(57)【要約】  本明細書に開示した方法は、マルチ属性分析のためにポリペプチドを調製することに関する。ポリペプチドは、第１消化を受ける前に、任意選択的に、変性、還元及び／又はアルキル化させられる。第１消化後、前記消化の結果として生じる大きな及び小さな断片は、相互から分離される。第２消化は、次に大きい方の断片で実施される。２回の消化からの断片の全部は、次にクロマトグラフィーによって、電気泳動法によって、若しくは分光測定法によって、又はこれらの方法の組合せによって分析される。本方法は、分析のための治療用ポリペプチド、特に容易に切断されないポリペプチドを調製するために特に有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析のためのポリペプチドを調製する方法であって、
ａ．第１消化においてポリペプチドを切断するステップであって、前記切断するステップは、前記ポリペプチドの少なくとも２つの断片を生成するステップ；
ｂ．第１の大きなペプチド断片含有溶液及び第１の小さなペプチド断片含有溶液を生成するために、前記少なくとも２つの断片を相互から分離するステップ；
ｃ．第２消化において前記第１の大きなペプチド断片含有溶液の大きなペプチド断片を切断するステップであって、前記第１の大きなペプチド断片含有溶液の前記大きなペプチド断片の少なくとも１つが、前記第１の大きなペプチド断片含有溶液の前記大きなペプチド断片の少なくとも２つの断片を生成するために切断されるステップ；
ｄ．ｃ．の消化溶液及びｂ．の前記小さなペプチド断片含有溶液を分析するステップ
を含む方法。
【請求項２】
ｃ．の消化溶液及びｂ．の小さなペプチド断片含有溶液は、分析前に組み合わせられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分析のためのポリペプチドを調製する方法であって、
ａ．第１消化においてポリペプチドを切断するステップであって、前記切断するステップは、前記ポリペプチドの少なくとも２つの断片を生成するステップ；
ｂ．第１の大きなペプチド断片含有溶液及び第１の小さなペプチド断片含有溶液を生成するために、前記少なくとも２つの断片を相互から分離するステップ；
ｃ．第２消化において前記第１の大きなペプチド断片含有溶液の大きなペプチド断片を切断するステップであって、前記第１の大きなペプチド断片含有溶液の前記大きなペプチド断片の少なくとも１つが、前記第１の大きなペプチド断片含有溶液の前記大きなペプチド断片の少なくとも２つの断片を生成するために切断されるステップ；
ｄ．第２の大きなペプチド断片含有溶液及び第２の小さなペプチド断片含有溶液を生成するために、大きなペプチド断片の少なくとも２つの断片を相互から分離するステップ；
ｅ．第３消化において前記第２の大きなペプチド断片含有溶液の前記大きなペプチド断片を切断するステップであって、前記第２の大きなペプチド断片含有溶液の前記大きなペプチド断片の少なくとも１つが、前記第２の大きなペプチド断片含有溶液の前記大きなペプチド断片の少なくとも２つの断片を生成するために切断されるステップ；
ｆ．ｃ．の消化溶液、ｂ．の前記第１の小さなペプチド断片含有溶液及びｄ．の前記第２の小さなペプチド断片含有溶液を分析するステップ
を含む方法。
【請求項４】
ｃ．の消化溶液、ｂ．の第１の小さなペプチド断片含有溶液及びｄ．の第２の小さなペプチド断片含有溶液は、分析前に組み合わせられる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
第１消化においてポリペプチドを切断するステップは、タンパク質分解性切断又は化学的切断を含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項６】
切断するステップは、プロテアーゼによって実施されるタンパク質分解性切断である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
プロテアーゼは、好中球エラスターゼ、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、ペプシン、キモトリプシン、キモトリプシンＢ、Ｌｙｓ−Ｎプロテアーゼ、Ｌｙｓ−Ｃプロテアーゼ、Ｇｌｕ−Ｃプロテアーゼ、Ａｓｐ−Ｎプロテアーゼ、膵臓ペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、プロテイナーゼＫ及びサーモリシン並びにそれらの組合せから成る群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
プロテアーゼは、トリプシンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
切断するステップは、化学物質によって実施される化学的切断である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
化学物質は、臭化シアン、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸、ヒドロキシルアミン及びＢＮＰＳ−スカトール並びにそれらの組合せから成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドは、第１消化においてサンプル中のポリペプチドを切断する前に変性される、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１２】
ポリペプチドは、第１消化においてサンプル中のポリペプチドを切断する前にアルキル化される、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１３】
ポリペプチドは、第１消化においてサンプル中のポリペプチドを切断する前に変性され、アルキル化又は還元の何れかが行われる、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１４】
ポリペプチドは、第１消化においてサンプル中のポリペプチドを切断する前に変性、還元及びアルキル化される、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１５】
第２消化においてポリペプチドを切断するステップは、プロテアーゼによって実施されるタンパク質分解性切断を含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１６】
プロテアーゼは、好中球エラスターゼ、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、ペプシン、キモトリプシン、キモトリプシンＢ、Ｌｙｓ−Ｎプロテアーゼ、Ｌｙｓ−Ｃプロテアーゼ、Ｇｌｕ−Ｃプロテアーゼ、Ａｓｐ−Ｎプロテアーゼ、膵臓ペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、プロテイナーゼＫ及びサーモリシン並びにそれらの組合せから成る群から選択されるが、ここで前記プロテアーゼは、第１消化においてポリペプチドを切断するために使用されるプロテアーゼとは異なる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
プロテアーゼは、好中球エラスターゼである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
好中球エラスターゼは、ヒト好中球エラスターゼ（ＥＣ３．４．２１．３７）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
分析するステップは、クロマトグラフィー、電気泳動法、分光測定法及びそれらの組合せから成る群から選択される少なくとも１つの技術を含む、請求項１又３に記載の方法。
【請求項２０】
サンプルを分析するための技術は、
ａ．ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、超高速液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、拡張吸着流動床クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィー並びにそれらの組合せから成る群から選択されるクロマトグラフィー；
ｂ．ゲル電気泳動法、フリー・フロー電気泳動法、等電点電気泳動法、等速電気泳動法、親和性電気泳動法、免疫電気泳動法、逆電気泳動法、キャピラリー電気泳動法及びキャピラリーゾーン電気泳動法並びにそれらの組合せから成る群から選択される電気泳動法；又は
ｃ．質量分光測定法、紫外分光測定法、可視分光測定法、蛍光分光測定法及び紫外−可視分光測定法並びにそれらの組合せから成る群から選択される分光測定法
を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
技術は、液体クロマトグラフィー−質量分光測定法を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
技術は、質量分光測定法に連結されたキャピラリーゾーン電気泳動法を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
第３消化においてポリペプチドを切断するステップは、プロテアーゼによって実施されるタンパク質分解性切断を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項２４】
プロテアーゼは、好中球エラスターゼ、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、ペプシン、キモトリプシン、キモトリプシンＢ、Ｌｙｓ−Ｎプロテアーゼ、Ｌｙｓ−Ｃプロテアーゼ、Ｇｌｕ−Ｃプロテアーゼ、Ａｓｐ−Ｎプロテアーゼ、膵臓ペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、プロテイナーゼＫ及びサーモリシン並びにそれらの組合せから成る群から選択されるが、ここで前記プロテアーゼは、第１消化においてポリペプチドを切断するために使用されるプロテアーゼとは異なり、第２消化においてポリペプチドを切断するために使用されるプロテアーゼとは異なる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
分析のためのポリペプチドを調製する方法であって、
ａ．ポリペプチドを変性、還元、及びアルキル化するステップ；
ｂ．大きなトリプシン切断ポリペプチド断片及び小さなトリプシン切断ポリペプチド断片を生成するためにトリプシンにより前記ポリペプチドを消化するステップ；
ｃ．前記大きなトリプシン切断ポリペプチド断片及び小さなトリプシン切断ポリペプチド断片を第１アリコート及び第２アリコートに分割するステップ；
ｄ．前記第１アリコートの前記大きなトリプシン切断ポリペプチド断片を好中球エラスターゼにより消化するステップ；
ｅ．前記第１アリコート及び第２アリコートを約１：１の比で組み合わせるステップ；及び
ｆ．ステップ（ｅ）の組み合わせられたアリコートを分析するステップ
を含む方法。
【請求項２６】
好中球エラスターゼは、ヒト好中球エラスターゼ（ＥＣ３．４．２１．３７）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
サンプルを分析するステップは、クロマトグラフィー、電気泳動法、分光測定法及びそれらの組合せから成る群から選択される少なくとも１つの技術を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ａ．技術は、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、超高速液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、拡張吸着流動床クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィー並びにそれらの組合せから成る群から選択されるクロマトグラフィーを含み；
ｂ．技術は、ゲル電気泳動法、フリー・フロー電気泳動法、等電点電気泳動法、等速電気泳動法、親和性電気泳動法、免疫電気泳動法、逆電気泳動法及びキャピラリー電気泳動法並びにそれらの組合せから成る群から選択される電気泳動法を含み、；又は
ｃ．技術は、質量分光測定法、紫外分光測定法、可視分光測定法、蛍光分光測定法及び紫外−可視分光測定法並びにそれらの組合せから成る群から選択される分光測定法を含む、
請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ステップａ．の少なくとも２つの断片は、分子量カットオフフィルターを使用して分離される、請求項１〜２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
フィルターの分子量カットオフは、３０ｋＤａである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ポリペプチドは、治療用ポリペプチドである、請求項１〜３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項３２】
治療用ポリペプチドは、抗体又はその抗原結合断片、抗体又は抗体断片の誘導体及び融合ポリペプチドから成る群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
治療用ポリペプチドは、インフリキシマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ラニビズマブ、パリビズマブ、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アラシズマブペゴル、ａｌｄ５１８、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブマフェナトクス、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ、アルチヌマブ、アトリズマブ、アトロリムマブ、トシリズマブ、バピネウズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ビシロマブ、ビバツズマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブロソズマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カンツズマブメルタンシン、カプラシズマブ、カプロマブペンデチド、カルルマブ、カツマキソマブ、ｃｃ４９、セデリズマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、シタツズマブボガトクス、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コナツムマブ、クレネズマブ、ｃｒ６２６１、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダラツムマブ、デムシズマブ、デノスマブ、デツモマブ、ドルリモマブアリトクス、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュピルマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エロツズマブ、エルシリモマブ、エナバツズマブ、エンリモマブペゴル、エノキズマブ、エノチクマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブシツキセタン、エプラツズマブ、エレヌマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、エトロリズマブ、エボロクマブ、エキシビビルマブ、ファノレソマブ、ファラリモマブ、ファルレツズマブ、ファシヌマブ、ｆｂｔａ０５、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フォントリズマブ、フォラルマブ、フォラビルマブ、フレソリムマブ、フルラヌマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブベドチン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、ｇｓ６６２４、イバリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イゴボマブ、イムシロマブ、イムガツズマブ、インクラクマブ、インダツキシマブラブタンシン、インフリキシマブ、インテツムマブ、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、イトリズマブ、イキセキズマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レブリキズマブ、レマレソマブ、レルデリムマブ、レキサツムマブ、リビビルマブ、リゲリズマブ、リンツズマブ、リリルマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツズマブ、マスリモマブ、マブリリムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モロリムマブ、モタビズマブ、モキセツモマブパスドトクス、ムロモナブ−ｃｄ３、ナコロマブタフェナトクス、ナミルマブ、ナプツモマブエスタフェナトクス、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネレリモマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オデュリモマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブモナトクス、オレゴボマブ、オルチクマブ、オテリキシズマブ、オキセルマブ、オザネズマブ、オゾラリズマブ、パジバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パノバクマブ、パルサツズマブ、パスコリズマブ、パテクリズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペラキズマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ピジリズマブ、ピンツモマブ、プラクルマブ、ポネズマブ、プリリキシマブ、プリツムマブ、ＰＲＯ１４０、クイリズマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラフィビルマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、ロレデュマブ、ロモソズマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サマリズマブ、サリルマブ、サツモマブペンデチド、セクキヌマブ、セビルマブ、シブロツズマブ、シファリムマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、シプリズマブ、シルクマブ、ソラネズマブ、ソリトマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、スビズマブ、タバルマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タネズマブ、タプリツモマブパプトクス、テフィバズマブ、テリモマブアリトクス、テナツモマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、テゼペルマブ、ＴＧＮ１４１２、トレメリムマブ、チシリムマブ、チルドラキズマブ、チガツズマブ、ＴＮＸ−６５０、トシリズマブ、トラリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、ウブリツキシマブ、ウレルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バパリキシマブ、バテリズマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ベセンクマブ、ビジリズマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブマフォドチン、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ、ジラリムマブ、ゾリモマブアリトクス、糖タンパク質、ＣＤポリペプチド、ＨＥＲ受容体ポリペプチド、細胞接着ポリペプチド、成長因子ポリペプチド、インスリンポリペプチド、インスリン関連ポリペプチド、凝固ポリペプチド、凝固関連ポリペプチド、アルブミン、ＩｇＥ、血液型抗原、コロニー刺激因子、受容体、神経栄養因子、インターフェロン、インターロイキン、ウイルス抗原、リポタンパク質、カルシトニン、グルカゴン、心房性ナトリウム利尿因子、肺界面活性剤、腫瘍壊死因子α及びβ、エンケファリナーゼ、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、ＤＮＡｓｅ、インヒビン、アクティビング（ａｃｔｉｖｉｎｇ）、インテグリン、プロテインＡ、プロテインＤ、リウマチ因子、イムノトキシン、骨形成タンパク質、スーパーオキシド・ジスムターゼ、表面膜ポリペプチド、崩壊促進因子、ＡＩＤＳエンベロープ、輸送ポリペプチド、ホーミング受容体、アドレシン、調節ポリペプチド、イムノアドヘシン��ミオスタチン、ＴＡＬＬポリペプチド、アミロイドポリペプチド、胸腺間質リンホポエチン、ＲＡＮＫリガンド、ｃ−ｋｉｔポリペプチド、ＴＮＦ受容体及びアンギオポエチン並びに表７に示した抗体及びそれらの生物活性断片、アナログ又は変異体から成る群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
治療用ポリペプチドは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
方法は、自動液体処理装置によって少なくとも部分的に実施される、請求項１〜３４の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、参照により本明細書に全体として組み込まれる、２０１８年３月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／６４２，５４９号明細書の利益を主張するものである。
【０００２】
本明細書に提示した主題は、ポリペプチド分析の技術分野に関する。詳細には、本明細書に提示した主題は、治療用ポリペプチド等の、その中に含まれるポリペプチドを検出するためのサンプルの調製に関する。本明細書に開示した方法は、ポリペプチドの調製における連続消化及び分離を使用する。
【背景技術】
【０００３】
マルチ属性法（ＭＡＭ）は、その後に質量分光測定法に基づく重要な属性の特性解析及び定量が実施される、分子の酵素的消化に依存している。相補性決定領域（ＣＤＲ）における修飾は、それらが分子の効力及び／又は安全性に影響を及ぼし得るために特に懸念される。本発明は、複数の酵素を使用する新規な酵素的消化アプローチについて記載する。酵素的消化は、タンパク質を特定のアミノ酸残基上で切断する。タンパク質内でのこれらの特異的切断可能残基の一様ではない分布に起因して、単一酵素的消化は、ＭＡＭ及び他の分析技術によって分析することが極めて困難である大きなペプチドを生成し得る。この問題に対処するため、通常は第２酵素が使用される。慣習的には、第２酵素は、第１酵素と一緒に同時に使用される、又は独立して使用される。慣習的な複数の酵素的消化の短所は、最後には過剰に多数のピークを備える複雑な消化物、又は別個に分析する必要がある複数の酵素的消化の何れかが生じることである。本明細書に記載した方法は、連続方法でタンパク質を消化するために複数の酵素を使用するが、これは様々な酵素間の干渉を排除し、最終生成物は、単一酵素的消化のピークに近い複数のペプチドピークを伴う単一のきれいな消化物である。本方法は、ＬＣ／ＵＶペプチドマッピング法等のＭＡＭ及び他の分析技術と共に使用し易い。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本願は、分析のためのポリペプチドを調製する方法であって：
ａ．  第１消化においてポリペプチドを切断するステップであって、切断するステップは、ポリペプチドの少なくとも２つの断片を生成するステップ；
ｂ．  第１の大きなペプチド断片含有溶液及び第１の小さなペプチド断片含有溶液を生成するために少なくとも２つの断片を相互から分離するステップ；
ｃ．  第２消化において第１の大きなペプチド断片含有溶液の大きなペプチド断片を切断するステップであって、第１の大きなペプチド断片含有溶液の大きなペプチド断片の少なくとも１つが第１の大きなペプチド断片含有溶液の大きなペプチド断片の少なくとも２つの断片を生成するために切断されるステップ；
ｄ．  ｃ．の消化溶液及びｂ．の小さなペプチド断片含有溶液を分析するステップを含む方法に関する。
【０００５】
１つの実施形態では、ｃ．の消化溶液及びｂ．の小さなペプチド断片含有溶液が分析前に組み合わせられる。
【０００６】
別の態様では、本発明は、分析のためのポリペプチドを調製する方法であって：
ａ．  第１消化においてポリペプチドを切断するステップにおいて、切断するステップは、ポリペプチドの少なくとも２つの断片を生成するステップ；
ｂ．  第１の大きなペプチド断片含有溶液及び第１の小さなペプチド断片含有溶液を生成するために少なくとも２つの断片を相互から分離するステップ；
ｃ．  第２消化において第１の大きなペプチド断片含有溶液の大きなペプチド断片を切断するステップであって、第１の大きなペプチド断片含有溶液の大きなペプチド断片の少なくとも１つが第１の大きなペプチド断片含有溶液の大きなペプチド断片の少なくとも２つの断片を生成するために切断されるステップ；
ｄ．  第２の大きなペプチド断片含有溶液及び第２の小さなペプチド断片含有溶液を生成するために、大きなペプチド断片の少なくとも２つの断片を相互から分離するステップ；
ｅ．  第３消化において第２の大きなペプチド断片含有溶液の大きなペプチド断片を切断するステップであって、第２の大きなペプチド断片含有溶液の大きなペプチド断片の少なくとも１つが、第２の大きなペプチド断片含有溶液の大きなペプチド断片の少なくとも２つの断片を生成するために切断されるステップ；
ｆ．  ｃ．の消化溶液、ｂ．の第１の小さなペプチド断片含有溶液及びｄ．の第２の小さなペプチド断片含有溶液を分析するステップを含む方法に関する。
【０００７】
１つの実施形態では、ｃ．の消化溶液、ｂ．の第１の小さなペプチド断片含有溶液及びｄ．の第２の小さなペプチド断片含有溶液が分析前に組み合わせられる。
【０００８】
所定の実施形態では、第１消化においてポリペプチドを切断するステップは、タンパク質分解性切断又は化学的切断を含む。１つの実施形態では、切断するステップは、プロテアーゼによって実施されるタンパク質分解性切断である。所定の実施形態では、プロテアーゼは、好中球エラスターゼ、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、ペプシン、キモトリプシン、キモトリプシンＢ、Ｌｙｓ−Ｎプロテアーゼ、Ｌｙｓ−Ｃプロテアーゼ、Ｇｌｕ−Ｃプロテアーゼ、Ａｓｐ−Ｎプロテアーゼ、膵臓ペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、プロテイナーゼＫ及びサーモリシン並びにそれらの組合せから成る群から選択される。
【０００９】
別の実施形態では、切断するステップは、化学物質によって実施される化学的切断である。所定の実施形態では、化学物質は、臭化シアン、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸、ヒドロキシルアミン及びＢＮＰＳ−スカトール並びにそれらの組合せから成る群から選択される。
【００１０】
所定の実施形態では、ポリペプチドは、第１消化においてサンプル中のポリペプチドを切断する前に変性させられる。所定の実施形態では、ポリペプチドは、第１消化においてサンプル中のポリペプチドを切断する前にアルキル化させられる。所定の実施形態では、ポリペプチドは、第１消化においてサンプル中のポリペプチドを切断する前に、変性させられ、及びアルキル化又は還元の何れかが行われる。
【００１１】
１つの実施形態では、ポリペプチドは、第１消化においてサンプル中のポリペプチドを切断する前に、変性、還元及びアルキル化させられる。
【００１２】
１つの実施形態では、第２消化においてポリペプチドを切断するステップは、プロテアーゼによって実施されるタンパク質分解性切断を含む。
【００１３】
所定の実施形態では、第２消化のプロテアーゼは、好中球エラスターゼ、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、ペプシン、キモトリプシン、キモトリプシンＢ、Ｌｙｓ−Ｎプロテアーゼ、Ｌｙｓ−Ｃプロテアーゼ、Ｇｌｕ−Ｃプロテアーゼ、Ａｓｐ−Ｎプロテアーゼ、膵臓ペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、プロテイナーゼＫ及びサーモリシン並びにそれらの組合せから成る群から選択されるが；ここでプロテアーゼは、第１消化においてポリペプチドを切断するために使用されるプロテアーゼとは異なる。１つの実施形態では、プロテアーゼは、好中球エラスターゼである。１つの実施形態では、好中球エラスターゼは、ヒト好中球エラスターゼ（ＥＣ３．４．２１．３７）である。
【００１４】
所定の実施形態では、分析するステップは、クロマトグラフィー、電気泳動法、分光測定法及びそれらの組合せから成る群から選択される少なくとも１つの技術を含む。
【００１５】
１つの実施形態では、サンプルを分析するための技術は：
ａ．  クロマトグラフィーであって、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、超高速液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、拡張吸着流動床クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィー並びにそれらの組合せから成る群から選択されるクロマトグラフィー；
ｂ．  電気泳動法であって、ゲル電気泳動法、フリー・フロー電気泳動法、等電点電気泳動法、等速電気泳動法、親和性電気泳動法、免疫電気泳動法、逆電気泳動法、キャピラリー電気泳動法及びキャピラリーゾーン電気泳動法並びにそれらの組合せから成る群から選択される電気泳動法；又は
ｃ．  分光測定法であって、質量分光測定法、紫外分光測定法、可視分光測定法、蛍光分光測定法及び紫外−可視分光測定法並びにそれらの組合せから成る群から選択される分光測定法を含む。
【００１６】
１つの実施形態では、本技術は、液体クロマトグラフィー質量分光測定法を含む。１つの実施形態では、本技術は、質量分光測定法に連結されたキャピラリーゾーン電気泳動法を含む。１つの実施形態では、第３消化においてポリペプチドを切断するステップは、プロテアーゼによって実施されるタンパク質分解性切断を含む。１つの実施形態では、第３消化のプロテアーゼは、好中球エラスターゼ、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、ペプシン、キモトリプシン、キモトリプシンＢ、Ｌｙｓ−Ｎプロテアーゼ、Ｌｙｓ−Ｃプロテアーゼ、Ｇｌｕ−Ｃプロテアーゼ、Ａｓｐ−Ｎプロテアーゼ、膵臓ペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、プロテイナーゼＫ及びサーモリシン並びにそれらの組合せから成る群から選択されるが；ここでプロテアーゼは、第１消化においてポリペプチドを切断するために使用されるプロテアーゼとは異なり、第２消化においてポリペプチドを切断するために使用されるプロテアーゼとは異なる。
【００１７】
１つの態様では、本発明は、分析のためのポリペプチドを調製する方法であって：
ａ．  ポリペプチドを変性させる、還元させる、及びアルキル化させるステップ；
ｂ．  大きなトリプシン切断ポリペプチド断片及び小さなトリプシン切断ポリペプチド断片を生成するためにトリプシンでポリペプチドを消化するステップ；
ｃ．  大きなトリプシン切断ポリペプチド断片及び小さなトリプシン切断ポリペプチド断片を第１アリコート及び第２アリコートに分割するステップ；
ｄ．  第１アリコートの大きなトリプシン切断ポリペプチド断片を好中球エラスターゼで消化するステップ；
ｅ．  第１アリコート及び第２アリコートを約１：１の比で組み合わせるステップ；及び
ｆ．  ステップ（ｅ）の組み合わせられたアリコートを分析するステップを含む方法に関する。
【００１８】
１つの実施形態では、ステップａ．の少なくとも２つの断片は、分子量カットオフフィルターを使用して分離される。１つの実施形態では、フィルターの分子量カットオフは、３０ｋＤａである。
【００１９】
１つの実施形態では、ポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。１つの実施形態では、治療用ポリペプチドは、抗体又はその抗原結合断片、抗体又は抗体断片の誘導体及び融合ポリペプチドから成る群から選択される。
【００２０】
所定の実施形態では、治療用ポリペプチドは、インフリキシマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ラニビズマブ、パリビズマブ、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アラシズマブペゴル、ａｌｄ５１８、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブマフェナトクス、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ、アルチヌマブ、アトリズマブ、アトロリムマブ、トシリズマブ、バピネウズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ビシロマブ、ビバツズマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブロソズマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カンツズマブメルタンシン、カプラシズマブ、カプロマブペンデチド、カルルマブ、カツマキソマブ、ｃｃ４９、セデリズマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、シタツズマブボガトクス、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コナツムマブ、クレネズマブ、ｃｒ６２６１、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダラツムマブ、デムシズマブ、デノスマブ、デツモマブ、ドルリモマブアリトクス、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュピルマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エロツズマブ、エルシリモマブ、エナバツズマブ、エンリモマブペゴル、エノキズマブ、エノチクマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブシツキセタン、エプラツズマブ、エレヌマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、エトロリズマブ、エボロクマブ、エキシビビルマブ、ファノレソマブ、ファラリモマブ、ファルレツズマブ、ファシヌマブ、ｆｂｔａ０５、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フォントリズマブ、フォラルマブ、フォラビルマブ、フレソリムマブ、フルラヌマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブベドチン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、ｇｓ６６２４、イバリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イゴボマブ、イムシロマブ、イムガツズマブ、インクラクマブ、インダツキシマブラブタンシン、インフリキシマブ、インテツムマブ、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、イトリズマブ、イキセキズマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レブリキズマブ、レマレソマブ、レルデリムマブ、レキサツムマブ、リビビルマブ、リゲリズマブ、リンツズマブ、リリルマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツズマブ、マスリモマブ、マブリリムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モロリムマブ、モタビズマブ、モキセツモマブパスドトクス、ムロモナブ−ｃｄ３、ナコロマブタフェナトクス、ナミルマブ、ナプツモマブエスタフェナトクス、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネレリモマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オデュリモマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブモナトクス、オレゴボマブ、オルチクマブ、オテリキシズマブ、オキセルマブ、オザネズマブ、オゾラリズマブ、パジバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パノバクマブ、パルサツズマブ、パスコリズマブ、パテクリズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペラキズマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ピジリズマブ、ピンツモマブ、プラクルマブ、ポネズマブ、プリリキシマブ、プリツムマブ、ＰＲＯ  １４０、クイリズマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラフィビルマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、ロレデュマブ、ロモソズマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サマリズマブ、サリルマブ、サツモマブペンデチド、セクキヌマブ、セビルマブ、シブロツズマブ、シファリムマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、シプリズマブ、シルクマブ、ソラネズマブ、ソリトマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、スビズマブ、タバルマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タネズマブ、タプリツモマブパプトクス、テフィバズマブ、テリモマブアリトクス、テナツモマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、テゼペルマブ、ＴＧＮ１４１２、トレメリムマブ、チシリムマブ、チルドラキズマブ、チガツズマブ、ＴＮＸ−６５０、トシリズマブ、トラリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、ウブリツキシマブ、ウレルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バパリキシマブ、バテリズマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ベセンクマブ、ビジリズマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブマフォドチン、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ、ジラリムマブ、ゾリモマブアリトクス、糖タンパク質、ＣＤポリペプチド、ＨＥＲ受容体ポリペプチド、細胞接着ポリペプチド、成長因子ポリペプチド、インスリンポリペプチド、インスリン関連ポリペプチド、凝固ポリペプチド、凝固関連ポリペプチド、アルブミン、ＩｇＥ、血液型抗原、コロニー刺激因子、受容体、神経栄養因子、インターフェロン、インターロイキン、ウイルス抗原、リポタンパク質、カルシトニン、グルカゴン、心房性ナトリウム利尿因子、肺界面活性剤、腫瘍壊死因子α及びβ、エンケファリナーゼ、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、ＤＮＡｓｅ、インヒビン、アクティビング（ａｃｔｉｖｉｎｇ）、インテグリン、プロテインＡ、プロテインＤ、リウマチ因子、イムノトキシン、骨形成タンパク質、スーパーオキシド・ジスムターゼ、表面膜ポリペプチド、崩壊促進因子、ＡＩＤＳエンベロープ、輸送ポリペプチド、ホーミング受容体、アドレシン、調節ポリペプチド、イムノアドヘシン、ミオスタチン、ＴＡＬＬポリペプチド、アミロイドポリペプチド、胸腺間質リンホポエチン、ＲＡＮＫリガンド、ｃ−ｋｉｔポリペプチド、ＴＮＦ受容体及びアンギオポエチン並びに表７に示した抗体並びにそれらの生物活性断片、アナログ又は変異体から成る群から選択される。
【００２１】
１つの実施形態では、治療用ポリペプチドは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子である。
【００２２】
所定の実施形態では、本方法は、少なくとも一部は自動化によって実施され得る。所定の実施形態では、溶液の添加及び交換は、自動液体処理装置又はロボットによって取り扱われる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】連続酵素的消化のワークフローを例示する図である。
【図２】連続消化と二重消化を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
タンパク質の特性解析は、治療用タンパク質製造のライフサイクルを通して極めて重要である。タンパク質はサイズが大きく複雑であるために、インタクトタンパク質の分析は、分子の限定された情報しか提供しない。酵素的消化は、分析が容易であるために、一般にタンパク質をより小さなペプチドに破壊するために使用されている。単一の酵素的消化は、分析のペプチドマッピングのタイプにとって難題をもたらす大きなペプチド断片を生成し得る。慣習的な複数の酵素による消化の短所は、最後には過剰に多数のピークを備える複雑な消化物、又は別個に分析する必要がある複数の酵素的消化の何れかが生じることである。
【００２５】
本発明の開示に記載した連続消化法は、分割及び征服戦略を使用する。初期消化に続いて、分子量カットオフフィルターを使用すると、高分子量ペプチドをそれらの低分子量対応物から分離することができる。引き続いて、高分子量ペプチドだけが第２酵素的消化を受けるので、これは２つの完全酵素的消化を混合する複雑さを排除する。第２酵素的消化の後に、全ペプチドは１つのペプチドマップを作成するために一緒に混合することができ、これはＭＡＭ及び他の分析方法のためにサンプルを分析することを容易にする。より重要なことに、本方法は、他の多数の酵素的消化にとって問題の１つである、複数のペプチドを使用した同一生成物の属性の定量を回避する。
【００２６】
図１に示したように、第１酵素的消化の後には、分子量カットオフフィルターを使用して小さなペプチドと大きなペプチドが分離される。通常、この分離は、遠心分離によって達成されるが、適正なフィルターが使用される場合は、重力によって分離することができる。分離後には分子量カットオフより小さなペプチドが収集され、大きなペプチドはフィルターの上部に捕捉され、これは引き続いて更に第２酵素を用いて消化される。第２酵素的消化後に、大きなペプチドは、分子量カットオフより小さく、沈降後に収集できる小さなペプチドに切断されることになる。第１及び第２消化からの消化物は一緒に混合され、ＭＡＭ又は他の技術を使用して分析するためには１つのペプチドマップしか必要とされない。このプロセスはＮ回繰り返すことができ、消化物は、第Ｎ消化後に１つのペプチドマップを生成するために一緒に混合することができる。
【００２７】
この方法は、ｍＡｂ、ＢｉＴＥ及びＦｃ融合タンパク質を含むがそれらに限定されない任意の様式の治療用タンパク質において使用することができる。
【００２８】
定義
上述の一般的説明及び以下の詳細な説明はどちらも、例示的且つ説明的に過ぎず、限定するものではない。単数形の使用は、特に他に明記しない限り、複数形を含む。「又は」の使用は、他に明記しない限り「及び／又は」を意味する。用語「含んでいる」並びに「含む」及び「含まれる」等の他の形態の使用は、限定的ではない。「要素」又は「構成要素」等の用語は、特に他に明記しない限り、１つのユニットを含む要素及び構成要素並びに２つ以上のサブユニットを含む要素及び構成要素の両方を包含する。用語「部分」の使用は、部分の一部又は部分全体を含むことができる。例えば１〜５等の数値範囲が言及される場合、１、２、３、４及び５並びに１．５、２．２、３．４及び４．１等のそれらの小数等の全ての介在値は明示的に含まれる。
【００２９】
「約」又は「〜」は、量を修飾する場合（例えば「約」３ｍＭ）、修飾された量の前後で変動が発生し得ることを意味する。これらの変動は、典型的な測定手順及び処理手順、不注意による誤り、成分の純度等の様々な手段によって発生し得る。
【００３０】
「含んでいる」及び「含む」は、方法が列挙された要素を含むが、その他の列挙されていない要素を除外しないことを意味することが意図されている。用語「〜から本質的に成っている」及び「〜から本質的に成る」は、本明細書に開示した方法において使用される場合、列挙された要素を含み、本方法の基本的性質を変更させる列挙されていない要素は除外するが、その他の列挙されていない要素は除外しない。用語「〜から成っている」及び「〜から成る」は、方法を規定するために使用される場合、実質的な方法ステップを除外する。これらの変遷する用語の各々によって定義される実施形態は、本開示の範囲内に含まれる。
【００３１】
「連結（した）」は、直接的並びに間接的に関連していることを意味する。例えば、装置若しくはプロセスは別の装置若しくはプロセスと直接的に関連し得る、又はこれらの装置若しくはプロセスは、例えば、別の装置若しくはプロセスを介して相互に間接的に関連し得る。
【００３２】
「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、各アミノ酸がペプチド結合によって隣と接続されているアミノ酸の鎖を意味するために同義的に使用される。
【００３３】
「変性」、「変性させている」、「変性させる」等は、ポリペプチドが少なくとも部分的に、それらの自然状態においてポリペプチド内で見出される四次構造、三次構造及び二次構造を外部ストレス又は試薬（即ち、変性剤）を適用するステップによって失うプロセスを意味する。
【００３４】
「変性剤」は、ポリペプチドを変性させ得る任意の物質、組成物、エネルギー又は状態を意味する。変性剤の例としては、強酸若しくは強塩基、無機塩、有機溶媒、放射線、カオトロピック剤又は熱又はこれらの組合せが挙げられる。
【００３５】
「変性ポリペプチド」、「変性タンパク質」等は、天然ポリペプチドから変化したその二次構造、三次構造及び／又は四次構造を有するポリペプチドを意味する。ポリペプチドは、完全に変性され得る、又は部分的に変性され得る。「非変性ポリペプチド」又は「非変性タンパク質」（及び類似用語）は、その二次構造、三次構造及び該当する場合は四次構造を維持しているポリペプチドを意味する。「天然ポリペプチド」又は「天然タンパク質」（及び同類のもの）は、自然に見出されるポリペプチドを指し、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅデータベース（Ｔｈｅ  ＵｎｉＰｒｏｔ，２０１７）又はＵｎｉＧｅｎｅデータベース（Ｐｏｎｔｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）に記載された任意の主要参照配列を有する。
【００３６】
「還元ポリペプチド」又は「還元タンパク質」（及び類似用語）は、その鎖間又は鎖内ジスルフィド結合の少なくとも１つが破断しているポリペプチドを意味する。そのような結合は、例えばシステイン残基上で入手できる基等の還元チオール基間で形成し得る。
【００３７】
「アルキル化ポリペプチド」又は「アルキル化タンパク質」（及び同類のもの）は、それにアルキル基が移されているポリペプチドを意味する。実際的に、ポリペプチドは、還元チオールが形成されるのを、又は還元後にジスルフィド結合若しくは架橋を再形成するのを防止するために（例えばシステイン残基で利用可能であるように）チオール基上でアルキル化されることが多い。
【００３８】
ポリペプチドの状況における「消化」等は、２つ以上の断片へのポリペプチドの断片化を意味し、この断片化は別の物質、化学物質又は酵素によって媒介される。
【００３９】
「タンパク質分解性切断」、「タンパク質分解性消化」等は、ポリペプチド内のペプチド結合を破断することによってポリペプチドを切断するステップ、従って断片を生成するステップを意味する。タンパク質分解性切断は、酵素によって媒介され得る。
【００４０】
「プロテアーゼ」、「ペプチダーゼ」、「タンパク質分解性切断酵素」等は、酵素を意味し、ペプチド結合の加水分解を触媒するポリペプチド又はその断片を意味する。プロテアーゼには、そのような触媒活性が変異体内で減少している場合でさえ、ペプチド結合加水分解を触媒する公知のプロテアーゼのアミノ酸配列の変異体が含まれる。
【００４１】
酵素触媒反応は、酵素委員会ナンバリングシステムに従って分類される。プロテアーゼはペプチド結合加水分解を触媒するために、それらは、ＥＣ３．４．１１のアミノペプチダーゼ、ＥＣ３．４．１３のジペプチダーゼ、ＥＣ３．４．１４のジペプチジルペプチダーゼ及びトリペプチジルペプチダーゼ、ＥＣ３．４．１５のペプチジルジペプチダーゼ、ＥＣ３．４．１６のセリン型カルボキシペプチダーゼ、ＥＣ３．４．１７のメタロカルボキシペプチダーゼ、ＥＣ３．４．１８のシステイン型カルボキシペプチダーゼ、ＥＣ３．４．１９のωペプチダーゼ、ＥＣ３．４．２１のセリンプロテアーゼ、ＥＣ３．４．２２のシステインプロテアーゼ、ＥＣ３．４．２３のアスパラギン酸エンドペプチダーゼ、ＥＣ３．４．２４のメタロペプチダーゼ、ＥＣ３．４．２５のトレオニンエンドペプチダーゼ、ＥＣ３．４．９９の触媒メカニズムが未知のエンドペプチダーゼを含むＥＣ３．４クラスに分類される。プロテアーゼの特定の例としては、トリプシン（ＥＣ３．４．２１．４）、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（ＥＣ３．４．２４．３３）及びエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（ＥＣ３．４．２１．１９）が挙げられる。
【００４２】
エラスターゼは、細胞外マトリックスの弾性繊維ポリペプチドであるエラスチンを加水分解する（ＥＣ３．４．２１．７０として分類されるものを除く）プロテアーゼである。エラスターゼをコードする８種のヒト遺伝子が存在する（表１）。
【００４３】
【表１】
2021515893.tif 000003
【００４４】
ポリペプチドの断片を生成する状況における「化学的切断」は、化学物質によるポリペプチドの断片化を意味する。「化学物質」は、非タンパク質分解性物質又は化合物である。化学物質は、有機又は無機であり得る。
【００４５】
「分子量のカットオフ」又は「ＭＷＣＯ」は、膜のＭＷＣＯが様々な分子量（ＭＷ）の溶質分子に対する膜選択性の表現であることを意味しており、ここでＭＷ値（ダルトン（Ｄａ）で表示する）は、ある範囲の異なるＭＷ溶質が標的溶媒（大多数の液体をベースとする圧駆動膜用途のためには水である）中で濾過される場合に９０％の阻止率をもたらす溶質分子から得られ、ここで阻止率は、方程式（１）：
【数１】
2021515893.tif 000004
（式中、Ｃｐ及びＣｆは、透過物及び供給材料それぞれの濃度である）におけるように定義される。
【００４６】
ＭＷＣＯは、膜又はフィルターのＭＷＣＯを評価するために、様々な分子量のデキストラン、ポリエチレングリコール及びタンパク質を使用して実験によって決定される。阻止率は、多数の溶質並びに溶質のタイプ、濃度、流体力学、圧力、温度及びｐＨ等のプロセスパラメーターに左右される。ＭＷＣＯの測定は、通常は各々が所定のＭＷを備える、異なる溶質を使用する個別実験において実施される。
【００４７】
低範囲のＭＷ（およそ１０ｋＤａ未満）については、溶質阻止アッセイにおいてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｎ−アルカン及びオリゴスチレンを使用することができる。高範囲のＭＷ（およそ１０ｋＤａ超）については、デキストラン及び糖が使用されることが多い（Ｒｏｈａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【００４８】
方法
本明細書で開示するのは、サンプル中のポリペプチドを第１プロテアーゼ及び第２プロテアーゼにより消化するステップであって、ここで第１プロテアーゼが、ポリペプチドの少なくとも２つの断片を生成し、そのポリペプチドの少なくとも２つの断片が引き続いて相互から分離され、より大きな断片は引き続いて第２プロテアーゼによって消化され、その後に第２プロテアーゼにより消化した後にサンプルを分析するステップが続くステップに関する方法である。これらの断片は、全部が分析の前に組み合わせられ得る。サンプル中のポリペプチドは、第１プロテアーゼを用いた消化の前に変性及び／又は還元及び／又はアルキル化させることができる。分析は、クロマトグラフィー、電気泳動法、分光測定法及びそれらの組合せを含むことができる。
【００４９】
一部の実施形態では、本方法は、第１プロテアーゼを用いてフィルター上のサンプル中のポリペプチドを消化する前にＭＷＣＯを有するフィルターにサンプルを適用するステップ、サンプル中のポリペプチドを第２プロテアーゼを用いて消化するステップ、及びサンプルを分析するステップを含む。そのような実施形態は、更に濾過するステップを組み込むことができる。ＭＷＣＯフィルターは、一部の実施形態では、有意な比率のポリペプチド及びポリペプチド断片を、これらのポリペプチド又はポリペプチド断片のサイズがフィルターのＭＷＣＯより有意に小さいＭＷを有する場合でさえ保持する。
【００５０】
方法ステップ
ポリペプチドの変性
一部の実施形態では、本明細書に開示した方法に従って調製及び分析されるポリペプチドは、変性させられる。
【００５１】
ポリペプチドは、様々な当技術分野で認められた技術及び変性剤を使用して変性させることができる。一部の実施形態では、多数の変性剤が同時又は順々の何れかで一緒に使用される。例えば、ＳＤＳの変性剤及び熱は、ポリペプチドを変性させるために組み合わせられ得る。
【００５２】
タンパク質の変性は、四次、三次又は二次ポリペプチド構造を破壊する任意の手段によって実施することができる。例えば、尿素等のカオトロープ剤及び変性洗剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））、熱、還元剤及びジスルフィド再形成を遮断するために反応性チオール基を不活性化する作用物質の使用。ポリペプチド含有サンプルのｐＨは、更に変性を促進するために操作することができる。これらの成分は、ポリペプチドの鎖を効果的に解くために一緒に使用されることが多い。
【００５３】
カオトロープ剤の追加の例としては、尿素に加えて、ｎ−ブタノール、エタノール、塩化グアニジン、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、２−プロパノール及びチオ尿素が挙げられる。尿素は、殆どの場合に好ましい。
【００５４】
洗剤は、親水性基：アニオン性、カチオン性、非イオン性及び両性イオン性の形態に分類される。アニオン性及びカチオン性洗剤は、変性する可能性がより高く、それらの例としては：ＳＤＳ、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、グリコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシン、ドデシル硫酸リチウム（アニオン性）及び臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）及び臭化トリメチル（テトラデシル）アンモニウム（ＴＴＡＢ）（カチオン性）が挙げられる。一部の場合には、両性イオン性洗剤は有用であり得るが、例としては、アミドスルホベタイン−１４（ＡＳＢ−１４）、アミドスルホベタイン−１６（ＡＳＢ−１６）、Ｃ７Ｂｚ０、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＥＭＰＩＧＥＮ（登録商標）ＢＢ、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアンモニオ）プロパンスルホネート分子内塩（ＳＢ３−８）、ｄ（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート分子内塩（ＳＢ３−１０）等が挙げられる。アニオン性洗剤が好ましく、特に好ましいのはＳＤＳである。
【００５５】
変性剤は、（大多数のポリペプチドに対して）熱、例えば３０℃以上の高温であり得る。変性剤には撹拌が含まれる。一部の実施形態では、本質的若しくは実質的を含む低塩又は無塩がポリペプチドを変性させ得る。
【００５６】
変性剤は、エタノール又は他のアルコール等の溶媒であり得る。
【００５７】
ポリペプチドを変性させるステップは、広範に試験されて報告されている；例えば、詳細については（Ｔａｎｆｏｒｄ，１９６８）を参照されたい。当業者であれば、ポリペプチド及び選択すべき多数の変性剤の性質を前提に、ポリペプチドを変性させる方法を理解している。
【００５８】
ポリペプチドの還元
還元ポリペプチドは、システイン等のポリペプチド構造において還元可能残基を還元させるために十分な還元条件に曝露させられているポリペプチドである。還元ポリペプチドがチオール基又は硫黄含有残基を含有する場合、還元ポリペプチド内のチオール基が還元させられる。システイン残基を含む還元ポリペプチドは、「−ＳＨ」と表示され得る、還元させられたシステイン残基の硫黄原子を有する。還元ポリペプチドは、ジスルフィド結合含有ポリペプチドであり得る。ジスルフィド結合含有ポリペプチドは、ジスルフィド結合含有ポリペプチド内の１つ以上のジスルフィド結合（ジスルフィド架橋）が破断するのを誘発する還元条件に曝露させることによって還元ポリペプチドになり得る。
【００５９】
「還元剤（ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」、「還元剤（ｒｅｄｕｃｔａｎｔ）」又は「還元剤（ｒｅｄｕｃｅｒ）」は、酸化還元化学反応において別の化学種へ電子を失う（又は付与する）要素又は化合物である。還元剤は、ジスルフィド基がチオール（−ＳＨ）基を生成することによって反応性になることを許容する。一般的ポリペプチド還元試薬は、表２に示す。
【００６０】
【表２】
2021515893.tif 000005
【００６１】
一部の実施形態では、ポリペプチドの変性及び還元は、同時に実施される。他の実施形態では、ポリペプチドの変性及び還元は、別個のステップで実施される。
【００６２】
当業者であれば、ポリペプチド及び選択すべき還元試薬の性質を前提に、ポリペプチドを還元させる方法を理解している。
【００６３】
サンプル中に含まれるポリペプチドをアルキル化させる
「反応性チオール基を不活性化するステップ」は、望ましくないチオール−ジスルフィドの交換反応を防止するためにポリペプチド内の遊離チオール基を遮断することを意味する。アルキル化剤は、アルキル基による水素の置換を誘発する物質である。
【００６４】
遊離システインのアルキル化は、頻回にはそれらの還元後に、カルバミドメチル又はカルボキシメチル基の共有結合を生じさせ、ジスルフィド結合の形成及び再形成を防止する。一般に使用されるアルキル化剤としては、ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）及びヨード酢酸が挙げられる。その他の適切なアルキル化剤の例としては、ジチオビス（２−ニトロ）安息香酸；アクリルアミド；４−ビニルピリジン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル及びシクロホスファミド；シスプラチン；ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、ロムスチン及びセムスチン；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン；エチレンイミン、例えばチオテパ；並びにトリアジン、例えばデカルバジンが挙げられる。当業者であれば、スルフヒドリル基を保護するために使用され得る試薬並びにそのような試薬を使用する方法を承知している。
【００６５】
ポリペプチドの消化
本明細書に開示した方法は、サンプル中の分析対象のポリペプチドを第１消化で切断するステップであって、切断するステップがポリペプチドの少なくとも２つの断片を生成するステップを含む。ポリペプチドを断片化する任意の方法は、ポリペプチドの少なくとも２つの断片が生成されること；更に、ポリペプチドの、例えば単一アミノ酸への完全な分解が望ましくないことを前提に使用され得る。
【００６６】
そのような消化ステップでは、切断の便宜的手段には、プロテアーゼを使用することが含まれる。そのようなプロテアーゼがポリペプチドを少なくとも２つの断片に切断する限り、任意のプロテアーゼを使用することができる。
【００６７】
一部の実施形態では、２種以上のプロテアーゼの混合物が使用され得る。他の実施形態では、第１消化は、多数の連続消化を含み得る。例えば、第１消化は、第１プロテアーゼを用いて実施され、次にその後の反応では、第２消化が第２プロテアーゼを用いて実施される。
【００６８】
有用なプロテアーゼ（しかし全部を含むわけではない）の例としては、トリプシン、好中球エラスターゼ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、ペプシン、キモトリプシン、キモトリプシンＢ、Ｌｙｓ−Ｎプロテアーゼ、Ｌｙｓ−Ｃプロテアーゼ、Ｇｌｕ−Ｃプロテアーゼ、Ａｓｐ−Ｎプロテアーゼ、膵臓ペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、プロテイナーゼＫ及びサーモリシンが挙げられる。一部の実施形態では、これらのプロテアーゼの組合せが使用される。一部の実施形態では、トリプシン単独が使用される。
【００６９】
ペプチド結合選択性及びＥＣ番号を含むこれらやその他のプロテアーゼは、（Ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｅｄ，２００７）から採用した表３に示す。各プロテアーゼについて示した供給源は、例示のためだけである；これらのプロテアーゼの多くは、市販で入手できる。
【００７０】
一部の実施形態では、１０：１、２０：１、２５：１、５０：１又は１００：１のタンパク質：プロテアーゼ比（ｗ／ｗ）を使用できる。一部の実施形態では、比率は、２０：１である。一部の実施形態では、使用されるプロテアーゼは、約１００ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ、又は約１００ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ、又は約１００ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ、又は約１μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ、又は約１μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ、又は約１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ、又は約１０μｇ／ｍｇ〜１ｍｇ／ｍＬ、又は約１０μｇ／ｍｇ〜５００μｇ／ｍＬ、又は約１０μｇ／ｍｇ〜１００μｇ／ｍＬの濃度にある。一部の実施形態では、消化ステップは、１０分間〜４８時間、又は３０分間〜４８時間、又は３０分間〜２４時間、又は３０分間〜１６時間、又は１時間〜４８時間、又は１時間〜２４時間、又は１時間〜１６時間、又は１〜８時間、又は１〜６時間、又は１〜４時間である。一部の実施形態では、消化ステップは、２０℃〜４５℃、又は２０℃〜４０℃、又は２２℃〜４０℃、又は２５℃〜３７℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、消化ステップは、３７℃でインキュベートされる。当業者であれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏプロテアーゼ消化は当技術分野において明確に理解されているので、適切な条件（緩衝液、インキュベーション時間、プロテアーゼの量、容積等）を選択することができる。
【００７１】
【表３】
2021515893.tif 000006
【００７２】
【表４】
2021515893.tif 000007
【００７３】
一部の実施形態では、第１消化は、化学物質を使用して実施される。特に有用な化学物質には、部位特異的方法でポリペプチドを切断する化学物質が含まれる。そのような化学物質には、メチオニン残基のＣ末端を切断する臭化シアン（ＣＮＢｒ；カルボノニトリジク・ブロミド）；システイン残基のＮ末端を切断する２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸塩（ＮＴＣＢ）；ヒドロキシルアミンを使用して切断され得るアスパラギン−グリシンジペプチド；アルパラギン酸−プロリン（Ａｓｐ−Ｐｒｏ）ペプチド結合で切断するギ酸及びトリプトファン残基のＣ末端を切断するＢＮＰＳ−スカトール（３−ブロモ−３−メチル−２−（２−ニトロフェニル）スルファニルインドール）が含まれる。当業者であれば、ポリペプチドの濃度、化学物質の濃度、インキュベーション時間及び温度等を含む適切な変量を選択する方法を理解している。例えば、更に（Ｃｒｉｍｍｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）を参照されたい。
【００７４】
一部の実施形態では、第１消化は、複数の連続消化を含むことができ、ここでそのような連続消化の少なくとも１回は、ＣＮＢｒ、ＮＴＣＢ、ヒドロキシルアミン、ギ酸及びＢＮＰＳ−スカトール等の化学物質を使用するステップを含む。例えば、第１消化は、ポリペプチドを少なくとも２つの断片に切断する化学物質を用いて実施され、及び次にその後の反応では、第２消化が１種のプロテアーゼを用いて実施される、又はその逆も当てはまる。
【００７５】
本明細書に開示した方法では、その後の消化は、第１消化及び第２消化が異なる化学的又はタンパク質分解性手段を使用するという唯一の但し書きを含めて実施される。一部の実施形態では、第２消化は、好中球エラスターゼを使用して実施される。第２消化は、第１消化について記載した実施形態を使用して実施され得る。
【００７６】
フィルターの選択
特定用途のために適切なＭＷＣＯを選択する場合、サンプルの濃度、組成、分子の形状並びに温度、圧力及びクロスフロー速度等の作動条件を含む多数の因子が検討される。分子通路の流動に関する他の変量も又考慮に入れられる。例えば、直鎖分子、高い膜間差圧（ＴＭＰ）及び低いサンプル濃度は、分子通路を増加させる可能性があり、他方では低い温度及び膜汚染は分子通路を減少させる可能性がある。ＭＷＣＯについての検証方法は、それらが製造業者毎に変動するので、必ずしも比較可能ではない。当技術分野では一般に、保持されている溶質の分子量よりも少なくとも２倍小さいＭＷＣＯを選択することが勧告されている。１つの実施形態では、ＭＷＣＯは、３０ｋＤａである。
【００７７】
ＭＷＣＯ膜のために適切な材料は、親水性である。適切な親水性材料としては、ポリエーテルスルホン、二フッ化ポリビニリデン及び再生セルロースが挙げられる。
【００７８】
好適なカットオフフィルターは、例えばＰａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から市販で入手することができる。
【００７９】
ＭＷＣＯフィルターを使用してサンプルを濾過するステップは、任意の適切なフィルター装置を使用する、任意の適切なフィルター法を使用することができる。濾過するステップは、重力、キャピラリー力又は超遠心分離を含む一般的な遠心分離によって発生させることができる。
【００８０】
サンプルを分析するステップ
ポリペプチドが２回目に消化された後に、結果として生じたポリペプチド断片は、任意の適切な方法によって分析することができる。手順に関する考察は、調製されたポリペプチドを分析するために使用できる方法を限定することは決して意図していない。
【００８１】
一般に、好適な分析方法は、クロマトグラフィー、電気泳動法及び分光測定法であり得る。これらの方法の一部は、組み合わせることができる。
【００８２】
当業者であれば、例えば、適切な分析方法、並びに、例えばそれらの方法を実施するために適切な条件の選択を容易にする、例えば（Ｇｕｎｚｌｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，２００１）を含むハンドブックを利用できる。
【００８３】
クロマトグラフィー法は、その相が固定相を保持する構造を通して処理される移動相内のポリペプチド断片を分離する方法である。ポリペプチド断片はサイズ及び組成が異なるために、各断片は、固有の分配係数を有する。分配係数が異なるために、ポリペプチドは、固定相上に示差的に維持される。当技術分野において公知のそのような方法の例としては、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、超高速液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、拡張吸着流動床クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーが挙げられる。
【００８４】
公知のクロマトグラフィー法の一部の概要は、表４に示す。
【００８５】
【表５】
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【００８６】
【表６】
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【００８７】
調製されたポリペプチドは、更に、電気泳動法−ゲル電気泳動法、フリー・フロー電気泳動法、等電点電気泳動法、等速電気泳動法、親和性電気泳動法、免疫電気泳動法、逆電気泳動法、キャピラリー電気泳動法及びキャピラリーゾーン電気泳動法を使用して分析することができる。当業者であれば、（Ｋｕｒｉｅｎ  ａｎｄ  Ｓｃｏｆｉｅｌｄ，２０１２；Ｌｏｒｄ，２００４）等の概観及びハンドブックを入手することができる。
【００８８】
電気泳動法は、電場によって溶媒を通して輸送される、それらの等電点には存在しないポリペプチド等の荷電分子を分析するために使用することができる。ポリペプチドは、それらの荷電密度に比例する速度で移動する。電場を通してのポリペプチドの移動度は：電場の強度、ポリペプチド上の正味電荷、ポリペプチドのサイズ及び形状、イオン強度並びにポリペプチドがそれを通って移動するマトリックスの特性（例えば、粘度、孔径）に左右される。ポリアクリルアミド及びアガロースは、２種の一般的な支持マトリックスである。これらのマトリックスは、多孔質媒体として機能し、分子ふるいのように挙動する。ポリアクリルアミドは、より小さな孔径を備える支持体を形成し、本明細書に開示した方法において特に有用であり、大多数のポリペプチド断片を分離するために理想的である。
【００８９】
表５は、ポリペプチドの電気泳動技術の例を提示している。
【００９０】
【表７】
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【００９１】
【表８】
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【００９２】
調製されたポリペプチドは、更に、分光測定法−質量分光測定法（Ｒｕｂａｋｈｉｎ  ａｎｄ  Ｓｗｅｅｄｌｅｒ，２０１０）、紫外分光測定法、可視分光測定法、蛍光分光測定法及び紫外−可視分光測定法（Ｎｏｗｉｃｋａ−Ｊａｎｋｏｗｓｋａ，１９８６）を使用して分析することができる。
【００９３】
表６は、ポリペプチドの電気泳動技術の例を提示している。
【００９４】
【表９】
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【００９５】
質量分光測定法（ＭＳ）を可能にする原理は、化学的化合物をイオン化して荷電分子又は分子断片を生成するステップ、及び次に質量電荷比を測定するステップから成る。例示的なＭＳ手順では、サンプルがＭＳ機器に装填されて気化させられ、サンプルの成分は、正電荷粒子の形成を生じさせる様々な方法（例えば、それらに電子ビームで衝撃を与えることによる）の１つによってイオン化され、陽イオンは次に磁場によって加速され、電磁場を通してそれらが通過するのでイオンの運動の詳細に基づいて粒子の質量電荷比（ｍ／ｚ）についての計算、及びそれらのｍ／ｚ比に従って分類されるイオンの検出が実施される。
【００９６】
実例となるＭＳ機器は、３つのモジュール：気相サンプル分子をイオンに変換する（又は、エレクトロスプレーイオン化の場合、溶液中に存在するイオンを気相内に移動させる）イオン源；電磁場を適用することによってそれらの質量電荷比によってイオンを分類する質量分析器；及びインジケーター量の数値を測定するので、従って存在する各イオンの存在度を計算するためのデータを提供する検出器を有する。
【００９７】
ＭＳ技術は、未知の化合物を同定すること、分子内の要素の同位体組成を決定すること、及びその断片化を観察することによって化合物の構造を決定することを含む定性的及び定量的両方の使用を有する。含まれるのは、ガスクロマトグラフィー−質量分光測定法（ＧＣ／ＭＳ又はＧＣ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー質量分光測定法（ＬＣ／ＭＳ又はＬＣ−ＭＳ）及びイオン移動度分光測定／質量分光測定法（ＩＭＳ／ＭＳ又はＩＭＭＳ）である。
【００９８】
分析方法（クロマトグラフィー法、電気泳動法及び分光測定法）は、組み合わせることができる。例えば、液体クロマトグラフィー−質量分光測定法、質量分光測定法に連結されたキャピラリーゾーン電気泳動法及びイオン移動度分光測定法−質量分光測定法等の組合せ。
【００９９】
自動化
本明細書に開示した方法の様々なステップは、液体処理ロボットを使用して実施することができる。そのようなロボットは、試薬、サンプル又は他の液体を指定の容器に分注する。ロボットは、ロボット自体に直接的に統合されたソフトウエア又は接続されたコンピューターの何れかによって制御される。液体処理を自動化することによって、本明細書に開示した方法は、ハイスループットで、より少ないエラーで、及び分析者が実際に操作する時間を減少させて実施することができる。
【０１００】
液体処理ロボットは、遠心分離機、ＰＣＲ装置、コロニーピッカー、振とう装置、加熱器具等の様々な実験室用器具を使用して構成することができる。そのようなカスタマイズ化は、これらの機械を特定方法に適応させることを許容する。
【０１０１】
一部の場合には、そのようなロボットは、液体を移動させるために音響を使用すること（音響液体処理）によってピペット及び／又はシリンジの使用に取って代わる。
【０１０２】
現在は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ（Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，ＮＹ）、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｒｏｂｏｔｉｃｓ（Ｒｅｎｏ，ＮＶ）、Ｈｕｄｓｏｎ  Ｒｏｂｏｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＮＪ）及びＴｅｃａｎ  ＡＧ（Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）は、そのようなロボットの製造業者の一部である。
【０１０３】
治療用ポリペプチド
以下の１つ以上に結合するものを含むポリペプチドは、本明細書で開示する方法において調製及び分析することができる。これらには、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、及びＣＤ３４を含むＣＤタンパク質が含まれる（受容体結合を妨害するものを含む）。ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４及びＥＧＦ受容体を含むＨＥＲ受容体ファミリータンパク質。細胞接着分子、例えば、ＬＦＡ−Ｉ、ＭｏＩ、ｐｌ５０、９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−Ｉ、ＶＣＡＭ、及びα  ｖ／β  ３インテグリン。成長因子、例えば、血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、ミュラー管阻害物質、ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−α）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＮＧＦ−β等の神経成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、例えばａＦＧＦ及びｂＦＧＦ等を含む線維芽細胞増殖因子、上皮成長因子（ＥＧＦ）、特にＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βを含む、例えばＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４又はＴＧＦ−β５を含むトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ及びインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）、ｄｅｓ（ｌ−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）及び骨誘導因子。インスリン並びにインスリン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、及びインスリン様成長因子結合タンパク質を含むインスリン関連タンパク質。とりわけ第ＶＩＩＩ因子、組織因子、フォン・ヴィレブランド因子、プロテインＣ、α−１−アンチトリプシン等の凝固及び凝固関連タンパク質、例えば、ウロキナーゼ及び組織プラスミノーゲン活性化因子（「ｔ−ＰＡ」）等のプラスミノーゲン活性化因子、ボンバジン（ｂｏｍｂａｚｉｎｅ）、トロンビン及びトロンボポエチン；アルブミン、ＩｇＥ及び血液型抗原を含むがそれらに限定されない他の血液タンパク質及び血清タンパク質。以下の、特に、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦ並びに例えばＣＳＦ−１受容体（ｃ−ｆｍｓ）等のそれらの受容体を含む、コロニー刺激因子及びそれらの受容体。例えば、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体、肥満（ＯＢ）受容体、ＬＤＬ受容体、成長ホルモン受容体、トロンボポエチン受容体（「ＴＰＯ−Ｒ」、「ｃ−ｍｐｌ」）、グルカゴン受容体、インターロイキン受容体、インターフェロン受容体、Ｔ細胞受容体、ｃ−Ｋｉｔ等の幹細胞因子受容体及び他の受容体を含む、受容体及び受容体関連タンパク質。例えば、ＯＸ４０受容体のリガンドであるＯＸ４０Ｌを含む、受容体リガンド。骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及びニューロトロフィン−３、−４、−５又は−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５又はＮＴ−６）を含む、神経栄養因子。リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、及びプロリラキシン；例えば、インターフェロン−α、−β、及び−γ、並びにそれらの受容体を含むインターフェロン及びインターフェロン受容体。ＩＬ−１〜ＩＬ−３３及びＩＬ−１〜ＩＬ−３３受容体、例えば、とりわけＩＬ−８受容体を含む、インターロイキン及びインターロイキン受容体。ＡＩＤＳエンベロープウイルス抗原を含む、��イルス抗原。リポタンパク質、カルシトニン、グルカゴン、心房性ナトリウム利尿因子、肺界面活性物質、腫瘍壊死因子α及びβ、エンケファリナーゼ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、ＤＮＡｓｅ、インヒビン及びアクチビン。インテグリン、プロテインＡ又はＤ、リウマチ因子、免疫毒素、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、スーパーオキシド・ジスムターゼ、表面膜タンパク質、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＡＩＤＳエンベロープ、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、調節タンパク質、イムノアドヘシン、抗体。ミオスタチン、ＴＡＬＬ−Ｉを含むＴＡＬＬタンパク質、限定されずにアミロイドβタンパク質を含むアミロイドタンパク質、胸腺間質性リンパ球新生因子（「ＴＳＬＰ」）、ＲＡＮＫリガンド（「ＯＰＧＬ」）、ｃ−ｋｉｔ、ＴＮＦ受容体１型を含むＴＮＦ受容体、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、アンジオポエチン並びに前述の何れかの生物活性断片又はアナログ又は変異体。
【０１０４】
例示的なポリペプチド及び抗体としては、Ａｃｔｉｖａｓｅ（登録商標）（アルテプラーゼ）；アリロクマ、Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダルベポエチンα）、Ｅｐｏｇｅｎ（登録商標）（エポエチンα、又はエリスロポエチン）；Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）（インターフェロンβ−１ａ）；Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）（トシツモマブ）；Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）（インターフェロンβ）；ボコシズマブ（Ｌ１Ｌ３として示される抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体、米国特許第８０８０２４３号明細書を参照）；Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）（アレムツズマブ）；Ｄｙｎｅｐｏ（登録商標）（エポエチンδ）；Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）（ボルテゾミブ）；ＭＬＮ０００２（抗α４β７  ｍＡｂ）；ＭＬＮ１２０２（抗ＣＣＲ２ケモカイン受容体ｍＡｂ）；Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）；Ｅｐｒｅｘ（登録商標）（エポエチンα）；Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）；エボロクマブ；Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（登録商標）（ソマトロピン）；Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）；Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（登録商標）（ソマトロピン［ｒＤＮＡ由来］注射液）；Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）（アダリムマブ）；Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（登録商標）（インターフェロンＡｌｆａｃｏｎ−１）；Ｎａｔｒｅｃｏｒ（登録商標）（ネシリチド）；Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）（アナキンラ）、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）（サルガモスチム）；ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（登録商標）（エプラツズマブ）；Ｂｅｎｌｙｓｔａ（商標）（ベリムマブ）；Ｍｅｔａｌｙｓｅ（登録商標）（テネクテプラーゼ）；Ｍｉｒｃｅｒａ（登録商標）（メトキシポリエチレングリコールエポエチンβ）；Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）（ゲムツズマブオゾガマイシン）；Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標）（エファリズマブ）；Ｃｉｍｚｉａ（登録商標）（セルトリズマブペゴル）；Ｓｏｌｉｒｉｓ（商標）（エクリズマブ）；ペキセリズマブ（抗Ｃ５補体）；ＭＥＤＩ−５２４（Ｎｕｍａｘ（登録商標））；Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（ラニビズマブ）；エドレコロマブ（Ｐａｎｏｒｅｘ（登録商標））；Ｔｒａｂｉｏ（登録商標）（レルデリムマブ）；ＴｈｅｒａＣｉｍ  ｈＲ３（ニモツズマブ）；Ｏｍｎｉｔａｒｇ（ペルツズマブ、２Ｃ４）；Ｏｓｉｄｅｍ（登録商標）（ＩＤＭ−Ｉ）；ＯｖａＲｅｘ（登録商標）（Ｂ４３．１３）；Ｎｕｖｉｏｎ（登録商標）（ビジリズマブ）；カンツズマブメルタンシン（ｈｕＣ２４２−ＤＭｌ）；ＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎ（登録商標）（エポエチンβ）；Ｎｅｕｍｅｇａ（登録商標）（オプレルベキン）；Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標）（ＰＥＧ化フィルガストリム、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ、ＰＥＧ化ｈｕ−Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ）；Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（フィルグラスチム）；Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ３（登録商標）（ムロモナブ−ＣＤ３）、Ｐｒｏｃｒｉｔ（登録商標）（エポエチンα）；Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）（インフリキシマブ）、Ｒｅｏｐｒｏ（登録商標）（アブシキシマブ）、Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標）（抗ＩＬ６受容体ｍＡｂ）、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＨｕＭａｘ−ＣＤ４（ザノリムマブ）、Ｒｉｔｕｘａｎ（��録商標）（リツキシマブ）；Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）（エルロチニブ）；Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ（登録商標）（インターフェロンα−２ａ）；Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）（バシリキシマブ）；Ｓｔｅｌａｒａ（商標）（ウステキヌマブ）；Ｐｒｅｘｉｇｅ（登録商標）（ルミラコキシブ）；Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）（パリビズマブ）；１４６Ｂ７−ＣＨＯ（抗ＩＬ１５抗体、米国特許第７１５３５０７号明細書を参照）、Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）（ナタリズマブ）；Ｖａｌｏｒｔｉｍ（登録商標）（ＭＤＸ−１３０３、抗炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）防御抗原ｍＡｂ）；ＡＢｔｈｒａｘ（商標）；Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）；Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）（オマリズマブ）、ＥＴＩ２１１（抗ＭＲＳＡ  ｍＡｂ）、ＩＬ−Ｉ  Ｔｒａｐ（ヒトＩｇＧｌのＦｃ部分及び両ＩＬ−Ｉ受容体成分（１型受容体及び受容体補助タンパク質）の細胞外ドメイン）、ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ（ＩｇＧｌ  Ｆｃと融合したＶＥＧＦＲＩのＩｇドメイン）、Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）（ダクリズマブ）；Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）（ダクリズマブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン）、Ｚｅｔｉａ（エゼチマイブ）、アタシセプト（ＴＡＣＩ−Ｉｇ）、抗α４β７  ｍＡｂ（ベドリズマブ）；ガリキシマブ（抗ＣＤ８０モノクローナル抗体）、抗ＣＤ２３  ｍＡｂ（ルミリキシマブ）；ＢＲ２−Ｆｃ（ｈｕＢＲ３／ｈｕＦｃ融合タンパク質、可溶性ＢＡＦＦ拮抗薬）；Ｓｉｍｐｏｎｉ（商標）（ゴリムマブ）；マパツズマブ（ヒト抗ＴＲＡＩＬ受容体−１  ｍＡｂ）；オクレリズマブ（抗ＣＤ２０ヒトｍＡｂ）；ＨｕＭａｘ−ＥＧＦＲ（ザルツムマブ）；Ｍ２００（ボロシキシマブ、抗α５β１インテグリンｍＡｂ）；ＭＤＸ−０１０（イピリムマブ、抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ及びＶＥＧＦＲ−Ｉ（ＩＭＣ−１８Ｆ１）；抗ＢＲ３  ｍＡｂ；抗Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ及び毒素Ｂ  Ｃ  ｍＡｂ  ＭＤＸ−０６６（ＣＤＡ−Ｉ）及びＭＤＸ−１３８８）；抗ＣＤ２２  ｄｓＦｖ−ＰＥ３８抱合体（ＣＡＴ−３８８８及びＣＡＴ−８０１５）；抗ＣＤ２５  ｍＡｂ（ＨｕＭａｘ−ＴＡＣ）；抗ＴＳＬＰ抗体；抗ＴＳＬＰ受容体抗体（米国特許第８１０１１８２号明細書）；Ａ５と指名された抗ＴＳＬＰ抗体（米国特許第７９８２０１６号明細書）；抗ＣＤ３  ｍＡｂ（ＮＩ−０４０１）；アデカツムマブ（ＭＴ２０１、抗ＥｐＣＡＭ−ＣＤ３２６  ｍＡｂ）；ＭＤＸ−０６０、ＳＧＮ−３０、ＳＧＮ−３５（抗ＣＤ３０  ｍＡｂ）；ＭＤＸ−１３３３（抗ＩＦＮＡＲ）；ＨｕＭａｘ  ＣＤ３８（抗ＣＤ３８  ｍＡｂ）；抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ；抗Ｃｒｉｐｔｏ  ｍＡｂ；抗ＣＴＧＦ特発性肺線維症第Ｉ期フィブロゲン（ＦＧ−３０１９）；抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ；抗エオタキシン１  ｍＡｂ（ＣＡＴ−２１３）；抗ＦＧＦ８  ｍＡｂ；抗ガングリオシドＧＤ２  ｍＡｂ；抗スクレロスチン抗体（米国特許第８７１５６６３号明細書又は同第７５９２４２９号明細書を参照）、Ａｂ−５と指名された抗スクレロスチン抗体（米国特許第８７１５６６３号明細書又は同第７５９２４２９号明細書）；抗ガングリオシドＧＭ２  ｍＡｂ；抗ＧＤＦ−８ヒトｍＡｂ（ＭＹＯ−０２９）；抗ＧＭ−ＣＳＦ受容体ｍＡｂ（ＣＡＭ−３００１）；抗ＨｅｐＣ  ｍＡｂ（ＨｕＭａｘ  ＨｅｐＣ）；ＭＥＤＩ−５４５、ＭＤＸ−１１０３（抗ＩＦＮα  ｍＡｂ）；抗ＩＧＦＩＲ  ｍＡｂ；抗ＩＧＦ−ＩＲ  ｍＡｂ（ＨｕＭａｘ−Ｉｎｆｌａｍ）；抗ＩＬ１２／ＩＬ２３ｐ４０  ｍＡｂ（ブリアキヌマブ）；抗ＩＬ−２３ｐ１９  ｍＡｂ（ＬＹ２５２５６２３）；抗ＩＬ１３  ｍＡｂ（ＣＡＴ−３５４）；抗ＩＬ−１７モノクローナル抗体（ＡＩＮ４５７）；抗ＩＬ２Ｒａ  ｍＡｂ（ＨｕＭａｘ−ＴＡＣ）；抗ＩＬ５受容体ｍＡｂ；抗インテグリン受容体ｍＡｂ（ＭＤＸ−Ｏｌ８、ＣＮＴＯ９５）；抗ＩＰＩＯ潰瘍性大腸炎ｍＡｂ（ＭＤＸ−１１００）；抗ＬＬＹ抗体；ＢＭＳ−６６５１３；抗マンノース受容体／ｈＣＧβ  ｍＡｂ（ＭＤＸ−１３０７）；抗メソテリンｄｓＦｖ−ＰＥ３８抱合体（ＣＡＴ−５００１）；抗ＰＤｌｍＡｂ（ＭＤＸ−１  １０６（ＯＮＯ−４５３８））；抗ＰＤＧＦＲα抗体（ＩＭＣ−３Ｇ３）；抗ＴＧＦβ  ｍＡｂ（ＧＣ−１００８）；抗ＴＲＡＩＬ受容体−２ヒトｍＡｂ（ＨＧＳ−ＥＴＲ２）；抗ＴＷＥＡＫ  ｍＡｂ；抗ＶＥＧＦＲ／Ｆｌｔ−１  ｍＡｂ；抗ＺＰ３  ｍＡｂ（ＨｕＭａｘ−ＺＰ３）；ＮＶＳ抗体＃１；ＮＶＳ抗体＃２；並びに配列番号８及び配列番号６の配列を含むアミロイドβモノクローナル抗体（米国特許第７９０６６２５号明細書）が挙げられる。
【０１０５】
方法及び医薬製剤に適した抗体の例としては、表１に示す抗体が挙げられる。好適な抗体のその他の例としては、インフリキシマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ラニビズマブ、パリビズマブ、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アラシズマブペゴル、ａｌｄ５１８、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブマフェナトクス、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ、アルチヌマブ、アトリズマブ、アトロリムマブ、トシリズマブ、バピヌズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ビシロマブ、ビバツズマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブロソズマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カンツズマブメルタンシン、カプラシズマブ、カプロマブペンデチド、カルルマブ、カツマキソマブ、ｃｃ４９、セデリズマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、シタツズマブボガトクス、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コナツムマブ、クレネズマブ、ｃｒ６２６１、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダラツムマブ、デミシズマブ、デノスマブ、デツモマブ、ドルリモマブアリトクス、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュピルマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エロツズマブ、エルシリモマブ、エナバツズマブ、エンリモマブペゴル、エノキズマブ、エノチクマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブシツキセタン、エプラツズマブ、エレヌマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、エトロリズマブ、エボロクマブ、エキシビビルマブ、ファノレソマブ、ファラリモマブ、ファルレツズマブ、ファシヌマブ、ｆｂｔａ０５、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フォントリズマブ、フォラルマブ、フォラビルマブ、フレソリムマブ、フルラヌマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブベドチン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、ｇｓ６６２４、イバリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イゴボマブ、イムシロマブ、イムガツズマブ、インクラクマブ、インダツキシマブラブタンシン、インフリキシマブ、インテツムマブ、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、イトリズマブ、イキセキズマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レブリキズマブ、レマレソマブ、レルデリムマブ、レキサツムマブ、リビビルマブ、リゲリズマブ、リンツズマブ、リリルマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツズマブ、マスリモマブ、マブリリムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モロリムマブ、モタビズマブ、モキセツモマブパスドトクス、ムロモナブ−ｃｄ３、ナコロマブタフェナトクス、ナミルマブ、ナプツモマブエスタフェナトクス、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネレリモマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オデュリモマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブモナトクス、オレゴボマブ、オルチクマブ、オテリキシズマブ、オキセルマブ、オザネズマブ、オゾラリズマブ、パジバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パノバクマブ、パルサツズマブ、パスコリズマブ、パテクリズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペラキズマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ピジリズマブ、ピンツモマブ、プラクルマブ、ポネズマブ、プリリキシマブ、プリツムマブ、ＰＲＯ  １４０、クイリズマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラフィビルマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、ロレデュマブ、ロモソズマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サマリズマブ、サリルマブ、サツモマブペンデチド、セクキヌマブ、セビルマブ、シブロツズマブ、シファリムマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、シプリズマブ、シルクマブ、ソラネズマブ、ソリトマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、スビズマブ、タバルマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タネズマブ、タプリツモマブパプトクス、テフィバズマブ、テリモマブアリトクス、テナツモマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、ＴＧＮ１４１２、トレメリムマブ、チシリムマブ、チルドラキズマブ、チガツズマブ、ＴＮＸ−６５０、トシリズマブ、トラリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、ウブリツキシマブ、ウレルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バパリキシマブ、バテリズマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ベセンクマブ、ビジリズマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブマフォドチン、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ、ジラリムマブ、ゾリモマブアリトクスが挙げられる。
【０１０６】
抗体としては、アダリムマブ、ベバシズマブ、ブリナツモマブ、セツキシマブ、コナツムマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エレヌマブ、エボロクマブ、インフリキシマブ、ナタリズマブ、パニツムマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロモソズマブ、テゼペルマブ及びトラスツズマブ並びに表７から選択される抗体も挙げられる。
【０１０７】
【表１０】
2021515893.tif 000013
【０１０８】
【表１１】
2021515893.tif 000014
【０１０９】
一部の実施形態では、治療用ポリペプチドは、ＢｉＴＥ（登録商標）である。ＢｉＴＥ（登録商標）は、癌細胞に対してＴ細胞の細胞傷害活性を指示する遺伝子組換え二重特異性モノクローナル抗体である。ｓｃＦｖの１つはＣＤ３受容体を介してＴ細胞に結合し、他の１つは腫瘍特異的分子を介して腫瘍細胞に結合する。ブリナツモマブ（ＢＬＩＮＣＹＴＯ（登録商標））は、ＣＤ１９に対して特異的であるＢｉＴＥ（登録商標）の１つの例である。
【実施例】
【０１１０】
下記の実施例のセクションは、単に例として提示されたものであり、決して本明細書の開示又は特許請求項を限定するために明記されたものではない。
【０１１１】
実施例１−フィルターの平衡化及び濃度
２００μＬの変性溶液（６ＭのグアニジンＨＣｌ、２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭのメチオニン、ｐＨ８．３（１００ｍＬ））をフィルター装置に添加し、１０分間に渡り１４，０００×ｇで遠心する。フロースルー画分を廃棄する。
【０１１２】
１００μｇのＢＩＴＥ（登録商標）−１をＭｉｃｒｏｃｏｎの３０Ｋのフィルター装置に添加し、１０分間に渡り１４，０００×ｇで遠心する。フロースルー画分を廃棄する。
【０１１３】
還元及びアルキル化
各サンプルに対して、３μＬの０．５ＭのＤＴＴを３７μＬの変性溶液に添加する。この溶液４０μＬを各フィルターに添加し、３０分間に渡り３７℃でインキュベートする。
【０１１４】
各サンプルに対して、７μＬの０．５Ｍのヨウ化酢酸ナトリウムを３３μＬの変性溶液に添加する。この溶液４０μＬを各フィルターに添加し、２０分間に渡り暗所の２５℃でインキュベートする。
【０１１５】
各サンプルに対して、４μＬの０．５ＭのＤＴＴを３６μＬの変性溶液に添加する。この溶液４０μＬを各フィルターに添加してアルキル化をクエンチする。
【０１１６】
このフィルターを１５分間に渡り１４，０００×ｇで遠心する。フロースルー画分を廃棄する。
【０１１７】
実施例２−トリプシンによる消化
２００μＬの消化溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭのメチオニン、ｐＨ７．８（１００ｍＬ））をフィルター装置に添加し、１５分間に渡り１４，０００×ｇで遠心する。フロースルー画分を廃棄する。このステップをもう２回繰り返す。
【０１１８】
５μＬのトリプシン溶液（１ｍｇ／ｍＬのトリプシン）を３５μＬの消化溶液に添加する。この溶液４０μＬを各フィルターに添加する（酵素対タンパク質比１：２０）。ボルテックスミキサー上で緩徐に１分間混合する。３７℃で１時間インキュベートする。
【０１１９】
フィルターを新規のコレクションチューブ（チューブ２）に移し、１０分間に渡り１４，０００×ｇで遠心する。チューブ２内のフロースルー画分を保持する。チューブ２は、今度は３０ｋＤａ未満のトリプシン断片を含有しているであろう。その後の消化及び濾過のために最初のコレクションチューブ（チューブ１）を保持する。
【０１２０】
２０μＬの消化溶液をフィルターに添加し、膜を洗浄するために１０分間に渡り１４，０００×ｇで遠心してチューブ２に入れる。このステップをもう１回繰り返す。
【０１２１】
フィルターを以前に使用したコレクションチューブ（チューブ１）に戻す。先行するステップでトリプシンペプチドを収集するために使用したコレクションチューブ（チューブ２）を３時間まで２〜８℃で保管する。
【０１２２】
実施例３−ヒト好中球エラスターゼ消化物
各サンプルについて、５μＬのヒト好中球エラスターゼ（１ｍｇ／ｍＬのヒト好中球エラスターゼ）を３５μＬの消化溶液に添加する。この溶液４０μＬを各フィルターに添加する（酵素対タンパク質比１：２０）。ボルテックスミキサー上で緩徐に１分間混合する。３０分間に渡り３７℃でインキュベートする。
【０１２３】
フィルターをトリプシンペプチドを含有するコレクションチューブ（チューブ２）に移し、１０分間に渡り１４，０００×ｇで遠心する。フロースルー画分を収集する。２０μＬの消化溶液をフィルターに添加し、膜を洗浄するために１４，０００×ｇで遠心する。同一コレクションチューブ（チューブ２）内に１０分間に渡り遠心する。
【０１２４】
フロースルー画分に１６０μＬの消化クエンチング溶液（８Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、２５０ｍＭの酢酸塩、ｐＨ４．７（１００ｍＬ））を添加する。
【０１２５】
緩徐に混合し、消化物を適切なＨＰＬＣバイアル内に移す。
【０１２６】
消化物は、２週間まで−７０℃で冷凍することができる。
【０１２７】
実施例４−超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）の条件
全サンプルについて、移動相Ａは、０．１％のギ酸水溶液から構成し、移動相Ｂは、アセトニトリル中の０．１％のギ酸溶液から構成した。分離は、ＣＳＨ  Ｃ１８  １．７μｍ、２．１×１５０ｍｍのＵＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ、Ｐ／Ｎ  １８６００５２９８）又はＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ、２．１×１５０ｍｍのＵＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ、Ｐ／Ｎ  １８６００３５５６）の何れかを使用して実施した。ＵＰＬＣの分離は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｕ−３０００システム（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｈ−Ｃｌａｓｓシステム（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）及び／又はＡｇｉｌｅｎｔ  １２９０システム（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）の何れかを使用して実施した。出発材料に基づいて、約３〜４μｇのサンプルをカラム上に装填した。
【０１２８】
実施例５−質量分光測定法の条件
消化の結果として生じたペプチドは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）又はＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して分析した。多数の機器を使用したので、データ収集パラメーターは、機器に依存して僅かに変動した。機器は、２００〜２，０００ｍ／ｚのスキャン範囲に渡ってデータ依存方式（上部４〜８）で操作した。ＡＧＣ標的は、ＭＳ１スキャンに対しては１Ｅ６に設定し、ＭＳＭＳスキャンに対しては５Ｅ５に設定した。ＭＳ１スキャンは、３５，０００又は１４０，０００何れかの解像度で収集し、ＭＳ２スキャンは１７，５００の解像度で収集した。ＭＳＭＳスキャンに対しては２〜４ｍ／ｚの単離窓を特定した。未使用の荷電状態及び８より大きい荷電状態でのピークは、ＭＳＭＳから排除した。動的排除は、１０秒間に設定した。ｍ／ｚ  ３９１．２８４３０のロックマスが可能になった。
【０１２９】
実施例６−データ分析
ＭＳデータは、ＭａｓｓＡｎａｌｙｚｅｒを用いて検索した。カルボキシメチル化は、静的修飾として特定した。全検索のために、信号対雑音比は２０に設定し、１５ｐｐｍの質量精度を特定し、信頼は０．９５に設定した。配列カバレッジマップのために、最少ピーク面積はベースピークの１％に設定し、相対ピーク面積閾値は１７％に設定し、最少信頼は０．９５に設定し、最高ペプチド質量は１５，０００に設定した。
【０１３０】
参考文献
全ての参考文献は、本明細書にそれらの全体として参照して組み込まれる。
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Ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｅｄ．２００７．Ｔａｂｌｅ  ２．Ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｃｏｍｍｏｎｌｙ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ｆｒａｇｍｅｎｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．２００７：ｐｄｂ．ｔａｂ２ｉｐ１３．
Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ，Ｊ．Ｒ．，Ａ．Ｚｏｕｇｍａｎ，Ｎ．Ｎａｇａｒａｊ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｍａｎｎ．２００９．Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ．６：３５９−３６２．
【図１】
2021515893.tif 000015
【図２】
2021515893.tif 000016
【国際調査報告】
2021515893.tif 000017
2021515893.tif 000018