(57)【要約】  本発明はアミド基−ＮＨ−ＣＯ−の殆どの水素原子が塩素原子に置換された（−ＮＣｌ−ＣＯ−）ヒアルロン酸誘導体−ヒアルロナンクロラミドに関する。該ヒアルロナンクロラミドを含む組成物は，広範囲の抗菌及び抗ウイルス活性を示し，また生体適合性のおかげで創傷被覆の分野での適用又は広範囲の移植可能な医療機器の製造に適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミド基：−ＮＨ−ＣＯ−の水素原子が構造式：−ＮＣｌ−ＣＯ−に従って塩素原子で置換され，その置換度が５０〜１００％であるヒアルロン酸又は修飾されたヒアルロン酸の塩素化誘導体，いわゆるクロラミド。
【請求項２】
前記修飾されたヒアルロン酸が，いくつかの−ＯＨ基が−Ｏ−ＣＯ−Ｒ2基で置換され及び／又はいくつかの−ＣＨ2−ＯＨ基が−ＣＨ＝Ｏ基で置換され及び／又はいくつかの−ＣＯ−ＯＨ基が−ＣＯ−ＯＲ2基で置換されたヒアルロン酸（式中，Ｒ2は１〜１７個の炭素原子を含む直鎖又は芳香族鎖である）である請求項１記載の塩素化誘導体。
【請求項３】
前記修飾されたヒアルロン酸がエチルエステル，ベンジルエステル，ホルミル，ラウロイル（Ｃ１２），パルミトイル（Ｃ１６），カプロイル（Ｃ６）からなる群より選択される請求項２記載の塩素化誘導体。
【請求項４】
その分子量が５〜５００kg.mol-1である請求項１〜３いずれか１項記載の塩素化誘導体。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか１項記載のヒアルロン酸又は修飾されたヒアルロン酸のクロラミドの調製方法であって，
分子量が４０〜２２００kg.mol-1である最初のヒアルロン酸又はその修飾された誘導体の水溶液を調製し，その濃度は０．５〜５重量％であり，ｐＨを２．５〜７．５の範囲に合わせ，そしてその後ヒアルロナンの二糖に対して０．３〜１．５当量の量の塩素化剤を添加し，その混合物を５〜４０℃の温度で５〜７２時間反応させ，その後，生じたクロラミドを析出により単離することを特徴とする方法。
【請求項６】
前記ｐＨを４〜６の範囲に合わせることを特徴とする請求項５記載の調製方法。
【請求項７】
前記ヒアルロナンの二糖に対して０．２〜７当量の量の酢酸を添加することにより前記ｐＨを合わせることを特徴とする請求項５記載の調製方法。
【請求項８】
前記塩素化剤がトリクロロイソシアヌル酸，又はジクロロイソシアヌル酸のナトリウム塩であることを特徴とする請求項５〜７いずれか１項記載の調製方法。
【請求項９】
１０〜９９重量％の濃度の請求項１〜４いずれか１項記載の誘導体，並びに水，塩化ナトリウム，塩化カルシウム，グリセロール，ヒアルロン酸，コンドロイチン硫酸，アルギン酸ナトリウム，オキシセルロース，カルボキシメチルセルロース，ヒドロキシエチルセルロース，又はいくつかの−ＯＨ基が−Ｏ−ＣＯ−Ｒ2基で置換され及び／又はいくつかの−ＣＨ2−ＯＨ基が−ＣＨ＝Ｏ基で置換され及び／又はいくつかの−ＣＯ−ＯＨ基が−ＣＯ−ＯＲ2基で置換された修飾されたヒアルロン酸（式中，Ｒ2は１〜１７個の炭素原子を含む直鎖又は芳香族鎖である）からなる群から選択された添加剤を含有することを特徴とする，抗菌性，抗真菌性及び抗ウイルス性組成物。
【請求項１０】
水溶液中の溶液又はゲルの形態であり，最終組成物中の前記クロラミドの含有量が，乾燥物質に換算して計算して１０〜１００％の範囲内であることを特徴とする請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
自己支持性フィルム，凍結乾燥物，ステープルファイバーの層(不織布)，エンドレスファイバー，織物，ニット布，組物，又はナノファイバー層からなる群から選択された固体基材の形態であって，最終組成物中の前記クロラミドの含有量が，乾燥物質に換算して計算して１０〜１００％の範囲内であることを特徴とする請求項９記載の組成物。
【請求項１２】
創傷被覆材の製造のための又は移植可能な医療機器の製造のための請求項１〜４いずれか１項記載の塩素化誘導体の使用。
【請求項１３】
創傷被覆材の製造のための又は移植可能な医療機器の製造のための請求項９〜１１いずれか１項記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，アミド基−ＮＨ−ＣＯ−の水素原子の大部分が塩素原子で置換された−ＮＣｌ−ＣＯ−ヒアルロン酸の誘導体に関する。本発明の方法で修飾されると，ポリマー−ヒアルロナンクロラミド(chloramide)は酸化反応及び還元反応の両方において増加した反応性を示す。
【０００２】
さらに，本発明は，化学修飾がトリクロロイソシアヌル酸により又はトリクロロイソシアヌル酸の塩により水性環境の中で行われるヒアルロナンクロラミドの調製方法に関する。最終組成物の調製は，ヒアルロナンクロラミドを含有する形態の提供をも含む。ここで，用語「形態」は，薄いフィルム，凍結乾燥物，ステープルファイバーの層，エンドレスファイバー，織物，ニット布，組物又はナノファイバー層のような様々なタイプの材料を表す。
【０００３】
さらに，本発明は，ヒアルロナンクロラミドを含む最終組成物，及び下記の特性又は下記の特性の任意の組み合わせが要求される分野における該組成物の使用に関する:
- 酸化又は還元又は抗菌（antimicrobial）又は抗真菌又は抗ウイルス活性
- 生物学的適合性及び生物学的分解性
- 好適な安定度を有する様々な形態を製造する可能性
- 制御された生分解速度の可能性
- 酸化還元反応の制御された速度の可能性
- 治癒プロセスへの著しい寄与
【背景技術】
【０００４】
ヒアルロン酸
ヒアルロン酸又はそのナトリウム塩は，Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとの二つの繰り返し単位によって構成された，硫酸化されていないグリコサミノグリカンである。
2021535245.tif 000002
（式中，Ｒ1は水素又はナトリウムを表す）
【０００５】
天然のヒアルロン酸の分子量は５ｘ１０4〜５ｘ１０6g.mol -1の範囲内にある。この親水性の多糖類は，プロテオグリカン類の構成，水和又は細胞の分化のような多数の生物学的プロセスに重要な役割を果たし，皮膚，滑液，そして結合組織の本質的な要素であることが知られている。上記ポリマーは生物系において自然に発生し，従って，それは生分解性で生体適合性であるとして特徴づけられ得る。従って，それは，広範囲の生物医学的な用途のための生物活性物質のキャリヤーの分野に適する基材を構成する。
【０００６】
ヒアルロン酸の化学的修飾及び形態
その物理的及び生物学的特性を調節する目的のためのヒアルロン酸の化学的修飾の多数の既知の方法が存在する(Burdick J. A. and Prestwich G. D., Adv. Mater. 23, 41-56, 2011)。特定用途に関して溶解度の本質的な変化が要求される場合，最も頻繁に行なわれる方法は，生分解性のエステル結合により疎水性鎖を高分子構造に共有結合することからなる(Kettou S. et al., PV 2009-399, Buffa R. et al., WO2010105582)。上記の方法で修飾した場合，該材料は，ファイバー(Scudlova J. et. al., EP2925916 A1), ニット布又は組物(Pitucha T. et al., CZ 306354)，自己支持性フィルム(Foglarova M. et al. PV2015-166; Foglarova M. et al., Carbohydrate Polymers, 144, 68-75, 2016)又はナノファイバー層(Ruzickova J. et al. PV2013-913)のような様々な形態の製造に使用できる。別の可能性は接着したステープルマイクロファイバーによって形成した不織布であり，該ファイバーは非静止凝固浴（a non-stationary coagulation bath）中で湿式紡糸法によって製造される(Zapotocky V. et al., International Journal of Biological Macromolecules, 95, 903-909, 2017)。
【０００７】
トリクロロイソシアヌル酸，又はトリクロロイソシアヌル酸ナトリウムによる酸化
トリクロロイソシアヌル酸（ＴＣＣ）は，ほとんどの場合非水溶媒中で，構造的に単純なアミドをＮ−塩素化してＮ−クロラミドにするためにしばしば使用される(Hiegel G. A. et al., Synthetic Communications, 35, 2099-2105, 2005)。さらに，ＴＣＣは，水の存在下で一級水酸基を選択的に酸化するために，ピペリジニルオキシ-タイプ（ＴＥＭＰＯ）のような安定なラジカルとの組み合わせでしばしば言及される。ヒアルロン酸に関しては，水中でＴＥＭＰＯと共にＴＣＣを使用することが，例えば特許(Buffa R. et al., WO2011069475A3)に記載された。そこでは一級水酸基をアルデヒドとカルボン酸に酸化することのみが述べられクロラミドの形成は述べられていなかった。従って，大量の第二及び第一アルコールの両方を含む基質(多糖類)の場合，ＴＣＣ及びその類似化合物が使用される場合は水酸基上の反応が予測され得る。ジクロロイソシアヌル酸ナトリウム（ＤＣＣ−Ｎａ）としても知られているＴＣＣのモノナトリウム塩は，反応性はより低いが，より良好な水溶性のＴＣＣ類似化合物である。しかしながら，水酸基を含まないアミン及びアミドを酸化させるためのＤＣＣ−Ｎａの使用が開示された(Sun X. et al., Ind. Eng. Chem. Res., 49, 22, 2010)。生じるクロラミンは重合され，最終基質は，ラテックス乳濁液の形態の抗菌性，抗真菌性及び抗ウイルス性物質として試験され成功した(Cao Z. et al., App. Mat. Inter. 1, 2, 494-504, 2009)。
【０００８】
上記の資料に基づくと，選択的なやり方で水中のＮ−塩素化ヒアルロナンアミド（N-chlorinated hyaluronan amide）を調製するためのＴＣＣ又はその類似化合物の使用は，ヒアルロナンの水酸基との反応が想定されるため，予測可能でないことが結論付けられ得る。
【０００９】
多糖類の次亜塩素酸又は次亜塩素酸塩による酸化
次亜塩素酸及びその塩は，主としてピペリジニルオキシラジカル（ＴＥＭＰＯ）と組み合わせて，多糖類の水酸基の酸化にしばしば使用される(Bragd P. et al., WO2002/48197, Buffa R. et al., WO2011/069475A3)。アミド基を含む多糖類に関しては，大多数の場合，クロラミドの形成が観察されなかったと一般的には言えるであろう。初期の資料はヒアルロナンクロラミドの存在に言及しなかった(Green S. P. et al., J. Rheumatology, 17, 1670-5, 1990, Lindvall S. et al., Chem.-Biol. Interac. 90, 1-12, 1994, Baker M. S. et al. , 461-7Arthritis and Rheumatism, 32, 4, 1989)。前述の刊行物は，ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）と過酸化水素及び塩化物との反応において生じる次亜塩素酸又はその塩によって引き起こされたヒアルロナンの分解過程の検討を記載した。炎症過程をシミュレートする目的で主として細胞間マトリックスに含まれるグリコサミノグリカンの分解について記述しているいくつかの刊行物がさらに存在する。主な資料は，プロセス自体及び予測される特定の化学構造の生体内での存在の両方に関する情報であった。より最近又は現在の情報は，既にヒアルロナンのクロラミドに言及している。例えば，アミド基を含む，低分子のものを含む，ヒアルロン酸，コンドロイチン硫酸及び他の基質の分解のメカニズムに関する研究を扱った刊行物(Hawkins C. L. et al., Free Radical Biology & Medicine, 24, 9, 1396-1410, 1998)。使用された酸化剤はＨＯＣｌ／ＣｌＯ-であった。著者らは，不安定な中間体以外のヒアルロナンクロラミドの形態の存在を仮定していない。しかしながら，この不安定な中間体は直接的な方法では検出されていなかった。その理由は，その急速な均等な又は還元的な開裂にあり，いずれの場合もポリマーの分解につながるように反応するラジカルの形成に帰着する。別の論文(Parsons B. J. et al., Biochem. J., 381, 175-184, 2004)には，ＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ酵素)，過酸化水素及び塩化物による，ヒアルロナン，コンドロイチン硫酸及び他の基質のクロラミドの形成について記載されている。著者はそれぞれのクロラミドは一定のライフタイムを有すると推定し，そのようなクロラミドの添加剤による分解の詳細な記載を提供している。別の非常に興味深い論文(Rees M. D. et al. , 125, 13719-13733J. Am. Chem. Soc., 2003)には，アミド基を含む単糖，オリゴ糖及び多糖のＮａＣｌＯとの反応について記載されている。前述の論文は，Ｃｕ2+及び酸素のような他の試薬及び物質の存在下及び不存在下の両方における，各々３５％及び１６％の修飾度を有するヒアルロナン並びにコンドロイチン硫酸のクロラミドの安定性の完全な分析を含んでいる。この分解がある種の金属の存在によってかなり加速されることが見出された。ヒアルロナン，及びコンドロイチン硫酸のポリマーのクロラミドの５０ ℃の温度における急速な分解は，金属がない状態でさえ観察された。この分解は，より低い温度では著しく遅かった。直接観察の結果は，さらに過酸化水素の存在下及び生理学的な量の塩化物の存在下で生じるＭＰＯとグリコサミノグリカンとの反応が少量のグリコサミノグリカンクロラミドを生成することを示す。従って，著者は該クロラミドも生体内で生成されるという結論に達した。
【００１０】
上記の資料に基づいて，低い修飾度を有するヒアルロナンクロラミドは，既知ではあっても，それらを生物医学的な用途のための組成物を調製するのに適切なものとする十分な安定性を有することを期待できないという結論になった。
【００１１】
Ｎ−ハロゲン化ポリマーの利用
このセクションは，クロラミン又はクロラミドの選択された，より特殊な利用についてさらに記述する資料を記載する。
【００１２】
要約している論文(Hui F. et al., Biomacromolecules, 14, 585-601, 2013)は，−Ｎ−ハロゲン結合を有する様々な材料の調製，分析及び利用について記述している。それにも拘わらず，前述の要約はヒアルロン酸に言及しておらず，その記載は構造の点で最も近い関連物質であると考えられるキトサンに関するものである。可能な塩素化剤の中で，トリクロロイソシアヌル酸及びより反応性の低いその類似化合物，ジクロロイソシアヌル酸ナトリウムが言及された。上記の材料の利用の一般的な利点は，広範囲の微生物に対する有効性，長期安定性，再生可能性，ヒト及び自然に対する安全性，並びにその低いコストにある。記述した用途の大多数では，主にN-hal基に隣接する水素(アルファ水素)を有する炭素がない場合に，通常比較的よい安定性が観察されたＮ−塩素化誘導体が使用された。他方では，αハロゲンが存在する場合，ハロゲン化水素の脱離及びそれに続くイミン多重結合の形成−ＮＨａｌ−ＣＨ→−Ｎ＝Ｃ−が起こり得る。ヒアルロン酸又はキトサンはアルファ水素を含んでおり，そのことはこのタイプの基質(アミノ糖類)が安定性の観点からすると問題かもしれない構造断片を含むことを意味する。
【００１３】
塩素化キトサンの調製，分析及び試験も，論文(Cao Z. et al., Journal of Biomedical Materials Research, Part A, 85, 99-107, 2008)に記載された。フィルムの形態を有する材料が，微生物，Staphylococcus aureus及びEscherichia coli.に対して試験され成功した。前述の材料によるバイオフィルムの形成の顕著な制御も同様に観察された。２５℃における安定性も観察され，そこでは１か月の貯蔵期間後に活性塩素の量の著しい減少が検出され，最終値は初期値の１５％の低さであった。
【００１４】
Ｃｌ2の溶液との反応で調製されたフィルムの形態のＮ−塩素化ポリウレタン(Luo J. et al., J Bioact Compat Polym, 30, 157-166, 2015)が，微生物，Staphylococcus aureus (グラム陽性菌)，Escherichia coli (グラム陰性菌)及びCandida albicans(真菌類)に対して試験され成功した。この材料は，細菌の増殖を顕著に抑えた上，バイオフィルムの形成を著しく制御した。
【００１５】
広範囲の基質のＮ−クロラミンの調製及び使用に特許が請求された(Heller A. et al., WO 2008/094664)。該基質はさらに下記の生体高分子を含んでいた:Ｎ−塩素化キトサン，Ｎ−塩素化ポリリシン，及び塩素がヒアルロナンアミドには存在しないが脱アセチル化アミンには存在するＮ−塩素化脱アセチル化ヒアルロン酸。ここで使用された形態はそれぞれのクロラミンを含む溶液又は包帯を含んでいた。局所適用した場合，該材料は顕著な痛み及び痒みの軽減を与えた。このクロラミンの調製においては，多数の試薬，例えばＨＯＣｌ，ＮａＣｌＯ，ＨＣｌＯ2，Ｎ−クロロスクシンイミド，Ｎ−クロロスルホンアミドの塩，分子状塩素，塩化チオニル，ホスゲン，ＰＣｌ3及びＰＣｌ5が言及されている。
【００１６】
一般に，より高い修飾度(５０％以上)を有するヒアルロン酸のクロラミドは，まだ記述されていないと言える。既知のクロラミドは，より低い修飾度(せいぜい３５％)を有するものしか含まず，不十分な安定性に関する理由により実用化についてもこれまで記述されていない。しかし，実際，ここで論じられる材料は，次の必要条件を同時に満たすであろうという点で独特であろう:
・生物学的適合性及び生物学的分解性(例えば，人体内の特定の炎症過程に関連して生じる)
・広範囲の微生物，真菌類及びウイルスの増殖抑制(クロラミド及びクロラミンと同様の)
・治癒プロセスに対する好ましい効果(ヒアルロン酸の存在に起因して)
・広範囲の形態を製造する可能性(有効成分がそれを保持するポリマーに共有結合によって結合されるという事実に起因して)
【００１７】
一般に，前述の組み合わせは，抗ウイルス性を必要とする外用・内服用の両方，そして同時に生体適合性の創傷ドレッシング，充填材，抗接着性のバリア（barriers)，膜（membranes），ポケット（pockets）又はラップ(wraps）との関連で望ましい。
【００１８】
本発明は，ヒアルロナンクロラミドを含有し，抗菌及び抗ウイルス作用並びに治癒効果を示す，安定な，生体適合性及び生分解性の組成物の調製及び使用を解決する。さらに，大きく調節可能な表面積，機械的又は流動学的性質及び分解時間を有する，広範囲の形態が記載されている。
【００１９】
発明の要約
本発明の主題は，アミド基：−ＮＨ−ＣＯ−の水素原子が構造式：−ＮＣｌ−ＣＯ−に従って塩素で置換され，その置換度が５０〜１００％であるヒアルロン酸又は修飾されたヒアルロン酸の塩素化誘導体である。したがって，前記修飾されたヒアルロン酸がいくつかの−ＯＨ基が−ＯＣＯＲ2基で置換され及び／又はいくつかの−ＣＨ2−ＯＨ基が−ＣＨ＝Ｏで置換され及び/又はいくつかの−ＣＯ−ＯＨ基が−ＣＯ−ＯＲ2基で置換されたヒアルロン酸（式中，Ｒ2は１〜１７個の炭素原子を含む直鎖又は芳香族鎖である）である。好ましくは前記ヒアルロン酸誘導体がエチルエステル，ベンジルエステル，ホルミル，ラウロイル（Ｃ１２），パルミトイル（Ｃ１６），カプロイル（Ｃ６）からなる群より選択される。前記誘導体の分子量が好ましくは５〜５００kg.mol-1であり，修飾の程度が１〜１００％である。
【００２０】
さらに，本発明は化学修飾が，窒素原子に結合した塩素原子を含む試薬により，好ましくはトリクロロイソシアヌル酸により又はジクロロイソシアヌル酸の塩により実現される，ヒアルロナンクロラミドの調製方法に関する。本発明の方法は特に，分子量が４０〜２２００kg.mol-1である最初のヒアルロン酸又はその修飾された誘導体の水溶液を調製し，その濃度は０．５〜５重量％であり，ヒアルロン酸二糖に対して０．２〜７当量の酢酸を用いてｐＨを２．５〜７．５，好ましくは４〜６の範囲に合わせ，そしてその後ヒアルロナンの二糖に対して０．３〜１．５当量，好ましくは２〜４当量の量の塩素化剤を添加し，その混合物を５〜４０℃の温度で５〜７２時間反応させ，その後，生じたクロラミドを沈殿により単離する。最初の基質は，ヒアルロン酸又はその化学的に修飾された誘導体であり得，そのような基質の分子量は，４０〜２２００kg.mol-1の範囲である。
【００２１】
さらに，本発明の主題は，アミド基の水素原子の大多数が塩素原子により置換され，その結果，酸化反応及び還元反応の両方において増加した反応性を示す，ヒアルロナンクロラミドを含有する組成物である。最終組成物は，化学的修飾がカルボキシル及び／又は水酸基に対して存在する修飾されたヒアルロン酸をさらに含んでいてもよい。本発明による組成物は抗菌，抗真菌及び抗ウイルス活性を示す。前記組成物に含まれるクロラミドの濃度は，１０〜９９重量％の範囲であり，水，塩化ナトリウム，塩化カルシウム，グリセロール，ヒアルロン酸，コンドロイチン硫酸，アルギン酸ナトリウム，オキシセルロース，カルボキシメチルセルロース，ヒドロキシエチルセルロース，又はいくつかの−ＯＨ基が−ＯＣＯＲ2基で置換され及び／又はいくつかの−ＣＨ2−ＯＨ基が−ＣＨ＝Ｏで置換され及び/又は−ＣＯ−ＯＨ基が−ＣＯ−ＯＲ2基で置換された修飾されたヒアルロン酸（式中，Ｒ2は１〜１７個の炭素原子を含む直鎖又は芳香族鎖である）からなる群から選択された添加剤を含有する。前記組成物は，例えば，水溶液中の溶液又はゲルの形態であってよく，最終組成物中のヒアルロナンクロラミドの含有量は，乾燥物質に換算して計算して１０〜１００％の範囲内である。該組成物はまた，自己支持性フィルム，凍結乾燥物，ステープルファイバーの層(不織布)，エンドレスファイバー，織物，ニット布，組物，又はナノファイバー層のような固体形態の形態をとることができ，前記組成物は，最終組成物中のヒアルロナンクロラミドの含有量は，乾燥物質に換算して計算して１０〜１００％の範囲内である。
【００２２】
本発明の塩素化誘導体並びに本発明の組成物は，創傷被覆材の製造又は移植可能な医療機器の製造に使用可能である。該適用の非制限的例として，吻合を行なった後の癒着の予防のための生成物，又は離開の予防のための生成物，又は他の物質との組み合わせで，腹壁欠陥の外科的修復のための又は医療機器のための移植可能なラッパー(wrapper)の組成物の一部としての製品が含まれる。
【００２３】
最終組成物の調製はさらに，ヒアルロナンクロラミドを含む下記の形態の提供を含む:
・自己支持性フィルム，凍結乾燥物，ステープルファイバーの層(不織布)，エンドレスファイバー，織物，ニット布，組物，又はナノファイバー層のような固体形態，それらの全ては所望によりさらに添加剤を含む
・液体形態，特に所望によりさらに添加剤を含むクロラミド水溶液。
【００２４】
該添加剤の非制限的な例は以下のとおりである:ポリエチレンオキシド，ヒアルロン酸，コンドロイチン硫酸，エステルの形態の修飾したヒアルロン酸，アルデヒドの形態の修飾したヒアルロン酸，アルギン酸ナトリウム，オキシセルロース，カルボキシメチルセルロース，ヒドロキシエチルセルロース，脂肪酸のエステル，塩化ナトリウム，塩化カリウム又は塩化カルシウム。
【００２５】
さらに，本発明は，特に次の特性又は次の特性の任意の組み合わせが必要とされる分野における，該組成物の使用に関する:
・酸化性又は還元性又は抗菌性又は抗真菌剤又は抗ウイルス活性
・生物学的適合性及び生分解性
・好適な安定度を有する様々な形態を調製する可能性
・制御した生分解速度の可能性
・酸化及び還元反応の制御した速度の可能性
・治癒プロセスに対する著しい寄与
【００２６】
ヒアルロナンクロラミドをベースとする安定な液体組成物は，ヒアルロナンクロラミドと反応する添加剤を含むべきではない。これは，特に酸化に対して感受性の高い化合物(その場合には，ヒアルロナンクロラミドは還元の対象で，酸化剤として作用する)及び／又は酸素ラジカルを含むもののような強い酸化剤(その場合には，ヒアルロナンクロラミドは酸化の対象となり，還元剤として作用する)にあてはまる。安定な固体の組成物については，ヒアルロナンクロラミドはそれと反応する添加剤と組み合わせることができる。しかしながらそれは，ヒアルロナンクロラミドの溶液と添加剤の溶液を本発明の調製方法の間に接触させ得ない場合のみ，適用可能である。
【００２７】
最終組成物の制御された生分解速度は，ヒアルロナンクロラミドを，アルギン酸ナトリウム，カルボキシメチルセルロース又は化学的に修飾されたヒアルロン酸のようなより遅い分解性を示す添加剤と組み合わせること，及び／又は，ヒアルロナンクロラミドそれ自体を例えば多価のＣａ2+陽イオンで架橋することによって達成できる。
【００２８】
酸化成分の制御された放出速度は最終組成物の膨潤（swelling)のような物性を変えることにより，特により低い極性の添加剤の添加により達成できる。より低い極性の添加剤の非制限的な例は，ヒアルロン酸の化学的に修飾された誘導体，いくつかの−ＯＨ基が−ＯＣＯＲ2基によって置換された及び／又はＣＯＯＨ基が−ＣＯＯＲ2基によって置換された該誘導体（式中，Ｒ2は１〜１７個の炭素原子を含む直鎖又は芳香族鎖である）に代表される。
【００２９】
最終組成物は，生物医学的な用途，特に創傷ドレッシング，痙瘡に対する製剤，抗菌性の充填材，抗接着性のバリア，膜，ポケット又はラップの製造ために使用可能である。
【００３０】
本発明は，治癒効果を伴う抗菌・抗ウイルス性を示す，ヒアルロナンクロラミドを含む安定な，生体適合性及び生分解性の組成物の調製及び使用に関する。該材料の安定性は実施例１６に記載されている。さらに，大きく調節可能な表面積，機械的又は流動学的性質及び分解時間を有する広範囲の形態が記載されている。
【００３１】
本発明による技術的解決法の実際の実行は，技術的な観点から複雑ではなく，また，入手しにくい化学薬品，溶剤又は単離手段を使用することを要しない。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
無し
【００３３】
図面の詳細な説明
図１Ａ，１Ｂ−  実施例２５により調製したヒアルロナンクロラミドをベースとする凍結乾燥物の形態を有する組成物の抗菌活性。
この図は，実施例２５により調製されたヒアルロナンクロラミドをベースとする可溶性の凍結乾燥物（図１Ａ）の存在下での，対照材料，即ち凍結乾燥した天然のヒアルロン酸（図１Ｂ）と比較した，微生物，Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida Albicans, Pseudomona aeruginosa, Staphylolococus epidermisの増殖抑制を示す。抗菌活性の測定方法は実施例４３に記載されている。
図２−実施例３２によって調製されたヒアルロナンクロラミドをベースとするフィルムの形態を有する組成物の抗菌活性。
この図は，ラウリン酸によってエステル化されたヒアルロナンによって構成された添加剤を含むヒアルロナンクロラミドをベースとする実施例３２によって調製された不溶性フィルムの存在下での，実施例３１によって調製された対照材料と比較した，微生物，Bacillus subtilis, Escherichia coli and Staphylococcus aureusの増殖抑制を示す。抗菌活性の測定方法は実施例４３に記載されている。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
ＤＳ＝置換度＝１００%ｘ(修飾されたポリマー単位のモル量)／(全てのポリマー単位の総モル量)
別段の定めがない限り，ここに使用される表現「当量」(eq)は，ヒアルロナンの二糖のようなそれぞれの多糖類の繰り返し単位についてのものである。別段の定めがない限り，パーセントは重量パーセントである。
ここに使用される限り，ポリマーの分子量はSEC-MALLS方法によって決定した重量平均値を表す。
【００３５】
実施例１
ヒアルロナンのエチルエステルの調製
ヒアルロナン水溶液(１g，３００ kg.mol-1，４０mlの水中)にＮａＯＨをｐＨ値が９に達するまで添加した。続いて，２０mlのジメチルスルホキシド及び０．０８mlのヨウ化エチルを添加し，生じた混合物を，３日間４５℃の温度で撹拌した。その後，生じた混合物を，１００％のイソプロパノール１４０mlによって沈殿させ，濾過によって分離した固形物をイソプロパノールで洗浄し，真空乾燥した。この生成物(８９７mg)をＮＭＲによって分析した。
このエステルのＤＳ値は６％（ＮＭＲにより測定した。文献：Kettou S. et al., CZ PV 2009-399)であった。
【００３６】
実施例２
ヒアルロナンのベンジルエステルの調製
ヒアルロナン水溶液(１g，３００kg.mol-1，４０mlの水中)にＮａＯＨをｐＨ値が９に達するまで添加した。続いて，２０mlのジメチルスルホキシド及び０．０８mlの臭化ベンジルを添加し，生じた混合物を，４日間２０℃の温度で撹拌した。その後，生じた混合物を，１００％のイソプロパノール１４０mlによって沈殿させ，濾過によって分離した固形物をイソプロパノールで洗浄し，真空乾燥した。最終生成物(９２０mgの量で得られた)をＮＭＲによって分析した。
このエステルのＤＳ値は３％（ＮＭＲにより測定した。文献：Kettou S. et al., CZ PV 2009-399)であった。
【００３７】
実施例３
ヒアルロナンのラウロイルの調製
７０mlのテトラヒドロフラン，４当量のトリエチルアミン及び０．１当量の４−ジメチルアミノピリジンを，蒸留水１００ml中のヒアルロナン(５g，２５０kg.mol-1)の溶液に添加した。同時に，ラウリン酸（４当量)を，３０mlのテトラヒドロフラン及び７mlのトリエチルアミンの混合物に溶解し，得られた溶液に，０〜５℃で１５分間で４．８mlのエチルクロロホルメートを添加した。続いて，生じた懸濁液を，前記ヒアルロナンの溶液に濾過して入れ，その反応混合物を２０℃で５時間撹拌した。生じた溶液を，１００％のイソプロパノール４００mlを加えることにより沈殿させ，８０％のイソプロパノールで，そして次に１００％のイソプロパノールで洗浄した。その後，その沈殿を４０℃で２日間乾燥した。置換度はＮＭＲによって測定され３７％であった。
【００３８】
実施例４
ヒアルロナンのホルミルの調製
ＮａＣｌ１％，ＫＢｒ１％，Ｎ−アセチルアミノ−ＴＥＭＰＯ(０．０１当量）及びＮａＨＣＯ3（２０当量）を含有するＨＡ（１g，２００kg.mol-1)の１％水溶液に，窒素雰囲気下でＮａＣｌＯ（０．５当量)の水溶液を徐々に添加した。この混合物を１０℃で１２時間撹拌し，そこに０．１gのエタノールを添加した。続いて，最終混合物をもう1時間撹拌した。生じた溶液を蒸留水で希釈して０．２％の濃度にし，混合物（０．１％ＮａＣｌ，０．１％ＮａＨＣＯ3）に対して５リットル３回（１ｘ１日），その後蒸留水に対して５リットル７回（２ｘ１日）透析した。最終溶液を蒸発させ分析した。ＤＳ９％（ＮＭＲで決定した）。
【００３９】
実施例５
ヒアルロナンクロラミドの調製
５gのヒアルロナン(Ｍｗ２２００kg.mol-1）を２５０mlの蒸留水に溶解した。続いて，２mlの酢酸を添加し，その溶液を２０℃で１５分間撹拌した。その後，３．２g(１当量)の量のジクロロイソシアヌル酸のナトリウム塩を添加した。その後，該混合物を２０℃の温度で２４時間撹拌した。続いて，該混合物を２．５リットルのイソプロパノールによって沈殿させ濾過した。固体の部分を２リットルのイソプロパノールで洗浄し，２０時間真空乾燥した。ＤＳ８２％（ＮＭＲによって決定した)。
【００４０】
実施例６
ヒアルロナンクロラミドの調製
５gのヒアルロナン（Ｍｗ４０kg.mol-1）を，１００mlの蒸留水に溶解した。続いて，２mlの酢酸を添加し，該溶液を２０℃の温度で１５分間撹拌した。その後，３．２g（１当量)の量のジクロロイソシアヌル酸のナトリウム塩を添加した。その後，その混合物を２０℃の温度で２４時間撹拌した。続いて，該混合物を２．５リットルのイソプロパノールによって沈殿させ濾過した。固体の部分を２リットルのイソプロパノールで洗浄し，２０時間真空乾燥した。ＤＳ８３％（ＮＭＲから決定した)。
【００４１】
実施例７
ヒアルロナンクロラミドの調製
５gのヒアルロナン（Ｍｗ２２００kg.mol-1）を１０００mlの蒸留水に溶解した。続いて，２mlの酢酸を添加し，その溶液を２０℃の温度で１５分間撹拌した。その後，３．２g（１当量)の量のジクロロイソシアヌル酸のナトリウム塩を添加した。その後，その混合物を２０℃の温度で２４時間撹拌した。続いて，その混合物を２．５リットルのイソプロパノールによって沈殿させ濾過した。固体の部分を２リットルのイソプロパノールで洗浄し，２０時間真空乾燥した。ＤＳ７２％（ＮＭＲから決定した)。
【００４２】
実施例８
ヒアルロナンクロラミドの調製
５gのヒアルロナン（Ｍｗ２２００kg.mol-1）を２５０mlの蒸留水に溶解した。続いて，０．１４mlの酢酸（０．２当量)を添加し，その溶液を２０℃で１５分間撹拌した。その後，３．２g（１当量）の量のジクロロイソシアヌル酸のナトリウム塩を添加した。その後，該混合物を２０℃の温度で２４時間撹拌した。続いて，その混合物を２．５リットルのイソプロパノールによって沈殿させ濾過した。固体の部分を２リットルのイソプロパノールで洗浄し，２０時間真空乾燥した。ＤＳ５３％（ＮＭＲから決定した)。
【００４３】
実施例９
ヒアルロナンクロラミドの調製
５gのヒアルロナン（Ｍｗ１８０kg.mol-1）を２５０mlの蒸留水に溶解した。続いて，３mlの酢酸を添加し，その溶液を２０℃の温度で１５分間撹拌した。その後，３．２g（１当量）の量のジクロロイソシアヌル酸のナトリウム塩を添加した。その後，その混合物を２０℃の温度で２４時間撹拌した。続いて，その混合物を２．５リットルのイソプロパノールによって沈殿させ濾過した。固体の部分を２リットルのイソプロパノールで洗浄し，２０時間真空乾燥した。ＤＳ８３％（ＮＭＲから決定した）。
【００４４】
実施例１０
ヒアルロナンクロラミドの調製
５gのヒアルロナン（Ｍｗ２２００kg.mol-1）を２５０mlの蒸留水に溶解した。続いて，５mlの酢酸（７当量）を添加し，その溶液を２０℃の温度で１５分間撹拌した。その後，３．２g（１当量）の量のジクロロイソシアヌル酸のナトリウム塩を添加した。その後，その混合物を２０℃の温度で２４時間撹拌した。続いて，その混合物を２．５リットルのイソプロパノールによって沈殿させ濾過した。固体の部分を２リットルのイソプロパノールで洗浄し，２０時間真空乾燥した。ＤＳ９５％（ＮＭＲから決定した）。
【００４５】
実施例１１
ヒアルロナンクロラミドの調製
５gのヒアルロナン（Ｍｗ２２００kg.mol-1）を２５０mlの蒸留水に溶解した。続いて，２mlの酢酸を添加し，その溶液を２０℃の温度で１５分間撹拌した。その後，１．０７g（０．３３当量）の量のジクロロイソシアヌル酸のナトリウム塩を添加した。その後，その混合物を２０℃の温度で２４時間撹拌した。続いて，その混合物を２．５リットルのイソプロパノールによって沈殿させ濾過した。固体の部分を２リットルのイソプロパノールで洗浄し，２０時間真空乾燥した。ＤＳ５１％（ＮＭＲから決定した）。
【００４６】
実施例１２
ヒアルロナンクロラミドの調製
５gのヒアルロナン（Ｍｗ２２００kg.mol-1）を２５０mlの蒸留水に溶解した。続いて，２mlの酢酸を添加し，その溶液を２０℃の温度で１５分間撹拌した。その後，４．８g（１．５当量）の量のジクロロイソシアヌル酸のナトリウム塩を添加した。その後，その混合物を２０℃の温度で２４時間撹拌した。続いて，その混合物を２．５リットルのイソプロパノールによって沈殿させ濾過した。固体の部分を２リットルのイソプロパノールで洗浄し，２０時間真空乾燥した。ＤＳ９６％（ＮＭＲから決定した）。
【００４７】
実施例１３
ヒアルロナンクロラミドの調製
５gのヒアルロナン（Ｍｗ２２００kg.mol-1）を２５０mlの蒸留水に溶解した。続いて，２mlの酢酸を添加し，その溶液を２０℃の温度で１５分間撹拌した。その後，２．９１g（１当量）の量のトリクロロイソシアヌル酸を添加した。その後，その混合物を２０℃の温度で２４時間撹拌した。続いて，その混合物を２．５リットルのイソプロパノールによって沈殿させ濾過した。固体の部分を２リットルのイソプロパノールで洗浄し，２０時間真空乾燥した。ＤＳ９７％（ＮＭＲから決定した）。
【００４８】
実施例１４
ヒアルロナンクロラミドの調製
５gのヒアルロナン（Ｍｗ２２００kg.mol-1）を２５０mlの蒸留水に溶解した。続いて，２mlの酢酸を添加し，その溶液を２０℃の温度で１５分間撹拌した。その後，０．８７g（０．３当量）の量のトリクロロイソシアヌル酸を添加した。その後，その混合物を２０℃の温度で２４時間撹拌した。続いて，その混合物を２．５リットルのイソプロパノールによって沈殿させ濾過した。固体の部分を２リットルのイソプロパノールで洗浄し，２０時間真空乾燥した。ＤＳ７１％（ＮＭＲから決定した）。
【００４９】
実施例１５
ヒアルロナンクロラミドの調製
５gのヒアルロナン（Ｍｗ２２００kg.mol-1）を２５０mlの蒸留水に溶解した。続いて，２mlの酢酸を添加し，その溶液を２０℃の温度で１５分間撹拌した。その後，３．２g（１当量）の量のジクロロイソシアヌル酸のナトリウム塩を添加した。その後，その混合物を２０℃の温度で５時間撹拌した。続いて，その混合物を２．５リットルのイソプロパノールによって沈殿させ濾過した。固体の部分を２リットルのイソプロパノールで洗浄し，２０時間真空乾燥した。ＤＳ５２％（ＮＭＲから決定した）。
【００５０】
実施例１６
ヒアルロナンクロラミドの調製
５gのヒアルロナン（Ｍｗ２２００kg.mol-1）を２５０mlの蒸留水に溶解した。続いて，２mlの酢酸を添加し，その溶液を２０℃の温度で１５分間撹拌した。その後，３．２g（１当量）の量のジクロロイソシアヌル酸のナトリウム塩を添加した。その後，その混合物を２０℃の温度で４８時間撹拌した。続いて，その混合物を２．５リットルのイソプロパノールによって沈殿させ濾過した。固体の部分を２リットルのイソプロパノールで洗浄し，２０時間真空乾燥した。ＤＳ８５％（ＮＭＲから決定した）。ＮＭＲ溶液（Ｄ2Ｏ０．７ml中の７mgの生成物）を，２０℃でさらに５日間放置した後に測定した。ＤＳ値は８４％と決定された。粉末の形態の固体部分は２０℃で１００日間放置し，その後，その試料をＤ2Ｏに溶解した。ＤＳ値は８４％と決定された。
【００５１】
実施例１７
ヒアルロナンクロラミドの調製
５gのヒアルロナン（Ｍｗ２２００kg.mol-1）を２５０mlの蒸留水に溶解した。続いて，２mlの酢酸を添加し，その溶液を２０℃の温度で１５分間撹拌した。その後，３．２g（１当量）の量のジクロロイソシアヌル酸のナトリウム塩を添加した。その後，その混合物を５℃の温度で７２時間撹拌した。続いて，その混合物を２．５リットルのイソプロパノールによって沈殿させ濾過した。固体の部分を２リットルのイソプロパノールで洗浄し，２０時間真空乾燥した。ＤＳ６４％（ＮＭＲから決定した）。
【００５２】
実施例１８
ヒアルロナンクロラミドの調製
５gのヒアルロナン（Ｍｗ２２００kg.mol-1）を２５０mlの蒸留水に溶解した。続いて，２mlの酢酸を添加し，その溶液を２０℃の温度で１５分間撹拌した。その後，３．２g（１当量）の量のジクロロイソシアヌル酸のナトリウム塩を添加した。その後，その混合物を４０℃の温度で５時間撹拌した。続いて，その混合物を２．５リットルのイソプロパノールによって沈殿させ濾過した。固体の部分を，２リットルのイソプロパノールで洗浄し，２０時間真空乾燥した。ＤＳ７５％（ＮＭＲから決定した）。
【００５３】
実施例１９
ヒアルロナンクロラミドの調製
５gのヒアルロナン（Ｍｗ３００kg.mol-1）を２５０mlの蒸留水に溶解した。続いて，２mlの酢酸を添加し，その溶液を２０℃の温度で１５分間撹拌した。その後，２．５６g（０．８当量）の量のジクロロイソシアヌル酸のナトリウム塩を添加した。その後，その混合物を２０℃の温度で２４時間撹拌した。続いて，その混合物を２．５リットルのイソプロパノールによって沈殿させ濾過した。固体の部分を２リットルのイソプロパノールで洗浄し，２０時間真空乾燥した。ＤＳ７９％（ＮＭＲから決定した）。
【００５４】
実施例２０
ヒアルロナンクロラミドの調製
５gのヒアルロナン（Ｍｗ３００kg.mol-1）を３５０mlの蒸留水に溶解した。続いて，２mlの酢酸を添加し，その溶液を２０℃の温度で５分間撹拌した。その後，２．５６g（０．８当量）の量のジクロロイソシアヌル酸のナトリウム塩を添加した。その後，その混合物を１７℃の温度で２２時間撹拌した。続いて，その混合物を２．５リットルのイソプロパノールによって沈殿させ濾過した。固体の部分を２リットルのイソプロパノールで洗浄し，２０時間真空乾燥した。ＤＳ６６％（ＮＭＲから決定した）。
【００５５】
実施例２１
ヒアルロナンクロラミドの調製
５gのヒアルロナン（Ｍｗ３００kg.mol-1）を２５０mlの蒸留水に溶解した。続いて，２mlの酢酸を添加し，その溶液を５℃の温度で１５分間撹拌した。その後，２．５６g（０．８当量）の量のジクロロイソシアヌル酸のナトリウム塩を添加した。その後，その混合物を５℃の温度で２４時間撹拌した。続いて，その混合物を２．５リットルのイソプロパノールによって沈殿させ濾過した。固体の部分を２リットルのイソプロパノールで洗浄し，２０時間真空乾燥した。ＤＳ５０％（ＮＭＲから決定した）。
【００５６】
実施例２２
ヒアルロナンのエチルエステルのクロラミドの調製
実施例１によって調製したヒアルロナンエチルエステル０．５gを２５mlの蒸留水に溶解した。続いて，０．２mlの酢酸を添加し，その溶液を２０℃の温度で１５分間撹拌した。その後，０．３２g（１当量）の量のジクロロイソシアヌル酸のナトリウム塩を添加した。その後，その混合物を２０℃の温度で２４時間撹拌した。続いて，その混合物を２５０mlのイソプロパノールによって沈殿させ濾過した。固体の部分を０．２リットルのイソプロパノールで洗浄し，２０時間真空乾燥した。ＤＳ８０％（ＮＭＲから決定した）。
【００５７】
実施例２３
ヒアルロナンのベンジルエステルのクロラミドの調製
実施例２によって調製したヒアルロナンのベンジルエステル０．５gを，２５mlの蒸留水に溶解した。続いて，０．２mlの酢酸を添加し，その溶液を２０℃の温度で１５分間撹拌した。その後，０．３２g（１当量）の量のジクロロイソシアヌル酸のナトリウム塩を添加した。その後，その混合物を２０℃の温度で２４時間撹拌した。続いて，その混合物を０．２５リットルのイソプロパノールによって沈殿させ濾過した。固体の部分を０．２リットルのイソプロパノールで洗浄し，２０時間真空乾燥した。ＤＳ７８％（ＮＭＲから決定した）。
【００５８】
実施例２４
ヒアルロナンのホルミルの調製
実施例４によって調製したヒアルロナンホルミル０．５gを２５mlの蒸留水に溶解した。続いて，０．２mlの酢酸を添加し，その溶液を２０℃の温度で１５分間撹拌した。その後，０．３２g（１当量）の量のジクロロイソシアヌル酸のナトリウム塩を添加した。その後，その混合物を２０℃の温度で２４時間撹拌した。続いて，その混合物を０．２５リットルのイソプロパノールによって沈殿させ濾過した。固体の部分を０．２リットルのイソプロパノールで洗浄し，２０時間真空乾燥した。ＤＳ７５％（ＮＭＲから決定した）。
【００５９】
実施例２５
凍結乾燥したヒアルロナンクロラミドの調製
蒸留水１０ml中の実施例５により調製された０．２gのヒアルロナンクロラミドの溶液を直ちに均質化に続いて，−５０℃の温度で急速冷凍し，凍結乾燥した。ＤＳ値はＮＭＲによって７０％として決定した。
【００６０】
実施例２６
ヒアルロナンのエチルエステルの凍結乾燥したクロラミドの調製
蒸留水中１０ml中の実施例２２により調製されたヒアルロナンのエチルエステルのクロラミド０．２gの溶液を，均質化に続いて直ちに−５０℃の温度で急速冷凍し，凍結乾燥した。ＤＳ値はＮＭＲによって６８％と決定された。
【００６１】
実施例２７
凍結乾燥したヒアルロナンのベンジルエステルのクロラミドの調製
蒸留水中１０ml中の実施例２３により調製されたヒアルロナンのベンジルエステルのクロラミド０．２gの溶液を，均質化に続いて直ちに−５０℃の温度で急速冷凍し，凍結乾燥した。ＤＳ値はＮＭＲによって６７％と決定された。
【００６２】
実施例２８
ヒアルロナンクロラミドで作られたステープルファイバーからの不織布の製造
２％溶液の調製のために，ＮＭＲによる置換度が７１％のヒアルロナンクロラミド（実施例１４）を使用した。上記の成分を秤量し，必要な量の蒸留水を添加した。全混合物を，室温で，攪拌機中，該攪拌機の規定速度を５００rpmとして，撹拌時間２４時間で撹拌した。最終溶液は透明で，わずかに粘性であった。ステープルファイバーの製造法は，１００％のイソプロパノールを含む可動の凝固浴の液流中の高分子溶液の析出をベースとする。続いて，上記溶液を，糸道ダクト（１管／直径８mm）を通して供給される凝固浴流中へ押出ノズルにより室温でドーズした。この浴の制御した流速は１．１５m/sである。ステープルファイバーの形成は析出によって得られた。形成されたファイバーを浴流中に漂わせ，分離コーム（separation combs）に捕獲し，１００％イソプロパノールを含む熟成浴に移した。熟成浴に入れた直後に，この粗ファイバー（raw fiber）を，ファイバーの量と浴の量の比率０．５g/３５０mlで，攪拌機の回転ブレードによって粉砕した。最終的な繊維の分散液をフィルターフレームを通し多孔基材を通して濾過した。与えられた実験については，表面積６４cm2のフィルターフレームを使用した。濾過した後に，不織布の固着と共に，ＰＡＤニットファブリックを用いてファイバーを乾燥装置上に移した。乾燥装置上に置かれる前に，析出残渣をローラーでファイバーから取り除いた。この不織布を４０℃の温度で３０分間乾燥した。生じた層を，自己支持性層として基材から分離し，化学天秤によって秤量した。織物の面積重量は５０．２g/m2であった。形成した不織布の置換度はＮＭＲによって６４％と決定された。
【００６３】
実施例２９
ヒアルロナンクロラミドからのナノファイバー層の製造
ヒアルロン酸を含むナノファイバー層の製造のために，下記の組成の水溶液を調製した。実施例５により調製されたヒアルロナンクロラミドの濃度は乾燥分で３７．５％であり，８０kg.mol-1の分子量の天然のヒアルロナンの濃度は３７．５％であり，６００kg.mol-1の分子量のポリエチレンオキシドの量は２５％であった。全乾燥分の濃度は５％であった。この溶液をシリンジに供給し，針なし線状ノズル（a needleless linear nozzle）を用いて，コレクタエミッタ間の電圧５０kV及び間隔１６cmで，プレート型コレクター上の静電場で紡糸した。ファイバーの寸法は１１０±２７nmであった。ＤＳ値はＮＭＲによって３０％と決定された。
【００６４】
実施例３０
ヒアルロナンクロラミドからの自己支持性フィルムの製造
該フィルムの調製を，密閉チャンバーでフィルムを乾燥する特別な乾燥装置中行った。該装置は温度が制御可能な底板及び天板を装備していた。装置の詳細な説明は刊行物（Foglarova et al., PV2015-166; FoglarovaM. Et al., Carbohydrate Polymers 2016, 144, 68-75)に提供されている。実施例５に記載した秤量２００mgのヒアルロナンクロラミドを，２０mlの脱塩水に溶解し，生じた溶液を２時間撹拌した。その後，最終溶液を乾燥装置内のパッド（疎水化ガラス）上にドーズし，１８時間密閉チャンバーで乾燥した。乾燥機の底板及び天板の温度は各々５０℃及び２０℃であった。乾燥した後に，フィルムをパッドから外し，将来の使用のために保管した。ＤＳ値はＮＭＲによって６０％と決定された。
【００６５】
実施例３１
ラウロイルヒアルロナン及び天然のヒアルロナン（４／１）からの自己支持性フィルムの調製
フィルムの調製は実施例３０に記載した装置中で行なった。秤量１６０mgのヒアルロン酸ナトリウムのラウロイル誘導体（実施例３に記載）を，２−プロパノールの水溶液（５０重量％）１６mlに溶解し，生じた溶液を１８時間撹拌した。秤量４０mgの分子量３３０kg.mol-1の天然のヒアルロナンを４mlの脱塩水に溶解し，生じた溶液を１８時間撹拌した。続いて，両方の溶液を混合し３０分間撹拌した。その後，生じた混合溶液を，乾燥装置のパッド（疎水化ガラス）上にドーズし，７時間密閉チャンバーで乾燥した。乾燥機の底板及び天板の温度は各々５０℃及び２０℃であった。乾燥した後に，フィルムをパッドから外し，将来の使用のために保管した。
【００６６】
実施例３２
ラウロイルヒアルロナン及びヒアルロナンクロラミド（３／１）からの自己支持性フィルムの調製
フィルムの調製は実施例３０に記載した装置の中で行なった。秤量１５０mgのヒアルロン酸ナトリウムのラウロイル誘導体（実施例３に記載）を２−プロパノールの水溶液（５０重量％）１５mlに溶解し，生じた溶液を１８時間撹拌した。秤量５０mgの実施例５に記載のヒアルロナンクロラミドを５mlの脱塩水に溶解し，生じた溶液を２時間撹拌した。続いて，両方の溶液を混合し３０分間撹拌した。その後，生じた混合溶液を，乾燥装置のパッド（疎水化ガラス）上にドーズし，７時間密閉チャンバーで乾燥した。乾燥機の底板及び天板の温度は各々５０℃及び２０℃であった。乾燥した後に，フィルムをパッドから外し，将来の使用のために保管した。最終材料中のヒアルロナンクロラミドのＤＳ値はＮＭＲによって２５％と決定された。
【００６７】
実施例３３
ラウロイルヒアルロナン及びヒアルロナンクロラミド（４／１）からの自己支持性フィルムの製造
フィルムの調製は実施例３０に記載した装置の中で行なった。秤量１６０mgのヒアルロン酸ナトリウムのラウロイル誘導体（実施例３に記載）を，１６mlの２−プロパノールの水溶液（５０重量％）に溶解し，生じた溶液を１８時間撹拌した。秤量４０mgの実施例５に記載のヒアルロナンクロラミドを４mlの脱塩水に溶解し，生じた溶液を２時間撹拌した。続いて，両方の溶液を混合し３０分間撹拌した。その後，生じた混合溶液を，乾燥装置のパッド（疎水化ガラス）上にドーズし，７時間密閉チャンバーで乾燥した。乾燥機の底板及び天板の温度は各々５０℃及び２０℃であった。乾燥した後に，フィルムをパッドから外し，将来の使用のために保管した。最終材料中のヒアルロナンクロラミドのＤＳ値はＮＭＲによって２０％と決定された。
【００６８】
実施例３４
ヒアルロナンクロラミドで製造されたファイバーからのニット布の製造
ファイバーの形成に使用した最初の原料は，実施例１４によって調製したヒアルロナンクロラミドであった。脱塩水中に前述のポリマーを溶解させることによって濃度４．７％の溶液を調製した。溶解の後，溶液をシリンジに移し，遠心機によって脱気した。その溶液を，乳酸及びイソプロパノール１：４の混合物からなる凝固浴の中に２００μl/minの速度でドーズした。ファイバーを１．４５m/minの速度で巻き取った。続いて，このファイバーをイソプロピルアルコールで洗浄し，乾燥した。このファイバーには下記の特性があった：９テックスの細さ，１．０Ｎの引張強さ及び１１％の伸び。このクロラミドのＤＳ値はＮＭＲによって３４％と決定された。ニット布を得る目的で，３本のファイバーを，リング型撚糸機中，１０m/分の供給速度及び３０００min-1のスピンドル速度で束ねて縒った；最終的な縒り数は３００ｍ-1であった。二床たて編機（a double-bed warp knitting machine）を使用して，閉ループ結合（a closed-loop binding）を有する両面ウェフトニットをスレッドから製造した。最終的なニットストリップは，１０mmの幅，９９g.m-2の基本重量及び３６cm-2のループ密度を有していた。
【００６９】
実施例３５
ラウロイルヒアルロナン及びヒアルロナンクロラミド（４／１）で製造されたファイバーからのニット布の調製
ファイバーの形成に使用した最初の原料は，実施例３によって調製したラウロイルヒアルロナン４００mgと実施例１４によって調製したヒアルロナンクロラミド１００mgを含むコンビネーションであった。秤量したヒアルロナンクロラミドを６mlの脱塩水に溶解し，５．１mlのイソプロパノール及び秤量したラウロイルヒアルロナン（ＮＭＲによるＤＳ：９１％，ＭＷ３００−３５０kDa）を添加した。調製した溶液（４．５％の濃度であった）を，シリンジへ移し，遠心機によって脱気した。続いて，その溶液を，乳酸及びイソプロパノール１：４の混合物からなる凝固浴中に２００μl/分の速度でドーズした。該ファイバーを１．３２m/分の速度で巻き取った。その後，該ファイバーをイソプロピルアルコールで洗浄し，アセトンで安定化し，乾燥させた。該ファイバーは下記の特性を有していた:８テックスの細さ，０．７Ｎの引張強さ及び１６％の伸び。ニット布を得る目的で，３本のファイバーを，リング型撚糸機中，１０m/minの供給速度及び３０００min-1のスピンドル速度で束ねて縒った；最終的な縒り数は３００m-1であった。二床たて編機を使用して，閉じ目結合を有する両面ウェフトニットをスレッドから製造した。最終的なニットストリップは，１０mmの幅，９１g.m-2の基本重量及び３６cm-2のループ密度を有していた。
【００７０】
実施例３６
凍結乾燥物の調製：酸化セルロース／ヒアルロナンクロラミド
蒸留水１００ml中の酸化セルロース（Ｍｗ５０kg.mol-1）０．３g及び実施例５により調製したヒアルロナンクロラミド０．１gの溶液を，均質化に続いて直ちに−５０℃の温度で急速冷凍し，凍結乾燥した。ヒアルロナンクロラミドのＤＳ値はＮＭＲによって２４％と決定された。
【００７１】
実施例３７
凍結乾燥物の調製：アルギナート／ヒアルロナンクロラミド
蒸留水１００ml中のアルギナート（Ｍｗ４０kg.mol-1）０．３g及び実施例５によって調製したヒアルロナンクロラミド０．１gの溶液を，均質化に続いて直ちに−５０℃の温度で急速冷凍し，凍結乾燥した。ヒアルロナンクロラミドのＤＳ値はＮＭＲによって２６％と決定された。
【００７２】
実施例３８
凍結乾燥物の調製：カルボキシメチルセルロース／ヒアルロナンクロラミド
蒸留水中１００mlのカルボキシメチルセルロース（Ｍｗ３０kg.mol-1）０．３g及び実施例５によって調製したヒアルロナンクロラミド０．０３gの溶液を，均質化に続いて直ちに−５０℃の温度で急速冷凍し，凍結乾燥した。ヒアルロナンクロラミドのＤＳ値はＮＭＲによって３％と決定された。
【００７３】
実施例３９
凍結乾燥物の調製：コンドロイチン硫酸／ヒアルロナンクロラミド
蒸留水１００ml中のコンドロイチン硫酸（Ｍｗ４５kg.mol-1）０．０３g及び実施例５によって調製したヒアルロナンクロラミド０．３gの溶液を，均質化に続いて直ちに−５０℃の温度で急速冷凍し，凍結乾燥した。ヒアルロナンクロラミドのＤＳ値はＮＭＲによって７５％と決定された。
【００７４】
実施例４０
凍結乾燥物の調製：ヒドロキシエチルセルロース／ヒアルロナンクロラミド
蒸留水１００ml中のヒドロキシエチルセルロース（Ｍｗ４５kg.mol-1）０．３g及び実施例５によって調製したヒアルロナンクロラミド０．１gの溶液を，均質化に続いて直ちに−５０℃の温度で急速冷凍し，凍結乾燥した。ヒアルロナンクロラミドのＤＳ値はＮＭＲによって２５％決定された。
【００７５】
実施例４１
凍結乾燥物の調製：ヒアルロナンホルミル／ヒアルロナンクロラミド
蒸留水１００ml中の実施例４によって調製したホルミル・ヒアルロナン（Ｍｗ４５kg.mol-1）０．３g及び実施例５によって調製したヒアルロナンクロラミド０．１gの溶液を，均質化に続いて直ちに−５０℃の温度で急速冷凍し，凍結乾燥した。ヒアルロナンクロラミドのＤＳ値はＮＭＲによって２５％と決定された。
【００７６】
実施例４２
凍結乾燥物の調製：ＣａＣｌ2で架橋したヒアルロナンクロラミド
蒸留水１００ml中の実施例５によって調製したヒアルロナンクロラミド（０．１g）の溶液に０．０１gのＣａＣｌ2．２Ｈ2Ｏを添加し，その混合物を２０℃で１時間撹拌した。均質化に続いて，最終粘稠溶液を−５０℃の温度で急速冷凍し，凍結乾燥した。ヒアルロナンクロラミドのＤＳ値はＮＭＲによって６４％と決定された。
【００７７】
実施例４３
インビトロ抗菌活性試験（図１及び２）：
試験する個々の微生物について，約１０5のCFU/mlの濃度を有する懸濁液を調製した。１００μlの量の懸濁液を，ペトリ皿中のトリプトンソイ寒天の表面上に接種した（各皿に適用した微生物の概数は１０4CFUであった）。その懸濁液を，滅菌ループにより皿の全表面に一様に広げた。寒天に懸濁液を吸収させた後に，寒天の表面を試験のために選択された無菌の正方形の試料で覆った。試験する細菌株は３７℃で２４時間培養した。この試験は，実施例２５によって調製された凍結乾燥したヒアルロナンクロラミド，及び実施例３２によって調製されたヒアルロナンクロラミドを含む自己支持性フィルムの試験を含み，それぞれの対照材料はヒアルロナンクロラミドを含まない類似の四角片によって構成されていた。その目的のため，８〜１２mgの重量で約１５mmｘ１５mmの大きさを有する四角片を作成した。有効性試験については拡散プレート法（２Ｄレイアウト）を選択した。培養のためには非選択的な基材（トリプトンソイ寒天）を選択した。正方形の試料は下記の微生物に関して試験した：Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida Albicans, Pseudomona aeruginosa, Staphylolococus epidermis。図１及び２は，ヒアルロナンクロラミドを含まない対照材料と比較して，本発明によるヒアルロナンクロラミドを含む組成物が著しく高い細菌増殖抑制の効果を与えることを明確に示す。
【００７８】
実施例４４
プラーク減少に基づいた抗ウイルス活性の試験：
繰り返し数：５，実施例１９により調製した試験物質，試験したウイルス：濃度３ｘ１０Ｅ７，５PFU/mlのＣＶＢ３（Ｎａｎｃｙ）,ＶＥＲＯ細胞基材
方法：
１．５mlの体積に１０7倍希釈した後，ウイルスをペトリ皿中の細胞基材上に３０分間吸着させた。ネガティブ対照は，ウイルスを含まないＰＢＳを入れた。その後，ウイルスを吸引によって除去し，細胞に試験物質（又はネガティブ対照材料に含まれるＨＡ及びＰＢＳ）の層を挿入し，５％ＣＯ2の存在下，３７℃で５時間インキュベートした。該細胞をＰＢＳで洗浄し，不活化したＦＢＳ５％及びアガロース０．７５％を添加したＥＭＥＭを含む培地の層で覆った。ＣＯ2５％を含む環境中，３７℃で４日間のインキュベーション。続いて，培地を除去し，細胞をクリスタルバイオレット染料によって染色し，プラークの数を測定した。試験中，抗ウイルス活性はプラークの数の減少に比例した。
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ＦＢＳ：ウシ胎児血清，ＶＥＲＯ：Cercopithecus aethiopsの腎臓に由来する安定化された細胞系，ＥＭＥＭ：イーグルの最少必須培地，３ｘ１０Ｅ７．５PFU/ml：感染懸濁液の調製のために使用したウイルスの濃度−１ml当たり３ｘ１０Ｅ７．５プラーク形成単位，PFU/mlはウイルスの量の単位であり，PFUはプラーク形成単位である，ＰＤ：ペトリ皿，ＳＤ：標準偏差。
【００７９】
得られた結果は，標準の「ＨＡによるウイルスの試験」と比較して，ヒアルロナンクロラミドの存在がウイルス増殖の抑制を引き起こすこと（試験１，２及び３），及びヒアルロナンクロラミドの濃度が増加するとその抑制がより効率的になることを明確に示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【国際調査報告】
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