(57)【要約】本発明は、ポサコナゾールホスフェートモノコリン塩、その調製方法及び用途に関し、本発明の前記ポサコナゾールホスフェートモノコリン塩は、下記式（Ｉ）の構造を有する。2021515049.tif 000049（式中、ｎは０〜１２の整数、好ましくは、０〜８の整数、より好ましくは、０〜６の整数である。）
2021515049.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）で示される化合物（ポサコナゾールホスフェートモノコリン塩）。
2021515049.tif 000045
（式中、
ｎは０〜１２の整数、好ましくは、０〜８の整数、より好ましくは、０〜６の整数である。）
【請求項２】
請求項１に記載の式（Ｉ）で示される化合物の調製方法であって、
式Ａで示される化合物と式Ｂで示される化合物を、不活性ガスの存在下で、溶媒無し又は有機溶媒Ａにて反応させ、式Ｃで示される化合物を生成するステップ（ａ）と、
2021515049.tif 000046
2021515049.tif 000047
ステップ（ａ）で生成された、式Ｃで示される化合物を溶媒Ｂで加水分解し、式Ｄで示される化合物を生成するステップ（ｂ）と、
2021515049.tif 000048
ステップ（ｂ）で得た、式Ｄで示される化合物と水酸化コリンを溶媒Ｃにて反応させて、前記式（Ｉ）で示される化合物を調製するステップ（ｃ）と、を含む調製方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）では、前記不活性ガスは、窒素ガス、ヘリウムガス及びアルゴンガスから選ばれる１種又は複数種、好ましくは、窒素ガス又はアルゴンガスであり、
好ましくは、ステップ（ａ）では、前記有機溶媒Ａは、芳香族炭化水素類、ハロゲン化炭化水素類、ニトリル類、ケトン類、エーテル類、トリエチルアミン、ジエチルアミン、ピリジン、１−メチルイミダゾール、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン及びエステル類から選ばれる１種又は複数種、好ましくは、酢酸エチル、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、トルエン、アセトン、トリエチルアミン、１−メチルイミダゾール、ピリジン又はクロロホルムであり、
好ましくは、ステップ（ｂ）では、前記溶媒Ｂは、水、アルカリ性水溶液及び有機溶媒水溶液から選ばれる１種又は複数種であり、前記アルカリ性水溶液は、好ましくは、水酸化ナトリウム水溶液、アンモニア水、水酸化カリウム水溶液又は炭酸ナトリウム水溶液であり、前記有機溶媒水溶液は、好ましくは、メタノール水溶液、エタノール水溶液、イソプロパノール水溶液又はアセトン水溶液であり、
好ましくは、ステップ（ｃ）では、前記溶媒Ｃは、水、芳香族炭化水素類、ハロゲン化炭化水素類、ニトリル類、ケトン類、エーテル類、アルコール類、エステル類から選ばれる１種又は複数種、好ましくは、水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ジクロロメタン、トルエン及びブタノンから選ばれる１種又は複数種である、ことを特徴とする請求項２に記載の調製方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）では、前記反応温度は−１０℃〜５０℃、好ましくは、０〜３５℃であり、
好ましくは、上記調製方法において、ステップ（ｂ）では、前記加水分解温度は−２０℃〜３０℃、好ましくは、−５〜１０℃であり、
好ましくは、上記調製方法において、ステップ（ｃ）では、前記反応温度は−１０℃〜８０℃、好ましくは、１０〜４０℃である、ことを特徴とする請求項２又は３に記載の調製方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）では、前記式Ａで示される化合物と前記式Ｂで示される化合物の間のモル比は、１：１．０〜２０．０、好ましくは、１：２．２５〜１０．０であり、
好ましくは、上記調製方法において、ステップ（ｃ）では、前記式Ｄで示される化合物と前記水酸化コリンの間のモル比は、１：０．５〜２、好ましくは、１：１．０５である、ことを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物の抗真菌感染薬の調製における用途であって、好ましくは、前記真菌感染は、カンジダ属又はクリプトコッカス属により引き起こされる感染である用途。
【請求項７】
医薬組成物であって、請求項１に記載の化合物及び薬学的に許容される配合材料を含み、
好ましくは、前記医薬組成物は、錠剤、坐剤、分散性錠剤、腸溶性錠剤、チュアブル錠、口腔内崩壊錠、カプセル、糖衣剤、顆粒剤、乾燥粉末剤、経口溶液剤、小量注入剤、凍結乾燥粉末注射剤又は大容量注入剤であり、
好ましくは、前記薬学的に許容される配合材料は、ｐＨ調整剤、希釈剤、崩壊剤、懸濁剤、潤滑剤、粘着剤、充填剤、矯味剤、甘味剤、酸化防止剤、防腐剤、コード剤及び色素から選ばれる１種又は複数種である医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポサコナゾールホスフェートモノコリン塩、その調製方法及び用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌感染症は、臨床的によく見られ、頻繁に発生する疾患であり、感染症は、表在性真菌感染症と深在性真菌感染症の２種類に分けられる。表在性真菌感染症は、白癬菌が皮膚、髪、爪（足爪）などの体表面の部分に侵入することによって引き起こされ、発症率が高く、有害性が小さい。深在性真菌感染症は、カンジダ、アスペルギルスやクリプトコッカスなどの真菌が内臓器官や深部組織に侵入することによって引き起こされるものであり、有害性が大きい。
【０００３】
近年、免疫抑制患者の増加に伴い、深在性真菌感染症の発症率は著しく増加しており、真菌感染症、特に深在性真菌感染症はますます注目を集めている。しかしながら、現在臨床で使用されている抗真菌薬には、副作用が大きく、薬剤耐性を発生させやすいなどの問題がある。従来の臨床用抗真菌薬は、その構造によって、有機酸類、ポリエン類、アゾール類、アリルアミン類などに分類できるが、その中でも、アゾール類抗真菌薬は、急速に発展されている完全合成抗真菌化合物であり、現在、深在性及び表在性真菌感染症を治療するための主要な臨床薬となっており、最初のアゾール類化合物の抗真菌作用が前世紀の半ばに報告されて以来、第一世代のトリアゾール類薬物であるフルコナゾール、イトラコナゾール、第二世代のトリアゾール類薬物であるボリコナゾールは、抗真菌治療の分野で徐々に登場している。
【０００４】
ポサコナゾール（ｐｏｓａｃｏｎａｚｏｌｅ）はイトラコナゾールの誘導体であり、その経口懸濁剤は、２００５年にドイツで最初に販売され、２００６年にＦＤＡによって市販を承認さており、アスペルギルス、カンジダによって引き起こされる全身性真菌感染症及び中咽頭のカンジダ感染症に対して臨床的に良好な治療効果を示し、現在、世界７０カ国以上、区域で承認されており、米国、ＥＵなどの４０カ国余り、区域で市販されている。ただし、経口懸濁剤の吸収の程度は、食品や胃腸機能などの要因により影響されやすいので、個人間の薬物動態パラメータに大きな違いが生じ、血中濃度値が大きく変動し、バイオアベイラビリティが低いなどの問題を生じさせる。また、ポサコナゾールは弱アルカリ性で水溶性の悪い薬物であり、注射剤形として開発するのが困難である。しかしながら、化学療法又は臓器移植を受けている一部の免疫抑制患者は、吐き気、嘔吐や胃腸の不快感などの問題を抱えているので、経口投与が困難になり、注射投与を必要とする。
【０００５】
低溶解度のため注射製剤として開発されにくいというポサコナゾールの問題を解決するために、メルク社の特許出願ＣＮ２０１１８００３１４８８．９は、置換β−シクロデキストリンで可溶化したポサコナゾール静脈輸液用注射製剤を開示しており、置換β−シクロデキストリンを用いてポサコナゾールを可溶化することで注射製剤を調製する。現在、この注射剤は米国で販売を承認されている。この注射剤は、水に不溶であるというポサコナゾールの欠陥を解決し、経口投与に不便な患者への投与を可能にするが、可溶化のためにスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン（ＳＢＥ−β−ＣＤ）を大量に添加したので、潜在的な安全性のリスクがあり、前臨床毒性学研究から分かるように、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンは尿路上皮細胞での液胞の形成、肝臓と肺内のファージの活性化につながる。臨床研究から明らかなように、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン（ＳＢＥ−β−ＣＤ）は腎臓で代謝される必要があるため、腎臓への負担を大幅に増加し、一方、ポサコナゾール注射剤の対象となる適応症の患者は、骨髄移植、化学療法などを受けている免疫抑制、真菌感染のリスクが高い患者であり、このような患者のうちかなりの部分には腎機能障害があり、特に中等度又は重度の腎不全の患者の場合、糸球体ろ過効率が低く、ＳＢＥ−β−ＣＤは体内に大量に蓄積すると、安全上のリスクが高くなる。配合材料であるスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンの使用により、この薬物の臨床応用の範囲が大幅に制限される。ポサコナゾール注射剤の取扱書には、この薬物が中等度、重度の腎損傷患者には適していないことが特に明記されている。したがって、従来技術の欠陥を解決し、腎損傷患者への投薬の安全性及び薬物適用性を高めることは重要な臨床的価値がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来技術の欠陥を解決するために、本発明は、抗真菌感染が可能な式 （Ｉ）で示される化合物、前記化合物の調製方法、前記化合物を含む医薬組成物、及び抗真菌感染薬の調製における前記化合物の用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の上記目的は、以下の技術案によって実現される。
【０００８】
一態様によれば、本発明は、式（Ｉ）で示される化合物（ポサコナゾールホスフェートモノコリン塩）を提供する。
2021515049.tif 000003
（式中、
ｎは０〜１２の整数、好ましくは、０〜８の整数、より好ましくは、０〜６の整数であり、たとえば、ｎは０、１、２、３、４、５又は６であってもよい。）
【０００９】
別の態様によれば、本発明は、上記式（Ｉ）で示される化合物の調製方法を提供し、前記調製方法は、
式Ａで示される化合物と式Ｂで示される化合物を、不活性ガスの存在下、溶媒無し又は有機溶媒Ａにて反応させ、式Ｃで示される化合物を生成するステップ（ａ）と、
2021515049.tif 000004
2021515049.tif 000005
ステップ（ａ）で生成された、式Ｃで示される化合物を溶媒Ｂで加水分解して、式Ｄで示される化合物を生成するステップ（ｂ）と、
2021515049.tif 000006
ステップ（ｂ）で得た、式Ｄで示される化合物と水酸化コリンを溶媒Ｃにて反応させて、前記式（Ｉ）で示される化合物を調製するステップ（ｃ）と、を含む。
【００１０】
好ましくは、上記調製方法において、ステップ（ａ）では、前記不活性ガスは、窒素ガス、ヘリウムガス及びアルゴンガスから選ばれる１種又は複数種、好ましくは、窒素ガス又はアルゴンガスである。
【００１１】
好ましくは、上記調製方法において、ステップ（ａ）では、前記有機溶媒Ａは、芳香族炭化水素類、ハロゲン化炭化水素類、ニトリル類、ケトン類、エーテル類、トリエチルアミン、ジエチルアミン、ピリジン、１−メチルイミダゾール、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン及びエステル類から選ばれる１種又は複数種、好ましくは、酢酸エチル、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、トルエン、アセトン、トリエチルアミン、１−メチルイミダゾール、ピリジン又はクロロホルムである。
【００１２】
好ましくは、上記調製方法において、ステップ（ｂ）では、前記溶媒Ｂは、水、アルカリ性水溶液及び有機溶媒水溶液から選ばれる１種又は複数種である。前記アルカリ性水溶液は、好ましくは、水酸化ナトリウム水溶液、アンモニア水、水酸化カリウム水溶液又は炭酸ナトリウム水溶液であり、前記有機溶媒水溶液は、好ましくは、メタノール水溶液、エタノール水溶液、イソプロパノール水溶液又はアセトン水溶液である。
【００１３】
好ましくは、上記調製方法において、ステップ（ｃ）では、前記溶媒Ｃは、水、芳香族炭化水素類、ハロゲン化炭化水素類、ニトリル類、ケトン類、エーテル類、アルコール類、エステル類から選ばれる１種又は複数種、好ましくは、水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ジクロロメタン、トルエン及びブタノンから選ばれる１種又は複数種である。
【００１４】
好ましくは、上記調製方法において、ステップ（ａ）では、前記反応温度は、−１０℃〜５０℃、好ましくは、０〜３５℃である。
【００１５】
好ましくは、上記調製方法において、ステップ（ｂ）では、前記加水分解温度は、−２０℃〜３０℃、好ましくは、−５〜１０℃である。
【００１６】
好ましくは、上記調製方法において、ステップ（ｃ）では、前記反応温度は、−１０℃〜８０℃、好ましくは、１０〜４０℃である。
【００１７】
好ましくは、上記調製方法において、ステップ（ａ）では、前記式Ａで示される化合物と前記式Ｂで示される化合物の間のモル比は、１：１．０〜２０．０、好ましくは、１：２．２５〜１０．０である。
【００１８】
好ましくは、上記調製方法において、ステップ（ｃ）では、前記式Ｄで示される化合物と前記水酸化コリンの間のモル比は、１：０．５〜２、好ましくは、１：１．０５である。
【００１９】
また別の態様によれば、本発明は、上記式（Ｉ）で示される化合物の抗真菌感染薬の調製における用途であって、好ましくは、前記真菌感染はカンジダ属又はクリプトコッカス属により引き起こされる感染である用途を提供する。
【００２０】
さらなる態様によれば、本発明は、上記式（Ｉ）で示される化合物、及び薬学的に許容される配合材料を含む医薬組成物をさらに提供する。
好ましくは、前記医薬組成物は、錠剤、坐剤、分散性錠剤、腸溶性錠剤、チュアブル錠、口腔内崩壊錠、カプセル、糖衣剤、顆粒剤、乾燥粉末剤、経口溶液剤、容量注入剤、凍結乾燥粉末注射剤又は大容量注入剤である。
【００２１】
好ましくは、前記薬学的に許容される配合材料は、ｐＨ調整剤、希釈剤、可溶化剤、崩壊剤、懸濁剤、潤滑剤、粘着剤、充填剤、矯味剤、甘味剤、酸化防止剤、界面活性剤、防腐剤、コード剤及び色素から選ばれる１種又は複数種である。
【００２２】
本発明の化合物の用量及び使用方法は、患者の年齢、体重、性別、健康の状況、栄養状態、化合物の活性強度、使用時間、代謝速度、病症の重症度、及び医師の主観的判断を含む多くの要因に依存する。好ましい投与量は２〜１２００ｍｇ／ｋｇであり、最も好ましくは、２４時間の投与量は０．２〜３００ｍｇ／ｋｇであり、複数回投与方式を使用することもできる。
【発明の効果】
【００２３】
従来技術に比べて、本発明は少なくとも以下の有益な効果を有する。
第一に、本願の式（Ｉ）で示される化合物、すなわちモノコリン塩化合物は、溶解性が高く、影響因子（高温、高湿、光照射）や長期保存条件下での安定性が非常に良好であり、その他のポサコナゾールホスフェート一塩及びポサコナゾールホスフェート二塩よりもはるかに高い。
第二に、本願の式（Ｉ）で示されるモノコリン塩化合物は、体内に投与されると、「プロドラッグ」として作用し、アルカリホスファターゼの存在下で生物学的活性を有する親ポサコナゾールに転化される。本願の式（Ｉ）で示されるモノコリン塩化合物は、低吸湿性を有するので、予想外に改良した物理的安定性を有し、それによって、適度な溶解性を維持しながら調製プロセス中の取り扱いが容易になるため、このプロドラッグは経口投与、局所投与及び非経口投与に適している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、具体的な実施形態を参照しながら本発明をさらに詳細に説明するが、以下の実施例は本発明を説明するために過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００２５】
実施例１：ポサコナゾールホスフェートモノコリン塩の調製
2021515049.tif 000007
ステップ１
2021515049.tif 000008
ポサコナゾール（１０ｇ、１４．２８ｍｍｏｌ）を乾燥した２５０ｍＬ三口フラスコに秤量し、窒素ガスの保護下で、ジクロロメタン（１００ｍｌ）を加え、撹拌して溶解し、トリエチルアミン（５ｍｌ）を室温（２５℃）で加えて、室温（２５℃）で３０ｍｉｎ撹拌して反応させた後、オキシ塩化リン（３ｍｌ、３２．１３ｍｍｏｌ）を約１ｍｉｎかけてゆっくりと加えて、添加終了後、６ｈ反応させると、反応は完了した。反応が完了したかどうかをインプロセスＨＰＬＣにより判断した。
クロマトグラフィー条件：
移動相：リン酸でｐＨを３．０に調整した６．８ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム：アセトニトリル＝６０：４０
検出波長：２２０ｎｍ      流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ      カラム温度：２５℃
サンプル濃度：１ｍｇ／ｍｌ    希釈媒体  ５０％アセトニトリル
反応液を０℃の純水１５０ｍｌに滴下し、加水分解温度を０〜５℃に制御して１６ｈ撹拌し、有機相と水相を分液漏斗に移して抽出し、固相をＭｅＯＨ（１５０ｍｌ）で溶解し、抽出した有機相と合わせて、次に、２００〜３００メッシュのシリカゲル約２５ｇをその中に注入し、ロータリーエバポレーターで溶媒を乾固するまで蒸発させ、サンプルを撹拌し、乾固するまで蒸発させたシリカゲルを、２５ｃｍのシリカゲルが入ったカラム（直径４．５ｃｍ）に入れて、目標製品をカラムから溶出し始め、収集した溶媒を回転蒸発により除去して、黄色固体を得て、水１５０ｍｌとジクロロメタン５０ｍｌを加えて抽出し、有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、ロータリーエバポレーターで乾固するまで蒸発させ、淡黄色固体６．３ｇを得た。関連物質：単一不純物０．４２％、総不純物１．０２％。
ステップ２：
2021515049.tif 000009
水酸化コリン（０．３１ｇ、１．２８ｍｍｏｌ、５０％）を、純水５ｍｌを容れたビーカーに秤量し、均一に撹拌した後、化合物（式Ｄ）（１ｇ、１．２８ｍｍｏｌ）をビーカーに注入し、３０℃で１ｈ撹拌し、固体を溶解して、ろ過し、ろ液をエタノール５０ｍｌが入ったビーカーに注入し、室温で１２ｈ撹拌し、吸引ろ過して白色固体を得て、次にエタノール５ｍｌでリンスし、真空乾燥させて白色固体０．７６ｇを得た。（関連物質：０．１３％；水分：０．３％；含有量９９．８７％）。
【００２６】
実施例２：ポサコナゾールホスフェートモノコリン塩の調製
2021515049.tif 000010
ステップ１
2021515049.tif 000011
オキシ塩化リン４０ｍｌを、乾燥した２５０ｍｌ三口フラスコに入れ、窒素ガスの保護下で、温度を−５〜５℃に下げて、ポサコナゾール（１０ｇ、１４．２８ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、添加終了後、保温しながら１２時間撹拌すると、反応は完了した。反応が完了したかどうかをインプロセスＨＰＬＣにより判断した。
クロマトグラフィー条件：
移動相：リン酸でｐＨを３．０に調整した６．８ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム：アセトニトリル＝６０：４０
検出波長：２２０ｎｍ      流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ      カラム温度：２５℃
サンプル濃度：１ｍｇ／ｍｌ    希釈媒体  ５０％アセトニトリル
反応液を０℃の水酸化ナトリウム水溶液８００ｍｌに滴下し、加水分解温度を０〜５℃に制御し、加水分解終了後、１０％塩酸でｐＨを３〜４に調整した。ろ過して、ろ過ケーキをアセトンで洗浄し、２５〜４０℃で送風乾燥させた。類白色固体８．３ｇを得た。関連物質：単一不純物０．４２％、総不純物１．０２％。
ステップ２： 
2021515049.tif 000012
水酸化コリン（０．３１ｇ、１．２８ｍｍｏｌ、５０％）を、純水３ｍｌを容れたビーカーに秤量し、均一に撹拌した後、化合物（式Ｄ）（１ｇ、１．２８ｍｍｏｌ）をビーカーに注入し、３５℃で１ｈ撹拌し、固体を溶解してろ過し、ろ液をエタノール５０ｍｌが入ったビーカーに注入し、５℃で１２ｈ撹拌し、吸引ろ過して白色固体を得て、次にエタノール５ｍｌでリンスし、真空乾燥させて白色固体０．７６ｇを得た。（関連物質：０．１３％；水分：０．３％；含有量９９．８７％）。
【００２７】
実施例３：ポサコナゾールホスフェートモノコリン塩五水和物の調製
2021515049.tif 000013
ステップ２の乾燥方式を３５±５℃の送風乾燥に変更した以外、実施例１と同じバッチのポサコナゾールを用いて、実施例２のステップ１、２を繰り返して試験した。表題化合物を白色固体として得た。（関連物質：０．１３％；水分：９．０６％；含有量９９．８７％）。
【００２８】
実施例４：ポサコナゾールホスフェートモノコリン塩の調製
2021515049.tif 000014
ステップ１
2021515049.tif 000015
ポサコナゾール（１０ｇ、１４．２８ｍｍｏｌ）を、乾燥した２５０ｍｌ三口フラスコに秤量し、窒素ガスの保護下で、テトラヒドロフラン（２０ｍｌ）を加え、撹拌して溶解し、トリエチルアミン（５ｍｌ）を５０℃で加え、５０℃で撹拌して３０ｍｉｎ反応させた後、オキシ塩化リン（１．３ｍｌ、１４．２８ｍｍｏｌ）を約１ｍｉｎかけてゆっくりと加え、添加終了後、６ｈ反応させると、ＨＰＬＣで反応を監視したところ、約２０％反応させ、２４時間反応させ続けると、約８１％反応させ、３６時間反応させると、反応は基本的に完了した。ＨＰＬＣクロマトグラフィー条件は、実施例１と同じであった。
反応液を１０℃の純水１５０ｍｌに滴下し、加水分解温度を１０℃に制御して１６ｈ撹拌し、有機相と水相を分液漏斗に移して抽出し、固相をＭｅＯＨ（１５０ｍｌ）で溶解し、抽出した有機相と合わせて、次に、２００〜３００メッシュのシリカゲル約２５ｇをその中に注入し、ロータリーエバポレーターで溶媒を乾固するまで蒸発させ、サンプルを撹拌し、乾固するまで蒸発させたシリカゲルを、２５ｃｍのシリカゲルが入ったカラム（直径４．５ｃｍ）に注入し、目標製品をカラムから溶出し始め、収集した溶媒を回転蒸発により除去し、黄色固体を得て、水１５０ｍｌとジクロロメタン５０ｍｌを加えて抽出し、有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、ロータリーエバポレーターで乾固するまで蒸発させ、淡黄色固体５．２ｇを得た。関連物質：単一不純物２．５％、総不純物４．９０％。
ステップ２：
2021515049.tif 000016
水酸化コリン（０．３１ｇ、１．２８ｍｍｏｌ、５０％）を、純水５ｍｌを容れたビーカーに秤量し、均一に撹拌した後、化合物（式Ｄ）（１ｇ、１．２８ｍｍｏｌ）をビーカーに注入し、６０℃で１ｈ撹拌して、固体を溶解してろ過し、ろ液をアセトン５０ｍｌが入ったビーカーに注入し、室温で１２ｈ撹拌し、吸引ろ過して白色固体を得て、次にアセトン５ｍｌでリンスし、真空乾燥させて白色固体０．４５ｇを得た。関連物質：単一不純物１．２３％、総不純物２．５４％。
【００２９】
実施例５：ポサコナゾールホスフェートモノコリン塩の調製
2021515049.tif 000017
ステップ１
2021515049.tif 000018
ポサコナゾール（１０ｇ、１４．２８ｍｍｏｌ）を、乾燥した２５０ｍｌ三口フラスコに秤量し、窒素ガスの保護下で、アセトニトリル（２０ｍｌ）を加え、撹拌して溶解し、トリエチルアミン（５ｍｌ）を３０℃で加え、３０℃で撹拌して３０ｍｉｎ反応させ、オキシ塩化リン（１３ｍｌ、１４２．８ｍｍｏｌ）を約１ｍｉｎかけてゆっくりと加え、添加終了後、６ｈ反応させると、ＨＰＬＣで反応を監視したところ、反応は基本的に完了した。ＨＰＬＣクロマトグラフィー条件は、実施例１と同じであった。
反応液を０℃の純水１５０ｍｌに滴下し、加水分解温度を−５〜０℃に制御して１６ｈ撹拌し、有機相と水相を分液漏斗に移して抽出し、固相をＭｅＯＨ（１５０ｍｌ）で溶解し、抽出した有機相と合わせて、２００〜３００メッシュのシリカゲル約２５ｇをその中に注入し、ロータリーエバポレーターで溶媒を乾固するまで蒸発させ、サンプルを撹拌し、乾固するまで蒸発させたシリカゲルを、２５ｃｍのシリカゲルが入ったカラム（直径４．５ｃｍ）に注入し、目標製品をカラムから溶出し始め、収集した溶媒を回転蒸発により除去して、黄色固体を得て、水１５０ｍｌとジクロロメタン５０ｍｌを加えて抽出し、有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、ロータリーエバポレーターで乾固するまで蒸発させ、淡黄色固体７．３ｇを得た。関連物質：単一不純物０．２６％、総不純物０．６８％。
ステップ２：
2021515049.tif 000019
水酸化コリン（０．３１ｇ、１．２８ｍｍｏｌ、５０％）を、純水５ｍｌを容れたビーカーに秤量し、均一に撹拌した後、化合物（式Ｄ）（１ｇ、１．２８ｍｍｏｌ）をビーカーに注入し、３５℃で１ｈ撹拌し、固体を溶解してろ過し、ろ液をメタノール５０ｍｌが入ったビーカーに注入し、室温で１２ｈ撹拌し、吸引ろ過して白色固体を得て、次にメタノール５ｍｌでリンスし、真空乾燥させて白色固体０．２５ｇを得た。関連物質：単一不純物０．０２％、総不純物０．１０％。
【００３０】
実施例６：ポサコナゾールホスフェートモノコリン塩の調製
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ステップ１
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ポサコナゾール（１０ｇ、１４．２８ｍｍｏｌ）を乾燥した２５０ｍｌ三口フラスコに秤量し、窒素ガスの保護下で、クロロホルム（７０ｍｌ）を加え、撹拌して溶解し、トリエチルアミン（５ｍｌ）を３０℃で加え、３０℃で撹拌して３０ｍｉｎ反応させ、オキシ塩化リン（６ｍｌ、６４．３６ｍｍｏｌ）を約１ｍｉｎかけてゆっくりと加え、添加終了後、６ｈ反応させると、ＨＰＬＣで反応を監視したところ、反応は基本的に完了した。ＨＰＬＣクロマトグラフィー条件は、実施例１と同じであった。
反応液を０℃の純水１５０ｍｌに滴下し、加水分解温度を−５〜０℃に制御して１６ｈ撹拌し、有機相と水相を分液漏斗に移して抽出し、固相をＭｅＯＨ（１５０ｍｌ）で溶解し、抽出した有機相と合わせて、次に、２００〜３００メッシュのシリカゲル約２５ｇをその中に注入し、ロータリーエバポレーターで溶媒を乾固するまで蒸発させ、サンプルを撹拌し、乾固するまで蒸発させたシリカゲルを、２５ｃｍのシリカゲルが入ったカラム（直径４．５ｃｍ）に注入し、目標製品をカラムから溶出し始め、収集した溶媒を回転蒸発により除去して、黄色固体を得て、水１５０ｍｌとジクロロメタン５０ｍｌを加えて抽出し、有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、ロータリーエバポレーターで乾固するまで蒸発させ、淡黄色固体７．０ｇを得た。関連物質：単一不純物０．３３％、総不純物０．６１％。
ステップ２：
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水酸化コリン（０．３１ｇ、１．２８ｍｍｏｌ、５０％）を、純水５ｍｌを容れたビーカーに秤量し、均一に撹拌した後、化合物（式Ｄ）（１ｇ、１．２８ｍｍｏｌ）をビーカーに注入し、３５℃で１ｈ撹拌し、固体を溶解してろ過し、ろ液をイソプロパノール５０ｍｌが入ったビーカーに注入し、室温で１２ｈ撹拌し、吸引ろ過して白色固体を得て、次にイソプロパノール５ｍｌでリンスし、真空乾燥させて白色固体０．２１ｇを得た。関連物質：単一不純物０．２２％、総不純物０．５３％。
【００３１】
実施例７：錠剤の調製
処方
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製法：ポサコナゾールホスフェートモノコリン塩を粉砕して８０メッシュのふるいにかけて、処方量のデンプン、処方量のポサコナゾールホスフェートモノコリン塩及び微結晶セルロースを秤量し、均一に混合した。４％ポビドンＫ３０溶液を使用して材料を軟質材とし、２０メッシュのふるいで造粒し、顆粒中の水分が約５％になるまで４０〜６０℃で乾燥させた。２０メッシュのふるいにかけて整粒し、処方量のステアリン酸マグネシウムを加え、最後に混合し、中間含有量を測定し、錠剤の重量を決定して打錠した。
【００３２】
実施例８：錠剤の調製
処方
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製法：ポサコナゾールホスフェートモノコリン塩五水和物を粉砕して８０メッシュのふるいにかけて、処方量のデンプン、処方量のポサコナゾールホスフェートモノコリン塩五水和物及び微結晶セルロースを秤量し、均一に混合した。４％ポビドンＫ３０溶液を使用して材料を軟質材とし、２０メッシュのふるいで造粒し、顆粒中の水分が約５％になるまで４０〜６０℃で乾燥させた。２０メッシュのふるいにかけて整粒し、処方量のステアリン酸マグネシウムを加え、最後に混合し、中間含有量を測定し、錠剤の重量を決定して打錠した。
【００３３】
実施例９：注射用ポサコナゾールホスフェートモノコリンの調製
処方
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製法：注射用水をバッチ量で加え、処方量のポサコナゾールホスフェートモノコリン塩五水和物、マンニトールを秤量し、撹拌して完全に溶解した後、塩酸でｐＨを５〜１０に調整し、０．２２μｍ微多孔膜でろ過して充填し、凍結乾燥させて蓋を掛けて、包装した。
【００３４】
実施例１０：注射用ポサコナゾールホスフェートモノコリンの調製
処方
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製法：注射用水をバッチ量で加え、処方量のポサコナゾールホスフェートモノコリン塩、グルコースを秤量し、撹拌して完全に溶解した後、塩酸でｐＨを５〜１０に調整し、０．２２μｍ微多孔膜でろ過して充填し、凍結乾燥させて蓋をかけて、包装した。
【００３５】
実施例１１：注射用ポサコナゾールホスフェートモノコリンの調製
処方
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製法：注射用水をバッチ量で加え、処方量のポサコナゾールホスフェートモノコリン塩を秤量し、撹拌して完全に溶解した後、０．２２μｍ微多孔膜でろ過して充填し、凍結乾燥させて蓋をかけて、包装した。
【００３６】
比較例１：ポサコナゾールホスフェートジコリン塩の調製
ステップ２の水酸化コリンの投入量と化合物（式Ｄ）の投入量のモル比を２：１に変更した以外、実施例１と同じバッチのポサコナゾールを用いて、実施例１のステップ１、２を繰り返して試験を行った。表題化合物を白色固体として得た。
【００３７】
比較例２：ポサコナゾールホスフェートジコリン塩五水和物の調製
ステップ２の水酸化コリンの投入量と化合物（式Ｄ）の投入量のモル比を２：１に変更した以外、実施例１と同じバッチのポサコナゾールを用いて、実施例３のステップ１、２を繰り返して試験を行った。表題化合物を白色固体として得た。
【００３８】
比較例３：ポサコナゾールホスフェートモノカリウム塩の調製
ステップ２の水酸化コリンを水酸化カリウムに変更し、且つ水酸化カリウムと化合物（式Ｄ）のモル比を１：１とした以外、実施例１と同じバッチのポサコナゾールを用いて、実施例１のステップ１、２を繰り返して試験を行った。表題化合物を白色固体として得た。
【００３９】
比較例４：ポサコナゾールホスフェートモノメグルミン塩の調製
ステップ２の水酸化コリンをメグルミンに変更し、且つメグルミンと化合物（式Ｄ）のモル比を１：１とした以外、実施例１と同じバッチのポサコナゾールを用いて、実施例１のステップ１、２を繰り返して試験を行った。表題化合物を白色固体として得た。
【００４０】
比較例５：ポサコナゾールホスフェートモノアルギニン塩の調製
ステップ２の水酸化コリンをアルギニンに変更し、且つアルギニンと化合物（式Ｄ）のモル比を１：１とした以外、実施例１と同じバッチのポサコナゾールを用いて、実施例１のステップ１、２を繰り返して試験を行った。表題化合物を白色固体として得た。
【００４１】
比較例６：ポサコナゾールホスフェートモノカリウム塩三水和物の調製
ステップ２の水酸化コリンを水酸化カリウムに変更し、且つ水酸化カリウムと化合物（式Ｄ）のモル比を１：１とした以外、実施例１と同じバッチのポサコナゾールを用いて、実施例３のステップ１、２を繰り返して試験を行った。表題化合物を白色固体として得た。
【００４２】
比較例７：ポサコナゾールホスフェートモノナトリウム塩三水和物の調製
ステップ２の水酸化コリンを水酸化ナトリウムに変更し、且つ水酸化ナトリウムと化合物（式Ｄ）のモル比を１：１とした以外、実施例１と同じバッチのポサコナゾールを用いて、実施例３のステップ１、２を繰り返して試験を行った。表題化合物を白色固体として得た。
【００４３】
比較例８：ポサコナゾールホスフェートモノナトリウム塩の調製
ステップ２の水酸化コリンを水酸化ナトリウムに変更し、且つ水酸化ナトリウムと化合物（式Ｄ）のモル比を１：１とした以外、実施例１と同じバッチのポサコナゾールを用いて、実施例１のステップ１、２を繰り返して試験を行った。表題化合物を白色固体として得た。
【００４４】
比較例９：ポサコナゾールホスフェートジナトリウム塩五水和物の調製
ステップ２の水酸化コリンを水酸化ナトリウムに変更し、且つ水酸化ナトリウムと化合物（式Ｄ）のモル比を２：１とした以外、実施例１と同じバッチのポサコナゾールを用いて、実施例３のステップ１、２を繰り返して試験を行った。表題化合物を白色固体として得た。
【００４５】
比較例１０：ポサコナゾールホスフェートジナトリウム塩の調製
ステップ２の水酸化コリンを水酸化ナトリウムに変更し、且つ水酸化ナトリウムと化合物（式Ｄ）のモル比を２：１とした以外、実施例１と同じバッチのポサコナゾールを用いて、実施例１のステップ１、２を繰り返して試験を行った。表題化合物を白色固体として得た。
【００４６】
比較例１１：式Ｅで示される化合物の調製
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ステップＡ：メカニカルスターラー、窒素ガス注入口のアダプター、ゴム製ガスケット付きの圧力バランス型添加漏斗及び温度プローブを備えた、オーブンで乾燥した１Ｌ丸底フラスコに、水素化ナトリウム（２．８９ｇ、０．０６９ｍｏｌ、６０％）及びＴＨＦ（５０ｍｌ）を加えた。ＴＨＦ  ３０ｍｌに溶解したポサコナゾール（式Ａで示される化合物）（実施例１と同じバッチのポサコナゾールを用いる）（１７．９４ｇ、０．０２３ｍｏｌ）を室温で２０分間かけて、この撹拌された懸濁液に滴下した。４５分間撹拌した後、ＴＨＦ  ３０ｍｌに溶解したヨウ素（２．９９ｇ、０．０１１５ｍｏｌ）の溶液を１０分間かけて滴下し、次にリン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルクロロメチル（式ＩＩＩ）（１３．２９ｇ、０．０３５ｍｏｌ、〜６８％純度）を１５分間かけて滴下した。反応混合物を約４１℃で４時間撹拌して反応を完了させた。反応が完了したかどうかをインプロセスＨＰＬＣにより判断した。
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この反応混合物を氷水（１００ｍｌ）に注入した。水相を分離し、酢酸エチル（３×５０ｍｌ）で抽出し、混合した有機抽出物を１０％チオ亜硫酸ナトリウム（５０ｍｌ）、水（５０ｍｌ）、塩水（５０ｍｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で濃縮させて、淡黄色油状物（２２．８ｇ、そのプロセスにおいて、ＨＰＬＣにより生成物の反応度を監視したところ、９７％以上になると、反応の終点とする）を得た。粗生成物（式ＩＶ）は、ステップＢでそのまま使用された。
ステップＢ：マグネチックスターラー、冷却浴、ｐＨプローブ、及び窒素ガスの給排口を備えた丸底フラスコに、ＣＨ２Ｃｌ２（２３ｍｌ）に溶解した上記ステップＡの生成物（式ＩＶ）（７．５ｇ）を加えて、０℃に冷却した。この撹拌中の溶液にトリフルオロ酢酸（８．８ｍｌ）をゆっくりと加え、３時間撹拌して反応を完了させた。反応が完了したかどうかをインプロセスＨＰＬＣにより判断した。この反応混合物を２Ｎ  ＮａＯＨ（６４ｍｌ）の冷却溶液に注入した。反応混合物を酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（２×６５ｍｌ）で抽出して、すべての有機不純物を除去した。ジナトリウム塩生成物を含有する水層を活性炭（１０ｇ）で処理し、珪藻土層でろ過した。透明なろ液を１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ２．５に酸性化した。遊離酸生成物を酢酸エチル（２×５０ｍｌ）に抽出した。混合有機層を水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させてろ過し、ろ液を減圧下で濃縮させて、粗生成物Ｖ３．３９ｇを得た。あるいは、本発明の好ましい態様では、ステップＢは、連続プロセスで実行することができ、その詳細については、当業者によって決定される。
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ステップＣ：上記で得られた生成物Ｖをメタノール（７５ｍｌ）に溶解した。ｐＨを４．２〜５．５に維持しながら、Ｌ−リジン（１．８ｇ）をこの遊離酸溶液に加え、混合物を６０℃で４．５時間加熱した。熱い反応物を珪藻土層でろ過した。ろ液を約５ｍｌに濃縮させ、エタノール（１００ｍｌ）と混合し、６５℃に加熱して、モノリジン塩の溶媒和物として結晶化させた。この溶媒和物をブフナー漏斗の上に収集し、真空下で乾燥させて、結晶性固体として表題溶媒和物の化合物３．０ｇを得た。
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【００４７】
実験例１：溶解性の研究
本発明で得られた化合物、比較例１〜１１で得られた化合物及びポサコナゾールの水、イソプロパノール及びメタノールへの溶解度をそれぞれテストした。試験結果を下表に示した。
テスト化合物の溶解度のデータ
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実験結果から、本発明で調製された化合物は、溶解度が高く、いずれも、比較例１〜１１で得られた化合物及びポサコナゾールの水、メタノール及びイソプロパノールへの溶解度よりも高かった。同じ薬物担持量では、本発明の化合物の溶解度は、比較例１〜１１で得られた化合物及びポサコナゾールの溶解度よりも優れているため、本発明の化合物は、効き目が早く、バイオアベイラビリティが高く、また、製剤安定性も向上した。したがって、本発明で調製された化合物は、そのバイオアベイラビリティ及び治療効果を向上させるために重要な意義があった。
【００４８】
実験例２：吸湿性の研究
中国薬局方２０１５年版４部通則９１０３に記載の薬物の吸湿性試験の指導原則を参考して、本願の化合物及び比較例の化合物の吸湿性を調べた。
試験方法：１、乾燥したストッパー付きガラス秤量瓶（外径５０ｍｍ、高さ１５ｍｍ）を取り、試験の前日に適切な２５℃±１℃の恒温乾燥機（その底部には塩化アンモニウム飽和溶液が収納された）に入れ、重量（ｍ１）を正確に秤量した。２、適量の試験品を取り、上記秤量瓶に平らに広げ、試験品の厚さを約１ｍｍとして、重量（ｍ２）を正確に秤量した。３、秤量瓶を開放したままにして、キャップとともに上記恒温恒湿の条件下で２４時間放置した。４、秤量瓶の蓋を閉めて、重量（ｍ３）を正確に秤量した。
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吸湿性の特徴の説明及び吸湿性による増量の定義
潮解：十分量の水を吸収して液体となる。
高吸湿性：吸湿による増量は１５％以上である。
吸湿性あり：吸湿による増量は１５％未満であるが、２％以上である。
僅かな吸湿性有り：吸湿による増量は、２％未満であるが、０．２％以上である。
吸湿性無し又はほぼ無し：吸湿による増量は０．２％未満である。
本製品の２４時間後の吸湿性試験の結果を下表に示した。
テスト化合物の吸湿性試験の結果
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【００４９】
実験例３：安定性の研究
一、２５℃±２℃、６５％Ｒ．Ｈ±５％Ｒ．Ｈ条件下での安定性実験
本実験例では、本発明のポサコナゾールホスフェートモノコリン塩と比較例の化合物について、安定性実験を２５℃±２℃、６５％Ｒ．Ｈ±５％Ｒ．Ｈの条件で実施し、０ケ月、３ケ月、６ケ月、９ケ月、１２ケ月、２４ケ月にサンプリングして性状、関連物質、及び含有量を測定し、結果を下表に示した。
テスト化合物の安定性実験の結果
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実験結果から、ポサコナゾールホスフェートモノコリン塩の安定性結果は、比較例１〜１１の化合物の安定性結果よりも優れており、工業化生産の場合の保存に有益であることがわかった。
二、４０℃±２℃、７５％Ｒ．Ｈ±５Ｒ．Ｈの条件下での安定性実験
ポサコナゾールホスフェートモノコリン塩と比較例の化合物について、安定性試験を温度４０℃±２℃、７５％Ｒ．Ｈ±５Ｒ．Ｈで実施し、０ケ月、１ケ月、２ケ月、３ケ月、６ケ月にサンプリングして、性状、関連物質、及び含有量を測定し、その結果を下表に示した。
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結論：本発明で調製されたポサコナゾールホスフェートモノコリン塩は、６ケ月の加速試験を受けたところ、０ケ月と比較してすべての調査指標に明らかな変化はなかった一方、比較例１〜１１の化合物は、６ケ月の加速試験を受けたところ、０ケ月と比較して、各調査指標としては、関連物質が大幅に増加し、このことから、本発明のポサコナゾールホスフェートモノコリン塩の安定性は、比較例１〜１１の化合物のそれよりも優れていることがわかった。
【００５０】
実験例４：影響因子の試験
本実験例で発明されたポサコナゾールホスフェートモノコリン塩を、高温４０℃、光照射４５００ＬＸ、高湿度９２．５％の条件下で１０日間放置して、０日間、５日間、１０日間でサンプリングして、性状、関連物質、及び含有量を検出し、この結果を下表に示した。
影響因子の試験結果
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結論：本発明で調製された化合物は、高温、高湿、光照射の条件下で１０日間放置したところ、０日と比較して、各調査指標には明らかな変化がなく、このことから、本発明の化合物の特性が安定していることを示した。
【００５１】
実験例５：本発明の化合物の静脈内投与によるカンジダ・アルビカンス膣炎治療実験 
１．実験材料
１．１実験器具
血球カウントプレート、パラフィンミクロトーム、ＳＰＸ−２５０Ｂ生化学インキュベーター、クリーンベンチ、マイクロピペット、加圧蒸気滅菌器、光学顕微鏡、電子分析天びん。
１．２実験試薬
安息香酸エストラジオール注射液、ポリエチレングリコール、サブローブドウ糖寒天固形培地。
１．３実験動物
江蘇省実験動物センターから提供されたＫＭマウス、体重１８〜２２ｇ、メス。
１．４実験菌株
標準菌株であるカンジダ・アルビカンスはアメリカンカルチャーコレクションから購入し、菌株番号はＡＴＣＣ１０２３１である。
２．実験方法
上記マウスの体重を秤量した後、それらをポサコナゾール群、試験化合物群及び溶媒群に無作為に群分けし、各群を２０匹とし、ポサコナゾールは溶媒（生理食塩水）に不溶なので、試験において、ポサコナゾール群はスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンで可溶化された市販のポサコナゾール注射液（メルク／シェリング・プラウ、３ＰＡＲ８０７０１、下同）である。カンジダ・アルビカンスに感染する前に、各群の動物に安息香酸エストラジオール（２ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｌを連続的に６日間皮下注射して、発情期に入るようにし、それ以降、実験終了まで２日ごとに１回注射した。６日後、各マウスの膣に濃度３．５×  １０６ＣＦＵ／ｍｌのカンジダ・アルビカンス液２０ｕｌを注入して、膣感染モデルを作成した。感染後の初日から、各群の動物に、０．１ｍｌ／ｋｇの投与体積で、対応する薬物２０ｍｇ／ｋｇ（ポサコナゾール換算）を、１日１回、連続的に５日間尾静脈内投与し、モデル群には、同体積の溶媒（生理食塩水）を投与した。感染後３日目と５日目に、マウスの膣を滅菌綿棒で拭き、綿棒を生理食塩水０．９ｍｌに浸し、１０倍ずつ増加するようにこの菌液を一連の濃度に希釈し、その後、それぞれ各濃度の菌液１００ｕｌを取り、０．５％（Ｗ／Ｖ）のクロラムフェニコールを含むサブローブドウ糖寒天固形培地に接種し、膣上のカンジダ・アルビカンスの真菌担持量を観察した。
３．実験結果
カンジダ・アルビカンス膣炎（静脈内投与）：各群のマウスの膣真菌担持量
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注：データは、２０匹のマウスのＣＦＵ値の対数の平均値±標準偏差として表される。
実験結果から、静脈内投与５日後、本発明の化合物群のマウスの真菌担持量は、溶媒群のそれよりも有意に低く、ビサコナゾール群と一致しており、明らかな治療効果を達成し、且つβ−シクロデキストリン類配合材料による可溶化によってもたらされる安全上のリスクを回避することがわかった。
【００５２】
実験例６：本発明の化合物の胃内投与によるカンジダ・アルビカンス膣炎治療実験
１．実験材料
１．１実験器具
血球カウントプレート、パラフィンミクロトーム、ＳＰＸ−２５０Ｂ生化学インキュベーター、クリーンベンチ、マイクロピペット、加圧蒸気滅菌器、光学顕微鏡、電子分析天びん。
１．２実験試薬
安息香酸エストラジオール注射液、ポリエチレングリコール、サブローブドウ糖寒天固形培地。
１．３実験動物
江蘇省実験動物センターから提供されたＫＭマウス、体重１８〜２２ｇ、メス。
１．４実験菌株
標準菌株であるカンジダ・アルビカンスはアメリカンカルチャーコレクションから購入し、菌株番号はＡＴＣＣ１０２３１である。
２．実験方法
上記マウスの体重を秤量した後、それらをポサコナゾール（ＣＭＣ−Ｎａ）群、試験化合物群及び媒体群に無作為に群分けし、各群を２０匹とし、ポサコナゾールは溶媒（生理食塩水）に不溶なので、試験において、ポサコナゾール群は、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンで可溶化された市販のポサコナゾール注射液（メルク／シェリング・プラウ、３ＰＡＲ８０７０１、下同）であり、ほかの試験薬物を生理食塩水に溶解し、清澄化するまで超音波処理後、投与に使用した。カンジダ・アルビカンスに感染する前に、各群の動物に安息香酸エストラジオール（２ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｌを連続的に６日間皮下注射して、発情期に入るようにし、それ以降、実験終了まで２日ごとに１回注射した。６日後、各マウスの膣に濃度３．５×  １０６ＣＦＵ／ｍｌのカンジダ・アルビカンス液２０ｕｌを注入して、膣感染モデルを作成した。感染後の初日から、各群の動物に、０．１ｍｌ／１０ｇの投与体積で、対応する薬物２０ｍｇ／ｋｇ（ポサコナゾール換算）を、１日１回、連続的に１５日間胃内投与し、モデル群には、同体積の溶媒（生理食塩水）を投与した。感染後３日目、５日目、７日目、１１日目及び１５日目に、各群のマウスの膣を滅菌綿棒で拭き、綿棒を生理食塩水０．９ｍｌに浸し、１０倍ずつ増加するようにこの菌液を一連の濃度に希釈し、その後、それぞれ各濃度の菌液１００ｕｌを取り、０．５０／（Ｗ／Ｖ）クロラムフェニコールを含むサブローブドウ糖寒天固形培地に接種し、膣上のカンジダ・アルビカンスの真菌担持量を観察した。
３．実験結果
カンジダ・アルビカンス膣炎（胃内投与）：各群のマウスの膣真菌担持量
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実験結果から、投与１５日間後、生理食塩水に溶解した本発明の化合物群のマウスの真菌担持量は、溶媒群のそれよりも有意に低く、ポサコナゾール群と一致しており、明らかな治療効果を達成したことがわかった。
【００５３】
実験例７：本発明の化合物の静脈内投与によるミズネズミの全身性真菌感染症に対する治療作用の実験
１．実験材料
１．１実験器具
Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＭＫ３型のＥＬＩＳＡ検出器、防水電気加熱恒温インキュベーター、ｚｏ−Ｆ１６０全温度振とうインキュベーター、ＭＪＸ型インテリジェントモールドインキュベーター、ＳＷ−ＣＴ−ＩＦ型クリーンベンチ、紫外線分光光度計。
１．２実験試薬
ジメチルスルホキシド、サブローブドウ糖寒天固形培地（ＳＤＡ）。
１．３実験動物
湖北省実験動物センターから提供されたＩＣＲマウス、体重１８〜２２ｇ、オス。
１．４実験菌株
標準菌株であるカンジダ・アルビカンスはアメリカンカルチャーコレクションから購入し、菌株番号はＡＴＣＣ１０２３１である。
２．実験方法
実験前に、接種ループを使用して、４℃で保存されたＳＤＡ（サブロー寒天、下同）培地からカンジダ・アルビカンスを少量採取し、１  ｍｌ  ＹＰＤ（Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｐｅｐｔｏｎｅ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）培養液に接種し、３０℃、２００ｒｐｍで振とう培養し、１６ｈ活性化し、真菌を指数増殖期の後期にした。血球カウントプレートでカウントし、ＲＰＭＩ１６４０（ＲｏｓｗｅｌｌＰａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ１６４０、下同）培養液で菌液の濃度を１×  １０３〜５×  １０３ＣＦＵ／ｍｌに調整した。ＳＤＡプレート上のカンジダ・アルビカンスの単一クローンを採取し、１  ｍｌ  ＹＰＤ（Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｐｅｐｔｏｎｅ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、下同）培地に接種し、３５℃、２００ｒｐｍで指数増殖期の後期まで１６ｈ培養して、新鮮な培地に１％を接種して６ｈ培養し、１０００ｘｇで５分間遠心分離し、上清が無色になるまで生理食塩水で３回洗浄し、血球カウントプレートでカウントし、細胞の濃度を５×  １０６細胞／ｍｌに調整し、０．１ｍｌ／ｋｇ  を尾静脈から注射して、マウスに全身性真菌感染症を引き起こした。マウスをポサコナゾール群、試験化合物群、及びビークル群に無作為に群分けして、１群１０匹とし、ポサコナゾールは溶媒（生理食塩水）に不溶なので、試験において、ポサコナゾール群はスルホブチルエーテル−βシクロデキストリンで可溶化された市販のポサコナゾール注射液である。マウスの全身性真菌感染症モデルの作成から２ｈ後、各投与群に２０ｍｇ／ｋｇ（ポサコナゾール換算）を０．１ｍｌ／ｋｇ  の投与体積で尾静脈内投与し、モデル群には０．９％の塩化ナトリウム溶液０．１ｍｌ／ｋｇ  を１日１回、５日間連続投与した。マウスの死亡状況を観察して、生存時間を記録した。合計７日間観察して、死亡したマウスをすべてエタノールで焼却した。
３．実験結果
全身性真菌感染症（静脈内投与）：投与後の各群のマウスの生存率（％）
2021515049.tif 000040
実験データから明らかなように、本発明の化合物群では、マウスの生存率は、溶媒群のそれよりも有意に高く、記載された化合物では、７日目のマウスの生存率は、ポサコナゾール群のそれと同じであり、良好な結果が達成された。
【００５４】
実験例８：本発明の化合物の胃内投与によるマウスの全身性真菌感染症に対する治療作用の実験
１．実験材料
１．１実験器具
Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＭＫ３型のＥＬＩＳＡ検出器、防水電気加熱恒温インキュベーター、ｚｏ−Ｆ１６０全温度振とうインキュベーター、ＭＪＸ型インテリジェントモールドインキュベーター、ＳＷ−ＣＴ−ＩＦ型クリーンベンチ、紫外線分光光度計。
１．２実験試薬
ジメチルスルホキシド、サブローブドウ糖寒天固形培地（ＳＤＡ）。
１．３実験動物
江蘇省実験動物センターから提供されたＩＣＲマウス、体重１８〜２２ｇ、オス。
１．４実験菌株
標準菌株であるカンジダ・アルビカンスはアメリカンカルチャーコレクションから購入し、菌株番号はＡＴＣＣ１０２３１である。
２．実験方法
実験前に、接種ループを使用して、４℃で保存されたＳＤＡ培地からカンジダ・アルビカンスを少量採取し、１ｍｌ   ＹＰＤ培養液に接種し、３０℃、２００ｒｐｍで振とう培養し、１６ｈ活性化し、真菌を指数増殖期の後期にした。血球カウントプレートでカウントし、ＲＰＭＩ１６４０培養液で菌液の濃度を１×  １０３〜５×  １０３ＣＦＵ／ｍｌに調整した。ＳＤＡプレート上のカンジダ・アルビカンスの単一クローンを採取し、１ｍｌ    ＹＰＤ培地に接種し、３５℃、２００ｒｐｍで指数増殖期の後期まで１６ｈ培養し、新鮮な培地に１％を接種して６ｈ培養し、１０００ｘｇで５分間遠心分離し、上清が無色になるまで生理食塩水で３回洗浄し、血球カウントプレートでカウントし、細胞の濃度を５×  １０６細胞／ｍｌに調整し、０．１ｍｌ／ｋｇを尾静脈から注射して、マウスに全身性真菌感染を引き起こした。マウスをポサコナゾール群、試験化合物群、及び溶媒群に無作為に群分け、１群１０匹とし、試験において、ポサコナゾール群はスルホブチルエーテル−βシクロデキストリンで可溶化された市販のポサコナゾール注射液であり、ほかの試験薬物を生理食塩水に溶解し、清澄まで超音波処理後、投与に使用した。マウスの全身性真菌感染モデルの作成から２ｈ後、各投与群に２０ｍｇ／ｋｇ（ポサコナゾール換算）を０．１ｍｌ／ｋｇ  の投与体積で胃内投与し、モデル群には０．９％の塩化ナトリウム溶液０．１ｍｌ／ｋｇ  を、１日１回、５日間連続投与した。マウスの死亡状況を観察して、生存時間を記録した。合計７日間観察した。死亡したマウスをすべてエタノールで焼却した。
３．実験結果
全身性真菌感染症（胃内投与）：投与後の各群のマウスの生存率（％）
2021515049.tif 000041
実験結果から明らかなように、本発明の化合物では、マウスの生存率は、溶媒群のそれよりも有意に高く、記載された化合物では、７日目のマウスの生存率は、ポサコナゾール群のそれよりも優れており、バイオアベイラビリティは高かった。
【００５５】
実験例９：生体内薬物動態試験
試験方法：実験動物は、北京維利通華実験動物技術有限公司から購入した、６〜８週齢、体重１９０〜２１５ｇの雄マウスである。マウスは、１群３匹として、体重によってランダムに５群に分けられた。各群のマウスの投与量及び投与経路を下表に示した。
2021515049.tif 000042
薬物動態試験前に、マウスを１６時間絶食させた。次に、上表に示すように、化合物の単回投与量を静脈内投与した（１ｍｌ／ｋｇ；１ｍｇ／ｋｇ）。頸静脈穿刺の方式を用いて、投与後、血液２００μｌを定期的に採取し、その中でも、静脈内投与された動物群では、投与後０分間、１５分間、３０分間、１時間、２時間、４時間、８時間及び２４時間後に血液を採取し、２時間、４時間、８時間、１２時間、及び２４時間に尿を採取した。ＥＤＴＡのサンプルチューブに血液サンプルを収集した直後、４℃、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、血漿を別のサンプルチューブに移して、−２０℃で保存した。
各時点で得られた血液及び尿のサンプル中の、試験化合物から転化されたポサコナゾールの濃度を検出し、これから、サンプルについての薬物動態検出を実施し、この試験に使用される方法及び器具は次のとおりである。
ＨＰＬＣ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ
ＭＳ：ＡＢ  ＡＰＩ４０００Ｑ
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ５μＣ１８
移動相：１００％アセトニトリル（３ｍｍol 酢酸アンモニウム）及び１００％水（３ｍｍol 酢酸アンモニウム）
定量方法：内部標準法
生体内薬物動態試験の結果は以下のとおりである。
比較例１１の化合物Ｅの試験結果
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本発明の実施例１の化合物の試験結果
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表のデータからわかるように、比較例の化合物Ｅは、生体内の酵素によって活性成分に加水分解することが困難であるが、生体内で循環系を通じて迅速に代謝され、生体内の尿に蓄積することができるため、そのような化合物のバイオアベイラビリティを大幅に低下させる。一方、本発明の化合物は尿に蓄積することがなく、このため、その医療用途に有利である。
【国際調査報告】
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