(57)【要約】本発明は、ＰＬＡ２−ＧＩＢに結合するヒトまたはヒト化抗体、それらの産生およびそれらの使用に関する。これらの抗体は、特に治療および診断目的のために、有利な特徴を示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢに結合する、単離されたヒトもしくはヒト化抗体、またはその誘導体。
【請求項２】
モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体またはその誘導体。
【請求項３】
配列番号１４を参照して、ヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢのＷ３、Ｒ６、Ｋ７、Ｋ１０、Ｃ７７、Ｙ７５、Ｇ７９およびＳ８０から選択されたアミノ酸残基の少なくとも１つを含むエピトープに結合する、請求項１または２に記載の抗体またはその誘導体。
【請求項４】
配列番号２を含む軽鎖可変領域および配列番号３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体１４Ｇ９のヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対する結合を競合阻害する、請求項１または２に記載の抗体またはその誘導体。
【請求項５】
配列番号４を含む軽鎖可変領域および配列番号５を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体＃２ＢのヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対する結合を競合阻害する、請求項１または２に記載の抗体またはその誘導体。
【請求項６】
配列番号４を含む軽鎖可変領域および配列番号６を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体＃２Ｂ１のヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対する結合を競合阻害する、請求項１に記載の抗体またはその誘導体。
【請求項７】
配列番号４を含む軽鎖可変領域および配列番号７を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体＃２Ｂ２のヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対する結合を競合阻害する、請求項１に記載の抗体またはその誘導体。
【請求項８】
ｓＰＬＡ２−ＧＩＢを中和する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体またはその誘導体。
【請求項９】
配列番号４を含むまたは配列番号４から成る軽鎖、および配列番号５を含むまたは配列番号５から成る重鎖を含む、単離された請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
配列番号４を含むまたは配列番号４から成る軽鎖、および配列番号６を含むまたは配列番号６から成る重鎖を含む、単離された請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号４を含むまたは配列番号４から成る軽鎖、および配列番号７を含むまたは配列番号７から成る重鎖を含む、単離された請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
アミノ酸残基ＱＤＶＳＴＡのＣＤＲ−Ｌ１と、
アミノ酸残基ＷＡＳのＣＤＲ−Ｌ２と、
アミノ酸残基ＱＱＤＹＳＴＰＰＴのＣＤＲ−Ｌ３と、
アミノ酸残基ＧＹＴＦＴＮＹＷのＣＤＲ−Ｈ１と、
アミノ酸残基ＩＤＰＳＤＴＲＴのＣＤＲ−Ｈ２と、
アミノ酸残基ＡＲＱＴＬＹＹＥＡＬＤＹのＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む、単離された請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかの抗体もしくは誘導体、またはそのような抗体の軽鎖もしくは重鎖、またはその可変ドメインをコードする核酸。
【請求項１４】
配列番号１０〜１３のいずれかまたはその相補体から選択されたヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターまたは請求項１３に記載の核酸を含む、組換え宿主細胞。
【請求項１７】
（ｉ）請求項１から１２のいずれか一項に記載の抗体または誘導体、または請求項１５に記載のベクターもしくは請求項１３に記載の核酸もしくは請求項１６に記載の組換え宿主細胞と、
（ｉｉ）薬学的に許容される担体または賦形剤と、
を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
対象の疾患の治療に使用するための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の抗体または誘導体。
【請求項１９】
請求項１６に記載の細胞を、前記抗体の発現に適した条件下で培養し、場合により前記抗体を回収することを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の抗体を産生する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＬＡ２−ＧＩＢに結合する抗体、それらの産生およびそれらの使用に関する。これらの抗体は、特に治療および診断目的のために、有利な特徴を示す。
【背景技術】
【０００２】
グループＩＢ膵臓ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２−ＧＩＢ）は、低分子量（１４ｋＤ）で、非常に安定（７ジスルフィド結合）な分泌タンパク質であり、リン脂質のｓｎ−２脂肪アシル結合の加水分解を触媒して、遊離脂肪酸およびリゾリン脂質を放出する（ラムボーおよびゲルブ、２００８）。ヒトでは、ＰＬＡ２−ＧＩＢ遺伝子は主に膵臓で発現され、十二指腸、空腸、および胃では発現レベルが低くなる（エスコラ等、１９８３ａ）（ネヴァライネンおよびハーパネン、１９９３）。辺縁部の発現は、肺、目（コルコ等、２００７）、精巣など他の組織で報告されている。ヒト膵臓では、ＰＬＡ２−ＧＩＢは、主に膵腺房細胞の頂端チモーゲン顆粒部分で合成される（エスコラ等、１９８３ａ）。ＰＬＡ２−ＧＩＢは、膵島β細胞のインスリン分泌顆粒でも検出され、グルコース刺激膵島からのインスリンと共に分泌される（ラマナダム等、１９９８）。ＰＬＡ２−ＧＩＢは、不活性なプロ型（プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ）として膵液中に分泌され、プロペプチドのタンパク質分解切断によって活性化され、活性な成熟分泌型（ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ）を生成する。生体外実験では、トリプシンおよびプラスミンがプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢを良好な効力で活性化できることが示唆された（ナカノ等、１９９４）。
【０００３】
ＰＬＡ２−ＧＩＢは、消化管での役割に加えて、ヒト血漿においても循環している（（ニシジマ等、１９８３）（エスコラ等、１９８３ｂ）（スターンビ、１９８４）（ネヴァライネン等、１９８５）（キタガワ等、１９９１））。最近、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢは、ウイルス血症ＨＩＶ感染患者で観察されるＣＤ４Ｔリンパ球の不応答に潜む機序に重要な役割を果たしていることが同定された。特に、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢはＣＤ４Ｔリンパ球の慢性的な不活性化に関与するタンパク質であり、それらによってＣＤ４Ｔリンパ球は活性化分化の異常な状態になり、インターロイキン−７によって送達されるような特定の生理学的信号に対して不応性になることが示された（ＴＨＥＺＥ  Ｊａｃｑｕｅｓ等、２０１５）。
【０００４】
それゆえ、ＰＬＡ２−ＧＩＢの酵素活性を阻害できる、ＰＬＡ２−ＧＩＢに対する抗体が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、抗ＰＬＡ２−ＧＩＢ抗体およびその使用方法を提供する。より具体的には、本発明は、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢの酵素活性を中和することができるヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対する治療用抗体を提供する。
【０００６】
本発明の目的は、より具体的には、ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢに結合する、ヒトまたはヒト化抗体、またはその誘導体に関する。
【０００７】
本発明の好ましいヒトまたはヒト化抗体は、ヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢのＷ３、Ｒ６、Ｋ７、Ｋ１０、Ｃ７７、Ｙ７５、Ｇ７９およびＳ８０から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含むエピトープに結合する。本発明のさらに好ましい抗体は中和抗体である。そのような抗体の具体例は、抗体＃２Ｂ、＃２Ｂ１および＃２Ｂ２である。
【０００８】
本発明の別の目的は、上記で定義した抗体もしくは誘導体、その軽鎖もしくは重鎖、またはその可変ドメインをコードする核酸分子に関する。
【０００９】
本発明はまた、上記で定義した核酸を含むベクター、およびそのようなベクターまたは核酸分子を含む組換え宿主細胞に関する。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、以下を含む医薬組成物である。すなわち（ｉ）上記で定義した抗体もしくはその誘導体、核酸、ベクター、または組換え宿主細胞、および（ｉｉ）医薬的に許容される担体または賦形剤である。
【００１１】
また、本発明は、上記で定義した抗体もしくはその誘導体、核酸、ベクター、組換え宿主細胞、または組成物であって、特に、免疫疾患の治療において必要とする対象に、医薬として使用するものに関する。
【００１２】
また、本発明は、それを必要とする対象、特に、免疫不全を有する対象を治療する方法であって、上記で定義した抗体もしくはその誘導体、核酸、ベクター、組換え宿主細胞、または組成物を投与する方法を含むものに関する。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、上記で定義した抗体を産生する方法であって、発現に適した条件下において上記で定義した細胞を培養し、かつ場合により上記抗体を回収する方法を含むものに関する。
【００１４】
本発明の治療用抗体は、任意の哺乳動物、特にそれを必要とする任意のヒト対象において使用することができる。それらは、ＰＬＡ２−ＧＩＢを阻害し、前記タンパク質の望ましくない活性に関連するあらゆる疾患を矯正するのに適している。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】モノクローナル抗体１４Ｇ９の特性を示す。図１Ａは、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性の阻害である。
【図１Ｂ】モノクローナル抗体１４Ｇ９の特性を示す。図１Ｂは、間接ＥＬＩＳＡにおける希釈曲線である。
【図１Ｃ】モノクローナル抗体１４Ｇ９の特性を示す。図１Ｃは、競合ＥＬＩＳＡにおける希釈曲線である。
【図２】１人の健康なドナーからのＣＤ４Ｔ細胞におけるリン酸化ＳＴＡＴ５核移行へのＨＩＶ−１感染患者から分離された血漿の阻害効果に対するモノクローナル抗体１４Ｇ９による阻害を示す。アイソタイプ対照ｍＡｂを使用しても同様の効果は観察されなかった。
【図３】５人の健康なドナーからのＣＤ４Ｔ細胞におけるリン酸化ＳＴＡＴ５核移行へのＨＩＶ−１感染患者から分離された血漿の阻害効果に対する１０μｇのモノクローナル抗体１４Ｇ９による阻害を示す。１０μｇのアイソタイプ対照ｍＡｂまたは非阻害性＃６Ｆ７ｍＡｂを使用しても同様の効果は観察されなかった。
【図４】マウス脾細胞から分離されたＣＤ４Ｔ細胞におけるリン酸化ＳＴＡＴ５核移行への１００μｇのｓＰＬＡ２−ＧＩＢの阻害効果に対する１ｍｇのモノクローナル抗体１４Ｇ９による、生体内阻害を示す。アイソタイプ対照ｍＡｂを９００μｇ注入しても、有意な影響は観察されなかった。
【図５Ａ】競合ＥＬＩＳＡによる１４Ｇ９ヒト化変異体＃１Ａの親和性の推定を示す。
【図５Ｂ】競合ＥＬＩＳＡによる１４Ｇ９ヒト化変異体＃１Ｂの親和性の推定を示す。
【図５Ｃ】競合ＥＬＩＳＡによる１４Ｇ９ヒト化変異体＃２Ａの親和性の推定を示す。
【図５Ｄ】競合ＥＬＩＳＡによる１４Ｇ９ヒト化変異体＃２Ｂの親和性の推定を示す。
【図６】ヒト化抗体＃１Ａ、＃１Ｂ、＃２Ａ、および＃２Ｂの正規化された熱変性を示す。
【図７】＃２ＢのＳＥＣ分析を示す。上部パネルは、＃２ＢのＳＥＣクロマトグラム、中央パネルは、ベースラインの拡大図、下部パネルは、ピークを割り当てたベースライン拡大図である。
【図８】ヒト化抗体＃２Ｂ１および＃２Ｂ２の正規化された熱変性を示す。
【図９】ヒト化抗体＃２Ｂ、＃２Ｂ１および＃２Ｂ２のヒトＦｃγＲへの単量体ＩｇＧ結合のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１０】＃２ＢのヒトＦｃγＲへの免疫複合体結合のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１１】ヒト化抗体＃２Ｂ、＃２Ｂ１および＃２Ｂ２の抗体感作細胞上の抗原のヒトＦｃγＲに対する残留結合のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、Ｆａｂ＃２Ｂ２／ｓＰＬＡ２−ＩＢ複合体の結晶構造を示す。ｓＰＬＡ２−ＧＩＢの骨格は灰色および紫色で描かれ、＃２Ｂ２Ｆａｂ軽鎖は水色およびピンク色で、＃２Ｂ２Ｆａｂ重鎖は緑色および黄色で示されている。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、Ｆａｂ＃２Ｂ２／ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ複合体の非共有結合を示す。ｓＰＬＡ２−ＧＩＢの骨格は黄色であり、＃２Ｂ２Ｆａｂ軽鎖は、水色であり、＃２Ｂ２Ｆａｂ重鎖は、緑色である。
【図１３Ａ】１人の健康なドナーからのＣＤ４Ｔ細胞におけるリン酸化ＳＴＡＴ５核移行へのｓＰＬＡ２−ＧＩＢの阻害効果に対する、１４Ｇ９または＃２Ｂによる阻害を示す。
【図１３Ｂ】１人の健康なドナーからのＣＤ４Ｔ細胞におけるリン酸化ＳＴＡＴ５核移行へのＨＩＶ−１感染患者から単離された血漿の阻害効果に対する、１４Ｇ９または＃２Ｂによる阻害を示す。
【図１４】マウス脾細胞から分離されたＣＤ４Ｔ細胞におけるリン酸化ＳＴＡＴ５核移行への１００μｇのｓＰＬＡ２−ＧＩＢの阻害効果に対する、１または２ｍｇの＃２Ｂ２による生体内阻害を示す。アイソタイプ対照ｍＡｂを１ｍｇ注入しても、有意な影響は観察されなかった。
【００１６】
表１は、アクセプター配列として使用される可変ヒト生殖細胞系列を有するマウスＶ遺伝子またはそのヒト化バージョン間の同一性のパーセンテージを示す。
表２は、ヒト化バージョンおよび対応するヒト生殖細胞系列の間のＶ遺伝子全体の配列の違いの詳細を示す。
表３は、ヒト化抗体によるｓＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性の阻害を示す。結果を対照の％として表す。
表４は、組換えヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよび組換えヒトプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対する競合ＥＬＩＳＡによって得られた、種々のヒト化抗体の推定ＩＣ５０を示す。
表５は、ヒト化抗体の示差走査熱量測定を示す。Ｔｍは変性／融解温度である。Ｔｏｎｓｅｔは、展開遷移が始まる温度である。Ｔ１／２は、ピークの半分の高さにおける遷移幅である。ΔＨは展開の熱量測定エンタルピーであり、タンパク質の分子内相互作用の破壊を反映する。総面積は展開の全エンタルピー（サーモグラムの下の総面積）であり、熱力学的安定性を反映する。
表６は、＃１Ａ、＃１Ｂ、＃２Ａおよび＃２Ｂヒト化抗体のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析結果を示す。
表７は、＃２Ｂ、＃２Ｂ１及び＃２Ｂ２ヒト化抗体の表面プラズモン共鳴により決定した、組換えヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよび組換えヒトプロｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対するＫｄを示す。
表８は、＃２Ｂ１および＃２Ｂ２ヒト化抗体の示差走査熱量測定を示す。Ｔｍは変性／融解温度である。Ｔｏｎｓｅｔは、展開遷移が始まる温度である。Ｔ１／２は、ピークの半分の高さにおける遷移幅である。ΔＨは展開の熱量測定エンタルピーであり、タンパク質の分子内相互作用の破壊を反映する。総面積は展開の全エンタルピー（サーモグラムの下の総面積）であり、熱力学的安定性を反映する。
表９は、＃２Ｂ１および＃２Ｂ２ヒト化抗体のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析結果を示す。
表１０は、＃２Ｂ、＃２Ｂ１、および＃２Ｂ２ヒト化抗体のイメージキャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）分析を示す。試料に存在するさまざまな電荷異性体の見かけの平均ｐＩを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（抗体）
本発明は、ヒトの対象の治療のためにＰＬＡ２−ＧＩＢの活性を効果的かつ選択的に調節するのに有用な新規のヒトおよびヒト化抗体の生成に基づく。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「ＰＬＡ２−ＧＩＢ」という用語は、グループＩＢの膵臓ホスホリパーゼＡ２を指す。ＰＬＡ２−ＧＩＢは、さまざまな哺乳動物種から同定され、かつ複製されてきた。ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質は、例えば、ラムボーおよびゲルブ（２００８）に開示されている。その配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＮＰ＿０００９１９で入手できる。
【００１９】
例示的なヒトＰＬＡ２−ＧＩＢのアミノ酸配列を以下に示す（配列番号１）。
ＭＫＬＬＶＬＡＶＬＬ  ＴＶＡＡＡ  ＤＳＧＩＳ  ＰＲ  ＡＶＷＱＦＲＫＭ  ＩＫＣＶＩＰＧＳＤＰ  ＦＬＥＹＮＮＹＧＣＹ  ＣＧＬＧＧＳＧＴＰＶ  ＤＥＬＤＫＣＣＱＴＨ  ＤＮＣＹＤＱＡＫＫＬ  ＤＳＣＫＦＬＬＤＮＰ  ＹＴＨＴＹＳＹＳＣＳ  ＧＳＡＩＴＣＳＳＫＮ  ＫＥＣＥＡＦＩＣＮＣ  ＤＲＮＡＡＩＣＦＳＫ  ＡＰＹＮＫＡＨＫＮＬ  ＤＴＫＫＹＣＱＳ
【００２０】
配列番号１のアミノ酸１〜１５位はシグナル配列であり、配列番号１のアミノ酸１６〜２２位はプロペプチド配列である。
【００２１】
本発明の文脈内で、用語「ＰＬＡ２−ＧＩＢ」は、好ましくはヒトＰＬＡ２−ＧＩＢを指す。
【００２２】
ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質は、２つの異なる形態で存在する可能性がある。すなわち、不活性なプロ型（プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ）は、プロペプチドのタンパク質分解開裂によって活性化され、成熟した分泌型（ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ）になる。ＰＬＡ２−ＧＩＢという用語は、プロ型および／または成熟型などのタンパク質の任意の形態を含む。典型的には、成熟分泌型は、配列番号１（配列番号１４）のアミノ酸残基２３〜１４８位の配列、または多型性もしくは組み換えから生じる変異体などのその任意の天然変異体を含む。「プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ」または「プロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢ」の用語は、好ましくは、配列番号１のアミノ酸残基１６〜１４８位の配列を含むタンパク質、または多型性もしくは組み換えから生じる変異体などのその任意の天然変異体を指す。
【００２３】
（配列番号１４）
ＡＶＷＱＦＲＫＭＩＫ  ＣＶＩＰＧＳＤＰＦＬ  ＥＹＮＮＹＧＣＹＣＧ  ＬＧＧＳＧＴＰＶＤＥ  ＬＤＫＣＣＱＴＨＤＮ  ＣＹＤＱＡＫＫＬＤＳ  ＣＫＦＬＬＤＮＰＹＴ  ＨＴＹＳＹＳＣＳＧＳ  ＡＩＴＣＳＳＫＮＫＥ  ＣＥＡＦＩＣＮＣＤＲ  ＮＡＡＩＣＦＳＫＡＰ  ＹＮＫＡＨＫＮＬＤＴ  ＫＫＹＣＱＳ
【００２４】
「プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ」または「プロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢ」という用語は、好ましくは、配列番号１のアミノ酸残基１６〜１４８位の配列を含むタンパク質または多型または組み換えから生じる変異体などのその任意の天然変異体を指す。
【００２５】
出願人は、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対するいくつかのモノクローナル抗体を生成した。その１つである抗体＃１４Ｇ９がｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対して顕著な中和活性を示し、かつ選択的であることを見つけた。出願人はさらに、このモノクローナル抗体の可変領域、およびそのエピトープを特徴付けた。特に、実験の項に示すように、抗体１４Ｇ９は、配列番号１４を参照して、ヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢのアミノ酸残基Ｗ３、Ｒ６、Ｋ７、Ｋ１０、Ｃ７７、Ｙ７５、Ｇ７９およびＳ８０を含むエピトープに結合する。出願人はまた、１４Ｇ９に基づくヒト化抗体を産生すること、およびそれらの顕著な活性を生体外および生体内で実証することができた。
【００２６】
したがって、本発明は、ＰＬＡ２−ＧＩＢに対する単離されたヒトまたはヒト化抗体に関する。
【００２７】
本発明は、より具体的には、ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢに選択的に結合してそれを中和するヒトまたはヒト化抗体を提供する。
【００２８】
「ヒト化」型の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、人間の足場（抗体鎖の例えば、ヒト定常ドメイン）に移植された、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超可変領域残基が、望ましい特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含み得る。これらの変更は、抗体の性能をさらに改善するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、その超可変領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、そのフレームワーク領域（ＦＲ）のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれも含む（ジョーンズ等による「ネイチャー」３２１、５２２−５２５（１９８６）、レイヒマン等による「ネイチャー」３３２、３２３、３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａによる「Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２」：５９３−５９６（１９９２））。
【００２９】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応する、及び／又は本明細書に開示したヒト抗体を作製する技術を使用して作製されたアミノ酸配列である。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー（フーゲンブームおよびウインターによる「Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．」、２２７：３８１（１９９１）、マークス等による「Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．」、２２２：５８１（１９９１））を含む、当技術分野でそれ自体公知の種々の技術を用いて産生することができる。また、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用できる方法として、コール等による「モノクローナル抗体および癌療法」、アラン・リス、７７頁（１９８５）、ボーナー等による「Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、１４７（１）：８６−９５（１９９１）に記載された方法がある。また、バン・ダイクおよびバン・デ・ウィンケル等による「Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．」、５：３６８−７４（２００１）も参照されたい。ヒト抗体は、抗原攻撃に応答してそのような抗体を産生するように改変されているものの、その内因性遺伝子座は無効にされ、ヒト遺伝子座で置換されたトランスジェニック動物、たとえば免疫化ゼノマウス（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥテクノロジーに関する米国特許第６，０７５，１８１および第６，１５０，５８４号明細書を参照のこと）などに抗原を投与することにより調製することができる。例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体に関して、リー等による「Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ」、１０３：３５５７−３５６２（２００６）も参照されたい。
【００３０】
本発明の抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、または、例えばヒト化ナノ体もしくはＳｃＦｖのような同じ抗原特異性を保持するその誘導体であり得る。本発明の抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体、すなわち、それぞれが単一の抗原部位に対して向けられている抗体である。本発明のモノクローナル抗体は、当技術分野でそれ自体公知の方法、たとえばコーラー等による「ネイチャー」２５６：４９５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ法、または組換えＤＮＡ法によって調製ができる。また、たとえば、クラックソン等による「Ｎａｔｕｒｅ」３５２：６２４−６２８（１９９１）およびマークス等による「Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．」、２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載された技術を用いたファージ抗体ライブラリーから単離することができる。
【００３１】
本発明は、特に、ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢに選択的に結合してそれを中和するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体を提供する。
【００３２】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。
【００３３】
より好ましい実施形態では、本発明は、ヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢに結合するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体であって、好ましくはヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢの（配列番号１４を参照して）Ｗ３、Ｒ６、Ｋ７、Ｋ１０、Ｃ７７、Ｙ７５、Ｇ７９およびＳ８０から選択したアミノ酸残基の少なくとも一つを含むエピトープ、より好ましくはヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢのＷ３、Ｒ６、Ｋ７、Ｋ１０、Ｃ７７、Ｙ７５、Ｇ７９およびＳ８０から選択した少なくとも２つまたは少なくとも３つのアミノ酸残基を含むエピトープ、さらにより好ましくはヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢのＷ３、Ｒ６、Ｋ７、Ｋ１０、Ｃ７７、Ｙ７５、Ｇ７９およびＳ８０から選択した少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６または少なくとも７つのアミノ酸残基を含むエピトープに結合するものに関する。本発明は、そのような残基に結合する抗体が強力な中和活性を示し、ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢの生体内阻害のための価値ある治療薬を意味することを示す。
【００３４】
特定の態様では、本発明の抗体または誘導体は、配列番号２を含む軽鎖可変領域および配列番号３を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体１４Ｇ９のヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対する結合を競合阻害する。
【００３５】
別の特定の態様では、本発明の抗体または誘導体は、配列番号４を含む軽鎖可変領域および配列番号５を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体＃２ＢのヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対する結合を競合阻害する。
【００３６】
さらに特定の態様では、本発明の抗体または誘導体は、配列番号４を含む軽鎖可変領域および配列番号６を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体＃２Ｂ１のヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対する結合を競合阻害する。
【００３７】
別の特定の態様では、本発明の抗体または誘導体は、配列番号４を含む軽鎖可変領域および配列番号７を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体＃２Ｂ２のヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対する結合を競合阻害する。
【００３８】
「競合的に阻害する」という用語は、抗体が参照抗体のｓＰＬＡ２−ＧＩＢへの結合を低減または阻害または置換できることを示す。競合アッセイは、例えば、競合ＥＬＩＳＡまたは他の結合アッセイなどの標準的な技術を使用して実行することができる。典型的には、競合的結合アッセイは、一般に固体基質または細胞のいずれかに結合した精製標的抗原、非標識試験抗体および標識参照抗体を含む。競合阻害は、試験抗体の存在下で結合した標識抗体の量を測定することによって測定される。通常、試験抗体は、参照抗体の量の約５〜５００倍など、過剰に存在する。典型的には、ＥＬＩＳＡの場合、試験抗体は１００倍過剰であり、酵素的方法の場合、試験抗体は１０倍過剰である。過剰に存在する試験抗体が抗原への参照抗体の結合の少なくとも７０％を阻害または置換する場合、それは前述の参照抗体を競合的に阻害すると見なされる。特定の実施形態では、１００倍過剰に存在する試験抗体が、ＥＬＩＳＡにおいて抗原への参照抗体の結合の少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％を阻害または置換する場合、それは前述の参照抗体を競合的に阻害すると見なされる。好ましい競合抗体は、共通のアミノ酸残基を共有するエピトープに結合する。
【００３９】
特定の実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体であって、（ｉ）配列番号２の軽鎖可変領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｌ３、ならびにヒト免疫グロブリン配列から成る、または本質的に成るＦＲ−Ｌを含む軽鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号３の重鎖可変領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｈ３、ならびにヒト免疫グロブリン配列から成る、または本質的に成るＦＲ−Ｈを含む重鎖可変領域と、を含むものに関する。
【００４０】
抗体の「可変領域」は、抗原結合部位を含む重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメイン（「ＶＨ」または「ＶＬ」）を指す。軽鎖または重鎖可変領域（ＶＬまたはＶＨ）は一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる３つの超可変領域によって遮られたフレームワーク領域（「ＦＲ」）からなる。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、たとえば、カバット（Ｅ．カバット等による「免疫学的に関心のあるタンパク質の配列」、米国保健社会福祉省（１９８３）を参照のこと）、およびチョシアにおけるように精確に定義された。
【００４１】
配列番号２を参照して、３つのＣＤＲ領域は、以下のアミノ酸残基に対応する。すなわち、
・ＣＤＲ−Ｌ１：アミノ酸残基ＱＤＶＳＴＡ、
・ＣＤＲ−Ｌ２：アミノ酸残基ＷＡＳ、
・ＣＤＲ−Ｌ３：アミノ酸残基ＱＱＤＹＳＴＰＰＴ、
である。
【００４２】
配列番号３を参照して、３つのＣＤＲ領域は、以下のアミノ酸残基に対応する。すなわち、
・ＣＤＲ−Ｈ１：アミノ酸残基ＧＹＴＦＴＮＹＷ、
・ＣＤＲ−Ｈ２：アミノ酸残基ＩＤＰＳＤＴＲＴ、
・ＣＤＲ−Ｈ３：アミノ酸残基ＡＲＱＴＬＹＹＥＡＬＤＹ、
である。
【００４３】
特定の実施形態では、本発明は、以下から選択されるモノクローナル抗体に関する。
すなわち、
・配列番号４を含む、または配列番号４から本質的に成るもしくは成る軽鎖、および配列番号５を含む、または配列番号５から本質的に成るもしくは成る重鎖を含むモノクローナル抗体（クローン＃２Ｂ）と、
・配列番号４を含む、または配列番号４から本質的に成るもしくは成る軽鎖、および配列番号６を含む、または配列番号６から本質的に成るもしくは成る重鎖を含むモノクローナル抗体（クローン＃２Ｂ１）と、
・配列番号４を含む、または配列番号４から本質的に成るもしくは成る軽鎖、および配列番号７を含む、または配列番号７から本質的に成るもしくは成る重鎖を含むモノクローナル抗体（クローン＃２Ｂ２）と、
・その誘導体と、
である。
【００４４】
本明細書で使用する「抗体誘導体」という用語は、参照抗体の抗原特異性を保持するが、１つまたは複数のアミノ酸残基が（化学的または生物学的に）修飾されてその特性を改善した抗体を指す。
【００４５】
そのような化学的修飾の例としては、例えば、アルキル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステルもしくはアミド形成などがある。具体的には、誘導体は、本明細書に開示したように、水溶性ポリマーのような一つ以上の非−タンパク質性部分を追加して含むよう修飾された抗体である。水溶性ポリマーの例には、ＰＥＧ、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストランおよびポリビニルアルコールが含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
誘導体はまた、グリコシル化する抗体の程度を増加または減少させるために生成し得る。抗体へのグリコシル化部位の追加または削除は、１つまたは複数のグリコシル化部位を生成または除去するようにアミノ酸配列を変更することによって便利に達成することができる。抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合した炭水化物を変更し得る。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、通常、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合により一般的に結合した分岐型の二分岐オリゴ糖を含む（たとえば、ライト等による「ＴＩＢＴＥＣＨ」、１９９７、１５：２６−３２を参照のこと）。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含み得る。いくつかの実施形態では、特定の改善された特性を有する抗体変異体を作製するため、本発明の抗体においてオリゴ糖の修飾を行うことができる。
【００４７】
一実施形態では、誘導体は、（ＦＣγＲＩＩＩ結合の調節を介して）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を変化させるために修飾されたＦｃ領域を有する。
【００４８】
一実施形態では、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、そのような抗体中のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％、または２０％〜４０％であってよい。フコースの量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定され、Ａｓｎ２９７に結合したすべての糖構造（複合、混成、および高マンノース構造など）の合計に対する、Ａｓｎ２９７の糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７とは、Ｆｃ領域の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕ番号付け）にあるアスパラギン残基を指す。しかしながら、Ａｓｎ２９７はまた、抗体における小さな配列変動のために、２９７位の約±３上流または下流、すなわち、２９４位および３００位の間のアミノ酸に位置し得る。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関連する刊行物の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない。すなわち、オカザキ等による「Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．」、３３６：１２３９−１２４９（２００４）およびヤマネ・Ｎ．オーヌキ、Ｍ．サトウによる「ｍＡｂｓ」、２００９；１：２３０-２３６である。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例には、タンパク質フコシル化欠損ＬＥＤ３  ＣＨＯ細胞（リプカ等による「Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．」２４９：５３３−５４５（１９８６））、およびα−１、６フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞株（例えば、ヤマネ・オーヌキ等による「Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｅｎｇ．」８７：６１４（２００４）、Ｙ．カンダ等による「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．」、９４（４）：６８０−６８８（２００６）を参照のこと）が含まれる。
【００４９】
特定の実施形態では、抗体の１つまたは複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体、例えば「チオＭＡｂ」を作成することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、置換される残基は、抗体のアクセス可能な部位に存在する。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書でさらに説明するように、抗体を薬物部分またはリンカー薬物部分などの他の部分に結合して、免疫複合体を作成するために使用できる。特定の実施形態では、以下の残基のいずれか１つまたは複数をシステインで置換することができる。すなわち、軽鎖のＶ２０５（カバット番号）と、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号）と、重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号）とである。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号明細書に記載されているように生成することができる。
【００５０】
誘導体という用語には、また、１または複数の異種分子（単数または複数）に、たとえば、これらに限定されないが、細胞傷害性薬剤や、蛍光部、診断用放射性同位元素もしくは造影剤のような検出可能な部分に、またはアガロースビーズなどの固体支持体に、結合した上記で定義したような抗ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ抗体を含む免疫複合体が含まれる。細胞傷害性薬剤の例としては、化学療法剤もしくは薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、酵素活性毒素で細菌、真菌、植物、または動物起源のもの、またはそれらの断片）、または放射性同位元素が含まれるが、これらに限定されない。抗体と細胞傷害性薬剤の複合体は、当業者に周知の様々な二機能性タンパク質カップリング剤を使用して作製することができる。リンカーは、細胞における細胞傷害薬の放出を促進する「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感知リンカー、光に不安定なリンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（チャリ等による「Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．」、５２：１２７−１３１（１９９２））を使用することができる。誘導体は二重特異性抗体であってもよい。
【００５１】
本発明の抗体は、通常、単離され、例えば、その自然環境の少なくとも１つの成分から分離されたものである。特に、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）技術によって決定されるように、例えば、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の純度まで精製され得る。抗体純度の評価方法の概説については、例えば、フラットマン等による「Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ」、８４８：７９−８７（２００７）を参照されたい。
【００５２】
上記のように、本発明の抗体は本質的に中和抗体であり、すなわち、それらは少なくとも部分的にＰＬＡ２−ＧＩＢの活性を阻害することができる。
【００５３】
ｓＰＬＡ２−ＧＩＢは、リン脂質のｓｎ−２脂肪アシル結合の加水分解を触媒して、遊離脂肪酸およびリゾリン脂質を放出する。本発明の特定の抗体は、リン脂質のｓｎ−２脂肪アシル結合の加水分解などのｓＰＬＡ２−ＧＩＢの酵素活性を阻害する。そのような特性を試験する方法について、実験の項で詳細に開示する。
【００５４】
本発明のさらなる特定の抗体は、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢのその基質への結合を阻害する。
【００５５】
本発明のさらなる特定の抗体は、ＣＤ４Ｔ細胞におけるＩＬ−７誘発性リン酸化ＳＴＡＴ５核移行のｓＰＬＡ２−ＧＩＢ媒介阻害を阻害する。そのような特性を試験する方法について、実験の項で詳細に開示する。
【００５６】
抗体又は誘導体の中和動作は、生体外または生体内において、実験の項で説明するような結合または生物学的アッセイを使用して決定することができる。阻害／中和は、完全または部分的であり得る。特に、抗体は、試験した活性の１０％以上、好ましくは２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上を阻害し得る。
【００５７】
好ましい態様では、抗体はＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。
【００５８】
好ましい抗体は、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対して選択的に結合する、すなわち、他の分子と比較してｓＰＬＡ２−ＧＩＢへの優先的な結合を示す。選択性は、競合ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）アッセイによって決定できる。選択性を示す親和性／結合力の違いは、検出可能な選好性、たとえば１：１．１を超える比、または約１：５、１：１０、１：１００、１：１０００以上を超える比などである。
【００５９】
本発明の抗体または誘導体を、従来の方法および培地を使用して単離し保存し得る。本発明の抗体または誘導体を凍結乾燥してもよいし、凍結してもよい。
【００６０】
（核酸、ベクター、宿主細胞および組換え産生）
別の態様では、本発明は、本発明の抗体をコードする核酸分子、またはその軽鎖もしくは重鎖、またはその可変ドメイン、または前記コード配列に相補的な核酸に関する。好ましくは、当該核酸は、単離または精製された核酸である。
【００６１】
核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡもしくはｇＤＮＡ）、ＲＮＡ、またはそれらの混合物であり得る。それは、一本鎖型もしくは二本鎖型またはその２つの混合であり得る。それは、例えば、修飾された結合、修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基、または修飾された糖などを含む、修飾されたヌクレオチドを含むことができる。それは、化学合成、組換え、および突然変異誘発を含む、当業者に公知の任意の方法によって調製され得る。本発明に係る核酸を、本発明に係る抗体の配列から推定することができ、核酸が転写される宿主細胞に従ってコドン使用頻度を適合させることができる。これらの工程は、当業者に周知の方法に従って実行することができ、それらのいくつかは、サムブルック等による参照マニュアル（Ｊ．サムブルック、Ｄ．ラッセル編、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」、第３版、コールドスプリングハーバー社、２００１）に記載されている。
【００６２】
本発明の核酸は、前述の抗体の軽鎖を含むアミノ酸配列および／もしくは重鎖を含むアミノ酸配列をコードしてもよく、またはそのようなコード配列に相補的であってもよい。
【００６３】
そのような核酸配列の特定の例は、配列番号１０〜１３として提供される配列を含む。
【００６４】
本発明はさらに、本発明の核酸を含むベクターを提供する。必要に応じて、ベクターは、本発明のいくつかの核酸を含み得る。特に、当該ベクターは、制御領域、すなわち１つ以上の制御配列を含む領域に作動可能に連結された本発明の核酸を含み得る。必要に応じて、当該ベクターは、いくつかの制御領域に作動可能に連結された本発明のいくつかの核酸を含み得る。
【００６５】
「制御配列」という用語は、コード領域の発現に必要な核酸配列を意味する。制御配列は、内因性または異種であり得る。周知の制御配列であり、当業者によって現在使用されているものが好ましい。そのような制御配列には、プロモーター、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターが含まれるが、これらに限定されない。
【００６６】
「作動可能に連結された」という用語は、制御配列がコード領域の発現を指示するように、制御配列がコード配列に対して適切な位置に配置される構成を意味する。
【００６７】
本発明はさらに、宿主細胞を形質転換、形質移入または形質導入するための、本発明に係る核酸またはベクターの使用に関する。
【００６８】
本発明はまた、本発明の１つもしくはいくつかの核酸および／または本発明の１つもしくはいくつかのベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００６９】
「宿主細胞」という用語はまた、複製中に生じる突然変異のために親宿主細胞と同一ではない親宿主細胞の任意の子孫を包含する。
【００７０】
抗体をコードしているベクターの複製または発現に適した宿主細胞には、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が含まれる。
【００７１】
例えば、特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要とされない場合、抗体は細菌において産生され得る。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号、および第５，８４０，５２３号明細書を参照されたい（また、チャールトンによる「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．ロウ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００３）、ｐｐ．２４５〜２５４の大腸菌における抗体断片の発現についての記載も参照）。発現後、抗体を、可溶性画分で細菌細胞溶解物から単離することができ、さらに精製することができる。
【００７２】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、グリコシル化経路が「ヒト化」されている真菌および酵母菌株を含む、抗体をコードするベクターにとって適切な複製または発現宿主であり、部分的なまたは完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体を産生する。ゲルングロスによる「Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２２」、１４０９〜１４１４、２００４、およびリー等による「Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２４」、２１０〜２１５、２００６を参照されたい。
【００７３】
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は、また、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が含まれる。特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質移入のために、昆虫細胞と組み合わせて使用できる多数のバキュロウイルス株が確認された。植物細胞培養物も宿主として利用できる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５，９７８号、および第６，４１７，４２９号明細書を参照されたい。
【００７４】
脊椎動物細胞も宿主として使用できる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例には、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株と、ヒト胚腎臓株（例えば、グラハム等による「Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．」、３６：５９、１９７７に記載されているような２９３細胞、または２９３）と、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）と、マウスセルトリ細胞（例えば、メイザーによる「Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ２３」、２４３〜２５１、１９８０に記載されたＴＭ４細胞）と、サル腎細胞（ＣＶ１）と、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）と、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）と、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）と、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ）と、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）と、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）と、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）と、例えばメイザー等による「Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．」、３８３：４４〜６８、１９８２に記載されたＴＲＩ細胞と、ＭＲＣ５細胞と、およびＦＳ４細胞とがある。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ等による「Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ」、７７：４２１６、１９８０）、およびＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２／０などの骨髄腫細胞株がある。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概観については、例えば、ヤザキおよびウーによる「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｖｏｌ．２４８（ＢＫＣ  ロウ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）、ｐｐ．２５５〜２６８、２００３を参照されたい。
【００７５】
本発明はまた、本発明の核酸または本発明のベクターを含む宿主細胞を、上記で提供されるように、抗体の発現に適した条件下で培養すること、および場合により当該宿主細胞または宿主細胞培養培地から前述の抗体を回収することを含む、本発明の抗体を産生する方法に関する。必要に応じて、回収された抗体はさらに精製または単離され得る。適切な培地、培養条件および産生方法は当業者に周知であり、宿主細胞および産生される抗体に従って容易に選択することができる。
【００７６】
（医薬組成物）
本発明はさらに、本発明の抗体、核酸、ベクター、または宿主細胞を含む医薬組成物に関する。当該組成物は、本発明の１つもしくは複数の抗体、本発明の１つもしくは複数の核酸および／または本発明の１つもしくは複数のベクターおよび／または本発明の１つもしくは複数の宿主細胞を含み得る。好ましくは、当該医薬組成物は、本発明の１つまたはいくつかの抗体を含む。
【００７７】
本発明の抗体を含む医薬組成物は、医薬的に有用な組成物を調製するための既知の方法に従って製剤化することができ、それにより所望の純度を有する抗体が、水溶液、凍結乾燥またはその他の乾燥製剤の形で、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合される（レミントンによる「Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」、第２０版（２０００））。
【００７８】
本明細書で使用する場合、「医薬製剤」または「医薬組成物」という用語は、有効成分の生物学的活性を有効にすることができるような形態の、かつその製剤が投与される対象に許容できないほどの毒性の追加成分を含まない調製物を指す。好ましくは、そのような製剤は殺菌され、すなわち無菌であるか、またはすべての生きた微生物およびそれらの胞子を含まない。
【００７９】
許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される用量と濃度でレシピエントに無害であり、緩衝剤、安定剤、保存剤、等張化剤、非イオン性洗剤、抗酸化剤、およびその他の添加剤を含むが、これらに限定されない。
【００８０】
緩衝剤は、生理的条件に近い範囲にｐＨを維持するのに役立つ。それらは、好ましくは約１ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度に存在する。本発明での使用に適した緩衝剤には、有機酸および無機酸の両方ならびにそれらの塩、例えば、クエン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩および酢酸塩緩衝液、ならびにリン酸塩緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびトリスなどのトリメチルアミン塩などが含まれるが、これらに限定されない。
【００８１】
微生物の増殖を遅らせるために防腐剤を添加してもよく、０．２％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で添加してもよい。本発明での使用に適した保存剤には、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコールと、メタクレゾールと、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベンと、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム塩化物、ベンズアルコニウムハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）と、ヘキサメトニウムまたはベンゼトニウム塩化物と、カテコールと、レゾルシノールと、シクロヘキサノールと、３−ペンタノールと、が含まれるがこれらに限定されない。
【００８２】
本発明の液体組成物の等張性を確保するため等張剤を添加してもよく、等張剤には、多価糖アルコール、好ましくは三価以上の糖アルコール、例えば、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールが含まれる。
【００８３】
安定剤は、機能の範囲が増量剤から、治療剤を可溶化するまたは変性もしくは容器壁への固着を防止するのに役立つ添加剤に及ぶことができる広範なカテゴリーの賦形剤を指す。典型的な安定剤には、多価糖アルコール（上記に列挙済み）と、アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなどのアミノ酸と、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロールなどの有機糖または糖アルコールと、イノシトールなどのシクリトールと、ポリエチレングリコールと、アミノ酸ポリマーと、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール、チオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤と、低分子量ポリペプチド（すなわち、１０残基未満）と、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質と、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコースなどのポリビニルピロリドン単糖類などの親水性ポリマーと、ラクトース、マルトース、スクロースなどの二糖類およびラフィノースなどの３糖類と、デキストランなどの多糖類と、が含まれる。安定剤は、治療剤の重量当たり０．１〜１０，０００重量の範囲で存在し得る。
【００８４】
非イオン性界面活性剤または界面活性剤（「湿潤剤」としても知られている）を添加して、治療剤の可溶化を助け、攪拌により誘発される凝集に対して治療用タンパク質を保護することができる。適した非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート（２０、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、プルロニクス（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）、ポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０など）が含まれる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在し得る。
【００８５】
追加のその他の賦形剤には、増量剤（例えば、デンプン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、および共溶媒が含まれるが、これらに限定されない。
【００８６】
有効成分はまた、例えば、コアセルベーション技術により、または界面重合により、例えば、それぞれ、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルションにおけるヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンのマイクロカプセル、およびポリ（メタクリル酸メチル）のマイクロカプセルにより、調製されたマイクロカプセル中に封入され得る。このような技術は、レミントンによる「Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」、第２０版（２０００）に開示されている。
【００８７】
医薬組成物の形態、投与経路、投与量および投与計画は、治療される状態、病気の重症度、患者の年齢、体重および性別などに依存する。
【００８８】
投与に使用する用量について、様々なパラメータの関数として、特に、使用する投与様式、関連する病状、または所望の治療期間の関数として適合させることができる。
【００８９】
本発明の医薬組成物を、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下または眼内投与などのために処方することができる。
【００９０】
好ましくは、医薬製剤は、注射することができる製剤である。これらは、特に等張性の無菌食塩水（リン酸一ナトリウムもしくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウムもしくはマグネシウムなど、またはそのような塩の混合物）、または場合に応じて滅菌水または生理食塩水の添加により注射液を構成できる、乾燥した、特に凍結乾燥した組成物である。
【００９１】
無菌注射液は、必要量の活性化合物を適切な溶媒に、上記に列挙した他の様々な成分とともに組み込み、必要に応じてその後濾過滅菌することによって調製することができる。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分および以前に無菌濾過した溶液からの任意の追加の所望成分の粉末を産出する真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【００９２】
静脈内または筋肉内注射などの非経口投与用に処方された組成物に加えて、他の薬学的に許容される形態には、例えば、経口投与用の錠剤または他の固形物と、徐放性カプセルと、現在使用されている他の任意の形式と、が含まれる。
【００９３】
本発明の医薬組成物は、本発明の１つまたは複数の抗体を含み得る。
【００９４】
医薬組成物は、さらに、１つまたはいくつかの追加の活性化合物を含み得る。追加の活性化合物の例には、化学療法薬、抗生物質、抗寄生虫剤、抗真菌剤または抗ウイルス剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】
特定の障害または状態の治療に有効であろう本発明の抗体の量は、障害または状態の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定することができる。
【００９６】
好ましい実施形態では、各用量の範囲は、体重１キログラム当たり抗体約０．１ｍｇ〜約２５ｍｇ、より好ましくは、体重１キログラム当たり約１ｍｇ〜約１０ｍｇである。
【００９７】
投与のための投薬スケジュールは、疾患の種類、疾患の重症度、および治療剤に対する対象の感度を含む多くの臨床的要因に応じて、月に１回から毎日まで変化し得る。
【００９８】
（治療用途）
本発明はさらに、特にｓＰＬＡ２−ＧＩＢに関連する疾患の予防または治療において、医薬として使用するための、本発明に係る抗体、核酸、ベクター、宿主細胞または医薬組成物に関する。
【００９９】
本発明はまた、疾患を治療するための医薬としての、本発明に係る抗体、核酸、ベクター、宿主細胞または医薬組成物の使用に関する。本発明はまた、対象における疾患を治療するための医薬の製造または調製のための、本発明に係る抗体、核酸、ベクター、宿主細胞または医薬組成物の使用に関する。
【０１００】
特に、本発明は、対象の疾患を治療する方法に関し、それを必要とする対象に本発明に係る抗体、核酸、ベクター、宿主細胞、または組成物の有効量を投与する方法を含む。
【０１０１】
本明細書で使用する場合、「対象」または「患者」という用語は、任意の哺乳動物、好ましくは人間を指す。
【０１０２】
有効量は、治療的または予防的に有効な量であり得る。「治療的有効量」とは、所望の治療的または予防的結果を達成するために必要な用量および期間について有効な量を指す。本発明の抗体または組成物の治療的有効量は、個体の病状、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する抗体または組成物の能力などの要因によって異なり得る。治療上有効量は、抗体または組成物の毒性または有害な効果が、治療上有益な効果によって凌駕される量を包含する。「予防的有効量」とは、所望の予防的結果を達成するために必要な用量および期間について有効な量を指す。必ずしもそうとは限らないが、典型的には、予防的用量は疾患の前または初期段階で対象に使用されるため、予防的有効量は治療的有効量より少ないであろう。
【０１０３】
本発明を使用して、望ましくないＰＬＡ２−ＧＩＢ活性にある程度関連する疾患または障害を予防しまたは治療することができる。
【０１０４】
特定の実施形態では、本発明は、不適切な（例えば、欠陥のまたは誤った）免疫応答、特に不適切なＣＤ４Ｔ細胞活性に関連するあらゆる疾患、および免疫の増加により対象の状態を改善し得るあらゆる疾患を予防または治療するために使用され得る。これらの疾患を、本願において「免疫障害」または「免疫不全症」と呼ぶことがある。これには、特にウイルス感染もしくは病原体の感染、または癌によって引き起こされる免疫不全状況が含まれる。
【０１０５】
本明細書で使用する場合、「治療」または「治療する」という用語は、例えば、治療されている個体の自然経過を変更しようとするあらゆる臨床的介入を指し、予防目的または治療目的のいずれかで行うことができる。治療の望ましい効果には、疾患の発生もしくは再発の防止、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾患の進行速度の低下、病態の改善もしくは寛解、および鎮静または予後の改善が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、疾患または障害の発症を遅らせるため、または疾患または障害の進行を遅らせるために使用される。
【０１０６】
そのような治療から恩恵を受けることができる疾患の例には、ＨＩＶ媒介免疫不全などの免疫不全を伴うあらゆる病気が含まれる。これに関して、特定の実施形態では、本発明は、上記で定義した抗体、核酸、ベクター、宿主細胞または組成物を前記対象に投与する方法を含む、それを必要とする対象における免疫不全または関連する障害を治療する方法に関する。
【０１０７】
別の特定の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象における免疫不全または関連する障害の治療に使用するための、上記で定義した抗体、核酸、ベクター、宿主細胞または組成物に向けられる。
【０１０８】
免疫不全症および関連する障害は、対象の免疫機能もしくは応答の低下を特徴とする、および／またはそれによって引き起こされるあらゆる状態もしくは病状を表す。免疫不全は、例えば、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎など）、細菌感染、癌、または他の病的状態によって引き起こされる可能性がある。したがって、「免疫不全関連障害」という用語は、免疫不全によって引き起こされるか、または免疫不全に関連するあらゆる疾患を指す。本発明は、ＣＤ４−Ｔ細胞に関連する免疫不全症および関連する疾患の治療に特に適している。
【０１０９】
特定の実施形態では、本発明は、上記で定義した抗体、核酸、ベクター、宿主細胞または組成物を前記対象に投与することにより、対象のＨＩＶ感染を治療する方法に関する。いくつかの実施形態では、当該対象は初期のＨＩＶ患者であり、前述の方法は、患者がＨＩＶ管理者である確率を増加させる結果となる。いくつかの実施形態では、当該対象は、抗レトロウイルス治療後の免疫再構成が低い患者、および／または重度の特発性ＣＤ４Ｔリンパ球減少症（ＩＣＬ）患者である。本発明はまた、製剤Ａの化合物を対象に投与することにより、ＨＩＶ感染対象におけるＣＤ４−Ｔ細胞活性を増加させる方法に関する。本発明を使用して、感染の初期段階で対象を治療し、免疫不全の発生、程度、または期間を防止または低減することができる。典型的には、それらを感染症の検出時に即時、臨床的徴候の出現前に投与する。ＨＩＶ感染の極初期では、本発明により、患者をＨＩＶ管理者の状態に導くことができる。また、本発明を、後で、単独で、または抗ウイルス剤と組み合わせて、感染した対象に使用することもできる。そのような投与計画において、本発明により、ＣＤ４Ｔリンパ球の回復およびそれらの機能回復を加速することができる。したがって、特定の実施形態では、本発明は、ウイルス感染を有する対象に（ｉ）抗ウイルス剤および（ｉｉ）上記で定義した抗体、核酸、ベクター、宿主細胞もしくは組成物を同時に、別々にまたは順次投与することを含む。そのような手順により、本発明の抗体は、抗レトロウイルス療法（例えば、ＨＡＡＲＴ）と組み合わせて使用するＨＩＶ感染対象の治療に特に適しているので、重篤な有害性で知られているＨＡＡＲＴ治療を減少させ、または少なくとも一時的に中断させることさえできる。本発明はまた、対象の免疫応答を増加させることによって癌を治療する方法を提供し、上記で定義した抗体、核酸、ベクター、宿主細胞または組成物を前記対象に投与することが含まれる。本発明はまた、上記で定義した抗体、核酸、ベクター、宿主細胞または組成物を対象に投与することによって当該対象の癌に関連するＣＤ４Ｔ細胞結合免疫不全の治療方法を提供する。
【０１１０】
本発明の抗体（および任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、および鼻腔内を含む任意の適切な手段によって、ならびに局所治療が望ましい場合は病変内投与によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。投与は、一部は投与が短期であるか慢性であるかに応じて、静脈内または皮下注射などの注射によるなど、任意の適切な経路によるものであり得る。本明細書では、様々な時点にわたる単回投与または複数回投与、大量瞬時投与、およびパルス注入を含む様々な投与計画を企図するが、これらに限定されない。
【実施例】
【０１１１】
以下の例は、説明の目的で提供するものであり、本発明を制限する目的ではない。
【０１１２】
１−抗ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ抗体１４Ｇ９の生成および特性評価
１．１−＃１４Ｇ９ｍＡｂの生成
要するに、マウスを組換えヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢで免疫し、生成されたｍＡｂについてｓＰＬＡ２−ＧＩＢとプロ型ｓＰＬＡ２−ＩＢに対する阻害能およびそれぞれの親和性をスクリーニングした。
【０１１３】
１．２−＃１４Ｇ９ｍＡｂの特性評価
１．２．１−競合ＥＬＩＳＡによる親和性
プロ型ｓＰＬＡ２−ＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＩＢに対する抗体の結合親和性を、プレートベースの競合免疫測定法によって測定した。競合ＥＬＩＳＡのために、要するに、様々なレベルの抗体の一定量を、抗原タンパク質であるヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢの０〜１０μｇ／ｍｌの範囲の連続希釈物と予備混合し、室温で２時間インキュベートし、抗体および抗原の間の擬似結合平衡に到達させた。これらの溶液を、次いで、９６ウェルのｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢを予めコーティングしたプレートに移し、混合物中の遊離抗体をプレートにコーティングしたｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢに結合させた。プレートは、通常、一晩４℃のＰＢＳ溶液中で３０〜１００ｎｇのヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質でコーティングをし、続いてＢＳＡ非特異的ブロッキングを行った。溶液中の過剰な抗体を洗い流した後、プレート結合抗体をＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＡポリクローナル抗体試薬で検出し、比色基質を使用して現像した。溶液中の抗原濃度に対するシグナルの依存性を、Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ）を使用した４パラメーターフィット分析で分析し、ＩＣ５０として報告した。
【０１１４】
１．２．２−ＳＰＲによる親和性の決定
＃１４Ｇ９抗体へのプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢの結合の親和定数（ＫＤ）を、リアルタイムバイオセンサー表面プラズモン共鳴アッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））での表面速度論により決定した。より具体的には、ヒトプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対する前述の抗体の親和性をＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００を用いて測定した。前述の抗体を抗マウスＩｇＧ表面上で捕捉し、様々な濃度の組換えプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質に曝露した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用した速度論的分析を行って、会合および解離速度定数を求めた。
【０１１５】
１．２．３−間接ＥＬＩＳＡによる特異性の決定
マイクロプレートウェルを、通常、一晩４℃、ｐＨ７．５のＰＢＳ中で１００ｎｇの組換えヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢによりコーティングした。試料ウェルを０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。最終洗浄後、試料ウェルをＰＢＳ緩衝液中で１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むブロッキング溶液により室温で６０分間処理した。０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳで洗浄後、ヒトのプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対して、ｍＡｂを（１０ｎｇ／ｍＬから最大３μｇ／ｍＬまで）増量しながら抗原がコーティングされたウェルに加え、室温で１２０分間インキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳで洗浄した後、ＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＡポリクローナル抗体試薬でｍＡｂの結合を検出し、比色基質を使用して現像した。溶液中の抗原濃度に対するシグナルの依存性を、Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ）を使用した４パラメーターフィット分析で分析し、ＥＣ５０として報告した。
【０１１６】
１．２．４−ｓＰＬＡ２−ＩＢ酵素活性の阻害
＃１４Ｇ９ｍＡｂによるｓＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性の阻害を、公開された手順（Ｒｏｕａｕｌｔ等、２００７）に従って試験した。要するに、組換えヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢ（０．１ｎＭ）について、ヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢを標的とする精製ウサギポリクローナル免疫血清または精製＃１４Ｇ９抗体の量を増やしながら（０．１、０．３、１、および３μｇ）、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、［３Ｈ］−オレイン酸で放射標識し加圧滅菌した大腸菌の膜をｓＰＬＡ２−ＧＩＢ活性緩衝液のリン脂質基質として用いて、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性を測定した。３００μＬの停止緩衝液を加えて反応を停止後、混合物を１００００ｇで５分間遠心分離し、放出された［３Ｈ］−オレイン酸を含む上清を数えた。
【０１１７】
結果を、市販の蛍光酵素活性アッセイを使用して確認した。組換えヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢ（３ｎＭ）を、室温で１２０分間精製モノクローナル抗体を増加させながらインキュベートした。ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性を、その後、選択的蛍光測定法（ＡｔｅｒｏＤＸ  ｓＰＬＡ２活性、Ａｔｅｒｏｖａｘ社、パリ、フランス）を用いて測定した。結果は、試料１ｍＬあたりのユニット（Ｕ／ｍＬ）で表され、１ユニットは、１分で１ｎｍｏｌの生成物の放出を触媒するｓＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素の量として定義される。アッセイの検出限界は１７Ｕ／ｍＬで、線形分析範囲の上限は２３２Ｕ／ｍＬ、機能感度（２０％）は２１Ｕ／ｍＬである。平均実行内変動および平均アッセイ内変動はそれぞれ、５．９％および８．９％である。両方法の結果を、Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ）を使用した４パラメーターフィット分析で分析し、ＩＣ５０として報告した。
【０１１８】
１．３−ＣＤ４Ｔ細胞でのＩＬ−７誘導リン酸化ＳＴＡＴ５の核移行に対する＃１４Ｇ９ｍＡｂの生体外効果
１．３．１−ＩＬ−７誘導リン酸化ＳＴＡＴ５の核移行
ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ単離キット（ステムセル・テクノロジーズ社、＃１５０６２）を用いて、ヒトＣＤ４を精製した。ＣＤ４Ｔ細胞を１０６細胞／ｍｌで再懸濁させたＲＰＭＩ１６４０培地（ロンザ社、ベルビエ、ベルギー）に、５％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびファンギゾン（完全培地）を補充し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中の３７°Ｃで、少なくとも２時間平衡化させた。
【０１１９】
共焦点顕微鏡を使用して、ｐＳＴＡＴ５核移行を追跡した。平衡化後、固定化された細胞をポリリジンでコーティングしたスライドガラスにプレーティングし、２ｎＭのＩＬ−７で１５分間活性化した。細胞を３７℃で１５分間、次に室温で１５分間、４％ＰＦＡ中に固定し、−２０℃の９０％メタノール／水溶液で透過処理した。その後ロバ抗ウサギ−アレクサフルオル５５５（ライフ・テクノロジーズ社、＃Ａ３１５７２）で標識したウサギ抗ｐＳＴＡＴ５（ＣＳＴ、＃９３５９）で染色することによってｐＳＴＡＴ５を可視化した。ヒトＣＤ４Ｔリンパ球については、ヤギ抗マウス−アレクサフルオル４８８（ライフ・テクノロジーズ社、＃Ａ１１０２９）で標識したマウス抗ヒトＣＤ４（イーバイオサイエンス社、＃１４−００４２−８２）で細胞を染色した。マウスＣＤ４Ｔリンパ球については、ニワトリ抗ラット−アレクサフルオル４８８（ライフ・テクノロジーズ社、＃Ａ２１４７０）で標識したラット抗マウスＣＤ４（イーバイオサイエンス社、＃１４−００４２−８５）で細胞を染色した。水浸アポクロマート４０ｘ／１．２ＮＡ対物レンズ（ツァイス社）または油浸プランアポクロマート６３ｘ／１．４ＮＡ対物レンズ（ツァイス社）を備えた倒立レーザー走査共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７００、ツァイス社）の回折限界を超えて画像を取得した。ＺＥＮソフトウェア（ツァイス社）を用いて画像の取得および分析をした。
【０１２０】
１．３．２−ヒトＣＤ４Ｔ細胞におけるＩＬ−７誘導リン酸化ＳＴＡＴ５核移行のＨＩＶ−１陽性血漿による阻害に対する＃１４Ｇ９ｍＡｂの生体外効果
用量反応実験では、＃１４Ｇ９ｍＡｂまたはアイソタイプのｍＡｂの量を増やしながら、最初に室温で２５分間、続いて３７℃で５分間、組換えｓＰＬＡ２−ＩＢまたはＨＩＶ−１陽性患者（ＰＢＳで３％希釈ｖ／ｖ）からのヒト血漿と一緒にインキュベートした。次に平衡化された混合物を、一人の健康なドナーから単離したＣＤ４Ｔ細胞に加え、リン酸化ＳＴＡＴ５の核移行を上記のように共焦点顕微鏡で分析した。単回投与実験では、１０μｇ（最終濃度）の＃１４Ｇ９ｍＡｂ、非阻害性の＃６Ｆ７ｍＡｂ、またはアイソタイプの対照ｍＡｂを最初に室温で２５分間、続いて３７℃で５分間、５人の異なるＨＩＶ−１陽性患者からのヒト血漿（ＰＢＳで３％希釈ｖ／ｖ）と一緒にインキュベートした。次に平衡化された混合物を、一人の健康なドナーから単離されたＣＤ４Ｔ細胞に加え、リン酸化ＳＴＡＴ５の核移行を上記のように共焦点顕微鏡で分析した。
【０１２１】
１．４−ｓＰＬＡ２−ＩＢによるＣＤ４Ｔ細胞でのＩＬ−７誘導リン酸化ＳＴＡＴ５の核移行の阻害に対する＃１４Ｇ９ｍＡｂの生体内中和効果
３０匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊ  ＳＯＰＦ雌マウス（チャールズ・リバー研究所）をＳＯＰＦ条件で個別に換気されたケージに入れ、無菌の食物および水を自由に与え、１２時間の昼夜のサイクルを維持した新しい環境に実験開始の５日前に静置した。すべての実験手順は、地元の動物倫理委員会（ＣＥＴＥＡ８９、パスツール・ド・パリ研究所）から承認を受けた。３０匹の動物を６つの実験グループ（グループごとに１ケージ）に分け、腹腔内注射によりさまざまな組み合わせの試験製品を投与した。グループ１はＴ０で１ｍｇ（３００μＬ）のアイソタイプ対照ｍＡｂを受け、その後Ｔ＋２ｈ（時間）で１００μｇ（１００μＬ）のｓＰＬＡ２−ＩＢを受け、グループ２はＴ０で１ｍｇ（３００μＬ）の＃１４Ｇ９ｍＡｂを受け、その後Ｔ＋２ｈで１００μｇ（１００μＬ）のｓＰＬＡ２−ＩＢを受け、グループ３は、Ｔ＋２ｈで１００μｇ（１００μＬ）のｓＰＬＡ２−ＩＢを受け、グループ４は、Ｔ＋２ｈでＰＢＳ注射（１００μＬ）を受け、グループ５は、Ｔ０でＰＢＳ注射（１００μＬ）を受け、グループ６は、Ｔ０で１００μｇ（１００μＬ）のｓＰＬＡ２−ＧＩＢを受けた。実験開始後の異なる時点で、マウスを頸椎脱臼により安楽死させた。グループ１〜４はＴ＋５ｈで安楽死させ、グループ５および６はＴ＋４８ｈで安楽死させた。安楽死の直後に、脾臓を動物から採取し、さらに処理するまで５ｍＬのＲＰＭＩ５％を含む１５ｍＬチューブに室温で保存した。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（登録商標）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（ｍ＿ｓｐｌｅｅｎ＿０１プログラム）を用いてマウス脾細胞を調製し、ＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）単離キット（ステムセル・テクノロジーズ社、＃１９８５１）を用いて陰性選択によってマウスＣＤ４を単離した。上記のように、リン酸化ＳＴＡＴ５の核移行を共焦点顕微鏡で分析した。マンホイットニー検定を使用して、グループの中央値を比較した。
【０１２２】
１．５−＃１４Ｇ９ｍＡｂの配列
＃１４Ｇ９ｍＡｂの可変領域を、古典的な手順に従って配列化した。要するに、ハイブリドーマ細胞から高純度のＲＮＡを抽出し、高忠実度の逆転写酵素を使用して相補的なＤＮＡ鎖を合成した。高忠実度ＰＣＲを使用して生成されたＰＣＲ産物と、抗体重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡを特異的にターゲットする縮重プライマーを直接配列化（二重鎖配列化）した。ｃＤＮＡ配列を分析し、組み立てた。ペプチド配列を、抗体の構造に応じて翻訳し検証した。
【０１２３】
２−＃１４Ｇ９抗体のヒト化
２．１−ヒト化戦略および＃１４Ｇ９ヒト化変異体の生成
＃１４Ｇ９マウス抗体について、カバット命名法で定義された３つのＣＤＲを、軽鎖可変領域（ＶＬ）から、マウス抗体ＶＬと可能な限り相同なヒト生殖細胞系列ＶＬに移植することでヒト化した。同様に、重鎖可変領域（ＶＨ）からの３つのＣＤＲを、マウス抗体ＶＨと可能な限り相同なヒト生殖系列ＶＨに移植した。さらに、選択したヒト生殖細胞系列可変領域のフレームワーク領域のいくつかのアミノ酸残基を、マウス可変領域に存在するアミノ酸残基に変更した（いわゆる復帰突然変異）。
【０１２４】
２．２−ヒト化抗体によるｓＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性の阻害
ヒト化抗体＃１Ａ、＃１Ｂ、＃２Ａおよび＃２ＢによるｓＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性の阻害を、公開された手順（Ｒｏｕａｕｌｔ等、２００７）に従って試験した。要するに、組換えヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢ（０．０５ｎＭ）について、精製モノクローナル抗体を増やしながら（０．１、０．３、１、および３μｇ）、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、［３Ｈ］−オレイン酸で放射標識し加圧滅菌した大腸菌の膜をｓＰＬＡ２−ＧＩＢ活性緩衝液のリン脂質基質として用いて、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性を測定した。３００μＬの停止緩衝液を加えて反応を停止後、混合物を１００００ｇで５分間遠心分離し、放出された［３Ｈ］−オレイン酸を含む上清を数えた。
【０１２５】
２．３−競合ＥＬＩＳＡによるヒト化抗体の親和性測定
プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対するヒト化抗体の結合親和性を、プレートベースの競合免疫測定法によって測定した。競合ＥＬＩＳＡのために、要するに、様々なレベルの抗体の一定量を、抗原タンパク質であるヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢの０〜１０μｇ／ｍｌの範囲の連続希釈物と予備混合し、室温で２時間インキュベートし、抗体および抗原の間の擬似結合平衡に到達させた。これらの溶液を、次いで、９６ウェルのｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢを予めコーティングしたプレートに移し、混合物中の遊離抗体をプレートにコーティングしたｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢに結合させた。プレートは、通常、一晩４℃のＰＢＳ溶液中で３０〜１００ｎｇのヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質でコーティングをし、続いてＢＳＡ非特異的ブロッキングを行った。溶液中の過剰な抗体を洗い流した後、プレート結合抗体をＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＡポリクローナル抗体試薬で検出し、比色基質を使用して現像した。溶液中の抗原濃度に対するシグナルの依存性を、Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ）を使用した４パラメーターフィット分析で分析し、ＩＣ５０として報告した。
【０１２６】
２．４−ヒト化抗体の示差走査熱量測定
抗体＃１Ａ、＃１Ｂ、＃２Ａ、および＃２ＢのＰＢＳ緩衝液における熱安定性を、Ｍｉｃｒｏｃａｌ  ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣシステムの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）で比較した。全ての試料をドライアイスで出荷し、−２０°Ｃで一晩インキュベートして解凍し、その後２時間氷でインキュベートした。試料の解凍後、全ての試料を遠心分離（２００００ｇ、５分、４°Ｃ）し、ＤＳＣ分析の前に、ＩｇＧ分析プログラムを備えたＮａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計でタンパク質含有量を定量した。事前平衡化時間は３分で、その後、サーモグラムを２０〜１１０°Ｃの温度、６０°Ｃ／時間の走査速度、２５秒のフィルター期間、および中程度のフィードバックで取得した。試料分析の前に、機器を安定させるための５回の緩衝液／緩衝液走査を測定し、かつ緩衝液／緩衝液走査を各タンパク質／緩衝液走査の間に実行した。
【０１２７】
２．５−ヒト化抗体の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を、島津プロミネンス（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（登録商標））ＨＰＬＣのＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ５／１５０  ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア社）について行った。カラムオーブンを３０°Ｃに設定して、カラムをＰＢＳ中で０．２５ｍＬ／分で事前に平衡化した。全ての試料を遠心分離し（２００００ｇ、５分、４℃）、ＳＥＣ分析の前に、ＩｇＧ分析プログラムを備えたＮａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計でタンパク質含有量を定量した。均一濃度プログラムを、各試料の約１５μｇを０．２５ｍＬ／分で１８分間注入するように設定した。ＳＥＣ分析後、生データから２８０ｎｍクロマトグラムを抽出し、ピーク積分により分析した。ＧＥライフサイエンス分子量ＳＥＣ較正キットの一連のタンパク質を使用して、試料分析中に使用したのと同一条件および緩衝液でカラムを較正した。使用したタンパク質は、アプロチニン（６．５００Ｄａ）、リボヌクレアーゼＡ（１３．７００Ｄａ）、炭酸脱水酵素（２９．０００Ｄａ）、卵白アルブミン（４４．０００Ｄａ）、コナルブミン（７５．０００Ｄａ）およびアルドラーゼ（１５８．０００）である。Ｂｌｕｅ  Ｄｅｘｔｒａｎを使用して、カラムの空隙容量を決定した。カラム較正は、Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ較正キットの指示（ＧＥライフサイエンス社）に従って行った。
【０１２８】
３−＃２Ｂ１および＃２Ｂ２の特性評価
３．１−＃２Ｂ、＃２Ｂ１、および＃２Ｂ２抗体のＳＰＲ親和性決定
＃２Ｂ、＃２Ｂ１、および＃２Ｂ２抗体へのプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢの結合の親和定数（ＫＤ）を、リアルタイムバイオセンサー表面プラズモン共鳴アッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））での表面速度論により決定した。より具体的には、ヒトプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対する前述の抗体の親和性をＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００を用いて測定した。前述の抗体を抗マウスＩｇＧ表面上で捕捉し、様々な濃度の組換えプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質に曝露した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用した速度論的分析を行って、会合および解離速度定数を求めた。
【０１２９】
３．２−＃２Ｂ１および＃２Ｂ２ヒト化抗体の示差走査熱量測定
＃２Ｂ１および＃２Ｂ２抗体のＰＢＳ緩衝液中での熱安定性を、上記の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）で比較した。
【０１３０】
３．３−＃２Ｂ１および＃２Ｂ２ヒト化抗体の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
＃２Ｂ１および＃２Ｂ２の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を、上記のように実行した。
【０１３１】
３．４−＃２Ｂ１および＃２Ｂ２ヒト化抗体のキャピラリー等電点電気泳動分析
＃２Ｂ、＃２Ｂ１、および＃２Ｂ２の電荷異性体の等電点および相対分布について、尿素の存在下でＰｈａｒｍａｌｙｔｅ（登録商標）ｐＨ３−１０（ほとんどのｍＡｂに適した広い範囲）を使用し、０．２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度において、イメージキャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）分析によって決定した。試料の予想されるｐＩを囲む２つのｐＩマーカーを較正に使用した。データ測定値を、吸光度（２８０ｎｍ）として測定し、エレクトロフェログラムで表した。ｐＩ値をＣｏｍｐａｓｓおよびＥｍｐｏｗｅｒ（登録商標）３ソフトウェアを使用して計算し、ピーク積分をＥｍｐｏｗｅｒ（登録商標）３で実行した。
【０１３２】
３．５−＃２Ｂ、＃２Ｂ１、および＃２Ｂ２ヒト化抗体のヒトＦｃγＲへの結合
＃２Ｂ、＃２Ｂ１、および＃２Ｂ２抗体（１００ｎｇ／ｍＬ）を氷上で３０分間、ヒトＦｃγＲを安定して発現する１×１０５ＣＨＯ細胞とインキュベートすることにより、単量体ＩｇＧ結合を試験した。次に、細胞を洗浄し、分離し、固定し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）、ＢＤバイオサイエンス社）で分析した。結合したｍＡｂを、０．５ｍｇ／ｍｌのＰＥ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片を使用して検出した（ジャクソン研究所；Ｃａｔ＃１０９−０９６−００６）。
【０１３３】
１０μｇ／ｍｌのヒト化抗体および５μｇ／ｍｌのｓＰＬＡ２−ＧＩＢを３７°Ｃで３０分間一緒にインキュベートすることにより、抗体−抗原免疫複合体を生成した。次に、免疫複合体を、氷上で３０分間、ヒトＦｃγＲを安定して発現する１×１０５ＣＨＯ細胞とインキュベートした。次に、細胞を洗浄し、分離し、固定し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤバイオサイエンス社）で分析した。結合したｍＡｂを、０．５ｍｇ／ｍｌのＰＥ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片を使用して検出した（ジャクソン研究所；Ｃａｔ＃１０９−０９６−００６）。
【０１３４】
抗体感作細胞上の抗原の残留結合を、最初に＃２Ｂ、＃２Ｂ１、および＃２Ｂ２抗体（１０μｇ／ｍＬ）を、氷上で３０分間、ヒトＦｃγＲを安定して発現する１×１０５ＣＨＯ細胞とインキュベートすることによって試験した。洗浄後、ｓＰＬＡ２−ＩＢビオチン化抗原（５μｇ／ｍＬ）を氷上に３０分間加えた。次に、細胞を洗浄し、分離し、固定し、フローサイトメトリーで分析した。結合したビオチン化抗原を、アビジン−ＦＩＴＣ複合体を使用して検出した。すべてのデータについて、フローサイトメトリー分析ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ）で分析した。
【０１３５】
４−＃２Ｂ２ヒト化抗体の生物学的特性
４．１−ＣＤ４Ｔ細胞でのリン酸化ＳＴＡＴ５のＩＬ−７誘導核移行に対する＃２ＢｍＡｂの生体外効果
＃１４Ｇ９または＃２Ｂ抗体を増量しながら、最初に室温で２５分間、続いて３７℃で５分間、７５ｎＭの組換えｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたは１人のＨＩＶ−１陽性患者からのヒト血漿（ＰＢＳ中で３％に希釈ｖ／ｖ）と一緒にインキュベートした。次に、平衡化した混合物を、１人の健康なドナーから単離したＣＤ４Ｔ細胞に加え、リン酸化ＳＴＡＴ５の核移行を上記のように共焦点顕微鏡で分析した。用量依存曲線を、Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ）を使用した４パラメーターフィット分析で分析し、ＥＣ５０として報告した。
【０１３６】
４．２−ｓＰＬＡ２−ＩＢによるＣＤ４Ｔ細胞でのＩＬ−７誘導リン酸化ＳＴＡＴ５核移行の阻害に対する＃１４Ｇ９ｍＡｂの生体内中和効果
１８匹の７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ  ＳＯＰＦ雄マウス（チャールズ・リバー研究所）をＳＯＰＦ条件で個別に換気されたケージに入れ、無菌の食物および水を自由に与え、１２時間の昼夜のサイクルを維持した新しい環境に実験開始の５日前に静置した。すべての実験手順は、地元の動物倫理委員会（ＣＥＴＥＡ８９、パスツール・ド・パリ研究所）から承認を受けた。１８匹の動物を５つの実験グループ（グループごとに１ケージ）に分け、腹腔内注射によりさまざまな組み合わせの試験製品を投与した。グループ１はＴ０でＰＢＳ注射（３５０μＬ）を受け、その後Ｔ＋２ｈでＰＢＳ注射（１００μＬ）を受け、グループ２はＴ０でＰＢＳ注射（３５０μＬ）を受け、その後Ｔ＋２ｈで１００μｇ（１００μＬ）のｓＰＬＡ２−ＧＩＢを受け、グループ３は、Ｔ０で２ｍｇ（３５０μＬ）のアイソタイプ対照ｍＡｂを受け、その後Ｔ＋２ｈで１００μｇ（１００μＬ）のｓＰＬＡ２−ＧＩＢを受け、グループ４は、Ｔ０で１ｍｇ（３５０μＬ）の＃２Ｂ２ヒト化ｍＡｂを受け、その後Ｔ＋２ｈで１００μｇ（１００μＬ）のｓＰＬＡ２−ＩＢを受け、グループ５は、Ｔ０で２ｍｇ（３５０μＬ）の＃２Ｂ２ヒト化ｍＡｂを受け、その後Ｔ＋２ｈで１００μｇ（１００μＬ）のｓＰＬＡ２−ＩＢを受けた。実験開始後Ｔ＋５ｈで、マウスを頸椎脱臼により安楽死させた。安楽死の直後に、脾臓を動物から採取し、即座に処理した。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（登録商標）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（ｍ＿ｓｐｌｅｅｎ＿０１プログラム）を用いてマウス脾細胞を調製し、ＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）単離キット（ステムセル・テクノロジーズ社、＃１９８５１）を用いて陰性選択によってマウスＣＤ４を単離した。上記のように、リン酸化ＳＴＡＴ５の核移行を共焦点顕微鏡で分析した。マンホイットニー検定を使用して、グループの中央値を比較した。
【０１３７】
（結果）
５−抗ｓＰＬＡ２−ＩＢ  １４Ｇ９抗体の生成および特性評価
５．１−＃１４Ｇ９ｍＡｂの生成と特性評価
要するに、マウスを組換えヒトｓＰＬＡ２−ＩＢで免疫し、生成されたｍＡｂの阻害能ならびにｓＰＬＡ２−ＩＢおよびプロ型ｓＰＬＡ２−ＩＢのそれぞれに対する親和性をスクリーニングした。＃１４Ｇ９ｍＡｂは、推定ＥＣ５０の２．３ｎＭでｓＰＬＡ２−ＩＢ酵素活性を阻害し（図１Ａ）、プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢｓに対してｓＰＬＡ２−ＧＩＢに非常に特異的である（図１Ｂおよび１Ｃ）ことが示された。競合ＥＬＩＳＡにおけるＩＣ５０は、プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対しそれぞれ１０８．６ｎＭおよび１．０ｎＭと推定された。＃１４Ｇ９へのプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢ結合の親和定数（ＫＤ）を、リアルタイムバイオセンサー表面プラズモン共鳴アッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））での表面速度論によって決定した。これらの実験によると、プロ型ｓＰＬＡ２−ＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＩＢのＫｄは、それぞれ１７４ｎＭおよび０．３４ｎＭと推定された。
【０１３８】
５．２−ＨＩＶ−１感染患者からの血漿によるＣＤ４Ｔ細胞でのＩＬ−７誘導リン酸化ＳＴＡＴ５核移行の阻害に対する＃１４Ｇ９ｍＡｂの生体外効果
最近、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素は、ウイルス血症ＨＩＶ感染患者におけるＣＤ４Ｔリンパ球の不応答に潜む機序に重要な役割を果たしていることが同定された。特に、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢはＣＤ４Ｔリンパ球の慢性的な活性化に関与するタンパク質であり、それらによってＣＤ４Ｔリンパ球は活性化分化の異常な状態になり、インターロイキン−７によって送達されるような特定の生理学的信号に対して不応性になることが示された（ＴＨＥＺＥ  Ｊａｃｑｕｅｓ等、２０１５）。
【０１３９】
ＣＤ４Ｔ細胞中でのＩＬ−７誘導リン酸化ＳＴＡＴ５の核移行に対するＨＩＶ−１感染患者から分離された血漿の阻害効果を生体内で相殺する＃１４Ｇ９ｍＡｂの能力について、ＨＩＶ−１感染患者から分離された血漿を＃１４Ｇ９ｍＡｂと一緒にインキュベートすることによって試験した。
【０１４０】
図２に示すように、＃１４Ｇ９ｍＡｂの量が増えると、ウイルス血症患者の血漿が、１人の健康なドナーから分離されたヒトＣＤ４Ｔ細胞でＩＬ−７によって誘導されるリン酸化ＳＴＡＴ５の核移行を阻害する能力が用量依存的に回復した。この用量反応回復効果は、アイソタイプ対照ｍＡｂでは観察されなかった。これらの結果は、５人の異なる健康なドナーから分離されたＣＤ４Ｔ細胞において、＃１４Ｇ９ｍＡｂを単回投与（１０μｇ）する、または１０μｇの非阻害性＃６Ｆ７ｍＡｂもしくはアイソタイプ対照ｍＡｂを使用するという実験で５回とも連続して再現した（図３）。
【０１４１】
５．３−ｓＰＬＡ２−ＩＢによるリン酸化ＳＴＡＴ５核移行の阻害に対する＃１４Ｇ９ｍＡｂの生体内効果
ＣＤ４Ｔ細胞中でのＩＬ−７誘導リン酸化ＳＴＡＴ５の核移行に対するｓＰＬＡ２−ＩＢ注入の阻害効果を生体内で相殺する＃１４Ｇ９ｍＡｂの能力について試験し、マウスに最初、１ｍｇの＃１４Ｇ９ｍＡｂを注入し、その後、１００μｇのｓＰＬＡ２−ＩＢを注入した。処置されたマウスの脾細胞から単離されたＣＤ４Ｔ細胞におけるリン酸化ＳＴＡＴ５の核移行を、その後、共焦点顕微鏡によって分析した。
【０１４２】
図４に示すように、マウスに１ｍｇのｓＰＬＡ２−ＧＩＢを注入すると、脾細胞から分離されたＣＤ４Ｔ細胞中のリン酸化ＳＴＡＴ５の核移行が６０％阻害された。この効果は、先に１ｍｇの＃１４Ｇ９ｍＡｂを注入することによって完全に無効になったが、対照の注入では有意な効果は観察されなかった。
【０１４３】
５．４−＃１４Ｇ９ｍＡｂ可変領域の配列
＃１４Ｇ９ｍＡｂの軽鎖および重鎖の可変領域の配列化を行い、以下に示した。
＞１４Ｇ９−ＶＬ（配列番号８）
ＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＡＣＡＡＡＣＴＣＡＴＧＴＣＣＡＣＡＴＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＡＧＴＡＣＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＡＴＣＴＣＣＴＡＡＡＣＴＡＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＧＧＧＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＡＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＡＧＧＣＡＧＴＡＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＡＴＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＣＡＣＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＧＡＴＴＡＴＡＧＣＡＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＴＣＣＡＴＣ
＞１４Ｇ９−ＶＬ（配列番号２）
ＤＩＶＭＴＱＳＨＫＬＭＳＴＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＥＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＮＲＦＴＧＳＲＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＬＹＹＣＱＱＤＹＳＴＰＰＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩ
＞１４Ｇ９−ＶＨ（配列番号９）
ＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＧＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＴＡＡＴＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＣＴＧＡＴＡＣＴＡＧＡＡＣＴＣＡＣＴＡＣＡＡＴＣＡＡＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＧＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＴＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＣＡＧＡＣＣＣＴＣＴＡＣＴＡＴＧＡＧＧＣＣＴＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧ
＞１４Ｇ９−ＶＨ（配列番号３）
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＩＨＷＶＫＲＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＮＩＤＰＳＤＴＲＴＨ  ＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＡＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＦＹＣＡＲＱＴＬＹＹＥＡＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬ
【０１４４】
大多数の抗体では、保存されるＶＨ／ＶＬの界面は主に、重鎖フレームワーク残基のカバット位置Ｈ３７、Ｈ４５、Ｈ４７、Ｈ８９、Ｈ９１、Ｈ１００ＢおよびＨ１０３ならびに軽鎖フレームワーク残基のＬ３６、Ｌ４４、Ｌ４６、Ｌ８７、Ｌ９６およびＬ９８間の疎水性相互作用、ならびにＨ３９およびＬ３８間の水素結合から成る。
【０１４５】
＃１４Ｇ９モノクローナル抗体の印象的でユニークな特徴は、カバット位置Ｈ３９のＡｒｇおよびカバット位置Ｌ３８のＧｌｕという異常な存在であり、両位置が通常の高度に保存されるＧｌｎでないことである。１４Ｇ９では、Ｈ３９のＧｌｎおよびＬ３８のＧｌｎ間の水素結合相互作用は、Ｈ３９のＡｒｇおよびＬ３８のＧｌｕ間の静電引力に置換されている。
【０１４６】
６−＃１４Ｇ９マウスモノクローナル抗体のヒト化
６．１−ヒト化戦略およびヒト化抗体の生成
＃１４Ｇ９マウス抗体について、カバット命名法で定義された３つのＣＤＲを、軽鎖可変領域（ＶＬ）から、マウス抗体ＶＬと可能な限り相同なヒト生殖細胞系列ＶＬに移植することでヒト化した。同様に、重鎖可変領域（ＶＨ）からの３つのＣＤＲを、マウス抗体ＶＨと可能な限り相同なヒト生殖系列ＶＨに移植した。さらに、選択したヒト生殖細胞系列可変領域のフレームワーク領域のいくつかのアミノ酸残基を、マウス可変領域に存在するアミノ酸残基に変更した（いわゆる復帰突然変異）。免疫グロブリン可変領域の構造に関する情報に基づいて、フレームワーク領域のこれらのいくつかの残基は、ＣＤＲを正しい構造またはＶＨ／ＶＬパッキングに維持する上で重要な役割を果たすことが同定され、かくしてヒト化バージョンＡおよびＢにおいて保持した。＃１４Ｇ９ＶＨのＣＤＲ移植バージョンの設計では、２つの人間の生殖細胞系列、ＩＧＨＶ１−４６＊０１およびＩＧＨＶ５−１０−１＊０１を選択した。ヒト生殖細胞系列ＩＧＨＶ１−４６＊０１を選択したのは、マウス１４Ｇ９ＶＨとＶ遺伝子全体で６６．３％と最高の全体的な同一性を示したためである。人間の生殖系列ＩＧＨＶ５−１０−１＊０１を選択したのは、１４Ｇ９ＶＨとの全体的な同一性（５８．２％）は少ないものの、ＩＧＨＶ１−４６＊０１とは１４Ｇ９ＶＨ全体にわたって異なる相同性パターンがあるためである。１４Ｇ９ＶＬのＣＤＲ移植バージョンの設計では、２つの異なるヒトカッパ生殖細胞系列、ＩＧＫＶ１−３９＊０１およびＩＧＫＶ３−１５＊０１を選択した。ＩＧＫＶ１−３９＊０１を選択したのは、マウス１４Ｇ９ＶＬとＶ遺伝子全体で６７．４％の同一性と最高の相同性を持っているためである。ＩＧＫＶ３−１５＊０１を選択したのは、低率（６２．１％）の同一性にもかかわらず、ＩＧＫＶ１−３９＊０１とは＃１４Ｇ９ＶＬのＣＤＲ内で異なる同一性パターンを有するためである。
【０１４７】
ヒト化バージョンの設計では、ＶＨ／ＶＬ界面でのＨ３９のＡｒｇおよびＬ３８のＧｌｕという異常な存在を考慮した。ＣＤＲ移植のＶＨおよびＶＬ配列のバージョンＡでは、Ｈ３９（Ａｒｇ）およびＬ３８（Ｇｌｕ）の親マウス残基をそれぞれ保存した。バージョンＢでは、高度に保存された水素結合相互作用を再現するために、カバットのＨ３９およびＬ３８の位置にある親残基をＧｌｎ（ヒト生殖細胞系残基）で置換した。その結果、ＣＤＲ移植の＃１４Ｇ９の設計に使用する各ヒト生殖細胞系列（ＶＨに２つおよびＶＬに２つ）に対して、２つのバージョン（ＡとＢ）を構築した。バージョンＡではＨ３９（ＶＨ）にＡｒｇまたはＬ３８（ＶＬ）にＧｌｕがあり、バージョンＢでは両位置はＧｌｎとした。ヒト化バージョンＡのＶＨは、ヒト化バージョンＡのＶＬとのみペアリングし、同じ原理をヒト化バージョンＢにも当てはめる。マウス＃１４Ｇ９ハイブリドーマおよびＣＤＲ移植バージョン間のＶ遺伝子全体にわたる配列同一性の割合（つまり、人間性の割合）の増加を表１に示す。ヒト化バージョンと対応する免疫グロブリン可変ヒト生殖細胞系列の間のＶ遺伝子全体の配列の違いの詳細を表２に示す。
【０１４８】
６．２−ヒト化抗体によるｓＰＬＡ２−ＩＢ酵素活性の阻害
異なるヒト化抗体のｓＰＬＡ２−ＩＢ酵素活性を阻害する能力について、精製モノクローナル抗体を増量させながら、放射標識された膜を組み換えヒトｓＰＬＡ２−ＩＢでインキュベートすることによって試験した。結果を、試験した最高濃度のｍＡｂで観察された酵素活性の阻害率として表し、表３に示す。表示されているように、＃２Ｂは、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢを阻害する最高の効力のｍＡｂである。
【０１４９】
６．３−競合ＥＬＩＳＡによるヒト化抗体の親和性決定
ヒトプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対するヒト化抗体の結合親和性について、それぞれ、プレートベースの競合免疫測定法によって測定した。要するに、様々なレベルの抗体の一定量を、抗原タンパク質の連続希釈物と予備混合し、抗体と抗原の間の擬似結合平衡に到達させた。これらの溶液を、次いで、抗原を予めコーティングしたプレートに移し、混合物中の遊離抗体をプレートにコーティングしたｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢに結合させた。プレート結合抗体をＨＲＰ共役ポリクローナル抗体試薬で検出した。様々な変異体について得られた滴定曲線の例を図５に示す。データを４ＰＬロジスティック非線形回帰モデルでフィッティングし、当該モデルから相対ＩＣ５０値を推定した（表４）。
【０１５０】
６．４−ヒト化抗体の示差走査熱量測定
試験した様々な抗体について、正規化した熱変性を図６に、ＤＳＣパラメータを表５に示す。Ｔｍは変性／融解温度である。Ｔｏｎｓｅｔは、展開遷移が始まる温度である。Ｔ１／２は、ピークの半分の高さにおける遷移幅である。ΔＨは展開の熱量測定エンタルピーであり、タンパク質の分子内相互作用の破壊を反映する。総面積は展開の全エンタルピー（サーモグラムの下の総面積）であり、熱力学的安定性を反映する。全てのサーモグラムの重ね合わせ（図６）によると、＃１ＢはＤＳＣによる挙動がより優れている。最初の遷移である約７０〜７２°Ｃは、ＣＨ２ドメインに対応する。最後の遷移である約８２〜８３°ＣはＣＨ３に対応し、最も高いピークはＦａｂ遷移に対応する。＃２Ａでは、Ｆａｂ遷移はＣＨ２上にあり、他のすべての変異体では、ＣＨ３遷移上にＦａｂ遷移があり、少なくとも＃２Ｂでは、Ｆａｂ遷移の右端の肩がＣＨ３遷移に対応している必要がある。
【０１５１】
６．５−ヒト化抗体の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
ヒト化抗体＃１Ａ、＃１Ｂ、＃２Ａ及び＃２Ｂについて、ＰＢＳ緩衝液中でＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。＃２Ｂの代表的なクロマトグラムを図７に示し、結果を表６にまとめている。示すように、全ての変異体は見かけの分子量が１６０ｋＤａに近く、試験した条件では単量体構造であり、かつ凝集が無いことを示す。
【０１５２】
６．６−＃２Ｂ配列
上記の阻害、結合、生物物理学的特性に基づいて、さらに最適化するために＃２Ｂ抗体を選択した。変異体＃２Ｂの重鎖は、ＩＧＨＶ１−４６＊０１ヒト生殖細胞系列と８１．６０％の同一性（８０／９８）を示す。＃２Ｂの軽鎖は、ＩＧＫＶ３−１５＊０１生殖細胞系列と８６．３％の同一性（８２／９５）を示す。基準となるヒト生殖細胞系列に対する全体的な＃２Ｂの同一性は、８３．９４％である。
【０１５３】
＃２Ｂの重鎖と軽鎖のシーケンスを以下に示す。
重鎖
＞３３５２．ＶＨ  ２Ｂ（配列番号１１）
ｇｃｇｇｃｃｇｃｃａｔｇａａｔｔｔｔｇｇａｃｔｇａｇｇｃｔｇａｔｔｔｔｃｃｔｇｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｔｇａａａｇｇｃｇｔｃｃａｇｔｇｔｃａａｇｔｃｃａｇｃｔｃｇｔｃｃａｇａｇｃｇｇｇｇｃｇｇａａｇｔｃａａｇａａｇｃｃｇｇｇｇｇｃｇａｇｃｇｔｇａａａｇｔｃｔｃｇｔｇｃａａｇｇｃｇａｇｃｇｇａｔａｔａｃｇｔｔｃａｃｇａａｃｔａｃｔｇｇａｔｔｃａｃｔｇｇｇｔｃｃｇｇｃａａｇｃｇｃｃｇｇｇｇｃａｇｇｇｇｃｔｇｇａｇｔｇｇａｔｃｇｇｇａａｃａｔｃｇａｃｃｃｇｔｃｇｇａｃａｃｇｃｇｇａｃｇｃａｃｔａｃａａｃｃａｇａａｇｔｔｃａａｇｇａｃｃｇｇｇｃｇａｃｇｃｔｇａｃｃｇｔｃｇａｃａａｇａｇｃａｃｇａｇｃａｃｇｇｃｇｔａｃａｔｇｇａｇｃｔｇｔｃｇａｇｃｃｔｇｃｇｇａｇｃｇａｇｇａｃａｃｇｇｃｃｇｔｃｔａｃｔａｃｔｇｃｇｃｇｃｇｇｃａｇａｃｇｃｔｇｔａｃｔａｃｇａｇｇｃｇｃｔｇｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｇｃａｇｇｇｇａｃｇｃｔｃｇｔｃａｃｇｇｔｃｔｃｇａｇｃｇｃｔａｇｃａｃａａａｇｇｇｃｃｃｔａｇｔｇｔｇｔｔｔｃｃｔｃｔｇｇｃｔｃｃｃｔｃｔｔｃｃａａａｔｃｃａｃｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃａｃｔｇｃｔｇｃｔｃｔｇｇｇａｔｇｃｃｔｇｇｔｇａａｇｇａｔｔａｃｔｔｔｃｃｔｇａａｃｃｔｇｔｇａｃｔｇｔｃｔｃａｔｇｇａａｃｔｃｔｇｇｔｇｃｔｃｔｇａｃｔｔｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃａｃｔｔｔｃｃｃｔｇｃｔｇｔｇｃｔｇｃａｇｔｃｔａｇｔｇｇａｃｔｇｔａｃｔｃｔｃｔｇｔｃａｔｃｔｇｔｇｇｔｃａｃｔｇｔｇｃｃｃｔｃｔｔｃａｔｃｔｃｔｇｇｇａａｃｃｃａｇａｃｃｔａｃａｔｔｔｇｔａａｔｇｔｇａａｃｃａｃａａａｃｃａｔｃｃａａｃａｃｔａａａｇｔｇｇａｃａａａａｇａｇｔｇｇａａｃｃｃａａａｔｃｃｔｇｔｇａｃａａａａｃｃｃａｃａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｔｔｇｔｃｃｔｇｃｃｃｃｔｇａａｃｔｇｃｔｇｇｇａｇｇａｃｃｔｔｃｔｇｔｇｔｔｔｃｔｇｔｔｃｃｃｃｃｃｃａａａｃｃａａａｇｇａｔａｃｃｃｔｇａｔｇａｔｃｔｃｔａｇａａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｇａｃａｔｇｔｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｔｇｔｇｔｃｔｃａｔｇａｇｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａａａｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｔｇｇａｇｔｇｇａａｇｔｃｃａｃａａｔｇｃｃａａａａｃｃａａｇｃｃｔａｇａｇａｇｇａａｃａｇｔａｃａａｔｔｃａａｃｃｔａｃａｇａｇｔｇｇｔｃａｇｔｇｔｇｃｔｇａｃｔｇｔｇｃｔｇｃａｔｃａｇｇａｔｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａａｔａｃａａｇｔｇｔａａａｇｔｃｔｃａａａｃａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｔｇｃｔｃｃａａｔｔｇａｇａａａａｃａａｔｃｔｃａａａｇｇｃｃａａｇｇｇａｃａｇｃｃｔａｇｇｇａａｃｃｃｃａｇｇｔｃｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃａｃｃｔｔｃａａｇａｇａｇｇａａａｔｇａｃｃａａａａａｃｃａｇｇｔｇｔｃｃｃｔｇａｃａｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｔｔｃｔｇａｃａｔｔｇｃｔｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇｔｃａａａｔｇｇａｃａｇｃｃｔｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａａａｃａａｃｃｃｃｃｃｃｔｇｔｇｃｔｇｇａｔｔｃｔｇａｔｇｇｃｔｃｔｔｔｃｔｔｔｃｔｇｔａｃｔｃｃａａａｃｔｇａｃｔｇｔｇｇａｃａａｇｔｃｔａｇａｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｔｇｔｃｔｔｔｔｃｔｔｇｃｔｃｔｇｔｃａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｔａａｃｃａｃｔａｃａｃｔｃａｇａａａｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｔｇｔｃｔｃｃｃｇｇｇａａａｔｇａｔａｇｔａａａａｇｃｔｔｔｇａ
軽鎖
＞３３５２．ＶＬ  ２Ｂ（配列番号１０）
Ｇｃｇｇｃｃｇｃｃａｔｇａａｔｔｔｔｇｇａｃｔｇａｇｇｃｔｇａｔｔｔｔｃｃｔｇｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｔｇａａａｇｇｃｇｔｃｃａｇｔｇｔｇａｇａｔｃｇｔｇａｔｇａｃｇｃａｇｔｃｇｃｃｇｇｃｇａｃｇｃｔｇａｇｃｇｔｇａｇｔｃｃｇｇｇｇｇａｇｃｇｇｇｃｇａｃｇｃｔｇａｇｃｔｇｃａａｇｇｃｇｔｃｇｃａｇｇａｃｇｔｇａｇｃａｃｇｇｃｃｇｔｃｇｃｇｔｇｇｔａｔｃａａｃａｇａａｇｃｃｇｇｇｇｃａａｇｃｇｃｃｇｃｇｇｃｔｇｃｔｇａｔｃｔａｃｔｇｇｇｃｇａｇｃａｃｇｃｇｇｃａｃａｃｇｇｇｃａｔｃｃｃｇｇｃｇｃｇａｔｔｃｔｃｇｇｇｇａｇｃｃｇｇａｇｃｇｇｇａｃｇｇａｇｔａｃａｃｇｃｔｇａｃｇａｔｃｔｃｇｔｃｇｃｔｇｃａａａｇｃｇａｇｇａｃｔｔｃｇｃｃｇｔｃｔａｃｔａｃｔｇｃｃａｇｃａｇｇａｃｔａｃｔｃｇａｃｇｃｃｇｃｃｇａｃｇｔｔｃｇｇｇｇｇｇｇｇｔａｃｃａａｇｇｔｃｇａｇａｔｃａａａｃｇｔａｃｇｇｔｃｇｃｇｇｃｇｃｃｔｔｃｔｇｔｇｔｔｃａｔｔｔｔｃｃｃｃｃｃａｔｃｔｇａｔｇａａｃａｇｃｔｇａａａｔｃｔｇｇｃａｃｔｇｃｔｔｃｔｇｔｇｇｔｃｔｇｔｃｔｇｃｔｇａａｃａａｃｔｔｃｔａｃｃｃｔａｇａｇａｇｇｃｃａａａｇｔｃｃａｇｔｇｇａａａｇｔｇｇａｃａａｔｇｃｔｃｔｇｃａｇａｇｔｇｇｇａａｔｔｃｃｃａｇｇａａｔｃｔｇｔｃａｃｔｇａｇｃａｇｇａｃｔｃｔａａｇｇａｔａｇｃａｃａｔａｃｔｃｃｃｔｇｔｃｃｔｃｔａｃｔｃｔｇａｃａｃｔｇａｇｃａａｇｇｃｔｇａｔｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａａｇｔｇｔａｃｇｃｃｔｇｔｇａａｇｔｃａｃａｃａｔｃａｇｇｇｇｃｔｇｔｃｔａｇｔｃｃｔｇｔｇａｃｃａａａｔｃｃｔｔｃａａｔａｇｇｇｇａｇａｇｔｇｃｔｇａｔａｇｔａａａａｇｃｔｔｔｇａ
＞重鎖（配列番号５）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＮＩＤＰＳＤＴＲＴＨＹＮＱＫＦＫＤＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＴＬＹＹＥＡＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
＞軽鎖（配列番号４）
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＲＳＧＴＥＹＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＤＹＳＴＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＤＳＶＳＫＳＫＳＤＳＤＳＴＨＫＶＥＳＴＶＳＬＶＱＳＶＫＳＶＳＬ
【０１５４】
７−＃２Ｂ１および＃２Ｂ２ヒト化変異体の特性評価
７．１−補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）およびＡＤＣＣを消失させる点突然変異の戦略
ヒト化＃２Ｂ抗体について、さらに、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの両方の機能を消失させることが知られている特定の点変異をｍＡｂの重鎖定常領域に導入することによって最適化した。
【０１５５】
得られた抗体＃２Ｂ１（二重変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ｅ）ならびに＃２Ｂ２（三重変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＰ３３１Ｓ）の配列を以下に示す。
【０１５６】
２Ｂ１（突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ｅ）
重鎖
配列番号１２
ｇｃｇｇｃｃｇｃｃａｔｇａａｔｔｔｔｇｇａｃｔｇａｇｇｃｔｇａｔｔｔｔｃｃｔｇｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｔｇａａａｇｇｃｇｔｃｃａｇｔｇｔｃａａｇｔｃｃａｇｃｔｃｇｔｃｃａｇａｇｃｇｇｇｇｃｇｇａａｇｔｃａａｇａａｇｃｃｇｇｇｇｇｃｇａｇｃｇｔｇａａａｇｔｃｔｃｇｔｇｃａａｇｇｃｇａｇｃｇｇａｔａｔａｃｇｔｔｃａｃｇａａｃｔａｃｔｇｇａｔｔｃａｃｔｇｇｇｔｃｃｇｇｃａａｇｃｇｃｃｇｇｇｇｃａｇｇｇｇｃｔｇｇａｇｔｇｇａｔｃｇｇｇａａｃａｔｃｇａｃｃｃｇｔｃｇｇａｃａｃｇｃｇｇａｃｇｃａｃｔａｃａａｃｃａｇａａｇｔｔｃａａｇｇａｃｃｇｇｇｃｇａｃｇｃｔｇａｃｃｇｔｃｇａｃａａｇａｇｃａｃｇａｇｃａｃｇｇｃｇｔａｃａｔｇｇａｇｃｔｇｔｃｇａｇｃｃｔｇｃｇｇａｇｃｇａｇｇａｃａｃｇｇｃｃｇｔｃｔａｃｔａｃｔｇｃｇｃｇｃｇｇｃａｇａｃｇｃｔｇｔａｃｔａｃｇａｇｇｃｇｃｔｇｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｇｃａｇｇｇｇａｃｇｃｔｃｇｔｃａｃｇｇｔｃｔｃｇａｇｃｇｃｔａｇｃａｃａａａｇｇｇｃｃｃｔａｇｔｇｔｇｔｔｔｃｃｔｃｔｇｇｃｔｃｃｃｔｃｔｔｃｃａａａｔｃｃａｃｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃａｃｔｇｃｔｇｃｔｃｔｇｇｇａｔｇｃｃｔｇｇｔｇａａｇｇａｔｔａｃｔｔｔｃｃｔｇａａｃｃｔｇｔｇａｃｔｇｔｃｔｃａｔｇｇａａｃｔｃｔｇｇｔｇｃｔｃｔｇａｃｔｔｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃａｃｔｔｔｃｃｃｔｇｃｔｇｔｇｃｔｇｃａｇｔｃｔａｇｔｇｇａｃｔｇｔａｃｔｃｔｃｔｇｔｃａｔｃｔｇｔｇｇｔｃａｃｔｇｔｇｃｃｃｔｃｔｔｃａｔｃｔｃｔｇｇｇａａｃｃｃａｇａｃｃｔａｃａｔｔｔｇｔａａｔｇｔｇａａｃｃａｃａａａｃｃａｔｃｃａａｃａｃｔａａａｇｔｇｇａｃａａａａｇａｇｔｇｇａａｃｃｃａａａｔｃｃｔｇｔｇａｃａａａａｃｃｃａｃａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｔｔｇｔｃｃｇｇｃｇｃｃｔｇａａｇｃｇｇａａｇｇａｇｇａｃｃｔｔｃｔｇｔｇｔｔｔｃｔｇｔｔｃｃｃｃｃｃｃａａａｃｃａａａｇｇａｔａｃｃｃｔｇａｔｇａｔｃｔｃｇｃｇａａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｇａｃａｔｇｔｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｔｇｔｇｔｃｔｃａｔｇａｇｇａｃｃｃｃｇａａｇｔｃａａａｔｔｔａａｔｔｇｇｔａｔｇｔｃｇａｃｇｇｃｇｔｃｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａａａｃｃａａｇｃｃｔａｇａｇａｇｇａａｃａｇｔａｃａａｔｔｃａａｃｃｔａｃａｇａｇｔｃｇｔｃａｇｔｇｔｇｃｔｇａｃｔｇｔｇｃｔｇｃａｔｃａｇｇａｔｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａａｔａｃａａｇｔｇｔａａａｇｔｃｔｃａａａｃａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｔｇｃｔｃｃａａｔｔｇａｇａａａａｃａａｔｃｔｃａａａｇｇｃｃａａｇｇｇａｃａｇｃｃｔａｇｇｇａａｃｃｃｃａｇｇｔｃｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃａｃｃｔｔｃａａｇａｇａｇｇａａａｔｇａｃｃａａａａａｃｃａｇｇｔｇｔｃｃｃｔｇａｃａｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｔｔｃｔｇａｃａｔｔｇｃｔｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇｔｃａａａｔｇｇａｃａｇｃｃｔｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａａａｃａａｃｃｃｃｃｃｃｔｇｔｇｃｔｇｇａｔｔｃｔｇａｔｇｇｃｔｃｔｔｔｃｔｔｔｃｔｇｔａｃｔｃｃａａａｃｔｇａｃｔｇｔｇｇａｃａａｇｔｃｔａｇａｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｔｇｔｃｔｔｔｔｃｔｔｇｃｔｃｔｇｔｃａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｔａａｃｃａｃｔａｃａｃｔｃａｇａａａｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｔｇｔｃｔｃｃｃｇｇｇａａａｔｇａｔａａｇｃｔｔｔｇａ
軽鎖
２Ｂと同じ（配列番号１０を参照）
＞重鎖（配列番号６）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＮＩＤＰＳＤＴＲＴＨＹＮＱＫＦＫＤＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＴＬＹＹＥＡＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ
ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＮＧ
ＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
＞軽鎖
２Ｂと同じ（配列番号４を参照）
【０１５７】
２Ｂ２（突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＰ３３１Ｓ）
重鎖
配列番号１３
ｇｃｇｇｃｃｇｃｃａｔｇａａｔｔｔｔｇｇａｃｔｇａｇｇｃｔｇａｔｔｔｔｃｃｔｇｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｔｇａａａｇｇｃｇｔｃｃａｇｔｇｔｃａａｇｔｃｃａｇｃｔｃｇｔｃｃａｇａｇｃｇｇｇｇｃｇｇａａｇｔｃａａｇａａｇｃｃｇｇｇｇｇｃｇａｇｃｇｔｇａａａｇｔｃｔｃｇｔｇｃａａｇｇｃｇａｇｃｇｇａｔａｔａｃｇｔｔｃａｃｇａａｃｔａｃｔｇｇａｔｔｃａｃｔｇｇｇｔｃｃｇｇｃａａｇｃｇｃｃｇｇｇｇｃａｇｇｇｇｃｔｇｇａｇｔｇｇａｔｃｇｇｇａａｃａｔｃｇａｃｃｃｇｔｃｇｇａｃａｃｇｃｇｇａｃｇｃａｃｔａｃａａｃｃａｇａａｇｔｔｃａａｇｇａｃｃｇｇｇｃｇａｃｇｃｔｇａｃｃｇｔｃｇａｃａａｇａｇｃａｃｇａｇｃａｃｇｇｃｇｔａｃａｔｇｇａｇｃｔｇｔｃｇａｇｃｃｔｇｃｇｇａｇｃｇａｇｇａｃａｃｇｇｃｃｇｔｃｔａｃｔａｃｔｇｃｇｃｇｃｇｇｃａｇａｃｇｃｔｇｔａｃｔａｃｇａｇｇｃｇｃｔｇｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｇｃａｇｇｇｇａｃｇｃｔｃｇｔｃａｃｇｇｔｃｔｃｇａｇｃｇｃｔａｇｃａｃａａａｇｇｇｃｃｃｔａｇｔｇｔｇｔｔｔｃｃｔｃｔｇｇｃｔｃｃｃｔｃｔｔｃｃａａａｔｃｃａｃｔｔｃｔｇｇｔｇｇｃａｃｔｇｃｔｇｃｔｃｔｇｇｇａｔｇｃｃｔｇｇｔｇａａｇｇａｔｔａｃｔｔｔｃｃｔｇａａｃｃｔｇｔｇａｃｔｇｔｃｔｃａｔｇｇａａｃｔｃｔｇｇｔｇｃｔｃｔｇａｃｔｔｃｔｇｇｔｇｔｃｃａｃａｃｔｔｔｃｃｃｔｇｃｔｇｔｇｃｔｇｃａｇｔｃｔａｇｔｇｇａｃｔｇｔａｃｔｃｔｃｔｇｔｃａｔｃｔｇｔｇｇｔｃａｃｔｇｔｇｃｃｃｔｃｔｔｃａｔｃｔｃｔｇｇｇａａｃｃｃａｇａｃｃｔａｃａｔｔｔｇｔａａｔｇｔｇａａｃｃａｃａａａｃｃａｔｃｃａａｃａｃｔａａａｇｔｇｇａｃａａａａｇａｇｔｇｇａａｃｃｃａａａｔｃｃｔｇｔｇａｃａａａａｃｃｃａｃａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｔｔｇｔｃｃｇｇｃｇｃｃｔｇａａｇｃｇｇａａｇｇａｇｇａｃｃｔｔｃｔｇｔｇｔｔｔｃｔｇｔｔｃｃｃｃｃｃｃａａａｃｃａａａｇｇａｔａｃｃｃｔｇａｔｇａｔｃｔｃｇｃｇａａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｇａｃａｔｇｔｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｔｇｔｇｔｃｔｃａｔｇａｇｇａｃｃｃｃｇａａｇｔｃａａａｔｔｔａａｔｔｇｇｔａｔｇｔｃｇａｃｇｇｃｇｔｃｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａａａｃｃａａｇｃｃｔａｇａｇａｇｇａａｃａｇｔａｃａａｔｔｃａａｃｃｔａｃａｇａｇｔｃｇｔｃａｇｔｇｔｇｃｔｇａｃｔｇｔｇｃｔｇｃａｔｃａｇｇａｔｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａａｔａｃａａｇｔｇｔａａａｇｔｃｔｃａａａｃａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｔｇｃｔｔｃａａｔｔｇａｇａａａａｃａａｔｃｔｃａａａｇｇｃｃａａｇｇｇａｃａｇｃｃｔａｇｇｇａａｃｃｃｃａｇｇｔｃｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃａｃｃｔｔｃａａｇａｇａｇｇａａａｔｇａｃｃａａａａａｃｃａｇｇｔｇｔｃｃｃｔｇａｃａｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｔｔｃｔｇａｃａｔｔｇｃｔｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇｔｃａａａｔｇｇａｃａｇｃｃｔｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａａａｃａａｃｃｃｃｃｃｃｔｇｔｇｃｔｇｇａｔｔｃｔｇａｔｇｇｃｔｃｔｔｔｃｔｔｔｃｔｇｔａｃｔｃｃａａａｃｔｇａｃｔｇｔｇｇａｃａａｇｔｃｔａｇａｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｔｇｔｃｔｔｔｔｃｔｔｇｃｔｃｔｇｔｃａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｔａａｃｃａｃｔａｃａｃｔｃａｇａａａｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｔｇｔｃｔｃｃｃｇｇｇａａａｔｇａｔａａｇｃｔｔｔｇａｔｇｔｃａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｔａａｃｃａｃｔａｃａｃｔｃａｇａａａｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｔｇｔｃｔｃｃｃｇｇｇａａａｔｇａｔａａｇｃｔｔｔｇａ
軽鎖
２Ｂと同じ（配列番号１０を参照）
＞重鎖（配列番号７）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＮＩＤＰＳＤＴＲＴＨＹＮＱＫＦＫＤＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＴＬＹＹＥＡＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ
ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＮＧ
ＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡ  Ｓ  ＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
＞軽鎖
２Ｂと同じ（配列番号４を参照）
【０１５８】
７．２−＃２Ｂ１および＃２Ｂ２ヒト化抗体のＳＰＲ親和性決定
＃２Ｂ１および＃２Ｂ２へのプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢの結合の親和定数（ＫＤ）を、リアルタイムバイオセンサー表面プラズモン共鳴アッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））での表面速度論により決定した。前述の抗体を抗マウスＩｇＧ表面上で捕捉し、様々な濃度の組換えプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質に曝露した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用した速度論的分析を行って、会合および解離速度定数を求めた（表７）。表７に示すように、＃２Ｂ１または＃２Ｂ２への二重または三重変異の導入は、ｓＰＬＡ２−ＩＢターゲットに対する変異体の親和性に大きな影響を与えなかった。
【０１５９】
７．３−＃２Ｂ１および＃２Ｂ２ヒト化抗体の示差走査熱量測定
＃２Ｂ１および＃２Ｂ２の正規化した熱変性を図８に、ＤＳＣパラメータを表８に示す。これらの実験で、＃２Ｂ１は展開遷移の始まる温度ＴｏｎｓｅｔおよびＴｍ１（ＣＨ２に対応）がより高いので、より良いプロファイルを示している。
【０１６０】
７．４−＃２Ｂ１および＃２Ｂ２ヒト化抗体の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
＃２Ｂ１および＃２Ｂ２について、ＰＢＳバッファー中のＳＥＣ−ＨＰＬＣで分析した。結果を表９にまとめている。示されているように、高分子量の凝集体に存在するのはｍＡｂの５％未満であり、試験した条件では単量体構造でありかつ凝集が無いことを示す。
【０１６１】
７．５−＃２Ｂ１および＃２Ｂ２ヒト化抗体のキャピラリー等電点電気泳動分析
＃２Ｂ、＃２Ｂ１、および＃２Ｂ２の電荷異性体の等電点および相対分布を、イメージキャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）分析によって決定した。結果を表１０にまとめている。全ての抗体について、再現性のある結果を低いＲＳＤ％値で得た。主ピークのｐＩは、＃２Ｂでは８．９６、＃２Ｂ１では８．７６、＃２Ｂ２では８．７５であった。わずかにｐＩが異なる主ピークの他に、＃２Ｂは他の２つの試料とは対照的なわずかに異なる電荷異性体プロファイルを示す。＃２Ｂ１および＃２Ｂ２は酸性よりも塩基性の電荷を持つが、＃２Ｂの場合はその逆である（表１０）。＃２Ｂの主ピークは全てのピークの６４％を含むが、＃２Ｂ１および＃２Ｂ２の主ピークは５７％のみであった。全ての試験した試料において、酸性前および塩基性後のピークは検出されなかった。
【０１６２】
７．６−＃２Ｂ、＃２Ｂ１および＃２Ｂ２のヒトＦｃγＲへの結合
単量体＃２Ｂ、＃２Ｂ１および＃２Ｂ２のヒトＦｃγＲへの結合について、ｍＡｂをヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１）、ＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ１３１）、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１７６）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖ１７６）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＮＡ１）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＮＡ２）、およびＦｃγＲＩＩＩＢ（ＳＨ）を安定して発現するＣＨＯ細胞とインキュベートすることによりフローサイトメトリーで試験した（Ｐ．  Ｂｒｕｈｎｓを参照のこと）。図９に示すように、＃２ＢはｈＦｃγＲＩおよびｈＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖ１７６）にのみ結合するが、＃２Ｂ１および＃２Ｂ２について全ての試験したｈＦｃγＲへの単量体結合は観察されなかった。抗体−抗原免疫複合体について、最初にｍＡｂを抗原と共にインキュベートし、次に形成された免疫複合体を、ヒトＦｃγＲを安定して発現するＣＨＯ細胞とインキュベートすることにより試験した。＃２Ｂの免疫複合体は、ｈＦｃγＲＩＩＢを除き、試験した全てのｈＦｃγＲに結合した（図１０）。免疫複合体＃２Ｂ１については、ｈＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖ１７６）との弱い結合が観察されるが（データ示さず）、＃２Ｂ２の試験したｈＦｃγＲとの免疫複合体結合は観察されない（データ示さず）。抗体感作細胞上の抗原の残留結合について、まず＃２Ｂ、＃２Ｂ１、および＃２Ｂ２を、ヒトＦｃγＲを安定して発現するＣＨＯ細胞とインキュベートすることによって試験した。洗浄後、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢビオチン化抗原を添加し、アビジン−ＦＩＴＣ複合体を使用してフローサイトメトリーで検出した。図１１に示すように、ｈＦｃγＲＩおよびｈＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖ１７６）に結合すると、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ抗原のｍＡｂ＃２Ｂへの残留結合が観察された。対照的に、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ抗原のｍＡｂ＃２Ｂ１および＃２Ｂ２への残留結合は観察されなかった。
【０１６３】
７．７−ｓＰＬＡ２−ＧＩＢによる＃２Ｂ２Ｆａｂの共結晶化およびエピトープの定義
＃２Ｂ２のＦａｂ断片をその抗原と一緒に共結晶化し、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびその共結晶のＸ線回折データをソレイユ  シンクロトロン（サン・トーバン、フランス）のＰＲＯＸＩＭＡ−１ビームラインで収集した。結晶は、非対称ユニットごとに２つのｓＰＬＡ２−ＧＩＢ／Ｆａｂ複合体を持つＰ２１空間グループ（ａ＝７１．９Å、ｂ＝８３．８Å、ｃ＝１０３．９Å；α＝β＝９９．５８°）に属する。ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ／Ｆａｂ複合体構造の解明により、複合体における非共有相互作用に関与する重要な残基の同定およびエピトープの定義が可能になった。図１２Ｂに示すように、ｓＰＬＡ２−ＩＢのＷ３、Ｒ６、およびＫ７は、Ｆａｂ軽鎖との相互作用に関与し、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢのＫ１０、Ｃ７７、Ｙ７５、Ｇ７９およびＳ８０は、Ｆａｂ重鎖との相互作用に関与する。
【０１６４】
８−＃２Ｂ２ヒト化抗体の生物学的特性
８．１−ｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはＨＩＶ感染患者の血漿によるリン酸化ＳＴＡＴ５核移行の阻害に対する＃２Ｂヒト化抗体の生体外効果
【０１６５】
＃１４Ｇ９または＃２Ｂが、ＨＩＶ−１感染患者から分離した７５ｎＭのｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたは血漿がＣＤ−４Ｔ細胞においてＩＬ−７誘導リン酸化ＳＴＡＴ５核移行に対して阻害する効果を相殺する能力を、ＨＩＶ−１感染患者から分離した血漿を＃１４Ｇ９または＃２ＢｍＡｂとインキュベートすることによって試験した。
【０１６６】
図１３に示すように、＃１４Ｇ９ｍＡｂまたは＃２ＢｍＡｂの量が増えると、ｓＰＬＡ２−ＩＢ（図１３Ａ）またはウイルス血症患者の血漿（図１３Ｂ）が、１人の健康なドナーから分離されたヒトＣＤ４Ｔ細胞でＩＬ−７によって誘導されるリン酸化ＳＴＡＴ５の核移行を阻害する能力が用量依存的に回復した。ｓＰＬＡ２−ＩＢ効果の回復のＥＣ５０は、＃２Ｂおよび＃１４Ｇ９ｍＡｂでそれぞれ３．７ｎｇ／ｍＬおよび２．２ｎｇ／ｍＬであった。ＨＩＶ感染血漿効果の回復のＥＣ５０は、＃２Ｂおよび＃１４Ｇ９ｍＡｂでそれぞれ３．３ｎｇ／ｍＬおよび２．７ｎｇ／ｍＬであった。
【０１６７】
８．２−ｓＰＬＡ２−ＧＩＢによるリン酸化ＳＴＡＴ５核移行の阻害に対する＃２Ｂ２の生体内効果
ＣＤ４Ｔ細胞中でのＩＬ−７誘導リン酸化ＳＴＡＴ５の核移行に対するｓＰＬＡ２−ＩＢ注入の阻害効果を生体内で相殺する＃２Ｂ２ｍＡｂの能力について試験し、マウスに最初、１ｍｇまたは２ｍｇの＃２Ｂ２ｍＡｂを注入し、その後、１００μｇのｓＰＬＡ２−ＩＢを注入した。処置されたマウスの脾細胞から単離されたＣＤ４Ｔ細胞におけるリン酸化ＳＴＡＴ５の核移行を、その後、共焦点顕微鏡によって分析した。
【０１６８】
図１４に示すように、マウスに１００μｇのｓＰＬＡ２−ＩＢを注入すると、脾細胞から分離されたＣＤ４Ｔ細胞中のリン酸化ＳＴＡＴ５の核移行が５０％阻害された。この効果は、先に１または２ｍｇの＃２Ｂ２ｍＡｂを注入することによって完全に無効になったが、対照の注入では有意な効果は観察されなかった。
【０１６９】
【表１】
2021515554.tif 000002
【０１７０】
【表２】
2021515554.tif 000003
【０１７１】
【表３】
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【０１７２】
【表４】
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【０１７３】
【表５】
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【０１７４】
【表６】
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【０１７５】
【表７】
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【０１７６】
【表８】
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【０１７７】
【表９】
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【０１７８】
【表１０】
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【０１７９】
（参考文献）
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・Ｊ．Ｕ．エスコラ、Ｔ．Ｊ．ネヴァライネン、Ｈ．Ｊ．アホ、「ヒト膵臓ホスホリパーゼＡ２の精製および特性評価」、２９（１０）、ｐｐ．１７７２〜１７７６、１９８３ｂ。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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