(57)【要約】  本発明は水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム、及びリン酸カルシウム微粒子からなるリストより選択される無機物微粒子の分野に位置している。より具体的には、本発明は有機的に誘導される無機物微粒子、それらの使用、及び同一のものを調製する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）一以上の有機ポリリン酸の溶液を提供すること、
ｂ）無機物微粒子を提供すること、
ｃ）前記無機物微粒子を前記一以上の有機ポリリン酸の溶液において懸濁すること、
ｄ）結果として生じた懸濁液を撹拌すること、
を含み、ここで前記無機物微粒子が水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム及び／又はリン酸カルシウム微粒子より選択され、並びに前記有機ポリリン酸が式１Ａ又は式１Ｂの化合物より選択される有機的に誘導される無機物微粒子の調製方法：
【化１】
2021521089.tif 000012
【化２】
2021521089.tif 000013
（式中ｎは０〜５の範囲内の整数であって、ｍは２〜１０の範囲の整数であって、そして式中Ｒaはアデノシン及び他のヌクレオシド、チアミン、炭水化物及びイソプレンより選択される有機置換基を意味し、Ｒbはイノシトール及び他のシクリトール、並びに炭化水素から選択された有機置換基を意味する方法）。
【請求項２】
一以上の有機ポリリン酸の溶液が、イノシトール２リン酸（ＩＰ２）、イノシトール３リン酸（ＩＰ３）、イノシトール４リン酸（ＩＰ４）、イノシトール５リン酸（ＩＰ５）、イノシトール６リン酸（ＩＰ６）より選択されるイノシトールリン酸を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一以上の有機ポリリン酸の溶液がイノシトール６リン酸（ＩＰ６）又はその塩を含む請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
有機的に誘導される無機物微粒子のゼータ電位が、５分±１０秒の間隔で単離された反応産物の試料の分析による測定に従い、５分間の間に、１０％超変化しない、好ましくは最大で５％変化するまで、ｄ）工程を継続する請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記無機物微粒子出発物質がリン酸カルシウム微粒子を含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記無機物微粒子出発物質がアルミニウムを含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法により入手可能な有機的に誘導される無機物微粒子。
【請求項８】
請求項１〜５に記載の方法により入手可能な有機的に誘導されるリン酸カルシウム微粒子。
【請求項９】
蒸留水においてｐＨ７．０で測定した場合に、リン酸アルミニウム若しくはヒドロキシリン酸より由来する微粒子について少なくとも−３５ｍＶ又はリン酸カルシウムから由来する微粒子について少なくとも−４０ｍＶの名目上のゼータ電位を有することによって特徴づけられる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の有機的に誘導される無機物微粒子。
【請求項１０】
薬物における使用のための請求項７〜９のいずれか一項に記載の有機的に誘導される無機物微粒子。
【請求項１１】
生体分子送達又は吸着システムとしての使用のための請求項７〜９のいずれか一項に記載の有機的に誘導される無機物微粒子。
【請求項１２】
前記生体分子送達システムがワクチンのアジュバントである生体分子送達システムとしての使用のための請求項１１に記載の有機的に誘導される無機物微粒子。
【請求項１３】
ワクチンにおける、ワクチンアジュバントとしての使用のための請求項１２に記載の有機的に誘導される無機物微粒子。
【請求項１４】
血液分画における使用のための請求項１１に記載の有機的に誘導される無機物微粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子送達又は吸着システムとして使用のための、例えばワクチンアジュバントとして使用のための、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又はリン酸カルシウム又はそれらの混合物からなる無機物微粒子の分野に位置している。より具体的には、本発明は有機的に誘導される水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、又はリン酸カルシウム微粒子、それらの使用、及び同様のものの調製方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
無機物アジュバント、例えばリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム及びリン酸カルシウムを含む、アルミニウムを含むアジュバントは数十年継続して使用され、死滅された、不活化された及びサブユニットのワクチン抗原に対する免疫反応を促進する。現在、アルミニウムアジュバントは動物及びヒトの両方のワクチンにおいて最も広く用いられるアジュバントである。これは、これらの無機物含有アジュバントでさえもより強力にすることにおいて大きな関心を作り出す。より強力なアジュバント及びワクチンは潜在的に単純化され、減少された予防接種キャンペーンを意味し、これは潜在的に患者、医療関係者の負担を減らし、費用／利益を改善する方法である。
【０００３】
アジュバントの効力の中心的な側面は、排液リンパ節における免疫システムの細胞性又は体液性の分岐への抗原の送達及び提示を頼りにする。アジュバントによって吸着される抗原量又は負荷（質量／質量比で示される）は、それが、アジュバントと共に、いくつかの抗原分子が異なる物質として認識され、適当な免疫反応を誘発するであろう可能性を条件付けするように、一つの重要なパラメータである。アジュバントのユニットあたりのより高い抗原の用量を成し遂げることが潜在的に所望されており、同じ抗原の用量についてアジュバント積載量の減少を認めるように、これは製造コストを減らすと考えられる。アジュバントへの抗原の結合の強さ及び性質は、それがとりまく生理学的な環境内に自由な形式において放出される代わりに（アジュバント粒子へ結合される）粒子状の形状に提示される抗原のための可能性を条件づけるので別の重要なパラメータである。これは、高い拡散定数を有する小さな可溶性ペプチドと特に関連性があるかもしれず、実際のところ、ワクチンとしてのペプチドは、低い免疫原性を引き起こし、アジュバント化される必要があることが一般的に知られている［Ｌｉ，Ｗ．，Ｊｏｓｈｉ，Ｍ．Ｄ．，Ｓｉｎｇｈａｎｉａ，Ｓ．，Ｒａｍｓｅｙ，Ｋ．Ｈ．，＆Ｍｕｒｔｈｙ，Ａ．Ｋ．（２０１４）．Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅ：ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，２（３），５１５−５３６．］。粒子に相対的に強く結合することは、抗原において放出するため及び培地中に拡散するための可能性を減少し、そして抗原提示細胞による認識から逃れ、それゆえワクチンの拡散を制限することを減らすだろう。しかしながら、研究はアルミニウムアジュバントへの抗原のあまりに強力な吸着が、抗原提示細胞による吸着した抗原の不十分な加工及び提示のせいで、ワクチン効果の減少をもたらしうることを示す（Ｈａｎｓｅｎ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｎ  ａｌｕｍｉｎｕｍ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ，Ｖａｃｃｉｎｅ，２００７）。それゆえ、抗原が最終的にアジュバントと結合して送達される方法をよりよく制御することへ、ワクチンコミュニティー及び産業における強力な圧力がある。この問題への可能な手がかりは、送達される抗原の物理化学的な特異性を目的に合わせてアジュバントを設計することができることである。
【０００４】
アジュバントの能力の別の側面は粒子サイズに関連しうる。例えば、より大きな粒子と比較して、より小さいサイズのアルミニウム含有粒子が、特に抗原特異的な抗体反応を誘導することについて、より小さい粒子が最も近い輸入リンパ管に移送されうるので、より良い効果を発揮することがＭｏｒｅｆｉｅｌｄら（Ｍｏｒｅｆｉｅｌｄ  Ｇ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｌｕｍｉｎｕｍ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎｔｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，Ｖａｃｃｉｎｅ，２００５）及びＬｉら（Ｌｉ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｓｈｏｗ  ａ  ｓｔｒｏｎｇｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｈａｎ  ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１４）によって示された。現在、超音波破砕、高圧剪断、濾過、ホモジネーション、製粉、微小溶液操作、沈降、又は再結晶化のような利用可能な多くの技術がある。さらに規定サイズの粒子の産生をもたらす合成プロトコールが十分に確立された。合成パラメータの調節は、異なるサイズの粒子を潜在的に導きうる（Ｂｕｒｒｅｌｌ  Ｌ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，  Ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｂｙ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ａｔ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｐＨ．  Ｐａｒｔ  I：  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０００；Ｂｕｒｒｅｌｌ  Ｌ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｂｙ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ａｔ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｐＨ．Ｐａｒｔ  ＩＩ：ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０００）。
【０００５】
しかしながら、時間浪費及び費用を減らし、粒子サイズの均一性のより良い制御を提供し、そして無機物微粒子に至適な抗原結合特性を上昇する改善された方法に対するニーズが残存している。
【発明の概要】
【０００６】
同時係属の国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７６２３２において、本発明者は、有機ポリリン酸の溶液のように、一以上の無機ポリリン酸の水溶液において、リン酸アルミニウム、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム及び／又はリン酸カルシウム、又はそれらの混合物より選択される、ある二価又は三価の金属塩の無機物微粒子の懸濁液を撹拌する方法を記載し、前記無機物微粒子の修飾をもたらし、その名目上の静電ポテンシャルの重大な変化と粒子サイズの減少との両方を導く。
【０００７】
理論に縛られることなく、これらの修飾は、前記無機物微粒子の表面で無機リン酸イオンによる水酸化物又はオルトリン酸基の置換反応又はリガンドの交換により生じることが想定される。
【０００８】
本発明者は、類似の置換反応、又はリガンド交換が一般式１Ａ又は１Ｂの有機ポリリン酸を用いて成し遂げられうることを今回発見した：
【化１】
2021521089.tif 000002
【化２】
2021521089.tif 000003
式中、ｎは０〜５の範囲の整数であり、そしてｍは２〜１０の範囲の整数であり、そして式中Ｒaはアデノシン及び他のヌクレオシド、チアミン、炭化水素並びにイソプレンより選択される有機的な置換基、を意味し、そしてＲbはイノシトール及び他のシクリトール並びに炭化水素より選択される有機的な置換基を意味する。
【０００９】
本発明に従う有機ポリリン酸はそれゆえ、ｎが０〜５の範囲における整数である、少なくとも一つのポリリン酸基−Ｏ−ＰＯ2−（−Ｏ−ＰＯ2−）−Ｏ−ＰＯ3を有するか、又は−Ｏ−ＰＯ3の２〜１０の間のリン酸基を有するかのいずれかによって「ポリリン酸塩」と見なされうる。
【００１０】
式１Ａの有機的なポリリン酸塩の例として、アデノシン及びＡＴＰ及びＡＤＰのような他のヌクレオシドリン酸、チアミン三リン酸及びチアミン二リン酸のようなチアミンリン酸、α−Ｄ−リボース５−三リン酸及びＬ−アスコルビン酸２−三リン酸塩のようなカーボネートポリリン酸塩、プテリンリン酸塩並びにゲラニル二リン酸のようなイソプレノイドリン酸塩が挙げられうる。
【００１１】
式１Ｂの有機ポリリン酸の例として、イノシトール及び他のシクリトールリン酸塩、例えばイノシトール２リン酸（ＩＰ２）、イノシトール３リン酸（ＩＰ３）、イノシトール４リン酸（ＩＰ４）、イノシトール５リン酸（ＩＰ５）及びフィチン酸、又は（塩として）フィチン酸塩としても知られているイノシトール６リン酸（ＩＰ６）が挙げられうる。式１Ｂのさらなる例は、グルコース−１，６−ビスリン酸、フルクトース１，６−ビスリン酸、フルクトース２，６−ビスリン酸、リブロース−１，５−ビスリン酸、２−デオキシ−Ｄ−リボース１，５−ビスリン酸、並びに１，３−及び２，３−ジホスホグリセリン酸のようなカーボハイドレードリン酸塩を含む。
【００１２】
本明細書で開示した本発明は、同時係属の国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７６２３２の開示と比較して驚くべき利点を提供する。一般式１Ａ又は１Ｂの有機ポリリン酸を用いることは、粒子表面で生じる促進された反応を導き、より高い表面被覆をもたらす。結果として、微粒子の名目上の静電ポテンシャルのより重大な変化が以前よりも観察され、より小さい有機的に誘導される無機物微粒子及びナノ粒子を生じることの安定性がより高くなるように見えるので、そして粒子サイズの減少を制御することがより容易であるように思われる。第二に、そして最も重要なことに、特に一般式１Ｂの有機ポリリン酸を用いることは、同時係属の国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７６２３２に記載された無機ポリリン酸によって成し遂げうるよりも、最終修飾した無機物微粒子のより高い熱安定性を導き、それはオートクレーブ処理／滅菌処理目的に重要である。最終的に、鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）により例示されるように、本発明に記載の有機的に誘導される無機物微粒子の、抗原に対する吸着効率は、同時係属の国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７６２３２に開示された無機ポリリン酸修飾した微粒子に見られるよりも高い。本発明者はこれがタンパク質及びポリペプチド、例えばリシン及びアルギニンにおける正電荷の残基のキレート効果により生じ、特に一般式１Ｂの有機ポリリン酸によって、粒子の表面へより強い吸着をもたらすと考えている。
【００１３】
一般式１Ａの有機ポリリン酸は一般式１Ｂのポリリン酸よりもより低い熱安定性を有しうる。（一般式１Ａの有機ポリリン酸の例の）ヌクレオチドはエネルギー代謝、ＤＮＡ合成及び細胞内シグナル伝達において中心的な役割を果たす生物学的な多機能分子である。それらは、−ｏｓｅ部分の５’位に１、２、３リン酸基を有するヌクレオチド基からなる。アルミニウムゲルに対するリン酸の親和性のために、ＡＴＰのようなヌクレオチドはアルミニウムアジュバントに吸着し、そしてそれゆえアジュバント粒子の表面静電ポテンシャルの修正に用いられうる。同様に、アジュバントのアルミニウム粒子は細胞へのヌクレオチドの運搬及び送達に用いられうる。しかしながら、アルミニウムアジュバントは典型的にオートクレーブにより安定的であり、これはヌクレオチドの化学的な完全性と両立しない。オートクレーブ処理中の高温及び高圧の条件で、ＡＤＰ又はＡＴＰの無機ポリリン酸鎖の無水亜リン酸結合の加水分解が生じ、そしてこれらの分子の物理的及び化学的な特性が失われ又は反対に修飾される。オートクレーブ処理に代替するものとして、水において最大１００ｍＭまで濃縮されたＡＴＰ、ＡＤＰ又はＡＭＰの溶液が、０．２２μｍ又は０．１０μｍの孔を有する膜を通じてフィルター滅菌されうり、そしてその滅菌した溶液にオートクレーブしたアルミニウムアジュバント粒子を、適当な終濃度、例えば０．５ｍＭから２ｍＭ添加し、それによってオートクレーブのニーズを不必要にした。
【００１４】
式１Ａ又は式１Ｂの有機ポリリン酸による反応は、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム及び／又はリン酸カルシウムより選択された、ある２価又は３価の金属塩により実施されたが、他の無機物微粒子の幅広い範囲に適用可能である。
【００１５】
置換反応、又はリガンド交換は、水溶性の反応環境に適合する幅広い温度範囲内で実施されうる。
【００１６】
本出願を通じて、「未修飾の無機物微粒子」という用語は、前記の置換反応／リガンド交換に対する出発物質を意味すべきであって、一方で「有機的に誘導される無機物微粒子」という用語は、前記置換反応／リガンド交換の結果、又は産物を意味すべきである。
【００１７】
図６Ａは無機物微粒子の出発物質（本明細書では：リン酸アルミニウム）と有機ポリリン酸の溶液との間の想定される反応を示し、これは、微粒子の表面で起こる。本明細書内で称されるリン酸アルミニウム（アジュバント）は、基本的にヒドロキシリン酸アルミニウムであり、この中でいくつかの水酸基（Ａｌ−ＯＨ）をオルトリン酸基（Ｐｉと示されるＡｌ−ＯＰＯ３）によって置換される。前記反応は主に利用可能なＡｌ−ＯＨ基と溶解される有機ポリリン酸イオンとの間に生じ、そして時間の経過と共に、徐々に有機ポリリン酸基（ｎＰorgと表示される）によってリン酸アルミニウム粒子表面のより完全な被覆をもたらす。また、前記置換反応はおそらくオルトリン酸基を含む；すなわち、そのような利用可能なオルトリン酸基はある程度、有機ポリリン酸基によって置き換えられる。しかしながら、水酸基はオルトリン酸基よりもより良く遊離する基であり、そしてそれゆえ優先的に置換されることが想定される。
【００１８】
図６Ｃにおいて、電子顕微鏡により観察されるように、前記無機物微粒子出発物質は実際により小さな結晶の会合体／凝集体により構成される。結晶は粒子上に位置する水酸基間の水素結合によって少なくとも部分的に共に保持されると想定される。一旦水酸基が有機ポリリン酸基によって交換され始めると、減少した数の水素結合は結晶のまとまりを弱める。同時に、電子顕微鏡を用いて観察（図６Ｃ）されるように、それらの多数の負電荷を有する、増加した数の近接して位置する有機的なポリリン酸基はさらなる結晶会合体の脱安定化及びその最終的な脱凝集化（図６Ｂ）に繋がる。
【００１９】
しかしながら、同時係属の国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７６２３２に記載された無機ポリリン酸修飾した無機物微粒子と比較して、本発明の結果として生じる有機的に誘導される無機物微粒子の安定性は改善される。第一に、二つのオルトリン酸間のリン酸無水物結合（一般的な１Ａ式）よりも１Ｂ型分子内のホスホエステル結合はより高い活性エネルギーを示し、これは大部分のリン酸基を加水分解なしに安定化するための熱処理を行う可能性をもたらし、それゆえ、そのような有機ポリリン酸による修飾の性質を保存する。第二に、理論に束縛されることなく、発明者は懸濁液（コロイド）における粒子の増加した安定性が、無機物微粒子の表面とそれ自身とを接着する有機リン酸基により与えられる立体障害を増加することなく、少なくとも部分的に生じると考える。その有機リン酸基の有機的な基（Ｒa又はＲb）はＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７６２３２に論ぜられた無機ポリリン酸イオンよりもよりかさばっている。それゆえ、無機物微粒子の表面に位置するいくつかの元の水酸基又はオルトリン酸基が有機ポリリン酸基によって置き換わった後に、残存する水酸基又はオルトリン酸基へのアクセスがさらなる置換を通じて効果的に阻害されるようになる。
【００２０】
加えて、本発明には、有機的に誘導される無機物微粒子が正に荷電された生体分子、又は正電荷のパッチを有する生体分子、より具体的には抗原結合特性によって結合する性質を増加することを発見した。この性質は、おそらく正に荷電した生体分子の増加した誘因によって引き起こされ、増加した吸着能力及び／又は結合強度、すなわち増加した結合定数を導く。これを考慮して、本発明に従う有機的に誘導される無機物微粒子は、例えば改善されたワクチンアジュバントとして用いられうる。
【００２１】
従って、第一の側面において、一以上の有機ポリリン酸基の溶液内の無機物微粒子出発物質の懸濁液を撹拌することを含む有機的に誘導される無機物微粒子の調製方法が本明細書で提供され、ここで前記無機物微粒子は、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム及び／又はリン酸カルシウム微粒子、又はその混合物より選択され、そしてその中で前記有機ポリリン酸は式１Ａ又は１Ｂの化合物より選択され：
【化１】
2021521089.tif 000004
【化２】
2021521089.tif 000005
式中ｎは０〜５の範囲の整数であり、ｍは２〜１０の範囲の整数であり、そして式中Ｒaはアデノシン及び他のヌクレオシド、チアミン、炭化水素及びイソプレンより選択される有機置換物を示し、Ｒbはイノシトール及び他のシクリトール、炭化水素より選択される有機的な置換物を示す。
【００２２】
前記撹拌は、利用可能な水酸化物により及びオルトリン酸基がまたある程度交換される、即ち有機リン酸によって置換されるまで、無機物微粒子の表面で反応が起こることを認めるのに十分な時間継続される。その置換反応が認められうり、期間を短縮又は延長し、部分的又はより完全なイオンの置換をもたらす。
【００２３】
前記化学反応はリガンド交換又は置換反応として記載されうり、それにより無機物微粒子出発物質の表面に位置する水酸化物アニオンが有機的なポリリン酸イオンにより交換される。有機ポリリン酸イオンのリン酸基は水酸化物よりＡｌ（ＩＩＩ）に対してより高い親和性を有し、その平衡はルシャトリエの原理に従い、右にシフトされる（例えば：ＡｄｊｕＰｈｏｓ＋ｎＰｏｒｇ→ＡｄｊｕＰｈｏｓ−ｎＰｏｒｇ＋ＯＨ-）。
【００２４】
上記のように、前記リガンド交換／置換反応は典型的に水性反応環境中で起こり、そして約０〜約１００度（℃）、例えば５〜９５℃、又は１０〜９０℃、又は１５〜８５℃、又は２０〜８０℃、又は２５〜７５℃、又は３０〜７０℃、又は４０〜６０℃の温度範囲内で起こりうる。またその反応、又はリガンド交換は、＞１００℃以上の温度で中圧下で実行されうる。
【００２５】
リガンド交換／置換反応の間、元の（未修飾の）粒子のサイズと比較して粒子のサイズは減少する。サイズの減少は、置換反応が進行する程度、反応速度及び反応時間に依存する。その反応速度は、パラメータ例えば特定の出発物質、有機ポリリン酸の型、有機ポリリン酸の開始時の濃度、バルク溶液のｐＨ、反応温度及び（粒子表面とバルク溶液との界面での）界面効果に依存するため複雑である。
【００２６】
反応の進行はｉｎ  ｓｉｔｕ測定によってオンライン、又はサンプリング及び単離されたサンプルの続く分析によってオフラインのいずれかに従いうる。それゆえ、当業者は、発明に関する努力を求められることなく有機ポリリン酸を有する無機物微粒子出発物質のある組み合わせについて正しい反応期間を成立するだろう。例えば、イオンクロマトグラフィーの使用は、時間関数としてバルク溶液から消失する有機ポリリン酸イオンの量を定量することを可能にし、そしてリン酸アルミニウム又はリン酸カルシウム粒子の表面で吸着するそれらのイオンの量の間接的な測定を示す。あるいは、有機ポリリン酸イオンの粒子表面への吸着の直接的な測定は、高感度の電気化学的な方法例えば電気化学走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）、電気化学水晶振動子アドミタンス（ＥＱＣＡ）によって、又は高感度水晶マイクロバランス（ＱＣＭ）を用いる量の変化を検出することによってさえ測定されると考えられる。また、粒子の界面動電位（ゼータ電位）の変化は、電気二重層の理論に従い、粒子表面のヘルムホルツ面でポリリン酸の吸着を反映すると考えられる。
【００２７】
本明細書の上記で記載したリガンド交換／置換反応について関連性のあるモニタリング工程は、その粒子表面の化学的な修飾が高い感度を有する表面静電荷によって反映されるので、それゆえ時間関数として、又は有機的なポリリン酸の濃度関数として、ゼータ電位における変化をモニタリングすることを含む。粒子表面の修飾をモニターする相補的な方法は、これらに限定されないが、吸収された有機ポリリン酸の特定の化学的な特徴を検出すると考えられるラマン散乱及び近赤外吸収スペクトル、イオンビームによる照射を受けた粒子表面から放出される（有機ポリリン酸からの）二次イオンをモニターすると考えられる二次イオン質量分析、又は最初に炭素を欠失した修飾因子から炭素の存在を記録するエネルギー分散型Ｘ線分析のような元素分析を含む。そのリガンド交換／置換反応は、有機ポリリン酸の溶液から有機的に誘導される無機物微粒子を取り除くこと及び、水中のそれらの洗浄によって所望されるゼータ値に到達すると一旦停止しうる。あるいは、前記反応は、ゼータ電位が５〜１０分間の間、例えば５分、７．５分、又は１０分にわたって１０％超変化せず、好ましくは最大５％変化すると一旦停止しうる。
【００２８】
都合よく、本明細書の上記に記載した有機ポリリン酸溶液中の無機物微粒子を含むそのリガンド交換／置換反応は、下記及び本特許出願を通じて、「平衡化」又は「平衡化工程」として称されるだろう。
【００２９】
第二の側面において、本発明は第一の側面に従う平衡化方法によって入手可能な有機的に誘導される無機物微粒子を提供する。
【００３０】
特定の態様において、前記平衡化は有機ポリリン酸イオンにより微粒子の表面に位置するリン酸イオン又は水酸化イオンの部分的又は完全な置換に繋がる。
【００３１】
他の特定の態様において、前記平衡化は一般的な構造１Ａの有機ポリリン酸イオンによって行われる。
【００３２】
好ましい態様において、前記平衡化は一般的な構造１Ｂの有機ポリリン酸イオンによって行われる。
【００３３】
特に好ましい態様において、前記平衡化はフィチン酸／ＩＰ−６／イノシトール６リン酸又はそれらの塩によって行われる。
【００３４】
特定の態様において、有機ポリリン酸による前記無機物微粒子の平衡化はその無機物微粒子の名目上の静電ポテンシャルを増加する。
【００３５】
特定の態様において、有機ポリリン酸による前記無機物微粒子の平衡化はその無機物微粒子のサイズを減少する。
【００３６】
特定の態様において、有機ポリリン酸の前記溶液はその有機ポリリン酸の負に荷電した塩、好ましくはここでその溶液が生理学的なｐＨを有することを含む。
【００３７】
別の態様において、有機ポリリン酸の前記溶液は２以上の負に荷電した有機ポリリン酸塩の混合物を含む。
【００３８】
特に好ましい態様において、有機ポリリン酸の前記溶液はイノシトール６リン酸（フィチン酸／ＩＰ−６）を含む。
【００３９】
他の特定の態様において、前記平衡化工程は
ｉ．環境温度、又は約２０℃±５〜１０℃、
ｉｉ．少なくとも２分間の反応時間にわたり、及び／又は
ｉｉｉ．少なくとも０．１ｍＭ及び最大で２０ｍＭの有機ポリリン酸の初期濃度を有し、及び／又は
ｉｖ．ｐＨ４．０〜ｐＨ７．５の間を含むｐＨ値
で実施される。
【００４０】
特定の態様において、前記無機物微粒子の出発物質は、
ｉ．ＤＬＳ又はレーザー回折によるコロイド懸濁液中で測定した場合に少なくとも０．１μｍ及び最大で５μｍの名目上のサイズ、及び／又は、
ｉｉ．蒸留水中、ｐＨ７．０で測定した場合に、リン酸アルミニウムについて少なくとも−２０及び最大で−３０ｍＶのゼータ電位、
ｉｉｉ．蒸留水中、ｐＨ７．０で測定した場合に、水酸化アルミニウムについて少なくとも＋１０及び最大で＋２０ｍＶのゼータ電位、
ｉｖ．蒸留水中、ｐＨ７．０で測定した場合に、リン酸カルシウムについて少なくとも−１０及び最大で−２０ｍＶのゼータ電位、
を有する。
【００４１】
また、本明細書で提供されたものは、水酸化アルミニウム微粒子、リン酸アルミニウム微粒子、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム及び／又はリン酸カルシウム微粒子からなるリストより選択した無機物微粒子の平衡化によって調製した有機的に誘導された無機物微粒子であって、ここで前記無機物微粒子の表面に位置する水酸化イオンの少なくとも一部は有機リン酸イオンによって置換される。
【００４２】
特定の態様において、本発明に従う有機的に誘導された無機物微粒子は、
（ｉ）蒸留水中、ｐＨ７．０で測定した場合に、リン酸アルミニウムについて、少なくとも−３５ｍＶの名目上のゼータ電位、
（ｉｉ）蒸留水中、ｐＨ７．０で測定した場合に、水酸化アルミニウムについて、少なくとも＋１０及び最大で＋２０ｍＶのゼータ電位、
（ｉｉｉ）蒸留水中、ｐＨ７．０で測定した場合に、リン酸カルシウムについて、少なくとも−４０ｍＶの名目上のゼータ電位。
（ｉｖ）少なくとも０．０１μｍ及び最大で２μｍの名目上のサイズ、
（ｖ）１．２±０．１５〜１のＡｌとＰとの化学量論比、
（ｖｉ）１．７±０．２のＣａとＰとの化学量論比及び／又は、
（ｖｉｉ）０．０５の最大化学量論比ｎＰorg／Ａｌを導く有機ポリリン酸イオンによる前記微粒子の最大表面被覆率を有する。
【００４３】
他の特定の態様において、前記有機的に誘導された無機物微粒子は滅菌した緩衝生理食塩溶液中にスラリー又は懸濁液として提供される。
【００４４】
さらに他の特定の態様において、前記有機的に誘導された無機物微粒子は噴霧凍結乾燥粉末として提供され（Ｗａｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓｐｒａｙ  ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｙｉｎｇ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，２０１５，４８８：１３６−１５３）、滅菌水中で再構成する準備が整っている。
【００４５】
さらに別の態様において、前記有機的に誘導された無機物微粒子は、安定化する賦形剤としてトレハロースを任意に含む乾燥製剤、凍結乾燥製剤として提供される。
【００４６】
特定の態様において、本発明に従う有機的に誘導された無機物微粒子は、無機物微粒子出発物質と比べて生体分子結合特性を増加し、好ましくは、ここでその生体分子は修飾した微粒子の反対の電荷を有し、又はここでその生体分子は修飾した微粒子が中性の場合中性である。
【００４７】
特定の態様において、前記生体分子は抗原である。
【００４８】
また、本明細書で提供されるものは本発明に従う有機的に誘導された無機物微粒子の医薬における使用である。
【００４９】
特定の態様において、本発明に従う前記有機的に誘導された無機物微粒子は生体分子送達又は吸着装置として用いられる。
【００５０】
特定の態様において、前記生体分子送達システムはワクチンアジュバントである。
【００５１】
特定の態様において、本発明に従う前記有機的に誘導された無機物微粒子はワクチンにおけるワクチンアジュバントとして用いられる。
【００５２】
特定の態様において、本発明に従う有機的に誘導された無機物微粒子は血液の分取に、好ましくは生体分子の吸着装置として用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ＩＰ６により処理したＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）アジュバント粒子の鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）の吸着容量。
【００５４】
図１は懸濁液におけるＨＥＬの濃度関数としてＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）粒子へ吸着するＨＥＬの量を示す。図１は懸濁液中のＨＥＬの濃度関数としてＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）粒子に吸着したＨＥＬ量を示す。明らかに、ＩＰ６によるＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）粒子の処理が、メタ−６リン酸による処理を超えて粒子の吸着容量を改善し、ｍ６Ｐｉについて〜１．１ｍｇ  ＨＥＬ／ｍｇのＡｌ3+当量及びオルトリン酸（Ｐｉ）について〜０．８ｍｇ  ＨＥＬ／ｍｇのＡｌ3+当量と比較すると、ＩＰ６について１．４ｍｇ  ＨＥＬ／ｍｇ  Ａｌ3+当量の最大容量を有した。加えて、これらの結果は、ＩＰ６によって処理したＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）粒子の優れたＨＥＬ吸着容量がＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓに対する滅菌工程として用いられる、オートクレーブ処理の後でさえも達成されることを示す。
【００５５】
【図２】リン酸カルシウムアジュバント粒子のゼータ電位のイノシトール６リン酸（ＩＰ６）の効果。
【００５６】
図２はオルトリン酸（Ｐｉ）、メタ−６リン酸（ｍ６Ｐｉ）及びイノシトール６リン酸（ＩＰ６）の濃度のリン酸カルシウム粒子のゼータ電位の依存性を示す。任意のホスフェートによる処理は、リン酸カルシウム粒子のゼータ電位における増加を導き、これは粒子の表面でのリン酸イオンの吸着現象を示唆する。このゼータ電位の濃度依存性はラングミュラー型吸着等温式を暗示し、これらは結合部位の飽和を示唆すると考えられる。一方で、オルトリン酸は約−５ｍＶから−２０ｍＶまでの増加に繋がり、ポリリン酸のｍ６Ｐｉ及びＩＰ６はそれぞれ約−５０ｍＶ及び−６０ｍＶへとより劇的なゼータ電位の増加を示す。
【００５７】
【図３】イノシトール６リン酸（ＩＰ６）により処理したリン酸カルシウム粒子の鶏卵リゾチームの吸着容量。
【００５８】
図３は懸濁液中のＨＥＬの濃度関数としてリン酸カルシウム粒子に吸着したＨＥＬ量を示す。明らかに、ＩＰ６によるリン酸カルシウム粒子の処理が、メタ−６リン酸による処理を超えて粒子の吸着容量を改善し、ｍ６Ｐｉについて〜１２０μｇ／ｍｇのＣａ2+当量及びＰｉについて〜４５μｇ／ｍｇのＣａ2+当量と比較すると、ＩＰ６について〜１８０μｇ／ｍｇ  Ｃａ2+当量の最大容量を有した。
【００５９】
【図４】Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）粒子へのアデノシン、アデノシン５’−一リン酸（ＡＭＰ）及びアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）の吸着容量。
【００６０】
図４は、ＡＴＰ吸着容量がＡＭＰ及びリン酸化されていないアデノシンの少なくとも５倍を超えて増加する方法を明白に実証する。ＡＴＰにおける凝集した三リン酸基の存在は、ＡＭＰにおける一リン酸基の代わりに、この効果に寄与すると結論づけられうる。三リン酸基がアデノシンの吸着容量を増強することによる機構は、まだ調査中である。ポリリン酸鎖上の追加のヒドロキシ基の存在が統計学的にリガンド交換を介するＡｄｕｊ−Ｐｈｏｓ（登録商標）への結合可能性を増加すること、又はこれらの反応性のヒドロキシ基はＡＴＰ中の立体障害がより少ないことを仮定しうる。他方、ＡＴＰの三リン酸鎖上の末端のヒドロキシ基の化学反応性は、ＡＭＰよりも高く、又はＡＴＰ中のα位のリン酸が、遊離基として働くピロリン酸（β及びγ位におけるリン酸）によってより反応性を高められる。
【００６１】
【図５】Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓのζ電位のイノシトール６リン酸（ＩＰ６）濃度の効果。
【００６２】
図５は他のリン酸及びポリリン酸イオンによって観察された同じパターンを示し、ここで第一のフェーズでは、Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）粒子の表面にイノシトール６リン酸（ＩＰ６）の吸着反応におけるζ電位は−４３ｍＶから−６０ｍＶまで増加し、そして第二のフェーズにおいて、増加したイオン強度の最もありえる結果として、ζ電位は−６０ｍＶから−３５ｍＶへと減少し、電荷のＣｏｕｌｏｍｂスクリーニング及び電荷二重層の圧縮へと繋がる。それゆえ、本試験において、５ｍＭの濃度のＩＰ６に到達することが至適なバランスであることが分かる。
【００６３】
【図６Ａ】ヒドロキシリン酸アルミニウム粒子及び溶解した有機ポリリン酸イオンの表面での仮定の置換反応。
【００６４】
図６Ａは、（水酸化アルミニウムにより例示される）無機物微粒子が有機的なポリリン酸と反応して、いくつかのヒドロキシ基が有機ポリリン酸基によって置換される、有機的に誘導される無機物微粒子を産生する方法を示す。
【００６５】
【図６Ｂ】ヒドロキシリン酸アルミニウム粒子及び溶解した有機ポリリン酸イオンの表面での仮定の置換反応。
【００６６】
図６Ｂは有機的に誘導された無機物微粒子が（おそらく）電荷間の斥力により最終的に解体しはじめる方法を示す。
【００６７】
【図６Ｃ】Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）粒子（上図）及びＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ  ＺＰ（下図）の電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）。
【００６８】
図６Ｃは修飾していないＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）粒子（上図）と２ｍＭ  Ｎａ−ＩＰ６により修飾したＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ  ＺＰとの顕微鏡的形態を比較する。Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）は〜２．５μｍの平均サイズの分布を有し、サイズの〜２０ｎｍの小さなプレート状の結晶の凝集物を構成する。ＩＰ６によって処理された場合に、Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）の顕微鏡的な粒子は部分的に脱凝集し、〜２０ｎｍの個々の結晶として下図に見られる。
【００６９】
【図７】Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ粒子へのアデノシン、アデノシン５’−一リン酸（ＡＭＰ）及びアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）の吸着容量。
【００７０】
図７はＡＴＰの吸着容量がＡＭＰ及びリン酸化されていないアデノシンの少なくとも２倍であることを示す。ＡＴＰの凝集した三リン酸基の存在は、ＡＭＰの一リン酸基に代わり、この効果に寄与すると結論づけられうる。三リン酸基がアデノシンの吸着容量を増やすことによるこの機構は、まだ調査されていない。ポリリン酸鎖上の追加のヒドロキシ基の存在が統計学的にリガンド交換を介するＡｄｕｊ−Ｐｈｏｓへの結合の可能性を増加すること、又はこれらの反応性のヒドロキシ基はＡＴＰ中の立体障害がより少ないことを仮定しうる。他方、ＡＴＰの三リン酸鎖上の末端のヒドロキシ基の化学反応性は、ＡＭＰにおける反応性よりも高く、又はＡＴＰ中のα位におけるリン酸が遊離基として働くピロリン酸（β及びγ位におけるリン酸）によってより反応性を高められる。
【００７１】
【図８】アルハイドロゲル粒子へのアデノシン、アデノシン５’−一リン酸（ＡＭＰ）及びアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）の吸着容量。
【００７２】
図８は、リン酸化されていないアデノシンと比較して、ＡＴＰ及びＡＭＰ、両方のリン酸化されたアデノシンの型がアルハイドロゲルに強固に吸着するかを示す。ＡＴＰにおける三リン酸鎖の存在がＡＭＰにおける一リン酸基上の任意の追加の改良を明らかに与えないことを示し、ＡＴＰとＡＭＰとの吸着容量の間の明白な差異はなかった。これは、同じ濃度範囲においてＡＴＰ吸着容量がＡＭＰ吸着容量よりも高いＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓと対照的である。その性質のために、水酸化アルミニウムは、リン酸基によるリガンド交換反応を経ることができるＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（ヒドロキシリン酸アルミニウム）よりも高いヒドロキシ基の割合を有する。それゆえ、アルハイドロゲルがＡＴＰ又はＡＭＰのようなリン酸化された分子についてＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓより高い吸着容量を示すことを期待される。ほとんど反応性の違いを有さない末端のリン酸基を含みうるだけであるので、ＡＭＰ及びＡＴＰへのアルハイドロゲルの反応性は同等又は類似である。
【００７３】
【図９】Ａｄｕｊ−Ｐｈｏｓζ電位のアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）及びアデノシン５’−一リン酸（ＡＭＰ）濃度の効果。
【００７４】
図９は、Ａｄｕｊ−Ｐｈｏｓζ電位が、ＡＴＰ濃度を最大１ｍＭまで増加することによって−４０ｍＶから−４８ｍＶへ（絶対値において）増加することを示す。さらに、１ｍＭから６ｍＭへのＡＴＰ濃度の増加は、ζ電位のさらなる増加をもたらさず、ＡＴＰの吸着部位の飽和が１ｍＭ以内で到達することを示している。ＡＴＰとは対照的に、ＡＭＰによる処理は、−４０ｍＶから−３５ｍＶへの（絶対値において）ζ電位の減少をもたらす。ＡＴＰとＡＭＰとの間のこの差異は、ＡＭＰよりもＡＴＰについてＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓのより高い吸着容量に帰属しうり（図１）、より高い負電荷がＡＴＰ（一リン酸の代わりに三リン酸）によって運搬される。ζ電位における有意な変化はリン酸化していないアデノシンによって処理されたＡｄｕｊ−Ｐｈｏｓについて観察されなかった。
【００７５】
【図１０】Ａｄｕｊ−Ｐｈｏｓ沈降物のベッド高のアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）及びアデノシン５’−一リン酸（ＡＭＰ）濃度の効果。
【００７６】
図１０は、Ａｄｕｊ−Ｐｈｏｓ沈降物のベッド高のアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）及びアデノシン５’−一リン酸（ＡＭＰ）濃度の効果を実証するプラスチック製の分光光度計用キュベット内のホモジナイズした懸濁液の写真である。左から右にＡＴＰ濃度は：０．０ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、２．０ｍＭ、３．０ｍＭ、４．０ｍＭ及び５．０ｍＭである。
【００７７】
【図１１】Ａｄｕｊ−Ｐｈｏｓ沈降物のベッド高のアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）及びアデノシン５’−一リン酸（ＡＭＰ）濃度の効果。
【００７８】
図１１は、静置４８時間後に測定した、Ａｄｕｊ−Ｐｈｏｓ沈降物のベッド高が、１６ｍｍから９．５ｍｍまで、ＡＴＰ濃度に応じて減少することを示す。最も劇的なベッドの高さの減少は０．０から１．０ｍＭまでのＡＴＰ濃度で生じ、これはＡｄｕｊ−Ｐｈｏｓのζ電位が最も増加した濃度範囲に一致し（図９）、２つのパラメータが関連していることを示唆する。興味深いことに、ＡＭＰ処理はＡｄｕｊ−Ｐｈｏｓ沈降物のベッド高が濃度に応じて増加する反対の効果に繋がる。静電反発力が粒子同士の距離を保つと予想されることより、増加したζ電位に関わらず、あたかもアデノシン５’−三リン酸上の三リン酸鎖が、Ａｄｕｊ−Ｐｈｏｓ粒子のパッキングを誘導するかもしれないことを明らかにする。類似のパターンが無機ポリリン酸及びフィチン酸塩（イノシトール６リン酸）に観察される。
【００７９】
【図１２】アデノシン、アデノシン５’−一リン酸（ＡＭＰ）、及びアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）のリン酸カルシウム粒子への吸着効率。
【００８０】
図１２はリン酸カルシウムがＡＴＰ、ＡＭＰ及びアデノシンへ吸着すること、そして吸着容量が（本試験において使用されるヌクレオチド濃度の範囲内の）ごくわずかな飽和の徴候のみを有する、一見したところ直線的に濃度に応じて増加することを示す。また、ＡＴＰ及びＡＭＰはアデノシンよりもより多くの量に吸着されると見え、そのリン酸基がより多くの吸着容量の要因であることを示唆する。ＡＭＰ及びＡＴＰにおけるリン酸基の存在は、本試験において使用されるリン酸カルシウムアジュバントが、化学量論数が不明な水酸化物を含む（非水溶性の）カルシウム及びリン酸の水酸化物塩なので、リン酸カルシウムマトリックスにおける水酸化物イオンによってリガンド交換を介してリン酸カルシウムの吸着を増加することを仮定されうる。
【００８１】
【図１３】リン酸カルシウムのζ電位のアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）及びアデノシン５’−一リン酸（ＡＭＰ）濃度の効果。
【００８２】
図１３はリン酸カルシウムのζ電位が、ＡＴＰ濃度を１ｍＭまで増加することによって（絶対値で）−５ｍＶから−４０ｍＶまで増加することを示す。ζ電位のこのシャープな増加は、（電気二重層モデルに従う）粒子のシュテルン層への特異的な吸着として解釈される。さらに、１ｍＭから６ｍＭへのＡＴＰ濃度の増加は、ζ電位の周辺の増加をもたらすのみであり、それはＡＴＰ吸着部位の飽和が１ｍＭ以内に達することを示す。ＡＴＰと対照的に、また、ＡＭＰによる処理は（絶対値で）−５ｍＶから−１０ｍＶまでのζ電位のわずかな増加をもたらすのみであり、粒子表面への特異的な吸着を示している。リン酸カルシウムへのＡＴＰ及びＡＭＰの吸着容量が類似しているように見えるので（図３）、ＡＴＰとＡＭＰとの間のζ電位の著しい差異は（一リン酸の代わりに三リン酸の）ＡＴＰによって保有されたより高い負電荷に帰属されうる。リン酸化されていないアデノシンで処理したリン酸カルシウムについてζ電位における有意な変化は観察されず、特異的な吸着が粒子のシュテルン層に生じていないことを示している。この結果はリン酸カルシウムへのアデノシンの吸着が非特異的でありうり、物質移動及びゲルマトリックス内への封入をもたらしうることを示す。ζ電位における変化が、リン酸カルシウム粒子の正味の静電荷の結果として生じる変化を有する化学吸着プロセスを示すので、ＡＴＰ及びＡＭＰの吸着は特異的であるように見える。
【００８３】
【図１４】リン酸カルシウムの沈降物のベッド高のアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）及びアデノシン５’−一リン酸（ＡＭＰ）の濃度の効果を示すプラスチック製の分光光度計用キュベット内のホモジナイズした懸濁液の写真。左から右にＡＴＰ濃度：０．０ｍＭ、１．０ｍＭ、２．０ｍＭ、３．０ｍＭ、４．０ｍＭ及び５．０ｍＭ。
【００８４】
【図１５】リン酸カルシウムの沈降物のベッド高のアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）及びアデノシン５’−一リン酸（ＡＭＰ）濃度の効果。
【００８５】
図１５は、静置４８時間後に測定したリン酸カルシウム沈降物のベッド高が、１１ｍｍから６ｍｍへ、ＡＴＰ濃度に応じて減少することを示す。最も著しいベッド高の減少は０．０から２．０ｍＭまでのＡＴＰ濃度で生じ、それはリン酸カルシウムのζ電位が最も増加した濃度の範囲に対応し（図１３）、２つのパラメータが関連していることを示している。興味深いことに、ＡＭＰ処理はリン酸カルシウムの沈降物のベッド高を変えなかった。静電反発力が粒子同士の距離を保つと予想されることより、増加したζ電位に関わらず、あたかもアデノシン５’−三リン酸上の三リン酸鎖が、リン酸カルシウム粒子のパッキングを誘導するかもしれないことを明らかにした。類似のパターンは無機ポリリン酸及びフィチン酸塩（イノシトール６リン酸）に観察される。
【００８６】
【図１６】イノシトール６リン酸ナトリウムによって最初に処理されるＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）の一連の希釈の効果。
【００８７】
図１６はｐＨ７．０で５ｍＭイミダゾールに希釈した、未処理のＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓのζ電位が（絶対値で）５倍から３２０倍までの希釈の範囲内でそれぞれ−３５ｍＶから−２２ｍＶまで減少したことを示す。対照的に、第一に０．２ｍＭ  Ｎａ−ＩＰ６によって処理されたＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓは−４７ｍＶから−３３ｍＶまでのより高い値を示し、未処理のＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓについて見られる値と対応した傾向をたどった。
【００８８】
未処理のＡｄｕｊ−Ｐｈｏｓについて、希釈に応じたζ電位の減少は、平均の粒子間距離が希釈によって増加したことによる、静電界の強度の減少により説明されうる。これは、低希釈倍率で、粒子が近距離にあり、それらの相互の静電場が（重複して）相互作用しより強く（より高いζ電位に）見える。希釈倍率を増やすにつれて、粒子間の距離は増加し、そしてその見かけの静電場の強度は（より低いζ電位に）減少する。また、この影響はＡｄｕｊ−ＰｈｏｓＺＰについてみられる。しかしながら、Ａｄｕｊ−ＰｈｏｓＺＰとＡｄｕｊ−Ｐｈｏｓとの間のより高いζ電位における差異は約−１２ｍＶで一定である。
【００８９】
もしＩＰ６がＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓのみと可逆的に吸着するならば、ある者は高希釈倍率でＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ  ＺＰのζ電位がＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）のζ電位に到達することを期待するだろうが、そんなことはない。０．２ｍＭ  ＩＰ６によって処理された初期のＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）から３２０倍の希釈液は、０．６μＭの最終のＩＰ６濃度をもたらすだろう。Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）は１０μＭより低いＩＰ６濃度によって処理された場合、ζ電位の変化は観察されなかった。それゆえ、図１６において結果は、最初のＩＰ６の一部が強力にＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓと吸着し、そしてそのζ電位を不可逆的に修正したことを強く示した。
【００９０】
【図１７】最初にＡＴＰで処理されたＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）の一連の希釈の効果。
【００９１】
図１７は、ｐＨ７．０で５ｍＭイミダゾールにおける希釈の、通常（未処理）のＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）のζ電位が５倍から３２０倍までの希釈の範囲において（絶対値で）−４１ｍＶから−２７ｍＶまで減少することを示す。最初に１．０ｍＭ  ＡＴＰで処理されたＡｄｕｊ−Ｐｈｏｓ（登録商標）は−４４ｍＶから−３０ｍＶまで、わずかに高いζ電位値を示し、未処理のＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）について見られるそれと対応している傾向をたどった。
【００９２】
また、ＩＰ６によって処理したＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓの処理（試験ｎｏ．１２、図１６）と比較して、（ＩＰ６の−１２ｍＶと比較して）ζ電位における差異は約−３ｍＶのみであるが、ＡＴＰによって処理したＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓは希釈倍率のζ電位の不可逆的な増加を示す。試験ｎｏ．１２と同じ議論に従い、本結果はＡｄｊｕ−ＰｈｏｓへＡＴＰの強力な吸着を意味している。
【００９３】
【図１８】最初にＩＰ６又はＡＴＰによって処理されたリン酸カルシウムの一連の希釈の影響。
【００９４】
図１８はｐＨ７．０で５ｍＭのイミダゾールの希釈の、未処理のリン酸カルシウムのζ電位が、５倍から３２０倍までの希釈の範囲において、それぞれ（絶対値で）−５ｍＶから−１０ｍＶまでの増加することを示す。対照的に、最初に０．５ｍＭ  Ｎａ−ＩＰ６によって処理されたリン酸カルシウムは、−２６ｍＶから−２３ｍＶまでのより高いζ電位を示した。同様に、最初に１．０ｍＭ  ＡＴＰによって処理したリン酸カルシウムは、−１６ｍＶから−２２ｍＶまでのより高いζ電位の値を示す。
【００９５】
もしＩＰ６又はＡＴＰが可逆的にリン酸カルシウムとだけ吸着するならば、ある者は高希釈倍率でリン酸カルシウムのζ電位がリン酸カルシウムのそれに到達することを期待するだろうが、そんなことはない。０．５ｍＭ  ＩＰ６又は１．０ｍＭ  ＡＴＰのいずれかで処理された最初のリン酸カルシウムから３２０倍の希釈は、それぞれ１．５μＭ  ＩＰ６又は３．０μＭ  ＡＴＰの最終的なＩＰ６濃度の結果をもたらすだろう。リン酸カルシウムが１０μＭより少ないＩＰ６又はＡＴＰの濃度によって処理された場合、ζ電位において変化は観察されなかった。それゆえ、図１８において示した結果は、最初のＩＰ６又はＡＴＰの一部が、リン酸カルシウムと強力に吸着し、そしてζ電位を不可逆的に修正することを示す。
【００９６】
定義
【００９７】
断りのない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的な用語は、本発明の属する分野に関わる当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるそれらと類似又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の試験の実行において用いられうり、その好ましい方法及び材料は本明細書で記載される。
【００９８】
本明細書及び特許請求の範囲において、その単数形の「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は本明細書で特に明確に定められていない限り、複数形の参照を含む。
【００９９】
本明細書で用いられる「含む」（“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”及び“ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ”）という用語は、「含む」（“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ”“ｉｎｃｌｕｄｅｓ”又は“ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ”“ｃｏｎｔａｉｎｓ”）と同意語であり、そして包括的又は変更可能であり、追加の、列挙されない要素、要因又は方法、工程を除外しない。
【０１００】
また、含む（“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”、“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”及び“ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ”）という用語は、からなる（“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ”）という用語を含む。
【０１０１】
本明細書で用いられる「約」という用語は、パラメータ、量、経時的な期間等のような測定可能な値を意味する場合に、その変動が開示された発明内で適切に実施する限りにおいて、特定の値の及び特定の値から±１０％又はそれ未満の、好ましくは±５％又はそれ未満の、さらに好ましくは±１％又はそれ未満の、及びよりいっそう好ましくは±０．１％又はそれ未満の変動を包含することを意図している。また、修飾語句「約」が意味する値はそれ自身が特異的に、及び好ましくは開示されると理解される。
【０１０２】
評価項目による数値的な範囲の引用は、引用された評価項目と同様に、対応の範囲内に包含される全ての数及び一部を含む。
【０１０３】
次節において、本発明の異なる側面又は態様をより詳細に定義する。そのように定義された各側面又は態様は、明確に反対の指示がない限り、任意の他の側面（等）又は態様（等）と組み合わされうる。特に、好ましい又は有利であると示された任意の特徴は、好ましい又は有利であるとして任意の他の特徴又は特徴等と組み合わされうる。
【０１０４】
本明細書を通じて「一の態様」（“ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ”“ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ”）についての参照は、その態様に関連して記載された特定の特徴、構造又は特性が本発明の少なくとも一つの態様に含まれることを意味する。それゆえ、本明細書を通じて様々な場所における「一の態様において」（“ｉｎ  ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ”又は“ｉｎ  ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ”）という言い回しの登場は、全て同じ態様を意味することを必要とはしないが、してもよい。さらに、本開示より当業者に明らかであると考えられるので、一以上の態様において、特定の特徴、構造又は特性は任意の適当な方法において組み合わされうる。
【０１０５】
本明細書で用いられる「リン酸アルミニウム」という用語は、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウムを意味し（Ｓｈｉｒｏｄｋａｒ  Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｌｍｉｎｕｍ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｕｓｅｄ  ａｓ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９０，７：１２８２−１２８８）、ここでいくつかの水酸化アルミニウムのヒドロキシ基がリン酸基に置換される。その乱雑な、非晶質の状態は高い表面領域及び高い吸着効率に寄与する。それは化学量論化合物ではなく、そしてその組成物は沈殿の作成方法及び状態に依存する。好ましくは、Ａｌ：Ｐの原子比率は１．２±０．１５〜１である。
【０１０６】
本明細書で参照されるようにリン酸アルミニウムの表面はＡｌ−ＯＨ及びＡｌ−ＯＰＯ3基を構成する。等電点（ＩＥＰ）はリン酸基の置換の度合いに依存して９．４〜４．５まで変化する。商用のリン酸アルミニウムアジュバントは４．５から５．５の範囲内のＩＥＰ値を有する。
【０１０７】
本明細書で用いられる「水酸化アルミニウム」という用語は、水酸化酸化アルミニウムを意味し、それは結晶性の、化学量論化合物である。
【０１０８】
本明細書で用いられる「リン酸カルシウム」という用語は、ハイドロキシアパタイトでないリン酸カルシウム又はハイドロキシアパタイトでないリン酸カルシウムを主に含む複合材料を意味する。リン酸カルシウムはＣａ3（ＰＯ4）2として又は不定比のハイドロキシアパタイト、Ｃａ10-X（ＨＰＯ4）X（ＰＯ4）6-X（ＯＨ）2-X、として製剤化されうり、式中Ｘは０と２との間の整数である（Ｊｉａｎｇ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ，Ｖａｃｃｉｎｅ，２００４，２３：６９３−６９８）。例えば、リン酸カルシウムはブラッシュ石（ＣａＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ）及びリン酸カルシウム（Ｃａ3（ＰＯ4）2）からなる複合材料を意味し、それは［Ｃａ3（ＰＯ4）2］x・［ＣａＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ］yとして製剤化されうり、式中リン酸カルシウムの量（ｘ）はブラッシュ石の量（ｙ）よりも多く、又は式中ｘ＞ｙである。より具体的には、リン酸カルシウムはＣａ／Ｐの質量比が約１．２９であるブラッシュ石（ＣａＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ）及びＣａ／Ｐの質量比が１．９４であるリン酸カルシウム（Ｃａ3（ＰＯ4）2）のハイドロキシアパタイトでない形態からなる複合材料を意味する。好ましくは、Ｃａ：Ｐの原子比率は１．７±０．２〜１である。
【０１０９】
本明細書で用いられる「微粒子」という用語は、少なくとも０．０１μｍ及び最大でも１０μｍ、最大でも５μｍ、又は最大でも２μｍの名目上のサイズを有する粒子を意味する。出発物質の微粒子は好ましくは少なくとも０．１μｍ及び最大でも５μｍの名目上のサイズを有する。さらに、前記微粒子がリン酸アルミニウム微粒子である場合、出発物質の微粒子は蒸留水内で測定した際に、少なくとも−１０及び最大で−２０ｍＶの名目上のζ電位を有しうる。
【０１１０】
本明細書で用いられるように、ＰｉまたＰiという用語は無機リン酸を意味するものとする。濃縮された無機リン酸が環状である場合、ｍ６Ｐｉのように「ｍ」（メタ）が付加される。例えば、二リン酸＝Ｐｉ及びメタ６リン酸＝ｍ６Ｐｉ。
【０１１１】
本明細書で用いられるように、「有機ポリリン酸」という用語は、少なくとも２つのリン酸基（−Ｏ−ＰＯ3）又は少なくとも一つのリン酸基によって置換された有機分子−Ｏ−ＰＯ2（−Ｏ−ＰＯ2−）n−Ｏ−ＰＯ3のいずれかに置換された有機分子であって、式中ｎが０〜５の範囲の整数であるものを意味するものとする：
【０１１２】
【化３】
2021521089.tif 000006
【０１１３】
本明細書で用いられるように、ｎＰｏｒｇという用語は、ｎ＝リン酸基の数を有する有機ポリリン酸を意味するものとする。
【０１１４】
本明細書で用いられるように、「ポリリン酸」という用語は、凝集したホスフェート、又はホスホリック・アシッドのポリマーを意味し、さらに好ましくは２リン酸塩、３リン酸塩、４リン酸塩、５リン酸塩、５リン酸塩、メタ３リン酸、メタ６リン酸を含むリストより選択されるポリマーを意味する。
【発明を実施するための形態】
【０１１５】
本発明は、それらの名目上の静電ポテンシャルの重要な変化と減少した粒子径との両方の観点から、前記無機物微粒子の修飾をもたらす、一以上の無機ポリリン酸の水溶液において、リン酸アルミニウム、非晶質のヒドロキシアルミニウム及び／又はリン酸カルシウム、又はそれらの混合物より選択された、ある二又は三価の金属塩の無機物微粒子を懸濁することを含む修飾された無機物微粒子の調製方法に関する同時係属の国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７６２３２において開示された発明のさらなる進展である。
【０１１６】
本発明は本明細書で、調製方法において、一以上の有機ポリリン酸の溶液を、例えば単一の有機ポリリン酸の溶液として利用することによって、類似の方法において製造されたリン酸アルミニウム、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、及び／又はリン酸カルシウムを含む有機的に誘導される無機物微粒子を開示する。同時係属の国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７６２３２における無機のポリリン酸による上記の処理と比較して、リン酸アルミニウム、ヒドロキシリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム及び／又はリン酸カルシウムの微粒子の好ましくは生体分子がワクチン抗原である生体分子の結合特性が、有機ポリリン酸によって前記微粒子を処理することにより有意に改善されることが見いだされた。
【０１１７】
特に、有機ポリリン酸イオンによるリン酸イオン又は水酸化物イオンの考えられる置換が前記微粒子のζ電位の数字上の値を増加し、それによって、静電ポテンシャルの強度、例えば生体分子、好ましくは抗原の引力について、及び／又は前記微粒子の表面への結合強度について増加させることを示した。さらに、同時係属の国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７６２３２において開示されるように、リン酸アルミニウム、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム及び／又はリン酸カルシウム微粒子の最初のアニオンの置換が、無機物的な超構造の不安定化及び分解へと繋がることを発見した。結果として、無機ポリリン酸によるそのような微粒子の処理は名目上の粒子サイズの減少をもたらす。
【０１１８】
また、同時係属の国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７６２３２において開示された改変は、本明細書で開示されるように、リン酸アルミニウム、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム及び／又はリン酸カルシウム微粒子の名目上のサイズの減少を含む、有機ポリリン酸によって果たされうる。
【０１１９】
しかしながら、本明細書に開示される有機ポリリン酸を用いる反応はより制御しやすく、特にサイズの減少と見なすので、それは本明細書における他の箇所で詳細に述べられるだろう。さらに、本明細書に開示される有機ポリリン酸を用いる反応産物は、一般的に同時係属の国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７６２３２において開示される無機ポリリン酸を用いる反応産物に見られるよりも、より高い熱安定性を有する。
【０１２０】
本発明に従う方法は、都合よく商用利用可能なリン酸アルミニウム、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム及び／又はリン酸カルシウムの微粒子の使用を構成しうる。
【０１２１】
従って、本発明の第一の側面は、その無機物微粒子を１以上の有機ポリリン酸の溶液、単例えば一の有機ポリリン酸の溶液によって平衡化する工程を含む、有機的に誘導される無機物微粒子を調製する方法に関し、ここで前記無機物微粒子はリン酸アルミニウム微粒子、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム微粒子、水酸化アルミニウム微粒子、及び／又はリン酸カルシウム微粒子からなるリストより選択され、ここで前記有機ポリリン酸は式１Ａ又は１Ｂの化合物より選択される：
【化１】
2021521089.tif 000007
【化２】
2021521089.tif 000008
式中、ｎは０〜５の範囲の整数であり、ｍは２〜１０の範囲の整数であり、式中Ｒaはアデノシン及び他のヌクレオシド、チアミン、炭水化物及びイソプレンより選択される有機置換物を示し、Ｒbはイノシトール及び他のシクリトール、及び炭水化物より選択される有機置換物を示す。
【０１２２】
無機物微粒子を有する式１Ａ及び１Ｂの有機ポリリン酸の反応は、個々に研究され、そしてそれぞれが無機ポリリン酸による類似の反応と比較して、有意に利点を示す。
【０１２３】
三リン酸のような短い凝集したポリリン酸基を有する式１Ａの有機ポリリン酸（すなわち、ＡＴＰによって本明細書に例示される、式中ｎ＝１について）は、類似の一リン酸（ＡＭＰ）の反応よりも、リン酸アルミニウム粒子の表面のヒドロキシ基によってより良く反応するように見える。理論に縛られることなく、本発明はＡＴＰのリン酸無水結合がより高エネルギーであり、それによってより求核であることを仮定する。ＡＭＰ分子に対するＡＴＰにおける追加の負電荷が別の理由になりうる。
【０１２４】
式１Ｂの有機ポリリン酸は粒子のζ電位を改善する観点から利点があり、それは再び改善した抗原吸着へと繋がる。これは、特にイノシトール及び他のシクリトールより由来する有機ポリリン酸について当てはまりうる。イノシトール６リン酸（ＩＰ６）は、例えばメタ−６リン酸（ｍ６Ｐｉ）について６-を有するのに対して、中性のｐＨで１２-の形式電荷を有する。それゆえ、その電荷密度はｍ６ＰｉついてよりもＩＰ６について１００％大きいだろう。加えて、実験的に、ｍ６Ｐｉにおけるリン酸無水物よりもＩＰ６におけるリン酸エステル結合は加水分解に対してより安定的であることが示され、それはＩＰ６に基づくアジュバントがｍ６ＰＩに基づくものよりも、よりオートクレーブに耐えることを示している。
【０１２５】
好ましい態様において、一以上の有機ポリリン酸は一般的な構造１Ｂを有する化合物より選択される。さらに好ましい態様において、一以上の有機ポリリン酸はそれらの様々な異性体及び／又は鏡像異性体の形態においてイノシトール及び他のシクリトールリン酸、例えばイノシトール２リン酸（ＩＰ２）、イノシトール３リン酸（ＩＰ３）、イノシトール４リン酸（ＩＰ４）、イノシトール５リン酸(ＩＰ５)及び、また、フィチン酸、又は（塩として）フィチン酸塩として知られるイノシトール６リン酸（ＩＰ６）より選択される。
【０１２６】
さらに好ましくは、一以上の有機ポリリン酸はイノシトール３リン酸（ＩＰ３）又はイノシトール６リン酸（ＩＰ６）を含む。
【０１２７】
さらに好ましくは、本発明は、フィチン酸、又はその塩（フィチン酸塩）としても知られるイノシトール６リン酸（ＩＰ６）、好ましくはフィチン酸ナトリウムの溶液を有する前記無機物微粒子を平衡化する工程を含む有機的に誘導される無機物微粒子を調製する方法に関する。
【０１２８】
別の好ましい態様において、前記無機物微粒子はリン酸カルシウム微粒子である。
【０１２９】
有機的に誘導される微粒子は好ましくは少なくとも０．０１μｍ及び最大で１μｍ、好ましくは０．１〜０．５μｍの名目上の大きさ、並びに本明細書の別の場所で定義した名目上のζ電位を有する。微粒子は様々な形状を有しうり、そして例えば、球状、円錐状、楕円体、複雑な形状、シリンダー状、又は立方体でありうる。さらに、微粒子の収集における微粒子は全て同じサイズ又は形状を有しえない。本明細書で用いられる「修飾した」又は「修飾する」という用語は、製品の形態又は特徴における、好ましくは前記製品の改良した（修飾した）型を生じさせる、小さい又は基本的ないずれかの、変換する、改正する又は変化させることを意味する。例えば、本明細書で教示するとおり有機的に誘導される無機物微粒子は、一以上の有機ポリリン酸の溶液によって平衡化する前の無機物微粒子出発物質と比較して、最初の、未修飾の微粒子出発物質の表面に位置する完全な又は部分的なリン酸イオン又は水酸化物イオンの、有機ポリリン酸イオン、表面電荷の変換、ζ電位における変化、生体分子結合における変化及び生体分子吸着特性及び／又はサイズの変化による置換を有しうる。好ましくは、有機ポリリン酸の溶液によって平衡化する前の無機物微粒子出発物質と比較して、前記表面電荷は数字的により高く、前記ζ電位は数字的により高く、前記生体分子結合及び生体分子吸着特性は増加する及び／又は前記名目上のサイズは減少する。好ましい態様において、前記生体分子は抗原である。さらに、その有機的に誘導される無機物微粒子は、無機物微粒子出発物質内に存在しない、ペプチド、タンパク質、又はポリペプチド、例えば生体分子の表面で塩基性アミノ酸残基のキレート化について特異的な結合部位を有し得る。
【０１３０】
特定の態様において、有機ポリリン酸の溶液による前記無機物微粒子の平衡化は、その無機物微粒子の名目上の静電ポテンシャルを修飾する。
【０１３１】
本明細書で用いられる「静電ポテンシャル」、「電位」又は「Ｖ」という用語は、当業者によって理解されるこの用語の一般的な意味、そして特に全体に荷電したポテンシャルエネルギー、例えば、プロトン、電子又は分子近くの特定の位置のイオンを意味し、単位電荷ごとのエネルギーとして定義されうる＜ｑ＞（Ｖ＝Ｕ／ｑ）。その静電ポテンシャルはジュール／クーロン、又はボルトの単位において表されうる。その静電ポテンシャルを例えば１つのポテンシャルＶ1から別のポテンシャルＶ2へ電荷を移動するために必要なエネルギーを予測及び／又は計算に用いられうる。
【０１３２】
本明細書で用いられる「ゼータ電位」又は「ζ電位」という用語は、液体中で懸濁される微粒子の相対的な電荷の測定を示す。より具体的には、ζ電位は粒子の物理学的な表面、いわゆる拡散層（いわゆる滑り面）の境界からある位置での中間の静電ポテンシャルを意味し、ここでイオンは、粒子表面の引力のある静電場と周囲の液体（例えば溶媒）との間で平衡状態にある。従って、ζ電位は、前記粒子の電荷が周囲の液体にもはや干渉しない、粒子の物理的な表面からある距離での電荷のポテンシャルを示す。そのζ電位は典型的に＋１００ｍＶから−１００ｍＶまでにおよび、ｅｌｅｃｔｒｏ−ｋｉｎｅｔｉｃモードにおいて、好ましくは２５℃で及び／又は脱イオン水中でＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）を使用することによって測定されうる。液体の微粒子について、名目上のζ電位が高いほど、懸濁液内の場合に、沈降する傾向が減少するという点において安定性が高まる。例えば、＋２５ｍＶより大きい又は−２５ｍＶより少ないζポテンシャルを有する微粒子は典型的に高度の安定性を有する。本明細書で教示するとおり、有機ポリリン酸の溶液によって前記微粒子を平衡化することによって無機物微粒子のζ電位の修飾は、増加、減少、逆転及び／又は前記微粒子のζ電位の中和でありうる。本明細書に教示する名目上のζ電位の増加又は減少は、その前の（＋）又は（−）の符号に関係せず、名目上のζ電位の絶対値の増加又は減少を意味する。例えば、最初の名目上のζ電位が−１０ｍＶである場合に、前記名目上のζ電位の増加は−１５ｍＶ、−２０ｍＶ、−２５ｍＶ、−３０ｍＶ等であり、一方で前記名目上のζ電位の減少は、−５ｍＶ、−３ｍＶ、−１ｍＶ、０ｍＶ等でありうる。別の例では、最初の名目上のζ電位が＋１０ｍＶである場合に、前記名目上のζ電位の増加は＋１５ｍＶ、＋２５ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ等であり、一方で前記名目上のζ電位の減少は＋５ｍＶ、＋３ｍＶ、＋１ｍＶ、０ｍＶ等でありうる。また、０ｍＶへの任意の名目上のζ電位の変化はζ電位の中和として意味しうる。名目上のζ電位の反転は電荷における変化、例えば＋１０ｍＶの名目上のζ電位が−１０ｍＶに反転されうる変化を示す。
【０１３３】
本明細書で教示するとおりポリリン酸溶液、例えば有機ポリリン酸の溶液によって前記微粒子を平衡化することによる無機物微粒子のゼータ電位の修飾（例えば、増加、減少、逆転、中和）の型は、無機物微粒子の型及びその最初の電荷及び／又はそのζ電位に依存する。例えば、正に荷電した水酸化アルミニウムの表面でポリリン酸について水酸化物を置換することは、水酸化アルミニウム微粒子のζ電位の逆転に繋がりうり、さらに、負電荷のリン酸アルミニウム又はリン酸カルシウム表面でホスフェートを有機ポリリン酸に置換することは、それぞれリン酸アルミニウム微粒子又はリン酸カルシウム微粒子のζ電位の絶対値の増加に繋がる。
【０１３４】
特定の態様において、前記無機物微粒子出発物質は、
（ｉ）ｐＨ  ７．０、蒸留水中で測定した場合、リン酸アルミニウムについて少なくとも−２０及び多くとも−３０ｍＶのζ電位、
（ｉｉ）ｐＨ  ７．０、蒸留水中で測定した場合、水酸化アルミニウムについて少なくとも＋１０及び多くとも＋２０ｍＶのζ電位、
（ｉｉｉ）ｐＨ  ７．０、蒸留水中で測定した場合、リン酸カルシウムについて少なくとも−１０及び多くとも−２０ｍＶのζ電位
を有する。
【０１３５】
特定の態様において、本明細書で教示するとおり、有機ポリリン酸の溶液によってリン酸アルミニウム及び／又はリン酸カルシウム微粒子の平衡化は、静電ポテンシャルの強度及び／又は前記微粒子のζ電位の絶対値を増加する。好ましくは、前記ζ電位は、蒸留水中で測定した場合、少なくとも−２０ｍＶ、少なくとも−２５ｍＶ、少なくとも−３０ｍＶ、少なくとも−３５ｍＶ、少なくとも−４０ｍＶ、少なくとも−５０ｍＶ、少なくとも−６０ｍＶ、少なくとも−７０ｍＶ、少なくとも−８０ｍＶ又は少なくとも−９０ｍＶに、好ましくは少なくとも−４０ｍＶ，少なくとも−５０ｍＶ、少なくとも−６０ｍＶ又は少なくとも−７０ｍＶに、より好ましくは少なくとも−５０ｍＶに増加する。
【０１３６】
特定の態様において、本明細書で教示するとおり有機ポリリン酸の溶液による水酸化アルミニウム微粒子の平衡化は前記微粒子の名目上の静電ポテンシャル及び／又は前記微粒子の名目上のζ電位を解除又は逆転する。
【０１３７】
特定の態様において、本明細書で教示するとおり無機物微粒子の平衡化は前記微粒子のサイズの減少につながる。有機的に誘導された無機物微粒子の得られたサイズは、典型的に出発物質の無機物微粒子の最初のサイズ及び平衡化期間の長さに依存する。
【０１３８】
特定の態様において、前記出発物質無機物微粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）又はレーザー回折によってコロイド性の懸濁液中において測定した場合、少なくとも０．１μｍ及び最大で５μｍの名目上のサイズを有する。
【０１３９】
特定の態様において、本明細書で教示する方法は、最大で１μｍ、最大で０．５μｍ、最大で０．２μｍ又は最大で０．１μｍ、最大で０．０５μｍ、最大で０．０２μｍ、好ましくは０．２μｍのサイズを有する有機的に誘導される無機物微粒子を提供しうる。例えば、４０時間までの期間におけるリン酸アルミニウム微粒子の本明細書で教示する平衡化工程は、出発物質粒子における２μｍの名目上のサイズの値が、結果として生じる有機的に誘導される無機物微粒子における０．２μｍの名目上のサイズへの減少に繋がりうる。本明細書で教示するその有機的に誘導される微粒子は、より小さい結晶の非晶質の凝集体又は同様の結晶サイズのより小さい非晶質の凝集体として生じうる。
【０１４０】
他の特定の態様において、本明細書に教示する方法は、出発物質粒子よりも小さいサイズ、例えば出発材料、すなわち比較がなされている出発物質無機物微粒子と比較して、少なくとも約１０％小さい、又は少なくとも約２０％小さい、又は少なくとも約３０％小さい、又は少なくとも約４０％小さい、又は少なくとも約５０％小さい、又は少なくとも約６０％小さい、又は少なくとも約７０％小さい、又は少なくとも約８０％小さい、又は少なくとも約９０％小さいサイズを有する有機的に誘導される無機物微粒子を提供しうる。
【０１４１】
本明細書で用いられる「平衡化」、「平衡化する」、又は「平衡化すること」は、無機物微粒子、例えばある温度である期間、一以上の有機ポリリン酸の溶液との接触においてリン酸アルミニウム、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム及び／又はリン酸カルシウム微粒子を導く反応を意味し、そして微粒子がさらに時間と共にさらなる変化を経る傾向がなくなるまで（例えばζ電位に変化がなくなるまで）、一以上の有機ポリリン酸の無機物微粒子と周囲の溶液との間の物質及び／又はエネルギーの流れを可能にすることを意味する。この期間、有機ポリリン酸イオンによるヒドロキシ基又はオルトリン酸基の置換反応、又はリガンド交換は前記無機物微粒子の表面で起こると想定される。この置換反応、又はリガンド交換は平衡に到達するまで継続する。
【０１４２】
典型的に平衡化する工程は、一以上の有機ポリリン酸の溶液による無機物微粒子の混合を含む。混合を実施するために用いうる装置の限定的されない例は、ロッキングプラットフォーム（ｒｏｃｋｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍｓ）、回転式カルーセル、ボルテックスミキサー、ミキサー（例えば、スクリュー、リボン又はパドル）、又はブレンダー（例えば、スクリュー、リボン又はパドル）である。さらに、その無機物微粒子は、一以上の有機ポリリン酸の溶液に加えられる前に洗浄されうる。好ましくは、その洗浄は、脱イオン水で実施される。平衡期間の長さは、無機物微粒子（例えば、リン酸アルミニウム、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、及び／又はリン酸カルシウム）の型及び／又は平衡化の目的（例えば前記微粒子のサイズ、静電ポテンシャル、及び／又はζ電位を修飾すること)に依存し、そして少なくとも１分間から長くても５０時間まで変化しうる。典型的に、本明細書で教示する無機物微粒子の静電ポテンシャル及び／又はζ電位の修飾は、サイズの修飾と比較してより短い平衡化期間を必要とする。好ましくは、無機物微粒子の静電ポテンシャル及び／又はζ電位を修飾する平衡化期間は最大で１時間であり、一方無機物微粒子のサイズを修飾するための平衡期間は少なくとも１時間である。さらに好ましくは、無機物微粒子の静電ポテンシャル及び／又はζ電位を修飾する平衡化期間は、少なくとも２分間、少なくとも３分間、少なくとも４分間、少なくとも５分間、少なくとも６分間、少なくとも７分間、少なくとも８分間、少なくとも９分間、少なくとも１０分間、少なくとも１１分間、少なくとも１２分間、さらにより好ましくは、少なくとも１０分間であり、無機物微粒子のサイズを修飾する平衡化期間は、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、少なくとも２５時間、少なくとも３０時間、少なくとも３５時間、少なくとも４０時間、少なくとも４５時間、少なくとも５０時間、さらにより好ましくは、少なくとも４０時間である。特定の態様において、前記平衡化期間は室温で実施される。任意に、一以上の有機ポリリン酸の溶液のいずれかが、平衡化期間後に、入手した有機的に誘導される無機物微粒子又は一以上の有機ポリリン酸の溶液より得られた有機的に誘導される無機物微粒子から取り除かれうる。この分離を果たす方法の限定されない例は、濾過、遠心、光誘起誘電泳動（ＯＤＥＰ）力、バッファー交換、洗浄又は当業者によって知られる他の技術である。
【０１４３】
第二の側面において、本発明は第一の側面に従う平衡化方法によって入手可能である有機的に誘導される無機物微粒子を提供する。
【０１４４】
本発明の方法によって入手した微粒子は、上記に記載の化学反応、表面変化及びサイズ減少により正確な、客観的な用語における記載が困難である。その測定したゼータ電位はリガンド交換／置換反応の間に大幅に変化し、そして前記化学反応、表面変化及びサイズ減少の結果とみなされなければならない。しかしながら、実験は有機的に誘導される無機物微粒子が以下に記載した工程に従うことにより、繰り返して持続的に同一の性能／ゼータ電位によって入手されることを示す。その有機的に誘導される無機物微粒子はそれゆえ前記平衡化方法の産物として最も正確に記載される。
【０１４５】
上記のように、イオン結合により金属カチオンと結合する水酸化物イオンによるリガンド交換によって、有機ポリリン酸はリン酸アルミニウム、又はリン酸カルシウムの表面と反応すると考えられる。粒子のゼータ電位の変化の測定は、粒子の物理学的な表面とバルク溶媒との間のイオンの吸着の直接的な証拠である（いわゆるヘルムホルツ面）。負に荷電した場合において、有機ポリリン酸の負電荷表面への吸着は静電反発力のせいで好ましくない。しかしながら、本明細書で示される実験データは、リン酸アルミニウムのゼータ電位が有機ポリリン酸による処理において増加されることを示し、リン酸アルミニウム粒子への有機ポリリン酸の特異的な吸着を示す。加えて、そのデータは、（非処理の粒子又はオルトリン酸処理した粒子と比較して）有機ポリリン酸により処理したリン酸アルミニウム粒子の増加したゼータ電位が脱イオン水による粒子の広範囲の洗浄後に保存される。そのデータは有機ポリリン酸が強力に粒子表面と結合されることを示し、リガンド交換が生じる証拠を支援することを提供している。
【０１４６】
それゆえ、時間に応じて粒子のゼータ電位の変化を観察することは、粒子表面（ヘルムホルツ面）で有機ポリリン酸の吸着の反応速度を与える。しかしながら、本方法は水酸化物イオンについてリガンド交換の反応速度を与えない。Ａｌ（ＩＩＩ）に対するリガンド交換速度はアルミニウム（ＩＩＩ）水和物において記録されたいくつかの最も遅いものである（Ｍａｒｔｉｎ  Ｒ．Ｂ．，Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ａｌｕｍｉｎｕｍ  ａｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８６，３２：１７９７−８０６）。しかしながら、Ａｌ（ＩＩＩ）が大部分はリン酸と錯体を形成しているリン酸アルミニウムの場合において、Ａｌ（ＩＩＩ）における水酸化物についてリガンド交換の反応速度は未知である。
【０１４７】
分光法を用いる、リガンド交換に対する直接的な証拠は、これらの分子における炭素の存在及びリン酸エステル結合の存在のため、無機ポリリン酸を用いる類似体の反応よりも困難でないものと予想され、それはラマン又はＩＲのように分光分析における異なる徴候、元々の未修飾の粒子において当初存在しない科学的な徴候を与えるだろう。リン酸のポリマーからなる無機ポリリン酸は、リン酸アルミニウム又はリン酸カルシウム粒子において既に存在するオルトリン酸の特有の特徴を示す。有機ポリリン酸によって修飾された粒子表面のラマン分光は当初の未修飾の粒子の表面と異なっていると予想される。さらに、リガンド交換反応より放出される水酸化物イオンは、溶液のアルカリ化へと繋がり、また時間に応じたｐＨ測定がそれゆえリガンド交換の反応速度を明らかにしうる。
【０１４８】
特定の態様において、本明細書で教示する方法は、商用利用可能な（未修飾の）リン酸アルミニウム、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、及び／又はリン酸カルシウム微粒子より開始し、連続して修飾される。好ましくは、前記出発物質のリン酸アルミニウム微粒子はＡｄｕｊ−Ｐｈｏｓ（登録商標）微粒子であり、前記未修飾（すなわち出発物質）のヒドロキシリン酸微粒子はＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）微粒子であり、より好ましくはそれぞれ２％  ＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）又は２％  Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）である。好ましくは、前記出発物質のリン酸カルシウム微粒子は非ヒドロキシアパタイト微粒子である。さらに特定の態様において、リン酸アルミニウム又はリン酸カルシウム微粒子はヒドロキシ基の部分を含みうる。よりさらに特定の態様において、リン酸アルミニウム又はリン酸カルシウム微粒子は、ほんのわずかの他の化学化合物又は要素、例えば塩化ナトリウム（例えば０．８〜１．０％  ｗ／ｗ）、塩化物（例えば≦０．３３％  ｗ／ｗ）、ナイトロジェン（例えば≦０．０５％  ｗ／ｗ）、硝酸塩（例えば≦１００ｐｐｍ）、硫酸塩（例えば≦０．１％ｗ／ｗ）、鉄（例えば≦１５ｐｐｍ）、ヒ素（例えば≦１ｐｐｍ）、重金属（例えば≦２０ｐｐｍ）、アンモニウム（例えば＜５０ｐｐｍ）を含みうる。
【０１４９】
特定の態様において、本明細書で教示した一以上の有機ポリリン酸の前記溶液による前記水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム及び／又はリン酸カルシウム微粒子を平衡化する工程を含む方法は、有機ポリリン酸イオンによる微粒子の表面に位置する水酸化物イオン又はリン酸イオンの部分的又は完全な置換を導く。
【０１５０】
本明細書で用いられる「置換」という用語は、またリガンド交換とも呼ばれ、固体のマトリックスにおける別のものによるアニオンの交換を意味する。それらの反対の電荷のせいで、それらがお互いに双方で働かせうるクーロン力によりカチオン及びアニオンはお互いに引き付けられるだろう。原子間距離が減少するにつれて、アニオンの原子価殻から電子がカチオンの原子価殻へと移動し、それによって（イオン原子価の）イオン結合を形成することを十分短縮させるだろう。比較のために、水酸化アルミニウムおける、アルミニウム（Ａｌ3+）は水酸化物（ＯＨ）によるイオン結合において関連する。共有結合に対するイオン結合は局在化していない。微粒子が単純な球状の形状及び有機ポリリン酸イオンによる表面の単層の被覆を有する想定において、有機ポリリン酸イオンによるリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、又はリン酸カルシウム微粒子の最大表面被覆率は、０．２％から０．８％（ｗ：ｗ）の範囲内である。
【０１５１】
本明細書で用いられる「表面」という用語は、また溶媒接触可能表面とも呼ばれ、三次元構造、例えば微粒子、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、生体分子又は抗原の外側の境界を意味し、それは液体媒体（例えば液体緩衝液）を覆うことから、溶媒（例えば水）と溶質（例えばイオン）との相互作用を利用しやすい。本明細書で教示する無機物微粒子の溶媒接触可能表面は結合等温線より決定又は推定されうる。
【０１５２】
特定の態様において、本明細書で教示する一以上の有機ポリリン酸の溶液による前記無機物微粒子の平衡化は、前記無機物微粒子の生体分子結合及び又は生体分子吸着容量を増加する。リン酸アルミニウム、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、及び／又はリン酸カルシウム微粒子からなるリストより選択される前記有機的に誘導される無機物微粒子の生体分子結合及び／又は生体分子吸着容量は、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム又はリン酸カルシウム微粒子より選択される出発物質の生体分子結合及び／又は生体分子吸着特性よりも少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍高くなりうる。好ましくは前記生体分子は抗原である。
【０１５３】
本明細書を通じて用いる「結合する」、「相互作用する」、「特異的に結合する」、又は「特異的に相互作用する」という用語は、ランダム又は関連のない他の分子を実質的に排除する、及び任意に構造的に関連のある他の分子を排除する一以上の所望される分子又は被験物質と結合する又は影響することを意味する。「結合する」、「相互作用する」、「特異的に結合する」、又は「特異的に相互作用する」という用語は、作用物質がその意図した標的に独占的に結合することに必ずしも必要ではない。例えば、作用物質は結合している状態においてその意図した標的に対する親和性が、非標的分子に対する親和性よりも少なくとも約２倍大きい、好ましくは約５倍大きい、より好ましくは少なくとも１０倍大きい、さらに好ましくは２５倍大きい、より一層好ましくは少なくとも５０倍大きい、及びさらにより一層好ましくは１００倍大きい場合に、関心のある標的に特異的に結合すると言われうる。
【０１５４】
作用物質とその意図した標的との間の結合又は相互作用は非共有結合でありうる（すなわち、非共有結合力、例えばイオン相互作用、水素架橋、双極子相互作用、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ力、等により仲介される）。好ましくは、その作用物質はＫA≧１×１０6Ｍ-1、さらに好ましくはＫA≧１×１０7Ｍ-1、さらにより好ましくはＫA≧１×１０8Ｍ-1、より一層好ましくはＫA≧１×１０9Ｍ-1、及びさらにより一層好ましくはＫA≧１×１０10Ｍ-1又はＫA≧１×１０11Ｍ-1のその結合の結合定数（ＫA）でその意図した標的と結合又は相互作用しうり、ここでＫA＝［Ａ＿Ｔ］／［Ａ］［Ｔ］＝ｋa／ｋd、Ａは作用物質を示し、Ｔは意図した標的を示し、ｋaは結合速度を示し、ｋdは解離速度を示す。ＫAの決定は当業者に既知の方法、例えば平衡透析及びスキャッチャードプロットを用いることによって行われた。
【０１５５】
微粒子の表面へ生体分子の引力（及び結合強度）の原因となる静電ポテンシャルの強さを増強するために、修飾された微粒子のζ電位の絶対値は可能な限り高いことが好ましい。さらに、より高い表面／質量比は、アジュバントの１ユニットあたりの量につきより高い生体分子のポテンシャル量を導き、修飾された微粒子のサイズはサブミクロンの範囲内であり、好ましくはナノメートルの範囲内である。好ましくは、前記生体分子はワクチン抗原である。
【０１５６】
可溶性イオン種が粒子表面に吸着しうることによる第一の一般的なメカニズムは、引力のある長距離の静電力を介する。これらの力は微粒子表面（例えばアジュバント微粒子）への抗原のような生体分子の吸着において最も重要な決定要因として認識される。このメカニズムに従い、拡散層内で自由に拡散し、バルク溶媒に出入りすることによって、抗原のような生体分子が微粒子の引き付ける静電場、上記の拡散層において捕捉されることをもたらすと考えられる。生体分子が粒子の表面に近づくので、他の短い範囲の力（例えば、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ力、又は双極子−双極子相互作用（水素結合））を生じうる。また、溶媒効果（疎水効果）はそのメカニズム及び粒子の表面への生体分子の総結合強度を加えうる。
【０１５７】
本発明者は、一以上の有機ポリリン酸塩の溶液、例えば本明細書で教示する単一の有機ポリリン酸塩の溶液における前記微粒子を平衡化することによりリン酸アルミニウム粒子の名目上の負電荷ポテンシャルを増加することによって、反対（正）電荷の、この電場の強度が同様に増加し、次に抗原タンパク質のような生体分子の結合容量を増加することを発見した。さらに、いかなる理論に束縛されるものではないが、本発明は、正に荷電した水酸化アルミニウムの表面で有機ポリリン酸について水酸化物を置換することがζ電位の反転に繋がりうり、通常、水酸化アルミニウム微粒子から静電的にはじかれる、正に荷電した生体分子、例えば抗原タンパク質の吸着を可能にすることを仮定する。
【０１５８】
いかなる理論に束縛されるものではないが、本発明者は抗原のような生体分子が本明細書に教示する無機物微粒子の表面に結合しうることにより、第二のメカニズムが、生体分子のタンパク質表面で正に荷電したアミノ酸、好ましくはリシン及びアルギニン、並びに微粒子（例えば、アジュバント微粒子）の表面で負に荷電した有機リン酸基との間でのイオン結合の形成を含む、より特異的な相互作用を通じることを仮定する。タンパク質の正に荷電したアミノ酸残基、特にリシン及びアルギニンについて、リン酸基の親和性は、ヌクレオチドのリン酸基が、酵素触媒部位のリシン又はアルギニン残基によるイオン対に一時的に含まれる、タンパク質キナーゼ及びポリリン酸の例によって、生化学において十分に立証された（Ｍａｖｒｉ  Ｊ．ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌ  Ｍ．Ｊ．，Ｉｏｎ  ｐａｉｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｌｙｓｉｎｅ  ａｎｄ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎｓ：Ａ  ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１９９６）。タンパク質間相互作用のいくつかの特定の場合において、このタイプのイオン結合は共有結合と同等に強力でありうることが示されており（Ｗｏｏｄｓ  Ａ．Ｓ．ａｎｄ  Ｆｅｒｒｅ  Ｓ．，Ａｍａｚｉｎｇ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓｅｒｃｈ，２００５）、そしてこの特性はいくつかの適用において利用されている（Ｆｏｋｋｅｎｓ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｗｅｅｚｅｒ  ｆｏｒ  ｌｙｓｉｎｅ  ａｎｄ  ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００５；Ｓｃｈｕｇ  Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｏｎｃｏｖａｌｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ａｎｄ  ａｎｉｏｎｉｃ  ｇｒｏｕｐｓ：ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ−ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ｂａｓｅｄ  ａｒｇｉｎｉｎｅ／ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｐｈｏｓｐｈ［ｏｎ］ａｔｅ  ａｎｄ  ｓｕｌｆ［ｏｎ］ａｔｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００５）。本発明はさらに、このタイプの相互作用が、適当なｐＨ値及びバルク溶媒のイオン強度で、（アジュバントとして用いるような）微粒子例えば、アルミニウム−又はカルシウム−リン酸を含むリン酸の表面で生じうることを仮定する。さらに、本明細書で教示する無機物微粒子の表面で有機ポリリン酸イオンの導入は、それらの重合体の機能及びコンフォメーションの柔軟性により、有機ポリリン酸が正に荷電したアミノ酸残基、好ましくはリシン又はアルギニン側鎖をキレートしうる方法において本結合メカニズムを改善しうる。結果として、それらの表面でそのような塩基性残基を提示する、抗原のような生体分子の結合容量又は結合強度は、キレート効果のために劇的に改善されうる。興味深いことに、正に荷電した水酸化アルミニウムの比較の��ースにおいて、有機ポリリン酸イオンによるいくつかの水酸化物イオンの置換は、正に荷電した、抗原のような生体分子の特異的な吸着のためのいくつかの場所を作り出しうり、それは一方で、ワクチン製造のような、生体分子の送達又は吸着システムの適用に共通に使用されるｐＨ値で、反発する電荷間の相互作用のために水酸化アルミニウムの低い親和性を示すことを期待される。
【０１５９】
本発明の別の側面は、リン酸アルミニウム、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム及び／又はリン酸カルシウム微粒子からなるリストより選択される有機的に誘導される無機物微粒子に関し、ここでリン酸アルミニウム又はリン酸カルシウム微粒子の表面に位置するオルトリン酸イオン又は水酸化アルミニウム微粒子の表面に位置する水酸化物イオンは部分的に又は完全に有機ポリリン酸イオンによって置換される。
【０１６０】
特定の態様において、本明細書に教示する有機的に誘導される無機物微粒子は、
（ｉ）蒸留水においてｐＨ７．０で測定した場合に、リン酸アルミニウムについて、少なくとも−４０ｍＶの名目上のζ電位、又は
（ｉｉ）蒸留水においてｐＨ７．０で測定した場合に、水酸化アルミニウムについて、少なくとも−２０ｍＶの名目上のζ電位、又は
（ｉｉｉ）蒸留水においてｐＨ７．０で測定した場合に、リン酸カルシウムについて、少なくとも−４０ｍＶの名目上のζ電位
を有する。
【０１６１】
特定の態様において、修飾されたリン酸アルミニウム微粒子は、蒸留水中で測定した場合、少なくとも−２０ｍＶ、少なくとも−２５ｍＶ、少なくとも−３０ｍＶ、少なくとも−３５ｍＶ、少なくとも−４０ｍＶ、少なくとも−５０ｍＶ、少なくとも−６０ｍＶ、少なくとも−７０ｍＶ、少なくとも−８０ｍＶ、少なくとも−９０ｍＶ、好ましくは、少なくとも−４０ｍＶ、少なくとも−５０ｍＶ、少なくとも−６０ｍＶ、少なくとも−７０ｍＶ、より好ましくは少なくとも−５０ｍＶの名目上のζ電位を有する。
【０１６２】
特定の態様において、本発明に従うリン酸アルミニウム、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム及び／又はリン酸カルシウム微粒子からなるリストより選択される有機的に誘導される微粒子は、少なくとも０．０１μｍ及び最大で２μｍ、最大で１μｍ、最大で０．５μｍ、最大で０．２μｍ、最大で０．１μｍ、最大で０．０５μｍ、最大で０．０２μｍ、好ましくは最大で２μｍの名目上のサイズを有する。
【０１６３】
特定の態様において、本発明に従う有機的に誘導されるリン酸アルミニウムは、１．２±０．１５から１のＡｌとＰとの理論混合比を有する。
【０１６４】
特定の態様において、本発明に従う有機的に誘導されるリン酸カルシウムは、１．７±０．２０から１のＣａとＰとの理論混合比を有する。
【０１６５】
特定の態様において、本明細書に教示する有機的に誘導される無機物微粒子は０．２から０．８％ｗ：ｗの有機ポリリン酸イオンによって前記微粒子の最大表面被覆率を有しうる。
【０１６６】
上記に記載のように、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、及びリン酸カルシウムを含む無機物を含むアジュバントは数十年間継続してワクチン調製に用いられ、殺された、不活性化された及びサブユニットの抗原に対する免疫応答を促進する。
【０１６７】
特定の態様において、本明細書に教示する有機的に誘導される無機物微粒子は、出発物質の水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム及び／又はリン酸カルシウム微粒子と比較して、増加した生体分子結合特性を有し、好ましくはここで前記生体分子は前記修飾された微粒子と反対の電荷を有し、又は、ここで前記微粒子が中性である場合に前記生体分子が中性である。例えば、有機的に誘導されるリン酸アルミニウム微粒子は負に荷電し、そして好ましくは正に荷電した生体分子に結合する。
【０１６８】
本明細書に記載した「生体分子」という用語は、精製又は合成によって生体組織由来の成分又は作用物質を含むこと及びそれらが生物学的に活性でありうることを意味する。また、これらの用語により包含されるものは、診断薬及びいわゆる「機能性化粧品」である。診断薬は、例えば、蛍光タンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質又はＧＦＰ）又は放射性標識された分子である。機能性化粧品は、個人の外見、例えば、皮膚、髪、唇、及び目に効果を有する有効成分を含み、そして抗しわ剤及び顔貌を改善する作用物質を含む。これらの適用において、本明細書に教示した修飾された微粒子は、好ましくは外用である。医薬品有効成分（また医薬品又は薬物として称される）は特別な興味の対象であり、そして生体分子のサブグループを形成する。
【０１６９】
前記生体分子は小分子（例えば、約１５００未満の分子量を有する分子）、合成の又は天然の例えば単糖、二糖類、三糖、オリゴ糖、ペプチド、核酸だけでなく、核酸類似体及び誘導体；又はプラスミド、ベクター、ポリサッカライド、生物学的な巨大分子、例えばより大きいペプチド（ポリペプチド）、タンパク質、そのペプチド類似体及び誘導体、ペプチド模倣薬、核酸に基づく分子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又は任意の他のＤＮＡ又はＲＮＡ様分子）、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素、抗生物質、生物学的な材料、例えば細菌、植物、真菌、又は動物細胞若しくは組織より作製された抽出物、治療薬、予防薬、診断薬、造影剤、（オリゴヌクレオチド又はタンパク質アプタマーを含む）アプタマーを含む大分子を含みうる。
【０１７０】
一の態様において、生体分子は水溶性であり、特に水溶性の医薬品有効成分である。そのような有効成分は生物薬剤学分類システム（ＢＣＳ）のクラスＩ又はＩＩＩに属しうり、それは原薬を４つのクラスに分類する：クラスＩ−高透過性、高溶解性；クラスＩＩ−高透過性、低溶解性；クラスＩＩＩ−低透過性、高溶解性；クラスＩＶ−低透過性、低溶解性。また、水溶剤は化合物１ｇを溶解するために必要な水（ｇ）の量により特定されうり、ここで水溶剤は以下の溶解性条件を満たすものである：１０〜３０ｇ（「やや溶けやすい」）；３０〜１００ｇ（「やや溶けにくい」）；１００〜１０００ｇ（「溶けにくい」）、１０００〜１００００ｇ（「極めて溶けにくい」又は「ほとんど溶けない」）；又は、とても溶けやすい（“ｐａｔｉｃｕｌａｒｌｙ  ｓｏｌｕｂｌｅ”）、やや溶けにくい及び溶けにくい薬物。
【０１７１】
別の態様において、その生体分子は抗体又は抗体断片でありうる。「抗体」という用語はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）を含むべきである。抗体断片は抗体の一部を、一般的にはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；リニア抗体；単鎖抗体分子；抗体断片より形成された多特異性抗体を含む。
【０１７２】
好ましい態様において、生体分子は宿主組織において免疫応答を含むことができる抗原でありうる。従って、好ましい態様において、本明細書で教示するとおり有機的に誘導される無機物微粒子は、出発物質のリン酸アルミニウム、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、及び／又はリン酸カルシウム微粒子と比較して、好ましくはここで前記抗原が前記修飾された微粒子と反対の電荷を有する、又はここで前記修飾された微粒子が中性である場合に前記抗原が中性である、増加した抗原結合特性を有する。例えば、修飾されたリン酸アルミニウム微粒子は負に荷電し、そして好ましくは、正に荷電した抗原と結合する。
【０１７３】
「宿主組織」という用語は、典型的には動物、好ましくは脊椎動物、例えば鳥類、ヒト及びヒト以外の哺乳類、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ又は霊長類を意味する。
【０１７４】
特定の態様において、本明細書で教示するとおり有機的に誘導される無機物微粒子は、それらの増加した抗原結合容量の結果として、抗原の吸着容量を増加しうる。これらの増加した抗原吸着容量は、先行技術において利用可能なものと比較して、多数の感染症病原体からの抗原を含みうるワクチンを組み合わせることを可能にするだろう。アジュバントのタンパク質吸着容量は様々な分析方法を用いて測定されうる。例えば、アジュバントの吸着前後の抗原溶液の水相においてタンパク質含有量を比較することにより（Ｌｉｎｄｂｌａｄ  Ｅ．，Ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００４，８２：４９７−５０５）、又は所望される抗原に対して特異的な抗原が利用可能な場合に、吸着、タンパク質吸着容量は、定量的免疫電気泳動又は一元放射免疫拡散のいずれかを用いることによって、免疫沈降技術を用いて測定されうる。抗体を使用せずに、分光光度法で試験されうる（Ｌｉｎｄｂｌａｄ  Ｅ．，Ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ，ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００４，８２：４９７−５０５）。
【０１７５】
本明細書に用いられる「吸着」という用語は、（例えば、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ力による）物理吸着又は（例えば、共有又はイオン結合による）化学吸着を意味し、ここで微粒子の表面と生体分子（例えば抗原及び／又は有機分子）との間の結合が構築される。
【０１７６】
特定の態様において、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム、及び／又はリン酸カルシウム微粒子からなるリストより選択される前記有機的に誘導される無機物微粒子の生体分子結合特性は、出発物質の水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム、及び／又はリン酸カルシウム微粒子の生体分子結合特性より少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍高く、好ましくはここで前記生体分子は抗原である。水酸化アルミニウム（ｍｇ／ｇ）、リン酸アルミニウム（ｍｇ／ｇ）、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム（ｍｇ／ｇ）又はリン酸カルシウム（ｍｇ／ｇ）微粒子上に吸着された生体分子（例えば抗原）の比率は、修飾された微粒子のタイプと生体分子（例えば抗原）の機能との組み合わせに依存する。例えば、無機物微粒子（ｍｇ／ｇ）上の生体分子（例えば抗原）の比率は少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、より好ましくは少なくとも１２でありうる。
【０１７７】
本発明に従う水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム、及び／又はリン酸カルシウム微粒子からなるリストより選択される有機的に誘導される無機物微粒子は、物理化学的な特性、すなわち増加したコロイド安定性又は減少した凝集を改善しうり、それは粒子間の増加した静電的な斥力；及び／又は改善した生体分子吸着及び結合性でありうり、好ましくは前記生体分子は抗原である。
【０１７８】
さらに、本発明の別の側面は、薬物における本明細書で教示する前記有機的に誘導される無機物微粒子の使用である。
【０１７９】
特定の態様において、「薬物」はヒト及び／又は動物用の薬物でありうる。
【０１８０】
特定の態様において、本明細書で教示するとおり有機的に誘導される無機物微粒子は生体分子送達又は吸着機構で用いられうり、好ましくはここで前記生体分子送達システムがワクチンアジュバントである。
【０１８１】
特定の態様において、本明細書で教示する前記有機的に誘導される無機物微粒子はワクチンにおいて、好ましくは生体分子送達システムとして、より好ましくはワクチンアジュバントとして用いられうる。
【０１８２】
特定の態様において、本明細書で教示する前記有機的に誘導される無機物微粒子はワクチンを製造することに用いられうる。
【０１８３】
他の特定の態様において、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウム、及び／又はリン酸カルシウム微粒子より選択される出発物質より調製される有機的に誘導される無機物微粒子はワクチンアジュバント又はワクチン成分を製造するために用いられうり、及び／又はワクチンの製造することにおいて用いられうる。
【０１８４】
本明細書で教示するとおりそれらの表面に結合する抗原を有する修飾された無機物微粒子は、動物において、抗体、例えばポリクローナル抗体を産生させるために用いられうる。これは血清中に高い発現レベルの抗原特異的な抗体を産生させるために、実験動物又は家畜に、それらの表面に結合する抗原を有する前記無機物微粒子を注射することによって果たされ、続いて動物から回収されうる。ポリクローナル抗体は、血清から直接回収されうり、一方で、不死の骨髄腫細胞によって免疫化したマウス由来の融合抗体分泌脾臓細胞によって、細胞培養上清における特定の抗体を発現するモノクローナルハイブリドーマ細胞株を作り出すことで、モノクローナル抗体が産生される。
【０１８５】
それゆえ、本発明の別の側面は、抗体の産生のための、本発明に従う有機的に誘導される無機物微粒子の使用である。
【０１８６】
生体分子及び／又は汚染物質（すなわち、ヒ素、クロム、硝酸、カルシウム、ラジウム、ウラン、フッ化物）を結合できる無機物微粒子は生体分子吸着システム、例えば精製工程、分離工程並びに水及び（例えばイオン交換体として機能することによって）他のイオンを含む溶液の除染工程として用いられうる。例えば、正に荷電した無機物微粒子は、負に荷電したアルブミンに結合可能でありうり、そしてそれゆえ血液試料からのアルブミンの除去に用いられうる。別の例において、荷電した無機物微粒子は様々な試料において酸性又は塩基性のタンパク質を選択的に濃縮するために用いられうる。産業的なスケールで、精製、分離、及び除染は往々にして吸着カラム（例えばイオン交換クロマトグラフィー）を用いて実施される。
【０１８７】
従って、本明細書に教示するように有機的に誘導される無機物微粒子は、精製、分離及び除染工程における生体分子吸着システムとして用いられうる。
【０１８８】
特定の態様において、本明細書に教示するように有機的に誘導される無機物微粒子は、血液分取時に所望しないタンパク質の除去のために用いられうる。
【０１８９】
本発明はさらに以下の限定されない実施例において示される。
【実施例】
【０１９０】
実施例１
【０１９１】
鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）モデル抗原の吸着をイノシトール６リン酸（ＩＰ６）によって処理されたＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）粒子によって実施し、メタ−６リン酸（ｍ６Ｐｉ）、オルトリン酸（Ｐｉ）、及びコントロールとして水と比較した。Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ  ＺＰ（登録商標）をＩＰ６又はｍ６ＰＩの添加により２０ｇ／Ｌで処理し、５ｍＭの終濃度にして、そしてｐＨをｐＨ５．０に再調整し、その懸濁液は穏やかな撹拌で１２時間置き、平衡化し、そして粒子の沈殿を生じていないか確認した。続いて、Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）粒子を超純水によって十分にすすぎ、過剰なイオンを除去し、オートクレーブ処理した。ＨＥＬ吸着を実施する前に懸濁液のｐＨを７．０に調整した。
【０１９２】
粒子の吸着容量をＨＥＬ濃度に応じて決定した。２ｍＭのストックＨＥＬ溶液から一連の希釈液を作製し、そして調節した量のリン酸カルシウム粒子、例えば１０μＭから１２０μＭに及ぶ終濃度に従って添加し、そしてリン酸カルシウム粒子の終濃度を４ｍｇ／ｍＬにした。混合物を平衡化のために撹拌下室温で３０分間置き、粒子の沈殿を生じていないか確認した。吸着したＨＥＬの量を、粒子の沈殿後上清の残存した量から決定した。その結果を図１に示す。
【０１９３】
実施例２
【０１９４】
リン酸カルシウム粒子のゼータ電位のイノシトール６リン酸（Ｉ６Ｐ）濃度の効果。リン酸カルシウムアジュバント粒子（Ｂｒｅｎｎｔａｇ−Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を超純水（６μＳ／ｃｍ）によって十分にすすぎ、様々な濃度のオルトリン酸（Ｐｉ）、メタ−６リン酸（ｍ６Ｐｉ）又はイノシトール６リン酸（ＩＰ６）によって室温で６０分間処理した。対応するリン酸溶液内において洗浄した粒子の当初の懸濁液を１０倍に希釈し、ゼータ電位の測定をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｕ．Ｋ．）によって実施した。その結果を図２に示す。
【０１９５】
実施例３
【０１９６】
モデル抗原の鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）の吸着を、ＨＥＬ濃度に応じた粒子の吸着容量を決定するために、０．２ｍＭリン酸によって処理したリン酸カルシウム粒子によって実行した。２ｍＭのストックＨＥＬ溶液から一連の希釈液を作製し、調節した量のリン酸カルシウム粒子、例えば１０μＭから１２０μＭまでに及ぶ範囲の終濃度に従って添加し、そしてリン酸カルシウム粒子の終濃度を４ｍｇ／ｍＬにした。混合物を平衡化のために撹拌下室温で３０分間置き、粒子の沈殿が生じていないか確認した。吸着したＨＥＬの量を、粒子の沈殿後上清中に残存した量より決定した。その結果を図３に示す。
【０１９７】
実施例４
【０１９８】
アデノシンヌクレオチドのリン酸化の程度によるＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）への吸着を、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）及びアデノシン（Ａ）とを比較することによって調査した。１％（ｗ／ｖ）でＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）をｐＨ７．０で調整し、０．１ｍＭから２．５ｍＭに及ぶ濃度のＡ、ＡＭＰ及びＡＴＰの溶液によって混合し、平衡化のために１時間撹拌下室温で置き、Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）の沈殿を避けた。続いて、粒子をスピンダウンし、上清を２５９ｎｍで吸光度測定した。吸収したアデノシンの量を、１５４００ｃｍ-1Ｍ-1のモル吸光係数を用いて、最初の濃度と吸着後の最終の濃度との間の差異から計算した。その結果を図４に示す。
【０１９９】
実施例５
【０２００】
Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）粒子のゼータ電位上のイノシトール６リン酸（ＩＰ６）濃度の効果を調査した。Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）粒子を、ｐＨを７．０に調整することによって、０．２ｍＭから４０ｍＭに及ぶ濃度のＩＰ６の溶液内に０．１％（ｗ：ｖ）に希釈し、ｐＨを７．０に調節した。室温で６０分間の平衡化後、ζ電位をＤＬＳ（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって記録した。その結果を図５に示す。
【０２０１】
実施例６
【０２０２】
Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ及びアルハイドロゲルへのアデノシンヌクレオチドの吸着を、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）及びアデノシン（Ａ）とを比較することによって調査した。１％（ｗ／ｖ）でＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ又はアルハイドロゲルを５ｍＭ  イミダゾールによってｐＨ７．０で緩衝し、そして０．２ｍＭから６．０ｍＭに及ぶ濃度のＡ、ＡＭＰ及びＡＴＰの溶液によって混合し、平衡化のために撹拌下室温で２時間置きアジュバント粒子の沈殿を避けた。アジュバント粒子をスピンダウンし、分光光度計によって（アデノシンについて最大吸光波長の）２５９ｎｍで吸光度を測定した。吸収したヌクレオチドの量を、アデノシンに対する１５４００ｃｍ-1Ｍ-1のモル吸光係数を用いて、最初の濃度と吸着後の最終濃度との間の差異より計算した。その結果を図７及び図８に示す。
【０２０３】
実施例７
【０２０４】
Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓの静電的なζ電位のアデノシンヌクレオチド（ＡＴＰ及びＡＭＰ）の効果を、動的光散乱法（Ｚｅｔａ−Ｓｉｚｅｒ，Ｎａｎｏ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。０．２％（ｗ／ｖ）でＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓを５ｍＭ  イミダゾール緩衝液ｐＨ７．０で、０．２ｍＭから４．０ｍＭに及ぶ濃度でＡＴＰ又はＡＭＰの溶液によって混合し、平衡化のために撹拌下室温で２時間置きアジュバント粒子の沈殿を避けた。試料をキャピラリーセル（ＤＴＳ１０６０、Ｍａｌｖｅｒｎ）内に移し、２分間の温度平衡化後、２５℃で三回測定した。その結果を図９に示す。
【０２０５】
実施例８
【０２０６】
Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ沈殿及びベッド高のアデノシンヌクレオチド（ＡＴＰ及びＡＭＰ）の効果を調査した。Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓをポリリン酸によって処理した場合、ｐＨ及び塩分濃度の同じ条件において、粒状物質のパッキング密度を増加し、減少したベッド高に繋がる。Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ沈殿のより高いパッキング密度はアジュバント粒子をバルク溶媒相内に再懸濁することをより困難にさせ、これはワクチン製造の重荷になりうる。それゆえ、修飾したＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓのパッキング密度を監視することは下流の適用について重要なパラメータである。
【０２０７】
５ｍＭ  イミダゾール緩衝液に１ｍＬのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ  ２％（ｗ／ｖ）をｐＨ７．０で加え、ＡＴＰ又はＡＭＰの濃縮した溶液を加え０．２ｍＭから５．０ｍＭに及ぶ終濃度に到達させた。（激しく振とうすることによって）ホモジナイズした懸濁液をプラスチックの分光光度用キュベットに移し、透明な相分離を粒子のビーズと上記の液体との間で観察するまで４８時間沈殿を置いた。ベッド高をヌクレオチド濃度に応じて測定した。これらの条件において、キュベット内の懸濁液の総量の高さを一定に２２ｍｍと等しくした。その結果を図１０及び図１１に示す。
【０２０８】
実施例９  カルシウムリン酸へのアデノシンヌクレオチドの吸着
【０２０９】
リン酸カルシウムへのアデノシンヌクレオチドの吸着をアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）及びアデノシン（Ａ）とを比較することによって調査した。１％（ｗ／ｖ）リン酸カルシウムを５ｍＭ  イミダゾールによってｐＨ７．０で緩衝し、そして０．２ｍＭから６．０ｍＭに及ぶ濃度のＡ，ＡＭＰ及びＡＴＰの溶液によって混合し、平衡化のために撹拌下室温で２時間置き、アジュバント粒子の沈殿を避けた。アジュバント粒子をスピンダウンし、分光光度計を用いて（アデノシンについて最大吸光波長の）２５９ｎｍで上清の吸光度を測定した。吸着したヌクレオチドの量を、アデノシンについて１５４００ｃｍ-1Ｍ-1のモル吸光係数を用いて最初の濃度と吸着後の最終の濃度の間の差異より計算した。この結果を図１２に示す。
【０２１０】
実施例１０  リン酸カルシウムの静電的なζ電位のアデノシンヌクレオチドの効果
【０２１１】
リン酸カルシウムの静電的なζ電位のアデノシンヌクレオチド（ＡＴＰ及びＡＭＰ）の効果を動的光散乱法（Ｚｅｔａ−Ｓｉｚｅｒ，Ｎａｎｏ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて測定した。０．２％（ｗ／ｖ）のＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓを５ｍＭイミダゾール緩衝液にｐＨ７．０で加え、０．２ｍＭから４．０ｍＭに及ぶ濃度でＡＴＰ又はＡＭＰの溶液によって混合し、平衡化のために撹拌下室温で２時間置き、アジュバント粒子の沈殿を避けた。試料をキャピラリーセル（ＤＴＳ１０６０，Ｍａｌｖｅｒｎ）に移し、２分間の温度平衡化後に２５℃で三回測定を実施した。その結果を図１３に示す。
【０２１２】
実施例１１  リン酸カルシウムの沈殿のアデノシンヌクレオチドの効果
【０２１３】
リン酸カルシウムの沈殿及びベッド高のアデノシンヌクレオチド（ＡＴＰ及びＡＭＰ）の効果を測定した。リン酸カルシウムをポリリン酸によって処理した場合、同条件のｐＨ及び塩濃度において、粒子物質のパッキング密度を増加し、減少したベッド高へと繋がった。リン酸カルシウムの沈殿のより高いパッキング密度はアジュバント粒子をよりバルク溶媒相へ再懸濁しづらくし、それはワクチン製造について重荷になりうる。それゆえ、修飾したリン酸カルシウムのパッキング密度を監視することは下流の適用について重要なパラメータである。
【０２１４】
２％（ｗ／ｖ）リン酸カルシウムをｐＨ７．０の５ｍＭイミダゾール緩衝液中に加え１ｍＬにして、濃縮したＡＴＰ又はＡＭＰ溶液を加えて、０．５ｍＭから５．０ｍＭに及ぶ終濃度に到達させた。（激しく振とうすることによって）ホモジナイズした懸濁液をプラスチックの分光光度のキュベットに移し、粒子の層と上記の液体との間に透明な相分離を観察するまで４８時間沈殿を置いた。ベッド高をヌクレオチド濃度に応じて測定した。これらの条件においてキュベット内の懸濁液の総量の高さを一定にし、２２ｍｍと等しくした。その結果を図１４及び図１５に示した。
【０２１５】
実施例１２  Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）粒子へのＩＰ６の不可逆的な吸着についての試験
【０２１６】
（例えばリガンド交換を通じて）Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）粒子へのＩＰ６の不可逆的な吸着をテストするために、２％ｗ／ｖのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓを５ｍＭイミダゾール緩衝液ｐＨ７．０内で０．２ｍＭのＮａ−ＩＰ６によって２４時間処理した。これはＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓのζ電位が、フリーな、未吸着のＩＰ６の超過を阻止するために、その最大値に到達する、ＩＰ６の名目上の濃度と一致する。（ＩＰ６によって修飾した）結果として生じたＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ  ＺＰを５ｍＭのイミダゾール緩衝液においてｐＨ７．０で連続して希釈し、ｐＨ及びイオン強度を一定に保った。ζ電位を希釈倍率に応じて記録し、通常（未処理の）Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）と比較した。その結果を図１６に示す。
【０２１７】
実施例１３  Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）へのＡＴＰの不可逆的な吸着についての試験
【０２１８】
（例えば、リガンド交換を通じて）Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）粒子へＡＴＰの不可逆的な吸着について試験するために、実施例１２のような試験を行った。２％ｗ／ｖのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓを１．０ｍＭのＡＴＰによって５ｍＭのイミダゾール緩衝液内でｐＨ７．０で２４時間処理した。結果として生じたＡＴＰによって修飾したＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓを５ｍＭのイミダゾール緩衝液内でｐＨ７．０で連続して希釈し、ｐＨ及びイオン強度を一定に保った。ζ電位を希釈倍率に応じて記録し、通常の（未処理の）Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）と比較した。その結果を図１７に示す。
【０２１９】
実施例１４  リン酸カルシウムへのＩＰ６及びＡＴＰの不可逆的な吸着についての試験
【０２２０】
（例えばリガンド交換を通じた）リン酸カルシウム粒子へのＩＰ６又はＡＴＰの不可逆的な吸着についてテストするために、実施例１３及び１４のような試験を行った。２％ｗ／ｖのリン酸カルシウムを０．５ｍＭのＩＰ６又は１．０ｍＭのＡＴＰのいずれかによってｐＨ７．０の５ｍＭのイミダゾール緩衝液で２４時間処理した。結果として生じたＩＰ６又はＡＴＰのいずれかによって修飾したリン酸カルシウムを５ｍＭのイミダゾール緩衝液内でｐＨ７．０で連続的に希釈し、ｐＨ及びイオン強度の条件を一定に保持した。ζ電位を希釈倍率に応じて記録し、そして通常の（未処理の）リン酸カルシウムと比較した。その結果を図１８に示す。
【０２２１】
実施例１５  Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ  ＺＰ（登録商標）（イノシトール６リン酸ナトリウムによって修飾したＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標））について大規模スケールの製造方法
【０２２２】
反応タンク内で２０００Ｌの量の純水に４５ｋｇのリン酸アルミニウム（ＩＩＩ）含水塩を沈降及び固定化した後、２０ｍＭのドデカナトリウムイノシトールヘキサホスフェート（Ｎａ−ＩＰ６）を純水内に加えて５０Ｌの新たに調製した溶液を５ｍＬ／分の流量で懸濁液に、一定の撹拌条件下で加えた。全ての量のＮａ−ＩＰ６溶液の添加後、懸濁液を撹拌下で追加で２時間置いた。Ｎａ−ＩＰ６溶液を添加した開始から、ゼータ電位を時間間隔をあけて測定し、リン酸アルミニウム粒子へのフィチン酸の吸着の進行を監視した。典型的に、２０ｍＭのＮａ−ＩＰ６溶液の添加後、最初の２時間以内に安定したζ電位値に到達した。続いて、５．８４ｋｇのＮａＣｌを懸濁液に加えて、リン酸アルミニウム粒子のイオン強度及び見かけの密度を制御した。続いて、その懸濁液をオートクレーブタンクに移し、Ｎａ−ＩＰ６によって処理したＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓを１２１℃で３０分間、１．３バールの圧力下で滅菌した。冷却後、その懸濁液を輸送用プラスチックコンテナに無菌的に充填した。
【０２２３】
実施例１６  通常のＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）とＩＰ６修飾したＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）（Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ  ＺＰ（登録商標））とのアジュバント効果の比較
【０２２４】
ＩＰ６修飾したＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）（Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標））のアジュバント効果を、メスのＢａｌｂ／Ｃマウス及び抗原として鶏卵リゾチームを用いた二つの異なるモデルにおいて、通常のＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）及びコントロールとしてフリー（非アジュバント化した）抗原とｉｎ  ｖｉｖｏで比較した。その試験はＭａｊｇａａｒｄ  Ｊｅｎｓｅｎ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．“Ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ａｌ（ＯＨ）3  ａｓ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔ”ＡＰＭＩＳ  ９６，２５７−２６４（１９９８）によって与えられた。
【０２２５】
モデル１
【０２２６】
モデル１において、Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ  ＺＰ（登録商標）の吸着容量とほぼ一致するＨＥＬの量を皮下注射した。この値は上記の図１より誘導されうる。それゆえ、Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ  ＺＰ（登録商標）及び通常のＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）の飽和を、二つのアジュバントについて、それぞれ、１．４及び０．５ｍｇのＨＥＬ／ｍｇ  Ａｌの吸着容量を観測した濃度である、１２５μＭの鶏卵リゾチーム濃度で成し遂げた。
【０２２７】
ｉｎ  ｖｉｖｏの試験において、アジュバントの二つの異なる用量を使用した：２５０μｇのＡｌ及び５００μｇのＡｌ。
【０２２８】
Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ  ＺＰ（登録商標）において１．４ｍｇのＨＥＬ／ｍｇ  Ａｌの吸着容量に基づき、以下のＨＥＬの量をモデル１のセットアップでは用いる必要がある：
・２５０μｇ用量について３５０μｇのＨＥＬ量を用いる（２５０μｇ×１．４）、及び
・５００μｇ用量について７００μｇのＨＥＬ量を用いる（５００μｇ×１．４）。
【０２２９】
これらの量、３５０μｇ及び７００μｇのＨＥＬを続く３種類の異なる方法において試験した：1)Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ  ＺＰ（登録商標）の吸着、2)通常のＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）の吸着、及び3)非アジュバント化、すなわち吸着していないものの使用。
【０２３０】
同様に、通常のＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）において０．５ｍｇ  ＨＥＬ／ｍｇ  Ａｌの吸着効率に基づき、以下のＨＥＬ量をモデル２のセットアップでは用いる必要がある：
・２５０μｇ用量について１２５μｇのＨＥＬ量を用いる（２５０μｇ×０．５）、及び
・５００μｇ用量について２５０μｇのＨＥＬ量を用いる（５００μｇ×０．５）
【０２３１】
モデル１の条件下では、使用されるＨＥＬ量は、Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ  ＺＰ（登録商標）の量によって十分に吸着させるだろうが、このアジュバントへのより低い吸着容量ために通常のＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）の量によっては部分的にのみ吸着させる。それゆえ、２５０μｇ用量について、通常のＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）を用いた場合、注射は（３５０−１２５）μｇ＝２２５μｇの未結合の抗原を含むだろう。５００μｇ用量について、Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）を用いた場合、（７００−２５０）μｇ＝４５０μｇの未結合の抗原があるだろう。コントロール群について、注射されたＨＥＬの全ては規定ごとに結合しないだろう。
【０２３２】
モデル２
【０２３３】
モデル２において、通常のＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）の吸着容量とほぼ一致するＨＥＬ量を皮下注射した。この飽和値を上記モデル１下で計算する。二つの異なる用量のアジュバントを再度用いた：２５０μｇ及び５００μｇ  Ａｌ、従って２５０μｇ用量について１２５μｇのＨＥＬ量（２５０μｇ×０．５）を用いて、５００μｇ用量について２５０μｇのＨＥＬ量（５００μｇ×０．５）を用いた。これらの量、１５０μｇ及び３００μｇのＨＥＬを再度三つの異なる方法において試験した：1)Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ  ＺＰ（登録商標）の吸着、2)通常のＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）の吸着、及び3)非アジュバント化、すなわち吸着していないものの使用。
【０２３４】
モデル２の条件下で用いられたＨＥＬ量は、Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ  ＺＰ（登録商標）の量によって十分に吸着し、そしてまた通常のＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）の量によって吸着した。しかしながら、Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ  ＺＰ（登録商標）の全容量はこれらの条件下では完全に利用されなかった。これは、Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ  ＺＰ（登録商標）の注射量がフリーな吸着容量を含むであろうことを意味し、それはＨＥＬの等量として示されうる。それゆえ、２５０μｇ用量について、Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ  ＺＰ（登録商標）の（３５０−１２５）μｇ＝２２５μｇのＨＥＬと等量のフリーな吸着容量があるだろう。５００μｇ用量について、Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ  ＺＰ（登録商標）の（７００−２５０）μｇ＝４５０μｇＨＥＬと等量のフリーな吸着容量があるだろう。コントロール群について、規定ごとにフリーな吸着容量はないだろう。
【０２３５】
試験：
【０２３６】
二つのモデル（１又は２）はそれぞれ３つの試験群を含み、それぞれ６〜８匹のメスのＢａｌｂ／Ｃマウスを含む。以下の量の抗原（「ＡＧ」）及びアジュバント（Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ  ＺＰ（登録商標）、並びに通常のＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）を意味する「ＡＰ」を含む２００μＬによって、皮内注射した：
【表１】
2021521089.tif 000009
【０２３７】
接種２１日後のマウスの終末出血（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ）後の抗ＨＥＬ抗体（Ａｂ＝ＩｇＧ）を上記のように、血清中の抗体をＥＬＩＳＡを用いて分析した。ＡＧ＋ＡＰよりもＡＧ＋ＺＰの組み合わせで高いＡｂ反応を観測した。また、モデル２について、同じ量の抗原を注射したにもかかわらず、ＡＧ＋ＡＰよりもＡＧ＋ＺＰの組み合わせでより高いＡｂ反応を観測し、モデル２のセットアップにおいてＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ  ＺＰ（登録商標）のフリーな吸着容量が類似の抗原容量に対して正の効果を有すると考えられることを示している。
【０２３８】
実施例１７  通常のリン酸カルシウム（ＣＡＰＯ）とＩＰ６修飾したリン酸カルシウム（ＩＰ６−ＣＡＰＯ）とのアジュバント効果の比較
【０２３９】
本試験を上記の実施例１５と同様に行った。ＩＰ６−ＣＡＰＯ及び通常のＣＡＰＯの飽和を成し遂げ（図３参照）、１７５μｇ  ＨＥＬ／ｍｇ  Ｃａ及び４０μｇ  ＨＥＬ／ｍｇ  Ｃａの吸着容量にそれぞれ到達した。飽和に対するこれらの値によって、以下の量の抗原（ＨＥＬ）を注射し、上記の実施例１５と類似的に計算できた。
【表２】
2021521089.tif 000010
【０２４０】
モデル１について：上記の量によって、ＣＡＰＯに未結合の抗原があるだろう。２５０μｇ用量で注射されたＣａの場合、これは合計（４４−１０）μｇ＝３４μｇの抗原量になるだろう。５００μｇ用量で注射されたＣａの場合、抗原の未結合の量は８８−２０＝６８μｇ抗原になるだろう。
【０２４１】
モデル２について：上記の量によって、ＩＰ６−ＣＡＰＯのフリーの用量があるだろう。２５０μｇ用量で注射されたＣａの場合、これは合計４４−１０＝３４μｇの抗原量になり、そして５００μｇ用量について注射したＣａの場合、これは合計８８−２０＝６８μｇ抗原量になるだろう。
【０２４２】
試験：
【０２４３】
２つのモデル（１又は２）のｉｎ  ｖｉｖｏ試験を上記の実施例１５として行った。
【０２４４】
各モデルは３つの試験群を含み、それぞれは６〜８匹のメスのＢａｌｂ／Ｃマウスを含む。以下の量の抗原（「ＡＧ」）及びアジュバント（ＩＰ６−ＣＡＰＯを「ＣＡＰＯ*」と示し、通常のリン酸カルシウムを「ＣＡＰＯ」と示した）を含む２００μＬによって、皮内注射した：
【表３】
2021521089.tif 000011
【０２４５】
接種２１日後のマウスの終末出血（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ）後の抗ＨＥＬ抗体（Ａｂ＝ＩｇＧ）を上記のように、血清中の抗体をＥＬＩＳＡを用いて分析した。ＡＧ＋ＣＡＰＯよりもＡＧ＋ＣＡＰＯ*の組み合わせで高いＡｂ反応を観測した。また、モデル２において、同じ量の抗原を注射したにもかかわらず、ＡＧ＋ＣＡＰＯよりもＡＧ＋ＣＡＰＯ*の組み合わせで高いＡｂ反応を観測し、モデル２のセットアップにおいてＩＰ６修飾したリン酸カルシウム（ＩＰ６−ＣＡＰＯ、ＣＡＰＯ*）のフリーな吸着容量が類似の抗原容量に対して正の効果を有すると考えられることを示している。
【図１】
2021521089.tif 000014
【図２】
2021521089.tif 000015
【図３】
2021521089.tif 000016
【図４】
2021521089.tif 000017
【図５】
2021521089.tif 000018
【図６Ａ】
2021521089.tif 000019
【図６Ｂ】
2021521089.tif 000020
【図６Ｃ】
2021521089.tif 000021
【図７】
2021521089.tif 000022
【図８】
2021521089.tif 000023
【図９】
2021521089.tif 000024
【図１０】
2021521089.tif 000025
【図１１】
2021521089.tif 000026
【図１２】
2021521089.tif 000027
【図１３】
2021521089.tif 000028
【図１４】
2021521089.tif 000029
【図１５】
2021521089.tif 000030
【図１６】
2021521089.tif 000031
【図１７】
2021521089.tif 000032
【図１８】
2021521089.tif 000033
【国際調査報告】
2021521089.tif 000034
2021521089.tif 000035