(57)【要約】  本発明は、ＣＴＬＡ−４を標的とする抗体、その調製方法および使用を開示する。具体的に、本発明は、ＣＴＬＡ−４を標的とする新しい完全ヒトモノクローナル抗体を開示する。本発明は、前記モノクローナル抗体の調製方法をさらに開示する。本発明のモノクローナル抗体は、ＣＴＬＡ−４抗原に高い特異性で結合することができ、高い親和性を有し、有意な抗腫瘍などの活性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の重鎖可変領域であって、
前記重鎖可変領域は、
配列番号８ｎ＋２に示されるＣＤＲ１、
配列番号８ｎ＋３に示されるＣＤＲ２、および
配列番号８ｎ＋４に示されるＣＤＲ３の３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
各ｎは独立して０、１、２、３または４であり、
前記アミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸が任意に付加、欠失、修飾および／または置換され、ＣＴＬＡ−４の結合親和性を保持できる誘導配列をさらに含む、前記抗体の重鎖可変領域。
【請求項２】
抗体の重鎖であって、
前記重鎖は、請求項１に記載の重鎖可変領域を有することを特徴とする、前記抗体の重鎖。
【請求項３】
抗体の軽鎖可変領域であって、
前記軽鎖可変領域は、
配列番号８ｎ＋６に示されるＣＤＲ１’、
配列番号８ｎ＋７に示されるＣＤＲ２’、および
配列番号８ｎ＋８に示されるＣＤＲ３’の３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
各ｎは独立して０、１、２、３または４であり、
前記アミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸が任意に付加、欠失、修飾および／または置換され、ＣＴＬＡ−４の結合親和性を保持できる誘導配列をさらに含む、前記抗体の軽鎖可変領域。
【請求項４】
抗体の軽鎖であって、
前記軽鎖は、請求項３に記載の軽鎖可変領域を含む、前記抗体の軽鎖。
【請求項５】
抗体であって、
前記抗体は、
（１）請求項１に記載の重鎖可変領域、および／または
（２）請求項３に記載の軽鎖可変領域、を含み、
または、前記抗体は、請求項２に記載の重鎖、および／または請求項４に記載の軽鎖を含み、
前記アミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸が任意に付加、欠失、修飾および／または置換され、ＣＴＬＡ−４の結合親和性を保持できる誘導配列をさらに含む、前記抗体。
【請求項６】
前記抗体は、請求項１に記載の重鎖可変領域および請求項３に記載の軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域は、
配列番号２に示されるＣＤＲ１、
配列番号３に示されるＣＤＲ２、および
配列番号４に示されるＣＤＲ３の３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記軽鎖可変領域は、
配列番号６に示されるＣＤＲ１’と、
配列番号７に示されるＣＤＲ２’と、および
配列番号８に示されるＣＤＲ３’との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記アミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸が任意に付加、欠失、修飾および／または置換され、ＣＴＬＡ−４の結合親和性を保持できる誘導配列をさらに含む、
請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号８ｎ＋１に示されるアミノ酸配列を含み、および／または前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号８ｎ＋５に示されるアミノ酸配列を含み、各ｎは独立して０、１、２、３または４である
請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む
請求項６に記載の抗体。
【請求項９】
組換えタンパク質であって、
（ｉ）請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、または請求項５〜８のいずれか一項に記載の抗体、および
（ｉｉ）発現および／または精製を支援する任意のタグ配列を含む、前記組換えタンパク質。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドであって、
（１）請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、または請求項５〜８のいずれか一項に記載の抗体、および
（２）請求項９に記載の組換えタンパク質
からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号４１、４３、４５、４７または４９に示される前記重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、および／または、
配列番号４２、４４、４６、４８または５０に示される前記軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである
請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号４１に示される前記重鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド、配列番号４２に示される前記軽鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチドである
請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
担体であって、
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、前記担体。
【請求項１４】
遺伝子操作された宿主細胞であって、
宿主細胞が請求項１３に記載の担体を含むか、またはそのゲノムに請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが組み込まれている、前記遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１５】
医薬組成物であって、
（ｉ）請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、および請求項５〜８のいずれか一項に記載の抗体、請求項９に記載の組換えタンパク質、およびそれらの組み合わせの群から選択される有効成分、および
（ｉｉ）薬学的に許容される担体
を含む、前記医薬組成物。
【請求項１６】
有効成分の使用であって、
前記有効成分は、請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、および請求項５〜８のいずれか一項に記載の抗体、請求項９に記載の組換えタンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、前記有効成分は、ＣＴＬＡ−４関連腫瘍および／またはウイルス感染に関連する疾患の予防および／または治療のための薬物を調製するために使用される、前記有効成分の使用。
【請求項１７】
有効成分として使用するための、請求項５〜８のいずれか一項に記載の抗体、請求項９に記載の組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、サンプル中のＣＴＬＡ−４タンパク質をインビトロで検出するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医学の分野に関し、具体的にＣＴＬＡ−４抗体およびその調製方法と応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体の応用は、過去２０年間で癌治療において最も成功した、革新的な治療法の１つである。従来の化学薬品と比較して、抗体薬物はより高い特異性とより低い毒性を持っている。モノクローナル抗体薬物は継続的な成功を収めているが、依然として多くの課題に直面している。
【０００３】
マウスモノクローナル抗体の最大の欠点は、それが誘発するＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）応答である。したがって、マウスのモノクローナル抗体は、腫瘍、臓器移植などの疾患の診断と治療において大きな制限があり、キメラ抗体は、３０％のマウス配列を保持しているため、異なる程度のＨＡＭＡ応答を引き起こす可能性がある。臨床的に、異なるキメラ抗体は異なる程度の免疫原性を有し、ヒト化抗体は移植抗体とも呼ばれる。簡単なＣＤＲ移植では抗原抗体親和性を低下することがよくあるが、少なくとも１０％の異種タンパク質が含まれているため、臨床応用はさまざまな程度に制限されている。したがって、より完全な治療用抗体−完全ヒト抗体をさらに開発する必要がある。
【０００４】
１９９４年、アメリカの企業であるＡｂｇｅｎｉｘとＧｅｎｐｈａｍは、トランスジェニックマウスを使用して完全なヒト抗体を調製することを報告し、それにより、人体を思い通りに免疫できないというヒト抗体作製研究の課題が解決された。それ以来、完全ヒト抗体を調製するための技術は開発および成熟し続け、得られたヒトモノクローナル抗体は強力な抗腫瘍活性を有する。
癌免疫療法は、患者自身の免疫系を使用して腫瘍細胞を攻撃する癌治療における最新の画期的なものである。
【０００５】
免疫チェックポイントとは、末梢組織における免疫応答の持続性と強度を調節することで組織の損傷を防ぎ、自己抗原に対する耐性の維持に関与する、免疫系のいくつかの抑制性シグナル経路を指す。免疫チェックポイントの抑制性シグナル経路を使用してＴ細胞の活性を阻害することは、腫瘍が免疫による死を回避するための重要なメカニズムである。免疫チェックポイントの遮断は、抗腫瘍免疫を活性化する多くの効果的な戦略の１つである。
【０００６】
免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤は、さまざまな種類の腫瘍（転移性黒色腫、肺癌、乳癌、腎細胞癌など）を治療する可能性がある。最近、癌免疫治療方法に関する研究は、特に転移性癌の症例に対して、有望な結果を示している。さらに、癌免疫治療は、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫などの血液癌の治療に大きな可能性を有する。免疫チェックポイント阻害剤によって引き起こされる副作用は無視でき、可逆的で制御可能であり、効果的な免疫チェックポイント阻害剤は癌患者の全体的な生存を大幅に改善することができる。免疫チェックポイント阻害剤は、標的治療や従来の放射線療法や化学療法と組み合わせて使用することもでき、これらの組み合わせ療法は、さまざまな種類の癌を効果的に治療でき、さまざまな癌の治療または治癒の希望であり得る。
【０００７】
ＣＴＬＡ−４（細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４またはＣＤ１５２）は、細胞外Ｉｇ−Ｖ様ドメイン、Ｉｇ−Ｃ様ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内Ｃ末端ドメインを含む、主要な免疫チェックポイント分子の１つとしてのタイプＩ膜貫通タンパク質である。ＣＴＬＡ−４は主に制御性Ｔ細胞で構成的に発現し、活性化Ｔ細胞の表面では誘導的に発現し、リガンドＢ７.１（ＣＤ８０）およびＢ７.２（ＣＤ８２）と相互作用して抑制シグナルを誘導して、Ｔ細胞の活性化、増殖阻害、およびサイトカイン産生の低下を引き起こし、ＣＴＬＡ−４は、Ｔｒｅｇ細胞の表面で構成的に高発現し、Ｔｒｅｇによる他のエフェクターＴ細胞の活性のダウンレギュレーションに参加する。
Ｔ細胞活性化の初期段階でのＣＴＬＡ−４活性の調節は重要であり、したがって末梢リンパ系における免疫寛容の主要な調節機構になる。ＣＴＬＡ−４はリガンドについてＣＤ２８と競合し、それ自体でＴＣＲシグナル伝達経路を阻害し、抗原に対するＴ細胞の反応の強さを調節することにより、体が自己抗原または外来の弱い抗原認識に対する耐性を示すようにする。
【０００８】
研究では、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７リガンド相互作用を遮断すると、体が腫瘍抗原を認識し、抗原特異的Ｔ細胞の増殖を刺激し、それによって免疫系を活性化し、抗腫瘍免疫応答を高めることができると見なされ、マウス腫瘍モデルの同じ系統で、ＣＴＬＡ−４遮断が抗腫瘍活性を促進することが証明されている。したがって、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７.１およびＢ７.２経路を遮断する薬物は、さまざまな癌や他の免疫疾患の新しい治療法を提供できる。
現在、既存のＣＴＬＡ−４抗体は、治療ウィンドウが小さい、適応が限られている、治療費が高いなどの欠点が多く、ＣＴＬＡ−４阻害抗体の開発はさまざまながんの治療が急務である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
完全ヒトＣＴＬＡ−４抗体の現在の欠如および既存のＣＴＬＡ−４抗体の活性および安全性の欠点を克服するために、本発明は、高い親和性および強い特異性を有するＣＴＬＡ−４抗体およびその調製方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の態様では、抗体の重鎖可変領域であって、前記重鎖可変領域は、
配列番号８ｎ＋２に示されるＣＤＲ１と、
配列番号８ｎ＋３に示されるＣＤＲ２と、および
配列番号８ｎ＋４に示されるＣＤＲ３との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
各ｎは独立して０、１、２、３または４であり、
前記アミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸が任意に付加、欠失、修飾および／または置換され、ＣＴＬＡ−４の結合親和性を保持できる誘導配列をさらに含む、前記抗体の重鎖可変領域を提供する。
別の好ましい例では、前記重鎖可変領域は配列番号８ｎ＋１に示されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｎは０、１、２、３または４である。
【００１１】
本発明の第２の態様では、抗体の重鎖であって、前記重鎖は、請求項１に記載の重鎖可変領域を有する、前記抗体の重鎖を提供する。
本発明の第３の態様では、抗体の軽鎖可変領域であって、前記軽鎖可変領域は、
配列番号８ｎ＋６に示されるＣＤＲ１’と、
配列番号８ｎ＋７に示されるＣＤＲ２’と、および
配列番号８ｎ＋８に示されるＣＤＲ３’との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
各ｎは独立して０、１、２、３または４であり、
前記アミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸が任意に付加、欠失、修飾および／または置換され、ＣＴＬＡ−４の結合親和性を保持できる誘導配列をさらに含む、前記抗体の軽鎖可変領域を提供する。
別の好ましい例では、前記軽鎖可変領域は、配列番号８ｎ＋５に示されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｎは０、１、２、３または４である。
【００１２】
本発明の第４の態様では、抗体の軽鎖であって、前記軽鎖は、請求項３に記載の軽鎖可変領域を有する、前記抗体の重鎖を提供する。
本発明の第５の態様では、抗体であって、前記抗体は、
（１）第１の態様に記載の重鎖可変領域と、および／または
（２）第３の態様に記載の軽鎖可変領域とを有し、
または、前記抗体は、第２の態様に記載の重鎖と、および／または第４の態様に記載の軽鎖とを有し、
前記アミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸が任意に付加、欠失、修飾および／または置換され、ＣＴＬＡ−４の結合親和性を保持できる誘導配列をさらに含む、前記抗体を提供する。
【００１３】
別の好ましい例では、前記任意のＣＤＲのアミノ酸配列は、１、２または３個のアミノ酸を付加、欠失、修飾および／または置換した誘導体ＣＤＲ配列を含み、前記誘導体ＣＤＲ配列を含むＶＨとＶＬで形成された誘導体抗体がＣＴＬＡ−４の結合親和性を保持できるようにする。
別の好ましい例では、前記誘導体抗体およびＣＴＬＡ−４結合親和性Ｆ１と、対応する非誘導体化抗体およびＣＴＬＡ−４結合親和性Ｆ０の比率（Ｆ１／Ｆ０）は、０.５−２であり、好ましくは、０.７−１.５であり、より好ましくは、０.８−１.２である。
別の好ましい例では、前記付加、欠失、修飾および／または置換されたアミノ酸の数は、１−５個（例えば、１−３個、好ましくは、１−２個、より好ましくは、１個）である。
【００１４】
別の好ましい例では、前記少なくともアミノ酸が付加、欠失、修飾および／または置換され、ＣＴＬＡ−４の結合親和性を保持できる誘導配列は、少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列である。
別の好ましい例では、前記抗体は、重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域をさらに含む。
別の好ましい例では、前記重鎖定常領域は、ヒト由来であり、および／または前記軽鎖定常領域は、ヒト由来である。
別の好ましい例では、前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、またはそれらの組み合わせの群から選択される。
【００１５】
別の好ましい例では、ヒトにおける完全ヒト抗体の免疫原性Ｚ１とヒトにおける非完全ヒト抗体（例えば、マウス抗体）の免疫原性の比率（Ｚ１／Ｚ０）は、０〜０.５であり、好ましくは、０〜０.２であり、より好ましくは、０〜０.０５（例えば、０.００１〜０.０５）である。
別の好ましい例では、前記抗体は、部分的または完全にヒト化された、または完全にヒトのモノクローナル抗体である。
別の好ましい例では、前記抗体は、二本鎖抗体、または一本鎖抗体である。
別の好ましい例では、前記抗体は、抗体全長タンパク質、または抗原結合断片である。
別の好ましい例では、前記抗体は、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。
【００１６】
別の好ましい例では、前記抗体は、以下の群から選択される１つまたは複数の特性を有する：
（ａ）腫瘍細胞の移動または転移を阻害し、
（ｂ）腫瘍の成長を阻害する。
別の好ましい例では、前記抗体は、本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域および本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域を有し、ここで、
前記重鎖可変領域は、
配列番号２に示されるＣＤＲ１と、
配列番号３に示されるＣＤＲ２と、および
配列番号４に示されるＣＤＲ３との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記軽鎖可変領域は、
配列番号６に示されるＣＤＲ１’と、
配列番号７に示されるＣＤＲ２’と、および
配列番号８に示されるＣＤＲ３’との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
ここで、前記アミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸が任意に付加、欠失、修飾および／または置換され、ＣＴＬＡ−４の結合親和性を保持できる誘導配列をさらに含む。
【００１７】
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号８ｎ＋１に示されるアミノ酸配列を含み、および／または前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号８ｎ＋５に示されるアミノ酸配列を含み、ここで、各ｎは独立して０、１、２、３または４である。
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例では、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例では、前記抗体は、９７Ａ８Ｄ１、９２Ｃ８Ｂ６、３１Ｃ１２Ｆ３、４０Ｃ４Ｃ６９７Ｂ８Ｅ１の群から選択される。
【００１９】
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表における配列番号１、配列番号９、配列番号１７、配列番号２５、配列番号３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有する。
前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表における配列番号５、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２９、配列番号３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有する。
別の好ましい例では、前記抗体は脱フコシル化抗体である。
別の好ましい例では、前記抗体は脱フコシル化抗体９７Ａ８Ｄ１である。
【００２０】
本発明の第６の態様では、組換えタンパク質であって、
（ｉ）第１の態様に記載の重鎖可変領域、第２の態様に記載の重鎖、第３の態様に記載の軽鎖可変領域、第４の態様に記載の軽鎖、または第５の態様のいずれか一項に記載の抗体と、および
（ｉｉ）発現および／または精製を支援する任意のタグ配列とを含む、前記組換えタンパク質を提供する。
別の好ましい例では、前記タグ配列は、６Ｈｉｓタグを含む。
別の好ましい例では、前記組換えタンパク質（またはポリペプチド）は、融合タンパク質を含む。
別の好ましい例では、前記組換えタンパク質は、単量体、二量体、または多量体である。
【００２１】
別の好ましい例では、前記組換えタンパク質は、
（ｉ）抗体の重鎖可変領域は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖可変領域は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む本発明の第５の態様に記載の抗体と、および
（ｉｉ）発現および／または精製を支援する任意のタグ配列とを含む。
別の好ましい例では、前記組換えタンパク質は、
（ｉ）脱フコシル化抗体（例えば、脱フコシル化抗体９７Ａ８Ｄ１）と、および
（ｉｉ）発現および／または精製を支援する任意のタグ配列とを含む。
【００２２】
本発明の第７の態様では、ポリヌクレオチドであって、
（１）第１の態様に記載の重鎖可変領域、第２の態様に記載の重鎖、第３の態様に記載の軽鎖可変領域、第４の態様に記載の軽鎖、または第５の態様のいずれか一項に記載の抗体と、および
（２）第６の態様に記載の組換えタンパク質との群から選択されるポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチドを提供する。
別の好ましい例では、配列番号４１、４３、４５、４７または４９に示される前記重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、および／または、
配列番号４２、４４、４６、４８または５０に示される前記軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。
【００２３】
別の好ましい例では、配列番号４１に示される前記重鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド、配列番号４２に示される前記軽鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチドである。
別の好ましい例では、配列番号４３に示される前記重鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド、配列番号４４に示される前記軽鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチドである。
別の好ましい例では、配列番号４５に示される前記重鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド、配列番号４６に示される前記軽鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチドである。
【００２４】
別の好ましい例では、配列番号４７に示される前記重鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド、配列番号４８に示される前記軽鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチドである。
別の好ましい例では、配列番号４９に示される前記重鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド、配列番号５０に示される前記軽鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチドである。
【００２５】
本発明の第８の態様では、担体であって、本発明の第７の態様のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、前記担体を提供する。
別の好ましい例では、前記担体は、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、アデノウイルスなどの哺乳動物細胞ウイルス、レトロウイルス、または他の担体を含む。
本発明の第９の態様では、遺伝子操作された宿主細胞であって、第８の態様に記載の担体を含むか、またはゲノムに第７の態様のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが組み込まれている、前記遺伝子操作された宿主細胞を提供する。
【００２６】
本発明の第１０の態様では、医薬組成物であって、
（ｉ）第１の態様に記載の重鎖可変領域、第２の態様に記載の重鎖、第３の態様に記載の軽鎖可変領域、第４の態様に記載の軽鎖、または第５の態様のいずれか一項に記載の抗体、第６の態様に記載の組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせの群から選択される有効成分と、および
（ｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む、前記医薬組成物を提供する。
別の好ましい例では、前記医薬組成物は、液体製剤である。
別の好ましい例では、前記医薬組成物は、注射剤である。
別の好ましい例では、前記医薬組成物は、０.０１〜９９.９９％の本発明の第５の態様のいずれか一項に記載の抗体、本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせおよび０.０１〜９９.９９％の薬用担体を含み、前記パーセンテージは前記医薬組成物に占める質量パーセンテージである。
【００２７】
本発明の第１１の態様では、有効成分の使用であって、前記有効成分は、第１の態様に記載の重鎖可変領域、第２の態様に記載の重鎖、第３の態様に記載の軽鎖可変領域、第４の態様に記載の軽鎖、または第５の態様のいずれか一項に記載の抗体、第６の態様に記載の組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせの群から選択され、前記有効成分は、ＣＴＬＡ−４関連腫瘍および／またはウイルス感染に関連する疾患の予防および／または治療の薬物を調製するために使用される、前記有効成分の使用を提供する。
【００２８】
別の好ましい例では、前記ＣＴＬＡ−４関連疾患は、黒色腫、中皮腫、非小細胞肺癌、乳癌、肝臓癌、滑膜肉腫、転移性結腸癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌、Ｃ型慢性肝炎ウイルス感染、進行固形癌、消化臓器悪性腫瘍、転移性非小細胞肺癌、前立腺腫瘍、子宮内膜癌、子宮内膜癌肉腫、再発黒色腫、頭頸部扁平上皮癌、肉腫、メルケル細胞癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、卵管癌、腹膜腫瘍、筋肉浸潤性膀胱癌、広範囲の小細胞肺癌、成人急性骨髄性白血病、非定型慢性骨髄性白血病、以前に治療された骨髄異形成症候群、卵巣上皮細胞癌、尿路系悪性腫瘍、成人グレードＩＩＩリンパ腫様肉芽腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、皮膚Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、眼内リンパ腫、精巣絨毛癌、神経芽細胞腫、食道癌などの群から選択される。
【００２９】
本発明の第１２の態様では、サンプル中のＣＴＬＡ−４タンパク質をインビトロで検出するための組成物であって、有効成分として使用するための、第５の態様のいずれか一項に記載の抗体、第６の態様に記載の組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、前記組成物を提供する。
【００３０】
本発明の第１３の態様では、腫瘍またはウイルス感染疾患を治療するための方法であって、第５の態様のいずれか一項に記載の抗体、第６の態様に記載の組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせを有効成分として含むことを特徴とする、前記腫瘍またはウイルス感染疾患を治療するための方法を提供する。
別の好ましい例では、前記腫瘍は癌である。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の範囲内で、本発明の上記の技術的特徴及び以下に（例えば、実施例）具体的に説明する技術的特徴を互いに組み合わせて、新規または好ましい技術的解決策を形成できることを理解されたい。スペースの制限のため、ここでは繰り返さない。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、ＣＴＬＡ−４−ｈＦｃタンパク質とビオチン標識リガンドＢ７.１−ｈＦｃまたはＢ７.１−ｈＦｃの結合活性を示した。
【図２】図２は、ＣＴＬＡ−４（Ｙ２０１Ｖ）タンパク質をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞のＦＡＣＳ検出結果を示した。
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡでのＨＥＫ２９３−ＣＴＬＡ−４細胞免疫後のＨａｒｂｏｕｒトランスジェニックマウスの血清抗体価の検出を示した。
【図４】図４（Ａ）および（Ｂ）は、ＦＡＣＳでのＣＴＬＡ−４抗体とＣＨＯＫ１−ｈＣＴＬＡ−４の結合反応の検出を示した。
【００３３】
【図５】図５（Ａ）および（Ｂ）は、ＦＡＣＳでのＣＴＬＡ−４抗体と２９３Ｆ−ｃＣＴＬＡ−４の結合反応の検出を示した。
【図６】図６（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、ＣＴＬＡ−４タンパク質とその受容体Ｂ７.１の結合に対するＣＴＬＡ−４抗体の阻害を示した。
【図７】図７（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、ＣＴＬＡ−４タンパク質とその受容体Ｂ７.２の結合に対するＣＴＬＡ−４抗体の阻害を示した。
【図８】図８は、ＰＢＭＣリンパ球刺激試験における対ＩＬ−２分泌に対するＣＴＬＡ−４抗体の影響を示した。
【００３４】
【図９】図９（Ａ）および（Ｂ）は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）での抗体とヒトＣＴＬＡ−４発現細胞の結合の検出を示した。
【図１０】図１０（Ａ）および（Ｂ）は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）での抗体とサルＣＴＬＡ−４発現細胞の結合の検出を示した。
【図１１】図１１（Ａ）および（Ｂ）は、ＣＴＬＡ−４タンパク質とその受容体Ｂ７.１の結合に対する完全ヒトＣＴＬＡ−４抗体の阻害を示した。
【図１２】図１２（Ａ）および（Ｂ）は、ＣＴＬＡ−４タンパク質とその受容体Ｂ７.２に対する完全ヒトＣＴＬＡ−４抗体の阻害を示した。
【００３５】
【図１３】図１３は、ＳＥＢ依存性ＰＢＭＣ活性化試験におけるＩＬ−２分泌に対するＣＴＬＡ−４完全ヒト抗体の影響を示した。
【図１４】図１４（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）は、ＰＨＡ誘発Ｔリンパ嚢細胞活性化試験におけるＩＬ−２分泌に対するＣＴＬＡ−４完全ヒト抗体の影響を示した。
【図１５】図１５は、担癌マウスの生存率に対するＣＴＬＡ−４抗体の影響を示した。
【図１６】図１６（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）は、液体質量分析により脱フコシル化およびフコシル化抗ＣＴＬＡ−４抗体Ｆｃセグメントの分子量の測定を示した。
【図１７】図１７は、ＳＥＢ依存性ＰＢＭＣ活性化試験におけるＩＬ−２分泌に対する脱フコシル化およびフコシル化抗ＣＴＬＡ−４抗体の影響を示した。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
広範囲にわたる詳細な研究を通じて、本発明者らはラット−ヒトキメラ抗体トランスジェニックマウスおよび２９３Ｆ−ＨｕＣＴＬＡ−４細胞（組換え発現された２９３Ｆ−ＨｕＣＴＬＡ４細胞など）を使用してトランスジェニックマウスを免疫し、高活性抗ＣＴＬＡ−４完全ヒト抗体を予期せずに取得した。実験結果では、前記ヒト由来とサル由来のＣＴＬＡ−４タンパク質の両方の親和性が高く（ＫＤは２.１５Ｅ−０９ｎＭである）、ＣＴＬＡ−４とその受容体Ｂ７.１およびＢ７.２の結合を阻害でき、ＰＨＡ誘発性ヒトＴリンパ球またはＳＥＢ媒介活性化ヒト末梢血単核球でＩＬ−２の発現レベルを大幅に増加させ、ヒトＣＤ２８および他の類似のタンパク質抗原との交差反応性を欠けていることを示す。得られた完全ヒト抗ＣＴＬＡ−４抗体は、より高い親和性、インビトロおよびインビボでより強い活性などの特徴を有する。また、完全ヒトＣＴＬＡ−４抗体（例えば、９７Ａ８Ｄ１）のインビボでの抗腫瘍効果は、先行技術の抗体Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂよりも優れている。本発明はこれに基づいて完成された。
【００３７】
用語
ＣＴＬＡ−４
細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４であるＣＴＬＡ−４は、構造的にはＣＤ２８免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、活性化Ｔ細胞で誘導的に発現し、制御性Ｔ細胞で構成的に発現し、免疫チェックポイントタンパク質として、ＣＤ２８リガンドとの競合的結合により、免疫チェックポイントタンパク質として、活性化Ｔ細胞での誘導性発現と調節性Ｔ細胞での構成的発現により、Ｔ細胞の活性をダウンレギュレーションする。トランスジェニックマウスと担癌マウスに関する研究では、ＣＴＬＡ−４が免疫系の認識と殺傷の腫瘍回避に関与しているため、ＣＴＬＡ−４の活性をブロックすると、体の腫瘍成長阻害が増加する可能性があることが示されている。
【００３８】
抗体
本明細書で使用される用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、２つの同じ軽鎖（Ｌ）と２つの同じ重鎖（Ｈ）からなる、同じ構造特性を持つ約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に接続されており、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は異なる。各重鎖と軽鎖には、規則的な間隔の鎖内ジスルフィド結合もある。各重鎖には、一端に可変領域（ＶＨ）があり、その後に複数の定常領域がある。各軽鎖には、一端に可変領域（ＶＬ）があり、他端に定常領域があり、軽鎖の定常領域は重鎖の最初の定常領域と対向し、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と対向する。特別なアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖の可変領域間の界面を形成する。
【００３９】
本明細書で使用される用語「可変」は、抗体の可変領域の特定の部分が配列上異なり、それらが特定の抗原に対する様々な特異的抗体の結合および特異性を形成することを意味する。ただし、可変性は抗体の可変領域全体に均一に分布していない。それは、軽鎖および重鎖可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つの断片に集中している。可変領域のより保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変領域には、それぞれ４つのＦＲ領域が含まれ、それらはおおよそβ−折りたたまれた構成で、接続ループを形成する３つのＣＤＲで接続されており、場合によっては部分的なβ折りたたみ構造を形成できる。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって密接に結合され、他の鎖のＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位を形成する（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ。Ｎｏ.  ９１−３２４２、Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ、６４７−６６９ページ（１９９１）を参照）。
【００４０】
定常領域は、抗原への抗体の結合には直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性に関与するなど、さまざまなエフェクター機能を発揮する。
脊椎動物の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常領域のアミノ酸配列に基づいて、２つの異なるタイプ（κおよびλと呼ばれる）のいずれかに分類できる。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に従って、免疫グロブリンは異なるタイプに分類できる。免疫グロブリンには主に５つのタイプがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、それらのいくつかはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２などのサブタイプ（アイソタイプ）にさらに分類できる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、β、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるタイプのサブユニット構造および三次元配置は、当業者によく知られている。
【００４１】
一般に、抗体の抗原結合特性は、重鎖および軽鎖の可変領域にある３つの特定の領域によって記述でき、可変領域（ＣＤＲ）と呼ばれ、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）に分割され、４つのＦＲのアミノ酸配列は比較的保守的であり、結合反応に直接関与しない。これらのＣＤＲは環状構造を形成し、その間のＦＲを介して形成されるβ折り畳みは空間構造が近接しており、重鎖のＣＤＲと対応する軽鎖のＣＤＲは抗体の抗原結合部位を構成する。同じタイプの抗体のアミノ酸配列を比較して、ＦＲまたはＣＤＲ領域を構成するアミノ酸を決定できる。
本発明は、完全な抗体だけでなく、免疫学的に活性な抗体の断片または抗体および他の配列によって形成される融合タンパク質も含む。したがって、本発明はまた、抗体の断片、誘導体およびアナログを含む。
【００４２】
本発明において、抗体は、当業者に周知の技術によって調製されたマウス、キメラ、ヒト化、または完全ヒト抗体を含む。ヒトおよび非ヒト部分を含む、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗体は、標準的なＤＮＡ組換え技術によって得ることができ、それらはすべて有用な抗体である。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗体からの可変領域とヒト免疫グロブリンからの定常領域を有するキメラ抗体である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号および米国特許第４，８１６，３９７号、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。ヒト化抗体は、非ヒト種に由来する抗体分子を指し、非ヒト種に由来する１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）およびヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を含む（米国特許第５，５８５，０８９号を参照、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。これらのキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野で周知のＤＮＡ組換え技術を使用して調製することができる。
【００４３】
本発明において、抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはより多重特異性であり得る。
本発明において、本発明の抗体はまた、その保存的変異体を含み、これは、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較して、多くとも１０、好ましくは多くとも８、より好ましくは多くとも５、最も好ましくは多くとも３つのアミノ酸が、類似または近い特性を持つアミノ酸に置き換えられて、ポリペプチドを形成することを意味する。これらの保存的変異ポリペプチドは、アミノ酸置換によって表Ａに従って最もよく生成される。これらの保存的変異ポリペプチドは、表Ａに従ってアミノ酸置換によって生成されるのが最適である。
【００４４】
【表１】
2021526012.tif 000002
【００４５】
抗ＣＴＬＡ−４の抗体
本発明は、重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列を含む重鎖と、および軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列を含む軽鎖とを含む高い親和性および強い特異性を有するＣＴＬＡ−４抗体を提供する。
【００４６】
好ましくは、重鎖可変領域（ＶＨ）は、
配列番号２に示されるＣＤＲ１と、
配列番号３に示されるＣＤＲ２と、および
配列番号４に示されるＣＤＲ３との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
軽鎖可変領域（ＶＬ）は、
配列番号６に示されるＣＤＲ１’と、
配列番号７に示されるＣＤＲ２’と、および
配列番号８に示されるＣＤＲ３’との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
ここで、前記アミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸が任意に付加、欠失、修飾および／または置換され、ＣＴＬＡ−４の結合親和性を保持できる誘導配列をさらに含む。
【００４７】
別の好ましい例では、前記少なくとも１つのアミノ酸が付加、欠失、修飾および／または置換あれて形成された配列は、相同性または配列同一性がこのましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％，最もさらに好少なくとも９５％のアミノ酸配列である。
【００４８】
当業者に周知の配列相同性または同一性を決定するための方法には、これらに限定されないが、計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｌｅｓｋ、Ａ.Ｍ.編集、オックスフォード大学出版社、ニューヨーク、１９８８；バイオコンピューティング：バイオコンピューティング：情報学とゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）Ｓｍｉｔｈ，Ｄ.Ｗ.編集、アカデミックプレス、ニューヨーク、１９９３；シーケンスデータのコンピューター分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ）、パート１、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ.Ｍ.とＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ.Ｇ.編集、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー、１９９４；分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ.、アカデミックプレス、１９８７、およびシーケンス分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ.とＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ.編集、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９１、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ.とＬｉｐｍａｎ，Ｄ.，ＳＩＡＭ  Ｊ.  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ.，４８：１０７３（１９８８）。同一性を測定するための好ましい方法は、試験された配列間の最大の一致を得ることである。同一性を測定する方法は、一般に入手可能なコンピュータープログラムにコンパイルされている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法には、ＧＣＧパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ.ら、１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆ.ら、１９９０）が含まれるが、これらに限定されない。一般の人々は、ＮＣＢＩおよびその他のソースからＢＬＡＳＴＸプログラムを入手できる（ＢＬＡＳＴハンドブック、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ.ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ.２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ.ら、１９９０）。よく知られているＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して、同一性を測定することもできる。
【００４９】
本発明の抗体は、二本鎖または一本鎖抗体であってよく、動物由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、より好ましくはヒト化抗体、ヒト−動物キメラ抗体、およびより好ましくは完全ヒト化抗体から選択することができる。
本発明の抗体誘導体は、一本鎖抗体および／または抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２または当該分野で公知の他の抗体誘導体、ならびにＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体、または他のサブタイプの抗体のいずれかの１つまたは複数であり得る。
ここで、前記動物は、マウスなどの哺乳動物であることが好ましい。
【００５０】
本発明の抗体は、ヒトＣＴＬＡ−４を標的とするキメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植および／または修飾抗体であってよい。
本発明の上記の内容において、前記付加、欠失、修飾および／または置換されたアミノ酸の数は、好ましくは最初のアミノ酸配列におけるアミノ酸の総数の４０％を超えず、より好ましくは３５％を超えず、より好ましくは１〜３３％であり、より好ましくは５〜３０％、より好ましくは１０〜２５％、より好ましくは１５〜２０％である。
本発明の上記の内容において、より好ましくは、前記付加、欠失、修飾および／または置換されたアミノ酸の数は、１〜７、より好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３、より好ましくは１−２であることができる。
【００５１】
別の好ましい例では、前記ＣＴＬＡ−４を標的とする抗体は、９７Ａ８Ｄ１、９２Ｃ８Ｂ６、３１Ｃ１２Ｆ３、４０Ｃ４Ｃ６または９７Ｂ８Ｅ１である。
別の好ましい例では、前記抗体９７Ａ８Ｄ１の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１に示されるアミノ酸配列である。
別の好ましい例では、前記抗体９７Ａ８Ｄ１の軽鎖可変領域アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：５に示されるアミノ酸配列である。
【００５２】
抗体の調製
本発明の抗体またはその断片のＤＮＡ分子の配列は、ＰＣＲ増幅またはゲノムライブラリースクリーニングなどの従来の技術によって得ることができる。さらに、軽鎖および重鎖のコード配列を互いに融合させて、一本鎖抗体を形成することができる。
関連する配列が得られたら、組換え法を使用して、関連する配列を大量に取得できる。これは通常、それを担体にクローニングし、次にそれを細胞に移し、次に従来の方法により増殖した宿主細胞から関連配列を単離することである。
さらに、特に断片の長さが短い場合は、人工的な合成方法を使用して関連配列を合成することもできる。通常、最初に複数の小さな断片を合成し、次にライゲーションして非常に長い断片を取得できる。
【００５３】
現在、本発明の抗体（またはその断片、またはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列は、化学合成により完全に得ることができる。次いで、ＤＮＡ配列は、当該分野で公知の様々な既存のＤＮＡ分子（または担体など）および細胞に導入され得る。さらに、化学合成により、本発明のタンパク質配列に変異を導入することもできる。
本発明はまた、前記適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーターまたは制御配列を含む担体に関する。これらの担体は、適切な宿主細胞を形質転換して、タンパク質を発現させるために使用できる。
宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞；または酵母細胞などの下等真核細胞；または哺乳動物細胞などの高等真核細胞であり得る。好ましい動物細胞には（これらに限定されないが）、ＣＨＯ−Ｓ、ＨＥＫ−２９３細胞が含まれる。
【００５４】
一般に、形質転換された宿主細胞は、本発明の抗体の発現に適した条件下で培養される。次に、従来の免疫グロブリン精製ステップを使用して、プロテインＡ−セファロース（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの当業者に周知の従来の分離および精製手段によって精製して本発明の抗体を得る。
【００５５】
得られたモノクローナル抗体は、常法により同定することができる。例えば、モノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ（ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）によって測定することができる。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ.  Ｂｉｏｃｈｅｍ.，１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）分析により測定することができる。
【００５６】
本発明の抗体は、細胞内、または細胞膜上で発現され得るか、または細胞から分泌され得る。必要に応じて、物理的、化学的、およびその他の特性を使用して、さまざまな分離方法で組換えタンパク質を分離および精製できる。これらの方法は当業者によく知られている。これらの方法の例には、従来の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧滅菌、超音波処理、超遠心分離、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着層、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、その他のさまざまな液体クロマトグラフィー技術、およびこれらの方法の組み合わせが含まれますが、これらに限定されない。
【００５７】
応用
本発明はまた、例えば、診断製剤を調製するため、またはＣＴＬＡ−４関連疾患を治療するための薬物を調製するための、本発明の抗体の使用を提供する。前記ＣＴＬＡ−４関連疾患には、腫瘍の発生、成長、および／または転移、病毒感染などの関連疾患を含む関連疾患が含まれる。
【００５８】
本発明の抗体の使用は、以下を含む（がこれらに限定されない）：
（ｉ）腫瘍の発生、成長および／または転移の治療。前記腫瘍は、乳がん（トリプルネガティブ乳がんなど）、膵臓がん、肺がん（非小細胞肺がん、広範囲の小細胞肺癌、転移性非小細胞肺がんなど）、悪性グリア腫瘍、消化器系悪性腫瘍、胃がん、肝がん、食道がん、腎がん、大腸がん、転移性大腸がん、膀胱がん、前立腺腫瘍（前立腺がんなど）、子宮内膜がん、子宮内膜がん肉腫、子宮頸がん、卵巣癌、卵管癌、白血病（成人急性骨髄性白血病、非定型慢性骨髄性白血病など）、骨髄癌、肉腫（血管肉腫、滑膜肉腫など）、黒色腫、再発性黒色腫、中皮腫、進行性固形がん、頭頸部扁平上皮がん、メルケル細胞がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、腹膜腫瘍、筋浸潤性膀胱がん、以前に治療された骨髄異形成症候群、卵巣上皮細胞がん、泌尿器系悪性腫瘍、成人グレードＩＩＩリンパ腫様肉芽腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、皮膚Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、眼内リンパ腫、精巣絨毛癌、神経芽細胞腫、食道癌を含む（がこれらに限定されない）。特にトリプルネガティブ乳がん、膵臓がん、悪性神経膠腫および肺がん、より好ましくはトリプルネガティブ乳がんおよび／または膵臓がんである。
（ｉｉ）ウイルス感染疾患の治療。前記ウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（慢性感染症）、ＨＩＶを含む（がこれらに限定されない）。
【００５９】
医薬組成物
本発明はまた、組成物を提供する。好ましい例において、前記組成物は、上記の抗体またはその活性断片または融合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。通常、これらの物質は、非毒性で不活性で薬学的に許容される水性担体媒体に製剤化でき、ｐＨは通常約５〜８、好ましくは約６〜８であるが、ｐＨは調製される物質の性質および治療される病症によって異なることができる。調製された医薬組成物は、腫瘍内、腹腔内、静脈内、または局所投与を含む（がこれらに限定されない）従来の経路によって投与することができる。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、ＣＴＬＡ−４タンパク質分子を結合するために直接に使用することができるため、腫瘍などの疾患のお予防及び治療に使用できる。さらに、他の治療剤を同時に使用することもできる。
本発明の医薬組成物は、安全かつ有効な量（例えば、０.００１〜９９重量％、好ましくは０.０１〜９０重量％、より好ましくは０.１〜８０重量％）の本発明の前記モノクローナル抗体および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。そのような担体には、生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる（これらに限定されない）。医薬品は投与方法に適合している必要がある。薬物製剤は投与方法に適合している必要がある。本発明の医薬組成物は、注射の形態で調製することができ、例えば、生理食塩水またはグルコースおよび他のアジュバントを含有する水溶液を用いて従来の方法により調製することができる。注射剤や溶液などの医薬組成物は、無菌条件下で製造する必要がある。有効成分の投与量は、治療有効量、例えば、約１マイクログラム／ｋｇ体重〜約５ｍｇ／ｋｇ体重／日である。さらに、本発明のポリペプチドはまた、他の治療剤と共に使用され得る。
【００６１】
医薬組成物を使用する場合、安全かつ有効な量の抗体が哺乳動物に投与され、安全かつ有効な量は、通常、少なくとも約１０マイクログラム／ｋｇ体重であり、ほとんどの場合、約５０ｍｇ／ｋｇ体重以下であり、好ましくは、投与量は、約１０マイクログラム／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん、具体的な投与量は、投与経路、患者の健康状態など、熟練した医師のスキルの範囲内にある要因も考慮する必要がある。
【００６２】
本発明は以下の主な利点を含む。
（１）野生型マウスと比較して、本発明で使用されるトランスジェニックマウスは、完全ヒト抗体をより簡単に取得できるため、抗体の免疫原性が低下し、完全ヒト抗体のトランスジェニックマウスと比較すると、取得される抗体の数が多く、親和性が強く、配列の多様性は良好で、活性が高い。
（２）本発明は、ハイブリドーマ技術を採用して抗体を取得するため、ファージライブラリーから取得した抗体と比較して、親和性が高く、配列発現も良好である。
（３）本発明は、組換え発現された２９３Ｆ−ＨｕＣＴＬＡ−４細胞を採用し、タンパク質またはポリペプチド系免疫原と比較して、発現された標的タンパク質はより自然なコンフォメーションを有し、他の組換え発現された細胞と比較して、その発現レベルは高い。
【００６３】
（４）本発明は、異なる配列を有する抗体を取得し、ＣＴＬＡ−４抗体に特異的に結合することができ、それらの結合活性がナノモル未満である。
（５）本発明で得られた抗体は、Ｔ細胞の活性化を促進する活性が高く、ＣＴＬＡ−４とその２つのリガンド（Ｂ７.１およびＢ７.２）の結合を遮断でき、Ｔ細胞に対するＣＴＬＡ−４の作用を逆転させることにより、Ｔ細胞を活性化してＩＬ−２を分泌するようにする。
（６）本発明で得られた抗体は、マウス（ヒトＣＴＬＡ−４トランスジェニックマウスなど）体内で有意な腫瘍増殖を阻害し、マウスの生存率を改善する活性を示す。
（７）本発明で得られた抗体は一連の優れた特徴を有する：可変領域配列は既存の抗体との相同性が低く（相同性＜９２％）、すべての活性は参考文献の抗体よりも優れている。
【００６４】
以下では具体的な実施例に結び合わせて、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。下記の実施例では、具体的な条件を明示していない実験方法は、一般に、例えば、米国Ｓａｍｂｒｏｏｋ.Ｊら「分子クローニング実験室マニュアル」（黄培堂ら訳、北京：科学出版社、２００２年）に記載の条件、またはメーカーが提案する条件（例えば、商品取扱説明書）に従う。特に明記しない限り、パーセンテージと部は重量で計算される。特に明記しない限り、以下の実施例で使用される実験材料および試薬は、市販のチャネルから入手できる。
実施例に記載されている室温は、当技術分野における通常の室温であり、通常１０−３０℃である。
特に明記しない限り、実施例に記載されているＰＢＳはＰＢＳリン酸緩衝液、ｐＨ７.２である。
【００６５】
材料
Ｈ２Ｌ２トランスジェニックマウスは、Ｈａｒｂｏｕｒ  ＢｉＭｅｄ（上海）有限責任会社から入手（購入）し、前記マウスは、完全ヒト系可変領域を備えた２つの重鎖と２つの軽鎖（Ｈ２Ｌ２）からなる従来の四量体抗体マウスを生成します。生成された抗体は成熟した親和性、完全にヒト化された可変領域を持ち、優れた溶解性を持っている。遺伝子組み換えマウス技術は、完全ヒト系抗体を産生するための主要なツールの１つである［４］。
【００６６】
一般的な方法
本発明は最初に免疫原としてヒトＣＴＬＡ−４を調製し、ヒト抗体トランスジェニックマウス技術を使用して完全ヒト抗体を調製し［Ｌｏｎｂｅｒｇ，  ｅｔ  ａｌ.１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９，Ｌｏｎｂｅｒｇ，  Ｎ.  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，  Ｄ.１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ.  Ｒｅｖ.  Ｉｍｍｕｎｏｌ.１３：６５−９３，  ａｎｄ  Ｈａｒｄｉｎｇ，  Ｆ.  ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，  Ｎ.  ，１９９５，Ａｎｎ.  Ｎ.Ｙ.  Ａｃａｄ.  Ｓｃｉ.  ７６４：５３６−５４６］、ＣＴＬＡ−４抗体のリード抗体を取得した。次に、リード抗体の予備生成、精製、および検証を通じて、抗体親和性（親和性ＫＤ＜１＊１０−９Ｍ）が高く、ＣＴＬＡ−４と受容体Ｂ７.１およびＢ７.２の結合を効果的にブロックし、ヒト末梢血単核球またはＴリンパ球の反応におけるＩＬ−２の発現レベルを大幅に増加させ、ヒトＣＤ２８などの類似のタンパク質抗原との交差反応性を欠くなど、優れた生物学的特性を持つＣＴＬＡ−４抗体を取得した。次に、分子生物学的方法のシークエンシングにより、ＣＴＬＡ−４抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を取得した。
【００６７】
実施例１  ＣＴＬＡ−４抗体の調製
（一）免疫原Ａの調製
ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列Ｌｙｓ３６−Ａｓｐ１６１を人ＩｇＧ  Ｆｃ断片（ｈＦｃ）を有するｐＣｐＣ担体（Ｖ０４４−５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）にクローニングし、確立された標準的な分子生物学の方法に従ってプラスミドを調製し、具体的な方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ.，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ.  Ｆ.，  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ.（１９８９）.  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を参照してください。ＨＥＫ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を一過性にトランスフェクトし（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＴＭ  ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、３７℃で増殖培養した。４日後、細胞培養液を回収し、遠心分離により細胞成分を除去し、ＣＴＬＡ−４タンパク質の細胞外ドメインを含む培養上清液を得た。培養上清液をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）にロードし、紫外線（ＵＶ）検出器を使用して紫外線吸収（Ａ２８０ｎｍ）の変化を監視した。サンプルをロードした後、ＵＶ吸収値がベースラインに戻るまで、ＰＢＳリン酸緩衝液（ｐＨ  ７.２）でタンパク質アフィニティークロマトグラフィーカラムを洗浄し、０.１Ｍグリシン塩酸（ｐＨ  ２.５）で溶出して、プロテインＡアフィニティー層カラムから溶出したｈＦｃタグ付きＣＴＬＡ−４タンパク質（ＣＴＬＡ−４−ｈＦｃ）を収集し、４℃の冷蔵庫でＰＢＳリン酸緩衝液（ｐＨ  ７.２）を用いて一晩透析した。透析したタンパク質を０.２２ミクロンで滅菌濾過し、−８０℃で保存して、精製された免疫原Ａを得た。免疫原Ａは、使用前に、そのタンパク質濃度、純度、分子量、生物活性など、一連の品質管理テストを受ける必要があり、結果は図１および表１に示したとおりである。表１は、タンパク質レベルでのＣＴＬＡ−４とＢ７.１またはＢ７.２の結合がＢ７.１またはＢ７.２の濃度によって変化することを示し、対照タンパク質は非ＣＬＡ−４融合タンパク質であり、表のデータはＯＤ４５０ｎｍ値である。
【００６８】
ここで、免疫原Ａの生物活性はＥＬＩＳＡを使用して検出し、具体的に：
ｈＦｃタグ付きＣＴＬＡ−４タンパク質（ＣＴＬＡ−４−ｈＦｃ、即ち、免疫原Ａ）をＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈して、１００ｕｌ／ウェルでＥＬＩＳＡマイクロプレートに加え、４℃で一晩インキュベートした。ＥＬＩＳＡブロッキング溶液（１％ＢＳＡ、ｐＨ７.４のＰＢＳリン酸緩衝液を含み、前記パーセンテージは質量パーセンテージである）を使用して、３７℃で２時間ブロッキングした後、勾配希釈されたビオチン標識のＢ７.１またはＢ７.２−ｈＦｃを３７℃で１時間インキュベートした。ビオチン標識のＢ７.１−ｈＦｃまたはＢ７.２−ｈＦｃの調製方法は以下のおとりである：Ｂ７.１−ｈＦｃまたはＢ７.２−ｈＦｃをビオチン化試薬と反応させる。前記Ｂ７.１−ｈＦｃまたはＢ７.２−ｈＦｃの調製方法は、免疫原Ａの調製方法と同じであり、ここでＢ７.１細胞外ドメインタンパク質（Ｖａｌ３５−Ａｓｎ２４２）のアミノ酸配列情報は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース、番号Ｐ３３６８１を参照、Ｂ７.２細胞外ドメインタンパク質（Ａｌａ２４−Ｐｒｏ２４７）のアミノ酸配列情報は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース、番号Ｐ４２０８１を参照、前記ビオチン化試薬は、Ｓｉｇｍａから購入し、製品番号Ｂ３２９５、ビオチン化試薬との反応ステップは、前記ビオチン化試薬の説明書を参照してください。ストレプトアビジン標識ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａから購入、製品番号Ｓ２４３８）を加え、室温で３０分間インキュベートし、未結合のストレプトアビジン標識ホースラディッシュペルオキシダーゼを洗浄液で洗い流し、１００ｕｌ／ウェルのＴＭＢ発色液を加えた。温で１５分間インキュベートした後、５０ｕｌの１Ｎ塩酸を加えて呈色反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーでＯＤ４５０ｎｍの読み取り値を読み取った。
【００６９】
【表２】
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具体的な活性結果は、表１および図１に示されたとおり、表明発現したリガンドと受容体タンパク質が正しいコンフォメーションを有し、免疫に適し、受容体−リガンド結合遮断検出方法の構築、および抗体活性の同定に適することを示す。
【００７０】
（二）免疫原Ｂの調製
ヒトＣＴＬＡ−４全長アミノ酸配列をＣＴＬＡ−４（Ｙ２０１Ｖ）に変異させ、ｐＩＲＥＳ担体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入）にクローニングし、プラスミドを調製した。ＨＥＫ２９３細胞株とＣＨＯＫ１細胞株（どちらもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）のプラスミドトランスフェクション後（Ｘ−ｔｒｅｍｅ  ＧＥＮＥ  ＨＰ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用したトランスフェクションし、Ｒｏｃｈｅ社から購入、製品番号Ｃａｔ＃０６  ３６６  ２３６  ００１、および説明書に従って操作）、０.５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む１０％（ｗ／ｗ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で選択的に２週間培養し、９６ウェル培養プレートに限界希釈法でサブクローニングし、３７℃に置き、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２で培養した。約２週間後、いくつかのモノクローナルウェルを選択し、６ウェルプレートに増幅した。増幅されたクローンを既知のＣＴＬＡ−４抗体で染色し、フローサイトメトリーでスクリーニングした。より良い成長、より高い蛍光強度、モノクローナル細胞株を選択して培養を拡大し続け、液体窒素で凍結し、免疫原Ｂを取得した。具体的な選択結果は、表２と図２に示したとおり、表２で、陽性細胞（％）は細胞総数における陽性細胞の割合を示す。図２は、ＨＥＫ２９３細胞がより高いレベルのＣＴＬＡ−４発現し、免疫原としての使用および抗体結合活性の同定に適することを示す。
【００７１】
【表３】
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【００７２】
（三）ハイブリドーマ細胞の調製と抗体スクリーニング
Ｈａｒｂｏｕｒトランスジェニックマウスは、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子とラット免疫グロブリン定常領域遺伝子を導入したが、マウス自体のＩｇ発現は抑制された（Ｆ.Ｇ.  Ｆｒａｎｋｌｉｎ，  ｅｔ  ａｌ、特許＃ＷＯ  ２０１０／０７０２６３  Ａｌ）。前記トランスジェニックマウスは、抗原で免疫された後、正常なマウス（Ｂａｌｂ／ｃなど）と同等の免疫応答と抗体価を生成できる。
【００７３】
Ａ、免疫原Ａ免疫は６〜８週齢のＨａｒｂｏｕｒヒト抗体トランスジェニックマウス（北京ｖｉｔａｌｒｉｖｅｒ社から購入）を使用し、マウスをＳＰＦ条件下で飼育した。最初の免疫時に、免疫原Ａタンパク質をフロイントの完全アジュバントで乳化し、０.２５ｍｌを腹腔内注射し、即ち、マウスあたり１００マイクログラムの免疫原Ａタンパク質を注射した。追加免疫する場合、免疫原Ａタンパク質をフロイントの不完全アジュバントで乳化し、０.２５ｍｌを腹腔内注射し、即ち、マウスあたり５０マイクログラムの免疫原Ａタンパク質を注射した。最初の免疫と最初の追加免疫の間には２週間の間隔があり、その後の各追加免疫の間には３週間の間隔がある。各追加免疫の１週間後に血液を採取し、ＥＬＩＳＡとＦＡＣＳによって血清中の免疫原Ａの抗体価と特異性を検出し、結果は図３と表３に示したとおりである。表３は、ＣＴＬＡ−４−ｈＦｃで免疫されたマウスの免疫後血清は、免疫原に異なる程度の結合を有し、抗原−抗体反応を示し、最高希釈率は約一千（１０００）程度であることを示した。ここで、空白対照は１％（ｗ／ｗ）ＢＳＡであり、バッチは３回目の追加免疫後の７日目のマウス血清を指し、表のデータはＯＤ４５０ｎｍの値である。
【００７４】
Ｂ、免疫原Ｂ免疫は６〜８週齢のＨａｒｂｏｕｒヒト抗体トランスジェニックマウス（北京ｖｉｔａｌｒｉｖｅｒ社から購入）を使用し、マウスをＳＰＦ条件下で飼育した。ステップ（二）で取得したヒトＣＴＬＡ−４を含むＨＥＫ２９３−ｈＣＴＬＡ−４（Ｙ２０１Ｖ）安定細胞株をＴ−７５細胞培養フラスコで９０％コンフルエンスに拡大培養し、培地を吸い尽くした。ＤＭＥＭ基礎培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で２回洗浄し、細胞が培養皿の壁から剥がれるまで３７℃で酵素を含まない細胞解離溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で処理してから、細胞を収集した。ＤＭＥＭ基礎培地で２回洗浄し、細胞をカウントした後、細胞をリン酸緩衝液（ｐＨ  ７.２）で２×１０７細胞／ｍｌに希釈した。各免疫化の間、各マウスに０.５ｍｌの細胞懸濁液を腹腔内注射した。１回目と２回目の免疫の間隔は２週間で、その後の免疫間隔は３週間である。最初の免疫を除いて、各免疫の１週間後に採血し、ＥＬＩＳＡで血清中の抗体価と特異性を検出した。表３および図３は、ＥＬＩＳＡによるＨＥＫ−ＣＴＬＡ−４細胞免疫血清および抗体力価検出の結果を示した。
【００７５】
【表４】
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通常、免疫原ＡまたはＢで免疫し、３回の免疫化の後、ほとんどのマウスのＥＬＩＳＡ力価は１：１０００以上に達する可能性があり、Ｈ２Ｌ２マウスが免疫原に対してより優れた体液性免疫応答を生み出し、脾臓細胞をハイブリドーマ細胞の調製に使用できることを示す。
【００７６】
ＡまたはＢステップが完了する前に、選択した各マウスに最後に１００μｇの精製ＣＴＬＡ−４−ｈＦｃ（免疫原Ａおよび免疫原Ｂに対して免疫化されたマウス）またはヒト由来ＣＴＬＡ−４のＨＥＫ２９３−ｈＣＴＬＡ−４安定細胞（免疫原Ｂに対して免疫化されたマウス）を腹腔内注射し、５日後に犠牲させ、脾臓細胞を収集した。ＮＨ４ＯＨを最終濃度１％（ｗ／ｗ）まで加えて、脾臓細胞内の混合赤血球を溶解して、脾臓細胞懸濁液を得た。ＤＭＥＭ基本培地で毎分１０００回転で遠心分離して細胞を３回洗浄し、生細胞数５：１の比率でマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０と混合（ＡＴＣＣから購入）し、高効率の電気融合またはＰＥＧ方法（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，  ＶＯＬ.  ２２０を参照）を使用して、細胞を融合した。融合後の細胞を２０％ウシ胎児血清、１×ＨＡＴを含むＤＭＥＭ培地で希釈し、前記パーセンテージは質量パーセンテージである。次に、１ウェルあたり１×１０５／２０ｕｌに９６ウェル細胞培養プレートに追加し、５％  ＣＯ２、３７℃のインキュベーターに入れ、前記パーセンテージは体積パーセンテージである。１４日後、ＥＬＩＳＡとＡｃｕｍｅｎ（マイクロウェルプレート細胞検出法）で細胞融合プレートの上清をスクリーニングし、ＥＬＩＳＡでＯＤ４５０ｎｍ＞１.０、ＡｃｕｍｅｎでＭＦＩ値＞１００の陽性クローンを２４ウェルプレートに増幅し、１０％（ｗ／ｗ）ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の培地で、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で、拡大培養した。３日間の培養後、２４ウェルプレートで拡大培養した培養液を遠心分離し、上清を収集し、上清について抗体のサブタイプ分析を行った。ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳでＣＴＬＡ−４タンパク質およびＣＴＬＡ−４陽性細胞の結合活性を決定し、リガンド受容体結合実験でＣＴＬＡ−４受容体に対する抗体サンプルの遮断活性を決定した。
【００７７】
２４ウェルプレートのスクリーニング結果によると、ＥＬＩＳＡ実験でＯＤ４５０ｎｍ＞１.０、ＦＡＣＳ実験でＭＦＩ値＞５０およびリガンド受容体結合実験でハイブリドーマ細胞培養上清を選択してＣＴＬＡ−４受容体のブロッキング阻害率が６０％に達したハイブリドーマ細胞を適格な陽性クローンとした。適格なハイブリドーマ細胞を選択して９６ウェル培養プレートに限界希釈法でサブクローニングし、１０％（ｗ／ｗ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。サブクローニングの１０日後、ＥＬＩＳＡとＡｃｕｍｅｎを使用して予備スクリーニングを行い、陽性の単一クローンを選択して２４ウェルプレートに増幅し、培養を継続した。３日後、ＦＡＣＳを使用して陽性抗原結合を確認し、ＣＴＬＡ−４受容体リガンド結合実験を使用して生物活性を評価した（評価基準は、ＥＬＩＳＡ実験ではＯＤ４５０ｎｍ＞１.０、ＦＡＣＳ実験ではＭＦＩ値＞５０、リガンド受容体結合実験におけるＢ７.１リガンドに対するハイブリドーマ細胞培養上清のブロッキング阻害率は６０％に達した）。
【００７８】
２４ウェルプレートサンプルの検出結果によると、陽性クローンを１０％（ｗ／ｗ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）培地で、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２で拡大培養し、凍結溶液［２０％（ｗ／ｗ）ＦＢＳおよび１０％（ｗ／ｗ）ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭ］に懸濁し、従来の方法に従って液体窒素で凍結保存して、後続の抗体の生産、精製、アミノ酸シークエンシングに使用できる本発明のハイブリドーマ細胞を得る。
【００７９】
実施例２  キメラ抗体の同定
（一）フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で抗体とＣＴＬＡ−４発現細胞の結合を検出
実施例１のステップ（二）に記載されるように、ヒト由来ＣＴＬＡ−４をコードする全長ヌクレオチド配列を含むｐＩＲＥＳプラスミドで２９３Ｆ細胞株をトランスフェクトして、ヒトＣＴＬＡ−４を含む２９３Ｆ安定的にトランスフェクトされた細胞株（本明細書ではＨＥＫ２９３−ｈＣＴＬＡ−４安定細胞株と呼ぶ）を得、サル由来ＣＴＬＡ−４ヌクレオチド配列のデータベース登録番号はＸＭ＿００５５７４０１４.１であるサル由来ＣＴＬＡ−４全長遺伝子を含むｐＩＲＥＳプラスミドでＨＥＫ２９３細胞株ををトランスフェクトして、サルＣＴＬＡ−４を含むＨＥＫ２９３安定的にトランスフェクトされた細胞株（本明細書ではＨＥＫ２９３−ｃＣＴＬＡ−４安定細胞株と呼ぶ）を得た。ＨＥＫ２９３−ｈＣＴＬＡ−４安定細胞株とＨＥＫ２９３−ｃＣＴＬＡ−４安定細胞株を９０％コンフルエンスまでＴ−７５細胞培養フラスコで拡大培養し、培地を吸引し、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で２回洗浄し、酵素を含まない細胞解離液（Ｖｅｒｓｅｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入）を使用して、細胞を処理および収集した。細胞をＨＢＳＳ緩衝液で２回洗浄し、細胞をカウントした後、細胞をＨＢＳＳ緩衝液で２×１０６細胞／ｍｌに希釈し、１％ヤギ血清ブロッキング溶液を加え、前記パーセンテージは質量パーセンテージである。氷上で３０分間インキュベートし、ＨＢＳＳ緩衝液で２回遠心分離して洗浄した。収集した細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含むＨＢＳＳ、前記パーセンテージは質量パーセンテージである）で２×１０６細胞／ｍｌに懸濁し、１００μｌ／ウェルに９６ウェルＦＡＣＳ反応プレートに追加し、検出する抗体サンプルを１００μｌ／ウェルに追加し、実施例２で得られた精製されたＣＴＬＡ−４抗体試験サンプルを１００ｕｌ／ウェルに加え、氷上で２時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回遠心分離して洗浄し、１００μｌ／ウェルに蛍光（Ａｌｅｘａ  ４８８）標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を追加し、氷上で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で３回遠心分離して洗浄し、ウェルあたり１００μｌの固定液（４％パラホルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ））を加えて細胞を懸濁し、１０分後、ＦＡＣＳ緩衝液で２回遠心分離して洗浄した。１００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液で細胞を懸濁し、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ社から購入）を使用して結果を検出および分析した。
【００８０】
【表５】
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【表６】
2021526012.tif 000007
【００８１】
結果は図４および図５、表４および表５に示したとおり、検出する抗体は、細胞表面のヒトまたはサルのＣＴＬＡ−４タンパク質に結合でき、各抗体の活性は同等であり、抗体がＣＴＬＡ−４に対して強い結合能力を持っていることを示す。ＩｇＧ対照はヒトＩｇＧであり、表のデータはＭＦＩによって測定された細胞集団の平均蛍光強度値である。
【００８２】
（二）ＣＴＬＡ−４抗体遮断ＣＴＬＡ−４タンパク質とそのリガンドＢ７.１またはＢ７.２の結合を検出
ＣＴＬＡ−４タンパク質の受容体リガンド結合試験でＣＴＬＡ−４抗体遮断ＣＴＬＡ−４タンパク質とそのリガンドＢ７.１またはＢ７.２の結合を検出した。
【００８３】
ＣＴＬＡ−４細胞外ドメインタンパク質（ＣＴＬＡ−４−ｈＦｃ）をＰＢＳで１.０μｇ／ｍＬの最終濃度に希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウェルで加えた。プラスチックフィルムで覆い、４℃で一晩インキュベートし、翌日、プレートをプレート洗浄液（０.０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で２回洗浄し、ブロッキング液（０.０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０および１％（ｗ／ｗ）ＢＳＡを含むＰＢＳ）を加え、室温で２時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を注ぎ捨て、まず５０μｌ／ウェルに実施例２で得られた精製されたＣＴＬＡ−４抗体試験サンプルを加え、次に１００μｌ／ウェルにビオチン標識のＢ７.１細胞外ドメインタンパク質（Ｂ７.１−ｈＦｃ）またはＢ７.２−ｈＦｃを加え、よく混合して３７℃でインキュベートした。２時間後、プレートをプレート洗浄液［０.０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ］で３回洗浄した。１００μｌ／ウェルにＨＲＰ（ホホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識アビジン希釈剤（Ｓｉｇｍａから購入）を加え、３７℃で２時間インキュベートした後、プレートをプレート洗浄液［０.０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ］で３回洗浄した。ＴＭＢ基質１００μｌを各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベートした後、各ウェルに１００μｌの停止液（１.０Ｎ  ＨＣｌ）を加えた。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ３８４ｐｌｕｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して、Ａ４５０ｎｍ値を読み取った。結果は図６、図７および表６、表７に示されたとおりである。
【００８４】
【表７】
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【００８５】
【表８】
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【００８６】
結果は、得られた抗体がＣＴＬＡ−４タンパク質とそのリガンドＢ７.１またはＢ７.２の結合を様々な程度に遮断でき、測定活性が同等であることを示す。ＩｇＧ対照はマウスＩｇＧであり、表のデータは阻害率（％）である。
【００８７】
（三）リンパ球刺激実験によりリンパ球活性に対するＣＴＬＡ−４抗体の影響を検出
リンパ球刺激実験によりＣＴＬＡ−４抗体遮断ＣＴＬＡ−４タンパク質とその受容体Ｂ７.１およびＢ７.２の結合によりＴリンパ球活性の阻害を緩和してＴ細胞の増殖刺激を検出する。
１.Ｆｉｃｏｌｌで全血を分離して末梢血単核リンパ球ＰＢＭＣを取得した
【００８８】
新たに得られた全血をリン酸緩衝液ＰＢＳで１：１の容量比で希釈し、希釈した全血を取得し、滅菌したピペットを使用して、希釈した全血をＦｉｃｏｌｌ液面（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）に広げ、Ｆｉｃｏｌｌと希釈した全血の容量比は３：４であり、振とう混合を避け、室温で４００ｇ、２０℃の勾配で３０分間遠心し、遠心後の遠沈管は３層に分かれ、上層は血漿で、中層は乳白色、即ち、単核リンパ球である。滅菌ピペットを使用して中層細胞を軽く吸引し、新しい遠心チューブにそれらを収集し、ＰＢＳリン酸緩衝液で容量の３倍に希釈し、室温、１００ｇで１０分間遠心分離し、上清を捨てた。ＰＢＳリン酸緩衝液でリンパ球を１０ｍＬに再懸濁し、前の手順を繰り返して血小板を除去した。最後に、リンパ球を１０ｍＬの１０％ウシ胎児血清の多成分ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）に再懸濁し、すなわち末梢血単核リンパ球ＰＢＭＣを使用した。前記パーセンテージは質量パーセンテージである。
【００８９】
２.ＳＥＢ依存ＰＢＭＣ刺激実験
試験前に、等量比に希釈した検出される実施例２で得られた精製されたＣＴＬＡ−４抗体を調製し、試験用試料液を取得した。
得られた末梢血単核球のＰＢＭＣを９６ウェル細胞培養プレートに１ウェルあたり１×１０５細胞１００μｌで広げ、前記試験用試料液を培養プレートに加え、室温で３０分間培養した。最後に、スーパー抗原ＳＥＢを加え、各反応ウェルには５０μｌの１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＥＢが含まれ、各反応ウェルの容量は２５０μＬを保証し、反応プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで７２時間培養した後、上清を収集し、−２０℃で凍結保存し、前記パーセンテージは体積パーセンテージである。
【００９０】
３.細胞上清中のサイトカインインターロイキンＩＬ−２の酵素免疫吸着検出
細胞上清中のサイトカインインターロイキンＩＬ−２含有量の酵素結合免疫吸着検出は、Ｒ＆Ｄシステム関連の検出キットＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−２（Ｓ２０５０）を使用し、説明書に従って操作した。検出抗体を除くすべての検出試薬は、検出キットによって提供された。
【００９１】
細胞上清中のサイトカインインターロイキンＩＬ−２含有量を測定する酵素結合免疫吸着検出は、二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入、ＩＬ−２  Ｃａｔ  ＃  Ｓ２０５０）を使用した。実験操作は厳密にキットの説明書の要件に従っており、すべての検出試薬はキットによって提供された。具体的な実験は次のように簡単に説明される：ＩＬ−２ポリクローナル抗体をＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートでコーティングし、プラスチックフィルムで密封し、４℃で一晩インキュベートし、ステップ２で得られた細胞上清液を検出サンプルとして使用し、標準品を加え、検出サンプルを室温で２時間インキュベートした。各ウェルに４００ｕｌの洗浄液を加え、プレートを４回繰り返して洗浄し、次に、抗ヒトＩＬ−２のホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗体を加え、室温で２時間インキュベートして、マイクロプレート上のＩＬ−２と免疫複合体を形成し、マイクロウェルを洗浄し、基質を加えて発色し、室温で３０分間光を避け、最後に停止液を加え、マイクロプレートリーダーでＡ４５０ｎｍの吸光度を測定した。ステップ２.で説明したＰＢＭＣ刺激実験におけるＩＬ−２分泌に対するＣＴＬＡ−４抗体の影響を検出した。結果は図８、および表８に示されたとおりである。
【００９２】
【表９】
2021526012.tif 000010
結果は、ＰＢＭＣリンパ球刺激試験で検出される抗体がＰＢＭＣのＩＬ−２分泌を増強でき、活性化効果が濃度勾配に依存し、９７Ａ８Ｄ１の活性率が他の抗体よりも優れていることを示す。ここでｈＩｇＧ対照はヒトＩｇＧであり、表のデータはＩＬ−２値（ｐｇ／ｍＬ）である。
【００９３】
実施例３  軽鎖および重鎖可変領域アミノ酸配列の測定
全ＲＮＡの単離：サブクローナル培養の上清が抗原結合について試験された後（すなわち、実施例３〜６の検証および活性決定後）、遠心分離により５×１０７のハイブリドーマ細胞を収集し、１ｍＬのトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）を加えて混合し、１.５ｍｌの遠沈管に移し、室温で５分間静置した。０.２ｍｌのクロロホルムを加え、１５秒間振とうし、２分間静置し、４℃、１２０００ｇで５分間遠心し、上清を取り、新しい１.５ｍｌの遠沈管に移した。０.５ｍｌのイソプロパノールを加え、チューブ内の液体を穏やかに混合し、室温で１０分間静置し、４℃、１２０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を捨てた。１ｍｌの７５％エタノールを加え（前記パーセンテージは体積パーセンテージである）、沈殿物を静かに洗浄し、４℃、１２０００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿物を乾燥させ、ＤＥＰＣ処理したＨ２Ｏを加えて溶解し（５５℃水浴で１０分間）、全ＲＮＡを取得した。
【００９４】
逆転写とＰＣＲ：１μｇの全ＲＮＡを取り、２０ｕｌのシステムを構成し、逆転写酵素を加え、４２℃で６０分間反応させ、７℃で１０分間反応させて反応を停止させた。１μｌのｃＤＮＡ、２５ｐｍｏｌの各プライマー、１μｌのＤＮＡポリメラーゼおよびマッチングバッファーシステム、２５０μｍｏｌのｄＮＴＰを含む５０μｌのＰＣＲシステムを構成した。ＰＣＲプログラムを設定し、９５℃で３分間の前変性、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３５秒間伸長、３５サイクル後、７２℃で５分間のさらに伸長してＰＣＲ産物を得た。逆転写に使用するキットは、Ｔａｋａｒａから購入したＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、アイテム番号ＲＲ０３６である。ＰＣＲに使用されるキットは、ＮＥＢから購入したＱ５超忠実度酵素、アイテム番号Ｍ０４９２である。
【００９５】
クローニングとシークエンシング：５μｌのＰＣＲ産物を取ってアガロースゲル電気泳動検出し、カラム回収キットを使用して陽性サンプルを精製し、ここで回収キットは、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬから購入したＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）  Ｇｅｌ  ＆  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ、アイテム番号７４０６０９である。ライゲーション反応を実行した：５０ｎｇのサンプル、５０ｎｇのＴ担体、０.５μｌのリガーゼ、１μｌの緩衝液、１０μｌの反応システム、１６℃で３０分間反応させ、ここでライゲーションキットはＮＥＢから購入したＴ４  ＤＮＡリガーゼ、アイテム番号Ｍ０４０２である；５μｌのライゲーション産物を１００μｌのコンピテントセル（Ｅｃｏｓ  １０１ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ、Ｙｅａｓｔｅｒｎから購入、アイテム番号ＦＹＥ６０７である）に加え、５分間氷浴した。次に４２℃ウォーターバスで１分間ヒートショックし、氷上に１分間戻し、抗生物質を含まない６５０μｌのＳＯＣ培地を加え、３７℃、２００ＲＰＭ、３０分間シェーカーで蘇生し、２００μｌを取り出して抗生物質を含むＬＢ固体培地に塗布し、３７℃インキュベーターで一晩培養した。翌日、Ｔ担体上でプライマーＭ１３ＦとＭ１３Ｒを使用して、３０μｌＰＣＲシステムを構成し、コロニーＰＣＲを実行し、ピペットチップを使用してコロニーをＰＣＲ反応システムとピペットに浸し、１００ｎＭアンピシリンを含む別のＬＢ固形ペトリ皿に０.５μｌを吸引して菌株を保存した。ＰＣＲ反応後、５μｌを取り出してアガロースゲル電気泳動し、陽性サンプルのシークエンシングを行った。ここで、シークエンシングのステップは、Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ.（１９９１）を参照。
シークエンシングの結果は表９に示したとおりである。
【００９６】
【表１０−１】
2021526012.tif 000011
【表１０−２】
2021526012.tif 000012
【００９７】
ここで、表９の番号は配列表「配列番号」番号であり、例えば、番号９７Ａ８Ｄ１の重鎖タンパク質可変領域のヌクレオチド配列は配列表の配列番号４１である。
ここで、９７Ａ８Ｄ１をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４１における８８番目から１０５番目である；
９７Ａ８Ｄ１をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４１における１４８番目から１９８番目である；
９７Ａ８Ｄ１をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４１における２８９番目から３２１番目である；
【００９８】
９７Ａ８Ｄ１をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４２における７３番目から１０８番目である；
９７Ａ８Ｄ１をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４２における１５１番目から１７７番目である；
９７Ａ８Ｄ１をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４２における２６８番目から２９４番目である；
【００９９】
９２Ｃ８Ｂ６をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４３における８８番目から１０５番目である；
９２Ｃ８Ｂ６をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４３における１４８番目から１９８番目である；
９２Ｃ８Ｂ６をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４３における２８９番目から３２７番目である；
【０１００】
９２Ｃ８Ｂ６をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４４における７３番目から１０５番目である；
９２Ｃ８Ｂ６をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４４における１４８番目から１７４番目である；
９２Ｃ８Ｂ６をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４４における２６５番目から２９４番目である；
【０１０１】
３１Ｃ１２Ｆ３をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４５における８８番目から１０５番目である；
３１Ｃ１２Ｆ３をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４５における１４８番目から１９８番目である；
３１Ｃ１２Ｆ３をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４５における２８６番目から３２７番目である；
【０１０２】
３１Ｃ１２Ｆ３をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４６における７３番目から１０５番目である；
３１Ｃ１２Ｆ３をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４６における１４８番目から１７４番目である；
３１Ｃ１２Ｆ３をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４６における２６５番目から２９１番目である；
【０１０３】
４０Ｃ４Ｃ６をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４７における８８番目から１０５番目である；
４０Ｃ４Ｃ６をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４７における１４８番目から１９８番目である；
４０Ｃ４Ｃ６をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４７における２８９番目から３２７番目である；
【０１０４】
４０Ｃ４Ｃ６をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４８における７３番目から１０５番目である；
４０Ｃ４Ｃ６をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４８における１４８番目から１７４番目である；
４０Ｃ４Ｃ６をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４８における２６５番目から２９１番目である。
【０１０５】
９７Ｂ８Ｅ１をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４９における８８番目から１０５番目である；
９７Ｂ８Ｅ１をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４９における１４８番目から１９８番目である；
９７Ｂ８Ｅ１をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号４９における２８９番目から３３０番目である；
【０１０６】
９７Ｂ８Ｅ１をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号５０における７３番目から１０５番目である；
９７Ｂ８Ｅ１をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号５０における１４８番目から１７４番目である；
９７Ｂ８Ｅ１をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３ドメインのヌクレオチド配列は配列表の配列番号５０における２６５番目から２９１番目である。
【０１０７】
実施例４  完全ヒト抗体ＩｇＧの変換および調製
（一）プラスミドの構築と準備：実施例２は、ハイブリドーマ細胞の培養上清から精製されたＣＴＬＡ−４抗体を取得し、実施例７のシークエンシング結果によれば、ＣＴＬＡ−４抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域配列が明らかにされた。ＣＴＬＡ−４抗体の重鎖可変領域配列をシグナルペプチドとヒト由来重鎖抗体ＩｇＧ１定常領域を含む発現担体（ここで、発現担体はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）に組み換え、ＣＴＬＡ−４抗体の軽鎖可変領域配列をシグナルペプチドとヒト由来抗体軽鎖ｋａｐｐａ定常領域を含む発現担体に組み換え、組み換えプラスミドを得、シークエンシングによって検証された（シークエンシング方法は実施例７のシークエンシング方法と同じである）。アルカリ溶解キット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬから購入）を使用して、純度が向上した組換えプラスミドを抽出し、質量は５００μｇ以上で、０.２２μｍフィルターメンブレン（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅから購入）でろ過して、トランスフェクションのために使用される。
【０１０８】
（二）細胞トランスフェクション：培地Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で２９３Ｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を培養した。シェーカーは３７℃、１３０ＲＰＭ、８％  ＣＯ２（ｖ／ｖ）濃度に設定した。
Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍのトランスフェクション時にＦ６８最終濃度が０.１％（ｖ／ｖ）になるまで１０％（ｖ／ｖ）Ｆ６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を加え、０.１％（ｖ／ｖ）Ｆ６８を含むＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３発現培地、すなわち培地Ａを得た。
【０１０９】
５ｍＬの培地Ａと２００μｇ／ｍＬのＰＥＩ（Ｓｉｇｍａから購入）を混合して、培地Ｂを得た。５ｍＬの培地Ａと１００μｇ／ｍＬのステップ（１）で得られた組み換えプラスミドを混合して、培地Ｃを得た。５分後、培地Ｂと培地Ｃを合わせて混合し、１５分間静置して混合物Ｄを得た。１０ｍＬの混合液Ｄを２９３Ｅの細胞密度が１.５×１０６／ｍＬになるまで１００ｍＬの２９３Ｅ細胞を含む培地Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍにゆっくり加え、ＰＥＩの過剰な濃縮を避けるために加えながら振とうし、シェーカーに入れて培養した。翌日、ペプトンを最終濃度０.５％（ｗ／ｖ）になるまでに加えた。５〜７日目に、培養液の抗体価を測定した。６〜７日目に、遠心分離（３５００ＲＰＭ、３０分）によって上清を収集し、０.２２μｍフィルターで濾過して、精製用の濾過された細胞上清を得た。
【０１１０】
（三）抗体の精製：エンドトキシンフリーのクロマトグラフィーカラムとプロテインＡフィラーの連続生産には、０.１Ｍ  ＮａＯＨで３０分間処理するか、または５カラム容量の０.５Ｍ  ＮａＯＨで洗浄した。長期間使用されていないカラム材料とクロマトグラフィーカラムには、少なくとも１Ｍ  ＮａＯＨを使用して１時間浸し、エンドトキシンフリーの水で中性になるまですすぎ、１０倍のカラム容量の１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００でカラム材料を洗浄した。５カラム容量のＰＢＳ（ＰＢＳリン酸緩衝液、ｐＨ７.２）で平衡化し、ステップ（２）で得られたろ過した細胞上清をカラムに入れ、必要に応じてフロースルーを収集した。カラムをロードした後、５倍のカラム容量ＰＢＳで洗浄した。５倍カラム容量の０.１Ｍ  ｐＨ３.０のＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌで溶出を行い、溶出液を収集し、５倍のカラム容量のｐＨ８.５の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１.５Ｍ  ＮａＣｌ）で中和して、完全ヒトＣＴＬＡ−４抗体を取得した。上記のすべての溶液は、新しく配置する必要がある。完全ヒトＣＴＬＡ−４抗体を取得した後、エンドトキシン汚染を避けるために１×ＰＢＳで４時間透析した。透析後、分光光度法またはキットを使用して濃度を測定し、ＨＰＬＣ−ＳＥＣを使用して抗体の純度を測定し、エンドトキシン検出キット（Ｌｏｎｚａから購入）を使用して抗体エンドトキシンの含有量を検出した。
【０１１１】
実施例５  フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で完全ヒト抗体とＣＴＬＡ−４発現細胞の結合を検出
得られた完全ヒトＣＴＬＡ−４抗体と細胞発現ＣＴＬＡ−４の結合活性を同定し、検出結果はそれぞれ図９、図１０および表１０、表１１に示されたとおりである。
【０１１２】
【表１１】
2021526012.tif 000013
【０１１３】
【表１２】
2021526012.tif 000014
結果は、完全ヒトＩｇＧの形質転換および調製後に得られた完全ヒトＣＴＬＡ−４抗体が、ヒトおよびサルのＣＴＬＡ−４に高い活性で結合でき、抗体活性が近いことを示す。
【０１１４】
実施例６  ＣＴＬＡ−４抗体遮断ＣＴＬＡ−４タンパク質とそのリガンドＢ７.１またはＢ７.２の結合を検出
得られた完全ヒトＣＴＬＡ−４抗体の遮断活性を同定し、検出結果はそれぞれ図１１、図１２および表１２、表１３に示されたとおりである。
【表１３】
2021526012.tif 000015
【０１１５】
【表１４】
2021526012.tif 000016
図１１、図１２および表１２、表１３は、完全ヒトＩｇＧの形質転換後に調製された完全ヒトＣＴＬＡ−４抗体が、ＣＴＬＡ−４とＢ７.１およびＢ７.２の結合を遮断できること、測定された抗体遮断活性が同等であることを示す。
【０１１６】
実施例７  リンパ球刺激実験によりリンパ球活性に対するＣＴＬＡ−４抗体の影響を検出
実験方法は実施例２（三）に、検出結果は表１４および図１３に示されたとおりである。
【表１５】
2021526012.tif 000017
表１４、図１３から、完全にヒト化された抗体はＳＥＢ依存ＰＢＭＣ活性化試験でＩＬ−２分泌を有意に刺激でき、この活性は濃度勾配依存性効果があり、ＣＴＬＡ−４抗体がＴ細胞活性化に対するＣＴＬＡ−４の阻害作用を逆転でき、測定された抗体活性のレベルが同等であることを示す。ここで、ＩｇＧ対照はヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）であり、表１４のデータはＩＬ−２濃度である。
【０１１７】
実施例８  ＰＨＡによって誘導されたＣＤ３＋Ｔリンパ球実験によりＢ７.１またはＢ７.２とＣＴＬＡ−４の結合後のＴリンパ球の活性化に対するＣＴＬＡ−４抗体の遮断を検出
Ｂ７.１またはＢ７.２とＣＴＬＡ−４の結合後のＴリンパ球の活性化に対するＣＴＬＡ−４抗体の遮断を検出した。
Ｔ細胞はＣＤ２８を構成的に発現し、ＰＨＡはＴ細胞を非特異的に活性化できるため、ＣＴＬＡ−４の膜発現を誘導し、Ｒａｊｉ細胞はＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８リガンドＢ７.１およびＢ７.２を構成的に発現し、活性化されたＴ細胞をＲａｊｉ細胞とインキュベートすると、ＣＴＬＡ−４とＣＤ２８はリガンドに競合的に結合し、ＣＴＬＡ−４はＣＤ２８よりもリガンドに対する親和性が高いため、Ｒａｊｉ細胞とインキュベートすると、Ｔ細胞活性化の部分的なダウンレギュレーションとして現れ、ＣＴＬＡ−４のリガンド結合能力が遮断されると、Ｔ細胞活性化のダウンレギュレーションが逆転し、ＩＬ−２分泌の増加として現れる。
【０１１８】
（一）ＰＨＡでヒトＣＤ３＋細胞の活性化を誘導
全血から試薬ＦＩＣＯＬＬＰＡＱＵＥ  ＰＬＵＳを使用し、その説明書に従ってＰＢＭＣ細胞を分離した。具体的なステップは、４.４.２の（５）で説明したとおりである。
ヒトＣＤ３＋細胞抽出キット（ＭａｇＣｅｌｌｅｃｔＴＭ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３＋  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を使用して、得られたＰＢＭＣ細胞を説明書のとおりに操作し、単離および精製されたＣＤ３＋細胞を得、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を６ウェルプレートに接種し、１０μｇ／ｍＬのＰＨＡを加え、７２時間処理して、ＣＴＬＡ−４を過剰発現するＣＤ３＋Ｔ細胞カプセルを得た。
【０１１９】
（二）マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）でＲａｊｉ細胞を処理
使用前に、Ｒａｊｉ細胞を１０μｇ／ｍＬのマイトマイシンで３７℃で１.５時間処理し、ＰＢＳで３回洗浄して残留マイトマイシンを除去した。同時に、試験する精製ＣＴＬＡ−４抗体を等体積比に希釈して調製し、試験用試料液を得た。
【０１２０】
（三）Ｒａｊｉが媒介したＴ細胞カプセルの活性化
ステップ１で得られたＣＤ３＋Ｔ細胞カプセルを９６ウェル細胞培養プレートに接種し、接種密度はそれぞれ１×１０５細胞／ウェルであり、接種体積は５０μＬ／ウェルであり、試験用試料液を５０μＬ／ウェルに加え、３０分間インキュベートし、ステップ２のＲａｊｉ細胞を加え、１００μＬ  ３×１０４細胞／ウェルに９６細胞培養プレートに広げ、３７℃、５％  ＣＯ２のインキュベーターで４日間インキュベートした。サイトカイン検出のために、細胞上清を収集し、前記パーセンテージは体積パーセンテージである。
【０１２１】
（四）細胞上清中のサイトカインインターロイキンＩＬ−２の酵素免疫吸着検出
ステップ３で得られた細胞上清中のサイトカインインターロイキンＩＬ−２を酵素結合免疫吸着検出した。Ｒ＆Ｄシステム関連の検出キットＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−２（Ｓ２０５０）を使用し、説明書に従って操作した。検出抗体を除くすべての検出試薬は、検出キットによって提供された。
図１４は、ＰＨＡ誘発Ｔリンパ嚢細胞活性化試験におけるＩＬ−２分泌に対するＣＴＬＡ−４完全ヒト抗体の影響を示した。結果は、検出した抗体がＴ細胞を刺激してＩＬ２を分泌できることを示しており、効果は抗体濃度と投与量に関連付け、つまり、抗体濃度が増加するとＩＬ２レベルが増加し、９２Ｃ８Ｂ６と９７Ａ８Ｄ１が最高の活性を示す。
【０１２２】
実施例９  抗ＣＴＬＡ−４抗体親和性の分析と測定
抗ヒトＦｃ  ＩｇＧをフローセル１と２に固定した：ＨＢＳ−ＥＰ＋（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０.０５％  Ｐ２０、ｐＨ  ７.４）を実行緩冲液として使用し、固定ウィザードを使用して抗ヒトＦｃ  ＩｇＧを固定した。シリアルＳ  ＣＭ５センサーチップのフローセル１と２を新たに混合された５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＨＳおよび２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＣで活性化した。１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＡＣ（ｐＨ４.５）で抗ヒトＦｃ  ＩｇＧを２０μｇ／ｍＬに希釈し、活性化されたフローセル１および２に注射した。残りのアクティブなカップリングサイトは、１ｍｏｌ／Ｌエタノールアミンでブロックした。
【０１２３】
組み換えＨｉｓ標識ｈＣＴＬＡ−４  ＥＣＤタンパク質を５０ｎｍｏｌ／Ｌに希釈し、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液で２倍の比率で４倍に連続的に希釈した。Ｈｉｓ標識ｈＣＴＬＡ−４  ＥＣＤタンパク質濃度は０ｎｍｏｌ／Ｌ、３.１２５ｎｍｏｌ／Ｌ、６.２５ｎｍｏｌ／Ｌ、１２.５ｎｍｏｌ／Ｌ、２５ｎｍｏｌ／Ｌおよび５０ｎｍｏｌ／Ｌである。ＨＢＳ−ＥＰ＋を実行緩冲液として使用し、ＫＤ測定を行った。各抗体を１０μＬ／分の流速でＣＭ５センサーフローセル２に注射して、２３０ＲＵの応答を達成した。調製したＨｉｓ標識ｈＣＴＬＡ−４ＥＣＤタンパク質を３０μＬ／分の流速で１８０秒間フローセル１および２に注入した。解離測定のために、緩衝液フローを４００秒間維持した（３０μＬ／分）。試験した抗体を表面から除去するために、１０ｍｍｏｌ／Ｌのグリシン−ＨＣｌｐＨ１.５を２０秒間注入した（３０μＬ／分）。フローセル１をフローセルとして使用した。各濃度の連続希釈したＨｉｓ−標識ＣＴＬＡ−４ＥＣＤタンパク質に前記ステップを繰り返した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェア１.０を使用して、各抗体のＫＤ値を評価し、１：１結合モデルを使用してデータを適合した。結果は表１５に示したとおりである。
【０１２４】
【表１６】
2021526012.tif 000018
結果は、検出した抗体のＫＤ値がすべてナノモル（ｎＭ）レベルにあり、ツール抗体に匹敵することを示し、これらの抗体がヒトＣＴＬＡ−４  ＥＣＤに対して良好な親和性を持っていることを示す。ここで、９７Ａ８Ｄ１抗体はヒトＣＴＬＡ−４  ＥＣＤに対して最も良好な親和性を持ち、インビボ活性確認用の候補抗体として適する。
【０１２５】
実施例１０  マウス体内における抗ＣＴＬＡ−４抗体の抗腫瘍活性の評価
ＭＣ３８同系マウスモデルを採用し、ヒトＣＴＬＡ−４遺伝子ノックインＣ５７ＢＬ／６マウスを使用して、マウス体内における抗体の抗腫瘍活性を評価した。実験は、以下のように設計した：５０匹のヒトＣＴＬＡ−４遺伝子ノックインＣ５７ＢＬ／６マウスを選択し、１０匹／組に６組に分け、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂとアイソタイプ抗体ｈＩｇＧ１を対照として使用し、サンプルは９２Ｃ８Ｂ６、９７Ａ８Ｄ１および９７Ｂ８Ｅ１である。投与経路は１０ｍｇ／ｋｇに腹腔内注射し、０、３、６、１０日目に腹腔内注射、２４日目にマウスを犠牲にし、腫瘍体積、マウス体重、腫瘍重量およびマウスの生存率を測定した。実験結果は図１５に示したとおりである。
【０１２６】
図１５の結果は、本発明の抗体（９２Ｃ８Ｂ６、９７Ａ８Ｄ１および９７Ｂ８Ｅ１を含む）が腫瘍増殖を有意に阻害でき、阻害効果が対照抗体Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂも有意に優れていることを示していることを示す（例えば、９７Ａ８Ｄ１の生存期間の中央値は２２.５日であり、これはＩｐｉｌｉｍｕｍａｂよりも１９日優れている）。
【０１２７】
実施例１１  脱フコース抗ＣＴＬＡ−４抗体の調製および特徴付け
この実施例において、フコシルトランスフェラーゼの欠く細胞株で完全ヒト抗ＣＴＬＡ−４抗体９７Ａ８Ｄ１を発現して、細胞株が脱フコシル化タンパク質を産生できるようにした。Ｉｄｅ  ＺおよびＥｎｄｏＳで酵素分解した後の脱フコシル化抗体９７Ａ８Ｄ１およびフコシル化抗体９７Ａ８Ｄ１の分子量を、液体クロマトグラフィー−質量分析技術によって分析して、抗体のＦｃ末端にフコースが含まれているかどうかを判断した。分析結果は、図１６に示したとおりである。
【０１２８】
図１６の結果は、酵素処理後、脱フコシル化抗体９７Ａ８Ｄ１の脱糖後のＦｃの分子量は２３７５５  Ｄａ（図１６Ａ）であり、糖を除去しない場合のＦｃの分子量は２３９５７Ｄａ（図１６Ｂ）であり、２つの間の分子量の差は２０２Ｄａ（ＧｌｃＮＡｃ）である。酵素処理後、アフコシル化抗体９７Ａ８Ｄ１の脱糖後のＦｃの分子量は２３７５５Ｄａ（図１６Ｃ）であり、糖を除去しない場合のＦｃの分子量は２４１０４Ｄａ（図１６Ｄ）であり、２つの間の分子量の差は３４９Ｄａ（Ｆｕｃ＋ＧｌｃＮＡｃ）であり、また脱フコシル化抗体のＦｃの分子量（２３９５７Ｄａ）がアフコシル化抗体のＦｃの分子量（２４１０４Ｄａ）より１４７Ｄａ少ないため、分子量レベルでは、脱フコシル化抗体にはフコースが含まれておらず、アフコシル化抗体にフコースが含まれていると推測される。
【０１２９】
実施例１２  リンパ球刺激実験でリンパ球活性に対する脱フコシル化抗ＣＴＬＡ−４抗体の影響を検出
実験方法は、実施例２（三）に、検出結果は表１８および図１７に示したとおりである。
【表１７】
2021526012.tif 000019
表１８、図１７は、脱フコシル化およびフコシル化抗ＣＴＬＡ−４抗体はすべてＴ細胞活性化に対するＣＴＬＡ−４の阻害効果を逆転させることができるが、脱フコシル化抗ＣＴＬＡ−４抗体の活性がフコシル化抗ＣＴＬＡ−４抗体より優れていることを示す。
【０１３０】
討論
（１）野生型マウスを免疫することで抗体を得ることができるが、ヒト化抗体を得るにはマウス由来抗体をヒト化する必要があり、不利な点は、改造された抗体がより免疫原性であり、抗体の構造が変化し、その結果、活性が失われたり、製造性が低下したりする可能性があることである。
（２）完全ヒト由来トランスジェニックマウスを免疫することにより完全ヒト抗体を得ることができるが、得られる抗体の数または親和性は乏しい。
【０１３１】
（３）抗体発現および活性スクリーニングは、ファージディスプレイ技術を使用して免疫化マウス抗体ライブラリーを構築することによって実行できるが、抗体の重鎖および軽鎖のランダム組換えは、形成された抗体の不十分な産生をもたらす。
（４）ヒト由来抗体ライブラリー用ファージディスプレイ技術を構築することにより抗体を発現およびスクリーニングすることができるが、免疫されていないため、得られた抗体の親和性は低い。
（５）免疫原は、ポリペプチド、タンパク質、その他の種類の細胞や遺伝子である可能性があるが、不正確なコンフォメーション、低発現、免疫原性の低下などの問題がある。
【０１３２】
本発明で言及されるすべての文書は、あたかも各文書が個々に参照により組み込まれたかのように、本出願に参照により組み込まれている。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も本願に添付された特許請求の範囲によって定義される範囲内にあることを理解されたい。
【０１３３】
本発明に関する配列情報は以下のとおりである：
ＣＴＬＡ−４抗体のアミノ酸配列番号に対応するアミノ酸配列、ここでＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’、ＣＤＲ３’はそれぞれ下線を引いた：
【０１３４】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ.１  ＞９７Ａ８Ｄ１＿ＶＨ  （ｍＡｂ４９）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧ  ＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬ  ＳＣＶＡＳＧＦＴＦＮ  ＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶ  ＩＷＹＧＧＲＮＫＦＹ  ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ  ＬＥＭＮＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＲＡＤ  ＷＧＧＷＦＤＰＷＧＱ  ＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０１３５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ.５  ＞９７Ａ８Ｄ１＿ＶＬ  （ｍＡｂ４９）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴ  ＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴ  ＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳ  ＳＴＹＬＡＷＹＱＱＫ  ＰＧＱＡＰＲＬＬＩＨ  ＧＡＦＳＲＡＴＧＩＰ  ＤＲＦＳＧＳＧＳＧＰ  ＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥ  ＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱ  ＱＹＧＴＳＰＦＴＦＧ  ＰＧＴＫＶＤＩＫ
【０１３６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ.９＞９２Ｃ８Ｂ６＿ＶＨ  （ｍＡｂ４２）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧ  ＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ  ＮＦＧＭＨＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶ  ＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹ  ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＦ  ＬＱＭＮＧＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＫＧＧ  ＩＬＭＡＧＴＬＤＹＷ  ＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０１３７】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ.１３＞９２Ｃ８Ｂ６＿ＶＬ  （ｍＡｂ４２）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ  ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ  ＩＴＣＲＡＳＱＳＶＳ  ＴＹＬＮＷＹＱＱＫＰ  ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡ  ＡＳＳＦＱＳＧＶＰＳ  ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ  ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ  ＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱ  ＳＹＳＴＰＦＴＦＧＰ  ＧＴＫＶＤＩＫ
【０１３８】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ.１７＞３１Ｃ１２Ｆ３＿ＶＨ  （ｍＡｂ０１０）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧ  ＶＶＱＰＧＲＳＬＩＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ  ＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶ  ＶＷＹＤＧＳＮＫＹＹ  ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ  ＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧ  ＩＶＶＰＧＬＦＥＹＷ  ＧＱＧＳＬＶＴＶＳＳ
【０１３９】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ.２１＞３１Ｃ１２Ｆ３＿ＶＬ  （ｍＡｂ０１０）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ  ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＡ  ＩＴＣＲＴＳＱＳＩＳ  ＮＬＬＮＷＹＱＱＫＰ  ＧＫＡＰＥＬＬＩＹＡ  ＰＳＳＦＱＳＧＶＰＳ  ＲＦＲＧＳＧＳＧＴＤ  ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ  ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱ  ＳＹＳＴＰＦＴＦＧＰ  ＧＴＫＶＤＩＫ
【０１４０】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ.２５＞４０Ｃ４Ｃ６＿ＶＨ  （ｍＡｂ０９）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧ  ＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ  ＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶ  ＩＷＹＤＧＲＮＫＹＹ  ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ  ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＲＡＳ  ＧＳＹＳＹＹＦＤＹＷ  ＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０１４１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ.２９＞４０Ｃ４Ｃ６＿ＶＬ  （ｍＡｂ０９）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ  ＬＳＡＳＶＧＧＲＶＴ  ＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳ  ＳＦＬＮＷＹＱＨＥＬ  ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧ  ＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳ  ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ  ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ  ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱ  ＴＹＳＴＰＦＴＦＧＰ  ＧＴＫＶＤＩＫ
【０１４２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ.３３＞９７Ｂ８Ｅ１＿ＶＨ  （ｍＡｂ５０）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧ  ＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ  ＳＹＶＭＨＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶ  ＩＷＳＤＧＲＮＫＹＹ  ＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ  ＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＡＲＳＧ  ＩＡＬＡＧＮＡＦＤＩ  ＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳ  Ｓ
【０１４３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ.３７＞９７Ｂ８Ｅ１＿ＶＬ  （ｍＡｂ５０）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ  ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ  ＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳ  ＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰ  ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡ  ＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳ  ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ  ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ  ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱ  ＳＹＳＴＰＦＴＦＧＰ  ＧＴＫＶＤＩＫ
【０１４４】
ＣＴＬＡ−４抗体のコーディングアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列、ここでＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’、ＣＤＲ３’のコーディングヌクレオチド配列はそれぞれ下線を引いた：
【０１４５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ.４１＿９７Ａ８Ｄ１＿ＶＨ  （ｍＡｂ４９）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＴＡＧＣＧＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＡＴＡＡＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＡＡＴＡＡＡＴＴＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＴＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＧＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＣＴＧＡＣＴＧＧＧＧＡＧＧＧＴＧＧＴＴＣＧＡＣＣＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
【０１４６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ.４２＿９７Ａ８Ｄ１＿ＶＬ  （ｍＡｂ４９）
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＣＡＴＧＧＴＧＣＡＴＴＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＣＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＴＧＧＴＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＴＣＡＡＡ
【０１４７】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ.４３＿９２Ｃ８Ｂ６＿ＶＨ  （ｍＡｂ４２）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＡＣＴＴＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＧＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＧＧＧＧＧＴＡＴＡＴＴＡＡＴＧＧＣＴＧＧＴＡＣＧＣＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
【０１４８】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ.４４＿９２Ｃ８Ｂ６＿ＶＬ  （ｍＡｂ４２）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＣＧＴＴＡＧＣＡＣＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴＣＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＴＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＡＧＴＴＡＣＡＧＴＡＣＣＣＣＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＴＣＡＡＡ
【０１４９】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ.４５＿３１Ｃ１２Ｆ３＿ＶＨ  （ｍＡｂ０１０）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＴＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＧＴＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＧＴＡＴＡＧＴＡＧＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＴＴＴＧＡＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
【０１５０】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ.４６＿３１Ｃ１２Ｆ３＿ＶＬ  （ｍＡｂ０１０）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＧＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＡＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＣＡＴＴＡＧＴＡＡＣＴＴＧＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＧＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴＣＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＴＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＡＧＴＴＡＣＡＧＴＡＣＣＣＣＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＴＣＡＡＡ
【０１５１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ.４７＿４０Ｃ４Ｃ６＿ＶＨ  （ｍＡｂ０９）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＡＡＡＴＡＡＡＴＡＴＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＧＧＣＴＴＣＧＧＧＧＡＧＴＴＡＴＴＣＧＴＡＣＴＡＣＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
【０１５２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ.４８＿４０Ｃ４Ｃ６＿ＶＬ  （ｍＡｂ０９）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＣＡＴＴＡＧＣＡＧＴＴＴＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＴＧＡＡＣＴＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＧＴＧＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡ
ＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＡＣＴＴＡＣＡＧＴＡＣＣＣＣＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＴＣＡＡＡ
【０１５３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ.４９＿９７Ｂ８Ｅ１＿ＶＨ  （ｍＡｂ５０）
ＣＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＧＴＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＧＧＴＣＴＧＡＴＧＧＡＡＧＡＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＴＡＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＣＧＧＴＣＧＧＧＴＡＴＡＧＣＧＣＴＧＧＣＴＧＧＴＡＡＣＧＣＴＴＴＴＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＴＣＡ
【０１５４】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ.５０＿９７Ｂ８Ｅ１＿ＶＬ  （ｍＡｂ５０）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＣＡＴＴＡＧＣＡＧＴＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＡＧＴＴＡＣＡＧＴＡＣＣＣＣＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＴＣＡＡＡ
【０１５５】
【表１８】
2021526012.tif 000020
【０１５６】
【表１９】
2021526012.tif 000021
【０１５７】
参照文献：
［４］任軍、黄紅艶、免疫チェックポイントを標的した腫瘍免疫治療の現状と傾向［Ｊ］．中国腫瘍臨床、２０１４、４１（７）：４１５−４１９
【図１】
2021526012.tif 000022
【図２】
2021526012.tif 000023
【図３】
2021526012.tif 000024
【図４】
2021526012.tif 000025
【図５】
2021526012.tif 000026
【図６】
2021526012.tif 000027
【図７】
2021526012.tif 000028
【図８】
2021526012.tif 000029
【図９】
2021526012.tif 000030
【図１０】
2021526012.tif 000031
【図１１−１】
2021526012.tif 000032
【図１１−２】
2021526012.tif 000033
【図１２】
2021526012.tif 000034
【図１３】
2021526012.tif 000035
【図１４−１】
2021526012.tif 000036
【図１４−２】
2021526012.tif 000037
【図１５】
2021526012.tif 000038
【図１６−１】
2021526012.tif 000039
【図１６−２】
2021526012.tif 000040
【図１７】
2021526012.tif 000041
【配列表】
2021526012000001.app
【国際調査報告】
2021526012.tif 000042
2021526012.tif 000043
2021526012.tif 000044
2021526012.tif 000045
2021526012.tif 000046
2021526012.tif 000047