(57)【要約】  本発明は、グリコシル化タンパク質および非グリコシル化タンパク質を含む混合物からの、グリコシル化タンパク質の除去による、非グリコシル化インスリンアナログの精製のためのプロセスに関する。除去は、２つのＲＰ−ＨＰＬＣステップの組み合わせにより達成される。
2021535214.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非グリコシル化インスリンアナログおよびグリコシル化インスリンアナログの両方を含む複合混合物からの、非グリコシル化インスリンアナログの精製のためのプロセスであって、前記精製プロセスは：
ａ）酸性ｐＨにおいて、アセトニトリルなどの有機修飾剤と組み合わせたイオンペアリング剤の存在下、前記複合混合物を用いてＲＰ−ＨＰＬＣを行い、部分的に精製された非グリコシル化インスリンアナログを含む第１の混合物を生じるステップ；および
ｂ）アルカリ性ｐＨにおいて、アセトニトリルなどの有機修飾剤と組み合わせたイオンペアリング剤の存在下、第１の混合物についてＲＰ−ＨＰＬＣを行い、少なくとも９９．９５％精製された非グリコシル化インスリンアナログを得るステップ、
または；
ａ）アルカリ性ｐＨにおいて、アセトニトリルなどの有機修飾剤と組み合わせたイオンペアリング剤の存在下、第１の混合物についてＲＰ−ＨＰＬＣを行い、部分的に精製された非グリコシル化インスリンアナログを含む第１の混合物を生じるステップ；および
ｂ）酸性ｐＨにおいて、アセトニトリルなどの有機修飾剤と組み合わせたイオンペアリング剤の存在下、前記第１の混合物を用いてＲＰ−ＨＰＬＣを行い、少なくとも９９．９５％精製された非グリコシル化インスリンアナログを得るステップ、
を含む、前記プロセス。
【請求項２】
インスリンアナログが、インスリン  グラルギンおよびインスリン  リスプロからなる群から選択される、請求項1に記載のプロセス。
【請求項３】
請求項１に記載のプロセスであって、低ｐＨベースのＲＰ−ＨＰＬＣにより得られる部分的に精製された非グリコシル化インスリンアナログを含む第１の混合物が、以下のステップ：
ａ）ＲＰ−ＨＰＬＣカラムをシリカベースの樹脂、好ましくはＣ８で充填するステップ；
ｂ）４〜１２ｇ／Ｌの容量のカラムにロードするステップ；
ｃ）有機修飾剤、好ましくはアセトニトリルと組み合わせた、イオンペアリング剤、好ましくはオクタンスルホン酸（ＯＳＡ）を用いて、３．５〜３．９の範囲の酸性ｐＨで、カラムを洗浄するステップ；および
ｄ）部分的に精製された非グリコシル化インスリンアナログの第１の混合物を溶出させるために、２４％〜３１％の線形勾配を行うステップ、
を含む、前記プロセス。
【請求項４】
請求項１に記載のプロセスであって、低ｐＨベースのＲＰ−ＨＰＬＣステップに続く高ｐＨベースのＲＰ−ＨＰＬＣにより得られる、少なくとも９９．９５％精製された非グリコシル化インスリンアナログが、以下のステップ：
ａ）ＲＰ−ＨＰＬＣカラムをシリカベースの樹脂、好ましくはＣ８で充填するステップ；
ｂ）第１の混合物を、４〜１２ｇ／Ｌの容量のカラムにロードするステップ；
ｃ）アセトニトリルと組み合わせた、イオンペアリング剤を用いて、８．３〜８．７の範囲のアルカリ性ｐＨで、カラムを洗浄するステップ；および
ｄ）少なくとも９９．９５％精製された非グリコシル化インスリンアナログを溶出させるために、２５％〜２９％の線形勾配を行うステップ、
を含む、前記プロセス。
【請求項５】
請求項１に記載のプロセスであって、部分的に精製された非グリコシル化インスリンアナログを含む第1の混合物が、以下のステップ：
ａ）ＲＰ−ＨＰＬＣカラムをシリカベースの樹脂、好ましくはＣ８で充填するステップ；
ｂ）第１の混合物を、４〜１２ｇ／Ｌの容量のカラムにロードするステップ；
ｃ）アセトニトリルを組み合わせた、イオンペアリング剤を用いて、７．３〜８．７の範囲のアルカリ性ｐＨで、カラムを洗浄するステップ；および
ｄ）部分的に精製された非グリコシル化インスリンアナログの第１の混合物を溶出させるために、２５％〜２９％の線形勾配を行うステップ、
を含む高ｐＨベースのＲＰ−ＨＰＬＣにより得られる、前記プロセス。
【請求項６】
請求項１に記載のプロセスであって、高ｐＨベースのＲＰ−ＨＰＬＣステップに続く低ｐＨベースのＲＰ−ＨＰＬＣにより得られる、少なくとも９９．９５％精製されたインスリンアナログが、以下のステップ：
ａ）ＲＰ−ＨＰＬＣカラムをシリカベースの樹脂、好ましくはＣ８で充填するステップ；
ｂ）４〜１２ｇ／Ｌの容量のカラムにロードするステップ；
ｃ）有機修飾剤、好ましくはアセトニトリルと組み合わせた、イオンペアリング剤、好ましくはオクタンスルホン酸（ＯＳＡ）を用いて、３．５〜３．９の範囲の酸性ｐＨで、カラムを洗浄するステップ；および
ｄ）少なくとも９９．９５％精製された非グリコシル化インスリンアナログを溶出させるために、２４％〜３１％の線形勾配を行うステップ、
を含む、前記プロセス。
【請求項７】
イオンペアリング剤が、オクタンスルホン酸（ＯＳＡ）のナトリウム塩、過塩素酸ナトリウム、および重硫酸テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＢ）からなる群から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
インスリンアナログがインスリン  グラルギンである場合には、イオンペアリング剤が過塩素酸ナトリウムであり、およびインスリンアナログがインスリン  リスプロである場合には、イオンペアリング剤がＴＢＡＢである、請求項４または５に記載のプロセス。
【請求項９】
インスリンアナログが、インスリン  グラルギンのグリコシル化バリアントを０．０５％未満含むインスリン  グラルギンである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１０】
インスリンアナログが、インスリン  リスプロのグリコシル化バリアントを０．０５％未満含むインスリン  リスプロである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１１】
インスリン  グラルギンのグリコシル化バリアントが少なくとも９９．９５％含まれていない、非グリコシル化インスリン  グラルギン。
【請求項１２】
インスリン  リスプロのグリコシル化バリアントが少なくとも９９．９５％含まれていない、非グリコシル化インスリン  リスプロ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、タンパク質精製方法の分野に関する。特に、非グリコシル化インスリンアナログの精製のためのクロマトグラフィープロセスが提供される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
組換え型のインスリン、インスリンアナログおよび／またはインスリン誘導体は、様々な微生物発現系で製造されてきた。大腸菌、出芽酵母（s.cerevisiae）などの生物は、組換えヒトインスリンおよびその誘導体の商業的製造のために採用されてきた。タンパク質またはタンパク質前駆体は、酵母（yeast）発現系に由来する場合があり、高い発現レベルとグリコシル化タンパク質前駆体の増加との間には相関が観察されている。それゆえ、グリコシル化タンパク質から非グリコシル化タンパク質を分離する、より効率的なプロセスに対する必要性がますます明らかになっている。低い発現レベル、下流精製における困難性などのこれらの系の欠点により、タンパク質発現系としては、メチル栄養酵母であるピキア酵母（Pichia pastoris）の使用が好まれてきた。米国特許第６，８００，６０６号においては、高発現、低製造コスト、高密度培養などのピキア酵母発現系の利点が言及されている。
【０００３】
しかしながら、ピキア酵母発現系の主要な欠点の一つは、組換えタンパク質の翻訳後修飾であり、これは、精製するのが非常に厳しい最終生成物中に不純物として存在する。タンパク質の翻訳後修飾は多数知られているが、翻訳後修飾の最も一般的な形態はグリコシル化である（Hart G. W, Glycosylation, Curr. Opin. Cell. Biol 1992; 4: 1017）。グリコシル化は、発現系に依存してＮ−結合またはＯ−結合のいずれかであり得る（Gemmill T Rら、Overview of N- and O-linked oligosaccharide structures found in various yeast species, Biochemica et Biophysica Acta, 1999; 1426:227）。グリコシル化は、タンパク質構造の安定性、免疫原性、クリアランス率、タンパク質分解からの保護に影響を与え、タンパク質の溶解性を改善する（Walsh G, Biopharmaceutical benchmarks 2006, Nature Biotechnology, 2006; 24:769）。
【０００４】
米国特許第６，１８０，７５７号は、カルシウム（Ｃａ＋＋）含有溶離液を用いて、グリコシル化タンパク質またはタンパク質前駆体を、非グリコシル化タンパク質またはタンパク質前駆体からクロマトグラフィーにより分離するプロセスに関する。このプロセスを用いることにより、実質的にグリコシル化タンパク質が含まれていない、非グリコシル化タンパク質を含む画分が得られる。しかし、この特許は、完全に精製された生成物を開示していない。
【０００５】
バイオコン社（Biocon Limited）による米国特許第８，８０２，８１６号は、純度９６％の精製された異種組換えインスリン  グラルギン（glargine）を生じる、不純物からの生成物の分離および／または精製方法に関する。
バイオコン社による米国特許公開第２０１２０１７８９００号は、インスリン  アスパルト（Aspart）、Atisoban、インスリン  グラルギンおよびインスリン  リスプロ（Lispro）の精製のためのＲＰ−ＨＰＬＣプロセスを開示している。このプロセスは、有機修飾剤と組み合わせたイオンペアリング剤を用いたＲＰ−ＨＰＬＣを採用することを含む。
【発明の概要】
【０００６】
発明の目的
本発明の目的は、モノグリコシル化、ジグリコシル化またはトリグリコシル化バリアントを実質的に含まない、少なくとも９９．９５％精製された非グリコシル化インスリン  グラルギンおよび非グリコシル化インスリン  リスプロを得るためのプロセスを提供することである。これは、２つの逆相ＨＰＬＣステップの組み合わせを使用することによって達成され、ここで、第１のステップは、より低いｐＨで好ましいイオンペアリング剤としてオクタンスルホン酸（ＯＳＡ）を用いて行われ、第２のステップは、好ましいイオンペアリング剤として過塩素酸ナトリウムまたは重硫酸テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＢ）を用いて高いｐＨで行われる。第１のステップおよび第２のステップは、逆の順序で行って、インスリン  グラルギンまたはインスリン  リスプロのグリコシル化バリアントの少なくとも９９．９５％除去が得られるようにしてもよい。
【０００７】
発明の概要
本発明は、インスリン  リスプロおよびグラルギンの非グリコシル化バリアント、モノグリコシル化バリアントおよびポリグリコシル化バリアントを含む複合混合物から、前記グリコシル化バリアントの少なくとも９９．９５％除去を達成することによる、インスリン  グラルギンおよびインスリン  リスプロなどの非グリコシル化インスリンアナログの精製のためのプロセスに関する。
【０００８】
精製プロセスは、連続して実行される、逆相−高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）の２つのステップを含む。１つの可能な方法において、第１のステップのＲＰ−ＨＰＬＣは、前記複合混合物を用い、有機修飾剤、好ましくはアセトニトリルと組み合わせたイオンペアリング剤、好ましくはオクタンスルホン酸（ＯＳＡ）の存在下、酸性ｐＨで行われ、著しく減少したレベルのインスリンアナログのグリコシル化バリアントを含んだ、部分的に精製された非グリコシル化インスリンアナログを含む第１の混合物を生じる。第２のステップのＲＰ−ＨＰＬＣは、第１の混合物を用い、イオンペアリング剤と有機修飾剤、好ましくはアセトニトリルとを組み合わせて、塩基性ｐＨで行われ、少なくとも９９．９５％精製された非グリコシル化インスリンアナログを生じる。
【０００９】
第２の可能な方法においては、第１のステップのＲＰ−ＨＰＬＣは、前記複合混合物を用い、イオンペアリング剤と有機修飾剤、好ましくはアセトニトリルとを組み合わせて、塩基性ｐＨで行われ、著しく減少したレベルのインスリンアナログのグリコシル化バリアントを含んだ、部分的に精製された非グリコシル化インスリンアナログを含む第１の混合物を生じる。第２のステップのＲＰ−ＨＰＬＣは、第１の混合物を用い、有機修飾剤、好ましくはアセトニトリルと組み合わせたイオンペアリング剤、好ましくはオクタンスルホン酸（ＯＳＡ）の存在下で、酸性ｐＨで行われ、少なくとも９９．９５％精製された非グリコシル化インスリンアナログを生じる。
【００１０】
インスリンアナログは、インスリン  グラルギン、またはインスリン  リスプロであり得る。インスリンアナログがインスリン  グラルギンである場合、塩基性ｐＨ条件下でのＲＰ−ＨＰＬＣにおいて用いられるイオンペアリング剤は、好ましくは過塩素酸ナトリウムである。インスリンアナログがインスリン  リスプロである場合、塩基性ｐＨ条件下でのＲＰ−ＨＰＬＣにおいて用いられるイオンペアリング剤は、好ましくはＴＢＡＢである。
【００１１】
グリコシル化型のインスリンアナログの除去は、低ｐＨベースのＲＰ−ＨＰＬＣと高ｐＨベースのＲＰ−ＨＰＬＣとの組み合わせによって達成される。その結果、インスリン  グラルギンおよびインスリン  リスプロのグリコシル化バリアントの少なくとも９９．９５％が除去される。
本概要は、請求の範囲に記載された主題の本質的な特徴を認定することを意図するものでなく、また、請求の範囲に記載された主題の範囲を決定または限定するために用いられることを意図するものでもない。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、および本開示の側面をさらに例示するために含まれている。本開示は、本明細書に提示された特定の態様の詳細な説明と組み合わせて図面を参照することにより、よりよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、精製ステップ−１のプロセスのフローチャートを表す。
【図２】図２は、精製ステップ−２のプロセスのフローチャートを表す。
【図３Ａ】図３Ａは、低ｐＨクロマトグラフィーの後に高ｐＨクロマトグラフィーが続く、インスリン  グラルギンの精製プロセスの、逆相精製−１最終産物のＵＶおよびＴＩＣクロマトグラムを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、低ｐＨクロマトグラフィーの後に高ｐＨクロマトグラフィーが続く、インスリン  グラルギンの精製プロセスの、逆相精製−２最終産物のＵＶおよびＴＩＣクロマトグラムを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、低ｐＨクロマトグラフィーの後に高ｐＨクロマトグラフィーが続く、インスリン  リスプロの精製プロセスの、逆相精製−１最終産物についての、質量分析データ−ＵＶおよびＴＩＣクロマトグラムを表す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、低ｐＨクロマトグラフィーの後に高ｐＨクロマトグラフィーが続く、インスリン  リスプロの精製プロセスの、逆相精製−１最終産物についての、質量分析データ−ＵＶおよびＴＩＣクロマトグラムを表す。
【００１３】
【図５Ａ】図５Ａは、低ｐＨクロマトグラフィーの後に高ｐＨクロマトグラフィーが続く、インスリン  リスプロの精製プロセスの、逆相精製−２最終産物の、ＵＶおよびＴＩＣクロマトグラムを表す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、低ｐＨクロマトグラフィーの後に高ｐＨクロマトグラフィーが続く、インスリン  リスプロの精製プロセスの、逆相精製−２最終産物の、ＵＶおよびＴＩＣクロマトグラムを表す。
【図６Ａ】図６Ａは、高ｐＨクロマトグラフィーの後に低ｐＨクロマトグラフィーが続く、インスリン  グラルギンの精製プロセスの、逆相精製−１および逆相精製−２最終産物の、質量分析データを表す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、高ｐＨクロマトグラフィーの後に低ｐＨクロマトグラフィーが続く、インスリン  グラルギンの精製プロセスの、逆相精製−１および逆相精製−２最終産物の、質量分析データを表す。
【図７Ａ】図７Ａ  高ｐＨクロマトグラフィーの後に低ｐＨクロマトグラフィーが続く、インスリン  リスプロの精製プロセスの、逆相精製−１最終産物のＵＶおよびＴＩＣクロマトグラム。
【図７Ｂ】図７Ｂ  高ｐＨクロマトグラフィーの後に低ｐＨクロマトグラフィーが続く、インスリン  リスプロの精製プロセスの、逆相精製−１最終産物のＵＶおよびＴＩＣクロマトグラム。
【図７Ｃ】図７Ｃ  高ｐＨクロマトグラフィーの後に低ｐＨクロマトグラフィーが続く、インスリン  リスプロの精製プロセスの、逆相精製−１最終産物のＵＶおよびＴＩＣクロマトグラム。
【図８Ａ】図８Ａ  高ｐＨクロマトグラフィーの後に低ｐＨクロマトグラフィーが続く、インスリン  リスプロの精製プロセスの、逆相精製−２最終産物のＵＶおよびＴＩＣクロマトグラム。
【図８Ｂ】図８Ｂ  高ｐＨクロマトグラフィーの後に低ｐＨクロマトグラフィーが続く、インスリン  リスプロの精製プロセスの、逆相精製−２最終産物のＵＶおよびＴＩＣクロマトグラム。
【図８Ｃ】図８Ｃ  高ｐＨクロマトグラフィーの後に低ｐＨクロマトグラフィーが続く、インスリン  リスプロの精製プロセスの、逆相精製−２最終産物のＵＶおよびＴＩＣクロマトグラム。
【００１４】
発明の詳細な説明
当業者は、本明細書において記載されている発明が、具体的に記載されているもの以外の変更および改変の対象となることが分かるであろう。本明細書において記載されている発明は、全てのかかる変更および改変を含むことが理解されるはずである。本発明はまた、本明細書中で言及されるまたは示される、全てのかかるステップ、特徴、組成物および方法を、個々にもしくはまとめて含み、ならびに前記ステップまたは特徴の任意の２つ以上の任意の全ての組み合わせを含む。
【００１５】
定義：
便宜上、本発明のさらなる説明の前に、本明細書において採用されている特定の用語、例をここにまとめる。これらの定義は、開示の残りの部分に照らして解釈されるべきであり、当業者により理解されるべきである。他に定義されていない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、当該技術分野における通常の知識を有する者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書全体にわたって用いられる用語は、特定の場合において他に限定されていない限り、以下のように定義される。
本開示は、例示のみを目的として意図されている本明細書において記載されている特定の態様によって、範囲が限定されるべきではない。
機能的に等価なプロセスおよび方法は、本明細書において記載されているように、明らかに本開示の範囲内にある。
【００１６】
用語「脱グリコシル化」は、特に、糖実体（グリカン）が精製プロセスによって糖タンパク質から除去されたタンパク質をいう。
用語「グリコシル化」は、特に、マンノース、ポリマンノース、リボース糖などの炭水化物骨格が、タンパク質のＡ鎖もしくはＢ鎖のアミノ酸に、またはＡ鎖およびＢ鎖の両方のアミノ酸に、付着しているタンパク質をいう。用語「グリコシル化タンパク質」には、モノグリコシル化タンパク質およびポリグリコシル化タンパク質が含まれる。
用語「非グリコシル化」は、特に、タンパク質の全ての鎖に糖骨格（グリカン）が付着していないタンパク質をいう。
【００１７】
用語「グラルギン」は、特に、インスリンＡ鎖の２１位におけるアミノ酸アスパラギンがグリシンに置換されており、およびＢ鎖のＣ末端に２個のアルギニンが付加されている点でヒトインスリンとは異なる、速効性および長時間作用性のヒトインスリンアナログをいう。
用語「リスプロ」は、特に、ヒトインスリンとは化学的に異なる速効性ヒトインスリンアナログをいう。インスリン  リスプロにおいては、Ｂ２８位におけるアミノ酸プロリンがリジンに置換されており、およびＢ２９位におけるリジンがプロリンに置換されている。
【００１８】
用語「ＲＰ−ＨＰＬＣ」は、特に、疎水性に基づく分子の分離を含む、逆相高速液体クロマトグラフィーをいう。
用語「下流精製」は、生合成医薬生成物の製造中に発生した関連不純物および廃棄物からの、該生成物の回収および精製をいう。
本発明は、多様なモノグリコシル化型およびポリグリコシル化型インスリンアナログの少なくとも９９．９５％除去による、非グリコシル化インスリンアナログの精製プロセスに関する。前記プロセスは、最終生成物中に存在する不純物の性質についてのよりよい理解に起因した、最適化された下流精製技術による生成物の選択的精製である。
【００１９】
精製ステップ−１および精製ステップ−２と称される、連続して採用される２つのクロマトグラフィー技術の組み合わせ効果の結果としての、非グリコシル化インスリンアナログ精製の精製プロセスである。非グリコシル化インスリンアナログの精製に用いられる両方のクロマトグラフィーステップは、カラムクロマトグラフィー法、好ましくはＲＰ−ＨＰＬＣ、または疎水性相互作用クロマトグラフィーである。前記クロマトグラフィーを用いる利点は、非グリコシル化インスリンアナログ画分の純度の増加である。精製された最終生成物は、グリコシル化バリアントを実質的に（少なくとも９９．９５％）含まない。好ましくは、非グリコシル化インスリン精製画分におけるグリコシル化型インスリンアナログの濃度は０．０５％未満である；したがって、グリコシル化バリアントは定量化未満のレベル（level below quantification（ＢＬＯＱ））まで除去する。
【００２０】
本発明はさらに、同定のためのエレクトロスプレーおよびマトリックス支援レーザー脱離イオン化などの質量分析技術と併用した化学的方法による、様々な糖型のインスリンアナログ、特にインスリン  グラルギンおよびインスリン  リスプロの同定に関する。
本発明において、低ｐＨで行われる精製ステップは、クロマトグラフィーの逆相モードにおいて、好ましいイオンペアリング剤としてオクタンスルホン酸、好ましくはオクタンスルホン酸（ＯＳＡ）のナトリウム塩を用いる。ＯＳＡは、スルホン基（ＳＯ３−）に付着した、炭素８個の長い疎水性鎖を有するカチオン性イオンペアリング剤である。ＯＳＡは、酸性ｐＨでタンパク質サンプルと相互作用し、結合化学を変化させて、グリコシル化タンパク質と非グリコシル化タンパク質との間の分割を増強させる。
【００２１】
本発明は、非グリコシル化インスリンからの、グリコシル化インスリンの分離において特に有利であることが証明されている。好ましくは、精製された非グリコシル化インスリン画分におけるグリコシル化インスリンの濃度は０．０５％未満である。
本開示は、これより実施例を用いて例示されるが、これは、開示の実施を例示することを意図しており、本開示の範囲について、いかなる限定をも暗示するように制限的にみなすことを意図していない。
【００２２】
本発明のある態様において、非グリコシル化インスリンアナログおよびグリコシル化インスリンアナログを含む混合物からの、非グリコシル化インスリンアナログの精製プロセスが提供される。
ある態様においては、インスリンアナログは、インスリン  グラルギンである。別の態様においては、インスリンアナログは、インスリン  リスプロである。
ある態様においては、グリコシル化インスリンアナログは、モノグリコシル化、ジグリコシル化、トリグリコシル化、ポリグリコシル化されていてもよく、およびそれらの混合物であってもよい。
【００２３】
ある態様においては、本発明の精製プロセスは、非グリコシル化インスリンアナログおよびグリコシル化インスリンアナログを含む混合物からの、グリコシル化型のインスリンアナログの少なくとも９９．９５％除去をもたらす。好ましい態様において、除去百分率は、９９．９６、９９．９７、９９．９８、９９．９９、および１００である。
【００２４】
ある態様においては、本発明の精製プロセスは、≦０．０５％のグリコシル化インスリン  グラルギンを含む非グリコシル化インスリン  グラルギンの単離をもたらす。好ましい態様において、本発明の精製プロセスは、≦０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、または０％のグリコシル化インスリン  グラルギンを含む非グリコシル化インスリン  グラルギンの単離をもたらす。
【００２５】
ある態様においては、本発明の精製プロセスは、≦０．０５％のグリコシル化インスリン  リスプロを含む非グリコシル化インスリン  リスプロの単離をもたらす。好ましい態様において、本発明の精製プロセスは、≦０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、または０％のグリコシル化インスリン  リスプロを含む非グリコシル化インスリン  リスプロの単離をもたらす。
【００２６】
ある態様においては、非グリコシル化およびグリコシル化インスリン  グラルギンを含む混合物からの、非グリコシル化インスリン  グラルギンの精製プロセスが提供され、前記方法は、第１および第２のステップからなり、ここで、第１のステップは、グリコシル化および非グリコシル化インスリン  グラルギンを含む混合物について、イオンペアリング剤およびアセトニトリル（有機修飾剤）の存在下、酸性ｐＨでＲＰ−ＨＰＬＣを行い、部分的に精製された非グリコシル化インスリン  グラルギンを含む第１の混合物を生じることを含み；第２のステップは、第１のステップからの第１の混合物について、イオンペアリング剤およびアセトニトリル（有機修飾剤）の存在下、アルカリ性ｐＨでＲＰ−ＨＰＬＣを行い、少なくとも９９．９５％純粋な非グリコシル化インスリン  グラルギンを生じることを含む。好ましい態様では、第１のステップにおけるイオンペアリング剤は、オクタンスルホン酸、より好ましくはＯＳＡのナトリウム塩であり、第２のステップにおけるイオンペアリング剤は、過塩素酸ナトリウムである。ある態様において、第１のステップにおけるｐＨ範囲は、３．５〜３．９の範囲にあり、第２のステップにおけるｐＨ範囲は、８．３〜８．７の範囲にある。
【００２７】
ある態様においては、非グリコシル化およびグリコシル化インスリン  リスプロを含む混合物からの、非グリコシル化インスリン  リスプロの精製プロセスが提供され、前記方法は、第１および第２のステップからなり、ここで、第１のステップは、グリコシル化および非グリコシル化インスリン  リスプロを含む混合物について、イオンペアリング剤およびアセトニトリル（有機修飾剤）の存在下、酸性ｐＨでＲＰ−ＨＰＬＣを行い、部分的に精製された非グリコシル化インスリン  リスプロを含む第１の混合物を生じることを含み；第２のステップは、第１のステップからの第１の混合物について、イオンペアリング剤およびアセトニトリル（有機修飾剤）の存在下、アルカリ性ｐＨでＲＰ−ＨＰＬＣを行い、少なくとも９９．９５％純粋な非グリコシル化インスリン  リスプロを生じることを含む。好ましい態様では、第１のステップにおけるイオンペアリング剤は、オクタンスルホン酸、より好ましくはＯＳＡのナトリウム塩であり、第２のステップにおけるイオンペアリング剤は、ＴＢＡＢである。ある態様において、第１のステップにおけるｐＨ範囲は、３．５〜３．９の範囲にあり、第２のステップにおけるｐＨ範囲は、８．３〜８．７の範囲にある。
【００２８】
ある態様においては、非グリコシル化およびグリコシル化インスリン  グラルギンを含む混合物からの、非グリコシル化インスリン  グラルギンの精製プロセスが提供され、前記方法は、第１および第２のステップからなり、ここで、第１のステップは、グリコシル化および非グリコシル化インスリン  グラルギンを含む混合物について、イオンペアリング剤およびアセトニトリル（有機修飾剤）の存在下、アルカリ性ｐＨでＲＰ−ＨＰＬＣを行い、部分的に精製された非グリコシル化インスリン  グラルギンを含む第１の混合物を生じることを含み；第２のステップは、第１のステップからの第１の混合物について、イオンペアリング剤およびアセトニトリル（有機修飾剤）の存在下、酸性ｐＨでＲＰ−ＨＰＬＣを行い、少なくとも９９．９５％純粋な非グリコシル化インスリン  グラルギンを生じることを含む。好ましい態様では、第１のステップにおけるイオンペアリング剤は、過塩素酸ナトリウムであり、第２のステップにおけるイオンペアリング剤は、オクタンスルホン酸、好ましくはオクタンスルホン酸のナトリウム塩である。ある態様において、第１のステップにおけるｐＨ範囲は、８．３〜８．７の範囲にあり、第２のステップにおけるｐＨ範囲は、３．５〜３．９の範囲にある。
【００２９】
ある態様においては、非グリコシル化およびグリコシル化インスリン  リスプロを含む混合物からの、非グリコシル化インスリン  リスプロの精製プロセスが提供され、前記方法は、第１および第２のステップからなり、ここで、第１のステップは、グリコシル化および非グリコシル化インスリン  リスプロを含む混合物について、イオンペアリング剤およびアセトニトリル（有機修飾剤）の存在下、アルカリ性ｐＨでＲＰ−ＨＰＬＣを行い、部分的に精製された非グリコシル化インスリン  リスプロを含む第１の混合物を生じることを含み；第２のステップは、第１のステップからの第１の混合物について、イオンペアリング剤およびアセトニトリル（有機修飾剤）の存在下、酸性ｐＨでＲＰ−ＨＰＬＣを行い、少なくとも９９．９５％純粋な非グリコシル化インスリン  リスプロを生じることを含む。好ましい態様では、第１のステップにおけるイオンペアリング剤は、ＴＢＡＢであり、第２のステップにおけるイオンペアリング剤は、オクタンスルホン酸、好ましくはオクタンスルホン酸のナトリウム塩である。ある態様において、第１のステップにおけるｐＨ範囲は、８．３〜８．７の範囲にあり、第２のステップにおけるｐＨ範囲は、３．５〜３．９の範囲にある。
【００３０】
ある態様においては、インスリン  グラルギンのグリコシル化バリアントが少なくとも９９．９５％含まれていない、非グリコシル化インスリン  グラルギンが提供される。ある態様においては、インスリン  グラルギンのグリコシル化バリアンが少なくとも９９．９６％含まれていない、非グリコシル化インスリン  グラルギンが提供される。ある態様においては、インスリン  グラルギンのグリコシル化バリアントが少なくとも９９．９７％含まれていない、非グリコシル化インスリン  グラルギンが提供される。ある態様においては、インスリン  グラルギンのグリコシル化バリアントが少なくとも９９．９８％含まれていない、非グリコシル化インスリン  グラルギンが提供される。ある態様においては、インスリン  グラルギンのグリコシル化バリアントが少なくとも９９．９９％含まれていない、非グリコシル化インスリン  グラルギンが提供される。ある態様においては、インスリン  グラルギンのグリコシル化バリアントが１００％含まれていない、非グリコシル化インスリン  グラルギンが提供される。
【００３１】
ある態様においては、インスリン  リスプロのグリコシル化バリアントが少なくとも９９．９５％含まれていない、非グリコシル化インスリン  リスプロが提供される。ある態様においては、インスリン  リスプロのグリコシル化バリアントが少なくとも９９．９６％含まれていない、非グリコシル化インスリン  リスプロが提供される。ある態様においては、インスリン  リスプロのグリコシル化バリアントが少なくとも９９．９７％含まれていない、非グリコシル化インスリン  リスプロが提供される。ある態様においては、インスリン  リスプロのグリコシル化バリアントが少なくとも９９．９８％含まれていない、非グリコシル化インスリン  リスプロが提供される。ある態様においては、インスリン  リスプロのグリコシル化バリアントが少なくとも９９．９９％含まれていない、非グリコシル化インスリン  リスプロが提供される。ある態様においては、インスリン  リスプロのグリコシル化バリアントが１００％含まれていない、非グリコシル化インスリン  リスプロが提供される。
【００３２】
例
低ｐＨベースのＲＰ−ＨＰＬＣの後に高ｐＨベースのＲＰ−ＨＰＬＣが続く、インスリン  グラルギンの精製
低ｐＨでの精製ステップ−１は、図１のフローチャートに示されている通りである。精製ステップ−１の詳細は以下の通りである。
定常相の詳細：
ａ．媒体：クロマシル（Kromasil）  Ｃ８−１００Ａ−１３ｐｍ
ｂ．高さ：２５．Ｏｉｌ．Ｏｃｍ
ｃ．線速度：全てのクロマトグラフィーステップについて、≦３６０ｃｍ／ｈ
【００３３】
移動相の詳細：
ａ．移動相Ａ：ｐＨ３．７±０．１の、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％（ｗ／ｖ）オクタンスルホン酸（ＯＳＡ）（ｐＨは氷酢酸を用いて調整）
ｂ．移動相Ｂ：１００．０％アセトニトリル
ｃ．精製サイクルの間の移動相ＡおよびＢの温度：２０〜３０℃
【００３４】
ロード（load）調製：
ａ．先のステップで得られたロード濃縮物を、精製水および酢酸の混合物を用いて、≧１．０：１０．０の比率で希釈した。
ｂ．希釈後、サンプルを１．２ｐｍ、０．４５ｐｍ、続いて０．２２ｐｍのフィルターでろ過した。
ｃ．１．２ｐｍのろ過に用いられたフィルターは、ポリプロピレン（ＰＰ）製であり、０．４５／０．２２ｐｍのろ過に用いられたものは、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）材質製であった。
ｄ．ロード中の生成物濃度は、１．０〜２．０ｇ／Ｌの範囲にあると予想された。
【００３５】
精製のためのプロセス条件：
ａ．カラムは、９０．０％（Ａ）：１０．０％（Ｂ）の移動相を用い、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて４〜５ＣＶ（カラム体積）で平衡化した。
ｂ．カラムは、４〜１２ｇグラルギン／Ｌクロマシルの容量で、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にてロードした。
ｃ．ロード後、カラムは、８５．０％（Ａ）：１５．０％（Ｂ）の移動相を用い、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて４〜５ＣＶ（カラム体積）で洗浄した。
ｄ．生成物は、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて、２４〜３１％Ｂの線形勾配を用い、２５ＣＶを超えてカラムから溶出させた。
【００３６】
ｅ．溶出の間、可変体積画分の収集は、２８０ｎｍにおける吸光度（ＵＶ）の上昇に基づいて行った。収集は、ＵＶ２８０がベースラインに低下するまで継続した。カラムからタンパク質を溶出させるのに必要な体積は２．０〜３．０ＣＶであった。
ｆ．溶出画分は、分析し、その純度レベルに基づいてプールし、調製した溶出プール（elution pool）を２〜８℃で保存した。
ｇ．溶出後、残留タンパク質がある場合にはそれを除去するために、カラムを、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度で、１Ｍ酢酸５０．０％およびアセトニトリル５０．０％を用いてアップフロー方向に２ＣＶ、続いて１Ｍ酢酸３０．０％およびアセトニトリル７０．０％を用いて１ＣＶで再生した。
異なる相対的保持時間（ＲＲＴ）における結果は、表１に示されるデータの通りであった。データによれば、グリコシル化タンパク質は、〜４．５倍、すなわちロード中の〜２．６％から溶出プール（ＥＰ）中の〜０．６％まで、減少した。
【００３７】
【表１】
2021535214.tif 000003
【００３８】
精製ステップ−１からの溶出プールは、グリコシル化タンパク質からの非グリコシル化タンパク質のさらなる精製のための精製ステップ−２にかけられる。
高ｐＨでの精製ステップ−２は、図２のフローチャートに示されている通りである。精製ステップ−２の詳細は以下の通りである。
定常相の詳細：
ａ．媒体：クロマシル  Ｃ８−１００Ａ−１３ｐｍ
ｂ．高さ：２５．Ｏｉｌ．Ｏｃｍ
ｃ．線速度：全てのクロマトグラフィーステップについて、≦３６０ｃｍ／ｈ
【００３９】
移動相の詳細：
ａ．移動相Ａ：ｐＨ８．５±０．１の、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム（ｐＨは氷酢酸を用いて調整）
ｂ．移動相Ｂ：１００．０％アセトニトリル
ｃ．精製サイクルの間の移動相ＡおよびＢの温度：２０〜３０℃
【００４０】
ロード調製：
ａ．精製ステップ−１で得られた溶出プール（ＥＰ）を、精製水を用いて１．０：２．０の比率で希釈した。
ｂ．希釈されたサンプルのｐＨを、２．５Ｍ  Ｔｒｉｓを用いて８．５±０．１に調整した。
ｃ．ｐＨ調整後、サンプルを、１．２μｍ、０．４５ｐｍ、続いて０．２２μｍでろ過した。
ｄ．１．２μｍのろ過に用いられたフィルターは、ポリプロピレン（ＰＰ）製であり、０．４５／０．２２μｍのろ過に用いられたものは、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）材質製であった。
ｅ．ロード中の生成物濃度は、１．０〜２．０ｇ／Ｌの範囲にあると予想された。
【００４１】
精製のためのプロセス条件：
ａ．カラムは、９０．０％（Ａ）：１０．０％（Ｂ）の移動相を用い、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて４〜５ＣＶ（カラム体積）で平衡化した。
ｂ．カラムは、４〜１２ｇグラルギン／Ｌクロマシルの容量で、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にてロードした。
ｃ．ロード後、カラムは、８０．０％（Ａ）：２０．０％（Ｂ）の移動相を用い、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて４〜５ＣＶ（カラム体積）で洗浄した。
ｄ．生成物は、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて、２５〜２９％Ｂの線形勾配を用い、２５ＣＶを超えてカラムから溶出させた。
ｅ．溶出の間、可変体積画分の収集は、２８０ｎｍにおける吸光度（ＵＶ）の上昇に基づいて行った。収集は、ＵＶがベースラインに低下するまで継続した。カラムからタンパク質を溶出させるのに必要な体積は２．０〜３．０ＣＶであった。
【００４２】
ｆ．画分収集後、画分のｐＨは、氷酢酸を用いて４．０±０．１に調整した。予想される酢酸消費量は、１５．０％〜２５．０％（Ｖ／Ｖ）であった。
ｇ．溶出画分は、分析し、その純度レベルに基づいてプールし、調製した溶出プールを２〜８℃で保存した。
ｈ．溶出後、残留タンパク質がある場合にはそれを除去するために、カラムを、精製水５０．０％およびアセトニトリル５０．０％を用い、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にてアップフロー方向に３ＣＶで再生する。
結果は、表２に示されるデータの通りであった。データによれば、グリコシル化タンパク質は、ロード中の〜０．５％から溶出プール中の〜０．００％まで減少した。
【００４３】
【表２−１】
2021535214.tif 000004
【表２−２】
2021535214.tif 000005
【００４４】
より完全な理解は、以下の例を参照することにより得ることができるが、これらは、例示のみを目的として提供されるものであり、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
【００４５】
例１は、実験番号１〜１０により、低ｐＨでの逆相精製−１である精製ステップ−１を例示する。
実験１
ヒトインスリン  グラルギンを４０ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する酵素反応最終産物（enzyme reaction end）を、５％アセトニトリル、０．５Ｍ酢酸に調整し、精製水を用いて１．３１ｍｇ／ｍｌに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル１００−１３−Ｃ８カラム（１＊２５ｃｍ）を使用し、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、約５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜８．０ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）８５％およびアセトニトリル１５％を用いて、約４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）を用いて２５〜３２％アセトニトリルの勾配で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、１Ｍ酢酸５０％およびアセトニトリル５０％を用いて２カラム体積で溶出し、続いて１Ｍ酢酸３０％およびアセトニトリル７０％を用いて１カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した）。結果を表３において下記に示す。
【００４６】
【表３】
2021535214.tif 000006
【００４７】
実験２
ヒトインスリン  グラルギンを４０ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する酵素反応最終産物を、５％アセトニトリル、０．５Ｍ酢酸に調整し、精製水を用いて１．３７ｍｇ／ｍｌに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル１００−１３−Ｃ８カラム（１＊２５ｃｍ）を使用し、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、約５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜８．０ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）８５％およびアセトニトリル１５％を用いて、約４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）を用いて２５〜３２％アセトニトリルの勾配で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、１Ｍ酢酸５０％およびアセトニトリル５０％を用いて２カラム体積で溶出し、続いて１Ｍ酢酸３０％およびアセトニトリル７０％を用いて１カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプルならびに溶出画分および溶出プールは、ＹＭＣ  Ｃ１８法によって分析した。結果を表４において下記に示す。
【００４８】
【表４】
2021535214.tif 000007
【００４９】
実験３
ヒトインスリン  グラルギンを４０ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する酵素反応最終産物を、５％アセトニトリル、０．５Ｍ酢酸に調整し、精製水を用いて１．４２ｍｇ／ｍｌに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル１００−１３−Ｃ８カラム（１＊２５ｃｍ）を使用し、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、約５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜７．６ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）８５％およびアセトニトリル１５％を用いて、約４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）を用いて２５〜３２％アセトニトリルの勾配で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、１Ｍ酢酸５０％およびアセトニトリル５０％を用いて２カラム体積で溶出し、続いて１Ｍ酢酸３０％およびアセトニトリル７０％を用いて１カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表５において下記に示す。
【００５０】
【表５】
2021535214.tif 000008
【００５１】
実験４
ヒトインスリン  グラルギンを１８ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する酵素反応最終産物を、５％アセトニトリル、０．５Ｍ酢酸に調整し、精製水を用いて１．５ｍｇ／ｍｌに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル１００−１３−Ｃ８カラム（１＊２５ｃｍ）を使用し、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、約５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜１０．０ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）８５％およびアセトニトリル１５％を用いて、約４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）を用いて２５〜３２％アセトニトリルの勾配で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、１Ｍ酢酸５０％およびアセトニトリル５０％を用いて２カラム体積で溶出し、続いて１Ｍ酢酸３０％およびアセトニトリル７０％を用いて１カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表６において下記に示す。
【００５２】
【表６】
2021535214.tif 000009
【００５３】
実験５
ヒトインスリン  グラルギンを１８ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する酵素反応最終産物を、５％アセトニトリル、０．５Ｍ酢酸に調整し、精製水を用いて１．６ｍｇ／ｍｌに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル１００−１３−Ｃ８カラム（２．１＊２５ｃｍ）を使用し、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、約５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜１０ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）８５％およびアセトニトリル１５％を用いて、約４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）を用いて２５〜３２％アセトニトリルの勾配で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、１Ｍ酢酸５０％およびアセトニトリル５０％を用いて２カラム体積で溶出し、続いて１Ｍ酢酸３０％およびアセトニトリル７０％を用いて１カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表７において下記に示す。
【００５４】
【表７】
2021535214.tif 000010
【００５５】
実験６
ヒトインスリン  グラルギンを３２ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する酵素反応最終産物を、５％アセトニトリル、０．５Ｍ酢酸に調整し、精製水を用いて１．５ｍｇ／ｍｌに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル１００−１３−Ｃ８カラム（２．１＊２５ｃｍ）を使用し、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、約５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜１０ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）８５％およびアセトニトリル１５％を用いて、約４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）を用いて２５〜３２％アセトニトリルの勾配で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、１Ｍ酢酸５０％およびアセトニトリル５０％を用いて２カラム体積で溶出し、続いて１Ｍ酢酸３０％およびアセトニトリル７０％を用いて１カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表８において下記に示す。
【００５６】
【表８】
2021535214.tif 000011
【００５７】
実験７
ヒトインスリン  グラルギンを１６ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する酵素反応最終産物を、５％アセトニトリル、０．５Ｍ酢酸に調整し、精製水を用いて１．５ｍｇ／ｍｌに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル１００−１３−Ｃ８カラム（２．１＊２５ｃｍ）を使用し、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、約５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜１０ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）８５％およびアセトニトリル１５％を用いて、約４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）を用いて２５〜３２％アセトニトリルの勾配で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、１Ｍ酢酸５０％およびアセトニトリル５０％を用いて２カラム体積で溶出し、続いて１Ｍ酢酸３０％およびアセトニトリル７０％を用いて１カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表９において下記に示す。
【００５８】
【表９】
2021535214.tif 000012
【００５９】
実験８
ヒトインスリン  グラルギンを３６ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する酵素反応最終産物を、５％アセトニトリル、０．５Ｍ酢酸に調整し、精製水を用いて１．６ｍｇ／ｍｌに希釈して、ロードサンプルとして用いた。クロマシル１００−１３−Ｃ８樹脂が充填されたNovosepステンレススチールカラム（５＊２５ｃｍ）を使用し、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、約５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜９ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）８５％およびアセトニトリル１５％を用いて、約４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）を用いて２５〜３２％アセトニトリルの勾配で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、１Ｍ酢酸５０％およびアセトニトリル５０％を用いて２カラム体積で溶出し、続いて１Ｍ酢酸３０％およびアセトニトリル７０％を用いて１カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表１０において下記に示す。
【００６０】
【表１０】
2021535214.tif 000013
【００６１】
実験９
ヒトインスリン  グラルギンを３２ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する酵素反応最終産物を、５％アセトニトリル、０．５Ｍ酢酸に調整し、精製水を用いて１．７ｍｇ／ｍｌに希釈して、ロードサンプルとして用いた。クロマシル１００−１３−Ｃ８樹脂が充填されたNovosepステンレススチールカラム（５＊２５ｃｍ）を使用し、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、約５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜９ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）８５％およびアセトニトリル１５％を用いて、約４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）を用いて２５〜３２％アセトニトリルの勾配で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、１Ｍ酢酸５０％およびアセトニトリル５０％を用いて２カラム体積で溶出し、続いて１Ｍ酢酸３０％およびアセトニトリル７０％を用いて１カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表１１において下記に示す。
【００６２】
【表１１】
2021535214.tif 000014
【００６３】
実験１０
ヒトインスリン  グラルギンを３２ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する酵素反応最終産物を、５％アセトニトリル、０．５Ｍ酢酸に調整し、精製水を用いて１．７ｍｇ／ｍｌに希釈して、ロードサンプルとして用いた。クロマシル１００−１３−Ｃ８樹脂が充填されたNovosepステンレススチールカラム（５＊２５ｃｍ）を使用し、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、約５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜１１ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）およびアセトニトリル１５％を用いて、約４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）８５％を用いて２５〜３２％アセトニトリルの勾配で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、１Ｍ酢酸５０％およびアセトニトリル５０％を用いて２カラム体積で溶出し、続いて１Ｍ酢酸３０％およびアセトニトリル７０％を用いて１カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表１２において下記に示す。
【００６４】
【表１２】
2021535214.tif 000015
【００６５】
低ｐＨでの逆相精製−１の実験データの概要を表１３において下記に詳細に示す。
ヒトインスリン  グラルギンについての第１の逆相精製ステップは、イオンペアリング剤オクタンスルホン酸（ＯＳＡ）を併用した低ｐＨ緩衝液を用いて、グリコシル化バリアントを６８〜９０％減少させ、それによりロード中の〜６０％から溶出プール（ＥＰ）中の＞９７％まで、純度を増加させる。
【００６６】
【表１３−１】
2021535214.tif 000016
【表１３−２】
2021535214.tif 000017
【００６７】
残りのグリコシル化不純物は、高ｐＨを採用する第２の逆相精製ステップを用いて取り除かれ、インスリン  グラルギンの純度は＞９９．５％に増加する。
【００６８】
例２は、実験番号１１〜２０により、高ｐＨでの逆相精製−２である精製ステップ−２を例示する。
実験１１
２．８ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトインスリン  グラルギンおよび〜２９％アセトニトリルを含有する逆相精製−１最終産物を、２Ｍ  Ｔｒｉｓを用いてｐＨ８．５に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル１０％を含む最終濃度１．３ｍｇ／ｍｌのインスリン  グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル１００−１３−Ｃ８カラム（１＊２５ｃｍ）を用いて、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜６．５ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）８０％およびアセトニトリル２０％を用いて、４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）を用いて２５〜２９％アセトニトリルの勾配で、２５カラム体積を超えて溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水５０％およびアセトニトリル５０％を用いて４カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表１４に示す。
【００６９】
【表１４】
2021535214.tif 000018
【００７０】
実験１２
２．８ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトインスリン  グラルギンおよび〜２９％アセトニトリルを含有する逆相精製−１最終産物を、２Ｍ  Ｔｒｉｓを用いてｐＨ８．５に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル１０％を含む最終濃度１．３ｍｇ／ｍｌのインスリン  グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル１００−１３−Ｃ８カラム（１＊２５ｃｍ）を用いて、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜６．６ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）８０％およびアセトニトリル２０％を用いて、４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）を用いて２５〜２９％アセトニトリルの勾配で、２５カラム体積を超えて溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水５０％およびアセトニトリル５０％を用いて４カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表１５に示す。
【００７１】
【表１５−１】
2021535214.tif 000019
【表１５−２】
2021535214.tif 000020
【００７２】
実験１３
２．８ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトインスリン  グラルギンおよび〜２９％アセトニトリルを含有する逆相精製−１最終産物を、２Ｍ  Ｔｒｉｓを用いてｐＨ８．５に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル１０％を含む最終濃度１ｍｇ／ｍｌのインスリン  グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル１００−１３−Ｃ８カラム（１＊２５ｃｍ）を用いて、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜９ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）８０％およびアセトニトリル２０％を用いて、４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）を用いて２５〜２９％アセトニトリルの勾配で、２５カラム体積を超えて溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水５０％およびアセトニトリル５０％を用いて４カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表１６に示す。
【００７３】
【表１６】
2021535214.tif 000021
【００７４】
実験１４
２．９ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトインスリン  グラルギンおよび〜２９％アセトニトリルを含有する逆相精製−１最終産物を、２Ｍ  Ｔｒｉｓを用いてｐＨ８．５に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル１０％を含む最終濃度１ｍｇ／ｍｌのインスリン  グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル１００−１３−Ｃ８カラム（１＊２５ｃｍ）を用いて、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜９ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）８０％およびアセトニトリル２０％を用いて、４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）を用いて２５〜２９％アセトニトリルの勾配で、２５カラム体積を超えて溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水５０％およびアセトニトリル５０％を用いて４カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表１７に示す。
【００７５】
【表１７】
2021535214.tif 000022
【００７６】
実験１５
３．８ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトインスリン  グラルギンおよび〜２９％アセトニトリルを含有する逆相精製−１最終産物を、２Ｍ  Ｔｒｉｓを用いてｐＨ８．５に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル１０％を含む最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌのインスリン  グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル１００−１３−Ｃ８カラム（１＊２５ｃｍ）を用いて、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜７ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）８０％およびアセトニトリル２０％を用いて、４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）を用いて２５〜２９％アセトニトリルの勾配で、２５カラム体積を超えて溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水５０％およびアセトニトリル５０％を用いて４カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表１８に示す。
【００７７】
【表１８】
2021535214.tif 000023
【００７８】
実験１６
３．８ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトインスリン  グラルギンおよび〜２９％アセトニトリルを含有する逆相精製−１最終産物を、２Ｍ  Ｔｒｉｓを用いてｐＨ８．５に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル１０％を含む最終濃度１．２ｍｇ／ｍｌのインスリン  グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル１００−１３−Ｃ８カラム（１＊２５ｃｍ）を用いて、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜６ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）８０％およびアセトニトリル２０％を用いて、４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）を用いて２５〜２９％アセトニトリルの勾配で、２５カラム体積を超えて溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水５０％およびアセトニトリル５０％を用いて４カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表１９に示す。
【００７９】
【表１９】
2021535214.tif 000024
【００８０】
実験１７
３．４ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトインスリン  グラルギンおよび〜２９％アセトニトリルを含有する逆相精製−１最終産物を、２Ｍ  Ｔｒｉｓを用いてｐＨ８．５に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル１０％を含む最終濃度１．２ｍｇ／ｍｌのインスリン  グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル１００−１３−Ｃ８カラム（１＊２５ｃｍ）を用いて、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜４ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）８０％およびアセトニトリル２０％を用いて、４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）を用いて２５〜２９％アセトニトリルの勾配で、２５カラム体積を超えて溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水５０％およびアセトニトリル５０％を用いて４カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表２０に示す。
【００８１】
【表２０】
2021535214.tif 000025
【００８２】
実験１８
４．２ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトインスリン  グラルギンおよび〜２９％アセトニトリルを含有する逆相精製−１最終産物を、２Ｍ  Ｔｒｉｓを用いてｐＨ８．５に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル１０％を含む最終濃度１．５ｍｇ／ｍｌのインスリン  グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル１００−１３−Ｃ８カラム（２．１＊２５ｃｍ）を用いて、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜６ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）８０％およびアセトニトリル２０％を用いて、４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）を用いて２５〜２９％アセトニトリルの勾配で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水５０％およびアセトニトリル５０％を用いて４カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表２１に示す。
【００８３】
【表２１】
2021535214.tif 000026
【００８４】
実験１９
４．２ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトインスリン  グラルギンおよび２９％アセトニトリルを含有する逆相精製−１最終産物を、２Ｍ  Ｔｒｉｓを用いてｐＨ８．５に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル１０％を含む最終濃度１．５ｍｇ／ｍｌのインスリン  グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル１００−１３−Ｃ８カラム（２．１＊２５ｃｍ）を用いて、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜９ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）８０％およびアセトニトリル２０％を用いて、４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）を用いて２５〜２９％アセトニトリルの勾配で、２５カラム体積を超えて溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水５０％およびアセトニトリル５０％を用いて４カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表２２に示す。
【００８５】
【表２２】
2021535214.tif 000027
【００８６】
実験２０
４．５ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトインスリン  グラルギンおよび２９％アセトニトリルを含有する逆相精製−１最終産物を、２Ｍ  Ｔｒｉｓを用いてｐＨ８．５に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル１０％を含む最終濃度１．８ｍｇ／ｍｌのインスリン  グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル１００−１３−Ｃ８カラム（２．１＊２５ｃｍ）を用いて、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜８ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）８０％およびアセトニトリル２０％を用いて、４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）を用いて２５〜２９％アセトニトリルの勾配で、２５カラム体積を超えて溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水５０％およびアセトニトリル５０％を用いて４カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表２３に示す。
【００８７】
【表２３】
2021535214.tif 000028
【００８８】
高ｐＨでの逆相精製−２の実験データの概要を表２４において下記に詳細に示す。
インスリン  グラルギンについての第２の逆相精製ステップは、イオンペアリング剤過塩素酸ナトリウムを併用した高ｐＨ緩衝液を用いて、残りのグリコシル化バリアントを検出レベル未満まで減少させ、それによりロード中の＞９６％から溶出プール（ＥＰ）中の＞９９．５％まで、純度を増加させる。
【００８９】
【表２４−１】
2021535214.tif 000029
【表２４−２】
2021535214.tif 000030
【００９０】
逆相精製ステップ１および２の終了までのクオリティプロファイルおよび推定質量に基づくＩＤを、それぞれ表２５および２６において下記に詳細に示す。逆相精製−１最終産物および逆相精製−２最終産物についての質量分析データ  ＵＶおよびＴＩＣクロマトグラムは、それぞれ図３Ａおよび図３Ｂの通りであった。
【００９１】
【表２５−１】
2021535214.tif 000031
【表２５−２】
2021535214.tif 000032
【００９２】
【表２６】
2021535214.tif 000033
【００９３】
低ｐＨベースのＲＰ−ＨＰＬＣの後に高ｐＨベースのＲＰ−ＨＰＬＣが続く、インスリン  リスプロの精製
低ｐＨでの精製ステップ−１は、図１のフローチャートに示されている通りである。精製ステップ−１の詳細は以下の通りである。
定常相の詳細：
ｄ．媒体：ダイソーパック（Daisopak）  Ｃ１８−２００Ａ−１０ｐｍ
ｅ．高さ：２５．Ｏｉｌ．０ｃｍ
ｆ．線速度：全てのクロマトグラフィーステップについて、≦３６０ｃｍ／ｈ
【００９４】
移動相の詳細：
ｄ．移動相Ａ：ｐＨ３．８５±０．１の、４００ｍＭクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液＋０．１％（ｗ／ｖ）オクタンスルホン酸（ＯＳＡ）＋５０ｍＭ  ＧｕＣｌ（塩化グアニジウム）
ｅ．移動相Ｂ：１００．０％アセトニトリル
ｆ．精製サイクルの間の移動相ＡおよびＢの温度：２５〜３０℃
【００９５】
ロード調製：
ｅ．先のステップで得られたロード濃縮物を、精製水および酢酸の混合物を用いて、≧１．０：１０．０の比率で希釈した。
ｆ．希釈後、サンプルを１．２ｐｍ、０．４５ｐｍ、続いて０．２２ｐｍのフィルターでろ過した。
ｇ．１．２ｐｍのろ過に用いられたフィルターは、ポリプロピレン（ＰＰ）製であり、０．４５／０．２２ｐｍのろ過に用いられたものは、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）材質製であった。
ｈ．ロード中の生成物濃度は、１．０〜２．０ｇ／Ｌの範囲にあると予想された。
【００９６】
精製のためのプロセス条件：
ｈ．カラムは、９０．０％（Ａ）：１０．０％（Ｂ）の移動相を用い、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて５〜１０ＣＶ（カラム体積）で平衡化した。
ｉ．カラムは、５〜７．５ｇリスプロ／Ｌ樹脂の容量で、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にてロードした。
ｊ．ロード後、カラムは、７８．０％（Ａ）：２２．０％（Ｂ）の移動相を用い、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて４〜５ＣＶ（カラム体積）で洗浄した。
ｋ．生成物は、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて、２４〜２８％Ｂの線形勾配を用い、２０ＣＶを超えてカラムから溶出させた。
【００９７】
Ｌ．溶出の間、可変体積画分の収集は、２８０ｎｍにおける吸光度（ＵＶ）の上昇に基づいて行った。収集は、ＵＶ２８０がベースラインに低下するまで継続した。カラムからタンパク質を溶出させるのに必要な体積は２．０〜３．０ＣＶであった。
ｍ．溶出画分は、分析し、その純度レベルに基づいてプールし、調製した溶出プールを２〜８℃で保存した。
ｎ．溶出後、残留タンパク質がある場合にはそれを除去するために、カラムを、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度で、１Ｍ酢酸５０．０％およびアセトニトリル５０．０％を用いてアップフロー方向に２ＣＶ、続いて１Ｍ酢酸３０．０％およびアセトニトリル７０．０％を用いて１ＣＶで再生した。
結果は、表２７に示されるデータの通りであった。データによれば、グリコシル化タンパク質は、〜３倍、すなわちロード中の〜４％から溶出プール（ＥＰ）中の〜１．０％まで、減少した。
【００９８】
【表２７−１】
2021535214.tif 000034
【表２７−２】
2021535214.tif 000035
【００９９】
精製ステップ−１からの溶出プールは、グリコシル化タンパク質からの非グリコシル化タンパク質のさらなる精製のための精製ステップ−２にかけられる。
高ｐＨでの精製ステップ−２は、図２のフローチャートに示されている通りである。精製ステップ−２の詳細は以下の通りである。
定常相の詳細：
ａ．媒体：フェノメネックス（Phenomenex）  Ｃ８−１００Ａ−１０ｐｍ
ｂ．高さ：２５．Ｏｉｌ．０ｃｍ
ｃ．線速度：全てのクロマトグラフィーステップについて、≦３６０ｃｍ／ｈ
【０１００】
移動相の詳細：
ａ．移動相Ａ：ｐＨ７．５±０．１の、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭイミダゾール＋０．２％（ｗ／ｖ）重硫酸テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＢ）（ｐＨは氷酢酸を用いて調整）
ｂ．移動相Ｂ：１００．０％アセトニトリル
ｃ．精製サイクルの間の移動相ＡおよびＢの温度：２６〜３０℃
【０１０１】
ロード調製：
ａ．精製ステップ−１で得られた溶出プール（ＥＰ）を、精製水を用いて１．０：２．０の比率で希釈した。
ｂ．希釈されたサンプルのｐＨを、２．５Ｍ  Ｔｒｉｓを用いて７．５±０．１に調整した。
ｃ．ｐＨ調整後、サンプルを、１．２ｐｍ、０．４５ｐｍ、続いて０．２２ｐｍでろ過した。
ｄ．１．２ｐｍのろ過に用いられたフィルターは、ポリプロピレン（ＰＰ）製であり、０．４５／０．２２ｐｍのろ過に用いられたものは、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）材質製であった。
ｅ．ロード中の生成物濃度は、１．０〜２．０ｇ／Ｌの範囲にあると予想された。
【０１０２】
精製のためのプロセス条件：
ａ．カラムは、９０．０％（Ａ）：１０．０％（Ｂ）の移動相を用い、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて５〜１０ＣＶ（カラム体積）で平衡化した。
ｂ．カラムは、５〜８．５ｇリスプロ／Ｌ樹脂の容量で、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にてロードした。
ｃ．ロード後、カラムは、８０．０％（Ａ）：２０．０％（Ｂ）の移動相を用い、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて４〜５ＣＶ（カラム体積）で洗浄した。
ｄ．生成物は、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて、２５〜２９％Ｂの線形勾配を用い、１３ＣＶを超えてカラムから溶出させた。
【０１０３】
ｅ．溶出の間、可変体積画分の収集は、２８０ｎｍにおける吸光度（ＵＶ）の上昇に基づいて行った。収集は、ＵＶがベースラインに低下するまで継続した。カラムからタンパク質を溶出させるのに必要な体積は、２．０〜３．０ＣＶであった。
ｆ．溶出画分は、分析し、およびその純度レベルに基づいてプールし、調製した溶出プールを２〜８℃で保存した。
ｇ．溶出後、残留タンパク質がある場合にはそれを除去するために、カラムを、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて、アップフロー方向に３ＣＶで、精製水５０．０％およびアセトニトリル５０．０％を用い、続いて１Ｍ酢酸３０％およびアセトニトリル７０．０％を用い、再生した。
結果は、表２８に示されるデータの通りであった。データによれば、グリコシル化タンパク質は、ロード中の〜０．５％から溶出プール中のＢＬＯＱまで減少した。
【０１０４】
【表２８】
2021535214.tif 000036
【０１０５】
例３は、実験番号２１〜２４により、低ｐＨでの逆相精製−１である精製ステップ−１を例示する。
より完全な理解は、以下の例を参照することにより得ることができるが、これらは、例示のみを目的として提供されるものであり、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１０６】
実験２１
ヒトインスリン  リスプロを１２．７ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する酵素反応最終産物を、氷酢酸を用いてｐＨを＜３．５に調整し、続いて１０％アセトニトリルに調整し、精製水を用いて１．１６ｍｇ／ｍｌに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相ダイソーパック２００−１０−Ｃ１８カラム（１＊２５ｃｍ）を用い、インスリン  リスプロを精製した。カラムは、最初に、４００ｍＭクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液＋０．１％（ｗ／ｖ）ＯＳＡ＋５０ｍＭ  ＧｕＣｌ緩衝液（ｐＨ３．８５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、約１０カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜５．６ｇヒトインスリン  リスプロ／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、４００ｍＭクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液＋０．１％（ｗ／ｖ）ＯＳＡ＋５０ｍＭ  ＧｕＣｌ緩衝液（ｐＨ３．８５±０．１）７８％およびアセトニトリル２２％を用いて、約４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、４００ｍＭクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液＋０．１％（ｗ／ｖ）ＯＳＡ＋５０ｍＭ  ＧｕＣｌ緩衝液（ｐＨ３．８５±０．１）を用いて２４〜２８％アセトニトリルの勾配で、２０カラム体積を超えて２２０ｃｍ／ｈの流速で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、３Ｍ酢酸７０％およびアセトニトリル３０％を用いて４カラム体積で溶出した。溶出相以外の全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した）。結果を表２９において下記に示す。
【０１０７】
【表２９】
2021535214.tif 000037
【０１０８】
実験２２
ヒトインスリン  リスプロを１２．７ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する酵素反応最終産物を、氷酢酸を用いてｐＨを＜３．５に調整し、続いて１０％アセトニトリルに調整し、精製水を用いて１．１６ｍｇ／ｍｌに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相ダイソーパック２００−１０−Ｃ１８カラム（１＊２５ｃｍ）を用い、インスリン  リスプロを精製した。カラムは、最初に、４００ｍＭクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液＋０．１％（ｗ／ｖ）ＯＳＡ＋５０ｍＭ  ＧｕＣｌ緩衝液（ｐＨ３．８５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、約１０カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜７．４ｇヒトインスリン  リスプロ／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、４００ｍＭクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液＋０．１％（ｗ／ｖ）ＯＳＡ＋５０ｍＭ  ＧｕＣｌ緩衝液（ｐＨ３．８５±０．１）７８％およびアセトニトリル２２％を用いて、約４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、４００ｍＭクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液＋０．１％（ｗ／ｖ）ＯＳＡ＋５０ｍＭ  ＧｕＣｌ緩衝液（ｐＨ３．８５±０．１）を用いて２４〜２８％アセトニトリルの勾配で、２０カラム体積を超えて２２０ｃｍ／ｈの流速で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、３Ｍ酢酸７０％およびアセトニトリル３０％を用いて４カラム体積で溶出した。溶出相以外の全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した）。結果を表３０において下記に示す。
【０１０９】
【表３０】
2021535214.tif 000038
【０１１０】
実験２３
ヒトインスリン  リスプロを１０．８ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する酵素反応最終産物を、氷酢酸を用いてｐＨを＜３．５に調整し、続いて１０％アセトニトリルに調整し、精製水を用いて１．４２ｍｇ／ｍｌに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相ダイソーパック２００−１０−Ｃ１８カラム（１＊２５ｃｍ）を用い、インスリン  リスプロを精製した。カラムは、最初に、４００ｍＭクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液＋０．１％（ｗ／ｖ）ＯＳＡ＋５０ｍＭ  ＧｕＣｌ緩衝液（ｐＨ３．８５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、約１０カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜６．７ｇヒトインスリン  リスプロ／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、４００ｍＭクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液＋０．１％（ｗ／ｖ）ＯＳＡ＋５０ｍＭ  ＧｕＣｌ緩衝液（ｐＨ３．８５±０．１）７８％およびアセトニトリル２２％を用いて、約４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、４００ｍＭクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液＋０．１％（ｗ／ｖ）ＯＳＡ＋５０ｍＭ  ＧｕＣｌ緩衝液（ｐＨ３．８５±０．１）を用いて２４〜２８％アセトニトリルの勾配で、２０カラム体積を超えて２２０ｃｍ／ｈの流速で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、３Ｍ酢酸７０％およびアセトニトリル３０％を用いて４カラム体積で溶出した。溶出相以外の全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した）。結果を表３１において下記に示す。
【０１１１】
【表３１】
2021535214.tif 000039
【０１１２】
実験２４
ヒトインスリン  リスプロを１０．８ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する酵素反応最終産物を、氷酢酸を用いてｐＨを＜３．５に調整し、続いて１０％アセトニトリルに調整し、精製水を用いて１．０６ｍｇ／ｍｌに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相ダイソーパック２００−１０−Ｃ１８カラム（１＊２５ｃｍ）を用い、インスリン  リスプロを精製した。カラムは、最初に、４００ｍＭクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液＋０．１％（ｗ／ｖ）ＯＳＡ＋５０ｍＭ  ＧｕＣｌ緩衝液（ｐＨ３．８５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、約８カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜６．７ｇヒトインスリン  リスプロ／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、４００ｍＭクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液＋０．１％（ｗ／ｖ）ＯＳＡ＋５０ｍＭ  ＧｕＣｌ緩衝液（ｐＨ３．８５±０．１）７８％およびアセトニトリル２２％を用いて、約４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、４００ｍＭクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液＋０．１％（ｗ／ｖ）ＯＳＡ＋５０ｍＭ  ＧｕＣｌ緩衝液（ｐＨ３．８５±０．１）を用いて２４〜２８％アセトニトリルの勾配で、２０カラム体積を超えて２２０ｃｍ／ｈの流速で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、３Ｍ酢酸７０％およびアセトニトリル３０％を用いて４カラム体積で溶出した。溶出相以外の全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した）。結果を表３２において下記に示す。
【０１１３】
【表３２】
2021535214.tif 000040
【０１１４】
低ｐＨでの逆相精製−１の実験データの概要を表３３において下記に詳細に示す。
【表３３】
2021535214.tif 000041
【０１１５】
インスリン  リスプロについての逆相精製ステップ−１は、イオンペアリング剤オクタンスルホン酸（ＯＳＡ）を併用した低ｐＨ緩衝液を用いて、グリコシル化バリアントを７０〜９５％減少させ、それによりロード中の〜５８％から溶出プール（ＥＰ）中の＞８３％まで、純度を増加させる。
【０１１６】
例４は、実験２５〜２６により、高ｐＨでの逆相精製ステップ−２を例示する。
実験２５
２．４ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトインスリン  リスプロおよび２６．４％アセトニトリルを含有する逆相精製−１最終産物を、２Ｍ  Ｔｒｉｓを用いてｐＨ７．５に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル１０％を含む最終濃度０．８２ｍｇ／ｍｌのインスリン  リスプロを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相フェノメネックス１００−１０−Ｃ８カラム（１＊２５ｃｍ）を用いて、インスリン  リスプロを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２００ｍＭイミダゾール＋０．２％（ｗ／ｖ）ＴＢＡＢ緩衝液（ｐＨ７．５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、１０カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜８ｇヒトインスリン  リスプロ／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２００ｍＭイミダゾール＋０．２％（ｗ／ｖ）ＴＢＡＢ緩衝液（ｐＨ７．５±０．１）８０％およびアセトニトリル２０％を用いて、４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２００ｍＭイミダゾール＋０．２％（ｗ／ｖ）ＴＢＡＢ緩衝液（ｐＨ７．５±０．１）を用いて２４〜２９％アセトニトリルの勾配で、１３カラム体積を超えて溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２００ｍＭイミダゾール＋０．２％（ｗ／ｖ）ＴＢＡＢ緩衝液（ｐＨ７．５±０．１）５０％およびアセトニトリル５０％を用いて２カラム体積で溶出し、続いて３Ｍ酢酸３０％およびアセトニトリル７０％を用いて２カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表３４に示す。
【０１１７】
【表３４】
2021535214.tif 000042
【０１１８】
実験２６
１．３ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトインスリン  リスプロおよび〜２６．４％アセトニトリルを含有する逆相精製−１最終産物を、２Ｍ  Ｔｒｉｓを用いてｐＨ７．５に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル１０％を含む最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌのインスリン  リスプロを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相フェノメネックス１００−１０−Ｃ８カラム（１＊２５ｃｍ）を用いて、インスリン  リスプロを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２００ｍＭイミダゾール＋０．２％（ｗ／ｖ）ＴＢＡＢ緩衝液（ｐＨ７．５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が５．６ｇヒトインスリン  リスプロ／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２００ｍＭイミダゾール＋０．２％（ｗ／ｖ）ＴＢＡＢ緩衝液（ｐＨ７．５±０．１）８０％およびアセトニトリル２０％を用いて、４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２００ｍＭイミダゾール＋０．２％（ｗ／ｖ）ＴＢＡＢ緩衝液（ｐＨ７．５±０．１）を用いて２４〜２９％アセトニトリルの勾配で、１３カラム体積を超えて溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２００ｍＭイミダゾール＋０．２％（ｗ／ｖ）ＴＢＡＢ緩衝液（ｐＨ７．５±０．１）５０％およびアセトニトリル５０％を用いて２カラム体積で溶出し、続いて３Ｍ酢酸３０％およびアセトニトリル７０％を用いて２カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表３５に示す。
【０１１９】
【表３５】
2021535214.tif 000043
【０１２０】
高ｐＨでの逆相精製−２の実験データの概要を表３６において下記に詳細に示す（実験番号２５−２６）。
【表３６】
2021535214.tif 000044
【０１２１】
インスリン  リスプロについての逆相精製ステップ−２は、イオンペアリング剤重硫酸テトラブチルアンモニウムを併用した高ｐＨ緩衝液を用いて、残りのグリコシル化バリアントを検出レベル未満まで減少させ、それによりロード中の＞８４％から溶出プール中の＞９５％まで、純度を増加させる。
【０１２２】
逆相精製ステップ−１の終了までのクオリティプロファイルおよび推定質量に基づくＩＤを、表３７（実験２１）および３８（実験２２）において下記に詳細に示し、逆相精製ステップ−２の終了までのクオリティプロファイルおよび推定質量に基づくＩＤを、表３９（実験２５）および４０（実験２６）において下記に詳細に示す。逆相精製−１最終産物についての質量分析データ  ＵＶおよびＴＩＣクロマトグラムは、図４Ａ（実験２１）および図４Ｂ（実験２２）の通りであり、逆相精製−２最終産物についての質量分析データ  ＵＶおよびＴＩＣクロマトグラムは、図５Ａ（実験２５）および図５Ｂ（実験２６）の通りであった。
【０１２３】
【表３７】
2021535214.tif 000045
【０１２４】
【表３８】
2021535214.tif 000046
【０１２５】
【表３９】
2021535214.tif 000047
【０１２６】
【表４０】
2021535214.tif 000048
【０１２７】
高ｐＨベースのＲＰ−ＨＰＬＣの後に低ｐＨベースのＲＰ−ＨＰＬＣが続く、インスリン  グラルギンの精製
高ｐＨでの精製ステップ−１は、図１のフローチャートに示されている通りである。精製ステップ−１の詳細は以下の通りである。
定常相の詳細：
ａ．媒体：クロマシル  Ｃ８−１００Ａ−１３ｐｍ
ｂ．高さ：２５．Ｏｉｌ．Ｏｃｍ
ｃ．線速度：全てのクロマトグラフィーステップについて、≦３６０ｃｍ／ｈ
【０１２８】
移動相の詳細：
ａ．移動相Ａ：ｐＨ８．５±０．１の、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム（ｐＨは氷酢酸を用いて調整）
ｂ．移動相Ｂ：１００．０％アセトニトリル
ｃ．精製サイクルの間の移動相ＡおよびＢの温度：２０〜３０℃
【０１２９】
ロード調製：
ａ．先のステップで得られたロード濃縮物を、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓおよび０．７Ｍアルギニンの混合物を用いて、≧１．０：１０．０の比率で希釈した。
ｂ．希釈されたサンプルのｐＨを、酢酸を用いて８．５±０．１に調整した。
ｃ．ｐＨ調整後、サンプルを、１．２ｐｍ、０．４５ｐｍ、続いて０．２２ｐｍでろ過した。
ｄ．１．２ｐｍのろ過に用いられたフィルターは、ポリプロピレン（ＰＰ）製であり、０．４５／０．２２ｐｍのろ過に用いられたものは、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）材質製であった。
ｅ．ロード中の生成物濃度は、１．０〜２．０ｇ／Ｌの範囲にあると予想された。
【０１３０】
精製のためのプロセス条件：
ａ．カラムは、９０．０％（Ａ）：１０．０％（Ｂ）の移動相を用い、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて５〜１０ＣＶ（カラム体積）で平衡化した。
ｂ．カラムは、９〜１０ｇグラルギン／Ｌ樹脂の容量で、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にてロードした。
ｃ．ロード後、カラムは、８０．０％（Ａ）：２０．０％（Ｂ）の移動相を用い、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて４〜５ＣＶ（カラム体積）で洗浄した。
ｄ．生成物は、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて、２５〜３０％Ｂの線形勾配を用い、２５ＣＶを超えてカラムから溶出させた。
ｅ．溶出の間、可変体積画分の収集は、２８０ｎｍにおける吸光度（ＵＶ）の上昇に基づいて行った。収集は、ＵＶがベースラインに低下するまで継続した。カラムからタンパク質を溶出させるのに必要な体積は２．０〜３．０ＣＶであった。
【０１３１】
ｆ．画分収集後、画分のｐＨは、氷酢酸を用いて４．０±０．１に調整した。予想される酢酸消費量は、１５．０％〜２５．０％（Ｖ／Ｖ）であった。
ｇ．溶出画分は、分析し、その純度レベルに基づいてプールし、調製した溶出プールを２〜８℃で保存した。
ｈ．溶出後、残留タンパク質がある場合にはそれを除去するために、カラムを、精製水５０．０％およびアセトニトリル５０．０％を用い、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にてアップフロー方向に３ＣＶで再生する。
結果は、表４１に示されるデータの通りであった。データによれば、グリコシル化タンパク質は、〜９倍、すなわちロード中の〜４．０％から溶出プール中の〜０．２５％まで、減少した。
【０１３２】
【表４１】
2021535214.tif 000049
【０１３３】
精製ステップ−１からの溶出プールは、グリコシル化タンパク質からの非グリコシル化タンパク質のさらなる精製のための精製ステップ−２にかけられる。
低ｐＨでの精製ステップ−２は、図２のフローチャートに示されている通りである。精製ステップ−２の詳細は以下の通りである。
定常相の詳細：
ａ．媒体：クロマシル  Ｃ８−１００Ａ−１３ｐｍ
ｂ．高さ：２５．Ｏｉｌ．０ｃｍ
ｃ．線速度：全てのクロマトグラフィーステップについて、≦３６０ｃｍ／ｈ
【０１３４】
移動相の詳細：
ａ．移動相Ａ：ｐＨ３．７±０．１の、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％（ｗ／ｖ）オクタンスルホン酸（ＯＳＡ）（ｐＨは氷酢酸を用いて調整）
ｂ．移動相Ｂ：１００．０％アセトニトリル
ｃ．精製サイクルの間の移動相ＡおよびＢの温度：２６〜３０℃
【０１３５】
ロード調製：
ａ．先のステップで得られた溶出プールを、酢酸を用いてｐＨを３．７±０．１に調整し、精製水を用いて≧１．０：１．５の比率で希釈した。
ｂ．希釈後、サンプルを１．２ｐｍ、０．４５ｐｍ、続いて０．２２ｐｍのフィルターでろ過した。
ｃ．１．２ｐｍのろ過に用いられたフィルターは、ポリプロピレン（ＰＰ）製であり、０．４５／０．２２ｐｍのろ過に用いられたものは、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）材質製であった。
ｄ．ロード中の生成物濃度は、１．０〜２．０ｇ／Ｌの範囲にあると予想された。
【０１３６】
精製のためのプロセス条件：
ａ．カラムは、９０．０％（Ａ）：１０．０％（Ｂ）の移動相を用い、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて１０ＣＶ（カラム体積）で平衡化した。
ｂ．カラムは、６〜７．５ｇグラルギン／Ｌ樹脂の容量で、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にてロードした。
ｃ．ロード後、カラムは、８５．０％（Ａ）：１５．０％（Ｂ）の移動相を用い、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて４〜５ＣＶ（カラム体積）で洗浄した。
ｄ．生成物は、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて、２４〜３１％Ｂの線形勾配を用い、２５ＣＶを超えてカラムから溶出させた。
【０１３７】
ｅ．溶出の間、可変体積画分の収集は、２８０ｎｍにおける吸光度（ＵＶ）の上昇に基づいて行った。収集は、ＵＶ２８０がベースラインに低下するまで継続した。カラムからタンパク質を溶出させるのに必要な体積は２．０〜３．０ＣＶであった。
ｆ．溶出画分は、分析し、その純度レベルに基づいてプールし、調製した溶出プールを２〜８℃で保存した。
ｇ．溶出後、残留タンパク質がある場合にはそれを除去するために、カラムを、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度で、１Ｍ酢酸５０．０％およびアセトニトリル５０．０％を用いてアップフロー方向に２ＣＶ、続いて１Ｍ酢酸３０．０％およびアセトニトリル７０．０％を用いて１ＣＶで再生した。
結果は、表４２に示されるデータの通りであった。データによれば、グリコシル化タンパク質は、ロード中の〜０．３％から溶出プール中のＢＬＯＱレベルまで減少した。
【０１３８】
【表４２−１】
2021535214.tif 000050
【表４２−２】
2021535214.tif 000051
【０１３９】
精製ステップ−１からの溶出プールは、グリコシル化タンパク質からの非グリコシル化タンパク質のさらなる精製のための精製ステップ−２にかけられる。
【０１４０】
例５は、実験２７〜２９により、高ｐＨでの逆相精製−１を例示する。
実験２７
１０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトインスリン  グラルギンを含有する酵素反応最終産物を、ｐＨを８．５に調整し、アセトニトリル１０％に調整し、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ＋０．７Ｍアルギニンを用いて１．９１ｍｇ／ｍｌに希釈し、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル１００−１３−Ｃ８カラム（１＊２５ｃｍ）を用いて、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、１０カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜９ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）８０％およびアセトニトリル２０％を用いて、４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）を用いて２５〜３０％アセトニトリルの勾配で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水５０％およびアセトニトリル５０％を用いて４カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表４３に示す。
【０１４１】
＊精製−１が高ｐＨで行われる場合、ロード調製は、Ｌ−アルギニンおよびＴｒｉｓを用い、より優れた溶解性を確実にする。ロード調製に用いられるアルギニンは、精製メカニズムには全く影響を与えない。緩衝液の組成および他の入力パラメータを含む、ステップの他の全ての側面は、変更しないでおく。
【０１４２】
【表４３】
2021535214.tif 000052
【０１４３】
実験２８
１０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトインスリン  グラルギンを含有する酵素反応最終産物を、ｐＨを８．５に調整し、アセトニトリル１０％に調整し、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ＋０．７Ｍアルギニン＊を用いて１．９１ｍｇ／ｍｌに希釈し、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル１００−１３−Ｃ８カラム（１＊２５ｃｍ）を用いて、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜９．３ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）８０％およびアセトニトリル２０％を用いて、４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）を用いて２５〜３０％アセトニトリルの勾配で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水５０％およびアセトニトリル５０％を用いて４カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表４４に示す。
【０１４４】
＊精製−１が高ｐＨで行われる場合、ロード調製は、Ｌ−アルギニンおよびＴｒｉｓを用い、より優れた溶解性を確実にする。ロード調製に用いられるアルギニンは、精製メカニズムには全く影響を与えない。緩衝液の組成および他の入力パラメータを含む、ステップの他の全ての側面は、変更しないでおく。
【０１４５】
【表４４】
2021535214.tif 000053
【０１４６】
実験２９
１０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトインスリン  グラルギンを含有する酵素反応最終産物を、ｐＨを８．５に調整し、アセトニトリル１０％に調整し、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ＋０．７Ｍアルギニン＊を用いて１．９１ｍｇ／ｍｌに希釈し、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル１００−１３−Ｃ８カラム（２．１＊２５ｃｍ）を用いて、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜９．７５ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）８０％およびアセトニトリル２０％を用いて、４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５±０．１）を用いて２５〜３０％アセトニトリルの勾配で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水５０％およびアセトニトリル５０％を用いて４カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表４５に示す。
【０１４７】
＊精製−１が高ｐＨで行われる場合、ロード調製は、Ｌ−アルギニンおよびＴｒｉｓを用い、より優れた溶解性を確実にする。ロード調製に用いられるアルギニンは、精製メカニズムには全く影響を与えない。緩衝液の組成および他の入力パラメータを含む、ステップの他の全ての側面は、変更しないでおく。
【０１４８】
【表４５】
2021535214.tif 000054
【０１４９】
高ｐＨでの逆相精製−１の実験データの概要を表４６において下記に詳細に示す。
【表４６】
2021535214.tif 000055
【０１５０】
ヒトインスリン  グラルギンについての第１の逆相精製ステップは、イオンペアリング剤オクタンスルホン酸（ＯＳＡ）を併用した高ｐＨ緩衝液を用いて、グリコシル化バリアントを９０〜９３％減少させ、それによりロード中の〜５６％から溶出プール中の＞８５％まで、純度を増加させる。
残りのグリコシル化不純物は、低ｐＨを採用する第２の逆相精製ステップを用いて取り除かれ、インスリン  グラルギンの純度は＞９９．５％に増加する。
【０１５１】
例６は、実験３０〜３２により、低ｐＨでの逆相精製ステップ−２を例示する。
実験３０
５．０６ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトインスリン  グラルギンおよび２８．８％アセトニトリルを含有する逆相精製−１最終産物を、酢酸を用いてｐＨ３．７に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル１０％を含む最終濃度〜１．６９ｍｇ／ｍｌのインスリン  グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル１００−１３−Ｃ８カラム（１＊２５ｃｍ）を使用し、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、約１０カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜６．９ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）８５％およびアセトニトリル１５％を用いて、約４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）を用いて２４〜３１％アセトニトリルの勾配で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、１Ｍ酢酸５０％およびアセトニトリル５０％を用いて２カラム体積で溶出し、続いて１Ｍ酢酸３０％およびアセトニトリル７０％を用いて１カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表４７において下記に示す。
【０１５２】
【表４７】
2021535214.tif 000056
【０１５３】
実験３１
５．４９ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトインスリン  グラルギンおよび２８．８％アセトニトリルを含有する逆相精製−１最終産物を、酢酸を用いてｐＨ３．７に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル１０％を含む最終濃度１．９６ｍｇ／ｍｌのインスリン  グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル１００−１３−Ｃ８カラム（１＊２５ｃｍ）を使用し、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、約１０カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜７．０ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）８５％およびアセトニトリル１５％を用いて、約４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）を用いて２４〜３１％アセトニトリルの勾配で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、１Ｍ酢酸５０％およびアセトニトリル５０％を用いて２カラム体積で溶出し、続いて１Ｍ酢酸３０％およびアセトニトリル７０％を用いて１カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表４８において下記に示す。
【０１５４】
【表４８】
2021535214.tif 000057
【０１５５】
実験３２
〜４．３ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトインスリン  グラルギンおよび２８．６％アセトニトリルを含有する逆相精製−１最終産物を、酢酸を用いてｐＨ３．７に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル１０％を含む最終濃度〜１．５ｍｇ／ｍｌのインスリン  グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル１００−１３−Ｃ８カラム（１＊２５ｃｍ）を使用し、インスリン  グラルギンを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、約５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜７．５ｇヒトインスリン  グラルギン／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）８５％およびアセトニトリル１５％を用いて、約４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム＋０．０５％ＯＳＡ緩衝液（ｐＨ３．７±０．１）を用いて２４〜３１％アセトニトリルの勾配で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、１Ｍ酢酸５０％およびアセトニトリル５０％を用いて２カラム体積で溶出し、続いて１Ｍ酢酸３０％およびアセトニトリル７０％を用いて１カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表４９において下記に示す。
【０１５６】
【表４９】
2021535214.tif 000058
【０１５７】
低ｐＨでの逆相精製−２の実験データの概要を表５０において下記に詳細に示す。
【表５０】
2021535214.tif 000059
【０１５８】
逆相精製ステップ１および２の終了までのクオリティプロファイルおよび推定質量に基づくＩＤを、それぞれ表５１および５２において下記に詳細に示す。逆相精製−１最終産物および逆相精製−２最終産物についての質量分析データ  ＵＶおよびＴＩＣクロマトグラムは、それぞれ図６Ａおよび図６Ｂの通りであった。
【０１５９】
【表５１】
2021535214.tif 000060
【０１６０】
【表５２】
2021535214.tif 000061
【０１６１】
高ｐＨベースのＲＰ−ＨＰＬＣの後に低ｐＨベースのＲＰ−ＨＰＬＣが続く、インスリン  リスプロの精製
高ｐＨでの精製ステップ−１は、図１のフローチャートに示されている通りである。精製ステップ−１の詳細は以下の通りである。
定常相の詳細：
ａ．媒体：ダイソーパック  Ｃ１８−２００Ａ−１０ｐｍ
ｂ．高さ：２５．Ｏｉｌ．０ｃｍ
ｃ．線速度：全てのクロマトグラフィーステップについて、≦３６０ｃｍ／ｈ
【０１６２】
移動相の詳細：
ａ．移動相Ａ：ｐＨ７．５±０．１の、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２００ｍＭイミダゾール＋０．２％（ｗ／ｖ）重硫酸テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＢ）（ｐＨは氷酢酸を用いて調整）
ｂ．移動相Ｂ：１００．０％アセトニトリル
ｃ．精製サイクルの間の移動相ＡおよびＢの温度：２０〜３０℃
【０１６３】
ロード調製：
ａ．先のステップで得られたロード濃縮物を、ｐＨを７．５±０．１に調整し、精製水を用いて≧１．０：１０．０の比率で希釈した。
ｂ．サンプルを、１．２ｐｍ、０．４５ｐｍ、続いて０．２２ｐｍでろ過した。
ｃ．１．２ｐｍのろ過に用いられたフィルターは、ポリプロピレン（ＰＰ）製であり、０．４５／０．２２ｐｍのろ過に用いられたものは、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）材質製であった。
ｄ．ロード中の生成物濃度は、１．０〜２．０ｇ／Ｌの範囲にあると予想された。
【０１６４】
精製のためのプロセス条件：
ａ．カラムは、９０．０％（Ａ）：１０．０％（Ｂ）の移動相を用い、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて５〜１０ＣＶ（カラム体積）で平衡化した。
ｂ．カラムは、９〜１０ｇリスプロ／Ｌ樹脂の容量で、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にてロードした。
ｃ．ロード後、カラムは、８０．０％（Ａ）：１５．０％（Ｂ）の移動相を用い、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて４〜５ＣＶ（カラム体積）で洗浄した。
ｄ．生成物は、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて、２４〜２９％Ｂの線形勾配を用い、１３ＣＶを超えてカラムから溶出させた。
【０１６５】
ｅ．溶出の間、可変体積画分の収集は、２８０ｎｍにおける吸光度（ＵＶ）の上昇に基づいて行った。収集は、ＵＶがベースラインに低下するまで継続した。カラムからタンパク質を溶出させるのに必要な体積は、２．０〜３．０ＣＶであった。
ｆ．溶出画分は、分析し、およびその純度レベルに基づいてプールし、調製した溶出プールを２〜８℃で保存した。
ｇ．溶出後、残留タンパク質がある場合にはそれを除去するために、カラムを、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて、アップフロー方向に２ＣＶで、移動相Ａ５０．０％およびアセトニトリル５０．０％を用い、続いて３Ｍ酢酸３０％およびアセトニトリル７０．０％を用い、再生した。
結果は、表５３に示されるデータの通りであった。データによれば、グリコシル化タンパク質は、〜３倍、すなわちロード中の〜４．０％から溶出プール中の〜１．０％まで、減少した。
【０１６６】
【表５３】
2021535214.tif 000062
【０１６７】
精製ステップ−１からの溶出プールは、グリコシル化タンパク質からの非グリコシル化タンパク質のさらなる精製のための精製ステップ−２にかけられる。
低ｐＨでの精製ステップ−２は、図２のフローチャートに示されている通りである。精製ステップ−２の詳細は以下の通りである。
定常相の詳細：
ａ．媒体：ダイソーパック  Ｃ１８−２００Ａ−１０ｐｍ
ｂ．高さ：２５．Ｏｉｌ．０ｃｍ
ｃ．線速度：全てのクロマトグラフィーステップについて、≦３６０ｃｍ／ｈ
【０１６８】
移動相の詳細：
ａ．移動相Ａ：ｐＨ３．８５±０．１の、４００ｍＭクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液＋０．１％（ｗ／ｖ）オクタンスルホン酸（ＯＳＡ）＋５０ｍＭ  ＧｕＣｌ
ｂ．移動相Ｂ：１００．０％アセトニトリル
ｃ．精製サイクルの間の移動相ＡおよびＢの温度：２６〜３０℃
【０１６９】
ロード調製：
ａ．先のステップで得られた溶出プールを、氷酢酸を用いてｐＨを４．０±０．１に調整し、精製水を用いて、≧１．０：１．５の比率で希釈した。
ｂ．希釈後、サンプルを１．２ｐｍ、０．４５ｐｍ、続いて０．２２ｐｍのフィルターでろ過した。
ｃ．１．２ｐｍのろ過に用いられたフィルターは、ポリプロピレン（ＰＰ）製であり、０．４５／０．２２ｐｍのろ過に用いられたものは、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）材質製であった。
ｄ．ロード中の生成物濃度は、０．８〜１．０ｇ／Ｌの範囲にあると予想された。
【０１７０】
精製のためのプロセス条件：
ａ．カラムは、９０．０％（Ａ）：１０．０％（Ｂ）の移動相を用い、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて５〜１０ＣＶ（カラム体積）で平衡化した。
ｂ．カラムは、７〜８ｇリスプロ／Ｌ樹脂の容量で、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にてロードした。
ｃ．ロード後、カラムは、７８．０％（Ａ）：２２．０％（Ｂ）の移動相を用い、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度にて４〜５ＣＶ（カラム体積）で洗浄した。
ｄ．生成物は、≦２２０ｃｍ／ｈの線速度にて、２４〜２８％Ｂの線形勾配を用い、２０ＣＶを超えてカラムから溶出させた。
【０１７１】
ｅ．溶出の間、可変体積画分の収集は、２８０ｎｍにおける吸光度（ＵＶ）の上昇に基づいて行った。収集は、ＵＶ２８０がベースラインに低下するまで継続した。カラムからタンパク質を溶出させるのに必要な体積は２．０〜３．０ＣＶであった。
ｆ．溶出画分は、分析し、その純度レベルに基づいてプールし、調製した溶出プールを２〜８℃で保存した。
ｇ．溶出後、残留タンパク質がある場合にはそれを除去するために、カラムを、≦３６０ｃｍ／ｈの線速度で、アップフロー方向に１Ｍ酢酸７０．０％およびアセトニトリル３０．０％を用いて４ＣＶで再生した。
結果は、表５４に示されるデータの通りであった。データによれば、グリコシル化タンパク質は、ロード中の〜０．３％から溶出プール中のＢＬＯＱレベルまで減少した。
【０１７２】
【表５４】
2021535214.tif 000063
【０１７３】
例７は、実験３３〜３５により、高ｐＨでの逆相精製ステップ−１を例示する。
実験３３
ヒトインスリン  リスプロを１３ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する酵素反応最終産物を、ｐＨを７．５に調整し、および１０％アセトニトリルに調整し、続いて精製水を用いて１．４５ｍｇ／ｍｌに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相ダイソーパック２００−１０−Ｃ１８カラム（２＊２５ｃｍ）を用い、インスリン  リスプロを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２００ｍＭイミダゾール＋０．２％（ｗ／ｖ）ＴＢＡＢ緩衝液（ｐＨ７．５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、１０カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜７．３ｇヒトインスリン  リスプロ／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２００ｍＭイミダゾール＋０．２％（ｗ／ｖ）ＴＢＡＢ緩衝液（ｐＨ７．５±０．１）７５％およびアセトニトリル１５％を用いて、４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２００ｍＭイミダゾール＋０．２％（ｗ／ｖ）ＴＢＡＢ緩衝液（ｐＨ７．５±０．１）を用いて２４〜２９％アセトニトリルの勾配で、１３カラム体積を超えて溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２００ｍＭイミダゾール＋０．２％（ｗ／ｖ）ＴＢＡＢ緩衝液（ｐＨ７．５±０．１）５０％およびアセトニトリル５０％を用いて２カラム体積で、続いて３Ｍ酢酸３０％およびアセトニトリル７０％を用いて２カラム容積で、溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表５５に示す。
【０１７４】
【表５５】
2021535214.tif 000064
【０１７５】
実験３４
ヒトインスリン  リスプロを１３ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する酵素反応最終産物を、ｐＨを７．５に調整し、および１０％アセトニトリルに調整し、続いて精製水を用いて１．４５ｍｇ／ｍｌに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相ダイソーパック２００−１０−Ｃ１８カラム（２＊２５ｃｍ）を用い、インスリン  リスプロを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２００ｍＭイミダゾール＋０．２％（ｗ／ｖ）ＴＢＡＢ緩衝液（ｐＨ７．５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜７．３ｇヒトインスリン  リスプロ／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２００ｍＭイミダゾール＋０．２％（ｗ／ｖ）ＴＢＡＢ緩衝液（ｐＨ７．５±０．１）７５％およびアセトニトリル１５％を用いて、４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２００ｍＭイミダゾール＋０．２％（ｗ／ｖ）ＴＢＡＢ緩衝液（ｐＨ７．５±０．１）を用いて２４〜２９％アセトニトリルの勾配で、１３カラム体積を超えて溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２００ｍＭイミダゾール＋０．２％（ｗ／ｖ）ＴＢＡＢ緩衝液（ｐＨ７．５±０．１）５０％およびアセトニトリル５０％を用いて２カラム体積で、続いて３Ｍ酢酸３０％およびアセトニトリル７０％を用いて２カラム容積で、溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表５６に示す。
【０１７６】
【表５６】
2021535214.tif 000065
【０１７７】
実験３５
ヒトインスリン  リスプロを１３ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する酵素反応最終産物を、ｐＨを７．５に調整し、および１０％アセトニトリルに調整し、続いて精製水を用いて１．４５ｍｇ／ｍｌに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相ダイソーパック２００−１０−Ｃ１８カラム（２＊２５ｃｍ）を用い、インスリン  リスプロを精製した。カラムは、最初に、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２００ｍＭイミダゾール＋０．２％（ｗ／ｖ）ＴＢＡＢ緩衝液（ｐＨ７．５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜７．３ｇヒトインスリン  リスプロ／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２００ｍＭイミダゾール＋０．２％（ｗ／ｖ）ＴＢＡＢ緩衝液（ｐＨ７．５±０．１）７５％およびアセトニトリル１５％を用いて、４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２００ｍＭイミダゾール＋０．２％（ｗ／ｖ）ＴＢＡＢ緩衝液（ｐＨ７．５±０．１）を用いて２４〜２９％アセトニトリルの勾配で、１３カラム体積を超えて溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２００ｍＭイミダゾール＋０．２％（ｗ／ｖ）ＴＢＡＢ緩衝液（ｐＨ７．５±０．１）５０％およびアセトニトリル５０％を用いて２カラム体積で、続いて３Ｍ酢酸３０％およびアセトニトリル７０％を用いて２カラム容積で、溶出した。全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表５７に示す。
【０１７８】
【表５７】
2021535214.tif 000066
【０１７９】
高ｐＨでの逆相精製−１の実験データの概要を表５８において下記に詳細に示す。
【表５８】
2021535214.tif 000067
【０１８０】
ヒトインスリン  リスプロについての第１の逆相精製ステップは、イオンペアリング剤重硫酸テトラブチルアンモニウムを併用した高ｐＨ緩衝液を用いて、グリコシル化バリアントを６５〜７５％減少させ、それによりロード中の〜５８％から溶出プール中の＞８２％まで、純度を増加させる。
残りのグリコシル化不純物は、低ｐＨを採用する第２の逆相精製ステップを用いて取り除かれ、インスリン  リスプロの純度は＞９５％に増加する。
【０１８１】
例８は、実験３６〜３８により、低ｐＨでの逆相精製ステップ−２を例示する。
実験３６
Ｇｍｇ／ｍｌの濃度のヒトインスリン  グラルギンおよび２８．３％アセトニトリルを含有する逆相精製−１最終産物を、酢酸を用いてｐＨ４．０に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル１０％を含む最終濃度１．０６ｍｇ／ｍｌのインスリン  リスプロを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相ダイソーパック２００−１０−Ｃ８カラム（１＊２５ｃｍ）を用いて、インスリン  リスプロを精製した。カラムは、最初に、４００ｍＭクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液＋０．１％（ｗ／ｖ）ＯＳＡ＋５０ｍＭ  ＧｕＣｌ（ｐＨ３．８５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、約１０カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜７．５ｇヒトインスリン  リスプロ／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、４００ｍＭクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液＋０．１％（ｗ／ｖ）ＯＳＡ＋５０ｍＭ  ＧｕＣｌ（ｐＨ３．８５±０．１）７８％およびアセトニトリル２２％を用いて、約４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、４００ｍＭクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液＋０．１％（ｗ／ｖ）ＯＳＡ＋５０ｍＭ  ＧｕＣｌ（ｐＨ３．８５±０．１）を用いて２４〜２８％アセトニトリルの勾配で、２０カラム体積を超えて２２０ｃｍ／ｈの線流速で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、１Ｍ酢酸３０％およびアセトニトリル７０％を用いて４カラム体積で溶出した。溶出以外の全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表５９において下記に示す。
【０１８２】
【表５９】
2021535214.tif 000068
【０１８３】
実験３７
〜３ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトインスリン  リスプロおよび２８．８％アセトニトリルを含有する逆相精製−１最終産物を、酢酸を用いてｐＨ４．０に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル１０％を含む最終濃度１．０６ｍｇ／ｍｌのインスリン  リスプロを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相ダイソーパック２００−１０−Ｃ８カラム（１＊２５ｃｍ）を用いて、インスリン  リスプロを精製した。カラムは、最初に、４００ｍＭクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液＋０．１％（ｗ／ｖ）ＯＳＡ＋５０ｍＭ  ＧｕＣｌ（ｐＨ３．８５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、約１０カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜７．２ｇヒトインスリン  リスプロ／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、４００ｍＭクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液＋０．１％（ｗ／ｖ）ＯＳＡ＋５０ｍＭ  ＧｕＣｌ（ｐＨ３．８５±０．１）７８％およびアセトニトリル２２％を用いて、約４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、４００ｍＭクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液＋０．１％（ｗ／ｖ）ＯＳＡ＋５０ｍＭ  ＧｕＣｌ（ｐＨ３．８５±０．１）を用いて２４〜２８％アセトニトリルの勾配で、２０カラム体積を超えて２２０ｃｍ／ｈの線流速で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、１Ｍ酢酸３０％およびアセトニトリル７０％を用いて４カラム体積で溶出した。溶出以外の全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表６０において下記に示す。
【０１８４】
【表６０】
2021535214.tif 000069
【０１８５】
実験３８
〜２．３ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトインスリン  リスプロおよび２８．６％アセトニトリルを含有する逆相精製−１最終産物を、酢酸を用いてｐＨ４．０に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル１０％を含む最終濃度〜０．８３ｍｇ／ｍｌのインスリン  リスプロを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相ダイソーパック２００−１０−Ｃ８カラム（１＊２５ｃｍ）を用いて、インスリン  リスプロを精製した。カラムは、最初に、４００ｍＭクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液＋０．１％（ｗ／ｖ）ＯＳＡ＋５０ｍＭ  ＧｕＣｌ（ｐＨ３．８５±０．１）９０％およびアセトニトリル１０％を用い、約５カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜８．０ｇヒトインスリン  リスプロ／Ｌ樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、４００ｍＭクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液＋０．１％（ｗ／ｖ）ＯＳＡ＋５０ｍＭ  ＧｕＣｌ（ｐＨ３．８５±０．１）７８％およびアセトニトリル２２％を用いて、約４カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、４００ｍＭクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液＋０．１％（ｗ／ｖ）ＯＳＡ＋５０ｍＭ  ＧｕＣｌ（ｐＨ３．８５±０．１）を用いて２４〜２８％アセトニトリルの勾配で、２０カラム体積を超えて２２０ｃｍ／ｈの線流速で溶出した。０．２５カラム体積の複数画分を２８０ｎｍにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、１Ｍ酢酸３０％およびアセトニトリル７０％を用いて４カラム体積で溶出した。溶出以外の全ユニットの操作は、３６０ｃｍ／ｈの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のＣ１８カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表６１において下記に示す。
【０１８６】
【表６１】
2021535214.tif 000070
【０１８７】
低ｐＨでの逆相精製−２の実験データの概要を表６２において下記に詳細に示す。
【表６２】
2021535214.tif 000071
【０１８８】
逆相精製ステップ−１の終了までのクオリティプロファイルおよび推定質量に基づくＩＤを、表６３（実験３３）、表６４（実験３４）および表６５（実験３５）において下記に詳細に示し、逆相精製ステップ−２の終了までのクオリティプロファイルおよび推定質量に基づくＩＤを、表６６（実験３６）、表６７（実験３７）および表６８（実験３８）において下記に詳細に示す。逆相精製−１最終産物についての質量分析データ  ＵＶおよびＴＩＣクロマトグラムは、図７Ａ（実験３３）、図７Ｂ（実験３４）および図７Ｃ（実験３５）の通りであった。逆相精製−２最終産物についての質量分析データ  ＵＶおよびＴＩＣクロマトグラムは、図８Ａ（実験３６）、８Ｂ（実験３７）および図８Ｃ（実験３８）の通りであった。
【０１８９】
【表６３】
2021535214.tif 000072
【０１９０】
【表６４】
2021535214.tif 000073
【０１９１】
【表６５】
2021535214.tif 000074
【０１９２】
【表６６−１】
2021535214.tif 000075
【表６６−２】
2021535214.tif 000076
【０１９３】
【表６７】
2021535214.tif 000077
【０１９４】
【表６８】
2021535214.tif 000078
【０１９５】
結論
例において詳細に示した通り、本発明は、一方のステップでイオンペアリング剤、好ましくはＯＳＡを、他方のステップでのアルカリｐＨベースの溶離液と併せて採用することによる、グリコシル化アナログからの非グリコシル化インスリンアナログの分離のための２ステップ精製プロセスに関し、グリコシル化型インスリンアナログの約９９．９５％除去を達成する。
【図１】
2021535214.tif 000079
【図２】
2021535214.tif 000080
【図３Ａ】
2021535214.tif 000081
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
2021535214.tif 000083
【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
2021535214.tif 000085
【図５Ｂ】
2021535214.tif 000086
【図６Ａ】
2021535214.tif 000087
【図６Ｂ】
2021535214.tif 000088
【図７Ａ】
2021535214.tif 000089
【図７Ｂ】
2021535214.tif 000090
【図７Ｃ】
2021535214.tif 000091
【図８Ａ】
2021535214.tif 000092
【図８Ｂ】
2021535214.tif 000093
【図８Ｃ】
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【国際調査報告】
2021535214.tif 000095
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