(57)【要約】  腫瘍微小環境（ＴＭＥ）応答性発現ベクターは、１つ以上のプロモーター応答エレメントを含む合成プロモーターをコードする核酸配列、およびキメラ抗原レセプターのような免疫エフェクター遺伝子をコードする核酸配列を含む。ＴＭＥ応答性ベクトルはＴＭＥ内で免疫エフェクター遺伝子の発現を誘発し、正常な健康組織では発現を誘発しないように設計されている。これにより、免疫活性に焦点を当て、安全性を高め、正常組織を標的としてしまうこと（ＯＮ−ｔａｒｇｅｔ  ＯＦＦ−ｔｕｍｏｒ）の危険性を減少させる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍微小環境（ＴＭＥ）応答性発現ベクターであって、
合成プロモーターをコードする核酸配列であって、前記プロモーターは、１つ以上のＴＭＥ依存性プロモーター応答エレメント（ＰＲＥ）およびエフェクター遺伝子をコードする核酸配列を含み、
前記ＴＭＥ応答性発現ベクターがＴＭＥ中に存在する１つ以上のＴＭＥ因子のプロモーター応答エレメントへの結合がエフェクター遺伝子の発現を誘導するように設計され、１つ以上のＴＭＥ因子のプロモーター応答エレメントへの結合の非存在下で、エフェクター遺伝子の発現率が低いか、または、エフェクター遺伝子が発現されない、
ＴＭＥ応答性発現ベクター。
【請求項２】
前記ＴＭＥ依存性ＰＲＥが、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）ＰＲＥ、ＴＮＦ−α  ＰＲＥ、核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）ＰＲＥ、低酸素ＰＲＥ、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ−７０）ＰＲＥ、ＩＬ−６  ＴＧＦ−βＰＲＥ、ＩＬ−１  ＰＲＥ、ＩＬ−８  ＰＲＥ、ＩＬ−１１  ＰＲＥ、ＩＬ−１２  ＰＲＥ、ＩＬ−１５  ＰＲＥ、ＩＬ−１８  ＰＲＥ、ＩＬ−１７  ＰＲＥ、ＩＬ−２１  ＰＲＥ、ＩＬ−３５  ＰＲＥ、ＧＭ−ＣＳＦ  ＰＲＥ、肝増殖因子（ＨＧＦ）ＰＲＥ、アリール水素受容体（ＡｈＲ）ＰＲＥ、またはこれらの任意の組み合わせからなるリストから選択される１つ以上の配列エレメントを含む、請求項１に記載のＴＭＥ応答性発現ベクター。
【請求項３】
前記エフェクター遺伝子がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１または２に記載のＴＭＥ応答性発現ベクター。
【請求項４】
プロモーター応答エレメントが、配列番号１〜４０に記載の核酸配列またはそれらの任意の組み合わせから選択される核酸に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＴＭＥ応答性発現ベクター。
【請求項５】
プロモーター応答エレメントが、配列番号１〜４に記載の核酸配列から選択される核酸配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＴＭＥ応答性発現ベクター。
【請求項６】
プロモーター応答エレメントが、配列番号２２〜４０に記載の核酸配列またはそれらの任意の組み合わせから選択される核酸配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＴＭＥ応答性発現ベクター。
【請求項７】
プロモーター応答エレメントが、配列番号４１に記載の核酸に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸配列を含む、請求項１に記載のＴＭＥ応答性発現ベクター。
【請求項８】
プロモーター応答エレメントが、２つ以上のプロモーター応答エレメントを含み、
２つ以上のＴＭＥ依存性プロモーター応答エレメントへの１つ以上のＴＭＥ因子の結合が、単一のＴＭＥ依存性プロモーター応答エレメントに結合する場合よりも高いＣＡＲの発現レベルを誘導する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＴＭＥ応答性発現ベクター。
【請求項９】
外部誘導性プロモーターおよびトランスアクチベーターをさらに含み、
合成プロモーターがトランスアクチベーターの発現を駆動し、外部誘導性プロモーターがＣＡＲの発現を駆動し、インデューサーおよびＴＭＥ因子の組み合わせがＣＡＲの発現を誘導する、請求項１〜８のいずれかに記載のＴＭＥ応答性発現ベクター。
【請求項１０】
外部インデューサーの存在下およびＴＭＥ因子の非存在下で、本質的にＣＡＲ発現が検出されない、請求項９に記載のＴＭＥ応答性発現ベクター。
【請求項１１】
ＴＭＥ因子が外部インデューサーの非存在下でプロモーター応答エレメントに結合する場合、本質的にＣＡＲ発現が検出されない、請求項９または１０に記載のＴＭＥ応答性発現ベクター。
【請求項１２】
外部誘導性プロモーターがＴｅｔ応答要素プロモーターであり、外部インデューサーがドキシサイクリンおよび／またはテトラサイクリンであり、Ｔｅｔ応答要素がトランス活性化因子およびドキシサイクリンおよび／またはテトラサイクリンの組み合わせによって活性化される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のＴＭＥ応答性発現ベクター。
【請求項１３】
トランスアクチベーターがｒｔＴＡ３である、請求項１２に記載のＴＭＥ応答性発現ベクター。
【請求項１４】
ＣＡＲ配列によってコードされるＣＡＲ分子が抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが疾患関連腫瘍抗原に結合する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＴＭＥ応答性発現ベクター。
【請求項１５】
前記ベクターが、ＤＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターから選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＴＭＥ応答性発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＴＭＥ応答性発現ベクターを含む免疫エフェクター細胞。
【請求項１７】
薬剤として使用される、請求項１６に記載の免疫エフェクター細胞。
【請求項１８】
それを必要とする患者の腫瘍を治療するための、請求項１６記載の免疫エフェクター細胞。
【請求項１９】
腫瘍が固形腫瘍である、請求項１８に記載の免疫エフェクター細胞。
【請求項２０】
固形腫瘍が肉腫、癌腫またはリンパ腫である、請求項１９に記載の免疫エフェクター細胞。
【請求項２１】
前記固形腫瘍が、肺腫瘍、メラノーマ、結腸癌、乳癌または脳腫瘍である、請求項２０に記載の免疫エフェクター細胞。
【請求項２２】
最適な合成プロモーターの決定のために腫瘍生検をスクリーニングするための方法であって、
生検における１つ以上のＴＭＥ因子の発現レベルを決定することと、
患者のＴＭＥに一致するＴＭＥ依存性プロモーター応答エレメントを有するＴＭＥ応答性発現ベクターを選択することと、を含む方法。
【請求項２３】
前記選択されたＴＭＥ応答性発現ベクターを免疫エフェクター細胞または細胞集団に導入することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
免疫エフェクター細胞または細胞集団が、ＮＫ細胞またはＴ細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
免疫エフェクター細胞または細胞集団が患者に対して自己由来である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
免疫エフェクター細胞または細胞集団が、治療前に患者から単離された免疫エフェクター細胞または細胞集団である、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
１つ以上のＴＭＥ因子が、腫瘍および／または非腫瘍ＴＭＥ細胞によって発現される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
患者のＴＭＥに一致するＴＭＥ依存性プロモーター応答エレメントを有するＴＭＥ応答性発現ベクターの選択が、ＴＭＥ依存性プロモーター応答エレメントを合成することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
患者のＴＭＥに適合するＴＭＥ依存性プロモーター応答エレメントを有するＴＭＥ応答性発現ベクターの選択が、患者のＴＭＥに最も適合するＴＭＥ依存性プロモーター応答エレメントのライブラリーからＴＭＥ依存性プロモーター応答エレメントを選択することを含む、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は一般に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現の分野、特に腫瘍組織特異的ＣＡＲ発現に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫システムを活用して癌を根絶することは、近年非常に効率的であることが証明されている。
【０００３】
その一例として、キメラ抗原レセプターＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）のような遺伝子操作された免疫細胞がある。この細胞は、他に効率的な治療法がなかった悪性腫瘍を根絶する能力に関して、優れた結果が示された後、様々な癌の治療のためにＦＤＡによって承認されている。
【０００４】
しかしながら、ＣＡＲ発現免疫細胞は、患者の体全体にわたって、腫瘍および転移に到達し得るが、操作された受容体の特異性は、少数の例外を除いて、腫瘍細胞と正常細胞とを完全に区別することを可能にしない。なぜなら、腫瘍は、体内のいくつかの正常細胞によって発現されない、絶対的にユニークな抗原を有しないことが多いからである。その結果、いくつかのＣＡＲ治療は、ＧＶＨＤに類似した毒性免疫反応を引き起こし、臨床試験中にＣＡＲ治療が原因となって死亡する事例もあった。
【０００５】
改変された免疫細胞内でＣＡＲの非構成的（恒常的）発現を達成する試みがなされている。一例は、外因的に提供される分子（テトラサイクリン／ドキシサイクリンなど）の存在下でのみ活性化されるプロモーターを利用することによって、ＣＡＲ発現ベクター内に「ＯＮ−ＯＦＦスイッチ」を適用することを含む。副作用症状が顕著な場合にＣＡＲ発現をオフにすることを可能にするが、このアプローチは、腫瘍細胞に対するＣＡＲ−Ｔ細胞の陽性活性をオフにするので、有効なＣＡＲ治療を中断する。
【０００６】
したがって、生命を脅かす「副作用」のリスクを低下させ、一方で腫瘍の効果的な除去を可能にする制御されたＣＡＲ発現に対する、未だ満たされていないニーズが残っている。
【発明の概要】
【０００７】
以下の実施形態およびその態様は例示的かつ例示的であり、範囲を限定するものではないことが意図される組成物および方法と併せて記載され、例示される。様々な実施形態では上述の問題のうちの１つまたは複数が低減または排除されており、他の実施形態は他の利点または改善に向けられている。
【０００８】
いくつかの実施形態によれば、腫瘍微小環境応答性プロモーターのコントロールの下で、必要に応じてｔｅｔ応答回路と組み合わせて、エフェクター遺伝子発現を調節するための新規なプラットフォームが提供される。
【０００９】
前記プラットフォームは、１つ以上のＴＭＥ依存性プロモーター応答エレメントを含む合成プロモーターをコードする核酸配列を含む腫瘍環境（ＴＭＥ）応答性発現ベクターを含む。前記核酸配列は、エフェクター遺伝子（例えば、エフェクター遺伝子（例えば、ＣＡＲ）をコードする核酸配列が挙げられるが、これに限定されない）に結合される。
【００１０】
有利には、ＴＭＥ応答性ベクターが、ＴＭＥ中に存在する１つ以上の因子のプロモーター応答エレメントへの結合が、直接的または間接的に、プロモーターによる発現を誘導するように設計される。ＴＭＥ因子結合が存在しない場合、プロモーター発現は、改変された細胞の各々内で自律的に下方制御される。これは有利には、ＣＡＲのようなエフェクターメカニズムの発現が、腫瘍のそれとは異なる組織環境において、最小限とされるか、または全く見られないことを保証する。一方、腫瘍環境においては、ＣＡＲのようなエフェクターメカニズムの発現は、正常組織を温存しながら上方制御され、腫瘍に対する活性をもたらす。
【００１１】
いくつかの実施形態によれば、発現ベクターは、２つ以上のＴＭＥ依存性プロモーター応答エレメントを含み得る。これは、最も高い発現レベルがＴＭＥ因子の特定の組み合わせが見出される場合にのみ得られることを確実にするのに役立ち得る。
【００１２】
有利には、プロモーターを活性化するように構成された１つ以上のＴＭＥ依存性プロモーター応答エレメントが、特定の患者または患者群の実際のＴＭＥシグネチャーに適合するように、カスタムメイドのプロモーターのための合成プロモーターを任意にさらに置換／変化させ、これにより、最も重要な特異的かつ効率的な応答を確実にすることができる。
【００１３】
いくつかの実施形態によれば、合成プロモーターをコードする核酸配列を含む腫瘍微小環境（ＴＭＥ）応答性発現ベクターが提供され、前記プロモーターは、１つ以上のＴＭＥ依存性プロモーター応答エレメント（ＰＲＥ）と、エフェクター遺伝子をコードする核酸配列とを含む。前記ＴＭＥ応答性発現ベクターは、ＴＭＥ中に存在する１つ以上のＴＭＥ因子のプロモーター応答エレメントへの結合がエフェクター遺伝子の発現を誘導するように設計され、１つ以上のＴＭＥ因子のプロモーター応答エレメントへの結合の不在下で、低エフェクター遺伝子が発現されるか、または、エフェクター遺伝子が実質的に全く発現されない。
【００１４】
いくつかの実施形態によれば、ＣＡＲは、キメラ抗原Ｔ細胞受容体（ＣＡＲ−Ｔ）、キメラ抗原ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞受容体（ＣＡＲ−ＮＫ）、キメラ先天性受容体、サイトカイン、ケモカイン、ケモカイン受容体、プロテアーゼ、マイクロＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない他の免疫エフェクターである。
【００１５】
いくつかの実施形態によれば、プロモーター応答エレメントは、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）エレメント応答、核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）応答エレメント、低酸素応答エレメント、ＩＬ−６応答エレメント、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ−７０）応答エレメント、ＩＬ−４応答エレメント、ＩＬ−６応答エレメント、ＩＬ−８応答エレメント、ＩＬ−１０応答エレメント、ＩＬ−１１応答エレメント、ＩＬ−１５応答エレメント、ＩＬ−１８応答エレメント、ＩＬ−２１応答エレメント、ＩＬ−３５応答エレメント、ＴＧＦ−β応答エレメント、肝成長因子（ＨＧＦ）応答エレメント、アリール水素受容体（ＡｈＲ）応答エレメント、ＰＧＥ２応答要素、または任意の他の適切なＴＭＥ因子応答エレメント、あるいはそれらの組み合わせからなるリストから選択される、１つ以上の応答エレメントを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態によれば、プロモーター応答エレメントは、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）エレメント応答、核因子κ−Ｂ（ＮＦ−κＢ）応答エレメント、低酸素応答エレメント、ＩＬ−１応答エレメント、ＩＬ−６応答エレメント、ＩＬ−８応答エレメント、ＩＬ−１１応答エレメント、ＩＬ−１２応答エレメント、ＩＬ−１５応答エレメント、ＩＬ−１８応答エレメント、ＩＬ−１７応答エレメント、ＩＬ−２１応答エレメント、ＴＧＦ−β応答エレメント、ＧＭ−ＣＳＦ応答エレメント、肝成長因子（ＨＧＦ）応答エレメント、アリール水素受容体（ＡｈＲ）応答エレメント、または任意の他の適切なＴＭＥ因子応答エレメント、あるいはそれらの組み合わせからなるリストから選択される１つ以上の応答エレメントを含むが、これらに限定されない。
【００１７】
いくつかの実施形態によれば、プロモーター応答エレメントはインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）エレメント応答、核因子κ−Ｂ（ＮＦ−κＢ）応答エレメント、低酸素応答エレメント、ＩＬ−６応答エレメント、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ−７０）応答エレメント、または任意の他の適切なＴＭＥ因子応答エレメント、またはそれらの組み合わせからなるリストから選択される１つ以上の応答エレメントを含むが、これらに限定されない。
【００１８】
いくつかの実施形態によれば、プロモーター応答エレメントは、センス（５’から３’）またはアンチセンス（３’から５’）方向で合成プロモーターに挿入され得る。
【００１９】
いくつかの実施形態によれば、プロモーター応答エレメントは、配列番号１で示されるＴＴＣＣＧＧＧＡＡ、配列番号２で示されるＧＧＧＡＡＴＴＴＣＣ、配列番号３で示されるＧＡＣＣＴＴＧＡＧＴＡＣＧＴＧＣＧＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＴＡＴＧ、配列番号４で示されるＧＣＧＣＴＴＣＣＴＧＡＣＡＧＴＧＡＣＧＣＧＡＧＣＣＧ、ＧＣＧＣＴＴＣＣＴＧＡＣＡＧＴＧＡＣＧＣＧＡＧＣＣＧ、またはこれらの任意の組み合わせからなるグループから選択される核酸を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態によれば、プロモーター応答エレメントは、配列番号２２で示されるＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＣＴＴＣＣＣＧＧＡＡＡＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＧＡＧＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＴＴＴＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣ、配列番号２３で示されるＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＣＴＴＣＣＣＧＧＡＡＧＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＣＴＴＣＣＣＧＧＡＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＡＡＴＴＴＴＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＧＧＴＴＣＴＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣ、配列番号２４で示されるＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＣＴＴＣＣＣＧＧＡＡＧＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＣＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＧＡＧＴＴＣＴＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＴＴＴＴＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣ、配列番号２５で示されるＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＣＴＴＣＣＣＧＧＡＡＧＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＴＣＴＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＡＧＡＴＴＣＴＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣ、配列番号２６で示されるＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＣＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＣＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＡＧＧＴＴＣＴＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣ、配列番号２７で示されるＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＣＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＣＴＴＣＣＧＧＧＡＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＡＧＧＴＴＴＣＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣ、配列番号２８で示されるＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＣＴＴＣＣＧＧＧＡＡＧＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＧＧＧＧＴＴＴＴＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＡＧＧＴＴＴＣＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣ、配列番号２９で示されるＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＣＴＴＣＣＧＧＧＡＡＧＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＧＡＧＴＴＣＴＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＴＴＴＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣ、配列番号３０で示されるＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＡＡＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＣＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＧＧＧＴＴＴＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＧＧＴＴＴＴＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣ、配列番号３１で示されるＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＡＡＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＣＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＧＧＧＴＴＴＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＧＧＴＴＴＴＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣ、配列番号３２で示されるＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＡＡＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＧＧＴＴＣＴＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＴＴＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣ、配列番号３３で示されるＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＡＡＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣ、配列番号３４で示されるＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＡＡＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＴＴＴＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＴＴＴＴＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣ、配列番号３５で示されるＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＧＡＴＴＣＴＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＧＧＴＴＣＴＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣ、配列番号３６で示されるＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＧＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＣＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＧＧＧＴＴＴＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＡＧＡＴＴＣＴＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣ、配列番号３７で示されるＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＧＧＧＧＴＴＴＴＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＡＡＡＴＴＴＴＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣ、配列番号３８で示されるＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＣＴＴＣＣＣＧＧＡＡＡＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣ、配列番号３９で示されるＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣ
ＣＣＧＧＴＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＴＴＣＣＧＧＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＡＧＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＴＴＴＣＧＧＧＧＡＣＴＴＣＣＧＧＡＡＡＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣ、配列番号４０で示されるＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＣＴＴＣＴＣＧＧＡＡＡＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＣＴＧＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣＡＧＡＣＣＡＡＧＴＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣ、またはこれらの任意の組み合わせからなるグループから選択される核酸を含む。各可能性は、別個の実施形態である。
【００２１】
いくつかの実施形態によれば、プロモーター応答エレメントは、配列番号１〜４に記載の核酸配列またはそれらの任意の組み合わせから選択される核酸を含む。各可能性は、別個の実施形態である。
【００２２】
いくつかの実施形態によれば、プロモーター応答エレメントは、配列番号２２〜４０に記載の核酸配列またはそれらの任意の組み合わせから選択される核酸を含む。各可能性は、別個の実施形態である。
【００２３】
いくつかの実施形態によれば、プロモーター応答エレメントは、配列番号４１で定義される次の核酸配列を含む。ＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＹＴＴＣＣＳＧＧＡＡＲＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＹＴＴＣＣＳＧＧＡＡＲＴＴＣＴＡＧＡＧＧＲＲＲＴＴＹＹＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＲＲＲＴＴＹＹＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣ。ここで、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｓ＝ＣまたはＧ、Ｒ＝ＡまたはＧである。
【００２４】
いくつかの実施形態によれば、１つ以上のＴＭＥ因子は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＨＳＰ−７０、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態によれば、合成プロモーターは、プロモーター応答エレメントに隣接する追加のヌクレオチド、および／またはプロモーター応答エレメント間の間隔（ｓｐａｃｉｎｇ）を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態によれば、プロモーター応答エレメントはＩＦＮ−γ、ＮＦ−κＢ、低酸素タンパク質、ＨＳＰ−７０、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０応答エレメント、ＩＬ−１１応答エレメント、ＩＬ−１２応答エレメント、ＩＬ−１５応答エレメント、ＩＬ−１８応答エレメント、ＩＬ−１７応答エレメント、ＩＬ−２１応答エレメント、ＴＧＦ−β応答エレメント、ＧＭ−ＣＳＦ応答エレメント、肝増殖因子（ＨＧＦ）応答エレメント、アリール水素受容体（ＡｈＲ）応答エレメント、ＰＧＥ２応答エレメント（センスまたはアンチセンス）のいずれかの応答エレメントの１つ以上を含み、これらは１つ以上の位置で改変されている。
【００２７】
いくつかの実施形態によれば、改変は、天然配列に対して増加したＴＭＥ因子結合を有する配列を生成する。
【００２８】
非限定的な例として、合成プロモーターは、種々の低酸素依存性標的遺伝子（ＬＤＨＡ／ＥＰＯ／ＶＥＧＦ）（例えば、ＬＤＨＡ／ＥＰＯ／ＶＥＧＦのＨＢＳ配列の共有部分および／またはＥＰＯ遺伝子のＨＡＳ配列）に由来する低酸素タンパク質の応答エレメント（または他のＴＭＥ因子応答エレメント）、ならびに標的遺伝子において見出されない約６〜９ヌクレオチドのリンカーを含み得る。この配列は以下に概説される配列番号４２に記載されるように、「塩基性低酸素プロモーター応答エレメント（ＰＲＥ）」と呼ばれる。
【００２９】
【化１】
2021514187.tif 000003
【００３０】
いくつかの実施形態によれば、塩基性ＴＭＥ因子プロモーター（ここでは塩基性低酸素ＰＲＥ）は、合成プロモーター配列の５’、３’または中央に付加され得る。いくつかの実施形態によれば、基本的なＴＭＥ因子ＰＲＥは、５’−３’方向で、または反転した３’−５’方向で挿入されてもよい。いくつかの実施形態によれば、合成プロモーターは、塩基性ＴＭＥ因子ＰＲＥの改変バージョンを含み得る。改変された塩基性低酸素症ＰＲＥの非限定的な例は、配列番号４３に、ＲＣＧＴＧＳＣＴＧＧＡＧＴＭＡＣＡＧＴＣＣＴＣＴＴＲＣＧＴＧＳＣＴＧＧＡＧＴＭＡＣＡＧＴＣＣＴＣＴＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｓ＝ＣまたはＧ、Ｍ＝ＡまたはＣ）、と記載されている。
【００３１】
いくつかの実施形態によれば、改変されたＴＭＥ因子ＰＲＥは、より少ない漏出性および低酸素刺激に対する最も高い応答を誘導する合成ＰＲＥである。
【００３２】
改変されたＩＦＮ−γＰＲＥの非限定的な例は、配列番号４４に、ＡＣＴＴＣＣＳＧＧＡＡＲＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＣＴＴＣＣＳＧＧＡＡＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｓ＝ＣまたはＧ）と記載されている。
【００３３】
改変されたＮＦ−κＢ  ＰＲＥの非限定的な例は、配列番号４５に、ＧＧＧＧＧＴＴＴＹＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＲＲＲＴＴＴＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ）と記載されている。
【００３４】
いくつかの実施形態によれば、プロモーター応答エレメントは、２つ以上のプロモーター応答エレメントを含みむ。ここで、２つ以上のＴＭＥ依存性プロモーター応答エレメントへのＴＭＥ因子の結合は、単一のＴＭＥ依存性プロモーター応答エレメントへの結合よりも高いエフェクター遺伝子の発現レベルを誘導する。
【００３５】
いくつかの実施形態によれば、ＴＭＥ応答性発現ベクターは、外部誘導性プロモーターおよびトランスアクチベーターをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、合成プロモーターは、トランスアクチベーターの発現を駆動し、外部誘導性プロモーターはエフェクター遺伝子の発現を駆動する。いくつかの実施形態によれば、インデューサーおよびＴＭＥ因子の組み合わせた存在は、エフェクター遺伝子の発現を誘導する。いくつかの実施形態によれば、外部インデューサーの存在下およびＴＭＥ因子の非存在下では、エフェクター遺伝子発現は本質的に検出されない。いくつかの実施形態によれば、ＴＭＥ因子が、外部インデューサーの非存在下でプロモーター応答エレメントに結合する場合、エフェクター遺伝子発現は本質的に検出されない。
【００３６】
いくつかの実施形態によれば、誘導性プロモーターはＴｅｔ応答要素プロモーターであり、外部インデューサーは、ドキシサイクリンおよび／またはテトラサイクリンである。
【００３７】
いくつかの実施形態によれば、エフェクター遺伝子は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および同時刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインを含むＣＡＲであってもよいが、これらに限定されず、前記抗原結合ドメインは腫瘍抗原に結合する。
【００３８】
いくつかの実施形態によれば、ＣＡＲは、ＣＡＲ、ケモカインレセプター、サイトカインレセプター、腫瘍内での免疫エフェクター細胞の付着を促進するＭＭＰ８／９のプロテアーゼのようなタンパク質（または機能性ＲＮＡ）、限定されるものではないが例えばＰＤ１および／またはＣＴＬＡ４のような免疫阻害剤を抑制するｍｉＲＮＡ、限定されるものではないが例えばＣＸＣＬ９／１０および／またはＣＲＣＲ３リガンドのような腫瘍内に免疫細胞保持をもたらすサイトカイン、または、特異的発現プロファイルが所望されるＴＭＥの他の適当なエフェクター遺伝子からなる群から選択され得る。
【００３９】
いくつかの実施形態によれば、ベクターは、ＤＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または合成構築物を免疫細胞に導入するための他のベクターから選択される。
【００４０】
いくつかの実施形態によれば、ＴＭＥ応答性発現ベクターは、ＭＭＰ８／９のプロテアーゼなどであるが、これらに限定されない、腫瘍への免疫エフェクター細胞の浸透を増強するタンパク質（または機能性ＲＮＡ）をコードするエフェクター遺伝子をさらに含む。
【００４１】
いくつかの実施形態によれば、ＴＭＥ応答性発現ベクターは、これらに限定されないがＰＤ１および／またはＣＴＬＡ４などの腫瘍内で免疫阻害剤を抑制するｍｉＲＮＡをコードする１つまたは複数のエフェクター遺伝子をさらに含む。
【００４２】
いくつかの実施形態によれば、ＴＭＥ応答性発現ベクターは、腫瘍内に免疫細胞保持をもたらすサイトカインをコードする１つ以上のエフェクター遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９／１０および／またはＣＲＣＲ３リガンド（これらに限定されない））をさらに含み、それによってオートクリンループを生成する。
【００４３】
いくつかの実施形態によれば、本質的に本明細書に記載されるように、１つ以上のＴＭＥ依存性プロモーター応答エレメントを含む合成プロモーターをコードする核酸配列と、キメラ抗原レセプターをコードする核酸配列を含むベクターを含む免疫エフェクター細胞とが提供される。いくつかの実施形態によれば、ＴＭＥ応答性ベクターは、ＴＭＥ中に存在する１つ以上の因子のプロモーター応答エレメントへの結合が直接的または間接的にエフェクター遺伝子の発現を誘導するように設計される。プロモーター応答エレメントへのＴＭＥ因子結合の非存在下で、本質的に、残留キメラ抗原レセプターが全く発現されないか、または、残留キメラ抗原レセプターの発現率は低くなる。
【００４４】
いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞は、薬剤としての使用に適している。いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞は、それを必要とする患者の腫瘍を治療するのに適している。いくつかの実施形態によれば、腫瘍は固形腫瘍である。いくつかの実施形態によれば、固形腫瘍は、肉腫、癌腫、またはリンパ腫である。いくつかの実施形態によれば、固形腫瘍は、肺腫瘍、黒色腫、結腸癌、乳房腫瘍または脳腫瘍である。
【００４５】
いくつかの実施形態によれば、それを必要とする患者において癌を治療するための方法であって、本質的に本明細書に記載される発現ベクターを含む免疫細胞を投与することを含む方法が提供される。
【００４６】
いくつかの実施形態によれば、最適な合成プロモーターの決定のために患者をスクリーニングするための方法であって、患者の腫瘍の生検を取得する工程と、生検における１つ以上のＴＭＥ因子の発現レベルを決定する工程と、生検における１つ以上のＴＭＥ因子の決定された発現レベルに一致するＴＭＥ依存性プロモーター応答エレメントを有するＴＭＥ応答性発現ベクターを選択する工程とを含む方法が提供される。
【００４７】
いくつかの実施形態によれば、最適な合成プロモーターを決定するために生検をスクリーニングするための方法であって、生検における１つ以上のＴＭＥ因子の発現レベルを決定することと、生検における１つ以上のＴＭＥ因子の決定された発現レベルに一致するＴＭＥ依存性プロモーター応答エレメントを有するＴＭＥ応答性発現ベクターを選択することとを含む方法が提供される。
【００４８】
いくつかの実施形態によれば、ＴＭＥは、腫瘍細胞および／または非腫瘍ＴＭＥ細胞によって発現され得る。
【００４９】
いくつかの実施形態によれば、この方法は、選択されたＴＭＥ応答性発現ベクターを免疫細胞に導入する工程をさらに包含する。
【００５０】
いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞または細胞集団はＴ細胞および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含み得るが、これらに限定されない。
【００５１】
いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞または細胞集団は、患者に対して自己由来である。
【００５２】
いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞／細胞集団は、治療前に患者から単離される。
【００５３】
いくつかの実施形態によれば、この方法は、免疫エフェクター細胞または細胞集団を患者に投与する工程をさらに包含する。
【００５４】
本開示の特定の実施形態は、上記の利点のいくつか、全て、またはいずれも含み得る。
【００５５】
１つまたは複数の技術的利点は、本明細書に含まれる図面、説明、および特許請求の範囲から当業者には容易に明らかになるのであろう。さらに、特定の利点が上に列挙されたが、様々な実施形態は列挙された利点のすべて、いくつか、または全く含まなくてもよい。
【００５６】
上記の例示的な態様および実施形態に加えて、さらなる態様および実施形態は図面を参照し、以下の詳細な説明を検討することによって明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
本発明は、以下の例示的な図面を参照して、特定の実施例および実施形態に関連して説明される。
【図１】図１は、レポーターおよび／またはＣＡＲ遺伝子発現を直接制御する合成プロモーターを含む発現構築物を概略的に示す。
【図２】図２は、レポーターおよび／またはＣＡＲ遺伝子発現を間接的に制御する合成プロモーターを含む発現構築物を概略的に示す。
【図３】図３は、最適なレポーターおよび／またはＣＡＲ遺伝子発現を提供する腫瘍微小環境（ＴＭＥ）のためのプロモーターライブラリーをスクリーニングするための方法の例示的なフローチャートである。
【図４Ａ】図４Ａは、ＴＭＥ因子および／またはドキシサイクリンの存在下および非存在下で、示されたＴＭＥ応答エレメント（ＧおよびＫ）を含む、図２の発現レンチウイルス構築物（ＧＦＰレポーターあり）で形質導入された２９３Ｔ  ＨＥＫ細胞におけるＧＦＰ強度（上のパネル）およびＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージ（下のパネル）を示す代表的なヒストグラムを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図３Ａに使用した代表的な反復の代表的なＦＡＣＳプロットを示す。
【図５】図５は、ＴＭＥ因子および／またはドキシサイクリンの存在下および非存在下で、示されたＴＭＥ応答エレメント（ＧおよびＫ）を含む、図２の発現構築物（ＧＦＰレポーターあり）でトランスフェクトされたＧＦＰ陽性２９３Ｔ  ＨＥＫ細胞をゲーティングする代表的なＦＡＣＳプロットを示す。
【図６】図６は、ＴＭＥ因子および／またはドキシサイクリンの存在下および非存在下で、示されたＴＭＥ応答エレメント（ＧおよびＫ）を含む、図２の発現構築物（ＧＦＰレポーターあり）でトランスフェクトされたＧＦＰ陽性２９３Ｔ  ＨＥＫ細胞内のレポーター強度を定量する代表的なヒストグラムを示す。
【図７】図７は、ＴＭＥ因子および／またはドキシサイクリンの存在下および非存在下で、示されたＴＭＥ応答エレメント（Ｇ、Ｋ、ＪおよびＨ）を含む、図２の発現構築物（ＧＦＰレポーターあり）でトランスフェクトされたＧＦＰ陽性２９３Ｔ  ＨＥＫ細胞内のレポーター強度を定量する代表的なヒストグラムを示す。
【図８】図８は、所望の最適なレポーター遺伝子発現プロフィールを有する細胞を同定および選別するために使用される例示的なＦＡＣＳ選別結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
以下の説明では、本開示の様々な態様が説明される。説明の目的のために、本開示の異なる態様の完全な理解を提供するために、特定の構成および詳細が記載される。しかし、本明細書に特定の詳細を提示することなく、本開示を実施することができることも当業者には明らかであろう。さらに、本開示を曖昧にしないために、周知の特徴は省略または簡略化されてもよい。
（定義）
特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。
【００５９】
用語「ａ」および「ａｎ」は記事の文法的対象の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指し、例えば、「要素」は、１つの要素または２つ以上の要素を手段する。
【００６０】
量、時間的持続時間などの測定可能な値に言及する場合、「約」という用語は、開示された方法を実行するのに適切であるため、特定の値から±２０％、場合によっては±１０％、場合によっては±５％、場合によっては±１％、または場合によっては±０．１％の変動を包含することを意味する。
【００６１】
用語「キメラ抗原受容体」または代わりに「ＣＡＲ」は、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および以下に定義されるような刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）を含む組換えポリペプチド構築物を指す。いくつかの実施形態において、ＣＡＲポリペプチド構築物中のドメインは同じポリペプチド鎖中にあり、例えば、キメラ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲポリペプチド構築物中のドメインが互いに連続しておらず、例えば、異なるポリペプチド鎖中にある。いくつかの実施形態によれば、ＣＡＲは、免疫細胞によって発現され、標的癌細胞に対して細胞毒性効果を有する任意の部分、すなわち標的上の死受容体を活性化するリガンドを広く指すことができる。
【００６２】
用語「腫瘍環境」、「腫瘍微小環境」および「ＴＭＥ」は、互換的に使用され、周囲の血管、免疫細胞、線維芽細胞、骨髄由来炎症細胞、リンパ球、シグナル伝達分子および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含む、腫瘍が存在する細胞環境を指すことができる。
【００６３】
「抗原」という用語は、免疫応答を引き起こす分子を指す。この免疫応答は、抗体産生、または特異的な免疫学的に適格な細胞の活性化、またはその両方を含み得る。当業者は、実質的に全てのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原として働き得ることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要がないことを理解するであろう。本発明は２つ以上の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含むが、これに限定されず、そしてこれらのヌクレオチド配列は所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードするために、種々の組み合わせで配置されることが容易に明らかである。抗原は、合成され得るか、または生物学的サンプルから誘導され得るか、またはポリペプチド以外の巨大分子であり得ることが容易に明らかである。このような生物学的サンプルとしては組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞、または他の生物学的成分を含む流体が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００６４】
用語「抗腫瘍効果」とは様々な手段によって発現され得る生物学的効果を指し、これには例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の増加、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞生存の減少、または癌状態に関連する様々な生理学的症状の改善が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
「自己由来」という用語は後に個体に再導入される同一の個体に由来する任意の物質を指し、「同種」という用語は、その物質が導入される個体とは異なる個体に由来する任意の物質を指す。
【００６６】
用語「保存的配列改変」はそれに対する因子の結合特性に有意に影響を及ぼさない、またはそれを変化させないアミノ酸改変を指す。このような保存的改変には、アミノ酸置換、付加および欠失が含まれる。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫エフェクター細胞」は、免疫応答に関与する細胞をいう。例としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、自然リンパ球細胞（ＩＬＣ）、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マスト細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、好塩基球、好中球および好酸球の様々なタイプ、およびサブタイプが挙げられる。
【００６８】
用語「発現」は、プロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳をいう。
【００６９】
用語「発現ベクター」は、発現されるべきヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターをいう。発現ベクターには、組換えヌクレオチド配列を組み込んだコスミド、プラスミド、エピソーム、トランスポゾンおよびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス）を含む、当技術分野で公知のすべてのものが含まれる。
【００７０】
本明細書中で使用される場合、用語「ＴＭＥ応答性発現ベクター」は、腫瘍環境を構成するか、規定するか、または、そうでなければ、関連する因子の存在下で遺伝子産物を発現するように構成される発現ベクターをいう。
【００７１】
本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するために必要とされる、細胞の合成機構によって認識されるＤＮＡ配列、または導入された合成機構をいう。
【００７２】
本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター／調節配列」および「プロモーター応答エレメント（ＰＲＥ）」は互換的に使用され得、そしてプロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列をいう。本明細書中で使用される場合、用語「ＴＭＥ因子」はサイトカイン、転写因子などのような（これらに限定されない）ＴＭＥ中に存在し、そして活性な因子をいう。本明細書中で使用される場合、用語「ＴＭＥ関連因子に連結されたＰＲＥ」はＴＭＥ関連因子の排出（ｅｘｃｒｅｔｅｄ）効果の後に活性化されるＰＲＥをいう。例えば、「低酸素ＰＲＥ」は、ＴＭＥ中の低酸素後に活性化されるＰＲＥを指す。「ＩＦＮ−γ  ＰＲＥ」がＴＭＥ中のＩＦＮ−γの存在後に活性化されるＰＲＥを指す。いくつかの例ではこの配列はコアプロモーター配列であってよく、他の例ではこの配列はまた、遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および他の調節エレメントを含んでいてもよい。プロモーター／調節配列は例えば、組織特異的な様式で遺伝子産物を発現するものであり得る。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、用語「構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）」プロモーターは、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結される場合、細胞のほとんどまたは全ての生理学的条件下で、細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列をいう。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、用語「誘導性（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）」プロモーターは遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結される場合、インデューサーが存在する場合にのみ、遺伝子産物を実質的に増強させるヌクレオチド配列をいう。「誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）」は、ＯＦＦ状態からＯＮ状態への発現の開始、ならびに相対的ＬＯＷから相対的ＨＩＧＨへの発現の増強の両方を含み得る。
【００７５】
本明細書中で使用される場合、用語「ＴＭＥ特異的プロモーター」、「ＴＭＥ誘導性プロモーター」および「ＴＭＥ応答性プロモーター」は、互換的に使用され得、そして遺伝子産物をＴＭＥ内で誘導させるヌクレオチド配列をいう。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、用語「合成プロモーター」は天然に存在するプロモーターのクローニングとは対照的に、人工的に合成されたＤＮＡ配列をいう。
【００７７】
用語「癌関連抗原」および「腫瘍抗原」は互換的に使用され得、そして完全にまたはフラグメントとしてのいずれかで癌細胞の表面上に発現され、そして癌細胞への薬理学的因子の優先的標的化に有用である分子（代表的にはタンパク質、炭水化物または脂質）をいう。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、正常細胞および癌細胞の両方によって発現されるマーカーである。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は正常細胞と比較して癌細胞において過剰発現される細胞表面分子であり、例えば、正常細胞と比較して１倍の過剰発現、２倍の過剰発現、３倍以上の過剰発現である。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は癌細胞において不適切に合成される細胞表面分子、例えば、正常細胞上で発現される分子と比較して欠失、付加または突然変異を含む分子である。
【００７８】
本明細書中で使用される場合、用語「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、増殖性障害の進行、重症度および／または持続時間の減少または改善、または治療の結果から生じる増殖性障害の１つ以上の症状（好ましくは１つ以上の識別可能な症状）の改善をいう。他の実施形態において、この用語は、増殖性障害の進行の阻害をいう。他の実施形態において、この用語は腫瘍サイズまたは癌性細胞数の減少または安定化をいう。用語「トランスフェクトされた（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）」は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスをいう。
【００７９】
細胞は、一次被験体細胞およびその子孫を含む。
【００８０】
用語「特異的に結合する」および「結合する」は同族核酸配列を認識し、結合する転写因子などの因子を意味する。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、非腫瘍環境（すなわち、健康な組織）における遺伝子発現の不在に関して「実質的に」および「本質的に」という用語は、全く存在しないか、または、残余発現レベルのみを意味する。いくつかの実施形態によれば、（健康な組織におけるように）実質的に発現がないことは、ＴＭＥ内で有効なレベルを誘導しながら、正常な健康な組織に対して生物学的／機能的に無効であるレベルでの発現レベルを指し得る。
【００８２】
範囲：本開示全体を通して、本発明の様々な態様は、範囲フォーマットで提示することができる。範囲形式での説明は単に便宜および簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内のすべての可能な部分範囲ならびに個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのサブ範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６などの具体的に開示されたサブ範囲を有すると考えられるべきである。別の例として、９５〜９９％同一などの範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一を有であるものを含み、９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％および９８〜９９％同一であるなどの下位範囲を含む。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
（説明）
いくつかの実施形態によれば、１つ以上のＴＭＥ依存性プロモーター応答エレメントを含む合成プロモーターをコードする核酸配列；およびキメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む腫瘍環境（ＴＭＥ）応答性発現ベクターが提供される。ＴＭＥ応答ベクターは、ＴＭＥに存在する１つ以上の因子のプロモーター応答エレメントへの結合が直接的または間接的に、ＣＡＲなどのエフェクター遺伝子の発現を誘導するように設計される。
【００８３】
より少ない応答エレメントを含む間でトレードオフがなされ得ることが理解され、その結果、同じＴＭＥ応答発現構築物を利用し、正常組織とは対照的に腫瘍組織に対する発現構築物の特異性を増加させる応答エレメントのより包括的な組み合わせを含む、広範なスペクトルの癌を標的化することができる。
【００８４】
いくつかの実施形態によれば、ＣＡＲは、キメラ抗原Ｔ細胞受容体（ＣＡＲ−Ｔ）またはキメラ抗原ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞受容体（ＣＡＲ−ＮＫ）である。
【００８５】
いくつかの実施形態によれば、プロモーター応答エレメントは、１つ以上のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ、Ｇ）−応答エレメント／結合部位、１つ以上の核因子κＢ（ＮＦ−κＢ、Ｋ）−応答エレメント／結合部位、１つ以上の熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ−７０）応答エレメント／結合部位、１つ以上の低酸素応答（Ｈ）エレメント／結合部位、１つ以上のインターロイキン６（ＩＬ−６、Ｊ）応答エレメント／結合部位、またはそれらの任意の組み合わせを含む／包含する。各可能性は、別個の実施形態である。
【００８６】
いくつかの実施形態によれば、１つ以上のＴＭＥ因子は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＨＳＰ−７０、および／または類似の活性化経路を誘導することができる等価物、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【００８７】
いくつかの実施形態によれば、プロモーター応答エレメントは、２つ以上のプロモーター応答エレメント／結合部位を含む。いくつかの実施形態によれば、２つ以上のプロモーター応答エレメント／結合部位は、同じであっても異なっていてもよい。非限定的な例として、２つ以上のプロモーター応答エレメント／結合部位は、２つ以上のＮＦ−κＢ応答エレメント／結合部位を含み得る。別の非限定的な例として、２つ以上のプロモーター応答エレメント／結合部位は、ＮＦ−κＢ応答エレメント／結合部位およびＩＦＮ−γ応答エレメント／結合部位を含み得る。いくつかの実施形態によれば、２つ以上のＴＭＥ依存性プロモーター応答エレメントへのＴＭＥ因子の結合は、単一のＴＭＥ依存性プロモーター応答エレメントへの結合よりも高いＣＡＲ発現レベルを誘導する。非限定的な例として、ＮＦ−κＢ応答エレメント／結合部位へのＮＦ−κＢの結合、およびプロモーターのＩＦＮ−γ応答エレメント／結合部位へのＴＮＦ−αの結合はいくつかの実施形態によれば、ＮＦ−κＢまたはＴＮＦ−α単独の結合よりも高いＣＡＲの発現を誘導し得る。
【００８８】
いくつかの実施形態によれば、プロモーター応答エレメントは、配列番号１に示されるＴＴＣＣＧＧＧＡＡ（本明細書中ではＧと略される）、配列番号２に示されるＧＧＧＡＡＴＴＴＣＣ（本明細書中ではＫと略される）、配列番号３に示されるＧＡＣＣＴＴＧＡＧＴＡＣＧＴＧＣＧＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＴＡＴＧ（本明細書中ではＨと略される）、配列番号４に示されるＧＣＧＣＴＴＣＣＴＧＡＣＡＧＴＧＡＣＧＣＧＡＧＣＣＧ（本明細書中ではＪと略される）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される核酸を含む。各可能性は、別個の実施形態である。非限定的な例として、プロモーター応答エレメントは、配列番号１（略称Ｇ２）に記載の核酸配列ＴＴＣＣＧＧＧＡＡの２倍を含む。別の非限定的な例として、プロモーター応答エレメントは、配列番号１に示される核酸配列ＴＴＣＣＧＧＧＡＡおよび配列番号２に示される核酸配列ＧＧＧＡＡＴＴＴＣＣ（略称Ｇ１Ｋ１）の両方を含む。いくつかの実施形態によれば、核酸は、同延（ｃｏｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）であってもよい。非限定的な例として、配列番号３に示される核酸配列ＧＡＣＣＴＴＧＡＧＴＡＣＧＴＧＣＧＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＴＡＴＧの直後に、配列番号４に示される核酸配列ＧＣＧＣＴＴＣＣＴＧＡＣＡＧＴＧＡＣＧＣＧＡＧＣＣＧ（略称Ｈ１Ｊ１）が続いてもよい。いくつかの実施形態によれば、核酸は、スペーサー配列によって分離され得る。非限定的な例として、配列番号１に記載の核酸配列ＴＴＣＣＧＧＧＡＡおよび配列番号２に記載の核酸配列ＧＧＧＡＡＴＴＴＣＣは、同じ合成プロモーター内のスペーサー要素によって離間されてもよい。
【００８９】
いくつかの実施形態によれば、ＴＭＥ応答性発現ベクターは、外部誘導性プロモーターをコードする核酸配列、およびトランスアクチベーター、例えばｒｔＴＡ３をコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態によれば、合成プロモーターはトランスアクチベーターの発現を駆動し、誘導性プロモーターはＣＡＲの発現を駆動する。いくつかの実施形態によれば、外部インデューサーとＴＭＥ因子との組み合わせた存在のみが、ＣＡＲ発現を生じる。いくつかの実施形態によれば、ＴＭＥ因子の非存在下での外部インデューサーの存在は、ＣＡＲ発現の誘導を実質的に引き起こさない。いくつかの実施形態によれば、ＴＭＥ因子の非存在下での外部インデューサーの存在は、ＣＡＲ発現の最小の誘導を引き起こす。いくつかの実施形態によれば、ＴＭＥ因子が、外部インデューサーの非存在下でプロモーター応答エレメントに結合する場合、本質的にＣＡＲ発現は誘導されない。いくつかの実施形態によれば、マイナーレベルのＣＡＲ発現もまた、誘導されない状態で見出される。そのような最小の発現は、ＣＡＲ−Ｔ記憶が確実に維持されるように役立つ可能性がある。
【００９０】
いくつかの実施形態によれば、誘導性プロモーターはＴｅｔ応答要素プロモーターであってもよく、外部インデューサーはドキシサイクリンおよび／またはテトラサイクリンであってもよい。いくつかの実施形態によれば、Ｔｅｔ応答要素は、トランス活性化因子およびドキシサイクリンおよび／またはテトラサイクリンの組み合わせた存在によって活性化され得る。テトラサイクリン（Ｔｅｔ）−Ｏｎ系は哺乳類細胞の誘導性遺伝子発現系であり、ドキシサイクリン結合Ｔｅｔ−リプレッサー変異蛋白質と単純ヘルペスウイルスＶＰ１６蛋白質由来のＣ末端活性化因子ドメインから構成される逆Ｔｅｔトランス活性化因子（ｒｔＴＡ）融合蛋白質がドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を提供することにより、遺伝子発現を制御するように改変される。Ｄｏｘの存在下で、ｒｔＴＡはアレイ（例えば、７つ）反復Ｔｅｔオペレーター配列の下流で融合される最小プロモーターを活性化する。最近まで、すべてのＴｅｔ−Ｏｎ系は２つの別々のベクターを必要とし、１つはｒｔＴＡを導入し、もう１つは目的の遺伝子を制御するために誘導性プロモーターを用いた。しかしながら、最近、ワンベクター系が開発され、これにより、目的の遺伝子の初代免疫細胞への形質導入が可能になった。このワンベクター系を利用することにより、Ｔｅｔ−Ｏｎ誘導系を用いて標的発現および機能を制御することが可能である。
【００９１】
いくつかの実施形態によれば、ＣＡＲ配列によってコードされるＣＡＲ分子は抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含み、任意選択で、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態によれば、抗原結合ドメインは腫瘍抗原に結合する。腫瘍抗原の非限定的な例としては、以下が挙げられる：甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；ＣＤ１７１；ＣＳ１（ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９、Ｎｅｕ５Ａｃ（２８）ｂＤＧａｌｐ（ＣＬＬ１）；ガングリオシド様分子１（２）ｂＤＧｌｃｐ（ｌ−ｌ）Ｃｅｒ）；Ｔｎ抗原（Ｔｎ  Ａｇ）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；ＣＤ３８；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン１３受容体サブユニットα−２（ＩＬ１３Ｒａ２）；インターロイキン１１受容体α（ＩＬＲａｌ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１（ＰＲＳＳ２１）；血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ＣＤ２４；血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲ−β）；ステージ特異的胚性抗原−４（ＳＳＥＡ−４）；ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）；上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；炭酸アンヒドラーゼＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム、β型（ＬＭＰ２）；エフリンＡ受容体２（ＥｐｈＡ２）；シアリルＬｅｗｉｓ接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３（２−３）ｂＤＧａｌｐ（ｌ−ｌ）Ｃｅｒ；ＴＧＳ５；高分子量エラノーマ関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ−アセチルＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体β；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クラウジン６（ＣＬＤＮ６）；Ｇ蛋白質共役受容体クラスＣグループ５  メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７Ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；グロボＨグリコセラミドの六糖部分（ＧｌｏｂｏＨ）；乳腺分化抗原（ＮＹ−ＢＲ１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；肝炎Ａ細胞性ウイルス受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体β３（ＰＡＮＸ３）；Ｇ蛋白質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６座Ｋ（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲ  Ｇａｍｍａ  Ａｌｔｅｒｎａｔｅ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＡＲＰ）；Ｗｉｌｍｓ腫瘍蛋白質（ＷＴ１）；染色体１２ｐに位置するＥＴＳ転座変異遺伝子６（ＥＴＶ６−ＡＭＬ）；精子蛋白質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｆａｍｉｌｙメンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ２）；メラノーマ癌精巣抗原−２（ＭＡＤＣＴ−２）；Ｆｏｓ関連抗原１；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；アポトーシスのメラノーマ阻害剤（ＭＬ−ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ）融合遺伝子）；ＮＡｃｅｔｙｌ  ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｖ（ＮＡ１７）；ペアボックス蛋白質Ｐａｘ−３（ＰＡＸ３））；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ−ミエロサイトーシスウイルス性神経芽細胞腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーＣ（ＣＹＰ１Ｂ  １）；ＣＣＣＴＣ結合因子（Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）様（ＢＯＲＩＳ）；Ｔ細胞により認識される扁平上皮癌抗原（ＳＡＲＴ３）；ペアボックス蛋白質Ｐａｘ−５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合蛋白質ｓｐ３２（ＯＹ−ＴＥＳ１）；リンパ球特異的蛋白質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカー蛋白質４（ＡＫＡＰ−４）；滑膜肉腫Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）；ＣＤ７９Ａ；ＣＤ７９Ａ；白血球分離免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチンホルモン様受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン−３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬ１）およびその任意の組合せ。各可能性は、別個の実施形態である。
【００９２】
いくつかの実施形態によれば、ＴＭＥ応答性発現ベクターはＭＭＰ８／９のプロテアーゼなどであるが、これらに限定されない、腫瘍への免疫エフェクター細胞の浸透を増強するタンパク質（または機能性ＲＮＡ）をコードするエフェクター遺伝子をさらに含む。
【００９３】
いくつかの実施形態によれば、ＴＭＥ応答性発現ベクターは、腫瘍内のＰＤ１および／またはＣＴＬＡ４などの免疫阻害剤を抑制するｍｉＲＮＡをコードする１つまたは複数のエフェクター遺伝子をさらに含むが、これらに限定されない。
【００９４】
いくつかの実施形態によれば、ＴＭＥ応答性発現ベクターは腫瘍内に免疫細胞保持をもたらすサイトカインをコードする１つ以上のエフェクター遺伝子（例えば、ＣＸＣＬ９／１０および／またはＣＲＣＲ３リガンド（これらに限定されない））をさらに含み、それによってオートクリンループを生成する。
【００９５】
いくつかの実施形態によれば、ベクターは哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）における発現を可能にする任意の適切なベクターであり得る。いくつかの実施形態によれば、ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターから選択され得る。各可能性は、別個の実施形態である。
【００９６】
いくつかの実施形態によれば、ＴＭＥベクターライブラリーが作製され得、このライブラリーはＴＭＥベクターを含み、各々は、固有のＴＭＥ応答性発現エレメントプロフィールを有する。
【００９７】
いくつかの実施形態によれば、干渉性腫瘍環境（ＴＭＥ）応答性発現ベクターを含む免疫エフェクター細胞または細胞集団が提供される。いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞または細胞集団は、ＮＫ細胞またはＴ細胞である。
【００９８】
いくつかの実施形態によれば、それを必要とする患者において癌を治療するための方法であって、有効量の免疫エフェクター細胞を投与することを含む方法であって、前記免疫エフェクター細胞は、前記非硬化腫瘍環境（ＴＭＥ）応答性発現ベクターを含む、方法が提供される。
【００９９】
いくつかの実施形態によれば、この方法はテトラサイクリンおよび／またはドキシサイクリンなどの外部誘導物質を患者に投与することをさらに含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態によれば、外部誘導体は固有の固有がん環境（ＴＭＥ）反応ベクトルを有する免疫効果細胞を注射する前に、同時または後に提供される可能性がある。
【０１００】
いくつかの実施形態によれば、この方法は、ＣＡＲ発現レベルを評価する工程、および／または有害作用について患者をチェックする工程を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＣＡＲ発現レベルは、外部誘導物質を投与する前に評価されてもよい。いくつかの実施形態によれば、ＣＡＲ発現レベルは、外部誘導物質の投与中および／または投与後に評価することができる。非限定的な例として、最初に外部誘導物質のボーラスを投与し、続いてＣＡＲ発現を評価することができる。次に、検出されたＣＡＲ発現レベルおよび治療に対する患者の反応に基づいて、２回目のボーラス投与を行うことができる。いくつかの実施形態によれば、外部誘導物質は、繰り返し、例えば、１０時間毎、毎日、２日毎、または任意の他の適切な時間隔で提供され得る。いくつかの実施形態によれば、外部誘導物質の投与は、副作用が検出された場合に終了されてもよい。いくつかの実施形態によれば、投与される外部誘導物質の量は、評価されたＣＡＲ発現レベルに基づいて、および／または治療に対する患者の応答に基づいて、増加／減少されてもよい。
【０１０１】
いくつかの実施形態によれば、ＣＡＲ発現のための最適な合成プロモーターの決定のために患者をスクリーニングするための方法が提供される。この方法は、患者の腫瘍の生検を得ること、生検における１つ以上のＴＭＥ因子の発現プロフィールを決定すること、および／または生検における１つ以上のＴＭＥ因子の発現プロフィールに一致するＴＭＥ依存性プロモーター応答エレメントを有するＴＭＥ応答性発現ベクターを選択および／または操作することを含む。いくつかの実施形態によれば、ＴＭＥは、腫瘍細胞および／または非腫瘍ＴＭＥ細胞によって発現され得る。いくつかの実施形態によれば、非腫瘍ＴＭＥ細胞は、免疫エフェクター細胞であってもよい。
【０１０２】
いくつかの実施形態によれば、患者の腫瘍から、および任意選択で健康な組織から得られた組織サンプルはインビトロおよびＴＭＥ応答性ベクターのライブラリーで増殖させることができ、治療に最も有効かつ選択的であることを証明するベクター、すなわち、腫瘍のものと一致するＴＭＥ応答プロフィールを有するベクターをスクリーニングするために使用することができる。これは、腫瘍組織において最大の発現を得る一方で、腫瘍に独特であり、その結果、健康な組織において発現が全く得られないか、または最小の発現が得られる。
【０１０３】
いくつかの実施形態によれば、この方法は、選択されたＴＭＥ応答性発現ベクターを免疫エフェクター細胞または細胞集団に導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞または細胞集団は、ＮＫ細胞またはＴ細胞である。いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞または細胞集団は、患者に対して自己由来である。いくつかの実施形態によれば、免疫エフェクター細胞または細胞集団は、治療前に患者から単離される。
【０１０４】
いくつかの実施形態によれば、この方法は、免疫エフェクター細胞または細胞集団を患者に投与する工程をさらに包含する。
【０１０５】
ここで、いくつかの実施形態による、ＣＡＲ（またはレポーター遺伝子）の発現を直接制御する合成プロモーターを含む発現構築物１００を概略的に示す図１を参照する。発現構築物１００は、宿主免疫エフェクター細胞に導入されると、発現構築物１００のＴＭＥ応答要素に一致するＴＭＥ因子が普及している組織環境においてＣＡＲ（またはＧＦＰマーカー）の転写を直接誘導するように構成される。発現構築物１００は、以下の要素を含む。
【０１０６】
Ｓｙｎｔｈ．Ｐｒｏ．（合成プロモーター）：（ｉ）適切な近位エレメントで発現を開始することができるＴＡＴＡＡボックスを有する最小転写プロモーターと、（ｉｉ）プロモーター応答エレメントのユニークな組み合わせと、から構成される合成プロモーターである。ここでは、プロモーター応答エレメントは、ＩＦＮ−γ応答エレメント（「Ｇ」と略す）、ＮＦ−ｋＢ応答エレメント（「Ｋ」と略す）、低酸素応答エレメント（「Ｈ」と略す）、および／または、ＩＬ−６応答エレメント（「Ｊ」と略す）である。
【０１０７】
ＴＭＥ：ＴＭＥは、プロモーター応答エレメント配列が位置し、ＴＭＥに存在する誘導因子が結合できるプロモーターの領域をマーキングし、それによって合成プロモーター（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、低酸素およびＩＬ−６）を活性化する。
【０１０８】
Ｐｕｒｏ：Ｐｕｒｏは、合成プロモーターによっても転写される耐性遺伝子である。
耐性遺伝子はここに示されるように、ピューロマイシン耐性遺伝子であるかもしれない。しかし、他の耐性遺伝子もまた適用可能であり、本開示の範囲内である。耐性遺伝子は、インビトロでポジティブと選択された細胞を、ベクターと共に導入することを可能とするために導入される。
【０１０９】
ＩＲＥＳ：  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅは同じｍＲＮＡから耐性遺伝子と標的遺伝子（例えば、ＣＡＲまたはＧＦＰマーカー）の両方の翻訳を可能にする。
【０１１０】
ここで、いくつかの実施形態による、ＣＡＲ（またはレポーター遺伝子）の発現を間接的に制御する合成プロモーターを含む発現構築物２００を概略的に示す図２を参照する。発現構築物２００は、宿主免疫エフェクター細胞に導入されると、発現構築物２００のＴＭＥ応答要素に一致するＴＭＥ因子が普及している組織環境において、トランスアクチベーターの転写を誘導するように構成される。次いで、トランスアクチベーターは、外因的に投与されたインデューサー（ここではドキシサイクリン）が提供される場合、ＣＡＲの発現を誘導する。このようなＣＡＲ発現の間接的誘導はＯＮ−ＯＦＦ安全メカニズムを提供し、非特異的発現が検出された場合、または有害作用が観察された場合にＣＡＲ発現の停止を可能にする。
【０１１１】
発現構築物２００は、以下の要素を含む。
【０１１２】
Ｓｙｎｔｈ．Ｐｒｏ．（合成プロモーター）：（ｉ）適切な近位エレメントで発現を開始することができるＴＡＴＡＡボックスを有する最小転写プロモーターと、（ｉｉ）プロモーター応答エレメントのユニークな組み合わせとから構成される合成プロモーターである。ここでは、プロモーター応答エレメントは、ＩＦＮ−γ応答エレメント（「Ｇ」と略す）、ＮＦ−ｋＢ応答エレメント（「Ｋ」と略す）、低酸素応答エレメント（「Ｈ」と略す）、および／またはＩＬ−６応答エレメント（「Ｊ」と略す）である。
【０１１３】
ＴＭＥ：ＴＭＥは、プロモーター応答エレメント配列が位置し、ＴＭＥに存在する誘導因子が結合できるプロモーターの領域をマーキングする。それによって合成プロモーター（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、低酸素およびＩＬ−６）を活性化する。
【０１１４】
Ｐｕｒｏ：合成プロモーターによっても転写される耐性遺伝子である。耐性遺伝子はここに示されるように、ピューロマイシン耐性遺伝子であっても良い。しかし、他の耐性遺伝子もまた適用可能であり、本開示の範囲内である。耐性遺伝子は、インビトロでポジティブと選択された細胞を、ベクターと共に導入することを可能とするために導入される。
【０１１５】
ｒｔＴＡ３：転写が合成プロモーターによって媒介されるトランス活性化遺伝子である。
【０１１６】
ＩＲＥＳ：ＩＲＥＳエレメントは、同じ合成プロモーターから耐性遺伝子とトランスアクチベーター遺伝子（ここではｒｔＴＡ３）の両方の転写を可能にする。
【０１１７】
Ｄｏｘ：テトラサイクリンの強力な類似体であるドキシサイクリンテトラサイクリンであり、トランス活性化因子に対する共活性化因子として働く。
【０１１８】
ＴＲＥ３Ｇ：Ｔｅｔ応答エレメントプロモーターで、ｒｔＴＡ３と外因性ドキシサイクリンの併用により活性化され、ＣＡＲ（またはレポーター遺伝子または他の標的遺伝子）の転写を媒介する。これは、一方ではＴｅｔ応答要素プロモーター下のｒｔＴＡ３トランスアクチベーターおよびレポーター遺伝子／ＣＡＲの前に上記の合成プロモーターを構築することによって、さらなる安全層と共に増幅されたＴＭＥ特異的ＣＡＲ発現を可能にする、増強安全性ベクターの基礎である。ｒｔＴＡ−ｔｅｔ応答を含むことにより、ＶＰ１６転写アクチベーターをリクルートする際の転写の増幅が得られる。さらに、テトラサイクリン／ドキシサイクリン誘導性要素はテトラサイクリン（またはＤｏｘ）の存在下でのみ活性であるため、別の安全層を付加し、したがって、系を容易にオフにすることを可能にする。
【０１１９】
ｍｉＲＥ：マイクロＲＮＡエレメント（ｍｉＲＥ）はＴＲＥ３ｇプロモーター転写ＯＲＦの転写終結と、目的とする他の遺伝子のサイレンシングのためのｍｉＲの同時発現（例えば、内因性Ｔ細胞レセプターまたはＰＤ−１のような免疫チェックポイントレセプターのサイレンシング）の両方を提供している。
【０１２０】
いくつかの実施形態によれば、最適な腫瘍微小環境（ＴＭＥ）発現パターンを有するためのプロモーター−ライブラリー、すなわち、ＴＭＥにおいて強い発現を誘導するが、非ＴＭＥにおいては発現があったとしても無いに等しいプロモーターを、スクリーニングするための方法が提供される。
【０１２１】
いくつかの実施形態によれば、プロモーターライブラリーは、構築され、場合によりインビトロで機能的に試験される候補合成プロモーターを有する発現構築物を含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態によれば、ライブラリー中のプロモーターは、ＴＭＥ内で活性化される転写因子の予想される結合部位を有する核酸配列を有する。
【０１２３】
いくつかの実施形態によれば、プロモーターは２つ以上の候補核酸配列を含み、候補核酸配列は、ヌクレオチド配列（本明細書では「スペーサー」とも呼ばれる）によって離間されている。
【０１２４】
いくつかの実施形態によれば、プロモーターは、蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子が後に続く最小プロモーター配列をさらに含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態によれば、構築物は、２つの蛍光レポーター：潜在的なオフフレームＡＴＧ開始コドンを有する第１のレポーター、および、その独立した翻訳を可能にする内部リボソームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）の後に位置する第２のレポーター、を含む。いくつかの実施形態によれば、第１の蛍光レポーターは翻訳が不十分であり、高度に転写された場合にのみシグナルを生じ、一方、第２の蛍光レポーターは、低レベルで転写された場合にも、独立して翻訳される。
【０１２６】
いくつかの実施形態によれば、候補プロモーターのライブラリーは、定常「コア」部分を有するプロモーター、および目的の転写因子の結合部位に基づく可変ヌクレオチドを含む。スペーサー配列、結合部位のタンデム反復、および複数の因子の種々の結合部位の組成もまた、ライブラリーの生成を可能にする。いくつかの実施形態によれば、複雑さは、目的の転写因子の複数の結合部位の分析に基づいて、戦略的位置に可変ヌクレオチドを集中させることによって制限され得る。いくつかの実施形態によれば、複雑性は、可変ヌクレオチドおよび／または結合部位の反復および／またはそれらの間のスペーサーの付加によって増加され得る。
【０１２７】
非限定的な例として、特定の可変ヌクレオチドを有するコア部位はＳＴＡＴ１結合のためのＡＹＴＴＣＣＳＧＧＡＡＲＴ、およびＮＦ−ｋＢのためのＧＧＲＲＲＴＴＹＹＣ（ここで、Ａ＝アデニン、Ｔ＝チミジン、Ｃ＝シチジン、Ｇ＝グアニン、Ｙ＝Ｃ／Ｔ、Ｓ＝Ｃ／Ｇ、Ｒ＝Ａ／Ｇである）を含むことができるが、これらに限定されない。適切なスペーサーの非限定的な例としては、ＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴ、ｔｃｔａｇａ、ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣが挙げられる。
【０１２８】
いくつかの実施形態によれば、プロモーターは発現ベクター（例えば、上記の第１および第２の蛍光レポーター、ならびにプラスミド増殖およびレンチウイルス粒子の生成に必要とされるさらなる配列を有するｐＨａｇｅ２レンチウイルスベクター（これらに限定されない））にクローニングされる。
【０１２９】
いくつかの実施形態によれば、合成プロモーター配列は、任意のクローニング技術を使用して発現ベクターにクローニングされ得る。適切なクローニング技術の非限定的な例としては、制限酵素を使用する「古典的」クローニング、および融合クローニングが挙げられる。
【０１３０】
必要に応じて、非プルーフリーダーポリメラーゼを使用するプロモーターライブラリーのＰＣＲ増幅を利用して、ランダム突然変異を導入することができ、これは、ライブラリーの可変性および複雑性をさらに増大し得る。
【０１３１】
いくつかの実施形態によれば、レンチウイルスは２９３Ｔ−ＨＥＫセルにおける、パッケージングプラスミドと共に、表現ベクトルの一時的な共変性などの一般的な技法によって生成される可能性がある。次いで、目的の細胞株（例えば、２９３細胞）を、ウイルス（好ましくは、ＭＯＩ＜０．３）で形質導入して、細胞当たり単一コピーを得てもよく、その後、必要に応じて増殖させてもよい。
【０１３２】
いくつかの実施形態によれば、この方法は最適なプロモーター、すなわち、ＴＭＥにおいて強い発現を誘導するが、非ＴＭＥにおいて発現があったとしてもほとんどないプロモーターを有する細胞を同定することをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、細胞は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、低酸素、ＩＬ−６、およびＴＧＦ−βなどの関連するＴＭＥ因子（これらに限定されない）の存在下／非存在下で、刺激の有無にかかわらず、形質導入された細胞を増殖させることによって同定され得る。次いで、細胞を、レポーター遺伝子の発現に従って（例えば、ＦＡＣＳを使用して）選別する。いくつかの実施形態によれば、第１および第２の蛍光レポーターの両方の二重色を獲得する非常に高い発現を有する細胞は、第２のレポーターのみの中程度の高い発現を有する細胞から分離され得る。
【０１３３】
他の技術が使用されてもよいことが理解される。例えば、第１および第２のレポーターは抗生物質耐性遺伝子であっても良く、この場合、選別は抗生物質耐性細胞を同定するようになされ得る。
【０１３４】
いくつかの実施形態によれば、選別された細胞はサイトカインを刺激することなくさらに増殖され、次いで、構成的活性プロモーターを回避するために、第１のレポーターの陰性／低発現について選別される。次いで、刺激の非存在下でネガティブ／ローの第１のレポーター発現を示す細胞をさらに増殖させる。
【０１３５】
いくつかの実施形態によれば、本方法は、上述の陽性および陰性選択を本質的に繰り返すことによって、追加の刺激分類工程をさらに含んでもよい。
【０１３６】
いくつかの実施形態によれば、一旦所望の表現型が得られると、本方法は従来の分子生物学を使用して、細胞からゲノムＤＮＡを抽出すること（任意に、細胞のさらなる増殖の後）をさらに含み得る。ベクターのプロモーターはＰＣＲを使用して、例えば、組み込まれたライブラリーの上流および下流の配列に特異的なプライマーを使用して、抽出される。いくつかの実施形態によれば、プライマーは、商業的サービスを使用する直接配列決定を可能にする追加の伸長部分を含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態によれば、この方法は濃縮されたプロモーターの配列をライブラリーの配列と比較すること、および場合により、新規の最適なプロモーター配列を同定するための既知のプロモーターとも比較することをさらに含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態によれば、この方法は、スクリーニングされた細胞株および／または他の細胞株および／または目的の一次免疫細胞における同定された最適なプロモーターの活性を確認することをさらに含む。
【０１３９】
図３は、最適な腫瘍微小環境（ＴＭＥ）ＣＡＲ発現パターンを提供するためのプロモーターライブラリーをスクリーニングするための方法の例示的なフローチャート３００である。
【０１４０】
本方法の工程３１０において、候補プロモーターを含むライブラリー（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）ライブラリー）が、本質的に本明細書に記載されるように構築される。
【０１４１】
工程３２０において、細胞株（例えば、２９３細胞）を、ライブラリーのレンチウイルスに感染させる。一旦、プロモーター構築物を発現する細胞株が生成されると、工程３３０において、細胞は刺激（ｒｔＴＡ３およびドキシサイクリン）の存在または非存在下、および刺激サイトカインの存在または非存在下で培養され、次いで、ＴＭＥ依存性レポーターのみの中程度の高発現を有する細胞から、第１および第２の蛍光レポーターの両方の二重色を獲得する非常に高い発現を有する細胞を分離することによって、それらのレポーター遺伝子発現プロフィールに従って（例えば、ＦＡＣＳによって）選別される。本明細書中に説明されるように、この工程は、プロモーターの感度および／または特異性をさらに増強するために繰り返され得る。
【０１４２】
工程３４０において、所望の発現プロフィール（刺激およびサイトカインの存在下での両方のプロモーターの高発現、第２のプロフィールの発現はほとんどまたは全くない）を有する細胞が同定され、サイトカインの非存在下でのＴＭＥ依存性レポーターが同定され、そしてそれらのプロモーターが配列決定される（工程３５０）。
【０１４３】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をより完全に例示するために提示される。しかしながら、それらは、本発明の広い範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示された原理の多くの変形および修正を容易に考案することができる。
【０１４４】
（実施例）
（実施例１−応答エレメントの定義）
以下の応答エレメント配列を含むプロモーターを、以下の表１に列挙する。応答エレメントは、適切な近位エレメントで発現を開始できるＴＡＴＡＡボックスを有する最小転写プロモーターの直前に構築された。
【０１４５】
表１：プロモーター応答エレメント配列
【０１４６】
【表１】
2021514187.tif 000004
2021514187.tif 000005
2021514187.tif 000006
2021514187.tif 000007
2021514187.tif 000008
2021514187.tif 000009
【０１４７】
表１に列挙される応答エレメントに結合する因子または因子の組み合わせ（例えば、ＴＮＦ−α、ＮＦ−κＢおよびＩＬ−６）は多くのＴＭＥに特徴的であり、これらの因子の特定の組み合わせは、特に、ＴＭＥシグネチャー／プロファイルを表し得る。
【０１４８】
しかしながら、前述の要因が全てのＴＭＥに存在するわけではないことに留意されたい。同様に、特定のＴＭＥにおいても、追加の要因を見出すことができる。したがって、他の応答要素が含まれてもよく、または前述の応答要素を置換してもよく、そのような追加および／または置換は、本開示の範囲内である。
【０１４９】
さらに、本明細書で説明するように、より少ないまたはより多い応答要素を含むことの間でトレードオフを行うことができることを理解されたい。例えば、より少ないタイプの応答エレメントを含むことは、同じＴＭＥ応答性発現構築物を利用して、広範囲の癌に対する発現の標的化を可能にし得る。別の例として、応答エレメントのより包括的／網羅的な組み合わせを含むことは、正常／健康な組織とは対照的に、腫瘍組織に対する発現構築物の特異性を増加させ得る。
（実施例２−プロモーターの漏れを制御）
本発明の主な局面は、ＴＭＥ内の免疫エフェクター遺伝子の内因性誘導を得ることである。本明細書に開示される合成プロモーターは健康な組織における発現を実質的に制限しながら、ＴＭＥ内での発現を誘導するように構成される。そこで、合成プロモーターの漏洩性を評価した。
【０１５０】
２つのタイプの漏れが想定された。
【０１５１】
第１のタイプの漏出は、図１の発現構築物１００の場合のようにＣＡＲ／ＧＦＰレポーターであろうと、図２の発現構築物２００の場合のようにトランスアクチベーターであろうと、ＴＭＥ因子の不在下で、ＴＭＥ刺激プロモーターからの転写として現れる。このタイプの漏出性は、外因的に提供されたＴＭＥ関連刺激なしで、内因的に試験された細胞が因子を発現するため、またはプロモーター漏出性自体による、最小プロモーターの誘導に起因する可能性がある。
【０１５２】
図２の発現構築物２００のようなＴｅｔ応答要素プロモーターを含む発現構築物に関連する第２のタイプの漏出レベルは、ドキシサイクリン／テトラサイクリンの不在下でのＣＡＲ／ＧＦＰレポーターの発現を指す。このタイプの漏出は、（ｉ）使用される培地または血清中の残留ｔｅｔ／ｄｏｘの存在、したがって、インビトロ設定の人為結果であること、または（ｉｉ）プロモーター漏出それ自体に起因し得る。
【０１５３】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、図２に開示される発現ベクターおよび以下の応答エレメントで形質導入した。
【０１５４】
１．Ｇ２（２ｘＩＦＮ−γ）、
２．Ｇ１Ｋ０．６（１ＸＩＦＮ−γとＮＦ−κＢ配列要素の６０％の組合せ）、または、
３．Ｇ３Ｋ３（３ｘＩＦＮ−γと３ｘＮＦ−κＢ（の組合せ）。
【０１５５】
細胞はベクター形質導入細胞のみの生存を保証するために、ピューロマイシンによる選択を受けた。
【０１５６】
ＧＦＰ集約度およびＧＦＰポジティブセルの割合をテストした。
【０１５７】
図４Ａのヒストグラムならびに図４Ｂの代表的なＦＡＣＳプロットから分かるように、３つの場合すべてにおいて、細胞培地へのドキシサイクリンの添加はそれ自体ではＧＦＰ発現を誘導しなかった（すなわち、ＧＦＰ強度またはＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージの増加は観察されなかった）。しかしながら、ドキシサイクリンとＴＮＦ−αおよび／またはＩＦＮ−γの組み合わせの存在において、ＧＦＰ強度およびＧＦＰ−正細胞の割合は著しく増加した。
【０１５８】
これらの結果は、本明細書中に開示される発現構築物がＴＭＥ特異的発現を可能にすることを明らかに実証する。
（実施例３−応答エレメントのシナジー）
ＴＭＥ応答性エレメントの組み合わせを含むことは、相乗的発現を提供すると仮定された。
【０１５９】
単一のＩＦＮ−γエレメントと比較して多数のＩＦＮ−γエレメント（２、４、および６）を含む効果は、ＧＦＰ陽性細胞の頻度およびＧＦＰ強度の両方において、２つのＩＦＮ−γエレメントの後にすでに安定状態に達した（データは示さず）。
【０１６０】
しかしながら、図５から分かるように、３つのＩＦＮ−γエレメント応答エレメントおよび３つのＮＦ−κＢ応答エレメントを含むプロモーターが、ＩＦＮ−γ応答エレメントのみを含むプロモーターよりも有意に高い割合のＧＦＰ陽性細胞を提供するという点で、ＮＦ−κＢ応答エレメントをＩＦＮ−γエレメントに添加した場合、相乗作用が有利に観察された。
（実施例４−ＴＭＥプロファイリング）
炎症性サイトカインと単一サイトカインによる刺激の組み合わせによる刺激時のＧＦＰ発現の強度と頻度も試験した。要するに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、以下の合成プロモーターの１つを含むベクターで形質導入した。
【０１６１】
１．Ｇ１Ｋ０．６：１ｘＩＦＮ−γとＮＦ−κＢの６０％、
２．Ｇ３Ｋ３：３ｘＩＦＮ−γと３ｘＮＦ−κＢとの併用。
【０１６２】
今度は、細胞を事前のピューロマイシン選択なしで採取したので、その結果は、形質導入細胞および非形質導入細胞の全細胞集団を表す。
【０１６３】
図６は、代表的なＦＡＣＳプロット（上のパネル）、ゲーティングＧＦＰ陽性細胞（ＧＦＰ＋）、ならびに各試験条件についてのＧＦＰ強度（中央値）の定量を示すヒストグラム（下のパネル）を示す。
【０１６４】
特に、Ｇ３Ｋ３応答エレメントを有する発現構築物を有する形質導入細胞は、サイトカイン添加当たりの累積発現を示した。Ｇ１Ｋ０．６応答エレメントを有する発現構築物を形質導入した細胞において、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの各々を別々に加えると、低レベルの発現のみが引き起こされたが、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を用いた併用処理は実質的に高い発現レベルを誘導した。
【０１６５】
これらの結果は、制御されたレベルの表現が固有の表現構成物を用いて達成できることを明確に示している。好ましくは、利用される構築物が必要性に基づいて発現レベルを最適化するように、処理／標的化された細胞のＴＭＥプロフィールに慣れているべきである。
（実施例５−３因子応答エレメント）
２つの応答要素ＩＦＮ−γおよびＮＦ−κＢ（ＧおよびＫ）の組合せを用いた研究に続いて、ＩＬ−６および低酸素（ＪおよびＨ）という追加因子の結合部位を含む応答要素も、前述のように本質的に評価した。
【０１６６】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、以下の合成プロモーターの１つを含むベクターで形質導入した。
【０１６７】
１．Ｇ１Ｋ０．６Ｊ１：１ＸＩＦＮ−γ、ＮＦ−κＢの６０％、１ｘＩＬ−６応答エレメント配列、
２．Ｇ１Ｋ０．６Ｈ１：１ＸＩＦＮ−γ、ＮＦ−κＢの６０％、１ｘＨｙｐｏｘｉａ応答エレメント配列。
【０１６８】
ＧＦＰ強度および発現頻度を、示された因子による刺激の前後にＦＡＣＳによって評価した。細胞を選択せずに回収した。
【０１６９】
図７は、各プロモーターおよび各条件におけるＧＦＰ陽性細胞（ＧＦＰ＋）のＦＡＣＳプロット（上部パネル）および各条件におけるＧＦＰ陽性細胞の発現強度（中央値として）の定量化を示すヒストグラム（下部パネル）を示す。
【０１７０】
図７から分かるように、Ｇ１Ｋ０．６要素の下流に第３の応答要素を挿入しても、その相乗効果にはそれ以上寄与しなかった。これは、必ずしも一般的な観察ではなく、むしろ試験された特定の細胞株の代表であり得ることに留意されたい。
（実施例６−最適なプロモーター配列のスクリーニング）
最適なＣＡＲ発現プロフィールを提供するプロモーターを同定するために、候補プロモーターのレンチウイルスライブラリーを構築した。ライブラリーは、定常「コア」部分を有するプロモーター、および目的の転写因子の結合部位に基づく可変ヌクレオチドを有する構築物を含む。スペーサー配列、結合部位のタンデム反復、および複数の因子の種々の結合部位の組成も含まれる。プロモーターの可変性はプロモーターの戦略的および／またはランダムな位置でヌクレオチドを変化させ、付加し、および／または欠失させることによって生じた。複合性は、結合部位反復および／またはそれらの間のスペーサーの数を変化させることによってさらに増加した。合計６５，５３６のプロモーター配列をスクリーニングに含めた。
【０１７１】
ライブラリーの構築物は、高レベルの転写物、すなわち高レベルの転写因子、ここではＴＭＥ転写因子の存在下でのみレポーター遺伝子が翻訳されることを確実にする潜在的オフフレームＡＴＧ開始コドンを有する蛍光レポーター（ＧＦＰ）を含む。この構築物はまた、内部リボソームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）の後に位置する第２のレポーター（ＤｓＲｅｄ）を含み、これもまた低レベルの転写物で、その独立した翻訳を可能にする。
【０１７２】
その後、構築物をレンチウイルスベクターにクローニングし、ウイルスは包装プラスミドと共にレンチウイルスベクトルの一時的なコトランスフェクションにより、２９３Ｔ−ＨＥＫセルに生成した。
【０１７３】
次に２９３個の細胞をレンチウイルスに感染（形質導入）させ、ライブラリーのプロモーター構築物をゲノムに組み込んだ細胞株を得た。
【０１７４】
次いで、形質導入細胞を２５０Ｕ／ｍＬ  ＴＮＦ、ＩＦＮまたはＴＮＦおよびＩＦＮの存在下または非存在下で４８時間増殖させ、続いてＦＡＣＳ選別に供した。最初に、ＴＮＦ、ＩＦＮまたはＴＮＦおよびＩＦＮの存在下で高いＧＦＰ発現または高いＧＦＰおよびＤｓＲｅｄ発現を示す細胞をゲートした（「陽性」選別）。図８の上部パネルから分かるように、サイトカインの非存在下では細胞の０．０９％のみが高いＧＦＰ発現を示したが、ＴＮＦ、ＩＦＮまたはＴＮＦおよびＩＦＮの存在下では細胞の０．２％が高いＧＦＰ発現を示した。
【０１７５】
次いで、ゲートされた細胞を、サイトカインの非存在下で増殖させた後、「ネガティブ」ソーティングのラウンドに供した（図８の第２のパネル）。この選別工程の間、サイトカインの非存在下でＧＦＰ発現を全くまたはほとんど有さない細胞が獲得されたが、構成的発現を引き起こすプロモーターを有する細胞は廃棄された（または別々に選別された）。
【０１７６】
最初の集団の１．９４％である最終集団が獲得されるまで、ソーティングの陽性および陰性ラウンドを２回繰り返し（図８の第３および第４パネル）、この集団は高ＧＦＰ発現を有すること、すなわち、ＴＮＦおよび／またはＩＦＮの存在／非存在に対して高度に感受性の発現様式を有することによって特徴付けられた。
【０１７７】
獲得した細胞を増殖させ、それらのプロモーターを、プロモーター特異的プライマーを用いて配列決定した。スクリーニングは、スクリーニングに含まれる６５，５３６個の配列のうち１９個の配列を同定した。１８個の配列は本質的に類似していたが、１６個のヌクレオチド（太字および下線）に加えて、いくつかの場合において、いくつかのさらなるランダムな変化が異なっていた。他の１８個と多少異なるさらなる配列（配列番号４１）も得られた。
【０１７８】
以下の表２は、スクリーニングから検索された最適なＣＡＲ発現プロフィールを提供するプロモーターの配列を提供する。
【０１７９】
表２：プロモーター配列
【０１８０】
【表２】
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【０１８１】
（実施例７−新しいＰＲＥベースのライブラリーを設計し、基本配列またはライブラリー最適化配列を他のＰＲＥと組み合わせて同じ合成プロモーターにする）
特定のＰＲＥのライブラリーを生成するために、単独で、または他のＰＲＥと組み合わせて、低酸素ＰＲＥエレメントを例として使用しながら、本明細書中で詳細に記載される以下の一般的なアプローチを採用した。
【０１８２】
異なる遺伝子の低酸素依存性プロモーターに利用されるＰＲＥ配列を収集した。
【０１８３】
塩基性、非自然発生低酸素ＰＲＥエレメントを、異なる遺伝子における低酸素ＰＲＥとして機能することが示唆される自然発生配列からの部分を取ることにより、配列に基づいて生成した。当該部分は以下を含む。
【０１８４】
例えば低酸素依存性ＬＤＨＡ／ＥＰＯ／ＶＥＧＦ遺伝子に見られるＨＢＳ配列（ＡＣＧＴＧ）；
リンカー１（ＧＣＴＧＧＡＧＴ）。これは８ヌクレオチドリンカーであり、天然の標的遺伝子（ＬＤＨＡ／ＥＰＯ／ＶＥＧＦ遺伝子の一部ではない）のプロモーターにはみられない；
例えば低酸素依存性ＥＰＯ遺伝子に見られるＨＡＳ（ＣＡＣＡＧ）；および
リンカー２（ＴＣＣＴＣＴＴ）。これは７ヌクレオチドリンカーであり、天然の標的遺伝子（ＬＤＨＡ／ＥＰＯ／ＶＥＧＦ遺伝子の一部ではない）のプロモーターにはみられない。
【０１８５】
これらの配列は１つの配列に直線的に組み合わされ、次いで、配列番号４２に示される配列ＡＣＧＴＧＧＣＴＧＧＡＧＴＣＡＣＡＧＴＣＣＴＣＴＴＡＣＧＴＧＧＣＴＧＧＡＧＴＣＡＣＡＧＴＣＣＴＣＴＴを得るために、タンデムで二重化された。
【０１８６】
これは「基本的低酸素症ＰＲＥ」を表す。基本的な低酸素ＰＲＥは単に例示的なものであり、他の組み合わせ、リンカー、ＰＲＥの数、ならびにそれらの配向もまた想定され得ることが理解される。
【０１８７】
次いで、「塩基性低酸素配列」を（同じまたは異なるＴＭＥの）追加のＰＲＥ配列に加えて、改変／代替合成プロモーターを生成することができる。塩基性ＴＭＥ因子（ここでは低酸素）ＰＲＥに基づく任意の改変／代替合成プロモーターの非限定的な例には、以下が含まれる。
【０１８８】
（ｉ）単一または複合ＰＲＥ。非限定的な例として、塩基性低酸素ＰＲＥをＧ１Ｋ１配列（配列番号９に記載）と組み合わせ、それによって配列番号４６に記載の配列（Ｈ１Ｇ１Ｋ１とも呼ばれる）ＡＣＧＴＧＧＣＴＧＧＡＧＴＣＡＣＡＧＴＣＣＴＣＴＴＡＣＧＴＧＧＣＴＧＧＡＧＴＣＡＣＡＧＴＣＣＴＣＴＴＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＣＴＴＣＣＣＧＧＡＡＧＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＣＴＴＣＣＣＧＧＡＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＡＡＴＴＴＴＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＧＧＴＴＣＴＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣを生成することができる。
【０１８９】
（ｉｉ）代替的な配置：基本的なＴＭＥ因子ＰＲＥは、合成プロモーターの５プライムおよび／または３プライムおよび／または中間に添加され得る。
【０１９０】
（ｉｉ）代替配向：基本ＴＭＥ係数ＰＲＥは、上記（ｉ）および（ｉｉ）のように反転させ、加えることができる。非限定的な例として、基本的な低酸素ＰＲＥは、反転配置でＧ１Ｋ１配列（配列番号９に示される）と組み合わせることができ、それによって、配列番号４７に示される配列（Ｈ１ｆｌｉｐＧ１Ｋ１とも呼ばれる）ＡＡＧＡＧＧＡＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＧＴＡＡＧＡＧＧＡＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＧＴＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＣＴＴＣＣＣＧＧＡＡＧＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＣＴＴＣＣＣＧＧＡＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＡＡＴＴＴＴＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＧＧＴＴＣＴＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣを生成する。
【０１９１】
（ｉｖ）代替的な配列
塩基性ＴＭＥ因子ＰＲＥ配列のヌクレオチドを置換することができる。例えば、配列番号４３に記載されるＲＣＧＴＧＳＣＴＧＧＡＧＴＭＡＣＡＧＴＣＣＴＣＴＴＲＣＧＴＧＳＣＴＧＧＡＧＴＭＡＣＡＧＴＣＣＴＣＴＴ。
【０１９２】
ライブラリーの生成に続いて、ライブラリーは本質的に実施例６に記載されるように、最良の配列（すなわち、より少ない漏出性および低酸素刺激に対する最も高い応答を誘導する配列）についてスクリーニングする。
【０１９３】
「基本応答要素」を設計し、次いで「基本応答要素」に基づいて修正／代替ＰＲＥのライブラリーを生成するための説明されたアプローチは、本明細書で説明されるＴＭＥ因子ＰＲＥのすべてに適合され得ることが理解される。
【０１９４】
本発明の特定の実施形態を図示し、説明したが、本発明が本明細書に記載の実施形態に限定されないことは明らかであろう。以下の特許請求の範囲によって記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの修正、変更、変形、置換および等価物が当業者には明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図６−１】
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【図７】
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【図７−１】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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