(57)【要約】本発明は、少なくともＷＯＸ５及びＰＬＴタンパク質、好ましくは、ＷＯＸ５及びＰＬＴ１の発現レベルを変化させることにより、植物細胞を再生し、好ましくは、植物細胞からシュートを再生するための方法に関する。加えて、ＷＩＮＤ１、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＲＢＲ、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５などのさらなるタンパク質の発現レベルを、変化させて、植物細胞からシュートを再生することができる。好ましくは、その発現レベルは一過性に変化される。本発明はさらに、植物細胞からシュートを再生するための、一過性タンパク質発現に適した核酸構築物、及び前記タンパク質組合せの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）少なくとも
ｉ）ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス５（ＷＯＸ５）タンパク質；及び
ｉｉ）ＰＬＥＴＨＯＲＡ（ＰＬＴ）１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択されるＰＬＥＴＨＯＲＡ（ＰＬＴ）タンパク質、好ましくはＰＬＴ１
を含む、タンパク質組合せの発現を植物細胞に導入し又は増加させるステップであって、前記タンパク質組合せのタンパク質の少なくとも１つの発現が一過性に導入又は増加される、ステップ；並びに
ｂ）前記植物細胞が前記シュートに再生するのを可能にするステップを含む、植物細胞からシュートを再生するための方法。
【請求項２】
前記タンパク質組合せが、
ｉｉｉ）ＷＯＵＮＤ  ＩＮＤＵＣＥＤ  ＤＥＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ  １（ＷＩＮＤ１）タンパク質
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質組合せが
ｉｖ）ＳＨＯＲＴ  ＲＯＯＴ（ＳＨＲ）タンパク質；
ｖ）ＳＣＡＲＥＣＲＯＷ（ＳＣＲ）タンパク質；並びに
ｖｉ）ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択される少なくとも３つのＰＬＥＴＨＯＲＡ（ＰＬＴ）タンパク質
をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質組合せが、ＰＬＴ１、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５のうちの少なくとも１つ又は複数を含む少なくとも３つの選択されたＰＬＴタンパク質を含み、好ましくは、前記少なくとも３つの選択されたＰＬＴタンパク質がＰＬＴ１、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）が、内因性Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｒｅｌａｔｅｄ（ＲＢＲ）タンパク質の発現を減少させることをさらに含み、好ましくは、前記ＲＢＲタンパク質の発現が一過性に減少される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に定義されるタンパク質組合せの全タンパク質の発現が、一過性に導入又は増加され、及び任意選択で、前記ＲＢＲタンパク質の発現が一過性に減少され、好ましくは、請求項１〜４のいずれか一項に定義されるタンパク質組合せの全タンパク質の発現が、同時に一過性に導入又は増加され、及び任意選択で、前記ＲＢＲタンパク質の発現が、前記タンパク質組合せと同時に、一過性に減少される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に定義されるタンパク質組合せのタンパク質の少なくとも１つの発現、好ましくは前記タンパク質組合せの全タンパク質の発現が、それらの発現の一過性活性化により一過性に導入又は増加され、及び任意選択で、前記ＲＢＲタンパク質の発現が、ＲＢＲ抑制因子の発現の一過性活性化により一過性に減少される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ｉ）前記ＳＨＲタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも６０％配列同一性を有し；
ｉｉ）前記ＳＣＲタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２と少なくとも６０％配列同一性を有し；
ｉｉｉ）前記ＷＯＸ５タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号３と少なくとも６０％配列同一性を有し；
ｉｖ）前記ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７タンパク質のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号３０と少なくとも６０％配列同一性を有し；
ｖ）前記ＲＢＲタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１７と少なくとも６０％配列同一性を有し；及び
ｖｉ）前記ＷＩＮＤ１タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２８と少なくとも６０％配列同一性を有し、
並びに／又は
ａ）前記ＳＨＲタンパク質が、配列番号９と少なくとも６０％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ；
ｂ）前記ＳＣＲタンパク質が、配列番号１０と少なくとも６０％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ；
ｃ）前記ＷＯＸ５タンパク質が、配列番号１１と少なくとも６０％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ；
ｄ）前記ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７タンパク質が、それぞれ、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１９と少なくとも６０％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ；
ｅ）前記ＲＢＲタンパク質が、配列番号１８と少なくとも６０％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ；及び
ｆ）前記ＷＩＮＤ１タンパク質が、配列番号２９と少なくとも６０％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記植物細胞が、多細胞組織、好ましくはカルス組織、植物器官、若しくは外植片の一部であり、好ましくは、前記植物器官が根であり、並びに／又は、好ましくは、前記植物細胞が、アラビドプシス、オオムギ、キャベツ、キャノーラ、キャッサバ、カリフラワー、チコリー、キク、ワタ、キュウリ、ナス、ブドウ、トウガラシ、レタス、トウモロコシ、メロン、セイヨウアブラナ、ジャガイモ、パンプキン、イネ、ライムギ、ソルガム、ダイズ、カボチャ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、パプリカ、トマト、スイカ、コムギ、及びズッキーニからなる群から選択される植物から入手できる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
再生シュートから植物又は植物部位を形成するステップｃ）を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも２つの核酸分子を含む組成物であって、
ｉ）第１の核酸分子が、誘導性プロモーターと作動可能に連結された、ＷＯＸ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み；並びに
ｉｉ）第２の核酸分子が、誘導性プロモーターと作動可能に連結された、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択されるＰＬＴタンパク質、好ましくはＰＬＴ１をコードするヌクレオチド配列を含む、
組成物。
【請求項１２】
請求項１１に定義される第１及び第２の核酸分子のヌクレオチド配列を含む核酸構築物であって、好ましくは、前記核酸構築物が、好ましくはプロモーターと作動可能に連結されているトランス活性化因子をコードするさらなるヌクレオチド配列を含み、前記トランス活性化因子が、誘導因子を結合する際に、前記誘導性プロモーターを活性化し、好ましくは、前記トランス活性化因子が
ｉ）配列番号２１と少なくとも６０％配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ、前記トランス活性化因子がデキサメタゾン、コルチコイド、若しくはその誘導体と結合する能力があり；又は
ｉｉ）配列番号２７と少なくとも６０％配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ、前記トランス活性化因子がβ−エストラジオール若しくはその誘導体と結合する能力がある、
核酸構築物。
【請求項１３】
ｉ）請求項１１に定義される第１及び第２の核酸分子；並びに
ｉｉ）請求項１２に記載の核酸構築物
のうちの少なくとも１つを含む植物細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法により獲得できるシュート、植物、又は植物部位。
【請求項１５】
植物細胞からシュートを再生するための、請求項１〜４のいずれか一項に定義されるタンパク質組合せ、及び、任意選択で、請求項７に定義されるＲＢＲ抑制因子、請求項１１に定義される組成物、又は請求項１２に定義される核酸構築物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子植物生物学の分野、特に、植物再生の分野に関する。本発明は、植物成長ホルモンの必要性なしに植物細胞の再生を向上させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最新の植物再生テクノロジーが、重要な作物種における所望の形質の操作に成功するかに関しては定まっていない。現在の再生プロトコールは依然として大部分が、新規の植物再生を２段階プロセスで制御する、２つの鍵となる植物ホルモン、オーキシン及びサイトカイニンの適用に依存している（Ｓｋｏｏｇ及びＭｉｌｌｅｒ、１９５７）。一般的に、オーキシンリッチな培地を用いて、再生応答能カルスを誘導し、そのカルスから、サイトカイニンリッチな培地によってシュート器官形成を誘導する。本プロトコールに不応性の植物種の操作では、それらの遺伝的向上のため現代的バイオテクノロジーを使用することが無効であるという結果を生じている。したがって、遺伝子型非依存的なシュート器官形成を可能にする再生効率を増加させる方法が必要とされている。
【０００３】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）での実験により、カルスのシュートを生成する応答能が、カルス細胞の根アイデンティティ獲得を示す根形質の出現により達成されることが明らかにされている（Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、２０１０）。再生応答能カルスにおける根形質の発現の後に、シュート特異的遺伝子の発現があり、シュート再生への開始のための創始細胞を生成する一過性の根獲得の重要性を示している（Ｒｏｓｓｐｏｐｏｆｆら、２０１７）。遺伝的研究は、カルス組織の再生能のための根形質獲得の重要性を裏付けている（Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、２０１０）（Ｋａｒｅｅｍら、２０１５）（Ｆａｎら、２０１２）。これらの研究は、シュート再生のための追加の制御因子の関与を明らかにしているが、再生過程中のホルモン誘導に依然として頼っている。したがって、この植物ホルモン誘導への依存性は、植物細胞の再生効率を依然として妨げている。
【０００４】
Ｉｗａｓｅら（２０１５）は、ＷＩＮＤ１の過剰発現がオーキシン前処理を迂回し得ることを示しているが、依然として植物ホルモンサイトカイニンの存在を必要とする。
【０００５】
フィトホルモンの非存在下でのシュート再生が、以前、当技術分野において示されているが、植物の傷害を必要とする（Ｉｗａｓｅら、２０１７）。
【０００６】
したがって、外部から投与される植物ホルモンには依存せず、かつ植物を傷つける必要性なしに、植物種、特に不応性植物種に再生能を与え、又はそれらの再生効率を増強する方法の必要性が当技術分野に依然として存在する。加えて、植物細胞に導入する際に、例えば、不応性植物の再生能を増加させ、又は誘導する組換えＤＮＡ構築物の必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００７】
ある態様において、本発明は、以下のステップを含む、植物細胞からシュートを再生するための方法に関する：
ａ）少なくとも
ｉ）ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス５（ＷＯＸ５）タンパク質；及び
ｉｉ）ＰＬＥＴＨＯＲＡ（ＰＬＴ）１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択されるＰＬＥＴＨＯＲＡ（ＰＬＴ）タンパク質、好ましくはＰＬＴ１
を含む、タンパク質組合せの発現を植物細胞に導入し、又は増加させるステップであって、前記タンパク質組合せのタンパク質の少なくとも１つの発現が一過性に導入又は増加される、ステップ；並びに
ｂ）前記植物細胞がシュートに再生するのを可能にするステップ。
【０００８】
ある実施形態において、タンパク質組合せは、
ｉｉｉ）ＷＯＵＮＤ  ＩＮＤＵＣＥＤ  ＤＥＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ  １（ＷＩＮＤ１）タンパク質
をさらに含む。
【０００９】
ある実施形態において、タンパク質組合せは
ｉｖ）ＳＨＯＲＴ  ＲＯＯＴ（ＳＨＲ）タンパク質；
ｖ）ＳＣＡＲＥＣＲＯＷ（ＳＣＲ）タンパク質；及び
ｖｉ）ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択される少なくとも３つのＰＬＥＴＨＯＲＡ（ＰＬＴ）タンパク質
をさらに含む。
【００１０】
ある実施形態において、タンパク質組合せは、ＰＬＴ１、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５のうちの少なくとも１つ又は複数を含む、少なくとも３つの選択されたＰＬＴタンパク質を含み、好ましくは、前記少なくとも３つの選択されたＰＬＴタンパク質がＰＬＴ１、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５である。
【００１１】
ある実施形態において、ステップａ）が、内因性Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｒｅｌａｔｅｄ（ＲＢＲ）タンパク質の発現を減少させることをさらに含み、好ましくは、前記ＲＢＲタンパク質の発現が一過性に減少される。
【００１２】
好ましくは、本明細書に定義されているようなタンパク質組合せの全タンパク質の発現は、一過性に導入又は増加され、任意選択で、ＲＢＲタンパク質の発現が一過性に減少される。
【００１３】
好ましくは、本明細書に定義されているようなタンパク質組合せの全タンパク質の発現は、同時に一過性に導入又は増加され、任意選択で、ＲＢＲタンパク質の発現が、前記タンパク質組合せと同時に、一過性に減少される。
【００１４】
ある実施形態において、本明細書に定義されているようなタンパク質組合せのタンパク質の少なくとも１つの発現、好ましくは前記タンパク質組合せの全タンパク質の発現が、それらの発現の一過性活性化により一過性に導入又は増加され、任意選択で、ＲＢＲタンパク質の発現が、ＲＢＲ抑制因子の発現の一過性活性化により一過性に減少される。
【００１５】
さらなる実施形態において、
ｉ）ＳＨＲタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも６０％配列同一性を有する；
ｉｉ）ＳＣＲタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２と少なくとも６０％配列同一性を有する；
ｉｉｉ）ＷＯＸ５タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３と少なくとも６０％配列同一性を有する；
ｉｖ）ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号３０と少なくとも６０％配列同一性を有する；
ｖ）ＲＢＲタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１７と少なくとも６０％配列同一性を有する；並びに
ｖｉ）ＷＩＮＤ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２８と少なくとも６０％配列同一性を有する。
【００１６】
ある実施形態において、
ｉ）ＳＨＲタンパク質は、配列番号９と少なくとも６０％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる；
ｉｉ）ＳＣＲタンパク質は、配列番号１０と少なくとも６０％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる；
ｉｉｉ）ＷＯＸ５タンパク質は、配列番号１１と少なくとも６０％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる；
ｉｖ）ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７タンパク質は、それぞれ、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１９と少なくとも６０％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる；
ｖ）ＲＢＲタンパク質は、配列番号１８と少なくとも６０％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる；並びに
ｖｉ）ＷＩＮＤ１タンパク質は、配列番号２９と少なくとも６０％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
【００１７】
さらなる実施形態において、植物細胞は、多細胞組織、好ましくはカルス組織、植物器官、外植片の一部である。好ましくは、植物器官は根である。
【００１８】
ある実施形態において、植物細胞は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、オオムギ、キャベツ、キャノーラ（ｃａｎｏｌａ）、キャッサバ、カリフラワー、チコリー、キク、ワタ、キュウリ、ナス、ブドウ、トウガラシ、レタス、トウモロコシ、メロン、セイヨウアブラナ（ｏｉｌｓｅｅｄ  ｒａｐｅ）、ジャガイモ、パンプキン（ｐｕｍｐｋｉｎ）、イネ、ライムギ、ソルガム、ダイズ、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、パプリカ（ｓｗｅｅｔ  ｐｅｐｐｅｒ）、トマト、スイカ、コムギ、及びズッキーニからなる群から選択される植物から入手できる。任意選択で、植物細胞は、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、任意選択でナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、任意選択でトマト種（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）又はナス種（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）の植物から入手できる。任意選択で、植物細胞は、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、任意選択でその種又は亜種、ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、カブ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、セイヨウワサビ（Ａｒｍｏｒａｃｉａ  ｒｕｓｔｉｃａｎａ）、又はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）から入手できる。
【００１９】
ある実施形態において、方法は、再生シュートから植物又は植物部位を形成するステップｃ）を含む。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、少なくとも２つの核酸分子を含む組成物であって、
ｉ）第１の核酸分子が、誘導性プロモーターと作動可能に連結された、ＷＯＸ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み；並びに
ｉｉ）第２の核酸分子が、誘導性プロモーターと作動可能に連結された、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択されるＰＬＴタンパク質、好ましくはＰＬＴ１をコードするヌクレオチド配列を含む、
組成物に関する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、本明細書に定義されているような第１及び第２の核酸分子のヌクレオチド配列を含む核酸構築物に関する。
【００２２】
好ましくは、核酸構築物は、好ましくはプロモーターと作動可能に連結されているトランス活性化因子をコードするさらなるヌクレオチド配列を含み、前記トランス活性化因子が、誘導因子を結合する際に、誘導性プロモーターを活性化する。好ましくは、前記誘導性プロモーターは、少なくとも１つの発現カセットの一部である。好ましくは、前記誘導性プロモーターは、本明細書に定義されているような、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＷＯＸ５、ＷＩＮＤ、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７タンパク質、並びにＲＢＲ抑制因子をコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つと作動可能に連結されている。
【００２３】
好ましくは、トランス活性化因子は、
ｉ）配列番号２１と少なくとも６０％配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ、前記トランス活性化因子がデキサメタゾン、コルチコイド、若しくはその誘導体と結合する能力があり；又は
ｉｉ）配列番号２７と少なくとも６０％配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ、前記トランス活性化因子がβ−エストラジオール若しくはその誘導体と結合する能力がある。
【００２４】
さらなる態様において、本発明は、
ｉ）誘導性プロモーターと作動可能に連結されたＷＯＸ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸分子、及び好ましくは誘導性プロモーターと作動可能に連結された、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択されるＰＬＴタンパク質、好ましくはＰＬＴ１をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸分子；並びに
ｉｉ）本明細書に定義されているような核酸構築物
のうちの少なくとも１つを含む植物細胞に関する。
【００２５】
別の態様において、本発明は、本明細書に定義されているような方法により獲得できるシュート、植物、又は植物部位に関する。
【００２６】
ある態様において、本発明は、植物細胞からシュートを再生するための、本明細書に定義されているようなタンパク質組合せ、及び、任意選択で、本明細書に定義されているようなＲＢＲ抑制因子、又は本明細書に定義されているような核酸組成物若しくは構築物の使用に関する。
【００２７】
〔定義〕
本発明の方法、組成物、使用、及び他の態様に関する様々な用語が、本明細書及び特許請求の範囲を通して用いられている。そのような用語は、他に指示がない限り、本発明が属する技術分野におけるそれらの通常の意味を与えられるものとする。他の明確に定義された用語は、本明細書に提供された定義と一致するように解釈されるものとする。
【００２８】
本明細書に記載されたものと類似した又は等価の任意の方法及び材料が、本発明を実施するために用いられ得ることは、当業者には明らかである。
【００２９】
本発明の方法において用いられる通常の技術を実行する方法は、当業者には明らかであろう。分子生物学、生化学、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、バイオインフォマティクス、ゲノミクス、シーケンシング、及び関連分野における通常の技術の実践は、当業者に周知であり、例えば、以下の参照文献に論じられている：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．  Ｙ．、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７及び定期的更新；並びにｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ。
【００３０】
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに別のことを指図しない限り、複数形の指示対象を含む。したがって、例えば、「１つの植物細胞」への言及は、２つ以上の植物細胞の組合せを含むなどである。このように、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【００３１】
用語「及び／又は」は、述べられた事例の１つ又は複数が、単独で、又は述べられた事例の全部までの、述べられた事例の少なくとも１つと組み合わせて、生じ得る状況を指す。
【００３２】
本明細書で用いられる場合、用語「約」は、わずかな変動を記載及び説明するために用いられる。例えば、その用語は、±（＋又は−）１０％以下、例えば、±５％以下、±４％以下、±３％以下、±２％以下、±１％以下、±０．５％以下、±０．１％以下、又は±０．０５％以下を指し得る。
【００３３】
加えて、量、比率、及び他の数値は、範囲形式で本明細書に提示される場合がある。そのような範囲形式は便利さ及び簡潔さのために用いられると理解されるべきであり、範囲の限界として明確に特定化された数値を含むだけでなく、各数値及び部分的範囲が明確に特定化されているかのように、その範囲内に包含される全ての個々の数値又は部分的範囲も含むものと柔軟に理解されるべきである。例えば、約１〜約２００の範囲における比率は、約１及び約２００の明確に列挙された限界を含むだけでなく、個々の比率、例えば、約２、約３、及び約４、並びに部分的範囲、例えば、約１０〜約５０、約２０〜約１００なども含むと理解されるべきである。
【００３４】
用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、包括的かつオープンエンドであり、排他的ではないと解釈される。具体的には、その用語及びその語尾変化形は、特定化された特徴、ステップ、又は成分が含まれることを意味する。これらの用語は、他の特徴、ステップ、又は成分の存在を排除すると解釈されるべきではない。
【００３５】
用語「植物ホルモン」、「植物成長ホルモン」、「植物成長調節物質」、又は「フィトホルモン」は、植物細胞及び組織の成長及び発生に影響を及ぼす化学物質として本明細書で理解されるべきである。植物成長調節物質は、以下の５つの群からの化学物質を含む：オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸（ＡＢＡ）、及びエチレン。その５つの主要な群に加えて、以下の２つの他のクラスの化学物質が、植物成長調節物質として見なされる場合が多い：ブラシノステロイド及びポリアミン。植物組織におけるシュート再生の誘導について、１つ又は複数のサイトカイニン及び１つ又は複数のオーキシンの組合せが通常、用いられる。
【００３６】
用語「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、交換可能に用いられ、作用の特定の様式、サイズ、３次元構造、又は起源を全く考慮せずに、アミノ酸の鎖からなる分子を指す。したがって、タンパク質の「断片」又は「一部分」は、依然として「タンパク質」と呼ばれ得る。「単離されたタンパク質」は、もはやその天然の環境にはなく、例えば、インビトロに、又は組換え細菌若しくは植物宿主細胞内にあるタンパク質を指すように用いられる。
【００３７】
「植物」は、植物全体、又は植物から入手できる植物の部位、例えば、細胞、組織、若しくは器官（例えば、花粉、種子、配偶子、根、葉、花、花蕾、葯、果実など）のいずれか、加えて、これらのいずれかの派生物、及び自家受粉又は交配によるそのような植物に由来した子孫を指す。
【００３８】
「（１つ又は複数の）植物細胞」は、単離された、又は組織、器官、若しくは生物体内のいずれかでの、プロトプラスト、配偶子、懸濁培養物、小胞子、花粉粒などを含む。植物細胞は、例えば、カルス、分裂組織植物器官、又は外植片などの多細胞構造の一部であり得る。
【００３９】
植物／植物細胞を培養するための「類似した条件」は、とりわけ、類似した温度、湿度、栄養、及び光条件、並びに類似した灌水及び昼／夜のリズムの使用を意味する。
【００４０】
用語「相同性」、「配列同一性」などは、本明細書で交換可能に用いられる。配列同一性は、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列間、又は２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列間の、その配列を比較することにより決定される場合の関係として本明細書で定義される。当技術分野において、「同一性」はまた、アミノ酸配列間又は核酸配列間の、場合によっては、そのような配列の文字列間の一致により決定される場合の、配列関連性の程度を意味する。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換体を第２のポリペプチドの配列と比較することにより、決定される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法により容易に計算することができる。パーセンテージ配列同一性／類似性は、その配列の完全長に渡って決定することができる。
【００４１】
「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つの配列の長さに依存して、グローバル又はローカルアラインメントアルゴリズムを用いる、２つのペプチド配列又は２つのヌクレオチド配列のアラインメントにより決定することができる。類似した長さの配列は、好ましくは、全長に渡って最適に配列をアラインメントするグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈ）を用いてアラインメントされ、一方、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）を用いてアラインメントされる。その後、配列は、（下記で定義されているように）それらが、（例えば、プログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによりデフォルトパラメーターを用いて最適にアラインメントされる時）少なくともある特定の最小パーセンテージの配列同一性を共有する場合、「実質的に同一」又は「本質的に類似」と呼ばれ得る。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムを用いて、一致の数を最大にし、かつギャップの数を最小にしながら、２つの配列をそれらの全長（完全長）に渡ってアラインメントする。グローバルアラインメントは、適切には、２つの配列が類似した長さを有する場合に配列同一性を決定するために用いられる。一般的に、ギャップ生成ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）、及びギャップ伸長ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）である、ＧＡＰデフォルトパラメーターが用いられる。ヌクレオチドについて、用いられるデフォルトスコアリングマトリックスは、ｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質について、デフォルトスコアリングマトリックスは、Ｂｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２、ＰＮＡＳ  ８９、９１５〜９１９）。配列アラインメント及びパーセンテージ配列同一性についてのスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．、９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  ９２１２１−３７５２  ＵＳＡから入手可能であるＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．３などのコンピュータプログラムを用いて、又はＥｍｂｏｓｓＷＩＮ  バージョン２．１０．０における、プログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いる）若しくは「ｗａｔｅｒ」（ローカルＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いる）などのオープンソースソフトウェアを用いて、上記のＧＡＰについてと同じパラメーター若しくはデフォルト設定（「ｎｅｅｄｌｅ」についてと「ｗａｔｅｒ」についての両方、及びタンパク質アラインメントについてとＤＮＡアラインメントについての両方とも、デフォルトのギャップオープニングペナルティは１０．０であり、デフォルトのギャップ伸長ペナルティは０．５である；デフォルトのスコアリングマトリックスは、タンパク質についてＢｌｏｓｓｕｍ６２及びＤＮＡについてＤＮＡＦｕｌｌである）を用いて、決定され得る。配列が、実質的に異なる全長を有する場合、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いるものなどのローカルアラインメントが好ましい。
【００４２】
或いは、パーセンテージ類似性又は同一性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを用いて、公開データベースに対して検索することにより、決定され得る。したがって、本発明の核酸配列及びタンパク質配列はさらに、例えば他のファミリーメンバー又は関連配列を同定するために、公開データベースに対する検索を実施するための「クエリ配列」として用いることができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３〜１０のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を用いて実施することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同的なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子と相同的なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施することができる。比較のためにギャップドアラインメントを得るために、ギャップドＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２に記載されているように、利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップドＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／におけるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのホームページを参照されたい。
【００４３】
用語「相補性」は、配列の完全相補鎖との配列同一性として本明細書に定義される。例えば、１００％相補的（完全に相補的）である配列は、その相補鎖と１００％配列同一性を有すると本明細書で理解され、例えば、８０％相補的である配列は、その（完全）相補鎖と８０％配列同一性を有すると本明細書で理解される。
【００４４】
用語「核酸構築物」、「核酸ベクター」、「ベクター」、及び「発現ベクター」は、本明細書で交換可能に用いられ、組換えＤＮＡテクノロジーの使用から生じる人工の核酸分子として本明細書で定義される。したがって、核酸構築物が天然に存在する核酸分子（の一部）を含み得るが、用語「核酸構築物」及び「核酸ベクター」には、天然に存在する核酸分子が含まれない。
【００４５】
ベクターバックボーンは、例えば、当技術分野において知られているような、及び本明細書中の他の箇所で記載されているような、バイナリー又はスーパーバイナリーベクター（例えば、米国特許第５，５９１，６１６号、米国特許出願公開第２００２１３８８７９号、及び国際公開第９５／０６７２２号を参照）、共組込みベクター、又はＴ−ＤＮＡベクターであり得、その中へ、キメラ遺伝子が組み込まれ、又は適切な転写制御配列がすでに存在している場合には、所望の核酸配列（例えば、コード配列、アンチセンス、又は逆方向反復配列）が、その転写制御配列の下流に組み込まれる。ベクターは、例えば、選択可能なマーカー、多重クローニング部位などの分子クローニングにおけるそれらの使用を促進するためのさらなる遺伝子エレメントを含むことができる。
【００４６】
用語「遺伝子」は、細胞においてＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）へ転写される領域（転写領域）を含むＤＮＡ断片を意味する。遺伝子は、適切な調節領域（例えば、プロモーター）と作動可能に連結され得る。遺伝子は、通常、プロモーター、５’リーダー配列、コード領域、及びポリアデニル化部位を含む３’非翻訳配列（３’末端）などのいくつかの作動可能に連結された断片を含む。
【００４７】
「遺伝子の発現」は、適切な調節領域、特にプロモーターと作動可能に連結されているＤＮＡ領域が、ＲＮＡへ転写され、そのＲＮＡが生物活性タンパク質又はペプチドをコードする場合、その後、生物活性タンパク質又はペプチドへ翻訳される、過程を指す。
【００４８】
用語「作動可能に連結された」とは、機能的関係でのポリヌクレオチドエレメントの連結を指す。核酸は、それが、別の核酸配列と機能的関係へ置かれた場合、「作動可能に連結されている」。例として、プロモーター、又はもっと正確に言えば、転写制御配列は、それがコード配列の転写に影響する場合には、コード配列と作動可能に連結されている。作動可能に連結されたとは、連結されているＤＮＡ配列が近接することを意味する場合がある。
【００４９】
「プロモーター」は、１つ又は複数の核酸の転写を制御するように機能する核酸断片を指す。プロモーター断片は、その遺伝子の転写開始部位の転写の方向に対して上流（５’）に位置し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対する結合部位、（１つ又は複数の）転写開始部位の存在により構造的に同定され、任意の他のＤＮＡ配列をさらに含み得、その任意の他のＤＮＡ配列には、転写因子結合部位、抑制及び活性化タンパク質結合部位、並びにプロモーターからの転写の量を調節するように直接的又は間接的に作用することを当業者に知られた任意の他のヌクレオチド配列が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５０】
任意選択で、用語「プロモーター」はまた、５’ＵＴＲ領域（５’非翻訳領域）も含み得る（例えば、プロモーターは、本明細書において、転写領域の翻訳開始コドンの上流に１つ又は複数のパーツを含み得、その理由は、この領域が、転写及び／又は翻訳を調節することに役割をもち得るからである）。「構成的」プロモーターは、ほとんどの生理的及び発生的条件下で、ほとんどの組織において活性があるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、生理的に（例えば、ある特定の化合物の外部適用により）又は発生的に調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、組織又は細胞の特定の型においてのみ活性がある。
【００５１】
用語「再生」は、単一の植物細胞、カルス、外植片、組織、又は器官からの新しい組織及び／又は新しい器官の形成として本明細書で定義される。好ましくは、再生は、シュート再生、異所性頂端分裂組織形成、及び根再生のうちの少なくとも１つである。再生は、体細胞不定胚形成又は器官形成を通して起こり得る。本発明の関連において、再生は、少なくとも器官形成を含み、好ましくは、再生は、器官形成の過程を通してである。好ましくは、本明細書で定義されているような再生は、少なくとも新規のシュート形成に関する。再生は、単一の植物細胞から、又は例えば、カルス、外植片、組織、若しくは器官から新しい植物の形成をさらに含み得る。再生のための植物細胞は、未分化植物細胞であり得る。したがって、再生過程は、親組織から直接的に、又は、例えばカルスの形成を経由して、間接的に起こり得る。
【００５２】
「再生を可能にする条件」は、植物細胞又は組織が再生することができる環境として本明細書で理解される。そのような条件は、最低限でも、適切な温度、栄養、昼／夜リズム、及び灌水を含む。
【００５３】
タンパク質の「変化した発現レベル」は、非改変の野生型植物細胞におけるそのタンパク質の内因性発現レベルから逸脱する発現レベルとして本明細書で理解される。非改変型植物細胞とタンパク質発現の変化を有する植物細胞は、好ましくは、同じ遺伝的背景を有する。変化した発現レベルは、内因性発現レベルと比較して、増加又は減少し得る。本発明の関連において、ＷＯＸ５、ＷＩＮＤ１、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、又はＰＬＴ７の変化した発現レベルは、好ましくは、発現の増加又は導入である。ＲＢＲの変化した発現レベルは、好ましくは、発現の減少である。発現レベルは、当技術分野において適した任意の方法により測定することができ、その方法は、例えば、ｑＰＣＲ、ノーザンブロット、マイクロアレイなどであるが、それらに限定されない。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
植物細胞の再生は、サイトカイニン及び／又はオーキシンなどの植物ホルモンへの細胞の曝露を必要とする。本発明者らは、特定の群のタンパク質のタイムリーな発現が、そのような植物ホルモンの存在を陳腐化するということを今回発見した。異なる言い方をすれば、本発明者らは、この特定の群のタンパク質の発現が、自発的再生、特に、自発的器官形成を誘導することに気づいた。
【００５５】
したがって、第１の態様において、本発明は、植物細胞を再生するための方法に関する。ある実施形態において、方法は、植物細胞から分裂組織を再生することに関し、好ましくは、前記分裂組織が、成長して、シュートを形成する。このように、本発明は、植物細胞からシュートを再生するための方法に関する。シュートは、基盤細胞塊から切り取られ、根を形成するように誘導され得る。或いは、シュートは、基盤細胞塊から切り取られ、根が、何のさらなる誘導もなしに、形成され得る。
【００５６】
したがって、本発明はまた、再生を誘導又は刺激するために植物細胞が植物成長ホルモンに曝露されるという必要性なしに、植物細胞からシュートを再生するための方法にも関する。このように、本明細書に定義されているような方法は、植物細胞からシュートを再生するためのホルモン非依存的方法である。
【００５７】
好ましくは、シュート再生は、器官形成の過程を通してである。したがって、本明細書に定義されているような再生のための方法は、好ましくは、器官形成、好ましくはシュート器官形成のための方法である。シュート器官形成は、直接的なシュート器官形成又は間接的なシュート器官形成であり得る。
【００５８】
植物組織培養におけるこの関連において、カルス又は組織外植片からの新しい植物の新規形成（すなわち、再生）のために、以下の２つの選択的経路が存在する：器官形成及び体細胞不定胚形成。器官形成は、カルス又は組織を、器官（シュート又は根）を形成するように誘導することを含む。組織培養における器官形成の好ましい型は、シュート器官形成である。体細胞不定胚形成は、カルス又は組織外植片が、通常、胚発生カルス相を通って、接合胚に似る構造を発生し、それが、完全な小植物体へと発芽する、過程である（Ｃｈｉｅｎｇ，ＬＭＮら（２０１４）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｏｎｙｓｔｙｌｕｓ  ｂａｎｃａｎｕｓ  （Ｍｉｑ．）  Ｋｕｒｚ  （Ｒａｍｉｎ）  ｉｎ  Ｓａｒａｗａｋ．ＳＡＲＡＷＡＫ  ＦＯＲＥＳＴＲＹ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＆  ＩＴＴＯ、Ｋｕｃｈｉｎｇ、Ｍａｌａｙｓｉａ  ＆  ＩＴＴＯ；ＩＳＢＮ  ９７８−９６７−１２８５５−３−４）。これらの経路は、本明細書で示されているように、いくつかの特性が異なる。
【００５９】
外植片は、植物から採取された一次組織の小片であり、それが、器官形成か又は体細胞不定胚形成かのいずれかを通しての再生の源としての役割を果たし得る。外植片には、茎及び根切片（ｓｅｇｍｅｎｔ）、葉切片（ｓｅｃｔｉｏｎ）、花序切片（ｓｅｃｔｉｏｎ）、子葉、胚軸などの実生部位、並びに未成熟及び成熟の種子胚を挙げることができる（Ｔｈｏｒｐｅ，ＴＡ（１９９３）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ．Ｒｏｕｂｅｌａｋｉｓ−Ａｎｇｅｌａｋｉｓ  Ｋ．Ａ．、Ｖａｎ  Ｔｈａｎｈ  Ｋ．Ｔ．（編）Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ．ＮＡＴＯ  ＡＳＩ  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｓｅｒｉｅｓ  Ａ：Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、２５３巻。Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）。植物成長調節物質の操作及び培養条件によって、外植片は、直接的にシュート（又は根）を発生し得る。これは、直接的器官形成と呼ばれる。シュートの形成がカルス相を通過する場合には、これは、間接的器官形成と呼ばれる。同様に、体細胞不定胚形成において、胚は、外植片から直接的に（直接的体細胞不定胚形成）、又はカルス相を経由して（間接的体細胞不定胚形成、Ｔｈｏｒｐｅ、上記；Ｃｈｉｅｎｇら、上記）、発生することができる。
【００６０】
シュート器官形成：シュート器官形成は、カルス又は外植片の細胞が、葉原基及び葉を有するシュートへ発生する新規の茎頂分裂組織を形成する、再生経路である。たった１つの頂端分裂組織があるため、これは単極構造であり、根は、このステージでは形成されない。シュートの維管束系は、親組織と接続されている場合が多い。シュートが完全に形成及び伸長しており、かつカルス又は外植片から離された後のみ、異なる培地での別個の根誘導ステップにおいて根の形成が誘導され得る（Ｔｈｏｒｐｅ、上記）。当技術分野において、シュート器官形成は、植物成長調節物質（ＰＧＲ）、通常、異なる濃度で単独での又はオーキシンと組み合わせてのサイトカイニンにより誘導され、新しい茎頂分裂組織及びシュートが形成されており、かつ一次外植片又はカルスからそれらを離すのに十分伸長するまで、サイトカイニンは培地の成分として残存する。
【００６１】
サイトカイニンは、例えば、６−アミノプリン（ＢＡＰ）、ゼアチン、キネチン、チジアズロン（ＴＤＺ）、及び６−（γ，γ−ジメチルアリルアミノ）プリン（２−ｉＰ）である。サイトカイニンとオーキシンの組合せによるシュート器官形成について、オーキシンに対するサイトカイニンの比率は、＞１でなければならない（Ｄｏｄｄｓ，ＪＨ及びＲｏｂｅｒｔｓ，ＬＷ（１９８５）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）。
【００６２】
体細胞不定胚形成：対照的に、体細胞不定胚形成は、閉じた独立の維管束系を有する根−シュート軸を含有する、接合胚に似る双極構造の形成をもたらす。換言すれば、根原基とシュート原基の両方が、同時に形成されつつあり、基盤組織への維管束接続がない（Ｄｏｄｄｓ及びＲｏｂｅｒｔｓ、上記）。体細胞不定胚形成は、カルス若しくは細胞懸濁液から間接的に誘導され得、又はそれらは、外植片の細胞に直接的に誘導され得る（Ｔｈｏｒｐｅ、上記）。体細胞胚形成は、球状ステージ（小さい等直径の細胞クラスター）から、ハート型ステージ（左右相称構造）を経て、魚雷型ステージ（伸長）へと、いくつかの異なるステージを通過する。球状からハート型への移行は、２つの子葉の生長及び小根の発生の開始によって特徴づけられる（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，ＪＬ（１９９３）Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｅａｒｌｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｐｌａｎｔｓ．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１４１１〜１４２３；Ｖｏｎ  Ａｒｎｏｌｄら（２００２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ６９：２３３〜２４９）。最後に、魚雷型ステージの体細胞胚は、「発芽」（接合胚と類似）又は「転換」若しくは「成熟」と名づけられている過程において（Ｖｏｎ  Ａｒｎｏｌｄら、上記）、緑色の子葉、伸長した胚軸、及び明らかに分化した根毛を有する発生した小根を含有する小植物体へ発達することができる（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ、上記）。直接的又は間接的な、体細胞不定胚形成の誘導において、オーキシンは、カルスにおいて胚形成状態を誘導するために初期ステージで用いられるが、オーキシンを含まず、又はオーキシンレベルが低下した培地への培養物の継代後のみ、胚が形成する。体細胞胚誘導に用いられるオーキシンは、例えば、１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、ピクロラム、及びジカンバである。
【００６３】
【表１】
2021521864.tif 000002
【００６４】
ある実施形態において、本発明は、少なくともＳＨＯＲＴ  ＲＯＯＴ（ＳＨＲ）タンパク質の発現を導入し又は増加させるステップを含む、植物細胞を再生し、好ましくは植物細胞からシュートを再生するための方法に関する。ＳＨＲ、ＳＧＲ７、ＳＨＯＯＴ  ＧＲＡＶＩＴＲＯＰＩＳＭ  ７、及びＳＨＯＲＴ  ＲＯＯＴという用語は、本明細書で交換可能に用いられる。好ましくは、その発現は、一過性に導入又は増加される。ＳＨＲタンパク質は、転写因子であり、中心柱に発現することができ、静止中心を含む周囲細胞へ移動する。
【００６５】
静止中心は、周囲の幹細胞の分化を防止するようにオーガナイザーとして働く細胞群である。静止中心に隣接する各幹細胞は、それ自体を更新するために、及び移行帯において細胞周期から出る前に、分裂組織帯において何回も分裂する娘細胞を生じるために、非対称的に分裂する。その後、細胞は伸長し、特定の分化状態を獲得する。静止中心の遠位にある幹細胞は、分化する娘細胞を生じる（Ｈｅｉｄｓｔｒａ及びＳａｂａｔｉｎｉ、２０１４）。静止中心において、ＳＨＲは、ＳＣＡＲＥＣＲＯＷ（ＳＣＲ）を活性化することができる。
【００６６】
加えて又は或いは、方法は、少なくともＳＣＡＲＥＣＲＯＷ（ＳＣＲ）タンパク質の発現を導入し又は増加させるステップを含む。ＳＣＲ、ＳＣＡＲＥＣＲＯＷ、ＳＧＲ１、及びＳＨＯＯＴ  ＧＲＡＶＩＴＲＯＰＩＳＭ  １という用語は、本明細書で交換可能に用いられる。好ましくは、その発現は、一過性に導入又は増加される。ＳＣＲタンパク質は、静止中心の特定化に必要とされることが知られており、幹細胞維持とそれらの子孫の分化の両方に関与する。静止中心において、ＳＣＲは、分化促進性サイトカイニン応答転写因子ＡＲＲ１の発現を直接的に抑制し得る。
【００６７】
加えて又は或いは、方法は、少なくともＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス５（ＷＯＸ５）タンパク質の発現を導入し又は増加させるステップを含む。好ましくは、その発現は、一過性に導入又は増加される。ＷＯＸ５はＷＵＳの相同体であり、静止中心を発端から以遠へマークする。ＷＯＸ５機能の喪失は、根成長及び分裂組織サイズを変化させることなく、遠位のコルメラ幹細胞の分化を生じることが知られている。それにも関わらず、変異体分析により、ＷＯＸ５が近位の幹細胞維持を冗長的に制御し得ることが示された（Ｓａｒｋａｒら  ２００７）。
【００６８】
加えて又は或いは、方法は、少なくともＰＬＥＴＨＯＲＡ（ＰＬＴ）タンパク質の発現を導入し又は増加させるステップを含む。好ましくは、その発現は、一過性に導入又は増加される。ＰＬＴタンパク質は、静止中心に蓄積して、指令的グラジエント、及び幹細胞ニッチにおける、オーキシン最大値と一致した最高タンパク質レベルを形成する。ＰＬＴは、ＰＩＮ遺伝子ファミリー発現を調節することができ、そのことは、幹細胞ニッチにおける高いオーキシン及びＰＬＴのレベルを維持するためのフィードフォワードループを示唆する（Ｈｅｉｄｓｔｒａ及びＳａｂａｔｉｎｉ、２０１４）。ＰＬＴタンパク質は、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択され得る。
【００６９】
加えて又は或いは、方法は、少なくとも２つ、３つ、４つ、又は５つのＰＬＴタンパク質、好ましくは少なくとも３つのＰＬＴタンパク質の発現を導入し又は増加させるステップ、並びに好ましくは、３つのＰＬＴタンパク質の発現を導入し又は増加させるステップを含む。好ましくは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＰＬＴタンパク質の発現は、一過性に導入又は増加される。ＰＬＴタンパク質は、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択され得る。好ましくは、本発明の方法に用いられるＰＬＴタンパク質は、ＰＬＴ１、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５である。好ましくは、これらの３つのタンパク質の発現は、一過性に導入又は増加される。ＰＬＴ４及びＢＢＭという用語は、本明細書で交換可能に用いられる。同様に、ＰＬＴ５、ＡＩＬ５、ＡＩＮＴＥＧＵＭＥＮＴＡ−ＬＩＫＥ  ５、ＣＨＯ１、ＣＨＯＴＴＯ  １、ＥＭＢＲＹＯＭＡＫＥＲ、及びＥＭＫという用語は、本明細書で交換可能に用いられ得る。加えて、ＰＬＴ７、ＡＩＬ７、ＡＩＮＴＥＧＵＭＥＮＴＡ−ＬＩＫＥ  ７、及びＰＬＥＴＨＯＲＡ  ７という用語は、本明細書で交換可能に用いられ得る。
【００７０】
加えて又は或いは、方法は、Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｒｅｌａｔｅｄ（ＲＢＲ）タンパク質の発現を植物細胞において減少させるステップを含む。ＲＢＲ、ＡＴＲＢＲ１、ＲＢ、ＲＢ１、ＲＢＲ１、ＲＥＴＩＮＯＢＬＡＳＴＯＭＡ  １、ＲＥＴＩＮＯＢＬＡＳＴＯＭＡ−ＲＥＬＡＴＥＤ、ＲＥＴＩＮＯＢＬＡＳＴＯＭＡ−ＲＥＬＡＴＥＤ  １、及びＲＥＴＩＮＯＢＬＡＳＴＯＭＡ−ＲＥＬＡＴＥＤ  ＰＲＯＴＥＩＮ  １という用語は、本明細書で交換可能に用いられる。好ましくは、ＲＢＲタンパク質の発現は一過性に減少される。ＲＢ腫瘍抑制タンパク質の植物相同体である、ＲＢＲタンパク質は、シュート幹細胞ニッチと根幹細胞ニッチの両方において重要な役割をもつ。動物においてのように、ＲＢＲは、Ｅ２Ｆ転写因子相同体と相互作用することにより、細胞周期進行を阻害する。さらに、ＲＢＲのレベルの低下は、結果として、幹細胞数の増加を生じ、ＲＢＲレベルの増加は、幹細胞分化をもたらし、そのことは、幹細胞維持におけるＲＢＲの顕著な役割を示している（Ｈｅｉｄｓｔｒａ及びＳａｂａｔｉｎｉ、２０１４）。
【００７１】
加えて又は或いは、方法は、少なくともＷＯＵＮＤ  ＩＮＤＵＣＥＤ  ＤＥＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ  １（創傷誘導性脱分化１）（ＷＩＮＤ１）の発現を導入し又は増加させるステップを含む。ＷＩＮＤ１、ＡＴＷＩＮＤ１、ＲＡＰ２．４、ＲＥＬＡＴＥＤ  ＴＯ  ＡＰ２  ４、及びＷＯＵＮＤ  ＩＮＤＵＣＥＤ  ＤＥＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ  １という用語は、本明細書で交換可能に用いられ得る。好ましくは、ＷＩＮＤ１タンパク質の発現は、一過性に導入又は増加される。ＷＩＮＤ１タンパク質は、植物における創傷誘導性細胞リプログラミングの中心的な制御因子である。ＷＩＮＤ１が、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）においてＥＳＲ１遺伝子の発現を上方制御することにより、カルス形成及びシュート再生を促進することが以前に実証されている（Ｉｗａｓｅら、２０１７）。
【００７２】
一実施形態において、本発明は、植物細胞を再生し、好ましくは、植物細胞からシュートを再生するための方法に関し、前記方法が、少なくとも本明細書の上記で詳述されたタンパク質の組合せ、例えば、以下のタンパク質組合せの１つの発現を植物細胞において増加させるステップを含む：
ＳＨＲタンパク質及びＳＣＲタンパク質；
ＳＨＲタンパク質及びＷＯＸ５タンパク質；
ＳＨＲタンパク質及び少なくとも１つ又は複数のＰＬＴタンパク質；
ＳＨＲタンパク質及びＷＩＮＤ１タンパク質；
ＳＣＲタンパク質及びＷＯＸ５タンパク質；
ＳＣＲタンパク質及び少なくとも１つ又は複数のＰＬＴタンパク質；
ＳＣＲタンパク質及びＷＩＮＤ１タンパク質；
ＷＯＸ５タンパク質及び少なくとも１つ又は複数のＰＬＴタンパク質；
ＷＯＸ５タンパク質及びＷＩＮＤ１タンパク質；
１つ又は複数のＰＬＴタンパク質及びＷＩＮＤ１タンパク質；
ＳＨＲタンパク質、ＳＣＲタンパク質、及びＷＯＸ５タンパク質；
ＳＨＲタンパク質、ＳＣＲタンパク質、及び少なくとも１つ又は複数のＰＬＴタンパク質；
ＳＨＲタンパク質、ＳＣＲタンパク質、及びＷＩＮＤ１タンパク質；
ＳＨＲタンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、及び少なくとも１つ又は複数のＰＬＴタンパク質；
ＳＨＲタンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、及びＷＩＮＤ１タンパク質；
ＳＣＲタンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、及び少なくとも１つ又は複数のＰＬＴタンパク質；
ＳＣＲタンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、及びＷＩＮＤ１タンパク質；
ＷＯＸ５、少なくとも１つ又は複数のＰＬＴタンパク質、及びＷＩＮＤ１タンパク質；
ＳＨＲタンパク質、ＳＣＲタンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、及び少なくとも１つ又は複数のＰＬＴタンパク質；
ＳＨＲタンパク質、ＳＣＲタンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、及びＷＩＮＤ１タンパク質；
ＳＨＲタンパク質、ＳＣＲタンパク質、少なくとも１つ又は複数のＰＬＴタンパク質、及びＷＩＮＤ１タンパク質
ＳＨＲタンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、少なくとも１つ又は複数のＰＬＴタンパク質、及びＷＩＮＤ１タンパク質；
ＳＣＲタンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、少なくとも１つ又は複数のＰＬＴタンパク質、及びＷＩＮＤ１タンパク質；並びに
ＳＨＲタンパク質、ＳＣＲタンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、少なくとも１つ又は複数のＰＬＴタンパク質、及びＷＩＮＤ１タンパク質。
【００７３】
好ましくは、上記で列挙されたタンパク質の発現は、植物細胞において一過性に導入又は増加される。
【００７４】
好ましくは、１つ又は複数のＰＬＴタンパク質は、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択され、好ましくは、選択されたＰＬＴタンパク質は、ＰＬＴ１、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５のうちの少なくとも１つ又は複数を含む。好ましくは、１つ又は複数のＰＬＴタンパク質は、ＰＬＴ１又は少なくともＰＬＴ１である。好ましくは、ＰＬＴタンパク質は、ＰＬＴ１、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５である。
【００７５】
上記で列挙されたこれらの組合せのそれぞれに加えて、内因性ＲＢＲタンパク質の発現が、植物細胞において減少され得る。好ましくは、ＲＢＲタンパク質の発現は一過性に減少される。
【００７６】
特に好ましい実施形態において、本発明は、植物細胞を再生し、好ましくは、植物細胞からシュートを再生するための方法に関し、前記方法が、以下のタンパク質組合せの少なくとも１つの発現を植物細胞において変化させるステップを含む：
ＷＯＸ５タンパク質及びＰＬＴ１タンパク質の発現を増加させるステップ
ＷＩＮＤ１タンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、及びＰＬＴ１タンパク質の発現を増加させるステップ；
ＳＨＲタンパク質、ＳＣＲタンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、ＰＬＴ１タンパク質、ＰＬＴ４タンパク質、及びＰＬＴ５タンパク質の発現を増加させるステップ；並びに
ＷＩＮＤ１タンパク質，ＳＨＲタンパク質、ＳＣＲタンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、ＰＬＴ１タンパク質、ＰＬＴ４タンパク質、及びＰＬＴ５タンパク質の発現を増加させ、かつＲＢＲタンパク質を下方制御し、好ましくはＲＢＲタンパク質を一過性に下方制御するステップ。
【００７７】
好ましくは、上記で列挙されたタンパク質の発現の導入又は増加は、植物細胞において、一過性に導入又は増加される。
【００７８】
ある実施形態において、方法は、植物細胞が、好ましくはシュートに再生するのを可能にするステップを含む。
【００７９】
ある実施形態において、タンパク質組合せにおけるタンパク質は、異なるファミリーに由来し、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの異なるファミリーに由来する。第１のファミリーはＲＢＲを含み、第２のファミリーはＷＩＮＤ１を含み、第３のファミリーはＳＨＲを含み、第４のファミリーはＳＣＲを含み、第５のファミリーはＷＯＸ５を含み、第６のファミリーはＰＬＴタンパク質を含み、特に、第６のファミリーはＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７を含む。当業者は、他のファミリーメンバーが、本発明の方法において等しく適し得ることを理解している。
【００８０】
ある実施形態において、本発明は、以下のステップを含む、植物細胞を再生し、好ましくは、植物細胞からシュートを再生するための方法に関する：
ａ１）ＷＯＸ５タンパク質及び少なくとも１つのＰＬＴタンパク質の発現を植物細胞に導入し又は増加させるステップ。好ましくは、前記少なくとも１つのＰＬＴタンパク質は、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択される。好ましくは、前記少なくとも１つのＰＬＴタンパク質はＰＬＴ１である。好ましくは、前記ＷＯＸ５タンパク質及び前記少なくとも１つのＰＬＴタンパク質のうちの、少なくとも１つの発現が、一過性に導入又は増加される。
ａ２）任意選択で、内因性ＲＢＲタンパク質の発現を植物細胞において減少させるステップであって、好ましくは、前記ＲＢＲタンパク質の発現が一過性に減少される、ステップ；並びに
ｂ）前記植物細胞が、好ましくはシュートに再生することを可能にするステップ。
【００８１】
ある実施形態において、本発明は、以下のステップを含む、植物細胞を再生し、好ましくは、植物細胞からシュートを再生するための方法に関する：
ａ１）ＷＯＸ５タンパク質、少なくとも１つのＰＬＴタンパク質、及びＷＩＮＤ１の発現を植物細胞に導入し又は増加させるステップ。好ましくは、前記少なくとも１つのＰＬＴタンパク質は、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択される。好ましくは、前記少なくとも１つのＰＬＴタンパク質はＰＬＴ１である。好ましくは、前記ＷＯＸ５タンパク質、前記ＷＩＮＤ１タンパク質、及び前記少なくとも１つのＰＬＴタンパク質のうちの、少なくとも１つの発現が一過性に導入又は増加される。
ａ２）任意選択で、内因性ＲＢＲタンパク質の発現を植物細胞において減少させるステップであって、好ましくは、前記ＲＢＲタンパク質の発現が一過性に減少される、ステップ；並びに
ｂ）前記植物細胞が、好ましくはシュートに再生することを可能にするステップ。
【００８２】
ある実施形態において、本発明は、以下のステップを含む、植物細胞を再生し、好ましくは、植物細胞からシュートを再生するための方法に関する：
ａ１）ＳＨＲタンパク質、ＳＣＲタンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、及び少なくとも１つのＰＬＴタンパク質の発現を植物細胞に導入し又は増加させるステップ。好ましくは、前記少なくとも１つのＰＬＴタンパク質は、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択される。好ましくは、前記ＳＨＲタンパク質、前記ＳＣＲタンパク質、前記ＷＯＸ５タンパク質、及び前記少なくとも１つのＰＬＴタンパク質のうちの、少なくとも１つの発現が一過性に導入又は増加される。
ａ２）任意選択で、内因性ＲＢＲタンパク質の発現を植物細胞において減少させるステップであって、好ましくは、前記ＲＢＲタンパク質の発現が一過性に減少される、ステップ；並びに
ｂ）前記植物細胞が、好ましくはシュートに再生することを可能にするステップ。
【００８３】
さらなる実施形態において、本発明は、以下のステップを含む、植物細胞を再生し、好ましくは、植物細胞からシュートを再生するための方法に関する：
ａ１）ＳＨＲタンパク質、ＳＣＲタンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、及び少なくとも２つのＰＬＴタンパク質の発現を植物細胞に導入し又は増加させるステップ。好ましくは、前記少なくとも２つのＰＬＴタンパク質は、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択される。好ましくは、前記ＳＨＲタンパク質、前記ＳＣＲタンパク質、前記ＷＯＸ５タンパク質、及び前記２つのＰＬＴタンパク質の少なくとも１つ又は両方のＰＬＴタンパク質のうちの、少なくとも１つの発現が一過性に導入又は増加される。
ａ２）任意選択で、内因性ＲＢＲタンパク質の発現を植物細胞において減少させるステップであって、好ましくは、前記ＲＢＲタンパク質の発現が一過性に減少される、ステップ；並びに
ｂ）前記植物細胞が、好ましくはシュートに再生することを可能にするステップ。
【００８４】
別の実施形態において、本発明は、以下のステップを含む、植物細胞を再生し、好ましくは、植物細胞からシュートを再生するための方法に関する：
ａ１）ＳＨＲタンパク質、ＳＣＲタンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、及び少なくとも３つのＰＬＴタンパク質の発現を植物細胞に導入し又は増加させるステップ。好ましくは、前記少なくとも３つのＰＬＴタンパク質は、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択される。好ましくは、前記少なくとも３つの選択されたＰＬＴタンパク質は、ＰＬＴ１、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５のうちの少なくとも１つ又は複数を含む。好ましくは、前記少なくとも３つの選択されたＰＬＴタンパク質は、ＰＬＴ１、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５である。好ましくは、前記ＳＨＲタンパク質、前記ＳＣＲタンパク質、前記ＷＯＸ５タンパク質、並びにＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択されたＰＬＴタンパク質の少なくとも１つのうちの、少なくとも１つの発現が一過性に導入又は増加される。好ましくは、前記ＳＨＲタンパク質、前記ＳＣＲタンパク質、前記ＷＯＸ５タンパク質、前記ＰＬＴ１タンパク質、ＰＬＴ４タンパク質、及びＰＬＴ５タンパク質のうちの、少なくとも１つの発現が一過性に導入又は増加される。
ａ２）任意選択で、内因性ＲＢＲタンパク質の発現を植物細胞において減少させるステップであって、好ましくは、前記ＲＢＲタンパク質の発現が一過性に減少される、ステップ；並びに
ｂ）前記植物細胞が、好ましくはシュートに再生することを可能にするステップ。
【００８５】
別の実施形態において、本発明は、以下のステップを含む、植物細胞を再生し、好ましくは、植物細胞からシュートを再生するための方法に関する：
ａ１）ＳＨＲタンパク質、ＳＣＲタンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、ＷＩＮＤ１タンパク質、及び少なくとも３つのＰＬＴタンパク質の発現を植物細胞に導入し又は増加させるステップ。好ましくは、前記少なくとも３つのＰＬＴタンパク質は、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択される。好ましくは、前記少なくとも３つの選択されたＰＬＴタンパク質は、ＰＬＴ１、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５のうちの少なくとも１つ又は複数を含む。好ましくは、前記少なくとも３つの選択されたＰＬＴタンパク質は、ＰＬＴ１、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５である。好ましくは、前記ＳＨＲタンパク質、前記ＳＣＲタンパク質、前記ＷＯＸ５タンパク質、前記ＷＩＮＤ１タンパク質、並びにＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択されたＰＬＴタンパク質の少なくとも１つのうちの、少なくとも１つの発現が一過性に導入又は増加される。好ましくは、前記ＳＨＲタンパク質、前記ＳＣＲタンパク質、前記ＷＯＸ５タンパク質、前記ＷＩＮＤ１、前記ＰＬＴ１タンパク質、ＰＬＴ４タンパク質、及びＰＬＴ５タンパク質のうちの、少なくとも１つの発現が一過性に導入又は増加される。
ａ２）任意選択で、内因性ＲＢＲタンパク質の発現を植物細胞において減少させるステップであって、好ましくは、前記ＲＢＲタンパク質の発現が一過性に減少される、ステップ；並びに
ｂ）前記植物細胞が、好ましくはシュートに再生することを可能にするステップ。
【００８６】
本発明の方法に用いられるタンパク質
本発明に用いられるタンパク質組合せは、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＷＯＸ５、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、ＰＬＴ７、ＲＢＲ、及びＷＩＮＤ１のうちの少なくとも１つを含む。好ましくは、本方法に用いられるタンパク質組合せは、少なくともＷＯＸ５、並びにＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択されたＰＬＴタンパク質を含む。
【００８７】
特に好ましい、タンパク質組合せは、少なくとも又は最大でも以下を含む：
ＷＯＸ５タンパク質及びＰＬＴ１タンパク質
ＷＩＮＤ１タンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、及びＰＬＴ１タンパク質；
ＳＨＲタンパク質、ＳＣＲタンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、ＰＬＴ１、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５タンパク質；並びに
ＷＩＮＤ１タンパク質、ＳＨＲタンパク質、ＳＣＲタンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、ＰＬＴ１、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５タンパク質、並びにＲＢＲタンパク質。
【００８８】
好ましくは、前記タンパク質組合せのタンパク質は、ＲＢＲを除いて、発現の誘導又は増加を有する。好ましくは、ＲＢＲタンパク質は発現の減少を有する。
【００８９】
ＳＨＲタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有し得る。配列番号１は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＳＨＲタンパク質である（本明細書に用いられた全ての配列番号の概要について表５参照）。一実施形態において、ＳＨＲアミノ酸配列は、ＡＴ４Ｇ３７６５０、その相同体、又はＡＴ４Ｇ３７６５０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列であり、又はそれに由来する。
【００９０】
ＳＣＲタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有し得る。配列番号２は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＳＣＲタンパク質である。一実施形態において、ＳＣＲアミノ酸配列は、ＡＴ３Ｇ５４２２０、その相同体、又はＡＴ３Ｇ５４２２０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列であり、又はそれに由来する。
【００９１】
ＷＯＸ５タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有し得る。配列番号３は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＷＯＸ５タンパク質である。一実施形態において、ＷＯＸ５アミノ酸配列は、ＡＴ３Ｇ１１２６０、その相同体、又はＡＴ３Ｇ１１２６０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列であり、又はそれに由来する。
【００９２】
ＰＬＴ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有し得る。配列番号４は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＰＬＴ１タンパク質である。一実施形態において、ＰＬＴ１アミノ酸配列は、ＡＴ３Ｇ２０８４０、その相同体、又はＡＴ３Ｇ２０８４０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列であり、又はそれに由来する。
【００９３】
ＰＬＴ２タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有し得る。配列番号５は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＰＬＴ２タンパク質である。一実施形態において、ＰＬＴ２アミノ酸配列は、ＡＴ１Ｇ５１１９０、その相同体、又はＡＴ１Ｇ５１１９０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列であり、又はそれに由来する。
【００９４】
ＰＬＴ３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有し得る。配列番号６は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＰＬＴ３タンパク質である。一実施形態において、ＰＬＴ３アミノ酸配列は、ＡＴ５Ｇ１０５１０、その相同体、又はＡＴ５Ｇ１０５１０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列であり、又はそれに由来する。
【００９５】
ＰＬＴ４タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号７と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有し得る。配列番号７は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＰＬＴ４タンパク質である。一実施形態において、ＰＬＴ４アミノ酸配列は、ＡＴ５Ｇ１７４３０、その相同体、又はＡＴ５Ｇ１７４３０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列であり、又はそれに由来する。
【００９６】
ＰＬＴ５タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号８と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有し得る。配列番号８は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＰＬＴ５タンパク質である。一実施形態において、ＰＬＴ５アミノ酸配列は、ＡＴ５Ｇ５７３９０、その相同体、又はＡＴ５Ｇ５７３９０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列であり、又はそれに由来する。
【００９７】
ＰＬＴ７タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３０と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有し得る。配列番号３０は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＰＬＴ７タンパク質である。一実施形態において、ＰＬＴ７アミノ酸配列は、ＡＴ５Ｇ６５５１０、その相同体、又はＡＴ５Ｇ６５５１０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列であり、又はそれに由来する。
【００９８】
ＷＩＮＤ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２８と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有し得る。配列番号２８は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＷＩＮＤ１タンパク質である。一実施形態において、ＷＩＮＤ１アミノ酸配列は、ＡＴ１Ｇ７８０８０、その相同体、又はＡＴ１Ｇ７８０８０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列であり、又はそれに由来する。
【００９９】
ＲＢＲタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１７と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有し得る。配列番号１７は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＲＢＲタンパク質である。一実施形態において、ＲＢＲアミノ酸配列は、ＡＴ３Ｇ１２２８０、その相同体、又はＡＴ３Ｇ１２２８０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列であり、又はそれに由来する。
【０１００】
本明細書に定義されているようなタンパク質は、タグ、例えば、非限定的に、Ｔ７タグ（例えば、配列番号５３と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するＴ７タグ）、Ｍｙｃタグ（例えば、配列番号４３と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を有するＭｙｃタグ）、ＦＬＡＧタグ（例えば、配列番号４６と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を有するＦＬＡＧタグ）、Ｖ５タグ（例えば、配列番号５０と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するＶ５タグ）、又はＨｉｓタグをさらに含み得る。好ましくは、タグは、本来の停止コドンの前で、前記タンパク質のＣ末端に位置する。
【０１０１】
本発明の方法に用いられる核酸
一実施形態において、ＳＨＲタンパク質は、配列番号９と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。ＳＨＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、遺伝子ＡＴ４Ｇ３７６５０、その相同体、又はＡＴ４Ｇ３７６５０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列であり得、又はそれに由来し得る。パーセンテージ同一性は、ゲノム配列の完全長に渡って決定することができる。或いは、パーセンテージ同一性は、その遺伝子のコード配列の完全長に渡って決定することができる。
【０１０２】
相同体の例には、セイヨウヤマカモジ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）（ミナトカモジグサ（Ｐｕｒｐｌｅ  ｆａｌｓｅ  ｂｒｏｍｅ））（ＢＲＡＤＩ１Ｇ２３０６０）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（ダイズ）（ＧＬＹＭＡ０１Ｇ４０１８０、ＧＬＹＭＡ０５Ｇ２２４６０、ＧＬＹＭＡ１１Ｇ０５１１０、ＧＬＹＭＡ１１Ｇ２３６９０、又はＧＬＹＭＡ１７Ｇ１７４００）、モチイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（イネ）（ＳＨＲ１及びＳＨＲ２）、ニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）（コケ）（ＰＨＹＰＡＤＲＡＦＴ＿１４９１１及びＰＨＹＰＡＤＲＡＦＴ＿２２６３３）、コットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）（ブラックコットンウッド）（ＰＯＰＴＲ＿００１２Ｓ０６４３０Ｇ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）（トマト）（ＳＯＬＹＣ０２Ｇ０９２３７０．１）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）（ソルガム）（ＳＢ０１Ｇ０３１７２０及びＳＢ０２Ｇ０３７８９０）、及びヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）（ブドウ）ＶＩＴ＿０７Ｓ０１２９Ｇ０００３０が挙げられる。
【０１０３】
一実施形態において、ＳＣＲタンパク質は、配列番号１０と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。ＳＣＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、遺伝子ＡＴ３Ｇ５４２２０、その相同体、又はＡＴ３Ｇ５４２２０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列であり得、又はそれに由来し得る。パーセンテージ同一性は、ゲノム配列の完全長に渡って決定することができる。或いは、パーセンテージ同一性は、その遺伝子のコード配列の完全長に渡って決定することができる。
【０１０４】
相同体の例には、セイヨウヤマカモジ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）（ミナトカモジグサ）（ＢＲＡＤＩ４Ｇ４４０９０）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（ダイズ）（ＧＬＹＭＡ０９Ｇ４０６２０及びＧＬＹＭＡ１８Ｇ４５２２０）、モチイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（イネ）（ＳＣＲ１及びＳＣＲ２）、ニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）（コケ）（ＰＨＹＰＡＤＲＡＦＴ＿１５０９１０、ＰＨＹＰＡＤＲＡＦＴ＿２２２７３、ＰＨＹＰＡＤＲＡＦＴ＿４２００８、及びＰＨＹＰＡＤＲＡＦＴ＿６５４８０）、コットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）（ブラックコットンウッド）（ＰＯＰＴＲ＿０００６Ｓ１１５００Ｇ及びＰＯＰＴＲ＿００１６Ｓ１５０６０Ｇ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）（トマト）ＳＯＬＹＣ１０Ｇ０７４６８０．１、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）（ソルガム）ＳＢ０５Ｇ００１５００、及びヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）（ブドウ）ＶＩＴ＿０８Ｓ００５６Ｇ０００５０が挙げられる。
【０１０５】
一実施形態において、ＷＯＸ５タンパク質は、配列番号１１と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。ＷＯＸ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、遺伝子ＡＴ３Ｇ１１２６０、その相同体、又はＡＴ３Ｇ１１２６０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列であり得、又はそれに由来し得る。パーセンテージ同一性は、ゲノム配列の完全長に渡って決定することができる。或いは、パーセンテージ同一性は、その遺伝子のコード配列の完全長に渡って決定することができる。
【０１０６】
相同体の例には、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（シロイヌナズナ）（ＡＴ５Ｇ０５７７０．１）、セイヨウヤマカモジ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）（ミナトカモジグサ）（ＢＲＡＤＩ２Ｇ５５２７０）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（ダイズ）（ＧＬＹＭＡ０２Ｇ４２２００）、モチイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（イネ）（ＷＯＸ９）、コットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）（ブラックコットンウッド）（ＰＯＰＴＲ＿０００８Ｓ０６５６０Ｇ及びＰＯＰＴＲ＿００１０Ｓ１９９５０Ｇ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）（トマト）（ＳＯＬＹＣ０３Ｇ０９６３００．２）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）（ソルガム）（ＳＢ０３Ｇ０４０２１０）、及びヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）（ブドウ）（ＶＩＴ＿１３Ｓ００１９Ｇ０３４６０）が挙げられる。
【０１０７】
一実施形態において、ＰＬＴ１タンパク質は、配列番号１２と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。ＰＬＴ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、遺伝子ＡＴ３Ｇ２０８４０、その相同体、又はＡＴ３Ｇ２０８４０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列であり得、又はそれに由来し得る。パーセンテージ同一性は、ゲノム配列の完全長に渡って決定することができる。或いは、パーセンテージ同一性は、その遺伝子のコード配列の完全長に渡って決定することができる。
【０１０８】
相同体の例には、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（シロイヌナズナ）（ＡＴ１Ｇ５１１９０．１）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（ダイズ）（ＧＬＹＭＡ１１Ｇ１４０４０及びＧＬＹＭＡ１２Ｇ０６０１０）、コットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）（ブラックコットンウッド）（ＰＯＰＴＲ＿０００１Ｓ０５５８０Ｇ及びＰＯＰＴＲ＿０００３Ｓ２０４７０Ｇ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）（トマト）（ＳＯＬＹＣ１１Ｇ０６１７５０．１）、及びヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）（ブドウ）（ＶＩＴ＿０６Ｓ０００４Ｇ０１８００）が挙げられる。
【０１０９】
一実施形態において、ＰＬＴ２タンパク質は、配列番号１３と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。ＰＬＴ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、遺伝子ＡＴ１Ｇ５１１９０、その相同体、又はＡＴ１Ｇ５１１９０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列であり得、又はそれに由来し得る。パーセンテージ同一性は、ゲノム配列の完全長に渡って決定することができる。或いは、パーセンテージ同一性は、その遺伝子のコード配列の完全長に渡って決定することができる。
【０１１０】
相同体の例には、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（シロイヌナズナ）（ＡＴ３Ｇ２０８４０．１）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（ダイズ）（ＧＬＹＭＡ１１Ｇ１４０４０及びＧＬＹＭＡ１２Ｇ０６０１０）、コットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）（ブラックコットンウッド）（ＰＯＰＴＲ＿０００１Ｓ０５５８０Ｇ及びＰＯＰＴＲ＿０００３Ｓ２０４７０Ｇ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）（トマトＳＯＬＹＣ１１Ｇ０６１７５０．１）、及びヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）（ブドウ）（ＶＩＴ＿０６Ｓ０００４Ｇ０１８００）が挙げられる。
【０１１１】
一実施形態において、ＰＬＴ３タンパク質は、配列番号１４と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。ＰＬＴ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、遺伝子ＡＴ５Ｇ１０５１０、その相同体、又はＡＴ５Ｇ１０５１０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列であり得、又はそれに由来し得る。パーセンテージ同一性は、ゲノム配列の完全長に渡って決定することができる。或いは、パーセンテージ同一性は、その遺伝子のコード配列の完全長に渡って決定することができる。
【０１１２】
一実施形態において、ＰＬＴ４タンパク質は、配列番号１５と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。ＰＬＴ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、遺伝子ＡＴ５Ｇ１７４３０、その相同体、又はＡＴ５Ｇ１７４３０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列であり得、又はそれに由来し得る。パーセンテージ同一性は、ゲノム配列の完全長に渡って決定することができる。或いは、パーセンテージ同一性は、その遺伝子のコード配列の完全長に渡って決定することができる。
【０１１３】
相同体の例には、セイヨウヤマカモジ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）（ミナトカモジグサ）（ＢＲＡＤＩ３Ｇ４８６９７及びＢＲＡＤＩ５Ｇ１４９６０）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（ダイズ）（ＧＬＹＭＡ０９Ｇ３８３７０及びＧＬＹＭＡ１０Ｇ３１４４０）、モチイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（イネ）（ＯＳＪＮＢＢ０１１６Ｋ０７．８）、コットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）（ブラックコットンウッド）（ＰＯＰＴＲ＿０００８Ｓ０７６１０Ｇ及びＰＯＰＴＲ＿００１０Ｓ１８８４０Ｇ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）（トマト）（ＳＯＬＹＣ１１Ｇ００８５６０．１）、及びモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）（ソルガム）（ＳＢ０４Ｇ０２５９６０）が挙げられる。
【０１１４】
一実施形態において、ＰＬＴ５タンパク質は、配列番号１６と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。ＰＬＴ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、遺伝子ＡＴ５Ｇ５７３９０、その相同体、又はＡＴ５Ｇ５７３９０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列であり得、又はそれに由来し得る。パーセンテージ同一性は、ゲノム配列の完全長に渡って決定することができる。或いは、パーセンテージ同一性は、その遺伝子のコード配列の完全長に渡って決定することができる。
【０１１５】
相同体の例には、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（シロイヌナズナ）（ＡＴ４Ｇ３７７５０．１）、セイヨウヤマカモジ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）（ミナトカモジグサ）（ＢＲＡＤＩ１Ｇ０７２９０）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（ダイズ）（ＧＬＹＭＡ００４１Ｓ５０、ＧＬＹＭＡ０１Ｇ４０３８０、ＧＬＹＭＡ０２Ｇ３１０３５、ＧＬＹＭＡ０５Ｇ２２９７０、ＧＬＹＭＡ０６Ｇ０５１７０、ＧＬＹＭＡ１１Ｇ０４９１０、ＧＬＹＭＡ１４Ｇ１０１３０、及びＧＬＹＭＡ１７Ｇ１７０１０）、モチイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（イネ）（ＯＳＪＮＢＡ００７２Ｆ１３．９）、ニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）（コケ）（ＰＨＹＰＡＤＲＡＦＴ＿１２７６７３、ＰＨＹＰＡＤＲＡＦＴ＿１２７６８８、ＰＨＹＰＡＤＲＡＦＴ＿１３６７２４、及びＰＨＹＰＡＤＲＡＦＴ＿１８９３３６）、コットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）（ブラックコットンウッド）（ＰＯＰＴＲ＿０００２Ｓ１１５５０Ｇ、ＰＯＰＴＲ＿０００５Ｓ１９２２０Ｇ、ＰＯＰＴＲ＿０００７Ｓ１４６９０Ｇ、及びＰＯＰＴＲ＿００１４Ｓ０１２６０Ｇ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）（トマト）（ＳＯＬＹＣ０２Ｇ０９２０５０．２、ＳＯＬＹＣ０３Ｇ１２３４３０．２、及びＳＯＬＹＣ０４Ｇ０７７４９０．２）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）（ソルガム）（ＳＢ０１Ｇ００６８３０）、及びヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）（ブドウ）（ＶＩＴ＿０７Ｓ０１５１Ｇ００４４０及びＶＩＴ＿１８Ｓ０００１Ｇ０８６１０）が挙げられる。
【０１１６】
一実施形態において、ＰＬＴ７タンパク質は、配列番号１９と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。ＰＬＴ７タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、遺伝子ＡＴ５Ｇ６５５１０、その相同体、又はＡＴ５Ｇ６５５１０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列であり得、又はそれに由来し得る。パーセンテージ同一性は、ゲノム配列の完全長に渡って決定することができる。或いは、パーセンテージ同一性は、その遺伝子のコード配列の完全長に渡って決定することができる。
【０１１７】
相同体の例には、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（シロイヌナズナ）（ＡＴ５Ｇ１０５１０．２）、セイヨウヤマカモジ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）（ミナトカモジグサ）（ＢＲＡＤＩ１Ｇ３１３３７）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（ダイズ）（ＧＬＹＭＡ０１Ｇ０２７６０、ＧＬＹＭＡ０８Ｇ３８１９０、ＧＬＹＭＡ０９Ｇ３３２４１、及びＧＬＹＭＡ１８Ｇ２９４００）、モチイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（イネ）（Ｐ０６７７Ｂ１０．１５）、コットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）（ブラックコットンウッド）（ＰＯＰＴＲ＿０００７Ｓ１４２１０Ｇ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）（トマト）（ＳＯＬＹＣ０５Ｇ０５１３８０．２及びＳＯＬＹＣ１１Ｇ０１０７１０．１）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）（ソルガム）（ＳＢ１０Ｇ０２６１５０）、及びヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）（ブドウ）（ＶＩＴ＿００Ｓ０７７２Ｇ０００２０及びＶＩＴ＿００Ｓ１２９１Ｇ０００１０）が挙げられる。
【０１１８】
一実施形態において、ＷＩＮＤ１タンパク質は、配列番号２９と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。ＷＩＮＤ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、遺伝子ＡＴ１Ｇ７８０８０、その相同体、又はＡＴ１Ｇ７８０８０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列であり得、又はそれに由来し得る。パーセンテージ同一性は、ゲノム配列の完全長に渡って決定することができる。或いは、パーセンテージ同一性は、その遺伝子のコード配列の完全長に渡って決定することができる。
【０１１９】
相同体の例には、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（シロイヌナズナ）（ＡＴ１Ｇ２２１９０．１、ＡＴ１Ｇ３６０６０．１、ＡＴ１Ｇ６４３８０．１、ＡＴ２Ｇ２０８８０．１、ＡＴ２Ｇ２２２００．１、ＡＴ４Ｇ１３６２０．１、ＡＴ４Ｇ２８１４０．１、ＡＴ４Ｇ３９７８０．１、及びＡＴ５Ｇ６５１３０．１）、セイヨウヤマカモジ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）（ミナトカモジグサ）（ＢＲＡＤＩ１Ｇ４５４７０）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（ダイズ）（ＧＬＹＭＡ０１Ｇ４３４５０、ＧＬＹＭＡ０５Ｇ３１３７０、ＧＬＹＭＡ０６Ｇ４５０１０、ＧＬＹＭＡ０８Ｇ１４６００、ＧＬＹＭＡ１０Ｇ３３７００、ＧＬＹＭＡ１１Ｇ０２０５０、ＧＬＹＭＡ１２Ｇ１２２７０、ＧＬＹＭＡ１２Ｇ３３０２０、ＧＬＹＭＡ１３Ｇ０１９３０、ＧＬＹＭＡ１３Ｇ３７４５１、ＧＬＹＭＡ１４Ｇ３４５９０、ＧＬＹＭＡ１８Ｇ０２１７０、及びＧＬＹＭＡ２０Ｇ３３８９０）、モチイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（イネ）（ＯＳ０６Ｇ０２２２４００及びＰ０５１６Ａ０４．３１）、ニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）（コケ）（ＰＨＹＰＡＤＲＡＦＴ＿１４２１１２及びＰＨＹＰＡＤＲＡＦＴ＿１５１３６７）、コットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）（ブラックコットンウッド）（ＰＯＰＴＲ＿０００１Ｓ１０５４０Ｇ、ＰＯＰＴＲ＿０００１Ｓ３２２５０Ｇ、ＰＯＰＴＲ＿０００２Ｓ０９４８０Ｇ、ＰＯＰＴＲ＿０００３Ｓ１３９１０Ｇ、ＰＯＰＴＲ＿０００５Ｓ０７９００Ｇ、ＰＯＰＴＲ＿０００５Ｓ１６６９０Ｇ、ＰＯＰＴＲ＿０００７Ｓ０５６９０Ｇ、ＰＯＰＴＲ＿００１３Ｓ１３９２０Ｇ、ＰＯＰＴＲ＿００１７Ｓ０８２５０Ｇ、及びＰＯＰＴＲ＿００１９Ｓ１３３３０Ｇ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）（トマト）（ＤＲＥＢ３、ＳＯＬＹＣ０４Ｇ０５４９１０．２、ＳＯＬＹＣ０７Ｇ０５４２２０．１、ＳＯＬＹＣ０８Ｇ０８２２１０．２、ＳＯＬＹＣ０９Ｇ０９１９５０．１、ＳＯＬＹＣ１２Ｇ０１３６６０．１、及びＳＯＬＹＣ１２Ｇ０５６９８０．１）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）（ソルガム）（ＳＢ０１Ｇ０４４４１０、ＳＢ０２Ｇ０２３２３０、ＳＢ０７Ｇ０２００９０、ＳＢ０８Ｇ００７４１１、及びＳＢ１０Ｇ００７７８０）、及びヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）（ブドウ）（ＶＩＴ＿００Ｓ０６６２Ｇ０００３０、ＶＩＴ＿００Ｓ０６６２Ｇ０００４０、ＶＩＴ＿０２Ｓ００２５Ｇ０１３６０、ＶＩＴ＿０５Ｓ００２９Ｇ００１４０、ＶＩＴ＿１２Ｓ００５９Ｇ００２８０、ＶＩＴ＿１８Ｓ０００１Ｇ０５２５０、及びＶＩＴ＿１９Ｓ００１４Ｇ０３１８０）が挙げられる。
【０１２０】
ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＷＯＸ５、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、ＰＬＴ７、又はＷＩＮＤ１タンパク質をコードする配列は、好ましくは、植物細胞における発現のためにコドン最適化され、好ましくは、本発明の方法の植物細胞における発現のためにコドン最適化され、好ましくは、本発明の方法に用いられる植物細胞の種についてコドン最適化される。非限定的例として、本明細書に定義されているような、過剰発現した、又は新規に発現したタンパク質は内因性タンパク質であり得るが、この内因性タンパク質をコードする配列は、外因性のコドン最適化された配列である。或いは、コドン最適化された配列は、その植物細胞にとって外因性であるタンパク質をコードし得る。
【０１２１】
本発明のある実施形態において、本明細書に定義されているような、発現の増加又は導入を有するタンパク質は機能性タンパク質である。本明細書に定義されているようなＳＨＲは、好ましくは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）における配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能と同じ又は類似した機能を植物細胞において果たしている。本明細書に定義されているようなＳＣＲは、好ましくは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）における配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能と同じ又は類似した機能を植物細胞において果たしている。本明細書に定義されているようなＷＯＸ５は、好ましくは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）における配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能と同じ又は類似した機能を植物細胞において果たしている。本明細書に定義されているようなＰＬＴ１は、好ましくは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）における配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能と同じ又は類似した機能を植物細胞において果たしている。本明細書に定義されているようなＰＬＴ２は、好ましくは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）における配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能と同じ又は類似した機能を植物細胞において果たしている。本明細書に定義されているようなＰＬＴ３は、好ましくは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）における配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能と同じ又は類似した機能を植物細胞において果たしている。本明細書に定義されているようなＰＬＴ４は、好ましくは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）における配列番号７のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能と同じ又は類似した機能を植物細胞において果たしている。本明細書に定義されているようなＰＬＴ５は、好ましくは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）における配列番号８のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能と同じ又は類似した機能を植物細胞において果たしている。本明細書に定義されているようなＰＬＴ７は、好ましくは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）における配列番号３０のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能と同じ又は類似した機能を植物細胞において果たしている。本明細書に定義されているようなＷＩＮＤ１は、好ましくは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）における配列番号２８のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能と同じ又は類似した機能を植物細胞において果たしている。
【０１２２】
一実施形態において、内因性ＲＢＲタンパク質は、配列番号１８と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。ＲＢＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、遺伝子ＡＴ３Ｇ１２２８０、その相同体、又はＡＴ３Ｇ１２２８０若しくはその相同体と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列であり得、又はそれに由来し得る。パーセンテージ同一性は、ゲノム配列の完全長に渡って決定することができる。或いは、パーセンテージ同一性は、その遺伝子のコード配列の完全長に渡って決定することができる。
【０１２３】
相同体の例には、セイヨウヤマカモジ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）（ミナトカモジグサ）（ＢＲＡＤＩ３Ｇ４１６３０）、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）（クラミドモナス）（ＭＡＴ３）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（ダイズ）（ＧＬＹＭＡ０４Ｇ３６７００、ＧＬＹＭＡ１３Ｇ２６１７０、及びＧＬＹＭＡ１５Ｇ３６８９０）、モチイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（イネ）（ＲＢＲ１）、ニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）（コケ）（ＰＨＹＰＡＤＲＡＦＴ＿８８８３３、ＲＢＬ１５０２及びＲＢＲ）、コットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）（ブラックコットンウッド）（ＲＢＬ９０１）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）（トマト）（ＳＯＬＹＣ０９Ｇ０９１２８０．２）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）（ソルガム）（ＳＢ０７Ｇ０２５７６０）、及びヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）（ブドウ）（ＶＩＴ＿０４Ｓ０００８Ｇ０２７８０）が挙げられる。
【０１２４】
本発明のある実施形態において、発現の減少を有するＲＢＲタンパク質は、機能性タンパク質である。したがって、本明細書に定義されているようなＲＢＲは、好ましくは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）における配列番号１７のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能と同じ又は類似した機能を植物細胞において果たしている。
【０１２５】
一実施形態において、当業者は、植物細胞において、好ましくは、本明細書に定義されているような植物細胞のゲノムにおいて、相同性ＲＢＲタンパク質をコードする配列、好ましくはゲノム配列を見出すために、配列番号１７又は配列番号１８と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を用いることができる。その後、この配列は、例えばＲＮＡｉ機構を用いることにより、内因性ＲＢＲタンパク質の発現をターゲットし、かつ下方制御するために用いることができる。
【０１２６】
一過性に増加された（ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＷＯＸ５、ＰＬＴ１−ＰＬ５、ＰＬＴ７、ＷＩＮＤ１）又は減少された（ＲＢＲ）発現
一実施形態において、ＳＨＲタンパク質、ＳＣＲタンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、ＷＩＮＤ１タンパク質のうちの少なくとも１つの発現、並びにＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＰＬＴタンパク質の発現は、一過性に導入又は増加される。任意選択で、加えて、内因性ＲＢＲタンパク質の発現が一過性に減少される。
【０１２７】
一実施形態において、少なくともＷＯＸ５並びにＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択されるＰＬＴタンパク質の発現が、一過性に導入又は増加される。好ましくは、少なくともＷＯＸ５及びＰＬＴ１の発現が一過性に導入又は増加される。ＷＯＸ５及びＰＬＴ１のみの発現が、一過性に導入又は増加され得る。
【０１２８】
一実施形態において、少なくともＷＩＮＤ１、ＷＯＸ５、並びにＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択されるＰＬＴタンパク質の発現が、一過性に導入又は増加される。好ましくは、少なくともＷＩＮＤ１、ＷＯＸ５、及びＰＬＴ１の発現が、一過性に導入又は増加される。ＷＩＮＤ１、ＷＯＸ５、及びＰＬＴ１のみの発現が、一過性に導入又は増加され得る。
【０１２９】
一実施形態において、少なくともＳＨＲ、ＳＣＲ、ＷＯＸ５、並びにＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択される１つ、２つ、又は３つのＰＬＴタンパク質の発現が一過性に導入又は増加される。好ましくは、少なくともＳＨＲ、ＳＣＲ、ＷＯＸ５、ＰＬＴ１、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５の発現が一過性に導入又は増加される。ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＷＯＸ５、ＰＬＴ１、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５のみの発現が一過性に導入又は増加され得る。
【０１３０】
一実施形態において、少なくともＷＩＮＤ１、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＷＯＸ５、並びにＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択される１つ、２つ、又は３つのＰＬＴタンパク質の発現が一過性に導入又は増加される。好ましくは、少なくともＷＩＮＤ１、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＷＯＸ５、ＰＬＴ１、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５の発現が一過性に導入又は増加される。ＷＩＮＤ１、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＷＯＸ５、ＰＬＴ１、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５のみの発現が一過性に導入又は増加され得る。加えて、内因性ＲＢＲタンパク質の発現が一過性に減少される。
【０１３１】
本明細書に定義されているようなタンパク質の発現の増加又は減少は、植物細胞の再生、好ましくはシュート再生を誘導する。本明細書に定義されているようなタンパク質の、一過性の発現導入又は増加、及び任意選択で、一過性の発現減少は、連続的又は同時的であり得る。例えば、本明細書に定義されているようなタンパク質組合せのうちの第１の１つ又は複数のタンパク質、例えば、ＷＩＮＤ１などの一過性発現は、本明細書に定義されているような次の１つ又は複数のタンパク質の一過性発現の前に起こり得る。タンパク質組合せのうちのこれらの次の１つ又は複数のタンパク質の発現増加又は導入は、第１の１つ又は複数のタンパク質の発現増加又は導入中又は後であり得る。
【０１３２】
同様に、本明細書に定義されているようなＲＢＲタンパク質の一過性の発現減少は、本明細書に定義されているような１つ又は複数のタンパク質の一過性の発現導入又は増加の前、中、又は後で起こり得る。同じく、前記１つ又は複数のタンパク質の発現増加又は導入は、ＲＢＲタンパク質の発現減少の前、中、又は後であり得る。
【０１３３】
好ましくは、一時期に、ＷＩＮＤ１、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＷＯＸ５、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択される少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのタンパク質の、植物細胞における同時の発現増加又は導入がある。任意選択で、ＲＢＲタンパク質の発現が、同時に又は同じ期間中に減少される。
【０１３４】
好ましくは、一時期に、ＷＩＮＤ１、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＷＯＸ５、ＰＬＴ１、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５からなる群から選択される少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのタンパク質の、植物細胞における同時の発現増加又は導入がある。
【０１３５】
例えば、一時期に、少なくともＷＯＸ５及びＰＬＴ１の同時の発現増加又は導入、又は少なくともＷＯＸ５、ＰＬＴ１、及びＷＩＮＤ１の同時の発現増加又は導入、又は少なくともＳＨＲ、ＳＣＲ、ＷＯＸ５、ＰＬＴ１、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５の同時の発現増加又は導入、又は少なくともＷＩＮＤ１、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＷＯＸ５、ＰＬＴ１、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５の同時の発現増加又は導入がある。任意選択で、ＲＢＲタンパク質の発現が、同時に又は同じ期間中に減少される。
【０１３６】
或いは又は加えて、本明細書に定義されているような１つ又は複数のタンパク質の発現は、次の１つ又は複数のタンパク質の発現導入又は増加の前に、一過性に導入又は増加され、任意選択で減少される。一実施形態において、本明細書に定義されているようなＳＨＲ、ＳＣＲ、ＷＯＸ５、及び１つ又は複数のＰＬＴタンパク質のうちの、１つ又は複数の発現導入又は増加の前に、ＷＩＮＤ１の発現が一過性に導入又は増加され、任意選択でＲＢＲの発現が一過性に減少される。
【０１３７】
非限定的例として、ＷＩＮＤ１の発現は、少なくともＷＯＸ５及びＰＬＴ１の一過性の発現導入又は増加の前に、一過性に増加又は導入され得る。ＷＩＮＤ１の発現は、少なくともＷＯＸ５、ＰＬＴ１、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５の一過性の発現増加又は導入の前に、一過性に増加又は導入され得る。ＲＢＲタンパク質の発現は、ＷＩＮＤ１の発現増加又は導入と同時に減少され得る。
【０１３８】
ＷＩＮＤ１の発現導入又は増加、及び任意選択で、ＲＢＲ発現減少は、本明細書に定義されているような他のタンパク質のいずれかの発現の前に起こり得る。ＷＩＮＤ１発現レベル、及び任意選択でＲＢＲ発現レベルは、本明細書に定義されているようなタンパク質組合せの他のタンパク質の発現導入又は増加中に変化したままであり得る。或いは、ＷＩＮＤ１、及び任意選択でＲＢＲの発現レベルは、本明細書に定義されているようなタンパク質組合せの他のタンパク質の発現増加又は導入の前に、内因性レベルに戻っている場合がある。
【０１３９】
ＷＩＮＤ１及び任意選択でＲＢＲの発現レベルの変化を導入することと、本明細書に定義されているようなタンパク質の組成物の他のタンパク質の発現レベルの変化を誘導することとの間の期間は、好ましくは、少なくとも約０日間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１２日間、又は少なくとも約１４日間である。
【０１４０】
期間
本明細書に定義されているようなタンパク質が、植物細胞において、（特定のタンパク質について本明細書で特定されているように）発現の増加若しくは導入、又は任意選択で減少を有する期間は、好ましくは、植物細胞の再生を誘導するのに十分長い期間である。しかしながら、変化した発現レベルを維持することは、再生された植物細胞の植物へのさらなる発達を妨害し得る。したがって、好ましい実施形態において、前記の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのタンパク質の発現の変化は、一過性である。本明細書に定義されているようなタンパク質の発現レベルは、内因性レベル、すなわち、発現の増加、導入、又は減少の前のタンパク質レベルに、好ましくはその１つ又は複数のタンパク質が無制御な分裂組織形成を誘導する前に、戻すことができる。タンパク質レベルを内因性レベルに戻すことは、好ましくは、組織分化を惹起する。
【０１４１】
一実施形態において、本明細書に定義されているようなタンパク質組合せが、植物細胞において、発現の増加、導入、又は減少を有する期間は、少なくとも約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２５日間、３０日間、３５日間、４０日間、４５日間、又は少なくとも約５０日間である。前記期間は、少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、又は少なくとも約１０週間であり得る。この期間後、少なくとも１つのタンパク質、好ましくは全タンパク質のタンパク質レベルは、内因性レベルに戻ることができる。したがって、前記期間は、約１００日未満、９５日未満、９０日未満、８５日未満、８０日未満、７５日未満、７０日未満、６５日未満、６０日未満、５５日未満、５０日未満、４５日未満、４０日未満、３５日未満、３０日未満、２５日未満、２０日未満、又は約１５日未満であり得る。前記期間は、約２０週間未満、１５週間未満、１２週間未満、１０週間未満、８週間未満、７週間未満、６週間未満、５週間未満、４週間未満、３週間未満、又は約２週間未満であり得る。本明細書に定義されているような１つ又は複数のタンパク質が、発現の増加又は導入を有する期間は、約０．５〜１０週間、１〜８週間、１〜６週間、１〜４週間、約１〜３週間、又は約２週間であり得る。
【０１４２】
好ましくは、ＷＩＮＤ１、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＷＯＸ５、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５からなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのタンパク質が植物細胞において発現の増加又は導入を有する、本明細書の上記で定義されているのと同じ期間、好ましくは、本明細書に定義されているようなタンパク質組合せのタンパク質のそれぞれが発現の増加又は導入を有する同じ期間において、植物細胞はまた、内因性ＲＢＲタンパク質の発現の減少を有する。
【０１４３】
本明細書に定義されているような１つ又は複数のタンパク質の発現を導入し、増加させ、及び任意選択で減少させる期間は、植物細胞の型及び／又は再生条件に依存し得、適切な期間は、当技術分野において知られた通常の手段を用いて決定することができる。非限定的例として、前記タンパク質の発現は、本明細書に定義されているように、導入又は増加され得、及び任意選択で減少され得、再生中の植物の形態はモニターすることができる。タンパク質レベルは、再生の直前又は直後に、正常又は内因性レベルに戻すことができる。例えば、本明細書に定義されているようなタンパク質組合せのタンパク質の発現の導入又は増加及び任意選択で減少は、再生から、例えば最初のシュートの出現から、約２週間後、４週間後、６週間後、８週間後、若しくは１０週間後、又は約２カ月後、４カ月後、６カ月後、８カ月後、若しくは１０カ月後、内因性レベルに戻すことができる。
【０１４４】
一過性に導入又は増加された発現
ある実施形態において、ＷＯＸ５、ＷＩＮＤ１、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７のうちの少なくとも１つの発現が、植物細胞に導入又は増加される。そのような増加は、内因性タンパク質の発現の増加により（すなわち、機能性タンパク質の発現の増加を生じる、これらのタンパク質をコードする内因性遺伝子−制御配列若しくはコード配列における変異を介して、又はタンパク質機能の増加を生じる、制御配列若しくはコード配列における変異を介して）、又は前記タンパク質配列をコードする構築物のトランスジェニック導入を介してであり得る。導入又は増加された発現は、好ましくは、一過性発現である。したがって、発現は、本明細書の上記で定義されているようなある特定の期間中、導入又は増加され、好ましくは、発現は、ある特定の期間中のみ、導入又は増加される。一過性の発現増加又は導入は、当技術分野において知られた任意の適切な手段を用いて達成することができる。例えば、前に導入された１つ又は複数のタンパク質の発現は、例えば、標的変異誘発又はＲＮＡｉを用いて、ノックアウトすることができる。
【０１４５】
或いは、一過性の発現増加は、本明細書に定義されているようなタンパク質の１つ又は複数の植物細胞への一過性の導入により達成することができる。或いは又は加えて、一過性発現は、１つ又は複数の核酸構築物を植物細胞へ導入することにより達成され、前記核酸構築物が、本明細書に定義されているようなタンパク質の１つ又は複数をコードするコード配列を含み、前記コード配列が、制御エレメント、例えば、構成的又は組織特異的プロモーターと作動可能に連結されている。「構成的」プロモーターは、ほとんどの生理的及び発生的条件下でほとんどの組織において活性があるプロモーターであることが、本明細において理解される。「組織特異的」プロモーターは、特定の型の組織又は細胞においてのみ活性がある。
【０１４６】
或いは又は加えて、本明細書に定義されているような１つ又は複数のタンパク質の一過性発現は、それらの遺伝子発現の一過性活性化により達成される。したがって、ＷＯＸ５、ＷＩＮＤ１、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７タンパク質のうちの少なくとも１つ、好ましくは、本明細書に定義されているようなタンパク質組合せの発現が、それらの発現の一過性活性化により一過性に導入又は増加される。
【０１４７】
発現の一過性活性化は、誘導性プロモーターの制御下に、本明細書に定義されているようなタンパク質をコードする配列の１つ又は複数を置くことにより達成することができる。「誘導性」プロモーターは、生理的に（例えば、ある特定の化合物の外部適用により）又は発生的に調節されるプロモーターとして本明細書に定義される。好ましくは、ＷＯＸ５、ＷＩＮＤ１、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、又はＰＬＴ７タンパク質を、それぞれコードする少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は少なくとも７つの遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下に置かれる。本明細書に定義されているようなタンパク質の発現は、同じ型の誘導性プロモーターにより制御され得る。或いは、異なるタンパク質の発現は、異なる型の誘導性プロモーターにより制御され得る。
【０１４８】
誘導性プロモーターは、本明細書に定義されているようなタンパク質をコードする１つ又は複数の内因性遺伝子の上流に、例えば、ＷＯＸ５、ＷＩＮＤ１、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、又はＰＬＴ７をコードする内因性遺伝子の上流に、及び任意選択で、その内因性遺伝子と作動可能に連結されて、置かれ得る。誘導性プロモーターの好ましい例は、本明細書の下記の第２の態様において、記載されている。
【０１４９】
或いは又は加えて、植物細胞は、構築物で安定的に形質転換され得、ＷＯＸ５、ＷＩＮＤ１、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、又はＰＬＴ５のうちの少なくとも１つの発現が誘導性プロモーターによって制御される。好ましくは、植物細胞は、下記の第２の態様に記載されているような構築物で形質転換される。好ましくは、植物細胞は、本明細書の第２の態様において定義されているような１つ又は複数の発現構築物で安定的に形質転換される。
【０１５０】
非限定的例として、トランス活性化因子は、誘導性プロモーターと結合することができ、その後、本明細書に定義されているようなタンパク質の１つの転写を誘導する。そのようなトランス活性化因子は、まず、特定の化合物（誘導因子）と結合することにより活性化され得る。或いは、トランス活性化因子の誘導性プロモーターとの結合は、特定の化合物（抑制因子）が存在する場合、抑制され得る。好ましくは、本発明の方法に用いられるトランス活性化因子は、特定の化合物（誘導因子）との結合の際に活性化される。好ましくは、誘導因子は、本明細書の下記の第２の態様に記載されているような誘導因子である。
【０１５１】
一過性に減少された発現
本明細書の上記で定義されているようなタンパク質の少なくとも１つの発現の増加又は導入と組み合わせて、ある実施形態において、ＲＢＲタンパク質の発現が植物細胞において減少され、好ましくは、その発現は一過性に減少される。ＲＢＲタンパク質の発現減少は、その内因性タンパク質の発現減少であると本明細書で理解される。そのような発現減少は、内因性機能性タンパク質の発現減少を生じる内因性遺伝子の１つ若しくは複数の変異、すなわち、制御配列（例えば、プロモーター）若しくはコード配列における変異により、又は抑制因子をコードする構築物のトランスジェニック導入を介してであり得る。
【０１５２】
その発現は、好ましくは、本明細書の上記で定義されているようなある特定の期間中、減少され、好ましくは、その発現は、本明細書の上記で定義されているようなある特定の期間中のみ、減少される。一過性の発現減少は、当技術分野において知られた任意の適切な手段を用いて達成することができる。例えば、一過性の発現減少は、スモールＲＮＡ転写産物（例えば、ＲＢＲ遺伝子転写産物をターゲットするｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ）の細胞への導入、又はＲＮＡｉ構築物を植物細胞へ導入することにより、達成することができ、前記スモールＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ）の発現が、制御エレメント、例えば、構成的又は組織特異的プロモーターにより制御され得る。
【０１５３】
或いは又は加えて、一過性のＲＢＲ発現減少は、ＲＢＲ抑制因子の一過性発現により達成することができる。ＲＢＲ抑制因子の非限定的例は、ＲＢＲ  ＲＮＡ転写産物をターゲットする、非コードスモールＲＮＡ、例えば、ｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡである。成熟ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡは、少なくとも２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、又は少なくとも２５個の連続したヌクレオチドを含み得る。成熟ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡは、内因性ＲＢＲ転写産物における連続した配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列相補性を有する少なくとも２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、又は少なくとも２５個の連続したヌクレオチドを含み得る。
【０１５４】
内因性ＲＢＲ転写産物は、好ましくは、内因性ＲＢＲ  ｍＲＮＡ分子であり、好ましくは、３’及び５’非翻訳ＲＢＲ配列を含む。したがって、非コードスモールＲＮＡの配列は、ＲＢＲコード配列に含まれる配列と、又はＲＢＲ転写産物の３’若しくは５’非翻訳領域に含まれる配列と、部分的又は完全に相補的であり得る。好ましくは、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡは、ＲＢＲコード配列に含まれる配列と部分的又は完全に相補的であり得る。例えば、スモールＲＮＡ分子の少なくとも２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、又は少なくとも２５個の連続したヌクレオチドは、それぞれ、内因性ＲＢＲ転写産物の少なくとも２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、又は少なくとも２５個の連続したヌクレオチドの連続した配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列相補性を有する。
【０１５５】
通常のＲＮＡｉを用いて内因性ＲＢＲタンパク質発現を下方制御する能力があるスモールＲＮＡ分子を設計する方法であって、前記ＲＢＲタンパク質が本明細書の上記で定義されているようなＲＢＲタンパク質である、方法を当業者は理解している。
【０１５６】
一実施形態において、ＲＢＲ発現を阻害するためのスモールＲＮＡ分子が、配列番号２３と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含み得る。前記スモールＲＮＡ分子は、配列番号２４と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含み得る。
【０１５７】
本明細書に定義されているようなＲＢＲ抑制因子の発現の一過性活性化は、ＲＢＲ抑制因子をコードする配列を誘導性プロモーターの上流に、及びその誘導性プロモーターと作動可能に連結して、置くことにより、達成することができる。ＲＢＲ抑制因子の発現を制御する誘導性プロモーターは、ＷＯＸ５、ＷＩＮＤ１、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、又はＰＬＴ７タンパク質のうちの少なくとも１つの発現を制御する同じ型の誘導性プロモーターであり得る。或いは、誘導性プロモーターは、異なる型の誘導性プロモーターであり得る。ＲＢＲ抑制因子の一過性発現は、本明細書に定義されているようなＲＢＲタンパク質の一過性の発現減少を生じる。
【０１５８】
誘導性プロモーターの好ましい例は、本明細書の下記の第２の態様に記載されている。
【０１５９】
本発明の構築物の使用
一実施形態において、植物細胞は、ＷＯＸ５、ＷＩＮＤ１、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７のうちの少なくとも１つ、好ましくは、ＷＯＸ５、ＷＩＮＤ１、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＰＬＴ１、ＰＬＴ４、又はＰＬＴ５のうちの少なくとも１つの発現が、誘導性プロモーターによって制御される、発現カセットを含む１つ又は複数の核酸で安定的に形質転換することができる。任意選択で、植物細胞は、加えて、ＲＢＲ抑制因子の発現が誘導性プロモーターによって制御される、発現カセットを含む核酸構築物で安定的に形質転換することができる。前記核酸のいくつか又は全部が、単一の構築物に含まれ得る。
【０１６０】
好ましくは、植物細胞は、下記の第２の態様に記載されているような１つ又は複数の構築物で形質転換される。
したがって、ある実施形態において、本発明は、以下のステップを含む、植物細胞を再生し、好ましくは、植物細胞からシュートを再生するための方法に関する：
ａ）植物細胞において、本明細書の第２の態様において定義されているような１つ又は複数の核酸又は核酸構築物を導入し、好ましくは安定的に導入するステップ；
ｂ）誘導因子を含む培地において前記細胞を維持するステップ；
ｃ）任意選択で、本明細書に定義されているような少なくとも１つ又は複数のタンパク質の発現レベルを検出し、及び任意選択で、本明細書に定義されているような少なくとも１つ又は複数のタンパク質の発現の変化を有する植物細胞を選択するステップ；
ｄ）任意選択で、本明細書に定義されているような期間中、前記誘導因子を含む培地において前記選択された植物細胞を維持するステップ；並びに
ｅ）前記植物細胞が、好ましくはシュートに再生するのを可能にするステップ。
【０１６１】
植物細胞が再生された後、誘導因子は、培地から除去され得る。
【０１６２】
構築物は、当技術分野において知られた任意の通常の手段を用いて、植物細胞に導入することができる。形質転換方法の非限定的例には、植物組織のアグロバクテリウム形質転換、微粒子銃照射、及びエレクトロポレーションが挙げられる。好ましい形質転換方法は、例えばフローラルディップ法を用いる、アグロバクテリウム形質転換である（Ｃｌｏｕｇｈら、１９９８）。
【０１６３】
ステップｂ）における誘導因子の好ましい濃度は、その後の誘導性プロモーターの活性化を生じる、本明細書に定義されているようなトランス活性化因子を効果的に活性化することが当技術分野において知られている濃度である。好ましい濃度は、約０．０５μＭ〜５０μＭ、好ましくは、約０．１μＭ〜１５μＭ、好ましくは約１０μＭである。
【０１６４】
一実施形態において、本発明は、本明細書で定義されているような植物細胞を再生するための方法であって、前記植物細胞が、前記植物細胞の再生の前、後、及び／又は中に植物成長ホルモンに曝露されない、方法に関する。植物成長ホルモンは、サイトカイニン又はオーキシンのうちの少なくとも１つであり得る。好ましくは、植物細胞は、改変されていない、例えば野生型の、植物細胞の再生を誘導するであろう植物成長ホルモンの濃度に曝露されない。
【０１６５】
植物細胞は、植物成長ホルモンに曝露され得るが、前記植物ホルモンの存在が、植物細胞の再生に必須の必要条件ではないことが、本明細書でさらに企図される。
【０１６６】
好ましい実施形態において、本発明は、以下のステップを含む、植物細胞からのホルモン非依存的シュート再生のための方法に関する：
ａ）少なくとも
ｉ）ＷＵＳＣＨＥＬ関連ホメオボックス５（ＷＯＸ５）タンパク質；並びに
ｉｉ）ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７からなる群から選択されるＰＬＥＴＨＯＲＡ（ＰＬＴ）タンパク質、好ましくはＰＬＴ１
を含むタンパク質組合せの発現を植物細胞に導入し又は増加させるステップであって、前記タンパク質組合せのタンパク質の少なくとも１つの発現が一過性に導入又は増加される、ステップ；並びに
ｂ）前記植物細胞がシュートに再生するのを可能にするステップ。
【０１６７】
「ホルモン非依存的シュート再生」は、植物細胞の植物成長ホルモンへの曝露の必要性がないシュート再生として、本明細書で理解される。好ましくは、シュート再生はシュート器官形成である。
【０１６８】
一実施形態において、植物組織は、植物再生を刺激するために傷害されることはない。傷害することは、組織培養技術における周知のステップであり、当業者は、植物細胞を傷害する方法及び創傷ストレスを誘導する方法を知っている。植物組織は傷害され得るが、その傷害することは、再生のための必須ステップではないことが本明細書で企図される。
【０１６９】
多細胞植物組織
一実施形態において、植物細胞は、多細胞組織の一部である。植物多細胞組織は、分化細胞を含み得る。或いは又は加えて、多細胞組織は、未分化細胞を含み得る。ある実施形態において、多細胞組織の全細胞が、本明細書に定義されているようなタンパク質の１つ又は複数の発現の増加又は導入を、ある特定の時点又は期間、有する。好ましくは、多細胞組織の細胞の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％が、ある特定の時点又は期間、ＷＯＸ５、ＷＩＮＤ１、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＷＯＸ５、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７タンパク質のうちの少なくとも１つの発現増加又は新規の発現、並びに任意選択で、本明細書に定義されているようなＲＢＲタンパク質の発現減少を有する。
【０１７０】
一実施形態において、多細胞組織の細胞の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％が、本明細書に定義されているようなタンパク質組合せの全タンパク質の発現の変化を、ある特定の時点又は期間、有する。
【０１７１】
多細胞植物組織の全細胞は、本明細書に定義されているような１つ又は複数のタンパク質の発現増加又は導入、好ましくは、一過性の発現増加又は導入を有するように、形質転換され得る。加えて、多細胞組織の全細胞は、本明細書に定義されているようなＲＢＲタンパク質の発現減少を有するように形質転換され得る。好ましくは、多細胞組織の細胞の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％が、本明細書に定義されているようなタンパク質組合せの全タンパク質の発現の変化を有するように形質転換される。
【０１７２】
多細胞組織は、カルス組織、植物器官、又は外植片であり得る。ある実施形態において、本明細書に定義されているようなタンパク質の１つ又は複数の発現増加又は導入を有する植物細胞は、植物器官の一部であり得る。植物器官は、栄養器官又は生殖器官であり得る。栄養器官は、シュート系又は根系に由来し得る。器官は、根、茎、及び葉のうちの少なくとも１つであり得る。生殖性植物器官は、花、種子、果実、球果、胞子嚢、胞子嚢穂、及びガメトフォアからなる群から選択され得る。好ましくは、植物器官は根である。根は、植物体の、葉も節ももたない部位として本明細書で理解される。根における細胞の典型的な配置は、根毛、表皮、エピブレム、皮層、内層（ｅｎｄｏｄｅｒｍｉｓ）、内鞘、及び維管束組織である。一実施形態において、根毛、表皮、エピブレム、皮層、内層、内鞘、及び維管束組織のうちの少なくとも１つの、少なくとも細胞又は細胞の一部が、本明細書に定義されているようなＷＯＸ５、ＷＩＮＤ１、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＷＯＸ５、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７タンパク質のうちの少なくとも１つの新規な発現又は発現増加を有し、及び任意選択で、内因性ＲＢＲタンパク質の発現減少を有する。好ましくは、根毛、表皮、エピブレム、皮層、内層、内鞘、及び維管束組織のうちの少なくとも１つの、少なくとも細胞又は細胞の一部が、本明細書に定義されているようなタンパク質組合せの全タンパク質の発現の変化を、本明細書の上記で定義されているような期間、有する。
【０１７３】
或いは又は加えて、本明細書に定義されているようなタンパク質の１つ又は複数の発現の変化を有する植物細胞は、実生の一部であり得る。
【０１７４】
或いは又は加えて、本明細書に定義されているようなタンパク質の１つ又は複数の発現の変化を有する植物細胞は、カルスの一部であり得る。カルスは、好ましくは成体細胞に由来した、未分化細胞の群である。カルス細胞は、胚形成及び完全に新しい植物の形成を起こす能力があり得る。植物カルスは、組織化されていない植物柔細胞の成長性塊と見なされる。カルスは、単一の分化細胞から生じることができ、カルス細胞は、全能性であり得、植物体全体を再生することができる。植物カルスは、１つ又は複数の体細胞組織、例えば、外植片培養に利用できる組織に由来し得る。カルス及び体細胞胚を生じる細胞は、好ましくは、分裂組織など、急速な分裂を起こし及び／又は部分的に未分化である。本発明の方法に用いられるカルス細胞は、脆弱又はコンパクトであり得る。加えて又は或いは、カルス細胞は、根形成性、シュート形成性、又は胚形成性カルスであり得る（Ｉｋｅｕｃｈｉ  Ｍ、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．２０１３年９月；２５（９）：３１５９〜３１７３）。
【０１７５】
ある実施形態において、本明細書に定義されているようなタンパク質の１つ又は複数の発現の変化を有する植物細胞は、外植片の一部であり得る。外植片は、植物の一部から得られる試料として本明細書で定義することができる。植物試料は、固体培地又は液体培地に置くことができる。外植片は、シュート、葉、茎、花、根、単一の未分化細胞の部分を含む植物の多くの異なる部位から、及び成熟細胞から取り出すことができる。その細胞は、好ましくは、生きている細胞質及び核酸を含有し、脱分化し、細胞分裂を再開することができる。外植片は、例えば、茎頂、腋芽の頂端、又は根端などの植物の分裂組織末端であり得、又はそれから取得可能、若しくは取得され得る。一実施形態において、外植片は、胚軸外植片、茎外植片、子葉外植片、根外植片、葉外植片、花外植片、及び分裂組織からなる群から選択される。
【０１７６】
さらなる実施形態において、植物細胞は、アラビドプシス、オオムギ、キャベツ、キャノーラ、キャッサバ、カリフラワー、チコリー、キク、ワタ、キュウリ、ナス、ブドウ、トウガラシ、レタス、トウモロコシ、メロン、セイヨウアブラナ、ジャガイモ、パンプキン、イネ、ライムギ、ソルガム、ダイズ、カボチャ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、パプリカ、トマト、スイカ、コムギ、及びズッキーニからなる群から選択される植物から入手できる。任意選択で、植物細胞は、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、任意選択でナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、任意選択でトマト種（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）又はナス種（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）の植物から入手できる。任意選択で、植物細胞は、アブラナ科、任意選択でその種又は亜種、ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、カブ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、セイヨウワサビ、又はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）から入手できる。
【０１７７】
ある実施形態において、植物細胞は、不応性植物細胞、すなわち、再生効率が役に立たない植物細胞又は再生効率が乏しい植物細胞である。非限定的例には、コショウ、ダイズ、キュウリ、及びサトウダイコンが挙げられる。
【０１７８】
さらなる実施形態において、植物細胞は、アラビドプシス属、トマト、及びパプリカからなる群から選択される。
【０１７９】
好ましくは、植物は、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）ではなく、又はそれから入手することができない。好ましくは、植物は、タバコ種（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）ではなく、又はそれから入手できない。
【０１８０】
ある実施形態において、方法は、再生シュートから植物又は植物部位を形成するステップを含む。植物又は植物部位を「形成すること」、「生じること」、又は「再生すること」は、好ましくは、形成されたシュートの伸長のステップを含む。好ましくは、伸長したシュートは、カルス又は外植片から取り出される。
【０１８１】
その後の根の形成は、別個の根誘導ステップにおいて、例えばシュートを異なる培地でインキュベートすることにより、誘導され得る（Ｔｈｏｒｐｅ、上記）。或いは、根は、任意のさらなる誘導で自然に形成され得る。その後、再生個体を、例えば、種子を生じるように、土壌で成長させ得る。
【０１８２】
形成された植物、植物部位、又は植物生成物は、本明細書に定義されているようなタンパク質組合せの全タンパク質の発現の変化、好ましくは一過性変化を有するように形質転換されている細胞を含み得る。形成された植物、植物部位、又は植物生成物は、本明細書に定義されているようなタンパク質組合せの全タンパク質の発現の変化、好ましくは一過性変化を有するように形質転換されている細胞からなり得る。
【０１８３】
好ましくは、形成された植物、植物部位、又は植物生成物の細胞の少なくとも約０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％が、本明細書に定義されているようなタンパク質組合せの全タンパク質の発現の変化、好ましくは一過性変化を有するように形質転換されている。
【０１８４】
好ましくは、形成された植物又は植物部位は、本明細書に定義されているようなＷＩＮＤ１、ＷＯＸ５、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、又はＰＬＴ７タンパク質のうちの少なくとも１つの発現の導入も増加も有しない。好ましくは、形成された植物又は植物部位は、本明細書に定義されているようなＲＢＲタンパク質の発現減少を有しない。したがって、本明細書に定義されているようなＷＩＮＤ１、ＷＯＸ５、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＷＯＸ５、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、ＰＬＴ７、及びＲＢＲタンパク質のうちの少なくとも１つが、形成された植物又は植物部位において内因性発現レベルを有する。好ましくは、本明細書に定義されているようなＷＩＮＤ１、ＷＯＸ５、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、ＰＬＴ７、及びＲＢＲタンパク質は、形成された植物又は植物部位において内因性発現レベルを有する。好ましくは、本明細書に定義されているようなタンパク質組合せの全タンパク質の発現レベルは、形成された植物又は植物部位において内因性発現レベルを有する。それにも関わらず、形成された植物又は植物部位は、本明細書の第２の態様において定義されているような構築物を含み得、その構築物は、少なくとも検出可能な量で存在し得る。
【０１８５】
内因性タンパク質発現レベルは、改変されていない、天然に存在するタンパク質発現レベルとして本明細書で理解される。したがって、内因性発現レベルは、本明細書に定義されているような１つ又は複数のタンパク質の発現の変化、例えば、導入、増加、又は減少を有するように改変されていない、例えばその他の点では同一の、植物細胞における、発現レベルである。形成された植物又は植物部位において、本明細書に定義されているような１つ又は複数のタンパク質の発現レベルは、その内因性タンパク質発現レベルと同じ又は類似し得る。或いは、形成された植物又は植物部位は、本明細書に定義されているようなタンパク質の１つ又は複数の発現の上昇を維持し得る。
【０１８６】
核酸構築物
第２の態様において、本発明は、少なくとも１つの発現カセットを含む核酸分子であって、前記発現カセットが、本明細書で第１の態様において定義されているようなＷＩＮＤ１タンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、ＳＨＲタンパク質、ＳＣＲタンパク質、ＰＬＴ１タンパク質、ＰＬＴ２タンパク質、ＰＬＴ３タンパク質、ＰＬＴ４タンパク質、ＰＬＴ５タンパク質、ＰＬＴ７タンパク質、及びＲＢＲ抑制因子のうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子に関する。用語「核酸」及び「核酸分子」は、本明細書で交換可能に用いることができる。
【０１８７】
ある実施形態において、ＷＩＮＤ１、ＷＯＸ５、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７タンパク質のうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列は、第１の態様において定義されているような配列である。ある実施形態において、ＲＢＲ抑制因子をコードするヌクレオチド配列は、第１の態様において定義されているような配列を有する。
【０１８８】
好ましくは、ＳＨＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号９と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する。好ましくは、ＳＣＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する。好ましくは、ＷＯＸ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する。好ましくは、ＰＬＴ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する。好ましくは、ＰＬＴ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する。好ましくは、ＰＬＴ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する。好ましくは、ＰＬＴ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する。好ましくは、ＰＬＴ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する。好ましくは、ＰＬＴ７タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１９と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する。好ましくは、ＷＩＮＤ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２９と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する。好ましくは、ＲＢＲ抑制因子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２３と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有し、又は好ましくは、ＲＢＲ抑制因子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２４と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する。
【０１８９】
一実施形態において、１つのプロモーターは、本明細書に定義されているような２つ以上のタンパク質の発現を制御することができる。そのような場合、２つ以上のタンパク質をコードする配列は、好ましくは、例えばキャップ非依存性様式で翻訳開始を可能にする配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）又は他の適切なエレメントで、分離される。
【０１９０】
ある実施形態において、ＷＩＮＤ１、ＷＯＸ５、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、ＰＬＴ７、及びＲＢＲ抑制因子のそれぞれが、プロモーターにより独立して制御される。したがって、発現カセットは、本明細書に定義されているようなＳＨＲタンパク質の発現を制御するプロモーターを含み得、又は発現カセットは、本明細書に定義されているようなＳＣＲタンパク質の発現を制御するプロモーターを含み得、又は発現カセットは、本明細書に定義されているようなＷＯＸ５タンパク質の発現を制御するプロモーターを含み得、又は発現カセットは、本明細書に定義されているようなＰＬＴ１タンパク質の発現を制御するプロモーターを含み得、又は発現カセットは、本明細書に定義されているようなＰＬＴ２タンパク質の発現を制御するプロモーターを含み得、又は発現カセットは、本明細書に定義されているようなＰＬＴ３タンパク質の発現を制御するプロモーターを含み得、又は発現カセットは、本明細書に定義されているようなＰＬＴ４タンパク質の発現を制御するプロモーターを含み得、又は発現カセットは、本明細書に定義されているようなＰＬＴ５タンパク質の発現を制御するプロモーターを含み得、又は発現カセットは、本明細書に定義されているようなＰＬＴ７タンパク質の発現を制御するプロモーターを含み得、又は発現カセットは、本明細書に定義されているようなＷＩＮＤ１タンパク質の発現を制御するプロモーターを含み得、又は発現カセットは、本明細書に定義されているようなＲＢＲ抑制因子の発現を制御するプロモーターを含み得る。
【０１９１】
発現カセットにおけるプロモーターは、好ましくは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、又は誘導性プロモーターである。好ましくは、本明細書に定義されているようなタンパク質又は抑制因子をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、好ましくは本明細書の下記で定義されているような誘導性プロモーターと作動可能に連結される。
【０１９２】
誘導性プロモーターは当技術分野において周知されている。好ましい誘導性プロモーターは、誘導剤によりスイッチをオンにすることができ、典型的には、それが誘導剤（すなわち、誘導因子）に曝露されている限り、活性がある。誘導剤は、化学剤、例えば、代謝産物、成長調節物質、除草剤、若しくはフェノール化合物、又は植物細胞へ直接的に課せられる生理的ストレス、例えば、低温、熱、塩、毒素、又は微生物病原体若しくは害虫の作用を通してであり得る。
【０１９３】
したがって、誘導性プロモーターは、第１の態様において定義されているような１つ又は複数のタンパク質の発現を調節するために利用することができる。
【０１９４】
本発明の発現カセットにおける誘導性プロモーターは、ストレス誘導性プロモーター、光誘導性プロモーター、又は化学物質誘導性プロモーターであり得る。
【０１９５】
非生物的ストレス誘導性プロモーターの例には、ＲＤ２９Ａ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ−Ｓｈｉｎｏｚａｌｅｉら、１９９３）などの塩誘導性プロモーター；トウモロコシｒａｂｌ７遺伝子プロモーター（Ｐｌａら、１９９３）、トウモロコシｒａｂ２８遺伝子プロモーター（Ｂｕｓｋら、１９９７）、及びトウモロコシＩｖｒ２遺伝子プロモーター（Ｐｅｌｌｅｓｃｈｉら、１９９９）などの乾燥誘導性プロモーター；トマト由来の熱トマトｈｓｐ８０プロモーター（米国特許第５，１８７，２６７号）及びＰＨＳ１熱ショックタンパク質遺伝子（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９８９）などの熱誘導性プロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１９６】
光誘導性プロモーターの例には、３つのクロロフィルａ／ｂ集光性タンパク質プロモーター（Ｌｅｕｔｗｉｌｅｒら、１９８６）及びプレフェレドキシンプロモーター（Ｖｏｒｓｔら、１９９０）が挙げられる。
【０１９７】
誘導性プロモーターの他の例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、アイソフォームＩＩの２７ｋＤサブユニット（ＧＳＴ−ＩＩ−２７）由来のプロモーターが挙げられる。このプロモーターは、「除草剤解毒剤」として知られる化学的化合物によって誘導され、その化学的化合物は、そのプロモーターを誘導するために植物細胞へ適用することができる。参照により本明細書に組み入れられた国際出願ＰＣＴ／ＧＢ９２／０１１８７及び国際出願ＰＣＴ／ＧＢ９０／００１０１を参照。このプロモーターは、単子葉植物と双子葉植物の両方において機能する。同様に、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）のａｌｃＡ／ａｌｃＲ遺伝子活性化系（例えば、配列番号３２のＡｌｃＡエレメント、又は配列番号３２と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する任意の配列、及び配列番号３１のＡｌｃＲトランス活性化因子配列、又は配列番号３１と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する任意の配列を含む）が、化学的誘導性遺伝子発現に用いることができる。
【０１９８】
ＡｌｃＲ／ＡｌｃＡ遺伝子活性化系はエタノール誘導性である。化学的誘導のための他の適切な系には、ａｌｃ−ｓｗｉｔｃｈ、ＧＶＥ／ＶＧＥ、ＧＶＧ、ｐＯｐ６／ＬｈＧＲ（Ｃｒａｆｔら、２００５）、及びＸＶＥ系（参照により本明細書に組み入れられている、Ｍｏｏｒｅら、２００６、特に、図３及び表５）が挙げられる。
【０１９９】
ＬｈＧＲ及びＧＶＧ系は、誘導因子としてデキサメタゾンを用いる。ＸＶＥ系は、誘導因子として１７−β−エストラジオール（ｏｅｓｔｒａｄｉｏｌ）を用い、ＶＧＥ系は、メトキシフェノジド（Ｉｎｔｒｅｐｉｄ−Ｆ２）を用いる。誘導性発現系を達成するために、本明細書の第１の態様において定義されているようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列の上流に適切なプロモーターエレメントをクローニングするために、これらの誘導系を用いる方法を当業者は知っている。
【０２００】
ある実施形態において、本明細書に定義されているような発現の一過性活性化のために用いられる誘導系は、ＬｈＧＲ、ＧＶＧ、若しくはＸＶＥ系のうちの少なくとも１つ、又はそれらの組合せである。
【０２０１】
本明細書に定義されているような１つ又は複数の核酸分子は、核酸構築物の一部であり得る。
【０２０２】
本発明は、本明細書に定義されているような２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つの異なる発現カセットなどの２つ以上の発現カセットを含む核酸構築物にさらに関する。或いは又は加えて、本明細書に定義されているような各発現カセットは、核酸構築物内に１倍より多く、例えば、２倍、３倍、４倍、又は５倍、存在し得る。好ましくは、各発現カセットは、誘導性プロモーターの制御下に、本明細書に定義されているようなＷＩＮＤ１、ＷＯＸ５、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、若しくはＰＬＴ７タンパク質、又はＲＢＲ抑制因子をコードする配列を含む。
【０２０３】
ある実施形態において、核酸構築物は、少なくとも
誘導性プロモーターの制御下に、本明細書に定義されているようなＷＩＮＤ１、ＷＯＸ５、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、若しくはＰＬＴ７タンパク質、又はＲＢＲ抑制因子をコードする配列を有する発現カセットを含む１つの第１の核酸配列；及び
制御エレメントと作動可能に連結されたトランス活性化因子をコードする配列を有する第２の発現カセットを含む第２の核酸配列
を含み得る。トランス活性化因子は、本明細書の下記に定義されているようなトランス活性化因子であり得る。好ましくは、制御エレメントは、ＣａＭＶ、Ｇ１０−９０、ＣｓＶ、ＴＣＴＰ２、又はＵＢＱ１０プロモーターなどの強い構成的プロモーターである。誘導因子を結合する際に、発現したトランス活性化因子は、第１の核酸分子の誘導性プロモーターと結合して、転写を惹起することができる。
【０２０４】
本発明の核酸分子又は構築物は、本明細書の第１の態様において定義されているようなタンパク質組合せ及び／又は抑制因子のそれぞれの発現のための発現カセットを含み得る。任意選択で、第１の態様のタンパク質組合せ及び／又は抑制因子は、別々の構築物、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個の異なる構築物にあるが、好ましくは、その組合せは、単一の構築物に存在する。
【０２０５】
ＧＶＧ系
核酸分子、及び核酸分子内に含まれる発現カセットは、１つ又は複数のＵＡＳエレメントを含み得、前記エレメントは、好ましくは、−４６  ３５Ｓ最小プロモーターなどの最小プロモーターと連結されている。最小プロモーター及び前記エレメントは、好ましくは、第１の態様において定義されているようなタンパク質又は抑制因子をコードする配列の上流に位置し、かつそれと作動可能に連結されている。好ましくは、核酸分子、及び核酸分子内に含まれる発現カセットは、第１の態様において定義されているようなタンパク質又は抑制因子をコードする配列の上流に位置した、少なくとも約４つ又は５つのＵＡＳエレメントを含み得る。ＵＡＳ配列は、好ましくは、配列番号２２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する。ＵＡＳエレメントは、好ましくは、第１の態様において定義されているようなタンパク質又は抑制因子をコードする配列と作動可能に連結されている。これらの１つ又は複数のＵＡＳエレメントは、トランス活性化因子によって結合され得、その結果として、本明細書に定義されているようなタンパク質又は抑制因子の転写を生じる。
【０２０６】
１つ又は複数のＵＡＳエレメントを結合するトランス活性化因子は、好ましくは、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン、ＶＰ１６ドメイン、及びグルココルチコイド受容体（ＧＲ）ドメインを含む。そのようなＧＶＧ系は、当技術分野において周知されており、例えば、Ｍｏｏｒｅら（２００６）に記載されている。トランス活性化因子は、デキサメタゾン又はその誘導体を結合する際に、転写を惹起することができる。したがって、本発明のある実施形態において、核酸は、発現カセットを含み得、前記発現カセットが、トランス活性化因子をコードする配列を含む。好ましくは、トランス活性化因子は、ＵＡＳエレメントと結合するドメイン、好ましくは、ＧＡＬ４ドメインを含むタンパク質である。好ましくは、トランス活性化因子は、ＧＲドメイン及びＶＰ１６ドメインをさらに含む。好ましい実施形態において、トランス活性化因子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２０と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する。
【０２０７】
ＬｈＧＲ系
ある実施形態において、核酸分子、及び核酸分子内に含まれる発現カセットは、１つ又は複数のＬａｃＯｐエレメントを含み得、前記エレメントは、好ましくは、−４６  ３５Ｓ最小プロモーターなどの最小プロモーターと連結されている。最小プロモーター及び前記エレメントは、好ましくは、第１の態様において定義されているようなタンパク質又は抑制因子をコードする配列の上流に位置し、かつそれと作動可能に連結されている。好ましくは、核酸分子、及び核酸分子内に含まれる発現カセットは、第１の態様において定義されているようなタンパク質又は抑制因子をコードする配列の上流に位置した、少なくとも約５つ又は６つのＬａｃＯｐエレメントを含み得る。ＬａｃＯｐ配列は、好ましくは、配列番号２５と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する。ＬａｃＯｐエレメントは、好ましくは、第１の態様において定義されているようなタンパク質又は抑制因子をコードする配列と作動可能に連結されている。これらの１つ又は複数のＬａｃＯｐエレメントは、トランス活性化因子によって結合され得、その結果として、本明細書に定義されているようなタンパク質又は抑制因子の転写を生じる。
【０２０８】
１つ又は複数のＬａｃＯｐエレメントを結合するトランス活性化因子は、好ましくは、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン、ＶＰ１６ドメイン、及びグルココルチコイド受容体（ＧＲ）ドメインを含む。そのようなＬａｃＯｐ系は、当技術分野において周知されており、例えば、Ｍｏｏｒｅら（２００６）に記載されている。トランス活性化因子は、デキサメタゾン又はその誘導体を結合する際に、転写を惹起することができる。したがって、本発明のある実施形態において、核酸は、発現カセットを含み得、前記発現カセットが、トランス活性化因子をコードする配列を含む。好ましくは、トランス活性化因子は、ＬａｃＯｐエレメントと結合するドメイン、好ましくは、ＧＡＬ４ドメインを含むタンパク質である。好ましくは、トランス活性化因子は、ＧＲドメイン及びＶＰ１６ドメインをさらに含む。好ましい実施形態において、トランス活性化因子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２１と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する。好ましくは、トランス活性化因子は、配列番号５８と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性のアミノ酸配列を有する。
【０２０９】
ＸＶＥ系
核酸分子、及び核酸分子内に含まれる発現カセットは、１つ又は複数のＬｅｘＡｏｐエレメントを含み得、前記エレメントは、好ましくは、−４６  ３５Ｓ最小プロモーターなどの最小プロモーターと連結されている。最小プロモーター及び前記エレメントは、好ましくは、第１の態様において定義されているようなタンパク質又は抑制因子をコードする配列の上流に位置し、かつそれと作動可能に連結されている。好ましくは、核酸分子、及び核酸分子内に含まれる発現カセットは、第１の態様において定義されているようなタンパク質又は抑制因子をコードする配列の上流に位置した、少なくとも約７つ又は８つのＬｅｘＡｏｐエレメントを含み得る。ＬｅｘＡｏｐ配列は、好ましくは、配列番号２６と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する。ＬｅｘＡｏｐエレメントは、好ましくは、第１の態様において定義されているようなタンパク質又は抑制因子をコードする配列と作動可能に連結されている。これらの１つ又は複数のＬｅｘＡｏｐエレメントは、トランス活性化因子によって結合され得、その結果として、本明細書に定義されているようなタンパク質又は抑制因子の転写を生じる。
【０２１０】
１つ又は複数のＬｅｘＡｏｐエレメントを結合するトランス活性化因子は、好ましくは、ＬＥＸＡ  ＤＮＡ結合ドメイン、ＶＰ１６ドメイン、及びエストロゲン（ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ）受容体（ＥＲ）ドメインを含む。そのようなＸＶＥ系は、当技術分野において周知されており、例えば、Ｍｏｏｒｅら（２００６）に記載されている。トランス活性化因子は、β−エストラジオール又はその誘導体を結合する際に、転写を惹起することができる。したがって、本発明のある実施形態において、核酸は、発現カセットを含み得、前記発現カセットが、トランス活性化因子をコードする配列を含む。好ましくは、トランス活性化因子は、ＬｅｘＡｏｐエレメントと結合するドメイン、好ましくは、ＬＥＸＡドメインを含むタンパク質である。好ましくは、トランス活性化因子は、ＥＲドメイン及びＶＰ１６ドメインをさらに含む。好ましい実施形態において、トランス活性化因子をコードする配列は、配列番号２７と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する。
【０２１１】
一実施形態において、核酸構築物は、本明細書に定義されているような少なくとも１つ又は複数の発現カセットを含む。好ましくは、発現カセットは、本明細書に定義されているようなＷＩＮＤ１、ＷＯＸ５、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、若しくはＰＬＴ７タンパク質、又はＲＢＲ抑制因子をコードする配列を含み、前記配列が、本明細書に定義されているような誘導性プロモーターと作動可能に連結されている。前記構築物は、１つより多いそのような発現カセットを含み得る。一実施形態において、前記構築物は、以下のエレメントを含み得る：
本明細書に定義されているような誘導性プロモーターと作動可能に連結された、本明細書に定義されているようなＷＩＮＤ１タンパク質をコードする発現カセットを含む核酸配列；及び
本明細書に定義されているような誘導性プロモーターと作動可能に連結された、本明細書に定義されているようなＷＯＸ５タンパク質をコードする発現カセットを含む核酸配列。
さらなる実施形態において、前記構築物は、以下のエレメントを含み得る：
本明細書に定義されているような誘導性プロモーターと作動可能に連結された、本明細書に定義されているようなＷＩＮＤ１タンパク質をコードする発現カセットを含む核酸配列；
本明細書に定義されているような誘導性プロモーターと作動可能に連結された、本明細書に定義されているようなＷＯＸ５タンパク質をコードする発現カセットを含む核酸配列；及び
本明細書に定義されているような誘導性プロモーターと作動可能に連結された、本明細書に定義されているようなＰＬＴ１タンパク質をコードする発現カセットを含む核酸配列。
【０２１２】
ある実施形態において、前記構築物は、以下のエレメントを含み得る：
本明細書に定義されているような誘導性プロモーターと作動可能に連結された、本明細書に定義されているようなＳＨＲタンパク質をコードする発現カセットを含む核酸配列；
本明細書に定義されているような誘導性プロモーターと作動可能に連結された、本明細書に定義されているようなＳＣＲタンパク質をコードする発現カセットを含む核酸配列；
本明細書に定義されているような誘導性プロモーターと作動可能に連結された、本明細書に定義されているようなＷＯＸ５タンパク質をコードする発現カセットを含む核酸配列；
本明細書に定義されているような誘導性プロモーターと作動可能に連結された、本明細書に定義されているようなＰＬＴ１タンパク質をコードする発現カセットを含む核酸配列；
本明細書に定義されているような誘導性プロモーターと作動可能に連結された、本明細書に定義されているようなＰＬＴ４タンパク質をコードする発現カセットを含む核酸配列；及び
本明細書に定義されているような誘導性プロモーターと作動可能に連結された、本明細書に定義されているようなＰＬＴ５タンパク質をコードする発現カセットを含む核酸配列。
さらなる実施形態において、前記構築物は、以下のエレメントを含み得る：
本明細書に定義されているような誘導性プロモーターと作動可能に連結された、本明細書に定義されているようなＷＩＮＤ１タンパク質をコードする発現カセットを含む核酸配列；
本明細書に定義されているような誘導性プロモーターと作動可能に連結された、本明細書に定義されているようなＳＨＲタンパク質をコードする発現カセットを含む核酸配列；
本明細書に定義されているような誘導性プロモーターと作動可能に連結された、本明細書に定義されているようなＳＣＲタンパク質をコードする発現カセットを含む核酸配列；
本明細書に定義されているような誘導性プロモーターと作動可能に連結された、本明細書に定義されているようなＷＯＸ５タンパク質をコードする発現カセットを含む核酸配列；
本明細書に定義されているような誘導性プロモーターと作動可能に連結された、本明細書に定義されているようなＰＬＴ１タンパク質をコードする発現カセットを含む核酸配列；
本明細書に定義されているような誘導性プロモーターと作動可能に連結された、本明細書に定義されているようなＰＬＴ４タンパク質をコードする発現カセットを含む核酸配列；
本明細書に定義されているような誘導性プロモーターと作動可能に連結された、本明細書に定義されているようなＰＬＴ５タンパク質をコードする発現カセットを含む核酸配列；及び
本明細書に定義されているような誘導性プロモーターと作動可能に連結された、本明細書に定義されているようなＲＢＲ抑制因子をコードする発現カセットを含む核酸配列。
【０２１３】
ある実施形態において、本明細書に定義されているようなＳＨＲ、ＳＣＲ、ＰＬＴ、及びＷＯＸ５タンパク質の発現は、本明細書の上記で定義されているようなＧＶＧ系によって制御される。
【０２１４】
ある実施形態において、本明細書に定義されているようなＷＩＮＤ１タンパク質及びＲＢＲ抑制因子の発現は、本明細書の上記で定義されているようなＸＶＥ系によって制御される。
【０２１５】
ある実施形態において、前記構築物は、トランス活性化因子の発現のための少なくとも１つの発現カセットをさらに含む。好ましくは、前記構築物は、２つのトランス活性化因子の発現のための２つの発現カセットをさらに含み、前記トランス活性化因子をコードする配列が、好ましくは、それぞれ、配列番号２０又は配列番号２７と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する。
【０２１６】
さらなる実施形態において、前記構築物は、前記構築物を安定的に組み込んでいる植物を選択するための抵抗性遺伝子を含み得、前記抵抗性遺伝子には、例えば、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ＢＡＳＴＡ除草剤抵抗性マーカーが挙げられるが、それに限定されない。
【０２１７】
組成物
第３の態様において、本発明は、組成物に関する。組成物は、本明細書の上記の第２の態様において定義されているような核酸構築物を含み得る。ある実施形態において、組成物は、例えば、安定剤、塩、又は希釈剤を含む。
【０２１８】
或いは又は加えて、組成物は、２つの核酸構築物を含み得、第１の核酸構築物が、誘導性プロモーターの制御下での、本明細書に定義されているようなＷＩＮＤ１、ＷＯＸ５、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、若しくはＰＬＴ７タンパク質、又は本明細書に定義されているようなＲＢＲ抑制因子をコードする配列を有する第１の発現カセットを含む。組成物は、第２の構築物をさらに含み、前記第２の構築物が、制御エレメントと作動可能に連結されたトランス活性化因子をコードする配列を有する発現カセットを含む。好ましくは、制御エレメントは、ＣａＭＶ、Ｇ１０−９０、ＣｓＶ、ＴＣＴＰ２、又はＵＢＱ１０プロモーターなどの強い構成的プロモーターである。誘導因子を結合する際に、発現したトランス活性化因子は、第１の構築物の誘導性プロモーターと結合し、転写を惹起することができる。
【０２１９】
第１の構築物は、それぞれが、誘導性プロモーターの制御下での、本明細書に定義されているようなＷＩＮＤ１、ＷＯＸ５、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、若しくはＰＬＴ７タンパク質、又はＲＢＲ抑制因子をコードする配列を有する、追加の発現カセットを含み得る。
【０２２０】
或いは又は加えて、組成物は、誘導性プロモーターの制御下での、本明細書に定義されているようなＷＩＮＤ１、ＷＯＸ５、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、若しくはＰＬＴ７タンパク質、又はＲＢＲ抑制因子をコードする配列を有する発現カセットを含む追加の構築物を含み得る。
【０２２１】
植物及び植物部位
第４の態様において、本発明は、
ｉ）第２の態様において定義されているような核酸分子；及び
ｉｉ）第２の態様において定義されているような核酸構築物
のうちの少なくとも１つを含む植物細胞に関する。
【０２２２】
好ましくは、植物細胞は、本明細書に定義されているような誘導因子への植物細胞の曝露の際に、本明細書に定義されているような、ＷＩＮＤ１、ＷＯＸ５、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７タンパク質のうちの少なくとも１つの発現導入又は増加、並びに任意選択で、内因性ＲＢＲタンパク質の発現減少を有し得る。好ましくは、第１の態様において定義されているような一時点又は期間において、植物細胞が、本明細書に定義されているような誘導因子への植物細胞の曝露の際に、少なくともＷＯＸ５及びＰＬＴ１の発現導入又は増加を有する。
【０２２３】
植物細胞は、好ましくは、アラビドプシス、オオムギ、キャベツ、キャノーラ、キャッサバ、カリフラワー、チコリー、キク、ワタ、キュウリ、ナス、ブドウ、トウガラシ、レタス、トウモロコシ、メロン、セイヨウアブラナ、ジャガイモ、パンプキン、イネ、ライムギ、ソルガム、ダイズ、カボチャ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、パプリカ、トマト、スイカ、コムギ、及びズッキーニから入手できる。任意選択で、植物細胞は、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、任意選択でナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、任意選択でトマト種（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）又はナス種（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）の植物から入手できる。任意選択で、植物細胞は、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、任意選択でその種又は亜種、ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、カブ、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、セイヨウワサビ、又はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）から入手できる。
【０２２４】
第５の態様において、本発明は、本明細書に定義されているような本発明の方法により獲得でき、又は獲得されるシュート、植物、又は植物部位に関する。前記植物又は植物部位から得られる植物細胞は、好ましくは、ＷＯＸ５、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＷＩＮＤ１、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＲＢＲのうちの少なくとも１つの内因性発現レベルを有する。好ましくは、前記植物又は植物部位から得られる植物細胞は、内因性ＷＯＸ５、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＷＩＮＤ１、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＲＢＲタンパク質レベルを有する。
【０２２５】
本明細書に定義されているような本発明の方法により獲得でき、又は獲得されるシュート、植物、又は植物部位の植物細胞は、少なくとも
ｉ）第２の態様における核酸分子；及び
ｉｉ）第２の態様において定義されているような核酸構築物、
又はそれらの少なくとも一部若しくは１つを含み得る。
【０２２６】
本発明の方法により獲得でき、又は獲得される植物は、好ましくは、アラビドプシス、オオムギ、キャベツ、キャノーラ、キャッサバ、カリフラワー、チコリー、キク、ワタ、キュウリ、ナス、ブドウ、トウガラシ、レタス、トウモロコシ、メロン、セイヨウアブラナ、ジャガイモ、パンプキン、イネ、ライムギ、ソルガム、ダイズ、カボチャ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、パプリカ、トマト、スイカ、コムギ、及びズッキーニからなる群から選択される。任意選択で、本発明の方法により獲得でき、又は獲得される植物は、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、任意選択でナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、任意選択でトマト種（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）又はナス種（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）由来である。任意選択で、本発明の方法により獲得でき、又は獲得される植物は、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）由来であり、任意選択で、その種又は亜種は、ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、カブ、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、セイヨウワサビ、又はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）である。
【０２２７】
或いは、植物細胞の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は約９９％は、少なくとも
ｉ）第２の態様において定義されているような核酸分子；及び
ｉｉ）第２の態様において定義されているような核酸構築物、
又はそれらの少なくとも一部若しくは１つを有する。一実施形態において、植物部位は、種子、果実、又は非繁殖性材料である。
【０２２８】
第６の態様において、本発明は、本発明の方法により獲得でき、又は獲得される植物又は植物部位に由来した生成物、例えば、粉砕され、製粉され、又は依然として無傷の、他の材料と混合され、乾燥され、凍結されたなどのいずれかの果実、葉、植物器官、植物脂肪、植物油、植物デンプン、及び植物タンパク質画分に関する。これらの生成物は、非繁殖性であり得る。好ましくは、前記植物生成物は、少なくとも
ｉ）第２の態様において定義されているような核酸分子；及び
ｉｉ）第２の態様において定義されているような核酸構築物、
又はそれらの少なくとも一部若しくは１つを含む。好ましくは、これらの生成物は、前記核酸及び／又は構築物の少なくとも画分を含み、それは、前記植物生成物が、本明細書に定義されているような本発明の第１の態様の方法により獲得された植物に由来していることを評価することを可能にする。
【０２２９】
第７の態様において、本発明は、本発明の方法により獲得でき、又は獲得される植物細胞、小植物、又は植物の子孫に関する。子孫の植物細胞は、本明細書に定義されているような誘導因子への曝露の際に、本明細書に定義されているようなＷＯＸ５、ＳＨＲ、ＳＣＲ、ＷＩＮＤ１、ＰＬＴ１、ＰＬＴ２、ＰＬＴ３、ＰＬＴ４、ＰＬＴ５、及びＰＬＴ７タンパク質のうちの少なくとも１つの発現増加又は誘導、並びに任意選択で、本明細書に定義されているようなＲＢＲタンパク質の発現減少を有し得る。
【０２３０】
前記子孫は、本明細書に定義されているように、本発明の第２の態様において定義されているような核酸及び／又は発現構築物を含み得る。好ましくは、子孫は、本明細書に定義されているような１つ又は複数の誘導因子への曝露後、植物細胞からシュートを発生させることができる。
【０２３１】
第８の態様において、本発明は、植物を産生するための方法であって、前記方法が上記の第１の態様において定義されているような植物細胞からシュートを再生するステップを含み、かつ前記シュートが植物へ発達する、方法に関する。
【０２３２】
再生のための本発明のタンパク質の使用
第９の態様において、本発明は、植物細胞からシュートを再生するための、本明細書に定義されているようなタンパク質組合せ及び／又は抑制因子の組合せの使用に関する。好ましくは、本発明は、植物細胞からシュートを再生するための、
ＷＯＸ５タンパク質及びＰＬＴ１タンパク質；
ＷＩＮＤ１タンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、及びＰＬＴ１タンパク質；
ＳＨＲタンパク質、ＳＣＲタンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、ＰＬＴ１、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５タンパク質；並びに
ＷＩＮＤ１タンパク質、ＳＨＲタンパク質、ＳＣＲタンパク質、ＷＯＸ５タンパク質、ＰＬＴ１、ＰＬＴ４、及びＰＬＴ５タンパク質、及びＲＢＲ抑制因子
のうちの少なくとも１つの組合せの使用に関する。植物細胞は、好ましくは、本明細書の上記で定義されているような植物細胞である。
【０２３３】
第１０の態様において、本発明は、植物細胞からシュートを再生するための、第２の態様において定義されているような核酸分子又は核酸構築物の使用に関する。植物細胞は、好ましくは、本明細書の上記で定義されているような植物細胞である。
【実施例】
【０２３４】
実施例１
１セットの定義済みのアラビドプシス（転写）因子を用いる、植物細胞からのシュート再生の誘導のための組成物及び方法が提供される。組成物は、以下の因子を有する構築物を含む：ＷＩＮＤ１（Ｉｗａｓｅら、２０１１）、人工ミクロＲＮＡターゲティングＲＥＴＩＮＯＢＬＡＳＴＭＡ  ＲＥＬＡＴＥＤ（ａｍｉＲＢＲ）（Ｃｒｕｚ−Ｒａｍｉｒｅｚら、２０１３）、ＳＨＯＲＴ  ＲＯＯＴ（ＳＨＲ）（Ｂｅｎｆｅｙら、１９９３）、ＳＣＡＲＥＣＲＯＷ（ＳＣＲ）（Ｄｉ  Ｌａｕｒｅｎｚｉｏら、１９９６）、ＰＬＥＴＨＯＲＡ１（ＰＬＴ１）（Ａｉｄａら、２００４）、ＢＡＢＹＢＯＯＭ／ＰＬＥＴＨＯＲＡ４（ＰＬＴ４）（Ｂｏｕｔｉｌｉｅｒら、２００２、Ｇａｌｉｎｈａら、２００７）、ＰＬＥＴＨＯＲＡ５（ＰＬＴ５）（Ｔｓｕｗａｍｏｔｏら、２０１０、Ｐｒａｓａｄら、２０１１）、及びＷＵＳＣＨＥＬ  ＲＥＬＡＴＥＤ  ＨＯＭＥＯＢＯＸ  ５（ＷＯＸ５）（Ｓａｒｋａｒら、２００７）。選択された因子を、２つの異なるセットへ分け、時限的かつ制御的発現を可能にするための、異なる構成的発現する化学的誘導性トランス活性化系の制御下に置いた。構築物を、ゴールデンゲートクローニング方法を用いてモジュラーパーツから構築した（Ｅｎｇｌｅｒら、２０１４）。トランス活性化系は、−４６  ３５Ｓ最小プロモーターと融合したＧＡＬ４上流活性化配列の６コピーを含有するプロモーター（ＵＡＳ）と結合する、酵母転写因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（Ｇ）、ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ１６のトランス活性化ドメイン（Ｖ）、及びラットグルココルチコイド受容体の受容体ドメイン（Ｇ）の融合によりアセンブルされたキメラ転写ＧＶＧからなるＧＶＧ／ＵＡＳ（Ａｏｙａｍａ及びＣｈｕａ、１９９７）、並びに−４６  ３５Ｓ最小プロモーターと融合したＬｅｘＡオペレーター配列の８コピーを含有するプロモーター（ｌｅｘＡ）と結合する、細菌抑制因子ＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメイン（Ｘ）、ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ１６のトランス活性化ドメイン（Ｖ）、及びヒトエストロゲン受容体の調節領域（Ｅ）の融合によりアセンブルされたキメラ転写活性化因子ＸＶＥからなるＸＶＥ／ｌｅｘＡ（Ｚｕｏら、２０００）を含む。
【０２３５】
本明細書の下記でさらに詳述されているように、別々に又は同時に制御的転写を誘導するための化学的誘導因子の適用を含む因子の時限的誘導のための方法が提供される。外部から加えられる植物ホルモンに依存せず、植物細胞からシュート再生を誘導するためのこれらの構築物を用いる方法もまた提供される。
【０２３６】
材料及び方法
構築物作製
以下の転写エレメントを含むベクターを構築した：
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ノパリンシンターゼプロモーター（ＮＯＳｐ；配列番号３３）及びＡ．ツメファシエンスノパリンシンターゼターミネーター（ＮＯＳＴ；配列番号３４）と作動可能に連結された、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスＢＡＳＴＡ除草剤抵抗性マーカー（ＢＡＲ；Ｔｈｏｍｐｏｎら、１９８７）；
シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬＬＹ−ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ  ＴＵＭＯＲ  ＰＲＯＴＥＩＮ  １プロモーター（ＡｔＴＣＴＰ１）（Ｃｚｅｃｈｏｗｓｋｉら、２００５；配列番号３５）及びシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＵＢＩＱＵＩＴＩＮ１０ターミネーター（ＡｔＵＢＱ１０Ｔｅｒ；配列番号３６）と作動可能に連結された、キメラ転写因子ＸＶＥ（Ｚｕｏ、２０００；配列番号２７）コード配列；
Ｇ１０：９０合成プロモーター（Ｉｓｈｉｇｅ、１９９９；配列番号３７）及びエンドウ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットターミネーター（ｒｂｃＳＴ；配列番号３８）及びＮＯＳＴ（配列番号３４）と作動可能に連結された、キメラ転写因子ＧＶＧ（Ａｏｙａｍａ、１９９７；配列番号２０）コード配列；
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＬｅｘＡ（Ｚｕｏ、２０００）プロモーター（配列番号３９）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓｍｉｎｉプロモーター（３５Ｓｍｉｎｉ）（Ｏｄｅｌｌら、１９８５；配列番号４０）、及びトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）ＡＴＰａｓｅ（ＳｌＡＴＰａｓｅ）ターミネーター（Ｅｎｇｌｅｒ、２０１４；配列番号４１）と作動可能に連結された、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｒｅｌａｔｅｄコード配列（Ｃｒｕｚ−Ｒａｍｉｒｅｚ、２０１３；配列番号１８）に特異的なＧｅｎｅ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｏｖｅｒｃｏｍｅの人工ミクロＲＮＡ（ＡｍｉＲＢＲ）；
ＬｅｘＡ＋３５Ｓｍｉｎｉプロモーター（ＬｅｘＡｏｐ；配列番号２６）及びシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＵＢＩＱＵＩＴＩＮ３ターミネーター（ＡｔＵＢＱ３；配列番号４４）と作動可能に連結された、４ｘＭｙｃ  Ｃ−タグ（４ｘＭｙｃ；配列番号４２）を含むシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＷＯＵＮＤ  ＩＮＤＵＣＥＤ  ＤＥＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ１コード配列（ＡｔＷＩＮＤ１；配列番号２９）；
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）上流活性化配列プロモーター（ＵＡＳｐ；配列番号４７）、３５Ｓｍｉｎｉ（配列番号４０）、及びＡ．ツメファシエンス精製オクトピンシンターゼターミネーター（ＡｔｕＯＣＳ；配列番号４８）と作動可能に連結された、３ｘＦＬＡＧオクタペプチドＣ−タグ（３ｘＦＬＡＧ；配列番号４５）を含むシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＳＨＯＲＴ−ＲＯＯＴコード配列（ＡｔＳＨＲ；配列番号９）；
ＵＡＳ＋３５Ｓｍｉｎｉプロモーター及びＡ．ツメファシエンスマンノピンシンターゼターミネーター（ＡｔｕＭａｓ；配列番号５１）と作動可能に連結された、サルウイルス５  Ｃ−タグ（Ｖ５；配列番号４９）を含むシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＳＣＡＲＥＣＲＯＷコード配列（ＡｔＳＣＲ；配列番号１０）；
ＵＡＳ＋３５Ｓｍｉｎｉプロモーター（ＵＡＳ；配列番号２２）及びシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）熱ショックタンパク質１８．２ターミネーター（ＡｔＨＳＰ；配列番号５４）と作動可能に連結された、バクテリオファージＴ７遺伝子１０  Ｃ−タグ（Ｔ７；配列番号５２）を含むシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＰＬＥＴＨＯＲＡ  １コード配列（ＡｔＰＬＴ１）；
ＵＡＳ＋３５Ｓｍｉｎｉプロモーター（ＵＡＳ；配列番号２２）及びシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＵＢＩＱＵＩＴＩＮ５ターミネーター（ＡｔＵＢＱ５；配列番号５５）と作動可能に連結された、Ｔ７  Ｃ−タグ（配列番号５２）を含むシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＢＡＢＹＢＯＯＭコード配列（ＡｔＰＬＴ４；配列番号１５）；
ＵＡＳ＋３５Ｓｍｉｎｉプロモーター（ＵＡＳ；配列番号２２）及びシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）アルコールデヒドロゲナーゼターミネーター（ＡｔＡＤＨ；配列番号５６）と作動可能に連結された、３ｘＦＬＡＧ  Ｃ−タグ（３ｘＦＬＡＧ；配列番号４５）を含むシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＰＬＥＴＨＯＲＡ  ５コード配列（ＡｔＰＬＴ５；配列番号１６）；並びに
ＵＡＳ＋３５Ｓｍｉｎｉプロモーター（ＵＡＳ；配列番号２２）及びカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓターミネーター（Ｔ３５Ｓ；配列番号５７）と作動可能に連結された、Ｖ５  Ｃ−タグ（配列番号４９）を含むシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＷＵＳＣＨＥＬ  ＲＥＬＡＴＥＤ  ＨＯＭＥＯＢＯＸ  ５コード配列（ＡｔＷＯＸ５；配列番号１１）。
【０２３７】
アラビドプシス形質転換：
植物形質転換について、ベクターＳＨＯＯＴ  ＲＥＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮを、Ａ．ツメファシエンス（Ｃ５８Ｃ１．ｐＭＰ９０株）へエレクトロポレーションによって導入した。形質転換体Ａ．ツメファシエンスを用いて、Ｃｏｌ−０生態型のシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）植物をフローラルディップ法により形質転換した（Ｃｌｏｕｇｈ、１９９８）。
【０２３８】
発芽：
種子を、蒸気滅菌法による塩素ガスにより表面滅菌した（Ｌｉｎｄｓｅｙ、２０１７）。滅菌後、種子を、暗闇中４℃で４８時間、低温処理する前に、０．１％アガロース溶液中に懸濁した。その後、種子を、無菌条件下で、発芽培地上にプレーティングした。種子を、微細ナイロンメッシュ（１００μｍ）上にプレーティングし、それにより実生がメッシュを貫通するのを許すことなく、培地との接触を可能にした。実生を含むプレートを、乾燥を防ぐためにサージカルテープ（３Ｍ、Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅ）で密封した。プレートを、成長チャンバー（２２℃、１２０〜１５０μｍｏｌ／ｍ２秒、１６時間の明期／８時間の暗期の光周期）に立位で置いた。プレートを、これらの状況で５日間、成長させておいた。
【０２３９】
誘導：
５日間の成長後、実生を、それらが成長するメッシュを発芽培地から誘導培地へ運ぶことにより、無菌条件下で移植した。実生を含むプレートを、乾燥を防ぐためにサージカルテープ（３Ｍ、Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅ）で密封した。プレートを、成長チャンバーに立位で戻した。プレートをこの状態で１４日間、成長させておいた。誘導の第２週目において、シュートが出現し始めた。
【０２４０】
用いられる培地：
発芽培地
５ｇ  スクロース（Ｄｕｃｈｅｆａ、製品番号Ｓ０８０９．５０００）
１．１ｇ  ＭＳ＋ビタミン（Ｄｕｃｈｅｆａ、製品番号Ｍ０２２２．００５０）
４ｇ  植物用寒天（Ｄｕｃｈｅｆａ、製品番号Ｐ１００１．１０００）
０．５ｇ／Ｌ  ＭＥＳ  ５．８ｍｇ／Ｌ
誘導培地
５ｇ  スクロース（Ｄｕｃｈｅｆａ、製品番号Ｓ０８０９．５０００）
１．１ｇ  ＭＳ＋ビタミン（Ｄｕｃｈｅｆａ、製品番号Ｍ０２２２．００５０）
４ｇ  植物用寒天（Ｄｕｃｈｅｆａ、製品番号Ｐ１００１．１０００）
０．５ｇ／Ｌ  ＭＥＳ  ５．８ｍｇ／Ｌ
４００μＬ  ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号１００８９７０７７）中に溶解した１０ｍＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号１０１１５２２５５）
【０２４１】
結果
ＳＨＯＯＴ  ＲＥＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮベクター（ＸＶＥトランス活性化ＡｍｉＲＢＲ及びＡｔＷＩＮＤ１；ＧＶＧトランス活性化ＡｔＳＨＲ、ＡｔＳＣＲ、ＡｔＰＬＴ１、ＡｔＰＬＴ４、ＡｔＰＬＴ５、及びＡｔＷＯＸ５）で形質転換された植物を、１０μＭ  １７β−エストラジオール（ＥＳＴ：ＸＶＥの活性化）及び／又は１０μＭ  デキサメタゾン（ＤＥＸ：ＧＶＧの活性化）を含有する培地上で成長させた。
【０２４２】
ＥＳＴとＤＥＸの両方で誘導されたＳＨＯＯＴ  ＲＥＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮベクターを含有する１１系統の形質転換体において、一次根の成長停止が観察された。一次根におけるカルス形成が、あらゆる独立した系統の形質転換体において観察された。緑色カルスの形成は、トランスジェニック系統の５５％の形質転換体において観察され、これらの系統の６７％の形質転換体が、植物ホルモンの適用なしに、観察された緑色カルスからシュートを再生した（表３）。これは、試験された全形質転換体の３６％を表す（表２）。
【０２４３】
ＤＥＸ単独で誘導されたＳＨＯＯＴ  ＲＥＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮベクターを含有する全系統の形質転換体において、一次根の成長停止が観察された。一次根におけるカルス形成が、トランスジェニック系統の８２％の形質転換体において観察された。緑色カルスの形成は、これらのトランスジェニック系統の４４％の形質転換体において観察され、これらの系統の全部（１００％）の形質転換体が、植物ホルモンの適用なしに、観察された緑色カルスからシュートを再生した（表３）。これは、試験された全形質転換体の３６％を表す（表２）。
【０２４４】
ＳＨＯＯＴ  ＲＥＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ−２ベクター（ＸＶＥトランス活性化ＡｔＷＩＮＤ１；ＧＶＧトランス活性化ＡｔＰＬＴ１及びＡｔＷＯＸ５）で形質転換された植物を、１０μＭ  １７β−エストラジオール（ＥＳＴ：ＸＶＥの活性化）及び／又は１０μＭ  デキサメタゾン（ＤＥＸ：ＧＶＧの活性化）を含有する培地上で成長させた。
【０２４５】
ＥＳＴとＤＥＸの両方で誘導されたＳＨＯＯＴ  ＲＥＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ−２ベクターを含有する全ての２５系統の形質転換体において、一次根の成長停止が観察された。一次根におけるカルス形成が、トランスジェニック系統の２０％の形質転換体において観察された。緑色カルスの形成は、これらのトランスジェニック系統の６０％の形質転換体において観察され、これらの系統の３３％の形質転換体が、植物ホルモンの適用なしに、観察された緑色カルスからシュートを再生した（表３）。
【０２４６】
ＤＥＸ単独で誘導されたＳＨＯＯＴ  ＲＥＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ−２ベクターを含有する全系統の形質転換体において、一次根の成長停止が観察された。一次根におけるカルス形成が、トランスジェニック系統の２８％の形質転換体において観察された。緑色カルスの形成は、これらのトランスジェニック系統の５７％の形質転換体において観察され、これらの系統の全部（１００％）の形質転換体が、植物ホルモンの適用なしに、観察された緑色カルスからシュートを再生した（表３）。これは、試験された全形質転換体の１６％を表す（表２）。
【０２４７】
デキサメタゾンでもエストラジオールでも誘導されなかったいずれの形質転換系統のアラビドプシス根も、少しの根成長停止もカルス形成もシュート再生も示さなかった。同様に、１０μＭデキサメタゾン又はエストラジオールで誘導された非形質転換型アラビドプシスの根は、少しの根成長停止もカルス形成もシュート再生も示さなかった（表２及び表３）。
【０２４８】
シュートを再生した植物根から、出現したシュートを切り取り、土壌へ移し、そこで、それらが、根を含む完全な植物を形成するのを観察したところ、それらの生活環を完成し、種子を生じることができた。
【０２４９】
【表２】
2021521864.tif 000003
【０２５０】
【表３】
2021521864.tif 000004
【０２５１】
シュートの切除は、さらなる誘導なしに、結実性植物全体を確実に再生した。切除されたシュートを、根が自然に形成するまで、１／２ＧＭ上で培養した。その後、再生個体は、土壌で成長することができ、そこで、それらは種子を生じるだろう。この所見は、両方の構築物型に渡って、及びいくつかの異なる挿入事象に渡って、一貫していた。
【０２５２】
実施例２
トマトにおけるシュート再生の誘導
トマトのための形質転換構築物
上記の実施例１からの形質転換構築物ＳＨＯＯＴ  ＲＥＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮを、アグロバクテリウム・ツメファシエンスノパリンシンターゼプロモーター（ＮＯＳｐ；配列番号３３）及びＡ．ツメファシエンスオクトピンシンターゼターミネーター（ＯＣＳＴ；配列番号６０）の制御下でＢＡＳＴＡ除草剤抵抗性マーカーをカナマイシン抵抗性マーカーｎｐｔＩＩ（Ｂｅｖａｎら、１９８３；配列番号５９及び６４）に置き換えることにより、トマト形質転換に適合させた。この構築物は、さらなる使用のための、５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含有する培地上での安定的に形質転換されたトマト組織の容易な選択を可能にした（この実施例において、カナマイシン選択を用いなかった）。さらに、最初の構築物における転写因子ＸＶＥ及びＧＶＧの発現を駆動させるためのプロモーター及びターミネーターを、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、１９８５；配列番号６１）及びＣａＭＶターミネーター（Ｔ３５Ｓ；配列番号６２）に置き換えた。最後に、第１の転写エレメントと第２の転写エレメントとの間に、同じＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター及びＣａＭＶターミネーターの制御下での小胞体（ＥＲ）ターゲット化緑色蛍光タンパク質遺伝子（ｅｒＧＦＰ；配列番号６３及び６５）からなる蛍光レポーター遺伝子を置いた。生じたプラスミド構築物を、ｐＫＧ１１０５１と名づけ、大腸菌においてクローニングし、制限酵素消化によりチェックした。ＭｉｎｉｐｒｅｐプラスミドＤＮＡを、植物形質転換用アグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株へエレクトロポレーションした。
【０２５３】
同様に、上記の実施例１からの形質転換構築物ＳＨＯＯＴ  ＲＥＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ−２を、ＢＡＳＴＡマーカーをｎｐｔＩＩに置き換え、ＸＶＥ及びＧＶＧのためのプロモーターをＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターに置き換え、ｅｒＧＦＰ蛍光レポーター遺伝子を付加することにより、適合させた。生じたプラスミド構築物を、ｐＫＧ１１０５２と名づけた。ＭｉｎｉｐｒｅｐプラスミドＤＮＡを、植物形質転換用アグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株へエレクトロポレーションした。
【０２５４】
トマト形質転換
改変を加えたＫｏｏｒｎｎｅｅｆら（１９８６、１９８７）の方法に従って、アグロバクテリウム媒介型遺伝子移入により、トマトに両方の構築物ｐＫＧ１１０５１とｐＫＧ１１０５２を導入した。およそ５０個のトマト種子を滅菌し、１／２ＭＳ１０培地上で１１日間、発芽させた。実生から子葉外植片を切り取り、４０μｇ／ｌアセトシリンゴンを追加したＭＳ２０培地で２４時間、前培養した。２０ｍｇ／ｌストレプトマイシン及び５０ｍｇ／ｌスペクチノマイシンを含有するＴＹ培地中で一晩、成長させ、ＯＤ６００  ０．１３８に希釈した、ｐＫＧ１１０５１又はｐＫＧ１１０５２を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１の懸濁液中に外植片を浸した。外植片をブロットドライし、４０μｇ／ｌアセトシリンゴンを含むＭＳ２０培地のプレートで２日間、共培養した。実験的処理は、いかなるホルモンの存在もなしの、共培養中、１０μＭ  β−エストラジオールの添加による、設定された転写因子の前誘導からなった。対照処理は、トマト形質転換についての標準的技法通り、共培養培地への２ｍｇ／ｌ  ＮＡＡ及び１ｍｇ／ｌ  ＢＡＰの添加からなった。
【０２５５】
共培養後、外植片を、さらなるアグロバクテリウム成長を抑制するために２００ｍｇ／ｌセフォタキシム及び２００ｍｇ／ｌバンコマイシンを含むＭＳ２０培地からなる培地ＭＳ２０ＣＶへ移した。加えて、ＧＶＧの制御下の転写因子遺伝子を誘導するために１０μＭデキサメタゾン（実験的処理）を、又は１ｍｇ／ｌゼアチン（植物成長調節物質、トマト形質転換における標準的技法）をこの培地に追加した。この方法において、トランス活性化された幹細胞遺伝子の効果を、植物成長調節物質の添加と比較した。外植片を、成長チャンバーにおいて、２５℃及び３０００ルクス（１６／８時間の光周期）で培養した。外植片を、新鮮な培地へ２週間ごとに継代した。
【０２５６】
シュート再生効率の記録
実験を、非依存的様式で２回、行った。外植片のシュート及びカルス形成を、実験の開始後２８日間、記録した（表４）。データは、エストラジオール及びデキサメタゾンでの誘導が、植物成長調節物質での通常のシュート誘導（すなわち、最初に、ＮＡＡ＋ＢＡＰで２日間、その後、ゼアチン）後より若干高い効率で、ホルモン非依存的シュート形成を生じることを実証している。この効果は、構築物ｐＫＧ１１０５１及びｐＫＧ１１０５２のいずれかで形質転換されたトマト外植片についても明らかである。カルスは、全ての誘導処理において外植片の創傷端に形成されている。
【０２５７】
いかなる誘導もない対照外植片は、少しのカルス形成もシュート形成も示さなかった。非形質転換型トマト外植片は、通常の植物成長調節物質（すなわち、最初に、ＮＡＡ＋ＢＡＰで２日間、その後、ゼアチン）を含有する培地で正常なシュート誘導を示したが、これらの外植片におけるエストラジオール及びデキサメタゾンによる誘導は、少しのシュート形成も生じなかった。この実験は、遺伝子構築物に存在する転写因子遺伝子の誘導制御が、いかなる成長調節物質の存在もなしに、新規なシュート形成を生じることを実証している。誘導因子エストラジオール及びデキサメタゾンだけでは、非形質転換型組織においてシュート形成を誘導するには十分ではない。
【０２５８】
【表４】
2021521864.tif 000005
【０２５９】
【表５】
2021521864.tif 000006
2021521864.tif 000007
【０２６０】
参考文献
AIDA, M., BEIS, D., HEIDSTRA, R.,WILLEMSEN, V., BLILOU, I., GALINHA, C., NUSSAUME, L., NOH, Y. S., AMASINO, R.& SCHERES, B. 2004. The PLETHORA genes mediate patterning of theArabidopsis root stem cell niche. Cell, 119, 109-20.
AOYAMA, T. & CHUA, N.-H. 1997. Aglucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.The Plant Journal, 11, 605-612.
BENFEY, P. N., LINSTEAD, P. J., ROBERTS,K., SCHIEFELBEIN, J. W., HAUSER, M. T. & AESCHBACHER, R. A. 1993. Rootdevelopment in Arabidopsis: four mutants with dramatically altered rootmorphogenesis. Development, 119, 57-70.
BEVAN,M.W., FLAVELL, R.B., CHILTON, M.-D. (1983) Nature 304: 184-187.
BOUTILIER, K., OFFRINGA, R., SHARMA, V. K.,KIEFT, H., OUELLET, T., ZHANG, L., HATTORI, J., LIU, C. M., VAN LAMMEREN, A.A., MIKI, B. L., CUSTERS, J. B. & VAN LOOKEREN CAMPAGNE, M. M. 2002.Ectopic expression of BABY BOOM triggers a conversion from vegetative toembryonic growth. Plant Cell, 14, 1737-49.
BUSK et al. 1997. Plant J. 11: 1285-1295.
Clough SJ,Bent AF. Floral dip: a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. The Plantjournal : for cell and molecular biology. 1998;16(6):735-43.
CRAFT et al., 2005. New pOp/LhG4 vectorsfor stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. ThePlant journal : for cell and molecular biology, 41(6), 899-918.
CRUZ-RAMIREZ, A., DIAZ-TRIVINO, S.,WACHSMAN, G., DU, Y., ARTEAGA-VAZQUEZ, M., ZHANG, H., BENJAMINS, R., BLILOU,I., NEEF, A. B., CHANDLER, V. & SCHERES, B. 2013. ASCARECROW-RETINOBLASTOMA protein network controls protective quiescence in theArabidopsis root stem cell organizer. PLoS Biol, 11, e1001724.
CZECHOWKSI et al. 2005 Genome-wideidentification and testing of superior reference genes for transcriptnormalization in Arabidopsis. Plant Physiol. 139(1):5-17.
DI LAURENZIO, L., WYSOCKA-DILLER, J.,MALAMY, J. E., PYSH, L., HELARIUTTA, Y., FRESHOUR, G., HAHN, M. G., FELDMANN,K. A. & BENFEY, P. N. 1996. The SCARECROW gene regulates an asymmetric celldivision that is essential for generating the radial organization of theArabidopsis root. Cell, 86, 423-33.
ENGLER, C., YOULES, M., GRUETZNER, R.,EHNERT, T.-M., WERNER, S., JONES, J. D. G., PATRON, N. J. & MARILLONNET, S.2014. A Golden Gate Modular Cloning Toolbox for Plants. ACS Synth Biol.
FAN, M., XU, C., XU, K. & HU, Y. 2012. LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN transcription factors direct callusformation in Arabidopsis regeneration. 22,1169-1180.
GALINHA, C., HOFHUIS, H., LUIJTEN, M.,WILLEMSEN, V., BLILOU, I., HEIDSTRA, R. & SCHERES, B. 2007. PLETHORA proteins as dose-dependent master regulators of Arabidopsisroot development. Nature, 449, 1053-7.
HEIDSTRA and SABATINI. 2014. Plant andanimal stem cells: similar yet different. Nature reviews. 15: 301-312.
IshigeF, Takaichi M, Foster R, Chua NH, Oeda K. 1999. A G-box motif(GCCACGTGCC) tetramer confers high-level constitutive expression in dicot andmonocot plants. The Plant Journal. 18(4):443-8.
IWASE, A., MITSUDA, N., KOYAMA, T.,HIRATSU, K., KOJIMA, M., ARAI, T., INOUE, Y., SEKI, M., SAKAKIBARA, H.,SUGIMOTO, K. & OHME-TAKAGI, M. 2011. The AP2/ERF transcription factor WIND1controls cell dedifferentiation in Arabidopsis. Curr Biol, 21, 508-14.
IWASE et al. 2015. WIND1-based acquisition of regenerationcompetency, in Arabidopsis and rapeseed. J Plant Res,128:389-397.
IWASE et al. 2017. WIND1 Promotes ShootRegeneration through Transcriptional Activation of ENHANCER OF SHOOTREGENERATION1 in Arabidopsis The Plant Cell, Vol. 29: 54-69.
KAREEM, A., DURGAPRASAD, K., SUGIMOTO, K.,DU, Y., PULIANMACKAL, AJAIJ., TRIVEDI, ZANKHANAB., ABHAYADEV, PAZHOORV., PINON,V., MEYEROWITZ, ELLIOTM., SCHERES, B. & PRASAD, K. 2015. PLETHORA GenesControl Regeneration by a Two-Step Mechanism. Current Biology, 25, 1017-1030.
KOORNNEEF,M., HANHART, C., JONGSMA, M., TOMA, I., WEIDE, R, ZABEL, P., HILLE, J. (1986)Plant Science 45: 201-208.
KOORNNEEF,M., HANHART, C.J., MARTINELLI, L. (1987) Theor.Appl.Genet. 74: 633-641.
LEUTWILER, L.S., MEYEROWITZ, E.M., TOBIN, E.M.1986. Structure and expression of threelight-harvesting chlorophyll a/b-binding protein genes in Arabidopsis thaliana.Nucl. Acid Res. 14: 4051-4064.
LindseyBE, 3rd, Rivero L, Calhoun CS, Grotewold E, Brkljacic J.Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds.Journal of visualized experiments : JoVE. 2017(128).
MOORE et al, 2006. Transactivated andchemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal 45, 651-683.
ODELL et al. 1985. Identification of DNAsequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature 313: 810-812.
PELLESCHI et. al. 1999. Plant Mol. Biol.39:373-380.
PLA et. al. 1993 Plant Mol. Biol. 21:259-266.
PRASAD, K., GRIGG, S. P., BARKOULAS, M.,YADAV, R. K., SANCHEZ-PEREZ, G. F., PINON, V., BLILOU, I., HOFHUIS, H.,DHONUKSHE, P., GALINHA, C., MAHONEN, A. P., MULLER, W. H., RAMAN, S., VERKLEIJ,A. J., SNEL, B., REDDY, G. V., TSIANTIS, M. & SCHERES, B. 2011. Arabidopsis PLETHORA transcription factors control phyllotaxis. CurrBiol, 21, 1123-8.
ROSSPOPOFF, O., CHELYSHEVA, L., SAFFAR, J.,LECORGNE, L., GEY, D., CAILLIEUX, E., COLOT, V., ROUDIER, F., HILSON, P.,BERTHOME, R., DA COSTA, M. & RECH, P. 2017. Direct conversion of rootprimordium into shoot meristem relies on timing of stem cell niche development.Development, 144, 1187-1200.
SARKAR, A. K., LUIJTEN, M., MIYASHIMA, S.,LENHARD, M., HASHIMOTO, T., NAKAJIMA, K., SCHERES, B., HEIDSTRA, R. & LAUX,T. 2007. Conserved factors regulate signalling in Arabidopsis thaliana shoot androot stem cell organizers. Nature, 446, 811-4.
SKOOG, F. & MILLER, C. O. 1957.Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured invitro. Symposia of the Society for Experimental Biology, 11, 118-130.
SUGIMOTO, K., JIAO, Y. & MEYEROWITZ, E.M. 2010. Arabidopsis Regeneration from Multiple Tissues Occurs via a RootDevelopment Pathway. Developmental Cell, 18, 463-471.
TAKAHASHI et al. 1989. Mol. Gen. Genet.219: 365-372.
TSUWAMOTO, R., YOKOI, S. & TAKAHATA, Y.2010. Arabidopsis EMBRYOMAKER encoding an AP2 domain transcription factor playsa key role in developmental change from vegetative to embryonic phase. PlantMol Biol, 73, 481-492.
THOMPSON et al. 1987. The EMBO Journal,6(9), 2519-2523.
VORST et al. 1990. Plant Mol. Biol. 14: 491-499.
YAMAGUCHI-SHINOZALEI et al. 1993 Mol. Gen.Genet. 236:331-340.
ZUO, J., NIU, Q.-W. & CHUA, N.-H. 2000. An estrogen receptor-based transactivator XVE mediates highlyinducible gene expression in transgenic plants. The Plant Journal, 24,265-273.
【配列表】
2021521864000001.app
【国際調査報告】
2021521864.tif 000008
2021521864.tif 000009
2021521864.tif 000010
2021521864.tif 000011