(57)【要約】トキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質を提供し、ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質で、ＳＥＱ  ＩＤ  ２に記載のアミノ酸配列により構成される。また、トキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質をコードできる核酸も提供し、ＳＥＱ  ＩＤ  １に記載の核酸配列を有する。また、ワクチンを提供し、トキソプラズマ抗原遺伝子をダブルダイジェストして、ｐＥＴ２８ａなどの原核発現生物ベクターと接続して、ＢＬ２１（ＤＥ３）などの原核生物発現工学菌に転換し、高効率の発現を誘導して、精製して得られるタンパク質が可溶性タンパク質で、特有の免疫原性を保持する。 【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ２に記載のアミノ酸配列により構成される、トキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ２に記載の前記アミノ酸配列を代替、削除、または置換して得られるタンパク質変異体である、請求項１に記載のトキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ２に記載の前記アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列により構成されるタンパク質である、請求項１に記載のトキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ２に記載のアミノ酸配列をコードする核酸であり、ＳＥＱ  ＩＤ  １に記載の核酸配列を有する、トキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質をコードできる核酸。
【請求項５】
（１）関連遺伝子を発現ベクタープラスミドにクローンして、組換え発現ベクターが得られるステップと、
（２）前記組換え発現ベクターを大腸菌に転換して、遺伝子工学菌が得られるステップと、
（３）前記遺伝子工学菌を発酵培養して、ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質を発現するステップと、
（４）遺伝子工学菌の菌体を破砕した上清液を回収して、トキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質を分離精製するステップと、を備える、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質を作製する方法。
【請求項６】
ステップ（２）の前記ベクターがＰＥＴ−２８ａであり、大腸菌がＢＬ２１（ＤＥ３）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（２）の前記組換え遺伝子工学菌がＤＨ５α／ｐＥＴ２８ａ−１８Ｃである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（３）の前記遺伝子工学菌がトキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質を構成的発現の形式により発現する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（３）における前記組換えトキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質が下記三種のポリペプチドの任意一種である、
１）配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２の配列を有するポリペプチド、
２）１）と少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチド、
請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（１）における前記発現ベクタープラスミドが、ｐＭＡＬ−ｐ５ｘ、ｐＥＴ−４２ｂ（＋）、ｐＣｏｌｄ−ＧＳＴ、ｐＴｒｃＨｉｓ  Ａ、ｐＧＥＸ−ＫＧ、ｐＥＴ−２８ｂ（＋）、ｐＢＡＤ１０２／Ｄ−ＴＯＰＯ、ｐＡｍＣｙａｎ、ｐｔｄＴｏｍａｔｏ、ｐＣＳ１０５、ｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ、ｐＥＴ−２４ａ（＋）、ｐＥＴ−２４ｃ（＋）、ｐＥＴ−２４ｄ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ｃ（＋）、ｐＥＴ−２９ａ（＋）、ｐＥＴ−２９ｂ（＋）、ｐＥＴ−２９ｃ（＋）、ｐＥＴ−３０ｂ（＋）、ｐＥＴ−３０ｃ（＋）、ｐＥＴ−３０  Ｘａ／ＬＩＣ、ｐＥＴ−３０  ＥＫ／ＬＩＣ、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３２ｂ（＋）、ｐＥＴ−３２ｃ（＋）、ｐＥＴ−３２  ＥＫ／ＬＩＣ、ｐＥＴ−３２  Ｘａ／ＬＩＣ、ｐＥＴ−３３ｂ（＋）、ｐＥＴ−３９ｂ（＋）、ｐＥＴ−４０ｂ（＋）、ｐＥＴ−４１ａ（＋）、ｐＥＴ−４１ｂ（＋）、ｐＥＴ−４２ｃ（＋）、ｐＥＴ−４３．１ａ（＋）、ｐＥＴ−４３．１ｂ（＋）、ｐＥＴ−４３．１ｃ（＋）、ｐＥＴ−４３．１  ＥＫ／ＬＩＣ、ｐＥＴ−４３．１  ＥＫ／ＬＩＣ、ｐＥＴ−４４ａ（＋）、ｐＥＴ−４４ｂ（＋）、ｐＥＴ−４４ｃ（＋）、ｐＥＴ−４４  ＥＫ／ＬＩＣ、ｐＥＴ−４５ｂ（＋）、ｐＥＴ−４６  ＥＫ／ＬＩＣ、ｐＥＴ−４７ｂ（＋）、ｐＥＴ−４８ｂ（＋）、ｐＥＴ−４９ｂ（＋）、ｐＥＴＤｕｅｔ−１、ｐＥＴ−３７ｂ（＋）、ｐＥＴ−５ｂ（＋）、ｐＥＴ−５１ｂ（＋）、ｐＥＴ−５２ｂ（＋）、ｐＢＶ２２０、ｐｋｋ２３２−８、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＱＥ−１６、ｐＣｏｌｄ  ＩＶ、ｐＱＥ−７０、ｐＳＵＭＯ、ｐＥＴ−ＳＵＭＯ、ｐＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２、ｐＣｏｌｄＳ−ＳＵＭＯ、ｐＣｏｌｄ  ＴＦ、ｐＣｏｌｄ  ＩＩＩ、ｐＣｏｌｄ  ＩＩ、ｐＣｏｌｄ  Ｉ、ｐＥ−ＳＵＭＯ     、ｐＣｏｌｄ−ＰｒｏＳ２、ｐＢＡＤ２０２／Ｄ−ＴＯＰＯ、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＡＤ／Ｔｈｉｏ−ＴＯＰＯ、ｐＢａｄ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｃ、ｐＢａｄ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｂ、ｐＢａｄ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ａ、ｐＢａｄ／Ｈｉｓ  Ｃ、ｐＢａｄ／Ｈｉｓ  Ｂ、ｐＢａｄ／Ｈｉｓ  Ａ、ｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ、ｐＥＴ−２３ｂ（＋）、ｐＥＴ−２３ａ（＋）、ｐＥＴ−２３ｃ（＋）、ｐＥＴ−２３（＋）、ｐＥＴ−１２ｂ（＋）、ｐＥＴ−１２ｃ（＋）、ｐＥＴ−１２ａ（＋）、ｐＥＴ−１１ｂ（＋）、ｐＥＴ−１１ａ（＋）、ＥＴ−１１ｃ（＋）、ｐＢａｄ２４、ｐＱＥ−８１Ｌ、ｐＱＥ−３２、ｐＱＥ−９、ｐＱＥ−３１、ｐＱＥ−６０、ｐＱＥ−４０、ｐＥＴ−５０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−３２ａ（＋）、ｐＥＴ−２１ｂ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−１４ｂ、ｐＥＴ−１６ｂ、ｐＥＴ−１９ｂ、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ｄ（＋）、ｐＥＴ−２１ｃ（＋）、ｐＥＴ−２１ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ａ（＋）、ｐＥＴ−３０ａ（＋）、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３、ｐＧＥＸ−５Ｘ−２、ｐＧ−ＫＪＥ８、ｐＧｒｏ７、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１、ｐＴｆ１６、ｐＥＺＺ１８、ｐＢＡＤ１８、ｐＭＡＬ−ｃ５ｘ、ｐＭａｌ−ｐ２Ｅ、ｐＭａｌ−ｐ２Ｘ、ｐＥＴ−４１  ＥＫ／ＬＩＣ、ｐＭａｌ−ｃ４Ｘ、ｐＴｒｃＨｉｓ  Ｂ、ｐＥＴ−３ｂ（＋）、ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＧＥＸ−４Ｔ−��、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１、ｐＴｒｃ９９ａ、ｐＥＴ−Ｈｉｓ、ｐＡＬＥＸ  ａ，ｂ，ｃ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＫＤ４、ｐＫＤ２０、ｐＭＸＢ１０、ｐＫＪＥ７、ｐＲＳＥＴ  Ｂ、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１、ｐＥＴ−３ａ（＋）、ｐＧＥＸ−６Ｐ−３、ｐＧＥＸ−６Ｐ−２、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ｐＧＥＸ−２ＴＫ、ｐＲＳＥＴ  Ａ、ｐＭａｌ−ｃ２Ｇ、ｐＭａｌ−ｃ２Ｅ、ｐＭａｌ−ｃ２Ｘ、ｐＲＳＥＴ  Ｃ、及び上記任意のベクターを基づいて改造されるベクターも含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１または２に記載の前記トキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質及び精製ラベルを含む可溶性融合タンパク質。
【請求項１２】
前記精製ラベルのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３である、請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
犬トキソプラズマの感染を予防するサブユニット不活性化ワクチンの作製において請求項１、２また１１に記載の前記タンパク質の応用。
【請求項１４】
ヒトトキソプラズマの感染を予防するサブユニット不活性化ワクチンの作製において請求項１、２また１１に記載の前記タンパク質の応用。
【請求項１５】
猫トキソプラズマの感染を予防するサブユニット不活性化ワクチンの作製において請求項１、２また１１に記載の前記タンパク質の応用。
【請求項１６】
請求項１に記載の前記アミノ酸配列及びその変異体、または請求項４に記載の前記ヌクレオチド配列及びその至適化配列、及び医学上に許容されるベクターを含む、トキソプラズマのサブユニット不活性化ワクチン。
【請求項１７】
請求項１に記載の前記アミノ酸配列及びその変異体、または請求項４に記載の前記ヌクレオチド配列及びその至適化配列、及び医学上に許容されるベクターを含む犬トキソプラズマの感染を予防する薬剤の作製において請求項１６に記載の前記サブユニット不活性化ワクチンの応用。
【請求項１８】
前記サブユニット不活性化ワクチンがトキソプラズマ抗原を請求項１２に記載の前記発現ベクターに接続し、原核発現工学菌に転換して、高効率の発現を誘導して、精製することにより得られるタンパク質が可溶性タンパク質で、ワクチン佐剤を添加することにより作製される、請求項１６の前記サブユニット不活性化ワクチンを作製する方法。
【請求項１９】
前記タンパク質の濃度が少なくとも１０μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌである、請求項１８のいずれか一項に記載の前記犬トキソプラズマ病を予防するワクチン。
【請求項２０】
前記原核発現工学菌がＢＬ２１（ＤＥ３），ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）、Ｃ４１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｃ４１（ＤＥ３）、ＢＬ２１、ＡＤ４９４、ＢＬ２１−ＳＩ、ＢＬ２１  ｔｒｘＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１  ｔｒｘＢ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｂ８３４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＮｏｖａＢｌｕｅ  Ｔ１、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）、Ｔｕｎｅｒ、ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）、ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  Ｂ、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  ２、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ、Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ  ２、Ｏｒｉｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｒｏｓｅｔｔａ、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ、Ｏｒｉｇａｍｉ  ２、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｏｒｉｇａｍｉ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、ＢＬＲ、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＢＬＲ（ＤＥ３）、ＤＨ１０ＭｕｌｔｉＢａｃ、ＥＲ２７３８、ＥＴ１２５６７（ｐＵＺ８００２）、ＢＬ２１−ＡＩ、ＢＪ５１８３、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙＳｓ、Ｒｏｓｅｔｔａ  ２（ＤＥ３）ｐＬｙＳｓ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙＳｓ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）、ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）、Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］、Ｓｕｒｅ、ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙＳｓ、ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）、及び上記任意の工学菌に基づいて改造される工学菌である、請求項１８に記載の前記原核発現工学菌。
【請求項２１】
ＳＥＱ  ＩＤ  １またはその変異体と対応する核酸及び生物学ベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学と生物学分野に関し、犬トキソプラズマの感染を予防するワクチン及びその作製方法、特に、ワクチンが犬トキソプラズマ病の感染を予防する際の応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
トキソプラズマ病（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）は、胞子虫綱、トキソプラズマ属のトキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）により引き起こされる、動物またはヒトの細胞に寄生するマルチホスト原虫感染病の一種であり、世界的に分布するズーノティック寄生虫病である。ネコ科動物が終宿主であり、ヒトと多種の動物が中間宿主である。トキソプラズマ病が中国の緊急公衆衛生問題の一つになった。その主な原因は以下の通りである。
（１）人のトキソプラズマの感染率は極めて高く、一般的は２０％〜５０％であり、特に女と児童の感染率の方がより高い。世界中の約１／３の人がトキソプラズマに感染している。中国のトキソプラズマの感染率が５％〜２０％である。妊婦が感染後、臨床症状があるかどうかに関わらず、約５０％の可能性で垂直感染が発生し、早産、流産、胎児の発育異常及び死産などの症状を引き起こす。６％〜１０％のエイズ患者がトキソプラズマ病を合併する。エイズ患者が罹患する脳炎の５０％がトキソプラズマの感染によるものである。
（２）猫、犬、豚、羊、牛、兎などの家畜がトキソプラズマに感染することは非常に普通で、その感染率は１０％〜５０％に達し、豚、牛、羊の流産率が３０〜４０．７％に達する。豚は、トキソプラズマに感染することにより「豚高熱症候群」も引き起こし、病死率は６０％に達する。従って、トキソプラズマ病は、家畜流産の重要な原因の一つであり、畜産業に影響する。
（３）家庭で飼うペットの数の増加に伴って、犬や猫はペットとして広く飼われている。犬はトキソプラズマの重要な中間宿主で、猫は唯一の終宿主であり、人と緊密に接触することにより、人がトキソプラズマ病の主要伝染源になってしまう。
（４）トキソプラズマは全ての有核細胞を感染させることができ、動物（豚、牛、羊、鶏、鴨、グースなど）の感染率の平均は１５．４％で、感染後のトキソプラズマがブラディゾイトの形式で、全身の各組織に広がる。これによって、トキソプラズマが肉、乳、卵類を通じて大量に食品市場に流入してしまい、ヒトの伝染源になり、動物性食品の公衆衛生安全に対する深刻な脅威になる。
【０００３】
今まで、国内外で犬トキソプラズマ病の予防と治療するための理想的な市販ワクチンや薬剤はない。トキソプラズマに感染後、宿主の保護性免疫応答を引き起こせる。よって、安全、有効なワクチンを研究することは好ましいトキソプラズマ病の予防対策である。トキソプラズマワクチンの研究が１９７０年代から全虫ワクチンに注目する。全虫ワクチンは不活性化ワクチンと弱毒化活性ワクチンを含むが、不活性化ワクチンはマウスに対する免疫保護性が欠けるため、実際の応用価値はない。トキソプラズマの急増虫体が紫外線、放射線及び化学試薬などにより処理して毒力が減少することにより、より強い免疫応答を誘導でき、Ｔｓ−４、Ｔ−２６３とＳ４８が例として挙げられる。しかし、弱毒化活性ワクチンには弱毒化不十分や毒力回復などの危険があるため、弱毒化活性ワクチンは広く使用されない。本発明の遺伝子工学ワクチンは、トキソプラズマ抗原遺伝子を高効率的発現ベクターにおいて発現させることにより、精製された単一の抗原が大量に得られる。その利点は免疫原性がよく、生物安全性が高く、免疫刺激性が弱いことである。上記の内容をまとめてわかるように、遺伝子工学ワクチンがトキソプラズマワクチン発展の希望であり、さらなる開発応用価値がある。
【０００４】
トキソプラズマの成長は五つの段階に分けられ、即ち栄養体、被嚢、分裂体、生殖母体及び胞嚢体である。前二つの段階が中間宿主内において行い、後ろ三つの段階が終宿主、つまりネコ科動物の腸管と体表において行う。虫体の成長過程では、ネコ科動物が成熟した胞嚢体、またはトキソプラズマの胞嚢体を含む動物組織を食べて、胞嚢体内の胞子虫体または胞嚢体内の栄養体が体の消化管に侵入し、徐々に腸管上皮細胞に移動し、細胞内においてコクシジウム型の成長と繁殖を行う。
【０００５】
胞子化の胞嚢体を食べること、または胞嚢体及び栄養体を含む肉や内臓などを食べることにより、感染が引き起こされることは、犬がトキソプラズマ病に罹患する主な原因である。これ以外に、怪我した皮膚、気道、目、及び胎盤などの経路によっても感染し得る。病犬は、一歳以内の子犬や青年犬が多い。妊娠している雌犬はトキソプラズマ病に感染すると、流産、早産を引き起こし、成年犬は不顕性または一過性感染の方が多く、死亡する病例が報告されることもある。また、当該病気の発生は、犬のスカトロジーの悪い癖、またはネズミ類を捕食することなどに関連する。犬が猫から排出した胞嚢体を食べた後、中の胞子虫体がリンパ液と血液を通じて腸管組織以外の細胞に侵入し、二重芽の方式で繁殖し、急増虫体が大量に産生する。当該時期が急性感染期である。体から免疫力が生じる場合、急増虫体が緩増虫体になり、被嚢を形成して、脳、目、骨格筋及び心臓に長時間生存でき、当該時期が慢性感染期である。犬が免疫力と抵抗力を形成できない場合、かつトキソプラズマがかなり強い毒性を有する場合は、体が急性的に発病することに至る可能性がある。逆に、トキソプラズマの繁殖が阻害される場合、軽度の発病または何の臨床症状も出ない可能性もある。
【０００６】
シクロフィリン（ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ、ＣｙＰ）は原核と真核生物体内に広く存在する胞容性タンパク質であり、構造上高度の保存性を有する。現在、ＣｙＰは、単包条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、マレー糸状虫（Ｆｉｌａｒｉａ  ｍａｌａｙｉ）、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｎｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、ネオスポラ・カニナム（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｎｕｍ）、日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｉａｓｉｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、及びニワトリ盲腸コクシジウム（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ）などの寄生虫に存在する。
【発明の概要】
【０００７】
現在の課題に対して、本発明は、犬トキソプラズマの感染を予防する組換えサブユニット不活性化ワクチン及びその応用を提供し、遺伝子工学技術を用いて、トキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ遺伝子をクローン及び改造し、改造されたｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ遺伝子を工学菌に転換し、誘導後組換え抗原を高効率の発現が得られ、組換え抗原の特異性と免疫原性について生理的研究を行い、良好な免疫原性を表現する。
【０００８】
本発明の第一の目的は、ＳＥＱ  ＩＤ  ２に記載のアミノ酸配列により構成されるトキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質を提供することである。当該配列の由来は以下の通りである。タンパク質の空間構造及び疎水性をｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎタンパク質のアミノ酸配列に対して改造するとともに、コード至適化ウェブサイトであるｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｃｏｒｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／Ｃｏｄｏｎ．ｈｔｍを用いて、改造後のアミノ酸配列をコード至適化することにより、大腸菌内により高効率に発現させる。
【０００９】
上記の技術課題を解決するために、本発明が採用する技術案は以下の通りである。
【００１０】
ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ２に記載のアミノ酸配列により構成される、トキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質。
【００１１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ２に記載の前記アミノ酸配列を代替、削除、または置換して得られるタンパク質変異体である、前記のトキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質。
【００１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ２に記載の前記アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列により構成されるタンパク質である、前記のトキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質。
【００１３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ２に記載の前記アミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列により構成されるタンパク質である、前記のトキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質。
【００１４】
前記ＳＥＱ  ＩＤ  １またはその変異体と対応する核酸をダイジェストしてベクターと接続して、原核または真核細胞中に転換または導入して発現させる、上記タンパク質を作製する方法。
【００１５】
（１）関連遺伝子を発現ベクタープラスミドにクローンして、組換え発現ベクターが得られるステップと、
（２）前記組換え発現ベクターを大腸菌に転換して、遺伝子工学菌が得られるステップと、
（３）前記遺伝子工学菌を発酵培養して、ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質を発現するステップと、
（４）遺伝子工学菌の菌体を破砕した上清液を回収して、トキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質を分離精製するステップと、を備える、上記ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質を作製する方法。
【００１６】
上記の方法において、ステップ（２）のベクターがＰＥＴ−２８ａであり、大腸菌がＢＬ２１（ＤＥ３）である。
【００１７】
上記の方法において、ステップ（２）の組換え遺伝子工学菌がＤＨ５α／ｐＥＴ２８ａ−１８Ｃである。
【００１８】
上記の方法において、ステップ（３）の遺伝子工学菌がトキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質を構成的発現の形式により発現する。
【００１９】
上記の方法において、ステップ（３）における組換えトキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質が下記三種のポリペプチドの任意一種である、
１）配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２の配列を有するポリペプチド、
２）１）と少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチド。
【００２０】
トキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質が犬トキソプラズマの感染のサブユニット不活性化ワクチンの作製においての応用。
【００２１】
トキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質がヒトトキソプラズマのワクチンの作製においての応用、猫トキソプラズマワクチンの作製においての応用。
【００２２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ２に記載のアミノ酸配列をコードする核酸であり、ＳＥＱ  ＩＤ  １に記載の核酸配列を有する、トキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質をコードできる核酸。
【００２３】
請求項１の前記アミノ酸配列及びその変異体、または請求項４の前記ヌクレオチド配列及びその至適化配列、及び医学上に許容されるベクターを含む、トキソプラズマのサブユニット不活性化ワクチンを提供する。
【００２４】
請求項１の前記アミノ酸配列及びその変異体、または請求項４の前記ヌクレオチド配列及びその至適化配列、及び医学上に許容されるベクターを含む犬トキソプラズマの感染を予防する薬剤の作製においてトキソプラズマのサブユニット不活性化ワクチンの応用も提供する。
【００２５】
前記サブユニット不活性化ワクチンがトキソプラズマ抗原を請求項１２の前記発現ベクターに接続し、原核発現工学菌に転換して、高効率の発現を誘導して、精製することにより得られるタンパク質が可溶性タンパク質で、ワクチン佐剤を添加することにより作製される、前記サブユニット不活性化ワクチンを作製する方法。好ましいワクチン佐剤はＭＦ５９佐剤またはＳｅｐｐｉｃ社の２０６佐剤により作製される。
【００２６】
前記犬トキソプラズマ病を予防するワクチンにおいて、タンパク質の濃度が少なくとも１０μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌである。
【００２７】
好ましくは、上記犬トキソプラズマ病を予防するワクチンにおいてのタンパク質の濃度が１００μｇ／ｍｌである。
【００２８】
上記原核発現工学菌がＢＬ２１（ＤＥ３），ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）、Ｃ４１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｃ４１（ＤＥ３）、ＢＬ２１、ＡＤ４９４、ＢＬ２１−ＳＩ、ＢＬ２１  ｔｒｘＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１  ｔｒｘＢ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｂ８３４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＮｏｖａＢｌｕｅ  Ｔ１、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）、Ｔｕｎｅｒ、ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）、ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  Ｂ、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  ２、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ、Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ  ２、Ｏｒｉｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｒｏｓｅｔｔａ、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ、Ｏｒｉｇａｍｉ  ２、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｏｒｉｇａｍｉ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ、ＢＬＲ、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＢＬＲ（ＤＥ３）、ＤＨ１０ＭｕｌｔｉＢａｃ、ＥＲ２７３８、ＥＴ１２５６７（ｐＵＺ８００２）、ＢＬ２１−ＡＩ、ＢＪ５１８３、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙＳｓ、Ｒｏｓｅｔｔａ  ２（ＤＥ３）ｐＬｙＳｓ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙＳｓ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ  ２（ＤＥ３）、ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）、Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］、Ｓｕｒｅ、ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙＳｓ、ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）、及び上記任意の工学菌に基づいて改造される工学菌である。
【００２９】
前記ＳＥＱ  ＩＤ  １またはその変異体と対応する核酸及び生物学ベクターを含む宿主細胞。
【００３０】
本発明の第二の目的は、ベクターを提供することであり、前記ベクターはヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  １を含み、前記ベクターはｐＥＴ−２８ａ、ｐＭＡＬ−ｐ５ｘ、ｐＥＴ−４２ｂ（＋）、ｐＣｏｌｄ−ＧＳＴ、ｐＴｒｃＨｉｓ  Ａ、ｐＧＥＸ−ＫＧ、ｐＥＴ−２８ｂ（＋）、ｐＢＡＤ１０２／Ｄ−ＴＯＰＯ、ｐＡｍＣｙａｎ、ｐｔｄＴｏｍａｔｏ、ｐＣＳ１０５、ｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ、ｐＥＴ−２４ａ（＋）、ｐＥＴ−２４ｃ（＋）、ｐＥＴ−２４ｄ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ｃ（＋）、ｐＥＴ−２９ａ（＋）、ｐＥＴ−２９ｂ（＋）、ｐＥＴ−２９ｃ（＋）、ｐＥＴ−３０ｂ（＋）、ｐＥＴ−３０ｃ（＋）、ｐＥＴ−３０  Ｘａ／ＬＩＣ、ｐＥＴ−３０  ＥＫ／ＬＩＣ、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３２ｂ（＋）、ｐＥＴ−３２ｃ（＋）、ｐＥＴ−３２  ＥＫ／ＬＩＣ、ｐＥＴ−３２  Ｘａ／ＬＩＣ、ｐＥＴ−３３ｂ（＋）、ｐＥＴ−３９ｂ（＋）、ｐＥＴ−４０ｂ（＋）、ｐＥＴ−４１ａ（＋）、ｐＥＴ−４１ｂ（＋）、ｐＥＴ−４２ｃ（＋）、ｐＥＴ−４３．１ａ（＋）、ｐＥＴ−４３．１ｂ（＋）、ｐＥＴ−４３．１ｃ（＋）、ｐＥＴ−４３．１  ＥＫ／ＬＩＣ、ｐＥＴ−４３．１  ＥＫ／ＬＩＣ、ｐＥＴ−４４ａ（＋）、ｐＥＴ−４４ｂ（＋）、ｐＥＴ−４４ｃ（＋）、ｐＥＴ−４４  ＥＫ／ＬＩＣ、ｐＥＴ−４５ｂ（＋）、ｐＥＴ−４６  ＥＫ／ＬＩＣ、ｐＥＴ−４７ｂ（＋）、ｐＥＴ−４８ｂ（＋）、ｐＥＴ−４９ｂ（＋）、ｐＥＴＤｕｅｔ−１、ｐＥＴ−３７ｂ（＋）、ｐＥＴ−５ｂ（＋）、ｐＥＴ−５１ｂ（＋）、ｐＥＴ−５２ｂ（＋）、ｐＢＶ２２０、ｐｋｋ２３２−８、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＱＥ−１６、ｐＣｏｌｄ  ＩＶ、ｐＱＥ−７０、ｐＳＵＭＯ、ｐＥＴ−ＳＵＭＯ、ｐＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２、ｐＣｏｌｄＳ−ＳＵＭＯ、ｐＣｏｌｄ  ＴＦ、ｐＣｏｌｄ  ＩＩＩ、ｐＣｏｌｄ  ＩＩ、ｐＣｏｌｄ  Ｉ、ｐＥ−ＳＵＭＯ、ｐＣｏｌｄ−ＰｒｏＳ２、ｐＢＡＤ２０２／Ｄ−ＴＯＰＯ、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＡＤ／Ｔｈｉｏ−ＴＯＰＯ、ｐＢａｄ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｃ、ｐＢａｄ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｂ、ｐＢａｄ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ａ、ｐＢａｄ／Ｈｉｓ  Ｃ、ｐＢａｄ／Ｈｉｓ  Ｂ、ｐＢａｄ／Ｈｉｓ  Ａ、ｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ、ｐＥＴ−２３ｂ（＋）、ｐＥＴ−２３ａ（＋）、ｐＥＴ−２３ｃ（＋）、ｐＥＴ−２３（＋）、ｐＥＴ−１２ｂ（＋）、ｐＥＴ−１２ｃ（＋）、ｐＥＴ−１２ａ（＋）、ｐＥＴ−１１ｂ（＋）、ｐＥＴ−１１ａ（＋）、ＥＴ−１１ｃ（＋）、ｐＢａｄ２４、ｐＱＥ−８１Ｌ、ｐＱＥ−３２、ｐＱＥ−９、ｐＱＥ−３１、ｐＱＥ−６０、ｐＱＥ−４０、ｐＥＴ−５０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−３２ａ（＋）、ｐＥＴ−２１ｂ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−１４ｂ、ｐＥＴ−１６ｂ、ｐＥＴ−１９ｂ、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ｄ（＋）、ｐＥＴ−２１ｃ（＋）、ｐＥＴ−２１ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ａ（＋）、ｐＥＴ−３０ａ（＋）、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３、ｐＧＥＸ−５Ｘ−２、ｐＧ−ＫＪＥ８、ｐＧｒｏ７、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１、ｐＴｆ１６、ｐＥＺＺ１８、ｐＢＡＤ１８、ｐＭＡＬ−ｃ５ｘ、ｐＭａｌ−ｐ２Ｅ、ｐＭａｌ−ｐ２Ｘ、ｐＥＴ−４１  ＥＫ／ＬＩＣ、ｐＭａｌ−��４Ｘ、ｐＴｒｃＨｉｓ  Ｂ、ｐＥＴ−３ｂ（＋）、ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１、ｐＴｒｃ９９ａ、ｐＥＴ−Ｈｉｓ、ｐＡＬＥＸ  ａ，ｂ，ｃ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＫＤ４、ｐＫＤ２０、ｐＭＸＢ１０、ｐＫＪＥ７、ｐＲＳＥＴ  Ｂ、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１、ｐＥＴ−３ａ（＋）、ｐＧＥＸ−６Ｐ−３、ｐＧＥＸ−６Ｐ−２、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ｐＧＥＸ−２ＴＫ、ｐＲＳＥＴ  Ａ、ｐＭａｌ−ｃ２Ｇ、ｐＭａｌ−ｃ２Ｅ、ｐＭａｌ−ｃ２Ｘ、ｐＲＳＥＴ  Ｃ、及び上記任意のベクターを基づいて改造されるベクターである。好ましい発現ベクターは、ｐＥＴ−２８ａベクターである。
【００３１】
本発明の第三の目的は、可溶性融合タンパク質を提供することであり、前記可溶性融合タンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２、及びその変異体を含む。
【００３２】
好ましくは、前記可溶性融合タンパク質はトキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質、及びヒスチジン精製ラベルを含み、トキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質をコードするＤＮＡの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１から選ばれ、精製ラベルのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３である。
【００３３】
好ましくは、可溶性融合タンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２である。
【００３４】
本発明の第三の目的は、宿主細胞を提供することであり、上記または請求項１に記載のヌクレオチド配列を用いて転換または導入されたベクターを含む。
【００３５】
本発明の第四の目的は、可溶性融合タンパク質を作製する方法を提供することであり、宿主細胞を通じて可溶性融合タンパク質を発現させ、分離することを含む。
【００３６】
本発明の第五の目的は、ワクチンを提供し、ＳＥＱ  ＩＤ  ２中のヌクレオチド配列、及び医学上に許容されるベクターを含む。
【００３７】
ワクチンが好ましく、トキソプラズマ抗原をダブルダイジェストして、ｐＥＴ２８ａ発現ベクターと接続して、ＢＬ２１（ＤＥ３）工学菌に転換し、高効率の発現を誘導して、精製することにより得られるタンパク質が可溶性タンパク質で、ＭＦ５９佐剤またはＳｅｐｐｉｃ社の２０６佐剤により作製される。ワクチンが特有の免疫原性を保持し、工業的生産に適する。
【００３８】
本発明の利点は以下の通りである。トキソプラズマに対する有効である抗原遺伝子を選択してサブユニット不活性化ワクチンの研究を行う。当該抗原により作製されたサブユニット不活性化ワクチンがより強く細胞免疫及び体液性免疫効果を有し、体の先天性免疫応答を誘導でき、各細胞炎症性因子を分泌することにより、犬トキソプラズマ病を有効に予防できる。本発明がｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎタンパク質の配列を至適化し、原核細胞である大腸菌においての発現量は至適化する前の２倍になる。本発明により提供されるワクチンは工学菌種において作製でき、ワクチン佐剤をさらに添加することにより作製される。ワクチンが特有の免疫原性を保持し、工業的生産に適する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ＳＥＱ  ＩＤ  ２の遺伝子ＯＲＦ増幅結果である。図面において、Ｍ、ＤＬ２０００  ｍａｒｋｅｒ；Ｃ１８、目的遺伝子断片。
【００４０】
【図２】トキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎタンパク質とトキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。図面において、Ｍ、タンパク質ｍａｒｋｅｒ；ｒ１、トキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎタンパク質の可溶性発現；ｒ２、トキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質の可溶性発現。
【００４１】
【図３】トキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ組換え変異体発現タンパク質を精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。図面において、Ｍ、タンパク質ｍａｒｋｅｒ；ｒ、組換えｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質。
【００４２】
【図４】Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔにより体外発現組換えタンパク質の特異性を鑑定する結果である。図面において、Ｍ、タンパク質ｍａｒｋｅｒ；ｒ、組換えｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質。
【００４３】
【図５】トキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ組換え変異体タンパク質でマウスＲＡＷ２６４．７細胞を活性化して産生するＴＮＦ−αレベルである。
【００４４】
【図６】トキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ組換え変異体タンパク質でマウス樹状細胞を活性化して産生するＩＬ−１２レベルである。
【００４５】
【図７】トキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ組換え変異体タンパク質ワクチンを注射するマウスから産生する抗体のタイター図である。
【００４６】
【図８】マウス抗トキソプラズマの感染に対するトキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ組換え変異体タンパク質ワクチンの保護作用である。
【００４７】
【図９】トキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ組換え変異体タンパク質ワクチンを注射した犬から産生する抗体のタイター図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
以下、実施例と結合して、本発明の技術案について具体的に説明する。説明する実施例は本発明の一部であり、全ての実施例ではない。本発明の実施例に基づいて、本分野の普通の技術者が進歩性を有する労働をしない限り得られた全ての他の実施例が、本発明の保護範囲に属する。
【００４９】
実施例１：トキソプラズマ組換えｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質原核発現ベクターの構築
【００５０】
核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に基づいて遺伝子を人工合成するとともに、原核発現ベクターｐＥＴ２８ａの物理地図に基づいてプライマーを設計し、制限部位に導入する。
フォワードプライマー：ＡＴＧＧＡＡＴＴＣ  ＡＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＧＧＧＣＧＴＧＣＧＣＡＡＡ
リバースプライマー：ＡＡＧＣＴＴ  ＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＣＡＡＴＡＴＣＧＧＴＡＡ
【００５１】
人工合成によって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１遺伝子配列を合成し、上記プライマーに基づいて大量増幅させて、ＰＣＲ精製産物をｐＭＤ−１８−Ｔにクローンし、陽性クローン菌をダイジェスト及び配列同定される。陽性プラスミドをＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩによりダブルダイジェストした後、精製した目的断片を原核発現ベクターｐＥＴ２８ａに接続する。接続産物をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αの受容性細胞に転換して、組換えプラスミドをスクリーニングする。ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩによりダブルダイジェスト反応を用いて鑑定して、原核発現プラスミドｐＥＴ２８ａ−Ｃ１８を獲得する。ｐＥＴ２８ａ−Ｃ１８をＢＬ２１（ＤＥ３）工学菌に転換して、シングルコロニーをピックアウトし、５ｍｌ  ＬＢの液体培地（１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含有）に播種して、３７℃、２２０ｒｐｍで一晩震盪培養する。ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体ＯＲＦ増幅結果を図１に参照する。
【００５２】
実施例２：発現タンパク質の精製
【００５３】
（１）発現タンパク質の抽出と可溶性の検証
【００５４】
選択された組換えプラスミドｐＥＴ−２８ａ（＋）−Ｃ１８が転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）シングルコロニーを５ｍｌ  ＬＢの液体培地に播種して、３７℃で一晩震盪培養する。翌日に種培養液を８００ｍＬ  ＬＢの液体培地に転移して、３７℃で増殖させる。菌液のＯＤ６００が０．６〜０．７になるまで観察する。最適条件下において発現を誘導する。遠心して、菌体を収集し、２０ｍＬＰＢＳを用いて懸濁し、凍結溶解（−８０℃、１ｈ／３７℃、１０ｍｉｎ）を５回繰り返してから、超音波処理を行う。遠心した上清が可溶性タンパク質（活性を有するタンパク質）である。沈殿物を１０ｍＬの変性緩衝液で懸濁し、室温で１時間震盪する。遠心した上清が非可溶性タンパク質（変性タンパク質）である。上記二種類のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ検測を行って、目的タンパク質の可溶性を検証する。目的タンパク質が主に可溶性タンパク質の上清にある場合、可溶性発現であると説明する。目的タンパク質の大部分が非可溶性タンパク質の上清液にある場合、封入体形式の発現であると説明する。その結果、改造されたトキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質が可溶性発現であり、その発現量が１２０ｍｇ／Ｌで、未変異改造されたトキソプラズマｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎタンパク質が可溶性発現であり（作製方法が下記文献と同じ、トキソプラズマシクロフィリンタンパク質遺伝子のクローン及び原核発現、李運娜、２０１０年）、その発現量が６０ｍｇ／Ｌで、その結果を図２に参照する。
【００５５】
（２）融合発現タンパク質の精製
【００５６】
ニッケルカラムをＡ液（ＰＢＳ）で平衡化して安定させ、Ａ液でシステムを洗い、流速２０ｍＬ／ｍｉｎで、２ｍｉｎで洗う。平衡化したニッケルカラムをサンプルインターフェースに接続して、流速１ｍＬ／ｍｉｎでサンプルを流すと、目的タンパク質がカラムに残る。流し終わった後、目的タンパク質が残るニッケルカラムを溶出インターフェースに接続する。まずＡ液でニッケルカラムを平衡化して、流速１ｍＬ／ｍｉｎで未結合の不純タンパク質を洗う。流速を保持して、勾配洗浄条件を設定する。Ｂ液（ＰＢＳ、１Ｍイミダゾールを含有）の濃度は１０％であり、即ちイミダゾールの濃度は１００ｍＭ、時間は３０ｍｉｎで、非特異性吸着不純タンパク質を洗う。流速を保持して、洗浄条件を設定する。Ｂ液の濃度が３０％で、即ちイミダゾールの濃度が３００ｍＭ、時間が１２０ｍｉｎで、目的タンパク質を洗い、収集した目的タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥして、純度を観察する。その結果を図３に参照する。Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔを用いて対外発現組み換え変異体タンパク質変異性の検定結果を図４に参照する。
【００５７】
実施例３：発現産物によるマウスマクロファージ免疫原性の検測
【００５８】
ＲＡＷ２６４．７細胞を０．５×１０６／ｍＬになるように２４ウェル培養板に播種し、各ウェルに０．５ｍＬを添加し、５％  ＣＯ２、３７℃で２４ｈ培養する。上清を吸って、作製されたトキソプラズマ組換えｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質をＲＡＷ２６４．７細胞培養液に溶解する。各ウェルに１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．０１μｇ／ｍＬの濃度で０．５ｍＬ／ウェルを２４ウェル板に添加し、同体積のＰＢＳを陰性対照とする。細胞培養板を５％  ＣＯ２、３７℃のインキュベーターに４８ｈ培養する。上清液を収集して、ＥＬＩＳＡ実験でＴＮＦ−ａレベルを検測する。その結果から分かるように、ＴＮＦ−ａの産生がタンパク質の濃度の上昇により増加する、範囲が４０ｐｇ−３１０ｐｇ以内で等しくない、その結果を図５に参照する。当該結果から分かるように、トキソプラズマ組換えｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質がＲＡＷ２６４．７細胞を活性化して、ＴＮＦ−ａを産生させる。
【００５９】
実施例４：発現産物によるマウス樹状細胞免疫原性の検測
【００６０】
マウス樹状細胞を分離し、細胞濃度を０．５×１０６個／ｍＬになるように調整して、２４ウェル組織細胞培養板に播種し、各ウェルに０．５ｍＬを播種する。処理したトキソプラズマ組換えｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質を各ウェルに１００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．０１μｇ／ｍＬの濃度で培養板に添加して、各ウェルに０．５ｍＬを添加する。細胞培養板を５％  ＣＯ２、３７℃のインキュベーターに２４ｈ培養して、培養上清液を収集し、ＥＬＩＳＡ実験で上清液中のＩＬ−１２レベルを検測する。その結果から分かるように、各群から産生されたＩＬ−１２がタンパク質依存性を表し、即ち、タンパク質の濃度の上昇により増加する、その結果を図６に参照する。当該結果から分かるように、トキソプラズマ組換えｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質がマウス樹状細胞を活性化して、大量のＩＬ−１２を産生させる。
【００６１】
実施例５：トキソプラズマ組換えサブユニットワクチンによるマウス免疫ウィルス攻撃保護実験
【００６２】
１２５匹の８〜１０週齢の雌ＳＰＦ級のＢＡＬＢ／ｃマウスを５群に分けて、各群２５匹である。第一群がｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ実験群Ｉ（佐剤がＭＦ５９で、３０μｇ／匹、皮下注射）であり、第二群がｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ実験群ＩＩ（佐剤が２０６で、３０μｇ／匹、皮下注射）であり、第３群が陰性対照群Ｉ（体積相当量のＰＢＳ、佐剤がＭＦ５９で、皮下注射）であり、第４群が陰性対照群ＩＩ（体積相当量のＰＢＳ、佐剤が２０６で、皮下注射）であり、第５群が空白対照群（体積相当量のＰＢＳ、皮下注射）である。各群三回注射して、間隔が二週間である。毎週に抗体のタイターを検測する。第三回の免疫注射の一週間後に、精製したトキソプラズマ栄養体１０３個／匹を腹内注射して、マウスの状況を毎日観察して記録する。
【００６３】
抗体結果から、一回免疫後の三週間の抗体レベルが素早く増加し、６週目において頂点に達することがわかり、ワクチン抗体タイターを図７に参照する。
【００６４】
免疫保護性試験の結果から、陰性対照群及び空白対照群より、実験群の免疫生存率が明らかに高く、かつＭＦ５９佐剤ワクチン群の効果が２０６佐剤ワクチン群と対照群の効果より良いことがわかる（図８に参照する）。
【００６５】
実施例６：トキソプラズマ組換えサブユニットワクチンによる犬免疫ウィルス攻撃保護実験
【００６６】
病原のない（寄生虫病、ウィルス病、細菌伝染病のないことを含む）実験犬（ビークル犬、性成熟した雌犬）２０匹、特にトキソプラズマ、ネオスポラカニナム、犬ジステンパー、犬伝染性肝炎、バルウィルスなどの伝染性病原がない。実験動物を２群に分けて、第１群がｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ実験群（佐剤がＭＦ５９で、３００μｇ／匹、皮下注射）、全部で犬１５匹である。第２群が空白対照群で（体積相当量のＰＢＳ、皮下注射）、全部で犬５匹である。各群を三回注射して、間隔が二週間である。毎週抗体のタイターを検測する。第三回の免疫注射後一週間後に、精製したトキソプラズマ栄養体１０４個／匹を腹内注射する。３０日後、各犬を解剖して、脳、心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓、リンパ節、咬筋、舌の筋肉、腹筋組織のトキソプラズマの感染状況をＰＣＲで検測する。任意の組織のＰＣＲ結果が陽性の場合、当該犬がトキソプラズマ感染と判定される。全部の組織のＰＣＲ結果が陰性の場合、トキソプラズマ保護と判定される。
【００６７】
抗体結果から免疫群の一回免疫後の抗体レベルが増高し続けることが分かる、ワクチンの抗体タイターを図９に参照する。
【００６８】
ウィルス攻撃後の結果から、対照群の犬がすべてトキソプラズマ感染と判定され、免疫群の１５匹の犬の中の１３匹がトキソプラズマ保護、２匹がトキソプラズマ感染と判定され、保護率が８６％である。
【００６９】
上記の実験結果をまとめると、本発明により提供されたトキソプラズマサブユニット不活性化ワクチンは、犬トキソプラズマに対する免疫保護率が高く、犬トキソプラズマ病の予防と治療の候補ワクチンに用いられる。
【００７０】
上記の各実施例を使用して本発明の技術案を説明したが、それらの説明は、制限ではなく例示であることに留意すべきである。当業者は、本発明の明細書をもとに各実施例に記載された技術案を補正し、または、一部の技術特徴に対して均等置換を行ってもよい。このような補正及び代用実施例が本発明の実際の保護範囲内に含むことができる。これらの補正や置換による技術案の要旨は、本発明の各実施例の技術案の範囲から逸脱しない。
【図１】
2021526866.tif 000002
【図２】
2021526866.tif 000003
【図３】
2021526866.tif 000004
【図４】
2021526866.tif 000005
【図５】
2021526866.tif 000006
【図６】
2021526866.tif 000007
【図７】
2021526866.tif 000008
【図８】
2021526866.tif 000009
【図９】
2021526866.tif 000010
【配列表】
2021526866000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年8月4日(2021.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ変異体タンパク質であり、ＳＥＱ  ＩＤ ＮＯ．２に記載のアミノ酸配列により構成される、トキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ ＮＯ．２に記載のアミノ酸配列をコードする核酸である、トキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質をコードする核酸。
【請求項３】
ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ ＮＯ．１に記載のようである、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
（１）ＳＥＱ  ＩＤ ＮＯ．２に記載のアミノ酸配列により構成されるタンパク質の遺伝子またはＳＥＱ  ＩＤ ＮＯ．１に記載のヌクレオチド配列のようなコードを発現ベクタープラスミドにクローンして、組換え発現ベクターが得られるステップと、（２）前記組換え発現ベクターを大腸菌に転換して、遺伝子工学菌が得られるステップと、（３）前記遺伝子工学菌を発酵培養して、トキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質を発現するステップと、（４）遺伝子工学菌の菌体を破砕した上清液を回収して、トキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質を分離精製するステップと、を備える、トキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質を作製する方法。
【請求項５】
ステップ（１）の前記ベクターがＰＥＴ−２８ａであり、ステップ（２）の前記大腸菌がＢＬ２１（ＤＥ３）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（３）の前記遺伝子工学菌がトキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質を構成的発現の形式により発現する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の前記トキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質及び精製ラベルを含む可溶性融合タンパク質。
【請求項８】
前記精製ラベルのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ ＮＯ．３である、請求項７に記載の可溶性タンパク質。
【請求項９】
犬トキソプラズマの感染を予防するサブユニット不活性化ワクチンの作製において請求項１に記載の前記トキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質、または請求項７または８に記載の前記可溶性融合タンパク質の応用。
【請求項１０】
ヒトトキソプラズマの感染を予防するサブユニット不活性化ワクチンの作製において請求項１に記載の前記トキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質、または請求項７または８に記載の前記可溶性融合タンパク質の応用。
【請求項１１】
猫トキソプラズマの感染を予防するサブユニット不活性化ワクチンの作製において請求項１に記載の前記トキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質、または請求項７または８に記載の前記可溶性融合タンパク質の応用。
【請求項１２】
請求項１に記載の前記トキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質、または請求項２または３に記載の前記トキソプラズマに対する免疫原性を有するタンパク質をコードする核酸、及び医学上に許容されるベクターを含む、トキソプラズマのサブユニット不活性化ワクチン。
【請求項１３】
犬トキソプラズマの感染を予防する薬剤の作製において請求項１２に記載の前記サブユニット不活性化ワクチンの応用。
【請求項１４】
請求項７または８に記載の前記可溶性融合タンパク質をコードする配列が含まれる発現ベクターを原核発現工学菌に転換して、高効率の発現を誘導して、精製することにより得られるタンパク質が可溶性タンパク質で、ワクチン佐剤を添加することにより作製される、請求項１２の前記サブユニット不活性化ワクチンを作製する方法。
【請求項１５】
前記タンパク質の濃度が１０μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌである、請求項１４に記載の請求項１２の前記サブユニット不活性化ワクチンを作製する方法。
【請求項１６】
請求項２または３に記載の核酸及び生物学ベクターを含む宿主細胞。      
【国際調査報告】
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