｎ５５７（Ｉ、Ｅ）、Ｎ５８１（Ｐ）、Ｓ５５３（Ｃ、Ｒ、Ｆなどの本明細書におけるいずれか）、Ｎ５５８（Ｄ）、Ｄ５７５（Ｖ、Ａなどの本明細書におけるいずれか）、Ｔ５８５（Ｐ）、Ｌ５１３（本明細書におけるいずれか）、Ｎ５７３（Ｉ、Ｖ、Ｐなどの本明細書におけるいずれか）、Ｋ５７８（Ｎ、Ｄ、Ｒなどの本明細書におけるいずれか）、Ｑ６１６（本明細書におけるいずれか）、Ｗ５７１（Ｖ、Ｄ、Ｃ）、及び／又は本明細書における他の位置であってもよく、置換アミノ酸残基は、例として補足的に列挙される。
【００８０】
簡潔に例示する目的として、本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、表Ａ（ｉ−ｌｘｉｉｉ）において示されるとおりの位置でのアミノ酸置換の組合せを含むことができ、各置換位置は、配列番号６２のそれぞれのアミノ酸位置番号に対応する。表Ａにおける置換アミノ酸残基は、例として補足的に列挙される。いくつかの態様では、非天然グルコシルトランスフェラーゼは、表Ａにおいて示されるとおりのアミノ酸置換の組合せを含んでもよく、置換アミノ酸は、表Ａにおいて補足的に示されるものである。
【００８１】
【表４】
2021514681.tif 000005
【００８２】
【表５】
2021514681.tif 000006
【００８３】
本明細書の１つ以上アミノ酸置換を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼは、例えば、本明細書に開示されるとおりの種々のグルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列のいずれかに基づき得る。簡潔に例示する目的として、このような非天然グルコシルトランスフェラーゼの例としては、単一のアミノ酸置換（例えば、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３、Ｐｒｏ−５５０、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ｔｒｐ−５７１、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、Ａｓｎ−５８１、Ｔｈｒ−５８５、又はＧｌｎ−６１６に対応する位置での）又はアミノ酸置換の組合せ（例えば、表Ａの実施形態ｉ〜ｌｘｉｉｉのいずれか）を有し、且つ配列番号６５（任意選択的に配列番号６５の開始メチオニンを有しない）若しくは配列番号６５の残基５４〜９５７、配列番号３０（任意選択的に配列番号３０の開始メチオニンを有しない）若しくは配列番号３０の残基５５〜９６０、配列番号４（任意選択的に配列番号４の開始メチオニンを有しない）若しくは配列番号４の残基５５〜９６０、配列番号２８（任意選択的に配列番号２８の開始メチオニンを有しない）若しくは配列番号２８の残基５５〜９６０、又は配列番号２０（任意選択的に配列番号２０の開始メチオニンを有しない）若しくは配列番号２０の残基５５〜９６０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるものが挙げられる。
【００８４】
いくつかの態様では、１つ以上の置換は、保存的又は非保存的置換であり；このような保存（又は非保存）は、例えば、非天然グルコシルトランスフェラーゼが由来する天然のグルコシルトランスフェラーゼに存在するアミノ酸に関するものであり得る。
【００８５】
本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、置換位置においてのみ非天然グルコシルトランスフェラーゼと異なる第２のグルコシルトランスフェラーゼ（又は単に「別の」グルコシルトランスフェラーゼ）（例えば、親グルコシルトランスフェラーゼ）によって合成されるα−１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンの分子量よりも小さい分子量を有するα−１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを合成することができる。本明細書の第２のグルコシルトランスフェラーゼは、例えば、全て又は大部分が天然のアミノ酸配列で構成され得る。したがって、本明細書の第２のグルコシルトランスフェラーゼは、いくつかの態様において天然のグルコシルトランスフェラーゼであり得るが、それは、他の態様において予め改変されたグルコシルトランスフェラーゼであり得る（例えば、本開示の置換と異なる１つ以上の他のアミノ酸置換を有するグルコシルトランスフェラーゼ）。いくつかの実施形態では、非天然グルコシルトランスフェラーゼと比較される第２のグルコシルトランスフェラーゼは、置換位置で天然のアミノ酸残基を有する。アミノ酸残基が天然のものであるかどうかの決定は、第２のグルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を、第２のグルコシルトランスフェラーゼが由来する天然／野生型のグルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と比較することによってなされ得る。
【００８６】
いくつかの態様では、本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、第２のグルコシルトランスフェラーゼによって合成される不溶性α−グルカンの分子量よりも約、又は少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％小さい分子量を有する不溶性α−グルカンを合成することができる。このような判断は、本明細書に開示されるとおりの（例えば、初期スクロース濃度、温度、ｐＨ及び／又は反応時間を考慮する）任意のグルカン合成反応／プロセスに対して、任意の好適な測定技術（例えば、ＳＥＣ）を用いてなされ得る。典型的には、本明細書における非天然グルコシルトランスフェラーゼと第２のグルコシルトランスフェラーゼとの比較は、同一又は類似の反応条件下でなされ得る。不溶性α−グルカンの分子量は、例えば、ＤＰｗとして表すことができる。分子量は、例えば、２０以下のモノマー単位を有する不溶性グルカンに関する実施形態において、任意選択的にＤＰとして表すことができる。
【００８７】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に開示されるとおりの非天然グルコシルトランスフェラーゼ（例えば、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３、Ｐｒｏ−５５０、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ｔｒｐ−５７１、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、Ａｓｎ−５８１、Ｔｈｒ−５８５、又はＧｌｎ−６１６に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む非天然グルコシルトランスフェラーゼ）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに関する。任意選択的に、１つ以上の調節配列は、ヌクレオチド配列と作動可能に連結され、好ましくは、プロモーター配列は、調節配列として含まれる。
【００８８】
本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、細胞中にヌクレオチド配列を移入するのに有用なベクター又はコンストラクトであり得る。好適なベクター／コンストラクトの例は、プラスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、コスミド、ファージミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ウイルス、又は線状ＤＮＡ（例えば、線状ＰＣＲ産物）から選択することができる。いくつかの態様におけるポリヌクレオチド配列は、細胞内に一過的（すなわちゲノムに組み込まれていない）又は安定に（すなわちゲノムに組み込まれている）存在することができる。いくつかの態様におけるポリヌクレオチド配列は、１つ以上の好適なマーカー配列（例えば、選択又は表現型マーカー）を含み得、又はそれらを欠き得る。
【００８９】
ある種の実施形態におけるポリヌクレオチド配列は、非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結された１つ以上の調節配列を含み得る。例えば、非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、プロモーター配列（例えば、異種プロモーター）と作動可能な連結であり得る。プロモーター配列は、例えば、細胞中（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などの細菌細胞；真菌、酵母、昆虫又は哺乳動物細胞などの真核細胞）又はｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質発現系での発現に好適であり得る。他の好適な調節配列の例としては、転写ターミネーター配列が挙げられる。
【００９０】
本明細書のいくつかの態様は、本明細書に開示されるとおりのポリヌクレオチド配列を含む細胞に関し、このような細胞は、本明細書に開示される任意の型であり得る（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などの細菌細胞；真菌、酵母、昆虫又は哺乳動物細胞などの真核細胞）。細胞は、任意選択的に、ポリヌクレオチド配列によりコードされる非天然グルコシルトランスフェラーゼを発現し得る。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド配列は、細胞内に一過的（すなわちゲノムに組み込まれていない）又は安定に（すなわちゲノムに組み込まれている）存在する。
【００９１】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、水、スクロース、及び１種以上の本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼ（例えば、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３、Ｐｒｏ−５５０、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ｔｒｐ−５７１、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、Ａｓｎ−５８１、Ｔｈｒ−５８５、又はＧｌｎ−６１６に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む非天然グルコシルトランスフェラーゼ）を含む反応組成物に関する。このような反応組成物は、少なくとも、開示されるとおりのα−１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを生成する。
【００９２】
本明細書の反応組成物の温度は、必要に応じて制御される場合があり、例えば約５〜５０℃、２０〜４０℃、３０〜４０℃、２０〜３０℃、２０〜２５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、又は４０℃であり得る。
【００９３】
本明細書の反応組成物中のスクロースの初期濃度は、例えば、約２０〜４００ｇ／Ｌ、７５〜１７５ｇ／Ｌ、又は５０〜１５０ｇ／Ｌであり得る。いくつかの態様では、初期スクロース濃度は、約、又は少なくとも約５０、７５、１００、１５０若しくは２００ｇ／Ｌであるか、又は約５０〜６００ｇ／Ｌ、１００〜５００ｇ／Ｌ、５０〜１００ｇ／Ｌ、１００〜２００ｇ／Ｌ、１５０〜４５０ｇ／Ｌ、２００〜４５０ｇ／Ｌ、若しくは２５０〜６００ｇ／Ｌである。「スクロースの初期濃度」は、全ての反応成分（例えば、少なくとも水、スクロース、非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素）が加えられた／合わせられた直後の反応組成物におけるスクロース濃度を指す。
【００９４】
特定の実施形態における反応組成物のｐＨは、約４．０〜９．０、４．０〜８．５、４．０〜８．０、５．０〜８．０、５．５〜７．５、又は５．５〜６．５であり得る。いくつかの態様では、ｐＨは、約４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５又は８．０であり得る。ｐＨは、リン酸塩、トリス、クエン酸塩、又はこれらの組合せを含むが、これらに限定されない、好適な緩衝剤の添加又は組込みによって調整又は制御することができる。本明細書の反応組成物中の緩衝剤濃度は、例えば、約０．１〜３００ｍＭ、０．１〜１００ｍＭ、１０〜１００ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、又は５０ｍＭであり得る。
【００９５】
反応組成物は、本明細書に開示される反応条件のうちの１つ以上を適用するのに好適な任意の容器（例えば、不活性容器／コンテナ）内に入れることができる。いくつかの態様における不活性容器は、ステンレス鋼製、プラスチック製又はガラス製（又はこれらの構成要素の２つ以上を含む）であり得、且つ特定の反応物を入れるのに好適なサイズであり得る。例えば、不活性容器の体積／容量（及び／又は本明細書の反応組成物の体積）は、約又は少なくとも約１、１０、５０、１００、５００、１０００、２５００、５０００、１００００、１２５００、１５０００又は２００００リットルであり得る。不活性容器は、任意選択的に撹拌装置を備えることができる。例えば、前述の特徴のいずれかは、本明細書の単離反応を特徴付けるために使用され得る。
【００９６】
本明細書の反応組成物は、１種、２種、又はそれ以上の異なるグルコシルトランスフェラーゼ酵素を、例えば、まさにその酵素のうちの少なくとも１つが本明細書に開示されるとおりの非天然グルコシルトランスフェラーゼである限り、含有することができる。いくつかの実施形態では、１つ又２つのグルコシルトランスフェラーゼ酵素のみが反応組成物に含まれる。本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ反応は、無細胞（例えば、細胞全体が存在しない）であってもよく、通常は無細胞（例えば、細胞全体が存在しない）である。
【００９７】
反応組成物に関して本明細書に開示される（例えば、上記及び以下の実施例において）特徴のいずれも、本明細書のグルカン生成方法の適切な態様を特徴付けることができ、その逆も同様である。
【００９８】
本開示はまた、α−１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを生成するための方法であって、（ａ）少なくとも水、スクロース、及びα−１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを生成する本明細書に開示されるとおりの少なくとも１種の非天然グルコシルトランスフェラーゼを接触させることであって、それにより、α−１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンが生成される接触させること；及びｂ）任意選択的に、工程（ａ）で生成された不溶性α−グルカンを単離することを含む方法にも関する。任意選択的に、グルカン合成法として特徴付けることができるこのような方法の実施は、典型的には、本明細書の反応組成物を実施する場合にも実行される。
【００９９】
本明細書に開示されるとおりのグルカン合成法は、少なくとも水、スクロース、及びα−１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを生成する本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼを接触させることを含む。これら及び任意選択的に他の試薬は、一緒に添加することができるか、又は下記で考察するような任意の順序で添加することができる。この工程は、任意選択的に、水、スクロース、及びα−１，３−結合を含む不溶性α−グルカンを合成する非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む反応組成物を提供することとして特徴付けることができる。本明細書の接触工程は、任意の数の方法において実施できる。例えば、所望の量のスクロースを最初に水に溶解させ（任意選択的に、他の成分、例えば緩衝剤成分もこの調製段階で添加され得る）、その後、グルコシルトランスフェラーゼ酵素を添加することができる。溶液は、静止させたままであり得るか、又は例えば撹拌若しくはオービタルシェイカーによる振盪によってかき混ぜられ得る。グルカン合成法は、バッチ、フェドバッチ、継続的な方法、又はこれらの方法の任意の変形形態によって実施され得る。
【０１００】
ある種の実施形態における反応の完了は、視覚的に（例えば、不溶性グルカンがもはや蓄積しない）、且つ／又は溶液中に残ったスクロース（残留スクロース）の量を測定することによって決定でき、この場合、少なくとも約９０％、９５％、又は９９％のスクロース消費率が反応完了を指示し得る。開示したプロセスの反応は、例えば、約１時間〜約又は少なくとも約２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、３６、４８、６０、７２、９６、１２０、１４４又は１６８時間実施され得る。
【０１０１】
本明細書のグルカン合成法のいくつかの態様において生成される不溶性α−グルカンの分子量は、第２のグルコシルトランスフェラーゼによって合成される不溶性α−グルカンの分子量よりも約、又は少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％小さい場合がある。いくつかの態様におけるそのような分子量の下方調節は、約３６〜６０時間（例えば、約４８時間）にわたって実施される反応において達成される。
【０１０２】
本明細書の方法において生成されるα−１，３−結合を含む不溶性α−グルカンは、任意選択的に単離され得る。ある種の実施形態では、不溶性α−グルカンの単離は、遠心分離及び／又は濾過の工程を少なくとも実施することを含み得る。単離はさらに、任意選択的に、不溶性α−グルカンを水若しくは他の水性液体で１回、２回、若しくはそれ以上洗浄すること、及び／又は不溶性α−グルカン生成物を乾燥させることを含み得る。
【０１０３】
前述又は下記実施例において記載されるものなど、不溶性α−グルカンを合成するための開示された条件のいずれかを、本明細書に開示される反応組成物の実施に適用することができ（逆も同様である）、且つ／又は非天然グルコシルトランスフェラーゼの特徴／活性を特徴付けるために適宜使用することができる。
【０１０４】
いくつかの態様では、単離された（任意選択的に「精製された」と特徴付けられた）不溶性α−グルカン生成物は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．８％、又は９９．９％のｗｔ％（乾燥重量基準）で組成物中に存在し得る。このような単離されたポリマーは、例えば、生成物／用途において成分／構成成分として使用され得る。
【０１０５】
本開示は、本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を作製する方法にも関する。この方法は、
（ａ）（ｉ）配列番号４又は配列番号４の５５〜９６０位と少なくとも約４０％同一であるアミノ酸配列を含み、且つ（ｉｉ）α−１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを合成する親グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を同定すること；及び
（ｂ）工程（ａ）で同定されたポリヌクレオチド配列を改変して、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３、Ｐｒｏ−５５０、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ｔｒｐ−５７１、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、Ａｓｎ−５８１、Ｔｈｒ−５８５、又はＧｌｎ−６１６に対応する位置において親グルコシルトランスフェラーゼの少なくとも１つのアミノ酸を置換し、それにより、α−１，３−グリコシド結合を含み且つ親グルコシルトランスフェラーゼによって合成される不溶性α−グルカンの分子量よりも小さい分子量を有する不溶性α−グルカンを合成する非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を提供することを含む。
【０１０６】
このような方法はさらに、任意選択的に、ポリヌクレオチドによってコードされる非天然グルコシルトランスフェラーゼを発現する方法において、このようにして作製されるポリヌクレオチドを使用することを含み得る。このような発現方法は、例えば、当該技術分野で知られるとおりの任意の異種タンパク質発現法に従い得る。ポリヌクレオチドを作製する本方法は、任意選択的に、グルコシルトランスフェラーゼの生成物分子量を減少させる方法として代替的に特徴付けられ得る。
【０１０７】
本明細書の親グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、例えば、配列番号４（任意選択的にその開始メチオニンを有しない）又は配列番号４の５５〜９６０位（およその触媒ドメイン）と、少なくとも約４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６９％、７０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み得る。単に参照を目的として、開始メチオニンを有しない配列番号４が配列番号６２の部分配列であることに留意されたい。
【０１０８】
本明細書の同定工程（ａ）は、場合によっては、親グルコシルトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列を同定することを含み得る。ポリヌクレオチド配列は、親グルコシルトランスフェラーゼが同定された種において使用される遺伝暗号などの遺伝暗号（コドン）に従うこのアミノ酸配列から決定され得る。
【０１０９】
本明細書の親グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドの同定は、例えば、（ａ）ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで、（ｂ）核酸ハイブリダイゼーション工程を含む方法を用いて、（ｃ）タンパク質配列決定工程を含む方法を用いて、及び／又は（ｄ）タンパク質結合工程を含む方法を用いて実施することができる。
【０１１０】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ検出に関して、コンピューター又データベース（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ、ＥＭＢＬ、ＲＥＦＳＥＱ、ＧＥＮＥＰＥＰＴ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＰＤＢなどの公開データベース）に保存された候補となる親グルコシルトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列（及び／又はこのようなグルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列）をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで精査して、親グルコシルトランスフェラーゼについて上で記載されるとおりの配列同一性パーセントを有するアミノ酸配列を含むグルコシルトランスフェラーゼ酵素を同定することができる。このような精査は、例えば、上述したようなアラインメントアルゴリズム又はソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＶ、Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｏｍｅｇａ、ＥＭＢＯＳＳ）などの当該技術分野において知られる任意の手段を使用することを含むことができた。
【０１１１】
上記に開示されるとおりの親グルコシルトランスフェラーゼの同定は、任意選択的に、核酸ハイブリダイゼーション工程を含む方法を介して実施することができる。このような方法は、例えば、ＤＮＡハイブリダイゼーション（例えば、サザンブロット、ドットブロット）、ＲＮＡハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンブロット）、又は核酸ハイブリダイゼーション工程（例えば、全てがオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを含み得るＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）を有する任意の他の方法の使用を含むことができる。配列番号４又はその部分配列（例えば、配列番号４の５５〜９６０位）をコードするポリヌクレオチド配列は、例えば、このようなハイブリダイゼーションにおいてプローブとして使用することができる。ハイブリダイゼーション法を実施するための条件及びパラメータは、一般によく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｓｉｌｈａｖｙ  ＴＪ，Ｂｅｎｎａｎ  ＭＬ  ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ  ＬＷ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｈｏｂｏｋｅｎ，  ＮＪ（１９８７）；及びＩｎｎｉｓ  ＭＡ，Ｇｅｌｆａｎｄ  ＤＨ，Ｓｎｉｎｓｋｙ  ＪＪ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ  ＴＪ（Ｅｄｉｔｏｒｓ），ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）において開示される。
【０１１２】
上記に開示されるとおりの親グルコシルトランスフェラーゼの同定は、任意選択的に、タンパク質配列決定工程を含む方法を介して実施することができる。このようなタンパク質配列決定工程は、例えば、Ｎ末端アミノ酸分析、Ｃ末端アミノ酸分析、エドマン分解法、又は質量分析法などの１つ以上の手法を含むことができる。
【０１１３】
上記に開示されるとおりの親グルコシルトランスフェラーゼの同定は、任意選択的に、タンパク質結合工程を含む方法を介して実施することができる。このようなタンパク質結合工程は、例えば、配列番号４内（例えば、配列番号４の５５〜９６０位内）のモチーフ又はエピトープに結合する抗体を用いて実施することができる。
【０１１４】
工程（ａ）（すなわち工程［ｂ］における改変前）で同定されたポリヌクレオチドは、いくつかの態様において、表１に開示される任意のグルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と同一であるか、又は少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．５％同一であるアミノ酸配列を含むグルコシルトランスフェラーゼをコードすることができる。このようなグルコシルトランスフェラーゼによって生成されるα−グルカンは、例えば、本明細書に開示されるものであり得る。
【０１１５】
本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を作製する方法は、工程（ａ）で同定された（親グルコシルトランスフェラーゼをコードする）ポリヌクレオチド配列を改変する工程（ｂ）を含む。このような改変は、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３、Ｐｒｏ−５５０、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ｔｒｐ−５７１、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、Ａｓｎ−５８１、Ｔｈｒ−５８５、又はＧｌｎ−６１６に対応する位置で親グルコシルトランスフェラーゼの少なくとも１つのアミノ酸を置換する。このような１つ以上の置換から生じる（改変されたポリヌクレオチド配列によってコードされる）非天然グルコシルトランスフェラーゼは、任意選択的に、本明細書において「子グルコシルトランスフェラーゼ」として特徴付けることができる。
【０１１６】
工程（ｂ）におけるポリヌクレオチドの好適な改変は、当該技術分野で知られる任意のＤＮＡ操作技術に従って行うことができる。改変工程（ｂ）は、任意選択的に、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで実施することができ、その後、非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列の合成が行われる。例えば、工程（ａ）で同定されたポリヌクレオチド配列は、好適な配列操作プログラム／ソフトウェア（例えば、ＶＥＣＴＯＲ  ＮＴＩ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；ＤＮＡＳｔｒｉｄｅｒ；ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いてｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで操作され得る。このような仮想的な操作の後、改変ポリヌクレオチド配列を、任意の好適な技術（例えば、オリゴヌクレオチドのアニーリングに基づく連結又はＨｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４９８：２７７−３０９（この文献は、参照により本明細書に組み込まれる）において開示される任意の技術）によって人工的に合成することができる。前述の方法論が（親グルコシルトランスフェラーゼをコードする）既存のポリヌクレオチドを有していることに必ず依存するとは考えられないことが理解されなければならない。
【０１１７】
改変工程（ｂ）は、任意選択的に、工程（ａ）で同定された親グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列の物理的なコピーを用いて実施することができる。例として、そのようなポリヌクレオチドは、増幅された産物が本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするような方法で設計されたプライマーを用いる、増幅のための鋳型として役立ち得る（例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｂｉｄ．を参照されたい）。
【０１１８】
本方法におけるアミノ酸置換は、本明細書に開示されるとおりのそれらの１つ以上の置換のいずれかであり得る。基本的には、本明細書で開示されるとおりの任意の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、例えば、本方法によって作製されるとおりのポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【０１１９】
本明細書に開示される組成物及び方法の非限定的な例としては、以下が挙げられる。
１．配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３、Ｐｒｏ−５５０、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ｔｒｐ−５７１、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、Ａｓｎ−５８１、Ｔｈｒ−５８５、又はＧｌｎ−６１６に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含む非天然グルコシルトランスフェラーゼであって、非天然グルコシルトランスフェラーゼが、α−１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを合成し、且つ不溶性α−グルカンの分子量が、置換位置で非天然グルコシルトランスフェラーゼと異なるのみの第２のグルコシルトランスフェラーゼによって合成される不溶性α−グルカンの分子量よりも小さい、非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１２０】
２．配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、又はＧｌｎ−６１６に対応する位置で、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、実施形態１の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１２１】
３．（ｉ）アミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３に対応する位置でのアミノ酸置換が、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒ残基によるものであり；（ｉｉ）アミノ酸残基Ｐｒｏ−５５０に対応する位置でのアミノ酸置換が、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＩｌｅ残基によるものであり；（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｓｅｒ−５５３に対応する位置でのアミノ酸置換が、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、又はＴｙｒ残基によるものであり；（ｉｖ）アミノ酸残基Ａｓｎ−５５７に対応する位置でのアミノ酸置換が、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＳｅｒ残基によるものであり；（ｖ）アミノ酸残基Ａｓｎ−５５８に対応する位置でのアミノ酸置換が、Ａｓｐ又はＧｌｕ残基によるものであり；（ｖｉ）アミノ酸残基Ｔｒｐ−５７１に対応する位置でのアミノ酸置換が、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、又はＳｅｒ残基によるものであり；（ｖｉｉ）アミノ酸残基Ａｓｎ−５７３に対応する位置でのアミノ酸置換が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、又はＴｒｐ残基によるものであり；（ｖｉｉｉ）アミノ酸残基Ａｓｐ−５７５に対応する位置でのアミノ酸置換が、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒ残基によるものであり；（ｉｘ）アミノ酸残基Ｌｙｓ−５７８に対応する位置でのアミノ酸置換が、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒ残基によるものであり；（ｘ）アミノ酸残基Ａｓｎ−５８１に対応する位置でのアミノ酸置換が、Ｐｒｏ又はＧｌｙ残基によるものであり；（ｘｉ）アミノ酸残基Ｔｈｒ−５８５に対応する位置でのアミノ酸置換が、Ｐｒｏ又はＧｌｙ残基によるものであり；且つ／又は（ｘｉｉ）アミノ酸残基Ｇｌｎ−６１６に対応する位置でのアミノ酸置換が、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒ残基によるものである、実施形態１又は２の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１２２】
４．２つ以上のアミノ酸置換を含み、置換の少なくとも１つが、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３、Ｐｒｏ−５５０、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ｔｒｐ−５７１、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、Ａｓｎ−５８１、Ｔｈｒ−５８５、又はＧｌｎ−６１６に対応する位置におけるものである、実施形態１、２、又は３の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１２３】
５．配列番号６２のアミノ酸残基Ｐｒｏ−５５０、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ａｓｎ−５８１、又はＴｈｒ−５８５に対応する位置で、少なくとも１つのアミノ酸置を含み；任意選択的に、（ｉ）アミノ酸残基Ｐｒｏ−５５０に対応する位置でのアミノ酸置換が、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＩｌｅ残基によるものであり；（ｉｉ）アミノ酸残基Ａｓｎ−５５７に対応する位置でのアミノ酸置換が、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＳｅｒ残基によるものであり；（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ａｓｎ−５５８に対応する位置でのアミノ酸置換が、Ａｓｐ又はＧｌｕ残基によるものであり；（ｉｖ）アミノ酸残基Ａｓｎ−５８１に対応する位置でのアミノ酸置換が、Ｐｒｏ又はＧｌｙ残基によるものであり；且つ／又は（ｖ）アミノ酸残基Ｔｈｒ−５８５に対応する位置でのアミノ酸置換が、Ｐｒｏ又はＧｌｙ残基によるものである、実施形態４の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１２４】
６．不溶性α−グルカンが、少なくとも約５０％のα−１，３−グリコシド結合を含む、実施形態１、２、３、４、又は５の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１２５】
７．不溶性α−グルカンが、少なくとも約９０％のα−１，３グリコシド結合を含む、実施形態６の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１２６】
８．不溶性α−グルカンが、約３００未満の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する、実施形態１、２、３、４、５、６、又は７の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１２７】
９．不溶性α−グルカンが、約１５０未満のＤＰｗを有する、実施形態８の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１２８】
１０．不溶性α−グルカンが、約７５未満のＤＰｗを有する、実施形態９の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１２９】
１１．配列番号４の残基５５〜９６０、配列番号６５の残基５４〜９５７、配列番号３０の残基５５〜９６０、配列番号２８の残基５５〜９６０、又は配列番号２０の残基５５〜９６０と少なくとも約９０％同一である触媒ドメインを含む、実施形態６、７、８、９、又は１０の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１３０】
１２．配列番号４、配列番号６５、配列番号３０、配列番号２８、又は配列番号２０と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１１の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１３１】
１３．不溶性α−グルカンの分子量が、第２のグルコシルトランスフェラーゼによって合成される不溶性α−グルカンの分子量よりも少なくとも約１０％小さい、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
【０１３２】
１４．実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、任意選択的に、１つ以上の調節配列がヌクレオチド配列に作動可能に連結され、好ましくは、１つ以上の調節配列がプロモーター配列を含む、ポリヌクレオチド。
【０１３３】
１５．水、スクロース、及び実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼを含む反応組成物。
【０１３４】
１６．α−１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを生成する方法であって、（ａ）少なくとも水、スクロース、及び実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させることであって、それにより、α−１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンが生成される、接触させること；及び（ｂ）任意選択的に、工程（ａ）で生成された不溶性α−グルカンを単離することを含む、方法。
【０１３５】
１７．非天然グルコシルトランスフェラーゼ（例えば、実施形態１〜１３のいずれか１つの）をコードするポリヌクレオチド配列を作製する方法であって：（ａ）（ｉ）配列番号４又は配列番号４の５５〜９６０位と少なくとも約４０％同一であるアミノ酸配列を含み、且つ（ｉｉ）α−１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを合成する親グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を同定すること；及び（ｂ）工程（ａ）で同定されたポリヌクレオチド配列を改変して、配列番号６２のアミノ酸残基Ｌｅｕ−５１３、Ｐｒｏ−５５０、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ｔｒｐ−５７１、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、Ａｓｎ−５８１、Ｔｈｒ−５８５、又はＧｌｎ−６１６に対応する位置において親グルコシルトランスフェラーゼの少なくとも１つのアミノ酸を置換し、それにより、不溶性α−グルカンの分子量が、親グルコシルトランスフェラーゼによって合成される不溶性α−グルカンの分子量よりも小さいα−１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを合成する非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を提供することを含む、方法。
【０１３６】
１８．同定する工程が：（ａ）ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで、（ｂ）核酸ハイブリダイゼーション工程を含む方法を用いて、（ｃ）タンパク質配列決定工程を含む方法を用いて、及び／若しくは（ｄ）タンパク質結合工程を含む方法を用いて実施され、且つ／又は改変する工程が、（ｅ）ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで実施され、その後非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列の合成が行われるか、若しくは（ｆ）親グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列の物理的なコピーを使用して実施される、実施形態１７の方法。
【実施例】
【０１３７】
以下の実施例において、本開示をさらに例示する。これらの実施例は、本明細書の特定の好ましい態様を示しているが、単に説明の目的でのみ示されていると理解されるべきである。上述の考察及びこれらの実施例から、当業者であれば、本明細書に開示した実施形態の本質的な特徴を確認することができ、本発明の趣旨及び範囲を逸脱しない範囲において、本明細書に開示した実施形態を様々な使用及び条件に適合させるために様々な変更及び修飾をなし得る。
【０１３８】
実施例１
グルコシルトランスフェラーゼα−グルカン生成物の分子量に影響を及ぼすアミノ酸部位の分析
本実施例は、分子量が減少したα−グルカンを生成するグルコシルトランスフェラーゼバリアントに関するスクリーニングについて記載する。
【０１３９】
本実施例におけるアミノ酸置換を作製するために使用されるグルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、配列番号４（ＧＴＦ  ６８５５）であったが、これは、本質的にはストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ＳＫ１２６（表１を参照されたい）由来の全長野生型グルコシルトランスフェラーゼ（配列番号６２によって表される）のＮ末端がトランケートされた（シグナルペプチド及び可変領域が除去された）バージョンである。配列番号４においてなされる置換は、配列番号４の各アミノ酸残基／位置（配列番号４のＭｅｔ−１残基を除く）が配列番号６２内のアミノ酸残基／位置と適宜に対応するため、天然のアミノ酸残基に対する置換として特徴付けられ得る。少なくともスクロース及び水を含む反応において、配列番号４のグルコシルトランスフェラーゼは、典型的には、約１００％のα−１，３結合及び４００以上の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有するα−グルカンを生成する（例えば、米国特許第８８７１４７４号明細書及び同第９１６９５０６号明細書並びに米国特許出願公開第２０１７／０００２３３６号明細書（これらの文献は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。不溶性であるこのα−グルカン生成物は、例えば、濾過を介して酵素的合成後に単離することができる。
【０１４０】
単一変異は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に基づく変異誘発プロトコル（ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ  ＬＩＧＨＴＮＩＮＧ部位特異的変異誘発キット、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して、配列番号４をコードするＤＮＡ配列に個別に導入された。各変異に関して、変異を含有するＤＮＡ配列は、配列番号４をコードするＤＮＡ鋳型、変異をコードするフォワードプライマー、及び共有のリバースプライマーによるＰＣＲを使用して生成された。
【０１４１】
ＧＴＦ  ６８５５（配列番号４）の様々な単一アミノ酸置換バリアントを個別に発現するためのプラスミド（ｐＢＡＤベクターに基づく）を使用して、１つの追加のノックアウト（ΔｉｌｖＣ）を有するＦ−、λ−、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＢＤ７９２（ＣＧＳＣ６１５９）の派生体である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｂｗ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）を形質転換した。１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天を使用して、形質転換体を選択した。クローン由来のプラスミドＤＮＡを個別に配列決定して、各々の目的の単一置換が正しく存在することを検証した。ＧＴＦ  ６８５５（配列番号４）及びその各々の単一アミノ酸置換バリアントを生成するために、上記の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂｗ２５１１３（ΔｉｌｖＣ）形質転換体を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン及び０．０２５％のＬ−アラビノースを含有するＬＢ培地中において３０℃で一晩個別に培養した。次に、細胞を収集し、ＢＵＧＢＵＳＴＥＲ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；体積は、培養体積の１０％であった）により室温で約１時間溶解した。溶解した細胞を遠心分離して、細胞片を除去し；ＧＴＦ  ６８５５（配列番号４）又はその単一アミノ酸置換バリアントを含有した各々の得られた上清を、グルカン重合反応（下記）のために使用した。
【０１４２】
ＧＴＦ  ６８５５（配列番号４）及びその各々の単一アミノ酸置換バリアントを、個別に、以下のものと同じであるか、又は類似したパラメータを有するグルカン合成反応に入れた：容器、７５ｒｐｍで撹拌される５０ｍＬのくぼみ付き振盪フラスコ；初期ｐＨ、５．７；反応体積、１０ｍＬ；スクロース、４００ｇ／Ｌ；ＧＴＦ、０．３ｍＬの培養上清（上記）；ＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭ；温度、３５℃；時間、約２日。次に、反応は、８０℃で３０分間熱不活性化された。反応で生成された不溶性グルカンポリマーを個別に収集し、水洗浄し、標準的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）手法により分子の大きさについて分析した。表３（下記）は、各々の不溶性グルカン生成物のＤＰｗを提供する。
【０１４３】
【表６】
2021514681.tif 000007
【０１４４】
【表７】
2021514681.tif 000008
【０１４５】
【表８】
2021514681.tif 000009
【０１４６】
表３におけるデータに基づくと、ＧＴＦ  ６８５５（配列番号４）におけるある種のアミノ酸置換は、未改変ＧＴＦ  ６８５５（配列番号４）によって生成される不溶性α−１，３−グルカンの分子量と比較して減少した分子量を有する不溶性α−１，３−グルカンを生成する酵素をもたらすことが明白である。不溶性グルカンを生成した表３におけるそれらの酵素に関して、４つのアミノ酸置換を除く全てのアミノ酸置換が、少なくとも約２３％の分子量の減少をもたらした；表３において列挙されるアミノ酸置換の３分の２を優に超えるものが、５０％以上の分子量減少をもたらした。例えば、最大約８６％の分子量の減少（Ｄ５７５Ｐ、Ｑ６１６Ｅ）が観察された。
【０１４７】
この実施例における前述のいずれかの部位（配列番号６２のＬｅｕ−５１３、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、又はＧｌｎ−６１６に相当する位置）での１つ以上の置換は、親非置換グルコシルトランスフェラーゼによって生成される不溶性α−１，３−グルカンのＤＰｗより著しく低いＤＰｗを有する不溶性α−１，３−グルカンの生成を可能にすると予想される。
【０１４８】
実施例２
グルコシルトランスフェラーゼによる不溶性α−グルカン合成に対するアミノ酸置換の組合せの効果の分析
この実施例は、グルコシルトランスフェラーゼに対する複数のアミノ酸置換の導入の効果及びその不溶性α−グルカン合成機能におけるそれらの効果を決定することについて記載する。この分析は、例えば、不溶性α−グルカン生成物の分子量を減少させるために上記で同定されたアミノ酸置換が、同様にこの分子量効果を付与する置換の組合せに含まれ得ることを示す。
【０１４９】
簡潔に述べると、配列番号４（ＧＴＦ  ６８５５、このグルコシルトランスフェラーゼの説明については、表１及び実施例１を参照されたい）に対して、部位特異的変異誘発によって特定の組合せのアミノ酸置換がなされた。各組合せに関して、ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ  ＬＩＧＨＴＮＩＮＧ部位特異的変異誘発キットを連続的な様式で使用して、配列番号４をコードする配列に対して各置換を導入した。置換の各組合せは、下の表４に列挙される。各々の改変されたグルコシルトランスフェラーゼをコードする配列は、個別に配列決定され、意図した変化を確認した。次に、各々のアミノ酸が改変されたグルコシルトランスフェラーゼが発現され、実施例１に従って作製された。
【０１５０】
グルカン合成反応は、実施例１において使用されたものと同じ、又は類似したパラメータを使用して、各々の改変されたグルコシルトランスフェラーゼにより実施され、その後、８０℃で３０分間各反応の熱不活性化が行われた。反応で生成された不溶性グルカンポリマーを個別に収集し、水洗浄し、標準的なＳＥＣ手法により分子の大きさについて分析した。表４（下記）は、各々の不溶性α−１，３−グルカン生成物のＤＰｗを提供する。
【０１５１】
【表９】
2021514681.tif 000010
【０１５２】
【表１０】
2021514681.tif 000011
【０１５３】
【表１１】
2021514681.tif 000012
【０１５４】
表４におけるデータに基づくと、ＧＴＦ  ６８５５（配列番号４）に対する複数のアミノ酸置換の導入（これらのうちのいくつかの組合せは、分子量を減少させる実施例１において示される置換を含む）は、比較的低い分子量の不溶性α−１，３−グルカンを生成する取り組みにおいて採用され得ることは明白である。例えば、これらのＤＰｗ値（表４）を、置換を有しないＧＴＦ  ６８５５（配列番号４）によって生成された不溶性α−１，３−グルカンの約３５０ＤＰｗと比較されたい（表３）。
【０１５５】
例えば、（ｉ）配列番号６２のＰｒｏ−５５０、Ａｓｎ−５５７、Ａｓｎ−５５８、Ａｓｎ−５８１、及び／若しくはＴｈｒ−５８５、並びに／又は（ｉｉ）配列番号６２のＬｅｕ−５１３、Ｓｅｒ−５５３、Ａｓｎ−５７３、Ａｓｐ−５７５、Ｌｙｓ−５７８、及び／若しくはＧｌｎ−６１６に相当する位置でのものを含む複数の置換を有するグルコシルトランスフェラーゼが、減少した分子量を有する不溶性α−１，３−グルカンを生成できることは明白である。
【０１５６】
実施例３
１８．６％のα−１，２分枝を有するデキストラン及び低分子量のα−１，３−グルカンを生成するグルコシルトランスフェラーゼを含有する反応
この実施例は、１８．６％のα−１，２分枝を有するように予め改変されたデキストランプライマーを含有するグルコシルトランスフェラーゼ反応におけるα−１，３−グルカンの合成について記載する。これらの反応で使用されたグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、酵素の未改変の対応物によって作られたグルカン生成物と比較してより小さい分子量のα−１，３−グルカンを生成するように改変された（上記実施例において開示されるとおり）。デキストラン主鎖及びα−１，３−グルカンアームを含むグラフトコポリマーを合成した。
【０１５７】
α−１，２−分枝状デキストランが生成され、α−１，３−グルカン合成のためのグルコシルトランスフェラーゼ反応を刺激した。このプライマーの調製は、基本的に、国際公開第２０１７／０９１５３３号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１８／０２８２３８５号明細書（これらは、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているとおりに実施された。要約すると、分子量約１４ｋＤａ（約８９のＤＰｗ）の直鎖デキストラン（すなわち１００％のα−１，６グリコシド結合を有する多糖）は、グルコシルトランスフェラーゼＧＴＦ８１１７を用いて生成された。次に、このデキストランは、α−１，２−分枝酵素ＧＴＦＪ１８Ｔ１を使用して、１８．６％のα−１，２−分枝を有するように改変された。得られたデキストラン（約１０４（約１７ｋＤａ）のＤＰｗ及び１８．６％のα−１，２−分岐を有した）は、本明細書においてＰ５プライマーと呼ばれる。
【０１５８】
次に、Ｐ５プライマーを、グルコシルトランスフェラーゼを含むα−１，３−グルカン合成反応に含ませ、デキストラン主鎖及びα−１，３−グルカンアームを含むグラフトコポリマーを生成した。これらの反応において使用されるグルコシルトランスフェラーゼは、上の実施例２において記載されるとおりの非天然のものである（表４）。本実施例の酵素調製は、以下のとおりに実施された。要約すると、グルコシルトランスフェラーゼを異種発現するＫＯＢＷ−３ａ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのアンピシリン及び０．０２５％のＬ−アラビノースを含有するＬＢ培地において３０℃で一晩増殖させた。遠心分離により細胞をペレット化し、続いて１０体積％のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）タンパク質抽出試薬（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により、室温で少なくとも１時間溶解させた。遠心分離により細胞片を除去した後、透明な細胞溶解物を試験のために回収した。
【０１５９】
１３個の別個の４．０ｍＬのα−１，３−グルカン合成反応をガラスの５０ｍＬくぼみ付きフラスコで実施した。各反応は、水、スクロース（およそ２０、５０、又は２００ｇ／Ｌ）、リン酸緩衝液（５ｍＭ、ｐＨ５．７）、任意選択的にＰ５プライマー（およそ０．２、１．０、又は５．０ｇ／Ｌ）、及びグルコシルトランスフェラーゼ（上記）を含んだ。反応物は、適切な量のＰ５プライマー（５０ｇ／Ｌの原液を使用する）、０．２ｍＬの細胞溶解物（グルコシルトランスフェラーゼ含有する）及び対応する緩衝液を混合することにより調製された。これらの調製物の各々及びスクロース原液（４００ｇ／Ｌ）を３５℃で少なくとも３０分間温めた。次に、適切な体積のスクロース溶液を各調製物に添加し、α−１，３−グルカン合成を開始させた。反応は、３５℃で約６０時間振盪（１０ｒｐｍ）しながら実施した。このインキュベーションに続いて、反応内容物全体を１５ｍＬの遠心管に個別に移し、８５℃のオーブンに約３０分間入れて、グルコシルトランスフェラーゼを不活性化し、それによって反応を停止させた。各反応で生成された約３００〜５００ｍｇの湿潤ケークをＳＥＣにより分析して、不溶性ポリマー生成物の分子量及びＤＰを決定した。表５は、これらの分析の結果を示す。
【０１６０】
【表１２】
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【０１６１】
各プライマー含有反応のグルカン生成物でプライマー上にグラフトされた個別のα−１，３−グルカンアームのサイズは、追加のプライマーを含有しない対照反応で生成されたα−１，３−グルカンのサイズと非常に類似していると考えられる。対照反応生成物は、α−１，３−グルカンホモポリマーを含んだ。とはいえ、プライマーの濃度が反応系列の各セット（２０、５０又は２００ｇ／Ｌのスクロース）で増加すると、グラフトコポリマー生成物ＤＰｗが大幅に減少したことは、注目に値する。
【０１６２】
したがって、本開示の非天然グルコシルトランスフェラーゼを使用して、デキストラン主鎖及びα−１，３−グルカンアームを含むグラフトコポリマーが合成された。プライマーは、明らかに消費され、グラフトコポリマー生成物に組み込まれた。α−１，２−分岐デキストランは、この実施例においてプライマーとして使用されたが、α−１，３−グルカン合成は、α−１，２−分岐により改変されていないデキストランを使用する場合にも（上記のとおり）観察された（データは示さず）。
【０１６３】
実施例４
９．７％のα−１，２分枝を有するデキストラン及び低分子量のα−１，３−グルカンを生成するグルコシルトランスフェラーゼを含有する反応
この実施例は、９．７％のα−１，２分枝を有するように予め改変されたデキストランプライマーを含有するグルコシルトランスフェラーゼ反応におけるα−１，３−グルカンの合成について記載する。これらの反応で使用されたグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、酵素の未改変の対応物によって生成されたグルカン生成物と比較してより小さい分子量のα−１，３−グルカンを生成するように改変された（上記実施例において開示されるとおり）。デキストラン主鎖及びα−１，３−グルカンアームを含むグラフトコポリマーを合成した。
【０１６４】
α−１，２−分枝状デキストランを生成し、α−１，３−グルカン合成のためのグルコシルトランスフェラーゼ反応を刺激した。このプライマーの調製は、基本的に、国際公開第２０１７／０９１５３３号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１８／０２８２３８５号明細書において開示されるとおりに実施された。要約すると、分子量約４０ｋＤａ（約２５０のＤＰｗ）の直鎖デキストラン（すなわち１００％のα−１，６グリコシド結合を有する多糖）は、グルコシルトランスフェラーゼＧＴＦ６８３１を用いて生成された。次に、このデキストランは、α−１，２−分枝酵素ＧＴＦＪ１８Ｔ１を使用して、９．７％のα−１，２−分枝を有するように改変された。結果的なα−１，２−分枝状デキストラン（約２７１（約４４ｋＤａ）のＤＰｗを有した）は、本明細書においてＰ６プライマーと呼ばれる。
【０１６５】
次に、Ｐ６プライマーを、グルコシルトランスフェラーゼを含むα−１，３−グルカン合成反応に含ませ、デキストラン主鎖及びα−１，３−グルカンアームを含むグラフトコポリマーを生成した。本反応で使用したグルコシルトランスフェラーゼは、実施例３で使用して作製したものと同一であった。
【０１６６】
１３個の別個の４．０ｍＬのα−１，３−グルカン合成反応をガラスの５０ｍＬくぼみ付きフラスコで実施した。各反応は、水、スクロース（およそ２０、５０、又は２００ｇ／Ｌ）、リン酸緩衝液（５ｍＭ、ｐＨ５．７）、任意選択的にＰ６プライマー（およそ０．２、１．０、又は５．０ｇ／Ｌ）、及びグルコシルトランスフェラーゼ（上記）を含んだ。反応物は、適切な量のＰ６プライマー（５０ｇ／Ｌの原液を使用する）、０．２ｍＬの細胞溶解物（グルコシルトランスフェラーゼ含有する）及び対応する緩衝液を混合することにより調製された。これらの調製物の各々及びスクロースストック溶液（４００ｇ／Ｌ）を３５℃で少なくとも３０分間温めた。次に、適切な体積のスクロース溶液を各調製物に添加し、α−１，３−グルカン合成を開始させた。反応は、３５℃で約６０時間振盪（１０ｒｐｍ）しながら実施した。このインキュベーションに続いて、反応内容物全体を１５ｍＬの遠心管に個別に移し、８５℃のオーブンに約３０分間入れて、グルコシルトランスフェラーゼを不活性化し、それによって反応を停止させた。各反応で生成された約３００〜５００ｍｇの湿潤ケークをＳＥＣにより分析して、不溶性ポリマー生成物の分子量及びＤＰを決定した。表６は、これらの分析の結果を示す。
【０１６７】
【表１３】
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【０１６８】
各プライマー含有反応のグルカン生成物でプライマー上にグラフトされた個別のα−１，３−グルカンアームのサイズは、追加のプライマーを含有しない対照反応で生成されたα−１，３−グルカンのサイズと非常に類似していると考えられる。対照反応生成物は、α−１，３−グルカンホモポリマーを含んだ。とはいえ、一般に、プライマーの濃度が反応系列の各セット（２０、５０又は２００ｇ／Ｌのスクロース）で増加すると、グラフトコポリマー生成物ＤＰｗが大幅に減少したことは、注目に値する。したがって、実施例３と同様に、本開示の非天然グルコシルトランスフェラーゼを使用して、デキストラン主鎖及びα−１，３−グルカンアームを含むグラフトコポリマーが合成された。プライマーは、明らかに消費され、グラフトコポリマー生成物に組み込まれた。
【配列表】
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【国際調査報告】
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