(57)【要約】本開示は、ＭＡＧＥ−Ｂ２特異的Ｔ細胞を生成するための方法、および操作されたＭＡＧＥ−Ｂ２特異的Ｔ細胞受容体を含む組成物を提供する。さらに、がんを処置する方法であって、ＭＡＧＥ−Ｂ２特異的Ｔ細胞を投与することを含む方法が提供される。本開示のある特定の実施形態は、黒色腫関連抗原Ｂ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）に由来する抗原ペプチドを結合することができるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。一実施形態では、ＴＣＲは、配列番号３の配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するＴＣＲアルファポリペプチド、および配列番号５の配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するＴＣＲベータポリペプチドを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
黒色腫関連抗原Ｂ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）に由来する抗原ペプチドを結合することができる単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、配列番号３または１９の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＴＣＲアルファポリペプチドおよび配列番号５または２２の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＴＣＲベータポリペプチドを含むＴ細胞受容体。
【請求項２】
前記抗原ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性である、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項３】
前記抗原ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性である、請求項２に記載のＴＣＲ。
【請求項４】
前記ＴＣＲアルファポリペプチドが、ＣＤＲ１（配列番号７）、ＣＤＲ２（配列番号９）、およびＣＤＲ３（配列番号１１）に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、前記ＴＣＲベータポリペプチドが、ＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１５）、およびＣＤＲ３（配列番号１７）に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項５】
前記ＴＣＲアルファポリペプチドが、ＣＤＲ１（配列番号７）、ＣＤＲ２（配列番号９）、およびＣＤＲ３（配列番号１１）に対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み、前記ＴＣＲベータポリペプチドが、ＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１５）、およびＣＤＲ３（配列番号１７）に対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項６】
前記ＴＣＲアルファポリペプチドが、ＣＤＲ１（配列番号７）、ＣＤＲ２（配列番号９）、およびＣＤＲ３（配列番号１１）の配列を含み、前記ＴＣＲベータポリペプチドが、ＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１５）、およびＣＤＲ３（配列番号１７）の配列を含む、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、配列番号３の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有し、ＴＣＲベータポリペプチドが、配列番号５の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項８】
前記ＴＣＲアルファポリペプチドが、配列番号３の配列に対して少なくとも９９％の同一性を有し、前記ＴＣＲベータポリペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項９】
前記ＴＣＲアルファポリペプチドが配列番号３の配列を有し、前記ＴＣＲベータポリペプチドが配列番号５の配列を有する、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項１０】
前記ＴＣＲアルファポリペプチドが、ＣＤＲ１（配列番号２３）、ＣＤＲ２（配列番号２５）、およびＣＤＲ３（配列番号２７）に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、前記ＴＣＲベータポリペプチドが、ＣＤＲ１（配列番号２９）、ＣＤＲ２（配列番号３１）、およびＣＤＲ３（配列番号３３）に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項１１】
前記ＴＣＲアルファポリペプチドが、ＣＤＲ１（配列番号２３）、ＣＤＲ２（配列番号２５）、およびＣＤＲ３（配列番号２７）に対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み、前記ＴＣＲベータポリペプチドが、ＣＤＲ１（配列番号２９）、ＣＤＲ２（配列番号３１）、およびＣＤＲ３（配列番号３３）に対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項１２】
前記ＴＣＲアルファポリペプチドが、ＣＤＲ１（配列番号２３）、ＣＤＲ２（配列番号２５）、およびＣＤＲ３（配列番号２７）の配列を含み、前記ＴＣＲベータポリペプチドが、ＣＤＲ１（配列番号２９）、ＣＤＲ２（配列番号３１）、およびＣＤＲ３（配列番号３３）の配列を含む、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、配列番号１９の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有し、ＴＣＲベータポリペプチドが、配列番号２２の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項１４】
前記ＴＣＲアルファポリペプチドが、配列番号１９の配列に対して少なくとも９９％の同一性を有し、前記ＴＣＲベータポリペプチドが、配列番号２２のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項１５】
前記ＴＣＲアルファポリペプチドが配列番号１９の配列を有し、前記ＴＣＲベータポリペプチドが配列番号２２の配列を有する、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項１６】
膜貫通ドメインを欠く可溶性ＴＣＲである、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項１７】
検出可能な標識をさらに含む、請求項１６に記載のＴＣＲ。
【請求項１８】
治療剤をさらに含む、請求項１６または請求項１７に記載のＴＣＲ。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれかに記載の複数のＴＣＲを含む、多価ＴＣＲ複合体。
【請求項２０】
前記多価ＴＣＲが、２、３、４またはそれよりも多いＴＣＲを含む、請求項１９に記載の複合体。
【請求項２１】
前記多価ＴＣＲが、脂質二重層中に存在するか、または粒子に付着している、請求項２０に記載の複合体。
【請求項２２】
前記ＴＣＲが、リンカー分子を介してコンジュゲートされている、請求項２０に記載の複合体。
【請求項２３】
ＣＤＲ１（配列番号７）、ＣＤＲ２（配列番号９）、およびＣＤＲ３（配列番号１１）の配列を含むＴＣＲアルファポリペプチド、ならびに／またはＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１５）、およびＣＤＲ３（配列番号１７）の配列を含むＴＣＲベータポリペプチドを含む、ポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＴＣＲアルファポリペプチド、および／または配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＴＣＲベータポリペプチドを含む、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＴＣＲアルファポリペプチド、および／または配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＴＣＲベータポリペプチドを含む、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号３のＴＣＲアルファポリペプチドおよび配列番号５のＴＣＲベータポリペプチドを含む、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号３のＴＣＲアルファポリペプチドを含む、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号５のＴＣＲベータポリペプチドを含む、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
ＣＤＲ１（配列番号２３）、ＣＤＲ２（配列番号２５）、およびＣＤＲ３（配列番号２７）の配列を含むＴＣＲアルファポリペプチド、ならびに／またはＣＤＲ１（配列番号２９）、ＣＤＲ２（配列番号３１）、およびＣＤＲ３（配列番号３３）の配列を含むＴＣＲベータポリペプチドを含む、ポリペプチド。
【請求項３０】
配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＴＣＲアルファポリペプチド、および／または配列番号２２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するＴＣＲベータポリペプチドを含む、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＴＣＲアルファポリペプチド、および／または配列番号２２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するＴＣＲベータポリペプチドを含む、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
配列番号１９のＴＣＲアルファポリペプチドおよび配列番号２２のＴＣＲベータポリペプチドを含む、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
配列番号１９のＴＣＲアルファポリペプチドを含む、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
配列番号２２のＴＣＲベータポリペプチドを含む、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
請求項２３から３４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３６】
請求項１から１８のいずれかに記載のＴＣＲを含む発現ベクター。
【請求項３７】
ウイルスベクターである、請求項３６に記載の発現ベクター。
【請求項３８】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項３７に記載の発現ベクター。
【請求項３９】
リンカードメインをさらに含む、請求項３６から３８のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項４０】
前記リンカードメインが、前記ＴＣＲアルファポリペプチドと前記ＴＣＲベータポリペプチドとの間にある、請求項３９に記載の発現ベクター。
【請求項４１】
前記リンカードメインが、１つまたは複数の切断部位を含む、請求項３９または請求項４０に記載の発現ベクター。
【請求項４２】
前記１つまたは複数の切断部位が、フューリン切断部位および／またはＰ２Ａ切断部位である、請求項４１に記載の発現ベクター。
【請求項４３】
前記１つまたは複数の切断部位が、スペーサーによって分離している、請求項４１または請求項３９に記載の発現ベクター。
【請求項４４】
前記スペーサーが、ＳＧＳＧまたはＧＳＧである、請求項４３に記載の発現ベクター。
【請求項４５】
前記ＴＣＲアルファポリペプチドおよび前記ＴＣＲベータポリペプチドが、ＩＲＥＳ配列によって連結している、請求項３９に記載の発現ベクター。
【請求項４６】
請求項１から１８のいずれかに記載のＴＣＲを発現するように操作された宿主細胞。
【請求項４７】
免疫細胞である、請求項４６に記載の宿主細胞。
【請求項４８】
ＮＫ細胞、インバリアントＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項４６に記載の宿主細胞。
【請求項４９】
臍帯または血液から単離されている、請求項４６に記載の宿主細胞。
【請求項５０】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞または末梢血リンパ球である、請求項４６に記載の宿主細胞。
【請求項５１】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはγδ  Ｔ細胞である、請求項５０に記載の宿主細胞。
【請求項５２】
同種異系または自家である、請求項５０に記載の宿主細胞。
【請求項５３】
請求項４６から５２のいずれかに記載のＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ特異的細胞の集団を含む医薬組成物。
【請求項５４】
ＭＡＧＥ−Ｂ２特異的免疫細胞を操作するための方法であって、前記免疫細胞を、請求項３６から４４のいずれかに記載の発現ベクターと接触させることを含む方法。
【請求項５５】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、末梢血リンパ球、ＮＫ細胞、インバリアントＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
接触させることが、トランスフェクトすることまたは形質導入することとしてさらに定義される、請求項５４または請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記末梢血リンパ球が、ＯＫＴ３およびＩＬ−２で刺激される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記免疫細胞を選別してＴＣＲ操作されたＴ細胞を単離すること、連続希釈によるＴ細胞クローニングを実施すること、および急速拡大プロトコールによってＴ細胞クローンを拡大することをさらに含む、請求項５４から５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
がんの処置のための、請求項４６から５２のいずれか一項に記載の、治療有効量のＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ特異的細胞の使用。
【請求項６０】
前記ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ特異的細胞がＴ細胞である、請求項５９に記載の使用。
【請求項６１】
被験体におけるがんの処置のための、請求項４６から５２のいずれか一項に記載の治療有効量のＭＡＧＥ−Ｂ２特異的細胞を含む組成物。
【請求項６２】
前記ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ特異的細胞がＴ細胞である、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６３】
被験体におけるがんを処置する方法であって、請求項４６から５２のいずれか一項に記載の治療有効量のＭＡＧＥ−Ｂ２特異的細胞を、前記被験体に投与することを含む方法。
【請求項６４】
前記ＭＡＧＥ−Ｂ２特異的細胞がＴ細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記被験体が、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０３、ＨＬＡ−Ａ＊０２０４またはＨＬＡ−Ａ＊０２０５対立遺伝子を有すると同定される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記治療有効量のＭＡＧＥ−Ｂ２特異的Ｔ細胞の投与の前に、前記被験体に対してリンパ球枯渇を実施するステップをさらに含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記治療有効量のＭＡＧＥ−Ｂ２特異的Ｔ細胞が、抗腫瘍活性を有する自家腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の試料に由来する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＭＡＧＥ−Ｂ２特異的細胞が、前記被験体に、静脈内、腹腔内、または腫瘍内投与される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記被験体が、ヒトである、請求項６３に記載の方法。
【請求項７０】
少なくとも１つの追加の治療剤を前記被験体に投与するステップをさらに含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項７１】
前記少なくとも１つの追加の治療剤が、化学療法、放射線療法、および免疫療法からなる群より選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記少なくとも１つの追加の治療剤が免疫療法である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記免疫療法が、免疫チェックポイント阻害剤である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＴＩＭ３、ＫＩＲ、またはアデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）からなる群より選択される免疫チェックポイントタンパク質またはそのリガンドを阻害する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４を阻害する、請求項７４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年４月１９日出願の米国仮特許出願第６２／６６０，０８３号の利益を主張し、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
２０１９年４月１９日に作成された２９ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定）である「ＵＴＦＣＰ１３７２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前のファイルに含有される配列表は、電子提出によって本明細書と共に出願され、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、一般に、薬および免疫学の分野に関する。より具体的には、黒色腫関連抗原Ｂ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）を特異的に認識するＴ細胞受容体に関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｔ細胞ベースの治療法は、多くのがんを処置するための方法として顕著な見込みを示しているが、残念なことに、このアプローチはまた、一般的ながんに対する免疫原性抗原標的の不足、および非がん性組織に対する潜在的な毒性によって妨げられてきた。これらのＴ細胞ベースの治療法は、養子細胞療法（ＡＣＴ）および／または抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発するワクチン接種アプローチを含むことができる。がんワクチン接種アプローチは、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡワクチンによる特異的抗原の送達、または樹状細胞（ＤＣ）ワクチンを使用した抗がん応答の誘発を含むことができる。
【０００５】
ＡＣＴは、一般に、例えば、がんを処置するために、活性化した自家腫瘍特異的Ｔ細胞を患者に注入することを伴う。ＡＣＴは、黒色腫患者に治療的臨床応答をもたらした。一般に、有効な抗腫瘍Ｔ細胞応答を発生させるには、通常、次の３つのステップ：抗原特異的Ｔ細胞をプライミングし、活性化させるステップ、活性化したＴ細胞を腫瘍部位へ移動させるステップ、および抗原特異的Ｔ細胞によって腫瘍を認識し、殺傷するステップが必要である。
【０００６】
標的抗原の選択は、有効な抗原特異的Ｔ細胞の誘発に重要である。黒色腫および他の少数の固形腫瘍の悪性疾患についていくつかの腫瘍関連抗原が同定されているが、膵臓がん、卵巣がん、胃がん、肺がん、子宮頸がん、乳がん、および頭頸部がんの免疫原性標的はほとんどない。がんの処置に有効であり、実質的なオフターゲットの副作用を回避するために必要なその発現パターン、特徴において免疫原性でも、腫瘍特異的でもある標的抗原が欠如している。したがって、これらの悪性疾患の追加の標的抗原に対する新規のＴ細胞ベースの治療法への満たされていない医学上の必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示のある特定の実施形態は、黒色腫関連抗原Ｂ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）に由来する抗原ペプチドを結合することができるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。一実施形態では、ＴＣＲは、配列番号３の配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するＴＣＲアルファポリペプチド、および配列番号５の配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するＴＣＲベータポリペプチドを含む。別の実施形態では、ＣＤＲ１（配列番号７）、ＣＤＲ２（配列番号９）、およびＣＤＲ３（配列番号１１）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するＴＣＲアルファポリペプチド、ならびにＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１５）、およびＣＤＲ３（配列番号１７）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含むＴＣＲベータポリペプチドを含むＴＣＲが提供される。特定の態様では、ＴＣＲは、配列番号３の配列を有するＴＣＲアルファポリペプチドおよび配列番号５の配列を有するＴＣＲベータポリペプチドを含む。
【０００８】
別の実施形態では、ＴＣＲは、配列番号１９の配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するＴＣＲアルファポリペプチド、および配列番号２２の配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するＴＣＲベータポリペプチドを含む。別の実施形態では、ＣＤＲ１（配列番号２３）、ＣＤＲ２（配列番号２５）、およびＣＤＲ３（配列番号２７）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するＴＣＲアルファポリペプチド、ならびにＣＤＲ１（配列番号２９）、ＣＤＲ２（配列番号３１）、およびＣＤＲ３（配列番号３３）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含むＴＣＲベータポリペプチドを含むＴＣＲが提供される。特定の態様では、ＴＣＲは、配列番号１９の配列を有するＴＣＲアルファポリペプチドおよび配列番号２２の配列を有するＴＣＲベータポリペプチドを含む。
【０００９】
一部の態様では、抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２拘束性である。一部の態様では、抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０３、ＨＬＡ−Ａ＊０２０４、またはＨＬＡ−Ａ＊０２０５拘束性である。特定の態様では、抗原ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性である。
【００１０】
一部の態様では、ＴＣＲは、膜貫通ドメインを欠く可溶性ＴＣＲである。ある特定の態様では、ＴＣＲは、検出可能な標識および／または治療剤をさらに含む。
【００１１】
別の実施形態では、実施形態による複数のＴＣＲ（例えば、ＭＡＧＥ−Ｂ２に由来する抗原ペプチドを結合することができるＴＣＲ）を含む多価ＴＣＲ複合体が提供される。一部の態様では、多価ＴＣＲは、２、３、４またはそれよりも多いＴＣＲを含む。ある特定の態様では、多価ＴＣＲは、脂質二重層中に存在するか、または粒子に付着している。ある特定の態様では、ＴＣＲはリンカー分子を介してコンジュゲートされている。
【００１２】
さらなる実施形態は、配列番号３の配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有するＴＣＲアルファポリペプチド、および／または配列番号５の配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有するＴＣＲベータポリペプチドを含むポリペプチドを提供する。別の実施形態は、ＣＤＲ１（配列番号７）、ＣＤＲ２（配列番号９）、およびＣＤＲ３（配列番号１１）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するＴＣＲアルファポリペプチド、ならびにＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１５）、およびＣＤＲ３（配列番号１７）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含むＴＣＲベータポリペプチドを含むポリペプチドを提供する。特定の態様では、ポリペプチドは、配列番号３のＴＣＲアルファポリペプチドおよび配列番号５のＴＣＲベータポリペプチドを含む。一部の態様では、ポリペプチドは、配列番号３のＴＣＲアルファポリペプチドを含む。ある特定の態様では、ポリペプチドは、配列番号５のＴＣＲベータポリペプチドを含む。本明細書でさらに提供されるのは、実施形態のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００１３】
さらなる実施形態は、配列番号１９の配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有するＴＣＲアルファポリペプチド、および／または配列番号２２の配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有するＴＣＲベータポリペプチドを含むポリペプチドを提供する。別の実施形態は、ＣＤＲ１（配列番号２３）、ＣＤＲ２（配列番号２５）、およびＣＤＲ３（配列番号２７）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するＴＣＲアルファポリペプチド、ならびにＣＤＲ１（配列番号２９）、ＣＤＲ２（配列番号３１）、およびＣＤＲ３（配列番号３３）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含むＴＣＲベータポリペプチドを含むポリペプチドを提供する。特定の態様では、ポリペプチドは、配列番号１９のＴＣＲアルファポリペプチドおよび配列番号２２のＴＣＲベータポリペプチドを含む。一部の態様では、ポリペプチドは、配列番号１９のＴＣＲアルファポリペプチドを含む。ある特定の態様では、ポリペプチドは、配列番号２２のＴＣＲベータポリペプチドを含む。本明細書でさらに提供されるのは、実施形態のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００１４】
別の実施形態では、実施形態のＴＣＲ（例えば、ＭＡＧＥ−Ｂ２に由来する抗原ペプチドを結合することができるＴＣＲ）を含む発現ベクターが提供される。一部の態様では、発現ベクターはウイルスベクターである。ある特定の態様では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。追加の態様では、ＴＣＲはリンカードメインを含む。一部の態様では、リンカードメインは、ＴＣＲアルファポリペプチドとＴＣＲベータポリペプチドとの間にある。ある特定の態様では、リンカードメインは、１つまたは複数の切断部位を含む。一部の態様では、１つまたは複数の切断部位は、フューリン切断部位および／またはＰ２Ａ切断部位である。一部の態様では、１つまたは複数の切断部位は、スペーサーによって分離している。特定の態様では、スペーサーはＳＧＳＧまたはＧＳＧである。一部の態様では、ＴＣＲアルファポリペプチドおよびＴＣＲベータポリペプチドは、ＩＲＥＳ配列によって連結している。
【００１５】
本明細書でさらに提供されるのは、実施形態のＴＣＲ（例えば、ＭＡＧＥ−Ｂ２に由来する抗原ペプチドを結合することができるＴＣＲ）を発現するように操作された宿主細胞である。
【００１６】
一部の態様では、細胞は免疫細胞である。ある特定の態様では、細胞は、臍帯または血液から単離される。一部の態様では、免疫細胞は、Ｔ細胞または末梢血リンパ球である。特定の態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはγδ  Ｔ細胞である。一部の態様では、関連するシグナル伝達分子は、ＴＣＲに付着することができ、ＴＣＲ係合の際に、非Ｔ細胞免疫エフェクター細胞において活性化シグナルを伝達する。ある特定の態様では、細胞は、ＮＫ細胞、インバリアントＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。一部の態様では、細胞は同種異系または自家である。本明細書でさらに提供されるのは、実施形態のＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ特異的細胞の集団を含む医薬組成物である。
【００１７】
本明細書でさらに提供されるのは、ＭＡＧＥ−Ｂ２特異的免疫細胞を操作するための方法であって、前記免疫細胞を実施形態の発現ベクターと接触させることを含む方法である。一部の態様では、免疫細胞は、Ｔ細胞、末梢血リンパ球、ＮＫ細胞、インバリアントＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞である。一部の態様では、接触させることは、トランスフェクトすることまたは形質導入することとしてさらに定義される。ある特定の態様では、末梢血リンパ球は、ＯＫＴ３およびＩＬ−２で刺激される。追加の態様では、方法は、免疫細胞を選別してＴＣＲ操作されたＴ細胞を単離すること、連続希釈によるＴ細胞クローニングを実施すること、および急速拡大プロトコールによるＴ細胞クローンの拡大をさらに含む。
【００１８】
別の実施形態では、がんの処置のための、実施形態による治療有効量のＭＡＧＥ−Ｂ２特異的ＴＣＲ発現細胞の使用が提供される。被験体におけるがんの処置のための、実施形態による有効量のＭＡＧＥ−Ｂ２特異的細胞を含む組成物も、本明細書で提供される。特定の態様では、ＭＡＧＥ−Ｂ２特異的ＴＣＲ発現細胞は、Ｔ細胞である。
【００１９】
別の実施形態では、被験体におけるがんを処置する方法であって、実施形態の治療有効量のＭＡＧＥ−Ｂ２特異的細胞（例えば、ＭＡＧＥ−Ｂ２に由来する抗原ペプチドを結合することができるＴＣＲを発現する）を被験体に投与することを含む方法が提供される。一部の態様では、ＭＡＧＥ−Ｂ２特異的細胞はＴ細胞である。
【００２０】
ある特定の態様では、被験体は、ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子、例えばＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０３、ＨＬＡ−Ａ＊０２０４またはＨＬＡ−Ａ＊０２０５対立遺伝子を有すると同定される。ある特定の態様では、被験体は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１対立遺伝子を有すると同定される。追加の態様では、方法は、治療有効量のＭＡＧＥ−Ｂ２特異的Ｔ細胞の投与の前に、被験体に対してリンパ球枯渇を実施するステップをさらに含む。一部の態様では、治療有効量のＭＡＧＥ−Ｂ２特異的Ｔ細胞は、抗腫瘍活性を有する自家腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の試料に由来する。一部の態様では、ＭＡＧＥ−Ｂ２特異的細胞は、被験体に静脈内、腹腔内、または腫瘍内投与される。特定の態様では、被験体はヒトである。一部の態様では、方法は、少なくとも１つの追加の治療剤を被験体に投与するステップをさらに含む。ある特定の態様では、少なくとも１つの追加の治療剤は、化学療法、放射線療法、および免疫療法からなる群より選択される。一部の態様では、少なくとも１つの追加の治療剤は免疫療法である。一部の態様では、免疫療法は免疫チェックポイント阻害剤である。ある特定の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＴＩＭ３、ＫＩＲ、またはアデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）からなる群より選択される免疫チェックポイントタンパク質またはそのリガンドを阻害する。一部の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４を阻害する。
【００２１】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに示すために含まれる。本発明は、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つまたは複数を参照することにより、よりよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、肺がん細胞株および不死化した正常ヒト小気道上皮細胞（ＨＳＡＥＣ１−ＫＴおよびＨＳＡＥＣ２−ＫＴ）におけるＭＡＧＥ−Ｂ２発現のウエスタンブロット検出を示す。
【００２３】
【図２】図２は、ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチド特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成を示す。ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＭＡＧＥ−Ｂ２エピトープ（ＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ）を有する四量体を含むＴ細胞集団の検出（左）。ＣＤ８＋四量体＋集団の選別および急速拡大プロトコール（ＲＥＰ）による拡大（中央）。限界希釈法を使用したＣＴＬクローンの生成（右）。
【００２４】
【図３−１】図３Ａ〜３Ｄは、ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＣＴＬクローンの殺傷能力の検出を示す。（図３Ａ）ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドでパルスされたＴ２細胞のペプチド滴定アッセイ。（図３Ｂ）５１Ｃｒ放出アッセイによる肺がん細胞株Ｈ２０２３（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１）および正常肺細胞株ＨＳＡＥＣ２−ＫＴ（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１）に対するＣＴＬクローンの細胞傷害。（図３Ｃ）肺がん細胞株Ｈ５２２、Ｈ１３５５、Ｈ１７５５およびＤＦＣ−１０３２に対するＣＴＬクローンの細胞傷害。（図３Ｄ）親肺がん細胞株ＰＣ−９およびＨ１５７３、ならびに両方の細胞株におけるＨＬＡ−Ａ２強制発現に対するＭＡＧＥ−Ｂ２  ＣＴＬクローンの細胞傷害。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｄは、ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＣＴＬクローンの殺傷能力の検出を示す。（図３Ａ）ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドでパルスされたＴ２細胞のペプチド滴定アッセイ。（図３Ｂ）５１Ｃｒ放出アッセイによる肺がん細胞株Ｈ２０２３（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１）および正常肺細胞株ＨＳＡＥＣ２−ＫＴ（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１）に対するＣＴＬクローンの細胞傷害。（図３Ｃ）肺がん細胞株Ｈ５２２、Ｈ１３５５、Ｈ１７５５およびＤＦＣ−１０３２に対するＣＴＬクローンの細胞傷害。（図３Ｄ）親肺がん細胞株ＰＣ−９およびＨ１５７３、ならびに両方の細胞株におけるＨＬＡ−Ａ２強制発現に対するＭＡＧＥ−Ｂ２  ＣＴＬクローンの細胞傷害。
【００２５】
【図４】図４は、ＭＡＧＥ−Ｂ２  Ｔ細胞受容体操作されたＴ細胞（ＴＣＲ−Ｔ）の生成を示す。活性化した同種異系ＰＢＭＣ（左）をレトロウイルスに感染させ、感染後にＣＤ８＋四量体＋が出現した（中央）。ＴＣＲ−Ｔ細胞株は、ＣＤ８＋四量体＋集団を選別し、拡大させることによって発生させた（右）。
【００２６】
【図５】図５Ａ〜Ｂは、ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ−Ｔ殺傷能力アッセイを示す。（図５Ａ）ペプチド滴定アッセイ。異なる濃度のＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドでパルスされたＴ２細胞。（図５Ｂ）標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによって検出された肺がん細胞株Ｈ２０２３（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１）および正常肺細胞株ＨＳＡＥＣ２−ＫＴ（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１）に対するＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ−Ｔの細胞傷害。
【００２７】
【図６−１】図６は、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によるＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ−Ｔ機能的検出を示す。
【図６−２】図６は、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によるＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ−Ｔ機能的検出を示す。
【図６−３】図６は、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によるＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ−Ｔ機能的検出を示す。
【００２８】
【図７−１】図７は、健康なドナーＰＢＭＣとの樹状細胞−Ｔ細胞（ＤＣ−Ｔ）共培養系からのＭＡＧＥ−Ｂ２特異的Ｔ細胞産物の代表的生成を示す。ＭＢ２−２３１ペプチドパルスＤＣを使用した２回の刺激後、１枚の４８ウェルプレートのうちの３つのウェル内でＣＤ８＋／四量体＋の小集団が観察された。３つの陽性ウェルを、四量体誘導選別技術を使用して別々に選別し、ＲＥＰにより１回または２回の拡大を行った。最終産物のＣＤ８および四量体染色を示す。
【図７−２】図７は、健康なドナーＰＢＭＣとの樹状細胞−Ｔ細胞（ＤＣ−Ｔ）共培養系からのＭＡＧＥ−Ｂ２特異的Ｔ細胞産物の代表的生成を示す。ＭＢ２−２３１ペプチドパルスＤＣを使用した２回の刺激後、１枚の４８ウェルプレートのうちの３つのウェル内でＣＤ８＋／四量体＋の小集団が観察された。３つの陽性ウェルを、四量体誘導選別技術を使用して別々に選別し、ＲＥＰにより１回または２回の拡大を行った。最終産物のＣＤ８および四量体染色を示す。
【００２９】
【図８−１】図８Ａ〜８Ｅは、ＭＡＧＥ−Ｂ２特異的Ｔ細胞の機能的アビディティーを示す。（図８Ａ）２０：１のエフェクター  対  標的（Ｅ：Ｔ）比を用いた、３種のＭＡＧＥ−Ｂ２  ＣＴＬ細胞株による種々の濃度のＭＢ２−２３１ペプチドでパルスされたＴ２細胞の溶解。（図８Ｂ）種々のＥ：Ｔ比での、３種のＭＡＧＥ−Ｂ２  ＣＴＬ細胞株によるＭＡＧＥ−Ｂ２発現腫瘍細胞株Ｈ２０２３（ＨＬＡ−Ａ２＋）の溶解。正常肺細胞株ＨＳＡＥＣ２−ＫＴ（ＭＡＧＥ−Ｂ２−、ＨＬＡ−Ａ２＋）は、陰性対照である。（図８Ｃ）種々のＥ：Ｔ比での、３種のＭＡＧＥ−Ｂ２  ＣＴＬ細胞株によるＭＡＧＥ−Ｂ２発現およびＨＬＡ−Ａ２強制発現腫瘍細胞株Ｈ１２９９−Ａ２の溶解。親細胞株Ｈ１２９９（ＨＬＡ−Ａ２−）は、陰性対照である。（図８Ｄ〜８Ｅ）３種のＭＡＧＥ−Ｂ２  ＣＴＬ細胞株による、より多くの腫瘍細胞株Ｈ１３９５（ＭＡＧＥ−Ｂ２＋、ＨＬＡ−Ａ２＋）、Ｈ５２２（ＭＡＧＥ−Ｂ２＋、ＨＬＡ−Ａ２＋）、Ｈ１３５５（ＭＡＧＥ−Ｂ２＋、ＨＬＡ−Ａ２＋）、Ｈ１７５５（ＭＡＧＥ−Ｂ２＋、ＨＬＡ−Ａ２＋）およびＤＦＣ−１０３２（ＭＡＧＥ−Ｂ２＋、ＨＬＡ−Ａ２＋）の溶解。
【図８−２】同上。
【図８−３】同上。
【図８−４】同上。
【図８−５】同上。
【００３０】
【図９−１】図９Ａ〜９Ｅは、ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ−Ｔの生成および機能的アビディティーを示す。（図９Ａ）高機能ＣＴＬ細胞株ＭＢ２−２３１  Ｃ５由来のＴＣＲ−Ｔ遺伝子を含有するレトロウイルスによる感染の前、後、ならびに四量体誘導選別および拡大後のＴＣＲ−Ｔの四量体検出。（図９Ｂ）２０：１のエフェクター  対  標的（Ｅ：Ｔ）比を用いた、ＭＢ２−２３１  Ｃ５  ＴＣＲ−Ｔによる種々の濃度のＭＢ２−２３１ペプチドでパルスされたＴ２細胞の溶解。（図９Ｃ）ＭＢ２−２３１  Ｃ５  ＴＣＲ−ＴによるＭＡＧＥ−Ｂ２発現腫瘍細胞株Ｈ２０２３（ＨＬＡ−Ａ２＋）の溶解、正常肺細胞株ＨＳＡＥＣ２−ＫＴ（ＭＡＧＥ−Ｂ２−、ＨＬＡ−Ａ２＋）は、陰性対照である。（図９Ｄ）種々のＥ：Ｔ比での、ＭＢ２−２３１  Ｃ５  ＴＣＲ−ＴによるＭＡＧＥ−Ｂ２発現およびＨＬＡ−Ａ２強制発現腫瘍細胞株Ｈ１２９９−Ａ２の溶解。親細胞株Ｈ１２９９（ＨＬＡ−Ａ２−）は、陰性対照である。（図９Ｅ）種々のＥ：Ｔ比での、ＭＢ２−２３１  Ｃ５  ＴＣＲ−Ｔによる、より多くの腫瘍細胞株Ｈ１３９５（ＭＡＧＥ−Ｂ２＋、ＨＬＡ−Ａ２＋）、Ｈ５２２（ＭＡＧＥ−Ｂ２＋、ＨＬＡ−Ａ２＋）、Ｈ１３５５（ＭＡＧＥ−Ｂ２＋、ＨＬＡ−Ａ２＋）、Ｈ１７５５（ＭＡＧＥ−Ｂ２＋、ＨＬＡ−Ａ２＋）およびＤＦＣ−１０３２（ＭＡＧＥ−Ｂ２＋、ＨＬＡ−Ａ２＋）の溶解。
【図９−２】同上。
【図９−３】同上。
【図９−４】同上。
【００３１】
【図１０−１】図１０Ａ〜１０Ｃは、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイによるＭＢ２−２３１  Ｃ５  ＴＣＲ−Ｔの機能的検出を示す。ＭＢ２−２３１  Ｃ５  ＴＣＲ−Ｔを、ＭＢ２−２３１ペプチド／Ｍ２６ペプチドでパルスされたＴ２、腫瘍細胞株Ｈ２０２３（ＭＡＧＥ−Ｂ２＋、ＨＬＡ−Ａ２＋）、正常肺細胞株ＨＳＡＥＣ２−ＫＴ（ＭＡＧＥ−Ｂ２−、ＨＬＡ−Ａ２＋）、腫瘍細胞株Ｈ１３９５（ＭＡＧＥ−Ｂ２＋、ＨＬＡ−Ａ２＋）、Ｈ５２２（ＭＡＧＥ−Ｂ２＋、ＨＬＡ−Ａ２＋）、Ｈ１２９９−Ａ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２＋、ＨＬＡ−Ａ２強制発現）、Ｈ１２９９（ＭＡＧＥ−Ｂ２＋、ＨＬＡ−Ａ２−）、Ｈ１３５５（ＭＡＧＥ−Ｂ２＋、ＨＬＡ−Ａ２＋）、Ｈ１７５５（ＭＡＧＥ−Ｂ２＋、ＨＬＡ−Ａ２＋）およびＤＦＣ−１０３２（ＭＡＧＥ−Ｂ２＋、ＨＬＡ−Ａ２＋）と、Ｅ：Ｔ比１０：１で共培養した。一晩の後、ＴＣＲ経路下流で活性化されたマーカー、ＣＤ１３７、ＣＤ６９、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが、ＩＣＳアッセイにより検出された。Ｍ２６ペプチドパルスＴ２、ＨＳＡＥＣ２−ＫＴ、Ｈ１２９９は、陰性対照としてのものであった。ＭＢ２−２３１ペプチドでパルスされたＴ２、Ｈ２０２３、Ｈ１３９５、Ｈ１２９９−Ａ２、Ｈ１７５５と共培養した後、ＣＤ１３７、ＣＤ６９、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのレベルは、陰性対照と比較して大幅に増強された。
【図１０−２】同上。
【図１０−３】同上。
【図１０−４】同上。
【図１０−５】同上。
【図１０−６】同上。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
がん／精巣抗原３．２（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｏ１５４７９）（ＣＴ３．２）としても公知の黒色腫関連抗原Ｂ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）は、Ｘ染色体上に位置する遺伝子によってコードされる。ＭＡＧＥ−Ｂ２は、タンパク質およびＲＮＡレベルで測定されるように、精巣で発現するが、他の正常組織では発現しない。ＭＡＧＥ−Ｂ２は、肺がん、肝臓がん、頭頸部がん、胃がん、神経膠芽腫、および結腸直腸がんを含む、いくつかのがんにおいて過剰発現する。１つのＨＬＡ−Ａ２（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０３、ＨＬＡ−Ａ＊０２０４、またはＨＬＡ−Ａ＊０２０５）拘束性ペプチド（ＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ、配列番号１）が、卵巣がん細胞から溶出され、同定された（Ｂａｒｎｅａら、２００２）。エピトープは、多形性神経膠芽腫細胞Ｔ９８ＧおよびＵ−８７のペプチドーム分析からも同定された（Ｓｈｒａｉｂｍａｎら、２０１６）。
【００３３】
ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープを使用して、ＨＬＡ適合同種異系腫瘍細胞株上で内因的に提示された抗原を認識する抗原特異的ＣＴＬを、本研究において、患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から生成した。このＨＬＡ−Ａ２拘束性ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドを提示する抗原提示細胞によって刺激されたこれらの抗原特異的ＣＴＬは、肺がん細胞に対して選択的に細胞傷害性であることが示された。
【００３４】
したがって、ある特定の態様では、本開示は、ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ（配列番号１）を認識し、特異的に結合するＴＣＲを提供する。本開示はまた、このＴＣＲをコードするヌクレオチド配列、ナイーブＴ細胞を改変し、ＭＡＧＥ−Ｂ２特異的Ｔ細胞を生成するために使用することができるこのヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。本開示は、悪性細胞がＭＡＧＥ−Ｂ２抗原を発現するＨＬＡ−Ａ２陽性がん患者などのがん患者に対する養子細胞療法などの治療法のための、ＭＡＧＥ−Ｂ２特異的Ｔ細胞の使用をさらに提供する。本明細書で提供される、ＣＴＬなどの抗原特異的Ｔ細胞は、固形がんを標的化するために使用され得る。
【００３５】
Ｉ．定義
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形の用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「ペプチド」への言及は、当業者に公知の１つまたは複数のペプチドおよびその同等物（例えば、ポリペプチド）への言及を含む。
【００３６】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される「または」という用語は、代替物のみを指すように明示的に示されない限り、または代替物が相互に排他的でない限り、「および／または」を意味する。
【００３７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される「別の」という用語は、少なくとも第２のまたはそれよりも多いものを意味し得る。
【００３８】
本明細書で使用される「約」という用語は、特定の値または測定値が、測定値を得るため、値を計算するために使用されるデバイスに関連する固有の変動、または研究被験体間に存在する自然変動を含むことを示す。
【００３９】
溶液の構成成分（例えば、１つまたは複数のタンパク質、ポリマー、または小分子の調製物）に関して本明細書で使用される「本質的に含まない」という用語は、調製物がその構成成分を含むように製剤化されなかったこと、またはそのような構成成分が微量でのみ存在すること（例えば、汚染物質として）を意味する。ある特定の実施形態では、目的の分子の調製物は、調製物が０．０５％（ｗ／ｗ）未満の特定の構成成分を含む場合、本質的にその構成成分を含まない。ある特定の実施形態では、目的の分子の調製物は、調製物が０．０１％（ｗ／ｗ）未満の特定の構成成分を含む場合、本質的にその構成成分を含まない。ある特定の実施形態では、目的の分子の調製物は、標準的な分析方法（例えば、ＵＶ分光測光法、質量分析法、核磁気共鳴分光法など）を使用して調製物中の特定の構成成分の量を検出できない場合、本質的にその構成成分を含まない。
【００４０】
溶液または懸濁物の構成成分（例えば、１つまたは複数の細胞型、タンパク質、ポリマー、または小分子の調製物）に関して本明細書で使用される「富化された」という用語は、調製物が、通常の濃度よりも高くまたは通常の数よりも多く、その構成成分を含むように製剤化されたことを意味する（例えば、リンパ球の懸濁物はエフェクターＴリンパ球が富化されている場合がある）。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などの用語は、例えば、被験体に治療剤を投与することによって、または被験体に対して外科的、臨床的、または他の医学的手順を実施することによって、被験体における疾患または状態の症状を改善する、和らげる、または別様に軽減するプロセスを指す。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「被験体」または「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用されて、個体、例えば、ヒト、または霊長類、哺乳動物、もしくは脊椎動物などの非ヒト生物を指す。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「治療的に有効な」または「治療的に有益な」などの用語は、疾患、障害、または状態の１つまたは複数の症状を改善、軽減、もしくは別様に緩和する治療剤、または外科的、臨床的、もしくは他の医学的手順であって、それにより、例えば、疾患、障害、または状態の徴候または症状の頻度または重症度を低下させることによって、疾患、障害、または状態を有する被験体の健康な状態を高めるものを指す。したがって、治療的に有効または治療的に有益ながん処置は、例えば、腫瘍のサイズを縮小し、腫瘍の成長速度を低下させ、腫瘍の播種または転移の可能性を低下させ得る。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という用語は、哺乳動物または脊椎動物の被験体に投与された場合、有害、アレルギー、または他の望まない反応を生じない治療剤の医薬製剤を指す。そのような調製物は、無菌性、発熱性、純度に関する適正製造規範（ＧＭＰ）基準、およびＦＤＡ生物学的基準局が要求する任意の他の関連基準に準拠して製剤化する必要がある。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、哺乳動物または脊椎動物の被験体への送達のための治療剤を製剤化するために使用される、当業者に公知のあらゆる化学化合物または溶媒、例えば、水性溶媒（例えば、水、アルコール／水溶液、食塩溶液、非経口ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム、デキストロース加リンゲル液など）、非水性溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステル）、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌または抗真菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス）、等張剤、吸収遅延剤、塩、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、矯味矯臭剤、染料、体液および栄養補充液、ならびにそれらの任意の組合せなどを指す。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「単位用量」、「用量」、または「投薬量」という用語は、適切な経路で、所望の処置レジメンに従って投与した場合、被験体において治療的に有効であると予想される所定量の薬剤を含有する、哺乳動物または脊椎動物の被験体への投与に好適な治療剤の製剤を指す。被験体に投与される特定の治療剤の実際の投薬量は、例えば、被験体の体重、年齢、健康、および性別を含む様々な身体的および生理学的パラメーター、処置されている疾患の種類、疾患の進行の程度、以前または同時の治療的介入、投与経路、ならびに特定の治療物質の効力、安定性、および毒性に照らして、医療提供者によって経験的に決定され得る。
【００４７】
ＩＩ．ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲの方法および組成
ある特定の実施形態では、本開示は、配列ＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ（配列番号１）を含むＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープを提供する。ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープは、Ｔ細胞の集団と接触させるか、またはそれを使用してＴ細胞の集団を刺激して、ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープを認識または結合するＴ細胞の増殖を誘発することができる。ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープを、ヒト患者などの被験体に投与して、がんに対する被験体の免疫応答を増強することができる。ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープは、能動免疫療法（例えば、がんワクチン）または受動免疫療法（例えば、養子細胞療法）に含まれ得る。能動免疫療法は、精製された腫瘍抗原またはＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープ（天然または改変）により被験体を免疫化することを含む。あるいは、ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープでパルスされた（または腫瘍抗原をコードする遺伝子でトランスフェクトされた）抗原提示細胞を被験体に投与することができる。ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープは、改変されても、または、例えば、置換変異などの１つまたは複数の変異を含んでもよい。養子細胞療法は、細胞を被験体に投与することを伴ってもよく、細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープに対して感作されている。
【００４８】
特に、Ｔ細胞は、６〜８週間などの短期間内に、養子細胞療法のためにｅｘ  ｖｉｖｏで活性化させ、拡大させることができる。Ｔ細胞は、例えば四量体誘導選別および急速拡大プロトコール（ＲＥＰ）を用いて、末梢血から単離されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γδ  Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ））から単離し、拡大させることができる。次に、ペプチドまたは対応するポリヌクレオチド（例えば、完全長ＭＡＧＥ−Ｂ２またはＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープ）を、ＨＬＡ−Ａ２陽性樹状細胞、リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）、ＰＢＭＣ、または人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）に負荷し、次いで、数回の刺激によってＴ細胞と共培養し、抗原特異的ＣＴＬ細胞株またはクローンを生成することができる。さらに、免疫調節パラメーターの操作により、これらの拡大した抗原特異的Ｔ細胞のエフェクター機能およびｉｎ  ｖｉｖｏでの長期持続を増強することができる。これらのＣＴＬは、ＭＡＧＥ−Ｂ２およびＨＬＡ−Ａ２陽性のがん患者のための養子細胞療法に使用することができる。さらに、本開示から生成することができる他のＭＡＧＥ−Ｂ２特異的細胞には、ＮＫ細胞、インバリアントＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、および人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞が含まれる。これらの細胞は、血液または臍帯から単離することができる。本開示の抗原特異的細胞は、自家または同種異系であり得る。
【００４９】
別の方法では、抗原特異的細胞は、本明細書で提供されるＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ（例えば、配列番号２〜５または１８〜２２）を使用することによって生成することができる。この方法では、ＴＣＲ配列を、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γδ  Ｔ細胞、およびＴｒｅｇ）、ＮＫ細胞、インバリアントＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＭＳＣ、またはｉＰＳ細胞などの宿主細胞に導入されるベクター（例、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクター）に挿入して、がん患者のための養子細胞療法に使用することができる抗原特異的細胞を生成する。
【００５０】
ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープおよびＴＣＲ配列を以下に提供する。
【化１−１】
2021521776.tif 000003
【化１−２】
2021521776.tif 000004
【００５１】
ＭＡＧＥ−Ｂ２−２３１  Ｃ５  ＴＣＲ配列を以下に提供する。シグナルペプチドには下線を引き、可変領域をイタリック体で示している。
【化２−１】
2021521776.tif 000005
【化２−２】
2021521776.tif 000006
【００５２】
Ａ．ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチド
一部の態様では、本開示は、ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープを含む。ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープは、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ、配列番号１のアミノ酸配列を有し得る。ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープは、配列番号１のペプチド配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
【００５３】
ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープは、７〜３５アミノ酸、好ましくは８〜３５アミノ酸残基、さらにより好ましくは８〜２５アミノ酸、または７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、もしくは３５アミノ酸長、あるいはそれらの中で誘導可能な任意の範囲を含むまたはそれらからなり得る。例えば、本開示のＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープは、一部の実施形態では、配列番号１のＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープを含むまたはそれからなり得る。抗原ペプチドは、免疫反応性ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープを含み得、追加の配列を含み得る。追加の配列は、天然の抗原に由来していてもよく、異種であってもよく、そのような配列は、免疫原性であってもよいが、そうである必要はない。一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープは、ＨＬＡ−Ａ２、特にＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０３、ＨＬＡ−Ａ＊０２０４、またはＨＬＡ−Ａ＊０２０５と選択的に結合することができる。
【００５４】
当業者によって理解されるように、ＭＨＣ分子は、様々なサイズのペプチドを結合することができるが、典型的には、完全長タンパク質を結合することができない。ＭＨＣクラスＩ分子は、８〜１１アミノ酸長のペプチドに結合すると従来説明されてきたが、１５アミノ酸長のペプチドは、結合部位の中央で膨らむか、またはＭＨＣクラスＩ結合溝から伸びることでＭＨＣクラスＩ分子に結合することができることが示されている。当業者によって直ちに理解されるように、ＭＡＧＥ−Ｂ２などの天然に存在する完全長腫瘍抗原は、クラスＩＩ  ＭＨＣを選択的に結合し、したがってエンドサイトーシスされて、Ｔ細胞の増殖を生じさせるのに有用ではないことがある。一般に、天然に存在する完全長腫瘍抗原タンパク質はこれらの特性を示さないため、これらの免疫療法の目的に有用ではない。
【００５５】
ある特定の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープは、免疫原性または抗原性である。以下の実施例に示されるように、本開示のＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープは、Ｔ細胞の増殖を促進することができる。
【００５６】
ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープは、組換えペプチド、合成ペプチド、精製ペプチド、固定化ペプチド、検出可能に標識されたペプチド、カプセル化されたペプチド、またはベクター発現ペプチド（例えば、核酸に作動可能に連結した異種プロモーターを含むベクター中の核酸によってコードされたペプチド）であり得る。一部の実施形態では、合成ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープを、ヒト患者などの被験体に投与して、被験体における免疫応答を誘発することができる。合成ペプチドは、組換え発現ペプチドと比較して、細菌汚染のリスクの低下など、ある特定の利点を示すことがある。ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドはまた、哺乳動物またはヒト被験体への投与のために製剤化される、例えば、ワクチン組成物などの医薬組成物中に含まれ得る。
【００５７】
１．細胞透過性ペプチド
一部の実施形態では、免疫療法は、リポソームまたは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）などの細胞透過性物質に会合している本開示のＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープを利用し得る。ペプチドでパルスされた抗原提示細胞（樹状細胞など）を使用して、抗腫瘍免疫を増強することができる。一部の実施形態では、免疫療法は、本開示のＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープをコードする核酸を利用してもよく、核酸は、例えば、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターにおいて送達される。
【００５８】
腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチド）に共有結合によって結合し得る細胞透過性ペプチドとしては、例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔ、ヘルペスウイルスＶＰ２２、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアンテナペディアホメオボックス遺伝子産物、シグナル配列、融合配列、またはプロテグリンＩが挙げられる。ペプチドをＣＰＰに共有結合によって結合させると、樹状細胞によるペプチドの提示が延長され、したがって抗腫瘍免疫が強化され得る。一部の実施形態では、本開示のＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチド（例えば、ペプチドまたはポリエピトープストリング内に含まれる）を、ＣＰＰに共有結合によって結合させて（例えば、ペプチド結合を介して）、融合タンパク質を生成し得る。他の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープまたはペプチドエピトープをコードする核酸は、多層状、小胞性、もしくは多胞性リポソームなどのリポソーム、エキソサイトーシス小胞またはエクソソーム内にカプセル化されるか、またはそれらと会合し得る。
【００５９】
一部の実施形態では、細胞取り込みは、ステアリン酸塩またはミリスチン酸塩などの脂質のポリペプチドへの付着によって促進される。脂質化は、ペプチドの細胞への通過を増強することが示されている。脂質部分の付着は、本開示が細胞によるポリペプチド取り込みを増加させる別の様式である。細胞取り込みについては、以下でさらに論じる。
【００６０】
本開示のＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープは、リポソームワクチン組成物中に含まれ得る。例えば、リポソーム組成物は、プロテオリポソーム組成物であるか、またはそれを含み得る。
【００６１】
一部の実施形態では、ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープは、ナノ粒子と会合して、ナノ粒子−ポリペプチド複合体を形成し得る。一部の実施形態では、ナノ粒子は、リポソームまたは他の脂質ベースのナノ粒子、例えば脂質ベースの小胞（例えば、ＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞）である。他の実施形態では、ナノ粒子は、酸化鉄ベースの超常磁性ナノ粒子である。一部の実施形態では、ナノ粒子は、半導体ナノ結晶または半導体量子ドットであり、これらは両方とも光学イメージングにおいて使用することができる。さらなる実施形態では、ナノ粒子は、シリカのコア上に金層を含むナノシェルであり得る。
【００６２】
２．生物学的機能同等物
本開示のＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドエピトープは、ＨＬＡ−Ａ２などのＨＬＡクラスタンパク質結合領域とのそれぞれの相互作用を変化させないアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含有するように改変され得る。非限定的な例として、ＨＬＡ−Ａ２への検出可能な変化のないペプチド結合によって実証されるように、ＨＬＡ結合の感知できるほどの損失なしに、本明細書に開示されたＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドにおけるある特定のアミノ酸を他のアミノ酸の代わりに使用することができる。したがって、配列および／または構造が改変されているが、生物学的有用性または活性は変化していない、本明細書に開示されたＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチド（またはそのようなペプチドをコードする核酸）は、本明細書に開示された組成物および方法の範囲内にとどまることが企図される。
【００６３】
同等の生物学的活性の許容レベルを依然として維持しながらも分子の定義された部分内でなされ得る変化の数に制限があるという概念は、生物学的に機能同等なペプチドの定義に固有なものであることも、当業者によってよく理解されている。生物学的に機能同等なペプチドは、したがって、本明細書では、ほとんどまたはすべてではないある特定のアミノ酸が置換され得るペプチドとして定義される。当然ながら、本開示に従って、異なる置換により複数の別個のペプチドを容易に作製し、使用することができる。
【００６４】
当事者はまた、ある特定の残基、例えば、特定のエピトープにおける残基が、ペプチドの生物学的または構造的特性にとって特に重要であることが示される場合、そのような残基は一般に交換され得ないことを認識している。本明細書に開示されたＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドにおける変異は、種特異性の喪失をもたらし、それにより、本開示の方法で使用するための得られたペプチドの有用性を低下させ得るため、このことは本開示の場合に当てはまる場合がある。したがって、抗原性であり（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０３、ＨＬＡ−Ａ＊０２０４、またはＨＬＡ−Ａ＊０２０５を特異的に結合する）、保存的アミノ酸置換を含むペプチドは、本開示に含まれることが理解される。保存的置換は、タンパク質の活性を劇的に変化させる可能性が最も低い。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸の化学的に類似したアミノ酸での置き換え、すなわち、非極性アミノ酸を他の非極性アミノ酸で置き換えること、極性アミノ酸の他の極性アミノ酸での置換、酸性残基の他の酸性アミノ酸での置換などを指す。
【００６５】
本明細書に開示されたＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドを改変する際に用いられ得るようなアミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。アミノ酸側鎖置換基のサイズ、形状、および種類の分析により、アルギニン、リシン、およびヒスチジンがすべて正に帯電した残基であること、アラニン、グリシン、およびセリンがすべて類似したサイズであること、ならびにフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンがすべて、全体的に類似した形状を有していることが明らかにされている。したがって、これらの考察に基づいて、アルギニン、リシン、およびヒスチジン；アラニン、グリシン、およびセリン；ならびにフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、本明細書では、生物学的に機能同等物として定義されている。一部の実施形態では、変異は、ＴＣＲ−ｐＭＨＣ相互作用および／またはペプチド−ＭＨＣ結合を増強し得る。
【００６６】
本開示はまた、本明細書に開示されたＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドのアイソフォームを企図する。アイソフォームは、本開示のペプチドと同じ数および種類のアミノ酸を含有するが、アイソフォームは異なる分子構造を有する。本開示によって企図されたアイソフォームは、本明細書に記載された本開示のペプチドと同じ特性を有するものである。
【００６７】
非標準アミノ酸は、既存のアミノ酸の化学的改変によって、または本明細書に開示されたペプチドのｄｅ  ｎｏｖｏ合成によってタンパク質に組み込まれ得る。非標準アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされている２０の標準アミノ酸とは化学構造が異なるアミノ酸を指す。
【００６８】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されたＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドの化学誘導体を企図する。「化学誘導体」とは、側鎖官能基の反応によって化学的に誘導体化され、生物学的活性および有用性を保持する１つまたは複数の残基を有するペプチドを指す。そのような誘導体化ペプチドとしては、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて特定の塩を形成したか、またはアルキル化および／もしくはアシル化によって誘導体化されたもの、とりわけｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｂｕｔｙｌｏｃｙｃａｒｂｏｎｙｌ）基、クロロアセチル基、ホルミルまたはアセチル基が挙げられる。遊離カルボキシル基は、誘導体化されて、有機もしくは無機塩、メチルおよびエチルエステルもしくは他の種類のエステル、またはヒドラジド、および好ましくはアミド（一級または二級）を形成し得る。化学誘導体は、２０の標準アミノ酸の１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むペプチドを含み得る。例えば、４−ヒドロキシプロリンはセリンの代わりに使用してもよく、オルニチンはリシンの代わりに使用してもよい。
【００６９】
本明細書では、すべてのアミノ酸残基配列が、その左右の向きがアミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向である式によって表されることに留意すべきである。さらに、アミノ酸残基配列の最初または最後のダッシュは、１つまたは複数のアミノ酸残基のさらなる配列へのペプチド結合を示すことに留意すべきである。本明細書に記載のアミノ酸は、「Ｌ」異性体形態であることが好ましい。しかし、「Ｄ」異性体形態の残基は、本明細書に記載の所望の機能的特性がタンパク質によって保持されている限り、任意のＬ−アミノ酸残基と置換することができる。
【００７０】
好ましいＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドまたはそのアナログは、好ましくは、ＨＬＡ−Ａ２を特異的にまたは優先的に結合する。特定の腫瘍抗原特異的ペプチドもしくは標識されたペプチド、またはそれらのアナログがＨＬＡ−Ａ２を結合できるかどうか、あるいは結合の程度を決定し、この決定を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、イムノブロッティング、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫染色、ラテックス凝集、間接赤血球凝集アッセイ（ＩＨＡ）、補体結合、間接免疫蛍光アッセイ（ＦＡ）、比濁法、フローサイトメトリーアッセイ、ケミルミネッセンスアッセイ、ラテラルフローイムノアッセイ、ｕ−キャプチャーアッセイ、質量分析アッセイ、粒子ベースアッセイ、阻害アッセイ、および／またはアビディティーアッセイなどを使用して、評価することができる。
【００７１】
Ｂ．操作されたＭＡＧＥ−Ｂ２特異的細胞
一部の実施形態では、本開示はＭＡＧＥ−Ｂ２特異的ＴＣＲを提供する。ＴＣＲは、配列番号６〜１２のα鎖ＣＤＲおよび／または配列番号１３〜１７のβ鎖ＣＤＲを含み得る。ＴＣＲは、配列番号２〜３に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性もしくは類似性を有するα鎖、および／または配列番号４〜５に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性もしくは類似性を有するβ鎖を含み得る。本明細書で提供されるＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖をコードするポリペプチドおよびポリヌクレオチドも、本明細書で提供される。本明細書でさらに提供されるのは、本明細書で提供されるＭＡＧＥ−Ｂ２特異的ＴＣＲを発現するように操作された、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、インバリアントＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＭＳＣ、またはｉＰＳ細胞などの細胞である。これらの非Ｔ細胞エフェクター免疫細胞は、ＣＤ３分子またはＴＣＲに連結した他のシグナル伝達ドメインと一緒にＴＣＲを発現することがあり、ＴＣＲは、これらの細胞においてシグナル変換を開始する。
【００７２】
操作された免疫細胞は、当業者に公知の多くの十分に確立された遺伝子移入方法のいずれかを使用して構築され得る。ある特定の実施形態では、操作された細胞は、ウイルスベクターベースの遺伝子移入方法を使用して構築されて、ＭＡＧＥ−Ｂ２特異的ＴＣＲをコードする核酸を導入する。ウイルスベクターベースの遺伝子移入方法は、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクターを含み得る。ある特定の実施形態では、操作された細胞は、非ウイルスベクターベースの遺伝子移入方法を使用して構築されて、ＭＡＧＥ−Ｂ２特異的ＴＣＲをコードする核酸を導入する。ＴＣＲのベクターは、リンカードメインまたはＩＲＥＳ配列によって連結され得るα鎖ポリペプチドおよびβ鎖ポリペプチドを含み得る。リンカードメインは、ＳＧＳＧまたはＧＳＧなどのスペーサーによって分離され得る、フューリン切断部位および／またはＰ２Ａ切断部位などの１つまたは複数の切断部位を含み得る。ある特定の実施形態では、非ウイルスベクターベースの遺伝子移入方法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化され規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）ヌクレアーゼからなる群より選択される遺伝子編集方法を含む。ある特定の実施形態では、非ウイルスベクターベースの遺伝子編集方法は、リポフェクション、ヌクレオフェクション、ビロソーム、リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤によって増強されたＤＮＡ取り込みからなる群より選択されるトランスフェクションまたは形質転換方法を含む。
【００７３】
Ｃ．可溶性ＴＣＲおよびＢｉＴＥ
さらに、本開示は、ＨＬＡ−Ａ２陽性がん患者を直接処置するために使用することができる可溶性ＴＣＲを提供する。可溶性二重特異性Ｔ細胞係合分子（ＢｉＴＥ）は、ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲをＣＤ３特異的Ｆａｂ断片に連結させることによって生成することができる。これらの二重特異性分子は、ペプチド／ＨＬＡ複合体へのＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ結合を介して、腫瘍細胞表面を結合することができ、ＣＤ３特異的Ｆａｂ断片は、標的Ｔ細胞などにおいてＴＣＲを架橋する。これにより、細胞の活性化および標的細胞の排除がもたらされる。したがって、これらの可溶性二重特異性ＴＣＲ構築物は、がん患者を処置するために直接使用することができる。
【００７４】
最終的に、可溶性ＴＣＲは、腫瘍細胞におけるペプチド／ＭＨＣの診断評価のためのプローブとして、または治療用分子を腫瘍部位に向けるために使用することができる。この可溶性ＴＣＲ分子を、蛍光プローブまたは放射性プローブなどのトレーサーにより標識し、次いで腫瘍細胞におけるペプチド／ＭＨＣの提示の診断評価に使用することもできる。さらに、この可溶性ＴＣＲ分子を、毒素などの治療用分子と連結させ、次いでこれらの治療用分子を、がん患者の処置のために腫瘍部位に向けることができる。
【００７５】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書で提供されるＭＡＧＥ−Ｂ２特異的ＴＣＲなどの可溶性ＴＣＲを提供する。可溶性ＴＣＲは、特定のＴＣＲ−ｐＭＨＣ相互作用を調査するため、または感染を検出するための診断ツールとして、または自己免疫疾患マーカーを検出するために使用することができる。可溶性ＴＣＲは、染色における、例えば、ＭＨＣとの関係において提示される特定のペプチド抗原の存在について細胞を染色するための用途を有し得る。同様に、可溶性ＴＣＲを使用して、治療剤、例えば細胞傷害性化合物または免疫刺激化合物を、特定の抗原を提示する細胞に送達することができる。可溶性ＴＣＲはまた、Ｔ細胞、例えば、自己免疫ペプチド抗原に反応するＴ細胞を阻害するために使用してもよい。一部の態様では、ＴＣＲは、腫瘍の近くに細胞を送達する別の分子に連結している。さらなる態様では、ＴＣＲは、毒素、サイトカイン、共刺激リガンド、または阻害剤リガンドを送達し、分子、細胞、または化合物を、ペプチド−ＭＨＣを発現する標的細胞に向ける。
【００７６】
一部の態様では、本開示は、（ｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲ  α鎖（例えば、配列番号２または３）の全部または一部、および（ｉｉ）その膜貫通ドメインを除くＴＣＲ  β鎖（例えば、配列番号４または５）の全部または一部を含む可溶性Ｔ細胞受容体（ｓＴＣＲ）であって、（ｉ）および（ｉｉ）がそれぞれ、ＴＣＲ鎖の機能的可変ドメインおよび定常ドメインの少なくとも一部を含み、ネイティブＴＣＲに存在しない定常ドメイン残基間のジスルフィド結合によって連結している、可溶性Ｔ細胞受容体（ｓＴＣＲ）を提供する。
【００７７】
一部の態様では、可溶性ＴＣＲは、ロイシンジッパーなどの一対のＣ末端二量体化ペプチドによって、ＴＣＲ  βまたはδ鎖細胞外ドメインに二量体化されたＴＣＲ  αまたはγ鎖細胞外ドメインそれぞれを含む。
【００７８】
本開示の可溶性ＴＣＲは、実質的に純粋な形態で、または精製もしくは単離された調製物として提供されてもよい。例えば、他のタンパク質を実質的に含まない形態で提供されてもよい。
【００７９】
本開示の複数の可溶性ＴＣＲは、多価複合体で提供されてもよい。したがって、本開示は、一態様では、本明細書に記載の複数の可溶性ＴＣＲを含む多価ＴＣＲ複合体を提供する。複数の可溶性ＴＣＲのそれぞれは、好ましくは同一である。
【００８０】
本開示による多価ＴＣＲ複合体は、その最も単純な形態では、好ましくはリンカー分子を介して互いに会合した（例えば、共有結合によってまたは他の方法で連結された）２つまたは３つまたは４つまたはそれよりも多いＴ細胞受容体分子の多量体を含む。好適なリンカー分子としては、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、およびエクストラビジンなどの多価付着分子が挙げられるが、これらに限定されず、これらのそれぞれは、ビオチンに対する４つの結合部位を有する。したがって、ビオチン化ＴＣＲ分子は、複数のＴＣＲ結合部位を有するＴＣＲの多量体に形成することができる。多量体中のＴＣＲ分子の数は、多量体を作製するために使用されるリンカー分子の量に関連するＴＣＲの量に、および任意の他のビオチン化分子の存在または非存在にも依存する。好ましい多量体は、二量体、三量体または四量体のＴＣＲ複合体である。
【００８１】
本発明の方法で使用するのに好適な構造には、リポソームなどの膜構造、および好ましくはビーズ、例えばラテックスビーズなどの粒子である固体構造が含まれる。Ｔ細胞受容体分子で外面コーティングされ得る他の構造も好適である。好ましくは、構造は、個々のＴ細胞受容体分子ではなく、Ｔ細胞受容体多量体でコーティングされている。
【００８２】
リポソームの場合、Ｔ細胞受容体分子またはその多量体を、膜に付着させるか、そうでなければ膜と会合させてもよい。このための技術は、当業者に周知である。
【００８３】
標識または毒性もしくは治療部分などの別の部分を、本開示の多価ＴＣＲ複合体に含んでもよい。例えば、標識または他の部分を、混合分子多量体に含んでもよい。そのような多量体分子の例は、３つのＴＣＲ分子および１つのペルオキシダーゼ分子を含有する四量体である。これは、ＴＣＲと酵素とを３：１のモル比で混合して四量体複合体を生成し、正しい比の分子を含有しない任意の複合体から所望の複合体を単離することによって実現することができる。これらの混合分子は、立体障害が分子の所望の機能を損なうことがない、または著しく損なうことがなければ、分子の任意の組合せを含有することができる。ストレプトアビジン分子上の結合部位の配置は、立体障害が発生する可能性が低いため、混合四量体に好適である。
【００８４】
本開示のＴＣＲ（またはその多価複合体）を、代替的または追加的に、例えば、細胞殺傷に使用するための毒性部分であり得る治療剤、またはインターロイキンもしくはサイトカインなどの免疫刺激剤と会合させ（例えば、共有結合によってまたは別の形で連結させ）てもよい。本開示の多価ＴＣＲ複合体は、非多量体Ｔ細胞受容体ヘテロ二量体と比較して、ＴＣＲリガンドに対する結合能力が増強している場合がある。したがって、本開示による多価ＴＣＲ複合体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、特定の抗原を提示する細胞を追跡または標的化するために特に有用であり、そのような使用を有するさらなる多価ＴＣＲ複合体の産生の中間体としても有用である。したがって、ＴＣＲまたは多価ＴＣＲ複合体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用するための薬学的に許容される製剤で提供され得る。
【００８５】
本開示はまた、治療剤を標的細胞に送達するための方法であって、ＴＣＲまたは多価ＴＣＲ複合体の標的細胞への付着が可能な条件下で、本開示に従って、潜在的な標的細胞をＴＣＲまたは多価ＴＣＲ複合体と接触させることを含み、前記ＴＣＲまたは多価ＴＣＲ複合体が、ＴＣＲリガンドに特異的であり、治療剤がこれと会合している、方法を提供する。
【００８６】
特に、可溶性ＴＣＲまたは多価ＴＣＲ複合体を使用して、特定の抗原を提示する細胞の場所に治療剤を送達することができる。これは、多くの状況において、特に腫瘍に対して有用であり得る。治療剤を、それが結合する細胞だけでなく、局所的にその効果を発揮するように送達することができる。したがって、１つの特定の戦略は、腫瘍抗原に特異的なＴ細胞受容体または多価ＴＣＲ複合体に連結した抗腫瘍分子を想定している。
【００８７】
多くの治療剤、例えば放射性化合物、酵素（例えばパーフォリン）または化学療法剤（例えばシスプラチン）をこの使用のために用いることができる。毒性効果を所望の場所で確実に発揮させるために、毒素は、ストレプトアビジンに連結したリポソームの内部にあり得、その結果、化合物はゆっくりと放出される。これにより、体内での輸送中の損傷効果を防ぎ、ＴＣＲの関連する抗原提示細胞への結合後に毒素が最大の効果を確実に有する。
【００８８】
本開示の可溶性ＴＣＲを使用して、特定のＴＣＲリガンドに結合することによりＴ細胞活性化をモジュレートし、それによってＴ細胞活性化を阻害してもよい。Ｔ細胞媒介性炎症および／または組織損傷を伴う自己免疫疾患、例えば、Ｉ型糖尿病は、このアプローチに適している場合がある。この使用には、関連するｐＭＨＣによって提示される特定のペプチドエピトープの知識が必要である。
【００８９】
がんまたは自己免疫疾患の処置のための組成物の調製における本開示の可溶性ＴＣＲおよび／または多価ＴＣＲ複合体の使用もまた想定される。
【００９０】
有効量の本開示の可溶性ＴＣＲおよび／または多価ＴＣＲ複合体の、それを必要とする患者への投与を含む、がんまたは自己免疫疾患の処置方法も提供される。
【００９１】
抗がんおよび自己免疫療法において一般的であるように、本開示の可溶性ＴＣＲを、がんおよび自己免疫疾患、ならびに同様の患者群に見られる他の関連する状態の処置のために、他の薬剤と組み合わせて使用してもよい。
【００９２】
ＩＩＩ．使用方法
別の態様では、本明細書で提供されるのは、被験体におけるがんを処置するための方法であって、本明細書で提供される方法のいずれかによって産生されるＴ細胞、ＮＫ細胞、インバリアントＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＭＳＣ、またはｉＰＳ細胞などのＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ特異的細胞の集団の治療有効量を、被験体に投与することを含む、方法である。ＴＩＬがｉｎ  ｖｉｔｒｏから培養され得るか、または腫瘍抗原特異的ＣＴＬがｉｎ  ｖｉｔｒｏから生成され得る細胞を、がんを有する被験体に養子移入することができる。
【００９３】
本明細書で提供されるのは、個体におけるがんを処置する、またはがんの進行を遅延させるための方法であって、個体に有効量のＭＡＧＥ−Ｂ２特異的Ｔ細胞療法を投与することを含む方法である。遺伝子操作されたＴＣＲ形質導入Ｔ細胞（ＴＣＲを他の生体反応性タンパク質（例えば、抗ＣＤ３）にコンジュゲートさせる）を用いた養子Ｔ細胞療法も、本明細書で提供される。さらなる実施形態では、精製された腫瘍抗原または免疫優勢腫瘍抗原特異的ペプチドにより被験体を免疫化することを含む、がんの処置のための方法が提供される。
【００９４】
本明細書で提供されるＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドを利用して、がんワクチンまたは免疫原を開発することができる。これらのペプチド特異的ワクチンまたは免疫原を、がん患者を直接免疫化してｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍免疫応答を誘発するために、または、ペプチドもしくはコード化ポリヌクレオチド負荷ＡＰＣ刺激によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗原特異的Ｔ細胞を拡大させるために使用することができる。これらの多数のＴ細胞を、患者に養子移入して、腫瘍の退縮を誘発することができる。
【００９５】
本処置方法が有用である腫瘍には、固形腫瘍または血液腫瘍に見られるものなど、ＭＡＧＥ−Ｂ２を発現する任意の悪性細胞型が含まれる。例示的な固形腫瘍としては、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭、首、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、黒色腫、前立腺、および乳房からなる群より選択される臓器の腫瘍を挙げることができるが、これらに限定されない。例示的な血液腫瘍としては、骨髄の腫瘍、ＴまたはＢ細胞の悪性疾患、白血病、リンパ腫、芽細胞腫、骨髄腫などが挙げられる。本明細書で提供される方法を使用して処置することができるがんのさらなる例としては、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、および肺扁平上皮癌を含む）、腹膜がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）がんまたは胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がん（消化器がんおよび消化管間質がんを含む）、膵臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓または腎がん、前立腺がん、外陰がん（ｖｕｌｖａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺がん、種々の種類の頭頸部がん、および黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
がんは、特に以下の組織学的種類のもの：新生物、悪性；癌腫；癌腫、未分化；巨細胞および紡錘体細胞癌；小細胞癌；乳頭状癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛母癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌；肝細胞癌；肝細胞癌および胆管癌の混合型；索状腺癌（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ；）；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープ内腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支−肺胞腺癌（ｂｒａｎｃｈｉｏｌｏ−ａｌｖｅｏｌａｒ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）；乳頭状腺癌；嫌色素性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基球癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞腺癌；乳頭状および濾胞腺癌；非被包性硬化性癌；副腎皮質がん；子宮内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌（ｃｅｒｕｍｉｎｏｕｓ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液腺癌；印環細胞癌；浸潤性乳管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳腺；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生随伴腺癌；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；アンドロブラストーマ、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；悪性黒子黒色腫（ｌｅｎｔｉｇｏ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ）；末端黒子型黒色腫；結節型黒色腫；巨大色素性母斑内悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質性肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胎児性癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星細胞腫；原形質性星細胞腫；原線維性星細胞腫；星芽腫；神経膠芽腫；乏突起膠腫；乏突起膠芽腫；未分化神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節神経芽腫；神経芽腫；網膜芽細胞腫；嗅神経腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経線維鞘腫、悪性；顆粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞型、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉症；他の特定されている非ホジキンリンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫；低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞��ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；ワルデンストレームマクログロブリン血症；悪性組織球症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；有毛細胞白血病；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；および慢性骨髄芽球性白血病、であり得るが、これらに限定されない。
【００９７】
ある特定の実施形態では、方法は、治療有効量のＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ細胞の集団の投与前にリンパ球枯渇を実施するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、リンパ球枯渇は、非骨髄破壊的リンパ球枯渇化学療法を含む。ある特定の実施形態では、非骨髄破壊的リンパ球枯渇化学療法は、シクロホスファミドおよびフルダラビンの投与を含む。
【００９８】
ある特定の実施形態では、方法は、自家Ｔ細胞に付随して、または自家Ｔ細胞の後に続いてのいずれかで、自家Ｔ細胞の成長および活性化を促進するＴ細胞増殖因子を、被験体に投与するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増殖因子は、自家Ｔ細胞の成長および活性化を促進する任意の好適な増殖因子を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞増殖因子は、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、およびＩＬ−１２、ならびにそれらの組合せ（例えば、ＩＬ−２とＩＬ−７、ＩＬ−２とＩＬ−１５、ＩＬ−７とＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５、ＩＬ−１２とＩＬ−７、ＩＬ−１２とＩＬ−１５、またはＩＬ−１２とＩＬ−２）からなる群より選択される。
【００９９】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法のいずれかによって産生されるＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ特異的細胞の集団の治療有効量を、被験体に、静脈内、腫瘍内、または腹腔内投与する。細胞療法の適切な投薬量は、処置されるがんの種類、疾患の重症度および経過、個体の臨床状態、個体の病歴および処置に対する応答、ならびに主治医の裁量に基づいて決定され得る。
【０１００】
Ａ．併用療法
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、少なくとも１つの追加の治療剤を被験体に投与するステップをさらに含む。本明細書に開示されたすべての追加の治療剤は、任意の潜在的な毒性、起こり得る副作用、および任意の他の関連する要因を考慮に入れて、各特定の組成物または治療法の優良臨床試験基準に従って被験体に投与される。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、追加の治療法は、免疫療法、放射線療法、外科手術（例えば、腫瘍の外科的切除）、化学療法、骨髄移植、または前述の組合せであり得る。追加の治療法は、標的化療法であってもよい。ある特定の実施形態では、追加の治療法は、一次処置の前に（すなわち、アジュバント療法として）投与される。ある特定の実施形態では、追加の治療法は、一次処置の後に（すなわち、ネオアジュバント療法として）投与される。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、追加の治療法は、免疫療法を含む。ある特定の実施形態では、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤を含む。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、プログラム細胞死経路１（ＰＤ−１／ＣＤ２７９）およびそのリガンド（ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ２７４およびＰＤ−Ｌ２／ＣＤ２７３）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４／ＣＤ１５２）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３／ＣＤ２２３）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｉｇおよび免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）ドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３／ＨＡＶｃｒ２）、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ／ＣＤ１５８）、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリンサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、ならびにアデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）からなる群より選択される免疫チェックポイントタンパク質を阻害する。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１結合アンタゴニストである。ある特定の実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−１抗体である。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびＣＴ−０１１からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、免疫グロブリン定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合したＰＤＬ１またはＰＤＬ２の細胞外またはＰＤ−１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４結合アンタゴニストである。ある特定の実施形態では、ＣＴＬＡ−４結合アンタゴニストは、抗ＣＴＬＡ−４抗体である。ある特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブおよびトレメリムマブからなる群より選択される。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、放射線療法による処置を含む。ある特定の実施形態では、放射線療法は、ガンマ線（γ線）、Ｘ線、マイクロ波、プロトンビーム照射、紫外線照射、および腫瘍への放射性同位元素の指向性送達からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、放射線療法は、Ｘ線による処置を含む。ある特定の実施形態では、Ｘ線は、３〜４週の期間にわたって５０〜２００レントゲンの１日線量で投与される。ある特定の実施形態では、Ｘ線は、２０００〜６０００レントゲンの単回線量で投与される。ある特定の実施形態では、放射線療法は、腫瘍への放射性同位元素の指向性送達を含む。放射性同位元素の放射線量範囲は、同位体の半減期、放出される放射線の強度および種類、ならびに腫瘍細胞による取り込みの程度によって、大きく異なっているが、適切な治療有効線量の決定は、当業者のレベルの範囲内にある。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、一次処置に関連する副作用（例えば、悪心、悪液質など）の処置のための薬剤の投与を含む。ある特定の実施形態では、追加の治療法は、免疫療法を含む。ある特定の実施形態では、追加の治療法は、放射線療法を含む。一部の実施形態では、放射線療法は、ガンマ照射を含む。ある特定の実施形態では、追加の治療法は、外科手術を含む。ある特定の実施形態では、追加の治療法は、放射線療法と外科手術との組合せを含む。ある特定の実施形態では、追加の治療法は、アルキル化剤、アントラサイクリン、細胞骨格破壊剤、エポチロン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、キナーゼ阻害剤、ヌクレオチドアナログおよびヌクレオチド前駆体アナログ、ペプチド抗生物質、白金ベースの化合物、レチノイド、ビンカアルカロイドならびにそれらの誘導体からなる群より選択される化学療法剤のクラスによる処置を含む。
【０１０７】
本明細書で企図される追加の治療法は、本明細書で提供される組成物の投与の前、後、または同時に投与することができる。ある特定の実施形態では、追加の治療法は、本明細書で提供される組成物の前に投与される。ある特定の実施形態では、追加の治療法は、本明細書で提供される組成物の後に投与される。ある特定の実施形態では、追加の治療法は、本明細書で提供される組成物の投与前または後に、１回または複数の間隔で投与される。処置されている被験体が併用療法から利益を得るような、追加の治療法の投与の適切な間隔の決定は、当業者のレベルの範囲内である。
【０１０８】
Ｂ．医薬組成物
別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ特異的細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物および製剤である。
【０１０９】
本明細書に記載の医薬組成物および製剤は、水溶液の形態、例えば、生理食塩水（例えば、０．９％）およびヒト血清アルブミン（例えば、１０％）中で、所望の程度の純度を有する活性成分（抗体またはポリペプチドなど）を、１つまたは複数の必要に応じた薬学的に許容される担体と混合することによって調製することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２０１２）。薬学的に許容される担体は、一般に、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシン；単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストランを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、亜鉛−タンパク質複合体）；ならびに／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。
【実施例】
【０１１０】
ＩＶ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において良好に機能するように本発明者らによって発見された技術を表し、したがってその実施のための好ましい様式を構成すると考えることができることが、当業者には認識されるべきである。しかし、当業者であれば、本開示の見地から、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された具体的な実施形態において多くの変更がなされ、依然として同様のまたは類似の結果を得ることができることを認識すべきである。
【０１１１】
（実施例１  ＭＡＧＥ−Ｂ２特異的Ｔ細胞の産生および特徴付け）
ＭＡＧＥ−Ｂ２の発現を、肺がん細胞株および不死化した正常ヒト小気道上皮細胞（ＨＳＡＥＣ１−ＫＴおよびＨＳＡＥＣ２−ＫＴ）において分析した（図１）。ＭＡＧＥ−Ｂ２タンパク質は、ほとんどの肺がん細胞株において強く発現していることが見出され、正常肺（ｌｉｎｇ）細胞株では発現がほとんど観察されなかった。
【０１１２】
ＭＡＧＥ−Ｂ２特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを生成するために、樹状細胞を、ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープをコードするＲＮＡでパルスした。次に、Ｔ細胞を、パルスした樹状細胞で刺激し、ＣＤ８＋四量体をフローサイトメトリーにより検出した。次いで、Ｔ細胞を選別し、クローニングし、ランダム拡大プロトコール（ＲＥＰ）によって拡大させた。次いで、Ｔ細胞を、機能的ＭＡＧＥ−Ｂ２特異的ＴＣＲのクローニングの前に機能的スクリーニングによって特徴付けた。
【０１１３】
このように、ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープを、ＭＡＧＥ−Ｂ２特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成に使用した。ナイーブＴ細胞を、健康なＨＬＡ−Ａ２ドナーから導出し、完全長ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＲＮＡでパルスされた自家成熟樹状細胞（ｍＤＣ）により刺激した。２回の刺激後、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＭＡＧＥ−Ｂ２エピトープ（ＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ；配列番号１）を有する四量体を使用して、エピトープを認識するＴ細胞集団を検出した。次いで、ＣＤ８＋四量体＋集団を選別し、急速拡大プロトコール（ＲＥＰ）で拡大させて、ＣＴＬ細胞株を生成した。相関ＣＴＬクローンは、限界希釈法を使用して生成した。９９％を超える細胞がＣＤ８＋かつ四量体＋であることが観察された（図２）。
【０１１４】
次に、ＭＡＧＥ−Ｂ２特異的Ｔ細胞の機能的アビディティーを試験した。ペプチド滴定アッセイでは、Ｔ２細胞を異なる濃度のＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチド（１０ｐｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）でパルスした（図３Ａ）。Ｔ２細胞を標的細胞として使用し、単離されたＭＡＧＥ−Ｂ２  ＣＴＬクローンと共培養した（Ｅ：Ｔ＝２０：１）。肺がん細胞株Ｈ２０２３（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１）および正常肺細胞株ＨＳＡＥＣ２−ＫＴ（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１）に対するＣＴＬクローンの細胞傷害活性（図３Ｂ）を測定した。標的細胞を、異なるＥ：Ｔ比でＭＡＧＥ−Ｂ２  ＣＴＬクローンと共培養した。細胞傷害活性を、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにより検出した。ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＣＴＬクローンは、肺がん細胞株に対して細胞傷害性であることが観察されたが、正常肺細胞株に対しては観察されなかった（図３Ｂ）。さらに、ＨＬＡ−Ａ２＋肺がん細胞株Ｈ５２２、Ｈ１３５５、Ｈ１７５５、およびＤＦＣ−１０３２を標的細胞として使用し、異なるＥ：Ｔ比でＭＡＧＥ−Ｂ２  ＣＴＬクローンと共培養し、細胞傷害を測定した。ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＣＴＬクローンは、肺がん細胞株ＤＦＣ−１０３２およびＨ１７５５に対して細胞傷害性であることが観察された（図３Ｃ）。最後に、親肺がん細胞株ＰＣ−９およびＨ１５７３、ならびにＨＬＡ−Ａ２強制発現を伴う両方の細胞株に対するＣＴＬクローンの細胞傷害を評価した。親ＰＣ−９およびＨ１５７３細胞と比較して、ＨＬＡ−Ａ２強制発現を伴う細胞株に対してより大きな細胞傷害活性が観察された（図３Ｄ）。
【０１１５】
ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ操作されたＴ細胞（ＴＣＲ−Ｔ）を生成するために、ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＣＴＬクローンからのＴＣＲをクローン化し、レトロウイルスベクターｐＭＳＧＶ１に挿入した。フューリン切断部位、ＳＧＳＧリンカーおよびＰ２Ａ切断部位を含有するリンカー断片をＴＣＲ−β鎖とＴＣＲ−α鎖との間に挿入して、両方の鎖がＭＳＣＶプロモーターの下で等しく発現することを保証した。組換えレトロウイルスは、レトロウイルスベクターおよびエンベロープベクターＲＤ１１４のパッケージング細胞株ＧＰ２−２９３への同時トランスフェクションにより生成した。トランスフェクションの２〜３日後、レトロウイルスを含有する上清を使用して、５０ｎｇ／ｍｇ  ＯＫＴ３および３００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２の刺激により２日間活性化させた同種異系ＰＢＭＣに感染させた。最初の感染の１日後にもう一回感染を実施した。５日後、明確なＣＤ８＋四量体＋集団がフローサイトメトリーによって検出された（図４）。ＴＣＲ−Ｔ細胞株は、ＣＤ８＋四量体＋集団を選別し、急速拡大プロトコールを使用して拡大させることによって発生させた。
【０１１６】
ペプチド滴定アッセイを、異なる濃度のＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチド（１０ｐｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）でパルスされたＴ２細胞を、標的細胞として用いて実施した。Ｔ２細胞を、ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ−Ｔ細胞株と共培養した（Ｅ：Ｔ＝２０：１）。細胞傷害を、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにより検出した（図５Ａ）。肺がん細胞株Ｈ２０２３（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１）および正常肺細胞株ＨＳＡＥＣ２−ＫＴ（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１）に対するＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ−Ｔの細胞傷害も評価した（図５Ｂ）。肺がん細胞株Ｈ２０２３および正常肺細胞株ＨＳＡＥＣ２−ＫＴを、異なるＥ：Ｔ比でＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ−Ｔ細胞と共培養した。殺傷活性を、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにより検出した。ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ−Ｔ細胞株は肺がん細胞株に対して特異的に細胞傷害性であることが観察された。
【０１１７】
最後に、ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ−Ｔ細胞を、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって機能的に特徴付けた。ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ−Ｔ細胞株を、肺がん細胞株Ｈ２０２３、正常肺細胞株ＨＳＡＥＣ２−ＫＴ、ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドでパルスされたＴ２、およびＭＡＲＴ−１ペプチドＭ２６でパルスされたＴ２と共培養した。ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ならびに抗原特異的応答マーカーＣＤ１３７およびＣＤ６９を、ＩＣＳアッセイによって検出した。ＴＣＲ−Ｔ細胞を肺がん細胞株Ｈ２０２３またはＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチドでパルスされたＴ２と共培養すると、正常肺細胞株ＨＳＡＥＣ２−ＫＴまたは対照ペプチドＭ２６でパルスされたＴ２との共培養と比較して、共培養後に、ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ−Ｔ細胞株のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＣＤ１３７、およびＣＤ６９レベルが大幅に増強された（図６）。
【０１１８】
したがって、ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ−Ｔ細胞は、例えば、同種異系ＰＢＭＣを使用してＴＣＲ遺伝子改変ＣＴＬを生成し、拡大させることによって、進行性または再発性のがんを有するＨＬＡ−Ａ２（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０３、ＨＬＡ−Ａ＊０２０４、またはＨＬＡ−Ａ＊０２０５）陽性患者の処置に使用することができる。機能的検出（例えば、表現型および細胞傷害）の後、ＴＣＲ改変Ｔ細胞を患者に注入する。
【０１１９】
（実施例２  材料および方法）
Ｔ細胞クローンを生成する：完全長ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＲＮＡを、健康なＨＬＡ−Ａ２ドナー由来の成熟樹状細胞（ＤＣ）にトランスフェクトした。ＲＮＡをトランスフェクトしたＤＣを、ＩＬ−２１の存在下でＤＣ：Ｔ＝１：１０の比でナイーブＴ細胞と共培養した。１週間後、ＲＮＡをトランスフェクトしたＤＣを使用して、Ｔ細胞を再刺激した。２回の刺激後、ＣＤ８および四量体二重陽性Ｔ細胞集団を選別し、急速拡大プロトコール（ＲＥＰ）で拡大させた。Ｔ細胞クローンは、限界希釈法により生成した。高活性ＣＴＬクローンを、がん細胞に対する細胞傷害性アッセイを介してスクリーニングした。
【０１２０】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のクローニングおよびレトロウイルス発現ベクターの構築：ＴＣＲ（α鎖およびβ鎖を含む）は、製造業者の指示に従って５’−ＲＡＣＥ法を使用してクローニングした。ＴＣＲ  Ｖ−アルファおよびＴＣＲ  Ｖ−ベータの使用法は、ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴアノテーションツールにより識別した。ＴＣＲ発現レトロウイルスベクターの構築のために、フォワードプライマーを、ＴＣＲ  Ｖ−アルファまたはベータの使用法に従って設計した。リバースプライマーを、ＴＣＲアルファまたはベータの定常領域の配列に従って設計した。フューリンおよびＰ２Ａリンカーペプチドによって分離されたアルファおよびベータ−ＴＣＲ鎖を含有する発現カセットを生成し、完全長ＰＣＲ産物を、レトロウイルスベクターｐＭＳＧＶ１にクローニングした。クローニングされたＤＮＡ配列は、シーケンシングにより検証した。
【０１２１】
レトロウイルス生成およびヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の感染：ＴＣＲを含有するｐＭＳＧＶ１ベクターおよびエンベロープベクターＲＤ１１４を、パッケージング細胞株ＧＰ２−２９３に同時トランスフェクションした。６〜８時間のトランスフェクション後、培地をリフレッシュした。２４時間後に上清を回収し、２０μｇ／ｍＬ  ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎでコーティングした６ウェルプレートに加えた後、３２℃で２時間遠心分離（２０００×ｇ）した。次いで、上清を除去し、５０ｎｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３および３００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２で２日間活性化したＰＢＬを、レトロウイルスを負荷したプレートに加え、続いて３２℃で１０分間遠心分離（１０００×ｇ）した。次いで、細胞を３２℃で一晩インキュベートし、手順を翌日繰り返した（合計２回の形質導入）。その後、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で拡大させ、必要に応じて分割した。
【０１２２】
ＴＣＲ操作されたＴ細胞クローンの生成：感染後、ＣＤ８＋および四量体＋Ｔ細胞集団を選別し、急速拡大プロトコール（ＲＥＰ）で拡大させた。
【０１２３】
５１Ｃｒ放出アッセイ：ＨＬＡ−Ａ２腫瘍標的を溶解するためのＴＣＲ操作されたＴ細胞またはＣＴＬクローンの殺傷能力を、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイを使用して測定した。腫瘍細胞または正常細胞を、２００μＣｉの５１Ｃｒにより、３７℃で２時間標識した。標識された標的細胞を洗浄し、次いで、０．２ｍｌの完全培地中で３７℃で４時間、異なる比でエフェクター細胞と共にインキュベートした。回収された上清は、自動ガンマカウンターを使用して計数した。最大および自発的５１Ｃｒ放出は、標識された標的細胞を、トリパン溶解バッファーまたは培地のいずれか中で、３７℃で４時間インキュベートすることによって決定した。各データポイントを、４連のウェルの平均として決定した。特異的溶解のパーセントは次のように計算した：％殺傷＝（（特異的放出−自発的放出）／（総放出−自発的放出））×１００。
【０１２４】
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイ：Ｔ細胞を、ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）の存在下、３７℃で一晩、１０：１の比で標的細胞と共にインキュベートした。共培養後、Ｔ細胞を回収し、洗浄した。最初に、細胞を、フロー抗体抗表面マーカーで染色した。その後、細胞を洗浄し、Ｆｉｘ  Ｂｕｆｆｅｒにより固定し、次いで、Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを使用して透過処理した。次いで、透過処理した細胞を、細胞内サイトカインフロー抗体で染色する。最後に、細胞内で産生されているサイトカインのレベルを、ＦＡＣＳを使用して分析した。
【０１２５】
（実施例３  ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチド（ＭＢ２−２３１）特異的ＴＣＲ−Ｔの生成）
追加のＭＡＧＥ−Ｂ２特異的Ｔ細胞産物を、ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチド（ＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ；配列番号１）でパルスした樹状細胞を使用して生成し、同じ健康なドナーに由来するＰＢＭＣを刺激した（図７）。２回の刺激後、１枚の４８ウェルプレートのうちの３つのウェル内でＣＤ８＋／四量体＋の小集団が観察された。３つの陽性ウェルを、四量体誘導選別技術を使用して別々に選別し、ＲＥＰにより１回または２回の拡大を行った。最終産物のＣＤ８および四量体染色を、図７に示す。
【０１２６】
３つのＭＡＧＥ−Ｂ２特異的ＣＴＬ細胞株の機能的アビディティーを、２０：１のエフェクター  対  標的（Ｅ：Ｔ）比での、種々の濃度のＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチド（ＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ；配列番号１）でパルスされたＴ２細胞株の溶解によって示した。細胞傷害を、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにより検出した（図８Ａ）。肺がん細胞株Ｈ２０２３（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋、ＭＡＧＥ−Ｂ２＋）および正常肺細胞株ＨＳＡＥＣ２−ＫＴ（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋、ＭＡＧＥ−Ｂ２−）に対する、３つのＭＡＧＥ−Ｂ２特異的ＣＴＬ細胞株の細胞傷害も評価した（図８Ｂ）。肺がん細胞株Ｈ２０２３および正常肺細胞株ＨＳＡＥＣ２−ＫＴを、異なるＥ：Ｔ比でＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ−Ｔ細胞と共培養した。殺傷活性を、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにより検出した。３つすべてのＭＡＧＥ−Ｂ２特異的ＣＴＬ細胞株は、肺がん細胞株Ｈ２０２３に対して特異的に細胞傷害性であることが観察された（図８Ｂ）。他の肺がん細胞株Ｈ１２９９（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−、ＭＡＧＥ−Ｂ２＋）、Ｈ１２９９−Ａ２（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１強制発現、ＭＡＧＥ−Ｂ２＋）、Ｈ１３９５（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋、ＭＡＧＥ−Ｂ２＋）、Ｈ５２２（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋、ＭＡＧＥ−Ｂ２−）、Ｈ１３５５（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋、ＭＡＧＥ−Ｂ２−）、Ｈ１７５５（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋、ＭＡＧＥ−Ｂ２＋）およびＤＦＣ−１０３２（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋、ＭＡＧＥ−Ｂ２−）に対する、３つのＭＡＧＥ−Ｂ２特異的ＣＴＬ細胞株の細胞傷害をさらに評価した（図８Ｃ、８Ｄ、８Ｅ）。
【０１２７】
ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ操作されたＴ細胞（ＴＣＲ−Ｔ）を生成するために、ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＣＴＬ細胞株Ｃ５由来のＴＣＲをクローン化し、レトロウイルスベクターｐＭＳＧＶ１に挿入した。フューリン切断部位、ＳＧＳＧリンカーおよびＰ２Ａ切断部位を含有するリンカー断片をＴＣＲ−β鎖とＴＣＲ−α鎖との間に挿入して、両方の鎖がＭＳＣＶプロモーターの下で等しく発現することを保証した。組換えレトロウイルスは、レトロウイルスベクターおよびエンベロープベクターＲＤ１１４のパッケージング細胞株Ｐｈｏｅｎｉｘ−ＧＰへの同時トランスフェクションにより生成した。トランスフェクションの２〜３日後、レトロウイルスを含む上清を使用して、５０ｎｇ／ｍｇ  ＯＫＴ３および３００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２の刺激により２日間活性化させた同種異系ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋健康なドナーのＰＢＭＣに感染させた。５日後、明確なＣＤ８＋四量体＋集団がフローサイトメトリーによって検出された（図９Ａ）。ＣＤ８＋四量体＋集団は、四量体誘導選別技術を使用して選別し、ＲＥＰにより拡大させた。最終産物のＣＤ８および四量体染色を、図９Ａに示す。ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ−Ｔの機能的アビディティーを、２０：１のエフェクター  対  標的（Ｅ：Ｔ）比での、種々の濃度のＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチド（ＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ；配列番号１）でパルスされたＴ２細胞株の溶解によって示した。細胞傷害を、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにより検出した（図９Ｂ）。肺がん細胞株Ｈ２０２３（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋，ＭＡＧＥ−Ｂ２＋）および正常肺細胞株ＨＳＡＥＣ２−ＫＴ（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋，ＭＡＧＥ−Ｂ２−）に対する、ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ−Ｔの細胞傷害も評価した（図９Ｃ）。他の肺がん細胞株Ｈ１２９９（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−、ＭＡＧＥ−Ｂ２＋）、Ｈ１２９９−Ａ２（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１強制発現、ＭＡＧＥ−Ｂ２＋）、Ｈ１３９５（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋、ＭＡＧＥ−Ｂ２＋）、Ｈ５２２（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋、ＭＡＧＥ−Ｂ２−）、Ｈ１３５５（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋、ＭＡＧＥ−Ｂ２−）、Ｈ１７５５（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋、ＭＡＧＥ−Ｂ２＋）およびＤＦＣ−１０３２（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋、ＭＡＧＥ−Ｂ２−）に対する、ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ−Ｔの細胞傷害をさらに評価した（図９Ｄ、９Ｅ）。
【０１２８】
最後に、ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ−Ｔ細胞を、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって機能的に特徴付けた。ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ−Ｔ細胞株を、ＭＡＧＥ−Ｂ２ペプチド（ＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ；配列番号１）でパルスされたＴ２、およびＭＡＲＴ−１ペプチドＭ２６（対照として）でパルスされたＴ２と共培養した（図１０Ａ）。肺がん細胞株Ｈ２０２３、正常肺細胞株ＨＳＡＥＣ２−ＫＴ（対照として）に対するＭＡＧＥ−Ｂ２特異的ＴＣＲ−Ｔの応答も評価した（図１０Ａ）。さらに、他の肺がん細胞株、Ｈ１３９５、Ｈ５２２、Ｈ１２９９、Ｈ１２９９−Ａ２、ＤＦＣ−１０３２、Ｈ１３５５およびＨ１７５５も、ＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ−Ｔの機能および特異性を評価するための標的として使用した（図１０Ｂ、１０Ｃ）。ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αのサイトカイン放出、およびＭＡＧＥ−Ｂ２  ＴＣＲ−Ｔ細胞株の抗原特異的応答マーカーＣＤ１３７およびＣＤ６９のアップレギュレーションが、ＩＣＳにより検出された。
【０１２９】
本明細書に開示および特許請求されたすべての方法は、本開示に照らして過度の実験なしに作成し、実行することができる。本発明の組成物および方法を、好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法および方法のステップまたはステップの順序に変形形態を適用し得ることは、当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連するある特定の薬剤が、同じかまたは類似の結果を達成する限り、本明細書に記載の薬剤の代わりになり得ることが明らかであろう。当業者に明らかなそのような同様の代替物および改変はすべて、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると見なされる。
参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書に記載されたものを補足する例示的な手順または他の詳細を提供する限りにおいて、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
Ｂａｒｎｅａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ３２（１）：２１３−２２，  ２００２．
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０１２．  Ｓｈｒａｉｂｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，  １５（９）：３０５８−７０，  ２０１６．
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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