(57)【要約】  有効量のチューブリン重合阻害剤化合物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における膵臓癌を治療する方法が本明細書に記載される。より詳細には、有効量の置換逆ピリミジンチューブリン重合阻害剤化合物を単独でまたは他の化学療法剤と組み合わせて対象に投与することを含む、それを必要とする対象における膵管腺癌を治療する方法が、本明細書に記載される。
2021535198.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の構造を有する有効量の５−フルオロ−２−（６−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−１−イル）−Ｎ４−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］ピリミジン−４，６−ジアミン、またはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における膵臓癌を治療する方法。
【化１】
2021535198.tif 000006
式(I)
【請求項２】
有効量の５−フルオロ−２−（６−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−１−イル）−Ｎ４−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］ピリミジン−４，６−ジアミン、またはその薬学的に許容される塩を有効量の１つまたは複数の化学療法剤と組み合わせて対象に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化学療法剤が、ゲムシタビン、ｎａｂ−パクリタキセルおよびこれらの組み合わせから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
膵臓癌が膵管腺癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
医薬組成物の形態で有効量の５−フルオロ−２−（６−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−１−イル）−Ｎ４−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］ピリミジン−４，６−ジアミン、またはその薬学的に許容される塩を対象に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
有効量のチューブリン重合阻害剤化合物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における膵臓癌を治療する方法が本明細書に記載される。より詳細には、有効量の置換逆ピリミジンチューブリン重合阻害剤化合物を単独でまたは他の化学療法剤と組み合わせて対象に投与することを含む、それを必要とする対象における膵管腺癌を治療する方法が、本明細書に記載される。
【背景技術】
【０００２】
２０１８年に膵臓癌と診断されたアメリカ人は推定５５，４４０人であり、膵臓癌は癌関連死亡率の５番目に多い原因である。これらの数字は、今後１０年間で増加することが予想される。膵管腺癌（ＰＤＡ）は化学療法抵抗性の高い癌で、年間４５，０００人を超える死亡の原因であり、膵臓腫瘍の約９３％を占める。近年のいくつかの大きな進歩にもかかわらず、ＰＤＡは依然として主として難治性の癌であり、生存期間中央値は６カ月未満、５年生存率はわずか８．７％である。
いくつかの因子がこの予後不良に寄与する。ほとんどの患者（８５％）は、１つの有効な介入：外科的切除を妨げる進行性疾患を呈する。しかし、手術を受けた限局性疾患を有する患者の間でも、５年および１０年生存率は高い再発率により各々わずか２５％および８％である（A. Richter et al., World J Surg 27, 324, Mar 2003）。これらの残り８５％の患者、および再発性疾患を有する患者については、利用可能な治療が少ない。国の標準治療療法であるゲムシタビンは、生存を数週間緩やかに延長し、主に生活の質の指標を改善することが認められている（H. A. Burris, 3rd et al., J Clin Oncol 15, 2403, Jun 1997）。進行性ＰＤＡの唯一の他のＦＤＡ承認薬としてはタルセバがあり、これはゲムシタビンと組み合わせた場合、平均でちょうど１０日の追加の利点を提供する。様々な剤および組み合わせの６０を超える臨床試験（H. Q. Xiong, K. Carr, J. L. Abbruzzese, Drugs 66, 1059, 2006）にもかかわらず、他の有効な療法は同定されていない。
【０００３】
ＰＤＡの最も顕著な特徴の一つは、高い間質性流体圧、血管分布の低下、ならびに組織灌流および拡散の低下をもたらす、局所微小環境を調整する拡張性線維形成性間質の存在である。結果的に、膵臓腫瘍への薬物送達は、正常な組織よりも効率が悪く、この疾患を特徴付ける広範な一次化学療法抵抗性に寄与する。細胞傷害性療法に対するＰＤＡの広範な抵抗性は、一つには、薬物送達に対するこの生物物理学的障害に起因する。
ＫＰＣ（ＫｒａｓＬＳＬ．Ｇ１２Ｄ／＋；ｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋；ＰｄｘＣｒｅｔｇ／＋）遺伝子操作マウスモデルにおける化学療法剤の前臨床試験は、ＰＤＡに対する薬物の開発努力が、薬物暴露を改善する手段として長い半減期および高い治療指数（有効性と毒性との間の濃度範囲）を有する剤を重視すべきであることを示唆している。同様に、腫瘍細胞内での薬物安定性および保持率も、ＰＤＡの新しいレジメンの設計において考慮されるべきである。
【０００４】
残念なことに、最も伝統的な細胞毒性剤は、循環から急速に除去されるか、正常な増殖組織に対して急性毒性があるか、急速に代謝されるか、または腫瘍細胞から積極的に排出される。有益な反例としては、転移性膵臓癌患者のためのゲムシタビンと組み合わせた、ＦＤＡ承認のアルブミン結合形態の微小管安定化剤パクリタキセルであるｎａｂ−パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ、Ｃｅｌｇｅｎｅ）がある。ｎａｂ−パクリタキセルは、循環において２７時間の末端半減期を有し、非修飾パクリタキセルよりも毒性が低い。このレジメンの成功は、膵臓癌薬の開発における薬理学の重要性を立証する一助となり、ゲムシタビン（デオキシシチジン類似体）と微小管標的剤との組み合わせの利点を実証した。
したがって、ＰＤＡの生物物理学的障害を克服して、腫瘍組織への有効な生体内分布をもたらし、必要な薬力学的特性を有し、膵臓癌の治療のための他の化学療法剤と相乗的に組み合わせられる化学療法剤が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
式（Ｉ）の構造を有する５−フルオロ−２−（６−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−１−イル）−Ｎ４−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］ピリミジン−４，６−ジアミンと称される化合物１、またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物は、チューブリン重合およびＢＭＩ−１タンパク質機能を阻害するのに有用な小分子抗癌剤である（ＷＯ２０１４／０８１９０６を参照のこと）。
【０００６】
【化１】
2021535198.tif 000003
式(I)
化合物１は、長い循環半減期およびＰ糖タンパク質（ＰＧＰ）基質活性の欠如および腫瘍組織への有効な生体内分布を含む薬理学的特性を示した。さらに、化合物１は、複数のＰＤＡ細胞株において有糸分裂停止およびアポトーシスを誘導することが示された。
【０００７】
機構研究により、いずれか１つの特定の理論に限定されずに、化合物１は、微小管重合阻害剤として機能することが示された。さらに、化合物１は、ゲムシタビンおよびｎａｂ−パクリタキセルのいずれかまたは両方など、標準的な臨床レジメンと相乗的に組み合わせて、患者由来の異種移植モデル（ＰＤＸ）における有効性を改善し、強力かつ永続的な癌の退行をもたらす。さらに、化合物１は、化学療法抵抗性の高い遺伝子操作ＫＰＣ  ＰＤＡマウスモデルにおいて、ゲムシタビンとの組み合わせにおける有効性を示した。
臨床開発中の抗癌剤としてのこれらのデータおよび実証された安全性プロファイルは、ＰＤＡに対する標準治療化学療法と組み合わせた化合物１の開発の明確な理論的根拠を実証する。
説明
本明細書に記載される一態様は、式（Ｉ）の構造を有する、有効量の化合物１である５−フルオロ−２−（６−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−１−イル）−Ｎ４−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］ピリミジン−４，６−ジアミン、またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における膵臓癌を治療する方法を含む。
【０００８】
【化２】
2021535198.tif 000004
式(I)
別の態様は、有効量の化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における膵管腺癌を治療する方法を含む。
【０００９】
本明細書に記載される一態様は、有効量の化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物を有効量の１つまたは複数の化学療法剤と組み合わせて対象に投与することを含む、それを必要とする対象における膵臓癌を治療する方法を含む。
別の態様は、有効量の化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物を有効量の１つまたは複数の化学療法剤と組み合わせて対象に投与することを含む、それを必要とする対象における膵管腺癌を治療する方法を含む。
本明細書に記載される一態様は、有効量の化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物を、有効量のゲムシタビンおよびｎａｂ−パクリタキセルのいずれかまたは両方と組み合わせて対象に投与することを含む、それを必要とする対象における膵管腺癌を治療する方法を含む。
別の態様は、有効量の化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物を、有効量のゲムシタビンおよびｎａｂ−パクリタキセルのいずれかまたは両方と組み合わせて対象に投与することを含む、それを必要とする対象における膵管腺癌を治療する方法を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１ａ】ビヒクルまたは化合物１（０．１μＭまたは１．０μＭ）での処理後の経時的な相対的Ａｓｐｃ１細胞生存率を示すグラフである。結果は、ビヒクルと比較して、化合物１が、ヒトＰＤＡ細胞生存率の用量および時間依存的低下を示すことを示している。
【図１ｂ】ヒビクルまたは化合物１（０．１μＭまたは１．０μＭ）で処理したＡｓｐｃ１細胞からの７−ＡＡＤ蛍光のフローサイトメトリーにより測定したＤＮＡ含有量を示す代表的なヒストグラムである。
【図１ｃ】ビヒクル（ＤＭＳＯ）、化合物１（０．１μＭ、１．０μＭ）または０．１μＭのノコダゾール（ＮＯＣ、陽性対照）での処理から２４時間後のＧ０／Ｇ１期、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期におけるＡｓｐｃ１細胞のパーセントを示すグラフである。
【図１ｄ】ＤＭＳＯ、化合物１（０．１μＭまたは１．０μＭ）、または０．１μＭのノコダゾール（ＮＯＣ）での２４時間の処理後の有糸分裂におけるＡｓｐｃ１細胞（ＰＨ３+／４Ｎ  ＤＮＡ含有量）のパーセントを示すプロットである。図１ｂ、１ｃおよび１ｄは、化合物１がヒトＰＤＡ細胞の細胞周期停止の用量および時間依存的効果を示すことを示している。
【図２ａ】２４時間、４８時間および７２時間の時点でのビヒクルまたは化合物１（１．０μＭ）で処理したＡｓｐｃ１細胞のＤＡＰＩ蛍光により測定したＤＮＡ含有量を示す代表的なヒストグラムである。
【図２ｂ】２４時間、４８時間、７２時間の時点でのＤＭＳＯまたは化合物１（０．１μＭまたは１．０μＭ）での処理後の＞４ＮのＤＮＡ含有量を有するＡｓｐｃ１細胞のパーセントを示すグラフである。図２ａおよび２ｂは、化合物１が、倍数性に影響されるヒトＰＤＡ細胞の量の用量および時間依存的増加を示すことを示している。
【図３ａ】ＤＭＳＯで２４時間、または１．０μＭの化合物１で７２時間の処理後のＡｓｐｃ１細胞におけるアポトーシスの誘導を示す代表的なフローサイトメトリー散布図である。未固定細胞を、活性カスパーゼ３およびＤＡＰＩで染色して、生細胞（下部左）を初期アポトーシス（上部左）、後期アポトーシス（上部右）および壊死（下部右）と区別した。
【図３ｂ】２４時間、４８時間および７２時間の時点でＤＭＳＯまたは化合物について定量した総アポトーシス性Ａｓｐｃ１細胞（活性カスパーゼ３+）を示すグラフである。図３ａおよび３ｂは、ビヒクルと比較して、化合物１が細胞バイオマーカーの時間依存的増加を示し、これは細胞アポトーシスの対応する増加を示すことを示している。
【図４ａ】ベースラインでまたは化合物１（１０ｍｇ／ｋｇ）の単回経口用量の２、４、７、２４もしくは４８時間後に質量分析で測定したマウスにおける化合物１の血漿レベルを示すグラフである。図４ａは、化合物１が、長い血漿半減期を有し、ＣＮＳを透過し、脳組織に分布することを示している。
【図４ｂ】化合物１、化合物２、クロルプロマジン、ピューロマイシン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、パクリタキセルおよびビンクリスチンでのＭＤＣＫ−Ｐ−ｇｐ対ＭＤＣＫ−ＷＴ細胞の処理に対するＣＣ50値の比を示すプロットである。図４ｂは、細胞周期停止を引き起こす他の化学療法剤と比較して、化合物１、化合物２およびクロルプロマジンが、ＰＧＰ基質として機能しないことを示している。
【図５ａ】単独でまたはゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせた化合物１（１０ｍｇ／ｋｇ）の単回経口用量の２４時間後のＫＰＣマウスからの血漿、四頭筋およびＰＤＡ組織における化合物１の濃度を示すプロットである。図５ａは、該組み合わせの有効性の改善が、薬物動態学的薬物−薬物相互作用によるものではないことを示している。
【図５ｂ】１０ｍｇ／ｋｇの化合物１で処置したＫＰＣマウスからの腫瘍に対するサイクリンＢ１のウエスタンブロットである。腫瘍生検試料（Ｂｘ）を、第１の用量の４８時間前に得、第３の用量の２４時間後に剖検（ｎｘ）で得た試料と比較した。
【図５ｃ】ビンキュリン（Ｖｉｎｃ）に対して正規化された図５ｂからのサイクリンＢ１（ＣｙｃＢ１）を定量するグラフである。図５ａは、化合物１がＰＤＡ組織に分布していることを示しており、図５ｂおよび５ｃは、化合物１が、ビンキュリンと比較してサイクリンＢ１の一貫した減少を示すことを示しており、ビンキュリンに誘導されるアポトーシスと比較してサイクリンＢ１の減少により誘導されるＰＤＡ細胞の有糸分裂の進行の低減を示唆している。
【図６ａ】化合物１とゲムシタビンとの組み合わせで処置したＫＰＣマウスの経時的な体重を示すプロットである。
【図６ｂ】ビヒクル（ＶＥＨ）、ゲムシタビン（ＧＥＭ、１００ｍｇ／ｋｇ週２回）、化合物１（Ｃｐｄ１、１７ｍｇ／ｋｇ週２回）または化合物１とゲムシタビンとの組み合わせ（Ｃｐｄ／ＧＥＭ）で処置したＫＰＣマウスの経時的な生存を示すプロットである。
【図６ｃ】ビヒクル（ＶＥＨ）、ゲムシタビン（ＧＥＭ）、化合物１（Ｃｐｄ１）、または化合物１とゲムシタビンとの組み合わせ（Ｃｐｄ／ＧＥＭ）で処置したＫＰＣマウスにおける縦方向の腫瘍体積から計算した腫瘍増殖率の計算を示すプロットである。
【図６ｄ】ビヒクル（ＶＥＨ）、ゲムシタビン（ＧＥＭ）、化合物１（Ｃｐｄ１）または化合物１とゲムシタビンとの組み合わせ（Ｃｐｄ／ＧＥＭ）で処置したＫＰＣマウスの剖検後の１腫瘍あたり１０視野にわたって、４０倍１視野あたりの平均陽性細胞を示す、リン酸化ヒストンＨ３（ＰＨ３）細胞の免疫組織化学定量を示すプロットである。
【図６ｅ】ビヒクル（ＶＥＨ）、ゲムシタビン（ＧＥＭ）、化合物１（Ｃｐｄ１）または化合物１とゲムシタビンとの組み合わせ（Ｃｐｄ１／ＧＥＭ）で処置したＫＰＣマウスの剖検後、１腫瘍あたり１０視野にわたって、４０倍１視野あたりの平均陽性細胞を示す、リン酸化切断型カスパーゼ３（ＣＣ３）細胞の免疫組織化学定量を示すプロットである。図６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｄおよび６ｅは、ゲムシタビンと組み合わせた化合物１が、ＫＰＣマウスモデルの全生存を相乗的に増加させることを示している。そこで、図６ａは、ゲムシタビンと組み合わせた化合物１が、ＫＰＣマウスの相対的体重を維持することを示している。図６ｂは、ビヒクル、ゲムシタビン単独または化合物１単独と比較して、ゲムシタビンと組み合わせた化合物１が、各剤単独と比較して、全生存を相乗的に増加させながら、腫瘍体積を同時に低下させることを示している。図６ｃ、６ｄおよび６ｅは、ビヒクル、ゲムシタビン単独または化合物１単独と比較して、ゲムシタビンと組み合わせた化合物１が、ＰＤＡ細胞および特定の細胞バイオマーカーの増殖率の全体的な低下を示すことを示している。
【図７ａ】ビヒクル（ｖｅｈ）または化合物１（Ｃｐｄ１）で処置したＫＰＣマウスの３Ｄ高解像度超音波で測定した腫瘍体積を示すプロットである。
【図７ｂ】ビヒクル（ｖｅｈ）または化合物１とゲムシタビンとの組み合わせ（Ｃｐｄ１／ｇｅｍ）で処置したＫＰＣマウスの３Ｄ高解像度超音波で測定した腫瘍体積を示すプロットである。図７ａは、ビヒクルと比較して、化合物１が、ＫＰＣマウスモデルＰＤＡ腫瘍体積の時間依存的低下を示すことを示しており、図７ｂは、ゲムシタビン単独または化合物１単独と比較して、ゲムシタビンと組み合わせた化合物１が、ＫＰＣマウスＰＤＡ腫瘍体積のさらなる時間依存的低下を示すことを示している。
【図８ａ】ビヒクル（ＶＥＨ）、化合物１（Ｃｐｄ１）、ゲムシタビン（ＧＥＭ）または化合物１とゲムシタビンとの組み合わせ（Ｃｐｄ１／ＧＥＭ）で処置したＫＰＣマウスにおいて７日にわたって体積パーセント変化により測定した腫瘍増殖を示すプロットである。
【図８ｂ】ビヒクル（Ｖ）、化合物１（Ｃｐｄ１＋Ｖ）、ゲムシタビン（Ｇ）または化合物１とゲムシタビンとの組み合わせ（Ｃｐｄ１＋Ｇ）で処置したＫＰＣマウスにおいてマウスが肝転移を有するパーセントを示すプロットである。図８ａは、ビヒクル、ゲムシタビン単独または化合物１単独と比較して、ゲムシタビンと組み合わせた化合物１が、ＫＰＣマウスＰＤＡ腫瘍増殖の低下を示すことを示しており、図８ｂは、ビヒクルおよびゲムシタビン単独と比較して、ゲムシタビンと組み合わせた化合物１が、ＫＰＣマウスＰＤＡ駆動肝転移の減少を示すことを示している。
【図９ａ】ゲムシタビン（ＧＥＭ）で処置したＫＰＣマウスからの染色腫瘍切片を示す画像である。
【図９ｂ】化合物１とゲムシタビンとの組み合わせ（Ｃｐｄ１／ＧＥＭ）で処置したＫＰＣマウスからの染色腫瘍切片を示す画像である。図９ａは、ゲムシタビン誘導アポトーシス細胞集団を示しており、図９ｂは、ゲムシタビンと組み合わせた化合物１により誘導されるアポトーシス細胞集団を示している。そこで、ゲムシタビンと組み合わせた化合物１は、アポトーシス細胞集団の顕著な増加を示し、アポトーシス誘導の相乗的増加を示唆している。
【図１０ａ】ビンキュリン（ＶＩＮＣ）負荷対照と比較した、ビヒクル（ＶＥＨ）、０．１μＭのノコダゾール（ＮＯＣ）、０．１μＭの化合物１（０．１）または１．０μＭの化合物１（１．０）で２４時間処理したＡｓｐｃ１、ＭｉａＰａＣａ−２およびＰａｎｃ１細胞のＢＭＩ−１レベルを示す一連のウエスタンブロットである。図１０ａは、ビヒクルおよびビンキュリンの発現と比較して、化合物１が、様々な細胞型におけるＢＭＩ−１タンパク質発現の一貫した減少を示すことを示している。
【図１０ｂ】ビヒクル（ＶＥＨ）、０．１μＭの化合物１（Ｃｐｄ１）または１．０μＭの化合物１（Ｃｐｄ１）で９６時間にわたって処理したＪ１００２ＶＥＨおよびＪ１００２ＴＡＭ細胞の相対的生存率を示すグラフである。図１０ｂは、ビヒクルおよびＪ１００２の存在と比較して、化合物１が、ＢＭＩ−１タンパク質発現に依存する細胞の生存率の用量および時間依存的低下を示すことを示している。
【図１０ｃ】化合物１で７２時間処理したＪ１００２ＶＥＨおよびＪ１００２ＴＡＭ細胞の用量応答曲線を示すグラフである。図１０ｃは、ビヒクル処理した細胞と比較して、化合物１が、Ｊ１００２の存在下でＢＭＩ−１タンパク質発現の減少に対してサブμＭの活性を示すことを示している。
【図１０ｄ】ビヒクル（ＶＥＨ）または１．０μＭの化合物１（Ｃｐｄ１）で２４時間処理したＪ１００２ＶＥＨ細胞の代表的なＤＮＡヒストグラムを示すグラフである。
【図１０ｅ】ビヒクル（ＶＥＨ）または１．０μＭの化合物１（Ｃｐｄ１）での処理から２４時間後のＧ０／Ｇ１期、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期におけるＪ１００２ＶＥＨ細胞のパーセントを示すグラフである。
【図１０ｆ】ビヒクル（ＶＥＨ）または１．０μＭの化合物１（Ｃｐｄ１）で２４時間処理したＪ１００２ＴＡＭ細胞の代表的なＤＮＡヒストグラムを示すグラフである。
【図１０ｇ】ビヒクル（ＶＥＨ）または１．０μＭの化合物１（Ｃｐｄ１）での処理から２４時間後のＧ０／Ｇ１期、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期におけるＪ１００２ＴＡＭ細胞のパーセントを示すグラフである。図１０ｄ、１０ｅ、１０ｆおよび１０ｇは、ビヒクルおよびＪ１００２の存在と比較して、化合物１が、倍数性に影響されるＢＭＩ−１依存性細胞の量の用量および時間依存的増加を示すことを示しており、そこでデータは総体的に、化合物１が有糸分裂停止の結果として間接的にＢＭＩ−１過剰リン酸化を誘導することを示唆している。
【図１１ａ】８、１６および２４時間の時点にわたって組み込まれた、ＤＭＳＯまたは１μＭの化合物１（Ｃｐｄ１）で処理したＡｓｐｃ１細胞のＲＮＡ−ｓｅｑにより測定された差次的発現遺伝子を示すプロットである。
【図１１ｂ】ビヒクル（ＶＥＨ）、３．０μＭの化合物１（Ｃｐｄ１）、１．０μＭのコルヒチン（ＣＯＬ）または１．０μＭのパクリタキセル（ＴＡＸ）で２時間処理したＡｓｐｃ１細胞からの遊離チューブリンを示すウエスタンブロットである。処理後、細胞溶解物を遠心分離により分画し、遊離チューブリンを微小管から分離した。ＬＳＰ＝低速ペレット（１，０００×ｇ、５分）、ＨＳＰ＝高速ペレット（１００，０００×ｇ、１時間）、ＨＳＳ＝高速上清（１００，０００×ｇ、１時間）。図１１ａおよび１１ｂは、ビヒクル、ＣＯＬ（カルボプラチン）およびＴＡＸ（タモキシフェン）と比較して、化合物１が、チューブリン形成の防止において有意な倍率変化の増加を示すことを示している。
【図１１ｃ】ビヒクル（ＶＥＨ）で２４時間処理したＡｓｐｃ１細胞におけるチューブリンおよびＤＡＰＩを示す画像である。
【図１１ｄ】化合物１（Ｃｐｄ１）で２４時間処理したＡｓｐｃ１細胞におけるチューブリンおよびＤＡＰＩを示す画像である。図１１ｃおよび１１ｄは、ビヒクルと比較して、化合物１がチューブリン形成の有意な減少を示すことを示している。
【図１１ｅ】ビヒクル（ＤＭＳ）、タモキシフェン（ＴＡＸ）、カルボプラチン（ＣＯＬ）および化合物１（０．１２μＭ、０．３７μＭ、１．１１μＭ、３．３３μＭおよび１０μＭ）で処理した細胞の経時的なチューブリン重合アッセイを示すグラフである。
【図１１ｆ】図１１ｅに示す蛍光単位／分を示すグラフである。図１１ｅおよび１１ｆは、ビヒクル、ＣＯＬ（カルボプラチン）およびＴＡＸ（タモキシフェン）と比較して、化合物１がチューブリン重合の用量依存的低下を示すことを示しており、そこでデータは総体的に、化合物１が微小管形成を直接阻害することを示唆している。
【図１２ａ】ビヒクル（ｖｅｈ）、ゲムシタビン（ｇｅｍ）、ｎａｂ−パクリタキセル（ｎａｂＰ）、ゲムシタビンとｎａｂ−パクリタキセルとの組み合わせ（ｇｍ／ｎａｂＰ）、化合物１（Ｃｐｄ１）、化合物１とゲムシタビンとの組み合わせ（Ｃｐｄ１／ｇｅｍ）、化合物１とｎａｂ−パクリタキセルとの組み合わせ（Ｃｐｄ１／ｎａｂＰ）および化合物１とゲムシタビンとｎａｂ−パクリタキセルとの組み合わせ（Ｃｐｄ１／ｇｅｍ／ｎａｂＰ）で処置したヒトＰＤＡに由来する患者由来の皮下異種移植片の経時的な平均腫瘍体積を示すグラフである。
【図１２ｂ】ビヒクル（ｖｅｈ）、ゲムシタビン（ｇｅｍ）、ｎａｂ−パクリタキセル（ｎａｂＰ）、ゲムシタビンとｎａｂ−パクリタキセルとの組み合わせ（ｇｍ／ｎａｂＰ）、化合物１（Ｃｐｄ１）、化合物１とゲムシタビンとの組み合わせ（Ｃｐｄ１／ｇｅｍ）、化合物１とｎａｂ−パクリタキセルとの組み合わせ（Ｃｐｄ１／ｎａｂＰ）および化合物１とゲムシタビンとｎａｂ−パクリタキセルとの組み合わせ（Ｃｐｄ１／ｇｅｍ／ｎａｂＰ）で処置したマウスの経時的な体重を示すグラフである。
【図１２ｃ】ゲムシタビン（ｇｅｍ）、ｎａｂ−パクリタキセル（ｎａｂＰ）および化合物１（Ｃｐｄ１）で処理した腫瘍の増殖定数および減衰定数を示すグラフである。
【図１２ｄ】ビヒクル（ｖｅｈ）、ゲムシタビン（ｇｅｍ）、ｎａｂ−パクリタキセル（ｎａｂＰ）、ゲムシタビンとｎａｂ−パクリタキセルとの組み合わせ（ｇｍ／ｎａｂＰ）、化合物１（Ｃｐｄ１）、化合物１とゲムシタビンとの組み合わせ（Ｃｐｄ１／ｇｅｍ）、化合物１とｎａｂ−パクリタキセルとの組み合わせ（Ｃｐｄ１／ｎａｂＰ）および化合物１とゲムシタビンとｎａｂ−パクリタキセルとの組み合わせ（Ｃｐｄ１／ｇｅｍ／ｎａｂＰ）で処置した各マウスの腫瘍応答を示すプロットである。図１２ａ、１２ｂ、１２ｃおよび１２ｄは、ｎａｂ−パクリタキセルとの二重の組み合わせ、ならびにゲムシタビンとｎａｂ−パクリタキセルとの三重の組み合わせのいずれかまたは両方での化合物１が、ＰＤＡのヒト由来異種移植片モデルにおいて腫瘍体積および全体的な腫瘍増殖を相乗的に低下させることを示している。そこで、図１２ａは、ビヒクル、ゲムシタビン単独、化合物１単独、ｎａｂ−パクリタキセル単独、ｎａｂ−パクリタキセルと組み合わせたゲムシタビンおよび化合物１と組み合わせたゲムシタビンと比較して、ｎａｂ−パクリタキセルとの二重の組み合わせ、ならびにゲムシタビンとｎａｂ−パクリタキセルとの三重の組み合わせのいずれかまたは両方での化合物１が、腫瘍体積を相乗的に低下させることを示している。図１２ｂは、ビヒクル、ゲムシタビン単独、化合物１単独、ｎａｂ−パクリタキセル単独、ｎａｂ−パクリタキセルと組み合わせたゲムシタビンおよび化合物１と組み合わせたゲムシタビンと比較して、ｎａｂ−パクリタキセルと組み合わせた化合物１およびゲムシタビンとｎａｂ−パクリタキセルの両方と組み合わせた化合物１では、相乗的に、すべての組み合わせが、ＫＰＣマウスの相対的体重を維持することを示している。図１２ｃは、ゲムシタビン、化合物１およびｎａｂ−パクリタキセルのいずれかの存在または不在と比較して、ゲムシタビンおよびｎａｂ−パクリタキセルのいずれかまたは両方と組み合わせた化合物１が、腫瘍体積の減衰率を増加させながら、全体的な腫瘍増殖率を有意に低下させることを示している。図１２ｄは、ゲムシタビン、化合物１およびｎａｂ−パクリタキセルのいずれかの存在または不在と比較して、ゲムシタビンおよびｎａｂ−パクリタキセルのいずれかまたは両方と組み合わせた化合物１が、初期腫瘍体積を有意に低下させることを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
本明細書で使用する用語「約」は、得られた値が明示的に列挙される値と実質的に同じである、所与の値の付近の範囲を意味する。一態様において、「約」は、所与の値または範囲の２５％以内を意味する。例えば、表現「約７０質量％」は、５２質量％〜８８質量％の少なくともすべての値を含む。別の態様において、用語「約」は、所与の値または範囲の１０％以内を意味する。例えば、表現「約７０質量％」は、６３質量％〜７７質量％の少なくともすべての値を含む。別の態様において、用語「約」は、所与の値または範囲の７％以内を意味する。例えば、表現「約７０質量％」は、６５質量％〜７５質量％の少なくともすべての値を含む。
【００１２】
濃度、量、細胞数、パーセンテージおよび他の数値は、範囲形式で本明細書に示され得る。このような範囲形式は、単に簡便性および簡潔性のために用いられ、範囲の限度として明示的に列挙された数値を含むだけでなく、各数値および部分範囲が明示的に列挙されているかのように、その範囲内に包含される個々の数値または部分範囲すべてを含むと柔軟に解釈されるべきであることが理解されるべきである。
本明細書で使用する用語「療法（ｔｈｅｒａｐｙｉｅｓおよびｔｈｅｒａｐｙ）」は、状態もしくは障害、またはこれらの１つもしくは複数の症状（例えば、膵臓癌、あるいはこれに関連する１つもしくは複数の症状または１つもしくは複数の状態）の予防、治療、管理または改善に使用できる任意のプロトコル、方法、組成物、製剤および／または剤を指し得る。
【００１３】
ある種の態様において、用語「療法（ｔｈｅｒａｐｙｉｅｓおよびｔｈｅｒａｐｙ）」は、状態もしくは障害またはこれらの１つもしくは複数の症状（例えば、膵臓癌、あるいはこれに関連する１つもしくは複数の症状または１つもしくは複数の状態）の治療、管理、予防または改善に有用な化学療法などの薬物療法、補助療法、放射線、手術、生物学的療法、支持療法、抗ウイルス療法および／または他の療法を指す。ある種の態様において、用語「療法」は、化合物１、またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物以外の療法を指す。具体的な態様において、「追加療法（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｔｈｅｒａｐｙおよびａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｔｈｅｒａｐｙｉｅｓ）」は、化合物１、またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物を用いる治療以外の療法を指す。具体的な態様において、療法は、補助療法としての化合物１の使用を含む。例えば、化合物１を、状態もしくは障害またはこれらの１つもしくは複数の症状（例えば、膵臓癌、あるいはこれに関連する１つもしくは複数の症状または１つもしくは複数の状態）の治療、管理、予防または改善に有用な化学療法などの薬物療法、生物学的療法、手術、支持療法、抗ウイルス療法および／または他の療法と組み合わせて使用する。
【００１４】
本明細書で使用する用語「ヒト乳児」は、新生児から１歳までのヒトを指す。
本明細書で使用する用語「ヒト幼児」は、１歳から３歳までのヒトを指す。
本明細書で使用する用語「ヒト小児」は、１歳〜１８歳のヒトを指す。
本明細書で使用する用語「ヒト成人」は、１８歳以上のヒトを指す。
本明細書で使用する用語「中年のヒト」は、３０歳〜６４歳のヒトを指す。
【００１５】
本明細書で使用する用語「高齢のヒト」は、６５歳以上のヒトを指す。
本明細書で使用する用語「対象」は、本明細書に記載される療法が投与される個体を指す。具体的な態様において、個体はヒトである。
本明細書で使用する用語「膵臓癌」は、全般的に本明細書に記載される膵臓癌を指す。具体的な態様において、膵臓癌の総称は、膵管腺癌の用語を具体的に使用しなくても膵管腺癌（ＰＤＡ）を指し得る。
【００１６】
化合物１を膵臓癌を有する対象に投与する文脈において、本明細書で使用する用語「有効量」は、有益な効果または治療効果をもたらす化合物１の用量を指す。具体的な態様において、化合物１の「有効量」は、以下の有益な効果または治療効果のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上を達成するのに十分な化合物１の量を指す：（ｉ）膵臓癌の阻害；（ｉｉ）膵臓癌の退行；（ｉｉｉ）膵臓癌の根絶、除去または完全な寛解；（ｉｖ）膵臓癌に関連する１つまたは複数の症状の発生または発症の予防；（ｖ）膵臓癌に関連する１つまたは複数の症状の重症度の低減または改善；（ｖｉ）膵臓癌に関連する１つまたは複数の症状の数の減少；（ｖｉｉ）膵臓癌に関連する１つまたは複数の症状の重症度の改善；（ｖｉｉｉ）膵臓癌に関連する１つまたは複数の症状の持続期間の短縮；（ｉｘ）増殖または膵臓癌に関連する１つもしくは複数の症状の再発の予防；（ｘ）死亡率の低下；（ｘｉ）対象の生存率の増加；（ｘｉｉ）無再発生存の増加；（ｘｉｉｉ）寛解状態の膵臓癌対象の数の増加；（ｘｉｖ）対象の入院の減少；（ｘｖ）入院期間の短縮；（ｘｖｉ）入院率の低下；（ｘｖｉｉ）対象の生存の増加；（ｘｖｉｉｉ）膵臓癌対象の無症状生存の増加；（ｘｉｘ）対象における膵臓癌の寛解期間の延長；（ｘｘ）当技術分野で周知の方法、例えば、ＱＯＬアンケートなどにより評価される生活の質（ＱＯＬ）の改善；（ｘｘｉ）別の化学療法剤での治療前の化合物１の投与による増殖の低下；（ｘｘｉｉ）別の化学療法剤での治療後の化合物１の投与による増殖の低下；（ｘｘｉｉｉ）別の化学療法剤と共に化合物１の投与による組み合わせ療法での増殖の低下；（ｘｘｉｖ）別の化学療法剤と共に化合物１の投与による組み合わせ療法での相加的な抗増殖効果；（ｘｘｖ）別の化学療法剤と共に化合物１の投与による組み合わせ療法での相乗的な抗増殖効果；（ｘｘｖｉ）放射線による療法前の化合物１の投与による増殖の低下；（ｘｘｖｉｉ）放射線による療法後の化合物１の投与による増殖の低下；（ｘｘｖｉｉｉ）放射線との組み合わせ療法での化合物１の投与による増殖の低下；（ｘｘｉｘ）手術による治療前の化合物１の投与による増殖の低下；（ｘｘｘ）手術との組み合わせ治療における化合物１の投与による増殖の低下；（ｘｘｘｉ）対症療法と共に化合物１の投与による治療効果の向上または改善；（ｘｘｘｉｉ）膵臓癌を有する対象におけるＢＭＩ−１の血漿濃度の低下；（ｘｘｘｉｉｉ）膵臓癌を有する対象の血漿における循環増殖細胞の減少；（ｘｘｘｉｖ）膵臓癌を有する対象における膵臓癌バイオマーカー（例えば、ＢＭＩ−１、チューブリン重合、アポトーシスマーカーまたは組織など）の血漿濃度の変化（例えば、低下または増加）；（ｘｘｘｖ）膵臓癌を有する対象からの生体試料（例えば、血漿、血清、尿または任意の他の生体液）におけるＢＭＩ−１の濃度の低下；（ｘｘｘｖｉ）磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ダイナミック造影ＭＲＩ（ＤＣＥ−ＭＲＩ）、Ｘ線、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャン、７−ＡＡＤ蛍光またはＤＡＰＩ蛍光など、当業者に利用可能な従来の方法により測定したとき、増殖細胞数は、本明細書に記載される療法の投与後維持される；（ｘｘｘｖｉｉ）磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ダイナミック造影ＭＲＩ（ＤＣＥ−ＭＲＩ）、Ｘ線、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャン、７−ＡＡＤ蛍光またはＤＡＰＩ蛍光など、当業者に利用可能な従来の方法により測定したとき、増殖細胞数は、本明細書に記載される療法の投与後減少する；（ｘｘｘｖｉｉｉ）磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ダイナミック造影ＭＲＩ（ＤＣＥ−ＭＲＩ）、Ｘ線、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャン、７−ＡＡＤ蛍光またはＤＡＰＩ蛍光など、当業者に利用可能な従来の方法により測定したとき、増殖細胞数は、本明細書に記載される療法の投与後増加しないか、または増加が予想を下回る。
【００１７】
本明細書で使用する用語「２４時間で」は、状態が維持される期間を指す。例えば、化合物１の有効量は、化合物１の平均血漿濃度が達成され、２４時間の大部分で維持される場合に同定される。言い換えれば、化合物１の平均血漿濃度は、２４時間を超え得るかまたは下回り得る好適な時間に到達され得る。
本明細書で使用する用語「本明細書に記載される療法」は、有効量の化合物１を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における膵臓癌の治療または改善において、チューブリン重合の阻害を標的化することによる、ＢＭＩ−１機能の阻害剤としての化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物の使用方法を指す。
一態様において、膵臓癌は膵管腺癌である。本明細書に記載される療法の別の態様において、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物の使用方法は、相乗的な抗増殖活性を有する他の化学療法剤との組み合わせを含む。一態様において、他の化学療法剤は、ＢＭＩ−１の機能的活性を阻害する。別の態様において、他の化学療法剤は、チューブリン重合を阻害する。
【００１８】
本明細書で使用する用語「薬学的に許容される塩」は、無機酸および塩基、ならびに有機酸および塩基を含む、薬学的に許容される非毒性の酸または塩基から調製される塩を指す；例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th eds., Mack Publishing, Easton PA (1990)またはRemington:  The Science and Practice of Pharmacy, 19 th eds., Mack Publishing, Easton PA (1995)を参照のこと。
本明細書で使用する用語「化合物１」は全般的に、５−フルオロ−２−（６−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−１−イル）−Ｎ４−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］ピリミジン−４，６−ジアミン化合物およびその薬学的に許容される塩を指す。「化合物１」は、実質的に純粋（例えば、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％または約９９．９％純粋）であり得る。様々な態様において、用語「化合物１」は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開番号ＷＯ２０１４／０８１９０６に開示される化合物１０９を指す。
【００１９】
使用方法
本明細書に示されるように、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物は、有効量の化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における膵臓癌の治療または改善において使用するためのチューブリン重合およびＢＭＩ−１機能の阻害剤である。
一態様において、膵臓癌は膵管腺癌である。
別の態様において、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物の使用方法は、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物と、１つまたは複数の他の化学療法剤との組み合わせを含み、該組み合わせは、相乗的な抗増殖活性を示す。一態様において、他の化学療法剤はＢＭＩ−１の機能的活性を阻害する。別の態様において、他の化学療法剤はチューブリン重合を阻害する。しかし、膵臓癌の治療において使用するためのＢＭＩ−１の機能的活性またはチューブリン重合のいずれかまたは両方の公知のまたは承認された阻害剤は存在しない。したがって、強力かつ選択的活性、好ましい製薬学的特性および広範な臨床経験は、化合物１が膵臓癌の治療に有用な剤であることを示唆している。
【００２０】
一態様において、増殖細胞または細胞株において細胞周期停止を誘導するために、チューブリン重合およびＢＭＩ−１機能を阻害するかまたは低下させる方法が本明細書に記載される。
別の態様において、増殖細胞または細胞株における細胞周期停止を誘導するために、チューブリン重合およびＢＭＩ−１機能を阻害するかまたは低下させる方法は、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物と、増殖細胞または細胞株とを接触させることを含み、この増殖細胞または細胞株はナイーブであり得るか、またはチューブリン重合およびＢＭＩ−１機能の阻害または低下に影響を受けることが示されている。
別の態様において、このような細胞または細胞株の非限定的な例は、ＨＬ−６０、ＨｅＬａ、ＨＴ１０８０、ＨＣＴ１１６、ＨＥＫ２９３、ＮＣＩ  Ｈ４６０、Ｕ−８７ＭＧ、ＡＳＰＣ−１、ＰＬ−４５、ＨＰＡＦ−２、ＰＣ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ａ４３１、ＳＮＵ−１、ＡＧＳ、Ｋａｔｏ  ＩＩＩ、Ａ５４９、Ｃａｌｕ−６、Ａ３７５、ＳＹ５Ｙ、ＳＫＯＶ３、Ｃａｐａｎ−１、ｓＮＦ９６．２、ＴＩＶＥ−Ｌ１、ＴＩＶＥ−Ｌ２、ＬＮＣａＰ細胞などから選択される。より具体的な態様において、細胞または細胞株は膵臓癌細胞であり得る。
【００２１】
一態様において、膵臓癌を有するそれを必要とする対象においてチューブリン重合およびＢＭＩ−１機能を阻害するかまたは低下させる方法は、本明細書に記載されるように有効量の化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物を対象に投与することを含む。
具体的な態様において、対象は、チューブリン重合およびＢＭＩ−１機能を阻害するかまたは低下させることにより治療できる膵臓癌と診断される。
具体的な態様において、本明細書に記載されるチューブリン重合およびＢＭＩ−１機能を阻害するかまたは低下させる方法は、当技術分野で周知の方法により評価したとき、対象への化合物１の投与前のチューブリン重合およびＢＭＩ−１機能と比較して、チューブリン重合およびＢＭＩ−１機能を約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％阻害するかまたは低下させる。
【００２２】
具体的な態様において、本明細書に記載されるチューブリン重合およびＢＭＩ−１機能を阻害するかまたは低下させる方法は、当技術分野で周知の方法により評価したとき、対象への化合物１の投与前のチューブリン重合およびＢＭＩ−１機能と比較して、チューブリン重合およびＢＭＩ−１機能を約５％〜約２０％、１０％〜３０％、１５％〜４０％、１５％〜５０％、２０％〜３０％、２０％〜４０％、２０％〜５０％、３０％〜６０％、３０％〜７０％、３０％〜８０％、３０％〜９０％、３０％〜９５％、３０％〜９９％もしくは約４０％〜約１００％の範囲でまたはその間の任意の範囲で阻害するかまたは低下させる。
【００２３】
具体的な態様において、本明細書に記載されるチューブリン重合およびＢＭＩ−１機能を阻害するかまたは低下させる方法は、当技術分野で周知の方法により評価したとき、対象への化合物１の投与前のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ増殖細胞または細胞株集団と比較して、増殖を約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％阻害するか、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏ増殖細胞もしくは細胞株集団を前記の割合で減少させる。
【００２４】
具体的な態様において、本明細書に記載されるチューブリン重合およびＢＭＩ−１機能を阻害するかまたは低下させる方法は、当技術分野で周知の方法により評価したとき、対象への化合物１の投与前のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ増殖細胞または細胞株集団と比較して、増殖を約５％〜約２０％、１０％〜３０％、１５％〜４０％、１５％〜５０％、２０％〜３０％、２０％〜４０％、２０％〜５０％、３０％〜６０％、３０％〜７０％、３０％〜８０％、３０％〜９０％、３０％〜９５％、３０％〜９９％もしくは約４０％〜約１００％またはその間の任意の範囲で阻害するか、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏ増殖細胞もしくは細胞株集団を前記の範囲で減少させる。
様々な態様において、本明細書に記載されるチューブリン重合およびＢＭＩ−１機能を阻害するかまたは低下させる方法は、当技術分野で周知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡにより評価したとき、対象におけるＢＭＩ−１の血漿濃度を低下させる。
一態様において、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、本明細書に記載されるように、対象においてチューブリン重合およびＢＭＩ−１機能を阻害するかまたは低下させるのに有効な量の化合物１を投与することを含む。
【００２５】
具体的な態様において、本明細書に記載されるように、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、当技術分野で周知の方法により評価したとき、対象への化合物１の投与前のチューブリン重合およびＢＭＩ−１機能と比較して、チューブリン重合およびＢＭＩ−１機能を約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％阻害するかまたは低下させる。
具体的な態様において、本明細書に記載されるように、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、当技術分野で周知の方法により評価したとき、対象への化合物１の投与前のチューブリン重合およびＢＭＩ−１機能と比較して、チューブリン重合およびＢＭＩ−１機能を約５％〜約２０％、１０％〜３０％、１５％〜４０％、１５％〜５０％、２０％〜３０％、２０％〜４０％、２０％〜５０％、３０％〜６０％、３０％〜７０％、３０％〜８０％、３０％〜９０％、３０％〜９５％、３０％〜９９％もしくは約４０％〜約１００％の範囲でまたはその間の任意の範囲で阻害するかまたは低下させる。
【００２６】
様々な態様において、本明細書に記載されるように、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、当技術分野で周知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡにより評価したとき、対象におけるＢＭＩ−１の濃度を低下させる。
一態様において、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、本明細書に記載されるように、増殖を阻害するかまたは対象のｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏ増殖細胞もしくは細胞株集団を減少させるのに有効な量の化合物１を投与することを含む。
具体的な態様において、本明細書に記載されるように、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、当技術分野で周知の方法により評価したとき、対象への化合物１の投与前の増殖または対象のｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏ増殖細胞もしくは細胞株集団と比較して、増殖を約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％阻害するか、または対象のｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏ増殖細胞もしくは細胞株集団を前記の割合で減少させる。
【００２７】
具体的な態様において、本明細書に記載されるように、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、当技術分野で周知の方法により評価したとき、対象への化合物１の投与前の増殖または対象のｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏ増殖細胞もしくは細胞株集団と比較して、増殖を約５％〜約２０％、１０％〜３０％、１５％〜４０％、１５％〜５０％、２０％〜３０％、２０％〜４０％、２０％〜５０％、３０％〜６０％、３０％〜７０％、３０％〜８０％、３０％〜９０％、３０％〜９５％、３０％〜９９％もしくは約４０％〜約１００％またはその間の任意の範囲で阻害するか、または対象のｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏ増殖細胞もしくは細胞株集団を前記の範囲で減少させる。
【００２８】
様々な態様において、本明細書に記載されるように、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、当技術分野で周知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡにより評価したとき、増殖を阻害するか、または対象のｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏ増殖細胞もしくは細胞株集団を減少させる。
一態様において、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、本明細書に記載されるように、増殖を阻害するか、または対象のｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏ増殖細胞もしくは細胞株集団を減少させるのに有効な量の化合物１を、別の療法（例えば、化合物１を含まないか、または異なる抗増殖剤を含む、１つまたは複数の追加療法）と組み合わせてそれを必要とする対象に投与することを含む。
このような方法は、追加療法の投与前、投与と同時、または投与後に化合物１を投与することを含み得る。ある種の態様において、このような方法は、相加効果または相乗効果を有する。
【００２９】
具体的な態様において、有効量の化合物１および有効量の別の療法をそれを必要とする対象に投与することを含む、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法が本明細書に提供される。
本明細書に提供される方法に従って予防、治療または改善できる癌の具体例としては、膵臓癌、例えば、これに限定されないが膵管腺癌が挙げられるが、これに限定されない。
ある種の態様において、本明細書に提供される方法に従って予防、治療または改善できる膵臓癌は、膵管腺癌から選択される。
一態様において、（ａ）１回または複数回用量の化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物をそれを必要とする対象に投与する工程と、（ｂ）工程（ａ）の前および／またはその後に特定のバイオマーカーの濃度を監視する工程とを含む、膵臓癌を予防、治療または改善する方法が本明細書に提供される。
【００３０】
具体的な態様において、監視工程（ｂ）は、一定数の用量（例えば、１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１５もしくは２９用量またはそれ以上の用量；２〜４、２〜８、２〜２０または、２〜３０用量）または一定期間（例えば、１、２、３、４、５、６もしくは７日間；または１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、４５、４８もしくは５０週間）の化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物の投与前および／または投与後に行われる。
具体的な態様において、これらの監視パラメーターのうちの１つまたは複数は、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物を対象に投与する前に検出される。
具体的な態様において、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物の投与後のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ増殖細胞または細胞株集団の増殖の低下は、一連の治療が膵臓癌を予防、治療または改善するのに有効であることを示す。
【００３１】
具体的な態様において、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物の投与後のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ増殖細胞または細胞株集団の増殖における変化は、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物の投与の投薬量、頻度および／または期間が調整（例えば、増加、減少または維持）され得ることを示し得る。
具体的な態様において、対象の生体試料における特定のバイオマーカーの濃度は、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物の対象への投与を含む膵臓癌の一連の治療前、治療中および／または治療後監視される。
【００３２】
化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物の投与の投薬量、頻度および／または期間は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ増殖細胞または細胞株集団の増殖の結果によって変更され得る。代替的には、これらの監視パラメーター（例えば、特定のバイオマーカーの濃度）の変化は、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物の投与を含む一連の治療が、膵臓癌を予防、治療または改善するのに有効であることを示し得る。
対象における特定のバイオマーカーの濃度は、当業者に公知の任意の技術により検出され得る。ある種の態様において、対象の特定のバイオマーカーの濃度を検出する方法は、生体試料（例えば、組織または体液試料）を対象から得、特定の種類の処理（例えば、遠心分離）が施された生体試料（例えば、血漿、血清、尿または任意の他の生体液）におけるバイオマーカーの濃度を検出すること、および免疫学的技術、例えば、ＥＬＩＳＡの使用による検出を含む。
【００３３】
具体的な態様において、本明細書に記載されるＥＬＩＳＡアッセイは、特定の種類の処理（例えば、遠心分離）が施された生体試料（例えば、血漿、血清、尿または任意の他の生体液）におけるバイオマーカーの濃度を検出するために用いられ得る。生体試料におけるバイオマーカーの濃度を検出するために用いられ得る当技術分野で公知の他の技術としては、多重アッセイまたはプロテオミクスアッセイが挙げられる。
具体的な態様において、本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、膵臓癌に関連する１つ、２つまたはそれ以上の症状を軽減または管理する。膵臓癌の１つ、２つまたはそれ以上の症状の軽減または管理は、膵臓癌を予防、治療または改善するための化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物の有効性の臨床エンドポイントとして用いられ得る。いくつかの態様において、本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、膵臓癌に関連する１つまたは複数の症状の持続時間および／または重症度を低減する。いくつかの態様において、本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、膵臓癌に関連する１つまたは複数の症状の発症、進行および／または再発を阻害する。いくつかの態様において、本明細書に提供される膵臓癌を治療する方法は、膵臓癌に関連する症状の数を減少させる。
【００３４】
ある種の態様において、本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、細胞周期のＧ１／Ｓ期またはＧ１／Ｓ後期（すなわち、後期チェックポイント（休薬または前ＤＮＡ合成期）から初期ＤＮＡ合成期までの期間）を延長または遅延させる。他の態様において、本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、細胞周期のＳ期またはＧ２／Ｍ期（ＤＮＡ合成期から初期分裂期までの期間）を延長または遅延させる。
いくつかの態様において、本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、膵臓癌および／またはその１つもしくは複数の症状の重症度を低減、改善または軽減する。他の態様において、本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、膵臓癌と診断された対象の入院（例えば、入院頻度または入院の持続期間）を減少させる。
【００３５】
ある種の態様において、本明細書に提供される方法は、膵臓癌と診断された対象の生存を増加させる。具体的な態様において、本明細書に提供される方法は、膵臓癌と診断された対象の生存を約６カ月以上、約７カ月以上、約８カ月以上、約９カ月以上または約１２カ月以上増加させる。
特定の態様において、本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、膵臓癌、またはこれに関連する１つもしくは複数の症状の進行を阻害または低減する。具体的な態様において、本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、別の療法（例えば、抗癌剤、放射線、化学療法などの薬物療法、抗アンドロゲン療法または手術）の治療効果を向上または改善する。ある種の態様において、本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、補助療法としての化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物の使用を含む。
【００３６】
特定の態様において、本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、膵臓癌と診断された対象の死亡率を低下させる。ある種の態様において、本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、寛解状態の対象の数を増加させるか、または入院率を低下させる。他の態様において、本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、膵臓癌に関連する１つまたは複数の症状の発生、発症または進行を予防する。
特定の態様において、本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、膵臓癌対象の無症状生存を増加させる。いくつかの態様において、本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、対象における膵臓癌を治癒するのではなく、疾患の進行または悪化を予防する。いくつかの態様において、本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、対象の生活の質を改善する。
【００３７】
ある種の態様において、本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、癌と診断された対象の無癌生存率を増加させる。いくつかの態様において、本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、無再発生存を増加させる。ある種の態様において、本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、寛解状態の対象の数を増加させる。他の態様において、本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、対象の寛解期間を延長する。
治療集団
いくつかの態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、膵臓癌を有するか、または膵臓癌と診断されたヒトである。他の態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、膵臓癌に罹患しやすいか、またはその影響を受けやすいヒトである。いくつかの態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、膵臓癌を発生するリスクのあるヒトである。
【００３８】
一態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、ヒト乳児である。別の態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、ヒト幼児である。別の態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、ヒト小児である。別の態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、ヒト成人である。別の態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、中年のヒトである。別の態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、高齢のヒトである。
ある種の態様において、本明細書に提供される方法に従って癌の治療を受ける対象は、身体の他の部分、例えば、骨、肺および肝臓に転移した膵臓癌を有する。ある種の態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、膵臓癌からの寛解状態にある。いくつかの態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、膵臓癌の再発を有していた。ある種の態様において、本明細書に提供される方法に従って治療を受ける対象は、膵臓癌に関連する１つまたは複数の症状の再発を経験している。
【００３９】
ある種の態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、約１〜約５歳、約５〜約１０歳、約１０〜約１８歳、約１８〜約３０歳、約２５〜約３５歳、約３５〜約４５歳、約４０〜約５５歳、約５０〜約６５歳、約６０〜約７５歳、約７０〜約８５歳、約８０〜約９０歳、約９０〜約９５歳または約９５〜約１００歳、またはその間の任意の年齢のヒトである。
【００４０】
具体的な態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、１８歳以上のヒトである。特定の態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、１歳〜１８歳の年齢のヒト小児である。ある種の態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、１２歳〜１８歳の年齢のヒトである。ある種の態様において、対象は男性のヒトである。別の態様において、対象は女性のヒトである。一態様において、対象は妊娠していないか、または授乳していない女性のヒトである。一態様において、対象は、妊娠しているか、もしくは妊娠する予定である／可能性があるか、または授乳している女性である。
特定の態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、免疫無防備状態または免疫抑制状態にあるヒトである。ある種の態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、免疫抑制療法を受けているか、またはそれから回復しているヒトである。ある種の態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、膵臓癌を有するか、またはそれに罹患するリスクがあるヒトである。ある種の態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、手術、化学療法などの薬物療法、ホルモン療法および／または放射線療法を受けているか、これらを受ける予定であるかまたはこれらを受けたヒトである。
【００４１】
いくつかの態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象には、化合物１以外の療法に対する何らかの有害な作用またはそれに対する不耐性が発生する前に、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物、あるいは組み合わせ療法が投与される。いくつかの態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、不応性である対象である。ある種の態様において、不応性である対象は、標準的療法（例えば、手術、放射線および／または化学療法などの薬物療法）に不応性である対象である。ある種の態様において、膵臓癌が有意に根絶されなかった場合、および／または１つもしくは複数の症状が有意に軽減されなかった場合、膵臓癌を有する対象は療法に不応性である。対象が不応性であるかどうかの決定は、このような文脈において「不応性」に関して当技術分野で認められる意味を用いて、膵臓癌の治療の有効性をアッセイする当技術分野で公知の任意の方法により、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかで行われ得る。
【００４２】
いくつかの態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物での治療以外の療法に対して不応性であることが証明されたが、もはやこれらの療法を受けていないヒトである。ある種の態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、１つまたは複数の従来の抗癌療法、例えば、手術、化学療法などの薬物療法、抗アンドロゲン療法または放射線をすでに受けているヒトである。とりわけ対象は不応性である対象、従来の療法には若すぎる対象、既存の療法での治療にもかかわらず膵臓癌が再発した対象である。
いくつかの態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、従来の療法に対する有害反応の影響を受けやすいヒトである。いくつかの態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物の投与前に、化学療法などの薬物療法、手術、抗アンドロゲン療法または放射線療法などの療法を受けていないヒトである。他の態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物の投与前に療法を受けたヒトである。いくつかの態様において、本明細書に提供される方法に従って膵臓癌の治療を受ける対象は、前の療法に対する有害な副作用を経験したヒト、または前の療法が、ヒトに対する許容できないレベルの毒性により中断されたヒトである。
【００４３】
投薬量および投与
化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物は、本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法に従って、有益な効果または治療効果をもたらす量で、様々な経路によりそれを必要とする対象に投与され得る。化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物は、本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法に従ってそれを必要とする対象に経口投与され得る。化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物の経口投与は、このような治療を必要とする対象が、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物の接種のレジメンに従うことを容易にし得る。したがって、具体的な態様において、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物は、それを必要とする対象に経口投与される。別の態様において、本明細書に提供される化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物は、食物または水を伴わず、またはそれを伴って経口投与され得る。
【００４４】
他の投与経路としては、静脈内、皮内、髄腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、吸入、経皮、局所、経粘膜、頭蓋内、硬膜外および関節滑液嚢内が挙げられるが、これらに限定されない。一態様において、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物は、それを必要とする対象に全身（例えば、非経口）投与される。一態様において、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物は、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物が、血液脳関門を横断することを可能にする経路（例えば、経口）を介して投与される。
化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物、および１つまたは複数の追加療法は、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物を１つまたは複数の追加療法と組み合わせて投与することを含む、本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法に従って、同じ投与経路または異なる投与経路で投与され得る。
【００４５】
本明細書に提供される膵臓癌を予防、治療または改善する方法に従って、それを必要とする対象に投与される、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物の投与の投薬量および頻度は、何らかの副作用を最小限に抑えながら効果がある。化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物の投与の正確な投薬量および頻度は、治療を必要とする対象に関連する因子を考慮して、実務者により決定され得る。
考慮され得る因子としては、疾患状態の重症度、対象の全般的な健康、対象の年齢、体重および性別、食事、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応感度および療法に対する耐性／応答が挙げられる。化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物の投与の投薬量および頻度は、化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物の有効量を提供するため、または所望の効果を維持するために、経時的に調整され得る。
【００４６】
本明細書に記載されるように、本明細書に提供されるそれを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、有効量の化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物を対象に投与することを含み、そこで有効量は、対象に週２回異なる日に投与される用量であり、ある週の２回目の用量は１回目の３日目までに続き、翌週の１回目の用量は前週の２回目の用量の４日目までに続く。
具体的な態様において、有効量は対象に投与される用量であり、これは、対象の応答に応じて増加または減少され得る。
【００４７】
具体的な態様において、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、有効量の化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物を対象に投与することを含み、そこで有効量は、週２回経口投与される約５０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１５０ｍｇ〜約２００ｍｇなどの範囲、またはその間の任意の範囲の用量から選択される用量である。
具体的な態様において、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、有効量の化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物を対象に投与することを含み、そこで有効量は、週２回経口投与される約５０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇまたは約２００ｍｇなど、またはその間の任意の範囲から選択される用量である。
具体的な態様において、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、有効量の化合物１またはその薬学的に許容される塩もしくは医薬組成物を対象に投与することを含み、そこで有効量は、週２回経口投与される約５０ｍｇの用量である。
【００４８】
いくつかの態様において、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、有効量の化合物１またはその医薬組成物を対象に投与することを含み、そこで有効量は、１平方メートルあたりのｍｇ（ｍｇ／ｍ2）で表される投薬量である。化合物１のｍｇ／ｍ2は、例えば、動物の変換係数に１キログラムあたりのｍｇ（ｍｇ／ｋｇ）の動物の用量を乗じて、ヒト用量相当のｍｇ／ｍ2の用量を得ることにより求められ得る。規制上、以下の変換係数が用いられ得る：マウス＝３、ハムスター＝４．１、ラット＝６、モルモット＝７．７（Freireich et al., Cancer Chemother. Rep. 50(4):219-244 (1966)に基づく）。ヒトの身長および体重を使用して、ヒトの体表面積をボイドの体表面積算出式を適用して算出することができる。具体的な態様において、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、有効量の化合物１またはその医薬組成物を対象に投与することを含み、そこで有効量は、約０．１ｍｇ／ｍ2〜約１０００ｍｇ／ｍ2の範囲またはその間の任意の範囲の量である。
【００４９】
一態様において、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、有効量の化合物１またはその医薬組成物を対象に投与することを含み、そこで有効量は、膵臓癌を有する対象または予め確立された膵臓癌を有する動物モデルにおいて化合物１の標的平均血漿濃度を達成する投薬量である。
具体的な態様において、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、有効量の化合物１またはその医薬組成物を対象に投与することを含み、そこで有効量は、膵臓癌を有する対象または予め確立された膵臓癌を有する動物モデルにおいて、２４時間での化合物１の平均血漿濃度を約３時間μｇ／ｍＬ〜約７０時間μｇ／ｍＬ、約３時間μｇ／ｍＬ〜約６０時間μｇ／ｍＬ、約３時間μｇ／ｍＬ〜約５０時間μｇ／ｍＬ、約３時間μｇ／ｍＬ〜約４０時間μｇ／ｍＬ、約３時間μｇ／ｍＬ〜約３０時間μｇ／ｍＬ、約３時間μｇ／ｍＬ〜約２０時間μｇ／ｍＬ、約３時間μｇ／ｍＬ〜約１０時間μｇ／ｍＬなどの範囲で、またはその間の任意の範囲で達成する投薬量である。
【００５０】
具体的な態様において、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、有効量の化合物１またはその医薬組成物を対象に投与することを含み、そこで有効量は、膵臓癌を有する対象または予め確立された膵臓癌を有する動物モデルにおいて、２４時間での化合物１の平均血漿濃度を約３時間μｇ／ｍＬ、約１０時間μｇ／ｍＬ、約２０時間μｇ／ｍＬ、約３０時間μｇ／ｍＬ、約４０時間μｇ／ｍＬ、約５０時間μｇ／ｍＬ、約６０時間μｇ／ｍＬ、約７０時間μｇ／ｍＬなどまたはその間の任意の範囲で達成する投薬量である。
このような血漿濃度を達成するために、化合物１またはその医薬組成物の本明細書に記載される用量が投与され得る。ある種の態様において、化合物１またはその医薬組成物のその後の用量は対象に投与された化合物１またはその医薬組成物の用量で達成された化合物１の平均血漿濃度に基づき相応に調整され得る。
【００５１】
具体的な態様において、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、有効量の化合物１またはその医薬組成物を対象に投与することを含み、そこで有効量は、膵臓癌を有する対象または予め確立された膵臓癌を有する動物モデルにおいて、１つまたは複数のバイオマーカーの標的平均血漿濃度の低下を達成する投薬量である。
特定の態様において、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、有効量の化合物１またはその医薬組成物を対象に投与することを含み、そこで有効量は、膵臓癌を有する対象または予め確立された膵臓癌を有する動物モデルにおいて、例えば、当技術分野で公知の任意の撮像技術により決定される化合物１またはその医薬組成物の所望の組織対平均血漿濃度比を達成する投薬量である。
【００５２】
いくつかの態様において、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、有効量の化合物１またはその医薬組成物を対象に投与することを含み、そこで有効量は、各用量で同じであってもよく、または同じでなくてもよい。特定の態様において、化合物１またはその医薬組成物の第１の（すなわち、初期）用量は第１の期間にそれを必要とする対象に投与され、次いで、化合物１またはその医薬組成物の第２の（すなわち、負荷）用量が第２の期間に対象に投与され、その後、化合物１またはその医薬組成物の第３の（すなわち、維持）用量が第２の期間に対象に投与される。第１の用量は第２の用量より多くてもよく、または第１の用量は第２の用量より少なくてもよい。同様の方式において、化合物１またはその医薬組成物の第３の用量は、第２の用量より多くてもまたは少なくてもよく、第１の用量より多くてもまたは少なくてもよい。
【００５３】
いくつかの態様において、本明細書に記載される投薬量は、投与される総量を指す；すなわち、１超の化合物が投与される場合、いくつかの態様において、投薬量は、投与される総量に対応する。具体的な態様において、経口組成物は、約５質量％〜約９５質量％の化合物１を含有する。
それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法に従って化合物１またはその医薬組成物がそれを必要とする対象に投与される期間は、無癌生存または症状からの解放により決定される期間である。ある種の態様において、本明細書に提供される膵臓癌を治療する方法は、化合物１またはその医薬組成物を、膵臓癌に関連する１つまたは複数の症状の重症度および／または数が減少するまでの期間投与することを含む。
いくつかの態様において、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、化合物１またはその医薬組成物を最大４８週間投与することを含む。他の態様において、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、化合物１またはその医薬組成物を最大４週間、８週間、１２週間、１６週間、２０週間、２４週間、２６週間（０．５年間）、５２週間（１年間）、７８週間（１．５年間）、１０４週間（２年間）、または１３０週間（２．５年間）またはそれ以上投与することを含む。
【００５４】
ある種の態様において、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、化合物１またはその医薬組成物を無期限投与することを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される膵臓癌を治療する方法は、化合物１またはその医薬組成物を一定期間投与し、次いで、休薬期間（すなわち、化合物１またはその医薬組成物が投与されない期間）の後、化合物１またはその医薬組成物の投与が再開されることを含む。
具体的な態様において、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、化合物１またはその医薬組成物を、１週間サイクル、２週間サイクル、３週間サイクル、４週間サイクル、５週間サイクル、６週間サイクル、８週間サイクル、９週間サイクル、１０週間サイクル、１１週間サイクルまたは１２週間サイクルなどのサイクルで投与することを含む。このようなサイクルにおいて、化合物１またはその医薬組成物は、週１回または週２回投与され得る。毎週のサイクルの具体的な態様において、化合物１またはその医薬組成物は、週２回投与され得る。このような毎週のサイクルの具体的な態様において、化合物１またはその医薬組成物は１日１回投与され得る。
【００５５】
具体的な態様において、化合物１またはその医薬組成物の投与期間は、１つまたは複数の監視パラメーター、例えば、特定のバイオマーカーの濃度により指示され得る。
特定の態様において、化合物１またはその医薬組成物の投与期間は、１つまたは複数の監視パラメーター、例えば、バイオマーカーの濃度に基づき調整され得る。
ある種の態様において、化合物１またはその医薬組成物は、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法に従って、それを必要とする対象に、食事（例えば、朝食、昼食または夕食）の前、食事と同時または食事の後に投与される。具体的な態様において、化合物１またはその医薬組成物は、本明細書に提供される膵臓癌を治療する方法に従って、それを必要とする対象に午前中（例えば、午前５時〜午後１２時）に投与される。
【００５６】
ある種の態様において、化合物１またはその医薬組成物は、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法に従って、それを必要とする対象に正午（すなわち、午後１２時）に投与される。特定の態様において、化合物１またはその医薬組成物は、本明細書に提供される膵臓癌を治療する方法に従って、それを必要とする対象に午後（すなわち、午後１２時〜午後５時）、夕方（例えば、午後５時から就寝まで）、および／または就寝前に投与される。
具体的な態様において、化合物１またはその医薬組成物の一用量は、対象に１日１回および週２回投与される。
組み合わせ療法
化合物１またはその医薬組成物を１つまたは複数の追加療法と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含む、膵臓癌の治療のための組み合わせ療法が、本明細書に提供される。具体的な態様において、有効量の化合物１またはその医薬組成物を有効量の別の療法と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含む、膵臓癌の治療のための組み合わせ療法が、本明細書に提供される。
【００５７】
本明細書で使用する用語「組み合わせ」は、化合物１またはその医薬組成物の投与の文脈において、膵臓癌の治療において使用するための１つまたは複数の追加療法（例えば、剤、手術または放射線）の投与前、投与と同時、または投与後に化合物１またはその医薬組成物を投与することを指す。用語「組み合わせ」の使用は、１つまたは複数の治療剤および１つまたは複数の追加療法が対象に投与される順番を制限しない。具体的な態様において、化合物１またはその医薬組成物の投与と１つまたは複数の追加療法の投与との間の時間間隔は、約１〜５分間、１〜３０分間、３０〜６０分間、１時間、１〜２時間、２〜６時間、２〜１２時間、１２〜２４時間、１〜２日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１５週間、２０週間、２６週間、５２週間、１１〜１５週間、１５〜２０週間、２０〜３０週間、３０〜４０週間、４０〜５０週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、１２カ月間、１年間、２年間またはその間の任意の期間であり得る。ある種の態様において、化合物１またはその医薬組成物および１つまたは複数の追加療法は、１日未満、１週間未満、２週間未満、３週間未満、４週間未満、１カ月未満、２カ月未満、３カ月未満、６カ月未満、１年未満、２年未満または５年未満あけて投与される。
【００５８】
いくつかの態様において、本明細書に提供される組み合わせ療法は、化合物１またはその医薬組成物を毎日投与する工程、および１つまたは複数の追加療法を週１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、月１回、２カ月に１回（例えば、約８週間）、３カ月に１回（例えば、約１２週間）または４カ月に１回（例えば、約１６週間）投与する工程を含む。ある種の態様において、化合物１またはその医薬組成物および１つまたは複数の追加療法は、対象に周期的に投与される。サイクリング療法は、化合物１またはその医薬組成物を一定期間投与し、次いで１つまたは複数の追加療法を一定期間投与し、この順次投与を繰り返すことを含む。ある種の態様において、サイクリング療法は、化合物１もしくはその医薬組成物または追加療法が、一定期間（例えば、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、１０週間、２０週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、１２カ月間、２年間または３年間）投与されない休薬期間も含み得る。一態様において、投与サイクル数は１〜１２サイクル、２〜１０サイクルまたは２〜８サイクルである。
【００５９】
いくつかの態様において、それを必要とする対象における膵臓癌を予防、治療または改善する方法は、化合物１またはその医薬組成物を追加療法と組み合わせて投与する前に、化合物１またはその医薬組成物を単剤として一定期間投与することを含む。ある種の態様において、本明細書に提供される膵臓癌を治療する方法は、化合物１またはその医薬組成物を追加療法と組み合わせて投与する前に、追加療法を単独で一定期間投与することを含む。
いくつかの態様において、本明細書に提供される方法に従った化合物１またはその医薬組成物および１つまたは複数の追加療法の投与は、化合物１もしくはその医薬組成物または前記１つもしくは複数の追加療法の単独での投与と比較して、相加効果を有する。いくつかの態様において、本明細書に提供される方法に従った化合物１またはその医薬組成物および１つまたは複数の追加療法の投与は、化合物１もしくはその医薬組成物または前記１つもしくは複数の追加療法の単独での投与と比較して、相乗効果を有する。
【００６０】
本明細書で使用する用語「相乗」は、化合物１またはその医薬組成物を１つまたは複数の追加療法（例えば、剤）と組み合わせて投与する効果を指し、その組み合わせは、任意の２つ以上の単一療法（例えば、剤）の相加効果よりも有効である。
具体的な態様において、組み合わせ療法の相乗効果は、化合物１もしくはその医薬組成物または追加療法のより低い投薬量（すなわち、最適以下の用量）の使用、ならびに／あるいは対象への化合物１もしくはその医薬組成物または追加療法のより低い頻度の投与を可能にする。
ある種の態様において、化合物１もしくはその医薬組成物または追加療法のより低い投薬量を利用するか、ならびに／あるいは化合物１もしくはその医薬組成物または前記追加療法をより低い頻度で投与する能力は、膵臓癌の治療において、化合物１もしくはその医薬組成物または前記追加療法各々の有効性を低下させずに、対象に対する化合物１もしくはその医薬組成物または前記追加療法各々の投与に関連する毒性を低減する。
【００６１】
いくつかの態様において、相乗効果は、膵臓癌の治療において、化合物１またはその医薬組成物および各前記追加療法の有効性の改善をもたらす。いくつかの態様において、化合物１またはその医薬組成物と１つまたは複数の追加療法との組み合わせの相乗効果は、任意の単一療法の使用に関連する有害または望ましくない副作用を回避または低減する。
化合物１またはその医薬組成物と１つまたは複数の追加療法との組み合わせは、同じ医薬組成物中で対象に投与され得る。代替的に、化合物１またはその医薬組成物および１つまたは複数の追加療法は、別個の医薬組成物中で対象に同時投与され得る。化合物１またはその医薬組成物および１つまたは複数の追加療法は、別個の医薬組成物中で対象に順次投与され得る。化合物１またはその医薬組成物および１つまたは複数の追加療法はまた、同じまたは異なる投与経路で対象に投与され得る。
【００６２】
本明細書に提供される組み合わせ療法は、化合物１またはその医薬組成物を、膵臓癌を治療するための従来のまたは公知の療法と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含む。膵臓癌またはこれに関連する状態の他の療法は、１つまたは複数の症状を制御または緩和することが目的とされる。したがって、いくつかの態様において、本明細書に提供される組み合わせ療法は、鎮痛剤、または膵臓癌に関連する１つもしくは複数の症状またはこれに関連する状態を緩和または制御することを目的とした他の療法を、それを必要とする対象に投与することを含む。
膵臓癌を治療するための化合物１またはその医薬組成物と組み合わせて用いられ得る抗癌剤の具体例としては、ホルモン剤（例えば、アロマターゼ阻害剤、選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）およびエストロゲン受容体アンタゴニスト）、化学療法剤（例えば、微小管分解ブロッカー、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤およびＤＮＡ架橋剤または損傷剤）、血管新生阻害剤（例えば、ＶＥＧＦアンタゴニスト、受容体アンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト、血管標的剤（ＶＴＡ）／血管破壊剤（ＶＤＡ））、放射線療法および従来の手術が挙げられる。
【００６３】
膵臓癌を治療するための化合物１またはその医薬組成物と組み合わせて用いられ得るホルモン剤の非限定的な例としては、アロマターゼ阻害剤、ＳＥＲＭおよびエストロゲン受容体アンタゴニストが挙げられる。アロマターゼ阻害剤であるホルモン剤は、ステロイド系または非ステロイド系であり得る。非ステロイド系ホルモン剤の非限定的な例としては、レトロゾール、アナストロゾール、アミノグルテチミド、ファドロゾールおよびボロゾールが挙げられる。ステロイド系ホルモン剤の非限定的な例としては、アロマシン（エキセメスタン）、ホルメスタンおよびテストラクトンが挙げられる。ＳＥＲＭであるホルモン剤の非限定的な例としては、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標）として商標が付され／市販されている）、アフィモキシフェン、アルゾキシフェン、バゼドキシフェン、クロミフェン、フェマレル、ラソホキシフェン、オルメロキシフェン、ラロキシフェンおよびトレミフェンが挙げられる。エストロゲン受容体アンタゴニストであるホルモン剤の非限定的な例としては、フルベストラントが挙げられる。他のホルモン剤としては、アビラテロンおよびロナプリサンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
癌を治療するための化合物１またはその医薬組成物と組み合わせて用いられ得る化学療法剤の非限定的な例としては、微小管分解ブロッカー、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤およびＤＮＡ架橋剤または損傷剤が挙げられる。
微小管分解ブロッカーである化学療法剤としては、タキサン（例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）として商標が付され／市販されている）、ドセタキセル、ｎａｂ−パクリタキセル（ナノ粒子アルブミン結合パクリタキセル、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）として商標が付され／市販されている）、ラロタキセル、オルタタキセルおよびテセタキセル）；エポチロン（例えば、イクサベピロン）；およびビンカアルカロイド（Ｖｉｎｃａｌｋａｌｏｉｄ）（例えば、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標）として商標が付され／市販されている））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
代謝拮抗剤である化学療法剤としては、葉酸代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、アミノプテリン、ペメトレキセド、ラルチトレキセド）；プリン代謝拮抗剤（例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、ペントスタチン、チオグアニン）；ピリミジン代謝拮抗剤（例えば、５−フルオロウラシル、カペシタビン（ｃａｐｃｉｔａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、シタラビン、デシタビン、フロクスウリジン、テガフール）：およびデオキシリボヌクレオチド代謝拮抗剤（例えば、ヒドロキシ尿素）が挙げられるが、これらに限定されない。
トポイソメラーゼ阻害剤である化学療法剤としては、クラスＩ（カンプトテカ）トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標）として商標が付され／市販されている）、イリノテカン、ルビテカンおよびベロテカン）；クラスＩＩ（ポドフィルム）トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシドまたはＶＰ−１６、およびテニポシド）；アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、ドキシル、アクラルビシン、アムルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、バルルビシンおよびゾルビシン）；およびアントラセンジオン（例えば、ミトキサントロンおよびピクサントロン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
ＤＮＡ架橋剤（またはＤＮＡ損傷剤）である化学療法剤としては、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、メクロレタミン、イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標）として商標が付され／市販されている）、トロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、プレドニムスチン、ベンダムスチン、ウラムスチン、エストラムスチン、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標）として商標が付され／市販されている）、ロムスチン、セムスチン、フォテムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、マンノスルファン、トレオスルファン、カルボコン、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−トリエチレンチオホスホラミド、トリアジコン、トリエチレンメラミン）；アルキル化様剤（例えば、カルボプラチン（ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（登録商標）として商標が付され／市販されている）、シスプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、四硝酸トリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン）；非古典的ＤＮＡ架橋剤（例えば、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド（ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）として商標が付され／市販されている）、アルトレタミン、ミトブロニトール）；および挿入剤（例えば、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンおよびプリカマイシン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
膵臓癌を治療するための化合物１またはその医薬組成物と組み合わせて用いられ得る血管新生阻害剤の非限定的な例としては、ＶＥＧＦアンタゴニスト、受容体アンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト（例えば、ビタキシン、シレンギチドおよびＳ２４７）、およびＶＴＡ／ＶＤＡ（例えば、フォスブレタブリン）が挙げられる。ＶＥＧＦアンタゴニストとしては、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）として商標が付され／市販されている）およびラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）として商標が付され／市販されている））、ＶＥＧＦトラップ（例えば、アフリベルセプト）、ＶＥＧＦアンチセンスまたはｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡおよびアプタマー（例えば、ペガプタニブ（ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）として商標が付され／市販されている）が挙げられるが、これらに限定されない。受容体アンタゴニストである血管新生阻害剤としては、抗体（例えば、ラムシルマブ）、およびキナーゼ阻害剤（例えば、スニチニブ、ソラフェニブ、セジラニブ、パゾパニブ（ｐａｎｚｏｐａｎｉｂ）、バンデタニブ、アキシチニブおよびＡＧ−０１３９５８）、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。血管新生阻害剤の他の非限定的な例としては、ＡＴＮ−２２４、酢酸アネコルタブ（ＲＥＴＡＡＮＥ（登録商標）として商標が付され／市販されている）、微小管脱重合阻害剤、例えば、コンブレタスタチンＡ４プロドラッグ、およびタンパク質またはタンパク質断片、例えば、コラーゲン１８（エンドスタチン）が挙げられる。
【００６８】
膵臓癌を治療するための化合物１またはその医薬組成物と組み合わせて対象に投与され得る他の療法の非限定的な例としては、以下が挙げられる：
（１）スタチン、例えば、ロバスタチン（例えば、ＭＥＶＡＣＯＲ（登録商標）として商標が付され／市販されている）；
（２）ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシン（例えば、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）として商標が付され／市販されている）としても公知であるシロリムス、テムシロリムス（例えば、ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標）として商標が付され／市販されている）、エベロリムス（ｅｖｏｒｏｌｉｍｕｓ）（例えば、ＡＦＩＮＩＴＯＲ（登録商標）として商標が付され／市販されている）およびデフォロリムス；
（３）ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、チピファルニブ（例えば、ＺＡＲＮＥＳＴＲＡ（登録商標）として商標が付され／市販されている）；
（４）抗線維化剤、例えば、ピルフェニドン；
【００６９】
（５）ペグ化インターフェロン、例えば、ＰＥＧ−インターフェロンアルファ−２ｂ；
（６）ＣＮＳ刺激剤、例えば、メチルフェニデート（ＲＩＴＡＬＩＮ（登録商標）として商標が付され／市販されている）；
（７）ＨＥＲ−２アンタゴニスト、例えば、抗ＨＥＲ−２抗体（例えば、トラスツズマブ）およびキナーゼ阻害剤（例えば、ラパチニブ）；
（８）ＩＧＦ−１アンタゴニスト、例えば、抗ＩＧＦ−１抗体（例えば、ＡＶＥ１６４２およびＩＭＣ−Ａ１１）またはＩＧＦ−１キナーゼ阻害剤；
（９）ＥＧＦＲ／ＨＥＲ−１アンタゴニスト、例えば、抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、セツキシマブ、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍａｍａｂ））またはＥＧＦＲキナーゼ阻害剤（例えば、エルロチニブ（例えば、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）として商標が付され／市販されている）、ゲフィチニブ）；
（１０）ＳＲＣアンタゴニスト、例えば、ボスチニブ；
（１１）サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤、例えば、セリシクリブ；
（１２）ヤヌスキナーゼ２阻害剤、例えば、レスタウルチニブ；
（１３）プロテアソーム阻害剤、例えば、ボルテゾミブ；
（１４）ホスホジエステラーゼ阻害剤、例えば、アナグレリド；
（１５）イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、例えば、チアゾフリン；
【００７０】
（１６）リポキシゲナーゼ阻害剤、例えば、マソプロコール；
（１７）エンドセリンアンタゴニスト；
（１８）レチノイド受容体アンタゴニスト、例えば、トレチノインまたはアリトレチノイン；
（１９）免疫モジュレータ、例えば、レナリドミド、ポマリドミドまたはサリドマイド（例えば、ＴＨＡＬＩＤＯＭＩＤ（登録商標）として商標が付され／市販されている）；
（２０）キナーゼ（例えば、チロシンキナーゼ）阻害剤、例えば、イマチニブ（例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）として商標が付され／市販されている）、ダサチニブ、エルロチニブ、ニロチニブ、ゲフィチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ（例えば、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）として商標が付され／市販されている）、ラパチニブ、ＡＥＥ７８８またはＴＧ１００８０１；
（２１）非ステロイド系抗炎症剤、例えば、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）として商標が付され／市販されている）；
（２２）ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、例えば、フィルグラスチム（ＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標）として商標が付され／市販されている）；
（２３）フォリン酸またはロイコボリンカルシウム；
【００７１】
（２４）インテグリンアンタゴニスト、例えば、インテグリンα５β１−アンタゴニスト（例えば、ＪＳＭ６４２７）；
（２５）核内因子カッパベータ（ＮＦ−κβ）アンタゴニスト、例えば、抗酸化剤でもあるＯＴ−５５１；
（２６）ヘッジホッグ阻害剤、例えば、ＣＵＲ６１４１４、シクロパミン、ＧＤＣ−０４４９、または抗ヘッジホッグ抗体；
（２７）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、例えば、ＳＡＨＡ（ボリノスタット（ＺＯＬＩＮＺＡ（登録商標）として商標が付され／市販されている）としても公知である）ＰＣＩ−２４７８１、ＳＢ９３９、ＣＨＲ−３９９６、ＣＲＡ−０２４７８１、ＩＴＦ２３５７、ＪＮＪ−２６４８１５８５またはＰＣＩ−２４７８１；
（２８）レチノイド、例えば、イソトレチノイン（例えば、ＡＣＣＵＴＡＮＥ（登録商標）として商標が付され／市販されている）；
（２９）肝細胞増殖因子／散乱因子（ＨＧＦ／ＳＦ）アンタゴニスト、例えば、ＨＧＦ／ＳＦモノクローナル抗体（例えば、ＡＭＧ１０２）；
（３０）合成化学物質、例えば、アンチネオプラストン；
（３１）抗糖尿病薬、例えば、マレイン酸ロシグリタゾン（例えば、ＡＶＡＮＤＩＡ（登録商標）として商標が付され／市販されている）；
（３２）抗マラリア薬および殺アメーバ薬、例えば、クロロキン（例えば、ＡＲＡＬＥＮ（登録商標）として商標が付され／市販されている）；
（３３）合成ブラジキニン、例えば、ＲＭＰ−７；
（３４）血小板由来増殖因子受容体阻害剤、例えば、ＳＵ−１０１；
（３５）ＦＩｋ−１／ＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ２、ＦＧＦＲ１およびＰＤＧＦＲベータの受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ＳＵ５４１６およびＳＵ６６６８；
（３６）抗炎症剤、例えば、スルファサラジン（例えば、ＡＺＵＬＦＩＤＩＮＥ（登録商標）として商標が付され／市販されている）；ならびに
（３７）ＴＧＦ−ベータアンチセンス療法。
【００７２】
膵臓癌を治療するための化合物１またはその医薬組成物と組み合わせて対象に投与され得る他の療法の非限定的な例としては、天然に存在するゴナドトロピン放出ホルモンの合成ノナペプチド類似体、例えば、酢酸ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）として商標が付され／市販されている）；非ステロイド系抗アンドロゲン、例えば、フルタミド（ＥＬＵＥＸＩＮ（登録商標）として商標が付され／市販されている）またはニルタミド（ＮＩＬＡＮＤＲＯＮ（登録商標）として商標が付され／市販されている）；非ステロイド系アンドロゲン受容体阻害剤、例えば、ビカルタミド（ＣＡＳＯＤＥＸ（登録商標）として商標が付され／市販されている）；ステロイド系ホルモン、例えば、プロゲステロン；抗真菌剤、例えば、ケトコナゾール（ＮＩＺＯＲＡＬ（登録商標）として商標が付され／市販されている）；グルココルチコイド、例えば、プレドニゾン；リン酸エストラムスチンナトリウム（ＥＭＣＹＴ（登録商標）として商標が付され／市販されている）；ならびにビスホスホネート、例えば、パミドロネート、アレンドロネートおよびリセドロネートが挙げられる。
【００７３】
膵臓癌を治療するための化合物１またはその医薬組成物と組み合わせて用いられ得る療法のさらなる具体例としては、癌免疫療法に関連する剤（例えば、サイトカイン、インターロイキンおよび癌ワクチン）が挙げられるが、これらに限定されない。
化合物１またはその医薬組成物との組み合わせ療法として用いられ得る、膵臓癌に関連する副作用を軽減する剤の具体例としては、制吐剤、例えば、塩酸オンダンセトロン（ＺＯＦＲＡＮ（登録商標）として商標が付され／市販されている）、塩酸グラニセトロン（ＫＹＴＲＩＬ（登録商標）として標識が付され／市販されている）、ロラゼパム（ＡＴＩＶＡＮ（登録商標）として標識が付され／市販されている）およびデキサメタゾン（ＤＥＣＡＤＲＯＮ（登録商標）として標識が付され／市販されている）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
ある種の態様において、膵臓癌を治療するための本明細書に提供される組み合わせ療法は、化合物１またはその医薬組成物を、副作用、例えば、出血（通常、一過性で軽度の鼻出血）、動脈および静脈血栓症、高血圧、創傷治癒の遅延、無症候性タンパク尿、鼻中隔穿孔、高血圧に関連する可逆性後白質脳症症候群、意識朦朧、運動失調、頭痛、嗄声、悪心、嘔吐、下痢、発疹、爪下出血、骨髄異形成症候群、骨髄抑制、疲労、甲状腺機能低下症、ＱＴ間隔延長または心不全を治療および／または管理するために用いられる１つまたは複数の剤と組み合わせて投与することを含む。
ある種の態様において、化合物１またはその医薬組成物は、膵臓癌を治療するために、ＣＹＰ２Ｄ６により主に代謝される薬物（例えば、抗うつ薬（例えば、非三環系抗うつ薬、選択的セロトニン再取り込み阻害剤など）、抗精神病薬、ベータアドレナリン受容体ブロッカーまたは特定の種類の抗不整脈薬）と組み合わせて用いられない。
【００７５】
キット
化合物１またはその医薬組成物が充填された１つまたは複数の容器を含む医薬パックまたはキットが本明細書に提供される。さらに、膵臓癌の治療に有用な１つもしくは複数の他の療法、または他の適切な剤も、医薬パックまたはキットに含まれ得る。本明細書に記載される医薬組成物の成分のうちの１つまたは複数が充填された１つまたは複数の容器を含む医薬パックまたはキットも本明細書に提供される。医薬品または生物由来物質の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知がこのようなキットに関連してもよく、この通知は、ヒト投与のための製造、使用または販売に関する機関による承認を反映する。
【００７６】
本明細書において引用される文書が、参照により組み込まれるように具体的かつ個々に示されたかどうかにかかわらず、本明細書において参照されるすべての文書は、あたかも各々の個々の参照が、本明細書に十分に記載されていたかのように、あらゆる目的のために同じ程度で参照により本出願に組み込まれる。
次に、特許請求の範囲の主題が十分に記載され、前記が、本明細書に記載される主題の範囲または態様に影響を与えずに、広範囲の等価物内で実施され得ることが当業者により理解されるであろう。添付の特許請求の範囲は、すべてのこのような等価物を含むと解釈されることが意図される。
【実施例】
【００７７】
以下の実施例は、本発明の様々な方法を例示することが意図されるものであるが、本発明の範囲を限定することが意図されるものでは決してない。
以下の実施例で用いられる材料および方法は、商業的供給源から入手可能であったか、または公知の手順もしくは示された参考文献に記載される手順に従って当業者に公知の方法により得られた。
化合物１は、国際公開ＷＯ２０１４／０８１９０６に記載される手順に従って調製された。
化合物２は、ＢＭＩ−１機能の公知の阻害剤である６−（５，６−ジフルオロ−２−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−１−イル）−Ｎ−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）ピラジン−２−アミンを指し、国際公開ＷＯ２０１５／０７６８００に記載される手順に従って調製された。
【００７８】
細胞株、細胞培養物および生存率アッセイ
認証されたヒト細胞株をＡＴＣＣから購入し、最初の購入から３０累積継代以内で利用した。マウスＫＰＣ株を産生し、３０累積継代以内で使用した。Ｊ１００２細胞をＫＰＢＢＲマウスから産生し、１５累積継代以内で使用した。ＭｙｃｏＡｌｅｒｔマイコプラズマ検出キット（Ｌｏｎｚａ；ＬＴ０７−３１８）を用いて、実験期間を通して全細胞株のマイコプラズマ陰性を一貫して試験した。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２の標準条件下で維持し、ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３０−００３−ＣＩ）ならびに１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１０４３８−０３４）を補足したＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１２４３０−０５４）で増殖した。
【００７９】
増殖曲線については、細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３６０３）にプレーティングし、一晩播種させた。生存率測定がエンドポイント法であったため、各時点で複製プレートをプレーティングした。翌日、細胞を、指示された濃度の化合物１で処理し、最高使用濃度（常に０．００３％未満）のＤＭＳＯで処理した。細胞を９６時間処理し、生存率を、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ試薬（ＢｉｏＲａｄ、ＢＵＦ０１２Ｂ）を用いて２４時間ごとに求めた。簡単に言えば、１０μＬのＡｌａｍａｒＢｌｕｅを各ウェル（１００μＬ）に添加し、簡単に混合し、３７℃および５％ＣＯ2で４時間インキュベートさせた。インキュベーション後、蛍光をＰｒｏｍｅｇａマルチモードマイクロプレートリーダーで測定した。分析のために、バックグラウンドレベルを生の結果から減算し、次いでこれを正規化して、０日目のＤＭＳＯ処理細胞と比較した倍数変化として表した。すべてのアッセイを、処理群ごと、実験ごとに４〜８の技術的複製を用いて、少なくとも３連で行った。（図１ａおよび図１０ｂ）
【００８０】
用量応答曲線については、細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３６０３）にプレーティングし、一晩播種させた。翌日、細胞を化合物１で処理した。用量応答曲線は１０μＭで開始し、３倍の増加において低下し、最高使用濃度（常に０．０３％未満）のＤＭＳＯで終了した。細胞を７２時間処理し、次いで生存率を、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ試薬（ＢｉｏＲａｄ、ＢＵＦ０１２Ｂ）を用いて求めた。簡単に言えば、１０μＬのＡｌａｍａｒＢｌｕｅを各ウェル（１００μＬ）に添加し、簡単に混合し、３７℃および５％ＣＯ2で４時間インキュベートさせた。インキュベーション後、蛍光をＰｒｏｍｅｇａマルチモードマイクロプレートリーダーで測定した。分析のために、バックグラウンドレベルを生の結果から減算し、次いでこれを正規化して、ＤＭＳＯ処理細胞のパーセントとして表した。すべてのアッセイを、実験ごとに４〜８の技術的複製を用いて、少なくとも３連で行った。（図１０ｃ）
【００８１】
細胞周期分析
１６時間後、細胞が約３０〜５０％コンフルエントであるように、細胞を１２ウェルまたは６ウェルプレートに播種した。次いで、細胞を、ＤＭＳＯ（＜０．００３％）、化合物１（１００ｎＭまたは１μＭ）、または１００ｎＭのノコダゾール（Ｓｉｇｍａ、Ｍ１４０４）のいずれかで２４時間処理した。処理後、細胞を採取し、７０％氷冷エタノールに最低１時間固定した。固定後、細胞をＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋３μＭのＤＡＰＩ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、４２２８０１）または０．２５μｇの７−ＡＡＤ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５９９２５）に再懸濁し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）アナライザー１０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）またはＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ（商標）で分析した。細胞周期分析時間経過実験については、細胞を２４、４８または７２時間処理したことを除いて、上記のように調製した。データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。Ｇ２／Ｍの集団パーセントを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより得られた単変量細胞周期プラットフォームを用いて同定した。ＤＭＳＯ−処理細胞の４Ｎ集団にゲートをかけることにより、＞４Ｎの集団パーセントを求めた。（図１ｂ、図１ｃ、図２ａ、図２ｂ、図１０ｅおよび図１０ｇ）
【００８２】
細胞内タンパク質のフローサイトメトリー
リン酸化ヒストンＨ３（ＰＨ３）染色については、細胞を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｘｐ３／転写因子染色バッファーセット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、００−５５２３−００）を用いて、製造業者の指示書に従って、固定および透過処理した。細胞をＦｃ  Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５６４２２０）でブロッキングし、１００万細胞あたり５μＬのＰＨ３（Ｓｅｒ１０）抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、６５０８０５）を用いて染色した（４５分、室温、暗所）。試料をＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）で分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより分析した。（図１ｄおよび図３ａ）
【００８３】
活性カスパーゼ３（ＡｃｔＣａｓｐ３）染色については、カスパーゼ３（活性）ＦＩＴＣ染色キット（Ａｂｃａｍ、ａｂ６５６１３）を製造業者の指示書に従って使用した。約１６時間後、細胞が約５０〜６０％コンフルエントであるように、細胞を１２ウェルプレートに播種した。次いで、細胞を指示された濃度の薬物またはＤＭＳＯビヒクルで２４時間処理し、この時点で、細胞を採取し、ＦＩＴＣ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫで染色し（１μＬ／試料、１時間、室温、暗所）、洗浄し、次いでＤＡＰＩで染色して、分析した。試料をＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ（商標）で分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより分析した。（図３ａおよび図３ｂ）
【００８４】
ウエスタンブロッティング
ウエスタンブロッティングを、処理した細胞から単離した溶解物で行った。細胞を、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、１１８３６１７０００１）およびＨａｌｔ（商標）ホスファターゼ阻害剤カクテル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、７８４２０）を補足した、ＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸塩）を用いて溶解した。溶解物を、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、２３２２７）を用いて定量し、ＳＤＳ試料バッファーで希釈し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５〜３０μｇ／試料）により分離し、ＰＶＤＦ膜にトランスファーした。膜をＴＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中の５質量／体積％無脂肪乾燥乳でブロッキングし、一次抗体を４℃で一晩インキュベートし、指示された濃度のＴＢＳ−Ｔ中の５％ＢＳＡで希釈した。ＨＲＰコンジュゲート二次抗体をブロッキングバッファー中で室温で１時間インキュベートした後、Ｓｕｐｅｒ  Ｄｉｇｉｔａｌ−ＥＣＬ（商標）基質溶液（Ｋｉｎｄｌｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｒ１００２）を用いて検出した。（図５ｂ、図１０ａおよび図１１ｂ）
ウエスタンブロット抗体；
Ｂｍｉ１：細胞シグナル伝達、＃５８５６、１：１０００
ビンキュリン：細胞シグナル伝達、＃４６５０Ｓ、１：１０００
ベータ−チューブリン：細胞シグナル伝達、＃２１４６Ｓ、１：１０００
【００８５】
Ｐ−糖タンパク質基質の活性実験
ＭＤＣＫＩＩ−ｍｄｒ１およびＭＤＣＫＩＩ−ｗｔ細胞をＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＮＫＩ−ＡＶＬから購入した。細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補足したダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ）で培養し、３〜９継代で使用した。細胞を３×１０３細胞／ウェルの密度で９６ウェル組織培養処理プレートに播種した。細胞を付着させた４時間後、細胞を、Ｐ−糖タンパク質阻害剤Ｖａｌｓｐｏｄａｒの存在下または不在下で、試験化合物で処理した。プレートを３７℃、５％ＣＯ2で７２時間インキュベートし、ＡＴＰを、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて蛍光により測定した。（図４ｂ）
【００８６】
ＲＮＡシーケンシング
１試料あたり約１．７５μｇの総ＲＮＡをｐｏｌｙ−Ａプルダウンして、ｍＲＮＡを濃縮した。次いで、これを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡプレップキットのインプットとして使用した。試料を、Ｂｅｃｋｍａｎｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＲｏｂｏｔｅｒおよびＳＰＲＩｗｏｒｋｓ断片ライブラリーキットＩを用いてＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ４０００プラットフォーム用に調製した。ＰＣＲをＫＡＰＡ  ＰＣＲ増幅キットを用いて行った。次いで、ライブラリーを、Ｃｏｌｕｍｕｂｉａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｅｎｔｅｒでシーケンシングして、３０００万個の１００ｂｐ長のシングルエンドリードを生成した。（図１１ａ）
【００８７】
ＲＮＡ−ｓｅｑ解析
リードを、ＳＴＡＲアライナー（バージョン２．４．２）(Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, et al. STAR: Ultrafast Universal RNA-Seq Aligner, Bioinformatics 2013;29:15-21）を用いてヒト参照ゲノム（ＮＣＭｌ／Ｂｕｉｌｄ  ３７．２）にマッピングし、Ｒパッケージからの遺伝子アノテーション情報「ＴｘＤｂ．Ｈｓａｐｉｅｎｓ．ＵＣＳＣ．ｈｇ１９．ｋｎｏｗｎＧｅｎｅ」（Carlson M, Maintainer BP. TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene: Annotation Package for TxDb Object(s). 2015）を用いるＲパッケージからのｓｕｍｍａｒｉｚｅＯｖｅｒｌａｐｓ機能「ＧｅｎｏｍｉｃＡｌｉｇｎｍｅｎｔｓ」（Lawrence M, Huber W, Pages H, et al. Software for computing and annotating genomic ranges, PLoS Computational Biology 2013;9:e1003118）を用いて遺伝子レベルで定量した。ＲＮＡ−ｓｅｑデータをＧＥＯ（ＩＤ：ＧＳＥ１１８４４１）に蓄積させた。（図１１ａ）
【００８８】
差次的遺伝子発現（ＤＥＧ）
指示された条件間の差次的遺伝子発現解析を、Ｒパッケージ「ｌｉｍｍａ」を実装するｖｏｏｍ−ｌｉｍｍａフレームワークを用いて行った（Ritchie ME, Phipson B, Wu D, et al. Limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies, Nucleic Acids Research 2015;43:e47）。ＤＭＳＯと比較した化合物１の処理の全体的効果を、処理と時点の両方を考慮する多変量設計を用いて評価した。
【００８９】
遺伝子セット濃縮
デフォルトパラメーターを用いた単一試料のＧＳＥＡ：遺伝子セット変動解析のＲ実装を使用した（Hanzelmann S, Castelo R, Guinney J. GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data, BMC Bioinformatics 2013;14:7）。ＲＮＡシーケンシングからの生のカウントを、様々なライブラリーサイズを考慮して正規化し、ＤＥＳｅｑ２  Ｒパッケージに実装される負の二項分布に分散を適合させることにより、分散を安定化させた（Love MI, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2, Genome Biol 2014;15:550）。遺伝子セットをＭＳｉｇＤｂ  ｖ６．０モジュールＨＡＬＬＭＡＲＫ、Ｃ２  ｃａｎｏｎｉｃａｌ経路およびＣ６発癌性シグネチャーから回収した（Subramanian A, Tamayo P, Mootha VK, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles, Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102:15545-50およびLiberzon A, Subramanian A, Pinchback R, et al. Molecular signatures database (MSigDB) 3.0, Bioinformatics 2011;27:1739-40）。ＤＭＳＯの処理と化合物１の処理との間でのこれらの遺伝子セットの差次的濃縮解析を、ｌｉｍｍａ  Ｒパッケージを用いて行い（Ritchie ME, Phipson B, Wu D, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies, Nucleic Acids Res 2015;43:e47）、＜０．１の偽発見率（ＦＤＲ）を有意とみなした。厳選された経路の単一試料の濃縮結果を、ｐｈｅａｔｍａｐ  Ｒパッケージを用いてヒートマップに示した（http://CRAN R-project org/package= pheatmap R package version 2017;1:2）。（図１１ａ）
遺伝子セットシグネチャー
【００９０】
【表１】
2021535198.tif 000005
【００９１】
無細胞チューブリン重合アッセイ
ブタの脳からの＞９９％純粋なチューブリンを使用する、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ製の蛍光ベースチューブリン重合アッセイキット（＃ＢＫ０１１Ｐ）を用いて、製造業者の推奨に従って、アッセイを行った。使用した薬物をすべてＤＭＳＯに溶解し、次いで超純水で１０倍の最終濃度に希釈した。ＤＭＳＯの最終パーセンテージをすべての試料で一定に保った。チューブリンを、８０ｍＭのＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．９、２．０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、１．０ｍＭのＧＴＰ、１５％グリセロールおよび１０μＭの蛍光レポーター中で２ｍｇ／ｍＬで再懸濁して調製した。すべての薬物試料（１０倍）を、予め昇温させたハーフエリア９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、３６８６）に２連で添加し、次いで３７℃に１分間昇温させた。次いで、チューブリン（５０μL／ウェル）をすべてのウェルに添加し、プレートを３７℃に予め昇温させたプレートリーダーに置いた。プレートを、５秒間の中程度の軌道振盪により混合し、蛍光をＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ２プレートリーダーで９０分間６０秒ごとに測定した（Ｅｘ：３４０〜３６０＋／−２０ｎｍ、Ｅｍ：４１０〜４６０ｎｍ＋／−２０ｎｍ）。重合曲線の増殖期の直線部分の最大勾配（線形回帰による）を測定することにより、重合速度（蛍光単位／分）を求めた。（図１１ｅおよび図１１ｆ）
【００９２】
遊離チューブリン含有量の分析
遊離ヘテロ二量体チューブリンを、微小管／チューブリンＩｎ  ｖｉｖｏ生化学アッセイキット（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ、＃ＢＫ０３８）を用いて、製造業者の推奨に従って、微小管に組み込まれたチューブリンから分離した。約１６時間後、細胞が約５０〜６０％コンフルエントであるように、細胞を１２ウェルプレートに播種した。細胞を指示された濃度の薬物またはＤＭＳＯビヒクルで２時間処理し、この時点で、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、採取した。このアッセイのすべての工程を３７℃で行って、微小管塊を保存した。細胞を、０．１ｍＭのＧＴＰ、１．０ｍＭのＡＴＰおよび１倍のプロテアーゼ阻害剤カクテル（＃ＰＩＣ０２）を補足したＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎの溶解および微小管安定化バッファー（ＬＭＳ０１）に溶解した。試料を１，０００×ｇで３７℃にて５分間遠心分離した。上清を超遠心分離のために慎重に回収し、低速ペレット（ＬＳＰ）をＳＤＳ試料バッファー（ＳＤＳ０１）に懸濁し、−２０℃で凍結し、その後ウエスタンブロットにより分析した。低速上清を１００，０００×ｇで３７℃にて６０分間遠心分離した。上清（高速上清、ＨＳＳ）を慎重に回収し、ＳＤＳ試料バッファーに再懸濁し、−２０℃で凍結し、その後ウエスタンブロットにより分析した。ペレット（高速ペレット、ＨＳＰ）を最初に１倍の微小管脱重合バッファー（ＢＵＦ０１）に１５分間溶解し、ＳＤＳ試料バッファーに再懸濁し、−２０℃で凍結し、その後ウエスタンブロットにより分析した。（図１１ｂ）
【００９３】
免疫細胞化学
細胞を１２ウェルプレートのガラスカバースリップに播種した。１Ｎ  ＨＣｌに浸漬し（６０℃、６時間）、７０％エタノールで洗浄し、製造業者の指示書に従ってポリ−ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ、Ｐ５８９９）でコーティングすることにより、カバースリップを調製した。翌日、細胞が約５０％コンフルエントであるように、細胞を播種した。次いで、細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ、＜０．００３％）または１μＭの化合物１で処理し、２４時間インキュベートした。処理後、細胞をＴＢＳで洗浄し、遊離チューブリンを、４ｍＭのＥＧＴＡおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを補足したＢｒｉｎｋｌｅｙバッファー１９８０（８０ｍＭのＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．８、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＥＧＴＡ）で抽出した（３０秒）。抽出後、細胞を、０．３２Ｍのショ糖を補足したＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎバッファー（１０ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ６．１、１３８ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ2、２ｍＭのＥＧＴＡ）で希釈した４％ホルムアルデヒドに２０分間固定した。固定後、細胞をＴＢＳで洗浄し、次いで、ＴＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）＋２％ＢＳＡ＋２２．５２ｍｇ／ｍＬのグリシンで３０分間ブロッキングした。ベータチューブリン抗体を４℃で一晩インキュベートし（Ａｂｃａｍ１７９５１３、１：１０００）、次いで１：５００でヤギ抗ウサギ５９４二次抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１１０１２）を用いて、二次抗体を室温で１時間インキュベートした。すべての洗浄をＴＢＳ−Ｔで行い、すべてのブロッキングおよび抗体インキュベーションをＴＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）＋２％ＢＳＡ＋２２．５２ｍｇ／ｍＬのグリシンで行った。染色後、細胞を３００ｎＭのＤＡＰＩ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、４２２８０１）で５分間インキュベートし、洗浄し、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄ褐色防止用封入剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐ３６９６５）に載せた。スライドを放置して室温で２４時間乾燥し、次いで画像が得られるまで４℃で暗所で貯蔵した。
【００９４】
共焦点撮像を、６０倍／１．４９  ＡｐｏＴＩＲＦ油浸対物ならびに標準レーザーおよびフィルターセットを用いるＥｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ顕微鏡スタンド上でＡ１レーザー走査型共焦点アタッチメント（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を用いて行った。ピンホール径を１エアリーユニットに設定し、単一の光学切片を細胞の基底面付近で得て、微小管の検出を最大にした。すべての撮像条件を一定に保った。ＩｍａｇｅＪのＦｉｊｉディストリビューションを用いて画像を視覚化し、分析し、公表用に作成した（Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frise E, et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods 2012;9:676-682）。（図１０ｄおよび図１０ｆ）
【００９５】
動物の繁殖および遺伝子型判定
以下の遺伝子操作系統を交雑させることにより、混合遺伝バックグラウンドの遺伝子操作モデルを産生した：
ＫｒａｓLSL.G12D−Tuveson DA, Shaw AT, Willis NA, et al. Endogenous oncogenic K-ras(G12D) stimulates proliferation and widespread neoplastic and developmental defects, Cancer Cell 2004;5:375-87に報告された。
Ｔｐ５３LSL.R172H−Olive KP, Tuveson DA, Ruhe ZC, et al. Mutant p53 gain of function in two mouse models of Li-Fraumeni syndrome, Cell 2004;119:847-60に報告された。
Ｐｄｘ１−Ｃｒｅtg−Hingorani SR, Petricoin EF, Maitra A, et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse, Cancer Cell 2003;4:437-50に報告された。
Ｔｐ５３Flox−Jonkers J, Meuwissen R, van der Gulden H, et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer, Nat Genet 2001;29:418-25に報告された。
ＫｒａｓFSF.G12D−Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、在庫番号００８６５３。
Ｔｐ５３R172H−Ｔｐ５３LSL.R172H系統をＤｅｌｅｔｅｒ−Ｃｒｅと交雑させて、生殖系列組換えを誘導し、次いでＣｒｅ対立遺伝子を交雑除去することにより、この系統を産生した。これは、Ｔｐ５３LSL.R172H対立遺伝子のＬｏｘ−ＳＴＯＰ−ＬＯＸカセットの組換えを誘導し、イントロン１に単一の外因性ＬｏｘＰ部位を有する生殖系列Ｔｐ５３R172H対立遺伝子をもたらした。
Ｐｄｘ１−ＦｌｐＯtg−Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ導入遺伝子の６ｋｂ近位プロモーターを、哺乳動物コドン最適化耐熱性Ｆｌｐリコンビナーゼ（ＦｌｐＯ）の開始コドンに融合させ、その後、ＦｌｐＯオープンリーディングフレームの５’末端をｈＧＨポリアデニル化シグナル配列に融合させた。
Ｂｍｉ１Flox−Mich JK, Signer RA, Nakada D, et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain, Elife 2014;3:e02669に記載された。
Ｒｏｓａ２６Cre-ERT2−Ventura A, Kirsch DG, McLaughlin ME, et al. Restoration of p53 function leads to tumour regression in vivo, Nature 2007;445:661-5に記載された。
ＫｒａｓLSL.G12D/+；ｐ５３LSL.G12D/+；Ｐｄｘ１−Ｃｒｅtg/+（ＫＰＣ）マウスおよび関連マウスを、Hingorani SR, Wang L, Multani AS, et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice, Cancer Cell 2005;7:469-83に記載されるように利用した。Ｊ１００２細胞は、ＫｒａｓFSF.G12D/+；ｐ５３R172H/+；Ｐｄｘ１−ＦｌｐＯtg/+；Ｂｍｉ１Fl/Fl；Ｒｏｓａ２６CreERT2/+（ＫＰＦＢＲ）マウスの自発性膵臓腫瘍に由来し、これは、セルリアン処理後（腫瘍発生を促進する）であるが、タモキシフェン処理前に発生した。遺伝子型判定をＴｒａｎｓｎｅｔｙｘ（Ｃｏｒｄｏｖａ、ＴＮ）により行った。試験では雄と雌両方の動物を利用した。動物には標準的な固形飼料を与え、１２時間の明／暗サイクル下で収容した。
【００９６】
ＫＰＦＢＲ初代腫瘍細胞株の産生
腫瘍の小片（約３０ｍｇ）を、氷冷腫瘍消化バッファー（５ｍＬ／試料）中で滅菌ハサミで最低５分間切断することにより、機械的に解離した。腫瘍消化バッファーは、滅菌ＰＢＳで希釈された７５μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＮ０５２１）、８０μｇ／ｍＬのディスパーゼＩＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１７１０５０４１）および１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＶ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ９２６３）で構成されていた。切断後、解離した腫瘍を、消化バッファー中３７℃で２０分間インキュベートした。消化後、４０ｍＬの氷冷ＰＢＳを使用して、消化した腫瘍を希釈し、全４５ｍＬを７０μｍの滅菌メッシュフィルターを通して濾過した。単一細胞懸濁液をスピンダウンし（３００×ｇ、５分）、ＰＢＳで１回洗浄し、無血清管培地（ＳＦＤＭ、以下の製法）に再懸濁し、コラーゲンコーティング６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４４００）の１〜２ウェルにプレーティングした。細胞をコラーゲンコーティングプレート上のＳＦＤＭに広げ、標準ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１％Ｌ−グルタミン）および標準組織培養プレート（コラーゲンなし）に移行した。
【００９７】
ＳＦＤＭ製法
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１２６３４０１０）
１．２２ｍｇ／ｍＬのニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ、Ｎ３３７６）
５ｍｇ／ｍＬのグルコース（Ｓｉｇｍａ、Ｇ６１５２）
５％ＩＴＳ＋（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、３５４３５２）
２．５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１５２９００１８）
５％Ｎｕ−血清ＩＶ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９２−０３２１）
２５μｇ／ｍＬのウシ脳下垂体抽出物（Ｓｉｇｍａ、１４７６）
２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＰＭＧ８０４１）
５０ｎＭの３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニン（Ｓｉｇｍａ、５６４６０５）
１μＭのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ、Ｄ１７５６）
１００ｎｇ／ｍＬのコレラ毒素（Ｑｕａｄｒａｔｅｃｈ、１００）
【００９８】
Ｂｍｉ１欠失の評価
Ｊ１００２細胞中の条件的Ｂｍｉ１対立遺伝子の組換えを評価するために、ＰＣＲを、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール抽出により単離したＤＮＡで行った。細胞を、１ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｐ８１０７Ｓ）を補足した溶解バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＮａＣｌおよび０．５％サルコシル）中５５℃で一晩消化した。翌日、溶解物を５０％フェノール、４８％クロロホルムおよび２％イソアミルアルコールの混合物と組み合わせ、１６，０００×ｇで３０分間遠心分離することにより、ＤＮＡを単離した。ＤＮＡを含有する上層を除去し、沈殿させ、２．５体積の１００％エタノールで洗浄した。ＤＮＡ濃度を、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計を用いて測定した。ＰＣＲ反応を、ＧｏＴａｑ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍ７１２Ｂ）、１ｎｇのＤＮＡおよび２５０ｎＭの各プライマーを用いて行った。野生型Ｂｍｉ１（Ｂｍｉ１WT）、ｌｏｘＰ導入部位を有するＢｍｉ１（Ｂｍｉ１fl/fl）および組換えＢｍｉ１（Ｂｍｉ１Δ）をすべて単一反応で増幅する３つのプライマー（ＤＮ４３７、ＤＮ４３８、ＤＮ９４６）を使用した。ＰＣＲ後、増幅したＤＮＡを、ＳＹＢＲ（商標）Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｓ３３１０２）を補足した２％アガロースゲルで分離し、ＵＶ光を用いて視覚化した。
【００９９】
プライマー
ＤＮ４３７：ｇｃｔａｇｃａｔｔｃｃｔｇｇｔｔｔｔｇｃ
ＤＮ４３８：ｇｇｃａｃａｇｔｇａｔｇａｇｇｔｇｔｔｇ
ＤＮ９４６：ｃａｃｇａｇｇｔｇｃｔｔｃｔｔｔｃｃｔｃ
サイクリング条件：
１．９５℃、２分
２．９５℃、１５秒
３．５１．４℃、１５秒
４．６８℃、４５秒
（工程２〜４を３０回繰り返す）
５．６８℃、５分
６．４℃、永久
予想される増幅産物：
野生型Ｂｍｉ１（Ｂｍｉ１WT）＝４００ｂｐ
フロックス化Ｂｍｉ１（Ｂｍｉ１fl/fl）＝５００ｂｐ
組換えＢｍｉ１（Ｂｍｉ１Δ）＝３００ｂｐ
【０１００】
ＰＤＸモデル介入試験
ＣｈａｍｐｉｏｎｓモデルＣＴＧ−１４６２からの初期継代腫瘍断片を、ｎｕ／ｎｕマウスに皮下移植し、次いで、腫瘍が１５０〜３００ｍｍ3に達したら、処置群に無作為化した。マウス（ｎ＝５／群）を、７群：ビヒクル、ゲムシタビン（５０ｍｇ／ｋｇ、週１回、腹腔内）、ｎａｂ−パクリタキセル（１０ｍｇ／ｋｇ、静脈内、週１回×３）、化合物１（１２．５ｍｇ／ｋｇ、週２回×４、経口）またはゲムシタビン＋ｎａｂ−パクリタキセル、ゲムシタビン＋化合物１、ｎａｂ−パクリタキセル＋化合物１またはゲムシタビン＋ｎａｂ−パクリタキセル＋化合物１の全用量の組み合わせのうちの１つで処置した。エンドポイントは、腫瘍が１５００ｍｍ3に達するか、または試験の９０日後であった。腫瘍の長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）径を、デジタルカリパーを用いて測定し、マウスを週２回秤量した。腫瘍体積を（Ｌ×Ｗ2）／２で計算した。（図１２ａおよび図１２ｂ）
【０１０１】
ＫＰＣ介入／生存試験
ＫＰＣマウスにおける腫瘍形成を、塊が検出されるまで毎週触診して監視した。触診陽性後、腫瘍が４〜７ｍｍの平均径の登録可能なサイズに達するまで、塊を週２回の超音波により監視した。登録可能になったら、ＫＰＣマウスを介入試験の処置群に無作為に登録した。マウスを、ビヒクル、化合物１（１７ｍｇ／ｋｇ、経口、週２回）、ゲムシタビン単独（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、週２回）または化合物１＋ゲムシタビンで処置した。化合物１が投与されたマウスには、ゲムシタビンビヒクル（生理食塩水、腹腔内、週２回）も５０×体重（ｇ）の体積（μＬ）で投与した。ゲムシタビンが投与されたマウスには、５．７×体重（ｇ）の体積（μＬ）で化合物１ビヒクル（０．１％Ｔｗｅｅｎ８０（ｗ／ｖ）を含む０．５％ヒドロキシプロピルメチルセルロース、経口、週２回）も投与した。薬物とビヒクルとの組み合わせをすべて同時に投与した。
【０１０２】
血漿および組織試料における化合物１のレベルの測定
分析のために用いられる血漿および組織試料をドライアイス上で即時凍結し、分析まで−８０℃で貯蔵した。試料中の化合物１の濃度を、高性能液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて定量した。化合物１およびその内部標準物質（重水素化された化合物１）を、試料からのタンパク質沈殿抽出により回収した。
血漿薬物動態時間経過試験のために、標準曲線を、０．００１μｇ／ｍＬ〜３．０μｇ／ｍＬの濃度に対応するように作成した。血漿中の化合物１（いずれかのバージョン）の定量下限（ＬＬＯＱ）は０．００１μｇ／ｍＬであった。（図４ａ）
【０１０３】
単回用量の化合物１の後に血漿、四頭筋および腫瘍組織を評価した薬物動態試験については、アッセイ条件は以下の通りであった（図５ａ）：
血漿：標準曲線を、０．００２μｇ／ｍＬ〜６．０μｇ／ｍＬの濃度に対応するように作成した。血漿中の化合物１（いずれかのバージョン）のＬＬＯＱは０．００１μｇ／ｍＬであった。
四頭筋：標準曲線を、０．００１μｇ／ｇの湿潤組織〜３．０μｇ／ｇの湿潤組織の濃度に対応するように作成した。化合物１（いずれかのバージョン）のＬＬＯＱは０．０１μｇ／ｇの湿潤組織であった。
腫瘍組織：標準曲線を、０．００１μｇ／ｇの湿潤組織〜３．０μｇ／ｇの湿潤組織の濃度に対応するように作成した。化合物１（いずれかのバージョン）のＬＬＯＱは０．０２μｇ／ｇの湿潤組織であった。
超音波
腫瘍の超音波検査および体積定量を、Sastra SA, Olive KP, Quantification of murine pancreatic tumors by high-resolution ultrasound, Methods Mol Biol 2013;980:249-66に記載されるように行った。（図７ａおよび図７ｂ）
【０１０４】
免疫組織化学
免疫組織化学用試料を調製するために、組織を最初に１０％リン酸緩衝ホルマリンに一晩固定し、次いで７０％エタノールに貯蔵して、長期貯蔵した。次いで、固定した組織に、標準脱水プロトコルを行って、それをパラフィンワックスブロックに包埋した。組織を、Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２２３５ミクロトームを用いて５μｍの厚さに切開し、正電荷ガラススライド上に載せて、６０℃で３０分間焼成した。染色用に調製するために、スライドを最初にキシレンで脱パラフィン化し、次いで、一連のエタノール工程で再水和した後、蒸留水ですすいだ。次に、抗原賦活化を、実験的に決定した抗体特異的抗原賦活化バッファー（通常１０ｍＭのクエン酸、ｐＨ６．０または１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ１０．０）で行った。抗原賦活化バッファーを加熱して、プレッシャークッカー中で沸騰させ、この時点でスライドを５分間導入した。室温に冷却した後、スライドをＰＢＳ中の３％過酸化水素に２０分間浸漬して、内因性ペルオキシダーゼを失活させた。
【０１０５】
次いで、スライドを、ＴＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）＋１．５％正常ウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓ−２０００）＋２％Ａｎｉｍａｌ  Ｆｒｅｅ  Ｂｌｏｃｋｅｒ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＳＰ−５０３０）中で室温で１時間ブロッキングした。一次抗体を、ブロッキング溶液で希釈し、４℃で、指示された濃度で一晩インキュベートした。翌日、二次抗体インキュベーションをＩｍｍＰＲＥＳＳ  ＨＲＰ抗ウサギＩｇＧ（ペルオキシダーゼ）ポリマー検出キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭＰ−７４０１）を用いて室温で３０分間行った。検出を、ＩｍｍＰＡＣＴ  ＤＡＢペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＳＫ−４１０５）を用いて行った後、スライドをヘマトキシリンで対比染色し、キシレンで脱水し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｓ７０１０４）でカバースリップした。（図６ｄおよび図６ｅ）
ＩＨＣ抗体：
ＰＨ３：細胞シグナル伝達、＃９７０１、１：１００
ＣＣ３：細胞シグナル伝達、＃９６６４Ｓ、１：１００
【図１ａ】
2021535198.tif 000007
【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
2021535198.tif 000029
【図９ｂ】
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【図１０ａ】
2021535198.tif 000031
【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
2021535198.tif 000033
【図１０ｄ】
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【図１０ｅ】
2021535198.tif 000035
【図１０ｆ】
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【図１０ｇ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１１ｅ】
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【図１１ｆ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【国際調査報告】
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