(57)【要約】  細胞の自動培養のためのシステム及び方法、並びに細胞の培養物中の１又は複数のコロニーを解離させるための装置及び方法が記載されている。自動システムは、少なくとも撮像モジュール、ピペットモジュール、取扱モジュール、及び所望によりステージモジュールを含む。前述のモジュールの協働動作は、第１の時点及び１又は複数の後続の時点で取り込まれた１又は複数の画像から計算された細胞の培養物の１又は複数の特性に基づいて、少なくとも１つのプロセッサによって行われる。この装置は、回転可能なドライブに接続された１又は複数の衝撃バンパと、ドライブに依存して又は独立して回転可能なプラットフォームと、１又は複数の衝撃ブラケットであって、プラットフォームに接続され、プラットフォーム上の細胞培養容器内の細胞の培養物に解離力を伝達するために１又は複数の衝撃バンパと衝突可能な、１又は複数の衝撃ブラケットとを有する取り付け面を含む。
2021527440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養容器内の細胞培養培地において細胞の培養物を適応的に継代するための自動システムであって、前記自動システムが、
第１の時点及び１又は複数の後続の時点での前記細胞の培養物の１又は複数の画像を取り込むための撮像モジュールと、
１又は複数のピペットの端部と嵌合可能なピペットチップを介して前記細胞培養容器から流体を引き出すための前記１又は複数のピペットを有するピペットモジュールと、
前記ピペットモジュールから離間された液体ディスペンサモジュールであって、前記液体ディスペンサモジュールが複数の溶液リザーバと流体連通している、液体ディスペンサモジュールと、
前記自動システム内で前記細胞培養容器若しくはその蓋又は娘細胞培養容器若しくはその蓋を把持及び輸送するための一対の対向可能なアームを有する取扱モジュールと、
前記撮像モジュール、前記ピペットモジュール、前記液体ディスペンサ、及び前記取扱モジュールと通信する少なくとも１つのプロセッサであって、前記プロセッサが、
前記撮像モジュールから前記１又は複数の画像を受信し、
前記撮像モジュールから受信した前記１又は複数の画像に基づいて、前記細胞の培養物の１又は複数の特性を計算し、
自動継代プロトコルを実行して、前記細胞の培養物を継代する
ように構成され、前記プロトコルが、前記細胞の培養物の前記計算された１又は複数の特性と、
ａ）前記１又は複数の特性について学習された閾値レベル、又は
ｂ）前記１又は複数の特性について入力された閾値レベル
との比較に基づいて、前記ピペットモジュール、前記液体ディスペンサモジュール、及び前記撮像モジュールの動作を調整することを含む、プロセッサと
を備える、自動システム。
【請求項２】
前記１又は複数の特性が、
ａ）前記細胞の培養物の培養密度の測定値、
ｂ）前記細胞の培養物の細胞又はコロニーの形態の測定値、
ｃ）前記細胞の培養物の細胞又はコロニーの分化の測定値、
ｄ）前記細胞の培養物のコロニーサイズ分布の測定値、
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）、又はｄ）の前記第１の時点から前記１又は複数の後続の時点への変化の測定値、又は
ｆ）ｂ）、ｃ）、若しくはｄ）に対するａ）の測定値、ａ）、ｃ）、若しくはｄ）に対するｂ）の測定値、ａ）、ｂ）、若しくはｄ）に対するｃ）の測定値、又はａ）、ｂ）、若しくはｃ）に対するｄ）の測定値
を含む、請求項１に記載の自動システム。
【請求項３】
前記学習された閾値レベル又は前記入力された閾値レベルが、
ｉ．ａ）の場合、細胞又はコロニーの培養密度に関して約３０〜９０％、
ｉｉ．ｂ）の場合、対照培養物の約±３０％、
ｉｉｉ．ｃ）の場合、維持プロトコルでは対照培養物の約０〜３０％、若しくは分化プロトコルでは対照培養物の約５０％〜１００％、又は
ｉｖ．ｄ）の場合、対照培養物又はそのサブフラクションの平均コロニーサイズ分布の約１５％以内である、請求項２に記載の自動システム。
【請求項４】
前記第１の時点又は前記１又は複数の後続の時点において、前記細胞培養容器内の前記細胞の培養物に関して計算された前記１又は複数の特性と、第２の細胞培養容器内の第２の細胞の培養物に関して計算された前記１又は複数の特性と、が異なり、前記１又は複数の特性が、後続の継代中により一貫性を持つようになる、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の自動システム。
【請求項５】
前記撮像モジュールが、前記培養容器内の単一の細胞を解像できるカメラを含む、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の自動システム。
【請求項６】
前記細胞培養容器を支持するためのステージモジュールをさらに備える、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の自動システム。
【請求項７】
前記ステージモジュールが、第１の軸若しくは第２の軸、又はその両方に沿って第１の平面内で移動可能である、請求項６に記載の自動システム。
【請求項８】
前記ステージモジュール又はそのサブコンポーネントが、第３の軸に沿ってその端部を中心に旋回する、請求項６又は請求項７に記載の自動システム。
【請求項９】
前記１又は複数のピペットがキャリッジに取り付けられている、請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の自動システム。
【請求項１０】
前記液体ディスペンサモジュールが複数の導管を含み、各導管が前記複数の溶液リザーバのうちの個別の１つと流体連通している、請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の自動システム。
【請求項１１】
前記液体ディスペンサモジュールが、第１の溶液のリザーバと流体連通する第１の導管と、第２の溶液のリザーバと流体連通する第２の導管とを含み、前記第１の溶液と前記第２の溶液とが娘細胞培養容器に同時に分注される、請求項１０に記載の自動システム。
【請求項１２】
各導管が再利用可能又は交換可能である、請求項１０又は請求項１１に記載の自動システム。
【請求項１３】
少なくとも前記撮像モジュール、ピペットモジュール、液体ディスペンサモジュール、ステージモジュール、及び取扱モジュールを収容するためのエンクロージャをさらに備える、請求項１から請求項１２のいずれか一項に記載の自動システム。
【請求項１４】
前記エンクロージャが無菌である、請求項１３に記載の自動システム。
【請求項１５】
前記複数の溶液リザーバのうちの１又は複数を保管するための冷蔵モジュール、及び水リザーバ（water reservoir)をさらに備え、前記複数の溶液リザーバ、前記冷蔵モジュール及び前記廃棄物リザーバは、前記エンクロージャの外部にある、請求項１３又は請求項１４に記載の自動システム。
【請求項１６】
前記廃棄物リザーバは、前記エンクロージャ内の廃棄物トラフと流体連通している、請求項１５に記載の自動システム。
【請求項１７】
前記廃棄物トラフが疎水性コーティングでコーティングされている、請求項１６に記載の自動システム。
【請求項１８】
１又は複数のセンサをさらに備え、前記１又は複数のセンサは、前記撮像モジュール上、前記ステージモジュール上、又は前記複数の溶液リザーバ内の負荷の質量を検出及び報告して、
ａ）前記撮像モジュール上、前記ステージモジュール上、又は前記複数の溶液リザーバ内の負荷の質量を検出し、
ｂ）前記負荷の前記質量が予想と異なる場合にアラートをトリガする
ように構成される、請求項１５から請求項１７のいずれか一項に記載の自動システム。
【請求項１９】
前記エンクロージャとインキュベータモジュールを接続し、前記細胞培養容器を前記インキュベータモジュールから前記取扱モジュールの近くに輸送するための閉じたコンベヤモジュールをさらに備える、請求項１３から請求項１８のいずれか一項に記載の自動システム。
【請求項２０】
前記インキュベータモジュールが、前記細胞の培養物のための許容環境条件を維持する、請求項１９に記載の自動システム。
【請求項２１】
グラフィカルユーザインタフェースをさらに備える、請求項１から請求項２０のいずれか一項に記載の自動システム。
【請求項２２】
前記グラフィカルユーザインタフェースが、前記複数の溶液リザーバのそれぞれについての流体レベルレポートを表示する、請求項２１に記載の自動システム。
【請求項２３】
細胞培養容器内の細胞培養培地において多能性幹細胞の付着培養物を適応的に継代するための自動システムであって、
第１の時点及び１又は複数の後続の時点で前記多能性幹細胞の培養物の１又は複数の画像を取り込むための撮像モジュールと、
前記１又は複数のピペットの端部と嵌合可能なピペットチップを介して前記細胞培養容器から流体を引き出すための１又は複数のピペットを有するピペットモジュールと、
前記ピペットモジュールから離間された液体ディスペンサモジュールであって、前記液体ディスペンサモジュールが複数の溶液リザーバと流体連通している、液体ディスペンサモジュールと、
前記自動システム内で前記細胞培養容器若しくはその蓋又は娘細胞培養容器若しくはその蓋を把持及び輸送するための一対の対向可能なアームを有する取扱モジュールと、
前記撮像モジュール、前記ピペットモジュール、前記液体ディスペンサ、及び前記取扱モジュールと通信する少なくとも１つのプロセッサであって、前記プロセッサが、
前記撮像モジュールから前記１又は複数の画像を受信し、
前記撮像モジュールから受信した前記１又は複数の画像に基づいて、前記多能性幹細胞の培養物の１又は複数の特性を計算し、
自動継代プロトコルを実行して、前記多能性幹細胞の培養物を継代する
ように構成され、前記プロトコルが、前記多能性幹細胞の培養物の前記計算された１又は複数の特性と、
ａ）前記１又は複数の特性について学習された閾値レベル、又は
ｂ）前記１又は複数の特性について入力された閾値レベル
との比較に基づいて、前記ピペットモジュール、前記液体ディスペンサモジュール、及び前記撮像モジュールの動作を調整することを含む、プロセッサと
を備える、自動システム。
【請求項２４】
前記１又は複数の特性が、
ａ）前記細胞の培養物の培養密度の測定値、
ｂ）前記細胞の培養物の細胞又はコロニーの形態の測定値、
ｃ）前記細胞の培養物の細胞又はコロニーの分化の測定値、
ｄ）前記細胞の培養物のコロニーサイズ分布の測定値、
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）、又はｄ）の前記第１の時点から前記１又は複数の後続の時点への変化の測定値、又は
ｆ）ｂ）、ｃ）、若しくはｄ）に対するａ）の測定値、ａ）、ｃ）、若しくはｄ）に対するｂ）の測定値、ａ）、ｂ）、若しくはｄ）に対するｃ）の測定値、又はａ）、ｂ）、若しくはｃ）に対するｄ）の測定値
を含む、請求項２３に記載の自動システム。
【請求項２５】
前記学習された閾値レベル又は前記入力された閾値レベルが、
ｉ．ａ）の場合、細胞又はコロニーの培養密度に関して約３０〜９０％、
ｉｉ．ｂ）の場合、対照培養物の約±３０％、
ｉｉｉ．ｃ）の場合、維持プロトコルでは対照培養物の約０〜３０％、若しくは分化プロトコルでは対照培養物の約５０％〜１００％、又は
ｉｖ．ｄ）の場合、対照培養物又はそのサブフラクションの平均コロニーサイズ分布の約１５％以内である、請求項２４に記載の自動システム。
【請求項２６】
前記第１の時点又は前記１又は複数の後続の時点において、前記細胞培養容器内の前記多能性幹細胞の培養物に関して計算された前記１又は複数の特性と、第２の細胞培養容器内の第２の多能性幹細胞の培養物に関して計算された前記１又は複数の特性と、が異なり、前記１又は複数の特性が、後続の継代中により一貫性を持つようになる、請求項２３から請求項２５のいずれか一項に記載の自動システム。
【請求項２７】
前記撮像モジュールが、前記培養容器内の単一の細胞を解像できるカメラを含む、請求項２３から請求項２６のいずれか一項に記載の自動システム。
【請求項２８】
前記細胞培養容器を支持するためのステージモジュールをさらに備える、請求項２３から請求項２７のいずれか一項に記載の自動システム。
【請求項２９】
前記ステージモジュールが、第１の軸若しくは第２の軸、又はその両方に沿って第１の平面内で移動可能である、請求項２８に記載の自動システム。
【請求項３０】
前記ステージモジュール又はそのサブコンポーネントが、第３の軸に沿ってその端部を中心に旋回する、請求項２８又は請求項２９に記載の自動システム。
【請求項３１】
前記１又は複数のピペットがキャリッジに取り付けられている、請求項２３から請求項３０のいずれか一項に記載の自動システム。
【請求項３２】
前記液体ディスペンサモジュールが複数の導管を含み、各導管が前記複数の溶液リザーバのうちの個別の１つと流体連通している、請求項２３から請求項３１のいずれか一項に記載の自動システム。
【請求項３３】
前記液体ディスペンサモジュールが、第１の溶液のリザーバと流体連通する第１の導管と、第２の溶液のリザーバと流体連通する第２の導管とを含み、前記第１の溶液と前記第２の溶液とが娘細胞培養容器に同時に分注される、請求項３２に記載の自動システム。
【請求項３４】
各導管が再利用可能又は交換可能である、請求項３２又は請求項３３に記載の自動システム。
【請求項３５】
少なくとも前記撮像モジュール、ピペットモジュール、液体ディスペンサモジュール、ステージモジュール、及び取扱モジュールを収容するためのエンクロージャをさらに備える、請求項２３から請求項３４のいずれか一項に記載の自動システム。
【請求項３６】
前記エンクロージャが無菌である、請求項３５に記載の自動システム。
【請求項３７】
前記複数の溶液リザーバのうちの１又は複数を保管するための冷蔵モジュール、及び廃棄物リザーバをさらに備え、前記複数の溶液リザーバ、前記冷蔵モジュール及び前記廃棄物リザーバは、前記エンクロージャの外部にある、請求項３５又は請求項３６に記載の自動システム。
【請求項３８】
前記廃棄物リザーバは、前記エンクロージャ内の廃棄物トラフと流体連通している、請求項３７に記載の自動システム。
【請求項３９】
前記廃棄物トラフが疎水性コーティングでコーティングされている、請求項３８に記載の自動システム。
【請求項４０】
１又は複数のセンサをさらに備え、前記１又は複数のセンサは、前記撮像モジュール上、前記ステージモジュール上、又は前記複数の溶液リザーバ内の負荷の質量を検出及び報告して、
ａ）前記撮像モジュール上、前記ステージモジュール上、又は前記複数の溶液リザーバ内の負荷の質量を検出し、
ｂ）前記負荷の前記質量が予想と異なる場合にアラートをトリガする
ように構成される、請求項３７から請求項３９のいずれか一項に記載の自動システム。
【請求項４１】
前記エンクロージャとインキュベータモジュールを接続し、前記細胞培養容器を前記インキュベータモジュールから前記取扱モジュールの近くに輸送するための閉じたコンベヤモジュールをさらに備える、請求項３５から請求項４０のいずれか一項に記載の自動システム。
【請求項４２】
前記インキュベータモジュールが、前記多能性幹細胞の付着培養物のための許容環境条件を維持する、請求項４１に記載の自動システム。
【請求項４３】
グラフィカルユーザインタフェースをさらに備える、請求項２３から請求項４２のいずれか一項に記載の自動システム。
【請求項４４】
前記グラフィカルユーザインタフェースが、前記複数の溶液リザーバのそれぞれについての流体レベルレポートを表示する、請求項４３に記載の自動システム。
【請求項４５】
細胞の培養物を適応的に継代するための自動化された方法であって、
細胞培養容器内の細胞培養培地において前記細胞の培養物を提供することと、
撮像モジュールによって、第１の時点及び１又は複数の後続の時点で前記細胞の培養物の１又は複数の画像を取り込むことと、
前記撮像モジュールに通信可能に結合された少なくとも１つのプロセッサによって、前記１又は複数の画像に基づいて、前記細胞の培養物の１又は複数の特性を計算することと、
前記細胞の培養物の前記計算された１又は複数の特性と、
ａ）前記１又は複数の特性について学習された閾値レベル、又は
ｂ）前記１又は複数の特性について事前に決定された閾値レベル
との比較に基づいて、前記少なくとも１つのプロセッサによって、自動化された継代プロトコルを実行することと
を含む、自動化された方法。
【請求項４６】
前記１又は複数の特性が、
ａ）前記細胞の培養物の培養密度の測定値、
ｂ）前記細胞の培養物の細胞又はコロニーの形態の測定値、
ｃ）前記細胞の培養物の細胞又はコロニーの分化の測定値、
ｄ）前記細胞の培養物のコロニーサイズ分布の測定値、
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）、又はｄ）の前記第１の時点から前記１又は複数の後続の時点への変化の測定値、又は
ｆ）ｂ）、ｃ）、若しくはｄ）に対するａ）の測定値、ａ）、ｃ）、若しくはｄ）に対するｂ）の測定値、ａ）、ｂ）、若しくはｄ）に対するｃ）の測定値、又はａ）、ｂ）、若しくはｃ）に対するｄ）の測定値
を含む、請求項４５に記載の自動システム。
【請求項４７】
前記学習された閾値レベル又は前記入力された閾値レベルが、
ｉ．ａ）の場合、細胞又はコロニーの培養密度に関して約３０〜９０％、
ｉｉ．ｂ）の場合、対照培養物の約±３０％、
ｉｉｉ．ｃ）の場合、維持プロトコルでは対照培養物の約０〜３０％、若しくは分化プロトコルでは対照培養物の約５０％〜１００％、又は
ｉｖ．ｄ）の場合、対照培養物又はそのサブフラクションの平均コロニーサイズ分布の約１５％以内である、請求項４６に記載の自動システム。
【請求項４８】
前記第１の時点又は前記１又は複数の後続の時点において、前記細胞培養容器内の前記細胞の培養物に関して計算された前記１又は複数の特性と、第２の細胞培養容器内の第２の細胞の培養物に関して計算された前記１又は複数の特性と、が異なり、前記１又は複数の特性が、後続の継代中により一貫性を持つようになる、請求項４５から請求項４７のいずれか一項に記載の自動システム。
【請求項４９】
前記細胞の培養物を提供することは、インキュベータから前記細胞の培養物を運ぶことを含む、請求項４５から請求項４８のいずれか一項に記載の自動化された方法。
【請求項５０】
前記細胞培養容器をステージモジュール上に配置することをさらに含む、請求項４５から請求項４９のいずれか一項に記載の自動化された方法。
【請求項５１】
前記細胞の培養物から細胞の懸濁液を得ることと、娘細胞培養容器に前記細胞の懸濁液の一部又は全部を播種することとをさらに含む、請求項４５から請求項５０のいずれか一項に記載の自動化された方法。
【請求項５２】
前記娘細胞培養容器に播種する前に、前記細胞の懸濁液を第１のピペットチップに通して、前記細胞の培養物を単一細胞懸濁液又は前記第１のピペットチップの口径を超えない平均直径を有する複数のクランプに解離させる、請求項５１に記載の自動化された方法。
【請求項５３】
前記細胞の懸濁液を得ることは、前記細胞培養容器から細胞培養培地を吸引することと、前記細胞培養容器内の前記細胞の培養物を剥離溶液と接触させることとを含む、請求項５１又は請求項５２に記載の自動化された方法。
【請求項５４】
前記剥離溶液が分画溶液であり、前記分画溶液が、前記細胞培養容器の壁から分化細胞の第１の集団又は未分化細胞の第２の集団のいずれかを選択的に剥離する、請求項５３に記載の自動化された方法。
【請求項５５】
前記細胞の懸濁液を播種する前に、第１の溶液と第２の溶液とを前記娘細胞培養容器に同時に分注することをさらに含む、請求項５１から請求項５４のいずれか一項に記載の自動化された方法。
【請求項５６】
前記第１の溶液が前記細胞培養培地であり、前記第２の溶液が可溶化細胞外マトリックスである、請求項５５に記載の自動化された方法。
【請求項５７】
前記細胞の培養物が多能性幹細胞である、請求項４５から請求項５６のいずれか一項に記載の自動化された方法。
【請求項５８】
前記多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である、請求項５７に記載の自動化された方法。
【請求項５９】
前記多能性幹細胞がクランプとして継代される、請求項５７又は請求項５８に記載の自動化された方法。
【請求項６０】
多能性幹細胞の付着培養物を適応的に継代するための自動化された方法であって、
細胞培養容器内の細胞培養培地において前記細胞の培養物を提供することと、
撮像モジュールによって、第１の時点及び１又は複数の後続の時点で前記細胞の培養物の１又は複数の画像を取り込むことと、
前記撮像モジュールに通信可能に結合された少なくとも１つのプロセッサによって、前記１又は複数の画像に基づいて、前記多能性幹細胞の培養物の１又は複数の特性を計算することと、
前記多能性幹細胞の培養物の前記計算された１又は複数の特性と、
ａ）前記１又は複数の特性について学習された閾値レベル、又は
ｂ）前記１又は複数の特性について入力された閾値レベル
との比較に基づいて、前記少なくとも１つのプロセッサによって、自動化された継代プロトコルを実行することと
を含む、自動化された方法。
【請求項６１】
前記１又は複数の特性が、
ａ）前記多能性幹細胞の培養物の培養密度の測定値、
ｂ）前記多能性幹細胞の培養物の細胞又はコロニーの形態の測定値、
ｃ）前記多能性幹細胞の培養物の細胞又はコロニーの分化の測定値、
ｄ）前記多能性幹細胞の培養物のコロニーサイズ分布の測定値、
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）、又はｄ）の前記第１の時点から前記１又は複数の後続の時点への変化の測定値、又は
ｆ）ｂ）、ｃ）、若しくはｄ）に対するａ）の測定値、ａ）、ｃ）、若しくはｄ）に対するｂ）の測定値、ａ）、ｂ）、若しくはｄ）に対するｃ）の測定値、又はａ）、ｂ）、若しくはｃ）に対するｄ）の測定値
を含む、請求項６０に記載の自動システム。
【請求項６２】
前記学習された閾値レベル又は前記入力された閾値レベルが、
ｉ．ａ）の場合、細胞又はコロニーの培養密度に関して約３０〜９０％、
ｉｉ．ｂ）の場合、対照培養物の約±３０％、
ｉｉｉ．ｃ）の場合、維持プロトコルでは対照培養物の約０〜３０％、若しくは分化プロトコルでは対照培養物の約５０％〜１００％、又は
ｉｖ．ｄ）の場合、対照培養物又はそのサブフラクションの平均コロニーサイズ分布の約１５％以内である、請求項６１に記載の自動システム。
【請求項６３】
前記第１の時点又は前記１又は複数の後続の時点において、前記細胞培養容器内の前記多能性幹細胞の培養物に関して計算された前記１又は複数の特性と、第２の細胞培養容器内の第２の多能性幹細胞の培養物に関して計算された前記１又は複数の特性と、が異なり、前記１又は複数の特性が、後続の継代中により一貫性を持つようになる、請求項６０から請求項６２のいずれか一項に記載の自動システム。
【請求項６４】
前記多能性幹細胞の付着培養物を提供することは、インキュベータから前記細胞培養容器を運ぶことを含む、請求項６０から請求項６３のいずれか一項に記載の自動化された方法。
【請求項６５】
前記細胞培養容器をステージモジュール上に配置することをさらに含む、請求項６０から請求項６４のいずれか一項に記載の自動化された方法。
【請求項６６】
前記細胞培養容器から前記細胞培養培地を吸引することと、細胞の懸濁液を生成するために、前記細胞培養容器内の前記多能性幹細胞の付着培養物を剥離溶液と接触させることとをさらに含む、請求項６５に記載の自動化された方法。
【請求項６７】
前記剥離溶液が、前記細胞培養容器の壁から選択的に剥離された分化細胞の第１の集団又は未分化細胞の第２の集団のいずれかとして、前記細胞の懸濁液を生成する分画溶液である、請求項６６に記載の自動化された方法。
【請求項６８】
前記細胞の懸濁液が、前記細胞の懸濁液が通過する第１のピペットチップの口径を超えない平均直径を有する多能性幹細胞のクランプを含む、請求項６６又は請求項６７に記載の自動化された方法。
【請求項６９】
前記細胞の懸濁液を娘培養容器に播種することをさらに含む、請求項６６から請求項６８のいずれか一項に記載の自動化された方法。
【請求項７０】
前記細胞の懸濁液を播種する前に、第１の溶液と第２の溶液とを前記娘培養容器に同時に分注することをさらに含む、請求項６９に記載の自動化された方法。
【請求項７１】
前記第１の溶液が前記細胞培養培地であり、前記第２の溶液が可溶化細胞外マトリックスである、請求項７０に記載の自動化された方法。
【請求項７２】
前記多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である、請求項６０から請求項７１のいずれか一項に記載の自動化された方法。
【請求項７３】
上記で説明され、及び／又は上記で請求され、及び／又は図面に示されている特徴のうちの１又は複数の任意の組み合わせを含むシステム、装置、又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる２０１８年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／６８６，９６２号明細書に対する優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、細胞の培養、特に細胞の自動培養に関する。
【背景技術】
【０００３】
とりわけ、細胞の培養物の維持は、培地の頻繁な交換、細胞密度の監視、維持又は拡大などの下流の用途を目的とした継代又は継代培養、及び下流の用途のための培養細胞の回収を含み得る。
【０００４】
実験室での細胞培養の規模によっては、細胞の日々の維持が研究者や技術者の時間に過度に負担をかけることがある。さらに、単一の研究者又は技術者の側であろうとチームのメンバー間であろうと、細胞培養慣行の不一致は、限定されるものではないが、生存率、成長速度、表現型、代謝などの最適ではない細胞特性につながることがある。さらに、定期的な細胞培養は、関与する研究者又は技術者の間で反復運動過多障害を引き起こすことがある。
【０００５】
実験室での細胞の培養物の規模が必ずしも大きくない場合、培養細胞の下流の用途もまた特定の細胞培養慣行を指示することがある。例えば、培養細胞を臨床用途で使用する場合、細胞培養との人間の接触を最小限に抑える一定レベルの規制順守が必要になることがある。あるいは、規制又はガイドラインは、空間と時間の両方で細胞培養の一貫した培養／継代培養を要求することがある。
【０００６】
確かに、細胞の自動培養は、他の利点も提供する可能性もありながら、前述の懸念のいくつかに対処することがある。
【０００７】
幹細胞を含むがこれに限定されない、先行技術によって対処されないままである細胞の培養への自動化されたアプローチの一態様は、ある継代から別の継代への一貫した培養／継代培養に関する。細胞の培養／継代培養の異なる又は関連する課題は、細胞培養容器の異なるウエル又は異なる細胞培養容器のいずれかにおける細胞の異なる成長ダイナミクスから生じることがある。これら及びその他の課題は、一次細胞や幹細胞などの敏感な細胞タイプを培養するときに悪化する。感受性幹細胞の具体例には、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、上皮幹細胞、神経幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などがある。ＥＳＣ及びｉＰＳＣは、他の多能性細胞タイプの中でも、広く多能性幹細胞（ＰＳＣ）と呼ばれることがある。
【０００８】
ＰＳＣは、密に付着したコロニー又は最大数千の細胞の凝集体として成長する傾向がある。特定の目に見える、形態学的又は表現型の手がかりに基づいて、研究者又は技術者は、ＰＳＣ培養の細胞を継代培養したいと考えるであろう。実際、マウスＰＳＣは、単一のＰＳＣに完全に解離した後、又はクランプとしてその後の培養で新しいコロニーを形成することにほとんど又はまったく影響を与えずに継代培養され得る。対照的に、ヒトＰＳＣは、例えば核型の不安定性のために単一のＰＳＣに完全に解離した場合、その後の培養ではパフォーマンスが低下する傾向がある。むしろ、ヒトＰＳＣは、継代培養の前に少数（約５個以上）のＰＳＣのクランプに解離すると、パフォーマンスが向上する傾向がある。
【０００９】
継代時などの培養条件が細胞の培養物の特性に影響を及ぼし、したがって下流の用途でのそれらの有用性に影響を与えることはよく知られている。前述のことは、下流の用途での結果の再現性に自信を持つために、一貫した細胞培養の実施の重要性を強調している。したがって、研究者や技術者にとって最も都合の良い時点ではなく、最適な時点で細胞の培養物を継代することが重要である。そのいくつかは前述に記載されているが、ＰＳＣなどの幹細胞を含むがこれらに限定されない細胞の培養／継代培養の複雑さを考慮して、後の継代で子孫の一貫した培養を得る目的で、細胞を適応的に培養及び継代することができる自動細胞培養システムが必要である。
【発明の概要】
【００１０】
本開示は、細胞の培養物を培養するためのシステム及び方法を記載している。具体的な実施形態において、細胞の培養物は、多能性幹細胞であってもよく、所望によりヒト多能性幹細胞であり得る。より具体的な実施形態において、ヒト多能性幹細胞などの細胞の培養物は、細胞の付着培養物として培養され得る。本開示はまた、多能性幹細胞などの細胞の培養物を継代又は拡大させるためのシステム及び方法を記載する。いくつかの実施形態では、システム及び方法は自動化されている。
【００１１】
１つの広い態様において、細胞培養容器内の細胞培養培地において細胞の培養物を適応的に継代するための自動システムが本明細書に記載されている。自動システムは、第１の時点及び１又は複数の後続の時点での細胞の培養物の１又は複数の画像を取り込むための撮像モジュールと、１又は複数のピペットの端部と嵌合可能なピペットチップを介して細胞培養容器から流体を引き出すための１又は複数のピペットを有するピペットモジュールと、ピペットモジュールから離間された液体ディスペンサモジュールであって、液体ディスペンサモジュールが複数の溶液リザーバと流体連通している、液体ディスペンサモジュールと、自動システム内で細胞培養容器若しくはその蓋又は娘細胞培養容器若しくはその蓋を把持及び輸送するための一対の対向可能なアームを有する取扱モジュールと、撮像モジュール、ピペットモジュール、液体ディスペンサ、及び取扱モジュールと通信する少なくとも１つのプロセッサとを含む。プロセッサは、撮像モジュールから１又は複数の画像を受信し、撮像モジュールから受信した１又は複数の画像に基づいて、細胞の培養物の１又は複数の特性を計算し、自動継代プロトコルを実行して、細胞の培養物を継代するように構成され、プロトコルが、細胞の培養物の計算された１又は複数の特性と、１又は複数の特性について学習された閾値レベル、又は、１又は複数の特性について入力された閾値レベルとの比較に基づいて、ピペットモジュール、液体ディスペンサモジュール、及び撮像モジュールの動作を調整することを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、１又は複数の特性が、細胞の培養物の培養密度（confluence of the culture of cells）の測定値；細胞の培養物の細胞又はコロニーの形態の測定値；細胞の培養物の細胞又はコロニーの分化の測定値；細胞の培養物のコロニーサイズ分布の測定値；ａ）、ｂ）、ｃ）、又はｄ）の第１の時点から１又は複数の後続の時点への変化の測定値；又は、ｂ）、ｃ）、若しくはｄ）に対するａ）の測定値、ａ）、ｃ）、若しくはｄ）に対するｂ）の測定値、ａ）、ｂ）、若しくはｄ）に対するｃ）の測定値、又はａ）、ｂ）、若しくはｃ）に対するｄ）の測定値；を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、学習された閾値レベル又は入力された閾値レベルが、ａ）の場合、細胞又はコロニーの培養密度に関して約３０〜９０％；ｂ）の場合、対照培養物の約±３０％；ｃ）の場合、維持プロトコルでは対照培養物の約０〜３０％、若しくは分化プロトコルでは対照培養物の約５０％〜１００％；又はｄ）の場合、対照培養物又はそのサブフラクションの平均コロニーサイズ分布の約１５％以内である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、第１の時点又は１又は複数の後続の時点において、細胞培養容器内の細胞の培養物に関して計算された１又は複数の特性と、第２の細胞培養容器内の第２の細胞の培養物に関して計算された１又は複数の特性と、が異なり、１又は複数の特性が、後続の継代中により一貫性を持つようになる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、撮像モジュールは、培養容器内の単一の細胞を解像できるカメラを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、システムは、細胞培養容器を支持するためのステージモジュールをさらに備える。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ステージモジュールは、第１の軸若しくは第２の軸、又はその両方に沿って第１の平面内で移動可能である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ステージモジュール又はそのサブコンポーネントが、第３の軸に沿ってその端部を中心に旋回する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、１又は複数のピペットがキャリッジに取り付けられている。
【００２０】
いくつかの実施形態では、液体ディスペンサモジュールが複数の導管を含み、各導管が前記複数の溶液リザーバのうちの個別の１つと流体連通している。
【００２１】
いくつかの実施形態では、液体ディスペンサモジュールが、第１の溶液のリザーバと流体連通する第１の導管と、第２の溶液のリザーバと流体連通する第２の導管とを含み、第１の溶液と第２の溶液とが娘細胞培養容器に同時に分注される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、各導管が再利用可能又は交換可能である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、システムは、少なくとも撮像モジュール、ピペットモジュール、液体ディスペンサモジュール、ステージモジュール、及び取扱モジュールを収容するためのエンクロージャをさらに備える。
【００２４】
いくつかの実施形態では、エンクロージャは無菌である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、システムは、複数の溶液リザーバのうちの１又は複数を保管するための冷蔵モジュール、及び水リザーバ（water reservoir)をさらに備え、複数の溶液リザーバ、冷蔵モジュール及び廃棄物リザーバは、エンクロージャの外部にある。
【００２６】
いくつかの実施形態では、廃棄物リザーバは、エンクロージャ内の廃棄物トラフと流体連通している。
【００２７】
いくつかの実施形態では、廃棄物トラフが疎水性コーティングでコーティングされている。
【００２８】
いくつかの実施形態では、システムは１又は複数のセンサをさらに備え、１又は複数のセンサは、撮像モジュール上、ステージモジュール上、又は複数の溶液リザーバ内の負荷の質量を検出及び報告して、撮像モジュール上、ステージモジュール上、又は複数の溶液リザーバ内の負荷の質量を検出し；負荷の質量が予想と異なる場合にアラートをトリガする、ように構成される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、システムは、エンクロージャとインキュベータモジュールを接続し、細胞培養容器をインキュベータモジュールから取扱モジュールの近くに輸送するための閉じたコンベヤモジュールをさらに備える。
【００３０】
いくつかの実施形態では、インキュベータモジュールは、細胞の培養物のための許容環境条件を維持する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、システムは、グラフィカルユーザインタフェースをさらに備える。
【００３２】
いくつかの実施形態では、グラフィカルユーザインタフェースは、複数の溶液リザーバのそれぞれについての流体レベルレポートを表示する。
【００３３】
別の広い態様において、細胞培養容器内の細胞培養培地において多能性幹細胞の付着培養物を適応的に継代するための自動システムが本明細書に記載されている。自動システムは、第１の時点及び１又は複数の後続の時点で多能性幹細胞の培養物の１又は複数の画像を取り込むための撮像モジュールと、１又は複数のピペットの端部と嵌合可能なピペットチップを介して細胞培養容器から流体を引き出すための１又は複数のピペットを有するピペットモジュールと、ピペットモジュールから離間された液体ディスペンサモジュールであって、液体ディスペンサモジュールが複数の溶液リザーバと流体連通している、液体ディスペンサモジュールと、自動システム内で細胞培養容器若しくはその蓋又は娘細胞培養容器若しくはその蓋を把持及び輸送するための一対の対向可能なアームを有する取扱モジュールと、撮像モジュール、ピペットモジュール、液体ディスペンサ、及び取扱モジュールと通信する少なくとも１つのプロセッサとを含む。プロセッサは、撮像モジュールから１又は複数の画像を受信し、撮像モジュールから受信した１又は複数の画像に基づいて、多能性幹細胞の培養物の１又は複数の特性を計算し、自動継代プロトコルを実行して、多能性幹細胞の培養物を継代する、ように構成され、プロトコルが、多能性幹細胞の培養物の計算された１又は複数の特性と、１又は複数の特性について学習された閾値レベル；又は、１又は複数の特性について入力された閾値レベル、との比較に基づいて、ピペットモジュール、液体ディスペンサモジュール、及び撮像モジュールの動作を調整することを含む。
【００３４】
別の広い態様では、細胞の培養物を適応的に継代するための自動化された方法が本明細書に記載されている。この方法は、細胞培養容器内の細胞培養培地において細胞の培養物を提供することと、撮像モジュールによって、第１の時点及び１又は複数の後続の時点で細胞の培養物の１又は複数の画像を取り込むことと、撮像モジュールに通信可能に結合された少なくとも１つのプロセッサによって、１又は複数の画像に基づいて、細胞の培養物の１又は複数の特性を計算することと、細胞の培養物の計算された１又は複数の特性と：１又は複数の特性について学習された閾値レベル；又は、１又は複数の特性について事前に決定された閾値レベル；との比較に基づいて、少なくとも１つのプロセッサによって、自動化された継代プロトコルを実行することと、を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、細胞の培養物を提供することは、インキュベータから細胞の培養物を運ぶことを含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、方法は、細胞培養容器をステージモジュール上に配置することをさらに含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、方法は、細胞の培養物から細胞の懸濁液を得ることと、娘細胞培養容器に細胞の懸濁液の一部又は全部を播種することとをさらに含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、娘細胞培養容器に播種する前に、細胞の懸濁液を第１のピペットチップに通して、細胞の培養物を単一細胞懸濁液又は第１のピペットチップの口径を超えない平均直径を有する複数のクランプに解離させる。
【００３９】
いくつかの実施形態では、細胞の懸濁液を得ることは、細胞培養容器から培養培地を吸引することと、細胞培養容器内の細胞の培養物を剥離溶液と接触させることとを含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、剥離溶液が分画溶液であり、分画溶液が、細胞培養容器の壁から分化細胞の第１の集団又は未分化細胞の第２の集団のいずれかを選択的に剥離する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、方法は、細胞の懸濁液を播種する前に、第１の溶液と第２の溶液とを娘細胞培養容器に同時に分注することをさらに含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、第１の溶液が細胞培養培地であり、第２の溶液が可溶化細胞外マトリックスである。
【００４３】
いくつかの実施形態において、細胞の培養物は多能性幹細胞である。
【００４４】
いくつかの実施形態において、多能性幹細胞はヒト多能性幹細胞である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞はクランプとして継代される。
【００４６】
別の広い態様では、多能性幹細胞の付着培養物を適応的に継代するための自動化された方法が本明細書に記載されている。この方法は、細胞培養容器内の細胞培養培地において細胞の培養物を提供することと、撮像モジュールによって、第１の時点及び１又は複数の後続の時点で細胞の培養物の１又は複数の画像を取り込むことと、撮像モジュールに通信可能に結合された少なくとも１つのプロセッサによって、１又は複数の画像に基づいて、多能性幹細胞の培養物の１又は複数の特性を計算することと、多能性幹細胞の培養物の計算された１又は複数の特性と：１又は複数の特性について学習された閾値レベル；又は、１又は複数の特性について入力された閾値レベル；との比較に基づいて、少なくとも１つのプロセッサによって、自動化された継代プロトコルを実行することと、を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、方法はまた、細胞培養容器から細胞培養培地を吸引することと、細胞の懸濁液を生成するために、細胞培養容器内の多能性幹細胞の付着培養物を剥離溶液と接触させることとをさらに含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、剥離溶液が、細胞培養容器の壁から選択的に剥離された分化細胞の第１の集団又は未分化細胞の第２の集団のいずれかとして、細胞の懸濁液を生成する分画溶液である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、細胞の懸濁液が、細胞の懸濁液が通過する第１のピペットチップの口径を超えない平均直径を有する多能性幹細胞のクランプを含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、方法はまた、細胞の懸濁液を娘培養容器に播種することをさらに含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、方法はまた、細胞の懸濁液を播種する前に、第１の溶液と第２の溶液とを娘培養容器に同時に分注することをさらに含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、第１の溶液が細胞培養培地であり、第２の溶液が可溶化細胞外マトリックスである。
【００５３】
別の広い態様では、細胞の培養物中の１又は複数のコロニーを解離するための方法が提供される。方法は、本開示に従って装置を提供することと、装置のプラットフォーム上の剥離溶液に曝露されている培養細胞の１又は複数のコロニーを含む細胞培養容器を配置することと、ドライブの影響下でプラットフォームを回転させることと、装置の１又は複数の衝撃ブラケットを装置の１又は複数の衝撃バンパと繰り返し衝突させることと、を含み、１又は複数の衝撃ブラケットはプラットフォームに結合されて、プラットフォーム及びその上の細胞培養容器に力を伝達して、細胞の培養物中の１又は複数のコロニーを解離させる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、方法は、細胞の培養物をプラットフォームに固定することをさらに含み得る。
【００５５】
いくつかの実施形態では、プラットフォームを回転させることは時計回りの方向であり得る。いくつかの実施形態では、プラットフォームを回転させることは反時計回りの方向であり得る。
【００５６】
いくつかの実施形態では、方法は、時計回りと反時計回りの方向との間のドライブの揺動回転をさらに含み得る。具体的な実施形態では、揺動は、時計回りと反時計回りの方向に回転する間の５秒未満の遅延を含み得る。より具体的な実施形態では、揺動は、時計回りと反時計回りの方向に回転する間の１秒未満の遅延を含み得る。さらにより具体的な実施形態では、揺動は、時計回りと反時計回りの方向に回転する間の約０．５ミリ秒以下の遅延を含み得る。
【００５７】
いくつかの実施形態において、培養細胞の１又は複数のコロニーは、細胞培養容器のウエル底部に直接的又は間接的に付着され得る。
【００５８】
いくつかの実施形態において、培養細胞の１又は複数のコロニーは、多能性幹細胞の培養物中の１又は複数の未分化コロニーであり得る。
【００５９】
別の広い態様では、多能性幹細胞を継代するための自動システムが提供される。このシステムは、１又は複数の細胞培養容器を支持するためのステージモジュールと、細胞培養容器取扱モジュールと、ピペットモジュールと、ピペットモジュールから離間された液体ディスペンサモジュールであって、液体ディスペンサモジュールが複数の溶液リザーバと流体連通している、液体ディスペンサモジュールと、請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の装置による解離モジュールと、廃棄物リザーバと、自動システムの各モジュールの動作を調整するためのコントローラとを含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ステージモジュールはプラットフォームを含むことがあり、プラットフォーム又はそのサブコンポーネントは移動可能であり得る。いくつかの実施形態では、プラットフォーム又はそのサブコンポーネントは、第１の平面において移動可能であり得る。いくつかの実施形態では、プラットフォーム又はそのサブコンポーネントは、第１の軸及び第２の軸に沿った経路で移動可能であり得る。いくつかの実施形態では、プラットフォーム又はそのサブコンポーネントはまた、第３の軸に沿った経路で移動し得る。
【００６１】
いくつかの実施形態では、取扱モジュールは、一対の対向可能なアームを含み得る。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ピペットモジュールは、複数のピペットを含むことがあり、各ピペットの端部は、使い捨てのピペットチップと嵌合可能である。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ピペットモジュール及び取扱モジュールは両方とも可動ユニットに含まれる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、液体ディスペンサモジュールは、複数のラインを含むことがあり、各ラインは、複数の溶液リザーバのうちの個別の１つと流体連通し得る。いくつかの実施形態では、複数のラインの各ラインは再利用可能であり得る。いくつかの実施形態では、複数のラインの各ラインは交換可能であり得る。
【００６５】
いくつかの実施形態では、システムは、撮像モジュールをさらに含むことがあり、撮像モジュールは、１又は複数の培養容器のウエル内の単一の細胞を解像できるカメラを含む。いくつかの実施形態では、撮像モジュールは、１又は複数の培養容器のウエル内の多能性幹細胞の培養物の特性を照会するための画像プロセッサを含み得る。
【００６６】
いくつかの実施形態では、システムは、インキュベータモジュールをさらに含むことがあり、インキュベータモジュールは、多能性幹細胞の培養物のための許容環境条件を維持する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、システムは、１又は複数の細胞培養容器をインキュベータから取扱モジュールの近くに輸送するためのコンベヤモジュールをさらに含み得る。
【００６８】
いくつかの実施形態では、システムは、１又は複数の複数の溶液リザーバのうちの１又は複数を保管するための冷蔵モジュールをさらに含み得る。
【００６９】
いくつかの実施形態では、システムは、少なくともステージモジュール、取扱モジュール、ピペットモジュール、及び渦モジュールのための筐体をさらに含み得る。
【００７０】
いくつかの実施形態では、溶液リザーバ、冷蔵モジュール、及び廃棄物リザーバ以外のものは、筐体の外部にある。
【００７１】
いくつかの実施形態では、システムは、グラフィカルユーザインタフェースをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、グラフィカルユーザインタフェースは、複数の溶液リザーバのそれぞれについての流体レベルレポートを表示し得る。
【００７２】
別の広い態様では、細胞の自動継代の方法が提供される。この方法は、本明細書に開示されるようなシステムを提供することと、取扱モジュールを使用して、ステージモジュール上に細胞の第１の細胞培養容器を配置することと、ピペットモジュールを使用して、第１の細胞培養容器のウエルから培地を吸引することと、液体ディスペンサモジュールを使用して、第１の細胞培養容器のウエルに解離溶液を分注することと、解離モジュールを使用して、第１の細胞培養容器のウエルの底部から細胞コロニーを剥離することと、剥離した細胞コロニーを細胞の懸濁液に解離させることと、ピペットモジュールを使用して、ある量の細胞の懸濁液を第２の細胞培養容器のウエルに播種することと、を含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、方法は、コンベヤモジュールを使用して、配置工程の前に、インキュベータモジュールから第１の細胞培養容器を運ぶことをさらに含み得る。
【００７４】
いくつかの実施形態では、方法は、ステージモジュールを使用して、吸引工程の前に、第１の細胞培養容器を傾けることをさらに含み得る。
【００７５】
いくつかの実施形態では、方法は、吸引工程の後に、液体ディスペンサモジュールを使用して分注された洗浄バッファで、第１の細胞培養容器のウエルを洗浄することをさらに含み得る。
【００７６】
いくつかの実施形態では、方法は、分注工程の後に、インキュベータモジュール内の第１の細胞培養容器をインキュベートすることをさらに含み得る。
【００７７】
いくつかの実施形態では、方法は、細胞の剥離したコロニーを細胞の懸濁液に粉砕することをさらに含み得る。
【００７８】
いくつかの実施形態では、方法は、取扱モジュールを使用して、播種工程の前に、ステージモジュール上に第２の細胞培養容器を配置することをさらに含み得る。
【００７９】
いくつかの実施形態では、方法は、コンベヤモジュールを使用して、第２の細胞培養容器をインキュベータモジュールに運ぶことをさらに含み得る。
【００８０】
本開示の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本開示の精神及び範囲内の様々な変更及び修正が、詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細な説明及び特定の例は、本開示の好ましい実施形態を示しながら、例示としてのみ与えられることを理解されたい。
【００８１】
本明細書に記載の様々な実施形態をよりよく理解し、これらの様々な実施形態をどのように実施できるかをより明確に示すために、例として、少なくとも１つの例示的な実施形態を示し、ここで説明する添付の図面を参照する。図面は、本明細書に記載の教示の範囲を限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は、細胞の培養物を継代するための自動システムの一実施形態の上面図を示す。所望により存在する要素は破線で示されている。
【図２】図２は、本明細書に記載の自動システムで使用される撮像モジュールの一実施形態の側面図を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、本明細書に記載の自動システムで使用されるキャリッジの一実施形態の正面図を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本明細書に記載の自動システムで使用されるキャリッジの一実施形態の側面図を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、細胞の生きた培養物の、様々な時点で撮像モジュールを使用して取り込まれた代表的な画像を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａに示されている生細胞画像の対応する変換された表現の、様々な時点で撮像モジュールを使用して取り込まれた代表的な画像を示す。２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目の画像を注釈付きで示す。
【図５Ａ】図５Ａから図５Ｃは、細胞の培養物の培養密度が、撮像モジュールによって取り込まれた１又は複数の画像に基づいて判定され得ることを示す。図５Ａは、オンボード撮像モジュールを使用して撮像された細胞の培養物の生細胞の培養密度及び対応する変換表現と、Ｈｏｅｃｈｓｔを使用して染色され、蛍光顕微鏡（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、３５２  ｎｍ励起、４６１  ｎｍ放射）を使用して撮像された細胞の培養物の培養密度の視覚的比較である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、撮像モジュールウエルを使用した１９４個の細胞の培養物の生細胞画像、又は同じ１９４個の培養物のＨｏｅｃｈｓｔ染色のいずれかによって判定された培養密度％の回帰分析。各ドットは１つの細胞培養容器（つまり、６ウエルプレートの１つのウエル）を表す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、連続継代にわたって様々な示された条件下で培養された様々な示された細胞型の１つのウエルの培養密度％の判定を要約するチャート。示されている様々な条件には、Ｇｅｎｔｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＣＤＲ（商標））（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はＲｅＬｅＳＲ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ベースのクランプ生成、ＴｅＳＲ−Ｅ８（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅＳｓ）又はｍＴｅＳＲ１（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）維持培地、ｉＰＳ又はＥＳ細胞株、及び様々な細胞株が含まれる。
【図６Ａ】図６Ａから図６Ｄは、複数の時点での培養密度％の判定を活用し得る様々な方法を示す。図６Ａは、細胞の６つの培養物（すなわち、６ウエルプレートの各ウエル）の培養密度％が指数関数的成長モデルに適合しているグラフを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、培養密度％及び指数関数あてはめを使用してＦ０１６細胞の１６２個の培養の倍加時間を計算し得るヒストグラムを示す（平均＝３３．１時間、標準偏差±７．２時間）。
【図６Ｃ】図６Ｃは、培養密度％及び指数関数あてはめを使用してＨ９細胞の１８６個の培養の倍加時間を計算し得るヒストグラムを示す（平均＝３７．９時間、標準偏差±１４．９時間）。
【図６Ｄ】図６Ｄは、予測された７日目の培養密度と実際の７日間の培養密度の回帰分析を示す（Ｒ２＝０．９５）。予測された７日目の培養密度は、図６Ａのように、２日目〜６日目の培養密度％データを指数関数的成長モデルに適合させることによって判定された。
【図７Ａ】図７Ａから図７Ｆは、スプレー継代細胞及び単一細胞継代細胞の１又は複数の画像から培養密度％を計算し得ることを示す。図７Ａは、スプレー継代したＨ９細胞の６ウエル培養プレートの各ウエルの代表的な画像を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａの各ウエルの対応するマスク領域を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、図７Ｂのマスク領域の画像分析後の対応する培養密度％値を示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、単一細胞継代Ｍ００１細胞の６ウエル培養プレートの各ウエルの代表的な画像を示す。
【図７Ｅ】図７Ｅは、図７Ｄの各ウエルの対応するマスク領域を示す。
【図７Ｆ】図７Ｆは、図７Ｅのマスク領域の画像分析後の対応する培養密度％値を示す。
【図８】図８は、撮像モジュールによって取り込まれた１又は複数の画像に基づいて計算された、２４ウエル（つまり、６ウエルプレートの各ウエル）の細胞の培養物の平均コロニー面積と、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色プロトコルによって同じ細胞の培養物について判定された平均コロニー面積の回帰分析を示す（Ｒ２＝０．８６、ｐ＝０．９４）。
【図９】図９は、撮像モジュールによって取り込まれた１又は複数の画像と、同じ細胞の培養物内の実際の細胞数に基づいて計算された、２４個の細胞の培養物内の総強度（任意の単位）の回帰分析を示す（Ｒ２＝０．９４、ｐ＜０．０００１）。総強度は、画像のマスク領域内の各ピクセルの強度の合計として定義される。実際の細胞数を生成するために、すべての細胞を培養容器から回収し、単一細胞懸濁液を生成するために使用し、次にそれはサンプル抽出されカウントされた。
【図１０Ａ】図１０Ａから図１０Ｃは、撮像モジュールによって取り込まれた一連の画像に対して適用された機械学習アルゴリズムの結果を示している。図１０Ａは、トリミング後に撮像モジュールによって取り込まれた細胞の培養物の代表的な画像を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、図１０Ａに示す代表的な画像の背景（最も暗い）、分化（最も明るい）、及び未分化（中間）の領域の自動的に分類された領域の重ね合わせたものを示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、３つの異なる分類モデルの結果を示す。モデル３は、すべてのピクセルを最も一般的なクラス、つまり未分化として分類し、調整として含まれている。
【図１１】図１１は、ＲｅＬｅＳＲ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した自動継代プロトコル後、３つの異なる細胞株の培養物に残っている分化面積の割合を示す。各細胞株について、神経様コロニー、線維芽細胞様コロニー、完全に分化したコロニー（全体）、及び複雑な分化したコロニーについて、６つの異なるウエルを評価した。
【図１２】図１２は、複数のより早い時点での細胞の培養物の培養密度％の計算を使用して、高い時間的解像度で細胞の培養物が所望の培養密度％に達する時間を予測し得るグラフを示す。各ラインは、異なる細胞培養容器（つまり、６ウエルプレートのウエル）に対応する。
【図１３】図１３は、３回の連続継代での１Ｃ細胞の７日目の培養密度％の６ウエルプレートの６ウエル内の変動係数のドットプロットを示す。計算された培養密度％に基づく適応継代は、後続の時点での細胞の培養物のより一貫した培養密度％をもたらすことができる。ペアサンプルのウィルコクソン符号順位検定に基づくと、Ｐ１とＰ２とは対照的に、Ｐ０とＰ２の間の変動係数に有意な差は観察されなかった。Ｐ０で、所与のプレートのすべてのウエルに同じ量を播種した。Ｐ１で、１：２５から１：２００の範囲の希釈液を使用してウエルを継代し、ＣＯＶを増加させた。Ｐ２では、適応継代の回帰モデルを使用して、各ウエルの分割比を選択し、ウエルが同様の培養密度に戻るようにした。
【図１４Ａ】図１４Ａは、本明細書に記載の自動システムで使用される廃棄物トラフの一実施形態の斜視図を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、本明細書に記載の自動システムで使用される廃棄物トラフの一実施形態の断面斜視図を示す。
【図１５】図１５は、細胞の培養物を継代する方法の一実施形態のフローチャートを示す。
【図１６】図１６は、細胞の培養物中に存在する１又は複数のコロニーを解離するための装置の斜視図を示す。
【図１７】図１７は、細胞の培養物中に存在する１又は複数のコロニーを解離するための装置の正面図を示す。
【図１８】図１８は、細胞の培養物中に存在する１又は複数のコロニーを解離するための装置の側面図を示す。
【図１９】図１９は、細胞の培養物中に存在する１又は複数のコロニーを解離するための装置の上面図を示す。説明のために、プラットフォームは示されていないが、一般的にそれに接続されている衝撃ブラケットが示されている。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
請求された主題の少なくとも１つの実施形態の例を提供するために、様々なシステム、装置、及び方法が以下に説明される。以下に記載される実施形態は、請求される主題を制限するものではなく、また特許請求される主題は、以下に記載されるものとは異なるシステム、装置、及び方法をカバーし得る。特許請求される主題は、以下に記載される任意の１つのシステム、装置若しくは方法のすべての特徴を有するシステム、装置及び方法、又は以下に記載される複数又はすべてのシステム、装置及び方法に共通の特徴に限定されない。特許請求され得る主題は、その特許請求の範囲及び図を含む、本書の任意の部分に開示されている要素又は工程の任意の組み合わせ又は副組み合わせに存在することがある。したがって、当業者は、本明細書の教示に従って開示されるシステム、装置、又は方法が、本明細書に含まれる特徴のいずれか１又は複数を具体化することがあり、特徴は、意図された目的のために物理的に実行可能であり実現可能である、任意の特定の組み合わせ又は副組み合わせで使用され得ることを理解されよう。
【００８４】
さらに、以下に記載されるシステム、装置又は方法は、特許請求された主題の実施形態ではない可能性がある。本書で特許請求されていない、本明細書に記載のシステム、装置又は方法に開示されている主題は、別の保護手段、例えば、継続特許出願の主題であることがあり、出願人、発明者及び／又は所有者は、本書での開示により、そのような発明を放棄、否認、又は公に捧げることを意図していない。
【００８５】
例示を単純化及び明確にするために、適切であると考えられる場合、参照番号を図間で繰り返して、対応する又は類似の要素を示すことができることも理解されよう。さらに、本明細書に記載の例示的な実施形態の完全な理解を提供するために、多数の特定の詳細が示されている。しかしながら、本明細書に記載の例示的な実施形態は、これらの特定の詳細なしで実施され得ることを当業者は理解されよう。他の例において、本明細書に記載の例示的な実施形態を不明瞭にしないように、周知の方法、手順、及び構成要素は詳細に説明されていない。また、説明は、本明細書に記載の例示的な実施形態の範囲を限定すると見なされるべきではない。
【００８６】
本明細書で使用される「実質的に」、「約」及び「ほぼ」などの程度の用語は、結果が大幅に変更されないように、修正された用語の妥当な量の偏差を意味することに留意されたい。これらの程度の用語は、例えば、この偏差が、修正する用語の意味を否定しない場合、１％、２％、５％、又は１０％などの修正された用語の偏差を含むと解釈されるべきである。
【００８７】
さらに、ここでのエンドポイントによる数値範囲の列挙には、その範囲内に含まれるすべての数値及び分数が含まれる（例えば、１から５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、及び５が含まれる）。また、そのすべての数値及び分数は、例えば、最終結果が大幅に変更されない場合は、１％、２％、５％又は１０％などの、参照されている数の特定の量までの変動を意味する用語「約」によって修正されると推定されることも理解されたい。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「及び／又は」という表現は、包括的又は、を表すことを意図していることにも留意されたい。つまり、「Ｘ及び／又はＹ」は、例えばＸ若しくはＹ、又はその両方を意味することを意図している。さらなる例として、「Ｘ、Ｙ、及び／又はＺ」は、Ｘ若しくはＹ若しくはＺ又はそれらの任意の組み合わせを意味することを意図している。
【００８９】
本開示は、細胞の培養物において１又は複数のコロニーを培養又は解離するためのシステム、装置、及び方法を記載している。具体的な実施形態において、細胞の培養物は、多能性幹細胞であり、所望によりヒト多能性幹細胞である。より具体的な実施形態では、ヒト多能性幹細胞などの細胞の培養は、１又は複数のコロニーをヒト多能性幹細胞のクランプ又はクラスタに解離させることを含む。本開示はまた、装置及び／又は方法を、細胞の培養物を継代又は拡大させるためのシステム及び方法に統合することを記載している。具体的な実施形態では、システム及び方法は自動化されている。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「継代」は、細胞の培養物が継代又は継代培養され得る時点までの細胞培養活動と、細胞の培養物の継代又は継代培養に関連する活動とを指し、新鮮な培地を用いて細胞の培養物の一部又は全部を、１又は複数の娘細胞培養容器へ播種することを含む。したがって、継代という用語は、細胞の培養物の継代培養などの細胞の日常の培養に関連する活動と、細胞の培養物の拡大、回収（凍結保存用など）、若しくは分化、又は新しく派生された細胞株のオンボードを目的としたワークフローも指す。一実施形態では、第１の細胞培養容器からの細胞の懸濁液の量は、１つの娘細胞培養容器のみに播種され得る（すなわち、１：１継代）。一実施形態では、第１の細胞培養容器からの細胞の懸濁液の量は、複数の娘細胞培養容器に播種され得る（すなわち、拡大の一形態と見なされ得る１：ｎ＋１継代）。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「細胞の培養物」は、細胞培養容器内で培養、継代、拡大、又は分化され得る任意のタイプの細胞を指す。一実施形態では、細胞は、造血幹細胞又はその前駆細胞などの足場非依存性細胞である。一実施形態では、細胞は、単層で培養されるか、又は細胞の付着培養物として培養されるものなどの足場依存性細胞である。一実施形態では、足場依存性細胞は間葉系幹細胞である。一実施形態では、足場依存性細胞は、多能性幹細胞（「ＰＳＣ」）である。ＰＳＣは、胚性幹細胞、ナイーブ型幹細胞、拡張多能性幹細胞、又は人工多能性幹細胞であり得る。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「細胞培養容器」又は「娘細胞培養容器」は、細胞の培養物を支持するために使用され得る容器を指す。細胞培養容器は、単一のフラスコ又は円形皿などの皿であり得るか、又はマルチウエル培養プレートであり得る。細胞培養容器がマルチウエル培養プレートに対応する場合各ウエル、いくつかのウエル、又はそのすべてのウエルは、細胞培養容器と見なされ得る。具体的には、継代方法を実施した後、新しい細胞培養容器に細胞の培養物を播種する際、そのような新しい細胞培養容器は、本明細書では娘細胞培養容器と呼ばれる。
【００９３】
システム
本開示の一態様では、細胞の培養物を継代するためのシステムが記載されている。一実施形態では、細胞はＰＳＣであり、さらにより具体的には、細胞はヒトＰＳＣであり得る。一実施形態では、ＰＳＣは、ヒトであろうとなかろうと、細胞の付着培養物として培養又は継代される。ヒトＰＳＣなどの細胞をクランプ又はクラスタとして継代することが多くの用途において望ましいため、そのような細胞を継代するための自動化されたシステム及び方法は、そのクランプ継代に適していることがある。
【００９４】
一実施形態では、ヒト多能性幹細胞などの細胞の培養物を継代するための自動システム１は、撮像モジュール１００と、ピペットモジュール２００と、液体ディスペンサモジュール３００と、複数の溶液リザーバ３５０（例えば、３５０ａ、３５０ｂ、３５０ｃなど）と、取扱モジュール４００と、所望により、ステージモジュール５００と、自動システム（図１及び図３を参照）の各モジュールの動作を調整するためのプロセッサ６００とを含む様々なモジュールを含む。
【００９５】
撮像モジュール１００は、一実施形態ではステージ１１０（図２）の上に配置され得るカメラ１０５を含む。一実施形態では、カメラ１０５は、ステージ１１０の上に固定され得るか又は移動可能のいずれかであり得る。一実施形態では、カメラ１０５は、ステージ１１０の下に固定され得るか又は移動可能のいずれかであり得る。細胞培養容器がステージ１１０に配置されると、カメラ１０５は、第１の時点及び１又は複数の後続の時点で、細胞培養容器内の細胞の培養物の適切なスケール及び解像度で１又は複数の画像を取り込み得る。
【００９６】
一実施形態では、カメラ１０５（図示せず）のレンズは、ステージ１１０の平面に対して実質的に水平方向に向けられ、細胞の培養物の１又は複数の画像は、反射ミラー１２０に依存して取り込まれる（図２参照）。ミラー１２０は、カメラ１０５のレンズから適切な距離に配置され、また、対象面（すなわち、細胞培養容器内の細胞の培養物）をカメラ１０５の焦点面に反射するために十分な角度が付けられている。一実施形態では、ミラー１２０の角度１２５は約４５°である。
【００９７】
カメラ１０５は、数十の時点にわたって数千個の培養容器について取り込まれ得る１又は複数の画像を記憶するのに十分なコンピュータ可読メモリに関連付けられている。コンピュータ可読メモリは、カメラ１０５に配置されることがあり、及び／又はコンピュータ可読メモリは、パーソナルコンピュータデバイス内又はクラウド上（すなわち、遠隔サーバ上）などの遠隔に記憶され得る。
【００９８】
一実施形態では、カメラ１０５は、動画又は静止画像を取り込む。一実施形態では、カメラ１０５は、白黒（又はグレースケール）又はカラーの静止画像を取り込む。一実施形態では、１又は複数の画像は、暗視野技術を使用して取り込まれ、細胞の培養物の周りの視野は一般に暗く、細胞の培養物はサンプルのコントラストを提供する。
【００９９】
一実施形態では、カメラ１０５は、細胞を培養するために使用される細胞培養容器のエリアを撮像することができる。そのような実施形態では、細胞培養容器は、３５ｍｍディッシュ又は１００ｍｍディッシュであり得る。また、そのような実施形態では、細胞培養容器は６ウエルプレートであることがあり、カメラ１０５は、その６ウエルのそれぞれの細胞培養エリアを含む単一の画像を取り込み得る。そのような画像は、そのまま保管され得るか、又は、例えば、その各ウエルのトリミングされた画像に対応するサブセットとして、６つの関連ファイルと共に記憶され得る。一実施形態では、６ウエルプレートの各ウエルに対応する６つの個別の画像を取り込み得る。当業者は、細胞培養容器が、１２、２４、９６、又は３８４ウエルプレートなどであり得るがこれらに限定されない任意の形式であることがあり、いずれの場合でも、カメラ１０５は、その各ウエル（又は所望のサブセット）を含む１又は複数の画像、あるいはその各ウエル（又は所望のサブセット）の個々の画像を取り込み得ることを理解されよう。
【０１００】
具体的な実施形態では、カメラ１０５は、細胞培養容器又はそのウエル内の単一の細胞を解像できることがある。そのような実施形態又は異なる実施形態では、カメラ１０５は、細胞培養容器又はそのウエル内の細胞の培養物の単一のコロニーを解像できる。カメラ１０５は、細胞培養容器全体（又はそのウエル）の画像を取り込むことができることがあるため、カメラ１０５はまた、細胞培養容器内の細胞の培養物の単一細胞又はコロニーのそれぞれを解像できることがある。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、撮像モジュール１００は、細胞培養容器内のＰＳＣなどの細胞の培養物の１又は複数の特性を照会するための画像プロセッサを含む。１又は複数の特性を照会することにより、システム１は、培地交換プロトコル、継代プロトコル、拡大プロトコル、分化プロトコル、又は培養終了プロトコルなどの適切な動作を実行し得る。他の実施形態では、１又は複数の特性を照会するためのプロセッサは、撮像モジュール１００内に含まれず、コンピュータデバイス内に含まれ得る中央プロセッサモジュール内など、むしろ別個に含まれ得る。したがって、システム１は、少なくとも１つのプロセッサ（以下でより詳細に説明される）を含み得る。
【０１０２】
一実施形態では、ステージ１１０は、その上の細胞培養容器の存在及び重量を検出及び報告するための１又は複数のロードセルを含む。したがって、１又は複数のロードセルは、動作を開始するかどうかについてシステム１にフィードバックを提供し得る。例えば、ステージ１１０からの細胞培養容器の欠如は、撮像動作が実行されるべきではないことを合図し得る。一実施形態では、１又は複数のロードセルは、適切な量の溶液が細胞培養容器に添加されたか、又は細胞培養容器から除去されたかどうかを検証する。一実施形態では、１又は複数のロードセルは、蓋が細胞培養容器から取り外されているかどうかを検証するのに十分な感度がある。
【０１０３】
一実施形態では、ステージ１１０は、ステージモジュール５００から分離されている。一実施形態では、ステージ１１０は、ステージモジュール５００のサブコンポーネントである。一実施形態では、ステージ１１０及びステージモジュール５００は同一である。
【０１０４】
システム１はまた、ピペットモジュール２００を備える。ピペットモジュール２００は、細胞培養培地などの流体を、１又は複数のピペットの端部と嵌合可能なピペットチップを通して細胞培養容器から引き出すための１又は複数のピペットを含む。ピペットモジュール２００はまた、１又は複数のピペットのそれぞれとの流体連通において、細胞培養容器から流体を引き出すために必要な吸引を生成する手段を含む。
【０１０５】
一実施形態では、ピペットモジュール２００の１又は複数のピペットを下降又は上昇させて、それに取り付けられたピペットチップを細胞培養容器内の流体に接触させるか、又は接触させないようにし得る。一実施形態では、細胞培養容器を上昇又は下降させて、１又は複数のピペットのピペットチップを中の流体に接触させるか、又は接触させないようにし得る。
【０１０６】
１又は複数のピペットが垂直面で上昇又は下降できるかどうかにかかわらず、ピペットモジュール２００及びその１又は複数のピペットが、システム１内で、ステージ１１０の水平面に対してｘ軸又はｙ軸のいずれか又は両方に沿って移動することも望ましいことがある。そのような実施形態では、ピペットモジュール２００は、例えば、ピペットモジュール２００を取り付けることによって、可動ユニット２２０（又はキャリッジ）に含まれ得る（図３）。一実施形態では、キャリッジ２２０は、システム１内のトラッキングに沿って移動することがあり、トラッキングは、システム１のデッキ２２７の上に吊り下げられるか、又は定着させることができる。一実施形態では、キャリッジ２２０は、デッキの片側又は両側の長さに沿って、又は実質的に長さに沿って延びていることがある。このようなキャリッジは当技術分野で知られており、例示的なキャリッジには、Ｎｉｍｂｕｓ（商標）（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ）システムが含まれる。
【０１０７】
一実施形態では、ピペットチップは使い捨てであり、したがって、１又は複数のピペットはまた、ピペット排出機構を含み得る。ピペット排出機構の一例は、１又は複数のピペットの管状本体上をスライドし、カラーの端がピペットチップに接触したときにピペットチップを管状本体から外すカラーを含む。
【０１０８】
ピペットモジュール２００の例示的な使用例には、細胞の懸濁液を粉砕すること、廃棄物のために細胞培養容器から液体を吸引すること、又は、自動継代プロトコル中に娘細胞培養容器に細胞を播種する場合など、細胞培養容器の液体の一部又は全部を娘細胞培養容器に移すことが含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１０９】
システム１はまた、ピペットチップの複数のラック用のステージングエリアを含み得る。システム１は、複数の使用中のチップラックに対応することがあり、複数のバックアップチップラックに対応することがある。一実施形態では、ピペットチップラック２２５は、使用中のピペットチップラックに対応することがあり、一方、ピペットチップラック２３０ａ、２３０ｂ、２３０ｃ、及び２３０ｄは、バックアップチップラックに対応することがある。ピペットチップラック２２５内のピペットチップを使い果たすと、消費されたチップラックは、バックアップチップラック（２３０ａ、２３０ｂ、２３０ｃ、又は２３０ｄ）と置き換え得る。システム１内のすべてのピペットチップが消費されると、システム１のユーザは、ステージングエリアに新しいピペットチップラックを再び設け得る。ステージングエリア（ピペットチップラック２２５と直列のボックス）はまた、アクセス可能であるべきであるが、現在、ステージ１１０、ステージモジュール５００のいずれにも近接して配置されていない細胞培養容器又はその蓋を保管するために使用され得る。
【０１１０】
システム１又はそのコンポーネントを不必要に汚染する可能性を最小限に抑えるために、ピペットチップが１又は複数のピペットの端部から外れるシステム１の領域は、重要な考慮事項である。具体的には、そのような領域は、細胞培養容器、ピペットチップラックステージングエリア、及び使用中のピペットチップラックと接触するシステム１のコンポーネントから離れている必要がある。一実施形態では、ピペットチップは、１又は複数のピペットから廃棄物容器２５０に外される。一実施形態では、廃棄物容器２５０は、システム１からのその内容物の除去を容易にすると同時に、撮像モジュール１００、ピペットモジュール２００、ピペットチップラック２２５及び２３０、並びに以下で説明する他のモジュールなどのシステム１のコンポーネントとのユーザ接触を最小限にするために、スライド可能な引き出し内に含まれ得る。一実施形態では、センサは、例えば、キャリッジ２２０の動きを妨げないように、廃棄物容器２５０の位置を検出して報告する。
【０１１１】
システム１は、液体ディスペンサモジュール３００をさらに備える。液体ディスペンサモジュール３００は、ピペットモジュール２００から離間され得る。明確にするために、離間することは、これらがシステム１の別個の要素であり、場合によってはシステム１の異なる場所にあることを意味する。液体ディスペンサモジュール３００は、溶液を細胞培養容器に大量に分注するために使用されるが、ピペットモジュール２００は、細胞培養容器から流体の一部又は全部を引き出すために使用される。液体ディスペンサモジュール３００の例示的な使用例は、細胞の懸濁液を播種する前又は後のいずれかで、細胞培養容器又は娘細胞培養容器に細胞の培養物又は分化培地を分注すること、細胞培養容器内の細胞の培養物の自動継代プロトコル中の細胞培養容器への洗浄バッファ又は細胞剥離溶液を分注すること、又は細胞培養マトリックス溶液（例えば可溶化細胞外マトリックス）を分注することを含み得る。
【０１１２】
液体ディスペンサモジュール３００は、複数の溶液リザーバ３５０と流体連通する複数の導管３２５を含む（例えば、図１を参照）。溶液リザーバ３５０は、多能性幹細胞などの細胞の自動培養又は継代を実行するための様々な溶液を含む。溶液リザーバ３５０に含まれ得る溶液の例には、細胞培養培地、細胞分化培地、細胞培養マトリックス溶液（例えば、可溶化細胞外マトリックス）、細胞洗浄バッファ、及び細胞剥離溶液又は細胞解離溶液が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１３】
溶液リザーバ３５０の内容物は、システム１のユーザによって採用されたワークフローに依存することがあり、ユーザの必要に応じて交換し得る。ワークフローの非限定的な例には、細胞の供給、細胞の継代、細胞の拡大、細胞のオンボード、細胞のクローン集団の派生、又は細胞の分化が含まれ得る。このようなワークフローは、多能性幹細胞培養の側面を自動化することに関心のあるユーザの間で特に一般的である。
【０１１４】
溶液リザーバ３５０は、システム１のユーザによって採用されたワークフローで使用される任意の合理的な量の溶液を保持し得る。例えば、溶液リザーバ３５０は、細胞培養溶液を収容するために一般的に使用される５００ｍＬのボトルに対応し得る。あるいは、溶液リザーバ３５０は、１ガロン又は１０Ｌのカーボイなどのより大きなボトル又は袋に対応し得る。いくつかの実施形態では、溶液リザーバ３５０は、様々な量の溶液を保持し得る。例えば、より大きな量で使用される溶液は、比較的大きなリザーバで提供され得るが、より小さな量で使用される溶液は、比較的小さなリザーバで提供され得る。
【０１１５】
前述のように、溶液リザーバ３５０は、液体ディスペンサモジュール３００の複数の導管３２５と流体連通している。複数の導管は、それを介して溶液を送達し得るという条件で、任意の形態をとることができる。一実施形態では、複数の導管のそれぞれは、可撓性チューブに対応する。複数の導管のそれぞれを通して溶液を送達するために、溶液リザーバ３５０及び複数の導管はポンプに関連付けられ得る。一実施形態では、ポンプは蠕動ポンプである。一実施形態では、ポンプは、溶液リザーバから導管を通して溶液を引く排水ポンプと同様に動作し得る。
【０１１６】
液体ディスペンサモジュール３００は、複数の導管を含むことがあり、各導管は、複数の溶液リザーバ３５０のうちの個別の１つ、例えば、第１のリザーバ３５０ａと流体連通している第１の導管３２５ａなどと流体連通していることがある（図示せず）。液体ディスペンサモジュール３００が複数の導管を含み、各導管が複数の溶液リザーバ３５０のうちの個別の１つと流体連通している実施形態では、各導管は再利用可能及び／又は交換可能であり得る。
【０１１７】
一実施形態では、液体ディスペンサモジュール３００は、第１の溶液のリザーバと流体連通する第１の導管と、第２の溶液のリザーバと流体連通する第２の導管とを含むことがあり、第１の溶液と第２の溶液は異なる時間に分注される。例えば、第１の溶液は洗浄バッファであることがあり、第２の溶液は細胞剥離溶液又は細胞解離溶液であることがある。したがって、適切な量の第１の溶液は細胞培養容器（細胞の培養物を含むことも含まないこともある）に分注されることがあり、ピペットモジュール２００を使用するなどによって第１の溶液を除去した後、適切な量の第２の溶液は、細胞培養容器に分注され得る。あるいは、第１の溶液は、細胞剥離溶液又は細胞解離溶液に対応することがあり、第２の溶液は、細胞培養培地に対応することがある。あるいは、第１の溶液は細胞培養マトリックスに対応することがあり、第２の溶液は細胞培養培地に対応することがある。
【０１１８】
一実施形態では、液体ディスペンサモジュール３００は、第１の溶液のリザーバと流体連通する第１の導管と、第２の溶液のリザーバと流体連通する第２の導管とを含むことがあり、第１の溶液と第２の溶液は同時に分注される。例えば、第１の溶液は細胞培養マトリックス溶液であることがあり、第２の溶液は細胞培養培地であることがある。したがって、適切な量の第１の溶液は細胞培養容器（細胞の培養物を含むことも含まないこともある）に分注されることがあり、第１の溶液を除去することなく、適切な量の第２の溶液はまた、細胞培養容器に分注され得る。
【０１１９】
システム１は、細胞培養容器取扱モジュール４００をさらに含む（図３を参照）。取扱モジュール４００は、自動システム１内で、細胞培養容器若しくはその蓋、又は娘細胞培養容器若しくはその蓋を把持及び輸送するための一対の対向可能なアームを含み得る。細胞培養容器又はその蓋を把持した取扱モジュール４００は、容器又は蓋をシステム１の異なるステーション（すなわち、モジュール）に輸送し得る。
【０１２０】
取扱モジュール４００はまた、システム１内でピペットチップラックを往復し得る。一実施形態では、取扱モジュール４００は、ピペットチップが消費されたピペットチップラックを、使用場所から廃棄物容器２５０、又は消費されたピペットチップラックのステージングエリアのいずれかに輸送し得る。次に、取扱モジュール４００は、ピペットチップ２３０のバックアップラックを使用場所に輸送し得る。代替の実施形態では、ユーザは、システム１内でピペットチップラックを往復し得る。
【０１２１】
取扱モジュール４００はまた、ピペットモジュール２００（図３Ａ）と共にキャリッジ２２０に含まれ得る。一実施形態では、取扱モジュール４００は、キャリッジ２２０のピペットモジュール２００とは異なる要素である。一実施形態では、ピペットモジュール２００は、取扱モジュール４００の機能も実行し得る。例えば、一対のパドルを（ピペットチップの代わりに）２つのピペットの端部に嵌合させることがあり、一対のパドルを使用して、システム１内の細胞培養容器又はその蓋を把持及び輸送することがある。一実施形態では、取扱モジュール４００及びピペットモジュール２００は両方ともキャリッジ２２０の別個の要素として含まれることがあり、ピペットモジュール２００はまた、その２つのピペットの端部を一対のパドルと嵌合することによって把持機能を提供し得る。
【０１２２】
システム１は、その上に配置された１又は複数の細胞培養容器を支持するためのステージモジュール５００をさらに含み得る。ステージモジュール５００は、少なくとも部分的に液体ディスペンサモジュール３００の下にあることがあり、また、少なくとも部分的に撮像モジュール１００の下にあることがある（図１）。
【０１２３】
ステージモジュール５００は、プラットフォーム５１０を含むことがあり、ステージモジュール５００若しくはプラットフォーム５１０、又はそのサブコンポーネントは移動可能である。ステージモジュール５００若しくはプラットフォーム５１０、又はそのサブコンポーネントは、第１の水平面内で移動可能であり得る。ステージモジュール５００若しくはプラットフォーム５１０、又はそのサブコンポーネントが第１の水平面で移動可能である実施形態では、それは、第１の軸に沿った経路（すなわち、ｘ軸）若しくは第２の軸に沿った経路（すなわち、ｙ軸）、又はその両方で移動可能であり得る。
【０１２４】
ステージモジュール５００若しくはプラットフォーム５１０、又はそのサブコンポーネントの水平面移動は、細胞の懸濁液の量を中に播種するときなど、細胞培養容器又はその１又は複数のウエルに含まれる細胞を分配するのに役立ち得る。水平面移動はまた、細胞培養容器内、あるいはその１又は複数のウエル内に、細胞培養培地、洗浄バッファ、剥離若しくは解離溶液、又は細胞培養マトリックス溶液（例えば、可溶化細胞外マトリックス）などの、中に分注された溶液を分配するのに役立ち得る。
【０１２５】
一実施形態では、ステージモジュール５００若しくはプラットフォーム５１０、又はそのサブコンポーネントもまた、第３の軸に沿った経路で移動し得る。例えば、ステージモジュール５００若しくはプラットフォーム５１０、又はそのサブコンポーネントは、ステージモジュール５００若しくはプラットフォーム５１０、又はそのサブコンポーネントの端部を中心にして垂直に傾斜又は旋回し得る。具体的な実施形態では、傾斜は、プラットフォーム５１０などのステージモジュール５００のサブコンポーネントの端部を中心にして起こる。
【０１２６】
ステージモジュール５００若しくはプラットフォーム５１０、又はそのサブコンポーネントの傾斜移動は、細胞培養容器に含まれ得る任意の溶液を、その１又は複数のウエルの各隅を含む細胞培養容器の隅に収集するのに役立ち得る。細胞培養容器内の溶液のそのような収集は、娘細胞培養容器に播種するために細胞培養容器から細胞の懸濁液の量を引き出すことを含む、ピペットモジュール２００の粉砕又は吸引動作を容易にし得る。したがって、ステージモジュール５００若しくはプラットフォーム５１０、又はそのサブコンポーネントは、特に細胞培養容器がその上に配置され得る場合、ピペットモジュール２００の複数のピペットによってアクセス可能であるべきである。
【０１２７】
取扱モジュール４００の特定の機能は、システム１が１又は複数の画像を取り込むなどのその様々な機能を実行する前に、及び自動化された細胞培養の方法の様々な工程を実行する前に、細胞培養容器をステージモジュール５００（又はステージ１１０）に配置することであり得る。
【０１２８】
一実施形態では、ステージモジュール５００は、その上の細胞培養容器の存在及び重量を検出及び報告するための１又は複数のロードセルを含む。したがって、１又は複数のロードセルは、動作を開始するかどうかについてシステム１にフィードバックを提供し得る。例えば、ステージモジュール５００からの細胞培養容器の欠如は、液体分注動作が実行されるべきではないことを合図することがあり、それにより、不必要な流出を防ぐことがあり、システム１形態をオフラインにする必要を防ぐことがある。一実施形態では、１又は複数のロードセルは、蓋が細胞培養容器から取り外されているかどうかを検証するのに十分な感度がある。一実施形態では、１又は複数のロードセルは、わずか約１００μＬの液体移動が起こったことを検証するのに十分な感度がある。
【０１２９】
一実施形態では、ステージ１１０は、ステージモジュール５００に含まれる。一実施形態では、ステージ１１０は、ステージモジュール５００とは別個である。
【０１３０】
システム１は、少なくとも撮像モジュール１００、ピペットモジュール２００、液体ディスペンサモジュール３００、及び取扱モジュール４００に通信可能に結合された少なくとも１つのプロセッサ６００をさらに備える。一実施形態では、少なくとも１つのプロセッサ６００は、少なくとも撮像モジュール１００、ピペットモジュール２００、液体ディスペンサモジュール３００、取扱モジュール４００、及びステージモジュール５００に通信可能に結合されている。
【０１３１】
撮像モジュール１００に関して、少なくとも１つのプロセッサ６００は、細胞培養容器をステージ１１０（又はステージモジュール５００若しくはプラットフォーム５１０、又はそのサブコンポーネント）に配置するか、又は細胞培養容器をステージ１１０（又はステージモジュール５００若しくはプラットフォーム５１０、又はそのサブコンポーネント）から除去するか、１又は複数の画像を取り込むか、あるいは、１又は複数の画像に基づいて１又は複数の特性を計算するかどうか、命令を開始し得る。
【０１３２】
ピペットモジュール２００に関して、少なくとも１つのプロセッサ６００は、システム１の第１の位置からシステム１の第２の位置に移動するか、細胞の懸濁液の量など、細胞培養容器からある量を吸引するか、細胞培養容器内の量を粉砕（すなわち、ピペットで上下）するか、娘細胞培養容器にある量の細胞の懸濁液を播種するか、１又は複数のピペットの端部からピペットチップを外すか、又は、吸引した量を廃棄物トラフに排出するかどうか（以下を参照）のコマンドを開始し得る。
【０１３３】
液体ディスペンサモジュール３００に関して、少なくとも１つのプロセッサ６００は、ある量の液体を細胞培養容器に分注するか、又は、どの溶液を分注するか、及びそのような溶液の量を指定するかどうかのコマンドを開始し得る。
【０１３４】
取扱モジュール４００に関して、少なくとも１つのプロセッサ６００は、システム１内の第１の位置からシステム１内の第２の位置に移動するか、細胞培養容器又はその蓋をシステム１内の第１の位置からシステム１内の第２の位置に移動させるか、細胞培養容器の蓋を外すか、又はピペットチップラックを移動するかどうかのコマンドを開始し得る。少なくとも１つのプロセッサ６００はまた、取扱モジュール４００の一対の対向可能なアームに優先して一対のパドルを係合するかどうかのコマンドを開始し得る。
【０１３５】
ステージモジュール５００に関して、少なくとも１つのプロセッサ６００は、ステージモジュール５００若しくはプラットフォーム５１０、又はそのサブコンポーネントを、Ｘ軸若しくはＹ軸、又はその両方に沿った経路で移動させるか、あるいはステージモジュール５００若しくはプラットフォーム５１０、又はそのサブコンポーネントをその端部に沿って傾斜させるかどうか、コマンドを開始し得る。
【０１３６】
一実施形態では、システム１は、システム１の様々なモジュールの動作を調整して、自動化された継代、培養、拡大、又は分化プロトコルを実行するための１つの中央プロセッサ６００を備える。「継代」という用語が本明細書の以下又はどこかで使用される場合、培養、拡大、又は分化、又はそれらの変形の用語が等しく適用され得ることが意図されていることに留意されたい。そのような実施形態では、プロセッサ６００は、システム１に通信可能に結合されたコンピュータデバイスに含まれ得る。
【０１３７】
一実施形態では、システム１は、システム１の様々なモジュールの動作を調整して、自動化された継代、培養、拡大、又は分化プロトコルを実行するための複数のプロセッサ６００を備える。そのような実施形態では、第１のプロセッサは、システム１に通信可能に結合された第１のコンピュータデバイスに含まれることがあり、第２のプロセッサは、システム１のモジュール（撮像モジュール１００の画像プロセッサなど）に統合されることがあり、第１のプロセッサ及びシステム１に通信可能に結合され得る第２のコンピュータデバイスに含まれ得る。
【０１３８】
それにもかかわらず、少なくとも１つのプロセッサ６００は、撮像モジュール１００から１又は複数の画像を受信し、撮像モジュール１００から受信した１又は複数の画像に基づいて、細胞の培養物の１又は複数の特性を計算するように構成される。
【０１３９】
一実施形態では、１又は複数の特性は、細胞培養容器内の細胞の培養物の培養密度の測定値に対応する。細胞の培養物の培養密度は、１又は複数の画像を分析して、細胞の培養物によって覆われる細胞培養容器の表面積、又は判定を行うために使用される表面積の他の部分を判定することと、この値を、細胞培養容器の総表面積、又は判定を行うために使用される表面積の他の部分によって分割することとによって、計算し得る。一実施形態では、ソフトウェアスクリプトを実行して、１又は複数の画像のそれぞれを表現に変換することがあり、灰色又はグレースケールのピクシレーションが細胞の培養に割り当てられて、白い背景から細胞の培養物を対比する。一実施形態では、細胞は、黒い背景に対して白色、灰色、又はグレースケールのピクシレーションを割り当てられ得る。いずれにしろ、変換された表現は、システム１の少なくとも１つのプロセッサ６００によって容易に分析されて、細胞培養容器内の細胞の培養物の培養密度の測定値を判定し得る。
【０１４０】
図４Ａは、細胞培養容器のウエル内の細胞の培養物を毎日撮影した画像を示している。画像の目視検査により、細胞の培養物の培養密度が後続の１又は複数の時点と比較して第１の（早い）時点から増加することが確認されるが、培養密度とその変化を効率的かつ確実に定量化することは困難である。図４Ｂは、図４Ａに示されている各画像の変換された表現を示している。変換された表現に基づいて、システム１の少なくとも１つのプロセッサ６００は、単一の時点又は複数の時点にわたるかどうかにかかわらず、細胞培養容器内又は細胞培養容器間の細胞の培養物の培養密度を容易に計算し得る。
【０１４１】
変換された表現に基づく培養密度の判定は、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色などのＤＮＡ結合染料を用いた古典的なアプローチを使用した培養密度の判定と一致している（図５Ａ及び図５Ｂ）。図５Ａは、Ｈｏｅｃｈｓｔで染色されていない、又は染色された同じ細胞培養容器の実際の画像と変換された表現を比較している。図５Ｂは、２つの方法（Ｒ２＝０．９、標準誤差＝０．０４、ｐ＝０．９５）を使用して、細胞の培養物の計算された培養密度の一致を回帰分析によって検証する。図５Ｃは、一連の時点での細胞の培養物の培養密度が、様々な条件下で培養された様々な細胞株の１又は複数の画像に基づいて計算できることを示している。
【０１４２】
さらに、変換された表現に基づく異なる時点での培養密度の判定は、細胞の培養物の培養密度の増加が、培養中の細胞の予想される成長速度と一致して、ほぼ指数関数的成長モデル（図６Ａ）に適合することを確認する。培養密度の変化の判定はまた、細胞の培養物の成長速度（すなわち倍加時間）を計算するために使用され得る。図６Ｂ及び図６Ｃは、細胞の２つの異なる培養物（すなわち細胞株）について、計算された倍加時間が期待値と一致していることを示している。細胞の培養物の培養密度の経時変化から判定された指数関数的成長モデルに基づいて、後続の時点での細胞の培養物の培養密度を予測することが可能であった（図６Ｄ）。図６Ｄは、後続の時点で予測された培養密度が、同じ後続の時点での同じ細胞の培養物の実際の培養密度と一致することを確認している。
【０１４３】
前述のことは、クランプ継代された細胞の培養物の１又は複数の画像に基づいて培養密度を計算し得ることを示しているが、スプレー継代又は単一細胞として継代された細胞の培養物の培養密度を計算することも可能である（機械的掻き取りなしの、細胞の培養物上の培地の繰り返し洗浄によって剥離された細胞）（図７Ａ〜図７Ｆ）。したがって、本明細書に開示される自動化されたシステム及び方法は、特定のＰＳＣ株、間葉系幹細胞、上皮幹細胞、神経幹細胞、癌細胞、癌細胞株などを含むがこれらに限定されない一般的な哺乳動物細胞など、クランプとして必ずしも継代／培養されない細胞に適用可能であり得る。ＰＳＣが単一細胞として継代される実施形態において、培養培地中に、ＣｌｏｎｅＲ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又は開示及び／又は市販され得る他のものなどの個々のＰＳＣの生存を促進するサプリメントを含める必要があることがある。したがって、自動システム１を使用して、細胞のクローン集団を派生させることが可能であり得る。
【０１４４】
一実施形態では、１又は複数の特性は、細胞培養容器内の細胞数の測定値に対応する。コロニーに組織化されたものなど、細胞の培養物内の細胞の数は、少なくとも個々の細胞の面積、個々の細胞が含まれるコロニーの面積、及び／又はコロニー内の細胞スタッキングの程度の関数であり得る。多くの場合、目的の個々の細胞の面積は既知であり得るが、個々の細胞及び細胞のコロニーの面積、並びに細胞スタッキングの程度はそれぞれ、撮像モジュール１００を使用して取り込まれた１又は複数の画像から計算され得る。確かに、より大きなコロニー面積及び細胞コロニーにおける高度の細胞スタッキングは、そのコロニー内の細胞数の増加、したがって細胞の培養物中の細胞数の増加に対応するはずである。
【０１４５】
コロニー面積は、生の画像あるいは１又は複数の画像の変換された表現に基づいて計算され得るが、細胞スタッキングの程度を定量化することは、より大きな課題となる。細胞スタッキングの程度は、個々のコロニーの明るさに基づいて判定することがあり、これは、細胞の層が増えると、通過できる光が少なくなり、コロニーが比較的明るくなるためである。一実施形態では、変換された表現は、細胞スタッキングの程度を判定し得るヒートマップとして提示し得る。一実施形態では、１又は複数の画像の生画像は、コロニーの見た目の明るさに関して十分なデータを提供し得る。いずれにせよ、必要な値が得られたら、細胞培養容器内（又はその中の各コロニー内）の細胞数を計算し得る。細胞の特定の培養物が細胞スタッキングを起こしにくい実施形態では、細胞数は、細胞の培養物の個々のコロニーの明るさの判定に依存することなく計算され得る。
【０１４６】
図８では、１又は複数の画像に基づいて計算された平均コロニーサイズ（つまり面積）が、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色アプローチ（Ｒ２＝０．８６、ｐ＝０．９４）を使用して判定された平均コロニーサイズ（つまり面積）に対応することが示されている。したがって、細胞の培養物内（又は細胞の複数の培養物の間）のコロニーサイズ分布の測定値は、１又は複数の画像から判定されることがあり、そのような１又は複数の特性は、単独で、又は他の１又は複数と組み合わせて使用して、システム１の動作を実行し得る。
【０１４７】
図９では、細胞培養容器内の総細胞数は、撮像モジュール１００を使用して取り込まれた１又は複数の画像に基づいて計算されることがあり、そのような計算は、手動アプローチを使用して得られた総細胞数のカウントとの良好な相関を示すことが示される（Ｒ２＝０．９４、ｐ＜０．０００１）。１又は複数の画像に基づく総細胞数の判定は、生の強度密度の観点で表され、生の強度密度値は、生の細胞の培養物の１又は複数の画像（つまり、生の画像）と組み合わせて、細胞の培養密度の変換された表現から生成される。
【０１４８】
一実施形態では、１又は複数の特性は、細胞培養容器内の細胞の培養物の形態の測定値に対応し得る。細胞の培養物の許容できる又は許容できない形態は、１又は複数の画像に基づいて、細胞の培養物のデジタルプロファイルを既知の標準と比較することによって判定し得る。例えば、ＰＳＣコロニーは通常、滑らかな端部でドーム型になっており、細胞が密に詰まっており、核対細胞質比が高い。対照的に、分化したＰＳＣコロニー又は分化を受けているそれらのＰＳＣコロニーは、前述の特性から逸脱している。したがって、細胞の培養物中のＰＳＣコロニーのデジタルプロファイルは、１又は複数の画像に基づいて生成することがあるり、標準と比較すると、システム１は、少なくとも１つのプロセッサを介して適切な動作方式を実行し得る。
【０１４９】
上記の段落に関連する実施形態では、１又は複数の特性は、細胞培養容器内の細胞の培養物の分化の程度の測定値に対応し得る。１又は複数の画像に基づいて、標準と比較した細胞の培養物の形態の一致又は不一致（コロニー毎又は平均ベースなど）は、細胞の培養物の分化状態を予測し得る。例えば、自動システム１を使用して分化プロトコルが進行中であり、計算された１又は複数の特性が特定の時点で予想される細胞形態を確認する場合、その時点で進行中のプロトコルからの逸脱は必要ないことがある。ただし、計算された１又は複数の特性に基づいて、予想よりも少ないか、分化が判定されない場合、システム１は、プロトコルをさらに１又は複数の撮像時点まで続行することを許可するか、システム１は培地変更を実行して新しい分化培地を導入することがある。別の例では、自動システム１がＰＳＣの培養物の拡張プロトコル又は維持プロトコルを実行している場合、かなりの程度の分化が、予想よりも早く継代プロトコル又は終了プロトコルをトリガし得る。
【０１５０】
一実施形態では、細胞の培養物の分化状態（又は形態の変化）は、１又は複数の画像、及び機械学習分類器（すなわち、訓練された機械学習分類器）を使用して得られたデータから導出された方程式又はモデルに依存して判定され得る。図１０Ａ及び１０Ｂは、それぞれ、撮像モジュール１００によって取り込まれた代表的な画像と、１０Ａの画像の未分化、分化（より明るい）及び背景（最も暗い）領域が重ね合わされた代表的な画像を示す。図１０Ｃは、３つの異なる分類モデルを使用した分類器の結果を示している。未分化コロニーの分類のみに依存し、予測子を無視する第１の分類モデルを使用すると、５３．８３％±０．００％の分類精度を達成できる。相関が最も高いクラス（つまり、未分化、分化、及び背景）に特徴を割り当てる第２の分類モデルを使用すると、９４．９３％±０．０８％の分類精度を達成できる。規則の決定木に基づいてクラス（つまり、未分化、分化、及び背景）に特徴を割り当てる第３の分類モデルを使用すると、９９．９０％±０．０２％の分類精度を達成できる。前述のデータを生成するために使用される分類器は、背景、未分化ＰＳＣ、及び分化ＰＳＣの領域が１又は複数の画像のサブセットにおいて手動で選択された画像のセットを使用して訓練された。この訓練セットには、図１０のテスト画像は含まれていない。分類器の訓練と実験は、ＷＥＫＡ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈを使用して実行された。例えば、Ｉａｎ  Ｈ．Ｗｉｔｔｅｎ及びＥｉｂｅ  Ｆｒａｎｋ（２００５）「ＤａｔａＭｉｎｉｎｇ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｔｏｏｌｓ  ａｎｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、第２版、Ｍｏｒｇａｎ  Ｋａｕｆｍａｎｎ、サンフランシスコ、２００５を参照されたい。
【０１５１】
外胚葉、内胚葉、中胚葉の系統細胞はそれぞれ固有の形態を示すため、訓練された機械学習分類器が１又は複数の画像に基づいてそのような区別を行うことも可能である。
【０１５２】
本明細書に開示されるシステム又は方法がＰＳＣ維持プロトコルを実行するために使用される実施形態において、未分化ＰＳＣを選択的に継代することも可能であることがあり、したがって、比較的高度の分化を示す細胞培養容器コロニーを残す（図１１）。例えば、システム１が少なくとも１つのプロセッサ６００によって開始されたコマンドに応答して継代プロトコルを開始するような時点で、ピペットモジュール２００は、（ステージモジュール５００の傾斜機能の依存の有無にかかわらず）細胞培養容器から細胞培養培地を吸引することがあり、液体ディスペンサモジュール３００は、ある量の洗浄バッファを細胞培養容器に分注し得る（この洗浄バッファは、その後、ピペットモジュール２００を使用して吸引される）。ＲｅＬｅＳＲ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの特殊な細胞剥離溶液を細胞培養容器に分注して、未分化ＰＳＣのコロニーを細胞培養容器から選択的に剥離し得る。細胞の培養物の分化の測定値に応じて、細胞剥離溶液への曝露時間を調整し得る。例えば、高推定分化の場合、より短いインキュベーション時間は、剥離する分化したコロニーの割合を減らすことがある。したがって、未分化ＰＳＣの剥離したコロニーのみから生成されたある量の細胞の懸濁液を播種すると、娘細胞培養容器内の未分化ＰＳＣが濃縮されることがある。同様に、分化プロトコルを実行する際に、このように剥離された未分化ＰＳＣのコロニーは廃棄されることがあり、残りの分化したコロニーは解離され、次いで継代され得る。
【０１５３】
一実施形態では、１又は複数の特性は、１又は複数の後続の時点と比較した、第１の時点からの計算された１又は複数の特性の変化の測定値に対応し得る。例えば、１又は複数の特性は、第２の時点での細胞の培養物の培養密度の測定値と比較した、第１の時点での細胞の培養物の培養密度の測定値であり得る。
【０１５４】
図１２は、自動システム１を使用して継代プロトコルが実行される時点が、第１の時点及び１又は複数の後続の時点での細胞の培養物の培養密度を計算することに基づいて判定され得ることを示している。したがって、前述のデータのプロットを、任意の細胞の培養物の最大又は所望の継代前培養密度に外挿することは、特に自動システム１が任意の時点で最大数百のプレートを担当する場合、継代プロトコルのスケジューリングに役立つことがある。
【０１５５】
一実施形態では、１又は複数の特性は、１又は複数の特性のうちの異なる特性の関数として、１又は複数の特性のうちの１つの測定値に対応し得る。例えば、１又は複数の特性は、細胞又は細胞の培養物のコロニーの分化の程度の関数として、細胞の培養物の培養密度の測定値であり得るか、又はその逆も成り立つ。そのような１又は複数の特性はまた、第１の時点及び１又は複数の後続の時点で評価され得る。
【０１５６】
１又は複数の特性の計算に関連するすべてのデータポイントの取得及び分析に基づいて、システム１は自己学習（つまり自己訓練）が可能であり、自動継代又はその他のプロトコルをいつ実行するかに関する命令をオペレータが提供する必要はない。したがって、本明細書に開示される主題は、細胞の培養物を適応的に継代するためのシステム及び方法に関連し得る。
【０１５７】
本明細書で使用される場合、「適応的継代」は、柔軟であり、その実行が、１又は複数の時点で取り込まれた１又は複数の画像に基づいて計算された１又は複数の特性に依存する継代プロトコルを指す。さらに、そのような継代プロトコルは、必ずしもシステム１のオペレータからの合図に依存するわけではない。むしろ、１又は複数の画像（１又は複数の時点で取り込まれた）を処理し、１又は複数の特性を計算したシステム１は、適切な時間に、限定されるものではないが細胞の培養物の日常の維持培養中、又は新たに派生された若しくは得られた細胞株のオンボード操作中など、後続の各継代中に、細胞の一貫した培養物を取得又は維持することを目的とした適切な量の細胞を用いて、継代プロトコル（又は拡張プロトコル、又は分化プロトコル）を実行し得る。
【０１５８】
一実施形態では、細胞培養容器内の細胞の培養物及び第２の細胞培養容器内の細胞の第２の培養物に関して計算された１又は複数の特性が、第１の時点又は１又は複数の後続の時点で異なり、システム１の動作に基づいて、１又は複数の特性が、後続の継代中により一貫性を持つようになる。例えば、第１の細胞培養容器又はその第１のウエルにおける細胞の第１の培養物の培養密度は、第１の時点（例えば、継代０の６日後）で２５％であり、第１の細胞培養容器の第２のウエルなどの第２の細胞培養容器内の細胞の第２の培養物の培養密度は、第１の時点で１０％であり、これにより、非同期の自動継代プロトコルが実行される。非同期自動継代プロトコルを実行することは、効率の問題にとって望ましくないことがあるが、例えば細胞の第１の培養物と細胞の第２の培養物が同じ細胞培養容器の異なるウエルにある場合、他の細胞の培養物が継代されているため、細胞の一方の培養物を不必要なリスクにさらすこともある。したがって、自動システム１は、後続の時点（例えば、継代０＋ｎの６日後）で細胞の第１及び第２の培養物の培養密度をより一貫性のあるものにするために、播種密度など、細胞の第１及び第２の培養物の両方の後続の継代の１又は複数の要素を適応的に調整し得る。
【０１５９】
図１３は、中の細胞のそれぞれの培養物の培養密度の比較的広い変動を有するいくつかの細胞培養容器にわたって、システム１を使用する適応継代プロトコルに従って、培養密度の変動がより一貫し得るようになることを示す。親細胞培養容器の培養密度と娘細胞培養容器の培養密度との間の関係を判定すると、娘又は孫娘細胞培養容器への細胞懸濁液の適切な希釈液（すなわち、播種密度）を計算することが可能である。
【０１６０】
システム１の少なくとも１つのプロセッサは、細胞の培養物を継代するための自動継代プロトコルを実行するようにさらに構成され、プロトコルは、細胞の培養物の計算された１又は複数の特性と、細胞の培養物の１又は複数の特性について学習又は入力された閾値レベルとの比較に基づいて、少なくとも撮像モジュール１００、ピペットモジュール２００、液体ディスペンサモジュール３００、及び取扱モジュール４００ベースの動作を調整することを含む。
【０１６１】
１又は複数の画像を取り込むとき、自動システム１は、１又は複数の画像に基づいて、細胞の培養物の１又は複数の特性を（撮像モジュールに通信可能に結合された少なくとも１つのプロセッサ６００によって）計算する。一実施形態では、１又は複数の特性の計算は、上記で提供された説明に従って達成し得る。特に、１又は複数の特性は、
ａ）細胞の培養物の培養密度の測定値、
ｂ）細胞の培養物の細胞又はコロニーの形態の測定値、
ｃ）細胞の培養物の細胞又はコロニーの分化の測定値、
ｄ）細胞の培養物のコロニーサイズ分布の測定値、
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）、又はｄ）の第１の時点から１又は複数の後続の時点への変化の測定値、又は
ｆ）ｂ）、ｃ）、若しくはｄ）に対するａ）の測定値、ａ）、ｃ）、若しくはｄ）に対するｂ）の測定値、ａ）、ｂ）、若しくはｄ）に対するｃ）の測定値、又はａ）、ｂ）、若しくはｃ）に対するｄ）の測定値、を含み得る。
【０１６２】
１又は複数の特性を計算すると、自動システム１は、細胞の培養物を継代するための自動継代プロトコルを実行するようにさらに構成され、プロトコルは、細胞の培養物の計算された１又は複数の特性と、細胞の培養物の１又は複数の特性について学習又は入力された閾値レベルとの比較に基づいて、自動継代プロトコルを（少なくとも１つのプロセッサ６００によって）実行する。
【０１６３】
一実施形態では、細胞の培養物（すなわち、細胞又はコロニー）の培養密度の測定値に関して学習又は入力された閾値レベルは、約３０〜９０％の範囲にある。したがって、細胞の培養物が約３０〜９０％の培養密度を達成した場合、自動システム１は継代プロトコルを開始し得る。一実施形態では、細胞の培養物（すなわち、細胞又はコロニー）の培養密度の測定値は、約４０〜８０％の範囲にある。一実施形態では、細胞の培養物（すなわち、細胞又はコロニー）の培養密度の測定値は、約５０〜７０％の範囲にある。
【０１６４】
一実施形態では、細胞の培養物（すなわち、細胞又はコロニー）の形態の測定値に関して学習又は入力された閾値レベルは、対照細胞培養物の約±３０％である。したがって、細胞の培養物が、その形態に関して、対照細胞培養物の約±３０％の間で逸脱している場合、自動システム１は、継代プロトコルを開始し得る。一実施形態では、細胞の培養物（すなわち、細胞又はコロニー）の形態の測定値は、対照細胞培養物の約±２０％である。一実施形態では、細胞の培養物（すなわち、細胞又はコロニー）の形態の測定値は、対照細胞培養物の約±１０％である。
【０１６５】
一実施形態では、細胞の培養物（すなわち、細胞又はコロニー）の分化レベルの測定値に関して学習又は入力された閾値レベルは、維持プロトコルにおいて対照培養物の約０〜３０％、又は分化プロトコルににおいて対照培養物の約５０％〜１００％である。一方で、細胞の培養物が、維持プロトコルにおいて対照培養物に対して、約０〜３０％、又は約１０〜２０％、又は約１５％の分化レベルを達成した場合、自動システム１は継代プロトコルを開始し得る。対照的に、細胞の培養物が、分化プロトコルにおいて対照培養物に対して、約０〜３０％、又は約１０〜２０％、又は約１５％の分化レベルを達成した場合、自動システム１は継代プロトコルを開始しないことがある。むしろ、そのようなシナリオでは、自動システム１は、何もしないか、又は使用済みの分化培地を新しい分化培地に置き換え得る。他方、細胞の培養物が、分化プロトコルにおいて対照培養物に対して、約５０〜１００％、又は約６０〜９０％、又は約７０〜８０％、又は約７５％の分化レベルを達成した場合、自動システム１は、継代（及び／又は拡張）プロトコルを開始し得るか、又は下流の用途のために分化細胞を回収し得る。対照的に、細胞の培養物が、維持プロトコルにおいて対照培養物に対して、約５０〜１００％、又は約６０〜９０％、又は約７０〜８０％、又は約７５％の分化レベルを達成した場合、自動システム１は、細胞の培養物をトライ及び救済するための継代プロトコル又は終了プロトコルを開始し得る。
【０１６６】
一実施形態では、細胞の培養物（すなわち、細胞又はコロニー）のコロニーサイズ分布の測定値に関して学習又は入力された閾値レベルは、対照培養物の平均コロニーサイズ分布又はそのサブフラクションの約２０％、又は約１５％、又は約１０％、又は約５％以内である。したがって、細胞の培養物が、対照培養物の平均コロニーサイズ分布又はそのサブフラクションの約２０％、又は約１５％、又は約１０％、又は約５％以内の平均コロニーサイズ分布を達成した場合、自動システム１は、継代プロトコルを開始し得る。一実施形態では、対照培養物の平均コロニーサイズ分布の約２０％、又は約１５％、又は約１０％、又は約５％以内の閾値レベルは、コロニーサイズ分布のサブフラクション、例えば、上位１０％、又は上位２０％、又は上位３０％、又は上位４０％、又は下位１０％、又は下位２０％、又は下位３０％、又は下位４０％に関係する。
【０１６７】
システム１は、少なくともピペットモジュール２００、液体ディスペンサモジュール３００、取扱モジュール４００、及びステージモジュール５００、またピペットチップラック２２５及び２３０、並びにキャリッジ２２０が含まれる実施形態ではこれら、を収容するためのエンクロージャ７００をさらに備え得る。撮像モジュール１００及びカメラ１０５はまた、エンクロージャ７００（図３Ｂ）に収容され得るが、インキュベータモジュール（以下に説明される）などの他の場所に含まれ得る。
【０１６８】
一実施形態では、エンクロージャ７００は、無菌の内部環境を維持する。一実施形態では、エンクロージャ７００は、無菌室に対応し得る。そのような実施形態では、本明細書に開示されるシステム１のすべてのモジュールは、無菌室に含まれ得る。一実施形態では、エンクロージャ７００は、生物学的安全性キャビネットに対応し得る。そのような実施形態では、スペースの制約のために、内部に配置されたモジュールは、自動継代（又は他の）プロトコルを実行するモジュールに限定されるべきである。
【０１６９】
一実施形態では、複数の溶液リザーバ３５０、冷蔵モジュール８００、及び廃棄物リザーバ９００は、エンクロージャ７００の外部にある。
【０１７０】
システム１は、１又は複数の溶液リザーバ３５０のうちの１又は複数を保管するための冷蔵モジュール８００をさらに備え得る。冷蔵モジュール８００は、所望の温度で１又は複数の溶液リザーバ３５０のうちの１又は複数を保管することを意図する。例えば、細胞培養培地は、その内容物の分解を制限するために、約４℃で保管され得る。同様に、細胞剥離溶液、洗浄バッファ、及び特定の細胞培養マトリックス溶液は、望ましくは約４℃で保管し得る。
【０１７１】
冷蔵モジュール８００は、１又は複数のセンサを含み得る。一実施形態では、第１のセンサは、複数の溶液リザーバ３５０のそれぞれの質量を検出し、（少なくとも１つのプロセッサ６００に）報告する。したがって、第１のセンサは、適切な量の溶液が第１のリザーバから排出されたことをシステム１にリアルタイムでフィードバックする。これに失敗すると、システム１は、第１のリザーバから分注される溶液の修正量を決定することがある。同じ又は異なる実施形態では、第２のセンサが、冷蔵モジュール８００内の温度を検出し、（少なくとも１つのプロセッサ６００に）報告する。したがって、第２のセンサは、冷蔵モジュール８００が適切な温度に維持されているというリアルタイムのフィードバックをシステム１に提供する。
【０１７２】
システム１はまた、廃棄物リザーバ９００を含み得る（図１を参照のこと）。廃棄物リザーバ９００は、エンクロージャ７００内に配置された廃棄物トラフ９２５と流体連通していることがある。システム１内の細胞の培養物又は他の構成要素を汚染する可能性を最小限に抑えるには、望ましくない溶液又は微生物であるかどうかにかかわらず、廃棄物トラフの設計及び位置が重要な考慮事項である。図１４Ａ及び図１４Ｂは、廃棄物トラフ９２５の一実施形態を示している。
【０１７３】
一実施形態では、廃棄物トラフ９２５は、撮像モジュール１００、液体ディスペンサモジュール３００、及びステージモジュール５００から離れていることがある。一実施形態では、廃棄物トラフ９２５を液体ディスペンサモジュール３００の下に配置して、液体呼び動作中（すなわち、導管から古い又は室温の溶液を取り除く）の液体ディスペンサモジュール３００の１又は複数の導管からの細胞培養溶液の廃棄を単純化し得る。
【０１７４】
廃棄物トラフ９２５は、溶液を廃棄物リザーバ９００に運ぶためのチャネル９３０を備える。一実施形態では、廃棄物トラフは、第１のシンク９３５及び第２のシンク９３７を含み、第１及び第２のシンクの両方が、チャネル９３０と流体連通している。第１のシンク９３５は、ピペットモジュール２００から排出物を受け取ることがあり、第２のシンクは、液体ディスペンサモジュール３００から、より具体的には、それに関連付けられた複数の導管から排出物を受け取ることがある。
【０１７５】
一実施形態では、第１のシンク９３５は、滅菌溶液などの溶液を提供するためのフラッシュ入口９３８をさらに含む。当業者は、細胞培養プロセスに有用な適切な滅菌溶液を知っているであろう。例えば、滅菌溶液は、希釈された漂白剤であり得る。あるいは、滅菌溶液は、イソプロピルアルコールなどのアルコールであり得る。
【０１７６】
一実施形態では、廃棄物トラフ９２５は、そこに排出される溶液の貯留を最小限に抑える形状を組み込み得る。一実施形態では、廃棄物トラフ９２５の受容面９４０は、チャネル９３０に向かって下向きに傾斜し、排出された溶液を促すことがある。一実施形態では、受容面９４０は、受容面９４０内に形成された点、又は実質的に点に集まる一対の傾斜壁をさらに含み得る。そのような実施形態では、壁の収束対は、下向きの傾斜と協働して、排出された溶液をチャネル９３０に向かって、チャネル９３０を通して促す。
【０１７７】
一実施形態では、廃棄物トラフ９２５は、廃棄物リザーバ９００の詰まり又はチャネル９３０の閉塞を検出して（少なくとも１つのプロセッサ６００に）報告するための液面センサ９４５をさらに備える。
【０１７８】
一実施形態では、廃棄物トラフ９２５は、疎水性コーティング又は超疎水性コーティングでコーティングし得る。一実施形態では、コーティングは、シリカナノ粒子ベースであり得る。当業者は、シロキサン又はパーフルオロカーボンベースのコーティングなどの他の適切な疎水性又は超疎水性コーティングに気付くであろう。
【０１７９】
一実施形態では、廃棄物トラフ９２５は、細胞培養培地などの残留溶液が集まり、潜在的な汚染問題を引き起こす可能性がある大きな開放エリアを最小化するために、比較的小さな設置面積を占めることがある。一実施形態では、廃棄物トラフ９２５は、その容量を減少させずに、開放エリアをさらに減少させるためのカバー９５０をさらに備える。
【０１８０】
システム１は、インキュベータモジュール１０００をさらに含むことがあり、インキュベータモジュールは、多能性幹細胞などの細胞の培養物のための許容環境条件を維持する。インキュベータモジュールは当技術分野で知られており、例えば、Ｌｉｃｏｎｉｃから購入し得る。一実施形態では、インキュベータモジュール１０００は、複数の細胞培養容器用のラックを含み得る。一実施形態では、インキュベータモジュール１０００は、細胞培養容器をラックから選択的に引っ張るための取扱手段をさらに含み、そのような取扱手段は、細胞培養容器に関連付けられた固有の識別子（すなわち、バーコード及びバーコードリーダ）に基づいて細胞培養容器を選択的に引っ張る。
【０１８１】
一実施形態では、インキュベータモジュール１０００は、その中の温度、又は湿度及びＣＯ２％のような他の大気条件などの他の条件を検出して（少なくとも１つのプロセッサ６００に）報告するための１又は複数のセンサを含む。
【０１８２】
システム１がインキュベータモジュール１０００を含む場合、エンクロージャ７００とインキュベータモジュール１０００を接続し、細胞培養容器をインキュベータモジュール１０００から取扱モジュール４００の近くに輸送するためのコンベヤモジュール１１５０を含むことが望ましいことがある（図１）。一実施形態では、コンベヤモジュール１１５０は、細胞培養容器が非滅菌環境にさらされるのを防ぐために閉鎖され得る。
【０１８３】
インキュベータモジュール１０００及びコンベヤ１１５０の両方は、少なくとも１つのプロセッサ６００に通信可能に結合されている。インキュベータモジュール１０００に関して、少なくとも１つのプロセッサ６００は、取扱手段を作動させて、その中のラックから細胞培養容器を選択的に引っ張るか、若しくは細胞培養容器を交換するか、又はその中の大気条件を調整するかどうかのコマンドを開始し得る。コンベヤモジュール１１５０に関して、少なくとも１つのプロセッサ６００は、インキュベータモジュール１０００から細胞培養容器を輸送するか、又は、細胞容器を、例えば、エンクロージャ７００からインキュベータモジュールに輸送するかどうかのコマンドを開始し得る。
【０１８４】
システム１は、所望により、自動システムの各モジュールの動作を調整するためのコントローラ７００をさらに備えることがある。コントローラ７００は、パーソナルコンピュータに含まれ得るソフトウェアを含む。コントローラ７００内のソフトウェアは、自動システムの各モジュールの動作を調整するために必要なコマンドを実行することができる。
【０１８５】
システム１は、少なくとも１つのプロセッサに通信可能に結合されたグラフィカルユーザインタフェース１２００をさらに含み得る。グラフィカルユーザインタフェース１２００は、好ましくは、エンクロージャ７００の外部に配置される。一実施形態では、グラフィカルユーザインタフェース１２００は、システム１と統合されたパーソナルコンピュータのディスプレイである。一実施形態では、グラフィカルユーザインタフェース１２００は、システム１に無線で接続されたパーソナルコンピュータのディスプレイである。グラフィカルユーザインタフェース１２００は、システム１のユーザに、自動細胞培養プロセスをスケジュールし、システム１によって実行される自動細胞培養プロセスを評価し、カメラ１０５によって取り込まれた１又は複数の画像を評価し、システム１に統合された各センサからの通知又はその状態を受信し、複数の溶液リザーバ３５０のそれぞれの液面レポートを観察するなど、システム１の動作を指示するために必要な制御を提供し得る。
【０１８６】
システム１は、本明細書で以下に記載されるように、細胞の培養物中の１又は複数のコロニーを解離するための装置に従って、解離モジュール１３００をさらに含み得る。細胞培養容器は、取扱モジュール３００を使用して解離モジュール１３００に輸送され得る。
【０１８７】
システムの使用方法
本開示の別の態様では、自動システム１を使用して、細胞の培養物を継代する自動化された方法を実行し得る（図１５）。一実施形態では、自動システム１を使用して、細胞の培養物を適応的に継代する自動化された方法を実行し得る。具体的な実施形態では、細胞は多能性幹細胞であることがあり、さらにより具体的には、細胞はヒト多能性幹細胞であり得る。多くの用途において、ヒト多能性幹細胞をクランプ又はクラスタとして継代することが望ましいため、ヒト多能性幹細胞の培養物を継代するための自動化された方法は、そのクランプ継代に適していることがある。
【０１８８】
本明細書に開示される方法は、細胞の培養物を継代するために使用され得るが、それらはそれに限定されない。方法のバリエーションを使用して、日常の維持方式の一部として培地交換を実行し得る。あるいは、この方法を使用して、細胞拡大方式を実施することがあり、細胞の培養物を、より大きな培養容器又はより多くのウエルに連続的に培養し得る。あるいは、この方法を使用して、新たに派生された、又は得られたＰＳＣ細胞株などの新しい細胞株のオンボード方式を実行することがあり、初期継代でのデータ（つまり、１又は複数の特性）の取得及び分析は後続の継代を実行するための最適な条件について通知することがある。あるいは、方法を使用して、細胞の開始集団を分化培地などの分化条件にさらして、細胞の開始集団を細胞の派生系統に変換する、細胞分化方式を実施し得る。多能性幹細胞に特有の例には、適切な培養培地への曝露によるそのような細胞の外胚葉様又は外胚葉細胞、内胚葉様又は内胚葉細胞、又は中胚葉様又は中胚葉細胞への分化が含まれる。
【０１８９】
細胞の培養物を継代するための自動化された方法は、細胞培養容器内の細胞培養培地において細胞の培養物を提供することを含む。一実施形態では、細胞の培養物を提供することは、インキュベータから細胞の培養物を運ぶことを含む。細胞培養容器の運搬は、上記のコンベヤモジュールなどのコンベヤ手段を使用して達成し得る。一実施形態では、細胞培養容器（及びその中の細胞の培養物）を提供することは、上記の取扱モジュールなどの細胞培養容器ハンドラを使用して達成し得る。
【０１９０】
一実施形態では、自動化された方法、より具体的には細胞培養容器（及びその中の細胞の培養物）を提供することは、培養容器を上記のステージモジュールなどのステージ上に配置することをさらに含み得る。一実施形態では、細胞培養容器の位置決めは、細胞培養容器ハンドラ（つまり、取扱モジュール）を使用して達成し得る。
【０１９１】
自動化された方法はまた、第１の時点及び１又は複数の後続の時点での細胞の培養物の１又は複数の画像を撮像モジュールによって取り込むことを含む。一実施形態では、撮像モジュールは、本質的に上記のとおりである。
【０１９２】
１又は複数の画像を取り込むとき、自動化された方法はまた、１又は複数の画像に基づいて、細胞の培養物の１又は複数の特性を、撮像モジュールに通信可能に結合された少なくとも１つのプロセッサによって計算することを含む。一実施形態では、１又は複数の特性の計算は、上記で提供された説明に従って達成し得る。特に、１又は複数の特性は、
ａ）細胞の培養物の培養密度の測定値、
ｂ）細胞の培養物の細胞又はコロニーの形態の測定値、
ｃ）細胞の培養物の細胞又はコロニーの分化の測定値、
ｄ）細胞の培養物のコロニーサイズ分布の測定値、
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）、又はｄ）の第１の時点から１又は複数の後続の時点への変化の測定値、又は
ｆ）ｂ）、ｃ）、若しくはｄ）に対するａ）、ａ）、ｃ）、若しくはｄ）に対するｂ）、ａ）、ｂ）、若しくはｄ）に対するｃ）、又はａ）、ｂ）、若しくはｃ）に対するｄ）の測定値、を含み得る。
【０１９３】
１又は複数の特性を計算すると、自動化された方法はまた、細胞の培養物を継代するための自動継代プロトコルを実行するようにさらに構成され、プロトコルは、細胞の培養物の計算された１又は複数の特性と、細胞の培養物の１又は複数の特性について学習又は入力された閾値レベルとの比較に基づいて、自動継代プロトコルを、１又は複数のプロセッサによって実行することを含む。
【０１９４】
一実施形態では、細胞の培養物（すなわち、細胞又はコロニー）の培養密度の測定値に関して学習又は入力された閾値レベルは、約３０〜９０％にある。したがって、細胞の培養物が約３０〜９０％の培養密度を達成した場合、自動システム１は継代プロトコルを開始し得る。一実施形態では、細胞の培養物（すなわち、細胞又はコロニー）の培養密度の測定値は、約４０〜８０％にある。一実施形態では、細胞の培養物（すなわち、細胞又はコロニー）の培養密度の測定値は、約５０〜７０％にある。
【０１９５】
一実施形態では、細胞の培養物（すなわち、細胞又はコロニー）の形態の測定値に関して学習又は入力された閾値レベルは、対照細胞培養物の約±３０％である。したがって、細胞の培養物が、その形態に関して、対照細胞培養物の約±３０％の間で逸脱している場合、自動システム１は、継代プロトコルを開始し得る。一実施形態では、細胞の培養物（すなわち、細胞又はコロニー）の形態の測定値は、対照細胞培養物の約±２０％である。一実施形態では、細胞の培養物（すなわち、細胞又はコロニー）の形態の測定値は、対照細胞培養物の約±１０％である。
【０１９６】
一実施形態では、細胞の培養物（すなわち、細胞又はコロニー）の分化レベルの測定値に関して学習又は入力された閾値レベルは、維持プロトコルにおいて対照培養物の約０〜３０％、又は分化プロトコルにおいて対照培養物の約５０％〜１００％である。一方で、細胞の培養物が、維持プロトコルにおいて対照培養物に対して、約０〜３０％、又は約１０〜２０％、又は約１５％の分化レベルを達成した場合、自動システム１は継代プロトコルを開始し得る。対照的に、細胞の培養物が、分化プロトコルにおいて対照培養物に対して、約０〜３０％、又は約１０〜２０％、又は約１５％の分化レベルを達成した場合、自動システム１は継代プロトコルを開始しないことがある。むしろ、そのようなシナリオでは、自動システム１は、何もしないか、又は使用済みの分化培地を新しい分化培地に置き換え得る。他方、細胞の培養物が、分化プロトコルにおいて対照培養物に対して、約５０〜１００％、又は約６０〜９０％、又は約７０〜８０％、又は約７５％の分化レベルを達成した場合、自動システム１は、継代（及び／又は拡張）プロトコルを開始し得るか、又は下流の用途のために分化細胞を回収し得る。対照的に、細胞の培養物が、維持プロトコルにおいて対照培養物に対して、約５０〜１００％、又は約６０〜９０％、又は約７０〜８０％、又は約７５％の分化レベルを達成した場合、自動システム１は、細胞の培養物をトライ及び救済するための継代プロトコル又は終了プロトコルを開始し得る。
【０１９７】
一実施形態では、細胞の培養物（すなわち、細胞又はコロニー）のコロニーサイズ分布の測定値に関して学習又は入力された閾値レベルは、対照培養物の平均コロニーサイズ分布又はそのサブフラクションの約２０％、又は約１５％、又は約１０％、又は約５％以内である。したがって、細胞の培養物が、対照培養物の平均コロニーサイズ分布又はそのサブフラクションの約２０％、又は約１５％、又は約１０％、又は約５％以内の平均コロニーサイズ分布を達成した場合、自動システム１は、継代プロトコルを開始し得る。一実施形態では、対照培養物の平均コロニーサイズ分布の約２０％、又は約１５％、又は約１０％、又は約５％以内の閾値レベルは、コロニーサイズ分布のサブフラクション、例えば、上位１０％、又は上位２０％、又は上位３０％、又は上位４０％、又は下位１０％、又は下位２０％、又は下位３０％、又は下位４０％に関係する。
【０１９８】
本明細書で使用される場合、「自動継代プロトコル」は、継代培養などによって細胞の培養物が増殖され得る時点までの培養活動と、細胞の培養物の一部又は全部を１又は複数の娘細胞培養容器に播種することを含む細胞の培養物の継代培養を行うために必要な活動とを指す。したがって、継代という用語は、細胞の培養物の継代培養などの細胞の日常の培養に関連する活動と、細胞の培養物を拡大又は分化させることを目的としたワークフローも指す。
【０１９９】
一実施形態では、継代プロトコルの実行は、細胞の培養物から細胞の懸濁液を取得し、娘細胞培養容器に細胞の懸濁液の一部又は全部を播種することによって達成し得る。
【０２００】
一実施形態では、細胞の懸濁液を得ることは、細胞の懸濁液を第１のピペットチップに通して、細胞の培養物を単一細胞懸濁液又は第１のピペットチップの口径を超えない平均直径を有する複数のクランプに解離させることをさらに含む。一実施形態では、細胞の懸濁液を第１の先端に通すことは、上記のようにピペットモジュールを使用して実施し得る。
【０２０１】
細胞懸濁液を得る前に、第１の細胞培養容器内の培養培地は、細胞培養容器又はそのウエルから培養培地を吸引することによって除去され得る。上記のように、一実施形態では、細胞培養培地の吸引は、上記のピペットモジュールを使用して達成し得る。一実施形態では、細胞培養培地を除去する（すなわち、吸引する）ことは、第１の細胞培養容器を傾け、続いてピペットモジュールのピペットに嵌合したピペットチップを細胞培養容器又はそのウエルの下部隅に向けることを含み得る。
【０２０２】
培養培地を吸引した後、洗浄バッファを細胞培養容器又はそのウエルに分注することによって洗浄工程を実行することが望ましいことがある。一実施形態では、洗浄バッファは、上記の液体ディスペンサモジュールを使用して分注し得る。その後、洗浄バッファは、ピペットモジュールを介するなど、上記のように吸引（すなわち、除去）され得る。
【０２０３】
供給方式が実施されている場合、細胞培養容器を上記のインキュベータモジュールなどのインキュベータに戻す前に、新鮮な培養培地を（使用済み培地を吸引及び／又は洗浄した後）細胞培養容器又はそのすべての適切なウエルに加え得る。
【０２０４】
細胞の継代又は拡大に関連する方法では、細胞培養培地が除去された（また所望により洗浄工程を経た）細胞培養容器内の細胞の培養物を、剥離／解離溶液と接触させ得る。任意の適切な剥離又は解離溶液を使用して、細胞培養容器又はそのウエル内の細胞の培養物に接触させ得る。一実施形態では、剥離溶液は、ＲｅＬｅＳＲ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｎｅｕｒａｌ  Ｒｏｓｅｔｔｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であり得る。一実施形態では、解離溶液は、ＧＣＤＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又は他のいくつかのトリプシンベースの溶液であり得る。細胞培養容器内の細胞の培養物を剥離又は解離溶液と接触させることは、上記のように液体ディスペンサモジュールを使用して実施し得る。使用する溶液のタイプに応じて、細胞の培養物は、剥離又は解離溶液の存在下で、約３７℃又は室温で十分な時間インキュベートし得る。また、使用する溶液のタイプによっては、細胞の培養物をインキュベートする前に溶液を吸引することが望ましいことがある。さらに、使用される溶液のタイプ及び細胞タイプに応じて、細胞培養容器をインキュベータモジュールに運ぶことが望ましいことがある。
【０２０５】
一実施形態では、剥離溶液は分画溶液であり、分画溶液は、細胞培養容器の壁から分化細胞の第１の集団又は未分化細胞の第２の集団のいずれかを選択的に剥離する。そのような実施形態では、用途に応じて、ＲｅＬｅＳＲ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｎｅｕｒａｌ  Ｒｏｓｅｔｔｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかを使用し得る。
【０２０６】
第１の細胞培養容器のインキュベーションに続いて、方法の次の工程は、取扱モジュールを使用して第１の細胞培養容器を解離モジュール（以下に記載される）に輸送し、解離モジュールを使用して第１の細胞培養容器のウエルの底部から、限定されるものではないが多能性幹細胞コロニーなどの細胞コロニーを剥離することを含み得る。
【０２０７】
上記のように、１又は複数の細胞コロニーの一部又は全部が剥離／解離溶液により剥離することがあり、又は解離モジュールを使用して１又は複数の細胞コロニーの一部又は全部を剥離するように促す必要があることがある。いずれにせよ、解離モジュールを活性化することはまた、剥離した細胞コロニーを細胞の懸濁液に、そして一実施形態では多能性幹細胞のクランプの懸濁液に解離するのを助け得る。
【０２０８】
いくつかの実施形態において、解離モジュールを活性化する前又は後にピペットモジュールを使用して細胞の懸濁液を粉砕することは、多能性幹細胞のクランプの懸濁液などの細胞の懸濁液への１又は複数のコロニーの解離を容易にし得る。
【０２０９】
１又は複数の細胞コロニーが細胞の懸濁液に解離した後、ある量の細胞の懸濁液（単一細胞懸濁液又は複数のクランプの懸濁液にかかわらず）を、ピペットモジュールを使用するなどして、娘細胞培養容器又はそのウエルに播種し得る。
【０２１０】
一実施形態では、細胞の懸濁液の量を娘細胞培養容器に播種する前又は後に、自動化された方法は、第１の溶液及び第２の溶液を、同時に又は順番に娘細胞培養容器に分注することをさらに含み得る。一実施形態では、第１の溶液は細胞培養培地であり、第２の溶液は可溶化細胞外マトリックスである。
【０２１１】
拡大実験のために、細胞の懸濁液の一部又は全部を、第１の細胞培養容器よりも大きい第２の培養容器、又は第２の培養容器の複数のウエルに播種し得る。
【０２１２】
装置
本開示の一態様では、細胞の培養物中に存在する１又は複数のコロニーを剥離又は解離するための装置が提供される（図１６を参照）。本開示を通して、装置２はまた、解離モジュールと呼ばれ得る。
【０２１３】
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにかかわらず、培養することができる任意のタイプの細胞を指す。細胞が付着培養物として増殖することが重要であり得るが、懸濁液中で増殖する細胞もまた、本開示の範囲内である。細胞は哺乳動物由来であり得、状況によっては、細胞はヒト細胞であり得る。細胞はまた、多能性幹細胞であることがあり、いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト多能性幹細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、多能性幹細胞の培養物中の１又は複数の未分化コロニーである。未分化多能性幹細胞は、単層又は懸濁液中で培養されることがあり、分裂すると、それぞれコロニー又は凝集体を形成する。未分化多能性幹細胞は、自己複製が可能な細胞であり、任意の系統に分化することがある。例えば、多能性幹細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、又は野外で出現する他のタイプの細胞であることがあり、その例は、伸長した多能性幹細胞を含む。多くの多能性幹細胞株が知られているが、既存の科学技術を使用して新しい多能性幹細胞株を作成することは日常業務である。
【０２１４】
細胞培養物中の１又は複数のコロニーを解離するための装置２の一実施形態では、装置は、取り付け面１０に接続された回転可能なドライブ５を備える（図１６を参照）。回転可能なドライブ５は、電気エネルギーを回転運動に変換する任意の既知の機構を含み得る。一実施形態では、回転可能なドライブ５は、回転可能なシャフト２０に接続されたモータ１５を備える（図１７を参照）。ドライブ５は、取り付け面１０の上面に接続することができ、モータ１５及び回転可能なシャフト２０は、取り付け面１０の水平面から上方に突出し得る。したがって、回転可能なドライブ５、又はその回転可能なシャフト２０は、取り付け面１０に垂直又は実質的に垂直である第１の軸を中心に回転可能である。
【０２１５】
装置２は、細胞培養容器を支持するためのプラットフォーム２５をさらに備える。プラットフォーム２５は、ドライブ５に接続され、より具体的には、回転可能なドライブ５の端部２２に接続され、さらにより具体的には、回転可能なシャフト２０の端部２２に接続される（図１７を参照）。
【０２１６】
プラットフォーム２５は、細胞培養容器の底面を支持するために実質的に平面であり得る（図示せず）。プラットフォーム２５は、その上面で少なくとも１つの細胞培養容器を支持できるという条件で、任意の寸法であり得る。多くのタイプの細胞培養容器が当技術分野で知られており、すべてが本開示において企図されている。一般に、細胞培養容器は、その培養のために細胞を受容できる任意の容器であり得る。非限定的な例として、細胞培養容器は、例えば、６ウエルプレート、１２ウエルプレート、２４ウエルプレート、又は９６ウエルプレートなどであるがこれらに限定されないマイクロプレートであり得る。あるいは、細胞培養容器は、Ｔフラスコなどであるがこれに限定されない細胞培養フラスコであり得る。細胞培養容器がＴフラスコであるいくつかの実施形態では、プラットフォームは、例えば、Ｔ２５フラスコ、Ｔ７５フラスコ、Ｔ１５０フラスコ、１７５フラスコ、又はＴ２２５フラスコを支持するように適切な寸法にされ得る。あるいは、細胞培養容器は、ペトリ皿、３５ｍｍ皿、１０ｍｍ皿、又はそれ以上などであるがこれらに限定されない細胞培養皿であり得る。
【０２１７】
一実施形態では、プラットフォーム２５は、ドライブ５又はその端部２２にオフセットされて接続されている。例えば、前述のように、ドライブ５又はその端部２２は、第１の回転軸を規定することがあり、プラットフォーム２５は、プラットフォーム２５の回転中心を通過する第２の回転軸を中心に回転し得る。いくつかの実施形態では、ドライブ５又は端部２２は、プラットフォーム２５の回転の中心からオフセットされた位置でプラットフォーム２５に結合され得る。プラットフォーム２５がドライブ５にオフセットされて接続されている場合、プラットフォーム２５は、ドライブ５又はその端部２２がプラットフォーム２５の回転の中心に結合されている場合と比較して、第１の軸（すなわち、ドライブ５又はその端部２２の回転軸）の周りにより広い軌道を有する。
【０２１８】
同じ又は異なる実施形態では、プラットフォーム２５はまた、ドライブ５に間接的に接続され得る。そのような実施形態では、装置１は、プラットフォーム２５のドライブ５への取り付けを仲介するスペーサ２７をさらに含み得る。スペーサ２７は、プラットフォーム２５のドライブ５への取り付けを仲介する任意の構成要素であり得るが、プラットフォーム２５が回転可能なドライブ５に依存して又は独立して回転することを依然として許容している。好ましい実施形態では、スペーサ２７はベアリングである。
【０２１９】
プラットフォーム２５がドライブ５に間接的かつオフセットされて接続されている実施形態では、スペーサ２７は、代替的に、本明細書では偏心スペーサと呼ばれ得る。図１８に見られるように、スペーサ２７は、その第１の位置２８でドライブ５に接続されることがあり、その第２の位置２９でプラットフォーム２５に接続され得る。スペーサ２７がベアリングである具体的な実施形態では、ドライブ５は、その第１のレース（すなわち、内レース）に接続されることがあり、プラットフォーム２５は、その第２のレース（すなわち、外レース）に接続され得る。したがって、第１の位置２８は内レースに対応し、第２の位置２９は第２のレースに対応する。
【０２２０】
スペーサ２７がベアリングであり、プラットフォーム２５がその外レースに接続されている実施形態では、プラットフォーム２５は、第１の軸からオフセットされた第２の軸を中心に回転可能である。いくつかの実施形態では、第２の軸は、プラットフォーム２５の回転中心を通過し得る。他の実施形態では、第２の軸は、プラットフォーム２５の回転中心以外の点を通過し得る。第１の軸及び第２の軸は、形状が装置１の動作及びその要素、すなわち１又は複数の衝撃ブラケット及び１又は複数の衝撃バンパ、の介在を可能にするという条件で、任意の距離だけオフセットされることがあり、以下で詳細に説明する。具体的な実施形態では、第１の軸（すなわち、第１の位置）及び第２の軸（すなわち、第２の位置）は、約４ｍｍ、約４．５ｍｍ、約５ｍｍ、約５．５ｍｍ、約６ｍｍ、約６．５ｍｍ、約７ｍｍ、約７．５ｍｍ、約８ｍｍ、約８．５ｍｍ、約９ｍｍ、約９．５ｍｍ、又は約１０ｍｍだけオフセットされている。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、プラットフォーム２５は、その上に細胞培養容器を配置するのを助けるガイド要素３０をさらに含み得る。ガイド要素３０は、プラットフォーム２５の上面から上方に上昇する、ピン又はリッジなどであるがこれらに限定されない突起に対応し得る。プラットフォーム２５上に細胞培養容器を配置するのを助けることに加えて、ガイド要素３０はまた、装置２の動作中にプラットフォーム２５上に細胞培養容器を固定するのを助けることがある。
【０２２２】
プラットフォーム２５が四辺形である実施形態では、ガイド要素３０は、プラットフォーム２５の１又は複数の隅に配置され得る。具体的な実施形態では、ガイド要素３０は、プラットフォーム２５の少なくとも２つの角に配置され得る。より好ましい実施形態では、ガイド要素３０は、プラットフォーム２５の４つの角すべてに配置され得る。
【０２２３】
プラットフォーム２５が四辺形ではない実施形態では、細胞培養容器をプラットフォーム２５に配置し、所望により固定するのに役立つ構成でガイド要素３０を適切に配置することは簡単である。
【０２２４】
装置１は、プラットフォーム２５に接続された１又は複数の衝撃ブラケット３５をさらに備え得る。衝撃ブラケット３５は、その１又は複数の縁部又はその下側などであるがこれらに限定されない、プラットフォーム２５の任意の部分に接続し得る。細胞培養容器がプラットフォーム２５の表面積よりも大きい専有面積を有する場合、衝撃ブラケット３５の上面がプラットフォーム２５の上面から突出しないことを確実にすることが重要である可能性がある。
【０２２５】
衝撃ブラケット３５は任意の材料で作ることができるが、過度の摩耗及び騒音を最小限に抑えるか又はそれらに抵抗するために、衝撃ブラケット３５をゴム又はゴム様物質、好ましくは比較的密度の高いゴム又はゴム様物質から製造することが望ましいことがある。あるいは、衝撃ブラケット３５は、金属又はメタロイドなどであるがこれらに限定されない、より強くより耐久性のある材料で作製されることがあり、所望により衝撃部位でゴム又はゴム様物質で覆われ得る。
【０２２６】
具体的な実施形態では、装置２は、２つの衝撃ブラケット３５ａ及び３５ｂを備える。衝撃ブラケット３５ａ及び３５ｂは、プラットフォーム２５の下側又は対向する縁部に接続し得る。衝撃ブラケット３５ａ及び３５ｂを含む衝撃ブラケット３５がプラットフォーム２５に接続されている場所に関係なく、それらが取り付け面１０に接続された１又は複数の衝撃バンパ４０と接触させられ得ることのみが重要である。
【０２２７】
衝撃バンパ４０は、一般に、取り付け面１０の上面に結合され、取り付け面１０からプラットフォーム２５の下側に向かって軸方向に延びる。いくつかの実施形態では、特に衝撃ブラケット３５がプラットフォーム２５の下側に結合されている場合、衝撃バンパ４０は、一般に、取り付け面１０とプラットフォーム２５との間の間隔よりも短い距離だけ、プラットフォーム２５の下側に向かって延びる。
【０２２８】
衝撃バンパ４０は任意の材料で作ることができるが、過度の摩耗及び騒音を最小限に抑えるか又はそれらに抵抗するために、衝撃バンパ４０をゴム又はゴム様物質、好ましくは比較的密度の高いゴム又はゴム様物質から製造することが望ましいことがある。あるいは、衝撃バンパ４０は、金属又はメタロイドなどであるがこれらに限定されない、より強くより耐久性のある材料で作製されることがあり、所望により衝撃部位でゴム又はゴム様物質で覆われ得る。
【０２２９】
具体的な実施形態では、装置２は、四辺形を画定するために取り付け面１０上に配置された４つの衝撃バンパ４０ａ、４０ｂ、４０ｃ、及び４０ｄを備える。衝撃バンパ４０ａ、４０ｂ、４０ｃ、及び４０ｄの配置は、３５ａ又は３５ｂなどの任意の１つの衝撃ブラケットの移動が、それぞれ４０ｃ及び４０ｄ又は４０ａ及び４０ｂなどの２つの衝撃バンパによって制限されることを確実にし得る。いずれか１つの衝撃ブラケットの移動が２つの衝撃バンパによって制限されている場合、衝撃ブラケット（したがってプラットフォーム）の移動は、２つの衝撃バンパ間で制限される。
【０２３０】
図１９を参照して、衝撃ブラケット３５ａ及び３５ｂ、並びに衝撃バンパ４０ａ、４０ｂ、４０ｃ、及び４０ｄの例示的な配置が示されている。例示のみを目的として、プラットフォーム２５（図１９には示されていない）がドライブ５の直接の影響下で所与の方向に回転するとき、衝撃ブラケット３５ａは衝撃バンパ４０ｃと衝突する。スペーサ２７のおかげで、ブラケット３５ａは、ドライブ５の回転とは無関係に、衝撃バンパ４０ｄに向かって跳ね返り、潜在的に接触することがある。衝撃ブラケット３５ｂ及び衝撃バンパ４０ａ及び４０ｂに関しても同じ動力学が発生する。
【０２３１】
したがって、１又は複数の衝撃バンパ４０は、取り付け面１０に接続され、プラットフォーム２５がドライブ５の影響下で回転するときに、１又は複数の衝撃ブラケット３５によって接触可能である。１又は複数の衝撃ブラケット３５と１又は複数の衝撃バンパ４０との繰り返しの衝突は、プラットフォーム２５に力を伝達し、そこに含まれる内容物を含むその上の任意の細胞培養容器に力を伝達する。そのような攪拌力又は衝撃力は、細胞培養容器に含まれる培養細胞の１又は複数のコロニーを、細胞のクランプ又はクラスタなどであるがこれらに限定されない、より小さな単位に解離させる可能性がある。
【０２３２】
装置２は、ドライブ５の出力を調整するコントローラをさらに備え得る。コントローラを操作することにより、ドライブ５の回転方向、ドライブ５の回転速度、及びドライブ５の回転加速度は調整可能である。具体的な実施形態では、ドライブ５の回転方向は時計回りであり得る。他の実施形態では、ドライブ５の回転方向は反時計回りであり得る。より具体的な実施形態では、ドライブ５の回転方向は、時計回り又は反時計回りであり得る。さらにより具体的な実施形態では、ドライブ５の回転方向は、時計回りと反時計回りの間で振動し得る。
【０２３３】
装置２は、装置の動作に関するフィードバックを受信するための加速度計又は光学フラグセンサなどのセンサをさらに含み得る。
【０２３４】
装置２は、プラットフォームの向きを提供するためのホームセンサをさらに含み得る。
【０２３５】
装置の使用方法
本開示の別の態様では、装置２は、細胞の培養物中の１又は複数のコロニーを解離する方法において使用し得る。非限定的な実施形態では、細胞の培養物は、１又は複数のコロニーに含まれる多能性幹細胞の培養物であり得る。より具体的な非限定的な実施形態では、細胞の培養物中の１又は複数のコロニーは、多能性幹細胞の培養物中の１又は複数の未分化コロニーであることがあり、所望により多能性幹細胞はヒト多能性幹細胞である。
【０２３６】
本開示の他の態様において、装置２は、細胞培養容器のウエル内の培養培地に播種された細胞を分配する方法、又は細胞培養容器のウエルを細胞外マトリックスなどのコーティング材料でコーティングする方法において使用され得る。
【０２３７】
以下の方法は、本開示に従って装置を提供し、装置上の細胞の培養物中に１又は複数のコロニーを含む細胞培養容器を配置することに依存している。具体的な実施形態では、細胞培養容器をステージに固定することが望ましいことがある。例えば、細胞培養容器は、細胞培養容器とガイド要素との協働によってステージに固定され得る。
【０２３８】
いくつかの実施形態において、細胞の培養物は、剥離溶液の存在下でインキュベートされ得るが、これは、その後、除去、不活性化、又は中和され得ることもされないこともある。培養細胞の１又は複数のコロニーが細胞培養容器のウエル底部に直接又は間接的に付着している場合、剥離溶液を使用することが望ましいことがある。剥離溶液の一般的な例には、ＲｅＬｅＳＲ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）又はＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｎｅｕｒａｌ  Ｒｏｓｅｔｔｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）が含まれる。一般的な剥離溶液、特にＲｅＬｅＳＲ（商標）及びＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｎｅｕｒａｌ  Ｒｏｓｅｔｔｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを参照すると、このような剥離溶液は、細胞の適切な培養物に短時間（例えば、１〜１５分、その後、さらに一定期間細胞の培養物をインキュベートする前に除去される）添加され得る。このようなインキュベーションに続いて、最小限の力に応答して、コロニーの一部又は全部がウエル底部から剥離したか、ウエルの底部から剥離する傾向があったことがあり得る。
【０２３９】
一実施形態において、細胞の培養物は、解離溶液の存在下でインキュベートされ得るが、これは、その後、除去、不活性化、又は中和され得ることもされないこともある。単層として成長する細胞を扱う場合は、解離溶液を使用することが望ましいことがある。解離溶液の一般的な例はトリプシンである。当業者は、特定の細胞株又は細胞タイプについて、解離溶液への過度の曝露が、細胞の培養物中の１又は複数のコロニーを完全に解離し、及び／又は細胞の培養物を損傷することがあることに気付くであろう。
【０２４０】
さらに他の実施形態では、細胞の培養物は、剥離又は解離溶液の存在下で細胞の培養物をインキュベートしながら、装置上に配置し得る。そのような実施形態において、細胞の培養物中の１又は複数のコロニーは、本開示の装置を使用して同時に解離され得るか、又は十分なインキュベーション期間後に本開示の装置を使用して直ちに解離され得る。いくつかの実施形態では、特定の剥離又は解離溶液は、所与の温度（すなわち、３７℃以上）で最適に機能し得る。いくつかの実施形態では、プラットフォーム及び／又は装置若しくはプラットフォームを取り囲むエンクロージャを加熱するために、本明細書に記載の装置に加熱要素を提供することが望ましいことがある。
【０２４１】
前述の剥離又は解離の実施に関係なく、細胞の培養物が十分な時間インキュベートされた後、細胞の培養物中の１又は複数のコロニーは、本開示に記載される装置を使用してより小さな単位に解離される準備ができていることがある。上記のように、ドライブの影響下でプラットフォームを回転させると、１又は複数の衝撃ブラケットが１又は複数の衝撃バンパと接触し、それによって細胞の培養物中の１又は複数のコロニーに解離力が伝達される。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、ドライブの回転速度、したがってプラットフォームの回転速度を調整することが、細胞の培養物中の１又は複数のコロニーを最適に解離させるために望ましいことがある。ドライブの回転速度を上方に調整することにより、衝撃頻度が増加する。同様に、ドライブの回転速度を下方に調整することにより、衝撃頻度が低下する。当業者は、適切な衝撃頻度が、培養される特定の細胞株又は細胞タイプに依存し得ることに気付くであろう。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、ドライブの回転方向を調整することが、細胞の培養物中の１又は複数のコロニーを最適に解離させるために望ましいことがある。一実施形態では、ステージの回転は時計回りの方向である。別の実施形態では、ステージの回転は反時計回りの方向である。さらに別の実施形態では、ステージの回転は時計回り又は反時計回りの方向である。
【０２４４】
さらに別の実施形態では、ステージを回転させることは、時計回り方向と反時計回り方向との間で往復することを含み得る。ステージの回転方向を時計回りと反時計回りの方向に往復させることを含む実施形態では、往復は、時計回り及び反時計回りの方向に回転する間の５秒未満の遅延を含み得る。ステージの回転方向を時計回りと反時計回りの方向に往復させることを含むさらに具体的な実施形態では、往復は、時計回り及び反時計回りの方向に回転する間の１秒未満の遅延を含み得る。ステージの回転方向を時計回りと反時計回りの方向に往復させることを含むさらに具体的な実施形態では、往復は、時計回り及び反時計回りの方向に回転する間の０．５ミリ秒以下の遅延を含み得る。
【０２４５】
ドライブの回転の速度、方向、又は加速度を調整することを含む実施形態では、そのような操作は、上記のように、コントローラによって実行され得る。したがって、本明細書に開示される方法の具体的な実施形態は、コントローラを使用してドライブの回転の速度、方向、又は加速度を制御することをさらに含み得る。
【０２４６】
本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態は、ヒト多能性幹細胞などであるがこれに限定されない、多能性幹細胞の１又は複数の未分化コロニーを解離することを特に対象としている。このような方法では、多能性幹細胞の未分化コロニーを選択的に剥離するために、ＲｅＬｅＳＲ（商標）などの特定の剥離溶液の優先度を利用することが望ましいことがある。したがって、ＲｅＬｅＳＲ（商標）などであるがこれに限定されない選択的剥離溶液を本開示の装置と共に使用する方法は、細胞の培養物中に存在する所望の１又は複数のコロニーをより小さな単位に解離すると同時に、所望の細胞タイプを有利に選択し得る。
【０２４７】
細胞の培養物中のヒト多能性幹細胞の１又は複数の未分化コロニーを解離する一実施形態では、ＲｅＬｅＳＲ（商標）などであるがこれに限定されない剥離溶液は、ヒト多能性幹細胞の未分化コロニーの細胞培養容器のウエルのウエル底部への付着を弱めることがある。細胞培養培地などであるがこれに限定されないある量の溶液をウエルに加えると、ヒト多能性幹細胞の１又は複数のコロニーの一部又は全部がウエル底部から剥離し、溶液中に懸濁することがある。ドライブの影響下でプラットフォームを回転させ、１又は複数の衝撃ブラケットを１又は複数の衝撃バンパと繰り返し衝突させると、ウエル底部に付着したヒト多能性幹細胞の残りの未分化コロニーがウエル底から剥離することがある。ヒト多能性幹細胞の１又は複数の未分化コロニーの選択と同時に、そのようなコロニーは、互いにかつ細胞培養容器のウエル壁に対して衝突するときに、より小さな単位（すなわち、クランプ）に分解される。
【０２４８】
分化実験中などであるがこれに限定されない代替の実施形態では、多能性幹細胞の１又は複数の分化したコロニーを選択することが望ましいことがある。上記と同じプロセスに従って、剥離及び解離した多能性幹細胞を吸引し、細胞培養容器のウエルから廃棄して、さらなる培養又は処理のためにウエル底部に付着した目的の（分化した）コロニーを生成し得る。
【０２４９】
本明細書に記載の出願人の教示は、例示の目的で様々な実施形態に関連しているが、本明細書に記載の実施形態が例であることを意図しているため、出願人の教示がそのような実施形態に限定されることを意図しない。むしろ、本明細書に記載及び図示された出願人の教示は、本明細書に記載の実施形態から逸脱することなく、様々な代替、修正、及び同等物を包含し、その一般的な範囲は、添付の特許請求の範囲に定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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