(57)【要約】  本発明は、Dbait分子の投与に基づいた、患者におけるがん療法剤に耐性を有するがんの発生を遅延させる及び/又は予防する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者におけるがん療法剤に耐性を有するがんの発生の遅延化及び/又は予防における使用のためのDbait分子。
【請求項２】
前記がん療法剤が、Dbait分子である、請求項1に記載の使用のためのDbait分子。
【請求項３】
前記がん療法剤が、化学療法又は標的療法である、請求項1に記載の使用のためのDbait分子。
【請求項４】
前記がん療法剤が、PARP阻害剤である、請求項1又は3に記載の使用のためのDbait分子。
【請求項５】
前記PARP阻害剤が、オラパリブ、ルカパリブ、ニラパリブ、タラゾパリブ、イニパリブ及びベリパリブからなる群から選択される、請求項1及び3から4のいずれか一項に記載の使用のためのDbait分子。
【請求項６】
前記がん療法剤が、白金剤、アルキル化剤、カンプトテシン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、代謝拮抗剤、及びビンカからなる群から選択される、請求項1又は3に記載の使用のためのDbait分子。
【請求項７】
前記がん療法剤が、好ましくはシスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンからなる群から選択される、白金剤である、請求項1、3及び6のいずれか一項に記載の使用のためのDbait分子。
【請求項８】
前記Dbait分子が、好ましくは少なくとも2サイクルの投与のために、反復投与により投与される、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用のためのDbait分子。
【請求項９】
前記Dbait分子が、前記がん療法剤との併用療法において投与される、請求項3から8のいずれか一項に記載の使用のためのDbait分子。
【請求項１０】
前記Dbait分子及び前記がん療法剤が、少なくとも2サイクルの投与のために組み合わせて投与される、請求項3から8のいずれか一項に記載の使用のためのDbait分子。
【請求項１１】
前記Dbait分子及び前記がん療法剤が、少なくとも3又は4サイクルの投与のために組み合わせて投与される、請求項10に記載の使用のためのDbait分子。
【請求項１２】
前記Dbait分子が、以下の式:
【化１】
2021515580.tif 000009
の1つを有し、式中、Nは、デオキシヌクレオチドであり、nは、1〜195の整数であり、下線を付したNは、修飾ホスホジエステル骨格を有する又は有しないヌクレオチドを表し、L'は、リンカーであり、Cは、親油性分子又は受容体媒介エンドサイトーシスを可能にする細胞受容体を標的とするリガンドから選択されるエンドサイトーシスを促進する分子であり、Lは、リンカーであり、m及びpは、独立して、0又は1の整数である、
請求項1から11のいずれか一項に記載の使用のためのDbait分子。
【請求項１３】
前記Dbait分子が、以下の式:
【化２】
2021515580.tif 000010
を有し、N、N、n、L、L'、C及びmについて、式(I)、(II)及び(III)と同じ定義を有する、
請求項1から12のいずれか一項に記載の使用のためのDbait分子。
【請求項１４】
前記Dbait分子が、以下の式:
【化３】
2021515580.tif 000011
を有する、請求項1から13のいずれか一項に記載の使用のためのDbait分子。
【請求項１５】
前記がんが、白血病、リンパ腫、肉腫、黒色腫、並びに頭頸部、腎臓、卵巣、膵臓、前立腺、甲状腺、肺、食道、乳房、膀胱、脳、結腸直腸、肝臓及び子宮頸部のがんからなる群から選択される、請求項1から14のいずれか一項に記載の使用のためのDbait分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、特に腫瘍学の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
一部の患者では完全奏効と完全寛解が得られるが、大多数の患者では放射線治療及び/又は化学療法及び標的療法等の従来の療法で中等度の奏効が得られたり、奏効が不十分であったりし、非常に大多数の患者で疾患が再発する。また、これらの療法を受けた一定数の患者で再発がおきることがある。再発した患者で維持療法による治療が試みられているが、従来の療法であっても、その成功は限定的である。
【０００３】
抗がん剤に対する耐性が比較的急速に獲得されることは、がん療法を成功させるための重要な障害となっている。獲得薬剤耐性を示す多くのがん患者において、耐性をもたらす特異的な突然変異が実際に確認されているが、薬剤耐性に対する突然変異メカニズムと非突然変異メカニズムの相対的な寄与、及び腫瘍細胞亜集団の役割については、いまだに不明な点が多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】WO14201972
【特許文献２】WO12141990
【特許文献３】WO10091140
【特許文献４】WO9524379
【特許文献５】WO09155402
【特許文献６】WO09046205
【特許文献７】WO08146035
【特許文献８】WO08015429
【特許文献９】WO0191796
【特許文献１０】WO0042040
【特許文献１１】US2006004028
【特許文献１２】EP2604610
【特許文献１３】EP1802578
【特許文献１４】CN104140426
【特許文献１５】CN104003979
【特許文献１６】US060229351
【特許文献１７】US7041675
【特許文献１８】WO07041357
【特許文献１９】WO2003057699
【特許文献２０】US06444676
【特許文献２１】US20060229289
【特許文献２２】US20060063926
【特許文献２３】WO2006033006
【特許文献２４】WO2006033007
【特許文献２５】WO03051879
【特許文献２６】WO2004108723
【特許文献２７】WO2006066172
【特許文献２８】WO2006078503
【特許文献２９】US20070032489
【特許文献３０】WO2005023246
【特許文献３１】WO2005097750
【特許文献３２】WO2005123687
【特許文献３３】US7087637
【特許文献３４】US6903101
【特許文献３５】WO20070011962
【特許文献３６】US20070015814
【特許文献３７】WO2006135873
【特許文献３８】UA20070072912
【特許文献３９】WO2006065392
【特許文献４０】WO2005012305
【特許文献４１】EP412848
【特許文献４２】EP453210
【特許文献４３】EP454831
【特許文献４４】EP879820
【特許文献４５】WO030805
【特許文献４６】WO03007959
【特許文献４７】US6989388
【特許文献４８】EP1212328
【特許文献４９】WO2006078711
【特許文献５０】US06426415
【特許文献５１】US06514983
【特許文献５２】US20040254372
【特許文献５３】US20050148575
【特許文献５４】US20060003987
【特許文献５５】US06635642
【特許文献５６】WO200116137
【特許文献５７】WO2004105700
【特許文献５８】WO03057145A2
【特許文献５９】WO2002044157
【特許文献６０】US20056924284
【特許文献６１】WO2005112935
【特許文献６２】US20046828319
【特許文献６３】WO2005054201
【特許文献６４】WO2005054209
【特許文献６５】WO2005054210
【特許文献６６】WO2005058843
【特許文献６７】WO2006003146
【特許文献６８】WO2006003147
【特許文献６９】WO2006003148
【特許文献７０】WO2006003150
【特許文献７１】UA20070072842
【特許文献７２】US05587384
【特許文献７３】US20060094743
【特許文献７４】WO2002094790
【特許文献７５】WO2004048339
【特許文献７６】EP1582520
【特許文献７７】US20060004028
【特許文献７８】WO2005108400
【特許文献７９】US6964960
【特許文献８０】WO20050080096
【特許文献８１】WO2006137510
【特許文献８２】UA20070072841
【特許文献８３】WO2004087713
【特許文献８４】WO2006046035
【特許文献８５】WO2006008119
【特許文献８６】WO06008118
【特許文献８７】WO2006042638
【特許文献８８】US20060229351
【特許文献８９】WO2005023800
【特許文献９０】WO1991007404
【特許文献９１】WO2000042025
【特許文献９２】WO2004096779
【特許文献９３】WO02068407
【特許文献９４】US06476048
【特許文献９５】WO2001090077
【特許文献９６】WO2001085687
【特許文献９７】WO2001085686
【特許文献９８】WO2001079184
【特許文献９９】WO2001057038
【特許文献１００】WO2001023390
【特許文献１０１】WO01021615A1
【特許文献１０２】WO2001016136
【特許文献１０３】WO2001012199
【特許文献１０４】WO95024379
【特許文献１０５】WO200236576
【特許文献１０６】WO2004080976
【特許文献１０７】WO2007149451
【特許文献１０８】WO2006110816
【特許文献１０９】WO2007113596
【特許文献１１０】WO2007138351
【特許文献１１１】WO2007144652
【特許文献１１２】WO2007144639
【特許文献１１３】WO2007144637
【特許文献１１４】WO2005/040378
【特許文献１１５】WO2008/034866
【特許文献１１６】WO2008/084087
【特許文献１１７】WO2011/161075
【特許文献１１８】US2004/242582
【特許文献１１９】WO09/126933
【特許文献１２０】WO2007/040469
【特許文献１２１】WO2008/022309
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Goldsteinら、Ann.Rev.Cell Biol.、1985、1:1〜39頁
【非特許文献２】Leamon & Lowe、Proc Natl Acad Sci USA、1991、88:5572〜5576頁
【非特許文献３】GalluzziLら、Cell Rep.、2012年8月30日、2(2):257〜69頁
【非特許文献４】MichelsJら、Cancer Res.、2013年4月1日、73(7):2271〜80頁
【非特許文献５】Chiarugi A.、Trends Pharmacol Sci.、2012年1月、33(1):42〜8頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
がん細胞集団内の不均一性や療法に耐性を有するがん細胞の出現にうまく対処するためには、新しい治療法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、患者におけるがん療法剤に耐性を有するがんの発生の遅延化及び/又は予防における使用のためのDbait分子に関する。
【０００８】
本発明者らは、Dbait分子の反復投与、例えば、数サイクルにわたる治療の少なくとも1回のAsiDNAの投与が、以下の利点を有することを実際に示した：
i)反復治療後に、腫瘍細胞はDbait分子に対して耐性にならなかった；
ii)PARP阻害剤等のがん療法剤や白金剤等の化学療法に対して、腫瘍細胞は耐性にならなかった；
ii)腫瘍細胞は、治療の各サイクルの後にDbait分子に対してより感受性になった；及び
iii)非腫瘍細胞は、反復治療によって影響を受けなかった(毒性はなかった)。
【０００９】
本開示はまた、単独療法及び併用療法の両方において、がんの治療のための新規な維持療法レジメンを提供する。
【００１０】
Dbait分子をがん療法(標的療法の有無にかかわらず)と併用して投与した場合、好ましくは、両分子を併用して又は同時に投与した場合、がん感受性の期間を長くし、及び/又は併用されたがん療法剤に対するがん耐性の発現を遅延させ、及び/又は予防する。したがって、反復治療により、がん療法剤に対する耐性の出現が許容され、それは、AsiDNAのようなDbait分子の存在下では防止され、更には逆になり、この併用療法に対する腫瘍エスケープの可能性が低いことを示していることを、本発明者らは示した。
【００１１】
これらの利点は、特に腫瘍の再発を減少させることにつながる(Dbait分子を長期間にわたって投与することができるため)。その結果、AsiDNAのようなDbait分子の反復投与により、従来の抗がん剤や標的抗がん剤の使用で見られる再発のリスクはかなり制限される。
【００１２】
第1の態様において、がん療法剤はDbait分子である。第2の態様において、がん療法剤は化学療法又は標的療法である。例えば、がん療法剤は、オラパリブ、ルカパリブ、ニラパリブ、タラゾパリブ、イニパリブ、及びベリパリブ等のPARP阻害剤であり得る。或いは、がん療法剤は、白金剤、アルキル化剤、カンプトテシン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、代謝拮抗剤、及びビンカからなる群から選択することができ、好ましくはシスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチン等の白金剤である。
【００１３】
好ましくは、Dbait分子は、反復投与により、好ましくは少なくとも2サイクルの投与を繰り返すことによって投与される。特に、Dbait分子は、がん療法剤との併用療法において、好ましくは少なくとも2サイクルの投与、より好ましくは少なくとも3サイクル又は4サイクルの投与で投与される。
【００１４】
したがって、本発明は、がん治療のための維持療法に使用するためのDbait分子に関する。
【００１５】
この療法レジメンは、例えば、放射線療法及び/又は化学療法等の従来のがん療法、又は標的療法による誘導療法に続くものであってもよい。
【００１６】
本発明はまた、がん療法剤に対して耐性であるか、又は耐性を発現する可能性が増大しているがん患者を治療するために使用するDbait分子に関する。
【００１７】
好ましくは、Dbait分子は、少なくとも1つの遊離末端、及びヒトゲノム中の任意の遺伝子と60%未満の配列同一性を有する20〜200bpのDNA二本鎖部分を有する。
【００１８】
より好ましくは、Dbait分子は、以下の式：
【化１】
2021515580.tif 000002
の1つを有し、式中、Nはデオキシヌクレオチドであり、nは1〜195の整数であり、下線を付したNは修飾ホスホジエステル骨格を有する又は有しないヌクレオチドを表し、L'はリンカーであり、Cは親油性分子及び受容体媒介エンドサイトーシスを可能にする細胞受容体を標的とするリガンドから好ましくは選択されるエンドサイトーシスを促進する分子であり、Lはリンカーであり、m及びpは、独立して、0又は1の整数である。
【００１９】
非常に特定の実施形態では、Dbait分子は、以下の式(AsiDNA)：
【化２】
2021515580.tif 000003
を有する。
【００２０】
すべての種類のがんを治療することができる。より好ましくは、がんは、白血病、リンパ腫、肉腫、黒色腫、並びに頭頸部、腎臓、卵巣、膵臓、前立腺、甲状腺、肺、特に小細胞肺がん、及び非小細胞肺がん、食道、乳房(TBNCを含む)、膀胱、結腸直腸、肝臓、子宮頸部、並びに子宮内膜及び腹膜のがんから選択される。特に、がんは固形がんである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】AsiDNA処理の反復サイクルは耐性を回復しなかったことを示す図である。(A)AsiDNAを用いた反復処理のプロトコール(5μM。黒矢印、細胞生存評価、薬剤除去及び生存細胞の増幅;灰色矢印、細胞計数、凍結及び次の処理サイクルのための播種。(B)MDA-MB-231細胞株に対するAsiDNA(1〜4サイクル)の有効性。細胞生存率は、生きた処理細胞/生きた未処理細胞の割合として計算した。(C)モック処理(黒線)又は3サイクルのAsiDNA(灰色の長方形)処理(灰色線)した、MDA-MD-231細胞由来の異種移植された腫瘍の成長。プロトコールに従って5日間連続して注入し、その後17日間の休止を行った(ビヒクル、n=6;AsiDNA、n=8)。データは平均±s.e.m.で表されている。
【図２】AsiDNAはPARP阻害剤に対する耐性の出現を抑止することを示す図である。(A)薬剤反復処理のプロトコール。黒矢印、細胞生存評価、薬剤除去及び生存細胞の増幅;灰色矢印、細胞計数、凍結及び次の処理サイクルのための播種。(B)Aに示された処理プロトコールに従って、PARP阻害剤オラパリブ(10μM)及びタラゾパリブ(100nM)に対する耐性の出現に及ぼすAsiDNA(2.5μM)の同時処理の効果の評価。
【図３】AsiDNAはPARP阻害剤タラゾパリブに対する獲得耐性を後退させることを示す図である。(A)タラゾパリブ耐性誘導後、i)耐性バリデーション又はii)タラゾパリブ+AsiDNA併用療法による後退のプロトコール。(B)細胞生存率は、生きた処理細胞/生きた未処理細胞の割合として計算した。RT、タラゾパリブに対する耐性。
【図４】AsiDNAは卵巣がんにおけるニラパリブに対する耐性の出現を抑止することを示す図である。(A)薬剤反復処理のプロトコール。黒矢印、細胞生存評価、薬剤除去及び生存細胞の増幅;灰色矢印、細胞計数、凍結及び次の処理サイクルのための播種。(B)Aに示された処理プロトコールに従って、ニラパリブ(5μM)に対する耐性の出現に及ぼすAsiDNA(2.5μM)の同時処理の効果の評価。
【図５】AsiDNAはSCLCにおけるタラゾパリブに対する耐性の出現を抑止することを示す図である。(A)薬剤反復処理のプロトコール。黒矢印、細胞生存評価、薬剤除去及び生存細胞の増幅;灰色矢印、細胞計数、凍結及び次の処理サイクルのための播種。(B)Aに示された処理プロトコールに従って、タラゾパリブ(100nM)に対する耐性の出現に及ぼすAsiDNA(2.5μM)の同時処理の効果の評価。
【図６】AsiDNAはSCLCにおけるカルボプラチンに対する耐性の出現を抑止することを示す図である。(A)薬剤反復処理のプロトコール。黒矢印、細胞生存評価、薬剤除去及び生存細胞の増幅;灰色矢印、細胞計数、凍結及び次の処理サイクルのための播種。(B)Aに示された処理プロトコールに従って、カルボプラチン(2.5μM)に対する耐性の出現に及ぼすAsiDNA(2.5μM)の同時処理の効果の評価。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
第1の態様において、本発明は、患者におけるがん療法剤に耐性を有するがんの発生の遅延化及び/又は予防における使用のためのDbait分子に関する。また、本発明は、患者におけるがん療法剤に耐性を有するがんの発生の遅延化及び/又は予防における使用のためのDbait分子を含む組成物、又は、患者におけるがん療法剤に耐性を有するがんの発生の遅延化及び/又は予防における使用のための薬剤の製造のためのDbait分子の使用に関する。本発明は、更に、患者におけるがん療法剤に耐性を有するがんの発生を遅延させる及び/又は予防するための方法であって、有効量のDbait分子を投与すること、それによって、がん療法剤に耐性を有するがんの発生を遅延させる及び/又は予防すること、を含む方法に関する。特に、方法は、有効量のがん療法剤を投与すること、及び有効量のDbait分子を投与すること、それによってがん療法剤に耐性を有するがんの発生を遅延させる及び/又は予防すること、を含む。
【００２３】
別の態様では、本開示は、がんの維持療法に使用するためのDbait分子に関する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「維持療法」という用語は、誘導療法(疾患又は障害を有する個人又は対象者に投与される最初の治療コース)に続いて投与される療法、治療レジメン又は療法コースを表す。維持療法を使用して、疾患/障害の進行を止めたり、後退させたりすること、誘導療法によって得られた健康状態の改善を維持すること、及び/又は誘導療法によって得られた利益を強化したり、「統合」したりすることができる。その結果、維持療法は主に疾患の再発を予防又は最小化するために使用される。
【００２５】
療法、特に維持療法は、継続療法(例えば、一定の間隔(例えば、毎週、毎月、毎年等)で薬剤を投与する、を採用してもよく、又は間欠療法(例えば、断続的治療、間欠的治療、再発時の治療、又は特定のあらかじめ定められた基準(例えば、疾患兆候等)の達成時の治療)を採用してもよい。
【００２６】
一実施形態では、療法、特に維持療法は、反復投与レジメンからなる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「反復投与」という用語は、薬物を一定の時間間隔で一定量の薬物を投与することを表す。反復投与では、前の投与量が完全になくなる前に薬物を投与すると、蓄積が起こる。蓄積の結果、反復投与レジメン中は単回投与後よりも血漿中濃度が高くなる。反復投与レジメンは、長期間にわたって治療範囲内の薬物に曝露することを保証するために使用される。その結果、Dbait分子は、例えば、毎日、週2回、週3回、又は毎週1回、2週間に1回、3週間に1回、毎月1回の間隔で投与されてもよい。
【００２８】
一部の実施形態では、定常状態の血漿濃度は、より迅速に到達されなければならない。次いで、より高い用量(初期用量又は負荷用量としても知られている)を、蓄積を補償するために、治療開始時に投与してもよい。次いで、一部の実施形態では、「反復投与」とは、初期のより高い用量の後に、Dbait分子の少なくとも1つの特定の用量を投与することを意味する。治療は、複数のサイクル、例えば2〜10サイクル、特に2、3、4又は5サイクルを含む。サイクルは、継続されてもよく、又は分離されてもよい。例えば、各サイクルは、1〜8週間の期間によって分割される。
【００２９】
一実施形態では、Dbait分子は、単剤療法で(単独の治療レジメンとして)投与される。一部の実施形態では、Dbait分子は、誘導療法中に使用された。好ましい実施形態では、Dbait分子はAsiDNAである。他の実施形態では、Dbait分子は、がん療法剤との併用療法において投与される。一部の実施形態では、がん療法剤は、誘導療法中に使用される薬剤である。他の実施形態では、がん療法剤は、誘導療法中に使用される薬剤ではない。
【００３０】
一部の実施形態では、「併用療法」は、これらの治療剤の逐次的な方法での投与を包含することが意図され、各治療剤は、異なる時間に投与されるとともに、これらの治療剤の投与、又はこれらの治療剤のうちの少なくとも2つの治療剤の投与が、同時に、又は実質的に並行である。好ましくは、Dbait分子及びがん療法剤は、同時又は並行して投与される。
【００３１】
本明細書では、「同時に」という用語は、治療剤の個々の治療効果が時間的に重なり合うような十分に近い時間的近接性を与えて、2つ以上の治療剤の投与を表すために使用される。その結果、同時投与は、1つ又は複数の他の薬剤の投与を中止した後に、1つ又は複数の薬剤の投与が継続される場合の投与レジメンを含む。
【００３２】
本明細書で使用される場合、特別の定めのない限り、「併用」という用語は、2つ以上の治療剤を、別段の指示がない限り、特定の時間制限なしに、並行して、同時に、又は逐次的に投与することを含む。一実施形態では、Dbait分子は、がん療法剤(化学療法、放射線療法、PARP阻害剤等の標的療法)と併用して投与される。一実施形態では、薬剤は、細胞内若しくは対象の体内に同時に存在するか、又は同時に生物学的若しくは治療的効果を発揮する。特定の実施形態では、第1の薬剤は、第2の治療剤の投与に先立って(例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、又は12週間前)、第2の治療剤と実質的に同時に、又は第2の治療剤の投与に後続して(例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、又は12週間後)、又はそれらの任意の組合せで投与することができる。例えば、一実施形態では、第1の薬剤は、第2の治療剤の投与に先立って、例えば1週間、投与することができる。別の実施形態では、第1の薬剤は、第2の薬剤の投与に先立って(例えば1日前に)投与され、次いで第2の治療剤と同時に投与することができる。
【００３３】
治療剤は、同一の経路で投与してもよく、又は異なる経路で投与してもよい。例えば、選択された組合せの第1の治療剤は静脈内注射により投与されてもよく、一方、組合せの他の治療剤は経口投与されてもよい。或いは、例えば、すべての治療剤を経口投与してもよく、又はすべての治療剤を静脈内注射で投与してもよい。治療剤は、交互に投与されてもよい。特定の実施形態では、組み合わせて使用される各薬剤の治療有効量は、各薬剤単独での単独療法と比較して、組み合わせて使用される場合、より低い。そのようなより低い治療有効量は、治療レジメンのより低い毒性をもたらし得る。
【００３４】
一部の実施形態では、がん療法剤は化学療法である。本明細書で使用される場合、「化学療法」という用語は、がんの治療に有用な化合物を表す。
【００３５】
化学療法の例としては、シクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標))等のアルキル化剤;クロドロネート(BONEFOS(登録商標)又はOSTAC(登録商標))、エチドロネート(DIDROCAL(登録商標))、NE-58095、ゾレドロン酸/ゾレドロネート(ZOMETA(登録商標))、アレンドロネート(FOSAMAX(登録商標))、パミドロネート(AREDIA(登録商標))、チルドロネート(SKELK)(登録商標))、及びリセドロネート(ACTONEL(登録商標))等のビスホスホネート剤;カンプトテシン(合成アナログのトポテカン(HYCAMTIN(登録商標))及びCPT-11(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))を含む)、クロラムブシル及びメルファラン等のナイトロジェンマスタード;ドキソルビシン(ADRIAMYCIN(登録商標)、モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンHClリポソーム注射剤(DOXIL(登録商標))、リポソームドキソルビシンTLCD-99(MYOCET(登録商標))、及びペグリル化リポソームドキソルビシン(CAELYX(登録商標))等の抗生物質;メソトレキセート、ゲムシタビン(GEMZAR(登録商標))、テガフール(UFTORAL(登録商標))、カペシタビン(XELODA(登録商標))及び5-フルオロウラシル(5-FU)等の代謝拮抗剤;タキソイド、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標))、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤(ABRAXANE(商標))、及びドセタキセル(TAXOTERE(登録商標));シスプラチン、オキサリプラチン(ELOXATIN(登録商標))、及びカルボプラチン等の白金剤;ビンブラスチン(VELBAN(登録商標))、ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標))、ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))及びビノレルビン(NAVELBINE(登録商標))を含み、チューブリンの重合による微小管の形成を阻害するビンカ、が挙げられる。
【００３６】
一部の実施形態では、化学療法は白金剤である。一部の実施形態では、白金剤はシスプラチンである。一部の実施形態では、白金剤はオキサリプラチンである。一部の実施形態では、白金剤はカルボプラチンである。
【００３７】
一部の実施形態では、がん療法剤は放射線療法である。
【００３８】
一部の実施形態では、がん療法剤は標的療法である。本明細書で使用される場合、「標的療法」という用語は、目的のポリペプチドに結合し、目的の特定のポリペプチドの活性及び/又は活性化を阻害する治療剤を表す。
【００３９】
そのような薬剤の例としては、抗体及び目的のポリペプチドに結合する小分子が挙げられる。標的療法は、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)に結合して阻害するPARP阻害剤(オラパリブ(LYNPARZA(登録商標))、ルカパリブ(RUBRACA(登録商標))、ニラパリブ(ZEJULA(登録商標))、タラゾパリブ、イニパリブ、ベリパリブ等)であってもよい。
【００４０】
PARP阻害剤。
また、本明細書に記載の方法において有用なPARP阻害剤がここに提供される。PARPは、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼを意味する。PARPは、β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)のニコチンアミド及びポリ-ADP-リボース(PAR)への変換を触媒する。PARPは、DNA一本鎖切断(SSB)の修復において重要な分子である。本明細書で使用される場合、「PARP阻害剤」という用語は、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)の活性を低下させる能力を有する任意の化合物を表す。PARP阻害は、主に2つの異なるメカニズムに依存する。(i)主にPARP酵素活性を阻害することによって作用する触媒的阻害、及び(ii)PARP酵素活性を阻害し、損傷部位からのPARP酵素の放出を防止する結合阻害である。結合阻害剤は、触媒阻害剤よりも細胞に対して毒性が強い。本発明に記載のPARP阻害剤は、好ましくは触媒阻害剤及び/又は結合阻害剤である。多くのPARP阻害剤は公知であり、したがって、公知の出発物質から公知の方法で合成することができ、商業的に入手可能であるか、又は文献に記載されている方法で調製することができる。
【００４１】
本発明に記載の好適なPARP阻害剤の例としては、これらに限定されないが、オラパリブ(AZD-2281、4-[(3-[(4-シクロプロピルカルボニル)ピペラジン-4-イル]カルボニル)-4-フルオロフェニル]メチル(2H)-フタラジン-1-オン)、ベリパリブ(ABT-888、CAS 912444-00-9、2-((fi)-2-メチルピロリジン-2-イル)-1W-ベンズイミダゾール-4-カルボキサミド)、CEP-8983(11-メトキシ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-シクロペンタ[a]ピロロ[3,4-c]カルバゾール-1,3(2H)-ジオン)又はそのプロドラッグ(例えば、CEP-9722)、ルカパリブ(AG014699、PF-01367338、8-フルオロ-2-{4-[(メチルアミノ)メチル]フェニル}-1,3,4,5-テトラヒドロ-6H-アゼピノ[5,4,3-cd]インドール-6-オン)、E7016(GPI-21016、10-((4-ヒドロキシピペリジン-1-イル)メチル)クロメノ-[4,3,2-デ]フタラジン-3(2H)-オン)、タラゾパリブ(BMN-673、(8S,9R)-5-フルオロ-8-(4-フルオロフェニル)-9-(1-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール-5-イル)-8,9-ジヒドロ-2H-ピリド[4,3,2デ]フタラジン-3(7H)-オン)、INO-1001(4-フェノキシ-3-ピロリジン-1-イル-5-スルファモイル-安息香酸)、KU0058684(CAS 623578-11-0)、ニラパリブ(MK4827、Merck & Co Inc社)、イニパリブ(BSI 201)、イニパリブメット(イニパリブのC-ニトロソ代謝物)、CEP 9722(Cephalon Inc社)、LT-673、MP-124、NMS-P118、XAV939及びAZD2461が挙げられる。追加のPARP阻害剤は、例えば、WO14201972、WO14201972、WO12141990、WO10091140、WO9524379、WO09155402、WO09046205、WO08146035、WO08015429、WO0191796、WO0042040、US2006004028、EP2604610、EP1802578、CN104140426、CN104003979、US060229351、US7041675、WO07041357、WO2003057699、US06444676、US20060229289、US20060063926、WO2006033006、WO2006033007、WO03051879、WO2004108723、WO2006066172、WO2006078503、US20070032489、WO2005023246、WO2005097750、WO2005123687、WO2005097750、US7087637、US6903101、WO20070011962、US20070015814、WO2006135873、UA20070072912、WO2006065392、WO2005012305、WO2005012305、EP412848、EP453210、EP454831、EP879820、EP879820、WO030805、WO03007959、US6989388、EP1212328、WO2006078711、US06426415、US06514983、EP1212328、US20040254372、US20050148575、US20060003987、US06635642、WO200116137、WO2004105700、WO03057145A2、WO2006078711、WO2002044157、US20056924284、WO2005112935、US20046828319、WO2005054201、WO2005054209、WO2005054210、WO2005058843、WO2006003146、WO2006003147、WO2006003148、WO2006003150、WO2006003146、WO2006003147、UA20070072842、US05587384、US20060094743、WO2002094790、WO2004048339、EP1582520、US20060004028、WO2005108400、US6964960、WO20050080096、WO2006137510、UA20070072841、WO2004087713、WO2006046035、WO2006008119、WO06008118、WO2006042638、US20060229289、US20060229351、WO2005023800、WO1991007404、WO2000042025、WO2004096779、US06426415、WO02068407、US06476048、WO2001090077、WO2001085687、WO2001085686、WO2001079184、WO2001057038、WO2001023390、WO01021615A1、WO2001016136、WO2001012199、WO95024379、WO200236576、WO2004080976、WO2007149451、WO2006110816、WO2007113596、WO2007138351、WO2007144652、WO2007144639、WO2007138351、WO2007144637、に記載される。
【００４２】
好ましい実施形態では、PARP阻害剤は、ルカパリブ(AG014699、PF-01367338)、オラパリブ(AZD2281)、ベリパリブ(ABT888)、イニパリブ(BSI201)、ニラパリブ(MK4827)、タラゾパリブ(BMN673)、AZD2461、CEP 9722、E7016、INO-1001、LT-673、MP-124、NMS-P118、及びXAV939からなる群から選択される。
【００４３】
別の態様では、本発明は、患者における無増悪生存期間(PFS)の増加に使用するためのDbait分子に関する。本明細書で使用される場合、「無増悪生存期間」又は「PFS」という用語は、治療されている疾患が悪化しない期間の維持療法の開始から測定される時間(年単位)を表す。無増悪生存期間は、疾患に罹患している個人のグループにおいて、疾患が安定化するか、又は後退する可能性を示す指標である。例えば、維持療法を開始してから特定の期間が経過した後、健康ではないにせよ、健康である可能性が高いグループ内の個人の割合を示す。一部の実施形態では、患者は、前記がんを治療するために一般的に使用されるがん療法剤に対して耐性であるか、又は耐性を発現する可能性が増大しているがん患者である。
【００４４】
更なる態様では、本開示は、がんの長期療法において使用するためのDbait分子に関する。Dbait分子は、それに応じて長期間にわたって投与される。「長期期間」とは、数ヶ月(例えば、3、6、9又は12カ月、更には数年(例えば、1、2又は3年)を意味する。本発明は、有効量のDbait分子を長期間にわたって投与することを含む、患者のがんを治療する方法に関する。一部の実施形態では、患者は、前記がんを治療するために一般的に使用されるがん療法剤に対して耐性であるか、又は耐性を発現する可能性が増大しているがん患者である。
【００４５】
追加の態様では、本発明は、患者における無再発生存期間(RFS)の増加に使用するためのDbait分子に関する。本明細書で使用される場合、「無再発生存期間」又は「RFS」という用語は、診断から疾患の最初の再発、例えば、腫瘍性疾患における悪性腫瘍の最初の再発までに測定される時間(年単位)を表す。RFSは、完全寛解を達成した患者に対してのみ定義され、寛解を達成した日から再発又は何らかの原因による死亡の日まで測定される。一部の実施形態では、患者は、がんを治療するために一般的に使用されるがん療法剤に対して耐性であるか、又は耐性を発現する可能性が増大しているがん患者である。
【００４６】
別の態様では、本発明は、患者における腫瘍の再発を予防又は低減するための使用のためのDbait分子に関する。一部の実施形態では、患者は、がんを治療するために一般的に使用されるがん療法剤に対して耐性であるか、又は耐性を発現する可能性が増大しているがん患者である。
【００４７】
別の態様では、本発明は、患者におけるがん療法剤に耐性を有するがんの発生を遅延させる及び/又は予防する及び/又は後退させる腫瘍での使用のためのDbait分子に関する。本発明は、患者におけるがん療法剤に対する応答の持続時間を延長するために使用するDbait分子にも関する。本発明は更に、患者におけるがん療法剤に対する応答の感受性の期間を延長するために使用するDbait分子に関する。一部の実施形態では、がん療法剤は化学療法である。例えば、がん療法剤は、白金剤、アルキル化剤、カンプトテシン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、代謝拮抗剤、及びビンカからなる群から選択することができる。好ましくは、がん療法剤は、シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチン等の白金剤である。他の実施形態では、がん療法剤は放射線療法である。更に他の実施形態では、がん療法剤は、標的療法(例えば、ルカパリブ(AG014699)、オラパリブ(AZD2281)、ベリパリブ(ABT888)、イニパリブ(BSI201)、ニラパリブ(MK4827)、タラゾパリブ(BMN673)等のPARP阻害剤)である。更なる実施形態では、がん療法剤はDbait分子である。確かに、Dbait分子は、自己感受性を増加させ、自己に対する耐性の発現を遅延させる、及び/又は予防するのに適している。
【００４８】
本発明は、がん療法剤に耐性を有するがんの発生を遅延させる及び/又は予防する方法で使用するがん療法剤とDbait分子との組合せにも関する。本発明は、がん療法剤に耐性を有するがんの発生を遅延させる及び/又は予防することによって患者のがんを治療する方法であって、有効量の(i)がん療法剤と(ii)Dbait分子とを患者に投与すること、それによって、がん療法剤に耐性を有するがんの発生を遅延させる及び/又は予防すること、を含む方法に関する。一実施形態では、がん療法剤及びDbait分子は、同時に又は並行して投与される。別の実施形態では、Dbait分子は、がん療法剤による前処理の後に投与される。場合により、Dbait分子は、がん療法剤との併用療法において、好ましくは少なくとも2サイクルの投与、より好ましくは少なくとも3サイクル又は4サイクルの投与で投与される。
【００４９】
一部の実施形態では、がん療法剤は化学療法である。例えば、がん療法剤は、白金剤、アルキル化剤、カンプトテシン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、代謝拮抗剤、及びビンカからなる群から選択することができる。好ましくは、がん療法剤は、シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチン等の白金剤である。他の実施形態では、がん療法剤は放射線療法である。更に他の実施形態では、がん療法剤は、標的療法(例えば、ルカパリブ(AG014699)、オラパリブ(AZD2281)、ベリパリブ(ABT888)、イニパリブ(BSI201)、ニラパリブ(MK4827)、タラゾパリブ(BMN673)等のPARP阻害剤)である。更なる実施形態では、がん療法剤はDbait分子である。確かに、Dbait分子は、自己感受性を増加させ、自己に対する耐性の発現を遅延させる、及び/又は予防するのに適している。
【００５０】
本発明は、がん療法剤に対するがん細胞の耐性を克服して患者のがんを治療する方法で使用するがん療法剤とDbait分子の組合せにも関する。本発明は、がん療法剤に対するがん細胞の耐性を克服して患者のがんを治療する方法であって、有効量の(i)がん療法剤と(ii)Dbait分子とを患者に投与することを含む方法に関する。一実施形態では、がん療法剤及びDbait分子は、同時に又は並行して投与される。別の実施形態では、Dbait分子は、がん療法剤による前処理の後に投与される。
【００５１】
本発明は、更に、がん療法剤に対するがん細胞の耐性を克服する方法で使用するがん療法剤とDbait分子との組合せに関する。本発明は、患者におけるがん細胞の薬剤耐性を克服する方法であって、有効量の(i)がん療法剤と(ii)Dbait分子とを患者に投与することを含む方法に関する。一実施形態では、がん療法剤及びDbait分子は、同時に又は並行して投与される。別の実施形態では、Dbait分子は、がん療法剤による前処理の後に投与される。
【００５２】
一部の実施形態では、がん療法剤は化学療法である。他の実施形態では、がん療法剤は放射線療法である。更に他の実施形態では、がん療法剤は、標的療法(例えば、ルカパリブ(AG014699)、オラパリブ(AZD2281)、ベリパリブ(ABT888)、イニパリブ(BSI201)、ニラパリブ(MK4827)、タラゾパリブ(BMN673)等のPARP阻害剤である。
【００５３】
本明細書で使用される療法に対して耐性を有するがんは、療法に対して応答性を有さない、及び/又は有意な応答(例えば、部分応答及び/又は完全応答)を生じる能力が低下したがんを含む。耐性は、治療法の過程で生じる獲得耐性であってもよい。一部の実施形態では、獲得した薬剤耐性は、一過性及び/又は可逆的な薬剤耐性である。療法に対する一過性及び/又は可逆的な薬物耐性は、治療法の中断後に療法に対する感受性を回復することが可能である場合を含む。一部の実施形態では、獲得耐性は、永続的な耐性(薬剤耐性を付与する遺伝的変化を含む)である。
【００５４】
本明細書で使用される療法に対して感受性を有するがんは、応答性を有する、及び/又は有意な応答(例えば、部分応答及び/又は完全応答)をもたらすことが可能ながんを含む。療法に対する耐性の獲得及び/又は感受性の維持を評価する方法は、当技術分野で知られている。薬剤耐性及び/又は感受性は、(a)Dbait分子の存在下及び/又は非存在下で、基準となるがん細胞又は細胞集団をがん療法剤(例えば、標的療法、化学療法、及び/又は放射線療法)に曝すこと、及び/又は(b)例えば、がん細胞増殖、細胞生存率、アポトーシス及び/又は応答のレベル及び/又は割合のうちの1つ又は複数についてアッセイすることによって決定されてもよい。
【００５５】
薬剤耐性及び/又は感受性は、時間経過及び/又は様々な濃度のがん療法剤(例えば、標的療法、化学療法、及び/又は放射線療法)及び/又はDbait分子の量で測定されてもよい。薬剤耐性及び/又は感受性は、更に、測定されてもよく、及び/又は基準細胞株と比較されてもよい。一部の実施形態では、細胞生存率は、CyQuant Direct細胞増殖アッセイによってアッセイされてもよい。一部の実施形態では、耐性は、IC50、EC50の変化、又は腫瘍増殖の減少によって示されてもよい。一部の実施形態では、変化は、約50%、約100%、及び/又は約200%のいずれかよりも大きい。更に、耐性の獲得及び/又は感受性の維持の変化は、例えば、応答、応答の持続時間、及び/又は療法への進行までの時間、例えば、部分応答及び完全奏効を評価することによって、インビボで評価され得る。耐性の獲得及び/又は感受性の維持の変化は、応答、応答の持続時間、及び/又は個体の集団における療法への進行までの時間、例えば部分応答及び完全奏効の数の変化に基づいてもよい。本発明は、患者における白金剤に耐性を有するがんの発生を遅延させる及び/又は予防する及び/又は後退させる方法で使用するためのDbait分子及び白金剤に関する。本発明は、また、患者における白金剤に耐性を有するがんの発生を遅延させる及び/又は予防する及び/又は後退させる方法で使用するためのDbait分子及び白金剤に関し、(a)有効量のDbait分子及び(b)有効量の白金剤を患者に逐次、同時に、又は並行して投与することを含む。
【００５６】
本発明は、白金剤に対して耐性であるか、又は耐性を発現する可能性が増大しているがん患者を治療する方法で治療するために使用するDbait分子及び白金剤に関する。本発明はまた、白金剤に対して耐性であるか、又は耐性を発現する可能性が増大しているがん患者を治療する方法で使用するためのDbait分子及び白金剤に関し、(a)有効量のDbait分子及び(b)有効量の白金剤を患者に逐次、同時に、又は並行して投与することを含む。
【００５７】
本発明は、がん患者の白金剤感受性の期間を延長する方法で使用するDbait分子及び白金剤に関する。本発明はまた、がん患者の白金剤感受性の期間を延長する方法で使用するDbait分子及び白金剤に関し、(a)有効量のDbait分子及び(b)有効量の白金剤を患者に逐次、同時に、又は並行して投与することを含む。
【００５８】
本発明は、患者における白金剤に対する応答の持続時間を延長する方法で使用するためのDbait分子及び白金剤に関する。本発明は、また、患者における白金剤に対する応答の持続時間を延長する方法で使用するためのDbait分子及び白金剤に関し、(a)有効量のDbait分子及び(b)有効量の白金剤を患者に逐次、同時に、又は並行して投与することを含む。
【００５９】
本発明は、白金剤に対するがん細胞の耐性を克服して患者のがんを治療する方法で使用するためのDbait分子及び白金剤に関する。本発明は、患者における白金剤に対するがん細胞の耐性を克服して患者のがんを治療する方法で使用するためのDbait分子及び白金剤に関し、(a)有効量のDbait分子及び(b)有効量の白金剤を患者に逐次、同時に、又は並行して投与することを含む。
【００６０】
本発明は、白金剤に対するがん細胞の耐性を克服する方法で使用するためのDbait分子及び白金剤に関する。本発明はまた、患者における白金剤に対するがん細胞の耐性を克服する方法で使用するためのDbait分子及び白金剤に関し、(a)有効量のDbait分子及び(b)有効量の白金剤を患者に逐次、同時に、又は並行して投与することを含む。
【００６１】
一部の実施形態では、上述の方法及び使用において有用な白金剤は、シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンからなる群から選択され、Dbait分子はAsiDNAである。
【００６２】
本発明は、患者におけるPARP阻害剤に耐性を有するがんの発生を遅延させる及び/又は予防する及び/又は後退させる方法で使用するためのDbait分子及びPARP阻害剤に関する。本発明は、また、患者におけるPARP阻害剤に耐性を有するがんの発生を遅延させる及び/又は予防する及び/又は後退させる方法で使用するためのDbait分子及びPARP阻害剤に関し、(a)有効量のDbait分子及び(b)有効量のPARP阻害剤を個体に逐次、同時に、又は並行して投与することを含む。
【００６３】
本発明は、PARP阻害剤に対して耐性であるか、又は耐性を発現する可能性が増大しているがん患者を治療する方法で治療するために使用するDbait分子及び白金剤に関する。本発明はまた、PARP阻害剤に対して耐性であるか、又は耐性を発現する可能性が増大しているがん患者を治療する方法で使用するためのDbait分子及び白金剤に関し、(a)有効量のDbait分子及び(b)有効量のPARP阻害剤を患者に逐次、同時に、又は並行して投与することを含む。
【００６４】
本発明は、がん患者のPARP阻害剤感受性の期間を延長する方法で使用するDbait分子及びPARP阻害剤に関する。本発明はまた、がん患者のPARP阻害剤感受性の期間を延長する方法で使用するDbait分子及びPARP阻害剤に関し、(a)有効量のDbait分子及び(b)有効量のPARP阻害剤を患者に逐次、同時に、又は並行して投与することを含む。
【００６５】
本発明は、PARP阻害剤に対する応答の持続時間を延長する方法で使用するためのDbait分子及びPARP阻害剤に関する。本発明は、また、患者におけるPARP阻害剤に対する応答の持続時間を延長する方法で使用するためのDbait分子及びPARP阻害剤に関し、(a)有効量のDbait分子及び(b)有効量のPARP阻害剤を患者に逐次、同時に、又は並行して投与することを含む。
【００６６】
本発明は、PARP阻害剤に対するがん細胞の耐性を克服して患者のがんを治療する方法で使用するためのDbait分子及びPARP阻害剤に関する。本発明はまた、PARP阻害剤に対するがん細胞の耐性を克服して患者のがんを治療する方法で使用するためのDbait分子及びPARP阻害剤に関し、(a)有効量のDbait分子及び(b)有効量の白金剤を患者に逐次、同時に、又は並行して投与することを含む。
【００６７】
本発明は、PARP阻害剤に対するがん細胞の耐性を克服する方法で使用するためのDbait分子及びPARP阻害剤に関する。本発明はまた、PARP阻害剤に対するがん細胞の耐性を克服する方法で使用するためのDbait分子及びPARP阻害剤に関し、(a)有効量のDbait分子及び(b)有効量のPARP阻害剤を患者に逐次、同時に、又は並行して投与することを含む。
【００６８】
一部の実施形態では、上述の方法及び使用において有用なPARP阻害は、ルカパリブ、オラパリブ、ベリパリブ、イニパリブ、ニラパリブ及びタラゾパリブからなる群から選択され、Dbait分子はAsiDNAである。
【００６９】
Dbait分子
本明細書で使用される場合、シグナル干渉DNA(siDNA)としても知られる「Dbait分子」という用語は、DNA修復に対抗するように設計された核酸分子、好ましくはヘアピン核酸分子を表す。Dbait分子は、少なくとも1つの遊離末端と、ヒトゲノム中の任意の遺伝子と60%未満の配列同一性を有する6〜200bpのDNA二本鎖部分とを有する。
【００７０】
好ましくは、本発明で使用するDbait分子は、結合されているか否かにかかわらず、以下の式：
【化３】
2021515580.tif 000004
で記載することができ、式中、Nはデオキシヌクレオチドであり、nは1〜195の整数であり、下線を付したNは修飾ホスホジエステル骨格を有する又は有しないヌクレオチドを表し、L'はリンカーであり、Cは親油性分子及び受容体媒介エンドサイトーシスを可能にする細胞受容体を標的とするリガンドから好ましくは選択されるエンドサイトーシスを促進する分子であり、Lはリンカーであり、m及びpは、独立して、0又は1の整数である。
【００７１】
好ましい実施形態では、式(I)、(II)、又は(III)のDbait分子は、以下の特徴のうちの1つ又は複数を有する：
-  Nは、デオキシヌクレオチドであり、好ましくは、A(アデニン)、C(シトシン)、T(チミン)及びG(グアニン)からなる群から選択され、CpGジヌクレオチドの出現を回避し、ヒトゲノム中の任意の遺伝子と80%未満又は70%未満、更には60%未満又は50%未満の配列同一性を有するように選択され；及び/又は、
-  nは、1〜195、好ましくは3〜195、任意選択で1〜95、2〜95、3〜95、5〜95、15〜195、19〜95、21〜95、27〜95、1〜45、2〜35、3〜35、5〜35、15〜45、19〜45、21〜45、又は27〜45の整数である。特に好ましい実施形態では、nは27であり；及び/又は、
-  下線を付したNは、ホスホロチオエート又はメチルホスホネート骨格、より好ましくはホスホロチオエート骨格を有する又は有しないヌクレオチドを表し、好ましくは、下線を付したNは、修飾ホスホジエステル骨格を有するヌクレオチドを表し；及び/又は、
-  リンカーL'は、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジレート(T4)、1,19-ビス(ホスホ)-8-ヒドラザ-2-ヒドロキシ-4-オキサ-9-オキソ-ノナデカン、及び2,19-ビス(ホスホロ)-8-ヒドラザ-1-ヒドロキシ-4-オキサ-9-オキソ-ノナデカンからなる群から選択され；及び/又は、
-  mは1であり、Lはカルボキサミドポリエチレングリコール、より好ましくはカルボキサミドトリエチレン又はテトラエチレングリコールであり；及び/又は、
-  Cは、コレステロール、オクタデシル、オレイン酸、ジオレイル若しくはステアリン酸等の一本鎖若しくは二本鎖脂肪酸、又は葉酸、トコフェロール、ガラクトース、マンノース等の糖類及びそれらのオリゴ糖、RGD、ボンベシン等のペプチド、トランスフェリン、インテグリン等のタンパク質等の細胞受容体を標的とするリガンド(ペプチド、タンパク質、アプタマーを含む)からなる群から選択され、好ましくはコレステロール又はトコフェロールであり、更に好ましくはコレステロールである。
【００７２】
好ましくは、C-Lmは、トリエチレングリコールリンカー(10-O-[1-プロピル-3-N-カルバモイルコレステリル]-トリエチレングリコールラジカルである。或いは、C-Lmは、テトラエチレングリコールリンカー(10-O-[1-プロピル-3-N-カルバモイルコレステリル]-テトラエチレングリコールラジカルである。
【００７３】
好ましい実施形態では、Dbait分子は、以下の式：
【化４】
2021515580.tif 000005
を有し、N、N、n、L、L'、C及びmについて、式(I)、(II)及び(III)と同じ定義を有する。
【００７４】
特定の実施形態では、Dbait分子は、PCT特許出願WO2005/040378、WO2008/034866、WO2008/084087及びWO2011/161075に広範囲に記載されているものであり、その開示は参照によって本明細書に組み入れる。
【００７５】
Dbait分子は、その最小の長さ、少なくとも1つの遊離末端の存在、及び二本鎖部分、好ましくはDNA二本鎖部分の存在等、それらの治療活性に必要ないくつかの特徴によって定義される場合がある。後述するように、Dbait分子の正確なヌクレオチド配列は、その活性に影響を与えないことに注意することが重要である。更に、Dbait分子は、修飾された及び/又は非天然の骨格を含んでいてもよい。
【００７６】
好ましくは、Dbait分子は、非ヒト由来(すなわち、そのヌクレオチド配列及び/又は立体配座(例えば、ヘアピン)がヒト細胞内にそのようなものとして存在しない)であり、最も好ましくは合成由来である。Dbait分子の配列は、ほとんど(もしあったとしても)役割を果たしていないので、Dbait分子は、好ましくは、既知の遺伝子、プロモーター、エンハンサー、5'-又は3'-上流配列、エクソン、イントロン等と有意な程度の配列相同性又は同一性のを有していない。つまり、Dbait分子は、ヒトゲノム中の任意の遺伝子に対して、80%未満又は70%未満、更には60%未満又は50%未満の配列同一性を有する。配列同一性を決定する方法は当技術分野でよく知られており、例えばBlastが含まれる。Dbait分子は、ストリンジェントな条件下では、ヒトゲノムDNAとハイブリダイズしない。典型的なストリンジェントな条件は、完全に相補的な核酸と部分的に相補的な核酸との識別を可能にするようなものである。
【００７７】
更に、Dbait分子の配列は、よく知られているトール様受容体媒介免疫反応を避けるために、好ましくはCpGを欠いている。
【００７８】
Dbait分子の長さは、Kuタンパク質とDNA-PKcsタンパク質を含むKuタンパク質複合体への適切な結合を可能にするのに十分な長さであれば、可変であってもよい。このようなKuタンパク質複合体に確実に結合し、DNA-PKcsの活性化を可能にするためには、Dbait分子の長さは20bpよりも長く、好ましくは約32bpでなければならないことが示されている。好ましくは、Dbait分子は、20〜200bp、より好ましくは24〜100bp、更に好ましくは26〜100、最も好ましくは24〜200、25〜200、26〜200、27〜200、28〜200、30〜200、32〜200、24〜100、25〜100、26〜100、27〜100、28〜100、30〜100、32〜200又は32〜100bpの間からなる。例えば、Dbait分子は、24〜160、26〜150、28〜140、28〜200、30〜120、32〜200又は32〜100bpの間からなる。「bp」とは、分子が指示された長さの二本鎖部分を含むことを意味する。
【００７９】
特定の実施形態では、少なくとも32pb、又は約32bpの二本鎖部分を有するDbait分子は、Dbait32(配列番号1)、Dbait32Ha(配列番号2)、Dbait32Hb(配列番号3)、Dbait32Hc(配列番号4)又はDbait32Hd(配列番号5)と同じヌクレオチド配列を含む。任意選択で、Dbait分子は、Dbait32(配列番号1)、Dbait32Ha(配列番号2)、Dbait32Hb(配列番号3)、Dbait32Hc(配列番号4)又はDbait32Hd(配列番号5)と同じヌクレオチド組成を有するが、それらのヌクレオチド配列は異なる。次いで、Dbait分子は、3A、6C、12G及び11Tを有する二本鎖部分の1本の鎖を含む。好ましくは、Dbait分子の配列は、CpGジヌクレオチドを含まない。
【００８０】
或いは、二本鎖部分は、Dbait32(配列番号1)、Dbait32Ha(配列番号2)、Dbait32Hb(配列番号3)、Dbait32Hc(配列番号4)又はDbait32Hd(配列番号5)の少なくとも16、18、20、22、24、26、28、30又は32の連続したヌクレオチドを含む。より特定の実施形態では、二本鎖部分は、Dbait32(配列番号1)、Dbait32Ha(配列番号2)、Dbait32Hb(配列番号3)、Dbait32Hc(配列番号4)又はDbait32Hd(配列番号5)の20、22、24、26、28、30又は32の連続したヌクレオチドで構成される。
【００８１】
本明細書で開示されるDbait分子は、二本鎖切断(DSB)を模倣するように、少なくとも1つの遊離末端を有していなければならない。前記遊離末端は、遊離の平滑末端であってもよく、又は、5'-/3'-突出末端であってもよい。本明細書で「遊離末端」とは、核酸分子、特に二本鎖核酸部分を表し、5'末端と3'末端の両方を有するか、又は3'末端又は5'末端のいずれかを有する。任意選択で、5'末端及び3'末端の一方は、核酸分子を結合するために使用することができ、又はブロッキング基、例えば、a又は3'-3'ヌクレオチド連結に連結することができる。
【００８２】
特定の実施形態では、それらは1つの遊離末端のみを含む。好ましくは、Dbait分子は、二本鎖DNAステム及びループを有するヘアピン核酸からなる。ループは、核酸、又は当業者に知られている他の化学基、又はそれらの組合せであり得る。ヌクレオチドリンカーは、2から10個のヌクレオチド、好ましくは3、4又は5個のヌクレオチドを含んでいてもよい。非ヌクレオチドリンカーは、非網羅的には、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、又は他の高分子化合物(例えば、2〜10個の間のエチレングリコール単位を有するもの、好ましくは3、4、5、6、7又は8個のエチレングリコール単位を有するもの等のオリゴエチレングリコール)を含む。好ましいリンカーは、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジレート(T4)、及び1,19-ビス(ホスホ)-8-ヒドラザ-2-ヒドロキシ-4-オキサ-9-オキソ-ノナデカン、及び2,19-ビス(ホスホロ)-8-ヒドラザ-1-ヒドロキシ-4-オキサ-9-オキソ-ノナデカン等の他のリンカーからなる群から選択される。その結果、特定の実施形態では、Dbait分子は、二本鎖部分又はステムを有するヘアピン分子であることができ、Dbait32(配列番号1)、Dbait32Ha(配列番号2)、Dbait32Hb(配列番号3)、Dbait32Hc(配列番号4)又はDbait32Hd(配列番号5)の少なくとも16、18、20、22、24、26、28、30又は32の連続したヌクレオチド、及びヘキサエチレングリコールリンカー、テトラデオキシチミジレートリンカー(T4)、1,19-ビス(ホスホ)-8-ヒドラザ-2-ヒドロキシ-4-オキサ-9-オキソ-ノナデカン、又は2,19-ビス(ホスホロ)-8-ヒドラザ-1-ヒドロキシ-4-オキサ-9-オキソ-ノナデカンであるループを含む。より特定の実施形態では、Dbait分子は、Dbait32(配列番号1)、Dbait32Ha(配列番号2)、Dbait32Hb(配列番号3)、Dbait32Hc(配列番号4)又はDbait32Hd(配列番号5)の20、22、24、26、28、30又は32の連続したヌクレオチドで構成される二本鎖部分を有することができる。
【００８３】
Dbait分子は、好ましくは、2'-デオキシヌクレオチド骨格を含み、任意選択で、アデニン、シトシン、グアニン及びチミン以外の1つ又は複数の(2、3、4、5又は6)修飾ヌクレオチド及び/又は核酸塩基を含む。その結果、Dbait分子は基本的にDNA構造である。特に、Dbait分子の二本鎖部分又はステムは、デオキシリボヌクレオチドからなる。
【００８４】
好ましいDbait分子は、特に、それらを分解から保護するために、1本又は各鎖の末端に1つ又は複数の化学的に修飾されたヌクレオチド又は基を含む。特定の好ましい実施形態では、Dbait分子の遊離末端は、1本又は各鎖の末端で、1個、2個又は3個の修飾ホスホジエステル骨格によって保護されている。好ましい化学基、特に修飾ホスホジエステル骨格は、ホスホロチオエートを含む。或いは、好ましいDbaitは、3'-3'ヌクレオチド連結、又はメチルホスホネート骨格を有するヌクレオチドを有する。他の修飾骨格は、当技術分野でよく知られており、ホスホロアミデート、モルホリノ核酸、2'-0,4'-Cメチレン/エチレン架橋ロックド核酸、ペプチド核酸(PNA)、及び短鎖アルキル、又はシクロアルキル糖間連結、又は可変長の短鎖ヘテロ原子又はヘテロ環糖間連結、又は当業者に知られている任意の修飾ヌクレオチドを含む。第1の好ましい実施形態では、Dbait分子は、1本又は各鎖の末端に1本、2本又は3本の修飾ホスホジエステル骨格によって、より好ましくは少なくとも3'末端、更に好ましくは5'末端及び3'末端の両方に3本の修飾ホスホジエステル骨格(特にホスホロチオエート又はメチルホスホネート)によって、保護された遊離末端を有する。
【００８５】
最も好ましい実施形態では、Dbait分子は、ヘアピン核酸分子であって、32bpのDNA二本鎖部分又はステム(例えば、配列番号1〜5、特に配列番号4からなる群から選択される配列を有する)、及びヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジレート(T4)、及び1,19-ビス(ホスホ)-8-ヒドラザ-2-ヒドロキシ-4-オキサ-9-オキソ-ノナデカン、及び2,19-ビス(ホスホロ)-8-ヒドラザ-1-ヒドロキシ-4-オキサ-9-オキソ-ノナデカンからなる群から選択されるリンカーを含むか、又はそれらからなるDNA二本鎖部分又はステムの2本の鎖を連結するループを含み、DNA二本鎖部分又はステムの遊離末端(すなわち、ループの反対側にある)は3つの修飾ホスホジエステル骨格(特にホスホロチオエートインターヌクレオチドリンク)を有する。
【００８６】
前記核酸分子は、化学合成、半生合成又は生合成、増幅の任意の方法、それに続く任意の抽出及び調製方法、及び任意の化学修飾によって作られる。リンカーは、標準的な核酸の化学合成によって取り込まれるように提供される。より好ましくは、核酸分子は、特別に設計された収束的合成によって製造される。2つの相補的な鎖は、適切なリンカー前駆体の取り込みを伴う標準的な核酸化学合成によって調製され、それらの精製の後、それらは共有結合的に一緒に結合される。
【００８７】
任意選択で、核酸分子は、エンドサイトーシス又は細胞内取り込みを促進する分子に結合してもよい。
【００８８】
特に、エンドサイトーシス又は細胞内取り込みを促進する分子は、コレステロール、一本鎖又は二本鎖脂肪酸等の親油性分子、又は葉酸及び葉酸誘導体又はトランスフェリン等の受容体媒介エンドサイトーシスを可能にする細胞受容体を標的とするリガンドであってもよい(Goldsteinら、Ann.Rev.Cell Biol.、1985、1:1〜39頁、Leamon & Lowe、Proc Natl Acad Sci USA、1991、88:5572〜5576頁)。分子は、トコフェロール、ガラクトース、マンノース等の糖類及びそれらのオリゴ糖、RGD、ボンベシン等のペプチド、インテグリン等のタンパク質であってもよい。脂肪酸は、飽和又は不飽和であってもよく、C4〜C28、好ましくはC14〜C22であり、更により好ましくはオレイン酸又はステアリン酸等のC18であってもよい。特に、脂肪酸は、オクタデシル又はジオレイルであってもよい。脂肪酸は、グリセロール、ホスファチジルコリン又はエタノールアミン等の適切なリンカーで連結された、又はDbait分子上に付着させるために使用されるリンカーで連結された、二重鎖形態として見出されてもよい。本明細書で使用される場合、「葉酸」という用語は、プテロイン酸誘導体及びアナログを含む葉酸及び葉酸誘導体を表すことを意味する。本発明における使用に適した葉酸のアナログ及び誘導体は、これらに限定されないが、葉酸代謝拮抗剤、ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、フォリン酸、プテロポリグルタミン酸、1-デザ、3-デアザ、5-デアザ、8-デアザ、10-デアザ、1,5-デアザ、5,10-デアザ、8,10-デアザ、及び5,8-デアザの葉酸、葉酸代謝拮抗剤、及びプテロイン酸誘導体が挙げられる。追加の葉酸アナログは、US2004/242582に記載されている。その結果、エンドサイトーシスを促進する分子は、一本鎖又は二本鎖脂肪酸、葉酸及びコレステロールからなる群から選択されてもよい。より好ましくは、エンドサイトーシスを促進する分子は、ジオレオイル、オクタデシル、葉酸、及びコレステロールからなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、核酸分子は、コレステロールに結合している。
【００８９】
エンドサイトーシスを促進するDbait分子は、好ましくはリンカーを介してエンドサイトーシスを促進する分子に結合してもよい。エンドサイトーシスを促進する分子をDbait分子に結合させるために、当技術分野で知られている任意のリンカーを使用してもよい。例えば、WO09/126933には、便利なリンカーの広範なレビューが38〜45頁に記載されている。リンカーは、非網羅的に、脂肪族鎖、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、又は他の高分子化合物(例えばエチレングリコール単位を2〜10個、好ましくは3、4、5、6、7又は8個、更により好ましくは3個のエチレングリコール単位を有するもの等のオリゴエチレングリコール)、及び例えばジスルフィド連結、保護されたジスルフィド連結、酸不安定性連結(例えば、ヒドラゾン連結)、エステル連結、オルトエステル連結、ホスホンアミド連結、生物的開裂性(biocleavable)ペプチド連結、アゾ連結又はアルデヒド連結等のような化学的又は酵素的方法で分解され得る任意の結合を組み込む。そのような開裂性リンカーは、WO2007/040469の12〜14頁、WO2008/022309の22〜28頁に詳細に記載されている。
【００９０】
特定の実施形態では、核酸分子は、エンドサイトーシスを促進する1つの分子に連結することができる。或いは、エンドサイトーシスを促進する複数の分子(例えば、2個、3個又は4個)を1つの核酸分子に結合することができる。
【００９１】
特定の実施形態では、エンドサイトーシスを促進する分子、特にコレステロールと核酸分子との間のリンカーは、CO-NH-(CH2-CH2-O)nであり、nは1から10までの整数であり、好ましくは、nは3、4、5及び6からなる群から選択される。非常に特定の実施形態では、リンカーは、CO-NH-(CH2-CH2-O)4(カルボキサミドテトラエチレングリコール)又はCO-NH-(CH2-CH2-O)3(カルボキサミドトリエチレングリコール)である。リンカーは、核酸分子の活性を改変しない任意の好都合な位置で核酸分子に連結することができる。特に、リンカーは、5'末端で連結することができる。したがって、好ましい実施形態では、考えられた結合したDbait分子は、ヘアピン構造を有し、エンドサイトーシスを促進する分子に、好ましくはリンカーを介して、その5'末端で結合したDbait分子である。
【００９２】
別の特定の実施形態では、エンドサイトーシスを促進する分子、特にコレステロールと核酸分子との間のリンカーは、ジアルキルジスルフィド{例えば、(CH2)r-S-S-(CH2)sであり、r及びsは1〜10、好ましくは3〜8、例えば6の整数}である。
【００９３】
最も好ましい実施形態では、Dbait分子は、ヘアピン核酸分子であって、32bpのDNA二本鎖部分又はステム、及びヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジレート(T4)、1,19-ビス(ホスホ)-8-ヒドラザ-2-ヒドロキシ-4-オキサ-9-オキソ-ノナデカン、及び2,19-ビス(ホスホロ)-8-ヒドラザ-1-ヒドロキシ-4-オキサ-9-オキソ-ノナデカンからなる群から選択されるリンカーを含むか、又はそれらからなるDNA二本鎖部分又はステムの2本の鎖を連結するループを含み、DNA二本鎖部分又はステムの遊離末端(すなわち、ループの反対側にある)は3つの修飾ホスホジエステル骨格(特にホスホロチオエートインターヌクレオチドリンク)を有し、前記Dbait分子は、好ましくはリンカー(例えば、カルボキサミドオリゴエチレングリコール、好ましくはカルボキサミドトリエチレングリコール又はテトラエチレングリコール)を介して、その5'末端のコレステロールに結合している。
【００９４】
特定の実施形態では、Dbait分子は、PCT特許出願WO2011/161075に広範囲に記載されているような結合Dbait分子である可能性があり、その開示は参照によって本明細書に組み入れる。
【００９５】
好ましい実施形態では、NNNN-(N)n-Nは、Dbait32(配列番号1)、Dbait32Ha(配列番号2)、Dbait32Hb(配列番号3)、Dbait32Hc(配列番号4)又はDbait32Hd(配列番号5)の少なくとも6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30又は32の連続したヌクレオチドを含むか、又はDbait32、Dbait32Ha、Dbait32Hb、Dbait32Hc又はDbait32Hdの20、22、24、26、28、30又は32の連続したヌクレオチドで構成される。特定の実施形態では、NNNN-(N)n-Nは、Dbait32(配列番号1)、Dbait32Ha(配列番号2)、Dbait32Hb(配列番号3)、Dbait32Hc(配列番号4)又はDbait32Hd(配列番号5)、より好ましくはDbait32Hc(配列番号4)を含むか、又はそれで構成される。
【００９６】
その結果、結合したDbait分子は、
配列番号1であるNNNN-(N)n-Nを有するもの、
配列番号2であるNNNN-(N)n-Nを有するもの、
配列番号3であるNNNN-(N)n-Nを有するもの、
配列番号4であるNNNN-(N)n-Nを有するもの、又は
配列番号5であるNNNN-(N)n-Nを有するもの、
からなる群から選択してもよい。
【００９７】
好ましい実施形態では、Dbait分子は、以下の式：
【化５】
2021515580.tif 000006
を有し、式中、
-  NNNN-(N)n-Nは、28、30又は32個のヌクレオチド、好ましくは32個のヌクレオチドを含み、及び/又は、
-  下線を付したヌクレオチドは、ホスホロチオエート又はメチルホスホネート骨格、より好ましくはホスホロチオエート骨格を有する又は有しないヌクレオチドを表し、好ましくは、下線を付したヌクレオチドは、ホスホロチオエート又はメチルホスホネート骨格、より好ましくはホスホロチオエート骨格を有するヌクレオチドを表し、及び/又は、
-  リンカーL'は、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジレート(T4)、1,19-ビス(ホスホ)-8-ヒドラザ-2-ヒドロキシ-4-オキサ-9-オキソ-ノナデカン、又は2,19-ビス(ホスホロ)-8-ヒドラザ-1-ヒドロキシ-4-オキサ-9-オキソ-ノナデカンからなる群から選択され、及び/又は、
-  mは1であり、Lはカルボキサミドポリエチレングリコール、より好ましくはカルボキサミドトリエチレン又はテトラエチレングリコールであり、及び/又は、
-  pは1であり、及び/又は、
-  Cは、コレステロール、オクタデシル、オレイン酸、ジオレイル若しくはステアリン酸等の一本鎖若しくは二本鎖脂肪酸、又は葉酸、トコフェロール、ガラクトース、マンノース等の糖類及びそれらのオリゴ糖、RGD、ボンベシン等のペプチド、トランスフェリン、インテグリン等のタンパク質等の細胞受容体を標的とするリガンド(ペプチド、タンパク質、アプタマーを含む)からなる群から選択され、好ましくはコレステロールである。
【００９８】
非常に特定の実施形態では、Dbait分子(本明細書ではAsiDNAとも呼ばれる)は、以下の式：
【化６】
2021515580.tif 000007
を有し、式中、C-Lmはテトラエチレングリコールリンカー(10-O-[1-プロピル-3-N-カルバモイルコレステリル]-テトラエチレングリコールラジカルであり、L'は1,19-ビス(ホスホ)-8-ヒドラザ-2-ヒドロキシ-4-オキサ-9-オキソ-ノナデカンであり、また、以下の式：
【化７】
2021515580.tif 000008
で表される。
【００９９】
治療すべきがんや腫瘍
「がん(cancer)」、「がん性」、又は「悪性」という用語は、典型的には制御されていない細胞増殖によって特徴づけられる哺乳動物の生理的状態を指すか、又は記載する。がんの例としては、例えば、白血病、リンパ腫、芽細胞腫、癌(carcinoma)及び肉腫が挙げられる。
【０１００】
様々ながんもまた、本発明の範囲に包含され、膀胱(加速性及び転移性膀胱がんを含む)、乳房、結腸(結腸直腸を含む)、腎臓、肝臓、肺(小細胞肺がん及び非小細胞肺がん並びに肺腺癌を含む)、卵巣、前立腺、精巣、泌尿生殖器、リンパ系、直腸、喉頭、膵臓(外分泌性膵臓癌を含む)、食道、胃、胆嚢、子宮頸部、甲状腺、及び皮膚(扁平上皮癌を含む)を含む癌;白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫(皮膚又は末梢T細胞リンパ腫を含む)、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、毛様細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫、及びバーキットリンパ腫を含むリンパ系の造血器腫瘍;急性及び慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、及び前骨髄球性白血病を含む骨髄系の造血器腫瘍;星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、及びシュワン細胞腫を含む中枢神経系及び末梢神経系の腫瘍;線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含む間葉系由来の腫瘍;黒色腫、色素性乾皮症(xenoderma pigmentosum)、ケラトアカントーマ(keratoactanthoma)、精上皮腫、甲状腺濾胞状がん、及びテラトカルシノーマを含むその他の腫瘍;黒色腫、切除不能なIII期又はIV期の悪性黒色腫、扁平上皮癌、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、神経膠腫、消化管がん、腎がん、卵巣がん、肝臓がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、神経芽細胞腫、膵臓がん、多形神経膠芽腫、子宮頸がん、胃がん、膀胱がん、肝癌、乳がん、結腸癌、頭頸部がん、網膜芽細胞腫、胃がん、生殖細胞腫瘍、骨がん、骨腫瘍、成人悪性骨線維性組織球腫;小児悪性骨線維性組織球腫、肉腫、小児肉腫;骨髄異形成症候群;神経芽細胞腫;精巣生殖細胞腫瘍、眼内黒色腫、骨髄異形成症候群;骨髄異形成/骨髄増殖性疾患、滑膜肉腫、を含むが、これらに限定されない。
【０１０１】
本発明の好ましい実施形態では、がんは固形腫瘍である。例えば、カポジ肉腫、エイズ関連カポジ肉腫、黒色腫、特にぶどう膜黒色腫のような肉腫及び骨肉腫であってもよく、頭頸部がん、腎臓がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、肺がん、食道がん、乳がん、特にトリプルネガティブ乳がん(TNBC)、膀胱がん、結腸直腸がん、肝臓及び胆道がん、子宮がん、虫垂及び子宮頸部がん、精巣がん、消化管がん、子宮内膜及び腹膜がんであってもよい。
【実施例】
【０１０２】
(実施例1)
AsiDNAは腫瘍細胞をAsiDNA治療に過敏にする
材料及び方法
細胞培養
トリプルネガティブ乳がん細胞株MDA-MB-231をATCCから購入し、製造業者の取扱説明書に従って増殖させた。簡潔に言えば、MDA-MB-231細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したL15 Leibovitz培地中で増殖させ、37℃及び0%CO2の加湿雰囲気中で維持する。
【０１０３】
AsiDNA処理及び細胞生存率の測定
細胞を適切な密度で6ウェル培養プレートに播種し、AsiDNA添加前に37℃で24時間インキュベートした。処理後7日目に細胞を採取し、0.4%トリパンブルー(Sigma Aldrich社、Saint-Louis、USA)で染色し、Kovaスライドを用いて顕微鏡下で計数した。細胞生存率は、生きた処理細胞/生きた未処理細胞の割合として計算した。細胞死は、計数した細胞の総数のうち、死細胞の数として計算した。細胞を洗浄してAsiDNAを除去し、再び6ウェル培養プレートに播種して、6日間の間に回復させた。次いで、処理/回復の第2サイクルを開始した。4サイクルを行った。(図1A)。
【０１０４】
インビボ実験
MDA-MB-231細胞由来の異種移植(CDX)を、6〜8週齢の成体雌ヌードNMRI-nu Rj:NMRI-Foxnln1nu/Foxn1nuマウス(Janvier)の乳房脂肪体に5.106個の細胞を注入することによって得た。動物を、明暗(12時間/12時間)、相対湿度(55%)、温度(21℃)の管理された条件下で、腫瘍の移植の少なくとも1週間前に収容した。マウスは、移植腫瘍が80〜250mm3に達した時点で、10〜15匹の異なる治療群に無作為に割り付けた。AsiDNAを全身に注入した(腹腔内投与)。腫瘍の成長を、ノギスを用いて週3回評価し、腫瘍体積を以下の式：(長さ×幅2)/2を用いて計算した。マウスは最大3ヶ月間追跡し、腫瘍体積が1,500mm3に達した時点で倫理的に屠殺した。現地の動物実験倫理委員会は、すべての実験を承認した。動物実験を実施するための認可(#01593.02)は、French Ministere de l'Education Nationale, de l'Enseignement Superieur et de la Rechercheから交付された。
【０１０５】
結果
化学療法又は標的治療の耐性を生成するためのより正確なプロトコールは、耐性クローンの選択を有利にするために、腫瘍細胞を反復治療サイクルに投入することであることがいくつかの報告で示されている(GalluzziLら、Cell Rep.、2012年8月30日、2(2):257〜69頁; MichelsJら、Cancer Res.、2013年4月1日、73(7):2271〜80頁)。トリプルネガティブ乳がん細胞株MDA-MB-231の生存に対するAsiDNAの効果を試験するために、このプロトコールを使用した。
【０１０６】
プロトコールと結果を図1に示す。
【０１０７】
MDA-MB-231細胞の3つの独立した集団において、AsiDNA処理(5μM)の反復サイクルを行った。各処理サイクルの間に生細胞プールを再配置するために、「1週間処理-1週間回復」(図1A)のスケジュールで4サイクルのAsiDNA処理を行った。AsiDNAに対する耐性クローンは、反復処理中に単離されなかった。一方、反復サイクルの後に、AsiDNAに対する感受性の治療誘発性の増加が観察された(図1B)。実際、MDA-MB-231細胞は、5μMの用量でAsiDNAに対して低い感受性を示す(非処理集団と比較して85%の生存率)。第1サイクルの後では85%の細胞が生存していた野に対し、処理の第2サイクル以降では、45%の細胞が生存している。第4サイクル以降では、わずか20%の細胞が生存し、AsiDNAによる反復処理は、耐性の出現よりもむしろがん細胞の感受性を高めることを示している(図1B)。
【０１０８】
我々は、MDA-MB-231細胞由来の異種移植片を用いた周期的な治療により、AsiDNAに対する感受性が増加することをインビボで検証した(図1C)。腫瘍は治療の第1サイクルには反応しなかったが、2回目の治療サイクルでは増殖が停止し、反復治療でも感受性が高まる可能性が示唆された。これらの結果は、AsiDNA治療の第2サイクルから始まるAsiDNAに対する感受性の大幅な増加を示したインビトロデータと一致している(図1B)。
【０１０９】
(実施例2)
AsiDNAはPARP阻害剤に対する耐性の出現を抑止する
材料及び方法
細胞培養
トリプルネガティブ乳がん細胞株BC227(BRCA2-/-、患者由来細胞株、Curie institute社)を製造業者の取扱説明書に従って増殖させる。BC227細胞株を、10%FBS及び10μg/mlインスリンを添加したDMEM培地中で増殖させ、37℃及び5%CO2の加湿雰囲気中で維持する。
【０１１０】
薬物処理及び細胞生存率の測定
処理プロトコールの反復サイクルについて、薬物の細胞毒性を相対生存率及び細胞死の定量化によって測定した。細胞を適切な密度で6ウェル培養プレートに播種し、薬物添加(10μMオラパリブ又は0.1μMタラゾパリブ、2.5μMのAsiDNAの有無)前に37℃で24時間インキュベートした。処理後7日目に細胞を採取し、0.4%トリパンブルー(Sigma Aldrich社、Saint-Louis、USA)で染色し、Kovaスライドを用いて顕微鏡下で計数した。細胞生存率は、生きた処理細胞/生きた未処理細胞の割合として計算した。細胞死は、計数した細胞の総数のうち、死細胞の数として計算した。細胞を洗浄して薬物を除去し、再び6ウェル培養プレートに播種して、6日間の間に回復させた。次いで、処理/回復の第2サイクルを開始した。4サイクルを行った(図2A)。
【０１１１】
結果
従来の抗がん治療、最近では標的療法によって腫瘍の制御が改善されてきているが、投与量の増量を制限する副作用や治療中の耐性の発現が治療の失敗の主な原因となっている。抗がん治療の選択的圧力の下では、がん細胞の耐性集団は常に進化し、治療によって誘発される新たな環境に適応した「耐性クローン」を生み出している。
【０１１２】
これに関連して、PARP阻害剤に対する獲得耐性の発現に及ぼすAsiDNA同時処理の効果を評価した。
【０１１３】
非効率的なHR修復を有する患者を治療するためのポリ(アデノシン二リン酸[ADP]-リボース)ポリメラーゼ阻害剤(PARPi)の開発は、DNA修復の欠陥をがん治療に利用する最初の例である。しかし、このFDA承認の唯一のDNA修復阻害剤ファミリーに対する耐性のメカニズムは、前臨床モデル及び臨床で報告されている(Chiarugi A.、Trends Pharmacol Sci.、2012年1月、33(1):42〜8頁)。BC227細胞(BRCA2-/-、HR欠損)は、最初はPARPiに非常に敏感で、AsiDNA(低用量  - 2.5μM)の有無にかかわらず、オラパリブ10μM)又はタラゾパリブ(100nM)(IC90に対応する高用量)の反復サイクルで処理されている。各処理の5つの独立した集団を、4サイクルの処理に増殖させ、維持した(図2A)。すべての細胞の独立集団において、オラパリブ及びタラゾパリブに対する明らかな耐性が観察された(図2B)。興味深いことに、PARPi及びAsiDNAの両方で処理された細胞集団は、薬剤に対して非常に敏感なままであり、AsiDNAは低用量で、両方のPARPiに対する獲得耐性の出現を抑止することを示している。これらの結果は、AsiDNAを乳がん治療のためにPARP阻害剤と組み合わせて使用することで、PARP阻害剤に対する獲得耐性の発現を遅らせるか、或いはその発現を抑止できることを強く示唆している。
【０１１４】
(実施例3)
AsiDNAは乳がんのタラゾパリブに対する獲得耐性を後退させる
材料及び方法
細胞培養
トリプルネガティブ乳がん細胞株BC227(BRCA2-/-、患者由来細胞株、Curie institute社)を製造業者の取扱説明書に従って増殖させる。BC227細胞株を、10%FBS及び10μg/mlインスリンを添加したDMEM培地中で増殖させ、37℃及び5%CO2の加湿雰囲気中で維持する。
【０１１５】
薬物処理及び細胞生存率の測定
処理プロトコールの反復サイクルについて、タラゾパリブ(100nM)細胞毒性を相対生存率及び細胞死の定量化によって測定した。細胞を適切な密度で6ウェル培養プレートに播種し、薬物添加前に37℃で24時間インキュベートした。処理後7日目に細胞を採取し、0.4%トリパンブルー(Sigma Aldrich社、Saint-Louis、USA)で染色し、Kovaスライドを用いて顕微鏡下で計数した。細胞生存率は、生きた処理細胞/生きた未処理細胞の割合として計算した。細胞死は、計数した細胞の総数のうち、死細胞の数として計算した。細胞を洗浄してタラゾパリブを除去し、再び6ウェル培養プレートに播種して、6日間の間に回復させた。次いで、処理/回復の第2サイクルを開始した。4サイクルを実施し、タラゾパリブに対するBC227耐性集団を2週間継代培養し、次いで、獲得耐性を検証するためにタラゾパリブ(100nM)で処理するか、又はAsiDNA(5μM)がタラゾパリブ耐性を後退させることができるかどうかを試験するために、タラゾパリブ+AsiDNAで処理した(図3A)。
【０１１６】
結果
標的療法に対する獲得耐性を後退させるための適切な処理プロトコールを見つけるために、多くの努力がなされている。これに関連して、本発明者らは、AsiDNAを添加することにより、PARP阻害剤であるタラゾパリブに対する獲得耐性を後退させることができるかどうかを試験した。
【０１１７】
特に、結果を図3に示す。
【０１１８】
最初は非常に感受性の高い親株BC227細胞株において、PARP阻害剤であるタラゾパリブに対する耐性を生成するには、1週間の処理/1週間の解除の4サイクルは十分であった。タラゾパリブに対する5つの独立した耐性集団(集団RT1、RT2、RT3、RT5及びRT6)を、処理せずに2週間継代培養した後、耐性の持続性を検証するためにタラゾパリブ(100nM)で処理するか、又はAsiDNAがタラゾパリブ耐性を後退させることができるかどうかを確認するために、タラゾパリブ+AsiDNA併用療法で処理するかのいずれかを行った(図3A)。タラゾパリブ(100nM)に対する耐性は、BC227対照細胞(生存率10%)と比較して、5つの独立した集団(生存率50〜90%の間)で維持された(図3B)。興味深いことに、1週間の間にタラゾパリブにAsiDNAを添加すると、5つのうち3つの耐性集団(RT1、RT2及びRT3)でこの耐性が後退した(生存率は0〜20%の間)。RT5及びRT6の集団におけるタラゾパリブ耐性を後退させるためには、より多くの併用処理のサイクルが必要かどうかを確認するために、他の処理サイクルが進行中である。
【０１１９】
(実施例4)
AsiDNAは卵巣がんにおけるニラパリブに対する耐性の出現を抑止する
材料及び方法
細胞培養
卵巣がん細胞株SKOV-3を、10%FBSを添加したMcCoy's 5a培地中で、製造業者の取扱説明書に従って増殖させ、37℃及び5%CO2の加湿雰囲気中で維持した。
【０１２０】
薬物処理及び細胞生存率の測定
処理プロトコールの反復サイクルについて、薬物の細胞毒性を相対生存率及び細胞死の定量化によって測定した。細胞を適切な密度で6ウェル培養プレートに播種し、薬物添加(5μMニラパリブ、2.5μMのAsiDNAの有無)前に37℃で24時間インキュベートした。処理後7日目に細胞を採取し、0.4%トリパンブルー(Sigma Aldrich社、Saint-Louis、USA)で染色し、Kovaスライドを用いて顕微鏡下で計数した。細胞生存率は、生きた処理細胞/生きた未処理細胞の割合として計算した。細胞死は、計数した細胞の総数のうち、死細胞の数として計算した。細胞を洗浄して薬物を除去し、再び6ウェル培養プレートに播種して、6日間の間に回復させた。次いで、処理/回復の第2サイクルを開始した。4サイクルを行った。(図4A)。
【０１２１】
結果
従来の抗がん治療、最近では標的療法によって腫瘍の制御が改善されてきているが、投与量の増量を制限する副作用や治療中の耐性の発現が治療の失敗の主な原因となっている。抗がん治療の選択的圧力の下では、がん細胞の耐性集団は常に進化し、治療によって誘発される新たな環境に適応した「耐性クローン」を生み出している。
【０１２２】
これに関連して、PARP阻害剤ニラパリブに対する獲得耐性の発現に及ぼすAsiDNA同時処理の効果を評価した。
【０１２３】
非効率的なHR修復を有する患者を治療するためのポリ(アデノシン二リン酸[ADP]-リボース)ポリメラーゼ阻害剤(PARPi)の開発は、DNA修復の欠陥をがん治療に利用する最初の例である。しかし、このFDA承認の唯一のDNA修復阻害剤ファミリーに対する耐性のメカニズムは、前臨床モデル及び臨床で報告されている(Chiarugi A.、Trends Pharmacol Sci.、2012年1月、33(1):42〜8頁)。SKOV-3細胞を、AsiDNA(低用量  - 2.5μM)の有無にかかわらず、ニラパリブ(5μM)(IC90に対応する高用量)の反復サイクルで処理した。各処理の3つの独立した集団を、4サイクルの処理に増殖させ、維持した(図4A)。すべての独立集団において、タラゾパリブに対する明らかな耐性が観察された(図4B)。興味深いことに、ニラパリブ及びAsiDNAの両方で処理された2つの細胞集団は、薬剤に対して非常に敏感なままであり、AsiDNAは低い分割実薬用量で、ニラパリブに対する獲得耐性の出現を抑止することを示している。これらの結果は、AsiDNAを卵巣がん治療のためにニラパリブと組み合わせて使用することで、ニラパリブに対する獲得耐性の発現を遅らせるか、或いはその発現を抑止できることを強く示唆している。
【０１２４】
(実施例5)
AsiDNAは小細胞肺がんにおけるタラゾパリブに対する耐性の出現を抑止する
材料及び方法
細胞培養
小細胞肺がん(SCLC)細胞株NCI-H446を、10%FBSを添加したRPMI培地中で、製造業者の取扱説明書に従って増殖させ、37℃及び5%CO2の加湿雰囲気中で維持した。
【０１２５】
薬物処理及び細胞生存率の測定
処理プロトコールの反復サイクルについて、薬物の細胞毒性を相対生存率及び細胞死の定量化によって測定した。細胞を適切な密度で6ウェル培養プレートに播種し、薬物添加前に37℃で24時間インキュベートした。処理後7日目に細胞を採取し、0.4%トリパンブルー(Sigma Aldrich社、Saint-Louis、USA)で染色し、Kovaスライドを用いて顕微鏡下で計数した。細胞生存率は、生きた処理細胞/生きた未処理細胞の割合として計算した。細胞死は、計数した細胞の総数のうち、死細胞の数として計算した。細胞を洗浄してAsiDNAを除去し、再び6ウェル培養プレートに播種して、6日間の間に回復させた。次いで、処理/回復の第2サイクルを開始した。4サイクルを行った。(図5A)。
【０１２６】
結果
従来の抗がん治療、最近では標的療法によって腫瘍の制御が改善されてきているが、投与量の増量を制限する副作用や治療中の耐性の発現が治療の失敗の主な原因となっている。抗がん治療の選択的圧力の下では、がん細胞の耐性集団は常に進化し、治療によって誘発される新たな環境に適応した「耐性クローン」を生み出している。
【０１２７】
これに関連して、PARP阻害剤に対する獲得耐性の発現に及ぼすAsiDNA同時処理の効果を評価した。
【０１２８】
非効率的なHR修復を有する患者を治療するためのポリ(アデノシン二リン酸[ADP]-リボース)ポリメラーゼ阻害剤(PARPi)の開発は、DNA修復の欠陥をがん治療に利用する最初の例である。しかし、このFDA承認の唯一のDNA修復阻害剤ファミリーに対する耐性のメカニズムは、前臨床モデル及び臨床で報告されている(Chiarugi A.、Trends Pharmacol Sci.、2012年1月、33(1):42〜8頁)。NCI-H446細胞は、最初はPARPiであるタラゾパリブに非常に敏感で、AsiDNA(低用量  - 2.5μM)の有無にかかわらず、タラゾパリブ(100nM)(IC90に対応する高用量)の反復サイクルで処理した。各処理の3つの独立した集団を、4サイクルの処理に増殖させ、維持した(図5A)。すべての独立集団において、タラゾパリブに対する明らかな耐性が観察された(図5B)。興味深いことに、タラゾパリブ及びAsiDNAの両方で処理された細胞集団は、薬剤に対して非常に敏感なままであり、AsiDNAは低い分割実薬用量で、タラゾパリブに対する獲得耐性の出現を抑止することを示している。これらの結果は、AsiDNAをがん治療のためにPARP阻害剤と組み合わせて使用することで、PARP阻害剤に対する獲得耐性の発現を遅らせるか、或いはその発現を抑止できることを強く示唆している。
【０１２９】
(実施例6)
AsiDNAはSCLCにおけるカルボプラチンに対する耐性の出現を抑止する
材料及び方法
細胞培養
小細胞肺がん細胞株NCI-H446を、10%FBSを添加したRPMI培地中で、製造業者の取扱説明書に従って増殖させ、37℃及び5%CO2の加湿雰囲気中で維持した。
【０１３０】
薬物処理及び細胞生存率の測定
処理プロトコールの反復サイクルについて、薬物の細胞毒性を相対生存率及び細胞死の定量化によって測定した。細胞を適切な密度で6ウェル培養プレートに播種し、薬物添加前に37℃で24時間インキュベートした。処理後7日目に細胞を採取し、0.4%トリパンブルー(Sigma Aldrich社、Saint-Louis、USA)で染色し、Kovaスライドを用いて顕微鏡下で計数した。細胞生存率は、生きた処理細胞/生きた未処理細胞の割合として計算した。細胞死は、計数した細胞の総数のうち、死細胞の数として計算した。細胞を洗浄してAsiDNAを除去し、再び6ウェル培養プレートに播種して、6日間の間に回復させた。次いで、処理/回復の第2サイクルを開始した。5サイクルを行った。(図6A)。
【０１３１】
結果
従来の抗がん治療、最近では標的療法によって腫瘍の制御が改善されてきているが、投与量の増量を制限する副作用や治療中の耐性の発現が治療の失敗の主な原因となっている。抗がん治療の選択的圧力の下では、がん細胞の耐性集団は常に進化し、治療によって誘発される新たな環境に適応した「耐性クローン」を生み出している。
【０１３２】
これに関連して、カルボプラチンに対する獲得耐性に及ぼすAsiDNA同時処理の効果を評価した。
【０１３３】
NCI-H446細胞は、最初はカルボプラチンに敏感で、AsiDNA(低用量  -  2.5μM)の有無にかかわらず、カルボプラチン(2.5μM)(IC90に対応する高用量)の反復サイクルで処理した。各処理の3つの独立した集団を増殖させ、4サイクル処理の間、維持した(図6A)。すべての独立集団において、カルボプラチンに対する明らかな耐性が観察された(図6B)。興味深いことに、カルボプラチン及びAsiDNAの両方で処理された細胞集団は、薬剤に対して非常に敏感なままであり、AsiDNAは低い分割実薬用量で、カルボプラチンに対する獲得耐性の出現を抑止したことを示している。これらの結果は、AsiDNAをがん治療のためにカルボプラチンと組み合わせて使用することで、白金塩に対する獲得耐性の発現を遅らせるか、或いはその発現を抑止できることを強く示唆している。
【図１】
2021515580.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2021515580000001.app
【国際調査報告】
2021515580.tif 000018
2021515580.tif 000019
2021515580.tif 000020
2021515580.tif 000021