(57)【要約】本開示は、ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象にループ利尿薬ブメタニドの治療有効量を投与することによって、アルツハイマー病（ＡＤ）を治療し、ＡＤに関連する認知障害を救済する方法を提供する。ブメタニド処方物の１つ以上の用量を含む、同方法を実施するためのキットがさらに本明細書で提供され、これはまた、ブメタニドを投与することによってａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する患者を治療するための電子的または紙による指示、および／またはａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象を試験／同定するための指示および試薬を含み得る。
2021521198.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）を治療する方法であって、前記方法は、治療有効量のブメタニドを同対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記投与することが、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日以下の用量でブメタニドを前記対象に投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記投与することが、０．０２ｍｇ／ｋｇ／日以下の用量でブメタニドを前記対象に投与することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ブメタニドが薬学的に許容可能な担体を含む経口剤形として処方され、前記経口剤形が経口投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記経口剤形が、カプセル剤、錠剤、崩壊錠もしくはトローチ剤、またはサシェ剤として１日１回投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ブメタニドが静脈内または非経口的に投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ブメタニドが経皮パッチ中に提供される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記対象が哺乳動物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳動物がヒトである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象におけるアルツハイマー病を治療する方法であって、前記方法は、
ａ）ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象を同定すること；および
ｂ）治療有効量のブメタニドを対象に投与すること、
を含む方法。
【請求項１１】
前記同定することが、前記対象由来の生物学的サンプルについてＰＣＲに基づくＤＮＡ解析方法を実施することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物学的サンプルを対象から単離することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記投与することが、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日以下の用量としてブメタニドを前記対象に投与することを含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記投与することが、０．０２ｍｇ／ｋｇ／日以下の用量としてブメタニドを前記対象に投与することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ブメタニドが薬学的に許容可能な担体を含む経口剤形として処方され、前記経口剤形が経口投与される、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記経口剤形が、カプセル剤、錠剤、崩壊錠もしくはトローチ剤、またはサシェ剤として１日１回投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ブメタニドが静脈内または非経口的に投与される、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ブメタニドが経皮パッチ中に提供される、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象が哺乳動物である、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
キットであって、
ａ）ブメタニド処方物；
ｂ）パッケージ；および
ｃ）ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象へのブメタニド投与の指示を含む、電子的または紙の形態の情報、
を含むキット。
【請求項２２】
前記指示は、ブメタニド処方物の対象への投与が、対象の重量、投与される処方物の重量および体積の少なくとも一方に基づくことを特定するものである、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記指示が、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日以下のブメタニドの用量で前記処方物を対象に投与する指示を含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記指示が、０．０２ｍｇ／ｋｇ／日以下のブメタニドの用量で前記処方物を対象に投与する指示を含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
１以上のａｐｏＥ遺伝子型について試験される対象から単離された生物学的サンプルを保持するための容器をさらに含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２６】
生物学的サンプル中のａｐｏＥ４対立遺伝子の特異的検出を可能にするためのＰＣＲまたはマイクロアレイ解析を実施するための１つ以上の試薬、および試薬を生物学的サンプルと反応させるための電子的または紙による指示をさらに含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
１以上の対照参照サンプルをさらに含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記ブメタニド処方物が、経口送達用の、カプセル、錠剤、崩壊錠もしくはトローチ剤、またはサシェ剤の形態である、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９】
前記ブメタニド処方物が、静脈内または非経口送達のために注射可能である、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
前記ブメタニド処方物が経皮パッチの形態である、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
キットであって、
ａ）薬学的に許容される担体およびブメタニドを含む処方物の１つ以上の用量を含む容器；および
ｂ）ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象を治療するための電子的または紙による指示、
を含むキット。
【請求項３２】
前記処方物の各用量が２ｍｇを超えないブメタニドを含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記処方物の各用量が１ｍｇを超えないブメタニドを含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記用量が経口投与のために処方される、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３５】
前記経口投与のための用量が１日１回のカプセル剤、錠剤、崩壊錠もしくはトローチ剤、またはサシェ剤として処方される、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記処方物の用量が静脈内または非経口的に投与されるように処方される、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３７】
前記処方物の用量が、経皮パッチによって投与されるように処方される、請求項３１に記載のキット。
【請求項３８】
前記対象が哺乳動物である、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３９】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
対象由来の生物学的サンプル中のａｐｏＥ４対立遺伝子の特異的検出を可能にするためのＰＣＲまたはマイクロアレイ解析を実施するための１つ以上の試薬、および試薬を生物学的サンプルと反応させるための電子的または紙による指示をさらに含む、請求項３１〜３９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４１】
１以上の対照参照サンプルをさらに含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
請求項３１〜４１のいずれか一項に記載のキットであって、対照を治療するための指示は、対象の重量および投与される処方物の重量または体積に基づく用量を特定するものである、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＰＯＥ４／４に関連した障害を治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知機能低下に関連する進行性の神経変性障害であり、高齢者における最も一般的な形態の認知症である。遺伝学的、病理学的および機能的研究は、脳におけるアミロイド−β（Ａβ）ペプチドの産生とクリアランスとの間の不均衡がＡβの蓄積と凝集をもたらすという証拠を提供している。可溶性Ａβオリゴマー、ニューロン内Ａβおよびアミロイドプラークの形態にある毒性のＡβ凝集体はシナプスを損傷し、最終的に神経変性および認知症を引き起こす。
【０００３】
認知症には多くの遺伝的危険因子があり、アルツハイマー病患者の約２５％にこの疾患に対する強い家族歴がある。しかしながら、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）としても知られる早発型アルツハイマー病を引き起こす遺伝子変異を直接受け継いでいるＡＤ患者はわずか１％である。より一般的な遅発型ＡＤ（ＬＯＡＤ）では、ヒトアポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）遺伝子が最大のリスク因子であることが報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
ＡｐｏＥタンパク質は、ある組織または細胞型から別の組織または細胞型への脂質輸送を媒介し、脳の損傷修復をサポートするコレステロール担体である。ＡｐｏＥリポタンパク質は、脂質を運搬するいくつかの細胞表面受容体に結合するだけでなく、脳内の疎水性Ａβペプチドにも結合する。ＡｐｏＥは、ＡＤにおけるシナプス機能障害および神経変性に関連するプラークの構成要素であるＡβの除去に役立つと考えられている。
【０００５】
ヒトＡｐｏＥは、２９９のアミノ酸を有する約３４ｋＤａのタンパク質である。ＡｐｏＥには、受容体結合領域（アミノ酸（ａａ）１３５〜１５０）を含むアミノ末端ドメイン（ａａ１〜１９１）と、脂質結合領域（ａａ２４１〜２７２）を含むカルボキシル末端ドメイン（ａａ２２２〜２９９）の２つの構造ドメインがあり、構造的に柔軟なヒンジ領域（ａａ１９２〜２２１）によって連結されている。
【０００６】
ＡＰＯＥ遺伝子には３つの多型対立遺伝子があり、ＡＰＯＥε２、ε３、ε４（Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４としても知られる）である；したがって、ヒトでは、ＡＰＯＥ遺伝子型は次のように記号化される：Ｅ２／Ｅ２、Ｅ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ４、またはＥ４／Ｅ４。Ｅ３対立遺伝子は最も一般的であり、ＡＤのリスクと関連するとは考えられていないが、Ｅ４対立遺伝子を保有する個人はＡＤのリスクが高く、Ｅ２対立遺伝子（最もまれである）のコピーを１つでも保有する個人はアルツハイマー病を発症するリスクが低い。対照的に、Ｅ４対立遺伝子の存在は、脳アミロイド血管症のリスク増加および正常な加齢時の年齢と関係した認知低下と関係する。（前述の非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌｉｕ、Ｃ．Ｃ．他、「アポリポタンパク質Ｅおよびアルツハイマー病：リスク、メカニズムおよび治療」、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２０１３、９（２）：１０６−１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＡＤは世界中で認知症の主要な原因であるが、効果的な治療法はまだ利用可能ではない。したがって、認知症および／またはアルツハイマー病などのＡｐｏＥ４遺伝子型関連障害を治療するのに有効な治療薬が当技術分野で依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象にループ利尿薬ブメタニドの治療有効量を投与することによって、アルツハイマー病（ＡＤ）を治療し、ＡＤに関連する認知障害を救済する方法、ならびにその方法を実施するためのキットを提供する。ブメタニド処方物の１つ以上の用量を含むキットがさらに本明細書で提供され、これはまた、ブメタニドを投与することによってａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する患者を治療するための電子的または紙による指示（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）、および／またはａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象を試験／同定するための指示および試薬を含み得る。
【００１０】
いくつかの態様において、治療有効量のブメタニドを対象に投与することにより、ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）を治療する方法が提供される。この方法のいくつかの実施形態において、ブメタニドは、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日以下の用量で対象に投与される。
【００１１】
いくつかの態様において、本明細書において、ａ）ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象を同定することと、ｂ）治療有効量のブメタニドを対象に投与することと、により、ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象におけるアルツハイマー病を治療する方法が提供される。この方法のいくつかの実施形態において、投与することは、ブメタニドを０．０５ｍｇ／ｋｇ／日以下の用量で対象に投与すること、を含む。
【００１２】
これらの方法のいくつかの実施形態において、ブメタニドは、薬学的に許容される担体を含む経口剤形として処方され、経口剤形は経口投与される。これらの方法のいくつかの実施形態において、経口剤形は、カプセル、錠剤、崩壊錠もしくはトローチ剤、またはサシェ剤として１日１回投与される。
【００１３】
これらの方法のいくつかの実施形態において、ブメタニドは、静脈内または非経口的に投与され、そして任意選択的に、薬学的に許容される担体と共に処方される。
これらの方法のいくつかの実施形態において、ブメタニドは、経皮パッチで提供される。
【００１４】
これらの方法のいくつかの実施形態において、対象は哺乳動物である。これらの方法のいくつかの実施形態において、哺乳動物はげっ歯類である。これらの方法のいくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００１５】
これらの方法のいくつかの実施形態において、ＰＣＲに基づくＤＮＡ解析方法を用いて、ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有するものとして対象を同定する。
いくつかの態様において、ａ）ブメタニド処方物；ｂ）パッケージ；ｃ）ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象にブメタニドを投与するための指示を含む電子的又は紙面による指示、を含むキットが提供される。キットのいくつかの実施形態において、指示は、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日以下のブメタニドの用量で処方物を対象に投与するための指示を含む。
【００１６】
キットのいくつかの実施形態において、指示は、対象へのブメタニド処方物の投与が、投与される処方物の重量および／または体積と同様に、対象の体重に基づくことを指定している。
【００１７】
いくつかの実施形態において、キットはまた、１つ以上のａｐｏＥ遺伝子型について試験される対象から単離された生物学的サンプルを保持するための容器を含む。
いくつかの実施形態において、キットはまた、生物学的サンプル中のａｐｏＥ４対立遺伝子の特異的検出を可能にするＰＣＲおよび／またはマイクロアレイ解析を実施するための１つ以上の試薬、および試薬を生物学的サンプルと反応させるための電子的または紙面による指示、を含む。いくつかの実施形態において、キットは、１つ以上の対照参照サンプルをさらに含む。
【００１８】
これらのキットのいくつかの実施形態において、ブメタニド処方物は、カプセル、錠剤、崩壊錠もしくはトローチ剤、またはサシェ剤として１日１回投与される。キットのいくつかの実施形態において、ブメタニド処方物は、静脈内または非経口送達のために注射可能である。キットのいくつかの実施形態において、ブメタニド処方物は、経皮パッチの形態である。
【００１９】
いくつかの態様において、本明細書において、ａ）薬学的に許容される担体およびブメタニドを含む活性成分を含む処方物の１以上の用量を有する容器、ｂ）ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象を治療するための電子的または紙面による指示、を含む、キットが提供される。キットのいくつかの実施形態において、処方物の各用量は、２ｍｇを超えるブメタニドを含まない。
【００２０】
キットのいくつかの実施形態において、用量は経口投与用に処方される。キットのいくつかの実施形態において、経口投与のために処方される用量は、１日１回のカプセル、錠剤、崩壊錠もしくはトローチ剤、またはサシェ剤である。
【００２１】
キットのいくつかの実施形態において、処方物の用量は、静脈内または非経口的に投与されるように処方される。キットのいくつかの実施形態において、処方物の用量は、経皮パッチによって投与されるように処方される。
【００２２】
キットのいくつかの実施形態において、対象は哺乳動物である。キットのいくつかの実施形態において、哺乳動物はげっ歯類である。キットのいくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００２３】
いくつかの実施形態において、キットはまた、対象からの生物学的サンプル中のａｐｏＥ４対立遺伝子の特異的検出を可能にするＰＣＲおよび／またはマイクロアレイ解析を実施するための１つ以上の試薬、および試薬を生物学的サンプルと反応させるための電子的または紙面による指示、を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、キットは、１つ以上の対照参照サンプルをさらに含む。
キットのいくつかの実施形態において、対象を治療するための指示は、投与される処方物の重量および／または体積と同様に、対象の体重に基づくことを指定している。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１（パネルａ〜ｅ）は、ＡＤ対対照データセットにおけるＡｐｏＥ遺伝子型特異的差次的発現（ＤＥ）の実験ワークフローおよび解析を示す。
【図２】図２（パネルａ〜ｇ）は、（ａ）ａｐｏＥ４／４特異的、（ｂ）ａｐｏＥ３／４特異的、および（ｃ）ａｐｏＥ３／３特異的なＡＤのトランスクリプトームシグネチャを順序付け、かつスコア付けしたＣＭａｐ化合物を示し、ＡＤのａｐｏＥ４／４特異的トランスクリプトームシグネチャのブメタニドへの有意な治療応答を示す。
【図３】図３（パネルａ〜ｆ）は、老齢ＡｐｏＥ４−ＫＩマウスにおける学習および記憶に対するブメタニドの効果のインビボ研究を示す。
【図４】図４（パネルａ〜ｆ）は、ＡｐｏＥ４−ＫＩマウス海馬トランスクリプトームに対するブメタニドの効果のインビボ研究を示す。
【図５】図５は、ヒトのトランスクリプトームデータセットの共変量測定（ＡｐｏＥ遺伝子型、診断、平均年齢、ＳＤ，対照とＡＤサンプルとの間の年齢差の遺伝子型の有意性内、群のサイズ、男性の数、女性の数、ダウンサンプリングした性別適合群の男性または女性の数、男性／女性比および男性／女性比ダウンサンプル）を示す。
【図６】図６（パネルａ〜ｃ）は、隠れプラットフォームトライアル（ｈｉｄｄｅｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｔｒｉａｌｓ）（ａ）および可視トライアル（ｖｉｓｉｂｌｅ  ｔｒｉａｌｓ）（ｂ）におけるａｐｏＥ４−ＫＩ対ａｐｏＥ３−ＫＩマウスの成績を示しており、ブメタニド治療は、いずれの群においても、遊泳速度に影響を及ぼさず、また運動障害または視覚障害を伴うブメタニド治療ではないことを示している。パネル（ｃ）は、分散安定化変換（Ｖｓｔ）が、より低い値でｌｏｇ２変換から逸脱することを示す。
【図７】図７（パネルａ〜ｃ）は、ＧＳＥ１５２２２データセットの主成分分析（ＰＣＡ）が、ａｐｏＥ４遺伝子型、診断、年齢、または性別共変量にわたるクラスター化傾向を示さないことを示す。
【図８】図８（パネルａ〜ｅ）は、Ｓｙｎ３１５７２５５−ＭａｙｏＥＧＷＡＳデータセットのＰＣＡが、ａｐｏＥ４遺伝子型、診断、年齢、または性別共変量にわたってクラスター化傾向を示さないことを示す。
【図９】図９（パネルａおよびｂ）は、ＣｏｍＢａｔ補正前（ａ）および補正後（ｂ）の、Ｓｙｎ３１５７２５５−ＭａｙｏＥＧＷＡＳおよびＧＳＥ１５２２２データセットの差次的発現（ＤＥ）のメタ解析を提供する。
【図１０−１】図１０は、ヒトａｐｏｅＥ３のゲノム配列を提供する。
【図１０−２】図１０は、ヒトａｐｏｅＥ３のゲノム配列を提供する。
【図１１−１】図１１は、ヒトａｐｏｅＥ４のゲノム配列を提供する。
【図１１−２】図１１は、ヒトａｐｏｅＥ４のゲノム配列を提供する。
【図１２】図１２は、ブメタニド治療が、特に老齢ａｐｏＥ４−ＫＩマウスにおけるニューロンの可塑性欠損を救済することを実証するグラフを提供する。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｇは、老齢ａｐｏＥ４−ＫＩマウスの海馬におけるブメタニドのトランスクリプトーム摂動シグネチャの単一核ＲＮＡ−ｓｅｑ解析の結果を示す概略図、プロット、およびグラフを提供する。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜１３Ｇは、老齢ａｐｏＥ４−ＫＩマウスの海馬におけるブメタニドのトランスクリプトーム摂動シグネチャの単一核ＲＮＡ−ｓｅｑ解析の結果を示す概略図、プロット、およびグラフを提供する。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜１３Ｇは、老齢ａｐｏＥ４−ＫＩマウスの海馬におけるブメタニドのトランスクリプトーム摂動シグネチャの単一核ＲＮＡ−ｓｅｑ解析の結果を示す概略図、プロット、およびグラフを提供する。
【図１３Ｄ】図１３Ａ〜１３Ｇは、老齢ａｐｏＥ４−ＫＩマウスの海馬におけるブメタニドのトランスクリプトーム摂動シグネチャの単一核ＲＮＡ−ｓｅｑ解析の結果を示す概略図、プロット、およびグラフを提供する。
【図１３Ｅ】図１３Ａ〜１３Ｇは、老齢ａｐｏＥ４−ＫＩマウスの海馬におけるブメタニドのトランスクリプトーム摂動シグネチャの単一核ＲＮＡ−ｓｅｑ解析の結果を示す概略図、プロット、およびグラフを提供する。
【図１３Ｆ】図１３Ａ〜１３Ｇは、老齢ａｐｏＥ４−ＫＩマウスの海馬におけるブメタニドのトランスクリプトーム摂動シグネチャの単一核ＲＮＡ−ｓｅｑ解析の結果を示す概略図、プロット、およびグラフを提供する。
【図１３Ｇ】図１３Ａ〜１３Ｇは、老齢ａｐｏＥ４−ＫＩマウスの海馬におけるブメタニドのトランスクリプトーム摂動シグネチャの単一核ＲＮＡ−ｓｅｑ解析の結果を示す概略図、プロット、およびグラフを提供する。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｆは、ａｐｏＥ４／４−ｉＰＳＣ由来のヒトニューロンにおけるブメタニドのトランスクリプトーム摂動シグネチャのＲＮＡ−ｓｅｑ解析の結果を示す概略図およびグラフを提供する。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｆは、ａｐｏＥ４／４−ｉＰＳＣ由来のヒトニューロンにおけるブメタニドのトランスクリプトーム摂動シグネチャのＲＮＡ−ｓｅｑ解析の結果を示す概略図およびグラフを提供する。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜１４Ｆは、ａｐｏＥ４／４−ｉＰＳＣ由来のヒトニューロンにおけるブメタニドのトランスクリプトーム摂動シグネチャのＲＮＡ−ｓｅｑ解析の結果を示す概略図およびグラフを提供する。
【図１４Ｄ】図１４Ａ〜１４Ｆは、ａｐｏＥ４／４−ｉＰＳＣ由来のヒトニューロンにおけるブメタニドのトランスクリプトーム摂動シグネチャのＲＮＡ−ｓｅｑ解析の結果を示す概略図およびグラフを提供する。
【図１４Ｅ】図１４Ａ〜１４Ｆは、ａｐｏＥ４／４−ｉＰＳＣ由来のヒトニューロンにおけるブメタニドのトランスクリプトーム摂動シグネチャのＲＮＡ−ｓｅｑ解析の結果を示す概略図およびグラフを提供する。
【図１４Ｆ】図１４Ａ〜１４Ｆは、ａｐｏＥ４／４−ｉＰＳＣ由来のヒトニューロンにおけるブメタニドのトランスクリプトーム摂動シグネチャのＲＮＡ−ｓｅｑ解析の結果を示す概略図およびグラフを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
定義
本発明がさらに説明される前に、本発明は、記載された特定の実施形態に限定されず、それ自体は無論変更できることを理解されたい。本発明の範囲は添付した特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図しないことも理解されたい。
【００２７】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法および材料もまた、本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料を以下で説明する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、刊行物が引用されることに関連して方法および／または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ポリペプチド」への言及は、複数のそのようなポリペプチドおよびその同等物を含み、「疾患または障害」への言及は、当業者に知られている関連する障害の症候群などを含む。請求項は、任意の要素を除外するために起草される場合があることにさらに留意されたい。したがって、この記載は、請求項の要素の記載に関連して「単独で（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」などの排他的用語を使用するための、又は「否定的な」限定を使用するための先行的基礎として役立つことを意図している。
【００２９】
本明細書で交換可能に使用される「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、コード化および非コード化アミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、および修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる。この用語は、限定されるものではないが、異種アミノ酸配列との融合タンパク質、異種および相同リーダー配列との融合、Ｎ末端メチオニン残基を伴うまたは伴わないもの、を含む融合タンパク質、免疫学的にタグ付けされたタンパク質；など、を含む。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離のカルボキシル基を指す。標準的なポリペプチドの命名法に従って、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４３（１９６９）、３５５２−５９が使用される。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療すること」などの用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防するという点で予防的であり得、および／または疾患および／または疾患に起因する有害作用の部分的または完全な治癒に関して治療的であり得る。本明細書中で使用される「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のいずれかの治療を包含し、（ａ）疾患の素因となり得るが、まだそれを有すると診断されていない対象において疾患が生じるのを防止すること；（ｂ）疾病の抑制、すなわちその発生を停止すること；および（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の改善および／または退縮を引き起こすこと、を含む。例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）に関しては、治療によって改善されうる症状には、学習および記憶の問題などの認知障害がある。同様に、治療によって改善される可能性のあるＡＤに関連する現象には、アミロイドプラーク、神経炎プラークおよび／または神経原線維変化が含まれる。
【００３１】
「治療有効量」または「有効量」は、疾患を治療するために哺乳動物または他の対象に投与された場合に、疾患のそのような治療を行うのに十分である化合物または薬剤の量を指す。「治療有効量」は、化合物または薬剤、疾患およびその重症度、ならびに治療される対象の年齢、体重などによって異なる。
【００３２】
「生物学的サンプル」は、個体から得られた様々なサンプルタイプを含み、診断またはモニタリングアッセイで使用することができる。その定義には、血液および生物学的起源の他の液体サンプル、生検標本または組織培養物などの固体組織サンプル、またはそれらに由来する細胞、ならびにそれらの子孫が含まれる。この定義には、試薬による処理、可溶化、またはポリヌクレオチドなどの特定の成分の濃縮など、その入手後に何らかの方法で操作されたサンプルも含まれる。「生物学的サンプル」という用語は、臨床サンプルを含み、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的流体、および組織サンプルも含む。
【００３３】
本明細書で交換可能に使用される「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、ネズミ（ラット、マウス）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むがこれらに限定されない哺乳動物を指す。
【００３４】
本明細書において使用される用語「アルツハイマー病」（ここでは「ＡＤ」と略記する）は、主として海馬および大脳皮質におけるアミロイドβタンパク質を含む神経突起斑の形成、ならびに学習および記憶の両方における障害に関連する状態を指す。本明細書で使用される「ＡＤ」は、ＡＤおよびＡＤ型の病状の両方を包含することを意味する。
【００３５】
ａｐｏＥの６種類の遺伝子型は以下のとおりである：Ｅ２／Ｅ２（「Ｅ２対立遺伝子のホモ接合体」とも称される）、Ｅ２／Ｅ３（「ヘテロ接合Ｅ２／Ｅ３」とも称される）、Ｅ２／Ｅ４（「ヘテロ接合Ｅ２／Ｅ４」とも称される）、Ｅ３／Ｅ３（「Ｅ３対立遺伝子のホモ接合体」とも称される）、Ｅ３／Ｅ４（「ヘテロ接合Ｅ３／Ｅ４」とも称される）およびＥ４／Ｅ４（「Ｅ４対立遺伝子のホモ接合体」とも称される）である。３つのＡｐｏＥタンパク質アイソフォームは、システインおよびアルギニンのいずれかが存在する２つのアミノ酸位置（アミノ酸１１２および１５８）でのみ異なる。具体的には、ＡｐｏＥ２タンパク質アイソフォームはＣｙｓ１１２、Ｃｙｓ１５８を有し；ＡｐｏＥ３タンパク質アイソフォームはＣｙｓ１１２、Ａｒｇ１５８を有し；そしてＡｐｏＥ４タンパク質アイソフォームはＡｒｇ１１２、Ａｒｇ１５８を有する（シグナルペプチドを含まない成熟ポリペプチドに対する番号付けである）。これら２つの位置におけるアミノ酸の違いは、３つのＡｐｏＥアイソフォームの構造に影響を及ぼし、脂質、受容体およびＡβとの結合能に影響を及ぼす。ヒトａｐｏｅＥ３のゲノム配列は、ＮＣＢＩレファレンス配列：ＮＧ＿００７０８４．２（配列番号１）によって提供される。ヒトａｐｏｅＥ４のゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ１００６５、バージョンＭ１００６５．１（配列番号２）によって提供される。
【００３６】
開示された方法に関連して治療される対象は、Ｅ４対立遺伝子についてホモ接合性である（「ａｐｏＥ４／４」）。いくつかの実施形態において、治療される対象は、ヘテロ接合性Ｅ３／Ｅ４ではない。いくつかの実施形態において、治療される対象は、Ｅ２対立遺伝子についてホモ接合性ではない。いくつかの実施形態において、治療される対象は、Ｅ３対立遺伝子についてホモ接合性ではない。いくつかの実施形態において、治療される対象は、ヘテロ接合性Ｅ２／Ｅ３ではない。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「ａｐｏＥ４／４関連障害」は、ａｐｏＥ４／４遺伝子型、および／または得られた表現型によって引き起こされる任意の障害；ａｐｏＥ４／４遺伝子型および／または結果として生じる表現型によって特徴づけられる任意の障害；ａｐｏＥ４／４遺伝子型および／または結果として生じる表現型によって引き起こされる障害の症状；ａｐｏＥ４／４遺伝子型および／または結果として生じる表現型によって引き起こされる障害に関連する現象；ａｐｏＥ４／４遺伝子型および／または結果として生じる表現型によって引き起こされる任意の障害の後遺症、である。
【００３８】
ＡｐｏＥ４／４関連疾患／障害は、ａｐｏＥ４／４関連神経障害を含み、ａｐｏＥ４／４関連疾患／障害は、限定されるものではないが、散発性アルツハイマー病；家族性アルツハイマー病；脳卒中後の転帰不良；外傷性頭部損傷後の転帰不良；脳虚血を含む。ＡｐｏＥ４／４関連神経障害に関連する現象には、限定されるものではないが、アルツハイマー病に関連する現象、神経原線維変化；アミロイド沈着；記憶喪失；学習能力の低下；および認知機能の低下が含まれる。高い血清脂質レベルと関連するａｐｏＥ４／４関連障害には、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化症および冠動脈疾患が含まれる。このようなＡｐｏＥ４／４−関連障害に関連する現象には、血清コレステロールの高値が含まれる。
【００３９】
本明細書で使用される「アルツハイマー病に関連する現象」という用語は、動物モデルで容易に評価できるような事象を含む、ＡＤに関連する構造的、分子的、または機能的事象を指す。そのような事象には、限定されるものではないが、アミロイド沈着、神経病理学的発症、学習および記憶の障害、および他のＡＤ関連特性が含まれる。
【００４０】
値の範囲が提供される場合、文脈が明確に指示しない限り、その範囲の上限値および下限値と、その範囲内の他の記載された値または介在値との間の、下限値の単位の１０分の１までの各介在値が、本発明の範囲内に包含されることが理解されよう。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲に含まれてもよく、また、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界値に従うことを条件として、本発明に包含される。記載された範囲が限界値の一方または両方を含む場合、含まれる限界値の一方または両方を除く範囲も本発明に含まれる。
【００４１】
本明細書に記載される刊行物は、本出願の出願日前の開示のためにのみ提供される。本明細書のいかなるものも、本発明がそのような刊行物に先行する権利を有しないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される公開日は、独立して確認する必要がある実際の公開日と異なる場合がある。
【００４２】
詳細な説明
以下、様々な態様についてさらに詳しく説明する。しかしながら、このような態様は、多くの異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載される実施形態に限定されるものと解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が完全かつ完全であり、その範囲を当業者に十分に伝えるように提供される。
【００４３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は世界中で認知症の主要な原因であり、現在まで、有効な治療法はない。ＡＤの複雑性と多因子病因は、従来の薬剤開発に特有の課題をもたらし、ヒト治験でＡＤ関連経路を標的とするほとんどすべての努力は、成功していないことが証明されている１，２。アポリポタンパク質（ａｐｏ）Ｅ４は、ＡＤの主要な遺伝的リスク因子である１，３−５である（患者の６０〜８０％が少なくとも１つのＡＰＯＥ４対立遺伝子を有し、ホモ接合体の約７０％が８５歳までにＡＤを発症する）６，７が、ＡＤ薬剤開発のために積極的には研究されていない１，２。
【００４４】
本明細書では、ａｐｏＥ４関連アルツハイマー病（ＡＤ）の治療に有用な薬物をスクリーニングするためのａｐｏＥ遺伝子型特異的ドラッグリポジショニングアプローチを開示する。公共データベースからのヒト側頭葉サンプルのメタ解析から、ＡＤのａｐｏＥ−遺伝子型特異的トランスクリプトームシグネチャを確立し、既存の薬物のトランスクリプトーム摂動シグネチャを含む検証済みコネクティビティマップ（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍａｐ）（ＣＭａｐ）データベースに適用して、ａｐｏＥ−遺伝子型に起因する疾患状態から離れて正常状態に向けて遺伝子発現ネットワーク全体を摂動することができるものを同定した。ループ利尿薬ブメタニドはａｐｏＥ４／４ＡＤ表現型のトランスクリプトームシグネチャと遺伝子発現パターンを逆転させるための最上位予測薬物候補であった。さらに、本明細書に提供される実施例で議論されるように、ブメタニドで老齢ａｐｏＥ４ノックイン（ａｐｏＥ４−ＫＩ）マウスを処理すると、認知障害が回復した。このように、ブメタニドは、ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象を治療し、ＡＤに関連する認知障害を救済するのに特に有用であることが見出された。驚くべきことに、本明細書で提供される開示に基づいて、ブメタニドの有効性はａｐｏＥ４／４遺伝子型に特異的であると考えられ、ａｐｏｅＥ３／４遺伝子型に対するブメタニドの薬物予測スコアは、本明細書により詳細に記載されるように、ａｐｏｅＥ３／３遺伝子型に対する有効性の指標よりもさらに低い。特定の理論に拘束されることを意図するものではないが、これは、ａｐｏｅＥ３／４とａｐｏＥ４／４の発現シグネチャ間の有意差に起因する可能性がある。
【００４５】
従って、いくつかの態様において、ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象に治療有効量のブメタニドを投与することによって、ａｐｏＥ４／４関連神経障害、例えばアルツハイマー病（ＡＤ）を治療する方法が提供される。関連する組成物、処方物、およびキットも以下でより詳細に記載する。
【００４６】
ａｐｏＥ４／４関連神経障害を有する対象の治療方法
本開示は、ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象において、ａｐｏＥ４／４関連神経障害、例えばＡＤを有する対象を治療する方法を提供する。一般に、それを必要とする個体（例えば、ＡＤおよび／またはａｐｏＥ４／４遺伝子型に関連する障害を有する個体）に有効量のブメタニドを単独で（例えば単剤療法で）または１種以上の追加の治療剤と組み合わせて（例えば併用療法）投与することを含む方法。
【００４７】
本開示は、ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象におけるＡＤの症状を治療する方法を提供し、同方法は、一般に、それを必要とする個体に治療有効量のブメタニドを投与することを含む。例えば、いくつかの実施形態において、治療有効量のブメタニドは、単独で（例えば単剤療法では）、または１以上のさらなる治療剤と組み合わせて（例えば併用療法）、１以上の用量で投与された場合に、治療される個体における認知機能を改善するのに有効な量である。例えば、有効量のブメタニドは、ブメタニドによる治療の前または治療がない場合の対象の認知機能と比較して、個体の認知機能を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、少なくとも約９９％、またはそれ以上改善することができる。
【００４８】
いくつかの実施形態において、有効量のブメタニドは、単独で（例えば単剤療法では）または１以上のさらなる治療剤と組み合わせて（例えば併用療法）、１以上の用量で投与した場合に、ブメタニドによる治療が存在しない場合の有害症状の重症度と比較して、ＡＤまたはａｐｏＥ４／４−遺伝子型関連障害の有害症状を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、少なくとも約９９％、またはそれ以上、減少させるのに有効な量である。
【００４９】
いくつかの実施形態において、本開示は、有効量のブメタニドを個体に投与することを含む、個体における神経原線維変化の形成を阻害するための方法を提供する。ブメタニドが神経原線維変化および／またはＡβ沈着物の形成を減少させるかどうかは、脳生検サンプルの免疫組織化学的染色を含むがこれらに限定されない任意の公知の方法を用いてヒトにおいて決定することができる。
【００５０】
ＡＤを発症するリスクがあることが知られている個体は、主題の方法を使用する治療に適している。したがって、ブメタニドはａｐｏＥ４のホモ接合体であるが、アルツハイマー病または他の神経変性疾患の明白な症状を示さない患者における予防的使用に適している。この方法は、すでにＡＤの症状を示している個体を治療するためにも有用であり、同方法は、疾患の進行を低減させることによってＡＤを治療するか、またはＡＤに関連する症状の重症度を低減する。ＡＤの進行が低減するか、またはＡＤ関連症状の重症度が低減するかは、認知機能および記憶を含むがこれらに限定されないＡＤに関連する任意の症状またはパラメータを評価することによって決定することができる。そのような決定は、当業者に公知の標準的な方法を用いて十分に当業者の能力の範囲内である。
【００５１】
ブメタニド（３−（ブチルアミノ）−４−フェノキシ−５−スルファモイル安息香酸；ＭＷ３６４．４１）は強力な利尿薬であり、過剰量を投与すると、水および電解質の枯渇を伴う重度の利尿を引き起こす可能性がある。ブメタニドは利尿薬として、腎臓に、不要な水分と塩分を身体から尿中に排出させる作用がある。ＦＤＡ承認のブメタニド（Ｂｕｍｅｘ（商標））はループ利尿薬であり、腎臓のヘンレ係蹄の上行脚に作用し、心臓、腎臓、肝臓疾患を含む様々な病状に起因する浮腫および／または高血圧の治療に用いられる。Ｂｕｍｅｘ（商標）は経口投与用に割線入り錠剤として０．５ｍｇ（淡緑色）、１ｍｇ（黄）および２ｍｇ（桃）が市販されている；各錠剤はまた、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、微結晶セルロース、コーンスターチおよびタルクを含有し、以下の染料系を有する：０．５ｍｇ−Ｄ＆ＣイエローＮｏ．１０およびＦＤ＆ＣブルーＮｏ．１；１ｍｇ−Ｄ＆ＣイエローＮｏ．１０；２ｍｇ赤色酸化鉄。
【００５２】
投与量
適切な投与量は、様々な臨床的因子に基づいて、担当医または他の資格のある医療従事者によって決定され得る。医療分野においてよく知られているように、いずれか１人の患者に対する投与量は、患者のサイズ、ボディマスインデックス（ＢＭＩ）、体表面積、年齢、投与すべき特定の化合物、患者の性別、投与の時間および経路、一般的な健康状態、及び同時に投与される他の薬物を含む多くの因子に依存する。例えば、ブメタニドは、例えば包括的に１μｇ／ｋｇ体重〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重の間の量で投与することができる。包括的に１０μｇ／ｋｇ体重〜０．２ｍｇ／ｋｇ体重の間の量、例えば包括的に２０μｇ／ｋｇ体重〜０．１ｍｇ／ｋｇ体重の間の量、例えば包括的に３０μｇ／ｋｇ体重〜５０μｇ／ｋｇ体重の間の量で投与することができるが、特に前述の要因を考慮して、この例示的な範囲より下または上の用量が想定される。いくつかの実施形態において、ブメタニドは、包括的に０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．２ｍｇ／ｋｇ体重の量、例えば、包括的に０．０２ｍｇ／ｋｇ体重以〜０．１ｍｇ／ｋｇ体重の量、包括的に０．０３ｍｇ／ｋｇ体重〜０．０９ｍｇ／ｋｇ体重の量、包括的に０．０４ｍｇ／ｋｇ体重〜０．０８ｍｇ／ｋｇ体重の量、または包括的に０．０５ｍｇ／ｋｇ体重〜０．０７ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与することができる。いくつかの実施形態において、レジメンが持続注入である場合、それはまた、０．５〜２ｍｇ／時間の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、ブメタニドは、０．５ｍｇ〜１０ｍｇ、例えば、０．６ｍｇ〜９ｍｇ、０．７ｍｇ〜８ｍｇ、０．８ｍｇ〜７ｍｇ、０．９ｍｇ〜６ｍｇ、１ｍｇ〜５ｍｇ、または２ｍｇ〜４ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、ブメタニドは、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇまたは１０ｍｇの用量で、例えば１日１回または２回で投与される。
【００５３】
したがって、いくつかの実施形態において、ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象においてＡＤを治療する方法が提供され、この方法は、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日以下、例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ／日以下の用量でブメタニドを対象に投与することを含む。当業者は、用量レベルが、特定の組成物、症状の重症度および副作用に対する対象の感受性の関数として変化し得ることを容易に理解するであろう。所与の化合物の好ましい投与量は、様々な手段によって当業者によって容易に決定可能である。
【００５４】
投与経路
ブメタニドは、インビボおよびエクスビボ法ならびに全身的および局所的な投与経路を含む薬物送達のための任意の適切な方法及び経路を用いて個体に投与することができる。従来の薬学的に許容される投与経路には、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、局所適用、静脈内、動脈内、直腸、鼻、経口、および他の経腸および非経口または吸入投与経路が含まれるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。投与経路は、所望であれば組み合わせてもよく、または組成および／または所望の効果に応じて調節してもよい。ブメタニド組成物は、単回投与または複数回投与で投与することができる。いくつかの実施形態において、ブメタニド組成物は経口投与される。いくつかの実施形態において、ブメタニド組成物は吸入経路を介して投与される。いくつかの実施形態において、ブメタニド組成物は鼻腔内投与される。いくつかの実施形態において、ブメタニド組成物は局所的に投与される。いくつかの実施形態において、ブメタニド組成物は頭蓋内投与される。いくつかの実施形態において、ブメタニド組成物は静脈内投与される。
【００５５】
吸入投与以外の非経口投与経路には、局所投与、経皮投与、皮下投与、筋肉内投与、眼窩内投与、被膜内投与、脊髄内投与、腹腔内投与、静脈内投与、すなわち消化管を介する以外の任意の投与経路が含まれるが、これらに限定されるものではない。非経口投与は、ブメタニドの全身または局所送達を行うために実施することができる。全身送達が望まれる場合、投与は通常、医薬処方物の侵襲的または全身的に吸収された局所または粘膜投与を伴う。
【００５６】
ブメタニドはまた、経腸投与によって対象に送達することができる。経腸投与経路には、経口および直腸（例えば、坐剤を使用する）送達が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００５７】
いくつかの実施形態において、ブメタニドは、注射および／または送達によって、例えば、脳動脈の部位に、または脳組織に直接投与される。ブメタニドはまた、例えば、標的部位への微粒子銃による（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）送達によって、標的部位（例えば、アミロイドプラークを含む脳領域）に直接投与することができる。
【００５８】
いくつかの態様において、本明細書に開示される方法は、ＡｐｏＥ４／４関連神経学的障害に関連する少なくとも１つの現象を改善するのに有効であり、そのような現象には、例えば、神経原線維変化；アミロイド沈着；記憶喪失；学習した行動を学ぶ、または保持する能力の減少；認知機能の低下が含まれる。したがって、例えば、主題の方法は、記憶喪失を減少させ、少なくとも認知機能の低下を遅らせるのに効果的である。例えば、主題の方法は、記憶機能の向上および／または認知機能の向上に有効である。従って、例えば、有効量のブメタニドは、１回以上の用量で、単剤療法または併用療法で投与される場合、記憶喪失を低減させるため、記憶機能を増加させるため、認知機能の喪失を低減させるため、または認知機能を増加させるために、神経原線維変化および／またはアミロイドプラークを減少させることができる。
【００５９】
いくつかの実施形態において、方法の有効性は、ブメタニド治療および／または障害の進行／退縮に対する応答についてモニターされ得る（例えば、ＡＤまたはＡｐｏＥ４／４関連疾患もしくは障害についてブメタニドによる治療を受けた個人）。そのような実施形態において、ブメタニドが個体に投与され、認知機能が測定され、ベースライン測定と比較され、および／または神経原線維変化の存在が個体の脳組織において評価される。例えば、ＡＤまたはＡｐｏＥ４／４関連疾患または障害の症状のベースライン測定を行うことができ、次いで、その方法を個体に対して実施することができ、次いで、その個体がその障害に対する治療を開始した後の１つまたは複数の時点で、治療後測定を行うことができる。症状の改善を示す測定、または対象／個体における疾患または障害の退縮を示す測定は、有効な治療の指標を提供することができ、治療を継続すべきか、投薬レジメンを変更すべきか、または投与されている薬剤を変更すべきかについて決定することができる。
【００６０】
いくつかの実施形態において、治療方法は、ＡｐｏＥ４／４関連疾患に対するブメタニド治療の開始から測定して、１日以内または複数日以内、１週間または複数週間にわたって、１ヵ月にわたって、または２ヵ月、３ヵ月、６ヵ月、または６ヵ月を超える期間にわたって、個体に対して実施することができる。主題の方法は、個人に対して複数回実行することができる。
【００６１】
組成物
本開示は、開示された方法およびキットに関連して使用するためのブメタニドを含む、医薬組成物を含む組成物を提供する。一般に、処方物は有効量のブメタニドを含む。「有効量」は、所望の結果、例えば、アミロイドプラークの減少、ＡｐｏＥ４／４関連障害（例えば、散発性または家族性アルツハイマー病（ＡＤ）；アルツハイマー病；脳卒中後の転帰不良；外傷性頭部損傷後の転帰不良；脳虚血；神経原線維変化；アミロイド沈着；記憶喪失；学習能力の低下；認知機能の低下；血清脂質および／またはコレステロール高値；アテローム性動脈硬化症；および／または冠動脈疾患）の症状の改善を生じるのに十分な用量を意味する。一般に、所望の結果は、対照と比較して、ＡＤのようなＡｐｏＥ４／４−関連障害の症状の少なくとも減少である。ブメタニドは、以下により詳細に説明するように、血液脳関門を回避するような方法で送達することができる。対象の組成物は、組成物が血液脳関門を通過することを可能にするように処方する、および／または改変することができる。
【００６２】
処方物（Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）
主題の方法において、ブメタニド組成物は、所望の治療効果または診断効果をもたらすことができる任意の便利な手段を使用して、宿主に投与することができる。したがって、薬剤は、治療投与のための様々な処方物に組み込むことができる。より具体的には、ブメタニドは、適切な薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせることによって医薬組成物に処方することができ、固体、半固体、液体または気体形態の処方物、例えば、錠剤、カプセル剤、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤およびエアロゾルに処方することができる。
【００６３】
薬学的投与形態において、ブメタニドは、薬学的に受容可能な塩の形態で投与することができ、または単独で、または適切に結合して、ならびに他の薬学的に活性な化合物と組み合わせて使用することもできる。以下の方法および賦形剤は、単に例示的であり、決して限定するものではない。
【００６４】
経口用処方物では、ブメタニドは単独で、又は適切な添加剤と組み合わせて錠剤、散剤、顆粒剤若しくはカプセル剤を製造することができ、例えば、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ又はポテトスターチのような従来の添加剤と；結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンのような結合剤と；コーンスターチ、ポテトスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウムのような崩壊剤と；タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤と、そして必要に応じて、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤及び着香剤と組み合わせることができる。
【００６５】
ブメタニドは、植物油又は他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸又はプロピレングリコールのエステルのような水性又は非水性溶媒中にそれらを溶解、懸濁又は乳化することによって、また、必要に応じて、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤及び保存剤のような従来の添加剤を用いて、注射用の注射可能な処方物に処方することができる。いくつかの実施形態において、ブメタニドは錠剤、Ｂｕｍｅｘ（商標）の形態で経口投与される。
【００６６】
ブメタニドを含む医薬組成物は、所望の純度のブメタニドを任意の生理学的に許容される担体、賦形剤、安定剤、界面活性剤、緩衝剤および／または等張化剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｇｅｎｔｓ）と混合することによって調製される。許容される担体、賦形剤および／または安定剤は、使用される用量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニンおよびクエン酸を含む抗酸化剤；保存剤（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クロロ−ｍ−クレゾール、メチルまたはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、またはそれらの組み合わせ）；アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリンおよびそれらの組合せなどのアミノ酸；単糖類、二糖類および他の炭水化物；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；ゼラチンや血清アルブミンなどのタンパク質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；トレハロース、スクロース、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、ラフィノース、グルコサミン、Ｎ−メチルグルコサミン、ガラクトサミン、ノイラミン酸などの糖；および／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）、Ｂｒｉｊ（登録商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）−Ｘまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤、を含む。
【００６７】
医薬組成物は、液体形態、凍結乾燥形態、または凍結乾燥形態から再構成された液体形態であってもよく、ここで、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌溶液で再構成されるものである。凍結乾燥した組成物を再構成するための標準的な手順は、一定量の純水（典型的には凍結乾燥中に除去された量と同等）を再び加えることである；しかしながら、抗菌剤を含む溶液が非経口投与のための医薬組成物の製造のために使用されてもよい；Ｃｈｅｎ（１９９２）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｉｎｄ  Ｐｈａｒｍ、１８、１３１１−５４も参照。
【００６８】
主題の医薬処方物中の例示的なブメタニド濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬまたは約５０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、または約１５０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。
【００６９】
ブメタニドの水性処方物は、ｐＨ緩衝溶液中で、例えば、約４．０〜約８．５、または約５．０〜約６．０、あるいは約５．５の範囲のｐＨで調製することができる。この範囲内のｐＨに適した緩衝液の例には、リン酸塩−、ヒスチジン−、クエン酸塩−、コハク酸塩−、酢酸塩−緩衝液および他の有機酸緩衝液が含まれる。緩衝液の濃度は、例えば、緩衝液および処方物の所望の張度に応じて、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約５ｍＭ〜約５０ｍＭであり得る。
【００７０】
等張化剤は、処方物の張性（ｔｏｎｉｃｉｔｙ）を調節するためにブメタニド処方物に含まれていてもよい。例示的な等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、およびアミノ酸、糖の群からの任意の成分、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態において、水性処方物は等張性であるが、高張性または低張性の溶液が適切であり得る。「等張性（ｉｓｏｔｏｎｉｃ）」という用語は、生理的塩溶液または血清など、それが比較される他の溶液と同じ張性を有する溶液を意味する。等張化剤は、約５ｍＭ〜約３５０ｍＭの量で、例えば、１００ｍＭ〜３５０ｎＭの量で使用することができる。
【００７１】
界面活性剤をブメタニド処方物に添加して、処方物中の凝集を減少させ、および／または微粒子の形成を最小にし、および／または吸着を減少させることもできる。例示的な界面活性剤には、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（商標））、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ（商標））、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（商標）−Ｘ）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が含まれる。適切なポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの例は、ポリソルベート２０、（商標名Ｔｗｅｅｎ２０（商標）で販売されている）およびポリソルベート８０（商標名Ｔｗｅｅｎ８０（商標）で販売されている）である。適切なポリエチレン−ポリプロピレンコポリマーの例は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８またはＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８（商標）の名称で販売されているものである。適切なポリオキシエチレンアルキルエーテルの例は、商標名Ｂｒｉｊ（商標）で販売されているものである。界面活性剤の例示的な濃度は、約０．００１％〜約１％ｗ／ｖの範囲であり得る。
【００７２】
また、凍結保護剤を添加して、不安定な活性成分（例えばタンパク質）を凍結乾燥プロセス中の不安定化条件から保護してもよい。例えば、既知の凍結保護剤には、糖（グルコースおよびスクロースを含む）；ポリオール（マンニトール、ソルビトール、グリセロールを含む）；およびアミノ酸（アラニン、グリシン、グルタミン酸を含む）が含まれる。凍結保護剤は、約１０ｍＭ〜５００ｎＭの量で含むことができる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、主題の処方物は、ブメタニド、および上記で特定された薬剤（例えば、界面活性剤、緩衝剤、安定剤、等張化剤）の１つ以上を含み、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クロロ−ｍ−クレゾール、メチルパラベンもしくはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、およびそれらの組み合わせなどの１つ以上の保存剤を実質的に含まない。他の実施形態では、保存剤が処方物中に、例えば約０．００１〜約２％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で含まれる。
【００７４】
例えば、主題の処方物は、非経口投与に適した液体または凍結乾燥した処方物であってもよく、そして約１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬのブメタニド；約０．００１％〜約１％の少なくとも１つの界面活性剤；約１ｍＭ〜約１００ｍＭの緩衝液；任意選択的に約１０ｍＭ〜約５００ｍＭの安定剤；約５ｍＭ〜約３０５ｍＭの等張化剤；を含むことができ、約４．０〜約７．０のｐＨを有することができる。
【００７５】
別の例として、主題の非経口処方物は、以下を含む液体または凍結乾燥した処方物である：約１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬのブメタニド；０．０４％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０（商標）；２０ｍＭのＬ−ヒスチジン；および２５０ｍＭスクロース；５．５のｐＨを有する。
【００７６】
別の例として、主題の非経口処方物は、１）１５ｍｇ／ｍＬのブメタニド；０．０４％のＴｗｅｅｎ（商標）２０（ｗ／ｖ）；２０ｍＭのＬ−ヒスチジン；および２５０ｍＭのスクロース；を含み、かつ５．５のｐＨを有するか、２）７５ｍｇ／ｍＬのブメタニド；０．０４％のＴｗｅｅｎ（商標）２０（ｗ／ｖ）；２０ｍＭのＬ−ヒスチジン；および２５０ｍＭのスクロース；を含み、かつ５．５のｐＨを有するか；または３）７５ｍｇ／ｍＬのブメタニド；０．０２％のＴｗｅｅｎ（商標）２０（ｗ／ｖ）；２０ｍＭのＬ−ヒスチジン；および２５０ｍＭスクロース；を含み、かつ５．５のｐＨを有するか、４）７５ｍｇ／ｍＬのブメタニド；０．０４％のＴｗｅｅｎ（商標）２０（ｗ／ｖ）；２０ｍＭのＬ−ヒスチジン；および２５０ｍＭのトレハロース；を含み、かつ５．５のｐＨを有するか；または６）７５ｍｇ／ｍＬのブメタニド；０．０２％のＴｗｅｅｎ（商標）２０（ｗ／ｖ）；２０ｍＭのＬ−ヒスチジン；および２５０ｍＭのトレハロース；を含み、かつ５．５のｐＨを有する、凍結乾燥した処方物を含む。
【００７７】
別の例として、主題の非経口処方物は、１）７．５ｍｇ／ｍＬのブメタニド；０．０２２％のＴｗｅｅｎ（商標）２０（ｗ／ｖ）；１２０ｍＭのＬ−ヒスチジン；および２５０  １２５ｍＭのスクロース；を含み、かつ５．５のｐＨを有するか、２）３７．５ｍｇ／ｍＬのブメタニド；０．０２２％のＴｗｅｅｎ（商標）２０（ｗ／ｖ）；１０ｍＭのＬ−ヒスチジン；および１２５ｍＭのスクロース；を含み、かつ５．５のｐＨを有するか；または、３）３７．５ｍｇ／ｍＬのブメタニド；０．０１％のＴｗｅｅｎ（商標）２０（ｗ／ｖ）；１０ｍＭのＬ−ヒスチジン；および１２５ｍＭのスクロース；を含み、かつ５．５のｐＨを有するか；４）３７．５ｍｇ／ｍＬのブメタニド；０．０２％のＴｗｅｅｎ（商標）２０（ｗ／ｖ）；１０ｍＭのＬ−ヒスチジン；および１２５ｍＭトレハロース；を含み、かつ５．５のｐＨを有するか；または、５）３７．５ｍｇ／ｍＬのブメタニド；０．０１％のＴｗｅｅｎ（商標）２０（ｗ／ｖ）；１０ｍＭのＬ−ヒスチジン；および１２５ｍＭトレハロース；を含み、かつ５．５のｐＨを有するか；または、６）５ｍｇ／ｍＬのブメタニド；０．０２％のＴｗｅｅｎ（商標）２０（ｗ／ｖ）；２０ｍＭのＬ−ヒスチジン；および２５０ｍＭトレハロース；を含み、かつ５．５のｐＨを有するか；または、７）７５ｍｇ／ｍＬのブメタニド；０．０２％のＴｗｅｅｎ（商標）２０（ｗ／ｖ）；２０ｍＭのＬ−ヒスチジン；および２５０ｍＭマンニトール；を含み、かつ５．５のｐＨを有するか；または、８）７５ｍｇ／ｍＬのブメタニド；０．０２％のＴｗｅｅｎ（商標）２０（ｗ／ｖ）；２０ｍＭのＬヒスチジン；および１４０ｍＭ塩化ナトリウム；を含み、かつ５．５のｐＨを有するか；または、９）１５０ｍｇ／ｍＬのブメタニド；０．０２％のＴｗｅｅｎ（商標）２０（ｗ／ｖ）；２０ｍＭのＬ−ヒスチジン；および２５０ｍＭトレハロース；を含み、かつ５．５のｐＨを有するか；または、１０）１５０ｍｇ／ｍＬのブメタニド；０．０２％のＴｗｅｅｎ（商標）２０（ｗ／ｖ）；２０ｍＭのＬ−ヒスチジン；および２５０ｍＭマンニトール；を含み、かつ５．５のｐＨを有するか；または、１１）１５０ｍｇ／ｍＬのブメタニド；０．０２％のＴｗｅｅｎ（商標）２０（ｗ／ｖ）；２０ｍＭのＬ−ヒスチジン；および１４０ｍＭ塩化ナトリウム；を含み、かつ５．５のｐＨを有するか；または、１２）１０ｍｇ／ｍＬのブメタニド；０．０１％のＴｗｅｅｎ（商標）２０（ｗ／ｖ）；２０ｍＭのＬ−ヒスチジン；および４０ｍＭ塩化ナトリウム；を含み、かつ５．５のｐＨを有する、液体処方物である。
【００７８】
ブメタニドは、吸入を介して投与されるエアロゾル処方物に利用することができる。ブメタニドは、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容可能な推進剤中に処方することができる。
【００７９】
さらに、ブメタニドは、乳化基剤または水溶性基剤などの様々な基剤と混合することによって坐剤にすることができる。ブメタニドは坐剤を介して直腸投与することができる。坐剤は、体温で融解するが、室温で凝固するカカオ脂、カーボワックスおよびポリエチレングリコールのようなビヒクルを含むことができる。
【００８０】
シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁剤などの経口または直腸投与のための単位剤形を提供することができ、各投与単位（例えば、ティースプーン１杯、テーブルスプーン１杯、錠剤または坐剤）が、１つ以上の阻害剤を含有する所定量の組成物を含有する。同様に、注射または静脈内投与のための単位剤形は、滅菌水、通常の生理食塩水、または別の薬学的に許容される担体中の溶液としての組成物中のブメタニドを含み得る。
【００８１】
本明細書で使用される「単位剤形（ｕｎｉｔ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ）」という用語は、ヒトおよび動物対象の単一用量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体またはビヒクルと関連して所望の効果を生じるのに十分な量で計算された本発明の化合物の所定の量を含有する。ブメタニドの規格は、使用する組成物中のブメタニドの純度または濃度、達成される効果、および宿主中の組成物に関連する薬力学に依存し得る。
【００８２】
他の投与様式もまた、主題の方法での使用を見出すであろう。例えば、ブメタニドは坐剤中に処方することができ、ある場合には、エアロロゾルおよび鼻腔内組成物中に処方することができる。坐剤については、ビヒクル組成物は、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドなどの従来の結合剤および担体を含む。そのような坐剤は、約０．５％〜約１０％（ｗ／ｗ）の範囲、例えば約１％〜約２％の活性成分を含有する混合物から形成することができる。
【００８３】
鼻腔内処方物は通常、鼻粘膜への刺激を引き起こさず、毛様体機能を著しく妨げないビヒクルを含む。水、生理食塩水または他の既知の物質などの希釈剤を主題の発明とともに使用することができる。鼻用処方物はまた、限定されるものではないが、クロロブタノールおよび塩化ベンザルコニウムなどの保存剤を含有してもよい。界面活性剤は、鼻粘膜による主題のタンパク質の吸収を増強するために存在し得る。
【００８４】
ブメタニドは注射可能な処方物として投与することができる。典型的には、注射可能な組成物は、液体溶液または懸濁液として調製される；注射前の液体ビヒクル中の溶液または液体ビヒクル中の懸濁液に適した固体形態も調製することができる。調製物はまた、乳化されてもよく、またはブメタニドがリポソームビヒクル中に封入されてもよい。
【００８５】
適切な賦形剤ビヒクルは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、必要に応じて、ビヒクルは、湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤などの少量の補助物質を含み得る。そのような剤形を調製する実際の方法は、当業者に知られているか、または明らかになるであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ペンシルベニア州イーストン）、第１７版、１９８５年、を参照されたい。投与される組成物または処方物は、いずれにせよ、治療される対象において所望の状態を達成するのに適切な量のブメタニドを含むであろう。
【００８６】
ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤は、一般に容易に入手可能である。さらに、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化調整剤、安定剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助物質は、一般に容易に入手可能である。
【００８７】
いくつかの実施形態において、ブメタニドは放出制御処方物として処方される。徐放性の調製物は、当該技術分野で周知の方法を用いて調製することができる。徐放性調製物の適切な例には、ブメタニドを含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、フィルムまたはマイクロカプセルなどの成形品の形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ヒドロゲル、ポリラクチド、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。徐放性調製物に含まれる抗体の生物学的活性の喪失の可能性および免疫原性の変化の可能性は、適切な添加剤を使用し、水分含有量を制御し、特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって防ぐことができる。
【００８８】
本発明の範囲内の制御放出は、多数の徐放性投与形態のいずれか１つを意味すると考えることができる。以下の用語は、本発明の目的のために、制御放出と実質的に同等であると見なされ得る：連続放出、制御放出、遅延放出、デポ、段階的放出、長期放出、プログラムされた放出、延長された放出、比例放出、持続した（ｐｒｏｔｒａｃｔｅｄ）放出、貯蔵、遅延、徐放、間隔を置いた放出、持続放出、タイムコート、時間を置いた放出、遅延作用、延長作用、層状時間作用、長時間作用、持続（ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ）作用、反復作用、徐行作用、持続作用、持続作用薬、および延長放出。これらの用語についてのさらなる議論はＬｅｓｃｚｅｋ  Ｋｒｏｗｃｚｙｎｓｋｉ、「Ｅｘｔｅｎｄｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍ」、１９８７年（ＣＲＣプレス社）に記載されている。
【００８９】
種々の制御放出技術は、非常に広範囲の薬物剤形をカバーする。制御放出技術には、物理的システム及び化学的システムが含まれるが、これらに限定されない。
物理的システムには、限定されるものではないが、マイクロカプセル化、マクロカプセル化、および膜システムなどの速度制御膜を備えたリザーバーシステム；中空繊維、超微孔性セルローストリアセテート、多孔性ポリマー基材および発泡体などの速度制御膜のないリザーバーシステム；非多孔性、ポリマー性、またはエラストマー性マトリックスに物理的に溶解したシステム（例えば、非腐食性、侵食性、環境因子の侵入、および分解性）、および非多孔性、ポリマー性またはエラストマー性マトリックスに物理的に分散した材料（例、非腐食性、侵食性、環境因子の侵入、および分解性）を含むモノリシックシステム；外側の制御層と化学的に類似または非類似のリザーバー層を含む積層構造；および浸透圧ポンプやイオン交換樹脂への吸着のような他の物理的方法、が含まれる。
【００９０】
化学システムには、限定されるものではないが、ポリマーマトリックスの化学的侵食（例えば、不均一または均一な侵食）、またはポリマーマトリックスの生物学的侵食（例えば、不均一または均一）が含まれる。制御放出のためのシステムのカテゴリーのさらなる議論は、Ａｇｉｓ  Ｆ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、１９８０年（ＣＲＣプレス社）、に記載されている。
【００９１】
経口投与のために開発された多くの放出制御処方物が存在する。これらには、限定されるものではないが、浸透圧制御消化管送達システム；流体力学的圧力制御消化管送達システム；微小孔膜透過制御消化管送達デバイスを含む膜透過制御消化管送達システム；胃液耐性腸標的化制御放出胃腸送達デバイス；ゲル拡散制御消化管送達システム；陽イオン性および陰イオン性薬物を含むイオン交換制御消化管送達システム、が含まれる。徐放性薬物送達システムに関するさらなる情報は、Ｙｉｅ  Ｗ．Ｃｈｉｅｎ、「Ｎｏｖｅｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、１９９２年（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ社）に記載されている。これらの処方のいくつかについて、ここでより詳細に説明する。
【００９２】
併用療法
いくつかの実施形態において、主題の治療方法は、ブメタニドおよび１つ以上の追加の治療薬を投与することを含む。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、ＡＤの認知症状（記憶障害、錯乱、思考や推論の問題）を治療するために、コリンエステラーゼ阻害薬（例：アリセプト（登録商標）（ドネペジル）、エクセロン（登録商標）（リバスチグミン）、ラザダイン（登録商標）（ガランタミン））とメマンチン（ナメンダ（商標））の２種類の薬物を承認している。また、コリンエステラーゼ阻害薬の１つであるドネペジルとメマンチンを組み合わせたナムザリック（登録商標）という薬物もある。
【００９３】
適切なさらなる治療剤としては、限定されるものではないが、アリセプト（登録商標）（ドネペジル）、エクセロン（登録商標）（リバスチグミン）、メトリフォネート、およびタクリン（コグネックス（登録商標））を含むアセチルコリンエステラーゼ阻害剤；イブプロフェンおよびインドメタシンを含むがこれらに限定されない非ステロイド系抗炎症剤；セレブレックス（商標）などのシクロオキシゲナーゼ−２（Ｃｏｘ２）阻害薬；およびセレギレン（エルデプリル（登録商標）またはデプレニル（登録商標））などのモノアミンオキシダーゼ阻害薬、が含まれる。上記薬剤の各々の用量は、当技術分野において公知である。例えば、アリセプト（登録商標）は、一般に、１日５０ｍｇで６週間経口投与され、患者が十分に耐えられる場合には、その後、１日１０ｍｇで投与される。
【００９４】
いくつかの実施形態において、主題の併用療法は、有効量のブメタニドおよびａｐｏＥ４タンパク質ドメイン相互作用を阻害する薬剤（例えば、米国特許出願公開第２００６／００７３１０４号明細書、およびＹｅ他（２００５年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｔ  ＵＳＡ、１０２：１８７００）に記載されているような薬剤）の投与を含む。
【００９５】
いくつかの実施形態において、主題の併用療法は、有効量のブメタニドおよびアセチルコリンエステラーゼ阻害剤の投与を含む。いくつかの実施形態において、主題の併用療法は、有効量のブメタニドおよび抗炎症剤の投与を含む。
【００９６】
治療に適した対象
種々の対象が主題の方法による治療に適している。適切な対象は、ＡＤまたはＡｐｏＥ４／４−関連障害を有する個体、ＡＤまたはＡｐｏＥ４／４−関連障害と診断されている個体、ＡＤまたはＡｐｏＥ４／４−関連障害を発症するリスクがある個体、ＡＤまたはＡｐｏＥ４／４−関連障害を有していたことがあり、かつＡＤまたはＡｐｏＥ４／４−関連障害の再発リスクがある個体、またはＡＤまたはＡｐｏＥ４／４−関連障害から回復中の個体のいずれかであり、特に哺乳動物、とりわけヒトを含む。
【００９７】
主題の方法での治療に適した対象は、２つのａｐｏＥ４対立遺伝子を有する個体が含まれる。言い換えれば、適切な対象には、ａｐｏＥ４についてホモ接合性である対象が含まれる。いくつかの実施形態において、対象は、アルツハイマー病を有すると診断されている。
【００９８】
ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象の同定
本明細書中で議論するように、いくつかの態様において、開示された方法および／または開示されたキットの使用は、ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有するとして対象を同定することを含む。対象の同定方法は、個体から得られた生物学的サンプルに対してインビトロで実施することができる。従って、本開示は、血液、毛髪または上皮細胞サンプル（例えば、頬スワブから）などの組織サンプルから抽出されたＤＮＡの生物学的サンプル中の対象のａｐｏＥ遺伝子型を検出する方法を提供する。生物学的サンプルは、例えば、個々の死後から得られた脳サンプルであり得る。
【００９９】
遺伝子型検査の方法は当技術分野で公知である。例えば、対象のａｐｏＥ遺伝子型は、制限イソタイピングおよび／またはＰＣＲに基づく方法を用いた末梢血サンプルの解析によって得ることができる。典型的には、遺伝子型決定のための血液（約６ｃｃ）を採取し、解析のためにＤＮＡを抽出する。ＤＮＡサンプルは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から入手可能なＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイに従ってａｐｏＥ遺伝子型を構成する両方のＳＮＰからのＴａｑｍａｎ（登録商標）Ｒｅａｄｙ  ｔｏ  ｕｓｅアッセイを用いて遺伝子型決定することができる。あるいは、ａｐｏＥ遺伝子型決定のための迅速で半自動化された方法が開発されている（Ｇｕｏ他、１９９３年、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２：３４８−３５０）。ＡＲＯＥ−ε４の遺伝子型決定はまた、先に詳細に報告されたように、ＨｉｘｓｏｎおよびＶｅｒｎｉｅｒの制限アイソタイピングプロトコルに従って実施されてもよい。（Ｈｉｘｓｏｎ  Ｊ．，Ｖｅｒｎｉｅｒ  Ｄ．、（１９９０年）「遺伝子増幅およびＨｈａｌによる切断によるヒトアポリポタンパク質Ｅの制限イソタイピング（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｗｉｔｈ  Ｈｈａｌ）」、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．、３１：５４５−５４８）。近年、Ｈｕａｎｇ他（２０１８年）の研究では、ＷｉｚａｒｅゲノムＤＮＡ精製キット（アメリカ合衆国、ウィスコンシン州、マディソン、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して２ｍｌの静脈内末梢血（−８０°Ｃで保存する）からＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ増幅と制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析を、Ｈｉｘｓｏｎ（前述）に記載されている方法に従って行い、ＡｐｏＥ遺伝子型決定に用いた特異的プライマー（フォワード、５’−ＧＧＣＡＣＧＧＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＡ−３’；リバース、５’−ＧＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＡＣＴＧＣＣ−３’）を用いて、ＤＮＡサンプルの２０％を、品質管理の目的で異なるオペレータにより再び遺伝子型決定した。ＡｐｏＥ遺伝子型に対し、Ｅ２／Ｅ２およびＥ２／Ｅ３遺伝子型を有する対象はＥ２キャリアとしてグループ化した；Ｅ３／Ｅ３を有する対象はＥ３ホモ接合体として分類した；Ｅ３／Ｅ４またはＥ４／Ｅ４を有する対象はＥ４キャリアとしてグループ化した。（Ｈｕａｎｇ他、（２０１８年）、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、９（７１））。
【０１００】
キット
本開示は、ブメタニドを含む組成物を含むキット（例えば、試験キット）を提供する。主題のキットは、主題の治療法を実施するのに有用である。
【０１０１】
キットのその他の任意選択的な構成要素には、緩衝液；検出可能な標識；説明書などが含まれる。キットのさまざまな構成要素は、別々の容器内に存在していてもよく、必要に応じて、特定の互換性のある構成要素は単一の容器内にて事前に合わせられていてもよい。
【０１０２】
上記の構成要素に加えて、主題のキットは、主題の方法を実施するためにキットの構成要素を使用するための指示（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）を含むことができる。主題の方法を実施するための指示は、一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、指示は、紙やプラスチックなどの基材に印刷することができる。したがって、指示は、添付文書としてキット内に、キットの容器またはキットの構成要素のラベル（すなわち、包装又は副包装に関連する）などに存在してもよい。他の実施形態において、指示は、適切なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、コンパクト・ディスク読み取り専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、ディスケットなどに存在する電子記憶データファイルとして存在している。さらに他の実施形態において、実際の指示はキット内には存在しないが、例えばインターネットを介して遠隔ソースから指示を得るための手段が提供される。この実施形態の例は、指示を見ることができるウェブアドレスおよび／または指示をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。指示と同様に、指示を入手するためのこの手段は、適切な基板に記録されている。
【０１０３】
ブメタニドの単位用量、例えば経口または注射用量を有するキットが提供される。そのようなキットでは、単位用量を含有する容器に加えて、関心のある病理学的状態を治療する際の組成物の使用および付随する利益を記載する情報（電子の、または紙の）挿入物が含まれる。好ましい化合物および単位用量は、本明細書に記載されているものである。
【０１０４】
特定の実施形態において、本開示に従うキットは、ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象への、例えばブメタニド０．０５ｍｇ／ｋｇ／日以下、例えばブメタニド０．０２ｍｇ／ｋｇ／日以下の用量でのブメタニドの投与の指示を含む、電子的または紙の形態の情報を含む。
【０１０５】
別の態様において、本開示は、ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象をブメタニドで同定および治療するためのキット、ならびに使用説明書を提供する。いくつかの実施形態において、キットは、ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象を治療するためのブメタニド処方物を含む。キットは、ＡＤを有することが疑われるヒト対象から単離された生物学的サンプルを保持するための容器を含み得る。そして、任意選択的に、ａｐｏＥ４対立遺伝子を特異的に検出および／または増幅し、ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象の同定を可能にする薬剤、ならびに薬剤を生物学的サンプルまたは生物学的サンプルの一部と反応させて生物学的サンプル中のａｐｏＥ４対立遺伝子の存在または量を検出するための電子的または紙による指示、を含み得る。キットの構成要素は、別々の容器にパッケージ化することができる。キットは、本明細書に記載されるように、１つ以上のａｐｏＥ４対立遺伝子を検出するためのＰＣＲまたはマイクロアレイ解析を実施するための１つ以上の対照参照サンプルおよび試薬をさらに含み得る。
【０１０６】
特定の実施形態において、キットは、生物学的サンプルからａｐｏＥ４対立遺伝子のポリヌクレオチドを検出するための薬剤を含む。さらに、キットは、ａｐｏＥ２および／またはａｐｏＥ３対立遺伝子のような１つ以上のさらなる対立遺伝子を検出するための薬剤を含んでもよく、この薬剤は、単独でまたは任意の組み合わせで、および／またはａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象を同定するための臨床パラメータと組み合わせて使用され得る。
【０１０７】
特定の実施形態において、キットは、複数のａｐｏＥ対立遺伝子またはＡＤ関連遺伝子型の解析のためのマイクロアレイを含む。一実施形態において、キットは、ａｐｏＥポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイを含む。
【０１０８】
一態様において、ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象を同定するためのキットが提供される。例えば、キットは、対象のａｐｏＥ４／４遺伝子型の検出を含め、本明細書に記載されるアルツハイマー病に関連する任意の１つ以上のバイオマーカーを検出するために使用することができ、特に、健康な対象またはＡＤを有する対象からの生物学的サンプルから、ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象の同定を可能にする。
【０１０９】
特定の実施形態において、キットは、対象のａｐｏＥ遺伝子型の同定を可能にする１つ以上のポリヌクレオチドを含む、複数のバイオマーカーポリヌクレオチドの解析のためのマイクロアレイを含む。キットに含まれる例示的なマイクロアレイは、ａｐｏＥ２対立遺伝子ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ａｐｏＥ３対立遺伝子ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、および／またはａｐｏＥ４対立遺伝子ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはそれらの任意の組合せもしくは下位の組合せを含む。
【０１１０】
キットは、キットに含まれる組成物のための１つ以上の容器を含むことができる。組成物は、液体形態であってもよく、または凍結乾燥されてもよい。組成物に適した容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックを含む様々な材料から形成することができる。キットはまた、キットの使用方法に関する電子的または紙による指示を含む添付文書を含むことができる。
【０１１１】
開示の例示的かつ非限定的な態様
上述の本主題の態様（実施形態を含む）は、単独で、または１つ以上の他の態様または実施形態と組み合わせて有益であり得る。前述の説明を限定することなく、本開示の特定の非限定的な態様を以下に提供する。本開示を読むと当業者には明らかであるように、個々に番号付けされた態様の各々は、先行または後続の個々に番号付けされた態様のいずれかと共に使用または組み合わせられ得る。これは、態様のこのようなすべての組み合わせをサポートすることを意図しており、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに限定されるものではない。本発明の精神または範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正を行うことができることは、当業者には明らかであろう。
【０１１２】
１．ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）を治療する方法であって、前記方法は、治療有効量のブメタニドを同対象に投与することを含む、方法。
【０１１３】
２．前記投与することが、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日以下の用量でブメタニドを対象に投与することを含む、１に記載の方法。
３．前記投与することが、０．０２ｍｇ／ｋｇ／日以下の用量でブメタニドを対象に投与することを含む、２に記載の方法。
【０１１４】
４．ブメタニドが薬学的に許容可能な担体を含む経口剤形として処方され、経口剤形が経口投与される、１〜３のいずれか一項に記載の方法。
５．経口剤形が、カプセル剤、錠剤、崩壊錠もしくはトローチ剤、またはサシェ剤として１日１回投与される、４に記載の方法。
【０１１５】
６．ブメタニドが静脈内または非経口的に投与される、１〜３のいずれか一項に記載の方法。
７．ブメタニドが経皮パッチ中に提供される、１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【０１１６】
８．対象が哺乳動物である、１〜７のいずれか一項に記載の方法。
９．哺乳動物がヒトである、８に記載の方法。
１０．ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象におけるアルツハイマー病を治療する方法であって、前記方法は、
ａ）ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象を同定すること；および
ｂ）治療有効量のブメタニドを対象に投与すること、
を含む方法。
【０１１７】
１１．前記同定することが、前記対象由来の生物学的サンプルについてＰＣＲに基づくＤＮＡ解析方法を実施することを含む、１０に記載の方法。
１２．生物学的サンプルを対象から単離することをさらに含む、１１に記載の方法。
【０１１８】
１３．前記投与することが、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日以下の用量としてブメタニドを対象に投与することを含む、１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
１４．前記投与することが、０．０２ｍｇ／ｋｇ／日以下の用量としてブメタニドを対象に投与することを含む、１３に記載の方法。
【０１１９】
１５．ブメタニドが薬学的に許容可能な担体を含む経口剤形として処方され、経口剤形が経口投与される、１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
１６．経口剤形が、カプセル剤、錠剤、崩壊錠もしくはトローチ剤、またはサシェ剤として１日１回投与される、１５に記載の方法。
【０１２０】
１７．ブメタニドが静脈内または非経口的に投与される、１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
１８．ブメタニドが経皮パッチ中に提供される、１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【０１２１】
１９．対象が哺乳動物である、１０〜１８のいずれか一項に記載の方法。
２０．哺乳動物がヒトである、１９に記載の方法。
２１．キットであって、
ａ）ブメタニド処方物；
ｂ）パッケージ；および
ｃ）ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象へのブメタニド投与の指示を含む、電子的または紙の形態の情報、
を含むキット。
【０１２２】
２２．指示は、ブメタニド処方物の対象への投与が、対象の重量、投与された処方物の重量および／または体積に基づくことを特定する、２１に記載のキット。
２３．前記指示が、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日以下のブメタニドの用量で前記処方物を対象に投与する指示を含む、２２に記載のキット。
【０１２３】
２４．前記指示が、０．０２ｍｇ／ｋｇ／日以下のブメタニドの用量で前記処方物を対象に投与する指示を含む、２３に記載のキット。
２５．１以上のａｐｏＥ遺伝子型について試験される対象から単離された生物学的サンプルを保持するための容器をさらに含む、２１〜２４のいずれか一項に記載のキット。
【０１２４】
２６．生物学的サンプル中のａｐｏＥ４対立遺伝子の特異的検出を可能にするためのＰＣＲまたはマイクロアレイ解析を実施するための１つ以上の試薬、および試薬を生物学的サンプルと反応させるための電子的または紙による指示をさらに含む、２５に記載のキット。
【０１２５】
２７．１以上の対照参照サンプルをさらに含む、２６に記載のキット。
２８．ブメタニド処方物が、経口送達用の、カプセル、錠剤、崩壊錠もしくはトローチ剤、またはサシェ剤の形態である、２１〜２７のいずれか一項に記載のキット。
【０１２６】
２９．ブメタニド処方物が、静脈内または非経口送達のために注射可能である、２１〜２７のいずれか一項に記載のキット。
３０．ブメタニド処方物が経皮パッチの形態である、２１〜２７のいずれか一項に記載のキット。
【０１２７】
３１．キットであって、
ａ）薬学的に許容される担体およびブメタニドを含む処方物の１つ以上の用量を含む容器；および
ｂ）ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象を治療するための電子的または紙による指示、
を含むキット。
【０１２８】
３２．処方物の各用量が２ｍｇを超えないブメタニドを含む、３１に記載のキット。
３３．処方物の各用量が１ｍｇを超えないブメタニドを含む、３２に記載のキット。
３４．用量が経口投与のために処方される、３１〜３３のいずれか一項に記載のキット。
【０１２９】
３５．経口投与のための用量が１日１回のカプセル剤、錠剤、崩壊錠もしくはトローチ剤、またはサシェ剤として処方される、３４に記載のキット。
３６．処方物の用量が静脈内または非経口的に投与されるように処方される、３１〜３３のいずれか一項に記載のキット。
【０１３０】
３７．前記処方物の用量が、経皮パッチによって投与されるように処方される、３１に記載のキット。
３８．対象が哺乳動物である、３１〜３７のいずれか一項に記載のキット。
【０１３１】
３９．哺乳動物がヒトである、３８に記載のキット。
４０．対象由来の生物学的サンプル中のａｐｏＥ４対立遺伝子の特異的検出を可能にするためのＰＣＲまたはマイクロアレイ解析を実施するための１つ以上の試薬、および試薬を生物学的サンプルと反応させるための電子的または紙による指示をさらに含む、３１〜３９のいずれか一項に記載のキット。
【０１３２】
４１．１以上の対照参照サンプルをさらに含む、４０に記載のキット。
４２．３１〜４１のいずれか一項に記載のキットであって、対照を治療するための指示は、対象の重量および投与された処方物の重量または体積に基づく用量を特定する、キット。
【実施例】
【０１３３】
以下の実施例は、当業者に本発明の製造方法および使用方法の完全な開示および説明を提供するために記載されており、発明者が発明とみなす範囲を限定することを意図しておらず、以下の実験がすべてまたは唯一の実験であることを示すことを意図していない。使用した数値（例えば、量、温度等）の精度を確保するための努力がなされているが、いくつかの実験誤差や偏差を考慮に入れるべきである。特に明記しない限り、部分は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。標準的な省略形、例えば、ｂｐ、塩基対；ｋｂ、キロベース；ｐｌ、ピコリットル；ｓまたはｓｅｃ、秒；ｍｉｎ、分；ｈまたはｈｒ、時間；ａａ、アミノ酸；ｋｂ、キロベース；ｂｐ、塩基対；ｎｔ、ヌクレオチド；ｉ．ｍ．、筋肉内；ｉ．ｐ．、腹腔内；ｓ．ｃ．、皮下；が使用されてもよい。
【０１３４】
材料および方法
以下の材料および方法は、以下に提供される実施例１〜３に適用可能である。
データ統合。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）およびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ’ｓ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ−Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ（ＡＭＰ−ＡＤ）データベースを用いて、ａｐｏＥ遺伝子型情報が利用可能な側頭葉組織からのトランスクリプトームＡＤデータを検索した。Ｗｅｂｓｔｅｒ他、２００９１７からのマイクロアレイ実験、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＧＳＥ１５２２２は、ＮＣＢＩ  ＧＥＯデータベース２４から利用可能なｓｅｒｉｅｓ  ｍａｔｒｉｘ  ｆｉｌｅフォーマットで直接ダウンロードされた。データは、説明されているようにランク不変に（ｒａｎｋ−ｉｎｖａｒｉａｎｔ）正規化されていた１７，２５。正規化前の手順では、ｓｅｒｉｅｓ  ｍａｔｒｉｘ  ｆｉｌｅに負の値が作成されたが、これは、発現マトリックス全体に定数を追加することで削除されました２６。この追加後に計算された倍率変化（ＦＣ）は過小評価であるため、以降のすべてのＦＣ推定値は、指定されたしきい値に対して保守的である。その後、Ｌｏｇ２変換を全正値発現マトリックスに適用した。ａｐｏＥ３／３、ａｐｏＥ３／４またはａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する全てのサンプルを、性別が報告されていない１つのサンプルを除き、更なる解析のため用いた。Ｓｙｎ３ｌ５７２５５−ＭａｙｏＥＧＷＡＳデータセットはＡＭＰ−ＡＤポータルからダウンロードした。説明されているように、データはバックグラウンド補正され、分散安定化変換（Ｖｓｔ）、ｑｕａｎｔｉｌｅ正規化、ＢｉｏＣｏｎｄｕｃｔｏｒのｌｕｍｉパッケージによるプローブフィルタリングにかけられた１８。Ｖｓｔは高い値ではｌｏｇ２変換と同一であるが、低い値では外れている（ｄｅｖｉａｔｅｓ）（図６のパネルＣ）２７。図６のパネル（ｃ）は、分散安定化変換（Ｖｓｔ）が、より低い値でｌｏｇ２変換から外れることを示す。ｌｕｍｉパッケージ（例えば、ｌｕｍｉ）が提供するサンプルデータをダウンロードした。これらのデータには、Ｂａｒｎｅｓら（２００５）のマイクロアレイ研究１からランダムに選択された８，０００個の遺伝子が含まれている。Ｖｓｔ変換（ｌｕｍｉパッケージ）をｌｏｇ２変換（ベースＲパッケージ）に対してプロットした。Ｖｓｔ値は、大きい数値ではｌｏｇ２と等しくなるが、変換された値９を中心に上方に外れ始める。したがって、Ｖｓｔ変換における９よりも低い値からの倍率（ｆｏｌｄ）変化の計算は、実際に測定された倍率変化を過小評価していることになる。Ｖｓｔアルゴリズムは、この偏差値の下で、ｌｏｇ２スケールに基づいて計算したＶｓｔ変換データのＦＣ値を過小評価することになる。したがって、このデータセットのその後のＦＣ推定値も、前述のしきい値と比較して保守的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）であった。
【０１３５】
両データセットを主成分分析（ＰＣＡ）により解析し、技術的アーチファクトの正規化を確認した（図７および８）。図７は、ＧＳＥ１５２２２データセットの主成分分析（ＰＣＡ）が、ａｐｏＥ４遺伝子型、診断、年齢、または性別共変量にわたりクラスター化傾向を示さないことを示す。パネル（ａ）：ＧＳＥ１５２２２は、ＧＥＯから入手可能なｓｅｒｉｅｓ  ｍａｔｒｉｘ  ｆｉｌｅフォーマットで直接ダウンロードされた。データは、説明されているようにランク不変に正規化された２。正規化前の手順で負の値が生成されたが、発現マトリックス全体に定数を追加することで除去された３。データはｌｏｇ２に変換され、結果のデータは主成分分析にかけられた。第１の主成分（ＰＣ１）は診断共変量と相関した（ピアソンのｒ＝０．４５８５、Ｐ＝１．６１×ｌ０−１２）。ＰＣ２も診断と有意に関連していた（ピアソンのｒ＝−０．１５８１、Ｐ＝０．０２０７）。ＰＣ１はａｐｏＥ４状態とも有意に相関した（ピアソンのｒ＝０．１８２７、Ｐ＝０．００７４）。ＰＣ２は診断またはａｐｏＥ４状態と相関しなかった。パネル（ｂ）：サンプルの年代別に表示されたデータ。ＰＣ１は年齢共変量と相関しなかった。ＰＣ２は年齢と相関した（ピアソンのｒ＝−０．１５８１、Ｐ＝０．０２０６）。（ｃ）性別に従って表示されたデータ。ＰＣ１およびＰＣ２は性別と相関しなかった。
【０１３６】
図８は、バッチ補正後のＳｙｎ３１５７２５５−ＭａｙｏＥＧＷＡＳデータセットのＰＣＡが、ａｐｏＥ４遺伝子型、診断、年齢、または性別共変量にわたってクラスター化傾向を示さないことを示す。パネル（ａ）：Ｓｙｎ３１５７２５５−ＭａｙｏＥＧＷＡＳデータセットはＡＭＰ−ＡＤポータルからダウンロードした。説明されているように４、データはバックグラウンド補正され、ＢｉｏＣｏｎｄｕｃｔｏｒのｌｕｍｉパッケージを用いて、分散安定化変換（Ｖｓｔ）、ｑｕａｎｔｉｌｅ正規化、プローブフィルタリングが行われた。Ｖｓｔ変換はより高い値ではｌｏｇ２変換と同一であるが、より低い値では外れている（図６のパネルｃ）５。データセットをＰＣＡにより解析し、技術的アーチファクトの正規化を確認した。「プレート」共変量に対応する明確な技術的アーチファクトが第１の主成分（ＰＣ１、説明される分散（ｅｘｐｌａｉｎｅｄ  ｖａｒｉａｎｃｅ）の２９．０％）全体に認められた。ＰＣ１はプレート共変量と相関し（ピアソンｒ＝０．７１５９、Ｐ＜２．２×ｌ０−１６）、ＰＣ２も相関した（ピアソンｒ＝０．２０４９、Ｐ＝３．９×ｌ０−５）。パネル（ｂ）：データセットを、ｓｖａパッケージのＣｏｍＢａｔ機能を使用してプレート共変量全体にわたってバッチ補正し、ＰＣＡを行って、技術的アーチファクトが対処されたことを確認した。ＰＣ１とＰＣ２はバッチ補正後のプレート共変量と相関しなかった。パネル（ｃ）：ａｐｏＥ遺伝子型に従って表示されたＣｏｍＢａｔ補正データのＰＣＡ。ＰＣ１は診断と相関し（ピアソンｒ＝−０．４１２６，Ｐ＜２．２×ｌ０−１６）、ＰＣ２も相関した（ピアソンのｒ＝０．１６５３、Ｐ＝０．０００９）。ＰＣ１はａｐｏＥ４対立遺伝子量（ｄｏｓａｇｅ）と相関したが（ピアソンＲ２＝−０．１７２７、Ｐ＝０．０００５）、ＰＣ２はしなかった。パネル（ｄ）：性別に従って表示したＣｏｍＢａｔ補正データ。ＰＣ１は性別と相関したが（ピアソンｒ＝−０．２８４２、Ｐ＝８．２３×ｌ０−９）、ＰＣ２はしなかった。パネル（ｅ）：サンプルの年代別に表示されたＣｏｍＢａｔ補正データ。ＰＣ２は年齢と相関し（ピアソンのｒ＝０．１２２４、Ｐ＝０．０１４７）、ＰＣ１と年齢の相関は有意に近かった（ピアソンのｒ＝−０．０９４３、Ｐ＝０．０６０５）。
【０１３７】
このようなアーチファクトは第１の主成分に存在するため、Ｓｙｎ３１５７２５５−ＭａｙｏＥＧＷＡＳデータセットは、ｓｖａパッケージのＣｏｍＢａｔ関数を使用して「プレート」共変量全体にわたってさらにバッチ補正された２８。差次的発現（ＤＥ）解析に線形モデルを使用するＬｉｍｍａＲパッケージを各データセットに個別に適用して、ａｐｏＥ遺伝子型に関係なく、すべての対照サンプルおよびＡＤサンプルの遺伝子のＤＥを推定した；複数のプローブを有する遺伝子については、ＡＤサンプルと対照サンプルとの間の差異について最も有意なＰ値を有するプローブを用いて、２つのデータセットのその後の統合およびメタ解析を行った２９。両データセットをａｐｏＥ−遺伝子型特異的群（ａｐｏＥ３／３、ａｐｏＥ３／４、およびａｐｏＥ４／４）に分けて；両マイクロアレイプラットフォームで共有される遺伝子（１６４７７遺伝子）をＣｏｍＢａｔアルゴリズム（ｓｖａパッケージ）を用いて各群について２つのデータセットでバッチ補正した（図９）。
【０１３８】
図９は、プローブ選択およびバッチ補正によるデータ統合が、メタ解析のための正規化されたデータセットをもたらすことを示す。パネル（ａ）：Ｓｙｎ３１５７２５５−ＭａｙｏＥＧＷＡＳデータセットはＡＭＰ−ＡＤポータルからダウンロードした。説明されているように４、データはバックグラウンド補正され、ＢｉｏＣｏｎｄｕｃｔｏｒのｌｕｍｉパッケージを用いて、分散安定化変換（ｖｓｔ）、ｑｕａｎｔｉｌｅ正規化、プローブフィルタリングが行われ、その後、「プレート」共変量全体にわたってバッチ補正された（図８を参照）。ＧＳＥ１５２２２をダウンロードし、負の値を排除するためにデータセットに定数を適用した；次いで、データをｌｏｇ２に変換した。Ｌｉｍｍａパッケージを２つのデータセットに別々に適用して、遺伝子型に関係なくすべての対照サンプルとＡＤサンプル間の差次的発現（ＤＥ）を推定した；２つ以上のプローブを持つ遺伝子については、ＡＤサンプルと対照サンプルとの差で最も有意なＰ値を有するプローブをその後の統合に使用した６。次に、データは両方のデータセットで共有される遺伝子を使用して結合した（ｎ＝１６４７７ｓ）。ｖｓｔ（ＭａｙｏＥＧＷＡＳ）またはｌｏｇ２変換（ＧＳＥ１５２２２）後の遺伝子発現値は、データセット間で発現レベルに明らかな違いを示した。パネル（ｂ）は、ＣｏｍＢａｔ補正後の統合データの発現値を研究別に示したものであり、統合データセット間の整合性が示されており、それ以降のすべてのＤＥ解析に使用された。
【０１３９】
差次的発現（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）および経路解析。平均年齢は、Ｓｙｎ３１５７２５５−ＭａｙｏＥＧＷＡＳ試験で高かったａｐｏＥ３／４ＡＤ群（＋３．２４歳、ＴｕｋｅｙのＨＳＤ事後検定（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔｅｓｔｉｎｇ）を用いたＡＮＯＶＡ、Ｐ＝０．０１５３）を除き、ａｐｏＥ遺伝子型群で差はなかった。冪（ｐｏｗｅｒ）を維持するために、Ｓｙｎ３１５７２５５−ＭａｙｏＥＧＷＡＳのａｐｏＥ３／４群からサンプルを除去しなかった。年齢がＤＥの結果に影響しないことを確かめるために、ａｐｏＥ３／４対照とＡＤのデータセットの両方から得た各ＤＥ遺伝子のＳｙｎ３１５７２５５−ＭａｙｏＥＧＷＡＳデータセットにおける発現レベルと年齢共変量とのピアソンの相関を計算した。有意に相関した遺伝子はなかった（ＦＤＲ＜０．０５）。性別が一致しない群に関連する偽の結果を根絶するために、各ａｐｏＥ遺伝子型特異的群を診断全体で各遺伝子型内の男女比に一致するようにランダムにダウンサンプリングした（図５）。図５は、ヒトのトランスクリプトームデータセットの共変量測定を示す。各研究を別々に、あるいは組み合わせて、以下の共変量を報告した：ａｐｏＥ状態、診断、各群の平均年齢、群内年齢のＳＤ，各遺伝子型内の対照とＡＤサンプル間の年齢差の有意性（遺伝子型内の有意性）、群サイズ（ｎ）、男性の数、女性の数、ダウンサンプリングした性同一群の男性または女性の数、群内の男女比（男性／女性比）およびダウンサンプリング後の群内の男女比（男性／女性比ダウンサンプル）。ＭａｙｏＥＧＷＡＳ研究ではａｐｏＥ３／４ＡＤサンプルはａｐｏＥ３／４対照サンプルよりも有意に年齢が高かった（３．２４歳差）。この不一致は、オンライン方法のセクションに記載されているように、計算パイプラインで対処した。
【０１４０】
起こり得る確率的効果を説明するために、この処理を１０回適用した。ノンパラメトリックランクベースのアルゴリズムＲａｎｋＰｒｏｄ（バージョン２．４２．０）を、２起源（ｔｗｏ−ｏｒｉｇｉｎ）設計による１０の置換（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ）の各々に適用した。２起源設計ＲａｎｋＰｒｏｄアルゴリズムは、各データセットにおける各対照とＡＤサンプルのペアワイズ（ｐａｉｒｗｉｓｅ）ＦＣ比を個別に計算し、各ペアワイズ比較内の各遺伝子の比をランク付けし、両データセットからの全ペアワイズランク比の積を取ることにより各遺伝子のランク積を計算する。Ｐ値は１０００の置換により決定した１９。調整されたＰ値は、Ｒのｐ．ａｄｊｕｓｔ  ｂａｓｅ関数を用いて個別に決定した。ＣｏｍＢａｔ関数は、各サンプルの平均値とＳＤを変更する。したがって、ＲａｎｋＰｒｏｄパッケージによる報告されたＦＣ推定におけるさらなるアーチファクトを避けるために、すべての後続カットオフで使用されるＦＣをバッチ補正前に各データセットに対して別々に計算し、算術平均を使用した。ＧＳＥ１５２２２マトリックスの正規化変換およびＳｙｎ３１５７２５５−ＭａｙｏＥＧＷＡＳのＶｓｔ変換の理由から、いくつかのＦＣ値は過小評価され、「推定ＦＣ」と呼ばれる。推定ＦＣ値およびＰ値は、各遺伝子型に対する１０の性別が一致する置換の各々について平均化し、ＦＤＲ値はｐ．ａｄｊｕｓｔパッケージを使用して計算した。推定平均絶対ＦＣがｌ．３×より大きく、かつＦＤＲカットオフ＜０．０５の両方を有するＤＥ遺伝子をさらに解析した。薬物シグネチャのＤＥ遺伝子をＩｎｇｅｎｕｉｔｙ（登録商標）Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ソフトウェアで解析した。直接的および間接的な遺伝子関係を含むＩｎｇｅｎｕｉｔｙ（登録商標）Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｂａｓｅからの参照セットを用いてオントロジー解析を行った；エンリッチメント（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）Ｐ値はＩＰＡソフトウェアから直接得た。
【０１４１】
ドラッグリポジショニング解析。Ｓｉｒｏｔａ他とＤｕｄｌｅｙ他１１，１２により開発され、Ｃｈｅｎ他１６から採用されたコンピュータによるドラッグリポジショニングアルゴリズムを、公的に利用可能なＣＭａｐデータベース（１３００の化合物）を用いて各ａｐｏＥ−遺伝子型特異的遺伝子シグネチャに適用した。ＬＩＮＣＳははるかに包括的なデータベースであるが、ＡＤにおけるＤＥ遺伝子のごく一部が、測定した１０００個の遺伝子と重複しており、この研究では使用しなかった。アルゴリズムは、アップレギュレートおよびダウンレギュレートされた上位１５０個の遺伝子ではなく、完全なａｐｏＥ−遺伝子型特異的ＤＥシグネチャを使用するように修正された。ＦＤＲ調整されたＰ値は、基本Ｒパッケージのｐ．ａｄｊｕｓｔ関数を用いて計算した。同じ薬物、濃度、細胞株、および治療として定義される技術的反復（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）をＣＭａｐスコアで平均した。ａｐｏＥ遺伝子型特異的群間の重複する薬物予測の解析において、薬物が複数の技術的反復を有する場合、最も包括的な薬物セットを有するために最も有意な反復からのＰ値が報告された。シグナルをさらに濃縮するために、各化合物について、最も低いＣＭａｐスコアを有する細胞株が報告された。ＰＣ３細胞中のブメタニドの生ＣＭａｐデータを更なる解析のために抽出した。Ｃｈｅｎ他１６によって詳述されたパイプラインからのＣＭａｐデータはブメタニド処理後のＦＣランクで構成されている。ブメタニドがＡＤのａｐｏＥ４／４特異的トランスクリプトームシグネチャをどのように「反転させる（ｆｌｉｐｓ）」か、を示すために、図２のＣＭａｐデータを、平均ＦＣランクにおけるシフトの有意性を計算するために、モンテカルロシミュレーションにより解析した。ブメタニドによるダウンレギュレーションは、アップレギュレートされたａｐｏＥ４／４ヒト遺伝子シグネチャの全遺伝子の平均ランクより低いランクへのシフトとして定義した。ブメタニドによるアップレギュレーションは、ａｐｏＥ４／４特異的ＡＤシグネチャにおけるダウンレギュレートされた遺伝子の平均ＦＣランクの全遺伝子の平均ランクより高いランクへのシフトとして定義した。
【０１４２】
マウス。全てのプロトコルと手順は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（ＵＣＳＦ）の実験動物リリースセンターのガイドラインに従った。すべてのマウスを出生から死亡まで同一の条件下で飼育した（１２時間明／暗サイクル、５匹／ケージで飼育、ＰｉｃｏＬａｂ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ  ２０）。全てのマウス系統をＣ５７Ｂ１／６Ｊバックグラウンドで維持した。ＡｐｏＥ３−ＫＩおよびＡｐｏＥ４−ＫＩホモ接合マウス系統（Ｔａｃｏｎｉｃ）３０，３１は、Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ／ＵＣＳＦ動物施設で正常条件下で生まれ、加齢した。雌のａｐｏＥ−ＫＩマウスを、ＡＤに関連する神経細胞および行動の障害に対する感受性のため使用した。マウスの年齢は、オンライン方法の行動試験のセクションに記載されている。
【０１４３】
ブメタニドでの処理。ブメタニドを０．９％滅菌生理食塩水中２％ＤＭＳＯ中２２０ｍＭで調製し、溶解性のためにＮａＯＨでｐＨ８．５に調整し、毎日のｉ．ｐ．注射によって与えられ、ｉ．ｐ．注射は、行動評価の６週間前から開始し、行動評価中も継続した。体重は、ブメタニド処理中に毎週測定した；注射量は、０．０２ｍｇ（低）または０．２ｍｇ（高）ブメタニド／ｋｇ体重（例えば、２０ｇのマウスに対して５０−μｌの毎日の注射）の投与量を達成するように計算した。対照マウスには、０．９％滅菌生理食塩水に同量の２％ＤＭＳＯ（ｐＨ８．５）を注射した。注射は忍容性が良好であり、健康に対する有害作用はなかった。
【０１４４】
行動試験。試験前にマウスを１匹ずつ飼育した。各マウスにはランダムな番号が割り当てられたため、研究者らは遺伝子型および処理情報を知らされなかった。約１４か月齢で、ａｐｏＥ３−ＫＩマウスおよびａｐｏＥ４−ＫＩマウスを処理群に無作為に割り当てた：ａｐｏＥ３−ＫＩビヒクル（ｎ＝１０、年齢１４．０１±０．４４ヵ月）、ａｐｏＥ３−ＫＩ低ブメタニド（ｎ＝１１、年齢１４．３０±０．３３ヵ月）、ａｐｏＥ３−ＫＩ高ブメタニド（ｎ＝１０、年齢１３．７４±０．２２ヵ月）、ａｐｏＥ４−ＫＩビヒクル（ｎ＝１０、年齢１４．１０±０．３５歳）、ａｐｏＥ４−ＫＩ低ブメタニド（ｎ＝１０、年齢１４．７０±０．２７ヵ月）、ａｐｏＥ４−ＫＩ高ブメタニド（ｎ＝９、年齢１３．７７±０．２８ヵ月）。処理は、モリス水迷路（ＭＷＭ）での試験の６週間前から試験の１４日間にわたって、毎日ｉ．ｐ．注射で投与した；注射は明サイクルの終了時およびその日の試験後に行われた。
【０１４５】
ＭＷＭプール（直径、１２２ｃｍ）は、直径１０ｃｍのプラットフォームを備えた不透明な水（２２〜２３℃）を含んでいた。プラットフォームは隠しプラットフォームセッション（ｈｉｄｄｅｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｓｅｓｓｉｏｎｓ）時には、１．５ｃｍ水中に沈められ２０〜２３，３２、キュートレーニングセッション（ｃｕｅｄ  ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｓｅｓｓｉｏｎｓ）時には、黒と白の縞模様のマスト（高さ１５ｃｍ）でマークされた。マウスは、それぞれ１５分のトライアル間間隔で２回の６０秒のトライアル（隠しおよびキュートレーニング）からなる、１日２回のセッション（３．５時間間隔）で、隠れたプラットフォーム（隠された日１〜５日）およびキュープラットフォーム（可視日１〜３日）を見つけるように訓練した。行動試験室の壁の遠位の視覚的な手がかり（ｃｕｅ）は、試験を通して一定のままであった。可視トライアルは、トレーニングと記憶プローブ（ｐｒｏｂｅｓ）の後に行われ、目に見えるキュープラットフォームを用いて６０秒の長さで行われた。プラットフォームの位置は、隠れプラットフォームのセッションでは一定のままであったが、キュー（可視的な）プラットフォームセッションごとに変更した。入水ポイント（ｅｎｔｒｙ  ｐｏｉｎｔｓ）は、トライアルとトライアルとの間にて半ランダム的に変更した。最後の隠しプラットフォームトレーニングの２４、７２、および１２０時間後に、６０秒プローブトライアル（プラットフォームを除去）を行った。プローブトライアルの入水ポイントは南西象限にあり、ターゲット象限は北東象限であった。パフォーマンスはＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ（登録商標）ビデオ−追跡システム（Ｎｏｌｄｕｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でモニターした。プローブトライアルでは、以下の解析を行った：（１）他の３つの象限で費やされた平均時間に対する、ターゲット象限で費やされた時間の割合（％）、（２）他の３つの象限において同等の位置を横切った交差数の平均値に対する、ターゲットプラットフォームの位置を横切った交差数、および（３）最初の１０秒のプラットフォームまでの距離。
【０１４６】
海馬組織のＲＮＡ−Ｓｅｑ解析。１２ヶ月齢のａｐｏＥ３−ＫＩマウスおよびａｐｏＥ４−ＫＩマウスに、ビヒクルまたはブメタニド（０．２ｍｇ／ｋｇ体重）を６０日間毎日ｉ．ｐ．注射した。マウスを０．９％生理食塩水で潅流し、海馬を解剖し、Ｔｒｉｚｏｌ試薬でホモジナイズした。全ＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅ処理を含むＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｃｒｏキットを使用して精製した。ｃＤＮＡは、ＮｕＧＥＮ  ＲＮＡ−ＳｅｑＶ２キットを用いて全長ＲＮＡ（５０ｎｇ／サンプル）から生成され、このキットは、単一プライマー等温増幅法を用いてリボソームＲＮＡを枯渇させ、Ｃｏｖａｒｉｓによって剪断されて均一なサイズの断片を生じた。ＮｕＧｅｎ  ＵｌｔｒａｌｏｗシステムＶ２は、アダプターの追加とバーコード化および増幅に使用された。得られたＲＮＡライブラリーをＡｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ＸＰ磁気ビーズで精製し、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによる品質管理の後、ｑＰＣＲによって定量した。ライブラリーをプールし、単末端（ＳＥ５０）配列決定のためにＨｉＳｅｑ（登録商標）４０００機器（Ｉｌｌｕｍｍａ）を用いて配列決定した。配列データをＳＴＡＲ  ｓｈｏｒｔ  ｒｅａｄ  ａｌｉｇｎｅｒ３３でアライメントし、Ｓｕｂｒｅａｄパッケージからｆｅａｕｔｕｒｅ  Ｃｏｕｎｔｓ関数を用いて特徴あたりのカウント数を取得した３４。アライメント後、ＧＳＥ１５２２２およびＳｙｎ３１５７２５５−ＭａｙｏＥＧＷＡＳデータベースで共有されていない転写産物を廃棄し、２つ以上のサンプルで１００万あたり１カウント未満の遺伝子も廃棄した３５。
【０１４７】
ＤＥＳｅｑパイプラインを用い、残りの１１，８７７転写物のＤＥを評価した。Ｐ値０．０５以下の遺伝子は将来の経路解析のためにＤＥと考えられた。ＤＥＳｅｑによるカウント正規化後、データをｒｌｄ変換し（ｖｓｎパッケージ）、ｐｈｅａｔｍａｐパッケージを用いてＤＥ遺伝子上でクラスタリングを行った。ＰＣＡをｒｌｄ変換ＤＥ遺伝子に適用した。薬物のＤＥシグネチャをＩｎｇｅｎｕｉｔｙ（登録商標）Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ソフトウェアで解析した。オントロジー解析は、直接的および間接的な遺伝子関係を含むＩｎｇｅｎｕｉｔｙ（登録商標）Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｂａｓｅからの参照セットを用いて行った。ＡＤのａｐｏＥ−遺伝子型特異的シグネチャ遺伝子のランク変化の解析のため、１１，８７７の転写物からの生のカウントデータをランク変換し、各遺伝子に対し、ビヒクル処理したサンプルの平均ランクをブメタニド処理したサンプルの平均ランクから差し引いた。すべての遺伝子のランク変化の母集団平均（０）から外れる、アップレギュレートされたａｐｏＥ４−ＫＩおよびダウンレギュレートされたａｐｏＥ４−ＫＩヒト遺伝子シグネチャのランク変化の有意性を、モンテカルロシミュレーションにより計算した。
【０１４８】
統計解析。行動指標は平均±ＳＥＭで表される。ｎの値はすべてマウス数または生物学的複製数である。データの分布はＳｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ正規性検定で評価した；データの大部分は正規分布であった。群間の差異は、対応のない、または対応のある両側ｔ検定によって決定した。多重比較には、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とＴｕｋｅｙの事後検定を使用した。Ｐ＜０．０５を有意とみなした。研究者は、実験中に遺伝子型および治療情報を知らされなかった。
【０１４９】
関連する倫理的規制および動物使用ガイドラインの順守。すべての実験および動物のプロトコルと手順は、大学および機関の倫理規定および動物使用ガイドラインに従って実施された。
【０１５０】
ライフサイエンス報告の要約。実験計画の詳細については、ライフサイエンスレポートの概要を参照のこと。
以下の材料および方法は、以下に提供される実施例４〜６に適用可能である。
【０１５１】
脳切片の電気生理学的記録およびデータ解析。長期増強（ＬＴＰ）記録研究のために、ａｐｏＥ４−ＫＩマウスをビヒクル（ｎ＝６、年齢１５．２±０．５６ヵ月）とブメタニド（ｎ＝３、年齢１５．１±０．０６歳）処理群にランダムに割り当てた。ＡｐｏＥ３−ＫＩマウスを同様にビヒクル（ｎ＝６、年齢１５．５±０．１１歳）とブメタニド（ｎ＝３、年齢１５．５７±０．１９歳）処理群に割り当てた。入出力記録研究のために、ａｐｏＥ４−ＫＩマウスをビヒクル（ｎ＝３、年齢１５．１±０．０６ヵ月）とブメタニド（ｎ＝３、年齢１５．１±０．０６歳）処理群にランダムに割り当てた。ＡｐｏＥ３−ＫＩマウスを同様にビヒクル（ｎ＝７、年齢１５．３±０．０６歳）とブメタニド（ｎ＝３、年齢１５．５７±０．２９歳）処理群に割り当てた。すべてのマウスに６〜８週間投与し、切片記録日および投与時間を群間でランダムに割り当てて、実験が実施されている間に等しい投与時間を確保した。最終ブメタニド注入は屠殺の１時間前に行った。記録時にはすべてのマウスが１６〜１７カ月齢であった。
【０１５２】
動物をイソフルランで麻酔し、首を切断した。脳を頭蓋から迅速に除去し、氷冷（２〜５℃）スライス溶液中に置いた。スライス溶液は（ｍＭで）、１１０ｍＭの塩化コリン、２．５ｍＭのＫＣｌ、２６ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１．２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのグルコース、３ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１ｍＭのＬ−アスコルビン酸、を含有しており、ｐＨ７．４であった。
【０１５３】
３００μｍ厚さの矢状切片をビブラトーム（ＶＴ１２００、ライカ、米国）を用いて両方の半球から切り取り、人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）を入れた９５％Ｏ２−ＣＯ２気相界面保持チャンバー（ＢＳＫ５、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｃ、カナダ）に移し、３４℃で１時間回復させ、その後室温（２０〜２２℃）で保持した。ＡＣＳＦは（ｍＭで）：１２６ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＣａＣｌ２、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２６ｍＭのＮａＨＣＯ３、１．２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのグルコースおよび１．５ｍＭのＬ−アスコルビン酸、を含有しており、ｐＨ７．４であった。記録のために、切片を液中チャンバー（ＲＣ−２７ＬＤ、Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｍｍｍｅｎｔｓ、米国）に移し、３２℃で１０ｍＬ／分の流速で酸素化ＡＣＳＦで両側を連続的に潅流した。
【０１５４】
シナプス後野電位（ｆＰＳＰ）は、定電圧分離刺激装置（ＤＳ２Ａ−ＭＫＩＩ、Ｄｉｇｉｔｉｍｅｒ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ）に接続し、ＣＡ２放射状層に置いた同心双極刺激電極（ＦＨＣ社、米国）によるＳｃｈａｆｆｅｒ側枝の順行性刺激により誘導した。ｆＰＳＰは、ＡＣＳＦで充填したホウケイ酸ガラス微小電極を用いてを記録し、ＣＡ１放射層に配置した。信号は、ｐＣｌａｍｐ１０ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国）を備えたＭｕｌｔｉ  Ｃｌａｍｐ７００Ｂ増幅器およびＤｉｇｉｄａｔａ１５５０Ｂ１収集システムによってサンプリングおよびデジタル化され、カスタムマクロを実行するＩｇｏｒＰｒｏ（登録商標）６ソフトウェア（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ  Ｉｎｃ．、米国）を使用して解析した。ｆＰＳＰ勾配は、ｆＰＳＰピークの１０％と９０％との間の線形適合勾配値として解析した。入出力関係は、刺激強度の増加（０．５〜１．４ｍＶ）に反応したｆＰＳＰ勾配値として記録した。長期増強（ＬＴＰ）記録に対し、刺激強度を飽和の５０％に調整し、０．１Ｈｚで送達した。コントロール記録の１０分後、０．２Ｈｚで５つの１００Ｈｚバースト（各４パルス）の２つの連続（５ｓ）θ周波数バースト（ＨＦＢ）列を用いてＬＴＰを誘発した。ＬＴＰの結果は、コントロールの１０分間に対する、誘導５０分後の１０分間の平均ｆＰＳＰ増加量（ｇａｉｎ）として確認された。
【０１５５】
単一核（Ｓｉｎｇｌｅ−Ｎｕｃｌｅｕｓ）ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーの調製および配列決定。１２ヶ月齢のａｐｏＥ３−ＫＩマウスおよびａｐｏＥ４−ＫＩマウスに、ビヒクルまたはブメタニド（０．２ｍｇ／ｋｇ体重）を６０日間毎日ｉ．ｐ．注射した。単一核ＲＮＡ−ｓｅｑプロトコルは、１０×ゲノミクス試料調製実証プロトコルおよび単一細胞ＲＮＡ配列決定のための核の単離に基づいて変更された。マウス海馬を氷上で急性解剖した。切断した海馬を、５ｍＬチューブ内の２ｍＬのＨｉｂｅｒｎａｔｅＡ（登録商標）／Ｂ２７（登録商標）／ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（ＨＥＢ）培地中に入れた。ＨＥＢ培地を１５ｍＬの円錐形に除去し、氷上に保持した。２ｍＬの冷却した溶解緩衝液（ヌクレアーゼフリー水中の１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、および０．１％のＮｏｎｉｄｅｔ（商標）Ｐ４０代替物）を組織に添加し、海馬を、２１Ｇ針を通して１０回吸引することによってホモジナイズした。ホモジナイズ後、組織を氷上で１５分間溶解し、このインキュベーション期間中に２〜３回旋回させた。次いで、保存した冷却ＨＥＢ培地を溶解した組織溶液に戻し、１ｍＬピペットに５〜７回通すことにより、組織をさらに粉砕した。３０μｍの細胞濾過器（ＭＡＣＳ（登録商標）Ｓｍａｒｔ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １３０−１１０−９１５）を１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、溶解した組織溶液を濾過器を通して濾過し、破片および塊を除去した。濾過された核を、５００ｒｅｆにて、４℃で５分間遠心分離した。上清を除去し、核をＮｕｃｌｅｉ  Ｗａｓｈ  ａｎｄ  Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１．０％のＢＳＡおよび０．２Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤を含む１×ＰＢＳ）１ｍＬに再懸濁し、次いで、５００ｒｅｆにて、４℃で５分間再度遠心分離し、Ｎｕｃｌｅｉ  Ｗａｓｈ  ａｎｄ  Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒの４００ｕｌに再懸濁した。ＤＡＰＩを０．１ｕｇ／ｍＬの最終濃度まで添加し、核溶液を３５ｕｍ細胞濾過器で濾過した後、グラッドストーン研究所のフローサイトメトリーコアのＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ−ＩＩにロードした。ＤＡＰｌ陽性核は、破片とダブレットを除外して、ＤＡＰＩ陽性事象でのゲーティングによって選択した。
【０１５６】
単一核ＲＮＡ−Ｓｅｑアラインメント、クラスタリングおよび細胞型同定。マウスのリファレンス（ｍｍ１０−３．０．０、アンサンブル９７）プレｍＲＮＡゲノムは、１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ（ｖ．２．２．０）ｍｋｒｅｆ機能により作成した。各サンプルからの読み取りをこのゲノムに整列させ、変更なしで１０Ｘ  Ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒパイプラインを用いて凝集させた。生データをＲパッケージＳｅｕｒａｔｅ（バージョン２．３．４）にロードした。少なくとも３つの核で発現が検出された遺伝子、および少なくとも２００の検出された遺伝子および最大２４００の核を、０．００２５未満のミトコンドリアパーセンテージを有する全核についての解析のために保持し、合計２７，４１５個の細胞について将来の解析のために保持した。高可変性遺伝子は、合計２５７８個の高可変性遺伝子に対して、ｘ．ｌｏｗ．ｃｕｔｏｆｆ＝０．０１２３、ｘ．ｈｉｇｈ．ｃｕｔｏｆｆ＝３、ｙ．ｃｕｔｏｆｆ＝０．５のパラメータを有するＦｉｎｄＶａｒｉａｂｌｅＧｅｎｅｓ関数を介して計算された。核内の高可変性遺伝子の発現レベルを、ＳｃａｌｅＤａｔａ関数を介してスケーリングし、中央揃えした後、ＲｕｎＰＣＡ関数に供給した。各主成分の累積標準偏差をプロットするためにＰＣＡＥｌｂｏｗ  Ｐｌｏｔを使用し、各遺伝子と各主成分との関連性の有意性をＪａｃｋＳｔｒａｗおよびＪａｃｋＳｔｒａｗＰｌｏｔ関数を介して評価した。この２つのグラフの結果をもとに、最初の１５のＰＣを選択してＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒ機能に供給し、以下の０．６の解像度を用いて実行した。この方法では、１８の異なるクラスターが識別された。次に、各クラスターに存在する細胞型を同定するためのデフォルト設定を用いてマーカー遺伝子を同定するためにＦｉｎｄＭａｒｋｅｒｓ関数を適用した。異なる細胞型のマーカー遺伝子発現をより良く可視化するために、ＲＭａｇｉｃ（Ｍａｒｋｏｖ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｇｒａｐｈ  Ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎ）パッケージのマジック関数をＳｕｅｒａｔオブジェクトに適用し、ノイズを除去し、カウントマトリックス中のドロップアウト事象を満たすために、類似した細胞間で情報を共有するデータ拡散を適用した。Ｓｅｕｒａｔ  ＶｌｎＰｌｏｔ関数を用いてマーカー遺伝子発現を可視化した。
【０１５７】
単一核ＲＮＡ−Ｓｅｑの差次的発現と経路解析。各細胞型におけるブメタニドと対照処理細胞間の全遺伝子の差次的発現ｌｏｇ倍率変化をＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を用いてＦｉｎｄＭａｒｋｅｒｓ関数により計算した。ブメタニドがＡＤのａｐｏＥ４／４−特異的トランスクリプトームシグネチャをどのように「反転」させるかを示すために、Ｃｍａｐデータベースで測定されたものと重複する各細胞クラスターに存在する全遺伝子のｌｏｇ倍率変化をランク変換し、その後、平均ＦＣランクのシフトの有意性を計算するためにモンテカルロシミュレーションにより解析した。ブメタニドによるダウンレギュレーションは、アップレギュレートされたａｐｏＥ４／４ヒト遺伝子シグネチャの全遺伝子の平均ランクより低いランクへのシフトとして定義した。ブメタニドによるアップレギュレーションは、ａｐｏＥ４／４特異的ＡＤシグネチャにおけるダウンレギュレートされた遺伝子の平均ＦＣランクの全遺伝子の平均ランクより高いランクへのシフトとして定義した。差次的に発現した経路を、ｌｉｍｍａパッケージのｋｅｇｇａ関数を用いて、各クラスターの全てのＤＥ遺伝子（ｐ＜０．０５）から計算した。エンリッチメントｐ＜０．００５の経路を更なる解析に用いた。
【０１５８】
ヒトａｐｏＥ４／４−ｉＰＳＣのニューロン分化。ヒトｉＰＳ系統をａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象の皮膚線維芽細胞から作出し、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において無給餌条件下で維持した。ヒトａｐｏＥ４／４−ｉＰＳＣをＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）による短時間処理とスクレーピングにより１：２〜１：４で日常的に継代した。ヒトｉＰＳＣプロトコルは、カリフォルニア大学のヒト研究委員会により承認された。ａｐｏＥ４／４−ｉＰＳＣを修飾して報告したようにニューロンに分化させた。ｉＰＳＣをコラゲナーゼＩＶ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理し、ｂＦＧＦを含まないｈＥＳ培地中で胚様体として懸濁状態で増殖させた。培地は５日間、毎日交換した。５日目に、ＴＧＦ−β受容体（ＳＢ４３１５４２、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ；５μＭ）および骨形成タンパク質受容体（ＬＤＮ−１９３１８９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ；０．２５μＭ）の阻害剤を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地／Ｆｌ２とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（１：１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、１％Ｎ２添加（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％Ｂ２７添加（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、非必須アミノ酸、および０．５％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む神経誘導培地で胚様体を成長させた。７日目に、球を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングしたウェルに移し、ＳＢおよびＬＤＮを含まないが、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、１０ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子（ＥＧＦ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、および２μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ）を含有する神経誘導培地からなる神経前駆体培地で増殖させた。付着した神経上皮細胞を１日おきに７日間与えた。１５日目頃までに神経ロゼット構造が出現し、プレートから持ち上げ、神経前駆体培地で懸濁培養してニューロスフェア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）を形成した。ニューロン分化のために、ニューロスフェアをＡｃｃｕｔａｓｅで解離し、１００μｇ／ｍｌのポリ−ｌ−オルニチン（Ｓｉｇｍａ）および１０μｇ／ｍｌラミニン（Ｓｉｇｍａ）でコーティングした培養プレート上にプレーティングした。ニューロン培養は、ｂＦＧＦ，ＥＧＦまたはヘパリン無しで、神経前駆体培地、脳由来神経栄養因子（１０ｎｇ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）およびグリア細胞由来成長因子（１０ｎｇ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）よりなる神経分化培地で維持した。ニューロンが数日後に観察され、３０日間以上さらに分化した。大部分の実験は８週以降に分化したニューロン培養物で行った。
【０１５９】
この培養条件では、７５±４％のｖＧＬＵＴ＋総グルタミン酸作動性興奮性ニューロン、１５±３％のＧＡＢＡ＋ＧＡＢＡ作動性抑制性ニューロン、および５±２％のＴＨ＋ドーパミン作動性ニューロンを有するニューロン細胞が生成された。
【０１６０】
ヒトＡｐｏＥ４／４−ｉＰＳ由来ニューロンのＲＮＡ−Ｓｅｑ解析。ＤＮａｓｅ処理を含むＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｃｒｏキットを使用してａｐｏＥ４／４−ｉＰＳＣ由来ヒトニューロンから全ＲＮＡを抽出し、精製した。ｃＤＮＡは、ＮｕＧＥＮ  ＲＮＡ−ＳｅｑＶ２キットを用いて全長ＲＮＡ（５０ｎｇ／サンプル）から生成され、このキットは、単一プライマー等温増幅法を用いてリボソームＲＮＡを枯渇させ、Ｃｏｖａｒｉｓによって剪断されて均一なサイズの断片を生じた。ＮｕＧｅｎ  ＵｌｔｒａｌｏｗシステムＶ２は、アダプターの追加とバーコード化および増幅に使用された。得られたＲＮＡライブラリーをＡｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ＸＰ磁気ビーズで精製し、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによる品質管理の後、ｑＰＣＲによって定量した。ライブラリーをプールし、単末端（ＳＥ５０）配列決定のためにＨｉＳｅｑ（登録商標）４０００機器（Ｉｌｌｕｍｉｍａ）を用いて配列決定した。配列データをＳＴＡＲ  ｓｈｏｒｔ  ｒｅａｄ  ａｌｉｇｎｅｒでアライメントし、Ｓｕｂｒｅａｄパッケージからｆｅａｕｔｕｒｅ  Ｃｏｕｎｔｓ関数を用いて特徴あたりのカウント数を取得した。
【０１６１】
ＤＥＳｅｑパイプラインを用いて、得られた４９，６９７の特徴の差次的発現を評価した。ｐ＜０．０５以下の遺伝子は将来の経路解析のためにＤＥと考えられた。ＤＥＳｅｑによるカウント正規化後、データをｒｌｄ変換し（ｖｓｎパッケージ）、ＰＣＡをｒｌｄ−変換ＤＥ遺伝子に適用した。ｌｉｍｍａパッケージのｋｅｇｇａ関数を、濃縮オントロジー経路を解明するために、全てのＤＥ遺伝子（ｐ＜０．０５）で使用した。濃縮した（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）経路（ｐ＜０．０５）を更なる解析に用いた。
【０１６２】
ブメタニドがＡＤのａｐｏＥ４／４特異的トランスクリプトームシグネチャをどのように「反転」させるかを示すために、各転写産物のＥＮＳＥＭＢＬ  ＩＤから遺伝子シンボルを生成し、複数のＥＮＳＥＭＢＬ  ＩＤに対応する遺伝子について平均倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）を測定した。Ｃｍａｐデータベースで測定された遺伝子とも重複する遺伝子のＦＣをランク変換し、次いで、平均ＦＣランクにおけるシフトの有意性を計算するためにモンテカルロシミュレーションにより解析した。ブメタニドによるダウンレギュレーションは、アップレギュレートされたａｐｏＥ４／４ヒト遺伝子シグネチャの全遺伝子の平均ランクより低いランクへのシフトとして定義した。ブメタニドによるアップレギュレーションは、ａｐｏＥ４／４特異的ＡＤシグネチャにおけるダウンレギュレートされた遺伝子の平均ＦＣランクの全遺伝子の平均ランクより高いランクへのシフトとして定義した。
【０１６３】
実施例１
ブメタニドのインシリコ（ＩＮ  ＳＩＬＩＣＯ）スクリーニングおよび同定
研究プロトコルが記載され、結果がここに示される。
【０１６４】
ＡＤおよび／またはａｐｏＥ４／４−遺伝子型関連疾患および障害を治療するための薬物をスクリーニングするためのａｐｏＥ−遺伝子型特異的ドラッグリポジショニングアプローチが本明細書に記載される。
【０１６５】
公的データベースから得られた６１０のヒト側頭葉サンプルの遺伝子発現メタ解析から、ＡＤのａｐｏＥ遺伝子型特異的トランスクリプトームシグネチャを確立し、１３００の既存薬剤のトランスクリプトーム摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）シグネチャを含む有効な接続性マップ（ＣＭａｐ）データベースをクエリーするために使用して、ａｐｏＥ遺伝子型駆動疾患状態から正常状態に向けて全遺伝子発現ネットワークを摂動できる（ｐｅｒｔｕｒｂｉｎｇ）ものを同定した。
【０１６６】
公的に利用可能なデータベースからのＡＤのａｐｏＥ遺伝子型特異的トランスクリプトームシグネチャを最初に解析し、ＡＤのａｐｏＥ遺伝子型特異的シグネチャを用いた最初のＣＭａｐデータベース検索を完了した。
【０１６７】
ＡＤのａｐｏＥ遺伝子型特異的トランスクリプトームシグネチャを確立するために、ａｐｏＥ遺伝子型情報を有する２つの最大の公的ヒト側頭葉トランスクリプトームデータセット−ＧＳＥ１５２２２（ｎ＝２１３）およびＳｙｎ３１５７５５５−ＭａｙｏＥＧＷＡＳ（ｎ＝３９７）を解析した。データセットはノンパラメトリックアルゴリズムであるＲａｎｋＰｒｏｄを用いて、メタ解析のためにａｐｏＥ遺伝子型で層別化した。平均偽発見率（ＦＤＲ）調整値＜０．０５および平均絶対推定倍率変化（ＦＣ）＞１．３×を有する遺伝子をさらに解析した。ａｐｏＥ遺伝子型とマッチした対照との比較は、ａｐｏＥ４／４、ａｐｏＥ３／４、およびａｐｏＥ３／３遺伝子型を有するＡＤ対象において、それぞれ３１４，１５０および６９６の遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを示した。驚くべきことに、わずか３１のＤＥ遺伝子（全ＤＥ遺伝子の２．７％）が３つのＡＤ群のすべてで共有され、ＡＤ病因における各ａｐｏＥ遺伝子型の独特な病理生物学を強調した。ＣＭａｐデータベースへのＡＤのａｐｏＥ−遺伝子型特異的トランスクリプトームシグネチャを適用し、治療予測を作成した。ＦＤＡ承認のループ利尿薬であるブメタニドはａｐｏＥ４／４ＡＤに対して最良の予測スコアを有し、ａｐｏＥ３／４およびａｐｏＥ３／３ＡＤに対してより弱いＣＭａｐスコアを有していた。ＣＭａｐデータベースにおけるブメタニド処理細胞において、ａｐｏＥ４／４ＡＤでアップレギュレートされた遺伝子は下方にシフトし（より高いランク数、モンテカルロシミュレーションによるＰ＝０．００３）、ａｐｏＥ４／４ＡＤでダウンレギュレートされた遺伝子は上方にシフトし（より低いランク数、モンテカルロシミュレーションによるＰ＝０．００２）、ブメタニドのトランスクリプトーム摂動シグネチャはａｐｏＥ４／４ＡＤのそれと負に相関することを確認した。
【０１６８】
本明細書に記載されたＡＤに対するドラッグリポジショニングアプローチは、疾患状態において差次的に発現する（ＤＥ）遺伝子を対照レベルに戻るように摂動または「反転（ｆｌｉｐ）」する薬物が、この疾患に対して有効であり得るという十分に検証された仮説に基づいている９〜１５。このパイプライン内で、第１のステップは、ＡＤのａｐｏＥ遺伝子型特異的トランスクリプトームシグネチャを確立することであった。第２は、検証済みのコンピュータによるドラッグリポジショニングアルゴリズム９，１１，１２，１６を適用して、１３００の薬物のトランスクリプトーム摂動シグネチャを含むＣＭａｐデータベースをクエリーする（ｑｕｅｒｙ）ことであった８。各化合物は、ａｐｏＥ遺伝子型特異的ＡＤにおける治療可能性の予測スコアを受け取った１１，１２，１６。負のスコアは、化合物が疾患のトランスクリプトームシグネチャを逆転させる可能性があることを示唆した。ＡＤのトランスクリプトームシグネチャを各化合物により摂動されたものと比較したため、予測戦略は孤立した経路を標的とする仮説駆動アプローチによるものよりもむしろ疾患のＤＥ遺伝子シグネチャにより駆動された。最後に、実施例２および３で考察したように、最も予測される薬物をａｐｏＥ４駆動ＡＤのマウスモデルで試験し、効力を確認し、作用機序を探索した。
【０１６９】
図１は、ＡＤのａｐｏＥ遺伝子型特異的トランスクリプトームシグネチャを示す。パネル（ａ）は、データセットの選択および統合、ａｐｏＥ遺伝子型の層別化、遺伝子のＤＥ解析、ドラッグリポジショニング解析、ならびに行動的およびトランスクリプトーム的検証を含む実験的ワークフローを示す。パネル（ｂ）は、ＡＤおよび対照データセットＧＳＥ１５２２２（ｎ＝２１３）およびＳｙｎ３ｌ５７２５５−ＭａｙｏＥＧＷＡＳ（ｎ＝３９７）のａｐｏＥ遺伝子型構成を示す。ａｐｏＥ４対立遺伝子表現（ａｐｏＥ３／４およびａｐｏＥ４／４）はＡＤ群で大きかった（ａｐｏＥ４キャリア対ＡＤにおける非キャリア対対照集団のχ２検定、Ｐ＜０．００１）。パネル（ｃ，ｄ）は、ａｐｏＥ遺伝子型特異的、ランクに基づくメタ解析から、重複し、ユニークにアップレギュレートされた（ｃ）およびダウンレギュレートされた（ｄ）ＤＥ遺伝子（推定絶対ＦＣ＞１．３ｘ、ＦＤＲ＜０．５）のベン（Ｖｅｎｎ）図を示す。ａｐｏＥ４／４ＡＤでは１５３遺伝子が、ａｐｏＥ３／４ＡＤでは１５遺伝子が、ａｐｏＥ３／４ＡＤでは３１９遺伝子が特異的に有意にアップレギュレートされた。これらの群で共有されたＤＥ遺伝子はわずか１８遺伝子であった。ａｐｏＥ４／４ＡＤでは６９遺伝子が、ａｐｏＥ３／４ＡＤでは８遺伝子が、ａｐｏＥ３／４ＡＤでは１９３遺伝子が特異的に有意にダウンレギュレートされた。１３のＤＥ遺伝子は３群全てで共有された。パネル（ｅ）は、ａｐｏＥ−遺伝子型に特異的な群にわたって共有され、ユニークで有意に濃縮されたオントロジー経路のベン図を示す。１９の経路がａｐｏＥ４／４ＡＤで、１０がａｐｏＥ３／４ＡＤで、２８がａｐｏＥ３／３ＡＤでユニークに有意に濃縮された。３つの経路は、３つの全ての群で共有された。
【０１７０】
ＡＤのａｐｏＥ遺伝子型特異的トランスクリプトームシグネチャを確立するため、２つの最大の公的（ｐｕｂｌｉｃ）ヒト側頭葉トランスクリプトームデータセットであるＧＳＥ１５２２２（ｎ＝２１３）１７およびＳｙｎ３１５７２５５−ＭａｙｏＥＧＷＡＳ（ｎ＝３９７）１８をａｐｏＥ遺伝子型情報で解析した（図１、パネルａ；図５）。ほとんどの臨床研究６と同様に、各データセットのＡＤ群は対照群よりもａｐｏＥ３／４およびａｐｏＥ４／４キャリアが比例的に多かった（図１、パネルｂ）。データセットはノンパラメトリックアルゴリズムであるＲａｎｋＰｒｏｄ１９を用いたメタ解析のためにａｐｏＥ遺伝子型によって階層化した（図１、パネルａ）。平均偽発見率（ＦＤＲ）で調整したＰ値＜０．０５および平均絶対推定倍率変化（ＦＣ）＞１．３ｘを有する遺伝子をさらに解析した。ａｐｏＥ遺伝子型とマッチした対照との比較は、ａｐｏＥ４／４、ａｐｏＥ３／４、およびａｐｏＥ３／３遺伝子型を有するＡＤ対象において、それぞれ３１４、１５０および６９６の遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを示した（図１、パネルｃおよびｄ）。驚くべきことに、わずか３１のＤＥ遺伝子（全ＤＥ遺伝子の２．７％）が３つすべてのＡＤ群で共有され（図１、パネルｃおよびｄ）、ＡＤ病因における各ａｐｏＥ遺伝子型の特異な病理生物学を強調した。
【０１７１】
オントロジー解析は、ＡＤのａｐｏＥ４／４−、ａｐｏＥ３／４−、およびａｐｏＥ３／３−特異的シグネチャにおいて２８、２４、および４８の摂動（ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ）経路を同定した（図１、パネルｅ）。３つ（すべての摂動経路の３％）は３つのＡＤ群すべてで共有され（図１、パネルｅ）、ＡＤの分子環境に対する各ａｐｏＥ遺伝子型の特異な効果をさらに強調した。
【０１７２】
次に、ＡＤのａｐｏＥ−遺伝子型特異的トランスクリプトームシグネチャをＣＭａｐデータベースに適用して、治療予測を作成した１６。図２は、ａｐｏＥ４／４ＡＤの最上位予測薬物候補としてブメタニドを同定するａｐｏＥ−遺伝子型特異的ドラッグリポジショニング解析を示す。図２のパネル（ａ−ｃ）は、（ａ）ａｐｏＥ４／４特異的、（ｂ）ａｐｏＥ３／４特異的、および（ｃ）ａｐｏＥ３／３特異的トランスクリプトームシグネチャに対するＣＭａｐスコアで順序付けられたＣＭａｐ化合物のグラフを示す。ＣＭａｐスコアは３つの遺伝子型の全てについて負であったが、ブメタニドに関連したＣＭａｐスコアの調整後のｐ値（Ｑ）は最上位予測薬物としてのａｐｏＥ４／４およびａｐｏＥ３／３ＡＤに対して有意であったが、ａｐｏＥ３／４ＡＤに対しては有意ではなかった。パネル（ｄ）は、ＡＤのａｐｏＥ４／４特異的トランスクリプトームシグネチャからの遺伝子のヒートマップを示しており、ａｐｏＥ４／４ＡＤにおいて、推定されるＦＣによってランク付けおよびカラーコード化され（ｃｏｌｏｒ  ｃｏｄｅｄ）（左）、次いで、ＣＭａｐランクによって再び、カラーコード化されている（右）。ブメタニドは、ＡＤのａｐｏＥ４／４特異的トランスクリプトームシグネチャにおけるアップレギュレートされた遺伝子とダウンレギュレートされた遺伝子の両方の発現ランクを反転させる。パネル（ｅ）は、ＣＭａｐデータからのＦＣランク対ａｐｏＥ４／４ＡＤにおけるＤＥ遺伝子の推定ＦＣを、ランクに基づくメタ解析により決定して示す（図１参照）。水平方向の点線は、推定ＦＣカットオフ値１．３（ＡＤのａｐｏＥ４／４シグネチャにおける１５１のアップレギュレートされた遺伝子および７１のダウンレギュレートされた遺伝子を、ＣＭａｐデータで共有した）を示す。ＣＭａｐデータにおけるブメタニド処理後の全遺伝子の平均ＦＣランクは１１，０６６．５４（灰色の垂直方向の点線）であった。ａｐｏＥ４／４ＡＤでアップレギュレートされた１５１の遺伝子は、平均ＦＣランク１２，３９３．６２（赤色の垂直方向の点線）を有し、ブメタニドに反応した低いランクおよび低い発現を示した。ａｐｏＥ４／４ＡＤにおける７１のダウンレギュレートされた遺伝子は、８，８１５．２２（垂直方向の赤線）の平均ＦＣランクを有し、ブメタニドに反応したより高いランクおよびより高い発現を示した。右のｙ軸は、スキャッタプロット値のヒストグラムにおける遺伝子の数を示す。パネル（ｆ、ｇ）は、ａｐｏＥ４／４ＡＤにおいてアップレギュレートされた遺伝子（ｎ＝１５１）（ｆ）とダウンレギュレートされた遺伝子（ｎ＝７１）（ｇ）に対するＣＭａｐからのブメタニド処理データからランダムに採取したサイズ−適合遺伝子セットの１０００の置換（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ）のＦＣランクのヒストグラムを示す。ブメタニド処理後のヒトａｐｏＥ４／４特異的アップレギュレーション遺伝子のＦＣランク（１２，３９３．６２、垂直方向の赤い点線）は、モンテカルロシミュレーションにより計算した１０００の置換の平均より有意に高く（モンテカルロシミュレーション、Ｐ＝０．００３）、ブメタニド処理後のダウンレギュレーション遺伝子のＦＣランク（８，８１５．���２、垂直方向の赤い線）は有意に低く（モンテカルロシミュレーション、Ｐ＝０．００２）、それぞれ低発現と高発現へのシフトを示した。
【０１７３】
ＦＤＡ承認ループ利尿薬であるブメタニドは、ａｐｏＥ４／４ＡＤに対して最良の予測スコアを示し（図２、パネルａ）、ａｐｏＥ３／４およびａｐｏＥ３／３ＡＤに対してはるかに弱いＣＭａｐスコアを示した（図２、パネルｂおよびｃ）。ＣＭａｐデータベースにおけるブメタニド処理細胞において、ａｐｏＥ４／４ＡＤでアップレギュレートされた遺伝子は下方にシフトし（モンテカルロシミュレーションによる上位ランク数Ｐ＝０．００３）、ａｐｏＥ４／４ＡＤでダウンレギュレートされた遺伝子は上方にシフトし（低ランク数、モンテカルロシミュレーションによるＰ＝０．００２）（図２、パネルｄ〜ｇ）、ブメタニドのトランスクリプトーム摂動シグネチャはａｐｏＥ４／４ＡＤのそれと負に相関することを確認した。
【０１７４】
また、ヒトＥ３／４トランスクリプトームシグネチャはヒトＥ４／４ＡＤシグネチャと大きく異なり（図１）、Ｅ３／４に対するブメタニドの薬物予測スコアはＥ３／３ＡＤよりもさらに厳しい（図２）ことが観察される。
【０１７５】
実施例２
記憶に対するブメタニドの効果に関するインビボ動物モデル試験
研究プロトコルが記載され、結果がここに示される。
【０１７６】
以下に示すように、ブメタニドの効果を、インビボでＡｐｏＥ３／３とＡｐｏＥ４／４ノックイン（ＫＩ）マウスで試験した。全体として、ブメタニドで処理したａｐｏＥ４／４遺伝子型のマウスでは認知機能が改善することが観察された。
【０１７７】
老齢のａｐｏＥ４−ＫＩマウスおよびａｐｏＥ３−ＫＩマウスの空間学習および記憶能力に対するブメタニドの効果を測定した。モリス水迷路（ＭＷＭ）を用いて、隠れプラットフォーム学習トライアルで５日間以上（ｏｖｅｒ）の空間学習と記憶を試験し、その後、最後の隠れトライアル後の２４時間での短期記憶、７２時間および１２０時間での長期記憶のプローブトライアルを行った。学習曲線と遊泳速度は、隠れトライアルの間、遺伝子型または治療群で相違はなかった。しかしながら、ビヒクル処理ａｐｏＥ４−ＫＩマウスはビヒクル処理ａｐｏＥ３−ＫＩマウスでは見られない短期空間記憶の障害を有した。驚くべきことに、ブメタニドは、２４時間プローブトライアルにおいて、ａｐｏＥ４−ＫＩマウスの記憶障害を回復させ、ａｐｏＥ３−ＫＩマウスと同様のパフォーマンスを示した。ブメタニド処理ａｐｏＥ３−ＫＩマウスとビヒクル処理ａｐｏＥ３−ＫＩマウスは等しく良好なパフォーマンスを示し、ブメタニドが記憶形成に悪影響を及ぼさないことを示唆している。１２０時間プローブトライアルでは、ブメタニド処理ａｐｏＥ４−ＫＩマウスは依然としてターゲット象限に対して有意な選好性を有し、強力な長期記憶を示した。興味深いことに、ブメタニド処理ａｐｏＥ３−ＫＩマウスは１２０時間プローブトライアルにおいて隠れプラットフォーム位置を記憶したが、ビヒクル処理ａｐｏＥ３−ＫＩマウスは記憶しなかった。これはブメタニドが老齢のａｐｏＥ３−ＫＩマウスの長期記憶に及ぼす有益な効果を示唆するものである。空間記憶のより厳密な試験では、各プローブトライアル中の他の象限の類似領域に対するターゲットプラットフォーム位置の正確な交差を、記憶能力の特異性と正確性を評価するために計数した。驚くべきことに、ブメタニド処理ａｐｏＥ４−ＫＩマウスは、２４時間および１２０時間プローブトライアルの両方でターゲット象限で有意により多くのプラットフォーム交差を示したが、ａｐｏＥ３−ＫＩマウスは示さなかった。このように、ブメタニドはａｐｏＥ４−ＫＩマウスにおける短期および長期記憶能力の精度を回復させた。これらの知見は、プローブトライアルにおける最初の１０秒以内のプラットフォーム位置への移動距離を評価することによって確証された。このようにブメタニドは老齢ａｐｏＥ４−ＫＩマウスにおける短期及び長期記憶及び記憶精度を回復させ、老齢ａｐｏＥ３−ＫＩマウスの記憶精度ではなく長期記憶を増強した。
【０１７８】
図３は、ブメタニド治療が特に老齢ａｐｏＥ４−ＫＩマウスにおける空間記憶障害を救済することを示す。パネル（ａ）はＭＷＭ試験の概略図を示す。マウスは迷路の入水ポイントに配置され、遠位の空間的手がかりを使用して隠れているプラットフォームを見つける。パネル（ｂ）は、ブメタニド（０．０２ｍｇ／ｋｇの低用量と０．２ｍｇ／ｋｇの高用量を８週間の間、毎日腹腔内投与）およびビヒクル処理ａｐｏＥ３−ＫＩマウス（それぞれｎ＝１１、１０、１０）およびａｐｏＥ４−ＫＩマウス（それぞれｎ＝１０、９、１０）の、学習日１〜５日にわたる脱出レイテンシー（ｅｓｃｐｅ  ｌａｔｅｎｃｙ）を示し、群間に差はなかった。パネル（ｃ）は、２４時間プローブトライアルにおいて、低用量および高用量ブメタニド処理の両方が、他の象限における平均時間の割合（％）（各治療条件の右のバー）に対するａｐｏＥ４−ＫＩマウスがターゲット象限で費やす時間の割合（％）（各治療条件の左のバー）が、ビヒクル処理ａｐｏＥ３−ＫＩマウスのレベルまで増加したことを例示している。高用量ブメタニド処理は、ビヒクル処理ａｐｏＥ３−ＫＩマウスと比較してａｐｏＥ３−ＫＩマウスの記憶を障害した。パネル（ｄ）は、ｌ２０時間プローブトライアルにおいて、高ブメタニド処理ａｐｏＥ４−ＫＩマウスが対照よりもターゲット象限（各治療条件の左のバー）でより多くの時間を過ごしたことを示している。パネル（ｅ、ｆ）は、２４時間（ｅ）および１２０時間（ｆ）プローブトライアルにおいて、高用量ブメタニド処理が、ａｐｏＥ４−ＫＩマウスにおいてターゲット象限（各治療条件の左のバー）で他の象限（各治療条件の右のバー）と比較してプラットフォーム交差を有意に増加させたことを示している。値は平均±ＳＥＭである。ｃ−ｆの群内差は対応のある（ｐａｉｒｅｄ）両側ｔ検定で求め、ｐ値は図のパネルに示すとおりである。ｃ−ｆにおいて、ｌｏ−Ｂｕｍはブメタニド治療群の低用量を示し、ｈｉ−Ｂｕｍはブメタニド治療群の高用量を示す。
【０１７９】
図６（パネル（ａ）および（ｂ））は、ブメタニド処理が遊泳速度または可視トライアルのパフォーマンスに影響を及ぼさないことを示している：（ａ）ブメタニドは、ａｐｏＥ４−ＫＩおよびａｐｏＥ３−ＫＩマウスの隠れプラットフォームトライアル中に遊泳速度に有意に影響を及ぼさなかった；（ｂ）可視トライアルではいずれの群にも有意差がなく、いずれの群にも運動障害または視覚障害がなかったことを示している。
【０１８０】
インビボ検証のため、１６か月齢のａｐｏＥ４−ＫＩマウスにおける認知障害に対するブメタニド治療（０．０２ｍｇ／ｋｇの低用量と０．２ｍｇ／ｋｇの高用量を８週間にわたり毎日腹腔内投与）の効果を調べた。モリス水迷路（ＭＷＭ）２０〜２３を用いて、隠れプラットフォーム学習トライアルで５日間にわたる（ｏｖｅｒ）の空間学習と記憶を試験し、その後、最後の隠れトライアル後の２４時間での短期記憶、１２０時間での長期記憶のプローブトライアルを行った（図３、パネルａ）。学習曲線と遊泳速度は、隠れトライアルおよび可視トライアルの間、遺伝子型または治療群で相違はなかった（図３、パネルｂ；図６、パネルａ、ｂ）。しかしながら、ビヒクル処理ａｐｏＥ４−ＫＩマウスはビヒクル処理ａｐｏＥ３−ＫＩマウスでは見られない短期空間記憶の障害があった（図３、パネルｃ）。驚くべきことに、低用量および高用量のブメタニド処理はいずれも、２４時間プローブトライアルにおいて、ａｐｏＥ４−ＫＩマウスの短期の記憶障害を回復させ、ａｐｏＥ３−ＫＩマウスと同様のパフォーマンスを示した（図３、パネルｃ）。低用量ブメタニド処理ａｐｏＥ３−ＫＩマウスとビヒクル処理ａｐｏＥ３−ＫＩマウスは等しく良好なパフォーマンスを示し、低用量ブメタニドが記憶形成に悪影響を及ぼさないことを示唆している。しかしながら、高用量ブメタニド処理は、２４時間プローブトライアルにおいてａｐｏＥ３−ＫＩマウスの短期記憶を障害し（図３、パネルｃ）、ａｐｏＥ４−ＫＩマウスに対するブメタニドの有益な効果の特異性を示した。１２０時間プローブトライアルでは、高ブメタニド処理ａｐｏＥ４−ＫＩマウスは依然としてターゲット象限に対して有意な選好性を有し（図３、パネルｄ）、ａｐｏＥ４−ＫＩマウスの長期記憶に対するブメタニドの強い有益な効果を示した。興味深いことに、低用量および高用量のブメタニドで処理されたａｐｏＥ３−ＫＩマウスはいずれも１２０時間プローブトライアルにおいてビヒクル処理ａｐｏＥ３−ＫＩマウスと同様に隠れプラットフォーム位置を忘れ（図３、パネルｄ）、長期記憶に対するブメタニドの有益な効果はａｐｏＥ４−ＫＩマウスに特異的であることを更に示唆した。
【０１８１】
空間記憶のより厳密な試験では、各プローブトライアル中の他の象限の類似領域に対するターゲットプラットフォーム位置の正確な交差を計数して、記憶能力の特異性と正確性を評価した。驚くべきことに、高用量ブメタニド処理ａｐｏＥ４−ＫＩマウスは、２４時間および１２０時間プローブトライアルの両方でターゲット象限で有意により多くのプラットフォーム交差を示したが、ａｐｏＥ３−ＫＩマウスは示さなかった（図３、パネルｅおよびｆ）。低用量のブメタニドで処理したａｐｏＥ４−ＫＩマウスは２４時間プローブトライアルにおいて短期記憶精度の有意な改善傾向を示した（図３、パネルｅ）。まとめると、これらのデータはブメタニドが特にａｐｏＥ４−ＫＩマウスにおいて短期および長期記憶能力の精度を回復させることを示している。
【０１８２】
実施例３
ブメタニドがトランスクリプトームに及ぼす影響のインビボ試験
インビボでトランスクリプトームに対するブメタニドの作用を調べるために、ビヒクルまたはブメタニド（０．２ｍｇ／ｋｇ／日腹腔内注射）で８週間処理したａｐｏＥ４−ＫＩマウス由来海馬（ＡＤ病理の震央と考えられる側頭葉領域）のＲＮＡ配列解析を行った。階層的クラスタリングおよび主成分分析は、ブメタニド対ビヒクル処理からのＤＥ遺伝子に基づくサンプルの有意なクラスタリングを示し、海馬における異なる薬物効果を示唆した。さらに、ブメタニド処理ａｐｏＥ４−ＫＩマウスでは、ａｐｏＥ４／４ＡＤで有意にアップレギュレートされた遺伝子は、それらの発現ランクで（高い番号のランクに対して）シフトダウンし（モンテカルロシミュレーションによるＰ＜０．００１）、ＣＭａｐデータおよび疾患特異的トランスクリプトームシグネチャの反転は、動物モデルでも、コンピュータによるドラッグリパーパシングに対する合理的な戦略であるという仮説を裏付けた。ａｐｏＥ４−ＫＩマウス（Ｐ＜０．０５）においてブメタニドによって発現が最も影響を受ける遺伝子の経路解析により、７１の有意に摂動された経路を同定した。興味深いことに、これらの経路のうち６つはａｐｏＥ４／４ＡＤシグネチャに富む経路：ＧＡＢＡ受容体シグナル伝達、ｃＡＭＰ媒介シグナル伝達、Ｇタンパク質共役受容体シグナル伝達、ＶＤＲ／ＲＸＲ活性化、シナプス長期抑制、およびＣＣＲ３経路、と重複した。
【０１８３】
図４は、ａｐｏＥ４−ＫＩマウスの海馬におけるブメタニドのトランスクリプトーム摂動シグネチャのＲＮＡ−ｓｅｑ解析を示す。パネル（ａ）は、ブメタニド（０．２ｍｇ／ｋｇを８週間腹腔内投与）またはビヒクルで処理した後のａｐｏＥ４−ＫＩマウスからの海馬組織のＲＮＡ−ｓｅｑによって定量化されたＤＥ遺伝子のスケール化された正則化ｌｏｇ（ｒｌｄ）変換ＲＮＡ発現レベルの階層的クラスタリング解析を示す。（Ｐ＜０．０５）。カラーバーは、スケール化されたｒｌｄ発現レベルを示す。パネル（ｂ）は、ａｐｏＥ４−ＫＩマウス海馬組織におけるＤＥ遺伝子の主成分分析（ＰＣＡ）を提示し、ビヒクル処理サンプルからブメタニド処理試サンプルを区別している。主成分１（ＰＣ１）は分散の５７．４％を、ＰＣ２は１１．２％を占める。パネル（ｃ）は、ａｐｏＥ４−ＫＩマウス海馬中のＲＮＡ−ｓｅｑによっても検出されたヒト側頭葉サンプルの解析から得られた、ＡＤのａｐｏＥ４／４−特異的トランスクリプトームシグネチャを表す遺伝子セットを示す（図１参照）。ブメタニド処理後のａｐｏＥ４−ＫＩマウス海馬組織におけるこれら遺伝子の発現ランクの変化を、ビヒクル処理と比較して、ａｐｏＥ４／４ＡＤのヒト側頭葉サンプルにおける推定ＦＣに対して健常な対照と比較してプロットした。ブメタニド処理後の全遺伝子の発現ランクの平均変化は予想通り０であった（垂直方向の灰色の点線）。ａｐｏＥ４／４ヒトＡＤでアップレギュレートされた１５７の遺伝子は、ブメタニド処理後に４９．７６の発現ランクの平均変化を示し（垂直方向の赤色の点線）、ブメタニドに反応して低ランクおよび低発現へのシフトを示した。右のｙ軸は、スキャッタプロット値のヒストグラムにおける遺伝子の数を示す。パネル（ｄ）および（ｅ）は、ａｐｏＥ４／４ＡＤにおけるアップレギュレートされた遺伝子（ｎ＝１５７）（ｄ）およびダウンレギュレートされた遺伝子（ｎ＝５６）（ｅ）のセットに対するサイズが一致した遺伝子セットの１０００のランダムな置換のブメタニド処理後の発現ランクの平均変化のヒストグラムを示す。ブメタニド処理後のヒトａｐｏＥ４／４特異的アップレギュレートされた遺伝子の発現ランクの平均変化（４９．７６、赤い点線）は、モンテカルロシミュレーションにより計算した０（１０００の置換の平均）より有意に高く、より低い発現への有意なシフトを示した；ダウンレギュレートされた遺伝子の発現ランクの平均変化は０から有意にシフトしなかった。パネル（ｆ）は、ヒトのａｐｏＥ４／４ＡＤで有意に濃縮された経路と比較して、ブメタニド処理後のａｐｏＥ４−ＫＩマウスの海馬からのＤＥ遺伝子におけるＩｎｇｅｎｕｉｔｙ（登録商標）Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）による特異的（６５）および共有する（６）の有意に濃縮されたオントロジー的経路のベン図と表である（Ｐ＜０．０５）。
【０１８４】
階層的クラスタリングおよび主成分分析は、ブメタニド対ビヒクル処理からのＤＥ遺伝子に基づくサンプルの有意なクラスタリングを示し（図４、パネルａおよびｂ）、海馬における異なる薬物効果を示唆している。さらに、ブメタニド処理ａｐｏＥ４−ＫＩマウスでは、ａｐｏＥ４／４ＡＤで有意にアップレギュレートされた遺伝子は、それらの発現ランクで（高い数のランクに対して）シフトダウンし（図４、パネルｃおよびｄ、モンテカルロシミュレーションによるＰ＜０．００１）、ＣＭａｐデータおよび疾患特異的トランスクリプトームシグネチャの反転は、動物モデルでも、コンピュータによるドラッグリパーパシングに対する合理的な戦略であるという仮説を裏付けた。しかしながら、ａｐｏＥ４−ＫＩマウスにおいて、ブメタニドはａｐｏＥ４／４ＡＤでダウンレギュレートされた遺伝子のより小さなサブセットを変化させなかった（図４、パネルｅ）が、これはおそらくダウンレギュレートされた遺伝子のいくつかがａｐｏＥ４／４ＡＤでの遺伝子発現の変化ではなく細胞死を反映するためである。
【０１８５】
全体として、ａｐｏＥ４−ＫＩマウス（Ｐ＜０．０５）においてブメタニドによって発現が最も影響を受ける遺伝子の経路解析により、７１の有意に摂動された経路を同定した。興味深いことに、これらの経路のうち６つはａｐｏＥ４／４ＡＤシグネチャに富む経路：ＧＡＢＡ受容体シグナル伝達、ｃＡＭＰ媒介シグナル伝達、Ｇタンパク質共役受容体シグナル伝達、ＶＤＲ／ＲＸＲ活性化、シナプス長期抑制、およびＣＣＲ３経路、と重複した（図４、パネルｆ）。
【０１８６】
参考文献
【０１８７】
【表１−１】
2021521198.tif 000003
【０１８８】
【表１−２】
2021521198.tif 000004
【０１８９】
補足の参考文献
【０１９０】
【表２】
2021521198.tif 000005
【０１９１】
いくつかの例示的な態様および実施形態が上記で論じられてきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更を加えて同等物を置き換えることができることを当業者は理解すべきである。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセスステップまたは複数のステップを本発明の目的、精神および範囲に適合させるために、それらの多くの修正、置換、追加、およびサブコンビネーションを行うことができる。このような変更はすべて、本明細書に添付された特許請求の範囲内にあることが意図されている。
【０１９２】
実施例４
ブメタニド処理は老齢ａｐｏＥ４−Ｋ１マウスにおけるニューロンの可塑性および興奮性欠損を回復する。
【０１９３】
ａｐｏＥ４特異的行動救済の根底機序のより良好な理解を得るために、長期増強（ＬＴＰ）に対するブメタニドの遺伝子型特異的効果を試験した。ＬＴＰはニューロン可塑性の電気生理学的測定である。これは正常な記憶形成の基礎となる分子機構と考えられており、ＡＤの動物モデルでは損なわれている。老齢（１６ヵ月齢）ａｐｏＥ４−ＫＩマウスの記憶障害と一致して、海馬切片のＣＡ１領域で記録されたＬＴＰは、老齢のビヒクル投与ａｐｏＥ４−ＫＩマウスでは、年齢が一致したビヒクル投与ａｐｏＥ３−ＫＩマウスと比較して有意な欠損を示した（図１２、パネルａおよびｂ）。ブメタニド処理（０．２ｍｇ／ｋｇ、８週間）は老齢ａｐｏＥ４−ＫＩマウスにおけるＬＴＰ欠損を完全に救済した（図１２、パネルａおよびｂ）。さらに、入出力曲線解析で測定したａｐｏＥ４−ＫＩマウスの海馬のＣＡ１領域におけるニューロンの過剰興奮性もブメタニド処理で正常化した（図１２、パネルｃ）。このように、インビボブメタニド処理は老齢ａｐｏＥ４−ＫＩマウスの海馬において正常記憶形成の基礎となるニューロン可塑性および興奮性を回復させた。
【０１９４】
上で議論したように、図１２は、ブメタニド治療が老齢ａｐｏＥ４−ＫＩマウスにおけるニューロン可塑性欠損を特に救済することを示すグラフを提供する。（パネルａとｂ）８週間の高用量（０．２ｍｇ／ｋｇ）ブメタニド処理はａｐｏＥ４−ＫＩマウス由来のエクスビボ海馬切片におけるＬＴＰ欠損を救済した。シータバースト刺激（ＴＢＳ）誘導ＬＴＰを、１６か月齢のビヒクル処理ａｐｏＥ３−ＫＩマウス（ｎ＝６匹のマウスからの１４の脳切片）、ブメタニド処理ａｐｏＥ３−ＫＩマウス（ｎ＝３匹のマウスの１１の脳切片）、ビヒクル処理ａｐｏＥ４−ＫＩマウス（ｎ＝６匹のマウスからの１４の脳切片）、及びブメタニド処理ａｐｏＥ４−ＫＩマウス（ｎ＝３匹のマウスからの１２の脳切片）からのエクスビボ海馬切片で測定した。平均ｆＰＳＰ勾配値を１分間隔にバイナリ化し、対照（ａ）に正規化した。実験群間のＬＴＰ獲得結果をまとめた（ｂ）。（パネルｃ）高用量ブメタニド処理はａｐｏＥ４−ＫＩマウス由来のエクスビボ海馬切片における海馬ネットワーク興奮性欠損を救済した。Ｓｈａｅｆｆｅｒ側枝−ＣＡ１ネットワークにおける入出力関係を、１６か月齢の、ビヒクル処理ａｐｏＥ３−ＫＩマウス（ｎ＝７匹のマウスの２３の脳切片）、ブメタニド処理ａｐｏＥ３−ＫＩマウス（ｎ＝３匹のマウスの１０の脳切片）、ビヒクル処理ａｐｏＥ４−ＫＩマウス（ｎ＝３匹のマウスの１１の脳切片）、およびブメタニド処理ａｐｏＥ４−ＫＩマウス（ｎ＝３匹のマウスの１２の脳切片）からのエクスビボ海馬切片で測定した。増加する刺激振幅にわたる平均ｆＰＳＰ勾配値（最小に正規化）を示した。値は平均±ＳＥＭである。両側ｔ検定を、ｂの群間のＬＴＰ増加量（ｇａｉｎ）の結果の統計解析に使用した。マンホイットニーＵ検定を使用して、ｃの動物群間の差異を解析した。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【０１９５】
実施例５
ブメタニド処理は老齢ａｐｏＥ４−ＫＩマウス海馬における選択的ニューロン型におけるａｐｏＥ４／４ＡＤトランスクリプトームシグネチャ遺伝子を反転する。
【０１９６】
インビボで個々の海馬細胞のトランスクリプトームに対するブメタニドの作用を調べるために、異なる遺伝子発現の単一核ＲＮＡ−ｓｅｑ解析を、ビヒクルまたはブメタニド（０．２ｍｇ／ｋｇ／日の腹腔内注射）で８週間処理したａｐｏＥ４−ＫＩマウス由来の海馬（ＡＤ病理の震央と考えられる側頭葉領域）におけるブメタニド処理後に実施した。海馬細胞の１８の異なるクラスターを同定し、細胞型特異的薬物効果に対し更に解析した（図１３Ａ〜１３Ｃ）。ＳＳＴ／ＰＶ介在ニューロンだけでなく、全ての興奮性および混合ニューロンクラスターを含む１２の細胞型において、ａｐｏＥ４／４ＡＤでアップレギュレートされた遺伝子は、ブメタニド処理後に、より高いランク数に向かって下方にシフトし、ａｐｏＥ４／４ＡＤでダウンレギュレートされた遺伝子は、より低いランク数に向かって上方にシフトし（モンテカルロシミュレーションによるＰ＜０．０５）、ブメタニドのトランスクリプトーム摂動シグネチャは、これらの神経細胞型におけるヒトａｐｏＥ４／４ＡＤのそれと負に相関することを確認した（図１３Ｄおよび１３Ｅ）。このシフトは、ＣＭａｐデータおよび疾患特異的トランスクリプトームシグネチャの反転が、動物モデルの神経細胞においてさえ、コンピュータによるドラッグリパーパシングの合理的戦略であるという仮説を裏付けている。このシフトはＤＥ遺伝子の数に関係なく興奮性神経細胞型とＳＳＴ／ＰＹ介在ニューロン間で見られ、この効果は薬物効果とクラスターサイズの両方でロバストであることを示唆している（図１３Ｆ）。ヒトのａｐｏＥ４／４ＡＤ遺伝子の有意な「反転」を有する神経細胞型の少なくとも１つに濃縮された１０４のオントロジー経路があり（ｐ＜０．００５）（図１３Ｇ）、そのうちの１９は、ヒトのａｐｏＥ４／４媒介ＡＤにおいても濃縮されていた（黒矢印で識別される）。
【０１９７】
上述のように、図１３Ａ〜１３Ｇは、ａｐｏＥ４−ＫＩマウスの海馬におけるブメタニドのトランスクリプトーム摂動シグネチャの単一核ＲＮＡ−ｓｅｑ解析の結果を示す概略図、プロット、およびグラフを提供する。（図１３Ａ）ブメタニドとビヒクル処理マウスの海馬由来の２４，０００以上の核を、ハイスループットバーコード多重化による単一実験で一緒に配列決定した。（図１３Ｂ）ｔ−ＳＮＥによるクラスタリングおよび可視化は、細胞型に従ってコード化された１８の別個のクラスターを識別する。アスタリスクは、ヒト側頭葉サンプルＡＤの解析から得られたＡＤのａｐｏＥ４／４特異的トランスクリプトームシグネチャにおけるアップレギュレートされた遺伝子のＦＣの平均ランクが有意にダウンレギュレートされ、ヒトａｐｏＥ４／４ＡＤにおけるダウンレギュレートされた遺伝子が有意にアップレギュレートされているクラスターを示す（Ｐ＜０．０５）。（図１３Ｃ）治療によって色分けされたクラスターは、明確な薬物効果を示す。（図１３Ｄ）４つの代表的なクラスターにおけるａｐｏＥ４−ＫＩマウス海馬の単一核ｓｅｑによっても検出されたＡＤ遺伝子セットのヒトａｐｏＥ４／４特異的トランスクリプトームシグネチャのヒストグラム。ブメタニド処理後のａｐｏＥ４−ＫＩマウス海馬における歯状回顆粒細胞クラスター、ＣＡ１ニューロンクラスター、ＣＡ２／３ニューロンクラスター、およびＳｓｔ／Ｐｖニューロン間クラスターにおけるこれら遺伝子のＦＣのランクを、ビヒクル処理と比較して、ｘ軸対ｙ軸上のそのランクにおける遺伝子数でプロットした。この遺伝子セット内のすべての遺伝子の平均ランクは黒い線で示され、アップレギュレートされた遺伝子（ヒストグラムで赤で表示）の平均ＦＣランクは赤い点線で示され、ダウンレギュレートされた遺伝子（ヒストグラムで青で表示）の平均ＦＣランクは青い点線で示されている。モンテカルロシミュレーションにより計算した、全ての遺伝子のランク平均から離れた、アップレギュレートされたＦＣランク平均とダウンレギュレートされたＦＣランク平均の「反転」の有意性のＰ値を示す（Ｐ＜０．０５が有意と考えられる）。（図１３Ｅ）ＡＤのａｐｏＥ４／４特異的トランスクリプトームシグネチャからの遺伝子のヒートマップであり、ヒトａｐｏＥ４／４ＡＤにおける推定ＦＣによってランクが順序付けられ、色分けされたもの（上）、およびａｐｏＥ４／４−ＫＩマウス海馬における４つの代表的細胞型においてブメタニド投与後にＦＣランクによって再び色分けされたもの（下）。ブメタニドは、これら４つのクラスターにおけるＡＤのヒトａｐｏＥ４／４特異的トランスクリプトームシグネチャにおけるアップレギュレーション遺伝子とダウンレギュレーション遺伝子の両方の発現ランクを反転させる。（図１３Ｆ）ＡＤのａｐｏＥ４／４特異的なトランスクリプトームシグネチャの「反転」のＰ値は、ｘ軸に各クラスター内のＤＥ遺伝子の数に対してｙ軸にプロットされている。破線はＰ＝０．０５を示し、すべての興奮性ニューロンクラスターは黒い輪郭で強調されている。すべての興奮性ニューロンクラスター、混合ニューロンクラスター、Ｓｓｔ／Ｐｖ介在ニューロン、内皮／線維芽細胞様細胞は、ＤＥ遺伝子の数が異なるにもかかわらず、これらの遺伝子において有意な「反転」を示す。（図１３Ｇ）ＡＤのａｐｏｅ４／４特異的トランスクリプトームシグネチャの「反転」挙動を示す全てのニューロンクラスターにおける調節不全オントロジー経路のｐ値のヒートマップは、これらの細胞型の少なくとも１つで調節不全である１０４の経路を明らかにする（Ｐ＜０．００５）。矢印（ｎ＝１９経路）で示された経路名は、ａｐｏＥ４／４媒介ヒトＡＤシグネチャと共有される。ｙ軸の左から右の細胞型群は以下の通りである：非ニューロン、抑制性ニューロン、興奮性ニューロン、混合ニューロン、興奮性ニューロン、非ニューロン、興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、および興奮性ニューロン。ｘ軸に左から右にリストされている経路は次のとおりである：。アフリカトリパノソーマ症、セロトニン作動性シナプス、基本転写因子、ニコチン依存性イノシトールリン酸代謝、ホスファチジルイノシトールシグナル伝達系、上皮細胞の細菌侵入、Ｗｎｔシグナル伝達経路、Ｒａｐ１シグナル伝達経路、Ｔ細胞受容体シグナル伝達経路、コリン作動性シナプス、長期抑制、ギャップ結合、Ｎ−グリカン生合成、ホスホリパーゼＤシグナル伝達経路、癌のプロテオグリカン、ｍＲＮＡサーベイランス経路、アルコール依存症、エストロゲンシグナル伝達経路、ＧＡＢＡ作動性シナプス、モルヒネ中毒、アペリンシグナル伝達経路、内分泌およびその他の因子調節カルシウム再吸収、集合管酸分泌、関節リウマチ、胃癌、プロパン酸代謝、膀胱癌、細胞老化、プロテアソーム、クエン酸回路（ＴＣＡサイクル）、エンドサイトーシス、ハンチントン病、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、酸化的リン酸化、パーキンソン病、細胞周期、ＦｏｘＯシグナル伝達経路、ニューロトロフィンシグナル伝達経路、アドヘレンスジャンクション、卵母細胞の減数分裂、寿命調節経路、アクチン細胞骨格の調節、結核、長期増強、シナプス小胞サイクル、軸索ガイダンス、オキシトシンシグナル伝達経路、概日同調、グルタミン酸作動性シナプス、アンフェタミン中毒、ドーパミン作動性シナプス、ヒト免疫不全ウイルス１感染、オートファジー−動物、ユビキチン媒介タンパク質分解、グルカゴンシグナル伝達経路、小胞体におけるタンパク質プロセシング、ｃＡＭＰシグナル伝達経路、心筋細胞におけるアドレナリン作動性シグナル伝達、ｃＧＭＰ−ＰＫＧシグナル伝達経路、リソソーム、小胞輸送におけるＳＮＡＲＥ相互作用、スプライスソーム、カポシ肉腫関連ヘルペスウイルス感染、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型感染、ＲＮＡ輸送、内分泌抵抗性、腎細胞癌、インスリンシグナル伝達経路、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路、アルツハイマー病、熱発生、癌におけるコリン代謝、サルモネラ感染、ヒトサイトメガロウイルス、感染、逆行性エンドカンナビノイドシグナル伝達、ＥｒｂＢシグナル伝達経路、プロゲステロン介在性卵母細胞の成熟、ｍＴＯＲシグナル伝達経路、ファゴソーム、プリオン病、フェロプトーシス、リボソーム、メラノーマ、Ｂ細胞受容体シグナル伝達経路、ＦｃγＲ介在性食作用、膵臓癌、ＦｃεＲＩシグナル伝達経路、非小細胞肺癌、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤耐性、神経膠腫、前立腺癌、��イトファジー動物、真核生物におけるリボソーム生合成、甲状腺癌、ナチュラルキラー細胞媒介細胞毒性、ウイルス発癌、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、タンパク質輸出、ＲＮＡ分解、バソプレッシン調節性水再吸収、代謝経路、ホスホネートおよびホスフィネート代謝。
【０１９８】
実施例６
ブメタニドの治療は、ａｐｏＥ４／４−ｉＰＳＣ由来のヒトニューロンにおけるａｐｏＥ４／４ＡＤのトランスクリプトームシグネチャ遺伝子を反転させる。
【０１９９】
ａｐｏＥ４／４ｉＰＳＣ由来ヒトニューロン（約７５％の興奮性ニューロン、約１５％の抑制性ニューロン、約５％のドーパミン作動性ニューロン）をインビトロでブメタニド（１０ｍＭ）で６時間処理し、転写変化をＲＮＡ−ｓｅｑ解析で調べた（図１４Ａ）。主成分分析は、ブメタニド対ビヒクル処理からの差次的発現（ＤＥ）遺伝子に基づくサンプルの有意なクラスタリングを示し（図１４Ｂ）、ヒトａｐｏＥ４／４−ｉＰＳＣ由来ニューロンに対する異なる薬物効果を示唆した。さらに、ブメタニド処理ａｐｏＥ４／４−ｉＰＳＣ由来ニューロンでは、ａｐｏＥ４／４ＡＤでアップレギュレートされた遺伝子は、ブメタニド処理後に、より高いランク数に向かって下方にシフトし（モンテカルロシミュレーションによるＰ＜０．０５）、ａｐｏＥ４／４ＡＤでダウンレギュレートされた遺伝子は、より低いランク数に向かって上方にシフトし、ＣＭａｐデータベースの予測をさらに確証し、インビトロドラッグリパーパシングの取り組み（ｅｆｆｏｒｔｓ）に対するヒトｉＰＳＣ由来ニューロンの適合性を強調した（図１４Ｃおよび１４Ｄ）。
【０２００】
ａｐｏＥ４／４−ｉＰＳＣ由来ヒトニューロンにおいてブメタニドによって発現が影響を受ける遺伝子の経路解析により、２７の有意に摂動された経路を同定した（図１４Ｅ）。興味深いことに、これらの経路のうちの１４は、予測された薬物効果（興奮性ニューロンおよびＳＳＴ／ＰＶ介在ニューロンを含む）を示すマウス海馬神経細胞に富んだ経路と重複しており、これらの経路のうち４つ：ＧＡＢＡ作動性シナプス、概日同調、逆行性エンドカンナビノイドシグナル伝達、およびシナプス小胞サイクル、はヒトからのａｐｏＥ４／４ＡＤシグネチャとも共有されていた（図１４Ｅおよび１４Ｆ）。
【０２０１】
上述のように、図１４Ａ〜１４Ｆは、ａｐｏＥ４／４−ｉＰＳＣ由来のヒトニューロンにおけるブメタニドのトランスクリプトーム摂動シグネチャのＲＮＡ−ｓｅｑ解析の結果を示す概略図およびグラフを提供する。（図１４Ａ）ＡｐｏＥ４／４−ｉＰＳＣ由来ヒトニューロンを１０ｍＭブメタニドで６時間処理し、ＲＮＡ−Ｓｅｑによりトランスクリプトーム変化を解析した。（図１４Ｂ）ブメタニド処理ａｐｏＥ４／４−ｉＰＳＣ由来ヒトニューロンにおけるＤＥ遺伝子の主成分分析（ＰＣＡ）は、ビヒクル処理サンプルからブメタニド処理サンプルを分離する。主成分１（ＰＣ１）は分散の７１．９％を、ＰＣ２は１２．４％を占める。（図１４Ｃ）ブメタニド処理後のａｐｏＥ４／４−ｉＰＳＣ由来ヒトニューロンにおけるＲＮＡ−Ｓｅｑによっても検出されたＡＤ遺伝子セットのヒトａｐｏＥ４／４特異的トランスクリプトームシグネチャのヒストグラム。ビヒクル処理と比較したブメタニド処理後のｉＰＳＣ由来ヒトニューロンにおけるこれら遺伝子のＦＣのランクを、ｘ軸に、ｙ軸上のそのランクにおける遺伝子の数に対してプロットする。この遺伝子セット内のすべての遺伝子の平均ランクは黒い線で示され、アップレギュレートされた遺伝子の平均ＦＣランクは点線で示され、それに従って標識され、ダウンレギュレートされた遺伝子の平均ＦＣランクは点線で示され、それに従って標識される。モンテカルロシミュレーションにより計算した、全ての遺伝子のランク平均から離れた、アップレギュレートされたＦＣランク平均とダウンレギュレートされたＦＣランク平均の「反転」の有意性のＰ値を示す（Ｐ＜０．００１）。（図１４Ｄ）ＡＤのヒトａｐｏＥ４／４特異的トランスクリプトームシグネチャからの遺伝子のヒートマップであって、ａｐｏＥ４／４ＡＤにおける推定ＦＣによってランク順序付けされ、かつ色分けされた遺伝子のヒートマップ（上）、およびブメタニド処理後のｉＰＳ由来ニューロンにおけるＦＣランクによって再び色分けされた遺伝子のヒートマップ（下）。（図１４Ｅ）ブメタニド処理後のａｐｏＥ４／４−ｉＰＳＣ由来ヒトニューロンにおける濃縮されたオントロジー経路（ｎ＝２７）のｐ値のヒートマップ、および図１３Ａ〜１３Ｇに示すように「反転」した表現型を示したヒトａｐｏＥ４／４特異的ＡＤおよび全ての神経細胞型におけるそれらの対応するエンリッチメントのｐ値（すべての興奮性ニューロン、混合ニューロン、ＳＳＴ／ＰＶ介在ニューロン）。太字で強調表示された経路は、ブメタニド処理後にａｐｏＥ４／４−ｉＰＳＣ由来のヒトニューロンと、ａｐｏＥ４−ＫＩマウス海馬で「反転」を示す神経細胞型の間で共有されている経路を示す（ｎ＝１４経路、細胞型特異的情報については、図１３Ａ〜１３Ｇを参照）。赤色で強調表示された経路は、ブメタニド処理後のａｐｏＥ４／４−ｉＰＳＣ由来のヒトニューロンおよびａｐｏＥ４−ＫＩマウス海馬において「反転」を示す神経細胞型（細胞型特異的情報については図１３Ａ〜１３Ｇを参照）ならびにヒトａｐｏＥ４／４−特異的ＡＤ（ヒトの経路情報については図１を参照、ｎ＝４経路）の間で共有されている経路を示す。（図１４Ｆ）ベン図、およびブメタニド投与後のａｐｏＥ４／４−ｉＰＳＣ由来ヒトニューロン、ブメタニド投与後のａｐｏＥ４／４−ＫＩマウス海馬で「反転」を示す神経細胞型（細胞型特異的情報については、図１３Ａ〜１３Ｇを参照）、ならびにヒトにおけるａｐｏＥ４／４ＡＤにおいて有意に濃縮された経路、の間での特異的かつ共有されている濃縮されたオントロジー経路。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年12月16日(2020.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、前記対象に投与されるべき治療有効量のブメタニドを含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記医薬組成物は、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日以下の用量でブメタニドを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記医薬組成物は、０．０２ｍｇ／ｋｇ／日以下の用量でブメタニドを含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ブメタニドが薬学的に許容可能な担体を含む経口剤形として処方される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記経口剤形は、カプセル剤、錠剤、崩壊錠もしくはトローチ剤、またはサシェ剤として１日１回投与されるものである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ブメタニドは静脈内または非経口的に投与されるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ブメタニドは経皮パッチ中に提供される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記対象が哺乳動物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記哺乳動物がヒトである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象におけるアルツハイマー病を治療するための医薬組成物において、前記対象は、ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有するものとして同定された対象であり、前記医薬組成物は、前記対象に投与されるべき治療有効量のブメタニドを含む医薬組成物。
【請求項１１】
前記対象は、前記対象由来の生物学的サンプルについてＰＣＲに基づくＤＮＡ解析方法を実施することにより同定された対象である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ＰＣＲに基づくＤＮＡ解析方法は生物学的サンプルを前記対象から単離することをさらに含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記医薬組成物は、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日以下の用量でブメタニドを含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記医薬組成物は、０．０２ｍｇ／ｋｇ／日以下の用量でブメタニドを含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ブメタニドが薬学的に許容可能な担体を含む経口剤形として処方される、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記経口剤形は、カプセル剤、錠剤、崩壊錠もしくはトローチ剤、またはサシェ剤として１日１回投与されるものである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記ブメタニドは静脈内または非経口的に投与されるものである、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ブメタニドは経皮パッチ中に提供される、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記対象が哺乳動物である、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
キットであって、
ａ）ブメタニド処方物；
ｂ）パッケージ；および
ｃ）ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象へのブメタニド投与の指示を含む、電子的または紙の形態の情報、
を含むキット。
【請求項２２】
前記指示は、ブメタニド処方物の対象への投与が、対象の重量、投与される処方物の重量および体積の少なくとも一方に基づくことを特定するものである、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記指示が、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日以下のブメタニドの用量で前記処方物を対象に投与する指示を含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記指示が、０．０２ｍｇ／ｋｇ／日以下のブメタニドの用量で前記処方物を対象に投与する指示を含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
１以上のａｐｏＥ遺伝子型について試験される対象から単離された生物学的サンプルを保持するための容器をさらに含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２６】
生物学的サンプル中のａｐｏＥ４対立遺伝子の特異的検出を可能にするためのＰＣＲまたはマイクロアレイ解析を実施するための１つ以上の試薬、および試薬を生物学的サンプルと反応させるための電子的または紙による指示をさらに含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
１以上の対照参照サンプルをさらに含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記ブメタニド処方物が、経口送達用の、カプセル、錠剤、崩壊錠もしくはトローチ剤、またはサシェ剤の形態である、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９】
前記ブメタニド処方物が、静脈内または非経口送達のために注射可能である、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
前記ブメタニド処方物が経皮パッチの形態である、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
キットであって、
ａ）薬学的に許容される担体およびブメタニドを含む処方物の１つ以上の用量を含む容器；および
ｂ）ａｐｏＥ４／４遺伝子型を有する対象を治療するための電子的または紙による指示、
を含むキット。
【請求項３２】
前記処方物の各用量が２ｍｇを超えないブメタニドを含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記処方物の各用量が１ｍｇを超えないブメタニドを含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記用量が経口投与のために処方される、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３５】
前記経口投与のための用量が１日１回のカプセル剤、錠剤、崩壊錠もしくはトローチ剤、またはサシェ剤として処方される、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記処方物の用量が静脈内または非経口的に投与されるように処方される、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３７】
前記処方物の用量が、経皮パッチによって投与されるように処方される、請求項３１に記載のキット。
【請求項３８】
前記対象が哺乳動物である、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３９】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
対象由来の生物学的サンプル中のａｐｏＥ４対立遺伝子の特異的検出を可能にするためのＰＣＲまたはマイクロアレイ解析を実施するための１つ以上の試薬、および試薬を生物学的サンプルと反応させるための電子的または紙による指示をさらに含む、請求項３１〜３９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４１】
１以上の対照参照サンプルをさらに含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
請求項３１〜４１のいずれか一項に記載のキットであって、対照を治療するための指示は、対象の重量および投与される処方物の重量または体積に基づく用量を特定するものである、キット。
【国際調査報告】
2021521198.tif 000033
2021521198.tif 000034
2021521198.tif 000035