(57)【要約】  本発明は、水性媒体中に、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−６−アミノ−４−［Ｎ−（４−クロロフェニル）−Ｎ−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルメチル)アミノ］−３−ヒドロキシ−２−メチル−２−ジメトキシメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピランまたはその薬学的に許容可能な塩；安定化剤としてプロピレングリコール；およびｐＨ調整剤を含み、４．０〜５．０のｐＨを有する、溶液形態の点眼剤を提供する。本発明の点眼剤は、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−６−アミノ−４−［Ｎ−（４−クロロフェニル）−Ｎ−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルメチル)アミノ］−３−ヒドロキシ−２−メチル−２−ジメトキシメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピランまたはその薬学的に許容可能な塩を高濃度で含有することができ、優れた安定性を有する。また、本発明に係る黄斑変性の予防または治療のための医薬品は、長期間保管することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性媒体中に、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−６−アミノ−４−［Ｎ−（４−クロロフェニル）−Ｎ−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルメチル)アミノ］−３−ヒドロキシ−２−メチル−２−ジメトキシメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピランまたはその薬学的に許容可能な塩；安定化剤としてプロピレングリコール；およびｐＨ調整剤を含み、４．０〜５．０のｐＨを有する、溶液形態の点眼剤。
【請求項２】
前記（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−６−アミノ−４−［Ｎ−（４−クロロフェニル）−Ｎ−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルメチル)アミノ］−３−ヒドロキシ−２−メチル−２−ジメトキシメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピランまたはその薬学的に許容可能な塩が、３ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で存在することを特徴とする請求項１に記載の点眼剤。
【請求項３】
前記（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−６−アミノ−４−［Ｎ−（４−クロロフェニル）−Ｎ−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルメチル)アミノ］−３−ヒドロキシ−２−メチル−２−ジメトキシメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピランまたはその薬学的に許容可能な塩が、３〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在することを特徴とする請求項１に記載の点眼剤。
【請求項４】
前記プロピレングリコールが、１〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在することを特徴とする請求項１に記載の点眼剤。
【請求項５】
前記プロピレングリコールが、５〜１７ｍｇ／ｍｌの濃度で存在することを特徴とする請求項１に記載の点眼剤。
【請求項６】
前記プロピレングリコールが、１０〜１５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在することを特徴とする請求項１に記載の点眼剤。
【請求項７】
前記点眼剤が、４．２〜４．７のｐＨを有することを特徴とする請求項１に記載の点眼剤。
【請求項８】
前記点眼剤が、約４．５のｐＨを有することを特徴とする請求項１に記載の点眼剤。
【請求項９】
安定化補助剤、緩衝剤、および保存剤からなる群から選択される１種以上の添加剤をさらに含む、請求項１に記載の点眼剤。
【請求項１０】
前記安定化補助剤が、エチレンジアミン四酢酸またはその塩およびトロメタミンからなる群から選択される１種以上であることを特徴とする請求項９に記載の点眼剤。
【請求項１１】
前記緩衝剤が、ホウ砂、ホウ酸、リン酸塩、クエン酸、クエン酸ナトリウム、およびアミノカプロン酸からなる群から選択される１種以上であることを特徴とする請求項９に記載の点眼剤。
【請求項１２】
前記保存剤が、塩化ベンザルコニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、ソルビン酸類、クロロブタノール、およびパラベン類からなる群から選択される１種以上であることを特徴とする請求項９に記載の点眼剤。
【請求項１３】
水性媒体中に、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−６−アミノ−４−［Ｎ−（４−クロロフェニル）−Ｎ−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルメチル)アミノ］−３−ヒドロキシ−２−メチル−２−ジメトキシメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピランまたはその薬学的に許容可能な塩；プロピレングリコール；エチレンジアミン四酢酸またはその塩；トロメタミン；ホウ砂；ホウ酸；塩化ベンザルコニウム；およびｐＨ調整剤を含む、請求項１に記載の点眼剤。
【請求項１４】
水性媒体中に、３〜１０ｍｇ／ｍｌの（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−６−アミノ−４−［Ｎ−（４−クロロフェニル）−Ｎ−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルメチル)アミノ］−３−ヒドロキシ−２−メチル−２−ジメトキシメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピランまたはその薬学的に許容可能な塩；１〜２０ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコール；０．０１〜１．０ｍｇ／ｍｌのエチレンジアミン四酢酸またはその塩；０．０５〜１０．０ｍｇ／ｍｌのトロメタミン；１．０〜１１．０ｍｇ／ｍｌのホウ砂；０．１〜１８．０ｍｇ／ｍｌのホウ酸；０．０１〜０．５ｍｇ／ｍｌの塩化ベンザルコニウム；およびｐＨ調整剤を含む、請求項１に記載の点眼剤。
【請求項１５】
水性媒体中に、３〜１０ｍｇ／ｍｌの（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−６−アミノ−４−［Ｎ−（４−クロロフェニル）−Ｎ−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルメチル)アミノ］−３−ヒドロキシ−２−メチル−２−ジメトキシメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピランまたはその薬学的に許容可能な塩；１０〜１５ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコール；０．５ｍｇ／ｍｌのエチレンジアミン四酢酸またはその塩；０．３５ｍｇ／ｍｌのトロメタミン；５．８〜５．９ｍｇ／ｍｌのホウ砂；０．５〜０．６ｍｇ／ｍｌのホウ酸；０．０５〜０．１５ｍｇ／ｍｌの塩化ベンザルコニウム；およびｐＨ調整剤を含む、請求項１に記載の点眼剤。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の点眼剤を遮光容器に充填して得られる、黄斑変性の予防または治療のための医薬品。
【請求項１７】
前記医薬品が、前記点眼剤を遮光容器に充填した後、紙ケースで包装して得られる、請求項１６に記載の黄斑変性の予防または治療のための医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベンゾピラン誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を含む溶液形態の点眼剤に関する。さらに詳しくは、本発明は、ベンゾピラン誘導体またはその薬学的に許容可能な塩および特定の安定化剤を含み、特定のｐＨ範囲を有する、溶液形態の点眼剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の化学式1で表されるベンゾピラン誘導体は、その化学名が（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−６−アミノ−４−［Ｎ−（４−クロロフェニル）−Ｎ−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルメチル)アミノ］−３−ヒドロキシ−２−メチル−２−ジメトキシメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピランで表され、癌、関節リウマチ等に治療効果を有する化合物として知られている（韓国特許第１０−０４９２２５２号）。
＜化学式１＞
2021514995.tif 000003
【０００３】
また、化学式１の化合物は、低分子物質をベースとする点眼製剤としても調製することができ；抗体注射療法のように患部に直接注射することを必要とせずに、黄斑変性の予防および治療に有用に適用することができる（韓国特許公開第１０−２０１２−０１１２１６２号）。韓国特許公開第１０−２０１２−０１１２１６２号は、溶液または懸濁液形態の点眼剤を開示している。例えば、韓国特許公開第１０−２０１２−０１１２１６２号は、溶解補助剤（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｒ）としてポリエチレングリコールとグリセリンを使用して製造された、化学式１の化合物を０．０６ｗ／ｖ％および０．０９ｗ／ｖ％の濃度で含有する溶液形態の点眼剤を開示している。
【０００４】
一方、黄斑変性の効果的な治療のために、化学式１の化合物を高濃度で、例えば、０．３ｗ／ｖ％以上の濃度（すなわち、３．０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度）で、含有する溶液形態の点眼剤が必要である。しかし、化学式１の化合物は水難溶性物質なので、韓国特許公開第１０−２０１２−０１１２１６２号に開示されている溶液形態の点眼剤は、化学式１の化合物を３．０ｍｇ／ｍｌ以上の高濃度で溶解させることができない問題がある。また、化学式１の化合物は、水性媒体中で、低い安定性を有する。したがって、化学式１の化合物を３．０ｍｇ／ｍｌ以上の高濃度で含有する場合、分解産物の発生が大幅に増加する問題がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、水性媒体中に化学式１の化合物を高濃度（例えば、３．０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度）で含有し、また改善された安定性を有する溶液形態の点眼剤を開発するために、様々な研究を行った。その結果、本発明者らは、溶液のｐＨを特定の範囲（すなわち、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．０）に調節し、また、特定の安定化剤（すなわち、プロピレングリコール）を使用して製剤化を行うことにより、化学式１の化合物を高濃度で含有し、また、優れた安定性を有する、溶液形態の点眼剤を製造することができることを見出した。また、本発明者らは、得られた点眼剤を遮光容器に充填する場合、長期間の保管が可能な医薬品を得ることができるということを見出した。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩；および安定化剤としてプロピレングリコールを含み、４．０〜５．０のｐＨを有する、溶液形態の点眼剤を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、前記点眼剤を遮光容器に充填して得られる、黄斑変性の予防または治療のための医薬品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様によって、水性媒体中に、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−６−アミノ−４−［Ｎ−（４−クロロフェニル）−Ｎ−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルメチル)アミノ］−３−ヒドロキシ−２−メチル−２−ジメトキシメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピランまたはその薬学的に許容可能な塩；安定化剤としてプロピレングリコール；およびｐＨ調整剤を含み、４．０〜５．０のｐＨを有する、溶液形態の点眼剤が提供される。
【０００９】
本発明の点眼剤において、前記（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−６−アミノ−４−［Ｎ−（４−クロロフェニル）−Ｎ−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルメチル)アミノ］−３−ヒドロキシ−２−メチル−２−ジメトキシメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピランまたはその薬学的に許容可能な塩は、３ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で、好ましくは３〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在してもよい。また、前記プロピレングリコールは、１〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で、好ましくは５〜１７ｍｇ／ｍｌの濃度で、より好ましくは１０〜１５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在してもよい。本発明の点眼剤は、好ましくは４．２〜４．７のｐＨ、より好ましくは約４．５のｐＨを有してもよい。
【００１０】
本発明の点眼剤は、安定化補助剤、緩衝剤、および保存剤からなる群から選択される１種以上の添加剤をさらに含んでいてもよい。前記安定化補助剤は、エチレンジアミン四酢酸またはその塩およびトロメタミンからなる群から選択される１種以上であってもよい。前記緩衝剤は、ホウ砂、ホウ酸、リン酸塩、クエン酸、クエン酸ナトリウム、およびアミノカプロン酸からなる群から選択される１種以上であってもよい。前記保存剤は、塩化ベンザルコニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、ソルビン酸類、クロロブタノール、およびパラベン類からなる群から選択される１種以上であってもよい。
【００１１】
本発明の別の一態様によって、前記点眼剤を遮光容器に充填して得られる、黄斑変性の予防または治療のための医薬品が提供される。好ましくは、本発明の黄斑変性の予防または治療のための医薬品は、前記点眼剤を遮光容器に充填した後、紙ケースで包装して得られてもよい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る溶液形態の点眼剤は、化学式１の化合物を高濃度で含有することができ、優れた安定性を有する。また、本発明に係る医薬品は、長期間保管することができる。したがって、本発明に係る溶液形態の点眼剤および医薬品は、黄斑変性の予防または治療のために有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、黄斑変性の動物モデルで、本発明の点眼剤の血管漏出（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｌｅａｋａｇｅ）に対する抑制効果を評価して得られた結果を示す。
【図２】図２は、黄斑変性の動物モデルで、本発明の点眼剤の病因性の網膜血管新生（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｔｉｎａｌ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）に対する抑制効果を評価して得られた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、水性媒体中に、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−６−アミノ−４−［Ｎ−（４−クロロフェニル）−Ｎ−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルメチル)アミノ］−３−ヒドロキシ−２−メチル−２−ジメトキシメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピランまたはその薬学的に許容可能な塩；安定化剤としてプロピレングリコール；およびｐＨ調整剤を含み、４．０〜５．０のｐＨを有する、溶液形態の点眼剤を提供する。
【００１５】
本発明の点眼剤において、前記水性媒体は、注射用蒸留水、滅菌精製水、生理食塩水などを含む。
【００１６】
本発明の点眼剤において、前記（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−６−アミノ−４−［Ｎ−（４−クロロフェニル）−Ｎ−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルメチル)アミノ］−３−ヒドロキシ−２−メチル−２−ジメトキシメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピランは、前記したように、化学式１の化学構造を有する。前記化学式１の化合物の薬学的に許容可能な塩は、韓国特許公開第１０−２０１２−０１１２１６２号に開示された、酸付加塩、アルカリ金属塩、またはアルカリ土類金属塩の形態であってもよいが、これらに限定されない。本発明の点眼剤において、前記化学式１の化合物は、３ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で、好ましくは３〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在してもよい。
【００１７】
安定化剤としてプロピレングリコールを使用して化学式１の化合物の製剤化を行う場合、得られる点眼剤の安定性が著しく改善されることが、本発明によって明らかになった。前記プロピレングリコールは、１〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で、好ましくは５〜１７ｍｇ／ｍｌの濃度で、より好ましくは１０〜１５ｍｇ／ｍｌの濃度で、特に好ましくは約１３ｍｇ／ｍｌの濃度（すなわち、１２〜１４ｍｇ／ｍｌの濃度）で存在してもよい。
【００１８】
また、溶液形態の点眼剤のｐＨを特定の範囲（すなわち、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．０）に調節する場合、化学式１の化合物を高濃度で、沈殿物が生成せずに、溶解させることができるということが、本発明によって明らかになった。本発明の点眼剤は、好ましくは４．２〜４．７のｐＨ、より好ましくは約４．５のｐＨ（すなわち、ｐＨ４．４〜ｐＨ４．６）を有してもよい。前記ｐＨ調節は、点眼剤の分野で使用される通常のｐＨ調整剤を使用して行われてもよく、例えば、ｐＨ調整剤として塩酸および/または水酸化ナトリウムを使用してもよいが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明の点眼剤は、安定化補助剤、緩衝剤、および保存剤からなる群から選択される１種以上の添加剤をさらに含んでいてもよい。前記添加剤の使用量は、それぞれの機能を考慮して、本技術分野の当業者によって適切に選択してもよい。
【００２０】
前記安定化補助剤は、エチレンジアミン四酢酸またはその塩（例えば、そのナトリウム塩等）およびトロメタミンからなる群から選択される１種以上であってもよい。例えば、前記安定化補助剤は、０．０５〜１０．０ｍｇ／ｍｌの量で使用してもよいが、これに限定されない。
【００２１】
前記緩衝剤は、ホウ砂、ホウ酸、リン酸塩（例えば、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸カリウムなど）、クエン酸、クエン酸ナトリウム、およびアミノカプロン酸からなる群から選択される１種以上であってもよい。例えば、前記緩衝剤は、０．０５〜１８．０ｍｇ／ｍｌの量で使用してもよいが、それは種類に応じて異なる。
【００２２】
前記保存剤は、塩化ベンザルコニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、クロロブタノール、ソルビン酸類（例えば、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸ナトリウムなど）、およびパラベン類（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベンなど）からなる群から選択される１種以上であってもよい。例えば、前記保存剤は、０．０１〜０．５ｍｇ／ｍｌの量で使用してもよいが、これに限定されない。
【００２３】
必要に応じて、本発明の点眼剤は、例えば、０．２μｍメンブレンフィルターのような細菌フィルターなどで滅菌濾過した後、適切な容器に充填してもよい。
【００２４】
一実施形態において、水性媒体中に、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−６−アミノ−４−［Ｎ−（４−クロロフェニル）−Ｎ−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルメチル)アミノ］−３−ヒドロキシ−２−メチル−２−ジメトキシメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピランまたはその薬学的に許容可能な塩；プロピレングリコール；エチレンジアミン四酢酸またはその塩；トロメタミン；ホウ砂；ホウ酸；塩化ベンザルコニウム；およびｐＨ調整剤を含み、４．０〜５．０のｐＨを有する、溶液形態の点眼剤が提供される。
【００２５】
別の一実施形態において、水性媒体中に、３〜１０ｍｇ／ｍｌの（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−６−アミノ−４−［Ｎ−（４−クロロフェニル）−Ｎ−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルメチル)アミノ］−３−ヒドロキシ−２−メチル−２−ジメトキシメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピランまたはその薬学的に許容可能な塩；１〜２０ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコール；０．０１〜１．０ｍｇ／ｍｌのエチレンジアミン四酢酸またはその塩；０．０５〜１０．０ｍｇ／ｍｌのトロメタミン；１．０〜１１．０ｍｇ／ｍｌのホウ砂；０．１〜１８．０ｍｇ／ｍｌのホウ酸；０．０１〜０．５ｍｇ／ｍｌの塩化ベンザルコニウム；およびｐＨ調整剤を含み、４．０〜５．０のｐＨを有する、溶液形態の点眼剤が提供される。
【００２６】
さらに別の一実施形態において、水性媒体中に、３〜１０ｍｇ／ｍｌの（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−６−アミノ−４−［Ｎ−（４−クロロフェニル）−Ｎ−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルメチル)アミノ］−３−ヒドロキシ−２−メチル−２−ジメトキシメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピランまたはその薬学的に許容可能な塩；１０〜１５ｍｇ／ｍｌのプロピレングリコール；０．５ｍｇ／ｍｌのエチレンジアミン四酢酸またはその塩；０．３５ｍｇ／ｍｌのトロメタミン；５．８〜５．９ｍｇ／ｍｌのホウ砂；０．５〜０．６ｍｇ／ｍｌのホウ酸；０．０５〜０．１５ｍｇ／ｍｌの塩化ベンザルコニウム；およびｐＨ調整剤を含み、４．０〜５．０のｐＨを有する、溶液形態の点眼剤が提供される。
【００２７】
また、本発明は、前記点眼剤を遮光容器に充填して得られる、黄斑変性の予防または治療のための医薬品を提供する。好ましくは、本発明の黄斑変性の予防または治療のための医薬品は、前記点眼剤を遮光容器に充填した後、紙ケースで包装して得られてもよい。前記遮光容器は、例えば、不透明ＬＤＰＥ容器（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ  ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、不透明PP容器（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ  ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）などを含むが、これに限定されない。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例を参照することによって本発明をさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を一例として説明するためのものであり、本発明の範囲はこれらに限定されない。
【００２９】
以下の参照例、実施例、および試験例において、ＨＬ２１７とは、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−６−アミノ−４−［Ｎ−（４−クロロフェニル）−Ｎ−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルメチル)アミノ］−３−ヒドロキシ−２−メチル−２−ジメトキシメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピランを意味する。
【００３０】
参照例１：高濃度を有する点眼剤の製造可能性の評価
韓国特許公開第１０−２０１２−０１１２１６２号の製剤例１及び２に開示されている点眼液（０．０６ｗ／ｖ％及び０．０９ｗ／ｖ％点眼液）において、ＨＬ２１７の含有量として０．３ｗ／ｖ％の濃度（すなわち、３．０ｍｇ／ｍｌの濃度）を使用したことを除いては、同じ方法でＨＬ２１７を溶解させて、溶液形態の点眼剤の製造可能性を評価した。すなわち、表1に示した成分及び含有量に従って、滅菌精製水に、ＨＬ２１７、ポリエチレングリコール４００、グリセリン、ＥＤＴＡ、およびホウ酸を、攪拌しながら加えた。塩酸水溶液および/または水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを６．５に調整した後、滅菌精製水を加えて最終体積を調節した。下記表１の含有量は、総体積１ｍＬ当たりの各成分の含有量を示す。
＜表1＞
2021514995.tif 000004
【００３１】
上記のように、活性成分であるＨＬ２１７の濃度を３．０ｍｇ／ｍｌに増加させたとき、沈殿物が発生して、溶液が製造されなかった。
【００３２】
参照例２：ＨＬ２１７の可溶化および安定性の評価
（１）ＨＬ２１７の可溶化
ＨＬ２１７を高濃度（０．３ｗ／ｖ％以上の濃度）で溶解させるために、様々な物理化学的因子を評価した。点眼剤において、ポリエチレングリコール４００の米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の最大許容基準は、５０ｍｇ／ｍｌであるため、ポリエチレングリコール４００の使用量を１/１０（すなわち、１５．０ｍｇ）に調節し、それに応じてグリセリンの使用量も１/１０（すなわち、１２．０ｍｇ）に調節して、ＨＬ２１７の可溶化を評価した。様々な物理化学的因子による影響を評価したところ、溶液のｐＨがＨＬ２１７の可溶化に大きな影響を与えることが発見された。すなわち、様々な因子の中でｐＨを４．５±０．５の範囲で調整した場合、沈殿物が発生せずに、透明な溶液が得られた。具体的には、表２の成分と含有量に従って、滅菌精製水に、ＨＬ２１７、ポリエチレングリコール４００、グリセリン、ＥＤＴＡ、およびホウ酸を、攪拌しながら加えた。塩酸水溶液および/または水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを４．５に調整した後、滅菌精製水を加えて最終体積を調節した。下記表２の含有量は、総体積１ｍＬ当たりの各成分の含有量を示す。
＜表２＞
2021514995.tif 000005
【００３３】
上記表２の結果から分かるように、溶解補助剤（すなわち、ポリエチレングリコール４００およびグリセリン）の含有量が１/１０倍にもかかわらず、透明な溶液がｐＨ４．５の条件で、沈殿物が発生せずに、得られた。
【００３４】
（２）安定性の評価
参照例２−１、２−２、および２−３の溶液を、それぞれ冷蔵条件（５±３℃）、室温条件（２５±２℃、４０±５％ＲＨ）、および加速条件（４０±２℃、２５％ＲＨ）で４週間保管して、分解産物の含有量を測定した。分解産物の含有量として、最大分解産物の含有量および総分解産物の含有量を、下記条件の下で、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定した。
＜ＨＰＬＣ条件＞
−検出器：ＵＶ／ｖｉｓ 吸光光度計（測定波長：２５４ｎｍ）
−カラム：Ｌｕｎａ Ｃ８ ｃｏｌｕｍｎ (４．６ ＊ ２５０ ｍｍ、５ μｍ)
−流速：１．０ｍＬ／分
−注入量：２０μＬ
−移動相：ギ酸アンモニウム緩衝液／アセトニトリル＝５０／５０
（ギ酸アンモニウム緩衝液は、１０ｍＭギ酸アンモニウム溶液をリン酸でｐＨ５．５に調整して製造した。）
−カラム温度：約３０℃
−サンプル温度：約４℃
上記のように分解産物の含有量を測定して得られた結果は、以下の表３〜表５に示す。
【００３５】
＜表３＞
参照例２−１の溶液の分解産物の含有量
2021514995.tif 000006
【００３６】
＜表４＞
参照例２−２の溶液の分解産物の含有量
2021514995.tif 000007
【００３７】
＜表５＞
参照例２−３の溶液の分解産物の含有量
2021514995.tif 000008
【００３８】
上記表３〜５の結果から分かるように、参照例２−１〜２−３の溶液は、すべての条件で２週間後および４週間後に分解産物が大幅に増加したので、分解産物の含有量の許容基準（最大分解産物：１％以下、総分解産物：２％以下）に不適合である。
【００３９】
実施例１および２：ＨＬ２１７を含有する安定した溶液形態の点眼剤の製造
（１）溶液形態の点眼剤の製造
表６の成分および含有量に従って、ポリエチレングリコール/グリセリンの代わりに、プロピレングリコールを含有する溶液形態の点眼剤を製造した。すなわち、表６の成分および含有量に従って、滅菌精製水に、ＨＬ２１７、プロピレングリコール、安定化剤（ＥＤＴＡ、および/またはトロメタミン）、緩衝剤（ホウ酸およびホウ砂）、および塩化ベンザルコニウムを、攪拌しながら加えた。塩酸水溶液および/または水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを４．５に調整した後、滅菌精製水を加えて最終体積を調節した。下記表６の含有量は、総体積１ｍＬ当たりの各成分の含有量を示す。
【００４０】
＜表６＞
2021514995.tif 000009
【００４１】
（２）安定性の評価
実施例１および２の溶液を、それぞれ冷蔵条件（５±３℃）、室温条件（２５±２℃、４０±５％ＲＨ）、および加速条件（４０±２℃、２５％ＲＨ）で４週間保管して、分解産物の含有量を測定した。分解産物の含有量として、最大分解産物の含有量および総分解産物の含有量を、参照例２の（２）と同様の方法で測定した。その結果は、以下の表７および表８に示す。
【００４２】
＜表７＞
実施例１の溶液の分解産物の含有量
2021514995.tif 000010
【００４３】
＜表８＞
実施例２の溶液の分解産物の含有量
2021514995.tif 000011
【００４４】
上記表６〜８の結果から分かるように、プロピレングリコールを使用し、溶液のｐＨを４．５に調整した場合、透明な溶液が、沈殿物が発生せず、得られただけでなく、すべての条件（すなわち、冷蔵条件、室温条件、および加速条件）で、分解産物の発生が顕著に減少した。したがって、上記点眼剤は、分解産物の含有量の許容基準（最大分解産物：１％以下、総分解産物：２％以下）に適合している。また、トロメタミンを安定化剤としてさらに添加して製造した溶液は、有意性はないが、トロメタミン非添加の溶液に比べて、加速条件で若干の安定性の増加を示した。
【００４５】
実施例３および４：ＨＬ２１７を含有する安定した溶液形態の点眼剤の製造
（１）溶液形態の点眼剤の製造
表９の成分および含有量に従って、溶液形態の点眼剤を製造した。すなわち、ＨＬ２１７の濃度をそれぞれ５．０ｍｇ／ｍｌ及び１０．０ｍｇ／ｍｌに増加させ、実施例２と同様の方法で、溶液形態の点眼剤を製造した。下記表９の含有量は、総体積１ｍＬ当たりの各成分の含有量を示す。
【００４６】
＜表９＞
2021514995.tif 000012
【００４７】
（２）安定性の評価
実施例３および４の溶液を、それぞれ冷蔵条件（５±３℃）、室温条件（２５±２℃、４０±５％ＲＨ）、および加速条件（４０±２℃、２５％ＲＨ）で４週間保管して、分解産物の含有量を、参照例２の（２）と同様の方法で測定した。その結果は、以下の表１０および表１１に示す。
【００４８】
＜表１０＞
実施例３の溶液の分解産物の含有量
2021514995.tif 000013
【００４９】
＜表１１＞
実施例４の溶液の分解産物の含有量
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【００５０】
上記表９〜１１の結果から分かるように、プロピレングリコールを使用し、溶液のｐＨを４．５に調整した場合、ＨＬ２１７を高濃度（例えば、１０ｍｇ／ｍｌ）で含有する透明な溶液が得られ、すべての条件（すなわち、冷蔵条件、室温条件、および加速条件）で、分解産物の含有量の許容基準（最大分解産物：１％以下、総分解産物：２％以下）に適合している。
【００５１】
実施例５〜７：ＨＬ２１７を含有する安定した溶液形態の点眼剤の製造
（１）溶液形態の点眼剤の製造
表１２の成分および含有量に従って、溶液形態の点眼剤を製造した。すなわち、プロピレングリコールの濃度をそれぞれ１．０ｍｇ／ｍｌ、５．０ｍｇ／ｍｌ及び２０．０ｍｇ／ｍｌに変化させ、実施例２と同様の方法で、溶液形態の点眼剤を製造した。下記表１２の含有量は、総体積１ｍＬ当たりの各成分の含有量を示す。
【００５２】
＜表１２＞
2021514995.tif 000015
【００５３】
（２）安定性の評価
実施例５〜７の溶液を、それぞれ冷蔵条件（５±３℃）、室温条件（２５±２℃、４０±５％ＲＨ）、および加速条件（４０±２℃、２５％ＲＨ）で４週間保管して、分解産物の含有量を、参照例２の（２）と同様の方法で測定した。その結果は、以下の表１３〜表１５に示す。
【００５４】
＜表１３＞
実施例５の溶液の分解産物の含有量
2021514995.tif 000016
【００５５】
＜表１４＞
実施例６の溶液の分解産物の含有量
2021514995.tif 000017
【００５６】
＜表１５＞
実施例７の溶液の分解産物の含有量
2021514995.tif 000018
【００５７】
上記表１２〜１５の結果から分かるように、プロピレングリコールを１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した場合、沈殿物が発生せず、透明な溶液が得られ、すべての条件（すなわち、冷蔵条件、室温条件、および加速条件）で、分解産物の含有量の許容基準（最大分解産物：１％以下、総分解産物：２％以下）に適合している。
【００５８】
試験例１：光安定性試験
透明容器として透明な低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）容器［ＰｕｒｅｌｌＰＥ１８１０Ｅ  ｎａｔｕｒａｌ（ＧＥＲＲＥＳＨＥＩＭＥＲ）］、不透明容器として不透明な低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）容器［ＰｕｒｅｌｌＰＥ１８１０Ｅ  ｗｈｉｔｅ（ＧＥＲＲＥＳＨＥＩＭＥＲ）］を使用し、また、紙ケースをそれぞれ使用して、点眼剤の光安定性を評価した。すなわち、実施例２で製造した点眼剤を下記表１６の保管条件で保管した。それぞれの試験群を光チャンバー（ｐｈｏｔｏｃｈａｍｂｅｒ）に入れて、５ｗ／ｍ２の条件で４０時間紫外線にさらさせたり、または３００００ｌｕｘ／ｈｒの条件で４０時間可視光線にさらさせた。４０時間の暴露後、参照例２の（２）と同様の方法で分解産物の含有量を測定した。その結果を表１７に示す。
【００５９】
＜表１６＞
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【００６０】
＜表１７＞
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【００６１】
上記表１７の結果から分かるように、ＨＬ２１７含有の点眼剤は、不透明容器に充填することが好ましく、不透明容器に充填して、紙ケースに保管することがより好ましい。
【００６２】
試験例２：動物での効能試験
加齢黄斑変性（ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、ＡＭＤ）の動物モデルとして超低密度リポタンパク質受容体（ｖｅｒｙ−ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｖｌｄｌｒ）遺伝子がノックアウトされたマウス（Ｃ５７Ｂ１／６  ｍｏｕｓｅ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ）を利用して、黄斑変性に対する治療効能を検証した。陽性対照群としてルセンティスＴＭ注射剤（ＬｕｃｅｎｔｉｓＴＭ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｖａｔｉｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した。
【００６３】
対照群は、正常マウスの両眼に滅菌生理食塩水を毎日２回、３週間１滴ずつ点眼した（ｎ＝８）。ＡＭＤ誘発群は、ｖｌｄｌｒ遺伝子がノックアウトされたマウス（ｖｌｄｌｒ −/−マウス）の両眼に滅菌生理食塩水を毎日２回、３週間１滴ずつ点眼した。陽性対照群は、ｖｌｄｌｒ −/−マウスの両眼にルセンティスＴＭ注射剤１μl（５０ｎｇ／μlのラニビズマブを含有）をハミルトンシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｉｏｎ ｓｙｒｉｎｇｅ）（Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｅｎｏ、ＮＶ、ＵＳＡ）を用いて、眼の硝子体内に単回投与した。試験群は、実施例２の点眼剤をｖｌｄｌｒ −/−マウスの両眼に毎日２回、３週間１滴ずつ点眼した。
【００６４】
血管新生の形成および異常な血管透過性などの網膜血管の異常の有無を確認するために、次の実験を実施した。剖検時、１０ｍｇ／ｋｇのゾラゼパム（Ｚｏｌｅｔｉｌ、Ｖｉｒｂａｃ、Ｃａｒｒｏｓ、Ｆｒａｎｃｅ）と１０ｍｇ／ｋｇのキシラジン塩酸塩（Ｒｕｍｐｕｎ、Ｂａｙｅｒ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を腹腔内注射して、麻酔を誘導した。腹腔および胸腔を開いて心臓を確保し、滅菌ＰＢＳ（１ｍＬ）中の５０ｍｇ／ｍｌのフルオレセイン-デキストラン（１０Ｋｄａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ. Ｌｕｏｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）と１０ｍｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（ｓｉｇｍａ）を左心室に注射した。１０分後、眼球を摘出して、４％パラホルムアルデヒドで２時間固定し、網膜を分離した。分離された網膜をスライド上に置いて、水性封入剤（ａｑｕｅｏｕｓ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）（ＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔＴＭ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ. Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を滴下した後、蛍光顕微鏡で観察した。トレーサー染料の定量分析のために、染料注射１０分後に心臓から血液を採取し、滅菌ＰＢＳでかん流して、血管内残留染料を除去した後、眼球を摘出して網膜を分離した。分離された網膜は、１００μＬのＰＢＳで均質化した後、遠心分離して上澄み液を得て、蛍光分光光度計を使用してＦＩＴＣ−デキストランの量を測定した。蛍光強度は、４８５ｎｍの励起および５３０ｎｍの発光の条件の下で測定し、血液中のＦＩＴＣ蛍光値と網膜タンパク質濃度を補正して、計算した。上記結果は、図１に示す。
【００６５】
また、網膜下血管新生を評価するために、次の実験を実施した。分離された網膜組織を４％パラホルムアルデヒドで１時間固定した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４−ｃｏｎｊｕａｔｅｄ Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｂａｎｄｅｉｒａｅａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４（ＩＢ４ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、１：１００ ｄｉｌｕｔｉｏｎ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ、ＵＳＡ）と２時間反応させた。ＰＢＳで十分に洗浄した後、網膜組織をスライド上に置いて、水性封入剤（ａｑｕｅｏｕｓ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）（ＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔＴＭ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ. Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を滴下した。十分に乾燥した後、蛍光顕微鏡下で観察し、撮影した。網膜部位（ｒｅｔｉｎａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ）に対してＨ＆Ｅ染色を実行した後、網膜下新血管形成（ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）をＩｍａｇｅＪ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて分析した。その結果は、図２に示す。
【００６６】
図１に示すように、正常マウスでは、血管の境界がはっきりし、正常の血管形態（ｎｏｒｍａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）がよく維持されている。しかし、ｖｌｄｌｒ −/−マウスでは、血管内に注入した蛍光トレーサー染料（ｔｒａｃｅｒ ｄｙｅ）が血管外に流出されて（白矢印）、網膜の蛍光強度が増加した。また、青色蛍光を示すＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染色物質も、血管外に流出されて、血管漏出（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｌｅａｋａｇｅ）所見が多数観察され、網膜下新血管形成部位（ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ａｒｅａ、赤矢印）が観察された。しかし、実施例２の点眼剤で処理した眼球では、血管漏出（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｌｅａｋａｇｅ）と病因性の血管新生（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）が抑制された。陽性対照群では、薬物投与の第２週でのみ有意な効果を示した。
【００６７】
図２から分かるように、イソレクチンＢ４染色分析の場合、ｖｌｄｌｒ −/−マウスは、複数の散在された場所で、網膜下新生血管叢（ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ ｔｕｆｔｓ、白矢印）が見られたが、その面積は実施例２の点眼剤投与により減少した。また、網膜部位（ｒｅｔｉｎａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ）のＨ＆Ｅ染色分析の場合も、ｖｌｄｌｒ −/−マウスは、網膜下部位（矢印の部分）で、多数の異常な新血管形成を示したが、それは実施例２の点眼剤投与により減少した。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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