(57)【要約】  本発明は、細胞に特異的機能刺激を提供して、腫瘍退縮又はウイルス排除を媒介するために理想的な表現型及び機能的特性を得るための人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールドに関する。特に、本発明のスカフォールドは、抗原ペプチドのない安定化されたＭＨＣクラスＩ分子を含む。スカフォールドは、必要に応じて抗原ペプチドをロードして、ペプチド−ＭＨＣを標的とした方法で、特異的Ｔ細胞の有効な増殖及び機能刺激用の迅速なプラットフォームを提供することができる。
2021527419.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のテンプレート分子：
ｉ．サイトカイン、共刺激分子、接着分子、及び抗体からなる群から選択される少なくとも１つのＴ細胞影響分子、及び
ｉｉ．少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ分子
が結合したポリマー骨格を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールドであって、
前記ＭＨＣクラスＩ分子が、ジスルフィド架橋によって接続されたα−１ドメイン及びα−２ドメインを含む重鎖を含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールド。
【請求項２】
前記ジスルフィド架橋が、前記α−１ドメインに位置する変異システイン残基と、前記α−２ドメインに位置する変異システイン残基との間に形成される、請求項１に記載の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールド。
【請求項３】
前記重鎖が：
ａ．配列番号１、又は
ｂ．（ａ）における配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、
前記アミノ酸配列が、前記α−１ドメインに位置する変異システイン残基と、α−２ドメインに位置する変異システイン残基とを含む、請求項１又は２のいずれか一項に記載の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールド。
【請求項４】
前記α−１ドメインにおける前記変異システイン残基がアミノ酸残基８４又は８５であり、前記α−２ドメインに位置する前記変異システイン残基がアミノ酸残基１３９である、請求項３に記載の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールド。
【請求項５】
前記重鎖が：
ａ．配列番号２〜１３のいずれか１つ、又は
ｂ．（ａ）の配列のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールド。
【請求項６】
前記ポリマー骨格が、少なくとも５、例えば、少なくとも８、例えば、少なくとも１０、例えば、少なくとも２０、例えば、少なくとも３０、例えば、少なくとも４０、例えば、少なくとも５０又は例えば、少なくとも１００のＭＨＣクラスＩ分子を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールド。
【請求項７】
前記ａＡＰＣスカフォールドが、少なくとも２つの異なる、Ｔ細胞に影響を及ぼす分子を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールド。
【請求項８】
前記Ｔ細胞に影響を及ぼす分子がサイトカインである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールド。
【請求項９】
前記サイトカインが、ＩＬ−２１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、及びＩＬ−２３からなる群から選択される、請求項８に記載の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールド。
【請求項１０】
前記サイトカインがγ鎖受容体サイトカインである、請求項８又は９のいずれか一項に記載の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールド。
【請求項１１】
前記γ鎖受容体サイトカインが、ＩＬ−２１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−４、ＩＬ−７及びＩＬ−９からなる群から選択される、請求項１０に記載の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールド。
【請求項１２】
前記γ鎖受容体サイトカインが、ＩＬ−２１、ＩＬ−２及びＩＬ−１５からなる群から選択される、請求項１０又は１１のいずれか一項に記載の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールド。
【請求項１３】
前記ａＡＰＣスカフォールドが少なくとも２つのγ鎖受容体サイトカインを含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールド。
【請求項１４】
前記ＭＨＣクラスＩ分子が、抗原ペプチドのないペプチド結合グルーブを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールド。
【請求項１５】
前記ＭＨＣクラスＩ分子が、抗原ペプチドを含むペプチド結合グルーブ（ｐＭＨＣ）を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールド。
【請求項１６】
Ｔ細胞の同時インビトロ刺激及び増殖のための方法であって、以下のステップ：
ｉ．Ｔ細胞を含むサンプルを提供するステップと、
ｉｉ．前記サンプルを、請求項１５に記載の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールドを含む増殖溶液と接触させるステップと、
ｉｉｉ．培養物中の前記ａＡＰＣスカフォールドに対して特異性を有するＴ細胞を刺激し増殖させるステップと、
ｉｖ．ステップｉｉｉ）のＴ細胞を培養から収集して、Ｔ細胞の増殖した抗原特異性集団を得るステップと、
を含む、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法によって得られる増殖Ｔ細胞集団。
【請求項１８】
前記増殖Ｔ細胞集団が：
ｉ．培養の２週間後の抗原特異的Ｔ細胞を少なくとも１０倍増殖させ、
ｉｉ．後の抗原チャレンジに際してのＩＮＦ−γ及びＴＮＦ−αの分泌、
ｉｉｉ．ＣＤ２８の高発現、及び
ｉｖ．ＰＤ１の低発現
からなる群から選択される、少なくとも１つ、例えば、少なくとも２つ、例えば、少なくとも３つの特性を有する、請求項１７に記載の増殖Ｔ細胞集団。
【請求項１９】
薬剤として使用するための、請求項１７又は１８のいずれか一項に記載の増殖Ｔ細胞集団。
【請求項２０】
がん又はウイルス性疾患の治療において使用するための、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の増殖Ｔ細胞集団。
【請求項２１】
Ｔ細胞の増殖用キットであって：
ｉ．請求項１〜１４のいずれか一項に記載の少なくとも１つの人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールドを含む第一保存手段と、
ｉｉ．少なくとも１つ抗原ペプチドの第二保存手段と、
を含み、
前記第一保存手段及び前記第二保存手段の内容物が組み合わされるように構成されている、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞に特異的機能刺激を提供して腫瘍退縮又はウイルス排除を媒介するために理想的な表現型及び機能的特性を得るための人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールドに関する。特に、本発明のスカフォールドは、抗原ペプチドのない安定化されたＭＨＣクラスＩ分子を含む。スカフォールドは、必要に応じて抗原ペプチドをロードすることができ、ペプチド−ＭＨＣを標的とした方法で、特異的Ｔ細胞の有効な増殖及び機能刺激のための迅速なプラットフォームを提供する。
【背景技術】
【０００２】
末梢血（ＰＢＭＣ）又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）からの腫瘍反応性Ｔ細胞を患者から抽出し、エクスビボで活性化・増殖させ、その後、患者に戻す免疫療法アプローチである養子細胞移入（ＡＣＴ）は、悪性黒色腫研究では、患者の５０％超において持続的臨床反応を示した。しかしながら、ＰＢＭＣ又はＴＩＬからの腫瘍反応性Ｔ細胞の増殖は、多くの場合、Ｔ細胞分化及び機能的能力を犠牲にした広範なエクスビボ培養を必要とする。結果として、移入されたＴ細胞産物は、腫瘍退縮を媒介するために適切な表現型及び機能特性を有する充分な頻度の腫瘍反応性ＣＤ８Ｔ細胞を含まない可能性がある。さらに、そのような腫瘍浸潤Ｔ細胞の大多数は、腫瘍特異的ではなく、むしろ末梢からのＴ細胞のバイスタンダー浸潤であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）認識はどの腫瘍抗原とも適合しない可能性がある。最終的に、腫瘍反応性Ｔ細胞のフラクションは、腫瘍部位に存在する抑制環境のために成長可能性が低下する可能性がある。
【０００３】
増殖したＴ細胞の不十分な分化及び機能的能力の問題を克服するために、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を利用する試みがなされた。ａＡＰＣの背後にある単純な概念は、ＴＣＲと、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によって提示される特異的抗原ペプチドとの間の自然の相互作用を模倣することである。この相互作用は、効率的な免疫応答を誘発することができるＴ細胞の活性化、増殖及び分化による免疫の生成における核となる段階である。Ｔ細胞応答の自然発生は、Ｔ細胞に影響を及ぼす分子、例えばサイトカインや共刺激分子によってさらに支援され、Ｔ細胞活性化及び機能を誘導する働きをする。したがって、すべての必要な分子を単一のａＡＰＣスカフォールドに組み入れることは、Ｔ細胞の増殖の課題のいくつかを克服するための有望なツールである。ａＡＰＣは、Ｔ細胞活性化及び分化のための理想的な免疫学的シナプスを形成する。しかしながら、重大な課題は、ａＡＰＣが、機能的表現型も維持しつつ、抽出されたＴＩＬを効率的に増殖することを可能にする分子の組み合わせを明らかにすることである。
【０００４】
国際公開第２００２０７２６３１号では、ＭＨＣプラットフォームを利用する多くの概念が開示されており、それらのうちの１つは、１つ以上のＭＨＣが結合している担体分子を含むＭＨＣ構築物である。構築物はまた、生物学的に活性な分子、例えば、共刺激分子又は細胞調節分子も含み得る。ＭＨＣ構築物は、中でも、構築物を認識する細胞の増殖に使用され、疾患、例えばがんなどの治療で使用するための治療組成物を生成するために使用されることが企図される。国際公開第２００２０７２６３１号は、Ｔ細胞増殖に好適であり得る多くの共刺激分子及びサイトカインを開示しているが、Ｔ細胞の増殖のために特に好適かつ有効な特定の組み合わせを特定していない。
【０００５】
米国特許出願公開第２０１１／３１８３８０号は、がんワクチン及び免疫モニタリングのための国際公開第２００２０７２６３１号で記載されているＭＨＣ構築物の応用を開示している。しかしながら、米国特許出願公開第２０１１／３１８３８０号は、Ｔ細胞の増殖のために特に好適かつ有効な共刺激分子及びサイトカインの特定の組み合わせを例示していない。
【０００６】
国際公開第２００９００３４９２号は、抗原特異的Ｔ細胞の検出に主に焦点をあわせているが、抗原特異的Ｔ細胞の増殖も開示している。複合型ペプチドを含む及び含まないＭＨＣマルチマー、それらの調製法並びに、望ましくない標的Ｔ細胞の不活化又は除去が可能な抗原特異的Ｔ細胞の単離を含む、分析及び療法におけるそれらの使用法が記載されている。国際公開第２００９００３４９２号にかかるＭＨＣマルチマーは、デキストランスカフォールド並びに共刺激分子及び細胞調節分子を含み得る。しかしながら、この開示は、Ｔ細胞の増殖のために特に有効な分子の特定の組み合わせを指摘してはいない。
【０００７】
国際公開第２００９０９４２７３では、抗原−特異的Ｔ細胞を増殖するために使用される、ナノ粒子、サイトカイン、カップリング剤、Ｔ細胞受容体アクチベータ及び共刺激分子を含むａＡＰＣ組成物が開示される。Ｔ細胞受容体アクチベータは、抗原ペプチドに結合したＭＨＣ分子であり得る。さらに、養子免疫療法における増殖Ｔ細胞の使用を記載する。ただし、ａＡＰＣ上の単一のサイトカイン、すなわちＩＬ−２の適合性のみを調査し、外因性サイトカインと比較するだけである。
【０００８】
したがって、ａＡＰＣスカフォールドの以前の開示に共通するのは、それらが主に包括的な方法で概念を記載しているだけであることである。Ｔ細胞増殖の成功基準、すなわち、活性なＴ細胞の高い比率、Ｔ細胞の高い抗原特異性及びＴ細胞の高い機能性は、刺激分子の特定の組み合わせが組み合わせられる場合にのみ満たされるので、明確に定義され有効なａＡＰＣスカフォールドが強く求められている。Ｔ細胞増殖についての３つの成功基準のすべてが満たされた場合のみ、結果としてのＴ細胞集団がそれらの抗腫瘍又は抗ウイルス機能に適用するために最適に準備されている。
【０００９】
公知ａＡＰＣスカフォールドの別の制限は、それらの非効率的なかつ柔軟性のない産生であり、これは、新しい免疫療法の開発を加速するハイスループットプラットフォームの需要と同調しない。ａＡＰＣスカフォールドの調製における主要な障害は、抗原ペプチド提示のためのＭＨＣ分子の要件によって生じる。簡単に説明すると、ＭＨＣ分子の再フォールディングプロセスは、β２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及び抗原ペプチドの非存在下で重鎖をその天然状態にフォールディングすることができないという事実により複雑になる。したがって、空ＭＨＣクラスＩ分子は非常に不安定で、凝集しやすい。したがって、Ｔ細胞刺激に望ましいすべてのペプチド−ＭＨＣの組み合わせは、独立した生産ラインを必要とする。これは、抗原ペプチドの状況が非常に広範であり、患者一人につきＨＬＡ分子あたり推定範囲２００，０００ペプチドが効率的に提示され、ＭＨＣクラスＩ分子は非常に多様であり、１２，０００を超える既知ＭＨＣクラスＩ分子が存在するために問題である。さらに、所与の状況下で適切な抗原ペプチドの選択は、関心対象の疾患、患者のＭＨＣプロフィール及び利用可能なＴ細胞レパートリーに依存する。したがって、一つの抗原ペプチド特異的ａＡＰＣスカフォールドのみを生成することができる現行の一つの生産ラインのために、膨大な抗原ペプチド多様性及び従来型の個別化ａＡＰＣ産生技術を利用した広範囲の可能な抗原ペプチド及びＭＨＣ分子の組み合わせを対象とする問題に適合することが実質的に不可能になる。
【００１０】
組換えＭＨＣクラスＩ分子は、例えば、細菌で産生されて、不溶性封入体を形成する。以前は、これらの封入体を次いでカオトロピック剤の溶液中で変性させ、続いて関心対象の特異的抗原ペプチドの存在下で（例えば、再生及び再フォールディングにより）カオトロピック剤を除去し、結果としてｐＭＨＣ複合体が形成される。ｐＭＨＣ複合体を次いでゲルろ過クロマトグラフィによってフォールディングされていないタンパク質から精製する。これは、ｐＭＨＣの一種を産生するだけの、労力がかかり比効率的な技術である。
【００１１】
ＭＨＣ分子の非効率的な産生は、ＭＨＣ分子の再フォールディングの後に関心対象の抗原ペプチドと置換される、中間ペプチドを用いたＭＨＣ分子の産生によって解決することが試みられてきた。この技術は、ＭＨＣペプチド交換として知られる。しかしながら、交換率は１００％ではなく、交換可能なペプチドが失われると、新しいペプチド結合に利用可能でないＭＨＣ分子の実質的に（５０％まで）失われる可能性がある。さらに、この産生方法は時間がかかり、典型的に、ペプチド交換はＭＨＣモノマー段階で起こり、そのため当該テクノロジーはより大きなスカフォールドでの使用に適さなくなる。上述の制限のために、ａＡＰＣスカフォールドアセンブリの化学量論の制御が欠如し、適所のｐＭＨＣ分子に依存して可変産物安定性に関連する課題が生じる。
【００１２】
ｐＭＨＣを含む現行のａＡＰＣスカフォールドテクノロジーのさらに別の制限は、抗原ペプチド依存性寿命を有することが知られている主要組織適合性複合体に固有の不安定性である。ｐＭＨＣの不安定性は、ｐＭＨＣが充分に機能的なままであり、したがって機能的ａＡＰＣスカフォールドのアセンブリングに有用である範囲を限定する。また、ｐＭＨＣ複合体の不安定性は、アセンブリングされたａＡＰＣ複合体が充分機能的なままであり得、効率的かつ抗原特異的にＣＤ８Ｔ細胞を刺激することができる時間も限定する。
【００１３】
米国特許第９，４９４，５８８号では、ＭＨＣクラスＩ分子のフォールディング後に抗原ペプチドをロードすることができる空ＭＨＣクラスＩ分子を提供することが、単一の生産ラインから任意の抗原特異的ＭＨＣクラスＩ分子を産生する便利な方法として提案されている。しかしながら、この方法を大きなａＡＰＣスカフォールドでの使用に適用可能であるか否かは、単なる推測であり、開示されていない。例えば、ｗｔ  ＭＨＣ分子と類似の抗原特異的相互作用特性を有するＴ細胞とそれらが相互作用できることは示されていない。さらに、導入された変異がＴＣＲ−ｐＭＨＣ相互作用に対して構造的に影響を及ぼし得るか否かは不明である。そして同様に、この修飾された相互作用の機能性は記載されていない。
【００１４】
したがって、ハイスループットセットアップのための改善されたａＡＰＣスカフォールドが有利であろう。特に、あらかじめ産生することができ、必要に応じて抗原ペプチドをロードしてＴ細胞集団を増殖させ、刺激し、それによって活性なＴ細胞の高い比率、Ｔ細胞の高い抗原特異性及びＴ細胞の高い機能性をもたらすことができるａＡＰＣスカフォールドの提供が有益であろう。
【発明の概要】
【００１５】
したがって、本発明の目的は、末梢血（ＰＢＭＣ）又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から抽出された腫瘍反応性Ｔ細胞の増殖のための改善された能力を有する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールドを提供することに関する。
【００１６】
本発明の別の目的は、異なる抗原ペプチドを提示する改善されたａＡＰＣの大きなライブラリを生成するための、より使い勝手がよくハイスループットなプラットフォームを提供することである。
【００１７】
さらに、大きなバッチの品質が保証されたａＡＰＣスカフォールドの産生は、品質保証の規制当局からの高まる要求に対してより良好に対応するであろう。ここで、我々は、エンドユーザーのサイトで抗原ペプチドローディングに利用可能な、品質管理されたａＡＰＣスカフォールドの１つの大きなバッチを用いて生産課題に対する「すぐに利用可能な」解決策を提供することができる。これは、患者腫瘍を配列決定して腫瘍変異を特定して、がん特異的ペプチド抗原を予測する、増えつつある高度にパーソナル化された免疫療法プロトコルに対する理想的な解決策となる。そのような抗原ペプチドは、レディーメイドの抗原ペプチド受容的ａＡＰＣスカフォールドに直接ロードされることが企図され得る。
【００１８】
特に、本発明の目的は、不十分なＴ細胞分化及び増殖Ｔ細胞集団の機能的能力の先行技術の上述の課題を解決するａＡＰＣスカフォールドを提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、最適化された表現型及び機能的特性を有する、得られた増殖Ｔ細胞集団を利用して、腫瘍退縮又はウイルス排除を媒介することである。
【００２０】
したがって、本発明の一態様は、以下のテンプレート分子：
ｉ．少なくとも１つのＴ細胞に影響を及ぼす分子と、
ｉｉ．少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ分子
が付着したポリマー骨格を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールドであって、
ＭＨＣクラスＩ分子が、ジスルフィド架橋によって接続されたα−１ドメインとα−２ドメインとを含む重鎖を含む、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールドに関する。
【００２１】
本発明の別の態様は、Ｔ細胞の同時インビトロ刺激及び増殖のための方法であって、以下のステップ：
ｉ．Ｔ細胞を含むサンプルを提供するステップと、
ｉｉ．前記サンプルを、本発明にかかるａＡＰＣスカフォールドを含む増殖溶液と接触させるステップと、
ｉｉｉ．培養物中の前記ａＡＰＣスカフォールドに対する特異性を有するＴ細胞を刺激し増殖させるステップと、
ｉｖ．培養物からステップｉｉｉ）のＴ細胞を収集して、Ｔ細胞の増殖抗原特異性集団を得るステップと
を含む方法に関する。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、本発明にかかる方法によって得られる増殖Ｔ細胞集団を提供することである。
【００２３】
本発明のさらに別の態様は、薬剤として使用される、本発明にかかる方法によって得られる増殖Ｔ細胞集団に関する。
【００２４】
本発明のさらに別の態様は、がん又はウイルス性疾患の治療で使用するための、本発明にかかる方法によって得られる増殖Ｔ細胞集団を提供することである。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、Ｔ細胞の増殖用キットであって：
ｉ．本発明にかかる少なくとも１つのａＡＰＣスカフォールドを含む第一保存手段と、
ｉｉ．少なくとも１つ抗原ペプチドの第二保存手段と、
を含むキットを提供し、
第一保存手段及び第二保存手段の内容物は、組み合わせられるように構成されている。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、（Ａ）例示的人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールドの概略図を示す。ａＡＰＣスカフォールドは、テンプレート分子、例えばアンロードＭＨＣクラスＩ分子（又はロードされたペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）クラスＩ分子）及びＴ細胞に影響を及ぼす分子、例えばサイトカイン又は共刺激分子が結合した骨格で構成されている。異なる比率の骨格及びテンプレート分子がａＡＰＣスカフォールドにアセンブリングされたａＡＰＣスカフォールドの例を挙げる。（Ｂ）慎重に選択されたテンプレート分子の組み合わせをａＡＰＣスカフォールドに組み合わせて、患者から抽出した特異的Ｔ細胞集団を増殖するためにどのように利用することができるかを示す図である。
【図２】図２は、（Ａ）ＰＥ（Ｘ軸）及びＡＰＣ（Ｙ軸）標識テトラマーでエクスビボにて直接検出された健常なドナーからのＨＬＡ−Ａ１  ＦＬＵ  ＢＰ−ＶＳＤ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の頻度、（Ｂ）１：１０：５：５：５（スカフォールド：ｐＭＨＣ：Ｂ７−２：ＩＬ−１５：ＩＬ−２１）の比率の抗原提示スカフォールド、（Ｃ）遊離ＦＬＵ  ＢＰ−ＶＳＤペプチド、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１、又は（Ｄ）無関係のペプチド特異性を有する１：１０：５：５：５の比率の抗原提示スカフォールドのいずれかと、培養培地中に添加された２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と共に２週間培養した後のＨＬＡ−Ａ１  ＦＬＵ  ＢＰ−ＶＳＤ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の頻度、（Ｅ）ベースラインを用い、増殖後１週間及び２週間からテトラマー染色により検出された、ＨＬＡ−Ａ１  ＦＬＵ  ＢＰ−ＶＳＤ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の頻度に基づく増殖率、（Ｆ）２週間の増殖後のＨＬＡ−Ａ１  ＦＬＵ  ＢＰ−ＶＳＤ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の絶対数を示す。
【図３】図３は、Ｃｙｓ−変異体とアセンブリングしたａＡＰＣスカフォールド及び野生型ＭＨＣ分子とアセンブリングしたａＡＰＣスカフォールドを用いて増殖させたＣＤ８Ｔ細胞の機能性を比較する、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＦＬＵ  ５８−６６  ＧＩＬＧＦＶＦＴＬペプチド（配列番号２０）での刺激後のＣＤ８Ｔ細胞間のＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの発現のドットプロットを示す。健常なドナーＰＢＭＣからの、０．３％の初期頻度のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＦＬＵ  ５８−６６  ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ特異的ＣＤ８Ｔ細胞（左、増殖前ｐＭＨＣデュアルカラーテトラマー染色プロット）を、比率１：８：８：８（スカフォールド：ｐＭＨＣ：ＩＬ−２：ＩＬ−２１）でアセンブリングしたａＡＰＣスカフォールドを使用して１０日間増殖させ、ＦＬＵ  ５８−６６  ＧＩＬＧＦＶＦＴＬペプチドで刺激した。無関係のペプチド（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＨＩＶ  Ｐｏｌ  ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ（配列番号２３））特異性を有し、増殖培養で使用し、続いてペプチド刺激した、ａＡＰＣスカフォールドを負の対照として使用した。ＴＮＦ−α抗体はＰＥ−Ｃｙ７標識され（Ｙ軸）、ＩＦＮ−γ抗体はＡＰＣ標識されている（Ｘ軸）。これらの染色は、二連で行ったが、各染色の一方だけを図示する。
【図４】図４は、Ｃｙｓ−変異体とアセンブリングしたａＡＰＣスカフォールド及び野生型ＭＨＣ分子とアセンブリングしたａＡＰＣスカフォールドを用いて増殖させたＣＤ８Ｔ細胞の機能性を比較する、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬペプチド（配列番号２１）での刺激後のＣＤ８Ｔ細胞間のＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの発現のドットプロットを示す。健常なドナーＰＢＭＣから得られた初期頻度０．０５％を有するＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ特異性ＣＤ８  Ｔ細胞（左、増殖前、ｐＭＨＣデュアルカラーテトラマー染色プロット）を、１０日間、比率１：８：８：８（スカフォールド：ｐＭＨＣ：ＩＬ−２：ＩＬ−２１）とアセンブリングし、ＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬペプチドで刺激したａＡＰＣスカフォールドを使用して増殖させた。無関係のペプチド（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＨＩＶ  Ｐｏｌ  ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ（配列番号２３））特異性を有し、増殖培養で使用し、続いてペプチド刺激したａＡＰＣスカフォールドを負の対照として使用した。ＴＮＦ−α抗体はＰＥ−Ｃｙ７標識され（Ｙ軸）、ＩＦＮ−γ抗体はＡＰＣ標識されている（Ｘ軸）。これらの染色は二連で行ったが、各染色の一方だけを示す。
【図５】図５は、ａＡＰＣスカフォールドを使用して増殖させた、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号２２）特異的ＣＤ８Ｔ細胞のテトラマー染色ドットプロットであって、アセンブリ後Ｃｙｓ−変異ＭＨＣ（すなわち、ロード可能な）ａＡＰＣスカフォールドの増殖効率をスカフォールドの抗原ロードアセンブリ前（Ｃｙｓ−変異体又は野生型ＭＨＣ）と比較するものを示す。図５Ａ、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ特異的ＣＤ８Ｔ細胞のベースライン頻度（ｐＭＨＣ特異的ダブルポジティブテトラマーによって決定した総ＣＤ８Ｔ細胞の％で表す）。図５Ｂは、１０日間増殖させ、ｐＭＨＣ特異的ＰＥテトラマーを使用して定量化したＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を、Ｃｙｓ−変異ＭＨＣをロードしたプレアセンブリペプチド−抗原ａＡＰＣ、Ｃｙｓ−変異体ＭＨＣを有するプレロードａＡＰＣ、及び野生型ＭＨＣを有するプレロードａＡＰＣにわたって比較する。
【図６】図６は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶペプチド（配列番号２２）で刺激した後のＣＤ８Ｔ細胞間のＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの発現を示すドットプロットであって、Ｃｙｓ−変異ＭＨＣをロードしたポストアセンブリペプチド−抗原ａＡＰＣ、Ｃｙｓ−変異ＭＨＣを有するプレロードａＡＰＣ、及び野生型ＭＨＣを有するプレロードａＡＰＣを用いてアセンブリングしたａＡＰＣスカフォールドで増殖させたＣＤ８Ｔ細胞の機能性を比較するものを示す。ＴＮＦ−α抗体はＰＥ−Ｃｙ７標識され（Ｙ軸）、ＩＦＮ−γ抗体はＡＰＣ標識されている（Ｘ軸）。これらの染色は二連で行ったが、各染色の一方だけを示す。
【図７】図７は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬペプチド（配列番号２１）での刺激後のＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γダブルポジティブＣＤ８Ｔ細胞のドットプロットを示す。健常なドナーＰＢＭＣからのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を１０日間、ａＡＰＣスカフォールド１：８：８：８（スカフォールド：ＭＨＣ／ｐＭＨＣ：ＩＬ−２：ＩＬ−２１）を使用して増殖して、Ｃｙｓ−変異ＭＨＣをロードしたポストアセンブリペプチド−抗原ａＡＰＣ、Ｃｙｓ−変異ＭＨＣを有するプレロードａＡＰＣ、及び野生型ＭＨＣを有するプレロードａＡＰＣを用いてアセンブリングしたａＡＰＣスカフォールドにわたって増殖ＣＤ８Ｔ細胞の機能性を比較した（図７Ｂ）。ＴＮＦ−α抗体は、ＰＥ−Ｃｙ７標識され（Ｙ軸）、ＩＦＮ−γ抗体はＡＰＣ標識されている（Ｘ軸）。これらの染色は二連で行ったが、各染色の一方だけを示す。ドナーＰＢＭＣ中のベースラインＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を、ｐＭＨＣ特異的デュアルカラーテトラマーによって測定して、全ＣＤ８Ｔ細胞の％として示す（図７Ａ）。
【図８】図８は、ｗｔ  ＭＨＣ（上のパネル）又はＣｙｓ−変異ｐＭＨＣテトラマー（下のパネル）を用いて調製したｐＭＨＣテトラマーを使用した、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞のＴＣＲ認識を比較するフローサイトメトリー分析のドットプロットを示す。４つの異なる抗原特異性を分析して、Ｃｙｓ−変異ＭＨＣがｗｔ  ＭＨＣと比較する方式でＣＤ８Ｔ細胞ＴＣＲを認識することを立証する。ＣＤ８陽性Ｔ細胞は総ＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージで表され、２色で検出され、したがってダブルポジティブドットプロットである（Ｘ及びＹ軸）。
【図９】図９は、ＨＬＡ−Ａ＊０１：０１  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＹＳＥＨＰＴＦＴＳＱＹペプチド（配列番号３０）での刺激後のＣＤ８Ｔ細胞の増殖を示す。（Ａ）それぞれ蛍光マーカーＰＥ及びＢＶ６０５で標識されたＭＨＣテトラマーを使用した、末梢血からのＨＬＡ−Ａ＊０１：０１  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＹＳＥＨＰＴＦＴＳＱＹ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の同定。プロットはＣＤ８Ｔ細胞をあらかじめ標的とする。（Ｂ）ｎｅｏ２／１５＋ｐＭＨＣ  Ａｇスカフォールドを用いて２週間増殖後のＨＬＡ−Ａ＊０１：０１  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＹＳＥＨＰＴＦＴＳＱＹ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の集団。図示されているのは、ＣＤ８Ｔ細胞（Ｙ軸）及びＭＨＣテトラマー陽性Ｔ細胞標識ＢＶ６０５（ｘ軸）である。集団は、増殖前の総ＣＤ８Ｔ細胞に対するＨＬＡ−Ａ＊０１：０１  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＹＳＥＨＰＴＦＴＳＱＹ特異的ＣＤ８Ｔ細胞０．６％から、増殖後の８．４％まで増強される。（Ｃ）ＨＬＡ−Ａ＊０１：０１  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＹＳＥＨＰＴＦＴＳＱＹ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の抗原曝露に対して応答する能力。総Ｔ細胞の４０％はマルチサイトカイン分泌に応答する。
【００２７】
本発明を以下でさらに詳細に説明する。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
定義
本発明をさらに詳細に議論する前に、以下の用語及び表現をまず定義する：
人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールド
この文脈で、用語「人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールド」は、抗原提示細胞と同様に機能するために本明細書中で定義される必要な分子のアセンブリを意味する。
【００２９】
ポリマー骨格
この文脈で、用語「ポリマー骨格」は、個々のテンプレート分子がその上に固定されるａＡＰＣスカフォールドの部分を意味する。テンプレート分子は、ポリマー骨格上に位置するか又はポリマー骨格の一体化された部分としてのカップリング剤と、テンプレート分子上に配置されたアフィニティタグとの間の相互作用によって結合されている。あるいは、カップリング剤はテンプレート分子上にあり得、対応するアフィニティタグはポリマー骨格上にあり得る。
【００３０】
ポリマー骨格は、多糖類、ビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎ、ポリ−ストレプトアビジン、ビオチン結合タンパク質及びポリヒスチジン結合ポリマーから選択される材料のものであり得る。
【００３１】
テンプレート分子
この文脈で、用語「テンプレート分子」は、ａＡＰＣスカフォールドのポリマー骨格上に結合している任意の分子を指す。それらは、ＭＨＣクラスＩ分子、Ｔ細胞に影響を及ぼす分子、例えば、サイトカイン及び共刺激分子、並びにＣＤ４７から選択することができる。テンプレート分子はアフィニティタグを含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、テンプレート分子は、ポリマー骨格上ではなく、固体支持体に直接結合させることができる。
【００３３】
Ｔ細胞に影響を及ぼす分子
この文脈で、用語「Ｔ細胞に影響を及ぼす分子」は、Ｔ細胞に対して生物学的影響を及ぼす任意の分子を指す。生物学的影響としては、限定されるものではないが、Ｔ細胞の増殖、分化及び刺激が挙げられる。
【００３４】
したがって、Ｔ細胞に影響を及ぼす分子は、Ｔ細胞集団を増殖させ機能的に操作して、高特異性、高殺傷能力、高いインビボ増殖及び生存特性をもたらす所望の分化を得るために利用することができる。Ｔ細胞に影響を及ぼす分子としては、限定されるものではないが、サイトカイン、共刺激分子及び接着分子が挙げられる。
【００３５】
本発明のａＡＰＣスカフォールドは、１以上の異なる種類のＴ細胞に影響を及ぼす分子、例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４又は少なくとも５の異なる種類のＴ細胞に影響を及ぼす分子を含み得る。
【００３６】
さらに、各ａＡＰＣ上に位置するＴ細胞に影響を及ぼす分子の数は１つ以上であり得、ａＡＰＣの設計に依存して変動し得る。したがって、ａＡＰＣスカフォールド上のＴ細胞に影響を及ぼす分子の数は、１〜１００、例えば１〜５０、例えば１〜２５、例えば１〜２０、例えば１〜１５、例えば１〜１０、又は例えば１〜５の範囲内であり得る。
【００３７】
変異システイン残基
この文脈で、用語「変異システイン残基」は、ＭＨＣクラスＩ分子の重鎖に人工的に導入されたシステイン残基を指す。したがって、変異システイン残基は、対応する野生型ＭＨＣクラスＩ分子の重鎖中に存在しない。
【００３８】
変異システイン残基は、当業者に公知の変異誘発技術、例えば部位特異的変異誘発によって導入することができる。
【００３９】
非共有相互作用
この文脈で、用語「非共有相互作用」は、共有結合以外の相互作用を介する任意の結合を意味する。非共有結合は、例えば、疎水性相互作用、親水性相互作用、イオン性相互作用、ファンデアワールス力、水素結合、及びそれらの組み合わせによって形成することができる。
【００４０】
カップリング剤
この文脈で、用語「カップリング剤」は、ａＡＰＣのポリマー骨格上に位置する分子的実体を指す。カップリング剤は、アフィニティタグに非共有結合することができる。カップリング剤の例としては、ストレプトアビジン、アビジン、ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎ、抗体、ポリＨｉｓ−タグ、金属イオンキレートなどが挙げられる。
【００４１】
あるいは、カップリング剤はテンプレート分子上にあり得、対応するアフィニティタグはポリマー骨格上にあり得る。
【００４２】
アフィニティタグ
この文脈で、用語「アフィニティタグ」は、テンプレート分子上に位置する分子種を指す。アフィニティタグは、非共有相互作用によってカップリング剤に対して高度に特異的に結合する。カップリング剤の例としては、ビオチン、抗体エピトープ、Ｈｉｓ−タグ、ストレプトアビジン、ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎ、ポリヒスチジン、ペプチド、金属イオンキレートなどが挙げられる。
【００４３】
あるいは、アフィニティタグはポリマー骨格上にあり得、対応するカップリング剤はテンプレート分子の骨格上にあり得る。
【００４４】
抗原ペプチド
この文脈で、用語「抗原ペプチド」は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合して、ペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体を形成することができるペプチドを指す。ｐＭＨＣ複合体は、抗原ペプチドを免疫細胞に対して提示して、Ｔ細胞受容体依存性免疫応答を誘導することができる。
【００４５】
ＭＨＣはＭＨＣクラスＩ分子であり得る。
【００４６】
ＭＨＣ
この文脈で、用語「ＭＨＣ」は、その主要な機能が、病原体由来の抗原ペプチドと結合し、適切なＴ細胞による認識のためにそれらを細胞表面上に提示することであるタンパク質複合体である、主要組織適合性複合体を指す。
【００４７】
ＭＨＣ分子には、ＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子の２つの主なクラスがある。本明細書で、「ＭＨＣ」は、ＭＨＣクラスＩ分子を指す。ＭＨＣクラスＩ分子は、ＭＨＣ遺伝子によって産生されるα鎖（重鎖）と、β２−ミクログロブリン遺伝子によって産生されるβ鎖（軽鎖又はβ２−ミクログロブリン）とから構成される。
【００４８】
重鎖は、それぞれ、α−１、α−２及びα−３で示される３つのドメインから構成される。α−１ドメインは、非共有結合したβ２−ミクログロブリンの隣に位置する。α−３ドメインは、細胞膜中にＭＨＣクラスＩ分子を固定する膜貫通ドメインである。合わせると、α−１及びα−２ドメインは、特異的抗原ペプチドを結合するペプチド結合グルーブを含むヘテロダイマーを形成する。ペプチド結合グルーブのアミノ酸配列は、どの特異的抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子に結合するかに関する決定因子である。
【００４９】
当然ながら、ＭＨＣクラスＩ分子の重鎖は、４つの保存されたシステイン残基を含み、その結果、２つのジスルフィド架橋が形成される。ＭＨＣクラスＩ分子の正しくフォールディングされたコンフォメーションで、１つのジスルフィド架橋は、Ｃｙｓ１０１とＣｙｓ１６４との間のα−２ドメインの内部に位置し、別のジスルフィド架橋は、Ｃｙｓ２０３とＣｙｓ２５９との間のα−３ドメインの内部に位置し、アミノ酸ナンバリングはシグナルペプチドなしのＨＬＡ−Ａを参照する。
【００５０】
本発明では、さらなるジスルフィド架橋が、α−１ドメインとα−２ドメインとの間に２つのシステイン残基を組換え導入することによって導入される。好ましくは、２つの変異システインは、α−１ドメイン中のシステイン残基とα−２ドメイン中のシステイン残基との間の空間距離が２〜１０Åである重鎖中の位置で導入される。
【００５１】
ＭＨＣ分子は空であるか又は抗原ペプチドに結合するかのいずれかであり得る。したがって、この文脈で、抗原ペプチドのないＭＨＣ分子（すなわち、空ＭＨＣ分子）と、結合した抗原ペプチドを有するＭＨＣ分子を指すｐＭＨＣ分子との間には違いがある。
【００５２】
この文脈で、用語「ロード可能なａＡＰＣスカフォールド」、「抗原ペプチド受容的ａＡＰＣスカフォールド」及び「空ａＡＰＣスカフォールド」は交換可能に用いられ、抗原ペプチドのないＭＨＣ分子を有するａＡＰＣスカフォールドを意味する。
【００５３】
ヒトにおいて、ＭＨＣ複合体はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子複合体によってコードされる。したがって、この文脈で、用語「ＭＨＣ」は「ＨＬＡ」も包含する。３つの主な種類のＨＬＡが存在し、したがって、ＭＨＣとしては、この文脈で、限定されるものではないが、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃの遺伝子座においてコードされるＨＬＡ対立遺伝子が挙げられる。同様に、ＭＨＣとしては、限定されるものではないが、ＭＨＣクラスＩ様分子、例えば、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ｈ、ＭＩＣ  Ａ、ＭＩＣ  Ｂ、ＣＤ１ｄ、ＵＬＢＰ−１、ＵＬＢＰ−２、及びＵＬＢＰ−３が挙げられる。
【００５４】
ｐＭＨＣ
この文脈で、用語「ｐＭＨＣ」は、抗原ペプチドが結合する前記定義のＭＨＣ分子を指す。したがって、用語ｐＭＨＣは、抗原ペプチドをロードしたＭＨＣクラスＩ分子を指す。
【００５５】
サイトカイン
この文脈で、用語「サイトカイン」は、刺激されたＴ細胞の増殖、生存及びエフェクタ機能に影響を及ぼす免疫調節分子を意味する。サイトカインとしては、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、及び腫瘍壊死因子が挙げられる。
【００５６】
インターロイキンの例としては、限定されるものではないが、ＩＬ−２１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、及びＩＬ−２３が挙げられる。サイトカインには、１つ以上のインターロイキンに対応するＴ細胞刺激及び活性化を誘導するインターロイキンの変異体又は模倣物も含まれる。インターロイキンの変異体又は模倣物は、天然のサイトカインの結合部位を含み得るが、タンパク質の残りの部分は様々であり得る。したがって、インターロイキンの変異体又は模倣物としては、限定されるものではないが、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の変異体、又はそれらの組み合わせ、例えばＩＬ−２／ＩＬ−１５が挙げられる。
【００５７】
サイトカイン群に含まれる特定のインターロイキン変異体又は模倣物はネオロイキン−２／１５と称する。ネオロイキン−２／１５（Ｎｅｏ−２／１５）は、非常に安定で、ＩＬ−２Ｒβγｃに対して強力に結合するが、ＣＤ２５には結合しないデザイナーサイトカインである。
【００５８】
γ鎖受容体サイトカイン
この文脈で、用語「γ鎖受容体サイトカイン」は、共通のγ鎖サブユニットを含む対応するサイトカイン受容体と結合するサイトカインの群を指す。共通のγ鎖（γｃ）受容体は、ＣＤ１３２又はインターロイキン−２受容体サブユニットガンマ（ＩＬ−２ＲＧ）としても知られる。γ鎖受容体サイトカインの共通点の一つは、それらがすべて、共有されるγ鎖受容体を介して自身の細胞内シグナルを送達し、Ｔ細胞活性化及び分化に影響を及ぼすことである。
【００５９】
γｃ糖タンパク質は膜貫通タンパク質であり、これは、細胞外、膜貫通及び細胞内ドメインを含み、典型的にはリンパ球上で発現される。γｃサブユニットは、少なくとも６つの異なるサイトカイン受容体、すなわち、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１受容体の受容体複合体の部分である。したがって、γ鎖受容体サイトカインの群は、少なくともＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１を含む。γ鎖受容体サイトカインはまた、１つ以上のインターロイキンに対応するＴ細胞刺激及び活性化を誘導するγ鎖受容体サイトカインの変異体又は模倣物、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１、又はその組み合わせ、例えばＩＬ−２／ＩＬ−１５の変異体も含む。
【００６０】
共刺激分子
この文脈で、用語「共刺激分子」は、Ｔ細胞との相互作用により、サイトカインのＴ細胞応答、増殖、産生及び／又は分泌を増強し、Ｔ細胞の分化及びエフェクタ機能を刺激するか、又は共刺激分子と接触しないＴ細胞と比較してＴ細胞の生存を促進する分子を意味する。共刺激分子の例としては、限定されるものではないが、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＯＳ、ＰＤ−Ｌ１、ａ−ガラクトシルセラミド、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１４７、ＣＤｗ１５０（ＳＬＡＭ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ１５３（ＣＤ３０Ｌ）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、ＣＤ４０、ＣＤ４８、ＣＤ７０、及びＣＤ７２が挙げられる。
【００６１】
接着分子
この文脈で、用語「接着分子」は、ａＡＰＣスカフォールドとＴ細胞との間の接着を誘導する分子を指す。接着分子としては、限定されるものではないが、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＣＤ３４、抗ＬＦＡ−１、抗ＬＦＡ−２（ＣＤ２）、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）、抗ＣＤ４４、抗β−７、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、抗セレクチンＬ、抗セレクチンＥ、及び抗セレクチンＰが挙げられる。
【００６２】
エピトープ
この文脈で、用語「エピトープ」は、Ｔ細胞のＴＣＲによって認識される抗原決定基を意味する。ｐＭＨＣによって提示されるエピトープは、任意の外来物質に対して非常に特異的であり、ＴＣＲとの相互作用によって、ペプチド−ＭＨＣを標的とした方法で、特異的Ｔ細胞の有効な増殖及び機能的刺激が確実になる。
【００６３】
固体支持体
この文脈で、用語「固体支持体」は、ａＡＰＣスカフォールドを結合させることができる任意の種類の不溶性材料を指す。ａＡＰＣスカフォールドは、固体支持体に共有的又は可逆的に結合させることができる。固体支持体に結合させたａＡＰＣスカフォールドは、（例えば、ろ過、クロマトグラフィ、遠心分離などにより）、過剰の試薬又は溶媒から容易に分離することができる。
【００６４】
固体支持体としては、限定されるものではないが、ビーズ、ウェルプレート、粒子、フィルター、ゲル、チューブ、及びペトリ皿が挙げられる。
【００６５】
本発明のいくつかの実施形態において、テンプレート分子、すなわち、Ｔ細胞に影響を及ぼす分子及びＭＨＣクラスＩ分子は、固体支持体に直接結合させることができる。
【００６６】
サンプル
この文脈で、用語「サンプル」は、対象から抽出された溶液を指し、溶液はＴ細胞の集団を含む。サンプルは、任意の特定の供給源に限定されず、例えば、血液、組織又は体液から抽出することができる。Ｔ細胞集団は異なる特異性を有するＴ細胞を含み得る。
【００６７】
増殖溶液
この文脈で、用語「増殖溶液」は、ａＡＰＣに対する特異性を有するＴ細胞の増殖において使用するためのａＡＰＣスカフォールドを含む溶液を指す。増殖溶液は、Ｔ細胞の増殖、分化及び刺激を支持する他の実体をさらに含んでもよく、例えば、増殖溶液は、ａＡＰＣスカフォールド上に固定化されたものに加えて、さらなるサイトカイン、共刺激分子又は接着分子を含み得る。
【００６８】
臨床的に関連する数
この文脈で、用語「臨床的関連数」は、疾患と闘うために必要な細胞の数を指す。細胞の臨床的関連数の絶対値は疾患に応じて変わる。患者に再導入される前に利用可能な細胞の数は、投与当たり１０５〜１０１２個の細胞、例えば投与当たり１０５〜１０１０個の細胞、例えば投与あたり１０６〜１０９個の細胞の範囲内であり得る。
【００６９】
医薬組成物
この文脈で、用語「医薬組成物」は、本発明にしたがって得られ、好適な量の薬剤的に許容される希釈剤若しくは賦形剤及び／又は薬剤的に許容される担体中に懸濁された、増殖Ｔ細胞集団を含む組成物を指す。
【００７０】
薬剤的に許容される
この文脈で、用語「薬剤的に許容される」は、生理学的に許容され、ヒトに投与された場合、典型的にはアレルギー又は類似の有害な反応、例えば、異常亢進、めまいなどを生じない分子的実体及び組成物を指す。好ましくは、本明細書中で用いられる場合、用語「薬剤的に許容される」は、連邦若しくは州政府の規制機関によって認可されていること、又は動物、さらに詳細にはヒトでの使用のための米国薬局方若しくは他の一般に認識されている薬局方に記載されていることを意味する。
【００７１】
アジュバント
この文脈で、用語「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を増強する化合物又は混合物を指す。アジュバントは、抗原をゆっくりと放出する組織デポーとして、またリンパ系アクチベータとしての役割を果たすことができ、これは、免疫応答を非特異的に増強することができる。多くの場合、アジュバントの不在下で、抗原単独での一次負荷では、液性又は細胞性免疫応答は誘発されない。アジュバントとしては、限定されるものではないが、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、ミネラルゲル、例えば、水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えば、リソレシチン、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油又は炭化水素エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及び潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）及びコリネバクテリウム・パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が挙げられる。好ましくは、アジュバントは薬剤的に許容される。
【００７２】
賦形剤
この文脈で、用語「賦形剤」は、本発明の組成物と共に投与される希釈剤、アジュバント、担体、又はビヒクルを指す。そのような医薬担体は、無菌液体、例えば、水、及び石油、動物、植物又は合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などを含む油であり得る。水又は水溶液、生理食塩液並びにデキストロース及びグリセロール水溶液が担体として、特に注射液用に用いられる。好適な医薬担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによって「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」で記載されている。
【００７３】
配列同一性
この文脈で、用語「配列同一性」は、本明細書中では、それぞれヌクレオチド、塩基又はアミノ酸レベルでの遺伝子又はタンパク質間の配列同一性として定義される。具体的には、ＤＮＡ及びＲＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の転写産物を同じＲＮＡ配列に転写することができる場合、同じであるとみなされる。
【００７４】
したがって、この文脈で「配列同一性」は、アミノ酸レベルでのタンパク質間の同一性の尺度であり、ヌクレオチドレベルでの核酸間の同一性の尺度である。タンパク質配列同一性は、配列を整列させた場合、各配列における所与の位置のアミノ酸配列を比較することにより決定することができる。同様に、核酸配列同一性は、配列を整列させた場合に、各配列における所与の位置のヌクレオチド配列を比較することによって決定することができる。
【００７５】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸の同一性（％）を決定するために、配列を最適の比較目的のために整列させる（例えば、ギャップを、第二アミノ又は核酸配列との最適アラインメントのために、第一アミノ酸又は核酸配列の配列に導入することができる）。対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを次いで比較する。第一配列中のある位置が、第二配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められている場合、分子は当該位置で同一である。２つの配列間の同一性（％）は、当該配列によって共有される同じ位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同じ位置の数／位置の総数（例えば、オーバーラップする位置）×１００）。一実施形態において、２つの配列は同じ長さである。
【００７６】
別の実施形態では、２つの配列は異なる長さのものであり、ギャップは異なる位置として見られる。配列を手作業で整列させ、同じアミノ酸の数を数えることができる。あるいは、同一性（％）の決定のための２つの配列のアラインメントは、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。そのようなアルゴリズムは、（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長＝１２を用いて実施して、本発明の核酸分子と同種であるヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチは、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３で実施して、本発明のタンパク質分子と相同性のアミノ酸配列を得ることができる。
【００７７】
比較目的でギャップ付アラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔは、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施するために使用することができる。ＮＢＬＡＳＴ、ＸＢＬＡＳＴ、及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラムのデフォルトパラメータを使用してもよい。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照。あるいは、配列同一性は、配列を、例えば、ＥＭＢＬデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ）のＢＬＡＳＴプログラムにより整列させた後、算出することができる。概して、例えば、「スコアリングマトリックス」及び「ギャップペナルティ」に関するデフォルト設定をアラインメントに使用することができる。本発明の関連で、ＢＬＡＳＴＮ及びＰＳＩ  ＢＬＡＳＴデフォルト設定が有利であり得る。
【００７８】
２つの配列間の％同一性は、ギャップを許容するか否かを問わず、上述のものと類似の技術を用いて決定することができる。％同一性の算出において、正確な一致のみをカウントする。したがって、本発明の実施形態は、ある程度の配列変動を有する本発明の配列に関する。
【００７９】
安定化されたＭＨＣクラスＩ分子を有するａＡＰＣスカフォールド
Ｔ細胞は、免疫応答において重要な役割を果たし、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と相互作用することによって外来物質を認識し応答し、ＭＨＣ分子との複合体（ｐＭＨＣ）で外来物質の抗原ペプチドを提示する。Ｔ細胞は非常に特異的であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の単一特異性のみを発現させ、それにより、Ｔ細胞が、単一特異性ｐＭＨＣ分子のみを認識し応答することを可能にする。Ｔ細胞をまずプライミングして、抗原とＭＨＣ分子との特定の組み合わせの受容体を発生させると、それらは、その後、他の特異性を認識することができなくなる。Ｔ細胞のこの特殊化は、ＭＨＣ限定と呼ばれ、増殖Ｔ細胞集団を「汚染」する無関係の特異性のない単一特異性のＴ細胞を増殖させるために利用することができる。
【００８０】
ＭＨＣ分子は、いくつかの変異体で存在し、そのＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ分子が最も重要であるとみなされ得る。ＭＨＣクラスＩ分子はＣＤ８陽性細胞毒性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）と相互作用し、ＭＨＣクラスＩＩ分子はＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）と相互作用する。一旦活性化すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、概して、がん細胞、（特にウイルスに）感染した細胞、過剰発現するがん抗原によって特徴づけられる細胞、変異を発現する細胞、すなわちネオアンチゲン、がん−精巣抗原を発現する細胞又は他の方法で損傷を受けた細胞を殺滅しようとする。一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、免疫系を支援することにより、例えばサイトカインを放出することによって主に機能し、ＣＤ８＋Ｔ細胞を増強する。単一種のＴ細胞に限定されないが、本発明は主にＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化、刺激及び増殖に関連する。これは、ａＡＰＣスカフォールドの利用がＣＤ４＋Ｔ細胞及び抗原提示細胞の統合された役割をある程度果たすので、特に当てはまる。
【００８１】
ＴＣＲ−ｐＭＨＣ相互作用はＴ細胞の活性化の主な推進力であるが、有効な免疫応答のためにＴ細胞を調製するためにはいくつかの他の要因が必要とされる。全体として、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、２つのシグナル；１）ＴＣＲとｐＭＨＣクラスＩ分子との間の相互作用、及び２）ＣＤ２８、Ｔ細胞上の膜受容体及びＡＰＣ上に位置するＣＤ２８リガンド、例えばＢ７．１（ＣＤ８０）又はＢ７．２（ＣＤ８６）間の共刺激相互作用を必要とする。第二シグナルは、増殖、サイトカイン産生及び細胞生存を増強する働きをする。
【００８２】
刺激シグナルに加えて、Ｔ細胞応答は阻害シグナルによっても調節される。Ｔｉｍ−３、ＬＡＧ−３及びＰＤ−１は阻害シグナルのメディエータの例である。それらは、過剰なＴ細胞活性化を回避し、免疫系が生物全体に広がるのを防止するための自然のメカニズムとしての役割を果たす。
【００８３】
二次シグナルは、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって放出されたサイトカインでのＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激によって、支援されるか、又は場合によっては置換され得る。したがって、サイトカインは、免疫応答の調節に関与する別の重要な分子群を構成する。サイトカインには、一般的に、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、リンホカイン、及び腫瘍壊死因子が含まれる。それらは、受容体を介して作用し、中でも、Ｔ細胞集団の成熟、成長、及び反応性を調節する。合わせると、インターロイキン−２（ＩＬ−２）及び共刺激シグナルは、連続した細胞分裂の保存のための最も重要な因子である。共刺激分子とサイトカインとの間の繊細な相互作用は複雑であり、効率的かつ特異的なＴ細胞増殖の重要な因子のうちの１つである。
【００８４】
免疫応答においてだけでなく、アポトーシス、増殖、接着、及び遊走などの細胞プロセスにおいても重要な役割を果たす別の分子がＣＤ４７である。この膜貫通タンパク質は、ヒト細胞において偏在的に発現されるが、多種多様の腫瘍細胞において過剰発現され、高レベルのＣＤ４７により、がん細胞は食作用を回避することができる。しかしながら、ＣＤ４７はまた、免疫細胞においても広く発現され、免疫細胞の循環時間を延長する「食作用阻害（ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ  ｍｅ）」シグナルとして機能する。ＣＤ４７を発現するＴ細胞の増殖は、これらの細胞が治療的に使用される場合に半減期が増加することが予想されるので、好ましい場合がある。
【００８５】
したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、テンプレート分子が、Ｔ細胞集団におけるＣＤ４７発現を刺激することができるリガンドを含むａＡＰＣスカフォールドに関する。
【００８６】
ＣＤ４７はまた、ａＡＰＣ自体にとって、例えば、培養又は循環におけるａＡＰＣスカフォールドの半減期を延長する「食作用阻害（ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ  ｍｅ）」シグナルとして、有益な特性であり得る。
【００８７】
したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、ＣＤ４７をさらに含むａＡＰＣスカフォールドに関する。
【００８８】
上記により例示されるように、Ｔ細胞の活性化及び増殖に関与する多くの因子がある。しかしながら、免疫療法及び／又は特異的Ｔ細胞集団の増殖のために、Ｔ細胞集団に、これらの目的に適した高い活性及び機能性を提供する能力のために理想的に満たされるべきある条件を設定することが可能である。したがって、増殖Ｔ細胞の好ましい特性としては以下のものが挙げられる：
ａ．アクチベータ（例えばＣＤ２８）の高発現
ｂ．阻害剤（例えばＰＤ１）の低発現
ｃ．多機能性、すなわち、いくつかのサイトカインの同時分泌。
【００８９】
効率的な活性化及び刺激のために必要とされる異なる分子のクラスタは、Ｔ細胞機能及び増殖の最適能力を提供するために同時に存在しなければならない。ａＡＰＣスカフォールドを使用することで互いに所定の近接度にある必要とされる分子の組み合わせが集められるので、特異的Ｔ細胞の効率的な増殖に好適なプラットフォームを構成される。
【００９０】
高度に特殊化され、かつ活性なＴ細胞の効率的な増殖のためにａＡＰＣスカフォールドを利用する見込みは非常に有望である。しかしながら、ＭＨＣ抗原提示に基づく技術を真にハイスループットのプラットフォームに変えるという課題が引き続き存在する。これは、ＭＨＣ分子の再フォールディングが抗原ペプチドの非存在下では不可能であり、それらの産生はしたがって複雑かつ費用がかかるためである。数千のＭＨＣクラスＩアロタイプがあるだけでなく、治療目的で検査又は利用される各抗原ペプチドのために新しい個別化ａＡＰＣスカフォールドを産生しなければならない。抗原ペプチドなしでＭＨＣ分子を産生し、代わりに必要に応じてａＡＰＣスカフォールドをアセンブリングする直前に抗原ペプチドを添加するのがより効率的で柔軟性がある。抗原ペプチドなしでＭＨＣ分子を使用して完全にアセンブリングされたａＡＰＣスカフォールドを産生し、代わりに、必要に応じて抗原ペプチドを添加することが、なお一層効果的かつ柔軟性である。
【００９１】
したがって、Ｔ細胞の増殖及び新しい免疫療法の開発のためのハイスループットプラットフォームを提供するために、ａＡＰＣ本発明のスカフォールドは、ａＡＰＣスカフォールドの産生後に抗原ペプチドを添加できる、空ＭＨＣクラスＩ分子を備えていてもよい。ＭＨＣクラスＩ分子は、重鎖のα−１及びα−２ドメインを結合させるジスルフィド架橋の人工的導入によって安定化される。ジスルフィド架橋は、Ｃ末端ペプチド結合ポケットの遠位末端のペプチド結合グルーブの外側に位置する。ＭＨＣクラスＩ分子のこのような構造的変化は、結合した特異的抗原ペプチドのコンフォメーション的効果及び動的効果を模倣し、それによってＭＨＣクラスＩ分子を安定化させる。
【００９２】
天然クラスＩ  ＭＨＣ分子は、特異的アフィニティで多様な配列のペプチドと結合する。これは、ペプチド結合を促進するポケット（典型的には、ＭＨＣ結合グルーブのＡ及びＦポケット）を形成するペプチド結合グルーブの末端で保存アミノ酸の使用により達成することができる。これらの結合ポケットは、典型的にはアンカーモチーフ（典型的には、位置２又は３、及びペプチドのｃ末端位置）と称する、抗原ペプチドの結合についての一組の要件を決定する。天然のＭＨＣクラスＩ分子は多くの異なる抗原ペプチドとアンカーモチーフの認識によって結合するが、各対立遺伝子は、すべての利用可能な抗原ペプチドの異なるサブセットにのみ高アフィニティで結合する。しかしながら、安定化されたＭＨＣクラスＩ分子の人工的に導入されたジスルフィド架橋は、結合した特異的抗原ペプチドのコンフォメーション的効果及び動的効果を模倣するため、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドは、多種多様な抗原ペプチドを結合することができる空ＭＨＣクラスＩ分子を用いて産生することができる。これは、安定化されたＭＨＣクラスＩ分子のジスルフィド架橋に基づくＴ細胞相互作用が、野生型ＭＨＣ分子を用いて得られるものと充分同一であるという知見によってさらに強調される。
【００９３】
したがって、ａＡＰＣスカフォールドは、アフィニティタグ付けされたジスルフィド安定化空ＭＨＣクラスＩ分子が結合したカップリング剤と結合したポリマー骨格から構築される。空ＭＨＣクラスＩ分子に抗原ペプチドをロードして、特異的Ｔ細胞との特異的相互作用を支配することができるｐＭＨＣ分子を形成することができる。共結合（ｃｏ−ａｔｔａｃｈｅｄ）アフィニティタグ付けされた、Ｔ細胞に影響を及ぼす分子、例えば、サイトカイン及び共刺激分子と組み合わせて、ａＡＰＣスカフォールドは特異的Ｔ細胞を刺激して、増大した機能的特性を達成する。したがって、本発明は、腫瘍退縮又はウイルス排除を媒介するために理想的な表現型及び機能的特性を得るために細胞に特異的機能的刺激を提供するためにＭＨＣロードａＡＰＣスカフォールドを使用することにより、腫瘍反応性Ｔ細胞を増殖するために必要な特定の条件を示す。空ＭＨＣクラスＩ分子に抗原ペプチドをローディングした後のａＡＰＣスカフォールドは、ｐＭＨＣ分子の認識に基づいてＴ細胞と特異的に相互作用し、この特異的相互作用を介して、ペプチド−ＭＨＣを標的とした方法で、特異的Ｔ細胞を効果的に増殖し機能的に刺激することができる。
【００９４】
ａＡＰＣスカフォールドは、様々な異なるテンプレート分子（すなわち、ＭＨＣクラスＩ分子、Ｔ細胞に影響を及ぼす分子）の組み合わせによってアセンブリングすることができる。本明細書中で記載するａＡＰＣスカフォールドは、限定されるものではないが、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＯＳ、ＰＤ−Ｌ１、ａ−ガラクトシルセラミド、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１４７、ＣＤｗ１５０（ＳＬＡＭ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ１５３（ＣＤ３０Ｌ）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、ＣＤ４０、ＣＤ４８、ＣＤ７０、及びＣＤ７２を含む１つ以上の共刺激分子を含み得る。
【００９５】
さらに、本明細書中で記載するａＡＰＣスカフォールドは、限定されるものではないが、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、インターロイキン−２２（ＩＬ−２２）、インターロイキン−２３（ＩＬ−２３）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ−β）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、ＩＧＩＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦ−β）及びマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、並びにその変異体及びフラグメントを含む１つ以上のサイトカインを含み得る。
【００９６】
本明細書では、抗原ペプチドをロードした場合、Ｔ細胞増殖に好適であり、活性なＴ細胞の高い比率、Ｔ細胞の高い抗原特異性及びＴ細胞の高い機能性を保証するａＡＰＣスカフォールドを記載する。したがって、本発明の第一の態様は、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールドであって、以下のテンプレート分子：
ｉ．少なくとも１つのＴ細胞に影響を及ぼす分子、及び
ｉｉ．少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ分子
が結合したポリマー骨格を含み、
ＭＨＣクラスＩ分子が、α−１ドメインと、ジスルフィド架橋により接続されたα−２ドメインとを含む重鎖を含む、
人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールドに関する。
【００９７】
α−１及びα−２ドメイン間に形成されたジスルフィド架橋は、ＭＨＣクラスＩ分子に人工的に導入される。具体的には、２つの変異システイン残基を重鎖のアミノ酸配列に導入して、α−１及びα−２ドメイン間のジスルフィド架橋形成を可能にする。変異システイン残基の導入は、任意の種類の好適な変異誘発によって実施することができ、そのような技術は当業者には公知である。好ましくは、変異誘発の位置は、α−１及びα−２ドメインに位置する、結果として得られる変異システイン残基が、正常なタンパク質フォールディング条件下でジスルフィド架橋の形成を可能にするような相互の空間距離内にあるように選択される。
【００９８】
したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、前記ジスルフィド架橋が、α−１ドメインに位置する変異システイン残基とα−２ドメインに位置する変異システイン残基との間に形成されるａＡＰＣスカフォールドに関する。
【００９９】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、α−１ドメインに位置する変異システイン残基とα−２ドメインに位置する変異システイン残基との間の空間距離が、２〜１０Å、例えば２〜８Å、好ましくは２〜５Åである、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１００】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、
重鎖が：
ａ．配列番号１、又は
ｂ．（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含み、
前記アミノ酸配列が、α−１ドメインに位置する変異システイン鎖残基と、α−２ドメインに位置する変異システイン残基とを含む、
ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１０１】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、重鎖が：
ａ．配列番号１、又は
ｂ．（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは（ａ）の配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらのアミノ酸配列からなり、
前記アミノ酸配列が、α−１ドメインに位置する変異システイン残基とα−２ドメインに位置する変異システイン残基とを含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１０２】
２つのシステイン残基の好ましい変異には、位置１３９のアミノ酸及び位置８４又は８５のいずれかのアミノ酸の修飾が含まれる。位置１３９のアミノ酸は重鎖のα−２ドメインに位置し、多くの場合、アラニン残基である。位置８４又は８５のアミノ酸は重鎖のα−１ドメインに位置し、多くの場合、チロシン残基である。システイン変異は、標準的遺伝子操作を用いた重鎖の遺伝子配列の修飾によるアミノ酸置換によって導入することができる。
【０１０３】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、α−１ドメインにおける変異システイン残基がアミノ酸残基８４又は８５にあり、α−２ドメインに位置する変異システイン残基がアミノ酸残基１３９にある、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１０４】
ＭＨＣクラスＩ分子のフォールディングにより、ジスルフィド架橋が、Ｃｙｓ−８４又はＣｙｓ−８５とＣｙｓ−１３９との間に形成される。新たに形成されたジスルフィド架橋はＭＨＣクラスＩ分子を安定化させるので、抗原ペプチドの非存在下でも溶液中で安定なままである。これらの安定な空ＭＨＣクラスＩ分子を次いでアフィニティタグとカップリング剤との間の相互作用によってａＡＰＣスカフォールドのポリマー骨格に結合させることができる。
【０１０５】
システイン変異残基の導入は、いかなる種類のＭＨＣクラスＩ分子又はＭＨＣクラスＩ様分子にも適用することができる。したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、ＭＨＣクラスＩ分子が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ｈ、ＭＩＣ  Ａ、ＭＩＣ  Ｂ、ＣＤ１ｄ、ＵＬＢＰ−１、ＵＬＢＰ−２、及びＵＬＢＰ−３からなる群から選択される、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１０６】
本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドはまた、Ｈ−２複合体と称される、マウスのＭＨＣとの併用にも適用可能であり、したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、重鎖が、Ｈ−２分子、例えば、Ｈ−２Ｋｂ又はＨ−２Ｄｂである、ａＡＰＣスカフォールドに関する。本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、重鎖が：
ａ．配列番号１２若しくは配列番号１３のいずれか一つ、又は
ｂ．（ａ）の配列のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１０７】
ＭＨＣクラスＩ分子の好ましい変異体には、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨ−２が含まれ、各々、２つの変異システイン残基を含む。したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、重鎖が：
ａ．配列番号２〜１３のいずれか一つ、又は
ｂ．（ａ）の配列のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１０８】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、重鎖が：
ａ．配列番号２〜１３のいずれか一つ、又は
ｂ．（ａ）の配列のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性、例えば、（ａ）の配列のいずれか一つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はこれらのアミノ酸配列からなる、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１０９】
なお、用語「配列番号２〜１３」は、「配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３」と理解される。
【０１１０】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、重鎖が：
ａ．配列番号２〜１１のいずれか一つ、又は
ｂ．（ａ）の配列のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１１１】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、重鎖が：
ａ．配列番号２〜６のいずれか一つ、又は
ｂ．（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１１２】
Ｔ細胞の増殖によく利用されるＨＬＡの対立遺伝子はＨＬＡ−Ａ  ０２：０１対立遺伝子である。したがって、本発明の好ましい実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、重鎖が：
ａ．配列番号２、又は
ｂ．（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１１３】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、重鎖が：
ａ．配列番号２、又は
ｂ．（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性、例えば、（ａ）の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はこれらのアミノ酸配列からなる、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１１４】
ＭＨＣクラスＩ分子は、アフィニティタグとカップリング剤との間の相互作用によってａＡＰＣスカフォールドのポリマー骨格に結合されている。好ましくは、アフィニティタグ、例えば、ビオチンは、ＭＨＣクラスＩ分子上に位置する。ビオチンの重鎖への結合は、重鎖のビオチン化のためのハンドル、例えば、Ａｖｉ−ｔａｇを含めることによって達成することができる。したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、重鎖が：
ａ．配列番号２〜１３のいずれか一つ、又は
ｂ．（ａ）の配列のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性、例えば、（ａ）の配列のいずれか一つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はこれらのアミノ酸配列からなり、
重鎖が配列番号１９をさらに含む、
ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１１５】
本発明の好ましい実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、重鎖が：
ａ．配列番号１４、又は
ｂ．（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１１６】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、重鎖が：
ａ．配列番号１４、又は
ｂ．（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性、例えば、（ａ）の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含むか、又はこれらのアミノ酸配列からなる、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１１７】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、重鎖が：
ａ．配列番号１７、又は
ｂ．（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性、例えば、（ａ）の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含むか、又はこれらのアミノ酸配列からなる、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１１８】
重鎖は、β２−ミクログロブリン分子（Ｂ２Ｍ）と結合して、ＭＨＣクラスＩ分子を形成する。具体的には、重鎖のα−３ドメインはＢ２Ｍに隣接した位置にある。したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ分子がβ２−ミクログロブリン分子を含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１１９】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、β２−ミクログロブリン分子が：
ａ．配列番号１５、又は
ｂ．（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１２０】
ＭＨＣクラスＩ分子はまた、リンカーを介して重鎖に接続されたＢ２Ｍを有するファイナライズされた融合タンパク質として提供することもできる。したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ分子が：
ａ．配列番号１６、又は
ｂ．（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１２１】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ分子が：
ａ．配列番号１６、又は
ｂ．（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性、例えば、（ａ）の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はこれらのアミノ酸配列からなる、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１２２】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ分子が：
ａ．配列番号１８、又は
ｂ．（ａ）の配列と少なくとも８０％の配列同一性、例えば、（ａ）の配列と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はこれらのアミノ酸配列からなる、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１２３】
一部のＴ細胞の増殖は、いくつかの、Ｔ細胞に影響を及ぼす分子が同時に存在する場合に増強させることができる。達成される利点は、Ｔ細胞の増殖及び刺激において、異なる目的（例えば、成長、分化、活性化など）に役立つＴ細胞に影響を及ぼす分子の相乗効果であり得る。したがって、Ｔ細胞に影響を及ぼす分子は、同じ種類又は異なる種類の分子に属し得る。したがって、本願の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、少なくとも２つの異なる、Ｔ細胞に影響を及ぼす分子を含むａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１２４】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、Ｔ細胞に影響を及ぼす分子が、サイトカイン、共刺激分子、接着分子、及び抗体からなる群から選択される、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１２５】
Ｔ細胞に影響を及ぼす分子の好ましい一種がサイトカインである。サイトカインは、液性免疫応答と細胞系免疫応答との間のバランスを調節し、それらは、Ｔ細胞集団の成熟、成長、及び反応性を調節する。あるサイトカインは複雑な方法で他のサイトカインの作用を増強又は阻害し、サイトカインの選択間の相互作用を予測不可能にする。したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、Ｔ細胞に影響を及ぼす分子がサイトカインである、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１２６】
本明細書中で記載するサイトカインは、天然のサイトカイン、並びに増強されたＴ細胞活性化及び機能を誘導するように操作されたサイトカインの変異体又は模倣物の両方を包含する。したがって、インターロイキンなどのサイトカインの変異体又は模倣物は、１つ以上のサイトカインに対応するＴ細胞活性化及び機能を誘導し得る。したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、Ｔ細胞に影響を及ぼす分子がサイトカイン、又はそれらの変異体及び模倣物である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、サイトカインが、自然のサイトカイン、又はそれらの変異体及び模倣物から選択される、ａＡＰＣスカフォールドに関する。本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、サイトカインの変異体又は模倣物が、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の群から選択される１つ以上のインターロイキンに対応するＴ細胞刺激を誘導する、ａＡＰＣスカフォールドに関する。本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、サイトカインの変異体又は模倣物が、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の群から選択される２つのインターロイキン、例えば、ＩＬ−２／ＩＬ−１５、例えばＩＬ−２／ＩＬ−２１、又は例えばＩＬ−１５／ＩＬ−２１に対応するＴ細胞刺激を誘導する、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１２７】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、サイトカインが、ＩＬ−２１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、及びＩＬ−２３からなる群から選択される、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１２８】
ＩＬ−２は、免疫応答の強度を調節するために治療的に使用される。ＩＬ−２は、ＩＬ−２Ｒβγｃと呼ばれるヘテロダイマーシグナリングタンパク質を形成する、ＩＬ−２受容体β及びＩＬ−２受容体γ（ＩＬ−２Ｒβ及びＩＬ−２Ｒγ）として知られる２つの受容体サブユニットと同時に結合することによって、そのメッセージを送達する。ＩＬ−２Ｒαと呼ばれる第三の非シグナリング受容体（ＣＤ２５としても知られる）は、シグナリング複合体の形成に寄与し、ＩＬ−２とＩＬ−２Ｒβγｃとの間の結合をほぼ１００倍増強する。
【０１２９】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、サイトカインが少なくともＩＬ−２、又はそれらの変異体及び模倣物を含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、サイトカインがＩＬ−２、又はそれらの変異体及び模倣物からなるａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１３０】
ＩＬ−２の変異体又は模倣物は、ネオロイキン−２／１５と称する。ネオロイキン−２／１５（Ｎｅｏ−２／１５）は、非常に安定で、ＩＬ−２Ｒβγｃと強力に結合するが、ＣＤ２５とは結合しない、デザイナーサイトカインである。したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、サイトカインが、少なくともＮｅｏ−２／１５を含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、サイトカインがＮｅｏ−２／１５からなる、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１３１】
様々なサイトカイン群が、特に好ましいａＡＰＣスカフォールドを産生することが確認されている。理論によって拘束されないが、サイトカインの１つの効率的な群は、共有されるγ鎖受容体を介してそれらの細胞内シグナルを送達し、Ｔ細胞活性化及び分化に影響を及ぼすサイトカインである。この文脈で、これらのサイトカインは、「γ鎖受容体サイトカイン」と称する。したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、サイトカインがγ鎖受容体サイトカインである、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１３２】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、γ鎖受容体サイトカインが、ＩＬ−２１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−４、ＩＬ−７及びＩＬ−９からなる群から選択される、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１３３】
本発明者らは、γ鎖受容体サイトカインファミリー内の刺激分子の好ましい組み合わせを特定した。
【０１３４】
したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、γ鎖受容体サイトカインが、ＩＬ−２１、ＩＬ−２及びＩＬ−１５からなる群から選択される、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１３５】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、γ鎖受容体サイトカインが少なくともＩＬ−２１を含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１３６】
前に概説したように、以下サイトカインと称する、いくつかのＴ細胞に影響を及ぼす分子間の相互作用は、Ｔ細胞の増殖が恩恵を受け得る有益な効果をもたらし得る。これはまた、γ鎖受容体サイトカイン群についても当てはまる。したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、ａＡＰＣスカフォールドが少なくとも２つのγ鎖受容体サイトカインを含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１３７】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、γ鎖受容体サイトカインが：
ｉ．少なくともＩＬ−２及びＩＬ−２１、又は
ｉｉ．少なくともＩＬ−１５及びＩＬ−２１
を含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１３８】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、γ鎖受容体サイトカインが：
ｉ．ＩＬ−２及びＩＬ−２１、又は
ｉｉ．ＩＬ−１５及びＩＬ−２１
である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１３９】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、γ鎖受容体サイトカインが：
ｉ．少なくともＩＬ−４及びＩＬ−２１、
ｉｉ．少なくともＩＬ−７及びＩＬ−２１、又は
ｉｉｉ．少なくともＩＬ−９及びＩＬ−２１
を含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１４０】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、γ鎖受容体サイトカインが：
ｉ．ＩＬ−４及びＩＬ−２１、
ｉｉ．ＩＬ−７及びＩＬ−２１、又は
ｉｉｉ．ＩＬ−９及びＩＬ−２１
である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１４１】
ａＡＰＣスカフォールドに含まれ得る別の種類の、Ｔ細胞に影響を及ぼす分子は、サイトカインのＴ細胞応答、増殖、産生及び／又は分泌を増強するか、Ｔ細胞の分化及びエフェクタ機能を刺激するか、又はＴ細胞の生存を促進する、共刺激分子である。したがって、共刺激分子は、自然界で作用し、また、ａＡＰＣスカフォールドと共に作用して、Ｔ細胞増殖及び分化を単独で誘導し、他のＴ細胞に影響を及ぼす分子、例えばサイトカインの効果を増強する。したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、Ｔ細胞に影響を及ぼす分子が少なくとも１つの共刺激分子を含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１４２】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、共刺激分子が、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ及びＰＤ−Ｌ１からなる群から選択される、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１４３】
テンプレート分子は、カップリング剤とアフィニティタグとの間の相互作用によりポリマー骨格に結合させることができる。カップリング剤は、ａＡＰＣスカフォールドのポリマー骨格上に位置し、限定されるものではないが、疎水性相互作用、静電相互作用又は共有結合によって骨格に結合させることができる。ポリマー骨格上に位置する場合、カップリング剤は、アフィニティ−タグ付けされたテンプレート分子をモジュール方式で固定することができる柔軟性テンプレートを提供する。アフィニティタグは、限定されるものではないが、非共有相互作用を介してカップリング剤に特異的に結合する分子種である。アフィニティタグを各テンプレート分子に結合させることによって、特注のａＡＰＣスカフォールドをアセンブリングするのは容易である。
【０１４４】
したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、テンプレート分子が、ポリマー骨格上に位置するカップリング剤とテンプレート分子上のアフィニティタグとの間の非共有相互作用によってポリマー骨格に結合される、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１４５】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、テンプレート分子が、テンプレート分子上に位置するカップリング剤とポリマー骨格上のアフィニティタグとの間の非共有相互作用によってポリマー骨格に結合される、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１４６】
アフィニティタグとカップリング剤との多くの公知適合性対は、本発明で使用することができ、限定されるものではないが、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／アビジン、ビオチン／ニュートラアビジン、ビオチン／ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎ、ポリ−Ｈｉｓ／金属イオンキレート、ペプチド／抗体、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、エピトープ／抗体、マルトース結合タンパク質／アミラーゼ及びマルトース結合タンパク質／マルトースが挙げられる。アフィニティタグとカップリング剤との他の公知適合性対も本発明で使用することができる。
【０１４７】
したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、カップリング剤／アフィニティタグが、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／アビジン、ビオチン／ニュートラアビジン、ビオチン／ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎ、ポリ−Ｈｉｓ／金属イオンキレート、ペプチド／抗体、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、エピトープ／抗体、マルトース結合タンパク質／アミラーゼ及びマルトース結合タンパク質／マルトースからなる群から選択される、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１４８】
本発明の別の好ましい実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、カップリング剤がストレプトアビジンであり、アフィニティタグがビオチンである、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１４９】
テンプレート分子を結合させたａＡＰＣスカフォールドのポリマー骨格はまた、様々な異なる材料ベースであり得る。したがって、限定されるものではないが、多糖類、合成多糖類、ビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、誘導体化セルロース性物質、ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎ及びポリ−ストレプトアビジンを含む、数種類の骨格を本発明で使用することができる。多糖類は、デキストランのデキストラン又は異なる変異体、例えばカルボキシメチルデキストラン、デキストランポリアルデヒド、及びシクロデキストリンであり得る。合成多糖類の例は、例えば、フィコールである。ビニルポリマーとしては、限定されるものではないが、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アクリルエステル）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（マレイン酸）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸）及びポリ（ビニルアルコール）が挙げられる。誘導体化セルロース性物質からなるポリマー骨格としては、限定されるものではないが、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース及びヒドロキシ−エチルセルロースを含む誘導体化セルロース成物質が挙げられる。
【０１５０】
さらに、本発明にかかる自己集合性ａＡＰＣスカフォールドを形成するための基礎として機能し得る市販のポリマー骨格が存在する。これらのポリマー骨格としては、限定されるものではないが、ＩＢＡ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ製のＳｔｒｅｐｔａｍｅｒが挙げられ、これは、オリゴマー化して、いくつかのビオチン化分子、例えばビオチン化ＭＨＣ複合体及びＴ細胞に影響を及ぼす分子、例えばサイトカイン及び共刺激分子を結合することができるマルチマーを形成する、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎタンパク質に基づく。
【０１５１】
したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、ポリマー骨格が、多糖類、ビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎ及びポリ−ストレプトアビジンからなる群から選択される、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１５２】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、ポリマー骨格が多糖類である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１５３】
本発明のさらなる好ましい実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、多糖類がデキストランである、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１５４】
ポリマー骨格のサイズは、各ａＡＰＣスカフォールドにどれほど多くのテンプレート分子を結合させることができるかに対して物理的制限を設定する。ポリマー骨格のサイズは、その分子量によって与えられる。
【０１５５】
したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、デキストランが、５０〜３０００ｋＤａ、例えば１００〜２５００ｋＤａ、例えば２５０〜２５００ｋＤａの範囲内の分子量を有する、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１５６】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、デキストランが、２５０ｋＤａ、２７０ｋＤａ、７５０ｋＤａ、及び２０００ｋＤａからなる群から選択される分子量を有する、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１５７】
各ａＡＰＣスカフォールドに結合された分子の数に加えて、別の重要なパラメータは、テンプレート分子がポリマー骨格上に分布している密度である。密度は、ａＡＰＣスカフォールドに含まれるすべての分子間の比を調節することによって変えることができる。したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、ポリマー骨格：ＭＨＣクラスＩ分子：共刺激分子：サイトカイン間の比が、１：１：１：１、１：２：１：１、１：４：１：１、１：４：２：１、１：４：２：２、１：１０：５：５、１：４：４：４、１：８：８：８、１：１０：１０：１０、１：２０：２０：２０、１：３０：３０：３０、１：４０：４０：４０、１：５０：５０：５０、１：５０：１０：１０又は１：５０：２０：２０からなる群から選択される、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１５８】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、ポリマー骨格：ＭＨＣクラスＩ分子：サイトカイン１：サイトカイン２間の比が、１：１：１：１、１：２：１：１、１：４：１：１、１：４：２：１、１：４：２：２、１：１０：５：５、１：４：４：４、１：８：８：８、１：１０：１０：１０、１：２０：２０：２０、１：３０：３０：３０、１：４０：４０：４０、１：５０：５０：５０、１：５０：１０：１０又は１：５０：２０：２０からなる群から選択される、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１５９】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、ポリマー骨格：ＭＨＣクラスＩ分子：共刺激分子：サイトカイン１：サイトカイン２間の比が、１：１：１：１：１、１：２：１：１：１、１：４：１：１：１、１：４：２：１：１、１：４：２：２：２、１：１０：５：５：５、１：４：４：４：４、１：８：８：８：８、１：１０：１０：１０：１０、１：２０：２０：２０：２０、１：３０：３０：３０：３０、１：４０：４０：４０：４０、１：５０：５０：５０：５０、１：５０：１０：１０：１０又は１：５０：２０：２０：２０からなる群から選択される、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１６０】
本発明は、様々な対象からのＴ細胞の増殖に好適であり得る。したがって、本発明の実施形態は本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ分子が脊椎動物ＭＨＣ分子、例えば、ヒト、ネズミ、ラット、ブタ、ウシ又はトリ分子などである、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１６１】
本発明の別の好ましい実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、脊椎動物ＭＨＣクラスＩ分子がヒト分子であるａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１６２】
上述のように、ＭＨＣ分子はいくつかの変異体で存在する。ＭＨＣ分子には、ＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩ様分子が含まれるが、これらに限定されない。ＭＨＣクラスＩ様分子には、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＭＲ１、ＵＬＢＰ−１、ＵＬＢＰ−２、及びＵＬＢＰ−３が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６３】
本発明の好ましい実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ分子がヒトＭＨＣクラスＩ分子である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。ヒトでは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体と呼ばれる遺伝子複合体によってコードされる。ＭＨＣクラスＩに対応するＨＬＡは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃと呼ばれる。したがって、本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ分子が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃからなる群から選択される、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１６４】
本明細書中で記載されるａＡＰＣスカフォールドは、α−１及びα−２ドメインを接続するジスルフィド架橋によって安定化されるＭＨＣクラスＩ分子を含む。これによって、抗原ペプチドを含まないＭＨＣクラスＩ分子を有するａＡＰＣスカフォールドの形成が可能になる一方で、ａＡＰＣスカフォールドは、抗原ロードＭＨＣクラスＩ分子の有無にかかわらず提供することができる。アンロードＭＨＣクラスＩ分子を備える場合でも、ａＡＰＣスカフォールドの最終的に意図される使用としては、抗原ペプチドをローディングし、それによってｐＭＨＣ分子を形成することが含まれる。
【０１６５】
したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、ＭＨＣクラスＩ分子が抗原ペプチドのないペプチド結合グルーブを含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１６６】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、ＭＨＣクラスＩ分子が、抗原ペプチドを含むペプチド結合グルーブ（ｐＭＨＣ）を含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１６７】
ｐＭＨＣ分子によって提示される抗原ペプチドは、どの種類のＴ細胞がａＡＰＣスカフォールドによって増殖されるかを最終的に決定し、これは前記でＭＨＣ限定と称する概念である。本発明にかかるａＡＰＣスカフォールドでの使用に適した抗原ペプチドは、本質的にいかなる供給源からも得ることができる。抗原源としては、限定されるものではないが、ヒト、ウイルス、細菌、寄生生物、植物、真菌、又は腫瘍を挙げることができる。したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、ｐＭＨＣの抗原ペプチドが、ヒト、ウイルス、細菌、寄生生物、植物、真菌、及び腫瘍からなる群から選択される源由来である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１６８】
本発明のａＡＰＣスカフォールドの１つの使用は、養子細胞移入（ＡＣＴ）における使用のための腫瘍反応性Ｔ細胞の増殖においてである。ＡＣＴ方略の強度は、Ｔ細胞が、局所的腫瘍環境に反して、抗原特異的Ｔ細胞集団の効率的な増殖に最適な環境において、エクスビボで提示されることである。
【０１６９】
本発明のａＡＰＣスカフォールドの別の潜在的使用は、典型的には移植の結果として生じるある特定の感染症との闘争に特異的なＴ細胞集団の増殖のためのものである。移植を受けた患者は、典型的には、移植片拒絶を回避するために免疫抑制療法を受ける。多くの場合、そのような治療により、患者は攻撃的なウイルス株に攻撃されやすくなり、すでに弱っている患者の重篤な感染症を引き起こす。本発明のａＡＰＣスカフォールドは、ＡＣＴ方略により重篤な感染症を治療する目的で、移植患者から抽出されたＴ細胞の効果的な増殖のために非常に適している。
【０１７０】
したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、ｐＭＨＣの抗原ペプチドが、がん関連エピトープ又はウイルスエピトープである、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１７１】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、ｐＭＨＣの抗原ペプチドが、ネオエピトープ、例えば、がんネオエピトープ又はがんネオアンチゲンである、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１７２】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、がん関連エピトープが、ウイルス誘発性がんと関連するウイルスエピトープである、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１７３】
さらに、本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、がん関連エピトープが、がんと関連する過剰発現抗原である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１７４】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、がん関連エピトープが、がん−精巣抗原である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１７５】
本発明のａＡＰＣスカフォールドは、ポリマー骨格に結合されたｐＭＨＣ分子によって提示され得る任意の抗原ペプチドと共に機能する。いくつかの効能が本発明で好ましい。
【０１７６】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、ウイルスエピトープが、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトＴリンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及びインフルエンザウイルスからなる群から選択されるウイルスである、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１７７】
ａＡＰＣスカフォールドが単一Ｔ細胞特異性を増殖できる精度に関して、各ａＡＰＣスカフォールドの効率を最適化するために、本発明の１つのバージョンでは、各ａＡＰＣスカフォールドは、例えば、各種類のａＡＰＣスカフォールドについて抗原ペプチド１つだけを意図的にローディングすることを意図して、ＭＨＣクラスＩ分子の単一変異体のみを有する。
【０１７８】
したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、ａＡＰＣスカフォールドが同一のＭＨＣクラスＩ分子を含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１７９】
各ａＡＰＣスカフォールドについて単一の抗原ペプチドのみを提示することによって、異なる特異性のＴ細胞間の競合は最小に限定される。必要に応じて、異なるペプチドを提示するいくつかの異なるスカフォールドをあわせてプールし同時に増殖させることができる。様々な異なる特異性を有するＴ細胞の同時増殖が可能である。なぜなら、Ｔ細胞間の競合が、互いに近接したすべてのテンプレート分子（すなわち、ｐＭＨＣ及びＴ細胞に影響を及ぼす分子）をクラスタ化するａＡＰＣスカフォールドのために最小に保たれるからである。したがって、本発明のａＡＰＣスカフォールドの使用により増殖されるＴ細胞は、特異性を保持し、異なる特異性のプールは、対象に再導入された場合、任意の免疫応答の幅を保証する。この後者の特性は、免疫回避変異体を回避するために臨床上重要である。応答の幅は、どれほど多くの異なるａＡＰＣスカフォールドが単一の増殖であわせてプールされるかを決定することによって調整することができる。
【０１８０】
ポリマー骨格は、ポリマー骨格のサイズに照らして妥当である任意の数のＭＨＣクラスＩ分子を含み得る。したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、各ポリマー骨格が、少なくとも５つのＭＨＣクラスＩ分子、例えば、少なくとも８、例えば、少なくとも１０、例えば、少なくとも２０、例えば、少なくとも３０、例えば、少なくとも４０、例えば、少なくとも５０又は例えば、少なくとも１００のＭＨＣクラスＩ分子を含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１８１】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、各ポリマー骨格が、少なくとも２つのＭＨＣクラスＩ分子、例えば、少なくとも３つ又は例えば、少なくとも４つのＭＨＣクラスＩ分子を含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１８２】
一部の用途に関して、ａＡＰＣスカフォールドを、固体支持体、ｅ．例えば、ある特定の種類の分析用、又は増殖Ｔ細胞集団からのａＡＰＣスカフォールドの分離用の固体支持体上に固定化することが実際的であり得る。したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、前記ａＡＰＣスカフォールドを固体支持体上に固定化する、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１８３】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなテンプレート分子を直接結合させる固体支持体に関する。したがって、この特別な場合では、テンプレート分子はａＡＰＣスカフォールドのポリマー骨格上に配置されない。
【０１８４】
固体支持体の多くの変形が存在し、ａＡＰＣスカフォールドの用途に応じて選択することができる。固体支持体の変形としては、限定されるものではないが、ビーズ、ウェルプレート、粒子、フィルター、ゲル、チューブ、及びペトリ皿が挙げられる。
【０１８５】
したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、固体支持体が、ビーズ、ウェルプレート、粒子、フィルター、ゲル、チューブ、及びペトリ皿からなる群から選択される、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１８６】
ａＡＰＣスカフォールドは、任意の従来型手段、例えば、リンカー、抗体等によって固体支持体に結合させることができる。
【０１８７】
多くの異なるテンプレート分子が存在し、したがって、多様なａＡＰＣスカフォールドをアセンブリングすることができる。本発明者らは、テンプレート分子のある特定の組み合わせが、特に効率的かつ好ましいａＡＰＣスカフォールドをもたらすことを見出した。
【０１８８】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、
ｉ．ポリマー骨格がデキストランであり、
ｉｉ．γ鎖受容体サイトカインがＩＬ−１５及びＩＬ−２１であり、
ｉｉｉ．共刺激分子がＢ７．２（ＣＤ８６）である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１８９】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、デキストラン骨格上のＭＨＣクラスＩ分子、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１及びＢ７．２（ＣＤ８６）間の比が２：１：１：１である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１９０】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、デキストラン骨格、ＭＨＣクラスＩ分子、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１及びＢ７．２（ＣＤ８６）間の比が１：１０：５：５：５である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１９１】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、γ鎖受容体サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１９２】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、
ｉ．ポリマー骨格がデキストランであり、そして
ｉｉ．γ鎖受容体サイトカインがＩＬ−２１、ＩＬ−２及びＩＬ−１５である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１９３】
本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、デキストラン骨格、ＭＨＣクラスＩ分子、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の間の比が１：１０：５：５：５であるａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１９４】
本発明のさらに別の実施形態が、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、
ｉ．ポリマー骨格がデキストランであり、
ｉｉ．γ鎖受容体サイトカインがＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１であり、そして
ｉｉｉ．共刺激分子がＢ７．２（ＣＤ８６）である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１９５】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、デキストラン骨格、ＭＨＣクラスＩ分子、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１及びＢ７．２（ＣＤ８６）間の比が１：１０：５：５：５：５である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１９６】
本発明の好ましい実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、
ｉ．ポリマー骨格がデキストランであり、そして
ｉｉ．γ鎖受容体サイトカインが、ＩＬ−２及びＩＬ−２１、又はＩＬ−１５及びＩＬ−２１である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１９７】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、サイトカインが少なくともＩＬ−６及びＩＬ−１０を含むａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１９８】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、
ｉ．ポリマー骨格がデキストランであり、
ｉｉ．共刺激分子がＢ７．２（ＣＤ８６）であり、
ｉｉｉ．サイトカインがＩＬ−６及びＩＬ−１０である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０１９９】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、デキストラン骨格上のＭＨＣクラスＩ分子、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＢ７．２（ＣＤ８６）間の比が２：１：１：１である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０２００】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、デキストラン骨格、ＭＨＣクラスＩ分子、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＢ７．２（ＣＤ８６）間の比が１：１０：５：５：５である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０２０１】
本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、γ鎖受容体サイトカインが少なくともＩＬ−２及びＩＬ−２１を含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０２０２】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、
ｉ．ポリマー骨格がデキストランであり、
ｉｉ．γ鎖受容体サイトカインがＩＬ−２及びＩＬ−２１である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０２０３】
本発明のさらに別の実施形態が、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、デキストラン骨格上のＭＨＣクラスＩ分子、ＩＬ−２及びＩＬ−２１間の比が１：１：１である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０２０４】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、共刺激分子が少なくともＢ７．２（ＣＤ８６）を含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０２０５】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、デキストラン骨格、ＭＨＣクラスＩ分子、ＩＬ−２及びＩＬ−２１間の比が１：８：８：８である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０２０６】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、ポリマー骨格が少なくともＩＬ−１及びＰＤ−Ｌ１を含む、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０２０７】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、
ｉ．ポリマー骨格がデキストランであり、
ｉｉ．共刺激分子がＢ７．２（ＣＤ８６）及びＰＤ−Ｌ１であり、
ｉｉｉ．サイトカインがＩＬ−１である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０２０８】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、デキストラン骨格上のＭＨＣクラスＩ分子、ＩＬ−１、Ｂ７．２（ＣＤ８６）及びＰＤ−Ｌ１間の比が２：１：１：１である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０２０９】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、デキストラン骨格、ＭＨＣクラスＩ分子、ＩＬ−１、Ｂ７．２（ＣＤ８６）及びＰＤ−Ｌ１間の比が１：１０：５：５：５である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０２１０】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、
ｉ．ポリマー骨格がデキストランであり、
ｉｉ．共刺激分子がＢ７．２（ＣＤ８６）及びＩＣＯＳであり、
ｉｉｉ．サイトカインがＩＬ−１０である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０２１１】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、
ｉ．ポリマー骨格がデキストランであり、
ｉｉ．サイトカインがＩＬ−１及びＩＬ−２である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０２１２】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドであって、
ｉ．ポリマー骨格がデキストランであり、
ｉｉ．サイトカインがＩＬ−２及びＩＬ−１５である、ａＡＰＣスカフォールドに関する。
【０２１３】
本発明のａＡＰＣスカフォールドは、病院や研究所による使用に適したキットの一部であり得る。そのようなキットは、異なる特異性を有するＴ細胞を増殖させるために適した１つ以上の異なるａＡＰＣスカフォールド、並びにサンプルから抽出されたＴ細胞を増殖させるために適した培地を含み得る。キットはまた、Ｔ細胞含有サンプルの増殖に必要な他の化合物又は分子を保持してもよい。
【０２１４】
したがって、本発明の態様は、Ｔ細胞の増殖用キットであって：
ｉ．本明細書中に記載する少なくとも１つのａＡＰＣスカフォールドを含む第一保存手段、及び
ｉｉ．少なくとも１つ抗原ペプチドの第二保存手段
を含み、
第一保存手段及び第二保存手段の内容物が組み合わされるように構成される、キットに関する。
【０２１５】
本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなキットであって、第二保存手段が抗原ペプチドのライブラリを含む、キットに関する。抗原ペプチドのライブラリは、最も頻繁に使用される抗原ペプチドの選択を含み得る。
【０２１６】
本発明のａＡＰＣスカフォールドは、対象の免疫系を補助するために対象に直接投与するための免疫療法として使用することができる。ａＡＰＣは、任意の経路、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮又は経口により局所的又は全身的のいずれかで投与することができる。
【０２１７】
本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドは、Ｔ細胞増殖及び／又は養子Ｔ細胞（ＡＣＴ）療法のために自動システムの一部として利用することができる。したがって、ａＡＰＣスカフォールドは、例えば、臨床用途用のＴ細胞の製造のための、装置又はシステムの構成要素であり得る。したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドを含むＴ細胞増殖及び／又は養子Ｔ細胞（ＡＣＴ）療法用の装置又はシステムに関する。ａＡＰＣスカフォールドは、蛍光活性化細胞分類又は類似の細胞選択方略の様々な形態との組み合わせでの細胞製造のために使用することができる。
【０２１８】
Ｔ細胞増殖の方法
不健康な対象から免疫反応性Ｔ細胞を抽出し、Ｔ細胞をエクスビボで増殖させ、そして増殖Ｔ細胞集団を対象に再導入することによって、そうしなければ免疫型が麻痺してしまう免疫抑制疾患の課題の一部を克服することが可能である。しかしながら、例えば、末梢血からアフェレーシス処置によってＴ細胞を抽出し、その後、患者に再導入することは問題ないが、所与の特異性のＴ細胞の活性化及び増殖は依然として大きな課題であり、多くの場合、結果として得られるＴ細胞集団は充分な分化及び機能的能力が欠落している。
【０２１９】
本発明のａＡＰＣスカフォールドは、Ｔ細胞の同時インビトロ刺激及び増殖に好適であり、高い比率の活性なＴ細胞、高い抗原特異性のＴ細胞及び高機能性のＴ細胞を有するＴ細胞集団を産生する。したがって、本発明の別の態様は、Ｔ細胞の同時インビトロ刺激及び増殖のための方法であって、以下のステップ：
ｉ．Ｔ細胞を含むサンプルを提供するステップと、
ｉｉ．前記サンプルを、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドを含む増殖溶液と接触させるステップと、
ｉｉｉ．前記ａＡＰＣスカフォールドに対する特異性を有するＴ細胞を刺激し増殖させるステップと、
ｉｖ．培養からステップｉｉｉ）のＴ細胞を収集して、Ｔ細胞の増殖抗原特異性集団を得るステップと、
を含む方法に関する。
【０２２０】
本発明の実施形態は、Ｔ細胞の同時インビトロ刺激及び増殖のための方法であって、以下のステップ：
ｉ．本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドを提供するステップであって、ＭＨＣクラスＩ分子が抗原ペプチドを含まないペプチド結合グルーブを含む、ステップと、
ｉｉ．前記ａＡＰＣスカフォールドを抗原ペプチドと混合して、ｐＭＨＣ分子を含むロードされたａＡＰＣスカフォールドを提供するステップと、
ｉｉｉ．Ｔ細胞を含むサンプルを提供するステップと、
ｉｖ．前記サンプルをステップｉｉ）のロードされたａＡＰＣスカフォールドと接触させるステップと、
ｖ．培養中の前記ロードされたａＡＰＣスカフォールドに対する特異性を有するＴ細胞を刺激し増殖させるステップと、
ｖｉ．ステップｉｉｉ）のＴ細胞を培養から収集して、Ｔ細胞の増殖抗原特異性集団を得るステップと、
を含む方法に関する。
【０２２１】
Ｔ細胞を含むサンプルを対象から抽出し、続いて、Ｔ細胞の成長を可能にする条件下で、ａＡＰＣスカフォールドを含む培養中に入れる。したがって、Ｔ細胞の増殖は、ａＡＰＣスカフォールドに加えて、細胞増殖に必要な化合物及び因子をすべて含む溶液又は培地中で実施されると理解すべきである。したがって、Ｔ細胞増殖が実施される培養は、無関係な細胞の成長を阻害するか、又はＴ細胞、例えば、ＩＬ−２の成長を促進する化合物を含み得る。
【０２２２】
増殖Ｔ細胞集団の質を向上させるために、ａＡＰＣスカフォールドを、分子量カットオフフィルターを通した遠心分離によってろ過して、結合していないｐＭＨＣ分子をすべて除去した後、ａＡＰＣをサンプルと混合することができる。これは、スカフォールドと結合しないｐＭＨＣ分子からの刺激を回避し、また過剰の抗原ペプチド及びＴ細胞に影響を及ぼす分子を除去して、無関係のＴ細胞サブセットの刺激を制限することができる。同じことが、ＭＨＣ分子と複合体化していない抗原ペプチドにも当てはまり、これもまた、分子量カットオフフィルターを通した遠心分離によって除去することができる。
【０２２３】
したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するような方法であって、増殖溶液をろ過した後にサンプルと接触させる、方法に関する。
【０２２４】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するような方法であって、増殖溶液を、分子量カットオフフィルターを通した遠心分離によりろ過する、方法に関する。
【０２２５】
ａＡＰＣ本発明のスカフォールドの利点は、それらが異なるＴ細胞特異性の同時増殖を可能にすることである。なぜなら、複数の異なるａＡＰＣスカフォールドを使用した場合に交差反応性が前記説明した最小値まで低減されるからである。本発明の方法は、したがって、異なる特異性を有する様々なＴ細胞を含むサンプルについても有効である。
【０２２６】
したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するような方法であって、ステップｉ）の前記サンプルが、少なくとも２つの異なる特異性、例えば、少なくとも５つの異なる特異性、例えば、少なくとも１０の異なる特異性、例えば、少なくとも１５の異なる特異性、例えば、少なくとも２０の異なる特異性、又は例えば、少なくとも５０の異なる特異性のＴ細胞を含む方法に関する。
【０２２７】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するような方法であって、ａＡＰＣスカフォールドを含む前記溶液が、少なくとも２つの異なるａＡＰＣスカフォールド、例えば、少なくとも５つの異なるａＡＰＣスカフォールド、例えば、少なくとも１０の異なるａＡＰＣスカフォールド、例えば、少なくとも１５の異なるａＡＰＣスカフォールド、例えば、少なくとも２０の異なるａＡＰＣスカフォールド、又は例えば、少なくとも２０の異なるａＡＰＣスカフォールドを含む方法に関する。
【０２２８】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書中で記載するような方法であって、少なくとも２つの異なる特異性のＴ細胞が、例えば、少なくとも５つの異なる特異性、例えば、少なくとも１０の異なる特異性、例えば、少なくとも１５の異なる特異性、又は例えば少なくとも２０の異なる特異性を有する同じサンプル中で、並行して刺激し増殖される、方法に関する。
【０２２９】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するような方法であって、以下のステップ：
ｉ．少なくとも５つの異なる特異性を有するＴ細胞を含むサンプルを提供するステップと、
ｉｉ．前記サンプルを、少なくとも５つの異なるａＡＰＣスカフォールドを含む増殖溶液と接触させるステップと、
ｉｉｉ．培養中の前記少なくとも５つの異なるａＡＰＣスカフォールドに対して少なくとも５つの異なる特異性を有する前記Ｔ細胞の平行刺激及び増殖のステップと、
ｉｖ．ステップｉｉｉ）のＴ細胞を培養から収集して、少なくとも５つの異なる特異性を有するＴ細胞の増殖抗原特異性集団を得るステップと、
を含む、方法に関する。
【０２３０】
増殖させるＴ細胞を含むサンプルは、任意の供給源に由来し得るが、典型的には、血液、組織又は体液から抽出される。したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するような方法であって、サンプルが、末梢血単核細胞、腫瘍、組織、骨髄、バイオプシー、血清、血液、血漿、唾液、リンパ液、胸膜液、脳脊髄液（ｃｅｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）及び滑液からなる群から選択される、方法に関する。
【０２３１】
本明細書中で記載する方法にしたがって増殖されるＴ細胞を含むサンプルはまた、幹細胞又は、ＴＣＲ修飾／形質導入細胞から選択することもできる。
【０２３２】
本発明の方法を使用して、ａＡＰＣスカフォールド上のｐＭＨＣ分子との相互作用に必要なＴＣＲを発現する任意のＴ細胞を増殖することができる。したがって、本発明の方法による増殖に適したＴ細胞としては、限定されるものではないが、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、α−ベータＴ細胞、ガンマ−デルタＴ細胞、ＮＫ細胞、先天性粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、及びリンホカイン−活性化キラー（ＬＡＫ）細胞が挙げられる。
【０２３３】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子療法は、腫瘍反応性Ｔ細胞の事前の存在に依存せず、最適な所定のがん抗原ペプチドを標的とすることを可能にする。このアプローチは、一緒になってαβ−ＴＣＲヘテロダイマーを形成するＴＣＲα−及びβ鎖をコードする遺伝子を導入することにより、抗原特異性をＴ細胞間で輸送することができるという観察結果に基づく。したがって、腫瘍反応性ＴＣＲをコードする遺伝子の導入を使用して、関心対象の抗原に対して患者由来の細胞（自己）又は非患者由来の（異種）細胞を向けなおし、それによって、さもなければ存在しない腫瘍反応性Ｔ細胞区画を確立することができる。今では、いくつかのＴＣＲ光学的治療アプローチは固形腫瘍において臨床活性を示している。これらのＴＣＲ治療アプローチのほとんどは、ＴＣＲ形質導入細胞のエクスビボ増殖に依存する。これらの細胞は、自己又は異種Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＭＡＩＴ細胞又はＮＫＴ細胞であり得る。がん特異的ＴＣＲ遺伝子は細胞に形質導入されるので、これらはＴＣＲの以前からの存在に依存せず、したがって、必ずしもＴ細胞である必要はない。
【０２３４】
したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するような方法であって、Ｔ細胞が、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ガンマ−デルタＴ細胞、ＮＫ細胞及び自然粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞からなる群から選択される、方法に関する。
【０２３５】
本発明の好ましい実施形態は、本明細書中で記載するような方法であって、Ｔ細胞がＣＤ８Ｔ細胞である方法に関する。
【０２３６】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書中で記載するような方法であって、Ｔ細胞がＣＡＲ  Ｔ細胞である方法に関する。
【０２３７】
増殖Ｔ細胞集団の患者への再導入が治療学的展望から有意義であるためには、抽出されたＴ細胞が臨床的に関連する数まで増殖されることが必要である。本発明の方法によるＴ細胞の増殖は１００〜３０００倍程度であり得る。患者への再導入前に利用可能な細胞の数は、投与あたり１０５〜１０１２細胞、例えば、投与当たり１０５〜１０１０細胞、例えば、投与当たり１０６〜１０９細胞の範囲であり得る。細胞は、投与経路に応じて２０ｍＬ〜１Ｌの体積で投与される。
【０２３８】
したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するような方法であって、Ｔ細胞を臨床的に関連する数まで増殖させる方法に関する。
【０２３９】
ａＡＰＣスカフォールドについて上述したように、ＭＨＣクラスＩ分子は様々な抗原ペプチドを提示し得る。抗原ペプチドの選択に関してと同じことが方法にも当てはまる。したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するような方法であって、ｐＭＨＣの抗原ペプチドががん関連エピトープ又はウイルスエピトープである方法に関する。
【０２４０】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するような方法であって、抗原ペプチドが、がん関連エピトープ又はウイルスエピトープを含む方法に関する。
【０２４１】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するような方法であって、がん関連エピトープがウイルスで誘発されたがんに関連するウイルスエピトープである、方法に関する。
【０２４２】
本発明のさらに別の実施形態は、記載するような方法であって、ウイルスエピトープが、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトＴリンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及びインフルエンザウイルスからなる群から選択されるウイルス由来である方法に関する。
【０２４３】
増殖Ｔ細胞集団の使用
本発明の方法によって得られる増殖Ｔ細胞集団は、養子免疫療法（又は養子細胞移入）に重点をおいた治療計画において効果的に使用できることが想定される。そのような治療計画では、治療を必要とする対象由来の免疫反応性Ｔ細胞が抽出される。対象は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、トリ、イヌ、ネコ、マウス、ラットなどであり得る。Ｔ細胞源は、例えば、末梢血単核細胞、腫瘍、組織、骨髄、バイオプシー、血清、血液、血漿、唾液、リンパ液、胸膜液、脳脊髄液又は滑液であり得る。
【０２４４】
一旦対象から抽出したら、所望の特異性又は特異性のＴ細胞を含むサンプルを、対象や治療される状態又は疾患にあわせてカスタマイズされたａＡＰＣスカフォールドを使用して増殖させる。この増殖は、上述するような本発明の方法にしたがって実施される。Ｔ細胞集団が臨床的に関連する数まで増殖されたら、対象に投与して、免疫応答を誘導し、疾患を治療する。
【０２４５】
その結果として、本発明の態様は、本明細書中で記載するような方法によって得られる増殖Ｔ細胞集団に関する。
【０２４６】
本明細書中で開示されるａＡＰＣスカフォールドで増殖されたＴ細胞集団は、いくつかの好ましい特性、例えば、高フラクションの抗原特異的細胞、マルチサイトカイン分泌プロフィール、若年表現型及び低消耗（ｌｅｓｓ  ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）を有する。マルチサイトカイン分泌プロフィールは、ＩＮＦ−γ及びＴＮＦ−αの同時分泌、並びに細胞毒性脱顆粒によって特徴づけることができる。若年表現型は、高発現のアクチベータ、例えばＣＤ２８によって特徴づけることができる。減少した消耗は、低発現の阻害剤、例えばＰＤ１によって特徴づけることができる。したがって、本発明の実施形態は、本明細書中で記載するような方法によって得られる増殖Ｔ細胞集団であって、増殖Ｔ細胞集団が：
ｉ．培養の２週間後の抗原特異的Ｔ細胞が少なくとも１０倍増殖される、
ｉｉ．後の抗原チャレンジに際してのＩＮＦ−γ及びＴＮＦ−αの分泌、
ｉｉｉ．高発現のＣＤ２８、及び
ｉｖ．低発現のＰＤ１
からなる群から選択される、少なくとも１つ、例えば、少なくとも２つ、例えば、少なくとも３つの特性を有する、増殖Ｔ細胞集団に関する。
【０２４７】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するような方法によって得られる増殖Ｔ細胞集団であって、増殖Ｔ細胞集団が以下の特性：
ｉ．培養の２週間後の抗原特異的Ｔ細胞が少なくとも１０倍増殖させる、及び
ｉｉ．後の抗原チャレンジに際してのＩＮＦ−γ及びＴＮＦ−αの分泌
を含む、増殖Ｔ細胞集団に関する。
【０２４８】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するような方法によって得られる増殖Ｔ細胞集団であって、増殖Ｔ細胞集団が以下の特性：
ｉ．培養の２週間後の抗原特異的Ｔ細胞が少なくとも１０倍増殖される、
ｉｉ．後の抗原チャレンジに際してのＩＮＦ−γ及びＴＮＦ−αの分泌
ｉｉｉ．ＣＤ２８の高発現、及び
ｉｖ．ＰＤ１の低発現
を含む、増殖Ｔ細胞集団に関する。
【０２４９】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するような方法によって得られる増殖Ｔ細胞集団であって、培養の２週間後の抗原特異的Ｔ細胞が、少なくとも１０倍、例えば、少なくとも２５倍、例えば、少なくとも５０倍、例えば、少なくとも１００倍、例えば、少なくとも１０００倍、例えば、少なくとも５０００倍増殖される、Ｔ細胞集団に関する。
【０２５０】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書中で記載するような方法によって得られる増殖Ｔ細胞集団であって、培養の２週間後の抗原特異的Ｔ細胞が、１０倍〜５０００倍、例えば１００倍〜１０００倍の範囲で増殖する、増殖Ｔ細胞集団に関する。
【０２５１】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載するような方法によって得られる増殖Ｔ細胞集団であって、ＣＤ２８の高発現が、サンプル中の非増殖非特異的Ｔ細胞のＣＤ２８発現と比較して、ＣＤ２８の増大した発現の少なくとも２倍、例えば、増大した発現の少なくとも５倍、例えば、増大した発現の少なくとも１０倍と定義される、増殖Ｔ細胞集団に関する。
【０２５２】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するような方法によって得られる増殖Ｔ細胞集団であって、ＰＤ１の低発現が、サンプル中の増殖されていない非特異的Ｔ細胞と比較して、最大でＰＤ１の発現の半分（５０％）、例えば最大で発現の１／４（２５％）、例えば最大で発現の１／１０（１０％）と定義される、増殖Ｔ細胞集団に関する。
【０２５３】
本発明の第四の態様は、薬剤として使用するための、本明細書中で記載するような方法によって得られる増殖Ｔ細胞集団に関する。
【０２５４】
さらに具体的には、本発明の実施形態は、疾患又は障害の養子免疫療法のための方法であって
ｉ．対象からＴ細胞を含むサンプルを抽出し、
ｉｉ．前記サンプルを、本明細書中で記載するようなａＡＰＣスカフォールドを含む増殖溶液と接触させ、
ｉｉｉ．培養において、前記ａＡＰＣスカフォールドに対して特異性を有するＴ細胞を刺激し増殖させ、
ｉｖ．ステップｉｉｉ）のＴ細胞を培養物から収集して、Ｔ細胞の増殖抗原特異性集団を得、そして
ｖ．Ｔ細胞の増殖抗原特異性集団を対象に対して、免疫応答を誘導するために有効な量で投与する
ことを含む方法に関する。
【０２５５】
ａＡＰＣスカフォールドについて上述したように、ＭＨＣクラスＩ分子は、様々な抗原ペプチドを提示することができる。抗原ペプチドの選択に関して同じ検討事項が、本発明の方法によって得られる増殖Ｔ細胞集団の使用について当てはまる。
【０２５６】
したがって、本発明の別の態様は、がん又はウイルス性疾患の治療で使用するための、本明細書中で記載するような方法によって得られる増殖Ｔ細胞集団に関する。
【０２５７】
本発明の実施形態は、本明細書中で記載するような使用のための増殖Ｔ細胞集団であって、がんが、ウイルス性疾患と関連する、増殖Ｔ細胞集団に関する。
【０２５８】
本発明の別の実施形態は、本明細書中で記載するような使用のための増殖Ｔ細胞集団であって、ウイルス性疾患が、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトＴリンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及びインフルエンザウイルスからなる群から選択されるウイルスと関連する、増殖Ｔ細胞集団に関する。
【０２５９】
本明細書中で記載するような方法によって得られる増殖Ｔ細胞集団は、１つ以上のアジュバント及び／又は賦形剤及び／又は薬剤的に許容される担体をさらに含む医薬組成物に処方することができる。賦形剤としては、限定されるものではないが、緩衝液、懸濁化剤、分散剤、可溶化剤、ｐＨ調節剤及び／又は防腐剤を挙げることができる。
【０２６０】
医薬組成物は、任意の経路、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮又は経口により局所的又は全身的のいずれかでの投与のために、養子免疫療法（又は養子細胞移入）で使用することができる。
【０２６１】
本発明の態様のうちの一つの文脈で記載される実施形態及び特徴は、本発明の他の態様にも当てはまることに留意されたい。
【０２６２】
本願で引用するすべての特許及び非特許文献は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０２６３】
本発明を以下の非限定的実施例でさらに詳細に説明する。
【実施例】
【０２６４】
実施例１：抗原提示スカフォールドを使用した抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖（図２）
健常なドナーからのＨＬＡ−Ａ１  ＦＬＵ  ＢＰ−ＶＳＤ（ＶＳＤＧＧＰＮＬＹ（配列番号２９））特異的ＣＤ８Ｔ細胞を、比１：１０：５：５：５（スカフォールド：ｐＭＨＣ：Ｂ７−２：ＩＬ−１５：ＩＬ−２１）の抗原提示スカフォールド、遊離ＦＬＵ  ＢＰ−ＶＳＤペプチド（配列番号２９）、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１サイトカイン、又はＭＨＣ複合体において無関係ペプチド特異性を有する比１：１０：５：５：５の抗原提示スカフォールドのいずれかの存在下で平行して増殖させた。ａＡＰＣスカフォールドは、野生型ＭＨＣを用いて調製した。すべての培養には、２０ＩＵ／ＭＬのＩＬ−２を追加し、２週間培養した。ＨＬＡ−Ａ１  ＦＬＵ  ＢＰ−ＶＳＤ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖を週に１回テトラマー染色により追跡した。代表的なドットプロットを図２に示す。
【０２６５】
結論：（図２Ａ〜Ｄ）この実験は、抗原提示スカフォールドを用いてｐＭＨＣ指向的方法で低頻度ベースライン応答を伴って抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞を増殖させることが可能であることを示す。培養培地中に自由に添加したペプチド、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１で刺激された細胞、及び抗原提示スカフォールドで刺激された細胞の増殖を比較した場合、抗原提示スカフォールドで刺激された細胞が特異的ＣＤ８Ｔ細胞の頻度及び絶対数の両方で最も増殖したことは明らかである（図２Ｅ〜Ｆを参照）。さらに、無関係ペプチドＭＨＣ特異性を有する抗原提示スカフォールドは、Ａ１  ＦＬＵ  ＢＰ−ＶＳＤ特異的ＣＤ８Ｔ細胞増殖を刺激することができず、このことは、細胞が、確立されたｐＭＨＣ指向性相互作用なしで、共結合した（ｃｏ−ａｔｔａｃｈｅｄ）サイトカイン及び共刺激分子から恩恵を受けることができないことを示す。
【０２６６】
実施例２：Ｃｙｓ−変異ＭＨＣ（抗原／ペプチド受容的）の産生及び特異的Ｔ細胞増殖のための人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）スカフォールドのアセンブリ
ＭＨＣ複合体及びＴ細胞に影響を及ぼす分子、例えば、サイトカイン及び刺激分子を、デキストランにストレプトアビジン−ビオチン相互作用を介してカップリングさせることによってａＡＰＣスカフォールドを作製する方法をここで記載する。この実施例では、ＭＨＣ並びにジスルフィド安定化Ｃｙｓ−変異ＭＨＣの両方を調製し、ａＡＰＣスカフォールドのアセンブリのために使用した。原則として、ビオチン−ストレプトアビジンを任意の二量化ドメインで置換することができ、二量化ドメインの半分をＭＨＣ複合体又はＴ細胞に影響を及ぼす分子にカップリングさせ、そして残りの半分をデキストラン又は類似のスカフォールド骨格にカップリングさせる。
【０２６７】
ストレプトアビジン修飾デキストランは、様々なデキストランサイズ、例えば、ＭＷ２５０ＫＤａ、７５０ＫＤａ、２０００ＫＤａでＦｉｎａ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓから、及びＩｍｍｕｄｅｘから約２７０ＫＤａのデキストランで市販されている。
【０２６８】
ｗｔ  ＭＨＣ及びＣｙｓ−変異ＭＨＣの両方を、ここでは、それぞれ、Ａｖｉ−ｔａｇ（配列番号１７）を有するｗｔ  ＨＬＡ−Ａ  ０２：０１の重鎖と、Ａｖｉ−ｔａｇ（配列番号１４）を有するＣｙｓ−変異ＨＬＡ−Ａ  ０２：０１の重鎖を用いて例示される、古典的Ｅ．Ｃｏｌｉ発現により産生した。簡単に説明すると、ｗｔ  ＭＨＣ及びＭＨＣ  Ｃｙｓ−変異タンパク質の両方並びに軽鎖ベータ−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）タンパク質を、ｐＥＴシリーズプラスミドを用いてＥ．ｃｏｌｉにおいて産生した。Ｅ．ｃｏｌｉ産生タンパク質を含む封入体を、超音波処理、溶解緩衝液（Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５％スクロース）中でＥ．ｃｏｌｉ細胞を溶解させることによって収集した。変性タンパク質の可溶性フラクションを、封入体から、界面活性剤緩衝液（Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ２０ｍＭ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＮＰ４０  １％、デオキシコール酸１％）、及び洗浄緩衝液（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で洗浄することによって収集し、続いて再可溶化緩衝液（ＨＥＰＥＳ  ５０ｍＭ、ｐＨ６．５、８Ｍ尿素、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール）中、４℃で４８時間インキュベーションし、ＭＨＣクラスＩモノマー産生に使用するまで−８０℃で保存した。
【０２６９】
Ｃｙｓ−変異ＭＨＣモノマーは、例えば、ジペプチド／トリペプチド／小分子などのヘルパー分子の存在下で、Ｃｙｓ−変異ＭＨＣタンパク質及びＢ２Ｍのインビトロフォールディング（フォールディング緩衝液：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、４００ｍＭ  Ｌ−アルギニン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル）によって作製した。ヘルパー分子が含まれていないことを除いてＣｙｓ−変異ＭＨＣモノマーのようにｗｔ  ＭＨＣを作製した。その代わり、ｗｔ  ＭＨＣ分子をＵＶレイビルペプチドＫＩＬＧＦＶＦ−Ｘ−Ｖ（配列番号２４）の存在下でリフォールディングし、ここで、Ｘは、紫外線に対して感受性のアミノ酸である３−アミノ−２−（２−ニトロフェニル）プロピオン酸を指し、これは、ＵＶ光に曝露されると完全長ペプチドを切断する。結果として得られる切断されたペプチドフラグメントのＭＨＣ分子に対する低減した結合アフィニティによって、次期（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）交換抗原ペプチドの結合が可能となる。
【０２７０】
ＭＨＣモノマーを従来型サイズ排除クロマトグラフィによって精製した。あるいは、他の標準的タンパク質精製方法を使用することができる。サイズ排除クロマトグラフィによるＣｙｓ−変異ＭＨＣモノマーの精製は、ＭＨＣモノマー安定化ヘルパー分子、例えば、ジペプチドグリシン−ロイシンの有無を問わず、緩衝液を用いて実施することができる。
【０２７１】
抗原ペプチド（空ＭＨＣモノマー）のない、そのような産生された安定なＣｙｓ−変異ＭＨＣモノマーは、様々な研究、診断及び治療的使用のための多数の抗原ペプチドロードＭＨＣモノマーの迅速な生成のために非常に有用である。抗原ペプチドロードＣｙｓ−変異ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）モノマーは、１００μＭのペプチドを２００μｇ／ｍＬのＣｙｓ−変異空ＭＨＣモノマーと共に３０〜６０分間、室温にてインキュベートすることによって調製することができる。Ｗｔ  ｐＭＨＣは、最適の２００μＭの抗原−ペプチドを含め、その後、モノマーを３６０ｎｍのＵＶ光に１時間曝露することによって、ＵＶレイビルペプチドを含むＭＨＣモノマーから産生することができる。
【０２７２】
ｐＭＨＣ及びＴ細胞に影響を及ぼす分子、例えば、サイトカイン及び共刺激分子は、標準的な化学的及び酵素的プロトコルの両方によってビオチン化することができる。例えば、ｐＭＨＣは、ビオチン化コンセンサスペプチド配列をＭＨＣ重鎖中に含め、ＢｉｒＡ酵素及び遊離ビオチンを使用する部位特異的ビオチン化を可能にすることによって、酵素的にビオチン化することができる。サイトカイン及び共刺激分子は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ及びＰｒｅＰｒｏｔｅｃｈなどの供給業者から市販されている。これらのタンパク質は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンなどの市販のビオチン化試薬を使用し、供給業者のプロトコルにしたがって反応させることにより、容易にビオチン化される。
【０２７３】
本明細書中で記載する実施例において、ａＡＰＣスカフォールドをストレプトアビジン−ビオチン相互作用を介してアセンブリングした。簡単に説明すると、デキストランによって結合したビオチン化分子及びストレプトアビジンを、以下に記載する実施例にしたがって、相対的化学量論で、ＰＢＳなどの水性緩衝液中で組み合わせて、最終濃度６０ｎＭのアセンブリングされたａＡＰＣスカフォールドを得た。ａＡＰＣスカフォールドを４℃で１時間アセンブリングさせ、その後、細胞培養に添加するまで４℃に保持した。アセンブリングされたスカフォールドは４℃で少なくとも１か月保存することができる。結合していない抗原ペプチド、ｐＭＨＣ、サイトカイン及び共刺激分子から、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルターユニットＵｌｔｒａ−４、ＭＷＣＯ  １００ｋＤａなどのＭＷカットオフフィルターを通して結合していない分子を遠心分離することによって、アセンブリングされたａＡＰＣスカフォールドを精製することができ分離することができる。
【０２７４】
Ｔ細胞培養を、ヒトＰＢＭＣ又はＴＩＬから確立させ、４８ウェル平底培養皿中、２×１０６細胞／ｍｌでイニシエートさせ、３７℃及び５％ＣＯ２で２週間培養した。５％熱不活化ヒト血清を追加した１ｍＬの新鮮なＸ−ＶＩＶＯ１５培地中０．２ｎＭの最終濃度のａＡＰＣスカフォールドを添加することによって細胞を週に２回刺激した。１週間培養した後、細胞を２４ウェル平底培養皿に移し、ＭＨＣテトラマー染色のために培養からサンプルを週に１回採取して、フローサイトメトリーにより抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖を追跡した。
【０２７５】
実施例３：Ｃｙｓ−変異ＭＨＣモノマーを用いて調製したａＡＰＣスカフォールドを使用した抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖及び野生型ＭＨＣモノマーを用いて調製したａＡＰＣスカフォールドと比較してのそれらの機能評価（図３〜４）
【０２７６】
ここでは、ＦＬＵ  ５８−６６  ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号２０）及びＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号２１）に対してＣｙｓ−変異ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１モノマーを使用したａＡＰＣスカフォールドのアセンブリ並びにこれらのａＡＰＣスカフォールドを使用した健常なドナーＰＢＭＣからの特異的ＣＤ８Ｔ細胞増殖を記載する。野生型ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１モノマーから調製したａＡＰＣスカフォールドに関する比較的機能評価をする。データを図３及び４に示す。
【０２７７】
Ｃｙｓ−変異ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１モノマーを実施例２に記載するようにして調製した。簡単に説明すると、Ｃｙｓ−変異ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＤＮＡ配列（配列番号１４）を含む重鎖構築物及び野生型ヒトＢ２Ｍ（配列番号１５）構築物をＥ．Ｃｏｌｉ発現株ｐＬｙｓＳに形質転換して、これらのタンパク質を産生した。発現されたタンパク質を含む封入体を、溶解緩衝液中で超音波処理を使用する標準的手順によって収集し、続いて界面活性剤緩衝液、及び洗浄緩衝液中で洗浄し、タンパク質を尿素緩衝液中で４８時間、４℃にて可溶化して、タンパク質の変性された可溶性フラクションを集めた。同様の手順を行って、野生型ＨＬＡ−Ａ  ０２：０１の可溶性変性タンパク質を産生した。
【０２７８】
Ｃｙｓ−変異ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１の変性可溶性フラクションをフォールディングして、Ｃｙｓ−変異ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１のモノマーを産生した。Ｃｙｓ−変異ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１の重鎖タンパク質及びＢ２Ｍを、ジペプチドグリシン−ロイシン（ＧＬ）の存在下、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  １００ｍＭ、ｐＨ８．０、Ｌ−アルギニン４００ｍＭ、及びＥＤＴＡ  ２ｍＭを含むフォールディング緩衝液中、１：２のモル比で混合した。フォールディング後、モノマーを、Ａｖｉ−ｔａｇからのプロトコルにしたがって、３０℃で１時間のビオチン−タンパク質リガーゼ酵素反応を使用して、重鎖に組み入れたＡｖｉ−ｔａｇ配列でビオチン化した。Ｃｙｓ−変異ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１のこれらのビオチン化モノマーを、サイズ排除クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）により精製した。フォールディング反応はＨＬＡ−Ａ＊０２：０１特異的抗原ペプチドを含んでいなかったので、Ｃｙｓ−変異ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１モノマーは空であり、かつペプチド受容的である。精製後、Ｃｙｓ−変異ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１モノマーの品質評価をタンパク質濃度及びビオチン化について実施し、さらなる使用まで−８０℃で保存した。
【０２７９】
野生型ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１モノマーを、上述と類似のプロセスであるが、野生型ＭＨＣのフォールディング及び安定性に必須である、ＵＶレイビルＨＬＡ−Ａ＊０２：０１特異的ペプチド（配列番号２４）の存在下で調製した。したがって、精製されビオチン化された野生型ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１モノマーは常にこのペプチドに関連した形態である。
【０２８０】
ａＡＰＣスカフォールドをＦＬＵ  ５８−６６  ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号２０）又はＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号２１）に対して特異的なＣｙｓ−変異ＨＬＡ−Ａ０２：０１とアセンブリングするために、ＰＢＳ中で希釈した、各特異性の１００μＭペプチドを、１００μｇ／ｍＬ  Ｃｙｓ−変異ＨＬＡ−Ａ０２：０１モノマーと６０分間、ＰＢＳ中の２０μＬ反応物中に混合した。平行して、ＩＬ−２及びＩＬ−２１をデキストランスカフォールドと共に３０分間インキュベートすることによって、サイトカイン、ＩＬ−２及びＩＬ−２１をデキストランスカフォールド上で１：８：８のモル比にてアセンブリングした。これらのアセンブリングされたサイトカインデキストランスカフォールドに対して、抗原特異的Ｃｙｓ−変異ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１モノマーを１：８のモル比まで添加し、３０分間インキュベートして、骨格、ｐＭＨＣ、ＩＬ−２、ＩＬ−２１比が１：８：８：８の抗原提示スカフォールドを生成させた。スカフォールド上の任意の可能な遊離ストレプトアビジン部位を、２０μＭのＤ−ビオチンを添加し、２０分間インキュベートすることによってブロックした。
【０２８１】
野生型ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１モノマーはプレ結合ペプチドと結合していたので、ＦＬＵ  ５８−６６  ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号２０）又はＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号２１）に対して特異的な野生型ＨＬＡ−Ａ０２：０１を使用するａＡＰＣスカフォールドは、プレ結合ペプチドをＦＬＵ  ５８−６６  ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ又はＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ特異的ペプチドと交換するためにさらなるステップを必要とした。１００μｇ／ｍｌの野生型ＨＬＡ−Ａ＊０２：：０１モノマーをＰＢＳ中２００μＭの抗原ペプチドと混合して総体積２０μＬとし、ＵＶランプ（３６６ｎｍ）下で６０分間インキュベートして、プレ結合ＵＶレイビルペプチドの抗原特異的ペプチドとの交換を促進した。反応後、Ｃｙｓ−変異ａＡＰＣスカフォールドについて上述したように、野生型ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１モノマー及びサイトカインを１：８：８：８（骨格：ｐＭＨＣ：ＩＬ−２：ＩＬ−２１）のモル比で使用して、ａＡＰＣスカフォールドをアセンブリングした。スカフォールドをＴ細胞増殖のために使用するまで４℃で保存する。
【０２８２】
ＦＬＵ  ５８−６６  ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ及びＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬに対して特異的なＣｙｓ−変異及び野生型ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１分子を使用して調製したａＡＰＣスカフォールドを評価し比較するために、これらの２種類のスカフォールドを用いた平行培養を、各特異性に対応する２人の異なる健常ドナーからのＰＢＭＣを用いて確立させた。陽性特異性のスカフォールドとあわせて、無関係のペプチド（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＨＩＶ  Ｐｏｌ  ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ（配列番号２３））を用いて作成した陰性対照スカフォールドも含まれていた。すべてのａＡＰＣスカフォールドベースのＴ細胞増殖は、４８ウェル平底細胞培養プレートにおいて、５％ヒト血清を追加したＸ−ｖｉｖｏ培地中、特異性あたり２×１０６ＰＢＭＣを使用してイニシエートした。３μｌの各特異性のａＡＰＣスカフォールドを２日又は３日ごとに４回添加し、培養を２週間維持した。抗原特異的刺激によって誘導された細胞内サイトカイン染色を使用した増殖のために、１０サンプルを集めて試験した。各特異性の増殖させた細胞を、５％ヒト血清を追加したＸ−ｖｉｖｏ培地中、３００．０００細胞／１００μＬの細胞濃度で、５μＭの関連抗原ペプチドを負荷した。抗原ペプチドとともにインキュベーションした後、増殖させた細胞を洗浄し、まず、関連細胞表面抗体（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及び実効可能な染料）で染色し、続いて細胞透過処理緩衝液を使用したＴＮＦα（ＰＥ−Ｃｙ７）及びＩＦＮγ（ＡＰＣ）の細胞内染色を行った。細胞を固定し、フローサイトメータで分析した。
【０２８３】
本明細書中では、２つの抗原ペプチドを使用した実施例を示す。しかしながら、本発明は、抗原ペプチドの限定されたセットに限定されない。他の関連ペプチドとしては、限定されるものではないが、配列番号２５〜２８が挙げられる。
【０２８４】
結論：（図３及び４）この実験は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１タンパク質のＣｙｓ−変異変異体を使用してＦＬＵ５８−６６ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ抗原（図１）及びＥＢＶ  ＢＭＦ１ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（図２）抗原を提示する、ａＡＰＣスカフォールドを用いたｐＭＨＣ指向的方法で、低頻度ベースライン応答を伴って抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞を増殖することが可能であることを示す。この実施例は、迅速な産生のためのＣｙｓ−変異ＭＨＣ及び抗原−特異的Ｔ細胞の増殖のためのａＡＰＣスカフォールドの抗原多様化の使用が可能であることを示す。
【０２８５】
Ｃｙｓ−変異ＭＨＣ  ａＡＰＣスカフォールドを用いて増殖させたＣＤ８Ｔ細胞は、ＦＬＵ  ５８−６６  ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（図１）及びＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（図２）に対して抗原ペプチド特異的増殖ＣＤ８Ｔ細胞による細胞内サイトカイン（ＴＮＦα及びＩＦＮγ）放出によって示されるように、野生型ＭＨＣを用いて調製したａＡＰＣスカフォールドと機能的に匹敵することが判明した。機能的分析によってまた、無関係のペプチド特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖は観察されなかったので、Ｃｙｓ−変異ＭＨＣを有するａＡＰＣスカフォールドが抗原特異的細胞のみを増殖させることが確認される。
【０２８６】
実施例１では、ｗｔ  ＭＨＣ分子を用いて調製されたａＡＰＣスカフォールドで刺激された細胞が、遊離抗原ペプチド及びＴ細胞に影響を及ぼす分子を使用した増殖及び刺激と比較して、特異的ＣＤ８Ｔ細胞の頻度及び絶対数の点で優れた増殖を示すことが示されている。この実施例では、Ｃｙｓ−変異ＭＨＣ  ａＡＰＣスカフォールドが、ｗｔ  ＭＨＣ分子を用いて調製されたａＡＰＣスカフォールドと類似の効率でＣＤ８Ｔ細胞を増殖させ刺激することが示されている。その結果として、Ｃｙｓ−変異ＭＨＣ  ａＡＰＣスカフォールドは、遊離抗原ペプチド及びＴ細胞に影響を及ぼす分子を使用した増殖及び刺激よりも優れている。
【０２８７】
実施例４：ジスルフィド安定化空ＭＨＣクラスＩを使用した抗原人工抗原提示（ａＡＰＣ）スカフォールドのアセンブリ及び当該ａＡＰＣを使用した特異的Ｔ細胞増殖（図５〜７）
ここでは、抗原ペプチドなしのＣｙｓ−変異ＭＨＣを使用してどのようにしてａＡＰＣスカフォールドをアセンブリングすることができるかを記載する。そのようなａＡＰＣスカフォールドは抗原ペプチド受容的であり、したがって、抗原同定の前に、例えば、がんペプチド抗原を完全な腫瘍シーケンシングから同定する、個別化がん免疫療法と組み合わせて産生することができる。ａＡＰＣスカフォールドは、抗原ペプチドのＣｙｓ−変異ＭＨＣモノマーへのローディングを、ａＡＰＣスカフォールドのアセンブリの前（プレアセンブリ）にＭＨＣにローディングするのとは対照的に、ａＡＰＣスカフォールドのアセンブリの後（ポストアセンブリ）に実施することを除いて、本質的には実施例２及び３に記載するようにしてアセンブリングすることができる。
【０２８８】
空ＭＨＣ分子を有するこれらのａＡＰＣスカフォールドに、関心対象の抗原ペプチドを単一ステップでロードすることができ、それによって、それらをｐＭＨＣ特異的ａＡＰＣスカフォールドに変換した。そのような抗原受容的ａＡＰＣスカフォールドは、各ｐＭＨＣ  ａＡＰＣスカフォールドが空ＭＨＣ分子を有するａＡＰＣスカフォールドの安定なマスターバッチから生成されるので、各ｐＭＨＣ特異的ａＡＰＣスカフォールドを生成するための処理時間を排除し、またバッチ特異的変動を限定する。
【０２８９】
ここで記載するのは、健常なドナーＰＢＭＣからのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号２２）特異的ＣＤ８Ｔ細胞を増殖するためのそのようなロード可能な（ポストアセンブル）ａＡＰＣスカフォールドの使用である。Ｃｙｓ−変異ＭＨＣ及び野生型ＭＨＣ分子のいずれかを使用した、ポストアセンブルａＡＰＣスカフォールドとプレロード抗原ペプチドを有する（プレアセンブル）ａＡＰＣスカフォールドの定量的増殖効率の比較を図５に示す。ポストアセンブルａＡＰＣスカフォールド、Ｃｙｓ−変異ＭＨＣを有するプレアセンブルａＡＰＣスカフォールド、及び野生型ＭＨＣを有するプレアセンブルａＡＰＣスカフォールドによるＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶに対して特異的なこれらの増殖ＣＤ８Ｔ細胞の機能性を、サイトカイン放出を測定することによって決定した（図６）。
【０２９０】
一般的概念実証をさらに確立するために、ポストアセンブルａＡＰＣスカフォールドを用いたＣＤ８Ｔ細胞増殖の検証は、異なる健常なドナーＰＢＭＣからのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号２１）特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖及び機能評価によって実施した。結果を、Ｃｙｓ−変異ＭＨＣを有するプレアセンブルａＡＰＣスカフォールド、及び野生型ＭＨＣを有するプレアセンブルａＡＰＣスカフォールドによる増殖と比較した（図７）。
【０２９１】
空ａＡＰＣスカフォールドをアセンブリングするために、Ｃｙｓ−変異ＭＨＣクラスＩモノマーを、抗原ペプチドを直ちにロードしない以外は、実施例２に記載するように産生した。これらのビオチン化空ＭＨＣモノマー、サイトカイン、及び共刺激分子を、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用によりストレプトアビジン修飾デキストラン上でアセンブリングして、空ＭＨＣクラスＩ分子を有する抗原受容的ａＡＰＣスカフォールドを生成した。
【０２９２】
Ｃｙｓ−変異ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１分子を用いて空ａＡＰＣスカフォールドをアセンブリングするプロセスは、以下のように実施した。デキストランスカフォールド骨格をまず、１：８：８のモル比のビオチン化ＩＬ−２及びＩＬ−２１と、３０分間４℃にて、ＰＢＳ緩衝液中でインキュベートした。その後、１００μｇ／ｍＬのＣｙｓ−変異ＭＨＣ（空）モノマーを添加し、３０分間４℃でインキュベートして、１：８：８：８のモル比のアセンブリ後ロード可能なａＡＰＣスカフォールド（スカフォールド：Ｃｙｓ−変異ＭＨＣ：ＩＬ−２：ＩＬ−２１）を生成した。デキストラン骨格上の任意の残存する空ストレプトアビジン結合部位を、２０μＭのＤ−ビオチンを添加することによってブロックした。これらのａＡＰＣスカフォールドは抗原特異性を含まないので、大バッチのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１のこれらのロード可能なａＡＰＣスカフォールドをさらに使用するまで４℃で保存した。
【０２９３】
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１のポストアセンブリロード可能なａＡＰＣスカフォールドを次いで評価して、健常なドナーＰＢＭＣからのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号２２）特異的ＣＤ８Ｔ細胞を増殖させた。増殖培養をイニシエートする当日に、抗原ペプチドを空ａＡＰＣスカフォールドに直接添加することによって、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１の空ａＡＰＣスカフォールドをＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ特異的ａＡＰＣスカフォールドに変換した。簡単に説明すると、ＰＢＳ中で希釈した１００μＭのペプチドを、２０μＬの空ａＡＰＣスカフォールドとともにインキュベートし、３０分間インキュベートした。アセンブリ後ロード可能なａＡＰＣスカフォールドを単一ステップで変換することによって生成するそのようなａＡＰＣスカフォールドを次いで使用して、増殖培養をセットアップした。３μＬの特異的ａＡＰＣスカフォールドを２×１０６ＰＢＭＣに添加し、培養を４８ウェルプレートにおいて、５％血清を追加したＸ−ｖｉｖｏ培地中でイニシエートした。培養を次いで、３μＬのａＡＰＣスカフォールドを２週間の期間にわたってさらに３回添加して、２週間維持した。平行して、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ特異性の同様の増殖培養を、野生型及びＣｙｓ−変異ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１モノマーから作製された、プレアセンブルａＡＰＣスカフォールドを用いてイニシエートした。このセットアップからの増殖培養を、ロード可能なａＡＰＣスカフォールドの増殖効率との比較評価のために使用した。１０日後、サンプルを集め、各特異性のＣＤ８Ｔ細胞増殖を、ｐＭＨＣテトラマーを使用して各特異性について決定した（図５）。
【０２９４】
これらの増殖させた培養から、別のセットの増殖させた細胞を集めて機能性を評価し、３種類のａＡＰＣスカフォールド（Ｃｙｓ−変異ＭＨＣを有するポストアセンブリロードａＡＰＣスカフォールド、Ｃｙｓ−変異ＭＨＣを有するプレアセンブリロードａＡＰＣスカフォールド、及び野生型ＭＨＣを有するプレアセンブリロードａＡＰＣスカフォールド）すべてにわたって比較した。
【０２９５】
機能評価のために、増殖させた細胞に、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ抗原を負荷して、細胞毒性殺滅のマーカーとしての抗原刺激サイトカインＴＮＦα及びＩＦＮγを誘導し検出した。これらのマーカーを同時に発現するＣＤ８Ｔ細胞は、高殺傷能力を有すると解釈される。細胞に、５μＭの関連ペプチドを２時間、５％ヒト血清を追加したＸ−ｖｉｖｏ培地中で、３０００００細胞／１００μＬの細胞濃度で負荷した。抗原ペプチドとともにインキュベーションした後、増殖させた細胞を洗浄し、まず、関連細胞表面抗体（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及び実効可能な染料）で染色し、続いて細胞透過処理緩衝液を使用したＴＮＦα（ＰＥ−Ｃｙ７）及びＩＦＮγ（ＡＰＣ）の細胞内染色を行った。細胞を固定し、フローサイトメータで分析した（図６）。
【０２９６】
アセンブリ後ロード可能なａＡＰＣスカフォールドについてのさらなる検証実験において、異なる健常なドナーＰＢＭＣからのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号２１）特異的ＣＤ８Ｔ細胞は、アセンブリ後ロード可能なａＡＰＣスカフォールド（１：８：８：８）を使用することによって増殖させた。これらのスカフォールドを、１００μＭのＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬペプチドを２０μＬのロード可能なａＡＰＣスカフォールドに添加することによって抗原特異的ｐＭＨＣスカフォールドに変換し、３０分間インキュベートして、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ特異的ａＡＰＣスカフォールドを生成した。野生型又はＣｙｓ−変異ＭＨＣ分子を使用するＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ特異的ａＡＰＣスカフォールドを実施例２に記載するようにして生成させた。
【０２９７】
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬに対して特異的な増殖培養を、健常なドナーＰＢＭＣからの３種類のａＡＰＣスカフォールドを使用し、４８ウェルプレート中でイニシエートし、５％ヒト血清を追加したＸ−ｖｉｖｏ培地中で２週間、関連ａＡＰＣスカフォールドで３日ごとに刺激しながら維持した。
【０２９８】
各特異性につき３００．０００細胞を集め、実施例３で記載したように抗原ペプチドを負荷した後に細胞内サイトカイン放出を測定することによって、１０日の増殖後に増殖ＣＤ８Ｔ細胞の機能評価を実施した。簡単に説明すると、増殖させた細胞に、５μＭのＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬペプチドを２時間、５％ヒト血清を追加したＸ−ｖｉｖｏ培地中、３００．０００細胞／１００μＬの細胞濃度で負荷した。抗原ペプチドとともにインキュベーションした後、増殖させた細胞を洗浄し、まず、関連細胞表面抗体（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及び実効可能な染料）で染色し、続いて細胞透過処理緩衝液を使用したＴＮＦα（ＰＥ−Ｃｙ７）及びＩＦＮγ（ＡＰＣ）の細胞内染色を行った。細胞を固定し、フローサイトメータで分析した（図７）。
【０２９９】
結論：（図５〜７）この実験は、抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞を増殖することが可能であり、低頻度ベースライン応答は、抗原ペプチドローディングの単一ステップで抗原特異的ａＡＰＣスカフォールドに変換されるアセンブリ後ロード可能なａＡＰＣスカフォールドを使用することを示す。図５は、ベースラインで全ＣＤ８＋Ｔ細胞の０．１８％（図５Ａ）から全ＣＤ８＋Ｔ細胞の２５％（図５Ｂ）まで増殖されたＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号２２）ＣＤ８Ｔ細胞に対して特異的な、そのようなアセンブリ後ロード可能なａＡＰＣスカフォールドの増殖効率を示す。効率は、野生型並びにＣｙｓ−変異ＭＨＣ分子の両方を使用するプレアセンブルａＡＰＣスカフォールドに匹敵した。抗原特異的サイトカイン放出を用いて測定された、これらの増殖されたＣＤ８Ｔ細胞の機能性は、３つの変異体すべて（Ｃｙｓ−変異ＭＨＣを有するポストアセンブリロードａＡＰＣスカフォールド、Ｃｙｓ−変異ＭＨＣを有するプレアセンブリロードａＡＰＣスカフォールド、及び野生型ＭＨＣを有するプレアセンブリロードａＡＰＣ）（図６）にわたって同等であることが判明した。図７の結果は、異なるドナーＰＢＭＣからのアセンブリ後ロード可能なａＡＰＣスカフォールドを使用してＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号２１）に対して特異的な増殖ＣＤ８Ｔ細胞の機能性をさらに確立する。これは、ポストアセンブリロード可能なａＡＰＣスカフォールドが効率的なＴ細胞刺激を提供することを示し、多機能Ｔ細胞を活性化し、したがって、それらは使用するまで４℃にてロード可能な形態で保存することができ、抗原ペプチドの単一ステップ添加で任意の特異性のａＡＰＣスカフォールドに変換することができるので、有益なａＡＰＣスカフォールドを提供する。
【０３００】
まとめると、これらの実施例は、迅速な産生のための空Ｃｙｓ−変異ＭＨＣの使用及び抗原−特異的Ｔ細胞の増殖のためのａＡＰＣスカフォールドの抗原多様化が可能であることを示す。これは、患者由来のがん−特異的Ｔ細胞の迅速な増殖が有効な臨床結果のために必須である、養子Ｔ細胞移入設定において有利である。
【０３０１】
本明細書中では、２つの抗原ペプチドを使用する実施例を挙げる。しかしながら、本発明は、抗原ペプチドの限定されたセットに限定されない。他の関連ペプチドとしては、限定されるものではないが、配列番号２５〜２８が挙げられる。
【０３０２】
実施例５：ジスルフィド安定化（Ｃｙｓ−変異体）ｐＭＨＣテトラマーのＴＣＲ認識
この実施例で、我々は、ｗｔ  ｐＭＨＣがＴＣＲを認識する能力を、Ｃｙｓ−変異ｐＭＨＣが同じＴＣＲを認識する能力と比較した。これは、Ｃｙｓ−変異ｐＭＨＣがｗｔ  ｐＭＨＣと同様の方法でＴＣＲにペプチド抗原を提示することを検証するために実施した。
【０３０３】
簡単に説明すると、ｐＭＨＣテトラマーをフルオロクロム結合ストレプトアビジンと組み合わせたビオチン化ｗｔ  ｐＭＨＣモノマーから調製した。ビオチン化ｐＭＨＣモノマー及びＣｙｓ−変異ＭＨＣモノマーは、本質的に実施例2に記載した通りに調製した。ｗｔ  ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１モノマーを使用する抗原ペプチド特異的ＭＨＣテトラマー（ｐＭＨＣ）を実施例４で記載する通りに調製した。
【０３０４】
簡単に説明すると、ｗｔ  ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１モノマー（ＵＶレイビルペプチド  ＫＩＬＧＦＶＦ−Ｘ−Ｖ（配列番号２４）とあらかじめ結合）は、１００μｇ／ｍＬのｗｔ  ＨＬＡ−Ａ０２：０１モノマーを２００μＭの抗原ペプチドとＰＢＳ緩衝液中２０μＬの反応体積で１時間、ＵＶランプ（３６６ｎｍ波長）下でインキュベートすることによって抗原ペプチドと交換した。これらの交換後抗原ペプチド特異的モノマーを次にフルオロフォア標識ストレプトアビジンと結合させて、抗原ペプチド特異的テトラマーを作製し、各テトラマー特異性は、コンフォメーション分析のために２つの異なる色を用いて各特異性のＣＤ８Ｔ細胞を検出するために２つの異なるフルオロフォアを用いて調製した。Ｃｙｓ−変異ＭＨＣ分子を使用するｐＭＨＣテトラマーは、あらかじめ結合させた抗原ペプチドがなく、したがって交換プロセスを必要としないので、１時間、２０μＬの反応体積で、２００μＭの抗原ペプチドを１００μｇ／ｍＬのＣｙｓ−変異ＭＨＣモノマーとともに直接インキュベートすることによって調製した。抗原ペプチド特異的Ｃｙｓ−変異ＭＨＣモノマーを次に、各特異性のために２つの異なる色のフルオロフォア標識ストレプトアビジンをと共にインキュベートすることによってテトラマー化した。
【０３０５】
ＴＣＲ認識の比較分析のために、ｗｔ及びＣｙｓ−変異ＭＨＣテトラマーを４つの異なるＨＬＡ−Ａ＊０２：０１抗原特異性；ＥＢＶ  ＬＭＰ２  ＦＬＹＡＬＡＬＬＬ（配列番号２６）、ＦＬＵ  ５８−６６  ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号２０）、ＥＢＶ  ＬＭＰ２  ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（配列番号２５）、及びＥＢＶ  ＢＭＦ１  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号２１）に対して調製した。ｗｔ及びＣｙｓ−変異ＭＨＣテトラマーを使用して、健常なドナーからのＣＤ８Ｔ細胞を検出し、抗原ペプチド特異的Ｔ細胞を総ＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージとして評価した（図８）。
【０３０６】
結論：この実施例は、Ｃｙｓ−変異ＭＨＣがｗｔ  ＭＨＣの抗原ペプチド特異的Ｔ細胞と結合するのと同じ能力を有することを示す。ｐＭＨＣモノマーの両形態は、ＭＨＣテトラマーに変換することができ、抗原ペプチド特異的Ｔ細胞の同じ集団を等しく効率的に顕出することが示されている。
【０３０７】
実施例６：がんモデルにおけるａＡＰＣスカフォールド増殖Ｔ細胞の機能的能力
この実施例で、我々は、腫瘍材料からヒトがん特異的腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する。ＴＩＬは、ａＡＰＣスカフォールドを用いて増殖させ、がんモデルにおける機能的能力について試験する。ａＡＰＣスカフォールドで増殖させたＴ細胞は、高用量のＩＬ−２を用いた迅速な増殖による最先端の（ｓｔａｔｅ−ｏｆｆ−ｔｈｅ−ａｒｔ）ＴＩＬ増殖プロトコルを用いて増殖させたＴ細胞に対する基準である。
【０３０８】
ａＡＰＣスカフォールド増殖Ｔ細胞の抗腫瘍活性を３Ｄ微小腫瘍モデルにおいて調べる。新鮮な黒色腫組織を手術後２４時間以内に処理する。組織サンプルを洗浄し、細かく刻み、コラゲナーゼ酵素のブレンドを使用して穏やかに消化する。この後、微小腫瘍調製物を続いて、セルストレーナーを通してろ過して、５０μｍを越えるサイズを有する３Ｄ微小腫瘍を分離する。これらの３Ｄ微小腫瘍を無血清条件下で増殖させる。ａＰＣスカフォールド増殖Ｔ細胞の抗腫瘍反応性を、同じ患者から確立された３Ｄ微小腫瘍を用いた共培養において、蛍光染料ベースの細胞毒性アッセイを用いて評価する。自己細胞産物（対照）に対する３Ｄ微小腫瘍細胞の細胞毒性応答を９６時間までの期間にわたって評価する。上述の細胞毒性分析と平行して、各細胞産物による３Ｄ微小腫瘍浸潤の程度を、肝細胞３Ｄ共焦点蛍光顕微鏡法を用いて分析する。
【０３０９】
結論：この実施例は、ＡＡＰＣスカフォールドを使用して増殖させたＴ細胞が自己がん微小腫瘍に対して抗腫瘍反応性を有することを示す。
【０３１０】
実施例７：ヒト化マウスモデルにおけるａＡＰＣスカフォールド増殖Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍活性
この実施例で、我々は、ヒト化ｈｕＩＬ２−ＮＯＧマウスにおけるａＡＰＣスカフォールド増殖Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍活性を示し、これは、養子移入の黒色腫由来のＴＩＬの臨床活性をモデル化し予想することが最近報告された。
【０３１１】
簡単に説明すると、腫瘍をＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒγ（ＮＯＧ）マウスに移植する。生着後、腫瘍を連続的に、３〜５匹のＮＯＧマウス又は３〜５匹のヒトＩＬ−２導入ＮＯＧマウス（ｈｕＩＬ２−ＮＯＧ）に移植する。ｈｕＩＬ２−ＮＯＧマウスを、尾静脈に注入することによってａＡＰＣ増殖Ｔ細胞で処置する。腫瘍成長は、養子Ｔ細胞移入で処置した、又は未処置の担腫瘍マウス間で、カリパス測定又は画像化によって比較する（腫瘍種類に対する依存性）。マウス中で増殖させたＴ細胞を、免疫表現型決定し、阻害及び刺激シグナルについて分析する。
【０３１２】
結論：この実施例は、ａＡＰＣスカフォールド増殖Ｔ細胞がインビボ抗腫瘍反応性を有することを示す。
【０３１３】
実施例８：ネオロイキン−２／１５を有するａＡＰＣスカフォールド（Ｎｅｏ−２／１５）を用いた抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖
この実施例では、Ａ１  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＹＳＥＨＰＴＦＴＳＱＹ（配列番号３０）に対する野生型ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ＊０１：０１モノマーを用いたＮｅｏ−２／１５を有するａＡＰＣスカフォールドのアセンブリ、及びこれらのａＡＰＣスカフォールドを用いた、健常なドナーＰＢＭＣからの特異的ＣＤ８Ｔ細胞増殖を記載する（図９）。
【０３１４】
野生型ＨＬＡ  Ａ＊０２：０１モノマーを、実施例２に記載したのと同様のプロセスであるが、ＵＶレイビルＨＬＡ  Ａ＊０１：０１特異的ペプチドＳＴＡＰＧ−Ｘ−ＬＥＹ（配列番号３１）の存在下で調製し、ここで、Ｘは、紫外線に対して感受性のアミノ酸である３−アミノ−２−（２−ニトロフェニル）プロピオン酸を指し、これはＵＶ光に曝露されると、完全長ペプチドを切断し、また、野生型ＭＨＣのフォールディング及び安定性に必須である。したがって、精製及びビオチン化野生型ＨＬＡ  Ａ＊０１：０１モノマーは、常にこのペプチド結合形態である。
【０３１５】
野生型ＨＬＡ−Ａ＊０１：０１モノマーを有するａＡＰＣスカフォールドは、プレ結合ペプチドと結合していたので、Ａ１  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＹＳＥＨＰＴＦＴＳＱＹの野生型ＨＬＡ−Ａ＊０１：０１モノマーを使用したａＡＰＣスカフォールドは、プレ結合ペプチドとＣＭＶ  ｐｐ６５  ＹＳＥＨＰＴＦＴＳＱＹ特異的ペプチドとのペプチド交換を必要とした。１００μｇ／ｍｌの野生型ＨＬＡ−Ａ＊０１：０１モノマーをＰＢＳ中２００μＭの抗原ペプチドと混合して総体積２０μＬとし、そしてＵＶランプ（３６６ｎｍ）下で６０分間インキュベートして、プレ結合ＵＶレイビルペプチドと抗原特異的ペプチドとの交換を促進した。反応後、ａＡＰＣスカフォールドを、野生型ＨＬＡ−Ａ＊０１：０１モノマー及びサイトカインを使用してアセンブリングした。スカフォールドをＴ細胞増殖のために使用するまで４℃で保存する。
【０３１６】
ａＡＰＣスカフォールドベースのＴ細胞増殖を、４８ウェル平底細胞培養プレートにおいて５％ヒト血清を追加したＸ−ｖｉｖｏ培地中、特異性あたり２×１０６ＰＢＭＣでイニシエートした。３μｌのａＡＰＣスカフォールドを２日又は３日おきに４回添加し、培養を２週間維持した。１０サンプルを集め、抗原特異的刺激によって誘導された細胞内サイトカインを使用した増殖について試験した。増殖させた細胞に、５μＭの関連抗原ペプチドを、２時間、５％ヒト血清を追加したＸ−ｖｉｖｏ培地中、３００．０００細胞／１００μＬの細胞濃度で負荷した。抗原ペプチドとインキュベーションした後、増殖した細胞を洗浄し、まず関連細胞表面抗体（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及び実効可能な染料）で染色し、続いて細胞透過処理緩衝液を使用して、ＴＮＦα（ＰＥ−Ｃｙ７）及びＩＦＮγ（ＡＰＣ）について細胞内染色を行った。細胞を次いで固定し、フローサイトメータによって分析した。
【０３１７】
本明細書中で、１つの抗原ペプチドを使用する例を示す。しかしながら、本発明は、抗原ペプチドの限定されたセットに限定されるものではない。他の関連ペプチドには、限定されるものではないが、配列番号２５〜２８が含まれる。
【０３１８】
結論：この実験は、ＨＬＡ−Ａ＊０１：０１  ＣＭＶ  ｐｐ６５ＹＳＥＨＰＴＦＴＳＱＹ抗原と組み合わせてＮｅｏ−２／１５を提示するａＡＰＣスカフォールドを使用して、ｐＭＨＣ指向的方法で、低頻度ベースライン応答を伴って抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞を増殖させることが可能であることを示す（図９）。この実施例は、抗原−特異的Ｔ細胞の迅速な産生のためにＨＬＡ−Ａ＊０１：０１と組み合わせてＮｅｏ−２／１５を提示するａＡＰＣスカフォールドの使用が可能であることを示す。
【０３１９】
Ｎｅｏ−２／１５  ａＡＰＣスカフォールドで増殖させたＣＤ８Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ＊０１：０１  ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＹＳＥＨＰＴＦＴＳＱＹ抗原について抗原ペプチド特異的増殖ＣＤ８Ｔ細胞によって放出された細胞内サイトカイン（ＴＮＦα及びＩＦＮγ）によって示されるように、ＩＬ−２で調製されたａＡＰＣスカフォールドと機能的に匹敵することが判明した（図９）。機能的分析によってまた、無関係のペプチド特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖が観察されなかったので、Ｎｅｏ−２／１５を有するａＡＰＣスカフォールドが抗原特異的細胞のみを増殖することが確認された。
【０３２０】
実施例１では、ＭＨＣ分子を用いて調製されたａＡＰＣスカフォールドで刺激された細胞は、遊離抗原ペプチド及びＴ細胞に影響を及ぼす分子を使用した増殖及び刺激と比較して、特異的ＣＤ８Ｔ細胞の頻度及び絶対数の観点から優れた増殖を示すことが示されている。実施例３では、Ｃｙｓ−変異ＭＨＣ  ａＡＰＣスカフォールドが、ｗｔ  ＭＨＣ分子を用いて調製されたａＡＰＣスカフォールドに類似した効率でＣＤ８Ｔ細胞を増殖し、かつ刺激することが示されている。この実施例では、Ｎｅｏ−２／１５を有するａＡＰＣスカフォールドは、抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞を有利に増殖し、かつ刺激することが示されている。
【０３２１】
引例
国際公開第２００２０７２６３１号
国際公開第２００９００３４９２号
国際公開第２００９０９４２７３
米国特許出願公開第２０１１／３１８３８０号
米国特許第９，４９４，５８８号
【図１Ａ】
2021527419.tif 000003
【図１Ｂ】
2021527419.tif 000004
【図２Ａ−Ｄ】
2021527419.tif 000005
【図２Ｅ】
2021527419.tif 000006
【図２Ｆ】
2021527419.tif 000007
【図３】
2021527419.tif 000008
【図４】
2021527419.tif 000009
【図５】
2021527419.tif 000010
【図６】
2021527419.tif 000011
【図７】
2021527419.tif 000012
【図８】
2021527419.tif 000013
【図９Ａ−Ｃ】
2021527419.tif 000014
【配列表】
2021527419000001.app
【国際調査報告】
2021527419.tif 000015
2021527419.tif 000016
2021527419.tif 000017