(57)【要約】本開示は、概して、中枢神経系変性を治療、予防、阻害、または遅延するための組成物および方法に関する。本開示は、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＤＪ−１、ＬＲＲＫ２、ＳＣＮＡ、ｃ−Ｒｅｌ、ＡＴＧ７、ＶＭＡＴ２、またはＧＢＡ遺伝子、またはその機能的断片もしくはバリアントを含む組換え遺伝子治療ベクターに関する。本開示はまた、中枢神経系変性を治療、予防、阻害、または遅延するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系遺伝子編集システムに関する。【選択図】図１
2021522273.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＰＡＲＫ２）、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）、タンパク質デグリカーゼＤＪ−１（ＤＪ−１）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、アルファ−シヌクレイン（ＳＣＮＡ）、がん原遺伝子ｃ−Ｒｅｌ（ｃ−Ｒｅｌ）、ユビキチン様修飾因子活性化酵素（ＡＴＧ７）、シナプス小胞アミン輸送体（ＶＭＡＴ２）、またはグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）をコードする導入遺伝子を含む発現カセットを含み、
前記導入遺伝子のポリヌクレオチドが、真核生物で活性なプロモーター配列と作動可能に連結される、
組換え遺伝子治療ベクター。
【請求項２】
前記導入遺伝子が、前記ＰＡＲＫ２をコードし、前記導入遺伝子のポリヌクレオチド配列が、配列番号３５〜３８のうちの１つと少なくとも９５％の同一性を共有する、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記プロモーター配列が、表５から選択される、請求項１または請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
前記発現カセットが、ＣＭＶエンハンサーをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項５】
前記発現カセットが、表６から選択される５’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項６】
前記発現カセットが、表７から選択される３’非翻訳領域をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項７】
前記発現カセットが、表８から選択されるポリアデニル化配列（ポリＡ）をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項８】
前記導入遺伝子が、コドン最適化されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項９】
前記発現カセットが、配列番号３９〜５８のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を共有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１０】
前記発現カセットが、
ＨｕＢＡプロモーター、前記導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｘ）、およびｐＡグロビン−Ｏｃ；
ＣＭＶプロモーター、ＴＰＬ−ｅＭＬＰエンハンサー、前記導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡグロビン−Ｏｃ；
Ｓｙｎプロモーター、前記導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｂｔ；
ＣＢＡプロモーター、前記導入遺伝子、およびｐＡＧＨ−Ｂｔ；
ＥＦ１αプロモーター、前記導入遺伝子、およびｐＡグロビン−Ｏｃ；
ＨｕＢＡプロモーター、前記導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡＧＨ−Ｂｔ；
Ｓｙｎプロモーター、前記導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｘ）、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ；
ＣａＭＫＩＩａプロモーター、前記導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ；
ＣＭＶプロモーター、ＴＰＬ−ｅＭＬＰ５’エンハンサー、前記導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ；
ＨｕＢＡプロモーター、前記導入遺伝子、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ；
ＣＭＶおよびＴＰＬプロモーター、ｅＭＰＬ、前記導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、３’ＵＴＲ（グロビン）、ならびにｐＡＧＨ−Ｂｔ；
ＥＦ１αプロモーター、前記導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡＧＨ−Ｂｔ；
Ｓｙｎプロモーター、前記導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡグロビン−Ｏｃ；
ＣａＭＫＩＩａプロモーター、前記導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡグロビン−Ｏｃ；
ＣＢＡプロモーター、前記導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｘ）、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ；
ＣＢＡプロモーター、前記導入遺伝子、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡグロビン−Ｏｃ；
ＣａＭＫＩＩａプロモーター、前記導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡＧＨ−Ｂｔ；
ＥＦ１αプロモーター、前記導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ；
ＣＭＶプロモーター、前記導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ；または
ＣＭＶプロモーター、前記導入遺伝子、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ
を５’から３’の順序で含み、
任意で、前記導入遺伝子が、ＰＡＲＫ２をコードする、
請求項１〜９のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１２】
前記発現カセットに隣接する２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
前記ＡＡＶが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶｒｈ７４を有する、請求項１１または１２に記載のベクター。
【請求項１４】
前記組換え遺伝子治療ベクターが、自己相補的ＡＡＶまたは一本鎖ＡＡＶを含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１５】
前記ＡＡＶが、野生型ＡＡＶまたは修飾ＡＡＶである、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１６】
前記ＡＡＶが、野生型ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３カプシドタンパク質と少なくとも９５％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１８】
パーキンソン病（ＰＤ）に関連する遺伝子中に変異を含むドーパミン作動性ニューロンの変性または死を阻害する方法であって、
前記ニューロンを、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組換え遺伝子治療ベクターと接触させること、を含み、
前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、前記ニューロンが、前記ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＤＪ−１、ＬＲＲＫ２、ＳＣＮＡ、ｃ−Ｒｅｌ、ＡＴＧ７、ＶＭＡＴ２、またはＧＢＡを発現し、
任意で、前記ニューロンが、ＰＡＲＫ２遺伝子中に変異を含み、前記発現カセットが、ＰＡＲＫ２をコードする、方法。
【請求項１９】
前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、減少した量のアルファ−シヌクレインを発現し、かつ／または減少した量のレビー小体を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、減少した量のモノアミンオキシダーゼを発現する、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、増加した量のドーパミンを産生および／または放出する、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、増加したマイトファジーを受ける、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンにおいて発現されるモノアミンオキシダーゼの量と比較して、より少ない量のモノアミンオキシダーゼを発現し、
任意で、前記の、より少ない量が、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していない前記ニューロンにおいて発現される前記量より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％低い、
請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンによって産生および／または放出されるドーパミンの量と比較して、増加した量のドーパミンを産生および／または放出し、
任意で、前記増加した量が、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していない前記ニューロンによって産生および／または放出される前記量よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍大きい、
請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンが受けるオートファジーの量と比較して、増加した量のオートファジーを受け、
任意で、前記増加した量が、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していない前記ニューロンが受ける前記量よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍大きい、
請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ニューロンが、初代チロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンである、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ニューロンが、パーキンソン病と診断された対象から得られた細胞から調製された人工多能性幹細胞から生成されている、請求項１８〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
パーキンソン病（ＰＤ）に罹患しているかまたはそのリスクがある対象において、前記ＰＤを治療またはその発症を阻害する方法であって、
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のベクターを前記対象に投与すること、を含み、
前記組換え遺伝子治療ベクターの投与が、前記対象における前記パーキンソン病を治療またはその発症を阻害する、方法。
【請求項２９】
前記ＰＤが、早期発症ＰＤ、任意で、早期発症常染色体劣性ＰＤである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象が、ＰＡＲＫ２遺伝子中に変異を含む、請求項２８または請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＰＡＲＫ２が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
投与するステップが、全身、非経口、静脈内、大脳、脳脊髄、髄腔内、大槽内、被殻内、海馬内、線条体内、または脳室内投与を含む、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記投与するステップが、静脈内、大脳、脳脊髄、髄腔内、大槽内、被殻内、海馬内、線条体内、または脳室内注入を含む、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記投与するステップが、トレンデレンブルグ傾斜での髄腔内注入を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記投与するステップが、脳の黒質の緻密部に直接的に注入することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記投与するステップが、前記対象の脳または脳脊髄液（ＣＳＦ）に前記組換え遺伝子治療ベクターを導入することを含む、請求項２８〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記対象の体重１キログラムあたり１ｘ１０９〜１ｘ１０１４のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の前記遺伝子治療ベクターが、前記対象に投与される、請求項２８〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記対象の体重１キログラムあたり１ｘ１０９〜１ｘ１０１４のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の前記遺伝子治療ベクターが、前記対象の脳に投与される、請求項２８〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記対象の体重１キログラムあたり１ｘ１０９〜１ｘ１０１４のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の前記遺伝子治療ベクターが、前記対象のＣＳＦに投与される、請求項２８〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記対象の体重１キログラムあたり１ｘ１０７〜１ｘ１０９のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の前記遺伝子治療ベクターが、前記対象に投与される、請求項２８〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記対象が、成人である、請求項２８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記対象が、子供である、請求項２８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記投与するステップ後の前記対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数が、前記投与するステップ前の前記対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数よりも多い、請求項２８〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記投与するステップ後の前記対象におけるドーパミンのレベルが、前記投与するステップ前の前記対象におけるドーパミンのレベルよりも大きい、請求項２８〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記方法によって治療される対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数が、そのように治療されない対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数と比較して増加する、請求項２８〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記方法によって治療される対象のドーパミンのレベルが、そのように治療されない対象におけるドーパミンのレベルと比較して増加する、請求項２８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
方法によって治療される対象の前記黒質におけるドーパミンのレベルが、そのように治療されない対象の前記黒質におけるドーパミンのレベルと比較して増加する、請求項２８〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記投与するステップ後の前記対象のＣＳＦにおけるＰＲＫＮのレベルが、前記投与するステップ前の前記対象のＣＳＦにおけるＰＲＫＮのレベルよりも大きい、請求項２８〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記投与するステップ前の前記対象の統一パーキンソン病評価尺度（ＵＰＤＲＳ）スコアが、前記投与するステップ前の前記対象のＵＰＤＲＳスコアと比較して改善される、請求項２８〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記方法によって治療される対象の前記ＣＳＦにおけるＰＲＫＮのレベルが、そのように治療されない対象の前記ＣＳＦにおけるＰＲＫＮのレベルと比較して増加する、請求項２８〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記方法によって治療される対象の前記ＵＰＤＲＳスコアが、そのように治療されない対象の前記ＵＰＤＲＳスコアと比較して改善される、請求項２８〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記対象のニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、減少した量のアルファ−シヌクレインを発現し、かつ／または減少した量のレビー小体を含む、請求項２８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
パーキンソン病（ＰＤ）に関連する遺伝子中に変異を含むドーパミン作動性ニューロンの変性または死を阻害する方法であって、
前記変異遺伝子が、パーキンソンタンパク質２のＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＰＡＲＫ２）遺伝子、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）遺伝子、タンパク質デグリカーゼＤＪ−１（ＤＪ−１）遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、アルファ−シヌクレイン（ＳＣＮＡ）遺伝子、がん原遺伝子ｃ−Ｒｅｌ（ｃ−Ｒｅｌ）遺伝子、ユビキチン様修飾因子活性化酵素（ＡＴＧ７）遺伝子、シナプス小胞アミントランスポーター（ＶＭＡＴ２）遺伝子、またはグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）遺伝子であり、
前記ニューロンを、前記変異遺伝子の野生型バージョンによって発現される野生型タンパク質またはその機能的バリアントもしくは断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換え遺伝子治療ベクターと接触させること、を含み、
前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、前記ニューロンが、前記野生型タンパク質またはその機能的バリアントもしくは断片を発現する、方法。
【請求項５４】
前記野生型ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＬＲＲＫ２、ＳＣＮＡ、ｃ−Ｒｅｌ、ＡＴＧ７、ＶＭＡＴ２、またはＧＢＡタンパク質が、それぞれ、配列番号１〜９に示されるアミノ酸配列を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記遺伝子が、前記ＰＡＲＫ２遺伝子であり、前記野生型ＰＡＲＫ２タンパク質が、配列番号１０〜１７のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記ポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号１８〜２６に示されるＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＬＲＲＫ２、ＳＣＮＡ、ｃ−Ｒｅｌ、ＡＴＧ７、ＶＭＡＴ２、またはＧＢＡポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記遺伝子が、前記ＰＡＲＫ２遺伝子であり、前記ポリヌクレオチドが、配列番号２７〜３４のいずれかに示されるＰＡＲＫ２アイソフォームポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記ポリヌクレオチドが、コドン最適化されている、請求項５３〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記組換え遺伝子治療ベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項５３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＡＡＶが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶｒｈ７４を有する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記組換え遺伝子治療ベクターが、自己相補的ＡＡＶを含む、請求項５９または請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記組換え遺伝子治療ベクターが、一本鎖ＡＡＶを含む、請求項５９〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＡＡＶが、野生型ＡＡＶまたは修飾ＡＡＶである、請求項５９〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＡＡＶが、野生型ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３カプシドタンパク質と少なくとも９５％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む、請求項５９〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記組換え遺伝子治療ベクターが、以下の
ａ．真核生物で活性なプロモーター配列と、
ｂ．前記野生型タンパク質またはその機能的断片もしくはバリアントをコードする配列と
を５’から３’の順序で含むポリヌクレオチドを含み、
前記野生型タンパク質またはその機能的断片もしくはバリアントをコードする配列が、前記真核生物で活性なプロモーター配列と作動可能に連結されている、
請求項５３〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記組換え遺伝子治療ベクターが、
ｈＳＹＮ１（ヒトシナプシン）、ＩＮＡ（アルファ−インターネキシン）、ＮＥＳ（ネスチン）、ＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）、ＦＯＸＡ２（フォークヘッドボックスＡ２）、ＣａＭＫＩＩ（カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ）、およびＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）プロモーターからなる群から任意で選択される、ニューロン特異的プロモーター、
ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、ＥＦ１−アルファ、ＧＡＰＤＨ、ＳＶ４０、ＨＢＶ、およびニワトリベータアクチン、ヒトベータアクチンプロモーターからなる群から選択されるユビキタスプロモーター、
エンハンサー、
イントロン、
ポリＡシグナル、
２Ａペプチドをコードする配列、ならびに
ＷＰＲＥ（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素）
のうちの１つ以上をさらに含む、請求項５３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、減少した量のアルファ−シヌクレインを発現し、かつ／または減少した量のレビー小体を含む、請求項５３〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、減少した量のモノアミンオキシダーゼを発現する、請求項５３〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、増加した量のドーパミンを産生および／または放出する、請求項５３〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、増加したマイトファジーを受ける、請求項５３〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンにおいて発現されるモノアミンオキシダーゼの量と比較して、より少ない量のモノアミンオキシダーゼを発現し、
任意で、前記の、より少ない量が、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していない前記ニューロンにおいて発現される前記量より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％低い、
請求項５３〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンによって産生および／または放出されるドーパミンの量と比較して、増加した量のドーパミンを産生および／または放出し、
任意で、前記増加した量が、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していない前記ニューロンによって産生および／または放出される前記量よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍大きい、
請求項５３〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンが受けるオートファジーの量と比較して、増加した量のオートファジーを受け、
任意で、前記増加した量が、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していない前記ニューロンが受ける前記量よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍大きい、
請求項５３〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記ニューロンが、初代チロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンである、請求項５３〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記ニューロンが、パーキンソン病と診断された対象から得られた細胞から調製された人工多能性幹細胞から生成されている、請求項５３〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
野生型パーキンソンタンパク質２のＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＰＡＲＫ２）遺伝子、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）遺伝子、タンパク質デグリカーゼＤＪ−１（ＤＪ−１）遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、アルファ−シヌクレイン（ＳＣＮＡ）遺伝子、がん原遺伝子ｃ−Ｒｅｌ（ｃ−Ｒｅｌ）遺伝子、ユビキチン様修飾因子活性化酵素（ＡＴＧ７）遺伝子、シナプス小胞アミントランスポーター（ＶＭＡＴ２）遺伝子、またはグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）遺伝子、またはその機能的バリアントもしくは断片をコードするポリヌクレオチドを含み、
前記ポリヌクレオチドが、真核生物で活性なプロモーターと作動可能に連結され、前記組換え遺伝子治療ベクターで形質導入されたニューロンが、前記野生型タンパク質、またはその機能的バリアントもしくは断片を発現する、
組換え遺伝子治療ベクター。
【請求項７７】
前記野生型ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＬＲＲＫ２、ＳＣＮＡ、ｃ−Ｒｅｌ、ＡＴＧ７、ＶＭＡＴ２、またはＧＢＡタンパク質が、それぞれ、配列番号１〜９に示されるアミノ酸配列を含む、請求項７６に記載の組換え遺伝子治療ベクター。
【請求項７８】
前記遺伝子が、前記ＰＡＲＫ２遺伝子であり、前記野生型ＰＡＲＫ２タンパク質が、配列番号１０〜１７のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、請求項７６に記載の組換え遺伝子治療ベクター。
【請求項７９】
前記ポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号１８〜２６に示されるＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＬＲＲＫ２、ＳＣＮＡ、ｃ−Ｒｅｌ、ＡＴＧ７、ＶＭＡＴ２、またはＧＢＡポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含む、請求項７６に記載の組換え遺伝子治療ベクター。
【請求項８０】
前記遺伝子が、前記ＰＡＲＫ２遺伝子であり、前記ポリヌクレオチドが、配列番号２７〜３４のいずれかに示されるＰＡＲＫ２アイソフォームポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含む、請求項７６に記載の組換え遺伝子治療ベクター。
【請求項８１】
前記ポリヌクレオチドが、コドン最適化されている、請求項７６に記載の組換え遺伝子治療ベクター。
【請求項８２】
前記組換え遺伝子治療ベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である、請求項７６〜８１のいずれか一項に記載の組換え遺伝子治療ベクター。
【請求項８３】
前記ｒＡＡＶが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶｒｈ７４を有する、請求項８２に記載の組換え遺伝子治療ベクター。
【請求項８４】
自己相補的ＡＡＶまたは一本鎖ＡＡＶを含む、請求項７６〜８３のいずれか一項に記載の組換え遺伝子治療ベクター。
【請求項８５】
前記ＡＡＶが、野生型ＡＡＶまたは修飾ＡＡＶである、請求項７６〜８３のいずれか一項に記載の組換え遺伝子治療ベクター。
【請求項８６】
前記ＡＡＶが、野生型ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３カプシドタンパク質と少なくとも９５％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む、請求項７６〜８５のいずれか一項に記載の組換え遺伝子治療ベクター。
【請求項８７】
パーキンソン病（ＰＤ）に罹患しているかまたはそのリスクがある対象において、前記ＰＤを治療またはその発症を阻害する方法であって、
野生型パーキンソンタンパク質２のＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＰＡＲＫ  ２）、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）、タンパク質デグリカーゼＤＪ−１（ＤＪ−１）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、アルファ−シヌクレイン（ＳＣＮＡ）、がん原遺伝子ｃ−Ｒｅｌ（ｃ−Ｒｅｌ）、ユビキチン様修飾因子活性化酵素（ＡＴＧ７）、シナプス小胞アミントランスポーター（ＶＭＡＴ２）、またはグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）タンパク質またはその機能的バリアントもしくは断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え遺伝子治療ベクターを前記対象に投与すること、を含み、
前記組換え遺伝子治療ベクターの投与が、前記対象における前記パーキンソン病を治療またはその発症を阻害する、方法。
【請求項８８】
前記ＰＤが、早期発症ＰＤ、任意で、早期発症常染色体劣性ＰＤである、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記対象が、ＰＡＲＫ２遺伝子、ＰＩＮＫ１遺伝子、ＬＲＲＫ２遺伝子、ＳＣＮＡ遺伝子、ｃ−Ｒｅｌ遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、ＶＭＡＴ２、またはＧＢＡ遺伝子中に変異を含む、請求項８７または請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＬＲＲＫ２、ＳＣＮＡ、ｃ−Ｒｅｌ、ＡＴＧ７、ＶＭＡＴ２、またはＧＢＡタンパク質が、それぞれ、配列番号１〜９に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８７〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記配列が、前記ＰＡＲＫ２遺伝子をコードし、前記野生型ＰＡＲＫ２タンパク質が、配列番号１０〜１７のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、請求項８７〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記ポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号１８〜２６に示されるＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＬＲＲＫ２、ＳＣＮＡ、ｃ−Ｒｅｌ、ＡＴＧ７、ＶＭＡＴ２、またはＧＢＡポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含む、請求項８７〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記配列が、前記ＰＡＲＫ２遺伝子をコードし、前記ポリヌクレオチドが、配列番号２７〜３４のいずれかに示されるＰＡＲＫ２アイソフォームポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含む、請求項８７〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＬＲＲＫ２、ＳＣＮＡ、ｃ−Ｒｅｌ、ＡＴＧ７、ＶＭＡＴ２、またはＧＢＡタンパク質、またはその機能的バリアントもしくは断片をコードする前記配列が、コドン最適化され、任意で、前記配列が、配列番号３５〜３８のうちのいずれかを含む、請求項８７〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である、請求項８７〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記ＡＡＶが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶｒｈ７４を有する、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記組換え遺伝子治療ベクターが、自己相補的ＡＡＶまたは一本鎖ＡＡＶを含む、請求項９５または請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記ＡＡＶが、野生型ＡＡＶまたは修飾ＡＡＶである、請求項９５〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記ＡＡＶが、野生型ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３カプシドタンパク質と少なくとも９５％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む、請求項９５〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記組換え遺伝子治療ベクターが、以下の
ａ．真核生物で活性なプロモーター配列と、
ｂ．前記野生型タンパク質またはその機能的断片もしくはバリアントをコードする配列と
を５’から３’の順序で含むポリヌクレオチドを含み、
前記野生型タンパク質またはその機能的断片もしくはバリアントをコードする配列が、前記真核生物で活性なプロモーター配列と作動可能に連結されている、
請求項９５〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記組換え遺伝子治療ベクターが、
ｈＳＹＮ１（ヒトシナプシン）、ＩＮＡ（アルファ−インターネキシン）、ＮＥＳ（ネスチン）、ＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）、ＦＯＸＡ２（フォークヘッドボックスＡ２）、ＣａＭＫＩＩ（カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ）、およびＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）プロモーターからなる群から任意で選択される、ニューロン特異的プロモーター、
ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、ＥＦ１−アルファ、ＧＡＰＤＨ、ＳＶ４０、ＨＢＶ、およびニワトリベータアクチン、ヒトベータアクチンプロモーターからなる群から選択されるユビキタスプロモーター、
エンハンサー、
イントロン、
ポリＡシグナル、
２Ａペプチドをコードする配列、ならびに
ＷＰＲＥ（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素）のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０２】
前記組換え遺伝子治療ベクターが、
ＨｕＢＡプロモーター、前記導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｘ）、およびｐＡグロビン−Ｏｃ；
ＣＭＶプロモーター、ＴＰＬ−ｅＭＬＰエンハンサー、前記導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡグロビン−Ｏｃ；
Ｓｙｎプロモーター、前記導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｂｔ；
ＣＢＡプロモーター、前記導入遺伝子、およびｐＡＧＨ−Ｂｔ；
ＥＦ１αプロモーター、前記導入遺伝子、およびｐＡグロビン−Ｏｃ；
ＨｕＢＡプロモーター、前記導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡＧＨ−Ｂｔ；
Ｓｙｎプロモーター、前記導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｘ）、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ；
ＣａＭＫＩＩａプロモーター、前記導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ；
ＣＭＶプロモーター、ＴＰＬ−ｅＭＬＰエンハンサー、前記導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ；
ＨｕＢＡプロモーター、前記導入遺伝子、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ；
ＣＭＶおよびＴＰＬプロモーター、ｅＭＰＬ、前記導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、３’ＵＴＲ（グロビン）、ならびにｐＡＧＨ−Ｂｔ；
ＥＦ１αプロモーター、前記導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡＧＨ−Ｂｔ；
Ｓｙｎプロモーター、前記導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡグロビン−Ｏｃ；
ＣａＭＫＩＩａプロモーター、前記導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡグロビン−Ｏｃ；
ＣＢＡプロモーター、前記導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｘ）、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ；
ＣＢＡプロモーター、前記導入遺伝子、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡグロビン−Ｏｃ；
ＣａＭＫＩＩａプロモーター、前記導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡＧＨ−Ｂｔ；
ＥＦ１αプロモーター、前記導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ；
ＣＭＶプロモーター、前記導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ；または
ＣＭＶプロモーター、前記導入遺伝子、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ
を５’から３’の順序で含み、
任意で、前記導入遺伝子が、ＰＡＲＫ２をコードする、
請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
投与するステップが、全身、非経口、静脈内、大脳、脳脊髄、髄腔内、大槽内、被殻内、海馬内、線条体内、または脳室内投与を含む、請求項８７〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記投与するステップが、静脈内、大脳、脳脊髄、髄腔内、大槽内、被殻内、海馬内、線条体内、または脳室内注入を含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記投与するステップが、トレンデレンブルグ傾斜での髄腔内注入を含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記投与するステップが、脳の黒質の緻密部に直接的に注入することを含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０７】
前記投与するステップが、前記対象の脳または脳脊髄液（ＣＳＦ）に前記組換え遺伝子治療ベクターを導入することを含む、請求項８７〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記対象の体重１キログラムあたり１ｘ１０９〜１ｘ１０１４のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の前記遺伝子治療ベクターが、前記対象に投与される、請求項８７〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記対象の体重１キログラムあたり１ｘ１０９〜１ｘ１０１４のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の前記遺伝子治療ベクターが、前記対象の脳に投与される、請求項８７〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記対象の体重１キログラムあたり１ｘ１０９〜１ｘ１０１４のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の前記遺伝子治療ベクターが、前記対象のＣＳＦに投与される、請求項８７〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記対象の体重１キログラムあたり１ｘ１０７〜１ｘ１０９のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の前記遺伝子治療ベクターが、前記対象に投与される、請求項８７〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記対象が、成人である、請求項８７〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記対象が、子供である、請求項８７〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記投与するステップ後の前記対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数が、前記投与するステップ前の前記対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数よりも多い、請求項８７〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記投与するステップ後の前記対象におけるドーパミンのレベルが、前記投与するステップ前の前記対象におけるドーパミンのレベルよりも大きい、請求項８７〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記方法によって治療される対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数が、そのように治療されない対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数と比較して増加する、請求項８７〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記方法によって治療される対象のドーパミンのレベルが、そのように治療されない対象におけるドーパミンのレベルと比較して増加する、請求項８７〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
方法によって治療される対象の前記黒質におけるドーパミンのレベルが、そのように治療されない対象の前記黒質におけるドーパミンのレベルと比較して増加する、請求項８７または請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記投与するステップ後の前記対象のＣＳＦにおけるＰＲＫＮのレベルが、前記投与するステップ前の前記対象のＣＳＦにおけるＰＲＫＮのレベルよりも大きい、請求項８７〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記投与するステップ前の前記対象の統一パーキンソン病評価尺度（ＵＰＤＲＳ）スコアが、前記投与するステップ前の前記対象のＵＰＤＲＳスコアと比較して改善される、請求項８７〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記方法によって治療される対象の前記ＣＳＦにおけるＰＲＫＮのレベルが、そのように治療されない対象の前記ＣＳＦにおけるＰＲＫＮのレベルと比較して増加する、請求項８７〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記方法によって治療される対象の前記ＵＰＤＲＳスコアが、そのように治療されない対象の前記ＵＰＤＲＳスコアと比較して改善される、請求項８７〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記対象のニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、減少した量のアルファ−シヌクレインを発現し、かつ／または減少した量のレビー小体を含む、請求項８７〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
変異パーキン（ＰＲＫＮ）遺伝子を有するドーパミン作動性ニューロンの変性または死を阻害する方法であって、
ａ．Ｃａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｂ．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；および
ｃ．機能的パーキンソンタンパク質２のＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＰＡＲＫ２）遺伝子、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）遺伝子、タンパク質デグリカーゼＤＪ−１（ＤＪ−１）遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、アルファ−シヌクレイン（ＳＣＮＡ）遺伝子、がん原遺伝子ｃ−Ｒｅｌ（ｃ−Ｒｅｌ）遺伝子、ユビキチン様修飾因子活性化酵素（ＡＴＧ７）遺伝子、シナプス小胞アミントランスポーター（ＶＭＡＴ２）遺伝子、またはグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）遺伝子、またはその機能的バリアントもしくは断片を含む修復鋳型
を含む遺伝子編集システムと、前記ニューロンとを接触させること、を含み、
前記遺伝子編集システムが、前記ニューロン内の内因性遺伝子を修復するか、または前記ニューロンのゲノム内に機能的遺伝子を挿入することが可能である、方法。
【請求項１２５】
前記遺伝子編集システムのうちの少なくとも１つの構成要素が、組換えＡＡＶによって送達される、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記遺伝子編集システムが、組換えＡＡＶによって送達される、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２７】
細胞の遺伝子編集システムであって、
ａ．Ｃａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｂ．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；および
ｃ．機能的パーキンソンタンパク質２のＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＰＡＲＫ２）遺伝子、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）遺伝子、タンパク質デグリカーゼＤＪ−１（ＤＪ−１）遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、アルファ−シヌクレイン（ＳＣＮＡ）遺伝子、がん原遺伝子ｃ−Ｒｅｌ（ｃ−Ｒｅｌ）遺伝子、ユビキチン様修飾因子活性化酵素（ＡＴＧ７）遺伝子、シナプス小胞アミントランスポーター（ＶＭＡＴ２）遺伝子、またはグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）遺伝子、またはその機能的バリアントもしくは断片を含む修復鋳型
を含み、
前記遺伝子編集システムが、前記細胞内の内因性遺伝子を修復するか、または前記細胞のゲノム内に機能的遺伝子を挿入することが可能である、
遺伝子編集システム。
【請求項１２８】
前記遺伝子編集システムのうちの少なくとも１つの構成要素が、組換えＡＡＶによって送達される、請求項１２７に記載の遺伝子編集システム。
【請求項１２９】
組換えＡＡＶによって送達される、請求項１２７に記載の遺伝子編集システム。
【請求項１３０】
前記細胞が、エクスビボニューロンである、請求項１２７〜１２９のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム。
【請求項１３１】
前記細胞が、対象の細胞である、請求項１２７〜１３０のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／６６４，００６号に対する優先権の利益を主張するものであり、その開示は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の組み込み
本出願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＲＯＰＡ＿００９＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは２５４ＫＢであり、２０１９年４月２９日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。
【０００３】
開示の分野
本開示は、概して、パーキンソン病などの中枢神経系変性に関連する障害の治療のための遺伝子治療および／または遺伝子編集に関する。詳細には、本開示は、エクスビボおよびインビボの両方でのニューロンにおける遺伝子治療または遺伝子修復のための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
背景
様々な遺伝子は、パーキンソン病（ＰＤ）などの中枢神経系変性の障害に関与している。これらの遺伝子は、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）、ＬＲＲＫ２、アルファ−シヌクレイン、およびＤＪ−１を含む。Ｃｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）Ｍｏｖ  Ｄｉｓｏｒｄ．３３：７１７−７２９（非特許文献１）、Ｂｌｅｓａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．８：１−１２（非特許文献２）、Ａｌｃａｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．６７：１１１６−１１２２（非特許文献３））。ＰＲＫＮとしても知られるＰＡＲＫ２は、常染色体劣性若年性ＰＤであるＰＤの形態に関与している。広範な試みにもかかわらず、中枢神経系変性についての遺伝子治療に成功したという報告はほとんどない。
【０００５】
中枢神経系変性を治療および予防する新しい組成物および方法が当技術分野において非常に必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）Ｍｏｖ  Ｄｉｓｏｒｄ．３３：７１７−７２９
【非特許文献２】Ｂｌｅｓａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．８：１−１２
【非特許文献３】Ａｌｃａｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．６７：１１１６−１１２２
【発明の概要】
【０００７】
開示の概要
本開示は、一部、中枢神経系変性を治療、予防、阻害、または遅延するための組成物および方法を提供する。詳細には、本発明者らは、パーキンソンタンパク質２のＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＰＡＲＫ２）遺伝子、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）遺伝子、タンパク質デグリカーゼＤＪ−１（ＤＪ−１）遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、アルファ−シヌクレイン（ＳＣＮＡ）遺伝子、がん原遺伝子ｃ−Ｒｅｌ（ｃ−Ｒｅｌ）遺伝子、ユビキチン様修飾因子活性化酵素（ＡＴＧ７）遺伝子、シナプス小胞アミントランスポーター（ＶＭＡＴ２）遺伝子、またはグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）遺伝子、またはその機能的断片もしくはバリアントを含む組換え遺伝子治療ベクターの様々な実施形態およびそれに関連する方法を開示する。
【０００８】
さらなる発明者らは、Ｃａｓタンパク質；ガイドＲＮＡ；パーキンソンタンパク質２のＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＰＡＲＫ  ２）遺伝子、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）遺伝子、タンパク質デグリカーゼＤＪ−１（ＤＪ−１）遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、アルファ−シヌクレイン（ＳＣＮＡ）遺伝子、がん原遺伝子ｃ−Ｒｅｌ（ｃ−Ｒｅｌ）遺伝子、ユビキチン様修飾因子活性化酵素（ＡＴＧ７）遺伝子、シナプス小胞アミントランスポーター（ＶＭＡＴ２）遺伝子、またはグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）遺伝子、またはその機能的断片もしくはバリアントを含む修復鋳型、を含む遺伝子編集システムの様々な実施形態およびそれに関連する方法を開示する。
【０００９】
第１の態様において、本開示は、パーキンソン病（ＰＤ）に関連する遺伝子中に変異を含むドーパミン作動性ニューロンの変性または死を阻害する方法を提供する。変異遺伝子は、パーキンソンタンパク質２のＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＰＡＲＫ  ２）遺伝子、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）遺伝子、タンパク質デグリカーゼＤＪ−１（ＤＪ−１）遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、アルファ−シヌクレイン（ＳＣＮＡ）遺伝子、がん原遺伝子ｃ−Ｒｅｌ（ｃ−Ｒｅｌ）遺伝子、ユビキチン様修飾因子活性化酵素（ＡＴＧ７）遺伝子、シナプス小胞アミントランスポーター（ＶＭＡＴ２）遺伝子、またはグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）遺伝子であり得る。本態様の方法では、本方法は、ニューロンを、変異遺伝子の野生型バージョンによって発現される野生型タンパク質またはその機能的バリアントもしくは断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換え遺伝子治療ベクターと接触させることを含む。組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、ニューロンは、野生型タンパク質またはその機能的バリアントもしくは断片を発現する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＬＲＲＫ２、ＳＣＮＡ、ｃ−Ｒｅｌ、ＡＴＧ７、ＶＭＡＴ２、またはＧＢＡタンパク質は、それぞれ、配列番号１〜９に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、ＰＡＲＫ２遺伝子であり、野生型ＰＡＲＫ２タンパク質は、配列番号１０〜１７のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１８〜２６に示されるＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＬＲＲＫ２、ＳＣＮＡ、ｃ−Ｒｅｌ、ＡＴＧ７、ＶＭＡＴ２、またはＧＢＡポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、ＰＡＲＫ２遺伝子であり、ポリヌクレオチドは、配列番号２７〜３４のいずれかに示されるＰＡＲＫ２アイソフォームポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、コドン最適化される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、４０未満、３０未満、２０未満、または１０以下のＣｐＧアイランドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、または少なくとも１０のＣｐＧアイランドを含む。いくつかの実施形態では、それは、５〜２０のＣｐＧアイランドを含む。
【００１１】
様々なウイルスまたは非ウイルスベクターを使用することができる。いくつかの実施形態では、組換え遺伝子治療ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。既知の血清型のいずれかを使用することができる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶｒｈ７４を有する。いくつかの実施形態では、組換え遺伝子治療ベクターは、自己相補的ＡＡＶを含む。いくつかの実施形態では、組換え遺伝子治療ベクターは、一本鎖ＡＡＶを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、野生型ＡＡＶまたは修飾ＡＡＶである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、野生型ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３カプシドタンパク質と少なくとも９５％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。
【００１２】
組換え遺伝子治療ベクターは、遺伝子調節要素を含み得る。いくつかの実施形態では、組換え遺伝子治療ベクターは、真核生物で活性なプロモーター配列と、野生型タンパク質またはその機能的断片もしくはバリアントをコードする配列とを５’から３’の順序で含むポリヌクレオチドを含む。野生型タンパク質またはその機能的断片もしくはバリアントをコードする配列は、真核生物で活性なプロモーター配列と作動可能に連結される。
【００１３】
本開示の例によって制限されることなく、いくつかの実施形態では、組換え遺伝子治療ベクターは、ｈＳＹＮ１（ヒトシナプシン）、ＩＮＡ（アルファ−インターネキシン）、ＮＥＳ（ネスチン）、ＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）、ＦＯＸＡ２（フォークヘッドボックスＡ２）、ＣａＭＫＩＩ（カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ）、およびＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）プロモーターからなる群から任意で選択される、ニューロン特異的プロモーター、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、ＥＦ１−アルファ、ＧＡＰＤＨ、ＳＶ４０、ＨＢＶ、およびニワトリベータアクチンプロモーターからなる群から選択されるユビキタスプロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリＡシグナル、ＷＰＲＥ（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素）、ならびにＨＰＲＥ（肝炎転写後調節要素）のうちの１つ以上をさらに含む。ＷＰＲＥは、ＷＰＲＥ（ｒ）またはＷＰＲＥ（ｘ）であり得る。
【００１４】
本明細書に開示されるベクターおよび方法のうちのいずれかの様々な実施形態では、ベクターは、
ＨｕＢＡプロモーター、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｘ）、およびｐＡグロビン−Ｏｃ、
ＣＭＶプロモーター、ＴＰＬ−ｅＭＬＰ  ５’エンハンサー、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡグロビン−Ｏｃ、
Ｓｙｎプロモーター、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｂｔ
ＣＢＡプロモーター、導入遺伝子、およびｐＡＧＨ−Ｂｔ、
ＥＦ１ａプロモーター、導入遺伝子、およびｐＡグロビン−Ｏｃ、
ＨｕＢＡプロモーター、導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡＧＨ−Ｂｔ、
Ｓｙｎプロモーター、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｘ）、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ、
ＣａＭＫＩＩａプロモーター、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ、
ＣＭＶおよびＴＰＬプロモーター、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、ならびにｐＡＧＨ−Ｈｓ、
ＨｕＢＡプロモーター、導入遺伝子、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ、
ＣＭＶおよびＴＰＬプロモーター、ｅＭＰＬ、導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、３’ＵＴＲ（グロビン）、ならびにｐＡＧＨ−Ｂｔ、
ＥＦ１αプロモーター、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡＧＨ−Ｂｔ、
Ｓｙｎプロモーター、導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡグロビン−Ｏｃ、
ＣａＭＫＩＩａプロモーター、導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡグロビン−Ｏｃ、
ＣＢＡプロモーター、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｘ）、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ、
ＣＢＡプロモーター、導入遺伝子、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡグロビン−Ｏｃ、
ＣａＭＫＩＩａプロモーター、導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡＧＨ−Ｂｔ、
ＥＦ１ａプロモーター、導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、３’グロビン、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ、
ＣＭＶプロモーター、導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ、または
ＣＭＶプロモーター、導入遺伝子、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ
を５’から３’の順序で含み、
任意で、導入遺伝子は、ＰＡＲＫ２をコードする。
【００１５】
本開示の方法は、様々な効果を有し得る。いくつかの実施形態では、ニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、減少した量のアルファ−シヌクレインを発現し、かつ／または減少した量のレビー小体を含む。いくつかの実施形態では、ニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、減少した量のモノアミンオキシダーゼを発現する。いくつかの実施形態では、ニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、増加した量のドーパミンを産生および／または放出する。いくつかの実施形態では、ニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、増加したマイトファジーを受ける。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンにおいて発現されるモノアミンオキシダーゼの量と比較して、少ない量のモノアミンオキシダーゼを発現し、任意で、該少ない量が、該組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンにおいて発現される量より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％低い。いくつかの実施形態では、ニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンによって産生および／または放出されるドーパミンの量と比較して、増加した量のドーパミンを産生および／または放出し、任意で、該増加した量が、該組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンによって産生および／または放出される量よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍大きい。いくつかの実施形態では、ニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンによって受けるオートファジーの量と比較して、増加した量のオートファジーを受け、任意で、増加した量が、該組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンによって受ける量よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍大きい。
【００１７】
本開示の方法で使用されるニューロンは、様々な特徴を有し得る。いくつかの実施形態では、ニューロンは、初代チロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンである。いくつかの実施形態では、ニューロンは、パーキンソン病と診断された対象から得られた細胞から調製された人工多能性幹細胞から生成されている。
【００１８】
別の態様では、本開示は、野生型パーキンソンタンパク質２のＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＰＡＲＫ  ２）遺伝子、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）遺伝子、タンパク質デグリカーゼＤＪ−１（ＤＪ−１）遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、アルファ−シヌクレイン（ＳＣＮＡ）遺伝子、がん原遺伝子ｃ−Ｒｅｌ（ｃ−Ｒｅｌ）遺伝子、ユビキチン様修飾因子活性化酵素（ＡＴＧ７）遺伝子、シナプス小胞アミントランスポーター（ＶＭＡＴ２）遺伝子、またはグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）遺伝子、またはその機能的バリアントもしくは断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換え遺伝子治療ベクターを提供し、ポリヌクレオチドは、真核生物で活性なプロモーター配列と作動可能に連結され、該組換え遺伝子治療ベクターで形質導入されたニューロンは、野生型タンパク質、またはその機能的バリアントもしくは断片を発現する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、機能的ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＬＲＲＫ２、ＳＣＮＡ、ｃ−Ｒｅｌ、ＡＴＧ７、ＶＭＡＴ２、またはＧＢＡタンパク質が、それぞれ、配列番号１〜９に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、ＰＡＲＫ２遺伝子であり、野生型ＰＡＲＫ２タンパク質は、配列番号１０〜１７のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１８〜２６に示されるＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＬＲＲＫ２、ＳＣＮＡ、ｃ−Ｒｅｌ、ＡＴＧ７、ＶＭＡＴ２、またはＧＢＡポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、ＰＡＲＫ２遺伝子であり、ポリヌクレオチドは、配列番号２７〜３４のいずれかに示されるＰＡＲＫ２アイソフォームポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、
ＨｕＢＡプロモーター、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｘ）、およびｐＡグロビン−Ｏｃ、
ＣＭＶプロモーター、ＴＰＬ−ｅＭＬＰ  ５’エンハンサー、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡグロビン−Ｏｃ、
Ｓｙｎプロモーター、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｂｔ
ＣＢＡプロモーター、導入遺伝子、およびｐＡＧＨ−Ｂｔ、
ＥＦ１ａプロモーター、導入遺伝子、およびｐＡグロビン−Ｏｃ、
ＨｕＢＡプロモーター、導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡＧＨ−Ｂｔ、
Ｓｙｎプロモーター、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｘ）、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ、
ＣａＭＫＩＩａプロモーター、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ、
ＣＭＶおよびＴＰＬプロモーター、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、ならびにｐＡＧＨ−Ｈｓ、
ＨｕＢＡプロモーター、導入遺伝子、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ、
ＣＭＶおよびＴＰＬプロモーター、ｅＭＰＬ、導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、３’ＵＴＲ（グロビン）、ならびにｐＡＧＨ−Ｂｔ、
ＥＦ１ａプロモーター、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡＧＨ−Ｂｔ、
Ｓｙｎプロモーター、導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡグロビン−Ｏｃ、
ＣａＭＫＩＩａプロモーター、導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡグロビン−Ｏｃ、
ＣＢＡプロモーター、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｘ）、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ、
ＣＢＡプロモーター、導入遺伝子、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡグロビン−Ｏｃ、
ＣａＭＫＩＩａプロモーター、導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡＧＨ−Ｂｔ、
ＥＦ１ａプロモーター、導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ、
ＣＭＶプロモーター、導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ、または
ＣＭＶプロモーター、導入遺伝子、およびｐＡＧＨ−Ｈｓ
を５’から３’の順序で含む発現カセットを含み、
任意で、導入遺伝子は、ＰＡＲＫ２をコードする。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、コドン最適化される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３５〜３８のいずれかを含む。いくつかの実施形態では、組換え遺伝子治療ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶｒｈ７４を有する。いくつかの実施形態では、組換え遺伝子治療ベクターは、自己相補的または一本鎖ＡＡＶゲノムを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、野生型ＡＡＶまたは修飾ＡＡＶである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、野生型ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３カプシドタンパク質と少なくとも９５％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。
【００２１】
別の態様では、本開示は、パーキンソン病（ＰＤ）に罹患しているかまたはそのリスクがある対象において、ＰＤを治療またはその発症を阻害する方法であって、野生型パーキンソンタンパク質２のＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＰＡＲＫ２）、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）遺伝子、タンパク質デグリカーゼＤＪ−１（ＤＪ−１）遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、アルファ−シヌクレイン（ＳＣＮＡ）遺伝子、がん原遺伝子ｃ−Ｒｅｌ（ｃ−Ｒｅｌ）遺伝子、ユビキチン様修飾因子活性化酵素（ＡＴＧ７）遺伝子、シナプス小胞アミントランスポーター（ＶＭＡＴ２）遺伝子、またはグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）遺伝子、またはその機能的バリアントもしくは断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換え遺伝子治療ベクターを対象に投与することを含み、組換え遺伝子治療ベクターの投与が、対象におけるパーキンソン病を治療またはその発症を阻害する、方法を提供する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ＰＤは、早期発症ＰＤ、任意で、早期発症常染色体劣性ＰＤである。いくつかの実施形態では、対象は、ＰＡＲＫ２遺伝子、ＰＩＮＫ１遺伝子、ＬＲＲＫ２遺伝子、ＳＣＮＡ遺伝子、ｃ−Ｒｅｌ遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、ＶＭＡＴ２、またはＧＢＡ遺伝子中に変異を含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＬＲＲＫ２、ＳＣＮＡ、ｃ−Ｒｅｌ、ＡＴＧ７、ＶＭＡＴ２、またはＧＢＡタンパク質は、それぞれ、配列番号１〜９に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、ＰＡＲＫ２遺伝子であり、野生型ＰＡＲＫ２タンパク質は、配列番号１０〜１７のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１８〜２６に示されるＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＬＲＲＫ２、ＳＣＮＡ、ｃ−Ｒｅｌ、ＡＴＧ７、ＶＭＡＴ２、またはＧＢＡポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、ＰＡＲＫ２遺伝子であり、ポリヌクレオチドは、配列番号２７〜３４のいずれかに示されるＰＡＲＫ２アイソフォームポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、コドン最適化される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３５〜３８のいずれかに示される配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、組換え遺伝子治療ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶｒｈ７４を有する。いくつかの実施形態では、組換え遺伝子治療ベクターは、自己相補的ＡＡＶゲノムを含む。いくつかの実施形態では、組換え遺伝子治療ベクターは、一本鎖ＡＡＶを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、野生型ＡＡＶまたは修飾ＡＡＶである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、野生型ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３カプシドタンパク質と少なくとも９５％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、組換え遺伝子治療ベクターは、真核生物で活性なプロモーター配列と、野生型タンパク質またはその機能的断片もしくはバリアントをコードする配列とを５’から３’の順序で含むポリヌクレオチドを含み、野生型タンパク質またはその機能的断片もしくはバリアントをコードする配列が、真核生物で活性なプロモーター配列と作動可能に連結される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、組換え遺伝子治療ベクターは、ｈＳＹＮ１（ヒトシナプシン）、ＩＮＡ（アルファ−インターネキシン）、ＮＥＳ（ネスチン）、ＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）、ＦＯＸＡ２（フォークヘッドボックスＡ２）、ＣａＭＫＩＩ（カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ）、およびＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）プロモーターからなる群から任意で選択される、ニューロン特異的プロモーター、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、ＥＦ１−アルファ、ＧＡＰＤＨ、ＳＶ４０、ＨＢＶ、ヒトベータアクチン、およびニワトリベータアクチンプロモーターからなる群から選択されるユビキタスプロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリＡシグナル、ＷＰＲＥ（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素）、ならびにＨＰＲＥ（肝炎転写後調節要素）のうちの１つ以上をさらに含む。
【００２６】
組換え遺伝子治療ベクターまたは遺伝子編集システムは、様々な方法で投与され得る。いくつかの実施形態では、投与するステップは、全身、非経口、静脈内、大脳、脳脊髄、髄腔内、大槽内、被殻内、海馬内、線条体内、または脳室内投与を含む。いくつかの実施形態では、投与するステップが、静脈内、大脳、脳脊髄、髄腔内、大槽内、被殻内、海馬内、線条体内、または脳室内注入を含む。いくつかの実施形態では、投与するステップは、トレンデレンブルグ傾斜での髄腔内注入を含む。いくつかの実施形態では、投与するステップは、脳の黒質の緻密部に直接的に注入することを含む。いくつかの実施形態では、投与するステップは、対象の脳または脳脊髄液（ＣＳＦ）に組換え遺伝子治療ベクターを導入することを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、対象の体重１キログラムあたり１ｘ１０９〜１ｘ１０１４のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の遺伝子治療ベクターが、対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象の体重１キログラムあたり１ｘ１０９〜１ｘ１０１４のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の遺伝子治療ベクターが、対象の脳に投与されるいくつかの実施形態では、対象の体重１キログラムあたり１ｘ１０９〜１ｘ１０１４のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の遺伝子治療ベクターが、対象のＣＳＦに投与される。いくつかの実施形態では、対象の体重１キログラムあたり１ｘ１０７〜１ｘ１０９のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の遺伝子治療ベクターが、対象に投与される。
【００２８】
本開示の方法は、成人および少年型疾患の両方に関する。いくつかの実施形態では、対象は、成人である。いくつかの実施形態では、対象は、子供である。
【００２９】
本開示の方法は、対象に対して様々な効果を有し得る。いくつかの実施形態では、投与するステップ後の対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数は、投与するステップ前の対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数よりも多い。いくつかの実施形態では、投与するステップ後の対象におけるドーパミンのレベルは、投与するステップ前の対象におけるドーパミンのレベルよりも大きい。いくつかの実施形態では、本方法によって治療される対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数は、そのように治療されない対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数と比較して増加する。いくつかの実施形態では、本方法によって治療される対象のドーパミンのレベルは、そのように治療されない対象におけるドーパミンのレベルと比較して増加する。いくつかの実施形態では、方法によって治療される対象の黒質におけるドーパミンのレベルは、そのように治療されない対象の黒質におけるドーパミンのレベルと比較して増加する。いくつかの実施形態では、投与するステップ後の対象のＣＳＦにおけるＰＲＫＮのレベルは、投与するステップ前の対象のＣＳＦにおけるＰＲＫＮのレベルよりも大きい。いくつかの実施形態では、投与するステップ前の対象の統一パーキンソン病評価尺度（ＵＰＤＲＳ）スコアは、投与するステップ前の対象のＵＰＤＲＳスコアと比較して改善される。いくつかの実施形態では、本方法によって治療される対象のＣＳＦにおけるＰＲＫＮのレベルは、そのように治療されない対象のＣＳＦにおけるＰＲＫＮのレベルと比較して増加する。いくつかの実施形態では、投与するステップ後の対象の黒質におけるＰＲＫＮのレベルは、投与するステップ前の対象の黒質におけるＰＲＫＮのレベルよりも大きい。いくつかの実施形態では、本方法によって治療される対象のＵＰＤＲＳスコアは、そのように治療されない対象のＵＰＤＲＳスコアと比較して改善される。いくつかの実施形態では、対象のニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、減少した量のアルファ−シヌクレインを発現し、かつ／または減少した量のレビー小体を含む。
【００３０】
別の態様では、本開示は、変異パーキン（ＰＲＫＮ）遺伝子を有するドーパミン作動性ニューロンの変性または死を阻害する方法であって、Ｃａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；および、機能的パーキンソンタンパク質２のＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＰＡＲＫ２）遺伝子、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）遺伝子、タンパク質デグリカーゼＤＪ−１（ＤＪ−１）遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、アルファ−シヌクレイン（ＳＣＮＡ）遺伝子、がん原遺伝子ｃ−Ｒｅｌ（ｃ−Ｒｅｌ）遺伝子、ユビキチン様修飾因子活性化酵素（ＡＴＧ７）遺伝子、シナプス小胞アミントランスポーター（ＶＭＡＴ２）遺伝子、またはグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）遺伝子、またはその機能的バリアントもしくは断片を含む修復鋳型、を含む遺伝子編集システムと、ニューロンとを接触させることを含み、遺伝子編集システムが、ニューロン内の内因性遺伝子を修復するか、またはニューロンのゲノム内に機能的遺伝子を挿入することが可能である、方法を提供する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムのうちの少なくとも１つの構成要素は、組換えＡＡＶによって送達される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムは、組換えＡＡＶによって送達される。
【００３２】
別の態様では、本開示は、細胞の遺伝子編集システムであって、Ｃａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；および、機能的パーキンソンタンパク質２のＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＰＡＲＫ２）遺伝子、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）遺伝子、タンパク質デグリカーゼＤＪ−１（ＤＪ−１）遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、アルファ−シヌクレイン（ＳＣＮＡ）遺伝子、がん原遺伝子ｃ−Ｒｅｌ（ｃ−Ｒｅｌ）遺伝子、ユビキチン様修飾因子活性化酵素（ＡＴＧ７）遺伝子、シナプス小胞アミントランスポーター（ＶＭＡＴ２）遺伝子、またはグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）遺伝子、またはその機能的バリアントもしくは断片を含む修復鋳型、を含み、遺伝子編集システムが、細胞内の内因性遺伝子を修復するか、または細胞のゲノム内に機能的遺伝子を挿入することが可能である、遺伝子編集システムを提供する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムのうちの少なくとも１つの構成要素は、組換えＡＡＶによって送達される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムは、組換えＡＡＶによって送達される。いくつかの実施形態では、細胞は、エクスビボニューロンである。いくつかの実施形態では、細胞は、対象の細胞である。
【００３４】
別の態様では、本開示は、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＰＡＲＫ２）遺伝子をコードする導入遺伝子ポリヌクレオチドを含む組換え遺伝子治療ベクターを提供し、導入遺伝子ポリヌクレオチドは、真核生物で活性なプロモーター配列と作動可能に連結される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子ポリヌクレオチドは、配列番号３５〜３８のうちの１つと少なくとも９５％の同一性を共有する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、表５から選択される。
【００３７】
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣＭＶエンハンサーをさらに含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ベクターは、表６から選択される５’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ベクターは、表７から選択される３’非翻訳領域をさらに含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ベクターは、表８から選択されるポリアデニル化配列（ポリＡ）をさらに含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、コドン最適化される。
【００４２】
いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号３９〜５８のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を共有する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ベクターは、発現カセットに隣接する２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶｒｈ７４を有する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、組換え遺伝子治療ベクターは、自己相補的ＡＡＶを含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、組換え遺伝子治療ベクターは、一本鎖ＡＡＶを含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、野生型ＡＡＶまたは修飾ＡＡＶである。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、野生型ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３カプシドタンパク質と少なくとも９５％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。
【００５０】
別の態様では、本開示は、前述の組換え遺伝子治療ベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。
【００５１】
別の態様では、本開示は、パーキンソン病（ＰＤ）に関連する遺伝子中に変異を含むドーパミン作動性ニューロンの変性または死を阻害する方法を提供し、変異遺伝子は、パーキンソンタンパク質２のＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＰＡＲＫ２）遺伝子であり、本開示の組換え遺伝子治療ベクターをニューロンと接触させることを含み、組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、ニューロンは野生型タンパク質を発現する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、減少した量のアルファ−シヌクレインを発現し、かつ／または減少した量のレビー小体を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、減少した量のモノアミンオキシダーゼを発現する。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、増加した量のドーパミンを産生および／または放出する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、増加したマイトファジーを受ける。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンにおいて発現されるモノアミンオキシダーゼの量と比較して、少ない量のモノアミンオキシダーゼを発現し、任意で、該少ない量が、該組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンにおいて発現される量より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％低い。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンによって産生および／または放出されるドーパミンの量と比較して、増加した量のドーパミンを産生および／または放出し、任意で、該増加した量が、該組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンによって産生および／または放出される量よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍大きい。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンによって受けるオートファジーの量と比較して、増加した量のオートファジーを受け、任意で、増加した量が、該組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンによって受ける量よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍大きい。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ニューロンは、初代チロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンである。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ニューロンは、パーキンソン病と診断された対象から得られた細胞から調製された人工多能性幹細胞から生成されている。
【００６１】
別の態様では、本開示は、パーキンソン病（ＰＤ）に罹患しているかまたはそのリスクがある対象において、ＰＤを治療またはその発症を阻害する方法であって、本開示の遺伝子治療ベクターを投与することを含み、組換え遺伝子治療ベクターの投与が、対象におけるパーキンソン病を治療またはその発症を阻害する、方法を提供する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ＰＤは、早期発症ＰＤ、任意で、早期発症常染色体劣性ＰＤである。
【００６３】
いくつかの実施形態では、対象は、ＰＡＲＫ２遺伝子中に変異を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ＰＡＲＫ２は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、投与するステップは、全身、非経口、静脈内、大脳、脳脊髄、髄腔内、大槽内、被殻内、海馬内、線条体内、または脳室内投与を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、投与するステップが、静脈内、大脳、脳脊髄、髄腔内、大槽内、被殻内、海馬内、線条体内、または脳室内注入を含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、投与するステップは、トレンデレンブルグ傾斜での髄腔内注入を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、投与するステップは、脳の黒質の緻密部に直接的に注入することを含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、投与するステップは、対象の脳または脳脊髄液（ＣＳＦ）に組換え遺伝子治療ベクターを導入することを含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、対象の体重１キログラムあたり１ｘ１０９〜１ｘ１０１４のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の遺伝子治療ベクターが、対象に投与される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、対象の体重１キログラムあたり１ｘ１０９〜１ｘ１０１４のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の遺伝子治療ベクターが、対象の脳に投与される。
【００７２】
いくつかの実施形態では、対象の体重１キログラムあたり１ｘ１０９〜１ｘ１０１４のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の遺伝子治療ベクターが、対象のＣＳＦに投与される。
【００７３】
いくつかの実施形態では、対象の体重１キログラムあたり１ｘ１０７〜１ｘ１０９のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の遺伝子治療ベクターが、対象に投与される。
【００７４】
いくつかの実施形態では、１×１０７〜１×１０１１の総ベクターゲノムは、例えば、被殻または黒質への直接的な注入を介して対象に投与される。
【００７５】
いくつかの実施形態では、対象は、成人である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、対象は、子供である。
【００７７】
いくつかの実施形態では、投与するステップ後の対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数は、投与するステップ前の対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数よりも多い。
【００７８】
いくつかの実施形態では、投与するステップ後の対象におけるドーパミンのレベルは、投与するステップ前の対象におけるドーパミンのレベルよりも大きい。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本方法によって治療される対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数は、そのように治療されない対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数と比較して増加する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本方法によって治療される対象のドーパミンのレベルは、そのように治療されない対象におけるドーパミンのレベルと比較して増加する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、方法によって治療される対象の黒質におけるドーパミンのレベルは、そのように治療されない対象の黒質におけるドーパミンのレベルと比較して増加する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、投与するステップ後の対象のＣＳＦにおけるＰＲＫＮのレベルは、投与するステップ前の対象のＣＳＦにおけるＰＲＫＮのレベルよりも大きい。
【００８３】
いくつかの実施形態では、投与するステップ前の対象の統一パーキンソン病評価尺度（ＵＰＤＲＳ）スコアは、投与するステップ前の対象のＵＰＤＲＳスコアと比較して改善される。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本方法によって治療される対象のＣＳＦにおけるＰＲＫＮのレベルは、そのように治療されない対象のＣＳＦにおけるＰＲＫＮのレベルと比較して増加する。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本方法によって治療される対象のＵＰＤＲＳスコアは、そのように治療されない対象のＵＰＤＲＳスコアと比較して改善される。
【００８６】
いくつかの実施形態では、対象のニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、減少した量のアルファ−シヌクレインを発現し、かつ／または減少した量のレビー小体を含む。
【００８７】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載および特許請求の範囲から明らかであり、それによって包含される。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を含む本特許または特許出願公開の写しは、請求および必要な料金の支払いに応じて官庁から提供されるであろう。
【図１】本開示の発現カセットの一実施形態を示す。
【図２−１】未トランスフェクション陰性対照（図２Ａ）および陽性対照（図２Ｂ）のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における遺伝子発現の代表的な顕微鏡写真を示す。発現カセットは二重で試験した：ＷＴ（図２Ｃおよび図２Ｄ）、ＣＯ１（図２Ｅおよび図２Ｆ）、ＣＯ２（図２Ｇおよび図２Ｈ）、およびＣＯ３（図２Ｉおよび図２Ｊ）。
【図２−２】図２Ｋは、ＧＦＰ＋細胞の割合を示す。
【図２−３】図２Ｌは、ＧＦＰ＋細胞の蛍光強度を示す。
【図３】トランスフェクトした細胞からの細胞溶解物に対して行われたパーキンの酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を示す。
【図４−１】未トランスフェクション陰性対照（図４Ａ）、ＷＴ（図４Ｂ）、ＣＯ１（図４Ｃ）、またはＣＯ４（図４Ｄ）のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における遺伝子発現の代表的な顕微鏡写真を示す。
【図４−２】図４Ｅは、ＧＦＰ＋細胞の割合を示す。図４Ｆは、ＧＦＰ＋細胞の蛍光強度を示す。
【図５】トランスフェクトした細胞からの細胞溶解物に対して行われたパーキンの酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を示す。
【図６−１】未トランスフェクション陰性対照（図６Ａ）、ＷＴ（図６Ｂ）、ＣＯ１（図６Ｃ）、またはＣＯ４（図６Ｄ）の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のパーキンノックアウトドーパミン作動性前駆細胞における遺伝子発現の代表的な顕微鏡写真を示す。
【図６−２】図６Ｅは、ＧＦＰ＋細胞の割合およびＧＦＰ＋細胞の蛍光強度を示す。ＷＴ、ＣＯ１、ＣＯ＄の各々について、左側のバーはＷＴに対するＧＦＰ強度の変化％を示し、右側のバーはＧＦＰ＋細胞の割合％を示す。
【図７】本開示のＡＡＶベクター発現カセットの一実施形態を示す。
【図８】導入遺伝子カセットおよびその様々な要素の図を示す。
【図９】表１０に列挙される構築物の各々についてのＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるパーキン導入遺伝子発現を示す。
【図１０】表１１に列挙される構築物の各々についてのｉＰＳＣ由来のパーキンノックアウトドーパミン作動性前駆細胞におけるパーキン導入遺伝子の発現を示す。
【図１１Ａ】明視野（図１１Ａ）、またはパーキン（図１１Ｂ）、ニューロンマーカーＮｅｕＮ（図１１Ｃ）、もしくはアストロサイトマーカーＧＦＡＰ（図１１Ｄ）について免疫蛍光で画像化された表１１の構築物の各々でトランスフェクトしたｉＰＳＣ由来のパーキンノックアウトドーパミン作動性前駆細胞の代表的な蛍光顕微鏡写真を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａの説明を参照のこと。
【図１１Ｃ】図１１Ａの説明を参照のこと。
【図１１Ｄ】図１１Ａの説明を参照のこと。
【図１２Ａ】図１１Ａの拡大画像を示す。
【図１２Ｂ】図１１Ｂの拡大画像を示す。
【図１２Ｃ】図１１Ｃの拡大画像を示す。
【図１２Ｄ】図１１Ｄの拡大画像を示す。
【図１３】例示的な構築物設計の図を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
詳細な説明
本開示は、一部、例えば、パーキンソン病の治療における中枢神経系変性を治療、予防、阻害、または遅延するための組成物および方法を提供する。詳細には、本発明者らは、パーキンソンタンパク質２のＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＰＡＲＫ  ２）遺伝子、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）遺伝子、タンパク質デグリカーゼＤＪ−１（ＤＪ−１）遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、アルファ−シヌクレイン（ＳＣＮＡ）遺伝子、がん原遺伝子ｃ−Ｒｅｌ（ｃ−Ｒｅｌ）遺伝子、ユビキチン様修飾因子活性化酵素（ＡＴＧ７）遺伝子、シナプス小胞アミントランスポーター（ＶＭＡＴ２）遺伝子、またはグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）遺伝子、またはその機能的断片もしくはバリアントを含む組換え遺伝子治療ベクターの様々な実施形態を開示する。本明細書で使用される場合、「遺伝子」または「導入遺伝子」という用語は、互換的に使用され、ポリペプチドまたはタンパク質、例えば表１に開示されるタンパク質のいずれか、をコードするポリヌクレオチド配列を指す。
【００９０】
本開示は、Ｃａｓタンパク質；ガイドＲＮＡ；パーキンソンタンパク質２のＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＰＡＲＫ  ２）遺伝子、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）遺伝子、タンパク質デグリカーゼＤＪ−１（ＤＪ−１）遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、アルファ−シヌクレイン（ＳＣＮＡ）遺伝子、がん原遺伝子ｃ−Ｒｅｌ（ｃ−Ｒｅｌ）遺伝子、ユビキチン様修飾因子活性化酵素（ＡＴＧ７）遺伝子、シナプス小胞アミントランスポーター（ＶＭＡＴ２）遺伝子、またはグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）遺伝子、またはその機能的断片もしくはバリアントを含む修復鋳型、を含む遺伝子編集システムの様々な実施形態をさらに含む。
【００９１】
本開示は、変異したＰＡＲＫ２遺伝子を有するドーパミン作動性ニューロンの変性または死を阻害する方法、およびパーキンソン病に罹患しているかまたはそのリスクがある対象における、パーキンソン病の発症または進行を治療または阻害する方法をさらに含む。特定の実施形態では、パーキンソン病は、早期発症または若年性パーキンソン病である。特定の実施形態では、それは、例えば、対象のＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ  １、ＤＪ−１、ＬＲＲＫ２、ＳＣＮＡ、ｃ−Ｒｅｌ、ＡＴＧ７、ＶＭＡＴ２、またはＧＢＡ遺伝子における常染色体劣性変異に関連するか、またはそれによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、組換え遺伝子治療構築物を対象の身体またはより詳細には脳に送達する。ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＤＪ−１、ＬＲＲＫ２、ＳＣＮＡ、ｃ−Ｒｅｌ、ＡＴＧ７、ＶＭＡＴ２、またはＧＢＡの組換え遺伝子治療ベクターまたは遺伝子編集システムも提供される。表１は、タンパク質配列を提供する。これらの遺伝子は、様々なアイソフォームとして発現する。例えば、本開示をＰＡＲＫ２に限定することなく、ＰＡＲＫ２のアイソフォームが表２に提供される。表３は、ポリヌクレオチド配列を提供する。表４は、ＰＡＲＫ２のアイソフォームのポリヌクレオチド配列を提供する。本開示は、コドン最適化ポリヌクレオチド、およびスプライスまたは非スプライスバリアントを含む、タンパク質またはポリヌクレオチドとしてのアイソフォームのいずれかを含むか、またはコードする組成物および方法を提供する。
【００９２】
（表１）ＣＮＳ分解に関連する遺伝子の非限定的な例
2021522273.tif 000003
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【００９３】
（表２）ＰＡＲＫ２のアイソフォーム
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【００９４】
（表３）ＣＮＳ分解に関連する非限定的な例の遺伝子のポリヌクレオチド
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【００９５】
（表４）ＰＡＲＫ２のアイソフォームのポリヌクレオチド
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【００９６】
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、これらのタンパク質またはポリヌクレオチド配列のうちのいずれかの機能的バリアントおよび機能的断片の使用を企図する。機能的断片およびバリアントは、対応する野生型タンパク質の生物学的特性または活性を保持するが、特定の事例において、特性または活性は、野生型タンパク質と比較して、例えば、約５０％、約６０％、約７０％、または約８０％に低減され得るか、または野生型タンパク質と比較して、例えば、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、または５倍に増加され得る。特定の実施形態では、タンパク質の機能的断片またはバリアントは、対応する野生型タンパク質と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、タンパク質の機能的断片は、対応する野生型タンパク質の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含む。
【００９７】
別の態様では、本開示は、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＰＡＲＫ２）をコードする導入遺伝子ポリヌクレオチドを含む組換え遺伝子治療ベクターを提供し、導入遺伝子ポリヌクレオチドは、真核生物で活性なプロモーター配列と作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、導入遺伝子ポリヌクレオチドは、配列番号３５〜３８のうちの１つと少なくとも９５％の同一性を共有する。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＰＡＲＫ２をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの事例では、導入遺伝子配列全体は、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化される。コドン最適化とは、コード化ＤＮＡにおける同義コドン（すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン）の出現頻度が、異なる種において偏っていることを指す。かかるコドン変性は、同一のポリペプチドを様々なヌクレオチド配列によってコードすることを可能にする。様々なコドン最適化方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、少なくとも米国特許第５，７８６，４６４号および同号第６，１１４，１４８号に開示される方法を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、ＰＡＲＫ２をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、ヒトＰＡＲＫ２をコードする天然ヒトポリヌクレオチド配列よりも少ないＣｐＧアイランドを含む。例えば、いくつかの実施形態では、天然ヒト配列は、９５のＣｐＧアイランドを含み、一方、コドン最適化ポリヌクレオチドは、９５未満、９０未満、８５未満、８０未満、７５未満、７０未満、６５未満、６０未満、５５未満、５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、３０未満、２５未満、２０未満、１５未満、１０未満、５未満のＣｐＧアイランドを含むか、または含まない。いくつかの実施形態では、コドン最適化ポリヌクレオチド配列は、２〜２０、５〜２０、約５、または約１０のＣｐＧアイランドを含む。いくつかの実施形態では、コドン最適化ポリヌクレオチド配列は、１つ以上のＣｐＧアイランドを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号３９〜５８のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号３９〜５８のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現カセットに隣接する２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶｒｈ７４を有する。いくつかの実施形態では、組換え遺伝子治療ベクターは、自己相補的ＡＡＶを含む。いくつかの実施形態では、組換え遺伝子治療ベクターは、一本鎖ＡＡＶを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、野生型ＡＡＶまたは修飾ＡＡＶである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、野生型ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３カプシドタンパク質と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含む。
【０１０１】
別の態様では、本開示は、前述の組換え遺伝子治療ベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。例示的な宿主細胞としては、ＨＥＫ２９３、２９３Ｔ、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、およびＳｆ９細胞が含まれる。
【０１０２】
別の態様では、本開示は、パーキンソン病（ＰＤ）に関連する遺伝子中に変異を含むドーパミン作動性ニューロンの変性または死を阻害、低減、または遅延させる方法を提供し、変異遺伝子は、パーキンソンタンパク質２のＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＰＡＲＫ２）遺伝子であり、本開示の組換え遺伝子治療ベクターをニューロンと接触させることを含み、組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、ニューロンは野生型タンパク質を発現する。本方法は、インビトロ、またはインビボで、例えば、それを必要とする対象において実践され得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、ニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、減少した量のアルファ−シヌクレインを発現し、かつ／または減少した量のレビー小体を含む。いくつかの実施形態では、アルファ−シヌクレインおよび／または減少した量のレビー小体が、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％以上低減されることを含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、減少した量のモノアミンオキシダーゼを発現する。いくつかの実施形態では、モノアミンオキシダーゼの量は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％以上低減される。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、ニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、増加した量のドーパミンを産生および／または放出する。いくつかの実施形態では、産生および／または放出されるドーパミンの量は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％以上増加する。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、増加したマイトファジーを受ける。いくつかの実施形態では、マイトファジーは、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％以上増加する。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンにおいて発現されるモノアミンオキシダーゼの量と比較して、少ない量のモノアミンオキシダーゼを発現し、任意で、該少ない量が、該組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンにおいて発現される量より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％低い。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、ニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンによって産生および／または放出されるドーパミンの量と比較して、増加した量のドーパミンを産生および／または放出し、任意で、該増加した量が、該組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンによって産生および／または放出される量よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍大きい。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、ニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンによって受けるオートファジーの量と比較して、増加した量のオートファジーを受け、任意で、増加した量が、該組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンによって受ける量よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍大きい。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ニューロンは、初代チロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンである。いくつかの実施形態では、ニューロンは、パーキンソン病と診断された対象から得られた細胞から調製された人工多能性幹細胞から生成されている。
【０１１１】
別の態様では、本開示は、パーキンソン病（ＰＤ）に罹患しているかまたはそのリスクがある対象において、ＰＤを治療またはその発症もしくは進行を阻害もしくは遅延する方法であって、本開示の遺伝子治療ベクターを対象に投与することを含み、組換え遺伝子治療ベクターの投与が、対象におけるパーキンソン病を治療またはその発症もしくは進行を阻害もしくは遅延する、方法を提供する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ＰＤは、早期発症ＰＤである。いくつかの実施形態では、ＰＤは、早期発症常染色体劣性ＰＤである。いくつかの実施形態では、対象は、ＰＡＲＫ２遺伝子中に変異を含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ＰＡＲＫ２またはその機能的断片もしくはバリアントをコードする導入遺伝子を含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＲＫ２は、配列番号１に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子ポリヌクレオチドは、配列番号３５〜３８のうちの１つと少なくとも９５％の同一性を共有する。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、投与するステップは、全身、非経口、静脈内、大脳、脳脊髄、髄腔内、大槽内、被殻内、海馬内、線条体内、または脳室内投与を含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、投与するステップが、静脈内、大脳、脳脊髄、髄腔内、大槽内、被殻内、海馬内、線条体内、または脳室内注入を含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、投与するステップは、トレンデレンブルグ傾斜での髄腔内注入を含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、投与するステップは、脳の黒質の緻密部に直接的に注入することを含む。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、投与するステップは、対象の脳または脳脊髄液（ＣＳＦ）に組換え遺伝子治療ベクターを導入することを含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、対象の体重１キログラムあたり１ｘ１０９〜１ｘ１０１４のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の遺伝子治療ベクターが、対象に投与される。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、対象の体重１キログラムあたり１ｘ１０９〜１ｘ１０１４のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の遺伝子治療ベクターが、対象の脳に投与される。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、対象の体重１キログラムあたり１ｘ１０９〜１ｘ１０１４のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の遺伝子治療ベクターが、対象のＣＳＦに投与される。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、対象の体重１キログラムあたり１ｘ１０７〜１ｘ１０９のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の遺伝子治療ベクターが、対象に投与される。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、対象は、成人または子供である。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、投与するステップ後の対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数は、投与するステップ前の対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数よりも多い。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、投与するステップ後の対象におけるドーパミンのレベルは、投与するステップ前の対象におけるドーパミンのレベルよりも大きい。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本方法によって治療される対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数は、そのように治療されない対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数と比較して増加する。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、本方法によって治療される対象のドーパミンのレベルは、そのように治療されない対象におけるドーパミンのレベルと比較して増加する。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、方法によって治療される対象の黒質におけるドーパミンのレベルは、そのように治療されない対象の黒質におけるドーパミンのレベルと比較して増加する。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、投与するステップ後の対象のＣＳＦにおけるＰＲＫＮのレベルは、投与するステップ前の対象のＣＳＦにおけるＰＲＫＮのレベルよりも大きい。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、投与するステップ前の対象の統一パーキンソン病評価尺度（ＵＰＤＲＳ）スコアは、投与するステップ前の対象のＵＰＤＲＳスコアと比較して改善される。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本方法によって治療される対象のＣＳＦにおけるＰＲＫＮのレベルは、そのように治療されない対象のＣＳＦにおけるＰＲＫＮのレベルと比較して増加する。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本方法によって治療される対象のＵＰＤＲＳスコアは、そのように治療されない対象のＵＰＤＲＳスコアと比較して改善される。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、対象のニューロンは、組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、減少した量のアルファ−シヌクレインを発現し、かつ／または減少した量のレビー小体を含む。
【０１３４】
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または等価の方法および材料を本発明の実施に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書に参照される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参照は、それらの全体が参照により明示的に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が、支配するであろう。加えて、本明細書に記載される材料、方法、および実施例は例示的であり、限定することを意図するものではない。
【０１３５】
本明細書に参照される全ての刊行物および特許は、あたかも各個々の刊行物または特許が詳細および個別に参照により組み込まれることが示されているかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本明細書における任意の定義を含む本願が、支配するであろう。しかしながら、本明細書に引用される任意の参照、記事、公開、特許、特許公開、および特許出願について言及することは、これらが有効な既存技術を構成するか、または世界の任意の国における一般常識の一部であることを認識すること、または任意の形式の示唆であることを認識するものではなく、かつ取り上げるべきではない。
【０１３６】
本記載では、別段の指示がない限り、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲は、列挙された範囲内の任意の整数の値、ならびに適切な場合、その端数（整数の１０分の１および１００分の１など）を含むと理解されるべきである。「約」という用語は、数または数値の直前にあるとき、数または数値の範囲がプラスまたはマイナス１０％であることを意味する。本明細書で使用される「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という用語は、別段の指示がない限り、列挙される構成要素の「１つ以上」を指すことを理解されたい。代替物（例えば、「または」）の使用は、代替物のいずれか一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されたい。「および／または」という用語は、代替物のいずれか一方、または両方を意味すると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、同義に使用される。
【０１３７】
ＰＲＫＮおよびＰＡＲＫ２という略称は、本明細書では互換的に使用される。
【０１３８】
本明細書で使用されるセクション見出しは、整理を目的のためにのみであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１３９】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスまたはその組換えベクターの標準的な略称である。アデノ随伴ウイルスは、特定の機能が共感染ヘルパーウイルスによって提供される細胞中でのみ増殖する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶの一般的な情報およびレビューは、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９−２２８、およびＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３−１７６４，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見出すことができる。これらのレビューに記載される同じ原理が、遺伝子レベルであっても、様々な血清型が構造的および機能的にかなり密接に関連していることが周知であるため、レビューの公開日後に特徴付けられる追加のＡＡＶ血清型に適用されることが完全に予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５−１７４  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．、およびＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３：１−６１（１９７４）を参照されたい）。例えば、すべてのＡＡＶ血清型は、明らかに、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を示し、全ては、ＡＡＶ２に発現されるものなどの３つの関連するカプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範なクロスハイブリダイゼーション、および「逆方向末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在を明らかにするヘテロ二本鎖分析によってさらに示唆される。同様の感染性パターンはまた、各血清型における複製機能が同様の制御下にあることを示唆する。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶベクター」または「ｒＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する１つ以上の目的のポリヌクレオチド（または導入遺伝子）を含む組換えベクターを指す。かかるＡＡＶベクターは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物をコードし発現するプラスミドでトランスフェクトした宿主細胞内に存在するときに、感染性ウイルス粒子に複製およびパッケージ化することができる。代替的に、ＡＡＶベクターは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するように安定的に操作されている宿主細胞を使用して感染性粒子にパッケージ化することができる。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質およびカプシド化ポリヌクレオチドＡＡＶベクターからなるウイルス粒子を指す。本明細書で使用される場合、粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは、典型的には「ＡＡＶベクター粒子」、または単に「ＡＡＶベクター」と称される。したがって、そのようベクターはＡＡＶベクター粒子内に含有されるため、ＡＡＶベクター粒子の産生はＡＡＶベクターの産生を必ず含む。
【０１４２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損型パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、約４．７ｋｂの長さであり、２つの１４５ヌクレオチド逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。抗原エピトープによって分類される場合、血清型とも称される、ＡＡＶの複数の既知のバリアントが存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が既知である。例えば、ＡＡＶ−１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７に提供され、ＡＡＶ−２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１４０１、およびＳｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５−５６４｛１９８３）に提供され、ＡＡＶ−３の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿１８２９に提供され、ＡＡＶ−４の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９に提供され、ＡＡＶ−５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６に提供され、ＡＡＶ−６の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００  １８６２に提供され、ＡＡＶ−７およびＡＡＶ−８ゲノムの少なくとも一部は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９にそれぞれ提供され、ＡＡＶ−９ゲノムは、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１−６３８８（２００４）に提供され、ＡＡＶ−１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７−７６  （２００６）に提供され、ならびにＡＡＶ−１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５−３８３（２００４）に提供される。ＡＡＶｒｈ．７４ゲノムの配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４３４，９２８号に提供される。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、封入／パッケージ化、および宿主細胞染色体統合を指示するシス作用配列は、ＡＡＶ  ＩＴＲ内に含まれる。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置に関してｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と命名された）は、ｒｅｐおおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）は、単一ＡＡＶイントロン（ヌクレオチド２１０７および２２２７での）の差動スプライシングと結合して、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）を産生する。Ｒｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムの複製に最終的に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するカプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクルおよび遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７−１２９（１９９２）に概説される。
【０１４３】
ＡＡＶは、遺伝子治療などで外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的な独自の機能を備えている。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞障害性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染は、サイレントおよび無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞に感染し、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性をもたらす。さらに、ＡＡＶは、ゆっくりと分裂した細胞および非分裂細胞を形質導入し、転写活性核エピソーム（染色体外要素）としてこれらの細胞の生涯にわたって本質的に持続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミド中にクローニングＤＮＡとして挿入され、組み換えゲノムの構築が実現可能である。さらに、ＡＡＶ複製およびゲノムカプシド形成を指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるため、ゲノムの内部およそ４．３ｋｂ（複製および構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ−ｃａｐをコードする）の一部または全ては、外来ＤＮＡで置き換えられ得る。ＡＡＶベクターを生成するために、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶのもう一つの大きな特徴は、極めて安定的および盛んなウイルスであることである。アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃〜６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの冷却保存の危険性が低くなる。ＡＡＶは凍結乾燥されてもよい。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性がない。
【０１４４】
ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ  ＤＮＡは、限定されないが、ＡＡＶバリアントまたは血清型ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３、およびＡＡＶｒｈ１０を含む、組み換えウイルスが誘導され得る任意のＡＡＶバリアントまたは血清型に由来し得る。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ  ０１／８３６９２に開示される。他の種類のｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００−１９０９（２０１４）を参照されたい。種々のＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当該技術分野で既知である。眼特異的発現を促進するために、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９が使用され得る。
【０１４５】
いくつかの事例では、ｒＡＡＶは、自己相補的ゲノムを含む。本明細書に定義されるように、「自己相補的」または「二本鎖」ゲノムを含むｒＡＡＶは、ＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．８（１６）：１２４８−５４（２００１）に記載されるように、ｒＡＡＶのコード領域が分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように構成されるように操作されたｒＡＡＶを指す。本開示は、いくつかの事例では、感染（かかる形質導入）時に、ｒＡＡＶゲノムの第２鎖の細胞媒介合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な半分が結合して、すぐに複製および転写の準備ができている１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成する、自己相補的ゲノムを含むｒＡＡＶの使用を企図する。ｒＡＡＶ（４．７〜６ｋｂ）に見られる完全なコーディング能力の代わりに、自己相補的ゲノムを含むｒＡＡＶは、その量の約半分（≒２．４ｋｂ）しか保持できないことを理解されたい。
【０１４６】
他の事例では、ｒＡＡＶベクターは、一本鎖ゲノムを含む。本明細書で定義される場合、「単一標準」ゲノムは、自己相補的ではないゲノムを指す。ほとんどの事例では、非組換えＡＡＶは、一本鎖ＤＮＡゲノムを有する。ｒＡＡＶは、眼細胞などの細胞の効率的な形質導入を達成するためにｓｃＡＡＶであるべきであるといういくつかの指標が存在している。しかしながら、本開示は、ｒＡＡＶベクターの他の遺伝的修飾が標的細胞において最適な遺伝子転写を得るのに有益であり得るという理解とともに、自己相補的ゲノムではなく一本鎖ゲノムを有し得るｒＡＡＶベクターを企図する。いくつかの事例では、本開示は、マウスの眼の前眼部への効率的な遺伝子導入を達成することができる一本鎖ｒＡＡＶベクターに関する。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ａｃｈｉｅｖｅｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｙｅ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １２（８）：ｅ０１８２４７３（２０１７）を参照されたい。
【０１４７】
いくつかの事例では、ｒＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、またはＡＡＶｒｈ１０のものである。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ  ０１／８３６９２に開示される。他の種類のｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００−１９０９（２０１４）を参照されたい。いくつかの事例では、ｒＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ９である。いくつかの実施形態では、該ｒＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ９であり、一本鎖ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、該ｒＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ９であり、自己相補的ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶベクターが、ＡＡＶ−２／９ベクター、ＡＡＶ−２／６ベクター、またはＡＡＶ−２／８ベクターであるような、ＡＡＶ２ゲノムを含む。
【０１４８】
最も知られているＡＡＶのカプシド遺伝子の全長配列および配列は、米国特許第８，５２４，４４６号に提供され、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４９】
ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶ配列を含み得るか、またはそれらは、野生型ＡＡＶ配列に対する１つ以上の修飾を含み得る。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３内の１つ以上のアミノ酸修飾、例えば、置換、欠失、または挿入を含む。特定の実施形態では、修飾は、ＡＡＶベクターが対象に提供されるとき、免疫原性の低下を提供する。
【０１５０】
プロモーター
いくつかの実施形態では、野生型ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＬＲＲＫ２、ＳＣＮＡ、ｃ−Ｒｅｌ、ＡＴＧ  ７、ＶＭＡＴ２、またはＧＢＡタンパク質またはその機能的バリアントもしくは断片をコードするポリヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターと作動可能に連結される。本開示は、他のプロモーター配列の使用をさらに企図する。本開示の実施形態において有用なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターホスホグリセートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、またはＣＭＶエンハンサー、ならびにニワトリベータアクチンプロモーターおよびウサギベータグロビン遺伝子（ＣＡＧ）の一部からなるプロモーター配列が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの事例では、プロモーターは、合成プロモーターであり得る。例示的な合成プロモーターは、Ｓｃｈｌａｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｓｔｒｏｎｇ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１０  Ｆｅｂ  ９；１０７（６）：２５３８−２５４３に提供される。
【０１５１】
いくつかの事例では、治療用タンパク質または野生型ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１、ＬＲＲＫ２、ＳＣＮＡ、ｃ−Ｒｅｌ、ＡＴＧ７、ＶＭＡＴ２、もしくはＧＢＡタンパク質またはその機能的バリアントもしくは断片をコードするポリヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターと作動可能に連結される。誘導性プロモーターと作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列は、薬剤の添加もしくは蓄積に応答して、または薬剤の除去、分解、もしくは希釈に応答して、ポリヌクレオチド配列を転写発現させるか、または転写発現させないように構成され得る。薬剤は、薬物であり得る。薬剤は、ドキシサイクリンを含むがこれらに限定されない、テトラサイクリンまたはその誘導体のうちの１つであり得る。いくつかの事例では、誘導性プロモーターは、ｔｅｔ−ｏｎプロモーター、ｔｅｔ−ｏｆｆプロモーター、化学調節プロモーター、物理調節プロモーター（すなわち、光の存在もしくは不在、または低温もしくは高温に応答するプロモーター）である。この誘導性プロモーターのリストは、非限定的である。
【０１５２】
本明細書で使用される場合、「真核生物で活性なプロモーター」または「プロモーター」は互換的に使用され、真核細胞内のポリヌクレオチドからのＲＮＡ転写の開始を促進することができるプロモーターを指す。いくつかの事例では、プロモーターは、ニューロンにおける発現を非ニューロン細胞よりも大きな範囲で駆動することができるプロモーターなどの組織特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターは、ｈＳＹＮ１（ヒトシナプシン）、ＩＮＡ（アルファ−インターネキシン）、ＮＥＳ（ネスチン）、ＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）、ＦＯＸＡ２（フォークヘッドボックスＡ２）、ＣａＭＫＩＩ（カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ）、およびＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）からなるニューロン特異的プロモーターのリストから選択される。いくつかの事例では、プロモーターは、ユビキタスプロモーターである。「ユビキタスプロモーター」は、実験または臨床条件下で組織特異的ではないプロモーターを指す。いくつかの事例では、ユビキタスプロモーターは、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、ＰＧＫ、ＥＦ１−アルファ、ＧＡＰＤＨ、ＳＶ４０、ＨＢＶ、ニワトリベータアクチン、およびヒトベータアクチンからなる群から選択される。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、表５から選択され、それと少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する。
【０１５４】
（表５）
2021522273.tif 000038
2021522273.tif 000039
【０１５５】
プロモーターのさらなる例示的な例は、シミアンウイルス４０由来のＳＶ４０後期プロモーター、バキュロウイルス多面体エンハンサー／プロモーター要素、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ  ｔｋ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来の最初期プロモーター、およびＬＴＲ要素を含む様々なレトロウイルスプロモーターである。誘導性プロモーターとしては、重金属イオン誘導性プロモーター（マウス乳腺腫瘍ウイルス（ｍＭＴＶ）プロモーターまたは種々の成長ホルモンプロモーターなど）、およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの存在下で活性であるＴ７ファージ由来のプロモーターが含まれる。例示として、組織特異的プロモーターの例として、様々なサーファクチンプロモーター（肺における発現のための）、ミオシンプロモーター（筋肉における発現のための）、およびアルブミンプロモーター（肝臓における発現のための）が含まれる。多種多様な他のプロモーターが既知であり、当該技術分野で一般に利用可能であり、多くのそのようなプロモーターの配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースなどの配列データベースで利用可能である。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣＭＶエンハンサーをさらに含む。
【０１５７】
他の制御性要素
いくつかの事例では、本開示のベクターは、エンハンサー、イントロン、ポリＡシグナル、２Ａペプチドコード化配列、ＷＰＲＥ（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素）、およびＨＰＲＥ（Ｂ型肝炎転写後調節要素）からなる群から選択される１つ以上の制御性要素をさらに含む。
【０１５８】
特定の実施形態では、ベクターは、１つ以上のエンハンサーを含む。特定の実施形態では、エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサー配列、ＧＡＰＤＨエンハンサー配列、β−アクチンエンハンサー配列、またはＥＦ１−αエンハンサー配列である。前述の配列は、当該技術分野で既知である。例えば、ＣＭＶ最初期（ＩＥ）エンハンサーの配列は、以下である。
2021522273.tif 000040
【０１５９】
特定の実施形態では、ベクターは、１つ以上のイントロンを含む。特定の実施形態では、イントロンは、ウサギグロビンイントロン配列、ニワトリβアクチンイントロン配列、合成イントロン配列、またはＥＦ１−αイントロン配列である。
【０１６０】
特定の実施形態では、ベクターは、ポリＡ配列を含む。特定の実施形態では、ポリＡ配列は、ウサギグロビンポリＡ配列、ヒト成長ホルモンポリＡ配列、ウシ成長ホルモンポリＡ配列、ＰＧＫポリＡ配列、ＳＶ４０ポリＡ配列、またはＴＫポリＡ配列である。いくつかの実施形態では、ポリＡシグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）であり得る。
【０１６１】
特定の実施形態では、ベクターは、１つ以上の転写物安定化要素を含む。特定の実施形態では、転写物安定化要素は、ＷＰＲＥ配列、ＨＰＲＥ配列、足場結合領域、３’ＵＴＲ、または５’ＵＴＲである。特定の実施形態では、ベクターは、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方を含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、ベクターは、表６から選択される５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。
【０１６３】
（表６）
2021522273.tif 000041
2021522273.tif 000042
2021522273.tif 000043
2021522273.tif 000044
【０１６４】
いくつかの実施形態では、ベクターは、表７から選択される３’非翻訳領域を含む。
【０１６５】
（表７）
2021522273.tif 000045
2021522273.tif 000046
2021522273.tif 000047
【０１６６】
いくつかの実施形態では、ベクターは、表８から選択されるポリアデニル化配列（ポリＡ）を含む。
【０１６７】
（表８）
2021522273.tif 000048
【０１６８】
例示的な発現カセットは、図１３に示され、表１０に列挙される配列番号３９〜５８として提供される。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号３９〜５８のうちのいずれか１つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、発現カセットは、治療用遺伝子産物をコードする配列を除く配列番号３９〜５８のうちのいずれか１つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、治療用遺伝子産物ｓｉをコードする配列は、異なる治療用遺伝子産物をコードする配列によって置き換えられる。
【０１６９】
一実施形態では、発現カセットは、ＨｕＢＡプロモーター、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｘ）、およびｐＡグロビン−Ｏｃを５’から３’の順序で含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）、ＬＲＲＫ２、α−シヌクレイン、およびＤＪ−１をコードする。特定の実施形態では、それはＰＡＲＫ２をコードし、特定の実施形態では、配列番号２７または３５〜３８のうちのいずれかに示される配列を含む。
【０１７０】
一実施形態では、発現カセットは、ＣＭＶプロモーター、ＴＰＬ−ｅＭＬＰエンハンサー、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡグロビン−Ｏｃを５’から３’の順序で含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）、ＬＲＲＫ２、α−シヌクレイン、およびＤＪ−１をコードする。特定の実施形態では、それはＰＡＲＫ２をコードし、特定の実施形態では、配列番号２７または３５〜３８のうちのいずれかに示される配列を含む。
【０１７１】
一実施形態では、発現カセットは、Ｓｙｎプロモーター、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｂｔを５’から３’の順序で含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）、ＬＲＲＫ２、α−シヌクレイン、およびＤＪ−１をコードする。特定の実施形態では、それはＰＡＲＫ２をコードし、特定の実施形態では、配列番号２７または３５〜３８のうちのいずれかに示される配列を含む。
【０１７２】
一実施形態では、発現カセットは、ＣＢＡプロモーター、導入遺伝子、およびｐＡＧＨ−Ｂｔを５’から３’の順序で含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）、ＬＲＲＫ２、α−シヌクレイン、およびＤＪ−１をコードする。特定の実施形態では、それはＰＡＲＫ２をコードし、特定の実施形態では、配列番号２７または３５〜３８のうちのいずれかに示される配列を含む。
【０１７３】
一実施形態では、発現カセットは、ＥＦ１αプロモーター、導入遺伝子、およびｐＡグロビン−Ｏｃを５’から３’の順序で含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）、ＬＲＲＫ２、α−シヌクレイン、およびＤＪ−１をコードする。特定の実施形態では、それはＰＡＲＫ２をコードし、特定の実施形態では、配列番号２７または３５〜３８のうちのいずれかに示される配列を含む。
【０１７４】
一実施形態では、発現カセットは、ＨｕＢＡプロモーター、導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡＧＨ−Ｂｔを５’から３’の順序で含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）、ＬＲＲＫ２、α−シヌクレイン、およびＤＪ−１をコードする。特定の実施形態では、それはＰＡＲＫ２をコードし、特定の実施形態では、配列番号２７または３５〜３８のうちのいずれかに示される配列を含む。
【０１７５】
一実施形態では、発現カセットは、Ｓｙｎプロモーター、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｘ）、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓを５’から３’の順序で含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）、ＬＲＲＫ２、α−シヌクレイン、およびＤＪ−１をコードする。特定の実施形態では、それはＰＡＲＫ２をコードし、特定の実施形態では、配列番号２７または３５〜３８のうちのいずれかに示される配列を含む。
【０１７６】
一実施形態では、発現カセットは、ＣａＭＫＩＩａプロモーター、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓを５’から３’の順序で含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）、ＬＲＲＫ２、α−シヌクレイン、およびＤＪ−１をコードする。特定の実施形態では、それはＰＡＲＫ２をコードし、特定の実施形態では、配列番号２７または３５〜３８のうちのいずれかに示される配列を含む。
【０１７７】
一実施形態では、発現カセットは、ＣＭＶプロモーター、ＴＰＬ−ｅＭＬＰエンハンサー、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓを５’から３’の順序で含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）、ＬＲＲＫ２、α−シヌクレイン、およびＤＪ−１をコードする。特定の実施形態では、それはＰＡＲＫ２をコードし、特定の実施形態では、配列番号２７または３５〜３８のうちのいずれかに示される配列を含む。
【０１７８】
一実施形態では、発現カセットは、ＨｕＢＡプロモーター、導入遺伝子、およびｐＡＧＨ−Ｈｓを５’から３’の順序で含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）、ＬＲＲＫ２、α−シヌクレイン、およびＤＪ−１をコードする。特定の実施形態では、それはＰＡＲＫ２をコードし、特定の実施形態では、配列番号２７または３５〜３８のうちのいずれかに示される配列を含む。
【０１７９】
一実施形態では、発現カセットは、ＣＭＶプロモーター、ＴＰＬ／ｅＭＬＰエンハンサー、導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｂｔを５’から３’の順序で含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）、ＬＲＲＫ２、α−シヌクレイン、およびＤＪ−１をコードする。特定の実施形態では、それはＰＡＲＫ２をコードし、特定の実施形態では、配列番号２７または３５〜３８のうちのいずれかに示される配列を含む。
【０１８０】
一実施形態では、発現カセットは、ＥＦ１αプロモーター、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｒ）、およびｐＡＧＨ−Ｂｔを５’から３’の順序で含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）、ＬＲＲＫ２、α−シヌクレイン、およびＤＪ−１をコードする。特定の実施形態では、それはＰＡＲＫ２をコードし、特定の実施形態では、配列番号２７または３５〜３８のうちのいずれかに示される配列を含む。
【０１８１】
一実施形態では、発現カセットは、Ｓｙｎプロモーター、導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡグロビン−Ｏｃを５’から３’の順序で含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）、ＬＲＲＫ２、α−シヌクレイン、およびＤＪ−１をコードする。特定の実施形態では、それはＰＡＲＫ２をコードし、特定の実施形態では、配列番号２７または３５〜３８のうちのいずれかに示される配列を含む。
【０１８２】
一実施形態では、発現カセットは、ＣａＭＫＩＩａプロモーター、導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡグロビン−Ｏｃを５’から３’の順序で含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）、ＬＲＲＫ２、α−シヌクレイン、およびＤＪ−１をコードする。特定の実施形態では、それはＰＡＲＫ２をコードし、特定の実施形態では、配列番号２７または３５〜３８のうちのいずれかに示される配列を含む。
【０１８３】
一実施形態では、発現カセットは、ＣＢＡプロモーター、導入遺伝子、ＷＰＲＥ（ｘ）、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓを５’から３’の順序で含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）、ＬＲＲＫ２、α−シヌクレイン、およびＤＪ−１をコードする。特定の実施形態では、それはＰＡＲＫ２をコードし、特定の実施形態では、配列番号２７または３５〜３８のうちのいずれかに示される配列を含む。
【０１８４】
一実施形態では、発現カセットは、ＣＢＡプロモーター、導入遺伝子、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡグロビン−Ｏｃを５’から３’の順序で含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）、ＬＲＲＫ２、α−シヌクレイン、およびＤＪ−１をコードする。特定の実施形態では、それはＰＡＲＫ２をコードし、特定の実施形態では、配列番号２７または３５〜３８のうちのいずれかに示される配列を含む。
【０１８５】
一実施形態では、発現カセットは、ＣａＭＫＩＩａプロモーター、導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、およびｐＡＧＨ−Ｂｔを５’から３’の順序で含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）、ＬＲＲＫ２、α−シヌクレイン、およびＤＪ−１をコードする。特定の実施形態では、それはＰＡＲＫ２をコードし、特定の実施形態では、配列番号２７または３５〜３８のうちのいずれかに示される配列を含む。
【０１８６】
一実施形態では、発現カセットは、ＥＦ１αプロモーター、導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓを５’から３’の順序で含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）、ＬＲＲＫ２、α−シヌクレイン、およびＤＪ−１をコードする。特定の実施形態では、それはＰＡＲＫ２をコードし、特定の実施形態では、配列番号２７または３５〜３８のうちのいずれかに示される配列を含む。
【０１８７】
一実施形態では、発現カセットは、ＣＭＶプロモーター、導入遺伝子、Ｒ２Ｖ１７、３’ＵＴＲ（グロビン）、およびｐＡＧＨ−Ｈｓを５’から３’の順序で含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）、ＬＲＲＫ２、α−シヌクレイン、およびＤＪ−１をコードする。特定の実施形態では、それはＰＡＲＫ２をコードし、特定の実施形態では、配列番号２７または３５〜３８のうちのいずれかに示される配列を含む。
【０１８８】
一実施形態では、発現カセットは、ＣＭＶプロモーター、導入遺伝子、およびｐＡＧＨ−Ｈｓを５’から３’の順序で含む。特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＰＡＲＫ２、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）、ＬＲＲＫ２、α−シヌクレイン、およびＤＪ−１をコードする。特定の実施形態では、それはＰＡＲＫ２をコードし、特定の実施形態では、配列番号２７または３５〜３８のうちのいずれかに示される配列を含む。
【０１８９】
前述の実施形態では、プロモーターがエンハンサー要素に先行するか、またはエンハンサー要素がプロモーター要素に先行するように、導入遺伝子に対する要素５’の順序が逆になる。
【０１９０】
治療用組成物および方法
本明細書で使用される場合、「必要とする患者」または「必要とする対象」という用語は、本明細書に開示される組換え遺伝子治療ベクターまたは遺伝子編集システムによる治療または改善に適している疾患、障害、または状態のリスクがあるか、またはそれに罹患している、患者または対象を指す。必要とする患者または対象は、例えば、中枢神経系分解に関連する障害と診断される患者または対象であり得る。対象は、ＰＡＲＫ２、ＰＡＲＫ６、ＰＡＲＫ７、ＬＲＲＫ２、もしくはα−シヌクレインの遺伝子またはタンパク質中の変異または機能不全を有し得る。「対象」および「患者」は、本明細書において互換的に使用される。本明細書に記載される方法によって治療される対象は、成人または子供であり得る。対象は、年齢の範囲がある場合がある。対象は、パーキンソン病、例えば、早期発症パーキンソン病のリスクがあると特定された人物であり得る。
【０１９１】
組み合わせ療法はまた、本発明によって企図される。本明細書で使用される組み合わせは、同時治療または連続治療を含む。本発明の方法と標準的な医療的治療（例えば、コルチコステロイドまたは局所減圧薬）との組み合わせは、新規療法との組み合わせと同様に特に企図される。いくつかの事例では、対象は、本明細書に記載されるｒＡＡＶの投与に対する免疫応答を予防するか、または低減するためにステロイドで治療することができる。特定の事例では、対象は、本明細書に記載されるｒＡＡＶの投与前、投与中、または投与後に局所減圧薬を受け得る。
【０１９２】
治療有効量のｒＡＡＶベクターは、約１ｅ７ｖｇ／ｋｇ〜約５ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ７ｖｇ／ｋｇ〜約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ８ｖｇ／ｋｇ〜約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ９ｖｇ／ｋｇ〜約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ９ｖｇ／ｋｇ〜約１ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ７ｖｇ／ｋｇ〜約５ｅ７ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ８ｖｇ／ｋｇ〜約５ｅ８ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ９ｖｇ／ｋｇ〜約５ｅ９ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１０ｖｇ／ｋｇ〜約５ｅ１０ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１１ｖｇ／ｋｇ〜約５ｅ１１ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１２ｖｇ／ｋｇ〜約５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ〜約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ〜約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１５ｖｇ／ｋｇ〜約５ｅ１５ｖｇ／ｋｇの範囲のｒＡＡＶの用量である。本発明はまた、これらの範囲のｒＡＡＶベクターを含む組成物を含む。
【０１９３】
例えば、特定の実施形態では、治療有効量のｒＡＡＶベクターは、約１ｅ１０ｖｇ／ｋｇ、約２ｅ１０ｖｇ／ｋｇ、約３ｅ１０ｖｇ／ｋｇ、約４ｅ１０ｖｇ／ｋｇ、約５ｅ１０ｖｇ／ｋｇ、約６ｅ１０ｖｇ／ｋｇ、約７ｅ１０ｖｇ／ｋｇ、約８ｅ１０ｖｇ／ｋｇ、約９ｅ１０ｖｇ／ｋｇ、約１ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約２ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約３ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、約４ｅ１２ｖｇ／ｋｇ、および５ｅ１２ｖｇ／ｋｇの用量である。本発明はまた、これらの用量のｒＡＡＶベクターを含む組成物を含む。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、例えば、黒質に直接的に注入する場合、治療有効量のｒＡＡＶベクターは、１ｅ７ｖｇ〜１ｅ１１ｖｇ、または約１ｅ７ｖｇ、約１ｅ８ｖｇ、約１ｅ９ｖｇ、約１ｅ１０ｖｇ、または約１ｅ１１ｖｇの範囲の用量である。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、例えば、被殻内に直接的に注入する場合、治療有効量のｒＡＡＶベクターは、１ｅ７ｖｇ〜１ｅ１１ｖｇ、または約１ｅ７ｖｇ、約１ｅ８ｖｇ、約１ｅ９ｖｇ、約１ｅ１０ｖｇ、または約１ｅ１１ｖｇの範囲の用量である。
【０１９６】
いくつかの事例では、治療用組成物は、注入される治療用組成物の体積あたりのｒＡＡＶベクターの約１ｅ９、１ｅ１０、または１ｅ１１を超えるゲノムを含む。いくつかの事例では、治療用組成物は、注入される治療用組成物の体積あたりのｒＡＡＶベクターの約１ｅ９、１ｅ１０、または１ｅ１１を超えるゲノムを含む。いくつかの事例では、治療用組成物は、１ｍＬあたりおよそ１ｅ１０、１ｅ１１、１ｅ１２、または１ｅ１３を超えるｒＡＡＶベクターのゲノムを含む。ある特定の実施形態では、治療用組成物は、１ｍＬあたり約１ｅ１４、１ｅ１３、または１ｅ１２未満のｒＡＡＶベクターのゲノムを含む。
【０１９７】
組成物の投与
有効用量の組成物の投与は、限定されないが、全身、局所、直接的注入、非経口、静脈内、大脳、脳脊髄、髄腔内、大槽内、被殻内、海馬内、線条体内、または脳室内投与を含む、当該技術分野における標準的な経路によって行われ得る。いくつかの事例では、投与は、静脈内、大脳、脳脊髄、髄腔内、大槽内、被殻内、海馬内、線条体内、または脳室内注入を含む。投与は、トレンデレンブルグ傾斜での髄腔内注入によって実行され得る。本発明のｒＡＡＶ（特に、ＡＡＶ  ＩＴＲおよびカプシドタンパク質）の投与経路およびＡＡＶ成分の血清型（複数可）は、治療される障害および修復されたおよび／または外因的に提供される遺伝子を発現する標的細胞／組織（複数可）を考慮して当業者によって選択および／または適合され得る。
【０１９８】
特定の実施形態では、本開示は、有効用量のｒＡＡＶおよび本発明の組成物の局所投与および全身投与を提供する。例えば、全身投与は、全身が影響を受けるような循環系への投与であり得る。全身投与としては、胃腸管を介した吸収などの経腸投与、および注入、点滴、または移植を介した非経口投与が含まれる。
【０１９９】
詳細には、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本発明による投与としては、限定されないが、中枢神経系（ＣＮＳ）または脳脊髄液（ＣＳＦ）への注入、および／または脳への直接的な注入が含まれる。
【０２００】
ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶがニューロンまたはより詳細にはドーパミン作動性ニューロンなどの対象の特定の標的組織を標的とするように修飾され得る。例えば、Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．ＡＡＶ  Ｖｅｃｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ  Ｎｉｇｒａ  Ｄｏｐａｍｉｎｅ  Ｎｅｕｒｏｎｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ．Ｇｅｎｅｓ．２０１７  Ｆｅｂ  ８を参照し、さらに米国特許第６，１８０，６１３号および米国特許公開第ＵＳ２０１２／００８２６５０Ａ１号も参照されたく、これらの両方の開示が、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、対象の黒質に直接的に注入される。
【０２０１】
例えば注入による投与の目的のために、滅菌水溶液などの種々の溶液を利用することができる。かかる水溶液は、必要に応じて緩衝することができ、液体希釈剤は、まず、生理食塩水またはグルコースで等張性となる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含有する）または薬理学的に許容される塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロエキプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合された水中で調製することができる。ｒＡＡＶの分散体は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物中、ならびに油中で調製することもできる。通常の保存および使用条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を防ぐための防腐剤を含んでいる。これに関連して、利用される滅菌水性媒体はすべて、当業者に既知の標準的な技法によって容易に入手可能である。
【０２０２】
注入用途に好適な薬学的形態は、滅菌水溶液、または滅菌注射液もしくは分散液を即時調製するための分散液および滅菌粉末を含むが、これらに限定されない。すべての事例では、形態は滅菌であり、容易な注入可能性が存在する程度まで流体である必要がある。それは、製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物活動の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注入可能組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。
【０２０３】
滅菌注入可能溶液は、必要に応じて、上に列挙される様々な他の成分を含む適切な溶媒に、必要とされる量のｒＡＡＶを組み込み、その後で濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、基本的な分散媒、および上に列挙されるものから必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに滅菌された活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌注入可能溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これにより、予め滅菌濾過したその溶液から活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末を得る。
【０２０４】
ｒＡＡＶによる形質導入は、インビトロでも行われ得る。一実施形態では、所望される標的細胞が対象から除去され、ｒＡＡＶで形質導入され、対象に再導入される。
【０２０５】
形質導入細胞の対象への形質導入および再導入に好適な方法は、当該技術分野で既知である。一実施形態では、細胞は、例えば適切な培地中でｒＡＡＶを細胞と組み合わせ、サザンブロットおよび／もしくはＰＣＲなどの従来の技術を使用して、または選択可能なマーカーを使用して目的のＤＮＡを保持する細胞をスクリーニングすることにより、インビトロで形質導入できる。次いで、形質導入細胞は、薬学的組成物に製剤化することができ、組成物は、全身、局所、直接的注入、非経口、静脈内、大脳、脳脊髄、髄腔内、大槽内、被殻内、海馬内、線条体内、または脳室内投与などの様々な技術によって対象に導入される。いくつかの事例では、投与は、静脈内、大脳、脳脊髄、髄腔内、大槽内、被殻内、海馬内、線条体内、または脳室内注入を含む。投与は、トレンデレンブルグ傾斜での髄腔内注入によって実行され得る。
【０２０６】
本発明のｒＡＡＶによる細胞の形質導入は、ＰＡＲＫ２、ＰＡＲＫ６、ＰＡＲＫ７、ＬＲＲＫ２、またはα−シヌクレインなどの目的の遺伝子の持続的な発現をもたらす。したがって、本発明は、ＣＮＳ変性に関連する遺伝子を哺乳動物対象、好ましくはヒトに発現する組換え遺伝子治療ベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）を投与または送達する方法を提供する。これらの方法は、本発明の１つ以上のｒＡＡＶで組織（脳の組織を含むが、これらに限定されない）を形質導入することを含む。形質導入は、組織特異的制御要素を含む遺伝子カセットで行われ得る。例えば、本発明の一実施形態は、限定されないが、ニューロン濃縮プロモーターおよび他の制御要素に由来するものを含むニューロン特異的制御要素によって指示されるニューロン細胞および脳組織を形質導入する方法を提供する。
【０２０７】
遺伝子編集システム
本明細書で使用される場合、遺伝子編集システムは、配列特異的に内因性標的遺伝子または遺伝子座を編集することができる１つ以上のタンパク質またはポリヌクレオチドを含むシステムである。いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムは、１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインおよび酵素ドメインを含むタンパク質を含むタンパク質系遺伝子制御システムである。いくつかの実施形態では、タンパク質系遺伝子制御システムは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ドメインおよび酵素ドメインを含むタンパク質を含む。かかる実施形態は、本明細書において「ＴＡＬＥＮ」と称される。
【０２０８】
１．ジンクフィンガー系システム
ジンクフィンガー系システムは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよび酵素ドメインの２つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質を含む。「ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」、「ジンクフィンガータンパク質」、または「ＺＦＰ」は、１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的様式でＤＮＡと結合するタンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインであり、結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域であり、その構造は亜鉛イオンの配位によって安定化される。ジンクフィンガードメインは、標的ＤＮＡ配列と結合することにより、酵素ドメインの活性を配列の近くに導き、したがって、標的配列の近くの内因性標的遺伝子の修飾を誘導する。ジンクフィンガードメインは、実質的に任意の所望される配列と結合するように設計することができる。したがって、切断または組み換えが所望される標的ＤＮＡ配列（例えば、表１に参照される標的遺伝子内の標的遺伝子座）を含む標的遺伝子座を特定した後、１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを操作して、標的遺伝子座内の１つ以上の標的ＤＮＡ配列と結合することができる。細胞におけるジンクフィンガー結合ドメインおよび酵素ドメインを含む融合タンパク質の発現は、標的遺伝子座の修飾をもたらす。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、１つ以上のジンクフィンガーを含む。Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＥＭＢＯＪ．４：１６０１０−１７１４；Ｒｈｏｄｅｓ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｅｂｕａｒｙ：５６−６５、米国特許第６，４５３，２４２号。通常、単一ジンクフィンガードメインは、約３０アミノ酸長である。個々のジンクフィンガーは、３ヌクレオチド（すなわち、トリプレット）配列（または隣接するジンクフィンガーの４ヌクレオチド結合部位と１ヌクレオチド重複することができる４ヌクレオチド配列）と結合する。したがって、ジンクフィンガー結合ドメインが結合するように操作されている配列（例えば、標的配列）の長さは、操作されたジンクフィンガー結合ドメイン中のジンクフィンガーの数を決定する。例えば、フィンガーモチーフが重複するサブサイトに結合しないＺＦＰについては、６ヌクレオチド標的配列は、２つのフィンガー結合ドメインによって結合され、９ヌクレオチド標的配列は、３つのフィンガー結合ドメインなどによって結合される。標的部位における個々のジンクフィンガー（すなわち、サブサイト）の結合部位は、連続する必要はないが、マルチフィンガー結合ドメイン内のジンクフィンガー（すなわち、フィンガー間リンカー）間のアミノ酸配列の長さおよび性質に応じて、１つ以上のヌクレオチドによって分離することができる。いくつかの実施形態では、個々のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、３〜６個のジンクフィンガーリピートを含み、それぞれ９〜１８塩基対を認識することができる。
【０２１０】
ジンクフィンガー結合ドメインは、選択した配列と結合するように設計できる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１、Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新しい結合特異性を有することができる。操作する方法としては、限定されないが、合理的な設計および様々な種類の選択が含まれる。
【０２１１】
ジンクフィンガードメインによる結合のための標的ＤＮＡ配列の選択は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号に開示される方法に従って達成することができる。ヌクレオチド配列の簡単な目視検査も標的ＤＮＡ配列の選択に使用できることは、当業者には明らかであろう。したがって、標的ＤＮＡ配列選択のための任意の手段を、本明細書に記載される方法に使用することができる。標的部位は、概して、少なくとも９ヌクレオチドの長さを有し、したがって、少なくとも３つのジンクフィンガーを含むジンクフィンガー結合ドメインによって結合される。しかしながら、例えば、１２ヌクレオチド標的部位との４つのフィンガー結合ドメイン、１５ヌクレオチド標的部位との５つのフィンガー結合ドメイン、または１８ヌクレオチド標的部位との６つのフィンガー結合ドメインも可能である。明らかであろうように、より長い標的部位とのより大きな結合ドメイン（例えば、７、８、９つのフィンガー以上）の結合も可能である。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、表１に列挙されるものを選択した標的遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列と結合する。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、表１に列挙されるものを選択した標的遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列と結合する。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、表１に列挙されるものを選択した標的遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列と結合する。
【０２１３】
ジンクフィンガー融合タンパク質の酵素ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから取得することができる。酵素ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。例えば、２００２−２００３  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ、およびＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断する追加の酵素は既知である（例えば、５１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ、小球菌ヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ、Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照されたい）。これらの酵素（またはその機能的断片）のうちの１つ以上を切断ドメインの供給源として使用することができる。
【０２１４】
本明細書に記載されるＺＦＰの酵素ドメインとしての使用に好適な例示的な制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、（認識部位で）ＤＮＡに配列特異的に結合し、結合部位またはその付近でＤＮＡを切断することができる。特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素Ｆｏｋ  Ｉは、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒し、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチド、他方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドで触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同号第５，４３６，１５０号、および同号第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２７５−４２７９、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２７６４−２７６８、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８８３−８８７、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からの酵素ドメインおよび１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
【０２１５】
その切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、Ｆｏｋ  Ｉである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０，５７０−１０，５７５。したがって、ジンクフィンガー−Ｆｏｋ  Ｉ融合を使用した標的化二本鎖ＤＮＡ切断のために、それぞれがＦｏｋＩ酵素ドメインを含む２つの融合タンパク質を使用して、触媒活性のある切断ドメインを再構成できる。代替的に、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ酵素ドメインを含む単一ポリペプチド分子もまた使用することができる。ＦｏｋＩ酵素ドメインを含む例示的なＺＦＰは、米国特許第９，７８２，４３７号に記載される。
【０２１６】
２．ＴＡＬＥＮ系システム
ＴＡＬＥＮ系は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインおよび酵素ドメインを含むタンパク質を含む。これらは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ鎖を切断するヌクレアーゼ）に融合することによって作製される。上述のＦｏｋＩ制限酵素は、ＴＡＬＥＮ系遺伝子制御システムでの使用に好適な例示的な酵素ドメインである。
【０２１７】
ＴＡＬエフェクターは、植物に感染するときに、そのＩＩＩ型分泌系を介してＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌によって分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインには、１２番目および１３番目のアミノ酸が異なる、繰り返し、高度に保存された３３〜３４アミノ酸配列が含まれる。反復可変二残基（ＲＶＤ）と称されるこれらの２つの位置は、非常に可変であり、特定のヌクレオチド認識と強く相関する。したがって、ＴＡＬエフェクタードメインは、適切なＲＶＤを含む反復セグメントの組み合わせを選択することによって、特定の標的ＤＮＡ配列に結合するように操作することができる。ＲＶＤの組み合わせに対する核酸特異性は、以下の通りである：ＨＤはシトシンを標的とし、ＮＩはアデニンを標的とし、ＮＧはチミンを標的とし、ＮＮはグアニンを標的とする（ただし、いくつかの実施形態では、ＮＮはより低い特異性でアデニンと結合することもできる）。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、ＴＡＬエフェクタードメインは、表１に列挙されるものを選択した標的遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列と結合する。いくつかの実施形態では、ＴＡＬエフェクタードメインは、表１に列挙されるものを選択した標的遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列と結合する。いくつかの実施形態では、ＴＡＬエフェクタードメインは、表１に列挙されるものを選択した標的遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列と結合する。
【０２１９】
ＴＡＬ−エフェクター反復物を組み立てるための方法および組成物は、当該分野で公知である。例えば、Ｃｅｒｍａｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９：１２，２０１１，ｅ８２を参照されたい。ＴＡＬ−エフェクター反復物の構築のためのプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅから市販されている。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムは、部位特異的修飾ポリペプチドおよび核酸ガイド分子を含む組み合わせ遺伝子制御システムである。本明細書において、「部位特異的修飾ポリペプチド」は、核酸ガイド分子と結合し、それが結合する核酸ガイド分子によって、例えばＤＮＡ配列などの標的核酸配列を標的とし、標的ＤＮＡ配列を修飾する（例えば、標的ＤＮＡの切断、変異、またはメチル化）ポリペプチドを指す。部位特異的修飾ポリペプチドは、核酸ガイドと結合する部分および活性部分の２つの部分を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドは、部位特異的酵素活性（例えば、ＤＮＡメチル化、ＤＮＡ切断、ヒストンアセチル化、ヒストンメチル化など）を示す活性部分を含み、酵素活性部位は、ガイド核酸によって決定される。
【０２２１】
核酸ガイドは、内因性標的ＤＮＡ配列（本明細書において「ＤＮＡ結合セグメント」と称される）に相補的であり、かつそれと結合することができる第１の部分と、部位特異的修飾ポリペプチド（本明細書において「タンパク質結合セグメント」と称される）と相互作用することができる第２の部分との２つの部位を含む。いくつかの実施形態では、核酸ガイドのＤＮＡ結合セグメントおよびタンパク質結合セグメントは、単一ポリヌクレオチド分子内に含まれる。いくつかの実施形態では、核酸ガイドのＤＮＡ結合セグメントおよびタンパク質結合セグメントは、それぞれ別個のポリヌクレオチド分子内に含まれ、その結果、核酸ガイドは互いに会合して機能ガイドを形成する２つのポリヌクレオチド分子を含む。
【０２２２】
核酸ガイドは、標的遺伝子のＤＮＡ配列内に含まれる標的ＤＮＡ配列と特異的にハイブリダイズすることにより、組み合わされたタンパク質／核遺伝子調節システムの標的特異性を媒介する。本明細書における標的遺伝子への言及は、その特定の遺伝子の全長ＤＮＡ配列を包含し、特定の標的遺伝子の全長ＤＮＡ配列は、特定の標的遺伝子配列（例えば、エキソンまたはイントロン）の一部を指す複数の標的遺伝子座を含む。各標的遺伝子座内には、本明細書に記載される遺伝子制御システムによって修飾され得る、本明細書において「標的ＤＮＡ配列」または「標的配列」と称されるＤＮＡ配列のより短いストレッチが存在する。さらに、各標的遺伝子座は、遺伝子制御システムによって誘導される修飾の正確な位置（例えば、挿入、欠失、または変異の位置、ＤＮＡ切断の位置、またはエピジェネティック修飾の位置）を指す「標的修飾部位」を含む。本明細書に記載される遺伝子制御システムは、単一核酸ガイドを含み得るか、または複数の核酸ガイド（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の核酸ガイド）を含み得る。
【０２２３】
以下に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、組み合わせタンパク質／核酸システムの例示的な実施形態である。
【０２２４】
３．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子制御システム
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的に間隔が空いている短い回文の反復）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼシステムである。そのような実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（「Ｃａｓ」エンドヌクレアーゼ）であり、核酸ガイド分子は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。
【０２２５】
Ｃａｓポリペプチドは、ｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と協調して、標的ＤＮＡ配列にホームまたは局在化することができ、天然に存在するＣａｓタンパク質、および天然に存在するＣａｓ配列と１つ以上のアミノ酸残基によって異なる操作、修飾、または他の方法で修飾されたＣａｓタンパク質を含むポリペプチドを指す。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。Ｃａｓ９は、ＤＮＡの標的鎖を切断するためにＨＮＨヌクレアーゼドメインを使用し、非標的鎖を切断するためにＲｕｖＣ様ドメインを使用するマルチドメイン酵素である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、ＷＴ  Ｃａｓ９の酵素的に不活性な変異体（例えば、ｄＣａｓ９）への変換を可能にする選択的ドメイン不活性化によって生成でき、ＤＮＡを切断することができない、またはニッカーゼ変異体は、標的または非標的鎖の一方または他方を切断することによって一本鎖ＤＮＡ切断を生成することができる。
【０２２７】
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ＤＮＡ結合セグメントおよびタンパク質結合セグメントの２つのセグメントを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、１つのＲＮＡ分子に含まれ、ＤＮＡ結合セグメントは、別の別個のＲＮＡ分子に含まれる。かかる実施形態は、本明細書において「二重分子ｇＲＮＡ」または「２分子ｇＲＮＡ」または「二重ｇＲＮＡ」と称される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、単一ＲＮＡ分子であり、本明細書において「単一ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」と称される。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」という用語は包含的であり、２分子ガイドＲＮＡおよびｓｇＲＮＡの両方を指す。
【０２２８】
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、部分的に、互いにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二本鎖（ｄｓＲＮＡ二本鎖）を形成する２つの相補的なヌクレオチドストレッチを含み、これは、Ｃａｓタンパク質との結合を容易にする。
【０２２９】
ｇＲＮＡのＤＮＡ結合セグメント（または「ＤＮＡ結合配列」）は、特定の配列標的ＤＮＡ配列と相補的であり、かつそれと結合することができるヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、Ｃａｓポリペプチドと相互作用し、ｇＲＮＡ分子と部位特異的修飾ポリペプチドとの相互作用は、内因性ＤＮＡとのＣａｓ結合をもたらし、標的ＤＮＡ配列内またはその周辺に１つ以上の修飾を生じる。標的修飾部位の正確な位置は、（ｉ）ｇＲＮＡと標的ＤＮＡ配列との間の塩基対相補性、および（ｉｉ）標的ＤＮＡ配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される短いモチーフの位置の両方によって決定される。ＰＡＭ配列は、標的ＤＮＡ配列とのＣａｓ結合に必要である。様々なＰＡＭ配列は、当該技術分野で既知であり、特定のＣａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）での使用に好適であることは当該技術分野で既知である（例えば、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３  Ｎｏｖ；１０（１１）：１１１６−１１２１、およびＳｃｉ  Ｒｅｐ．２０１４；４：５４０５を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、標的修飾部位の５０塩基対以内に位置する。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、標的修飾部位の１０塩基対以内に位置する。この方法によって標的化することができるＤＮＡ配列は、ＰＡＭ配列から標的修飾部位の相対距離と、配列特異的なｇＲＮＡ媒介Ｃａｓ結合を媒介するための固有の２０塩基対配列の存在によってのみ制限される。いくつかの実施形態では、標的修飾部位は、標的遺伝子座の５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、標的修飾部位は、標的遺伝子座の３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、標的修飾部位は、標的遺伝子座のイントロンまたはエキソン内に位置する。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡコード化核酸は、発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターに含まれる。いくつかの実施形態では、本開示は、部位特異的修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターに含まれる。
【０２３１】
ａ．Ｃａｓタンパク質
いくつかの実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドは、Ｃａｓタンパク質である。様々な種のＣａｓ分子は、本明細書に記載される方法および組成物に使用することができ、S.ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、S.アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、アシドボラックス・アベナ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ）、アクチノバチルス・プレウロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバチルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｉｓ）、アクチノミセス種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、シクリフィルスデニトリフィカンス（Ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．）、ブラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム種（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）、ブレビバチルス・ラテロスポクサス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｘｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ）、カンジダタス・プニセイスピリルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｃｏｌｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マツルショッティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｉｂａｅ）、ユウバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガンマプロテオバクテリウム（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｕｔｏｍｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シナエディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター���ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア科の細菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メチロシスティス種（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）、メチロシナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バシリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・フラベッセンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ナイセリア種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐ．）、ナイセリア・ワズワーシイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス種（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラルクトバクテリウム・スクシナテューテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム種（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ  ｓｐ．）、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス種（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、スポロラクトバチルス・ビネア（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、サブドリグラヌルム種（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ  ｓｐ．）、ティストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネマ種（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐ．）、またはバーミネフロバクター・エイセニア（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｉｓｅｎｉａｅ）に由来するＣａｓ分子を含む。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９オルソログであり、ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ２、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ３、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ４、ＳａＣａｓ９、ＦｎＣｐｆ、ＦｎＣａｓ９、ｅＳｐＣａｓ９、およびＮｍｅＣａｓ９からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃ２Ｃ１、Ｃ２Ｃ３、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとも称される）、Ｃａｓｌ、ＣａｓｌＢ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（ＣｓｎｌおよびＣｓｘ１２とも称される）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、およびＣｓｆ４からなる群から選択される。追加のＣａｓ９オルソログは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号に記載される。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、天然に存在するＣａｓ９タンパク質である。例示的な天然に存在するＣａｓ９分子は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３  １０：５，７２７−７３７に記載される。かかるＣａｓ９分子には、クラスター１細菌ファミリー、クラスター２細菌ファミリー、クラスター３細菌ファミリー、クラスター４細菌ファミリー、クラスター５細菌ファミリー、クラスター６細菌ファミリー、クラスター７細菌ファミリー、クラスター８細菌ファミリー、クラスター９細菌ファミリー、クラスター１０細菌ファミリー、クラスター１１細菌ファミリー、クラスター１２細菌ファミリー、クラスター１３細菌ファミリー、クラスター１４細菌ファミリー、クラスター１５細菌ファミリー、クラスター１６細菌ファミリー、クラスター１７細菌ファミリー、クラスター１８細菌ファミリー、クラスター１９細菌ファミリー、クラスター２０細菌ファミリー、クラスター２１細菌ファミリー、クラスター２２細菌ファミリー、クラスター２３細菌ファミリー、クラスター２４細菌ファミリー、クラスター２５細菌ファミリー、クラスター２６細菌ファミリー、クラスター２７細菌ファミリー、クラスター２８細菌ファミリー、クラスター２９細菌ファミリー、クラスター３０細菌ファミリー、クラスター３１細菌ファミリー、クラスター３２細菌ファミリー、クラスター３３細菌ファミリー、クラスター３４細菌ファミリー、クラスター３５細菌ファミリー、クラスター３６細菌ファミリー、クラスター３７細菌ファミリー、クラスター３８細菌ファミリー、クラスター３９細菌ファミリー、クラスター４０細菌ファミリー、クラスター４１細菌ファミリー、クラスター４２細菌ファミリー、クラスター４３細菌ファミリー、クラスター４４細菌ファミリー、クラスター４５細菌ファミリー、クラスター４６細菌ファミリー、クラスター４７細菌ファミリー、クラスター４８細菌ファミリー、クラスター４９細菌ファミリー、クラスター５０細菌ファミリー、クラスター５１細菌ファミリー、クラスター５２細菌ファミリー、クラスター５３細菌ファミリー、クラスター５４細菌ファミリー、クラスター５５細菌ファミリー、クラスター５６細菌ファミリー、クラスター５７細菌ファミリー、クラスター５８細菌ファミリー、クラスター５９細菌ファミリー、クラスター６０細菌ファミリー、クラスター６１細菌ファミリー、クラスター６２細菌ファミリー、クラスター６３細菌ファミリー、クラスター６４細菌ファミリー、クラスター６５細菌ファミリー、クラスター６６細菌ファミリー、クラスター６７細菌ファミリー、クラスター６８細菌ファミリー、クラスター６９細菌ファミリー、クラスター７０細菌ファミリー、クラスター７１細菌ファミリー、クラスター７２細菌ファミリー、クラスター７３細菌ファミリー、クラスター７４細菌ファミリー、クラスター７５細菌ファミリー、クラスター７６細菌ファミリー、クラスター７７細菌ファミリー、またはクラスター７８細菌ファミリーのＣａｓ９分子が含まれる。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３  １０：５，７２７−７３７、Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  Ｅａｒｌｙ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２０１３，１−６）に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、以下の活性のうちの１つ以上を含む：
ａ）ニッカーゼ活性、すなわち、核酸分子の一本鎖、例えば、非相補鎖または相補鎖を切断する能力、
ｂ）二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の両鎖を切断し、一実施形態では２つのニッカーゼ活性の存在である二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｂｒｅａｋ）を作成する能力、
ｃ）エンドヌクレアーゼ活性、
ｄ）エキソヌクレアーゼ活性、および／または
ｅ）ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の螺旋構造をほどく能力。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、野生型（ＷＴ）Ｃａｓ９タンパク質またはオルソログである。ＷＴ  Ｃａｓ９は、２つの触媒活性ドメイン（ＨＮＨおよびＲｕｖＣ）を含む。ｇＲＮＡ特異性に基づくＤＮＡとのＷＴ  Ｃａｓ９の結合は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同指向修復（ＨＤＲ）によって修復することができる二本鎖ＤＮＡ切断をもたらす。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、ＤＮＡ損傷シグナル伝達タンパク質、エキソヌクレアーゼ、またはホスファターゼを動員する異種タンパク質と融合して、１つの修復メカニズムまたは別の修復メカニズムによる標的配列の修復の可能性または速度をさらに増加させる。いくつかの実施形態では、ＷＴ  Ｃａｓ９は、核酸修復鋳型と同時発現して、相同性指向修復による外来性核酸配列の取り込みを促進する。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、異なるＣａｓ９タンパク質（すなわち、様々な種由来のＣａｓ９タンパク質）は、異なるＣａｓ９タンパク質の様々な酵素特性を利用するために（例えば、異なるＰＡＭ配列を優先するため、酵素活性を増加または減少するため、細胞毒性のレベルを増加または減少するため、ＮＨＥＪ、相同指向修復、一本鎖切断、二本鎖切断などの間のバランスを変更するため）、様々な提供される方法で使用することが有利であり得る。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮＧＧ、ＮＡＧ、ＮＧＡを認識する（Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３；３３９（６１２１）：８２３−８２６）。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓ．サーモフィルス由来のＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮＧＧＮＧおよび／またはＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ）を認識する（例えば、Ｈｏｒｖａｔｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０；３２７（５９６２）：１６７−１７０、およびＤｅｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ  ２００８；１９０（４）：１３９０−１４００を参照されたい）。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）由来のＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮＧＧおよび／またはＮＡＡＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識する（例えば、Ｄｅｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ  ２００８；１９０  （４）：１３９０−１４００を参照されたい）。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓ．アウレウス由来のＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓ．アウレウス由来のＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮ  ＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓ．アウレウス由来のＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮ  ＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｎ．メニンギティディス由来のＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮ  ＧＡＴＴまたはＮ  ＧＣＴＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ａ、Ｇ、またはＣ）を認識する（例えば、Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｈ，ＰＮＡＳ  ２０１３，１−６を参照されたい）。前述の実施形態では、Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴのいずれかであり得る。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号、またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３  １０：５，７２７−７３７に記載されるＣａｓタンパク質と少なくとも９０％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号、またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３  １０：５，７２７−７３７に記載されるＣａｓタンパク質と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号、またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３  １０：５，７２７−７３７に記載されるＣａｓタンパク質と１００％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。
【０２４０】
ｉ．Ｃａｓ変異型
いくつかの実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、Ｃａｓポリペプチドの１つ以上の特性を変更するように操作される。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、変更された酵素特性、例えば、変更されたヌクレアーゼ活性（天然に存在するまたは他の参照Ｃａｓ分子と比較して）または変更されたヘリカーゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＣａｓポリペプチドは、そのサイズを変更する変化、例えば、Ｃａｓポリペプチドの別の性質に有意な影響を及ぼすことなく、そのサイズを減少させるアミノ酸配列の欠失を有することができる。いくつかの実施形態では、操作されたＣａｓポリペプチドは、ＰＡＭ認識に影響を及ぼす変更を含む。例えば、操作されたＣａｓポリペプチドを変更して、対応する野生型Ｃａｓタンパク質によって認識されるＰＡＭ配列以外のＰＡＭ配列を認識することができる。
【０２４１】
所望の特性を有するＣａｓポリペプチドは、所望の特性を有する変異または変更Ｃａｓポリペプチドを提供するために、天然に存在するＣａｓポリペプチドまたは親Ｃａｓポリペプチドの変更を含む、いくつかの方法で作製することができる。例えば、１つ以上の変異は、親Ｃａｓポリペプチド（例えば、天然に存在するか、または操作されたＣａｓポリペプチド）の配列に導入され得る。かかる変異および差異は、置換（例えば、非必須アミノ酸の保存的置換または置換）、挿入、または欠失を含み得る。いくつかの実施形態では、変異Ｃａｓポリペプチドは、親Ｃａｓポリペプチドに対して１つ以上の変異（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、または５０変異）を含む。
【０２４２】
一実施形態では、変異Ｃａｓポリペプチドは、天然に存在するＣａｓポリペプチドとは異なる切断特性を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓは、Ｃａｓニッカーゼ変異である。Ｃａｓニッカーゼ変異は、１つの触媒活性ドメイン（ＨＮＨドメインまたはＲｕｖＣドメインのいずれか）のみを含む。Ｃａｓニッカーゼ変異は、ｇＲＮＡ特異性に基づいてＤＮＡ結合を保持するが、ＤＮＡの１つの鎖のみを切断することができ、一本鎖切断をもたらす（例えば、「ニック」）。いくつかの実施形態では、２つの相補的なＣａｓニッカーゼ変異（例えば、不活性化ＲｕｖＣドメインを有する１つのＣａｓニッカーゼ変異、および不活性化ＨＮＨドメインを有する１つのＣａｓニッカーゼ変異）は、２つのそれぞれの標的配列、センスＤＮＡ鎖上の１つの標的配列、およびアンチセンスＤＮＡ鎖上の１つの標的配列に対応する２つのｇＲＮＡを有する同じ細胞において発現される。この二重ニッカーゼシステムは、２つのオフターゲットニックが二本鎖切断を生成するために十分に近くに生成される可能性が低いため、二本鎖切断をずらし、標的特異性を高めることができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼ変異は、核酸修復鋳型と同時発現して、相同性指向修復による外来性核酸配列の取り込みを促進する。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣａｓポリペプチドは、ＣａｓポリペプチドのＰＡＭ特異性を変更するように操作され得る。いくつかの実施形態では、変異Ｃａｓポリペプチドは、親ＣａｓポリペプチドのＰＡＭ特異性とは異なるＰＡＭ特異性を有する。例えば、天然に存在するＣａｓタンパク質は、変異Ｃａｓポリペプチドが認識するＰＡＭ配列を変更して、非特異的部位を低減させ、特異性を向上させ、またはＰＡＭ認識要件を排除するように修飾することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＰＡＭ認識配列の長さを増加させるように修飾され得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ認識配列の長さは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、または１５個のアミノ酸長である。異なるＰＡＭ配列を認識し、かつ／またはオフターゲット活性を低減したＣａｓポリペプチドは、指向性進化を使用して生成することができる。Ｃａｓポリペプチドの指向性進化に使用することができる例示的な方法およびシステムは、例えば、Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１１，４７２（７３４４）：４９９−５０３に記載される。
【０２４４】
例示的なＣａｓ変異は、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１６１２７６号に記載され、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２４５】
２．ｇＲＮＡ
本開示は、部位特異的修飾ポリペプチドを特定の標的ＤＮＡ配列に誘導するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供する。ｇＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメントおよびタンパク質結合セグメントを含む。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ配列中の配列と相補的なヌクレオチド配列を含む。したがって、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して配列特異的様式で標的ＤＮＡと相互作用し、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は、ｇＲＮＡが結合するであろう標的ＤＮＡ内の位置を決定する。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ配列内の任意の所望の配列とハイブリダイズするために（例えば、遺伝子操作によって）修飾することができる。
【０２４６】
ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、部位特異的修飾ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）と相互作用して、複合体を形成する。ガイドＲＮＡは、上記のＤＮＡ標的化セグメントを介して、結合ポリペプチドを標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に誘導する。ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的であり、二本鎖ＲＮＡ二本鎖を形成する２つのヌクレオチドストレッチを含む。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２つの別個のＲＮＡ分子を含む。かかる実施形態では、２つのＲＮＡ分子の各々は、２つのＲＮＡ分子の相補的ヌクレオチドがハイブリダイズして、タンパク質結合セグメントの二本鎖ＲＮＡ二重鎖を形成するように互いに相補的であるヌクレオチドのストレッチを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、単一ＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）を含む。
【０２４８】
標的遺伝子座に対するｇＲＮＡの特異性は、標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と相補的な約２０個のヌクレオチドを含むＤＮＡ結合セグメントの配列によって媒介される。いくつかの実施形態では、対応する標的ＤＮＡ配列は、およそ２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、本発明のｇＲＮＡ配列のＤＮＡ結合セグメントは、標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％相補的である。いくつかの実施形態では、本発明のｇＲＮＡ配列のＤＮＡ結合セグメントは、標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的である。いくつかの実施形態では、本発明のｇＲＮＡ配列のＤＮＡ結合セグメントは、標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と１００％相補的である。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列のＤＮＡ結合セグメントは、表１に列挙されるものを選択した標的遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列と結合する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列のＤＮＡ結合セグメントは、表１に列挙されるものを選択した標的遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列と結合する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列のＤＮＡ結合セグメントは、表１に列挙されるものを選択した標的遺伝子の標的遺伝子座内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列と結合する。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡ配列のＤＮＡ結合セグメントは、特定の標的遺伝子座または標的遺伝子に固有である標的配列を識別するために、当該技術分野で既知のアルゴリズム（例えば、Ｃａｓ−ＯＦＦファインダー）を使用してオフターゲット結合を最小化するように設計される。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する安定性を導入する１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むことができる。かかる実施形態では、これらの修飾ｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡと比較して低減した自然免疫を誘発し得る。「自然免疫応答」という用語は、一般にウイルスまたは細菌起源の一本鎖核酸を含む外因性核酸に対する細胞応答を含み、これは、サイトカイン発現および放出、特にインターフェロンの誘導、ならびに細胞死を伴う。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡは、５’末端またはその付近（例えば、その５’末端の１〜１０ヌクレオチド、１〜５ヌクレオチド、または１〜２ヌクレオチド内）で修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端は、真核ｍＲＮＡ  ｃａｐ構造またはｃａｐ類似体（例えば、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ  ｃａｐ類似体、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ  ｃａｐ類似体、または３’−０−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ抗反転ｃａｐ類似体（ＡＲＣＡ））を含むことによって修飾される。いくつかの実施形態では、インビトロ転写ｇＲＮＡは、ホスファターゼ（子牛の腸のアルカリ性ホスファターゼなど）で処理することにより修飾され、５’三リン酸基が除去される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、その３’末端またはその近く（例えば、その３’末端の１〜１０ヌクレオチド、１〜５ヌクレオチド、または１〜２ヌクレオチド内）での修飾を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端は、１つ以上（例えば、２５〜２００）のアデニン（Ａ）残基を追加することによって修飾される。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、ｇＲＮＡ中に存在することができるが、他の遺伝子制御システム、例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、またはｓｉＲＮＡ系システム中に存在することもできる。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下のうちの１つ以上を含むことができる：
ａ）変更、例えば、リン酸ジエステル骨格結合における非結合リン酸酸素および／または１つ以上の結合リン酸酸素の一方または両方の置換、
ｂ）変更、例えば、リボース糖の成分、例えば、リボース糖上の２’ヒドロキシルの置換、
ｃ）リン酸部分の「デホスホ」リンカーへの大規模な置換、
ｄ）天然に存在する核酸塩基の修飾または置換、
ｅ）リボース−リン酸骨格の置換または修飾、
ｆ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾、もしくは置換、または部分抱合、および
ｇ）糖の修飾。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、上記に列挙される修飾を組み合わせて、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の修飾を有することができる修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドを提供することができる。例えば、いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、修飾糖および修飾核酸塩基を有することができる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのすべての塩基が修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子のリン酸基の各々は、ホスホロチオエート基で置換される。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、ソフトウェアツールを使用して、ユーザの標的配列内のｇＲＮＡの選択を最適化することができ、例えば、ゲノムにわたる全オフターゲット活性を最小限に抑えることができる。オフターゲット活性は、切断以外であり得る。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９を使用する各可能なｇＲＮＡ選択について、ソフトウェアツールは、最大一定数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の不一致塩基対を含むゲノム全体にわたるすべての潜在的オフターゲット配列（ＮＡＧまたはＮＧＧ  ＰＡＭのいずれかの前）を識別することができる。各オフターゲット配列での切断効率は、例えば、実験的に導出された重み付けスキームを使用して予測できる。次いで、可能な各ｇＲＮＡは、その総予測オフターゲット切断に従ってランク付けすることができ、上位ランクのｇＲＮＡは、最大のオンターゲットおよび最小のオフターゲット切断を有する可能性が高いものを表す。他の機能、例えば、ｇＲＮＡベクター構築のための自動試薬設計、オンターゲット測定アッセイのためのプライマー設計、ならびに次世代シーケンシングを介したハイスループット検出およびオフターゲット切断の定量化のためのプライマー設計もまた、ツールに含まれ得る。
【０２５６】
本発明は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない以下の実施例にさらに記載される。
【実施例】
【０２５７】
実施例１
パーキン導入遺伝子バリアントの評価
一連のプラスミドベクターを生成して、パーキン導入遺伝子バリアントの発現を評価した。発現カセット（図１）は、ＣＭＶ最初期（ＩＥ）エンハンサー／プロモーターおよび５’ＵＴＲ、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）と連結したパーキン導入遺伝子２Ａ、３’ＵＴＲ、ならびにウサギグロビンポリアデニル化配列（ポリＡ）を５’から３’の順序で含んだ。パーキン導入遺伝子について、ヒトＰＲＫＮ（ＷＴ）の野生型配列または４つのコドン最適化バリアント（ＣＯ１〜ＣＯ４）のうちの１つを試験した。野生型およびコドン最適化パーキン導入遺伝子の配列は、配列番号２７、３５、３６、３７、および３８に提供した。
【０２５８】
コドン最適化ＣＯ１〜ＣＯ４の設計における１つの考慮は、ＣｐＧ部位の数である。ＣｐＧアイランドは、シトシンヌクレオチドが、その５’→３’方向に沿った塩基の直鎖配列にグアニンヌクレオチドが続くＤＮＡ領域である。ＣｐＧアイランド（典型的には、少なくとも２００ｂｐのポリヌクレオチド配列、５０％を超えるＧＣパーセンテージ、および６０％を超える観察値対予想値のＣｐＧ比として定義される）は、ベクター免疫原性に関連することが即知である。したがって、ＣｐＧ部位の数を減少させることは、免疫原性を低下させることによってベクター性能を向上すると予想した。各パーキンコドンバリアントにおけるＣｐＧ部位（５’−Ｃ−Ｇ−３’）の数を表９に示す。
【０２５９】
（表９）例示的なパーキンコドンバリアントにおけるＣｐＧ部位
2021522273.tif 000049
【０２６０】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞。ヒト神経芽細胞腫細胞株、ＳＨ−ＳＹ５Ｙを使用して、神経系統細胞における遺伝子発現を評価した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、ウェルあたり１０，０００細胞の播種密度で９６ウェルプレートで培養した。２４時間後、細胞は、１μｇプラスミドあたり４μＬのＦｕｇｅｎｅ  ＨＤと複合化した０．１０μｇのＷＴ、ＣＯ１、ＣＯ２、またはＣＯ３プラスミドでトランスフェクトした。細胞をさらに４８時間培養し、次いで蛍光顕微鏡によるｅＧＦＰ発現についてアッセイした。
【０２６１】
代表的な顕微鏡写真を図２Ａ〜２Ｊに示す。対照は、陰性対照としての未トランスフェクション細胞（図２Ａ）および陽性対照としての既知のプラスミド（図２Ｂ）である。発現カセットは二重で試験した：ＷＴ（図２Ｃ〜２Ｄ）、ＣＯ１（図２Ｅ〜２Ｆ）、ＣＯ２（図２Ｇ〜２Ｈ）、およびＣＯ３（図２Ｉ〜２Ｊ）。ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージおよびＧＦＰ＋細胞の蛍光強度は、それぞれ図２Ｈおよび図２Ｋにプロットした。トランスフェクションの７日後に細胞溶解物を回収し、図３に示すように、パーキンについて酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってアッセイした。これらの実験は、ＣＯ１〜ＣＯ３がパーキンの発現を増加させず、実際にパーキンを発現した細胞のパーセンテージおよびパーキンの発現の全体的なレベルを減少させたことを示した。
【０２６２】
次に、コドンバリアントＣＯ４をＷＴおよびＣＯ１に対して試験した。未トランスフェクション陰性対照（図４Ａ）、ＷＴ（図４Ｂ）、ＣＯ１（図４Ｃ）、またはＣＯ４（図４Ｄ）についてのＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の蛍光顕微鏡写真を示し、その結果をＧＦＰ＋のパーセント（図４Ｅ）および強度（図４Ｆ）について定量した。細胞溶解物を、ＥＬＩＳＡによるパーキン発現についてアッセイした（図５）。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞では、ＣＯ４発現はＷＴおよびＣＯ１と同様であった。
【０２６３】
ｉＰＳＣ由来、パーキンノックアウトドーパミン作動性前駆細胞。ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来、パーキンノックアウトドーパミン作動性前駆細胞を、ウェルあたり１０，０００細胞の播種密度で９６ウェルプレートで培養した。７日後、細胞は、１μｇプラスミドあたり４μＬのＶｉａＦｅｃｔと複合化した０．１５μｇのＷＴ、ＣＯ１、およびＣＯ４プラスミドでトランスフェクトした）。未トランスフェクションウェル（図６Ａ）、ＷＴ（図６Ｂ）、ＣＯ１（図６Ｃ）、またはＣＯ４（図６Ｄ）ウェルでトランスフェクション後７日に導入遺伝子発現を評価した。図６Ｅに示すように、３つの導入遺伝子（ＷＴ、ＣＯ１、およびＣＯ４）は、同様のパーセンテージのＧＦＰ＋細胞をもたらしたが、驚くべきことに、ＣＯ４は、ＷＴと比較してＧＦＰ強度が２０％増加した。
【０２６４】
実施例２
ＣＯ４パーキン導入遺伝子の発現のためのカセットの選択
他の制御要素を評価するために、ヘルパーフリーＡＡＶパッケージ化システムで使用するための、導入プラスミドの形態で様々なＡＡＶ発現カセットを構築した。ＡＡＶ発現カセット（図７）は、ＡＡＶ２の５’ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー（Ｅｎｈ）またはエンハンサーなし、表５から選択したプロモーター、表６から選択した５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、パーキン導入遺伝子バリアントＣＯ４（配列番号３８）、表７から選択した３’非翻訳領域、表８から選択したポリアデニル化配列（ポリＡ）、およびＡＡＶ２の３’ＩＴＲを５’から３’の順序で含む。カセットおよび様々な要素の図を図８に提供する。インビトロ試験における導入遺伝子発現の検出のために、表１０に列挙される配列の各々のパーキン導入遺伝子上の開始コドンの後に、Ｎ末端フラグ／ＨＡタグ（配列番号８１）をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号８０）を挿入した。
【０２６５】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、ウェルあたり５０，０００細胞の播種密度で２４ウェルプレートで培養した。２４時間後、細胞は、１μｇプラスミドあたり４μＬのＦｕｇｅｎｅ６と複合化した０．７５μｇのプラスミドでトランスフェクトした。細胞をさらに４８時間培養し、パーキン発現を、抗パーキン一次抗体を用いて細胞溶解物に対してＥＬＩＳＡを行うことによりアッセイした。各構築物の結果を表１０に示し、図９にグラフ化した。特筆すべきことに、タンパク質発現は、神経特異的プロモーター（ＳｙｎおよびＣａＭＫＩＩａ）の方が低かった。
【０２６６】
（表１０）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるパーキンの発現（複製の平均）
2021522273.tif 000050
【０２６７】
ｉＰＳＣ由来、パーキンノックアウトドーパミン作動性前駆細胞。ｉＰＳＣ由来、パーキンノックアウトドーパミン作動性前駆細胞を、ウェルあたり１０，０００細胞の播種密度で９６ウェルプレートで培養した。１５日後、細胞は、１μｇプラスミドあたり４μＬのＶｉａＦｅｃｔと複合化した０．１５μｇのプラスミドでトランスフェクトした）。パーキン発現は、抗パーキン一次抗体を用いて細胞溶解物に対してＥＬＩＳＡを行うことにより、２日後にアッセイした。各構築物の結果を表１１に示し、図１０にグラフ化した（各構築物について示される３つの複製）。
【０２６８】
（表１１）ｉＰＳＣ由来細胞におけるパーキンの発現（複製の平均）
2021522273.tif 000051
【０２６９】
蛍光顕微鏡法では、トランスフェクション８日後にトランスフェクション細胞を固定し、染色し、明視野（図１１Ａおよび図１２Ａ）、またはパーキン（図１１Ｂおよび図１２Ｂ）、ニューロンマーカーＮｅｕＮ（図１１Ｃおよび図１２Ｃ）、またはアストロサイトマーカーＧＦＡＰ（図１１Ｄおよび図１２Ｄ）の免疫蛍光によって画像化した。図１２Ａ〜１２Ｄは、図１１Ａ〜１１Ｄの拡大画像を示す。
【０２７０】
実施例３
パーキンＡＡＶ遺伝子治療のインビボおよび臨床治験
ＡＡＶベクターは、実施例２の構築物１〜２０、特に表１１の構築物１、７、１１、および１５からのＡＡＶベクターゲノムのパッケージングによって生成した。試験はラットで実施し、１つ以上の構築物を非ヒト霊長類（ＮＨＰ）で試験するために選択した。用量設定研究を実施し、観察したタンパク質発現および毒性の測定によって臨床治験の開始用量を決定した。
【０２７１】
臨床治験は、ＰＲＫＮ遺伝子（ＰＲＫ２としても知られている）に劣性変異を有すると特定された対象において実施した。タンパク質発現および観察した毒性を使用して、最適な用量を決定する。有効性は、統一パーキンソン病評価尺度（ＵＰＤＲＳ）の改善を使用して評価した。
【０２７２】
実施例４
インビトロ試験
組換えカセットをヒト神経芽腫細胞株（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）で試験した。（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＳＨ−ＳＹ５Ｙ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｙｎａｐｓｅ．２００８  Ｎｏｖ；６２（１１）：７９７−８０３．ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｙｎ．２０５５４を参照されたい）。試験した目的の遺伝子は、パーキンソンタンパク質２のＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＰＡＲＫ  ２）遺伝子、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）遺伝子、タンパク質デグリカーゼＤＪ−１（ＤＪ−１）遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、アルファ−シヌクレイン（ＳＣＮＡ）遺伝子、がん原遺伝子ｃ−Ｒｅｌ（ｃ−Ｒｅｌ）遺伝子、ユビキチン様修飾因子活性化酵素（ＡＴＧ７）遺伝子、シナプス小胞アミントランスポーター（ＶＭＡＴ２）遺伝子、またはグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）遺伝子である。
【０２７３】
各細胞株は、目的の遺伝子ごとに組換え遺伝子治療ベクターで治療した。目的の遺伝子の発現が増加した。目的の遺伝子の機能が改善した。いくつかの事例では、改善したマイトファジー、減少した細胞毒性、および／または減少した酸化ストレスを観察した。
【０２７４】
実施例５
インビボ試験
目的の遺伝子における１つ以上の既知の変異の組み合わせを有するげっ歯類または非ヒト霊長類を、その目的の遺伝子のための組換え遺伝子治療ベクターで治療した。試験した目的の遺伝子は、パーキンソンタンパク質２のＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＰＡＲＫ  ２）遺伝子、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）遺伝子、タンパク質デグリカーゼＤＪ−１（ＤＪ−１）遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、アルファ−シヌクレイン（ＳＣＮＡ）遺伝子、がん原遺伝子ｃ−Ｒｅｌ（ｃ−Ｒｅｌ）遺伝子、ユビキチン様修飾因子活性化酵素（ＡＴＧ７）遺伝子、シナプス小胞アミントランスポーター（ＶＭＡＴ２）遺伝子、またはグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）遺伝子である。
【０２７５】
試験対象は、以下の特徴のうちの１つ以上を有する：ドーパミン（ＤＡ）の喪失、２０％以上の黒質細胞の喪失、ジスキネジア、レビー小体、ミトコンドリア機能障害の適応症、ＲＯＳ、炎症、他の運動挙動障害、および神経変性症状。
【０２７６】
本開示の方法が試験される動物としては、非疾患および疾患動物、ならびに変異保有および非保有動物が含まれる。本開示の方法が試験される動物モデルおよび例示的な運動挙動読み取りは、表１２に提供する。
【０２７７】
（表１２）
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【０２７８】
試験対象は、運動挙動読み取りのうちのいずれかまたは以下の特徴のうちの１つ以上において改善を示す：線条体におけるＤＡの増加、黒質細胞の増加、減少したレビー小体、改善した挙動または他の運動機能障害、改善したミトコンドリア機能、減少した炎症マーカー、改善した寿命。
【０２７９】
実施例６
臨床試験
早期発症パーキンソン病のパーキン型の診断は、主に早期発症パーキンソン症（年齢４０歳未満）の個体、特に常染色体劣性遺伝が疑われる場合に考えられる。パーキンタンパク質をコードする遺伝子であるＰＲＫＮ（以前はＰＡＲＫ２と呼ばれていた）は、病原性バリアントが早期発症パーキンソン病のパーキン型を引き起こすことが知られている主要な遺伝子である。早期発症パーキンソン病のパーキン型の診断は、ＰＲＫＮの両方の対立遺伝子上で病原性バリアントが同定された場合にのみ確認することができる（すなわち、個体は、同じ病原性対立遺伝子に対してホモ接合性であるか、または２つの異なる病原性対立遺伝子に対してヘテロ接合性の化合物である）。バリアント検出頻度は、家族歴および発症年齢によって異なる。
【０２８０】
パーキンソン病に関連する他の変異を表１３に提供する。
【０２８１】
（表１３）
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【０２８２】
パーキンソン病に関連する１つ以上の変異を有するヒト対象は、変異遺伝子の野生型または機能的バリアントをコードする組換え遺伝子治療ベクターで治療される。対象は、表１２に列挙される運動挙動読み取りのうちのいずれか、または以下の特徴のうちのいずれかにおいて改善を示す：増加した脳内のドーパミン、特に黒質、増加したドーパミン作動性ニューロンの数、増加したＰＲＫＮを含む目的の遺伝子の発現、または改善した統一パーキンソン病評価尺度（ＵＰＤＲＳ）。
【０２８３】
本明細書において参照されている、かつ／または出願データシートに列挙されている上記の米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物の全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２８４】
本発明は、本明細書に広く記載され、以下に特許請求されるその構造、方法、または他の本質的特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。記載される実施形態は、あらゆる態様において、例示的であり、限定的ではないと見なされるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の説明ではなく、添付の特許請求の範囲によって示される。特許請求の同等性の意味および範囲内にあるすべての変更は、それらの範囲内で受け入れるものとする。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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