(57)【要約】  本発明は、タンパク質またはペプチドを含む製剤を安定化させる方法に関し、選択されるメグルミン塩をタンパク質溶液、とくに医薬活性タンパク質の溶液へと添加するステップを包含する。しかし、本発明は、タンパク質またはペプチドおよび選択されるメグルミン塩を含む安定化された組成物にもまた関する。本発明の別の目的は、選択されるメグルミン塩によって安定化された抗体分子を含む医薬組成物および対応する安定化された医薬組成物を産生するための方法、およびこれらの組成物を含むキットを提供することにある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体タンパク質またはペプチド製剤を安定化する方法、またはそこに含有されるタンパク質またはペプチド分子を安定化するのに有効な濃度におけるメグルミンと生理学的に十分に許容される有機対イオンの組み合わせでのペプチドまたはタンパク質を含有する溶液の処理による該製剤におけるタンパク質の凝集を抑制するための方法。
【請求項２】
以下：
（ａ）タンパク質またはペプチド分子を含む第一の溶液を提供すること；および
（ｂ）好適な製剤においてメグルミンを生理学的に十分に許容される有機対イオンと組み合わせて含む第二の溶液を提供すること、
（ｃ）充分な量の第二の溶液を第一の溶液へと添加すること、
それによってその結果得られる混合物においてメグルミン−対イオン濃度を設定すること、このことは、構成するタンパク質またはペプチド分子の安定化のために有効である、
による液体タンパク質またはペプチド製剤の安定化のための、またはタンパク質の凝集を抑制するための請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対イオンが、以下：
少なくとも１のカルボン酸基および少なくとも１のアミノ基を有するが分子中に芳香族基を有さない化合物の群、
または少なくとも１のカルボン酸基、少なくとも１のアミノ基および少なくとも１のＯＨ基を有するが、分子中に芳香族基を有さない化合物の群、
または少なくとも１のカルボン酸基および少なくとも２またはそれより多いＯＨ基を有するが、分子中に芳香族基を有さない化合物の群、
のいずれかから選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
対イオンが、グルタマート、アスパルタート、ラクタートおよびラクトビオナートの群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
タンパク質が、抗体、抗体フラグメント、ミニボディ（minibody）、改変された抗体、抗体様分子および融合タンパク質の群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
タンパク質分子が、抗体分子である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
液体タンパク質またはペプチド製剤が、医薬組成物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
対イオンと組み合わせてのメグルミンの第一の溶液への添加の後に、ｐＨが、ｐＨ５〜８の範囲内に調整される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
対イオンと組み合わせてのメグルミンの第一の溶液への添加の後に、ｐＨが、７．２〜７．６の範囲内、好ましくはｐＨ７．４で調整される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
その結果得られる混合物において、メグルミンに対する対イオンのモル比を１：１から最大１：２までの範囲に設定し、このことが構成するタンパク質またはペプチド分子の安定化のために有効である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
その結果得られる混合物において、メグルミンに対する対イオンのモル比を１：１に設定し、このことが構成するタンパク質またはペプチド分子の安定化に有効である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
１ｍｇ／ｍｌと最大５００ｍｇ／ｍｌの間の範囲におけるタンパク質またはペプチド濃度を有するタンパク質またはペプチド溶液が、安定化される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質またはペプチドの安定化のために、メグルミン濃度が、溶液中１ｍＭ〜１．５Ｍの範囲にある高い濃度で調整される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質またはペプチドの安定化のために、メグルミン濃度が、溶液中５ｍＭ〜５００ｍＭの範囲にある濃度で調整される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質またはペプチドが安定化されており、および変性および凝集が室温での長期保管条件下で抑制されている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質またはペプチドが安定化されており、ならびに変性および凝集が４０℃および７５％ｒｅｌの相対湿度で３ヶ月間の長期保管条件下で抑制されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
タンパク質またはペプチドが安定化されており、ならびに変性および凝集が−８０℃〜１０℃の範囲にある低い温度での長期保管条件下で抑制されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
メグルミンと対イオンとを組み合わせて含む溶液を添加するステップの後に、その結果得られる混合物をさらに凍結乾燥し、凍結乾燥調製物を産生する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
抗体分子ならびにメグルミングルタマート、メグルミンアスパルタートおよびメグルミンラクトビオナートの群から選択されるメグルミン塩を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法によって得られる医薬組成物。
【請求項２０】
その剤形が、凍結乾燥調製である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法によって得られる医薬組成物、および薬学的に許容し得る担体を含むキット。
【請求項２２】
使用に先立ち溶液調製物とすることができる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法によって得られる、医薬組成物の凍結乾燥または噴霧乾燥調製物を含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
９６ウェルプレートに入っている既製の凍結乾燥または噴霧乾燥製剤を含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
容器、シリンジおよび／または針の有無にかかわらず他の投与デバイス、注入ポンプ、ジェット式注射器、ペンデバイス、経皮注射器、または他の無針注射器および取扱説明書を包含する、患者への投与のための、請求項２１または２２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、製剤を含むタンパク質またはペプチドを安定化するための方法に関し、それは、選択されるメグルミン塩をタンパク質溶液、とくに医薬活性タンパク質の溶液へと添加するステップを包含する。しかし本発明は、タンパク質またはペプチドおよび選択されるメグルミン塩を含む安定化された組成物にもまた関する。別の本発明の目的は、選択されるメグルミン塩によって安定化された抗体分子を含む医薬組成物および対応する安定化された医薬組成物を産生する方法、およびこれらの組成物を含むキットを提供することである。
【背景技術】
【０００２】
技術水準
タンパク質の安定性は、タンパク質治療法の開発の間の主な課題であり（Wang, W.;  Int J Pharm, 185(2) (1999)129-88; “Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals”）、およびタンパク質薬物の有効性を確かにし、および患者の安全性を保証する、厳格な管理の下、残る必要がある。タンパク質治療法の開発の間の安定性の重要性は、規制当局によってもまた認識される。ＩＣＨ  Ｑ５Ｃに従った強制劣化研究またはタンパク質粒子の同定および緩和は、開発の間の重大な安定性を指し示す基準である（Hawe, A.,; Wiggenhorn, M.;van de Weert, M.; Garbe, J. H.; Mahler, H. C. and Jiskoot, W.; J Pharm Sci, 101: (2012) 895-913; “Forced degradation of therapeutic proteins”）。
【０００３】
タンパク質の安定性を増加させるバイオ医薬品産業における最も一般的なストラテジーは、タンパク質溶液への安定化させる賦形剤の添加に依拠する（ペプチド配列を変更することによるタンパク質の安定性の改善は、本発明において扱われない）。賦形剤は、伝統的に液体または凍結乾燥された状態のいずれかにおける、最終的に処方される産物を安定化するために使用される。しかしながら、安定化の同様の概念が、全製造プロセス、例として細胞培養または下流の精製プロセスの間にもまた適用され得ることについて言及する価値がある。
【０００４】
今日まで、当該技術分野において通常の技術を有する科学者は、タンパク質の安定化のために一握りの賦形剤から選び得る。安定剤の１つのファミリーは、スクロース、トレハロース、マンニトールおよびソルビトールなどの糖およびポリオールからなる。それらは、除去溶媒（excluded solvent）として作用することによりタンパク質を安定化させる(Arakawa, T.; Timasheff, S. N.; Biophysical Journal, 47: (1985) 411-14; "The stabilization of proteins by osmolytes")。他方、安定化は、NaClおよびアルギニンなどの荷電した賦形剤を使用するタンパク質の電荷相互作用を修正することによってもまた達成され得る。
【０００５】
近年、メグルミン（Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン）は、潜在的なタンパク質を安定化する賦形剤として提案されている（Igawa, T.C.S.K.K.；Kameoka, D.C.S.K.K.；ＵＳ８，９４５，５４３Ｂ２（２００８）；"Stabilizer for protein preparation comprising meglumine and use thereof"；およびManning, M.；Murphy, B.；ＵＳ２０１３／１０８６４３Ａ１（２０１３）；"Etanercept Formulations Stabilized with Meglumine")。
これに関連して、メグルミンが、タンパク質の凝集を低減させることが可能であるだろう一方で、含有する溶媒および電荷修飾因子の効果よりも、タンパク質製剤においてもはや後者が必要ではないという効果の方が優れ得ることが推測されている。
しかしながら、この文書において開示されている、製剤のより詳細な分析は、より最近の製剤において使用されるタンパク質の充分な安定化が、このように達成され得ないことを示す。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的
開発における有意な数のタンパク質、とくに融合タンパク質などの新規タンパク質の形式について、一般的に既知の賦形剤を使用した安定化についての試みは、依然として失敗している。このことは、とくにこれらの新しいタンパク質の形式について、改善された安定化特性を示す好適な賦形剤を提供することがバイオ医薬品産業において依然として必要とされている理由である。
【０００７】
本発明の内容
本発明の対象は、液体タンパク質またはペプチド製剤の安定化の方法、またはペプチド−またはタンパク質を含有する溶液を有効な濃度でのメグルミンおよび生理学的に十分に許容される有機対イオンの組み合わせで処置することにより該製剤におけるタンパク質の凝集を抑制し、そこに含有されるタンパク質またはペプチド分子を安定化させるための方法である。本発明の選択される態様において、液体タンパク質またはペプチド製剤の安定化のための方法、またはタンパク質凝集を抑制するための方法は、以下によって実行される：
（ａ）タンパク質またはペプチド分子を含む第一の溶液を提供すること；
および
（ｂ）好適な製剤における、選択される、生理学的に十分に許容される有機対イオンと組み合わせてメグルミンを含む第二の溶液を提供すること、
（ｃ）第一の溶液に充分な量の第二の溶液を添加すること、および
それによって、その結果得られる混合物において、メグルミン−対イオン濃度を設定すること、そのことは、構成するタンパク質またはペプチド分子の安定化のために有効である。
【０００８】
さらにまた、本発明は、請求項３〜１８によって請求される本方法のさらなる態様、および本方法によって産生され、および安定化された請求項１９および２０に記載の医薬タンパク質またはペプチド製剤を網羅する。本発明の別の目的は、請求項２１〜２４に記載の発明に従うタンパク質製剤を含有するキットである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
図面のリスト：
【図１】例１Ａ）マッキルベイン緩衝液（ｐＨ５）中１ｍｇ／ｍｌで処方されたｍＡｂＡの融解温度（Ｔｍ）に対するメグルミン−グルタマートおよびメグルミンアスパルタート対メグルミンおよびスクロースの安定化効果。
【図２】例１Ｂ）マッキルベイン緩衝液（ｐＨ５）中１ｍｇ／ｍｌで処方されたｍＡｂＢの融解温度（Ｔｍ）に対するメグルミン−グルタマートおよびメグルミンアスパルタート対メグルミンおよびスクロースの安定化効果。
【図３】例１Ｃ）マッキルベイン緩衝液（ｐＨ５）中１ｍｇ／ｍｌで処方された融合タンパク質融合Ａの融解温度（Ｔｍ）に対するメグルミン−グルタマートおよびメグルミンアスパルタート対メグルミンおよびスクロースの安定化効果。
【００１０】
【図４】例１Ｄ）マッキルベイン緩衝液（ｐＨ５）中１ｍｇ／ｍｌで処方されたｍＡｂＡについての凝集の開始温度（Ｔａｇｇ）に対するメグルミン−グルタマートおよびメグルミンアスパルタート対メグルミンおよびスクロースの安定化効果。
【図５】例１Ｅ）：マッキルベイン緩衝液（ｐＨ５）中１ｍｇ／ｍｌで処方されたｍＡｂＢについての凝集の開始温度（Ｔａｇｇ）に対するメグルミン−グルタマートおよびメグルミンアスパルタート対メグルミンおよびスクロースの安定化効果。
【図６】例２Ａ）１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ５）中５０ｍｇ／ｍｌで処方されたｍＡｂＡの融解温度（Ｔｍ）に対するメグルミン−グルタマート（Ｍｅｇ−Ｇｌｕ）、メグルミン−ラクトビオナート（Ｍｅｇ−Ｌａｃ）およびメグルミンアスパルタート（Ｍｅｇ−Ａｓｐ）対メグルミンおよびスクロースの安定化効果。
【００１１】
【図７】例２Ｂ）１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ５）中５０ｍｇ／ｍｌで処方されたｍＡｂＢの融解温度（Ｔｍ）に対するメグルミン−グルタマート（Ｍｅｇ−Ｇｌｕ）、メグルミン−ラクトビオナート（Ｍｅｇ−Ｌａｃ）およびメグルミンアスパルタート（Ｍｅｇ−Ａｓｐ）対メグルミンおよびスクロースの安定化効果。
【図８】例２Ｃ）１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ５）中５０ｍｇ／ｍｌで処方された融合Ａの融解温度（Ｔｍ）に対するメグルミン−グルタマート（Ｍｅｇ−Ｇｌｕ）、メグルミン−ラクトビオナート（Ｍｅｇ−Ｌａｃ）およびメグルミンアスパルタート（Ｍｅｇ−Ａｓｐ）対メグルミンおよびスクロースの安定化効果。
【図９】例２Ｄ）１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ５）中５０ｍｇ／ｍｌで処方されたｍＡｂＡについての凝集の開始温度（Ｔａｇｇ）に対するメグルミン−グルタマート（Ｍｅｇ−Ｇｌｕ）、メグルミン−ラクトビオナート（Ｍｅｇ−Ｌａｃ）およびメグルミンアスパルタート（Ｍｅｇ−Ａｓｐ）対メグルミンおよびスクロースの安定化効果。
【００１２】
【図１０】例２Ｅ）１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ５）中５０ｍｇ／ｍｌで処方されたｍＡｂＢについての凝集の開始温度（Ｔａｇｇ）に対するメグルミン−グルタマート（Ｍｅｇ−Ｇｌｕ）、メグルミン−ラクトビオナート（Ｍｅｇ−Ｌａｃ）およびメグルミンアスパルタート（Ｍｅｇ−Ａｓｐ）対メグルミンおよびスクロースの安定化効果。
【図１１】例２Ｆ）１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ５）中５０ｍｇ／ｍｌで処方された融合Ａについての凝集の開始温度（Ｔａｇｇ）に対するメグルミン−グルタマート（Ｍｅｇ−Ｇｌｕ）、メグルミン−ラクトビオナート（Ｍｅｇ−Ｌａｃ）およびメグルミンアスパルタート（Ｍｅｇ−Ａｓｐ）対メグルミンおよびスクロースの安定化効果。
【図１２】様々な濃度の等モル濃度のメグルミンおよびグルタマートの混合物を用いた６０℃１８０分間の等温性の負荷の後の、リン酸塩／クエン酸バッファー（マッキルベイン緩衝液）中に処方された１ｍｇ／ｍｌの濃度のｍＡｂＡの残存するタンパク質−モノマー濃度［ｍｇ／ｍｌ］。
【００１３】
【図１３】様々な濃度のメグルミンを用いた６０℃１８０分間の等温性の負荷の後の、リン酸塩／クエン酸バッファー（マッキルベイン緩衝液）中に処方された１ｍｇ／ｍｌの濃度のｍＡｂＡの残存するタンパク質−モノマー濃度［ｍｇ／ｍｌ］。
【図１４】様々な濃度のメグルミンを用いた６０℃１８０分間の等温性の負荷の後の、リン酸塩／クエン酸バッファー（マッキルベイン緩衝液）中に処方された１ｍｇ／ｍｌの濃度のｍＡｂＡの残存するタンパク質−モノマー濃度［ｍｇ／ｍｌ］。
【図１５】例４Ａ）４０℃７５％ｒ．Ｈ．での０週間（初期値）、４週間、８週間および１２週間の保管の後の３５０ｎｍにおける濁度測定。
【図１６】例４Ｂ）４０℃７５％ｒ．Ｈ．での０週間（初期値）、４週間、８週間および１２週間の保管の後のＳＥＣの測定。
【００１４】
【図１７】例５Ａ：等温性の負荷の後の３５０ｎｍでの濁度測定。
【図１８】例５Ｂ：等温性の負荷の後のＳＥＣの測定。
【図１９】例６Ａ：２、４、９および１２週間での安定性試験の間の３５０ｎｍでの濁度測定。
【図２０】例６Ｂ：２、４、９および１２週間での安定性試験の間のＳＥＣ分析。
【００１５】
【図２１】例７：ｐＨ５およびｐＨ７での５０ｍＭ／２５０ｍＭのメグルミンで安定化された５０ｍｇ／ｍｌのｍａｂＢについてのＴｍ値。
【図２２】例７：ｐＨ５およびｐＨ７での５０ｍＭ／２５０ｍＭのメグルミンで安定化された５０ｍｇ／ｍｌのｍａｂＢについてのＴａｇｇ値。
【図２３】例７：ｐＨ５およびｐＨ７での５０ｍＭ／２５０ｍＭのスクロースで安定化された５０ｍｇ／ｍｌのｍａｂＢについてのＴｍ値。
【図２４】例７：ｐＨ５およびｐＨ７での５０ｍＭ／２５０ｍＭのスクロースで安定化された５０ｍｇ／ｍｌのｍａｂＢについてのＴａｇｇ値。
【図２５】例７：ｐＨ５およびｐＨ７での５０ｍＭ／２５０ｍＭのメグルミン−グルタマートで安定化された５０ｍｇ／ｍｌのｍａｂＢについてのＴｍ値。
【図２６】例７：ｐＨ５およびｐＨ７での５０ｍＭ／２５０ｍＭのメグルミン−グルタマートで安定化された５０ｍｇ／ｍｌのｍａｂＢについてのＴａｇｇ値。
【００１６】
【図２７】ｐＨ５．０での安定性研究についての融合Ａ試料の調製のための試料の体積。
【図２８】ｐＨ７．０での安定性研究についての融合Ａ試料の調製のための試料の体積。
【図２９】凍結乾燥のための条件。
【図３０】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ５．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４、８または１２週間の保管の後の＞１０μｍのサブビジュアル粒子。
【００１７】
【図３１】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ５．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４、８または１２週間の保管の後の＞２５μｍのサブビジュアル粒子。
【図３２】０、４、８または１２週間２５℃／６０％ｒ．Ｈ．で保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａ液剤（ｐＨ５．０）についてのサブビジュアル粒子の点での５０ｍＭおよび２００ｍＭのスクロースおよびメグルミン−グルタマートの比較。
【図３３】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ７．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４、８および１２週間の保管の後の＞１０μｍのサブビジュアル粒子。
【００１８】
【図３４】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ７．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４、８および１２週間の保管の後の＞２５μｍのサブビジュアル粒子。
【図３５】０、４、８または１２週間２５℃／６０％ｒ．Ｈ．で保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ７．０）についてのサブビジュアル粒子の点での５０ｍＭおよび２００ｍＭのスクロースおよびメグルミン−グルタマートの比較。
【図３６】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ５．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４および１２週間の保管の後の＞１０μｍのサブビジュアル粒子。
【００１９】
【図３７】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ５．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４および１２週間の保管の後の＞２５μｍのサブビジュアル粒子。
【図３８】０、４および１２週間２５℃／６０％ｒ．Ｈ．で保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ５．０）についてのサブビジュアル粒子の点での５０ｍＭおよび２００ｍＭのスクロースおよびメグルミン−グルタマートの比較。
【図３９】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ７．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４および１２週間の保管の後の＞１０μｍのサブビジュアル粒子。
【００２０】
【図４０】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ７．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４および１２週間の保管の後の＞２５μｍのサブビジュアル粒子。
【図４１】０、４および１２週間２５℃／６０％ｒ．Ｈ．で保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ７．０）の点での５０ｍＭおよび２００ｍＭのスクロースおよびメグルミン−グルタマートの比較。
【図４２】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ５．０）の２〜８℃での１２週間の保管の後の＞１０μｍのサブビジュアル粒子。
【００２１】
【図４３】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ５．０）の２〜８℃での１２週間の保管の後の＞２５μｍのサブビジュアル粒子。
【図４４】２〜８℃で保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ５．０）についてのサブビジュアル粒子の点での５０ｍＭおよび２００ｍＭのスクロースおよびメグルミン−グルタマートの比較。
【図４５】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ７．０）の２〜８℃での１２週間の保管の後の＞１０μｍのサブビジュアル粒子。
【図４６】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ７．０）の２〜８℃での１２週間の保管の後の＞２５μｍのサブビジュアル粒子。
【図４７】２〜８℃で保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａ液剤（ｐＨ７．０）についてのサブビジュアル粒子の点での５０ｍＭおよび２００ｍＭのスクロースおよびメグルミン−グルタマートの比較。
【００２２】
【図４８】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ５．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４、８および１２週間の保管の後の融合Ａモノマーの含量についてのＳＥＣの結果。
【図４９】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ５．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４、８および１２週間の保管の後の融合Ａモノマーの純度についてのＳＥＣの結果。
【図５０】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ７．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４、８および１２週間の保管の後の融合Ａモノマーの含量についてのＳＥＣの結果。
【００２３】
【図５１】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ７．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４、８および１２週間の保管の後の融合Ａモノマーの純度についてのＳＥＣの結果。
【図５２】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ５．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４および１２週間の保管の後の融合Ａモノマーの含量についてのＳＥＣの結果。
【図５３】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ５．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４および１２週間の保管の後の融合Ａモノマーの純度についてのＳＥＣの結果。
【００２４】
【図５４】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ７．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４および１２週間の保管の後の融合Ａモノマーの含量についてのＳＥＣの結果。
【図５５】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ７．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４および１２週間の保管の後の融合Ａモノマーの純度についてのＳＥＣの結果。
【図５６】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ５．０）の２〜８℃での１２週間の保管の後の融合Ａモノマーの含量についてのＳＥＣの結果。
【００２５】
【図５７】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ５．０）の２〜８℃での１２週間の保管の後の融合Ａモノマーの純度についてのＳＥＣの結果。
【図５８】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ７．０）の２〜８℃での１２週間の保管の後の融合Ａモノマーの含量についてのＳＥＣ結果。
【図５９】２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ７．０）の２〜８℃での１２週間の保管の後の融合Ａモノマーの純度についてのＳＥＣの結果。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の詳細な記載
タンパク質の有効な適用についての好適な医薬製剤に対する様々な研究があるにも関わらず、これらの剤は、依然として好ましくは溶液中で皮下投与される。したがって、溶液中のタンパク質の好ましい相互作用は、大抵水または添加された賦形剤のいずれかとであるために、タンパク質の安定化は、調合剤について不可欠なタスクである。タンパク質の環境から賦形剤は、大抵除外される（優先的な除外）ために、安定化させる賦形剤の存在下で、タンパク質は、好ましくは、水分子に「取り囲まれて」（優先的な水和）いる。このことは、ネイティブなタンパク質について熱力学的に好ましい状態を表し、物理的な変性が妨げられる［Stabenau, Anke; in“Trocknung und Stabilisierung von Proteinen mittels Warmlufttrocknung und Applikation von Mikrotropfen“, Dissertation Munchen 2003］。
【００２７】
文献において、タンパク質分子の立体障害を通した凝集および変性を妨げる安定剤の様々な例がある。
他の添加剤は、順に、タンパク質の融解温度（Ｔｍ）における増加またはタンパク質分子の表面上の付着につながる他のタンパク質の表面への吸着の減少を引き起こし、次いでタンパク質自身における変化およびその活性の喪失につながり得る。このことを妨げるために、ポリソルベートなどの少量の表面−活性化合物を扱う試みがなされている。しかし化学構造に応じて、タンパク質を安定化するために使用されるこれらの添加剤まもた、望ましくない不利な点、すなわち、自己酸化の対象となり得、およびそれによってヒドロペルオキシドの放出、側鎖切断および最終的にはギ酸などの短鎖酸の形成につながり得、およびそれらの全てが、バイオ医薬組成物の安定性に影響を与え得る該ポリソルベートのようなものを有し得る。
【００２８】
以上から理解できるように、様々な物質が、タンパク質製剤の安定化のために好適であるものとして文献に記載されている。これらは、スクロースまたはトレハロースなどの糖、マンニトールまたはソルビトールなどのポリアルコール、グリシン、アルギニン、ロイシンまたはプロリンなどのアミノ酸、ポリソルベートのような界面活性剤、およびヒト血清アルブミンのような他の安定剤を包含する。しかしながら、これらの物質のほとんどがそれ自体多かれ少なかれ強い効果を示し、タンパク質の活性を保持するための他の添加剤の添加によってバランスをとらなければならず、および他のものは、充分な安定化効果を示さない。
【００２９】
加えて、各タンパク質製剤の活性は、正しいｐＨの調整および最適なバッファー系の選択に依存する。
正しいｐＨという点で、ほとんどのタンパク質は異なるが、そうであるにも関わらずほとんど全てについて、ｐＨが、極めて狭い範囲内に保たれている場合にのみ、それらの安定性は維持されることが可能である。この範囲の外側で、帯電した基は、静電反発、および偽塩橋を形成し、タンパク質の変性をもたらす。
しかしながら、すべての化学的および物理的な不安定性を考慮することに加えて、患者によって全てのｐＨ値が許容されるものではないため、タンパク質製剤の適応性は、念頭に置かれなければならない。したがって、溶液は、生理学的なｐＨである７．４にできるだけ近づけるべきである。迅速な希釈のために多少の逸脱は、静脈内投与によって許容され得るが、筋肉内または皮下に投与される溶液は、等水素イオン濃度（isohydric）であるべきである。ほとんどの場合において、産物において存在するｐＨ値は、相溶性および保管安定性の間の妥協を表す。加えて、タンパク質の物理化学的安定性の根本的な問題は、投与までの保管の間存続する。
【００３０】
この背景知識を用いて、薬学的に活性なタンパク質溶液を安定化するための好適な可能性が今探されており、それ自身は、いずれの不要な新たな副作用も生じない。
これに関連して、メグルミンは、我々の実験において、極めて有望な物質であると証明されている。メグルミンは、既にＦＤＡの承認を受けた医薬製剤における使用のための賦形剤であり、およびがん治療における様々なＸ線造影剤において使用され、およびそれはＡＰＩの一部としてもまた使用され、いくつかの規制当局によって承認され（例として、非経口小分子）およびそれは有益な安全性の実績を有する。
【００３１】
メグルミンは、種々の投与ルート（例として経口、静脈内）において適用され得る。対イオンとして作用する機能的な賦形剤として、製剤中のＡＰＩの安定性および可溶性を増強することに役立つであろう。
しかしながら、特許および科学雑誌において公開されたデータは別として、メグルミンは、承認されている薬または臨床試験のいずれにおいても、製造または製剤におけるタンパク質の安定化について、未だに成功裏に適用されていない。
【００３２】
驚くべきことに、タンパク質製剤に対するメグルミンの安定化の効果は、好適な帯電した対イオンと組み合わされる場合に、有意に改善され得る。対応する実験は、製剤中に含有されるメグルミンおよび対イオンの相互のモル比が、安定化の効果について不可欠であるが、全体の組成に応じて、最適な比率が異なってもよいことが、これに関連して示されている。しかしとりわけ、具体的な条件を選択するときに、メグルミンおよび適切な対イオンが、等モル比で製剤に添加される場合に、最良の安定化の結果が受けられるであろう。これらの条件下で、タンパク質製剤を安定化するために、対応するメグルミン塩（「メグルミン誘導体」）が、直接、好ましくは溶液中に、添加されるであろう。
【００３３】
そのため、本発明のタンパク質製剤は、ｐＨ５〜８の範囲にあるｐＨ値を有していてもよい。既に言った通り、しかしながら、最適に調整されるｐＨ値を有するかかるタンパク質製剤を提供することが所望される。有利なことに、メグルミンおよび対イオンの等モル濃度の混合物の製剤をタンパク質溶液と組み合わせて適用することによって、メグルミンおよびスクロースの単独での使用よりも、所望されるレベルのｐＨ＝７．４にはるかに近いｐＨの範囲を使用することが可能である。したがって、メグルミンおよび対イオンの添加後の本発明に従った組成物は、好ましくは、７．２から７．６までの範囲内での、最も好ましくは７．４のｐＨを有し、充分な量の生理学的に許容し得る酸の添加によって調整される。
【００３４】
本明細書において「メグルミン」は、式１−デオキシ−１−メチルアミノ−Ｄ−グルシトールによって表される化合物を指し、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、および以下の式
【化１】
2021521232.tif 000002
によって表される化合物としてもまた知られている。
【００３５】
驚くべきことに最も有効なメグルミン塩は、薬学的に使用可能なタンパク質溶液について予想外に良好な安定化効果を示し、とくにメグルミンのグルタマートおよびアスパルタートでそうである。
Ｌ−グルタミン酸は、酸性の、親水性のカルボキシル基を持つ側鎖を有する、非必須の、タンパク質を構成するアミノ酸である。α−アミノ酸グルタマートまたは対応するα−ケト酸α−ケトグルタラートは、窒素の収集および分配部位として、代謝における顕著な役割を担う。
【化２】
2021521232.tif 000003
【００３６】
次に、Ｌ−アスパルタート（Ｌ−アスパラギン酸）は、側鎖において親水性、酸性のカルボキシル基を有する、非必須の、タンパク質を構成するアミノ酸である。該アミノ酸は、グルタマートの窒素基を取り入れることによってオキサルアセタートから形成される。アスパルタートは、プリン、ピリミジンおよび尿素の合成に必要であるｕ．ａ．である。
【化３】
2021521232.tif 000004
【００３７】
有利なことに、とくにメグルミンについてのこれらの２つの対イオンは、製剤中に相溶性があることが見出され、およびそれらが、一般的に血液などの体液中に見受けられる、代謝において重要な役割を担うアミノ酸であるために、皮下に投与されるときに対応するタンパク質溶液が予想外の副反応をもたらすだろうことは予期されない。
【００３８】
目下、最終的に処方されたタンパク質産物を液体または凍結乾燥された状態のいずれかで安定化することは、まず第一に、製剤において、溶液中でのタンパク質の不可逆的な凝集が、できる限り完全に避けられることを意味する。その上、このタイプの安定化は、タンパク質の単離の瞬間から完了まで医薬タンパク質製剤を調製するプロセスを通してずっと適用可能であるべきことが所望される。その上、タンパク質の安定化について考えるときに、凝集を避けることに加えて、タンパク質の構造上の立体配座が、維持および安定化されることが所望される。
これら２つの特性を試験し、および選ばれる添加剤によるそれらに対する安定化の影響を研究するために、様々なモノクローナルＩｇＧ１抗体（ｍＡｂＡおよびｍＡｂＢ）、ならびに融合タンパク質（融合Ａ）が、希釈溶液中で検査された。このことについて、希釈したタンパク質溶液が１ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌまたはそれより高い範囲にある濃度で使用され、それらはクエン酸リン酸緩衝液（マッキルベイン緩衝液）を用いてｐＨ５に調整された。しかしながら、好適な条件下で、および必要であるならば、濃度が５００ｍＭより高く、および最大１．５Ｍまでである溶液を使用することもまた可能である。好ましくは、実験は、１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲にある濃度でのタンパク質溶液を使用して実行される。これらの溶液は、安定化の可能性を試験するために、最近固定された量のメグルミンおよびグルタマート、アスパルタートおよび他のもののような対応する対イオンと意図的に混合された［メグルミン−グルタマート（glutamte）（Ｍｅｇ−Ｇｌｕ）およびメグルミン−アスパルタート（Ｍｅｇ−Ａｓｐ）］。
【００３９】
安定化の改善を実証するための測定方法として、固有のトリプトファンまたはチロシン蛍光を用いてタンパク質の安定性を決定するための改変された示差走査型蛍光定量法である、ｎａｎｏＤＳＦ測定が選択された。
タンパク質の安定性は、典型的には熱による、または化学的な変性実験によって取り組まれる。熱による変性実験において、線状の温度勾配がタンパク質を変性するのに適用される一方で、化学的な変性実験は、増加する濃度において化学的な変性剤を使用する。タンパク質の熱安定性は、典型的には、タンパク質集団の５０％が変性される、折り畳みから変性までの推移の中点に対応する、「融解温度」または「Ｔｍ」によって記載される。ｎａｎｏＤＳＦ測定は、トリプトファンまたはチロシン蛍光を使用して、タンパク質の変性をモニタリングする。蛍光強度および最大蛍光の両方は、トリプトファンの近くの環境に強く依存する。したがって、３５０ｎｍおよび３３０ｎｍでの蛍光強度の比率は、例えばタンパク質の変性に起因した、タンパク質の構造におけるいずれかの変化を検出するのに好適である。
【００４０】
要約すれば、立体配座安定性は、示差走査型蛍光定量法を使用して、タンパク質の融解温度という形式で査定され、ここで融解温度（Ｔｍ）は、５０％のタンパク質が変性する（denaturized）温度を記載する。ゆえにＴｍの増加は、改善されたタンパク質安定性の指標である（Menzen, T., and Friess, W. J Pharm Sci, 102: (2013) 415-28；“High-throughput melting-temperature analysis of a monoclonal antibody by differential scanning fluorimetry in the presence of surfactants”）。
【００４１】
実験の結果は、メグルミンのタンパク質安定化効果は、タンパク質溶液が、メグルミンだけではなく、メグルミンについての帯電した対イオンとしての、およそ等モル濃度の量の生理学的に許容されるアミノ酸またはヒトに十分に許容される他の好適な対イオンを加えて共に混合される場合に、大幅に改善され得ることを明確に示す。
本発明に従うと、好適な対イオンは、分子中に少なくとも１のカルボン酸基および少なくとも１のアミノ基を有するが、芳香族基を有さない、薬学的に許容し得る有機化合物である。具体的に良好な安定化の結果は、対イオンとして対応するジカルボン酸を用いて達成される。これに関連して、上述した対イオンであるアスパルタートおよびグルタマートが言及されなければならない。しかし薬学的に許容し得る帯電した化合物もまた、安定化のために好適であり、それは少なくとも１のカルボン酸基、少なくとも１のアミノ基および少なくとも１のＯＨ基を有し、およびよってメグルミンについて対イオンとして作用し得る。しかしながら、アミノ基を有さないが、少なくとも１のカルボン酸基および少なくとも２またはそれ以上のＯＨ基を有し、好適な条件下で、含有されるタンパク質またはペプチドに対して安定化効果を有する対イオンもまた極めて好適であることが証明されている。このグループの対イオンは、分子中にいかなる芳香族基も有さない。このグループの対イオンの代表は、例えばラクトビオナートである。
【００４２】
メグルミンについての対イオンとして使用される化合物の化学的および物理的な特性に応じて、より多くの量の対イオン作用性化合物を添加する必要があるであろう。いくつかのケースにおいて、したがって製剤へと過剰に添加される対イオン化合物が必要であり、およびよってメグルミンと対イオンのモル比は最大で１：２となるであろう。添加される対イオンの最適なモル濃度の量は、結果的に１：１〜１：２の間のメグルミンと対イオンのモル比であるであろう。
改善された安定化効果は、例１Ａ〜１Ｃに示され得るように、とりわけアスパルタートまたはグルタマートが対イオンとして使用されるタンパク質溶液について生じる。すべてのモデル分子について、改善された安定化効果は、ここに実証され得る。
【００４３】
とりわけ、メグルミン−グルタマートが、メグルミンを単独で含む溶液と比較すると、ほぼ３℃のＴｍの増加を伴い最良に実施することが見出された。このことは、メグルミングルタマート［Ｍｅｇ−Ｇｌｕ］が、融合タンパク質（融合Ａ）の溶液を用いて最大５００ｍＭの濃度までにおいて混合されている、例１Ｃにおいて極めて明確に見ることができる。
概して、実行された実験は、等モル濃度の量でのメグルミンおよび好適な対イオンの添加が、一般にタンパク質溶液を、望ましくない凝集の点およびタンパク質分子の構造上の立体配座の点の両方で安定させ得ることを示す。しかしながら、使用される対イオンに応じて、使用されるべき対イオンの量は、調整されなければならず、および２倍の量を必要としてもよい。とりわけ、このことは、モノクローナル抗体の溶液についてのみならず、融合タンパク質などの、新しいタンパク質の形式の溶液についてもまた適用する。加えて、メグルミンおよび好適な対イオンの等モル濃度の混合物が、目下殆どの場合に使用されるタンパク質安定化添加剤である、二糖類、スクロースよりもさらにいっそうＴｍの値を増加させることが見出される。
【００４４】
溶液中のタンパク質の安定性を査定するために、コロイド安定性が、しばしば凝集に関連して利用される。これに関連して、上に挙げたとおりのｍＡｂＡおよびｍＡｂＢのコロイド安定性に対するメグルミンおよび対イオンの等モル濃度の混合物の安定化の潜在力もまた、分析される（例１Ｄ〜Ｅ）。
コロイド安定性および立体配座安定性の両方が、タンパク質の凝集において重要であると推測される。成功裏に凝集に対してタンパク質を安定化するために、溶液の条件は、タンパク質のネイティブな立体配座を安定化するのみならず、分子間引力に対してもまたタンパク質を安定化するために選択される必要がある。
【００４５】
溶液中のネイティブなタンパク質−タンパク質相互作用に起因した凝集への耐性は、タンパク質の「コロイド安定性」としばしば称される。今日数多の実験方法が、この安定性を決定するために入手可能である。静的光散乱［ＳＬＳ］は、ほぼ間違いなく溶液中のタンパク質−タンパク質相互作用を測定するための最も利用しやすく、および最も発展した方法を提供し、および目的の溶液中の目的のタンパク質からのタンパク質濃度依存の光散乱強度のみを必要とする。
一般に、２６６ｎｍでのＳＬＳ測定値は、「コロイド安定性」についての指標として使用され、測定された散乱が、その最大値のおよそ１０％である閾値に到達する温度として定義され得る、凝集温度（Ｔａｇｇ）の開始を報告する。
【００４６】
ＳＬＳシグナルにおける変化は、タンパク質の凝集に起因した観察された重量平均分子量における変化を表す。立体配座安定性は、融解の開始の温度、つまり第１の変性の推移の中点温度、Ｔｍ１を測定することによって査定され、タンパク質が変性するときのトリプトファンの露出に対して感受性がある、固有の蛍光強度の比率（３５０／３３０ｎｍ）によってモニタリングされる（Avacta, 2013b; “Predicting Monoclonal Antibody Stability in Different Formulations Using Optim 2”. Application Note. Avacta Analytical, UK.）。
凝集（Ｔａｇｇ）の開始温度は、nanoDSF器械であるNanotemper Prometheus NT 48（NanoTemper Technologies GmbH, Munich, Germany）の後方反射光学系を使用して測定される。Ｍｅｇ−ＧｌｕおよびＭｅｇ−Ａｓｐの両方のメグルミン塩について、メグルミンおよびスクロース単独で、またはそれらを組み合わせた適用と比較して、優れた値が見出される。
【００４７】
その他の点では同一の条件下でのスクロースおよびメグルミンとの比較実験に基づいて、以下：メグルミン−グルタマート（Ｍｅｇ−Ｇｌｕ）、メグルミン−ラクトビオナート（Ｍｅｇ−Ｌａｃ）およびメグルミンアスパルタート（Ｍｅｇ−Ａｓｐ）であるような様々なメグルミン塩の形態の有意な安定化効果が、ｍＡｂＡ、ｍＡｂＢおよび融合Ａのタンパク質溶液の立体配座（Ｔｍ）およびコロイド（Ｔａｇｇ）安定性について示され、ベンチマークテストされ得る（例２Ａ〜Ｆ）。
すべてのモデルタンパク質は、１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ５）中５０ｍｇ／ｍｌというやや高濃度で処方された。
すべてのケースにおいて、メグルミンの塩形態は、メグルミンそれ自体と比較して、および殆どのケースにおいてスクロースの使用ともまた比較して、優れた安定化の潜在力を示す。
【００４８】
結果的に、本発明は、選択されるメグルミン塩をタンパク質溶液、とくに医薬活性タンパク質の溶液に添加するステップを包含する、溶液中のタンパク質の安定化に関する。本発明に従った安定化は、タンパク質溶液の長期安定化をもたらすであろう。
本明細書において、「長期安定化」は、以下のように定義される：調製がタンパク質溶液であるときに、長期安定化は、凝集の含量が、５５℃での２週間の保管の後に、好ましくは３５％未満であることを意味する；代替的に、４０℃での２週間の保管の後に、それが１０％未満、好ましくは７％未満である；代替的に、２５℃での２か月の保管の後に、それが１％未満である；代替的に、−２０℃での６か月の保管の後に、それが２％未満、好ましくは１％またはそれより少ない。
本発明に従って安定化する標的医薬組成物（タンパク質）は、ペプチド、または他のバイオポリマー、合成ポリマー、低分子量化合物、その誘導体、またはその組み合わせを含む複合体を包含する、タンパク質であってもよい。本発明の好ましい例は、抗体である。
【００４９】
本発明に従って安定化される標的抗体は、既知の抗体であってもよく、および全抗体、抗体フラグメント、改変された抗体、およびミニボディ（minibody）または融合タンパク質のいずれかであってもよい。
既知の全抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）、Ｉｇｌ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＹ、およびそのようなものを包含する。抗体のタイプは、具体的に限定されない。全抗体は、二重特異性ＩｇＧ抗体をもまた包含する（J J. Immunol. Methods. 2001 Feb. 1; 248(1-2):7-15）。
新規な抗原を使用して当業者に既知の方法によって調製される抗体もまた、標的であり得る。とりわけ新しい抗体は、既知の文献において開示された方法によって、および当業者にとって既知である方法によってもまた調製され得る。
【００５０】
本発明に従って安定化される標的抗体は、抗体フラグメントおよびミニボディを包含する。抗体は、既知の抗体または新しく調製される抗体であってもよい。抗体フラグメントおよびミニボディは、全抗体（例えば、全ＩｇＧ）の一部分を欠く抗体フラグメントを包含する。抗体フラグメントおよびミニボディは、それらが抗原に結合する能力を有する限り、具体的に限定されない。対応する特徴付けは、当業者にとって既知であり、および彼にとって既知である文献において見出され得る。
本発明にとって不可欠なことは、メグルミン塩の安定化効果が、いずれかの薬学的に活性なタンパク質の溶液について使用され得ることおよびそれが特定のタンパク質に限定されないことである。有利なことに、この安定化は、既知の、および試験された手段によって実行され得る。
【００５１】
本発明において使用される抗体は、改変された抗体であってもよい。改変された抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、放射性物質、および毒素などの様々な分子と連結することによって得られる抱合された抗体であってもよい。
さらにまた、改変された抗体は、抱合された抗体のみならず、抗体分子、抗体分子フラグメント、または抗体様分子、および他のタンパク質またはペプチド間の融合タンパク質をもまた包含する。かかる融合タンパク質は、具体的に限定されることはないが、ＴＮＦＣ．およびＦｃ間の融合タンパク質（IntJ Clin Pract. 2005 January: 59(1): 114-8）およびＩＬ−２およびｓｃＦｖ間の融合タンパク質（J Immunol Methods. 2004 December; 295(1-2):49-56）を包含する。
さらにまた、本発明に使用される抗体は、抗体様分子であってもまたよい。抗体様分子は、アフィボディ（affibodies）（Proc Natl AcadSci USA. 2003 Mar. 18; 100(6):3191-6）およびアンキリン（Nat Biotechnol. 2004 May; 22(5):575-82）を包含するが、それらに具体的に限定されない。
上に記載の抗体は、当業者にとって既知の方法によって産生され得る。
【００５２】
本明細書において、メグルミン塩をタンパク質に「添加すること」はまた、メグルミンをタンパク質と混合することを意味する。本明細書において、「メグルミンをタンパク質と混合すること」は、メグルミン塩含有溶液中にタンパク質を溶解することを意味してもよい。本明細書において、「安定化」は、天然の状態でタンパク質を維持すること、またはそれらの活性を保存することを意味する。
さらにまた、本発明のメグルミン塩を含む安定剤を添加する際に、天然の状態または対照と比較して、タンパク質活性が増強されるとき、または保管の間の凝集に起因した活性の程度の低減が減少するとき、タンパク質はまた、安定化されていると推測され得る。具体的に言うと、タンパク質、例えば、抗体分子の活性が増強されるか否かは、同じ条件下で目的の活性をアッセイすることによって試験され得る。安定化される標的抗体分子は、新しく合成された抗体および生物から単離された抗体を包含する。
【００５３】
本発明のタンパク質の活性は、結合活性、中和活性、細胞傷害活性、アゴニスト活性、アンタゴニスト活性、および酵素活性などのいずれかの活性であってもよい。活性は、具体的に限定されるものではない；しかしながら、活性は、好ましくは生体、組織、細胞、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそのようなものを定量的におよび／または定性的に変更するかまたは影響する活性である。アゴニスト活性が、とくに好ましい。
「アゴニスト活性」は、受容体などの抗体の抗原への結合に起因した細胞およびそのようなもの内へのシグナル伝達によっていくつかの生理学的な活性における変化を誘導する活性を指す。生理学的活性は、これらに限定されないが、例えば、増殖活性、生存活性、分化活性、転写活性、膜輸送活性、結合活性、タンパク質分解活性、リン酸化／脱リン酸化活性、酸化／還元活性、移動活性、核酸分解活性、脱水活性、細胞死誘導活性、およびアポトーシス誘導活性を包含する。
【００５４】
本発明のタンパク質、融合タンパク質または抗原は、具体的には限定されず、および任意の抗原が使用されるであろう。
本明細書において、「安定化タンパク質」は、タンパク質の凝集を抑えることによって保管の間のタンパク質の凝集量の増加を抑えること、および／または保管の間に形成される不溶性の凝集物（沈殿物）の量の増加を抑えること、および／またはタンパク質の機能を維持することを意味する。好ましくは、「安定化タンパク質」は、保管の間に形成されるタンパク質凝集物の量の増加を抑えることを意味する。本発明は、選択されるメグルミン塩をタンパク質に添加するステップを含む、タンパク質の凝集を抑えるための方法に関する。より具体的に言うと、本発明は、選択されるメグルミン塩を抗体分子に添加するステップを含む、抗体分子の凝集を抑えるための方法に関する。本明細書において、凝集は、可逆的または不可逆的なタンパク質（抗体分子）の集合を介した２以上の抗体分子からなるマルチマーの形成を指す。
【００５５】
凝集が抑えられているか否かは、当業者に既知の方法、例えば、沈降平衡法（超遠心法）、浸透圧測定、光散乱法、低角度レーザー光散乱法、小角Ｘ線散乱法、小角中性子散乱法、およびゲル濾過により、抗体分子凝集物の含量を測定することによって試験され得る。
選択されるメグルミン塩の添加の際に、保管の間の抗体凝集物の含量が低減しているとき、凝集は抑えられていると解釈され得る。
本明細書において、「ペプチドまたはタンパク質または抗体分子の安定化」は、ペプチド、タンパク質または抗体の濃度および状態を問わず、溶液調製物、凍結乾燥調製物だけではなく、噴霧乾燥調製物中のこのような分子の安定化を包含し、および低温または室温での長期間保管されるこのような分子を安定化させることもまた包含する。本明細書において、低温保管は、例えば、−８０℃〜１０℃での保管を包含する。よって、凍結保存もまた、保管手段に包含される。好ましい低温は、例えば、−２０℃および５℃を包含するが、それに限定されない。本明細書において、室温保管は、例えば、１５℃〜３０℃での保管を包含する。好ましい室温は、例えば、２５℃を包含するが、それに限定されない。
【００５６】
高濃度でのタンパク質の溶液調製物は、当業者に既知の方法によって処方され得る。例えば、ＴＦＦ膜を使用した膜濃縮法が適用され得、Shire, S. J. et alによって“Challenges in the development of high protein concentration formulations”（J. Pharm. Sc, 2004, 93(6), 1390-1402）に記載されるとおりである。
凍結乾燥は、当業者に既知の方法によって実行され得る（Pharm. Biotechnol, 2002, 13, 109-33; Int. J. Pharm. 2000, 203(1-2), 1-60; Pharm. Res. 1997, 14(8), 969−75）。例えば、適正な量の溶液は、凍結乾燥のためのバイアルなどの槽内に分取される。槽は、凍結チャンバーまたは凍結乾燥チャンバー内に置かれるか、またはアセトン／ドライアイスまたは液体窒素などの冷却剤に浸されて、凍結乾燥を達成する。
さらにまた、噴霧乾燥調製物もまた、当業者に既知の方法によって処方され得る（J. Pharm. Sci. 1998 November; 87(11): 1406-11）。
【００５７】
とりわけ、本発明は、選択されるメグルミン塩を含む、タンパク質を安定化させるための化合物およびタンパク質の凝集を抑えるための化合物に関する。より具体的に言うと、本発明は、少なくとも１の特別なメグルミン塩を含む、抗体分子を安定化させるための化合物および抗体分子の凝集を抑えるための剤に関する。
本発明はまた、少なくとも１のメグルミン塩を含む、抗体分子を安定化させるための化合物および凍結乾燥した抗体調製物中の抗体分子を安定化させるための剤に関する。
【００５８】
本発明の剤は、防腐剤および安定剤などの薬学的に許容し得る担体を含んでもよい。「薬学的に許容し得る担体」は、上記の化合物と組み合わせて投与され得る薬学的に許容し得る材料を意味する。担体は、該メグルミン塩と組み合わせて使用されるときに、安定化効果のない材料であっても、または相乗的なまたは相加的な安定化効果を産生する材料であってもよい。
このような薬学的に許容し得る材料は、例えば、滅菌水、生理食塩水、安定剤、賦形剤、バッファー、防腐剤、洗浄剤、キレート剤、およびバインダーを包含してもよい。
本発明において、洗浄剤は、非イオン性の洗浄剤を包含する。しかし好ましくは、目標は、添加される必要のある洗浄剤なしに製剤を調製することである。
【００５９】
本発明において、バッファーは、ホスファート、クエン酸バッファー、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、乳酸、リン酸カリウム、グルコン酸、カプリル酸、デオキシコール酸、サリチル酸、トリエタノールアミン、フマル酸、および他の有機酸；および炭酸バッファー、トリスバッファー、ヒスチジンバッファー、およびイミダゾールバッファーを包含する。
溶液調製物は、液体調製物の分野において既知の水性バッファーに剤を溶解することによって調製されるであろう。バッファー濃度は、一般に１〜５００ｍＭ、好ましくは５〜１００ｍＭ、およびより好ましくは１０〜２０ｍＭである。
本発明の剤はまた、他の低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、および免疫グロブリンなどのタンパク質；アミノ酸；多糖類および単糖類などの糖および炭水化物；糖アルコールおよびそのようなものを含んでもよい。
【００６０】
本明細書において、アミノ酸は、塩基性アミノ酸、例えば、アルギニン、リシン、ヒスチジン、およびオルニチン、およびこれらのアミノ酸の無機塩（好ましくは塩酸塩、およびリン酸塩、つまりアミノ酸リン酸塩の形態で）を包含する。フリーのアミノ酸が使用されるとき、ｐＨは、適切な生理学的に許容し得る緩衝物質、例えば、無機酸、とりわけ塩酸、リン酸、硫酸、酢酸、およびギ酸、およびそれらの塩を添加することによって好ましい値に調整される。このケースにおいて、リン酸塩の使用は、とくに安定した凍結乾燥産物を供給するために、特に有益である。リン酸塩は、調製物がリンゴ酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、およびフマル酸などの有機酸を実質的に含有しないときに、または対応するアニオン（マラートイオン、タートラートイオン、シトラートイオン、スクシナートイオン、フマラートイオン、およびそのようなもの）を含有しないときに、特に有利である。好ましいアミノ酸は、アルギニン、リシン、ヒスチジン、およびオルニチンである。
【００６１】
さらにまた、中性アミノ酸、例えば、イソロイシン、ロイシン、グリシン、セリン、トレオニン、バリン、メチオニン、システイン、およびアラニン；および芳香族アミノ酸、例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびその誘導体、Ｎ−アセチルトリプトファンもまた、使用されるであろう。
本明細書において、多糖類および単糖類などの糖および炭水化物は、例えば、デキストラン、グルコース、フルクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、スクロース、トレハロース、およびラフィノースを包含する。本明細書において、糖アルコールは、例えば、マンニトール、ソルビトール、およびイノシトールを包含する。
本発明の剤が、注射のための水性溶液として調製されるとき、剤は、例えば、生理食塩水、および／またはグルコースまたは他の助剤（Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、および塩化ナトリウムなど）を含有する等張溶液と混合されてもよい。
【００６２】
水性溶液は、アルコール（エタノールおよびそのようなもの）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ、およびそのようなもの）、または非イオン性洗浄剤（ポリソルベート８０およびＨＣＯ−５０）などの適切な安定化剤と組み合わせて使用されてもよい。好ましくは、しかしながら、水性溶液は、洗浄剤を含有せずに使用される。
本発明の組成物は、必要である場合に、希釈剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、硫黄を含有する還元剤、抗酸化剤、およびそのようなものをさらに含んでもよい。本明細書において、硫黄を含有する還元剤は、例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸およびそれらの塩などのスルフヒドリル基を含む化合物、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、および１〜７個の炭素原子を有するチオアルカン酸を包含する。しかしながら、好ましくは、異なる添加剤の数が、可能な限り低く保たれている組成物が使用される。
【００６３】
その上、本発明における抗酸化剤は、例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、Ｃ−トコフェロール、トコフェロールアセタート、Ｌ−アスコルビン酸およびそれらの塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミタート、Ｌ−アスコルビン酸ステアラート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピル、およびエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、およびメタリン酸ナトリウムなどのキレート剤を包含する。
必要である場合に、剤は、マイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリメチルメタクリル酸またはそのようなもののマイクロカプセル）内にカプセル化されてもよく、またはコロイド状薬物送達システム（リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子、ナノカプセル、およびそのようなもの）として調製されてもよい（“Remington's Pharmaceutical Science 16th edition', Oslo Ed., 1980等を参照されたい）。
【００６４】
とりわけ、本発明は、上で特定される少なくとも１のメグルミン塩によって安定化される、タンパク質またはペプチド分子、好ましくは抗体分子を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、メグルミン塩によってそれらの凝集が抑えられる、抗体分子を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、医薬組成物および薬学的に許容し得る担体を含むキットに関する。これらのキットは、合理化された製剤のスクリーニング、例として、９６ウェルプレート中に置いてある既製の凍結乾燥製剤とこれに続くＤＯＥ分析によるものについて潜在的に使用可能である。このようなキットデバイスの助けを借りて、夫々の活性医薬成分、例としてモノクローナル抗体についてのメグルミンとその対イオンの間の最適なモル比を容易に理解し得る。
本発明の医薬組成物およびキットは、上に記載の安定化された抗体分子に加えて薬学的に許容し得る材料を含んでもよい。このような薬学的に許容し得る材料は、上に記載の材料を包含する。
【００６５】
本発明の医薬組成物の処方（剤形）は、注射、凍結乾燥調製物、溶液、および噴霧乾燥調製物を包含するが、それらに限定されない。
一般に、本発明の調製物は、決まった体積で、閉じた滅菌されたプラスチック製またはガラス製バイアル、アンプル、および注射器などの容器、または瓶などの大容量容器中に提供され得る。プレフィルドシリンジは、使用の利便性について好ましい。
患者への投与は、好ましくは注射などの皮下投与である。注射による投与は、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、および全身性または局所投与のための皮下注射を包含する。投与方法は、患者の年齢および症状に従って好適に選択される。
【００６６】
タンパク質、ペプチド、または抗体の単回の投与用量は、例えば、０．０００１ｍｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で選択され得る。代替的に、用量は、例えば、０．００１〜２００，０００ｍｇ／患者の範囲から選択され得る。しかしながら、本発明の用量および投与方法は、上に記載のそれらに限定されない。活性成分としての低分子量化合物の用量は、０．１〜２０００ｍｇ／成人／日の範囲であってもよい。しかし本発明の用量および投与方法は、上に記載のそれらに限定されない。
【００６７】
本発明の凍結乾燥または噴霧乾燥の調製物は、使用に先立ち溶液調製物とすることができる。
よって、本発明は、本発明の凍結乾燥または噴霧乾燥の調製物および薬学的に許容し得る担体を含むキットもまた提供する。
薬学的に許容し得る担体（単数または複数）が凍結乾燥または噴霧乾燥の調製物の溶液調製物への処方を可能とする限り、薬学的に許容し得る担体のタイプ、または担体の組み合わせがあるか否かはについての限定はない。溶液調製物中の抗体分子の凝集は、薬学的に許容し得る担体として、または薬学的に許容し得る担体の一部として本発明の安定剤を使用することにより抑えられ得る。
【００６８】
よって、本発明は、安定化のための特定のメグルミン塩を添加するステップを含む、タンパク質またはペプチド分子、好ましくは抗体分子を含む医薬組成物を産生するための方法に関する。本発明はまた、メグルミン塩を添加して凝集を抑えるステップを含む、抗体分子を含む医薬組成物を産生するための方法に関する。
正確に言うと、本発明は、以下のステップを含む、抗体分子を含む医薬組成物を産生するための方法に関する：
（１）それぞれ好適な処方において、特別なメグルミン塩を抗体に添加すること
および
（２）（１）の混合物を溶液調製物に処方すること。
【００６９】
さらにまた、本発明はまた、以下のステップを含む、抗体分子を含む医薬組成物を産生する方法に関する：
（１）特別なメグルミン塩を抗体に添加すること
および
（２）（１）の混合物を凍結乾燥すること。
溶液調製物および凍結乾燥調製物の製剤は、既知の方法によって実行され得、および本明細書に引用される全ての先行技術文献は、本発明の開示の一部として、参照により組み込まれる。
【００７０】
抗体分子の凝集は、メグルミンおよび互いに特別に調整された関係性において選択される対イオンを含む安定剤を添加し、本発明の対応する塩を築き上げることにより回避され得る。医薬としての抗体製剤の開発において、抗体分子は、凝集が調製物の保管の間最小限に抑えられるように、安定化されなければならない。本発明の安定剤は、抗体分子を安定化し得、および安定化される抗体の濃度が極めて高い場合でさえ、凝集を抑え得る。よって、これらの安定剤は、抗体調製物の産生において極めて有用である。さらにまた、本発明のメグルミン塩を含む剤はまた、抗体分子が液体調製物または凍結乾燥調製物内へ処方される場合に、抗体分子を安定化する効果を有する。本明細書に記載される安定剤はまた、凍結乾燥調製物の製剤化における凍結乾燥プロセスの間に課せられる負荷に対して抗体分子を安定化する効果を有する（例６）。有利なことに本発明の安定剤は、全抗体、抗体フラグメント、およびミニボディを安定化する効果を有し、およびよって医薬適用のための抗体製剤の産生において幅広く使用されるであろう。
【００７１】
本発明のこれらのメグルミン塩によって安定化された抗体分子を含む、本発明の医薬組成物は、抗体分子の変性および凝集が抑えられているために、従来の抗体調製物と比較して保存が良い。したがって、本明細書に開示されるような保存による活性喪失の程度が極めて低いことが見出されている。
溶液調製物および凍結乾燥物の製剤化は、上に記載のとおりの方法および以下の例において開示されるものによって実行され得る。
本記載は、当業者が本発明を包括的に実践することを可能とする。したがって、さらなるコメントがなくても、当業者が最も広い範囲において上の記載を利用することができるであろうことが推測される。
【００７２】
何か不明確なものがあれば、引用され、および当業者に既知である刊行物および特許文献が参照されるべきであることが理解される。結果的に、引用される文書は、本記載の開示の内容の一部とみなされ、および参照により本明細書に組み込まれる。
よりよい理解のため、および本発明を説明するために、本発明の保護の範囲内にある例が、以下に提示される。これらの例は、実行可能な変形を説明することにもまた役立つ。
さらにまた、当業者にとって言うまでのないことだが、与えられた例および記載の残りにおいてもの両方において、組成物中に存在する構成要素の量は、常に組成物全体としてに基づき合計で１００重量％またはｍｏｌ％にのみなり、および指し示されるパーセント範囲からより高い値が生じ得る場合でさえ、このバーセンテージを超過することはできない。したがって他に指し示されない限り、％データは、体積データにおいて示されている比率を除いて、重量％またはｍｏｌ％である。
【００７３】
例
例１：示差走査蛍光定量法を介して分析された等温性の負荷に対する低タンパク質濃度（１ｍｇ／ｍｌ）でのメグルミン−グルタマートおよびメグルミン−アスパルタート対メグルミンおよびスクロースの安定化効果
−例１Ａ〜Ｃは、ｍＡｂＡ、ｍＡｂＢおよび融合タンパク質融合Ａの立体配座安定性（Ｔｍ）に対するメグルミングルタマートおよびメグルミンアスパルタートの明確な濃度依存的な安定化効果を示す。
−５００ｍＭの濃度で、タンパク質製剤についての予測的な安定性指標として使用され得るｍＡｂＡの融解温度（Ｔｍ）は、メグルミンと比較して、Ｍｅｇ−Ｇｌｕのケースで２．７℃およびＭｅｇ−Ａｓｐのケースで２．２℃増加する。
−例１Ｄ〜Ｅは、Nanotemper社のPrometheusの後方反射光学（backreflection optic）を介して測定される、ｍＡｂＡおよびｍＡｂＢのコロイド安定性（Ｔａｇｇ）に対するメグルミングルタマートおよびメグルミンアスパルタートの明確な濃度依存的な安定化効果を示す。
−５００ｍＭの濃度で、タンパク質製剤についての予測的な安定性指標として使用され得る、ｍＡｂＡの凝集の開始温度（Ｔａｇｇ）は、メグルミンと比較して、Ｍｅｇ−Ｇｌｕのケースで２．３℃およびＭｅｇ−Ａｓｐのケースで１．９℃増加する。
【００７４】
例１Ａ）図１に示されるマッキルベイン緩衝液（ｐＨ５）中１ｍｇ／ｍｌで処方されるｍＡｂＡの融解温度(Ｔｍ）に対するメグルミン−グルタマートおよびメグルミンアスパルタート対メグルミンおよびスクロースの安定化効果
バッファー調製：
−ｐＨ５のバッファー調製は、室温にて、および文献に記載される通りのマッキルベイン緩衝液の調製（McIlvaine 1921）に従って行われる。０．２Ｍのリン酸水素二ナトリウム（無水）および０．１のＭクエン酸（無水）の溶液を調製する。０．２Ｍのリン酸水素二ナトリウム１０．３部を、０．１Ｍのクエン酸溶液９．７部に添加する。ｐＨ値を調べ、および必要ならばオルトリン酸（８５％）を使用して５．０（＋／−０．０５）に調整する。
試料調製：
−１００ｍＭ、２５０ｍＭおよび５００ｍＭのメグルミン−グルタマート、メグルミン−アスパルタート、メグルミンおよびスクロースの賦形剤の溶液を、ｐＨ５．０のマッキルベイン緩衝液中で調製する。
−マッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．０）を使用して洗浄する、ｍＡｂＡ（約１４５ｋＤａ）の濃縮したタンパク質溶液を、賦形剤溶液を使用して１ｍｇ／ｍｌに希釈する。
【００７５】
ＮａｎｏＤＳＦ方法：
−ＮａｎｏＤＳＦは、固有のトリプトファンまたはチロシン蛍光を用いてタンパク質の安定性を決定する改変された示差走査蛍光定量法である。タンパク質の安定性は、熱による変性実験によって取り組まれ得る。タンパク質の熱安定性は、典型的にはタンパク質集団の５０％が変性する、「融解温度」または「Ｔｍ」によって記載され、それはフォールディングから変性までの推移の中点に対応する。
−試料の体積は１０μｌであり、および１℃／分の加熱速度である一方で、温度勾配は２０℃から開始し、および９５℃まで続く。
−分析は、Nanototemper Prometheus NT 48（NanoTemper Technologies GmbH, Munich, Germany）を用いて実施する。
【００７６】
例１Ｂ）図２に示されるマッキルベイン緩衝液（ｐＨ５）中１ｍｇ／ｍｌで処方されたｍＡｂＢの融解温度（Ｔｍ）に対するメグルミン−グルタマートおよびメグルミンアスパルタート対メグルミンおよびスクロースの安定化効果
試料調製：
−１００ｍＭ、２５０ｍＭおよび５００ｍＭのメグルミン−グルタマート、メグルミン−アスパルタート、メグルミンおよびスクロースの賦形剤溶液を、ｐＨ５．０のマッキルベイン緩衝液中で調製する。
−マッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．０）を使用して洗浄する、ｍＡｂＢ（約１５２ｋＤａ）の濃縮したタンパク質溶液を、賦形剤溶液を使用して１ｍｇ／ｍｌに希釈する。
ｎａｎｏＤＳＦ方法を、例１Ａ）に記載されるように実施する。
【００７７】
例１Ｃ）図３に示されるマッキルベイン緩衝液（ｐＨ５）中１ｍｇ／ｍｌで処方された融合タンパク質融合Ａの融解温度（Ｔｍ）に対するメグルミン−グルタマートおよびメグルミンアスパルタート対メグルミンおよびスクロースの安定化効果
試料調製：
−１００ｍＭ、２５０ｍＭおよび５００ｍＭのメグルミン−グルタマート、メグルミン−アスパルタート、メグルミンおよびスクロースの賦形剤溶液を、ｐＨ５．０のマッキルベイン緩衝液中で調製する。
−マッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．０）を使用して洗浄する、融合Ａ（約７１ｋＤａ）の濃縮したタンパク質溶液を、賦形剤溶液を使用して１ｍｇ／ｍｌに希釈する。
ｎａｎｏＤＳＦ方法を、例１Ａ）に記載されるように実施する。
【００７８】
例１Ｄ）：図４に示されるマッキルベイン緩衝液（ｐＨ５）中１ｍｇ／ｍｌで処方されたｍＡｂＡについての凝集の開始温度（Ｔａｇｇ）に対するメグルミン−グルタマートおよびメグルミンアスパルタート対メグルミンおよびスクロースの安定化効果
試料調製：
−１００ｍＭ、２５０ｍＭおよび５００ｍＭのメグルミン−グルタマート、メグルミン−アスパルタート、メグルミンおよびスクロースの賦形剤溶液を、ｐＨ５．０のマッキルベイン緩衝液中で調製する。
−マッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．０）を使用して洗浄する、ｍＡｂＡ（約１４５ｋＤａ）の濃縮したタンパク質溶液を、賦形剤溶液を使用して１ｍｇ／ｍｌに希釈する。
Ｔａｇｇの検出方法（後方反射光学）：
−ｎａｎｏＤＳＦを使用したタンパク質の温度誘導性凝集の検出は、試料のキャピラリーを２度通って伝わる、放射光ビームの後方反射を測定することによって達成される。凝集が生じる場合に、光は形成される凝集体に起因して散らされ、および強度を下げる。
−分析は、Nanotemper社のPrometheus NT 48（Nanotemper Technologies GmbH, Munich, Germany）を用いて実施する。
【００７９】
例１Ｅ）：図５に示されるマッキルベイン緩衝液（ｐＨ５）中１ｍｇ／ｍｌで処方されるｍＡｂＢについての凝集の開始温度（Ｔａｇｇ）に対するメグルミン−グルタマートおよびメグルミンアスパルタート対メグルミンおよびスクロースの安定化効果
試料調製：
−１００ｍＭ、２５０ｍＭおよび５００ｍＭのメグルミン−グルタマート、メグルミン−アスパルタート、メグルミンおよびスクロースの賦形剤溶液を、ｐＨ５．０のマッキルベイン緩衝液中で調製する。
−マッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．０）を使用して洗浄する、ｍＡｂＢ（約１５２ｋＤａ）の濃縮したタンパク質溶液を、賦形剤溶液を使用して１ｍｇ／ｍｌに希釈する。
Ｔａｇｇの検出方法は、例１Ｄ）に記載されるものを適用する。
【００８０】
例２：示差走査蛍光定量法を介して分析される等温性の負荷に対する高タンパク質濃度（５０ｍｇ／ｍｌ）でのメグルミン−グルタマート、メグルミン−アスパルタートおよびメグルミン−ラクトビオナート対メグルミンおよびスクロースの安定化効果
−例２Ａ〜Ｃは、ｍＡｂＡ、ｍＡｂＢおよび融合タンパク質融合Ａの立体配座安定性に対するメグルミン−グルタマート（Ｍｅｇ−Ｇｌｕ）、メグルミン−ラクトビオナート（Ｍｅｇ−Ｌａｃ）およびメグルミンアスパルタート（Ｍｅｇ−Ａｓｐ）の明確な濃度依存的な安定化効果を示す。
−２５０ｍＭの濃度で、タンパク質製剤についての予測的な安定性指標として使用され得る、ｍａｂＡの融解温度（Ｔｍ）は、メグルミンと比較して、Ｍｅｇ−Ｇｌｕのケースで２．３℃、Ｍｅｇ−ＬａｃおよびＭｅｇ−Ａｓｐについては１．７℃増加する。
【００８１】
−例２Ｄ〜Ｆは、ｍＡｂＡ、ｍＡｂＢおよび融合Ａのコロイド安定性に対するメグルミングルタマート、メグルミン−ラクトビオナートおよびメグルミンアスパルタートの明確な濃度依存的な安定化効果を示す。
−２５０ｍＭの濃度で、タンパク質製剤についての予測的な安定性指標として使用され得る、ｍＡｂＡの凝集の開始温度（Ｔａｇｇ）は、メグルミンと比較して、Ｍｅｇ−Ｇｌｕのケースで２．５℃、Ｍｅｇ−Ｌａｃについては２．２℃およびＭｅｇ−Ａｓｐのケースでは１．８℃増加する。
【００８２】
例２Ａ）図６に示される１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ５）中で５０ｍｇ／ｍｌで処方されるｍＡｂＡの融解温度（Ｔｍ）に対するメグルミン−グルタマート（Ｍｅｇ−Ｇｌｕ）、メグルミン−ラクトビオナート（Ｍｅｇ−Ｌａｃ）およびメグルミンアスパルタート（Ｍｅｇ−Ａｓｐ）対メグルミンおよびスクロースの安定化効果
バッファー調製：
−充分な量のトリクエン酸ナトリウム二水和物を、１０ｍＭのクエン酸バッファーの調製のために適切なフラスコ内にはかりとる。ｐＨを、クエン酸（無水）を用いて、５．０（＋／−０．０５）のｐＨ値に到達するまで調整する。
【００８３】
試料調製：
−５００ｍＭの濃度を有するメグルミン−グルタマート、メグルミン−ラクトビオナート、メグルミン−アスパルタート、メグルミンおよびスクロースについての賦形剤ストック溶液を、１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ５．０）中で調製する。
−１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ５．０）を使用して洗浄する、ｍＡｂＡ（約１４５ｋＤａ）の濃縮したタンパク質溶液を、５００ｍＭの賦形剤溶液および１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ５．０）溶液を使用して５０ｍｇ／ｍｌに希釈する。
ｎａｎｏＤＳＦ方法を、例１Ａ）に記載されるように実施する。
【００８４】
例２Ｂ）図７に示される１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ５）中５０ｍｇ／ｍｌで処方されるｍＡｂＢの融解温度（Ｔｍ）に対するメグルミン−グルタマート（Ｍｅｇ−Ｇｌｕ）、メグルミン−ラクトビオナート（Ｍｅｇ−Ｌａｃ）およびメグルミンアスパルタート（Ｍｅｇ−Ａｓｐ）対メグルミンおよびスクロースの安定化効果
−試料調製を、ｍＡｂＢ（１５２ｋＤａ）を使用して、例２Ａ）に記載されるように実施する。
−ＮａｎｏＤＳＦ方法を、例１Ａ）に記載されるように実施する。
【００８５】
例２Ｃ）図８に示される１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ５）中５０ｍｇ／ｍｌで処方される融合Ａの融解温度（Ｔｍ）に対するメグルミン−グルタマート（Ｍｅｇ−Ｇｌｕ）、メグルミン−ラクトビオナート（Ｍｅｇ−Ｌａｃ）およびメグルミンアスパルタート（Ｍｅｇ−Ａｓｐ）対メグルミンおよびスクロースの安定化効果
−試料調製を、融合Ａ（７１ｋＤａ）を使用して、例２Ａ）に記載されるように実施する。
−ＮａｎｏＤＳＦ方法を、例１Ａ）に記載されるように実施する。
【００８６】
例２Ｄ）図９に示される１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ５）中５０ｍｇ／ｍｌで処方されるｍＡｂＡについての凝集の開始温度（Ｔａｇｇ）に対するメグルミン−グルタマート（Ｍｅｇ−Ｇｌｕ）、メグルミン−ラクトビオナート（Ｍｅｇ−Ｌａｃ）およびメグルミンアスパルタート（Ｍｅｇ−Ａｓｐ）対メグルミンおよびスクロースの安定化効果
−試料調製を、例２Ａ）に記載されるように実施する。
−Ｔａｇｇの検出方法は、例１Ｄ）に記載されるものを適用する。
【００８７】
例２Ｅ）図１０に示される１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ５）中５０ｍｇ／ｍｌで処方されるｍＡｂＢについての凝集の開始温度（Ｔａｇｇ）に対するメグルミン−グルタマート（Ｍｅｇ−Ｇｌｕ）、メグルミン−ラクトビオナート（Ｍｅｇ−Ｌａｃ）およびメグルミンアスパルタート（Ｍｅｇ−Ａｓｐ）対メグルミンおよびスクロースの安定化効果
−試料調製を、ｍＡｂＢ（１５２ｋＤａ）を使用して、例２Ａ）に記載されるように実施する。
−Ｔａｇｇの検出方法は、例１Ｄ）に記載されているものを適用する。
【００８８】
例２Ｆ）図１１に示される１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ５）中５０ｍｇ／ｍｌで処方される融合Ａについて凝集の開始温度（Ｔａｇｇ）に対するメグルミン−グルタマート（Ｍｅｇ−Ｇｌｕ）、メグルミン−ラクトビオナート（Ｍｅｇ−Ｌａｃ）およびメグルミンアスパルタート（Ｍｅｇ−Ａｓｐ）対メグルミンおよびスクロースの安定化効果
−試料調製を、融合Ａ（７１ｋＤａ）を使用して、例２Ａ）に記載されるように実施する。
−Ｔａｇｇの検出方法は、例１Ｄ）に記載されているものを適用する。
【００８９】
例３：等温性の負荷に対するメグルミン−グルタマート対メグルミンおよびスクロースのタンパク質安定化効果（ＳＥＣ−分析）
−例３Ａ〜３Ｃは、様々な濃度のタンパク質安定化添加剤を用いて６０℃の温度で最大１８０分間保管したモノクローナルＩｇＧ１抗体（ｍＡｂＡ）のモノマー濃度の低下を説明する。
−５００ｍＭの濃度および６０℃で１８０分の総負荷時間で、残存するｍＡｂＡ濃度は、メグルミン−グルタマートのケースで０．８４ｍｇ／ｍｌ、メグルミンについては０．６７ｍｇ／ｍｌおよびスクロースについては０．３１ｍｇ／ｍｌであった。
−本研究は、メグルミンの塩形態（ここではメグルミン−グルタマート）が、メグルミンならびにスクロース単独の使用よりも、ｍＡｂＡに対するより大きな安定化の潜在力を有することを明確に示す。
【００９０】
例３Ａ）メグルミン−グルタマート
６０℃１８０分間での等温性の負荷の後の様々な濃度のメグルミンおよびグルタマートの等モル濃度の混合物を用いてのリン酸／クエン酸バッファー（マッキルベイン緩衝液）中処方された１ｍｇ／ｍｌの濃度でのｍＡｂＡの残存するタンパク質−モノマー濃度（図１２に示される）［ｍｇ／ｍｌ］。モノマー含量を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて検出する。
ＳＥＣ分析のための条件：
溶離液    ：０．０５Ｍのリン酸ナトリウム／０．４Ｍの過塩素酸ナトリウム／ｐＨ６．３
プレカラム：Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW Guard；４μｍ；３５×４．６ｍｍ；品番１８７６２
カラム    ：Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW3000；４μｍ；３００×４．６ｍｍ；品番１８６７５
流速      ：０．３５ｍｌ／ｍｉｎ．
検出波長  ：２１４ｎｍ
【００９１】
バッファー調製:
塩の除去またはバッファーの交換はAmicon（登録商標）Ultra-0.5デバイスを使用して、試料を濃縮し、濾液を廃棄し、次いで濃縮物を所望される溶媒を用いて元の試料の体積に再構成することによって成し遂げられる。「ウォッシュアウト」のプロセスを、５回繰り返す。
ｐＨ５のバッファーの調製を、マッキルベイン緩衝液の調製に従って行う。０．２Ｍのリン酸水素二ナトリウム（無水）および０．１Ｍのクエン酸（無水）の溶液を調製する。１０．３部の０．２Ｍのリン酸水素二ナトリウムを、９．７部の０．１Ｍクエン酸溶液に添加する。ｐＨ値を調べ、および必要ならばオルトリン酸（８５％）を使用して５．０（＋／−０．０５）に調整する。
【００９２】
試料調製を、以下の通り実施する：
使用される構成要素の分子量：
Ｍ（メグルミン）＝１９５．２１ｇ／ｍｏｌ
Ｍ（グルタマート）＝１８７．１３ｇ／ｍｏｌ
Ｍ（スクロース）＝３４２．３０ｇ／ｍｏｌ
２５ｍｌの試料体積について：
【表１】
2021521232.tif 000005
【００９３】
適切な量の物質を、２５ｍｌのガラスフラスコ内にはかりとる。２０ｍｌのバッファーを、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭおよび２５０ｍＭの濃度でフラスコ内に添加する一方で、１５ｍｌのバッファーを、５００ｍＭの濃度に添加する。ｐＨを、８５％のＨ３ＰＯ４または１ｍｏｌ／ｌのＮａＯＨを使用して５に調整する（必要ならば）。その後溶液を２５ｍｌのメスフラスコに移し、および標線までバッファーで充填する。溶液を徹底的に混合する。
１ｍｇ／ｍｌの濃度を有する５００μｌの抗体溶液を、各濃度についてバッファー溶液中で調製し、および２ｍｌのエッペンドルフチューブ内に移す。
抗体製剤を含むチューブを、Eppendorf thermomixer内で加熱する。６０分ごとに５０μｌの試料をとり、およびＳＥＣを使用して分析する。最終的な試料を、１８０分の負荷時間の後にとる。
【００９４】
例３Ｂ）メグルミン
図１３に示されるリン酸塩／クエン酸バッファー（マッキルベイン緩衝液）中で処方される１ｍｇ／ｍｌの濃度でのｍＡｂＡの、様々な濃度のメグルミンを用いた６０℃１８０分間の等温性の負荷の後の、残存するタンパク質−モノマー濃度［ｍｇ／ｍｌ］。
試料調製を、以下の量を使用して例３Ａ）に記載されるように実施する：
２５ｍｌの試料体積についてのメグルミン（所望される値）の重量：
【表２】
2021521232.tif 000006
【００９５】
例３Ｃ）スクロース
リン酸塩／クエン酸バッファー（マッキルベイン緩衝液）中処方された１ｍｇ／ｍｌの濃度でのｍＡｂＡの、様々な濃度のスクロースを用いた６０℃１８０分間の等温性の負荷の後の、残存するタンパク質−モノマー濃度（図１４に示される）［ｍｇ／ｍｌ］
試料調製を、以下の量を使用して例３Ａ）に記載されるように実施する：
２５ｍｌの試料体積についてのスクロースの重量：
【表３】
2021521232.tif 000007
【００９６】
例４：制御された長期安定性（保管条件：４０℃／７５％ｒ．Ｈ．で１２週間）におけるメグルミン（Ｍｅｇ）、メグルミン−グルタマート（Ｍｅｇ−Ｇｌｕ）、メグルミン−アスパルタート（Ｍｅｇ−Ａｓｐ）およびメグルミン−ラクトビオナート（Ｍｅｇ−Ｌａｃｔｏ）のタンパク質安定化効果
−例４Ａ（濁度、図１５に示される）および４Ｂ（ＳＥＣ、図１６に示される）は、融合タンパク質（融合Ａ）についての安定性の増加を示す。
−Ｍｅｇ−Ｇｌｕ、Ｍｅｇ−ＬａｃｔｏおよびＭｅｇ−Ａｓｐについての濁度値は、バッファー溶液ならびにスクロースのみを含有する安定化されていない試料よりも有意に低い。
−ＳＥＣ含量分析は、Ｍｅｇ−Ｇｌｕ、Ｍｅｇ−ＬａｃｔｏおよびＭｅｇ−Ａｓｐの残存するモノマーの含量が、バッファーまたはスクロースのみを含有する安定化されていない試料よりも有意に高いことを明らかにする。加えて、安定剤としてＭｅｇのみを使用することは、１２週間の保管の後にスクロースの含量を有意に上回らせる。
【００９７】
１０ｍＭのクエン酸Ｎａ溶液（ｐＨ５）：
２．９４ｇのクエン酸Ｎａ＊２Ｈ２Ｏ（Ｍ＝２９４．１０ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。超純水を１ｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを、クエン酸（固体）を使用して５＋／−０．０５に調整した。この溶液を、０．１μｍフィルターを使用して濾過した。
【００９８】
ストック溶液（５００ｍＭのメグルミン）：
９．７６ｇのメグルミン（Ｍ＝１９５．２１ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。１０ｍＭのクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）を約８０ｍｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨをクエン酸（固体）を使用して５＋／−０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌの目盛り付きのメスフラスコに移し、および標線まで１０ｍＭのクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）で充填し、および徹底的に混合した。この溶液を０．１μｍフィルターを使用して濾過した。
【００９９】
ストック溶液（５００ｍＭのメグルミン−グルタマート）：
９．７６ｇのメグルミン（Ｍ＝１９５．２１ｇ／ｍｏｌ）および９．３６ｇのグルタミン酸Ｎａ（Ｍ＝１８７．１３ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。１０ｍＭのクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）を約８０ｍｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨをクエン酸（固体）を使用して５＋／−０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌの目盛り付きのメスフラスコに移し、および標線まで１０ｍＭのクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）で充填し、および徹底的に混合した。この溶液を０．１μｍフィルターを使用して濾過した。
【０１００】
ストック溶液（５００ｍＭのメグルミン−アスパルタート）：
９．７６ｇのメグルミン（Ｍ＝１９５．２１ｇ／ｍｏｌ）および８．６６ｇのアスパラギン酸Ｎａ（Ｍ＝１７３．１０ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。１０ｍＭのクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）を約８０ｍｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを、クエン酸（固体）を使用して５＋／−０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌの目盛り付きのメスフラスコに移し、および標線まで１０ｍＭのクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）で充填し、および徹底的に混合した。この溶液を、０．１μｍフィルターを使用して濾過した。
【０１０１】
ストック溶液（５００ｍＭのメグルミン−ラクトビオナート）：
９．７６ｇのメグルミン（Ｍ＝１９５．２１ｇ／ｍｏｌ）および１７．９２ｇのラクトビオン酸（Ｍ＝３５８．３０ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。１０ｍＭのクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）を約８０ｍｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを、クエン酸（固体）を使用して５＋／−０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌの目盛り付きのメスフラスコに移し、および標線まで１０ｍＭのクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）で充填し、および徹底的に混合した。この溶液を０．１μｍフィルターを使用して濾過した。
【０１０２】
ストック溶液（５００ｍＭのスクロース）：
１７．１１ｇのスクロース（Ｍ＝３４２．２９ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。１０ｍＭのクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）を約８０ｍｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを、クエン酸（固体）を使用して５＋／−０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌの目盛り付きのメスフラスコに移し、および標線まで１０ｍＭのクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）で充填し、および徹底的に混合した。この溶液を０．１μｍフィルターを使用して濾過した。
【０１０３】
３ヶ月の保管安定性のための試料溶液の調製
保管条件を、制御された気候キャビネット（climate cabinet）において７５％ｒ．Ｈ．で４０℃に設定した。サンプリング時間を、０週目（初期値）、４週目、８週目および１２週目に設定した。
タンパク質として融合Ａを含有する試料溶液を、適切なプラグおよびアルミニウムクランプを使用して密閉する、２Ｒの注射バイアル中に調製した。粒子汚染を低減するために、すべての試料バイアルを層流下で充填した。
【０１０４】
２５０ｍＭの賦形剤、５０ｍｇ／ｍｌの融合Ａおよびクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）を含有する３つの試料のサンプルセットを、各サンプリング時間について調製した。
加えて、１０ｍＭのクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）と５０ｍｇ／ｍｌの濃度の融合Ａのみを含有する３つの試料のサンプルセットを、対照試料として調製した。
各試料についての最終的な体積は、クエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）、融合Ａおよび賦形剤からなり、５００μｌであった。
各サンプリング時間で試料をとり、およびこれに続く分析を開始するまで−８０℃で冷凍庫中に保管した。
【０１０５】
例５：等温性の負荷におけるメグルミン（Ｍｅｇ）、メグルミン−グルタマート（Ｍｅｇ−Ｇｌｕ）、メグルミン−アスパルタート（Ｍｅｇ−Ａｓｐ）およびメグルミン−ラクトビオナート（Ｍｅｇ−Ｌａｃｔｏ）のタンパク質安定化効果
−例５Ａ（濁度、図１７）および５Ｂ（ＳＥＣ、図１８）は、融合タンパク質（融合Ａ）についての安定性の増加を示す。
−ＳＥＣモノマー含量分析は、賦形剤についての安定化効果に関しての有意な濃度依存性を明らかにする。
−１００ｍＭの濃度の賦形剤で、メグルミンおよびその塩は、安定化されていない試料およびスクロースで安定化されたそれらよりも有意に高い含量を示す。
【０１０６】
１０ｍＭのクエン酸Ｎａ溶液（ｐＨ５）：
２．９４ｇのクエン酸Ｎａ＊２Ｈ２Ｏ（Ｍ＝２９４．１０ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。超純水を１ｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを、クエン酸（固体）を使用して５＋／−０．０５に調整した。この溶液を０．１μｍフィルターを使用して濾過した。
【０１０７】
ストック溶液（５００ｍＭのメグルミン）：
９．７６ｇのメグルミン（Ｍ＝１９５．２１ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。１０ｍＭのクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）を約８０ｍｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを、クエン酸（固体）を使用して５＋／−０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌの目盛り付きのメスフラスコに移し、および標線まで１０ｍＭのクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）で充填し、および徹底的に混合した。この溶液を０．１μｍフィルターを使用して濾過した。
【０１０８】
ストック溶液（５００ｍＭのメグルミン−グルタマート）：
９．７６ｇのメグルミン（Ｍ＝１９５．２１ｇ／ｍｏｌ）および９．３６ｇのグルタミン酸Ｎａ（Ｍ＝１８７．１３ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。１０ｍＭのクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）を約８０ｍｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを、クエン酸（固体）を使用して５＋／−０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌの目盛り付きのメスフラスコに移し、および標線まで１０ｍＭのクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）で充填し、および徹底的に混合した。この溶液を０．１μｍフィルターを使用して濾過した。
【０１０９】
ストック溶液（５００ｍＭのメグルミン−アスパルタート）：
９．７６ｇのメグルミン（Ｍ＝１９５．２１ｇ／ｍｏｌ）および８．６６ｇのアスパラギン酸Ｎａ（Ｍ＝１７３．１０ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。１０ｍＭのクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）を約８０ｍｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを、クエン酸（固体）を使用して５＋／−０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌの目盛り付きのメスフラスコに移し、および標線まで１０ｍＭのクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）で充填し、および徹底的に混合した。この溶液を０．１μｍフィルターを使用して濾過した。
【０１１０】
ストック溶液（５００ｍＭのメグルミン−ラクトビオナート）：
９．７６ｇのメグルミン（Ｍ＝１９５．２１ｇ／ｍｏｌ）および１７．９２ｇのラクトビオン酸（Ｍ＝３５８．３０ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。１０ｍＭのクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）を約８０ｍｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを、クエン酸（固体）を使用して５＋／−０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌの目盛り付きのメスフラスコに移し、および標線まで１０ｍＭのクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）で充填し、および徹底的に混合した。この溶液を０．１μｍフィルターを使用して濾過した。
【０１１１】
ストック溶液（５００ｍＭのスクロース）：
１７．１１ｇのスクロース（Ｍ＝３４２．２９ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。１０ｍＭのクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）を約８０ｍｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを、クエン酸（固体）を使用して５＋／−０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌの目盛り付きのメスフラスコに移し、および標線まで１０ｍＭのクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）で充填し、および徹底的に混合した。この溶液を０．１μｍフィルターを使用して濾過した。
【０１１２】
５０℃２時間での等温性の負荷についての試料溶液の調製
等温性の負荷を、５０℃に調整した乾燥オーブンを使用して行った。
タンパク質として融合Aを含有する試料溶液を、適切なプラグおよびアルミニウムクランプを使用して密閉する、２Ｒの注射バイアル中に調製した。粒子汚染を低減するために、すべての試料バイアルを層流下で充填した。
１００ｍＭおよび２５０ｍＭの賦形剤、２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａおよびクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）を含有する３つの試料のサンプルセットを、各サンプリング時間について調製した。
【０１１３】
加えて、１０ｍＭのクエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）と２５ｍｇ／ｍｌの濃度の融合Ａのみを含有する３つの試料のサンプルセットを、対照試料として調製した。
各試料についての最終的な体積は、クエン酸Ｎａバッファー（ｐＨ５）、融合Ａおよび賦形剤からなり、３００μｌであった。
【０１１４】
例６：制御された長期安定性（保管条件：４０℃／７５％ｒ．Ｈ．で３ヶ月）でのメグルミン（Ｍｅｇ）およびその塩の凍結乾燥におけるタンパク質安定化効果
−メグルミンおよびその塩は、凍結乾燥に関係のある濃度の製剤において使用され得る。
−例６Ａ（濁度、図１９）および例６Ｂ（ＳＥＣ分析、図２０）は、ｍａｂＡについての安定性の増加を示す。
−メグルミン、Ｍｅｇ−ＨＣｌ、Ｍｅｇ−ＧｌｕおよびＭｅｇ−Ａｓｐについての濁度値は、バッファー溶液ならびにスクロースおよびＭｅｇ−Ｌａｃのみ含有する安定化されていない試料よりも有意に低い。
【０１１５】
−ＳＥＣ含量分析は、メグルミン、スクロース、Ｍｅｇ−ＨＣｌ、Ｍｅｇ−Ｌａｃｔｏ、Ｍｅｇ−Ａｓｐ、Ｍｅｇ−ＧｌｕおよびＭｅｇ−Ｍｅｓベースの製剤の残存するモノマーの含量が、バッファーのみ含有する安定化されていない試料よりも有意に高いことを明らかにする。加えて、安定剤としてのＭｅｇのＳＥＣの結果は、１２週間の保管の後、スクロース、Ｍｅｇ−ＨＣｌおよびＭｅｇ−Ｇｌｕの結果と同等のモノマーの含量を示した。
−５０ｍＭのメグルミン−ラクトビオナート、メグルミン−アスパルタートおよびメグルミン−メシラートで安定化されたｍａｂＡのモノマーの含量は、他の製剤と比較して有意に高かった（初期のモノマーの含量の約９０％）。
【０１１６】
バッファーおよび賦形剤ストック溶液の調製：
１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５）：
１．４２ｇの無水リン酸水素ナトリウム（Ｍ＝１４１．９６ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。超純水を１ｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを、Ｈ２Ｏ中８５ｗｔ．％のリン酸または１ＭのＮａＯＨを使用して５＋／−０．０５に調整した。この溶液を０．１μｍフィルターを使用して濾過した。
【０１１７】
ストック溶液（２００ｍＭのメグルミン）：
３．９ｇのメグルミン（Ｍ＝１９５．２１ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５）を約８０ｍｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを、Ｈ２Ｏ中８５ｗｔ．％のリン酸または１ＭのＮａＯＨを使用して５＋／−０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌの目盛り付きのメスフラスコに移し、および標線まで１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５）で充填し、および徹底的に混合した。この溶液を０．１μｍフィルターを使用して濾過した。
【０１１８】
ストック溶液（２００ｍＭのスクロース）：
６．８４ｇのスクロース（Ｍ＝３４２．２９ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５）を約８０ｍｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを、Ｈ２Ｏ中８５ｗｔ．％のリン酸または１ＭのＮａＯＨを使用して５＋／−０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌの目盛り付きのメスフラスコに移し、および標線まで１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５）で充填し、および徹底的に混合した。この溶液を０．１μｍフィルターを使用して濾過した。
【０１１９】
ストック溶液（１００ｍＭのメグルミン−ＨＣｌ）：
１．９５ｇのメグルミン（Ｍ＝１９５．２１ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５）を約８０ｍｌおよび１０００ｍＭのＨＣｌを１ｍｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを、Ｈ２Ｏ中８５ｗｔ．％のリン酸または１ＭのＮａＯＨを使用して５＋／−０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌの目盛り付きのメスフラスコに移し、および標線まで１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５）で充填し、および徹底的に混合した。この溶液を０．１μｍフィルターを使用して濾過した。
【０１２０】
ストック溶液（１００ｍＭのメグルミン−ラクトビオナート）：
１．９５ｇのメグルミン（Ｍ＝１９５．２１ｇ／ｍｏｌ）および３．５８ｇのラクトビオン酸（Ｍ＝３５８．３０ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５）を約８０ｍｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを、Ｈ２Ｏ中８５ｗｔ．％のリン酸または１ＭのＮａＯＨを使用して５＋／−０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌの目盛り付きのメスフラスコに移し、および標線まで１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５）で充填し、および徹底的に混合した。この溶液を０．１μｍフィルターを使用して濾過した。
【０１２１】
ストック溶液（１００ｍＭのメグルミン−アスパルタート）：
１．９５ｇのメグルミン（Ｍ＝１９５．２１ｇ／ｍｏｌ）および１．７３ｇのアスパラギン酸Ｎａ（Ｍ＝１７３．１０ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５）を約８０ｍｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを、Ｈ２Ｏ中８５ｗｔ．％のリン酸または１ＭのＮａＯＨを使用して５＋／−０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌの目盛り付きのメスフラスコに移し、および標線まで１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５）で充填し、および徹底的に混合した。この溶液を０．１μｍフィルターを使用して濾過した。
【０１２２】
ストック溶液（１００ｍＭのメグルミン−グルタマート）：
１．９５ｇのメグルミン（Ｍ＝１９５．２１ｇ／ｍｏｌ）および１．８７ｇのグルタミン酸Ｎａ（Ｍ＝１８７．１３ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５）を約８０ｍｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを、Ｈ２Ｏ中８５ｗｔ．％のリン酸または１ＭのＮａＯＨを使用して５＋／−０．０５に調整した。その後、溶液を１００．０ｍｌの目盛り付きのメスフラスコに移し、および標線まで１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５）で充填し、および徹底的に混合した。この溶液を０．１μｍフィルターを使用して濾過した。
【０１２３】
３ヶ月の安定性保管のための凍結乾燥試料の調製：
１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を使用して洗浄した、ｍＡｂＡ（約１４５ｋＤａ）の濃縮したタンパク質溶液を、賦形剤ストック溶液またはバッファーを使用して所望される濃度（５０ｍｇ／ｍｌのｍａｂＡ）および製剤（メグルミンおよび対イオンの混合物について２５ｍＭおよび５０ｍＭ；メグルミンおよびスクロースについて５０ｍＭおよび１００ｍＭ）まで希釈した。
ｍａｂＡを含有する試料溶液を、適切なプラグを使用して密閉する、２Ｒの注射バイアル中で調製した。粒子汚染を低減するために、すべての試料バイアルを層流下で充填した。
賦形剤、５０ｍｇ／ｍｌのｍａｂＡおよび１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５）を含有する２つの試料のサンプルセットを、各サンプリング時間について調製した。
【０１２４】
加えて、５０ｍｇ／ｍｌの濃度のｍａｂＡと１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５）のみを含有する２つの試料のサンプルセットを、各サンプリング時間について対照試料として調製した。
各試料についての最終的な体積は、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５）、ｍａｂＡおよび賦形剤からなり、１ｍｌであった。
次いで、Martin Christ社の凍結乾燥機Epsilon 2-12Dを使用して、試料を凍結乾燥した。
【０１２５】
凍結乾燥を、以下のプロトコルを使用して実施した：
【表４】
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凍結乾燥ステップの後に、適切なアルミニウムクランプを使用して試料を密閉し、および制御された気候キャビネットにおいて４０℃７５％ｒ．Ｈでの保管条件で保管した。サンプリング時間を、凍結乾燥後の０週目（初期値）、４週目、９週目および１２週目に設定した。各サンプリング時間で凍結乾燥された試料をとり、および分析のために１ｍｌのｍｉｌｌｉ−Ｑ水で再構成した。
【０１２６】
例７：ｐＨ７でのメグルミン−グルタマート（Ｍｅｇ−Ｇｌｕ）対メグルミンおよびスクロースのタンパク質安定化効果
−試験されたメグルミン塩（Ｍｅｇ−Ｇｌｕ）は、ｐＨ７でスクロースまたはメグルミン単独よりもｍａｂＢを安定化し得、このことはＴｍ値において、とくにＴａｇｇ値において可視化され得る。
−生理学的なｐＨである約７．４近くにタンパク質を処方することは、このことが注射の疼痛を低減するために望ましいが、しかしながらほとんどのタンパク質は、その範囲に近いｐＩを有しており、およびしたがってｐＨ５〜６の近くに処方する必要がある。
【０１２７】
−驚くべきことに、Ｍｅｇ−Ｇｌｕを溶液に添加することは、メグルミン単独およびスクロースと比較して有意にコロイド安定性（Ｔａｇｇを介して表される）を改善する。
−Ｔｍ値は、すべての試験された条件についてｐＨ５からｐＨ７まで増加する一方で、Ｔｍについて最も高い値は、賦形剤としてＭｅｇ−Ｇｌｕを使用して到達した。
【０１２８】
バッファーおよび賦形剤ストック溶液の調製：
６．６７ｍＭのリン酸塩溶液
０．７５８ｇのＮａ２ＨＰＯ４を、適切なフラスコ内にはかりとった。８００ｍｌの超純水を添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。最終的な溶液を、０．１μｍフィルターを通して濾過した。
【０１２９】
３．３３ｍＭのクエン酸塩溶液
０．３２０ｇのクエン酸を、適切なフラスコ内にはかりとった。５００ｍｌの超純水を添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。最終的な溶液を、０．１μｍフィルターを通して濾過した。
【０１３０】
リン酸塩−クエン酸バッファー（ｐＨ５）の調製
６．６７ｍＭのリン酸塩溶液を２５７．５ｍｌおよび３．３３ｍＭのクエン酸塩溶液を２４２．５ｍｌ適切なフラスコ内に充填し、および徹底的に混合した。溶液のｐＨを、１Ｍのリン酸または１ＭのＮａＯＨを使用して５＋／−０．０５に調整した。
【０１３１】
リン酸塩−クエン酸バッファー（ｐＨ７）の調製
６．６７ｍＭのリン酸塩溶液を４１１．７ｍｌおよび３．３３ｍＭのクエン酸塩溶液を８８．３ｍｌ適切なフラスコ内に充填し、および徹底的に混合した。溶液のｐＨを、１Ｍのリン酸または１ＭのＮａＯＨを使用して７＋／−０．０５に調整した。
【０１３２】
ストック溶液（５００ｍＭのメグルミン（ｐＨ５））：
１．９５ｇのメグルミン（Ｍ＝１９５．２１ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。リン酸塩−クエン酸バッファー（ｐＨ５）を約１５ｍｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを、１Ｍのリン酸または１ＭのＮａＯＨを使用して５＋／−０．０５に調整した。その後、溶液を、２０．０ｍｌの目盛り付きのメスフラスコに移し、および標線までリン酸塩−クエン酸バッファー（ｐＨ５）で充填し、および徹底的に混合した。
【０１３３】
ストック溶液（５００ｍＭのメグルミン−グルタマート（ｐＨ５））：
１．９５ｇのメグルミン（Ｍ＝１９５．２１ｇ／ｍｏｌ）および１．８７ｇグルタミン酸Ｎａ（Ｍ＝１８７．１３ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。リン酸塩−クエン酸バッファー（ｐＨ５）を約１５ｍｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを、１Ｍのリン酸または１ＭのＮａＯＨを使用して５＋／−０．０５に調整した。その後、溶液を、２０．０ｍｌの目盛り付きのメスフラスコに移し、および標線までリン酸塩−クエン酸バッファー（ｐＨ５）で充填し、および徹底的に混合した。
【０１３４】
ストック溶液（５００ｍＭのスクロース（ｐＨ５））：
３．４２ｇのスクロース（Ｍ＝３４２．２９ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。リン酸塩−クエン酸バッファー（ｐＨ５）を約１５ｍｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを、１Ｍのリン酸または１ＭのＮａＯＨを使用して５＋／−０．０５に調整した。その後、溶液を、２０．０ｍｌの目盛り付きのメスフラスコに移し、および標線までリン酸塩−クエン酸バッファー（ｐＨ５）で充填し、および徹底的に混合した。
【０１３５】
ストック溶液（５００ｍＭのメグルミン（ｐＨ７））：
１．９５ｇのメグルミン（Ｍ＝１９５．２１ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。リン酸塩−クエン酸バッファー（ｐＨ７）を約１５ｍｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを、１Ｍのリン酸または１ＭのＮａＯＨを使用して、７＋／−０．０５に調整した。その後、溶液を２０．０ｍｌの目盛り付きのメスフラスコに移し、および標線までリン酸塩−クエン酸バッファー（ｐＨ７）で充填し、および徹底的に混合した。
【０１３６】
ストック溶液（５００ｍＭのメグルミン−グルタマート（ｐＨ７））：
１．９５ｇのメグルミン（Ｍ＝１９５．２１ｇ／ｍｏｌ）および１．８７ｇのグルタミン酸Ｎａ（Ｍ＝１８７．１３ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。リン酸塩−クエン酸バッファー（ｐＨ７）を約１５ｍｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを、１Ｍのリン酸または１ＭのＮａＯＨを使用して７＋／−０．０５に調整した。その後、溶液を、２０．０ｍｌの目盛り付きのメスフラスコに移し、および標線までリン酸塩−クエン酸バッファー（ｐＨ７）で充填し、および徹底的に混合した。
【０１３７】
ストック溶液（５００ｍＭのスクロース（ｐＨ７））：
３．４２ｇのスクロース（Ｍ＝３４２．２９ｇ／ｍｏｌ）を、適切なフラスコ内にはかりとった。リン酸塩−クエン酸バッファー（ｐＨ７）を約１５ｍｌ添加し、および物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌した。ｐＨを、１Ｍのリン酸または１ＭのＮａＯＨを使用して７＋／−０．０５に調整した。その後、溶液を、２０．０ｍｌの目盛り付きのメスフラスコに移し、および標線までリン酸塩−クエン酸バッファー（ｐＨ７）で充填し、および徹底的に混合した。
【０１３８】
試料調製
ｍａｂＢストック溶液を、充分な体積の賦形剤ストック溶液および対応するｐＨ値のリン酸塩−クエン酸バッファーで希釈し、５０ｍＭ／２５０ｍＭの最終的な賦形剤濃度および５０ｍｇ／ｍｌのｍａｂＢに到達させた。
ｐＨ５およびｐＨ７の溶液についての５０ｍｇ／ｍｌでのｍａｂＢのＴｍ／Ｔａｇｇ値を、Nanotemper Prometheus NT 48（NanoTemper Technologies GmbH, Munich, Germany）を使用して分析した。同じ溶液の３回の測定を実行した。
【０１３９】
例７：
図２１および２２に示されるｐＨ５およびｐＨ７での５０ｍＭ／２５０ｍＭのメグルミンで安定化されたｍａｂＢ５０ｍｇ／ｍｌについてのＴｍ／Ｔａｇｇ値
図２３および２４に示されるｐＨ５およびｐＨ７での５０ｍＭ／２５０ｍＭのスクロースで安定化されたｍａｂＢ５０ｍｇ／ｍｌについてのＴｍ／Ｔａｇｇ値
図２５および２６に示されるｐＨ５およびｐＨ７での５０ｍＭ／２５０ｍＭのメグルミン−グルタマートで安定化されたｍａｂＢ５０ｍｇ／ｍｌについてのＴｍ／Ｔａｇｇ値
【０１４０】
例８：２５℃／６０％ｒ．Ｈ．および２〜８℃で保管した２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａを含む１２週間の安定性試料のFluid Imaging社のFlowCam 8100を使用した欧州薬局方／米国薬局方に従ったサブビジュアル粒子（Sub visual particle）の測定
粒子の測定を、１０ｍＭのクエン酸Ｎａ（ｐＨ５．０）および１０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ７．０）のバッファーを用いたタンパク質融合Ａを備えた安定性研究の間に行う。融合Ａについての標的濃度は２５ｍｇ／ｍｌであり、および以下の処方は、バッファー溶液（ｐＨ５．０およびｐＨ７．０）を用いて調製された：
１０ｍＭのバッファー
５０ｍＭ／２００ｍＭのトレハロース
５０ｍＭ／２００ｍＭのメグルミン
２５ｍＭ／１００ｍＭのメグルミン＋２５ｍＭ／１００ｍＭのグルタミン酸Ｎａ
２５ｍＭ／１００ｍＭのメグルミン＋２５ｍＭ／１００ｍＭのアスパラギン酸Ｎａ
２５ｍＭ／１００ｍＭのメグルミン＋２５ｍＭ／１００ｍＭのラクトビオン酸
５０ｍＭ／２００ｍＭのスクロース
２５ｍＭ／１００ｍＭのアルギニン＋２５ｍＭ／１００ｍＭのグルタミン酸Ｎａ
【０１４１】
１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ５．０）の調製
１．９２ｇのクエン酸／リットルを、フラスコ内にはかりとり、および適切な体積の超純水で充填する。ｐＨを、水酸化ナトリウム溶液を使用して５．０（＋／−０．０５）に調整する。最終的な溶液を、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、および２〜８℃で保管する。
【０１４２】
１０ｍＭのヒスチジンバッファー（ｐＨ７．０）の調製
１．５５ｇのヒスチジン／リットルを、フラスコ内にはかりとり、および適切な体積の超純水で充填する。ｐＨを、塩酸溶液を使用して７．０（＋／−０．０５）に調整する。最終的な溶液を、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、および２〜８℃で保管する。
【０１４３】
賦形剤ストック溶液の調製
４００ｍＭのトレハロース［２０．５４ｇのトレハロース（３４２．３０ｇ／ｍｏｌ）］を、２つの２００ｍｌのフラスコ内にはかりとる。１５０ｍｌのバッファー（ｐＨ５．０）を一方のフラスコに添加し、１５０ｍｌのバッファー（ｐＨ７．０）を他方に添加した。物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌し、および必要ならばｐＨを夫々５．０および７．０に調整した。フラスコを、適切なバッファー溶液を使用して標線まで充填する。溶液を、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、および２〜８℃で冷蔵庫内で保管する。
４００ｍＭのスクロース［２０．５４ｇのスクロース（３４２．３０ｇ／ｍｏｌ）］を、２つの２００ｍｌのフラスコ内にはかりとる。１５０ｍｌのバッファー（ｐＨ５．０）を一方のフラスコに添加し、１５０ｍｌのバッファー（ｐＨ７．０）を他方に添加する。物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌し、および必要ならばｐＨを夫々５．０および７．０に調整する。フラスコを、適切なバッファー溶液を使用して標線（１５０ｍｌ）まで充填する。溶液を、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、および２〜８℃で冷蔵庫内で保管する。
【０１４４】
４００ｍＭのメグルミン［１１．７１ｇのメグルミン（１９５．２２ｇ／ｍｏｌ）］を、２つの２００ｍｌのフラスコ内にはかりとる。１００ｍｌのバッファー（ｐＨ５．０）を一方のフラスコに添加し、１００ｍｌのバッファー（ｐＨ７．０）を他方に添加する。物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌し、およびｐＨを夫々５．０および７．０に調整する。溶液を、別々の目盛り付きのフラスコに移し、それらを次いで適切なバッファー溶液を用いて標線（１５０ｍｌ）まで充填し、および徹底的に混合した。溶液を、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、および２〜８℃で冷蔵庫内に保管する。
【０１４５】
２００ｍＭのメグルミンおよび２００ｍＭのグルタミン酸Ｎａ
５．８５ｇのメグルミン（１９５．２２ｇ／ｍｏｌ）および５．６１ｇグルタミン酸Ｎａ（１８７．１３ｇ／ｍｏｌ）を、２つの２００ｍｌのフラスコ内にはかりとる。１００ｍｌのバッファー（ｐＨ５．０）を一方のフラスコに添加し、１００ｍｌのバッファー（ｐＨ７．０）を他方に添加する。物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌し、およびｐＨを夫々５．０および７．０に調整する。溶液を、別々の目盛り付きのフラスコに移し、それらを、次いで適切なバッファー溶液を用いて標線（１５０ｍｌ）まで充填し、および徹底的に混合した。溶液を、０．２２μｍフィルターを通して濾過する。および２〜８℃で冷蔵庫内に保管する。
【０１４６】
２００ｍＭのメグルミンおよび２００ｍＭのアスパラギン酸Ｎａ
５．８５ｇのメグルミン（１９５．２２ｇ／ｍｏｌ）および５．１９ｇアスパラギン酸Ｎａ（１７３．１０ｇ／ｍｏｌ）を、２つの２００ｍｌのフラスコ内にはかりとる。１００ｍｌのバッファー（ｐＨ５．０）を一方のフラスコに添加し、１００ｍｌのバッファー（ｐＨ７．０）を他方に添加する。物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌し、およびｐＨを夫々５．０および７．０に調整する。溶液を、別々の目盛り付きのフラスコに移し、それらを、次いで適切なバッファー溶液を用いて標線（１５０ｍｌ）まで充填し、および徹底的に混合した。溶液を、０．２２μｍフィルターを通して濾過する。および２〜８℃で冷蔵庫内に保管する。
【０１４７】
２００ｍＭのメグルミン＋２００ｍＭのラクトビオン酸
５．８５ｇのメグルミン（１９５．２２ｇ／ｍｏｌ）および１０．７５ｇのラクトビオン酸（３５８．３０ｇ／ｍｏｌ）を、２つの２００ｍｌのフラスコ内にはかりとる。１００ｍｌのバッファー（ｐＨ５．０）を一方のフラスコに添加し、１００ｍｌのバッファー（ｐＨ７．０）を他方に添加する。物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌し、およびｐＨを夫々５．０および７．０に調整する。溶液を、別々の目盛り付きのフラスコに移し、それらを、次いで適切なバッファー溶液を用いて標線（１５０ｍｌ）まで充填し、および徹底的に混合した。溶液を、０．２２μｍフィルターを通して濾過する。および２〜８℃で冷蔵庫内に保管する。
【０１４８】
２００ｍＭのアルギニン＋２００ｍＭのグルタミン酸Ｎａ
５．２３ｇのアルギニン（１７４．２０ｇ／ｍｏｌ）および５．６１ｇのグルタミン酸Ｎａ（１８７．１３ｇ／ｍｏｌ）を、２つの２００ｍｌのフラスコ内にはかりとる。１００ｍｌのバッファー（ｐＨ５．０）を一方のフラスコに添加し、１００ｍｌのバッファー（ｐＨ７．０）を他方に添加する。物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌し、およびｐＨを夫々５．０および７．０に調整した。溶液を、別々の目盛り付きのフラスコに移し、それらを、次いで適切なバッファー溶液を用いて標線（１５０ｍｌ）まで充填し、および徹底的に混合した。溶液を、０．２２μｍフィルターを通して濾過する。および２〜８℃で冷蔵庫内に保管する。
【０１４９】
タンパク質ストック溶液
安定性研究に、２つのｐＨ値（５．０／７．０）でのモデルタンパク質として融合Ａを使用した。したがって、これらのｐＨ値を有するタンパク質ストック溶液を使用した。
・１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ５．０）：融合Ａｃ＝１３４．４ｍｇ／ｍｌ
・１０ｍＭのヒスチジンバッファー（ｐＨ７．０）：融合Ａｃ＝１７２．４ｍｇ／ｍｌ
【０１５０】
試料調製
２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での安定性研究を、液体試料だけでなく、Martin Christ社の凍結乾燥機Epsilon 2-12D内で調製される凍結乾燥試料でもまた実行する。
ｐＨ５．０での安定性研究のための融合Ａ試料の調製についての試料の体積を図２７に示す。
下表に従って、ｐＨ５．０の条件についてのすべての賦形剤溶液を、注意して、しかし徹底的にピペッティングし、混合する。
【表５】
2021521232.tif 000009
【０１５１】
ｐＨ７．０での安定性研究のための融合Ａ試料の調製についての試料の体積を図２８に示す。
下表に従って、ｐＨ７．０の条件についてのすべての賦形剤溶液を、注意して、しかし徹底的にピペッティングし、混合する。
【表６】
2021521232.tif 000010
【０１５２】
最終的に、各ｐＨ条件についての１５の賦形剤溶液が、得られた。
安定性試料の調製は、安定性研究のために必要な２Ｒのバイアル内に適切な溶液をピペットで移すことによりなされる。２Ｒのバイアルを、凍結乾燥ストッパーまたは標準的なストッパーのいずれかで密閉する。凍結乾燥ストッパーを用いる２Ｒのバイアルを凍結乾燥する。すべてのバイアルを、アルミニウムクリンプキャップで密閉する。
試料調製プロセスの後に、試料を、２５℃／６０ｒ．Ｈ．で気候キャビネット内かまたは２〜８℃で冷蔵庫内のいずれかに保管する。
凍結乾燥のための条件を図２９に示す。
【０１５３】
Ａ１）２５℃／６０％ｒ．Ｈ．で保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液体試料（ｐＨ５．０）
２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ５．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４、８または１２週間の保管の後のサブビジュアル粒子を、図３０（＞１０μｍ）および図３１（＞２５μｍ）に示す。
２５℃／６０％ｒ．Ｈ．で０、４、８または１２週間保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ５．０）についてのサブビジュアル粒子の点での５０ｍＭおよび２００ｍＭのスクロースおよびメグルミン−グルタマートの比較を図３２に示す。
【０１５４】
図３０および図３１ならびに図３２は、メグルミン−グルタマートを用いて安定化された試料に伴うサブビジュアル粒子の量が、殆どのケースにおいて、タンパク質スクロースについての標準的な安定剤を下回る値かまたはそれと同等であることを示す。したがって、メグルミン−グルタマートは、より低い粒子値のよりよい傾向を伴い、少なくともスクロースと同じくらい良好に安定化することが結論づけられ得る。
１２週間の安定性研究の間に見られるｐＨ値、浸透圧および濁度における有意な傾向または変化はない。したがって、製剤が保管の間に変質を受けることの自明な証拠はない。
【０１５５】
Ａ２）２５℃／６０％ｒ．Ｈ．で保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液体試料（ｐＨ７．０）
２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ７．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４、８および１２週間の保管の後のサブビジュアル粒子を、図３３（＞１０μｍ）および図３４（＞２５μｍ）に示す。
２５℃／６０％ｒ．Ｈ．で０、４、８または１２週間保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ７．０）についてのサブビジュアル粒子の点での５０ｍＭおよび２００ｍＭのスクロースおよびメグルミン−グルタマートの比較を図３５に示す。
【０１５６】
１０ｍＭのヒスチジンバッファー（ｐＨ７．０）中のタンパク質融合Ａの液剤について、バッファー（ｐＨ５．０）中の製剤について示されるものと同じ傾向が見られる。図３３および図３４ならびに図３５は、サブビジュアル粒子の量が、メグルミン−グルタマートについての殆どのケースにおいて、標準的なタンパク質安定剤物質のスクロースの値を下回ることを示し、およびしたがって、メグルミン−グルタマートは、より低い粒子値のよりよい傾向を伴い、少なくともスクロースと同じくらい良好に安定化するという、同じ結論が得られ得る。
１２週間の安定性研究の間に見られるｐＨ値、浸透圧および濁度における有意な傾向または変化はない。したがって、製剤が保管の間に変質を受けることの自明な証拠はない。
【０１５７】
Ｂ１）２５℃／６０％ｒ．Ｈ．で保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥試料（ｐＨ５．０）
２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ５．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４および１２週間の保管の後のサブビジュアル粒子を、図３６（＞１０μｍ）および図３７（＞２５μｍ）に示す。
図４０：０、４および１２週間２５℃／６０％ｒ．Ｈ．で保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ５．０）についてのサブビジュア粒子の点での５０ｍＭおよび２００ｍＭのスクロースおよびメグルミン−グルタマートの比較を図３８に示す。
【０１５８】
図３６、図３７および図３８に示されるとおり、１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ５．０）中のタンパク質融合Ａの凍結乾燥製剤は、殆どのケースにおいて、標準的なタンパク質安定剤物質のスクロースの値を下回るメグルミン−グルタマートについてのサブビジュアル粒子の量である。したがって、メグルミン−グルタマートが少なくともスクロースと同じくらい良好に安定化すると結論づけられ得る。
１２週間の安定性研究の間に見られるｐＨ値、浸透圧および濁度における有意な傾向または変化はない。したがって、製剤が保管の間に変質を受けることの自明な証拠はない。
【０１５９】
Ｂ２）２５℃／６０％ｒ．Ｈ．で保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥試料（ｐＨ７．０）
２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ７．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４および１２週間の保管の後のサブビジュアル粒子を、図３９（＞１０μｍ）および図４０（＞２５μｍ）に示す。
０、４および１２週間２５℃／６０％ｒ．Ｈ．で保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ７．０）についてのサブビジュアル粒子の点での５０ｍＭおよび２００ｍＭのスクロースおよびメグルミン−グルタマートの比較を図４１に示す。
【０１６０】
１０ｍＭのヒスチジンバッファー（ｐＨ７．０）中のタンパク質融合Ａの凍結乾燥製剤について、バッファー（ｐＨ５．０）中の製剤について示されたものと同じ傾向が見られる。メグルミン−グルタマートについてのサブビジュアル粒子の量は、殆どのケースにおいて、標準的なタンパク質安定剤物質であるスクロースの同じ範囲内にあり、およびしたがって、メグルミン−グルタマートが少なくともスクロースと同じくらい良好に安定化するという同じ結論が得られ得る。
１２週間の安定性研究の間に見られるｐＨ値、浸透圧および濁度における有意な傾向または変化はない。したがって、製剤が保管の間に変質を受けることの自明な証拠はない。
【０１６１】
Ｃ１）２〜８℃で保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液体試料（ｐＨ５．０）
２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ５．０）の２〜８℃での１２週間の保管の後のサブビジュアル粒子を、図４２（＞１０μｍ）および図４３（＞２５μｍ）に示す。
２〜８℃で保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ５．０）についてのサブビジュアル粒子の点での５０ｍＭおよび２００ｍＭのスクロースおよびメグルミン−グルタマートの比較を図４４に示す。
【０１６２】
２〜８℃で保管された１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ５．０）中のタンパク質融合Ａの液剤について、メグルミン−グルタマートについてのサブビジュアル粒子の量は、殆どのケースにおいて、標準的なタンパク質安定剤物質であるスクロースの値を下回ることが示され、およびしたがって、メグルミン−グルタマートが、より低い粒子値のより良い傾向を伴い、少なくともスクロースと同じくらい良好に安定化するという結論が得られ得る。
１２週間の安定性の間に見られる、ｐＨ値、浸透圧および濁度における有意な傾向または変化はない。したがって、製剤が保管の間に変質を受けることの自明な証拠はない。
【０１６３】
Ｃ２）２〜８℃で保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液体試料（ｐＨ７．０）
２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ７．０）の２〜８℃での１２週間の保管の後のサブビジュアル粒子を、図４５（＞１０μｍ）および図４６（＞２５μｍ）に示す。
２〜８℃で保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ７．０）についてのサブビジュアル粒子の点での５０ｍＭおよび２００ｍＭのスクロースおよびメグルミン−グルタマートの比較を図４７に示す。
【０１６４】
２〜８℃で保管された１０ｍＭのヒスチジンバッファー（ｐＨ７．０）中のタンパク質融合Ａの液剤についての図４５、図４６および図４７のとおり、バッファー（ｐＨ５．０）中の製剤について示されるものと同じ傾向が見られる。メグルミン−グルタマートについてのサブビジュアル粒子の量は、殆どのケースにおいて、標準的なタンパク質安定剤物質であるスクロースの値を下回り、およびしたがって、メグルミン−グルタマートが、２００ｍＭでより低い粒子値のより良い傾向を伴い、少なくともスクロースと同じくらい良好に安定化するという同じ結論が得られ得る。
１２週間の安定性の間に見られるｐＨ値、浸透圧および濁度における有意な傾向または変化はない。したがって、製剤が保管の間に変質を受けることの自明な証拠はない。
【０１６５】
例９：２５℃／６０％ｒ．Ｈ．および２〜８℃で保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａを用いた１２週間の安定性試料のＳＥＣの測定
Ａ１）２５℃／６０％ｒ．Ｈ．で保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液体試料（ｐＨ５．０）
２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ５．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４、８および１２週間の保管の後の融合Ａモノマーの含量についてのＳＥＣの結果を図４８に示す。
２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ５．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４、８および１２週間の保管の後の融合Ａモノマーの純度についてのＳＥＣの結果を図４９に示す。
２５℃／６０％ｒ．Ｈ．で、１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ５．０）を用いた融合Ａの液剤は、すべての製剤について含量および純度で僅かな低減を示す。十分に確立された物質であるスクロース、トレハロースおよびアルギニン−グルタマートが、メグルミン製剤よりも優れないために、メグルミンで安定化されたタンパク質製剤は、少なくとも周知の物質と同じくらい安定していると結論付けられ得る。
【０１６６】
Ａ２）２５℃／６０％ｒ．Ｈ．で保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液体試料（ｐＨ７．０）
２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ７．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４、８および１２週間の保管の後の融合Ａモノマーの含量についてのＳＥＣの結果を図５０に示す。
２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ７．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４、８および１２週間の保管の後の融合Ａモノマーの純度についてのＳＥＣの結果を図５１に示す。
１０ｍＭのヒスチジンバッファー（ｐＨ７）を用いた融合Ａの液剤は、含量およびモノマーの純度において有意な低減を示す。加えて、メグルミン−グルタマートおよび僅かに少ない様式でメグルミン−ラクトビオン酸が、十分に確立された物質であるスクロースおよびトレハロースのものと少なくとも同等の方法でタンパク質製剤を安定化することが示され得る。
【０１６７】
Ｂ１）２５℃／６０％ｒ．Ｈ．で保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥試料（ｐＨ５．０）
２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ５．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４および１２週間の保管の後の融合Ａモノマーの含量についてのＳＥＣの結果を図５２に示す。
２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ５．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４および１２週間の保管の後の融合Ａモノマーの純度についてのＳＥＣの結果を図５３に示す。
２５℃／６０％ｒ．Ｈ．で保管された１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ５．０）中の融合Ａの凍結乾燥製剤の結果は、いかなる賦形剤もなしに製剤のみで、含量および純度の点で明確な低減を示す。賦形剤で安定化された試料は、含量および純度において僅かな低減を示すが、それらが殆ど同じレベルであるために、試験された製剤の間の区別は不可能である。
【０１６８】
Ｂ２）２５℃／６０％ｒ．Ｈ．で保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥試料（ｐＨ７．０）
２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ７．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４および１２週間の保管の後の、融合Ａのモノマーの含量についてのＳＥＣの結果を図５４に示す。
２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの凍結乾燥製剤（ｐＨ７．０）の２５℃／６０％ｒ．Ｈ．での０、４および１２週間の保管の後の、融合Ａのモノマーの純度についてのＳＥＣの結果を図５５に示す。
ｐＨ７．０での融合Ａの凍結乾燥製剤は、１２週間の保管の後に含量のわずかな低減を示し、および安定化されていない製剤のみが、モノマーの純度において有意な低減を示す。
【０１６９】
Ｃ１）２〜８℃で保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液体試料（ｐＨ５．０）
２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ５．０）の２〜８℃での１２週間の保管の後の、融合Ａのモノマーの含量についてのＳＥＣの結果を図５６に示す。
２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ５．０）の２〜８℃での１２週間の保管の後の、融合Ａのモノマーの純度についてのＳＥＣの結果を図５７に示す。
【０１７０】
Ｃ２）２〜８℃で保管された２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液体試料（ｐＨ７．０）
２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ７．０）の２〜８℃での１２週間の保管の後の、融合Ａのモノマーの含量についてのＳＥＣの結果を図５８に示す。
２５ｍｇ／ｍｌの融合Ａの液剤（ｐＨ７．０）の２〜８℃での１２週間の保管の後の融合Ａモノマーの純度についてのＳＥＣの結果を図５９に示す。
２〜８℃の冷蔵庫内での液体融合Ａ製剤の保管は、両方の試験されたｐＨ値について含量に僅かな低減のみを示す。モノマーの純度は、全ての製剤のｐＨ５．０について同じレベルである一方で、ｐＨ７．０の製剤は、各試験された溶液について純度の値で僅かな低減を示す。各製剤が、同じレベルの含量および純度にあるために、メグルミン塩が、タンパク質ならびに顕著な物質であるスクロース、トレハロースおよびアルギニン−グルタマートを安定化するのに好適であると結論付けられ得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【国際調査報告】
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