(57)【要約】  本開示は、ＤＬＬ３−ＣＤ３二重特異性抗体であって、その配列を特徴とする、抗体に関する。本出願は、さらに、抗体およびその組成物の、特に、がん疾患の分野における治療目的での使用に関する。
2021526816.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＬＬ３に特異的に結合する第１の抗原結合ユニットと、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合ユニットとを含むタンパク質であって、ＤＬＬ３に特異的に結合する前記第１の抗原結合ユニットが、ｉ）〜ｘｖｉｉｉ）：
ｉ）配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）、および配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）、および配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｉｉ）配列番号７（ＣＤＲ１）、配列番号８（ＣＤＲ２）、および配列番号９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１０（ＣＤＲ１）、配列番号１１（ＣＤＲ２）、および配列番号１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｉｉｉ）配列番号１３（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）、および配列番号１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１６（ＣＤＲ１）、配列番号１７（ＣＤＲ２）、および配列番号１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｉｖ）配列番号１９（ＣＤＲ１）、配列番号２０（ＣＤＲ２）、および配列番号２１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号２２（ＣＤＲ１）、配列番号２３（ＣＤＲ２）、および配列番号２４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｖ）配列番号２５（ＣＤＲ１）、配列番号２６（ＣＤＲ２）、および配列番号２７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号２８（ＣＤＲ１）、配列番号２９（ＣＤＲ２）、および配列番号３０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｖｉ）配列番号３１（ＣＤＲ１）、配列番号３２（ＣＤＲ２）、および配列番号３３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号３４（ＣＤＲ１）、配列番号３５（ＣＤＲ２）、および配列番号３６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｖｉｉ）配列番号１３３（ＣＤＲ１）、配列番号１３４（ＣＤＲ２）、および配列番号１３５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１３６（ＣＤＲ１）、配列番号１３７（ＣＤＲ２）、および配列番号１３８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｖｉｉｉ）配列番号１３９（ＣＤＲ１）、配列番号１４０（ＣＤＲ２）、および配列番号１４１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１４２（ＣＤＲ１）、配列番号１４３（ＣＤＲ２）、および配列番号１４４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｉｘ）配列番号１４５（ＣＤＲ１）、配列番号１４６（ＣＤＲ２）、および配列番号１４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１４８（ＣＤＲ１）、配列番号１４９（ＣＤＲ２）、および配列番号１５０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｘ）配列番号１５１（ＣＤＲ１）、配列番号１５２（ＣＤＲ２）、および配列番号１５３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１５４（ＣＤＲ１）、配列番号１５５（ＣＤＲ２）、および配列番号１５６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｘｉ）配列番号１５７（ＣＤＲ１）、配列番号１５８（ＣＤＲ２）、および配列番号１５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１６０（ＣＤＲ１）、配列番号１６１（ＣＤＲ２）、および配列番号１６２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｘｉｉ）配列番号１６３（ＣＤＲ１）、配列番号１６４（ＣＤＲ２）、および配列番号１６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１６６（ＣＤＲ１）、配列番号１６７（ＣＤＲ２）、および配列番号１６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｘｉｉｉ）配列番号１６９（ＣＤＲ１）、配列番号１７０（ＣＤＲ２）、および配列番号１７１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１７２（ＣＤＲ１）、配列番号１７３（ＣＤＲ２）、および配列番号１７４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｘｉｖ）配列番号１７５（ＣＤＲ１）、配列番号１７６（ＣＤＲ２）、および配列番号１７７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１７８（ＣＤＲ１）、配列番号１７９（ＣＤＲ２）、および配列番号１８０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｘｖ）配列番号１８１（ＣＤＲ１）、配列番号１８２（ＣＤＲ２）、および配列番号１８３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１８４（ＣＤＲ１）、配列番号１８５（ＣＤＲ２）、および配列番号１８６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｘｖｉ）配列番号１８７（ＣＤＲ１）、配列番号１８８（ＣＤＲ２）、および配列番号１８９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１９０（ＣＤＲ１）、配列番号１９１（ＣＤＲ２）、および配列番号１９２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｘｖｉｉ）配列番号１９３（ＣＤＲ１）、配列番号１９４（ＣＤＲ２）、および配列番号１９５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１９６（ＣＤＲ１）、配列番号１９７（ＣＤＲ２）、および配列番号１９８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、ならびに
ｘｖｉｉｉ）配列番号１９９（ＣＤＲ１）、配列番号２００（ＣＤＲ２）、および配列番号２０１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号２０２（ＣＤＲ１）、配列番号２０３（ＣＤＲ２）、および配列番号２０４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット
からなる群から選択される、タンパク質。
【請求項２】
ＤＬＬ３に特異的に結合する前記第１の抗原結合ユニットが、第１の軽鎖可変ドメインおよび第１の重鎖可変ドメインを含み、ｉ）〜ｘｖｉｉｉ）：
ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｉｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｉｖ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｖ）配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｖｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｖｉｉ）配列番号２０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｖｉｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｉｘ）配列番号２０９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｘ）配列番号２１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｘｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｘｉｉ）配列番号２１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｘｉｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｘｉｖ）配列番号２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｘｖ）配列番号２２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｘｖｉ）配列番号２２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｘｖｉｉ）配列番号２２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、ならびに
ｘｖｉｉｉ）配列番号２２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット
からなる群から選択される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
ＣＤ３に特異的に結合する前記第２の抗原結合ユニットが、ｉ）〜ｉｉｉ）：
ｉ）配列番号５５（ＣＤＲ１）、配列番号５６（ＣＤＲ２）、および配列番号５７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号５８（ＣＤＲ１）、配列番号５９（ＣＤＲ２）、および配列番号６０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｉｉ）配列番号６１（ＣＤＲ１）、配列番号６２（ＣＤＲ２）、および配列番号６３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号６４（ＣＤＲ１）、配列番号６５（ＣＤＲ２）、および配列番号６６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、ならびに
ｉｉｉ）配列番号９６（ＣＤＲ１）、配列番号９７（ＣＤＲ２）、および配列番号９８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号９９（ＣＤＲ１）、配列番号１００（ＣＤＲ２）、および配列番号１０１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット
からなる群から選択される、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
ＣＤ３に特異的に結合する前記第２の抗原結合ユニットが、ｉ）〜ｉｉｉ）：
ｉ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｉｉ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、ならびに
ｉｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号１０３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット
からなる群から選択される、第２の軽鎖可変ドメインおよび第２の重鎖可変ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
ｉ）ＤＬＬ３に特異的に結合する前記第１の抗原結合ユニットが、そのＮからＣ末端へ、第１の軽鎖可変ドメイン、第１の軽鎖定常ドメイン、第１のペプチドリンカー、第１の重鎖可変ドメイン、および第１の重鎖定常ＣＨ１ドメインを含み、
ｉｉ）ＣＤ３に特異的に結合する前記第２の抗原結合ユニットが、そのＮからＣ末端へ、第２の軽鎖可変ドメイン、第２の軽鎖定常ドメイン、第２のペプチドリンカー、第２の重鎖可変ドメイン、および第２の重鎖定常ＣＨ１ドメインを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記第１および／または第２のペプチドリンカーが、２６〜４２個のアミノ酸、好ましくは３０〜４０個のアミノ酸、３４〜４０個のアミノ酸、または３６〜３９個のアミノ酸のうちのいずれか１つ、より好ましくは３８個のアミノ酸を含む、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記第１のリンカーおよび／または第２のリンカーが、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーであり、好ましくは、配列番号８９のアミノ酸配列を含み、より好ましくは、前記第１および第２のペプチドリンカーが、同じ配列を含む、請求項５または６に記載のタンパク質。
【請求項８】
第１および第２のＦｃドメインをさらに含み、前記第１のＦｃドメインが、前記第１の抗原結合ユニットに共有結合により連結されており、前記第２のＦｃドメインが、前記第２の抗原結合ユニットに共有結合により連結されている、請求項５〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項９】
ｉ）前記第１のＦｃドメインが、３６６位にチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］を含み、前記第２のＦｃドメインが、４０７位にスレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］を含むか、または
ｉｉ）前記第１のＦｃドメインが、３６６位にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含み、前記第２のＦｃドメインが、３６６位にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、３６８位にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］、および４０７位にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含むか、または
ｉｉｉ）前記第２のＦｃドメインが、３６６位にチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］を含み、前記第１のＦｃドメインが、４０７位にスレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］を含むか、または
ｉｖ）前記第２のＦｃドメインが、３６６位にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含み、前記第１のＦｃドメインが、３６６位にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、３６８位にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］、および４０７位にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含み、
好ましくは、前記第１または前記第２のＦｃドメインが、４３５位にアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］および４３６位にフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］をさらに含む、請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記第１および／または前記第２のＦｃドメインが、２３４位にアラニン［Ｌ２３４Ａ］および２３５位にアラニン［Ｌ２３５Ａ］をさらに含む、請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記第１の軽鎖定常ドメインおよび前記第２の軽鎖定常ドメインが、ヒトカッパまたはラムダドメインを含む、請求項５〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１２】
配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、および配列番号２５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖と、配列番号７９、配列番号８０、または配列番号１０５のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む、タンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質の前記第１の抗原結合ユニットおよび／または前記第２の抗原結合ユニットをコードし、第１および／または第２のＦｃドメインをさらにコードしてもよい、単離された核酸分子。
【請求項１４】
請求項１２に記載の第１および／または第２のポリペプチド鎖をコードする、単離された核酸分子。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の発現ベクターがトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質を製造する方法であって、
ｉ）請求項１６に記載の宿主細胞を、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質の発現を可能にする条件下において培養するステップと、
ｉｉ）前記タンパク質を回収するステップと
を含み、
ｉｉｉ）さらに、前記タンパク質を精製および／または修飾および／または製剤化するステップ
を含んでもよい、方法。
【請求項１８】
ＤＬＬ３に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖と、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む、タンパク質であって、前記第１のポリペプチド鎖が、第１の軽鎖、第１のリンカー、および第１の重鎖を含み、前記第２のポリペプチド鎖が、第２の軽鎖、第２のリンカー、および第２の重鎖を含み、好ましくは、前記第１の軽鎖のＣ末端が、前記第１のペプチドリンカーを介して、前記第１の重鎖のＮ末端に共有結合により連結されており、前記第２の軽鎖のＣ末端が、前記第２のペプチドリンカーを介して、前記第２の重鎖のＮ末端に共有結合により連結されている、タンパク質。
【請求項１９】
ＤＬＬ３に特異的に結合する前記第１のポリペプチド鎖が、ｉ）〜ｘｖｉｉｉ）：
ｉ）配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）、および配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）、および配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｉｉ）配列番号７（ＣＤＲ１）、配列番号８（ＣＤＲ２）、および配列番号９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１０（ＣＤＲ１）、配列番号１１（ＣＤＲ２）、および配列番号１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｉｉｉ）配列番号１３（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）、および配列番号１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１６（ＣＤＲ１）、配列番号１７（ＣＤＲ２）、および配列番号１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｉｖ）配列番号１９（ＣＤＲ１）、配列番号２０（ＣＤＲ２）、および配列番号２１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号２２（ＣＤＲ１）、配列番号２３（ＣＤＲ２）、および配列番号２４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｖ）配列番号２５（ＣＤＲ１）、配列番号２６（ＣＤＲ２）、および配列番号２７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号２８（ＣＤＲ１）、配列番号２９（ＣＤＲ２）、および配列番号３０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｖｉ）配列番号３１（ＣＤＲ１）、配列番号３２（ＣＤＲ２）、および配列番号３３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号３４（ＣＤＲ１）、配列番号３５（ＣＤＲ２）、および配列番号３６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｖｉｉ）配列番号１３３（ＣＤＲ１）、配列番号１３４（ＣＤＲ２）、および配列番号１３５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１３６（ＣＤＲ１）、配列番号１３７（ＣＤＲ２）、および配列番号１３８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｖｉｉｉ）配列番号１３９（ＣＤＲ１）、配列番号１４０（ＣＤＲ２）、および配列番号１４１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１４２（ＣＤＲ１）、配列番号１４３（ＣＤＲ２）、および配列番号１４４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｉｘ）配列番号１４５（ＣＤＲ１）、配列番号１４６（ＣＤＲ２）、および配列番号１４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１４８（ＣＤＲ１）、配列番号１４９（ＣＤＲ２）、および配列番号１５０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｘ）配列番号１５１（ＣＤＲ１）、配列番号１５２（ＣＤＲ２）、および配列番号１５３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１５４（ＣＤＲ１）、配列番号１５５（ＣＤＲ２）、および配列番号１５６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｘｉ）配列番号１５７（ＣＤＲ１）、配列番号１５８（ＣＤＲ２）、および配列番号１５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１６０（ＣＤＲ１）、配列番号１６１（ＣＤＲ２）、および配列番号１６２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｘｉｉ）配列番号１６３（ＣＤＲ１）、配列番号１６４（ＣＤＲ２）、および配列番号１６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１６６（ＣＤＲ１）、配列番号１６７（ＣＤＲ２）、および配列番号１６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｘｉｉｉ）配列番号１６９（ＣＤＲ１）、配列番号１７０（ＣＤＲ２）、および配列番号１７１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１７２（ＣＤＲ１）、配列番号１７３（ＣＤＲ２）、および配列番号１７４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
配列番号１７５（ＣＤＲ１）、配列番号１７６（ＣＤＲ２）、および配列番号１７７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１７８（ＣＤＲ１）、配列番号１７９（ＣＤＲ２）、および配列番号１８０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｘｉｖ）配列番号１８１（ＣＤＲ１）、配列番号１８２（ＣＤＲ２）、および配列番号１８３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１８４（ＣＤＲ１）、配列番号１８５（ＣＤＲ２）、および配列番号１８６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｘｖ）配列番号１８７（ＣＤＲ１）、配列番号１８８（ＣＤＲ２）、および配列番号１８９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１９０（ＣＤＲ１）、配列番号１９１（ＣＤＲ２）、および配列番号１９２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｘｖｉ）配列番号１９３（ＣＤＲ１）、配列番号１９４（ＣＤＲ２）、および配列番号１９５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１９６（ＣＤＲ１）、配列番号１９７（ＣＤＲ２）、および配列番号１９８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、ならびに
ｘｖｉｉ）配列番号１９９（ＣＤＲ１）、配列番号２００（ＣＤＲ２）、および配列番号２０１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号２０２（ＣＤＲ１）、配列番号２０３（ＣＤＲ２）、および配列番号２０４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ
からなる群から選択されるＣＤＲ配列を含む、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含む、請求項１８に記載のタンパク質。
【請求項２０】
ＣＤ３に特異的に結合する前記第２のポリペプチド鎖が、ｉ）〜ｉｉｉ）：
ｉ）配列番号５５（ＣＤＲ１）、配列番号５６（ＣＤＲ２）、および配列番号５７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号５８（ＣＤＲ１）、配列番号５９（ＣＤＲ２）、および配列番号６０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｉｉ）配列番号６１（ＣＤＲ１）、配列番号６２（ＣＤＲ２）、および配列番号６３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号６４（ＣＤＲ１）、配列番号６５（ＣＤＲ２）、および配列番号６６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、ならびに
ｉｉｉ）配列番号９６（ＣＤＲ１）、配列番号９７（ＣＤＲ２）、および配列番号９８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号９９（ＣＤＲ１）、配列番号１００（ＣＤＲ２）、および配列番号１０１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ
からなる群から選択されるＣＤＲ配列を含む、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含む、請求項１８または１９に記載のタンパク質。
【請求項２１】
ＤＬＬ３に特異的に結合する前記第１のポリペプチド鎖が、ｉ）〜ｘｖｉｉｉ）：
ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
ｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
ｉｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
ｉｖ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
ｖ）配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
ｖｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
ｖｉｉ）配列番号２０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
ｖｉｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
ｉｘ）配列番号２０９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
ｘ）配列番号２１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
ｘｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
ｘｉｉ）配列番号２１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
ｘｉｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
ｘｉｖ）配列番号２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
ｘｖ）配列番号２２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
ｘｖｉ）配列番号２２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
ｘｖｉｉ）配列番号２２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに
ｘｖｉｉｉ）配列番号２２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン
からなる群から選択される軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２２】
ＣＤ３に特異的に結合する前記第２のポリペプチド鎖が、ｉ）〜ｉｉｉ）：
ｉ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
ｉｉ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに
ｉｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号１０３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン
からなる群から選択される軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含む、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２３】
前記第１および／または第２のペプチドリンカーが、２６〜４２個のアミノ酸、好ましくは３０〜４０個のアミノ酸、３４〜４０個のアミノ酸、または３６〜３９個のアミノ酸のうちのいずれか１つ、より好ましくは３８個のアミノ酸を含む、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２４】
前記第１のリンカーおよび／または第２のリンカーが、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーであり、好ましくは、配列番号８９のアミノ酸配列を含み、より好ましくは、前記第１および第２のペプチドリンカーが、同じ配列を含む、請求項２３に記載のタンパク質。
【請求項２５】
ｉ）前記第１の重鎖が、３６６位にチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］を含み、前記第２の重鎖が、４０７位にスレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］を含むか、または
ｉｉ）前記第１の重鎖が、３６６位にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含み、前記第２の重鎖が、３６６位にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、３６８位にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］、および４０７位にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含むか、または
ｉｉｉ）前記第２の重鎖が、３６６位にチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］を含み、前記第１の重鎖が、４０７位にスレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］を含むか、または
ｉｖ）前記第２の重鎖が、３６６位にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含み、前記第１の重鎖が、３６６位にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、３６８位にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］、および４０７位にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含み、
好ましくは、前記第１または前記第２の重鎖が、４３５位にアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］および４３６位にフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］をさらに含む、請求項１８〜２４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２６】
前記第１および／または前記第２の重鎖が、２３４位にアラニン［Ｌ２３４Ａ］および２３５位にアラニン［Ｌ２３５Ａ］をさらに含む、請求項２５に記載のタンパク質。
【請求項２７】
前記第１の軽鎖および前記第２の軽鎖が、ヒトカッパまたはラムダドメインを含む、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２８】
医薬において使用するための、請求項１〜１２または１８〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２９】
請求項１〜１２または１８〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項３０】
がんを処置する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の、請求項１〜１２または１８〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質を投与するステップを含む、方法。
【請求項３１】
がんを処置するための医薬組成物を調製するための、請求項１〜１２または１８〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質の使用。
【請求項３２】
がんを処置する方法において使用するための、請求項１〜１２または１８〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項３３】
前記がんが、ＤＬＬ３を発現する腫瘍であり、好ましくは、前記がんが、ＳＣＬＣ、神経膠芽腫、またはＤＬＬ３を発現する神経内分泌腫瘍である、請求項３０に記載の方法、請求項３１に記載の使用、または請求項３２に記載の使用のためのタンパク質。
【請求項３４】
前記タンパク質が、化学療法剤、血管新生を阻害する治療的に活性な化合物、シグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、免疫調節剤、免疫チェックポイント阻害剤、またはホルモン療法剤と組み合わせて使用される、請求項３０もしくは３３に記載の方法、請求項３１もしくは３３に記載の使用、または請求項３２もしくは３３に記載の使用のためのタンパク質。
【請求項３５】
前記タンパク質が、免疫チェックポイント阻害剤、好ましくは、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わされる、請求項３４に記載の方法、使用、または使用のためのタンパク質。
【請求項３６】
前記抗ＰＤ−１抗体が、ＰＤ１−１、ＰＤ１−２、ＰＤ１−３、ＰＤ１−４、およびＰＤ１−５からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法、使用、または使用のためのタンパク質。
【請求項３７】
抗ＤＬＬ３抗体分子であって、
ｉ）配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）、および配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）、および配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｉｉ）配列番号７（ＣＤＲ１）、配列番号８（ＣＤＲ２）、および配列番号９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１０（ＣＤＲ１）、配列番号１１（ＣＤＲ２）、および配列番号１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｉｉｉ）配列番号１３（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）、および配列番号１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１６（ＣＤＲ１）、配列番号１７（ＣＤＲ２）、および配列番号１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｉｖ）配列番号１９（ＣＤＲ１）、配列番号２０（ＣＤＲ２）、および配列番号２１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号２２（ＣＤＲ１）、配列番号２３（ＣＤＲ２）、および配列番号２４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｖ）配列番号２５（ＣＤＲ１）、配列番号２６（ＣＤＲ２）、および配列番号２７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号２８（ＣＤＲ１）、配列番号２９（ＣＤＲ２）、および配列番号３０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｖｉ）配列番号３１（ＣＤＲ１）、配列番号３２（ＣＤＲ２）、および配列番号３３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号３４（ＣＤＲ１）、配列番号３５（ＣＤＲ２）、および配列番号３６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｖｉｉ）配列番号１３３（ＣＤＲ１）、配列番号１３４（ＣＤＲ２）、および配列番号１３５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１３６（ＣＤＲ１）、配列番号１３７（ＣＤＲ２）、および配列番号１３８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｖｉｉｉ）配列番号１３９（ＣＤＲ１）、配列番号１４０（ＣＤＲ２）、および配列番号１４１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１４２（ＣＤＲ１）、配列番号１４３（ＣＤＲ２）、および配列番号１４４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｉｘ）配列番号１４５（ＣＤＲ１）、配列番号１４６（ＣＤＲ２）、および配列番号１４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１４８（ＣＤＲ１）、配列番号１４９（ＣＤＲ２）、および配列番号１５０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｘ）配列番号１５１（ＣＤＲ１）、配列番号１５２（ＣＤＲ２）、および配列番号１５３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１５４（ＣＤＲ１）、配列番号１５５（ＣＤＲ２）、および配列番号１５６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｘｉ）配列番号１５７（ＣＤＲ１）、配列番号１５８（ＣＤＲ２）、および配列番号１５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１６０（ＣＤＲ１）、配列番号１６１（ＣＤＲ２）、および配列番号１６２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｘｉｉ）配列番号１６３（ＣＤＲ１）、配列番号１６４（ＣＤＲ２）、および配列番号１６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１６６（ＣＤＲ１）、配列番号１６７（ＣＤＲ２）、および配列番号１６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｘｉｉｉ）配列番号１６９（ＣＤＲ１）、配列番号１７０（ＣＤＲ２）、および配列番号１７１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１７２（ＣＤＲ１）、配列番号１７３（ＣＤＲ２）、および配列番号１７４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｘｉｖ）配列番号１７５（ＣＤＲ１）、配列番号１７６（ＣＤＲ２）、および配列番号１７７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１７８（ＣＤＲ１）、配列番号１７９（ＣＤＲ２）、および配列番号１８０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｘｖ）配列番号１８１（ＣＤＲ１）、配列番号１８２（ＣＤＲ２）、および配列番号１８３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１８４（ＣＤＲ１）、配列番号１８５（ＣＤＲ２）、および配列番号１８６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｘｖｉ）配列番号１８７（ＣＤＲ１）、配列番号１８８（ＣＤＲ２）、および配列番号１８９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１９０（ＣＤＲ１）、配列番号１９１（ＣＤＲ２）、および配列番号１９２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｘｖｉｉ）配列番号１９３（ＣＤＲ１）、配列番号１９４（ＣＤＲ２）、および配列番号１９５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１９６（ＣＤＲ１）、配列番号１９７（ＣＤＲ２）、および配列番号１９８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｘｖｉｉｉ）配列番号１９９（ＣＤＲ１）、配列番号２００（ＣＤＲ２）、および配列番号２０１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号２０２（ＣＤＲ１）、配列番号２０３（ＣＤＲ２）、および配列番号２０４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ
を含む、抗ＤＬＬ３抗体分子。
【請求項３８】
前記抗体分子が、モノクローナル、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体分子である、請求項３７に記載の抗ＤＬＬ３抗体分子。
【請求項３９】
前記抗体分子が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、またはｓｃＦｖである、請求項３７または３８に記載の抗ＤＬＬ３抗体分子。
【請求項４０】
前記重鎖定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ定常領域からなる群から選択される、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の抗ＤＬＬ３抗体分子。
【請求項４１】
前記軽鎖定常領域が、カッパまたはラムダである、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の抗ＤＬＬ３抗体分子。
【請求項４２】
生物学的サンプル中のＤＬＬ３を検出する方法であって、
（ａ）前記サンプルを、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の抗ＤＬＬ３抗体と接触させるステップと、
（ｂ）前記サンプル中で、抗体−抗原複合体を形成させるステップと、
（ｃ）前記抗ＤＬＬ３抗体を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項４３】
前記抗ＤＬＬ３抗体が、検出可能なシグナルによって検出され、好ましくは、前記シグナルが、免疫細胞化学法（ＩＣＣ）、免疫組織化学法（ＩＨＣ）、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー、および／またはＥＬＩＳＡによって検出される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記生物学的サンプルが、組織サンプル、好ましくは、固定組織サンプルであり、より好ましくは、ホルマリンで固定しパラフィン包埋処理した組織サンプルである、請求項４２または４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗ＤＬＬ３抗体が、ＩＨＣによって検出される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記組織サンプルが、腫瘍組織サンプルであり、より好ましくは、ＳＣＬＣ、ＬＣＮＥＣ、神経膠腫、神経膠芽腫、黒色腫、または他の神経内分泌腫瘍からなる群から選択される腫瘍から単離された腫瘍組織サンプルである、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
ＤＬＬ３を検出するためのキットであって、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の抗体と、使用のための説明書とを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＬＬ３に特異的な第１の抗原結合ユニットと、ＣＤ３に特異的な第２の抗原結合ユニットとを含む、多重特異性結合タンパク質に関する。本発明はまた、そのような結合タンパク質をコードする核酸、そのような結合タンパク質を調製するための方法、そのような結合タンパク質を発現するかまたはそのような結合タンパク質を発現することができる宿主細胞、そのような結合タンパク質を含む組成物、ならびにそのような結合タンパク質または組成物の、特に、がん疾患の分野における治療目的での使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＬＬ３は、ノッチリガンドファミリーに属するＩ型膜貫通タンパク質である。ＤＬＬ３は、主として、体節形成に関与し、主にゴルジ体に局在化され、他のＤＬＬファミリーメンバーであり細胞表面に局在化されるＤＬＬ１およびＤＬＬ４とは対照的に、ノッチシグナル伝達の阻害剤として作用する。ＤＬＬ３が過剰発現されるがん細胞においてのみ、一部のＤＬＬ３分子は、細胞表面へと逃避する（Dylla, Molecular & Cellular Oncology 2016, Vol. 3, No. 2）。ＤＬＬ３は、いくつかの方法、たとえば、腫瘍組織のＬＣ／ＭＳ分析（国際公開第２０１４／１２５２７３号）、ＲＮＡシーケンシング（国際公開第２０１７／０２１３４９号）、および免疫組織化学法（Saunders et al., Sci Transl Med. 2015 Aug 26;7(302):302ra136、Saunders et al., AACR 2017、国際公開第２０１３／１２６７４６号）分析を使用して、腫瘍特異的標的として特定されている。
ＤＬＬ３の発現は、神経内分泌腫瘍、たとえば、大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、小細胞膀胱がん、神経内分泌性前立腺がん、神経内分泌性膵臓がん、および神経膠芽腫において、説明されている（Saunders et al., Sci Transl Med. 2015 Aug 26;7(302):302ra136、Saunders et al., AACR 2017）。
【０００３】
ＳＣＬＣは、極めて高度な医療を必要とする適応症の代表である。ＳＣＬＣは、肺がん診断のうちの１３％を占め、ＮＳＣＬＣよりも予後が悪い。これらのがんの従来的な処置としては、主として、化学療法、放射線療法、外科手術、またはこれらの組合せが挙げられ、依然として標的化療法は存在しない。化学療法に対する初期応答率は高いが、多くの患者は、化学療法耐性疾患が急速に再発し、それに利用可能な処置選択肢は存在しない。過去数年間にわたり、これらのがんの処置には改善が見られているが、これらの腫瘍型の全生存率は、変わらないままであり、したがって、さらに標的化された強力な治療法に対し、満たされていない医療上の必要性が存在している。
標的化療法の１つのアプローチは、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）によって提供される。しかしながら、ＤＬＬ３については、ＤＬＬ３の細胞表面発現が低いことおよび化学療法に対する高い耐性率に起因して、この戦略は好ましくない。患者の大半が化学療法処置の後に再発するため、および細胞表面におけるＤＬＬ３の発現が低いことに起因して、ＡＤＣによるＤＬＬ３の標的化は、制限を有し得る。加えて、ＡＤＣのアプローチは、リンカーの不安定性または分解の結果として、遊離薬物によって引き起こされる標的外毒性を有することが多い。
【０００４】
ＤＬＬ３の標的化を、他のタンパク質の標的化と組み合わせる試みが行われている。たとえば、国際公開第２０１７／０２１３４９号は、標的細胞の表面上のヒトＤＬＬ３への結合と、Ｔ細胞の表面上のヒトＣＤ３への結合を組み合わせた、二重特異性抗体コンストラクトについて記載している。しかしながら、そのようなアプローチが成功するかどうかは実証されておらず、現時点で、利用可能なＳＣＬＣおよび神経膠芽腫ならびに他のＤＬＬ３発現腫瘍のための標的化療法は存在しない。
【０００５】
そのようながん患者の前途の悪さを踏まえると、より有効な治療法、特に、耐容性が改善された有効な治療法を特定する必要性が存在する。したがって、現在使用されているおよび／または当該技術分野において公知の薬剤、組成物、および／または方法と比較して、ある特定の利点を提供する、薬理学的に活性な薬剤、組成物、および／または処置の方法を提供することが、本発明の目的である。これらの利点としては、インビボでの有効性、改善された治療特性および薬理学的特性、増加した特異性、改善された安全性プロファイル、より少ない副作用、低減された免疫原性、ならびに他の有利な特性、たとえば、特に、すでに当該技術分野において公知の候補薬物と比較して、改善された調製の容易さもしくは低減された物品の費用、より高い安定性／より長い半減期、より低頻度な投与レジメンの必要性が挙げられる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、Ｔ細胞上のＣＤ３に対する結合アームと、腫瘍細胞の細胞表面上のＤＬＬ３に対する結合アームとを有する多重特異性結合タンパク質を利用した、二重特異性Ｔ細胞エンゲージアプローチに基づく。Ｔ細胞および腫瘍細胞に同時に結合することにより、Ｔ細胞エンゲージャーは、これらの２つの細胞間で細胞溶解性シナプスの形成を強制的に行い、そうして、Ｔ細胞活性を、標的とされる腫瘍細胞へと選択的に再指向させる。
【０００７】
一態様において、本発明は、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１の抗原結合ユニットと、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合ユニットとを含む、多重特異性結合タンパク質であって、ＤＬＬ３に特異的に結合する前記第１の抗原結合ユニットが、ｉ）〜ｘｖｉｉｉ）：
ｉ）配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）、および配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）、および配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｉｉ）配列番号７（ＣＤＲ１）、配列番号８（ＣＤＲ２）、および配列番号９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１０（ＣＤＲ１）、配列番号１１（ＣＤＲ２）、および配列番号１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｉｉｉ）配列番号１３（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）、および配列番号１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１６（ＣＤＲ１）、配列番号１７（ＣＤＲ２）、および配列番号１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｉｖ）配列番号１９（ＣＤＲ１）、配列番号２０（ＣＤＲ２）、および配列番号２１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号２２（ＣＤＲ１）、配列番号２３（ＣＤＲ２）、および配列番号２４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｖ）配列番号２５（ＣＤＲ１）、配列番号２６（ＣＤＲ２）、および配列番号２７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号２８（ＣＤＲ１）、配列番号２９（ＣＤＲ２）、および配列番号３０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｖｉ）配列番号３１（ＣＤＲ１）、配列番号３２（ＣＤＲ２）、および配列番号３３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号３４（ＣＤＲ１）、配列番号３５（ＣＤＲ２）、および配列番号３６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｖｉｉ）配列番号１３３（ＣＤＲ１）、配列番号１３４（ＣＤＲ２）、および配列番号１３５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１３６（ＣＤＲ１）、配列番号１３７（ＣＤＲ２）、および配列番号１３８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｖｉｉｉ）配列番号１３９（ＣＤＲ１）、配列番号１４０（ＣＤＲ２）、および配列番号１４１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１４２（ＣＤＲ１）、配列番号１４３（ＣＤＲ２）、および配列番号１４４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｉｘ）配列番号１４５（ＣＤＲ１）、配列番号１４６（ＣＤＲ２）、および配列番号１４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１４８（ＣＤＲ１）、配列番号１４９（ＣＤＲ２）、および配列番号１５０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｘ）配列番号１５１（ＣＤＲ１）、配列番号１５２（ＣＤＲ２）、および配列番号１５３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１５４（ＣＤＲ１）、配列番号１５５（ＣＤＲ２）、および配列番号１５６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｘｉ）配列番号１５７（ＣＤＲ１）、配列番号１５８（ＣＤＲ２）、および配列番号１５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１６０（ＣＤＲ１）、配列番号１６１（ＣＤＲ２）、および配列番号１６２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｘｉｉ）配列番号１６３（ＣＤＲ１）、配列番号１６４（ＣＤＲ２）、および配列番号１６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１６６（ＣＤＲ１）、配列番号１６７（ＣＤＲ２）、および配列番号１６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｘｉｉｉ）配列番号１６９（ＣＤＲ１）、配列番号１７０（ＣＤＲ２）、および配列番号１７１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１７２（ＣＤＲ１）、配列番号１７３（ＣＤＲ２）、および配列番号１７４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｘｉｖ）配列番号１７５（ＣＤＲ１）、配列番号１７６（ＣＤＲ２）、および配列番号１７７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１７８（ＣＤＲ１）、配列番号１７９（ＣＤＲ２）、および配列番号１８０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｘｖ）配列番号１８１（ＣＤＲ１）、配列番号１８２（ＣＤＲ２）、および配列番号１８３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１８４（ＣＤＲ１）、配列番号１８５（ＣＤＲ２）、および配列番号１８６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｘｖｉ）配列番号１８７（ＣＤＲ１）、配列番号１８８（ＣＤＲ２）、および配列番号１８９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１９０（ＣＤＲ１）、配列番号１９１（ＣＤＲ２）、および配列番号１９２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｘｖｉｉ）配列番号１９３（ＣＤＲ１）、配列番号１９４（ＣＤＲ２）、および配列番号１９５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１９６（ＣＤＲ１）、配列番号１９７（ＣＤＲ２）、および配列番号１９８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、ならびに
ｘｖｉｉｉ）配列番号１９９（ＣＤＲ１）、配列番号２００（ＣＤＲ２）、および配列番号２０１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号２０２（ＣＤＲ１）、配列番号２０３（ＣＤＲ２）、および配列番号２０４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット
からなる群から選択される、多重特異性結合タンパク質を提供する。
【０００８】
本発明の結合タンパク質の一部の実施形態において、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１の抗原結合ユニットは、第１の軽鎖可変ドメインおよび第１の重鎖可変ドメインを含み、ｉ）〜ｘｖｉｉｉ）：
ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｉｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｉｖ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｖ）配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｖｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｖｉｉ）配列番号２０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｖｉｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｉｘ）配列番号２０９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｘ）配列番号２１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｘｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｘｉｉ）配列番号２１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｘｉｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｘｉｖ）配列番号２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｘｖ）配列番号２２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｘｖｉ）配列番号２２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｘｖｉｉ）配列番号２２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、ならびに
ｘｖｉｉｉ）配列番号２２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット
からなる群から選択される。
【０００９】
本発明の結合タンパク質の一部の実施形態において、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合ユニットは、ｉ）〜ｉｉｉ）：
ｉ）配列番号５５（ＣＤＲ１）、配列番号５６（ＣＤＲ２）、および配列番号５７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号５８（ＣＤＲ１）、配列番号５９（ＣＤＲ２）、および配列番号６０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、
ｉｉ）配列番号６１（ＣＤＲ１）、配列番号６２（ＣＤＲ２）、および配列番号６３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号６４（ＣＤＲ１）、配列番号６５（ＣＤＲ２）、および配列番号６６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット、ならびに
ｉｉｉ）配列番号９６（ＣＤＲ１）、配列番号９７（ＣＤＲ２）、および配列番号９８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号９９（ＣＤＲ１）、配列番号１００（ＣＤＲ２）、および配列番号１０１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット
からなる群から選択される。
【００１０】
本発明の結合タンパク質の一部の実施形態において、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合ユニットは、第２の軽鎖可変ドメインおよび第２の重鎖可変ドメインを含み、
ｉ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ｉｉ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、ならびに
ｉｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号１０３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット
からなる群から選択される。
【００１１】
本発明の一部の実施形態において、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１の抗原結合ユニットは、そのＮからＣ末端へ、第１の軽鎖可変ドメイン、第１の軽鎖定常ドメイン、第１のペプチドリンカー、第１の重鎖可変ドメイン、および第１の重鎖定常ＣＨ１ドメインを含み、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合ユニットは、そのＮ末端からＣ末端へ、第２の軽鎖可変ドメイン、第２の軽鎖定常ドメイン、第２のペプチドリンカー、第２の重鎖可変ドメイン、および第２の重鎖定常ＣＨ１ドメインを含む。本発明の一部の実施形態において、第１および／または第２のペプチドリンカーは、２６〜４２個のアミノ酸、好ましくは３０〜４０個のアミノ酸、３４〜４０個のアミノ酸、または３６〜３９個のアミノ酸のうちのいずれか１つ、より好ましくは３８個のアミノ酸を含む。本発明の一部の実施形態において、第１のリンカーおよび／または第２のリンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーであり、好ましくは、配列番号８９のアミノ酸配列を含み、より好ましくは、前記第１および第２のペプチドリンカーは、同じ配列を含む。
一部の実施形態において、本発明の結合タンパク質は、第１および第２のＦｃドメインをさらに含み、前記第１のＦｃドメインは、前記第１の抗原結合ユニットに共有結合により連結されており、前記第２のＦｃドメインは、前記第２の抗原結合ユニットに共有結合により連結されている。
【００１２】
本発明の一部の実施形態において、
ｉ）第１のＦｃドメインが、３６６位にチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］を含み、第２のＦｃドメインが、４０７位にスレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］を含むか、または
ｉｉ）第１のＦｃドメインが、３６６位にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含み、第２のＦｃドメインが、３６６位にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、３６８位にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］、および４０７位にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含むか、または
ｉｉｉ）第２のＦｃドメインが、３６６位にチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］を含み、第１のＦｃドメインが、４０７位にスレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］を含むか、または
ｉｖ）第２のＦｃドメインが、３６６位にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含み、第１のＦｃドメインが、３６６位にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、３６８位にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］、および４０７位にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含み、
好ましくは、第１または第２のＦｃドメインが、４３５位にアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］および４３６位にフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］をさらに含む。一部の実施形態において、第１および／または第２のＦｃドメインは、２３４位にアラニン［Ｌ２３４Ａ］および２３５位にアラニン［Ｌ２３５Ａ］をさらに含む。一部の実施形態において、第１の軽鎖定常ドメインおよび第２の軽鎖定常ドメインは、ヒトカッパまたはラムダドメインを含む。
【００１３】
好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、および配列番号２５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖と、配列番号７９、配列番号８０、または配列番号１０５のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む。
さらなる態様において、本発明は、ｉ）本発明のタンパク質の第１の抗原結合ユニットおよび／もしくは第２の抗原結合ユニットをコードし、第１および／もしくは第２のＦｃドメインをさらにコードしてもよい、単離された核酸分子、またはｉｉ）本発明のタンパク質の第１および／もしくは第２のポリペプチド鎖をコードする、単離された核酸分子を提供する。さらなる態様において、本発明の核酸分子を含む発現ベクター、そのような発現ベクターがトランスフェクトされた宿主細胞、および本発明のタンパク質を製造する方法が、本明細書において提供される。
【００１４】
本発明のさらなる態様において、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖と、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む、多重特異性結合タンパク質であって、第１のポリペプチド鎖が、第１の軽鎖、第１のリンカー、および第１の重鎖を含み、第２のポリペプチド鎖が、第２の軽鎖、第２のリンカー、および第２の重鎖を含み、好ましくは、前記第１の軽鎖のＣ末端が、前記第１のペプチドリンカーを介して、前記第１の重鎖のＮ末端に共有結合により連結されており、前記第２の軽鎖のＣ末端が、前記第２のペプチドリンカーを介して、前記第２の重鎖のＮ末端に共有結合により連結されている、多重特異性結合タンパク質が、本明細書において提供される。
【００１５】
本発明の結合タンパク質の一部の実施形態において、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖は、本明細書に記載されるＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３、ＤＬＬ３＃４、ＤＬＬ３＃５、ＤＬＬ３＃６、ＤＬＬ３＃７、ＤＬＬ３＃８、ＤＬＬ３＃９、ＤＬＬ３＃１０、ＤＬＬ３＃１１、ＤＬＬ３＃１２、ＤＬＬ３＃１３、ＤＬＬ３＃１４、ＤＬＬ３＃１５、ＤＬＬ３＃１６、ＤＬＬ３＃１７、またはＤＬＬ３＃１８の抗原結合ユニットについて定義されるＣＤＲ配列および／またはＶＨ／ＶＬ配列を含む、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態において、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖は、本明細書に記載されるＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、またはＣＤ３＃３の抗原結合ユニットについて定義されるＣＤＲ配列および／またはＶＨ／ＶＬ配列を含む、軽鎖可変および重鎖可変ドメインを含む。
本発明の結合タンパク質に関与するさらなる態様、実施形態、使用、および方法は、以下の本発明の詳細な説明および添付の特許請求の範囲から、明らかとなろう。
本発明は、ＤＬＬ３を発現するがん、たとえば、ＳＣＬＣ、神経膠芽腫、またはＤＬＬ３を発現する神経内分泌腫瘍のより効率的な処置を可能にする、新規な結合タンパク質を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の二重特異性結合タンパク質の概略図である。
【図２】エピトープドメインマッピングのためのＨＥＫ２９３細胞上に発現される、ＤＬＬ３全長タンパク質およびＤＬＬ３ドメインコンストラクトの概略図である。ＤＬＬ３ドメインコンストラクトについては、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、ＥｐＣＡＭに由来する。
【図３Ａ】７つの例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質のＤＬＬ３エピトープドメインマッピングを示す図である。ＤＬＬ３の膜近傍ペプチド、ＥＧＦ４、ＥＧＦ１、およびＤＳＬドメインを認識する例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質である。ｙ軸は、計数を示し、ｘ軸は、ＰＥ−Ａ（フィコエリトリンシグナル領域）を示す。
【図３Ｂ】６つの例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質のＤＬＬ３エピトープドメインマッピングを示す図である。ＤＬＬ３のＥＧＦ１、ＥＧＦ３、ＥＧＦ４、またはＥＧＦ６を認識する例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質である。ｙ軸は、計数を示し、ｘ軸は、ＰＥ−Ａ（フィコエリトリンシグナル）を示す。
【図３Ｃ】６つの例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質のＤＬＬ３エピトープドメインマッピングを示す図である。ＤＳＬドメインを認識するか、またはＤＬＬ３のＤＳＬも、ＥＧＦも、膜近傍ペプチドも認識しない、例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質である。ｙ軸は、計数を示し、ｘ軸は、ＰＥ−Ａ（フィコエリトリンシグナル）を示す。
【図４】７つの例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の、ヒトおよびカニクイザルＤＬＬ３を発現する細胞株への結合を示す図である。ｙ軸は、計数を示し、ｘ軸は、ＰＥ−Ａ（フィコエリトリンシグナル領域）を示す。
【図５】７つの例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の、ヒトＤＬＬ１およびＤＬＬ４を発現する細胞株への結合を示す図であり、ヒトＤＬＬ１およびＤＬＬ４への結合は検出されなかった。ｙ軸は、計数を示し、ｘ軸は、ＰＥ−Ａ（フィコエリトリンシグナル領域）を示す。
【図６Ａ】フローサイトメトリー分析による、７つの例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の、ＳＣＬＣ細胞株およびヒトＴ細胞への結合を示す図である。
【図６Ｂ】例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＤＳＬでもＥＧＦ１〜６でも膜近傍ペプチドでもないペプチドに指向される）の、ＳＨＰ７７細胞への結合を示す図である。
【図６Ｃ】例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＤＳＬドメインに対して指向される）の、ＳＨＰ７７細胞への結合を示す図である。
【図６Ｄ】例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＥＧＦ１ドメインに対して指向される）の、ＳＨＰ７７細胞への結合を示す図である。
【図６Ｅ】例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＥＧＦ３ドメインに対して指向される）の、ＳＨＰ７７細胞への結合を示す図である。
【図６Ｆ】例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＥＧＦ４ドメインに対して指向される）の、ＳＨＰ７７細胞への結合を示す図である。
【図６Ｇ】例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＤＳＬドメインに対して指向される）の、ＳＨＰ７７細胞への結合を示す図である。
【図６Ｈ】例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（膜近傍ペプチドドメインに対して指向される）の、ＳＨＰ７７細胞への結合を示す図である。
【図６Ｉ】例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＤＳＬでもＥＧＦ１〜６でも膜近傍ペプチドでもないペプチドに指向される）の、ＮＣＩ−Ｈ８２細胞への結合を示す図ある。
【図６Ｊ】例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＤＳＬドメインに対して指向される）の、ＮＣＩ−Ｈ８２細胞への結合を示す図である。
【図６Ｋ】例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＥＧＦ１ドメインに対して指向される）の、ＮＣＩ−Ｈ８２細胞への結合を示す図である。
【図６Ｌ】例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＥＧＦ３ドメインに対して指向される）の、ＮＣＩ−Ｈ８２細胞への結合を示す図である。
【図６Ｍ】例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＥＧＦ４ドメインに対して指向される）の、ＮＣＩ−Ｈ８２細胞への結合を示す図である。
【図６Ｎ】例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＤＳＬドメインに対して指向される）の、ＮＣＩ−Ｈ８２細胞への結合を示す図である。
【図６Ｏ】例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（膜近傍ペプチドドメインに対して指向される）の、ＮＣＩ−Ｈ８２細胞への結合を示す図である。
【図６Ｐ】例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＤＳＬでもＥＧＦ１〜６でも膜近傍ペプチドでもないペプチドに指向される）の、Ｔ細胞への結合を示す図である。
【図６Ｑ】例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＤＳＬドメインに対して指向される）の、Ｔ細胞への結合を示す図である。
【図６Ｒ】例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＥＧＦ１ドメインに対して指向される）の、Ｔ細胞への結合を示す図である。
【図６Ｓ】例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＥＧＦ３ドメインに対して指向される）の、Ｔ細胞への結合を示す図である。
【図６Ｔ】例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＥＧＦ４ドメインに対して指向される）の、Ｔ細胞への結合を示す図である。
【図６Ｕ】例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＥＧＦ６ドメインに対して指向される）の、Ｔ細胞への結合を示す図である。
【図６Ｖ】例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（膜近傍ペプチドドメインに対して指向される）の、Ｔ細胞への結合を示す図である。
【図７Ａ】細胞を溶解させることにおける、刺激されていないＰＢＭＣをヒトＳＣＬＣ細胞株へと再指向させる７つのＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の有効性を示す図である。
【図７Ｂ】細胞を溶解させることにおける、刺激されていないＴ細胞をヒトＳＨＰ７７細胞へと再指向させる例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＤＳＬでもＥＧＦ１〜６でも膜近傍ペプチドでもないペプチドに指向される）の有効性を示す図である。
【図７Ｃ】細胞を溶解させることにおける、刺激されていないＴ細胞をヒトＳＨＰ７７細胞へと再指向させる例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＤＳＬドメインに対して指向される）の有効性を示す図である。
【図７Ｄ】細胞を溶解させることにおける、刺激されていないＴ細胞をヒトＳＨＰ７７細胞へと再指向させる例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＥＧＦ１ドメインに対して指向される）の有効性を示す図である。
【図７Ｅ】細胞を溶解させることにおける、刺激されていないＴ細胞をヒトＳＨＰ７７細胞へと再指向させる例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＥＧＦ３ドメインに対して指向される）の有効性を示す図である。
【図７Ｆ】細胞を溶解させることにおける、刺激されていないＴ細胞をヒトＳＨＰ７７細胞へと再指向させる例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＥＧＦ４ドメインに対して指向される）の有効性を示す図である。
【図７Ｇ】細胞を溶解させることにおける、刺激されていないＴ細胞をヒトＳＨＰ７７細胞へと再指向させる例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＥＧＦ６ドメインに対して指向される）の有効性を示す図である。
【図７Ｈ】細胞を溶解させることにおける、刺激されていないＴ細胞をヒトＳＨＰ７７細胞へと再指向させる例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（膜近傍ペプチドに対して指向される）の有効性を示す図である。
【図７Ｉ】細胞を溶解させることにおける、刺激されていないＴ細胞をヒトＮＣＩ−Ｈ８２細胞へと再指向させる例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＤＳＬでもＥＧＦ１〜６でも膜近傍ペプチドでもないペプチドに指向される）の有効性を示す図である。
【図７Ｊ】細胞を溶解させることにおける、刺激されていないＴ細胞をヒトＮＣＩ−Ｈ８２細胞へと再指向させる例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＤＳＬドメインに対して指向される）の有効性を示す図である。
【図７Ｋ】細胞を溶解させることにおける、刺激されていないＴ細胞をヒトＮＣＩ−Ｈ８２細胞へと再指向させる例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＥＧＦ１ドメインに対して指向される）の有効性を示す図である。
【図７Ｌ】細胞を溶解させることにおける、刺激されていないＴ細胞をヒトＮＣＩ−Ｈ８２細胞へと再指向させる例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＥＧＦ３ドメインに対して指向される）の有効性を示す図である。
【図７Ｍ】細胞を溶解させることにおける、刺激されていないＴ細胞をヒトＮＣＩ−Ｈ８２細胞へと再指向させる例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＥＧＦ４ドメインに対して指向される）の有効性を示す図である。
【図７Ｎ】細胞を溶解させることにおける、刺激されていないＴ細胞をヒトＮＣＩ−Ｈ８２細胞へと再指向させる例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（ＥＧＦ６ドメインに対して指向される）の有効性を示す図である。
【図７Ｏ】細胞を溶解させることにおける刺激されていないＴ細胞をヒトＮＣＩ−Ｈ８２細胞へと再指向させる例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（膜近傍ペプチドに対して指向される）の有効性を示す図である。
【図８】２つの例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質を用いたインビトロ内部移行アッセイを示す図である。ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質を、ＤＬＬ３陽性ＳＨＰ７７細胞とともに、２時間および４時間、プレインキュベートした後に、ヒトＰＢＭＣとともに４８時間共インキュベートした。
【図９】２つの例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の薬物動態を示す図である。１ｍｇ／ｋｇの単回の静脈内投薬後の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１（白四角形）およびＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２（黒四角形）の平均薬物動態プロファイルである。
【図１０】２つの例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の抗腫瘍活性を示す図である。ｙ軸は、腫瘍体積中央値を示し、ｘ軸は、時間を示す。
【図１１】細胞を溶解させることにおける、刺激されていないＰＢＭＣをヒトＳＨＰ７７およびＲＫＯ−Ｅ６細胞へと再指向させる例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の有効性を示す図である。
【図１２】ＳＨＰ７７細胞の存在下での、Ｔ細胞活性化における例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の有効性を示す図である。
【図１３】ＳＨＰ７７細胞の存在下での、Ｔ細胞脱顆粒化における例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の有効性を示す図である。
【図１４Ａ】ＳＨＰ７７細胞の存在下での、ＰＢＭＣによるインターフェロンガンマの分泌における例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の有効性を示す図である。
【図１４Ｂ】ＳＨＰ７７細胞の存在下での、ＰＢＭＣによるＭＣＰ−１の分泌における例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の有効性を示す図である。
【図１５】ＳＨＰ７７細胞の存在下での、Ｔ細胞の増殖における例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の有効性を示す図である。
【図１６】細胞を溶解させることにおける、刺激されていないパンＴ細胞およびナイーブＴ細胞をヒトＳＨＰ７７細胞へと再指向させる例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の有効性を示す図である。
【図１７】細胞を溶解させることにおける、刺激されていないＣＤ４+およびＣＤ４+セントラルメモリーＴ細胞をヒトＳＨＰ７７細胞へと再指向させる例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の有効性を示す図である。
【図１８】細胞を溶解させることにおける、刺激されていないＣＤ４+およびＣＤ４+エフェクターメモリーＴ細胞をヒトＳＨＰ７７細胞へと再指向させる例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の有効性を示す図である。
【図１９】細胞を溶解させることにおける、刺激されていないＣＤ８+およびＣＤ８+ＣＤ４５ＲＡ+エフェクターメモリーＴ細胞をヒトＳＨＰ７７細胞へと再指向させる例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の有効性を示す図である。
【図２０】細胞を溶解させることにおける、刺激されていないＣＤ８+およびＣＤ８+メモリーＴ細胞をヒトＳＨＰ７７へと再指向させる例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の有効性を示す図である。
【図２１】例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質によるＳＨＰ７７異種移植片腫瘍組織へのＴ細胞浸潤を示す図である。
【図２２】ＥＬＩＳＡアッセイにおける、３つの例示的な抗ＤＬＬ３抗体の組換えＤＬＬ３タンパク質への結合を示す図である。ｙ軸は、計数を示し、ｘ軸は、ＤＬＬ３タンパク質の濃度を示す。
【図２３】フローサイトメトリーによって判定される、６つの例示的な抗ＤＬＬ３抗体のＤＬＬ３陽性ＳＣＬＣ細胞株への結合を示す図である。ｙ軸は、計数を示し、ｘ軸は、抗ＤＬＬ３抗体の濃度を示す。
【図２４】５つの例示的な抗ＤＬＬ３抗体によるＳＣＬＣ組織サンプルの代表的な染色を示す図である。抗ＤＬＬ３抗体ＤＬＬ３＃１およびＤＬＬ３＃５は、腫瘍細胞が、点状および／または拡散した細胞質および／または膜状のＤＬＬ３染色を呈することを示す。画像は、ＬＥＩＣＡ  ＳＣＮ４００自動化スキャナーによって１０倍の拡大率で電子的に生成された。
【図２５】異なるＤＬＬ３発現レベルを有するＳＣＬＣ細胞株に由来する細胞ペレットの代表的な染色を示す図である。抗ＤＬＬ３抗体はＤＬＬ３＃５である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
使用される用語および定義
本発明の上記およびその他の態様および実施形態は、本明細書のさらなる説明から、明らかになろう。
【００１８】
別途示されるか定義されない限り、使用されるすべての用語は、当該技術分野における通常の意味を有し、これは、当業者には明らかであろう。たとえば、標準的な教本、たとえば、Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), VoIs. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990)、およびRoitt et al., "Immunology" (2nd Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989)、ならびに本明細書に引用される一般的な背景技術への参照がなされる。さらに、別途示されない限り、当業者には明らかなように、具体的に詳述されていないすべての方法、ステップ、技法、および操作は、本質的に公知の様式で実行することができ、またそのように実行されている。さらに、たとえば、標準的な教本、上記で言及されている一般的な背景技術、およびそこに引用されているさらなる参考文献への参照がなされる。
本明細書において使用される場合、「含む（comprising）」という用語およびその変化形、たとえば、「含む（comprises）」および「含む（comprise）」は、「含む（containing）」または「含む（including）」または「有する（having）」で置き換えることができる。
【００１９】
本明細書において（たとえば、「重鎖／軽鎖配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「定常ドメイン配列」、または「タンパク質配列」などの用語において）使用される「配列」という用語は、概して、文脈によってより限定的な解釈が必要とされない限り、関連するアミノ酸配列ならびにそれをコードする核酸配列またはヌクレオチド配列の両方を含むことが理解されるものとする。
本明細書において使用される「抗原結合ユニット」とは、その特定の標的または抗原に結合することができ、標的結合を可能にする抗体由来の（典型的に抗体に存在する）最低限の構造要件を含む、ポリペプチドを指す。したがって、抗原結合ユニットは、少なくとも、３つの軽鎖および３つの重鎖ＣＤＲ配列の存在、好ましくは、少なくとも軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含む。
【００２０】
抗体または免疫グロブリンの一般化された構造は、当業者には周知である。これらの分子は、２つの同一な軽鎖（Ｌ）および２つの同一な重鎖（Ｈ）から構成される、典型的には約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、典型的に、全長抗体と称される。それぞれの軽鎖は、１つのジスルフィド結合によって重鎖に共有結合で連結されて、ヘテロ二量体を形成しており、ヘテロ四量体分子は、ヘテロ二量体の２つの同一な重鎖間での共有結合によるジスルフィド結合を通じて形成される。軽鎖および重鎖は、１つのジスルフィド結合によって一緒に連結されるが、２つの重鎖間のジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンアイソタイプによって変動する。それぞれの重鎖および軽鎖はまた、規則的に離間した鎖内ジスルフィド結合を有する。それぞれの重鎖は、Ｎ末端に、可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いて、３つまたは４つ（ＩｇＥの場合）の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）、ならびにＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジ領域を有する。それぞれの軽鎖は、Ｎ末端側の可変ドメイン（ＶＬ）およびＣ末端側の定常ドメイン（ＣＬ）という２つのドメインを有する。ＶＬドメインは、非共有結合によりＶＨドメインと会合し、一方で、ＣＬドメインは、一般に、ジスルフィド結合を介してＣＨ１ドメインに共有結合で連結される。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の境界部を形成すると考えられている（Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663）。可変ドメインは、本明細書において、可変領域またはＦｖとも称され、抗原結合部位を有することで、抗体に、抗原に対する特異性を付与する部分を指す。
【００２１】
本明細書において使用される「軽鎖可変ドメイン」（または「軽鎖可変領域」）および「重鎖可変ドメイン」（または「重鎖可変領域」）は、同じ一般構造を有し、それぞれのドメインは、配列が広く保存されており、当該技術分野および本明細書の下記においてそれぞれ「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」、および「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」と称される４つのフレームワーク（ＦＲ）領域から本質的になり、これらのフレームワーク領域は、当該技術分野および本明細書の下記においてそれぞれ「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」、および「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」と称される３つの超可変領域、ＨＶＲ（またはＣＤＲ）で分断されている。したがって、免疫グロブリン可変ドメインの一般構造または配列は、以下のように示すことができる：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。フレームワーク領域は、ベータシート構造を採用し、ＣＤＲは、ベータシート構造を接続するループを形成し得る。それぞれの鎖におけるＣＤＲは、フレームワーク領域によって３次元構造で保持され、他の鎖に由来するＣＤＲと一緒に、抗原結合部位を形成している。
【００２２】
本発明の文脈内で、ＣＤＲへの参照は、ＩＭＧＴとも称されるＣＣＧの定義に基づく（Lefranc MP, Pommie C, Ruiz M, Giudicelli V, Foulquier E, Truong L, Thouvenin-Contet V, Lefranc G. "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains." Dev Comp Immunol. 2003 Jan;27(1):55-77、Giudicelli V, Brochet X, Lefranc MP. "IMGT/V-QUEST: IMGT standardized analysis of the immunoglobulin (IG) and T cell receptor (TR) nucleotide sequences". Cold Spring Harb Protoc. 2011;2011(6):695-715。当該技術分野において公知のＣＤＲの別の定義は、Ｋａｂａｔ（E.A. Kabat, T.T. Wu, H. Bilofsky, M. Reid-Miller and H. Perry, Sequence of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda (1983)）とともに、Ｃｈｏｔｈｉａ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 1987, 196: 901-917）に基づく。
【００２３】
本出願内において使用される「定常ドメイン」または「定常領域」という用語は、可変領域以外の抗体のドメインの合計を指す。そのような定常ドメインおよび領域は、当該技術分野において周知であり、たとえば、Ｋａｂａｔら（"Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91）によって記載されている。
【００２４】
抗体の「Ｆｃ部分」または「Ｆｃドメイン」は、抗体の抗原への結合に直接関わらないが、様々なエフェクター機能を示す。「抗体のＦｃ部分／ドメイン」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定義される。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体または免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのクラスに分割される。重鎖定常領域に応じて、免疫グロブリンの異なるクラスは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと称される。これらのうちのいくつかは、さらに、サブクラス（アイソタイプ）、たとえば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分割され得る。抗体のＦｃ部分は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、およびＦｃ受容体結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞毒性）およびＣＤＣ（補体依存性細胞毒性）に直接関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、補体因子Ｃ１ｑの、ほとんどのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分への結合によって開始される。補体系に対する抗体の影響は、ある特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ部分における定義された結合部位によって引き起こされる。そのような結合部位は、たとえば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、およびＰ３２９である（番号付けは、ＵＥ番号付けに従う（Edelman et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May;63(1):78-85)）。これらの残基のなかで、ＩｇＧ１においてＣ１ｑおよびＦｃガンマ受容体結合を媒介するのに最も重要なものは、Ｌ２３４およびＬ２３５である（Hezareh et al., J. Virology 75 (2001) 12161- 12168、Shields et al (2001) JBC, 276 (9): 6591-6604）。サブクラスＩｇＧ１およびＩｇＧ３の抗体は、通常、補体活性化ならびにＣ１ｑおよびＣ３結合を示し、一方でＩｇＧ２およびＩｇＧ４は、補体系を活性化せず、Ｃ１ｑおよびＣ３に結合しない。
【００２５】
「抗体」または「抗体分子」（本明細書において同義に使用される）という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体）、抗体のフラグメント、特に、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体、特に、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、一本鎖Ｆａｂフラグメント（ｓｃＦａｂ）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、ドメイン抗体、ナノボディ、ダイアボディを包含する。抗体は、通常、抗体のＦｃ部分（抗体定常領域）によって媒介される、エフェクター機能、たとえば、ＡＤＣＣもしくはＣＤＣを有し得るか、または抗体は、たとえば、Ｆｃ部分が欠如しているかもしくは遮断されマスクされたＦｃ部分、本質的に免疫細胞もしくは補体系などの免疫系構成要素によって認識されないかもしくは不十分に認識されるＦｃ部分、を有することによって、エフェクター機能を有さない場合がある。
【００２６】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、アミノ酸配列が同一である単一特異性抗体である。これらは、特定の抗体産生Ｂ細胞と骨髄腫（Ｂ細胞がん）細胞との融合体のクローンを表すハイブリッド細胞株（ハイブリドーマと称される）から、ハイブリドーマ技術によって産生させることができる（Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975;256:495-7）。あるいは、モノクローナル抗体は、宿主細胞における組換え発現によって産生してもよい（Norderhaug L, Olafsen T, Michaelsen TE, Sandlie I. (May 1997). "Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells." J Immunol Methods 204 (1): 77-87、以下もまた参照されたい）。「組換え抗体」または「組換え結合タンパク質」は、組換え操作された宿主細胞によって産生された、抗体または結合タンパク質である。これは、単離または精製されていてもよい。
全長抗体を、酵素、たとえば、パパインまたはペプシンで処理して、有用な抗体フラグメントを生成することができる。パパイン消化は、それぞれが単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フラグメントと称される２つの同一な抗原結合抗体フラグメント、ならびに残りの「Ｆｃ」フラグメントを産生するために使用される。Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖のＣＨ１ドメインを含む。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原への架橋が可能なＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。
【００２７】
Ｆａｂ’フラグメントは、ＣＨ１ドメインのＣ末端における抗体ヒンジ領域に由来する１つまたは複数のシステインを含む追加の残基の存在が、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、ヒンジ領域におけるシステイン残基によって連結されたＦａｂ’フラグメントの対である。抗体フラグメントの他の化学的カップリングもまた、公知である。
「Ｆｖ」フラグメントは、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインが緊密な非共有結合で会合した二量体からなる、完全な抗原認識および結合部位を含む。この構成では、それぞれの可変ドメインの３つのＣＤＲが、相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合性部位を定めている。まとめると、６つのＣＤＲにより、抗体には、抗原結合特異性が付与される。
【００２８】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む一本鎖Ｆｖバリアントであり、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖で存在する。一本鎖Ｆｖは、抗原を認識し、それに結合することができる。ｓｃＦｖポリペプチドはまた、ｓｃＦｖによる抗原結合に所望される三次元構造の形成を容易にするために、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に配置されるポリペプチドリンカーを含んでもよい（たとえば、Pluckthun, 1994, In The Pharmacology of monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315を参照されたい）。
【００２９】
「一本鎖Ｆａｂ」または「ｓｃＦａｂ」抗体フラグメントは、抗体のＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、およびＣＨ１ドメインを含む一本鎖Ｆａｂバリアントであり、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一本鎖Ｆａｂは、抗原を認識し、それに結合することができる。ｓｃＦａｂポリペプチドはまた、ＣＬドメインとＶＨドメインとの間に配置されるポリペプチドリンカーを含んでもよい（Hust et al (2007) BMC Biotechnology）。
【００３０】
人間における適用に関して、多くの場合、もともとマウスなどの他の種に由来する、治療用分子、たとえば、本明細書に記載される抗原結合ユニットを含む抗体または結合タンパク質の免疫原性を低減させることが望ましい。これは、キメラ抗体／結合タンパク質の構築によって、または「ヒト化」と称されるプロセスによって、行うことができる。この文脈において、「キメラ抗体」または「キメラ抗原結合ユニット」は、１つの種（たとえば、マウス）に由来する配列部分（たとえば、可変ドメイン）が、異なる種（たとえば、ヒト）に由来する配列部分（たとえば、定常ドメイン）に融合されたものを含む、抗体または抗原結合ユニットであると理解される。この文脈において、「ヒト化抗体」、「ヒト化結合タンパク質」、または「ヒト化抗原結合ユニット」は、もともと非ヒト種に由来する可変ドメインを含む抗体、タンパク質、または抗原結合ユニットであり、ある特定のアミノ酸が、その可変ドメインの全体的な配列をヒト可変ドメインの配列により近似するように突然変異されている。抗体のヒト化の方法は、当該技術分野において周知である（Billetta R, Lobuglio AF. "Chimeric antibodies". Int Rev Immunol. 1993;10(2-3):165-76、Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G (1988). "Reshaping human antibodies for therapy". Nature: 332:323）。
【００３１】
「最適化された抗体」または「最適化された抗原結合ユニットもしくはタンパク質」は、所定の抗原に結合することができ、実質的にヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＦＲおよび実質的に非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＣＤＲを含む、免疫グロブリンアミノ酸配列バリアントを含む、特定の種類のヒト化抗体またはヒト化抗原結合ユニット／タンパク質、またはそのフラグメントである。多くの場合「移入」配列と称される、この非ヒトアミノ酸配列は、典型的に、「移入」抗体ドメイン、特に、可変ドメインから取られる。一般に、最適化された抗体には、少なくとも、ヒト重鎖または軽鎖可変ドメインのＦＲの間に挿入された、非ヒト抗体のまたは非ヒト抗体に由来するＣＤＲ（またはＨＶＬ）が含まれる。ある特定のマウスＦＲ残基が、最適化された抗体の機能に重要であり得、したがって、ヒト生殖細胞系配列の重鎖および軽鎖可変ドメイン残基のうちのある特定のものが、対応するマウス配列のものと同じになるように修飾されることが、理解されるであろう。このプロセスの間に、たとえば、脱アミド化、望ましくない電荷もしくは親油性、または非特異的結合を回避するために、望ましくないアミノ酸の除去または変更も行われ得る。「最適化された抗体」、「最適化された抗体フラグメント」、または「最適化された」は、しばしば、「ヒト化抗体」、「ヒト化抗体フラグメント」、または「ヒト化」、または「配列最適化された」と称され得る。
【００３２】
さらに、たとえば、ファージディスプレイまたはトランスジェニック動物の使用により、ヒトゲノムに由来する配列に基づいて、抗体またはＶＨ／ＶＬドメインを作成するための技術が、開発されている（WWW. Ablexis.com/technology-alivamab.php、国際公開第９０／０５１４４号、D. Marks, H.R. Hoogenboom, T.P. Bonnert, J. McCafferty, A.D. Griffiths and G. Winter (1991) "By-passing immunisation. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage." J.Mol.Biol., 222, 581-597、Knappik et al., J. Mol. Biol. 296: 57-86, 2000; S. Carmen and L. Jermutus, "Concepts in antibody phage display". Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2002 1(2):189-203、Lonberg N, Huszar D. "Human antibodies from transgenic mice". Int Rev Immunol. 1995;13(1):65-93.、Bruggemann M, Taussig MJ. "Production of human antibody repertoires in transgenic mice". Curr Opin Biotechnol. 1997 Aug;8(4):455-8．）。そのような抗体または抗原結合ユニットまたはＶＨ／ＶＬドメインは、本発明の文脈において、「ヒト抗体」、「ヒト抗原結合ユニット」、または「ヒトＶＨ／ＶＬドメイン」である。
【００３３】
本明細書において使用される「ヒト抗体」、「ヒト抗原結合ユニット」、または「ヒトＶＨ／ＶＬドメイン」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変（および該当する場合には定常）領域を有する抗体、抗原結合ユニット、またはＶＨ／ＶＬドメインを含むことが意図される。本技術のヒト抗体、抗原結合ユニット、タンパク質、またはＶＨ／ＶＬドメインは、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（たとえば、インビトロでランダムもしくは部位特異的突然変異生成によって、またはインビボで体細胞系突然変異によって導入される、突然変異）を含み得る。しかしながら、本明細書において使用される「ヒト抗体」、「ヒト抗原結合ユニット」、または「ヒトＶＨ／ＶＬドメイン」という用語は、マウス、ラット、またはウサギなどの別のもの（哺乳類種）の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むようには意図されない。したがって、本明細書において使用される場合、「ヒト抗体」、「ヒト抗原結合ユニット」、または「ヒトＶＨ／ＶＬドメイン」という用語は、タンパク質の実質的にすべての部分（たとえば、ＣＤＲ、フレームワーク、ＣＬ、ＣＨドメイン（たとえば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ、ＶＬ、ＶＨ）が、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、配列変化または変動がわずかしかない、抗体、抗原結合ユニット、またはＶＨ／ＶＬドメインを指す。そのような変化または変動は、任意に、また好ましくは、修飾されていない抗体または抗原結合ユニットと比べて、ヒトまたは他の種において免疫原性を保持するかまたは低減させる。
したがって、ヒト抗体、ヒト抗原結合ユニット、またはヒトＶＨ／ＶＬドメインは、たとえば、キメラまたはヒト化抗体とは区別される。ヒト抗体、ヒト抗原結合ユニット、またはヒトＶＨ／ＶＬドメインは、機能的に再配列されたヒト免疫グロブリン（たとえば、重鎖および／または軽鎖）遺伝子を発現することができる非ヒト動物または原核生物細胞もしくは真核生物細胞によって、産生させることができることが、指摘されている。
【００３４】
「単量体」という用語は、本明細書に記載される抗体または多重特異性タンパク質の均質な形態を指す。たとえば、全長抗体について、単量体は、２つの同一な重鎖および２つの同一な軽鎖を有する単量体抗体を意味する。本発明の文脈において、単量体は、本明細書に記載される、ＤＬＬ３に特異的な単一の抗原結合ユニットと、ＣＤ３に特異的な単一の抗原結合ユニットとを有する、本発明のタンパク質を意味する。たとえば、本明細書に記載される結合タンパク質の単量体は、２つの鎖を有し得、第１の鎖が、第１の抗原結合ユニットを有する一本鎖Ｆａｂと任意に第１のＦｃドメインとを含み、第２の鎖が、第２の抗原結合ユニットを有する一本鎖Ｆａｂと任意に第２のＦｃドメインとを含む。
エピトープは、抗体または抗原結合部分（たとえば、本明細書に記載されるタンパク質の抗原結合ユニット）によって結合される、抗原の領域である。「エピトープ」という用語には、抗体または抗原結合部分に特異的に結合することができる、任意のポリペプチド決定基が含まれる。ある特定の実施形態において、エピトープ決定基は、アミノ酸、グリカン側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面基（surface grouping）を含み、ある特定の実施形態においては、特定の三次元構造特徴および／または特定の電荷特徴を有し得る。立体構造および非立体構造エピトープは、立体構造エピトープへの結合が変性溶媒の存在下において消失するが、非立体構造エピトープへの結合は消失しないという点で、区別される。
【００３５】
ある特定のエピトープ、抗原、またはタンパク質（またはその少なくとも一部分、フラグメント、またはエピトープ）に「結合し」得る、それ「と結合し」得る、それ「に特異的に結合し」得る、それ「と特異的に結合し」得る、それ「に対する親和性を有する」、それ「に特異的な」、および／またはそれ「に対する特異性を有する」、抗原結合分子／タンパク質（たとえば、免疫グロブリン、抗体、抗原結合ユニット、またはそのような抗原結合分子／タンパク質のフラグメント）は、前記エピトープ、抗原、もしくはタンパク質「に対する」、もしくはそれ「に指向される」と称されるか、またはそのようなエピトープ、抗原、またはタンパク質に対して「結合する」分子／タンパク質である。
【００３６】
本明細書において使用される場合、「結合」および「特異的結合」という用語は、精製された野生型抗原を用いたインビトロアッセイ、好ましくは、プラズモン共鳴アッセイ（（Malmqvist M., "Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics.", Curr Opin Immunol. 1993 Apr;5(2):282-6.））における、抗体または抗原結合部分（たとえば、免疫グロブリン、抗体、抗原結合ユニット、またはそのような抗原結合分子／タンパク質のフラグメント）の、抗原のエピトープへの結合を指す。抗体親和性はまた、結合平衡除外法（kinetic exclusion assay、KinExA）技術（Darling, R.J., and Brault P-A., "Kinetic exclusion assay technology: Characterization of Molecular Interactions."  ASSAY and Drug Development Technologies. 2004, Dec 2(6): 647-657）を使用して測定することができる。
【００３７】
一般に、「特異性」という用語は、特定の抗原結合分子／タンパク質（たとえば、免疫グロブリン、抗体、抗原結合ユニット、またはそのような抗原結合分子／タンパク質のフラグメント）が結合することができる、様々な種類の抗原またはエピトープの数を指す。抗原結合分子／タンパク質の特異性は、その親和性および／またはアビディティに基づいて判定することができる。抗原と抗原結合タンパク質との解離の平衡定数（ＫD）によって表される親和性は、エピトープと、抗原結合分子／タンパク質上の抗原結合部位との間の結合強度の尺度であり、ＫDの値が小さいほど、エピトープと抗原結合分子／タンパク質との間の結合強度は強い（あるいは、親和性は、１／ＫDである親和性定数（ＫA）として表すこともできる）。当業者には明らかなように（たとえば、本明細書におけるさらなる開示に基づいて）、親和性は、目的とされる特定の抗原に応じて、本質的に公知の様式で判定することができる。アビディティは、抗原結合分子／タンパク質（たとえば、免疫グロブリン、抗体、抗原結合ユニット、またはそのような抗原結合分子／タンパク質のフラグメント）と、関連する抗原との間の結合の強度の尺度である。アビディティは、エピトープと、抗原結合分子／タンパク質上のその抗原結合部位との間の親和性、および抗原結合分子／タンパク質上に存在する関連する結合部位の数の両方に関する。
【００３８】
「単離された」という用語は、本明細書において使用される場合、そのもともとのまたは本来の環境（たとえば、それが天然に存在する場合には天然の環境）から取り出された材料を指す。たとえば、生きている動物に存在している天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、ヒトの介入により、天然系にともに存在する材料のうちのいくつかまたはすべてから分離されたものは、単離されている。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であってもよく、かつ／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であってもよく、そのようなベクターまたは組成物が、それが本来見出される環境の一部ではないという点で、依然として単離されていると言える。たとえば、核酸、タンパク質／ポリペプチド分子は、それが得られたその本来の生物学的源および／または反応培地もしくは培養培地と比較して、それが前記源または培地において通常会合している少なくとも１つの他の成分、たとえば、別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分もしくは巨大分子、または少なくとも１つの混入物質、不純物、もしくは微量の成分から分離されている場合、「本質的に単離されている（形態にある）」と考えられる。具体的には、核酸またはタンパク質／ポリペプチド分子は、少なくとも２倍、具体的には、少なくとも１０倍、より具体的には少なくとも１００倍、および最大１０００倍またはそれ以上精製されている場合、「本質的に単離されている」と考えられる。「本質的に単離された形態にある」核酸またはタンパク質／ポリペプチド分子は、好適な技法、たとえば、好適なクロマトグラフィー技法、たとえば、ポリアクリルアミド電気泳動を使用して判定される場合に、好ましくは、本質的に均質である。
【００３９】
本明細書において使用される場合、２つまたはそれを上回る核酸またはポリペプチド配列の文脈における「同一」または「同一性パーセント」という用語は、２つまたはそれを上回る配列または部分配列が、最大の一致に関して比較およびアライメントした場合に、同一であること、または指定されたパーセンテージの同一であるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有することを指す。同一性パーセントを判定するために、配列を、最適な比較の目的でアライメントする（たとえば、第１のアミノ酸または核酸配列の配列には、第２のアミノ酸または核酸配列との最適なアライメントのために、ギャップが導入されてもよい）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占有されている場合、分子は、その位置において同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列が共有している同一な位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一な位置の数／位置（たとえば、オーバーラップする位置）の総数ｘ１００）。一部の実施形態において、比較される２つの配列は、適宜、配列内にギャップを導入した後に、同じ長さである（たとえば、比較されている配列を越えて伸長する追加の配列は除外する）。たとえば、可変領域配列を比較する場合、リーダーおよび／または定常ドメイン配列は、考慮しない。２つの配列間の配列比較について、「対応する」ＣＤＲとは、両方の配列において同じ位置にあるＣＤＲを指す（たとえば、それぞれの配列のＣＤＲ−Ｈ１）。
【００４０】
２つの配列間の同一性パーセントまたは類似性パーセントの判定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムであり、Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877のように改変される。そのようなアルゴリズムは、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。目的のタンパク質をコードする核酸に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行うことができる。目的のタンパク質に相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことができる。比較目的でギャップ付きアライメントを得るために、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されるようなギャップ付きＢＬＡＳＴを利用してもよい。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の離れた関係性を検出する、反復検索を行ってもよい（同上）。ＢＬＡＳＴ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラム（たとえば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメーターを使用することができる。配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧの配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するのにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０の加重残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用することができる。配列分析のためのさらなるアルゴリズムは、当該技術分野において公知であり、これには、Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5に記載されるＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ、ならびにPearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8に記載されるＦＡＳＴＡが挙げられる。ＦＡＳＴＡ内で、ｋｔｕｐは、検索の感度および速度を設定する制御選択肢である。ｋｔｕｐ＝２の場合には、比較されている２つの配列における類似の領域が、アライメントされた残基の対を検索することによって見出され、ｋｔｕｐ＝１の場合には、単一のアライメントされるアミノ酸が検索される。ｋｔｕｐは、タンパク質配列については２もしくは１に設定することができ、またはＤＮＡ配列については１〜６に設定することができる。ｋｔｕｐが指定されない場合のデフォルトは、タンパク質については２であり、ＤＮＡについては６である。あるいは、タンパク質配列アライメントは、Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402によって記載されているＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムを使用して実行してもよい。
【００４１】
本明細書において使用される「共有結合により連結された」という用語は、残基間の直接的な共有結合、または２つの残基が直接的に結合されるのではなく、両方の残基が中間分子もしくはドメイン、たとえば、免疫グロブリンの中間ドメインに共有結合により連結される間接的な会合のいずれも意味する。
【００４２】
「競合する」または「交差競合する」という用語は、抗体分子、たとえば、本発明のＤＬＬ３抗体分子の、標的、たとえば、ヒトＤＬＬ３への結合を妨害する、抗体分子の能力を指して、本明細書において互換可能に使用される。結合の妨害は、直接的であっても間接的（たとえば、抗体分子もしくは標的のアロステリック調節を通じたもの）であってもよい。抗体分子が、別の抗体分子の標的への結合を妨害することができる程度、およびしたがってそれが競合すると称され得るかどうかは、競合的結合アッセイ、たとえば、ＦＡＣＳアッセイ、ＥＬＩＳＡ、またはＢＩＡＣＯＲＥアッセイを使用して判定することができる。一部の実施形態において、競合結合アッセイは、定量的競合アッセイである。一部の実施形態において、第１の抗ＤＬＬ３抗体分子の標的への結合が、競合結合アッセイ（たとえば、本明細書に記載される競合アッセイ）において、１０％またはそれ以上、たとえば、２０％またはそれ以上、３０％またはそれ以上、４０％またはそれ以上、５０％またはそれ以上、５５％またはそれ以上、６０％またはそれ以上、６５％またはそれ以上、７０％またはそれ以上、７５％またはそれ以上、８０％またはそれ以上、８５％またはそれ以上、９０％またはそれ以上、９５％またはそれ以上、９８％またはそれ以上、９９％またはそれ以上低減される場合に、第１の抗ＤＬＬ３抗体分子は、標的への結合に関して、第２の抗ＤＬＬ３抗体分子と競合すると称される。
明示的な記述なしに、また別意図されない限り、本技術が、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または抗体に関する場合、そのようなものの同等物または生物学的同等物は、本技術の範囲内であることが意図されると推定される。
【００４３】
本明細書において使用される場合、「その生物学的同等物」という用語は、参照タンパク質、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または核酸に言及する場合、「その同等物」と同義であることが意図され、相同性は最小限であるが、依然として所望される構造または機能性を維持するものを意図する。本明細書において別途記述されない限り、本明細書において言及される任意の核酸、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、または抗体はまた、その同等物を含むことが企図される。たとえば、同等物は、少なくとも約８０％の相同性または同一性を意図し、代替として少なくとも約８５％、または代替として少なくとも約９０％、または代替として少なくとも約９５％、または代替として９８％の相同性または同一性パーセントを意図し、参照タンパク質、ポリペプチド、抗体、または核酸と実質的に同等の生物学的活性を呈する。
【００４４】
本明細書において使用される場合、「検出可能な標識」という用語は、検出可能なシグナル、すなわち、比色、蛍光、電気、放射性、および化学発光性シグナルを含む、物理的または化学的シグナルを産生することができ、視覚的または機器を用いた方法によって測定することができ、サンプル中の標識の存在および／または量／濃度を示す、分子、化合物、または組成物を指す。
「検出可能なシグナル」は、光子（無線周波数、マイクロ波周波数、赤外線周波数、可視光周波数、および紫外線周波数の光子を含む）の吸収、放出、および／または散乱を含む、様々な機序によって生成され得、これには、比色、蛍光、電気、放射性、および化学発光性シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
本明細書において使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが、続いてペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には、真核生物細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。遺伝子の発現レベルは、細胞または組織サンプル中のｍＲＮＡまたはタンパク質の量を測定することによって判定することができる。
本明細書において使用される場合、「生物学的サンプル」という用語は、生細胞に由来するかまたはそれが接触したサンプル材料を意味する。この用語は、対象から単離された組織、細胞、および生物学的流体を含むことを意図する。本明細書において使用される場合、「組織サンプル」という用語は、細胞がサンプルを得た対象内に存在していたように、細胞間の横断面の空間的関係性を保存する細胞サンプルを指すものとする。生物学的サンプルはまた、内部器官の生検またはがんから得られてもよい。
【００４６】
「組織化学法」および「細胞化学法」は、サンプルを、顕微鏡において視覚化することができる様式で、分子に特異的に結合する薬剤で標識することによって、インタクトな細胞の環境内の分子を特定するために使用される技法である。「免疫組織化学法」および「免疫細胞化学法」は、抗体を使用して分子を標識する種類の組織化学法および細胞化学法である。
【００４７】
本発明の多重特異性結合タンパク質
本発明は、ＤＬＬ３に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ユニット（第１の抗原結合ユニット）と、ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合ユニット（第２の抗原結合ユニット）とを含む、多重特異性結合タンパク質を提供する。そのような（多重特異性）結合タンパク質はまた、本明細書において、（多重特異性）結合分子またはＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質またはＤＬＬ３／ＣＤ３結合分子とも称される。
本発明者らは、驚くべきことに、本発明の多重特異性結合タンパク質が、Ｔ細胞の存在下において、ＤＬＬ３陽性ＳＣＬＣ細胞株の選択的溶解を誘導し、低いエフェクター対標的細胞比ですら活性であることを見出した。重要なことに、本発明の結合タンパク質は、ＤＬＬ３陽性細胞の不在下におけるＴ細胞活性化、Ｔ細胞増殖、およびサイトカイン分泌を引き起こさず、ＤＬＬ３陰性細胞の溶解も引き起こさない。
曖昧さを回避するために、本明細書において使用されるＤＬＬ３は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ９ＮＹＪ７のヒトＤＬＬ３、およびそのタンパク質をコードする核酸配列を指す。本明細書において使用されるＣＤ３は、ヒトＣＤ３イプシロン（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０７７６６）およびＣＤ３ガンマ（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０９６９３）複合体（ヒトＣＤ３εγ複合体）を指す。
【００４８】
Ｔ細胞の再指向は、化学療法に対する耐性によって影響を受けず、細胞表面上の発現レベルが低いことは、この作用様式にあまり重要ではないため、二重特異性Ｔ細胞エンゲージアプローチを用いてＤＬＬ３を標的化することは、ＡＤＣアプローチに優る利点を提供することが期待される。Ｔ細胞エンゲージャーは、Ｔ細胞上のＣＤ３に対する結合アームと、腫瘍細胞の細胞表面上の抗原に対する結合アームとを有する、多重特異性結合タンパク質である。Ｔ細胞および腫瘍細胞に同時に結合することにより、Ｔ細胞エンゲージャーは、これらの２つの細胞間で細胞溶解性シナプスの形成を強制的に行い、そうして、Ｔ細胞活性を、標的とされる腫瘍細胞へと選択的に再指向させる。
【００４９】
一態様において、本発明の多重特異性結合タンパク質は、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１の抗原結合ユニットと、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合ユニットとを含み、ここで、前記第１の結合ユニットは、ｉ）〜ｘｖｉｉｉ）：
ｉ）配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）、および配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）、および配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃１）、
ｉｉ）配列番号７（ＣＤＲ１）、配列番号８（ＣＤＲ２）、および配列番号９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１０（ＣＤＲ１）、配列番号１１（ＣＤＲ２）、および配列番号１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃２）、
ｉｉｉ）配列番号１３（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）、および配列番号１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１６（ＣＤＲ１）、配列番号１７（ＣＤＲ２）、および配列番号１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃３）、
ｉｖ）配列番号１９（ＣＤＲ１）、配列番号２０（ＣＤＲ２）、および配列番号２１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号２２（ＣＤＲ１）、配列番号２３（ＣＤＲ２）、および配列番号２４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃４）、
ｖ）配列番号２５（ＣＤＲ１）、配列番号２６（ＣＤＲ２）、および配列番号２７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号２８（ＣＤＲ１）、配列番号２９（ＣＤＲ２）、および配列番号３０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃５）、
ｖｉ）配列番号３１（ＣＤＲ１）、配列番号３２（ＣＤＲ２）、および配列番号３３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号３４（ＣＤＲ１）、配列番号３５（ＣＤＲ２）、および配列番号３６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃６）、
ｖｉｉ）配列番号１３３（ＣＤＲ１）、配列番号１３４（ＣＤＲ２）、および配列番号１３５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１３６（ＣＤＲ１）、配列番号１３７（ＣＤＲ２）、および配列番号１３８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃７）、
ｖｉｉｉ）配列番号１３９（ＣＤＲ１）、配列番号１４０（ＣＤＲ２）、および配列番号１４１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１４２（ＣＤＲ１）、配列番号１４３（ＣＤＲ２）、および配列番号１４４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃８）、
ｉｘ）配列番号１４５（ＣＤＲ１）、配列番号１４６（ＣＤＲ２）、および配列番号１４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１４８（ＣＤＲ１）、配列番号１４９（ＣＤＲ２）、および配列番号１５０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃９）、
【００５０】
ｘ）配列番号１５１（ＣＤＲ１）、配列番号１５２（ＣＤＲ２）、および配列番号１５３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１５４（ＣＤＲ１）、配列番号１５５（ＣＤＲ２）、および配列番号１５６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃１０）、
ｘｉ）配列番号１５７（ＣＤＲ１）、配列番号１５８（ＣＤＲ２）、および配列番号１５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１６０（ＣＤＲ１）、配列番号１６１（ＣＤＲ２）、および配列番号１６２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃１１）、
ｘｉｉ）配列番号１６３（ＣＤＲ１）、配列番号１６４（ＣＤＲ２）、および配列番号１６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１６６（ＣＤＲ１）、配列番号１６７（ＣＤＲ２）、および配列番号１６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃１２）、
ｘｉｉｉ）配列番号１６９（ＣＤＲ１）、配列番号１７０（ＣＤＲ２）、および配列番号１７１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１７２（ＣＤＲ１）、配列番号１７３（ＣＤＲ２）、および配列番号１７４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃１３）、
ｘｉｖ）配列番号１７５（ＣＤＲ１）、配列番号１７６（ＣＤＲ２）、および配列番号１７７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１７８（ＣＤＲ１）、配列番号１７９（ＣＤＲ２）、および配列番号１８０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃１４）、
ｘｖ）配列番号１８１（ＣＤＲ１）、配列番号１８２（ＣＤＲ２）、および配列番号１８３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１８４（ＣＤＲ１）、配列番号１８５（ＣＤＲ２）、および配列番号１８６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃１５）、
ｘｖｉ）配列番号１８７（ＣＤＲ１）、配列番号１８８（ＣＤＲ２）、および配列番号１８９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１９０（ＣＤＲ１）、配列番号１９１（ＣＤＲ２）、および配列番号１９２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃１６）、
ｘｖｉｉ）配列番号１９３（ＣＤＲ１）、配列番号１９４（ＣＤＲ２）、および配列番号１９５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１９６（ＣＤＲ１）、配列番号１９７（ＣＤＲ２）、および配列番号１９８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃１７）、ならびに
ｘｖｉｉｉ）配列番号１９９（ＣＤＲ１）、配列番号２００（ＣＤＲ２）、および配列番号２０１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号２０２（ＣＤＲ１）、配列番号２０３（ＣＤＲ２）、および配列番号２０４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃１８）
からなる群から選択される。
好ましくは、本発明の結合タンパク質の第１の抗原結合ユニットは、上述のＣＤＲ配列によって定義されるｉ）〜ｉｉｉ）のうちのいずれか１つである。
曖昧さを回避するために、本明細書において列挙される特定の実施形態のそれぞれはまた、本発明の独立した態様と考えることができる。
【００５１】
本発明の結合タンパク質の一部の実施形態において、ＣＤ３に特異的に結合する前記第２の抗原結合ユニットは、ｉ）〜ｉｉｉ）：
ｉ）配列番号５５（ＣＤＲ１）、配列番号５６（ＣＤＲ２）、および配列番号５７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号５８（ＣＤＲ１）、配列番号５９（ＣＤＲ２）、および配列番号６０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット（抗原結合ユニットＣＤ３＃１）、
ｉｉ）配列番号６１（ＣＤＲ１）、配列番号６２（ＣＤＲ２）、および配列番号６３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号６４（ＣＤＲ１）、配列番号６５（ＣＤＲ２）、および配列番号６６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット（抗原結合ユニットＣＤ３＃２）、ならびに
ｉｉｉ）配列番号９６（ＣＤＲ１）、配列番号９７（ＣＤＲ２）、および配列番号９８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号９９（ＣＤＲ１）、配列番号１００（ＣＤＲ２）、および配列番号１０１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、抗原結合ユニット（抗原結合ユニットＣＤ３＃３）
からなる群から選択される。
【００５２】
上記に概説される第１の抗原結合ユニットｉ）〜ｘｖｉｉｉ）は、それぞれ、ＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３、ＤＬＬ３＃４、ＤＬＬ３＃５、ＤＬＬ３＃６、ＤＬＬ３＃７、ＤＬＬ３＃８、ＤＬＬ３＃９、ＤＬＬ３＃１０、ＤＬＬ３＃１１、ＤＬＬ３＃１２、ＤＬＬ３＃１３、ＤＬＬ３＃１４、ＤＬＬ３＃１５、ＤＬＬ３＃１６、ＤＬＬ３＃１７、およびＤＬＬ３＃１８と称され、上記に概説される第２の抗原結合ユニットｉ）〜ｉｉｉ）は、それぞれ、ＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、およびＣＤ３＃３と称される。本発明の特定の抗原結合ユニットおよび全長結合タンパク質に対する個々のアミノ酸配列の特定を容易に可能にする配列表が、本明細書において提供される。概要は、実施例２の表１に提供されている。
【００５３】
概して抗原結合ユニットに関する「第１」および「第２」という用語は、本明細書において使用される場合、単純に、これらのユニットが、２つの異なるユニットであることを示すことを意図する（これらは、異なる標的抗原に結合するため）。したがって、これらの用語は、本発明の結合タンパク質内におけるこれらのユニットの厳密な順序または順番を指すと理解されるものではない。
【００５４】
一部の実施形態において、本発明の結合タンパク質は、上記のそれぞれのＣＤＲ配列によって定義されるＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３、ＤＬＬ３＃４、ＤＬＬ３＃５、ＤＬＬ３＃６、ＤＬＬ３＃７、ＤＬＬ３＃８、ＤＬＬ３＃９、ＤＬＬ３＃１０、ＤＬＬ３＃１１、ＤＬＬ３＃１２、ＤＬＬ３＃１３、ＤＬＬ３＃１４、ＤＬＬ３＃１５、ＤＬＬ３＃１６、ＤＬＬ３＃１７、およびＤＬＬ３＃１８からなる群から選択される第１の抗原結合ユニットと、上記のそれぞれのＣＤＲ配列によって定義されるＣＤ３＃１の第２の抗原結合ユニットとを含む。好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、上記のそれぞれのＣＤＲ配列によって定義されるＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、およびＤＬＬ３＃３からなる群から選択される第１の抗原結合ユニットと、上記のそれぞれのＣＤＲ配列によって定義されるＣＤ３＃１の第２の抗原結合ユニットとを含む。
【００５５】
一部の実施形態において、本発明の結合タンパク質は、上記のそれぞれのＣＤＲ配列によって定義されるＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３、ＤＬＬ３＃４、ＤＬＬ３＃５、ＤＬＬ３＃６、ＤＬＬ３＃７、ＤＬＬ３＃８、ＤＬＬ３＃９、ＤＬＬ３＃１０、ＤＬＬ３＃１１、ＤＬＬ３＃１２、ＤＬＬ３＃１３、ＤＬＬ３＃１４、ＤＬＬ３＃１５、ＤＬＬ３＃１６、ＤＬＬ３＃１７、およびＤＬＬ３＃１８からなる群から選択される第１の抗原結合ユニットと、上記のそれぞれのＣＤＲ配列によって定義されるＣＤ３＃２の第２の抗原結合ユニットとを含む。好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、上記のそれぞれのＣＤＲ配列によって定義されるＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、およびＤＬＬ３＃３からなる群から選択される第１の抗原結合ユニットと、上記のそれぞれのＣＤＲ配列によって定義されるＣＤ３＃２の第２の抗原結合ユニットとを含む。
【００５６】
一部の実施形態において、本発明の結合タンパク質は、上記のそれぞれのＣＤＲ配列によって定義されるＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３、ＤＬＬ３＃４、ＤＬＬ３＃５、ＤＬＬ３＃６、ＤＬＬ３＃７、ＤＬＬ３＃８、ＤＬＬ３＃９、ＤＬＬ３＃１０、ＤＬＬ３＃１１、ＤＬＬ３＃１２、ＤＬＬ３＃１３、ＤＬＬ３＃１４、ＤＬＬ３＃１５、ＤＬＬ３＃１６、ＤＬＬ３＃１７、およびＤＬＬ３＃１８からなる群から選択される第１の抗原結合ユニットと、上記のそれぞれのＣＤＲ配列によって定義されるＣＤ３＃３の第２の抗原結合ユニットとを含む。好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、上記のそれぞれのＣＤＲ配列によって定義されるＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、およびＤＬＬ３＃３からなる群から選択される第１の抗原結合ユニットと、上記のそれぞれのＣＤＲ配列によって定義されるＣＤ３＃３の第２の抗原結合ユニットとを含む。
【００５７】
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）、および配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）、および配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１の抗原結合ユニットと、配列番号５５（ＣＤＲ１）、配列番号５６（ＣＤＲ２）、および配列番号５７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号５８（ＣＤＲ１）、配列番号５９（ＣＤＲ２）、および配列番号６０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合ユニットとを含む。
【００５８】
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号７（ＣＤＲ１）、配列番号８（ＣＤＲ２）、および配列番号９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１０（ＣＤＲ１）、配列番号１１（ＣＤＲ２）、および配列番号１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１の抗原結合ユニットと、配列番号５５（ＣＤＲ１）、配列番号５６（ＣＤＲ２）、および配列番号５７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号５８（ＣＤＲ１）、配列番号５９（ＣＤＲ２）、および配列番号６０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合ユニットとを含む。
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号１３（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）、および配列番号１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１６（ＣＤＲ１）、配列番号１７（ＣＤＲ２）、および配列番号１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１の抗原結合ユニットと、配列番号５５（ＣＤＲ１）、配列番号５６（ＣＤＲ２）、および配列番号５７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号５８（ＣＤＲ１）、配列番号５９（ＣＤＲ２）、および配列番号６０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合ユニットとを含む。
【００５９】
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）、および配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）、および配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１の抗原結合ユニットと、配列番号６１（ＣＤＲ１）、配列番号６２（ＣＤＲ２）、および配列番号６３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号６４（ＣＤＲ１）、配列番号６５（ＣＤＲ２）、および配列番号６６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合ユニットとを含む。
【００６０】
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号７（ＣＤＲ１）、配列番号８（ＣＤＲ２）、および配列番号９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１０（ＣＤＲ１）、配列番号１１（ＣＤＲ２）、および配列番号１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１の抗原結合ユニットと、配列番号６１（ＣＤＲ１）、配列番号６２（ＣＤＲ２）、および配列番号６３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号６４（ＣＤＲ１）、配列番号６５（ＣＤＲ２）、および配列番号６６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合ユニットとを含む。
【００６１】
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号１３（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）、および配列番号１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１６（ＣＤＲ１）、配列番号１７（ＣＤＲ２）、および配列番号１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１の抗原結合ユニットと、配列番号６１（ＣＤＲ１）、配列番号６２（ＣＤＲ２）、および配列番号６３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号６４（ＣＤＲ１）、配列番号６５（ＣＤＲ２）、および配列番号６６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合ユニットとを含む。
本明細書に記載されるＣＤＲ配列に加えて、本発明の結合タンパク質の抗原結合ユニットは、免疫グロブリンフレームワーク領域（ＦＲ）配列を含む。これらの配列は、好ましくは、ヒトにおいて免疫原性でなく、したがって、好ましくは、ヒトまたはヒト化ＦＲ配列である。好適なヒトまたはヒト化ＦＲ配列は、当該技術分野において公知である。特に好ましいＦＲ配列は、完全な抗原結合ユニット、ならびにそれによってＣＤＲ配列およびＦＲ配列を開示している、本明細書に示される実施形態から得ることができる。
【００６２】
本発明の結合タンパク質の好ましい実施形態において、第１および第２の結合ユニットは、それぞれ、抗体分子に由来する軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含み、前記軽鎖／重鎖可変ドメインは、第１の抗原結合ユニットについてはＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３、ＤＬＬ３＃４、ＤＬＬ３＃５、ＤＬＬ３＃６、ＤＬＬ３＃７、ＤＬＬ３＃８、ＤＬＬ３＃９、ＤＬＬ３＃１０、ＤＬＬ３＃１１、ＤＬＬ３＃１２、ＤＬＬ３＃１３、ＤＬＬ３＃１４、ＤＬＬ３＃１５、ＤＬＬ３＃１６、ＤＬＬ３＃１７、またはＤＬＬ３＃１８のうちのいずれか１つのＣＤＲ配列によって定義され、前記軽鎖／重鎖可変ドメインは、第２の抗原結合ユニットについては、ＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、またはＣＤ３＃３のうちのいずれか１つのＣＤＲ配列によって定義される。本発明の結合タンパク質の一部の実施形態において、ＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３、ＤＬＬ３＃４、ＤＬＬ３＃５、ＤＬＬ３＃６、ＤＬＬ３＃７、ＤＬＬ３＃８、ＤＬＬ３＃９、ＤＬＬ３＃１０、ＤＬＬ３＃１１、ＤＬＬ３＃１２、ＤＬＬ３＃１３、ＤＬＬ３＃１４、ＤＬＬ３＃１５、ＤＬＬ３＃１６、ＤＬＬ３＃１７、ＤＬＬ３＃１８、ＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、またはＣＤ３＃３のうちのいずれか１つまたは複数の抗原結合ユニットのＶＨおよび／またはＶＬドメインは、ヒトまたはヒト化ＶＨおよび／またはＶＬドメインである。
本発明の好ましい実施形態において、第１の抗原結合ユニットの軽鎖／重鎖可変ドメインは、さらに、以下の通り定義される。
ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃１）、または
ｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃２）、または
【００６３】
ｉｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃３）、または
ｉｖ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃４）、または
ｖ）配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃５）、または
ｖｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃６）、または
ｖｉｉ）配列番号２０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃７）、または
ｖｉｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃８）、または
ｉｘ）配列番号２０９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃９）、または
ｘ）配列番号２１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃１０）、または
ｘｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃１１）、または
ｘｉｉ）配列番号２１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃１２）、または
ｘｉｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃１３）、または
ｘｉｖ）配列番号２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃１４）、または
ｘｖ）配列番号２２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃１５）、または
ｘｖｉ）配列番号２２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃１６）、または
ｘｖｉｉ）配列番号２２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃１７）、または
ｘｖｉｉｉ）配列番号２２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合ユニットＤＬＬ３＃１８）。
好ましくは、本発明の結合タンパク質の第１の抗原結合ユニットは、上述のＶＬおよびＶＨ配列によって定義されるｉ）〜ｉｉｉ）のうちのいずれか１つである。
【００６４】
本発明の好ましい実施形態において、第２の抗原結合ユニットの軽鎖／重鎖可変ドメインは、さらに、以下の通り定義される
ｉ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合ユニットＣＤ３＃１）、または
ｉｉ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合ユニットＣＤ３＃２）、または
ｉｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号１０３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合ユニットＣＤ３＃３）。
【００６５】
一部の実施形態において、本発明の結合タンパク質は、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃４／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃５／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃６／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃７／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃８／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃９／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１０／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１４／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１５／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１６／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１７／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１８／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃４／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃５／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃６／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃７／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃８／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃９／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１０／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１４／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１５／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１６／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１７／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１８／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃４／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃５／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃６／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃７／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃８／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃９／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１０／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１３／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１４／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１５／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１６／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１７／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１８／ＣＤ３＃３からなる群から選択される第１および第２の抗原結合ユニットの組合せを含み、第１および第２の抗原結合ユニットは、上述の抗原結合ユニットのＣＤＲならびに／またはＶＨおよびＶＬ配列によって定義される。好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、およびＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３からなる群から選択される第１および第２の抗原結合ユニットの組合せを含み、第１および第２の抗原結合ユニットは、上述の抗原結合ユニットのＣＤＲならびに／またはＶＨおよびＶＬ配列によって定義される。
【００６６】
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１の抗原結合ユニットと、（ｉｉ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合ユニットとを含む。
【００６７】
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１の抗原結合ユニットと、（ｉｉ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合ユニットとを含む。
【００６８】
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１の抗原結合ユニットと、（ｉｉ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合ユニットとを含む。
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１の抗原結合ユニットと、（ｉｉ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合ユニットとを含む。
【００６９】
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１の抗原結合ユニットと、（ｉｉ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合ユニットとを含む。
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１の抗原結合ユニットと、（ｉｉ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合ユニットとを含む。
【００７０】
一部の実施形態において、本発明の結合タンパク質は、ｉ）直接的にもしくは第１のペプチドリンカーを用いて間接的にのいずれかで、第１の重鎖可変ドメインに共有結合により連結された第１の軽鎖可変ドメインを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１の抗原結合ユニット（たとえば、上述のそれぞれのＣＤＲもしくはＶＨ／ＶＬ配列によって定義されるＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３、ＤＬＬ３＃４、ＤＬＬ３＃５、ＤＬＬ３＃６、ＤＬＬ３＃７、ＤＬＬ３＃８、ＤＬＬ３＃９、ＤＬＬ３＃１０、ＤＬＬ３＃１１、ＤＬＬ３＃１２、ＤＬＬ３＃１３、ＤＬＬ３＃１４、ＤＬＬ３＃１５、ＤＬＬ３＃１６、ＤＬＬ３＃１７、もしくはＤＬＬ３＃１８のうちのいずれか１つ）、ならびに／またはｉｉ）直接的にもしくは第２のペプチドリンカーを用いて間接的にのいずれかで、第２の重鎖可変ドメインに共有結合により連結された第２の軽鎖可変ドメインを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合ユニット（たとえば、上述のそれぞれのＣＤＲもしくはＶＨ／ＶＬ配列によって定義されるＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、もしくはＣＤ３＃３）を含む。
【００７１】
本発明の結合タンパク質の一部の実施形態において、第１および／または第２の抗原結合ユニットは、従来的な抗体分子の軽鎖／重鎖ＦａｂドメインにあるようなＣＬおよびＣＨ１ドメインをさらに含み、したがって、前記第１の結合ユニットは、ａ）第１のＣＬドメインに共有結合により連結された（直接的もしくは間接的に結合した）、ＶＬドメイン（たとえば、ＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３、ＤＬＬ３＃４、ＤＬＬ３＃５、ＤＬＬ３＃６、ＤＬＬ３＃７、ＤＬＬ３＃８、ＤＬＬ３＃９、ＤＬＬ３＃１０、ＤＬＬ３＃１１、ＤＬＬ３＃１２、ＤＬＬ３＃１３、ＤＬＬ３＃１４、ＤＬＬ３＃１５、ＤＬＬ３＃１６、ＤＬＬ３＃１７、もしくはＤＬＬ３＃１８のうちのいずれか１つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＣＤＲ）もしくはＶＬ配列によって定義される）と、ｂ）第１のＣＨ１ドメインに共有結合により連結された（直接的もしくは間接的に結合した）、ＶＨドメイン（たとえば、ＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３、ＤＬＬ３＃４、ＤＬＬ３＃５、ＤＬＬ３＃６  ＤＬＬ３＃７、ＤＬＬ３＃８、ＤＬＬ３＃９、ＤＬＬ３＃１０、ＤＬＬ３＃１１、ＤＬＬ３＃１２、ＤＬＬ３＃１３、ＤＬＬ３＃１４、ＤＬＬ３＃１５、ＤＬＬ３＃１６、ＤＬＬ３＃１７、もしくはＤＬＬ３＃１８のうちのいずれか１つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＣＤＲ）もしくはＶＨ配列によって定義される）とを含み、かつ／または前記第２の抗原結合ユニットは、ａ）第２のＣＬドメインに共有結合により連結された（直接的もしくは間接的に結合した）、ＶＬドメイン（たとえば、ＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、もしくはＣＤ３＃３のうちのいずれか１つのＬＣＣＤＲもしくはＶＬ配列によって定義される）と、ｂ）第２のＣＨ１ドメインに共有結合により連結された（直接的もしくは間接的に結合された）、ＶＨドメイン（たとえば、ＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、もしくはＣＤ３＃３のうちのいずれか１つのＨＣＣＤＲもしくはＶＨ配列によって定義される）とを含む。
【００７２】
本発明の文脈において、ＣＬドメインは、抗体軽鎖、たとえば、カッパ（κ）またはラムダ（λ）軽鎖の定常ドメインである。カッパ軽鎖の定常領域の例は、配列番号８７に示される。ラムダ軽鎖の定常領域の例は、配列番号８８に示される。一部の実施形態において、第１および第２のＣＬドメインは、同じであり、たとえば、第１および第２のＣＬドメインは、いずれも、カッパ軽鎖定常ドメインであるか、または第１および第２のＣＬドメインは、いずれも、ラムダ軽鎖定常ドメインである。一部の実施形態において、第１および第２のＣＬドメインは、異なり、たとえば、第１のＣＬドメインがカッパ定常ドメインであり、第２のＣＬドメインがラムダ定常ドメインであるか、またはその逆も同様である。
本発明の文脈において、ＣＨ１ドメインは、抗体重鎖の第１の定常ドメインである。ＣＨ１定常ドメインの例は、配列番号２５３に示される。
【００７３】
本発明の結合タンパク質の好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質の第１の抗原結合ユニット（たとえば、上記に概説されるＣＤＲおよび／もしくはＶＨ／ＶＬ配列によって定義されるＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３、ＤＬＬ３＃４、ＤＬＬ３＃５、ＤＬＬ３＃６、ＤＬＬ３＃７、ＤＬＬ３＃８、ＤＬＬ３＃９、ＤＬＬ３＃１０、ＤＬＬ３＃１１、ＤＬＬ３＃１２、ＤＬＬ３＃１３、ＤＬＬ３＃１４、ＤＬＬ３＃１５、ＤＬＬ３＃１６、ＤＬＬ３＃１７、もしくはＤＬＬ３＃１８のうちのいずれか１つ）は、ＮからＣ末端へ、第１の軽鎖可変ドメイン、第１のＣＬドメイン、第１のリンカーペプチド、第１のＶＨドメイン、および第１のＣＨ１ドメインを含み、かつ／または本発明の結合タンパク質の第２の結合ユニット（たとえば、上記に概説されるＣＤＲおよび／もしくはＶＨ／ＶＬ配列によって定義されるＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、もしくはＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ）は、ＮからＣ末端へ、第２の軽鎖可変ドメイン、第２のＣＬドメイン、第２のリンカーペプチド、第２のＶＨドメイン、および第２のＣＨ１ドメインを含む。この実施形態において、第１および／または第２の結合ユニットは、一本鎖Ｆａｂの構造を有する。いずれについても、第１および／または第２の抗原結合ユニットは、一本鎖Ｆａｂを形成する場合、抗原結合ユニットが、ＮからＣ末端の方向に、ＶＨ−ＣＨ１−［リンカーペプチド］−ＶＬ−ＣＬを含むように、順序は逆転してもよい。本発明のタンパク質の一部の実施形態において、第１および／または第２の抗原結合ユニットが、Ｆａｂまたは一本鎖Ｆａｂを含む場合、定常ドメインは、同じ種類のものであってもよく（たとえば、両方のＣＬドメインが、カッパもしくはラムダ軽鎖定常ドメインである）、または異なる種類のものであってもよい（第１のＣＬドメインがカッパ軽鎖定常ドメインであり、第２のＣＬドメインがラムダ軽鎖定常ドメインであるか、もしくはその逆も同様である）。
【００７４】
一態様において、本発明の結合タンパク質において使用されるリンカーは、２６〜４２個のアミノ酸、たとえば、３０〜４０個のアミノ酸を含む。さらなる態様において、本発明のタンパク質において使用されるリンカーは、３４〜４０個のアミノ酸、たとえば、３６〜３９個のアミノ酸、たとえば、３８個のアミノ酸を含む。一部の実施形態において、リンカーは、配列番号８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５のうちのいずれか１つ、好ましくは、配列番号８９の配列を含む。
リンカー配列は、天然に存在する配列であってもよく、または非天然の配列であってもよい。治療目的で使用される場合、リンカーは、好ましくは、本発明の結合タンパク質が投与される対象において、非免疫原性である。
リンカー配列の１つの有用な群は、国際公開第１９９６／３４１０３号および同第１９９４／０４６７８号に記載される重鎖抗体のヒンジ領域に由来するリンカーである。他の例は、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａなどのポリ−アラニンリンカー配列である。
【００７５】
リンカー配列のさらなる好ましい例は、異なる長さのＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー、たとえば、例として（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）５、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）７、（ｇｌｙ３ｓｅｒ）３、（ｇｌｙ３ｓｅｒ）５、（ｇｌｙ３ｓｅｒ）７、（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３、（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）５、および（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）７を含む、（ｇｌｙｘｓｅｒｙ）ｚリンカー、または配列番号８９〜９５のうちのいずれか１つのリンカーである。
【００７６】
本発明の結合タンパク質の一部の実施形態において、第１の抗原結合ユニットのＶＬドメイン（たとえば、ＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３、ＤＬＬ３＃４、ＤＬＬ３＃５、ＤＬＬ３＃６、ＤＬＬ３＃７、ＤＬＬ３＃８、ＤＬＬ３＃９、ＤＬＬ３＃１０、ＤＬＬ３＃１１、ＤＬＬ３＃１２、ＤＬＬ３＃１３、ＤＬＬ３＃１４、ＤＬＬ３＃１５、ＤＬＬ３＃１６、ＤＬＬ３＃１７、またはＤＬＬ３＃１８の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＣＤＲ）またはＶＬ配列によって定義される）は、第１のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー（たとえば、２６〜４２個のアミノ酸、３０〜４０個のアミノ酸、３４〜４０個のアミノ酸、または３６〜３９個のアミノ酸のうちのいずれか１つ、好ましくは、３８個のアミノ酸のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー）を介して、第１の抗原結合ユニットのＶＨドメイン（たとえば、ＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３、ＤＬＬ３＃４、ＤＬＬ３＃５、ＤＬＬ３＃６、ＤＬＬ３＃７、ＤＬＬ３＃８、ＤＬＬ３＃９、ＤＬＬ３＃１０、ＤＬＬ３＃１１、ＤＬＬ３＃１２、ＤＬＬ３＃１３、ＤＬＬ３＃１４、ＤＬＬ３＃１５、ＤＬＬ３＃１６、ＤＬＬ３＃１７、またはＤＬＬ３＃１８の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＣＤＲ）またはＶＨ配列によって定義される）に共有結合により連結されており（たとえば、直接的に結合しており）、第２の抗原結合ユニットのＶＬドメイン（たとえば、ＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、またはＣＤ３＃３の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＣＤＲ）またはＶＬ配列によって定義される）は、第２のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー（たとえば、２６〜４２個のアミノ酸、３０〜４０個のアミノ酸、３４〜４０個のアミノ酸、または３６〜３９個のアミノ酸のうちのいずれか１つ、好ましくは、３８個のアミノ酸のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー）を介して、第２の抗原結合ユニットのＶＨドメイン（たとえば、ＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、またはＣＤ３＃３の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＣＤＲ）またはＶＨ配列によって定義される）に共有結合により連結されている（たとえば、直接的に結合している）。より好ましくは、第１および第２のリンカーは、同じである。さらにより好ましくは、第１および第２のリンカーは、それぞれ、配列番号８９のアミノ酸配列を含む。
【００７７】
一部の実施形態において、本発明の結合タンパク質は、ＤＬＬ３に特異的な第１の抗原結合ユニットを形成する、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、および配列番号２４０からなる群から選択される配列を含む第１の一本鎖Ｆａｂと、ＣＤ３に特異的な第２の抗原結合ユニットを形成する、配列番号７１の第２の一本鎖Ｆａｂとを含む。好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号４９の配列を含む、第１の抗原結合ユニットを形成する第１の一本鎖Ｆａｂと、第２の抗原結合ユニットを形成する、配列番号７１の配列を含む第２の一本鎖Ｆａｂとを含む。好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号５０の配列を含む、第１の抗原結合ユニットを形成する第１の一本鎖Ｆａｂと、第２の抗原結合ユニットを形成する、配列番号７１の配列を含む第２の一本鎖Ｆａｂとを含む。好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号５１の配列を含む、第１の抗原結合ユニットを形成する第１の一本鎖Ｆａｂと、第２の抗原結合ユニットを形成する、配列番号７１の配列を含む第２の一本鎖Ｆａｂとを含む。
【００７８】
一部の実施形態において、本発明の結合タンパク質は、ＤＬＬ３に特異的な第１の抗原結合ユニットを形成する、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、および配列番号２４０からなる群から選択される配列を含む第１の一本鎖Ｆａｂと、ＣＤ３に特異的な第２の抗原結合ユニットを形成する、配列番号７２の第２の一本鎖Ｆａｂとを含む。好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号４９の配列を含む、第１の抗原結合ユニットを形成する第１の一本鎖Ｆａｂと、第２の抗原結合ユニットを形成する、配列番号７２の配列を含む第２の一本鎖Ｆａｂとを含む。好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号５０の配列を含む、第１の抗原結合ユニットを形成する第１の一本鎖Ｆａｂと、第２の抗原結合ユニットを形成する、配列番号７２の配列を含む第２の一本鎖Ｆａｂとを含む。好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号５１の配列を含む、第１の抗原結合ユニットを形成する第１の一本鎖Ｆａｂと、第２の抗原結合ユニットを形成する、配列番号７２の配列を含む第２の一本鎖Ｆａｂとを含む。
【００７９】
一部の実施形態において、本発明の結合タンパク質は、ＤＬＬ３に特異的な第１の抗原結合ユニットを形成する、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、および配列番号２４０からなる群から選択される配列を含む第１の一本鎖Ｆａｂと、ＣＤ３に特異的な第２の抗原結合ユニットを形成する、配列番号１０４の第２の一本鎖Ｆａｂとを含む。好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号４９の配列を含む、第１の抗原結合ユニットを形成する第１の一本鎖Ｆａｂと、第２の抗原結合ユニットを形成する、配列番号１０４の配列を含む第２の一本鎖Ｆａｂとを含む。好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号５０の配列を含む、第１の抗原結合ユニットを形成する第１の一本鎖Ｆａｂと、第２の抗原結合ユニットを形成する、配列番号１０４の配列を含む第２の一本鎖Ｆａｂとを含む。好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号５１の配列を含む、第１の抗原結合ユニットを形成する第１の一本鎖Ｆａｂと、第２の抗原結合ユニットを形成する、配列番号１０４の配列を含む第２の一本鎖Ｆａｂとを含む。
【００８０】
一部の実施形態において、第１の抗原結合ユニット（たとえば、上記に概説されるＣＤＲおよび／もしくはＶＨ／ＶＬ配列によって定義されるＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３、ＤＬＬ３＃４、ＤＬＬ３＃５、ＤＬＬ３＃６、ＤＬＬ３＃７、ＤＬＬ３＃８、ＤＬＬ３＃９、ＤＬＬ３＃１０、ＤＬＬ３＃１１、ＤＬＬ３＃１２、ＤＬＬ３＃１３、ＤＬＬ３＃１４、ＤＬＬ３＃１５、ＤＬＬ３＃１６、ＤＬＬ３＃１７、もしくはＤＬＬ３＃１８）ならびに／または第２の抗原結合ユニット（たとえば、ＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、もしくはＣＤ３＃３）は、ＣＬドメインに共有結合により連結された（たとえば、直接的に結合した）ＶＬドメインおよびＣＨ１ドメインに連結されたＶＨドメインを含み（すなわち、一緒になって抗体に由来するＦａｂフラグメントを形成しており）、前記ＣＨ１ドメインは、さらに、Ｆｃドメインに共有結合により連結され（たとえば、直接的に結合し）、それによって、１つの軽鎖および１つの重鎖を有する従来的なＹ字型の抗体分子のアームが形成される。一部の実施形態において、第１および第２の抗原結合ユニットは、それぞれが、Ｆａｂフラグメント、すなわち、第１および第２のＦａｂフラグメントを形成し、これが、それぞれ、第１および第２のＦｃドメインに共有結合により連結され（たとえば、直接的に結合し）、それによって、従来的なヘテロ四量体二重特異性および二価抗体分子が形成される。
【００８１】
好ましい実施形態において、第１の抗原結合ユニット（たとえば、上記に概説されるＣＤＲおよび／もしくはＶＨ／ＶＬ配列によって定義されるＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３、ＤＬＬ３＃４、ＤＬＬ３＃５、ＤＬＬ３＃６、ＤＬＬ３＃７、ＤＬＬ３＃８、ＤＬＬ３＃９、ＤＬＬ３＃１０、ＤＬＬ３＃１１、ＤＬＬ３＃１２、ＤＬＬ３＃１３、ＤＬＬ３＃１４、ＤＬＬ３＃１５、ＤＬＬ３＃１６、ＤＬＬ３＃１７、もしくはＤＬＬ３＃１８のうちのいずれか１つ）ならびに／または第２の抗原結合ユニット（たとえば、ＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、もしくはＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ）は、一本鎖Ｆａｂ、すなわち、ペプチドリンカー（たとえば、２６〜４２個のアミノ酸、３０〜４０個のアミノ酸、３４〜４０個のアミノ酸、もしくは３６〜３９個のアミノ酸のうちのいずれか１つ、好ましくは、３８個のアミノ酸のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー、さらにより好ましくは、配列番号８９のリンカー）を介して、重鎖のＶＨ−ＣＨ１ドメインに共有結合により連結された、抗体軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）を含む。好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１の一本鎖Ｆａｂ（たとえば、上記のそれぞれのＣＤＲまたはＶＨ／ＶＬ配列によって定義されるＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３、ＤＬＬ３＃４、ＤＬＬ３＃５、ＤＬＬ３＃６、ＤＬＬ３＃７、ＤＬＬ３＃８、ＤＬＬ３＃９、ＤＬＬ３＃１０、ＤＬＬ３＃１１、ＤＬＬ３＃１２、ＤＬＬ３＃１３、ＤＬＬ３＃１４、ＤＬＬ３＃１５、ＤＬＬ３＃１６、ＤＬＬ３＃１７、またはＤＬＬ３＃１８のうちのいずれか１つ、好ましくは、第１の抗原結合ユニットは、ＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３である）および第１のＦｃドメインを含む、第１のポリペプチド鎖（このポリペプチド鎖は、本明細書において「ＤＬＬ３鎖」とも称される）、ならびにＣＤ３に特異的に結合する第２の一本鎖Ｆａｂ（たとえば、上記のそれぞれのＣＤＲまたはＶＨ／ＶＬ配列によって定義されるＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、またはＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ）および第２のＦｃドメインを含む、第２のポリペプチド鎖（このポリペプチド鎖は、本明細書において「ＣＤ３鎖」とも称される）を含む。一部の実施形態において、第１および第２のＦｃドメインは、同じである。好ましい実施形態において、第１および第２のＦｃドメインは、異なる。本発明の結果として得られる結合タンパク質は、全長Ｆｃを有し、ＤＬＬ３に対する第１の結合ユニットおよびＣＤ３に対する第２の結合ユニットという２つの独立した結合部位を有する。一部の実施形態において、第１の抗原結合ユニットは、単一のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３鎖）からなる。一部の実施形態において、第２の抗原結合ユニットは、単一のポリペプチド鎖（ＣＤ３鎖）からなる。一部の実施形態において、第１および第２の抗原結合ユニットはいずれも、それぞれ、単一のポリペプチド鎖からなる。
【００８２】
一部の実施形態において、本発明のタンパク質の第１の抗原結合ユニットは、第１のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３鎖）によって形成され、第２の抗原結合ユニットは、第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３鎖）によって形成される。したがって、一部の実施形態において、本発明の結合タンパク質は、それぞれが異なる特異性を有する抗原結合ユニットを含む、２つの異なるポリペプチド鎖を含み、これらのポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合を介して、または可能性としてペプチドリンカーを介してのいずれかで、互いに共有結合により連結されている。一部の実施形態において、本発明の結合タンパク質は、一方のポリペプチド鎖（第１のポリペプチド鎖またはＤＬＬ３鎖）が、ＤＬＬ３に特異的に結合する抗原結合ユニット（たとえば、それぞれのＣＤＲおよび／またはＶＨ／ＶＬ配列によって定義されるＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３、ＤＬＬ３＃４、ＤＬＬ３＃５、ＤＬＬ３＃６、ＤＬＬ３＃７、ＤＬＬ３＃８、ＤＬＬ３＃９、ＤＬＬ３＃１０、ＤＬＬ３＃１１、ＤＬＬ３＃１２、ＤＬＬ３＃１３、ＤＬＬ３＃１４、ＤＬＬ３＃１５、ＤＬＬ３＃１６、ＤＬＬ３＃１７、またはＤＬＬ３＃１８のうちのいずれか１つ）を含み、もう一方のポリペプチド鎖（第２のポリペプチド鎖またはＣＤ３鎖）が、ＣＤ３に特異的に結合する抗原結合ユニット（たとえば、ＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、またはＣＤ３＃３）を含む、２つのポリペプチド鎖を含む二重特異性二価ヘテロ二量体タンパク質である。
【００８３】
本発明の文脈において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、たとえば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、またはＩｇＧ4の重鎖に由来する。たとえば、本発明のＦｃドメインは、ＩｇＧ1またはＩｇＧ4の重鎖のＦｃドメインであり、ヒンジ領域および２つの定常ドメイン（ＣH2およびＣH3）を含む。Ｆｃドメイン（ヒンジ領域を含む）の例は、配列番号８１および８４に示される。
【００８４】
本発明のタンパク質のアミノ酸鎖におけるアミノ酸の番号付けは、別途示されない限り、ＥＵ番号付けシステム（Edelman, Cunningham et al. 1969）に従う。これは、本明細書において示されるアミノ酸番号が、別途示されない限り、ＥＵ番号付けに従って、対応するサブタイプ（たとえば、ＩｇＧ1またはＩｇＧ4）の重鎖における位置に対応することを意味する。
【００８５】
一部の実施形態において、本発明のタンパク質における第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは、それぞれ、第１および第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体ではなく、第１または第２のポリペプチド鎖のホモ二量体の形成を低減させる、１つまたは複数のアミノ酸変化を含む。これらの変化を通じて、重鎖のうちの一方の境界部に由来する１つまたは複数の小さなアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖（たとえば、チロシンまたはトリプトファン）と置き換わることによって、Ｆｃドメインのうちの一方に、「突起」が生成される。他方のＦｃドメインには、大きなアミノ酸側鎖が、より小さいもの（たとえば、アラニンまたはスレオニン）と置き換わることによって、同一または類似のサイズの補完的「キャビティ」が形成される。これは、ヘテロ二量体の収率を、他の望ましくない最終産物、たとえば、ホモ二量体、特に、「突起」を有するＦｃドメインのホモ二量体よりも増加させるための機序を提供する（たとえば、Ridgway et al. Protein Eng, 1996. 9(7): p. 617-21、Atwell et al, JMB, 1997, 270, 26-35を参照されたい）。一部の実施形態において、そのようなアミノ酸変化は、第１のＦｃドメインの３６６位におけるチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］、および第２のＦｃドメインの４０７位におけるスレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］である。一部の実施形態において、第１のＦｃドメインは、３６６位にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］を含み、第２のＦｃドメインは、３６６位にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］、３６８位にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］、および４０７位にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含む。好ましい実施形態において、第１のＦｃドメインは、３６６位にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含み、第２のＦｃドメインは、３６６位にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、３６８位にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］、および４０７位にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含む。たとえば、配列番号８１のヒトＩｇＧ１  Ｆｃ配列におけるアミノ酸１４６位に対応する、ＥＵ番号付けによるＦｃドメインの３６６位は、配列番号８１における１４６位のＴから、配列番号８２における１４６位のＷに変化しており、配列番号８１におけるアミノ酸１４６位、１４８位、および１８７位にそれぞれ対応する、ＥＵ番号付けによる３６６位、３６８位、および４０７位は、配列番号８１におけるこれらの位置のＴ、Ｌ、およびＹから、配列番号８３におけるこれらの位置のＳ、Ａ、およびＶに変化している。これらの実施形態のいずれにおいても、第１のＦｃドメインについて説明されたアミノ酸変化は、第２のＦｃドメインに位置してもよく、第２のＦｃドメインのそれぞれのアミノ酸変化は、第１のＦｃドメインに位置してもよい。換言すると、「第１」および「第２」という用語は、これらの実施形態において、交換されてもよい。一部の実施形態において、そのようなＦｃドメインは、ＩｇＧ1またはＩｇＧ4の重鎖に由来するＦｃドメインである。
一部の実施形態において、第１のＦｃドメインは、３６６位におけるトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］に加えて、３５４位にシステイン（Ｃ）［Ｓ３５４Ｃ］を含み、第２のＦｃドメインは、３６６位におけるセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、３６８位におけるアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］、および４０７位におけるバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］に加えて、３４９位にシステイン（Ｃ）［Ｙ３４９Ｃ］を含む。一態様において、そのようなＦｃドメインは、ＩｇＧ4の重鎖に由来するＦｃドメインである。
【００８６】
一部の実施形態において、本発明の結合タンパク質における第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは、ＦｃドメインのプロテインＡへの結合を低減させる１つまたは複数のアミノ酸変化をさらに含む。一部の実施形態において、そのようなアミノ酸変化は、Ｆｃドメインうちの一方の４３５位におけるアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］および４３６位におけるフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］である。いずれの変化も、ヒトＩｇＧ３の配列に由来する（ＩｇＧ３は、プロテインＡに結合しない）。これらの２つの突然変異は、ＣＨ３ドメインに位置し、プロテインＡへの結合を低減させるために、Ｆｃドメインのうちの一方に組み込まれる（たとえば、Jendeberg et al. J Immunol Methods, 1997. 201(1): p. 25-34を参照されたい）。これらの２つの変化は、タンパク質精製中に、これらの変化を含む重鎖のホモ二量体の除去を容易にする。
【００８７】
一部の実施形態では、本発明の結合タンパク質において、４０７位にスレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］を含むＦｃドメインは、４３５位にアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］および４３６位にフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］をさらに含む。この事例において、他方の重鎖は、３６６位にチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］を含むが、４３５位および４３６位における２つの変化を含まない。あるいは、一部の実施形態では、本発明のタンパク質において、３６６位にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、３６８位にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］、および４０７位にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含むＦｃドメインは、４３５位にアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］および４３６位にフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］をさらに含む。この事例において、他方のＦｃドメインは、３６６位にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含むが、４３５位および４３６位における２つの変化を含まない。したがって、上述のように「キャビティ」をもたらすアミノ酸変化を含むＦｃドメインはまた、プロテインＡへの結合を低減させるアミノ酸変化も含む。このＦｃドメインを含むホモ二量体は、低減されたプロテインＡへの結合により、除去される。「突起」を含む他方のＦｃドメインのホモ二量体の産生は、「突起」の存在によって低減される。
【００８８】
一部の実施形態において、本発明のタンパク質のＦｃドメインは、ＹＴＥ突然変異（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、ＥＵ番号付け（Dall'Acqua, Kiener et al. 2006)）をさらに含む場合も含まない場合もある。これらの突然変異は、ｐＨ６．０における新生児ＦｃＲｎ受容体に対する結合親和性の優先的な増強を通じて、Ｆｃドメインの薬物動態特性を改善することが示されている。
一部の実施形態において、ＩｇＧ１に由来する本発明の第１および／または第２のＦｃドメインはまた、「ＫＯ」突然変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）も含む。さらなる態様において、ＩｇＧ４に由来する本発明の第１および／または第２のＦｃドメインはまた、Ｐｒｏヒンジ突然変異（Ｓ２２８Ｐ）も含む。
【００８９】
本発明の好ましい実施形態において、結合タンパク質は、ｉ）配列番号７３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１）、またはｉｉ）配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１）、またはｉｉｉ）配列番号７５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１）、またはｉｖ）配列番号７６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃４／ＣＤ３＃１）、またはｖ）配列番号７７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃５／ＣＤ３＃１）、またはｖｉ）配列番号７８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃６／ＣＤ３＃１）、またはｖｉｉ）配列番号２４１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃７／ＣＤ３＃１）、またはｖｉｉｉ）配列番号２４２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃８／ＣＤ３＃１）、またはｉｘ）配列番号２４３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃９／ＣＤ３＃１）、またはｘ）配列番号２４４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１０／ＣＤ３＃１）、またはｘｉ）配列番号２４５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１１／ＣＤ３＃１）、またはｘｉｉ）配列番号２４６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１２／ＣＤ３＃１）、またはｘｉｉｉ）配列番号２４７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１３／ＣＤ３＃１）、またはｘｉｖ）配列番号２４８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１４／ＣＤ３＃１）、またはｘｖ）配列番号２４９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１５／ＣＤ３＃１）、またはｘｖｉ）配列番号２５０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１６／ＣＤ３＃１）、またはｘｖｉｉ）配列番号２５１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１７／ＣＤ３＃１）、またはｘｖｉｉｉ）配列番号２５２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１８／ＣＤ３＃１）を含む。好ましくは、第１および第２のポリペプチド鎖は、１つまたは複数のジスルフィド結合を介して連結され、従来的なＹ字型の抗体分子に類似する抗体様構造（図１）を形成する。
【００９０】
別の好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号７３、配列番号７４、および配列番号７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＤＬＬ３に特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号７９のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。
１つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号７３のアミノ酸配列を含む、ＤＬＬ３に特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号７９のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。
１つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号７４のアミノ酸配列を含む、ＤＬＬ３に特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号７９のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。
１つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号７５のアミノ酸配列を含む、ＤＬＬ３に特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号７９のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態において、結合タンパク質は、ｉ）配列番号７３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号８０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２）、またはｉｉ）配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号８０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２）、またはｉｉｉ）配列番号７５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号８０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２）、またはｉｖ）配列番号７６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号８０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃４／ＣＤ３＃２）、またはｖ）配列番号７７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号８０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃５／ＣＤ３＃２）、またはｖｉ）配列番号７８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号８０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃６／ＣＤ３＃２）、またはｖｉｉ）配列番号２４１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号８０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃７／ＣＤ３＃２）、またはｖｉｉｉ）配列番号２４２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号８０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃８／ＣＤ３＃２）、またはｉｘ）配列番号２４３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号８０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃９／ＣＤ３＃２）、またはｘ）配列番号２４４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号８０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１０／ＣＤ３＃２）、またはｘｉ）配列番号２４５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号８０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１１／ＣＤ３＃２）、またはｘｉｉ）配列番号２４６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号８０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１２／ＣＤ３＃２）、またはｘｉｉｉ）配列番号２４７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号８０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１３／ＣＤ３＃２）、またはｘｉｖ）配列番号２４８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号８０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１４／ＣＤ３＃２）、またはｘｖ）配列番号２４９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号８０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１５／ＣＤ３＃２）、またはｘｖｉ）配列番号２５０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号８０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１６／ＣＤ３＃２）、またはｘｖｉｉ）配列番号２５１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号８０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１７／ＣＤ３＃２）、またはｘｖｉｉｉ）配列番号２５２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号８０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１８／ＣＤ３＃２）を含む。好ましくは、第１および第２のポリペプチド鎖は、１つまたは複数のジスルフィド結合を介して連結され、従来的なＹ字型の抗体分子に類似する抗体様構造（図１）を形成する。
【００９２】
別の好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号７３、配列番号７４、および配列番号７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＤＬＬ３に特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号８０のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。
１つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号７３のアミノ酸配列を含む、ＤＬＬ３に特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号８０のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。
１つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号７４のアミノ酸配列を含む、ＤＬＬ３に特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号８０のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。
１つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号７５のアミノ酸配列を含む、ＤＬＬ３に特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号８０のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。
【００９３】
本発明の好ましい実施形態において、結合タンパク質は、ｉ）配列番号７３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３）、またはｉｉ）配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３）、またはｉｉｉ）配列番号７５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３）、またはｉｖ）配列番号７６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃４／ＣＤ３＃３）、またはｖ）配列番号７７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃５／ＣＤ３＃３）、またはｖｉ）配列番号７８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃６／ＣＤ３＃３）、またはｖｉｉ）配列番号２４１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃７／ＣＤ３＃３）、またはｖｉｉｉ）配列番号２４２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃８／ＣＤ３＃３）、またはｉｘ）配列番号２４３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃９／ＣＤ３＃３）、またはｘ）配列番号２４４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１０／ＣＤ３＃３）、またはｘｉ）配列番号２４５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１１／ＣＤ３＃３）、またはｘｉｉ）配列番号２４６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１２／ＣＤ３＃３）、またはｘｉｉｉ）配列番号２４７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１３／ＣＤ３＃３）、またはｘｉｖ）配列番号２４８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１４／ＣＤ３＃３）、またはｘｖ）配列番号２４９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１５／ＣＤ３＃３）、またはｘｖｉ）配列番号２５０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１６／ＣＤ３＃３）、またはｘｖｉｉ）配列番号２５１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１７／ＣＤ３＃３）、またはｘｖｉｉｉ）配列番号２５２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖および配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（ＤＬＬ３＃１８／ＣＤ３＃３）を含む。好ましくは、第１および第２のポリペプチド鎖は、１つまたは複数のジスルフィド結合を介して連結され、従来的なＹ字型の抗体分子に類似する抗体様構造（図１）を形成する。
【００９４】
別の好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号７３、配列番号７４、および配列番号７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＤＬＬ３に特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。
１つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号７３のアミノ酸配列を含む、ＤＬＬ３に特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。
１つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号７４のアミノ酸配列を含む、ＤＬＬ３に特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。
１つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号７５のアミノ酸配列を含む、ＤＬＬ３に特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。
上述の実施形態のすべてについて、「含む」という用語を使用することにより、それぞれのドメインまたは分子が、示されるアミノ酸配列「からなる」実施形態も含むよう意図することを、理解されたい。
【００９５】
さらなる態様において、本発明は、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖と、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む、タンパク質であって、第１の鎖が、第１のリンカーに共有結合により連結された（たとえば、直接的に結合した）第１の軽鎖を含み、第１のリンカー自体が、第１の重鎖に共有結合により連結されており（たとえば、直接的に結合しており）、ＣＤ３に特異的に結合する第２の鎖が、第２のリンカーに共有結合により連結された（たとえば、直接的に結合した）第２の軽鎖を含み、第２のリンカー自体が、第２の重鎖に共有結合により連結されている（たとえば、直接結合している）、タンパク質を提供する。
【００９６】
一部の実施形態において、そのＮ末端から開始し、第１のポリペプチド鎖は、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１の軽鎖可変領域、第１の軽鎖定常領域、第１のリンカー、ＤＬＬ３に特異的な第１の重鎖可変領域、および第１の重鎖定常領域を含む。一部の実施形態において、そのＮ末端から開始し、第２のポリペプチド鎖は、ＣＤ３に特異的に結合する第２の軽鎖可変領域、第２の軽鎖定常領域、第２のリンカー、ＣＤ３に特異的な第２の重鎖可変領域、および第２の重鎖定常領域を含む。
【００９７】
結果として得られるタンパク質は、全長Ｆｃを有し、これは、ＩｇＧよりもわずかに大きく、ＤＬＬ３に対する第１の結合部位およびＣＤ３に対する第２の結合部位である２つの独立した結合部位を有する（たとえば、それぞれの結合部位は、それぞれの抗原に対して一価である）。好ましくは、第１および第２のポリペプチド鎖は、１つまたは複数のジスルフィド結合を介して連結されている。そのため、本発明のタンパク質は、従来的な全長抗体のＹ字型の構造を有する、抗体様構造体である（図１を参照されたい）。この二重特異性形式により、発現および精製後の不均質性が大幅に低減され（たとえば、異なる結合特異性を有する軽鎖および重鎖可変ドメインの誤った対合を回避することにより）、同時に、構造体内の結合部分の機能的特性が、望ましくない免疫原性反応を生成する可能性が低くなるように維持される。これはまた、たとえば、哺乳動物細胞において、ヘテロ二量体タンパク質の良好な発現も可能にする。
【００９８】
本発明のタンパク質の一部の実施形態において、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖は、第１の軽鎖可変ドメインおよび第１の重鎖可変ドメインを含み、これらは、ｉ）〜ｘｖｉｉｉ）：
ｉ）配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）、および配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）、および配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｉｉ）配列番号７（ＣＤＲ１）、配列番号８（ＣＤＲ２）、および配列番号９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１０（ＣＤＲ１）、配列番号１１（ＣＤＲ２）、および配列番号１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｉｉｉ）配列番号１３（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）、および配列番号１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１６（ＣＤＲ１）、配列番号１７（ＣＤＲ２）、および配列番号１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｉｖ）配列番号１９（ＣＤＲ１）、配列番号２０（ＣＤＲ２）、および配列番号２１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号２２（ＣＤＲ１）、配列番号２３（ＣＤＲ２）、および配列番号２４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｖ）配列番号２５（ＣＤＲ１）、配列番号２６（ＣＤＲ２）、および配列番号２７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号２８（ＣＤＲ１）、配列番号２９（ＣＤＲ２）、および配列番号３０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｖｉ）配列番号３１（ＣＤＲ１）、配列番号３２（ＣＤＲ２）、および配列番号３３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号３４（ＣＤＲ１）、配列番号３５（ＣＤＲ２）、および配列番号３６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｖｉｉ）配列番号１３３（ＣＤＲ１）、配列番号１３４（ＣＤＲ２）、および配列番号１３５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１３６（ＣＤＲ１）、配列番号１３７（ＣＤＲ２）、および配列番号１３８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
【００９９】
ｖｉｉｉ）配列番号１３９（ＣＤＲ１）、配列番号１４０（ＣＤＲ２）、および配列番号１４１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１４２（ＣＤＲ１）、配列番号１４３（ＣＤＲ２）、および配列番号１４４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｉｘ）配列番号１４５（ＣＤＲ１）、配列番号１４６（ＣＤＲ２）、および配列番号１４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１４８（ＣＤＲ１）、配列番号１４９（ＣＤＲ２）、および配列番号１５０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｘ）配列番号１５１（ＣＤＲ１）、配列番号１５２（ＣＤＲ２）、および配列番号１５３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１５４（ＣＤＲ１）、配列番号１５５（ＣＤＲ２）、および配列番号１５６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｘｉ）配列番号１５７（ＣＤＲ１）、配列番号１５８（ＣＤＲ２）、および配列番号１５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１６０（ＣＤＲ１）、配列番号１６１（ＣＤＲ２）、および配列番号１６２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｘｉｉ）配列番号１６３（ＣＤＲ１）、配列番号１６４（ＣＤＲ２）、および配列番号１６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１６６（ＣＤＲ１）、配列番号１６７（ＣＤＲ２）、および配列番号１６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｘｉｉｉ）配列番号１６９（ＣＤＲ１）、配列番号１７０（ＣＤＲ２）、および配列番号１７１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１７２（ＣＤＲ１）、配列番号１７３（ＣＤＲ２）、および配列番号１７４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｘｉｖ）配列番号１７５（ＣＤＲ１）、配列番号１７６（ＣＤＲ２）、および配列番号１７７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１７８（ＣＤＲ１）、配列番号１７９（ＣＤＲ２）、および配列番号１８０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｘｖ）配列番号１８１（ＣＤＲ１）、配列番号１８２（ＣＤＲ２）、および配列番号１８３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１８４（ＣＤＲ１）、配列番号１８５（ＣＤＲ２）、および配列番号１８６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｘｖｉ）配列番号１８７（ＣＤＲ１）、配列番号１８８（ＣＤＲ２）、および配列番号１８９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１９０（ＣＤＲ１）、配列番号１９１（ＣＤＲ２）、および配列番号１９２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｘｖｉｉ）配列番号１９３（ＣＤＲ１）、配列番号１９４（ＣＤＲ２）、および配列番号１９５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１９６（ＣＤＲ１）、配列番号１９７（ＣＤＲ２）、および配列番号１９８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、ならびに
ｘｖｉｉｉ）配列番号１９９（ＣＤＲ１）、配列番号２００（ＣＤＲ２）、および配列番号２０１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号２０２（ＣＤＲ１）、配列番号２０３（ＣＤＲ２）、および配列番号２０４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ
からなる群から選択されるＣＤＲ配列を含む。
【０１００】
これらのＣＤＲ配列によって定義されるそれぞれの軽鎖／重鎖可変ドメインは、それぞれ、ＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３、ＤＬＬ３＃４、ＤＬＬ３＃５、ＤＬＬ３＃６、ＤＬＬ３＃７、ＤＬＬ３＃８、ＤＬＬ３＃９、ＤＬＬ３＃１０、ＤＬＬ３＃１１、ＤＬＬ３＃１２、ＤＬＬ３＃１３、ＤＬＬ３＃１４、ＤＬＬ３＃１５、ＤＬＬ３＃１６、ＤＬＬ３＃１７、およびＤＬＬ３＃１８と称される。好ましくは、ＣＤＲ配列は、上記に定義されるｉ）〜ｉｉｉ）（ＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３）からなる群から選択される。
【０１０１】
本発明の結合タンパク質の好ましい実施形態において、ＣＤ３に特異的に結合する前記第２のポリペプチド鎖は、第２の軽鎖可変ドメインおよび第２の重鎖可変ドメインを含み、これらは、
ｉ）配列番号５５（ＣＤＲ１）、配列番号５６（ＣＤＲ２）、および配列番号５７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号５８（ＣＤＲ１）、配列番号５９（ＣＤＲ２）、および配列番号６０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、
ｉｉ）配列番号６１（ＣＤＲ１）、配列番号６２（ＣＤＲ２）、および配列番号６３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号６４（ＣＤＲ１）、配列番号６５（ＣＤＲ２）、および配列番号６６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、ならびに
ｉｉｉ）配列番号９６（ＣＤＲ１）、配列番号９７（ＣＤＲ２）、および配列番号９８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号９９（ＣＤＲ１）、配列番号１００（ＣＤＲ２）、および配列番号１０１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ
からなる群から選択されるＣＤＲ配列を含む。
これらのＣＤＲ配列によって定義されるそれぞれの軽鎖／重鎖可変ドメインは、それぞれ、ＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、およびＣＤ３＃３と称される。
【０１０２】
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）、および配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する第１の軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）、および配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを有する第１の重鎖可変ドメインを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖と、（ｉｉ）配列番号５５（ＣＤＲ１）、配列番号５６（ＣＤＲ２）、および配列番号５７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する第２の軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号５８（ＣＤＲ１）、配列番号５９（ＣＤＲ２）、および配列番号６０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを有する第２の重鎖可変ドメインを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む。
【０１０３】
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号７（ＣＤＲ１）、配列番号８（ＣＤＲ２）、および配列番号９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する第１の軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１０（ＣＤＲ１）、配列番号１１（ＣＤＲ２）、および配列番号１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを有する第１の重鎖可変ドメインを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖と、（ｉｉ）配列番号５５（ＣＤＲ１）、配列番号５６（ＣＤＲ２）、および配列番号５７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する第２の軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号５８（ＣＤＲ１）、配列番号５９（ＣＤＲ２）、および配列番号６０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを有する第２の重鎖可変ドメインを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む。
【０１０４】
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１３（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）、および配列番号１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する第１の軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１６（ＣＤＲ１）、配列番号１７（ＣＤＲ２）、および配列番号１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを有する第１の重鎖可変ドメインを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖と、（ｉｉ）配列番号５５（ＣＤＲ１）、配列番号５６（ＣＤＲ２）、および配列番号５７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する第２の軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号５８（ＣＤＲ１）、配列番号５９（ＣＤＲ２）、および配列番号６０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを有する第２の重鎖可変ドメインを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む。
【０１０５】
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）、および配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する第１の軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）、および配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを有する第１の重鎖可変ドメインを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖と、（ｉｉ）配列番号６１（ＣＤＲ１）、配列番号６２（ＣＤＲ２）、および配列番号６３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する第２の軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号６４（ＣＤＲ１）、配列番号６５（ＣＤＲ２）、および配列番号６６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを有する第２の重鎖可変ドメインを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む。
【０１０６】
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号７（ＣＤＲ１）、配列番号８（ＣＤＲ２）、および配列番号９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する第１の軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１０（ＣＤＲ１）、配列番号１１（ＣＤＲ２）、および配列番号１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを有する第１の重鎖可変ドメインを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖と、（ｉｉ）配列番号６１（ＣＤＲ１）、配列番号６２（ＣＤＲ２）、および配列番号６３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する第２の軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号６４（ＣＤＲ１）、配列番号６５（ＣＤＲ２）、および配列番号６６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを有する第２の重鎖可変ドメインを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む。
【０１０７】
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１３（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）、および配列番号１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する第１の軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１６（ＣＤＲ１）、配列番号１７（ＣＤＲ２）、および配列番号１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを有する第１の重鎖可変ドメインを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖と、（ｉｉ）配列番号６１（ＣＤＲ１）、配列番号６２（ＣＤＲ２）、および配列番号６３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する第２の軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号６４（ＣＤＲ１）、配列番号６５（ＣＤＲ２）、および配列番号６６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを有する第２の重鎖可変ドメインを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む。
【０１０８】
本発明のタンパク質の好ましい実施形態において、ＤＬＬ３に特異的に結合する前記第１のポリペプチド鎖は、ｉ）〜ｘｖｉｉｉ）：
ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃１）、
ｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃２）、
ｉｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃３）、
ｉｖ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃４）、
ｖ）配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃５）、
ｖｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃６）、
ｖｉｉ）配列番号２０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃７）、
ｖｉｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃８）、
ｉｘ）配列番号２０９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃９）、
ｘ）配列番号２１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃１０）、
ｘｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃１１）、
ｘｉｉ）配列番号２１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃１２）、
ｘｉｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃１３）、
ｘｉｖ）配列番号２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃１４）、
ｘｖ）配列番号２２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃１５）、
ｘｖｉ）配列番号２２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃１６）、
ｘｖｉｉ）配列番号２２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃１７）、ならびに
ｘｖｉｉｉ）配列番号２２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃１８）
からなる群から選択される、軽鎖可変ドメイン（第１の軽鎖可変ドメイン）および重鎖可変ドメイン（第１の重鎖可変ドメイン）を含む。
好ましくは、軽鎖可変および重鎖可変ドメインの配列は、上記に定義されるｉ）〜ｉｉｉ）（ＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３）からなる群から選択される。
【０１０９】
本発明のタンパク質の好ましい実施形態において、ＣＤ３に特異的に結合する前記第２のポリペプチド鎖は、
ｉ）配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＣＤ３＃１）、
ｉｉ）配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＣＤ３＃２）、ならびに
ｉｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号１０３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＣＤ３＃３）
からなる群から選択される、軽鎖可変ドメイン（第２の軽鎖可変ドメイン）および重鎖可変ドメイン（第２の重鎖可変ドメイン）を含む。
【０１１０】
一部の実施形態において、本発明の結合タンパク質は、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃４／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃５／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃６／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃７／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃８／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃９／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１０／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１４／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１５／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１６／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１７／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１８／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃４／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃５／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃６／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃７／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃８／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃９／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１０／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１４／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１５／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１６／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１７／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１８／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃４／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃５／ＣＤ３＃３およびＤＬＬ３＃６／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃７／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃８／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃９／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１０／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１３／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１４／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１５／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１６／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１７／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１８／ＣＤ３＃３からなるリストから選択される軽鎖／重鎖可変ドメインのＣＤＲならびに／またはＶＨおよびＶＬ配列を含む、第１および第２のポリペプチド鎖を含む。好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、およびＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３からなるリストから選択される軽鎖／重鎖可変ドメインのＣＤＲならびに／またはＶＨおよびＶＬ配列を含む、第１および第２のポリペプチド鎖を含む。
【０１１１】
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号３７の軽鎖可変ドメインおよび配列番号３８の重鎖可変ドメインを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖と、（ｉｉ）配列番号６７の軽鎖可変ドメインおよび配列番号６８の重鎖可変ドメインを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む。
【０１１２】
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号３９の軽鎖可変ドメインおよび配列番号４０の重鎖可変ドメインを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖と、（ｉｉ）配列番号６７の軽鎖可変ドメインおよび配列番号６８の重鎖可変ドメインを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む。
【０１１３】
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号４１の軽鎖可変ドメインおよび配列番号４２の重鎖可変ドメインを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖と、（ｉｉ）配列番号６７の軽鎖可変ドメインおよび配列番号６８の重鎖可変ドメインを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む。
【０１１４】
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号３７の軽鎖可変ドメインおよび配列番号３８の重鎖可変ドメインを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖と、（ｉｉ）配列番号６９の軽鎖可変ドメインおよび配列番号７０の重鎖可変ドメインを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む。
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号３９の軽鎖可変ドメインおよび配列番号４０の重鎖可変ドメインを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖と、（ｉｉ）配列番号６９の軽鎖可変ドメインおよび配列番号７０の重鎖可変ドメインを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む。
１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号４１の軽鎖可変ドメインおよび配列番号４２の重鎖可変ドメインを含む、ＤＬＬ３に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖と、（ｉｉ）配列番号６９の軽鎖可変ドメインおよび配列番号７０の重鎖可変ドメインを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む。
【０１１５】
本発明の一部の実施形態において、第１および／または第２のリンカーペプチドは、上述のリンカー、たとえば、ヒンジ領域に由来するリンカー、ポリ−アラニンリンカー、またはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーを含み、ここで、リンカーは、２６〜４２個のアミノ酸、たとえば、３０〜４０個のアミノ酸、３４〜４０個のアミノ酸、または３６〜３９個のアミノ酸のうちのいずれか１つ、好ましくは、３８個のアミノ酸を含む。
好ましい実施形態において、ＤＬＬ３に特異的な第１のポリペプチド鎖は、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、または配列番号２４０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み、ＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖は、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。
【０１１６】
一部の実施形態において、ＤＬＬ３に特異的な第１のポリペプチド鎖は、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、または配列番号２４０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み、ＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖は、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。
【０１１７】
一部の実施形態において、ＤＬＬ３に特異的な第１のポリペプチド鎖は、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、または配列番号２４０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み、ＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖は、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む。
１つの好ましい実施形態において、ＤＬＬ３に特異的な第１のポリペプチド鎖は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖は、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。
１つの好ましい実施形態において、ＤＬＬ３に特異的な第１のポリペプチド鎖は、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖は、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。
１つの好ましい実施形態において、ＤＬＬ３に特異的な第１のポリペプチド鎖は、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖は、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。
１つの好ましい実施形態において、ＤＬＬ３に特異的な第１のポリペプチド鎖は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖は、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。
１つの好ましい実施形態において、ＤＬＬ３に特異的な第１のポリペプチド鎖は、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖は、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。
１つの好ましい実施形態において、ＤＬＬ３に特異的な第１のポリペプチド鎖は、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖は、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。
【０１１８】
本発明の結合タンパク質の一部の実施形態において、第１および第２のポリペプチド鎖は、ＩｇＧ、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４の重鎖に由来するＦｃドメインを含む。たとえば、本発明のＦｃドメインは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４の重鎖のＦｃドメインであり、ヒンジ領域および２つの定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。ヒトＩｇＧのＦｃドメインの例は、配列番号８１および８４に示される。
【０１１９】
本発明の結合タンパク質の一部の実施形態において、重鎖は、１つまたは複数のアミノ酸変化を含む。たとえば、そのようなアミノ酸変化は、第１の重鎖の３６６位におけるチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］、および第２の重鎖の４０７位におけるスレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］である。一部の実施形態において、第１の重鎖は、３６６位にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］を含み、第２の重鎖は、３６６位にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］、３６８位にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］、および４０７位にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含む。好ましい実施形態において、第１の重鎖は、３６６位にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含み、第２の重鎖は、３６６位にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、３６８位にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］、および４０７位にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含む。たとえば、配列番号８１のヒトＩｇＧ１  Ｆｃ配列におけるアミノ酸１４６位に対応する、ＥＵ番号付けによるＦｃドメインの３６６位は、配列番号８１における１４６位のＴから、配列番号８２における１４６位のＷに変化しており、配列番号８１におけるアミノ酸１４６位、１４８位、および１８７位にそれぞれ対応する、ＥＵ番号付けによる３６６位、３６８位、および４０７位は、配列番号８１におけるこれらの位置のＴ、Ｌ、およびＹから、配列番号８３におけるこれらの位置のＳ、Ａ、およびＶに変化している。これらの実施形態のいずれにおいても、第１の重鎖について説明されたアミノ酸変化は、第２の重鎖に位置してもよく、第２の重鎖のそれぞれのアミノ酸変化は、第１の重鎖に位置してもよい。換言すると、「第１」および「第２」という用語は、これらの実施形態において、交換されてもよい。一部の実施形態において、重鎖は、ＩｇＧ1またはＩｇＧ4の重鎖に由来する。
【０１２０】
一部の実施形態において、本発明のタンパク質における第１の重鎖および第２の重鎖は、重鎖のプロテインＡへの結合を低減させる１つまたは複数のアミノ酸変化をさらに含む。一部の実施形態において、そのようなアミノ酸変化は、重鎖うちの一方の４３５位におけるアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］および４３６位におけるフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］である。
【０１２１】
一部の実施形態では、本発明のタンパク質において、４０７位にスレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］を含む重鎖は、４３５位にアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］および４３６位にフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］をさらに含む。この事例において、他方の重鎖は、３６６位にチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］を含むが、４３５位および４３６位における２つの変化を含まない。あるいは、一部の実施形態では、本発明のタンパク質において、３６６位にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、３６８位にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］、および４０７位にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含む重鎖は、４３５位にアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］および４３６位にフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］をさらに含む。この事例において、他方の重鎖は、３６６位にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含むが、４３５位および４３６位における２つの変化を含まない。したがって、上述のように「キャビティ」をもたらすアミノ酸変化を含む重鎖はまた、プロテインＡへの結合を低減させるアミノ酸変化も含む。これらの重鎖を含むホモ二量体は、低減されたプロテインＡへの結合により、除去される。「突起」を含む他方の重鎖のホモ二量体の産生は、「突起」の存在によって低減される。
【０１２２】
一部の実施形態において、本発明のタンパク質の重鎖は、ＹＴＥ突然変異（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、ＥＵ番号付け（Dall'Acqua, Kiener et al. 2006)）をさらに含む場合も含まない場合もある。これらの突然変異は、ｐＨ６．０における新生児ＦｃＲｎ受容体に対する結合親和性の優先的な増強を通じて、重鎖の薬物動態特性を改善することが示されている。
一部の実施形態において、ＩｇＧ１に由来する本発明の第１および／または第２の重鎖はまた、「ＫＯ」突然変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）も含む。さらなる態様において、ＩｇＧ４に由来する本発明の第１および／または第２の重鎖はまた、Ｐｒｏヒンジ突然変異（Ｓ２２８Ｐ）も含む。
【０１２３】
さらなる態様において、本発明のタンパク質は、ヒトおよびカニクイザルＤＬＬ３に対して、好ましくは１０ｎＭ以下、より好ましくは１ｎＭ以下、さらにより好ましくは０．１ｎＭ以下、さらにより好ましくは０．０１ｎＭ以下の親和性を有する、ＤＬＬ３に特異的な第１の抗原結合ユニットまたはポリペプチド鎖を含む。親和性は、たとえば実施例に記載されている、組換えＤＬＬ３タンパク質を使用したＳＰＲ（ＢＩＡｃｏｒｅ）アッセイにおいて、または当業者に周知の他の方法において測定することができる。タンパク質は、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３εγ複合体に対して、好ましくは５００ｎＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ以下、さらにより好ましくは１０ｎＭ以下の親和性を有する、第２の抗原結合ユニットまたはポリペプチド鎖を含む。
さらなる態様において、本発明のＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質は、実施例５において示されるように、ＤＬＬ３陰性細胞には結合せず、ヒトおよびＤＬＬ３パラログＤＬＬ１およびＤＬＬ４と交差反応しない。
【０１２４】
さらなる態様において、本発明のＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質は、ＤＬＬ３タンパク質の膜近傍ペプチドに特異的に結合する第１の抗原結合ユニットまたは第１のポリペプチド鎖を含む。さらなる態様において、本発明のタンパク質は、ＤＬＬ３タンパク質を発現する細胞への弱い結合を示し、たとえば、最大１００ｎＭの濃度まで、細胞表面へのタンパク質結合の飽和は達成されない（たとえば、図６を参照されたい）。
さらなる態様において、本発明のＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質は、Ｔ細胞活性を標的とされる腫瘍細胞に選択的に再指向させ、腫瘍細胞の溶解をもたらすために、ＤＬＬ３を発現する腫瘍細胞とＴ細胞との間の細胞溶解性シナプスの形成に最適な立体条件を提供することによって、腫瘍細胞に対する細胞毒性を媒介することができる。
【０１２５】
様々な方法を使用して、本発明のＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質によって媒介される細胞毒性を測定することができる。たとえば、細胞毒性は、実施例１０に記載される方法を使用して測定することができる。エフェクター細胞は、たとえば、刺激されたかもしくは刺激されていない（ヒトもしくはカニクイザル）Ｔ細胞もしくはそのサブセット（たとえば、ＣＤ４、ＣＤ８）、または刺激されていない（ヒトもしくはカニクイザル）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であり得る。標的細胞は、少なくとも、（ヒトまたはカニクイザル）ＤＬＬ３の細胞外ドメインを発現している必要があり、内因性（天然の）ＤＬＬ３発現を有する細胞、たとえば、ヒト小細胞肺癌細胞株ＳＨＰ７７、ＮＣＩ−Ｈ８２であり得るか、あるいは、全長ＤＬＬ３またはＤＬＬ３の細胞外ドメインのいずれかを発現する組換え細胞であり得る。エフェクター対標的細胞の比（Ｅ：Ｔ）は、通常、約１０：１であるが、変動し得る。ＤＬＬ３／ＣＤ３結合分子の細胞毒性活性は、たとえば、インキュベーションの４８または７２時間後に、ＬＤＨ放出アッセイにおいて判定することができる。細胞毒性の判定に使用されるインキュベーション時間および読取りの改変が可能であり、当業者に公知である。細胞毒性の読取りシステムは、ＭＴＴ／ＭＴＳアッセイ、ＡＴＰベースのアッセイ、ＦＡＣＳベースのアッセイ、５１−クロム放出アッセイ、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ、比色分析（ＷＳＴ）アッセイ、クローン原性アッセイ、ＥＣＩＳ技術、および生物発光アッセイを含み得る。
【０１２６】
本発明のＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質によって媒介される細胞毒性活性は、好ましくは、細胞ベースの細胞毒性アッセイにおいて測定される。細胞毒性は、細胞毒性アッセイにおいて測定されるＥＣ90値によって表される。当業者であれば、精製されたＴ細胞をエフェクター細胞として使用する場合には、ＥＣ90が、ＰＢＭＣと比較して低くなることが予測され得ることを認識しており、また、当業者であれば、刺激されたＴ細胞を使用する場合には、ＥＣ90が、さらに低くなり得ることを認識している。さらに、標的細胞が、細胞表面上に多数のＤＬＬ３を発現する場合には、細胞表面上に少数のＤＬＬ３分子を発現する細胞と比較して、ＥＣ90が低くなると予測することができる。ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質のＥＣ90は、好ましくは１０ｎＭ以下、より好ましくは５ｎＭ以下、およびさらにより好ましくは１ｎＭ以下である。
【０１２７】
好ましくは、本発明の多重特異性結合タンパク質は、ＤＬＬ３陰性細胞の溶解を誘導／媒介しない。ＤＬＬ３陰性細胞の「溶解を誘導／媒介しない」という用語は、ＤＬＬ３／ＣＤ３結合分子が、ＤＬＬ３陰性細胞の３０％を上回る溶解を誘導することも媒介することもなく、好ましくは２０％を上回って、より好ましくは１０％を上回って、または５％を上回って誘導することも媒介することもないことを意味し、一方でＤＬＬ３陽性肺癌細胞株の溶解は、１００％に設定される。これは、通常、最大１０００ｎＭまでの結合タンパク質濃度に適用される。
【０１２８】
好ましくは、本発明のＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質は、標的とされる細胞によって内部移行されない。内部移行の割合は、たとえば、実施例１１に記載されるようにアッセイすることができる。好ましくは、内部移行の割合（たとえば、細胞毒性の減少として測定される）は、ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質を標的細胞とともに４時間プレインキュベーションした後に、５０％以下であり、より好ましくは４０％以下であり、さらにより好ましくは３０％以下である。
【０１２９】
さらに、本発明のＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質は、９５％を上回る（たとえば、少なくとも９８％、実施例１４を参照されたい）の単量体含量で、安定であることが示されており、好ましい薬物動態特性および良好な下流製造性を有し、さらに、良好な生体分布を有することが予測される（たとえば、実施例１２を参照されたい）。本発明のタンパク質は、さらに、好ましい免疫原性プロファイルを有し（実施例１６を参照されたい）、インビトロおよびインビボにおいて良好な安定性を有する（たとえば、実施例１２および１５を参照されたい）。さらに、本発明のＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（たとえば、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２）は、ヒト化インビボ異種移植片マウスモデルにおいて、好ましい有効性を示す。ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質は、ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の初回投薬後にすでに開始される、強力な腫瘍退縮を誘導した。さらに、本発明のＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質は、１週間に１回（ｑ７ｄ）の０．２５ｍｇ／ｋｇという非常に低い用量の投与で、腫瘍退縮を誘導し、その治療適用性をさらに裏付けている。具体的には、本発明のＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質は、ＤＬＬ３陽性標的細胞の存在下においてのみ、選択的なＴ細胞増殖、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞脱顆粒化、およびサイトカイン分泌を誘導し（実施例１８を参照されたい）、ＤＬＬ３陰性標的細胞の存在下においては誘導せず、さらに、腫瘍組織へのＴ細胞浸潤を有意に増加させる（実施例２０を参照されたい）。さらに、実施例１９は、ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質が、ＣＤ４＋ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞再指向型溶解を媒介する。具体的には、ナイーブＴ細胞、ならびにＣＤ４+エフェクターメモリー、ＣＤ４+セントラルメモリー、ＣＤ８+ＣＤ４５ＲＡ+エフェクター、およびＣＤ８+メモリー細胞が、ＤＬＬ３発現腫瘍細胞のＴ細胞再指向型溶解に寄与する。
【０１３０】
本発明のさらなる態様は、本発明の多重特異性結合タンパク質の第一および／または第２の抗原結合ユニットをコードする単離された核酸分子を提供する。一部の実施形態において、核酸分子は、本明細書に記載される第１および／または第２のＦｃドメインをさらにコードし、第１および／または第２のＦｃドメインは、それぞれ、第１および／または第２の抗原結合ユニットをコードする核酸分子の３’末端に連結されている。一部の実施形態において、核酸分子は、ｉ）ＤＬＬ３に特異的な第１の一本鎖Ｆａｂ（たとえば、ＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３、ＤＬＬ３＃４、ＤＬＬ３＃５、ＤＬＬ３＃６、ＤＬＬ３＃７、ＤＬＬ３＃８、ＤＬＬ３＃９、ＤＬＬ３＃１０、ＤＬＬ３＃１１、ＤＬＬ３＃１２、ＤＬＬ３＃１３、ＤＬＬ３＃１４、ＤＬＬ３＃１５、ＤＬＬ３＃１６、ＤＬＬ３＃１７、およびＤＬＬ３＃１８のうちのいずれか１つ）を含み、第１のＦｃドメインを含んでもよい、第１のポリペプチド鎖、ならびに／またはｉｉ）ＣＤ３に特異的な第２の一本鎖Ｆａｂ（たとえば、ＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、およびＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ）を含み、第２のＦｃドメインを含んでもよい、第２のポリペプチド鎖をコードする。
【０１３１】
好ましくは、核酸分子は、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、もしくは配列番号２４０のうちのいずれか１つの第１の一本鎖Ｆａｂ、ならびに／または配列番号７１、配列番号７２、もしくは配列番号１０４の第２の一本鎖Ｆａｂをコードする、ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、核酸分子は、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、もしくは配列番号２５２のうちのいずれか１つの第１のポリペプチド鎖、ならびに／または配列番号７９、配列番号８０、もしくは配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖をコードする、ヌクレオチド配列を含む。
【０１３２】
本発明のさらなる態様は、第１および／または第２の抗原結合ドメイン（たとえば、本発明の第１および／または第２の一本鎖Ｆａｂ）をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む、発現ベクターを提供する。好ましくは、発現ベクターは、さらに、第１および／または第２の抗原結合ドメイン（たとえば、それぞれ、第１および／または第２の一本鎖Ｆａｂ）をコードする核酸分子、好ましくは、ＤＮＡ分子に連結された、第１および／または第２のＦｃドメインをコードする核酸分子、好ましくは、ＤＮＡ分子を含む。そのため、発現ベクターは、第１のＦｃドメインに連結された第１の一本鎖Ｆａｂを含むポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列、および／または第２のＦｃドメインに連結された第２の一本鎖Ｆａｂを含むポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１３３】
好ましい実施形態において、発現ベクターは、本発明の第１および／または第２のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子を含む。好ましい実施形態において、発現ベクターは、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、もしくは配列番号２５２のうちのいずれか１つの第１のポリペプチド鎖、および／または配列番号７９を含む第２のポリペプチド鎖をコードする、ヌクレオチド配列を含む。
さらに好ましい実施形態において、発現ベクターは、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、もしくは配列番号２５２のうちのいずれか１つの第１のポリペプチド鎖、および／または配列番号８０を含む第２のポリペプチド鎖をコードする、ヌクレオチド配列を含む。
【０１３４】
さらに好ましい実施形態において、発現ベクターは、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、もしくは配列番号２５２のうちのいずれか１つの第１のポリペプチド鎖、および／または配列番号１０５を含む第２のポリペプチド鎖をコードする、ヌクレオチド配列を含む。
【０１３５】
特に好ましい実施形態において、２つの発現ベクターを使用してもよく、そのうちの一方は、ＤＬＬ３に特異的な第１のポリペプチド鎖の発現のためのものであり、他方は、ＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖の発現のためのものであり、２つの発現ベクターは、そのため、いずれも、組換えタンパク質発現のために宿主細胞にトランスフェクトされ得る。
好ましくは、発現ベクターは、少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結された、前記核酸分子を含むベクターであり、ここで、そのような制御配列は、プロモーター、エンハンサー、またはターミネーター配列であり得、最も好ましくは、異種プロモーター、エンハンサー、またはターミネーター配列であり得る。
別の態様において、本発明は、本発明のＤＬＬ３に特異的な第１のポリペプチド鎖をコードする発現ベクターと、本発明のＣＤ３に特異的な第２のポリペプチド鎖をコードする発現ベクターとを有する、宿主細胞に関する。
特に好ましい実施形態によると、前記宿主細胞は、真核生物細胞、たとえば、哺乳動物細胞である。別の実施形態において、そのような宿主細胞は、細菌細胞である。他の有用な細胞は、酵母細胞または他の真菌細胞である。
好適な哺乳動物細胞としては、たとえば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞などが挙げられる。しかしながら、当該技術分野において異種タンパク質の発現に使用される、両生類細胞、昆虫細胞、植物細胞、および任意の他の細胞を、同様に使用することができる。
【０１３６】
抗ＤＬＬ３抗体
ＤＬＬ３は、通常、胎児（foetal）の脳におけるゴルジ体のものを含め、細胞内膜に発現され、傍軸中胚葉における体節形成に重要な役割を果たす（Geffers et al., J Cell Biol. 2007;178:465、Chapman et al., Hum. Mol. Genet. 2011;20:905-916）。ＳＣＬＣ、ＬＣＮＥＣ、および神経膠芽腫を含む一部の腫瘍型におけるＤＬＬ３発現の著しい誘導は、細胞表面への局在化をもたらし、これが、非悪性細胞には検出可能な細胞表面ＤＬＬ３が存在しないことと合わさって、腫瘍細胞特異的治療法ならびに診断および予後診断ツールとしての抗ＤＬＬ３抗体の使用の新たな絶好の機会をもたらした。
【０１３７】
いくつかの抗ＤＬＬ３抗体（たとえば、ＬＳ−ｃ１６７４４０、Ｌｉｆｅｓｐａｎ；ＡＰ２１７３９ＰＵ−Ｎ、Ａｃｒｉｓ；ＬＳ−Ｃ１４８７００、ＬＳＢｉｏ）が、市販入手可能である。しかしながら、これらの抗体は、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ＦＡＣＳ、およびＥＬＩＳＡアッセイにおいて性能が良好ではなく、細胞、特に腫瘍細胞上に発現されるＤＬＬ３タンパク質に特異的に結合することができない。抗ＤＬＬ３抗体はまた、たとえば、国際公開第２００７１１１７３３号においても報告されており、神経膠腫患者における診断的使用が提案されているが、ＩＨＣアッセイのデータは示されていない。したがって、患者、たとえば、腫瘍細胞／組織におけるＤＬＬ３発現を正確に測定するため、ならびに／またはＤＬＬ３標的化療法の有効性を評価するための信頼できる診断ツールとしての抗ＤＬＬ３抗体の使用には、課題が残る。
【０１３８】
したがって、様々なアッセイ、たとえば、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、放射免疫測定、フローサイトメトリー、ＩＨＣ、および免疫測定アッセイにおいて、あらゆる種類の生物学的サンプル中のＤＬＬ３タンパク質発現の正確かつ特異的な検出に使用することができ、信頼できる診断用試薬として使用することができる、代替的な抗ＤＬＬ３抗体を特定する必要性がある。
【０１３９】
したがって、本発明のさらなる態様は、
ｉ）配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）、および配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）、および配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｉｉ）配列番号７（ＣＤＲ１）、配列番号８（ＣＤＲ２）、および配列番号９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１０（ＣＤＲ１）、配列番号１１（ＣＤＲ２）、および配列番号１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｉｉｉ）配列番号１３（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）、および配列番号１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１６（ＣＤＲ１）、配列番号１７（ＣＤＲ２）、および配列番号１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｉｖ）配列番号１９（ＣＤＲ１）、配列番号２０（ＣＤＲ２）、および配列番号２１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号２２（ＣＤＲ１）、配列番号２３（ＣＤＲ２）、および配列番号２４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｖ）配列番号２５（ＣＤＲ１）、配列番号２６（ＣＤＲ２）、および配列番号２７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号２８（ＣＤＲ１）、配列番号２９（ＣＤＲ２）、および配列番号３０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｖｉ）配列番号３１（ＣＤＲ１）、配列番号３２（ＣＤＲ２）、および配列番号３３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号３４（ＣＤＲ１）、配列番号３５（ＣＤＲ２）、および配列番号３６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｖｉｉ）配列番号１３３（ＣＤＲ１）、配列番号１３４（ＣＤＲ２）、および配列番号１３５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１３６（ＣＤＲ１）、配列番号１３７（ＣＤＲ２）、および配列番号１３８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｖｉｉｉ）配列番号１３９（ＣＤＲ１）、配列番号１４０（ＣＤＲ２）、および配列番号１４１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１４２（ＣＤＲ１）、配列番号１４３（ＣＤＲ２）、および配列番号１４４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｉｘ）配列番号１４５（ＣＤＲ１）、配列番号１４６（ＣＤＲ２）、および配列番号１４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１４８（ＣＤＲ１）、配列番号１４９（ＣＤＲ２）、および配列番号１５０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｘ）配列番号１５１（ＣＤＲ１）、配列番号１５２（ＣＤＲ２）、および配列番号１５３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１５４（ＣＤＲ１）、配列番号１５５（ＣＤＲ２）、および配列番号１５６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｘｉ）配列番号１５７（ＣＤＲ１）、配列番号１５８（ＣＤＲ２）、および配列番号１５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１６０（ＣＤＲ１）、配列番号１６１（ＣＤＲ２）、および配列番号１６２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｘｉｉ）配列番号１６３（ＣＤＲ１）、配列番号１６４（ＣＤＲ２）、および配列番号１６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１６６（ＣＤＲ１）、配列番号１６７（ＣＤＲ２）、および配列番号１６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｘｉｉｉ）配列番号１６９（ＣＤＲ１）、配列番号１７０（ＣＤＲ２）、および配列番号１７１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１７２（ＣＤＲ１）、配列番号１７３（ＣＤＲ２）、および配列番号１７４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｘｉｖ）配列番号１７５（ＣＤＲ１）、配列番号１７６（ＣＤＲ２）、および配列番号１７７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１７８（ＣＤＲ１）、配列番号１７９（ＣＤＲ２）、および配列番号１８０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲを含む、または
ｘｖ）配列番号１８１（ＣＤＲ１）、配列番号１８２（ＣＤＲ２）、および配列番号１８３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１８４（ＣＤＲ１）、配列番号１８５（ＣＤＲ２）、および配列番号１８６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｘｖｉ）配列番号１８７（ＣＤＲ１）、配列番号１８８（ＣＤＲ２）、および配列番号１８９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１９０（ＣＤＲ１）、配列番号１９１（ＣＤＲ２）、および配列番号１９２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｘｖｉｉ）配列番号１９３（ＣＤＲ１）、配列番号１９４（ＣＤＲ２）、および配列番号１９５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１９６（ＣＤＲ１）、配列番号１９７（ＣＤＲ２）、および配列番号１９８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ、または
ｘｖｉｉｉ）配列番号１９９（ＣＤＲ１）、配列番号２００（ＣＤＲ２）、および配列番号２０１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号２０２（ＣＤＲ１）、配列番号２０３（ＣＤＲ２）、および配列番号２０４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ
を含む、抗ＤＬＬ３抗体分子を提供する。
【０１４０】
上記のｉ）〜ｘｖｉｉｉ）に概説される抗体は、それぞれ、ＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３、ＤＬＬ３＃４、ＤＬＬ３＃５、ＤＬＬ３＃６、ＤＬＬ３＃７、ＤＬＬ３＃８、ＤＬＬ３＃９、ＤＬＬ３＃１０、ＤＬＬ３＃１１、ＤＬＬ３＃１２、ＤＬＬ３＃１３、ＤＬＬ３＃１４、ＤＬＬ３＃１５、ＤＬＬ３＃１６、ＤＬＬ３＃１７、またはＤＬＬ３＃１８と称される。本発明の特定の抗体に対する個々のアミノ酸配列の特定を容易に可能にする配列表が、本明細書において提供される。
本発明の好ましい実施形態において、抗体分子は、ＤＬＬ３＃１またはＤＬＬ３＃５に対応する上記のｉ）またはｖ）に定義されるＣＤＲ配列を含む。
【０１４１】
一部の実施形態において、本発明の抗ＤＬＬ３抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体分子である。一部の実施形態において、抗体分子は、モノクローナル抗体Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、またはｓｃＦｖである。一部の実施形態において、本発明の抗ＤＬＬ３抗体分子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ定常領域からなる群から選択される重鎖定常領域を含む。一部の実施形態において、本発明の抗ＤＬＬ３抗体分子の軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダである。
【０１４２】
一部の実施形態において、本発明の抗ＤＬＬ３抗体は、配列番号３８、４０、４２、４４、４６、４８、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、および２２８のうちのいずれか１つに少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメインを有する。好ましくは、抗体分子は、配列番号３８、４０、４２、４４、４６、４８、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、または２２８のアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメインを有する。
【０１４３】
一部の実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体分子は、配列番号３７、３９、４１、４３、４５、４７、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、および２２７のうちのいずれか１つに少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメインを有する。好ましくは、抗体分子は、配列番号３７、３９、４１、４３、４５、４７、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、または２２７のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメインを有する。
アミノ酸配列同一性を計算する方法は、当該技術分野において周知であり、本明細書では本明細書の定義の節においてさらに考察されている。
【０１４４】
一部の実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体分子は、ｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃１）、またはｉｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃２）、またはｉｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃３）、またはｉｖ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃４）、またはｖ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃５）、またはｖｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃６）、またはｖｉｉ）配列番号２０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号２０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃７）、またはｖｉｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号２０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃８）、またはｉｘ）配列番号２０９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号２１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃９）、またはｘ）配列番号２１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号２１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃１０）、またはｘｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号２１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃１１）、またはｘｉｉ）配列番号２１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号２１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃１２）、またはｘｉｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号２１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃１３）、またはｘｉｖ）配列番号２１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号２２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃１４）、またはｘｖ）配列番号２２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号２２２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃１５）、またはｘｖｉ）配列番号２２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号２２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃１６）、またはｘｖｉｉ）配列番号２２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号２２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃１７）、またはｘｖｉｉｉ）配列番号２２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号２２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＤＬＬ３＃１８）を有する。
【０１４５】
一部の実施形態において、本発明の抗ＤＬＬ３抗体は、マウスモノクローナル抗体である。本発明の文脈において、マウスモノクローナル抗体には、ＶＨおよびＶＬが、ヒトＤＬＬ３タンパク質をマウスに免疫付与し、続いて、ヒトＤＬＬ３にある特定の親和性で結合する好適なＶＨおよびＶＬ配列を選択し、次いで、さらにそのようなＶＨおよびＶＬ配列を、組換え技法によりマウス（たとえば、マウスＩｇＧ２ａ）に由来する定常ドメインに結合させることによって得られ、宿主細胞における組換え発現によって産生される、抗体が含まれる。キメラ抗体、たとえば、異なる種に由来する可変および定常領域を含むものが、本発明によってさらに包含される。一部の実施形態において、本発明の抗体分子は、上述のマウスに由来するＶＨおよびＶＬドメインを含み、さらに、別の種、たとえば、ヒト、ウサギ、ラット、ヤギ、ロバに由来する定常ドメインを含む、キメラ抗体である。一部の実施形態において、キメラ抗体は、マウスに由来し、さらに上記に定義されるようにヒト化または配列最適化された、ＶＨおよびＶＬドメインを含み、別の種に由来する定常ドメインをさらに含む。一部の実施形態において、キメラ抗体は、ヒトＩｇＧ配列を含むトランスジェニック動物（たとえば、マウス）に由来するＶＨおよびＶＬドメインを含み、したがって、ヒトＶＨおよびＶＬ配列を含み、別の種に由来する定常ドメインをさらに含む。上記に概説されたキメラ抗体の実施形態のうちのいずれかにおいて、重鎖定常領域は、マウス、ヒト、ウサギ、ラット、ヤギ、またはロバ重鎖領域である。
【０１４６】
一部の実施形態において、本発明の抗ＤＬＬ３抗体分子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ定常ドメインからなる群から選択される定常ドメインを有する。好ましい実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体は、好ましくは配列番号２５４の配列を含む、ＩｇＧ２ａの定常ドメインを有する。一部の実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体分子は、カッパまたはラムダである軽鎖定常ドメインを有し、好ましくは、軽鎖定常ドメインは、好ましくは配列番号２５５の配列を含む、カッパ軽鎖定常ドメインである。
【０１４７】
一部の実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体分子は、好ましくは１０ｎＭ以下、より好ましくは１ｎＭ以下、さらにより好ましくは０．１ｎＭ以下、なおもより好ましくは０．０１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で、ヒトおよびカニクイザルＤＬＬ３に結合することができる。親和性（ＫＤ値）は、たとえば実施例に記載されている、組換えＤＬＬ３タンパク質を使用したＳＰＲ（ＢＩＡｃｏｒｅ）アッセイにおいて、または当業者に周知の他の方法において測定することができる。
一部の実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体分子は、マウスＤＬＬ３には結合しない。
【０１４８】
一部の実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体分子は、組織サンプル（たとえば、パラフィン包埋／ホルマリン固定組織サンプル）、たとえば、腫瘍組織サンプルまたは培養細胞株におけるＤＬＬ３発現（たとえば、細胞質および表面タンパク質発現）を検出することができる。パラフィン包埋／ホルマリン固定細胞培養物または組織サンプルは、プロテイナーゼＫなどのエピトープ賦活剤（epitope retriever）でさらに処理してもよい。
【０１４９】
一部の実施形態において、本発明の抗ＤＬＬ３抗体分子は、ＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ２＃２、ＤＬＬ３＃３、ＤＬＬ３＃４、ＤＬＬ３＃５、ＤＬＬ３＃６、ＤＬＬ３＃７、ＤＬＬ３＃８、ＤＬＬ３＃９、ＤＬＬ３＃１０、ＤＬＬ３＃１１、ＤＬＬ３＃１２、ＤＬＬ３＃１３、ＤＬＬ３＃１４、ＤＬＬ３＃１５、ＤＬＬ３＃１６、ＤＬＬ３＃１７、またはＤＬＬ３＃１８抗体のうちのいずれか１つと同じエピトープに結合する。一部の実施形態において、本発明の抗ＤＬＬ３抗体分子は、ヒトＤＬＬ３への結合に関して、ＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ２＃２、ＤＬＬ３＃３、ＤＬＬ３＃４、ＤＬＬ３＃５、ＤＬＬ３＃６、ＤＬＬ３＃７、ＤＬＬ３＃８、ＤＬＬ３＃９、ＤＬＬ３＃１０、ＤＬＬ３＃１１、ＤＬＬ３＃１２、ＤＬＬ３＃１３、ＤＬＬ３＃１４、ＤＬＬ３＃１５、ＤＬＬ３＃１６、ＤＬＬ３＃１７、またはＤＬＬ３＃１８抗体分子のうちのいずれか１つと交差競合する。
本発明の別の態様は、本発明の抗ＤＬＬ３抗体分子の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする、単離された核酸分子を提供する。
【０１５０】
好ましくは、核酸分子は、配列番号３８、４０、４２、４４、４６、４８、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、または２２８のうちのいずれか１つの重鎖可変ドメインをコードする、ヌクレオチド配列を含む。好ましくは、核酸分子は、配列番号３７、３９、４１、４３、４５、４７、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、または２２７のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメインをコードする、ヌクレオチド配列を含む。
本発明のさらなる態様は、本発明の抗ＤＬＬ３抗体分子の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む、発現ベクターを提供する。
好ましくは、発現ベクターは、さらに、核酸分子、好ましくは、核酸分子に連結された重鎖の定常ドメインおよび／または軽鎖の定常ドメインそれぞれをコードするＤＮＡ分子、好ましくは、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインそれぞれをコードするＤＮＡ分子を含む。
【０１５１】
特に好ましい実施形態において、２つの発現ベクターを使用してもよく、それらのうちの一方は、重鎖の発現のためのものであり、他方は、軽鎖の発現のためのものであり、これら２つの発現ベクターは、そのため、両方が、組換えタンパク質発現のために宿主細胞にトランスフェクトされ得る。
好ましくは、発現ベクターは、少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結された、前記核酸分子を含むベクターであり、ここで、そのような制御配列は、プロモーター、エンハンサー、またはターミネーター配列であり得、もっとも好ましくは、異種プロモーター、エンハンサー、またはターミネーター配列であり得る。
別の態様において、本発明は、本発明の抗ＤＬＬ３抗体分子の重鎖をコードする発現ベクターと、本発明の抗ＤＬＬ３抗体分子の軽鎖をコードする発現ベクターとを有する、宿主細胞に関する。
特に好ましい実施形態によると、前記宿主細胞は、真核生物細胞、たとえば、哺乳動物細胞である。別の実施形態において、そのような宿主細胞は、細菌細胞である。他の有用な細胞は、酵母細胞または他の真菌細胞である。
【０１５２】
好適な哺乳動物細胞としては、たとえば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞などが挙げられる。しかしながら、当該技術分野において異種タンパク質の発現に使用される、両生類細胞、昆虫細胞、植物細胞、および任意の他の細胞を、同様に使用することができる。
【０１５３】
製造および精製の方法
本発明は、本発明の多重特異性結合タンパク質を製造する方法であって、概して、
−  本発明の結合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、本発明の結合タンパク質の形成を可能にする条件下において培養するステップと、
−  宿主細胞によって発現された結合タンパク質を、培養物から回収するステップとを含み、
−  さらに、本発明の結合タンパク質を精製および／または修飾および／または製剤化するステップを含んでもよい、方法をさらに提供する。
本発明は、本発明の抗ＤＬＬ３抗体を製造する方法であって、概して、
−  本発明の抗体分子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、抗体分子の形成を可能にする条件下において培養するステップと、
−  宿主細胞によって発現された抗体分子を、培養物から回収するステップとを含み、
−  さらに、本発明の抗体分子を精製および／または修飾および／または製剤化するステップを含んでもよい、方法をさらに提供する。
【０１５４】
本発明の核酸は、たとえば、コーディング配列、ならびに制御配列を含み、天然もしくは人工のイントロンを含んでもよい、ＤＮＡ分子であってもよく、またはｃＤＮＡ分子であってもよい。それは、そのもともとのコドンを有してもよく、または意図される宿主細胞もしくは宿主生物における発現のために特別に適合された、最適化されたコドン使用頻度を有してもよい。本発明の一実施形態によると、本発明の核酸は、上記に定義されるように、本質的に単離された形態である。
本発明の核酸は、本明細書に提供される本発明のタンパク質のアミノ酸配列上の情報に基づいて、本質的に公知の様式で（たとえば、自動化されたＤＮＡ合成および／または組換えＤＮＡ技術によって）調製または獲得することができる。
本発明の核酸は、典型的に、発現ベクター、すなわち、好適な宿主細胞または他の発現系にトランスフェクトされるとタンパク質の発現をもたらすことができるベクターに、組み込まれるであろう。
本発明の結合タンパク質または抗体を製造するために、当業者であれば、当該技術分野において周知の様々な発現系、たとえば、Kipriyanow and Le Gall, 2004によって考察されているものから、選択することができる。
【０１５５】
発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、コスミド、ＥＢＶ由来のエピソームなどが含まれる。発現ベクターおよび発現制御配列は、宿主細胞と適合するように選択される。ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の第１の抗原結合ユニット（たとえば、本発明の結合タンパク質のＤＬＬ３特異的一本鎖Ｆａｂもしくは全長ＤＬＬ３鎖）をコードするヌクレオチド配列、および第２の抗原結合ユニット（たとえば、本発明の結合タンパク質のＣＤ３特異的一本鎖Ｆａｂもしくは全長ＣＤ３鎖）をコードするヌクレオチド配列を、別個のベクターに挿入してもよい。ある特定の実施形態において、両方のＤＮＡ配列は、同じ発現ベクターに挿入される。ＤＬＬ３抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列およびＤＬＬ３抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列を、別個のベクターに挿入してもよい。ある特定の実施形態において、両方のＤＮＡ配列は、同じ発現ベクターに挿入される。
【０１５６】
便宜的なベクターは、機能的に完全なヒトＣＨ（重鎖定常）免疫グロブリン配列をコードし、任意の抗原結合ユニット、たとえば、一本鎖Ｆａｂ配列または任意の重鎖／軽鎖可変ドメインが、上述のように、容易に挿入および発現され得るように、操作された適切な制限部位を有するものである。抗体重鎖については、これは、限定することなく、任意のＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、または対立遺伝子バリアントを含む他の免疫グロブリンであり得る。
組換え発現ベクターはまた、宿主細胞からの全長ＣＤ３もしくはＤＬＬ３鎖、または抗ＤＬＬ３抗体の軽鎖／重鎖の分泌を促進する、シグナペプチドもコードし得る。タンパク質鎖をコードするＤＮＡは、シグナルペプチドが、成熟した全長鎖ＤＮＡのアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドであってもよく、または非免疫グロブリンタンパク質由来の異種ペプチドであってもよい。あるいは、本発明のタンパク質の全長鎖をコードするＤＮＡ配列が、シグナルペプチド配列をすでに含んでいてもよい。
【０１５７】
ＤＬＬ３／ＣＤ３鎖をコードするＤＮＡ配列またはＤＬＬ３抗体の重鎖／軽鎖をコードするＤＮＡ配列に加えて、組換え発現ベクターは、典型的に、プロモーター、エンハンサー、終止およびポリアデニル化シグナル、ならびに宿主細胞におけるタンパク質鎖の発現を制御する他の発現制御エレメントを含む、異種制御配列であってもよい制御配列を有する。プロモーター配列の例（哺乳動物細胞における発現に関して例示）は、ＣＭＶ（たとえば、ＣＭＶシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（たとえば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー、ならびに強力な哺乳動物プロモーター、たとえば、天然の免疫グロブリンおよびアクチンプロモーターがある。ポリアデニル化シグナルの例は、ＢＧＨポリＡ、ＳＶ４０後期または初期ポリＡであり、代替的に、免疫グロブリン遺伝子の３’ＵＴＲなどを使用してもよい。
【０１５８】
組換え発現ベクターはまた、宿主細胞におけるベクターの複製を制御する配列（たとえば、複製起点）および選択的なマーカー遺伝子も有し得る。第１の抗原結合ユニット（一本鎖ＦａｂおよびＦｃドメイン）もしくはその抗原結合部分を有する全長鎖、および／または第２の抗原結合ユニット（一本鎖ＦａｂおよびＦｃドメイン）もしくはその抗原結合部分を有する全長鎖をコードする核酸分子、ならびにこれらのＤＮＡ分子を含むベクターは、リポソームに媒介されるトランスフェクション、ポリカチオンに媒介されるトランスフェクション、プロトプラスト融合、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈降、エレクトロポレーション、またはウイルスベクターによる移入を含む、当該技術分野において周知のトランスフェクション方法に従って、宿主細胞、たとえば、細菌細胞またはより高次の真核生物細胞、たとえば、哺乳動物細胞に導入することができる。
好ましくは、本発明のタンパク質のＤＬＬ３およびＣＤ３鎖をコードするＤＮＡ分子は、２つの発現ベクターに存在し、これらは、宿主細胞、好ましくは哺乳動物細胞に、コトランスフェクトされる。
【０１５９】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術分野において周知であり、これには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０、ＳＰ２／０細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト癌腫細胞（たとえば、Ｈｅｐ  Ｇ２およびＡ−５４９細胞）、３Ｔ３細胞、または任意のこのような細胞株の誘導体／子孫が挙げられる。ヒト、マウス、ラット、サル、およびげっ歯動物細胞株を含むがこれらに限定されない他の哺乳動物細胞、または酵母、昆虫、および植物細胞を含むがこれらに限定されない他の真核生物細胞、または細菌などの原核生物細胞を、使用することができる。
【０１６０】
本発明のタンパク質は、宿主細胞におけるタンパク質の発現を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって産生される。タンパク質分子は、好ましくは、分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収されるか、またはそれは、たとえば、分泌シグナルなしで発現される場合、宿主細胞ライセートから回収することができる。タンパク質の実質的に均質な調製物が得られる様式で、組換えタンパク質および宿主細胞タンパク質に使用される標準的なタンパク質精製方法を使用して、タンパク質分子を精製することが必要である。例として、本発明のタンパク質分子を得るのに有用な最新の精製方法には、第１のステップとして、細胞および粒子細胞残屑を培養培地またはライセートから除去することが含まれる。タンパク質は、次いで、混入可溶性タンパク質、ポリペプチド、および核酸から、たとえば、免疫親和性もしくはイオン交換カラムにおける分画、エタノール沈降、逆相ＨＰＬＣ、Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィー、シリカまたはカチオン交換樹脂におけるクロマトグラフィーによって、精製される。タンパク質分子調製物を得るためのプロセスにおける最終ステップとして、精製されたタンパク質分子を、治療適用のために、後述されるように乾燥、たとえば、凍結乾燥させてもよい。
【０１６１】
本発明は、少なくとも２つの異なる標的に対する結合特異性を有する結合タンパク質に関する。本発明に関して、結合分子は、抗体に由来する。結合分子を作製するための技法としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン鎖の組換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)）、国際公開第９３／０８８２９号、およびTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照されたい）、ならびに「ノブインホール（knob-in-hole）」操作（たとえば、米国特許第５，７３１，１６８号、Atwell et al, JMB, 1997, 270, 26-35を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の結合タンパク質はまた、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング作用の操作（国際公開第２００９／０８９００４号）、２つまたはそれを上回る抗体またはフラグメントの架橋（たとえば、米国特許第４，６７６，９８０号およびBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照されたい）、ロイシンジッパーを使用して二重特異性タンパク質を産生すること（たとえば、Kostelny et al., Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)を参照されたい）、二重特異性抗体フラグメントを作製するための「ダイアボディ」技術の使用（たとえば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444- 6448 (1993)を参照されたい）、ならびに一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用（たとえば、Gruber et al., /. Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい）、ならびにたとえばTutt et al. /. Immunol. 147: 60 (1991)に記載される三重特異性抗体の調製によっても、作製することができる。
【０１６２】
本明細書に開示される組成物（たとえば、多重特異性結合タンパク質および抗ＤＬＬ３抗体）ならびに方法は、指定される配列、またはそれに実質的に同一もしくは類似である配列、たとえば、指定される配列に少なくとも８５％、９０％、９５％同一であるかもしくはそれを上回って同一である配列を有する、ポリペプチドおよび核酸を包含する。アミノ酸配列の文脈において、「実質的に同一である」という用語は、第１および第２のアミノ酸配列が、共通の構造ドメインおよび／または共通の機能的活性を有し得るように、第１のアミノ酸配列が、第２のアミノ酸配列におけるアライメントしたアミノ酸残基と、ｉ）同一であるか、またはｉｉ）その保存的置換である、十分な数または最小限の数のアミノ酸残基を含むことを指して、本明細書に使用される。たとえば、共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列は、参照配列、たとえば、本明細書に提供される配列に対して、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。ヌクレオチド配列の文脈において、「実質的に同一である」という用語は、第１および第２のヌクレオチド配列が、共通の機能的活性を有するポリペプチドをコードするか、または共通の構造ポリペプチドドメインもしくは共通の機能的ポリペプチド活性をコードするように、第１の核酸配列が、第２の核酸配列におけるアライメントしたヌクレオチドに同一である十分な数または最小限の数のヌクレオチド、たとえば、参照配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことを指して、本明細書に使用される。
【０１６３】
本発明の核酸分子としては、配列表に示されるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ分子が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明は、国際公開第２００７／０４２３０９号に定義されるように、高ストリンジェンシーの結合および洗浄条件下において配列表に示されるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ分子にハイブリダイズする核酸分子にも関する。好ましい分子（ｍＲＮＡの観点から）は、本明細書に記載されるＤＮＡ分子のうち１つと少なくとも７５％または８０％（好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、およびもっとも好ましくは少なくとも９５％）の相同性または配列同一性を有するものである。例として、真核生物細胞における抗体の発現を考慮して、配列表に示されるＤＮＡ配列は、真核生物細胞におけるコドン使用頻度に一致するように設計されている。抗体を大腸菌において発現させることが所望される場合には、これらの配列は、大腸菌のコドン使用頻度に一致するように変更することができる。本発明のＤＮＡ分子のバリアントを、国際公開第２００７／０４２３０９号に記載されるように、いくつかの異なる様式において、構築することができる。
【０１６４】
本発明のタンパク質は、ある特定の発現系（たとえば、特定のベクターもしくは宿主細胞）を使用した発現のため、または封入体としてもしくは可溶性形態で発現させるため、または培地もしくは細胞膜周辺腔へ分泌させるためもしくは細胞内に含めるため、またはより均質な産物を得るために、分子を最適化するように、修飾されたＮ末端配列、たとえば、Ｎ末端アミノ酸のうちの１つもしくは複数の欠失、またはたとえば第１のＮ末端アミノ酸の交換（たとえば、グルタミン酸からアラニンへ）を有してもよい。本発明のポリペプチドは、たとえば、さらに、そのようなポリペプチドの安定性を増強させるかまたは免疫原性を低減させるために、たとえば、国際公開第２０１２／１７５７４１号、同第２０１１／０７５８６１号、または同第２０１３／０２４０５９号において説明されているように、修飾されたＣ末端配列、たとえば、追加のアラニン、および／またはＣ末端部分もしくはフレームワーク領域のうちのいずれかの内の他の定義される位置におけるさらなるアミノ酸の変化を有してもよい。
曖昧さを回避するために、本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質のうちのいずれかに関して、本明細書に記載される医薬組成物、キット、処置方法、医療上の使用、組合せ、投与の方法、および投薬量に関する実施形態のすべてが、単独またはさらなる治療剤（以下により詳細に示される）との組合せのいずれかで企図される。
【０１６５】
医薬組成物、投与の方法、投薬量
本発明は、さらに、少なくとも１つの本発明の多重特異性結合タンパク質を含む、疾患（以下により詳細に示される）の処置のための医薬組成物に関する。本発明は、さらに、少なくとも１つの本発明の多重特異性タンパク質または以下に示される医薬組成物を使用して、疾患（以下により詳細に示される）を処置する方法を包含し、さらに、そのような本発明の結合タンパク質または医薬組成物を使用することによるそのような疾患の処置のための医薬の調製を包含する。
【０１６６】
本発明の結合タンパク質（たとえば、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃４／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃５／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃６／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃７／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃８／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃９／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１０／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１４／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１５／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１６／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１７／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１８／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃４／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃５／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃６／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃７／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃８／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃９／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１０／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１４／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１５／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１６／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１７／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１８／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃４／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃５／ＣＤ３＃３およびＤＬＬ３＃６／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃７／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃８／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃９／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１０／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１３／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１４／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１５／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１６／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１７／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１８／ＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ、好ましくは、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ）および／またはそれを含む組成物は、使用される具体的な医薬製剤または組成物に応じて、任意の好適な様式で、それを必要とする患者に投与され得る。したがって、本発明の結合タンパク質および／またはそれを含む組成物は、たとえば、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、経皮、経口、舌下（たとえば、舌下錠、スプレー、もしくはドロップ剤の形態で、舌下に入れ、粘膜を通じて舌下の毛細管網目構造に吸収される）、鼻（内）（たとえば、点鼻スプレーおよび／もしくはエアロゾルの形態で）、局所に、坐剤を用いて、吸入により、または任意の他の好適な様式で、有効量または有効用量において、投与され得る。結合タンパク質は、注入、ボーラス、または注射によって投与してもよい。好ましい実施形態において、投与は、静脈内注入または皮下注射によって行われる。
【０１６７】
本発明の結合タンパク質および／またはそれを含む組成物は、処置または緩和しようとする疾患、障害、または状態を処置および／または緩和するのに好適な処置レジメンに従って投与される。臨床医は、一般に、処置または緩和しようとする疾患、障害、または状態、疾患の重症度、その症状の重症度、使用しようとする具体的な本発明の結合タンパク質、使用しようとする具体的な投与経路および医薬製剤もしくは組成物、患者の年齢、性別、体重、食事、全体的な状態、ならびに臨床医に周知の同様の因子といった因子に応じて、好適な処置レジメンを決定することができるであろう。一般に、処置レジメンは、治療有効量または用量での１つもしくは複数の本発明の結合タンパク質、またはそれを含む１つもしくは複数の組成物の投与を含む。
【０１６８】
一般に、本明細書に言及される疾患、障害、および状態の処置および／または緩和に関して、また処置しようとする具体的な疾患、障害、または状態、使用しようとする具体的な本発明の結合タンパク質の有効性、使用される具体的な投与の経路および具体的な医薬製剤または組成物に応じて、本発明の結合タンパク質は、通常、体重１キログラムおよび１用量当たり０．００５〜２０．０ｍｇの量、好ましくは０．０５〜１０．０ｍｇ／ｋｇ／用量で、連続的に（たとえば、注入によって）またはより好ましくは単回用量（たとえば、１週間に２回、週ごと、または月ごとの用量、以下を参照されたい）として投与されるが、特に前述のパラメーターに応じて、有意に変動し得る。したがって、一部の事例において、上記に提供された最小用量未満の使用が十分な場合があり、一方で、他の事例においては、上限を超える必要がある場合もある。多量に投与する場合は、それをある回数のより少ない用量に分割し、それをその１日にわたって分散させることが賢明な場合がある。
【０１６９】
本発明の具体的な結合タンパク質ならびにその具体的な薬物動態および他の特性に応じて、それは、毎日、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、または６日に１回、週ごと、月ごとなどで投与され得る。投与レジメンは、長期の週ごとの処置を含み得る。「長期」とは、少なくとも２週間、および好ましくは数ヶ月、または数年の期間を意味する。
【０１７０】
本発明の多重特異性タンパク質およびそれを含む組成物の有効性は、関連する具体的な疾患に応じて、本質的に公知の任意の好適なインビトロアッセイ、細胞ベースのアッセイ、インビボアッセイ、および／もしくは動物モデル、またはそれらの任意の組合せを使用して、試験することができる。好適なアッセイおよび動物モデルは、当業者には明らかであり、たとえば、以下の実施例において使用されるアッセイおよび動物モデルが挙げられる。
【０１７１】
製剤
医薬での使用のために、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）少なくとも１つの本発明の結合タンパク質（たとえば、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃４／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃５／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃６／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃７／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃８／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃９／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１０／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１４／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１５／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１６／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１７／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１８／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃４／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃５／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃６／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃７／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃８／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃９／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１０／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１４／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１５／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１６／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１７／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１８／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃４／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃５／ＣＤ３＃３およびＤＬＬ３＃６／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃７／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃８／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃９／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１０／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１３／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１４／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１５／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１６／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１７／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１８／ＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ、好ましくは、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ）と、（ｉｉ）少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、および／または安定剤とを含み、（ｉｉｉ）１つまたは複数のさらなる薬理学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含んでもよい、医薬調製物として製剤化され得る。「薬学的に許容される」とは、それぞれの材料が、個別に投与した場合にいずれの生物学的作用もそれ以外の望ましくない作用も示さず、それが含まれている医薬組成物の他の成分（たとえば、薬学的に活性な成分）のうちのいずれとも有害な様式で相互作用しないことを意味する。具体的な例は、標準的な教本、たとえば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990)などに見出すことができる。たとえば、本発明の結合タンパク質は、従来的な抗体および抗体フラグメント、ならびに他の薬学的に活性なタンパク質に関して本質的に公知の任意の様式で製剤化および投与することができる。したがって、さらなる実施形態によると、本発明は、少なくとも１つの本発明の結合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、および／または安定剤とを含み、１つまたは複数のさらなる薬理学的に活性な物質を含んでもよい、凍結乾燥もしくはそうでない場合には乾燥された製剤、または水溶性もしくは非水溶性溶液もしくは懸濁液の形態の、医薬組成物または調製物に関する。
【０１７２】
非経口投与、たとえば、静脈内、筋肉内、皮下注射、または静脈内注入のための医薬調製物は、たとえば、活性成分を含む滅菌溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、または粉末であり得、これらは、任意にさらなる溶解または希釈ステップの後に、注入または注射に好適となる。そのような調製物に好適な担体または希釈剤としては、たとえば、限定することなく、滅菌水および薬学的に許容される水性緩衝液および溶液、たとえば、生理学的リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液、水油、グリセロール、エタノール、グリコール、たとえば、プロピレングリコール、ならびに鉱油、動物油、および植物油、たとえば、ピーナッツ油、ダイズ油、ならびにこれらの好適な混合物が挙げられる。
【０１７３】
本発明の結合タンパク質の溶液はまた、微生物の成長を防止するための保存剤、たとえば、抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チオメルサール、エチレンジアミン四酢酸（そのアルカリ金属塩）なども含有し得る。多くの事例において、等張剤、たとえば、糖、緩衝剤、または塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。乳化剤および／または分散剤を使用してもよい。適切な流動性は、たとえば、リポソームの形成によって、分散剤の場合には、必要とされる粒子サイズの維持によって、または界面活性剤の使用によって、維持することができる。吸収を遅延させる他の薬剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンもまた、添加され得る。溶液は、注射用バイアル、アンプル、注入ボトルなどに充填され得る。
すべての事例において、最終的な剤形は、製造および保管の条件下において、滅菌、流体、かつ安定でなければならない。滅菌注射溶液は、必要に応じて、上記に列挙された様々な他の成分とともに、活性化合物を、必要とされる量で、適切な溶媒中に組み込み、続いて濾過滅菌することによって、調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の事例において、調製の好ましい方法は、事前に滅菌濾過した溶液中に存在する活性成分と任意の追加の所望される成分の粉末を得る、真空乾燥および凍結乾燥の技法である。
【０１７４】
通常、水溶液または懸濁液が好ましい。一般に、本発明の結合タンパク質などの治療用タンパク質の好適な製剤は、緩衝タンパク質溶液、たとえば、好適な濃度（たとえば、０．００１〜４００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．００５〜２００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０１〜２００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１．０〜１００ｍｇ／ｍｌ、たとえば、１．０ｍｇ／ｍｌ（静脈内投与）、または１００ｍｇ／ｍｌ（皮下投与）のタンパク質と、水性緩衝液、たとえば、
−  リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４、
−  他のリン酸緩衝液、ｐＨ６．２〜８．２、
−  酢酸緩衝液、ｐＨ３．２〜７．５、好ましくはｐＨ４．８〜５．５、
−  ヒスチジン緩衝液、ｐＨ５．５〜７．０、
−  コハク酸緩衝液、ｐＨ３．２〜６．６、および
−  クエン酸緩衝液、ｐＨ２．１〜６．２とを含み、
溶液の等張性を提供するために、塩（たとえば、ＮａＣｌ）ならびに／または糖（たとえば、スクロースおよびトレハロース）ならびに／または他の多価アルコール（たとえば、マンニトールおよびグリセロール）を含んでもよい、溶液である。
【０１７５】
加えて、他の薬剤、たとえば、界面活性剤、たとえば、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０またはＴｗｅｅｎ−８０が、そのような溶液に含まれてもよい。皮下適用のための製剤は、著しく高い濃度、たとえば、最大１００ｍｇ／ｍｌまたはさらには１００ｍｇ／ｍｌを上回る、本発明の抗体を含み得る。しかしながら、当業者には、上記に提供されている成分およびその量が、１つの好ましい選択肢を表すに過ぎないことは明らかであろう。その代替形および変化形が、当業者には即座に理解されるか、または上記の開示から容易に想起することができる。上述の製剤は、溶液、たとえば、注射用水（ＷＦＩ）中に再構成される凍結乾燥製剤として提供されてもよい。
本発明のさらなる態様によると、本発明の結合タンパク質は、タンパク質の投与に有用なデバイス、たとえば、シリンジ、注射ペン、マイクロポンプ、または他のデバイスと組み合わせて使用され得る。
【０１７６】
治療の方法
本発明のさらなる態様は、がんを処置する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の本発明の結合タンパク質を投与するステップを含む、方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、がんを処置する方法において使用するための本発明の結合タンパク質を提供する。
本発明のさらなる態様は、がんを処置するための医薬組成物を調製するための、本発明の結合タンパク質の使用である。
【０１７７】
曖昧さを回避するために、本発明の医学的使用の態様は、上述の本発明の特定の結合タンパク質のうちのいずれか（たとえば、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃４／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃５／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃６／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃７／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃８／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃９／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１０／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１４／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１５／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１６／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１７／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１８／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃４／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃５／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃６／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃７／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃８／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃９／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１０／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１４／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１５／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１６／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１７／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１８／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃４／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃５／ＣＤ３＃３、およびＤＬＬ３＃６／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃７／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃８／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃９／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１０／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１３／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１４／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１５／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１６／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１７／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１８／ＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ、好ましくは、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ）を含み得る。
本明細書において使用される場合、「がん」という用語は、侵襲の組織病理学的種類または段階に関係なく、すべての種類のがん性成長もしくは発がんプロセス、転移組織、または悪性形質転換細胞、組織、もしくは器官を含むことを意味する。
【０１７８】
本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質を使用して、その成長を阻害することができる例示的ながんは、任意のＤＬＬ３発現腫瘍、好ましくは、ＳＣＬＣ、ＬＣＮＥＣ、神経膠腫、神経膠芽腫、黒色腫、または他のＤＬＬ３発現神経内分泌腫瘍（たとえば、神経内分泌性前立腺がんもしくは神経内分泌性膵臓がん、小細胞膀胱がん）である。
【０１７９】
神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）は、散在した内分泌系から生じ、身体の多数の異なる領域で発生し得る。従来的には、ＮＥＴは、起源となる解剖学的部位によって分類されており、典型的に、攻撃性が高い。これらは、消化管、膵臓、または肺（小細胞肺癌および大細胞神経内分泌癌）、ならびに腎臓、または泌尿生殖器（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸、および子宮内膜）に位置することがもっとも多い。ＮＥＴには、消化管および膵島細胞のある特定の腫瘍、ある特定の胸腺および肺腫瘍、ならびに甲状腺の傍濾胞細胞の髄様癌が含まれる。
本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質を使用してその成長を阻害することができる追加のがんは、ある特定の遺伝子型、表現型、または生化学的特徴が、従来的に定義される神経内分泌腫瘍と共通している、偽神経内分泌腫瘍（ｐＮＥＴ）である。
【０１８０】
一部の実施形態において、以下のがん、腫瘍、および他の増殖性疾患は、本発明の多重特異性結合タンパク質で処置することができる：肺がん、好ましくは、ＳＣＬＣ、ＮＳＣＬＣ、またはＬＣＮＥＣ、乳房、子宮頸、結腸、結腸直腸、子宮内膜、頭頸部、肝臓（肝芽腫または肝細胞癌）、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、精巣、甲状腺、副腎、腎臓、膀胱、子宮、食道、尿路上皮のがん、脳腫瘍、リンパ腫、ユーイング肉腫、ならびに他の神経内分泌腫瘍および小青色円形細胞腫瘍。
本発明の好ましい実施形態において、がんは、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）または神経膠芽腫である。
身体における特定の位置／起源によって特徴付けられる、上述のすべてのがん、腫瘍、新生物などは、原発性腫瘍およびそれに由来する転移性腫瘍の両方を含むことを意味する。
【０１８１】
患者が高いＤＬＬ３発現を有することを特徴とするがんを有する場合、その患者は、本発明の（本明細書に記載される）結合タンパク質での処置に応答する可能性がより高いことが、可能である。したがって、一部の実施形態において、本発明の結合タンパク質で処置しようとするがんは、高いＤＬＬ３発現を有するがんであり、たとえば、ＤＬＬ３発現が、同じ種類のＤＬＬ３発現がんを患う患者の集団のがん細胞における平均発現よりも高い。
本発明の結合タンパク質は、第１選択肢、第２選択肢、または任意のさらなる選択肢の処置、および維持処置の状況における治療レジメンにおいて、使用することができる。
本発明の結合タンパク質は、上述の疾患の予防、短期または長期の処置に使用することができ、放射線療法、１つもしくは複数の追加の治療剤、および／または外科手術と組み合わせて使用してもよい。
【０１８２】
好ましい実施形態において、本発明のタンパク質は、ＰＤ−１アンタゴニスト、たとえば、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤＬ−１抗体と組み合わせて、がんの処置に使用される。好ましくは、前記抗ＰＤ−１抗体は、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、本明細書に記載されるＰＤ１−１、ＰＤ１−２、ＰＤ１−３、ＰＤ１−４、およびＰＤ１−５（以下の表Ａにおける配列によって定義される）、ならびに国際公開第２０１７／１９８７４１号（参照により本明細書に組み込まれる）からなる群から選択される。好ましくは、前記抗ＰＤＬ−１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、およびデュルバルマブからなる群から選択される。特に好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質（好ましくは、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、またはＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ）は、ＰＤ１−１と組み合わせて、がんの処置に使用される。特に好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質（好ましくは、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、またはＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ）は、ＰＤ１−２と組み合わせて、がんの処置に使用される。特に好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質（好ましくは、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ）は、ＰＤ１−３と組み合わせて、がんの処置に使用される。特に好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質（好ましくは、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ）は、ＰＤ１−４と組み合わせて、がんの処置に使用される。特に好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質（好ましくは、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ）は、ＰＤ１−５と組み合わせて、がんの処置に使用される。
【０１８３】
【表１】
2021526816.tif 000003
2021526816.tif 000004
2021526816.tif 000005
【０１８４】
これらの好ましい実施形態および本発明の態様のうちの任意のその他のものによると、抗体ＰＤ１−１、ＰＤ１−２、ＰＤ１−３、ＰＤ１−４、およびＰＤ１−５は、国際公開第２０１７／１９８７４１号に開示されている抗体分子であり、上記の表Ａに示される配列によって定義される。
【０１８５】
したがって、ＰＤ１−１は、配列番号２５６のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２５７のアミノ酸配列を含む軽鎖とを有し、
ＰＤ１−２は、配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２５９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを有し、
ＰＤ１−３は、配列番号２６０のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２６１のアミノ酸配列を含む軽鎖とを有し、
ＰＤ１−４は、配列番号２６２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２６３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを有し、
ＰＤ１−５は、配列番号２６４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２６５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを有する。
【０１８６】
上記には、上述の疾患を処置する様々な方法においてそれを必要とする患者に治療有効用量を投与することによる本発明の結合タンパク質の使用、ならびにそのような疾患の処置のための医薬品の製造のためのこれらの結合タンパク質の使用、ならびに本発明のそのような結合タンパク質を含む医薬組成物、ならびに本発明のそのような結合タンパク質を含む医薬品の調製および／または製造なども含まれる。
【０１８７】
他の活性な物質または処置との組合せ
本発明の結合タンパク質は、それ自体で使用されてもよく、または１つもしくは複数の追加の治療剤との組合せ、特に、化学療法剤、たとえば、ＤＮＡ損傷剤、血管新生を阻害する治療的に活性な化合物、シグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、免疫調節剤、免疫チェックポイント阻害剤、有糸分裂チェックポイント阻害剤、またはホルモン療法剤との組合せで使用されてもよい。
追加の治療剤は、同時に投与されてもよく、任意に同じ医薬調製物の成分として同時に投与されてもよく、またはＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の投与の前もしくは後に投与されてもよい。
【０１８８】
本発明の結合分子と組み合わせて投与され得る細胞分裂抑制性および／または細胞毒性の活性物質としては、ホルモン、ホルモン類似体および抗ホルモン薬、アロマターゼ阻害剤、ＬＨＲＨアゴニストおよびアンタゴニスト、成長因子（たとえば、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ヒト上皮成長因子（ＨＥＲ、たとえば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４）、および肝細胞成長因子（ＨＧＦ）などの成長因子）の阻害剤、阻害剤としては、たとえば、（抗）成長因子抗体、（抗）成長因子受容体抗体、およびチロシンキナーゼ阻害剤、たとえば、セツキシマブ、ゲフィチニブ、アファチニブ、ニンテダニブ、イマチニブ、ラパチニブ、ボスチニブ、およびトラスツズマブなどがある、抗代謝剤（たとえば、葉酸代謝拮抗剤（antifolate）、たとえば、メトトレキサート、ラルチトレキセド、ピリミジン類似体、たとえば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン、イリノテカン、ドキソルビシン、ＴＡＳ−１０２、カペシタビン、およびゲムシタビン、プリンおよびアデノシン類似体、たとえば、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、およびペントスタチン、シタラビン（ａｒａ  Ｃ）、フルダラビン）、抗腫瘍抗生物質（たとえば、アントラサイクリン）、白金誘導体（たとえば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン）、アルキル化剤（たとえば、エストラムスチン、メクロレタミン、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ダカルバジン、シクロホスファミド、イホスファミド、テモゾロミド、ニトロソ尿素、たとえば、カルムスチンおよびロムスチンなど、チオテパ）、抗有糸分裂剤（たとえば、ビンカアルカロイド、たとえば、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、およびビンクリスチンなど、ならびにタキサン、たとえば、パクリタキセル、ドセタキセル）、血管新生阻害剤、たとえば、ビバシズマブ、ラムシルマブ、およびアフリベルセプト、チューブリン阻害剤、ＤＮＡ合成阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（たとえば、エピポドフィロトキシン、たとえば、エトポシドおよびエトポホスなど、テニポシド、アムサクリン、トポテカン、イリノテカン、ミトキサントロン）、セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤（たとえば、ＰＤＫ１阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、Ａ−Ｒａｆ阻害剤、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤、Ｃ−Ｒａｆ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ｍＴＯＲＣ１／２阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＰＩ３Ｋα阻害剤、二重ｍＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＳＴＫ３３阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＰＬＫ１阻害剤（たとえば、ボラセルチブ）、ＣＤＫの阻害剤、たとえば、ＣＤＫ９阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤）、チロシンキナーゼ阻害剤（たとえば、ＰＴＫ２／ＦＡＫ阻害剤）、タンパク質タンパク質相互作用阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＢＲＤ４阻害剤、ＩＧＦ−１Ｒ阻害剤、Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤、Ｂｃｌ−２阻害剤、Ｂｃｌ−２／Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤、ＥｒｂＢ受容体阻害剤、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤、ＡＢＬ阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、ラパマイシン類似体（たとえば、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォ���リムス、シロリムス）、アンドロゲン合成阻害剤、アンドロゲン受容体阻害剤、ＤＮＭＴ阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＡＮＧ１／２阻害剤、ＣＹＰ１７阻害剤、放射性医薬、免疫療法剤、たとえば、免疫チェックポイント阻害剤（たとえば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ３、およびＴＩＭ３結合分子／免疫グロブリン、たとえば、イピリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ）、ならびに様々な化学療法剤、たとえば、アミフォスチン、アナグレリド、クロドロネート（clodronat）、フィルグラスチン（filgrastin）、インターフェロン、インターフェロンアルファ、ロイコボリン、リツキシマブ、プロカルバジン、レバミゾール、メスナ、ミトタン、パミドロネート、およびポルフィマー、プロテアソーム阻害剤（たとえば、ボルテゾミブ）、ＳｍａｃおよびＢＨ３模倣体、ｐ５３機能性を回復させる薬剤、たとえば、ｍｄｍ２−ｐ５３アンタゴニスト、Ｗｎｔ／ベータ−カテニンシグナル伝達経路の阻害剤、ならびに／またはサイクリン依存性キナーゼ９阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８９】
抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１剤ならびに抗ＬＡＧ３剤を含む、１つまたは複数の免疫療法剤と組み合わせた本発明の結合分子での処置が、特に好ましく、例示的な抗ＰＤ１剤としては、抗ＰＤ−１抗体ＰＤＲ−００１、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、ならびに本明細書（表Ａ）および国際公開第２０１７／１９８７４１号に開示されているＰＤ１−１、ＰＤ１−２、ＰＤ１−３、ＰＤ１−４、およびＰＤ１−５が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な抗ＰＤＬ−１剤としては、アテゾリズマブ、アベルマブ、およびデュルバルマブが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明の結合分子（好ましくは、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ）は、ＰＤ１−１と組み合わされる。好ましい実施形態において、本発明の結合分子（好ましくは、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ）は、ＰＤ１−２と組み合わされる。好ましい実施形態において、本発明の結合分子（好ましくは、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ）は、ＰＤ１−３と組み合わされる。好ましい実施形態において、本発明の結合分子（好ましくは、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ）は、ＰＤ１−４と組み合わされる。好ましい実施形態において、本発明の結合分子（好ましくは、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ）は、ＰＤ１−５と組み合わされる。
【０１９０】
ある特定の実施形態において、追加の治療剤は、さらなる免疫療法剤、たとえば、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ−４、ガレクチン９、ガレクチン−１、ＣＤ６９、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＣＡＥＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４、ＣＥＡＣＡＭ、ＣＤ３９、ＴＧＦβ、ＩＬ−１０、Ｆａｓリガンド、ＩＣＯＳ、Ｂ７ファミリー（Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ１（ＰＤＬ−１）、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ２（ＩＣＯＳ−Ｌ）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５（ＶＩＳＴＡ）、またはＢ７−Ｈ６）の調節剤であり得る。
一部の実施形態において、追加の免疫療法剤は、同族ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに結合するＴＮＦファミリーメンバーの分子であり、これには、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４−ｌＢＢＬ、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２−Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬｌＡ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡＲ、ＥＤＡｌ、ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲｌ、リンホトキシンα／ＴＮＦβ、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＬＴβＲ、リンホトキシンα１β２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹ、ＮＧＦＲが含まれる。
【０１９１】
一部の実施形態において、追加の治療剤は、ＳＭＡＣ模倣体である。ＳＭＡＣ模倣体は、アポトーシスタンパク質の阻害剤（ＩＡＰ）に結合し、免疫調節機能を有し、動物またはヒトに投与された場合に、全身性サイトカイン（たとえば、ＩＬ−６、ＴＮＦαなど）およびケモカイン（たとえば、ＭＣＰ−１）の誘導を媒介する、化合物である。一部の実施形態において、ＳＭＡＣ模倣体は、（ｉ）ＬＣＬ１６１、すなわち、国際公開第２００８／０１６８９３号の実施例における化合物１（２８／２９ページ、［１２２］）もしくはその薬学的に許容される塩、（ｉｉ）Ｄｅｂｉｏ−１１４３として公知のＳＭＡＣ模倣体もしくはその薬学的に許容される塩、（ｉｉｉ）ビリナパントとして公知のＳＭＡＣ模倣体もしくはその薬学的に許容される塩、（ｉｖ）ＡＳＴＸ−６６０として公知のＳＭＡＣ模倣体もしくはその薬学的に許容される塩、または（ｖ）ＣＵＤＣ−４２７として公知のＳＭＡＣ模倣体もしくはその薬学的に許容される塩である。
【０１９２】
一部の実施形態において、追加の免疫治療剤は、（ｉ）Ｔ細胞活性化を阻害するサイトカイン（たとえば、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ、「免疫抑制性サイトカイン」）のアンタゴニスト、ならびに／または（ｉｉ）Ｔ細胞活性化を刺激するサイトカイン、および／もしくは免疫応答を刺激するための、たとえば、増殖性疾患、たとえばがんを処置するためのＩＬ２などのサイトカインのアゴニストから選択される。
一部の実施形態において、追加の免疫療法剤は、Ｔ細胞活性化を刺激するタンパク質、たとえば、ＣＤ２８、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７、およびＣＤ２８Ｈのアゴニストである。
【０１９３】
一部の実施形態において、追加の治療剤は、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、（ＡｄＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１もしくはＨＳＶ２）、レオウイルス、粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）、ポリオウイルス、水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）、マラバウイルス、水痘ウイルス、麻疹ウイルス（ＭＶ）、またはニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）に由来する腫瘍溶解性ウイルスが挙げられるがこれらに限定されない、腫瘍溶解性ウイルスである。
【０１９４】
診断的使用
本発明の抗ＤＬＬ３抗体分子は、診断および予後診断方法において有用であり、異なる抗原に対する結合特異性を有する色素、薬物、または別の分子を付着させることによって、（たとえば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＦＡＣＳ分析、免疫組織学法などにおいて）ＤＬＬ３を発現する細胞または組織の標識化、局在化、または特定のために用いることができる。たとえば、検出可能な標識を、本発明の抗ＤＬＬ３抗体分子にコンジュゲートさせてもよく、または本発明の抗体分子に対して特異的に結合し、検出可能な標識（二次抗体）にコンジュゲートされている二次試薬を、そのような診断方法において使用してもよい。一部の実施形態において、ＤＬＬ３に特異的な抗体は、細胞において、細胞質および／または細胞表面のいずれかに発現されるＤＬＬ３に特異的に結合し、そのような細胞を局在化および／または特定するために使用される。一部の実施形態において、本明細書に提供されるＤＬＬ３特異的抗体は、ＤＬＬ３を発現する細胞または組織（たとえば、腫瘍細胞）を特定するために使用される。
本発明の抗体は、それらが、高いレベルのエピトープ結合特異性およびＤＬＬ３ポリペプチドに対する高い結合親和性を有するように、選択される。一般に、抗体の結合親和性が高いほど、よりストリンジェントな洗浄条件をイムノアッセイにおいて実行して、標的ポリペプチドを除去することなく、非特異的に結合した材料を除去することができる。
【０１９５】
したがって、生物学的サンプル中のＤＬＬ３を検出する方法が、本明細書においてさらに提供される。具体的には、一態様において、本発明は、サンプル（たとえば、組織サンプル、腫瘍組織サンプル）中のＤＬＬ３を検出する方法であって、
（ａ）サンプルを、本発明の抗体と接触させるステップと、
（ｂ）ＤＬＬ３に結合した抗ＤＬＬ３抗体を検出するステップと
を含む、方法を提供する。
生物学的サンプルは、対象の任意の組織（生検を含む）、細胞、または体液から獲得／単離することができる。好ましい実施形態において、サンプルは、組織サンプル、好ましくは、腫瘍組織サンプルである。特定の実施形態において、サンプルは、固定（腫瘍）組織サンプル、好ましくはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプル、より好ましくはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織サンプルである。
【０１９６】
サンプルは、典型的に、複数の部分に分割され、顕微鏡分析のための媒体、たとえば、顕微鏡スライドに固定される。サンプルが組織サンプルである場合、複数の部分は、組織切片であり得る。一部の実施形態において、連続切片は、ＦＦＰＥ組織サンプルから得られる。一部の実施形態において、連続切片は、ＦＦＰＥブロックの複数の異なる部位から得られ、これは、切片内の不均質性およびブロック内の不均質性の両方を捕捉するために行われ得る。一部の実施形態において、連続切片は、同じ腫瘍内の異なる位置から取得された複数の異なる生検サンプルから取得され、これは、切片内の不均質性および腫瘍内の不均質性の両方を捕捉するために行われ得る。典型的には、組織サンプルは、まず、脱パラフィン処理を受け、抗原検出の前に抗原賦活化（たとえば、プロテイナーゼＫによる）を受ける。組織サンプルは、様々な組織（たとえば、生検）、特に、ＳＣＬＣ、ＬＣＮＥＣ、神経膠腫、神経膠芽腫、黒色腫、または他の神経内分泌腫瘍（たとえば、神経内分泌性前立腺がんもしくは神経内分泌性膵臓がん、小細胞膀胱がん）を含むがこれらに限定されない腫瘍から得られた組織から獲得／単離され得る。
【０１９７】
（組織）サンプルを獲得／単離することができるさらなる例示的な腫瘍としては、肺がん、好ましくはＳＣＬＣ、ＮＳＣＬＣ、またはＬＣＮＥＣ、乳房、子宮頸、結腸、結腸直腸、子宮内膜、頭頸部、肝臓（肝芽腫または肝細胞癌腫）、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、精巣、甲状腺、副腎、腎臓、膀胱、子宮、食道、尿路上皮のがん、脳腫瘍、ユーイング肉腫、ならびに他の神経内分泌腫瘍（偽内分泌腫瘍を含む）および小青色円形細胞腫瘍が挙げられる。
サンプル中のＤＬＬ３検出の例示的な方法は、免疫細胞化学法（ＩＣＣ）、免疫組織化学法（ＩＨＣ）、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー、および／またはＥＬＩＳＡである。
好ましい実施形態において、ＤＬＬ３は、ＩＨＣを使用して検出される。
【０１９８】
本発明の特定の態様において、組織サンプル中のＤＬＬ３を検出する方法は、
ａ）組織サンプル（たとえば、腫瘍組織、たとえば、ＳＣＬＣ、神経膠芽腫、または神経内分泌腫瘍）、好ましくは、固定組織サンプル（たとえば、ホルマリン固定およびパラフィン包埋）を、本発明の抗体（たとえば、ＤＬＬ３＃１またはＤＬＬ３＃５）と接触させるステップと、
ｂ）サンプル中で、抗体−抗原複合体を形成させるステップと、
ｃ）ＤＬＬ３に結合した抗ＤＬＬ３抗体を検出するステップと
を含む。
【０１９９】
本発明の方法の一部の実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体は、検出可能なシグナルによって検出され、好ましくは、検出可能なシグナルは、検出可能な標識によって生成される。本発明の方法の好ましい実施形態において、検出可能なシグナルは、ＩＨＣアッセイにおいて検出される。一部の実施形態において、検出可能なシグナルは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、フローサイトメトリーによって、またはウエスタンブロットによって、検出される。一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、たとえば、フローサイトメトリーを使用して、細胞（たとえば、腫瘍細胞）の細胞表面上に存在するＤＬＬ３を検出するために使用され得る。一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、またはＩＨＣを使用して、組織サンプル（たとえば、腫瘍組織サンプル）中のＤＬＬ３の存在を検出するために使用され得る。
【０２００】
一部の実施形態において、検出可能な標識は、抗ＤＬＬ３抗体に直接的にコンジュゲートされており、したがって、抗ＤＬＬ３抗体がＤＬＬ３に結合すると、サンプル上に堆積され、これは、一般に直接標識法と称される。直接標識法は、より直接的に定量可能であることが多いが、感度の欠如という問題を有することが多い。他の実施形態において、検出可能な標識の堆積は、本発明の抗体分子に特異的に結合し、検出可能な標識にコンジュゲートされている、二次検出試薬（二次抗体）の使用によってもたらされ、これは、一般に、間接標識方法と称される。一部の実施形態において、具体的な二次検出試薬は、種特異性二次抗体、ハプテンにコンジュゲートした抗ＤＬＬ３抗体に結合する抗ハプテン抗体、またはビオチン化抗ＤＬＬ３抗体に結合したビオチン結合タンパク質であり得る）。
【０２０１】
本発明の抗ＤＬＬ３抗体または二次検出試薬のいずれかにコンジュゲートすることができる検出可能な標識の具体的な例としては、発色性、蛍光性、リン光性、発光性、および放射性分子および材料、１つの物質を別の物質に変換して検出可能な違いをもたらす（たとえば、無色の物質を有色の物質に変換することもしくはその逆によって、または沈殿物を産生するかもしくはサンプルの濁度を増加させることによって）触媒（たとえば、酵素）、さらなる検出可能に標識された抗体コンジュゲートを使用して抗体−ハプテンの結合相互作用を通じて検出することができるハプテン、ならびに常磁性および磁性の分子または材料が挙げられる。
たとえば、検出可能な標識は、酵素、たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、およびβ−ラクタマーゼ、フルオロフォア、たとえば、フルオレセイン、発色団、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ色素、レゾルフィン、およびローダミン、ナノ粒子、たとえば、量子ドット（米国特許第６，８１５，０６４号、同第６，６８２，５９６号、および同第６，６４９，１３８号）、金属キレート剤、たとえば、放射性または常磁性金属イオン、たとえば、Ｇｄ＜３＋＞のＤＯＴＡおよびＤＰＴＡキレート剤、ならびにリポソーム、たとえば、捕捉された蛍光分子を含有するリポソームであり得る。
【０２０２】
検出可能な標識が酵素を含む場合、検出可能な物質、たとえば、発色原、蛍光性化合物、または発光性化合物は、検出可能なシグナルを生成する酵素と組み合わせて使用することができる。発色性化合物の具体的な例としては、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４−ニトロフェニルホスフェート（nitrophenylphospate）（ｐＮＰＰ）、ファーストレッド（fast red）、ブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ファーストレッド、ＡＰオレンジ、ＡＰブルー、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート］（ＡＢＴＳ）、ｏ−ジアニシジン、４−クロロナフトール（４−ＣＮ）、ニトロフェニル−−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル−−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−Ｇａｌ）、ｐ−ニトロフェニル−ａ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルー、およびテトラゾリウムバイオレットが挙げられる。
一部の例において、検出可能な部分は、クマリン、フルオレセイン（またはフルオレセイン誘導体および類似体）、ローダミン、レゾルフィン、発光団、およびシアニンを含む、いくつかの一般的な化学クラスに属する、フルオロフォアである。
【０２０３】
他の実施形態において、検出可能な部分は、明視野顕微鏡によって検出可能な分子、たとえば、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）、テトラメチルローダミン（ＤＩＳＣＯＶＥＲＹパープル）、Ｎ，Ｎ’−ビスカルボキシペンチル−５，５’−ジスルホナト−インド−ジカルボシアニン（Ｃｙ５）、およびローダミン１１０（ローダミン）を含む色素である。
ハプテンは、抗体が特異的に結合する小分子であるが、それ自体は、動物において免疫応答を誘起せず、免疫応答を生成するには、まず、タンパク質などのより大きな担体分子に結合しなければならない。ハプテンの例としては、ジ−ニトロフェニル、ビオチン、ジゴキシゲニン、およびフルオレセインである。
【０２０４】
一態様において、腫瘍を、ＤＬＬ３発現腫瘍（細胞質および／または細胞表面にＤＬＬ３を発現する）として診断または特定する方法であって、本発明の抗ＤＬＬ３抗体（たとえば、ＤＬＬ３＃１またはＤＬＬ３＃５）を使用して（たとえば、ＩＨＣを腫瘍組織サンプルに対して使用して）、対象のサンプル（たとえば、腫瘍組織サンプル）中のＤＬＬ３を検出するステップを含む、方法が、本明細書においてさらに提供される。さらなる態様において、対象にＤＬＬ３標的化療法を選択する方法であって、本発明の抗ＤＬＬ３抗体（たとえば、ＤＬＬ３＃１またはＤＬＬ３＃５）を使用して（たとえば、ＩＨＣを腫瘍組織サンプルに対して使用して）、対象のサンプル（たとえば、腫瘍組織サンプル）中のＤＬＬ３を検出するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。さらなる態様において、対象における（たとえば、ＤＬＬ３標的化療法の）治療効果をモニタリングする方法であって、本発明の抗ＤＬＬ３抗体（たとえば、ＤＬＬ３＃１またはＤＬＬ３＃５）を使用して（たとえば、ＩＨＣを腫瘍組織サンプルに対して使用して）、対象のサンプル（たとえば、腫瘍組織サンプル）中のＤＬＬ３を検出するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。
【０２０５】
本発明の抗ＤＬＬ３抗体分子はまた、細胞を標的化するためにも使用することができる。一部の実施形態において、本明細書において提供されるＤＬＬ３特異的抗体は、薬物または細胞毒性剤を前記ＤＬＬ３抗体に結合させることによって、そのような薬物または細胞毒性剤を標的細胞（たとえば、ＤＬＬ３を発現する腫瘍細胞）に送達し、それによって、たとえば、前記標的細胞を殺滅するために使用される。
【０２０６】
キット
本発明はまた、少なくとも、本発明の多重特異性結合タンパク質（たとえば、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃４／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃５／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃６／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃７／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃８／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃９／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１０／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１４／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１５／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１６／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１７／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１８／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃４／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃５／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃６／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃７／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃８／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃９／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１０／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１４／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１５／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１６／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１７／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１８／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃４／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃５／ＣＤ３＃３およびＤＬＬ３＃６／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃７／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃８／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃９／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１０／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１３／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１４／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１５／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１６／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１７／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃１８／ＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ、好ましくは、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ）を含み、上述の疾患および障害の処置に使用される他の薬物からなる群から選択される１つまたは複数の他の成分を含んでもよい、キットも包含する。
一実施形態において、キットは、単位剤形で有効量の本発明の結合タンパク質を含む、組成物を含む。
本発明はまた、少なくとも、本発明の多重特異性結合タンパク質と、上述の疾患および障害の処置に使用される他の薬物からなる群から選択される１つまたは複数の他の成分とを含む、キットも包含する。
【０２０７】
一実施形態において、キットは、単位剤形で、有効量の本発明の多重特異性結合タンパク質（好ましくは、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ）を含有する、組成物を含む。さらなる実施形態において、キットは、単位剤形で有効量の本発明の多重特異性結合タンパク質（好ましくは、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃１／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃２／ＣＤ３＃３、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃１、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃２、ＤＬＬ３＃３／ＣＤ３＃３のうちのいずれか１つ）を含有する組成物、および単位剤形で有効量のＰＤ−１アンタゴニスト、たとえば、抗ＰＤ−１抗体、もっとも好ましくは本明細書（たとえば、表Ａ）および国際公開第２０１７／１９８７４１号に記載されているＰＤ１−１、ＰＤ１−２、ＰＤ１−３、ＰＤ１−４、およびＰＤ１−５を含有する組成物の両方を含む。
【０２０８】
一部の実施形態において、キットは、そのような組成物を含む滅菌容器を含み、そのような容器は、箱、アンプル、瓶、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパック、または当該技術分野において公知の他の好適な容器の形態であり得る。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属ホイル、または医薬品を保持するのに好適な他の材料から作製され得る。さらに、キットは、凍結乾燥形態の本発明の結合タンパク質を有する第１の容器内の医薬組成物、および注射用の薬学的に許容される希釈剤（たとえば、滅菌水）を有する第２の容器を含み得る。薬学的に許容される希釈剤は、結合タンパク質の再構成または希釈に使用され得る。
【０２０９】
所望される場合、本発明の多重特異性結合タンパク質は、がんを有する対象に多重特異性結合タンパク質を投与するための説明書とともに提供される。説明書は、一般に、がんの処置または予防のための組成物の使用に関する情報を含むであろう。他の実施形態において、説明書は、以下のうちの少なくとも１つを含む：治療剤の説明、がんもしくはその症状の処置もしくは予防のための投薬スケジュールおよび投与、注意書き、警告、適応症、禁忌、過量投与の情報、有害反応、動物薬理学、臨床研究、ならびに／または参考文献。説明書は、容器（存在する場合）に直接印刷されていてもよく、または容器に適用されるラベルとして、または容器内もしくは容器とともに提供される別個のシート、パンフレット、カード、もしくはフォルダとして印刷されてもよい。
本明細書に記載されるように、本開示は、生物学的サンプル中のＤＬＬ３の発現を判定するための診断方法をさらに提供する。一態様において、本開示は、これらの方法を実行するためのキット、ならびに本開示の方法を実行するため、たとえば、組織を採取するためおよび／または検出アッセイを実行するためおよび／または結果を分析するための説明書を提供する。
【０２１０】
キットは、本発明のＤＬＬ３抗体組成物（たとえば、モノクローナル抗体）および使用のための説明書を含むか、または代替的にはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなる。キットは、生物学的サンプル、たとえば、身体組織の任意の体液または生検サンプル中のＤＬＬ３ポリペプチドの存在を検出するのに有用である。一部の実施形態において、キットは、サンプル中のＤＬＬ３ポリペプチドに結合することができる１つまたは複数のＤＬＬ３抗体（たとえば、抗ＤＬＬ３抗体ＤＬＬ３＃１またはＤＬＬ３＃５）、サンプル中のＤＬＬ３ポリペプチドを検出するための手段を含み、サンプル中のＤＬＬ３ポリペプチドのシグナル／量を対照と比較するための手段を含んでもよい。本発明の抗ＤＬＬ３抗体のうちの１つまたは複数は、標識化されてもよい。キットの構成要素（たとえば、試薬）は、好適な容器にパッケージングされ得る。キットは、キットを使用してＤＬＬ３ポリペプチドを検出するための説明書をさらに含み得る。ある特定の実施形態において、キットは、本発明の抗ＤＬＬ３抗体（第１の抗体）、およびＤＬＬ３ポリペプチドまたは第１の抗体のいずれかに結合し、検出可能な標識にコンジュゲートされている、第２の異なる抗体を含む。
【０２１１】
キットはまた、たとえば、緩衝化剤、保存剤、またはタンパク質安定剤を含み得る。キットは、検出可能な標識を検出するために必要な成分、たとえば、酵素または基質をさらに含み得る。キットはまた、アッセイし、試験サンプルと比較することができる、対照サンプルまたは一連の対照サンプルも含み得る。キットのそれぞれの構成要素は、個別の容器内に封入されてもよく、様々な容器のすべてが、キットを使用して行われるアッセイの結果を解釈するための説明書とともに、単一のパッケージ内に含まれてもよい。本開示のキットは、キットの容器上またはその中に、文書を含み得る。文書は、キットに含まれる試薬を使用する方法について記載している。
適宜、これらの提案されたキットの構成要素は、当業者による使用に慣例的な様式で、パッケージングされ得る。たとえば、これらの提案されたキットの構成要素は、溶液で、または分散液などとして、提供され得る。
【実施例】
【０２１２】
以下の実施例により、本発明を例証する。これらの実施例は、本発明の範囲を制限すると解釈されるものではない。
【０２１３】
（実施例１）
ＣＤ３／ＤＬＬ３結合タンパク質の設計および構築
本発明者らは、ＤＬＬ３およびＣＤ３に結合し、ＤＬＬ３を発現する腫瘍細胞の溶解を引き起こすＴ細胞活性化を誘導する、多重特異性結合タンパク質を開発した。使用される分子設計は、ＩｇＧ抗体スキャフォールドおよびＩｇＧ様構造を有する。これは、Ｆｃにおけるノブ（抗ＤＬＬ３）アームとホール（抗ＣＤ３）アームとのヘテロ二量体化のためのノブインホール技術を特徴とする。加えて、結合タンパク質は、それぞれのアームにおいて軽鎖と対応する重鎖との間に可動性ペプチド配列を有する。したがって、結合タンパク質は、一方がＣＤ３に結合し、他方がＤＬＬ３に結合し、それぞれが一本鎖ＦａｂおよびＦｃ領域を含む、２つのアームを含む。
好ましくは、結合分子は、二重特異性であり、二価である（２つの標的のそれぞれに対して一価である）。
【０２１４】
ハイブリドーマおよび培養した単一Ｂ細胞からの高スループットＶ遺伝子回収を使用したＤＬＬ３およびＣＤ３を認識する結合ドメインの調製
抗ＤＬＬ３結合物質を得るために、ＤＬＬ３免疫付与野生型およびＡｌｉｖａＭａｂヒト化マウス（Ａｂｌｅｘｉｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を用いたＡｌｉｖａＭａｂトランスジェニックマウスプラットフォーム）に由来するハイブリドーマまたは単一Ｂ細胞を、インビトロで培養した。上清を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）によって組換えヒトＤＬＬ３に対する反応性についてスクリーニングし、フローサイトメトリーによってヒトＤＬＬ３を発現するＳＨＰ７７細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＣＲＬ−２１９５ＴＭ）に対する反応性についてスクリーニングした。
【０２１５】
免疫グロブリン（Ｉｇ）ＶＨおよびＶＬ遺伝子を、次いで、特定された陽性クローンから増幅させた。ハイブリドーマからＲＮＡを単離するために、単一クローンに由来する約２×１０6個の細胞を、ペレットにし、原料として使用した。単一Ｂ細胞については、単一で単離したＢ細胞から増大させた１００〜５００個の細胞を、原料として使用した。ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して単離した。次いで、Ｓｍａｒｔｅｒ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を製造業者の説明に従って使用して、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ合成を促進するために、ｏｌｉｇｏｄＴを使用して、全てのメッセンジャーＲＮＡ逆転写をプライミングし、次いで、Ｓｍａｒｔｅｒ  ＩＩＡオリゴヌクレオチドで「５’キャッピング」した。続いて、ＶＨおよびＶＬフラグメントの増幅を、Ｓｍａｒｔｅｒ  ＩＩＡキャップを標的とする５’プライマーおよびＣＨ１におけるコンセンサス領域を標的とする３’プライマーを使用して、２ステップのＰＣＲ増幅を使用して行った。簡単に述べると、それぞれの５０μｌのＰＣＲ反応物は、２０μＭのフォワードおよびリバースプライマーの混合物、２５μｌのＰｒｉｍｅＳｔａｒ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼプレミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、２μｌの未精製ｃＤＮＡ、ならびに２１μｌの二重蒸留Ｈ２Ｏからなる。サイクリングプログラムは、９４℃において３分間から開始され、続いて、３５回のサイクル（９４℃において３０秒間、５０℃において１分間、６８℃において１分間）の後、７２℃において７分間で終了する。２回目のＰＣＲは、それぞれのｐＴＴ５母ベクター（ＶＨおよびＶＬ）におけるそれぞれの領域と「オーバーラップする」１５ｂｐの相補的伸長を含む、ＶＬおよびＶＨの２回目のプライマーを用いて行った。２回目のＰＣＲは、以下のプログラムで行った：９４℃において３分間、３５回のサイクル（９４℃において３０秒間、５０℃において１分間、６８℃において１分間）、７２℃において７分間で終了。
【０２１６】
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を、ＶＬ遺伝子のｐＴＴ５  ｈｕＩｇＫベクターへの指向性クローニングおよびＶＨ遺伝子のｐＴＴ５  ｈｕＩｇＧ１ＫＯベクターへの指向性クローニングに使用した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングを促進するために、ＰＣＲ産物を、精製し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤクローニングの前に、クローニングエンハンサーで処理した。クローニングおよび形質転換は、製造業者のプロトコール（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に従って行った。ミニプレップＤＮＡを、サンガーシーケンシングに供して、完全なＶ遺伝子フラグメントが得られたことを確認した。
この手法を使用して、ＤＬＬ３に対する特異性を有する結合ドメインをコードするＩｇ  ＶＨおよびＶＬ遺伝子の対を、調製した。ＣＨＯ−Ｅ３７細胞に、対応する重鎖および軽鎖をコードするプラスミドを一過的にトランスフェクトすることによって、組換え抗体を産生させた。
【０２１７】
組換え抗体の確認用スクリーニング
発現された組換え抗体を含有する上清を、ヒトまたはカニクイザルＤＬＬ３を発現する細胞株への結合について、フローサイトメトリーによってアッセイした。簡単に述べると、細胞を、組換え上清とともにインキュベートし、洗浄し、上清から結合したｍＡｂを、抗ヒトＩｇＧ−ＡＰＣ（Jackson ImmunoResearch 109-136-098）を用いて検出した。シグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）は、サンプルの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を、アイソタイプ対照（無関係のタンパク質に対する可変領域および異なる定常領域骨格）のもので除すことによって、計算した。
【０２１８】
Ｂｉａｃｏｒｅ  ４００における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を、組換え上清に行った。簡単に述べると、ＨＴＰ上清中の最適化されていないＩｇＧを、１０ｕｌ／分で６０秒間、プロテインＡ／Ｇを介してセンサ表面に捕捉した。捕捉したＩｇＧへの１００ｎＭのヒトＤＬＬ３の結合を、３０ｕｌ／分で１８０秒間の会合、続いてＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中での１２０秒間の解離について、モニタリングした。プロテインＡ／Ｇ表面の再生を、それぞれの結合サイクルの合間に、ｐＨ２．１のグリシンを用いて行った。以下の材料を、このアッセイにおいて使用した：タンパク質試薬：組換えで発現させたヒトＤＬＬ３。システム泳動緩衝液：ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．００５％  ｖ／ｖのポリソルベートＰ２０）。捕捉用試薬：すべてのヒトＩｇＧアイソタイプに特異性を有するプロテインＡ／Ｇ  Ｇ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）。
目的のクローン（Ｋｄ＜３００ｐＭ）を、多重特異性形式に関して選択した。多重特異性結合タンパク質を生成し、機械的および機能的スクリーニング（たとえば、以下に記載される細胞結合、細胞毒性、およびＴ細胞活性化）においてさらに評価した。
【０２１９】
ＤＬＬ３およびＣＤ３結合物質のヒト化
上述のＤＬＬ３結合物質、ならびに文献に記載されているＣＤ３結合物質（Pessano et al., EMBO J. 1985 Feb; 4(2): 337-44、Salmeron A et al., J Immunol. 1991 Nov 1;147(9):3047-52）の配列を、ヒト化および／または最適化した。抗体の配列最適化／ヒト化は、治療薬として使用するために、ヒトにおいて産生される抗体に似させ、それによって、特異性を維持しながら免疫原性などの可能性のある副作用を排除する、（特定の抗原／エピトープに対して）非ヒト種において生じる抗体を操作するための手法である。利用される配列最適化／ヒト化アプローチは、Singh et al, 2015 (Singh S et al., mAbs 2015: 7(4):778-91)によって記載されている。簡単に述べると、緊密に一致するヒト生殖細胞系を、コンピュータで特定し、最適化／ヒト化バリアントを、ファージスクリーニング方法を使用して評価した。最終的なリード候補配列は、結合、ヒトパーセントスコア、およびＥｐｉｖａｘ（可能性のある免疫原性をコンピュータで予測するツール）スコアに基づいて選択した。
【０２２０】
ＤＬＬ３およびＣＤ３に結合する二重特異性タンパク質の構築
ＤＬＬ３およびＣＤ３結合物質の可変領域を、一般的な分子生物学技法を使用して発現ベクターｐＴＴ５（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ、Ｃａｎａｄａ）にクローニングして、ＤＬＬ３に結合する一本鎖ＦａｂおよびＦｃ領域を含む１つのＤＬＬ３特異的結合ユニット（そのような結合ユニットはまた、本明細書において、「ＤＬＬ３アーム」または「ＤＬＬ３鎖」とも称される）と、ＣＤ３に結合する一本鎖ＦａｂおよびＦｃ領域を含むＣＤ３特異的結合ユニット（そのような結合ユニットはまた、本明細書において、「ＣＤ３アーム」または「ＣＤ３鎖とも称される）とを有する二重特異性結合タンパク質を形成した。ＤＬＬ３およびＣＤ３アームのＦｃ領域には、「ノブ」または「ホール」のいずれかの突然変異が含まれ（Atwell et al, JMB, 1997, 270, 26-35）、それぞれの鎖は、ノブ鎖またはホール鎖と称される。多重フラグメントのＤＮＡアセンブリについては、ギブソンアセンブリおよびＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡアセンブリのアプローチを、製造業者のプロトコールに従って使用した（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）。ＤＮＡミニプレップをシーケンシングした。
【０２２１】
それぞれの発現ベクターは、鎖をコードする遺伝子（ＤＬＬ３またはＣＤ３アーム／鎖）、たとえば、シグナル配列ならびに軽鎖および重鎖をコードする遺伝子のための真核生物プロモーターエレメント、原核生物選択マーカー遺伝子、たとえば、アンピシリンの発現カセット、ならびに複製起点を含む。これらのＤＮＡプラスミドを、アンピシリン耐性大腸菌コロニーおよび培養物において伝播させ、精製した。
【０２２２】
（実施例２）
ＤＬＬ３およびＣＤ３に結合する二重特異性、二価結合タンパク質の発現および精製
ＤＬＬ３およびＣＤ３に結合する二重特異性分子を、ＤＬＬ３／ＣＤ３鎖をコードする遺伝子を保持するｐＴＴ５ベクターをＣＨＯ−Ｅ細胞に一過的にトランスフェクトすることによって産生させた。簡単に述べると、無血清培地において懸濁液中で成長するトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｅ細胞を、１４０ｒｐｍでの撹拌、３７℃、および５％  ＣＯ２下において、振盪フラスコ中で培養し、指数関数的成長の条件で維持した。トランスフェクションの日には、細胞に、ノブ鎖のプラスミドおよびホール鎖のプラスミドを１：３の質量比でトランスフェクトした。これらを、次いで、１〜２×１０＾６個の細胞／ｍｌで、１ＬのＧｉｂｃｏ（登録商標）ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ発現培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＹ、ＵＳ）に播種した。細胞を、次いで、２００ｍｌの市販フィード溶液を一度にフィードして、１０日間、回転振盪させながらインキュベートして、タンパク質の発現を可能にした。細胞培養上清中の抗体力価を、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）機器（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ、ＣＡ、ＵＳ）およびｐｒｏｔＡバイオセンサーチップを製造業者の説明書に従って使用して判定した。
【０２２３】
組換えＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質を、まず、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したプロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって、次に、Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用したカチオン交換クロマトグラフィーによって、２ステップのプロセスで培養上清から精製した。２ステップで精製した材料を、５０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０の最終緩衝液中で保存した。サンプルの純度および不均質性の程度を、サイズ排除クロマトグラフィー分析、質量分析法、および超遠心分析法によって、評価した。機能性試験へと進めたサンプルは、２ステップで精製した材料を含み、約９９％の単量体含量であった。
【０２２４】
【表２】
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【０２２５】
（実施例３）
組換えタンパク質の産生
・ヒトＤＬＬ３−Ｈｉｓ
ヒトＤＬＬ３−Ｈｉｓを産生するための細胞株を、ＨＥＫ−２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｌｅｎｔｉ−Ｘレンチウイルス系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、およびヒトＤＬＬ３−Ｈｉｓをコードするプラスミド（ヒトＤＬＬ３、受託番号Ｑ９ＮＹＪ７  ｈｕＤＬＬ３−Ｈｉｓ：配列番号１０６）を使用して生成した。発現のために、細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２、および１４０ｒｐｍでの振盪で、培養し、増殖させた。発現の０日目に、細胞を、ペレット化し、Ｅｘｐｉ  ２９３培地に再懸濁した。発現の３日目に、馴化させた培養上清を、細胞を４０分間、４７００ｒｐｍでペレット化することによって得た。プロテアーゼ阻害剤を、精製の前に生物材料（biomass）に添加した。発現を、ウエスタンブロットによって確認した。馴化した培養上清を、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ、０．０２％  ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭイミダゾールを用いて調節した。精製は、ＨｉｓＴｒａｐ  Ｎｉエクセルカラムおよび緩衝液Ａ：５０ｍＭ  ＭＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ、０．０２％  ＣＨＡＰＳ、ｐＨ６．５で実行した。目的のタンパク質を、２０ｍＭイミダゾールから５００ｍＭイミダゾールへの溶出勾配を使用して、０．５Ｍイミダゾール、ｐＨ８．５を補充した緩衝液Ａにおいて溶出させた。プールした画分を、緩衝液：５０ｍＭ  ＭＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、０．０２％  ＣＨＡＰＳ、０．２Ｍアルギニン、３％グリセロール、ｐＨ６．５中に透析した。精製した材料を、質量分析法および超遠心分析法によって定量した。
【０２２６】
・カニクイザルＤＬＬ３−Ｈｉｓ
カニクイザルＤＬＬ３−Ｈｉｓを産生するための細胞株を、ＨＥＫ−２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｌｅｎｔｉ−Ｘレンチウイルス系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、およびカニクイザルＤＬＬ３−Ｈｉｓをコードするプラスミド（カニクイザルＤＬＬ３、受託番号ＸＭ＿００５５８９１９６．１（ＲｅｆＳｅｑ）、カニクイザルＤＬＬ３−Ｈｉｓ：配列番号１０７）を使用して生成した。発現のために、細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２、および１４０ｒｐｍでの振盪で、培養し、増殖させた。発現の０日目に、細胞を、ペレット化し、Ｅｘｐｉ  ２９３培地に再懸濁した。発現の３日目に、馴化させた培養上清を、細胞を４０分間、４７００ｒｐｍでペレット化することによって得た。プロテアーゼ阻害剤を、精製の前に生物材料に添加した。発現を、ウエスタンブロットによって確認した。馴化した培養上清を、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ、０．０２％  ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭイミダゾールを用いて調節した。精製は、ＨｉｓＴｒａｐ  Ｎｉエクセルカラムおよび緩衝液Ａ：５０ｍＭ  ＭＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ、０．０２％  ＣＨＡＰＳ、ｐＨ６．５で実行した。目的のタンパク質を、２０ｍＭイミダゾールから５００ｍＭイミダゾールへの溶出勾配を使用して、０．５Ｍイミダゾール、ｐＨ８．５を補充した緩衝液Ａにおいて溶出させた。プールした画分を、緩衝液：５０ｍＭ  ＭＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、０．０２％  ＣＨＡＰＳ、０．２Ｍアルギニン、３％グリセロール、ｐＨ６．５中に透析した。精製した材料を、質量分析法および超遠心分析法によって定量した。
【０２２７】
・ヒトＣＤ３  Ｅ＋Ｇ  ＨｕＦｃ−６ｘＨｉｓ（Ｅ＋Ｇは、εγサブユニットを示す）
ヒトＣＤ３  Ｅ＋Ｇ  ＨｕＦｃ−６ｘＨｉｓを産生するための細胞株を、ＨＥＫ−２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｌｅｎｔｉ−Ｘレンチウイルス系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、およびヒトＣＤ３  Ｅ＋Ｇ  ＨｕＦｃ−６ｘＨｉｓをコードするプラスミド（ヒトＣＤ３Ｅ、受託番号：Ｐ０７７６６、ヒトＣＤ３Ｅ＋Ｇ−ＨｕＦｃ−Ｈｉｓ：配列番号１０８）を使用して生成した。発現のために、細胞を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３培地中で、３７℃、加湿８％  ＣＯ２環境、および１３５ｒｐｍでの振盪で、培養し、増殖させた。馴化させた培養上清を、９３００ｘｇで３０分間の遠心分離によって、６日目に採取した。発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによってモニタリングした。馴化させた培養上清を、０．２Ｍスクロース、５％グリセロール、０．０１％  ＣＨＡＰＳ、および１０ｍＭイミダゾールで調節した。ｐＨを、次いで、７．２に調節した。精製は、Ｎｉ／ＮＴＡ樹脂を使用した親和性精製（４℃で一晩のインキュベーション、および２５０ｍＭイミダゾールでの溶出）、次いで、０．２Ｍスクロース、５％グリセロール、０．０１％  ＣＨＡＰＳ、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、ｐＨ７．２を有する最終ＰＢＳ緩衝液中、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーという２ステップのプロセスにおいて実行した。プールした材料を、最終的な分析および保管の前に、分画分子量（MWCO）が１０，０００のＰＥＳ膜ｖｉｖａ  ｃｅｌｌ  １００遠心分離デバイスを使用して、濃縮した。精製した材料を、質量分析法および超遠心分析法によって定量した。
【０２２８】
・ＣＤ３  Ｅ＋Ｇ  ＨｕＦｃ−６ｘＨｉｓ  （Ｅ＋Ｇは、εγサブユニットを示す）
カニクイザルＣＤ３  Ｅ＋Ｇ  ＨｕＦｃ−６ｘＨｉｓを産生させるための細胞株を、ＨＥＫ−２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｌｅｎｔｉ−Ｘレンチウイルスシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、およびカニクイザルＣＤ３  Ｅ＋Ｇ  ＨｕＦｃ−６ｘＨｉｓをコードするプラスミド（カニクイザルＣＤ３Ｅ受託番号、Ｑ９５ＬＩ５、カニクイザルＣＤ３  Ｅ＋Ｇ  ｈｕＦｃ−Ｈｉｓ：配列番号１０９）を使用して生成した。発現のために、細胞を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３培地中で、３７℃、加湿８％  ＣＯ２環境、および１３５ｒｐｍでの振盪で、培養し、増殖させた。馴化させた培養上清を、９３００ｘｇで３０分間の遠心分離によって、６日目に採取した。発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによってモニタリングした。馴化させた培養上清を、０．２Ｍスクロース、５％グリセロール、０．０１％  ＣＨＡＰＳ、および１０ｍＭイミダゾールで調節した。ｐＨを、次いで、７．２に調節した。精製は、Ｎｉ／ＮＴＡ樹脂を使用した親和性精製（４℃で一晩のインキュベーション、および２５０ｍＭイミダゾールでの溶出）、次いで、０．２Ｍスクロース、５％グリセロール、０．０１％  ＣＨＡＰＳ、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、ｐＨ７．２を有する最終ＰＢＳ緩衝液中、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーという２ステップのプロセスにおいて実行した。プールした材料を、最終的な分析および保管の前に、分画分子量が１０，０００のＰＥＳ膜ｖｉｖａ  ｃｅｌｌ  １００遠心分離デバイスを使用して、濃縮した。精製した材料を、質量分析法および超遠心分析法によって定量した。
【０２２９】
（実施例４Ａ）
組換えＤＬＬ３およびＣＤ３εγサブユニットに対する親和性ならびに種間交差反応性のＳＰＲに基づく判定
精製したＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性コンストラクトの、組換えヒトおよびカニクイザルＤＬＬ３−ＥＣＤならびにヒトおよびカニクイザルＣＤ３εγサブユニットのＦｃ融合タンパク質に対する結合親和性を、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって判定した。泳動緩衝液およびすべての希釈（示される場合を除く）を、ＰＢＳ−Ｔ−ＥＤＴＡにおいて行った。ＧＬＭセンサーチップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を、製造業者の推奨に従って正規化し、事前に整えた。センサーチップを、３０ｕｌ／分の流速で、３００秒間、水平方向のＥＤＣ／ｓ−ＮＨＳの等量混合物で活性化し、３０ｕｌ／分の流速で、３００秒間、水平方向のプロテインＡ／Ｇ（１０ｍＭ酢酸、ｐＨ４．５中、２０ｕｇ／ｍｌ）で固定化し、約５０００ＲＵのプロテインＡ／Ｇを表面上に得た。センサーチップを、３０μｌ／分の流速で、３００秒間、水平方向の１ＭエタノールアミンＨＣｌで脱活性化した。センサーチップを、１００μｌ／分の流速で、１８秒間、水平方向で３回、および垂直方向で３回、０．８５％のリン酸で安定させた。
【０２３０】
ＤＬＬ３に対する結合動態の判定のために、二重特異性分子を、２５μｌ／分の流速で、２５０秒間、垂直方向に、プロテインＡ／Ｇ表面上に個別に捕捉した。４０μｌ／分の流速で６０秒間、水平方向にＰＢＳ−Ｔ−ＥＤＴＡを注射することによって、ベースラインを安定させた。分析物（ヒトＤＬＬ３またはカニクイザルＤＬＬ３）を、４０μｌ／分の流速で６００秒間、捕捉した抗体の上に水平方向に注射し、２７００秒間解離させた。分析物の濃度は、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ、および１．２５ｎＭであった。０．８５％のリン酸溶液を、１００μｌ／分の流速で１８秒間、水平方向に１回および垂直方向に１回注射することによって、表面を、再生させた。
【０２３１】
ＣＤ３に対する結合動態の判定のために、ヒトＣＤ３εγ−ＦｃおよびカニクイザルＣＤ３εγ−Ｆｃ（ｐＨ４．５酢酸中に溶解）を、３０μｌ／分の流速で１４０秒間、垂直方向でのアミンカップリングを通じて、センサー表面に直接的に固定化した。４０μｌ／分の流速で６０秒間、水平方向にＰＢＳ−Ｔ−ＥＤＴＡを注射することによって、ベースラインを安定させた。分析物（二重特異性分子）を、４０μｌ／分の流速で６００秒間、捕捉したＣＤ３εγ−Ｆｃコンストラクトの上に水平方向に注射し、６００秒間解離させた。分析物の濃度は、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、３１．３ｎＭ、および１５．６ｎＭ、または２μＭ、１μＭ、０．５μＭ、０．２５μＭ、および０．１２５μＭであった。０．８５％のリン酸溶液を、１００μｌ／分の流速で１８秒間、水平方向に１回および垂直方向に１回注射することによって、表面を、再生させた。
【０２３２】
スポット間（センサー表面との境界部）およびブランク（ＰＢＳ−Ｔ−ＥＤＴＡ）を、生データから差し引いた。次いで、センサーグラムを、１：１動態モデルに当てはめて、ヒトＤＬＬ３およびカニクイザルＤＬＬ３に対する速度定数（ｋａ、ｋｄ）、ならびに親和性（ＫＤ）値を得、平衡に対して包括的に当てはめて、ヒトＣＤ３εγおよびカニクイザルＣＤ３εγに対する親和性（ＫＤ）値を得た。
【０２３３】
本明細書に記載されるＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質は、ＤＬＬ３に対してｐＭ範囲の親和性を示した。ＣＤ３εγサブユニットに対する親和性は、低めのｎＭ範囲であった。ヒトとカニクイザルとの間の種間ギャップを、平衡させる。３つの例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（配列番号７５のＤＬＬ３鎖、およびそれぞれ配列番号７９、配列番号８０、または配列番号１０５のＣＤ３鎖を含む、ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質）の親和性を、表２Ａに示す。
【０２３４】
【表３】
2021526816.tif 000036
【０２３５】
（実施例４Ｂ）
組換えＤＬＬ３およびＣＤ３εγに対する親和性のＳＰＲに基づく判定
精製したＤＬＬ３／ＣＤ３二重特異性コンストラクトの、組み換えヒトＤＬＬ３−ＥＣＤおよびヒトＣＤ３εγサブユニットのＦｃ融合タンパク質に対する結合親和性を、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって判定した。この方法は、実施例４Ａと類似であったが、以下に概説されるいくつかの違いを有する。
【０２３６】
ＤＬＬ３に対する結合動態の判定のために、抗ＤＬＬ３／ＣＤ３分子を、３０μｌ／分の流速で２００秒間、垂直方向で、プロテインＡ／Ｇ表面上に個別に捕捉した。３０μｌ／分の流速で６０秒間、水平方向にＰＢＳ−Ｔ−ＥＤＴＡを注射することによって、ベースラインを安定させた。分析物（ヒトＤＬＬ３）を、３０μｌ／分の流速で３００秒間、捕捉した抗体の上に水平方向に注射し、１８００秒間解離させた。分析物の濃度は、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ、および１．２５ｎＭであった。０．８５％のリン酸溶液を、１００μｌ／分の流速で１８秒間、水平方向に１回および垂直方向に１回注射することによって、表面を、再生させた。
【０２３７】
ＣＤ３に対する結合動態の判定のために、ＨｕＣＤ３Ｅ＿ＨｕＣＤ３Ｇ−Ｆｃ（ｐＨ４．５酢酸中に溶解）を、３０μｌ／分の流速で３６０秒間、垂直方向でのアミンカップリングを通じて、センサー表面に直接的に固定化した。３０μｌ／分の流速で６０秒間、水平方向にＰＢＳ−Ｔ−ＥＤＴＡを注射することによって、ベースラインを安定させた。分析物（すべての抗ＤＬＬ３／ＤＬＬ３分子）を、３０μｌ／分の流速で６００秒間、捕捉した抗体の上に水平方向に注射し、１８００秒間解離させた。分析物の濃度は、２５０ｎＭ、８３．３ｎＭ、２７．８ｎＭ、９．３ｎＭ、および３．１ｎＭであった。０．８５％のリン酸溶液を、１００μｌ／分の流速で１８秒間、水平方向に１回および垂直方向に１回注射することによって、表面を、再生させた。
例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、または配列番号２５２のＤＬＬ３鎖と配列番号７９のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質、配列番号７５のＤＬＬ３鎖と配列番号８０のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３結合タンパク質、ならびに配列番号７５のＤＬＬ３鎖と配列番号１０５のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３結合タンパク質）の親和性を、２Ｂに示す。
【０２３８】
【表４】
2021526816.tif 000037
【０２３９】
（実施例５）
細胞外ドメインおよびそのサブドメインを細胞表面上に発現するＨＥＫ２９３細胞の生成
それぞれ、全長ヒトＤＬＬ３（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９ＮＹＪ７）、カニクイザルＤＬＬ３（ＵＰＩ０００３ＡＢ９５ＢＤ）、ヒトＤＬＬ１（Ｑ００５４８）、およびヒトＤＬＬ４（Ｑ９ＮＲ６１）を発現する安定なＨＥＫ２９３細胞の生成のために、それぞれのコーディング配列を、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングし、ＦＬＡＧ−タグを、シグナル配列と細胞外ドメインとの間に挿入した。細胞表面上の発現を、抗ＦＬＡＧ抗体（クローンＭ２、Ｓｉｇｍａ）、続いてモノクローナル抗マウスＩｇＧ１（Ａｃｒｉｓ）を使用して検証した。
【０２４０】
ＤＬＬ３の細胞外ドメインは、異なるサブドメインからなる。
・ヒトＤＬＬ３シグナルペプチド：アミノ酸１〜２６
・ヒトＤＬＬ３  Ｎ末端ＥＣＤドメイン：アミノ酸２７〜１７５
・ヒトＤＬＬ３  ＤＳＬ：アミノ酸１７６〜２１５
・ヒトＤＬＬ３  ＥＧＦ１：アミノ酸２１６〜２４９
・ヒトＤＬＬ３  ＥＧＦ２：アミノ酸２７４〜３１０
・ヒトＤＬＬ３  ＥＧＦ３：アミノ酸３１２〜３５１
・ヒトＤＬＬ３  ＥＧＦ４：アミノ酸３５３〜３８９
・ヒトＤＬＬ３  ＥＧＦ５：アミノ酸３９１〜４２７
・ヒトＤＬＬ３  ＥＧＦ６：アミノ酸４２９〜４６５
・膜近傍ペプチド：アミノ酸４６６〜４９２
【０２４１】
ＤＬＬ３の以下のサブドメインを、ＨＥＫ２９３細胞の細胞表面上に発現させた。
・ヒトＤＬＬ３  ＥＧＦ１＋２：Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９ＮＹＪ７、アミノ酸２１６〜３１０
・ヒトＤＬＬ３  ＥＧＦ  ２＋３：Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９ＮＹＪ７、アミノ酸２７４〜３５１
・ヒトＤＬＬ３  ＥＧＦ３＋４：Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９ＮＹＪ７、アミノ酸３１２〜３８９
・ヒトＤＬＬ３  ＥＧＦ４＋５：Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９ＮＹＪ７、アミノ酸３５３〜４２７
・ヒトＤＬＬ３  ＥＧＦ５＋６：Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９ＮＹＪ７、アミノ酸３９１〜４６５
・ヒトＤＬＬ３  ＥＧＦ６＋膜近傍ペプチド：Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９ＮＹＪ７、アミノ酸４２９〜４９２
【０２４２】
６−Ｈｉｓ−ｍｙｃタグ付けした、ヒトＤＬＬ３のサブドメインを発現するＨＥＫ２９３細胞の生成のために、それぞれのコーディング配列を、ｐｃＤＮＡ  ３．１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングした。コンストラクトは、Ｎ末端マウスＩｇＧ  Ｖｋリーディング配列、続いて、６−ヒスチジン−ｍｙｃタグおよびそれぞれのヒトＤＬＬ３ドメインを含む。ヒトＤＬＬ３ドメインの細胞表面局在化を確実にするために、すべてのコンストラクトには、Ｓｅｒ／Ｇｌｙリンカー、膜貫通ドメイン（アミノ酸２６６〜２８８）、およびヒトＥｐＣＡＭ（Ｐ１６４２２）の細胞内ドメイン（アミノ酸２８９〜３１４）が続いた。サブドメインの発現は、国際公開第２０１３１２６７４６号に記載される様々なドメインに対するマウスモノクローナルＩｇＧ２ａ抗体を使用して検証した。結合したモノクローナル抗体を、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆ（ａｂ’）２）−ＲＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。サンプルを、フローサイトメトリーによって測定した。ヒトＤＬＬ１およびＤＬＬ４の発現を、抗ＤＬＬ１抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ１８１８）および抗ＤＬＬ４抗体Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ１５０６）、続いて、ＰＥ標識化抗マウスまたは抗ラット二次抗体を使用して、ＦＡＣＳ分析によって確認した（図５の右パネルを参照されたい）。
【０２４３】
【表５】
2021526816.tif 000038
2021526816.tif 000039
2021526816.tif 000040
【０２４４】
（実施例６）
ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質のエピトープドメインマッピング
エピトープドメインを、ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の、ＤＬＬ３のサブドメインを発現する組換え細胞株への結合によって、判定した（図２を参照されたい）。これらの細胞株の生成は、実施例５に記載されている。
ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質は、実施例２に記載されるように、鎖をコードする遺伝子を保持するｐＴＴ５ベクターをＣＨＯ−Ｅ細胞に一過的にトランスフェクトすることによって産生させた。
【０２４５】
ＤＬＬ３のサブドメインを発現する細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．０５％アジ化ナトリウム）中１．６ｎＭの２ステップで精製したＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質で染色した。結合した分子を、ＰＥにコンジュゲートした抗ヒト二次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、番号Ｐ８０４７）で検出した。陰性対照として、細胞を、二次抗体のみとともにインキュベートした。サンプルを、フローサイトメトリーによって測定した。図３Ａ〜Ｃは、ＤＬＬ３の異なる領域に結合する例示的な結合物質（配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、または配列番号２５２のＤＬＬ３鎖と配列番号７９のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質、および配列番号７５のＤＬＬ３鎖と配列番号８０のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３結合タンパク質）を示す。エピトープドメインの配列は、実施例５、表３に列挙されている。
【０２４６】
（実施例７）
種間交差反応性
種間交差反応性は、ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の、２つのＳＣＬＣ細胞株であるＮＣＩ−Ｈ８２細胞（ＨＴＢ−１７５（商標））およびＳＨＰ７７細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＣＲＬ−２１９５（登録商標））、ならびにカニクイザルＤＬＬ３を発現する組換え細胞株への結合によって判定される（実施例５に記載される細胞株の生成）。
【０２４７】
ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質は、実施例２に記載されるように、鎖をコードする遺伝子を保持するｐＴＴ５ベクターをＣＨＯ−Ｅ細胞に一過的にトランスフェクトすることによって産生させた。ヒトまたはカニクイザルＤＬＬ３を発現する細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．０５％アジ化ナトリウム）中、漸増濃度の２ステップで精製したＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質で染色した。結合した分子を、ＰＥにコンジュゲートした抗ヒト二次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、番号Ｐ８０４７）で検出した。陰性対照として、細胞を、二次抗体のみとともにインキュベートした。サンプルを、フローサイトメトリーによって測定した。図４は、７つの例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（配列番号７３のＤＬＬ３鎖および配列番号７９のＣＤ３鎖、配列番号７４のＤＬＬ３鎖および配列番号７９のＣＤ３鎖、配列番号７５のＤＬＬ３鎖および配列番号７９のＣＤ３鎖、配列番号７５のＤＬＬ３鎖および配列番号８０のＣＤ３鎖、配列番号７６のＤＬＬ３鎖および配列番号７９のＣＤ３鎖、配列番号７７のＤＬＬ３鎖および配列番号７９のＣＤ３鎖、または配列番号７８のＤＬＬ３鎖および配列番号７９のＣＤ３鎖を含む、ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質）の、ヒトおよびカニクイザルＤＬＬ３を発現する細胞への結合を示す。
【０２４８】
（実施例８）
ヒトＤＬＬ１およびＤＬＬ４の結合の不在の確認
ヒトＤＬＬ１およびＤＬＬ４に対する交差反応性の不在を、ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の、ヒトＤＬＬ１またはＤＬＬ４を発現する組換え細胞への結合によって判定した（細胞株の生成は、実施例５に記載されている）。
ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質は、実施例２に記載されるように、鎖をコードする遺伝子を保持するｐＴＴ５ベクターをＣＨＯ−Ｅ細胞に一過的にトランスフェクトすることによって産生させた。
【０２４９】
ＤＬＬ１およびＤＬＬ４を発現する細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．０５％アジ化ナトリウム）中、漸増濃度の２ステップで精製したＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質で染色した。結合した分子を、ＰＥにコンジュゲートした抗ヒト二次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、番号Ｐ８０４７）で検出した。陰性対照として、細胞を、二次抗体のみとともにインキュベートした。サンプルを、フローサイトメトリーによって測定した。ヒトＤＬＬ１およびＤＬＬ４の発現を、抗ＤＬＬ１抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ１８１８）および抗ＤＬＬ４抗体Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ１５０６）、続いて、ＰＥ標識化抗マウスまたは抗ラット二次抗体を使用して、ＦＡＣＳ分析によって確認した。図５は、７つの例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（配列番号７３のＤＬＬ３鎖および配列番号７９のＣＤ３鎖、配列番号７４のＤＬＬ３鎖および配列番号７９のＣＤ３鎖、配列番号７５のＤＬＬ３鎖および配列番号７９のＣＤ３鎖、配列番号７５のＤＬＬ３鎖および配列番号８０のＣＤ３鎖、配列番号７６のＤＬＬ３鎖および配列番号７９のＣＤ３鎖、配列番号７７のＤＬＬ３鎖および配列番号７９のＣＤ３鎖、または配列番号７８のＤＬＬ３鎖および配列番号７９のＣＤ３鎖を含む、ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質）の、ヒトＤＬＬ１およびＤＬＬ４を発現する細胞への結合を示す。
【０２５０】
（実施例９）
ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質のＳＣＬＣ細胞株およびＴ細胞への結合
ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の、ヒトＳＣＬＣ細胞株への結合を、ＮＣＩ−Ｈ８２（ＨＴＢ−１７５（商標））およびＳＨＰ７７（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＣＲＬ−２１９５（商標））のフローサイトメトリーによって、試験した。ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質は、実施例２に記載されるように産生させた。
【０２５１】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によって、濃縮されたリンパ球調製物（軟膜）、および輸血用の血液を採取している血液バンクの副産物から調製した。すべての軟膜は、ヘルシンキ宣言およびＡｕｓｔｒｉａのｃａｎｔｏｎａｌ  ｅｔｈｉｃａｌ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認に従い、告知に基づく同意の後に得、ＰＢＭＣを、採取と同じ日に調製した。したがって、単核細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離（１４００ｒｐｍでブレーキなしで３５分間）およびＰＢＳでの広範な洗浄によって単離した。残留赤血球は、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ１０４９２０１）中で３分間インキュベートし、続いて、ＰＢＳ中で洗浄した後、ＲＰＭＩ  １６４０  ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、番号６１８７０−０１０）、５％ヒトＡＢ血清ＡＢ（Ｇｅｍｉｎｉ、ＧｅｍＣｅｌｌカタログ番号１００−５１２、ロット番号Ｈ５６５００Ｉ）＋１％  ＭＥＭ−ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ、番号１１１４０−０３５）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、番号７３６５−４９−９）、１０μＭ  ベータ−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ、番号２１９８５−０２３）、およびピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ、番号１１３６０−０３９）を含有するアッセイ培地に再懸濁させることによって、除去した。
【０２５２】
Ｔ細胞を、パンＴ細胞単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、番号１３０−０９１−１５６）を使用して、ネガティブセレクションによって単離した。簡単に述べると、細胞を、４０μｌの緩衝液ＰＢＳ／０，５％  ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ、参照番号０４１−９４５５３  Ｍ）／２ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号１５５７５−０３８）中に、１０個のＭｉｏ細胞ずつ再懸濁させ、１０個のＭｉｏ細胞当たり１０μｌのビオチン−抗体カクテルとともに、４℃で５分間インキュベートした。続いて、３０μｌの緩衝液および２０μｌの抗ビオチンＭｉｃｒｏＢｅｄｓ／１０００万個の細胞を、添加し、４℃で１０分間インキュベートした。続いて、混合物を、好適なＭＡＣＳセパレータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）の磁場において、事前にすすいだ２５ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、番号１３０−０４２−４０１）に入れた。フロースルーを収集し、アッセイ培地中で洗浄した。
【０２５３】
細胞（Ｔ細胞またはヒトＳＣＬＣ細胞）を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．０５％アジ化ナトリウム）中、漸増濃度で、漸増濃度の２ステップで精製したＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質で染色した。結合した分子を、ＰＥにコンジュゲートした抗ヒト二次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、番号Ｐ８０４７）で検出した。ＤＳＬ（ＤＬＬ３＃６）、ＥＧＦ１（ＤＬＬ３＃５）、またはＥＧＦ４（ＤＬＬ＃４）ドメインを標的とするＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質は、ＤＬＬ３を発現するＳＣＬＣ細胞株に対して、膜近傍ペプチド（ＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３）を標的とするＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質と比較して、より強力な結合を示す。異なるエピトープドメインに対する例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、または配列番号２５２のＤＬＬ３鎖と配列番号７９のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質、および配列番号７５のＤＬＬ３鎖と配列番号８０のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３結合タンパク質）のＳＨＰ７７、ＮＣＩ−Ｈ８２細胞、およびＴ細胞への結合を、図６Ａ〜Ｖに示す。
【０２５４】
（実施例１０Ａ）
刺激されていないＰＢＭＣをヒトＳＣＬＣ細胞株に対して再指向させる有効性
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出を細胞溶解の読取りとして使用して、ＳＣＬＣ細胞株に対する刺激されないＰＢＭＣの有効性を判定した。このアッセイにおいて、ＤＬＬ３陽性ＳＣＬＣ細胞株であるＳＨＰ７７およびＮＣＩ−Ｈ８２を、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣおよび漸増濃度のＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質とともに、エフェクター対標的細胞比１０：１で、７２時間、共培養した。ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８のＤＬＬ３鎖と配列番号７９のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質、および配列番号７５のＤＬＬ３鎖と配列番号８０のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３結合タンパク質）を、実施例２に記載されるように、鎖をコードする遺伝子を保持するｐＴＴ５ベクターをＣＨＯ−Ｅ細胞に一過的にトランスフェクトすることによって、産生させた。
【０２５５】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によって、濃縮されたリンパ球調製物（軟膜）、および輸血用の血液を採取している血液バンクの副産物から調製した。すべての軟膜は、ヘルシンキ宣言およびＡｕｓｔｒｉａのｃａｎｔｏｎａｌ  ｅｔｈｉｃａｌ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認に従い、告知に基づく同意の後に得、ＰＢＭＣを、採取と同じ日に調製した。したがって、単核細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離（１４００ｒｐｍでブレーキなしで３５分間）およびＰＢＳでの広範な洗浄によって単離した。残留赤血球を、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ１０４９２０１）中で３分間インキュベートし、続いて、ＰＢＳ中で洗浄することにより除去し、その後、ＲＰＭＩ  １６４０  ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、番号６１８７０−０１０）、５％ヒトＡＢ血清ＡＢ（Ｇｅｍｉｎｉ、ＧｅｍＣｅｌｌカタログ番号１００−５１２、ロット番号Ｈ５６５００Ｉ）＋１％  ＭＥＭ−ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ、番号１１１４０−０３５）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、番号７３６５−４９−９）、１０μＭ  ベータ−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ、番号２１９８５−０２３）、およびピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ、番号１１３６０−０３９）を含有するアッセイ培地に再懸濁した。
続いて、標的細胞であるＳＨＰ７７およびＮＣＩ−Ｈ８２、ならびにＰＢＭＣを、１：１０の比で、０．０００１ｎＭ〜１００ｎＭの濃度のＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質とともに、７２時間インキュベートした。
【０２５６】
細胞毒性検出キットPLUS（Ｒｏｃｈｅ）を、製造業者の説明書に従って使用して、細胞毒性活性を判定した。簡単に述べると、この方法は、死細胞または形質膜損傷細胞からのＬＤＨの放出の量に基づく。細胞培養上清を、キットから得られた反応混合物とともに３０分間インキュベートし、ＬＤＨ活性の結果として、ホルマザンの形成を、細胞溶解の代理として、５００ｎｍで分光光度計において測定する。最大溶解対照に対する細胞毒性のパーセンテージを、以下の式に従って計算した。
【０２５７】
【数１】
2021526816.tif 000041
バックグラウンド：標的細胞＋エフェクター細胞
最大溶解：標的細胞＋５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
最小溶解：標的細胞
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを使用して、最大溶解対照に対する細胞毒性のパーセンテージを、対応するＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質濃度に対してプロットした。用量応答曲線を、シグモイドの用量応答曲線の評価のための４パラメーターのロジスティック方程式モデルを用いて分析し、ＥＣ90値を計算した（ＥＣ90値を、表４Ａに示す）。
【０２５８】
図７Ａは、異なるエピトープドメインに結合する７つの例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８のＤＬＬ３鎖と配列番号７９のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質、および配列番号７５のＤＬＬ３鎖と配列番号８０のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３結合タンパク質）の細胞溶解における有効性の例を示す。
【０２５９】
【表６】
2021526816.tif 000042
【０２６０】
（実施例１０Ｂ）
刺激されていないＴ細胞をヒトＳＣＬＣ細胞株に対して再指向させることの有効性
Ｔ細胞を、実施例９に記載されるように単離した。続いて、実施例１０Ａに記載されるように、標的細胞としてＳＨＰ７７およびＮＣＩ−Ｈ８２細胞を用いた細胞毒性アッセイにおいて、精製したＴ細胞をエフェクター細胞として使用した。用量応答曲線を、図７Ｂ〜Ｈ（ＳＨＰ７７細胞）および図７Ｉ〜Ｏ（ＮＣＩ−Ｈ８２細胞）に示す。計算したＥＣ９０値を、表４Ｂに示す。
【０２６１】
図７Ｂ〜Ｏは、１９個の例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２のＤＬＬ３鎖を含むＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質）の細胞溶解における有効性の例を示す。
【０２６２】
【表７】
2021526816.tif 000043
【０２６３】
（実施例１１）
インビトロ内部移行アッセイ
標的細胞としてＤＬＬ３陽性ＳＨＰ７７細胞とともに事前インキュベートした後のＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の有効性の変化を、測定した。ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質が内部移行された場合、有効濃度は、これにより減少するはずであり、したがって、見かけの有効性が減少するはずである。
ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質を、実施例２に記載されるように産生させた。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、実施例１０に記載されるように調製した。
ＳＨＰ７７標的細胞を、播種し、０．０００１〜１００ｎＭの濃度でＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質とともに、２時間および４時間インキュベートした後、刺激されていないＰＢＭＣを４８時間添加した。エフェクター対標的細胞の比は、１０：１であった。実施例１０に記載されるように、細胞毒性検出キットPLUS（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、細胞毒性活性を判定した。
図８は、２つの例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（配列番号７５のＤＬＬ３鎖と配列番号７９のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質、および配列番号７５のＤＬＬ３鎖と配列番号８０のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質）の細胞溶解の有効性および効果に違いがないことを示す。有効性および効果が、事前インキュベートしていないサンプル（０時間）と比較して観察された。結果は、ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質で有意な内部移行が生じないことを示唆する。
【０２６４】
（実施例１２）
マウス薬物動態研究
ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の薬物動態を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、１ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投薬の後に評価した。ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の血清濃度を、ＤＬＬ３捕捉／ＣＤ３検出アッセイを使用して、判定した。
簡単に述べると、雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１ｍｇ／ｋｇの単回静脈内（ＩＶ）投薬（ｎ＝分子当たり３）。血液サンプルを、投薬前、ならびに投薬の０．１５時間後、２時間後、８時間後、２４時間後、７２時間後、９６時間後、１６８時間後、２４０時間後、および３３６時間後に採取した。血清薬物レベルを、ＭＳＤに基づくリガンド結合アッセイで、捕捉試薬としてビオチン化ＤＬＬ３および検出試薬としてスルホタグ化ＣＤ３を使用して、測定した。薬物動態（ＰＫ）パラメーターを、非コンパートメント分析を使用して、血清濃度時間プロファイルから計算した。以下の薬物動態パラメーターを評価した：ＡＵＣｔｌａｓｔ（時間ゼロから、最後の定量可能時点までの血清濃度−時間曲線下の面積）、ＡＵＣｉｎｆ（無限に外挿された血清濃度−時間曲線下の面積）、ＣＬ（全身クリアランス）、Ｖｓｓ（安定状態の体積分布）、ならびに１／２（消失半減期）。
【０２６５】
例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（配列番号７５のＤＬＬ３鎖と配列番号７９のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質、および配列番号７５のＤＬＬ３鎖と配列番号８０のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質）の平均（ＳＤ）血清濃度時間プロファイルを、図９に要約する。これらの例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の平均（ＳＤ）薬物動態パラメーターを、表５に要約する。
【０２６６】
【表８】
2021526816.tif 000044
【０２６７】
（実施例１３）
インビボ異種移植片有効性研究
ヒトＴ細胞で再構成したヒト異種移植片マウスモデルを使用して、有効性研究を行った。詳細に述べると、ヒトＳＨＰ７７小細胞肺がん細胞（２×１０7個）を、致死以下で照射した（２Ｇｙ、−１日目）雌性ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃscid  Ｉｌ２ｒｇtm1Sug／ＪｉｃＴａｃマウスの右背面腹部に皮下（ｓ．ｃ．）注射した（１日目）。並行して、ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞（健常なヒト血液ドナーから単離した）を、インビトロで増殖させた。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、実施例１０に記載されるように調製した。
【０２６８】
Ｔ細胞を、パンＴ細胞単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、番号１３０−０９１−１５６）を使用して、ネガティブセレクションによって単離した。簡単に述べると、細胞を、４０μｌの緩衝液ＰＢＳ／０，５％  ＢＳＡ（ｇｉｂｃｏ、参照番号０４１−９４５５３  Ｍ）／２ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、参照番号１５５７５−０３８）中に、１０個のＭｉｏ細胞ずつ再懸濁させ、１０個のＭｉｏ細胞当たり１０μｌのビオチン−抗体カクテルとともに、４℃で５分間インキュベートした。続いて、３０μｌの緩衝液および２０μｌの抗ビオチンＭｉｃｒｏＢｅｄｓ／１０００万個の細胞を、添加し、４℃で１０分間インキュベートした。続いて、混合物を、好適なＭＡＣＳセパレータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）の磁場において、事前にすすいだ２５ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、番号１３０−０４２−４０１）に入れた。フロースルーを収集し、アッセイ培地中で洗浄した。
【０２６９】
続いて、Ｔ細胞を、Ｔ細胞活性化／増殖キットヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０−０９１−４４１、ロット番号５１７０７２０８４３）を使用して、２０日間増殖させた。簡単に述べると、抗ビオチンＭＡＣＳｉＢｅａｄ（商標）粒子に、ＣＤ２−、ＣＤ３−、ＣＤ２８ビオチンをローディングし、精製したＴ細胞に、粒子１つ当たり２つの細胞の比で移入し、０．５〜１  １０６個の細胞／ｍｌの密度で、２０ユニットの組換えＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ、番号２０２−ＩＬ−０５０／ＣＦ）の存在下において、２０日間インキュベートした。細胞に、３日ごとに２０ユニットの新しいＩＬ−２を補充した。動物に注射する３日前に、細胞４つ当たり１つのビーズの比でＣＤ２−、ＣＤ３−、ＣＤ２８ビオチンをローディングした抗ビオチンＭＡＣＳｉＢｅａｄ（商標）粒子で、Ｔ細胞をさらに３日間再刺激した。最後に、ビーズを、ＭＡＣＳｉＭＡＧセパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で除去し、Ｔ細胞を、ＰＢＭＣ中で洗浄した。
【０２７０】
１４日目に、動物を、腫瘍体積に基づいて処置群にランダム化し、２×１０7個のヒトＴ細胞を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。処置は、１７日目に開始し、ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（配列番号７５のＤＬＬ３鎖と配列番号７９のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質、および配列番号７５のＤＬＬ３鎖と配列番号８０のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質）またはビヒクル緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）を、７日間に１回の投薬レジメンで、静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラス注射で側方尾静脈に投与した。腫瘍成長を、外部キャリパー測定によってモニタリングし、腫瘍体積を、標準的な半楕円式を使用して計算した。ヒトＴ細胞生着を、研究の終了時に、ヒトＣＤ３に対する免疫組織化学（ＩＨＣ）染色によって、脾臓において評価した。研究の終了時にヒトＴ細胞生着を示した動物のみを、統計学的分析に含めた。殺処分基準に到達した動物は、道徳的理由により研究中に早期に安楽死させた。１週間に１回、０．２５ｍｇ／ｋｇでの静脈内ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質による腫瘍保持マウスの処置は、有意な腫瘍退縮を誘導した（図１０）。
【０２７１】
（実施例１４）
ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の単量体含量パーセント
例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、または配列番号２５２のＤＬＬ３鎖と配列番号７９のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質、配列番号７５のＤＬＬ３鎖と配列番号８０のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３結合タンパク質、および配列番号７５のＤＬＬ３鎖と配列番号１０５のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３結合タンパク質）の単量体パーセントを、サイズ排除クロマトグラフィー分析（ａＳＥＣ）によって判定した（表６に示される）。ａＳＥＣは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＥＨ  ＳＥＣカラム２００Å、１．７μｍ、４．６×１５０ｍｍ（カタログ番号１８６００５２２５）を使用して、Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｒｏｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステムにおいて実行した。泳動条件は、次の通りであった：移動相：５０ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭアルギニン、および０．０５％アジ化ナトリウム、流速：０．５ｍｌ／分、泳動時間：５分間、サンプルローディング量：１０μｇ、ピーク検出：Ａ２８０ｎｍ、自動化クロマトグラム処理方法。
【０２７２】
【表９】
2021526816.tif 000045
【０２７３】
（実施例１５Ａ）
熱安定性
熱安定性を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって判定し、ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の第１の融解転移（Ｔｍ１）の結果を、表７に示す。ＤＳＣ熱融解は、緩衝液対照と比べた溶液中のタンパク質の熱安定性に関する情報を提供する。２０ｍＭクエン酸、１１５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６中の１ｍｇ／ｍｌのタンパク質の溶液の熱変性および凝集を、２０℃から１１０℃まで、６０℃／時間の走査速度で、自動化キャピラリーＤＳＣによってモニタリングした。
【０２７４】
【表１０】
2021526816.tif 000046
【０２７５】
（実施例１５Ｂ）
熱安定性
熱安定性を、熱シフト分析（ＴＳＡ）によって判定し、ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、または配列番号２５２のＤＬＬ３鎖と配列番号７９のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質、配列番号７５のＤＬＬ３鎖と配列番号８０のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３結合タンパク質、および配列番号７５のＤＬＬ３鎖と配列番号１０５のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３結合タンパク質）の第１の融解転移（Ｔｍ１）の結果を、表７Ｂに示す。ＳＹＰＲＯオレンジ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を外来フルオロフォアとして用いてＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ６  ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、温度に対する関数としての蛍光強度プロファイルを取得した。サンプルを、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０中、４０ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．０２％アジ化ナトリウムで０．４ｍｇ／ｍｌに希釈した。融解曲線を、２℃／分の速度で、２５℃から９５℃の熱傾斜で生成し、データを、およそ０．４℃ごとに、「ＲＯＸ」フィルターセット（励起：５８０±１０ｎｍ、放出：６２３±１４ｎｍ）を通じて取得した。データを、タンパク質熱シフトソフトウェアバージョン１．３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して分析した。
【０２７６】
【表１１】
2021526816.tif 000047
【０２７７】
（実施例１６）
Ｅｐｉｖａｘによるコンピュータでの免疫原性スコアの予測：
配列の免疫原性を、数学的アルゴリズムを用いてコンピュータで評価した。具体的には、免疫原性スコアの尺度として、ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、または配列番号２５２のＤＬＬ３鎖と配列番号７９のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質、配列番号７５のＤＬＬ３鎖と配列番号８０のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３結合タンパク質、および配列番号７５のＤＬＬ３鎖と配列番号１０５のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３結合タンパク質）のＥｐｉＭａｔｒｉｘ  Ｔｒｅｇ調整済みスコア（ＥｐｉＶａｘ  Ｉｎｃ．、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ  ＲＩ））を判定し、様々なＦｃ配列のスコアと比較した。これらのスコアは、Ｔ細胞エピトープおよびＴｒｅｇエピトープを考慮に入れる。免疫原性スコアが低いほど、配列が免疫原性である可能性が低い。一般に、負のスコアは、免疫原性のリスクが低いと考えられ、一方で高度に正のスコアは、免疫原性の可能性を示すと解釈される。以下の表に示されるように、本明細書に記載されるＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質は、非常に低い免疫原性スコアを示し、免疫原性であるリスクが、これらの結合タンパク質については低いことを示す。
【０２７８】
【表１２】
2021526816.tif 000048
【０２７９】
【表１３】
2021526816.tif 000049
【０２８０】
（実施例１７Ａ）
表面への非特異的結合
本発明のＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の特異性を、高度に荷電したタンパク質を使用して、ＳＰＲに基づくアッセイにおいてさらに試験した。バイオセンサー技術を使用して、結合タンパク質が無関係の荷電タンパク質に対して有意な結合を有するかどうかを判定するための非特異的結合アッセイを開発した。このアッセイにおいて、ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質を、一方が負に荷電したタンパク質（トリプシン阻害剤）をコーティングし、一方が正に荷電したタンパク質（リゾチーム）をコーティングした、２つのＳＰＲ表面を通過させた。タンパク質が、これらの表面に対して有意な非特異的結合を示す場合、候補物上の正または負に荷電した表面パッチの存在が結合の原因である可能性が高い。タンパク質の非特異的結合は、薬物動態（ＰＫ）および生体分布の不良と解釈され得、下流の製造可能性の影響も有し得る。
実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００において行った。希釈、表面調製、および結合実験を、１０倍ＨＢＳ−ＥＰから調製した１倍ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液において、２５℃で行った。固定化プロトコールおよび結合実験のいずれについても、流速は、５μＬ／分であった。
【０２８１】
表面を非特異的結合実験用に調製するために、ニワトリの卵白リゾチームおよびグリシンマックスダイズ（glycine max soybean）に由来するトリプシン阻害剤を、アミンカップリングキットを製造業者の説明書に従って使用して、３０００〜５０００ＲＵの表面密度で、手作業でＳシリーズのＣＭ５チップにカップリングさせた。
サンプルを、１倍ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中、１μＭで調製した。サンプルを、１０分間の会合および１０分間の解離で、活性化表面上に注射した。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００コントロールソフトウェアバージョン２．０．１を使用して収集し、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアバージョン３．０を使用して分析した。
【０２８２】
ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質は、これらの高度に荷電した表面には結合しなかった。表１０Ａは、２つの例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質での、トリプシン阻害剤およびリゾチームである２つの高度に荷電したタンパク質への結合の不在を示す。
【表１４】
2021526816.tif 000050
【０２８３】
（実施例１７Ｂ）
表面への非特異的結合
ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質（配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、または配列番号２５２のＤＬＬ３鎖と配列番号７９のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質、配列番号７５のＤＬＬ３鎖と配列番号８０のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３結合タンパク質、および配列番号７５のＤＬＬ３鎖と配列番号１０５のＣＤ３鎖とを含むＤＬＬ３結合タンパク質）の特異性を、実施例１７ａに記載されるように、１０分間の会合および１５分間の解離で、高度に荷電したタンパク質を使用してＳＰＲに基づくアッセイにおいてさらに試験した。結果を、表１０Ｂに示す。
【０２８４】
【表１５】
2021526816.tif 000051
【０２８５】
（実施例１８）
ＤＬＬ３陽性およびＤＬＬ３陰性腫瘍細胞の存在下における溶解、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞脱顆粒化、Ｔ細胞増殖、およびサイトカイン分泌の誘導
ＰＢＭＣを、実施例９に記載されるように精製した。Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞脱顆粒化、およびサイトカイン分泌を判定するために、ＰＢＭＣおよびＤＬＬ３陽性ＳＨＰ７７またはＤＬＬ３陰性ＲＫＯ−Ｅ６細胞を標的細胞として用いた細胞毒性アッセイを、実施例１０Ｂに記載されるように、設定した。Ｔ細胞をヒトＳＨＰ７７またはＲＫＯ−Ｅ６細胞へと再指向させることによる細胞溶解の有効性を、実施例１０Ａに記載されるように、判定した。Ｔ細胞活性化およびＴ細胞脱顆粒化を判定するために、細胞を、遠心分離し、ＣＤ４（ＢＤ、番号５５０６３０）、ＣＤ８（ＢＤ、番号５５７８３４）、ＣＤ２５（ＢＤ、番号３４０９０７）に対する抗体で染色し、続いて、細胞を、固定／透過処理溶液（ＢＤ、番号５５４７１４）を使用して透過処理し、パーフォリン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、番号３０８１２０）およびグランザイムＢ（ＢＤ、番号５６０２２１）に対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって測定した。上清中のサイトカインレベルを、Ｕ−ＰＬＥＸ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  １（ｈｕ）アッセイ（ＭＳＤ、番号Ｋ１５０６７Ｌ−２、キット）によって判定した。
Ｔ細胞の増殖を判定するために、ＰＢＭＣを、５μＭのＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３４５５４）で標識し、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ番号：３１７３３６）で染色した。続いて、標識したＰＢＭＣを、１０：１の比のＳＨＰ７７またはＲＫＯ−Ｅ６細胞、ならびに漸増濃度のＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質とともに、６日間インキュベートした。
図１１〜１５は、ＳＨＰ７７またはＲＯ−Ｅ６細胞ならびにＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質の存在下における、Ｔ細胞再指向によるＳＨＰ７７またはＲＫＯ−Ｅ６細胞の溶解の誘導（図１１）、および用量依存的Ｔ細胞活性化の誘導（図１２）、Ｔ細胞脱顆粒化（図）、サイトカインの分泌（図１４Ａ：インターフェロンガンマ、１４Ｂ：ＭＣＰ−１）、ならびにＴ細胞の増殖（図１５）を示す。
【０２８６】
（実施例１９）
Ｔ細胞サブセットのＳＨＰ７７細胞への再指向
ＰＢＭＣを、実施例１０ａに記載されるように単離した。続いて、Ｔ細胞サブセットを、以下の試薬およびプロトコールを使用して単離した。
【０２８７】
【表１６】
2021526816.tif 000052
図１６〜２０は、ＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質による、パンＴ細胞（図１６）、ナイーブＴ細胞（図１６）、ＣＤ４+Ｔ細胞（図１７、１８）、ＣＤ４+エフェクターメモリーＴ細胞（図１８）、ＣＤ４+セントラルメモリーＴ細胞（図１７）、ＣＤ８+Ｔ細胞（図１９、２０）、ＣＤ８+ＣＤ４５ＲＡ+エフェクターＴ細胞（図１９）、ＣＤ８+メモリーＴ細胞（図２０）の、ヒトＳＨＰ７７細胞への再指向の有効性を示す。
【０２８８】
（実施例２０）
例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質によるＳＨＰ７７異種移植片腫瘍組織へのＴ細胞浸潤
実施例１３に記載される研究におけるマウスに由来する残りの腫瘍組織を調製し、ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋した。続いて、組織切片を調製し、Ｔ細胞上のＣＤ３発現について染色した（２ＧＶ６  Ｖｅｎｔａｎａ）。例示的なＤＬＬ３／ＣＤ３結合タンパク質によるＳＨＰ７７異種移植片腫瘍組織へのＴ細胞浸潤を、図２１に示す。表１２におけるスコア付けを使用して、異種移植片腫瘍組織におけるＣＤ３発現を定量した。
【０２８９】
【表１７】
2021526816.tif 000053
【０２９０】
（実施例２１）
抗ＤＬＬ３抗体の産生
抗ＤＬＬ３結合物質を得るために、ＤＬＬ３免疫付与野生型およびＡｌｉｖａＭａｂヒト化マウス（Ａｂｌｅｘｉｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を用いたＡｌｉｖａＭａｂトランスジェニックマウスプラットフォーム）に由来するハイブリドーマまたは単一Ｂ細胞を、インビトロで培養した。上清を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）によって組換えヒトＤＬＬ３に対する反応性についてスクリーニングし、フローサイトメトリーによってヒトＤＬＬ３を発現するＳＨＰ−７７細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＣＲＬ−２１９５ＴＭ）に対する反応性についてスクリーニングした。
【０２９１】
免疫グロブリン（Ｉｇ）ＶＨおよびＶＬ遺伝子を、次いで、特定された陽性クローンから増幅させた。ハイブリドーマからＲＮＡを単離するために、単一クローンに由来する約２×１０6個の細胞を、ペレットにし、原料として使用した。単一Ｂ細胞については、単一で単離したＢ細胞から増大させた１００〜５００個の細胞を、原料として使用した。ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して単離した。次いで、Ｓｍａｒｔｅｒ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を製造業者の説明に従って使用して、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ合成を促進するために、ｏｌｉｇｏｄＴを使用して、全てのメッセンジャーＲＮＡ逆転写をプライミングし、次いで、Ｓｍａｒｔｅｒ  ＩＩＡオリゴヌクレオチドで「５’キャッピング」した。続いて、ＶＨおよびＶＬフラグメントの増幅を、Ｓｍａｒｔｅｒ  ＩＩＡキャップを標的とする５’プライマーおよびＣＨ１におけるコンセンサス領域を標的とする３’プライマーを使用して、２ステップのＰＣＲ増幅を使用して行った。簡単に述べると、それぞれの５０μｌのＰＣＲ反応物は、２０μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマーの混合物、２５μｌのＰｒｉｍｅＳｔａｒ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼプレミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、２μｌの未精製ｃＤＮＡ、ならびに２１μｌの二重蒸留Ｈ２Ｏからなる。サイクリングプログラムは、９４℃において３分間から開始され、続いて、３５回のサイクル（９４℃において３０秒間、５０℃において１分間、６８℃において１分間）の後、７２℃において７分間で終了する。２回目のＰＣＲは、それぞれのｐＴＴ５母ベクター（ＶＨおよびＶＬ）におけるそれぞれの領域と「オーバーラップする」１５ｂｐの相補的伸長を含む、ＶＬおよびＶＨの２回目のプライマーを用いて行った。２回目のＰＣＲは、以下のプログラムで行った：９４℃において３分間、３５回のサイクル（９４℃において３０秒間、５０℃において１分間、６８℃において１分間）、７２℃において７分間で終了。
【０２９２】
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を、ＶＬ遺伝子のｐＴＴ５  ｈｕＩｇＫベクターへの指向性クローニングおよびＶＨ遺伝子のｐＴＴ５  ｈｕＩｇＧ１ＫＯベクターへの指向性クローニングに使用した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングを促進するために、ＰＣＲ産物を、精製し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤクローニングの前に、クローニングエンハンサーで処理した。クローニングおよび形質転換は、製造業者のプロトコール（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に従って行った。ミニプレップＤＮＡを、サンガーシーケンシングに供して、完全なＶ遺伝子フラグメントが得られたことを確認した。
この手法を使用して、ＤＬＬ３に対する特異性を有する結合ドメインをコードするＩｇ  ＶＨおよびＶＬ遺伝子の対を、調製した。ＣＨＯ−Ｅ３７細胞に、対応する重鎖および軽鎖をコードするプラスミドを一過的にトランスフェクトすることによって、組換え抗体を産生させた。
【０２９３】
組換え抗体の確認用スクリーニング
発現された組換え抗体を含有する上清を、ヒトＤＬＬ３を発現する細胞株への結合について、フローサイトメトリーによってアッセイした。簡単に述べると、細胞を、組換え上清とともにインキュベートし、洗浄し、上清から結合したｍＡｂを、抗ヒトＩｇＧ−ＡＰＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  １０９−１３６−０９８）を用いて検出した。シグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）は、サンプルの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を、アイソタイプ対照のもので除すことによって、計算した。
【０２９４】
Ｂｉａｃｏｒｅ  ４００における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を、組換え上清に行った。簡単に述べると、ＨＴＰ上清中の最適化されていないＩｇＧを、１０ｕｌ／分で６０秒間、プロテインＡ／Ｇを介してセンサー表面に捕捉した。捕捉したＩｇＧへの１００ｎＭのヒトＤＬＬ３の結合を、３０ｕｌ／分で１８０秒間の会合、続いてＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中での１２０秒間の解離について、モニタリングした。プロテインＡ／Ｇ表面の再生を、それぞれの結合サイクルの合間に、ｐＨ２．１のグリシンを用いて行った。以下の材料を、このアッセイにおいて使用した：タンパク質試薬：組換えで発現させたヒトＤＬＬ３。システム泳動緩衝液：ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．００５％  ｖ／ｖのポリソルベートＰ２０）。捕捉用試薬：すべてのヒトＩｇＧアイソタイプに対して特異性を有するプロテインＡ／Ｇ。
目的のクローン（３００ｐＭを下回るＫｄを有する）を、選択し、以下に記載される様々な検出アッセイにおいてさらに評価した。
【０２９５】
（実施例２２）
抗ＤＬＬ３抗体の組換えヒトＤＬＬ３タンパク質への結合
抗体の結合を、ＥＬＩＳＡにおいて行った。簡単に述べると、抗ＤＬＬ３抗体を、４℃で一晩、２μｇ／ｍｌの濃度でコーティングした。プレートを洗浄した後、室温で１時間、ブロッキング緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｉｂｃｏ番号０４３−９０３０９Ａ）でブロッキングし、続いて、洗浄し、漸増濃度の組換えＤＬＬ３タンパク質とともにインキュベートした。検出のために、結合したＤＬＬ３タンパク質を、ポリクローナル抗ＤＬＬ３抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＢ４３１５）とともにインキュベートし、続いて、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識化抗ヤギ抗体（Ｒ３２ＡＧ−１）とともに１時間インキュベートした。結合した抗体を、Ｓｅｃｔｏｒイメージャー６０００（ＭＳＤ）においてＲｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＳＤ）を使用して定量した。図２２は、３つの例示的な抗ＤＬＬ３抗体の組換えタンパク質への結合を示す。膜近傍ペプチドドメインを標的とする抗ＤＬＬ３抗体（ＤＬＬ３＃３）は、ＥＧＦ４（ＤＬＬ３＃４）またはＥＧＦ１ドメイン（ＤＬＬ３＃５）を標的とする抗ＤＬＬ３抗体と比較して、組換えＤＬＬ３タンパク質への強力な結合を示す。
【０２９６】
（実施例２３）
抗ＤＬＬ３抗体のＳＣＬＣ細胞株への結合
細胞（Ｔ細胞またはヒトＳＣＬＣ細胞）を、漸増濃度のＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．０５％アジ化ナトリウム）中の漸増濃度の抗ＤＬＬ３抗体で染色した。結合した分子を、ＦＡＣＳ分析によってＰＥにコンジュゲートした抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１５−１１６−０７２）で検出した。ＤＳＬ（ＤＬＬ３＃６）、ＥＧＦ１（ＤＬＬ３＃５）、またはＥＧＦ４（ＤＬＬ３＃４）ドメインを標的とする抗ＤＬＬ３抗体は、図２３に示されるように、Ｃ末端ペプチドを標的とする抗ＤＬＬ３抗体（ＤＬＬ３＃１、ＤＬＬ３＃２、ＤＬＬ３＃３）よりも、ＤＬＬ３を発現するＳＣＬＣ細胞株への効力な結合を示す。
【０２９７】
（実施例２４）
（ＩＨＣ）
抗ＤＬＬ３抗体を、２０μｇ／ｍｌの濃度で、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｕｌｔｒａ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ、Ａｒｉｚｏｎａ）を製造業者の説明書に従って使用して、ＤＬＬ３  ｍＲＮＡ陽性ＳＣＬＣサンプルにおいて試験した。簡単に述べると、ＩＨＣを、抗ＤＬＬ３抗体で染色したホルマリン固定パラフィン包埋組織および切片（４μｍ）に行った。ＩＨＣアッセイを、ＲＵＯ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌプロトコールを使用して、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｕｌｔｒａプラットフォームで行った。抗ＤＬＬ３抗体染色は、１２分間、エピトープ賦活剤としてプロテイナーゼＫを使用して最適化させた。抗ＤＬＬ３抗体を、６０分間インキュベートした後、抗マウスＨＱ検出システムおよび抗ＨＱ  ＨＲＰとともにいずれも１２分間インキュベートした。陰性対照（ＩｇＧ抗体）は、それぞれの組織切片に対して行い、試験スライドと同じように処理した。
ヒトＳＣＬＣ細胞株ＳＨＰ７７を、陽性対照として使用した。全組織切片のデジタル画像を、Ｌｅｉｃａ  ＳＣＮ４００組織学スキャナー（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｌｔｏｎ  Ｋｅｙｎｅｓ、ＵＫ）を使用して取得した。
例示的な抗ＤＬＬ３抗体を用いたヒトＳＣＬＣサンプルの免疫組織化学的分析を、図２４に示す。
【０２９８】
（実施例２５）
ＳＣＬＣ細胞株における発現レベルの判定
抗ＤＬＬ３抗体の細胞表面発現を、ＱＩＦＩＫＩＴ（Ｋ００７８、Ｄａｋｏ）を使用して定量した。簡単に述べると、ＳＣＬＣ細胞株（ＳＨＰ７７、ＮＣＩ−Ｈ８２、およびＮＣＩ−Ｈ２２８６）を、抗ＤＬＬ３抗体（ＤＬ３０９、国際公開第２０１１／０９３０９７号）または無関係の抗体（アイソタイプ対照）で、５μｇ／ｍｌで標識した。別個のバイアルにおいて。続いて、細胞およびキットに提供されているビーズを、並行して、フルオレセインをコンジュゲートした抗マウス二次抗体で標識した。サンプルを、ＢＤ  ＣａｎｔｏＩＩ  Ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒにおいて測定したが、結果的に、蛍光は、細胞およびビーズ上に結合した抗ＤＬＬ３抗体の数と相関する。表１２は、３つのＳＣＬＣ細胞株の細胞表面上に発現されるＤＬＬ３分子を示す。
【０２９９】
【表１８】
2021526816.tif 000054
【０３００】
（実施例２６）
ＳＣＬＣ細胞株ブロックにおけるＩＨＣプロトコールの感度の判定
ＩＨＣプロトコールの感度を評価するために、ＳＣＬＣ細胞株（ＳＨＰ７７、ＮＣＩ−Ｈ８２、およびＮＣＩ−Ｈ２２８６）を、病院における組織のように処理し、ホルマリンに固定し、続いて、パラフィンに包埋した。
【０３０１】
ＳＣＬＣ細胞株を、ＡＴＣＣの説明書に従って培養した。細胞を、プレートからこそげ落とし、ホルマリンに固定し、続いて、可溶化したＨｉｓｔｏｇｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＨＧ−４０００−０１２）中に添加し、４℃で一晩インキュベートし、続いて、標準的なパラフィン包埋手順を、慣例的な病理研究室において行った。簡単に述べると、細胞ブロックを、エタノールおよびイソプロパノール中でインキュベートした後、パラフィンに包埋する（ｒｏｔｉ−Ｐｌａｓｔ、番号６６４２．５）。細胞ペレットブロックの切片を行い、切片を、実施例２４に記載されるプロトコールで染色した。図２５に示される結果は、抗ＤＬＬ３抗体ＤＬＬ３＃５を用いたＩＨＣプロトコールにより、非常に低いＤＬＬ３発現を有する細胞を検出することができることを示す。
【図１】
2021526816.tif 000055
【図２】
2021526816.tif 000056
【図３Ａ】
2021526816.tif 000057
【図３Ｂ】
2021526816.tif 000058
【図３Ｃ】
2021526816.tif 000059
【図４】
2021526816.tif 000060
【図５】
2021526816.tif 000061
【図６Ａ】
2021526816.tif 000062
【図６Ｂ】
2021526816.tif 000063
【図６Ｃ】
2021526816.tif 000064
【図６Ｄ】
2021526816.tif 000065
【図６Ｅ】
2021526816.tif 000066
【図６Ｆ】
2021526816.tif 000067
【図６Ｇ】
2021526816.tif 000068
【図６Ｈ】
2021526816.tif 000069
【図６Ｉ】
2021526816.tif 000070
【図６Ｊ】
2021526816.tif 000071
【図６Ｋ】
2021526816.tif 000072
【図６Ｌ】
2021526816.tif 000073
【図６Ｍ】
2021526816.tif 000074
【図６Ｎ】
2021526816.tif 000075
【図６Ｏ】
2021526816.tif 000076
【図６Ｐ】
2021526816.tif 000077
【図６Ｑ】
2021526816.tif 000078
【図６Ｒ】
2021526816.tif 000079
【図６Ｓ】
2021526816.tif 000080
【図６Ｔ】
2021526816.tif 000081
【図６Ｕ】
2021526816.tif 000082
【図６Ｖ】
2021526816.tif 000083
【図７Ａ】
2021526816.tif 000084
【図７Ｂ】
2021526816.tif 000085
【図７Ｃ】
2021526816.tif 000086
【図７Ｄ】
2021526816.tif 000087
【図７Ｅ】
2021526816.tif 000088
【図７Ｆ】
2021526816.tif 000089
【図７Ｇ】
2021526816.tif 000090
【図７Ｈ】
2021526816.tif 000091
【図７Ｉ】
2021526816.tif 000092
【図７Ｊ】
2021526816.tif 000093
【図７Ｋ】
2021526816.tif 000094
【図７Ｌ】
2021526816.tif 000095
【図７Ｍ】
2021526816.tif 000096
【図７Ｎ】
2021526816.tif 000097
【図７Ｏ】
2021526816.tif 000098
【図８】
2021526816.tif 000099
【図９】
2021526816.tif 000100
【図１０】
2021526816.tif 000101
【図１１】
2021526816.tif 000102
【図１２】
2021526816.tif 000103
【図１３】
2021526816.tif 000104
【図１４Ａ】
2021526816.tif 000105
【図１４Ｂ】
2021526816.tif 000106
【図１５】
2021526816.tif 000107
【図１６】
2021526816.tif 000108
【図１７】
2021526816.tif 000109
【図１８】
2021526816.tif 000110
【図１９】
2021526816.tif 000111
【図２０】
2021526816.tif 000112
【図２１】
2021526816.tif 000113
【図２２】
2021526816.tif 000114
【図２３】
2021526816.tif 000115
【図２４】
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【図２５】
2021526816.tif 000117
【配列表】
2021526816000001.app
【国際調査報告】
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2021526816.tif 000119
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