(57)【要約】  本発明は、以下の順序の構造を有する１つ以上のペプチドからなる化合物に関し：Ａ−Ｌ１−Ｂ−Ｌ２−Ｃ、ここでＡは、ヒトまたは動物ＩＬ−４またはＩＬ−１３のＡまたはＣアルファヘリックス領域から誘導される第１のアミノ酸配列に対応し、Ｂは、ヒトまたは動物ＩＬ−４またはＩＬ−１３のＡまたはＣアルファヘリックス領域から誘導される第２のアミノ酸配列に対応し、Ｃは、ヒトもしくは動物ＩＬ−４のＤもしくはＢアルファヘリックス領域、またはヒトもしくは動物ＩＬ−１３のＤアルファヘリックス領域から誘導される第３のアミノ酸配列に対応する。Ｌ１およびＬ２は１つ以上の連結アミノ酸に対応し、当該化合物は、神経細胞の軸索伸展を刺激することが可能である。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造からなる１つ以上のペプチドからなる化合物であって、
Ａ−Ｌ１−Ｂ−Ｌ２−Ｃ
式中、
Ａは、ヒトまたは動物ＩＬ−４またはＩＬ−１３のＡまたはＣアルファヘリックス領域から誘導された第１のアミノ酸配列に対応し、
Ｂは、ヒトまたは動物ＩＬ−４またはＩＬ−１３のＡまたはＣアルファヘリックス領域から誘導された第２のアミノ酸配列に対応し、
Ｃは、ヒトもしくは動物ＩＬ−４のＤもしくはＢアルファヘリックス領域、またはヒトもしくは動物ＩＬ−１３のＤアルファヘリックス領域から誘導される第３のアミノ酸配列に対応し、
Ｌ１およびＬ２は１つ以上の連結アミノ酸に対応する、化合物。
【請求項２】
Ａが、アミノ酸ＷＮＲ、ＲＡＲ、ＬＭＲ、ＬＩＲ、ＥＩＩＫＴ、またはＥＩＩＧに対応し、
Ｂが、アミノ酸ＥＩＩＫＴ、ＥＩＩＧＩ、ＥＬＩＥＥＬＶＮＩＴ、ＥＬＩＥＥＬＳＮＩＴ、ＲＬＤＲＮＬＷＧまたはＲＬＦＲＡＦＲＣに対応し、
Ｃが、アミノ酸ＫＴＩＭＲＥＫＹ、ＦＶＫＤＬＬＬＨＬＫＫ、ＲＡＡＴＶＬＲＱＦＹＳ、ＫＳＩＭＱＭＤＹ、ＦＩＴＫＬＩＳＹＴＫＱもしくはＲＡＳＫＶＬＲＩＦＹＬに対応するか、
または１つの位置で異なるアミノ酸を有するその変異体であり、前記ペプチドまたはその前記変異体は、神経細胞の軸索伸展を刺激することが可能である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ａが、アミノ酸ＷＮＲに対応し、
Ｂが、アミノ酸ＥＩＩＫＴに対応し、
Ｃが、アミノ酸ＫＴＩＭＲＥＫＹに対応するか、
または１つの位置で異なるアミノ酸を有するその変異体であり、前記ペプチドまたはその前記変異体は、神経細胞の軸索伸展を刺激することが可能である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ａが、アミノ酸ＬＭＲに対応し、
Ｂが、アミノ酸ＥＬＩＥＥＬＶＮＩＴに対応し、
Ｃが、アミノ酸ＦＶＫＤＬＬＬＨＬＫＫに対応するか、
または１つの位置で異なるアミノ酸を有するその変異体であり、前記ペプチドまたはその前記変異体は、神経細胞の軸索伸展を刺激することが可能である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ａが、アミノ酸ＥＩＩＫＴに対応し、
Ｂが、アミノ酸ＲＬＤＲＮＬＷＧに対応し、
Ｂが、アミノ酸ＲＡＡＴＶＬＲＱＦＹＳに対応するか、
または１つの位置で異なるアミノ酸を有するその変異体であり、前記ペプチドまたはその前記変異体は、神経細胞の軸索伸展を刺激することが可能である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｌ１および／またはＬ２が、Ｓ、ＧＳ、ＳＧＳ、Ｐ、ＧＰまたはＰＧＰに対応する、請求項１〜５のうちいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＷＮＲＳＥＩＩＫＴＧＳＫＴＩＭＲＥＫＹ（配列番号：１）を含むヒトＩＬ−４誘導体、または１つ以上の位置で異なるアミノ酸を有するその変異体であり、前記ペプチドまたはその前記変異体は、神経細胞の軸索伸展を刺激することが可能である、請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＬＭＲＳＥＬＩＥＥＬＶＮＩＴＧＳＦＶＫＤＬＬＬＨＬＫＫ（配列番号：２）を含むヒトＩＬ−１３誘導体、または１つ以上の位置で異なるアミノ酸を有するその変異体であり、前記ペプチドまたはその前記変異体は、神経細胞の軸索伸展を刺激することが可能である、請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＥＩＩＫＴＧＳＲＬＤＲＮＬＷＧＳＧＳＲＡＡＴＶＬＲＱＦＹＳ（配列番号：３）を含むヒトＩＬ−４誘導体、または１つ以上の位置で異なるアミノ酸を有するその変異体であり、前記ペプチドまたはその前記変異体は、神経細胞の軸索伸展を刺激することが可能である、請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＲＡＲＳＥＩＩＧＩＧＳＫＳＩＭＱＭＤＹ（配列番号：４）を含むマウスＩＬ−４誘導体、または１つ以上の位置で異なるアミノ酸を有するその変異体であり、前記ペプチドまたはその前記変異体は、神経細胞の軸索伸展を刺激することが可能である、請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＬＩＲＳＥＬＩＥＥＬＳＮＩＴＧＳＦＩＴＫＬＬＳＹＴＫＱ（配列番号：５）を含むマウスＩＬ−１３誘導体、または１つ以上の位置で異なるアミノ酸を有するその変異体であり、前記ペプチドまたはその前記変異体は、神経細胞の軸索伸展を刺激することが可能である、請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＥＩＩＧＩＧＰＲＬＦＲＡＦＲＣＳＧＳＲＡＳＫＶＬＲＩＦＹＬ（配列番号：６）を含むマウスＩＬ−４誘導体、または１つ以上の位置で異なるアミノ酸を有するその変異体であり、前記ペプチドまたはその前記変異体は、神経細胞の軸索伸展を刺激することが可能である、請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のうちいずれか一項に記載の化合物の少なくとも１つを含む医薬組成物、および医薬的に好適な担体、ビヒクルまたは薬品。
【請求項１４】
神経炎症または神経変性疾患の治療または予防で使用するための、請求項１〜１２のうちいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
神経障害または外傷性神経系損傷の治療または予防で使用するための、請求項１〜１２のうちいずれか一項に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトまたは動物インターロイキン−４（ＩＬ−４）またはインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）由来の新規ペプチド化合物および神経炎症性または神経変性疾患、神経障害または外傷性神経系損傷の治療または予防における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
進行しかつ蓄積される軸索病理は、特に神経変性疾患の進行期中における潜在的障害の主な特徴と考えられている（Ｖ．Ｓｉｆｆｒｉｎ，Ｈ．Ｒａｄｂｒｕｃｈ，Ｒ．Ｇｌｕｍｍ，Ｒ．Ｎｉｅｓｎｅｒ，Ｍ．Ｐａｔｅｒｋａ，Ｊ．Ｈｅｒｚ，Ｔ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｍ．Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｓ．Ｌｕｅｎｓｔｅｄｔ，Ｊ．Ｌ．Ｒｉｎｎｅｎｔｈａｌ，Ｇ．Ｌａｕｂｅ，Ｈ．Ｌｕｃｈｅ，Ｓ．Ｌｅｈｎｈａｒｄｔ，Ｈ．Ｊ．Ｆｅｈｌｉｎｇ，Ｏ．Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋ，Ｆ．Ｚｉｐｐ，“Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｔｈ１７  ｃｅｌｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ”，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１０，Ｖｏｌ．３３，ｐ．４２４−４３６；Ｉ．Ｎｉｋｉｃ，Ｄ．Ｍｅｒｋｌｅｒ，Ｃ．Ｓｏｒｂａｒａ，Ｍ．Ｂｒｉｎｋｏｅｔｔｅｒ，Ｍ．Ｋｒｅｕｔｚｆｅｌｄ，Ｆ．Ｍ．Ｂａｒｅｙｒｅ，Ｗ．Ｂｒｕｃｋ，Ｄ．Ｂｉｓｈｏｐ，Ｔ．Ｍｉｓｇｅｌｄ，Ｍ．Ｋｅｒｓｃｈｅｎｓｔｅｉｎｅｒ，“Ａ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ａｘｏｎ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ”，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２０１１，Ｖｏｌ．１７，ｐ．４９５−４９９）。炎症の攻撃を受けて、軸索膨張およびカルシウムの持続的アップレギュレーションは最終的にビーディングおよび変質となる。これらの炎症性神経細胞障害は少なくとも部分的に逆戻りする。現在まで、軸索コンパートメントはＭＳの治療戦略による対象に十分になっていない。（Ｃ．Ｌａｒｏｃｈｅｌｌｅ，Ｔ．Ｕｐｈａｕｓ，Ａ．Ｐｒａｔ，Ｆ．Ｚｉｐｐ，“Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ  ｏｒ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ？”，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１６，Ｖｏｌ．３９，ｐ．３２５−３３９；Ｒ．Ｊ．Ｍ．Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｃ．ｆｆｒｅｎｃｈ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｊ．Ｍ．Ｅｄｇａｒ，Ｋ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ，“Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ”，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｌ，２０１２，Ｖｏｌ．８，ｐ．６２４−６３４，Ｆ．Ｚｉｐｐ，Ｒ．Ｇｏｌｄ，Ｈ．Ｗｉｅｎｄｌ，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ｈｏｐｅ  ｆｏｒ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ？”，ＪＡＭＡ  Ｎｅｕｒｏｌ，２０１３，Ｖｏｌ．７０，ｐ．１５６９−１５７４）。
【０００３】
インターロイキン−４（ＩＬ−４）およびインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）は、代替活性化マクロファージおよびＴｈ２細胞分化の生成である、高親和性ＩｇＥ抗体の生成を刺激することによる細胞外寄生体に対する哺乳類の免疫反応において重複するが明確な役割を担う標準的な２型サイトカインである。ＩＬ−４は、中枢神経系（ＣＮＳ）における効果に関する抗炎症性サイトカインであるが、全身性のＩＬ−４は、過敏症、特に喘息において役割を果たしている。ＩＬ−４は外傷性ＣＮＳ傷害の神経細胞にいて有益作用を有すると報告されている（Ｊ．Ｔ．Ｗａｌｓｈ，Ｓ．Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｆ．Ｂｏａｔｏ，Ｉ．Ｓｍｉｒｎｏｖ，Ｊ．Ｚｈｅｎｇ，Ｊ．Ｒ．Ｌｕｋｅｎｓ，Ｓ．Ｇａｄａｎｉ，Ｄ．Ｈｅｃｈｌｅｒ，Ｇ．Ｇｏｌｚ，Ｋ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｔ．Ｋａｍｍｅｒｔｏｎｓ，Ｊ．Ｖｏｇｔ，Ｃ．Ｖｏｇｅｌａａｒ，Ｖ．Ｓｉｆｆｒｉｎ，Ａ．Ｒａｄｊａｖｉ，Ａ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃａｓｔａｎｅｄａ，Ａ．Ｇａｕｌｔｉｅｒ，Ｒ．Ｇｏｌｄ，Ｔ．Ｄ．Ｋａｎｎｅｇａｎｔｉ，Ｒ．Ｎｉｔｓｃｈ，Ｆ．Ｚｉｐｐ，Ｊ．Ｋｉｐｎｉｓ，“ＭＨＣＩＩ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｉｎｊｕｒｅｄ  ＣＮＳ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｖｉａ  ＩＬ−４”，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２０１５，Ｖｏｌ．１２５，ｐ．６９９−７１４）。実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）にて体系的に適用されたＩＬ−４の免疫調節機能、多発性硬化症（ＭＳ）のマウスモデル、および喘息モデルでの破壊的な役割が報告されている（Ｎ．Ｌ．Ｐａｙｎｅ，Ａ．Ｄａｎｔａｎａｒａｙａｎａ，Ｇ．Ｓｕｎ，Ｌ．Ｍｏｕｓｓａ，Ｓ．Ｃａｉｎｅ，Ｃ．ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｄ．Ｈｅｒｓｚｆｅｌｄ，Ｃ．Ｃ．Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｃ．Ｓｉａｔｓｋａｓ，“Ｅａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ”，Ｃｅｌｌ  Ａｄｈ．Ｍｉｇｒ．，２０１２，Ｖｏｌ．６，ｐ．１７９−１８９；Ｍ．Ｋ．Ｒａｃｋｅ，Ａ．Ｂｏｎｏｍｏ，Ｄ．Ｅ．Ｓｃｏｔｔ，Ｂ．Ｃａｎｎｅｌｌａ，Ａ．Ｌｅｖｉｎｅ，Ｃ．Ｓ．Ｒａｉｎｅ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｍ．Ｒｏｃｋｅｎ，“Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９４，Ｖｏｌ．１８０，ｐ．１９６１−１９６６；Ｊ．Ｉ．Ｉｎｏｂｅ，Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｈ．Ｌ．Ｗｅｉｎｅｒ，“Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−４  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｎｉｍａｌｓ  ｆｒｏｍ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ”，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９���，Ｖｏｌ．７７８，ｐ．３９０−３９２；Ｓ．Ｔ．Ｈｏｌｇａｔｅ，“Ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ” ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２０１２，Ｖｏｌ．１８，ｐ．６７３−６８３；Ｃ．Ｍ．Ｌｌｏｙｄ，Ｅ．Ｍ．Ｈｅｓｓｅｌ，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ：ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｊｕｓｔ  Ｔ（Ｈ）２  ｃｅｌｌｓ” ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１０，Ｖｏｌ．１０，ｐ．８３８−８４８）。
【０００４】
ＩＬ−４が免疫系におけるその効果によって潜在的に副作用を有することが知られている（Ｓ．Ｔ．Ｈｏｌｇａｔｅ，“Ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ” ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２０１２，Ｖｏｌ．１８，ｐ．６７３−６８３；Ｃ．Ｍ．Ｌｌｏｙｄ，Ｅ．Ｍ．Ｈｅｓｓｅｌ，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ：ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｊｕｓｔ  Ｔ（Ｈ）２  ｃｅｌｌｓ” ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１０，Ｖｏｌ．１０，ｐ．８３８−８４８）。さらに、ヒトへの臨床目的での大量の組み換えＩＬ−４を生産するには非常に高価である。さらに、ＩＬ−４の血漿中の半減期が非常に短い（（Ｓ．Ｇｅａ−Ｓｏｒｌｉ，ａｎｄ  Ｄ．Ｃｌｏｓａ，“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，ｒｅｖｅｒｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｃｕｔｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ”，ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９，Ｖｏｌ．１０，ｐ．４２；Ｍ．Ｋｈｏｄｏｕｎ，Ｃ．Ｃ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊ．Ｑ．Ｙａｎｇ，Ｔ．Ｏｒｅｋｏｖ，Ｃ．Ｐｏｔｔｅｒ，Ｔ．Ｗｙｎｎ，Ｍ．Ｍｅｎｔｉｎｋ−Ｋａｎｅ，Ｇ．Ｋ．Ｈｅｒｓｈｅｙ，Ｍ．Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ，ａｎｄ  Ｆ．Ｄ．Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ，“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｆｆｉｎｉｔｙ，ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ（ｓ）ＩＬ−４Ｒα  ａｎｄ  ｓｌＬ−１３Ｒａ２  ｓｕｇｇｅｓｔ  ｏｐｐｏｓｉｔｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ” ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７，Ｖｏｌ．１７９，ｐ．６４２９−６４３８）。したがって、大量に生産する際に費用効果のある方法で生産することができ、かつ組み換え全長ＩＬ−４よりも安定である化合物を所有することが望ましい。
【０００５】
ＩＬ−４およびＩＬ−１３のアミノ酸同一性が低い（２３％）一方で、ＩＬ−４ＲαおよびＩＬ−１３Ｒα１サブユニット（２型ＩＬ−４Ｒ）から構成される共通受容体に結合することができ、受容体鎖ＩＬ−４Ｒαに結合することが知られている唯一のサイトカインである。さらに、ＩＬ−４は、ＩＬ−４Ｒαおよび共通ｙ鎖で構成されるＩＬ−４Ｒ１型に結合することができる（Ｔ．Ｗａｎｇ，ａｎｄ  Ｃ．Ｊ．Ｓｅｃｏｍｂｅｓ，“Ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−４  ａｎｄ  ＩＬ−１３  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ”，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，２０１５，Ｖｏｌ．７５，ｐ．８−１３）。シグナル伝達について、ＩＬ−４およびＩＬ−１３の両方が同じ受容体サブユニットを必要とする（Ｔ．Ｄ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｌ．Ｚｈａｎｇ，Ｗ．Ｓｅｂａｌｄ，Ａ．Ｄｕｓｃｈｌ，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＩＬ−４／ＩＬ−１３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ”，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ａｃｔａ，２００２，Ｖｏｌ．１５９２，ｐ．２３７−２５０）。ＩＬ−４Ｒαは、官能性ヘテロ二量体受容体錯体両方の一部である。ＩＬ−４Ｒαは、シグナル伝達を、シグナル伝達分子の大きい細胞内ドメインに関連したシグナル伝達分子を介して組織する。ＩＬ−４およびＩＬ−１３は、逆並行並列螺旋αＡ、αＣ、αＢ、αＤおよび螺旋ＢおよびＤに対して詰まった短いβ−シートによって結合された２つの長いエンドツーエンドループ、ループＡＢおよびＣＤを特徴とする同一の二量体サブユニットアセンブリを有する。螺旋Ａ、ＡＢループ、螺旋ＢＣヘアピンおよびループＣＤプラス螺旋Ｄは４つの異なる軸索によってコードされる。複数の選択されたＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＬ−４／１３たんぱく質のａａ配列のアライメントは、概して４つのシステイン残留物が各たんぱく質に存在するが、システイン残留物のパターンは系統に特異的、すなわち哺乳類のＩＬ−４およびＩＬ−１３、硬骨魚類ＩＬ−４／１３、ならびに他の脊椎動物のＩＬ−４／１３であることを示している（Ｔ．Ｗａｎｇ，ａｎｄ  Ｃ．Ｊ．Ｓｅｃｏｍｂｅｓ，“Ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−４  ａｎｄ  ＩＬ−１３  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ”，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，２０１５，Ｖｏｌ．７５，ｐ．８−１３；Ｆ．Ｊ．Ｍｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１３  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏ，２００１，Ｖｏｌ．３１０，ｐ．２１９−２３０；Ｊ．Ｚｕｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１３  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｓｐａｔｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＩＬ−１３Ｒａｌｐｈａ／ＩＬ−４Ｒαｌｐｈａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ”，Ｉｍｍｕｎｏｉｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｅｉｉ  ｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，Ｖｏｌ．７９，ｐ．３３２−３３９）。
【０００６】
ＩＬ−４およびＩＬ−１３サイトカインは、左撚りの４αヘリックスバンドルによって支配されている（Ｍ．Ｌ．Ｗａｌｔｅｒ，Ｗ．Ｊ．Ｃｏｏｋ，Ｂ．Ｇ．Ｚｈａｏ，Ｒ．Ｐ．Ｃａｍｅｒｏｎ  Ｊｒ，Ｓ．Ｅ．Ｅａｌｉｃｋ，Ｒ．Ｌ．Ｗａｌｔｅｒ  Ｊｒ，Ｐ．Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，Ｔ．Ｌ．Ｎａｇａｂｈｕｓｈａｎ，Ｐ．Ｐ  Ｔｒｏｔｔａ，Ｃ．Ｅ．Ｂｕｇｇ，“Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４”，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９２，Ｖｏｌ．２６７，ｐ．２０３７１−６）。ＩＬ−１３の第二の構造の特徴はＩＬ−４のものと類似している。同様に、ＩＬ−１３は４αヘリックスバンドルを有する（Ｅ．Ｌ．Ｒａｅｌ，Ｒ．Ｆ．Ｌｏｃｋｅｙ，“Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１３  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ”，Ｗｏｒｌｄ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｏｒｇａｎ  Ｊ，２０１１，Ｖｏｌ．４，Ｖｏｌ．５４−６４）。
【０００７】
ＩＬ−４およびＩＬ−１３サイトカインの両者が共通のヘテロ二量体受容体を共有する。両者ともＴヘルパー１型炎症誘発性サイトカインをダウンレギュレートすることができる。神経保護または神経毒性効果の両方が、インターロイキン１３および４が、Ｍ２ミクログリア表現型を促進させ、ミクログリアＭ１表現型を死滅させることに貢献することによって、または神経炎症中の神経細胞上の酸化ストレスの効果を増強することによって、炎症を低減することができるという証拠に基づき提案されている。（Ｓ．Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｓ  １３  ａｎｄ  ４”，Ｂｒａｉｎ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１６，Ｖｏｌ．６，ｐ．１８）。
【０００８】
国際公開第２００６／０３６８７８号は、細胞のＩＬ−４、ＩＬ−９ＩＬ−１３への反応性を低減するまたは阻害するための、ＩＬ−９変異タンパク質に連結したインターロイキン−４変異タンパク質を含むキメラポリペプチドアンタゴニストを開示している。
【０００９】
免疫反応および神経炎症および神経変性疾患におけるＩＬ−４／ＩＬ−１３の役割を考慮すると、ＩＬ−４Ｒ１型および／または２型に結合することができ、かつ臨床症状を改善することができる薬剤を所有することが非常に望ましい。米国特許第５０１７６９１号明細書は、Ｂ−細胞およびＴ−細胞の成長におけるＩＬ−４の活性について試験される、ＩＬ−４ポリペプチドを記載している。天然ヒト並びにマウスのＩＬ−４たんぱく質並びにその変異タンパク質、および哺乳類のＩＬ−４並びにその変異タンパク質をコードするｃＤＮＡが記載される。しかしながら、これらのＬ−４ポリペプチドは、神経変性疾患の治療には歓迎されない、望まない免疫反応を引き起こす。
【００１０】
欧州特許出願公開第２３６５９８３号明細書では、慢性的な炎症反応および自己免疫性の疾患の変調のためのＩＬ−４−誘導ペプチドを記載している。ペプチドが最大３５個のＩＬ−４のαヘリックスから誘導される連続するアミノ酸を含み、各ペプチドはアミノ酸ＡＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＡ（配列番号：２７）である。
【００１１】
さらには、ＩＬ−４受容体（ＩＬ−４Ｒα）と相互作用するＩＬ−４のα−ヘリックスＣから誘導される、Ｐｈ８と呼ばれる新規の合成ペプチドが記載されており、Ｐｈ−結合ＩＬ−４Ｒαは、インビトロのマクロファージによってＴＮＦ−αの生成を阻害することによって抗炎症作用を模倣することがわかった。Ｐｈ８はＴｈ１／２細胞の増殖分化を阻害し、刺激したＴｈ１細胞の生成をダウンレギュレートする。Ｐｈ８は、一般的にさらなるＩＬ−４シグナリングに関連する副作用を誘発することなく、一般的なＴ−細胞の活性および炎症反応を誘発しないことが分かった（Ｂ．Ｋｌｅｍｅｎｔｉｅｖ，Ｍ．Ｎ．Ｅｎｅｖｏｌｄｓｅｎ，Ｓ．Ｌｉ，  Ｒ．Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｙ．Ｌｉｕ，Ｓ．ｓｓａｚａｄｅｈ−Ｎａｖｉｋａｓ，Ｅ．Ｂｏｃｋ，Ｖ．Ｂｅｒｅｚｉｎ，“Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４”，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，２０１３，Ｖｏｌ．６４，ｐ．１１２−１２１）。しかしながら、Ｐｈ８ペプチドは、ペプチドがリンパ球および骨髄由来マクロファージに対する作用があるため神経保護または神経再生の目的には適していない。
【００１２】
発明者らは驚くことにＩＬ−４は、多発性硬化症（ＭＳ）のマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）に供されたマウスの臨床症状を、病気の慢性期中に髄腔内に適用した場合に改善することができることを発見した。ＩＬ−４および本発明のＩＬ−４の誘導体の作用は、改善された軸索形態および増加した再生発芽を伴っていた。インビトロモデルを使用して、ＩＬ−４が阻害基質の神経保護、軸索再生および成長への役割を果たしていることが観察されている。特に、神経特異的ＩＬ−４受容体（ＩＬ−４Ｒ）ノックアウトマウスにてＩＬ−４作用が消滅することが発見された。早い直接的なＩＬ−４Ｒシグナル経路が特定されている。さらには、鼻腔内塗布ＩＬ−４がおなじ程度に有効であり、神経細胞の治療のためのより臨床的に適切な投薬ルートとなる（Ｃ．Ｆ．Ｖｏｇｅｌａａｒ，Ｓ．Ｍａｎｄａｌ，Ｓ．Ｌｅｒｃｈ，Ｋ．Ｂｉｒｋｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｒｋｅｎｓｔｏｃｋ，Ｕ．ＢＧｈｌｅｒ，Ａ．Ｓｃｈｎａｔｚ，Ｃ．Ｓ．Ｒａｉｎｅ，Ｓ．Ｂｉｔｔｎｅｒ，Ｊ．Ｖｏｇｔ，Ｊ．Ｋｉｐｎｉｓ，Ｒ．Ｎｉｔｓｃｈ，Ｆ．Ｚｉｐｐ，“Ｆａｓｔ  ｄｉｒｅｃｔ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ＩＬ−４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ”，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，２０１８，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｏ２３０４）。
【００１３】
外傷性傷害における神経保護の役割および特定された神経細胞のシグナル経路と併せたＩＬ−４の神経炎症における役割は、ＩＬ−４およびそのＩＬ−４誘導体並びにＩＬ−１３誘導体が、神経炎症および神経変性の治療または予防、特に多発性硬化症（ＭＳ）の治療または予防に好適であることを示唆している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２００６／０３６８７８号
【特許文献２】米国特許第５０１７６９１号明細書
【特許文献３】欧州特許出願公開第２３６５９８３号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｖ．Ｓｉｆｆｒｉｎ，Ｈ．Ｒａｄｂｒｕｃｈ，Ｒ．Ｇｌｕｍｍ，Ｒ．Ｎｉｅｓｎｅｒ，Ｍ．Ｐａｔｅｒｋａ，Ｊ．Ｈｅｒｚ，Ｔ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｍ．Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｓ．Ｌｕｅｎｓｔｅｄｔ，Ｊ．Ｌ．Ｒｉｎｎｅｎｔｈａｌ，Ｇ．Ｌａｕｂｅ，Ｈ．Ｌｕｃｈｅ，Ｓ．Ｌｅｈｎｈａｒｄｔ，Ｈ．Ｊ．Ｆｅｈｌｉｎｇ，Ｏ．Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋ，Ｆ．Ｚｉｐｐ，“Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｔｈ１７  ｃｅｌｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ”，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１０，Ｖｏｌ．３３，ｐ．４２４−４３６
【非特許文献２】Ｉ．Ｎｉｋｉｃ，Ｄ．Ｍｅｒｋｌｅｒ，Ｃ．Ｓｏｒｂａｒａ，Ｍ．Ｂｒｉｎｋｏｅｔｔｅｒ，Ｍ．Ｋｒｅｕｔｚｆｅｌｄ，Ｆ．Ｍ．Ｂａｒｅｙｒｅ，Ｗ．Ｂｒｕｃｋ，Ｄ．Ｂｉｓｈｏｐ，Ｔ．Ｍｉｓｇｅｌｄ，Ｍ．Ｋｅｒｓｃｈｅｎｓｔｅｉｎｅｒ，“Ａ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ａｘｏｎ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ”，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２０１１，Ｖｏｌ．１７，ｐ．４９５−４９９
【非特許文献３】Ｃ．Ｌａｒｏｃｈｅｌｌｅ，Ｔ．Ｕｐｈａｕｓ，Ａ．Ｐｒａｔ，Ｆ．Ｚｉｐｐ，“Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ  ｏｒ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ？”，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１６，Ｖｏｌ．３９，ｐ．３２５−３３９
【非特許文献４】Ｒ．Ｊ．Ｍ．Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｃ．ｆｆｒｅｎｃｈ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｊ．Ｍ．Ｅｄｇａｒ，Ｋ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ，“Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ”，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｌ，２０１２，Ｖｏｌ．８，ｐ．６２４−６３４
【非特許文献５】Ｆ．Ｚｉｐｐ，Ｒ．Ｇｏｌｄ，Ｈ．Ｗｉｅｎｄｌ，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ｈｏｐｅ  ｆｏｒ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ？”，ＪＡＭＡ  Ｎｅｕｒｏｌ，２０１３，Ｖｏｌ．７０，ｐ．１５６９−１５７４
【非特許文献６】Ｊ．Ｔ．Ｗａｌｓｈ，Ｓ．Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｆ．Ｂｏａｔｏ，Ｉ．Ｓｍｉｒｎｏｖ，Ｊ．Ｚｈｅｎｇ，Ｊ．Ｒ．Ｌｕｋｅｎｓ，Ｓ．Ｇａｄａｎｉ，Ｄ．Ｈｅｃｈｌｅｒ，Ｇ．Ｇｏｌｚ，Ｋ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｔ．Ｋａｍｍｅｒｔｏｎｓ，Ｊ．Ｖｏｇｔ，Ｃ．Ｖｏｇｅｌａａｒ，Ｖ．Ｓｉｆｆｒｉｎ，Ａ．Ｒａｄｊａｖｉ，Ａ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃａｓｔａｎｅｄａ，Ａ．Ｇａｕｌｔｉｅｒ，Ｒ．Ｇｏｌｄ，Ｔ．Ｄ．Ｋａｎｎｅｇａｎｔｉ，Ｒ．Ｎｉｔｓｃｈ，Ｆ．Ｚｉｐｐ，Ｊ．Ｋｉｐｎｉｓ，“ＭＨＣＩＩ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｉｎｊｕｒｅｄ  ＣＮＳ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｖｉａ  ＩＬ−４”，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２０１５，Ｖｏｌ．１２５，ｐ．６９９−７１４
【非特許文献７】Ｎ．Ｌ．Ｐａｙｎｅ，Ａ．Ｄａｎｔａｎａｒａｙａｎａ，Ｇ．Ｓｕｎ，Ｌ．Ｍｏｕｓｓａ，Ｓ．Ｃａｉｎｅ，Ｃ．ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｄ．Ｈｅｒｓｚｆｅｌｄ，Ｃ．Ｃ．Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｃ．Ｓｉａｔｓｋａｓ，“Ｅａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ”，Ｃｅｌｌ  Ａｄｈ．Ｍｉｇｒ．，２０１２，Ｖｏｌ．６，ｐ．１７９−１８９
【非特許文献８】Ｍ．Ｋ．Ｒａｃｋｅ，Ａ．Ｂｏｎｏｍｏ，Ｄ．Ｅ．Ｓｃｏｔｔ，Ｂ．Ｃａｎｎｅｌｌａ，Ａ．Ｌｅｖｉｎｅ，Ｃ．Ｓ．Ｒａｉｎｅ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｍ．Ｒｏｃｋｅｎ，“Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９４，Ｖｏｌ．１８０，ｐ．１９６１−１９６６
【非特許文献９】Ｊ．Ｉ．Ｉｎｏｂｅ，Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｈ．Ｌ．Ｗｅｉｎｅｒ，“Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−４  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｎｉｍａｌｓ  ｆｒｏｍ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ”，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９６，Ｖｏｌ．７７８，ｐ．３９０−３９２
【非特許文献１０】Ｓ．Ｔ．Ｈｏｌｇａｔｅ，“Ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ” ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２０１２，Ｖｏｌ．１８，ｐ．６７３−６８３
【非特許文献１１】Ｃ．Ｍ．Ｌｌｏｙｄ，Ｅ．Ｍ．Ｈｅｓｓｅｌ，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ：ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｊｕｓｔ  Ｔ（Ｈ）２  ｃｅｌｌｓ” ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１０，Ｖｏｌ．１０，ｐ．８３８−８４８
【非特許文献１２】Ｓ．Ｇｅａ−Ｓｏｒｌｉ，ａｎｄ  Ｄ．Ｃｌｏｓａ，“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，ｒｅｖｅｒｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｃｕｔｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ”，ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９，Ｖｏｌ．１０，ｐ．４２
【非特許文献１３】Ｍ．Ｋｈｏｄｏｕｎ，Ｃ．Ｃ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊ．Ｑ．Ｙａｎｇ，Ｔ．Ｏｒｅｋｏｖ，Ｃ．Ｐｏｔｔｅｒ，Ｔ．Ｗｙｎｎ，Ｍ．Ｍｅｎｔｉｎｋ−Ｋａｎｅ，Ｇ．Ｋ．Ｈｅｒｓｈｅｙ，Ｍ．Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ，ａｎｄ  Ｆ．Ｄ．Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ，“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｆｆｉｎｉｔｙ，ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ（ｓ）ＩＬ−４Ｒα  ａｎｄ  ｓｌＬ−１３Ｒａ２  ｓｕｇｇｅｓｔ  ｏｐｐｏｓｉｔｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ” ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７，Ｖｏｌ．１７９，ｐ．６４２９−６４３８
【非特許文献１４】Ｔ．Ｗａｎｇ，ａｎｄ  Ｃ．Ｊ．Ｓｅｃｏｍｂｅｓ，“Ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−４  ａｎｄ  ＩＬ−１３  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ”，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，２０１５，Ｖｏｌ．７５，ｐ．８−１３
【非特許文献１５】Ｔ．Ｄ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｌ．Ｚｈａｎｇ，Ｗ．Ｓｅｂａｌｄ，Ａ．Ｄｕｓｃｈｌ，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＩＬ−４／ＩＬ−１３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ”，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ａｃｔａ，２００２，Ｖｏｌ．１５９２，ｐ．２３７−２５０
【非特許文献１６】Ｆ．Ｊ．Ｍｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１３  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏ，２００１，Ｖｏｌ．３１０，ｐ．２１９−２３０
【非特許文献１７】Ｊ．Ｚｕｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１３  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｓｐａｔｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＩＬ−１３Ｒａｌｐｈａ／ＩＬ−４Ｒαｌｐｈａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ”，Ｉｍｍｕｎｏｉｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｅｉｉ  ｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，Ｖｏｌ．７９，ｐ．３３２−３３９
【非特許文献１８】Ｍ．Ｌ．Ｗａｌｔｅｒ，Ｗ．Ｊ．Ｃｏｏｋ，Ｂ．Ｇ．Ｚｈａｏ，Ｒ．Ｐ．Ｃａｍｅｒｏｎ  Ｊｒ，Ｓ．Ｅ．Ｅａｌｉｃｋ，Ｒ．Ｌ．Ｗａｌｔｅｒ  Ｊｒ，Ｐ．Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，Ｔ．Ｌ．Ｎａｇａｂｈｕｓｈａｎ，Ｐ．Ｐ  Ｔｒｏｔｔａ，Ｃ．Ｅ．Ｂｕｇｇ，“Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４”，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９２，Ｖｏｌ．２６７，ｐ．２０３７１−６
【非特許文献１９】Ｅ．Ｌ．Ｒａｅｌ，Ｒ．Ｆ．Ｌｏｃｋｅｙ，“Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１３  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ”，Ｗｏｒｌｄ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｏｒｇａｎ  Ｊ，２０１１，Ｖｏｌ．４，Ｖｏｌ．５４−６４
【非特許文献２０】Ｓ．Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｓ  １３  ａｎｄ  ４”，Ｂｒａｉｎ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１６，Ｖｏｌ．６，ｐ．１８
【非特許文献２１】Ｂ．Ｋｌｅｍｅｎｔｉｅｖ，Ｍ．Ｎ．Ｅｎｅｖｏｌｄｓｅｎ，Ｓ．Ｌｉ，  Ｒ．Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｙ．Ｌｉｕ，Ｓ．ｓｓａｚａｄｅｈ−Ｎａｖｉｋａｓ，Ｅ．Ｂｏｃｋ，Ｖ．Ｂｅｒｅｚｉｎ，“Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４”，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，２０１３，Ｖｏｌ．６４，ｐ．１１２−１２１
【非特許文献２２】Ｃ．Ｆ．Ｖｏｇｅｌａａｒ，Ｓ．Ｍａｎｄａｌ，Ｓ．Ｌｅｒｃｈ，Ｋ．Ｂｉｒｋｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｒｋｅｎｓｔｏｃｋ，Ｕ．ＢＧｈｌｅｒ，Ａ．Ｓｃｈｎａｔｚ，Ｃ．Ｓ．Ｒａｉｎｅ，Ｓ．Ｂｉｔｔｎｅｒ，Ｊ．Ｖｏｇｔ，Ｊ．Ｋｉｐｎｉｓ，Ｒ．Ｎｉｔｓｃｈ，Ｆ．Ｚｉｐｐ，“Ｆａｓｔ  ｄｉｒｅｃｔ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ＩＬ−４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ”，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，２０１８，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｏ２３０４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
この背景に反し、神経細胞に有効的作用し、リンパ球、または骨髄由来マクロファージに副作用が無く、神経細胞の疾患の予防または治療に好適である代替的化合物を提供するのが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本目的は、特許請求される化合物および神経炎症、または神経変性疾患、神経障害もしくは外傷性神経系損傷の予防または治療におけるその使用によって解決される。本発明の好ましい実施形態は従属請求項にて特許請求される。
【００１８】
特許請求される本化合物は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３のそれぞれの全長たんぱく質から誘導される。これはＩＬ−４およびＩＬ−１３のアルファヘリックス領域の一部のみがそれぞれ本発明のＩＬ−４誘導体、またはＩＬ−１３誘導体をそれぞれ構成することを意味する。
【００１９】
ＩＬ−４およびＩＬ−１３の二次構造的特徴の構造的類似性が高く、両者のサイトカインが４つのα−ヘリックス束を含んでいることから、本発明書においてαＡ，αＤ，αＣ，αＤの文字で示され、重要なアミノ酸は、ＩＬ−４およびＩＬ−１３のαＡ〜αＤアルファヘリックス領域からそれぞれ誘導されることが本発明の化合物で共通している。
【００２０】
本発明の文脈において使用される「ＩＬ−４誘導体」という用語は、化合物を示し、好ましくは、天然ＩＬ−４に基づくペプチド化合物である。好ましくは、本発明のＩＬ−４誘導体は、関連するＩＬ−４のαＡ〜αＤアルファヘリックス結合領域から少なくとも３つの選択されたドメインと同一または類似性が高いアミノ酸配列および／または構造を有する。
【００２１】
本発明の文脈において使用される「ＩＬ−１３誘導体」という用語は、化合物を示し、好ましくは、天然ＩＬ−１３に基づくペプチド化合物である。好ましくは、本発明のＩＬ−１３誘導体は、関連するＩＬ−１３のαＡ〜αＤアルファヘリックス結合領域から少なくとも３つの選択されたドメインと同一または類似性が高いアミノ酸配列および／または構造を有する。
【００２２】
本発明の文脈において使用される「αＡ・・・αＤアルファヘリックス領域から誘導される」という用語は、ＩＬ−４、またはＩＬ−１３のαＡ・・・αＤアルファヘリックス結合領域の一部であるアミノ酸配列を示す。
【００２３】
本発明の化合物は、以下の順番の一般構造からなるＩＬ−４、またはＩＬ−１３のαＡ〜αＤアルファヘリックス領域から誘導される１つ以上のペプチドからなる：
Ａ−Ｌ１−Ｂ−Ｌ２−Ｃ
式中、
Ａは、ヒトまたは動物ＩＬ−４またはＩＬ−１３のαＡまたはαＣアルファヘリックス領域から誘導される第１のアミノ酸配列に対応し、
Ｂは、ヒトまたは動物ＩＬ−４またはＩＬ−１３のαＡまたはαＣアルファヘリックス領域から誘導される第２のアミノ酸配列に対応し、
Ｃは、ヒトもしくは動物ＩＬ−４のαＤもしくはαＢアルファヘリックス領域、またはヒトもしくは動物ＩＬ−１３のαＤアルファヘリックス領域から誘導される第３のアミノ酸配列に対応する。
Ｌ１およびＬ２は１つ以上の連結アミノ酸に対応する。
【００２４】
本発明の化合物は、好ましくは、神経細胞の軸索伸展を刺激することが可能である。
【００２５】
「アルファ−ヘリックス」（α−ヘリックス）という用語は、ペプチドの二次構造における共通モチーフを示す。α−ヘリックスは、右巻きまたは左巻きの螺旋状の構造であり得、各骨格Ｎ−Ｈ基は、４残基離れたアミノ酸の骨格Ｃ＝０基に結合する水素を供与する。
【００２６】
従って、ＩＬ−４またはＩＬ−１３のαＡ〜αＤアルファヘリックス領域の１つ以上のアミノ酸配列が、本発明のペプチドのＡ、ＢおよびＣの部を形成するのに選択され得る。好ましくは、選択されたアミノ酸は、対応するヒトもしくは動物ＩＬ−４もしくはＩＬ−１３または与えられたアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸が削除、追加、置換または改変されたその変異体のα−ヘリックス領域で見られる連続するアミノ酸である。好適な本発明のペプチドは、ＩＬ−４のαＡ−αＣ−αＤヘリックス領域から誘導され、示される通りに互いに連結しているアミノ酸配列を含む。代替的な好適な本発明のペプチドは、ＩＬ−４またはＩＬ−１３のαＣ−αＡ−αＤヘリックス領域から誘導され、示される通りに互いに連結しているアミノ酸配列から構成される。
【００２７】
ペプチド残留物Ａ、ＢまたはＣ中の１つ以上のアミノ酸は修飾または非修飾の代替的アミノ酸によって変化すること、または結合能力および／または生物活性を大きく変えることなく１つ以上のアミノ酸により置換することができることは明らかである。従って、上記の構造を有するが、１つ以上の位置に異なるアミノ酸を有し、神経細胞の軸索伸展を刺激することが可能であるあらゆるペプチドまたはその変異体が、本発明に包含される。本明細書で定義される神経細胞の軸索伸展は皮質の成長アッセイ、または本明細書に記載されるＨ９細胞の成長アッセイによって測定することができる。
【００２８】
本発明の文脈において、アミノ酸残留物の標準１文字コードおよび標準３文字コードが適用される。アミノ酸の略語は、生化学命名法Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８４，ｖｏｌ．１８４，ｐｐ９−３７に記載されるＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  にて推奨されるものに従っている。明細書および特許請求の範囲全体を通じて、天然アミノ酸の３文字コードまたは１文字コードのいずれかが使用される。Ｌ体またはＤ体の明示がされていない場合、論議されているアミノ酸は天然Ｌ体（Ｐｕｒｅ＆Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．（５６（５）ｐｐ５９５−６２４（１９８４）参照））、またはＤ体を有していると理解される。そのため、形成されたペプチドは、Ｌ体、Ｄ体またはＬ体とＤ体との混合の配列から構成され得る。
【００２９】
ペプチドのＣ−末端アミノ酸は通常遊離カルボン酸として存在しており、「−ＯＨ」としても示される。しかしながら本発明による使用するためのペプチドのＣ末端アミノ酸はアミド化誘導体でもあり得、「−ＮＨ−２」として示される。特に記載のない場合、ポリペプチドのＮ−末端アミノ酸は、遊離アミノ基を含み、時に「Ｈ−」とも示される。本発明によるペプチド、その断片または変異体は、また１つまたは複数の非天然または修飾天然アミノ酸を含むことができる。
【００３０】
本発明の好ましい化合物は、ＩＬ−４誘導体、またはＩＬ−１３誘導体であるペプチドであり、当該ペプチドは、双対鎖ＩＬ−１３Ｒａ１または共通ｙ鎖に結合するために必要なアミノ酸と合わさったＩＬ−４Ｒαに結合するために必要であるα−ヘリックスαＡ、αＢ、αＣおよびαＤ内にアミノ酸を含むことによって特にＩＬ−４受容体１型および２型に特異的に結合することができる。
【００３１】
本発明の化合物を得るために、本発明者らは最も重要な受容体結合アミノ酸を結合し、共受容体鎖をお互いに連結させた。アミノ酸伸長物は、そのＩＬ−４Ｒα鎖およびＩＬ−１３Ｒａ１または共通ｙ鎖のどちらかへの結合に基づいて選択され、それによって鎖を連結しＩＬ−４Ｒ１型または２型のどちらかを形成する。全ての化合物は同じ原理の受容体鎖連結に基づいており、全てのＩＬ−４およびＩＬ−１３誘導体は同様の機構を有する。ヒトまたは動物ＩＬ−４またはＩＬ−１３のαＡ、αＢ、αＣａＤヘリックス領域から誘導された選択されたアミノ酸は、本発明の化合物をＩＬ−４ＲαまたはＩＬ−１３Ｒαに結合するために必要となる最も必須なアミノ酸である。
【００３２】
本発明は、共に修飾または非修飾の形態であるペプチド、またはポリペプチドを包含し、哺乳類の（例えばヒト、またはマウス）ＩＬ−４、またはＩＬ−１３の１つ以上のαＡ、αＢ、αＣ、αＤヘリックス領域の哺乳類のアミノ酸配列の一部であるが、哺乳類のＩＬ−４、またはＩＬ−１３の全長αＡ、αＢ、αＣ、αＤヘリックス領域は除く。本発明の化合物は１つ以上の前記ペプチドを含むことができ、任意選択的に構造的中性アミノ酸によって架橋される。特に、本発明は、哺乳動物におけるＩＬ−４、またはＩＬ−１３のαＡ、αＢ、αＣ、αＤヘリックス領域内にみることができるアミノ酸伸長物の組合せを包含し、これはＩＬ−４ＲαおよびＩＬ−１３Ｒα１、または共通ｙ鎖に結合するために必要なものである。本発明は、本明細書においてヒトおよびマウスのＩＬ−４およびＩＬ−１３を使用して例証しているが、本発明は、ＩＬ−４／ＩＬ−４ＲαおよびＩＬ−１３／ＩＬ−１３Ｒα相互作用の同じ原理が適用される、他の種に見ることができる同族のアミノ酸およびアミノ酸伸長物もまた包含している。
【００３３】
神経細胞の軸索伸展を刺激する能力は、例えば本明細書に記載される皮質の成長アッセイ、またはヒトＨ９細胞の成長アッセイによって過度の負担なく、容易に測定することができる。
【００３４】
本発明で示されるように、他の種からのαＡ〜αＤアルファヘリックスもまた互いに組み合わせることができ、本発明の誘導体は複数の種に渡って使用することができる。例えば、αＡ〜αＤアルファヘリックスで発生するアミノ酸は、全長ＩＬ−４、またはＩＬ−１３の同族関係よりも高次に種のなかで保たれる。本明細書に記載される、αＡ〜αＤアルファヘリックスに関する構造的特徴は、神経細胞上で確実に活発となるのに十分なものである。
【００３５】
好ましくは、αＡ、αＢ、αＣおよびαＤヘリックス領域のアミノ酸配列は、哺乳類のＩＬ−４から誘導される。４つのαＡ〜αＤアルファヘリックスを含包するヒトおよびマウスのＩＬ−４のアミノ酸配列が図１Ａに示される。代替的実施形態において、本発明のペプチドは、哺乳類のＩＬ−１３の選択されたαＡ、αＢ、αＣおよびαＤヘリックス領域から誘導される。４つのａＡ〜ａＤアルファヘリックスを含包するヒトおよびマウスのＩＬ−１３のアミノ酸配列が図１Ｄに示される。
【００３６】
本発明の化合物を生成するための異なるヘリックスセクションの構成が示される。Ａ−Ｌ１−Ｂ−Ｌ２−Ｃである本発明のＩＬ−４またはＩＬ−１３誘導ペプチドの一般構造を考慮すると、Ａは、ＩＬ−４、またはＩＬ−１３のαＣヘリックスに対応していることが望ましく、その次にＩＬ−４、またはＩＬ−１３のαＡヘリックスの選択されたアミノ酸配列に結合する第１のリンカー配列、その次にＩＬ−４、またはＩＬ−１３のαＤヘリックスから誘導される選択されたアミノ酸配列に結合する第２のリンカー配列が続く。リンカー配列は本発明のペプチドの３−Ｄ構造において必要である。
【００３７】
代替的実施形態において、Ａは、ＩＬ−４のαＡヘリックスから誘導される選択されたアミノ酸に対応し、その次にＩＬ−４のαＣヘリックスの選択されたアミノ酸配列に結合される第１のリンカー配列、その次にＩＬ−４のαＢヘリックスの選択されたアミノ酸配列に結合される第２のリンカー配列が続く。好ましくは、１つ以上の、好ましくは、αＡ，αＢ，αＣおよびαＤヘリックス領域に伸長する少なくとも３つのアミノ酸から誘導された選択されたアミノ酸は、好ましくは、ヒトまたは他の哺乳類の種のＩＬ−４またはＩＬ−１３である選択された種の前記領域に見つけることができる連続するアミノ酸である。
【００３８】
本発明の好ましい化合物はペプチドであって、
Ａが、アミノ酸ＷＮＲ（配列番号：７）、ＲＡＲ（配列番号：８）、ＬＭＲ（配列番号：９）、ＬＩＲ（配列番号：１０）、ＥＩＩＫＴ（配列番号：１１）、またはＥＩＩＧＩ（配列番号：１２）に対応し、
Ｂが、アミノ酸ＥＩＩＫＴ（配列番号：１１）、ＥＩＩＧＩ（配列番号：１２）、ＥＬＩＥＥＬＶＮＩＴ（配列番号：１３）、ＥＬＩＥＥＬＳＮＩＴ（配列番号：１４）、ＲＬＤＲＮＬＷＧ（配列番号：１５）、またはＲＬＦＲＡＦＲＣ（配列番号：１６）に対応し、
Ｃが、アミノ酸ＫＴＩＭＲＥＫＹ（配列番号：１７）、ＦＶＫＤＬＬＬＨＬＫＫ（配列番号：１８）、ＲＡＡＴＶＬＲＱＦＹＳ（配列番号：１９）、ＫＳＩＭＱＭＤＹ（配列番号：２０）、ＦＩＴＫＬＩＳＹＴＫＱ（配列番号：２１）、またはＲＡＳＫＶＬＲＩＦＹＬ（配列番号：２２）に対応するペプチドまたは１つの位置において異なるアミノ酸を有するその変異体であり、当該ペプチドまたはその変異体は神経細胞の軸索伸展を刺激することができる。
【００３９】
本発明による変異体は、αＡ、αＢ、αＣおよびαＤヘリックス領域の選択された配列と少なくとも７０％のポジティブアミノ酸一致、７１〜８０％のポジティブアミノ酸一致、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％ポジティブアミノ酸一致、例えば、αＡ、αＢ、αＣおよびαＤヘリックス領域の選択された配列と９１〜９９％のポジティブアミノ酸一致を有するアミノ酸配列を含み得る。ポジティブアミノ酸一致は、２つの比較された同一の物理的、生物学的および／または化学的特性を有するアミノ酸残留物の配列にて同ジ位置に存在することと定義される。置換として使用することのできる好適なポジティブアミノ酸一致は、ＫからＲ、ＥからＤ、ＬからＭ、ＱからＥ、ＩからＶ、ＩからＬ、ＡからＳ、ＹからＷ、ＫからＱ、ＳからＴ、ＮからＳおよびＱからＲである。本発明のペプチド、または変異体は、本明細書に記載される軸索伸展アッセイによって測定することのできる軸索伸展する能力を有することが必要である。
【００４０】
本発明によるペプチドまたは変異体は、ホスホリル、硫黄、アセチルまたはグリコシル部分など他の化学部分も含み得る。従って、示されたペプチド配列は、例えば、１つ以上のアミノ酸残留物の追加、削除、置換または化学修飾によって修飾され得る。そのような修飾には、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸の両方が使用され得る。可能な化学修飾には糖類または例えば、メチル、またはアセチルエステルエステルなどの誘導体またはポリエチレングリコール修飾を含み得る。さらに、ペプチドのアミン基は、脂肪酸を含むアミドに転化され得る。本発明のペプチドまたは変異体はまた、ビオチンのＣ末端でビオチンによって、またはＨｉｓタグのＮ末端でＨｉｓタグによっても修飾することがでる。
【００４１】
本発明によると、アミノ酸配列の変異体は、お互いに独立している、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含み得、ここで、（ｉ）前記変異体の少なくとも１つのグリシン（Ｇｌｙ）は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕおよびｌｉｅからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸と置換される、
（ｉｉ）前記変異体の少なくとも１つのアラニン（Ａｌａ）は、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸と置換される、
（ｉｉｉ）前記変異体の少なくとも１つのバリン（Ｖａｌ）は、Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｌｅｕおよびｌｉｅからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸と置換される、
（ｉｖ）前記変異体の少なくとも１つのロイシン（Ｌｅｕ）は、Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌおよびｌｉｅからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸と置換される、
（ｖ）前記変異体の少なくとも１つのイソロイシン（ｌｉｅ）は、Ｇｌｙ，Ａｌａ，ＶａｌおよびＬｅｕからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸と置換される、
（ｖｉ）前記変異体の少なくとも１つのアスパラギン酸（Ａｓｐ）は、Ｇｌｕ、ＡｓｎおよびＧｉｎからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸と置換される、
（ｖｉｉ）前記変異体の少なくとも１つのアスパラギン（Ａｓｎ）は、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＧｉｎからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸と置換される、
（ｖｉｉｉ）前記変異体の少なくとも１つのグルタミン（Ｇｉｎ）は、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＡｓｎからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸と置換される、
（ｉｘ）前記変異体の少なくとも１つのフェニルアラニン（Ｐｈｅ）は、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸、好ましくは、ＴｙｒおよびＴｒｐからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸と置換される、
（ｉｘ）前記変異体の少なくとも１つのチロシン（Ｔｙｒ）は、Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，Ｈｉｓ，Ｐｒｏからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸、好ましくは、ＰｈｅおよびＴｒｐからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸と置換される、
（ｘｉ）前記変異体の少なくとも１つのアルギニン（Ａｒｇ）は、ＬｙｓおよびＨｉｓからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸と置換される、
（ｘｉｉ）前記変異体の少なくとも１つのリジン（Ｌｙｓ）は、ＡｒｇおよびＨｉｓからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸と置換される、
（ｘｉｉｉ）前記変異体の少なくとも１つのプロリン（Ｐｒｏ）は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸と置換される、
（ｘｉｖ）前記変異体の少なくとも１つのシステイン（Ｃｙｓ）は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸と置換される。
【００４２】
上記に従って、ペプチドの同じ変異体、またはその断片は、本明細書の上述で定義される１つ超の保存的アミノ酸類から１つ超の保存的、または相同アミノ酸置換を含む。
【００４３】
保存的アミノ酸置換は、本発明のペプチドまたは変異体の任意の位置に導入され得る。しかし非保存的置換を導入すること、特に１つ以上の位置での非保存的置換も所望され得るが、これに限定されない。アミノ酸の置換は、疎水性および親水性値ならびにサイズおよび電荷などのアミノ酸側鎖の相対的類似性に基づいてなされ得る。
保存的アミノ酸類は、好ましくは、以下のそれらの既知の化学特性によるものである：
（ｉ）Ａ、Ｇ；（ｉｉ）Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ；（ｉｉｉ）Ｅ、Ｄ；（ｉｖ）Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ；（ｖ）Ｈ、Ｋ、Ｒ；（ｖｉ）Ｌ、Ｐ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｗ
【００４４】
本発明の好ましいペプチドは、ヒトＩＬ−４から誘導され、
Ａが、アミノ酸ＷＮＲ（配列番号：７）に対応し、
Ｂが、アミノ酸ＥＩＩＫＴ（配列番号：１１）に対応し、
Ｃが、アミノ酸ＫＴＩＭＲＥＫＹ（配列番号：１７）に対応するペプチド、または１つの位置で異なるアミノ酸を有するその変異体であり、前記ペプチドは神経細胞の軸索伸展を刺激することが可能である。
【００４５】
本発明の好ましいペプチドは、ヒトＩＬ−１３から誘導され、
Ａが、アミノ酸ＬＭＲ（配列番号：９）に対応し、
Ｂが、アミノ酸ＥＬＩＥＥＬＶＮＩＴ（配列番号：１３）に対応し、
Ｃが、アミノ酸ＦＶＫＤＬＬＬＨＬＫＫ（配列番号：１８）に対応するペプチド、または、１つの位置で異なるアミノ酸を有するその変異体であり、前記ペプチド、またはその変異体は神経細胞の軸索伸展を刺激することが可能である。
【００４６】
本発明の好ましいペプチドは、ＩＬ−４誘導体であり、
Ａが、アミノ酸ＥＩＩＫＴ（配列番号：１１）に対応し、
Ｂが、アミノ酸ＲＬＤＲＮＬＷＧ（配列番号：１５）に対応し、
Ｃが、アミノ酸ＲＡＡＴＶＬＲＱＦＹＳ（配列番号：１９）に対応するペプチド、または１つの位置で異なるアミノ酸を有するその変異体であり、前記ペプチドまたはその変異体は神経細胞の軸索伸展を刺激することが可能である。
【００４７】
本発明のペプチドの生物活性は、ＩＬ−４Ｒ１型または２型に結合するペプチドの能力によって定義され、本発明のペプチド、または変異体の結合は所望の神経保護のおよび神経再生効果をもたらす。これらの生物効果は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）などインビトロもしくはインビボモデルシステムまたは多発性硬化症（ＭＳ）の他のマウスモデルによって測定することができる。さらに、本発明のペプチド、または変異体の生物活性は皮質の成長アッセイ、または本明細書に記載されるＨ９細胞の成長アッセイによって測定することができる。
【００４８】
上記の式を含む化合物のアミノ酸伸長物Ａ、Ｂ、Ｃを結合するために、リンカー配列が使用され、好ましくは、１つ以上のアミノ酸からなる、好ましくは、１〜１０、より好ましくは、１〜５のアミノ酸からなるリンカーである。上記の式にて第１のリンカー配列がＡおよびＢのアミノ酸を結合し、第２のリンカー配列がＢおよびＣのアミノ酸を結合する。好ましくは、第１のリンカー配列（Ｌ１）および／または第２のリンカー配列（Ｌ２）はＳ、ＧＳ、ＳＧＳ、Ｐ、ＧＰまたはＰＧＰに対応する。当業者にとっては他のアミノ酸、またはリンカーもＩＬ−４およびＩＬ−１３のヘリックス領域から誘導されるアミノ酸伸長物を結合するために使用することができることが明らかである。本目的に好適なあらゆるリンカーが本発明の定義の範囲内となる。リンカーは、選択されたアルファヘリックス領域を互いに結合するのに、かつ受容体結合領域の３−Ｄ構造を模倣するのに必要である。
【００４９】
好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、アミノ酸配列ＷＮＲＳＥＩＩＫＴＧＳＫＴＩＭＲＥＫＹ（配列番号：１）を有するヒトＩＬ−４誘導体、または１つ以上の位置で異なるアミノ酸を有するその変異体であり、前記ペプチド、またはその変異体は神経細胞の軸索伸展を刺激することが可能である。このペプチドは１つ以上のアミノ酸からなる第１のおよび第２のリンカー酸配列によって一緒にリンクされた、αＣ、αＡおよびαＤヘリックス領域から構成される。
【００５０】
代替的実施形態において、本発明のペプチドは、アミノ酸配列ＬＭＲＳＥＬＩＥＥＬＶＮＩＴＧＳＦＶＫＤＬＬＬＨＬＫＫ（配列番号：２）を有するヒトＩＬ−１３誘導体、または１つ以上の位置で異なるアミノ酸を有するその変異体であり、前記ペプチド、またはその変異体は神経細胞の軸索伸展を刺激することが可能である。このペプチドは１つ以上のアミノ酸からなる第１のおよび第２のリンカー酸配列によって一緒にリンクされた、αＣ、αＡおよびαＤヘリックス領域から構成される。
【００５１】
代替的実施形態において、本発明のペプチドは、アミノ酸配列ＥＩＩＫＴＧＳＲＬＤＲＮＬＷＧＳＧＳＲＡＡＴＶＬＲＱＦＹＳ（配列番号：３）を有するヒトＩＬ−４誘導体、または１つ以上の位置で異なるアミノ酸を有するその変異体であり、前記ペプチド、またはその変異体は神経細胞の軸索伸展を刺激することが可能である。このペプチドは１つ以上のアミノ酸からなる第１のおよび第２のリンカー酸配列によって一緒にリンクされた、αＡ、αＣおよびαＢヘリックス領域から構成される。
【００５２】
代替的実施形態において、本発明のペプチドは、アミノ酸配列ＲＡＲＳＥＩＩＧＩＧＳＫＳＩＭＱＭＤＹ（配列番号：４）を有するマウスＩＬ−４誘導体、または１つ以上の位置で異なるアミノ酸を有するその変異体であり、前記ペプチド、またはその変異体は神経細胞の軸索伸展を刺激することが可能である。このペプチドは１つ以上のアミノ酸からなる第１のおよび第２のリンカー酸配列によって一緒にリンクされた、αＣ、αＡおよびαＤヘリックス領域から構成される。
【００５３】
代替的実施形態において、本発明のペプチドはアミノ酸配列ＬＩＲＳＥＬＩＥＥＬＳＮＩＴＧＳＦＩＴＫＬＬＳＹＴＫＱ（配列番号：５）を有するマウスＩＬ−１３誘導体、または１つ以上の位置で異なるアミノ酸を有するその変異体であり、前記ペプチド、またはその変異体は神経細胞の軸索伸展を刺激することが可能である。このペプチドは１つ以上のアミノ酸からなる第１のおよび第２のリンカー酸配列によって一緒にリンクされた、αＣ、αＡおよびαＤヘリックス領域から構成される。
【００５４】
代替的実施形態において、本発明のペプチドはアミノ酸配列ＥＩＩＧＩＧＰＲＬＦＲＡＦＲＣＳＧＳＲＡＳＫＶＬＲＩＦＹＬ（配列番号：６）を有するマウスＩＬ−４誘導体、または１つ以上の位置で異なるアミノ酸を有するその変異体であり、前記ペプチド、またはその変異体は神経細胞の軸索伸展を刺激することが可能である。このペプチドは１つ以上のアミノ酸からなる第１のおよび第２のリンカー酸配列によって一緒にリンクされた、αＡ、αＣおよびαＢヘリックス領域から構成される。
【００５５】
本発明のＩＬ−４およびＩＬ−１３誘導体はＩＬ−４と同様に神経細胞上で作用することができるが、リンパ球集団、または骨髄系細胞に影響する副作用がない（図４）。特に、軸索形態へのインビボ作用が分析されており、軸索膨張の数の減少が確認されている。ＩＬ−４およびＩＬ−１３誘導体は、全長ＩＬ−４と同じ方法で神経突起伸長を増加させることができる（図５）。本発明者らによって実施された実験において増加した結果は、ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３誘導体ペプチドが、免疫細胞に影響を与えずに神経突起伸長再生を刺激することが可能であることを示唆する。本発明の誘導体ペプチドの生物活性は、構造的特徴および共通結合原理による可能性が高く、生物活性は、免疫システムに影響を与えずに神経細胞の軸索伸展を刺激することが可能であると定義される。本発明によって、ＩＬ−４誘導体は有毒ではなく、ＥＡＥモデルで示されるようにインビボで自己免疫性脳脊髄炎に有益作用を示すこともまた示された。化合物はまた、軸索成長および神経細胞のシグナルにおいて有益作用、炎症細胞においては最小限の作用のみを有することも示している。本明細書で示す通り、本発明のＩＬ−４誘導体は、天然ＩＬ−４と同様の臨床結果の有意な改善を導いた。本発明の全てのＩＬ−４およびＩＬ−１３誘導体がＩＬ−４Ｒに結合する共通の能力を有し、ＩＬ−４Ｒ−アゴニストとしての役割を例証している。
【００５６】
従って、本発明は、少なくとも１つの本発明の化合物を含む医薬組成物、および薬学的に好適な担体、ビヒクルまたは薬品も含包する。好ましくは、そのような担体、ビヒクルまたは薬品は薬学的有効成分の投与、例えば鼻腔粘膜を介する経粘膜投与などにおいて好適である。医薬組成物に使用されるビヒクルは、溶媒、共溶媒、賦活薬、ｐＨ緩衝剤、抗酸化薬、添加剤等を含み得る。ビヒクルの様々な成分は非毒性であり、総組成物の他の成分と有害な方法で相互作用することが無い。
【００５７】
好ましくは、本発明の化合物は、医薬組成物中に療治効果的な量、すなわち、非毒性であるが、所望の治療効果を提供する薬または活性剤として作用するのに十分な濃度で医薬組成物中に含まれる。例えば、１回以上の本発明の化合物の量が、神経炎症もしくは神経変性疾患、または神経障害もしくは外傷性神経系損傷の治療に有効である。本発明の化合物は、Ｔ−細胞、または骨髄系細胞に影響を与えることなく神経細胞に作用する。
【００５８】
本明細書に記載されるインビトロおよびインビボデータによって例証されるように、本発明の化合物は、神経炎症、または神経変性疾患の治療または予防での使用に好適である。好ましい神経炎症または神経変性疾患には、全ての形の多発性硬化症（ＭＳ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、パーキンソン病、アルツハイマー病または他の形の痴呆症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびハンチントン舞踏病が含まれる。
【００５９】
本発明の化合物は、神経障害または外傷性神経系損傷の治療または予防での使用にも好適である。好ましい神経障害は、シャルコー・マリー・トゥース病、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチーおよび糖尿病性神経障害である。
【００６０】
好ましい外傷性神経系損傷は、脊髄損傷、外傷性脳損傷、発作、末梢神経損傷である。
【００６１】
医薬適用性は、腰椎穿刺（髄腔内注射）、鼻腔塗布および全身性注入によって本明細書で例証される。
【００６２】
本発明は、以下の実施例にてさらに例証される：
ＩＬ−４誘導体およびＩＬ−１３誘導体のデザイン
【００６３】
本発明のＩＬ−４誘導体およびＩＬ−１３誘導体は、Ａ−Ｌ１−Ｂ−Ｌ２−Ｃの順序の構造によって定義される化合物である。発明者らは、ヒトおよびマウスのＩＬ−４の異なるαヘリックス領域から誘導されたもので、上の構造に従って組成された、様々なＩＬ−４誘導体を試験した。これらの新しく生成されたＩＬ−４誘導体は、「Ｌｉｎｋ４」および「ＡｖｏＣ」と本明細書では名づけられる。
【００６４】
発明者らは、ヒトおよびマウスのＩＬ−１３の異なるαヘリックス領域から誘導されたもので、上の構造に従って組成された、様々なＩＬ−１３誘導体を試験した。これらの新しく生成されたＩＬ１３誘導体は、「Ｌｉｎｋ１３」と本明細書では名づけられる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１では、誘導体Ｌｉｎｋ４およびＬｉｎｋ１３のデザインが記載される。ＩＬ−４およびＩＬ−４受容体の既知の３−Ｄ構造に基づいて、発明者らはＩＬ−４Ｒに結合するのに必要となるアミノ酸伸長物を組み合わせた。次に発明者らは、どのａＡ〜ａＤヘリックスの組合せを作成するかを決定するためにＩＬ−４たんぱく質の表面上にどのアミノ酸が位置していたかを特定した。αＣヘリックスの一部分が方向転換し、１つの連結アミノ酸と共に、２つの連結アミノ酸と共にαＤヘリックスの一部分に結合されたαＡヘリックスの一部分に接続していた。受容体結合アミノ酸が同定されかつ結合され、共受容体鎖が互いに連結したＩＬ−４およびＩＬ−１３誘導体を得た。ＩＬ−４およびＩＬ−１３の誘導体が、ＩＬ−４およびＩＬ−１３の配列同族関係に基づいて同様の方法でデザインされた。ＩＬ−４誘導体ＡｖｏＣが、他のＩＬ−４がＩＬ−４の受容体に結合する原理に基づいてデザインされた。ＩＬ−４の結合配列は、コアが疎水性残基によって囲まれたアボカドクラスタと呼ばれるものによって同定された（Ｔ．Ｄ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｌ．Ｚｈａｎｇ，Ｗ．Ｓｅｂａｌｄ，Ａ．Ｄｕｓｃｈｌ，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＩＬ−４／ＩＬ−１３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ”，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ａｃｔａ，２００２，Ｖｏｌ．１５９２，ｐ．２３７−２５０）。アミノ酸の伸長物はＩＬ−４の表面構造を模倣する形で配置された。この誘導体もまた、αＡヘリックスから誘導された配列は両方の受容体鎖に結合するため、２つの受容体鎖を連結しそうである。図１Ａは、α−ヘリックスαＡ，αＢ，αＣ，αＤおよびβ−リンカーの位置と整列された、ヒトＩＬ−４（配列番号：２３）およびマウスＩＬ−４（配列番号：２４）のアミノ酸配列を示す。黒の矢印ヘッドはＩＬ−４Ｒα鎖への結合位置を示し、グレーの矢印ヘッドは、ＩＬ−１３Ｒα１または共通γ−鎖のいずれかの双対鎖への結合位置を指している。太字のアミノ酸は図１Ｂおよび１Ｃに示されるように本発明のＩＬ−４誘導体の構築に使用されるアミノ酸である。図１Ｂは、ＩＬ−４誘導体Ｌｉｎｋ４を示し、αＣ、αＡおよびαＤヘリックス領域からの選択されたアミノ酸が太字で示される。図１Ｃは、ＩＬ−４誘導体ＡｖｏＣを示し、αＡ、αＣおよびαＢヘリックス領域からの選択されたアミノ酸が太字で示される。図１Ｄは、α−ヘリックスαＡ，αＢ、αＣ、αＤを含む、ヒトＩＬ−１３（配列番号：２５）およびマウスＩＬ−１３（配列番号：２６）の整列されたアミノ酸配列を示す。本発明のＩＬ−１３誘導体Ｌｉｎｋ１３をデザインするために使用されるアミノ酸が示される。図１Ｅは、ＩＬ−１３誘導体Ｌｉｎｋ１３を示し、αＣ、αＡおよびαＤヘリックス領域からの選択されたアミノ酸が太字で示される。図１Ｆは、本発明のマウスおよびヒトＩＬ−４およびＩＬ−１３誘導体の配列類似性を示す。全長ＩＬ−４は、マウスおよびヒト変異体間でおおよそ４０％のみの同族関係を有し、マウスおよびヒトＬｉｎｋ４は６８．４％の類似性を共有し、ＡｖｏＣは６１％、Ｌｉｎｋ１３は８１％の類似性を共有する。
【図２】図２は、マウス胎仔線維芽細胞（Ｍｅｆ）（図２Ａ）および海馬神経細胞（ＨＴ２２）（図２Ｂ）についての毒性アッセイを示す。有毒はマウス胎仔線維芽細胞（Ｍｅｆ）および海馬細胞株ＨＴ２２をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ｂｌｕｅアッセイ（ｃｔｂ）に供することで確認する。濃度を高めた状態で適用したＬｉｎｋ４およびＡｖｏＣは、線維芽細胞（図２Ａ）、または海馬神経細胞（図２Ｂ）に有毒効果は無かった。
【図３】図３は、ＩＬ−４誘導体Ｌｉｎｋ４のインビボ効果を示す。腰部（Ａ）髄腔内注射、または（Ｂ）鼻腔塗布を介したＥＡＥ（グレーバー）の慢性期中のマウスの治療は、高い病気レベルのままであるＰＢＳ対照と比較して、ＩＬ−４およびＬｉｎｋ４治療動物の臨床スコアにて有意な改善を示した。Ｐｈ８ペプチドによる腰部治療では疾病経過の効果が無かったことも示される。Ｌｉｎｋ４が、ＩＬ−４インビボでも同様の効果を有するのかどうかを試験するために、２つのパイロット実験が実行された。第１の実験（図３Ａ）では、ＢＩ６マウスがＥＡＥに供され、第１の病気ピーク後５日目から始まる病気の慢性期中に、ＩＬ−４、Ｌｉｎｋ４、Ｐｈ８およびＰＢＳ（ｎ＝各グループ６〜７動物）によって１４日、１日おきに腰部髄腔内注射を直接脳脊髄液（ＣＳＦ）にすることによって治療される。Ｌｉｎｋ４による治療は、ＩＬ−４と同様に臨床スコアの有意な改善をもたらし、一方で既知の部分アゴニストＰｈ８は臨床症状を改善しなかった。より臨床を解釈するために、次に治療をＩＬ−４およびＬｉｎｋ４（図３Ｂ；２プールされた実験，ｎ＝各グループ１５〜１６）による鼻腔治療に切り替えた。鼻腔に塗布する治療は、嗅覚神経繊維が骨を通って横切る篩板を通って脳に入ることができ、結果的に鼻腔の頂部と脳の間を接続する（Ｃ．Ｆ．Ｘｉａｏ，Ｆ．Ｊ．Ｄａｖｉｓ，Ｂ．Ｃ．Ｃｈａｕｈａｎ，Ｋ．Ｌ．Ｖｉｏｌａ  Ｐ．Ｎ．Ｌａｃｏｒ，Ｐ．Ｔ．Ｖｅｌａｓｃｏ，Ｗ．Ｌ．Ｋｌｅｉｎ，ａｎｄ  Ｎ．Ｂ．Ｃｈａｕｈａｎ，Ｂｒａｉｎ  ｔｒａｎｓｉｔ  ａｎｄ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ａｎｔｉ−ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ５ＸＦＡＤ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ  ３５，７７７−７８８（２０１３））。またしても、ＩＬ−４およびＬｉｎｋ４治療の両方が有効であった。
【図４】図４は、免疫システムにおける本発明のＩＬ−４およびＩＬ−１３誘導体の効果を示す。Ａ−Ｂ：Ａ：ＣＤ１１ｂ＋骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）をＦ８０＋ＣＤ２０６＋細胞へ分化したものおよびＢ：ＣＤ４＋Ｔ細胞をＧａｔａ３＋細胞に分化したものにおける、ＩＬ−４並びに異なる濃度のＬｉｎｋ４およびＬｉｎｋ１３によるインキュベーションの効果。Ｃ−Ｄ：ＰＢＳ、ＩＬ−４、またはＬｉｎｋ４で治療されたＥＡＥマウスの、Ｔ細胞並びにＣ：脾臓およびＤ：中枢神経系（ＣＮＳ）から単離された免疫細胞のＣＤ１１ｂ＋ＭＨＯＩＧ単球／マクロファージ／ミクログリアの異なる集団についてのＦＡＣＳ結果。Ｌｉｎｋ４およびＬｉｎｋ１３が免疫細胞を変化させることができるかどうかを調査するために、インビトロアッセイを骨髄由来マクロファージ（ＢＤＭＢ）および天然Ｔ細胞にて実行した。ＩＬ−４によるＢＤＭＢの治療は、ＣＤ１１ｂ＋ＢＭＤＭ上の分化マーカーＦ８０およびＣＤ２０６の発現を増加させた。この分化は、Ｌｉｎｋ４またはＬｉｎｋ１３への反応としては起こらなかった（図４Ａ）。ＩＬ−４で観察した予期していたＧａｔａ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞への分化は、細胞がＬｉｎｋ４、またはＬｉｎｋｌ３でインキュベートされた場合には、またしても起こらなかった（図４Ｂ）。ＩＬ−４よりのも高い濃度ではリンク類似体が必要であることを否定するために、増加させた量でアッセイを実行したが、結果は同じであった。続いて、図３Ｂと同様に、鼻腔内に塗布した場合の免疫細胞におけるＩＬ−４およびＬｉｎｋ４の効果を分析した。鼻腔塗布治療は末梢（肺、血流）に侵入することができるため、物質が脾臓内のリンパ球集団に影響を与えるかどうかを確認することが最も重要であった。Ｌｉｎｋ４についてＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ−細胞に減少が見つかったのに対し、全てのｌＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞型が未変化であった。単球／マクロファージのＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣＩＩ＋集団もまた変化がなかった。脳および脊髄（ＣＮＳ、中枢神経系としてまとめる）に侵入するリンパ球の集団について、ＩＬ−１０＋細胞で有意な増加のみが観察された。
【図５】図５は、神経細胞における本発明のＩＬ−４およびＩＬ−１３誘導体の効果を示す。Ａ：ＰＢＳ対照と比較した、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、Ｌｉｎｋ４、またはＬｉｎｋｌ３を受けた皮質の伸展。４８時間での成長の増加を、２４時間での基本的な（未治療）成長で割って計算した。Ｂ：解離皮質ニューロンをＩＬ−４、Ｌｉｎｋ４、またはＰＢＳにて１０分治療した後のシグナル伝達分子のリン酸化における効果。Ｌｉｎｋ４は、ＩＬ−４と同様の神経細胞のシグナル効果を示した。
【図６】図６は、マウスＥＡＥモデルにおいて臨床症状を減少するのに、ヒトＬｉｎｋ４はマウスＬｉｎｋ４と等しく有効であることを示す。発明者らは、ＥＡＥ実験を実行し、マウスにおける症状の減少に、ヒトＬｉｎｋ４が、マウスＬｉｎｋ４およびマウス全長ＩＬ−４と等しく有効であることを観察した。これらの結果は、本発明の誘導体は複数の種に渡って使用することができることを示している。腰部注射を介したＥＡＥ（グレーバー）の慢性期中のマウスの治療は、臨床スコアにて有意な改善を示した。
【図７】図７は、マウスおよびヒトにおいて、Ｌｉｎｋ４の神経再生作用を示し、Ａ：病気の慢性期中におけるＥＡＥマウスの脊髄での皮質脊髄路軸索の組織学的解析。マウスＬｉｎｋ４は軸索膨張の数をかなり減らした。Ｂ：ヒトＨ９細胞−由来神経細胞におけるヒトＬｉｎｋ４誘発神経突起伸長。ヒト神経細胞は、市販されるヒト神経幹細胞（Ｈ９細胞）と一緒に培養され、次に分化され神経細胞になる。ヒトＬｉｎｋ４は、全長ＩＬ−４と同じ方法でこれらの細胞の神経突起伸長を増加させることができる。本明細書に記載されるヒトＨ９細胞の成長アッセイは、ヒト神経細胞における本発明の誘導体ペプチドの有効性を簡単に検知するのに使用することができる。特に、このアッセイは、本発明の範囲内に入る誘導体ペプチドが機能的かどうかを手早く試験するために使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
材料および方法
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）
活性ＥＡＥとして、週齢９〜１０のメスＣ５７ＢＩ６マウスを、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と混合した２００μｇミエリンオリゴデンドロサイトたんぱく質３５〜５５（ＭＯＧ３５〜５５）を皮下注射することによって、前述のように免疫化する（Ｍ．Ｐａｔｅｒｋａ，Ｊ．Ｏ．Ｖｏｓｓ，Ｊ．Ｗｅｒｒ，Ｅ．Ｒｅｕｔｅｒ，Ｓ．Ｆｒａｎｃｋ，Ｔ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．Ｈｅｒｚ，Ｈ．Ｒａｄｂｒｕｃｈ，Ｔ．Ｂｏｐｐ，Ｖ．Ｓｉｆｆｒｉｎ，ａｎｄ  Ｆ．Ｚｉｐｐ，Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｔｉｐ  ｔｈｅ  ｂａｌａｎｃｅ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｕｐｏｎ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  ６７，１０８−１  １４（２０１７））。ＭＯＧ３５〜５５免疫化の後、４００ｎｇの百日咳毒素（ＰＴＸ）を、免疫化した日および２４時間後に腹腔内に投与した。以下のパラメータを使用して臨床症状のスコアを付けた。
【００６７】
【表１】
2021514961.tif 000002
【００６８】
ｒｌＬ−４（１μｇ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、Ｐｈ８（１μｇ、カスタム合成、ＳｃｈａｆｅｒＮ）、Ｌｉｎｋ４（１μｇ，カスタム合成，ＳｃｈａｆｅｒＮ）またはビヒクル（ＰＢＳ）による治療を病気モデルの慢性期中に、腰部髄腔内注射によって実行（Ｒ．Ｌｕ  ａｎｄ  Ａ．Ｓｃｈｍｉｄｔｋｏ，Ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃＧＭＰ  ｏｎ  ｐａｉｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ１０２０，２１５−２２１（２０１３））、またはＩＬ−４およびＬｉｎｋ４の鼻腔塗布を掲載される手順に従って実行した（Ｃ．Ｆ．Ｘｉａｏ，Ｆ．Ｊ．Ｄａｖｉｓ，Ｂ．Ｃ．Ｃｈａｕｈａｎ，Ｋ．Ｌ．Ｖｉｏｌａ，Ｐ．Ｎ．Ｌａｃｏｒ，Ｐ．Ｔ．Ｖｅｌａｓｃｏ，Ｗ．Ｌ．Ｋｌｅｉｎ，ａｎｄ  Ｎ．Ｂ．Ｃｈａｕｈａｎ，Ｂｒａｉｎ  ｔｒａｎｓｉｔ  ａｎｄ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ａｎｔｉ−ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ５ＸＦＡＤ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ  ３５，７７７−７８８（２０１３））。マウスはストレスを避けるために事前にトレーニングされ、４５度の角度で支えＩＬ−４溶液（１μｇ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を、ピペットチップを使用して鼻腔に塗布した。
【００６９】
軸索膨張アッセイ
ＥＡＥ実験を、皮質脊髄神経細に胞黄色蛍光タンパク質を発現するＹＦＰ−ＨマウスをＭＯＧ３５−５５で免疫化することにより実行した。上述されるように、マウスをＩＬ−４、またはＰＢＳで治療した。治療最終日に、麻酔を過量投与して犠牲にし、４％のパラホルムアルデヒドで経心腔的灌流をした。脊髄を解剖し、さらに凍結切片を進めた。ＹＦＰ−ラベルされた皮質脊髄路軸索をＫｅｙｅｎｃｅＢＺ−９０００顕微鏡を使用して撮影した。軸索膨張を定量化するために、染色されたピクセルが強調されるようＩｍａｇｅＪに閾値を設定した。ＩｍａｇｅＪプラグイン「粒子解析」を使用して閾値膨張を数えた。
【００７０】
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）
ＣＮＳおよび脾臓をＥＡＥマウスから取り除き、ｄ３５で、鼻腔からのＩＬ−４、Ｌｉｎｋ４、またはＰＢＳにて治療し、免疫細胞を前述の通り単離した（Ｍ．Ｐａｔｅｒｋａ，Ｊ．Ｏ．Ｖｏｓｓ，Ｊ．Ｗｅｒｒ，Ｅ．Ｒｅｕｔｅｒ，Ｓ．Ｆｒａｎｃｋ，Ｔ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．Ｈｅｒｚ，Ｈ．Ｒａｄｂｒｕｃｈ，Ｔ．Ｂｏｐｐ，Ｖ．Ｓｉｆｆｒｉｎ，ａｎｄ  Ｆ．Ｚｉｐｐ，Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｔｉｐ  ｔｈｅ  ｂａｌａｎｃｅ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｕｐｏｎ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  ６７，１０８−１  １４（２０１７））。Ｔ細胞のインビトロ刺激について、抗ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）および抗ＣＤ２８（３７．５１）を使用した。以下の抗体をＢＤＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いたフローサイトメトリーで使用した：抗ＣＤ４  ＰＥｃｙ７（ＲＭ４−５）、抗ＣＤ８  ＦＩＴＣ（５３−６．７）、抗ＣＤ３  ＡＰＣ（１４５−２ｃ１１）、抗ＣＤ１１ｂｂｉｏ（Ｍ１／７０），抗ＭＨＣＩＩＰＥ（ＡＦ６−１２０．１）、抗ＣＤ１１ｂＶ４５０（ＨＬ３１１Ｂ）、抗ＣＤ４５ＡＦ６０５（３０−Ｆ１１）、抗ＧＭ−ＣＳＦＰＥ（ＭＰ１−２２Ｅ９）、抗ＩＬ１７ＡＰＣ（ｅＢｉｏ１７Ｂ７）、抗ＴＮＦａＡＦ７００（ＭＰ６−ＸＴ２２）、抗ＩＦＮ−ｙＶ４５０（ＸＭＧ１．２）、抗ＧＡＴＡ−３ＰＥ（ＴＷＡＺ）、抗ＦＯＸＰ３ＰＥｃｙ７（ＦＺＫ−１６ｓ）、抗ＩＬ−１０ＡＰＣ（ＪＥＳ５−１６Ｅ３）、抗ＣＤ４Ｖ４５０（ＲＭ４−５）。全ての抗体はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅまたはＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。
【００７１】
マウスのリンパ球（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋）の単離
Ｔリンパ球の単離には、週齢５〜８のＣ５７ＢＬ／６マウスを頚椎脱臼により犠牲にし、脾臓およびリンパ節（ＬＮ）を単離し、洗浄溶媒（ＰＢＳ中、５％ＦＣＳ、１％Ｐ／Ｓ、１％ＨＥＰＥＳ）と一緒に５０ｍｌチューブへ１００μｍセルストレーナーから擦りこむ。洗浄後、細胞は４℃、５５０ｇで５分間遠心分離機にかけた。赤血球を除去するために、上澄部を溶解バッファー中で再懸濁し、続いて遠心分離にかけた（５分間、５５０ｇ、４℃）。細胞を、ＭＡＣＳバッファー中で際懸濁し、ＭｉｄｉＭＡＣＳおよびＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ  Ｓｅｐｅｒａｔｏｒｓを使用して、氷上で磁気リンパ球ソートを実行した。ＣＤ４未接触およびＣＤ８接触細胞ソートを、ｍｌＭＡＣＳバッファー中（５分間、５５０ｇ、４℃）で洗浄工程内で実行した。細胞を、４℃で５分間、ＣＭＡＣＳバッファー中でＣＤ４Ｔ細胞ビオチン抗体カクテル（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）とインキュベートした。ＣＤ８＋リンパ球の汚染の可能性を低減させるためにＣＤ８マイクロビーズを添加した。４℃で１０分間インキュベートした後、細胞を再度洗浄しＭＡＣＳバッファー中で際懸濁した。ＭＡＣＳカラムは予め平衡化され、プレ分離フィルタ（３０μｍ）をかぶせた。最大３００ｘ１０６細胞を各カラムに添加し、続いてＭＡＣＳバッファー中で洗浄工程を３回連続行った。ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８濃縮フロースルーを次のＣＤ６２Ｌ接触ソートのために回収した。遠心分離（５分間、５５０ｇ、４℃）後、ＭＡＣＳバッファー中のＣＤ６２Ｌマイクロビーズを細胞に添加し、４℃で１５分間インキュベートした。洗浄後、細胞をＭＡＣＳバッファー中で再懸濁し、新しいカラムに装填した。ポジティブラベルのＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞を、カラム内濃縮し、ＭＡＣＳバッファー中に回収した。磁気細胞ソートの純度を、フローサイトメトリーによって事前および事後試料を比較することによって評価する。細胞をＣＤ４−Ｈｏｒｉｚｏｎ（１：４００）、ＣＤ３−ＡＰＣ（１：６００）およびＣＤ６２Ｌ−ＡＰＣ（１：２００）を用いて染色した。ＣＤ４＋細胞からのＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋純度は通常約＞９７％である。
【００７２】
マウス抗原提示細胞（ＡＰＣ）の単離
抗原提示細胞を成体Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓の溶解およびＭｉｄｉＭＡＣＳおよびＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒｓを用いた磁気免疫細胞ソートにより単離した。細胞懸濁液ＭＡＣＳバッファーで洗浄し、遠心分離した（５分、５５０ｇ、４℃）。続いて、細胞を９５ｍＩＭＡＣＳバッファーおよびＣＤ９０．２非接触マイクロビーズ中で再懸濁し、４℃で１５分間インキュベートした。ＭＡＣＳバッファーで洗浄および遠心分離（５分、５５０ｇ、４℃）の後、細胞を、ＭＡＣＳバッファー中で再懸濁し、カラムに充填しＭＡＣＳバッファー中に回収した。増殖サイクルを止めるために、精製したＡＰＣを３０Ｇｙ／３０００ｒａｄで照射した。
【００７３】
Ｔｈ２分化
最初の刺激として、２４ウェルプレートの各ウェルに２ｍｌマウス媒体（ＲＰＭＩバッファー中０％ＦＣＳ、１％Ｐ／Ｓ、１％Ｌ−グルタミン、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１％ＨＥＰＥＳ）中６００億個の細胞濃度にて、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と共に１：５の比率で共培養した。非特異的なＴ細胞受容体の活性化のために、２μｇ／ｍ抗ＣＤ３を培養液に添加した。ＴＨ２細胞への分化のために、ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）、α−ＩＬ−１２（１０μｇ／ｍｌ）およびα−ＩＦＮ（１０μｇ／ｍｌ）を添加した。３日および５日目に細胞が分割し、１０μｇ／ｍｌＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４を含有する新鮮な培地に蒔いた。７日目に、細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で刺激し、分泌を防止するためにブレフェルジンで処理した。４時間のインキュベーションの後、異なるＴリンパ球培養菌のサイトカイン確認を、細胞外染色にＣＤ４−ＰＥＣｙ７（１：１０００）、細胞内染色にＦｃ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｌｏｃｋ（１：１００）およびＩＦＮ−ｇ−Ｈｏｒｉｚｏｎ（１：２００）、ＴＮＦａ−ＡＦ７００（１：２００）およびＩＬ−１０−ＡＰＣ（１：２００）を使用してフローサイトメトリーによって実行した。ＴＨ２細胞を核内Ｇａｔａ３−ＰＥ（１：１００）のために追加的に染色した。
【００７４】
骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）の生成
マウスのＢＭＤＭを、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離した。脛骨および大腿骨を無菌のＰＢＳで流し、骨髄を洗浄溶媒中に回収した。細胞懸濁液を１００μｍナイロンメッシュで濾過した後、細胞を遠心分離し（５分、５５０ｇ、４℃）、マウス溶媒（ＲＰＭＩバッファー中、１０％ＦＣＳ、１％Ｐ／Ｓ、１％Ｌ−グルタミン、０．１％ｂ−メルカプトエタノール、１％ＨＥＰＥＳ）中で再懸濁した。ＢＭＤＭのインビトロ生成のために、細胞を６ウェルプレートに蒔き、２０ｎｇ／ｍｌのクロファージ刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）に４日間曝した。細胞の活性化のために、デキサメタゾン（５ｘ１０７Ｍ）、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）を培養液に次の３日間添加した。
【００７５】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ｂｌｕｅ細胞生存アッセイ（ｃｔｂ）
マウス胎仔線維芽細胞（Ｍｅｆ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および海馬ＨＴ２２（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）細胞を、メーカーのプロトコルに従って培養した。Ｃｔｂアッセイをメーカーのプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って実行した。
【００７６】
皮質の成長アッセイおよび解離皮質ニューロン
新生児（Ｐ１−３）皮質外植片を、ブレグマ０〜−１．５（運動皮質）からの２５０μｍ厚さのビブラトーム（ＨＭ６５０Ｖ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）セクションから解離させた。表層Ｖを顕微解剖し、ポリ−Ｄ−リジン（０．５ｍｇ／ｍｌ）およびラミニン（１ｍｇ／ｍｌ）でコーティングされたカバーガラスに蒔き、２％ウマ血清、２％Ｂ２７、１％ｇｌｕｔａｍａｘおよび０．５％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む神経細胞用基礎培地で成長させた。外植片をｒｌＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｌｉｎｋ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｌｉｎｋ１３（５０ｎｇ／ｍｌ）またはＰＢＳで４８時間処理した。軸索長さを、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して、初期成長２４時間目で補正した４０個の最長軸索の長さを測定することによって評価した。解離皮質ニューロンを前述の通り調製した（Ｊ．Ｔ．Ｗａｌｓｈ，Ｓ．Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｆ．Ｂｏａｔｏ，Ｉ．Ｓｍｉｒｎｏｖ，Ｊ．Ｚｈｅｎｇ，Ｊ．Ｒ．Ｌｕｋｅｎｓ，Ｓ．Ｇａｄａｎｉ，Ｄ．Ｈｅｃｈｌｅｒ，Ｇ．Ｇｏｌｚ，Ｋ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｔ．Ｋａｍｍｅｒｔｏｎｓ，Ｊ．Ｖｏｇｔ，Ｃ．Ｖｏｇｅｌａａｒ，Ｖ．Ｓｉｆｆｒｉｎ，Ａ．Ｒａｄｊａｖｉ，Ａ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃａｓｔａｎｅｄａ，Ａ．Ｇａｕｌｔｉｅｒ，Ｒ．Ｇｏｌｄ，Ｔ．Ｄ．Ｋａｎｎｅｇａｎｔｉ，Ｒ．Ｎｉｔｓｃｈ，Ｆ．Ｚｉｐｐ，Ｊ．Ｋｉｐｎｉｓ，“ＭＨＣＩＩ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｉｎｊｕｒｅｄ  ＣＮＳ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｖｉａ  ＩＬ−４”，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２０１５，Ｖｏｌ．１２５，ｐ．６９９−７１４）。１８日目のマウス胎児（Ｅ１８）の皮質をトリプシン／ＤＮａｓｅ溶液と一緒にインキュベートし、粉砕して分離させた。細胞を、プレート培地（１ｘＭＥＭ−Ｇｌｕｔａｍａｘ、２０％ぶどう糖、１０％ＨＳ、１ｘＰｅｎＳｔｒｅｐ）中で再懸濁し、６ウェルプレートの各プレートに６００，０００個の細胞を濾過−殺菌した。蒔いてから５時間後、培地を吸引し、ウェルを温かいＰＢＳで２回洗浄し、細胞をＮＢ−培地で培養した。５０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４、５０ｎｇ／ｍｌＬｉｎｋ４または相当量のＰＢＳで処理する前に、培養液を３日間展開させた。１０分後、細胞を溶解バッファーに採取し、ウエスタンブロット法にかけた。細胞培地試薬はＦｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃおよびＳｉｇｍａから入手した。シグナル実験のために、細胞を０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、または相当量のＰＢＳと一緒に１０分間インキュベートした。
【００７７】
Ｈ９ヒト神経幹細胞用培地
Ｈ９ヒト神経幹細胞用培地（Ｈ９ｈＮＳＣ）をＧｉｂｃｏから購入し、メーカーの指示通りに展開した。連続的神経分化のために、ｈＮＳＣを採取し、２５．０００細胞／ｃｍ２の密度で、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（高濃度、低下した成長因子；コーニング；ＫｎｏｃｋｏｕｔＤＭＥＭ［Ｇｉｂｃｏ］中１：１００に希釈）でコーティングされたカバーガラスに再び蒔いた。ｈＮＳＣを、神経細胞用基礎培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、１ＸＢ２７、１ＸＧｌｕｔａｍａｘ、１ＸＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、全てＧｉｂｃｏから入手）で４８時間休ませ、その後さらに４日間ＥｎＳｔｅｍ  Ａ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＣＭ０１７，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に切り替えて休ませた。培養物を、５０ｎｇ／ｍｌまたは相当量のＰＢＳで２４時間組み換えヒトＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、またはヒトＬｉｎｋ４で処理した。固定された培養物を、βＩＩＩ−チューブリン（ｃｌｏｎｅ  Ｔｕｊ１；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）のために免疫蛍光法で染色し、ＫｅｙｅｎｃｅＢＺ−Ｘ７１０オールインワン蛍光顕微鏡で撮像した。分析を、ＩｍａｇｅＪのＳｉｍｐｌｅ  Ｎｅｕｒｉｔｅ  Ｔｒａｃｋｅｒプラグインを使用して、各条件につき少なくとも５つの画像から最長の神経炎拡張をトラッキングすることにより盲検法で実施した。
【００７８】
ウエスタンブロット法
ウエスタンブロット法について、次の一次抗体を使用した：抗ＩＲＳ１（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗リン酸化ＩＲＳ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＭＡＰＫおよび抗リン酸化ＭＡＰＫ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＰＫＣｙ（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ）、抗リン酸化ＰＫＣｙ（Ｂｉｏｚｏｌ）。Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＦＣ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ−ＣｏｒＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用したたんぱく質の定量分析のためにＤｙＬｉｇｈｔ  ８００／６００−結合二次抗体を使用した。リン酸抗体でプローブしたブロットは視覚化した後剥がされ、同じ試料のパラレル検出のために全抗体と一緒にインキュベーションした。
【００７９】
統計分析  
統計分析をＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ）を使用して実施した。臨床スコアを、二元配置反復測定分散分析（Ｔｗｏ  Ｗａｙ  Ｒｅｐｅａｔｅｄ  Ｍｅａｓｕｒｅｓ  ＡＮＯＶＡ）を使用し、事後のボンフェローニ調整を行い分析した。インビトロ分析およびウエスタンブロット法によって取得したデータを、独立ｔ検定または多重検定のためにＴｕｋｅｙ検定を用いた一元配置分散分析（Ｏｎｅ  Ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）にかけた。
【００８０】
ヒト（ｈｕ）およびマウス（ｍｕ）  Ｌｉｎｋ４、Ｌｉｎｋ１３、ＡｖｏＣのアミノ酸配列
ＩＬ−４およびＩＬ−１３誘導体として以下のアミノ酸配列が決定された：
ｈｕＬｉｎｋ４  （配列番号  １）：
Ｔｒｐ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  ｌｉｅ  ｌｉｅ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  ｌｉｅ  Ｍｅｔ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｔｙｒ
ｈｕｌ＿ｉｎｋ１３  （配列番号  ２）：
Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  ｌｉｅ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  ｌｉｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ
ｈｕＡｖｏＣ  （配列番号  ３）：
Ｇｌｕ  ｌｉｅ  ｌｉｅ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｔ  ｒｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｇｉｎ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ
ｍｕＬｉｎｋ４  （配列番号  ４）：
Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  ｌｉｅ  ｌｉｅ  Ｇｌｙ  ｌｉｅ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  ｌｉｅ  Ｍｅｔ  Ｇｉｎ
ｍｕＬｉｎｋ１３  （配列番号  ５）：
Ｌｅｕ  ｌｉｅ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  ｌｉｅ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  ｌｉｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  ｌｉｅ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｇｉｎ
ｍｕＡｖｏＣ  （配列番号  ６）：
Ｇｌｕ  ｌｉｅ  ｌｉｅ  Ｇｌｙ  ｌｉｅ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  ｌｉｅ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ
ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＬＩＳＴＩＮＧ
＜１１０＞  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｓｍｅｄｉ  ｚｉｎ  ｄｅｒ  Ｊｏｈａｎｎｅｓ  Ｇｕｔｅｎｂｅｒｇ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ  Ｍａｉｎｚ
＜１２０＞  Ｎｏｖｅｌ  ＩＬ−４−／ＩＬ−１３−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｒ
ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｏｒ  ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  
＜１３０＞  ＬＩＮＫ４
＜１６０＞  ２７
＜１７０＞  Ｐａｔｅｎｔｌｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．５
＜２１０＞  １
＜２１１＞  １９
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞  １
Ｔｒｐ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  ｌｉｅ  ｌｉｅ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  ｌｉｅ  Ｍｅｔ  Ａｒｇ  １  ５  １０  １５
Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｔｙｒ
＜２１０＞  ２
＜２１１＞  ２７
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞  ２
Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  ｌｉｅ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  ｌｉｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  １  ５  １０  １５
Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ
２０  ２５
＜２１０＞  ３
＜２１１＞  ２９
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞  ３
Ｇｌｕ  ｌｉｅ  ｌｉｅ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  １  ５  １０  １５
Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｇｉｎ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ
２０  ２５
＜２１０＞  ４
＜２１１＞  １９
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ
＜４００＞  ４
Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  ｌｉｅ  ｌｉｅ  Ｇｌｙ  ｌｉｅ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  ｌｉｅ  Ｍｅｔ  Ｇｉｎ  １  ５  １０  １５
Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ
＜２１０＞  ５
＜２１１＞  ２７
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ
＜４００＞  ５
Ｌｅｕ  ｌｉｅ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  ｌｉｅ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  ｌｉｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  １  ５  １０  １５
Ｐｈｅ  ｌｉｅ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｇｉｎ
２０  ２５
＜２１０＞  ６
＜２１１＞  ２９
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ
＜４００＞  ６
Ｇｌｕ  ｌｉｅ  ｌｉｅ  Ｇｌｙ  ｌｉｅ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  １  ５  １０  １５
Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  ｌｉｅ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ
２０  ２５
＜２１０＞  ７
＜２１１＞  ３
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞  ７
Ｔｒｐ  Ａｓｎ  Ａｒｇ
１
＜２１０＞  ８
＜２１１＞  ３
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ
＜４００＞  ８
Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｒｇ
１
＜２１０＞  ９
＜２１１＞  ３
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞  ９
Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｒｇ
１
＜２１０＞  １０
＜２１１＞  ３
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ
＜４００＞  １０
Ｌｅｕ  ｌｉｅ  Ａｒｇ
１
＜２１０＞  １１
＜２１１＞  ５
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞  １１
Ｇｌｕ  ｌｉｅ  ｌｉｅ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ
１  ５
＜２１０＞  １２
＜２１１＞  ５
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ
＜４００＞  １２
Ｇｌｕ  ｌｉｅ  ｌｉｅ  Ｇｌｙ  ｌｉｅ
１  ５
＜２１０＞  １３
＜２１１＞  １０
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞  １３
Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  ｌｉｅ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  ｌｉｅ  Ｔｈｒ  １  ５  １０  ＜２１０＞  １４
＜２１１＞  １０
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ
＜４００＞  １４
Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  ｌｉｅ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  ｌｉｅ  Ｔｈｒ  １  ５  １０
＜２１０＞  １５
＜２１１＞  ８
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞  １５
Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ
１  ５
＜２１０＞  １６
＜２１１＞  ８
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ
＜４００＞  １６
Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ
１  ５
＜２１０＞  １７
＜２１１＞  ８
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞  １７
Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  ｌｉｅ  Ｍｅｔ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｔｙｒ
１  ５
＜２１０＞  １８
＜２１１＞  １１
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞  １８
Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  １  ５  １０
＜２１０＞  １９
＜２１１＞  １１
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞  １９
Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｇｉｎ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ
１  ５  １０
＜２１０＞  ２０
＜２１１＞  ８
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ
＜４００＞  ２０
Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  ｌｉｅ  Ｍｅｔ  Ｇｉｎ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ
１  ５
＜２１０＞  ２１
＜２１１＞  １１
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ
＜４００＞  ２１
Ｐｈｅ  ｌｉｅ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  ｌｉｅ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｇｉｎ
１  ５  １０
＜２１０＞  ２２
＜２１１＞  １１
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ
＜４００＞  ２２
Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  ｌｉｅ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ
１  ５  １０
＜２１０＞  ２３
＜２１１＞  １２０
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞  ２３
ｌｉｅ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｇｉｎ  Ｇｌｕ  ｌｉｅ  ｌｉｅ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｇｉｎ  １  ５  １０  １５
Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  ｌｉｅ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ
２０  ２５  ３０
Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ
３５  ４０  ４５
Ａｒｇ  Ｇｉｎ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  ５０  ５５  ６０
Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｇｉｎ  Ｇｉｎ  Ｐｈｅ  Ｈｉｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ  Ｇｉｎ  Ｌｅｕ  ｌｉｅ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  ６５  ７０  ７５  ８０
Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｐｒｏ
８５  ９０  ９５
Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｇｉｎ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ
１００  １０５  １１０
Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  ｌｉｅ  Ｍｅｔ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｔｙｒ
１１５  １２０
＜２１０＞  ２４
＜２１１＞  １１３
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ
＜４００＞  ２４
Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  ｌｉｅ  ｌｉｅ  Ｇｌｙ  ｌｉｅ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  １  ５  １０  １５
Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ａｌａ
２０  ２５  ３０
Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ
３５  ４０  ４５
Ｌｅｕ  Ａｒｇ  ｌｉｅ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  ５０  ５５  ６０
Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｇｉｎ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  ６５  ７０  ７５  ８０
Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  ｌｉｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ
８５  ９０  ９５
Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  ｌｉｅ  Ｍｅｔ  Ｇｉｎ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ
１００  １０５  １１０
Ｔｙｒ
＜２１０＞  ２５
＜２１１＞  １０６
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞  ２５
Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  ｌｉｅ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  ｌｉｅ  Ｔｈｒ  Ｇｉｎ  Ａｓｎ  １  ５  １０  １５
Ｇｉｎ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  ｌｉｅ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ
２０  ２５  ３０
Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  ｌｉｅ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ
３５  ４０  ４５
Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  ｌｉｅ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｉｎ  Ａｒｇ  Ｍｅｔ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  ５０  ５５  ６０
Ｐｒｏ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｉｎ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  ６５  ７０  ７５  ８０
Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  ｌｉｅ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｇｉｎ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ
８５  ９０  ９５
Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ
１００  １０５
＜２１０＞  ２６
＜２１１＞  １０２
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ
＜４００＞  ２６
Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  ｌｉｅ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  ｌｉｅ  Ｔｈｒ  Ｇｉｎ  １  ５  １０  １５
Ａｓｐ  Ｇｉｎ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ
２０  ２５  ３０
Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  ｌｉｅ  Ｓｅｒ
３５  ４０  ４５
Ａｓｎ  Ｃｙｓ  Ａｓｎ  Ａｌａ  ｌｉｅ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｇｉｎ  Ａｒｇ  ｌｉｅ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  ５０  ５５  ６０
Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  ｌｉｅ  ６５  ７０  ７５  ８０
Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  ｌｉｅ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｇｉｎ  Ｌｅｕ  ８５  ９０  ９５
Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ
１００
＜２１０＞  ２７
＜２１１＞  １６
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞  ２７
Ａｌａ  Ｇｉｎ  Ｐｈｅ  Ｈｉｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ  Ｇｉｎ  Ｌｅｕ  ｌｉｅ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  １  ５  １０  １５
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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