(57)【要約】  本発明は一般的に、レクチンドメインを含むポリペプチド、該ポリペプチドを含む多量体タンパク質、および炭水化物(例えばシアル酸含有炭水化物またはシグレックリガンド)の検出またはシグレック媒介障害の治療における該ポリペプチドまたは多量体タンパク質の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)レクチンドメイン；
b)三量体化ドメイン；および
c)二量体化ドメイン
を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
レクチンドメイン、三量体化ドメインおよび二量体化ドメインが、N末端からC末端の方向で共有結合されて一緒になる、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
レクチンドメイン、二量体化ドメインおよび三量体化ドメインが、N末端からC末端の方向で共有結合されて一緒になる、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項４】
リンカーをさらに含む、前記請求項いずれか記載のポリペプチド。
【請求項５】
レクチンドメインと三量体化ドメインの間にリンカーをさらに含む、請求項２記載のポリペプチド。
【請求項６】
二量体化ドメインと三量体化ドメインの間にリンカーをさらに含む、請求項３記載のポリペプチド。
【請求項７】
a)第1のレクチンドメイン；
b)第2のレクチンドメイン；および
c)二量体化ドメイン
を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項８】
第1のレクチンドメインおよび第2のレクチンドメインが同じである、請求項７記載のポリペプチド。
【請求項９】
第1のレクチンドメイン、第2のレクチンドメインおよび二量体化ドメインが、N末端からC末端の方向で共有結合されて一緒になる、請求項７または８記載のポリペプチド。
【請求項１０】
第1のレクチンドメイン、二量体化ドメインおよび第2のレクチンドメインが、N末端からC末端の方向で共有結合されて一緒になる、請求項７または８記載のポリペプチド。
【請求項１１】
レクチンドメインが、シグレックシアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、またはそのバリアントを含む、請求項１〜１０いずれか記載のポリペプチド。
【請求項１２】
レクチンドメインが、シグレック細胞外ドメイン、またはそのバリアントを含む、請求項１１記載のポリペプチド。
【請求項１３】
シグレックが哺乳動物シグレックである、請求項１１または１２記載のポリペプチド。
【請求項１４】
シグレックが、ヒト、サル、イヌ、ラットまたはマウスのシグレックである。請求項１３記載のポリペプチド。
【請求項１５】
シグレックがヒトシグレックである、請求項１４記載のポリペプチド。
【請求項１６】
シグレックが、シグレック-1、シグレック-2、シグレック-3、シグレック-4、シグレック-5、シグレック-6、シグレック-7、シグレック-8、シグレック-9、シグレック-10、シグレック-11、シグレック-12、シグレック-14およびシグレック-15から選択される、請求項１５記載のポリペプチド。
【請求項１７】
シグレックが、シグレック-3、シグレック-5、シグレック-6、シグレック-7、シグレック-8、シグレック-9、シグレック-10およびシグレック-11から選択される、請求項１６記載のポリペプチド。
【請求項１８】
シグレックが、シグレック-3、シグレック-7およびシグレック-9から選択される、請求項１７記載のポリペプチド。
【請求項１９】
シグレックが、シグレック-7およびシグレック-9から選択される、請求項１８記載のポリペプチド。
【請求項２０】
レクチンドメインが、配列番号：1、配列番号：2または配列番号：51を含む、請求項１９記載のポリペプチド。
【請求項２１】
レクチンドメインが、配列番号：1または配列番号：2を含む、請求項２０記載のポリペプチド。
【請求項２２】
レクチンドメインが、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：13、配列番号：14、配列番号：52、配列番号：65または配列番号：66を含む、請求項２０記載のポリペプチド。
【請求項２３】
レクチンドメインが、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：13または配列番号：14を含む、請求項２２記載のポリペプチド。
【請求項２４】
シグレックがマウスシグレックである、請求項１４記載のポリペプチド。
【請求項２５】
シグレックが、SigE、SigF、SigGおよびSigFから選択される、請求項２４記載のポリペプチド。
【請求項２６】
レクチンドメインがC型レクチンドメインを含む、請求項１〜８いずれか記載のポリペプチド。
【請求項２７】
C型レクチンが、CLEC1A、CLEC1B、CLEC2A、CLEC2B、CD69(CLEC2C)、CLEC2D、CLEC2L、CLEC3A、CLEC3B、CLEC4A、CLEC4C、CLEC4D、CLEC4E、CLEC4F、CLEC4G、ASGR1(CLEC4H1)、ASGR2(CLEC4H2)、FCER2(CLEC4J)、CD207(CLEC4K)、CD209(CLEC4L)、CLEC4M、CLEC5A、CLEC6A、CLEC7A、OLR1(CLEC8A)、CLEC9A、CLEC10A、CLEC11A、CLEC12A、CLEC12B、CD302(CLEC13A)、LY75(CLEC13B)、PLA2R1(CLEC13C)、MRC1(CLEC13D)、MRC2(CLEC13E)、CLEC14A、CLEC16A、CLEC17A、KLRA1、KLRB1(CLEC5B)、KLRC1、KLRC2、KLRC3、KLRC4、KLRD1、KLRF1(CLEC5C)、KLRG1(CLEC15A)、KLRG2(CLEC15B)およびKLRK1から選択される、請求項２６記載のポリペプチド。
【請求項２８】
C型レクチンが、CLEC4A、CLEC12AおよびCLEC12Bから選択される、請求項２７記載のポリペプチド。
【請求項２９】
三量体化ドメインが天然の三量体化ドメインまたは合成の三量体化ドメインである、請求項１〜６または１１〜２８のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項３０】
三量体化ドメインが、T4ファージフィブリチン(fibritin)(フォルドン(foldon))、クラスリン、熱ショック因子1、コラーゲン、血球凝集素、GCN4、GCN4系イソロイシンジッパーおよびコイルドコイルペプチドの三量体化ドメインから選択される、請求項２９記載のポリペプチド。
【請求項３１】
三量体化ドメインが、GCN4系イソロイシンジッパーおよびT4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメインから選択される、請求項３０記載のポリペプチド。
【請求項３２】
三量体化ドメインがT4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメインである、請求項３１記載のポリペプチド。
【請求項３３】
三量体化ドメインが配列番号：5を含む、請求項３記載のポリペプチド。
【請求項３４】
二量体化ドメインが天然の二量体化ドメインまたは合成の二量体化ドメインである、請求項１３３いずれか記載のポリペプチド。
【請求項３５】
二量体化ドメインが、免疫グロブリンFcドメイン、ロイシンジッパー系、コイルドコイル系およびヘリックス系の二量体化ドメインから選択される、請求項３４記載のポリペプチド。
【請求項３６】
二量体化ドメインが免疫グロブリンFcドメインである、請求項３５記載のポリペプチド。
【請求項３７】
免疫グロブリンFcドメインがマウスまたはヒトの免疫グロブリンFcドメインである、請求項３６記載のポリペプチド。
【請求項３８】
免疫グロブリンFcドメインがマウスIgG2a免疫グロブリンFcドメインである、請求項３７記載のポリペプチド。
【請求項３９】
免疫グロブリンFcドメインが配列番号：6を含む、請求項３８記載のポリペプチド。
【請求項４０】
リンカーが配列番号：69を含む、請求項４〜６または１１〜３９いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項４１】
ポリペプチドが、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：57または配列番号：67を含む、請求項１〜４または９〜３８いずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項４２】
ポリペプチドが配列番号：7または配列番号：8を含む、請求項４１記載のポリペプチド。
【請求項４３】
ポリペプチドが、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：59または配列番号：60を含む、請求項５〜４０いずれか記載のポリペプチド。
【請求項４４】
ポリペプチドが、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11または配列番号：12を含む、請求項４３記載のポリペプチド。
【請求項４５】
請求項１〜４４いずれか記載のポリペプチドを含む、多量体タンパク質。
【請求項４６】
多量体タンパク質が二量体、三量体、七量体または十二量体である、請求項４５記載の多量体タンパク質。
【請求項４７】
多量体タンパク質がヘキサマーである、請求項４６記載の多量体タンパク質。
【請求項４８】
六量体タンパク質を生じるように複合体化される6個の別々の請求項１〜６または１１〜４４いずれか一項記載のポリペプチドを含む、多量体タンパク質。
【請求項４９】
二量体タンパク質を生じるようにそれぞれのポリペプチドのそれぞれの二量体化ドメインを介して二量体化される、2個の別々の請求項５〜４２いずれか記載のポリペプチドを含む、多量体タンパク質。
【請求項５０】
表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法(bio-layer interferometry)により測定される場合に、多量体タンパク質が.01nM〜100nMのKDで炭水化物リガンドに結合する、請求項４５〜４９いずれか記載の多量体タンパク質。
【請求項５１】
KDが10nM以下である、請求項５０記載の多量体タンパク質。
【請求項５２】
KDが1nM以下である、請求項５１記載の多量体タンパク質。
【請求項５３】
炭水化物リガンドがシグレックリガンドである、請求項４５〜５２いずれか記載の多量体タンパク質。
【請求項５４】
シグレックリガンドが、シグレック-1、シグレック-2、シグレック-3、シグレック-4、シグレック-5、シグレック-6、シグレック-7、シグレック-8、シグレック-9、シグレック-10、シグレック-11、シグレック-12、シグレック-14およびシグレック-15リガンドから選択される、請求項５３記載の多量体タンパク質。
【請求項５５】
シグレックリガンドが、シグレック-3、シグレック-5、シグレック-6、シグレック-7、シグレック-8、シグレック-9、シグレック-10およびシグレック-11リガンドから選択される、請求項５４記載の多量体タンパク質。
【請求項５６】
シグレックリガンドが、シグレック-3、シグレック-7およびシグレック-9リガンドから選択される、請求項５５記載の多量体タンパク質。
【請求項５７】
シグレックリガンドが、シグレック-7およびシグレック-9リガンドから選択される、請求項５６記載の多量体タンパク質。
【請求項５８】
シグレックリガンドが、α2,3結合シアル酸、α2,6結合シアル酸、シアリルルイスX、NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc、NeuGcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-6GalNAc、Galβ1-3(NeuAcα2-6)GalNAc、NeuGcα2-6Galβ1-4Glc、NeuGcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-6GalNAc、NeuAcα2-8NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc6S、NeuAcα2-3Galβ1-4GalNAc、NeuAcα2-8NeuAc、NeuAcα2-3GalβSβ1-4GlcNAcα2-3FucおよびNeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc6Sα2-3Fucから選択される、請求項５３〜５７いずれか記載の多量体タンパク質。
【請求項５９】
シグレックリガンドが、α2,3結合シアル酸、α2,6結合シアル酸およびシアリルルイスXから選択される、請求項５８記載の多量体タンパク質。
【請求項６０】
2個のポリペプチドを含む多量体タンパク質であって、それぞれのポリペプチドが、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-7シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-7 C2-setドメイン、第2のシグレック-7シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第2のシグレック-7 C2-setドメインおよびFcドメインを含み、2個のポリペプチドが、それらのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)される、多量体タンパク質。
【請求項６１】
2個のポリペプチドを含む多量体タンパク質であって、それぞれのポリペプチドが、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-7シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-7 C2-setドメイン、第2のシグレック-7 C2-setドメイン、Fcドメイン、第2のシグレック-7シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第3のシグレック-7 C2-setドメインおよび第4のシグレック-7 C2-setドメインを含み、2個のポリペプチドが、それらのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)される、多量体タンパク質。
【請求項６２】
6個のポリペプチドを含む多量体タンパク質であって、それぞれのポリペプチドが、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-7シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-7 C2-setドメイン、第2のシグレック-7 C2-setドメイン、T4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメインおよびFcドメインを含み：
a)第1、第2および第3のポリペプチドが、それらのそれぞれの三量体化ドメインで三量体化され；
b)第4、第5および第6のポリペプチドが、それらのそれぞれの三量体化ドメインで三量体化され；
c)第1および第2のポリペプチドが、それらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)され；
d)第3および第4のポリペプチドが、それらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)され；
e)第5および第6のポリペプチドが、それらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)される、多量体タンパク質。
【請求項６３】
6個のポリペプチドを含む多量体タンパク質であって、それぞれのポリペプチドが、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-7シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-7 C2-setドメイン、第2のシグレック-7 C2-setドメイン、FcドメインおよびT4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメインを含み：
a)第1、第2および第3のポリペプチドが、それらのそれぞれの三量体化ドメインで三量体化され；
b)第4、第5および第6のポリペプチドが、それらのそれぞれの三量体化ドメインで三量体化され；
c)第1および第2のポリペプチドが、それらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)され；
d)第3および第4のポリペプチドが、それらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)され；
e)第5および第6のポリペプチドが、それらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)される、多量体タンパク質。
【請求項６４】
2個のポリペプチドを含む多量体タンパク質であって、それぞれのポリペプチドが、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-9シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-9 C2-setドメイン、第1のリンカー、第2のシグレック-9シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第2のシグレック-9 C2-setドメインおよびFcドメインを含み、2個のポリペプチドが、それらのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)される、多量体タンパク質。
【請求項６５】
2個のポリペプチドを含む多量体タンパク質であって、それぞれのポリペプチドが、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-9シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-9 C2-setドメイン、第2のシグレック-9 C2-setドメイン、Fcドメイン、第2のシグレック-9シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第3のシグレック-9 C2-setドメインおよび第4のシグレック-9 C2-setドメインを含み、2個のポリペプチドが、それらのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)される、多量体タンパク質。
【請求項６６】
6個のポリペプチドを含む多量体タンパク質であって、それぞれのポリペプチドが、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-9シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-9 C2-setドメイン、第2のシグレック-9 C2-setドメイン、T4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメインおよびFcドメインを含み：
a)第1、第2および第3のポリペプチドが、それらのそれぞれの三量体化ドメインで三量体化され；
b)第4、第5および第6のポリペプチドが、それらのそれぞれの三量体化ドメインで三量体化され；
c)第1および第2のポリペプチドが、それらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)され；
d)第3および第4のポリペプチドが、それらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)され；
e)第5および第6のポリペプチドが、それらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)される、多量体タンパク質。
【請求項６７】
6個のポリペプチドを含む多量体タンパク質であって、それぞれのポリペプチドが、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-9シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-9 C2-setドメイン、第2のシグレック-9 C2-setドメイン、FcドメインおよびT4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメインを含み：
a)第1、第2および第3のポリペプチドが、それらのそれぞれの三量体化ドメインで三量体化され；
b)第4、第5および第6のポリペプチドが、それらのそれぞれの三量体化ドメインで三量体化され；
c)第1および第2のポリペプチドが、それらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)され；
d)第3および第4のポリペプチドが、それらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)され；
e)第5および第6のポリペプチドが、それらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)される、多量体タンパク質。
【請求項６８】
2個のポリペプチドを含む多量体タンパク質であって、それぞれのポリペプチドが、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-3シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-3 C2-setドメイン、第1のリンカー、第2のシグレック-3シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第2のシグレック-3 C2-setドメインおよびFcドメインを含み、2個のポリペプチドが、それらのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)される、多量体タンパク質。
【請求項６９】
2個のポリペプチドを含む多量体タンパク質であって、それぞれのポリペプチドが、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-3シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-3 C2-setドメイン、Fcドメイン、第2のシグレック-3シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメインおよび第2のシグレック-3 C2-setドメインを含み、2個のポリペプチドが、それらのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)される、多量体タンパク質。
【請求項７０】
6個のポリペプチドを含む多量体タンパク質であって、それぞれのポリペプチドが、N末端からC末端の方向で、シグレック-3シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、シグレック-3 C2-setドメイン、FcドメインおよびT4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメインを含み：
a)第1、第2および第3のポリペプチドが、それらのそれぞれの三量体化ドメインで三量体化され；
b)第4、第5および第6のポリペプチドが、それらのそれぞれの三量体化ドメインで三量体化され；
c)第1および第2のポリペプチドが、それらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)され；
d)第3および第4のポリペプチドが、それらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)され；
e)第5および第6のポリペプチドが、それらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)される、多量体タンパク質。
【請求項７１】
多量体タンパク質がシアリダーゼで処理されている、請求項４５〜７０いずれか記載の多量体タンパク質。
【請求項７２】
多量体タンパク質が、シアリダーゼで処理されていない同様またはそうでなければ同一の多量体タンパク質のシアル酸含有量の50%、40%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%または1%未満を含む、請求項７１記載の多量体タンパク質。
【請求項７３】
請求項４５〜７２いずれか記載の多量体タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項７４】
シグレック媒介障害の治療を必要とする被験体においてシグレック媒介障害を治療する方法であって、被験体に、請求項４５〜７２いずれか記載の多量体タンパク質または請求項７３記載の医薬組成物の有効量を投与して、それにより被験体において該障害を治療する工程を含む、方法。
【請求項７５】
試料中の炭水化物を検出する方法であって、
(a)試料中に炭水化物が存在する場合に、試料と、請求項４５〜７２いずれか記載の多量体タンパク質を、多量体タンパク質が多量体タンパク質-炭水化物複合体を形成する条件下で接触させる工程；および
(b)もしあれば、工程(a)で生じた複合体の存在を検出する工程
を含む、方法。
【請求項７６】
癌を有する被験体において炭水化物を検出する方法であって、
(a)試料中に炭水化物が存在する場合に、被験体由来の試料と、請求項４５〜７２いずれか記載の多量体タンパク質を、多量体タンパク質が多量体タンパク質-炭水化物複合体を形成する条件下で接触させる工程；および
(b)もしあれば、工程(a)で生じた複合体の存在を検出する工程
を含む、方法。
【請求項７７】
炭水化物がシグレックリガンドである、請求項７５または７６記載の方法。
【請求項７８】
シグレック阻害剤による治療に応答する可能性のある癌を有する被験体を同定する方法であって、該方法が：
(a)試料中にシグレックリガンドが存在する場合に、被験体由来の試料と、請求項４５〜７２いずれか記載の多量体タンパク質を、多量体タンパク質が多量体タンパク質-シグレックリガンド複合体を形成する条件下で接触させる工程；および
(b)もしあれば、工程(a)で生じた複合体の存在を検出する工程
を含み、
複合体の存在が、被験体がシグレック阻害剤による治療に応答することを示す、方法。
【請求項７９】
癌の治療を必要とする被験体において癌を治療する方法であって、該方法が、被験体に、シグレック阻害剤の有効量を投与し、それにより被験体において癌を治療する工程を含み、癌が、請求項７６記載の方法により、シグレックの1つ以上のリガンドを発現する癌性細胞を含むものとして同定されている、方法。
【請求項８０】
シグレックリガンドが、シグレック-3、シグレック-5、シグレック-6、シグレック-7、シグレック-8、シグレック-9、シグレック-10およびシグレック-11リガンドから選択される、請求項７７〜７９いずれか記載の方法。
【請求項８１】
シグレックリガンドが、シグレック-3、シグレック-7およびシグレック-9リガンドから選択される、請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
シグレックリガンドが、シグレック-7およびシグレック-9リガンドから選択される、請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
シグレックリガンドが、α2,3結合シアル酸、α2,6結合シアル酸、シアリルルイスX、NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc、NeuGcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-6GalNAc、Galβ1-3(NeuAcα2-6)GalNAc、NeuGcα2-6Galβ1-4Glc、NeuGcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-6GalNAc、NeuAcα2-8NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc6S、NeuAcα2-3Galβ1-4GalNAc、NeuAcα2-8NeuAc、NeuAcα2-3GalβSβ1-4GlcNAcα2-3FucおよびNeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc6Sα2-3Fucから選択される、請求項８０〜８２いずれか記載の方法。
【請求項８４】
シグレックリガンドが、α2,3結合シアル酸、α2,6結合シアル酸およびシアリルルイスXから選択される、請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
シグレック阻害剤が抗シグレック抗体である、請求項７８〜８４いずれか記載の方法。
【請求項８６】
抗シグレック抗体が、抗シグレック-3抗体、抗シグレック-5抗体、抗シグレック-6抗体、抗シグレック-7抗体、抗シグレック-8抗体、抗シグレック-9抗体、抗シグレック-10抗体および抗シグレック-11抗体から選択される、請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
抗シグレック抗体が、抗シグレック-3抗体、抗シグレック-7抗体および抗シグレック-9抗体から選択される、請求項８６記載の方法。
【請求項８８】
抗シグレック抗体が抗シグレック-7抗体および抗シグレック-9抗体から選択される、請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
試料が、組織試料、体液試料または細胞試料から選択される、請求項７５〜８８いずれか記載の方法。
【請求項９０】
癌が上皮癌である、請求項７６〜８９いずれか記載の方法。
【請求項９１】
上皮癌が、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮頸癌、外陰癌、子宮癌、ファローピウス管癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、泌尿器癌、膀胱癌、頭頸部癌、口腔癌および肝臓癌から選択される、請求項９０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願についての相互参照
本願は、2018年6月7日に出願された米国仮特許出願第62/681,849号および2018年11月2日に出願された米国仮特許出願第62/755,285号に対する優先権およびそれらの利益を主張し、それらのそれぞれはそれらの全体において参照により本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は一般的に、炭水化物、例えばシグレック(Siglec)リガンドを検出するための方法および組成物、ならびにシグレック媒介障害を治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
シグレック(シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン)は、シアル酸に結合する細胞表面タンパク質である。シグレックは、シアログリカンに結合する表面受容体のレクチンファミリーを含み、細胞型および分化に依存的な様式で造血系の細胞上に優先的に発現される。シグレックは、アミノ末端が細胞外空間に位置し、カルボキシ末端が細胞質内に位置するI型膜貫通タンパク質である。それぞれのシグレックは、シアル酸に対する結合受容体として働くN末端V-set免疫グロブリン様ドメイン(Igドメイン)を含む。シグレックは、レクチンであり、レクチンドメインが免疫グロブリンフォールドであるためにI型レクチンの群に分類される。全てのシグレックは、結合活性を有さないC2-setドメインが介在することにより、細胞表面から伸長する。シグレックは、これらのC2-setドメインの数が異なる。これらのタンパク質はIgドメインを含むので、免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)のメンバーである。
【０００４】
少なくとも14の異なる哺乳動物シグレックがあり、これらは一緒になって、細胞表面受容体-リガンド相互作用に基づいて、一連の異なる機能を提供する。これらの受容体-グリカン相互作用は、特に、細胞接着および細胞シグナル伝達を媒介し得る。シアル酸は遍在的に、典型的に糖タンパク質および脂質の末端位置に発現されるが、非常に特異的な性質の異なる(distinct)シアログリカン構造のみが、同一性および末端近くの炭水化物部分への結合に依存して、個々のシグレックにより認識される。
【０００５】
増加する多数の証拠(growing body of evidence)は、腫瘍進行の種々の病理生理学的段階でのグリカンおよび特にシアログリカンについての役割を支持する。グリカンは、腫瘍増殖、浸潤、血行性の転移および新脈管形成を制御する(Fuster et al. (2005) Nat. Rev. Cancer 5(7): 526-42)。細胞表面糖コンジュゲートのシアリル化(sialylation)は、癌において頻繁に変化し、この疾患の特異的マーカーであるシアリル化腫瘍関連炭水化物抗原の発現を生じる。シアリル化グリカンは多くの生物学的プロセスに関連するので、腫瘍細胞によるシアリル化グリカンの発現はしばしば、腫瘍の攻撃性および転移可能性の増加と関連する。
【０００６】
しかしながら、シグレックリガンドの不均質性は、特定のリガンドに特異的な検出試薬(例えば抗体)の開発に困難さをもたらす。かかる検出試薬は、特定のシグレックリガンド(1つまたは複数)の発現に基づいて癌型を分類するためのバイオマーカー戦略の一部(sa part of)を含む多くの目的に有用である。したがって、シグレック検出方法および試薬の向上のための当該技術分野における必要性がある。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概要
本発明は部分的に、例えば目的の試料中のシグレックリガンドを検出するため、および/またはシグレック媒介障害の治療を必要とする被験体においてシグレック媒介障害を治療するために使用され得る組み換えポリペプチドの発見に基づく。ある態様において、組み換えポリペプチドは、(非共有的および/または共有的に)会合して、シグレックリガンドを検出するためおよび/またはシグレック媒介障害の治療を必要とする被験体においてシグレック媒介障害を治療するために使用される多量体タンパク質(multimeric protein)を生じる。
【０００８】
一局面において、本発明は、レクチンドメイン、三量体化ドメインおよび二量体化ドメインを含む単離されたポリペプチドを提供する。ある態様において、レクチンドメイン、三量体化ドメインおよび二量体化ドメインは、N末端からC末端の方向で共有結合されて一緒になる。ある態様において、レクチンドメイン、二量体化ドメインおよび三量体化ドメインは、N末端からC末端の方向で共有結合されて一緒になる。例えば、ある態様において、該ポリペプチドはさらにリンカーを含む。他のある態様において、該ポリペプチドはさらに、レクチンドメインと三量体化ドメインの間にリンカーを含み、他のある態様において、該ポリペプチドはさらに、二量体化ドメインと三量体化ドメインの間にリンカーを含む。
【０００９】
別の局面において、本発明は、第1のレクチンドメイン、第2のレクチンドメインおよび二量体化ドメインを含む単離されたポリペプチドを提供する。ある態様において、第1のレクチンドメインおよび第2のレクチンドメインは同一である。ある態様において、第1のレクチンドメイン、第2のレクチンドメインおよび二量体化ドメインは、N末端からC末端の方向で共有結合されて一緒になる。ある態様において、第1のレクチンドメイン、二量体化ドメインおよび第2のレクチンドメインは、N末端からC末端の方向で共有結合されて一緒になる。
【００１０】
上述の局面のある態様において、レクチンドメインは、シグレックシアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメインまたはそのバリアントを含む。ある態様において、レクチンドメインは、シグレック細胞外ドメインまたはそのバリアントを含む。シグレックシアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメインまたは細胞外ドメインが由来するシグレックは、哺乳動物シグレック、例えばヒト、サル、イヌ、ラットまたはマウスシグレックであり得る。
【００１１】
ある態様において、シグレックはヒトシグレックである。ある態様において、シグレックは、シグレック-1、シグレック-2、シグレック-3、シグレック-4、シグレック-5、シグレック-6、シグレック-7、シグレック-8、シグレック-9、シグレック-10、シグレック-11、シグレック-12、シグレック-14またはシグレック-15であり得る。ある態様において、シグレックは、シグレック-3、シグレック-5、シグレック-6、シグレック-7、シグレック-8、シグレック-9、シグレック-10またはシグレック-11であり得る。ある態様において、シグレックは、シグレック-3、シグレック-7またはシグレック-9であり得る。ある態様において、シグレックは、シグレック-7またはシグレック-9であり得る。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：43、または配列番号：44、または配列番号：51を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：13、配列番号：14、配列番号：52、配列番号：65または配列番号：66を含む。
【００１２】
ある態様において、シグレックはマウスシグレックである。マウスシグレックは、例えばSigE、SigF、SigGまたはSigFであり得る。
【００１３】
ある態様において、レクチンドメインは、C型レクチンドメインを含む。C型レクチンは、例えばCLEC1A、CLEC1B、CLEC2A、CLEC2B、CD69 (CLEC2C)、CLEC2D、CLEC2L、CLEC3A、CLEC3B、CLEC4A、CLEC4C、CLEC4D、CLEC4E、CLEC4F、CLEC4G、ASGR1(CLEC4H1)、ASGR2(CLEC4H2)、FCER2(CLEC4J)、CD207(CLEC4K)、CD209(CLEC4L)、CLEC4M、CLEC5A、CLEC6A、CLEC7A、OLR1(CLEC8A)、CLEC9A、CLEC10A、CLEC11A、CLEC12A、CLEC12B、CD302(CLEC13A)、LY75(CLEC13B)、PLA2R1(CLEC13C)、MRC1(CLEC13D)、MRC2(CLEC13E)、CLEC14A、CLEC16A、CLEC17A、KLRA1、KLRB1(CLEC5B)、KLRC1、KLRC2、KLRC3、KLRC4、KLRD1、KLRF1(CLEC5C)、KLRG1(CLEC15A)、KLRG2(CLEC15B)またはKLRK1であり得る。ある態様において、C型レクチンは、CLEC4A、CLEC12AおよびCLEC12Bから選択される。
【００１４】
ある態様において、三量体化ドメインは、天然の三量体化ドメインまたは合成三量体化ドメインである。ある態様において、三量体化ドメインは、T4ファージフィブリチン(fibritin)(フォルドン(foldon))、クラスリン、熱ショック因子1、コラーゲン、血球凝集素、GCN4、GCN4系イソロイシンジッパーおよびコイルドコイルペプチド三量体化ドメインから選択される。ある態様において、三量体化ドメインは、GCN4系イソロイシンジッパーおよびT4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメインから選択される。ある態様において、三量体化ドメインは、T4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメイン、例えば配列番号：5である。
【００１５】
ある態様において、二量体化ドメインは、天然の二量体化ドメインまたは合成二量体化ドメインである。ある態様において、二量体化ドメインは、免疫グロブリンFcドメイン、ロイシンジッパー系、コイルドコイル系およびヘリックス系の二量体化ドメインから選択される。ある態様において、二量体化ドメインは、免疫グロブリンFcドメイン、例えばマウスまたはヒト免疫グロブリンFcドメインである。ある態様において、免疫グロブリンFcドメインは、マウスIgG2a免疫グロブリンFcドメイン、例えば配列番号：6を含むマウスIgG2a免疫グロブリンFcドメインである。ある態様において、リンカーは配列番号：69を含む。
【００１６】
ある態様において、ポリペプチドは、配列番号：7または配列番号：8を含む。ある態様において、ポリペプチドは、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：53、配列番号：55、配列番号：57、配列番号：59、配列番号：60、配列番号：61、配列番号：62、配列番号：63、配列番号：64または配列番号：67を含む。
【００１７】
別の局面において、本発明は、本明細書に開示されるようなポリペプチドを含む多量体タンパク質に関する。ある態様において、多量体タンパク質は、ダイマー、トリマー、ヘキサマーまたはドデカマーである。ある態様において、多量体タンパク質はヘキサマーである。ある態様において、多量体タンパク質は、六量体タンパク質を生じるように複合体化される、本明細書に記載されるような6個の別々のポリペプチドを含む。ある態様において、多量体タンパク質は、二量体タンパク質を生じるように、それぞれのポリペプチドのそれぞれの二量体化ドメインを介して(例えば共有結合または非共有結合を介して)二量体化される2個の別々のポリペプチドを含む。
【００１８】
ある態様において、多量体タンパク質は、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法(bio-layer interferometry)により測定される場合に、0.01nM〜100nMのKDで炭水化物リガンドに結合する。ある態様において、KDは、10nM、1nM、0.1nMまたはそれ以下である。ある態様において、KDは、1nM、0.1nMまたはそれ以下である。ある態様において、炭水化物リガンドはシグレックリガンドである。ある態様において、シグレックリガンドは、シグレック-1、シグレック-2、シグレック-3、シグレック-4、シグレック-5、シグレック-6、シグレック-7、シグレック-8、シグレック-9、シグレック-10、シグレック-11、シグレック-12、シグレック-14およびシグレック-15リガンドから選択される。ある態様において、シグレックリガンドは、シグレック-3、シグレック-5、シグレック-6、シグレック-7、シグレック-8、シグレック-9、シグレック-10およびシグレック-11リガンドから選択される。ある態様において、シグレックリガンドは、シグレック3、シグレック-7およびシグレック-9リガンドから選択される。ある態様において、シグレックリガンドは、シグレック-7およびシグレック-9リガンドから選択される。
【００１９】
ある態様において、シグレックリガンドは、α2,3結合シアル酸、α2,6結合シアル酸、シアリルルイスX、NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc、NeuGcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-6GalNAc、Galβ1-3(NeuAcα2-6)GalNAc、NeuGcα2-6Galβ1-4Glc、NeuGcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-6GalNAc、NeuAcα2-8NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc6S、NeuAcα2-3Galβ1-4GalNAc、NeuAcα2-8NeuAc、NeuAcα2-3GalβSβ1-4GlcNAcα2-3FucおよびNeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc6Sα2-3Fuc(式中Sは硫酸塩を表す)から選択される。ある態様において、シグレックリガンドは、α2,3結合シアル酸、α2,6結合シアル酸およびシアリルルイスXから選択される。
【００２０】
別の局面において、本発明は、2個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-7シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-7 C2-setドメイン、第2のシグレック-7シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第2のシグレック-7 C2-setドメインおよびFcドメインを含み、2つのポリペプチドは、それらのFcドメインで(例えば1つ以上の共有結合により)二量体化される。
【００２１】
別の局面において、本発明は、2個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-7シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-7 C2-setドメイン、第2のシグレック-7 C2-setドメイン、Fcドメイン、第2のシグレック-7シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第3のシグレック-7 C2-setドメインおよび第4のシグレック-7 C2-setドメインを含み、2つのポリペプチドは、それらのFcドメインで(例えば1つ以上の共有結合により)二量体化される。
【００２２】
別の局面において、本発明は、6個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-7シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-7 C2-setドメイン、第2のシグレック-7 C2-setドメイン、T4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメインおよびFcドメインを含み：a)第1、第2および第3のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで三量体化され；b)第4、第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで三量体化され；c)第1および第2のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(例えば1つ以上の共有結合により)二量体化され；d)第3および第4のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(例えば1つ以上の共有結合により)二量体化され；e)第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(例えば1つ以上の共有結合により)二量体化される。
【００２３】
別の局面において、本発明は、6個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-7シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-7 C2-setドメイン、第2のシグレック-7 C2-setドメイン、FcドメインおよびT4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメインを含み：a)第1、第2および第3のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで三量体化され；b)第4、第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで三量体化され；c)第1および第2のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)され；d)第3および第4のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)され；e)第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)される。
【００２４】
別の局面において、本発明は、2個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-9シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-9 C2-setドメイン、第1のリンカー、第2のシグレック-9シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第2のシグレック-9 C2-setドメインおよびFcドメインを含み、2つのポリペプチドはそれらのFcドメインで(例えば1つ以上の共有結合により)二量体化される。
【００２５】
別の局面において、本発明は、2個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-9シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-9 C2-setドメイン、第2のシグレック-9 C2-setドメイン、Fcドメイン、第2のシグレック-9シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第3のシグレック-9 C2-setドメインおよび第4のシグレック-9 C2-setドメインを含み、2つのポリペプチドは、それらのFcドメインで(例えば1つ以上の共有結合により)二量体化される。
【００２６】
別の局面において、本発明は、6個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-9シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-9 C2-setドメイン、第2のシグレック-9 C2-setドメイン、T4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメインおよびFcドメインを含み：a)第1、第2および第3のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで三量体化され；b)第4、第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで三量体化され；c)第1および第2のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(例えば1つ以上の共有結合により)二量体化され；d)第3および第4のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(例えば1つ以上の共有結合により)二量体化され；e)第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(例えば1つ以上の共有結合により)二量体化される。
【００２７】
別の局面において、本発明は、6個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-9シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-9 C2-setドメイン、第2のシグレック-9 C2-setドメイン、FcドメインおよびT4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメインを含み：a)第1、第2および第3のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで三量体化され；b)第4、第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで三量体化され；c)第1および第2のポリペプチドはそれらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)され；d)第3および第4のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)され；e)第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)される。
【００２８】
別の局面において、本発明は、2個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-3シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-3 C2-setドメイン、第1のリンカー、第2のシグレック-3シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第2のシグレック-3 C2-setドメインおよびFcドメインを含み、2つのポリペプチドは、それらのFcドメインで二量体化される(例えば共有結合される)。
【００２９】
別の局面において、本発明は、2個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-3シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-3 C2-setドメイン、Fcドメイン、第2のシグレック-3シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメインおよび第2のシグレック-3 C2-setドメインを含み、2つのポリペプチドは、それらのFcドメインで二量体化される(例えば共有結合される)。
【００３０】
別の局面において、本発明は、6個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、シグレック-3シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、シグレック-3 C2-setドメイン、FcドメインおよびT4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメインを含み：a)第1、第2および第3のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで三量体化され；b)第4、第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで三量体化され；c)第1および第2のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)され；d)第3および第4のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)され；e)第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで二量体化(例えば共有結合)される。
【００３１】
ある態様において、多量体タンパク質は、タンパク質のシアル酸含有量を低減するようにシアリダーゼで処理されている。ある態様において、シアリダーゼで処理されている多量体タンパク質は、シアリダーゼで処理されていない同様または同一の多量体タンパク質のシアル酸含有量の50%、40%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%または1%未満を含む。
【００３２】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載される多量体タンパク質を含む医薬組成物に関する。
【００３３】
別の局面において、本発明は、シグレック媒介障害(例えば癌または炎症性障害)の治療を必要とする被験体においてシグレック媒介障害を治療する方法に関し、該方法は、被験体に本明細書に記載される多量体タンパク質または医薬組成物の有効量を投与して、それにより被験体においてシグレック媒介障害を治療する工程を含む。
【００３４】
別の局面において、本発明は、試料中の炭水化物を検出する方法に関する。該方法は、試料中に炭水化物が存在する場合に、試料と、本明細書に記載される多量体タンパク質を、多量体タンパク質が多量体タンパク質-炭水化物複合体を形成する条件下で接触させる工程、およびもしあれば、複合体の存在を検出する工程を含む。
【００３５】
別の局面において、本発明は、癌を有する被験体において炭水化物を検出する方法に関する。該方法は、試料中に炭水化物が存在する場合に、被験体由来の試料と、本明細書に記載される多量体タンパク質を、多量体タンパク質が多量体タンパク質-炭水化物複合体を形成する条件下で接触させる工程、およびもしあれば、複合体の存在を検出する工程を含む。ある態様において、炭水化物はシグレックリガンドである。
【００３６】
別の局面において、本発明は、シグレック阻害剤による治療に応答する可能性のある癌を有する被験体を同定する方法に関する。該方法は、試料中にシグレックリガンドが存在する場合に、被験体由来の試料と、本明細書に記載される多量体タンパク質を、多量体タンパク質が多量体タンパク質-シグレックリガンド複合体を形成する条件下で接触させる工程、およびもしあれば、複合体の存在を検出する工程を含み、ここで複合体の存在は、被験体がシグレック阻害剤による治療に応答することを示す。
【００３７】
別の局面において、本発明は、癌の治療を必要とする被験体において癌を治療する方法に関し、該方法は、被験体に、シグレック阻害剤の有効量を投与し、それにより該被験体において癌を治療する工程を含み、ここで癌は、本明細書に記載される方法によりシグレックの1つ以上のリガンドを発現する癌性細胞を含むものとして同定される。ある態様において、シグレックリガンドは、シグレック-3、シグレック-5、シグレック-6、シグレック-7、シグレック-8、シグレック-9、シグレック-10またはシグレック-11リガンドである。ある態様において、シグレックリガンドは、シグレック-7またはシグレック-9リガンドである。ある態様において、シグレックリガンドは、α2,3結合シアル酸、α2,6結合シアル酸、シアリルルイスX、NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc、NeuGcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-6GalNAc、Galβ1-3(NeuAcα2-6)GalNAc、NeuGcα2-6Galβ1-4Glc、NeuGcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-6GalNAc、NeuAcα2-8NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc6S、NeuAcα2-3Galβ1-4GalNAc、NeuAcα2-8NeuAc、NeuAcα2-3GalβSβ1-4GlcNAcα2-3FucおよびNeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc6Sα2-3Fuc(式中Sは硫酸塩を表す)から選択される。ある態様において、シグレックリガンドは、α2,3結合シアル酸、α2,6結合シアル酸およびシアリルルイスXから選択される。
【００３８】
ある態様において、シグレック阻害剤は抗シグレック抗体である。抗シグレック抗体は、例えば抗シグレック-3抗体、抗シグレック-5抗体、抗シグレック-6抗体、抗シグレック-7抗体、抗シグレック-8抗体、抗シグレック-9抗体、抗シグレック-10抗体または抗シグレック-11抗体であり得る。ある態様において、抗シグレック抗体は、抗シグレック-3抗体、抗シグレック-7抗体または抗シグレック-9抗体である。ある態様において、抗シグレック抗体は、抗シグレック-7抗体または抗シグレック-9抗体である。
【００３９】
別の局面において、本発明は、シグレック-3阻害剤(例えば抗シグレック-3抗体)による治療に応答する可能性がある癌または炎症性障害を有する被験体を同定する方法に関する。該方法は、試料中にシグレック-3リガンドが存在する場合に、被験体由来の試料と、本明細書に記載される多量体タンパク質を、多量体タンパク質が多量体タンパク質-シグレック-3リガンド複合体を形成する条件下で接触させる工程、およびもしあれば、複合体の存在を検出する工程を含み、ここで複合体の存在は、被験体がシグレック-3阻害剤による治療に応答することを示す。
【００４０】
別の局面において、本発明は、シグレック-5阻害剤(例えば抗シグレック-5抗体)による治療に応答する可能性がある癌または炎症性障害を有する被験体を同定する方法に関する。該方法は、試料中にシグレック-5リガンドが存在する場合に、被験体由来の試料と、本明細書に記載される多量体タンパク質を、多量体タンパク質が多量体タンパク質-シグレック-5リガンド複合体を形成する条件下で接触させる工程、およびもしあれば、複合体の存在を検出する工程を含み、ここで複合体の存在は、被験体がシグレック-5阻害剤による治療に応答することを示す。
【００４１】
別の局面において、本発明は、シグレック-6阻害剤(例えば抗シグレック-6抗体)による治療に応答する可能性がある癌または炎症性障害を有する被験体を同定する方法に関する。該方法は、試料中にシグレック-6リガンドが存在する場合に、被験体由来の試料と、本明細書に記載される多量体タンパク質を、多量体タンパク質が多量体タンパク質-シグレック-6リガンド複合体を形成する条件下で接触させる工程、およびもしあれば、複合体の存在を検出する工程を含み、ここで複合体の存在は、被験体がシグレック-6阻害剤による治療に応答することを示す。
【００４２】
別の局面において、本発明は、シグレック-7阻害剤(例えば抗シグレック-7抗体)による治療に応答する可能性がある癌または炎症性障害を有する被験体を同定する方法に関する。該方法は、試料中にシグレック-7リガンドが存在する場合に、被験体由来の試料と、本明細書に記載される多量体タンパク質(例えば配列番号：7を含むポリペプチドを含む多量体タンパク質)を、多量体タンパク質が多量体タンパク質-シグレック-7リガンド複合体を形成する条件下で接触させる工程、およびもしあれば、複合体の存在を検出する工程を含み、ここで複合体の存在は、被験体がシグレック-7阻害剤による治療に応答することを示す。
【００４３】
別の局面において、本発明は、シグレック-8阻害剤(例えば抗シグレック-8抗体)による治療に応答する可能性がある癌または炎症性障害を有する被験体を同定する方法に関する。該方法は、試料中にシグレック-8リガンドが存在する場合に、被験体由来の試料と、本明細書に記載される多量体タンパク質を、多量体タンパク質が多量体タンパク質-シグレック-8リガンド複合体を形成する条件下で接触させる工程、およびもしあれば、複合体の存在を検出する工程を含み、ここで複合体の存在は、被験体がシグレック-8阻害剤による治療に応答することを示す。
【００４４】
別の局面において、本発明は、シグレック-9阻害剤(例えば抗シグレック-9抗体)による治療に応答する可能性がある癌または炎症性障害を有する被験体を同定する方法に関する。該方法は、試料中にシグレック-9リガンドが存在する場合に、被験体由来の試料と、本明細書に記載される多量体タンパク質(例えば配列番号：8を含むポリペプチドを含む多量体タンパク質)を、多量体タンパク質が多量体タンパク質-シグレック-9リガンド複合体を形成する条件下で接触させる工程、およびもしあれば、複合体の存在を検出する工程を含み、ここで複合体の存在は、被験体がシグレック-9阻害剤による治療に応答することを示す。
【００４５】
別の局面において、本発明は、シグレック-10阻害剤(例えば抗シグレック-10抗体)による治療に応答する可能性がある癌または炎症性障害を有する被験体を同定する方法に関する。該方法は、試料中にシグレック-10リガンドが存在する場合に、被験体由来の試料と、本明細書に記載される多量体タンパク質を、多量体タンパク質が多量体タンパク質-シグレック-10リガンド複合体を形成する条件下で接触させる工程、およびもしあれば、複合体の存在を検出する工程を含み、ここで複合体の存在は、被験体がシグレック-10阻害剤による治療に応答することを示す。
【００４６】
別の局面において、本発明は、シグレック-11阻害剤(例えば抗シグレック-11抗体)による治療に応答する可能性がある癌または炎症性障害を有する被験体を同定する方法に関する。該方法は、試料中にシグレック-11リガンドが存在する場合に、被験体由来の試料と、本明細書に記載される多量体タンパク質を、多量体タンパク質が多量体タンパク質-シグレック-11リガンド複合体を形成する条件下で接触させる工程、およびもしあれば、複合体の存在を検出する工程を含み、ここで複合体の存在は、被験体がシグレック-11阻害剤による治療に応答することを示す。
【００４７】
別の局面において、本発明は、癌または炎症性障害の治療を必要とする被験体において癌または炎症性障害を治療する方法に関し、該方法は、被験体にシグレック-3阻害剤(例えば抗シグレック-3抗体)の有効量を投与し、それにより該被験体において癌を治療する工程を含み、ここで癌は、本明細書に記載される方法により、シグレック-3リガンドを発現する癌性細胞を含むものとして同定される。
【００４８】
別の局面において、本発明は、癌または炎症性障害の治療を必要とする被験体において癌または炎症性障害を治療する方法に関し、該方法は、被験体にシグレック-5阻害剤(例えば抗シグレック-5抗体)の有効量を投与し、それにより該被験体において癌を治療する工程を含み、ここで癌は、本明細書に記載される方法により、シグレック-5リガンドを発現する癌性細胞を含むものとして同定される。
【００４９】
別の局面において、本発明は、癌または炎症性障害の治療を必要とする被験体において癌または炎症性障害を治療する方法に関し、該方法は、被験体に、シグレック-6阻害剤(例えば抗シグレック-6抗体)の有効量を投与し、それにより該被験体において癌を治療する工程を含み、ここで癌は、本明細書に記載される方法により、シグレック-6リガンドを発現する癌性細胞を含むものとして同定される。
【００５０】
別の局面において、本発明は、癌または炎症性障害の治療を必要とする被験体において癌または炎症性障害を治療する方法に関し、該方法は、被験体に、シグレック-7阻害剤(例えば抗シグレック-7抗体)の有効量を投与し、それにより該被験体において癌を治療する工程を含み、ここで癌は、本明細書に記載される方法により、シグレック-7リガンドを発現する癌性細胞を含むものとして同定される。
【００５１】
別の局面において、本発明は、癌または炎症性障害の治療を必要とする被験体において癌または炎症性障害を治療する方法に関し、該方法は、被験体に、シグレック-8阻害剤(例えば抗シグレック-8抗体)の有効量を投与し、それにより該被験体において癌を治療する工程を含み、ここで癌は、本明細書に記載される方法により、シグレック-8リガンドを発現する癌性細胞を含むものとして同定される。
【００５２】
別の局面において、本発明は、癌または炎症性障害の治療を必要とする被験体において癌または炎症性障害を治療する方法に関し、該方法は、被験体に、シグレック-9阻害剤(例えば抗シグレック-9抗体)の有効量を投与し、それにより該被験体において癌を治療する工程を含み、ここで癌は、本明細書に記載される方法により、シグレック-9リガンドを発現する癌性細胞を含むものとして同定される。
【００５３】
別の局面において、本発明は、癌または炎症性障害の治療を必要とする被験体において癌または炎症性障害を治療する方法に関し、該方法は、被験体に、シグレック-10阻害剤(例えば抗シグレック-10抗体)の有効量を投与し、それにより該被験体において癌を治療する工程を含み、ここで癌は、本明細書に記載される方法により、シグレック-10リガンドを発現する癌性細胞を含むものとして同定される。
【００５４】
別の局面において、本発明は、癌または炎症性障害の治療を必要とする被験体において癌または炎症性障害を治療する方法に関し、該方法は、被験体に、シグレック-11阻害剤(例えば抗シグレック-11抗体)の有効量を投与し、それにより該被験体において癌を治療する工程を含み、ここで癌は、本明細書に記載される方法により、シグレック-11リガンドを発現する癌性細胞を含むものとして同定される。
【００５５】
ある態様において、試料は、組織試料、体液試料または細胞試料から選択される。ある態様において、癌は上皮癌である。ある態様において、上皮癌は、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮頸癌、外陰癌、子宮癌、ファローピウス管癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、泌尿器癌、膀胱癌、頭頸部癌、口腔癌または肝臓癌である。
【００５６】
本発明のこれらおよび他の局面および特徴は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲において説明される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
図面の説明
本発明は、以下の図面を参照してより完全に理解され得る。
【図１】図1は、種々の例示的な組み換えタンパク質立体配置を示し、図1Aは「二量体」と称される二量体の二価タンパク質立体配置を示し、図1Bは「dragonfly」と称される二量体の四価タンパク質立体配置を示し、図1Cは「butterfly」と称される二量体の四価タンパク質立体配置を示し、図1Dは「hydra」と称される六量体の六価タンパク質立体配置を示す。
【図２−１】図2Aは、シグレック-7二量体、dragonfly、butterflyおよびhydraを示す一連のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(「SDS-PAGE」)ゲルである。それぞれのゲルは、非還元(赤色でない)および還元(赤色)条件下の精製されたタンパク質を示す。
【図２−２】図2Bは、シグレック-7二量体、dragonfly、butterflyおよびhydraを示す一連のサイズ排除クロマトグラフィー高速液体クロマトグラフィー(「SEC-HPLC」)プロットである。それぞれのプロットは280nMでの吸光度を示す。670kDa、158kDaおよび44kDa分子量標準についての保持時間を記す。
【図３−１】図3Aは、Octet結合分析により測定したシグレック-7 hydra、dragonfly、butterflyおよび二量体のシアル酸ポリマーへの結合を示す折れ線グラフである。市販のシグレック-7二量体(R&D systems)を対照として使用した。
【図３−２】図3Bは、Octet結合分析により測定したシグレック-7 hydra結合の速度論を示す折れ線グラフである。シグレック-7 hydraは、0.1±0.025nMの見かけの結合親和性を有した。
【図３−３】図3Cは、蛍光細胞分析分離装置(「FACS」)により測定したシグレック-7 hydra、dragonfly、butterflyおよび二量体のシアル酸グリカン発現T47D癌細胞への結合を示す折れ線グラフである。
【図４−１】図4Aは、FACSにより測定した、シアリダーゼ処理ありまたはなしでのシグレック-7 hydraのT47D細胞への結合を示すプロットである。図4Bは、FACSにより測定したシグレック-7 hydraおよびシグレック-7 R124K hydraのT47D細胞への結合を示す折れ線グラフである。
【図４−２】図4Cは、Octetにより測定したシグレック-7 hydraおよびシグレック-7 R124K hydraのシアル酸ポリマーへの結合を示す折れ線グラフである。
【図５−１】図5Aは、シグレック-9 hydraを示すSEC-HPLCプロットである。該プロットは280nMでの吸光度を示す。670kDa、158kDa、44kDa、17kDaおよび1.4kDa分子量標準についての保持時間を記す。
【図５−２】図5Bは、Octet結合分析により測定したシグレック-9 hydraおよび二量体の結合を示す折れ線グラフである。
【図５−３】図5Cは、FACSにより測定したシグレック-9 hydraのシアル酸グリカン発現HT-29乳癌細胞への結合を示す折れ線グラフである。図5Dは、FACSにより測定したシグレック-9 hydraのHT-29 UDP-N-アセチルグルコサミン-2-エピメラーゼノックアウト(「HT-29 GNE KO」)細胞への結合を示す折れ線グラフである。
【図６】図6Aは、FACSにより測定したシグレック-9 hydraおよびシグレック-9 R120K hydraのK562細胞への結合を示す折れ線グラフである。図6Bは、Octetにより測定したシグレック-9 hydraおよびシグレック-9 R120K hydraのシアル酸ポリマーへの結合を示す折れ線グラフである。
【図７−１】図7Aは、FACSにより測定したT47D乳癌細胞に結合するシグレック-7 hydraおよびシグレック-9 hydraを示す折れ線グラフである。図7Bは、FACSにより測定したK562骨髄性白血病細胞に結合するシグレック-7 hydraおよびシグレック-9 hydraを示す折れ線グラフである。図7Cは、FACSにより測定したBT-20乳癌細胞に結合するシグレック-7 hydraおよびシグレック-9 hydraを示す折れ線グラフである。
【図７−２】図7Dは、FACSにより測定したEMT6乳癌細胞に結合するシグレック-7 hydraおよびシグレック-9 hydraを示す折れ線グラフである。図7Eは、FACSにより測定したHT-29結腸癌細胞に結合するシグレック-7 hydraおよびシグレック-9 hydraを示す折れ線グラフである。図7Fは、FACSにより測定したHT-29 GNE KO細胞に結合するシグレック-7 hydraおよびシグレック-9 hydraを示す折れ線グラフである。
【図７−３】図7Gは、FACSにより測定したA549肺癌細胞に結合するシグレック-7 hydraおよびシグレック-9 hydraを示す折れ線グラフである。図7Hは、FACSにより測定したA549 GNE KO細胞に結合するシグレック-7 hydraおよびシグレック-9 hydraを示す折れ線グラフである。
【図８】図8Aは、実施例2に記載されるようにシグレック-9 hydraを使用した免疫組織化学によりシグレック-9リガンドについて染色した黒色腫腫瘍組織試料および対応する非癌性組織試料の画像を示す。図8Bは、実施例2に記載されるようにシグレック-9 hydraを使用した免疫組織化学によりシグレック-9リガンドについて染色した乳癌腫瘍組織試料および対応する非癌性組織試料の画像を示す。染色シグナルは、-、+、++、+++、++++および+++++と示される6個の群に定性的に分類し、-は陰性染色を示し、+〜+++++はだんだん強くなる染色を示した。
【図９−１】図9は、実施例3に記載される結合アッセイに使用した100 N-グリカンアレイ(Z Biotech, Colorado)中のグリカン構造を示す。
【図９−２】図9は、実施例3に記載される結合アッセイに使用した100 N-グリカンアレイ(Z Biotech, Colorado)中のグリカン構造を示す。
【図９−３】図9は、実施例3に記載される結合アッセイに使用した100 N-グリカンアレイ(Z Biotech, Colorado)中のグリカン構造を示す。
【図９−４】図9は、実施例3に記載される結合アッセイに使用した100 N-グリカンアレイ(Z Biotech, Colorado)中のグリカン構造を示す。
【図９−５】図9は、実施例3に記載される結合アッセイに使用した100 N-グリカンアレイ(Z Biotech, Colorado)中のグリカン構造を示す。
【図１０】図10は、図9に示される100個のN-グリカンアレイへのシグレック-9 hydraの結合を示す。結合は、2つの異なるバッファ：DB1(50mMリン酸ナトリウムバッファ(pH5.8))；およびDB2(25mM酢酸ナトリウム(pH6.0))中で測定した。シグレック-9 hydraはα2,3およびα2,6シアル酸結合を含むグリカン構造に結合した。
【図１１−１】図11は、実施例3に記載される結合アッセイに使用したNeu5Ac/Neu5Gcグリカンアレイ(Z Biotech, Colorado)におけるグリカン構造を示す。
【図１１−２】図11は、実施例3に記載される結合アッセイに使用したNeu5Ac/Neu5Gcグリカンアレイ(Z Biotech, Colorado)におけるグリカン構造を示す。
【図１１−３】図11は、実施例3に記載される結合アッセイに使用したNeu5Ac/Neu5Gcグリカンアレイ(Z Biotech, Colorado)におけるグリカン構造を示す。
【図１１−４】図11は、実施例3に記載される結合アッセイに使用したNeu5Ac/Neu5Gcグリカンアレイ(Z Biotech, Colorado)におけるグリカン構造を示す。
【図１１−５】図11は、実施例3に記載される結合アッセイに使用したNeu5Ac/Neu5Gcグリカンアレイ(Z Biotech, Colorado)におけるグリカン構造を示す。
【図１２】図12は、図11に示されるNeu5Ac/Neu5Gcグリカンアレイへのシグレック-9 hydraの結合を示す。結合は50mMリン酸ナトリウムバッファ(pH5.8)中で測定した。シグレック-9 hydraはα2,3およびα2,6シアル酸結合を含むグリカン構造に結合した。
【図１３】図13は、実施例3に記載される結合アッセイに使用したグリコスフィンゴリピドグリカンアレイ(Z Biotech, Colorado)におけるグリカン構造を示す。
【図１４】図14は、図13に示されるグリコスフィンゴリピドグリカンアレイへのシグレック-7 hydraの結合を示す。結合は50mMリン酸ナトリウムバッファ(pH5.8)中で測定した。シグレック-7 hydraは、それぞれα2,8シアル酸結合を含むG11、G12、G13、G14、G15、G18、G19、G20、G21、G22、G23、G25、G27、G28、G30、G31およびG32グリカン構造に結合した。また、シグレック-7 hydraは、それぞれα2,3シアル酸結合を含むG1、G2、G26、G37、G38およびG48グリカン構造に結合した。
【図１５−１】図15は、シグレック-7 hydra (Hydra-7；左)およびシグレック-9 hydra (Hydra-9；右)を用いたパラフィン包埋ヒト腫瘍生検スライドの連続切片の代表的なIHC染色を示す。付随のHスコアも示す。図15Aおよび15Bは、ある範囲のHスコアを有する独立した結腸直腸癌試料の染色を示し、図15Cは、ある範囲のHスコアを有する独立した肺癌試料の染色を示す。
【図１５−２】図15Aおよび15Bは、ある範囲のHスコアを有する独立した結腸直腸癌試料の染色を示し、図15Cは、ある範囲のHスコアを有する独立した肺癌試料の染色を示す。
【図１５−３】図15Aおよび15Bは、ある範囲のHスコアを有する独立した結腸直腸癌試料の染色を示し、図15Cは、ある範囲のHスコアを有する独立した肺癌試料の染色を示す。
【図１６】図16は、示された癌にわたる平均Hスコアによるシグレック-7 hydra (S7-リガンド)、シグレック-9 hydra (S9-リガンド)およびMAL IIのIHC染色の比較を示す。
【図１７】図17は、特定の例示的なhydra立体配置の概略図を示す。シグレック-9 ECDを有するHydra-9、シグレック-7 ECDを有するHydra-7およびシグレック-3 ECDを有するHydra 3についてバージョン1.0構築物を示す。バージョン1.0構築物は6個のポリペプチドを含み、それぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、シグレックECD(円はV-setドメインを示し、楕円はC2-setドメインを示す)、三量体化(フォルドン)ドメイン(ひし形)およびFcドメイン(波線および長方形)を含む。シグレック-3 ECDを有するHydra-3についてバージョン2.0構築物を示す。バージョン2.0構築物は6個のポリペプチドを含み、それぞれはN末端からC末端の方向で、シグレックECD、Fcドメインおよび三量体化(フォルドン)ドメインを有する。
【図１８】図18A〜Dは、シグレック-3のFC二量体(Sig3、図18A)と比較した、種々のHydra 3バージョン(Hydra 3バージョン1.0、「Sig3 Hydra」(図18B)；Hydra 3バージョン1.1(図18C)；Hydra 3バージョン2.0(図18D))のSECクロマトグラムを提供する。Hydra 3バージョン2.0の予測分子量(MW)は340kDである。670kDおよび158kDのMW標準の保持時間も示す。
【図１９】図19は、GNE Knock Out(シアル酸を提示しない「GNE KO」系統)を用いたA549と比較した、Hydra 3によるA549細胞のシアル酸依存的染色を示すFACS結合分析を示す。
【図２０−１】図20Aは、Hydra 3-結合消失(loss of binding)(LOB)変異R121KおよびR121Aと比較した、Hydra 3のシアル酸発現K562癌細胞への結合を示す結合曲線を示す。
【図２０−２】図20Bは、Hydra 3-結合消失(LOB)変異R121KおよびR121Aと比較した、K562細胞表面リガンドHydra 3のシアル酸依存的染色を示すFACS結合分析を示す。用語「2ndary」は陰性対照を表す。
【図２１】図21は、2つのSDS-PAGEゲル、非還元ゲルおよび還元ゲルを示す。WT Hydra 9構築物は凝集する(非還元ゲルの一番上のより高いMW構築物参照)。2つのシステイン残基を除去したHydra 9構築物の二重変異体(DM)形態(C141SおよびC278Y)はより低い凝集を示す。
【図２２】図22は、Hydra 9のWT形態がHydra 9二重変異体(DM)構築物(C141SおよびC278Y変異を含む)と比較して、さらなるより高いMW構造を示すことを示すSECクロマトグラムを示し、WT形態がDMよりも大きな凝集を示すことが示唆される。
【図２３】図23は、Hydra 3のシアリダーゼ前処理(コレラ菌(VC)シアリダーゼまたはアルスロバクター・ウレファシエンス(Arthrobacter Ureafaciens)(Arthro)シアリダーゼを使用)が、K562細胞表面リガンドへの結合を増加させることを示す3つのFACS曲線図(curve diagram)および対応する棒グラフを示す。
【図２４】図24は、Hydra 9構築物をVCシアリダーゼで前処理することにより収率が向上される(例えば一実験においてWTについて24%から55%、または別の実験において27%から65%)ことを示すチャート図を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
詳細な説明
本発明は部分的に、例えば目的の試料中のシグレックリガンドを検出するため、および/またはシグレック媒介障害の治療を必要とする被験体においてシグレック媒介障害を治療するために使用され得る組み換えポリペプチドの発見に基づく。ある態様において、組み換えポリペプチドは、(非共有的および/または共有的に)会合して、例えば目的の試料中のシグレックリガンドを検出するため、および/またはシグレック媒介障害の治療を必要とする被験体においてシグレック媒介障害を治療するために使用され得る多量体タンパク質を生じる。
【００５９】
I. シグレックおよびシグレック生物学
シグレック(シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン)は、シアル酸に結合する細胞表面タンパク質である。シグレックは、シアログリカンに結合する表面受容体のレクチンファミリーを構成し、細胞型および分化に依存的な様式で造血系の細胞上に優先的に発現される。少なくとも14の異なる哺乳動物シグレックがあり、これらは一緒になって、細胞表面受容体-リガンド相互作用に基づいて、多くの異なる機能を提供する。これらの受容体-グリカン相互作用は、特に、細胞接着および細胞シグナル伝達を媒介し得る。シアル酸は遍在的に、典型的に糖タンパク質および脂質の末端位置に発現されるが、非常に特異的な独特のシアログリカン構造のみが、同一性および末端近くの炭水化物部分への結合に依存して、個々のシグレックにより認識される。
【００６０】
シグレックは、アミノ末端が細胞外空間に位置し、カルボキシ末端が細胞質内に位置するI型膜貫通タンパク質である。それぞれのシグレックは、シアル酸の結合受容体として働くN末端V-set免疫グロブリン様ドメイン(Igドメイン)を含む。シグレックは、レクチンであり、レクチンドメインが免疫グロブリンフォールドであるためにI型レクチンの群に分類される。全てのシグレックは、結合活性を有さないC2-setドメインが介在することにより、細胞表面から伸長する。シグレックは、これらのC2-setドメインの数が異なる。これらのタンパク質はIgドメインを含むので、免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)のメンバーである。
【００６１】
ほとんどのシグレックおよび特にCD33様シグレックは、それらの細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)(ITIM)を含む。これらは、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based cativation motif) (ITAM)により誘導されるものなどのリン酸化に関与するシグナル伝達経路を下方制御するように働く。
【００６２】
それらのITIM含有細胞質ドメインのために、ほとんどのCD33様シグレックは、細胞のシグナル伝達に干渉し、それにより免疫細胞活性化を阻害する。一旦それらのリガンドに結合すると、これらのシグレックは、それらのITIMドメインを介してSHPホスファターゼなどの阻害性タンパク質を補充する。ITIMに含まれるチロシンは、リガンド結合の際にリン酸化され、SHPホスファターゼと同様にSH2ドメイン含有タンパク質についてのドッキング部位として働く。これは細胞性タンパク質の脱リン酸化をもたらし、シグナル伝達経路の活性化を下方制御する。
【００６３】
シグレックは、それらの細胞型特異的発現パターン、エンドサイトーシス特性、特定のリンパ腫/白血病での高い発現および受容体シグナル伝達を調節する能力のために、魅力的な治療標的となっている。今日まで、シグレック標的化に基づく治療は、腫瘍細胞を直接標的化する抗体系およびグリカン系の戦略を含む。悪性細胞の表面上のシグレックを直接標的化するいくつかの抗体系治療は、現在臨床評価を受けており、リンパ腫/白血病および自己免疫疾患の治療のために開発が続けられている(Angata et al. (2015) Trends in Pharmacological Sciences, 36(10): 645-660)。
【００６４】
増加する多数の証拠は、腫瘍進行の種々の病理生理学的段階でのグリカンおよび特にシアログリカンについての役割を支持する。グリカンは、腫瘍増殖、浸潤、血行性の転移および新脈管形成を制御する(Fuster et al. (2005) Nat. Rev. Cancer 5(7): 526-42)。細胞表面糖コンジュゲートのシアリル化は、癌において頻繁に変化し、この疾患の特異的マーカーであるシアリル化腫瘍関連炭水化物抗原の発現を生じる。シアリル化グリカンは多くの生物学的プロセスに関連するので、腫瘍細胞によるシアリル化グリカンの発現はしばしば、腫瘍の攻撃性および転移可能性の増加と関連する。
【００６５】
例示的なヒトシグレック-1タンパク質のアミノ酸配列は配列番号：15に提供され(NCBI参照配列：NP＿075556.1)、例示的なヒトシグレック-1タンパク質をコードするDNA配列は配列番号：16に提供される(NCBI参照配列：NM＿023068.3)。例示的なヒトシグレック-2タンパク質のアミノ酸配列は配列番号：17に提供され(NCBI参照配列：NP＿001762.2)、例示的なヒトシグレック-2タンパク質をコードするDNA配列は配列番号：18に提供される(NCBI参照配列：NM＿001771.3)。例示的なヒトシグレック-3タンパク質のアミノ酸配列は配列番号：19に提供され(NCBI参照配列：NP＿001763.3)、例示的なヒトシグレック-3タンパク質をコードするDNA配列は配列番号：20に提供される(NCBI参照配列：NM＿001772.3)。例示的なヒトシグレック-4タンパク質のアミノ酸配列は配列番号：21に提供され(NCBI参照配列：NP＿002352.1)、例示的なヒトシグレック-4タンパク質をコードするDNA配列は配列番号：22に提供される(NCBI参照配列：NM＿002361.3)。例示的なヒトシグレック-5タンパク質のアミノ酸配列は配列番号：23に提供され(NCBI参照配列：NP＿003821.1)、例示的なヒトシグレック-5タンパク質をコードするDNA配列は配列番号：24に提供される(NCBI参照配列：NM＿003830)。例示的なヒトシグレック-6タンパク質のアミノ酸配列は配列番号：25に提供され(NCBI参照配列：NP＿001236.4)、例示的なヒトシグレック-6タンパク質をコードするDNA配列は配列番号：26に提供される(NCBI参照配列：NM＿198845.5)。例示的なヒトシグレック-7タンパク質のアミノ酸配列は配列番号：27に提供され(NCBI参照配列：NP＿055200.1)、例示的なヒトシグレック-7タンパク質をコードするDNA配列は配列番号：28に提供される(NCBI参照配列：NM＿014385.3)。例示的なヒトシグレック-8タンパク質のアミノ酸配列は配列番号：29に提供され(NCBI参照配列：NP＿055257.2)、例示的なヒトシグレック-8タンパク質をコードするDNA配列は配列番号：30に提供される(NCBI参照配列：NM＿014442.2)。例示的なヒトシグレック-9タンパク質のアミノ酸配列は配列番号：31に提供され(NCBI参照配列：NP＿055256.1)、例示的なヒトシグレック-9タンパク質をコードするDNA配列は配列番号：32に提供される(NCBI参照配列：NM＿014441.2)。例示的なヒトシグレック-10タンパク質のアミノ酸配列は配列番号：33に提供され(NCBI参照配列：NP＿149121.2)、例示的なヒトシグレック-10タンパク質をコードするDNA配列は配列番号：34に提供される(NCBI参照配列：NM＿033130.4)。例示的なヒトシグレック-11タンパク質のアミノ酸配列は配列番号：35に提供され(NCBI参照配列：NP＿443116.2)、例示的なヒトシグレック-11タンパク質をコードするDNA配列は配列番号：36に提供される(NCBI参照配列：NM＿052884.2)。例示的なヒトシグレック-12タンパク質のアミノ酸配列は配列番号：37に提供され(NCBI参照配列：NP＿443729.1)、例示的なヒトシグレック-12タンパク質をコードするDNA配列は配列番号：38に提供される(NCBI参照配列：NM＿053003.3)。例示的なヒトシグレック-14タンパク質のアミノ酸配列は配列番号：39に提供され(NCBI参照配列：NP＿001092082.1)、例示的なヒトシグレック-14タンパク質をコードするDNA配列は配列番号：40に提供される(NCBI参照配列：NM＿001098612.1)。例示的なヒトシグレック-15タンパク質のアミノ酸配列は配列番号：41に提供され(NCBI参照配列：NP＿998767.1)、例示的なヒトシグレック-15タンパク質をコードするDNA配列は配列番号：42に提供される(NCBI参照配列：NM＿213602.2)。
【００６６】
II. ポリペプチド
本開示は、1つ以上のレクチンドメイン、1つ以上の二量体化ドメインおよび/または1つ以上の三量体化ドメインを含む単離されたポリペプチドを提供する。レクチン、二量体化および/または三量体化ドメイン(1つまたは複数)は、任意の方向で結合(例えば共有結合)されて一緒になり得る。レクチン、二量体化および/または三量体化ドメイン(1つまたは複数)は、直接または間接的に例えばリンカーにより結合されて一緒になり得る。
【００６７】
例えば、ポリペプチドは、レクチンドメイン、三量体化ドメインおよび二量体化ドメインを含み得る。ある態様において、レクチンドメイン、三量体化ドメインおよび二量体化ドメインは、N末端からC末端の方向で共有結合されて一緒になる。
【００６８】
ポリペプチドは、第1のレクチンドメイン、第2のレクチンドメインおよび二量体化ドメインを含み得る。ある態様において、第1のレクチンドメインおよび第2のレクチンドメインは同一である。ある態様において、第1のレクチンドメイン、第2のレクチンドメインおよび二量体化ドメインは、N末端からC末端の方向で共有結合されて一緒になる。ある態様において、第1のレクチンドメイン、二量体化ドメインおよび第2のレクチンドメインは、N末端からC末端の方向で共有結合されて一緒になる。
【００６９】
ある態様において、ポリペプチドは、配列番号：7もしくは配列番号：8のアミノ酸配列、または配列番号：7もしくは配列番号：8のアミノ酸配列に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、ポリペプチドは、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11もしくは配列番号：12のアミノ酸配列、または配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11もしくは配列番号：12のアミノ酸配列に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７０】
配列同一性は、当該分野の技術の範囲内にある種々の方法で、例えば公的に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign (DNASTAR)ソフトウェアを使用して決定され得る。プログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxにより使用されるアルゴリズムを使用したBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)分析(Karlin et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Altschul, (1993) J. Mol. Evol. 36, 290-300; Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402、参照により援用される)は、配列類似性の検索のために調整される。配列データベースの検索における基本的な問題の議論については、参照により十分に援用されるAltschul et al., (1994) Nature Genetics 6:119-129参照。当業者は、比較される配列の全長にわたり最大の整列(alignment)を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメーターを決定し得る。ヒストグラム、ディスクリプション、アラインメント、エクスペクト(すなわちデータベース配列に対する適合を報告するための統計的有意さ閾値)、カットオフ、マトリックスおよびフィルターについての検索パラメーターは、デフォルト設定にある。blastp、blastx、tblastnおよびtblastxにより使用されるデフォルトスコアリングマトリックスは、BLOSUM62マトリックスである(Henikoff et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919、参照により十分に援用される)。4つのBlastnパラメーターは以下の通りに調整され得る：Q=10(ギャップ生成ペナルティー)；R=10(ギャップ伸長ペナルティー(gap extension penalty))；wink=1(クエリに沿ってwink.sup.thの位置毎にワードヒットを生じる)；およびgapw=16(ギャップのあるアラインメントが生成されるウィンドウ幅を設定する)。同等のblastpパラメーター設定は、Q=9；R=2；wink=1；およびgapw=32であり得る。検索はまた、NCBI (National Center for Biotechnology Information) BLAST Advanced Optionパラメーターを使用して実施され得る(例えば：-G、オープンギャップについてのコスト[整数]：デフォルト=ヌクレオチドについて5/タンパク質について11；-E、伸長ギャップについてのコスト[整数]：デフォルト=ヌクレオチドについて2/タンパク質について1；-q、ヌクレオチドミスマッチについてのペナルティー[整数]：デフォルト=-3；-r、ヌクレオチド適合についての報酬(reward)[整数]：デフォルト=1；-e、予測値[実数]：デフォルト=10；-W、ワードサイズ[整数]：デフォルト=ヌクレオチドについて11/megablastについて28/タンパク質について3；-y、ビットでのblast伸長についてのドロップオフ(X)：デフォルト=blastnについて20/その他について7；-X、ギャップのあるアラインメントについてのXドロップオフ値(ビット(in bit))：デフォルト=全てのプログラムについて15であるがblastnには適用可能ではない；および-Z、ギャップのあるアラインメントについての最終Xドロップオフ値(ビット)：blastnについて50、その他について25)。ペアワイズタンパク質アラインメントについてのClustalWも使用され得る(デフォルトパラメータは、例えばBlosum62マトリックスおよびギャップオープンペナルティー(Gap Opening Penalty)=10およびギャップ伸長ペナルティー=0.1を含み得る)。GCGパッケージバージョン10.0において利用可能な配列間の最適合比較はDNAパラメーターGAP=50(ギャップ生成ペナルティー)およびLEN=3(ギャップ伸長ペナルティー)を使用し、タンパク質比較における同等の設定はGAP=8およびLEN=2である。
【００７１】
a. レクチンドメイン
本明細書で使用する場合、レクチンドメインは、炭水化物に結合し得るアミノ酸の配列をいう。レクチンドメインは、典型的に、レクチンタンパク質(レクチン)に由来する。レクチンは、構造に応じて異なるファミリーに分類され、カルネキシンファミリーレクチン、C型レクチン、P-型レクチン、I-型レクチン(シグレックを含む)、R-型レクチン、ガレクチン、F-ボックスレクチン、フィコリン、キチナーゼ様レクチン、F-型レクチンおよびインテレクチン(intelectin)を含む。本明細書における使用に適したレクチンドメインは、マンノース結合レクチン、例えばコンカナバリンA(ConA)、ヒラマメ(Lentil)レクチン(LCH)およびスノードロップレクチン(GNA)；ガラクトース/N-アセチルガラクトサミン結合レクチン、例えばリシンまたはトウゴマ凝集素またはRCE120(RCA)、ラッカセイ凝集素(PNA)、Jacalin (AIL)およびヘアリーベッチ(Hairy vetch)レクチン(VVL)；N-アセチルグルコサミン(Acetylaglucosamine)結合レクチン、例えばコムギ胚芽凝集素(WGA)；N-アセチルノイラミン酸(acetylaneuraminic acid)結合レクチン、例えばニワトコレクチン(SNA)、イヌエンジュ白血球凝集素(MAL)およびイヌエンジュ血球凝集素(MAH)；ならびにフコース結合レクチン、例えばコマツナギ凝集素(UEA)およびヒイロチャワンタケレクチン(AAL)に由来し得る。
【００７２】
ある態様において、レクチンドメインは、シグレックタンパク質由来のレクチンドメインを含む。シグレックは、2〜17個の細胞外ドメインで構成される細胞表面膜貫通受容体である。例えば、レクチンドメインは、シグレックシアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメインもしくはそのバリアントおよび/またはシグレック細胞外ドメインもしくはそのバリアントを含み得る。ある態様において、シグレックシアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメインのバリアントまたはシグレック細胞外ドメインのバリアントは、野生型対応物と比較して1つ以上のアミノ酸変化を有するが、野生型対応物と比較して少なくとも20%結合親和性、少なくとも30%結合親和性、少なくとも40%結合親和性、少なくとも50%結合親和性、少なくとも60%結合親和性、少なくとも70%結合親和性、少なくとも80%結合親和性、少なくとも90%結合親和性、少なくとも95%結合親和性または少なくとも100%結合親和性を保持するシグレックシアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメインまたはシグレック細胞外ドメインである。シグレックシアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメインまたは細胞外ドメインが由来するシグレックは、哺乳動物シグレック、例えばヒト、サル、イヌ、ラットまたはマウスのシグレックであり得る。
【００７３】
ある態様において、シグレックはヒトシグレックである。ある態様において、シグレックは、シグレック-1、シグレック-2、シグレック-3、シグレック-4、シグレック-5、シグレック-6、シグレック-7、シグレック-8、シグレック-9、シグレック-10、シグレック-11、シグレック-12、シグレック-14またはシグレック-15であり得る。ある態様において、シグレックは、シグレック-3、シグレック-5、シグレック-6、シグレック-7、シグレック-8、シグレック-9、シグレック-10またはシグレック-11であり得る。ある態様において、シグレックはシグレック-7またはシグレック-9であり得る。
【００７４】
ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-1 V-set免疫グロブリン様ドメイン、例えば配列番号：15のアミノ酸残基21〜136を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：15のアミノ酸残基21〜136に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-1細胞外ドメイン、例えば配列番号：15のアミノ酸残基20〜1642を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：15のアミノ酸残基20〜1642に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７５】
ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-2 V-set免疫グロブリン様ドメイン、例えば配列番号：17のアミノ酸残基24〜122を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：17のアミノ酸残基24〜122に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-2細胞外ドメイン、例えば配列番号：17のアミノ酸残基20〜688を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：17のアミノ酸残基20〜688に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７６】
ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-3 V-set免疫グロブリン様ドメイン、例えば配列番号：19のアミノ酸残基23〜139を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：19のアミノ酸残基23〜139に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-3細胞外ドメイン、例えば配列番号：19のアミノ酸残基18〜260を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：19のアミノ酸残基18〜260に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７７】
ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-4 V-set免疫グロブリン様ドメイン、例えば配列番号：21のアミノ酸残基22〜139を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：21のアミノ酸残基22〜139に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-4細胞外ドメイン、例えば配列番号：21のアミノ酸残基20〜157を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：21のアミノ酸残基20〜157に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７８】
ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-5 V-set免疫グロブリン様ドメイン、例えば配列番号：23のアミノ酸残基21〜140を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：23のアミノ酸残基21〜140に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-5細胞外ドメイン、例えば配列番号：23のアミノ酸残基17〜442を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：23のアミノ酸残基17〜442に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７９】
ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-6 V-set免疫グロブリン様ドメイン、例えば配列番号：25のアミノ酸残基31〜141を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：25のアミノ酸残基31〜141に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-6細胞外ドメイン、例えば配列番号：25のアミノ酸残基27〜348を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：25のアミノ酸残基27〜348に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８０】
ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-7 V-set免疫グロブリン様ドメイン、例えば配列番号：27のアミノ酸残基26〜144、配列番号：27のアミノ酸残基31〜122、配列番号：1または配列番号：43を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：27のアミノ酸残基26〜144、配列番号：27のアミノ酸残基31〜122、配列番号：1または配列番号：43に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-7 V-Set免疫グロブリン様ドメインおよび1つのシグレック-7 C2-Setドメイン、例えば配列番号：3を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：3に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-7細胞外ドメイン、例えばシグレック-7 V-Set免疫グロブリン様ドメインおよび2つのシグレック-7 C2-Setドメイン、配列番号：27のアミノ酸残基19〜357または配列番号：13を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：27のアミノ酸残基19〜357または配列番号：13に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８１】
ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-8 V-set免疫グロブリン様ドメイン、例えば配列番号：29のアミノ酸残基27〜151を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：29のアミノ酸残基27〜151に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-8細胞外ドメイン、例えば配列番号：29のアミノ酸残基17〜364を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：29のアミノ酸残基17〜364に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８２】
ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-9 V-set免疫グロブリン様ドメイン、例えば配列番号：31のアミノ酸残基23〜144、配列番号：31のアミノ酸残基23〜140、配列番号：2または配列番号：44を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：31のアミノ酸残基23〜144、配列番号：31のアミノ酸残基23〜140、配列番号：2または配列番号：44に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-9 V-Set免疫グロブリン様ドメインおよび1つのシグレック-9 C2-Setドメイン、例えば配列番号：4を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：4に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-9細胞外ドメイン、例えばシグレック-9 V-Set免疫グロブリン様ドメインおよび2つのシグレック-9 C2-Setドメイン、例えば配列番号：31のアミノ酸残基18〜348または配列番号：14を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：31のアミノ酸残基18〜348または配列番号：14に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８３】
ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-10 V-set免疫グロブリン様ドメイン、例えば配列番号：33のアミノ酸残基23〜140を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：33のアミノ酸残基23〜140に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-10細胞外ドメイン、例えば配列番号：33のアミノ酸残基17〜551を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：33のアミノ酸残基17〜551に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８４】
ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-11 V-set免疫グロブリン様ドメイン、例えば配列番号：35のアミノ酸残基34-153を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：35のアミノ酸残基34〜153に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-11細胞外ドメイン、例えば配列番号：35のアミノ酸残基28〜562を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：35のアミノ酸残基28〜562に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８５】
ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-12 V-set免疫グロブリン様ドメイン、例えば配列番号：37のアミノ酸残基24〜142を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：37のアミノ酸残基24〜142に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-12細胞外ドメイン、例えば配列番号：37のアミノ酸残基19〜482を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：37のアミノ酸残基19〜482に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８６】
ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-14 V-set免疫グロブリン様ドメイン、例えば配列番号：39のアミノ酸残基21〜140を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：39のアミノ酸残基21〜140に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-14細胞外ドメイン、例えば配列番号：39のアミノ酸残基17〜359を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：39のアミノ酸残基17〜359に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８７】
ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-15 V-set免疫グロブリン様ドメイン、例えば配列番号：41のアミノ酸残基44〜150を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：41のアミノ酸残基44〜150に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-15細胞外ドメイン、例えば配列番号：41のアミノ酸残基20〜264を含む。ある態様において、レクチンドメインは、配列番号：41のアミノ酸残基20〜264に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-3 V-Set免疫グロブリン様ドメイン、例えば配列番号：51、シグレック-7 V-Set免疫グロブリン様ドメイン、例えば配列番号：1もしくは配列番号：43、またはシグレック-9 V-Set免疫グロブリン様ドメイン、例えば配列番号：2もしくは配列番号：44を含む。ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-3 V-Set免疫グロブリン様ドメインおよび1つのシグレック-3 C2-Setドメイン、例えば配列番号：52を含む。ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-7 V-Set免疫グロブリン様ドメインおよび1つのシグレック-7 C2-Setドメイン、例えば配列番号：3を含む。ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-9 V-Set免疫グロブリン様ドメインおよび1つのシグレック-9 C2-Setドメイン、例えば配列番号：4を含む。ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-7 V-Set免疫グロブリン様ドメインおよび2つのシグレック-7 C2-Setドメイン、例えば配列番号：13を含む。ある態様において、レクチンドメインは、シグレック-9 V-Set免疫グロブリン様ドメインおよび2つのシグレック-9 C2-Setドメイン、例えば配列番号：14を含む。
【００８８】
ある態様において、レクチンドメインは、少なくとも1つの野生型システイン残基の置換を含む。例えば、ある態様において、レクチンドメインはヒトシグレック-9由来であり、レクチンドメインは、野生型ヒトシグレック-9の141位に対応する位置でシステイン残基の置換を含み、例えば野生型ヒトシグレック-9の141位に対応する位置のシステイン残基はセリンで置換される(C141S)。ある態様において、レクチンドメインはヒトシグレック-9由来であり、レクチンドメインは、野生型ヒトシグレック-9の278位に対応する位置でシステイン残基の置換を含み、例えば野生型ヒトシグレック-9の278位に対応する位置のシステイン残基はトレオニンで置換される(C278T)。
【００８９】
ある態様において、シグレックはマウスシグレックである。マウスシグレックは、例えばSigE、SigF、SigGまたはSigFであり得る。
【００９０】
ある態様において、レクチンドメインは、C型レクチンドメインを含む。C型レクチンは、例えばCLEC1A、CLEC1B、CLEC2A、CLEC2B、CD69(CLEC2C)、CLEC2D、CLEC2L、CLEC3A、CLEC3B、CLEC4A、CLEC4C、CLEC4D、CLEC4E、CLEC4F、CLEC4G、ASGR1(CLEC4H1)、ASGR2 (CLEC4H2)、FCER2(CLEC4J)、CD207(CLEC4K)、CD209(CLEC4L)、CLEC4M、CLEC5A、CLEC6A、CLEC7A、OLR1(CLEC8A)、CLEC9A、CLEC10A、CLEC11A、CLEC12A、CLEC12B、CD302(CLEC13A)、LY75(CLEC13B)、PLA2R1(CLEC13C)、MRC1(CLEC13D)、MRC2(CLEC13E)、CLEC14A、CLEC16A、CLEC17A、KLRA1、KLRB1(CLEC5B)、KLRC1、KLRC2、KLRC3、KLRC4、KLRD1、KLRF1(CLEC5C)、KLRG1(CLEC15A)、KLRG2(CLEC15B)またはKLRK1であり得る。ある態様において、C型レクチンは、CLEC4A、CLEC12AおよびCLEC12Bから選択される。
【００９１】
b. 二量体化ドメイン
本明細書で使用する場合、二量体は、2つの単量体(2つの単量体サブユニット)の複合体をいい、二量体化ドメインは、共有および/または非共有的会合もしくは二量体中の2つの単量体の間の相互作用を媒介するかまたはそうでなければそれらを高めるアミノ酸の配列をいう。したがって、二量体は、第2の二量体化ドメインに優先的に結合する第1の二量体化ドメインを含み得る。二量体は、ホモ二量体であり得、ここで2つの単量体サブユニットは同一であるか、またはヘテロ二量体であり、ここで2つの単量体サブユニットは異なる。同様に、二量体化ドメインは、ホモ二量体化ドメインであり得、ここでホモ二量体化ドメインは同一の第2の二量体化ドメインに優先的に結合するか、またはヘテロ二量体化ドメインであり得、ここでヘテロ二量体化ドメインは異なる第2の二量体化ドメインに優先的に結合する。
【００９２】
ドメインに関して使用される場合、用語「優先的に結合する」または「特異的に結合する」は、標的分子以外の分子と結合および/または会合するよりも、(i)安定に、(ii)迅速に、(iii)強い親和性で、(iv)大きな持続時間でまたは(v)(i)〜(iv)のいずれか2つ以上の組合せで特定の標的分子(例えばタンパク質、炭水化物、糖タンパク質または糖脂質)と結合および/または会合するドメインをいう。例えば、第2の二量体化ドメインに特異的または優先的に結合する第1の二量体化ドメインは、例えば異なるドメインに結合するよりも強い親和性で、アビディティで、容易におよび/または大きな持続時間で第2の二量体化ドメインに結合する第1の二量体化ドメインである。第1の二量体化ドメインは、表面プラズモン共鳴により測定する場合に、第2の二量体化ドメインに対して約100nM、50nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.1nMもしくは0.01nMまたはそれより強い親和性を有し得る。例えば、第1の二量体化ドメインは、第2の二量体化ドメインに対して約0.01nM〜約100nM、約0.1nM〜約100nMまたは約1nM〜約100nMの範囲内の親和性を有し得る。第1の標的分子に優先的に結合するドメインは、第2の標的に優先的に結合し得るかまたは結合し得ないことが理解される。このように、「優先的な結合(preferential binding)」は、排他的な結合を(含み得るが)必ずしも必要としない。
【００９３】
ある態様において、二量体化ドメインは天然の二量体化ドメインまたは合成の二量体化ドメインである。ある態様において、二量体化ドメインは、免疫グロブリンFcドメイン、ロイシンジッパー系、コイルドコイル系およびヘリックス系の二量体化ドメインから選択される。
【００９４】
ある態様において、二量体化ドメインは、免疫グロブリンFcドメイン(本明細書においてFcドメインとも称される)、例えばマウスまたはヒト免疫グロブリンFcドメインである。本明細書で使用する場合、そうではないと示されない限り、用語「免疫グロブリンFcドメイン」は、単独または第2の免疫グロブリンFcドメインとの組合せのいずれかで、Fc受容体に結合し得る免疫グロブリン重鎖定常領域の断片をいう。免疫グロブリンFcドメインは、例えば免疫グロブリンCH2およびCH3ドメインを含み得る。免疫グロブリンFcドメインは、例えば免疫グロブリンCH2およびCH3ドメインならびに免疫グロブリンヒンジ領域を含み得る。免疫グロブリンヒンジ領域、CH2およびCH3ドメインの間の境界は当該技術分野で周知であり、例えばPROSITEデータベース(prosite.expasy.orgでワールドワイドウェブ上で利用可能)において見られ得る。
【００９５】
ある態様において、免疫グロブリンFcドメインは、ヒト免疫グロブリンFcドメイン、例えばヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgDまたはIgE Fcドメインである。ある態様において、免疫グロブリンFcドメインは、FcγRIIB1またはFcγRIIB2 Fc受容体に結合するFcドメインである。ある態様において、免疫グロブリンFcドメインは、マウス免疫グロブリンFcドメイン、例えばマウスIgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgM、IgA、IgDまたはIgE Fcドメインである。ある態様において、免疫グロブリンFcドメインは、マウスIgG2a免疫グロブリンFcドメイン、例えば配列番号：6を含むマウスIgG2a免疫グロブリンFcドメインである。
【００９６】
c. 三量体化ドメイン
本明細書で使用する場合、三量体は、3つの単量体(3つの単量体サブユニット)の複合体をいい、三量体化ドメインは、共有および/または非共有的会合もしくは三量体中の3つの単量体の間の相互作用を媒介するかまたはそうでなければそれらを高めるアミノ酸の配列をいう。したがって、三量体は、第2の三量体化ドメインおよび第3の三量体化ドメインに優先的に結合する第1の三量体化ドメインを含み得る。三量体は、ホモ三量体であり得、ここで3つの単量体サブユニットは同一であるか、またはヘテロ三量体であり、ここで3つの単量体サブユニットは異なる。同様に、三量体化ドメインは、ホモ三量体化ドメインであり得、ここでホモ三量体化ドメインは同一の第2および第3の三量体化ドメインに優先的に結合するか、またはヘテロ三量体化ドメインであり得、ここでヘテロ三量体化ドメインは異なる第2または第3の三量体化ドメインに優先的に結合する。
【００９７】
ある態様において、三量体化ドメインは、天然の三量体化ドメインまたは合成の三量体化ドメインである。ある態様において、三量体化ドメインは、T4ファージフィブリチン(フォルドン)、クラスリン、熱ショック因子1、コラーゲン、血球凝集素、GCN4、GCN4系イソロイシンジッパーおよびコイルドコイルペプチド三量体化ドメインから選択される。ある態様において、三量体化ドメインは、GCN4系イソロイシンジッパーおよびT4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメインから選択される。ある態様において、三量体化ドメインは、T4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメイン、例えば配列番号：5である。
【００９８】
d. リンカー
ある態様において、レクチン、二量体化および/または三量体化ドメインは、直接結合または融合されて一緒になりポリペプチドを形成する。他の態様において、レクチン、二量体化および/または三量体化ドメインは、1つ以上の介在リンカー配列により共有結合されて一緒になり得る。
【００９９】
リンカーは、1つ以上の天然のアミノ酸、レクチン、二量体化および/または三量体化ドメインと連結し得、ここでアミノ酸(例えば、システインアミノ酸)は、部位特異性(site-directed)突然変異誘発により導入され得る。リンカーは、1つ以上の非天然のアミノ酸を含み得る。特定の状況において、例えば1つ以上のスルフヒドリル反応性基(例えばマレイミド)を含むリンカーは、天然に存在するシステイン残基であるかまたは部位特異的(site-specific)突然変異誘発の産物であるレクチン、二量体化および/または三量体化ドメイン中のシステインと共有結合し得ることが企図される。
【０１００】
リンカーは、切断可能リンカーまたは非切断可能リンカーであり得る。任意にまたはさらに、リンカーは可撓性リンカーまたは非可撓性リンカーであり得る。
【０１０１】
リンカーは、レクチン、二量体化および/または三量体化ドメインが互いからの立体障害なく結合されることを可能にするのに十分な長さであり、ポリペプチドの意図された活性を保持するのに十分な短さであるべきである。リンカーは、好ましくはポリペプチドの不安定性を回避するかまたは最小化するのに十分に親水性である。リンカーは、好ましくはポリペプチドの不溶性を回避するかまたは最小化するのに十分に親水性である。リンカーは、融合タンパク質がインビボで適切に作用し得るように、インビボで、十分に安定である(例えば血清、酵素等で切断されない)べきである。
【０１０２】
リンカーは、約1オングストローム(Å)〜約150Åの長さ、または約1Å〜約120Åの長さ、または約5Å〜約110Åの長さ、または約10Å〜約100Åの長さであり得る。リンカーは、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、27、30オングストロームもしくはそれ以上より長い長さおよび/または約110、100、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31Åもしくはそれ以下未満の長さであり得る。さらに、リンカーは、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110および120Åの長さであり得る。
【０１０３】
ある態様において、リンカーは、ポリペプチドのレクチン、二量体化および/または三量体化ドメインを連結または融合させるポリペプチドリンカーを含む。例えば、直接または間接的に(例えばアミノ酸含有リンカーを介して)二量体化および/または三量体化ドメインに連結されるレクチンドメインをコードする遺伝子は、従来の組み換えDNA技術を使用して作製され得、発現され得ることが企図される。例えば、レクチンドメインのアミノ末端は、二量体化または三量体化ドメインのカルボキシ末端に結合され得る。リンカーを使用する場合、リンカーは、好ましくは、親水性アミノ酸残基、例えばGln、Ser、Gly、Glu、Pro、HisおよびArgを含む。ある態様において、リンカーは、1〜25アミノ酸残基、1〜20アミノ酸残基、2〜15アミノ酸残基、3〜10アミノ酸残基、3〜7アミノ酸残基、4〜25アミノ酸残基、4〜20アミノ酸残基、4〜15アミノ酸残基、4〜10アミノ酸残基、5〜25アミノ酸残基、5〜20アミノ酸残基、5〜15アミノ酸残基または5〜10アミノ酸残基を含むペプチドである。例示的なリンカーとしては、グリシンおよびセリンリッチリンカー、例えば(GlyGlyPro)n(配列番号：70)または(GlyGlyGlyGlySer)n(配列番号：71)が挙げられ、ここでnは1〜5である。ある態様において、リンカーは(GlyGlyGlyGlySer)3(配列番号：72)である。ある態様において、リンカーは(Gly4Ser)2(配列番号：69)である。さらなる例示的なリンカー配列は、例えばGeorge et al. (2003) Protein Engineering 15:871-879、ならびに米国特許第5,482,858号および同5,525,491号に開示される。
【０１０４】
e. 多量体タンパク質
別の局面において、本発明は、本明細書に開示されるようなポリペプチドを含む多量体タンパク質に関する。ある態様において、多量体タンパク質は、二量体、三量体、七量体または十二量体である。ある態様において、多量体タンパク質は七量体である。ある態様において、多量体タンパク質は、六量体タンパク質を生じるように複合体化される、本明細書に記載されるような6個の別々のポリペプチドを含む。ある態様において、多量体タンパク質は、二量体タンパク質を生じるように、それぞれのポリペプチドのそれぞれの二量体化ドメインを介して二量体化される2つの別々のポリペプチドを含む。
【０１０５】
ある態様において、多量体タンパク質は、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法により測定する場合に、.01nM〜100nMのKDで炭水化物リガンドに結合する。ある態様において、KDは、10nM、1nM、0.1nMまたはそれ以下である。ある態様において、KDは、1nM、0.1nMまたはそれ以下である。ある態様において、炭水化物リガンドはシグレックリガンドである。ある態様において、シグレックリガンドは、シグレック-1、シグレック-2、シグレック-3、シグレック-4、シグレック-5、シグレック-6、シグレック-7、シグレック-8、シグレック-9、シグレック-10、シグレック-11、シグレック-12、シグレック-14およびシグレック-15リガンドから選択される。ある態様において、シグレックリガンドは、シグレック-3、シグレック-5、シグレック-6、シグレック-7、シグレック-8、シグレック-9、シグレック-10およびシグレック-11リガンドから選択される。ある態様において、シグレックリガンドは、シグレック-7およびシグレック-9リガンドから選択される。ある態様において、シグレックリガンドは、α2,3結合シアル酸、α2,6結合シアル酸、シアリルルイスX、NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc、NeuGcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-6GalNAc、Galβ1-3(NeuAcα2-6)GalNAc、NeuGcα2-6Galβ1-4Glc、NeuGcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-6GalNAc、NeuAcα2-8NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc6S、NeuAcα2-3Galβ1-4GalNAc、NeuAcα2-8NeuAc、NeuAcα2-3GalβSβ1-4GlcNAcα2-3FucおよびNeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc6Sα2-3Fuc(式中Sは硫酸塩を表す)から選択される。ある態様において、シグレックリガンドは、α2,3結合シアル酸、α2,6結合シアル酸およびシアリルルイスXから選択される。
【０１０６】
別の局面において、本発明は、2個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック系シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック系C2-setドメイン、第2のシグレック系シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第2のシグレック系C2-setドメインおよびFcドメインを含む。2つのポリペプチドは、それらのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化され得る。ある態様において、それぞれのポリペプチドは、第1のシグレック系C2-setドメインと第2のシグレック系シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメインの間にリンカーを含む。
【０１０７】
別の局面において、本発明は、2個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック系シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック系C2-setドメイン、第2のシグレック系C2-setドメイン、Fcドメイン、第2のシグレック系シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第3のシグレック系C2-setドメインおよび第4のシグレック系C2-setドメインを含む。2つのポリペプチドは、それらのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化され得る。ある態様において、それぞれのポリペプチドは、Fcドメインと第2のシグレック系シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメインの間にリンカーを含む。
【０１０８】
別の局面において、本発明は、6個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック系シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック系C2-setドメイン、第2のシグレック系C2-setドメイン、三量体化ドメイン(例えばT4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメイン)およびFcドメインを含む。任意に、ポリペプチドの構成要素のいずれかの間でリンカーが使用され得る。ある態様において、a)第1、第2および第3のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで(共有的および/または非共有的に)三量体化され；b)第4、第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで(共有的および/または非共有的に)三量体化され；c)第1および第2のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化され；d)第3および第4のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化され；e)第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化される。
【０１０９】
別の局面において、本発明は、6個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、1つ以上のC2-setドメイン、任意にリンカー、T4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメインおよびFcドメインを含む。ある態様において、a)第1、第2および第3のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで(共有的および/または非共有的に)三量体化され；b)第4、第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで(共有的および/または非共有的に)三量体化され；c)第1および第2のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化され；d)第3および第4のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化され；e)第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化される。
【０１１０】
別の局面において、本発明は、6個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、1つ以上(例えば1つまたは2つ)のC2-setドメイン、Fcドメイン、任意にリンカー、T4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメインを含む。任意に、ポリペプチドの構成要素のいずれかの間でリンカーが使用され得る。ある態様において、a)第1、第2および第3のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで(共有的および/または非共有的に)三量体化され；b)第4、第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで(共有的および/または非共有的に)三量体化され；c)第1および第2のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化され；d)第3および第4のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化され；e)第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化される。
【０１１１】
別の局面において、本発明は、2個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-3シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-3 C2-setドメイン、第2のシグレック-3シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第2のシグレック-3 C2-setドメインおよびFcドメインを含み、2つのポリペプチドは、それらのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化される。ある態様において、それぞれのポリペプチドは、第1のシグレック-3 C2-setドメインと第2のシグレック-3シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメインの間にリンカーを含む。
【０１１２】
別の局面において、本発明は、2個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-3シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-3 C2-setドメイン、第2のシグレック-3 C2-setドメイン、Fcドメイン、第2のシグレック-3シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第3のシグレック-3 C2-setドメインおよび第4のシグレック-3 C2-setドメインを含み、2つのポリペプチドは、それらのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化される。ある態様において、それぞれのポリペプチドは、Fcドメインと第2のシグレック-3シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメインの間にリンカーを含む。
【０１１３】
別の局面において、本発明は、6個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-3シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-3 C2-setドメイン、T4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメインおよびFcドメインを含み：a)第1、第2および第3のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで(共有的および/または非共有的に)三量体化され；b)第4、第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで(共有的および/または非共有的に)三量体化され；c)第1および第2のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化され；d)第3および第4のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化され；e)第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化される。
【０１１４】
別の局面において、本発明は、6個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-3シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、シグレック-3 C2-setドメイン、任意にリンカー、T4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメインおよびFcドメインを含み：a)第1、第2および第3のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで(共有的および/または非共有的に)三量体化され；b)第4、第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで(共有的および/または非共有的に)三量体化され；c)第1および第2のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化され；d)第3および第4のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化され；e)第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化される。
【０１１５】
別の局面において、本発明は、6個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-3シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、シグレック-3 C2-setドメイン、Fcドメイン、任意にリンカー、T4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメインを含み：a)第1、第2および第3のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで(共有的および/または非共有的に)三量体化され；b)第4、第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで(共有的および/または非共有的に)三量体化され；c)第1および第2のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化され；d)第3および第4のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化され；e)第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化される。
【０１１６】
別の局面において、本発明は、2個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-7シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-7 C2-setドメイン、第2のシグレック-7シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第2のシグレック-7 C2-setドメインおよびFcドメインを含み、2つのポリペプチドは、それらのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化される。ある態様において、それぞれのポリペプチドは、第1のシグレック-7 C2-setドメインと第2のシグレック-7シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメインの間にリンカーを含む。
【０１１７】
別の局面において、本発明は、2個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-7シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-7 C2-setドメイン、第2のシグレック-7 C2-setドメイン、Fcドメイン、第2のシグレック-7シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第3のシグレック-7 C2-setドメインおよび第4のシグレック-7 C2-setドメインを含み、2つのポリペプチドは、それらのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化される。ある態様において、それぞれのポリペプチドは、Fcドメインと第2のシグレック-7シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメインの間にリンカーを含む。
【０１１８】
別の局面において、本発明は、6個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-7シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-7 C2-setドメイン、第2のシグレック-7 C2-setドメイン、T4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメインおよびFcドメインを含み：a)第1、第2および第3のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで(共有的および/または非共有的に)三量体化され；b)第4、第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで(共有的および/または非共有的に)三量体化され；c)第1および第2のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化され；d)第3および第4のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化され；e)第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化される。
【０１１９】
別の局面において、本発明は、6個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-7シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、1つ以上(例えば1つまたは2つ)のシグレック-7 C2-setドメイン(1つまたは複数)、Fcドメイン、任意にリンカー、T4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメインを含み：a)第1、第2および第3のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで(共有的および/または非共有的に)三量体化され；b)第4、第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで(共有的および/または非共有的に)三量体化され；c)第1および第2のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化され；d)第3および第4のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化され；e)第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化される。
【０１２０】
別の局面において、本発明は、2個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-9シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-9 C2-setドメイン、第2のシグレック-9シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第2のシグレック-9 C2-setドメインおよびFcドメインを含み、2つのポリペプチドは、それらのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化される。ある態様において、それぞれのポリペプチドは、第1のシグレック-9 C2-setドメインと第2のシグレック-9シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメインの間にリンカーを含む。
【０１２１】
別の局面において、本発明は、2個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-9シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-9 C2-setドメイン、第2のシグレック-9 C2-setドメイン、Fcドメイン、第2のシグレック-9シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第3のシグレック-9 C2-setドメインおよび第4のシグレック-9 C2-setドメインを含み、2つのポリペプチドは、それらのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化される。ある態様において、それぞれのポリペプチドは、Fcドメインと第2のシグレック-9シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメインの間にリンカーを含む。
【０１２２】
別の局面において、本発明は、6個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-9シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、第1のシグレック-9 C2-setドメイン、第2のシグレック-9 C2-setドメイン、T4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメインおよびFcドメインを含み：a)第1、第2および第3のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで(共有的および/または非共有的に)三量体化され；b)第4、第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで(共有的および/または非共有的に)三量体化され；c)第1および第2のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化され；d)第3および第4のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化され；e)第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化される。
【０１２３】
別の局面において、本発明は、6個のポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供し、ここでそれぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、第1のシグレック-9シアル酸結合V-set免疫グロブリン様ドメイン、1つ以上(例えば1つまたは2つ)のシグレック-9 C2-setドメイン(1つまたは複数)、1つ以上(例えば1つまたは2つ)のFcドメイン、任意にリンカー、T4ファージフィブリチン(フォルドン)三量体化ドメインを含み：a)第1、第2および第3のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで(共有的および/または非共有的に)三量体化され；b)第4、第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれの三量体化ドメインで(共有的および/または非共有的に)三量体化され；c)第1および第2のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化され；d)第3および第4のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化され；e)第5および第6のポリペプチドは、それらのそれぞれのFcドメインで(共有的および/または非共有的に)二量体化される。
【０１２４】
ある態様において、多量体タンパク質は、配列番号：7または配列番号：8を含むポリペプチドを含む。ある態様において、多量体タンパク質は、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：53、配列番号：55、配列番号：57、配列番号：59、配列番号：60、配列番号：61、配列番号：62、配列番号：63、配列番号：64もしくは配列番号：67、またはそれらに対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。ある態様において、多量体タンパク質は、配列番号：53、配列番号：55、配列番号：57、配列番号：59、配列番号：60、配列番号：61、配列番号：62、配列番号：63、配列番号：64または配列番号：67を含むポリペプチドを含み、ここで最初の19アミノ酸(MGWSCIILFLVATATGVHS、リーダー配列)は存在しない。
【０１２５】
II. ポリペプチドおよび/または多量体タンパク質を作製する方法
ポリペプチドおよび/または多量体タンパク質、例えば本明細書に開示されるもの、抗体または抗体コンジュゲート、例えば本明細書に開示されるものを作製する方法は当該技術分野で公知である。例えば、レクチンドメイン、二量体化ドメインおよび/または三量体化ドメインをコードするDNA分子は、化学的にまたは組み換えDNA法により合成され得る。例えば、レクチンドメイン、二量体化ドメインおよび/または三量体化ドメインの配列は、適切な合成核酸プライマーを使用して、従来のハイブリダイゼーション技術またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術により合成され得るかまたはライブラリーからクローニングされ得る。目的のレクチンドメイン、二量体化ドメインおよび/または三量体化ドメインをコードする得られたDNA分子を、例えば発現制御配列などの他の適切なヌクレオチド配列にライゲーションして、所望の抗体をコードする従来の遺伝子発現構築物(すなわち発現ベクター)を作製し得る。所定の遺伝子構築物の作製は当該技術分野の通常の技術の範囲内である。
【０１２６】
所望の組み換えポリペプチドをコードする核酸を、発現ベクターに組み込み得(ライゲーションし得)、これを従来のトランスフェクションまたは形質転換技術により宿主細胞に導入し得る。例示的な宿主細胞は、大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胚性腎臓293(HEK 293)細胞、HeLa細胞、乳児ハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(例えばHep G2)および他の方法ではIgGタンパク質を産生しない骨髄腫細胞である。形質転換された宿主細胞を、宿主細胞がレクチンドメイン、二量体化ドメインおよび/または三量体化ドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝子を発現する条件下で増殖させ得る。
【０１２７】
特定の発現および精製条件は、使用する発現系に応じて変化する。例えば、遺伝子が大腸菌において発現される場合、該遺伝子は最初に、適切な細菌性プロモーター、例えばTrpまたはTacおよび原核細胞シグナル配列の下流に遺伝子工学的に作り変えられた遺伝子を配置することにより発現ベクター内にクローニングされる。発現されたタンパク質は分泌され得る。発現されたタンパク質は、屈折体(refractile)または封入体内に蓄積し得、フレンチプレスまたは超音波処理による細胞の破壊後に回収され得る。次いで屈折体を可溶化して、当該技術分野で公知の方法により、タンパク質をリフォールディングし得るかおよび/または切断し得る。
【０１２８】
遺伝子工学的に作り変えられた遺伝子が真核生物宿主細胞、例えばCHO細胞中で発現される場合、該遺伝子は最初に、適切な真核生物プロモーター、分泌シグナル、ポリA配列および停止コドンを含む発現ベクターに挿入される。任意に、ベクターまたは遺伝子構築物はエンハンサーおよびイントロンを含み得る。抗体またはその一部を含む融合タンパク質を含む態様において、発現ベクターは任意に、全部または一部をコードし、定常領域の重鎖または軽鎖の全体または一部が発現されることを可能にする配列を含む。遺伝子構築物は、従来技術を使用して真核生物宿主細胞に導入され得る。
【０１２９】
宿主細胞は、レクチンドメイン、二量体化ドメインおよび/または三量体化ドメインまたはそれらの一部を含むポリペプチドを発現する。多量体タンパク質を含むいくつかの態様において、宿主細胞は、レクチンドメイン、二量体化ドメインおよび/または三量体化ドメインを発現するポリペプチドを発現する単一のベクターでトランスフェクトされる。いくつかの態様において、宿主細胞は、発現された場合に多量体タンパク質を形成する1つより多くの発現ベクター(例えばそれぞれは異なるポリペプチドをコードする)で共トランスフェクトされる。
【０１３０】
レクチンドメイン、二量体化ドメインおよび/または三量体化ドメインを含むポリペプチドをコードするDNAは、重複伸長(overlap extension)によりPCRを使用して集合され得、発現ベクター、例えばpCEP (Invitrogen)にクローニングされ得る。レクチンドメイン、二量体化ドメインおよび/または三量体化ドメインを含むポリペプチドをコードする発現ベクターを、例えばExpiFectamine (Invitrogen)を使用して宿主細胞にトランスフェクトし得る。レクチンドメイン、二量体化ドメインおよび/または三量体化ドメインを含むポリペプチドは、かかるポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞、例えばExpi293細胞を、例えばトランスフェクション後6日間、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で増殖(培養)することにより作製され得る。発現後、ポリペプチドは、当該技術分野で公知の技術、例えばグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)もしくはヒスチジンタグなどの親和性タグを用いて、またはプロテインA樹脂により、回収(hervest)され得、精製または単離(すなわち回収(recover))され得る。
【０１３１】
ある態様において、発現された本発明のポリペプチドは、宿主細胞のペリプラズムに分泌されそこから回収される。典型的に、タンパク質回収は、一般的に浸透圧性ショック、超音波処理または溶解などの手段により微生物を破壊することを含む。一旦細胞が破壊されると、細胞残屑または細胞全体は、遠心分離またはろ過により除去され得る。タンパク質は、例えば親和性樹脂クロマトグラフィーによりさらに精製され得る。代替的に、タンパク質は、培養培地に移送されて、そこで単離され得る。細胞は培養物から除去され得、培養上清は、生じたタンパク質のさらなる精製のために、ろ過および濃縮され得る。発現されたポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)およびウエスタンブロットアッセイなどの一般的に公知の方法を使用して、さらに単離および同定され得る。
【０１３２】
ある態様において、ポリペプチドおよび/または多量体タンパク質は、発現、安定性、回収および/またはシアル酸への結合親和性を向上するために、シアリダーゼで処理され得る。本明細書における使用に適切なシアリダーゼとしては、コレラ菌(VC)シアリダーゼまたはアルスロバクター・ウレファシエンスシアリダーゼが挙げられる。ある態様において、回収は、シアリダーゼで処理されていないポリペプチドおよび/または多量体タンパク質と比較して、少なくとも25%、50%、75%、100%、150%、200%、500%向上する。ある態様において、回収は、シアリダーゼで処理されていないポリペプチドおよび/または多量体タンパク質と比較して、約25%〜約500%、例えば約25%〜約200%、約25%〜約150%、約25〜約75%、約25%〜約50%、約50%〜約500%、約50%〜約200%、約50%〜約150%、約50%〜約100%、約50%〜約75%、約75%〜約500%、約75%〜約200%、約75%〜約150%、約75%〜約100%、約100%〜約500%、約100%〜約200%、約100%〜約150%、約150%〜約500%、約150%〜約200%または約200%〜約500%向上される。
【０１３３】
ある態様において、(例えばシアル酸に対する)結合親和性は、シアリダーゼで処理されていないポリペプチドおよび/または多量体タンパク質と比較して、少なくとも約25%〜約500%、例えば約25%〜約200%、約25%〜約150%、約25〜約75%、約25%〜約50%、約50%〜約500%、約50%〜約200%、約50%〜約150%、約50%〜約100%、約50%〜約75%、約75%〜約500%、約75%〜約200%、約75%〜約150%、約75%〜約100%、約100%〜約500%、約100%〜約200%、約100%〜約150%、約150%〜約500%、約150%〜約200%または約200%〜約500%増加する。結合親和性は、例えばFACS分析、Octet結合分析またはグリカンアレイなどの当該技術分野で公知の任意の方法により測定され得る。
【０１３４】
ある態様において、シアリダーゼで処理された多量体タンパク質は、シアリダーゼで処理されていない同様または同じ多量体タンパク質のシアル酸含有量の50%、40%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%または1%未満を含む。
【０１３５】
III. 医薬組成物
治療的用途のために、ポリペプチドおよび/または多量体タンパク質は、好ましくは薬学的に許容され得る担体と組み合される。用語「薬学的に許容され得る」は、本明細書で使用する場合、正常な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症なく、妥当な利益/リスク比に釣り合って、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適した化合物、材料、組成物および/または剤型をいう。
【０１３６】
用語「薬学的に許容され得る担体」は、本明細書で使用する場合、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症なく、妥当な利益/リスク比に釣り合って、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適したバッファ、担体および賦形剤をいう。薬学的に許容され得る担体としては、リン酸緩衝化食塩水溶液、水、エマルジョン(例えば油/水または水/油エマルジョンなど)、および種々の種類の湿潤剤などの標準的な医薬担体のいずれかが挙げられる。該組成物はまた、安定化剤および保存剤を含み得る。担体、安定化剤およびアジュバントの例について、例えば、Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975]参照。薬学的に許容され得る担体としては、薬学的投与に適合性のバッファ、溶媒、分散媒体、コーティング剤、等張剤および吸収遅延剤等が挙げられる。薬学的に活性な物質についてのかかる媒体および薬剤の使用は当該技術分野において公知である。
【０１３７】
ある態様において、医薬組成物は、例えば組成物のpH、容量オスモル濃度、粘度、清澄さ、色、等張性、臭い、滅菌性、安定性、溶解または放出の速度、吸着または浸透力を改変、維持または保存するための製剤材料を含み得る。かかる態様において、適切な製剤材料としては、限定されないが、アミノ酸(グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなど)；抗菌剤：酸化防止剤(アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど)；バッファ(ホウ酸塩、重炭酸塩、Tris-HCl、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸など)；増量剤(マンニトールまたはグリシンなど)；キレート剤(エチレンジアミン四酢酸(EDTA)など)；錯体化剤(カフェイン、ポリビニルピロリドン、βシクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル-βシクロデキストリンなど)；充填剤；単糖類；二糖類；および他の炭水化物(グルコース、マンノースまたはデキストリンなど)；タンパク質(血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど)；着色剤、矯味矯臭剤(flavoring)および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー(ポリビニルピロリドンなど)；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン(ナトリウムなど)；保存剤(塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など)；溶媒(グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど)；糖アルコール(マンニトールまたはソルビトールなど)；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤(プルロニック、PEG、ソルビタンエステル、ポリソルベート20などのポリソルベート、ポリソルベート、トリトン(triton)、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール(tyloxapal)など)；安定性増強剤(スクロースまたはソルビトールなど)；等張性増強剤(アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール ソルビトールなど)；送達ビヒクル：希釈剤；賦形剤および/または医薬アジュバント(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990参照)が挙げられる。
【０１３８】
ある態様において、医薬組成物は、ナノ粒子、例えばポリマーナノ粒子、リポソームまたはミセルを含み得る(Anselmo et al. (2016) Bioeng. Transl. Med. 1: 10-29参照)。
【０１３９】
ある態様において、医薬組成物は、持続または制御送達製剤を含み得る。持続または制御送達手段、例えばリポソーム担体、生体侵食性(bio-erodible)マイクロ粒子または多孔質ビーズおよびデポー注射剤を調製するための技術はまた、当業者に公知である。持続放出調製物は、例えば形作られた物品の形態の多孔質ポリマー性マイクロ粒子または半透過性ポリマーマトリックス、例えばフィルムまたはマイクロカプセルを含み得る。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド、L-グルタミン酸とγエチル-L-グルタミン酸のコポリマー、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート(inethacrylate))、エチレンビニルアセテート、またはポリ-D(-)-3-ヒドロキシ酪酸を含み得る。持続放出組成物はまた、当該技術分野において公知のいくつかの方法のいずれかにより調製され得るリポソームを含み得る。
【０１４０】
本明細書に開示されるポリペプチドおよび/または多量体タンパク質を含む医薬組成物は、単位剤型で存在し得、任意の適切な方法により調製され得る。医薬組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように調製されるべきである。投与経路の例は、静脈内(IV)、皮内、吸入、経皮、局所、経粘膜、鞘内および経直腸の投与である。好ましい投与経路はIV注入である。有用な製剤は、医薬の分野で公知の方法により調製され得る。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990)参照。非経口投与に適切な製剤構成要素は、滅菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えばEDTA；バッファ、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩；および張性の調整のための薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースを含む。
【０１４１】
静脈内投与について、適切な担体としては、生理学的食塩水、静菌水、Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ)またはリン酸緩衝化食塩水(PBS)が挙げられる。担体は、製造および保存の条件下で安定であるべきであり、微生物に対して保護されるべきである。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール)を含む溶媒または分散媒体、ならびにそれらの適切な混合物であり得る。
【０１４２】
好ましくは、医薬製剤は滅菌したものである。滅菌は、任意の適切な方法、例えば滅菌ろ過膜を通したろ過により達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、凍結乾燥および再構成の前または後にろ過滅菌を行い得る。
【０１４３】
本明細書に記載される組成物は、局所または全身に投与され得る。投与は一般的に非経口投与である。好ましい態様において、医薬組成物は皮下投与され、さらにより好ましい態様においては静脈内投与である。非経口投与のための調製物は、滅菌の水性または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンを含む。
【０１４４】
一般的に、活性構成要素、例えばポリペプチドおよび/または多量体タンパク質の治療有効量は、0.1mg/kg〜100mg/kg、例えば1mg/kg〜100mg/kg、1mg/kg〜10mg/kgの範囲である。投与量は、治療される疾患または徴候の種類および程度、患者の全体的な健康、抗体のインビボ効力、医薬製剤および投与経路などの変数に依存する。所望の血液レベルまたは組織レベルを迅速に達成するために、初期用量は、上限を超えて増加され得る。代替的に、初期用量は、最適よりも小さくあり得、日用量は治療経過の間に段々に増加され得る。ヒト用量は、例えば0.5mg/kgから20mg/kgまで行うように設計された従来の第I相用量段階的拡大試験において最適化され得る。投与頻度は、投与経路、投与量、血清半減期、および治療されている疾患などの要因に応じて変化し得る。例示的な投与頻度は、1日に1回、1週間に1回および2週間毎に1回である。好ましい投与経路は非経口、例えば静脈内注入である。ある態様において、ポリペプチドおよび/または多量体タンパク質は、凍結乾燥され、次いで投与の時点で、緩衝化食塩水中で再構成される。
【０１４５】
IV. 検出方法
本明細書に開示される組成物および方法を使用して、試料、例えば被験体由来の試料中の炭水化物、例えばシグレックリガンドを検出し得る。炭水化物は、当該技術分野で公知の技術を使用して、目的の被験体由来の組織、体液および/または細胞試料中で検出され得る。例えば、体液試料は、血液、血清または血漿であり得る。例えば、組織試料は腫瘍組織であり得る。例えば、細胞試料は癌細胞試料であり得る。腫瘍組織または試料のいずれかは、当該技術分野で公知の技術、例えばホルマリン固定、パラフィン包埋切片を使用して保存または処理され得る。
【０１４６】
本発明は、被験体、例えばヒト由来の試料、例えば体液試料、組織試料および/または細胞試料中の炭水化物、例えばシグレックリガンドの存在を検出および/またはその量を定量する方法を提供する。該方法は、試料と、本明細書に記載される多量体タンパク質のいずれか1つを合わせる工程、ならびに試料中に炭水化物が存在する場合に、多量体タンパク質および炭水化物、例えばシグレックリガンドを含む複合体の存在を検出および/またはその量を定量する工程を含む。
【０１４７】
本発明はまた、シグレック阻害剤、例えば抗シグレック抗体による治療に応答する可能性のある癌または炎症性障害を有する被験体を同定する方法を提供する。該方法は、被験体、例えばヒト由来の試料、例えば体液試料、組織試料および/または細胞試料と、本明細書に記載される多量体タンパク質のいずれか1つを合わせる工程、ならびに試料中に炭水化物が存在する場合に、多量体タンパク質および炭水化物、例えばシグレックリガンドを含む複合体の存在を検出するおよび/またはその量を定量する工程を含む。複合体の存在は、被験体がシグレック阻害剤による治療に応答することを示す。
【０１４８】
ある態様において、シグレックリガンドは、シグレック-1、シグレック-2、シグレック-3、シグレック-4、シグレック-5、シグレック-6、シグレック-7、シグレック-8、シグレック-9、シグレック-10、シグレック-11、シグレック-12、シグレック-14およびシグレック-15リガンドから選択される。ある態様において、シグレックリガンドは、シグレック-3、シグレック-5、シグレック-6、シグレック-7、シグレック-8、シグレック-9、シグレック-10およびシグレック-11リガンドから選択される。ある態様において、シグレックリガンドは、シグレック-7およびシグレック-9リガンドから選択される。ある態様において、シグレックリガンドは、α2,3結合シアル酸、α2,6結合シアル酸、シアリルルイスX、NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc、NeuGcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-6GalNAc、Galβ1-3(NeuAcα2-6)GalNAc、NeuGcα2-6Galβ1-4Glc、NeuGcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-6GalNAc、NeuAcα2-8NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc6S、NeuAcα2-3Galβ1-4GalNAc、NeuAcα2-8NeuAc、NeuAcα2-3GalβSβ1-4GlcNAcα2-3FucおよびNeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc6Sα2-3Fuc(式中Sは硫酸塩を表す)から選択される。ある態様において、シグレックリガンドは、α2,3結合シアル酸、α2,6結合シアル酸およびシアリルルイスXから選択される。
【０１４９】
ある態様において、シグレック阻害剤は抗シグレック抗体である。抗シグレック抗体は、例えば抗シグレック-3抗体、抗シグレック-5抗体、抗シグレック-6抗体、抗シグレック-7抗体、抗シグレック-8抗体、抗シグレック-9抗体、抗シグレック-10抗体または抗シグレック-11抗体であり得る。ある態様において、抗シグレック抗体は、抗シグレック-3抗体、抗シグレック-7抗体または抗シグレック-9抗体である。ある態様において、抗シグレック抗体は、抗シグレック-7抗体または抗シグレック-9抗体である。
【０１５０】
本発明はまた、シグレック-3阻害剤(例えば抗シグレック-3抗体)による治療に応答する可能性のある癌または炎症性障害を有する被験体を同定する方法に関する。該方法は、試料中にシグレック-3リガンドが存在する場合、被験体由来の試料と本明細書に記載される多量体タンパク質を、多量体タンパク質が多量体タンパク質-シグレック-3リガンド複合体を形成する条件下で接触させる工程、ならびにもしあれば複合体の存在および/またはその量を検出する工程を含み、ここで複合体の存在および/またはその量は、被験体がシグレック-3阻害剤による治療に応答することを示す。
【０１５１】
本発明はまた、シグレック-5阻害剤(例えば抗シグレック-5抗体)による治療に応答する可能性のある癌または炎症性障害を有する被験体を同定する方法に関する。該方法は、試料中にシグレック-5リガンドが存在する場合に、被験体由来の試料と、本明細書に記載される多量体タンパク質を、多量体タンパク質が多量体タンパク質-シグレック-5リガンド複合体を形成する条件下で接触させる工程、ならびにもしあれば、複合体の存在および/またはその量を検出する工程を含み、ここで複合体の存在および/またはその量は、被験体がシグレック-5阻害剤による治療に応答することを示す。
【０１５２】
本発明はまた、シグレック-6阻害剤(例えば抗シグレック-6抗体)による治療に応答する可能性のある癌または炎症性障害を有する被験体を同定する方法に関する。該方法は、試料中にシグレック-6リガンドが存在する場合に、被験体由来の試料と、本明細書に記載される多量体タンパク質を、多量体タンパク質が多量体タンパク質-シグレック-6リガンド複合体を形成する条件下で接触させる工程、ならびにもしあれば、複合体の存在および/またはその量を検出する工程を含み、ここで複合体の存在および/またはその量は、被験体がシグレック-6阻害剤による治療に応答することを示す。
【０１５３】
本発明はまた、シグレック-7阻害剤(例えば抗シグレック-7抗体)による治療に応答する可能性のある癌または炎症性障害を有する被験体を同定する方法に関する。該方法は、試料中にシグレック-7リガンドが存在する場合に、被験体由来の試料と、本明細書に記載される多量体タンパク質(例えば配列番号：7を含むポリペプチドを含む多量体タンパク質)を、多量体タンパク質が多量体タンパク質-シグレック-7リガンド複合体を形成する条件下で接触させる工程、ならびにもしあれば、複合体の存在および/またはその量を検出する工程を含み、ここで複合体の存在および/またはその量は、被験体がシグレック-7阻害剤による治療に応答することを示す。
【０１５４】
本発明はまた、シグレック-8阻害剤(例えば抗シグレック-8抗体)による治療に応答する可能性のある癌または炎症性障害を有する被験体を同定する方法に関する。該方法は、試料中にシグレック-8リガンドが存在する場合に、被験体由来の試料と、本明細書に記載される多量体タンパク質を、多量体タンパク質が多量体タンパク質-シグレック-8リガンド複合体を形成する条件下で接触させる工程、ならびにもしあれば、複合体の存在および/またはその量を検出する工程を含み、ここで複合体の存在および/またはその量は、被験体がシグレック-8阻害剤による治療に応答することを示す。
【０１５５】
本発明はまた、シグレック-9阻害剤(例えば抗シグレック-9抗体)による治療に応答する可能性のある癌または炎症性障害を有する被験体を同定する方法に関する。該方法は、試料中にシグレック-9リガンドが存在する場合に、被験体由来の試料と、本明細書に記載される多量体タンパク質(例えば配列番号：8を含むポリペプチドを含む多量体タンパク質)を、多量体タンパク質が多量体タンパク質-シグレック-9リガンド複合体を形成する条件下で接触させる工程、ならびにもしあれば、複合体の存在および/またはその量を検出する工程を含み、ここで複合体の存在および/またはその量は、被験体がシグレック-9阻害剤による治療に応答することを示す。
【０１５６】
本発明はまた、シグレック-10阻害剤(例えば抗シグレック-10抗体)による治療に応答する可能性のある癌または炎症性障害を有する被験体を同定する方法に関する。該方法は、試料中にシグレック-10リガンドが存在する場合に、被験体由来の試料と、本明細書に記載される多量体タンパク質を、多量体タンパク質が多量体タンパク質-シグレック-10リガンド複合体を形成する条件下で接触させる工程、ならびにもしあれば、複合体の存在および/またはその量を検出する工程を含み、ここで複合体の存在および/またはその量は、被験体がシグレック-10阻害剤による治療に応答することを示す。
【０１５７】
本発明はまた、シグレック-11阻害剤(例えば抗シグレック-11抗体)による治療に応答する可能性のある癌または炎症性障害を有する被験体を同定する方法に関する。該方法は、試料中にシグレック-11リガンドが存在する場合に、被験体由来の試料と、本明細書に記載される多量体タンパク質を、多量体タンパク質が多量体タンパク質-シグレック-11リガンド複合体を形成する条件下で接触させる工程、ならびにもしあれば、複合体の存在および/またはその量を検出する工程を含み、ここで複合体の存在および/またはその量は、被験体がシグレック-11阻害剤による治療に応答することを示す。
【０１５８】
多量体タンパク質-炭水化物、例えばシグレックリガンドの複合体の存在および/またはその量は、当該技術分野で公知の種々の技術を使用して検出および/または測定され得ることが企図される。1つのアプローチにおいて、多量体タンパク質は、検出可能な標識、例えば放射性標識、蛍光標識、視覚的標識、酵素標識または診断もしくは予後アッセイで有用な他の従来の検出可能な標識に連結され得る。代替的に、多量体タンパク質 炭水化物、例えばシグレックリガンドの複合体の存在および/またはその量は、二次試薬、例えば多量体タンパク質に結合する試薬、例えば検出可能な標識、例えば放射性標識、蛍光標識、視覚的標識、酵素標識または診断もしくは予後アッセイで有用な他の従来の検出可能な標識で標識された例えば抗体を使用することにより検出および/またはされ得る(can be detected and/or using)。
【０１５９】
V. 治療的用途
本明細書に開示される組成物および方法は、被験体においてシグレック媒介障害を治療するために使用され得る。本明細書で使用する場合、用語「シグレック媒介障害」は、シグレック分子により、例えばシグレック分子とシグレックリガンドの間の相互作用により媒介される、高められるまたはそうでなければ促進される障害をいう。
【０１６０】
シグレック媒介障害の例としては、例えば癌、炎症性障害および自己免疫障害が挙げられる。
【０１６１】
本発明は、シグレック媒介障害の治療を必要とする被験体においてシグレック媒介障害を治療する方法を提供する。該方法は、被験体に、組み換えポリペプチドおよび/または多量体タンパク質の有効量を、単独または被験体においてシグレック媒介障害を治療するための別の治療剤と組み合わせのいずれかて投与する工程を含む。ある態様において、シグレック媒介障害は、シグレック-1、シグレック-2、シグレック-3、シグレック-4、シグレック-5、シグレック-6、シグレック-7、シグレック-8、シグレック-9、シグレック-10、シグレック-11、シグレック-12、シグレック-14またはシグレック-15媒介性の障害である。ある態様において、シグレック媒介障害は、シグレック-3、シグレック-5、シグレック-6、シグレック-7、シグレック-8、シグレック-9、シグレック-10またはシグレック-11媒介性の障害である。
【０１６２】
用語「有効量」は、本明細書で使用する場合、有益または所望の結果をもたらすのに十分な活性剤(例えば本発明の組み換えポリペプチドおよび/または多量体タンパク質)の量をいう。有効量は1つ以上の投与、適用または用量において投与され得、特定の製剤または投与経路に限定されることを意図しない。
【０１６３】
本明細書で使用する場合、「治療する(treat)」、「治療すること(treating)」および「治療(treatment)」は、被験体、例えばヒトにおける疾患の治療を意味する。これは、(a)疾患を阻害すること、すなわちその進展を止めること；および(b)疾患を軽減すること、すなわち疾患状態の後退を引き起こすことを含む。本明細書で使用する場合、用語「被験体」および「患者」は、本明細書に記載される方法および組成物により治療される生物をいう。好ましくは、かかる生物としては限定されないが、哺乳動物(例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等)が挙げられ、より好ましくはヒトが挙げられる。
【０１６４】
本明細書に記載される方法および組成物は、単独または他の治療剤および/または様相(modality)と組み合わせて使用され得る。本明細書で使用する場合、用語「組み合わせて」投与されるは、2つ(またはそれ以上)の異なる治療が、障害を有する被験体の苦痛の過程の間に患者に対する治療の効果が時間内の時点で重複するように、被験体に送達されることを意味すると理解される。ある態様において、1つの治療の送達は、第2の送達が始まる際に依然行われているので、投与期間の重複がある。これは時々、本明細書において「同時(simultaneous)」または「同時送達(concurrent delivery)」と称される。他の態様において、1つの治療の送達は、他の治療の送達が開始される前に終了する。いずれかの場合のある態様において、治療は、組み合わされた投与のためにより効果的である。例えば、第2の治療はより効果的であり、例えばより少ない第2の治療により同等の効果が見られるか、または第2の治療は、第2の治療が第1の治療の非存在下で投与される場合に見られるよりも大きな程度に症状を低減し、あるいは第1の治療により同等の状況が見られる。ある態様において、送達は、症状または障害に関連する他のパラメーターの低減が、1つの治療が他の治療の非存在下で送達されることにより観察されるものよりも大きくなるようなものである。2つの治療の効果は、部分的に相加的であり得、全体的に相加的であり得または相加的よりも大きくあり得る。送達は、送達される第1の治療の効果が第2の治療を送達した際に依然として検出可能であるようなものであり得る。ある態様において、本明細書に記載される方法または組成物は、1つ以上のさらなる治療、例えばIDO阻害剤、または免疫チェックポイント阻害剤、例えばPD-1阻害剤、PD-L1阻害剤、CTLA-4阻害剤、アデノシンA2A受容体阻害剤、B7-H3阻害剤、B7-H4阻害剤、BTLA阻害剤、KIR阻害剤、LAG3阻害剤、TEVI-3阻害剤、VISTA阻害剤もしくはTIGIT阻害剤と組み合わせて投与される。
【０１６５】
別の局面において、本発明は、癌の治療を必要とする被験体において癌を治療する方法に関し、該方法は、被験体に、シグレック阻害剤の有効量を投与して、それにより該被験体において癌を治療する工程を含み、ここで癌は、本明細書に記載される方法により、シグレックの1つ以上のリガンドを発現する癌性細胞を含むものとして同定される。
【０１６６】
ある態様において、シグレックリガンドは、シグレック-3、シグレック-5、シグレック-6、シグレック-7、シグレック-8、シグレック-9、シグレック-10またはシグレック-11リガンドである。ある態様において、シグレックリガンドは、シグレック-7またはシグレック-9リガンドである。ある態様において、シグレックリガンドは、α2,3結合シアル酸、α2,6結合シアル酸、シアリルルイスX、NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc、NeuGcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-6GalNAc、Galβ1-3(NeuAcα2-6)GalNAc、NeuGcα2-6Galβ1-4Glc、NeuGcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-6GalNAc、NeuAcα2-8NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc6S、NeuAcα2-3Galβ1-4GalNAc、NeuAcα2-8NeuAc、NeuAcα2-3GalβSβ1-4GlcNAcα2-3FucおよびNeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc6Sα2-3Fuc(式中Sは硫酸塩を表す)から選択される。ある態様において、シグレックリガンドは、α2,3結合シアル酸、α2,6結合シアル酸およびシアリルルイスXから選択される。
【０１６７】
ある態様において、シグレック阻害剤は抗シグレック抗体である。抗シグレック抗体は、例えば抗シグレック-3抗体、抗シグレック-5抗体、抗シグレック-6抗体、抗シグレック-7抗体、抗シグレック-8抗体、抗シグレック-9抗体、抗シグレック-10抗体または抗シグレック-11抗体であり得る。ある態様において、抗シグレック抗体は、抗シグレック-7抗体または抗シグレック-9抗体である。
【０１６８】
別の局面において、本発明は、癌の治療を必要とする被験体において癌を治療する方法に関し、該方法は、被験体に、シグレック-3阻害剤(例えば抗シグレック-3抗体)の有効量を投与して、それにより該被験体において癌を治療する工程を含み、ここで癌は、本明細書に記載される方法により、シグレック-3リガンドを発現する癌性細胞を含むものとして同定される。
【０１６９】
別の局面において、本発明は、癌の治療を必要とする被験体において癌を治療する方法に関し、該方法は、被験体に、シグレック-5阻害剤(例えば抗シグレック-5抗体)の有効量を投与して、それにより該被験体において癌を治療する工程を含み、ここで癌は、本明細書に記載される方法により、シグレック-5リガンドを発現する癌性細胞を含むものとして同定される。
【０１７０】
別の局面において、本発明は、癌の治療を必要とする被験体において癌を治療する方法に関し、該方法は、被験体にシグレック-6阻害剤(例えば抗シグレック-6抗体)の有効量を投与して、それにより該被験体において癌を治療する工程を含み、ここで癌は、本明細書に記載される方法により、シグレック-6リガンドを発現する癌性細胞を含むものとして同定される。
【０１７１】
別の局面において、本発明は、癌の治療を必要とする被験体において癌を治療する方法に関し、該方法は、被験体にシグレック-7阻害剤(例えば抗シグレック-7抗体)の有効量を投与して、それにより該被験体において癌を治療する工程を含み、ここで癌は、本明細書に記載される方法により、シグレック-7リガンドを発現する癌性細胞を含むものとして同定される。
【０１７２】
別の局面において、本発明は、癌の治療を必要とする被験体において癌を治療する方法に関し、該方法は、被験体にシグレック-8阻害剤(例えば抗シグレック-8抗体)の有効量を投与して、それにより該被験体において癌を治療する工程を含み、ここで癌は、本明細書に記載される方法により、シグレック-8リガンドを発現する癌性細胞を含むものとして同定される。
【０１７３】
別の局面において、本発明は、癌の治療を必要とする被験体において癌を治療する方法に関し、該方法は、被験体に、シグレック-9阻害剤(例えば抗シグレック-9抗体)の有効量を投与して、それにより該被験体において癌を治療する工程を含み、ここで癌は、本明細書に記載される方法により、シグレック-9リガンドを発現する癌性細胞を含むものとして同定される。
【０１７４】
別の局面において、本発明は、癌の治療を必要とする被験体において癌を治療する方法に関し、該方法は、被験体に、シグレック-10阻害剤(例えば抗シグレック-10抗体)の有効量を投与して、それにより該被験体において癌を治療する工程を含み、ここで癌は、本明細書に記載される方法により、シグレック-10リガンドを発現する癌性細胞を含むものとして同定される。
【０１７５】
別の局面において、本発明は、癌の治療を必要とする被験体において癌を治療する方法に関し、該方法は、被験体に、シグレック-11阻害剤(例えば抗シグレック-11抗体)の有効量を投与して、それにより該被験体において癌を治療する工程を含み、ここで癌は、本明細書に記載される方法により、シグレック-11リガンドを発現する癌性細胞を含むものとして同定される。
【０１７６】
癌の例としては、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、血液の腫瘍および転移性の病変が挙げられる。血液の腫瘍の例としては、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、B細胞、T細胞またはFAB ALL、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、例えば変形(transformed)CLL、びまん性大B細胞リンパ腫(DLBCL)、濾胞性リンパ腫、毛様細胞性白血病、骨髄異形成症候群(myelodyplastic syndrome)(MDS)、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫またはリクター症候群(リクター形質転換(Richter's Transformation))が挙げられる。固形腫瘍の例としては悪性疾患、例えば種々の臓器系の肉腫、腺癌および癌腫、例えば頭頸部(咽頭を含む)、甲状腺、肺(小細胞または非小細胞肺癌(NSCLC))、乳房、リンパ系、胃腸(例えば口腔、食道、胃、肝臓、膵臓、小腸、結腸および直腸、肛門管)、生殖器および尿生殖器管(例えば腎臓、尿路上皮、膀胱、卵巣、子宮、子宮頸、子宮内膜、前立腺、精巣)、CNS(例えば神経細胞またはグリア細胞、例えば神経芽腫または神経膠腫)、または皮膚(例えば黒色腫)が冒されるものが挙げられる。
【０１７７】
ある態様において、癌は、上皮癌、例えばシアリル化グリカンの発現を上方制御する上皮癌である。例示的な上皮癌としては、限定されないが、子宮内膜癌、結腸癌、卵巣癌、子宮頸癌、外陰癌、子宮癌またはファローピウス管癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、泌尿器癌、膀胱癌、頭頸部癌、口腔癌および肝臓癌が挙げられる。上皮癌としてはまた、癌腫、例えば小葉癌、腺房細胞癌(acinous carcinoma)、腺嚢癌腫(adenocystic carcinoma)、腺様嚢胞癌、腺癌腫(carcinoma adenomatosum)、副腎皮質の癌腫、肺胞癌、肺胞細胞癌、基底細胞癌、基底細胞の癌(carcinoma basocellulare)、類基底細胞癌、基底扁平上皮癌(basosquamous cell carcinoma)、細気管支肺胞癌(bronchioalveolar carcinoma)、細気管支癌、肺癌、大脳様癌(cerebriform carcinoma)、胆管細胞癌、絨毛癌(chorionic carcinoma)、膠様癌(colloid carcinoma)、コメド癌、子宮体癌(corpus carcinoma)、篩状癌(cribriform carcinoma)、鎧状癌、皮膚の癌(carcinoma cutaneum)、柱状癌(cylindrical carcinoma)、柱状細胞癌(cylindrical cell carcinoma)、腺管癌、硬性癌(carcinoma durum)、胎生期癌、脳様癌(encephaloid carcinoma)、類表皮癌(epiermoid carcinoma)、上皮アデノイド癌(carcinoma epitheliale adenoids)、外向発育癌(exophytic carcinoma)、潰瘍癌(carcinoma ex ulcere)、線維性癌(carcinoma fibrosum)、膠様癌(gelatiniforni carcinoma)、コロイド癌腫(gelatinous carcinoma)、巨細胞癌、巨細胞の癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌、顆粒膜細胞癌、毛母癌(hair-matrix carcinoma)、血液様癌腫(hematoid carcinoma)、肝細胞癌、ヒュルトレ細胞癌、硝子体癌(hyaline carcinoma)、副腎様癌(hypemephroid carcinoma)、小児胎児性癌(infantile embryonal carcinoma)、上皮内癌(carcinoma in situ)、表皮内癌、上皮内癌(intraepithelial carcinoma)、クロムペッヘル癌(Krompecher's carcinoma)、クルチツキー細胞(Kulchitzky-cell)癌、大細胞癌、レンズ状癌(lenticular carcinoma)、レンズ状癌(carcinoma lenticulare)、脂肪性癌腫(lipomatous carcinoma)、リンパ上皮癌、髄様癌(carcinoma medullare)、髄様癌(medullary carcinoma)、黒色癌(melanotic carcinoma)、軟癌腫(carcinoma molle)、粘液性癌腫、粘液腺癌(carcinoma muciparum)、粘液細胞性腺癌(carcinoma mucocellulare)、粘液性類表皮癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液性癌(mucous carcinoma)、粘液腫様癌(carcinoma myxomatodes)、鼻咽腔癌、えん麦細胞癌、骨化性癌(carcinoma ossificans)、類骨癌(osteoid carcinoma)、乳頭状癌、門脈周囲癌(periportal carcinoma)、浸潤前癌(preinvasive carcinoma)、有棘細胞癌(prickle cell carcinoma)、粥状癌(pultaceous carcinoma)、腎臓の腎細胞癌、予備細胞癌(reserve cell carcinoma)、肉腫様癌腫(carcinoma sarcomatodes)、シュナイダー癌(schneiderian carcinoma)、硬癌、陰嚢癌腫(carcinoma scroti)、印環細胞癌、単純癌腫(carcinoma simplex)、小細胞癌、ソラノイド癌腫(solanoid carcinoma)、回転楕円面細胞癌腫(spheroidal cell carcinoma)、紡錘体細胞癌、海綿様癌腫(carcinoma spongiosum)、扁平上皮癌(squamous carcinoma)、扁平上皮癌(squamous cell carcinoma)、ストリング癌腫(string carcinoma)、毛細血管拡張性癌腫(carcinoma telangiectaticum)、毛細血管拡張性癌腫(carcinoma telangiectodes)、移行上皮癌、結節癌腫(carcinoma tuberosum)、結節状癌(tuberous carcinoma)、ゆうぜい癌および絨毛癌腫(carcinoma villosum)が挙げられる。ある態様において、上皮癌は、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮頸癌、外陰癌、子宮癌、ファローピウス管癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、泌尿器癌、膀胱癌、頭頸部癌、口腔癌または肝臓癌である。
【０１７８】
ある態様において、癌は乳癌である。ある態様において、癌は腺癌である。ある態様において、癌は転移性の癌である。ある態様において、癌は難治性の癌である。
【０１７９】
例示的な炎症性障害としては、慢性炎症性障害(例えば関節リウマチ、喘息、慢性消化性潰瘍、結核、歯周炎、潰瘍性大腸炎およびクローン病、静脈洞炎および活動性肝炎)および急性炎症性障害(例えば急性気管支炎、急性虫垂炎、皮膚炎、扁桃炎、感染性髄膜炎および静脈洞炎)が挙げられる。例示的な自己免疫障害としては、I型糖尿病、関節リウマチ(RA)、乾癬/乾癬性関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス(狼瘡)、炎症性腸疾患、アディソン病、グレーブス病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、脈管炎、悪性貧血およびセリアック病が挙げられる。
【０１８０】
被験体に、本発明の組み換えポリペプチドおよび/または多量体タンパク質の有効量を投与する工程を含む、被験体において炎症性障害を治療する開示される方法のある態様において、組み換えポリペプチドおよび/または多量体タンパク質は、FcγRIIB1またはFcγRIIB2 Fc受容体に結合するFcドメインを含む。
【０１８１】
明細書を通じて、組成物が、特定の構成要素を有する、含む(including)もしくは含む(comprising)と記載される場合、またはプロセスおよび方法が特定の工程を有する、含むもしくは含むと記載される場合、さらに、記載される構成要素から本質的になるかまたはそれからなる本発明の組成物があること、ならびに記載されるプロセス工程から本質的になるかまたはそれからなる本発明によるプロセスおよび方法があることが企図される。
【０１８２】
本願において、要素もしくは構成要素が記載される要素もしくは構成要素のリストに含まれるおよび/またはそれから選択されるといわれる場合、該要素もしくは構成要素は、記載される要素もしくは構成要素のいずれか1つであり得るか、または該要素もしくは構成要素は、記載される要素もしくは構成要素の2つ以上からなる群より選択され得ることが理解されるべきである。
【０１８３】
さらに、本明細書に記載される組成物もしくは方法の要素および/または特徴は、本明細書において明示的であろうと黙示的であろうと、本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の方法で組み合され得ることが理解されるべきである。例えば、特定の化合物について参照がなされる場合、化合物は、文脈からそうではないと理解されない限り、本発明の組成物の種々の態様および/または本発明の方法において使用され得る。すなわち、本願において、態様は、明確および簡潔な適用を記載および図示し得る方法で記載されて示されているが、態様は、本教示および発明(1つまたは複数)から逸脱することなく種々に組み合され得るかまたは分離され得ることが意図され、理解される。例えば、本明細書に記載および示される全ての特徴は、本明細書に記載および示される発明(1つまたは複数)の全ての局面に適用可能であり得ることが理解される。
【０１８４】
表現「少なくとも1つの」は、文脈および用途からそうではないと理解されない限り、該表現の後に記載されるもののそれぞれを個々におよび記載されるものの2つ以上の種々の組合せを含むことが理解されるべきである。3つ以上の記載されるものに関して、表現「および/または」は、文脈からそうではないと理解されない限り、同じ意味を有すると理解されるべきである。
【０１８５】
用語「含む(include)」、「含む(includes)」、「含む(including)」、「有する(have)」、「有する(has)」、「有する(having)」、「含む(contain)」、「含む(contains)」または「含む(containing)」の使用は、その文法的な同等物を含めて、文脈にそうではないと具体的に記されないかまたは文脈からそうではないと具体的に理解されない限り、例えば記載されていないさらなる要素または工程を排除することなく、一般的に、開放型および非限定として理解されるべきである。
【０１８６】
用語「約」の使用が量的値の前にある場合、本発明は、そうではないと具体的に記載されない限り、具体的な量的値自体も含む。本明細書で使用する場合、用語「約」は、そうではないと示されないかまたは推測されない限り、名目上の値から±10%の変動をいう。
【０１８７】
工程の順序または特定の行為を実行するための順序は、本発明が実施可能なままである限りは重要ではないことが理解されるべきである。さらに、2つ以上の工程または行為は同時に実施されてもよい。
【０１８８】
本明細書における任意および全ての例または例示的な用語、例えば「など(such as)」または「含む(including)」の使用は、単に本発明をよりよく説明するために意図され、特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を与えない。明細書における用語は、本発明の実施に必須のものとして、任意の特許請求されない要素を示すように解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１８９】
実施例
以下の実施例は単なる説明であり、いかなる方法においても本発明の範囲または内容を限定することは意図しない。
【０１９０】
実施例1
この実施例には、「dragonfly」と称される二量体の四価構築物(図1B参照)、「butterfly」と称される二量体の四価構築物(図1C参照)および「hydra」と称される六量体の六価構築物(図1D参照)を含む種々のシグレック結合構築物の構築、ならびにシアル酸リガンドに選択的に結合するそれらの能力が記載される。該構築物は、ヒトシグレック-7またはシグレック-9いずれか由来のレクチンドメインを含んだ。
【０１９１】
図1Bに示されるように、dragonfly構築物は、N末端V-set免疫グロブリン様ドメインおよび1つのC2-setドメインを含む切断ヒトシグレック細胞外ドメイン(ECD)の2つの繰り返しを、FcドメインのN末端に融合させることにより作製された。Fcドメインを介した二量体化により、4つのレクチンドメインを含む四価構築物が作製された。
【０１９２】
図1Cに示されるように、butterfly構築物は、シグレックN末端V-set免疫グロブリン様ドメインおよび2つのC2-setドメインを含むシグレックECDを、Fcドメインの N末端およびC末端の両方に融合させることにより作製された。Fcドメインを介した二量体化により、4つのレクチンドメインを含む四価構築物が作製された。
【０１９３】
図1Dに示されるように、hydra構築物は、シグレックN末端V-set免疫グロブリン様ドメインおよび2つのC2-setドメインを含むシグレックECDを、三量体化ドメイン(フォルドン)のN末端に融合し、続いてFcドメインを融合させることにより作製された。Fcドメインを介した二量体化およびフォルドンドメインによる三量体化により、6個のレクチンドメインを含む六価構築物が作製された。
【０１９４】
図1Aに示されるように、シグレック二量体は、シグレックN末端V-set免疫グロブリン様ドメインおよび2つのC2-setドメインを含むシグレックECDを、FcドメインのN末端に融合させることにより作製された。Fcドメインを介した二量体化により、2つのレクチンドメインを含む二価構築物が作製された。
【０１９５】
簡潔に、全ての構築物は以下のように調製された。関連のあるドメインをコードするDNAを、重複伸長によるPCRを使用して集合させ、哺乳動物発現ベクターpCEP (Invitrogen)にクローニングした。製造業者の指示書に従ってExpiFectamine (Invitrogen)を使用して、発現ベクターでExpi293細胞を一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの6日後に上清を回収した。製造業者の指示書に従ってプロテインA樹脂(Repligen)を使用してタンパク質を精製した。
【０１９６】
シグレック-7 hydra(核酸配列配列番号：46にコードされるアミノ酸配列配列番号：7)、dragonfly(核酸配列配列番号：47にコードされるアミノ酸配列配列番号：9)、butterfly(核酸配列配列番号：48にコードされるアミノ酸配列配列番号：11)および二量体(核酸配列配列番号：50にコードされるアミノ酸配列配列番号：49)を発現させ、精製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を使用して特徴付けた。図2Aに示されるように、全ての4つのタンパク質は高純度(>95%)を有し、変性、非還元および還元条件下、予想された見かけの分子量(MW)で移動した。多量体シグレック-7 hydra、dragonfly、butterflyおよび二量体のアセンブリを、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC-HPLC)を使用して特徴付けた。図2Bに示されるように、シグレック-7 hydraは多量体分子に集合し、MW≧400kDaに対応する保持時間を有した。シグレック-7二量体、dragonflyおよびbutterflyは、シグレック-7 hydraよりも遅い保持時間を有し、予想されたより小さいMWと一致した。
【０１９７】
シグレック-7 hydra、dragonfly、butterflyおよび二量体の相対的な結合親和性を測定した。対照として、市販のシグレック-7二量体(R&D Systems)も含めた。ビオチニル化シアル酸ポリマーNeu5Acα2-3Galb1-4(Fuca1-3) (6-HSO3) GlcNAcb-PAA-ビオチン(Glycotech ＃01-095)を捕捉して、ストレプトアビジンコートOctetバイオセンサーを使用してOctet結合分析を行った。0.1% BSAおよび0.02% Tween20を含むPBSバッファ中100秒のベースライン工程後、捕捉されたリガンドを有するバイオセンサーを、100nMのシグレック-7 hydra、シグレック-7 dragonfly、シグレック-7 butterflyまたはシグレック-7二量体を含むウェル中に5分間沈め、0.1% BSAおよび0.02% Tween20を含むPBSバッファ中3分の解離時間を続けた。図3Aに示されるように、シグレック-7 hydraは、シグレック-7 dragonfly、butterflyまたは二量体のシグナルよりも高いシグナルでシアル酸ポリマーに結合した。シグレック-7 hydraは、試験した構築物の最も高い結合シグナルを有したので、シグレック-7 hydraの結合速度論を決定した。結合速度論は、44nM〜67pM(1:3希釈)の濃度のシグレック-7 hydraならびに15分の会合時間および解離時間以外は上記のとおりにアッセイした。図3Bに示されるように、シグレック-7 hydraは0.1±0.025nMの見かけの結合親和性でシアル酸ポリマーに結合した。
【０１９８】
FACS結合アッセイはまた、内因性シアル酸シグレックリガンドを発現するT47D乳癌細胞を使用して行った。細胞を、100nM〜1.7pM(1:3希釈)の濃度のシグレック-7 hydra、dragonfly、butterflyおよび二量体とインキュベートした。細胞表面上の結合したシグレック-7構築物を、Alexa488標識抗Fc二次抗体(Invitrogen)およびフローサイトメーターを使用して検出した。図3Cに示されるように、シグレック-7 hydraは、0.6nMの見かけの親和性でシアル酸発現T47D癌細胞に結合した。この見かけの親和性は、シグレック-7 dragonfly、butterflyまたは二量体についての見かけの親和性よりも少なくとも100倍高かった。
【０１９９】
一緒になって、これらの結果は、シグレック-7 hydra、シグレック-7 dragonflyおよびシグレック-7 butterflyが、シグレック-7二量体よりも高い見かけの親和性でシグレック-7リガンドに結合し、シグレック-7 hydraについての見かけの親和性が最も高いことを示す。
【０２００】
シグレック-7 hydraのシアル酸についての特異性は、細胞表面上のシアル酸を除去するためにシアリダーゼで処理したT47D細胞を用いた結合実験を行うことにより示した。T47D細胞は、125nMの細菌性(コレラ菌)シアリダーゼを用いて、37℃で1.5時間処理した。未処理のT47D細胞を陽性対照として含んだ。シグレック-7 hydra結合は上記のようにFACSによりアッセイした。図4Aに示されるように、シアリダーゼ処理は、シグレック-7 hydraのT47D細胞への結合を破壊した(abolished)。これらの結果は、細胞へのシグレック-7 hydra結合は、シアル酸認識により媒介されたことを示す。
【０２０１】
シグレック-7 hydraの選択的結合はさらに、決定的なリガンド結合アルギニン残基(R124)をリジン(R124K)で置換して、結合欠失シグレック-7 hydra変異体を作製することにより確認した。FACS結合およびOctet結合分析は、上記のように行った。図4Bおよび図4Cに示されるように、R124K置換は実質的に、野生型シグレック-7 hydraと比較して、T47D細胞およびシアル酸ポリマーへの結合を低減した。
【０２０２】
一緒になって、これらの結果は、シグレック-7 hydra結合はシアル酸認識により媒介されることを示す。
【０２０３】
シグレック-9 hydra(核酸配列配列番号：45によりコードされるアミノ酸配列配列番号：8)を発現させ、精製し、SEC-HPLCを使用して特徴付けた。図5Aに示されるように、シグレック-9 hydraを、MW≧300kDaおよびSEC-HPLCにおける複数のピークを有する異成分からなる多量体分子に集合させた。シグレック-9 hydraの不均一性は、シグレック-9 ECDドメインの二量体化の結果であり得る。
【０２０４】
Octet結合分析を上記のように行い、シグレック-9 hydraおよびシグレック-9二量体の相対的結合親和性を決定した。図5Bに示されるように、シグレック-9 hydraは、二量体構築物のシグナルよりも高いシグナルでシアル酸ポリマーに結合した。上記のように、HT-29乳癌細胞を使用してFACS結合分析も行った。図5Cに示されるように、シグレック-9 hydraは、14.3nMの見かけの親和性でシアル酸発現HT-29癌細胞に結合した。一緒になって、これらの結果は、シグレック-9 hydraは、シグレック-9二量体よりも高い見かけの親和性でシグレック-9リガンドに結合することを示す。
【０２０５】
シグレック-9 hydraのシアル酸についての特異性は、UDP-N-アセチルグルコサミン-2-エピメラーゼ(GNE)を欠損する遺伝子工学的に作り変えられたHT-29細胞を用いた結合実験を行うことにより示した。GNEはシアル酸生合成の律速(rate-limiting)酵素であり、したがってGNE欠損HT-29細胞(HT-29 GNE KO)は、シアル酸シグレックリガンドを提示しない。野生型HT-29細胞を陽性対照として含めた。図5Dに示されるように、シグレック-9 hydraはHT-29 GNE KO細胞に結合しなかった。
【０２０６】
シグレック-9 hydraの選択的結合はさらに、重大なリガンド結合アルギニン残基(R120)をリジンで置換して(R120K)、結合欠失シグレック-9 hydra変異体を作製することにより確認した。シグレック-9 hydraのK562細胞(シグレックリガンドを発現することが報告される)への結合は、上記のようにFACSによりアッセイし、シグレック-9 hydraのシアル酸ポリマーへの結合は、上記のようにOctetによりアッセイした。図6Aおよび図6Bに示されるように、R120K置換は実質的に、野生型シグレック-9 hydraと比較して、K562細胞およびシアル酸ポリマーへの結合を低減した。
【０２０７】
一緒になって、これらの結果は、シグレック-9 hydra結合はシアル酸認識により媒介されることを示す。
【０２０８】
実施例2
この実施例には、シグレック-7およびシグレック-9 hydra構築物の細胞および組織試料における結合活性が記載される。
【０２０９】
T47D乳癌細胞、K562骨髄性白血病細胞、BT20乳癌細胞、EMT6乳癌細胞、HT-29結腸癌細胞(野生型とGNE KOの両方)およびA549肺癌細胞(野生型とGNE KOの両方)を含む癌細胞を、シグレック-7 hydraまたはシグレック-9 hydraとインキュベートした。癌細胞およびシグレックhydra(300nMで開始した1:3連続希釈)をPBS中、4℃で30分間インキュベートし、その後細胞を洗浄し、シグレックhydra結合を、実施例1に記載されるようにFACSによりアッセイした。
【０２１０】
図7A〜Hに示されるように、シグレックリガンドの異なる発現レベル(シグレックhydra結合により測定)を、T47D乳癌細胞、K562骨髄性白血病細胞、BT20乳癌細胞、EMT6乳癌細胞、HT-29結腸癌細胞およびA549肺癌細胞上で観察した。予想されたように、A549およびHT-29 GNE KOノックアウト細胞は、シグレック-7またはシグレック-9 hydra結合をほとんどまたは全く示さなかった。
【０２１１】
リガンド染色の幾何学平均蛍光強度を比較することにより、hydra結合により観察されたシグレック-7および-9リガンド発現プロフィールを、Jandus et al. (2014) J. Clin. Invest., 124:1810-1820において以前に観察されたものと比較した。シグレック-7 hydraおよびシグレック-9 hydraのそれぞれによる染色により観察されたシグレック-7および-9リガンド発現プロフィールは、Jandus et al.の結果と一致した。例えば、Jandus et al.は、K562細胞はシグレック-9リガンドよりも約3倍高いシグレック-7リガンドの発現を有し、A549細胞はシグレック-7リガンドよりも(that)約4倍高いシグレック-9リガンドの発現を有し、シグレック-7リガンド発現はA549細胞よりもK562細胞について高く、シグレック-9リガンド発現はA549およびK562細胞の間で同等であったことを見出した。Hydra染色は、K562細胞およびA549細胞について同じ発現プロフィールを示した。
【０２１２】
シグレック-9 hydraを使用して、原発性乳癌および黒色腫腫瘍組織試料ならびに異なるドナー由来の対応する非癌性組織試料におけるシグレック-9リガンド発現を決定した。
【０２１３】
組織試料をパラフィンに包埋して5μmで切片化した。切片を正に帯電したスライド(Fisher)上にマウントした。使用前にスライドを60℃の乾燥加熱で少なくとも1時間焼いた。組織切片を、標準的な条件および有機溶媒(100%キシレンで5分のインキュベーションを4回)およびアルコールシリーズ(100%、70%および30%エタノールのそれぞれで2分のインキュベーション)を用いて脱パラフィンし(de-waxed)、蒸留水まで下げて組織を十分に水和し、一次抗体および他の検出試薬と適切に結合させた。組織切片を脱パラフィン(dewaxed)した後に、熱供給源として市販のスチーマーを使用して(97℃より高くで20分)、プロテイナーゼK消化を行わずにBioGenixバッファ(Citra Plus Buffer、pH7.1、BioGenix、カタログ番号HK081-20K)による蒸気加熱誘導エピトープ回復(steam heat induced epitope recovery)を使用して、抗原回復を行った。標準的なプロトコルを使用して酵素処理(1:1000)により、Bond Rx自動染色機(Leica Biosystems)上で免疫組織化学を行った。1:1000希釈のシグレック-9 hydraをスライドとインキュベートし、二次抗体ヤギ抗マウスIgG2a(Thermofisher カタログ番号P131983)により検出した。製造業者のプロトコルに従ってBond Polymer Refine Detection (Leica Biosystems)を使用した。次いで切片をヘマトキシリン(hematoxycilin)で対比染色し、脱水して、TissueTek-PrismaおよびCoverslipper (Sakura)を使用してカバーガラスをかけた。Aperio AT2 (Leica Biosystems)上で全体スライドスキャン(40x)を行った。
【０２１４】
図8Aおよび8Bに示されるように、黒色腫および乳癌腫瘍組織試料は、対応する非癌性組織試料よりも高い染色を有した。染色シグナルは、-、+、++、+++、++++および+++++で示す6個の群に定性的に分類し、-は陰性染色を示し、+〜+++++は、段々と強くなる染色を示した。黒色腫試料は++〜+++++の範囲の染色を有し、非癌性皮膚組織試料は+の染色を有した。乳癌試料は+〜+++の範囲の染色を有し、非癌性乳房組織試料は-の染色を有した。一緒になって、これらの結果は、シグレック-9リガンド発現は、黒色腫と乳癌腫瘍の間で変化すること、シグレック-9リガンド発現は、非癌性組織と比較して、黒色腫および乳癌腫瘍のそれぞれで上方制御されることを示す。
【０２１５】
実施例3
この実施例には、Z Biotech (Aurora, CO)から入手可能な一連のグリカンアレイに対するシグレック-7およびシグレック-9 hydra構築物の結合活性が記載される。hydra構築物のアレイへの結合は、以下のようにアッセイされた：
(1)アレイをブロッキングバッファ(Z Biotech)で1時間ブロッキングし；
(2)アレイを示されるバッファで2回短く洗浄し(1ウェル当たり100μL)；
(3) 示されるバッファ中でシグレック-7およびシグレック-9 hydraを適用して2時間インキュベートし；
(4)アレイを洗浄バッファ(Z Biotech)で洗浄し；
(5)10μg/mlの抗マウスIgG-Cy3(fCy3 AffiniPureヤギ抗マウスIgG(完全IgG)、Fcγ断片特異的)を適用し；
(6)アレイを洗浄バッファ(Z Biotech)で洗浄し；
(7)アレイを532nmの波長でマイクロアレイスキャナーにより走査した。
【０２１６】
図9は、結合アッセイにおいて使用した100 N-グリカンアレイ(Z Biotech, Colorado)の要所である。図10は、バッファDB1およびDB2中4nMの100 N-グリカンアレイへのシグレック-9 hydra結合を示す。シグレック-9 hydraは、α2,3およびα2,6シアル酸結合を含むグリカン構造に結合した。
【０２１７】
図11は、結合アッセイにおいて使用したNeu5Ac/Neu5Gcグリカンアレイ(Z Biotech, Colorado)の要所である。図12は、50mMのリン酸ナトリウムバッファ(pH5.8)中4nMのNeu5Ac/Neu5Gcグリカンアレイへのシグレック-9 hydra結合を示す。シグレック-9 hydraは再度、α2,3およびα2,6シアル酸結合を含むグリカン構造に結合した。
【０２１８】
図13は、結合アッセイにおいて使用したグリコスフィンゴリピドグリカンアレイ(Z Biotech, Colorado)の要所である。図14は、50mMのリン酸ナトリウムバッファ(pH5.8)中20nMのグリコスフィンゴリピドグリカンアレイへのシグレック-7 hydra結合を示す。シグレック-7 hydraは、α2,8シアル酸結合を含むグリカン構造G11、G12、G13、G14、G15、G18、G19、G20、G21、G22、G27、G28、G30、G31およびG32に結合した。また、シグレック-7 hydraは、α2,3シアル酸結合を含むグリカン構造G1、G2、G26およびG38に結合した。
【０２１９】
この実施例は、シグレック-9 hydraがグリカンを含むα2,3およびα2,6結合シアル酸に結合し、シグレック-7 hydraがα2,8結合ジシアル酸およびグリカンを含む特定のα2,3結合シアル酸に結合することを示す。
【０２２０】
実施例4
この実施例には、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)ヒト組織に対するシグレック-7およびシグレック-9 hydra構築物の結合活性が記載される。
【０２２１】
簡潔に、免疫組織化学(IHC)アッセイを以下のように行った：
(1)FFPE組織ブロックを4〜5μmの厚さに切断し、切片を、正に帯電したキャピラリーギャップガラススライド(Fisher, 22-230-900)にマウントした。使用前にスライドを焼いた(60℃、乾燥加熱)。
(2)組織切片を、有機溶媒(キシレン、100%、4回交換)およびアルコールシリーズ(100%、70%、30%エタノール)を使用して脱パラフィンして、蒸留水まで下げて十分に組織を水和し、シグレック-7 hydra、シグレック-9 hydraまたは他の試薬に適切に結合させた。
(3)組織切片を脱パラフィンした後に抗原回復を行った。Ladner et al. (2000) CANCER RES. 60: 3493-3503に記載されるように、熱供給源として市販のスチーマーを使用して(97℃より高くで20分)、蒸気加熱誘導エピトープ回復(SHIER)溶液を、対になった顕微鏡スライドの間で形成されたキャピラリーギャップに引き込んだ。
(4)TechMate機器プラットフォームおよびMIP ENVプログラム(エピトープをさらに暴露するためのプロテイナーゼKによる酵素消化を含まない)を使用して、表1に概略される一般的な手順に従ってIHCにより試料を試験した。IHCの間に、一次検出試薬の連続検出を使用し、シグレックリガンドについて高レベルの特異性を有した。ホースラディッシュペルオキシダーゼポリマー(HRPポリマー、Agilent Dako, K4001)の存在下、リガンドの部位で、別々の不溶性反応生成物を沈殿させる比色定量色原体(colorimetric chromogen)(DAB; GBI Labs, C09-100)の適用により、シグレック-7 hydraまたはシグレック-9 hydraの位置を最終的に可視化した。ヘマトキシリン(青色染色；QML-SB, 100005)を使用して核を対比染色し、細胞および組織の形態を評価した。
【表１】
2021527036.tif 000002
(5)スライドを対にせずに、蒸留水ですすぎ、アルコールシリーズ(70%、95%、100%エタノール)および有機溶媒(キシレン、100%、4回交換)中で脱水し、次いで解釈および保存のために、CytoSeal (Thermo Scientific, 8312-4, 8310-4)を使用して永続的にカバーガラスをかけた。顕微鏡下でスライドを検査して、染色を評価した。
【０２２２】
FFPE組織中のエピトープをアンマスクするためにSHIER 7(Citra Plus、pH7.1、BioGenex, HK081-20K)溶液を使用した。熱誘導エピトープ回復の後、QML workmateソフトウェアv3.96を走らせるTechMate Instrument (Roche Diagnostics)を使用してプロセス工程を自動化した。この自動化されたプラットフォームは、対比染色までおよび対比染色を含む全ての試薬交換、ならびに間にあるバッファ洗浄についてキャピラリーギャッププロセスを使用する。全ての工程は室温(25℃)で行った。
【０２２３】
ヤギ血清(QML-SB, 300003)を用いた試薬製造バッファ(RMB、QML-SB)を使用して、シグレック-7 hydra(0.35μg/mlの最終作業濃度)、シグレック-9 hydra(0.5μg/mlの最終作業濃度)およびマウスIgG2a陰性対照抗体の作業希釈物を調製した。FFPE切片中のリガンド-一次検出試薬相互作用の部位でのシグレック-7 hydraまたはシグレック-9 hydraについての標的認識は、マウス一次抗体の検出のために設計されたDakoの一価のEnVision-Plus HRPキット(K4001)を使用した。
【０２２４】
全ての病理学的分析およびスコアリングは、委員会が保証した(board-certified)病理学者が行った。シグレック-7 hydraおよびシグレック-9 hydraは、腫瘍および正常細胞のサブセットにおいて反応性であった。反応性は主に形質膜に局在したが、細胞質(拡散性、顆粒性または小房性(ぉくぁてｄ))および核中でも染色が観察された。ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)腫瘍試料においてIHCにより検出した場合の結合したシグレック-7 hydraまたはシグレック-9 hydraのそれぞれをスコアリングするために使用したガイドラインは下記の通りであった。
【０２２５】
シグレック-7 hydraまたはシグレック-9 hydra染色は、完全または部分的な形質膜発現について、、委員会が保証した病理学者が半定量的にスコアリングした。完全または部分的な形質膜染色は、細胞外にある、細胞間に蓄積するまたは膜に結合する形質膜上(epi-plasma membrane)シグナルを含む。シグレック-7 hydraまたはシグレック-9 hydra染色について、スコアリングのための主要な構成要素は、示差的強度でのパーセンテージ、H-スコアおよびパーセントスコア(下記の通り)である。結腸直腸試料について、腫瘍細胞の明確な先端形質膜(definitive apical plasma membrane)染色をスコアリングした。ムチンであるように思われた(シグレック-7リガンドまたはシグレック-9リガンドではない)腫瘍中の先端染色はスコアリングしなかった。シグレック-7 hydraまたはシグレック-9 hydra染色が拡散性細胞質染色として存在した場合、該染色は腫瘍中いたるところに均一に現れ、0〜3の相対スケールを使用して全体的な平均強度スコアを割り当てられた。このスケールで、0は拡散性細胞質染色が存在しないことを示し、1は弱い拡散性細胞質染色を表し、2は中度の拡散性細胞質染色を表し、3は強い拡散性細胞質染色を表す。また、細胞質シグレック-7 hydraおよびシグレック-9 hydra染色は「小房性」のように思われ得る。小房性パターンはゴルジ体と一致する細胞質内の暗い染色のポケットとして観察された。小房性細胞質染色パターンの存在または非存在についての別々のスコアは、「Yes」または「No」(Y/N)として提供される。細胞質シグレック-7 hydraまたはシグレック-9 hydra染色はまた、小胞体(ER)と一致する細胞質内の暗い染色の小さい極微の点を有する「顆粒性」のように思われ得る。かかる染色は、全ての腫瘍中いたるところに一般的に普遍的に観察されるので、個々のスコアを割り当てられなかった。細胞質顆粒が形質膜の下に並ぶ場合、該顆粒は形質膜染色のスコアに含まれた。シグレック-7 hydraまたはシグレック-9 hydra染色は、時折腫瘍細胞核内で観察された(一般的に1+)。腫瘍組織をスコアリングする場合、スコアリングは、支質内、腫瘍でない領域および正常組織に隣接する任意の周囲の染色を除外する。
【０２２６】
癌徴候にわたる腫瘍細胞の形質膜でのシグレック-7 hydraまたはシグレック-9 hydra染色の完全な理解を得るために、標準的なパーセントスコアおよびH-スコアのアプローチの両方を使用して、観察された反応性のパターンを捕捉した。両方のアプローチは、半定量的な4点のスケール(0、1+、2+、3+)の対応する示差的な強度でのシグレック-7 hydraまたはシグレック-9 hydra形質膜染色を有する腫瘍細胞のパーセンテージを記録することを必要とする。このスケールで：0=ヌル(null)、陰性または非特異的染色、1+=低または弱い染色、2+=中間または中度の染色および3+=高または強い染色である。
【０２２７】
≧1+、≧2+または≧3+のいずれかでの強度のパーセンテージを合計することによりパーセントスコアを計算した。パーセントスコア≧1+=(1+での%)+(2+での%)+(3+での%)であり、パーセントスコア≧2+=(2+での%)+(3+での%)であり、パーセントスコア≧3+=(3+での%)である。したがって、スコアは0〜100の範囲であった。
【０２２８】
発現の強度(褐色の染色)を有する細胞のパーセンテージにそれらの4点半定量スケール(0、1+、2+、3+)での対応する示差的強度をかけたもので合計することによりH-スコアを計算した。H-スコア=[(<1での%)x0]+[(1+での%)x1]+[(2+での%)x2]+[(3+での%)x3]である。したがって、スコアは0〜300の範囲であった。
【０２２９】
図15は、シグレック-7 hydra(左)またはシグレック-9 hydra(右)での種々のパラフィン包埋ヒト腫瘍生検スライドの連続切片の代表的なIHC染色を示し、付随するH-スコアを示す。図15Aおよび15Bは独立した結腸直腸癌試料の染色についてのH-スコアの範囲を示し、図15Cは独立した肺癌試料の染色についてのH-スコアの範囲を示す。
【０２３０】
実施例5
この実施例には、シグレック-7 hydra、シグレック-9 hydraまたはビオチニル化イヌエンジュレクチン(MAL II；カタログ番号B-1265、Vector Labs, Burlingame, CA)による腫瘍マイクロアレイ(TMA)の染色が記載される。
【０２３１】
図16は、示される癌(黒色腫、非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸癌、HER2+乳癌(BRCA)、膀胱癌および腎臓癌)にわたる平均H-スコアによるシグレック-7 hydra (S7-リガンド)およびシグレック-9 hydra (S9-リガンド)染色の比較を示す。
【０２３２】
実施例6
この実施例には、Hydra 3構築物の構築および結合活性が記載される。種々のシグレック-3 hydra (「Hydra 3」)を設計して発現させた。図17は、6個のポリペプチドを含むHydra-3バージョン1.0構築物を示し、それぞれのポリペプチドは、N末端からC末端の方向で、シグレック-3 ECD(円はV-setドメインを示し、楕円はC2-setドメインを示す)、三量体化(フォルドン)ドメイン(ひし形)およびFcドメイン(波線および三角形)を含む。Hydra-3バージョン2.0構築物は、N末端からC末端の方向で、シグレック-3 ECD、Fcドメインおよび三量体化(フォルドン)ドメインを含む。シグレックECDとフォルドンドメインの間に(Gly4Ser)2(配列番号：69)リンカーを含んだ以外はバージョン1.0と同一であるバージョン1.1も作製した。Fcドメインを介した二量体化およびフォルドンドメインによる三量体化により、6個のレクチンドメインを含む六価の構築物が作製された。
【０２３３】
バージョン1.0、1.1および2.0は、本明細書に記載されるようなレクチン結合ドメインのいずれかについて構築され得ることが理解される。
【０２３４】
Hydra 3 v1.0、Hydra 3 v1.1およびHydra 3 v2.0構築物を発現させ、精製し、SEC-HPLCを使用して特徴付けた。Hydra 3 v1.0のアミノ酸配列は、核酸配列配列番号：54)によりコードされる配列番号：53として提供される。Hydra 3 v1.1のアミノ酸配列は、核酸配列配列番号：56)によりコードされる配列番号：55として提供される。Hydra 3 v2.0のアミノ酸配列は、核酸配列配列番号：58)によりコードされる配列番号：57として提供される。
【０２３５】
図18Bに示されるように、Hydra 3 v1.0を、SEC-HPLCによりMW<300kDaおよびヒトSig3-hIgG1Fc二量体と同等のサイズを有する多量体分子に集合させた(図18A)。理論に拘束されることを望まないが、Hydra 3 v1.0のサイズは、2つのシグレック-3 ECDドメインの二量体化の結果であり得ることが企図される。図18Cに示されるように、Hydra 3 v1.1を、MW<300kDaを有する多量体分子に集合させ、これは、シグレック-3 ECDおよびフォルドンドメインの間のリンカーの付加が、Hydra 3の予想MWを有する分子を生じなかったことを示した。図18Dに示されるように、Hydra 3 v2.0を、MW≧300kDaを有する多量体分子に集合させ、これは、フォルドンドメインc末端のFcドメインへの配置が、Hydra 3の予想MWを有する分子を生じたことを示した。Hydra 3 v2.0を以下の実験に使用した。
【０２３６】
Hydra 3のシアル酸に対する特異性は、遺伝子工学的に作り変えられた、UDP-N-アセチルグルコサミン-2-エピメラーゼ(GNE)を欠損するA549細胞を用いて結合実験を行うことにより示した。GNEは、シアル酸生合成についての律速酵素であり、結果的にGNE欠損A549細胞(A549 GNE KO)は、有意な量のシアル酸シグレックリガンドを提示しない。野生型A549細胞を陽性対照として含んだ。図19に示されるように、Hydra 3はA549 GNE KO細胞に最小限に結合する。
【０２３７】
上記のように、K562 CML細胞を使用してFACS結合分析を行った。図20Aに示されるように、Hydra 3は、nMの見かけの親和性でシアル酸発現K562癌細胞に結合した。Hydra 3の選択的結合はさらに、決定的なリガンド結合アルギニン残基(R121)をリジン(R121K)またはアラニン(R121A)で置換して、結合欠失Hydra 3変異体(Hydra 3 LOB)を作製することにより確認した。FACS結合分析は上記のように行った。図20Aおよび図20Bに示されるように、R121KおよびR121A置換は実質的に、野生型Hydra 3と比較して、K562細胞への結合を低減した。
【０２３８】
一緒になって、これらの結果は、Hydra 3結合がシアル酸認識により媒介されることを示す。
【０２３９】
実施例7
この実施例には、Hydra 9の野生型バージョンよりも凝集しないHydra 9二重変異体構築物の作製が示される。
【０２４０】
Hydra 9野生型(WT)は実施例1に記載されるように作製され、二重変異体バージョンは、C141SおよびC278Yに変異を有するように作製された(「Hydra 9二重変異体(DM)」)。図21に示されるように、Hydra 9 WTは、非還元レーンにより示されるように、Hydra 9 DMと比較してより多くのシステインが連結した凝集を有するように思われる。図22は、Hydra 9 DMと比較した場合に、Hydra 9 WTはSECを介してより多くの凝集を有することを示す。
【０２４１】
実施例8
この実施例には、シアリダーゼを用いたHydra構築物の処理により、構築物の安定性および/または回収率(yield recovery)が向上され得ることが示される。
【０２４２】
Hydra 3またはHydra 9含有上清をプロテインA樹脂に充填し、PBSで完全に洗浄した。この樹脂を、50mM Hepes pH6.8+50mM NaClを用いて50%スラリーに再懸濁し、コレラ菌(VC)またはアルスロバクター・ウレファシエンスのいずれかのシアリダーゼを懸濁液に添加した。これを室温で3時間インキュベートした。モック処理は、50mM Hepes pH6.8+50mM NaCl中樹脂のみの懸濁液であった。インキュベーション後、50mM Hepes pH6.8+50mM NaClでさらなる洗浄を行い、次いでHydra 3またはHydra 9を1MアルギニンpH3.9で溶出した。図23に示されるように、K562細胞をこれらの構築物で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。モック処理Hydra 3と比較した場合、シアリダーゼ前処理Hydra 3構築物は、K562細胞への結合の有意な増加を示した。図24において、シアリダーゼでの前処理ありまたはなしのHydra 9 WT、Hydra 9 WT LOBおよびHydra 9 DMについて、回収率を比較した。Hydra 9構築物からのシアル酸の除去は、安定性および/または回収率の増加を生じるように見えた。
【０２４３】
参照による援用
本明細書で言及される特許文献および科学論文のそれぞれの全開示は、全ての目的で参照により援用される。
【０２４４】
均等物
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態で実現され得る。そのため、前述の態様は、全ての点において本明細書に記載される発明の限定ではなく、例示としてみなされる。したがって、本発明の範囲は、前述の記載ではなく添付の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲の同等物の意味および範囲に入る全ての変更が本発明に包含されることが意図される。
【０２４５】
配列表
【表２−１】
2021527036.tif 000003
【表２−２】
2021527036.tif 000004
【表２−３】
2021527036.tif 000005
【表２−４】
2021527036.tif 000006
【表２−５】
2021527036.tif 000007
【表２−６】
2021527036.tif 000008
【表２−７】
2021527036.tif 000009
【表２−８】
2021527036.tif 000010
【表２−９】
2021527036.tif 000011
【表２−１０】
2021527036.tif 000012
【表２−１１】
2021527036.tif 000013
【表２−１２】
2021527036.tif 000014
【表２−１３】
2021527036.tif 000015
【表２−１４】
2021527036.tif 000016
【表２−１５】
2021527036.tif 000017
【表２−１６】
2021527036.tif 000018
【表２−１７】
2021527036.tif 000019
【表２−１８】
2021527036.tif 000020
【表２−１９】
2021527036.tif 000021
【表２−２０】
2021527036.tif 000022
【表２−２１】
2021527036.tif 000023
【表２−２２】
2021527036.tif 000024
【表２−２３】
2021527036.tif 000025
【表２−２４】
2021527036.tif 000026
【表２−２５】
2021527036.tif 000027
【表２−２６】
2021527036.tif 000028
【表２−２７】
2021527036.tif 000029
【表２−２８】
2021527036.tif 000030
【表２−２９】
2021527036.tif 000031
【表２−３０】
2021527036.tif 000032
【図１】
2021527036.tif 000033
【図２−１】
2021527036.tif 000034
【図２−２】
2021527036.tif 000035
【図３−１】
2021527036.tif 000036
【図３−２】
2021527036.tif 000037
【図３−３】
2021527036.tif 000038
【図４−１】
2021527036.tif 000039
【図４−２】
2021527036.tif 000040
【図５−１】
2021527036.tif 000041
【図５−２】
2021527036.tif 000042
【図５−３】
2021527036.tif 000043
【図６】
2021527036.tif 000044
【図７−１】
2021527036.tif 000045
【図７−２】
2021527036.tif 000046
【図７−３】
2021527036.tif 000047
【図８】
2021527036.tif 000048
【図９−１】
2021527036.tif 000049
【図９−２】
2021527036.tif 000050
【図９−３】
2021527036.tif 000051
【図９−４】
2021527036.tif 000052
【図９−５】
2021527036.tif 000053
【図１０】
2021527036.tif 000054
【図１１−１】
2021527036.tif 000055
【図１１−２】
2021527036.tif 000056
【図１１−３】
2021527036.tif 000057
【図１１−４】
2021527036.tif 000058
【図１１−５】
2021527036.tif 000059
【図１２】
2021527036.tif 000060
【図１３】
2021527036.tif 000061
【図１４】
2021527036.tif 000062
【図１５−１】
2021527036.tif 000063
【図１５−２】
2021527036.tif 000064
【図１５−３】
2021527036.tif 000065
【図１６】
2021527036.tif 000066
【図１７】
2021527036.tif 000067
【図１８】
2021527036.tif 000068
【図１９】
2021527036.tif 000069
【図２０−１】
2021527036.tif 000070
【図２０−２】
2021527036.tif 000071
【図２１】
2021527036.tif 000072
【図２２】
2021527036.tif 000073
【図２３】
2021527036.tif 000074
【図２４】
2021527036.tif 000075
【配列表】
2021527036000001.app
【国際調査報告】
2021527036.tif 000076
2021527036.tif 000077
2021527036.tif 000078