(57)【要約】  本発明は、胎盤組織由来ＣＤ１０６ｈｉｇｈＣＤ１５１＋ネスチン＋間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の細胞外小胞（ＥＶ）を含んでなる組成物を開示する。第１の側面において、本発明は、これらのＥＶを調製する特定の方法に関する。第２の側面において、本発明は、前記特定の方法により得られた細胞外小胞（ＥＶ）を含んでなる治療、診断、獣医学または化粧組成物に関する。第３の側面において、本発明は、虚血性疾患、循環系の障害、免疫疾患、臓器傷害または臓器機能不全に罹患している対象を治療するための薬剤として使用するための、これらのＥＶを含んでなる組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（ｉ）成長因子を欠いた第１の培養培地中の生体組織または生体液から得られた間葉系幹細胞を培養して、培養未分化間葉系幹細胞の集団を作製する工程、
（ｉｉ）前記培養未分化間葉系幹細胞の集団を、少なくとも２種類の炎症促進性成長因子を含有する第２の培養培地と接触させることにより、ＣＤ１０６ｈｉｇｈＣＤ１５１＋ネスチン＋間葉系幹細胞を作製する工程、
（ｉｉｉ）前記ＭＳＣを、それらの増殖を許す条件下で、ＥＶ不含培養培地中で培養する工程；
および
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた細胞からＥＶを精製する工程
によって得られた細胞外小胞（ＥＶ）を含んでなる、組成物。
【請求項２】
工程（ｉｉ）で使用される前記第２の培養培地が、ＴＮＦα、ＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１２、ＩＬ１８およびＩＦＮγの中から選択される、好ましくは、ＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１２およびＩＬ１８から選択される少なくとも２種類の炎症促進性成長因子を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＥＶ不含培養培地が、ＩＬ１とＩＬ４の混合物、好ましくは、ＩＬ１βとＩＬ４の混合物で補充されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＥＶが、胎盤、臍帯もしくは胎盤膜（絨毛膜、羊膜）またはそれらの成分から選択される生体組織に由来する、または臍帯血、胎盤血もしくは羊水などの生体液に由来する未分化ＭＳＣから得られたものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＥＶが、好ましくは臍帯断片の外植片からの細胞単離によって、臍帯に由来する未分化ＭＳＣから得られたものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＥＶが、好ましくは胎盤組織断片からの細胞単離によって、胎盤に由来する未分化ＭＳＣから得られたものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
虚血性疾患、循環系の障害、免疫疾患、臓器の傷害もしくは障害または臓器機能不全に罹患している対象を治療するために使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に定義される組成物。
【請求項８】
前記疾患または障害が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、ＧＶＨＤ、再生不良性貧血、多発性硬化症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、関節リウマチ、脳卒中、特発性肺線維症、拡張型心筋症、変形性関節症、硬変、肝不全、腎不全、末梢動脈閉塞性疾患、重症虚血肢、末梢血管疾患、心不全、糖尿病性潰瘍、線維性障害、癒着および子宮内膜障害からなる群において選択される、請求項７に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
前記疾患または障害が、皮膚または粘膜の疾患または障害、好ましくは、糖尿病性潰瘍、潰瘍、外傷、熱傷(burn)、熱傷(scald)、創傷もしくは創傷治癒の問題、褥瘡性潰瘍、疣贅、癒着、子宮内膜障害または痔瘻などの消化管の線維性障害である、請求項７に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に定義されるＥＶを含有する、医薬、獣医学、診断または化粧組成物。
【請求項１１】
ヒドロゲルまたは他の生体適合性材料をさらに含有する、請求項１０に記載の医薬または獣医学組成物。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に定義されるＥＶを含有する、局所製剤。
【請求項１３】
虚血性疾患、循環系の障害、免疫疾患、線維性障害、臓器傷害または臓器機能不全に罹患している対象を治療するために使用するための、請求項１０もしくは１１に記載の医薬組成物または請求項１２に記載の局所製剤。
【請求項１４】
Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、ＧＶＨＤ、再生不良性貧血、多発性硬化症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、関節リウマチ、脳卒中、特発性肺線維症、拡張型心筋症、変形性関節症、硬変、肝不全、腎不全、末梢動脈閉塞性疾患、重症虚血肢、末梢血管疾患、心不全、糖尿病性潰瘍、線維性障害、癒着および子宮内膜障害からなる群において選択される疾患または障害に罹患している対象を治療するために使用するための、請求項１０もしくは１１に記載の医薬組成物または請求項１２に記載の局所製剤。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか一項に定義されるＥＶを含有する、皮膚用または化粧組成物。
【請求項１６】
皮膚もしくは粘膜の細胞を再生するための、皮膚もしくは粘膜の側面を改善するための、または暗色斑、斑点、座瘡、しわ、乾燥などの皮膚もしくは粘膜の欠損を是正するための、請求項１５に定義される皮膚用または化粧組成物の使用。
【請求項１７】
熱傷(burn)、瘢痕、血管腫、黒子または疣贅などの皮膚の傷害または障害を治癒するための、請求項１５に定義される皮膚用または化粧組成物の使用。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか一項に定義されるＥＶを含有する、医療機器。
【請求項１９】
前記医療機器が、包帯、パッチ、ステント、内視鏡またはシリンジである、請求項１８に記載の医療機器。
【請求項２０】
請求項１〜６のいずれか一項に定義されるＥＶを含有する、送達システム。
【請求項２１】
前記送達システムが、生体高分子、脂質またはナノ粒子のマイクロベシクルまたはナノベシクルである、請求項２０に記載の送達システム。
【請求項２２】
細胞外小胞（ＥＶ）を調製する方法であって、以下の工程：
（ｉ）成長因子を欠いた第１の培養培地中の生体組織または生体液から得られた間葉系幹細胞を培養して、培養未分化間葉系幹細胞の集団を作製する工程、
（ｉｉ）前記培養未分化間葉系幹細胞の集団を、少なくとも２種類の炎症促進性成長因子を含有する第２の培養培地と接触させることにより、ＣＤ１０６ｈｉｇｈＣＤ１５１＋ネスチン＋間葉系幹細胞を作製する工程、
（ｉｉｉ）前記ＭＳＣを、それらの増殖を許す条件下で、ＥＶ不含培養培地中で培養する工程；
および
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた細胞からＥＶを精製する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２３】
前記炎症促進性成長因子が、ＴＮＦα、ＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１２、ＩＬ１８およびＩＦＮγの中から選択される、好ましくは、ＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１２およびＩＬ１８から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記炎症促進性成長因子が、ＩＬ１とＩＬ４の混合物、好ましくは、ＩＬ１βとＩＬ４の混合物である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記未分化ＭＳＣが、胎盤、臍帯もしくは胎盤膜（絨毛膜、羊膜）またはそれらの成分から選択される生体組織に由来する、または臍帯血、胎盤血もしくは羊水などの生体液に由来する、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記未分化ＭＳＣが、外植片組織からの細胞単離によって得られたものである、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記未分化ＭＳＣが、好ましくは臍帯断片の外植片からの細胞単離によって、臍帯に由来する、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記未分化ＭＳＣが、好ましくは胎盤組織断片からの細胞単離によって、胎盤に由来する、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２の培養培地が、１〜１００ｎｇ／ｍｌのインターロイキン１、好ましくは、インターロイキン１βを含有する、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２の培養培地が、１〜１００ｎｇ／ｍｌのインターロイキン４を含有する、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＥＶ不含培養培地が、ＩＬ１とＩＬ４の混合物、好ましくは、ＩＬ１βとＩＬ４の混合物で補充されている、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ＥＶが限外濾過によって精製される、請求項２２〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
要約
本発明は、胎盤組織由来ＣＤ１０６ｈｉｇｈＣＤ１５１＋ネスチン＋間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の細胞外小胞（ＥＶ）を含んでなる組成物を開示する。
【０００２】
第１の側面において、本発明は、これらのＥＶを調製する特定の方法に関する。
【０００３】
第２の側面において、本発明は、前記特定の方法により得られた細胞外小胞（ＥＶ）を含んでなる治療、診断、獣医学または化粧組成物に関する。
【０００４】
第３の側面において、本発明は、虚血性疾患、循環系の障害、免疫疾患、臓器傷害または臓器機能不全に罹患している対象を治療するための薬剤として使用するための、これらのＥＶを含んでなる組成物に関する。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
損傷組織の修復および再生のための間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の治療可能性が、前臨床ステージおよび臨床ステージの両方において広く研究されている。ＭＳＣは、免疫調節活性および再生促進活性を媒介する。例えば、ＭＳＣは、上皮形成、血管新生および肉芽組織形成を促進することによって、糖尿病マウスにおける創傷治癒を改善することが示されている。他の研究では、骨髄由来ＭＳＣが、血管新生および瘢痕縮小を促進することによって、慢性創傷を含む創傷の治療に有効であることが示されている。慢性非治癒性創傷を有する患者に、骨髄または臍帯に由来するＭＳＣを直接適用すると、創傷閉鎖および皮膚再構成がもたらされる。
【０００６】
特に、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８２３１６は、例えば、血管疾患および創傷などのいくつかの治療応用に向けてのＣＤ１０６ｈｉｇｈＣＤ１５１＋ネスチン＋ＭＳＣを調製する方法を示している。これらのＭＳＣは、他の活性の中でも、血管新生促進活性の亢進を示す。
【０００７】
ＭＳＣの治癒特性の根底にある機序が研究されている。興味深いことに、創傷治癒アッセイを用いて得られたＳｈａｂｂｉｒらの以前の結果は、ＭＳＣ自体が損傷組織（線維芽細胞）を置き換えるように分化すると結論付けられるものではなかった。代わりに、ＭＳＣは、治癒過程の不可欠な部分である線維芽細胞の遊走を、直接的な接触をすることさえなく、促進することが示されている(Shabbir & al 2015)。これは、ＭＳＣと損傷細胞との間のパラクリンシグナル伝達の重要性を強調するものである。
【０００８】
このパラクリン効果は、ＭＳＣによる種々の因子および細胞外小胞（ＥＶ）の分泌の結果であると考えられる。これらの小胞は、元のＭＳＣと類似する脂質二重膜を含んでなり、種々のタンパク質、このＭＳＣに由来するＲＮＡメッセンジャーおよびｍｉＲＮＡ（カーゴ）、修復および再生の内因性機序を亢進する因子を運搬する。
【０００９】
エキソソームおよびマイクロベシクルなどの細胞外小胞（ＥＶ）は、免疫生物学的過程におけるシグナル伝達メディエーターとして作用する、細胞のこれらのパラクリン効果の主要なメディエーターとして、実際に以前に同定されている(Raposo & al 1996)。それ以降、ＥＶは、種々の免疫細胞型間の相互作用および腫瘍細胞と免疫細胞の間の相互作用も媒介することが見出されている。ＥＶは、細胞源に応じて、炎症促進性応答を促進または抑制し得る。
【００１０】
細胞、特にＭＳＣは、多数の異なる小胞型をそれらの細胞外環境に放出し得る。総称してＥＶといわれるが、これには、エキソソーム（３０〜１５０ｎｍ）、形質膜から出芽して生じるマイクロベシクル（１００〜１，０００ｎｍ）およびアポトーシス小体（＞５００ｎｍ）が含まれる。ＥＶは、脂質、タンパク質およびＲＮＡを含有する。ＥＶは、生理学的および病態生理学的情報交換過程において標的とする細胞間シグナル伝達を媒介する。
【００１１】
ＭＳＣから単離されたＥＶは、細胞を患者に投与する際のリスクおよび困難さを伴わずに、幹細胞の治療効果を得るための新しい戦略として勢いを増してきている。ＭＳＣ−ＥＶは、以下のような他の細胞製品を上回るいくつかの重要な利点を実際にもたらし、これにより、ＥＶを臨床に移す試みが正当化される。
−  ＭＳＣ−ＥＶは、安全に投与することができる。
【００１２】
ＭＳＣ−ＥＶは、ますます多くの異なる動物モデルに適用されてきており、ステロイド抵抗性急性移植片対宿主病（急性ＧｖＨＤ）に罹患している患者および慢性腎臓病を有する患者コホートにおいて試験されている(Giebel & al 2017)。今までのところ、ＭＳＣ−ＥＶの投与は、ヒトおよび総ての試験した動物モデルにおいて安全であると思われる。
【００１３】
細胞製品とは対照的に、ＥＶは自己複製することができず、このため、いかなる内因性腫瘍形成能も欠いている。
【００１４】
細胞の生物学的特徴および機能は、環境因子によって影響され、再プログラム化され得ることが知られている。ＥＶは精巧な代謝活性を欠くため、それらの機能は、環境によって再プログラム化され得る可能性が低いと思われる。このため、ＥＶの生物活性および機能特性は、細胞よりもより正確に定義および制御することができる。
【００１５】
平均サイズが２００ｎｍ未満であるＥＶは、濾過により滅菌することができる。これにより、それぞれの治療の生物学的汚染のリスクが大幅に低減される。
−  ＥＶは、細胞よりも取扱いがかなり容易である。
【００１６】
凍結、解凍および保存の条件は、ＥＶでは細胞よりも重要ではないと思われる。細胞移植のベッドサイド調製に関しては、個人が特別に訓練されていなければならないが、これは、ＥＶベースの治療のベッドサイド調製では不要である可能性もある。
【００１７】
治療用ＥＶは、細胞株の上清から製造され得るが、その細胞株の細胞は、細胞療法自体に使用するべきではない。よって、ＥＶは、細胞治療よりもかなり容易なスケールの様式で製造することができる。
【００１８】
無細胞療法へのＭＳＣ由来ＥＶの使用が活発化しており(Phinney & Pittenger - Stem Cells. 2017)、以下のようないくつかの研究が、血管新生におけるＭＳＣにより分泌されたＥＶの役割を実証している。
−  exosomes secreted by MSCs promote endothelial cell angiogenesis by transferring miR-125a (Liang an al. J. Cell Sci. 2016)、
−  exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis (Zhang, J.& al. 20152015)、
−  MSC exosomes induce proliferation and migration of normal and chronic wound fibroblasts, and enhance angiogenesis in vitro (Shabbir & al.2015)、
−  Human umbilical cord MSC exosomes enhance angiogenesis through the WNT4/catenin pathway (Zhang, B. & al.. 2015)。
【００１９】
２０１７年のＴｈａｎ  ＵＴＴらのレビューでは、ＥＶが創傷治癒に必要な多数の細胞過程の制御に関与していることを実際に示している他の試験を報告している。特に、ＥＶは、凝固、細胞増殖、遊走、血管新生、コラーゲン産生および細胞外マトリックスのリモデリングに影響を及ぼし得る。元の分泌細胞からの情報の伝達に加えて、ＥＶのｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡは、増殖、血管新生およびアポトーシスを含む生物学的過程も促進し得る。
【００２０】
創傷治癒にとって必須の過程である細胞増殖のＥＶによる調節は、ＭＳＣ、線維芽細胞、マウス胚性幹細胞およびヒト内皮前駆前駆細胞などの多数の細胞型に由来するＥＶで示されている。特に、線維芽細胞によるＭＳＣ−ＥＶの内部移行は、正常ドナーであれ、慢性創傷を有する患者であれ、これらの線維芽細胞の増殖および遊走の用量依存的増大をもたらす。
【００２１】
ＥＶは、細胞周期の刺激に直接関与するシグナル伝達経路だけでなく、成長因子の発現の調節に関与するシグナル伝達経路も活性化することによって、細胞増殖を促進し得る。さらに、成長因子のこの過剰発現は、パラクリンまたはオートクリンシグナルとして作用し、次々に細胞増殖を刺激し得る。
【００２２】
血管の修復および再生にとって非常に重要な内皮細胞の遊走は、ケラチノサイトまたはヒトＣＳＭなどの細胞から放出されたＥＶによって影響を受けることも示されている。
【００２３】
あらゆる種類のＥＶ（マイクロベシクルおよびエキソソーム）が、血管新生促進因子の発現を増大させることによって、血管形成の調節に様々な程度で寄与している。例えば、ヒト胚性ＭＳＣおよびヒト内皮細胞によって放出されたエキソソームは、創傷部位への内皮細胞の増殖および遊走を促進することによって、血管新生を亢進する。エキソソームで治療された部位には、対照治療と比較して、多数の血管が認められた。
【００２４】
これらのアッセイの総てが、ＭＳＣ−ＥＶは、創傷の治療および再生血管医学において安全に使用できることを示唆している。
【００２５】
Ｄｏｎｇｄｏｎｇ  Ｔｉら(Journal of translational medicine, 2015)は、炎症促進性因子ＬＰＳでプレコンディショニングされた臍帯ＭＳＣから精製された細胞外小胞を説明した。
【００２６】
Ｙｕｎｂｉｎｇ  Ｗｕら(BioMed Research International, 2017)は、ヒト臍帯から得られた非刺激間葉系幹細胞に由来する細胞外小胞の抗炎症特性を説明した。
【００２７】
これらの２つの刊行物のいずれも、ＣＤ１０６血管新生マーカーに富むＥＶを得るために、ＭＳＣを刺激するためにＩＬ１βおよび／またはＩＬ４を添加することを提案していない。
【００２８】
より一般的に、ＭＳＣの血管新生促進特性を改善することはおろか、ＭＳＣをＩＬ４で処理することをかつて提案した先行技術文献はない。この文脈において、本発明者らは、ＷＯ２０１８／１０８８５９において、ＭＳＣをＩＬ４およびＩＬ１βで培養すると、ＣＤ１０６などの血管新生促進表面マーカーの表面レベルが有意に意外にも増加することを示している。特に、ＷＯ２０１８／１０８８５９の実施例４に示されるように、ＩＬ１βとＩＬ４の組合せで認められたＣＤ１０６発現の増加は、ＩＬ１β単独で認められた増加より３倍高い。また、ＩＬ１βとＩＬ４の組合せで認められたＣＤ１０６発現の増加は、ＩＬ４単独で認められた増加より５倍高い。これは、以前には認められたことがなかった。
【００２９】
本明細書に記載の本発明は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８２３１６（ＷＯ２０１８／１０８８５９）に記載の方法に従って製造されたＣＤ１０６ｈｉｇｈＣＤ１５１＋ネスチン＋ＭＳＣの血管新生促進活性および抗炎症活性は、これらのＭＳＣに由来するＥＶによって実質的に伝達されることを実証している。したがって、本発明者らは、−ＥＶを産生するＭＳＣとして−ＥＶは亢進したレベルの血管新生促進／炎症促進性表面タンパク質を発現するため、これらのＥＶを含有する生物学的製品の使用を提案する。したがって、この生物学的製品は、臨床現場および産業現場における使用に拘束されることなく、起源のＭＳＣと同じ亢進した血管新生促進活性を示す。
【００３０】
その治療可能性に加えて、ＥＶは、特に癌の診断におけるバイオマーカーとして使用することができる。癌をエキソソームと関連付けて現在進行中の３５件の臨床試験のうち、およそ３分の２が診断に関するものであり、残りが治療に関するものである(Roya & al 2018)。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
したがって、第１の側面において、本発明は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８２３１６（ＷＯ２０１８／１０８８５９として刊行）に記載の方法に従って製造されたＣＤ１０６ｈｉｇｈＣＤ１５１＋ネスチン＋ＭＳＣの細胞外小胞（ＥＶ）を含んでなる組成物に関する。
【００３２】
この製造方法は、以下の２つの一般工程：
（ｉ）成長因子を欠いた第１の培養培地中の生体組織または生体液から得られた間葉系幹細胞を培養して、培養未分化間葉系幹細胞の集団を作製する工程、
および
（ｉｉ）前記培養未分化間葉系幹細胞の集団を、炎症促進性成長因子または炎症性メディエーターを含有する第２の培養培地と接触させることにより、本発明のＥＶを製造するために使用される目的のＣＤ１０６ｈｉｇｈＣＤ１５１＋ネスチン＋間葉系幹細胞を作製する工程
を含んでなる。
【００３３】
前記「未分化ＭＳＣの集団」は、生体組織または生体液中に存在する単核細胞を回収して、前記単核細胞を第１の培養培地中で成長させることによって、得ることができる。これらの単核細胞は、任意の従来の手段、例えば、周産期組織小片の酵素消化もしくは外植片培養(Otte et al, 2013)、または生体液からの単離(Van Pham et al, 2016)によって得ることができる。
【００３４】
外植片培養は、以下の実施例３において公開するような、臍帯からこのようなＭＳＣを導出するための特に好ましい方法である。
【００３５】
一般に、この方法は、輸送液からサンプルを取り出し、それを切片（およそ２〜３ｃｍ長）に切り出し、前記切片を抗生物質および抗真菌剤で殺菌した後、すすぎ、組織を回収して、前記組織の小片を付着させるためにフラスコに入れ（好ましくは、培地不使用、室温）、次いで、付着した外植片に完全培地を慎重に加え、３７℃で数日間インキュベートすることを必要とする。遊走した細胞を、適当なツールで最終的に回収し、前記細胞が目標集密度を達成するまで、適当な第１の培地（下記参照）の培養液中で維持した。
【００３６】
前記「第１の培養培地」は、生存初代細胞の成長を支持するために一般的に使用される任意の古典的な培地であり得る。好ましくは、前記第１の培養培地は、いずれの成長因子も分化因子も含有しない。
【００３７】
当業者には、どの種類の培養培地を「第１の培養培地」として使用できるかを周知である。そのような培養培地は、例えば、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＭＥＭ、アルファ−ＭＥＭ（α−ＭＥＭ）、ＩＭＤＭまたはＲＰＭＩである。好ましくは、前記第１の培養培地は、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）またはＤＭＥＭ／Ｆ１２（ダルベッコ改変イーグル培地：栄養混合物Ｆ−１２）である。
【００３８】
より好ましくは、前記第１の培養培地は、２〜２０％または２〜１０％のウシ胎仔血清を含有する。あるいは、前記第１の培養培地は、１〜５％血小板ライセートを含有してもよい。最も好ましい培地は、２〜２０％または２〜１０％のウシ胎仔血清および１〜５％血小板ライセートを含有する。
【００３９】
第１の培養培地としては、生存初代細胞の成長を支持する他の適当な剤を含有する場合は、血清または血小板ライセートを欠いた培地を使用することも可能である。
【００４０】
好ましい実施形態において、前記「生体組織」は、胎盤組織または臍帯の任意の部分である。特に、前記生体組織は、胎盤葉、羊膜または胎盤の絨毛膜を含み得る、またはそれからなり得る。また、前記生体組織は、臍帯に認められるホウォートンゼリーであり得る。前記生体組織は、静脈および／もしくは動脈を含み得るか、またはそれを欠き得る。
【００４１】
別の実施形態において、前記「生体液」は、臍帯血、胎盤血または羊水のサンプルであり、一般に女性または哺乳動物から害を及ぼすことなく採取されたものである。例えば、これらの組織および液は、いずれの侵襲的な処置も用いることなく、乳児または仔の出産後に得ることができる。
【００４２】
前記未分化ＭＳＣの集団は、優先的に、プラスチック表面に播種された間葉系幹細胞の集団であり、細胞が８５〜９０％の集密度に達するまで、いずれの成長因子も欠いた前記第１の培養培地で培養されたものである。
【００４３】
通常、細胞は、表面マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ４５、ＣＤ３４およびＨＬＡ−ＤＲのレベルを検出するために、ＦＡＣＳまたは任意の従来の手段によって表現型的に特徴付けられる。
【００４４】
細胞の９５％が、陽性表面マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１６６を発現し、２％未満が、陰性表面マーカーＣＤ４５、ＣＤ３４およびＨＬＡ−ＤＲを発現する場合、細胞をトリプシン処理し、より低密度、例えば、密度１０００〜５０００ＭＳＣ／ｃｍ２で、第２の培養培地に再度播種する。
【００４５】
好ましくは、前記「第２の培養培地」は、生存初代細胞の成長を支持するために一般的に使用される任意の古典的な培地である。前記第２の培養培地は、「第１の培養培地」と同じ培地であり得るか、または、例えば、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＭＥＭ、アルファ−ＭＥＭ（α−ＭＥＭ）、ＩＭＤＭもしくはＲＰＭＩの中から選択される別の培地であり得る。より好ましくは、前記第２の培養培地は、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）またはＤＭＥＭ／Ｆ１２（ダルベッコ改変イーグル培地：栄養混合物Ｆ−１２）である。
【００４６】
さらにより好ましくは、前記第２の培養培地は、血清または血小板ライセート、例えば、２〜２０％のウシ胎仔血清および／または１〜５％血小板ライセートを含有する。最も好ましい第２の培地は、２〜２０％のウシ胎仔血清および１〜５％血小板ライセートを含有するＤＭＥＭである。第２の培養培地としては、生存初代細胞の成長を支持する他の適当な剤を含有する場合は、血清または血小板ライセートを欠いた培地を使用することも可能である。
【００４７】
細胞が４０〜５０％の集密度に達した場合、炎症促進性成長因子または炎症性メディエーターを第２の培養培地に加え、細胞が９０〜９５％の集密度に達するまで、前記培地で細胞を培養する。
【００４８】
前記「炎症促進性成長因子」は、一般に、炎症促進性効果を有することで知られるインターロイキンまたはケモカインである。第２の培養培地に加えることができるインターロイキンの例としては、ＴＮＦα、ＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１２、ＩＬ１８およびＩＦＮγが挙げられる。第２の培養培地に加えることができるケモカインの例としては、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＣＬ２およびＣＣＬ５が挙げられる。他の炎症性メディエーター（抗炎症剤など）を使用することができる。
【００４９】
好ましい実施形態において、少なくとも２種類の炎症促進性成長因子が、上記で定義される第２の培養培地に加えられる。これらの少なくとも２種類の炎症促進性成長因子は、ＴＮＦα、ＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１２、ＩＬ１８およびＩＦＮγからなる群において選択される。さらに好ましい実施形態において、前記炎症促進性成長因子は、ＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１２、ＩＬ１８の中から選択される。さらにより好ましくは、前記炎症促進性成長因子は、ＩＬ１およびＩＬ４である。
【００５０】
ＭＳＣに加えることができる１種類または複数種類の成長因子の典型的な濃度は、１〜２００ｎｇ／ｍＬの間、好ましくは、１〜１００ｎｇ／ｍＬの間、より好ましくは、１０〜８０ｎｇ／ｍＬの間に含まれる。好ましくは、１種類または複数種類の成長因子を用いたＭＳＣの培養工程は、少なくとも１日、より好ましくは、２日継続する。
【００５１】
本明細書における用語「ＩＬ１」は、インターロイキン１の任意のアイソフォーム、特に、ＩＬ１αおよびＩＬ１βを指す。ＩＬ１アイソフォームは、意図する用途に応じて、種々の起源のものであってよい。例えば、動物ＩＬ１は、獣医学的用途のために使用することができる。好ましくは、ＩＬ１βのみが、本発明の第２の培養培地に加えられる。この特定の実施形態において、加えられるインターロイキン１βの濃度は、１〜１００ｎｇ／ｍＬの間、好ましくは、１〜５０ｎｇ／ｍＬの間、より好ましくは、１０〜４０ｎｇ／ｍＬの間に含まれ得る。
【００５２】
ヒトＩＬ１ベータ（ＩＬ１βまたはＩＬ１ｂ）は、アクセッション番号ＮＰ＿０００５６７．１として参照される。組換えタンパク質が、ＧＭＰ条件下で市販されている（ＲｎＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）。
【００５３】
本明細書における用語「ＩＬ４」は、インターロイキン４の任意のアイソフォームを指す。ＩＬ４は、意図する用途に応じて、種々の起源のものであってよい。例えば、動物ＩＬ４は、獣医学的用途のために使用することができる。
【００５４】
ヒトＩＬ４は、アクセッション番号ＡＡＡ５９１４９として参照される。組換えタンパク質が、ＧＭＰ条件下で市販されている（ＲｎＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）。
【００５５】
異なる炎症促進性成長因子の任意の混合物を、前記第２の培地に使用することができる。特に、以下の実験部分で開示するように、ＩＬ１とＩＬ４の混合物、より正確には、ＩＬ１βとＩＬ４の混合物を使用することが好ましい実施形態である。
【００５６】
この特定の実施形態において、第２の培養培地中で、加えられるインターロイキン１βは、１〜１００ｎｇ／ｍＬの間、好ましくは、１〜５０ｎｇ／ｍＬの間、より好ましくは、１０〜４０ｎｇ／ｍＬの間に含まれる濃度を有し、加えられるＩＬ４は、１〜１００ｎｇ／ｍＬの間、好ましくは、１〜５０ｎｇ／ｍＬの間、より好ましくは、１０〜４０ｎｇ／ｍＬの間に含まれる濃度を有する。好ましくは、インターロイキン１βおよびＩＬ４を用いた培養工程は、少なくとも１日、より好ましくは、２日継続する。一般に、加えられるインターロイキン１βの濃度は１０ｎｇ／ｍＬであり、加えられるインターロイキンＩＬ４の濃度は１０ｎｇ／ｍＬである。したがって、細胞は、好ましくは、インターロイキン１βおよびＩＬ４の両方を１０ｎｇ／ｍＬ含有する培養培地で培養し、この培養工程を、例えば２日継続する。
【００５７】
細胞は、それらの製造中に、表面マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ４５、ＣＤ３４およびＨＬＡ−ＤＲのレベルを検出するために、任意の従来の手段によって表現型的に特徴付けられ得る。これらのマーカーは、当技術分野で周知である。これらのマーカーの発現レベルを検出するのに有用な抗体は、総て市販されている。
【００５８】
これらの細胞表面マーカーの発現は、ビオチン化を用いた細胞膜染色または他の同等の技法に次いで、特異抗体を用いた免疫沈降、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡもしくはＥＬＩＳＰＯＴ、抗体マイクロアレイ、または免疫組織化学と組み合わせた組織マイクロアレイなどの周知の技術を用いて、特に評価することができる。他の好適な技法としては、ＦＲＥＴまたはＢＲＥＴ、単一または複数の励起波長を用いた、および適合する光学的方法のいずれかを適用した単一細胞顕微鏡的または組織化学的方法、例えば、電気化学的方法（ボルタンメトリー法およびアンペロメトリー法）、原子間力顕微鏡法、ならびに高周波法、例えば、多極共鳴分光法、共焦点および非共焦点の、蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、および複屈折または屈折率の検出（例えば、表面プラズモン共鳴、偏光解析法、共振ミラー法、格子カプラー導波管法または干渉法）、磁気共鳴画像法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析；ＨＰＬＣ分画、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析；液体クロマトグラフィー／質量分析／質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が挙げられる。好ましくは、細胞表面マーカーのレベルは、ＦＡＣＳによって評価する。
【００５９】
具体的には、目的のＭＳＣを製造するには、一般に以下の工程：
ａ）周産期の生体組織または生体液に含まれる単核細胞を回収する工程、
ｂ）前記単核細胞を、好ましくはプラスチック表面で、前記単核細胞が８５〜９０％の集密度に達するまで、第１の培養培地中で成長させる工程、
ｃ）細胞の９５％が、陽性マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１６６を発現し、２％未満が、陰性マーカーＣＤ４５、ＣＤ３４およびＨＬＡ−ＤＲを発現したときに、密度１０００〜５０００ＭＳＣ／ｃｍ２で、細胞を第２の培養培地に播種する工程、
ｄ）細胞が４０〜５０％の集密度に達したときに、１〜１００ｎｇ／ｍＬの炎症性メディエーターまたは炎症促進性成長因子を加える工程、
ｅ）細胞が９０〜９５％の集密度に達したときに、細胞を回収する工程
を必要とする。
【００６０】
次に、回収した細胞を、表面マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ４５、ＣＤ３４およびＨＬＡ−ＤＲのレベルを検出するために、ＦＡＣＳまたは任意の従来の手段によって表現型的に特徴付けてもよい。前記第１および第２の培養培地は、上記で説明している。
【００６１】
前記方法の工程ｄ）において、加えられる１種類または複数種類の成長因子の典型的な濃度は、１〜２００ｎｇ／ｍＬの間、好ましくは、１〜１００ｎｇ／ｍＬの間、より好ましくは、１０〜８０ｎｇ／ｍＬの間に含まれる。好ましくは、１種類または複数種類の成長因子を用いた培養工程は、少なくとも１日、より好ましくは、２日継続する。
【００６２】
前記方法の工程ｄ）において、加えられるインターロイキン１βまたはＩＬ４の濃度は、１〜１００ｎｇ／ｍＬの間、好ましくは、１〜５０ｎｇ／ｍＬの間、より好ましくは、１０〜４０ｎｇ／ｍＬの間に含まれ得る。好ましくは、インターロイキン１βおよびＩＬ４を用いた培養工程は、少なくとも１日、より好ましくは、２日継続する。一般に、加えられるインターロイキン１βの濃度は１０ｎｇ／ｍＬであり、加えられるインターロイキンＩＬ４の濃度は１０ｎｇ／ｍＬである。したがって、細胞は、好ましくは、インターロイキン１βおよびＩＬ４の両方を１０ｎｇ／ｍＬ含有する培養培地で培養し、この培養工程を、例えば２日継続する。
【００６３】
最後に回収した細胞は、「本発明のＭＳＣ」、「目的の細胞培養物」、または「目的のＣＤ１０６ｈｉｇｈＣＤ１５１＋ネスチン＋ＭＳＣ」または「ＥＶ産生細胞」という。この細胞培養物は、一般に、ＣＤ１０６を発現する細胞を６０％超、好ましくは、６０〜７０％、好ましくは、７０％超、好ましくは、８０％超、より好ましくは、９０％超、さらにより好ましくは、９５％超含んでなる。さらに、前記細胞培養物は、ＣＤ１５１を発現する細胞を９８％超、好ましくは、９９％超含んでなる。さらに、前記細胞培養物は、ネスチンを発現する細胞を９８％超、好ましくは、９９％超含んでなり、最終的に、前記細胞培養物は、陽性マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１６６を発現する細胞を９５％超、好ましくは、９６％超、好ましくは、９７％超、好ましくは、９８％超含んでなり、陰性マーカーＣＤ４５、ＣＤ３４およびＨＬＡ−ＤＲを発現する細胞を２％未満含んでなる。
【００６４】
ＣＤ１０６（「血管細胞接着タンパク質１」を意味するＶＣＡＭ−１としても知られる）は、３種類のアイソフォームを有することで知られる。ＮＰ＿００１０６９．１、ＮＰ＿５４２４１３．１およびＮＰ＿００１１８６７６３．１が、それぞれアイソフォームａ、ｂおよびｃの配列である。この特定のバイオマーカーの発現レベルを検出するための抗体は、市販されている（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ａｂｃａｍ、ＯｒｉＧｅｎなど）。ＭＳＣの表面でのこのマーカーの発現は、ＭＳＣの治療的使用に必須である血管新生促進活性を惹起するため、非常に重要である。
【００６５】
ネスチンバイオマーカーは、ヒトにおける番号ＮＰ＿００６６０８．１の下で参照される。この特定のバイオマーカーの発現レベルを検出するための抗体は、市販されている（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ａｂｃａｍなど）。
【００６６】
ＣＤ１５１バイオマーカーは、ヒトにおける番号ＮＰ＿６２０５９９の下で参照される。この特定のバイオマーカーの発現レベルを検出するための抗体は、市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｂｃａｍなど）。
【００６７】
より具体的には、目的のＭＳＣを製造するには、一般に以下の工程：
ａ）場合により、複数のドナーから胎盤組織を別々に採取する工程；
ｂ）場合により、１倍ＰＢＳを用いて胎盤組織を３回洗浄し、１ｍｍ３立方体に解剖し、立方体組織を再度洗浄して、組織から血液の大部分を除去する工程。
ｃ）場合により、各ドナーの胎盤組織を別々にコラゲナーゼで消化し、消化組織を遠心分離し、単核細胞を回収する工程、
ｄ）回収した単核細胞を培養培地に播種する工程；
ｅ）細胞が８５〜９０％の集密度に達したときに、細胞をトリプシン処理し、継代する工程；
ｆ）陽性マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１６６、ならびに陰性マーカーＣＤ４５、ＣＤ３４およびＨＬＡ−ＤＲを発現する細胞のパーセンテージに基づいて、細胞を特徴付ける工程；
ｇ）細胞が、陽性マーカーを少なくとも９５％および陰性マーカーを最大２％含んでなる場合、９０％ダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２−ノックアウト（ＤＭＥＭ／Ｆ１２−ＫＯ）および１０％ＦＢＳおよび成長因子を含有する培養培地に、播種密度１０００〜５０００ＭＳＣ／ｃｍ２で細胞を播種する工程、
ｈ）細胞が４０〜５０％の集密度である場合、１〜１００ｎｇ／ｍＬのインターロイキン１βおよび場合により１〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ４を加える工程；
ｉ）細胞が９０〜９５％の集密度に達したときに、細胞をトリプシン処理し、回収する工程；および
ｊ）場合により、陽性マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１６６、ならびに陰性マーカーＣＤ４５、ＣＤ３４およびＨＬＡ−ＤＲを発現する細胞のパーセンテージに基づいて、細胞を特徴付ける工程
を必要とする。
【００６８】
これらの方法によって得られた細胞は、次に、本発明のＥＶを製造するために使用される。
【００６９】
細胞外小胞（ＥＶ）は、サイズがおよそ３０ｎｍ〜数μｍの範囲の細胞小胞を指す一般的な用語である。とりわけ、エキソソームは、最も顕著に説明されるクラスのＥＶを含んでなる。エキソソームは、約１５０ｎｍ未満の直径を有し、エンドソーム区画の派生物である。ＥＶは、親細胞に由来するサイトゾルタンパク質および膜タンパク質を含有する。ＥＶのタンパク質含量は、ＥＶの細胞起源に依存し、ＥＶは、特定の分子、特に、エンドソーム関連タンパク質（例えば、ＣＤ６３）および多小胞体形成に関与するタンパク質に富むが、標的／接着分子も含有する。注目すべきことに、ＥＶは、タンパク質だけでなく、機能性ｍＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡおよびｍｉＲＮＡも含有し、いくつかの場合において、ＥＶは、これらの遺伝物質をレシピエント細胞に送達することが示されている。
【００７０】
「細胞外小胞」または「ＥＶ」とは、細胞の形質膜から細胞の微小環境中に細胞によって放出される膜小胞、または細胞膜溶解後に回収される細胞内小胞を意味する。本発明の文脈において、ＥＶは一般に、約５００ｎｍ以下、特に、約３０〜約５００ｎｍ、または約４０〜約５００ｎｍ、または約５０〜約２５０ｎｍの直径を有する。ＥＶはリン脂質膜に囲まれており、リン脂質膜は、好ましくは、比較的高レベルのコレステロール、スフィンゴミエリンおよびセラミドを含有し、好ましくは、界面活性剤不溶性膜ドメイン（脂質ラフト）も含有する。
【００７１】
ＥＶの膜タンパク質は、細胞膜と同じ組成を有する。ＥＶは一般に、アクチンβ、膜輸送および膜融合に関与するタンパク質（例えば、Ｒａｂ、ＧＴＰアーゼ、アネキシンおよびフロチリン）、エンドソーム輸送選別複合体（ＥＳＣＲＴ）複合体の成分（例えば、Ａｌｉｘ）、腫瘍感受性遺伝子１０１（ＴＳＧ１０１）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ、例えば、ＨＳＰＡ８、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＨＳＣ７０およびＨＳＣ９０）、インテグリン（例えば、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２ＥまたはＣＤ６２Ｐ）、およびテトラスパニン（特に、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ５３、ＣＤ９および／またはＣＤ３７）の存在を特徴とする。以下の実施例において、ＥＶは、マーカーＣＤ９とＣＤ８１の組合せ、およびカルネキシンの非存在によって同定される。
【００７２】
ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８２３１６に記載の方法に従って製造されたＣＤ１０６ｈｉｇｈＣＤ１５１＋ネスチン＋ＭＳＣのセクレトームの使用を検討することも、本発明の範囲内である。本明細書における用語「セクレトーム」は、ＥＶ、タンパク質（成長因子、ケモカイン、サイトカイン、接着分子、プロテアーゼなど）、脂質、マイクロＲＮＡ、ｍＲＮＡを含む細胞により分泌される総ての因子を指す。ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８２３１６に記載の方法に従って製造されたＣＤ１０６ｈｉｇｈＣＤ１５１＋ネスチン＋ＭＳＣのセクレトームは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８２３１６に記載のＣＤ１０６ｈｉｇｈＣＤ１５１＋ネスチン＋ＭＳＣと同じ血管新生促進生物学的効果を共有すると考えられる。
【００７３】
ＥＶは、Ｋｏｎｏｓｈｅｎｃｋｏら２０１８またはＬａｉら２０１０に記載の方法など、種々の方法によって、目的のＭＳＣ細胞から精製してもよい。
【００７４】
分画遠心：
この方法は、少なくとも以下の３つの工程１）〜３）：
１）細胞および細胞デブリを除去するための低速遠心分離（＜１０，０００×ｇ）、
２）大きな小胞を除去するための高速スピン、および最後に：
３）ＥＶをペレットにするための高速遠心分離（＞１００，０００×ｇ）
を含むいくつかの工程からなる。
【００７５】
得られたＥＶ調製物をさらに精製し、単離された小胞を、懸濁液の精密濾過によって、小胞のサイズに従って選別する。
【００７６】
密度勾配遠心分離：
この手法は、超遠心分離をスクロース密度勾配と組み合わせたものである。より具体的には、密度勾配遠心分離は、タンパク質およびタンパク質／ＲＮＡ凝集体などの非小胞粒子からＥＶを分離するために使用される。このため、この方法は、異なる密度の粒子から小胞を分離する。遠心分離時間が十分であることが非常に重要であり、さもなければ、粒子が類似した密度を有する場合、汚染粒子がＥＶ画分に依然として認められる可能性がある。最近の研究では、遠心分離を実施する前に、ＥＶペレットを超遠心分離からスクロース勾配に適用することを示唆している。
【００７７】
サイズ排除クロマトグラフィー：
サイズ排除クロマトグラフィーは、分子量ではなくサイズおよび形状に基づいて、高分子を分離するために使用される。この技法は、複数の細孔およびトンネルを含有する多孔質ポリマービーズを充填したカラムを適用する。分子は、その直径に応じて、ビーズを通過する。小さな半径の分子は、カラムの細孔を移動するのに長く時間がかかるが、高分子は、カラムからより早く溶出する。サイズ排除クロマトグラフィーは、大分子と小分子の正確な分離を可能とする。さらに、この方法には、異なる溶離液を適用することができる。
【００７８】
限外濾過：
限外濾過膜も、ＥＶの単離に使用することができる。マイクロベシクルのサイズに応じて、この方法は、タンパク質および他の高分子量高分子からのＥＶの分離を可能とする。ＥＶは、多孔質構造を介して捕捉することによっても単離することができる。最も一般的な濾過膜は、０．８μｍ、０．４５μｍまたは０．２２μｍの孔径を有し、８００ｎｍ、４００ｎｍまたは２００ｎｍより大きいＥＶを回収するのに使用することができる。特に、マイクロピラー多孔質シリコン線毛構造は、４０〜１００ｎｍのＥＶを単離するように設計されたものである。最初の工程において、大きな小胞が除去される。続く工程において、ＥＶ集団が、濾過膜で濃縮される。単離工程は比較的短いが、この方法は、ＰＢＳ緩衝液によるシリコン構造のプレインキュベーションを必要とする。続く工程において、ＥＶ集団が、濾過膜で濃縮される。
【００７９】
ポリマー沈殿法：
ポリマー沈殿法は、通常、生体液とポリマー含有沈殿液との混合、４℃でのインキュベーションおよび超遠心分離を含む。ポリマー沈殿法に使用される最も一般的なポリマーの１つは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、好ましくは、ＰＥＧ６０００またはＰＥＧ８０００である。このポリマーを用いた沈殿は、単離されたＥＶに対する穏やかな効果および中性ｐＨの使用を含む、多数の利点を有する。ＥＶの単離のためにＰＥＧを適用するいくつかの市販のキットが作製された。最も一般的に使用されるキットは、ＥｘｏＱｕｉｃｋ（商標）（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マウンテンビュー、カリフォルニア州、米国）である。最近の研究では、ＥｘｏＱｕｉｃｋ（商標）法による超遠心分離を使用して、ＥＶの最高収率が得られたことが実証された。
【００８０】
免疫学的分離：
表面ＥＶ外在性もしくは内在性膜結合タンパク質またはＥＶ細胞内タンパク質に基づいて、ＥＶの免疫学的分離のいくつかの技法が開発されている。しかしながら、これらの方法は一般に、ＥＶタンパク質の検出、分析および定量に主に適用される。
【００８１】
以下の実施例においては、限外濾過が使用されている。
【００８２】
上記の製造方法から得られたＭＳＣ細胞を精製することによって得られるＥＶを、以下「本発明のＥＶ」という。本発明のＥＶは、従来技術のＥＶと比較して、亢進した血管新生促進活性（ＥＶを産生するＭＳＣ細胞として）を示す。
【００８３】
以下の実施例８に示されるように、これらのＥＶは、特に、以下のもの：
（ｉ）検出可能なレベルのＣＤ１０６、および
（ｉｉ）検出可能なレベルのＣＤ２００
を発現することを特徴とする。
【００８４】
重要なことに、本発明のＥＶは、従来技術のＥＶよりも高いレベルで、血管新生促進マーカーＣＤ１０６／ＶＣＡＭおよびＣＤ２００を発現する（図３参照）。本発明のＥＶはまた、ＦＧＦ７、ＣＣＬ２およびアンジオポエチン１などの多数の他の血管新生マーカーを発現する（図４参照）。
【００８５】
これらのマーカーは当技術分野で周知であり、これらのマーカーを検出する抗体は、市販されている。それらの存在は、ウエスタンブロットなどの任意の従来の手段によって評価することができる。
【００８６】
本発明によれば、前記マーカーが、有意なレベルで存在する場合、すなわち、前記ＥＶに対して測定される前記マーカー（一般に、前記マーカーを認識する抗体を用いて得られ、前記抗体は、例えば、蛍光色素に結合する）の染色に関連するシグナルが、前記マーカーを発現しないことで知られるＥＶの染色に対応するシグナルよりも優れている場合、ＥＶは、「検出可能なレベルでマーカーを発現する」。当業者は、前記細胞／マーカーを同定する方法を十分承知しているため、これらのプロトコールをここで詳述する必要はない。
【００８７】
本発明の組成物は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８２３１６に開示されるＭＳＣ細胞によって産生される本発明の細胞外小胞（ＥＶ）を、本質的に含んでなる。
【００８８】
本発明の文脈において、組成物中に存在するＥＶの数は、好ましくは、ナノサイト（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ）装置（Ｍａｌｖｅｒｎによって市販されている）を使用して決定され、この場合において、ＥＶの数は「ｐｐ」といい、ナノサイト装置によって検出された粒子の数に対応する。
【００８９】
一般に、本発明の組成物は、１×１０８〜１×１０１４ｐｐＥＶ／ｍＬ、より好ましくは、１×１０１１〜１×１０１２ｐｐＥＶ／ｍＬを含有する。
【００９０】
第２の側面において、本発明はまた、上記の方法によって得られたＭＳＣのＥＶを含んでなる組成物を調製する方法であって、以下の工程：
ａ）前記ＭＳＣを、それらの増殖を許す条件下で、ＥＶ不含培養培地中で培養する工程；および
ｂ）これらの細胞からＥＶを精製する工程
を含んでなる方法に関する。
【００９１】
本明細書において使用され得る「ＥＶ不含培養培地」は、例えば、非補充の古典的な基本培地（例えば、アルファ−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２…）または１〜１０％、好ましくは５％、より好ましくは８％の小胞不含血小板ライセートで補充された古典的な基本培地である。ＥＶ不含培養培地は、本発明のＭＳＣと接触する前、いずれの外因性ＥＶも含有しない（本発明のＭＳＣと接触すると、この培地は、本発明のＭＳＣによって産生されるＥＶを含有し始める）。したがって、ＥＶ不含培養培地は、外因性小胞を含有し得るいずれの血清も血小板ライセートも含有しない。
【００９２】
前記ＥＶ不含培養培地は、好ましくは、加えられる１種類または複数種類の成長因子で補充され、成長因子の濃度は、１〜２００ｎｇ／ｍＬの間、好ましくは、１〜１００ｎｇ／ｍＬの間、より好ましくは、１０〜８０ｎｇ／ｍＬの間に含まれる。より好ましくは、前記培養培地は、濃度が１〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、１〜５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは、１０〜４０ｎｇ／ｍＬの間に含まれるインターロイキン１βおよび／またはＩＬ４で補充される。一般に、前記培地中の加えられるインターロイキン１βの濃度は１０ｎｇ／ｍＬであり、前記培地中の加えられるインターロイキンＩＬ４の濃度は１０ｎｇ／ｍＬである。したがって、細胞は、好ましくは、インターロイキン１βおよびＩＬ４の両方を１０ｎｇ／ｍＬ含有するＥＶ不含培養培地で培養し、この培養工程を、例えば２日継続する。
【００９３】
ＭＳＣ細胞の増殖を許す条件は、上記で説明している。細胞死およびアポトーシス小体は、ＥＶ調製物の汚染に至る可能性があるため、重要な点は、細胞を良好な条件下におくべきということである。このため、指数関数的増殖におけるＭＳＣ細胞の増幅および維持を許す条件を使用するべきであり、増殖の対数期の最後の前、すなわち、細胞死が著しくなるときであるプラトーの前に、ＥＶを精製するべきである。動物由来成分（例えば、血清）を含有する培地に関しては、培地のＥＶ枯渇を実施するべきである。これは、培養培地を１０００００ｇで８〜１６時間（例えば、一晩）、約４℃にて回転させることによって、実施することができる。
【００９４】
前記条件下でのＭＳＣの培養は一般に、１〜７日、好ましくは、１〜５日、より好ましくは、２〜３日、さらにより好ましくは、７２時間継続する。
【００９５】
治療目的では、全方法を、好ましくは、無菌条件下で実施するべきである。
【００９６】
ＥＶの精製は、上記の方法のいずれかによって（好ましくは、以下の実験部分で開示するような限外濾過によって）実施することができる。
【００９７】
以下に開示する結果は、本発明の方法は、高レベルのＣＤ１０６／ＶＣＡＭ１膜タンパク質を発現するＥＶの作製を可能にすることも示している。重要なことに、このタンパク質は、血管新生促進サイトカインおよび炎症促進性タンパク質の発現に関連している(Han Z.C., et al, Bio-medical Materials and Engineering 2017 & Du W. et al, Stem Cell research & therapy 2016)。したがって、高レベルのＣＤ１０６タンパク質を発現する本発明のＥＶは、ＥＶの血管新生促進／炎症促進性効果のために使用することができる。
【００９８】
ＫａｔｏｈとＫａｔｏｈ(Stem Cell Investig. 2019; 6: 10)は、ＣＤ２００は、血管リモデリングと免疫調節の接点で、種々の生理学的および病理学的方法に関与していると述べている。ＣＤ２００は、Ｂリンパ球およびＴリンパ球、内皮細胞、ニューロンおよび膵島細胞などの種々の細胞に発現する膜貫通タンパク質であり、その発現は、ＩＬ４によってアップレギュレートされる。ＣＤ２００は、膜貫通タンパク質であるＣＤ２００Ｒを介して、シグナルを伝達する。ＣＤ２００−ＣＤ２００Ｒシグナル伝達は、免疫および血管新生の調節を介して、癌および非癌性疾患において重要な役割を果たす。例えば、ＣＤ２００−Ｂ１６メラノーマ細胞と比較して、ＣＤ２００＋Ｂ１６メラノーマ細胞は、Ｃｄ２００ｒノックアウトマウスにおいて、骨髄系細胞の増殖に起因する腫瘍形成の亢進、および腫瘍血管新生の増大を示す。
【００９９】
したがって、第３の側面において、本発明は、虚血性疾患、循環系の障害、免疫疾患、臓器傷害または臓器機能不全に罹患している対象を治療するために使用するための、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８２３１６に記載の方法に従って製造されたＣＤ１０６ｈｉｇｈＣＤ１５１＋ネスチン＋ＭＳＣに由来する細胞外小胞を含んでなる組成物に関する。言い換えれば、本発明は、虚血性疾患または循環系の障害に罹患している対象を治療するために使用されることを意図する薬剤の製造のための、前記ＥＶの使用に関する。本発明の薬剤は、皮膚血管の毛細血管網に適用することもでき、皮膚用途および化粧用途を含み得る。
【０１００】
好ましくは、本発明の組成物は、いずれの細胞も含有しない；特に、本発明の組成物は、いずれのＭＳＣ細胞も含有しない。本発明の組成物は、一般に、唯一の有効成分として、本発明のＥＶのみを含有する。本発明の組成物はまた、以下に説明するように、医薬担体またはアジュバントを含有し得る。
【０１０１】
本発明のＥＶを含んでなる組成物は、治療上有効な量で投与される。
【０１０２】
本明細書で使用する場合、「治療上有効な量」は、意図する使用にとって十分な量を指す。本発明の血管新生促進組成物に関しては、治療上有効な量は、内皮遊走および／または増殖を誘導するのに十分な量を指す。
【０１０３】
投与される用量は、対象の年齢、体表面積もしくは体重、または投与経路および関連するバイオアベイラビリティに応じて変わり得る。そのような用量調節は、当業者に周知である。
【０１０４】
いずれの哺乳動物も、本発明の組成物／ＥＶで治療することができる。前記哺乳動物は、ペット（イヌ、ネコ、ウマなど）または家畜動物（ヒツジ、ヤギ、雌ウシなど）であり得る。本発明の方法に従って動物を治療する場合、初期未分化ＭＳＣを、同じ動物種（同種移植片）または類似の種（異種移植片）に由来する生体サンプルから得、第２の培養培地に使用される成長因子は、同じ動物種のものに対応することは、当業者に明らかである。例えば、ネコを治療する場合は、初期ＭＳＣを、ネコの周産期組織または生体液から得、ネコＩＬ１β（組換えまたは非組換え）を、場合によりネコＩＬ４とともに、第２の培養培地に加える。
【０１０５】
好ましい実施形態において、前記哺乳動物はヒトである。この場合、初期ＭＳＣを、女性から得た周産期組織または生体液から得、ヒトＩＬ１β（組換えまたは非組換え）を、場合によりヒトＩＬ４とともに、第２の培養培地に加える。
【０１０６】
この目的において、本発明の組成物は、任意の従来の手段によって、前記対象に投与または局所適用することができる。この場合において、本発明は、虚血性疾患、循環系の障害、免疫疾患、臓器傷害または臓器機能不全に罹患している対象を治療するための方法であって、上記組成物を前記対象に投与する工程を含んでなる方法を対象とする。この投与は、埋込リザーバーを使用することによって、または筋肉にＥＶをイン・サイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で注射することによって、または静脈内注射を介して、または任意の適当な送達システムによって、実施することができる。適用は、ＥＶを皮膚もしくは粘膜と直接接触させることによって、またはＥＶをデバイスで皮膚もしくは任意の粘膜に適用することによって、または任意の適当な送達システムでＥＶを皮膚もしくは粘膜に送達することによって、実施することもできる。
【０１０７】
好ましくは、前記疾患または障害は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、ＧＶＨＤ、再生不良性貧血、多発性硬化症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、関節リウマチ、脳卒中、特発性肺線維症、拡張型心筋症、変形性関節症、硬変、肝不全、腎不全、末梢動脈閉塞性疾患、重症虚血肢、末梢血管疾患、心不全、糖尿病性潰瘍もしくはいずれかの変性疾患、癒着、子宮内膜障害または痔瘻などの消化管の線維性障害からなる群において選択される。より好ましくは、前記疾患または障害は、末梢動脈閉塞性疾患、重症虚血肢、末梢血管疾患または糖尿病性潰瘍である。特定の実施形態において、前記疾患または障害は、皮膚または粘膜の疾患であり、これには、（限定されるものではないが）、糖尿病性潰瘍、潰瘍、外傷、熱傷(burn)、熱傷(scald)、創傷または創傷治癒の問題、褥瘡性潰瘍、疣贅などが含まれる。
【０１０８】
本発明のＥＶは、より正確には、皮膚病態、例えば、熱傷(burn)、創傷、潰瘍、瘢痕、疣贅、または癒着もしくは消化管の線維性障害（例えば、痔瘻）などの他の疾患を治療することを目的とする、皮膚用調製物において使用することもできる。
【０１０９】
別の特定の実施形態において、前記疾患または障害は、痔瘻または子宮内膜傷害である。
【０１１０】
他の適用が、本出願に包含される。特に、診断目的、皮膚用目的または化粧目的で、例えば、皮膚もしくは粘膜の細胞を再生するため、皮膚もしくは粘膜の側面を改善するため、皮膚もしくは粘膜の欠損を是正するため、または皮膚もしくは粘膜の熱傷領域を治癒するために、本発明のＥＶおよび組成物を使用することが可能である。
【０１１１】
本発明の薬剤の効果を亢進し、その投与を促進するために、本発明のＥＶは、任意の剤、剤の組成物または他の生物学的に適合する材料もしくはデバイスと組み合わせてもよい。本発明のＥＶは、カプセル化してもよく、任意の適当な送達システムまたは生体適合性材料に含めてもよい。ＥＶまたはＥＶを含有する組成物は、例えば、内視鏡、ステントまたはシリンジなどの医療機器で適用することができる。ＥＶまたはＥＶを含有する組成物はまた、ＥＶを皮膚または粘膜と接触させることによって、局所に適用することもできる。
【０１１２】
静脈内投与、腫瘍内投与または鼻腔内投与のために、水性懸濁液、等張生理食塩水、または薬理学的に適合する分散剤および／もしくは湿潤剤を含有する無菌注射用液を使用してもよい。賦形剤として、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油などを使用してもよい。
【０１１３】
局所投与のために、組成物は、ゲル、パスタ、軟膏、クリーム、ローション、水性もしくは水性アルコール液体懸濁液、油性溶液、ローション型もしくは血清型の分散液、無水もしくは親油性ゲル、水相に脂肪相（もしくはその逆）を分散させることによって得られる液体もしくは半固体乳型の稠度を有するエマルション、軟性もしくは半固体クリームもしくはゲル型の稠度の懸濁液もしくはエマルション、あるいは、マイクロエマルション、マイクロカプセル、微粒子、またはイオン型および／もしくは非イオン型の小胞分散液の形態で存在してもよい。これらの組成物は、標準的な方法に従って調製される。さらに、ＥＶのより深い浸透を可能にするために、界面活性剤を組成物に含めることができる。浸透の増加を可能にする剤は、例えば、鉱油、エタノール、トリアセチン、グリセリンおよびプロピレングリコールから選択され得；凝集剤は、例えば、ポリイソブチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコールおよび増粘剤を含んでなる群から選択される。
【０１１４】
経口投与のための好適な単位用量投与製剤としては、特に、錠剤、コーティング錠剤、丸剤、カプセル剤および軟ゼラチンカプセル剤、経口散剤、顆粒剤、液剤および懸濁剤が挙げられる。
【０１１５】
錠剤形態の固体組成物を調製する場合、主要有効成分を、ゼラチン、デンプン、ラクトース、ステアリン酸もしくはステアリン酸マグネシウム、タルク、アラビアガムまたは類似体などの医薬ビヒクルと混合してもよい。錠剤は、サッカロースもしくは他の好適な材料でコーティングしてもよく、またはさらには、持続したまたは遅延した活性を有するように、また、所定の量の有効成分を連続的に放出するように処理してもよい。
【０１１６】
カプセル調製物は、有効成分を希釈剤と混合し、得られた混合物を、植物油、ワックス、脂肪、半固体または液体ポリオールなどの賦形剤とともに軟カプセルまたは硬カプセルに注ぐことによって、得ることができる。
【０１１７】
シロップまたはエリキシル剤形態の調製物は、甘味剤、防腐剤、ならびに味付与剤および好適な色素とともに、有効成分を含有する。賦形剤を使用してもよく、例えば、水、ポリオール、サッカロース、転化糖、グルコースなどが挙げられる。
【０１１８】
散剤または水分散性顆粒剤は、矯味剤および甘味剤とともに、分散剤、湿潤剤および懸濁化剤との混合物中の有効成分を含有し得る。
【０１１９】
皮下投与のために、任意の好適な薬学上許容可能なビヒクルを使用してもよい。特に、ゴマ油などの薬学上許容可能な油性ビヒクルを使用することができる。
【０１２０】
本発明はまた、本発明のＥＶを含有する医療機器を対象とする。「医療機器」とは、本明細書において、治療組成物を投与するための、任意の機器、装置、道具、機械、器具、インプラント、試薬を包含する。本発明の文脈において、前記医療機器は、例えば、パッチ、ステント、内視鏡またはシリンジである。
【０１２１】
本発明はまた、本発明のＥＶを含有する送達システムを対象とする。「送達システム」とは、本明細書において、医薬製品を患者に投与するための任意のシステム（培地または担体）を包含する。送達システムは、経口送達または放出制御システムであり得る。本発明の文脈において、前記送達システムは、例えば、生体高分子、脂質またはナノ粒子のリポソーム、プロリポソーム、マイクロスフェア、マイクロベシクルまたはナノベシクルである。
【０１２２】
本発明の好ましい実施形態において、本発明のＥＶは、ヒドロゲルまたは別の生体適合性材料または賦形剤に含まれる。前記ヒドロゲルは、特に、アルギン酸ナトリウムヒドロゲル、ヒアルロン酸ヒドロゲル、キトサンヒドロゲル、コラーゲンヒドロゲル、ＨＰＭＣヒドロゲル、ポリ−Ｌ−リシンヒドロゲル、ポリ−Ｌ−グルタミン酸ヒドロゲル、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）ヒドロゲル、ポリアクリル酸ヒドロゲル、ポリメチルアクリル酸ヒドロゲル、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）ヒドロゲルおよびポリＮアクリルアミド（ＰＮＡＭ）ヒドロゲルを含み得る。
【０１２３】
本発明はまた、本発明のＥＶおよび場合により別の生体適合性材料または賦形剤を含有するヒドロゲルに関する。アルギン酸塩ヒドロゲルが本明細書において好ましく、例えば、ＣＮ１０６５３８５１５に記載のアルギン酸塩ヒドロゲルが挙げられる。
【０１２４】
本発明の文脈において、「生体適合性材料」は、生物医学的用途に古典的に使用されるものである。生体適合性材料は、例えば、金属（例えば、ステンレス鋼、コバルト合金、チタン合金）、セラミック（酸化アルミニウム、ジルコニア、リン酸カルシウム）、ポリマー（シリコン、ポリ（エチレン）、ポリ（塩化ビニル）、ポリウレタン、ポリラクチド）または天然ポリマー（アルギン酸塩、コラーゲン、ゼラチン、エラスチンなど）である。これらの材料は、合成であっても天然であってもよい。生体適合性賦形剤は、当技術分野で周知であり、したがって、詳述する必要はない。
【０１２５】
このヒドロゲルは、化粧または治療目的で使用することができる。
【０１２６】
本発明はまた、本発明のＥＶを含有する医薬または獣医学組成物、ならびに上記の疾患および障害を治療するためのその使用に関する。本発明はまた、本発明のＥＶを含有する皮膚用または化粧組成物に関する。
【０１２７】
この医薬、獣医学または化粧組成物は、上記のように、他の生体適合性剤（例えば、ヒドロゲル）をさらに含有してもよい。
【０１２８】
前記組成物は、好ましくは、１×１０８〜１×１０１４ｐｐＥＶ／ｍＬ、より好ましくは、１×１０１１〜１×１０１２ｐｐＥＶ／ｍＬを含有する。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】図１は、実施例において精製された細胞外小胞におけるＣＤ９、ＣＤ８１およびカルネキシンマーカーの存在／非存在を示すウエスタンブロットを開示する。カラムＡ＝ＭＤＡ細胞の細胞ライセート／カラムＢ＝アルファ−ＭＥＭ中の本発明のＭＳＣの細胞ライセート／カラムＣ＝アルファ−ＭＥＭ中の本発明のＥＶ。
【図２】図２は、ＶＥＧＦの存在下または非存在下における、ＥＣＦＣに対する本発明のＥＶの製造に使用した細胞のパラクリン効果を示すボイデンチャンバー走化性遊走アッセイを開示する。カラムＴ＝５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦの非存在下（−）／存在下（＋）における培地対照の遊走レベル。カラム１＝５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦの非存在下（−）／存在下（＋）における細胞バッチ１の遊走レベル。カラム２＝５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦの非存在下（−）／存在下（＋）における細胞バッチ２の遊走レベル。カラム３＝５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦの非存在下（−）／存在下（＋）における細胞バッチ３の遊走レベル。
【図３】図３は、実施例８に記載の通り、３つの異なる条件において条件付けされたＭＳＣに由来するＥＶ：カラムＡ＝非刺激ＭＳＣに由来するＥＶ、カラムＢ＝ＩＬ１βおよびＩＬ４で刺激したＭＳＣに由来するＥＶ（本発明のＥＶ）、ならびにカラムＣ＝ＬＰＳで刺激したＭＳＣに由来するＥＶ、の含量を示すウエスタンブロットを開示する。６種類のマーカーを試験している（ＣＤ９、ＣＤ８１、Ａｌｉｘ、カルネキシン、ＶＣＡＭおよびＣＤ２００）。ウェルあたり２０μｇのＥＶを添加している。
【図４】図４は、３つの異なる条件（非刺激、ＩＬ刺激およびＬＰＳ刺激）において条件付けされたＭＳＣに由来するＥＶに対するタンパク質アレイによって決定された、異なる血管新生関連タンパク質中の含量の差を強調したものである。平均ピクセル強度は、各タンパク質に対して報告している。
【図５】図５は、実施例８に記載の通り、３つの異なる条件において条件付けされたＭＳＣ：カラムＡ＝非刺激ＭＳＣ、カラムＢ＝ＩＬ１βおよびＩＬ４で刺激したＭＳＣ（本発明のＭＳＣ）、ならびにカラムＣ＝ＬＰＳで刺激したＭＳＣ、の含量を示すウエスタンブロットを開示する。６種類のマーカーを試験している（ＣＤ９、ＣＤ８１、Ａｌｉｘ、カルネキシン、ＶＣＡＭおよびＣＤ２００）。ウェルあたり２０μｇのタンパク質ライセートを添加している。
【実施例】
【０１３０】
簡単のためおよび例示的目的のため、本発明を、その例示的実施形態を参照することにより、説明する。しかしながら、本発明は、これらの具体的な詳細に限定されることなく実施できることは、当業者には明らかであろう。他の例において、本発明を不必要に不明瞭にしないように、周知の方法は詳細に説明していない。
【０１３１】
以下の総ての工程１〜４は、引用することにより本明細書の一部とされるＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８２３１６の実施例部分に記載の通りに実施している。
【０１３２】
１．血管新生促進臍帯由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の単離
臍帯を、輸送液から取り出し、２〜３ｃｍの切片長に切り出した。除去できない血餅を含有する各セグメントは、接着血液細胞による汚染を避けるために、廃棄した。次に、切片を、αＭＥＭ＋バンコマイシン１ｇ／Ｌ＋アモキシシリン１ｇ／Ｌ＋アミカシン５００ｍｇ／Ｌ＋アムホテリシンＢ５０ｍｇ／Ｌから構成される抗生物質および抗真菌剤の浴によって、室温（ＲＴ）で３０分間殺菌した。抗生物質は、無菌注射用水に即時溶解した。
【０１３３】
臍帯の切片を浴から取り出し、室温にて１倍ＰＢＳ中で速やかにすすいだ。血管に触れないように、上皮膜をわずかに切り出した。次に、切片を０．５ｃｍ厚のスライスに薄切し、蓋付き１５０ｃｍ２プラスチックフラスコの底に置いた。フラスコあたり６〜１０枚のスライスを置き、各スライスの周りに少なくとも１ｃｍの半径円の空いた領域を作り、室温で培地なしで１５分間接着させた。
【０１３４】
接着後、完全培地（αＭＥＭ＋５％臨床グレード血小板ライセート＋２Ｕ／ｍＬヘパリン）を慎重に加え、外植片をフラスコの底に接着させた。次に、フラスコを、３７℃、湿度９０％および５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０１３５】
培養培地は、５〜７日後に交換した。
【０１３６】
単離後１０日目に、外植片からの細胞の遊走を、倒立顕微鏡法によって制御した。大部分の外植片の周囲に、接着細胞の円が視認できた場合、無菌の使い捨て単回用の一組のピンセットを用いて、蓋を介して細胞をフラスコから拾い上げることによって、慎重に除去した。
【０１３７】
この工程から、細胞の集密度を１日おきに目視で確認し、必要に応じて、１７日目に培地交換を実施した。
【０１３８】
細胞が７０〜９０％の集密度に達した場合またはＤ２０に、培地を除去し、細胞をフラスコあたり３０ｍＬの１倍ＰＢＳで洗浄した。次に、細胞をトリプシンで除去し、古い培地で回収し、３００ｇで１０分間遠心分離した。上清を捨て、次に細胞を、αＭＥＭ＋１００ｍｇ／ｍＬ  ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）＋１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）からなる凍結保存液に懸濁させ、凍結保存した。
【０１３９】
２．ＭＳＣ細胞の解凍および培養
古典的なプロトコールに従って、細胞を解凍した。簡単に述べれば、クライオチューブを液体窒素に関して除去し、３７℃の水浴に速やかに浸漬した。チューブ内に氷がなくなったらすぐに、細胞を、予熱した（３７℃）完全培地（αＭＥＭ＋０．５％（ｖ／ｖ）シプロフロキサシン＋２Ｕ／ｍＬヘパリン＋５％（ｖ／ｖ）血小板ライセート（ＰＬ））で希釈し、速やかに遠心分離した（３００ｇ、室温、５分）。
【０１４０】
遠心分離後、細胞を予熱した完全培地に懸濁させ、数および生存率に関して評価した（トリパンブルー／Ｍａｌａｓｓｅｚ血球計算盤）。
【０１４１】
細胞を、完全培地においてプラスチック培養フラスコ中で４０００細胞／ｃｍ２で播種し、インキュベートした（湿度９０％、５％ＣＯ２、３７℃）。
【０１４２】
３．ＭＳＣ細胞の刺激
増殖の数日後、細胞を集密度に関して確認した。集密度が３０〜５０％に達した場合、古い培地を捨て、非刺激条件用の新鮮完全培地か、または１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１βおよび１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４で補充された新鮮培地のいずれかと交換した。
【０１４３】
次に、フローサイトメトリー実験の前に、細胞を少なくとも２日間インキュベートした。
【０１４４】
この刺激工程は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８２３１６に記載の通り、血管新生促進表現型をＭＳＣに付与するのに役立った。
【０１４５】
いくつかの細胞バッチを、それらの血管新生活性に関するボイデンチャンバーアッセイにおいて試験している（図２参照）。
【０１４６】
簡単に述べれば、血管新生促進勾配に応答したＥＣＦＣ（内皮コロニー形成細胞）遊走を、ウシ血漿（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｆ１１４１）由来の２０μｇ／ｍＬフィブロネクチンでコートされた８μｍ細孔径のポリカーボネート膜フィルター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で、２４ウェル改変ボイデンチャンバーにおいて評価した。実験の前に、２４ウェルプレートのウェルの底に、密度６０００細胞／ｃｍ２でＭＳＣ細胞を６回播種し、αＭＥＭ＋１％ＳＶＦ中で４日間培養した。培地対照列を、αＭＥＭ＋１％ＦＢＳで満たして認識した。
【０１４７】
０．２％ＦＢＳで補充されたＥＢＭ−２基本培地（Ｌｏｎｚａ−ＣＣ−３１５６）中で一晩飢餓させた後、ＥＣＦＣを、飢餓培地中で、２００，０００細胞／ウェルでマイクロチャンバーの上部にロードした。
【０１４８】
各条件につき、ＶＥＧＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ−１３０−１０９−３８３）を、陽性対照として、濃度５０ｎｇ／ｍＬで６個中３個のウェルに加えた。
【０１４９】
５時間のインキュベーション後、膜フィルターの上部表面の細胞を、コットンスワブで拭うことにより、除去した。次に、総ての膜をＭＧＧ染色し、マウントし、撮影した。
【０１５０】
【表１】
2021535894.tif 000002
【０１５１】
図２において、総ての（−）カラムは、ＶＥＧＦの非存在下で遊走したＥＣＦＣの数であり、一方、総ての（＋）カラムは、ＶＥＧＦの存在下で遊走したＥＣＦＣの数である。対照条件（Ｔ−およびＴ＋）は、ＥＣＦＣは、ＶＥＧＦの存在下でそれらの遊走を亢進できることを示している。試験条件（１、２、３）は、バッチ１は、ＥＣＦＣの挙動に影響を及ぼさないように思われるが、バッチ２および３の両方は、ＥＣＦＣに対するＶＥＧＦの効果を亢進し、さらに、バッチ３は、ＶＥＧＦの非存在下でＥＣＦＣの遊走をさらに亢進することを示している。
【０１５２】
ボイデンチャンバーが細胞間接触を防止するように、この効果は、可溶性細胞外メディエーター、すなわち可溶性タンパク質または細胞外小胞のいずれかを介して必ず媒介される。
【０１５３】
４．ＭＳＣ細胞の回収および凍結保存
増殖／刺激の２〜３日後、細胞を集密度に関して確認した。集密度が８０％までになった場合、細胞を回収した。簡単に述べれば、古い培地を捨て、細胞を１倍ＤＰＢＳで洗浄した。トリプシンＥＤＴＡを加え、細胞を３７℃で５分間インキュベートした。トリプシンを、培地の容量の少なくとも２倍で中和し、細胞懸濁液を回収し、数および生存率に関して評価した。
【０１５４】
細胞を３００ｇで１０分間遠心分離した。上清を捨て、次に細胞を、αＭＥＭ＋１００ｍｇ／ｍＬ  ＨＳＡ＋１０％ＤＭＳＯからなる凍結保存液に懸濁させ、凍結保存した。
【０１５５】
５．ＭＳＣ細胞の解凍および条件培地の作製
古典的なプロトコールに従って、細胞を解凍した。簡単に述べれば、クライオチューブまたはバッグを液体窒素に関して除去し、３７℃の水浴に速やかに浸漬した。チューブ内に氷がなくなったらすぐに、細胞を、予熱した（３７℃）αＭＥＭで希釈し、速やかに遠心分離した（３００ｇ、室温、５分）。
【０１５６】
遠心分離後、細胞を予熱した完全培地に懸濁させ、数および生存率に関して評価した（トリパンブルー／Ｍａｌａｓｓｅｚ血球計算盤）。
【０１５７】
必要な数の３００ｃｍ２プラスチック培養フラスコに、細胞を密度２０００細胞／ｃｍ２で播種し、必要な量の条件培地（１Ｔ３００＝３０ｍＬの条件培地）を作製した。０．５％（ｖ／ｖ）シプロフロキサシン、２Ｕ／ｍＬヘパリンおよび８％（ｖ／ｖ）の遠心分離後のＰＬで補充されたαＭＥＭを用いて、細胞を湿度９０％、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。遠心分離後のＰＬは、６０００ｇおよび１０℃でＰＬを１時間遠心分離し、上清を回収することによって調製した。
【０１５８】
５日後、培地を交換した。細胞が８０％の集密度に達した場合（６日目）、培地を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。５０ｍｌ／Ｔ３００の非補充αＭＥＭを２４時間加えた。２４時間後、培地を、非補充αＭＥＭ、または８％の小胞欠乏ＰＬ（血小板ライセート）で補充されたαＭＥＭのいずれか３０ｍＬに交換した。
【０１５９】
細胞を３６時間分泌させ、培地を回収し、Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  ３  Ｓ−Ｒ中で４００ｇおよび室温にて５分間遠心分離した。上清を回収し、−８０℃で凍結した。
【０１６０】
細胞をトリプシン処理し、それらの数および生存率に関してアッセイした。
【０１６１】
６．細胞外小胞の単離およびキャラクタリゼーション
このようなＭＳＣに由来する細胞外小胞は、当技術分野で公知の任意の方法によって単離することができ、その例としては、限定されるものではないが、超遠心分離、限外濾過、密度勾配、サイズ排除クロマトグラフィー、キットベースの沈殿、免疫親和性捕捉、マイクロ流体デバイスが挙げられる。
【０１６２】
この実験において、細胞外小胞に富む画分を、条件培地の限外濾過、次いで、サイズ排除液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分離した。
【０１６３】
細胞外小胞の数およびサイズの分布の分析を、ナノ粒子トラッキング解析（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ）を使用して実施した。
【０１６４】
また、本発明のＥＶの含量を、以下の条件を用いて、ウエスタンブロットにより評価している。
【０１６５】
材料および試薬：
溶解緩衝液（ＲＩＰＡ）：
−  デオキシコール酸ナトリウム    １％
−  ＳＤＳ                        ０．１％
−  トリス．Ｃｌ  ｐＨ  ７．４    ２０ｍＭ
−  ＥＤＴＡ                      １ｍＭ
−  ＮａＣｌ                      １５０ｍＭ
−  トリトンｘ１００              １％
プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＣＩＰ  １００倍）、Ｓｉｇｍａ参照番号Ｐ８３４０
【０１６６】
細胞溶解：
１倍の終濃度のＣＩＰを含有する１００μｌの冷ＲＩＰを、１×１０６ＭＳＣ細胞に加えている。
【０１６７】
得られた混合物を、氷上で１０分間インキュベートし、２０分間４℃で１５分間遠心分離し、次いで、上清を回収している。
【０１６８】
タンパク質の用量は、マイクロＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ参照番号２３２３５）を用いて実施している。
【０１６９】
電気泳動を、Ｎｏｖｅｘ  Ｎｏｓｅｘ４〜１２％ビス−トリスタンパク質ゲル１．５ｍｍ、１０ウェル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＰ０３３５ＰＢＯＸ）またはＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＯＰＳ  ＳＤＳ泳動用緩衝液（２０倍）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＰ０００１）で実施した。サンプルは、ＤＴＴ（５００ｍＭ）含有または不含ＬＤＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮＰ０００７、４倍）の４分の１の容量を用いて、７０℃で１０分間変性させている。転写は、無水エタノールで活性化し、すすいだ後のＰＶＤＦのメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、参照番号：ＲＰＮ３０３ＬＦＰ）上で、Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ電気泳動セルメンブレントランスファー（参照番号：１７０−３９３０）を用いて実施した。
【０１７０】
タンパク質を明らかにするために、以下の材料を使用した：
ＴＢＳ１０倍、ＢｉｏＲａｄ参照番号１７０６４３５
ブロッキング緩衝液（ＴＢＳミルク）：ＴＢＳ１倍＿
ツイーン０．１％スキムミルク５％
洗浄緩衝液（ＴＢＳ）：ＴＢＳ１倍＿ツイーン０．１％
ＡＣ緩衝液（ＴＢＳ＿ＡＣ）：ＴＢＳ１倍＿ツイーン０．１％＿ミルク０．３％
【０１７１】
膜タンパク質ＣＤ９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ−３１２１０２）およびＣＤ８１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ−３４９５０１）の存在を、ウエスタンブロットにおいて分析した（図１）。ＭＤＡ細胞ライセート（カラムＡ−陽性対照）および元の細胞ライセート（カラムＢ）とともに、精製されたＥＶ（カラムＣ）の画分中に、マーカーＣＤ９およびＣＤ８１の両方が存在した。小胞体マーカーカルネキシン（Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ−Ｅ−ＡＢ−３０７２３）は存在せず、画分が正確に精製されたことが示された。
【０１７２】
蛍光定量を、１／１００００のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０抗体、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  ＧＡＭ（参照番号：Ａ２１０５８）またはＧＡＲ（参照番号：Ａ２１０７６）を用いて実施している。
【０１７３】
化学発光を、１／５０００のＨＲＰ抗体、Ｂｉｏ  Ｒａｄ  ＧＡＭ（参照番号：１７０−６５１６）またはＧＡＲ（参照番号：１７０−６５１５）を用いて実施している。
【０１７４】
７．ＬＰＳにより刺激されたＵＣＭＳＣに由来するＥＶと、ＩＬ１βおよびＩＬ４の組合せにより刺激されたＵＣＭＳＣに由来するＥＶ（本発明のＥＶ）との比較
Ｄｏｎｇｄｏｎｇ  Ｔｉら(Journal of translational medicine, 2015)は、炎症促進性因子ＬＰＳでプレコンディショニングされた臍帯ＭＳＣから精製された細胞外小胞を説明している。
【０１７５】
Ｙｕｎｂｉｎｇ  Ｗｕら(BioMed Research International, 2017)は、ヒト臍帯から得られた非刺激間葉系幹細胞に由来する細胞外小胞の抗炎症特性を説明している。
【０１７６】
これらの刊行物のいずれも、本発明のＥＶが由来するＭＳＣを刺激するためにＩＬ１βおよび／またはＩＬ４を添加することを提案していない。
【０１７７】
本実施例の目的は、本発明のＣＤ１０６ｈｉｇｈＣＤ１５１＋ネスチン＋ＭＳＣに由来するＥＶは、ＩＬ１βおよびＩＬ４などの炎症促進性成長因子を含有する特定のコンディショニング培地中で培養されている細胞によって分泌されるため、従来技術で説明されるものと異なることを実証することである。
【０１７８】
本発明のＥＶと、非刺激ＭＳＣまたはＬＰＳにより刺激されたＭＳＣに由来するＥＶとの比較では、本発明のＥＶは、例えば、タンパク質含量または表面マーカーの点で、従来技術のＥＶと実際に区別する分子的特徴を示すことを実証した。
【０１７９】
７．１．３つの異なるコンディショニング培地で培養された臍帯由来ＭＳＣの条件培地（培養上清）の作製：
７．１．１．３つのコンディショニング培地の調製
３つのコンディショニング培地を、以下のように調製した：
【０１８０】
ＮＳ＝対照培地（コンディショニング炎症促進性因子不含）：
６７５ｍＬのαＭＥＭバッグ（終濃度：１０ｎｇ／ｍＬ）に対して、
１−  出口ポートの１つに注入部を取り付ける。
２−  針を使用して、２９０μＬのヘパリン５０００Ｕ／ｍＬ（終濃度２Ｕ／ｍＬ）を注入する。吸引／放出によって、注入部にヘパリンが残らないようにする。
３−  臨床血小板ライセート（ＣＰＬ）のバッグの出口ポートに注入部を取り付け、５０ｍＬ  ＬＬシリンジを用いて、遠心分離したＣＰＬを５６．８ｍＬ取る。
【０１８１】
Ｓ１＝ＩＬ１β−ＩＬ４コンディショニング培地（ＷＯ２０１８／１０８８５９に記載の方法の「第２の培地」）：
６７５ｍＬのαＭＥＭバッグ（最終総インターロイキン濃度：１０ｎｇ／ｍＬ）に対して、
４−  出口ポートの１つに注入部を取り付ける。
５−  針を使用して、２９０μＬのヘパリン５０００Ｕ／ｍＬ（終濃度２Ｕ／ｍＬ）を注入する。吸引／放出によって、注入部にヘパリンが残らないようにする。
６−  ＣＰＬのバッグの出口ポートに注入部を取り付け、５０ｍＬ  ＬＬシリンジを用いて、遠心分離したＣＰＬを５６．８ｍＬ取る。
７−  αＭＥＭバッグにＣＰＬを注入し、シリンジを用いてホモジナイズする。
８−  サイトカインの添加：
１．各インターロイキン（ＩＬ）（Ｃ＝１００μｇ／ｍＬ）のアリコート７３，２μＬを解凍する。
２．１ｍＬ針付シリンジを使用して、完全培地４００μＬを採取し、それをＩＬと混合する。
３．ＩＬを含有する培地を取り、それを完全培地のバッグに加える。
【０１８２】
ＬＰＳコンディショニング培地：
６７５ｍＬのαＭＥＭバッグ（最終ＬＰＳ濃度：１００ｎｇ／ｍＬ）に対して、
１−  出口ポートの１つに注入部を取り付ける。
２−  針を使用して、２９０μＬのヘパリン５０００Ｕ／ｍＬ（終濃度２Ｕ／ｍＬ）を注入する。吸引／放出によって、注入部にヘパリンが残らないようにする。
３−  ＣＰＬのバッグの出口ポートに注入部を取り付け、５０ｍＬ  ＬＬシリンジを用いて、遠心分離したＣＰＬを５６．８ｍＬ取る。
４−  αＭＥＭバッグにＣＰＬを注入し、シリンジを用いてホモジナイズする。
５−  ＬＰＳの添加：
１．ＬＰＳ（Ｃ＝１ｍｇ／ｍＬ）のアリコート７３，２μＬを解凍する。
２．１ｍＬ針付シリンジを使用して、完全培地４００μＬを採取し、それをＬＰＳと混合する。
３．ＬＰＳを含有する培地を取り、それを完全培地のバッグに加える。
【０１８３】
遠心分離した臨床血小板ライセート（ＣＰＬ）の調製：
ＣＰＬに由来する外因性ＥＶからの細胞の「クリーニング」を開始するために、遠心分離したＣＰＬを刺激工程に使用した。
１−  出口ポートに注入部を取り付ける。
２−  ＣＰＬを５０ｍＬプラスチックチューブに移す。
３−  ６０００ｇおよび４℃で１時間遠心分離した。
４−  上清を新しい容器に移す。
【０１８４】
７．１．２．解凍および増幅：
単離および継代１回後の気体窒素で保存した臍帯由来間葉系幹細胞を、古典的なプロトコールに従って解凍している。簡単に述べれば、バッグを保存場所から取り出し、３７℃の水浴に速やかに浸漬した。バッグ内に氷がなくなったらすぐに、細胞を、予熱した（３７℃）完全培地（αＭＥＭ＋０．５％（ｖ／ｖ）シプロフロキサシン＋２Ｕ／ｍＬヘパリン＋５％（ｖ／ｖ）ＰＬ）で希釈し、速やかに遠心分離した（３００ｇ、室温、５分）。
【０１８５】
遠心分離後、細胞を予熱した完全培地に懸濁させ、細胞数および生存率に関してアッセイした（トリパンブルー／Ｍａｌａｓｓｅｚ血球計算盤）。
【０１８６】
細胞を、完全培地において２つの細胞スタック１（ＣＳ１）中で２０００細胞／ｃｍ２で播種し、７日間インキュベートした（湿度９０％、５％ＣＯ２、３７℃）。
【０１８７】
７日後、ＣＳ１を１００ｍＬのＰＢＳですすぎ、ＣＳ１あたり２５ｍＬのトリプジーンを加え、細胞を回収した。インキュベーター内で１０分後、計１００ｍＬの完全培地（ＣＳ１あたり５０ｍＬ）を用いて、トリプジーンを中和した。細胞をプールし、数および生存率に関して評価した。
【０１８８】
７．１．３．刺激：
Ｔ３００を、６０００細胞／ｃｍ２で播種した。
【０１８９】
１日後、培地を適当なコンディショニング培地と交換した。培地交換を行わずに、細胞を２日間刺激した。
【０１９０】
７．１．４．飢餓およびＥＶ分泌：
刺激後、培地を捨て、細胞をＰＢＳで３回すすいだ。次いで、細胞を、αＭＥＭ＋／−炎症促進性因子（１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１βおよびＩＬ４の組合せまたは１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ）を用いて、２４時間飢餓させた。
【０１９１】
飢餓期間の後、細胞を再度ＰＢＳで３回すすぎ、次いで、各フラスコに、３０ｍＬのαＭＥＭ＋／−炎症促進性因子（ＩＬまたはＬＰＳ）を７２時間ロードした。
【０１９２】
上清を５０ｍＬプラスチックチューブに回収し、４００ｇおよび室温で５分間遠心分離した。各条件の上清を５００ｍＬ瓶にプールし、１ｍｌの小さなアリコートを、瓶とともに−８０℃で別々に凍結した。
【０１９３】
各条件につき、３つのＴ３００フラスコをトリプシン処理して、細胞数を評価し、細胞をクライオチューブ中で凍結保存した。
【０１９４】
【表２】
2021535894.tif 000003
【０１９５】
７．２．３つの条件培地に含有される細胞の表現型キャラクタリゼーション
３つのコンディショニング培地を用いて培養された細胞の表現型キャラクタリゼーションを、サイトメトリー分析により実施し、刺激の効果を評価した。
【０１９６】
予想されたように、培地Ｓ１およびＬＰＳで条件付けされた細胞は、異なる表現型を示し、血管新生促進マーカーＣＤ１０６が、条件培地Ｓ１においてより高レベルで発現した（ＷＯ２０１８／１０８８５９に記載のＩＬによる細胞の刺激）。
【０１９７】
【表３】
2021535894.tif 000004
【０１９８】
【表４】
2021535894.tif 000005
【０１９９】
７．３．ＥＶの精製
この実験において、細胞外小胞に富む画分を、３つの条件培地の限外濾過によって分離した。
【０２００】
細胞外小胞の数およびサイズの分布の分析を、ナノ粒子トラッキング解析（Ｍａｌｖｅｒｎ−ＰａｎａｌｙｔｉｃａｌのＮａｎｏｓｉｇｈｔ３００）を使用して実施した。
【０２０１】
ＥＶの精製の結果を以下に示す：
【０２０２】
【表５】
2021535894.tif 000006
【０２０３】
【表６】
2021535894.tif 000007
【０２０４】
【表７】
2021535894.tif 000008
【０２０５】
７．３．ＮＳ／Ｓ１／ＬＰＳ条件付けＭＳＣから得られたＥＶのキャラクタリゼーション
７．３．１．ウエスタンブロットによるＥＶおよびＭＳＣのタンパク質含量分析
３つの条件（ＮＳ／Ｓ１／ＬＰＳ）において得られたＥＶおよびＭＳＣの含量を、以下の条件を用いて、ウエスタンブロットにより評価している。
【０２０６】
材料および試薬：
溶解緩衝液（ＲＩＰＡ）：
−  デオキシコール酸ナトリウム    １％
−  ＳＤＳ                        ０．１％
−  トリス．ＨＣｌ  ｐＨ７．４    ２０ｍＭ
−  ＥＤＴＡ                      １ｍＭ
−  ＮａＣｌ                      １５０ｍＭ
−  ＮＰ４０：                    １％
プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＣＩＰ  １００倍）、Ｓｉｇｍａ参照番号Ｐ８３４０
【０２０７】
細胞溶解（ＭＳＣに対して）：
１倍の終濃度のＣＩＰを含有する１００μｌ／１×１０６ＭＳＣ細胞の冷ＲＩＰＡを加える。
【０２０８】
氷中で１０分間インキュベートし、１００００ｇにて４℃で２０分間遠心分離し、次いで、上清を回収する。
【０２０９】
等容量の氷冷２倍ＲＩＰＡ溶解緩衝液を加えた後、ＥＶ含有画分を可溶化した。
【０２１０】
タンパク質の用量は、マイクロＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ参照番号２３２３５）を用いて実施している。
【０２１１】
電気泳動を、Ｎｏｖｅｘ  Ｎｏｓｅｘ４〜１２％ビス−トリスタンパク質ゲル１．５ｍｍ、１０ウェル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＰ０３３５ＰＢＯＸ）またはＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＯＰＳ  ＳＤＳ泳動用緩衝液（２０倍）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＰ０００１）で実施した。サンプルは、ＤＴＴ（５００ｍＭ）含有または不含ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮＰ０００７、４倍）の４分の１の容量を用いて、７０℃で１０分間変性させている。転写は、無水エタノールで活性化し、すすいだ後のＰＶＤＦのメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、参照番号：ＲＰＮ３０３ＬＦＰ）上で、Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ電気泳動セルメンブレントランスファー（参照番号：１７０−３９３０）を用いて実施した。
【０２１２】
タンパク質を明らかにするために、以下の材料を使用した：
ＴＢＳ１０倍、ＢｉｏＲａｄ参照番号１７０６４３５
ブロッキング緩衝液（ＴＢＳミルク）：ＴＢＳ１倍＿ツイーン０．１％スキムミルク５％
洗浄緩衝液（ＴＢＳ）：ＴＢＳ１倍＿ツイーン０．１％
ＡＣ緩衝液（ＴＢＳ＿ＡＣ）：ＴＢＳ１倍＿ツイーン０．１％＿ミルク０．３％
【０２１３】
蛍光定量を、１／１００００のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０抗体、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  ＧＡＭ（参照番号：Ａ２１０５８）またはＧＡＲ（参照番号：Ａ２１０７６）を用いて実施している。
【０２１４】
化学発光を、１／５０００のＨＲＰ抗体、Ｂｉｏ  Ｒａｄ  ＧＡＭ（参照番号：１７０−６５１６）またはＧＡＲ（参照番号：１７０−６５１５）を用いて実施している。
抗体抗ＣＤ９：Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ−３１２１０２
抗体抗ＣＤ８１：Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ−３４９５０１
抗体抗カルネキシン：Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ−Ｅ−ＡＢ−３０７２３
抗体抗ＶＣＡＭ：Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＶＭＡ００４６１
抗体抗ＣＤ２００：Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｅ  ２ＡＦ２７２４
【０２１５】
結果：
予想されたように、血管新生促進マーカーＣＤ１０６／ＶＣＡＭは、カラムＢ（本発明のＭＳＣ）において検出可能であり、カラムＣ（ＬＰＳ条件下のＭＳＣ）、および予想通りカラムＡ（陰性対照）においては完全に存在しなかった。第２の血管新生促進マーカーである膜糖タンパク質ＣＤ２００は、Ｓ１画分のＭＳＣに存在していたが、ＬＰＳ画分のＭＳＣにも、カラムＡ（陰性対照）にも存在しなかった（図５参照）。
【０２１６】
精製されたＥＶ（図３）において、ＣＤ９およびＣＤ８１の両方の膜タンパク質が、ＭＤＡ細胞ライセート（陽性対照）とともに、総ての画分（カラムＡ、ＢおよびＣ）に存在していた（図３）。
【０２１７】
小胞体マーカーカルネキシンは検出されず、ＥＶ画分が正確に精製されたことが示された。
【０２１８】
血管新生促進マーカーＣＤ１０６／ＶＣＡＭは、カラムＢ（本発明のＥＶ）において検出可能であり、カラムＣ（ＬＰＳ条件下のＥＶ）およびカラムＡ（陰性対照）においては完全に存在せず、本発明のＭＳＣの膜マーカーは、ＥＶに移されることが示された（図３）。
【０２１９】
第２の血管新生促進マーカーである膜糖タンパク質ＣＤ２００は、Ｓ１画分のＥＶに存在していたが、ＬＰＳ画分のＥＶにも、カラムＡ（陰性対照）にも存在しなかった（図３）。
【０２２０】
７．３．２  血管新生タンパク質アレイ
ＮＳ、Ｓ１およびＬＰＳ条件培地で培養されたＭＳＣに由来するＥＶを、血管新生プロテオームアレイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ−ＡＲＹ００７）を用いて比較した。
【０２２１】
溶解緩衝液を、以下のように調製した：
１．５０ｍＬにつき、１５７，６ｍｇのトリス−ＨＣＬを１０ｍＬの水に溶解し、４００，３ｍｇのＮａＣｌを１０ｍＬの水に溶解し、３７，２ｍｇのＥＤＴＡを１０ｍＬの水に溶解する。
２．ｐＨ＝８に調整する。
３．０，５ｍＬのトリトンＸ−１００、５ｍＬのグリセロール、５０μＬのアプロチニン１０ｍｇ／ｍＬ、５０μＬのロイペプチン１０ｍｇ／ｍＬおよび５００μＬのペプスタチン１ｍｇ／ｍＬを加える。
４．５０ｍＬの滅菌水をＱＳＰする。
【０２２２】
ＮＳ、Ｓ１およびＬＰＳ培地において得られたＭＳＣに由来するＥＶを、以下のように溶解緩衝液中で可溶化した：
−  ＮＳ：１５０μＬのＥＶを１ｍＬの溶解緩衝液に懸濁させた。
−  Ｓ１：１３０，４μＬのＥＶを１ｍＬの溶解緩衝液に懸濁させた。
−  ＬＰＳ：１２５μＬのＥＶを１ｍＬの溶解緩衝液に懸濁させた。
【０２２３】
３００μｇのライセート中のタンパク質の総量を、ＢＣＡアッセイを用いて定量化し、それにより、溶解の効果を確認した。
【０２２４】
次に、ＥＶライセートを、ピペットを上下に動かして再懸濁し、２〜８℃で３０分間緩やかに揺り動かし、次いで、１４，０００×ｇで５分間微量遠心分離した。上清を清潔な試験管に移し、製造業者の説明書に従ってアッセイした。
【０２２５】
【表８】
2021535894.tif 000009
【０２２６】
図４のグラフは、３つのサンプルにおいて有意に異なって発現したタンパク質に関する結果を示す。アレイにおいて分析した５９種類中、２８種類の血管新生促進タンパク質が、Ｓ１およびＬＰＳサンプルにおける発現の差を示し、これにより、本発明のＥＶは、特に血管新生促進タンパク質の含量の点で、従来技術のＥＶと異なる特徴を示すことが確認された。
【０２２７】
書誌参照
2021535894.tif 000010
2021535894.tif 000011
【図１】
2021535894.tif 000012
【図２】
2021535894.tif 000013
【図３】
2021535894.tif 000014
【図４】
2021535894.tif 000015
【図５】
2021535894.tif 000016
【国際調査報告】
2021535894.tif 000017
2021535894.tif 000018
2021535894.tif 000019