(57)【要約】  本発明は、機能的レシーバドメインまたは機能的ＤＮＡ結合ドメインを欠く変異体ＤｅｇＵおよび／または機能的単一結合ドメインまたは機能的ＡＴＰアーゼドメインを欠く変異体ＤｅｇＳを含んだ液体培養において粘度が低下したパエニバシラス属菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）の菌株の生物学的に純粋な培養物を含む組成物を提供する。また、パエニバシラス属菌の親株と比較して液体培養で粘度が低下したパエニバシラス属菌の変異誘導体株を、非ムコイド形態の変異株の視覚的スクリーニングによって同定する方法も提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的レシーバドメインまたは機能的ＤＮＡ結合ドメインを欠く突然変異体ＤｅｇＵおよび／または機能的単一結合ドメインまたは機能的ＡＴＰアーゼドメインを欠く突然変異体ＤｅｇＳを含むパエニバシラス属菌の菌株の生物学的に純粋な培養物を含む組成物であって、突然変異体ＤｅｇＵおよび／または突然変異体ＤｅｇＳが、野生型ＤｅｇＵおよび野生型ＤｅｇＳを含むパエニバシラス属菌の菌株の液体培養物と比較して粘度が低下したパエニバシラス属菌の菌株の液体培養物をもたらす、前記組成物。
【請求項２】
前記突然変異体ＤｅｇＵおよび／または突然変異体ＤｅｇＳが、ムコイド形態を有するパエニバシラス属菌の菌株のコロニーの形成を阻害する、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記突然変異体ＤｅｇＵおよび／または突然変異体ＤｅｇＳがノックアウトであるか、または未成熟終止コドンの結果として切断されている、請求項１または請求項２記載の組成物。
【請求項４】
前記未成熟終止コドンが、配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２１８位で切断された突然変異体ＤｅｇＵを生じる、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
前記突然変異体ＤｅｇＵが、
配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた１０９位の小残基の酸性残基へのアミノ酸置換；および／または
配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２２８位の小残基の極性残基へのアミノ酸置換；および／または
配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた６３位の酸性残基の極性残基へのアミノ酸置換；および／または
配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた１９５位の極性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または
配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２０４位の疎水性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または
配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２０８位の極性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または
配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２１２位の塩基性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または
配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２１７位の疎水性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または
配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２０７位の塩基性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または
配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２１１位の極性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または
配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２１４位の極性残基の小残基へのアミノ酸置換、
を含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記突然変異体ＤｅｇＵが、Ｇ１０９Ｄおよび／またはＡ２２８Ｔおよび／またはＤ６３Ｎおよび／またはＮ１９５Ａおよび／またはＩ２０４Ａおよび／またはＴ２０８Ａおよび／またはＨ２１２Ａおよび／またはＬ２１７Ａおよび／またはＫ２０７Ａおよび／またはＮ２１１Ａおよび／またはＳ２１４Ａのアミノ酸置換を有する配列番号：２を含むか、或いはそれらの変異体であって保存アミノ酸置換を有する変異体を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記突然変異体ＤｅｇＳが、
配列番号：４のアミノ酸配列との対応により番号付けされた９９位の疎水性残基の芳香族残基へのアミノ酸置換；および／または
配列番号：４のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２９４位の酸性残基の塩基性残基へのアミノ酸置換；および／または
配列番号：４のアミノ酸配列との対応により番号付けされた７３位の極性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または
配列番号：４のアミノ酸配列との対応により番号付けされた１９０位の小残基の疎水性残基へのアミノ酸置換を含む、請求項１〜６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
前記突然変異体ＤｅｇＳが、Ｌ９９Ｆおよび／またはＥ２９４Ｋおよび／またはＴ７３Ａおよび／またはＡ１９０Ｖのアミノ酸置換を有する配列番号：４を含むか、或いはそれらの変異体であって保存アミノ酸置換を有する変異体を含む、請求項１〜７のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
前記パエニバシラス属菌の菌株が突然変異誘発誘導株であり、非突然変異誘発親株と比較して増加したフサリシジン濃度を示す、請求項１〜８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
前記パエニバシラス属菌の菌株が突然変異誘発誘導株であり、非突然変異誘発親株と比較して減少したアミラーゼの発現および／または酵素活性を示す、請求項１〜９のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
前記減少したアミラーゼの発現および／または酵素活性が、配列番号：９または配列番号：１０と約９０％を超えるの配列同一性を有する配列を含むα−アミラーゼタンパク質で起こる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記非突然変異誘発親株が、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株、またはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株である、請求項９〜１１のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１３】
前記パエニバシラス属菌の菌株がＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株、またはその殺真菌性突然変異株である、請求項１〜８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４】
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株、またはそれらの殺真菌性突然変異株の発酵産物を含む、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
前記殺真菌性突然変異株が、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株、またはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株と約９０％を超える配列同一性を有するゲノム配列を有する、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
パエニバシラス属菌の親株と比較して液体培養において粘度が低下したパエニバシラス属菌の突然変異体誘導株を同定する方法であって、以下を含む方法：
パエニバシラス属菌の親株の突然変異誘発による突然変異体分離株を作製し；
突然変異体分離株およびパエニバシラス属菌の親株を、約１％（ｗ／ｖ）〜約４０％（ｗ／ｖ）の濃度で糖を含む固体培地上で培養し、ここでパエニバシラス属菌の親株は、固体培地上でムコイド形態を有しており；および
液体培養における粘度減少の指標である非ムコイド形態を有するパエニバシラス属菌の突然変異体誘導株を同定するために、固体培地上で突然変異体分離株を視覚的にスクリーニングする。
【請求項１７】
前記固体培地中の糖が、約５％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）の濃度である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記糖が、スクロース、マルトデキストリン、デンプン、コーンシロップ固形物、フルクトース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、キシロース、キシリトール、イヌリン、ソルビトール、フコース、糖蜜、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記固体培地中の炭素対窒素比が約１０：１〜約１０００：１である、および／または固体培地が寒天、アガロースおよび／またはゼラチンをさらに含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
さらに以下を含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法：
液体培養物を生産するためにパエニバシラス属菌の突然変異体誘導株を液体培地で培養し；および
パエニバシラス属菌の親株と比較したパエニバシラス属菌の突然変異体誘導株の粘度低下を確認するために、該液体培養物の粘度および／または充填細胞容量を測定する。
【請求項２１】
機能的レシーバドメインまたは機能的ＤＮＡ結合ドメインを欠く突然変異体ＤｅｇＵおよび／または機能的単一結合ドメインまたは機能的ＡＴＰアーゼドメインを欠く突然変異体ＤｅｇＳをコードする配列を同定するために、パエニバシラス属菌の突然変異体誘導株におけるｄｅｇＵおよび／またはｄｅｇＳの配列決定をさらに含む、請求項１６〜２０のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
パエニバシラス属菌の突然変異体誘導株およびパエニバシラス属菌の親株におけるアミラーゼの発現および／または酵素活性を測定し、パエニバシラス属菌の突然変異体誘導株において当該発現および／または酵素活性が低下しているかどうかを決定することをさらに含む、請求項１６から２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
低下したアミラーゼの発現および／または酵素活性が、配列番号：９または配列番号：１０と約９０％を超える配列同一性を有する配列を含むα−アミラーゼタンパク質で起こる、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
さらに以下を含む、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の方法：
パエニバシラス属菌の親株と比較してフサリシジンレベルが増加した突然変異体分離株を同定するために、突然変異体分離株中のフサリシジン量を定量する。
【請求項２５】
前記パエニバシラス属菌の親株が、Ｐ．ａｇａｒｅｘｅｄｅｎｓ、Ｐ．ａｇａｒｉｄｅｖｏｒａｎｓ、Ｐ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ａｌｋａｌｉｔｅｒｒａｅ、Ｐ．ａｌｖｅｉ、Ｐ．ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ａｎａｅｒｉｃａｎｕｓ、Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ、Ｐ．ａｓｓａｍｅｎｓｉｓ、Ｐ．ａｚｏｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｐ．ａｚｏｔｏｆｉｘａｎｓ、Ｐ．ｂａｒｃｉｎｏｎｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｐ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｐ．ｃａｍｐｉｎａｓｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｃｈｉｎｊｕｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｃｈｉｔｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎｕｓ、Ｐ．ｃｉｎｅｒｉｓ、Ｐ．ｃｏｏｋｉｅ、Ｐ．ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｄｅｎｄｒｉｔｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐ．ｄｕｒｕｍ、Ｐ．ｅｈｉｍｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｅｌｇｉｉ、Ｐ．ｆａｖｉｓｐｏｒｕｓ、Ｐ．ｇｌｕｃａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｇｌｙｃａｎｉｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｐ．ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｐ．ｇｒａｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐ．ｈｏｄｏｇａｙｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｉｌｌｉｎｏｉｓｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｊａｍｉｌａｅ、Ｐ．ｋｏｂｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｋｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐ．ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｋｒｉｂｂｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐ．ｌａｒｖａｅ、Ｐ．ｌａｕｔｕｓ、Ｐ．ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ、Ｐ．ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｐ．ｍａｃｑｕａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｍｅｎｄｅｌｉｉ、Ｐ．ｍｏｔｏｂｕｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｐ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐ．ｎｏｖ．ｓｐｅｃ．ｅｐｉｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｏｄｏｒｉｆｅｒ、Ｐ．ｐａｂｕｌｉ、Ｐ．ｐｅｏｒｉａｅ、Ｐ．ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ、Ｐ．ｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅ、Ｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ  ｓｓｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ  ｓｓｐ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｐ．ｐｏｐｉｌｌｉａｅ、Ｐ．ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ．ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ、Ｐ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｐ．ｓｔｅｌｌｉｆｅｒ、Ｐ．ｔａｉｃｈｕｎｇｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｔｅｒｒａｅ、Ｐ．ｔｈｉａｍｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｔｙｌｏｐｉｌｉ、Ｐ．ｔｕｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｖａｌｉｄｕｓ、Ｐ．ｖｏｒｔｅｘ、Ｐ．ｖｕｌｎｅｒｉｓ、Ｐ．ｗｙｎｎｉｉまたはＰ．ｘｙｌａｎｉｌｙｔｉｃｕｓである、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
パエニバシラス属菌の親株と比較して液体培養において粘度が低下したパエニバシラス属菌の突然変異体誘導株を作製する方法であって、以下を含む方法：
パエニバシラス属菌の親株を突然変異誘発して突然変異体分離株を作製し；
約１％（ｗ／ｖ）〜約４０％（ｗ／ｖ）の濃度の糖を含む固体培地上で前記突然変異体分離株およびパエニバシラス属菌の親株を培養し、ここでパエニバシラス属菌の親株は固体培地上でムコイド形態を有しており；
固体培地上の突然変異体分離株を目視によりスクリーニングして、液体培養における粘度減少の指標である非ムコイド形態を有するパエニバシラス属菌の突然変異体誘導株を同定し、および
同定されたパエニバシラス属菌の突然変異体誘導株の発酵産物を産生する。
【請求項２７】
前記突然変異誘発がパエニバシラス属菌の親株の化学的突然変異誘発を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記固体培地中の糖が、約５％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）の濃度である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記糖が、スクロース、マルトデキストリン、デンプン、コーンシロップ固形物、フルクトース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、キシロース、キシリトール、イヌリン、ソルビトール、フコース、糖蜜、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
さらに以下を含む、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法：
液体培養物を生産するためにパエニバシラス属菌の突然変異体誘導株を液体培地で培養し；および
パエニバシラス属菌の親株と比較したパエニバシラス属菌の突然変異体誘導株の粘度低下を確認するために、該液体培養物の粘度および／または充填細胞容量を測定する。
【請求項３１】
機能的レシーバドメインまたは機能的ＤＮＡ結合ドメインを欠く突然変異体ＤｅｇＵおよび／または機能的単一結合ドメインまたは機能的ＡＴＰアーゼドメインを欠く突然変異体ＤｅｇＳをコードする配列を同定するために、パエニバシラス属菌の突然変異体誘導株におけるｄｅｇＵおよび／またはｄｅｇＳの配列決定をさらに含む、請求項２６〜３０のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
パエニバシラス属菌の突然変異体誘導株およびパエニバシラス属菌の親株におけるアミラーゼの発現および／または酵素活性を測定し、パエニバシラス属菌の突然変異体誘導株において当該発現および／または酵素活性が低下しているかどうかを決定することをさらに含む、請求項２６〜３１のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
低下したアミラーゼの発現および／または酵素活性が、配列番号：９または配列番号：１０と約９０％を超える配列同一性を有する配列を含むα−アミラーゼタンパク質で起こる、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記パエニバシラス属菌の親株が、Ｐ．ａｇａｒｅｘｅｄｅｎｓ、Ｐ．ａｇａｒｉｄｅｖｏｒａｎｓ、Ｐ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ａｌｋａｌｉｔｅｒｒａｅ、Ｐ．ａｌｖｅｉ、Ｐ．ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ａｎａｅｒｉｃａｎｕｓ、Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ、Ｐ．ａｓｓａｍｅｎｓｉｓ、Ｐ．ａｚｏｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｐ．ａｚｏｔｏｆｉｘａｎｓ、Ｐ．ｂａｒｃｉｎｏｎｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｐ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｐ．ｃａｍｐｉｎａｓｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｃｈｉｎｊｕｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｃｈｉｔｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎｕｓ、Ｐ．ｃｉｎｅｒｉｓ、Ｐ．ｃｏｏｋｉｅ、Ｐ．ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｄｅｎｄｒｉｔｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐ．ｄｕｒｕｍ、Ｐ．ｅｈｉｍｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｅｌｇｉｉ、Ｐ．ｆａｖｉｓｐｏｒｕｓ、Ｐ．ｇｌｕｃａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｇｌｙｃａｎｉｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｐ．ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｐ．ｇｒａｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐ．ｈｏｄｏｇａｙｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｉｌｌｉｎｏｉｓｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｊａｍｉｌａｅ、Ｐ．ｋｏｂｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｋｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐ．ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｋｒｉｂｂｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐ．ｌａｒｖａｅ、Ｐ．ｌａｕｔｕｓ、Ｐ．ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ、Ｐ．ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｐ．ｍａｃｑｕａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｍｅｎｄｅｌｉｉ、Ｐ．ｍｏｔｏｂｕｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｐ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐ．ｎｏｖ．ｓｐｅｃ．ｅｐｉｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｏｄｏｒｉｆｅｒ、Ｐ．ｐａｂｕｌｉ、Ｐ．ｐｅｏｒｉａｅ、Ｐ．ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ、Ｐ．ｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅ、Ｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ  ｓｓｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ  ｓｓｐ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｐ．ｐｏｐｉｌｌｉａｅ、Ｐ．ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ．ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ、Ｐ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｐ．ｓｔｅｌｌｉｆｅｒ、Ｐ．ｔａｉｃｈｕｎｇｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｔｅｒｒａｅ、Ｐ．ｔｈｉａｍｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｔｙｌｏｐｉｌｉ、Ｐ．ｔｕｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｖａｌｉｄｕｓ、Ｐ．ｖｏｒｔｅｘ、Ｐ．ｖｕｌｎｅｒｉｓ、Ｐ．ｗｙｎｎｉｉまたはＰ．ｘｙｌａｎｉｌｙｔｉｃｕｓである、請求項２６〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１６〜２５のいずれか一項に記載の方法で同定されたパエニバシラス属菌の突然変異体誘導株を含む発酵産物。
【請求項３６】
前記発酵産物が、殺真菌活性および／または殺細菌活性を増加させるためのパエニバシラス属菌の突然変異体誘導株由来の全培養物の培養液濃縮物を含む、請求項３５記載の発酵産物。
【請求項３７】
病害を防除するために植物を処理する方法であって、該方法は、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物または請求項３５もしくは３６に記載の発酵産物の有効量を植物、植物の一部および／または植付け場所に施用することを含む方法。
【請求項３８】
ヘクタール当たり約１×１０４〜約１×１０１４コロニー形成単位（ＣＦＵ）またはヘクタール当たり約０．１ｋｇ〜約２０ｋｇの発酵固形物で組成物を施用する、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
植物病が真菌類によって引き起こされる、請求項３７または３８記載の方法。
【請求項４０】
植物病がうどんこ病またはべと病である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記真菌が、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｌａｇｅｎａｒｉｕｍ、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｎｅｃａｔｏｒ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ、Ｚｙｍｏｓｅｐｔｏｒｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｒｙｐｔｏｇｅａ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ  ｖｉｔｉｃｏｌａ、Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａ、Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃｕｂｅｎｓｉｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ、Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｌｉｇｉｎｅａ、Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓ  ｃｕｃｕｍｅｒｉｓ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｓｅｇｅｔｕｍ  ｖａｒ．  ａｖｅｎａｅ、Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓおよびＰｕｃｃｉｎｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉｎａからなる群より選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
植物病が細菌によって引き起こされる、請求項３７または３８記載の方法。
【請求項４３】
前記細菌が、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅおよびＥｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａからなる群より選択される、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
有用植物中の植物病原性生物を防除するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物または請求項３５もしくは３６に記載の発酵産物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌株の分野、および植物病害を防除するそれらの能力に関する。特に、本発明は、比較的高いレベルの抗真菌活性を有し、かつ菌株の全培養液産物の下流処理および濃縮を促進する粘度が低下したパエニバシラス属菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）の菌株に向けられる。
【０００２】
関連出願への相互参照：本出願は、２０１８年５月１４日付けで出願された米国仮特許出願第６２／６７１、０６７号に基づく優先権を主張しており、その内容の全体は参照することによってここに組み込まれている。
【０００３】
電子的に提出される配列表への参照：配列表の正式コピーは、ＡＳＣＩＩ形式の配列表として、２０１９年４月３０日に作成された「ＢＣＳ１６９００９＿ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称の容量２９キロバイトのファイルにより、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に本明細書と同時に提出される。このＡＳＣＩＩ形式の文書に含まれる配列リストは本明細書の一部であり、その全体が参照することによってここに組み込まれている。
【背景技術】
【０００４】
パエニバシラス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）は、低ＧＣ含量、内生胞子形成、グラム陽性菌（フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ））の属である。この属に属する細菌は、フサリシジンおよびポリミキシンのような非リボソームペプチドクラスを含む、工業的に関連する細胞外酵素および抗菌物質の多産生菌である。フサリシジン類は、種々の植物病原性真菌および細菌に対して抗微生物活性を有することが知られている。
【０００５】
多くのパエニバシラスの種は菌体外多糖類（ＥＰＳ）の多産生菌である。微生物ＥＰＳは水溶性生体高分子であり、細胞表面に付着し、細胞外培地に放出される。これらのポリマーは、その物理化学的およびレオロジー的特性により、食品、飼料、包装、化粧品および医薬品産業を含む広範囲の産業において、増粘剤として商業的に使用されている。ＥＰＳの産生は、特に高分子量種の結果として、全培養液試料の粘度増加をもたらす。培養液粘度の増加は、バイオリアクター増殖および生細菌全培養液製品を意図した培養液材料の下流処理の問題をもたらす。さらに処理する前に大規模発酵液体培養物からＥＰＳを除去するために、費用と作業集約的な手順が必要となる可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
低下した粘度と、より高レベルのフサリシジンおよびフサリシジン様化合物を示すことにより、殺真菌活性および加工適正（ｐｒｏｃｅｓｓａｂｉｌｉｔｙ）が増したパエニバシラス属菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）の菌株を産生し、同定する方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、パエニバシラス属菌の菌株およびその突然変異誘導体の殺真菌活性および加工適正を増強する戦略に向けられる。化学的処理と高スループットスクリーニングの連続ラウンドによりフサリシジンの生産を増強するための菌株改良戦略を考案した。さらに、パエニバシラス属菌株の殺真菌性突然変異誘導体の大規模増殖と下流処理を改善するために、発酵ブロス培養の粘度を低下させるための視覚スクリーニングを開発した。殺真菌性および加工特性を改良したパエニバシラス属菌株を数種作成し、特性化した。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本発明は、機能的レシーバドメインまたは機能的ＤＮＡ結合ドメインを欠く突然変異体ＤｅｇＵをおよび／または機能的単一結合ドメインまたは機能的ＡＴＰアーゼドメインを欠く突然変異体ＤｅｇＳを含むパエニバシラス属菌の菌株の生物学的に純粋な培養を含む組成物に関するものであり、ここで、突然変異体ＤｅｇＵおよび／または突然変異体ＤｅｇＳは、野生型ＤｅｇＵおよび野生型ＤｅｇＳを含むパエニバシラス属菌の菌株の液体培養と比較して粘度が低下したパエニバシラス属菌の菌株の液体培養物をもたらす。
【０００９】
特定の局面において、突然変異体ＤｅｇＵおよび／または突然変異体ＤｅｇＳは、ムコイド形態を有するパエニバシラス属菌の菌株のコロニーの形成を阻害する。
【００１０】
１つの実施形態において、突然変異体ＤｅｇＵおよび／または突然変異体ＤｅｇＳはノックアウトであるか、または未成熟終止コドンの結果として切断（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）されている。ある局面において、未成熟終止コドンは、配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２１８位で切断された突然変異体ＤｅｇＵを生じる。
【００１１】
他の実施形態では、突然変異体ＤｅｇＵは、配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた１０９位の小残基の酸性残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２２８位の小残基の極性残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた６３位の酸性残基の極性残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた１９５位の極性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２０４位の疎水性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２０８位の極性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２１２位の塩基性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２１７位の疎水性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２０７位の塩基性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２１１位の極性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２１４位の極性残基の小残基へのアミノ酸置換、を含む。
【００１２】
１つの態様において、突然変異体ＤｅｇＵは、Ｇ１０９Ｄおよび／またはＡ２２８Ｔおよび／またはＤ６３Ｎおよび／またはＮ１９５Ａおよび／またはＩ２０４Ａおよび／またはＴ２０８Ａおよび／またはＨ２１２Ａおよび／またはＬ２１７Ａおよび／またはＫ２０７Ａおよび／またはＮ２１１Ａおよび／またはＳ２１４Ａのアミノ酸置換を有する配列番号：２を含むか、或いはそれらの変異体であって保存アミノ酸置換を有する変異体を含む。
【００１３】
別の局面において、突然変異体ＤｅｇＳは、配列番号：４のアミノ酸配列との対応により番号付けされた９９位の疎水性残基の芳香族残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：４のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２９４位の酸性残基の塩基性残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：４のアミノ酸配列との対応により番号付けされた７３位の極性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：４のアミノ酸配列との対応により番号付けされた１９０位の小残基の疎水性残基へのアミノ酸置換を含む。
【００１４】
１つの実施形態において、突然変異体ＤｅｇＳは、Ｌ９９Ｆおよび／またはＥ２９４Ｋおよび／またはＴ７３Ａおよび／またはＡ１９０Ｖのアミノ酸置換を有する配列番号：４を含むか、或いはそれらの変異体であって保存アミノ酸置換を有する変異体を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、パエニバシラス属菌の菌株は、突然変異誘発された誘導株であり、非突然変異誘発親株と比較して増加したフサリシジンレベルを示す。他の実施形態において、パエニバシラス属菌の菌株は、突然変異誘発された誘導株であり、非突然変異誘発親株と比較して減少したアミラーゼの発現および／または酵素活性を示す。
【００１６】
特定の局面において、減少したアミラーゼの発現および／または酵素活性は、配列番号：９または配列番号：１０と約９０％を超える配列同一性を有する配列を含むα−アミラーゼタンパク質で起こる。他の局面において、減少したアミラーゼの発現および／または酵素活性は、配列番号：９または配列番号：１０に対する配列同一性が約９５％を超える配列、配列同一性が約９６％を超える配列、配列同一性が約９７％を超える配列、配列同一性が約９８％を超える配列または配列同一性が約９９％を超える配列を含むα−アミラーゼタンパク質で起こる。１つの実施形態において、α−アミラーゼタンパク質は配列番号：９を含む。別の実施形態において、α−アミラーゼタンパク質は配列番号：９からなる。１つの実施形態において、α−アミラーゼタンパク質は配列番号：１０を含む。別の実施形態では、α−アミラーゼタンパク質は配列番号：１０からなる。
【００１７】
いくつかの例において、非突然変異誘発親株は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株またはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株である。他の例では、非突然変異誘発親株は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株またはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株である。
【００１８】
一態様では、パエニバシラス属菌の菌株は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株、またはそれらの殺真菌性突然変異株である。
【００１９】
別の局面において、組成物は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株、またはその殺真菌性突然変異株の発酵産物を含む。
【００２０】
ある態様において、殺真菌性突然変異株は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株またはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株と約９０％を超える配列同一性を有するゲノム配列を有する。
【００２１】
他の実施態様において、本発明は、パエニバシラス属菌の親株と比較して液体培養において粘度が減少したパエニバシラス属菌の突然変異体誘導株を同定する方法に関するものであり、この方法は、パエニバシラス属菌の親株を突然変異誘発して突然変異体分離株を産生すること；突然変異体分離株およびパエニバシラス属菌の親株を、約１％（ｗ／ｖ）〜約４０％（ｗ／ｖ）の間の濃度で糖を含む固体培地上で培養すること、ここでパエニバシラス属菌の親株は固体培地上でムコイド形態を有しており；および液体培養における粘度減少の指標である非ムコイド形態を有するパエニバシラス属菌の突然変異体誘導株を同定するために固体培地上で突然変異体分離株を視覚的にスクリーニングすることを含む。
【００２２】
ある局面において、固体培地中の糖は、約５％（ｗ／ｖ）と約２０％（ｗ／ｖ）の間の濃度である。別の局面において、糖は、スクロース、デンプン、マルトデキストリン、コーンシロップ固形物、フルクトース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、キシロース、キシリトール、イヌリン、ソルビトール、フコース、糖蜜、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００２３】
ある実施態様では、固体培地中の炭素対窒素比は、約１０：１〜約１０００：１の間である。一態様では、固体培地はさらに、寒天、アガロースおよび／またはゼラチンを含む。特定の局面において、固体培地は固体寒天培地である。
【００２４】
他の実施形態では、本発明の方法は、さらに、液体培養物を生産するために液体培地中でパエニバシラス属菌の突然変異体誘導株を培養すること；およびパエニバシラス属菌の親株と比較してパエニバシラス属菌の突然変異体誘導株の減少した粘度を確認するために、液体培養物の粘度および／または充填細胞容量を測定することを含む。
【００２５】
特定の実施形態において、本発明の方法は、さらに、機能的レシーバドメインまたは機能的ＤＮＡ結合ドメインを欠く突然変異体ＤｅｇＵおよび／または機能的単一結合ドメインまたは機能的ＡＴＰアーゼドメインを欠く突然変異体ＤｅｇＳをコードする配列を同定するために、パエニバシラス属菌の突然変異体誘導株におけるｄｅｇＵおよび／またはｄｅｇＳの配列決定を含む。
【００２６】
他の実施形態において、本発明の方法は、パエニバシラス属菌の突然変異体誘導株およびパエニバシラス属菌の親株におけるアミラーゼの発現および／または酵素活性を決定して、パエニバシラス属菌の突然変異体誘導株においてその発現および／または酵素活性が減少しているかどうかを決定することをさらに含む。ある局面において、パエニバシラス属菌の突然変異体誘導株におけるアミラーゼの発現および／または酵素活性は、パエニバシラス属菌の親株の約９０％未満、約８０％未満、約７０％未満、約６０％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満または約１０％未満である。他の局面において、パエニバシラス属菌の突然変異体誘導株におけるアミラーゼの発現および／または酵素活性は、パエニバシラス属菌の親株の約１％〜約９０％、約１０％〜約９０％、約１０％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約１０％〜約６０％、約２０％〜９０％、約２０％〜８０％、約２０％〜７０％または約２０％〜６０％である。
【００２７】
いくつかの実施形態において、減少したアミラーゼの発現および／または酵素活性は、配列番号：９または配列番号：１０と約９０％を超える配列同一性を有する配列を含むα−アミラーゼタンパク質で起こる。
【００２８】
１つの実施形態において、本発明の方法は、さらに、パエニバシラス属菌の親株と比較してフサリシジンのレベルが増加した突然変異体分離株を同定するために、突然変異体分離株におけるフサリシジンレベルを定量することを含む。
【００２９】
ある実施形態において、パエニバシラス属菌の菌株は、Ｐ．ａｇａｒｅｘｅｄｅｎｓ、Ｐ．ａｇａｒｉｄｅｖｏｒａｎｓ、Ｐ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ａｌｋａｌｉｔｅｒｒａｅ、Ｐ．ａｌｖｅｉ、Ｐ．ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ａｎａｅｒｉｃａｎｕｓ、Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ、Ｐ．ａｓｓａｍｅｎｓｉｓ、Ｐ．ａｚｏｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｐ．ａｚｏｔｏｆｉｘａｎｓ、Ｐ．ｂａｒｃｉｎｏｎｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｐ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｐ．ｃａｍｐｉｎａｓｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｃｈｉｎｊｕｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｃｈｉｔｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎｕｓ、Ｐ．ｃｉｎｅｒｉｓ、Ｐ．ｃｏｏｋｉｅ、Ｐ．ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｄｅｎｄｒｉｔｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐ．ｄｕｒｕｍ、Ｐ．ｅｈｉｍｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｅｌｇｉｉ、Ｐ．ｆａｖｉｓｐｏｒｕｓ、Ｐ．ｇｌｕｃａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｇｌｙｃａｎｉｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｐ．ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｐ．ｇｒａｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐ．ｈｏｄｏｇａｙｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｉｌｌｉｎｏｉｓｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｊａｍｉｌａｅ、Ｐ．ｋｏｂｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｋｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐ．ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｋｒｉｂｂｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐ．ｌａｒｖａｅ、Ｐ．ｌａｕｔｕｓ、Ｐ．ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ、Ｐ．ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｐ．ｍａｃｑｕａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｍｅｎｄｅｌｉｉ、Ｐ．ｍｏｔｏｂｕｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｐ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐ．ｎｏｖ．ｓｐｅｃ．ｅｐｉｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｏｄｏｒｉｆｅｒ、Ｐ．ｐａｂｕｌｉ、Ｐ．ｐｅｏｒｉａｅ、Ｐ．ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ、Ｐ．ｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅ、Ｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ  ｓｓｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ  ｓｓｐ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｐ．ｐｏｐｉｌｌｉａｅ、Ｐ．ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ．ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ、Ｐ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｐ．ｓｔｅｌｌｉｆｅｒ、Ｐ．ｔａｉｃｈｕｎｇｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｔｅｒｒａｅ、Ｐ．ｔｈｉａｍｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｔｙｌｏｐｉｌｉ、Ｐ．ｔｕｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｖａｌｉｄｕｓ、Ｐ．ｖｏｒｔｅｘ、Ｐ．ｖｕｌｎｅｒｉｓ、Ｐ．ｗｙｎｎｉｉまたはＰ．ｘｙｌａｎｉｌｙｔｉｃｕｓである。
【００３０】
別の実施形態では、パエニバシラス属菌の菌株はＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ  ｓｓｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ  ｓｓｐ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎｏｖ．ｓｐｅｃ．ｅｐｉｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓまたはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｖｅｉである。さらに別の実施形態では、パエニバシラス属菌の菌株はＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒａｅである。
【００３１】
特定の側面において、パエニバシラス属菌の菌株はフサリシジンを生産するパエニバシラス属菌の菌株である。
【００３２】
フサリシジンを生産するパエニバシラス属菌の菌株の例は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ  ｓｓｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ  ｓｓｐ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎｏｖ．ｓｐｅｃ．ｅｐｉｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓおよびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｖｅｉを含むが、これに限定されない。。
【００３３】
さらに他の実施態様において、本発明は、パエニバシラス属菌の親株と比較して、液体培養において粘度が減少したパエニバシラス属菌の突然変異体誘導株を作製する方法に関するものであり、この方法は、パエニバシラス属菌の親株を突然変異誘発して突然変異体分離株を作製すること；突然変異体分離株およびパエニバシラス属菌の親株を約１％（ｗ／ｖ）〜約４０％（ｗ／ｖ）の間の濃度で糖を含む固体培地上で培養すること、ここでパエニバシラス属菌の親株が固体培地上でムコイド形態を有しており；固体培地上の突然変異体分離株を目視によりスクリーニングして、液体培養における粘度減少の指標である非ムコイド形態を有するパエニバシラス属菌の突然変異体誘導株を同定すること；および同定されたパエニバシラス属菌の突然変異体誘導株の発酵産物を作製することを含む。ある局面において、突然変異誘発は、パエニバシラス属菌の親株の化学的突然変異誘発を含む。
【００３４】
一態様では、本発明は、開示された方法で同定されたパエニバシラス属菌の突然変異体誘導株を含む発酵産物を提供する。別の局面において、発酵産物は、その殺真菌活性および／または殺細菌活性を増加させるために、パエニバシラス属菌の突然変異体誘導株由来の全培養液の培養液濃縮物を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態において、本発明は、植物を処理して病害を防除する方法に関し、この方法は、有効量の本明細書に開示される組成物または本明細書に開示される発酵産物を植物に、植物の一部におよび／または植付け場所に適用することを含む。
【００３６】
１つの実施形態において、組成物は、ヘクタール当たり約１×１０４〜約１×１０１４コロニー形成単位（ＣＦＵ）で、またはヘクタール当たり約０．１ｋｇ〜約２０ｋｇの発酵固形物で適用される。
【００３７】
ある局面では、植物病は真菌類によって引き起こされる。ある局面では、植物の病害はうどんこ病またはべと病である。別の局面において、当該真菌は、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｌａｇｅｎａｒｉｕｍ、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｎｅｃａｔｏｒ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ、Ｚｙｍｏｓｅｐｔｏｒｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｒｙｐｔｏｇｅａ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ  ｖｉｔｉｃｏｌａ、Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａ、Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃｕｂｅｎｓｉｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ、Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｌｉｇｉｎｅａ、Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓ  ｃｕｃｕｍｅｒｉｓ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｓｅｇｅｔｕｍ  ｖａｒ．  ａｖｅｎａｅ、Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓおよびＰｕｃｃｉｎｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉｎａからなる群から選択される。
【００３８】
他の局面では、植物病は細菌によって引き起こされる。ある局面において、細菌は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅおよびＥｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａからなる群より選択される。
【００３９】
さらに他の実施形態において、本発明は、有用な植物における植物病原性生物を防除するための、本明細書に開示される組成物または本明細書に開示される発酵産物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株のＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株由来の株系統を示す。
【図２】図２は、スクロースを含む固体寒天培地で増殖したムコイドコロニー表現型を有するＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．株を、スクロースを含まない固体寒天培地で増殖したムコイドコロニー表現型を欠く同じＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．株と比較したものである。Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．株は以下の通りである：（１）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒａｅ  株Ａ；（２）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｅｎｓｉｓ  株Ｂ；（３）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２；（４）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ  株Ｃ；（５）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ  株Ｄ；および（６）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｏｒｉａｅ  株Ｅ。
【図３】図３は、スクロースを添加した固体寒天培地上のムコイドおよび非ムコイド単離株の混合集団からのコロニーを示す。
【図４】図４は、スクロース含有固体寒天培地上の、（１）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２および（４）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９のムコイドコロニー表現型を、（２）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４および（３）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６の非ムコイド表現型と対比させたものである。すべての菌株は、スクロースを含まない対照固体寒天培地上で非ムコイド表現型を示す。
【図５】図５は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株の遠心後の発酵ブロスのペレッティングを示す。スクロース含有固体寒天培地上で非ムコイド表現型を示す株は、より小さい充填細胞容積（ＰＣＶ）でより緻密なペレットを形成する傾向がある。
【図６Ａ】図６Ａは、非ムコイド性コロニー表現型を有するパエニバシラス属菌の菌株において同定されたｄｅｇＳおよびｄｅｇＵ遺伝子におけるＳＮＰを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株（配列番号１）およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株（配列番号：２）由来のＤｅｇＵアミノ酸配列のアラインメントと、当該タンパク質のレシーバドメインおよびＤＮＡ結合ドメインにおいて同定されたＳＮＰを示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株（配列番号３）およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株（配列番号：４）由来のＤｅｇＳアミノ酸配列のアラインメントと、当該タンパク質の単一結合ドメインおよびＡＴＰアーゼドメインにおいて同定されたＳＮＰを示す。
【図７】図７は、スクロース含有固体寒天培地上でのパエニバシラス属菌の菌株による非ムコイド性コロニー表現型をもたらすｄｅｇＳおよびｄｅｇＵの破壊を示す。パエニバシラス属菌の菌株は、（１）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株、（２）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株、（３）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株  ｄｅｇＳ：：ｋａｎＲ、（４）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株  ｄｅｇＳｄｅｇＵ：ｋａｎＲ、および（５）Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒａｅ  株Ｆである。
【図８Ａ】図８Ａは、７２時間にわたって攪拌速度２５０ｒｐｍで増殖させたＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株（親株）およびＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株（後代株）の液体培養における粘度（実線）およびフサリシジンＡ（破線）の測定値を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、７２時間にわたって攪拌速度３００ｒｐｍで増殖させたＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株（親株）およびＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株（後代株）の液体培養における粘度（実線）およびフサリシジンＡ（破線）の測定値を示す。
【図９Ａ】図９Ａおよび９Ｂは、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株（親株）およびＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株（後代株）の液体培養において４０時間および４８時間の時点で評価した２つのα−アミラーゼ（すなわち、「α−アミラーゼ＃１」および「α−アミラーゼ＃２」）の相対的なタンパク質発現を示す。
【図９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂは、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株（親株）およびＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株（後代株）の液体培養において４０時間および４８時間の時点で評価した２つのα−アミラーゼ（すなわち、「α−アミラーゼ＃１」および「α−アミラーゼ＃２」）の相対的なタンパク質発現を示す。
【図１０】図１０は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株（親株）およびＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株（後代株）の液体培養からの無細胞上清におけるアミラーゼ活性の指標としての、培地中の多糖類からのグルコースの放出を示す。
【図１１】図１１は、４０時間の時点で０ｇ／Ｌグルコース（すなわち、対照）、２ｇ／Ｌグルコース、５ｇ／Ｌグルコースまたは１０ｇ／Ｌグルコースを添加し、６時間増殖を継続させた、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株（親株）およびＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株（後代株）の液体培養物の粘度測定を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本明細書に記載される微生物および特定の菌株は、特記しない限り、全て自然界から分離され、例えば振盪フラスコ培養のような人工的条件下や、生物活性代謝産物産生を最大にするためのバイオリアクターのようなスケールアップされた製造工程を通して増殖される。このような条件下での増殖は菌株の「家畜化」をひき起こす。一般に、このような「家畜化」された株は、自然環境で見られる淘汰圧の影響を受けず、むしろ人為的な淘汰圧の影響を受けやすい均質な集団として培養されるという点で、自然界で見られる対応物とは異なる。
【００４２】
本発明の微生物またはその培養物もしくは単離物は、「単離された」または「生物学的に純粋な」形態であると記載することができる。これらの用語は、微生物が環境或いは１つ以上の構成物、細胞またはその他のものから分離されたことを意味するものであり、自然またはその他の方法で発見された場合に関連している可能性がある。微生物がどの程度精製されたかを示すために「単離された」または「生物学的に純粋な」という用語を理解すべきではない。しかしながら、１つの実施形態において、微生物の単離物または培養物は、優勢な本発明の微生物を含む。
【００４３】
本願において、本明細書および請求の範囲の中で用いられている「含む」との動詞およびその活用形は、その非限定的な意味で用いられるものであって、その言葉の以下に挙げる項目を含むが、具体的に言及されていない項目を除外するものではない。さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素への言及は、要素の１つおよび１つのみが存在することを明らかに必要とする文脈を除き、要素の１つ以上が存在する可能性を排除するものではない。したがって、通常、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は「少なくとも１つ」を意味する。
【００４４】
本明細書中で使用される「塩基性残基」はアルギニン、リジンまたはヒスチジンであり、「酸性残基」はグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、「極性残基」はセリン、トレオニン、システイン、グルタミン、またはアスパラギンであり、「疎水性残基」はメチオニン、プロリン、ロイシン、イソロイシンまたはバリンであり、「芳香族残基」はフェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシンであり、「小残基」はグリシンまたはアラニンである。
【００４５】
いくつかの実施形態において、突然変異体ＤｅｇＵおよび／または突然変異体ＤｅｇＳを含むパエニバシラス属菌の菌株は、野生型ＤｅｇＵおよび野生型ＤｅｇＳを含むパエニバシラス属菌の菌株の液体培養と比較して粘度が低下した液体培養物を産生する。特定の局面において、粘度の減少は、変異体ＤｅｇＵおよび／または変異体ＤｅｇＳを含むパエニバシラス属菌の菌株、および野生型ＤｅｇＵおよび野生型ＤｅｇＳを含むパエニバシラス属菌の菌株を、定常期まで同じ液体培養培地中で別々に増殖させ、各液体培養の粘度を測定することによって計測される。粘度は、実施例２に概略を示した方法を含め、当該技術分野で知られている任意の方法によって測定することができる。野生型ＤｅｇＵおよび野生型ＤｅｇＳの例には、それぞれ配列番号１および配列番号：２として、ならびに配列番号３および配列番号：４として提示されるアミノ酸配列が含まれる。
【００４６】
本明細書中で使用される、用語「ムコイド」および「ムコイド形態」は、微生物コロニーの表現型を意味し、当該コロニーは、明確に規定された丸い縁部および光学顕微鏡下での光沢のある外観を有する。さらに、ムコイド形態を示す微生物コロニーは、より背が高く、三次元的に丸い傾向がある。ムコイド性コロニーの例を図３に示す。
【００４７】
本明細書中で使用される、用語「非ムコイド」および「非ムコイド形態」は、微生物コロニーの表現型を意味し、当該コロニーは、あまり明確ではない、ランダムな形の縁部および光学顕微鏡下での鈍い外観を有する。非ムコイド性コロニーは３次元的に平らになる傾向がある。非ムコイド性コロニーの例も図３に提示する。
【００４８】
約１％（ｗ／ｖ）〜約４０％（ｗ／ｖ）の濃度の糖を含む固体寒天培地上では、ムコイド形態と非ムコイド形態がより容易に識別される。ある局面において、糖濃度は約１％（ｗ／ｖ）〜約３０％（ｗ／ｖ）、約１％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）、約５％（ｗ／ｖ）〜約４０％（ｗ／ｖ）、約５％（ｗ／ｖ）〜約３０％（ｗ／ｖ）、または約５％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）の間にある。一態様では、固体寒天培地中の糖は、約５％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）の濃度である。
【００４９】
いくつかの実施形態において、固体培地中の炭素対窒素比は、約１０：１〜約１０００：１、約１０：１〜約７５０：１、約１０：１〜約５００：１、約１０：１〜約２５０：１、約１０：１〜約１００：１、約１０：１〜約７５：１、約１０：１〜約５０：１、約１０：１〜約２５：１、約１：１〜約１００：１、約１：１〜約７５：１、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１の間である。別の局面において、固体培地中の炭素対窒素比は、約１０：１〜約１０００：１、約１０：１〜約７５０：１、約１０：１〜約５００：１、約１０：１〜約２５０：１、約１０：１〜約１００：１の間である。ある局面において、固体培地中の炭素対窒素比は、約１０：１から約１０００：１の間である。
【００５０】
１つの実施形態において、パエニバシラス属菌の親株と比較して液体培養において粘度が減少したパエニバシラス属菌の突然変異体誘導株を同定するための開示された方法において使用される固体培地および／または液体培地は、パエニバシラス属菌細胞の増殖を補助する任意の糖を含む。
【００５１】
特定の局面において、糖は、スクロース、マルトデキストリン、デンプン、コーンシロップ固形物、フルクトース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、キシロース、キシリトール、イヌリン、ソルビトール、フコース、糖蜜、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。別の局面において、糖は、スクロース、デンプン、コーンシロップ固形物、マルトデキストリン、フルクトース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、およびこれらの組合せからなる群より選択される。別の態様では、糖は、スクロース、マルトデキストリン、フルクトース、およびそれらの組合せからなる群より選択される。さらに別の態様では、糖は、スクロースまたはマルトデキストリンである。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本発明は、視覚スクリーニングを用いて、パエニバシラス属菌の親株と比較して、液体培養において粘度が減少したパエニバシラス属菌の突然変異体誘導株を同定する方法に関する。本明細書中で使用される「視覚スクリーニング」および「視覚的スクリーニング」という用語は、手動或いは機械またはロボットで自動的に実施するかどうかにかかわらず、固体培地上で増殖させた微生物コロニーの大きさ、形状、および／または光沢（すなわち、テカリ）を分析する、あらゆるプロセスを意味する。いくつかの局面において、固体培地は固体寒天培地である。
【００５３】
他の実施態様において、本発明は、パエニバシラス属菌の親株と比較して液体培養において粘度が減少したパエニバシラス属菌の突然変異体誘導株を同定する方法に関するものであり、この方法は、パエニバシラス属菌の親株を突然変異誘発して突然変異体分離株を産生すること；突然変異体分離株およびパエニバシラス属菌の親株を、約１％（ｗ／ｖ）〜約４０％（ｗ／ｖ）の濃度の糖を含む液体培地中で培養すること；および液体培地中の突然変異体分離株の粘度および／または充填細胞容積を測定して、パエニバシラス属菌の親株と比較して液体培養において粘度が減少したパエニバシラス属菌の突然変異体誘導株を同定することを含む。
【００５４】
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株は、広域スペクトル抗真菌活性を有するフサリシジンおよびフサリシジン様化合物のユニークなグループの生産菌として以前に同定された（ＷＯ２０１６／１５４２９７）。
【００５５】
一態様では、本発明のパエニバシラス属菌の菌株は、以下のいずれか１つから選ばれる：Ｐ．ａｇａｒｅｘｅｄｅｎｓ、Ｐ．ａｇａｒｉｄｅｖｏｒａｎｓ、Ｐ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ａｌｋａｌｉｔｅｒｒａｅ、Ｐ．ａｌｖｅｉ、Ｐ．ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ａｎａｅｒｉｃａｎｕｓ、Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ、Ｐ．ａｓｓａｍｅｎｓｉｓ、Ｐ．ａｚｏｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｐ．ａｚｏｔｏｆｉｘａｎｓ、Ｐ．ｂａｒｃｉｎｏｎｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｐ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｐ．ｃａｍｐｉｎａｓｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｃｈｉｎｊｕｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｃｈｉｔｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎｕｓ、Ｐ．ｃｉｎｅｒｉｓ、Ｐ．ｃｏｏｋｉｅ、Ｐ．ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｄｅｎｄｒｉｔｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐ．ｄｕｒｕｍ、Ｐ．ｅｈｉｍｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｅｌｇｉｉ、Ｐ．ｆａｖｉｓｐｏｒｕｓ、Ｐ．ｇｌｕｃａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｇｌｙｃａｎｉｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｐ．ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｐ．ｇｒａｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐ．ｈｏｄｏｇａｙｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｉｌｌｉｎｏｉｓｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｊａｍｉｌａｅ、Ｐ．ｋｏｂｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｋｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐ．ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｋｒｉｂｂｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐ．ｌａｒｖａｅ、Ｐ．ｌａｕｔｕｓ、Ｐ．ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ、Ｐ．ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｐ．ｍａｃｑｕａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｍｅｎｄｅｌｉｉ、Ｐ．ｍｏｔｏｂｕｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｐ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐ．ｎｏｖ．ｓｐｅｃ．ｅｐｉｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｏｄｏｒｉｆｅｒ、Ｐ．ｐａｂｕｌｉ、Ｐ．ｐｅｏｒｉａｅ、Ｐ．ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ、Ｐ．ｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅ、Ｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ  ｓｓｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ  ｓｓｐ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｐ．ｐｏｐｉｌｌｉａｅ、Ｐ．ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ．ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ、Ｐ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｐ．ｓｔｅｌｌｉｆｅｒ、Ｐ．ｔａｉｃｈｕｎｇｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｔｅｒｒａｅ、Ｐ．ｔｈｉａｍｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐ．ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｔｙｌｏｐｉｌｉ、Ｐ．ｔｕｒｉｃｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｖａｌｉｄｕｓ、Ｐ．ｖｏｒｔｅｘ、Ｐ．ｖｕｌｎｅｒｉｓ、Ｐ．ｗｙｎｎｉｉおよびＰ．ｘｙｌａｎｉｌｙｔｉｃｕｓ。
【００５６】
別の局面において、本発明のパエニバシラス属菌の菌株は、以下のいずれか１つから選択される：Ｐ．ｔｅｒｒａｅ、Ｐ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａまたはＰ．ｐｅｏｒｉａｅ。一態様では、本発明のパエニバシラス属菌の菌株はＰ．ｔｅｒｒａｅである。
【００５７】
１つの実施形態において、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株またはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株の突然変異体株が提供される。当該「突然変異体」は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株またはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株に由来する遺伝的変異体を指す。１つの実施形態において、当該突然変異体は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株またはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株の同定（機能）特性の１つ以上または全てを有する。特定の例において、当該突然変異体またはその発酵産物は、少なくともその親株であるＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株またはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株と同様に、機能的な同定特性として、真菌、卵菌および／または細菌を防除する。このような突然変異体は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株またはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株と、約８５％超、約９０％超、約９５％超、約９８％超、または約９９％超の配列同一性を有するゲノム配列を有する遺伝的変異体であり得る。突然変異体は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株またはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株の細胞を化学物質もしくは放射線照射で処理するか、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株またはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株の細胞集団からの自然突然変異体（ファージ耐性や抗生物質耐性突然変異体など）を選択するか、以下に記載するようにゲノムシャフリングをするか、または当技術分野で実践されている他の公知の方法により得ることができる。
【００５８】
パエニバシラス株間のゲノムシャフリングは、プロトプラスト融合とよばれる過程を用いることによって容易にすることができる。この過程は栄養細菌細胞からプロトプラストが形成されることから始まる。典型的にはリゾチームと浸透圧安定剤を用いてペプチドグリカン細胞壁を除去すると、プロトプラストが形成される。この過程は光学顕微鏡下での球形の細胞の出現により可視化される。ＰＥＧ、ポリエチレングリコールを加えると、プロトプラスト間の融合が誘導され、２つ以上の細胞の遺伝的内容物が接触し、組換とゲノムシャフリングが促進される。融合細胞はその後再分裂し、固体の増殖培地上で回収される。回復の過程で、プロトプラストはペプチドグリカン細胞壁を再構築し、桿菌の形に戻る。Ｓｃｈａｅｆｆｅｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、ｖｏｌ．７３、６：２１５１−２１５５（１９７６）を参照されたい。
【００５９】
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株またはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株およびその突然変異体は、広範囲の植物病原体に対して活性を有する。ある局面において、当該菌株は、キュウリ炭疽病、キュウリうどんこ病、小麦葉さび病、大麦うどんこ病、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）およびボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）などの真菌類；トマト疫病、キュウリべと病およびアブラナ科べと病などのオオミセス（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）類；および／またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）およびエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）などの細菌に対して活性を有する。
【００６０】
特定の局面において、本発明のパエニバシラス属菌の菌株に特徴的な突然変異体ＤｅｇＵおよび／または突然変異体ＤｅｇＳは、保存的アミノ酸置換を含む。例えば、配列番号１〜４の配列内の保存的アミノ酸置換が考えられる。保存的アミノ酸置換の例は、塩基性アミノ酸（すなわち、アルギニン、リジンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（すなわち、グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（すなわち、セリン、トレオニン、システイン、グルタミン、およびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（すなわち、メチオニン、プロリン、ロイシン、イソロイシンおよびバリン）、芳香族アミノ酸（すなわち、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）および小アミノ酸（すなわち、グリシンおよびアラニン）のグループ内である。一般的に比活性を変化させないアミノ酸置換は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｈ．ＮｅｕｒａｔｈおよびＲ．Ｌ．Ｈｉｌｌ、１９７９、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されており、ここにその全体が引用することにより組み込まれる。よく起こる保存的置換には、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／ＩｌｅおよびＬｅｕ／Ｖａｌがある。
【００６１】
本発明はまた、植物または植物部分、例えば葉、茎、花、果実、根もしくは種子に対して、或いは植物または植物部分が生育する場所、例えば土壌に対して、開示されたパエニバシラス属菌の菌株もしくはその突然変異体、またはそれらの無細胞調製物もしくは代謝産物を施用することによって、植物病を防除するために植物を処理する方法を包含する。
【００６２】
本発明による方法では、開示されたパエニバシラス属菌の菌株またはその殺真菌性突然変異体を含む組成物を、植物を成長させるために使用される任意のタイプの媒体（例えば土壌、バーミキュライト、細断したダンボールおよび水）で成長させた任意の植物または任意の植物の任意の部分に対して施用することができるか、或いは例えばランまたはビカクシダのような空中で成長する植物または植物の部分に施用することができる。本発明の組成物は、例えば、散布、噴霧、気化、ばら撒き、散粉、湛水、噴水、散水、注入または燻蒸によって適用することができる。すでに示したように、農業、園芸、森林、植林、果樹園、苗床、有機栽培作物、芝草および都市環境など、対象とする植物が位置する任意の所望の場所で施用を行うことができる。
【００６３】
本発明の組成物は、開示されたパエニバシラス属菌の菌株またはそれに由来する殺真菌性突然変異体（株）を、当該技術分野で周知の方法に従って培養することにより得ることができ、これには以下の実施例に記載されている培地や方法を用いることが含まれる。従来の大規模微生物培養プロセスには、水中発酵、固体発酵または液体表面培養が含まれる。発酵の終わりに向かって、栄養分が枯渇すると、細胞は成長期から胞子形成期への移行を開始する。その結果、発酵の最終産物は主に胞子、代謝産物および残留発酵培地である。胞子形成はパエニバシラスの自然の生活環の一部であり、一般に栄養制限に応答して細胞によって開始される。発酵は、高レベルのコロニー形成単位を得て、胞子形成を促進するように設計される。発酵に起因する培養培地中の細菌細胞、胞子および代謝産物は、遠心分離、タンジェント流ろ過、深層ろ過およびエヴァポレーションのような従来の工業的方法によって直接または濃縮して使用することができる。
【００６４】
本発明の組成物には発酵産物が含まれる。いくつかの実施形態において、濃縮発酵培養液（ブロス）は、残留発酵ブロスおよび代謝産物を除去するために、例えばダイアフィルトレーション工程を介して洗浄される。本明細書中で使用される用語「培養液濃縮物」は、上記のように従来の工業的方法によって濃縮されたが、液体形態のままである全培養液（発酵ブロス）を指す。本明細書中で使用される用語「発酵固体」は、発酵ブロスが乾燥された後に残る固体物質を指す。本明細書中で使用される用語「発酵産物」は、全培養液、培養液濃縮物および／または発酵固体を指す。本発明の組成物には、発酵産物が含まれる。
【００６５】
発酵ブロスまたは培養液濃縮物は、噴霧乾燥、凍結乾燥、トレー乾燥、流動床乾燥、ドラム乾燥またはエヴァポレーションのような従来の乾燥プロセスまたは方法を用いて、担体の添加の有無にかかわらず乾燥することができる。
【００６６】
得られた乾燥生成物は、特定の粒径または物理的形式を達成するために、粉砕または造粒などによりさらに処理され得る。後述する担体を乾燥後に加えてもよい。
【００６７】
本発明の菌株の発酵ブロスの無細胞調製物は、発酵ブロスの抽出、遠心分離および／または濾過など、当該技術分野で公知の任意の手段によって得ることができる。当業者は、細胞を除去するために用いられる技術（例えば、遠心の速度）に依存して、いわゆる無細胞調製物は細胞が全くないのではなく、むしろ大部分が無細胞または本質的に無細胞であり得ることを認識するであろう。得られた無細胞調製物は、植物または植物成長媒体への施用を助ける成分と共に乾燥および／または処方され得る。発酵ブロスのための上記の濃縮法と乾燥技術は無細胞調製物にも適用可能である。
【００６８】
１つの実施形態において、発酵産物は、培養液１ｍLあたり、少なくとも約１×１０４コロニー形成単位（ＣＦＵ）の微生物（例えば、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株またはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株或いはその殺真菌性突然変異株）を含む。別の実施形態では、発酵産物は、培養液１ｍＬあたり、少なくとも約１×１０５コロニー形成単位（ＣＦＵ）の微生物を含む。別の実施形態では、発酵産物は、培養液１ｍＬあたり、少なくとも約１×１０６ＣＦＵの微生物を含む。さらに別の実施形態では、発酵産物は、培養液１ｍＬあたり、少なくとも約１×１０７ＣＦＵの微生物を含む。別の実施形態では、発酵産物は、培養液１ｍＬあたり、少なくとも約１×１０８ＣＦＵの微生物を含む。別の実施形態では、発酵産物は、培養液１ｍＬあたり、少なくとも約１×１０９ＣＦＵの微生物を含む。別の実施形態では、発酵産物は、培養液１ｍＬあたり、少なくとも約１×１０１０ＣＦＵの微生物を含む。別の実施形態では、発酵産物は、培養液１ｍＬあたり、少なくとも約１×１０１１ＣＦＵの微生物を含む。
【００６９】
本発明の組成物はそのままで、或いはその特定の物理的および／または化学的性質に従って、例えばエアロゾル、カプセル懸濁液、冷霧濃縮液、温霧濃縮液、カプセル化顆粒、細粒、種子処理のための濃厚フロアブル、使用準備済み溶液、粉末剤、乳化性濃縮物、水中油乳剤、油中水乳剤、マクロ顆粒、ミクロ顆粒、油分散性粉末、油混和性濃厚フロアブル、油混和性液、ガス（加圧下）、ガス発生製品、泡沫、ペースト、農薬被覆種子、濃厚懸濁液、油分散液、濃厚ＳＥ剤、可溶性濃縮物、懸濁剤、水和剤、水溶性粉末、粉剤および粒剤、水溶性および水分散性顆粒または錠剤、種子処理のための水溶性および水分散性粉末、有効成分を浸透させた水和剤、天然物および合成物質、並びに高分子物質および種子のコーティング材によるマイクロカプセル、並びにＵＬＶ冷霧および温霧製剤などの製剤または当該製剤から調製される使用形態の形で使用できる。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は液体製剤である。液体製剤の非限定的な例としては、濃厚懸濁液および油分散剤が挙げられる。他の実施形態では、本発明の組成物は固体製剤である。固形製剤の非限定的な例としては、凍結乾燥粉末および噴霧乾燥粉末が挙げられる。
【００７１】
すべての植物および植物部分は、本発明に従って処理することができる。これに関して、植物は、望ましいおよび望ましくない野生植物または作物植物（天然に存在する作物植物を含む）のような、全ての植物および植物集団を意味するものとして理解される。作物植物は、伝統的な育種および最適化方法またはバイオテクノロジーおよび組換方法、またはこれらの方法の組合せによって得ることができる植物であって、遺伝子組換植物および植物育種家の権利によって保護されるかまたは保護されない植物品種を含む。植物の部分は、新芽、葉、花、根など、植物のすべての地上部と地下部の部分と器官を意味すると理解される。たとえば、葉、針葉、柄、茎、花、子実体、果実と種子、根、塊茎、根茎などを挙げ得る。植物部分には、挿し木、塊茎、根茎、接ぎ穂および種子などの作物要素や栄養繁殖要素、生殖繁殖要素も含まれる。
【００７２】
すでに言及したように、全ての植物およびその部分は、本発明に従って処理することができる。好ましい実施形態では、野生で生育するか、またはハイブリダイゼーションまたはプロトプラスト融合などの伝統的な生物学的育種法によって得られる植物種および植物品種、およびそれらの部分が処理される。さらに好ましい実施形態では、適宜、従来の方法（遺伝子組換生物）と組み合わせて、組換方法によって得られている遺伝子組換植物および植物品種、ならびにそれらの部分を処理する。「部分」または「植物の部分」または「植物部分」という用語は、前述のように説明されている。各々の場合に市販されている、または使用されている植物品種の植物は、特に本発明に従って処理されることが好ましい。植物品種は、伝統的な育種、突然変異誘発または組換ＤＮＡ技術の両方によって育種されてきた、新規な形質を有する植物を意味すると理解される。これらは、品種（ｖａｒｉｅｔｉｅｓ）、種（ｒａｃｅｓ）、生物型および遺伝子型の形態をとることがある。
【００７３】
本発明に従った植物および植物部品の組成物による処理は、直接的に、或いは環境、生息または貯蔵空間に対して、例えば浸漬、散布、噴霧、潅漑、気化、散粉、煙霧、ばら撒き、泡状化、塗布、拡散（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）、注入、潅注（ｄｒｅｎｃｈｉｎｇ）、点滴潅漑および、繁殖要素の場合（特に種子の場合）には、乾式種子処理方法、湿式種子処理方法、スラリー処理方法、外皮形成、一つ以上の被膜等によるコーティングなどの一般的な処理方法を用いて実施される。さらに、微量散布法で活性物質を施用したり、活性物質製剤や活性物質そのものを土壌に注入することも可能である。
【００７４】
植物の好ましい直接処理は、葉面散布処理である。すなわち、本発明による組成物を葉面に施用し、処理頻度および施用率を問題の病原体の感染圧に合わせることが可能である。
【００７５】
システミック的に活性な化合物の場合、本発明による組成物は根系を経て植物に到達する。この場合、植物の処理は、本発明による組成物が植物の環境に作用することを可能にすることによって行われる。これは、例えば、土壌中または栄養液中に組込むためのドレンチ処理（すなわち、生育場所（例えば、土壌または水耕システム）に本発明による組成物の液体形態を含浸させること）によってか、または土壌施用（すなわち、生育場所に本発明による組成物を固体形態（例えば、顆粒の形）で組込むこと）により行うことができる。水稲栽培の場合には、本発明による組成物を、固体使用形態（例えば、顆粒の形態）で水田に計量することによっても行うことができる。
【００７６】
好ましい植物は、有用植物、観賞植物、芝、一般的に公共および家庭部門で観賞植物として採用される樹木および林業樹木の群からのものである。林業樹木は、木材、セルロース、紙および木の一部から作られる産物を生産するための樹木を含む。
【００７７】
ここでいう「有用植物」とは、食料、飼料、燃料を得るための、または工業用の植物として使用される作物をいう。
【００７８】
本発明の組成物および方法で処理および／または改良することができる有用植物には、例えば以下のものが含まれる：芝；ブドウ；穀物、例えば小麦、大麦、ライ麦、オート麦、米、トウモロコシおよびキビ／モロコシ；ビート類、例えばテンサイおよび飼料ビート；果実類、例えば仁果類、核果類およびソフトフルーツ、例えばリンゴ、ナシ、プラム、モモ、アーモンド、チェリーおよびベリー類（例えばイチゴ、ラズベリー、ブラックベリー）；マメ科植物、例えば豆、レンチル、エンドウ、大豆；油科作物、例えばナタネ、マスタード、ケシ、オリーブ、ヒマワリ、ココナツ、トウゴマ、カカオおよびピーナツ；ウリ類、例えばカボチャ／スカッシュ、キュウリおよびメロン類；繊維植物、例えばワタ、亜麻、大麻およびジュート；柑橘類、例えばオレンジ、レモン、グレープフルーツおよびミカン；野菜類、例えばホウレンソウ、レタス、アスパラガス、キャベツ類、ニンジン、オニオン、トマト、ジャガイモ、ピーマン；クスノキ科植物、例えばアボカド、セイロンニッケイ、ショウノウ；または他の植物、例えばタバコ、ナッツ、コーヒー、ナス、サトウキビ、茶、コショウ、グレープ、ホップ、バナナ、ゴムの木および観賞植物、例えば花、低木、落葉樹および針葉樹。この例示は限定的ではない。
【００７９】
以下の植物は、本発明の組成物および方法を適用するのに特に適した標的作物であると考えられる：ワタ、ナス、芝、仁果類、核果類、ソフトフルーツ、トウモロコシ、小麦、大麦、キュウリ、タバコ、ブドウ、米、穀類、ナシ、豆類、大豆、ナタネ、トマト、ピーマン、メロン、キャベツ、ジャガイモおよびリンゴ。
【００８０】
本発明による方法に従って改善され得る樹木の例としては、モミ属種（Ａｂｉｅｓ  ｓｐ．）、ユーカリ属種（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｐ．）、トウヒ属種（Ｐｉｃｅａ  ｓｐ．）、マツ属種（Ｐｉｎｕｓ  ｓｐ．）、トチノキ属種（Ａｅｓｃｕｌｕｓ  ｓｐ．）、プラタナス属種（Ｐｌａｔａｎｕｓ  ｓｐ．）、シナノキ属種（Ｔｉｌｉａ  ｓｐ．）、カエデ属種（Ａｃｅｒ  ｓｐ．）、ツガ属種（Ｔｓｕｇａ  ｓｐ．）、トネリコ属種（Ｆｒａｘｉｎｕｓ  ｓｐ．）、ナナカマド属種（Ｓｏｒｂｕｓ  ｓｐ．）、マカンバ属種（Ｂｅｔｕｌａ  ｓｐ．）、サンザシ属種（Ｃｒａｔａｅｇｕｓ  ｓｐ．）、ニレ属種（Ｕｌｍｕｓ  ｓｐ．）、コナラ属種（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｓｐ．）、ブナ属種（Ｆａｇｕｓ  ｓｐ．）、ヤナギ属種（Ｓａｌｉｘ  ｓｐ．）、ポプラ属種（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｓｐ．）が挙げられる。
【００８１】
本発明による方法に従って改良できる好ましい樹木は、樹木種トチノキ属からのＡ．ヒポカスタナム（Ａ．ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ）、Ａ．パリフロラ（Ａ．ｐａｒｉｆｌｏｒａ）、Ａ．カルネア（Ａ．ｃａｒｎｅａ）；樹木種プラタナス属からのＰ．アセリフロラ（Ｐ．ａｃｅｒｉｆｌｏｒａ）、Ｐ．オシデンタリス（Ｐ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、Ｐ．ラセモサ（Ｐ．ｒａｃｅｍｏｓａ）；樹木種トウヒ属からのＰ．アビエス（Ｐ．ａｂｉｅｓ）；樹木種マツ属からのＰ．ラジアート（Ｐ．ｒａｄｉａｔｅ）、Ｐ．ポンデロサ（Ｐ．ｐｏｎｄｅｒｏｓａ）、Ｐ．コントルタ（Ｐ．ｃｏｎｔｏｒｔａ）、Ｐ．シルベストル（Ｐ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ）、Ｐ．エリオッティ（Ｐ．ｅｌｌｉｏｔｔｉｉ）、Ｐ．モンテコラ（Ｐ．ｍｏｎｔｅｃｏｌａ）、Ｐ．アルビカウリス（Ｐ．ａｌｂｉｃａｕｌｉｓ）、Ｐ．レジノサ（Ｐ．ｒｅｓｉｎｏｓａ）、Ｐ．パルストリス（Ｐ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、Ｐ．タエダ（Ｐ．ｔａｅｄａ）、Ｐ．フレキシリス（Ｐ．ｆｌｅｘｉｌｉｓ）、Ｐ．ジェフレギ（Ｐ．ｊｅｆｆｒｅｇｉ）、Ｐ．バクシアナ（Ｐ．ｂａｋｓｉａｎａ）、Ｐ．ストロベス（Ｐ．ｓｔｒｏｂｅｓ）；樹木種ユーカリ属からのＥ．グランディス（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｓ）、Ｅ．グロブルス（Ｅ．ｇｌｏｂｕｌｕｓ）、Ｅ．カマデンティス（Ｅ．ｃａｍａｄｅｎｔｉｓ）、Ｅ．ニテンス（Ｅ．ｎｉｔｅｎｓ）、Ｅ．オブリクア（Ｅ．ｏｂｌｉｑｕａ）、Ｅ．レグナンス（Ｅ．ｒｅｇｎａｎｓ）、Ｅ．ピルラルス（Ｅ．ｐｉｌｕｌａｒｕｓ）である。
【００８２】
本発明による方法に従って改良することができる特に好ましい樹木は、樹木種マツ属からのＰ．ラジアート、Ｐ．ポンデロサ、Ｐ．コントルタ、Ｐ．シルベストル、Ｐ．ストロベス；樹木種ユーカリ属からのＥ．グランディス、Ｅ．グロブルスおよびＥ．カマデンティスである。
【００８３】
本発明による方法に従って改良することができる非常に好ましい樹木は、セイヨウトチノキ（ｈｏｒｓｅ ｃｈｅｓｔｎｕｔ）、スズカケノキ科（Ｐｌａｔａｎａｃｅａｅ）、菩提樹および楓である。
【００８４】
本発明はまた、寒地型芝生および暖地型芝生を包含する任意の芝生に適用することもできる。寒地型芝生の例は、ブルーグラス（ｂｌｕｅｇｒａｓｓ）（イチゴツナギ属種（Ｐｏａ  ｓｐｐ．））、例えばケンタッキーブルーグラス（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  ｂｌｕｅｇｒａｓｓ）（ポア・プラテンシス  Ｌ．（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ  Ｌ．））、オオスズメノカタビラ（ｒｏｕｇｈ  ｂｌｕｅｇｒａｓｓ）（ポア・トリビアリス  Ｌ．（Ｐｏａ  ｔｒｉｖｉａｌｉｓ  Ｌ．））、コイチゴツナギ（Ｃａｎａｄａ  ｂｌｕｅｇｒａｓｓ）（ポア・コンプレッサ  Ｌ．（Ｐｏａ  ｃｏｍｐｒｅｓｓａ  Ｌ．））、スズメノカタビラ（ａｎｎｕａｌ  ｂｌｕｅｇｒａｓｓ）（ポア・アンヌア  Ｌ．（Ｐｏａ  ａｎｎｕａ  Ｌ．））、アップランドブルーグラス（ｕｐｌａｎｄ  ｂｌｕｅｇｒａｓｓ）（ポア・グラウカンタ・ガウディン（Ｐｏａ  ｇｌａｕｃａｎｔｈａ  Ｇａｕｄｉｎ））、ウッドブルーグラス（ｗｏｏｄ  ｂｌｕｅｇｒａｓｓ）（ポア・ネモラリス  Ｌ．（Ｐｏａ  ｎｅｍｏｒａｌｉｓ  Ｌ．））およびバルバスブルーグラス（ｂｕｌｂｏｕｓ  ｂｌｕｅｇｒａｓｓ）（ポア・バルボサ  Ｌ．（Ｐｏａ  ｂｕｌｂｏｓａ  Ｌ．））など；ベントグラス（Ｂｅｎｔｇｒａｓｓ）（ヌカボ属種（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｓｐｐ．））、例えばクリーピングベントグラス（ｃｒｅｅｐｉｎｇ  ｂｅｎｔｇｒａｓｓ）（アグロスティス・パルストリス  Ｈｕｄｓ．（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  Ｈｕｄｓ．））、コロニアルベントグラス（ｃｏｌｏｎｉａｌ  ｂｅｎｔｇｒａｓｓ）（アグロスティス・テニウス  Ｓｉｂｔｈ．（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｔｅｎｕｉｓ  Ｓｉｂｔｈ．））、ベルベットベントグラス（ｖｅｌｖｅｔ  ｂｅｎｔｇｒａｓｓ）（アグロスティス・カニナ  Ｌ．（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｃａｎｉｎａ  Ｌ．））、サウスジャーマンミックスドベントグラス（Ｓｏｕｔｈ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｍｉｘｅｄ  Ｂｅｎｔｇｒａｓｓ）（アグロスティス・テニウス  Ｓｉｂｔｈ．、アグロスティス・カニナ  Ｌ．およびアグロスティス・パルストリス  Ｈｕｄｓ．を包含するヌカボ属種）およびコヌカグサ（ｒｅｄｔｏｐ）（アグロスティス・アルバ  Ｌ．（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ａｌｂａ  Ｌ．））など；
【００８５】
ウシノケグサ（ｆｅｓｃｕｅ）（ウシノケグサ属種（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｓｐｐ．））、例えばレッドフェスク（ｒｅｄ  ｆｅｓｃｕｅ）（フェスツカ・ルブラ  Ｌ．ｓｐｐ．ルブラ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｒｕｂｒａ  Ｌ．ｓｐｐ．ｒｕｂｒａ））、クリーピングフェスク（ｃｒｅｅｐｉｎｇ  ｆｅｓｃｕｅ）（フェスツカ・ルブラ  Ｌ．（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｒｕｂｒａ  Ｌ．））、チューイングフェスク（ｃｈｅｗｉｎｇｓ  ｆｅｓｃｕｅ）（フェスツカ・ルブラ・コミュタタ  Ｇａｕｄ．（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｒｕｂｒａ  ｃｏｍｍｕｔａｔａ  Ｇａｕｄ．））、シープフェスク（ｓｈｅｅｐ  ｆｅｓｃｕｅ）（フェスツカ・オビナ  Ｌ．（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｏｖｉｎａ  Ｌ．））、ハードフェスク（ｈａｒｄ  ｆｅｓｃｕｅ）（フェスツカ・ロンギホリア  Ｔｈｕｉｌｌ．（（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ  Ｔｈｕｉｌｌ．））、ヘアフェスク（ｈａｉｒ  ｆｅｓｃｕｅ）（フェスツク・カピラタ  Ｌａｍ．（Ｆｅｓｔｕｃｕ  ｃａｐｉｌｌａｔａ  Ｌａｍ．））、トールフェスク（ｔａｌｌ  ｆｅｓｃｕｅ）（フェスツカ・アルンディナセア  Ｓｃｈｒｅｂ．（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ  Ｓｃｈｒｅｂ．））およびメドウフェスク（ｍｅａｄｏｗ  ｆｅｓｃｕｅ）（フェスツカ・エラノル  Ｌ．（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｅｌａｎｏｒ  Ｌ．））など；
【００８６】
ライグラス（ｒｙｅｇｒａｓｓ）（ドクムギ属種（Ｌｏｌｉｕｍ  ｓｐｐ．））、例えば一年生ライグラス（ａｎｎｕａｌ  ｒｙｅｇｒａｓｓ）（ロリウム・マルチフロラム  Ｌａｍ．（Ｌｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ  Ｌａｍ．））、ペレニアルライグラス（ｐｅｒｅｎｎｉａｌ  ｒｙｅｇｒａｓｓ）（ロリウム・ペレンネ  Ｌ．（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ  Ｌ．））およびイタリアンライグラス（Ｉｔａｌｉａｎ  ｒｙｅｇｒａｓｓ）（ロリウム・マルチフロラム  Ｌａｍ．）など；
【００８７】
ウィートグラス（ｗｈｅａｔｇｒａｓｓ）（カモジグサ属種（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｓｐｐ．））、例えばフェアウェイウィートグラス（ｆａｉｒｗａｙ  ｗｈｅａｔｇｒａｓｓ）（アグロピロン・クリステータム（Ｌ．）Ｇａｅｒｔｎ．（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｃｒｉｓｔａｔｕｍ（Ｌ．）Ｇａｅｒｔｎ．））、クレステッドウィートグラス（ｃｒｅｓｔｅｄ  ｗｈｅａｔｇｒａｓｓ）（アグロピロン・デザートラム（Ｆｉｓｃｈ．）Ｓｃｈｕｌｔ．（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｄｅｓｅｒｔｏｒｕｍ（Ｆｉｓｃｈ．）Ｓｃｈｕｌｔ．））およびウェスタンウィートグラス（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｗｈｅａｔｇｒａｓｓ）（アグロピロン・スミチイ  Ｒｙｄｂ．（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｓｍｉｔｈｉｉ  Ｒｙｄｂ．））などである。
【００８８】
さらなる寒地型芝生の例は、ビーチグラス（ｂｅａｃｈｇｒａｓｓ）（アンモフィラ・ブレビリグラタ  Ｆｅｒｎ．（Ａｍｍｏｐｈｉｌａ  ｂｒｅｖｉｌｉｇｕｌａｔａ  Ｆｅｒｎ．））、スムーズブロムグラス（ｓｍｏｏｔｈ  ｂｒｏｍｅｇｒａｓｓ）（ブロムス・イネルミス  Ｌｅｙｓｓ．（Ｂｒｏｍｕｓ  ｉｎｅｒｍｉｓ  Ｌｅｙｓｓ．））、ガマ（ｃａｔｔａｉｌ）、例えばオオアワガエリ（Ｔｉｍｏｔｈｙ）（フレウム・プラテンス  Ｌ．（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ  Ｌ．））、サンドキャットテイル（ｓａｎｄ  ｃａｔｔａｉｌ）（フレウム・サブラタム  Ｌ．（Ｐｈｌｅｕｍ  ｓｕｂｕｌａｔｕｍ  Ｌ．））、カモガヤ（ｏｒｃｈａｒｄｇｒａｓｓ）（ダクチリス・グロメラタ  Ｌ．（Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ  Ｌ．））、ウィーピングアルカリグラス（ｗｅｅｐｉｎｇ  ａｌｋａｌｉｇｒａｓｓ）（プッチネリア・ディスタンス（Ｌ．）Ｐａｒｌ．（Ｐｕｃｃｉｎｅｌｌｉａ  ｄｉｓｔａｎｓ（Ｌ．）Ｐａｒｌ．））およびクシガヤ（ｃｒｅｓｔｅｄ  ｄｏｇ’ｓ−ｔａｉｌ）（シノスルス・クリステータス  Ｌ．（Ｃｙｎｏｓｕｒｕｓ  ｃｒｉｓｔａｔｕｓ  Ｌ．））などである。
【００８９】
暖地型芝生の例は、ギョウギシバ（Ｂｅｒｍｕｄａ  ｇｒａｓｓ）（シノドン  ｓｐｐ．Ｌ．Ｃ．リッチ（Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｓｐｐ．Ｌ．Ｃ．Ｒｉｃｈ））、ノシバ（ｚｏｙｓｉａ  ｇｒａｓｓ）（ゾイシア  ｓｐｐ．Ｗｉｌｌｄ．（Ｚｏｙｓｉａ  ｓｐｐ．Ｗｉｌｌｄ．））、セントオーガスティングラス（Ｓｔ．Ａｕｇｕｓｔｉｎｅ  ｇｒａｓｓ）（ステノタフラム・セクンダタム・ワルト・クンツ（Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ  ｓｅｃｕｎｄａｔｕｍ  Ｗａｌｔ  Ｋｕｎｔｚｅ））、センチピードグラス（ｃｅｎｔｉｐｅｄｅ  ｇｒａｓｓ）（エレモクロア・オフィウロイデス・ムンロ  Ｈａｃｋ．（Ｅｒｅｍｏｃｈｌｏａ  ｏｐｈｉｕｒｏｉｄｅｓ  Ｍｕｎｒｏ  Ｈａｃｋ．））、カーペットグラス（ｃａｒｐｅｔ  ｇｒａｓｓ）（アクソノパス・アフィニス・ケーゼ（Ａｘｏｎｏｐｕｓ  ａｆｆｉｎｉｓ  Ｃｈａｓｅ））、バヒアグラス（Ｂａｈｉａ  ｇｒａｓｓ）（パスパラム・ノテータム・フルッゲ（Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ  Ｆｌｕｇｇｅ））、キクユグラス（Ｋｉｋｕｙｕ  ｇｒａｓｓ）（ペニセタム・クランデスティナムチヌム  Ｈｏｃｈｓｔ．ｅｘ  Ｃｈｉｏｖ．（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｃｌａｎｄｅｓｔｉｎｕｍ  Ｈｏｃｈｓｔ．ｅｘ  Ｃｈｉｏｖ．））、バッファローグラス（ｂｕｆｆａｌｏ  ｇｒａｓｓ）（ブフロー・ダクチロイズ（Ｎｕｔｔ．）Ｅｎｇｅｌｍ．（Ｂｕｃｈｌｏｅ  ｄａｃｔｙｌｏｉｄｓ（Ｎｕｔｔ．）Ｅｎｇｅｌｍ．））、ブルーグランマ（Ｂｌｕｅ  ｇｒａｍｍａ）（ボウテロウア・グラシリス（Ｈ．Ｂ．Ｋ．）Ｌａｇ．ｅｘ  グリフィトス（Ｂｏｕｔｅｌｏｕａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ（Ｈ．Ｂ．Ｋ．）Ｌａｇ．ｅｘ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ））、シーショアパスパラム（ｓｅａｓｈｏｒｅ  ｐａｓｐａｌｕｍ）（パスパラム・バギナタム・スワルツ（Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｖａｇｉｎａｔｕｍ  Ｓｗａｒｔｚ））およびアゼガヤモドキ（ｓｉｄｅｏａｔｓ  ｇｒａｍａ）（ボウテロウア・カルチペンデュラ（Ｂｏｕｔｅｌｏｕａ  ｃｕｒｔｉｐｅｎｄｕｌａ）（Ｍｉｃｈｘ．Ｔｏｒｒ．））である。寒地型芝生は、一般に、本発明に従った使用が好ましい。特に好ましいのは、ブルーグラス、ベントグラスおよびコヌカグサ、ウシノケグサおよびライグラスである。ベントグラスが特に好ましい。
【００９０】
本発明の組成物は、強力な殺菌活性を有し、作物保護および材料の保護において、真菌および細菌などの望ましくない微生物の防除に使用することができる。
【００９１】
本発明はまた、本発明の組成物が植物病原性真菌、植物病原性細菌および／またはその生息場所に施用されることを特徴とする、望ましくない微生物を防除するための方法に関する。
【００９２】
殺真菌剤は、植物病原性真菌の防除のために作物保護に使用できる。これらは、特にネコブカビ類（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）、卵菌類（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒｏｍｙｃｅｔｅｓ（別名Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ））、ツボカビ類（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、接合菌類（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）、子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）および不完全菌類（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）のクラスのメンバーである、土壌伝染性病原菌を含む広範囲の植物病原性真菌類に対する顕著な効力によって特徴付けられる。一部の殺真菌剤はシステミック的に活性があり、葉、種子被覆材または土壌殺真菌剤として植物保護に使用できる。さらに、それらは、特に植物の木部または根に寄生する菌類と闘うのに適している。
【００９３】
殺細菌剤は、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、コリネバクテリウム科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）およびストレプトミセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）の防除のために作物保護に使用できる。
【００９４】
本発明に従って処理することができる真菌性病害の病原体の非限定的な例としては、以下が挙げられる：
【００９５】
うどんこ病（ｐｏｗｄｅｒｙ  ｍｉｌｄｅｗ）病原体に起因する病害、例えば、ブルメリア属種（Ｂｌｕｍｅｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばブルメリア・グラミニス（Ｂｌｕｍｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）；ポドスファエラ属種（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばポドスファエラ・ロイコトリカ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａ）；スファエロテカ属種（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばスファエロテカ・フリギネア（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｌｉｇｉｎｅａ）；ウンシヌラ属種（Ｕｎｃｉｎｕｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばウンシヌラ・ネカトル（Ｕｎｃｉｎｕｌａ  ｎｅｃａｔｏｒ）に起因するもの；
【００９６】
サビ病（ｒｕｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）病原体に起因する病害、例えば、ギムノスポランギウム属種（Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばギムノスポランギウム・サビナエ（Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｓａｂｉｎａｅ）；ヘミレイア属種（Ｈｅｍｉｌｅｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばヘミレイア・バスタトリクス（Ｈｅｍｉｌｅｉａ  ｖａｓｔａｔｒｉｘ）；ファコプソラ属種（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばファコプソラ・パキリジ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ）およびファコプソラ・メイボミアエ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｍｅｉｂｏｍｉａｅ）；プッシニア属種（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばプッシニア・レコンジテ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｒｅｃｏｎｄｉｔｅ）、Ｐ．トリチシナ（Ｐ．ｔｒｉｔｉｃｉｎａ）、Ｐ．グラミニス（Ｐ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）またはＰ．ストリイホルミス（Ｐ．ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ）；ウロミセス属種（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばウロミセス・アペンジクラタス（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）に起因するもの；
【００９７】
卵菌類（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）の群からの病原体に起因する病害、例えば、アルブゴ属種（Ａｌｂｕｇｏ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばアルブゴ・カンジダ（Ａｌｇｕｂｏ  ｃａｎｄｉｄａ）；ブレミア属種（Ｂｒｅｍｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばブレミア・ラクツカエ（Ｂｒｅｍｉａ  ｌａｃｔｕｃａｅ）；ペロノスポラ属種（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばペロノスポラ・ピシ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｐｉｓｉ）またはＰ．ブラシカエ（Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ）；フィトフトラ属種（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばフィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）；プラスモパラ属種（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばプラスモパラ・ビチコラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ  ｖｉｔｉｃｏｌａ）；シュードペロノスポラ属種（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばシュードペロノスポラ・フムリ（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｈｕｍｕｌｉ）またはシュードペロノスポラ・キュベンシス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃｕｂｅｎｓｉｓ）；フィチウム属種（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばフィチウム・ウルチマム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ）に起因するもの；
【００９８】
葉汚斑性病害（ｌｅａｆ  ｂｌｏｔｃｈ  ｄｉｓｅａｓｅ）および葉萎凋性病害（ｌｅａｆ  ｗｉｌｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）、例えば、アルテルナリア属種（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばアルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）；セルコスポラ属種（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばセルコスポラ・ベチコラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｂｅｔｉｃｏｌａ）；クラジオスポリウム属種（Ｃｌａｄｉｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばクラジオスポリウム・ククメリナム（Ｃｌａｄｉｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ）；コクリオボルス属種（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばコクリオボルス・サチバス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）（分生子形態：ドレクスレラ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ）、ヘルミントスポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）と同義）、コクリオボルス・ミヤベアヌス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｍｉｙａｂｅａｎｕｓ）；コレトトリカム属種（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばコレトトリカム・リンデムタニウム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｌｉｎｄｅｍｕｔｈａｎｉｕｍ）；シクロコニウム属種（Ｃｙｃｌｏｃｏｎｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばシクロコニウム・オレアギナム（Ｃｙｃｌｏｃｏｎｉｕｍ  ｏｌｅａｇｉｎｕｍ）；ジアポルテ属種（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばジアポルテ・シトリ（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｃｉｔｒｉ）；エルシノエ属種（Ｅｌｓｉｎｏｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばエルシノエ・ファウセッティ（Ｅｌｓｉｎｏｅ  ｆａｗｃｅｔｔｉｉ）；グロエオスポリウム属種（Ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばグロエオスポリウム・ラエチコロル（Ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌａｅｔｉｃｏｌｏｒ）；グロメレラ属種（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばグロメレラ・シングラタ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｃｉｎｇｕｌａｔａ）；ギナーディア属種（Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばギナーディア・ビドウェリ（Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ  ｂｉｄｗｅｌｌｉ）；レプトスフェリア属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばレプトスフェリア・マクランス（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍａｃｕｌａｎｓ）、レプトスフェリア・ノドラム（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）；マグナポルテ属種（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばマグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）；マルゾニア属種（Ｍａｒｓｓｏｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばマルゾニア・コロナリア（Ｍａｒｓｓｏｎｉａ  ｃｏｒｏｎａｒｉａ）；ミクロドキウム属種（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばミクロドキウム・ニバレ（Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ）；ミコスファエレラ属種（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばミコスファエレラ・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、Ｍ．アラキジコラ（Ｍ．ａｒａｃｈｉｄｉｃｏｌａ）およびＭ．フィジエンシス（Ｍ．ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）；ファエオスファエリア属種��Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばファエオスファエリア・ノドラム（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）；ピレノフォラ属種（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばピレノフォラ・テレス（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｔｅｒｅｓ）、ピレノフォラ・トリチシ・レペンチス（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｔｒｉｔｉｃｉ  ｒｅｐｅｎｔｉｓ）；ラムラリア属種（Ｒａｍｕｌａｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばラムラリア・コロ−シグニ（Ｒａｍｕｌａｒｉａ  ｃｏｌｌｏ−ｃｙｇｎｉ）、ラムラリア・アレオラ（Ｒａｍｕｌａｒｉａ  ａｒｅｏｌａ）；リンコスポリウム属種（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばリンコスポリウム・セカリス（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｅｃａｌｉｓ）；セプトリア属種（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばセプトリア・アピイ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ａｐｉｉ）、セプトリア・リコペルシイ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｉ）；チフラ属種（Ｔｙｐｈｕｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばチフラ・インカルナタ（Ｔｙｐｈｕｌａ  ｉｎｃａｒｎａｔａ）；ベンツリア属種（Ｖｅｎｔｕｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばベンツリア・イナエクアリス（Ｖｅｎｔｕｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）に起因するもの；
【００９９】
根および茎の病害、例えば、コルチシウム属種（Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばコルチシウム・グラミネアルム（Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）；フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばフザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）；ゴウマノマイセス属種（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばゴウマノマイセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）；リゾクトニア属種（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）などに起因するもの；サロクラジウム病（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ  ｄｉｓｅａｓｅ）、例えばサロクラジウム・オリゼ（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ  ｏｒｙｚａｅ）に起因するもの；スクレロチウム病（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｄｉｓｅａｓｅ）、例えばスクレロチウム・オリゼ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｏｒｙｚａｅ）に起因するもの；タペシア属種（Ｔａｐｅｓｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばタペシア・アクホルミス（Ｔａｐｅｓｉａ  ａｃｕｆｏｒｍｉｓ）；チエラビオプシス属種（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばチエラビオプシス・バシコラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ  ｂａｓｉｃｏｌａ）に起因するもの；
【０１００】
穂（ｅａｒ  ａｎｄ  ｐａｎｉｃｌｅ）（コーン穂軸を包含する）の病害、例えば、アルテルナリア属種（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばアルテルナリア属の各種（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐｐ．）；アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばアスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）；クラドスポリウム属種（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばクラドスポリウム・クラドスポリオイデス（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）；クラビセプス属種（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばクラビセプス・プルプレア（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）；フザリウム属種、例えばフザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）；ジベレラ属種（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）；モノグラフェラ属種（Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばモノグラフェラ・ニバリス（Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａ  ｎｉｖａｌｉｓ）；セプトリア属種、例えばセプトリア・ノドラム（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）に起因するもの；
【０１０１】
黒穂菌類に起因する病害、例えばスファセロテカ属種（Ｓｐｈａｃｅｌｏｔｈｅｃａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばスファセロテカ・レイリアナ（Ｓｐｈａｃｅｌｏｔｈｅｃａ  ｒｅｉｌｉａｎａ）；チレチア属種（Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばチレチア・カリエス（Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｃａｒｉｅｓ）、Ｔ．コントロベルサ（Ｔ．ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ）；ウロシスチス属種（Ｕｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばウロシスチス・オクルタ（Ｕｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｏｃｃｕｌｔａ）；ウスチラゴ属種（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばウスチラゴ・ヌダ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｎｕｄａ）、Ｕ．ヌダ・トリチシ（Ｕ．ｎｕｄａ  ｔｒｉｔｉｃｉ）に起因するもの；
【０１０２】
果実の腐敗、例えば、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばアスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）；ボトリチス属種（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）；ペニシリウム属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばペニシリウム・エキスパンサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｘｐａｎｓｕｍ）およびＰ．プルプロゲナム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）；スクレロチニア属種（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばスクレロチニア・スクレロチオラム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）；ベルチシリウム属種（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばベルチシリウム・アルボアトラム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｉｕｍ  ａｌｂｏａｔｒｕｍ）に起因するもの；
【０１０３】
種子および土壌が媒介する腐食、カビ、萎凋、腐敗および立枯病（ｄａｍｐｉｎｇ−ｏｆｆ  ｄｉｓｅａｓｅ）、例えば、アルテルナリア属種（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばアルテルナリア・ブラシシコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ）に起因するもの；アファノミセス属種（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばアファノミセス・エウテイケス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ  ｅｕｔｅｉｃｈｅｓ）に起因するもの；アスコキタ属種（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばアスコキタ・レンチス（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ  ｌｅｎｔｉｓ）に起因するもの；アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばアスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）に起因するもの；クラドスポリウム属種（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばクラドスポリウム・ヘルバラム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｈｅｒｂａｒｕｍ）に起因するもの；コクリオボルス属種（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばコクリオボルス・サチバス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）；（分生子形態：ドレクスレラ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ）、ビポラリス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）：ヘルミントスポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）と同義）に起因するもの；コレトトリカム属種（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばコレトトリカム・コッコデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｏｃｃｏｄｅｓ）に起因するもの；フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばフザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）に起因するもの；ジベレラ属種（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）に起因するもの；マクロフォミナ属種（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばマクロフォミナ・ファゼオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ  ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）に起因するもの；モノグラフェラ属種（Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばモノグラフェラ・ニバリス（Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｅｌｌａ  ｎｉｖａｌｉｓ）に起因するもの；ペニシリウム属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばペニシリウム・エキスパンサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｘｐａｎｓｕｍ）に起因するもの；フォーマ属種（Ｐｈｏｍａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばフォーマ・リンガム（Ｐｈｏｍａ  ｌｉｎｇａｍ）に起因するもの；フォモプシス属種（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばフォモプシス・ソジャエ（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ｓｏｊａｅ）に起因するもの；フィトフトラ属種（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばフィトフトラ・カクトラム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｃｔｏｒｕｍ）に起因するもの；ピレノフォラ属種（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばピレノフォラ・グラミネア（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｇｒａｍｉｎｅａ）に起因するもの；ピリクラリア属種（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばピリクラリア・オリゼ（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｒｙｚａｅ��に起因するもの；フィチウム属種（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばフィチウム・ウルチマム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ）に起因するもの；リゾクトニア属種（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）に起因するもの；リゾプス属種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばリゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）に起因するもの；スクレロチウム属種（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばスクレロチウム・ロルフシイ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ）に起因するもの；セプトリア属種（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばセプトリア・ノドラム（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）に起因するもの；チフラ属種（Ｔｙｐｈｕｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばチフラ・インカルナタ（Ｔｙｐｈｕｌａ  ｉｎｃａｒｎａｔａ）に起因するもの；ベルチシリウム属種（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばベルチシリウム・ダーリアエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ）に起因するもの；
【０１０４】
がん腫病、虫こぶおよび天狗巣病（ｗｉｔｃｈｅｓ’  ｂｒｏｏｍ）、例えば、ネクトリア属種（Ｎｅｃｔｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばネクトリア・ガリゲナ（Ｎｅｃｔｒｉａ  ｇａｌｌｉｇｅｎａ）に起因するもの；
【０１０５】
萎凋病（ｗｉｌｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）、例えば、モニリニア属種（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばモニリニア・ラキサ（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｌａｘａ）に起因するもの；
【０１０６】
葉ぶくれ病（ｌｅａｆ  ｂｌｉｓｔｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）または葉巻病（ｌｅａｆ  ｃｕｒｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）、例えばエクソバシジウム属種（Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばエクソバシジウム・ベキサンス（Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｖｅｘａｎｓ）に起因するもの；
【０１０７】
タフリナ属種（Ｔａｐｈｒｉｎａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばタフリナ・デフォルマンス（Ｔａｐｈｒｉｎａ  ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）；
【０１０８】
木本植物の変性病害、例えば、エスカ病（Ｅｓｃａ  ｄｉｓｅａｓｅ）、例えばファエモニエラ・クラミドスポラ（Ｐｈａｅｍｏｎｉｅｌｌａ  ｃｌａｍｙｄｏｓｐｏｒａ）、ファエオアクレモニウム・アレオフィラム（Ｐｈａｅｏａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ａｌｅｏｐｈｉｌｕｍ）およびフォミチポリア・メジテラネア（Ｆｏｍｉｔｉｐｏｒｉａ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ）に起因するもの；；ユータイパ・ダイバック（Ｅｕｔｙｐａ  ｄｙｅｂａｃｋ）、例えばユータイパ・ラタ（Ｅｕｔｙｐａ  ｌａｔａ）に起因するもの；ガノデルマ病（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｄｉｓｅａｓｅ）、例えばガノデルマ・ボニネンセ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｂｏｎｉｎｅｎｓｅ）に起因するもの；リギドポルス病（Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、例えばリギドポルス・リグノサス（Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｕｓ）に起因するもの；
【０１０９】
花および種子の病害、例えば、ボトリチス属種（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）に起因するもの；
【０１１０】
植物塊茎の病害、例えば、リゾクトニア属種（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）；ヘルミントスポリウム属種（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばヘルミントスポリウム・ソラニ（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）に起因するもの；
【０１１１】
根こぶ、例えば、プラスモディオフォラ属種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばプラスモディオフォラ・ブラシカエ（Ｐｌａｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）に起因するもの；
【０１１２】
細菌性病原体に起因する病害、例えばキサントモナス属種（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばキサントモナス・カムペストリス病原型オリゼ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ）；シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばシュードモナス・シリンガエ病原型ラクリマンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｌａｃｈｒｙｍａｎｓ）；エルウィニア属種（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばエルウィニア・アミロボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）に起因するもの。
【０１１３】
以下の大豆の病気を好適に防除できる：
【０１１４】
葉、茎、さやおよび種子の真菌病、例えば、アルテルナリア斑点病（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｌｅａｆ  ｓｐｏｔ）（アルテルナリア属種アトランス・テヌイシマ（ａｔｒａｎｓ  ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ））、炭疽病（コレトトリカム・グロエオスポロイデス・デマティウム変種トランケイタム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｏｉｄｅｓ  ｄｅｍａｔｉｕｍ  ｖａｒ．ｔｒｕｎｃａｔｕｍ））、褐斑症（ｂｒｏｗｎ  ｓｐｏｔ）（セプトリア・グリシネス（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｇｌｉｃｉｎｅｓ））、セルコスポラ斑点病および胴枯病（ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｌｅａｆ  ｓｐｏｔ  ａｎｄ  ｂｌｉｇｈｔ）（セルコスポラ・キクチイ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｋｉｋｕｃｈｉｉ））、コアネフォラ葉枯病（ｃｈｏａｎｅｐｈｏｒａ  ｌｅａｆ  ｂｌｉｇｈｔ）（コアネフォラ・インフンジブリフェラ・トリスポラ（Ｃｈｏａｎｅｐｈｏｒａ  ｉｎｆｕｎｄｉｂｕｌｉｆｅｒａ  ｔｒｉｓｐｏｒａ）と同義）、ダクツリオホラ斑点病（ｄａｃｔｕｌｉｏｐｈｏｒａ  ｌｅａｆ  ｓｐｏｔ）（ダクツリオホラ・グリシネス（Ｄａｃｔｕｌｉｏｐｈｏｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ））、べと病（ｄｏｗｎｙ  ｍｉｌｄｅｗ）（ペロノスポラ・マンシュリカ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｍａｎｓｈｕｒｉｃａ））、ドレクスレラ葉枯病（ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ  ｂｌｉｇｈｔ）（ドレクスレラ・グリシニ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｉ））、フロッグアイ斑点病（ｆｒｏｇｅｙｅ  ｌｅａｆ  ｓｐｏｔ）（セルコスポラ・ソジナ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｓｏｊｉｎａ））、レプトスファエルリナ斑点病（ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ  ｌｅａｆ  ｓｐｏｔ）（レプトスファエルリナ・トリホリイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ  ｔｒｉｆｏｌｉｉ））、フィロスティカ斑点病（ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃａ  ｌｅａｆ  ｓｐｏｔ）（フィロスティカ・ソジャエコラ（Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ  ｓｏｊａｅｃｏｌａ））、さやおよび茎枯病（ｐｏｄ  ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｂｌｉｇｈｔ）（フォモプシス・ソジャエ（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ｓｏｊａｅ））、うどんこ病（ミクロスファエラ・ジフーサ（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒａ  ｄｉｆｆｕｓａ））、ピレノカエタ斑点病（ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｌｅａｆ  ｓｐｏｔ）（ピレノカエタ・グリシネス（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ））、リゾクトニア葉腐、葉枯およびくもの巣病（ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ａｅｒｉａｌ，ｆｏｌｉａｇｅ，ａｎｄ  ｗｅｂ  ｂｌｉｇｈｔ）（リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ））、サビ病（ファコプソラ・パキリジ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ）、ファコプソラ・メイボミアエ（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｍｅｉｂｏｍｉａｅ））、黒痘病（ｓｃａｂ）（スファセロマ・グリシネス（Ｓｐｈａｃｅｌｏｍａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ））、ステムフィリウム葉枯病（ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ  ｌｅａｆ  ｂｌｉｇｈｔ）（（ステムフィリウム・ボトリオサム（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ  ｂｏｔｒｙｏｓｕｍ））、輪紋病（ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｏｔ）（コリネスポラ・カッシイコラ（Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ  ｃａｓｓｉｉｃｏｌａ））に起因するもの。
【０１１５】
根および茎基部の真菌病、例えば、黒色根腐病（ｂｌａｃｋ  ｒｏｏｔ  ｒｏｔ）（カロネクトリア・クロタラリアエ（Ｃａｌｏｎｅｃｔｒｉａ  ｃｒｏｔａｌａｒｉａｅ））、炭疽病（ｃｈａｒｃｏａｌ  ｒｏｔ）（マクロフォミナ・ファゼオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ  ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ））、赤かび病またはフザリウム萎凋、根腐ならびにさやおよび地際部腐病（ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂｌｉｇｈｔ  ｏｒ  ｗｉｌｔ，ｒｏｏｔ  ｒｏｔ，ａｎｄ  ｐｏｄ  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｒ  ｒｏｔ）（フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・オルトセラス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｒｔｈｏｃｅｒａｓ）、フザリウム・セミテクタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｅｍｉｔｅｃｔｕｍ）、フザリウム・エクイセチ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｅｑｕｉｓｅｔｉ））、ミコレプトディスカス根腐病（ｍｙｃｏｌｅｐｔｏｄｉｓｃｕｓ  ｒｏｏｔ  ｒｏｔ）（ミコレプトディスカス・テレストリス（Ｍｙｃｏｌｅｐｔｏｄｉｓｃｕｓ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ））、ネオコスモスポラ（ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）（ネオコスモスポラ・バシンフェクタ（ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ）、さやおよび茎枯病（ｐｏｄ  ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｂｌｉｇｈｔ）（ジアポルテ・ファセオロラム（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ））、茎潰瘍（ｓｔｅｍ  ｃａｎｋｅｒ）（ジアポルテ・ファセオロラム変種コーリボラ（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ  ｖａｒ．ｃａｕｌｉｖｏｒａ））、フィトフトラ腐敗病（ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒｏｔ）（フィトフトラ・メガスペルマ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ））、落葉病（ｂｒｏｗｎ  ｓｔｅｍ  ｒｏｔ）（フィアロホラ・グレガタ（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｇｒｅｇａｔａ））、フィチウム腐敗病（ｐｙｔｈｉｕｍ  ｒｏｔ）（フィチウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）、フィチウム・イレグラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）、フィチウム・デバリアヌム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｄｅｂａｒｙａｎｕｍ）、フィチウム・ミリオチルム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｍｙｒｉｏｔｙｌｕｍ）、フィチウム・ウルチマム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ））、リゾクトニア根腐病、茎腐病および立枯病（ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｒｏｏｔ  ｒｏｔ，ｓｔｅｍ  ｄｅｃａｙ，ａｎｄ  ｄａｍｐｉｎｇ−ｏｆｆ）（リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ））、スクレロチニア茎腐病（ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｔｅｍ  ｄｅｃａｙ）（スクレロチニア・スクレロチオラム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ））、スクレロチニア白絹病（ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｌｉｇｈｔ）（スクレロチニア・ロルフシ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｒｏｌｆｓｉｉ））、チエラビオプシス根腐病（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ  ｒｏｏｔ  ｒｏｔ）（チエラビオプシス・バシコラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ  ｂａｓｉｃｏｌａ））に起因するもの。
【０１１６】
本発明の殺真菌組成物は、植物病原性真菌の治癒的または保護的／予防的防除に使用することができる。従って、本発明は、種子、植物または植物部分、果実または植物が生育する土壌に適用される本発明の組成物の使用による植物病原菌の防除のための治癒的および保護的方法にも関連する。
【０１１７】
植物の病気を防除するのに必要な濃度で、その組成物が植物によく耐えられるという事実は、植物の地上部、繁殖株や種子、土壌の処理を可能にする。
【０１１８】
本発明によれば、全ての植物および植物部分は、（植物品種または植物育種家の権利によって保護可能であるか否かにかかわらず）栽培品種および植物品種を含めて治療することができる。栽培品種および植物品種は、二重半数体の使用、プロトプラスト融合、ランダムおよび指向突然変異誘発、分子または遺伝子マーカー、または生物工学および遺伝子工学的方法によるような１つ以上のバイオテクノロジー的方法によって補助または補足できる従来の増殖および育種方法によって得られた植物であり得る。
【０１１９】
特定の局面において、本発明の組成物は、ヘクタール当たり約１×１０４〜約１×１０１４のコロニー形成単位（ＣＦＵ）、ヘクタール当たり約１×１０４〜約１×１０１２のコロニー形成単位（ＣＦＵ）、ヘクタール当たり約１×１０４〜約１×１０１０のコロニー形成単位（ＣＦＵ）、ヘクタール当たり約１×１０４〜約１×１０８のコロニー形成単位（ＣＦＵ）、ヘクタール当たり約１×１０６〜約１×１０１４コロニー形成単位（ＣＦＵ）、ヘクタール当たり約１×１０６〜約１×１０１２のコロニー形成単位（ＣＦＵ）、ヘクタール当たり約１×１０６〜約１×１０１０のコロニー形成単位（ＣＦＵ）、ヘクタール当たり約１×１０６〜約１×１０８のコロニー形成単位（ＣＦＵ）、ヘクタール当たり約１×１０８〜約１×１０１４のコロニー形成単位（ＣＦＵ）、ヘクタール当たり約１×１０８〜約１×１０１２のコロニー形成単位（ＣＦＵ）、ヘクタール当たり約１×１０８〜約１×１０１０のコロニー形成単位（ＣＦＵ）で施用される。
【０１２０】
他の局面において、本発明の組成物は、ヘクタール当たり約１×１０６〜約１×１０１４コロニー形成単位（ＣＦＵ）で適用され、ヘクタール当たり約１×１０６〜約１×１０１２コロニー形成単位（ＣＦＵ）、ヘクタール当たり約１×１０６〜約１×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）、ヘクタール当たり約１×１０６〜約１×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）で施用される。さらに他の態様では、本発明の組成物は、ヘクタール当たり約１×１０９〜約１×１０１３のコロニー形成単位（ＣＦＵ）で施用される。ある局面において、本発明の組成物は、ヘクタール当たり約１×１０１０〜約１×１０１２のコロニー形成単位（ＣＦＵ）で施用される。
【０１２１】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、ヘクタール当たり約０．１ｋｇ〜約２０ｋｇの発酵固形物で施用される。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、ヘクタール当たり約０．１ｋｇ〜約１０ｋｇの発酵固形物で施用される。他の実施態様において、本発明の組成物は、ヘクタール当たり約０．２５ｋｇ〜約７．５ｋｇの発酵固形物で施用される。さらに他の実施形態において、本発明の組成物は、ヘクタール当たり約０．５ｋｇ〜約５ｋｇの発酵固形物で施用される。本発明の組成物はまた、ヘクタール当たり約１ｋｇまたは約２ｋｇの発酵固形物で施用され得る。
【０１２２】
本発明の組成物は、植物が良好な耐性を示し、恒温動物に対する毒性も望ましい程度であり、良好な環境適合性を示す場合、植物及び植物の器官を保護するのに適しており、収穫高を増大させるのに適しており、収穫物の質を向上させるのに適している。これらは、作物保護組成物として使用することが好ましい。これらは、通常の感受性種及び抵抗性種に対して活性を示し、さらに、全ての発育段階又は一部の発育段階に対して活性を示す。
【０１２３】
本発明に従って処理することができる植物としては、以下の主要作物植物が挙げられる：トウモロコシ、ダイズ、アルファルファ、ワタ、ヒマワリ、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）油料種子、例えばブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）（例としてキャノーラ、ナタネ）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）、Ｂ．ユンセア（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）（例としてカラシナ（菜の花（ｆｉｅｌｄ  ｍｕｓｔａｒｄ）））およびブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ）など、ヤシ科植物（Ａｒｅｃａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例としてアブラヤシ、ココナツ）、米、小麦、テンサイ、サトウキビ、カラス麦、ライ麦、大麦、キビおよびソルガム、ライ小麦、アマ、ナッツ、ブドウおよびブドウの木、ならびに様々な植物学的分類からの様々な果実および野菜、例としてバラ科植物（Ｒｏｓａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例として仁果、例えばリンゴおよびナシなど、これらだけでなく核果、例えばアンズ、サクランボ、アーモンド、プラムおよびモモなど、ならびに液果、例えばイチゴ、ラズベリー、アカフサスグリおよびクロフサスグリおよびスグリなど）、リベシオイダエ科植物（Ｒｉｂｅｓｉｏｉｄａｅ  ｓｐ．）、クルミ科植物（Ｊｕｇｌａｎｄａｃｅａｅ  ｓｐ．）、カバノキ科植物（Ｂｅｔｕｌａｃｅａｅ  ｓｐ．）、ウルシ科植物（Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ  ｓｐ．）、ブナ科植物（Ｆａｇａｃｅａｅ  ｓｐ．）、クワ科植物（Ｍｏｒａｃｅａｅ  ｓｐ．）、モクセイ科植物（Ｏｌｅａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例としてオリーブ）、マタタビ科植物（Ａｃｔｉｎｉｄａｃｅａｅ  ｓｐ．）、クスノキ科植物（Ｌａｕｒａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例としてアボカド、シナモン、ショウノウ）、バショウ科植物（Ｍｕｓａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例としてバナナの木および栽植）、アカネ科植物（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例としてコーヒー）、ツバキ科植物（Ｔｈｅａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例として茶）、アオギリ科植物（Ｓｔｅｒｃｕｌｉｃｅａｅ  ｓｐ．）、ミカン科植物（Ｒｕｔａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例としてレモン、オレンジ、マンダリンおよびグレープフルーツ）；ナス科植物（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例としてトマト、ジャガイモ、コショウ、トウガラシ、ナス、タバコ）、ユリ科植物（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ  ｓｐ．）、キク科植物（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉａｅ  ｓｐ．）（例としてレタス、アーティチョークおよびチコリー−ルートチコリー（ｒｏｏｔ  ｃｈｉｃｏｒｙ）、エンダイブまたはカモンチコリー（ｃｏｍｍｏｎ  ｃｈｉｃｏｒｙ）など）、セリ科植物（Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ  ｓｐ．）（例としてニンジン、パセリ、セロリおよびセルリアック）、ウリ科植物（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例としてキュウリ−ガーキン（ｇｈｅｒｋｉｎ）、カボチャ、スイカ、ヒョウタンおよびメロンなど）、ネギ科植物（Ａｌｌｉａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例としてニラおよびタマネギ）、アブラナ科植物（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ  ｓｐ．）（例としてホワイトキャベツ、レッドキャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ、チンゲンサイ、コールラビ、ダイコン、セイヨウワサビ、クレソンおよび白菜）、マメ科植物（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ  ｓｐ．）（例としてピーナッツ、エンドウマメ、レンズマメおよびマメ類−例としてインゲンマメおよびソラマメ）、アカザ科植物（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例としてフダンソウ、飼料ビート、ホウレンソウ、ビートルート）、アマ科植物（Ｌｉｎａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例としてアサ）、アサ科植物（Ｃａｎｎａｂｅａｃｅａ  ｓｐ．）（例として大麻）、アオイ科植物（Ｍａｌｖａｃｅａｅ  ｓｐ．）（例としてオクラ、ココア）、ケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）（例としてケシ）、クサスギカズラ科（Ａｓｐａｒａｇａｃｅａｅ）（例としてアスパラガス）；芝、芝生、草およびステビア・レバウジアナ（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）などの庭園および森林中で有用な植物および観賞植物；ならびに各々の場合にこれらの植物の遺伝子改変型。
【０１２４】
特定の局面において、発酵産物は、製剤成分をさらに含む。製剤成分は、湿潤剤、増量剤、溶媒、自発性促進剤、乳化剤、分散剤、凍結保護剤、増粘剤および／またはアジュバントであってよい。１つの実施形態において、製剤成分は湿潤剤である。他の局面では、発酵産物は凍結乾燥粉末またはスプレー乾燥粉末である。
【０１２５】
本発明の組成物は、回収率、有効性または物理的特性を改善するため、および／または加工、包装および施用を助けるために本発明の組成物に添加された製剤成分を含み得る。このような製剤成分は、個別にまたは組み合わせて添加され得る。
【０１２６】
製剤成分は、細胞、無細胞調製物、単離化合物および／または代謝物を含む組成物に添加して、有効性、安定性および物理的特性、使用性を改善し、および／または加工、包装および最終用途を容易にすることができる。このような製剤成分には、農業的に許容可能な担体、不活性剤、安定化剤、保存剤、栄養素または物理的特性改質剤が含まれ、これらは個別にまたは組み合わせて添加され得る。いくつかの実施形態において、上記担体には、水、油および他の有機または無機溶媒のような液体材料や、鉱物、ポリマーまたは生物学的にもしくは化学合成によって誘導されたポリマー複合体のような固体材料が含まれ得る。いくつかの実施形態において、製剤成分は、葉、種子または根などの植物部分への組成物の付着を容易にする結合剤、アジュバントまたは接着剤である。例えば、Ｔａｙｌｏｒ、Ａ．Ｇ．ら、“Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｏｆ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｓｅｅｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ”、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．、２８：３２１−３３９（１９９０）を参照されたい。安定化剤は、ケーキング防止剤、酸化防止剤、沈降防止剤、消泡剤、乾燥剤、保護剤または防腐剤であり得る。栄養素は、炭素、窒素およびリン源、例えば糖類、多糖類、油、タンパク質、アミノ酸、脂肪酸およびリン酸塩などであり得る。物理的特性改質剤は、増量剤、湿潤剤、増粘剤、ｐＨ改変剤、レオロジー改質剤、分散剤、アジュバント、界面活性剤、フィルム形成剤、ヒドロトロープ、ビルダー、不凍剤または着色剤であり得る。いくつかの実施形態において、細胞、無細胞調製物および／または発酵によって生成された代謝産物を含む組成物は、他の製剤調製なしで、希釈剤として水を用いてまたは用いずに直接使用することができる。特定の実施形態では、湿潤剤または分散剤が、凍結乾燥またはスプレー乾燥粉末などの発酵固体に添加される。いくつかの実施形態において、製剤不活性剤は、発酵ブロスを濃縮した後および／または乾燥中および／または乾燥後に添加される。湿潤剤は散布特性および浸透特性を増大させるし、分散剤は、表面に適用した場合、活性成分（一旦希釈）の分散性および溶解性を増大させる。例示的な湿潤剤は、当業者に公知であり、スルホコハク酸塩および誘導体、例えばＭＵＬＴＩＷＥＴＴＭ  ＭＯ−７０Ｒ（Ｃｒｏｄａ  Ｉｎｃ．、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）；シロキサン類、例えばＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）（Ｅｖｏｎｉｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；非イオン性化合物、例えばＡＴＬＯＸＴＭ  ４８９４（Ｃｒｏｄａ  Ｉｎｃ．、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）；アルキルポリグルコシド類、例えばＴＥＲＷＥＴ（登録商標）  ３００１（Ｈｕｎｔｓｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＬＬＣ、Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、Ｔｅｘａｓ）；Ｃ１２−Ｃ１４アルコールエトキシレート、例えばＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）  １５−Ｓ−１５（Ｔｈｅ  Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｄｌａｎｄ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）；リン酸エステル類、例えばＲＨＯＤＡＦＡＣ（登録商標）  ＢＧ−５１０（Ｒｈｏｄｉａ、Ｉｎｃ．）；およびアルキルエーテルカルボキシレート類、例えばＥＭＵＬＳＯＧＥＮＴＭ  ＬＳ（Ｃｌａｒｉａｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）が挙げられる。
【０１２７】
寄託情報：
本発明のパエニバシラス属菌の菌株の試料は、ブダペスト条約のもとに、米国農務省農業研究局農業利用研究センター（ＮＲＲＬ）、１８１５  ノース・ユニバーシティー・ストリート、ペオリア、イリノイ州、６１６０４、米国にある農業研究局カルチャー・コレクションに寄託されている。Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２が２０１４年８月２８日に寄託された。２０１５年９月１日にＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９が寄託された。２０１６年７月２２日にＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６が共に寄託された。Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５は２０１８年５月３日に寄託された。
【０１２８】
それらのパエニバシラス属菌の菌株は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．セクション１．１４および３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．セクション１２２の下でその権利があると特許・商標庁長官により判断された者に対して、本特許出願の継続期間中に当該培養物へのアクセスが可能であることを保証する条件下で寄託されている。しかし、寄託物の利用可能性は、政府の措置により付与された特許権を制限して、本発明を実施するためのライセンスをもたらすものではないことを理解すべきである。
【０１２９】
本発明の純粋に例示的で非限定的な目的のために、以下の実施例を挙げる。
【実施例】
【０１３０】
実施例１．パエニバシラス属菌のフサリシジン生産増強ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株と変異誘導体
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株を１−メチル−３−ニトロ−１−ニトログアニジン（ＮＴＧ）またはエチルメタンスルホナート（ＥＭＳ）で処理して遺伝的変異を導入した。コロニー形成単位（ＣＦＵ）の５０〜９０％の損失をもたらす処理は、その後のスクリーニングのために十分な遺伝的変異および生存細胞を得るのに適切であると考えられた。化学的に処理された集団からの個々の分離株を９６穴ディープウェルブロックで培養し、４つのフサリシジン様化合物、すなわちフサリシジンＡ（「Ｆｕｓ Ａ」としても知られる）、ＬｉＦ０８ａ、パエニセリンＡ１およびＢ１（それらの分子量から「Ｍ８６８」としても知られる）；およびＷＯ２０１６／１５４２９７に記載されているようパエニプロリキシンＡ２およびＢ２（それらの分子量から「Ｍ９３８」としても知られる）の産生増加についてスクリーニングした。
【０１３１】
この初回スクリーニングからフサリシジンレベルが明らかに改善された分離株を、９６穴ディープウェルブロックの技術的反復で再スクリーニングし、過剰生産菌であることが確認された。確認された分離株をその後スケールアップし、耐熱性細菌胞子を作る能力を含むフサリシジン生産および増殖特性について分析した。スクリーニング、確認、スケールアップの最初のラウンドから、いくつかの過剰生産分離株が同定され、再度化学処理され、フサリシジン生産の更なる改良のためのスクリーニングが行われた。この過程を数回繰り返した。
【０１３２】
この分析で確認された株をさらに評価し、フサリシジン生産を確認した。簡単に述べると、各菌株を大豆ベースの培地で培養し、該ブロス全体の脂溶性画分を抽出した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により全ブロス抽出物を分析し、フサリシジンＡを含む標準試料で作成したＨＰＬＣプロファイルに基づいてフサリシジンＡの存在を同定した。変異株の耐熱性胞子産生能も評価した。
【０１３３】
合計で、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株に由来する約１０、０００分離株を９６穴ディープウェルブロック形式でスクリーニングした。この分析から、４種類のフサリシジン様化合物の相対的なレベルについて特性評価を行なったいくつかの分離株が得られた（表１参照）。これらの株は広範に特性評価され、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．株ＪはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株と比較して、高水準のフサリシジン生産と好ましい増殖特性（例えば、胞子形成）を示すものであることが確認された。しかし、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．株Ｊは、加工を困難にする粘性発酵ブロスを生産した。この観測から、液体培養における粘度およびフサリシジン様化合物の製造において、変異株をスクリーニングする必要があることが明らかになった。
【表１】
2021522833.tif 000003
2021522833.tif 000004
【０１３４】
実施例２．パエニバシラス属菌の発酵ブロス粘度減少ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株変異体誘導体
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株とＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株に由来する変異株の多くと同様に粘性発酵ブロス培養物を生産した。これらの培養物の物理化学的特性は、発酵および下流加工における課題を提示した。したがって、粘度の低い発酵ブロス培養物を産生するＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株の突然変異体誘導体を同定する方法を見つけることが望ましかった。
【０１３５】
スクロースはパエニバシラス属菌による菌体外多糖類（ＥＰＳ）産生の炭素源として用いられることが多く、スクロースを用いると高分子量レバン型ＥＰＳが著しい収量でもたらされることが報告されている（Ｌｉａｎｇ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ．Ｍａｒ．Ｄｒｕｇｓ  ２０１５、１３、１８４７−１８６３）。高分子量ＥＰＳポリマーは増粘剤として商業利用されている。パエニバシラスではスクロースとともに他のオリゴ糖や多糖類がＥＰＳ産生の炭素源として利用されている。
【０１３６】
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株および突然変異体誘導体を、０．２５〜０．５Ｍの最終濃度のスクロースを添加した固体寒天培地上で増殖させた場合、明確なムコイドコロニー表現型が観察された（表２の配合表を参照）。２００ｇ／Ｌのマルトデキストリンを含む同様の固体寒天培地でもムコイドコロニー表現型が現れた。
【０１３７】
Ｐ．ｔｅｒｒａｅ、Ｐ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａおよびＰ．ｐｅｏｒｉａｅの菌株を含むいくつかのパエニバシラス属菌の菌株は、スクロース含有固体寒天培地上でムコイド表現型を生じた（図２参照）。粘度を低下させ、物理的特性を高めた発酵ブロス培養物をもたらす非ムコイドコロニー分離株について、迅速な視覚スクリーニングを設計できると仮定した。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、ムコイドコロニーの表現型は、浸漬培養におけるＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９、その突然変異体誘導体および他のパエニバシラス属菌の菌株によるＥＰＳの産生に対応している可能性がある。
【表２】
2021522833.tif 000005
【０１３８】
以下のプロトコルを開発し、非ムコイドコロニー分離株を同定するための迅速な視覚スクリーニングとして検証した。Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株の殺真菌性突然変異体誘導体の液体培養物を化学処理し、その後希釈し、スクロースを添加した固体寒天培地上に接種して単一コロニーを得た。非ムコイドコロニーは、ムコイドコロニーと肉眼によって容易に識別できた（図３参照）。非ムコイド分離株を拾い上げ、スクロースを添加した新鮮な固体寒天培地上にストリークし、表現型を確認した。
【０１３９】
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株に由来するフサリシジン過剰生産親株から８つの非ムコイド分離株を同定した。非ムコイド分離株には、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株とＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株が含まれていた（図４参照）。８分離株のうち６株は、それぞれの親株に匹敵するレベル以上のフサリシジンバイオマーカーを産生した。さらに、８分離株のうち５株は、同じ条件下でＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株が産生するものと同様のレベルで耐熱性胞子を産生することができた。これらの観測から、フサリシジン生産、胞子形成および粘度生産因子に関連する細胞過程は遺伝子的に分離可能であることが示された。
【０１４０】
８つの非ムコイド分離株をより大規模な培養で評価し、２つの非ムコイド分離株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６とＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４は、大豆ベースの培地でフサリシジン生産の改善と好ましい増殖特性を示すことが分かった。これらの株について、その充填細胞容積（％ＰＣＶ）およびその粘度を分析した。
【０１４１】
％ＰＣＶは、１ｍＬ容を１７、０００ｇで３分間、２ｍＬマイクロ遠心チューブ内で遠心分離して定量した。初めの１ｍＬ試料量マークを１００％とした当該チューブの目盛りに基づいて、充填細胞容積率を求めた。
【０１４２】
或いは、全ブロスの約１０ｍＬを１５ｍＬ遠心管に入れ、全ブロスの重量（「Ｗｗｂ」）を記録し、試料を１０、０００ｇで１０分間遠心分離し、上清液を注ぎ落とし、上清の重量（「Ｗｓｕｐ」）を記録した。％ＰＣＶを算出するために、以下の式を用いた：
％ＰＣＶ＝１００×（Ｗｗｂ−Ｗｓｕｐ）／（Ｗｗｂ）
【０１４３】
発酵ブロスの粘度を５０ｒｐｍの粘度計で試験し、値をセンチポアズで記載した。
【０１４４】
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株の発酵ブロスの５６センチポアズ（ｃＰ）に対して、それぞれ１１．５および３３．９ｃＰの粘度の発酵ブロスを生産した（表３参照）。さらに、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株と比較して、充填細胞容積（ＰＣＶ）が小さかった（表３および図５参照）。これらの結果は、高レベルの多糖類（例えば、スクロースまたはマルトデキストリン）を含む固体培地上での迅速視覚スクリーニングが、粘度を低下させ、物理的特性を増強した発酵ブロス培養物をもたらす非ムコイドコロニー分離株を同定できるという仮説を実証した。
【０１４５】
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株からの発酵ブロスの改良された物理的性質は、生きた微生物ベースの製品としてのこれらの非ムコイド菌株の処理性の増強を可能にした。ＰＣＶおよび発酵ブロスの粘度が低いため、農業用途での使用率を低下させるために全ブロス材料の濃度を高めることができる。
【表３】
2021522833.tif 000006
【０１４６】
実施例３．菌株改良分離株の突然変異解析
非ムコイド表現型を有するいくつかの分離株のゲノム配列を、標準的な配列決定法を用いて決定した。分離株の一塩基多型（ＳＮＰ）を比較した。驚いたことに、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株を含む、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株に由来する非ムコイド株の８株中５株が、ｄｅｇＳ ｄｅｇＵ領域のタンパク質コドン配列に突然変異を有することがわかった（図６Ａ参照）。これらの突然変異は、ＤｅｇＵのレシーバドメインおよびＤＮＡ結合ドメイン内、ならびにＤｅｇＳの単一結合ドメインおよびＡＴＰアーゼドメイン内に属していた（図６Ｂ−６Ｃ参照）。
【０１４７】
ｄｅｇＳおよびｄｅｇＵにおけるこれらの突然変異は、スクロースを添加した固体寒天プレート上でのこれらの分離株の非ムコイド性表現型に関連しているという仮説が立てられた。これを試験するために、親のＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株において、ｄｅｇＳ遺伝子をカナマイシンカセットで置換し、並びにｄｅｇＳおよびｄｅｇＵ領域をカナマイシンカセットで置換するために、標準的な分子法を用いてＤＮＡ構築物を作製した。
【０１４８】
ｄｅｇＳ単独またはｄｅｇＳおよびｄｅｇＵのカナマイシン耐性（ｋａｎＲ）による置換を標的にして、ｋａｎＲをコードする遺伝子を、ＤｅｇＳをコードする遺伝子の上流１ｋｂｐ領域、およびＤｅｇＳまたはＤｅｇＵをコードする遺伝子の下流１ｋｂｐに隣接させた接合可能な大腸菌−パエニバシラス・シャトルプラスミドにクローニングした。このプラスミドは、最初にエレクトロポレーションによって大腸菌株に導入され、続いて接合によってＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株に移した。プラスミド骨格にコードされたエリスロマイシン耐性を利用して、プラスミド導入に成功したものを選択した。カナマイシン耐性、エリスロマイシン感受性およびＰＣＲバリデーションを用いて、二重交差組込み体を確認した。カナマイシン耐性マーカー置き換え株のＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９  ｄｅｇＳ：：ｋａｎＲ株およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９  ｄｅｇＳｄｅｇＵ：：ｋａｎＲ株のいずれも、以前に選択した分離株の非ムコイド表現型を模倣した（図７参照）。これらの結果は、非機能性遺伝子産物に至るｄｅｇＳおよびｄｅｇＵの突然変異が非ムコイド表現型を生じることを確認した。
【０１４９】
ｄｅｇＳおよびｄｅｇＵにおける他の突然変異が特徴付けら、それらは機能しない遺伝子産物をもたらした。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株のセリン７６残基は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株のトレオニン７３に相当し、そのキナーゼ活性を刺激するリン酸化部位であり、セリン７６をアラニンに変異させると、ＤｅｇＳの酵素活性が有意に低下した（Ｊｅｒｓ，Ｃ．ら、“Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｔｗｏ−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ｋｉｎａｓｅ  ＤｅｇＳ  ｉｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  Ｓｅｒｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｔｓ  Ｉｎｐｕｔ  Ｄｏｍａｉｎ”、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（２０１１）６（２）：ｅ１４６５３参照。）。Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株におけるアラニン１９０に相当するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株におけるアラニン１９３残基のバリンへの変異は、ＤｅｇＳのキナーゼ活性を本質的に消滅させた（Ｄａｈｌ，Ｍ．Ｋ．ら、“Ｔｈｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  Ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤｅｇＵ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  Ａｃｔｓ  ａｓ  ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｗｉｔｃｈ  Ａｌｌｏｗｉｎｇ  Ｅｉｔｈｅｒ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ”、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）２６７（２０）：１４５０９参照。）。
【０１５０】
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株のアスパラギン酸６３に相当するアスパラギン酸５６をアスパラギンに置換するｄｅｇＵの変異は、ＤｅｇＳによるＤｅｇＵのリン酸化を妨げた（前述のＤａｈｌ，Ｍ．Ｋ．ら、参照。）。ＤｅｇＵのＤＮＡ結合ドメインのアラニンスキャニングにより、ｃｏｍＫおよびａｐｒＥのプロモーター領域へのＤｅｇＵの結合の極度の減少、およびその結果としてこれらの遺伝子の発現の減少を引き起こす５つの一般的な突然変異体が明らかになり、さらにａｐｒＥのプロモーター領域へのＤｅｇＵの結合を阻害し、その結果としてのこの遺伝子の発現を減少させる３つの追加の突然変異体も認められた（Ｓｈｉｍａｎｅら、“Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｅｌｉｘ−Ｔｕｒｎ−Ｈｅｌｉｘ  Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ＤｅｇＵ，ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｓ−Ａｃｔｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ＤｅｇＵ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｐｒＥ  ａｎｄ  ｃｏｍＫ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ”、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００４）１３６（３）：３８７−３９７で報告された表４の突然変異体参照。）。
【０１５１】
ｄｅｇＳ遺伝子またはｄｅｇＳ遺伝子およびｄｅｇＵ遺伝子を抗生物質耐性カセットで置換した結果に基づき、上記のものを含む非機能性遺伝子産物をもたらすｄｅｇＳまたはｄｅｇＵのいかなる突然変異も、野生型ＤｅｇＵおよび野生型ＤｅｇＳを含むパエニバシラス属菌の菌株と比較して、液体培養の粘度の減少および／または非ムコイド性コロニー形態を示すパエニバシラス属菌の菌株をもたらすであろうと結論される。
【表４】
2021522833.tif 000007
【表５】
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【表６】
2021522833.tif 000009
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2021522833.tif 000011
【０１５２】
実施例４．非ムコイド性株のさらなる突然変異誘発とスクリーニング
フサリシジン様化合物の力価をさらに改良するために、実施例１に記載したようにＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株の化学処理を行った。９６ウェルブロックで製造した培養ブロスからのサンプルを、フサリシジンＡの相対レベルについて分析した（表７参照）。その後、フサリシジン生産が増加したいくつかの分離株を選択し、より大規模な培養で発酵後のさらなる試験を行った。これらの大規模な培養物からの試料を再度、フサリシジンＡ含量について分析し（表８参照）、それらの充填細胞容積を実施例２に記載されているように測定した（表９参照）。充填細胞容積は、９６ウェルブロックからの培養物ではこれらの測定に十分な容積が得られなかったため、より大規模な培養物からのサンプルでのみ評価した。
【０１５３】
驚くべきことに、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株は、フサリシジン様化合物のレベルを向上させただけでなく（表７、８参照）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株よりも低いレベルの粘度を有していたことが判明した（表９参照）。これらの結果はさらに、フサリシジン生合成、胞子形成および粘度産生因子の産生に関連する細胞過程が遺伝的に分離可能であることを確認した。Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株と、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７１２９株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株との系統を図１に示す。
【表７】
2021522833.tif 000012
【表８】
2021522833.tif 000013
【表９】
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【０１５４】
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株並びにＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株の相対的フサリシジンＡレベル、充填細胞容積および粘度を合わせて評価し、開示された方法による複数回の突然変異誘発およびスクリーニングで達成された改善を確認した。表１０に示した結果は、開示されたスクリーニング方法が、フサリシジン生産の有意な改善、および発酵ブロス中の活性化合物のより高い濃度を可能にする、より低い充填細胞容積および粘度を有する突然変異体誘導株をもたらしたことを実証している。
【表１０】
2021522833.tif 000015
【０１５５】
実施例５．Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株の生物活性の比較
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株を大豆ベース培地で培養し、全ブロスを生産した。全ブロスを水と有機溶媒の混合液で２．５％、１．２５％、０．６２５％および０．３１２％の濃度に希釈した。希釈した全ブロスを幼植物に施用し、ついで該植物をＡｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ（ＡＬＴＥＳＯ）の接種材料に曝露した。陽性対照として化学的殺真菌剤を各アッセイに含めた。植物病原体の接種材料に曝露した数日後に、各植物を無処理対照植物に対する病原体の防除百分率としてスコア化した。各処理を３反復で評価し、平均防除百分率を記録した（表１１参照）。０％は無処理対照のそれに相当する有効性を意味し、１００％の有効性は病害が観察されないことを意味する。Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株とＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株に比べて優れた抗真菌活性を有した。
【表１１】
2021522833.tif 000016
【０１５６】
このアッセイは、真菌病原体Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ（ＡＬＴＥＳＯ）に対してＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株で繰り返した。このアッセイは、３反復の代わりに６反復を評価し、全ブロスを１．２５％または０．６２５％で施用したことを除いて、上記と同様に実施した。表１２に、当該処理によるの平均防除百分率を示す。Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株は、当該アッセイにおいて同程度の抗真菌活性を示した。
【表１２】
2021522833.tif 000017
【０１５７】
実施例６．Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株並びにＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株の卵菌植物病原体に対する抗真菌活性
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株を大豆ベース培地で培養し、全ブロスを生産した。全ブロスを水と有機溶媒の混合液で１０％、５％、２．５％、１．２５％および０．６２５％の濃度に希釈した。希釈した全ブロスを幼植物に施用し、ついで該植物を、キュウリべと病としても知られているＰｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃｕｂｅｎｓｉｓ（ＰＳＰＥＣＵ）またはトマト疫病としても知られるＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ（ＰＨＹＴＩＮ）の接種材料に曝露した。陽性対照として化学的殺真菌剤を各アッセイに含めた。植物病原体の接種材料に曝露した数日後に、各植物を無処理対照植物に対する病原体の防除百分率としてスコア化した。各処理を３反復で評価し、平均防除百分率を記録した（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃｕｂｅｎｓｉｓの結果については表１３、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓの結果については表１４を参照）。０％は無処理対照のそれに相当する有効性を意味し、１００％の有効性は病害が観察されないことを意味する。３つのパエニバシラス属菌の菌株は全て、２つの卵菌植物病原体の一貫した防除を示した。
【表１３】
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【表１４】
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【０１５８】
実施例７．夏疫病（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）に感染したジャガイモ圃場試験におけるパエニバシラス株の比較
自然発生の夏疫病（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）に曝露したジャガイモ植物体による圃場試験を行った。Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株とＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株の液体発酵産物を、菌株を大豆ベースの培地で培養し、得られた全ブロスを遠心分離と上清の分取を介して濃縮することにより調製した。表１６に概要を示したように、ＢＢＣＨ６５からＢＢＣＨ７０の生育段階において、７月２０日から８月４日の間に、植物に発酵産物を１０リットル／ヘクタールおよび２０リットル／ヘクタールで施用した。病害の平均発生率は未処理植物で約１３％であった。表１５に示す病害防除百分率は、最終施用７日後に実施した病状の目視観察による評価の結果である。０％は無処理対照のそれに相当する有効性を意味し、１００％の有効性は病害が観察されなかったことを意味する。
【表１５】
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【表１６】
2021522833.tif 000021
【０１５９】
表１５の結果は、この野外試験において、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株の観察された活性が、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２と比較して優れていることを明確に示している。
【０１６０】
実施例８．灰色かび病（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）に感染したイチゴ圃場試験におけるパエニバシラス株の比較
自然発生の灰色かび病（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）に曝露したイチゴ植物体による圃場試験を行った。Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株とＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株の液体発酵産物を、菌株を大豆ベースの培地で培養し、得られた全ブロスを遠心分離と上清の分取を介して濃縮することにより調製した。表１８に概要を示したように、ＢＢＣＨ６７からＢＢＣＨ８７の生育段階において、３月３１日から４月１８日の間に、植物に発酵産物を１０リットル／ヘクタールおよび２０リットル／ヘクタールで施用した。病害の平均発生率は未処理植物で約２２％であった。表１７に示す病害防除百分率は、最終施用２日後に実施した病状の目視観察による評価の結果である。０％は無処理対照のそれに相当する有効性を意味し、１００％の有効性は病害が観察されなかったことを意味する。
【表１７】
2021522833.tif 000022
【表１８】
2021522833.tif 000023
【０１６１】
表１７の結果は、この野外試験において、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株の観察された活性が、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２と比較して優れていることを明確に示している。
【０１６２】
実施例９．炭疽病（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｐｓｉｃｉ）に感染したトウガラシ圃場試験におけるパエニバシラス株の比較
自然発生の炭疽病（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｐｓｉｃｉ）に曝露したトウガラシ植物体による圃場試験を行った。Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２株とＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株の液体発酵産物を、菌株を大豆ベースの培地で培養し、得られた全ブロスを遠心分離と上清の分取を介して濃縮することにより調製した。表２０に概要を示したように、ＢＢＣＨ７５の生育段階において、１２月２８日から１月２日の間に、植物に発酵産物を１０リットル／ヘクタールおよび２０リットル／ヘクタールで施用した。病害の平均発生率は未処理植物で約６０％であった。表１９に示す病害防除百分率は、最終施用２日後に実施した病状の目視観察による評価の結果である。０％は無処理対照のそれに相当する有効性を意味し、１００％の有効性は病害が観察されなかったことを意味する。
【表１９】
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【表２０】
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【０１６３】
表１９の結果は、この野外試験において、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０６株の観察された活性がＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２と比較して優れていることを明確に示している。
【０１６４】
実施例１０．Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株およびＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株の粘度乖離が生じる増殖条件の同定
図１に示すように、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株を、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株の化学的突然変異誘発によって生成した。この化学的突然変異誘発の結果、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株は粘度が有意に低下したが、フサリシジンＡの濃度は比較的高かった（表１０参照）。液体培養中で２つの株の粘度が乖離する時点を決定するために、各株を７２時間の期間、大豆ベースの培地で増殖させた。１群の培養は２５０ｒｐｍで撹拌し、もう１群は３００ｒｐｍで撹拌した。各液体培養物の試料を２４時間、３２時間、４０時間、４８時間、５６時間および７２時間で取り出した。各試料の粘度およびフサリシジンＡの相対レベルを実施例４に概略を示したように測定した。２５０ｒｐｍおよび３００ｒｐｍで増殖させた培養について平均値および標準偏差（ｎ＝４）を求め、それぞれ図８Ａおよび図８Ｂに示す。
【０１６５】
各株によって産生されたフサリシジンＡの相対レベルは同等であり、７２時間にわたって同様の割合で増加した。胞子産生はすべての試料で顕微鏡下で視覚的に評価し、いずれの時点でも胞子は存在しなかった。Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株では粘度の有意な上昇が認められたが、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株の粘度はこの間に低レベルで比較的一定であったため（図８Ａおよび図８Ｂで粘度を示す実線を比較されたい。）、今後の実験では４０時間および４８時間の時点を選択した。３００ｒｐｍで攪拌しながら増殖した液体培養物は、その粘度値がより一貫していたため、この攪拌速度も今後の実験に選択した。
【０１６６】
実施例１１．Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株およびＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株の液体培養物によるプロテオーム解析
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株（親株）およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株（後代株）を用いて、分子レベルでの粘性表現型の洞察を得るために、探索プロテオミクスおよび経路解析手法を行った。菌株を大豆ベースの培地で４０時間および４８時間振とうフラスコで増殖させ、２菌株の乖離した粘度表現型を得た。Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株およびＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株について、条件当たり６個の複製を計２４検体について増殖させた。収穫時、検体を−８０℃で速やかに凍結して増殖を停止させた後にバッチ方式でサンプル調製を行った。全発酵物でタンパク質抽出を行い、分泌および栄養細胞タンパク質を得た。総タンパク質サンプルを還元、アルキル化およびトリプシン消化し、プロテオーム解析のための総ペプチドプールを作製した。総ペプチドサンプルを液体クロマトグラフィーで分離し、ＳＣＩＥＸ  ４６００  ＴＲＩＰＬＥＴＯＦ（登録商標）質量分析計での分析を、データ依存性（ＩＤＡ）およびデータ非依存性（ＳＷＡＴＨ）取得モードで連続的に実行し、イオンライブラリの作成および全ペプチドプールにわたる相対的定量を可能にした。
【０１６７】
イオンライブラリを作成するために、まずＳＣＩＥＸ社のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｉｌｏｔ（５．０．１．０，４８９５）ソフトウェアでＩＤＡランを解析し、偽発見率（ＦＤＲ）解析を伴う徹底的なＩＤモードで実行した。次に、ＳＷＡＴＨマイクロアプリ（２．０．１．２１３３）を用いて、ＳＣＩＥＸ社のＰｅａｋＶｉｅｗ（２．２．０．１１３９１）ソフトウェアにおいて、１％グローバルタンパク質ＦＤＲでイオンライブラリを作成した。ＳＷＡＴＨマイクロアプリによるデータ解析を継続し、ＳＷＡＴＨランの相対定量を９９％ペプチド信頼度と１％ＦＤＲ閾値で行った。次に、ペプチドあたり６個の遷移とタンパク質あたり６個のペプチドの合計強度から計算したタンパク質領域を、下流解析のためにエクスポートした。タンパク質領域の閾値は５０、０００とした。
【０１６８】
一番の興味は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株（親株）とＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株（後代株）の間で、単一時点（４０時間または４８時間）で発現変動するタンパク質の同定であった。その目的は、菌株間のタンパク質レベルの差異の解明であり、それが菌体外多糖（ＥＰＳ）産生および異なる粘度表現型に寄与すると仮定された。統計解析は、まずＳＣＩＥＸ社のＭａｒｋｅｒＶｉｅｗ（１．２．１）ソフトウェアを用いて行った。平均１対平均２およびＬｏｇ（発現変動）対ｐ値を含む探索的データ解析では大きなデータ異常はなく、主成分分析では菌株別および時間別にサンプルを群別に示した。株間の異なるタンパク質発現を決定するために、ＭａｒｋｅｒＶｉｅｗでｔ検定を実施し、次にＲ（ＦＤＲ／ＢＨ補正）における多重比較のためにｐ値を調整した。タンパク質はＰ（ＦＤＲ／ＢＨ補正）＜０．０５で発現変動し、最小発現変動倍率＝１．５であると考えられた。４０時間で検出された４４２のタンパク質のうち、５４のタンパク質が発現変動基準を満たした（表２１参照）。４８時間で検出された４２２個のタンパク質のうち、９４個のタンパク質が発現変動していた（表２２参照）。
【０１６９】
細菌の菌体外多糖は構造が多様で、さまざまな構成単位からなり、さまざまな経路で合成される。発現は菌株や環境（発酵過程など）によっても変化する。例えば、パエニバシラスの異なる株は、それぞれグルコース、またはグルコースおよびフルクトースから構成されるカードラン型およびレバン型ＥＰＳを作るものとして特徴付けられている。この最初のプロテオーム解析から、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株（親株）およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株（後代株）で発現変動すると同定されたタンパク質のいずれも、文献に記載されているタンパク質との相同性によって同定されたように、ＥＰＳ合成に直接的に関与しないことが示唆された。
【０１７０】
プロテオーム解析データーの更なる解析がＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株とＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株の間の粘性表現型の違いを説明するために必要であった。プロテオーム解析によって見られるタンパク質レベルの相違を文脈的に把握するために、タンパク質をＫＥＧＧ（ＢＬＡＳＴＫＯＡＬＡアルゴリズム）においてさらに注釈付けし、ＫＥＧＧ経路にマッピングした。Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株（後代株）では、４８時間の時点で解糖系とトリカルボン酸（ＴＣＡ）回路に関与するいくつかのタンパク質が有意に上昇していることが観察された（表２２の「後代におけるアップレギュレーション」以下の下線を引いたタンパク質参照）。このことから、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株（後代株）では、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株（親株）と比較して糖代謝の上昇が起こることが示唆される。ＥＰＳ産生は、一次代謝と同じヘキソース単量体（グルコースやフルクトースなど）に依存している。このように、一次代謝の増大は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株（後代株）において、出発基質の濃度低下および、その結果として生じるＥＰＳ産生および粘度の低下につながるであろう。
【０１７１】
逆に、炭水化物資源が過剰で、出発基質が豊富なところでは、ＥＰＳ生産と粘度は上昇するであろう。この考えと一致して、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株（親株）では、４０時間および４８時間に２種類のα−アミラーゼタンパク質が有意に上昇していた（表２１および表２２の「親におけるアップレギュレーション」以下の下線を引いたタンパク質を参照）。２種類のアミラーゼのアミノ酸配列を表２３に示す。これら２種類のアミラーゼは、グリコシドヒドロラーゼファミリー１３である“α−アミラーゼファミリー”に特徴的なタンパク質ドメインを有している（Ｃｏｃｋｂｕｒｎら、Ｂｉｏｌｏｇｉａ  ６９（６）：７０５−７１２、２０１４を参照）。
【０１７２】
４０時間および４８時間の時点で採取したサンプルを用いて、２つのα−アミラーゼ（「α−アミラーゼ＃１」および「α−アミラーゼ＃２」）の相対的発現を定量し、図９Ａおよび図９Ｂに示した。当該タンパク質の相対的定量は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株（親株）がＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株（後代株）よりも有意に多くのα−アミラーゼを一貫して発現することを示している。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、菌株を増殖させた大豆ベースの培養培地には、これらのアミラーゼがＥＰＳ産生に必要なヘキソース単量体に変換する多糖類が含まれている。次いで、多量の基質がＥＰＳ産生を促進し、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株（親株）の液状培養において粘度が増加する可能性がある。
【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【０１７３】
実施例１２．Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株（親株）でのアミラーゼ活性増加の確認
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株（親株）の液状培養物は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株（後代株）よりもアミラーゼ活性のレベルが高いことを確認するため、両菌株を大豆ベースの培地で増殖させ、４０時間および４８時間目に試料を分取した。試料を遠心分離し、上清を滅菌ろ過して全ての細胞を培地から除去し、アミラーゼおよび使い尽くされていない多糖類を含む細胞タンパク質を残した。上清中のアミラーゼは多糖を分解し、グルコースを生成し続ける。これらの無細胞上清中のグルコース含量を、２８℃でのインキュベーションの最初および５時間後に測定した。
【０１７４】
図１０に示したグルコース測定結果は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株（親株）が、菌株を同様の条件下で増殖させた場合に、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株（後代株）よりも大きなアミラーゼ活性レベルを有することを示している。
【０１７５】
実施例１３．Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株およびＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株の液体培養へのグルコースの添加
もしもパエニバシラス属菌株の液体培養におけるヘキソース単量体（例えば、グルコース、フルクトース）の利用性が、これらの培養物の粘度に寄与するＥＰＳ産生を制限するのならば、培養へのグルコースの添加はＥＰＳ産生と粘度の増加をもたらすはずであり、この作用はＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株（後代株）に対して最も強く示されるであろう。この仮説を検証するために、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株（後代株）およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株（親株）の液状培養を、４０時間の時点で０ｇ／Ｌグルコース（すなわち対照）、２ｇ／Ｌグルコース、５ｇ／Ｌグルコースまたは１０ｇ／Ｌグルコースで増補した。対照およびグルコース添加液体培養物は６時間増殖を続けさせ、その時点で各培養物中の粘度および残留グルコース濃度を測定した。
【０１７６】
１０ｇ／Ｌグルコースを添加したものを除く全ての培養において、残留グルコース濃度はほぼ０ｇ／Ｌであり、添加グルコースが細胞によって消費されることを示した。培養物の粘度測定値を図１１に示す。Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株（親株）培養へのグルコースの添加は粘度にほとんど影響を及ぼさず、おそらくこれは、該菌株の高レベルのアミラーゼ活性および、その結果として豊富なグルコースが培養培地から得られるためであろう。対照的に、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株（後代株）のグルコース添加培養では、添加したグルコース量の増加に起因する粘度増加のために、その粘度が高くなった（図１１の右側の棒グラフ参照）。
【０１７７】
総じて、前記の実験結果は、アミラーゼの発現および活性がＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７６１５株（後代株）ではＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  Ｂ−６７３０４株（親株）に比べて低く、そのためにＥＰＳ産生のための単純糖類（例えばグルコース）が少なく、粘性表現型が低くなることを示してる。
【０１７８】
特に定義しない限り、本明細書中の全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。引用されるすべての出版物、特許、および特許出版物は、すべての目的のためにここにその全体を引用して組み込まれる。
【０１７９】
開示された発明は、特定の方法論、プロトコルおよびこれらが変化し得ると記載される材料に限定されないことが理解される。また、本明細書中で使用される用語は、特定の実施態様のみを記載する目的であり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるであろう本発明の範囲を限定することを意図していないことも理解される。
【０１８０】
当業者は、定型的な実験にすぎないことを用いて、ここで説明した発明の特定の実施例についての多くの等価物を理解し、確認できる。このような均等物は添付の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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