(57)【要約】  被験体が末梢神経障害性疼痛に罹患しているか否かを診断する方法及び／又は被験体が開示される。方法は、アドビリンとそれに特異的に結合するモノクローナル抗体との間に免疫複合体を形成することにより生物学的サンプルにおけるアドビリンの存在を検出するステップを含む。末梢神経障害性疼痛に罹患している被験体を治療する方法も開示される。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アドビリン（ａｄｖｉｌｌｉｎ）のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
配列番号２２、２４及び２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号３０、３２及び３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
を含むモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記重鎖可変領域は、配列番号６、８及び１０のポリヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされ、
前記軽鎖可変領域は、配列番号１４、１６及び１８のポリヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記抗体は、ＩｇＧ又はＩｇＭである、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１に記載のモノクローナル抗体と、説明書とを含むキットであって、
前記説明書は、前記キットに関連し、前記キットの使用方法を示す、キット。
【請求項５】
被験体が末梢神経障害性疼痛に罹患しているか否かを診断する方法であって、
前記診断は、前記被験体の生物学的サンプルに基づいて行い、
前記方法は、免疫学的アッセイにおいて前記生物学的サンプルにおけるアドビリンと請求項１に記載のモノクローナル抗体とで形成された複合体の存在を検出するステップを含み、
前記複合体の形成は、前記被験体が末梢神経障害性疼痛に罹患していることを示す、方法。
【請求項６】
前記生物学的サンプルは、脳脊髄液、腹腔液、血液、血清、血漿、又は生体組織切片である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記末梢神経障害性疼痛は、感覚ニューロンの損傷に起因する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記感覚ニューロンは、イソレクチンＢ４、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、サブスタンスＰ又はニューロフィラメント２００に特異的に結合する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫学的アッセイは、ウエスタンブロット分析、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ、又は免疫細胞化学（ＩＣＣ）アッセイである、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
末梢神経障害性疼痛に罹患している被験体を治療する方法であって、
前記被験体の生物学的サンプルを取得するステップ（ａ）と、
免疫測定法において、前記生物学的サンプルと請求項１に記載のモノクローナル抗体とを混合させることで、前記生物学的サンプルにおけるアドビリンと請求項１に記載のモノクローナル抗体とを反応させ、複合体を形成するステップ（ｂ）と、
前記被験体に有効量の治療薬を投与し、前記末梢神経障害性疼痛を改善するステップ（ｃ）と、を含み、
前記治療薬は、鎮痛剤、抗癲癇剤又は抗鬱剤である、方法。
【請求項１１】
前記生物学的サンプルは、脳脊髄液、腹腔液、血液、血清、血漿又は生体組織切片である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫学的アッセイは、ウエスタンブロット分析、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ、又は免疫細胞化学（ＩＣＣ）アッセイである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記鎮痛剤は、アスピリン、イブプロフェン、デキシブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、デクスケトプロフェン、フルルビプロフェン、ロキソプロフェン、インドメタシン、トルメチン、スリンダク、エトドラク、ケトロラク、ジクロフェナク、アセクロフェナク、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、フェニルブタゾン、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸及びトルフェナム酸からなる群より選択される非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記鎮痛剤は、オピオイド又はオキシコドンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗癲癇剤は、ガバペンチン又はプレガバリンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗鬱剤は、アミトリプチリン、ドキセピン又はノルトリプチリンである、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年３月５に出願された米国仮出願Ｎｏ．６２／６３８，３３８の優先権を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、末梢神経障害の分野に関し、具体的には、末梢神経障害の診断及び治療の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
１つ又は複数の末梢神経の障害を示している被験体は、末梢神経障害に罹患している。末梢神経は、脳と脊髄を超えて中枢神経系の外側にある組織に延び、双方向の通信ネットワークを提供する。末梢神経は、脳と脊髄から体の残りの部分へのインパルスの導管として機能する。例えば、運動ニューロンは運動を指示する信号を運ぶ。末梢神経は、特殊な受容体によって収集された感覚情報を脳に伝達することもできる。要するに、末梢神経は、脳、体、環境の間の接続を提供し、生物の脳と外界との間の関係を調整するのに役立つ。
【０００４】
末梢神経障害には様々な種類が存在し、一般的なものもあれば、非常にまれなものもある。特定の末梢神経障害の病因はよく知られているが、病因がまだ明確ではないものもある。多くの神経障害は特定の症候群に分類されている。各症候群は、その一連の臨床症状と徴候、予後、及び治療計画に関連付けられている。特定の患者をその臨床状態に対応する症候群とマッチさせることができることは非常に重要である。このようなマッチングにより、ロードマップのように、医師が治療コースを選択し、予後に関して患者に助言することが可能となる。多くの場合、症候群の特定は、医師に患者の末梢神経障害に関連する別の病状に対する注意を喚起することができ、この別の病状は、特定の治療コースを必要とし、それ自体の予後をもたらす。従って、末梢神経障害に罹患している患者の管理において、正確で精密な診断を行う能力は非常に重要です。しかし、正確な診断を行うことは難しい場合がある。これまで、このような診断は、患者の症状の分析及び非常に詳細な身体検査に依存していた。さらに複雑なのは、多くの末梢神経障害症候群はまだ完全に確定されていないことである。
【０００５】
上述した状況に鑑み、この分野では、末梢神経障害に罹患している被験体を診断するのに有用な新規マーカーを開発する必要がある。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、少なくとも部分的に、感覚ニューロン特異的タンパク質であるアドビリン（ａｄｖｉｌｌｉｎ）が末梢神経障害を診断するためのバイオマーカーとして使用できるという予想外の発見に基づいている。そのため、末梢神経障害が疑われる被験体の生物学的サンプルからアドビリンを検出するための方法及びキット、並びに被験体を診断するための方法に使用されるアドビリンに対するモノクローナルヒト抗体を開発する。
【０００７】
従って、本開示の第１態様では、アドビリンのエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体が提供される。
【０００８】
本開示の実施形態によれば、上記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマＹＣＣ−Ｓ１によって生産される。
【０００９】
本開示の実施形態によれば、上記モノクローナル抗体は、ＩｇＧ又はＩｇＭである。
【００１０】
本開示の第２態様は、被験体が末梢神経障害性疼痛に罹患しているか否かを診断する方法に関する。上記診断は、被験体の生物学的サンプルに基づいて行う。上記方法は、
免疫学的アッセイにおいて上記生物学的サンプルにおけるアドビリンと本開示のモノクローナル抗体とで形成された複合体の存在を検出するステップを含む。
上記複合体の形成は、上記被験体が末梢神経障害性疼痛に罹患していることを示す。
【００１１】
本開示の実施形態によれば、上記モノクローナル抗体は、ＩｇＧ又はＩｇＭである。
【００１２】
本開示の実施形態によれば、上記生物学的サンプルは、脳脊髄液、腹腔液、血液、血清、又は血漿である。
【００１３】
本開示の実施形態によれば、上記末梢神経障害性疼痛は、感覚ニューロンの損傷に起因する。好ましくは、上記感覚ニューロンは、イソレクチンＢ４、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、サブスタンスＰ又はニューロフィラメント２００に特異的に結合する。
【００１４】
本開示の実施形態によれば、上記免疫学的アッセイは、ウエスタンブロット分析、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ又は免疫細胞化学（ＩＣＣ）アッセイである。
【００１５】
本開示の第３態様は、末梢神経障害性疼痛を有する被験体を治療する方法に関する。上記方法は、
上記被験体の生物学的サンプルを取得するステップ（ａ）と、
上記生物学的サンプルと本開示のモノクローナル抗体とを混合させることで、上記生物学的サンプルにおけるアドビリンと上記モノクローナル抗体とを反応させ、免疫測定法において複合体を形成するステップ（ｂ）と、
上記被験体に有効量の治療薬を投与し、上記末梢神経障害性疼痛を改善するステップ（ｃ）と、を含む。
上記治療薬は、鎮痛剤、抗癲癇剤又は抗鬱剤である。
【００１６】
本開示の実施形態によれば、ステップ（ａ）において、生物学的サンプルは、脳脊髄液、腹腔液、血液、血清、血漿又は生体組織切片であり得る。
【００１７】
本開示の実施形態によれば、ステップ（ｂ）において、上記免疫学的アッセイは、ウエスタンブロット分析、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ又は免疫細胞化学（ＩＣＣ）アッセイであり得る。
【００１８】
本開示の実施形態によれば、上記鎮痛剤は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、オピオイド又はオキシコドンであり得る。本発明の方法に適用されるＮＳＡＩＤの例には、アスピリン、イブプロフェン、デキシブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、デクスケトプロフェン、フルルビプロフェン、ロキソプロフェン、インドメタシン、トルメチン、スリンダク、エトドラク、ケトロラク、ジクロフェナク、アセクロフェナク、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、フェニルブタゾン、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸及びトルフェナム酸が含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】
本開示の実施形態によれば、抗癲癇剤は、ガバペンチン又はプレガバリンであり得る。
【００２０】
本開示の実施形態によれば、上記抗鬱剤は、アミトリプチリン、ドキセピン又はノルトリプチリンであり得る。
【００２１】
以下、本開示の１つ以上の実施形態の詳細を説明する。本発明の他の特徴又は利点は、以下の詳細な説明、及び添付の特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
本特許又は出願ファイルには、カラーで実行された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を備えるこの特許又は特許出願公開の写しは、要請に応じて必要な料金を支払った上で庁により提供される。
【００２３】
本明細書は、添付の図面に照らして読んだ以下の詳細な説明からよりよく理解される。
【００２４】
【図１】ＥＡＥマウスのＣＳＦにおけるアドビリンのウエスタンブロット分析を示す。図１（Ａ）は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスの脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるアドビリンタンパク質レベルの代表的なウエスタンブロット分析を示す。回復期のＥＡＥマウスからＣＳＦサンプルを収集した。各レーンには、４μｌのＣＳＦサンプル又は陽性対照とする１０μｇのＷＴ脊髄溶解物をロードした。アルブミンはローディングコントロールであった。遺伝子型の下の数字は、ＣＳＦ収集日のＥＡＥ臨床スコアを示す。ミオシンＩＩａは、アドビリンと相互作用するタンパク質である。図１（Ｂ）は、ＣＳＦサンプルにおけるアドビリン発現の定量化を示す。点線は、陽性アドビリン発現を定義するための閾値（陰性サンプルの平均値＋５ｘＳＤ）である。
【図２】オキサリプラチン処理マウスのＣＳＦにおけるアドビリンを示す。図２（Ａ）は、オキサリプラチン処理マウスのＣＳＦにおけるアドビリンタンパク質を検出する代表的なウエスタンブロットを示す。各レーンには、５μｌのＣＳＦサンプル又は陽性対照とする１０μｇのＷＴ脊髄溶解物をロードした。アルブミンはローディングコントロールであった。オキサリプラチン処理後のサンプル採取時間が示されている。生体防御反応の潜伏期間は、神経障害性疼痛の重症度の指標として使用される。ミオシンＩＩａは、アドビリンと相互作用するタンパク質である。ＳＣ  ＷＴは、ＷＴマウスに由来する脊髄細胞溶解物である。図２（Ｂ）は、ＣＳＦサンプルにおけるアドビリン発現の定量化を示す。点線は、陽性アドビリン発現を定義するための閾値（陰性サンプルの平均値＋５ｘＳＤ）である。初期段階はオキサリプラチン治療後１日目から７日目と定義され、後期段階は８日目以降と定義される。
【図３】オキサリプラチン処理又はＣＦＡ処理マウスのＣＳＦにおけるアドビリンタンパク質を示す。各レーンには、４μｌのＣＳＦサンプル又は陽性対照とする０．５μｇのＤＲＧ溶解物をロードした。アルブミンはローディングコントロールであった。アドビリンは、オキサリプラチン処理マウスのＣＳＦサンプルでは検出されたが、ＣＦＡ処理マウスでは検出されなかった。
【図４】座骨神経の慢性絞扼性損傷（ＣＣＩ）で処理されたマウスのＣＳＦにおけるアドビリンタンパク質を示す。図４（Ａ）は、ＣＣＩマウスのＣＳＦにおけるアドビリンタンパク質レベルのウエスタンブロット分析を示す。ナイーブ、ＣＣＩ（術後の７、８、９及び１０日目）及び減圧マウスからＣＳＦサンプルを収集した。各レーンには、６μｌのＣＳＦサンプル、０．５μｇのＤＲＧ溶解物又は１０μｇのＷＴ脊髄溶解物（ＳＣ  ＷＴ）をロードした。ＷＴ  ＤＲＧ及びＷＴ  ＳＣを陽性対照として使用した。ＫＯ  ＤＲＧを陰性対照として使用した。矢印は陽性サンプルを示す。図４（Ｂ）は、ＣＳＦサンプルにおけるアドビリン発現の定量化を示す。点線は、陽性アドビリン発現を定義するための閾値（陰性サンプルの平均値＋５ｘＳＤ）である。
【図５】脊髄後角におけるアドビリンのＣＣＩ誘発性アップレギュレーションを示す。図５（Ａ）は、脊髄後角のアドビリン免疫反応性は、ナイーブ及びＣＣＩ減圧マウスと比較して、ＣＣＩマウスの同側（術後９日目）で顕著に増加したことを示す（スケールバー：２００μｍ）。図５（Ｂ）は、表在性後角におけるアドビリン免疫反応強度の定量化、及び一元配置分散分析の結果を示す。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図６】ヒトアドビリンのモノクローナル抗体は、２９３細胞におけるヒトアドビリンの外因性発現を特異的に識別したことを示す。ヒトアドビリンクローンにＦＬＡＧを付け、ヒトアドビリンＦＬＡＧ（ｈＡｖｉｌ−ｆｌａｇ）又はベクターコントロール（ＦＬＡＧ）の構築物を２９３細胞にトランスフェクトした。それぞれヒトアドビリンのモノクローナル抗体及びＦＬＡＧ抗体により溶解物を検出した。ヒトアドビリンの分子量は９２ＫＤａと予測され、検出された信号は約１００ＫＤａのｈＡｖｉｌ  ＦＬＡＧの予測サイズに対応した。一番上の信号は、ＦＬＡＧ抗体識別信号で検出された集約形態と見なされる。
【図７】モノクローナル抗体はオキサリプラチンで治療された患者のヒトＣＳＦにおけるアドビリン発現を検出できることを示す。オキサリプラチンによる化学療法を受けた患者のＣＳＦサンプルを収集した。各レーンには、３０μｌのＣＳＦサンプル（約１５μｇ）、陽性対照とするｈＡｖｉｌ−ｆｌａｇでトランスフェクトされた２９３細胞の２μｇの細胞溶解物をロードした。アルブミンはＣＳＦのローディングコントロールであった。ＣＳＦ＃７３、７８、７９及び８０は、明らかなシグナル（閾値を超える）サンプルであった。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
添付の図面に関連して以下に提供される詳細な説明は、本実施例の説明として意図されており、本実施例が構築又は利用され得る唯一の形態を表すものではない。この説明は、この実施例の機能と、この実施例を構成し動作させるための一連のステップを示す。しかし、同じ又は同等の機能及び順序は、異なる実施例によって達成されてもよい。
【００２６】
１．定義
便宜上、本開示の文脈で使用される特定の用語をここに集める。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２７】
本明細書において、用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片（望ましい生物学的活性を示し、即ち、タンパク質及び／又は他の分子の複雑な混合物中の標的抗原を優先的に認識してこの抗原に特異的に結合する限り）を含む。本開示に係る抗体は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）又はクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又は免疫グロブリン分子のサブクラスであり得る。
【００２８】
本明細書において、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、特定の方法による抗体の調製を必要とするものとして構築されるべきではない。ポリクローナル抗体は、典型的に異なるエピトープに向けられる異なる抗体を含むのに対して、各モノクローナル抗体は、それぞれ抗原上の単一の決定基（即ち、エピトープ）に向けられる。モノクローナル抗体は通常、短命の抗体産生Ｂ細胞を、不死細胞などの急速に増殖する細胞に融合させることによって産生される。得られた雑種細胞又はハイブリドーマは急速に増殖し、大量の抗体を産生するクローンを産生する。或いは、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法によっても産生され得る。重鎖及び／又は軽鎖の一部は、特定の種に由来する抗体、又は抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は同種であり、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分は、他の種に由来する抗体、他の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体、又はこれらの抗体の断片（望ましい生物学的活性を示す限り）における対応する配列と同一又は同種である。
【００２９】
用語「被験体」又は「患者」は、本発明で診断可能な人類を含む動物を指す。用語「被験体」又は「患者」は、１つの性別が特定されていない限り、オスとメスの両方の性別を指すことが意図される。従って、用語「被験体」又は「患者」は、本開示の治療方法から利益を得ることができる任意の哺乳動物を含む。
【００３０】
本明細書では、用語「同一」又は「パーセント同一性」とは、最も一致するように比較及び整列された場合、２以上の配列又はサブ配列が同じであるか、又は特定の割合のアミノ酸残基が同じであることを意味する。パーセント同一性を決定するために、配列は最適な比較目的のために整列される（例えば、ギャップは、第２アミノ酸配列との最適な整列のために、第１アミノ酸配列の配列に隙間を導入することができる）。次に、対応するアミノ酸位置のアミノ酸残基が比較される。第１配列の位置が第２配列の対応する位置と同じアミノ酸残基で占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（即ち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数×１００）。特定の実施形態において、２つの配列は、長さが同じである。従って、１００％の同一性は、例えば、２つの異なる分子の２０個の連続するアミノ酸残基を比較すると、２つの異なる分子の２０個の残基が同一であることを意味する。
【００３１】
本明細書で使用されるように、文脈が明らかに他に示されない限り、単数形「ａ」及び「ａｎ」は複数の言及を含む。
【００３２】
１．アドビリンに対するモノクローナル抗体
本発明は、アドビリンに対するモノクローナル抗体、このモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、及びその用途に関する。上記用途において、被験体の生物学的サンプル（例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）、腹腔液、血液、血清、血漿又は生体組織切片（例えば、皮膚）に存在する可能性があるアドビリンを検出することで、上記生物学的サンプルの宿主が末梢神経障害性疼痛に罹患しているか否かを確認する。
本開示の一態様によれば、ヒトアドビリンに特異的に結合するモノクローナル抗体が提供される。
【００３３】
所望のモノクローナル抗体を産生するために、まず、マウス、ラット又はウサギなどの動物を、卵白アルブミンと結合した適量の合成ペプチドで免疫化する。一例では、合成ペプチドは、ヒトアドビリンのヘッドピースドメインに対応するＫＮＱＮＱＥＬＰＥＤＶＮＰＡＫＫＥＮＹＬＳＥ（配列番号１）のアミノ酸配列を有する。他の例では、合成ペプチドは、マウスアドビリンのヘッドピースドメインに対応するＤＧＥＰＫＹＹＰＶＥＶＬＫＧＱＮＱＥＬ（配列番号３）のアミノ酸配列を有する。一般的に、動物を免疫するとき、アジュバントと抗原溶液とを一緒に混合する。本発明に有用なアジュバントの例には、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）及び水酸化アルミニウムアジュバントが含まれる。免疫化は一般に、主に抗原の静脈内、皮下、腹腔内、又は筋肉内注射によって実施される。免疫化の間隔は特に制限されない。免疫化は、数日から数週間、好ましくは２から３週間の間隔で、１から１０回、好ましくは２から５回実施することができる。免疫の結果、抗体価が吸光度レベルで２以上に達した時に、抗体価が０．０５〜１、好ましくは０．０５−０．５、より好ましくは０．０５に低下するまで、動物を２〜６か月間、好ましくは４〜６か月間、より好ましくは６か月間放置する。
【００３４】
さらに、数週間の間隔で複数回、好ましくは２〜５回の再免疫化を行う。最終免疫の数日後、好ましくは３〜５日後に、脾臓細胞と所属リンパ節を切除する。免疫化後、定期的に血液サンプルを採取し、遠心分離して血清を分離する。次に、得られた血清に対して、任意の適切な方法（ウエスタンブロット分析、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ又は免疫細胞化学（ＩＣＣ）アッセイが含まれるが、これらに限定されない）により抗体価を測定する。好ましい例では、ＥＬＩＳＡにより抗体価を測定する。次に、アドビリンに対して高い抗体価を示す動物に最終免疫を与える。
【００３５】
免疫した動物の脾臓細胞や所属リンパ節などから抗体産生細胞を調製する。抗体産生細胞の調製においては、組織破片及び赤血球を可能な限り除去することが好ましい。この目的のために、市販の赤血球除去剤を使用することができる。或いは、塩化アンモニウム及びトリスの緩衝液を調製して使用することができる。
【００３６】
このようにして調製された抗体産生細胞を直ちに骨髄腫細胞などの不死細胞と融合して、抗体を産生しながら半永遠に増殖し続けるハイブリドーマ細胞を産生する。マウスなどの動物に由来する一般的に入手可能な細胞株を使用することができる。本発明で使用される好ましい細胞株は、ＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを含む）中で生存すべきではなく、抗体産生細胞と融合した場合にのみそこで生存すべきである。骨髄腫細胞の例には、マウス骨髄腫細胞株（例えば、骨髄腫ＦＯ細胞）及びヒト骨髄腫細胞株（例えば、Ｋａｒｐａｓ  ７０７Ｈ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
細胞融合は通常、脾臓細胞又はリンパ節細胞を、細胞融合プロモーター（例えば、平均分子量が約２００〜２０，０００ダルトンのポリエチレングリコール（ＰＥＧ））の存在下で市販の骨髄腫細胞と混合することによって実施する。或いは、細胞融合は、エレクトロポレーションなどの電気刺激を利用する市販の細胞融合デバイスで実施することができる。融合後、得られた細胞を希釈し、ＨＡＴ培地で培養する。モノクローナル抗体を産生する目的で、培地中のアミノプテリンはデノボ経路を遮断する。融合していない骨髄腫細胞は、デノボ又はサルベージ経路によってヌクレオチドを生成できないので死亡する。融合していないＢ細胞は寿命が短いので死亡する。このように、Ｂ細胞−骨髄腫ハイブリッド（即ち、特定のハイブリドーマ）のみが生き残る。これらの細胞は抗体を産生し（Ｂ細胞の特性）、不死である（骨髄腫細胞の特性）。次に、各ウェルに１つの細胞しか含まれないように、インキュベートした培地をマルチウェルプレートに希釈する。次に、各ウェルの上清を収集し、アドビリンに対する抗体価の有無を調べる。確認の方法として、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ又はＲＩＡを使用することができる。抗体陽性のウェルが特定されると、細胞をアミノプテリンを含まないＨＴ培地で培養する。しばらく培養した後、培養上清中の抗体価を再度確認する。単一の細胞を得るために、最終的に選択された細胞をクローニングする。アドビリンに対して高い特異性を示すクローンを選択し、ハイブリドーマを確立するためにある程度増殖させる。
【００３８】
本開示の好ましい実施形態によれば、１つのハイブリドーマを選択して「ＹＣＣ−Ｓ１」と名付けた。選択されたハイブリドーマは、２９３Ｔ細胞で外因的に発現されたヒトアドビリンに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生することができる。
【００３９】
このようにして産生されたモノクローナル抗体は、任意の既知の方法によって単離又は調製することができる。例えば、抗体は、低血清濃度の培地でハイブリドーマを培養することによって得られた培養上清から調製することができる。或いは、ハイブリドーマを動物の腹腔に注射し、得られた腹部の滴を集めて抗体を調製することができる。抗体は、アフィニティーカラム、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどを使用する方法によって精製又は単離することができる。これらの既知の方法のいずれかは、適切に選択するか、又は組み合わせて使用することができる。
【００４０】
本開示の一実施形態によれば、選択した株によって産生されたモノクローナル抗体は、ヒトアドビリンに特異的に結合する。このように産生されたモノクローナル抗体は、ＩｇＧであり、以下「ｈＡｖｉｌ」と呼ばれる。本発明のｈＡｖｉｌは、重鎖及び軽鎖を有する。各重鎖又は軽鎖は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３で構成される可変領域を含む。本発明のｈＡｖｉｌは、配列番号２２、２４及び２６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３０、３２及び３４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む。或いは、抗アドビリン−モノクローナル抗体は、ＤＮＡクローニングによって産生され得る。ｈＡｖｉｌのアミノ酸配列に基づいて、ｈＡｖｉｌをコードするＤＮＡは、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用するなどの従来の手順を使用することによって容易に単離及び配列決定され得る。ハイブリドーマ細胞（例えば、ＹＣＣ−Ｓ１ハイブリドーマ）は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として機能する。単離された後、ＤＮＡを発現ベクターに入れ、それを宿主細胞（例えば、大腸菌細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞）にトランスフェクトすることにより、組換え宿主細胞で所望のモノクローナル抗体を合成することができる。
【００４１】
本開示の実施形態によれば、抗アドビリン−モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードする核酸は、それぞれ重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードする配列番号６、８及び１０のポリヌクレオチド配列を含む。抗アドビリン−モノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードする核酸は、それぞれ軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードする配列番号１４、１６及び１８のポリヌクレオチド配列を含む。
【００４２】
このように調製されたモノクローナル抗体及びこの抗体をコードするＤＮＡを使用して、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び／又はこれらに由来する抗体断片を調製することができる。
【００４３】
２．末梢神経障害性疼痛を診断する方法及び／又はキット
被験体が末梢神経障害性疼痛に罹患しているか否かを診断及び／又は検出する方法も本開示の範囲に含まれる。
【００４４】
本開示のいくつかの実施形態によれば、アドビリンは、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウス（多発性硬化症をモデル化し、ＩＢ４＋感覚ニューロンに関連する重度の末梢神経障害を示すマウス）の脳脊髄液に存在する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ７：４２３０４）。本開示の他の実施形態によれば、アドビリンは、オキサリプラチン処理マウス（化学療法剤によって誘発されたＩＢ４＋感覚ニューロンに関連する末梢神経障害性疼痛をモデル化するマウス）にも存在する。さらなる実施形態によれば、アドビリンは、座骨神経の慢性絞扼性損傷で処理されたマウス（ＩＢ４＋感覚ニューロンに関連する局所神経障害をモデル化するマウス）にも存在する（Ｃａｓａｌｓ−Ｄｉａｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２１７：８４−９５）。従って、アドビリンは、被験体が末梢神経障害性疼痛を有するか否かを診断するバイオマーカーとして使用することができる。
【００４５】
従って、本開示は、さらに、被験体が末梢神経障害性疼痛に罹患しているか否かを診断する方法を提供することを目的とする。上記診断は、上記被験体から得られる生物学的サンプルに基づき、上記方法は、免疫学的アッセイにおいて、生物学的サンプルにおけるアドビリンと本開示のモノクローナル抗体とで形成された複合体の存在を検出することを含む。上記複合体の形成は、被験体が末梢神経障害性疼痛に罹患していることを示す。
【００４６】
本発明の一実施形態によれば、上記のモノクローナル抗体を生物学的サンプルと反応させ、免疫測定法によって同定され得る複合体を形成することにより。アドビリンを検出することが可能である。上記免疫測定法には、ウエスタンブロット分析、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ又は免疫細胞化学（ＩＣＣ）アッセイが含まれるが、これらに限定されない。測定結果は、生物学的サンプルの宿主が末梢神経障害性疼痛に罹患しているか否かを判断するための指標として使用することができる。
【００４７】
上記目的を達成するために、生物学的サンプルは、末梢神経障害性疼痛が疑われる被験体から採取される。上記生物学的サンプルは、全血サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、腹水（又は腹腔液）、脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプル、それらの精製若しくは濾過された形態、又は皮膚組織切片のいずれかであり得る。早期発見の観点から、血液、血清、血漿、腹水、ＣＳＦ又は皮膚組織切片サンプルは好ましい。次いで、このように得られた生物学的サンプルを本開示のモノクローナル抗体と反応させる。末梢神経障害性疼痛の測定又は生物学的サンプルにおけるアドビリンレベルの測定は、従来のＥＬＩＳＡ又はドットブロット分析により実施され得る。
【００４８】
本開示の別の実施形態によれば、アドビリンに対するモノクローナル抗体は、アドビリン検出用の検出キットに使用できるか、又はアドビリン検出用の試薬として使用され得る。
【００４９】
従って、本発明者らは、生体サンプルにおけるアドビリンのレベルを高感度で測定できるアドビリン検出キットを設計した。本発明のキットは、少なくとも本開示のモノクローナル抗体と、ｈＡｖｉｌと試験体の生物学的サンプルにおけるアドビリンとの結合を検出するのに適した少なくとも１つの試薬と、上記キットに関連し、キットの使用方法を示す説明書とを含む。
【００５０】
本明細書に記載の生物学的サンプルは、全血サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、腹水（又は腹腔液）、脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプル、それらの精製若しくは濾過された形態、又は皮膚組織切片を含むが、これらに限定されない。上記キットに含まれる成分は、容器、モノクローナル抗体ｈＡｖｉｌ、生物学的サンプルを検出する試薬、及び説明書である。上記説明書は、容器に関連し、如何にモノクローナル抗体を使用して生物学的サンプルにおけるアドビリンを検出するかを示す。上記説明書は、パンフレット、ＣＤ、ＶＣＤ、ＤＶＤ、又はソフトウェアアプリケーションの形式であり得る。上記キットは、被験体におけるアドビリンの正常レベルを示す陰性対照をさらに含んでもよい。
【００５１】
３．末梢神経障害性疼痛を治療する方法
末梢神経障害性疼痛に罹患している被験体を治療する方法も本開示の範囲に含まれる。上記のように、アドビリンは、被験体が末梢神経障害性疼痛を有するか否かを診断するためのバイオマーカーとして使用できる。従って、試験体が末梢神経障害性疼痛を有すると診断されると、治療及び／又は療法が適用され得る。方法は、
試験体から生物学的サンプルを得るステップ（ａ）と、
免疫測定法において、上記生物学的サンプルと本開示のモノクローナル抗体とを混合させることで、上記生物学的サンプルにおけるアドビリンと上記モノクローナル抗体とを反応させ、複合体を形成するステップ（ｂ）と、
有効量の治療薬を被験体に投与し、末梢神経障害性疼痛を改善するステップ（ｃ）と、を含み、上記治療薬は、鎮痛剤、抗癲癇剤又は抗鬱剤である。
【００５２】
本開示の実施形態によれば、ステップ（ａ）において、生物学的サンプルは、全血サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、腹水（又は腹腔液）、脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプル、それらの精製若しくは濾過された形態、又は皮膚組織切片のいずれかであり得る。早期発見の観点から、血液、血清、血漿、腹水、ＣＳＦ又は皮膚組織切片サンプルは好ましい。
【００５３】
ステップ（ｂ）において、ステップ（ａ）で製造された生物学的サンプルを本開示のモノクローナル抗体と完全に混合することにより反応させる。生物学的サンプルにおけるアドビリンと本発明のモノクローナル抗体との複合体の形成は、従来のＥＬＩＳＡ又はドットブロット分析により確認される。
【００５４】
ステップ（ｃ）において、有効量の治療薬を被験体に投与して末梢神経障害性疼痛を改善する。治療薬は、鎮痛剤、抗癲癇剤又は抗鬱剤であり得る。本発明の方法に適した鎮痛剤の例には、アスピリン，イブプロフェン，デキシブプロフェン，ナプロキセン、フェノプロフェン、デクスケトプロフェン、フルルビプロフェン、ロキソプロフェン、インドメタシン、トルメチン、スリンダク、エトドラク、ケトロラク、ジクロフェナク、アセクロフェナク、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、フェニルブタゾン、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸及びトルフェナム酸などの非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、トラマドールなどのオピオイド、オキシコンチンなどのオキシコドンが含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法に適した抗癲癇剤の例には、ガバペンチン及びプレガバリンが含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法に適した抗鬱剤は、アミトリプチリン、ドキセピン及びノルトリプチリンが含まれるが、これらに限定されない。
次に、本発明は、限定ではなく実証の目的で提供される以下の実施形態を参照してより具体的に説明される。
【００５５】
実施例
材料及び方法
動物
すべての手順は、実験動物の使用に関するガイド（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）に従った。アドビリン＋／ｃｒｅマウス系統は、Ｄｒ．Ｆａｎ  Ｗａｎｇ（Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）からの贈り物であった。アドビリンｃｒｅ／ｃｒｅマウスをアドビリンノックアウト（ＫＯ）マウスとして使用した。これは、アドビリンのエキソン２がＣｒｅカセットにより置換され、ホモ接合ノックインマウスがアドビリンｍＲＮＡを発現しないからである（Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．,Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２００７）２７（５２）：１４４０４−１４４１４；Ｚｈｏｕ  Ｘ,ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００７）１０７（２０）：９４２４−９４２９．）。
【００５６】
行動研究において、アドビリン＋／ｃｒｅマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに１０世代に戻し交配させ、コンジェニック系統を構築した。行動研究で使用された野生型マウス（ＷＴ又はＡｖｉｌ＋／＋）及びアドビリンノックアウト（ＫＯ）マウス（アドビリンｃｒｅ／ｃｒｅ又はＡｖｉｌ−／−）は、異系交配したヘテロ接合体（Ａｖｉｌ＋／−）の子孫であった。
【００５７】
ＣＳＦサンプルのウエスタン分析において、ＥＡＥ誘導及びオキサリプラチン処理のためにＣ５７ＢＬ／６Ｊ及びＢＡＬＢ／ｃＢｙＪＮａｒｌマウスを使用した。特に記載がない限り、すべての研究において８〜１２週齢の成体マウスを使用した。
【００５８】
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデル
ＥＡＥ誘導において、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド（３５−５５）（商品名：ＭＯＧ３５−５５、ＭＤＢｉｏ，Ｔａｉｗａｎ）等量の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）とをＰＢＳ中で乳化した。マウスの後肢にＭＯＧ／ＣＦＡエマルション（ＭＯＧ３５−５５：１００μｇ／マウス及びＣＦＡ：４００μｇ／マウス）を皮下注射した後、免疫の当日及び２日後にそれぞれ２００ｎｇの百日咳毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＣＡ，ＵＳＡ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。毎日及び行動テスト、病理学的検査又はＣＳＦ収集の当日に臨床スコアを評価した。臨床スコアは、いくつかの変更が加えられたＷａｎｇ  ＩＣ  ｅｔ  ａｌによって開示された方法（Ｓｃｉ  Ｒｅｐ（２０１７）７：４２３０４）に従って行われた。
０：臨床徴候なし
０．５：尾が部分的に麻痺した。
１：尾が麻痺した。
２：下半身の運動失調
３：片方又は両方の後肢の不全対麻痺
４：片方又は両方の後肢の対麻痺
５：片方又は両方の後肢の対麻痺、かつ前肢の不全麻痺
６：死亡
【００５９】
脳脊髄液（ＣＳＦ）の収集
ウレタン（１３％ｗ／ｖ（生理食塩水）、１．５−２ｍｇ／ｇ、ｉ．ｐ．）でマウスを麻酔し、頸部皮膚を剃り、定位システム（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ，Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）に固定した。後頭部の下の皮膚を矢状切開し、次に、皮下組織と筋肉とを鉗子により鈍的剥離した。引っ張られたガラスキャピラリーを用いて硬膜を貫いて大槽を穿刺した。各マウスから約６μｌのＣＳＦを収集した後、直ちにドライアイス上のチューブ中で凍結させ、−８０°Ｃの冷凍庫に移した。ウエスタンブロッティングに使用されたすべてのＣＳＦサンプルには、目に見える血液汚染が観察されなかった。
【００６０】
マウスアドビリンに対するウサギポリクローナル抗体の製造
マウスアドビリンのヘッドピースドメイン（ｈｅａｄｐｉｅｃｅ  ｄｏｍａｉｎ）に対応するペプチド「ＤＧＥＰＫＹＹＰＶＥＶＬＫＧＱＮＱＥＬ」（配列番号３）を合成してオボアルブミンに結合させた。合成ペプチドをウサギに投与してアドビリンのポリクローナル抗体の生成を促進した。血清を収集し、対応する抗原と結合したカラムで精製した。皮膚組織の免疫染色において、非特異的結合を最小限に抑えるために、アドビリン抗体をアドビリンノックアウト（ＫＯ）マウス肝臓の０．５％（ｗ／ｖ）アセトン粉末で吸収した。
【００６１】
ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析に用いた一次抗体は、抗マウスアドビリン−ウサギポリクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）、抗ヒトアドビリン−マウスモノクローナル抗体、及び抗アルブミン−ウサギ抗体（１：１０００、ＧｅｎｅＴｅｘ，Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ，ＵＳＡ）であった。マウスＤＲＧ、マウス脊髄、及びヒト２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−３２１６）を収集し、プロテイナーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むＲＩＰＡバッファーでタンパク質を抽出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した細胞溶解物からの脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプル又はタンパク質を、ニトランスブロット電気泳動転写セル（Ｂｉｏ−ｒａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してＰＶＤＦ膜に転写した。上記膜を５％ミルク（ＴＢＳＴ中、０．１％ＴＷＥＥＮ２０含有１ｘＴＢＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で室温で１．５時間ブロックし、一次抗体と室温で１．５インキュベートした。上記膜をＴＢＳＴで３回洗浄（１０分間／回）し、適切な二次抗体（１：１００００，ＧｅｎｅＴｅｘ）：ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及びヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰとインキュベートした。すべての抗体はブロッキング溶液で希釈した。Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＥＣＬ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して増強化学発光（ＥＣＬ）を行い、ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ａｕｔｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＵＶＰ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して信号を検出した。ＣＳＦサンプルアにおけるドビリンの検出において、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  ＥＣＬ  ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＰＡ，ＵＳＡ）を使用してＥＣＬを行った。
【００６２】
プラスミドの構築
ヒト胎盤ｃＤＮＡから得られたヒトアドビリンの完全長ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６５７６）をｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）にクローニングした。ＰＣＲクローニングには、フォワードプライマー５'−ｇａｇｇｇａｔｃｃａｔｇｃｃｔｃｔｇａｃｃａｇｔｇｃｃｔｔｃａ−３'（配列番号３６）及び終止コドンを有するリバースプライマー５'−ｃｇｃｔｃｔａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔａｇａａａａｇｃｃｃｃｔｔ−３'（配列番号３７）が関与した。アドビリンｃＤＮＡをｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ１４発現ベクター（Ｓｉｇｍａ）にサブクローニングした。
【００６３】
細胞培養及びトランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）中で維持した。プラスミドのトランスフェクションでは、コンフルエンス＞９０％に達した時に、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。ＤＲＧニューロンの初代培養をＣｈｅｎｇ  ＣＭ，ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ（２０１０）５（４）：７１４−７２４）に記載のプロセスに従って実施した。簡単に言えば、マウス（６−１２週齢）の全てのＤＲＧを摘出して収集し、２段階消化した。まず、０．１２５％のＩ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）含有ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３７°Ｃで６０分間処理し、さらに、０．１２５％のトリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）含有ＨＢＳＳを用いて３７°Ｃで２０分間処理した。完全に消化されたＤＲＧ細胞を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄した後、粉砕し、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）とラミニン（両方ともＳｉｇｍａ）でコーティングされたカバーガラスに播種した。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及びペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ中で培養し、５％ＣＯ２、３７°Ｃで培養した。
【００６４】
疼痛行動
寒冷異痛を無害温度でのコールドプレートテストによって評価した（Ｔｏｙａｍａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ  １２０（２）：４５９−４７３）。コールドプレート（３５１００，Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）の温度を１５°Ｃに設定し、５分間安定させた。次に、マウスをコールドプレート上に置き、マウスが立ってしまうのを防ぐために、高さ３．５ｃｍのアクリルプレキシグラスチャンバー内に入れた。行動を１５０秒間記録した。記録期間中のフリック（ｆｌｉｃｋｉｎｇ）、シェイク（ｓｈａｋｉｎｇ）、リック（ｌｉｃｋｉｎｇ）、フリンチ（ｆｌｉｎｃｈｉｎｇ）、ガード（ｇｕａｒｄｉｎｇ）、前足持ち上げ、後足舐め、及び体のジャンプ（ｊｕｍｐｉｎｇ）又はシェイク（ｓｈａｋｉｎｇ）を計数することによって生体防御行動を評価した。また、最初の生体防御反応までの潜時を確定した。薬物注射前をベースラインとして、２、４、及び１２日後にオキサリプラチンを投与したマウス（１５ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）の行動を記録した。なお、侵害行動を計数する実験者は、マウスの遺伝子型を知っていなかった。
【００６５】
ＣＣＩ減圧モデル
慢性絞扼性損傷（ＣＣＩ）モデルを（Ｔｓｅｎｇ  ＴＪ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２０４（２）：５７４−５８２；Ｌｏｒｅｎｚ  ＪＥ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ａｎｔｉｏｘｉｄ  Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ  ２１（１０）：１５０４−１５１５）の記載に従って構築した。簡単に言えば、マウスを２％イソフルランで麻酔した。左坐骨神経を大腿中央レベルで露出させ、６−０絹製縫合糸を使用して１ｍｍの距離を離れた３つの結紮糸となるように緩く結紮した。次に、５−０絹製縫合糸を使用して皮膚の切開を縫い合わせた。坐骨神経収縮後の１４日目に、マウスに麻酔をかけ、緩んだ結紮糸をすべて注意深く取り除くことにより減圧処理を行った。
【００６６】
免疫組織化学アッセイ及び画像定量化
ＣＣＩ手術の有無にかかわらず成体マウス（８−１２週齢）をウレタン（１３％ｗ／ｖ（生理食塩水中）、１．５−２ｍｇ／ｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔し、心臓血管系を介して、通常の生理食塩水及び４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）固定液（０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４））をこの順で灌流した。脊髄を収集し、４°Ｃで一晩後固定し、３０％ショ糖溶液中で一晩凍結保護し、凍結切片の作製のためにＯＣＴ（Ｌｅｉｃａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で凍結した。凍結切片組織を使用前に−８０°Ｃで保存した。切片をＴＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）で洗浄した後、ブロッキング溶液（５％ＢＳＡ、０．１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００（ＴＢＳ中）と共に室温で１時間インキュベートした。一次抗体であるヤギ抗ＣＧＲＰ（Ｓｅｒｏｔｅｃ，ＵＫ）、アドビリン及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ結合二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をブロッキング溶液中で希釈した。切片を一次抗体と共に４°Ｃで一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄した後、二次抗体と共に室温で９０分間インキュベートした。洗浄した後、切片をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で封入した。ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により免疫組織化学画像を得た。ＩｍａｇｅＪにより脊髄後角におけるアドビリンの免疫反応性を測定した。バックグラウンドを差し引いた後、同側の後角（ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ  ｄｏｒｓａｌ  ｈｏｒｎ）と対側の後角（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ  ｄｏｒｓａｌ  ｈｏｒｎ）の比率を計算した。
【００６７】
ヒトアドビリンのモノクローナル抗体の製造
免疫原の調製のために、ヒトアドビリンのヘッドピースドメインに対応する合成ペプチド「ＫＮＱＮＱＥＬＰＥＤＶＮＰＡＫＫＥＮＹＬＳＥ」（配列番号１）のＮ末端にアミノ酸「システイン」を付加し、担体オボアルブミンに結合した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫に使用し、一次注射（０．１ｍｇの抗原及び完全アジュバント）及びブースター注射（０．１ｍｇの抗原及び不完全アジュバント）を実施した。ポリクローナル血清の検証後、最終ブースター（０．０５ｍｇの抗原）を実施し、次に、ハイブリドーマ細胞を作り、限界希釈によりサブクローニングし、ＥＬＩＳＡにより別の合成ペプチド「ＬＫＮＱＮＱＥＬＰＥＤＶＮＰＡＫＫＥＮＹＬＳＥＱＤ」（配列番号２）を使用してスクリーニングした。ウエスタンブロットにより検証されたクローンをヒトアドビリンの発現プラスミドで確認した。
【００６８】
本発明のヒトアドビリンモノクローナル抗体の成分並びにそれぞれの核酸及びアミノ酸配列を表１、２に示す。
【００６９】
[表１]
表１：抗アドビリン抗体の重鎖の配列
2021514660.tif 000003
【００７０】
[表２]
表２：抗アドビリン抗体の軽鎖の配列
2021514660.tif 000004
【００７１】
実施例１：アドビリンをバイオマーカーとして末梢神経障害を検出する。
１．１アドビリンはＥＡＥマウスのＣＳＦに存在する。
発明者の以前の研究では、軸索再生中にアドビリンが神経突起の成長円錐に位置し、培養されたＤＲＧニューロンにおいて、神経突起退縮後に、アドビリン関連新生焦点接着タンパク質複合体はしばしば「脱落」することが発見された。従って、イソレクチンＢ４＋（ＩＢ４＋）感覚軸索の神経損傷（即ち、末梢神経障害）は、アドビリン関連新生焦点接着タンパク質が成長円錐から脱落することを引き起こし、最終的にはＣＳＦ又は血漿でアドビリンが検出され得るものと推測された。
【００７２】
上記推測を証明するために、ＩＢ４＋感覚ニューロンに関連する重度の末梢神経障害を示す構築された多発性硬化症マウスモデル、即ち、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスモデルを使用した。「材料及び方法」のセクションで説明された手順に従ってＥＡＥモデルを構築し、尾と手足の麻痺の程度によってマウスのＥＡＥ誘発症状を評価し、疾患の重症度の臨床スコアとして使用し、神経損傷の程度を反映した。ナイーブマウスとＥＡＥマウスのＣＳＦをそれぞれ収集し、ウエスタンブロットによってアドビリンの存在を分析した。
【００７３】
予想通り、アドビリンタンパク質は回復期のＥＡＥマウスのＣＳＦで検出可能であり、臨床スコアが３以上のマウスが占める割合が高かった。なお、回復期はＥＡＥモデルの３０日後と定義された。しかし、アドビリンは、ナイーブな健康マウスではほとんど検出されなかった（図１）。定量化結果を表３に示す。
【００７４】
[表３]
表３：ナイーブマウス及びＥＡＥマウスのＣＳＦにおけるアドビリン発現のウエスタンブロット分析の定量化。
2021514660.tif 000005
【００７５】
本実施例の結果により、末梢神経障害は、アドビリン関連新生焦点接着タンパク質が成長円錐から脱落することを引き起こし、最終的には負傷した被験体のCSFでアドビリンが検出され得る推測が実証された。
【００７６】
１．２アドビリンは化学療法誘発性寒冷異痛に罹患している動物のＣＳＦに存在する。
化学療法誘発性神経障害性疼痛を模擬するために、試験動物に単一用量のオキサリプラチン（１５ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）を投与して冷感異痛を誘発し、最初の生体防御症状までの潜時を記録した。ナイーブマウスとオキサリプラチン誘発性寒冷異痛マウスの両方からＣＳＦをそれぞれ収集し、ウエスタンブロットによりアドビリンの存在を分析した。
【００７７】
実施例１．１の発見と同様に、オキサリプラチン処理の２又は４日後に低温刺激に対して短い潜時（＜６５秒）を示すマウスではアドビリンが検出されたが、低温刺激に対して長い潜時を示すマウスではアドビリンが検出されなかった（図２）。
【００７８】
１．３アドビリンは完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）誘発性炎症性疼痛に罹患している動物のＣＳＦには存在しない。
アドビリンが末梢神経障害性疼痛のみのバイオマーカーであることを確認するために、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を試験動物に注射して、炎症性疼痛を引き起こした。
次に、各動物からＣＳＦを収集してアドビリンの存在を検出した。比較のために、オキサリプラチン処理動物（例えば、実施例１．２の動物）からのＣＳＦも収集して分析した。
【００７９】
図３に示すように、アドビリンはＣＦＡ誘発性炎症性疼痛に罹患している動物のＣＳＦでは検出されなかった。
【００８０】
１．４アドビリンは座骨神経の慢性絞扼性損傷に罹患している動物のＣＳＦに存在する。
本実施例において、坐骨神経の圧迫による局所神経損傷に関連する重度の神経障害性疼痛をモデル化したマウスを使用して、アドビリンがそのような疼痛に寄与したか否かを検証した。簡単に言えば、マウスの坐骨神経を外科的に結紮（又は圧迫）することで慢性絞扼性損傷（ＣＣＩ）を生じさせた。ＣＣＩ後の１４日目に、外科的減圧を行い、坐骨神経の結紮を除去した。ＣＣＩマウス及び対照マウスにおけるＣＳＦを収集し、ウエスタンブロットによりアドビリンの存在を分析した。
【００８１】
図４のデータに示されるように、アドビリンはＣＣＩマウスでは検出されたが、ＣＣＩ減圧マウスでは検出されなかった。
【００８２】
さらに、ナイーブマウス、ＣＣＩマウス及びＣＣＩ減圧マウスにおけるアドビリン分布も確認した。図５に示すように、坐骨神経圧迫により、９日目に同側後角におけるアドビリンの発現は顕著に増加し、減圧の２週間後にナイーブマウスの正常な基礎レベルに戻った。
実施例１．１、１．２、１．３及び１．４のデータから分かるように、アドビリンは、末梢神経障害性疼痛を診断するための特異性バイオマーカーとして適用できる。
【００８３】
実施例２：ヒトアドビリンのモノクローナル抗体の特異性の確認
ヒトサンプルの特異的測定を達成するために、ヒトアドビリン（以下「ｈＡｖｉｌ」）ためのモノクローナル抗体を「材料と方法」のセクションに記載の手順に従って製造した。ヒトアドビリンクローンの外因性発現と結合することによってｈＡｖｉｌの特異性を確認した（図６）。さらに、ｈＡｖｉｌは、オキサリプラチンで治療された患者から収集されたヒトＣＳＦにおけるアドビリンを特異的に検出することができる（図７）。
【００８４】
上記実験のデータにより、ｈＡｖｉｌは、ヒトアドビリンに非常に特異的であるとともに、末梢神経障害性疼痛に罹患している被験体から収集されたＣＳＦにおけるアドビリンの臨床的検出に適用できることが確認された。
【００８５】
実施形態の上記の説明は、例としてのみ与えられ、当業者によって様々な修正がなされ得ることが理解されるであろう。上記の態様、実施例、及びデータは、本発明の例示的な実施形態の構造及び使用の完全な説明を提供する。本発明の様々な実施形態が、ある程度の特殊性を伴って、又は１つ以上の個々の実施形態を参照して上記で説明されたが、当業者は、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、開示された実施形態に多数の変更を加えることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年11月4日(2020.11.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アドビリン（ａｄｖｉｌｌｉｎ）のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
配列番号２２、２４及び２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号３０、３２及び３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
を含むモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記重鎖可変領域は、配列番号６、８及び１０のポリヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされ、
前記軽鎖可変領域は、配列番号１４、１６及び１８のポリヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記抗体は、ＩｇＧ又はＩｇＭである、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１に記載のモノクローナル抗体と、説明書とを含むキットであって、
前記説明書は、前記キットに関連し、前記キットの使用方法を示す、キット。
【請求項５】
被験体が末梢神経障害性疼痛に罹患しているか否かを診断する方法であって、
前記診断は、前記被験体の生物学的サンプルに基づいて行い、
前記方法は、免疫学的アッセイにおいて前記生物学的サンプルにおけるアドビリンと請求項１に記載のモノクローナル抗体とで形成された複合体の存在を検出するステップを含み、
前記複合体の形成は、前記被験体が末梢神経障害性疼痛に罹患していることを示す、方法。
【請求項６】
前記生物学的サンプルは、脳脊髄液、腹腔液、血液、血清、血漿、又は生体組織切片である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記末梢神経障害性疼痛は、感覚ニューロンの損傷に起因する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記感覚ニューロンは、イソレクチンＢ４、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、サブスタンスＰ又はニューロフィラメント２００に特異的に結合する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫学的アッセイは、ウエスタンブロット分析、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ、又は免疫細胞化学（ＩＣＣ）アッセイである、請求項５に記載の方法。
【国際調査報告】
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