(57)【要約】  本明細書は、基礎培地、並びに化学的リプログラミングを促進する組成物を含む、多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系を開示しており、ここで、前記化学的リプログラミングを促進する組成物は、チミン類似体、ｃＡＭＰ活性化剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、骨形成タンパク質、ＲＡ受容体活性化剤、ＧＳＫ３阻害剤および塩基性線維芽細胞増殖因子を含み、且つ、ここで、前記培養系は血清を含まない。本明細書で提供される方法によって体細胞を化学的リプログラミングする過程では、細胞を頻繁に新たな培養容器へ移す必要がなく、従来の培養方法に比べて、操作ステップを簡略化し、新たな培養容器へ移す過程で生じる細胞損失を低減し、且つ、本明細書で提供される培養系を採用すると、血清を用いる必要がなく、後続の多能性幹細胞の収集および分子機序解析をさらに簡略化し、後続の人工多能性幹細胞の動物由来成分を含まない培養系の樹立がより便利になる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系であって、培地、並びに下記の成分：チミン類似体、ｃＡＭＰ活性化剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、骨形成タンパク質、ＲＡ受容体活性化剤、ＧＳＫ３阻害剤および塩基性線維芽細胞増殖因子を含み、且つ、ここで、前記培養系は血清を含まない、培養系。
【請求項２】
前記チミン類似体の濃度は０．０１〜１０μＭであり、
前記ｃＡＭＰ活性化剤の濃度は０．０１〜１０μＭであり、
前記ＴＧＦ−β受容体阻害剤の濃度は０．０１〜５μＭであり、
前記骨形成タンパク質の濃度は０．０１〜１０ｎｇ／ｍｌであり、
前記塩基性線維芽細胞増殖因子の濃度は０．０１〜１０ｎｇ／ｍｌであり、
前記ＲＡ受容体活性化剤の濃度は０．０１〜０．０５μＭであり、および／または
前記ＧＳＫ３阻害剤の濃度は０．０１〜３μＭである、請求項１に記載の培養系。
【請求項３】
前記チミン類似体はＢｒｄｕであり、
前記ｃＡＭＰ活性化剤はＦＳＫであり、
前記ＴＧＦ−β受容体阻害剤はＲｅｐＳｏｘであり、
前記骨形成タンパク質はＢＭＰ４であり、
前記塩基性線維芽細胞増殖因子はＦＧＦ２であり、
前記ＲＡ受容体活性化剤はＡＭ５８０であり、および／または
前記ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１である、請求項２に記載の培養系。
【請求項４】
前記培養系は、ビタミンＣ、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤および／またはＤＺＮｅｐをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の培養系。
【請求項５】
前記ビタミンＣの濃度は０．０１〜５０μｇ／ｍｌであり、
前記ＤＯＴ１Ｌ阻害剤の濃度は０．０１〜５μＭであり、
前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の濃度は０．０１〜０．５ｍＭであり、および／または
前記ＤＺＮｅｐの濃度は０．００１〜０．０５μＭである、請求項４に記載の培養系。
【請求項６】
前記ＤＯＴ１Ｌ阻害剤はＥＰＺ５６７６および／またはＳＧＣ０９４６であり、
前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤はバルプロ酸である、請求項５に記載の培養系。
【請求項７】
前記培養系は、ＥＺＨ２阻害剤および／またはｃＭｅｔ阻害剤をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の培養系。
【請求項８】
前記ＥＺＨ２阻害剤の濃度は０．０１μＭ〜１０μＭであり、および／または、前記ｃＭｅｔ阻害剤の濃度は０．０１μＭ〜１０μＭである、請求項７に記載の培養系。
【請求項９】
前記ＥＺＨ２阻害剤はＥＰＺ６４３８であり、前記ｃＭｅｔ阻害剤はＣａｐｍａｔｉｎｉｂである、請求項８に記載の培養系。
【請求項１０】
前記培養系は、
１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４；
５０μｇ／ｍｌのビタミンＣ；
５μＭのＥＰＺ５６７６；
１０μのＭＢｒｄｕ；
０．０５μＭのＡＭ５８０；
３μＭのＣＨＩＲ９９０２１；
１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２；
１０μＭのＦｏｒｓｋｌｉｎ；
５μＭのＲｅｐＳｏｘ；
０．１ｍＭのバルプロ酸；
０．０５μＭのＤＺＮｅｐ；および／または
５μＭのＳＧＣ０９４６を含む、請求項６に記載の培養系。
【請求項１１】
前記培養系は、
１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４；
５０μｇ／ｍｌのビタミンＣ；
５μＭのＥＰＺ５６７６；
１０μＭのＢｒｄｕ；
０．０５μＭのＡＭ５８０；
３μＭのＣＨＩＲ９９０２１；
１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２；
１０μＭのＦｏｒｓｋｌｉｎ；
５μＭのＲｅｐＳｏｘ；
０．１ｍＭのバルプロ酸；
０．０５μＭのＤＺＮｅｐ；
５μＭのＳＧＣ０９４６；
５μＭのＥＰＺ６４３８；および／または
５μＭのＣａｐｍａｔｉｎｉｂを含む、請求項９に記載の培養系。
【請求項１２】
前記培地はｉＣＤ１培地である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の培養系。
【請求項１３】
体細胞が化学的リプログラミングを行うことを誘導するための方法であって、体細胞を、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の培養系において、体細胞が多能性状態にリプログラミングされるのに十分な時間だけ培養し続けることを含む、方法。
【請求項１４】
体細胞が多能性状態にリプログラミングされた後、培地を下記の成分が補充されたＤＭＥＭ培地に交換し、該培地において、胚性幹細胞の原始状態を維持するのに十分な時間だけ培養し続けることをさらに含み、ここで、前記成分は、ＰＤ０３２５９０１；非必須アミノ酸；ＧｌｕｔａＭａｘＴＭ；ヒト白血球抗原Ｂ２７；ＣＨＩＲ９９０２１；白血病抑制因子、および／またはＮ２添加剤を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＤ０３２５９０１の濃度は１μＭであり、非必須アミノ酸の濃度は培地の総体積の１％であり、ＧｌｕｔａＭａｘＴＭの濃度は培地の総体積の１％であり、ヒト白血球抗原Ｂ２７の濃度は培地の総体積の２％であり、ＣＨＩＲ９９０２１の濃度は３μＭであり、Ｎ２添加剤の濃度は培地の総体積の１％であり、および／または白血病抑制因子の濃度は１Ｕ〜１０００Ｕである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記体細胞が多能性状態にリプログラミングされるのに十分な時間は８日間〜２２日間である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記胚性幹細胞の原始状態を維持するのに十分な時間は１日間〜１８日間である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記体細胞は、線維芽細胞、骨髄由来単球細胞、骨格筋細胞、脂肪細胞、末梢血単核細胞、マクロファージ、肝細胞、角化細胞、口腔角化細胞、毛包真皮細胞、胃上皮細胞、肺上皮細胞、滑膜細胞、腎臓細胞、皮膚上皮細胞、骨芽細胞、神経幹細胞および真皮細胞から選ばれる、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するためのキットであって、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の培養系を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年３月１日に提出した出願番号が２０１８１０１７０５５３．Ｘで、発明の名称が「多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系、および該培養系を用いる化学的リプログラミング方法」である中国特許出願の優先権を主張し、そのすべての内容は参照により本出願に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系、および該培養系を用いる化学的リプログラミング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
体細胞から多能性幹細胞の生成を誘導することは生物学分野および医学分野における画期的な発見である。特に、医学分野において、体細胞から多能性幹細胞の生成を誘導するという概念は、患者の特異的幹細胞として再生薬を研究開発することを指導することができ、パーキンソン病やアルツハイマー型認知症のような変性疾患を治療するのに用いられる。生物学分野では、現在、Ｙａｍａｎａｋａ因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびＭｙｃ）により駆動される体細胞リプログラミングに対して既に詳細に研究されており、例えば、現在、細胞運命およびその形質転換を制御する分子および細胞機序が既に詳細に研究されている。細胞運命に対するこのような詳細な研究は、がんの治療、神経系疾患の治療および心血管疾患の治療における、体細胞からの多能性幹細胞の生成の誘導の応用をより明らかにした。
【０００４】
本分野では、Ｙａｍａｎａｋａ因子の代わりに化学小分子を採用し体細胞リプログラミングを誘導して多能性幹細胞を生成することが既に提案されている。北京大学のトウ宏魁研究グループは、Ｙａｍａｎａｋａ因子中のＯｃｔ４の代わりに小分子Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎを採用して化学的に誘導された多能性幹細胞（Ｈｏｕ，Ｐ．ら，Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｍｏｕｓｅ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１，６５１−６５４）を生成することを既に報告しているが、彼らが報告した培養系は、多能性幹細胞の生成を効果的に誘導できず、且つ培養過程で細胞を頻繁に新たな培養容器へ移す必要があるため、該培養系は依然として改善される必要がある（Ｚｈａｏ  Ｙ．ら、Ａ  ＸＥＮ−ｌｉｋｅ  Ｓｔａｔｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｃｅｌｌ，１６３，１６７８−１６９１）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、Ｙａｍａｎａｋａ因子の代わりに化学小分子を採用して多能性幹細胞の生成を誘導する面で、さらなる鋭意研究を行う必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様において、本明細書は、多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系であって、培地、並びに下記の成分：チミン類似体、ｃＡＭＰ活性化剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、骨形成タンパク質、ＲＡ受容体活性化剤、ＧＳＫ３阻害剤および塩基性線維芽細胞増殖因子を含み、且つ、ここで、前記培養系は血清を含まない、培養系を提供する。
【０００７】
一実施形態において、本明細書で提供される培養系は、ビタミンＣ、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤および／またはＤＺＮｅｐをさらに含んでいる。
【０００８】
一実施形態において、本明細書で提供される培養系は、ＥＺＨ２阻害剤および／またはｃＭｅｔ阻害剤をさらに含んでいる。
【０００９】
一実施形態において、前記ｃＡＭＰ活性化剤の濃度は０．０１〜１０μＭである。一実施形態において、前記ＴＧＦ−β受容体阻害剤の濃度は０．０１〜５μＭである。一実施形態において、前記骨形成タンパク質の濃度は０．０１〜１０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態において、前記塩基性線維芽細胞増殖因子の濃度は０．０１〜１０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態において、前記ＲＡ受容体活性化剤の濃度は０．０１〜０．０５μＭである。一実施形態において、前記ＧＳＫ３阻害剤の濃度は０．０１〜３μＭである。一実施形態において、前記チミン類似体はＢｒｄｕである。一実施形態において、前記ｃＡＭＰ活性化剤はＦＳＫである。一実施形態において、前記ＴＧＦ−β受容体阻害剤はＲｅｐＳｏｘである。一実施形態において、前記骨形成タンパク質はＢＭＰ４である。一実施形態において、前記塩基性線維芽細胞増殖因子はＦＧＦ２である。一実施形態において、前記ＲＡ受容体活性化剤はＡＭ５８０である。一実施形態において、前記ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１である。一実施形態において、前記ビタミンＣの濃度は０．０１〜５０μｇ／ｍｌである。一実施形態において、前記ＤＯＴ１Ｌ阻害剤の濃度は０．０１〜５μＭである。一実施形態において、前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の濃度は０．０１〜０．５ｍＭである。一実施形態において、前記ＤＺＮｅｐの濃度は０．００１〜０．０５μＭである。一実施形態において、前記ＤＯＴ１Ｌ阻害剤はＥＰＺ５６７６および／またはＳＧＣ０９４６であり、前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤はバルプロ酸である。一実施形態において、前記ＥＺＨ２阻害剤の濃度は０．０１μＭ〜１０μＭである。一実施形態において、前記ｃＭｅｔ阻害剤の濃度は０．０１μＭ〜１０μＭである。一実施形態において、前記ＥＺＨ２阻害剤はＥＰＺ６４３８である。一実施形態において、前記ｃＭｅｔ阻害剤はＣａｐｍａｔｉｎｉｂである。
【００１０】
本発明の例示的な一実施形態において、前記多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系は、ｉＣＤ１のような培地、並びに下記の成分を含む。
１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４；
５０μｇ／ｍｌのビタミンＣ；
５μＭのＥＰＺ５６７６；
１０μのＭＢｒｄｕ；
０．０５μＭのＡＭ５８０；
３μＭのＣＨＩＲ９９０２１；
１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２；
１０μＭのＦｏｒｓｋｌｉｎ；
５μＭのＲｅｐＳｏｘ；
０．１ｍＭのバルプロ酸；
０．０５μＭのＤＺＮｅｐ；および／または
５μＭのＳＧＣ０９４６。
【００１１】
本発明の他の例示的な実施形態において、前記多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系は、ｉＣＤ１のような培地、並びに下記の成分を含む。
１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４；
５０μｇ／ｍｌのビタミンＣ；
５μＭのＥＰＺ５６７６；
１０μＭのＢｒｄｕ；
０．０５μＭのＡＭ５８０；
３μＭのＣＨＩＲ９９０２１；
１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２；
１０μＭのＦｏｒｓｋｌｉｎ；
５μＭのＲｅｐＳｏｘ；
０．１ｍＭのバルプロ酸；
０．０５μＭのＤＺＮｅｐ；
５μＭのＳＧＣ０９４６；
５μＭのＥＰＺ６４３８；および／または
５μＭのＣａｐｍａｔｉｎｉｂ。
【００１２】
一態様において、本明細書は、基礎培地と、化学的リプログラミングを促進する組成物とを含む、多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系を提供し、ここで、前記化学的リプログラミングを促進する組成物は、チミン類似体、ｃＡＭＰ活性化剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、骨形成タンパク質、ＲＡ受容体活性化剤、ＧＳＫ３阻害剤および塩基性線維芽細胞増殖因子を含み、且つ、ここで、前記培養系は血清を含まない。
【００１３】
一実施形態において、前記チミン類似体の濃度は０．０１〜１０μＭである。一実施形態において、前記ｃＡＭＰ活性化剤の濃度は０．０１〜１０μＭである。一実施形態において、前記ＴＧＦ−β受容体阻害剤の濃度は０．０１〜５μＭである。一実施形態において、前記骨形成タンパク質の濃度は０．０１〜１０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態において、前記塩基性線維芽細胞増殖因子の濃度は０．０１〜１０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態において、前記ＲＡ受容体活性化剤の濃度は０．０１〜０．０５μＭである。一実施形態において、前記ＧＳＫ３阻害剤の濃度は０．０１〜３μＭである。一実施形態において、前記チミン類似体はＢｒｄｕである。一実施形態において、前記ｃＡＭＰ活性化剤はＦＳＫである。一実施形態において、前記ＴＧＦ−β受容体阻害剤はＲｅｐＳｏｘである。一実施形態において、前記骨形成タンパク質はＢＭＰ４である。一実施形態において、前記塩基性線維芽細胞増殖因子はＦＧＦ２である。一実施形態において、前記ＲＡ受容体活性化剤はＡＭ５８０である。一実施形態において、前記ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１である。
【００１４】
前記化学的プログラミングを促進する組成物は、ビタミンＣ、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤および／またはＤＺＮｅｐをさらに含んでいる。
【００１５】
一実施形態において、前記ビタミンＣの濃度は０．０１〜５０μｇ／ｍｌである。一実施形態において、前記ＤＯＴ１Ｌ阻害剤の濃度は０．０１〜５μＭである。一実施形態において、前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の濃度は０．０１〜０．５ｍＭである。一実施形態において、前記ＤＺＮｅｐの濃度は０．００１〜０．０５μＭである。
【００１６】
一実施形態において、前記ＤＯＴ１Ｌ阻害剤はＥＰＺ５６７６および／またはＳＧＣ０９４６であり、前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤はバルプロ酸である。
【００１７】
前記化学的リプログラミングを促進する組成物は、ＥＺＨ２阻害剤および／またはｃＭｅｔ阻害剤をさらに含んでいる。一実施形態において、前記ＥＺＨ２阻害剤の濃度は０．０１μＭ〜１０μＭである。一実施形態において、前記ｃＭｅｔ阻害剤の濃度は０．０１μＭ〜１０μＭである。一実施形態において、前記ＥＺＨ２阻害剤はＥＰＺ６４３８である。一実施形態において、前記ｃＭｅｔ阻害剤はＣａｐｍａｔｉｎｉｂである。
【００１８】
本発明の例示的な一実施形態において、前記多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系は、ｉＣＤ１のような基礎培地と、下記の成分を含有する化学的リプログラミングを促進する組成物とを含む。
１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４；
５０μｇ／ｍｌのビタミンＣ；
５μＭのＥＰＺ５６７６；
１０μＭのＢｒｄｕ；
０．０５μＭのＡＭ５８０；
３μＭのＣＨＩＲ９９０２１；
１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２；
１０μＭのＦｏｒｓｋｌｉｎ；
５μＭのＲｅｐＳｏｘ；
０．１ｍＭのバルプロ酸；
０．０５μＭのＤＺＮｅｐ；および／または
５μＭのＳＧＣ０９４６。
【００１９】
本発明の他の例示的な実施形態において、前記多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系は、ｉＣＤ１のような基礎培地と、下記の成分を含有する化学的リプログラミングを促進する組成物とを含む。
１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４；
５０μｇ／ｍｌのビタミンＣ；
５μＭのＥＰＺ５６７６；
１０μＭのＢｒｄｕ；
０．０５μＭのＡＭ５８０；
３μＭのＣＨＩＲ９９０２１；
１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２；
１０μＭのＦｏｒｓｋｌｉｎ；
５μＭのＲｅｐＳｏｘ；
０．１ｍＭのバルプロ酸；
０．０５μＭのＤＺＮｅｐ；
５μＭのＳＧＣ０９４６；
５μＭのＥＰＺ６４３８；および／または
５μＭのＣａｐｍａｔｉｎｉｂ。
【００２０】
他の態様において、本明細書は、体細胞が化学的リプログラミングを行うことを誘導するための方法を提供し、前記方法は、体細胞を、上記の培養系において、体細胞が多能性状態にリプログラミングされるのに十分な時間だけ培養し続けることを含む。前記方法は、体細胞が多能性状態にリプログラミングされた後、培地を下記の成分が補充されたＤＭＥＭ培地に交換し、該培地において、胚性幹細胞の原始状態を維持するのに十分な時間だけ培養し続けることをさらに含んでもよく、ここで、前記成分は、ＰＤ０３２５９０１；非必須アミノ酸；ＧｌｕｔａＭａｘＴＭ；ヒト白血球抗原Ｂ２７；ＣＨＩＲ９９０２１；白血病抑制因子、および／またはＮ２添加剤を含む。一実施形態において、ＰＤ０３２５９０１の濃度は１μＭである。一実施形態において、非必須アミノ酸の濃度は培地の総体積の１％である。一実施形態において、ＧｌｕｔａＭａｘＴＭの濃度は培地の総体積の１％である。一実施形態において、ヒト白血球抗原Ｂ２７の濃度は培地の総体積の２％である。一実施形態において、ＣＨＩＲ９９０２１の濃度は３μＭである。一実施形態において、Ｎ２添加剤の濃度は培地の総体積の１％である。一実施形態において、白血病抑制因子の濃度は１Ｕ〜１０００Ｕである。
【００２１】
本明細書で提供される方法において、前記体細胞が多能性状態にリプログラミングされるのに十分な時間は、培養過程において細胞の形態変化並びにクローンの形成を観察することで決定してもよく、一実施形態において、前記体細胞が多能性状態にリプログラミングされるのに十分な時間は、８日間〜２２日間であってもよい。本明細書で提供される方法において、前記胚性幹細胞の原始状態を維持するのに十分な時間は、培養過程において細胞の形態変化並びにクローンの形成を観察することで決定してもよく、一実施形態において、前記胚性幹細胞の原始状態を維持するのに十分な時間は、１日間〜１８日間であってもよい。
【００２２】
本明細書で提供される方法を採用してリプログラミングが行われる体細胞は、線維芽細胞、骨髄由来単球細胞、骨格筋細胞、脂肪細胞、末梢血単核細胞、マクロファージ、肝細胞、角化細胞、口腔角化細胞、毛包真皮細胞、胃上皮細胞、肺上皮細胞、滑膜細胞、腎臓細胞、皮膚上皮細胞、骨芽細胞、神経幹細胞および真皮細胞から選ばれることができるが、これらに限定されない。
【００２３】
さらに他の態様において、本明細書は、上述の培養系を含む、多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するためのキットを提供する。
【発明の効果】
【００２４】
本明細書で提供される方法によって体細胞を化学的リプログラミングする過程では、細胞を頻繁に新たな培養容器へ移す必要がなく、従来の培養方法に比べて、操作ステップが簡略化され、新たな培養容器へ移す過程で生じる細胞損失を低減し、且つ、本明細書で提供される培養系を採用すると血清を用いる必要がないので、後続の多能性幹細胞の収集および分子機序解析をさらに簡略化し、後続の人工多能性幹細胞の動物由来成分を含まない培養系の樹立がより便利になる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の一実施形態による体細胞のリプログラミングを化学的に誘導する２段階方法の模式図である。
【図２】マウス胚性線維芽細胞、化学的に誘導された多能性幹細胞並びにマウス胚性幹細胞中の内在性多能性遺伝子Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｅｓｒｂ、Ｒｅｘ１Ｄａｐｐａ５、Ｓａｌｌ４およびＣｄｈ１の発現レベルを示す図であり、ここで、ＣｉＰＳ−１、ＣｉＰＳ−２およびＣｉＰＳ−３は異なるクローン株に由来する化学的に誘導された多能性幹細胞を表す。
【図３】化学的に誘導された多能性幹細胞、マウス胚性幹細胞およびマウス線維芽細胞のトランスクリプトーム特性を示す図である。
【図４】多能性遺伝子Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＥｓｒｂおよびＲｅｘ１の化学的に誘導された多能性幹細胞におけるタンパク質の発現レベルを示す図である。
【図５】化学的に誘導された多能性幹細胞がマウスの体内で奇形腫を形成し、分化して３つの胚葉の細胞を形成することを示す図である。
【図６】化学的に誘導された多能性幹細胞が継代過程において正常核型を維持することを示す図である。
【図７】化学的に誘導された多能性幹細胞を偽妊娠マウスの体内に注入して得られたキメラ子孫マウスを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
特に定義されない限り、本明細書で使用される科学技術用語の意味は、当業者によって理解される意味と同じである。
【００２７】
定義
本明細書で使用される用語「多能」または「多能性」とは、細胞がその後代から成体動物においてみられるいくつかの異なる細胞型を生成することができることを指す。
【００２８】
本明細書で使用される用語「分化」とは、比較的特殊化していない細胞をより特殊化した細胞に変化させて少なくとも１種の新しい細胞型の後代を形成するプロセスを指す。「脱分化」とは、部分的に分化した細胞または最終分化細胞が、例えば多分化能または多能性を有する比較的早い発達段階に戻る細胞のプロセスを指す。「分化転換」とは、１種の分化細胞型が他の分化細胞型に転換するプロセスである。ある特定の条件下で、新しい細胞型の特徴を有する後代の割合は、少なくとも約１％、５％、２５％またはより大きいであってもよい。
【００２９】
本明細書で使用される用語「体細胞」は、マウス体細胞およびヒト体細胞から選ばれるものであってよく、前記マウス体細胞および前記ヒト体細胞は、線維芽細胞、骨髄由来単球細胞、骨格筋細胞、脂肪細胞、末梢血単核細胞、マクロファージ、神経幹細胞、肝細胞、角化細胞、口腔角化細胞、毛包真皮細胞、胃上皮細胞、肺上皮細胞、滑膜細胞、腎臓細胞、皮膚上皮細胞、骨芽細胞および真皮細胞から選ばれることが好ましい。
【００３０】
本明細書で使用される用語「分離された」とは、細胞を物理的方式または化学的方式で分離することを指す。分離された細胞の例は、発達中の細胞塊、細胞培養物および細胞系である。
【００３１】
本明細書で使用される活性発現の用語「阻害剤」または「活性化剤」とは、それぞれ標的タンパク質（またはコード化ポリヌクレオチド）の発現または活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ検出することで同定される阻害分子または活性化分子を指し、例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニストおよびその同族体と模倣体が挙げられる。阻害剤とは、例えば、発現または結合を阻害し、活性化またはプロテアーゼ阻害剤の活性を部分的または完全にブロックし、活性化を低減、防止、遅延し、前記標的タンパク質の活性を不活性化、不安定化、または下方制御する試薬を指し、例えば、アンタゴニストが挙げられる。活性化剤とは、例えば、前記標的タンパク質の発現または結合を誘導または活性化し、活性化またはプロテアーゼ阻害剤の活性を刺激、増加、解放、活性化、促進、増強し、前記標的タンパク質（またはコード化ポリヌクレオチド）の活性を増感または上方制御する試薬を指し、例えば、アゴニストが挙げられる。上記の阻害剤および活性化剤についての測定は、例えば、特定の調節剤化合物を前記標的タンパク質を発現する細胞に適用し、その後、上記のように、前記標的タンパク質の活性に対する機能的作用を確定することを含む。潜在的な活性化剤または阻害剤によって処理された前記標的タンパク質を含むサンプルまたはアッセイを、阻害剤または活性化剤を含まない対照サンプルと比較して、作用の程度を検査する。対照サンプル（調節剤により処理されていない）の相対活性値を１００％とする。活性値が対照サンプルに対して約８０％、５０％、２５％、１０％、５％、または１％である場合に、前記標的タンパク質に対する抑制が達成される。活性値が対照サンプルに対して約１１０％、１５０％、２００％，３００％、４００％、５００％、または１０００％〜３０００％あるいはより高い場合に、前記標的タンパク質の活性化が達成される。
【００３２】
多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系
一態様において、本発明は、基礎培地と、化学的リプログラミングを促進する組成物とを含む、多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系を提供し、ここで、前記化学的リプログラミングを促進する組成物は、チミン類似体、ｃＡＭＰ活性化剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、骨形成タンパク質、ＲＡ受容体活性化剤、ＧＳＫ３阻害剤および塩基性線維芽細胞増殖因子を含み、且つ、前記培養系は血清を含まない。前記化学的リプログラミングを促進する組成物は、ビタミンＣ、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤および／またはＤＺＮｅｐをさらに含んでもよく、且つ、ＥＺＨ２阻害剤および／またはｃＭｅｔ阻害剤をさらに含んでもよい。本発明の培養系における各成分については、以下において詳細に述べる。
【００３３】
Ｉ．チミン類似体
本明細書におけるチミン類似体とは、チミンの構造と類似した化学化合物を指し、５−ブロモデオキシウリジン（Ｂｒｄｕ）であり、Ｂｒｄｕは、チミン環の５位の炭素に結合されたメチルが臭素に置換されたものであり、細胞増殖中のＤＮＡ合成時に内在性チミンヌクレオチドと競合して新たに合成されるＤＮＡ中に組み込まれることができることを特徴とする。Ｂｒｄｕの分子量は３０７．１であり、化学構造は次の通りである。
【化１】
2021514647.tif 000003
【００３４】
本明細書に記載の多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系において、Ｂｒｄｕの濃度は、０．０１〜１０μＭ、または０．１〜１０μＭ、または１〜１０μＭ、または２〜１０μＭ、または３〜１０μＭ、または４〜１０μＭ、または５〜１０μＭ、または６〜１０μＭ、または７〜１０μＭ、または８〜１０μＭ、または９〜１０μＭであり、３μＭ、５μＭ、８μＭ、または１０μＭであることが好ましい。
【００３５】
ＩＩ．ｃＡＭＰ活性化剤
アデニル酸シクラーゼ（ｃＡＭＰ）は内在性膜タンパク質であり、ＡＴＰをｃＡＭＰに転換して、細胞のシグナル応答を引き起こすことができ、Ｇタンパク質共役系中のエフェクターである。本明細書におけるアデニル酸シクラーゼ（ｃＡＭＰ）活性化剤は、細胞を透過してアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内のｃＡＭＰレベルを高めることができる。例示的なｃＡＭＰ活性化剤は、ＦＳＫ、ＦＳＨ、ミルリノン（ｍｉｌｒｉｎｏｎｅ）、シロスタミド（ｃｉｌｏｓｔａｍｉｄｅ）、ロリプラム（ｒｏｌｉｐｒａｍ）、ｄｂｃＡＭＰ、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ、ＩＢＭＸ、ＰＧＥ２、ＮＫＨ４７７、ｓｐ−８−ｂｒ−ｃＡＭＰｓを含むが、これらに限定されない。本発明で使用されるｃＡＭＰ活性化剤は、ＦＳＫであることが好ましい。本明細書に記載の多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系において、ＦＳＫの濃度は０．０１〜１０μＭ、または０．１〜１０μＭ、または１〜１０μＭ、または２〜１０μＭ、または３〜１０μＭ、または４〜１０μＭ、または５〜１０μＭ、または６〜１０μＭ、または７〜１０μＭ、または８〜１０μＭ、または９〜１０μＭであり、３μＭ、５μＭ、８μＭ、または１０μＭであることが好ましい。
【００３６】
ＩＩＩ．ＴＧＦ−β受容体阻害剤
本明細書におけるＴＧＦ−β受容体阻害剤は、ＴＧＦ−βシグナル経路を阻害するとともに細胞機能の特異分化を引き起こすことができ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤の例は、Ｒｅｐｓｏｘ（Ｅ−６１６４５２）、ＳＢ４３１５４２、Ａ８３０１、ＧＷ７８８３８８、ＳＤ２０８、ＳＢ５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、Ｄ４４７６、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ６６０４、ＳＵ５４１６、ＣＡＴ−１５２、ＣＡＴ−１９２、ＳＢ４３１５４２、ＳＤ−２０８、ＳＭ１６、ＮＰＣ−３０３４５、Ｋｉ２６８９４、ＳＢ−２０３５８０、ＳＤ−０９３、Ｇｌｅｅｖｅｃを含むが、これらに限定されない。本発明の一実施形態において、前記多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系におけるＴＧＦ−β受容体阻害剤はＲｅｐＳｏｘであることが好ましく、ＲｅｐＳｏｘの濃度は、０．０１〜５μＭ、または０．１〜５μＭ、または１〜５μＭ、または２〜５μＭ、または３〜５μＭ、または４〜５μＭであり、１μＭ、３μＭ、５μＭであることが好ましい。
【００３７】
ＩＶ．骨形成タンパク質（ＢＭＰ）
【００３８】
ＢＭＰは低分子量（約３０，０００Ｄａ）でコラーゲンを含まない糖タンパク質である。成熟したＢＭＰ分子は、システインによるジスルフィド結合により固定された二本鎖（各鎖に４００個のアミノ酸が含有されている）ポリペプチド二量体分子である。ＢＭＰは、１つの大きい前駆体タンパク質として合成され、シグナルペプチド部分、プレドメインおよびカルボキシル末端領域を含み、タンパク質分解酵素によりカルボキシル末端を前駆体タンパク質から切断すると二量体が形成される。本明細書におけるＢＭＰ４は、重要な骨芽細胞因子であり、異所性骨化の早期病変に関与する。ＢＭＰ４は、Ｉ型コラーゲン、アルカリホスファターゼ、オステオカルシンの発現に対して刺激作用を有する。本明細書に記載の多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系において、ＢＭＰ４の濃度は、０．０１〜１０ｎｇ／ｍｌ、または０．１〜１０ｎｇ／ｍｌ、または１〜１０ｎｇ／ｍｌ、または２〜１０ｎｇ／ｍｌ、または３〜１０ｎｇ／ｍｌ、または４〜１０ｎｇ／ｍｌ、または５〜１０ｎｇ／ｍｌ、または６〜１０ｎｇ／ｍｌ、または７〜１０ｎｇ／ｍｌ、または８〜１０ｎｇ／ｍｌ、または９〜１０ｎｇ／ｍｌであり、１ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、または１０ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００３９】
Ｖ．ＲＡ受容体活性化剤
レチノイン酸類化合物（Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄｓ、ＲＡ）は、細胞の成長、分化、死亡などの生命活動の調節制御において重要な作用を果たすものであり、その体内での生理活性代謝産物は、全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、１３−シスレチノイン酸（１３−ｃｉｓ−ＲＡ）および９−シスレチノイン酸（９−ｃｉｓ−ＲＡ）を含み、これらはレチノイン酸受容体（ＲＡ受容体）を介してＤＮＡ応答エレメントに結合して標的遺伝子の転写を調節し得る。例示的なＲＡ受容体活性化剤は、ＴＴＮＰＢ、Ｃｈ５５、Ｒｅｔｉｎｏｌ、ＡＭ５８０、ＡＴＲＡ、１３−ｃｉｓ−ＲＡ、Ｒｅｔｉｎｏｉｃを含むが、これらに限定されない。本明細書に記載の多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系におけるＲＡ受容体活性化剤は、ＡＭ５８０であることが好ましく、その濃度は、０．０１〜０．０５μＭ、または０．０２〜０．０５μＭ、または０．０３〜０．０５μＭ、または０．０４〜０．０５μＭであり、０．０１μＭ、０．０３μＭ、または０．０５μＭであることが好ましい。
【００４０】
ＶＩ．ＧＳＫ３阻害剤
グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）は、哺乳動物の真核細胞中に広く存在しており、最も早く発見されたグリコーゲン合成酵素（ＧＳ）の活性の調節制御以外に、ＧＳＫ−３は、多くのシグナルタンパク質、構造タンパク質および転写因子に作用して、細胞の分化、増殖、生存および死亡を調節することができる。ＧＳＫ３阻害剤は、例えば、Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ経路を活性化することができる。多くのβ−ｃａｔｅｎｉｎ下流遺伝子は、多能性遺伝子ネットワークを共調節する。例えば、ＧＳＫ阻害剤は、ｃＭｙｃの発現を活性化するとともにそのタンパク質の安定性および転写活性を増強させる。ＧＳＫ３阻害剤の例は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＴＤ１１４−２、ＢＩＯ、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、ＴＷＳ１１９、ＣＢＭ１０７８、ＳＢ２１６７６３、３Ｆ８（ＴＯＣＲＩＳ）、ＡＲ−Ａ０１４４１８、ＦＲＡＴｉｄｅ、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３´−ｍｏｎｏｘｉｍｅ、Ｌ８０３、ＣＴ９９０２１、ＣＴ２００２６、ＳＢ４１５２８６を含むが、これらに限定されない。本明細書に記載の多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系で使用されるＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１であることが好ましく、その濃度は、０．０１〜３μＭ、または０．１〜３μＭ、または０．５〜３μＭ、または１〜３μＭ、または１．５〜３μＭ、または２〜３μＭ、または２．５〜３μＭであり、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、または３μＭであることが好ましい。
【００４１】
ＶＩＩ．塩基性線維芽細胞増殖因子
塩基性線維芽細胞増殖因子は、中胚葉および神経外胚葉細胞の分裂を促すことができるポリペプチドであって、強力な血管新生作用を有する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、塩基性線維芽細胞増殖因子は、細胞の増殖、遊走を刺激して、プラスミノーゲンアクチベータおよびコラゲナーゼの活性を誘導できるものであって、高いヘパリン親和性を有する細胞分裂促進因子である。本明細書に記載の多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系で使用される塩基性線維芽細胞増殖因子の濃度は、０．０１〜１０ｎｇ／ｍｌ、または０．１〜１０ｎｇ／ｍｌ、または０．５〜１０ｎｇ／ｍｌ、または１〜１０ｎｇ／ｍｌ、または２〜１０ｎｇ／ｍｌ、または３〜１０ｎｇ／ｍｌ、または４〜１０ｎｇ／ｍｌ、または５〜１０ｎｇ／ｍｌ、または６〜１０ｎｇ／ｍｌ、または７〜１０ｎｇ／ｍｌ、または８〜１０ｎｇ／ｍｌ、または９〜１０ｎｇ／ｍｌであり、１ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、または１０ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００４２】
ＶＩＩＩ．ＤＯＴ１Ｌ阻害剤
ＤＯＴ１Ｌ遺伝子によってコードされたタンパク質は、ヒストンＨ３のリジン−７９をメチル化するヒストンメチルトランスフェラーゼであって、遊離コアヒストンに対して非活性であり且つ核小体に対して明らかなヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を示すものである。本発明におけるＤＯＴ１Ｌ阻害剤は、ＥＰＺ５６７６およびＳＧＣ０９４６であり、本明細書に記載の多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系で使用されるＥＰＺ５６７６の濃度は、０．０１〜５μＭ、または０．１〜５μＭ、または０．５〜５μＭ、または１〜５μＭ、または２〜５μＭ、または３〜５μＭ、または４〜５μＭであり、０．５μＭ、１μＭ、３μＭ、または５μＭであることが好ましく、ＳＧＣ０９４６の濃度は、０．０１〜５μＭ、または０．１〜５μＭ、または０．５〜５μＭ、または１〜５μＭ、または２〜５μＭ、または３〜５μＭ、または４〜５μＭであり、０．５μＭ、１μＭ、３μＭ、または５μＭであることが好ましい。
【００４３】
ＩＸ．ヒストンデアセチラーゼ阻害剤
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、ヒストンデアセチラーゼを妨害する機能を有する化学化合物である。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、一般にＮＡＤ＋依存性酵素とＺｎ２＋依存性酵素の２種類に分類される。Ｚｎ２＋依存プロテアーゼは、ＨＤＡＣｓＩ、ＩＩ、ＩＶサブファミリーを含み、ＮＡＤ＋依存性酵素は、主にＨＤＡＣ  ＩＩＩサブファミリーである。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、細胞内のヒストンのアセチル化の程度を増加させたり、ｐ２１などの遺伝子の発現レベルを向上させたりすることで、腫瘍細胞の増殖を抑制し、細胞の分化および/または死亡を誘導する。本発明の多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系で使用されるヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、ＨＤＡＣサブファミリーに属するバルプロ酸（ＶＰＡ）であり、その濃度は、０．０１ｍＭ〜０．５ｍＭ、または０．０５〜０．５ｍＭ、または０．１〜０．５ｍＭ、または０．２〜０．５ｍＭ、または０．３〜０．５ｍＭ、または０．４〜０．５ｍＭであり、０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、または０．５ｍＭであることが好ましい。
【００４４】
Ｘ．ＤＺＮｅｐ
３−Ｄｅａｚａｎｅｐｌａｎｏｃｉｎ  Ａ（ＤＺＮｅｐ）はアデノシン類似体であって、競合的なＳ−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅの阻害剤であり、その化学構造は次の通りである。
【化２】
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【００４５】
本明細書に記載の多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系において、ＤＺＮｅｐの濃度は、０．００１〜０．０５μＭ、または０．００５〜０．０５μＭ、または０．０１〜０．０５μＭ、または０．０２〜０．０５μＭ、または０．０３〜０．０５μＭ、または０．０４〜０．０５μＭであり、０．０１μＭ、０．０３μＭ、または０．０５μＭであることが好ましい。
【００４６】
ＸＩ．ＥＺＨ２阻害剤
ＥＺＨ２は、細胞内のヒストンメチルトランスフェラーゼであって、細胞内のヒストンＨ３の２７番目のアミノ酸におけるトリメチル（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）のメチル化を促進することができ、かつ、多くの種類の腫瘍の成長および転移に関連しているがん原遺伝子であることが証明されている。ＥＺＨ２は、細胞におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３のメチル化レベルを向上させることで、がん抑制遺伝子の発現を抑制でき、これにより、腫瘍が発生してしまう。ＥＺＨ２阻害剤は、小分子化合物であって、ＧＳＫ５０３、ＧＳＫ３４３、ＥＰＺ００５６８７、ＥＰＺ６４３８から選ばれることができるが、それらに限定されず、その分子の構造は次の通りである。
【化３】
2021514647.tif 000005
【００４７】
本明細書に記載の多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系で使用されるＥＺＨ２阻害剤は、上記構造を有する化合物ＥＰＺ６４３８であることが好ましく、その濃度は、０．０１〜１０μＭ、または０．１〜１０μＭ、または１〜１０μＭ、または２〜１０μＭ、または３〜１０μＭ、または４〜１０μＭ、または５〜１０μＭ、または６〜１０μＭ、または７〜１０μＭ、または８〜１０μＭ、または９〜１０μＭであり、３μＭ、５μＭ、８μＭ、または１０μＭであることが好ましい。
【００４８】
ＸＩＩ．ｃＭｅｔ阻害剤
受容体チロシンキナーゼ（ｃＭｅｔ）は、肝細胞増殖因子ＨＧＦ受容体である。ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔシグナル経路は腫瘍の形成、成長および転移過程において頻繁に活性化され、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤は、小分子化合物であって、Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ（効果的なＶＥＧＦＲ２阻害剤である）、Ｃａｐｍａｔｉｎｉｂ（新規のＡＴＰ競合的ｃ−ＭＥＴ阻害剤である）を含むが、これらに限定されない。本明細書に記載の多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系で使用されるｃＭｅｔ阻害剤は、Ｃａｐｍａｔｉｎｉｂであることが好ましく、その構造式は次の通りである。
【化４】
2021514647.tif 000006
【００４９】
本明細書に記載の多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系において、Ｃａｐｍａｔｉｎｉｂの濃度は、０．０１〜１０μＭ、または０．１〜１０μＭ、または１〜１０μＭ、または２〜１０μＭ、または３〜１０μＭ、または４〜１０μＭ、または５〜１０μＭ、または６〜１０μＭ、または７〜１０μＭ、または８〜１０μＭ、または９〜１０μＭであり、３μＭ、５μＭ、８μＭ、または１０μＭであることが好ましい。
【００５０】
ＸＩＩＩ．ビタミンＣ
ビタミンＣは、構造がグルコースに類似しているポリヒドロキシ化合物であって、その分子の２位および３位における隣接した２つのエノール型水酸基が非常に容易に解離してＨ＋を放出するため、酸の性質を有し、アスコルビン酸とも言われている。ビタミンＣの構造式は次の通りである。
【化５】
2021514647.tif 000007
【００５１】
本明細書に記載の多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系において、ビタミンＣの濃度は、０．０１〜５０μｇ／ｍｌ、または０．１〜５０μｇ／ｍｌ、または１〜５０μｇ／ｍｌ、または５〜５０μｇ／ｍｌ、または１０〜５０μｇ／ｍｌ、または２０〜５０μｇ／ｍｌ、または３０〜５０μｇ／ｍｌ、または４０〜５０μｇ／ｍｌであり、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、または５０μｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００５２】
本発明の一実施形態において、前記多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系は、ｉＣＤ１のような基礎培地と、下記の成分を含有する化学的リプログラミングを促進する組成物とを含む。
１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４；
５０μｇ／ｍｌのビタミンＣ；
５μＭのＥＰＺ５６７６；
１０μＭのＢｒｄｕ；
０．０５μＭのＡＭ５８０；
３μＭのＣＨＩＲ９９０２１；
１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２；
１０μＭのＦｏｒｓｋｌｉｎ；
５μＭのＲｅｐＳｏｘ；
０．１ｍＭのバルプロ酸；
０．０５μＭのＤＺＮｅｐ；
５μＭのＳＧＣ０９４６。
【００５３】
本発明の他の実施形態において、前記多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系は、ｉＣＤ１のような基礎培地と、下記の成分を含有する化学的リプログラミングを促進する組成物とを含む。
１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４；
５０μｇ／ｍｌのビタミンＣ；
５μＭのＥＰＺ５６７６；
１０μＭのＢｒｄｕ；
０．０５μＭのＡＭ５８０；
３μＭのＣＨＩＲ９９０２１；
１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２；
１０μＭのＦｏｒｓｋｌｉｎ；
５μＭのＲｅｐＳｏｘ；
０．１ｍＭのバルプロ酸；
０．０５μＭのＤＺＮｅｐ；
５μＭのＳＧＣ０９４６；
５μＭのＥＰＺ６４３８；
５μＭのＣａｐｍａｔｉｎｉｂ。
【００５４】
該培養系を採用すると、血清を用いる必要がなく且つ細胞を新たな培養容器へ移す必要がなく、体細胞が多能性幹細胞にリプログラミングされることを効果的に誘導できる。細胞を新たな培養容器へ移す必要がないため、細胞培養操作が簡略化され、新たな培養容器へ移す過程で生じる細胞損失を低減し、且つ、本発明の培養系は血清を用いる必要がないため、後続の多能性幹細胞の収集および分子機序解析をさらに簡略化し、後続の人工多能性幹細胞の動物由来成分を含まない培養系の樹立がより便利になる。
【００５５】
体細胞が化学的リプログラミングを行うことを誘導するための方法
他の態様において、本発明は、体細胞が化学的リプログラミングを行うことを誘導するための方法を提供し、前記方法は、上述の培養系において、体細胞を、体細胞が多能性状態にリプログラミングされるのに十分な時間だけ培養し続けることを含む。本発明の方法は、体細胞が多能性状態にリプログラミングされた後、培地を第二培地に交換し、該培地において、胚性幹細胞の原始状態を維持するのに十分な時間だけ培養し続けることをさらに含む。前記第二培地は、下記の成分が補充されたＤＭＥＭ培地であり、ここで、前記成分は、ＰＤ０３２５９０１；非必須アミノ酸；ＧｌｕｔａＭａｘＴＭ；ヒト白血球抗原Ｂ２７；ＣＨＩＲ９９０２１；白血病抑制因子および／またはＮ２添加剤を含む。
【００５６】
一実施形態において、前記第二培地には、濃度が１μＭであるＰＤ０３２５９０１；濃度が培地の総体積の１％である非必須アミノ酸；濃度が培地の総体積の１％であるＧｌｕｔａＭａｘＴＭ；濃度が培地の総体積の２％であるヒト白血球抗原Ｂ２７；濃度が３μＭであるＣＨＩＲ９９０２１；濃度が培地の総体積の１％であるＮ２添加剤；濃度が１Ｕ〜１０００Ｕである白血病抑制因子が含まれている。
【００５７】
本発明の一実施形態において、体細胞が化学的リプログラミングを行うことを誘導するための方法は、体細胞を上述の培養系で８日間〜２２日間、好ましくは２２日間培養し続け、その後、培地を上述の第二培地に交換し、１日間〜１８日間、好ましくは１８日間培養し続けることを含む。
【００５８】
キット
さらに別の態様では、本発明は、体細胞がリプログラミングを行うことを化学的に誘導するためのキットを提供し、該キットは、上述の化学的リプログラミングを促進する組成物および基礎培地、並びに場合によっては、培養系使用説明書、細胞を培養するのに必要な培養プレートを含む。該キットは、供与体から細胞サンプルまたは組織サンプルを収集するのに必要なツール、前記細胞サンプルまたは組織サンプルを保存する培養フラスコなどをさらに含んでもよい。前記キットにおける説明書は、培養系に関する使用およびその関連情報を使用者に提供することができる。該説明書は、いかなる適切な形式であってもよく、印刷物、ビデオテープ、コンピュータ読み取り可能なディスクまたは光ディスクを含むが、これらに限定されない。
【実施例】
【００５９】
本実施例では、マウス胚性線維芽細胞、マウス新生線維芽細胞、マウス肺線維芽細胞、マウス尾部線維芽細胞およびマウス神経幹細胞、並びにマウス肝細胞を例として、本発明の多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系を説明する。本実施例で使用されるマウス胚性線維芽細胞はＯＧ２マウスＥ１３．５胚に由来し；マウス新生線維芽細胞はＯＧ２マウス生後１〜３日目の真皮層に由来し；マウス尾部線維芽細胞は６〜８週齢のＯＧ２マウスの尾部の結合組織に由来し；マウス肺線維芽細胞は６〜８週齢のＯＧ２マウスの肺部組織に由来し、これらの線維芽細胞はいずれも１０％ＦＢＳ、ＧｌｕｔＭａｘ（１００×）およびＮＥＡＡ（１００×）を含有するＤＭＥＭ培地中に保持して培養する。本実施例で使用されるマウス神経幹細胞はＯＧ２マウスＥ１３．５胚の大脳組織に由来し、１％Ｎ２、２％Ｂ２７、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＧｌｕｔＭａｘ（１００×）およびＮＥＡＡ（１００×）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に保持して培養する。対照として使用されるマウス幹細胞は６〜８週齢のＯＧ２マウスの肝組織に由来し、ＨＣＭ培地中に保持して培養する。
【００６０】
実施例１．多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための培養系における多能性幹細胞の生成
上記のマウス胚性線維芽細胞、マウス新生線維芽細胞、マウス肺線維芽細胞、マウス尾部線維芽細胞およびマウス神経幹細胞を２０，０００細胞／ウェル（１２ウェル）の密度または５０，０００細胞／ウェル（６ウェル）の密度で、マウス肝細胞を５００，０００細胞／ウェル（６ウェルプレート）で、下記のような多能性幹細胞の生成を化学的に誘導するための化学的リプログラミング培地に播種した。該培地は、基礎培地としてのｉＣＤ１培地、並びに１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、１０μＭのＢｒｄｕ、５μＭのＲｅｐＳｏｘ、１０μＭのＦｏｒｓｋｌｉｎ、０．１ｍＭのＶＰＡ、０．０５μＭのＡＭ５８０、５μＭのＥＰＺ５６７６、０．０５μＭのＤＺＮｅｐ、５μＭのＳＧＣ０９４６、５０μｇ／ｍｌのビタミンＣ、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１および１０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子を含む。培地を毎日交換し、２２日間培養した後、上記の化学的リプログラミング培地を下記のＮ２（１００×）、Ｂ２７（５０×）、ＧｌｕｔＭａｘ（１００×）、ＮＥＡＡ（１００×）、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、１μＭのＰＤ０３２５９０１およびＬＩＦ（１０００Ｕ）を含有するＤＭＥＭ培地に交換し、引き続き１４日間〜１８日間培養し続けた（図１に示す通りである）。その後、化学的に誘導された多能性幹細胞（ｃｉＰＳＣ）を収集して解析を行った。
【００６１】
実施例２．化学的に誘導された多能性幹細胞の特徴付け
定量ＲＴ−ＰＣＲ技術により、ｃｉＰＳＣにおける内在性多能性遺伝子Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｅｓｒｂ、ＲｅＸ１Ｄａｐｐａ５、Ｓａｌｌ４およびＣｄｈ１の発現レベルを監視した。図２に示すように、これらの内在性多能性遺伝子の発現レベルは、マウス胚性幹細胞で検出された内在性多能性遺伝子Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｅｓｒｂ、ＲｅＸ１Ｄａｐｐａ５、Ｓａｌｌ４およびＣｄｈ１の発現レベルと同じであった。
【００６２】
ＲＮＡ−ｓｅｑ解析により、ｃｉＰＳＣのトランスクリプトーム特性を検出した。図３に示すように、ｃｉＰＳＣのトランスクリプトーム特性はマウス胚性幹細胞と同じであった。
【００６３】
さらには、図４に示すように、免疫蛍光法により、化学的に誘導された多能性幹細胞における多能性遺伝子Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＥｓｒｂおよびＲｅＸ１のタンパク質の発現レベルを確認した。
【００６４】
実施例３．化学的に誘導された多能性幹細胞のマウスｉｎ  ｖｉｖｏ分化特性
実施例１で得られたｃｉＰＳＣをＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス体内に皮下注射した。図５に示すように、ｃｉＰＳＣがマウス体内で奇形腫を形成し、分化して３つの胚葉の細胞（軟骨：中胚葉；筋肉：中胚葉；神経：外胚葉；消化管様上皮：内胚葉）を形成した。図６に示すように、ｃｉＰＳＣは継代過程において正常核型を維持した。ｃｉＰＳＣをマウス胞胚中に注入し、図７に示すように、子孫マウスはキメラマウスであった。
【００６５】
上記実施例２および実施例３の特徴付けの結果から、本発明の方法によれば、本発明の培養系において、培養して得られた化学的に誘導された多能性幹細胞が完全な多能性を有することが分かる。これから分かるように、本発明の培養系は、血清を採用する必要がなく且つ細胞を新たな培養容器へ移す必要がない条件で、２段階培養により、体細胞を効果的にリプログラミングして多能性幹細胞を生成することができる。また、本発明の方法では、細胞を新たな培養容器へ移す必要がなく、培養操作が簡略化され、培養系に血清を採用する必要がなく、後続の多能性細胞の収集および分子機序解析が簡略化され、後続の人工多能性幹細胞の動物由来成分を含まない培養系の樹立がより便利になる。
【００６６】
検出方法
定量ＲＴ−ＰＣＲ解析およびＲＮＡ−ｓｅｑ解析：ＴＲＩｚｏｌを採用して細胞から総ＲＮＡを分離し、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（Ｔｏｙｏｂｏ）およびオリゴ−ｄＴ（Ｔａｋａｒａ）を採用して総ＲＮＡをｃＤＮＡに転換し、その後ＰｒｅｍｉＸ  ＥＸ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を採用して、ｑＰＣＲにより解析を行った。ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡサンプルキット（ＲＳ−１２２−２０１１，Ｉｌｌｕｍｉｎａ）はライブラリの構築に用いられる。ＲＮＡ−ｓｅｑについて、Ｍｉｓｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（ＭＳ−１０２−２０１１，Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を採用してシーケンシングを完了した。シーケンシング過程で使用されるプライマーを以下の表１に示した。
【００６７】
免疫蛍光染色：シャーレ内で細胞を培養し、４％パラホルムアルデヒドを採用して室温で３０分間固定した。その後、ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で３０分間透過し続けた。その後、３％ＢＳＡのＰＢＳ溶液を採用して室温で１時間密閉し、４℃で、一次抗体で一晩インキュベートした。翌日、ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、適切な二次抗体で１時間インキュベートした。ＤＡＰＩを採用して細胞核を染色した。共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ７１０  ＮＬＯ）で観察した。一次抗体および二次抗体はいずれも３％のＢＳＡ中で希釈したものであって、抗−Ｏｃｔ４（ＳＣ−５２７９、１：４００）、抗−Ｓｏｘ２（ｓｃ−１７３２０、１：２００）、抗−Ｎａｎｏｇ（ＢＥＴＨＹＬ  ｎｏ．Ａ３００−３９７Ａ、１：２００）、抗−ＲｅＸ１（ＳＣ−５０６６８、１：１００）および抗−ＳＳＥＡ１（ＲＡ、ＭＡＢ２１５５、１：１００）である。
【００６８】
奇形腫の形成およびキメラマウスの生成：１×１０６個の化学的に誘導された多能性幹細胞をＮＯＤ  ＳＣＩＤマウス体内に皮下注射し、４〜８週間で奇形腫を形成した。キメラマウスの生成については、化学的に誘導された多能性幹細胞をＩＣＲ胞胚中に注射し、偽妊娠ＩＣＲ雌マウス体内に移植し、その後得られたキメラマウスは、Ｆ２マウスとＩＣＲマウスとを交配させることで生殖細胞系の伝達に用いた。
【表１】
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【００６９】
本明細書では本発明の好適な実施形態を記述および表示したが、これらの実施形態が単なる例示的な説明であることは当業者にとって明らかである。当業者は、これらの実施形態に対し、本発明を逸脱することなく、様々な変更、修正および置換を行うことが可能である。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって限定され、且つこれらの特許請求の範囲内の方法と構造およびその等価物も添付の特許請求の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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