(57)【要約】本発明は治療用オリゴヌクレオチド分析及び探索の分野に関し、かつ本発明は、オリゴヌクレオチド治療法の探索、製造、品質保証、治療法開発、及び患者モニタリングにおいて使用することができる配列に基づく品質情報を提供する、修飾オリゴヌクレオチドのプライマーベースの並列シーケンシングのための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＮＡ又は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの２’糖修飾オリゴヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列をシーケンシングするための方法であって、次の工程：
ＩＩＩ．前記２’糖修飾オリゴヌクレオチドからポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成を行って、前記２’糖修飾オリゴヌクレオチドの相補体を含む核酸配列を生成することと；
ＩＶ．工程ＩＩで得られた前記第１ストランド合成生成物のプライマーベースのシーケンシングを行うことと
を含む、方法。
【請求項２】
工程Ｉの後かつ工程ＩＩの前に、工程Ｉの前記第１ストランド生成物が、ＰＣＲ増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ＩＩが、前記プライマーベースのシーケンシングの前に、前記第１ストランド合成生成物又はＰＣＲ増幅生成物のクローン増幅を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
修飾オリゴヌクレオチド試料中に存在する、修飾オリゴヌクレオチド種の集団内の複数の修飾オリゴヌクレオチド種の並列シーケンシングのための方法である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成の前に、前記修飾オリゴヌクレオチドの３’領域に相補的な第１プライマーが、前記５’−３’第１ストランド合成の開始のため前記修飾オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成の前に、前記修飾オリゴヌクレオチドが、自己プライミング捕捉プローブであるか又は第１プライマー結合部位を含むかのいずれかである３’捕捉プローブに連結される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１ストランド合成工程の前に、第１プライマーが、前記ポリメラーゼ媒介第１ストランド合成の開始のため前記３’捕捉プローブにハイブリダイズされる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記修飾オリゴヌクレオチドへの前記３’捕捉プローブの連結後かつ第１ストランド合成の前に、ライゲーション産物が、例えばゲル精製により、又は非連結型３’捕捉プローブの酵素的分解により精製される、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＣＲ工程が、ＰＣＲプライマー対を用いて実施され、ここで、前記ＰＣＲプライマーの１つが前記３’捕捉プローブに特異的であり、第２のＰＣＲプライマーが、前記修飾オリゴヌクレオチドの５’領域などの前記修飾オリゴヌクレオチドに特異的である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記シーケンシング工程ＩＩが、クローン増幅プライマーを用いる工程Ｉの前記第１ストランド生成物の前記クローン増幅を含み、ここで、前記クローン増幅プライマーの１つが前記３’捕捉プローブに特異的であり、第２のクローン増幅プライマーが、前記修飾オリゴヌクレオチドの５’領域などの前記修飾オリゴヌクレオチドに特異的である、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１ストランド合成工程Ｉの後に、第１ストランド合成生成物の精製が行われた場合、アダプタープローブが、前記第１ストランド合成生成物の３’末端で連結される、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＣＲ工程が、一対のＰＣＲプライマーを用いて実施され、ここで、ＰＣＲプライマーの一方が前記３’捕捉プローブに特異的であり、他方のＰＣＲプライマーがアダプタープローブに特異的である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記シーケンシング工程ＩＩが、前記３’捕捉プローブ及びアダプタープローブにそれぞれ特異的なクローン増幅プライマーを用いる工程Ｉの第１ストランド合成生成物の前記クローン増幅を含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
第１ストランド合成後、前記第１ストランド合成生成物が、ポリアデニル化される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
第２ストランドが、ポリＴプライマーを用いて前記第１ストランドから合成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリＴプライマーが、ＰＣＲプライマー結合部位及び／又はクローン増幅プライマー結合部位を更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＣＲ工程が、前記３’捕捉プローブに特異的なプライマーと、前記ポリＴプライマー又は前記ポリＴプライマーにおける前記ＰＣＲプライマー結合部位に特異的なＰＣＲプライマーのいずれかと、を用いて行われる、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＣＲ工程が、前記修飾オリゴヌクレオチドの３’領域などの修飾オリゴヌクレオチドに特異的なプライマーと、前記ポリＴプライマー又は前記ポリＴプライマーにおける前記ＰＣＲプライマー結合部位に特異的なＰＣＲプライマーのいずれかと、を用いて行われる、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記シーケンシング工程が、クローン増幅を含み、ここで、前記クローン増幅プライマーの１つが、前記３’捕捉プローブ又は前記修飾オリゴヌクレオチド（前記修飾オリゴヌクレオチドの３’領域など）に特異的であり、第２のクローン増幅プライマーが、前記ポリＴプライマーに特異的である、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＰＣＲプライマーが、フローセル捕捉プローブ結合部位などのクローン増幅プライマー結合部位を更に含み、ここで、前記シーケンシング工程が、前記クローン増幅プライマー結合部位に相補的なフローセル結合プライマーなどのクローン増幅プライマーを用いるクローン増幅を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１ストランド合成の前に、前記ポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成の前に、前記修飾オリゴヌクレオチドが、プライマー結合部位を含む５’捕捉プローブに連結される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記修飾オリゴヌクレオチドが５’リン酸基を含むか、又は前記５’捕捉プローブの連結の前に前記修飾オリゴヌクレオチドの５’末端がリン酸化されるか、のいずれかである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＰＣＲ工程が、前記修飾オリゴヌクレオチドの前記３’領域などの前記修飾オリゴヌクレオチドに特異的な第１のＰＣＲプライマーと、前記５’捕捉プローブに特異的な第２のＰＣＲプライマーと、を用いて行われる、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
第１ストランド合成の前に、３’捕捉プローブが、前記修飾オリゴヌクレオチドの５’末端への前記５’捕捉プローブの前記連結の前、後、又は同時のいずれかで、前記修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に連結され、ここで、前記３’捕捉プローブが、自己プライミング捕捉プローブであるか又は第１のプライマー結合部位を含むかのいずれかである、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２５】
第１ストランド合成の前に、前記ライゲーション産物が、例えばゲル精製により、又は非連結型５’捕捉プローブの、及び使用される場合は３’捕捉プローブの、酵素的分解により精製される、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
第１ストランド合成が、前記３’捕捉プローブとハイブリダイズした第１のプライマーを用いて、又は前記自己プライミング３’捕捉プローブから、開始される、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＰＣＲ工程が、前記３’捕捉プローブに特異的な第１のＰＣＲプライマーと、前記５’捕捉プローブに特異的な第２のＰＣＲプライマーと、を用いて行われる、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰＣＲプライマーがクローン増幅プライマー結合部位（フローセルプライマー結合部位など）を含み、前記シーケンシング工程がクローン増幅を含む、請求項２３又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記シーケンシング工程ＩＩが、クローン増幅プライマーを用いる工程Ｉの前記第１ストランド生成物の前記クローン増幅を含み、ここで、前記クローン増幅プライマーの１つが前記３’捕捉プローブに特異的であり、第２のクローン増幅プライマーが、前記修飾オリゴヌクレオチドの５’領域などの前記修飾オリゴヌクレオチドに特異的である、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記３’捕捉プローブが、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて前記修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に連結される、請求項６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記５’捕捉プローブが、Ｔ４−ＲＮＡリガーゼ又はＴ４−ＲＮＡリガーゼＩＩを用いて前記修飾オリゴヌクレオチドの５’末端に連結される、請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記シーケンシング工程ＩＩがクローン増幅を含み、前記クローン増幅プライマーが、固体支持体（例えば、フローセル）に結合されるか、又はエマルション滴内に区画化される、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記固相増幅が、固相ブリッジ増幅である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記プライマーベースのシーケンシング方法が、合成法によるシーケンシングを用いて行われる、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記プライマーベースのシーケンシング方法が、循環可逆的終結法（ｃｙｃｌｉｃ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ：ＣＲＴ）である、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記シーケンシングが、超並列シーケンシングなどの並列シーケンシング方法である、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記プライマーベースのシーケンシングが、クローンブリッジ増幅（例えば、イルミナシーケンシング−可逆的色素ターミネータ）、又はクローンエマルションＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ  ４５４、ＧＳ  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＳＯＬｉＤ４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ）を用いて行われる、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１ストランド合成が、ポリメラーゼ及びポリエチレングリコール又はプロピレングリコールの存在下において行われる、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
第１ストランド合成に使用される前記ポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ又はＶｏｌｃａｎｏ２Ｇポリメラーゼ又はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素である、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記シーケンシング工程が、クローン増幅プライマーを用いる前記ＰＣＲ増幅生成物の前記クローン増幅を含む、請求項２〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記２’糖修飾オリゴヌクレオチドが、２’糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも２つの近接する２’糖修飾ヌクレオシドを含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも２つの近接する２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、前記修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に位置する少なくとも２つ又は少なくとも３つの近接する２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシドなどの、前記修飾オリゴヌクレオチドの３’に位置する少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも２つの近接するＬＮＡヌクレオチド又は少なくとも３つの近接するＬＮＡヌクレオチドを含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、１つ以上のＬＮＡヌクレオチドが３’末端に位置することを含む、請求項１〜４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、ＬＮＡホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、ＬＮＡギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）又はＬＮＡミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）などのＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのＬＮＡ−Ｔヌクレオシド又は少なくとも１つのＬＮＡ−Ｃヌクレオシドを含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、１つ以上のＬＮＡヌクレオシド、及び１つ以上の２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドなどの１つ以上の２’置換ヌクレオシドを含む、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー、混合ウィング（ｍｉｘｅｄ  ｗｉｎｇ）ギャップマー、交互フランク（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ｆｌａｎｋ）ギャップマー、又はＬＮＡギャップマーからなる群より選択される、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、ミクスマー又はトータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）である、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、ＧａｌＮＡｃ複合体などの複合基（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｇｒｏｕｐ）を含む、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
修飾オリゴヌクレオチドの集団、例えば単一のオリゴヌクレオチド合成バッチ又は複数のオリゴヌクレオチド合成バッチのプールにおいて、純度又は非均一性の程度を決定するための方法である、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
修飾オリゴヌクレオチドの集団、例えば修飾オリゴヌクレオチド合成バッチ又は複数のオリゴヌクレオチド合成バッチのプールに存在する、前記修飾オリゴヌクレオチドの前記配列又は優勢な配列を決定するための方法である、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、修飾オリゴヌクレオチドの集団、例えば同じオリゴヌクレオチド合成操作（若しくはバッチ）又はオリゴヌクレオチド合成操作（若しくはバッチ）のプールからの、修飾オリゴヌセロチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｅｌｏｔｉｄｅ）の集団である、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、細胞、又は組織若しくは生体から単離された修飾オリゴヌクレオチドの集団である、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
標的組織又は標的細胞に優先的に標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを同定するための方法であって、ここで、該方法が、次の工程：
（ｉ）修飾オリゴヌクレオチドの混合物を哺乳動物などの生体に投与することであって、ここで、修飾オリゴヌクレオチドの前記混合物の各メンバが特有の核酸塩基配列を含む、投与することと；
（ｉｉ）前記修飾オリゴヌクレオチドが、前記哺乳動物内に分配される、及び／又は前記細胞によって取り込まれるようにすることと；
（ｉｉｉ）所望の標的組織又は所望の標的細胞を含む、前記哺乳動物由来の１つ以上の組織又は細胞から修飾オリゴヌクレオチドの集団を単離することと；
（ｉｖ）前記請求項のいずれか一項に記載の方法を実施することと；これにより、
（ｖ）前記哺乳動物の前記所望の標的組織又は細胞に豊富である１つ以上の修飾オリゴヌクレオチド配列を同定することと
を含む、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
標的細胞などの細胞によって優先的に取り込まれる修飾オリゴヌクレオチドを同定するための方法であって、ここで、該方法が、次の工程：
（ｉ）修飾オリゴヌクレオチドの混合物を細胞に投与することであって、ここで、修飾オリゴヌクレオチドの前記混合物の各メンバが特有の核酸塩基配列を含む、投与することと；
（ｉｉ）前記細胞を一定期間インキュベートすることと；
（ｉｉｉ）修飾オリゴヌクレオチドの集団を前記細胞から単離することと；
（ｉｖ）請求項１〜５９のいずれか一項に記載の方法を実施することと；これにより、
（ｖ）前記細胞に豊富である１つ以上の修飾オリゴヌクレオチド配列を同定することと；
を含む、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、修飾オリゴヌクレオチドの集団を含み、ここで、修飾オリゴヌクレオチドの前記集団の各メンバがヌクレオチドのアプタマ領域を含む、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、修飾オリゴヌクレオチドの集団を含み、ここで、修飾オリゴヌクレオチドの前記集団の各メンバが異なる複合基を含む、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記５’捕捉プローブが、請求項６５〜７６のいずれか一項に規定のものである、請求項２１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
５’リン酸化修飾オリゴヌクレオチドの５’末端へのＴ４−ＲＮＡリガーゼ又はＴ４−ＲＮＡリガーゼＩＩ媒介連結のための、５’捕捉プローブであって、３’−５に：
ＶＩＩ．第１の領域であって、３’末端ＲＮＡヌクレオシド、又は３’末端−ＯＨ基を有するＲＮＡヌクレオチドの３’末端領域を含む、領域と；
ＶＩＩＩ．ヌクレオチドの第２の領域であって、プライマー結合部位、例えばＰＣＲプライマー結合部位（又は第２ストランド合成のためのプライマー部位）の前記相補体を含む、領域と；
ＩＸ．第３の領域であって、
ｄ．ヌクレオチドの配列、又は、
ｅ．ポリメラーゼのリードスルーを阻害するリンカー領域、又は、
ｆ．５’リン酸塩以外の５’末端基を含む、領域と；
Ｘ．ヌクレオチドの第４の領域であって、
ｃ．前記第３の領域と共有結合しているか、又は、
ｄ．前記第３の領域が５’−リン酸以外の５’末端基である場合、前記第４の領域と不連続であるか、のいずれかである、領域と；
ＸＩ．ヌクレオチドの第５の領域であって、前記修飾オリゴヌクレオチドの５’領域に相補的である、又は任意に縮重ヌクレオチドの領域であり得る、領域と；
ＸＩＩ．５’ブロッキング基、すなわち５’リン酸塩以外の５’基と；を含み、
ここで、前記第２の領域及び前記第４の領域が、前記第２の領域と前記第４の領域との間に二本鎖を形成することができるヌクレオチドの相補的領域を含む、５’捕捉プローブ。
【請求項６６】
前記第１の領域が、２〜２０のＲＮＡヌクレオチド、例えば３〜１０のＲＮＡヌクレオチドを含む、請求項６５に記載の５’捕捉プローブ。
【請求項６７】
前記第２の領域（ＩＩ）が、シーケンシングプライマー結合部位及び／又はフローセル結合部位を含む、請求項６５又は６６に記載の５’捕捉プローブ。
【請求項６８】
前記第２の領域（ＩＩ）が、分子バーコード領域を更に含む、請求項６５〜６７のいずれか一項に記載の５’捕捉プローブ。
【請求項６９】
前記第２の領域（ＩＩ）が、シーケンシング反応バーコード領域を更に含む、請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の５’捕捉プローブ。
【請求項７０】
前記第２の領域（ＩＩ）が、シーケンシングプライマー結合領域を更に含む、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の５’捕捉プローブ。
【請求項７１】
第１ストランド合成中におけるポリメラーゼのリードスルーを妨げるリンカー領域ＩＩＩを含む、請求項６５〜７０のいずれか一項に記載の５’捕捉プローブ。
【請求項７２】
前記リンカー領域ＩＩＩが、非ヌクレオチドリンカー、例えばＣ６−３２ポリエチレングリコールリンカー、例えばＣ１８ポリエチレングリコールリンカー、又はアルキルリンカーを含むか、あるいは逆ヌクレオシド結合（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）を含むヌクレオチドの領域である、請求項７１に記載の５’捕捉プローブ。
【請求項７３】
領域ＩＩＩが、領域Ｉ及びＩＩを含む前記第１ストランド並びに領域ＩＶ及びＶを含む第２ストランドである二本鎖の５’捕捉プローブをもたらす、不連続部を含むか、又は不連続部である、請求項７１に記載の５’捕捉プローブ。
【請求項７４】
領域Ｖが、修飾オリゴヌクレオチドの前記５’領域に相補的なヌクレオチドの所定の領域を含む、請求項６５〜７３のいずれか一項に記載の５’捕捉プローブ。
【請求項７５】
領域Ｖが、ヌクレオチドの縮重配列を含む、請求項６５〜７３のいずれか一項に記載の５’捕捉プローブ。
【請求項７６】
領域Ｖの前記５’末端が、５’−ＦＡＭなどの蛍光標識を含む、請求項６５〜７５のいずれか一項に記載の５’捕捉プローブ。
【請求項７７】
修飾オリゴヌクレオチドの前記捕捉に使用するためのキットであって、前記キットは３’捕捉プローブ及び５’捕捉プローブを含み、ここで、前記５’捕捉プローブが請求項６５〜７６のいずれか一項に記載のものである、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は治療用オリゴヌクレオチド分析の分野及び探索に関し、そして、オリゴヌクレオチド治療法の探索、製造、品質保証、治療法開発、及び患者モニタリングにおいて使用することができる配列に基づく品質情報を提供する、修飾オリゴヌクレオチドのプライマーベースの並列シーケンシングの方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景
欧州特許出願公開第１９１４３１７Ａ１号（特許文献１）は、約８〜５０ヌクレオチド長の短い核酸配列の定性的及び定量的検出のための方法を開示している。この方法は、オーバーラップする捕捉プローブとポリメラーゼ伸長とのハイブリダイゼーションを用いる。ＥＰ’３１７（特許文献１）の例ではＤＮＡホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＧ３１３９を使用する。
【０００３】
国際公開第０１／３４８４５Ａ１号（特許文献２）は、体液又は抽出物からホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを定量化する方法を開示している。この方法は、オリゴヌクレオチドに部分的にハイブリダイズする捕捉プローブ、次いで捕捉プローブ／オリゴヌクレオチドハイブリッドの酵素標識、次いで標識の検出を用いる。ＷＯ’８４５（特許文献２）の例ではＤＮＡホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ  ２３０２を使用する。
【０００４】
Ｃａｉｆｕら、「ＮＡＲ  ３３」（２００５年）第Ｅ１７９頁（非特許文献１）は、捕捉プローブ／ＰＣＲに基づく増幅システムを用いたマイクロＲＮＡなどの未修飾の短いオリゴヌクレオチドの検出及び定量化を開示している。
【０００５】
Ｆｒｏｉｍら、「ＶＡＲ」（１９９５年）第４２１９〜４２２３頁（非特許文献２）は、ＵＶ検出を用いるキャピラリ電気泳動法によるホスホロチオエートアンチセンスＤＮＡシーケンシングのための方法を開示している。
【０００６】
Ｔｒｅｍｂｌａｙら、「Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ」（２０１１年）第３巻、第５号（非特許文献３）は、オリゴヌクレオチド治療薬の特異的決定のため、及び定量的ＰＣＲを実施する複合混合物中における個々の代謝産物を特異的に決定する使用のための、二重連結ベースのハイブリダイゼーションアッセイを開示している。
【０００７】
国際公開第２００７／０２５２８１号（特許文献３）は、捕捉プローブハイブリダイゼーション、連結、及び増幅を用いて短いオリゴヌクレオチドを検出する方法を開示している。
【０００８】
Ｃｈｅｎｇら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」（２０１３年）第ｅ６７頁（非特許文献４）は、脳浸透性アプタマを同定するためのインビボｓｅｌｅｘ法を開示している。アプタマは、第１ストランド合成のためにＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）又はＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素を用いるサンガーシーケンシング又はイルミナシーケンシングを用いて配列決定した、２’フルオロ修飾ホスホジエステルオリゴヌクレオチドである。
【０００９】
Ｃｒｏｕｚｉｅｒら、「ＰＬｏＳ  ＯＮＥ」（２０１２年）第ｅ３５９９００頁（非特許文献５）は、ヌクレアーゼ耐性ＲＮＡアプタマを生成するためにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩを用いる、ロックされた核酸ヌクレオチドの効率的な逆転写に言及している。Ｃｒｏｕｚｉｅｒらは、サンガーベースのシーケンシングを使用して、ＬＮＡアプタマオリゴヌクレオチドの第１ストランド合成から得られたＰＣＲ増幅生成物を配列決定する。特に、ＬＮＡアプタマは、別な方法ではＲＮＡホスホジエステルヌクレオシドのバックグラウンド単一のＬＮＡヌクレオシドを有した。
【００１０】
本発明者らは、このような修飾オリゴヌクレオチドの超並列シーケンシングを可能にする２’−Ｏ−ＭＯＥ及びＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドの、３’捕捉プローブ連結及びポリメラーゼに基づく検出を提供した。以前に国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７８６９５号（特許文献４）に記載の通り、本発明者らは、捕捉プローブを用いた修飾オリゴヌクレオチドの３’捕捉、続いてヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドの鎖伸長及び検出、定量化、増幅、シーケンシング、又はクローニングに基づく、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドなどのヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドの検出、定量化、増幅、シーケンシング、又はクローニングの方法を開発している。国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７８６９５号（特許文献４）は、鎖伸長のための好適な酵素としてのＶｏｌｃａｎｏ２Ｇポリメラーゼの使用を開示している。
【００１１】
本発明者らによって開発された方法の効率は、修飾オリゴヌクレオチド捕捉及びＰＣＲに基づく検出を可能にするだけでなく、修飾オリゴヌクレオチド試料の超並列シーケンシングを初めて可能にし、この革命的な技術は、オリゴヌクレオチド治療の探索、製造、品質保証、治療開発、及び患者モニタリングにおける重要な新規のツールを提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】欧州特許出願公開第１９１４３１７Ａ１号
【特許文献２】国際公開第０１／３４８４５Ａ１号
【特許文献３】国際公開第２００７／０２５２８１号
【特許文献４】国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７８６９５号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｃａｉｆｕら、「ＮＡＲ  ３３」（２００５年）第Ｅ１７９頁
【非特許文献２】Ｆｒｏｉｍら、「ＶＡＲ」（１９９５年）第４２１９〜４２２３頁
【非特許文献３】Ｔｒｅｍｂｌａｙら、「Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ」（２０１１年）第３巻、第５号
【非特許文献４】Ｃｈｅｎｇら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」（２０１３年）第ｅ６７頁
【非特許文献５】Ｃｒｏｕｚｉｅｒら、「ＰＬｏＳ  ＯＮＥ」（２０１２年）第ｅ３５９９００頁
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、ＬＮＡオリゴヌクレオチド又は２−Ｏ−メトキシエチルオリゴヌクレオチドなどの２’糖修飾オリゴヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドをシーケンシングするための方法を提供し、該方法は、以下の一連の工程：
（Ｉ）該修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鋳型のポリメラーゼ媒介第１ストランド合成を行って、該修飾オリゴヌクレオチドの相補体を含む核酸配列を生成することと；
（ＩＩ）工程（Ｉ）の該第１ストランド合成生成物のプライマーベースのシーケンシングを行うことと；を含む。
【００１５】
本発明は、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの集団又は２−Ｏ−メトキシエチルオリゴヌクレオチドの集団などの２’糖修飾オリゴヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドの集団を並列シーケンシングするための方法を提供し、該方法は、以下の工程：
（Ｉ）オリゴヌクレオチド鋳型の集団のポリメラーゼ媒介第１ストランド合成を行って、オリゴヌクレオチドの該集団に存在する修飾オリゴヌクレオチドの相補体をそれぞれ含む核酸配列のライブラリを作製することであって、ここで、該集団の各メンバが修飾オリゴヌクレオチドであるか又はこの修飾オリゴヌクレオチドを含む、工程と；
（ＩＩ）工程（Ｉ）の該第１ストランド合成生成物のプライマーベースの集団のプライマーベースのシーケンシングを行うことと；を含む。
【００１６】
工程（Ｉ）の後かつ工程（ＩＩ）の前に、ＰＣＲ増幅工程を行ってもよい。いくつかの実施形態では、プライマーベースのシーケンシング工程は、工程（ＩＩ）の前に、又は工程（ＩＩ）の一部として、第１ストランド合成生成物のクローン増幅を含み得る。いくつかの実施形態では、クローン増幅は、固相増幅又はエマルション相増幅を用いる。
【００１７】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列をシーケンシングする方法を提供し、該方法は、次の工程：
ａ．該修飾オリゴヌクレオチドの５’末端に５’捕捉プローブオリゴヌクレオチドを連結することであって、ここで、該５’捕捉プローブはプライマー結合部位を含む、連結することと；
ｂ．前記捕捉プローブからポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成を行って、前記修飾オリゴヌクレオチドの相補体を含む核酸配列を生成することと；
ｃ．工程（ｂ）で得られた該第１ストランド合成生成物のプライマーベースのシーケンシングを行うことと；を含む。
【００１８】
この方法は、例えば、修飾オリゴヌクレオチドの３’領域が既知の配列を含み、プライマーベースのシーケンシング（及び／又はＰＣＲ工程が含まれる場合）が、修飾オリゴヌクレオチドの３’領域に特異的なプライマーと、５’捕捉プローブに特異的なプライマーとを用いて行われる場合、使用することができる。
【００１９】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列をシーケンシングする方法を提供し、該方法は、次の工程：
ａ．該修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に３’捕捉プローブを連結することであって、ここで、該３’捕捉プローブはプライマー結合部位を含む、連結することと；
ｂ．該修飾オリゴヌクレオチドの５’末端に５’捕捉プローブを連結することであって、ここで、該５’捕捉プローブはプライマー結合部位を含む、連結することと；
ｃ．前記捕捉プローブからポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成を行って、前記修飾オリゴヌクレオチドの相補体を含む核酸配列を生成することと；
ｄ．工程（ｃ）で得られた該第１ストランド合成生成物のプライマーベースのシーケンシングを行うことと；を含み、
ここで、工程ａ及び工程ｂは、順番に又は同時にのいずれかで実行することができる。
【００２０】
プライマーベースのシーケンシング及び／又はＰＣＲ工程は、３’捕捉プローブに特異的なプライマー及び５’捕捉プローブに特異的なプライマーを使用することによって行われる。
【００２１】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの集団の核酸塩基配列を並列シーケンシングする方法を提供し、該方法は、次の工程：
ａ．該修飾オリゴヌクレオチドの集団の５’末端に５’捕捉プローブオリゴヌクレオチドを連結することであって、ここで、該５’捕捉プローブはプライマー結合部位を含む、連結することと；
ｂ．該捕捉プローブからポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成を行って、該修飾オリゴヌクレオチドの集団のメンバの該相補体をそれぞれ含む核酸配列の集団を生成することと；
ｃ．工程（ｂ）で得られた該第１ストランド合成生成物のプライマーベースの並列シーケンシングを行うことと；を含み、
ここで、工程ａ及び工程ｂは、順番に又は同時にのいずれかで実行することができる。
【００２２】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの集団の核酸塩基配列を並列シーケンシングする方法を提供し、該方法は、次の工程：
ａ．該修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に３’捕捉プローブを連結することであって、ここで、該３’捕捉プローブはプライマー結合部位を含む、連結することと；
ｂ．該修飾オリゴヌクレオチドの５’末端に５’捕捉プローブを連結することであって、ここで、該５’捕捉プローブはプライマー結合部位を含む、連結することと；
ｃ．該捕捉プローブからポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成を行って、修飾オリゴヌクレオチドの該集団の修飾オリゴヌクレオチドの該相補体をそれぞれ含む核酸配列の集団を生成することと；
ｄ．工程（ｂ）で得られた該第１ストランド合成生成物のプライマーベースの並列シーケンシングを行うことと；を含み、
ここで、工程ａ及び工程ｂは、順番に又は同時にのいずれかで実行することができる。
【００２３】
プライマーベースのシーケンシング及び／又はＰＣＲ工程は、３’捕捉プローブに特異的なプライマー及び５’捕捉プローブに特異的なプライマーを使用することによって行われる。
【００２４】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの集団を並列シーケンシングする方法を提供し、該方法は、次の工程：
ａ．修飾オリゴヌクレオチドの集団の３’末端に３’捕捉プローブオリゴヌクレオチドを連結することであって、ここで、該３’捕捉プローブは、第１プライマー結合部位を含むか又は自己プライミング３’捕捉プローブであるかのいずれかである、連結することと；
ｂ．５’捕捉プローブを、該修飾オリゴヌクレオチドの集団の５’末端に連結することと；
ｃ．該３’捕捉プローブから第１ストランド合成を行うことと；
ｄ．一対のＰＣＲプライマーを用いる、工程ｃで得られた第１ストランドのＰＣＲ増幅を行って、増幅生成物の集団を調製することであって、該ＰＣＲプライマーの一方は該３’捕捉プローブオリゴヌクレオチドに特異的であり、他方は該５’捕捉プローブに特異的である、工程と；
ｅ．工程ｄの該ＰＣＲ増幅生成物のプライマーベースの並列シーケンシングを行うことと；を含み、
ここで、工程ａ及び工程ｂは、順番に又は同時にのいずれかで実行することができる。
【００２５】
第１ストランド合成を容易にするために、３’捕捉プローブは、第１プライマー結合部位を含んでもよく、又は自己プライミング３’捕捉プローブであってもよい。
【００２６】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドをシーケンシングする方法を提供し、該方法は、次の工程：
ａ．該修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に３’捕捉プローブオリゴヌクレオチドを連結することであって、ここで、該３’捕捉プローブは、第１プライマー結合部位を含むか又は自己プライミング３’捕捉プローブであるかのいずれかである、連結することと；
ｂ．５’捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、該修飾オリゴヌクレオチドの５’末端に連結することと；
ｃ．該３’捕捉プローブから第１ストランド合成を行うことと；
ｄ．一対のＰＣＲプライマーを用いる、工程ｃで得られた該第１ストランドのＰＣＲ増幅を行うことであって、該ＰＣＲプライマーの一方は該３’捕捉プローブオリゴヌクレオチドに特異的であり、他方は該５’捕捉プローブに特異的である、工程と；
ｅ．工程の該ＰＣＲ増幅生成物のプライマーベースのシーケンシングを行うことと；を含み、
ここで、工程ａ及び工程ｂは、順番に又は同時にのいずれかで実行することができる。
【００２７】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの集団を並列シーケンシングする方法を提供し、該方法は、次の工程：
ａ．該修飾オリゴヌクレオチドの集団の３’末端に３’捕捉プローブオリゴヌクレオチドを連結することであって、ここで、該３’捕捉プローブは、第１プライマー結合部位を含むか又は自己プライミング３’捕捉プローブであるかのいずれかである、連結することと；
ｂ．５’捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドの該集団の５’末端に連結することと；
ｃ．該３’捕捉プローブから第１ストランド合成を行って、第１ストランド合成生成物のライブラリを生成することと；
ｄ．一対のＰＣＲプライマーを用いる、工程ｃで得られた第１ストランド合成生成物のライブラリのＰＣＲ増幅を行うことであって、該ＰＣＲプライマーの一方は該３’捕捉プローブオリゴヌクレオチドに特異的であり、他方は該５’捕捉プローブに特異的である、工程と；
ｅ．工程ｄの該ＰＣＲ増幅生成物のプライマーベースの並列シーケンシングを行うことと；を含み、
ここで、工程ａ及び工程ｂは、順番に又は同時にのいずれかで実行することができる。
【００２８】
第１ストランド合成の前に連結される５’捕捉プローブを用いる利点とは、５’捕捉プローブが使用されない場合にＰＣＲ増幅又は配列決定されてもよい可能性のある短縮第１ストランド合成生成物と比較して、修飾オリゴヌクレオチドの全長第１ストランド合成相補体から得られたシーケンシングシグナルを改善することにある。
【００２９】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列をシーケンシングする方法を提供し、該方法は、次の工程：
ａ．捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、該修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に連結することと；
ｂ．前記捕捉プローブからポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成を行って、前記修飾オリゴヌクレオチドの相補体を含む核酸配列を生成することと；
ｃ．工程（ｂ）で得られた該第１ストランド合成生成物のプライマーベースのシーケンシングを行うことと；を含む。
【００３０】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの集団の塩基配列を並列シーケンシングする方法を提供し、該方法は、次の工程：
ａ．捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドの該集団に存在する該修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に連結することと；
ｂ．前記捕捉プローブからポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成を行って、修飾オリゴヌクレオチドの前記集団中に存在する修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の前記相補体をそれぞれ含む核酸配列の集団を生成することと；
ｃ．工程（ｂ）で得られた第１ストランド合成生成物の集団のプライマーベースの並列シーケンシングを行うことと；を含む。
【００３１】
本発明は、２’糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列をシーケンシングする方法を提供し、該方法は、次の工程：
ａ．捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、該修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に連結することと；
ｂ．前記捕捉プローブからポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成を行って、前記修飾オリゴヌクレオチドの相補体を含む核酸配列を生成することと；
ｃ．アダプタープローブを、工程ｂで得られた前記第１ストランド合成生成物の３’末端に連結することと；を含み、続いて、
−工程（ｃ）で得られた前記ライゲーション産物のプライマーベースのシーケンシングを行うこと；又は、
−工程（ｃ）で得られた前記ライゲーション産物のＰＣＲ増幅を行って、前記ＰＣＲ増幅生成物のプライマーベースのシーケンシングを行うこと、のいずれかを含む、方法。
【００３２】
本発明は、２’糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの集団などの修飾オリゴヌクレオチドの集団の核酸塩基配列を並列シーケンシングする方法を提供し、該方法は、次の工程：
ａ．捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドの該集団に存在する該修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に連結することと；
ｂ．前記捕捉プローブからポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成を行って、修飾オリゴヌクレオチドの前記集団中に存在する修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の前記相補体をそれぞれ含む核酸配列の集団を生成することと；
ｃ．アダプタープローブを、工程ｂで得られた前記第１ストランド合成生成物の３’末端に連結することと；を含み、続いて、
−工程（ｃ）で得られた前記ライゲーション産物のプライマーベースの並列シーケンシングを行うこと；又は、
−工程（ｃ）で得られた該ライゲーション産物のＰＣＲ増幅を行って、該ＰＣＲ増幅生成物のプライマーベースの並列シーケンシングを行うこと、のいずれかを含む。
【００３３】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列をシーケンシングする方法を提供し、該方法は、次の工程：
ａ．捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、該修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に連結することと；
ｂ．前記捕捉プローブからポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成を行って、前記修飾オリゴヌクレオチドの相補体を含む核酸配列を生成することと；
ｃ．工程（ｂ）で得られた第１ストランド合成生成物のプライマーベースのシーケンシングを行うことであって、ここで、該プライマーベースのシーケンシング工程が、クローン増幅プライマーを用いる第１ストランド合成工程（ｂ）のクローン増幅を含み、ここで、該クローン増幅プライマーの１つが該３’捕捉プローブに特異的であり、第２のクローン増幅プライマーが、該修飾オリゴヌクレオチドの５’領域などの該修飾オリゴヌクレオチドに特異的である、行うことと；を含む。
【００３４】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの集団の塩基配列を並列シーケンシングする方法を提供し、該方法は、次の工程：
ａ．捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドの該集団に存在する該修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に連結することと；
ｂ．前記捕捉プローブからポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成を行って、修飾オリゴヌクレオチドの前記集団中に存在する修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の前記相補体をそれぞれ含む核酸配列の集団を生成することと；
ｃ．工程（ｂ）で得られた第１ストランド合成生成物の集団のプライマーベースのシーケンシングを行うことであって、ここで、該プライマーベースの並列シーケンシング工程が、クローン増幅プライマーを用いる第１ストランド合成工程（ｂ）のクローン増幅を含み、ここで、該クローン増幅プライマーの１つが該３’捕捉プローブに特異的であり、第２のクローン増幅プライマーが、該修飾オリゴヌクレオチドの５’領域などの該修飾オリゴヌクレオチドに特異的である、行うことと；を含む。
【００３５】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列をシーケンシングする方法を提供し、該方法は、次の工程：
ａ．捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、該修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に連結することと；
ｂ．前記捕捉プローブからポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成を行って、前記修飾オリゴヌクレオチドの相補体を含む核酸配列を生成することと；
ｃ．ＰＣＲプライマーを用いて、工程（ｂ）で得られた該第１ストランド合成生成物のＰＣＲ増幅を行うことであって、ここで、該ＰＣＲプライマーの１つが該３’捕捉プローブに特異的であり、第２ＰＣＲプライマーが、該修飾オリゴヌクレオチドの５’領域などの該修飾オリゴヌクレオチドに特異的である、工程と；
ｄ．工程（ｃ）の該ＰＣＲ増幅生成物のプライマーベースのシーケンシングを行うことと；を含む。
【００３６】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの集団の塩基配列を並列シーケンシングする方法を提供し、該方法は、次の工程：
ａ．捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドの該集団に存在する該修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に連結することと；
ｂ．前記捕捉プローブからポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成を行って、修飾オリゴヌクレオチドの前記集団中に存在する修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の前記相補体をそれぞれ含む核酸配列の集団を生成することと；
ｃ．ＰＣＲプライマーを用いて、工程（ｂ）で得られた該第１ストランド合成生成物のＰＣＲ増幅を行うことであって、ここで、該ＰＣＲプライマーの１つが該３’捕捉プローブに特異的であり、第２ＰＣＲプライマーが、該修飾オリゴヌクレオチドの５’領域などの該修飾オリゴヌクレオチドに特異的である、工程と；
ｄ．工程（ｃ）の該ＰＣＲ増幅生成物のプライマーベースの並列シーケンシングを行うことと；を含む。
【００３７】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列をシーケンシングする方法を提供し、該方法は、次の工程：
ａ．捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、該修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に連結することと；
ｂ．前記捕捉プローブからポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成を行って、前記修飾オリゴヌクレオチドの相補体を含む核酸配列を生成することと；
ｃ．該第１ストランド合成生成物の３’末端を多核化すること（例えば、ポリアデニル化）と；
ｄ．該多核化３’末端に相補的な配列を含むプライマー（例えば、ポリＴ配列を有する第２ストランド合成プライマー）を用いて、第２ストランド合成を行うことと；
ｅ．工程（ｄ）で得られた第２ストランド合成生成物のプライマーベースのシーケンシングを行うことと；を含む。
【００３８】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの集団の塩基配列を並列シーケンシングする方法を提供し、該方法は、次の工程：
ａ．捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドの該集団に存在する該修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に連結することと；
ｂ．前記捕捉プローブからポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成を行って、修飾オリゴヌクレオチドの前記集団中に存在する修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の前記相補体をそれぞれ含む核酸配列の集団を生成することと；
ｃ．該第１ストランド合成生成物の３’末端を多核化すること（例えば、ポリアデニル化）と；
ｄ．該多核化３’末端に相補的な配列を含むプライマー（例えば、ポリＴ配列を有する第２ストランド合成プライマー）を用いて、第２ストランド合成を行うことと；
ｅ．工程（ｄ）で得られた第２ストランド合成生成物のプライマーベースの並列シーケンシングを行うことと；を含む。
【００３９】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列をシーケンシングする方法を提供し、該方法は、次の工程：
ａ．捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、該修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に連結することと；
ｂ．前記捕捉プローブからポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成を行って、前記修飾オリゴヌクレオチドの相補体を含む核酸配列を生成することと；
ｃ．該第１ストランド合成生成物の３’末端を多核化すること（例えば、ポリアデニル化）と；
ｄ．該多核化３’末端に相補的な配列を含むプライマー（例えば、ポリＴ配列を有する第２ストランド合成プライマー）を用いて、第２ストランド合成を行うことと；
ｅ．該第２ストランド合成生成物のＰＣＲ増幅を行うことと；
ｆ．工程（ｅ）で得られた該ＰＣＲ生成物のプライマーベースのシーケンシングを行うことと；を含む。
【００４０】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの集団の塩基配列を並列シーケンシングする方法を提供し、該方法は、次の工程：
ａ．捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドの該集団に存在する該修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に連結することと；
ｂ．前記捕捉プローブからポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成を行って、修飾オリゴヌクレオチドの前記集団中に存在する修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の前記相補体をそれぞれ含む核酸配列の集団を生成することと；
ｃ．該第１ストランド合成生成物の３’末端を多核化すること（例えば、ポリアデニル化）と；
ｄ．該多核化３’末端に相補的な配列を含むプライマー（例えば、ポリＴ配列を有する第２ストランド合成プライマー）を用いて、第２ストランド合成を行うことと；
ｅ．該第２ストランド合成生成物のＰＣＲ増幅を行うことと；
ｆ．工程（ｅ）で得られた該ＰＣＲ生成物のプライマーベースのシーケンシングを行うことと；を含む。
【００４１】
好適には、ＰＣＲプライマーは、３’捕捉プローブに特異的な第１ＰＣＲプライマー及び第２ストランド合成プライマー（第２ストランド合成プライマー）に特異的な第２ＰＣＲプライマーであり得る。
【００４２】
本発明は、共通のオリゴヌクレオチド合成操作から、又は独立したオリゴヌクレオチド合成操作のプールからの修飾オリゴヌクレオチドの集団における配列非均一性を決定するための方法を提供し、該方法は、次の工程：
（ｉ）該修飾オリゴヌクレオチドを得るか又は合成することと；
（ｉｉ）本発明に係る該修飾オリゴヌクレオチドの並列シーケンシングのための該方法を行うことと；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた配列データを分析して、修飾オリゴヌクレオチドの集団の配列非均一性を同定することと；を含む。
【００４３】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの該配列を検証する方法を提供し、該方法は、次の工程：
（ｉ）該修飾オリゴヌクレオチドを得るか又は合成することと；
（ｉｉ）本発明に係る該修飾オリゴヌクレオチドの並列シーケンシングのための該方法を行うことと；
（ｉｉｉ）該修飾オリゴヌクレオチドの該配列を検証するために得られた該配列データを分析することと；を含む。
【００４４】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの純度を決定する方法を提供し、
（ｉ）該修飾オリゴヌクレオチドを得るか又は合成することと；
（ｉｉ）本発明に係る該修飾オリゴヌクレオチドの並列シーケンシングのための該方法を行うことと；
（ｉｉｉ）該修飾オリゴヌクレオチドの純度を決定するために得られた該配列データを分析することと；を含む。
【００４５】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの集団の核酸塩基配列を配列決定するための、超並列シーケンシングなどの並列シーケンシングの使用を提供する。
【００４６】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列を配列決定するための、合成シーケンシングによる配列の使用を提供する。
【００４７】
本発明は、並列する修飾オリゴヌクレオチドの集団の核酸塩基配列を配列決定するための、合成シーケンシングによる配列の使用を提供する。
【００４８】
本発明は、治療用オリゴヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の生成物の品質を決定するための、合成シーケンシングによる配列の使用を提供する。
【００４９】
本発明は、治療用オリゴヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の生成物の、配列及び各特有の配列の存在における非均一性を決定するための、合成シーケンシングによる配列の使用を提供する。
【００５０】
本発明は、治療用オリゴヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の生成物の品質を決定するための、合成シーケンシングによる配列の使用を提供する。
【００５１】
本発明は、治療用オリゴヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の生成物の非均一性を決定するための、合成シーケンシングによる配列の使用を提供する。
【００５２】
本発明は、治療用オリゴヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の生成物の品質を決定するための、プライマーベースのシーケンシングの使用を提供する。
【００５３】
本発明は、治療用オリゴヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の生成物の、配列及び各特有の配列の存在における非均一性を決定するための、プライマーベースのシーケンシングの使用を提供する。
【００５４】
本発明は、治療用オリゴヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の生成物の品質を決定するための、超並列シーケンシングなどの並列シーケンシングの使用を提供する。
【００５５】
本発明は、治療用オリゴヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の生成物の品質を決定するための、超並列シーケンシングなどの並列シーケンシングの使用を提供する。
【００５６】
本発明は、ＬＮＡ修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含む鋳型からの第１ストランド合成のための、配列番号１などのＴａｑポリメラーゼ、又はＶｏｌｃａｎｏ２Ｇポリメラーゼなどの配列番号１と少なくとも７０％同一性を有する、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の使用を提供する。
【００５７】
本発明は、細胞内への細胞取り込みを増強する修飾オリゴヌクレオチド又は修飾オリゴヌクレオチド配列を同定する方法を提供し、該方法は、以下：
ｉ．修飾オリゴヌクレオチドの集団を、該細胞に投与することであって、ここで、修飾オリゴヌクレオチドの該集団の各メンバが、特有の核酸塩基配列を含む、投与することと；
ｉｉ．一定時間後、該細胞内から該修飾オリゴヌクレオチドを単離することと；
ｉｉｉ．工程（ｉｉ）で得られた該修飾オリゴヌクレオチドに対して本発明の該並列シーケンシングを行うことと；これにより、
ｉｖ．該細胞又は細胞の該集団に豊富である１つ以上の修飾オリゴヌクレオチド配列を同定することと；を含む。
【００５８】
本発明は、哺乳動物の標的組織又は細胞に豊富である修飾オリゴヌクレオチド（配列）を同定する方法を提供し、該方法は、以下：
ｉ．修飾オリゴヌクレオチドの混合物を哺乳動物に投与することであって、ここで、修飾オリゴヌクレオチドの該混合物の各メンバが特有の核酸塩基配列を含む、投与することと；
ｉｉ．該修飾オリゴヌクレオチドが、例えば少なくとも６時間の期間で、該哺乳動物内に分配されるようにすることと；
ｉｉｉ．所望の標的組織又は所望の標的細胞を含む、該哺乳動物由来の１つ以上の組織又は細胞から修飾オリゴヌクレオチドの集団を単離することと；
ｉｖ．工程ｉｉｉで得られた該修飾オリゴヌクレオチドの集団に対して本発明の該並列シーケンシングを行うことと；これにより、
ｖ．該哺乳動物の該所望の標的組織又は細胞に豊富である修飾オリゴヌクレオチド配列を同定することと；を含む。
【００５９】
本発明は、細胞取り込みを増強する修飾オリゴヌクレオチド又は修飾オリゴヌクレオチド配列を同定する方法を提供し、該方法は、以下を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどのＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどのＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドであり、三価ＧａｌＮＡｃ部分などのＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分などの複合基（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｇｒｏｕｐ）を更に含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メトキシエチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾オリゴヌクレオチドなどの、２’糖修飾オリゴヌクレオチドであり、任意に、三価ＧａｌＮＡｃ部分などのＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分などの複合基を更に含む。
【００６２】
本発明は、ホスホロチオエート・アンチセンス・オリゴヌクレオチドの複合体などのアンチセンスオリゴヌクレオチドの複合体、又はＬＮＡギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）若しくはミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）などのＬＮＡオリゴヌクレオチドの複合体などの、１つ以上の２’修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドの複合体を提供する。ここで、該複合体は、該オリゴヌクレオチドと、図に示されるようなＢ〜Ｔ群から選択される複合部分とを含み、任意に、オリゴヌクレオチドと複合体部分との間に位置するアルキルリンカーなどのリンカー基を含む。好適には、複合体部分は、オリゴヌクレオチドの５’又は３’末端に位置してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】パネルＡは、ＬＮＡオリゴを読み取るための異なるポリメラーゼ能力を試験するために生成された、２つの一本鎖試験鋳型分子の概略図を示す。ＬＴＴ１は、８個のＬＮＡ塩基と１１個のホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｉｏａｔｅ）骨格修飾を含有する、ＬＮＡオリゴを伴うストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）（ライトグレー）を含有する。ＤＴＴ１は、ＬＴＴ１と同じ塩基配列を含むが、ホスホロジエステル骨格を有するＤＮＡ塩基のみを用いる、対照鋳型である。（Ｂ）ＤＣＰ１と、オリゴＬＮＡ  Ｏ１（レーンＢ）と、実施例１のＤＮＡ  Ｏ１（レーンＣ）と、の間の連結反応である、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ染色１５％ＴＢＥ尿素ゲルを示す。レーンＡでは、連結反応にオリゴは存在しなかった。
【図２】パネルＡは、実施例２における６つの異なるＥｖａ  Ｇｒｅｅｎ  ｄｄＰＣＲ反応での液滴の蛍光強度の１Ｄプロットを示す。各反応に使用される鋳型分子は、各読み取りのレーンの上に示される。桃色の線は、正及び負の液滴を分離する、手動で設定された閾値線を示す。
【図３】図３は、実施例３で実施した異なるＥｖａ  Ｇｒｅｅｎ  ｄｄＰＣＲ反応における液滴の蛍光強度を示す。ＬＴＴ１において４２℃にて１時間で第１ストランドのコピーを生成するのに使用した酵素をプロットの上方に示す（左側６レーン）。右側６レーンは、ｄｄＰＣＲが第１ストランド合成を伴わない鋳型上で直接実行された、対照反応である。ストランド合成使用する鋳型はプロットの上方に示す。
【図４Ａ】図４は、実施例４からの異なる濃度である異なる添加物の存在下における、ＬＴＴ１鋳型でのｅｖａｇｒｅｅｎ  ｄｄＰＣＲ中の液滴の蛍光強度を示す。添加物及びその濃度をプロットに示す。添加物の濃度はプロット上方に示す。パネルＥは、パネルＡ〜Ｄに示す反応で検出されたＬＴＴ１の定量化を示す。パネルＧは、９％ＰＥＧ及び増量する１，２−プロパンジオールの存在下における、ＬＴＴ１鋳型上のｅｖａｇｒｅｅｎ  ｄｄＰＣＲ中の液滴の蛍光強度を示す。パネルＨは、パネルＧにおける陽性液滴の数の定量化を示し、１，２−プロパンジオールの更なる添加は、陽性液滴の数を増加させないことを示す。
【図４Ｂ】図４Ａの説明を参照のこと。
【図４Ｃ】図４Ａの説明を参照のこと。
【図４Ｄ】図４Ａの説明を参照のこと。
【図４Ｅ】図４Ａの説明を参照のこと。
【図４Ｆ】図４Ａの説明を参照のこと。
【図４Ｇ】図４Ａの説明を参照のこと。
【図４Ｈ】図４Ａの説明を参照のこと。
【図５Ａ】図５は、実施例５からのＬＴＴ１における第１ストランド合成に関するｄｄＰＣＲ反応の結果を示す。図５パネルＡは、ＰＣＲ添加物を含まない第１ストランドＴａｑポリメラーゼ合成におけるｄｄＰＣＲ反応を示す。ＰＣＲサイクルの数は、各反応のプロットの下方に示す。図５パネルＢは、１０％ＰＥＧ及び０．３１Ｍが第１の合成中に存在した場合の、ｄｄＰＣＲ反応の結果を示す。ＰＣＲサイクルの数は、各反応のプロットの下方に示す。ストランド合成反応．図５パネルＣは、同じ反応を示すが、Ｔａｑポリメラーゼの存在は示さない。ＰＣＲサイクルの数は、各反応のプロットの下方に示す。図５パネルＥ及びＦは、１０％ＰＥＧ及び０．３１Ｍの１．３−プロパンジオール添加物を伴う又は伴わないＨＦ緩衝液中における、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼによる第１ストランド合成反応に関するｄｄＰＣＲを示す。図５パネルＤは、試験された７つの条件（Ａ；Ｂ；Ｃ；Ｄ；Ｅ；Ｆ）について検出されたＬＴＴ１コピーの数の定量化を示す。
【図５Ｂ】図５Ａの説明を参照のこと。
【図５Ｃ】図５Ａの説明を参照のこと。
【図５Ｄ】図５Ａの説明を参照のこと。
【図５Ｅ】図５Ａの説明を参照のこと。
【図５Ｆ】図５Ａの説明を参照のこと。
【図６Ａ】パネルＡは、実施例６に記載された個々の捕捉プローブとオリゴとの間の連結反応の分離を伴う、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ染色１５％ＴＢＥ尿素ゲルを示す。白抜きの四角は、連結した生成物を含有するゲルから切り出した領域を示す。パネルＢ〜Ｅは、実施例６に記載されたデータ処理に続く４つの捕捉プローブの各々について、最多１８の塩基対読み取りの上位１０を示す。インプットＬＮＡオリゴの配列を各表の上方に示す。
【図６Ｂ】図６Ａの説明を参照のこと。
【図６Ｃ】図６Ａの説明を参照のこと。
【図６Ｄ】図６Ａの説明を参照のこと。
【図６Ｅ】図６Ａの説明を参照のこと。
【図７】例えば、ＬＮＡオリゴヌクレオチドなどの糖修飾、又は立体定義（ｓｔｅｒｅｏｄｅｆｉｎｅｄ）されたオリゴヌクレオチドを捕捉するための、４つの例示的な捕捉プローブ（ｉ）〜（ｉｖ）の重要な設計特徴：  領域Ａ：５’末端がリン酸化されて連結可能になる。領域Ａは領域Ｇと第１のデュプレックスを形成する（非直線的捕捉プローブの形成）。領域Ｇ及びＡ塩基対は細胞内ループを作成し、標的修飾オリゴヌクレオチドの位置を５’リン酸に向けて安定化させて、連結を強化する。  領域Ｂは、反応バーコードを含み、任意ではあるが、並列シーケンシングに対して非常に有利である。領域Ｃは、縮重ヌクレオチド又はユニバーサル塩基の領域を含んでもよく、任意に、例えば分子バーコードとして使用され得る。領域Ｂ及びＣはいずれの順序であってもよい。  領域Ｄは、例えば固相プライマーを用いる次世代シーケンシング用途に有利であり、ライゲーション産物又はＰＣＲ増幅生成物をシーケンシングプラットフォーム（例えば、フローセル結合プライマー）にハイブリダイズさせるために使用される。あるいは、ＰＣＲ増幅工程が含まれる場合、シーケンシングプラットフォームの結合部位を含むＰＣＲプライマーを使用してもよい。領域Ｄはまた、第１プライマー結合部位としても使用され得る。  領域Ｅは、任意の第１プライマー結合部位であり、領域Ｄとオーバーラップしていてもよい。  領域Ｈは、修飾オリゴヌクレオチドの３’末端とハイブリダイズする３’ヌクレオチドの領域であり、これによって、連結の修飾オリゴヌクレオチドを捕捉プローブの５’末端に配置する。領域Ｈは、縮重配列であってもよく、又は本明細書に記載されるような所定の配列であってもよい。捕捉プローブの３’末端は、自己連結を避ける連結のためにブロックされる。ここでは３’アミノ修飾を本明細書に例示するが、他の３’ブロッキング基を使用してもよい。  領域Ｆ’は、捕捉プローブが、領域Ｄの下流に配置されたデュプレックス領域内の切断可能な結合のために自己プライミングする（又は、領域Ｄとオーバーラップしてもよい）、実施形態を示す。  細い線は、図示された領域を結合する任意のヌクレオシドを表し、本明細書に記載されるように、これらは非ヌクレオシドリンカーで置換されてもよい。
【図８】パネルＡは、実施例７に記載された個々の捕捉プローブとオリゴとの間の連結反応の分離を伴う、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ染色１５％ＴＢＥ尿素ゲルを示す。白抜きの四角は、連結した生成物を含有するゲルから切り出した領域を示す。パネルＢ〜Ｅは、実施例７に記載されたデータ処理に続く４つの捕捉プローブの各々について、最多１８の塩基対読み取りの上位１０を示す。インプットＬＮＡオリゴの配列を各表の上方に示す。
【図９】図９は、実施例８に記載された反応の最多１５の塩基対読み取りの上位１０を示す。
【図１０Ａ】パネルＡは、１回４５分の第１ストランド合成反応で実施される、ＥｖａＧｒｅｅｎ  ｄｄＰＣＲ反応における液滴の蛍光強度を示す。検出されたコピーの定量化は、ｕＬ反応当たりのコピー数で濃度を示す図１０パネルＢに示す。図１０パネルＣは、第１ストランド合成の１、３、又は５回で行われた反応で実施されたＥｖａＧｒｅｅｎ  ｄｄＰＣＲ反応における、液滴の蛍光強度を示す。ストランド合成各反応で検出されたコピーの定量化は、ｕＬ反応当たりのコピー数で濃度を示す図１０パネルＤに示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａの説明を参照のこと。
【図１０Ｃ】図１０Ａの説明を参照のこと。
【図１０Ｄ】図１０Ａの説明を参照のこと。
【図１１】実施例９に記載された試料のゲル電気泳動の画像。ゲル画像上方の表は、以下について記載する：（１）上段では、捕捉プローブを使用した；（２）下段では、マスタミックスを使用した。捕捉プローブに付着したフルオロフォアの蛍光の検出。
【図１２】図１０に示したものと同じゲルだが、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色したもの。
【図１３】実施例１０に記載された連結試料のゲル電気泳動の画像。捕捉プローブに付着したフルオロフォアの蛍光の検出。
【図１４】実施例１１に記載された連結反応物のゲル電気泳動の画像。矢印で示される生成物は、ａ４及びＣ５捕捉プローブの両方と共有結合したＬＮＡ−オリゴヌクレオチドに対応する。捕捉プローブに付着したフルオロフォアの蛍光の検出。
【図１５−１】実施例１１に記載されているＰＣＲ増幅試料のバイオアナライザＤＮＡ高感度トレース。バイオアナライザのトレースは、２つの主要なピークを示し、一方は捕捉プローブＣ５及びａ４の直接連結に由来する空のシーケンシングライブラリ（プロット上でＥとマークされる）に対するものであり、もう一方はアッセイしたＬＮＡ−オリゴヌクレオチドの配列を含む充填シーケンシングライブラリ（プロット上でＦとしてマークされる）に対するものである。
【図１５−２】図１５−１の説明を参照のこと。
【図１６】本発明の５’捕捉プローブ：Ｉ．３’末端ＲＮＡヌクレオシド、又はＲＮＡヌクレオチドの３’末端領域を含む、第１の領域。ＩＩ．ヌクレオチドの第２の領域（プライマー結合部位の相補体を含む）。ＩＩＩ．任意の第３のリンカー領域（ポリメラーゼのリードスルーをブロックし得るか又は非連続性であり得る）。ＩＶ．ヌクレオチドの第４の領域。Ｖ．該修飾オリゴヌクレオチドの５’領域に相補的であり、任意に、縮重ヌクレオチドの領域及び５’ブロッキング基、すなわち５’リン酸塩以外の５’基であり得る、ヌクレオチドの第５の領域。
【図１７】皮下注射の４時間後の非複合オリゴヌクレオチド（配列番号３５）に対する、肝濃縮倍数。ＧａｌＮＡｃ複合オリゴヌクレオチド（配列番号２２）及び配列番号２６は、非複合オリゴヌクレオチド（配列番号３５）と比較して、３．５倍の肝濃縮を示す。
【図１８】皮下注射の４時間後の非複合オリゴ化合物（配列番号３５）に対する、血漿濃縮。Ｃ１６脂肪酸複合体（配列番号４６）を有するオリゴヌクレオチドは、裸のオリゴヌクレオチド配列番号３５と比較して１２．５倍の血漿存在量を示した。ＧａｌＮＡｃ複合オリゴヌクレオチド（配列番号２２）は血漿からの枯渇を示した。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
定義
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、それが当業者により、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として一般的に理解されているように定義される。そのような共有結合ヌクレオシドは、核酸分子又はオリゴマとも称され得る。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製とによって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの核酸塩基部分の配列若しくは順序、又はその修飾が参照される。本発明に関して、オリゴヌクレオチドは、人工であり、化学的に合成され、そして精製又は単離することができる。
【００６５】
修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、１つ以上の糖−修飾ヌクレオシド及び／若しくは修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチド、並びに／又は複合部分の存在を説明する。
【００６６】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、治療用オリゴヌクレオチドである。
【００６７】
いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの近接する２’糖修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ及び２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドからなる群より独立して選択される、少なくとも２つの近接する２’糖修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの近接するＬＮＡヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの近接する２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ及び２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドからなる群より独立して選択される、少なくとも３つの近接する２’糖修飾ヌクレオシドを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの近接するＬＮＡヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの近接する２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ及び２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドからなる群より独立して選択される、少なくとも４つの近接する２’糖修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも４つの近接するＬＮＡヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも４つの近接する２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ及び２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドからなる群より独立して選択される、少なくとも５つの近接する２’糖修飾ヌクレオシドを含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドの３’末端における少なくとも２つの近接する２’糖修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドの３’末端において、少なくとも３つの近接する２’糖修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドの３’末端において、少なくとも４つの近接する２’糖修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドの３’末端において、少なくとも５つの近接する２’糖修飾ヌクレオシドを含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ及び２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドからなる群より独立して選択される、３’末端における少なくとも２つの近接する２’糖修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、３’末端において、少なくとも２つの近接するＬＮＡヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、３’末端において、少なくとも２つの近接する２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドを含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ及び２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドからなる群より独立して選択される、３’末端における少なくとも３つの近接する２’糖修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、３’末端において、少なくとも３つの近接するＬＮＡヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、３’末端において、少なくとも３つの近接する２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ及び２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドからなる群より独立して選択される、３’末端における少なくとも４つの近接する２’糖修飾ヌクレオシドを含む。
【００７２】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、１つ以上のＬＮＡヌクレオシドなどの少なくとも１つ以上の糖修飾ヌクレオシドを含み、更に、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合などの修飾ヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドなどの少なくとも１つ以上の２’置換ヌクレオシドを含み、更に、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合などの修飾ヌクレオシド間結合を含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、３’側最末端位置（ｍｏｓｔ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）にＬＮＡヌクレオシド、又は３’最末端位置に２’−メトキシエチル若しくは２−Ｏ−メチルなどの２’置換ヌクレオシドを含み、更に、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含み得る。好適な修飾オリゴヌクレオチドは、例えば、長さが７〜５０の連続したヌクレオチド、例えば長さが７〜３０の連続したヌクレオチド、例えば長さが１０〜２４の連続したヌクレオチド、例えば１２〜２０の連続したヌクレオチド長であり得る。
【００７４】
骨格修飾オリゴヌクレオチド
骨格修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル以外の少なくとも１つのヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドである。修飾オリゴヌクレオチドは、有利には、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの骨格修飾オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。ここで、該修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間におけるヌクレオシド間結合の少なくとも７０％がホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、ヌクレオシド間結合の例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば全てが、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【００７５】
糖修飾オリゴヌクレオチド
糖修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドであり、ここで、リボース糖は、デオキシリボース（ＤＮＡヌクレオシド）又はリボース（ＲＮＡヌクレオシド）以外の部分で置換される。糖修飾オリゴヌクレオチドには、２’炭素が、水素又はヒドロキシル以外の置換基で置換されているヌクレオシドと、二環式ヌクレオシド（ＬＮＡ）と、が含まれる。いくつかの実施形態では、糖修飾は、２’フルオロＲＮＡ以外である。
【００７６】
２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨ若しくは−ＯＨ以外の置換基を有し（２’置換ヌクレオシド）、又は２’炭素とリボース環の第２の炭素との間に架橋を形成できる２’結合バイラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’−４’バイラジカル架橋）である。
【００７７】
実際、２’糖置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、多くの２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれた際に有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾糖は、向上された結合親和性、及び／又は増大されたヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドに提供することができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例には、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ、非ロック核酸（ｕｎｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＵＮＡ）、及び２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドがある。更なる例については、例えばＦｒｅｉｅｒ及びＡｌｔｍａｎｎ、「Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．」（１９９７年）第２５巻、第４４２９〜４４４３頁、及びＵｈｌｍａｎｎ，Ｃｕｒｒ．、「Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」（２０００年）第３巻、第２号、第２９３〜２１３頁、及びＤｅｌｅａｖｅｙ及びＤａｍｈａ、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（２０１２年）第１９巻、第９３７頁を参照されたい。以下は、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの説明である。
2021522816.tif 000002
【００７８】
本発明に関して、２’置換糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡなどの２’架橋ヌクレオシドを含まない。
【００７９】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２’フルオロ修飾ヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される少なくとも２つの連続した修飾ヌクレオチドを含み、これらは２’位に嵩高い側鎖基を含む修飾ヌクレオシドである。
【００８０】
ロックド核酸（ＬＮＡ）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、該ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを結合するバイラジカル（「２’−４’架橋」とも称される）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限又は固定する。これらのヌクレオシドは、文献にて架橋核酸又は二環式核酸（ｂｉｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＢＮＡ）とも称されている。リボースの立体配座の固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（デュプレックス安定化）に関連している。これはオリゴヌクレオチド／相補的デュプレックスの融解温度を測定することにより日常的に決定され得る。
【００８１】
非限定的に、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号、国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第００／０４７５９９号、国際公開第２００７／１３４１８１号、国際公開第２０１０／０７７５７８号、国際公開第２０１０／０３６６９８号、国際公開第２００７／０９００７１号、国際公開第２００９／００６４７８号、国際公開第２０１１／１５６２０２号、国際公開第２００８／１５４４０１号、国際公開第２００９／０６７６４７号、国際公開第２００８／１５０７２９号、Ｍｏｒｉｔａら、「Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．」、第１２巻、第７３〜７６頁；Ｓｅｔｈら、「Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．」（２０１０年）第７５巻、第５号、第１５６９〜８１頁；並びに、Ｍｉｔｓｕｏｋａら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」（２００９年）第３７巻、第４号、第１２２５〜１２３８頁；並びに、Ｗａｎ及びＳｅｔｈ、「Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（２０１６年）第５９巻、第９６４５〜９６６７頁に開示されている。
【００８２】
更なる非限定的で例示的なＬＮＡヌクレオシドは、スキーム１に開示されている。
スキーム１：
2021522816.tif 000003
【００８３】
特定のＬＮＡヌクレオシドは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、６’−メチル−β−Ｄ−オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）−６’−メチル−β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）、及びＥＮＡである。
【００８４】
特定の有利なＬＮＡは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。
【００８５】
２’置換オリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの３’末端２’置換ヌクレオシドなどの少なくとも１つの２’置換ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、２’置換オリゴヌクレオチドは、ギャップマーオリゴヌクレオチド、ミクスマーオリゴヌクレオチド、又はトータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、２’置換は、２’メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）又は２’Ｏ−メチルからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチドは、２’−Ｏ−ＭＯＥ又は２’−Ｏ−メチルなどの２’置換ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、４つより多くの連続したヌクレオシド修飾ヌクレオシドを含まない。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、３つより多くの連続したヌクレオシド修飾ヌクレオシドを含まない。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、３’末端において、２つの２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含み、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドに存在するヌクレオシド間結合の少なくとも７５％はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合の全ては、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。ホスホロチオエート結合オリゴヌクレオチドは、治療法としての使用を含め、哺乳動物におけるインビボ適用のために広く使用される。
【００８６】
いくつかの実施形態では、糖修飾オリゴヌクレオチドは、７〜３０ヌクレオチドの長さ、例えば８〜２５ヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、糖修飾オリゴヌクレオチドの長さは、１０〜２０ヌクレオチド、例えば１２〜１８ヌクレオチド長である。
【００８７】
ヌクレオシドオリゴヌクレオチドは、任意に、例えばＧａｌＮａＣ複合体と複合され得る。それらが複合される場合、複合基はオリゴヌクレオチドの３’位以外に位置することが好ましく、例えば、複合は５’末端にあってもよい。
【００８８】
ＬＮＡオリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの３’末端ＬＮＡヌクレオシドなどの少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、ギャップマーオリゴヌクレオチド、ミクスマーオリゴヌクレオチド、又はトータルマーオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、４つより多くの連続したＬＮＡヌクレオシドを含まない。いくつかの実施形態では、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、３つより多くの連続したＬＮＡヌクレオシドを含まない。いくつかの実施形態では、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、３’末端において、２つのＬＮＡヌクレオチドを含む。
【００８９】
ギャップマー
ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態において、ギャップマーオリゴヌクレオチドであり得る。
【００９０】
本明細書で使用される場合、用語「ギャップマー」とは、（フランク又はウィングにおける）親和性増強修飾ヌクレオシドなどの１つ以上のヌクレオシド修飾ヌクレオチドを含む隣接領域（「Ｆ」）によって、５’及び３’に隣接するＲＮアーゼＨ動員オリゴヌクレオチド（ギャップ「Ｇ」）の領域を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。ギャップマーは、典型的には１２〜２６ヌクレオチド長であり、いくつかの実施形態では、１〜６ヌクレオシド修飾ヌクレオシド（Ｆ１−６Ｇ６−１４Ｆ１−６）などの少なくとも１つのヌクレオシド修飾ヌクレオチドを含む隣接領域Ｆによって両側に隣接する、６〜１４ＤＮＡヌクレオシドの中央領域（Ｇ）を含み得る。ギャップ領域（例えば、ＤＮＡヌクレオシド領域）に隣接して位置する各フランクのヌクレオシドは、ＬＮＡ又は２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドなどのヌクレオシド修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、隣接領域内の全ヌクレオシドは、ＬＮＡ及び／又は２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドなどのヌクレオシド修飾ヌクレオシドであるが、しかしながら、フランクは、いくつかの実施形態において末端ヌクレオシドではないヌクレオシド修飾ヌクレオシドに加えて、ＤＮＡヌクレオシドを含んでもよい。
【００９１】
いくつかの実施形態では、隣接領域における全ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシド（ＭＯＥギャップマー）である。
【００９２】
ＬＮＡギャップマー
ＬＮＡギャップマーという用語は、フランクにおける親和性増強修飾ヌクレオシドの少なくとも１つがＬＮＡヌクレオシドである、ギャップマーオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドはＬＮＡギャップマーであり、ここで、オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの２つの３’側最末端ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマーの５’及び３’フランクの両方がＬＮＡヌクレオシドを含み、いくつかの実施形態では、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡオリゴヌクレオチド、例えばギャップマーオリゴヌクレオチドである。ここで、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオシドは、ＬＮＡ又はＤＮＡヌクレオシドのいずれかである。
【００９３】
混合ウィング（Ｍｉｘｅｄ  Ｗｉｎｇ）ギャップマー
混合ウィングギャップマー又は混合フランクギャップマーという用語は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドと、フランク領域の少なくとも１つが、例えば、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ、及び２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドなどの少なくとも１つの２’置換修飾ヌクレオシドなどの、少なくとも１つの非ＬＮＡ修飾ヌクレオシドと、を含む、ＬＮＡギャップマーを指す。いくつかの実施形態では、混合ウィングギャップマーは、ＬＮＡヌクレオシド（例えば、５’又は３’）のみを含む１つのフランクを有し、他のフランク（それぞれ、３’又は５’）は２’置換修飾ヌクレオシド及び任意にＬＮＡヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、混合ウィングギャップマーは、フランクにＬＮＡ及び２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドを含む。
【００９４】
ミクスマー
ミクスマーは、ヌクレオシド修飾ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含むオリゴヌクレオチドであって、ここで、該オリゴヌクレオチドは、４つより多くの連続したＤＮＡヌクレオシドを含まない。ミクスマーオリゴヌクレオチドは、核酸標的の非ＲＮＡｓｅＨ媒介調節のため、例えば、マイクロＲＮＡの阻害のため、又はスプライススイッチング調節若しくはプレｍＲＮＡのために、しばしば使用される。
【００９５】
トータルマー
トータルマーは、オリゴヌクレオチド中に存在する全ヌクレオシドがヌクレオシド修飾されている、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドである。トータルマーは、１つのタイプのヌクレオシド修飾のみを含んでもよく、例えば、完全２’−Ｏ−ＭＯＥ若しくは完全２’−Ｏ−メチル修飾オリゴヌクレオチド、又は完全ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドであってもよく、又は異なるヌクレオシド修飾の混合物、例えばＬＮＡと２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドとの混合物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、トータルマーは、１つ又は２つの３’末端ＬＮＡヌクレオシドを含み得る。
【００９６】
微小体（Ｔｉｎｙ）
微小オリゴヌクレオチドとは、オリゴヌクレオチド内の各ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである、７〜１０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。微小オリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡを標的とするため特に効果的な設計であることが知られている。
【００９７】
立体定義オリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、立体定義オリゴヌクレオチドである。立体定義オリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合の少なくとも１つが立体定義ヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチドである。
【００９８】
立体定義ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合の少なくとも１つが立体定義ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチドである。
【００９９】
ＲＮＡｉ又はｓｉＲＮＡ
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡセンス、及び／又はアンチセンス鎖などのＲＮＡｉ分子であり得る。本明細書では、用語「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子」とは、ＲＮＡ還元サイレンシング複合体（ＲＮＡ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＲＩＳＣ）によってＲＮＡ発現又は翻訳を阻害する任意の分子を指す。小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、典型的には、センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ複合体であり、これは細胞に投与されると、ＲＩＳＣ複合体（ｓｉＲＩＳＣ）へのアンチセンス鎖の組み込みがもたらされ、ＲＩＳＣ関連の細胞内の相補的なＲＮＡ標的核酸の翻訳阻害又は分解がもたらされる。センス鎖はパッセンジャ鎖とも称され、アンチセンス鎖はガイド鎖とも称される。小型ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＩＳＣを介してｍＲＮＡを分解することができるヘアピン構造を形成する単一の核酸分子である。ＲＮＡｉ核酸分子は、化学的に（ｓｉＲＮＡ複合体に典型的）若しくはインビトロ転写により合成され、又はベクタから発現され得る。
【０１００】
典型的には、ｓｉＲＮＡ（又は、ｓｈＲＮＡのアンチセンス領域）のアンチセンス鎖は、１７〜２５ヌクレオチド長、例えば１９〜２３ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡ複合体において、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、二本鎖デュプレックスを形成し、これは例えば１〜３ヌクレオチドの３’末端オーバーハングを含んでもよく、又は平滑末端（デュプレックスの一方又は両方の末端にオーバーハングがない）であってもよい。
【０１０１】
ＲＮＡｉは、細胞内でｓｉＲＮＡにプロセシングされる（ｄｓＲＮＡエンドヌクレアーゼＤＩＣＥＲが関与すると考えられるプロセス）、より長いｄｓＲＮＡ基質により媒介され得ることが認識されるであろう。Ｄｉｃｅｒ基質の有効な拡張形態は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３４９，８０９号及び米国特許第８，５１３，２０７号に記載されている。
【０１０２】
ＲＮＡｉ剤は、修飾ヌクレオチド間結合と、ＬＮＡ及びｃＥＴを含む２’−４’二環式リボース修飾ヌクレオシドなどの高親和性ヌクレオシドと、を用いて化学的に修飾することができる。例えば、２’Ｏ−メチル修飾ｓｉＲＮＡを開示している国際公開第２００２／０４４３２１号、ｓｉＲＮＡ複合体中のＬＮＡヌクレオシドの使用（ｓｉＬＮＡとして既知）を開示している国際公開第２００４０８３４３０号、及びｓｉＲＮＡ中の不連続パッセンジャ鎖の使用（ｓｉＬＮＡ複合体など）を開示している国際公開第２００７１０７１６２号を参照されたい。国際公開第０３００６４７７号はＲＮＡｉのｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ（ｓｔＲＮＡとも称される）オリゴヌクレオチドメディエータを開示している。Ｈａｒｂｏｒｔｈら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．（２００３年４月）第１３巻、第２号、第８３〜１０５頁は、小型干渉ＲＮＡ及び短ヘアピンＲＮＡの配列、化学、構造変化、及び哺乳動物遺伝子サイレンシングに対する効果に言及している。
【０１０３】
本発明の方法は、ｓｉＲＮＡ複合体の両方のストランドの同時シーケンシングを可能にすることが認識されるであろう。
【０１０４】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１０５】
本明細書で使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして、定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡではない。アンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。単鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたって内部（ｉｎｔｒａ）又は相互（ｉｎｔｅｒ）の自己相補性の程度が５０％未満である限り、ヘアピン又は分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２分子間の二重鎖）を形成できることが理解される。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖修飾オリゴヌクレオチドである。
【０１０７】
ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成単位であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチド及び天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む。本来、ＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、及び１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドに存在しない）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、「単位」又は「モノマー」と互換的に称されてもよい。
【０１０８】
修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される用語「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」とは、等価なＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと比較して、糖部分又は（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾された糖部分を含む。用語修飾ヌクレオシドはまた、用語「ヌクレオシド類似体」又は修飾「単位」若しくは修飾「モノマー」と互換的に使用されてもよい。非修飾ＤＮＡ又はＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書でＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの塩基領域における修飾を有するヌクレオシドは、それらがＷａｔｓｏｎ  Ｃｒｉｃｋ塩基対合が可能であれば、依然として一般にＤＮＡ又はＲＮＡと称される。
【０１０９】
修飾ヌクレオシド間結合
用語「修飾ヌクレオシド間結合」とは、２つのヌクレオシドを互いに共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者により理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増大させる。天然に存在するオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合は、隣接するヌクレオシド間のホスホジエステル結合を形成するリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間結合は、インビボ使用のためのオリゴヌクレオチドの安定化に特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの領域、例えばギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内、並びに領域Ｆ及びＦ’などの修飾ヌクレオシドの領域におけるヌクレアーゼ切断から保護する役割を果たし得る。
【０１１０】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合が、例えばヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性であるように、天然のホスホジエステルから修飾された１つ以上のヌクレオシド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを血清中でインキュベートすることにより、又はヌクレアーゼ耐性アッセイ（例えば、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ））を用いることにより決定することができ、これらの両方は当技術分野で周知である。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を向上させることができるヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合と称される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合が修飾され、例えばオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０又は例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基、例えば複合体に結合するヌクレオシドは、ホスホジエステルであり得ることが認識されるであろう。
【０１１１】
好ましい修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートである。
【０１１２】
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、そのヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態、及び製造の容易さのために特に有用である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであり、例えばオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％又は例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部がホスホロチオエートである。
【０１１３】
ホスホロチオエート結合などのヌクレアーゼ耐性結合は、標的核酸とデュプレックスを形成するときにヌクレアーゼを動員することができるオリゴヌクレオチド領域、例えばギャップマーの領域Ｇにおいて特に有用である。しかしながら、ホスホロチオエート結合は、非ヌクレアーゼ動員領域及び／又は親和性増強領域、例えばギャップマーの領域Ｆ及びＦ’においても有用であり得る。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、領域Ｆ若しくはＦ’、又は領域Ｆ及びＦ’の両方に１つ以上のホスホジエステル結合を含んでもよく、領域Ｇのヌクレオシド間結合は、完全にホスホロチオエートであり得る。
【０１１４】
有利には、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列の全ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
【０１１５】
欧州特許第２７４２１３５号に開示されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他のヌクレオシド間結合（ホスホジエステル及びホスホロチオエート以外の）、例えばアルキルホスホネート／メチルホスホネートヌクレオシド間結合を含んでもよいことが認識され、これは欧州特許第２７４２１３５号によれば、例えば別のＤＮＡホスホロチオエートのギャップ領域内で耐性であり得る。
【０１１６】
核酸塩基
核酸塩基という用語は、ヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン（例えば、アデニン及びグアニン）及びピリミジン（例えば、ウラシル、チミン、及びシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能性である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」とは、天然に存在する核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、及びヒポキサンチンと、天然に存在しない変異体との両方を指す。そのような変異体は、例えば、Ｈｉｒａｏら（２０１２年）「Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」第４５巻、第２０５５頁、及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９年）「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｕｐｐｌ．」第３７巻、第１．４．１頁に記載されている。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、核酸塩基部分は、プリン又はピリミジンを修飾プリン又はピリミジン、例えば置換プリン又は置換ピリミジン、例えばイソシトシン、シュードイソシトシン、５−メチルシトシン、５−チアゾロ−シトシン、５−プロピニル−シトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−ブロモウラシル５−チアゾロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、２’チオ−チミン、イノシン、ジアミノプリン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、及び２−クロロ−６−アミノプリンから選択される核酸塩基に変えることにより修飾される。
【０１１８】
核酸塩基部分は、各々の対応する核酸塩基の文字コード、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はＵにより示され、ここで、各文字は、等価な機能の修飾核酸塩基を場合により含み得る。例えば、例示したオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及び５−メチルシトシンから選択される。場合により、ＬＮＡギャップマーについて、５−メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。
【０１１９】
核酸塩基配列
核酸塩基配列とは、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド中に存在する核酸塩基の配列を指す。オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、通常、Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧ核酸塩基の配列を指す。したがって、オリゴヌクレオチド内の５−メチルシトシン塩基の存在は、シーケンシング法によって同定される核酸塩基配列中のシトシン残基として同定することができる。同様に、ウラシル核酸塩基は、シーケンシング法においてチロシン塩基として同定され得る。
【０１２０】
核酸配列
用語「核酸配列」とは、ヌクレオチドの連続配列を含み、修飾オリゴヌクレオチド又はその逆相補体に存在するヌクレオチドの配列を含み得る、核酸分子を指す。
【０１２１】
相補性
用語「相補性」とは、ヌクレオシド／ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋの塩基対合の能力を説明する。Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対は、グアニン（Ｇ）−シトシン（Ｃ）及びアデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでもよく、例えば５−メチルシトシンは度々シトシンの代わりに使用され、したがって相補性という用語は、非修飾及び修飾核酸塩基の間のＷａｔｓｏｎ  Ｃｒｉｃｋ塩基対合を包含することが理解されるであろう（例えばＨｉｒａｏら（２０１２年）「Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」第４５巻、第２０５５頁、及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９年）「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｕｐｐｌ．」第３７巻、第１．４．１頁を参照されたい）。
【０１２２】
同一性（ヌクレオチド配列）
本明細書で使用される用語「同一性」とは、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、配列モチーフ）に同一である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性の百分率は、２つの配列（本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列及び参照配列における）の間で同一の（一致する）整列された塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。したがって、同一性の百分率＝（一致×１００）／整列領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さ。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性の百分率の計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がＷａｔｓｏｎ  Ｃｒｉｃｋ塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５−メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
【０１２３】
ハイブリダイゼーション
本明細書で使用される用語「ハイブリダイズしている」又は「ハイブリダイズする」は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチド及び標的核酸）が対向する鎖上の塩基対の間で水素結合を形成することによりデュプレックスを形成するとして理解するべきである。
【０１２４】
本明細書で使用される用語「ハイブリダイズしている」又は「ハイブリダイズする」は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチド及び標的核酸）が対向する鎖上の塩基対の間で水素結合を形成することによりデュプレックスを形成するとして理解するべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、度々、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される融解温度（Ｔｍ）によって記述される。
【０１２５】
同一性（アミノ酸配列）
同一性：２つのアミノ酸の関連性は「同一性」というパラメータで表される。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（「ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ」、Ｒｉｃｅら（２０００年）「Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」第１６巻、第２７６〜２７７頁；ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）のＮｅｅｄｌｅプログラム、好ましくはバージョン３．０．０以降に実装される、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０年）「Ｊ．Ｍｏ／．Ｂｉｏｌ．」第５巻、第４８号、第４４３〜４５３頁）を用いて決定される。使用されるオプションのパラメータは、ギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ拡張ペナルティ０．５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリクスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識した「最長同一性（ｌｏｎｇｅｓｔ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」の出力（１０−ｎｏ  ｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）はパーセント同一性として使用され、次のように計算される：（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメントにおけるギャップの総数）。
【０１２６】
アプタマ
アプタマは、非核酸ハイブリダイゼーション機構を介して特定の標的分子に結合する、典型的には２０〜６０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、アプタマであってもよく、又はアプタマとして機能する核酸配列の領域を含んでもよい。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ及び２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドからなる群より独立して選択される、少なくとも２つ、例えば少なくとも３つの近接する２’糖修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ及び２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドからなる群より独立して選択される、２’糖修飾ヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に位置する、少なくとも２つ、例えば少なくとも３つの近接する２’糖修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に配置された、少なくとも２つ、例えば少なくとも３つの近接するＬＮＡヌクレオシドを含む。
【０１２７】
連結
連結とは、オリゴヌクレオチドなどの２つの核酸断片の共有結合連結を指す。連結は、典型的には、１つの核酸断片上の３’−ＯＨ基と別の核酸断片上の５’ホスホリル基との間のリン酸結合の形成を含み、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼ酵素によって触媒され得る。
【０１２８】
修飾オリゴヌクレオチドへの３’捕捉プローブの連結は、いくつかの実施形態において、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用し得る。好適には、３’捕捉プローブの５’側最末端ヌクレオシドはＤＮＡであり得る。
【０１２９】
修飾オリゴヌクレオチドへの５’捕捉プローブの連結は、いくつかの実施形態において、Ｔ４−ＲＮＡリガーゼ又はＴ４−ＲＮＡリガーゼＩＩを使用し得る。好適には、５’捕捉プローブの３’側最末端ヌクレオシドはＲＮＡであり得る。
【０１３０】
３’捕捉プローブオリゴヌクレオチド
本明細書に記載されるように、３’捕捉プローブオリゴヌクレオチドは、第１プライマー結合部位を含み、そして本発明の方法において、修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に連結され、それによって、修飾オリゴヌクレオチドを鋳型として用いるポリメラーゼベースの鎖伸長を可能にする、オリゴヌクレオチドである。第１プライマー結合部位はまた、固相結合プライマーなどの、プライマーをシーケンシングするための結合部位としても使用され得る。
【０１３１】
３’捕捉プローブは、修飾オリゴヌクレオチドの３’領域に相補的な３’領域を含み（又は、縮重領域である）、それによって、修飾オリゴヌクレオチドへの捕捉プローブの連結を容易にするオリゴヌクレオチドの３’領域を捕捉することができる。あるいは、スプリント（ｓｐｌｉｎｔ）連結を行ってもよい。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、プライマーベースのシーケンシングのために、３’捕捉プローブオリゴヌクレオチドは、固相結合プライマーなどのシーケンシングプライマー結合部位を更に含み得る。したがって、捕捉プローブは、第１プライマー側に共通であってもよいか、又は第１プライマー結合部位から分離している若しくはこれとオーバーラップしている独立した領域であってもよい、フローセル結合部位などの、超並列シーケンシングに使用される固体支持体に結合するための結合部位を含んでもよい。シーケンシングプライマー結合部位が第１プライマー結合部位と異なる場合、シーケンシングプライマー結合部位は上流（すなわち、第１プライマー結合部位の５’）にあり、それによって、捕捉プローブからの第１ストランド合成におけるシーケンシングプライマー結合部位の取り込みを確実にすることが理解されるであろう。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本発明の捕捉プローブは、例えば、自己プライミング３’捕捉プローブオリゴヌクレオチドにおいて使用するための切断可能な連鎖群を含む。自己プライミング３’捕捉プローブは、二本鎖（本明細書では、第２のデュプレックス領域と称することがある）を形成する捕捉プローブ内の２つの領域の間の自己相補性の２つの領域によって、第１プライマーの添加なしに、５’−３’鎖伸長（第１ストランド合成）を開始するために使用することができる。ここで、該自己プライミング捕捉プローブは、切断されると５’−３’ポリメラーゼ媒介鎖伸長（例えば、３’末端−ＯＨ基を含むデュプレックス領域）のための基質を提供する、切断可能な結合を含む。切断可能な結合は、自己相補性領域の３’側最末端領域に隣接して配置されてもよい。切断可能な結合は、任意の切断可能な基であり得、例えば、ＵＶ切断可能であり得る又は酵素的に切断され得る。１つの好ましい切断基は、ＲＮアーゼＨ２酵素を用いて切断することができる、ミスマッチＲＮＡヌクレオシドを含む領域である。効率的なＲＮアーゼＨ２切断のために、ミスマッチＲＮＡヌクレオシドは、２つの遠位領域の間に形成される捕捉プローブデュプレックスの一部を形成する３又は４の３’（及び、任意に５’）ヌクレオシドに隣接させることができる。
【０１３４】
好ましい実施形態では、３’捕捉プローブは、連結（例えば、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを使用する場合、他の連結法を使用してもよい）によってヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドを「捕捉する」ために使用される少なくとも１つの５’ＤＮＡヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドである。捕捉は、修飾ヌクレオシドオリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチドへの捕捉プローブの５’末端の連結によって起こり得る。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、連結工程の前に核酸ハイブリダイゼーション（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対）を介して標的核酸配列を捕捉するために使用される、標的修飾オリゴヌクレオチド配列上の領域に相補的な領域を更に含むことが有利であり得る。捕捉プローブの領域と修飾オリゴヌクレオチド上の相補的領域との間のハイブリダイゼーションの使用は、局所基質濃度を効果的に富化し、連結工程の効率を高める。国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７８６９５号は、本発明の方法で用いることができる捕捉プローブを開示している。３’捕捉プローブは、本発明の方法に含まれる増幅工程（ＰＣＴ工程）で使用するためのＰＣＲプライマー結合部位を更に含み得る。
【０１３５】
本発明は、糖修飾オリゴヌクレオチドの並列シーケンシングに使用するための３’捕捉プローブオリゴヌクレオチドを提供又は使用し、５’−３’：
Ａ．所定の配列の少なくとも３つの連続したヌクレオチドを含む５’領域であって、５’側最末端ヌクレオチドが、末端５’リン酸基を有するヌクレオチドである、領域と；
Ｂ．任意に、所定のヌクレオチド配列の領域を含む並列シーケンシング反応バーコード領域と；
Ｃ．任意に、領域Ｂの３’又は領域Ｂの５’に位置する縮重ヌクレオチド又は所定ヌクレオチドの領域と；
Ｄ．固相シーケンシングプライマー結合部位と；
Ｅ．任意に、第１プライマー結合部位と；
Ｆ．任意に、リンカー領域（ヌクレオチドの配列であり得る）と；
Ｇ．第１のセグメント（第１のデュプレックス領域）の所定の配列Ａに相補的な、ヌクレオチドの連続配列と；
Ｈ．少なくとも２ヌクレオチドの領域であって、３’側最末端ヌクレオチドが、ブロックされた３’末端基を有する末端ヌクレオチドである、領域と；を含む。
【０１３６】
図表示については、図７を参照されたい。捕捉プローブが第１プライマー結合部位を含まない実施形態では、第１プライマーは、領域Ｄとハイブリダイズするように設計され得る（すなわち、領域Ｄは、シーケンシングプライマー結合部位であり得、かつ第１プライマー結合部位として使用され得る）。
【０１３７】
本発明は、糖修飾オリゴヌクレオチドの並列シーケンシングに使用するための３’捕捉プローブオリゴヌクレオチドを提供又は使用し、５’−３’：
Ａ．所定の配列の少なくとも３つの連続したヌクレオチドを含む５’領域であって、５’側最末端ヌクレオチドが、末端５’リン酸基を有するヌクレオチドである、領域と；
Ｂ．任意に、所定のヌクレオチド配列の領域を含む並列シーケンシング反応バーコード領域と；
Ｃ．任意に、領域Ｂの３’又は領域Ｂの５’に位置する縮重ヌクレオチド又は所定ヌクレオチドの領域と；
Ｄ．固相シーケンシングプライマー結合部位と；
Ｅ．任意に、第１プライマー結合部位と；
Ｆ．任意に、リンカー領域（ヌクレオチドの配列であり得る）と；
Ｆ’  第１プライマー結合部位及び／又は固相シーケンシングプライマー結合部位とデュプレックスを形成する領域であり、ここで、デュプレックスは切断可能なリンカーを含む、領域と；
Ｇ．第１のセグメント（第１のデュプレックス領域）の所定の配列Ａに相補的な、ヌクレオチドの連続配列と；
Ｈ．少なくとも２ヌクレオチドの領域であって、３’側最末端ヌクレオチドが、ブロックされた３’末端基を有する末端ヌクレオチドである、領域と；を含む。
【０１３８】
領域Ｆ’における切断可能なリンカーの切断は、外因的に添加された第１プライマーを使用せずに第１ストランド合成に使用することができる３’末端を残す（すなわち、自己プライミング捕捉プローブを形成する）。
【０１３９】
本発明の方法において使用され得る例示的３’捕捉プローブの例としては、図７を参照されたい。
【０１４０】
領域Ａ：
いくつかの実施形態では、領域Ａは、所定の配列の少なくとも３つの連続したヌクレオチドを含むか、又はそれらからなり、ここで、５’末端ヌクレオチドは、５’リン酸基を含むＤＮＡヌクレオチドである。少なくとも３つの連続するヌクレオチドは、領域Ｇ（第１のデュプレックス領域）に相補的であり、かつ領域Ｇにハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、領域Ａの少なくとも３つの連続するヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレオチドである。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、領域Ａは、少なくとも３つの連続したヌクレオチド、例えば３〜１０の連続ヌクレオチド、例えば３〜１０のＤＮＡヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる。
【０１４２】
領域Ｂ：
領域Ｂは、ＤＮＡヌクレオチドなどの３〜２０ヌクレオチドの領域など、所定のヌクレオチド配列の領域を含む並列シーケンシング「反応バーコード」領域として使用され得るか、又は該並列シーケンシング領域である。捕捉プローブが領域Ｂを含むことは、別個の捕捉プローブ連結からの試料のプールが、共通の並列シーケンシング操作におけるシーケンシングの前にプールされることを可能にするので、有利である。異なる領域Ｂ配列を有する異なる捕捉プローブの使用によって、別個の捕捉プローブ連結からの配列データのシーケンシング後分離が可能となる。
【０１４３】
領域Ｃ
領域Ｃは、領域Ａの３’に位置するヌクレオチドの任意の配列であり、これは、所定の配列若しくは縮重配列を含んでもよいか、又はいくつかの実施形態では、所定の配列部分及び縮重配列部分の両方を含んでもよい。領域Ｃの長さは、存在する場合、用途に応じて調節され得る。縮重配列が使用される場合、その後のシーケンシング工程における増幅生成物の「分子バーコーディング」を可能にすることで、特定の増幅生成物が特有であるかどうかを決定させる。これは、オリゴヌクレオチドの異種混合物中に存在する、異なるオリゴヌクレオチドの比較定量化を可能にする。いくつかの実施形態では、領域Ｃは、３〜３０縮重連続ヌクレオチド、例えば３〜３０縮重連続ＤＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、領域Ｃは、イノシンヌクレオチドなどのユニバーサルヌクレオチドを含む。
【０１４４】
いくつかの配列はＰＣＲ中に優先的に増幅され得ることが知られており、これにより、縮重配列に由来する遺伝的「バーコード配列」の発生を計数することで、増幅前の相対量を決定することができる（例えば、Ｋｉｅｌｐｉｎｓｋｉ及びＶｉｎｔｅｒ、「ＮＡＲ」（２０１４年）第４２巻、第８号、第ｅ７０頁参照）。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、領域Ｃは、バーコード配列及び所定の配列の両方の利点を可能にする、半縮重配列を導入する。追加の利点とは、バーコード配列の品質管理である（例えば、Ｋｉｅｌｐｉｎｓｋｉら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（２０１５年）第５５８巻、第１５３〜１８０頁参照）。半縮重配列は、各位置に選択された半縮重核酸塩基を有する（半縮重の定義であるＮｅｅｄに基づき、ＩＵＰＡＣコード、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｋ、Ｍ、Ｂ、Ｄ、Ｈ、及びＶを追加する（表３を参照））。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、領域Ｃは、縮重配列及び所定の配列の両方を有するか、若しくは縮重配列及び半縮重配列の両方を有するか、若しくは所定の配列及び半縮重配列の両方を有するか、又は縮重配列及び所定の配列及び半縮重配列を有する。
【０１４７】
領域Ｃが所定の配列を含む場合、これは、例えば、第１プライマー部位の上流に代替的又はネストされたプライマー部位を提供することができ、ネストされたプライマー部位の使用は、ＰＣＲ増幅中に非特異的結合を減少させるための周知のツールである。いくつかの実施形態では、領域Ｃは、３〜３０の所定の連続ヌクレオチド、例えば３〜３０の所定の連続ＤＮＡヌクレオチドを含む。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、領域Ｃを含まない。
【０１４９】
機能性領域Ｃは、領域Ｂの５’又は領域Ｂの３’に配置され得ることが理解されるであろう。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、存在領域Ｃが、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の連続縮重ヌクレオシドなどの、少なくとも３つの連続縮重ヌクレオシドからなるか、又はそれらを含む。
【０１５１】
領域Ｄ
領域Ｄは固相プライマー結合部位であり、また、シーケンシングプライマー結合部位とも呼ばれ、任意のクローン増幅及び続く並列シーケンシングの前に、固相支持体に結合したオリゴヌクレオチドに、アダプターライゲーション産物か、又は任意にはアダプターライゲーション産物から調製されたＰＣＲ産物かを捕捉するために使用される。領域Ｄはまた、第１ストランド合成を開始するための第１プライマー結合部位として使用され得る。
【０１５２】
自己プライミング捕捉プローブにおいて、領域Ｄは、固相支持体に結合したプライマーとの領域Ｄの結合を損なわない限り、ミスマッチＲＮＡヌクレオチドなどの切断可能な結合を含む下流（３’）領域（Ｆ’）とハイブリダイズするデュプレックス（第２のデュプレックス）の一部を形成し得る（すなわち、シーケンシングプライマー結合部位の完全性は、領域Ｆ’の切断後も維持される）。
【０１５３】
領域Ｅ
領域Ｅは、第１ストランド合成を開始するために使用される、第１プライマー結合部位である。領域Ｄが第１プライマー結合部位として使用される場合、領域Ｅを含める必要はない。したがって、機能的には、第１プライマー結合部位領域Ｅは、販売相プライマー結合部位（Ｄ）と同一であってもよく、又は領域Ｄと部分的に重複していてもよい。
【０１５４】
本発明の自己プライミング捕捉プローブでは、領域Ｅは、ミスマッチＲＮＡヌクレオチドなどの切断可能な結合を含む下流（３’）領域（Ｆ’）とハイブリダイズする、デュプレックス（第２のデュプレックス）の一部を形成し得る。
【０１５５】
領域Ｇ
領域Ｇは、領域Ａとデュプレックスを形成する領域Ａに相補的なヌクレオチドの領域である。領域Ｇが領域Ａに相補的なＲＮＡヌクレオシドを含まない場合は有益であり、また、捕捉プローブの５’末端ヌクレオシドに相補的かつハイブリダイズする領域Ｇに存在するヌクレオシド（領域Ａの５’ヌクレオシド）が、ＤＮＡヌクレオシドであることも有益である。この結果、領域Ａと領域Ｇとがハイブリダイズすると、ＤＮＡ／ＤＮＡデュプレックスが形成される。いくつかの実施形態では、領域Ｇの２つ又は３つの３’側最末端は、ＤＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｇのヌクレオシドの全ては、ＤＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｇは、領域Ａに相補的であり、かつハイブリダイズし得る、少なくとも３つの連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、領域Ｇの少なくとも３つの連続するヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレオチドである。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、領域Ｇは、３〜１０の連続ヌクレオチド、例えば３〜１０のＤＮＡヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる。いくつかの実施形態では、領域Ａ及び領域Ｇのヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレオチドである。相補的配列Ａ及びＧの長さ及び組成（例えば、Ｇ／Ｃ対Ａ／Ｔ）は、ハイブリダイゼーションの強度を調節するために使用することができ、これにより捕捉プローブの最適化が可能となる。相補的配列内のミスマッチの導入を使用して、ハイブリダイゼーション強度を減少させることができることもまた認識されている（例えば、国際公開第２０１４１１０２７２号参照）。いくつかの実施形態では、領域Ａ及びＧは連続する相補的配列を形成しないが、いくつかの実施形態では部分的相補性に起因して、領域Ａ及びＧは、試料と混合されるとデュプレックスを形成する。領域Ａ及びＧの３’側最末端塩基対は相補的塩基対であるべきであり、いくつかの実施形態では、領域Ａ及びＧの２又は３の最末端塩基対は相補的塩基対である。いくつかの実施形態では、これらの３’塩基対は、ＤＮＡ塩基対である。
【０１５７】
領域Ｈ
領域Ｈは、検出され、捕捉され、配列決定され、及び／又は定量化されるヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドに、３’捕捉プローブオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる目的に役立つ。
【０１５８】
領域Ｈは、その相補的配列の領域Ａ及びＧがハイブリダイズする場合、３’オーバーハングを形成する少なくとも２又は３ヌクレオチドの領域である。領域Ｈの３’末端ヌクレオシドは３’位でブロックされている（すなわち、３’−ＯＨ基を含まない）。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、領域Ｈは、少なくとも３ヌクレオチドの長さを有する。領域Ｈの最適な長さは、少なくとも捕捉されるオリゴヌクレオチドの長さに依存してもよく、そして本発明者らは、領域Ｈが、例えばＲＮアーゼ処理試料を用いる場合に２ヌクレオチドのオーバーラップで機能することができ、好ましくは少なくとも３ヌクレオチドであることを見出した。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、領域Ｈは、オリゴヌクレオチド配列の事前知識なしにオリゴヌクレオチドの捕捉を可能にする、縮重配列又は半縮重配列を含む。これらの配列の予備知識なしにオリゴヌクレオチドを捕捉することは、所望の生体内分布を有する異なるオリゴヌクレオチド配列のライブラリから特定のオリゴヌクレオチドを同定するのに、又は部分的オリゴヌクレオチド分解生成物を同定するのに、特に有用である。本発明のプローブ及び方法はまた、アプタマの捕捉及び同定にも適用され得る。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、領域Ｈは、既知の配列を有するヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドの捕捉を可能にする所定の配列を含む。所定の捕捉領域Ｈの使用により、例えば、前臨床若しくは臨床開発のための、又はその後の患者由来材料における局所組織若しくは細胞濃度若しくは曝露を決定するための、インビボでの治療用オリゴヌクレオチドの捕捉、検出、及び定量化が可能となる。患者における化合物濃度の決定は、患者における治療用オリゴヌクレオチドの用量を最適化するのに重要であり得る。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、領域Ｈは、１つ以上のＬＮＡヌクレオシドなどの高親和性修飾ヌクレオシドを含む。領域ＨにおけるＬＮＡなどの高親和性修飾ヌクレオシドの使用は、修飾オリゴヌクレオチドの効率的な捕捉を可能にしながら、ヌクレオチドのより短い領域の使用を可能にする。ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドに関して、ＬＮＡ／ＬＮＡハイブリッドは特に強い。領域Ｈにおける高親和性修飾ヌクレオシドの選択的使用により、捕捉効力が最適化され得ることが理解されるであろう。
【０１６３】
領域Ｈは、所定のヌクレオチド配列又は縮重（若しくは、部分的縮重）配列の領域であり得る。修飾オリゴヌクレオチドの３’領域が既知である場合、所定のヌクレオチド配列を使用することができる。領域Ｈの縮重配列は、未知の配列の修飾オリゴヌクレオチドを連結するために、又は修飾オリゴヌクレオチドの集団内の３’領域内に非均一性がある場合に使用され得る。いくつかの実施形態では、領域Ｈは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２の連続縮重ヌクレオシドなどの、少なくとも４つの連続縮重ヌクレオシドからなるか、又はそれらを含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、存在する場合、領域Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥのヌクレオシドは、ＤＮＡヌクレオシドである。
【０１６５】
リンカー部分（Ｆ）（任意）
領域Ｆ
領域Ｆは任意の領域であり、図７の領域Ｅと領域Ｇとを結ぶ細い線によって図示される。領域Ｅが存在しない場合、領域Ｄ及び領域Ｇ、又は領域Ｄ若しくは領域Ｅを、領域Ｆ’に連結することができる。いくつかの実施形態では、捕捉プローブオリゴヌクレオチドは、非ヌクレオシドリンカーを含まない。
【０１６６】
領域Ｆは、捕捉プローブ領域Ａ及びＧを第１のデュプレックス領域へのハイブリダイズを容易にするために使用されてもよく、そしてヌクレオシドの領域であってもよいか、又は非ヌクレオチドリンカーを含み得る。いくつかの実施形態では、領域Ｆは存在し、かつ領域Ｆは、少なくとも３又は４ヌクレオチド、例えば少なくとも３又は４のＤＮＡヌクレオチド、例えば４〜２５ヌクレオチドを含む。
【０１６７】
領域Ｆの重要な機能は、領域Ａと領域Ｇとの間でのデュプレックス形成を可能にすることであり（最初のデュプレックス）、自己プライミング３’捕捉プローブの実施形態では、領域Ｆ’と領域Ｅとの間、若しくは領域Ｆ’と領域Ｄとの間、又は領域Ｆ’と領域Ｄ及び領域Ｅでのオーバーラップとの間における第２の二重鎖形成を可能にすることである。したがって、領域Ｆは、捕捉プローブ内で分子内ヘアピン構造を形成し得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、例えば、領域Ｄ（並びに、任意には領域Ｂ及び／又は領域Ｃ）が領域Ａと領域Ｇとの間のデュプレックス形成を可能にする分子内ヘアピンを形成することができる場合、領域Ｆは必要とされないことが認識されている。自己プライミング捕捉プローブの実施形態では、領域Ｆが有利であることが想定される。
【０１６８】
ヌクレオチドの領域は、ポリメラーゼのリードスルーを妨げる修飾（例えば、逆向きヌクレオチド結合）を含んでも又は含まなくてもよい。
【０１６９】
例えば非ヌクレオチドリンカー又はポリメラーゼ阻害修飾を介して、領域Ｄから領域ＧへのＤＮＡポリメラーゼのリードスルーを妨げる利点は、これが代替鋳型分子の形成を妨げることにある。このような代替鋳型分子は、捕捉プローブの５’領域上のヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドに特異的なプライマーのミスプライミングを生じる。
【０１７０】
本発明のいくつかの実施形態では、リンカー部分Ｆは、領域Ａ及びＧをハイブリダイズさせるヌクレオチドの領域であり得る。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、領域Ｆは、ポリメラーゼ遮断リンカー、例えばＣ６−３２ポリエチレングリコールリンカー、例えばＣ１８ポリエチレングリコールリンカー、又はアルキルリンカーを含む。使用され得る他の非限定的な例示的リンカー基は、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７８６９５号に開示されている。
【０１７２】
スプリント連結
３’及び／又は５’捕捉プローブは、いくつかの実施形態では、直線的捕捉プローブであってもよい。直線的捕捉プローブでは、直線的捕捉プローブと共にスプリント連結プライマーを使用することが有利であり得る。例えば、スプリント連結プライマーは、３’捕捉プローブの５’領域及び修飾オリゴヌクレオチドの３’領域にハイブリダイズし、それにより、連結される末端を整列させることができる。あるいは、スプリント連結プライマーは、５’捕捉プローブの３’領域及び修飾オリゴヌクレオチドの５’領域にハイブリダイズし、それにより、連結される末端を整列させることができる。
【０１７３】
５’捕捉プローブ
いくつかの実施形態では、５’捕捉プローブは、第１ストランド合成の前に修飾オリゴヌクレオチドの５’末端に連結される。５’捕捉プローブ連結を容易にするために、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端は、５’リン酸基を含むべきである。５’リン酸基を含まない修飾オリゴヌクレオチドについては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化することができる。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端への５’捕捉プローブの連結の前に、修飾オリゴヌクレオチドが５’リン酸基を含まない場合、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端のリン酸化を含む更なる工程が実施され得る。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼは、オリゴヌクレオチドの５’末端をリン酸化するために使用され得る。
【０１７５】
５’捕捉プローブは、有利には、１以上の３’末端ＲＮＡヌクレオシド、例えば１〜１０ＲＮＡヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、又は６ＲＮＡヌクレオチドを含み得る。３’末端にＲＮＡヌクレオチドを用いることにより、Ｔ４−ＲＮＡリガーゼ又はＴ４−ＲＮＡリガーゼＩＩを使用して、修飾オリゴヌクレオチドに対する５’捕捉プローブの連結を触媒することができる。５’捕捉プローブは、ＰＣＲ又はプライマーベースのシーケンシングアプローチに用いることができる、プライマー結合部位を含む。５’捕捉プローブは、フローセルプライマー結合部位、及び／又はクローン増幅プライマー結合部位、及び／又はシーケンシングプライマー結合部位を更に含み得る。フローセル結合部位、クローン増幅プライマー結合部位、及び／又はシーケンシングプライマー結合部位は、５’捕捉プローブＰＣＲプライマー結合部位を認識するＰＣＲプライマーに組み込まれ得ることが、理解されるであろう。
【０１７６】
５’捕捉プローブは、プライマー結合部位の３’に位置し得るバーコード配列を含み得る（下流のＰＣＲ又はクローン増幅工程で保持されることを確実にする）。バーコード配列は、分子バーコードであってもよく、若しくは配列反応バーコードであってもよく、又は５’捕捉プローブは、分子バーコード若しくは配列反応バーコードの両方を含んでもよい。
【０１７７】
修飾オリゴヌクレオチドの５’末端への５’捕捉プローブの３’末端の位置決めを容易にするために、スプリント連結アプローチを使用してもよい。あるいは、捕捉プローブは、５’捕捉プローブの３’領域内の相補的配列とデュプレックスを形成する５’領域を含むことができ、ここで、該５’領域は、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端又は縮重オリゴヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチドの領域を配置する。５’捕捉プローブの５’末端は、捕捉プローブの自己連結を避けるために、５’リン酸塩以外であるべきである。
【０１７８】
本発明は、本発明の方法で使用され得る捕捉プローブオリゴヌクレオチドを提供し、３’−５：
Ｉ．第１の領域であって、３’末端ＲＮＡヌクレオシド、又は３’末端−ＯＨ基を有するＲＮＡヌクレオチドの３’末端領域を含む、領域と；
ＩＩ．ヌクレオチドの第２の領域であって、プライマー結合部位、例えばＰＣＲプライマー結合部位（又は第２ストランド合成のためのプライマー部位）の該相補体を含む、領域と；
ＩＩＩ．第３の領域であって、
ａ．ヌクレオチドの配列、又は、
ｂ．ポリメラーゼのリードスルーを阻害するリンカー領域、又は、
ｃ．５’リン酸塩以外の５’末端基を含む、領域と；
ＩＶ．ヌクレオチドの第４の領域であって、
ａ．該第３の領域と共有結合しているか、又は、
ｂ．該第３の領域が５’−リン酸以外の５’末端基である場合、該第４の領域と不連続であるか、のいずれかである、領域と；
Ｖ．ヌクレオチドの第５の領域であって、該修飾オリゴヌクレオチドの５’領域に相補的である、又は任意に縮重ヌクレオチドの領域であり得る、領域と；
ＶＩ．５’ブロッキング基、すなわち５’リン酸塩以外の５’基と；を含み、
ここで、該第２の領域及び該第４の領域は、該第２の領域と該第４の領域との間にデュプレックスを形成することができるヌクレオチドの相補的領域を含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、第１の領域（Ｉ）は、２〜２０のＲＮＡヌクレオチド、例えば３〜１０のＲＮＡヌクレオチドを含む。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、第２の領域（ＩＩ）は、シーケンシングプライマー結合部位及び／又はフローセル結合部位を含む。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、第２の領域（ＩＩ）は、分子バーコード領域を更に含む。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、第２の領域（ＩＩ）は、シーケンシング反応バーコード領域を更に含む。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、第２の領域（ＩＩ）は、シーケンシングプライマー結合領域を更に含む。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、５’捕捉プローブは、第１ストランド合成中におけるポリメラーゼのリードスルーを妨げるリンカー領域ＩＩＩを含む。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、リンカー領域ＩＩＩは、非ヌクレオチドリンカー、例えばＣ６−３２ポリエチレングリコールリンカー、例えばＣ１８ポリエチレングリコールリンカー、又はアルキルリンカーを含むか、あるいは逆ヌクレオシド結合を含むヌクレオチドの領域である。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、領域ＩＩＩは、領域Ｉ及びＩＩを含む該第１ストランド並びに領域ＩＶ及びＶを含む第２ストランドである二本鎖の５’捕捉プローブをもたらす、不連続部を含むか、又は不連続部である。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、領域Ｖは、修飾オリゴヌクレオチドの該５’領域に相補的なヌクレオチドの所定の領域を含む。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、領域Ｖは、ヌクレオチドの縮重配列を含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、領域Ｖの５’末端は、５’−ＦＡＭなどの蛍光標識を含む。
【０１９０】
ＤＮＡポリメラーゼブロック
ＤＮＡポリメラーゼをブロックする修飾又はリンカー部分は、リンカー部分又は修飾を横切るポリメラーゼのリードスルーを妨げ、結果として鎖伸長の終結をもたらす。
【０１９１】
特異的プライマー
特異的プライマーは、プライマー結合部位に相補的な配列を含むプライマーである。プライマー及びプライマー結合部位に関する用語「特異的」とは、使用される鋳型分子を考慮する必要があり得ること、すなわち捕捉プローブ又はアダプターにおけるプライマー結合部位が、いくつかの実施形態において、捕捉プローブ又はアダプターを含む核酸分子から調製された相補的核酸分子においてプライマー結合部位を提示するように操作され得るこということが理解されるであろう。
【０１９２】
第１プライマー
本明細書中で使用される場合、第１プライマーとは、捕捉プローブオリゴヌクレオチド／修飾オリゴヌクレオチドライゲーション産物にハイブリダイズした場合、本明細書中に記載される領域Ｄ又はＥなどの、ポリメラーゼ媒介鎖伸長（第１ストランド合成）を開始するために使用される、捕捉プローブの領域に特異的なプライマーを指す。したがって、第１プライマーは、捕捉プローブオリゴヌクレオチド上の領域に相補的な配列を含み、更に、シーケンシングプライマー結合部位などの更なる領域を含み得る。第１プライマーは、フローセル結合部位などの、超並列シーケンシングにおいて使用される固体支持体に結合するための結合部位を更に含み得る。第１プライマーは、本発明の方法に含まれる増幅工程（ＰＣＴ工程）で使用するためのＰＣＲプライマー結合部位を更に含み得る。第１プライマーは、例えば１５〜３０ヌクレオチド長であり得、そして、例えばＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーであり得る。
【０１９３】
本明細書に記載される場合、いくつかの実施形態では、捕捉プローブは自己プライミングであり、第１ストランド合成を開始するために外因的に添加された第１プライマーは必要としない。
【０１９４】
ポリメラーゼ媒介５’−３’鎖伸長
本明細書中で使用される場合、ポリメラーゼ媒介５’−３’鎖伸長とは、捕捉プローブオリゴヌクレオチド／修飾オリゴヌクレオチドライゲーション産物にハイブリダイズした場合の、第１プライマーからの捕捉プローブオリゴヌクレオチド／修飾オリゴヌクレオチドライゲーション産物の相補ストランドのポリメラーゼ媒介伸長を指し、このプロセスは、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素などの核酸ポリメラーゼによって媒介され得る。本明細書に例示されているように、実施例は、修飾オリゴヌクレオチドを読み取る（すなわち、逆転写する）ことができる好適なポリメラーゼ酵素及び実験条件を同定するために使用することができる、アッセイを提供する。したがって、ポリメラーゼは、修飾オリゴヌクレオチド配列にわたって逆転写して、修飾オリゴヌクレオチド全体の相補的配列を含む伸長生成物を提供することができる酵素である。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチド配列、例えばＬＮＡホスホロチオエートオリゴヌクレオチド配列にわたって逆転写することができる酵素である。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合により連結された、少なくとも２つの連続ＬＮＡヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合により連結された、少なくとも２つの連続する糖修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって連結された少なくとも２つの連続する糖修飾ヌクレオシドを含み、ここで、該糖修飾ヌクレオシドの少なくとも１つは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合により連結された、少なくとも２つの連続する２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって連結された少なくとも２つの連続する糖修飾ヌクレオシドを含み、ここで、該糖修飾ヌクレオシドの少なくとも一方はＬＮＡヌクレオシドであり、他方は２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＬＮＡヌクレオシドを含む。
【０１９５】
実施例に例示されているように、ホスホロチオエートなどの修飾オリゴヌクレオチド、及び２’−Ｏ−ＭＯＥ又はＬＮＡオリゴヌクレオチドなどの２’糖修飾オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ酵素にとっての大きな障害となる。多数の異なるＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素を含む）をスクリーニングすることによって、本発明者らは、Ｖｏｌｃａｎｏ２Ｇポリメラーゼが、ＤＮＡ伸長のための鋳型として修飾オリゴヌクレオチドを利用する際に極めて有効であることを特定した。本発明者らはまた、Ｔａｑポリメラーゼがポリエチレングリコール及び／又はプロピレングリコールの存在下で使用される場合にも有効であることを特定した。実施例において使用される液滴ＰＣＲ法は、本発明の方法においても使用され得る更なる好適なポリメラーゼ酵素及び酵素条件を同定するために使用され得る。
【０１９６】
Ｖｏｌｃａｎｏ２Ｇポリメラーゼは、ｍｙＰＯＬＳ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ（ドイツ）から入手可能である。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本発明の方法において使用されるポリメラーゼは、野生型Ｔａｑのアミノ酸配列に関して突然変異Ｓ５１５Ｒ、Ｉ６３８Ｆ、及びＭ７４７Ｋを含む、野生型テルムス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼに基づくＤＮＡポリメラーゼである。Ｔａｑポリメラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１として提供される。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、（配列番号１）、又はポリメラーゼと少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも８０％の同一性、例えば少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９５％の同一性、例えば少なくとも９８％の同一性を有する有効なポリメラーゼからなる群より選択される。有効なＤＮＡポリメラーゼは、実施例に提供される方法（例えば、液滴ＰＣＲによる）を用いて決定することができる。
【０１９８】
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【０１９９】
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＴａｑポリメラーゼ又はそのＫｌｅｎｏｗ断片と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性を有するＤＮＡポリメラーゼであり、ここで、該ＤＮＡポリメラーゼは、Ｋｌｅｎｏｗ断片の配列番号１に示されるＴａｑポリメラーゼのアミノ酸配列の４８７位、５０８位、５３６位、５８７位、及び／又は６６０位に対応する１つ以上の位置に、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。参照により本明細書に組み込まれている国際公開第２０１５／０８２４４９号、特に、配列番号３〜２４として開示されているポリメラーゼを参照されたい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１に対して少なくとも８０％の相補性、例えば配列番号１に対して少なくとも９０％の相補性を有し、ここで、該１つ以上のアミノ酸置換は、配列番号１について、Ｒ４８７Ｈ／Ｖ、Ｋ５０８Ｗ／Ｙ、Ｒ５３６Ｋ／Ｌ、Ｒ５８７Ｋ／Ｉ、及びＲ６６０Ｔ／Ｖからなる群より選択される。
【０２００】
アダプタープローブ
本明細書中で使用される場合、用語「アダプタープローブ」とは、第１プライマーからのポリメラーゼ媒介５’−３’鎖伸長からの伸長生成物の３’末端に連結される、オリゴヌクレオチドプローブを指す。アダプタープローブは、プライマーベースのシーケンシングに直接使用することができる、及び／又は本発明の方法を含む増幅工程（ＰＣＴ工程）で使用することができる、プライマー結合部位を提供する。アダプタープローブは、シーケンシングプライマー結合部位などの更なる領域を更に含み得る。アダプタープローブは、フローセル結合部位などの、超並列シーケンシングにおいて使用される固体支持体に結合するための結合部位を更に含み得る。アダプタープローブは、本発明の方法に含まれる増幅工程（ＰＣＲ工程）で使用するためのＰＣＲプライマー結合部位を更に含み得る。
【０２０１】
ＰＣＲ増幅
いくつかの実施形態では、アダプタープローブを伸長生成物の３’末端に連結した後、ＰＣＲ増幅工程を行う。ＰＣＲ増幅は１対のＰＣＲプライマーを使用し、ここで、該プライマーの一方は、捕捉プローブ上の領域（第１プライマー結合配列、又は第１のプライマー結合配列の上流の捕捉プローブの領域であり得る）に特異的であり、他方のＰＣＲプライマーは、アダプタープローブの領域に特異的である。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、例えば並列シーケンシング定実施形態では、ＰＣＲ増幅は、オンビーズ（ｏｎ−ｂｅａｄ）増幅又は固相ブリッジ増幅などの、固体表面に付着したプライマーを用いて行われる。いくつかの実施形態では、固相は、フローセル（例えば固相ブリッジ増幅で使用されるように、例えばイルミナシーケンシングプラットフォームで使用されるように）である。固相ブリッジ増幅で使用される固相ＰＣＲはまた、クラスタ生成とも称される：アダプタープローブの連結から得られた生成物のライブラリを、アダプタープローブ及び／又は捕捉プローブの領域（フローセル結合部位）に相補的な、叢状の表面結合オリゴヌクレオチド上に捕捉する。次いで、各断片は、ブリッジ増幅を介して別個のクローンクラスタに増幅される。クラスタ生成が完了すると、鋳型は合成によるシーケンシングの準備が整う。
【０２０３】
ＰＣＲサイクルの数は、いくつかの実施形態では、各クラスタが約１０００コピーを有するように制限され得る。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ工程は、還元サイクルＰＣＲを利用する、すなわち、ＰＣＲサイクルの数が、約１０〜約２０回のＰＣＲサイクルなどの２〜約２５サイクルに制限される。
【０２０４】
バーコーディング
バーコードは、例えば、同じ捕捉プローブ連結事象（分子バーコード）由来又は共通の捕捉プローブ連結反応（反応バーコード）由来である複数の配列の同定に関して、本発明の方法で得られた配列のオリジナルを同定するために使用される、捕捉プローブ又はプライマー内の配列である。
【０２０５】
分子バーコード（例えば、捕捉プローブの領域Ｃにおいて使用され得る）
いくつかの実施形態では、捕捉プローブオリゴヌクレオチド及び／又はアダプタープローブは、ランダムヌクレオシド配列（縮重配列）の配列を含む。捕捉プローブ又はアダプタープローブ内の縮重配列の使用は、ＰＣＲ増幅工程後の同じ連結された伸長生成物分子の重複から生じるシーケンシング結果の同定を可能にするために、使用することができる。
【０２０６】
反応バーコード（例えば、捕捉プローブの領域ｂにおいて使用される）
超並列シーケンシングの能力は、シーケンシング鋳型を単一のシーケンシング実験にプールすることを可能にし、それによって、各シーケンシング操作の費用効果を高める。したがって、シーケンシングデータを分離して、別のシーケンシング鋳型反応から生じる配列を同定することができることが望ましい。これは、各鋳型に特有である共通の配列同定を組み込んだ捕捉プローブ又はＰＣＲプライマーを使用することによって達成することができる。反応バーコードの長さは、各並列シーケンシング操作にプールされた異なるシーケンシング鋳型の複雑さを反映するように修飾することができ、（例えば、ＤＮＡヌクレオチドの長さが）２〜２０ヌクレオチド、例えば長さが４〜５ヌクレオチドであってもよい。
【０２０７】
縮重ヌクレオチド
縮重ヌクレオチドとは、特定の位置に複数の代替塩基（核酸のＩＵＰＡＣ表記法で使用される通り）を有することができる、核酸配列上の位置を指す。個々の分子について、規定された位置に特異的ヌクレオチドが存在するが、オリゴヌクレオチド試料中の分子の集団内では、規定された位置のヌクレオチドは縮重するということが認識されるべきである。事実上、縮重配列の組込みは、オリゴヌクレオチドの集団の各メンバ間で規定された位置における、ヌクレオチド配列のランダム化をもたらす。いくつかの配列はＰＣＲ中に優先的に増幅され得ることが知られており、これにより、縮重配列に由来する遺伝的「バーコード配列」の発生を計数することで、増幅前の相対量を決定することができる（例えば、Ｋｉｅｌｐｉｎｓｋｉ及びＶｉｎｔｅｒ、「ＮＡＲ」（２０１４年）第４２巻、第８号、第ｅ７０頁参照）。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、縮重ヌクレオチドの代わりに使用され得るユニバーサル塩基（例えば、イノシンヌクレオチド）の領域を含む。
【０２０８】
シーケンシング
シーケンシングとは、核酸分子内の核酸塩基の順序（配列）の決定を指す。本発明の文脈において、シーケンシングとは、修飾オリゴヌクレオチド内の核酸塩基の配列の決定を指す。従来の配列決定方法は、インビトロＤＮＡ複製中にＤＮＡポリメラーゼによる連鎖停止ジデオキシヌクレオチドの組込みを選択すること、続いて連鎖停止生成物を電気泳動分離することを用いる、連鎖停止法（サンガーシーケンシングとして知られる）に基づく。異なる連鎖停止塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、又はＧ）を各々が有する４つの別々の反応を用いて、ゲル電気泳動における４つの連鎖停止反応生成物の相対運動性を比較することによって、配列を決定する。
【０２０９】
サンガーシーケンシングは、当初、放射性標識ヌクレオチドの組込みとそれに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に基づいて開発され、例えばキャピラリ電気泳動によって検出することができる蛍光色素で標識されたプライマーを用いる自動化ＤＮＡシーケンシングの基礎として、商業的に開発された。ダイターミネータシーケンシングの使用は、単一反応混合物（従来のサンガー法の４つの反応ではなく）からのシーケンシングを可能にすることで、自動化が可能となった。いくつかの実施形態では、本発明の方法のシーケンシング工程は、自動シーケンシングを用いて実施される。いくつかの実施形態では、本発明の方法のシーケンシング工程は、自動化ダイターミネータシーケンシングなどのダイターミネータシーケンシングを用いて実施される。
【０２１０】
サンガーベースのシーケンシングは、今日でも用いられているが、大規模なシーケンシング用途では、「次世代」のシーケンシング技術に取って代わられている。参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｏｄｗｉｎら、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、第１７巻（２０１６年）第３３３〜３５１頁を参照のこと。
【０２１１】
プライマーベースのシーケンシング
プライマーベースのシーケンシングとは、核酸鋳型にハイブリダイズしたプライマーからの５’−３’ポリメラーゼに基づく鎖伸長の使用を指す。プライマーベースのシーケンシングは、連鎖停止法（例えば、サンガー法）に基づくか、又は合成によるシーケンシングを有利に使用することができる。
【０２１２】
捕捉プローブ／アダプターベースのシーケンシング
本発明は、修飾オリゴヌクレオチド又は修飾オリゴヌクレオチドの集団をシーケンシングする方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、修飾オリゴヌクレオチドに捕捉プローブを連結する工程、次いで、その後ポリメラーゼに基づく鎖伸長のために使用されて伸長生成物を生成する、捕捉プローブに相補的である第１プライマーのハイブリダイゼーションの工程を含む。次に、アダプターを伸長生成物の３’末端に連結することで、既知のプローブ配列によって５’及び３’に隣接した修飾オリゴヌクレオチドの相補的配列を含む核酸分子を得る。ここで、該核酸分子は、プライマー結合部位として使用することができ、例えば、プライマーベースのシーケンシング（単一分子鋳型シーケンシング）において直接使用することができるか、又はシーケンシングの前に、例えばＰＣＲ又は縮小サイクル増幅（クローン増幅シーケンシング）を介して増幅してもよい。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、シーケンシング工程は、「合成によるシーケンシング」方法を用いて実施される。
【０２１４】
合成によるシーケンシング
従来のサンガー法に基づくシーケンシングが連鎖停止法に基づくのに対して、合成によるシーケンシングは、連鎖停止を開始することなく、鎖伸長中の色素標識ヌクレオチドの添加に基づく。特有の色素シグナル（Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧの４つの塩基それぞれに１つずつ）の実時間モニタリングにより、鎖伸長中に配列が捕捉される。合成法による合成によるシーケンシングの顕著な利点は、核酸配列の複雑な混合物の超並列シーケンシングを可能にすることである。いくつかの実施形態では、本発明の方法において使用されるシーケンシング方法は、循環可逆的終結方法又は単一ヌクレオチド付加方法である。
【０２１５】
合成法による配列決定は、典型的には、環状可逆的終結（ＣＲＴ）又は単一ヌクレオチド付加（ＳＮＡ）アプローチに基づく（Ｍｅｔｚｋｅｒ、「Ｍ．Ｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ―ｔｈｅ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．」、第１１巻、第３１〜４６頁（２０１０年）。
【０２１６】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮＧＳプラットフォーム及びＱｉａｇｅｎ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ／ＧｅｎｅＲｅａｄｅｒプラットフォームにより使用される環状可逆的終結（ＣＲＴ）法は、リボース３’−ＯＨ基がブロックされ、これにより伸長を抑制する、可逆的終結分子を使用する。このプロセスを開始するために、ＤＮＡ鋳型はアダプター領域に相補的な配列によってプライミングされ、この二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）領域へのポリメラーゼ結合を開始する。各サイクルの間に、全４つの個々に標識された、３’−ブロックデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）の混合物を加える。伸長する各相補ストランドに単一のｄＮＴＰが組み込まれた後、結合していないｄＮＴＰを除去し、表面を画像化して、各クラスタにどのｄＮＴＰが組み込まれたかを同定する。次いで、フルオロフォア及びブロッキング基を除去し、新規サイクルを開始することができる。
【０２１７】
クローンブリッジ増幅は、本明細書の実施例で使用されるように、イルミナシステムによって使用される。いくつかの実施形態では、本発明の方法において使用されるシーケンシング方法は、クローンブリッジ増幅である。
【０２１８】
４５４ピロシーケンシングシステム（Ｒｏｃｈｅ）及びＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＮＧＳシステムによって使用される単一ヌクレオチド付加法は、伸長ストランドへのｄＮＴＰの組込みをマークする単一シグナルに依存する。結果として、４つのヌクレオチドの各々は、１つのｄＮＴＰのみがシグナルの原因となることを確実にするために、シーケンシング反応へ反復的に加えられなければならない。その上、シーケンシング反応で次のヌクレオチドが不在であると伸長が妨げられるため、ｄＮＴＰをブロックする必要はない。これに対する例外は、同一のｄＮＴＰが添加されるホモ重合体領域であって、配列同定は、複数のｄＮＴＰが組み込まれる際のシグナルの比例的増加に依存する。特に、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシステムは蛍光ヌクレオチドを使用せず、代わりに、各ｄＮＴＰが組み込まれる際に放出されるＨ＋イオンを検出する。得られたｐＨ変化を、相補型金属酸化膜半導体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｍｅｔａｌ−ｏｘｉｄｅ−ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：ＣＭＯＳ）及びイオン感応電界効果トランジスタ（ｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆｉｅｌｄ−ｅｆｆｅｃｔ  ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ：ＩＳＦＥＴ）により検出する。
【０２１９】
並列シーケンシング
従来のサンガーシーケンシングでは、各シーケンシング操作は単一の核酸鋳型の配列を決定するために使用されるが、次世代シーケンシング方法の使用は、核酸配列の異種混合物の並列シーケンシングを可能にする。本明細書に記載されるように、並列シーケンシングは、クローン増幅工程を用いることができ、増幅プライマー内に配列ベースの識別子を組み込むことによって、各本来の鋳型分子に由来する反復クローン配列を同定することができる。
【０２２０】
超並列シーケンシングは、主に、染色体及びゲノム全体を含む長いポリヌクレオチド配列の迅速かつ効率的なシーケンシングを可能にし、個々の遺伝子型分類解決法（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を可能にするために開発されたが、本発明者らはまた、これらの解決法が、修飾オリゴヌクレオチドの集団内の個々の分子種の存在及び比較存在量を同定するための特有の機会も提供することを特定した。そのような方法は、オリゴヌクレオチド治療の探索、製造及び品質保証、治療開発、並びに患者モニタリングなどの数々の用途において有用である。
【０２２１】
発明の詳細な説明
本発明は、ＬＮＡオリゴヌクレオチド又は２−Ｏ−メトキシエチルオリゴヌクレオチドなどの２’糖修飾オリゴヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドをシーケンシングするための方法を提供する。
【０２２２】
修飾オリゴヌクレオチドの５’及び３’領域が既知である場合、本発明の方法を用いて、２つの既知の領域、例えばアプタマ領域間の配列を同定するために、２つの既知の領域の間を配列決定することができる。これは、修飾オリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲ又はシーケンシングプライマー）の既知の領域に特異的なプライマーを使用することによって達成され得るか、又は有利には、本明細書中に記載される捕捉プローブを使用して達成され得る。
【０２２３】
しかしながら、本発明の方法はまた、ヌクレオチド配列が知られていないか又は５’領域若しくは３’配列のみが知られている、修飾オリゴヌクレオチドの配列決定にも使用され得る。これは、本明細書に記載の５’及び／又は３’捕捉プローブを使用することによって達成することができる。
【０２２４】
修飾オリゴヌクレオチドの３’領域が既知であり、既知の３’領域の上流（５’）の修飾オリゴヌクレオチドの配列を決定する方法である場合、本発明の方法は、修飾オリゴヌクレオチドに５’捕捉プローブを連結し、既知の３’領域に特異的なプライマーを用いて第１ストランド合成を行うことによって、実施することができる。
【０２２５】
修飾オリゴヌクレオチドの５’領域が既知であり、既知の５’領域の下流（３’）の修飾オリゴヌクレオチドの配列を決定する方法である場合、本発明の方法は、修飾オリゴヌクレオチドに３’捕捉プローブを連結し、３’捕捉プローブに特異的なプライマーを用いて第１ストランド合成を行うことによって、実施することができる。
【０２２６】
この方法は、修飾オリゴヌクレオチドに３’捕捉プローブを連結し、続いて第１ストランド合成を行う工程を含み得る。第１ストランド合成後、アダプタープライマーを伸長生成物の３’末端に連結し、プライマーベースのシーケンシングを、３’捕捉プローブ及びアダプタープローブに特異的なプライマーを用いて行ってもよいか、又は第１ストランド合成生成物を、３’捕捉プローブ及びアダプタープローブに特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅してもよい。
【０２２７】
この方法は、修飾オリゴヌクレオチドに３’捕捉プローブ及び５’捕捉プローブを連結し、続いて第１ストランド合成を行う工程を含み得る。プライマーベースのシーケンシングは、３’及び５’捕捉プローブに特異的なプライマーを用いて行ってもよいか、又は第１ストランド合成生成物は、５’及び３’捕捉プローブに特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅されてもよい。
【０２２８】
この方法は、３’捕捉プローブを連結し、第１ストランド合成を実施し、その後第１ストランド合成生成物の３’末端にアダプタープローブを連結する工程を含むことができる。
【０２２９】
この方法は、修飾オリゴヌクレオチドに３’捕捉プローブを連結する工程を含んでもよく、ここで、該３’捕捉プローブを使用して、逆転写、又は５’−３’鎖伸長とも称される修飾オリゴヌクレオチド鋳型の第１ストランド合成を開始することで、修飾オリゴヌクレオチドに対する相補的配列及び好適には３’捕捉プローブの領域に対する相補的領域（この領域は、ＰＣＲプライマー／クローン増幅プライマー結合部位又はフローセルプライマー結合部位若しくはシーケンシングプライマー結合部位として使用され得る）を含む、第１ストランド合成生成物が得られる。
【０２３０】
第１ストランド合成後、第１ストランド合成生成物はＰＣＲ増幅されてもよく、これは、クローン増幅工程であり得る。ＰＣＲは、捕捉プローブ由来領域に特異的な第１ＰＣＲプライマーと、いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの領域（好適には、５’領域であり、これによって修飾オリゴヌクレオチドの残りの３’領域のシーケンシングを可能にする）に特異的であり得る第２ＰＣＲプライマーと、を使用し得る。あるいは、全修飾オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー結合部位を含むアダプタープローブの連結により、又はポリアデニル化（若しくはポリＣ及びポリＵ）などの多核化（ポリＮの領域が３’末端に付加される）を介して、３’末端で第１ストランド合成生成物を更に伸長することによってＰＣＲ増幅されてもよく、これは、末端トランスフェラーゼ酵素を用いて触媒され得るプロセスである。第２ストランド合成は、相補的ポリＮ配列を含む第２ストランド合成プライマーを用いて行うことができる。第２プライマーは、第２ＰＣＲプライマー結合部位を含み得る。次いで、ＰＣＲ工程は、３’捕捉プローブに特異的な第１ＰＣＲプライマー、及びポリ（Ｎ）配列又は第２ストランド合成プライマーＰＣＲ結合部位のいずれかに特異的な第２ＰＣＲプライマーを用いて行われ得る。ＰＣＲプライマー部位は、本発明の方法のシーケンシング工程の一部としてクローン増幅のために使用され得るか、又はプライマーベースのシーケンシングのため直接的に使用され得ることが理解されるであろう。アダプタープローブ連結実施形態又は多核化実施形態を使用する利点とは、オリゴヌクレオチドの５’領域が知られていない場合の修飾オリゴヌクレオチドのシーケンシングを容易にすることにある。
【０２３１】
修飾オリゴヌクレオチドの長さは、例えば、最大６０の連続ヌクレオチド、例えば最大５０の連続ヌクレオチド、例えば最大４０の連続ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、７〜３０ヌクレオチド長のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、７〜３０ヌクレオチド長の糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、７〜３０ヌクレオチド長の２’糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、７〜３０ヌクレオチド長のＬＮＡオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、７〜３０ヌクレオチド長のＬＮＡホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、１つ以上のＬＮＡヌクレオシド、又は１つ以上の２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの３’側最末端ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの３’側最末端ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メチオキシエチル（２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｏｘｙｅｔｈｙｌ）又は２’−Ｏ−メチルヌクレオシドなどの２’置換ヌクレオシドである。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、シーケンシング工程は、合成法によるシーケンシングを用いて実施される。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成とも称される鎖伸長工程は、ポリメラーゼ及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はプロピレングリコールの存在下で行われる。そのような実施形態では、ポリメラーゼは、任意に、配列番号１として示されるＴａｑポリメラーゼなどのＴａｑポリメラーゼ、又はこれと少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも８０％の同一性、例えば少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９５％の同一性、例えば少なくとも９８％の同一性を有する有効なポリメラーゼであってもよい。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成とも称される鎖伸長工程は、平均分子量１００〜２０，０００、例えば約２０００〜約１００００、例えば約４０００であるポリメラーゼ及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下で行われる。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、鎖伸長反応（第１ストランド合成工程）におけるＰＥＧの濃度は、約２％〜約１５％（ｗ／ｖは、すなわちＰＥＧの重量／反応体積）、例えば約３％〜約１５％である。１５％を超えても依然として効率的な伸長をもたらすことができるが、液滴ＰＣＲシステムにおいては、液滴の不安定化をもたらす。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの濃度は、約２％〜約２０％、又は約３％〜３０％（ｗ／ｖ）である。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、鎖伸長反応混合物（第１ストランド合成工程）中のプロピレングリコールの濃度は、少なくとも約０．８Ｍであり、例えば、約０．８Ｍ〜２Ｍ、例えば約１Ｍ〜約１．６Ｍであり得る。
【０２３７】
実施例に示されるように、ＰＥＧの添加は、プロピレングリコールの添加よりも効果的な鎖伸長／第１ストランド合成を提供し得る。
【０２３８】
ＰＥＧ及び／又はプロピレングリコールの使用は、一連のポリメラーゼ、例えば本明細書に開示されているようなＴａｑポリメラーゼ及びＴａｑポリメラーゼに由来するポリメラーゼ、例えばＶｏｌｃａｎｏ２Ｇポリメラーゼとの使用に有利であることが分かっている。本明細書に開示されたアッセイは、更なるポリメラーゼ酵素を同定するために、及び修飾オリゴヌクレオチドの長さにわたって有効な第１ストランド合成を提供する必要な反応条件として、使用されるものである。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、５’−３’鎖伸長（第１ストランド合成工程）に使用されるポリメラーゼは、本明細書に記載されるＴａｑポリメラーゼ又はＶｏｌｃａｎｏ２ＧポリメラーゼなどのＴａｑポリメラーゼである。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能）である。
【０２４１】
ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素の選択は、糖修飾オリゴヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドを読み取るためのポリメラーゼの相対効率を評価することによって行うことができる。糖修飾オリゴヌクレオチドの場合、これは、オリゴヌクレオチド中の連続する糖修飾ヌクレオシドの長さに依存し、そして重度に修飾されたオリゴヌクレオチドの場合、Ｔａｑポリメラーゼ以外の酵素が望ましくあり得ることが認識されている。ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素の選択はまた、試料の純度に依存し、いくつかのポリメラーゼ酵素は、血液などの混入物に感受性であることがよく知られている（例えば、Ａｌ−Ｓｏｕｄら、「Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」（１９９８年１０月）第６４巻、第１０号、第３７４８〜３７５３頁を参照）。
【０２４２】
有利には、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｖｏｌｃａｎｏ２Ｇ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、第１ストランド合成（鎖伸長工程）は、逆転写酵素を用いて行われる。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は、Ｍ−ＭｕＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、修飾Ｍ−ＭｕＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  ＲＴ、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｍａｘｉｍａ  Ｈ  Ｍｉｎｕｓ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅからなる群より選択され得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｈｏｔｔｕｂポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、ｒＴｔｈポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｕｌｔｉｍａポリメラーゼ、Ｖｏｌｃａｎｏ２Ｇポリメラーゼ、及びＶｅｎｔポリメラーゼからなる群より選択されるＤＮＡポリメラーゼなどの、耐熱性ポリメラーゼである。特定の酵素については、修飾オリゴヌクレオチドの第１ストランド合成を効率的に行うために、例えばＰＥＧ及び／又はプロピレングリコールの添加を介して反応条件を最適化することが必要であり得ることが、理解されるであろう。
【０２４４】
有利には、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチド内の少なくとも７５％のヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、例えば修飾オリゴヌクレオチド内のヌクレオシド間結合の少なくとも９０％はホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、例えば修飾オリゴヌクレオチド内の全ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２’糖修飾オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも２’糖修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ又は少なくとも２つの３’末端糖修飾ヌクレオシド、例えば、少なくとも１つ若しくは少なくとも３’末端ＬＮＡヌクレオシド、又は少なくとも１つ若しくは少なくとも２つの末端２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、少なくとも３つの２’糖修飾ヌクレオシド、例えば４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の２’糖修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、２’糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシド、及び２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドなどの２’置換糖修飾ヌクレオシドから独立して選択される。有利には、修飾オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの２’糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、ここで、オリゴヌクレオチド内のヌクレオシド間結合の少なくとも７５％がホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、そして修飾オリゴヌクレオチド内のヌクレオシドの少なくとも１つがＬＮＡヌクレオシドであり、例えば、修飾オリゴヌクレオチド内の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２のヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシドである。有利には、修飾ＬＮＡオリゴヌクレオチドのうちの３’側最末端ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドなどの糖修飾ヌクレオシドであるか、又は２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドなどの２’置換ヌクレオシドであり得る。いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの近接するＬＮＡヌクレオシドを含む。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ、及び２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドからなる群より選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの３’末端２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシド及び少なくとも１つの更なる２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、ここで、オリゴヌクレオチド内のヌクレオシド間結合の少なくとも７５％がホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、そして修飾オリゴヌクレオチド内のヌクレオシドの少なくとも１つが２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドであり、例えば、修飾オリゴヌクレオチド内の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２のヌクレオシドが、２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドである。好ましくは、修飾された２’−Ｏ−ＭＯＥオリゴヌクレオチドの３’側最末端ヌクレオシドは、２’−Ｏ−ＭＯＥなどの糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも３、４、又は５の近接する２−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドなどの、少なくとも２つの近接する２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドを含む。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドの集団であり、そのマット（ｍａｔ）は、例えば、同じオリゴヌクレオチド合成操作に由来する、又はオリゴヌクレオチド合成操作のプールに由来する。オリゴヌクレオチド合成又は製造の間、各オリゴヌクレオチド合成操作は、オリゴヌクレオチド種の集団、例えば所望のオリゴヌクレオチド生成物、及び短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｖｅｒｓｉｏｎ）、例えばいわゆるｎ−１生成物を含む。更に、本明細書に例示されているように、オリゴヌクレオチド種の集団内において、異なる配列を有するオリゴヌクレオチドが、合成操作で使用されるモノマー中の不純物又は以前のカップリングサイクルからの合成カラムの汚染のために生じ得る。したがって、これらの不純物の存在を配列レベルで特徴づけることが重要である。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの集団は一連の合成操作から得られ、ここで、各合成操作の生成物は、本発明の方法によって試験することができる修飾オリゴヌクレオチドの単一バッチを形成するためにプールされる。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、２’糖修飾オリゴヌクレオチドは、２’糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの近接する２’糖修飾ヌクレオシドを含む。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの近接する２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、該修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に位置する少なくとも２つ又は少なくとも３つの近接する２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシドなどの、該修飾オリゴヌクレオチドの３’に位置する少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの近接するＬＮＡヌクレオチド又は少なくとも３つの近接するＬＮＡヌクレオチドを含む。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、ＬＮＡヌクレオチドは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端に位置する。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドが、ＬＮＡギャップマー又はＬＮＡミクスマーなどのＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＴヌクレオシド又は少なくとも１つのＣヌクレオシド、例えば、少なくとも１つのＤＮＡ−Ｃ若しくは少なくとも１つのＤＮＡ−Ｔ、又は少なくとも１つの２’−メトキシエチル（ＭＯＥ）Ｃヌクレオシド若しくは少なくとも１つの２’−メトキシエチル（ＭＯＥ）Ｔヌクレオシドを含む。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、該ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＬＮＡ−Ｔヌクレオシド又は少なくとも１つのＬＮＡ−Ｃヌクレオシドを含む。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、１つ以上のＬＮＡヌクレオシド、及び１つ以上の２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドなどの１つ以上の２’置換ヌクレオシドを含む。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー、混合ウィングギャップマー、交互フランク（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ｆｌａｎｋ）ギャップマー、又はＬＮＡギャップマーからなる群より選択される。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ミクスマー又はトータルマーである。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ複合体などの複合基を含む。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、シーケンシング工程は、超並列シーケンシングを使用する。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、超並列シーケンシングなどの、プライマーベースのシーケンシング（本発明の方法のＰＣＲ工程）のための鋳型は、クローンブリッジ増幅（例えば、イルミナシーケンシング−可逆的色素ターミネータ）、又はクローンｅｍＰＣＲ（エマルションＰＣＲ、Ｒｏｃｈｅ  ４５４、ＧＳ  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＳＯＬｉＤ４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ）を用いて行われる。いくつかの実施形態では、プライマーベースのシーケンシングのための鋳型は、固相鋳型ウォーキング（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｗａｌｋｉｎｇ）（例えば、ＳＯＬｉＤ  Ｗｉｌｄｆｉｒｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて実施される。
【０２６８】
超並列シーケンシングプラットフォーム（次世代シーケンシング）は市販されており、例えば、以下の表に示すようなものがある（ウィキペディアに掲載されている通り）。
2021522816.tif 000005
【０２６９】
いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドへの該３’捕捉プローブの連結後、ライゲーション産物は、例えばゲル精製により、又は非連結型捕捉プローブの酵素的分解により、第１ストランド合成（鎖伸長）の前に精製される。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、第１ストランド合成生成物へのアダプタープローブの連結後、ライゲーション産物は、例えばゲル精製により、又は非連結型捕捉プローブの酵素的分解により、ＰＣＲ又はシーケンシング工程の前に精製される。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチド／３’捕捉プローブライゲーション産物は、例えばゲル精製により、又は非連結型捕捉プローブの酵素的分解により精製される。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、第１ストランド合成ストランド／アダプタープローブライゲーション産物は、例えばゲル精製により、又は非連結型捕捉プローブの酵素的分解により精製される。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、捕捉プローブ若しくはアダプタープローブ又はその両方は、それぞれ、シーケンシングプライマー結合部位を含む。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、第１プライマー若しくはアダプタープローブ又はその両方は、それぞれ、シーケンシングプライマー結合部位を含む。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、方法はＰＣＴ増幅工程を含み、ＰＣＲ工程において使用されるＰＣＲプライマーの一方又は両方は、プライマー結合部位をシーケンシングすることを含む。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、捕捉プローブ及びアダプタープローブ、又は第１プライマー及びアダプタープローブは、フローセル結合部位を更に含む。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、ＰＣＲ工程で使用したＰＣＲプライマーは、フローセル結合部位を更に含む。
【０２７８】
例示的な修飾オリゴヌクレオチド実施形態
修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり得る。修飾オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又は２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどのホスホロチオエート２’糖修飾オリゴヌクレオチドなどの、ホスホロチオエート糖修飾オリゴヌクレオチドであり得る。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、治療用オリゴヌクレオチドである。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、三価のＧａｌＮＡｃ部分などのＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分などの複合部分を含む。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、三価のＧａｌＮＡｃ部分などのＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分などの複合部分を含む、ＬＮＡオリゴヌクレオチドである。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、ＭＯＥギャップマー、ＬＮＡギャップマー、混合ウィングギャップマー、又は交互フランクギャップマーなどのゴマー（ｇｏｍｅｒ）オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡミクスマーオリゴヌクレオチドなどのミクスマーオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ＭＯＥトータルマー又はＬＮＡトータルマーオリゴヌクレオチドなどのトータルマーである。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、糖修飾オリゴヌクレオチド、例えばＬＮＡ若しくは２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオシド、又はＬＮＡ及び２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオチドの両方を含むオリゴヌクレオチドである。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドが、ＬＮＡギャップマー又はＬＮＡミクスマーなどのＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシド、又は少なくとも１つの（Ｓ）ｃＥＴ  ＬＮＡヌクレオシド（６’メチルβ−Ｄ−オキシＬＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＡオリゴヌクレオチドに存在するＬＮＡヌクレオシドは、β−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシド、又は少なくとも１つの（Ｓ）ｃＥＴ  ＬＮＡヌクレオシド（６’メチルβ−Ｄ−オキシＬＮＡ）のいずれかを含む。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの糖修飾Ｔヌクレオシド及び／又は少なくとも１つの糖修飾Ｃ残基（５メチルＣを含む）を含む。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＬＮＡ−Ｔヌクレオシド及び／又は少なくとも１つのＬＮＡ−Ｃ（５−メチルＣを含む）ヌクレオシドを含む。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチルＴヌクレオシド及び／又は少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチルＣ残基（５メチルＣを含む）を含む。オリゴヌクレオチド合成に使用されるシトシン及びチミンホスホラミダイトモノマーの合成は、しばしば共通の中間体を介して行われ、これは、実施例に示されるように、Ｃ又はＴホスホラミダイト間の汚染をもたらし得るが、本発明の方法が検出することができる問題である。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ（１、２、３、４、又は５など）のＬＮＡ又は少なくとも１つの（１、２、３、４、又は５など）の２’置換ヌクレオシド、例えば２’Ｏ−ＭＯＥなどの、少なくとも１つ（１、２、３、４、又は５など）の３’末端修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡなどの少なくとも１つの非末端修飾ヌクレオシド、又は２’−Ｏ−ＭＯＥなどの２’置換ヌクレオシドを含む。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドは、１つ以上のＬＮＡヌクレオシド、及び１つ以上の２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドなどの１つ以上の２’置換ヌクレオシドを含む。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ複合体などの複合部分とも称される複合基を含む。いくつかの実施形態では、複合部分は、修飾オリゴヌクレオチド中の末端位置、例えば３’末端又は５’末端に配置され、複合基をオリゴヌクレオチドに共有結合的に結合するヌクレオシド又は非ヌクレオシドリンカー部分が存在し得る。
【０２９２】
複合部分
いくつかの実施形態では、複合部分は、酵素、抗体若しくは抗体断片、又はペプチドなどのタンパク質；脂質、リン脂質、ステロールなどの親油性部分；ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールなどのポリマー；受容体リガンド；小分子；レポータ分子；及び、非ヌクレオシド炭水化物からなる群より選択される。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、複合部分は、炭水化物、非ヌクレオシド糖、炭水化物複合体を含むか、又はこれらである。いくつかの実施形態では、炭水化物は、ガラクトース、ラクトース、ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、及びマンノース−６−リン酸からなる群より選択される。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、複合部分は、タンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、酵素、及び抗体断片の群を含むか、又はこれらから選択される。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、複合部分は、脂質、リン脂質、脂肪酸、及びステロールからなる群より選択される部分などの、親油性部分である。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、複合部分は、小分子薬物、毒素、レポータ分子、及び受容体リガンドからなる群より選択される。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、複合部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールなどのポリマーである。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、複合部分は、例えば、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−ホルミル−ガラクトサミン、Ｎアセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニル−ガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブタノイル−ガラクトサミン、及びＮ−イソブタノイルガラクトス−アミンを含むことができる、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、複合部分は、Ｎ−アセチルガラクトサミン三量体などのガラクトースクラスタを含む。いくつかの実施形態では、複合部分は、四価ＧａｌＮＡｃの一価、二価、三価などのＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチルガラクトサミン）を含む。三価のＧａｌＮＡｃ複合体を用いて、化合物を肝臓に標的化することができる（例えば、米国特許第５，９９４５１７号、及びＨａｎｇｅｌａｎｄら、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．」（１９９５年１１〜１２月）第６巻、第６号、第６９５〜７０１頁、国際公開第２００９／１２６９３３号、国際公開第２０１２／０８９３５２号、国際公開第２０１２／０８３０４６号、国際公開第２０１４／１１８２６７号、国際公開第２０１４／１７９６２０号、及び国際公開第２０１４／１７９４４５号を参照）。
【０２９９】
複合体リンカー
リンケージ又はリンカーは、１つ以上の共有結合を介して、対象の１つの化学基又はセグメントを別の化学基又はセグメントに連結する２つの原子間の接続である。複合部分は、直接又は連結部分（例えば、リンカー又はテザー）を介してオリゴヌクレオチドに付着させることができる。リンカーは、第３の領域、例えば複合部分をオリゴヌクレオチド（例えば、領域Ａ又はＣの末端）に共有結合させるのに役立つ。
【０３００】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の複合体又はオリゴヌクレオチド複合体は、任意に、オリゴヌクレオチドと複合部分との間に位置するリンカー領域を含み得る。いくつかの実施形態では、複合体とオリゴヌクレオチドとの間のリンカーは、生体切断可能である。
【０３０１】
生体切断可能なリンカーは、哺乳動物の体内で通常遭遇する又は遭遇するものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含むか、又はそれからなる。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例えば、切断）を受ける条件には、ｐＨ、温度、酸化若しくは還元条件又は薬剤などの化学条件、及び哺乳動物細胞で見られる又は遭遇するものに類似した塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素又は加水分解酵素又はヌクレアーゼなどの哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施形態では、生体切断可能なリンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断の影響を受けやすい。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、１〜１０のヌクレオシド、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のヌクレオシドを含み、より好ましくは２〜６のヌクレオシドを含み、最も好ましくは２〜４の連結されたヌクレオシドを含み、これは少なくとも３又は４又は５の連続したホスホジエステル結合など、少なくとも２つの連続したホスホジエステル結合を含む。好ましくは、ヌクレオシドはＤＮＡ又はＲＮＡである。ホスホジエステルを含む生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号（参照により本明細書に組み込まれる）により詳細に記載されている。
【０３０２】
複合体はまた、非生体切断性リンカーを介してオリゴヌクレオチドに連結され得るか、又はいくつかの実施形態では、複合体は、生体切断可能なリンカーに共有結合的に結合された非切断可能リンカーを含み得る。リンカーは、必ずしも生物切断可能ではないが、主に複合部分をオリゴヌクレオチド又は生体切断可能なリンカーに共有結合させるのに役立つ。このようなリンカーは、エチレングリコール、アミノ酸単位又はアミノアルキル基などの反復単位の鎖構造又はオリゴマを含み得る。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、例えばＣ２−Ｃ３６アミノアルキル基などアミノアルキルであり、例えば、Ｃ６−Ｃ１２アミノアルキル基を含む。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。複合リンカー基は、アミノ修飾オリゴヌクレオチド、及び複合基上の活性化エステル基の使用を介して、オリゴヌクレオチドに日常的に結合され得る。
【０３０３】
品質保証用途
本発明は、同一の修飾オリゴヌクレオチド合成操作のプールからの修飾オリゴヌクレオチドの集団における配列非均一性を決定するための方法を提供し、該方法は、次の工程：
該修飾オリゴヌクレオチドを得るか又は合成することと；
本発明に係るプライマーベースのシーケンシング方法を行うことと；
得られた配列データを分析して、修飾オリゴヌクレオチドの集団の配列非均一性を同定することと；を含む。
【０３０４】
配列非均一性とは、集団の少なくとも０．０１％、例えば少なくとも０．０５％、例えば少なくとも０．１％、例えば少なくとも０．５％を形成する種などの集団内における、個々の種の配列の同定を指し、任意に、各同定された種（特有の配列）によって形成される全集団の割合で各配列の出現に基づく。
【０３０５】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの該配列を検証する方法を提供し、該方法は、次の工程：
該修飾オリゴヌクレオチドを得るか又は合成することと；
本発明に係るプライマーベースのシーケンシング方法を行うことと；
該修飾オリゴヌクレオチドの該配列を検証するために得られた該配列データを分析することと；を含む。
【０３０６】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの集団における主要な（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ）配列を検証する方法を提供し、該方法は、次の工程：
該修飾オリゴヌクレオチドを得るか又は合成することと；
本発明に係るプライマーベースのシーケンシング方法を行うことと；
該修飾オリゴヌクレオチドの該配列を検証するために得られた該配列データを分析することと；を含む。
【０３０７】
修飾オリゴヌクレオチドの集団は、例えば、同じシーケンシング操作（バッチ）又はシーケンシング操作のプール（複数のバッチ）に由来し得る。
【０３０８】
検証は、修飾オリゴヌクレオチド合成工程への誤ったインプットエラーを同定するために使用することができ、これは、例えば、印刷上のエラー、又は合成方法工程で使用されるエラー若しくは混入物に起因し得る。あるいは、検証を用いて、修飾オリゴヌクレオチドの同一性を確認してもよく、例えば、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチド投与された患者から（例えば、治療薬の形態で）得てもよい。配列検証は、不正確な配列、又は短縮オリゴヌクレオチド若しくは延長オリゴヌクレオチド、又は異常な合成生成物を同定し得る。
【０３０９】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの純度を決定する方法を提供し、
該修飾オリゴヌクレオチドを得るか又は合成することと；
本発明に係るプライマーベースのシーケンシング方法を行うことと；
該修飾オリゴヌクレオチドの純度を決定するために得られた該配列データを分析することと；を含む。
【０３１０】
本発明は、ＬＮＡ及び／又は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又は糖修飾オリゴヌクレオチドなどの、修飾オリゴヌクレオチドの集団の核酸塩基配列を配列決定するための超並列シーケンシングの使用を提供する。
【０３１１】
本発明は、ＬＮＡ及び／又は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又は糖修飾オリゴヌクレオチドなどの、治療用修飾オリゴヌクレオチドの集団などの治療用オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列を配列決定するための超並列シーケンシングの使用を提供する。
【０３１２】
本発明は、ＬＮＡ及び／又は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又は糖修飾オリゴヌクレオチドなどの、修飾オリゴヌクレオチドの集団の核酸塩基配列を配列決定するための合成シーケンシングによるシーケンシングの使用を提供する。
【０３１３】
本発明は、ＬＮＡ及び／又は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又は糖修飾オリゴヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の生成物の品質を決定するための、プライマーに基づくポリメラーゼシーケンシングの使用を提供する。
【０３１４】
本発明は、ＬＮＡ及び／又は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又は糖修飾オリゴヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の生成物の非均一性を決定するための、プライマーに基づくポリメラーゼシーケンシングの使用を提供する。
【０３１５】
本発明は、ＬＮＡ及び／又は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又は糖修飾オリゴヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の生成物の品質を決定するための超並列シーケンシングの使用を提供する。
【０３１６】
本発明は、ＬＮＡ及び／又は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又は糖修飾オリゴヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の生成物の非均一性を決定するための、合成によるシーケンシングの使用を提供する。
【０３１７】
本発明は、ＬＮＡ及び／又は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又は糖修飾オリゴヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の生成物の品質を決定するための、合成によるシーケンシングの使用を提供する。
【０３１８】
本発明は、ＬＮＡ及び／又は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又は糖修飾オリゴヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の生成物の非均一性を決定するための、合成によるシーケンシングの使用を提供する。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、修飾オリゴヌクレオチドの集団、例えば単一のオリゴヌクレオチド合成バッチ又は複数のオリゴヌクレオチド合成バッチのプールにおいて、純度又は非均一性の程度を決定するための方法である。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、修飾オリゴヌクレオチドの集団、例えば修飾オリゴヌクレオチド合成バッチ又は複数のオリゴヌクレオチド合成バッチのプールに存在する、該修飾オリゴヌクレオチドの該配列又は主要な配列を決定するための方法である。
【０３２１】
インビボ及び創薬用途
長年にわたり、オリゴヌクレオチド治療薬は、標的配列からＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対の規則に基づいて設計された薬剤へと移行することが期待されてきたが、実際にはこれを達成することは非常に困難であり、最近では、オリゴヌクレオチドの個々の配列がオリゴヌクレオチドの薬理学的分布に重大な影響を与える可能性があることが明らかになってきている。したがって、インビトロでの顕著な効果に基づいて選択された化合物がインビボで同様の顕著な効果を有すると推定することは困難である。簡単に言えば、その生体内分布は非標的組織への蓄積と、標的組織への低い薬理学的効果とをもたらす可能性がある。本発明は、ＬＮＡ又は２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾オリゴヌクレオチドの並列シーケンシング方法を提供することで、所望の組織への取り込みをもたらす潜在配列の同定を可能にし、及び／又は非標的組織への蓄積を回避する。これは、異なる配列（例えば、縮重オリゴヌクレオチドライブラリ）を有するオリゴヌクレオチドのライブラリを作製し、哺乳動物の標的組織に豊富であるヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチド（配列）を同定する方法においてそれらを使用することによって、達成することができる。
【０３２２】
本発明は、哺乳動物の標的組織に豊富である修飾オリゴヌクレオチド（配列）を同定する方法を提供し、該方法は、以下：
ａ．修飾オリゴヌクレオチドの混合物を哺乳動物に投与することであって、ここで、修飾オリゴヌクレオチドの該混合物の各メンバが特有の核酸塩基配列を含む、投与することと；
ｂ．該修飾オリゴヌクレオチドが、例えば少なくとも１２時間の期間、例えば１２〜９６時間、例えば２４〜４８時間の期間で、該哺乳動物内に分配されるようにすることと；
ｃ．所望の標的組織又は所望の標的細胞を含む、前記哺乳動物由来の１つ以上の組織又は細胞から修飾オリゴヌクレオチドの集団を単離することと；
ｄ．該修飾オリゴヌクレオチドの集団をシーケンシングする工程を含む、本発明に係る方法を行うことと；これにより、
ｅ．該哺乳動物の該所望の標的組織又は細胞に豊富である修飾オリゴヌクレオチド配列を同定することと；を含む。
【０３２３】
修飾オリゴヌクレオチドは、特有の核酸塩基の領域（特有の核酸塩基配列）を含む。この領域は、例えばアプタマ又はアプタマ配列の探索のための縮重核酸塩基の領域であってもよいか、又は既知の配列の領域、例えば分子バーコード領域（例えば、複合部分の探索のため）であってもよい。
【０３２４】
あるいは、又は組み合わせて、この方法を用いて、哺乳動物の非標的組織において低い蓄積を有する修飾オリゴヌクレオチド（配列）を同定することができ、該方法は、以下：
ａ．修飾オリゴヌクレオチドの混合物を哺乳動物に投与することであって、ここで、修飾オリゴヌクレオチドの該混合物の各メンバが特有の核酸塩基配列を含む、投与することと；
ｂ．該ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドが、例えば少なくとも１２時間の期間、例えば１２〜９６時間、例えば２４〜４８時間の期間で、該哺乳動物内に分配されるようにすることと；
ｃ．非標的組織又は非標的細胞を含む、該哺乳動物由来の１つ以上の組織又は細胞から修飾オリゴヌクレオチドの集団を単離することと；
ｄ．該修飾オリゴヌクレオチドの集団をシーケンシングする工程を含む、本発明に係る方法を行うことと；これにより、
ｅ．該哺乳動物の該非標的組織又は非標的細胞における蓄積が低い、修飾オリゴヌクレオチド配列を同定することと；を含む。
【０３２５】
上記の方法は、単一のインビボ実験内で組み合わせることができることが理解されよう。
【０３２６】
この方法は、所望の生体内分布又は組織取り込みプロファイル（自己標的化）を有する修飾オリゴヌクレオチドを同定するために使用することができるか、又は修飾オリゴヌクレオチドを標的とすることができるオリゴヌクレオチド配列（すなわち、「アプタマ」標的化配列を含む修飾オリゴヌクレオチド）を同定するために使用することができる。あるいは、本明細書に記載されるように、本方法を使用して、修飾オリゴヌクレオチドを標的化するために使用することができる複合部分を同定し、それによって生体内分布又は組織取り込みプロファイルを増強することができる。
【０３２７】
更に、組織／細胞取込みのためのインビトロアッセイを、インビボアッセイの代わりに、又はインビボアッセイに加えて用いることができると考えられる。
【０３２８】
本発明は、細胞取り込みを増強する修飾オリゴヌクレオチド又は修飾オリゴヌクレオチド配列を同定する方法を提供し、該方法は、以下：
ａ．修飾オリゴヌクレオチドの混合物を、細胞に又は細胞の集団に、例えば１〜３６時間など期間投与することであって、ここで、修飾オリゴヌクレオチドの該混合物の各メンバが特有の核酸塩基配列を含む、投与することと；
ｂ．該細胞又は細胞の集団から修飾オリゴヌクレオチドの集団をから単離することと；
ｃ．ｂで得られた該修飾オリゴヌクレオチドの集団をシーケンシングする工程を含む、本発明に係る方法を行うことと；これにより、
ｄ．該細胞又は細胞の該集団に豊富である１つ以上の修飾オリゴヌクレオチド配列を同定することと；を含む。
【０３２９】
細胞は、哺乳動物細胞、例えばげっ歯類細胞、例えばマウス若しくはラット細胞であってもよく、又は霊長類細胞、例えばサル若しくはヒト細胞であってもよい。また、細胞は、例えばマラリア細胞などの細菌細胞又は寄生細胞などの、病原体細胞であり得ることも想定される。
【０３３０】
工程ａの後かつ工程ｂの前に、細胞を洗浄して、細胞培地中に存在するか又は細胞の外表面に付着した任意のオリゴヌクレオチドを除去することができる。
【０３３１】
インビトロ投与について、投与工程は、ｇｙｍｎｏｓｉｓ法（非補助的取込み）を用いて行うことができる。
【０３３２】
典型的には、例えば細胞／細胞集団から得られる試料から、又はインビボ実施形態の場合、哺乳動物（又は、患者）から得られる組織若しくは細胞からのヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドの単離の工程は、ＲＮアーゼ処理され、本発明のオリゴヌクレオチド捕捉方法での使用に先立って更に精製され得る（例えば、ゲル又はカラム精製による）。本発明のインビトロ又はインビボ方法は、規定された細胞下区画に蓄積する修飾オリゴヌクレオチドを同定するための標的細胞の細胞内分画を更に含むことができる。
【０３３３】
本発明は、所望の細胞内区画化を有する修飾オリゴヌクレオチド又は修飾オリゴヌクレオチド配列を同定する方法を提供し、該方法は、以下：
ａ．修飾オリゴヌクレオチドの混合物を、細胞に又は細胞の集団に、例えば１〜３６時間など期間投与することであって、ここで、修飾オリゴヌクレオチドの該混合物の各メンバが特有の核酸塩基配列を含む、投与することと；
ｂ．細胞における細胞内分画を行うことと；
ｃ．少なくとも１つの細胞内分画又は種々の異なる細胞内分画から、修飾オリゴヌクレオチドの集団を単離することと；
ｄ．ｃで得られた該修飾オリゴヌクレオチドの集団をシーケンシングする工程を含む、本発明に係る方法を行うことと；これにより、
ｅ．１つ以上の所望の細胞内分画に豊富である１つ以上の修飾オリゴヌクレオチド配列を同定することと；を含む。
【０３３４】
本発明の方法は、アプタマ特性を有する同定された核酸配列、例えばインビボで所望の生体内分布を有する核酸配列に適用することができる。したがって、本発明の方法を使用して、作用／組織の所望の部位に薬物分子を標的化することができるアプタマ配列を同定することができる。
【０３３５】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合ヌクレオチドなどの１０〜６０縮重ヌクレオチドの領域であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態では、縮重ヌクレオチド領域のヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレオチドである。したがって、異なる核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドの混合物は、１０〜６０の縮重ヌクレオチドの領域を含むことができる。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、規定された（既知の）配列の５’領域（Ｘ）、及び縮重配列の領域である３’領域（Ｙ）、例えば１０〜６０縮重ヌクレオチドの領域を含む。５’領域は、例えば、本明細書に記載されるような２’糖修飾オリゴヌクレオチドであってもよく、治療用オリゴヌクレオチド（すなわち、薬物カーゴ）であってもよい。任意に、公知のヌクレオチドの領域を含む更なる３’末端領域（Ｚ）を使用してもよい。領域Ｚは、３’捕捉プローブへの連結を容易にし得る。したがって、修飾オリゴヌクレオチドは、式［領域Ｘ−領域Ｙ−領域Ｚ］、若しくは［領域Ｘ−領域Ｙ］、若しくは［領域Ｙ−領域Ｚ］、又はいくつかの実施形態では、［領域Ｙ］であり得る。所望の特性を有するアプタマ配列が同定されると、薬物分子、例えばｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの治療用オリゴヌクレオチドに共有結合され得る。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、領域Ｘ−Ｙ若しくは領域Ｘ−Ｙ−Ｚを含むか、又はこれらからなる。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、領域Ｙ内のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｙのヌクレオシドは、ＤＮＡヌクレオシドである。
【０３３６】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドのアプタマ領域は、１つ以上の立体定義されたホスホロチオエートのヌクレオシド間結合を含み得る。この点において、修飾オリゴヌクレオチドは、立体定義されたホスホロチオエートヌクレオシド間結合などの立体定義ヌクレオシド間結合によって結合されたヌクレオシドの領域（複数可）を含んでもよく、立体定義されていない領域を更に含んでもよい。いくつかの実施形態では、領域Ｙは、立体定義されたホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって連結されたヌクレオシドの領域を含むか、又はそれである。立体定義されたアプタマ配列を同定するこのアプローチの利点は、修飾オリゴヌクレオチドが、特有の立体定義ヌクレオシド間結合モチーフを有する分子の分子同定を可能にする分子バーコーディング領域を更に含み得ることである（該バーコードは特定の立体定義ヌクレオシド間結合モチーフと結合している）。この点において、修飾オリゴヌクレオチドの混合物は、各々が特有の立体定義ヌクレオシド間結合モチーフ及び分子バーコードを含む、修飾オリゴヌクレオチドのライブラリであり得る。したがって、修飾オリゴヌクレオチド間のアプタマ配列における多様性は、ヌクレオチド配列における多様性よりもむしろ、又はこれに加えて、立体定義ヌクレオシド間結合モチーフのパターンによって作り出され得ると考えられる。
【０３３７】
標的化複合体探索：上記の探索方法は、薬物カーゴを所望の標的組織又は細胞に標的化する複合部分の同定に使用され得る。いくつかの実施形態では、薬物カーゴは、ｓｉＲＮＡ及びアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ＬＮＡオリゴヌクレオチド、又は２’−Ｏ−メトキシエチルオリゴヌクレオチドを含む修飾オリゴヌクレオチドであり得、この方法は、続いて他の薬物様式に結合し得る複合体を同定するために使用され得る。この点において、修飾オリゴヌクレオチドは、治療用オリゴヌクレオチド（又は治療用オリゴヌクレオチドの可能性）であってもよく、又は他の薬物カーゴとその後の使用するため複合体を同定するために使用されるツールオリゴヌクレオチドであってもよい。
【０３３８】
この方法は、一連のバーコード化修飾オリゴヌクレオチドに複合部分のライブラリを複合する工程を含み（すなわち、修飾オリゴヌクレオチドは既知の配列を含む）、各複合部分は、それが共有結合的に結合される（複合される）バーコード化修飾オリゴヌクレオチドのシーケンシングによって同定され得る。次いで、バーコード化修飾オリゴヌクレオチド複合体のライブラリを生体又は細胞、例えば哺乳動物又は細胞に投与し、好適な期間（例えば、上記の方法を参照）の後、コード化修飾オリゴヌクレオチド複合体の集団を細胞若しくは選択された細胞、又は生体由来の組織から単離し、修飾オリゴヌクレオチドを、例えば本明細書に記載された方法に従って、並列シーケンシング方法を用いて配列決定する。次いで、特有のバーコードの同定、及びいくつかの実施形態では、同定されるバーコード配列の頻度を用いて、選択された細胞又は生体由来の組織などの細胞への取り込みを増強する複合部分を同定することができる。
【０３３９】
いくつかの実施形態では、例えば複合部分探索用途のために、集団内の修飾オリゴヌクレオチドは、定義された配列である５’領域（Ｘ’）を含む。すなわち、修飾オリゴヌクレオチドの集団内の共通配列であり、ＰＣＲ及び／又はクローン増幅のためのプライマー結合部位、及び分子バーコード領域（Ｙ’）を含む５’領域に対して３’に位置する領域を含むことができる。
【０３４０】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ及び／又はクローン増幅のためのプライマー結合部位を含み得る、修飾オリゴヌクレオチドの集団によって共有される更なる共通配列を含む、更なる領域（Ｚ’）を含み得る。３’プライマー結合部位領域を含めることによって、直接的ＰＣＲ増幅又はクローン増幅、及び３’捕捉プローブの連結を伴わない並列シーケンシングが可能となる。あるいは、３’捕捉プローブ連結を使用してもよい。好適には、異なる複合部分のライブラリは、任意にリンカー及び／又は切断可能なリンカーを介して、修飾オリゴヌクレオチドの５’領域に複合される。複合体探索のためには、修飾オリゴヌクレオチドは、３’末端２’糖修飾ヌクレオチドの領域、例えば、領域Ｘ’及び／又はＺ’をエキソヌクレアーゼ切断から保護する１つ以上の２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドの領域（例えば、１、２、３、４、又は４個の２’−Ｏ−ＭＯＥを含む領域）を含み得る。修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり得る。修飾オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ複合体の一部であってもよく、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでもよい。
【０３４１】
本発明は、細胞内への細胞取り込みを増強する修飾オリゴヌクレオチド又は修飾オリゴヌクレオチド配列を同定する方法を提供し、該方法は、以下：
ｉ．修飾オリゴヌクレオチドの集団を、該細胞に投与することであって、ここで、修飾オリゴヌクレオチドの該集団の各メンバが、特有の核酸塩基配列を含む、投与することと；
ｉｉ．一定時間後、該細胞内から該修飾オリゴヌクレオチドを単離することと；
ｉｉｉ．実施形態２〜４３のいずれか一項に記載の方法を行って、工程（ｉｉ）で得られた修飾オリゴヌクレオチドを並列シーケンシングすることと；これにより、
ｉｖ．該細胞又は細胞の該集団に豊富である１つ以上の修飾オリゴヌクレオチド配列を同定することと；を含む。
【０３４２】
本方法は、インビトロ又はインビボ法であってもよい。
【０３４３】
本発明は、哺乳動物の標的組織又は細胞に豊富である修飾オリゴヌクレオチド（配列）を同定する方法を提供し、該方法は、以下：
ｉ．修飾オリゴヌクレオチドの混合物を哺乳動物に投与することであって、ここで、修飾オリゴヌクレオチドの該混合物の各メンバが特有の核酸塩基配列を含む、投与することと；
ｉｉ．該修飾オリゴヌクレオチドが、例えば少なくとも６時間の期間で、該哺乳動物内に分配されるようにすることと；
ｉｉｉ．所望の標的組織又は所望の標的細胞を含む、前記哺乳動物由来の１つ以上の組織又は細胞から修飾オリゴヌクレオチドの集団を単離することと；
ｉｖ．該修飾オリゴヌクレオチドの集団を並列シーケンシングする工程を含む、実施形態２〜３８のいずれか一項に記載の方法を行うことと；これにより、
ｖ．該哺乳動物の該所望の標的組織又は細胞に豊富である修飾オリゴヌクレオチド配列を同定することと；を含む。
【０３４４】
いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドの該集団の各メンバは、異なる（特有の）分子バーコード配列を含む。
【０３４５】
いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドの集団の各メンバは、異なるアプタマ配列を含む。
【０３４６】
いくつかの実施形態では、該修飾オリゴヌクレオチドの集団の各メンバは、異なる複合部分を含む。
【０３４７】
いくつかの実施形態では、該方法は、標的細胞又は標的組織などの該細胞によって優先的に取り込まれるアプタマ又はアプタマ配列を同定する方法である。
【０３４８】
いくつかの実施形態では、該方法は、標的細胞又は標的組織などの該細胞によって優先的に取り込まれる複合部分を同定する方法である。
【０３４９】
ナノ粒子標的化探索：本発明の方法は、薬物カーゴを所望の標的組織又は細胞に標的化することができるナノ粒子の同定に使用することができる。
【０３５０】
この方法は、一連の特有のバーコード化オリゴヌクレオチドを、各ナノ粒子配合が特有のバーコード化オリゴヌクレオチドを含むように、種々のナノ粒子配合に配合する工程を含み（すなわち、オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子を同定するために使用することができる既知の「バーコーディング」配列を含む）、各ナノ粒子は、それが含まれるバーコード化オリゴヌクレオチドのシーケンシングによって同定され得る。バーコード化オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子内にあってもよく（例えば、カーゴ分子）、又はナノ粒子配合の一部を形成してもよい（例えば、脂質に組み込まれた親油性複合体を介して、ナノ粒子の表面に広がる）。
【０３５１】
一旦配合されると、バーコード化されたオリゴヌクレオチドナノ粒子の集団をプールして、バーコード化されたオリゴヌクレオチドナノ粒子のライブラリを提供し、次いでこれらを、細胞、組織、又は生体（哺乳動物など）に投与することができる。
【０３５２】
次いで、本発明の並列シーケンシング方法を用いて、標的細胞又は標的組織へのナノ粒子送達のレベルを決定することができる。これは、標的細胞又は組織からオリゴヌクレオチドを単離し、本発明の並列シーケンシング法を実施して、各特有のバーコード化オリゴヌクレオチドの含有量を決定し、それによって各ナノ粒子配合の送達の有効性を決定することによって、適切に達成される。
【０３５３】
あるいは、本発明の方法において、特有のバーコード化修飾オリゴヌクレオチドナノ粒子のライブラリー（又は集団）を、バーコード化修飾オリゴヌクレオチド複合体のライブラリを生体又は細胞、例えば哺乳動物又は細胞に投与し、好適な期間（例えば、上記の方法を参照）の後、コード化修飾オリゴヌクレオチドの集団を細胞若しくは選択された細胞、又は生体由来の組織から単離し、修飾オリゴヌクレオチドを、例えば本明細書に記載された方法に従って、並列シーケンシング方法を用いて配列決定する。次いで、特有のバーコードの同定、及びいくつかの実施形態では、同定されるバーコード配列の頻度を用いて、選択された細胞又は生体由来の組織などの細胞への取り込みを増強するナノ粒子分を同定することができる。
【０３５４】
次いで、標的細胞又は組織に成功裏に標的化されるナノ粒子を用いて、薬物カーゴを標的化することができる。
【０３５５】
いくつかの実施形態では、バーコード化オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ又は２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾オリゴヌクレオチドなどの２’糖修飾オリゴヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、バーコード化オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。
【０３５６】
いくつかの実施形態では、薬物カーゴは、ｓｉＲＮＡ及びアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ＬＮＡオリゴヌクレオチド、又は２’−Ｏ−メトキシエチルオリゴヌクレオチドを含む修飾オリゴヌクレオチドであり得、この方法は、続いて他の薬物様式に結合し得るナノ粒子を同定するために使用され得る。この点において、修飾オリゴヌクレオチドは、治療用オリゴヌクレオチド（又は治療用オリゴヌクレオチドの可能性）であってもよく、又は他の薬物カーゴとその後の使用するためナノ粒子を同定するために使用されるツールオリゴヌクレオチドであってもよい。
【０３５７】
いくつかの実施形態では、例えばナノ粒子探索用途のために、特有のバーコード化修飾オリゴヌクレオチドは、定義された配列である５’領域（Ｘ’）を含む。すなわち、修飾オリゴヌクレオチドの集団内の共通配列であり、ＰＣＲ及び／又はクローン増幅のためのプライマー結合部位、及び分子バーコード領域（Ｙ’）を含む５’領域に対して３’に位置する領域を含むことができる。
【０３５８】
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ及び／又はクローン増幅のためのプライマー結合部位を含み得る、修飾オリゴヌクレオチドの集団によって共有される更なる共通配列を含む、更なる領域（Ｚ’）を含み得る。３’プライマー結合部位領域を含めることによって、直接的ＰＣＲ増幅又はクローン増幅、及び３’捕捉プローブの連結を伴わない並列シーケンシングが可能となる。あるいは、３’捕捉プローブ連結を使用してもよい。好適には、異なる複合部分のライブラリは、任意にリンカー及び／又は切断可能なリンカーを介して、修飾オリゴヌクレオチドの５’領域に複合される。ナノ粒子探索のためには、修飾オリゴヌクレオチドは、３’末端２’糖修飾ヌクレオチドの領域、例えば、領域Ｘ’及び／又はＺ’をエキソヌクレアーゼ切断から保護する１つ以上の２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドの領域（例えば、１、２、３、４、又は４個の２’−Ｏ−ＭＯＥを含む領域）を含み得る。修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり得る。修飾オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ複合体の一部であってもよく、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでもよい。
【０３５９】
本発明は、細胞内への細胞取り込みを増強する修飾オリゴヌクレオチド配列を含むナノ粒子を同定する方法を提供し、該方法は、以下：
ｉ．各々が特有の核酸塩基配列（バーコード）を含む修飾オリゴヌクレオチドを含むナノ粒子の集団を細胞へ投与することと；
ｉｉ．一定時間後、該細胞内から該修飾オリゴヌクレオチドを単離することと；
ｉｉｉ．本明細書に記載の実施形態又は請求項のいずれか一項に記載の方法を行って、工程（ｉｉ）で得られた修飾オリゴヌクレオチドを並列シーケンシングすることと；これにより、
ｉｖ．該細胞又は細胞の該集団に豊富である１つ以上のナノ粒子配合を同定することと；を含む。
【０３６０】
本方法は、インビトロ又はインビボ法であってもよい。
【０３６１】
本発明は、哺乳動物の標的組織又は細胞に豊富である１つ以上のナノ粒子配合を同定する方法を提供し、該方法は、以下：
ｉ．修飾オリゴヌクレオチドの混合物を哺乳動物に投与することであって、ここで、修飾オリゴヌクレオチドの混合物の各メンバが特有の核酸塩基配列を含み、修飾オリゴヌクレオチドの混合物の各メンバが異なるナノ粒子配合物に配合される、工程と；
ｉｉ．該ナノ粒子配合された修飾オリゴヌクレオチドが、例えば少なくとも６時間の期間で、該哺乳動物内に分配されるようにすることと；
ｉｉｉ．所望の標的組織又は所望の標的細胞を含む、該哺乳動物由来の１つ以上の組織又は細胞から修飾オリゴヌクレオチドの集団を単離することと；
ｉｖ．該修飾オリゴヌクレオチドの集団を並列シーケンシングする工程を含む、本明細書に記載の請求項又は実施形態のいずれか一項に記載の方法を行うことと；これにより、
ｖ．哺乳動物の所望の標的組織又は細胞に豊富である修飾オリゴヌクレオチド配列を同定し、それによって標的組織又は細胞に標的化される１つ以上のナノ粒子配合を同定することと；を含む。
【０３６２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法又は使用は、標的細胞又は標的組織などの該細胞によって優先的に取り込まれるナノ粒子を同定する方法である。
【０３６３】
実施形態−本発明の以下の例示的な実施形態は、本明細書に記載の本発明の他の態様又は実施形態と組み合わせることができる。
【０３６４】
１．ＬＮＡ又は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの２’糖修飾オリゴヌクレオチドなどの修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列をシーケンシングする方法であって、該方法は、次の工程：
Ｉ．該２’糖修飾オリゴヌクレオチドからポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成を行って、該２’糖修飾オリゴヌクレオチドの相補体を含む核酸配列を生成することと；
ＩＩ．工程ＩＩで得られた該第１ストランド合成生成物のプライマーベースのシーケンシングを行うことと；を含む、方法。
【０３６５】
２．工程Ｉの後かつ工程ＩＩの前に、工程Ｉの該第１ストランド生成物が、ＰＣＲ増幅される、実施形態１に記載の方法。
【０３６６】
３．工程ＩＩが、該プライマーベースのシーケンシングの前に、該第１ストランド合成生成物又はＰＣＲ増幅生成物のクローン増幅を含む、実施形態１又は２に記載の方法。
【０３６７】
４．該方法が、修飾オリゴヌクレオチド試料中に存在する、修飾オリゴヌクレオチド種の集団内の複数の修飾オリゴヌクレオチド種の並列シーケンシングのための方法である、実施形態１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【０３６８】
５．該ポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成の前に、該修飾オリゴヌクレオチドの３’領域に相補的な第１プライマーが、該５’−３’第１ストランド合成の開始のため該修飾オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる、実施形態１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【０３６９】
６．該ポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成の前に、該修飾オリゴヌクレオチドが、自己プライミング捕捉プローブであるか又は第１プライマー結合部位を含むかのいずれかである３’捕捉プローブに連結される、実施形態１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【０３７０】
７．該第１ストランド合成工程の前に、第１プライマーが、該ポリメラーゼ媒介第１ストランド合成の開始のため該３’捕捉プローブにハイブリダイズされる、実施形態６に記載の方法。
【０３７１】
８．該修飾オリゴヌクレオチドへの該３’捕捉プローブの連結後かつ第１ストランド合成の前に、ライゲーション産物が、例えばゲル精製により、又は非連結型３’捕捉プローブの酵素的分解により精製される、実施形態６又は７に記載の方法。
【０３７２】
９．該ＰＣＲ工程が、ＰＣＲプライマー対を用いて実施され、ここで、該ＰＣＲプライマーの１つが該３’捕捉プローブに特異的であり、第２ＰＣＲプライマーが、該修飾オリゴヌクレオチドの５’領域などの該修飾オリゴヌクレオチドに特異的である、実施形態６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【０３７３】
１０．該シーケンシング工程ＩＩが、クローン増幅プライマーを用いる工程Ｉの該第１ストランド生成物の該クローン増幅を含み、ここで、該クローン増幅プライマーの１つが該３’捕捉プローブに特異的であり、第２のクローン増幅プライマーが、該修飾オリゴヌクレオチドの５’領域などの該修飾オリゴヌクレオチドに特異的である、実施形態６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【０３７４】
１１．該第１ストランド合成工程Ｉの後に、第１ストランド合成生成物の精製が行われた場合、アダプタープローブが、該第１ストランド合成生成物の３’末端で連結される、実施形態６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【０３７５】
１２．該ＰＣＲ工程が、一対のＰＣＲプライマーを用いて実施され、ここで、ＰＣＲプライマーの一方が該３’捕捉プローブに特異的であり、他方のＰＣＲプライマーがアダプタープローブに特異的である、実施形態１１に記載の方法。
【０３７６】
１３．該シーケンシング工程ＩＩが、該３’捕捉プローブ及びアダプタープローブにそれぞれ特異的なクローン増幅プライマーを用いる工程Ｉの第１ストランド合成生成物の該クローン増幅を含む、実施形態１１又は１２に記載の方法。
【０３７７】
１４．第１ストランド合成後、該第１ストランド合成生成物が、ポリアデニル化される、実施形態１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【０３７８】
１５．第２ストランドが、ポリＴプライマーを用いて該第１ストランドから合成される、実施形態１４に記載の方法。
【０３７９】
１６．該ポリＴプライマーが、ＰＣＲプライマー結合部位及び／又はクローン増幅プライマー結合部位を更に含む、実施形態１５に記載の方法。
【０３８０】
１７．該ＰＣＲ工程が、該３’捕捉プローブに特異的なプライマーと、該ポリＴプライマー又は該ポリＴプライマーにおける該ＰＣＲプライマー結合部位に特異的なＰＣＲプライマーのいずれかと、を用いて行われる、実施形態１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【０３８１】
１８．該ＰＣＲ工程が、該修飾オリゴヌクレオチドの３’領域などの修飾オリゴヌクレオチドに特異的なプライマーと、該ポリＴプライマー又は該ポリＴプライマーにおける該ＰＣＲプライマー結合部位に特異的なＰＣＲプライマーのいずれかと、を用いて行われる、実施形態１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【０３８２】
１９．該シーケンシング工程が、クローン増幅を含み、ここで、該クローン増幅プライマーの１つが、該３’捕捉プローブ又は該修飾オリゴヌクレオチド（該修飾オリゴヌクレオチドの３’領域など）に特異的であり、第２のクローン増幅プライマーが、該ポリＴプライマーに特異的である、実施形態１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【０３８３】
２０．該ＰＣＲプライマーが、フローセル捕捉プローブ結合部位などのクローン増幅プライマー結合部位を更に含み、ここで、該シーケンシング工程が、該クローン増幅プライマー結合部位に相補的なフローセル結合プライマーなどのクローン増幅プライマーを用いるクローン増幅を含む、実施形態１８に記載の方法。
【０３８４】
２１．第１ストランド合成の前に、該ポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成の前に、該修飾オリゴヌクレオチドが、プライマー結合部位を含む５’捕捉プローブに連結される、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【０３８５】
２２．該修飾オリゴヌクレオチドが５’リン酸基を含むか、又は該５’捕捉プローブの連結の前に該修飾オリゴヌクレオチドの５’末端がリン酸化されるか、のいずれかである、実施形態２１に記載の方法。
【０３８６】
２３．該ＰＣＲ工程が、該修飾オリゴヌクレオチドの該３’領域などの該修飾オリゴヌクレオチドに特異的な第１ＰＣＲプライマーと、該５’捕捉プローブに特異的な第２ＰＣＲプライマーと、を用いて行われる、実施形態２１又は２２に記載の方法。
【０３８７】
２４．第１ストランド合成の前に、３’捕捉プローブが、該修飾オリゴヌクレオチドの５’末端への該５’捕捉プローブの該連結の前、後、又は同時のいずれかで、該修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に連結され、ここで、該３’捕捉プローブが、自己プライミング捕捉プローブであるか又は第１プライマー結合部位を含むかのいずれかである、実施形態２１又は２２に記載の方法。
【０３８８】
２５．第１ストランド合成の前に、該ライゲーション産物が、例えばゲル精製により、又は非連結型５’捕捉プローブの、及び使用される場合は３’捕捉プローブの、酵素的分解により精製される、実施形態２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【０３８９】
２６．第１ストランド合成が、該３’捕捉プローブとハイブリダイズした第１プライマーを用いて、又は該自己プライミング３’捕捉プローブから、開始される、実施形態２４又は２５に記載の方法。
【０３９０】
２７．該ＰＣＲ工程が、該３’捕捉プローブに特異的な第１ＰＣＲプライマーと、該５’捕捉プローブに特異的な第２ＰＣＲプライマーと、を用いて行われる、実施形態２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【０３９１】
２８．該ＰＣＲプライマーがクローン増幅プライマー結合部位（フローセルプライマー結合部位など）を含み、該シーケンシング工程がクローン増幅を含む、実施形態２３又は２７に記載の方法。
【０３９２】
２９．該シーケンシング工程ＩＩが、クローン増幅プライマーを用いる工程Ｉの該第１ストランド生成物の該クローン増幅を含み、ここで、該クローン増幅プライマーの１つが該３’捕捉プローブに特異的であり、第２のクローン増幅プライマーが、該修飾オリゴヌクレオチドの５’領域などの該修飾オリゴヌクレオチドに特異的である、実施形態２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【０３９３】
３０．該３’捕捉プローブが、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて該修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に連結される、実施形態６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【０３９４】
３１．該５’捕捉プローブが、Ｔ４−ＲＮＡリガーゼ又はＴ４−ＲＮＡリガーゼＩＩを用いて該修飾オリゴヌクレオチドの５’末端に連結される、実施形態２１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【０３９５】
３２．該シーケンシング工程ＩＩがクローン増幅を含み、該クローン増幅プライマーが、固体支持体（例えば、フローセル）に結合されるか、又はエマルション滴内に区画化される、実施形態１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【０３９６】
３３．該固相増幅が、固相ブリッジ増幅である、実施形態３２に記載の方法。
【０３９７】
３４．該プライマーベースのシーケンシング方法が、合成法によるシーケンシングを用いて実施される、実施形態１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【０３９８】
３５．該プライマーベースのシーケンシング方法が、循環可逆的終結法（ＣＲＴ）である、実施形態１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【０３９９】
３６．該シーケンシングが、超並列シーケンシングなどの並列シーケンシング方法である、実施形態１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【０４００】
３７．該プライマーベースのシーケンシングが、クローンブリッジ増幅（例えば、イルミナシーケンシング−可逆的色素ターミネータ）、又はクローンエマルションＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ  ４５４、ＧＳ  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＳＯＬｉＤ４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ）を用いて行われる、実施形態１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【０４０１】
３８．該第１ストランド合成が、ポリメラーゼ及びポリエチレングリコール又はプロピレングリコールの存在下において行われる、実施形態１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【０４０２】
３９．第１ストランド合成に使用される該ポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ又はＶｏｌｃａｎｏ２Ｇポリメラーゼ又はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素である、実施形態１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【０４０３】
４０．該シーケンシング工程が、クローン増幅プライマーを用いる該ＰＣＲ増幅生成物の該クローン増幅を含む、実施形態２〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【０４０４】
４１．該２’糖修飾オリゴヌクレオチドが、２’糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、実施形態１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【０４０５】
４２．該修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも２つの近接する２’糖修飾ヌクレオシドを含む、実施形態１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【０４０６】
４３．該修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む、実施形態１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【０４０７】
４４．該修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも２つの近接２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む、実施形態１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【０４０８】
４５．該修飾オリゴヌクレオチドが、該修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に位置する少なくとも２つ又は少なくとも３つの近接する２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシドなどの、該修飾オリゴヌクレオチドの３’に位置する少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む、実施形態１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【０４０９】
４６．該修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む、実施形態１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【０４１０】
４７．該修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも２つの近接するＬＮＡヌクレオチド又は少なくとも３つの近接するＬＮＡヌクレオチドを含む、実施形態１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【０４１１】
４８．該修飾オリゴヌクレオチドが、１つ以上のＬＮＡヌクレオチドが３’末端に位置することを含む、実施形態１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【０４１２】
４９．該修飾オリゴヌクレオチドが、ＬＮＡホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、実施形態１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【０４１３】
５０．該修飾オリゴヌクレオチドが、ＬＮＡギャップマー又はＬＮＡミクスマーなどのＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含む、実施形態１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【０４１４】
５１．該ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのＬＮＡ−Ｔヌクレオシド又は少なくとも１つのＬＮＡ−Ｃヌクレオシドを含む、実施形態１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【０４１５】
５２．該修飾オリゴヌクレオチドが、１つ以上のＬＮＡヌクレオシド、及び１つ以上の２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドなどの１つ以上の２’置換ヌクレオシドを含む、実施形態１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【０４１６】
５３．該修飾オリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー、混合ウィングギャップマー、交互フランクギャップマー、又はＬＮＡギャップマーからなる群より選択される、実施形態１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【０４１７】
５４．該修飾オリゴヌクレオチドが、ミクスマー又はトータルマーである、実施形態１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【０４１８】
５５．該修飾オリゴヌクレオチドが、ＧａｌＮＡｃ複合体などの複合基を含む、実施形態１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【０４１９】
５６．該方法が、修飾オリゴヌクレオチドの集団、例えば単一のオリゴヌクレオチド合成バッチ又は複数のオリゴヌクレオチド合成バッチのプールにおいて、純度又は非均一性の程度を決定するための方法である、実施形態１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【０４２０】
５７．該方法が、修飾オリゴヌクレオチドの集団、例えば修飾オリゴヌクレオチド合成バッチ又は複数のオリゴヌクレオチド合成バッチのプールに存在する、該修飾オリゴヌクレオチドの該配列又は優勢な配列を決定するための方法である、実施形態１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【０４２１】
５８．該修飾オリゴヌクレオチドが、修飾オリゴヌクレオチドの集団、例えば同じオリゴヌクレオチド合成操作（若しくはバッチ）又はオリゴヌクレオチド合成操作（若しくはバッチ）のプールからの、修飾オリゴヌセロチドの集団である、実施形態１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【０４２２】
５９．該修飾オリゴヌクレオチドが、細胞、又は組織若しくは生体から単離された修飾オリゴヌクレオチドの集団である、実施形態１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【０４２３】
６０．該方法が、標的組織又は標的細胞に優先的に標的指向する修飾オリゴヌクレオチドを同定するための方法であって、ここで、該方法が、次の工程：
（ｉ）修飾オリゴヌクレオチドの混合物を哺乳動物などの生体に投与することであって、ここで、修飾オリゴヌクレオチドの該混合物の各メンバが特有の核酸塩基配列を含む、投与することと；
（ｉｉ）該修飾オリゴヌクレオチドが、該哺乳動物内に分配される、及び／又は該細胞によって取り込まれるようにすることと；
（ｉｉｉ）所望の標的組織又は所望の標的細胞を含む、前記哺乳動物由来の１つ以上の組織又は細胞から修飾オリゴヌクレオチドの集団を単離することと；
（ｉｖ）実施形態１〜５９のいずれか一項に記載の方法を実施することと；これにより、
（ｖ）該哺乳動物の該所望の標的組織又は細胞に豊富である１つ以上の修飾オリゴヌクレオチド配列を同定することと；を含む、実施形態１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【０４２４】
６１．該方法が、標的細胞などの細胞によって優先的に取り込まれる修飾オリゴヌクレオチドを同定するための方法であって、ここで、該方法が、次の工程：
（ｉ）修飾オリゴヌクレオチドの混合物を細胞に投与することであって、ここで、修飾オリゴヌクレオチドの該混合物の各メンバが特有の核酸塩基配列を含む、投与することと；
（ｉｉ）該細胞を一定期間インキュベートすることと；
（ｉｉｉ）修飾オリゴヌクレオチドの集団を該細胞から単離することと；
（ｉｖ）実施形態１〜５９のいずれか一項に記載の方法を実施することと；これにより、
（ｖ）該細胞に豊富である１つ以上の修飾オリゴヌクレオチド配列を同定することと；を含む、実施形態１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【０４２５】
６２．該修飾オリゴヌクレオチドが、修飾オリゴヌクレオチドの集団を含み、ここで、修飾オリゴヌクレオチドの該集団の各メンバがヌクレオチドのアプタマ領域を含む、実施形態１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【０４２６】
６３．該修飾オリゴヌクレオチドが、修飾オリゴヌクレオチドの集団を含み、ここで、修飾オリゴヌクレオチドの該集団の各メンバが異なる複合基を含む、実施形態１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【０４２７】
６４．該５’捕捉プローブが、実施形態６５〜７６のいずれか一項に規定のものである、実施形態２１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【０４２８】
６５．５’リン酸化修飾オリゴヌクレオチドの５’末端へのＴ４−ＲＮＡリガーゼ又はＴ４−ＲＮＡリガーゼＩＩ媒介連結のための、５’捕捉プローブであって、３’−５に：
Ｉ．第１の領域であって、３’末端ＲＮＡヌクレオシド、又は３’末端−ＯＨ基を有するＲＮＡヌクレオチドの３’末端領域を含む、領域と；
ＩＩ．ヌクレオチドの第２の領域であって、プライマー結合部位、例えばＰＣＲプライマー結合部位（又は第２ストランド合成のためのプライマー部位）の前記相補体を含む、領域と；
ＩＩＩ．第３の領域であって、
ａ．ヌクレオチドの配列、又は、
ｂ．ポリメラーゼのリードスルーを阻害するリンカー領域、又は、
ｃ．５’リン酸塩以外の５’末端基を含む、領域と；
ＩＶ．ヌクレオチドの第４の領域であって、
ａ．前記第３の領域と共有結合しているか、又は、
ｂ．前記第３の領域が５’−リン酸以外の５’末端基である場合、前記第４の領域と不連続であるか、のいずれかである、領域と；
Ｖ．ヌクレオチドの第５の領域であって、前記修飾オリゴヌクレオチドの５’領域に相補的である、又は任意に縮重ヌクレオチドの領域であり得る、領域と；
ＶＩ．５’ブロッキング基、すなわち５’リン酸塩以外の５’基と；を含み、
ここで、前記第２の領域及び前記第４の領域が、前記第２の領域と前記第４の領域との間にデュプレックスを形成することができるヌクレオチドの相補的領域を含む、５’捕捉プローブ。
【０４２９】
６６．該第１の領域が、２〜２０のＲＮＡヌクレオチド、例えば３〜１０のＲＮＡヌクレオチドを含む、実施形態６５に記載の５’捕捉プローブ。
【０４３０】
６７．該第２の領域（ＩＩ）が、シーケンシングプライマー結合部位及び／又はフローセル結合部位を含む、実施形態６５又は６６に記載の５’捕捉プローブ。
【０４３１】
６８．該第２の領域（ＩＩ）が、分子バーコード領域を更に含む、実施形態６５〜６７のいずれか一項に記載の５’捕捉プローブ。
【０４３２】
６９．該第２の領域（ＩＩ）が、シーケンシング反応バーコード領域を更に含む、実施形態６５〜６８のいずれか一項に記載の５’捕捉プローブ。
【０４３３】
７０．該第２の領域（ＩＩ）が、シーケンシングプライマー結合領域を更に含む、実施形態６５〜６９のいずれか一項に記載の５’捕捉プローブ。
【０４３４】
７１．第１ストランド合成中におけるポリメラーゼのリードスルーを妨げるリンカー領域ＩＩＩを含む、実施形態６５〜７０のいずれか一項に記載の５’捕捉プローブ。
【０４３５】
７２．該リンカー領域ＩＩＩが、非ヌクレオチドリンカー、例えばＣ６−３２ポリエチレングリコールリンカー、例えばＣ１８ポリエチレングリコールリンカー、又はアルキルリンカーを含むか、あるいは逆ヌクレオシド結合を含むヌクレオチドの領域である、実施形態７１に記載の５’捕捉プローブ。
【０４３６】
７３．領域ＩＩＩが、領域Ｉ及びＩＩを含む該第１ストランド並びに領域ＩＶ及びＶを含む第２ストランドである二本鎖の５’捕捉プローブをもたらす、不連続部を含むか、又は不連続部である、実施形態７１に記載の５’捕捉プローブ。
【０４３７】
７４．領域Ｖが、修飾オリゴヌクレオチドの該５’領域に相補的なヌクレオチドの所定の領域を含む、実施形態６５〜７３のいずれか一項に記載の５’捕捉プローブ。
【０４３８】
７５．領域Ｖが、ヌクレオチドの縮重配列を含む、実施形態６５〜７３のいずれか一項に記載の５’捕捉プローブ。
【０４３９】
７６．領域Ｖの該５’末端が、５’−ＦＡＭなどの蛍光標識を含む、実施形態６５〜７５のいずれか一項に記載の５’捕捉プローブ。
【０４４０】
７７．修飾オリゴヌクレオチドの該捕捉に使用するためのキットであって、該キットは３’捕捉プローブ及び５’捕捉プローブを含み、ここで、該５’捕捉プローブが実施形態６５〜７６のいずれか一項に記載のものである、キット。
【０４４１】
更なる実施形態Ａ（これらの実施形態は、特定の３’捕捉プローブ及びアダプタープローブの連結方法を参照している。従属的な実施形態は、本明細書に記載又は主張されているような５’捕捉プローブの実施形態などの、本明細書に記載されている本発明の他の方法にも適用され得る）。
【０４４２】
本発明は更に、以下の実施形態を提供する：
実施形態１：２’糖修飾ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列をシーケンシングする方法であって、次の工程：
ａ．捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、前記修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に連結することと；
ｂ．前記捕捉プローブからポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成を行って、前記修飾オリゴヌクレオチドの相補体を含む核酸配列を生成することと；
ｃ．アダプタープローブを、工程ｂで得られた前記第１ストランド合成生成物の３’末端に連結することと；を含み、続いて、
−工程（ｃ）で得られた前記ライゲーション産物のプライマーベースのシーケンシングを行うこと；又は、
−工程（ｃ）で得られた前記ライゲーション産物のＰＣＲ増幅を行って、前記ＰＣＲ増幅生成物のプライマーベースのシーケンシングを行うこと、のいずれかを含む、方法。
【０４４３】
実施形態２：２’糖修飾ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドの集団の塩基配列を並列シーケンシングする方法であって、次の工程：
ａ．捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドの前記集団に存在する前記修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に連結することと；
ｂ．前記捕捉プローブからポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成を行って、修飾オリゴヌクレオチドの前記集団中に存在する修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の前記相補体をそれぞれ含む核酸配列の集団を生成することと；
ｃ．アダプタープローブを、工程ｂで得られた前記第１ストランド合成生成物の３’末端に連結することと；を含み、続いて、
−工程（ｃ）で得られた前記ライゲーション産物のプライマーベースの並列シーケンシングを行うこと；又は、
−工程（ｃ）で得られた該ライゲーション産物のＰＣＲ増幅を行って、該ＰＣＲ増幅生成物のプライマーベースの並列シーケンシングを行うこと、のいずれかを含む。
【０４４４】
２．該捕捉プローブが第１プライマー結合部位を含み、第１ストランド合成の前に、第１プライマーが第１ストランド合成の開始のため該捕捉プローブにハイブリダイズされる、実施形態１又は２に記載の方法。
【０４４５】
３．該捕捉プローブが、自己プライミング捕捉プローブである、実施形態１又は２に記載の方法。
【０４４６】
４．該捕捉プローブ及び該アダプタープローブが、クローン増幅プライマー結合部位を含み、該シーケンシング工程が、工程ｃで得られた該ライゲーション産物又は該ＰＣＲ増幅生成物のクローン増幅を含む、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【０４４７】
５．該ＰＣＲ増幅工程が、一対のＰＣＲプライマーを用いて実施され、一方は該捕捉プローブオリゴヌクレオチドに特異的であり、他方は該アダプタープローブに特異的である、実施形態１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【０４４８】
６．該ＰＣＲ増幅プライマーがクローン増幅プライマー結合部位を含み、該プライマーベースのシーケンシング工程が該ＰＣＲ増幅生成物のクローン増幅を含む、実施形態６に記載の方法。
【０４４９】
７．該クローン増幅プライマーが該第１及び第２ＰＣＲプライマーに特異的である；又は、該クローン増幅プライマーが該３’捕捉プローブ及びアダプタープローブに特異的である；又は、一方の該クローン増幅プライマーが該ＰＣＲプライマーの一方に特異的であり、他方のクローン増幅プライマーが３’捕捉プローブ若しくはアダプタープローブのいずれかにそれぞれ特異的である、実施形態１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【０４５０】
８．該プライマーベースのシーケンシング工程が、合成法によるシーケンシングを用いて実施される、実施形態１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【０４５１】
９．該プライマーベースのシーケンシング方法が、循環可逆的終結法（ＣＲＴ）である、実施形態１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【０４５２】
１０．該シーケンシング工程がクローン増幅を含み、該クローン増幅プライマーが、固体支持体、例えばフローセルに結合されるか、又はエマルション滴内に区画化される、実施形態１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【０４５３】
１１．該プライマーベースのシーケンシング工程の該ＰＣＲ工程が、
ａ．固相ブリッジ増幅などの固相増幅、又は
ｂ．液滴ＰＣＲなどのエマルション相増幅、のいずれかを含む、実施形態１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【０４５４】
１２．該プライマーベースのシーケンシングが、超並列シーケンシングなどの並列シーケンシングを用いて行われる、実施形態１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【０４５５】
１３．該第１ストランド合成が、ポリメラーゼ及びポリエチレングリコール又はプロピレングリコールの存在下において行われる、実施形態１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【０４５６】
１４．第１ストランド合成に使用される該ポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ若しくはＶｏｌｃａｎｏ２Ｇポリメラーゼ若しくはＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素、又はＴａｑポリメラーゼと少なくとも７０％の同一性を有する有効なポリメラーゼである、実施形態１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【０４５７】
１５．該修飾オリゴヌクレオチドが、ＬＮＡホスホロチオエート又は２’−Ｏ−ＭＯＥホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（２’−Ｏ−ＭＯＥ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｅｌｏｔｉｄｅ）などの２’糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、実施形態１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【０４５８】
１６．該修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも２つの近接する２’糖修飾ヌクレオシドを含む、実施形態１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【０４５９】
１７．該修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む、実施形態１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【０４６０】
１８．該修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも２つの近接２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む、実施形態１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【０４６１】
１９．該修飾オリゴヌクレオチドが、該修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に位置する少なくとも２つ又は少なくとも３つの近接する２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシドなどの、該修飾オリゴヌクレオチドの３’に位置する少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む、実施形態１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【０４６２】
２０．該修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む、実施形態１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【０４６３】
２１．該修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも２つの近接するＬＮＡヌクレオチド又は少なくとも３つの近接するＬＮＡヌクレオチドを含む、実施形態１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【０４６４】
２２．該修飾オリゴヌクレオチドが、該ＬＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端に位置する少なくとも２つのＬＮＡヌクレオチドなどの、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオチドを含む、実施形態１〜２２に記載の方法。
【０４６５】
２３．該修飾オリゴヌクレオチドが、ＬＮＡホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、実施形態１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【０４６６】
２４．該修飾オリゴヌクレオチドが、ＬＮＡギャップマー又はＬＮＡミクスマーなどのＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含む、実施形態１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【０４６７】
２５．該修飾オリゴヌクレオチドが、ＬＮＡ−Ｔヌクレオシドなどの少なくとも１つの２’糖修飾Ｔヌクレオシド、又はＬＮＡ−Ｃヌクレオシドなどの少なくとも１つの２’糖修飾Ｃヌクレオシドを含む、実施形態１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【０４６８】
２６．該修飾オリゴヌクレオチドが、１つ以上のＬＮＡヌクレオシド、及び１つ以上の２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドなどの１つ以上の２’置換ヌクレオシドを含む、実施形態１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【０４６９】
２７．該修飾オリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー、混合ウィングギャップマー、交互フランクギャップマー、又はＬＮＡギャップマーからなる群より選択される、実施形態１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【０４７０】
２８．該修飾オリゴヌクレオチドが、ミクスマー又はトータルマーである、実施形態１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【０４７１】
２９．該修飾オリゴヌクレオチドが、ＧａｌＮＡｃ複合体などの複合基を含む、実施形態１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【０４７２】
３０．該方法が、修飾オリゴヌクレオチドの集団、例えば単一のオリゴヌクレオチド合成バッチ又は複数のオリゴヌクレオチド合成バッチのプールにおいて、純度又は非均一性の程度を決定するための方法である、実施形態１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【０４７３】
３１．該方法が、修飾オリゴヌクレオチドの集団、例えば修飾オリゴヌクレオチド合成バッチ又は複数のオリゴヌクレオチド合成バッチのプールに存在する、該修飾オリゴヌクレオチドの該配列又は主要な配列を決定するための方法である、実施形態１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【０４７４】
３２．該修飾オリゴヌクレオチドが、修飾オリゴヌクレオチドの集団、例えば同じオリゴヌクレオチド合成操作（若しくはバッチ）又はオリゴヌクレオチド合成操作（若しくはバッチ）のプールからの、修飾オリゴヌクレオチドの集団である、実施形態１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【０４７５】
３３．２’糖修飾オリゴヌクレオチドの集団の該核酸塩基配列をシーケンシングするための、プライマーベースのシーケンシングの使用。
【０４７６】
３４．２’糖修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の前記生成物の非均一性を決定するための、プライマーベースのシーケンシングの使用。
【０４７７】
３５．２’糖修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の前記生成物の質を決定するための、プライマーベースのシーケンシングの使用。
【０４７８】
３６．２’糖修飾オリゴヌクレオチドの集団の前記核酸塩基配列をシーケンシングするための、並列シーケンシングの使用。
【０４７９】
３７．２’糖修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の前記生成物の質を決定するための、並列シーケンシングの使用。
【０４８０】
３８．２’糖修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の前記生成物の非均一性を決定するための、並列シーケンシングの使用。
【０４８１】
３９．２’糖修飾オリゴヌクレオチドの集団の前記核酸塩基配列をシーケンシングするための、合成シーケンシングによるシーケンシングの使用。
【０４８２】
４０．２’糖修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の前記生成物の非均一性を決定するための、合成によるシーケンシングの使用。
【０４８３】
４１．２’糖修飾オリゴヌクレオチドの合成又は製造操作の該生成物の質を決定するための、合成によるシーケンシングの使用。
【０４８４】
４２．該２’糖修飾オリゴヌクレオチドが、実施形態１〜３３のいずれか一項に記載のものである、実施形態３４〜４２のいずれか一項に記載の使用。
【０４８５】
４３．ＬＮＡ修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含む鋳型からの第１ストランド合成のための、配列番号１と少なくとも７０％同一性を有するＴａｑポリメラーゼ又はポリメラーゼ酵素の使用。
【０４８６】
更なる実施形態Ｂ（これらの実施形態は、特定の３’捕捉プローブの態様を参照している。従属的な実施形態は、本明細書に記載又は主張されているような５’捕捉プローブの実施形態などの、本明細書に記載されている本発明の他の方法にも適用され得る）。
【０４８７】
実施形態１：修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列をシーケンシングするための方法であって、該方法は、次の工程：
ａ．捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、前記修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に連結することと；
ｂ．前記捕捉プローブからポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成を行って、前記修飾オリゴヌクレオチドの相補体を含む核酸配列を生成することと；
ｃ．工程（ｂ）で得られた該第１ストランド合成生成物のプライマーベースのシーケンシングを行うことと；を含む。
【０４８８】
実施形態２：修飾オリゴヌクレオチドの集団の塩基配列を並列シーケンシングする方法であって、該方法は、次の工程：
ｄ．捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドの前記集団に存在する前記修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に連結することと；
ｅ．前記捕捉プローブからポリメラーゼ媒介５’−３’第１ストランド合成を行って、修飾オリゴヌクレオチドの前記集団中に存在する修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の前記相補体をそれぞれ含む核酸配列の集団を生成することと；
ｆ．工程（ｂ）で得られた第１ストランド合成生成物の集団のプライマーベースの並列シーケンシングを行うことと；を含む。
【０４８９】
２．該捕捉プローブが第１プライマー結合部位を含み、第１ストランド合成の前に、第１プライマーが第１ストランド合成の開始のため該捕捉プローブにハイブリダイズされる、実施形態１又は２に記載の方法。
【０４９０】
３．該捕捉プローブが、自己プライミング捕捉プローブである、実施形態１又は２に記載の方法。
【０４９１】
４．工程ｂの後かつ工程ｃの前に、該第１ストランド合成生成物が、ＰＣＲ増幅される、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【０４９２】
５．工程（ｃ）が、該プライマーベースのシーケンシングの前に、工程ｂの該第１ストランド合成生成物、又は実施形態５の該ＰＣＲ増幅生成物のいずれかのクローン増幅を含む、実施形態１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【０４９３】
６．該修飾オリゴヌクレオチドへの該３’捕捉プローブの連結後かつ第１ストランド合成の前に、該ライゲーション産物が、例えばゲル精製により、又は非連結型３’捕捉プローブの酵素的分解により精製される、実施形態１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【０４９４】
７．該ＰＣＲ工程が、ＰＣＲプライマー対を用いて実施され、ここで、該ＰＣＲプライマーの１つが該３’捕捉プローブに特異的であり、第２ＰＣＲプライマーが、該修飾オリゴヌクレオチドの５’領域などの該修飾オリゴヌクレオチドに特異的である、実施形態５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【０４９５】
８．該プライマーベースのシーケンシング工程が、クローン増幅プライマーを用いる工程（ｂ）の該第１ストランド合成工程の該クローン増幅を含み、ここで、該クローン増幅プライマーの１つが該３’捕捉プローブに特異的であり、第２のクローン増幅プライマーが、該修飾オリゴヌクレオチドの５’領域などの該修飾オリゴヌクレオチドに特異的である、実施形態１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【０４９６】
９．該第１ストランド合成工程（ｂ）又は実施形態７の該精製工程の後に、アダプタープローブが、該第１ストランド合成生成物の３’末端で連結される、実施形態１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【０４９７】
１０．該ＰＣＲ工程が、一対のＰＣＲプライマーを用いて実施され、ここで、一方のＰＣＲプライマーが該３’捕捉プローブに特異的であり、他方のＰＣＲプライマーがアダプタープローブに特異的である、実施形態１０に記載の方法。
【０４９８】
１１．該捕捉プローブ及び該アダプタープローブが、クローン増幅プライマー結合部位を含み、該シーケンシング工程が、実施形態１０の該第１ストランド合成／アダプタープローブライゲーション産物又は実施形態１１の該ＰＣＲ増幅生成物のクローン増幅を含む、実施形態１０又は１１に記載の方法。
【０４９９】
１２．該クローン増幅プライマーが該第１及び第２ＰＣＲプライマーに特異的である；又は、該クローン増幅プライマーが該３’捕捉プローブ及びアダプタープローブに特異的である；又は、一方の該クローン増幅プライマーが該ＰＣＲプライマーの一方に特異的であり、他方のクローン増幅プライマーが３’捕捉プローブ若しくはアダプタープローブのいずれかにそれぞれ特異的である、実施形態１２に記載の方法。
【０５００】
１３．該第１ストランド合成工程（ｂ）の後、該第１ストランド合成生成物が、３’末端で多核化（ポリＮ）され、例えばポリアデニル化される、実施形態１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【０５０１】
１４．第２ストランドが、相補的ポリ（Ｎ）配列を有するプライマー、例えばポリＴプライマーを用いて合成される、実施形態１４に記載の方法。
【０５０２】
１５．該第２ストランド合成プライマーが、ＰＣＲプライマー結合部位及び／又はクローン増幅プライマー結合部位（又は、フローセルプライマー結合部位）を更に含む、実施形態１５に記載の方法。
【０５０３】
１６．該ＰＣＲ工程が、該３’捕捉プローブに特異的なプライマーと、該第２ストランド合成プライマー又は該第２ストランド合成プライマーに特異的なＰＣＲプライマーのいずれかと、を用いて行われる、実施形態１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【０５０４】
１７．該シーケンシング工程が、クローン増幅を含み、ここで、該クローン増幅プライマーの１つが該３’捕捉プローブに特異的であり、第２のクローン増幅プライマーが該第２ストランド合成プライマーに特異的である、実施形態１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【０５０５】
１８．該ＰＣＲプライマーが、フローセル捕捉プローブ結合部位などのクローン増幅プライマー結合部位を更に含み、ここで、該シーケンシング工程が、該クローン増幅プライマー結合部位に相補的なフローセル結合プライマーなどのクローン増幅プライマーを用いるクローン増幅を含む、実施形態１８に記載の方法。
【０５０６】
１９．該プライマーベースのシーケンシング工程が、合成法によるシーケンシングを用いて実施される、実施形態１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【０５０７】
２０．該プライマーベースのシーケンシング方法が、循環可逆的終結法（ＣＲＴ）である、実施形態１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【０５０８】
２１．該シーケンシング工程がクローン増幅を含み、該クローン増幅プライマーが、固体支持体、例えばフローセルに結合されるか、又はエマルション滴内に区画化される、実施形態１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【０５０９】
２２．該プライマーベースのシーケンシング工程の該クローン増幅工程が、
ａ．固相ブリッジ増幅などの固相増幅、又は
ｂ．液滴ＰＣＲなどのエマルション相増幅、のいずれかを含む、実施形態２２に記載の方法。
【０５１０】
２３．該プライマーベースのシーケンシングが、超並列シーケンシングなどの並列シーケンシングを用いて行われる、実施形態１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【０５１１】
２４．該第１ストランド合成が、ポリメラーゼ及びポリエチレングリコール又はプロピレングリコールの存在下において行われる、実施形態１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【０５１２】
２５．第１ストランド合成に使用される該ポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ若しくはＶｏｌｃａｎｏ２Ｇポリメラーゼ若しくはＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素、又はＴａｑポリメラーゼと少なくとも７０％の同一性を有する有効なポリメラーゼである、実施形態１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【０５１３】
２６．該修飾オリゴヌクレオチドが、ＬＮＡホスホロチオエート又は２’−Ｏ−ＭＯＥホスホロチオエートオリゴヌセロチド（２’−Ｏ−ＭＯＥ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｅｌｏｔｉｄｅ）などの２’糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、実施形態１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【０５１４】
２７．該修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも２つの近接する２’糖修飾ヌクレオシドを含む、実施形態１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【０５１５】
２８．該修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む、実施形態１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【０５１６】
２９．該修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも２つの近接２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む、実施形態１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【０５１７】
３０．該修飾オリゴヌクレオチドが、該修飾オリゴヌクレオチドの３’末端に位置する少なくとも２つ又は少なくとも３つの近接する２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシドなどの、該修飾オリゴヌクレオチドの３’に位置する少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む、実施形態１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【０５１８】
３１．該修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む、実施形態１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【０５１９】
３２．該修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも２つの近接するＬＮＡヌクレオチド又は少なくとも３つの近接するＬＮＡヌクレオチドを含む、実施形態１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【０５２０】
３３．該修飾オリゴヌクレオチドが、該ＬＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端に位置する少なくとも２つのＬＮＡヌクレオチドなどの、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオチドを含む、実施形態１〜３３に記載の方法。
【０５２１】
３４．該修飾オリゴヌクレオチドが、ＬＮＡホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、実施形態１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【０５２２】
３５．該修飾オリゴヌクレオチドが、ＬＮＡギャップマー又はＬＮＡミクスマーなどのＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含む、実施形態１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【０５２３】
３６．該修飾オリゴヌクレオチドが、ＬＮＡ−Ｔヌクレオシドなどの少なくとも１つの２’糖修飾Ｔヌクレオシド、又はＬＮＡ−Ｃヌクレオシドなどの少なくとも１つの２’糖修飾Ｃヌクレオシドを含む、実施形態１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【０５２４】
３７．該修飾オリゴヌクレオチドが、１つ以上のＬＮＡヌクレオシド、及び１つ以上の２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドなどの１つ以上の２’置換ヌクレオシドを含む、実施形態１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【０５２５】
３８．該修飾オリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー、混合ウィングギャップマー、交互フランクギャップマー、又はＬＮＡギャップマーからなる群より選択される、実施形態１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【０５２６】
３９．該修飾オリゴヌクレオチドが、ミクスマー又はトータルマーである、実施形態１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【０５２７】
４０．該修飾オリゴヌクレオチドが、ＧａｌＮＡｃ複合体などの複合基を含む、実施形態１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【０５２８】
４１．該修飾オリゴヌクレオチドが、アプタマである、又はアプタマ配列を含む、実施形態１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【０５２９】
４２．該修飾オリゴヌクレオチドが、修飾オリゴヌクレオチド複合体の集団を含み、ここで、修飾オリゴヌクレオチド複合体の該集団の各メンバが異なる複合基を含む、実施形態１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【０５３０】
４３．細胞内への細胞取り込みを増強する修飾オリゴヌクレオチド又は修飾オリゴヌクレオチド配列を同定する方法であって、該方法は、以下：
ｖ．修飾オリゴヌクレオチドの集団を、該細胞に投与することであって、ここで、修飾オリゴヌクレオチドの該集団の各メンバが、特有の核酸塩基配列を含む、投与することと；
ｖｉ．一定時間後、該細胞内から該修飾オリゴヌクレオチドを単離することと；
ｖｉｉ．実施形態２〜４３のいずれか一項に記載の方法を行って、工程（ｉｉ）で得られた修飾オリゴヌクレオチドを並列シーケンシングすることと；これにより、
ｖｉｉｉ．該細胞又は細胞の該集団に豊富である１つ以上の修飾オリゴヌクレオチド配列を同定することと；を含む。
【０５３１】
４４．該細胞が、インビトロである、実施形態４４のいずれか一項に記載の方法。
【０５３２】
４５．該細胞が、インビボである、実施形態４４のいずれか一項に記載の方法。
【０５３３】
４６．哺乳動物の標的組織又は細胞に豊富である修飾オリゴヌクレオチド（配列）を同定する方法であって、該方法は、以下：
ｖｉ．修飾オリゴヌクレオチドの混合物を哺乳動物に投与することであって、ここで、修飾オリゴヌクレオチドの該混合物の各メンバが特有の核酸塩基配列を含む、投与することと；
ｖｉｉ．該修飾オリゴヌクレオチドが、例えば少なくとも６時間の期間で、該哺乳動物内に分配されるようにすることと；
ｖｉｉｉ．所望の標的組織又は所望の標的細胞を含む、前記哺乳動物由来の１つ以上の組織又は細胞から修飾オリゴヌクレオチドの集団を単離することと；
ｉｘ．該修飾オリゴヌクレオチドの集団を並列シーケンシングする工程を含む、実施形態２〜３８のいずれか一項に記載の方法を行うことと；これにより、
ｘ．該哺乳動物の該所望の標的組織又は細胞に豊富である修飾オリゴヌクレオチド配列を同定することと；を含む。
【０５３４】
４７．該修飾オリゴヌクレオチドの該集団の該各メンバが、異なる（特有の）分子バーコード配列を含む、実施形態４４〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【０５３５】
４８．該修飾オリゴヌクレオチドの集団の各メンバが、異なるアプタマ配列を含む、実施形態４４〜４８に記載の方法。
【０５３６】
４９．該修飾オリゴヌクレオチドの集団の各メンバが、異なる複合部分を含む、実施形態４４〜４８に記載の方法。
【０５３７】
５０．該方法が、標的細胞又は標的組織などの該細胞によって優先的に取り込まれるアプタマ又はアプタマ配列を同定する方法である、実施形態４９に記載の方法。
【０５３８】
５１．該方法が、標的細胞又は標的組織などの該細胞によって優先的に取り込まれる複合部分を同定する方法である、実施形態５０に記載の方法。
【実施例】
【０５３９】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドなどのヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドを配列決定できるようにするためには、ＬＮＡオリゴヌクレオチド全体を効率的に読み取ることができるポリメラーゼが必要である。特定のポリメラーゼのみがこれを行うことができ、いくつかのポリメラーゼについては、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドにわたる読み取りの効率が、特定の添加物の存在によって増強されることを同定した。ここでは、好ましいポリメラーゼを同定し、ポリメラーゼを試験ＬＮＡオリゴヌクレオチドにわたって読み取ることを可能にするＰＣＲ反応のための添加物を探索した。
【０５４０】
実施例１：ＬＮＡオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ読取り効率を試験するための試験分子の生成
ＬＮＡオリゴヌクレオチドを横断して読む種々のポリメラーゼ能力を試験できるようにするために、ホスホロチオエート骨格（１２塩基対）を有するＬＮＡオリゴヌクレオチドがホスホロチオエート骨格（図１Ａ参照）を有する正常ＤＮＡ塩基の２０ｂｐ超である５’及び３’側の両方のフランクである、「ＬＮＡ試験鋳型１」（ＬＮＡ  Ｔｅｓｔ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  １：ＬＴＴ１）と命名した、一本鎖試験鋳型分子を作製した。この鋳型分子を種々の後の実験に用いた。このＬＮＡオリゴ試験分子と並行して、１２塩基対が同じ配列からなるが、ＤＮＡ及び骨格がホスホジエステルであった全塩基からなる、同じ試験鋳型も作製した。この鋳型は「ＤＮＡ試験鋳型１」（ＤＮＡ  Ｔｅｓｔ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  １：ＤＴＴ１）と呼ばれ、対照オリゴとして機能した。これらの鋳型は、これらの分子の５’末端及び３’部分に置かれたプライマーを用いた後の実験で使用された。ＰＣＲ反応が起こるためには、ポリメラーゼは、ホスホジエステル骨格を含む鋳型の部分及び５’正常ＤＮＡ部分全体にわたって、プライマーを伸長できなければならない。したがって、このＬＴＴ１分子は、ＬＮＡオリゴをコピーするポリメラーゼの能力を試験するのに役立つ。
【０５４１】
ＬＴＴ１及びＤＴＴ１は、次のように生成される：
以下のオリゴは、合成された（ＬＮＡ  Ｏ１）、又はＩＤＴ（ＤＮＡ  Ｏ１）から指示された。
2021522816.tif 000006
【０５４２】
ここで、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドであり、ｍＣ＝５メチルシトシンβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドであり、下付きｏ＝ホスホジエステルヌクレオシド間結合であり、下付きｓ＝ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。ＬＮＡ  Ｏ１は図１ＡにおいてＬＴＴ１として示され、ＤＮＡ  Ｏ１は図１ＡにおいてＤＴＴ１として示される。
【０５４３】
これらのオリゴを以下のＤＮＡ捕捉プローブ（ＤＮＡ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ：ＤＣＰ１）に連結した。
2021522816.tif 000007
（全ヌクレオシドはホスホジエステル結合ＤＮＡヌクレオシドである；「／５Ｐｈｏｓ／」は５’リン酸基を示す；／ｉＳｐ１８／は、１８原子のヘキサエチレングリコールスペーサーを示す；／３ＡｍＭＯ／は３’アミノ修飾子を示す。）配列表において、本明細書に開示されているプローブの塩基配列は、特定された修飾なしで提供され、場合によっては、ＲＮＡ塩基がＤＮＡ塩基として示されていることに留意されたい。相違する場合、実施例における配列及び配列の修飾は、配列表における開示よりも優先される。
【０５４４】
連結反応：
以下の連結反応をＰＣＲチューブ中にセットアップした：
ａ：２ｕＬ  Ｈ２Ｏ＋２ｕＬ  ＤＣＰ１（１００ｕＭ）
ｂ：２ｕＬ  ＬＮＡ  Ｏ１（１０ｕＭ）＋２ｕＬ  ＤＣＰ１（１００ｕＭ）
ｃ：２ｕＬ  ＬＮＡ  Ｏ１（１０ｕＭ）＋２ｕＬ  ＤＣＰ１（１００ｕＭ）
【０５４５】
混合物を５５℃で３分間加熱し、次いで４℃まで冷却した。
【０５４６】
各チューブに以下のものを追加した。
２ｕＬ  Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
６ｕＬ  ＰＥＧ（５０％）
６ｕＬ  Ｈ２Ｏ
２ｕＬ  Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
【０５４７】
混合物をボルテックスし、連結を次の条件で３回サイクル（１６℃；２０分、２５；１０分、３７℃；１分）し、その後７５℃で１０分間、続いて４℃保持した。
【０５４８】
ゲル電気泳動：
上記の反応の各々に、等量の２倍Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、試料を９５℃で２分間熱変性させ、氷上に置いた。このようにして調製した１５μｌの試料を、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  Ｇｅｌｓ、１５％、１５ウェル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードし、電気泳動を１８０Ｖの一定電圧で７５分間行った。ＤＮＡを、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて１０分間染色した。ゲルを、青色トレイ上のＣｈｅｍｉＤｏｃ  Ｔｏｕｃｈ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で可視化した（図１Ｂ参照）。
【０５４９】
ＤＣＰ１とオリゴヌクレオチドの間のライゲーション産物を含むバンドをゲルから切断した。ゲル片を粉砕し、連結したオリゴを抽出するため５００μＬのＴＥ緩衝液に一晩浸漬した。浸漬に続いて、連結したオリゴを洗浄し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−０．５  Ｕｌｔｒａｃｅｌ−３膜、３ｋＤａカラムを用いて濃縮した。２つの鋳型オリゴ（ＬＴＴ１及びＤＴＴ１）の濃度を、ナノドロップ上で測定し、同じ濃度に標準化した。
【０５５０】
実施例２：鋳型を含むＬＮＡオリゴに対する標準的ＰＣＲ増幅は、不可能である
ＬＴＴ１、ＤＴＴ１、及び捕捉プローブ（ＤＣＰ１）を、ＱＸ２００（商標）ｄｄＰＣＲ（商標）ＥｖａＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘで実施される標準エマルションＰＣＲ反応における鋳型分子として使用した。ＥｖａＧｒｅｅｎ用の自動化液滴生成油を用いて、ＡｕｔｏＤＧ（ＢｉｏＲａｄ）上に液滴を生成した。ＰＣＲサイクリング後、液滴をＱＸ２００液滴リーダ（ＢｉｏＲａｄ）で読み取った。
【０５５１】
ＰＣＲ反応を、ＤＣＰ１特異的プライマー
2021522816.tif 000008
と、ＬＴＴ１及びＤＴＴ１の５’末端に結合する順方向プライマー
2021522816.tif 000009
と、を用いてセットアップした。第２の反応も行い、追加の標準Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を加えた。これは、標準Ｔａｑを追加することでＬＴＴ１のリードスルーが改善されるかどうかを確認するために行った。
【０５５２】
２２ｕＬ  ＰＣＲ反応セットアップ：
2021522816.tif 000010
2021522816.tif 000011
【０５５３】
結果：
図２のパネルＡは、６つの異なるＰＣＲ反応での液滴の蛍光強度の１Ｄプロットを示す。多数の陽性液滴が出現するので、ＤＴＴ１鋳型のＰＣＲ増幅が実行可能であることが明らかになり得る。しかしながら、ＬＴＴ１又はＤＣＰ１を用いたＰＣＲ反応では、陽性液滴は見られなかったか、又はほとんど見られなかった。標準Ｔａｑポリメラーゼの更なる添加にかかわらず、同じ結果が見られた。このことは、Ｔａｑポリメラーゼが、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴを含有するＬＮＡを横切って完全に読み取ることがほとんど不可能であることを示している。
【０５５４】
実施例３：ＬＴＴ１の第１ストランド合成アッセイにおける種々の酵素能力の試験ＬＴＴ１のストランド合成アッセイ
Ｔａｑポリメラーゼは正常条件下でＬＴＴ１鋳型を横断して読むことができないので、逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：ＲＴ）がＬＮＡオリゴ伸長を横断して読むことができるかどうかを見るために、多くの市販のＲＴ酵素ポリメラーゼを試験した。これは、第１ストランドのコピー反応をセットアップすることによって行われ、異なるポリメラーゼは、ＤＣＰ１＿プライマー１をプライマーとして使用してＬＴＴ１をコピーしようと試みた。第２に、生成されたインタクトなＬＴＴ１第１ストランドのコピーの量を、実施例２に記載したように、ＤＣＰ１＿プライマー１及びＴＴ１＿プライマー１を用いたｄｄＰＣＲ反応で試験した。図３は、以下の６種類のポリメラーゼを試験した結果を示している：Ａｇｉｌｅｎｔ製ＡｃｃｕＳｃｒｉｐｔ  Ｈｉ−Ｆｉ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ２００Ｕ／ｕＬ、ＭｙＰｏｌｓ製Ｖｏｌｃａｎｏ２Ｇ  ＤＮＡポリメラーゼ  ５Ｕ／ｕＬ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ２００Ｕ／ｕＬ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ製ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  １０単位／ｕＬ、タカラバイオ製ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ）。
【０５５５】
１０ｕＬ第１ストランド合成反応：
全ての反応が含まれ（１ｕＬ  ＬＴＴ１（３１ｐＭ）、０．５ｕＬ  ＤＣＰ１＿プライマー１（１０ｕＭ）、水１０ｕＬを加えた。異なる酵素は、販売業者から提供された緩衝液を用いて実行した。
【０５５６】
ａ）１ｕＬ  Ａｃｃｕｓｃｒｉｐｔ、１ｕＬ  ０．１Ｍ  ＤＴＴ、１ｕＬ緩衝液、１ｕＬ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
ｂ）０．５ｕＬ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ、０．５ｕＬ  ０．１Ｍ  ＤＴＴ、２ｕＬ第１ストランド緩衝液、１ｕＬ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
ｃ）０．２ｕＬ  Ｖｕｌｃａｎｏ２Ｇ、２ｕＬ  Ｖｕｌｃａｎｏ緩衝液、１ｕＬ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
ｄ）０．５ｕＬ  ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ、２ｕＬ反応緩衝液、１ｕＬ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
ｅ）０．５ｕＬ  ＡＭＶ、０．５ｕＬ  ０．１Ｍ  ＤＴＴ、２ｕＬ  ｃＤＮＡ  合成緩衝液、１ｕＬ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
ｆ）０．５ｕＬ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ、２ｕＬ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ緩衝液、１ｕＬ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
【０５５７】
混合物中の酵素を除く全ての成分を添加し、６５℃まで５分間加熱し、次いで氷の上で１分、その後逆転写酵素を最終的に添加した。第１ストランド合成は、各条件について以下の温度で１時間行った（５５℃、５４．２℃、５２．５℃、５０℃、４７．１℃、４４．６℃、４２．９℃、４２℃）。その後、８０℃で１０分間冷却し、４℃で保持する。
【０５５８】
全ての第１ストランド反応を水で２００倍に希釈し、２ｕＬ試料を、実施例２に記載したように、通常のＱＸ２００（商標）ｄｄＰＣＲ（商標）ＥｖａＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ＰＣＲ反応のためのインプットとして使用した。２ｕＬ  ＬＴＴ１（１５．５ｆＭ）、ＤＴＴ１（１５．５ｆＭ）、又はＨ２Ｏを、陰性及び陽性対照として含めた。１５．５ｆＭの２ｕＬインプットは、第１ストランド合成工程から添加されるＬＴＴ１分子の数に等しい。
【０５５９】
結果：
図３は、異なるＰＣＲ反応における液滴の蛍光強度を示す。図には４２℃の逆転写反応の結果のみが示されている。他の温度の結果は、ＡＭＶで見られる非常に小さい活性が５２．５℃以上で失われることを除いて、各条件で同じであった。一般的な逆転写酵素では、ＬＴＴ１鋳型全体を読み取る能力がないか、又は極めて非常に低い効率であることが分かる。しかしながら、Ｖｕｌｃａｎｏ２Ｇは鋳型を読むのにかなりの効率があるように見えることが分かった。等数のインプット分子を有するＤＴＴ１鋳型上におけるｄｄＰＣＲと比較した液滴数の定量化は、Ｖｕｌｃａｎｏ２Ｇ酵素の読取効率がおよそ１０％であることを示し、これは１０個のＬＬＴ１分子のうちの１つがＶｕｌｃａｎｏ２Ｇ酵素によって丸ごと転写されることを意味した。ＡＭＶ及びＰｒｉｍｅ  Ｓｃｒｉｐｔ酵素でおよそ０．１％の効率が見られた。
【０５６０】
実施例４：ＤＮＡポリメラーゼによるＬＮＡオリゴのリードスルーを可能にする、ＰＣＲ添加物の試験
ポリメラーゼでＬＮＡオリゴを横断して転写する際の困難を克服するために、ＰＣＲ反応における添加物が、ＬＴＴ１におけるＬＮＡオリゴを横断して読み取る際にポリメラーゼを助けることができるかどうかの試験に着手した。ＬＮＡオリゴ、すなわち塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、塩化アンモニウム、及び１，２−プロパンジオールの読取りに有益な効果があるかどうかを調べるために、４種類の既知のＰＣＲ添加物を試験した。修飾Ｔａｑポリメラーゼを含有するＡｃｃｕＳｔａｒｔ  ＩＩ  ＰＣＲ  ＴｏｕｇｈＭｉｘ（ＱｕａｎｔｉＢｉｏ）を用いて、エマルションＰＣＲ反応における添加物を試験した。ＥｖａＧｒｅｅｎ用の自動化液滴生成油を用いて、ＡｕｔｏＤＧ（ＢｉｏＲａｄ）上に液滴を生成した。ＰＣＲサイクリング後、液滴をＱＸ２００液滴リーダ（ＢｉｏＲａｄ）で読み取った。別々のＥｖａＧｒｅｅｎ色素（Ｂｉｏｔｉｕｍカタログ番号３１０００）をＰＣＲ反応に加えた。
【０５６１】
以下の添加物を、ｄｄＰＣＲ反応について試験した：ＴＭＡ（１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ、６０ｍＭ、８０ｍＭ、１００ｍＭ）、ＰＥＧ（０％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％）、塩化アンモニウム（１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ、６０ｍＭ、８０ｍＭ、１００ｍＭ）、１，２−プロパンジオール（０．２Ｍ、０．４Ｍ、０．６Ｍ、０．８Ｍ、１Ｍ、１．２Ｍ、１．６Ｍ、２Ｍ）。
【０５６２】
ＰＣＲ反応混合物（２２ｕＬ）：
１１ｕＬ  ＡｃｃｕＳｔａｒｔ  ＩＩ  ＰＣＲ  ＴｏｕｇｈＭｉｘ
０．２ｕＬ  ＴＴ１＿プライマー１（１０ｕＭ）
０．２ｕｌ  ＤＣＰ１＿プライマー１（１０ｕＭ）
０．５ｕＬ  ＥｖａＧｒｅｅｎ色素（４０倍）
ＸｕＬ  ＰＣＲ添加物
２ｕＬ  ＬＴＴ１（１００ｆＭ）
Ｈ２Ｏ添加２２ｕＬ
2021522816.tif 000012
【０５６３】
結果：
図４は、添加物を用いたｄｄＰＣＲの結果を示す。結果は、全液滴の蛍光強度を示す、１Ｄプロットとして表示する。その結果、塩化ＴＭＡ及び塩化アンモニウムを添加しても、ＬＮＡリードスルーは改善されなかった（図４パネルＡ及びパネルＣ）。しかしながら、ＰＥＧの濃度の増加は、陽性液滴の量の増加をもたらすことが分かる。正の効果は３％ＰＥＧで始まり、４％及び５％の両方で増加した（図４パネルＢ）。また、１，２−プロオアンジオールの添加による正の効果を観察し、およそ０．８Ｍの１，２−プロパンジオール付近から始まる陽性液滴の量の増加を見出した（図４パネルＤ）。１．２Ｍ超の１，２−プロパンジオール濃度の増加は、若干の陽性液滴をもたらしたが、陽性液滴の蛍光強度の減少もまたもたらした。まとめると、ＰＥＧ又は１，２−プロパンジオールの添加は、Ｔａｑポリメラーゼがホスホロチオエート骨格を有するＬＮＡオリゴを横切るその読取能力を劇的に増加させることを可能にすると結論する。図４パネルＥは、検出されたＬＴＴ１分子の濃度を示し、ＰＥＧがＬＴＴ１検出を明らかに増加させることと、ＰＥＧが、ＬＴＴ１鋳型を読み取る能力もまたいくらか増加させた１．２−プロパンジオールと比較して、より良好な添加物であることと、を示す。
【０５６４】
ＰＥＧの正の効果の飽和が見られなかったので、同じ設定で第２の実験を行ったが、反応中のＰＥＧの濃度は更に増加した。（図４パネルＦ）。ＰＥＧの濃度が９％を超えると、陽性液滴の数は同じであるが、液滴が崩壊し始めることが分かる。ＰＥＧの濃度が１５％の場合、液滴の完全な崩壊が見られた。最後に、ＰＥＧと１，２プロパンジオールとの組合せがオリゴのリードスルーを更に増加させるかどうかを試験した。図４パネルＧは、したがって、９％ＰＥＧ、及び０Ｍ、０．５Ｍ、１．０Ｍ、又は１．５Ｍの１．２−プロパンジオールとを用いたｄｄＰＣＲ反応を示し、これは、反応を更に増強するための１．２−プロパンジオールの同時添加によって明らかな利益が見られなかったことを示す。一般的に、ＰＥＧの量が６％を超える場合、ｄｄＰＣＲ反応に更なる１，２−プロパンジオールを追加する利点は認められなかった（データ示さず）。
【０５６５】
実施例５：ＰＥＧ及び／又は１．２−プロパンジオールは、ある種のＤＮＡポリメラーゼがＬＮＡオリゴを読むことを可能にする
実施例４では、ＰＥＧ及び１，２−プロパンジオールの添加が、開示されていない修飾Ｔａｑポリメラーゼを含有する混合物（ＱｕａｎｔａＢｉｏ）を介してＡｃｃｕｓｔａｒｔ  ＩＩ  ＰＣＲを用いた場合に、ＬＴＴ１鋳型分子の成功した増幅に有益であったことが示された。ＰＣＲ添加物が他のポリメラーゼに対するＬＮＡオリゴ「リードスルー」も可能にするかどうかを調べるために、複数回のＬＴＴ１鋳型の第１ストランド合成を行うことによって、正常なＴａｑポリメラーゼ及び高忠実度ポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を試験した。ＬＴＴ１鋳型のストランド合成生成されたインタクトな第１ストランドのコピーの数は、実験２、３、４で実施したものと同様に、Ｅｖａｇｒｅｅｎ  ｄｄＰＣＲ検出によって検出された。以下の２０ｕＬ反応を設定し、０、１、３、５、及び１０回の第１ストランド増幅を用いて実施した。
【０５６６】
ａ）０．１ｕＬ  Ｔａｑポリメラーゼ、２ｕＬ  Ｔａｑ緩衝液、０．４ｕＬ  ＤＣＰ１＿プライマー１（１０ｕＭ）、０．４ｕＬ  ＬＴＴ１（１０ｐＭ）
ｂ）０．１ｕＬ  Ｔａｑポリメラーゼ、２ｕＬ  Ｔａｑ緩衝液、０．４ｕＬ  ＤＣＰ１＿プライマー１（１０ｕＭ）、０．４ｕＬ  ＬＴＴ１（１０ｐＭ）、０．５ｕＬ  １．２−プロパンジオール、４ｕＬ  ＰＥＧ（５０％）
ｃ）２ｕＬ  Ｔａｑ緩衝液、０．４ｕＬ  ＤＣＰ１＿プライマー１（１０ｕＭ）、０．４ｕＬ  ＬＴＴ１（１０ｐＭ）、０．５ｕＬ  １．２−プロパンジオール、４ｕＬ  ＰＥＧ（５０％）
ｄ）０．２ｕＬ  Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、５倍ＨＦ緩衝液、０．４ｕＬ  ＤＣＰ１＿プライマー１（１０ｕＭ）、０．４ｕＬ  ＬＴＴ１（１０ｐＭ）
ｅ）０．２ｕＬ  Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、５倍ＨＦ緩衝液、０．４ｕＬ  ＤＣＰ１＿プライマー１（１０ｕＭ）、０．４ｕＬ  ＬＴＴ１（１０ｐＭ）、０．５ｕＬ  １．２−プロパンジオール、４ｕＬ  ＰＥＧ（５０％）
ｆ）０．２ｕＬ  Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、５倍ＧＦ緩衝液、０．４ｕＬ  ＤＣＰ１＿プライマー１（１０ｕＭ）、０．４ｕＬ  ＬＴＴ１（１０ｐＭ）
ｇ）０．２ｕＬ  Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、５倍ＧＦ緩衝液、０．４ｕＬ  ＤＣＰ１＿プライマー１（１０ｕＭ）、０．４ｕＬ  ＬＴＴ１（１０ｐＭ）、０．５ｕＬ  １．２−プロパンジオール、４ｕＬ  ＰＥＧ（５０％）
第１ストランド再現（ｒｅａｋｔｉｏｎ）。（９５℃で５分；５２．５  ３分、９５℃で３０秒をＸサイクル；その後、氷上）
【０５６７】
実施例２に記載したように、第１ストランド合成反応を５０倍に希釈し、２ｕＬをＥｖａｇｒｅｅｎ  ｄｄＰＣＲ反応におけるインプットとして使用した。
【０５６８】
結果：
図５は、第１ストランド合成に関するｄｄＰＣＲ反応の結果を示す。図５パネルＡは、ＰＣＲ添加物を含まない第１ストランドＴａｑポリメラーゼ合成におけるｄｄＰＣＲ反応を示す。このように、第１ストランド合成サイクルの結果として陽性液滴の数増加することはほとんどなく、通常の条件下でＴａｑポリメラーゼがホスホロチオエート骨格及びＬＮＡ塩基を含有するオリゴを横切って読むことができないことが再び示される。図５パネルＣは、同じ反応を示すが、Ｔａｑポリメラーゼの存在は示さない。Ｔａｑポリメーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒｓｅ）を用いない第１ストランド反応における陽性液滴数は、添加物を用いない反応とほぼ同じであった。これは、陽性液滴の大部分が、第１ストランド合成の間ではなく、Ｅｖａｇｒｅｅｎ  ｄｄＰＣＲ反応の間に生じたＬＮＡ鋳型のコピーから生じたことを示した。図５パネルＢは、１０％ＰＥＧ及び０．３１Ｍが第１の合成中に存在した場合の、ｄｄＰＣＲ反応の結果を示す。ストランド合成反応．このように、陽性液滴の数は、第１ストランド合成サイクルの数と共に増加し、添加物が、標準ＴａｑポリメラーゼがＬＴＴ１のＬＮＡオリゴ部分を横切って読むことを可能にすることを実証する。図５パネルＥ及びＦは、１０％ＰＥＧ及び０．３１Ｍの１．３−プロパンジオール添加物を伴う又は伴わないＨＦ緩衝液中における、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼによる第１ストランド合成反応に関するｄｄＰＣＲを示す。これは、ＰＥＧ及び１，２−プロパンジオールの添加並びに緩衝液ＨＦ又はＧＦ緩衝液の使用にかかわらず、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼが、ＬＴＴ１のＬＮＡオリゴヌクレオチド部分を横切って読み取ることができないことを示す。図５パネルＤは、試験された７つの条件について検出されたＬＴＴ１コピーの数の定量化を示す。Ｔａｑポリメラーゼ及び添加物との反応においてのみ見られるように、ＬＴＴ１鋳型分子の効果的な第１ストランド複製が見られる。これらの試験したＰＣＲ添加物（ＰＥＧ及び１．２−プロパンジオール）の存在は、いくつかのＤＮＡポリメラーゼがＬＮＡオリゴを横断して読むことを可能にすると結論される。
【０５６９】
実施例６：ＬＮＡオリゴヌクレオチドのＮＧＳシーケンシング
完全なホスホロチオエート骨格を有するＬＮＡオリゴヌクレオチドのシーケンシングが可能であることを示すために、以下の方法を用いて、５つのＬＮＡオリゴヌクレオチドの混合物を配列決定した。シーケンシングは、正常Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＶｕｌｃａｎｏ２Ｇポリメラーゼ（ｍｙＰＯＬＳ）の両方を用いて、第１ストランド合成中にＰＥＧの添加の有無により行った。
【０５７０】
ストランド合成
以下のＬＮＡオリゴを１：１の比率で混合し、それぞれ１ｕＭの最終濃度に希釈した：
ＬＮＡ混合物：
2021522816.tif 000013
捕捉プローブ：
2021522816.tif 000014
捕捉プローブ逆転写プライマー：
2021522816.tif 000015
【０５７１】
１．連結反応：
２ｕＬ  ＬＮＡ混合物を、２ｕＬ捕捉プローブインデックス１（１０ｕＭ）と混合した。
２ｕＬ  ＬＮＡ混合物を、２ｕＬ捕捉プローブインデックス２（１０ｕＭ）と混合した。
２ｕＬ  ＬＮＡ混合物を、２ｕＬ捕捉プローブインデックス３（１０ｕＭ）と混合した。
２ｕＬ  ＬＮＡ混合物を、２ｕＬ捕捉プローブインデックス４（１０ｕＭ）と混合した。
【０５７２】
次いで、混合物を５５℃まで加熱し、その後４℃まで冷却した。
１６ｕＬの連結混合物を各チューブに添加した：
２０ｕＬ毎の反応：（２ｕＬ  Ｔ４連結緩衝液、６ｕＬ  ＰＥＧ、６ｕＬ  Ｈ２Ｏ、２ｕＬ  Ｔ４リガーゼ）
【０５７３】
ゲル電気泳動：
上記の反応の各々に、等量の２倍Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、試料を９５℃で２分間熱変性させ、氷上に置いた。このようにして調製した１５μｌの試料を、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  Ｇｅｌｓ、１５％、１５ウェル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードし、電気泳動を１８０Ｖの一定電圧で７５分間行った。ＤＮＡを、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて１０分間染色した。ゲルを、青色トレイ上のＣｈｅｍｉＤｏｃ  Ｔｏｕｃｈ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で可視化した（図６Ａ参照）。
【０５７４】
捕捉プローブとオリゴヌクレオチドとの間のライゲーション産物を含むバンドをゲルから切断した。切断領域は、図６Ａに赤いボックスで示す。ゲル片を粉砕し、連結したオリゴを抽出するため５００μＬのＴＥ緩衝液に一晩浸漬した。浸漬後、連結したオリゴを、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ０．５ｍＬ遠心式ＭＷＣＯ  ３ｋＤａフィルタを用いて洗浄し、濃縮した。最後に、試料を、スピードバックを用いておよそ１０μＬまで濃縮した。
【０５７５】
第１ストランド合成及び精製：
４つの異なるプロトコルを用いて、連結されたＬＮＡオリゴの第１ストランドのコピーを作製した。
2021522816.tif 000016
【０５７６】
以下のプログラムを用いてサーモサイクラ上にて、第１ストランド合成を行った：
９５℃；３分、１０回（５５℃；５分、７２℃；１分）、その後４℃で保持。
【０５７７】
第１ストランド合成反応を、Ｍｏｎａｒｃｈ（登録商標）ＰＣＲ＆ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用い、製造者のオリゴヌクレオチド・クリーンアップ・プロトコルを用いて精製した。試料を１０ｕＬの溶出緩衝液で溶出した。
２．連結反応：
2021522816.tif 000017
【０５７８】
８ｕＬの第１ストランド合成反応を、２ｕＬの捕捉プローブ２（１ｕＭ）と混合した。
【０５７９】
次いで、混合物を５５℃まで加熱し、その後４℃まで冷却した。
１６ｕＬの連結混合物を各チューブに添加した：
２０ｕＬ毎の反応：（２ｕＬ  Ｔ４連結緩衝液、６ｕＬ  ＰＥＧ、６ｕＬ  Ｈ２Ｏ、２ｕＬ  Ｔ４リガーゼ）。連結：２回（４℃；２分、１６℃；２時間、２２℃５分）、７５℃；１０分、その後４℃で保持。
【０５８０】
ＮＧＳライブラリのＰＣＲ増幅：
2021522816.tif 000018
連結された第１ストランド合成のＰＣＲ増幅を、ＮＧＳ＿ＰＣＲ＿プライマー１及び２を用いてＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼで行った。これらのプライマーは、イルミナＴｒｕＳｅｑ  ＮＧＳプロトコルと互換性のある５’オーバーハングを含む。
2021522816.tif 000019
ＰＣＲサイクル：９８℃；３０秒、１５回（９８℃；１５秒、６０℃；２０秒、７２℃；２０秒）、７２  ５分、その後４℃で保持。
【０５８１】
ＰＣＲ生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）上で、製造説明書に従って精製し、３０ｕＬのＨ２Ｏに溶出した。
【０５８２】
ＮＧＳセットアップ：
４つの反応を同じ濃度に標準化し、一緒にプールして、１０ｎＭのＮＧＳライブラリを作製した。ｐｈｉＸ対照混合物をこの試料にスパイクし、全分子の２０％の最終濃度にして、続くイルミン（ｉｌｌｕｍｉｎｅ）シーケンシングのための配列変動を得た。ＮＧＳライブラリは、イルミナのＭｉｎｉＳｅｑ  Ｓｙｓｔｅｍ用のＤｅｎａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｄｉｌｕｔｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｇｕｉｄｅに従って調製した。ライブラリを、ＭＩＤ出力カセットを用いてＩｌｌｕｍｉｎａ  ｍｉｎｉＳｅｑシステム上で配列決定した。シーケンシングは、１５１サイクルを実行するインデックスなしで、読取１のみを使用するｆａｓｔｑファイルを生成するように設定した。
【０５８３】
ＮＧＳデータ分析：
生成されたｆａｓｔｑファイルは、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  １０  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｑｉａｇｅｎ）にインポートした。読取りは、異なる捕捉プローブ１に組み込まれたバーコードに従って分離され、捕捉プローブ１からの残りの読取りは、読取りの５’末端からトリミングされた。その後、捕捉プローブ２に由来する配列は、捕捉プローブ１と２との間に挿入された配列のみを残して、３’末端からトリミングされた。次に、ａｗｋコマンドラインを使用して、１８未満の全読取りをトリミングし、最後に、１８ｂｐ又は３２ｂｐより長いａｌ読取りを、シーケンシング読取りの３末端から塩基を除去することによって、１８ｂｐ又は３２ｂｐにトリミングした。特有の読取りの数を定量化した。最多読取りの上位１０を図６のパネルＢに示す。図６において、読取りは、元のＬＮＡオリゴを５’−＞３’の様式で読み取るために、逆相補されている。
【０５８４】
実施例７：
実施例１：品質管理（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ：ＱＣ）としてのＬＮＡのＮＧＳシーケンシング
ここでは、ＱＣのための完全ホスホロチオエート化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｉｏａｔｅｄ）ＬＮＡオリゴのシーケンシングが可能であることが示される。
【０５８５】
以下のＬＮＡオリゴをシーケンシングに使用した。
ＬＮＡ混合物：
2021522816.tif 000020
捕捉プローブ：
2021522816.tif 000021
捕捉プローブ１逆転写プライマー：
2021522816.tif 000022
【０５８６】
第１の連結反応：
２ｕＬオリゴ１を、２ｕＬ捕捉プローブ１インデックス３（１０ｕＭ）と混合した。
２ｕＬオリゴ２を、２ｕＬ捕捉プローブ１インデックス２（１０ｕＭ）と混合した。
２ｕＬオリゴ３を、２ｕＬ捕捉プローブ１インデックス４（１０ｕＭ）と混合した。
２ｕＬオリゴ４を、２ｕＬ捕捉プローブ１インデックス１（１０ｕＭ）と混合した。
【０５８７】
次いで、混合物を５５℃まで加熱し、その後４℃まで冷却した。
１６ｕＬの連結混合物を各チューブに添加した：
２０ｕＬ毎の反応：（２ｕＬ  Ｔ４連結緩衝液、６ｕＬ  ＰＥＧ、６ｕＬ  Ｈ２Ｏ、２ｕＬ  Ｔ４リガーゼ）。連結：２回（４℃；２分、１６℃；２０分、２２℃５分、３０℃１分）、７５℃；１０分、その後４℃で保持。
【０５８８】
ゲル電気泳動：
上記の反応の各々に、等量の２倍Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、試料を９５℃で２分間熱変性させ、氷上に置いた。調製した１５μｌの試料を、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  Ｇｅｌｓ、１５％、１５ウェル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードし、電気泳動を１８０Ｖの一定電圧で７５分間行った。ＤＮＡを、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて１０分間染色した。ゲルを、青色トレイ上のＣｈｅｍｉＤｏｃ  Ｔｏｕｃｈ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で可視化した（図８Ａ参照）。
【０５８９】
捕捉プローブとオリゴの間のライゲーション産物を含むバンドをゲルから切断した。切断領域は、図１Ａに白いボックスで示す。ゲル片を粉砕し、連結したオリゴを抽出するため５００μＬのＴＥ緩衝液に一晩浸漬した。浸漬後、連結したオリゴを、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ０．５ｍＬ遠心式ＭＷＣＯ  ３ｋＤａフィルタを用いて洗浄し、濃縮した。最後に、試料を、スピードバックを用いておよそ１０μＬまで濃縮した。
【０５９０】
第１ストランド合成及び精製：
第１ストランド合成は、Ｖｕｌｃａｎｏ２Ｇ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて２０ｕＬ反応で行った：
４ｕＬ：５倍Ｖｕｌｃａｎｏ２Ｇ緩衝液
０．４ｕＬ：Ｖｕｌｃａｎｏ２Ｇポリメラーゼ
０．５ｕＬ：ｄＮＴＰ（１０ｕＭ）
０．４ｕＬ：捕捉ＲＴプライマー（１０ｕＭ）
４ｕＬ：連結鋳型
Ｈ２０添加２０ｕＬ
サーモサイクラで以下のプログラムを用いる：
９５℃；３分、１０回（５５℃；５分、７２℃；１分）、その後４℃で保持。
【０５９１】
第１ストランド合成反応を、Ｍｏｎａｒｃｈ（登録商標）ＰＣＲ＆ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用い、製造者のオリゴヌクレオチド・クリーンアップ・プロトコルを用いて精製した。試料を１０ｕＬの溶出緩衝液で溶出した。
【０５９２】
２．連結反応：
2021522816.tif 000023
８ｕＬの第１ストランド合成反応を、２ｕＬの捕捉プローブ２（１ｕＭ）と混合した。
【０５９３】
次いで、混合物を５５℃まで加熱し、その後４℃まで冷却した。
１６ｕＬの連結混合物を各チューブに添加した：
２０ｕＬ毎の反応：（２ｕＬ  Ｔ４連結緩衝液、６ｕＬ  ＰＥＧ、６ｕＬ  Ｈ２Ｏ、２ｕＬ  Ｔ４リガーゼ）。連結：２回（４℃；２分、１６℃；２時間、２２℃５分）、７５℃；１０分、その後４℃で保持。
【０５９４】
ＮＧＳライブラリのＰＣＲ増幅：
2021522816.tif 000024
連結された第１ストランド合成のＰＣＲ増幅を、ＮＧＳ＿ＰＣＲ＿プライマー１及び２を用いてＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼで行った。これらのプライマーは、イルミナＴｒｕＳｅｑ  ＮＧＳプロトコルと互換性のある５’オーバーハングを含む。
2021522816.tif 000025
ＰＣＲサイクル：９８℃；３０秒、１５回（９８℃；１５秒、６０℃；２０秒、７２℃；２０秒）、７２  ５分、その後４℃で保持。
【０５９５】
ＰＣＲ生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）上で、製造説明書に従って精製し、３０ｕＬのＨ２Ｏに溶出した。
【０５９６】
ＮＧＳセットアップ：
４つの反応を同じ濃度に標準化し、一緒にプールして、１０ｎＭのＮＧＳライブラリを作製した。ｐｈｉＸ対照混合物をこの試料にスパイクし、全分子の２０％の最終濃度にして、続くイルミン（ｉｌｌｕｍｉｎｅ）シーケンシングのための配列変動を得た。ＮＧＳライブラリは、イルミナのＭｉｎｉＳｅｑ  Ｓｙｓｔｅｍ用のＤｅｎａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｄｉｌｕｔｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｇｕｉｄｅに従って調製した。ライブラリを、ＭＩＤ出力カセットを用いてＩｌｌｕｍｉｎａ  ｍｉｎｉＳｅｑシステム上で配列決定した。シーケンシングは、１５１サイクルを実行するインデックスなしで、読取１のみを使用するｆａｓｔｑファイルを生成するように設定した。
【０５９７】
ＮＧＳデータ分析：
生成されたｆａｓｔｑファイルは、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  １０  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｑｉａｇｅｎ）にインポートした。読取りは、４つの捕捉プローブ１などに組み込まれたバーコードに従って分離され、捕捉プローブ１からの残りの読取りは、読取りの５’末端からトリミングされた。その後、捕捉プローブ２に由来する配列は、捕捉プローブ１と２との間に挿入された配列のみを残して、３’末端からトリミングされた。次に、ａｗｋコマンドラインを使用して、１８未満の全読取りをトリミングし、最後に、１８ｂｐより長いａｌ読取りを、シーケンシング読取りの３末端から塩基を除去することによって、１８ｂｐにトリミングした。特有の読取りの数を定量化した。最多読取りの上位１０を図８のパネルＢ〜パネルＥに示す。図８において、読取りは、元のＬＮＡオリゴを５’−＞３’の様式で読み取るために、逆相補されている。
【０５９８】
実施例８：ＱＣのためのＧａｌＮＡｃ−ＬＮＡのＮＧＳシーケンシング
ここでは、ＱＣのため５’末端でＧａｌＮＡｃと複合した完全ホスホロチオエート化ＬＮＡオリゴのシーケンシングが可能であることが示される。
【０５９９】
以下のＬＮＡオリゴをシーケンシングに使用した。
ＬＮＡ混合物：
2021522816.tif 000026
捕捉プローブ：
2021522816.tif 000027
捕捉プローブ１逆転写プライマー：
2021522816.tif 000028
【０６００】
第１の連結反応：
２ｕＬオリゴ１を、２ｕＬ捕捉プローブ１インデックス３（１０ｕＭ）と混合した。
【０６０１】
次いで、混合物を５５℃まで加熱し、その後４℃まで冷却した。
１６ｕＬの連結混合物をチューブに添加した：
２０ｕＬ毎の反応：（２ｕＬ  Ｔ４連結緩衝液、６ｕＬ  ＰＥＧ、６ｕＬ  Ｈ２Ｏ、２ｕＬ  Ｔ４リガーゼ）。連結：２回（４℃；２分、１６℃；２０分、２２℃５分、３０℃１分）、７５℃；１０分、その後４℃で保持。
【０６０２】
ゲル電気泳動：
上記の反応に、等量の２倍Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、試料を９５℃で２分間熱変性させ、氷上に置いた。調製した１５μｌの試料を、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  Ｇｅｌｓ、１５％、１５ウェル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードし、電気泳動を１８０Ｖの一定電圧で７５分間行った。ＤＮＡを、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて１０分間染色した。ゲルを、青色トレイ上のＣｈｅｍｉＤｏｃ  Ｔｏｕｃｈ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で可視化した。
【０６０３】
捕捉プローブとオリゴの間のライゲーション産物を含むバンドをゲルから切断した。ゲル片を粉砕し、連結したオリゴを抽出するため５００μＬのＴＥ緩衝液に一晩浸漬した。浸漬後、連結したオリゴを、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ０．５ｍＬ遠心式ＭＷＣＯ  ３ｋＤａフィルタを用いて洗浄し、濃縮した。最後に、試料を、スピードバックを用いておよそ１０μＬまで濃縮した。
【０６０４】
第１ストランド合成及び精製：
第１ストランド合成は、Ｖｕｌｃａｎｏ２Ｇ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて２０ｕＬ反応で行った：
４ｕＬ：５倍Ｖｕｌｃａｎｏ２Ｇ緩衝液
０．４ｕＬ：Ｖｕｌｃａｎｏ２Ｇポリメラーゼ
０．５ｕＬ：ｄＮＴＰ（１０ｕＭ）
０．４ｕＬ：捕捉ＲＴプライマー（１０ｕＭ）
４ｕＬ：連結鋳型
Ｈ２０添加２０ｕＬ
サーモサイクラで以下のプログラムを用いる：
９５℃；３分、１０回（５５℃；５分、７２℃；１分）、その後４℃で保持。
【０６０５】
第１ストランド合成反応を、Ｍｏｎａｒｃｈ（登録商標）ＰＣＲ＆ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用い、製造者のオリゴヌクレオチド・クリーンアップ・プロトコルを用いて精製した。試料を１０ｕＬの溶出緩衝液で溶出した。
【０６０６】
２．連結反応：
2021522816.tif 000029
８ｕＬの第１ストランド合成反応を、２ｕＬの捕捉プローブ２（１ｕＭ）と混合した。
【０６０７】
次いで、混合物を５５℃まで加熱し、その後４℃まで冷却した。
１６ｕＬの連結混合物を各チューブに添加した：
２０ｕＬ毎の反応：（２ｕＬ  Ｔ４連結緩衝液、６ｕＬ  ＰＥＧ、６ｕＬ  Ｈ２Ｏ、２ｕＬ  Ｔ４リガーゼ）。連結：２回（４℃；２分、１６℃；２時間、２２℃５分）、７５℃；１０分、その後４℃で保持。
【０６０８】
ＮＧＳライブラリのＰＣＲ増幅：
2021522816.tif 000030
連結された第１ストランド合成のＰＣＲ増幅を、ＮＧＳ＿ＰＣＲ＿プライマー１及び２を用いてＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼで行った。これらのプライマーは、イルミナＴｒｕＳｅｑ  ＮＧＳプロトコルと互換性のある５’オーバーハングを含む。
2021522816.tif 000031
ＰＣＲサイクル：９８℃；３０秒、１５回（９８℃；１５秒、６０℃；２０秒、７２℃；２０秒）、７２  ５分、その後４℃で保持。
【０６０９】
ＰＣＲ生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）上で、製造説明書に従って精製し、３０ｕＬのＨ２Ｏに溶出した。
【０６１０】
ＮＧＳセットアップ：
反応を１０ｎＭに標準化し、異なるバーコード化システムを含む別のＮＧＳライブラリでプールして、１０ｎＭ  ＮＧＳライブラリを作成した。この単一反応は、全ＮＧＳライブラリのおよそ１０％を構成した。ＮＧＳライブラリは、イルミナのＭｉｎｉＳｅｑ  Ｓｙｓｔｅｍ用のＤｅｎａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｄｉｌｕｔｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｇｕｉｄｅに従って調製した。ライブラリを、ＭＩＤ出力カセットを用いてＩｌｌｕｍｉｎａ  ｍｉｎｉＳｅｑシステム上で配列決定した。シーケンシングは、１５１サイクルを実行するインデックスなしで、読取１のみを使用するｆａｓｔｑファイルを生成するように設定した。
【０６１１】
ＮＧＳデータ分析：
生成されたｆａｓｔｑファイルは、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  １０  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｑｉａｇｅｎ）にインポートした。捕捉プローブ１インデックス１に由来する読取りを単離して、捕捉プローブ１由来の残りの読取りは、読取りの５’末端からトリミングした。その後、捕捉プローブ２に由来する配列は、捕捉プローブ１と２との間に挿入された配列のみを残して、３’末端からトリミングされた。次に、ａｗｋコマンドラインを使用して、１５未満の全読取りをトリミングし、最後に、１５ｂｐより長いａｌ読取りを、シーケンシング読取りの３末端から塩基を除去することによって、１５ｂｐにトリミングした。特有の読取りの数を定量化した。最多読取りの上位５を図９に示す。図９において、読取りは、元のＬＮＡオリゴを５’−＞３’の様式で読み取るために、逆相補されている。
【０６１２】
実施例９：ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素とＬＴＴ１のＶｕｌｃａｎｏ２Ｇ第１ストランド合成アッセイとの比較。ＬＴＴ１のストランド合成アッセイ
Ｃｒｏｕｚｉｅｒらは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（ＲＴ）（Ｔｈｅｒｍｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、ＲＮＡストランドを逆転写する際に、ＬＮＡヌクレオチド（ＬＮＡ−Ｔ及びＬＮＡ−Ａ）を読み取る能力を有することを記載している。著者らは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴが、ＲＮＡ鋳型を読み取る際、非連続的なＬＮＡ−Ｔ及びＬＮＡ−Ａを組み込むことができることを示している。著者らはまた、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴが、２つのＬＮＡ  Ａ及び２つのＬＮＡ  Ｔ（非連続）を含むＲＮＡ鋳型を、正常なｄＮＴＰのみを用いて逆転写できることも示している（Ｃｒｏｕｚｉｅｒら（２０１２年）、図３パネルＣレーン２）。
【０６１３】
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴはＲＮＡホスホジエステル結合ストランド中の非連続ＬＮＡを含むストランドを逆転写することができると示されているので（Ｃｒｏｕｚｉｅｒら、２０１２年）、また、ホスホロチオエート骨格を含むＤＮＡストランド中の連続ＬＮＡを横断して読むことができるかどうかを調べたい。そこで、実施例２に記載したように、ＥｖａＧｒｅｅｎ  ｄｄＰＣＲを用いて、ＬＴＴ１鋳型の第１ストランド合成、続いて第１ストランド検出を行う。ＬＴＴ１のコピーを作成するＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ能力と、Ｖｕｌｃａｎｏ２Ｇポリメラーゼ能力とを比較した。第１ストランドＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ反応の反応条件は、Ｃｒｏｕｚｉｅｒら（２０１２年）に記載されているものと同じであった。
【０６１４】
１０ｕＬ第１ストランド合成反応：
全ての反応が含まれ（１ｕＬ  ＬＴＴ１（３１ｐＭ）、０．５ｕＬ  ＤＣＰ１＿プライマー１（１ｕＭ）、水１０ｕＬを加えた。酵素は、販売業者から提供された緩衝液を用いて実行した。
【０６１５】
ａ）２ｕＬ  ５倍第１ストランド緩衝液、１ｕＬ  ＭｇＣＬ２（５０ｍＭ）、０．７５ｕＬ  ＤＴＴ（１００ｍＭ）、０．７５ｕＬ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
ｂ）２ｕＬ  ５倍第１ストランド緩衝液、１ｕＬ  ＭｇＣＬ２（５０ｍＭ）、０．７５ｕＬ  ＤＴＴ（１００ｍＭ）、０．７５ｕＬ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、０．５  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素
ｃ）２ｕＬ  ５倍Ｖｕｌｃａｎｏ２Ｇ緩衝液、１ｕＬ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
ｄ）２ｕＬ  ５倍Ｖｕｌｃａｎｏ２Ｇ緩衝液、１ｕＬ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、０．２ｕＬ  Ｖｕｌｃａｎｏ２Ｇ
【０６１６】
混合物中の酵素を除く全ての成分を添加し、６５℃まで５分間加熱し、次いで氷の上で１分、その後逆転写酵素を最終的に添加した。第１ストランド合成は４つの条件下で行った。
【０６１７】
ａ）４５分５０℃、５分８０℃、４℃で保持。
ｂ）５分５０℃、４℃で保持。
ｃ）サイクル（５分５０℃、３０秒９８℃）を３回、その後４℃で保持。
ｄ）サイクル（５分５０℃、３０秒９８℃）を５回、その後４℃で保持。
【０６１８】
Ｖｕｌｃａｎｏ２Ｇ酵素は耐熱性であり、したがって、２本鎖を変性させるのに必要なより高い温度によって不活性化されるＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴとは異なり、この酵素の感度を高めるために、複数回の第１ストランド合成を行うことができるので、条件ｃ及びｄにおけるサイクル条件を加えた。
【０６１９】
全ての第１ストランド反応を水で１００倍に希釈し、２ｕＬ試料を、実施例２に記載したように、通常のＱＸ２００（商標）ｄｄＰＣＲ（商標）ＥｖａＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ＰＣＲ反応のためのインプットとして使用した。
【０６２０】
結果：
図１０のパネルＡは、１回４５分の第１ストランド合成反応で実施される、ＥｖａＧｒｅｅｎ  ｄｄＰＣＲ反応における液滴の蛍光強度を示す。ＬＴＴ１の第１ストランドのコピーを作成するＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ能力の徴候は見られず、酵素を用いない反応でも同じ数の陽性液滴が見られた。検出されたコピーの定量化は図１０パネルＢに示されており、これは、ＬＴＴ１鋳型の第１ストランドのコピーを作製するＶｕｌｃａｎｏ２Ｇのはるかに優れた能力を示している。図１０パネルＣは、第１ストランド合成の１、３、又は５回で行われた反応で実施されたＥｖａＧｒｅｅｎ  ｄｄＰＣＲ反応における、液滴の蛍光強度を示す。ストランド合成反応．検出されたコピーの定量化は図１０パネルＤに示されており、これは、Ｖｕｌｃａｎｏ２Ｇが、その熱安定性のために数回の第１ストランド合成反応を実施することができ、ＬＮＡ含有分子の検出を増加させるために使用することができることを示す。ここでもまた、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴがＬＴＴ１鋳型を逆転写できるという兆候は見られなかった。
【０６２１】
参照：
Ｃｒｏｕｚｉｅｒら（２０１２年）、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｔｈｅ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ＲＮＡ  Ａｐｔａｍｅｒｓ．」  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（２０１２年４月）、第７巻、第４号、第ｅ３５９９０頁
【０６２２】
実施例１０：ＬＮＡオリゴヌクレオチドの５’末端への捕捉プローブの連結を可能にする。
この実施例の目的は、ＬＮＡ含有ホスホロチオートオリゴヌクレオチド（ＬＮＡオリゴヌクレオチド）の５’末端に捕捉プローブを共有結合させることができる条件を見出すことである。
【０６２３】
アダプターオリゴヌクレオチド混合物を調製するために、５．５μＬの１０μＭオリゴヌクレオチドＬ１（表Ｂ）を、５．５μＬの１００μＭ捕捉プローブＣ１又はＣ２又はＣ３又はＣ４又はＣ５（表ａ）と混合した。
【０６２４】
（表ａ）オリゴヌクレオチド．全ての結合はホスホジエステルであり、全てのヌクレオチドは「ｒ」が先行しない限りＤＮＡヌクレオチドであり、その場合、これらはリボヌクレオチドである。「／３６−ＦＡＭ／」は３’ＦＡＭ基を示し、／ｉＳｐ１８／は１８原子のヘキサエチレングリコールのスペーサを示し、／３ＡｍＭＯ／は３’アミノ修飾剤を示し、「／５Ｃｙ５／」は５’Ｃｙ５基を示す。ヌクレオチドコードは、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードによる。
2021522816.tif 000032
【０６２５】
（表Ｂ）修飾オリゴヌクレオチド−全ての結合はホスホチオエートである。大文字のヌクレオチドはＬＮＡヌクレオチドである。小文字のヌクレオチドはＤＮＡヌクレオチドである。大文字の「Ｃ」ヌクレオチドは、５−メチル−シチジンである。「５’ｐ」は、５’リン酸化を指す。
2021522816.tif 000033
【０６２６】
これらの捕捉プローブ−ＬＮＡ−オリゴヌクレオチド混合物を、５０℃で５分間インキュベートし、氷上に置いた。Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、及びＭ５と命名した５つのマスタミックスを調製した。マスタミックスＭ１について、４容量の５０％ＰＥＧ  ４０００を、３容量のＨ２Ｏ及び１容量の１０倍Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と合わせた。マスタミックスＭ２について、４容量の５０％ＰＥＧ  ４０００を、１容量の１０倍Ｔ４−ＲＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、１容量の１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１容量の１０ｍＭ  ＡＴＰ、及び１容量のＴ４−ＲＮＡリガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＥＬ００２１）と合わせた。マスタミックスＭ３について、４容量の５０％ＰＥＧ  ４０００を、２容量のＨ２Ｏ、１容量の１０倍Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び１容量のＴ４−ＤＮＡリガーゼＨＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＥＬ００１３）と合わせた。マスタミックスＭ４について、４容量の５０％ＰＥＧ  ４０００を、２容量のＨ２Ｏ、１容量の１０倍Ｔ４−ＲＮＡリガーゼ２緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、及び１容量のＴ４−ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２３９Ｓ）と合わせた。マスタミックスＭ５について、２容量の５０％ＰＥＧ  ４０００を、５容量の２倍Ｔ７−ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、及び１容量のＴ７−ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０３１８）と合わせた。マスタミックスＭ１〜Ｍ５の各々を、５つの８μＬアリコートに分割した。２μＬの捕捉プローブ−ＬＮＡ−オリゴヌクレオチド混合物を、マスタミックスのアリコートに添加し、その後２５の異なる組み合わせを作製した。反応物をサーモサイクラ中で２サイクル（３７℃で２分、３０℃で３分、２２℃で５分、１６℃で８０分）インキュベートし、続いて２μＬの２倍Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、９５℃で２分間インキュベートし、氷上に置いた。
【０６２７】
反応を分析するために、このようにして調製した７．５μＬの試料を、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  Ｇｅｌｓ、１５％、１５ウェル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードし、電気泳動を１８０Ｖの一定電圧で７５分間行った。ゲルを、青色トレイ上のＣｈｅｍｉＤｏｃ  Ｔｏｕｃｈ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で可視化した（図１１）。第１の可視化に続いて、ゲルを、１倍Ｎｏｖｅｘ  ＴＢＥ  ＲｕｎｎｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の１倍ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３０分間染色し、再び同じ装置で可視化した（図１２）。
【０６２８】
実験は、５’リン酸化され、ホスホロチオ化されたＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドの５’末端への最も効率的な連結が、Ｃ３又はＣ５捕捉プローブ、及びＴ４−ＲＮＡリガーゼ又はＴ４−ＲＮＡリガーゼ２酵素（いかなる組合せでもよい）を用いて達成されたことを示す。
【０６２９】
実施例１１：ＬＮＡオリゴヌクレオチドへの、３’及び５’捕捉プローブの両方の連結
捕捉プローブ及びＬＮＡ−オリゴヌクレオチドを、表Ｃに従って混合した。
【０６３０】
（表Ｃ）
2021522816.tif 000034
【０６３１】
各示された捕捉プローブを、２μＬの２０μＭとして添加した。各示されたＬＮＡ−オリゴヌクレオチドを、２μＬの１０μＭとして添加した。「Ｈ２Ｏ」を有する試料については、表中の「Ｈ２Ｏ」の各出現に対して、ＢμＬのＨ２Ｏを添加した。試料の各々を５０℃で５分間インキュベートし、氷上に置いた。
【０６３２】
マスタミックスＭ６について、３容量の５０％ＰＥＧ  ４０００を、１容量のＨ２Ｏ、１容量の１０倍Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１容量のＴ４−ＤＮＡリガーゼＨＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＥＬ００１３）、及び１容量のＴ４−ＲＮＡリガーゼ２（ＭＣＬＡＢ、カタログ番号Ｔ４ＲＬ２−２００）と合わせた。マスタミックスＭ７について、３容量の５０％ＰＥＧ  ４０００を、１容量のＨ２Ｏ、１容量の１０倍Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び１容量のＴ４−ＲＮＡリガーゼ２（ＭＣＬＡＢ、カタログ番号Ｔ４ＲＬ２−２００）と合わせた。マスタミックスＭ８について、３容量の５０％ＰＥＧ  ４０００を、１容量のＨ２Ｏ、１容量の１０倍Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び１容量のＴ４−ＤＮＡリガーゼＨＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＥＬ００１３）と合わせた。マスタミックスＭ９を、３容量の５０％ＰＥＧ  ４０００、３容量のＨ２Ｏ、及び１容量の１０倍Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と合わせて調製した。マスタミックスＭ１０は、マスタミックスＭ６を７０℃で１０分間インキュベートすることによって調製した。マスタミックスＭ１１は、２μＬのＨ２Ｏを１２μＬのマスタミックスＭ７に添加することで調製した。マスタミックスＭ１２は、２μＬのＨ２Ｏを１２μＬのマスタミックスＭ８に添加することで調製した。１２μＬ又は１４μＬのマスタミックスを、表Ｃの「マスタミックス容量」カラムに従って、調製された捕捉プローブ−ＬＮＡ−オリゴヌクレオチド混合物に添加した。
【０６３３】
試料（ＬＮＡ−オリゴヌクレオチド及び適切なマスタミックスによる捕捉プローブ）を、サーモサイクラ中で４サイクル（３７℃で２分、３０℃で３分、２２℃で５分、１６℃で１０分）インキュベートし、続いて７０℃で１０分間インキュベートした。熱サイクルの後、試料１０及び１２に、２μＬの２０μＭ捕捉プローブａ４と、２μＬのＴ４−ＤＮＡリガーゼＨＣとを添加した。試料１１及び１３に、２μＬの２０μＭ捕捉プローブＣ５と、２μＬのＴ４−ＲＮＡリガーゼ２とを添加した。試料１０、１１、１２、及び１３を、サーモサイクラ中で４サイクル（３７℃で２分、３０℃で３分、２２℃で５分、１６℃で１０分）インキュベートし、続いて７０℃で１０分間インキュベートした。
【０６３４】
反応を分析するために、５μＬの各反応を、５μＬの２倍Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合し、９５℃で２分間インキュベートし、氷上に置いた。このようにして調製した試料を、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  Ｇｅｌｓ、１５％、１５ウェル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードし、電気泳動を１８０Ｖの一定電圧で７５分間行った。ゲルを、青色トレイ上のＣｈｅｍｉＤｏｃ  Ｔｏｕｃｈ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で可視化した（図１３）。
【０６３５】
実験は、３’捕捉プローブと５’捕捉プローブとの間の望ましくない直接連結の程度を最小化するために、好ましい反応セットアップは、最初に５’捕捉プローブ（Ｃ５）をＬＮＡオリゴヌクレオチドに連結し、続いて３’捕捉プローブ（ａ４）を連結することを示す（試料１２と同じく）。
【０６３６】
実施例１２  シーケンシングライブラリの調製
ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドへの捕捉プローブの連結
試料ｎ１は、最初に５μＬの２０μＭ捕捉プローブＣ５と５μＬの１０μＭ  ＬＮＡ−オリゴヌクレオチドＬ１とを混合し、５０℃で５分間インキュベートし、氷上に置き、その後３０μＬのマスタミックスＭ７を加えることで調製した（実施例１０で説明した通り）。試料を、サーモサイクラ中で４サイクル（３７℃で２分、３０℃で３分、２２℃で５分、１６℃で１０分）インキュベートし、続いて７０℃で１０分間インキュベートした。５μＬの２０μＭ捕捉プローブａ４及び５μＬのＴ４−ＤＮＡリガーゼＨＣを添加し、次いでサーマルサイクラ中で２５サイクル（３７℃で２分、３０℃で３分、２２℃で５分、１６℃で１０分、８℃で１０分）インキュベートし、続いて７０℃で１０分間インキュベートした。試料ｎ２は、ＬＮＡオリゴヌクレオチドＬ１の代わりにＬＮＡオリゴヌクレオチドＬ２を使用するように変更して、試料ｎ１と同様の方法で調製した。反応性能をチェックするために、５μＬの試料ｎ１及びｎ２を、５μＬの２倍Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合し、９５℃で２分間インキュベートし、氷上に置き、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  Ｇｅｌｓ、１５％、１５ウェル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にロードし、１８０Ｖの一定電圧で電気泳動を行った。ゲルを、青色トレイ上のＣｈｅｍｉＤｏｃ  Ｔｏｕｃｈ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で可視化した（図１４）。図１４において矢印で示される生成物は、ａ４及びＣ５捕捉プローブの両方と共有結合したＬＮＡ−オリゴヌクレオチドである。
【０６３７】
第１ストランド合成
シーケンシングライブラリを、試料ｎ１、ｎ２（上述の通り、連結反応物は精製しなかった）、並びに試料２、１０、及び１２（実施例１０に記載の通り、連結反応物は精製しなかった）で調製した。各試料５μＬに、２μＬの１０μＭ  ＲＴＰプライマー及び３μＬのＨ２Ｏを加え、続いて６５℃で５分間インキュベートし、氷上に置いた。第１ストランド合成のためのマスタミックスを、４容量の５倍ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ緩衝液（タカラバイオ）、４容量のＨ２Ｏ、１容量の１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、及び１容量のＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ酵素（タカラバイオ、コード番号２６８０Ａ）を混合することによって調製した。このマスタミックス１０μＬを各試料に添加し、４２℃で３０分、続いて５０℃で１５分、そして７０℃で１５分インキュベートした。
【０６３８】
ＰＣＲ
ＰＣＲ反応のためのＰＣＲマスタミックスを、６２容量のＨ２Ｏ、１０容量の１０倍Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ緩衝液、１０容量の１０μＭ  ＲＰ１プライマー、２容量及び１容量のＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０５３０）を混合することで調製した。１μＬの第１ストランド合成反応物に、２μＬのＲＰＩ１２、ＲＰＩ２７、ＲＰＩ２８、ＲＰＩ２９、又はＲＰＩ３０プライマーを、それぞれ、試料２、１０、１２、ｎ１、又はｎ２に加えた。１７μＬのＰＣＲマスタミックスを、第１ストランド合成反応物−プライマー混合物へ加えた。試料を、以下のプログラムによるサーモサイクラでサイクルした：９８℃で３分間、８サイクル（９８℃で８０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１５秒）、７２℃で１０分間、その後４℃で保持。ＰＣＲ増幅試料をＨ２Ｏで６倍希釈し、バイオアナライザＤＮＡ高感度キットでアッセイした（図１５）。バイオアナライザのトレースは、２つの主要なピークを示し、一方は捕捉プローブＣ５及びａ４の直接連結に由来する空のシーケンシングライブラリ（プロット上でＥとマークされる）に対するものであり、もう一方はアッセイしたＬＮＡ−オリゴヌクレオチドの配列を含む充填シーケンシングライブラリ（プロット上でＦとしてマークされる）に対するものである。陰性対照試料は、第１ストランド合成のためのインプットとしてＨ２Ｏ（連結反応の代わり）を使用することで得られ、ＲＰＩ１１プライマー（ＲＰＩｘｘプライマーの代わり）を使用する以外は、他の試料と同じプロトコルを用いてＰＣＲで増幅された。
【０６３９】
シーケンシング
３．８μＬの５０ｍＭ  ＥＤＴＡに、プライマーＲＰＩ１２、ＲＰＩ２７、ＲＰＩ２８、ＲＰＩ２９、ＲＰＩ３０で得られた、１０μＬ、０．４８μＬ、４．５２μＬ、６．５４μＬ、１．２６μＬのＰＣＲ生成物を、それぞれ加えた。このようにして得られた混合物は、製造者の指示に従って精製されたＡｍｐｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、商品番号Ａ６３８８１）であった。試料を、別のイルミナ互換シーケンシングライブラリと混合し、インデックス読取りを含む５０ｂｐの単一末端読み取りによって、ＨｉＳｅｑ  Ｒａｐｉｄ  Ｖ２  プロトコル（イルミナ）で配列決定した。
【０６４０】
実施例１３  シーケンシングデータ分析
デマルチプレクスした読み取りは、以下のコマンド：
2021522816.tif 000035
を使用して、ｃｕｔａｄａｐｔユーティリティのバージョン１．１２（ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１４８０６／ｅｊ．１７．１．２００に記載）により最初にアダプタートリミングした。ここで、ｉｎｐｕｔ．ｆａｓｔｑ．ｇｚは適切なｆａｓｔｑファイルで置き換えた。使用されるｃｕｔａｄａｐｔオプションは、アダプターをトリミングした後、１０〜２０ヌクレオチドの間の長さの読み取りのみを確かに保持する。アダプタートリミングの統計を表Ｄに示す。
【０６４１】
（表Ｄ）
2021522816.tif 000036
【０６４２】
最後に、シーケンシングの質を評価するため、得られた配列とインプットＬＮＡ‐オリゴヌクレオチドの特性との整合性を分析した。試料２、１２、及びｎ１に対するインプットは、ランダム化された配列（Ｌ１）を有する１６−ｍｅｒのＬＮＡ−オリゴヌクレオチドであり、試料ｎ２に対するインプットは、固定された配列（Ｌ２）を有する１４−ｍｅｒのＬＮＡ−オリゴヌクレオチドであり、試料１０に対するインプットは、Ｈ２Ｏのみであり、オリゴヌクレオチドではなかった。アダプタートリミングしたデータセットにおける１４−ｍｅｒ及び１６−ｍｅｒの発生を数えると、試料ｎ２では１４−ｍｅｒ、試料２、１０、及びｎ１では１６−ｍｅｒの富化が明らかである（表Ｅ）。
【０６４３】
（表Ｅ）
2021522816.tif 000037
【０６４４】
驚くべきことに、試料ｎ２の１４−ｍｅｒのおよそ９７％が、オリゴヌクレオチドＬ２の配列と完全に一致する。その上、インプットがランダム化されたＬ１オリゴヌクレオチドであった試料については、１６−ｍｅｒの９８％以上が特有に表される。
【０６４５】
実施例１４：インビボ複合体探索
バーコードを含むＤＮＡ／ＰＳオリゴヌクレオチドに複合された種々の化学的部分のライブラリが、シーケンシングを用いて単一動物でのそれらの肝濃縮について調べることができるという原理の証明を示すデータ。データは、ＧａｌＮＡｃ複合オリゴヌクレオチド（配列番号２２）が裸のオリゴ（配列番号３５）と比較して、皮下注射から４時間後に肝臓で濃縮されることを、原理の証明として示している。データはまた、配列番号２６が、裸のオリゴである配列番号３７と比較して、皮下注射から４時間後に肝臓で濃縮されることも同定する。各オリゴ（下の表）の５μＭ溶液を、０．２５ｍＬ／マウスの用量でＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝３）に皮下注射し、注射の４時間後に肝臓を採取した。
【０６４６】
表．複合体を有するバーコード化オリゴのライブラリ。識別用のバーコードは太字で表示する。
【０６４７】
複合体は、化学構造又は単語のいずれかで示す。化学構造において、波線は、任意にＣ６アルキルリンカー基などのリンカーを介する５’末端に好適な、オリゴヌクレオチドへの共有結合を表す。
【０６４８】
（表１３）
2021522816.tif 000038
2021522816.tif 000039
2021522816.tif 000040
【０６４９】
インビボ注射の４時間後、肝臓組織試料（１００ｍｇ）を、０．１Ｍ  ＣａＣｌ２、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、及び１％ＮＰ−４０を含有する４００μＬ緩衝液中で、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｌｙｚｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて均質化した。並行して、５μＭの各オリゴを含有する溶液１０μＬを、上記のように均質化したエクスビボ肝臓試料（１００ｍｇ、ｎ＝３）中にスパイクした。２５μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（Ｓｉｇｍａ）を添加した後、試料を５０℃で一晩インキュベートした。次いで、１μＬ  ＲＮＡｓｅｉｆ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）及び１μＬ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｑｉａｇｅｎ）を添加し、試料を３７℃で１時間インキュベートし、ヌクレアーゼの不活性化を９９℃で１５分間行った。試料を１００００ｇで１０分間遠心し、上清をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ０．５ｍＬ遠心式ＭＷＣＯ  ３ｋＤａフィルタを用いて３回洗浄した。洗浄は、各洗浄工程でおよそ４００μＬの蒸留水を加えることによって行った。２μＬの残りの上清（およそ５０μＬ）を、１μＬの捕捉プローブ１（１０μＭ）、２μＬのＴ４リガーゼ緩衝液、６μＬのＰＥＧ、１μＬのＴ４リガーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び８μＬの蒸留水を含有する、第１の連結反応で使用した。各試料を、後で各個々の試料からの配列を同定するために、特定のインデックス配列を有する特異的な捕捉プローブに連結した（下記の表を参照）。
【０６５０】
（表１４）捕捉プローブ１のライブラリ。識別用のインデックスは太字で表示する。
2021522816.tif 000041
【０６５１】
１６℃で１時間インキュベートし、７５℃で１５分間不活化した後、等量の２倍Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をこの第１のライゲーション産物反応に加え、試料を９５℃で２分間熱変性させ、氷上に置いた。調製した１５μｌの試料を、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  Ｇｅｌｓ、１５％、１５ウェル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードし、電気泳動を１８０Ｖの一定電圧で７５分間行った。ＤＮＡを、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて１０分間染色した。ゲルを、青色トレイ上のＣｈｅｍｉＤｏｃ  Ｔｏｕｃｈ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で可視化した。オリゴヌクレオチドに連結された捕捉プローブのライゲーション産物を含むバンドを、ゲルから切り出した。次いで、ゲル片を粉砕し、５００μＬの蒸留水に浸漬し、４℃で一晩放置して、連結オリゴヌクレオチドを抽出した。続いて、抽出された連結オリゴヌクレオチドを、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ０．５ｍＬ遠心式ＭＷＣＯ  ３ｋＤａフィルタを用いて、各洗浄工程でおよそ４００μＬの蒸留水を加えることによって、３回洗浄した。最終洗浄の後、濃縮オリゴヌクレオチドを第１ストランド合成反応に使用した。均質化した連結ゲルインプット４μＬ、５倍Ｖｏｌｃａｎｏ２Ｇ緩衝液（ＭｙＰｏｌｓ）４μＬ、１μＭ第１ストランドプライマー０．４μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．５μＬ、Ｖｏｌｃａｎｏ２Ｇポリメラーゼ（ＭｙＰｏｌｓ）０．４μＬ、及び蒸留水１０．７μＬを用いて、第１ストランド合成を行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で３分、続いて９５℃で３０秒、５５℃で５分、及び７２℃で１分のサイクルを１５回であった。
2021522816.tif 000042
【０６５２】
第１ストランドＰＣＲ生成物を、製造業者の指示に従って、モナークＰＣＲ＆ＤＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて精製し、１０μＬの溶出緩衝液中で溶出した。次いで、溶出された８μＬの第１ストランド生成物を２μＬの捕捉プローブ２（１００ｎＭ）に連結し、６０℃まで５分間加熱し、続いて４℃までゆっくり（０．１℃／秒）温度を低下させた。次いで、２μＬのＴ４リガーゼ緩衝液、６μＬのＰＥＧ、１μＬのＴ４リガーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び１μＬの蒸留水からなる１０μＬを添加した。
2021522816.tif 000043
【０６５３】
１６℃で１時間のインキュベーション及び７５℃で１５分間の不活性化後、２μＬの連結反応物を、４μＬの５倍ＨＦ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、０．４μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μＬの１０μＭ順方向配列プライマー（ＰＥ１）及び１μＬの１０μＭ逆方向配列プライマー（ＰＥ２Ｖ２）、０．２μＬのＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、並びに１１，４μＬの蒸留水を含有する、ＰＣＲ反応物に適用した。ＰＣＲ条件は、９８℃で３０秒間、次いで９８℃で１５秒間、６０℃で２０秒間、及び７２℃で２０秒間の２０サイクル、最後に７２℃で５分間であった。ＰＣＲ生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造説明書に従って精製し、３０μＬの蒸留水に溶出した。
2021522816.tif 000044
【０６５４】
ＰＣＲ生成物は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉｎｉＳｅｑ  Ｓｙｓｔｅｍ（イルミナ）からのプロトコルに従って配列決定した。ＣＬＣ  ＧｅｎｏｍｉｃｓＷｏｒｋｂｅｎｃｈ、１１．０．１（Ｑｉａｇｅｎ）のソフトウェアを用いて、異なるバーコードに対する読取り数を同定し、バーコードの相対存在量を計算した。最後に、インビボ肝臓相対存在量と、肝臓試料相対存在量のエクスビボスパイクとの比率を計算した。
【０６５５】
（表１５）４時間の肝臓試料読取り数及び各試料の相対存在量（ｎ＝３）
2021522816.tif 000045
2021522816.tif 000046
【０６５６】
図１６は、皮下注射の４時間後の非複合オリゴヌクレオチド（配列番号３５）に対する、肝濃縮倍数を示す。ＧａｌＮＡｃ複合オリゴヌクレオチド（配列番号２２）及び配列番号２６は、非複合オリゴヌクレオチド（配列番号３５）と比較して、３．５倍の肝濃縮を示す。
【０６５７】
実施例１５
バーコードを含むＤＮＡ／ＰＳオリゴヌクレオチドに複合された種々の化学的部分のライブラリが、シーケンシングを用いて単一動物でのそれらの血漿保持について調べることができるという原理の証明を示すデータ。オリゴヌクレオチドに複合されたパルミチン酸アルブミン結合Ｃ１６が皮下注射の４時間後に血漿中に濃縮されることを原理の証明として示す、データ。データはまた、ＧａｌＮＡｃ複合オリゴヌクレオチドが、裸のオリゴヌクレオチドと比較して循環から除去されることを同定する。
【０６５８】
ＰＢＳ中の各オリゴヌクレオチド（下の表を参照）５μＭ溶液を、０．２５ｍＬ／マウスの用量でＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス８（ｎ＝３）に皮下注射し、注射の４時間後に血漿試料を採取した。
【０６５９】
表．複合体を有するバーコード化オリゴヌクレオチドのライブラリ。識別用のバーコードは太字で表示する。
【０６６０】
使用される化合物は、上記の表１３に複合体として示され、更に化合物配列番号４６を含む：
2021522816.tif 000047
【０６６１】
注射の４時間後、１０μＬの血漿試料を、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｌｙｚｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて２４０μＬのＲＩＰＡ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）中で均質化した。並行して、５μＭの各オリゴを含有する溶液１０μＬを、１０μＬのエクスビボ血漿試料中にスパイクし、試料を上述のように２４０μＬのＲＩＰＡ緩衝液中で均質化した。２μＬの均質化血漿ＲＩＰＡ溶液を、その後、１μＬの捕捉プローブ１（１ｎＭ）、２μＬのＴ４リガーゼ緩衝液、６μＬのＰＥＧ、１μＬのＴ４リガーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び８μＬの蒸留水を含有する、第１の連結反応で使用した。各試料を、後で各個々の試料を同定するために、特定のインデックス配列を有する特異的な捕捉プローブ１に連結した。
【０６６２】
（表１６）捕捉プローブ１のライブラリ．識別用のインデックスは太字で表示する
2021522816.tif 000048
【０６６３】
１６℃で１時間インキュベートし、７５℃で１５分間不活化した後、２μＬの連結反応物を、２μＬの連結反応物、４μＬの５倍Ｖｏｌｃａｎｏ緩衝液（ＭｙＰｏｌｓ）、０．４μＬの第１ストランドプライマー１μＭ、０．５μＬのｄＮＴＰ  １０ｍＭ、０．４μＬのＶｏｌｃａｎｏ  ＰＧ（ＭｙＰｏｌｓ）、及び１２．７μＬの蒸留水を含有する、第１ストランド合成のために使用した。ＰＣＲ条件は、９５℃で３分、続いて９５℃で３０秒、５５℃で３０分、及び７２℃で１分のサイクルを１５回であった。
2021522816.tif 000049
【０６６４】
全ての第１ストランドＰＣＲ生成物をプールし、５０μＬのプールした第１ストランドＰＣＲ生成物を、モナークＰＣＲ＆ＤＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて製造業者の指示に従って精製し、１０μＬの溶出緩衝液中で溶出した。次いで、溶出された８μＬの第１ストランド生成物を２μＬの捕捉プローブ２（１００ｎＭ）に連結し、６０℃まで５分間加熱し、続いて４℃までゆっくり（０．１℃／秒）温度を低下させた。次いで、２μＬのＴ４リガーゼ緩衝液、６μＬのＰＥＧ、１μＬのＴ４リガーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び１μＬの蒸留水からなる１０μＬを添加した。
2021522816.tif 000050
【０６６５】
１６℃で１時間のインキュベーション及び７５℃で１５分間の不活性化後、２μＬの連結反応物を、４μＬの５倍ＨＦ緩衝液、０．４μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μＬの１０μＭ順方向配列プライマー（ＰＥ１）及び１μＬの１０μＭ逆方向配列プライマー（ＰＥ２Ｖ２）、０．２μＬのＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、並びに１１，４μＬの蒸留水を含有する、ＰＣＲ反応物に適用した。ＰＣＲ条件は、９８℃で３０秒間、次いで９８℃で１５秒間、６０℃で２０秒間、及び７２℃で２０秒間の２０サイクル、最後に７２℃で５分間であった。
2021522816.tif 000051
【０６６６】
ＰＣＲ生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造説明書に従って精製し、３０μＬの蒸留水に溶出した。ＰＣＲ生成物は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉｎｉＳｅｑ  Ｓｙｓｔｅｍ（イルミナ）からのプロトコルに従って配列決定した。ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ、１１．０．１のソフトウェアを用いて、異なるバーコードに対する読取り数を同定し、バーコードの相対数を計算した。最後に、インビボ血漿相対存在量と、血漿試料中のエクスビボスパイクとの比率を計算した。
【０６６７】
（表１７）４時間の血漿試料読取り数及び各試料の相対存在量（ｎ＝３）
2021522816.tif 000052
【０６６８】
（表１８）４時間の血漿試料読取り相対存在量（平均及び標準偏差）、及び血漿のスパイクに対するインビボ比率
2021522816.tif 000053
【０６６９】
図１７は、皮下注射の４時間後の非複合オリゴ化合物（配列番号３５）に対する、血漿濃縮を示す。Ｃ１６脂肪酸複合体（配列番号４６）を有するオリゴヌクレオチドは、裸のオリゴヌクレオチド配列番号３５と比較して１２．５倍の血漿存在量を示した。ＧａｌＮＡｃ複合オリゴヌクレオチド（配列番号２２）は血漿からの枯渇を示した。
【０６７０】
実施例１６
バーコードを含むオリゴヌクレオチドを含有するＬＮＡ／ＤＮＡ／ＰＳに複合した種々の化学部分のライブラリが、シーケンシングを用いて単一動物での複数の組織における組織送達特性について調べられることを示す、データ。データはまた、コレステロール複合（配列番号４９及び５０）及びトコフェロール複合オリゴヌクレオチド（配列番号６０及び６１）が肝臓に豊富であり、静脈注射から３日後に腎臓で還元されることも、同定する。データはまた、胆汁アミン複合体（配列番号５１及び５２）が膵臓中のオリゴヌクレオチド含量を増加させることも同定している。
【０６７１】
１５のバーコード化オリゴヌクレオチドのライブラリ（下表）を、１０ｍｇ／ｋｇの用量（全オリゴヌクレオチド）でＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝２）に静脈内注射した。以下の臓器：脂肪組織、皮質、眼、大腿骨、心臓、腸骨、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、膵臓、血清、脊髄、脾臓、及び胃を、３日後に採取し、分析した。
【０６７２】
（表１９）複合体を有するバーコード化オリゴのライブラリ。識別用のバーコードは太字で表示する。
複合体は単語で示す。ＬＮＡヌクレオチドは大文字で示す。
2021522816.tif 000054
【０６７３】
注射の３日後、組織試料を、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｌｙｚｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＩＰＡ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）中で均質化した。組織を、１０ｍｇの組織／４５０μＬのＲｉｐａ緩衝液の比率で、その重量に応じた量のＲＩＰＡ緩衝液中で均質化した。均質化した肝臓、腎臓、及び肺組織を、その後蒸留水で１００倍に希釈し、一方で他の組織は蒸留水で１０倍に希釈した。試料を７５℃で４０分間、次いで４℃で１５分間インキュベートすることにより、ＤＮアーゼ不活化を行った。並行して、参照標準化のための２つの試料は、５μＭ（各）オリゴヌクレオチドライブラリ及び４９０μＬのＲＩＰＡ緩衝液（最終１００ｎＭの各オリゴヌクレオチド）を含む、１０μＬの溶液からなった。
【０６７４】
４μＬのＲＩＰＡ溶液を、２μＬの捕捉プローブ１（１ｎＭ）、２μＬのＴ４リガーゼ緩衝液、６μＬのＰＥＧ、０．２５μＬのＴ４リガーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び５．７５μＬの蒸留水を含有する、第１の連結反応で使用した。各組織試料を、後で各個々の試料を同定するために、特定のインデックス配列を有する特異的な捕捉プローブ１に連結した（下記の表を参照）。
【０６７５】
（表２０）３２の捕捉プローブ１のライブラリ。識別用のインデックスは太字で表示する。
2021522816.tif 000055
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【０６７６】
１６℃で１時間インキュベートし、７５℃で１５分間不活化した後、２μＬの連結反応物を、２μＬの連結反応物、４μＬの５倍Ｖｏｌｃａｎｏ緩衝液（ＭｙＰｏｌｓ）、０．５μＬの第１ストランドプライマー１００ｎＭ、０．５μＬのｄＮＴＰ  １０ｍＭ、０．４μＬのＶｏｌｃａｎｏ  ＰＧ（ＭｙＰｏｌｓ）、及び１２．６μＬの蒸留水を含有する反応物における、第１ストランド合成のために使用した。ＰＣＲ条件は、９５℃で２分、続いて９５℃で３０秒及び６０℃で３０分のサイクルを１５回、最後に７２℃で５分であった。
2021522816.tif 000059
【０６７７】
全ての第１ストランドＰＣＲ生成物をプールし、５０μＬのプールした第１ストランドＰＣＲ生成物を、モナークＰＣＲ＆ＤＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて製造業者の指示に従って精製し、１０μＬの溶出緩衝液中で溶出した。溶出された４μＬの第１ストランド生成物を４μＬの捕捉プローブ２（１００ｎＭ）と混合し、６０℃まで５分間加熱し、続いて４℃までゆっくり（０．１℃／秒）温度を低下させた。次いで、２μＬのＴ４リガーゼ緩衝液、６μＬのＰＥＧ、０．５μＬのＴ４リガーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び３．５μＬの蒸留水からなる１２μＬを添加した。
2021522816.tif 000060
【０６７８】
４℃で１時間のインキュベーション及び７５℃で１５分間の不活性化後、２μＬの連結反応物を、４μＬの５倍ＨＦ緩衝液、０．４μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μＬの１０μＭ順方向配列プライマー（ＰＥ１）及び１μＬの１０μＭ逆方向配列プライマー（ＰＥ２Ｖ３）、０．２μＬのＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、並びに１１．４μＬの蒸留水を含有する、ＰＣＲ反応物に適用した。ＰＣＲ条件は、９８℃で３０秒間、次いで９８℃で１５秒間、６０℃で２０秒間、及び７２℃で２０秒間の２０サイクル、最後に７２℃で５分間であった。
2021522816.tif 000061
【０６７９】
ＰＣＲ生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造説明書に従って精製し、３０μＬの蒸留水に溶出した。ＰＣＲ生成物は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉｎｉＳｅｑ  Ｓｙｓｔｅｍ（イルミナ）からのプロトコルに従って配列決定した。ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ，１１．０．１のソフトウェアを使用する。異なるバーコードに対する読取り数を同定し、各捕捉インデックス（各組織試料）に対するバーコードの相対数を計算した。各バーコードの相対数は、試験管反応からのインデックス参照ライブラリ１内のバーコードの相対数に対して正規化（％）した。
【０６８０】
（表２１）２匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける静脈内注射から３日後の組織試料読取り数
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【０６８１】
（表２２）参照ライブラリ１の読取りの相対的存在量で標準化（％）した、各組織試料中のバーコードオリゴの読取りの相対的存在量。読取りの相対的存在量は、トコフェロール複合体（化合物配列番号５８及び配列番号５９）及びコレステロール複合体（配列番号４７及び配列番号４８）が、裸のオリゴである配列番号５５、５６、及び５７、並びに他の複合体と比較して、肝臓への肝臓分布を増加させ、腎臓分布を減少させることを示す。胆汁アミン複合体（配列番号４９及び配列番号５０）は、膵臓における含有量の増加を示す。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2021522816.tif 000074
【図４Ｃ】
2021522816.tif 000075
【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
2021522816.tif 000079
【図４Ｈ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
2021522816.tif 000083
【図５Ｄ】
2021522816.tif 000084
【図５Ｅ】
2021522816.tif 000085
【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
2021522816.tif 000089
【図６Ｄ】
2021522816.tif 000090
【図６Ｅ】
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【図７】
2021522816.tif 000092
【図８】
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【図９】
2021522816.tif 000094
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
2021522816.tif 000100
【図１３】
2021522816.tif 000101
【図１４】
2021522816.tif 000102
【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
2021522816.tif 000105
【図１７】
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【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年2月3日(2021.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５８５】
以下のＬＮＡオリゴをシーケンシングに使用した。
ＬＮＡ混合物：
2021522816.tif 000108
捕捉プローブ：
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捕捉プローブ１逆転写プライマー：
2021522816.tif 000110
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６２４】
（表ａ）オリゴヌクレオチド．全ての結合はホスホジエステルであり、全てのヌクレオチドは「ｒ」が先行しない限りＤＮＡヌクレオチドであり、その場合、これらはリボヌクレオチドである。「／３６−ＦＡＭ／」は３’ＦＡＭ基を示し、／ｉＳｐ１８／は１８原子のヘキサエチレングリコールのスペーサを示し、／３ＡｍＭＯ／は３’アミノ修飾剤を示し、「／５Ｃｙ５／」は５’Ｃｙ５基を示す。ヌクレオチドコードは、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードによる。
2021522816.tif 000111
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６２５】
（表Ｂ）修飾オリゴヌクレオチド−全ての結合はホスホチオエートである。大文字のヌクレオチドはＬＮＡヌクレオチドである。小文字のヌクレオチドはＤＮＡヌクレオチドである。大文字の「Ｃ」ヌクレオチドは、５−メチル−シチジンである。「５’ｐ」は、５’リン酸化を指す。
2021522816.tif 000112
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６７６】
１６℃で１時間インキュベートし、７５℃で１５分間不活化した後、２μＬの連結反応物を、２μＬの連結反応物、４μＬの５倍Ｖｏｌｃａｎｏ緩衝液（ＭｙＰｏｌｓ）、０．５μＬの第１ストランドプライマー１００ｎＭ、０．５μＬのｄＮＴＰ  １０ｍＭ、０．４μＬのＶｏｌｃａｎｏ  ＰＧ（ＭｙＰｏｌｓ）、及び１２．６μＬの蒸留水を含有する反応物における、第１ストランド合成のために使用した。ＰＣＲ条件は、９５℃で２分、続いて９５℃で３０秒及び６０℃で３０分のサイクルを１５回、最後に７２℃で５分であった。
2021522816.tif 000113
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６７８】
４℃で１時間のインキュベーション及び７５℃で１５分間の不活性化後、２μＬの連結反応物を、４μＬの５倍ＨＦ緩衝液、０．４μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μＬの１０μＭ順方向配列プライマー（ＰＥ１）及び１μＬの１０μＭ逆方向配列プライマー（ＰＥ２Ｖ３）、０．２μＬのＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、並びに１１．４μＬの蒸留水を含有する、ＰＣＲ反応物に適用した。ＰＣＲ条件は、９８℃で３０秒間、次いで９８℃で１５秒間、６０℃で２０秒間、及び７２℃で２０秒間の２０サイクル、最後に７２℃で５分間であった。
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【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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