(57)【要約】本発明は、様々な態様では、合成キメラワクシニアウイルスまたはそのようなウイルスを含む組成物、ならびにそのような合成キメラワクシニアウイルスを製造するためのシステムおよび方法の開発および使用に関する。合成キメラワクシニアウイルスは、とりわけ、ウイルスワクチンとして、または腫瘍溶解性応答の生成および医薬製剤の作製のために好適である。本開示は、一態様では、合成キメラワクシニアウイルス（例えば、ｓｃＶＡＣＶ）が、ワクシニアウイルスゲノムの化学合成された重複断片から製造することができるとの知見に基づく。
2021522784.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成ＤＮＡに由来するＤＮＡから複製され、再活性化される合成キメラワクシニアウイルス（ｓｃＶＡＣＶ）であって、前記ウイルスのウイルスゲノムは、１つまたは複数の改変によって特徴付けられるという点で、前記ウイルスの野生型ゲノムと異なる、ｓｃＶＡＣＶ。
【請求項２】
前記合成ＤＮＡが、化学合成ＤＮＡ、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、操作されたＤＮＡおよびヌクレオシド類似体を含むポリヌクレオチドの１つまたは複数から選択される、請求項１に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項３】
前記合成ＤＮＡが化学合成ＤＮＡである、請求項１に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項４】
前記１つまたは複数の改変が、１つまたは複数の欠失、挿入、置換またはその組合せを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項５】
前記１つまたは複数の改変が、１つまたは複数の特異な制限部位を排除するための１つまたは複数の改変を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項６】
前記１つまたは複数の改変が、１つまたは複数の特異な制限部位を付加するかまたは修復するための１つまたは複数の改変を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項７】
前記１つまたは複数の改変が、１つまたは複数のＡａｒＩ制限部位を排除するための１つまたは複数の改変を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項８】
前記１つまたは複数の改変が、全てのＡａｒＩ制限部位を排除するための１つまたは複数の改変を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項９】
前記１つまたは複数の改変が、１つまたは複数のＢｓａＩ制限部位を排除するための１つまたは複数の改変を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項１０】
前記ウイルスゲノムが異種末端ヘアピンループを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項１１】
前記ウイルスゲノムが異なるワクシニアウイルス株に由来する末端ヘアピンループを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項１２】
前記ウイルスゲノムがＶＡＣＶ  ＷＲ株に由来する末端ヘアピンループを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項１３】
前記ウイルスゲノムが相同または異種末端ヘアピンループを含み、タンデムリピート領域が、ｗｔＶＡＣＶと異なる数の反復配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項１４】
前記ウイルスゲノムが、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ、クローン３、Ｔｉａｎ  Ｔｉａｎ、Ｔｉａｎ  ＴｉａｎクローンＴＰ５、Ｔｉａｎ  ＴｉａｎクローンＴＰ３、ＮＹＣＢＨ、ＮＹＣＢＨクローンＡｃａｍｂｉｓ  ２０００、Ｗｙｅｔｈ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒ  １０７、Ｌｉｓｔｅｒ−ＬＯ、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ１、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ２、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ３、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ４、Ｌｉｓｔｅｒ  ＣＴＣ１、Ｌｉｓｔｅｒ  ＩＭＧ２（Ｔｕｒｂｏ  ＦＰ６３５）、ＩＨＤ−Ｗ、ＬＣ１６ｍ１８、Ｌｅｄｅｒｌｅ、ＴａｓｈｋｅｎｔクローンＴＫＴ３、ＴａｓｈｋｅｎｔクローンＴＫＴ４、ＵＳＳＲ、Ｅｖａｎｓ、Ｐｒａｈａ、Ｌ−ＩＶＰ、Ｖ−ＶＥＴ１またはＬＩＶＰ６．１．１、Ｉｋｅｄａ、ＥＭ−６３、Ｍａｌｂｒａｎ、Ｄｕｋｅ、３７３７、ＣＶ−１、Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｅｒｒｏ  ２、ＣＭ−０１、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１３、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１５、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ２０、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１７、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ２１、ＶＡＣＶ−ＩＯＣ、漿尿膜ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＣＶＡ）、改変されたワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）およびＭＶＡ−ＢＮからなる群より選択されるＶＡＣＶ株のゲノムである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項１５】
前記ｓｃＶＡＣＶの前記ウイルスゲノムが、ＮＹＣＢＨ株、クローンＡｃａｍｂｉｓ  ２０００のゲノムに基づく、請求項１４に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項１６】
前記ｓｃＶＡＣＶの前記ウイルスゲノムが、ＮＹＣＢＨ株、クローンＤｒｙｖａｘのゲノムに基づく、請求項１４に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項１７】
前記ｓｃＶＡＣＶの前記ウイルスゲノムが、Ｌｉｓｔｅｒ株、Ｖ−ＶＥＴ１のゲノムに基づく、請求項１４に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項１８】
前記ｓｃＶＡＣＶの前記ウイルスゲノムが、改変されたウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）株のゲノムに基づく、請求項１４に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項１９】
前記ｓｃＶＡＣＶの前記ウイルスゲノムが、ＭＶＡ−ＢＮ株のゲノムに基づく、請求項１４に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項２０】
前記ｓｃＶＡＣＶの前記ウイルスゲノムが、ＩＯＣ株のゲノムに基づく、請求項１４に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項２１】
左および右の末端ヘアピンループが、ａ）ワクシニアウイルス末端ヘアピンループのｓｌｏｗ型およびｆａｓｔ型をそれぞれ含むか、ｂ）ワクシニアウイルス末端ヘアピンループのｆａｓｔ型およびｓｌｏｗ型をそれぞれ含むか、ｃ）共にワクシニアウイルス末端ヘアピンループのｓｌｏｗ型を含むか、または、ｄ）共にワクシニアウイルス末端ループのｆａｓｔ型を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項２２】
前記ｓｌｏｗ型が、配列番号１３または配列番号１９のヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ｆａｓｔ型が、配列番号１４または配列番号２０のヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項２３】
前記ｓｌｏｗ型が、配列番号１３または配列番号１９の配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ｆａｓｔ型が、配列番号１４または配列番号２０のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項２２に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項２４】
前記ｓｌｏｗ型が、配列番号１３または配列番号１９のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ｆａｓｔ型が、配列番号１４または配列番号２０のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項２３に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項２５】
前記ｓｌｏｗ型が、配列番号１３または配列番号１９のヌクレオチド配列からなり、前記ｆａｓｔ型が、配列番号１４または配列番号２０のヌクレオチド配列からなる、請求項２４に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項２６】
前記ウイルスが、前記ｓｃＶＡＣＶの前記ウイルスゲノムの実質的に全てに対応する、重複する化学合成ＤＮＡ断片から複製され、再活性化される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項２７】
前記ウイルスが、２〜１４個の重複する断片から複製され、再活性化される、請求項２６に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項２８】
前記ウイルスが、６〜１２個の重複する断片から複製され、再活性化される、請求項２７に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項２９】
前記ウイルスが、９個の重複する断片から複製され、再活性化される、請求項２８に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項３０】
前記ウイルスが、レポリポックスウイルスによって触媒される組換えおよび再活性化を使用して再活性化される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項３１】
前記レポリポックスウイルスが、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）、野兎線維腫ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、リス線維腫ウイルスおよび粘液腫ウイルスからなる群より選択される、請求項３０に記載のｓｃＶＡＣＶ。
【請求項３２】
合成キメラワクシニアウイルス（ｓｃＶＡＣＶ）を製造する方法であって、
（ｉ）前記ワクシニアウイルスのウイルスゲノムの実質的に全てに対応する、重複するＤＮＡ断片を化学合成するステップと；
（ｉｉ）前記重複するＤＮＡ断片をヘルパーウイルス感染細胞にトランスフェクトするステップと；
（ｉｉｉ）前記細胞を培養して前記細胞においてヘルパーウイルスおよび合成キメラワクシニアウイルス粒子の混合物を生成するステップと；
（ｉｖ）前記ｓｃＶＡＣＶに特異的な宿主細胞の上で前記混合物を平板培養して前記ｓｃＶＡＣＶを回収するステップと
を含む、方法。
【請求項３３】
前記ヘルパーウイルスが、レポリポックスウイルス、鶏痘ウイルスおよびソラレン不活化ヘルパーウイルスからなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記レポリポックスウイルスが、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）、野兎線維腫ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、リス線維腫ウイルスおよび粘液腫ウイルスからなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記レポリポックスウイルスが、ＳＦＶである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ヘルパーウイルス感染細胞が、ＢＧＭＫ細胞である、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ（ｉ）が、ＶＡＣＶの別の株から末端ヘアピンループを化学合成することと、前記ウイルスゲノムの左および右の末端を含む断片の上へそれらをライゲーションすることとをさらに含む、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記重複するＤＮＡ断片が、
（ｉ）配列番号１〜９の配列と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列番号１〜９の配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）配列番号１〜９の配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列；または
（ｉｖ）配列番号１〜９の配列からなるヌクレオチド配列
を含む、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の方法によって生成される、合成キメラワクシニアウイルス（ｓｃＶＡＣＶ）。
【請求項４０】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載のｓｃＶＡＣＶおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項４１】
前記ｓｃＶＡＣＶが、不活化されている、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記不活化が、熱、ＵＶまたはホルマリンによって実行される、請求項４１に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
被験体において腫瘍溶解性応答を誘導するための方法であって、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のｓｃＶＡＣＶを含む組成物または請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項４４】
宿主細胞において異種タンパク質を発現させるための方法であって、異種核酸配列を請求項１〜３１のいずれか一項に記載のｓｃＶＡＣＶに導入するステップと、前記宿主細胞を前記ｓｃＶＡＣＶに感染させるステップと、前記宿主細胞を前記異種タンパク質の発現のための条件の下で培養するステップとを含む、方法。
【請求項４５】
前記異種核酸配列が、異なるポックスウイルス種または任意の非ポックスウイルス供給源に由来する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ワクシニアウイルスに対する免疫応答を誘発またはブーストする方法であって、それを必要とする被験体に請求項１〜３１のいずれか一項に記載のｓｃＶＡＣＶを含む組成物または請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項４７】
痘瘡ウイルスに対する免疫応答を誘発またはブーストする方法であって、それを必要とする被験体に請求項１〜３１のいずれか一項に記載のｓｃＶＡＣＶを含む組成物または請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項４８】
サル痘ウイルスに対する免疫応答を誘発またはブーストする方法であって、それを必要とする被験体に請求項１〜３１のいずれか一項に記載のｓｃＶＡＣＶを含む組成物または請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項４９】
ヒト被験体を免疫化して前記被験体を痘瘡ウイルス感染症から防御する方法であって、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のｓｃＶＡＣＶを含む組成物または請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項５０】
痘瘡ウイルス感染症を処置する方法であって、それを必要とする被験体に請求項１〜３１のいずれか一項に記載のｓｃＶＡＣＶを含む組成物または請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項５１】
被験体においてがんを処置する方法であって、それを必要とする前記被験体に請求項１〜３１のいずれか一項に記載のｓｃＶＡＣＶを含む組成物または請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項５２】
前記投与が、皮膚乱切法、筋肉内または静脈内投与から選択することができる、請求項４３または４６〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記組成物が、ポックスウイルス処置施設において投与される、請求項４３または４６〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記組成物が、天然痘有害事象の専門家によって投与される、請求項４３または４６〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記天然痘有害事象が、種痘湿疹、進行性種痘疹、ワクチン後脳炎、心筋炎および拡張型心筋症から選択される、請求項５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願に付随する配列表は、テキスト形式でＥＦＳ−ウェブを通して電子的に提出され、これにより参照により本明細書に完全に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、１０４５４５−００３１−ＷＯ−ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔである。２０１９年５月２日に作成されたテキストファイルは、２８８，６５２バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００２】
ポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ科のメンバー）は、ヒトおよび動物の両方に感染することができる二本鎖ＤＮＡウイルスである。ポックスウイルスは、宿主範囲に基づいて２つの亜科に分類される。脊椎動物の宿主に感染するＣｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ亜科は８属からなり、そのうち４属（Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ、ＭｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘｖｉｒｕｓおよびＹａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓ）は、ヒトに感染することが知られている。天然痘は、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ（ＯＰＶ）属のメンバーである痘瘡ウイルス（ＶＡＲＶ）による感染によって引き起こされる。ＯＰＶ属は、ラクダ痘ウイルス（ＣＭＬＶ）、牛痘ウイルス（ＣＰＸＶ）、エクトロメリアウイルス（ＥＣＴＶ、「マウス痘因子」）、馬痘ウイルス（ＨＰＸＶ）、サル痘ウイルス（ＭＰＸＶ）、ウサギ痘ウイルス（ＲＰＸＶ）、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス、ウアシンギシュー病ウイルス、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）、痘瘡ウイルス（ＶＡＲＶ）およびハタネズミ痘ウイルス（ＶＰＶ）を含むいくつかの遺伝的に関連している形態学的に同一のウイルスを含む。ＶＡＲＶ以外に、ＶＡＣＶ、ＭＰＸＶおよびＣＰＸＶを含む、少なくとも３つの他のＯＰＶがヒトに感染することが知られている。これまで、「生」のＶＡＣＶによるワクチン接種が、天然痘に対する唯一の証明された防御である。ワクチン接種の攻撃的なプログラムは、１９８０年に天然痘の根絶につながり、公衆へのルーチンの種痘は中止された。しかし、ＶＡＲＶおよび他のＯＰＶに対して個体にワクチン接種をする、新規の安全で効果的な手段を見出すための必要性がまだある。
【０００３】
ＶＡＣＶの様々な調製物が、天然痘ワクチンとして使用されてきた。これらのほとんどはいくつかの近縁のウイルス（例えば、Ｄｒｙｖａｘ）を含み、１つは単一の分子クローン、ＡＣＡＭ２０００を含む。しかし、Ｄｒｙｖａｘおよび他のＶＡＣＶワクチンのように、ＡＣＡＭ２０００でさえも、心筋症および心外膜炎を含む重大な副作用を伴う。リスクを低減するために、ＡＣＡＭ２０００ワクチンは他の生ワクチンと同様に、がん、免疫不全を有する個体、臓器移植レシピエント、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、心臓状態を有する患者、および免疫抑制薬を服用中の患者を除外する多数の禁忌を有する。米国の人口の１５〜５０％がこれらのカテゴリーのうちの１つに該当するだろうと推定され、より安全なワクチンまたはワクチン接種プロトコールの開発の必要性が確認されている（Kennedy  et  al.,  2007  Kennedy  R,  Poland  GA.  2007.  T-Cell  epitope  discovery  for  variola  and  vaccinia  viruses.  Rev  Med  Viroll7:  93-113）。したがって、ＤｒｙｖａｘまたはＡＣＡＭ２０００（商標）に有効性において類似しているが、より安全であるワクチンの開発の必要性がある。
【０００４】
ワクチン製造プロセスの均一性および一貫性を確保するために、安全、純粋、強力および有効なワクチンの生産は、品質保証手順を必要とする。過去には、黄熱、インフルエンザ、はしかおよびおたふく風邪に対するワクチンの製造のためにウイルスを増殖させるために、発育鶏卵または初代ニワトリ胚線維芽細胞培養物が使用されてきた。ニワトリに感染するかもしれない偶発の因子はヒトに感染せず、病原性ではないだろうと考えられていたため、これらの培養基は許容できるとみなされていた（FDA  Briefing  Document  Vaccines  and  Related  Biological  Products  Advisory  Committee  Meeting.  September  19,  2012）。しかし、ウイルス親和性が変化すれば、安全性は損なわれる可能性がある。
【０００５】
ワクチンの製造のためのウイルスの増殖のために、他の培養基、例えば、天然痘ワクチンのために子ウシリンパ液が使用された。子ウシを天然痘で接種した後、白血球を含有するリンパ液を抽出し、キャピラリー管に保存する。次いで、これは、天然痘に対して人々にワクチン接種をするために使用される。しかし、ウシ海綿状脳症またはスクレーピープリオンによる汚染のリスクがある。現代のワクチンのための規制およびガイドラインは、使用される全ての材料がＢＳＥフリーの部位からのものでなければならないと述べているが、スクレーピーフリー部位の状態については何もない。１９８０〜１９８２年に生産されたＤｒｙｖａｘワクチンは、現代の方法によって精査されていないという事実が、特に懸念される。具体的には、これらのストックは、偶発因子のための試験をこれまで受けていない（Murphy  and  Osburn.  Emerging  Infectious  Diseases.  www.cdc.gov/eid.  Vol.  11,  No.  7,  July  2005）。
【０００６】
したがって、既存のＤｒｙｖａｘまたはＡＣＡＭ２０００（商標）ワクチンに有効性において類似しているが、より安全で、再生可能であり、残留細胞、残留ＤＮＡ、プリオンおよび偶発因子を含有しないワクチンの開発の必要性がある。
本出願は、安全で、再生可能であり夾雑物を含有しない、化学合成されたＤＮＡからアセンブルされ、複製される、キメラワクシニアウイルスを提供する。化学的ゲノム合成は天然の鋳型に依存しないので、ウイルスゲノムの過剰の構造的および機能的改変が可能である。化学的ゲノム合成は、従来の分子生物学的方法による遺伝子複製または改変に天然の鋳型を利用できない場合、特に有益である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kennedy  Rら、Rev  Med  Virol（2007）l7:93〜113
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の態様は、合成キメラワクシニアウイルス、そのようなウイルスの製造方法、および、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおける免疫原性製剤中の免疫原として、異種遺伝子発現のためのビヒクルとして、またはがんの処置のための腫瘍溶解剤としてのそのようなウイルスの使用を提供する。本出願の合成キメラワクシニアウイルスは、野生型ワクシニアウイルスと比較して１つまたは複数の改変によって特徴付けられる。
【０００９】
本開示は、一態様では、合成キメラワクシニアウイルス（例えば、ｓｃＶＡＣＶ）が、ワクシニアウイルスゲノムの化学合成された重複断片から製造することができるとの知見に基づく。
【００１０】
したがって、一態様では、本発明は、合成ＤＮＡに由来するＤＮＡから複製され、再活性化される合成キメラワクシニアウイルス（例えば、ｓｃＶＡＣＶ）に関し、前記ウイルスのウイルスゲノムは、１つまたは複数の改変によって特徴付けられるという点で、前記ウイルスの野生型ゲノムと異なり、改変は、化学合成されたＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含む群から誘導される。
【００１１】
別の態様では、本発明は、合成キメラワクシニアウイルス（ｓｃＶＡＣＶ）を製造する方法であって、（ｉ）ワクシニアウイルスのウイルスゲノムの実質的に全てに対応する重複ＤＮＡ断片を化学合成するステップと；（ｉｉ）重複ＤＮＡ断片をヘルパーウイルス感染細胞にトランスフェクトするステップと；（ｉｉｉ）前記細胞を培養して前記細胞においてヘルパーウイルスおよび合成キメラワクシニア粒子の混合物を生成するステップと；（ｉｖ）ｓｃＶＡＣＶに特異的な宿主細胞の上で混合物を平板培養してｓｃＶＡＣＶを回収するステップとを含む方法に関する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、本開示の方法によって生成される合成キメラワクシニアウイルス（ｓｃＶＡＣＶ）に関する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、本開示の合成キメラワクシニアウイルス（ｓｃＶＡＣＶ）および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、被験体において腫瘍溶解性応答を誘導するための方法であって、被験体に本開示のｓｃＶＡＣＶを含む組成物を投与するステップを含む方法に関する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、宿主細胞において異種タンパク質を発現させる方法であって、異種核酸配列を本開示のｓｃＶＡＣＶに導入するステップと、宿主細胞をｓｃＶＡＣＶに感染させるステップと、宿主細胞を異種タンパク質の発現のための条件の下で培養するステップとを含む方法に関する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、ワクシニアウイルスに対する免疫応答を誘発またはブーストする方法であって、それを必要とする被験体に本開示のｓｃＶＡＣＶを含む組成物を投与するステップを含む方法に関する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、痘瘡ウイルス感染に対する免疫応答を誘発またはブーストする方法であって、前記被験体に本開示のｓｃＶＡＣＶを含む組成物を投与するステップを含む方法に関する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、サル痘ウイルス感染に対する免疫応答を誘発またはブーストする方法であって、前記被験体に本開示のｓｃＶＡＣＶを含む組成物を投与するステップを含む方法に関する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、ヒト被験体を免疫化して前記被験体を痘瘡ウイルス感染から防御する方法であって、前記被験体に本開示のｓｃＶＡＣＶを含む組成物を投与するステップを含む方法に関する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、痘瘡ウイルス感染を処置する方法であって、前記被験体に本開示のｓｃＶＡＣＶを含む組成物を投与するステップを含む方法に関する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、被験体においてがんを処置する方法であって、それを必要とする被験体に本開示のｓｃＶＡＣＶを含む組成物を投与するステップを含む方法に関する。
【００２２】
この特許出願は、色刷りの少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を有するこの特許出願のコピーは、請求および必要な手数料の支払いによって特許庁から提供される。
【００２３】
上の概要ならびに本開示の以下の詳細な記載は、付随図面と一緒に読むときにより良く理解される。本開示を例示する目的で、図面において現在好ましい実施形態（複数可）が示される。しかし、本開示は、示される正確な構成および手段に限定されないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１−１】図１Ａおよび１Ｂは、直鎖状ｄｓＤＮＡ  ＶＡＣＶゲノム株ＡＣＡＭ２０００；Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＡＹ３１３８４７の概略図を示す。図１Ａは、ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ゲノムの未改変のゲノム配列を例示し、天然に存在するＡａｒＩおよびＢｓａＩ制限部位が示される。図１Ｂは、大きなｄｓＤＮＡ断片を化学合成するために使用した、改変されたＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ゲノムを表す。重複ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ゲノム断片は、青で表す。左の逆方向末端反復配列（ＬＩＴＲ）および右の逆方向末端反復配列（ＲＩＴＲ）においてサイレント変異されなかった、操作されたＢｓａＩ制限部位も示される。
【図１−２】同上。
【図１−３】同上。
【図１−４】同上。
【００２５】
【図２−１】図２Ａ〜２Ｃは、（Ａ）ＶＡＣＶ  ＷＲ株および（Ｂ）ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の公開されたゲノムの最初の約１５００〜３０００ｂｐの詳細な概略図を示す。タンデムリピート領域は、赤色（７０ｂｐ反復配列）、青色（１２５ｂｐ反復配列）および緑色（５４ｂｐ反復配列）のボックスで示される。遺伝子Ｃ２３Ｌに対応するＯＲＦも、ゲノムの各々において示される。（Ｃ）ＶＡＣＶ  ＷＲの７０ｂｐ反復配列を含有する直接反復配列領域の概略図。この配列は、ヘアピン／二重鎖部分およびＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＩＴＲ断片をそれぞれライゲーションするために、５’末端のＳａｐＩ制限部位および３’末端のＮｈｅＩ制限部位を含有するように合成された。
【図２−２】同上。
【図２−３】同上。
【図２−４】同上。
【図２−５】同上。
【図２−６】同上。
【００２６】
【図３−１】図３Ａおよび３Ｂは、二重鎖ＤＮＡを有するワクシニアウイルス末端ヘアピンループの最初の７０ｂｐ反復配列へのアセンブリーを示す。（Ａ）ＷＲ二重鎖ＤＮＡを作製するように順序付けられた、リン酸化オリゴヌクレオチド配列を表す。（Ｂ）ＷＲ株二重鎖ＤＮＡ（レーン２）およびヘアピンＤＮＡだけ（レーン３）および続くライゲーション（レーン４）のゲル電気泳動を表す。ライゲーション生成物（矢印）は、その後ゲルから切り出され、精製されたので、それは、ｗｔＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００配列の配列を模倣するために７０ｂｐ反復配列にライゲーションすることができた。
【図３−２】同上。
【図３−３】同上。
【図３−４】同上。
【００２７】
【図４−１】図４は、ＳａｐＩ／ＮｈｅＩ消化７０ｂｐ反復配列断片のＷＲ株ヘアピン／二重鎖ＤＮＡ断片へのライゲーションを示す。ヘアピン／二重鎖ＤＮＡの７０ｂｐ断片に対する５：１のモル比でのヘアピン／二重鎖ＤＮＡ断片とのライゲーションの前に、７０ｂｐ反復配列断片をＳａｐＩおよびＮｈｅＩで消化し、次いでゲル精製した。レーン４およびレーン５の概ね２３００ｂｐのバンドにおける上方シフトは、ヘアピン／二重鎖断片の付加の成功を示す。これらのバンドは、その後、消化されたＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＩＴＲ断片へのライゲーションの前にゲルからゲル抽出された。
【図４−２】同上。
【００２８】
【図５−１】図５は、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００断片の消化を示す。ＩＴＲ断片は、ＮｈｅＩ／Ｉ−ＳｃｅＩの両方によって３７℃で２時間消化し、続いてアルカリホスファターゼによって脱リン酸化してリン酸基を除去し、この断片の末端ヘアピンループ／二重鎖／７０ｂｐタンデムリピート断片へのより効率的なライゲーションを促進した。他のｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＤＮＡプラスミドは、Ｉ−ＳｃｅＩによって３７℃で２時間線状化し、その後、６５℃で１０分間の制限酵素の熱不活化が続いた。
【図５−２】同上。
【００２９】
【図６−１】図６は、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖特性を示す。サル腎臓上皮細胞（ＢＳＣ−４０）で測定した多段階増殖動態。細胞を感染多重度０．０３で感染させ、示した時間にウイルスを採収し、ＢＳＣ−４０細胞でウイルスを滴定した。データは、３件の独立した実験を表す。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【図６−２】同上。
【００３０】
【図７−１】図７は、ＹＦＰ−ｇｐｔマーカーがＪ２Ｒ遺伝子配列（ＶＡＣ＿ＷＲΔＪ２Ｒ）で置き換えられているｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰおよびｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰならびにｗｔＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００と比較した、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰおよびｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖特性を示す。サル腎臓上皮細胞（ＢＳＣ−４０）で測定した多段階増殖動態。細胞を感染多重度０．０３で感染させ、示した時間にウイルスを採収し、ＢＳＣ−４０細胞でウイルスを滴定した。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【図７−２】同上。
【００３１】
【図８−１】図８は、再活性化ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰクローンの制限エンドヌクレアーゼマッピングを示す。パルスフィールドゲル電気泳動分析。２つの独立したｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰクローン、ならびにＹＦＰ−ｇｐｔマーカーがＪ２Ｒ遺伝子配列（ＶＡＣ＿ＷＲΔＪ２Ｒ）で置き換えられているＶＡＣＶ  ＷＲ対照およびｗｔＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００対照（ＶＡＣ＿ＡＣＡＭ２０００）を精製し、次いで消化せずに放置したか、ＢｓａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩまたはＮｏｔＩおよびＰｖｕＩで消化した。ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００クローンにおけるＢｓａＩ部位のほぼ全ての予想された不在が、明らかだった。ＶＡＣ＿ＷＲΔＪ２ＲおよびＶＡＣＶ＿ＡＣＡＭ２０００と比較して、ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ゲノムＤＮＡにおける軽微な差が観察された。ＮｏｔＩおよびＰｖｕＩで消化したゲノムＤＮＡは、左および右のＩＴＲ配列で見出される７０ｂｐタンデムリピート断片を切り出す。ＶＡＣ＿ＷＲΔＪ２Ｒでは、７０ｂｐ反復配列のおよそのサイズは、約３．６ｋｂｐである。興味深いことに、２つの独立したｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００クローンにおいて、７０ｂｐタンデムリピートに対応する２つの異なるサイズのバンドが観察された（＊で印を付ける）が、完全長７０ｂｐタンデムリピートエレメントはＩＴＲ断片にライゲーションされていた。ＡＣＡＭ２０００ゲノムＤＮＡをＮｏｔＩおよびＰｖｕＩで消化したとき、約４．７ｋｂｐのバンドが観察され、それはＡＣＡＭ２０００における７０ｂｐ反復配列のサイズを示すことができる。
【図８−２】同上。
【００３２】
【図９−１】図９は、ＶＡＣＶ株の配列間のヌクレオチド配列変動を示す。図９Ａは、ＩＴＲ（配列番号１５〜１８）における二重鎖領域の中のＶＡＣＶヌクレオチド配列変動を表す。図９Ｂは、ＡＣＡＭ２０００の直鎖状ｄｓＤＮＡゲノムの末端に共有結合しているＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００二次ヘアピンループを表す（Ｓ型配列番号１９およびＦ型配列番号２０）。末端ループ配列は、緑色で強調される。
【図９−２】同上。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
一般技術
本明細書で別途規定されない限り、本出願で使用する科学用語および専門用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。一般的に、本明細書に記載される、薬理学、細胞および組織培養、分子生物学、細胞およびがん生物学、神経生物学、神経化学、ウイルス学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学に関連して使用される命名法およびそれらの技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。相反する場合には、定義を含めた本明細書が支配する。
【００３４】
本開示の実施は、別途指示がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を用い、それらは当分野の技術の範囲内である。そのような技術は、文献に、例えば、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  second  edition  (Sambrook  et  al.,  1989)  Cold  Spring  Harbor  Press；Oligonucleotide  Synthesis  (M.J.  Gait,  ed.,  1984)；Methods  in  Molecular  Biology,  Humana  Press；Cell  Biology:  A  Laboratory  Notebook  (J.E.  Cellis,  ed.,  1998)  Academic  Press；Animal  Cell  Culture  (R.I.  Freshney,  ed.,  1987)；Introduction  to  Cell  and  Tissue  Culture  (J.P.  Mather  and  P.E.  Roberts,  1998)  Plenum  Press；Cell  and  Tissue  Culture:  Laboratory  Procedures  (A.  Doyle,  J.B.  Griffiths,  and  D.G.  Newell,  eds.,  1993-1998)  J.  Wiley  and  Sons；Methods  in  Enzymology  (Academic  Press,  Inc.)；Gene  Transfer  Vectors  for  Mammalian  Cells  (J.M.  Miller  and  M.P.  Calos,  eds.,  1987)；Current  Protocols  in  Molecular  Biology  (F.M.  Ausubel  et  al.,  eds.,  1987)；PCR:  The  Polymerase  Chain  Reaction,  (Mullis  et  al.,  eds.,  1994)；Sambrook  and  Russell,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  3rd.  ed.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  NY  (2001)；Ausubel  et  al.,  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  John  Wiley  &  Sons,  NY  (2002)；Harlow  and  Lane  Using  Antibodies:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  NY  (1998)；Coligan  et  al.,  Short  Protocols  in  Protein  Science,  John  Wiley  &  Sons,  NY  (2003)；Short  Protocols  in  Molecular  Biology  (Wiley  and  Sons,  1999)に完全に説明されている。
【００３５】
酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般的に達成される通りに、または本明細書に記載される通りに、製造業者の仕様書に従って実行される。本明細書に記載される分析化学、生化学、免疫学、分子生物学、有機合成化学ならびに医薬および製薬化学に関連して使用される命名法、ならびにその検査法および技術は、当技術分野で周知であり一般的に使用されるものである。化学合成および化学分析のために、標準の技術が使用される。
【００３６】
本明細書および実施形態全体を通して、単語「含む（comprise）」または「含む（comprises）」もしくは「含んでいる（comprising）」などの変形形態は、明示される整数または整数の群が含まれることを暗示するが、他のいかなる整数または整数の群も除外されることを暗示しないものと理解される。
【００３７】
実施形態が「含んでいる」という言葉と一緒に本明細書に記載される場合はいつでも、「からなる」および／または「から本質的になる」という用語で記載される他の類似した実施形態も提供されることが理解される。
【００３８】
用語「含む」は、「を限定されずに含む」ことを意味するために使用される。「含む」および「を限定されずに含む」は、互換的に使用される。
【００３９】
「例えば（e.g.）」または「例えば（for  example）」という用語に続く任意の例（複数可）は、網羅的でも限定的であることも意図しない。
【００４０】
文脈が別途要求しない限り、単数形用語は複数形を含み、複数形用語は単数形を含むものとする。
【００４１】
冠詞「a」、「an」および「the」は、本明細書において、その冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素」は１つの要素または１つより多くの要素を意味する。本明細書で「約」のついた値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーター自体に向けられる実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。数値範囲は、その範囲を規定する数字を含む。
【００４２】
本開示の広い範囲を示す数値範囲およびパラメーターは近似値であるにもかかわらず、具体的な実施例に示す数値はできるだけ正確に報告される。しかし、いかなる数値も、それらのそれぞれの試験測定値で見出される標準偏差から必然的に生じる、ある特定の誤差を本来的に含有する。さらに、本明細書に開示される全ての範囲は、その中に包含されるあらゆる部分的範囲を包含すると理解すべきである。例えば、「１〜１０」の明記された範囲は、１の最小値および１０の最大値の間のあらゆる部分範囲；すなわち、１またはそれより大きい、例えば１〜６．１の最小値から始まり、１０またはそれより小さい、例えば５．５〜１０の最大値で終える、全ての部分範囲を含む（その両端を含む）と考えるべきである。
【００４３】
例示的な方法および材料が本明細書に記載されるが、本明細書に記載されるそれらに類似するかまたは同等である方法および材料を、本出願の実施または試験で使用することもできる。材料、方法および実施例は例示されるだけであり、限定するものではない。
【００４４】
定義
以下の用語は、別途指示がない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする：
本明細書で使用される場合、用語「野生型ウイルス」、「野生型ゲノム」、「野生型タンパク質」または「野生型核酸」は、ある特定の集団（例えば、特定のウイルス種等）の中に天然に存在する、アミノ酸または核酸の配列を指す。
【００４５】
用語「キメラ」または「操作された」または「改変された」（例えば、キメラワクシニア、操作されたポリペプチド、改変ポリペプチド、操作された核酸、改変核酸）またはその文法上の変形形態は本明細書において互換的に使用され、天然の配列と比較して１つまたは複数の変化を有するように操作されている、非天然配列を指す。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「合成ウイルス」は、合成ＤＮＡ（例えば、化学合成ＤＮＡ、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、操作されたＤＮＡ、ヌクレオシド類似体を含むポリヌクレオチド等、またはその組合せ）から最初に誘導されるウイルスを指し、その後代を含み、後代は、自然、偶然または故意の変異のために、元の親合成ウイルスと必ずしも完全に同一（形態または総ゲノムＤＮＡにおいて）でなくてもよい。一部の実施形態では、合成ウイルスは、ウイルスゲノムの実質的に全てが合成ＤＮＡ（例えば、化学合成ＤＮＡ、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、操作されたＤＮＡ、ヌクレオシド類似体を含むポリヌクレオチド等、またはその組合せ）から最初に誘導されるウイルスを指す。好ましい実施形態では、合成ウイルスは、化学合成ＤＮＡから誘導される。
【００４７】
本明細書の他の場所で概説されるように、ウイルスゲノムのある特定の位置を変更することができる。本明細書で使用される「位置」は、ゲノム配列の中の位置を意味する。対応する位置は、他の親配列とのアラインメントを通して一般的に決定される。
【００４８】
本明細書で使用される場合、ポリペプチドとの関連で用語「残基」は、直鎖状ポリペプチド鎖の中のアミノ酸単位を指す。それは、α−アミノ酸、すなわちＮＨ２−ＣＨＲ−ＣＯＯＨからのポリペプチドの形成において水が除去された後の、各アミノ酸の残りのもの、すなわち−ＮＨ−ＣＨＲ−Ｃ−である。
【００４９】
当技術分野で公知であるように、本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドの鎖を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変されたヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらの類似体、または、ＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによって鎖に組み込むことができる任意の基質であってもよい。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体を含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造の改変は鎖のアセンブリーの前または後に与えることができる。ヌクレオチドの配列には、非ヌクレオチド構成成分が割り込むことができる。ポリヌクレオチドは、例えば標識構成成分とのコンジュゲーションによって、重合の後にさらに改変されてもよい。他のタイプの改変には、例えば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドの１つまたは複数の類似体による置換；ヌクレオチド間改変、例えば非荷電結合によるもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）、および荷電結合によるもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）；ペンダント部分、例えばタンパク質を含有するもの（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシン等）；インターカレーターを有するもの（例えば、アクリジン、ソラレン等）；キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属等）を含有するもの；アルキル剤を含有するもの；改変された連結を有するもの（例えば、アルファアノマー核酸等）；ならびにポリヌクレオチド（複数可）の未改変の形態が含まれる。さらに、糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれも、例えばホスホネート基、リン酸基と置き換えるか、標準の保護基によって保護するか、または、追加のヌクレオチドへの追加の連結を調製するために活性化するか、または、固体支持体にコンジュゲートすることができる。５’および３’末端のＯＨは、リン酸化するか、または１から２０個の炭素原子のアミンもしくは有機キャップ形成基部分で置換することができる。他のヒドロキシルを、標準の保護基に誘導体化することもできる。ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、アルファまたはベータアノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体および無塩基ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドを含む、当技術分野で一般的に公知であるリボースまたはデオキシリボース糖の類似した形態を含有することもできる。１つまたは複数のホスホジエステル結合を、代替の連結基と置き換えてもよい。これらの代替の連結基には、限定されずに、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）で置き換えられる実施形態が含まれ、ここで、各ＲまたはＲ’は独立してＨであるか、またはエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジルを必要に応じて含有する、置換型もしくは非置換型のアルキル（１〜２０Ｃ）である。ポリヌクレオチドの全ての結合が同一である必要はない。上の記載は、本明細書において言及されるＲＮＡおよびＤＮＡを含む全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００５０】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は本明細書で互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸の鎖を指す。鎖は直鎖状または分枝状であってもよく、それは改変アミノ酸を含むことができ、および／またはアミノ酸以外が割り込んでもよい。本用語は、天然にまたは介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変、例えば標識構成成分とのコンジュゲーションによって改変されているアミノ酸鎖も包含する。例えば、アミノ酸の１つまたは複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸等を含む）ならびに当技術分野で公知の他の改変を含有するポリペプチドも、この定義の中に含まれる。ポリペプチドは、単一の鎖または会合した鎖として存在することができると理解される。
【００５１】
「相同な」は、全てのその文法上の形態およびつづり方の変形形態において、同じ種の生物体のスーパーファミリーからのタンパク質ならびに異なる種の生物体からの相同タンパク質を含む、「共通の進化起点」を有する２つのタンパク質の間の関係を指す。そのようなタンパク質（およびそれらのコード核酸）は、同一性パーセントの点であれ、または特異的残基もしくはモチーフおよび保存された位置の存在によるものであれ、それらの配列類似性によって反映されるように、配列相同性を有する。「相同な」は、ウイルスにとって天然である核酸を指すこともできる。
【００５２】
しかし、一般的な用法および本出願では、用語「相同な」は、「高度に」などの副詞で修飾される場合は配列類似性を指すことができ、共通の進化起点に関しても関しなくてもよい。
【００５３】
「異種」は、全てのその文法上の形態およびつづり方の変形形態において、ウイルスにとって非天然である核酸を指すことができる。それは、その核酸がそれに対して異種であると記載される生物体の核酸と異なる種または異なる株から誘導されることを意味する。非限定的な例では、ｓｃＶＡＣＶのウイルスゲノムは、異種末端ヘアピンループを含む。前記異種末端ヘアピンループは、異なるウイルス種から、または異なるＶＡＣＶ株から誘導することができる。
【００５４】
用語「配列類似性」は、全てのその文法上の形態において、共通の進化起点を共有しても共有しなくてもよい核酸またはアミノ酸配列の間の同一性または対応の程度を指す。
【００５５】
参照ポリペプチド（またはヌクレオチド）配列に関する「配列同一性パーセント（％）」または「に％同一である配列」は、配列を整列させ、必要に応じて最大の配列同一性パーセントを達成するためにギャップを導入した後の、また、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えない場合の、参照ポリペプチド（ヌクレオチド）配列中のアミノ酸残基（または核酸）と同一である候補配列中のアミノ酸残基（または核酸）の百分率と規定される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当該分野の技術の範囲内である様々な方法で、例えば公開されているコンピュータソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適当なパラメーターを決定することができる。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」には、本開示のウイルスのレシピエントであってよいかまたはそうであった個々の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞は、単一の宿主細胞の後代を含み、後代は、自然、偶然または故意の変異のために、元の親細胞と必ずしも完全に同一（形態または総ゲノムＤＮＡにおいて）でなくてもよい。宿主細胞には、この開示のポックスウイルスによってｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクトされた、および／または形質転換された細胞が含まれる。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、宿主細胞において目的の１つまたは複数の遺伝子または配列を送達すること、および好ましくは発現することが可能である構築物を意味する。ベクターの例には、限定されずに、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤に関連したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および産生細胞などのある特定の真核細胞が含まれる。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「単離された分子」（この分子は、例えばポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはその断片である）は、その誘導起点または起源のために、（１）天然の状態でそれに付随している１つまたは複数の天然に結合している構成成分に結合していないか、（２）同じ種からの１つまたは複数の他の分子を実質的に含有しないか、（３）異なる種からの細胞によって発現されるか、または（４）天然に存在しない分子である。したがって、化学合成されるかまたはそれが天然に由来する細胞と異なる細胞系において発現される分子は、その天然に結合している構成成分から「単離される」。分子は、当技術分野で周知である精製技術を使用して、単離によって天然に結合している構成成分を実質的に含まないようにすることもできる。分子の純度または均一性は、当技術分野で周知であるいくつかの手段によって検査することができる。例えば、ポリペプチド試料の純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および、当技術分野で周知である技術を使用してポリペプチドを可視化するためのゲル染色を使用して検査することができる。ある特定の目的のために、ＨＰＬＣまたは精製のために当技術分野で周知である他の手段を使用してより高い分解能を提供することができる。
【００５９】
本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、ウイルスとの関連で、単一の親ウイルスに由来するウイルスを指す。ウイルスは、プラーク精製および限界希釈に基づくものを限定されずに含む、当業者に公知であるルーチンの方法を使用して単離することができる。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「感染多重度」または「ＭＯＩ」という語句は、感染細胞あたりのウイルスの平均数である。ＭＯＩは、加えられるウイルスの数（加えられるｍｌ×プラーク形成単位（ＰＦＵ））を加えられる細胞の数（加えられるｍｌ×細胞数／ｍｌ）によって割ることによって決定される。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「精製する」およびその文法上の変形形態は、完全であろうと部分的であろうと、ポリペプチドおよび１つまたは複数の不純物を含有する混合物からの少なくとも１つの不純物の除去を指し、それにより、組成物中のポリペプチドの純度のレベルが改善される（すなわち、組成物中の不純物（複数可）の量（ｐｐｍ）を低下させることによって）。本明細書で使用される場合、ウイルスとの関連で「精製された」は、そのウイルスが由来する細胞または組織供給源からの細胞性物質および培養培地を実質的に含有しないウイルスを指す。「細胞性物質を実質的に含有しない」という言葉は、それが単離されたかまたは組換えで生成された細胞の細胞性構成成分からウイルスが分離されている、ウイルスの調製物を含む。したがって、細胞性物質を実質的に含有しないウイルスは、約３０％、２０％、１０％または５％未満（乾燥重量による）の細胞性タンパク質（本明細書では「混在タンパク質」とも呼ばれる）を有するタンパク質の調製物を含む。ウイルスは培養培地も実質的に含有せず、すなわち、培養培地はウイルス調製物の体積の約２０％、１０％または５％未満を占める。ウイルスは、クロマトグラフィーおよび遠心分離を限定されずに含む、当業者に公知であるルーチンの方法を使用して精製することができる。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋な」は、少なくとも５０％純粋である（すなわち、夾雑物を含有しない）、より好ましくは少なくとも９０％純粋である、より好ましくは少なくとも９５％純粋である、さらにより好ましくは少なくとも９８％純粋である、最も好ましくは少なくとも９９％純粋である物質を指す。
【００６３】
用語「患者」、「被験体」または「個体」は本明細書で互換的に使用され、ヒトまたは非ヒト動物を指す。これらの用語は、哺乳動物、例えばヒト、霊長類、畜産動物（ウシ、ブタ、ラクダ等を含む）、伴侶動物（例えば、イヌ、ネコ等）および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）を含む。
【００６４】
本明細書で使用される場合、用語「予防する」、「予防すること」および「予防」は、療法（例えば、予防剤または治療剤）の投与の結果としての、被験体における疾患（例えば、ポックスウイルス感染症）の１つまたは複数の症状の再発もしくは開始の遅延またはその低減を指す。例えば、感染症のための被験体への療法の投与との関連で、「予防する」、「予防すること」および「予防」は、療法（例えば、予防剤または治療剤）の投与、または療法の組合せ（例えば、予防剤または治療剤の組合せ）の投与からもたらされる、被験体における感染症（例えば、ポックスウイルス感染症またはそれに付随する状態）の発達もしくは開始の阻害もしくは低減、または感染症（例えば、ポックスウイルス感染症もしくはそれに付随する状態）の１つもしくは複数の症状の再発、開始もしくは発達の予防を指す。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置すること」または「処置」は、状態または患者を処置することを指し、臨床上の結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためにステップをとることを指す。感染症（例えば、ポックスウイルス感染症または痘瘡ウイルス感染症）に関して、処置は、１つまたは複数の療法の投与（１つまたは複数の予防剤または治療剤の投与を限定されずに含む）からもたらされる、感染因子（例えば、ポックスウイルスまたは痘瘡ウイルス）の根絶もしくは複製の制御、感染因子の数の低減（例えば、ウイルス力価の低減）、感染症（例えば、ポックスウイルス／天然痘感染症またはそれに付随する状態もしくは症状）の進行、重症度および／もしくは持続期間の低減もしくは改善、または１つまたは複数の症状の改善を指す。がんに関して、処置は、本開示の１つまたは複数の治療剤の投与からもたらされる、原発性、限局性または転移性がん組織の根絶、除去、改変または制御を指す。ある特定の実施形態では、そのような用語は、本開示の１つまたは複数の治療剤のそのような疾患を有する被験体への投与からもたらされる、がんの拡散を最小にするかまたは遅延させることを指す。他の実施形態では、そのような用語は、病原細胞の排除を指す。
【００６６】
被験体に物質、化合物または薬剤を「投与すること」または「投与」は、当業者に公知である様々な方法の１つを使用して実行することができる。例えば、化合物または薬剤は、舌下または鼻腔内に、肺への吸入によって、または直腸に投与することができる。投与することは、例えば、１回、複数回、および／または延長された１期間もしくは複数期間にわたって実行することもできる。一部の態様では、投与は、自己投与を含む直接投与、および薬物を処方する行為を含む間接投与の両方を含む。例えば、本明細書で使用される場合、薬物を自己投与すること、もしくは薬物を別の者に投与してもらうことを患者に指示する医師、および／または患者に薬物の処方を提供する医師は、患者に薬物を投与している。
【００６７】
本明細書に記載される各実施形態は、個々に、または本明細書に記載される任意の他の実施形態と組み合わせて使用することができる。
【００６８】
概要
ポックスウイルスは、感染細胞の細胞質の中で複製する大きな（約２００ｋｂｐ）ＤＮＡウイルスである。Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ（ＯＰＶ）属は、異なる宿主に感染するそれらの能力が大きく異なるいくつかのポックスウイルスを含む。ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）は、例えば、幅広い群の宿主に感染することができるが、天然痘の病原体である痘瘡ウイルス（ＶＡＲＶ）はヒトに感染するだけである。全てのポックスウイルスとまではいかないが多くに共通する特徴は、宿主の中で非遺伝的に「再活性化する」それらの能力である。非遺伝的再活性化は、１つのポックスウイルスに感染した細胞が、それ自体では非感染性だろう第２の「死」ウイルス（例えば熱によって不活化されるもの）の回復を促進することができる過程を指す。
【００６９】
ウイルスライフサイクルは、ビリオンの中にパッケージされるウイルスコードＲＮＡポリメラーゼを通して初期遺伝子の転写を必要とするので、精製されたポックスウイルスＤＮＡは感染性でない。しかし、以前にヘルパーポックスウイルスに感染し、トランスフェクトされたゲノムをトランスで転写、複製およびパッケージするのに必要とされる必要な因子を提供する細胞の中にウイルスＤＮＡがトランスフェクトされるならば、この欠陥は克服することができる（Sam  CK,  Dumbell  KR.  Expression  of  poxvirus  DNA  in  coinfected  cells  and  marker  rescue  of  thermosensitive  mutants  by  subgenomic  fragments  of  DNA.  Ann  Virol  (Inst  Past).  1981;132:135-50）。これは混合されたウイルス後代を生成するが、両方のウイルスの増殖を支持する細胞系において再活性化反応を実行し、次いで、ヘルパーウイルスの増殖を支持しない細胞の上でウイルスの混合物を平板培養することによってヘルパーウイルスを排除することによって、この問題を克服することができる（Scheiflinger  F,  Dorner  F,  Falkner  FG.  Construction  of  chimeric  vaccinia  viruses  by  molecular  cloning  and  packaging.  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America.  1992;89(21):9977-81）。
【００７０】
以前に、ＹａｏおよびＥｖａｎｓは、ウイルスＤＮＡの複数の重複断片を使用して組換えワクシニア株を迅速にアセンブルするために、Ｌｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）によって触媒される高頻度組換えおよび複製反応を、ＳＦＶ触媒再活性化反応と共役させることができる方法を記載した（Yao  XD,  Evans  DH.  High-frequency  genetic  recombination  and  reactivation  of  orthopoxviruses  from  DNA  fragments  transfected  into  leporipoxvirus-infected  cells.  Journal  of  Virology.  2003;77(13):7281-90）。初めて、化学合成された重複する二本鎖ＤＮＡ断片を使用した、機能的合成キメラワクシニアウイルス［ｓｃＶＡＣＶ］の再活性化および特徴付けが記載される。
【００７１】
本開示の合成キメラワクシニアウイルス
一態様では、本発明は、化学合成ＤＮＡから最初に複製され、アセンブルされる、機能的合成キメラワクシニアウイルス（ｓｃＶＡＣＶ）を提供する。本開示の方法によって生成することができるウイルスは、そのゲノムが配列決定をされているかもしくは大部分配列決定をすることができる、またはその天然の分離株が利用可能である、任意のワクシニアウイルスであってよい。様々な実施形態のｓｃＶＡＣＶは、天然に存在する株、バリアントまたは変異体、変異誘発されたウイルスまたは遺伝子操作ウイルスのゲノム配列に基づくことができる。一部の実施形態では、ｓｃＶＡＣＶのウイルスゲノムは、野生型ゲノムまたは前記ウイルスの基礎ゲノム配列と比較して１つまたは複数の改変を含む。改変は、１つまたは複数の欠失、挿入、置換またはその組合せを含むことができる。一実施形態では、改変は、外来性ＤＮＡを挿入することができるように、１つまたは複数の多重クローニング部位の挿入を含むことができる。改変は、当技術分野で一般的に公知である任意の数の方法で導入することができると理解される。ゲノムの改変部分は、化学合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから誘導することができる。別の実施形態では、本開示のｓｃＶＡＣＶのウイルスゲノムは、１つまたは複数の特異な制限部位を付加するかまたは修復するために、１つまたは複数の改変を含む。１つまたは複数の制限部位を付加するかまたは修復する改変は、クローン選択を促進するために排除された制限部位で実行することができる。
【００７２】
化学的ゲノム合成は、従来の分子生物学的方法による遺伝子改変、増幅また複製で天然の鋳型を利用できない場合、特に有益である。ｗｔＶＡＣＶ（ＮＹＣＢＨ株、クローンＡＣＡＭ２０００）のためのゲノム配列が記載され、公開されているが、それは完全でなかった。末端ヘアピンループの配列は決定されておらず、４つの５４ｂｐ反復配列だけが同定された。７０ｂｐ、１２５ｂｐおよび５４ｂｐのタンデムリピート配列の存在が、配列決定後にＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の野生型分離株において確認され、ＡＣＡＭ２０００の現在公開されている配列が不完全だったことを示した。本発明者らは、機能的合成キメラＶＡＣＶ（ｓｃＶＡＣＶ）を作製した。具体的には、本発明者らは、ＶＡＣＶの自身の末端ヘアピンループ配列の代わりに異なる株のｗｔＶＡＣＶテロメアに基づいて末端ヘアピンループを使用して、機能的ｓｃＶＡＣＶ株ＮＹＣＢＨ、クローンＡＣＡＭ２０００の作製に成功した。一部の実施形態では、ＶＡＣＶウイルスのウイルスゲノムは、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ、クローン３、Ｔｉａｎ  Ｔｉａｎ、Ｔｉａｎ  ＴｉａｎクローンＴＰ５、Ｔｉａｎ  ＴｉａｎクローンＴＰ３、ＮＹＣＢＨ、ＮＹＣＢＨクローンＡｃａｍｂｉｓ  ２０００、Ｗｙｅｔｈ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒ  １０７、Ｌｉｓｔｅｒ−ＬＯ、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ１、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ２、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ３、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ４、Ｌｉｓｔｅｒ  ＣＴＣ１、Ｌｉｓｔｅｒ  ＩＭＧ２（Ｔｕｒｂｏ  ＦＰ６３５）、ＩＨＤ−Ｗ、ＬＣ１６ｍ１８、Ｌｅｄｅｒｌｅ、ＴａｓｈｋｅｎｔクローンＴＫＴ３、ＴａｓｈｋｅｎｔクローンＴＫＴ４、ＵＳＳＲ、Ｅｖａｎｓ、Ｐｒａｈａ、Ｌ−ＩＶＰ、Ｖ−ＶＥＴ１またはＬＩＶＰ６．１．１、Ｉｋｅｄａ、ＥＭ−６３、Ｍａｌｂｒａｎ、Ｄｕｋｅ、３７３７、ＣＶ−１、Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｅｒｒｏ  ２、ＣＭ−０１、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１３、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１５、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ２０、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１７、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ２１、ＶＡＣＶ−ＩＯＣ、漿尿膜ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＣＶＡ）、改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）およびＭＶＡ−ＢＮの群から選択される株である。好ましい実施形態では、ウイルスゲノムは、ＮＹＣＢＨ株に基づく。より好ましくは、ウイルスゲノムは、ＮＹＣＢＨ株、クローンＡｃａｍｂｉｓ  ２０００またはＡＣＡＭ２０００から誘導される。新規のＶＡＣＶ株が、なお継続的に発見されている。本開示のｓｃＶＡＣＶは、そのような新たに発見されるＶＡＣＶ株に基づくことができるものと理解される。
【００７３】
Ｄｒｙｖａｘ（登録商標）は、ワクシニアウイルスのＮｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ株（Ｗｙｅｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍａｒｉｅｔｔａ、ＰＡ）から誘導され、子ウシの皮膚で増殖され、次いで保存のために事実上フリーズドライされた。
【００７４】
ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００株、天然痘（ワクシニア）生ワクチンは、Ｄｒｙｖａｘ（登録商標）からのプラーク精製クローニングから誘導され、アフリカミドリザル腎臓（Ｖｅｒｏ）細胞で増殖され、試験の結果偶発因子を含有しない生ワクシニアウイルスである（Osborne  JD  et  al.  Vaccine.  2007;  25(52):8807-32）。
【００７５】
Ｖ−ＶＥＴ１またはＬＩＶＰ６．１．１は、Ｇｅｎｅｌｕｘによって開発された。それはワクシニアウイルスのＬｉｓｔｅｒ株の野生型ストック（Ｌｉｓｔｅｒ株、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（ＬＩＶＰ）、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）から単離され、「天然の」ウイルスを表す（いかなる遺伝子操作も実行されていない）。ＬＩＶＰ６．１．１ウイルスのチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子は、不活性である（Shvalov  AN  et  al.  Genome  Announc.  2016  May-Jun;  4(3):  e00372-16）。
【００７６】
ＧＬＶ−１ｈ６８（臨床調査のために製造される場合、ＧＬ−ＯＮＣ１と呼ばれる）は、ウミシイタケルシフェラーゼ−Ａｅｑｕｏｒｅａ緑色蛍光タンパク質融合（Ｒｕｃ−ＧＦＰ）、ＬａｃＺおよびβ−グルクロニダーゼをコードする３つの発現カセットを、ウイルスゲノムのＦ１４．５Ｌ、Ｊ２Ｒ（チミジンキナーゼ）およびＡ５６Ｒ（血球凝集素）遺伝子座にそれぞれ挿入することによって、ＧｅｎｅｌｕｘによってＬｉｓｔｅｒ株から開発された（Zhang  Q  et  al.  Cancer  Res.  2007;  67(20):10038-46.）。
【００７７】
化学的ウイルスゲノム合成は、多数の有益な改変を生じるゲノムに、またはその特異的部分に導入する可能性も開く。改変は、ウイルスを作製するためにクローニングの容易さを向上させること、組換え遺伝子生成物の導入のための部位を提供すること、再活性化されたウイルスクローンを同定することの容易さを向上させること、および／または過剰の他の有益な特徴（例えば、所望の抗原を導入すること、腫瘍溶解性ウイルスを生成すること等）を付与することができる。一部の実施形態では、改変は、１つまたは複数の病原性因子の弱毒化または欠失を含むことができる。一部の実施形態では、改変は、１つまたは複数の病原性調節遺伝子または遺伝子コード調節因子の付加または挿入を含むことができる。
【００７８】
伝統的に、ポックスウイルスの末端ヘアピンはクローニングおよび配列決定が困難だったので、公開されたゲノム配列（例えば、ＶＡＣＶ、ＡＣＡＭ２０００およびＨＰＸＶ  ＭＮＲ−７６）のいくつかが不完全であることは意外でない。具体的には、ｗｔＶＡＣＶ、ＮＹＣＢＨ株、クローンＡＣＡＭ２０００のゲノム配列が記載され、公開されているが、それは完全でない。末端ヘアピンループの配列は決定されておらず、４つの５４ｂｐ反復配列だけが同定された。ｗｔＶＡＣＶ株ＮＹＣＢＨ、クローンＡＣＡＭ２０００ゲノムの公開された配列は不完全であるので、ヘアピンは正確に複製することができず、本出願の前までは、ｗｔＶＡＣＶゲノムの既知の部分だけに基づいてＶＡＣＶをポリヌクレオチドから複製し、アセンブルすることができるかどうかはわかっていなかった。１つの株ウイルスからのヘアピンが別の株において作動可能だろうこともわかっていなかった。本発明者らは、ＶＡＣＶの自身の末端ヘアピンループ配列の代わりに異なる株のｗｔＶＡＣＶテロメアに基づいて末端ヘアピンループを使用して、機能的合成キメラＶＡＣＶ（ｓｃＶＡＣＶ）ＡＣＡＭ２０００を作製した。例示的な実施形態では、ＶＡＣＶ  ＷＲ株テロメアの公開された配列をガイドとして使用してｓｓＤＮＡ断片を化学合成し、ＶＡＣＶ株ＮＹＣＢＨの左および右の末端を含むｄｓＤＮＡ断片の上へライゲーションした。一部の実施形態では、末端ヘアピンは、そのゲノムが完全に配列決定されているかまたはその天然分離株がゲノム配列決定で利用可能である、任意のＶＡＣＶ株の末端ヘアピンに基づく。一部の実施形態では、末端ヘアピンループは、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ、クローン３、Ｔｉａｎ  Ｔｉａｎ、Ｔｉａｎ  ＴｉａｎクローンＴＰ５、Ｔｉａｎ  ＴｉａｎクローンＴＰ３、ＮＹＣＢＨ、ＮＹＣＢＨクローンＡｃａｍｂｉｓ  ２０００、Ｗｙｅｔｈ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒ  １０７、Ｌｉｓｔｅｒ−ＬＯ、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ１、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ２、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ３、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ４、Ｌｉｓｔｅｒ  ＣＴＣ１、Ｌｉｓｔｅｒ  ＩＭＧ２（Ｔｕｒｂｏ  ＦＰ６３５）、ＩＨＤ−Ｗ、ＬＣ１６ｍ１８、Ｌｅｄｅｒｌｅ、ＴａｓｈｋｅｎｔクローンＴＫＴ３、ＴａｓｈｋｅｎｔクローンＴＫＴ４、ＵＳＳＲ、Ｅｖａｎｓ、Ｐｒａｈａ、Ｌ−ＩＶＰ、Ｖ−ＶＥＴ１またはＬＩＶＰ６．１．１、Ｉｋｅｄａ、ＥＭ−６３、Ｍａｌｂｒａｎ、Ｄｕｋｅ、３７３７、ＣＶ−１、Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｅｒｒｏ  ２、ＣＭ−０１、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１３、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１５、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ２０、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１７、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ２１、ＶＡＣＶ−ＩＯＣ、漿尿膜ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＣＶＡ）、改変されたワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）およびＭＶＡ−ＢＮの群から選択される株に基づく。好ましい実施形態では、末端ヘアピンループは、ＶＡＣＶのＷｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ株（ＷＲ株）に基づく。新規のＶＡＣＶ株が、なお継続的に発見されている。本��示のｓｃＶＡＣＶは、そのような新たに発見されるＶＡＣＶ株に基づくことができるものと理解される。
【００７９】
別の実施形態では、本開示のｓｃＶＡＣＶのウイルスゲノムは、相同または異種の末端ヘアピンループおよびヘアピンループの下流に位置するタンデムリピート領域（７０ｂｐ、１２５ｂｐおよび５４ｂｐタンデムリピート）を含み、ここで、タンデムリピート領域は、ｗｔＶＡＣＶ（すなわち、天然に存在するウイルス）と異なる数の反復配列を含む。ＶＡＣＶウイルス株ＷＲに見出される７０ｂｐ、１２５ｂｐおよび５４ｂｐタンデムリピートの反復配列の数は、それぞれ２２、２および８であった。別の実施形態では、タンデムリピート領域の数は、異なるポックスウイルス、異なるワクシニアウイルス、および異なるワクシニアウイルス株で変動する。相同末端ヘアピンループという用語は、前記末端ヘアピンループが同じウイルス種／同じ株に由来することを意味し、異種末端ヘアピンループという用語は、前記末端ヘアピンループが異なるウイルス種／異なる株に由来することを意味する。
【００８０】
一部の実施形態では、改変は、１つまたは複数の制限部位の欠失を含むことができる。一部の実施形態では、改変は、１つまたは複数の制限部位の導入を含むことができる。一部の実施形態では、ゲノムから欠失させるかまたはゲノムに付加される制限部位は、限定されずに、ＡａｎＩ、ＡａｒＩ、ＡａｓＩ、ＡａｔＩ、ＡａｔＩＩ、ＡｂａＳＩ、ＡｂｓＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＡｃｃＩ、ＡｃｃＩＩ、ＡｃｃＩＩＩ、ＡｃｉＩ、ＡｃｌＩ、ＡｃｕＩ、ＡｆｅＩ、ＡｆｌＩＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＡｇｅＩ、ＡｈｄＩ、ＡｌｅＩ、ＡｌｕＩ、ＡｌｗＩ、ＡｌｗＮＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＡｐｅＫＩ、ＡｐｏＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｅＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢａｅＧＩ、ＢａｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢａｎＩ、ＢａｎＩＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＣＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｌＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆａＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｆｕＣＩ、ＢｇｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｌｐＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｍｔＩ、ＢｐｍＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＪＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＨＫＡＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｏＢＩ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｐＥＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＦαＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｓＳαＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢｓｔＹＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＢｔｇＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓαＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩＭｕｔＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣｌａＩ、ＣｓｐＣＩ、ＣｖｉＡＩＩ、ＣｖｉＫＩ−１、ＣｖｉＱＩ、ＤｄｅＩ、ＤｐｎＩ、ＤｐｎＩＩ、ＤｒａＩ、ＤｒｄＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ５３ｋＩ、ＥｃｏＮＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＦａｔＩ、ＦａｕＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｏｋＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＥＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｈＩ、Ｈｐｙ１６６ＩＩ、Ｈｐｙ１８８Ｉ、Ｈｐｙ１８８ＩＩＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＡＶ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＫａｓＩ、ＫｐｎＩ、ＬｐｎＰＩ、ＭｂｏＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＣＩ、ＭｌｕＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＭｓｃＩ、ＭｓｅＩ、ＭｓｌＩ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｓｐＩ、ＭｓｐＪＩ、ＭｗｏＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｃｉＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＮｈｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｉＩ、ＮｓｐＩ、ＰａｃＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｃｉＩ、ＰｆｌＦＩ、ＰｆｌＭＩ、ＰｌｅＩ、ＰｌｕＴＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｐｕＭＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｉＩ、ＰｓｐＧＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｓｐＸＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＲｓａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｐＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＳｂｆＩ、ＳｃｒＦＩ、ＳｅｘＡＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｆｃＩ、ＳｆｉＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｍｌＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｒｆＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、ＳｔｙＩ、ＳｗａＩ、ＴａｑαＩ、ＴｆｉＩ、ＴｓｅＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＴｓｐＭＩ、ＴｓｐＲＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、ＸｂａＩ、ＸｃｍＩ、ＸｈｏＩ、ＸｍａＩ、ＸｍｎＩまたはＺｒａＩなどの制限部位の１つまたは複数から選択することができる。任意の所望の制限部位（複数可）または制限部位の組合せをゲノムに挿入することまたは変異させること、および／またはゲノムから排除することができるものと理解される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡａｒＩ部位がウイルスゲノムから欠失させられる。一部の実施形態では、１つまたは複数のＢｓａＩ部位がウイルスゲノムから欠失させられる。一部の実施形態では、１つまたは複数の制限部位がゲノムから完全に排除される（例えば、ウイルスゲノムの中の全てのＡａｒＩ部位を排除することができる）。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡｖａＩ制限部位がウイルスゲノムに導入される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳｔｕＩ部位がウイルスゲノムに導入される。一部の実施形態では、１つまたは複数の改変は、ｌｏｘＰまたはＦＲＴ部位を限定されずに含む、組換え標的の組込みを含むことができる。
【００８１】
一部の実施形態では、改変は、蛍光マーカー、例えば、限定されずに、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）、強化されたＧＦＰ、黄色蛍光性タンパク質（ＹＦＰ）、シアン／青色蛍光性タンパク質（ＢＦＰ）、赤色蛍光性タンパク質（ＲＦＰ）またはそのバリアント等；選択マーカー、例えば、限定されずに、薬物耐性マーカー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｏｎｉｇｅｒピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩ遺伝子（ｎｐｔＩ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子ＩＩ（ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）、ｓｈ  ｂｌｅ遺伝子等；タンパク質またはペプチドタグ、例えば、限定されずに、ＭＢＰ（マルトース結合性タンパク質）、ＣＢＤ（セルロース結合性ドメイン）、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−転移酵素）、ポリ（Ｈｉｓ）、ＦＬＡＧ、Ｖ５、ｃ−Ｍｙｃ、ＨＡ（血球凝集素）、ＮＥ−タグ、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質）、ルシフェラーゼ、プロテインＡ、プロテインＧ、ストレプトアビジン、Ｔ７、チオレドキシン、酵母２−ハイブリッドタグ、例えばＢ４２、ＧＡＬ４、ＬｅｘＡまたはＶＰ１６；局在化タグ、例えば、ＮＬＳ−タグ、ＳＮＡＰ−タグ、Ｍｙｒ−タグ等の導入を含むことができる。当技術分野で公知である他の選択マーカーおよび／またはタグを使用することができるものと理解される。一部の実施形態では、改変は、再活性化されたウイルスクローンの選択を助けるために、再活性化されたクローンの選択を助ける１つまたは複数の選択マーカー（例えば、ＹＦＰなどの蛍光マーカー、ｇｐｔなどの薬物選択マーカー等）を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の選択マーカーは、選択ステップの後に再活性化されたクローンから欠失される。
【００８２】
一態様では、本発明のｓｃＶＡＣＶは、病原性のポックスウイルス感染症（例えば、ＶＡＲＶ、ＭＰＸＶ、ＭＣＶ、ＯＲＦＶ、Ａｕｓｄｙｋウイルス、ＢＰＳＶ、アザラシポックスウイルス等）に対して防御するワクチンとして、病原性のポックスウイルス感染症（例えば、ＶＡＲＶ、ＭＰＸＶ、ＭＣＶ、ＯＲＦＶ、Ａｕｓｄｙｋウイルス、ＢＰＳＶ、アザラシポックスウイルス等）を処置もしくは予防する治療剤として、異種遺伝子発現のためのビヒクルとして、または腫瘍溶解剤として使用することができる。一部の実施形態では、ｓｃＶＡＣＶは、ＶＡＲＶ感染症に対して防御するワクチンとして使用することができる。一部の実施形態では、ｓｃＶＡＣＶは、ＶＡＲＶ感染症を処置または予防するために使用することができる。
【００８３】
合成キメラＶＡＣＶの製造方法
一態様では、本発明は、ウイルスゲノムの化学合成された重複する二本鎖ＤＮＡ断片から機能的合成キメラＶＡＣＶ（ｓｃＶＡＣＶ）を合成、再活性化および単離するためのシステムおよび方法を提供する。ウイルスゲノムの重複するＤＮＡ断片の組換えおよび機能的ｓｃＶＡＣＶの再活性化は、以前にヘルパーウイルスに感染した細胞で実行される。簡潔には、ｓｃＶＡＣＶのウイルスゲノムの全部または実質的に全部を包含する重複するＤＮＡ断片を化学合成し、ヘルパーウイルス感染細胞にトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を培養して、ヘルパーウイルスおよび再活性化ｓｃＶＡＣＶを含む混合したウイルス後代を生成する。次に、ヘルパーウイルスを排除し、合成キメラワクシニアウイルスを回収するために、ヘルパーウイルスの増殖を支持しないが、合成キメラワクシニアウイルスの増殖を可能にする宿主細胞の上に、混合したウイルス後代を平板培養する。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、宿主細胞に感染しない。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは宿主細胞に感染することができるが、宿主細胞において十分に増殖しない。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、ｓｃＶＡＣＶと比較して宿主細胞においてより遅く増殖する。
【００８４】
一部の実施形態では、合成キメラワクシニアウイルスゲノムの実質的に全ては、化学合成ＤＮＡから誘導される。一部の実施形態では、合成キメラワクシニアウイルスゲノムの約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、９９％超、または１００％は、化学合成ＤＮＡから誘導される。一部の実施形態では、ワクシニアウイルスゲノムは、化学合成ＤＮＡおよび天然に存在するＤＮＡの組合せから誘導される。一部の実施形態では、ワクシニアウイルスゲノムを包含する断片の全ては、化学合成される。一部の実施形態では、断片の１つまたは複数は化学合成され、断片の１つまたは複数は天然に存在するＤＮＡから誘導される（例えば、ＰＣＲ増幅によって、または確立された組換えＤＮＡ技術によって）。
【００８５】
本開示の方法で使用される重複するＤＮＡ断片の数は、ワクシニアウイルスゲノムのサイズに依存する。実際的な考慮事項、例えば、一方では断片の数の増加に伴う組換え効率の低下、および他方では断片の数の減少に伴う非常に大きなＤＮＡ断片の合成における困難も、本開示の方法で使用される重複する断片の数について情報を与える。一部の実施形態では、合成キメラワクシニアウイルスゲノムは、単一の断片として合成することができる。一部の実施形態では、合成キメラワクシニアウイルスゲノムは、２〜１４個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。一部の実施形態では、合成キメラワクシニアウイルスゲノムは、４〜１２個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。一部の実施形態では、合成キメラワクシニアウイルスゲノムは、６〜１２個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。一部の実施形態では、合成キメラワクシニアウイルスゲノムは、８〜１１個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。一部の実施形態では、合成キメラワクシニアウイルスゲノムは、８〜１０個、１０〜１２個または１０〜１４個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。一部の実施形態では、合成キメラワクシニアウイルスゲノムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。好ましい実施形態では、合成キメラワクシニアウイルスゲノムは、９個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。本開示の例示的な実施形態では、合成ワクシニアウイルス（ｓｃＶＡＣＶ）は、９つの化学合成された重複する二本鎖ＤＮＡ断片から再活性化される。一部の実施形態では、末端ヘアピンループは別々に合成されて、ワクシニアウイルスゲノムの左および右の末端を含む断片の上へライゲーションされる。一部の実施形態では、末端ヘアピンループは、天然に存在する鋳型から誘導することができる。一部の実施形態では、ｓｃＶＡＣＶの末端ヘアピンは、ｗｔＶＡＣＶから誘導される。一部の実施形態では、末端ヘアピンは、ＶＡＣＶの自身の末端ヘアピンループ配列の代わりに、異なる株のｗｔＶＡＣＶ末端ヘアピンから誘導される。一部の実施形態では、末端ヘアピンは、そのゲノムが完全に配列決定されているかまたはその天然分離株がゲノム配列決定で利用可能である、任意のｗｔＶＡＣＶの末端ヘアピンに基づく。
【００８６】
本発明の方法の様々な態様において使用される重複する断片のサイズは、ワクシニアウイルスゲノムのサイズに依存する。断片サイズに広い変動があってよいこと、および非常に大きなＤＮＡ断片を化学合成する能力などの様々な実際的な考慮事項が、断片サイズの選択について情報を与えることが理解される。一部の実施形態では、断片は、サイズが約２，０００ｂｐから約５０，０００ｂｐの範囲内である。一部の実施形態では、断片は、サイズが約３，０００ｂｐから約４５，０００ｂｐの範囲内である。一部の実施形態では、断片は、サイズが約４，０００ｂｐから４０，０００ｂｐの範囲内である。一部の実施形態では、断片は、サイズが約５，０００ｂｐから３５，０００ｂｐの範囲内である。一部の実施形態では、最大の断片は、約１８，０００ｂｐ、２０，０００ｂｐ、２１，０００ｂｐ、２２，０００ｂｐ、２３，０００ｂｐ、２４，０００ｂｐ、２５，０００ｂｐ、２６，０００ｂｐ、２７，０００ｂｐ、２８，０００ｂｐ、２９，０００ｂｐ、３０，０００ｂｐ、３１，０００ｂｐ、３２，０００ｂｐ、３３，０００ｂｐ、３４，０００ｂｐ、３５，０００ｂｐ、３６，０００ｂｐ、３７，０００ｂｐ、３８，０００ｂｐ、３９，０００ｂｐ、４０，０００ｂｐ、４１，０００ｂｐ、４２，０００ｂｐ、４３，０００ｂｐ、４４，０００ｂｐ、４５，０００ｂｐ、４６，０００ｂｐ、４７，０００ｂｐ、４８，０００ｂｐ、４９，０００ｂｐまたは５０，０００ｂｐである。本開示の例示的な実施形態では、ｓｃＶＡＣＶは、サイズが約１０，０００ｂｐから約３２，０００ｂｐの範囲内である、９つの化学合成された重複する二本鎖ＤＮＡ断片から再活性化される（表１）。
【００８７】
ヘルパーウイルスは、トランスフェクトされたＤＮＡからポックスウイルスを再活性化するために必要なトランス作用性酵素機構を提供することができる、任意のポックスウイルスであってよい。ヘルパーウイルスは、生成されるｓｃＶＡＣＶと異なるかまたはより狭い宿主細胞範囲を有することができる（例えば、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）は、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）またはＨＰＸＶなどのオルソポックスウイルスと比較して非常に狭い宿主範囲を有する）。ヘルパーウイルスは、生成されるｓｃＶＡＣＶと比較して異なるプラーク表現型を有することができる。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、Ｌｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｌｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓは、ＳＦＶ、野兎線維腫ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、リス線維腫ウイルスまたは粘液腫ウイルスである。好ましい実施形態では、ヘルパーウイルスは、ＳＦＶである。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓは、ラクダ痘ウイルス（ＣＭＬＶ）、牛痘ウイルス（ＣＰＸＶ）、エクトロメリアウイルス（ＥＣＴＶ、「マウス痘因子」）、ＨＰＸＶ、サル痘ウイルス（ＭＰＸＶ）、ウサギ痘ウイルス（ＲＰＸＶ）、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス、ウアシンギシュー病ウイルス、ＶＡＣＶおよびハタネズミ痘ウイルス（ＶＰＶ）である。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、Ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｃａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｃｅｒｖｉｄｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｃｒｏｃｏｄｙｌｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｍｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ、ＳｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓまたはＹａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、鶏痘ウイルスである。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、Ａｌｐｈａｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｉｒｕｓ、ＢｅｔａｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｉｒｕｓまたはＧａｍｍａｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、ソラレン不活化ヘルパーウイルスである。本開示の例示的な実施形態では、ｓｃＶＡＣＶは、ＳＦＶ感染ＢＧＭＫ細胞にトランスフェクトされる重複するＤＮＡ断片から再活性化される。次いで、混合されたウイルス後代をＢＳＣ−４０細胞の上に平板培養することによって、ＳＦＶを排除する。
【００８８】
熟練者は、ｓｃＶＡＣＶの再活性化のために適切な宿主細胞が使用され、ｓｃＶＡＣＶの選択および／または単離は、ヘルパーウイルスおよび本開示の方法の様々な態様によって生成されるキメラポックスウイルスの特定の組合せに依存することを理解する。ヘルパーウイルスおよびｓｃＶＡＣＶの両方の増殖を支持する任意の宿主細胞を再活性化ステップのために使用することができ、ヘルパーウイルスを排除し、ｓｃＶＡＣＶを選択および／または単離するために、ヘルパーウイルスの増殖を支持しない任意の宿主細胞を使用することができる。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスはＬｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓであり、再活性化ステップのために使用される宿主細胞は、ウサギ腎臓細胞（例えば、ＬＬＣ−ＲＫ１、ＲＫ１３等）、ウサギ肺細胞（例えば、Ｒ９ａｂ）、ウサギ皮膚細胞（例えば、ＳＦ１Ｅｐ、ＤＲＳ、ＲＡＢ−９）、ウサギ角膜細胞（例えば、ＳＩＲＣ）、ウサギ癌腫細胞（例えば、Ｏｃ４Ｔ／ｃｃ）、ウサギ皮膚／癌腫細胞（例えば、ＣＴＰＳ）、サル細胞（例えば、Ｖｅｒｏ、ＢＧＭＫ等）またはハムスター細胞（例えば、ＢＨＫ−２１等）から選択することができる。好ましい実施形態では、宿主細胞は、ＢＧＭＫ細胞である。
【００８９】
一部の実施形態では、ｓｃＶＡＣＶは、本明細書に記載されるｓｃＶＡＣＶの使用を可能にする力価までウイルスが増殖することを可能にする、任意の培養基で増殖させることができる。一実施形態では、培養基は、ｓｃＶＡＣＶが、対応する野生型ウイルスのために決定されるものと同等の力価まで増殖することを可能にする。一部の実施形態では、ｓｃＶＡＣＶは、ＶＡＣＶによる感染に感受性である細胞（例えば、鳥類の細胞、コウモリの細胞、ウシの細胞、ラクダの細胞、カナリアの細胞、ネコの細胞、シカの細胞、ウマの細胞、ニワトリの細胞、スナネズミの細胞、ヤギの細胞、ヒトの細胞、サルの細胞、ブタの細胞、ウサギの細胞、アライグマの細胞、アザラシの細胞、ヒツジの細胞、スカンクの細胞、ハタネズミの細胞等）で増殖させることができる。そのような方法は、当業者に周知である。代表的な哺乳動物細胞には、限定されずに、ＢＨＫ、ＢＧＭＫ、ＢＲＬ３Ａ、ＢＳＣ−４０、ＣＥＦ、ＣＥＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＣＶＩ、ＨａＣａＴ、ＨＥＬ、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３、ヒト骨肉腫細胞系１４３Ｂ、ＭＤＣＫ、ＮＩＨ／３Ｔ３およびベロ細胞が含まれる。ウイルス単離のために、一般的に周知の浄化手順、例えば、密度勾配遠心分離およびカラムクロマトグラフィーによってｓｃＶＡＣＶは細胞培養物から取り出され、細胞構成成分から分離され、所望により、プラークアッセイなどの当業者に周知の手順を使用してさらに精製することができる。
【００９０】
本発明の別の態様では、合成キメラワクシニアウイルス（ｓｃＶＡＣＶ）を製造する方法は、（ｉ）ワクシニアウイルスのウイルスゲノムの実質的に全てに対応する重複ＤＮＡ断片を化学合成するステップ、およびワクシニアウイルスの別の株から末端ヘアピンループを化学合成するステップと；（ｉｉ）重複ＤＮＡ断片をヘルパーウイルス感染細胞にトランスフェクトするステップと；（ｉｉｉ）前記細胞を培養して前記細胞においてヘルパーウイルスおよび合成キメラワクシニアウイルス粒子の混合物を生成するステップと；（ｉｖ）ｓｃＶＡＣＶに特異的な宿主細胞の上で混合物を平板培養してｓｃＶＡＣＶを回収するステップとを含む。一部の実施形態では、本方法のｓｃＶＡＣＶは、ＮＹＣＢＨ株、クローンＡｃａｍｂｉｓ２０００に由来し、末端ヘアピンループはワクシニアウイルスのＷｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ株に由来する。
【００９１】
本開示のポリヌクレオチド
一態様では、本発明は、機能的合成キメラポックスウイルス（ｓｃＶＡＣＶ）を製造するためのポリヌクレオチド（例えば、二本鎖ＤＮＡ断片）を提供する。一部の実施形態では、本発明は、合成ＤＮＡ（例えば、化学合成ＤＮＡ、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、操作されたＤＮＡ、ヌクレオシド類似体を含むポリヌクレオチド等）から機能的ｓｃＶＡＣＶを製造する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ウイルスゲノムの化学合成された重複する二本鎖ＤＮＡ断片から機能的ｓｃＶＡＣＶを製造する方法を提供する。本発明の様々な態様のポリヌクレオチドは、公開されているゲノム配列に基づいて設計することができる。ワクシニアウイルスの天然分離株が直ちに利用できる場合、本開示のポリヌクレオチドを選択および設計する前に、ウイルスゲノムを配列決定することができる。あるいは、ワクシニアウイルスの部分的ＤＮＡ配列が、例えば感染者に関連した材料からの臨床分離株からか、法医学試料からかまたはＰＣＲ増幅ＤＮＡから利用可能である場合、本開示のポリヌクレオチドを選択および設計する前に、部分的ウイルスゲノムを配列決定することができる。一態様では、本発明のｓｃＶＡＣＶ、したがって本開示のポリヌクレオチドは、天然に存在する株、バリアントまたは変異体、変異誘発されたウイルスまたは遺伝子操作ウイルスのゲノム配列に基づくことができる。
【００９２】
一態様では、本発明は、参照ＶＡＣＶゲノム配列またはその相補体の全部または一部に、少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％または９４％同一）、少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一）、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。本開示の単離されたポリヌクレオチドは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００ｂｐまたはそれより多くの、参照ポリヌクレオチド分子（例えば、参照ＶＡＣＶゲノムまたはその断片）の連続または不連続のヌクレオチドを含むことができる。当業者は、核酸に相補的な核酸配列および核酸のバリアントも、本出願の範囲内にあることを理解する。さらなる実施形態では、本開示の核酸配列は、単離すること、組み換えること、および／または異種ヌクレオチド配列に融合することができ、またはＤＮＡライブラリーの中にあってもよい。
【００９３】
一部の態様では、本発明はｓｃＶＡＣＶを製造するためのポリヌクレオチドを提供し、ここで、ＶＡＣＶは以下の株から選択される：Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ、クローン３、Ｔｉａｎ  Ｔｉａｎ、Ｔｉａｎ  ＴｉａｎクローンＴＰ５、Ｔｉａｎ  ＴｉａｎクローンＴＰ３、ＮＹＣＢＨ、ＮＹＣＢＨクローンＡｃａｍｂｉｓ  ２０００、Ｗｙｅｔｈ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒ  １０７、Ｌｉｓｔｅｒ−ＬＯ、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ１、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ２、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ３、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ４、Ｌｉｓｔｅｒ  ＣＴＣ１、Ｌｉｓｔｅｒ  ＩＭＧ２（Ｔｕｒｂｏ  ＦＰ６３５）、ＩＨＤ−Ｗ、ＬＣ１６ｍ１８、Ｌｅｄｅｒｌｅ、ＴａｓｈｋｅｎｔクローンＴＫＴ３、ＴａｓｈｋｅｎｔクローンＴＫＴ４、ＵＳＳＲ、Ｅｖａｎｓ、Ｐｒａｈａ、Ｌ−ＩＶＰ、Ｖ−ＶＥＴ１またはＬＩＶＰ６．１．１、Ｉｋｅｄａ、ＥＭ−６３、Ｍａｌｂｒａｎ、Ｄｕｋｅ、３７３７、ＣＶ−１、Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｅｒｒｏ  ２、ＣＭ−０１、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１３、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１５、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ２０、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１７、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ２１、ＶＡＣＶ−ＩＯＣ、漿尿膜ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＣＶＡ）、改変されたワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）およびＭＶＡ−ＢＮ。好ましい実施形態では、ｓｃＶＡＣＶは、ＮＹＣＢＨ株クローンＡｃａｍｂｉｓ  ２０００またはＡＣＡＭ２０００から誘導される。
【００９４】
一態様では、本発明は、合成キメラワクシニアウイルス（ｓｃＶＡＣＶ）を製造するためのポリヌクレオチドを提供する。具体的な実施形態では、ｓｃＶＡＣＶゲノムは、ＶＡＣＶ株ＮＹＣＢＨクローンＡＣＡＭ２０００のために記載される公開されたゲノム配列に基づくことができる（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＹ３１３８４７；Osborne  JD  et  al.  Vaccine.  2007;  25(52):8807-32）。本発明の様々な態様では、本開示の方法を使用して機能的ｓｃＶＡＣＶ粒子を製造するために、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）株ＷＲからの末端ヘアピンループを、ＶＡＣＶゲノム株ＮＹＣＢＨクローンＡＣＡＭ２０００の末端の上へライゲーションすることができることが示されている。一部の実施形態では、本開示の方法を使用して機能的ｓｃＶＡＣＶ粒子を製造するために、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）株ＡＣＡＭ２０００からの末端ヘアピンループを、ＶＡＣＶゲノム株ＮＹＣＢＨクローンＡＣＡＭ２０００の末端の上へライゲーションすることができる。ｓｃＶＡＣＶゲノムは、本開示の実施例に記載の通りに、および表１に示される通りに、９つの重複する断片に分割することができる。一部の実施形態では、ＶＡＣＶゲノムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の重複する断片に分割することができる。一部の実施形態では、全体のゲノムを１つの断片として提供することができる。断片サイズは、表１に示す。一部の実施形態では、ＶＡＣＶゲノムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の重複する断片に分割することができる。一部の実施形態では、全体のゲノムを１つの断片として提供することができる。断片サイズは、表１に示す。本発明の様々な態様のポリヌクレオチドは、配列番号１〜９と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、これらの配列のバリアントを含み、ここで、そのようなバリアントは、ミスセンス変異、ナンセンス変異、重複、欠失および／または付加を含むことができる。配列番号１３および配列番号１４は、ＶＡＣＶ（ＷＲ株）末端ヘアピンループのヌクレオチド配列を表す。配列番号１９および配列番号２０は、ＶＡＣＶ（ＡＣＡＭ２０００株）末端ヘアピンループのヌクレオチド配列を表す。一部の実施形態では、末端ヘアピンループは、配列番号１３または配列番号１４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、末端ヘアピンループは、配列番号１９または配列番号２０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む。
【００９５】
他の実施形態では、ｓｃＶＡＣＶゲノムは、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＮＣ００６９９８；Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＡＹ２４３３１２）、ＣＬ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＡＹ３１３８４８）、Ｔｉａｎ  Ｔｉａｎ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＡＦ０９５６８９．１）、Ｔｉａｎ  ＴｉａｎクローンＴＰ５（ＪＸ４８９１３６）、ＴＰ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＫＣ２０７８１０）およびＴＰ５（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＫＣ２０７８１１）、ＮＹＣＢＨ、Ｗｙｅｔｈ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託Ｍ３５０２７）、ＮＹＣＢＨクローンＡｃａｍｂｉｓ  ２０００（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＡＹ３１３８４７）、Ｌｉｓｔｅｒ  １０７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＤＱ１２１３９４）、Ｌｉｓｔｅｒ−ＬＯ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＡＹ６７８２７６）、改変されたワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託Ｕ９４８４８；Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＡＹ６０３３５５）、ＭＶＡ−ＢＮ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＤＱ９８３２３８）、Ｌｅｄｅｒｌｅ、ＴａｓｈｋｅｎｔクローンＴＫＴ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＫＭ０４４３０９）およびＴＫＴ４（ＫＭ０４４３１０）、ＵＳＳＲ、Ｅｖａｎｓ、Ｐｒａｈａ、ＬＩＶＰ、Ｉｋｅｄａ、ＩＨＤ−Ｗ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＫＪ１２５４３９）、ＬＣ１６ｍ８（ＡＹ６７８２７５）、ＥＭ−６３、ＩＣ、Ｍａｌｂｒａｎ、Ｄｕｋｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＤＱ４３９８１５）、３７３７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＤＱ３７７９４５）、ＶＡＣＶ−ＩＯＣ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＫＴ１８４６９０およびＫＴ１８４６９１）、ＣＶ−１、Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＶＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＡＭ５０１４８２）、Ｓｅｒｒｏ  ２ウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＫＦ１７９３８５）、Ｃａｎｔａｇｌｏウイルス分離株ＣＭ−０１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＫＴ０１３２１０）、ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１５（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＪＮ６５４９８１）、ＤＰＰ２０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＪＮ６５４９８５）、ＤＰＰ１３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＪＮ６５４９８０）、ＤＰＰ１７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＪＮ６５４９８３）、ＤＰＰ２１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＪＮ６５４９８６）から選択されるＶＡＣＶ株に基づく。
【００９６】
一態様では、本発明は、参照ｗｔＶＡＣＶゲノム配列の全部または一部と、少なくとも９０％同一である（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％または９４％同一である）、少なくとも９５％同一である（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一である）、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、本開示の単離されたポリヌクレオチドは、参照配列のバリアントを含み、ここで、そのようなバリアントは、ミスセンス変異、ナンセンス変異、重複、欠失および／または付加を含むことができる。一部の実施形態では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００ｂｐまたはそれより大きい、参照ポリヌクレオチド分子（例えば、参照ｗｔＶＡＣＶゲノム）の連続または非連続のヌクレオチドを含むことができる。
【００９７】
本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列のいずれかに相補的なポリヌクレオチドも、本出願に包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードするかまたはアンチセンスの）または二本鎖であってもよく、ＤＮＡ（ゲノムまたは合成の）またはＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子を含む。追加のコードまたは非コード配列は、そうする必要はないが、本開示のポリヌクレオチドの中に存在することができ、ポリヌクレオチドは、そうする必要はないが、他の分子および／または支持材料に連結することができる。
【００９８】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、下記のように最大の対応のために整列させたときに、２つの配列の中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が同じである場合、「同一である」と言われる。２つの配列の間の比較は、比較ウインドウにわたって配列を比較して、配列類似性の局所領域を同定し、比較することによって一般的に実行される。「比較ウインドウ」は、本明細書で使用される場合、少なくとも約２０、通常３０〜約７５、または４０〜約５０の連続した位置のセグメントを指し、ここでは、それらの２つの配列を最適に整列させた後に、配列を同数の連続した位置の参照配列と比較することができる。さらに、または代わりに、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、本明細書で提供されるポリヌクレオチドに実質的に相同的であってもよい。そのようなポリヌクレオチドバリアントは、中程度にストリンジェントな条件下で本開示のポリヌクレオチド（または、その相補体）にハイブリダイズすることが可能である。
【００９９】
好適な「中程度にストリンジェントな条件」は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液における予洗；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣで一晩のハイブリダイゼーション；続いて、０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣの各々による６５℃で２０分間の２回の洗浄を含む。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「高度にストリンジェントな条件」、または「高いストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄のために低いイオン強度および高い温度、例えば５０℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリダイゼーションの間に変性剤、例えばホルムアミド、例えば５０（ｖ／ｖ）％ホルムアミドと一緒に、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含むｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を４２℃で用いるもの；または、（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％硫酸デキストランを４２℃で用い、４２℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５５℃の５０％ホルムアミドで洗浄し、続いて、５５℃でＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシーで洗浄するものである。当業者は、プローブ長などの因子を適合させるために、必要に応じて温度、イオン強度等を調整する方法を認める。
【０１０１】
この開示のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え方法またはＰＣＲを使用して得ることができる。ポリヌクレオチドの化学合成の方法は当技術分野で周知であり、本明細書で詳細に記載する必要はない。当業者は、所望のＤＮＡ配列を製造するために、本明細書で提供される配列および市販のＤＮＡ合成装置提供者を使用することができる。
【０１０２】
組換え方法を使用してポリヌクレオチドを調製するために、所望の配列を含むポリヌクレオチドを好適なベクターに挿入することができ、ベクターは、本明細書でさらに議論されるように、複製および増幅のために好適な宿主細胞に次に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知である任意の手段によって宿主細胞に挿入することができる。細胞は、直接取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ−接合または電気穿孔法によって外来性ポリヌクレオチドを導入することによって形質転換される。導入されると、外来性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター（プラスミドなど）として細胞の中で維持することができるか、または宿主細胞ゲノムに組み入れることができる。そのように増幅されたポリヌクレオチドは、当技術分野で周知の方法によって宿主細胞から単離することができる。例えば、Sambrook  et  al.,  1989を参照。
【０１０３】
代わりに、ＰＣＲは、ＤＮＡ配列の再生産を可能にする。ＰＣＲ技術は当技術分野で周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、４，８００，１５９号、４，７５４，０６５号および４，６８３，２０２号、ならびにPCR:  The  Polymerase  Chain  Reaction,  Mullis  et  al.  eds.,  Birkauswer  Press,  Boston,  1994に記載される。
【０１０４】
ＲＮＡは、適切なベクターの中の単離されたＤＮＡを使用し、それを好適な宿主細胞に挿入することによって得ることができる。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡに転写されるとき、例えば、上記のSambrook  et  al.,  1989に示す通り、当業者に周知の方法を使用してＲＮＡを次いで単離することができる。
【０１０５】
他の実施形態では、本発明の核酸は、高度にストリンジェントな条件の下で配列番号１〜９に示すヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列またはそれに相補的である配列も含む。当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件は異なることができることを容易に理解する。例えば、約４５℃の６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）と、続く５０℃の２．０×ＳＳＣの洗浄で、ハイブリダイゼーションを実行することができる。例えば、洗浄ステップでの塩濃度は、５０℃の約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃の約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーから選択することができる。さらに、洗浄ステップでの温度は、約２２℃の室温の低ストリンジェンシー条件から約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで増加させることができる。温度と塩の両方を変化させることができるか、または温度もしくは塩濃度を一定に保持することができ、他の変数を変化させる。一実施形態では、本発明は、室温で６×ＳＳＣの低ストリンジェンシー条件と、続く室温で２×ＳＳＣでの洗浄の下でハイブリダイズする核酸を提供する。
【０１０６】
遺伝子コードの縮重のために異なる単離された核酸も、本発明の一部の態様の範囲内にある。例えば、いくつかのアミノ酸は、１つより多いトリプレットによって指定される。同じアミノ酸を指定するコドンまたは同義語（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジンの同義語である）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」変異をもたらすことができる。当業者は、特定のタンパク質をコードする核酸の１つまたは複数のヌクレオチド（ヌクレオチドの最大約３〜５％）におけるこれらの変動が、天然の対立遺伝子の変動のために、所与の種のメンバーの間に存在することができることを理解するであろう。あらゆるそのようなヌクレオチド変動および結果として生じるアミノ酸多型は、本出願の範囲内にある。
【０１０７】
本発明の一態様は、本開示のポリヌクレオチドをクローニングするのに有益である、組換えクローニングベクターおよび発現ベクターをさらに提供する。本発明の一態様は、ポリヌクレオチド分子または組換えベクターを含む形質転換宿主細胞、およびそこから誘導される新規の株または細胞系をさらに提供する。
【０１０８】
宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、糸状菌細胞、藻類の細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞であってよい。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。これらの宿主細胞の各々での特定の使用のために、ファージ、高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミドおよびシャトルベクターをとりわけ含む、様々な異なるベクターが開発され、これらのいずれも本開示を実施するために使用することができる。
【０１０９】
好適なクローニングベクターは標準の技術によって構築することができるか、または当技術分野で利用可能な多数のクローニングベクターから選択することができる。選択されるクローニングベクターは、使用する予定の宿主細胞によって異なってもよいが、有益なクローニングベクターは、自己複製する能力を一般的に有し、特定の制限エンドヌクレアーゼの単一の標的を有することができ、および／または、ベクターを含有するクローンの選択において使用することができるマーカーの遺伝子を有することができる。好適な例には、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、ｐＢＡＤ１８、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ  ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などのシャトルベクターが含まれる。これらおよび多くの他のクローニングベクターは、商業的ベンダー、例えばＢｉｏＲａｄ、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手できる。
【０１１０】
本開示のクローニングベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を助けるために、リポーター遺伝子生成物または他の選択マーカーのためのコード配列をさらに含むように、ベクターを操作することができる。そのようなコード配列は、上記の通り、好ましくは調節エレメントコード配列に作動可能に結合している。本発明の一部の態様において有益であるリポーター遺伝子は当技術分野で周知であり、とりわけ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、ｘｙｌＥおよびチロシナーゼをコードするものを含む。選択マーカーをコードするヌクレオチド配列は当技術分野で周知であり、抗生物質耐性または代謝拮抗物質耐性を付与する遺伝子生成物をコードするか、または、栄養要求性要件を供給するものを含む。そのような配列の例には、中でも、アンピシリン、エリスロマイシン、チオストレプトンまたはカナマイシンへの耐性をコードするものが含まれる。
【０１１１】
目的のポリヌクレオチドを含有するベクターおよび／またはポリヌクレオチドそれ自身は、電気穿孔法、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたは他の物質を用いるトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；ならびに感染（例えば、ベクターがワクシニアウイルスなどの感染因子である場合）を含む、いくつかの適切な手段のいずれかによって宿主細胞に導入することができる。導入ベクターまたはポリヌクレオチドの選択は、宿主細胞の特徴にしばしば依存する。
【０１１２】
本発明の一態様は、ポリヌクレオチド分子または組換えベクターを含む形質転換宿主細胞、およびそこから誘導される新規の株または細胞系をさらに提供する。一部の実施形態では、本発明の実施において有益な宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。Ｅ．ｃｏｌｉの株、例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０、ＵＳＡ、および商業的な供給源から入手できる、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０またはＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＤＨ５α等を一般的に使用することができる。一部の実施形態では、他の原核生物細胞または真核生物細胞を使用することができる。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、ＰｉｃｈｉａまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓから選択される属のメンバーである。そのような形質転換宿主細胞には、限定されずに、微生物、例えば、とりわけ組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡベクターで形質転換された細菌、または組換えベクターで形質転換された酵母が一般的に含まれる。好ましい真核生物の宿主細胞には酵母細胞が含まれるが、哺乳動物細胞または昆虫細胞を効果的に利用することもできる。好適な宿主細胞には、原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓまたはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）および酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＫ．ｌａｃｔｉｓ）が含まれる。
【０１１３】
一態様では、本発明は、ｓｃＶＡＣＶのゲノム、その組換え体、またはその機能的部分も含む。ウイルスゲノムの機能的部分は、タンパク質またはその一部（例えば、ドメイン、エピトープ等）をコードするゲノムの一部、調節エレメントまたは調節エレメントの構成成分、例えばプロモーター、エンハンサー、シスもしくはトランス作用性エレメント等を含む一部であってよい。そのようなウイルスの配列は、ウイルスまたはその組換え体を、例えばＰＣＲ、ハイブリダイゼーション技術を使用して、またはＥＬＩＳＡアッセイを確立することによって、同定または単離するために使用することができる。
【０１１４】
本開示の医薬組成物
一態様では、本発明は、本開示のｓｃＶＡＣＶおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【０１１５】
用語「薬学的に許容される」は、連邦もしくは州政府の規制機関に承認されたこと、または、動物、より詳細にはヒトでの使用のために米国薬局方もしくは他の公認の薬局方に掲載されていることを意味する。用語「担体」は、医薬組成物（例えば、免疫原性またはワクチンの製剤）が一緒に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液を、液体担体として、特に注射液として用いることもできる。好適な賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。好適な医薬担体の例は、E.  W.  Martinによる"Remington's  Pharmaceutical  Sciences"に記載される。製剤は、投与様式に適するべきである。
【０１１６】
一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、標準の投与経路によって投与することができる。製剤を被験体に導入するために多くの方法を使用することができ、これらには、限定されずに、鼻腔内、気管内、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、結膜および皮下経路が含まれる。
【０１１７】
例示的な使用
病原性ポックスウイルス感染症の予防または処置
一部の実施形態では、本発明の合成キメラワクシニアウイルス（ｓｃＶＡＣＶ）は、免疫化において使用することができるか、または病原性ポックスウイルス感染症に対する被験体の免疫応答を誘発もしくはブーストするために使用することができる。別の実施形態では、ｓｃＶＡＣＶは、ワクシニアウイルスに対する免疫応答を誘発またはブーストするために使用することができる。別の実施形態では、ｓｃＶＡＣＶは、痘瘡ウイルスに対する免疫応答を誘発またはブーストするために使用することができる。別の実施形態では、ｓｃＶＡＣＶは、サル痘ウイルスに対する免疫応答を誘発またはブーストするために使用することができる。別の実施形態では、ｓｃＶＡＣＶは、被験体における１つまたは複数の病原性ポックスウイルス感染症を予防、管理または処置するために、例えば痘瘡ウイルス感染症を処置するために使用することができる。一部の実施形態では、ｓｃＶＡＣＶは、ワクシニアウイルスの以下の株から選択される：Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ、クローン３、Ｔｉａｎ  Ｔｉａｎ、Ｔｉａｎ  ＴｉａｎクローンＴＰ５、Ｔｉａｎ  ＴｉａｎクローンＴＰ３、ＮＹＣＢＨ、ＮＹＣＢＨクローンＡｃａｍｂｉｓ  ２０００、Ｗｙｅｔｈ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒ  １０７、Ｌｉｓｔｅｒ−ＬＯ、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ１、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ２、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ３、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ４、Ｌｉｓｔｅｒ  ＣＴＣ１、Ｌｉｓｔｅｒ  ＩＭＧ２（Ｔｕｒｂｏ  ＦＰ６３５）、ＩＨＤ−Ｗ、ＬＣ１６ｍ１８、Ｌｅｄｅｒｌｅ、ＴａｓｈｋｅｎｔクローンＴＫＴ３、ＴａｓｈｋｅｎｔクローンＴＫＴ４、ＵＳＳＲ、Ｅｖａｎｓ、Ｐｒａｈａ、Ｌ−ＩＶＰ、Ｖ−ＶＥＴ１またはＬＩＶＰ６．１．１、Ｉｋｅｄａ、ＥＭ−６３、Ｍａｌｂｒａｎ、Ｄｕｋｅ、３７３７、ＣＶ−１、Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｅｒｒｏ  ２、ＣＭ−０１、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１３、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１５、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ２０、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１７、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ２１、ＶＡＣＶ−ＩＯＣ、漿尿膜ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＣＶＡ）、改変されたワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）およびＭＶＡ−ＢＮ。好ましい実施形態では、ｓｃＶＡＣＶは、ＮＹＣＢＨ株クローンＡｃａｍｂｉｓ  ２０００またはＡＣＡＭ２０００から誘導される。
【０１１８】
一態様では、本発明のｓｃＶＡＣＶは、免疫原性製剤、例えば、ワクチン製剤において使用することができる。製剤は、病原性ポックスウイルス感染症を予防、管理、中和、処置および／または改善するために使用することができる。免疫原性製剤は、生のまたは不活化されたｓｃＶＡＣＶを含むことができる。ｓｃＶＡＣＶは、当業者に周知の方法によって不活化することができる。一般的な方法は、不活化のためにホルマリンおよび熱を使用する。一部の実施形態では、免疫原性製剤は、生ワクチンを含む。そのような生の免疫原性製剤の製造は、細胞培養におけるｓｃＶＡＣＶの増殖とそれに続く精製を含む従来の方法を使用して達成することができる。例えば、熟練者が決定することができるように、ｓｃＶＡＣＶは、ＢＨＫ、ＢＧＭＫ、ＢＲＬ３Ａ、ＢＳＣ−４０、ＣＥＦ、ＣＥＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＣＶＩ、ＨａＣａＴ、ＨＥＬ、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３、ヒト骨肉腫細胞系１４３Ｂ、ＭＤＣＫ、ＮＩＨ／３Ｔ３、ベロ細胞等において培養することができる。
【０１１９】
一態様では、本発明のｓｃＶＡＣＶは、天然痘を予防、管理または処置するために使用することができる。別の態様では、本発明のｓｃＶＡＣＶは、天然痘に曝露したか、潜在的に曝露したか、または天然痘への曝露の危険がある個体または集団における、天然痘の予防のためのワクチンとして使用することができる。本発明の様々な態様のｓｃＶＡＣＶは、天然痘ワクチンの新規の国家備蓄を形成するために使用することができる。一部の実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶは、防御人員、最初の対応者等に予防的に投与することができる。
【０１２０】
一実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶを含む組成物は、天然痘ワクチンとして使用される。一態様では、本開示の方法によって製造される本発明のｓｃＶＡＣＶは、小さいプラークの表現型を有する。一般に、小さいプラークの表現型は、弱毒化を反映すると考えられる。したがって、本発明の様々な方法によって製造されるｓｃＶＡＣＶは、既存の天然痘ワクチンの安全な代替物を提供する。一部の実施形態では、このワクチンは、既存の天然痘ワクチンからの重度の合併症を患う可能性があり、したがって既存の天然痘ワクチンが禁忌である、免疫が抑制された被験体（例えば、ＨＩＶ患者、化学療法を受けている患者、がん、リウマチ性障害または自己免疫性障害の処置を受けている患者、臓器または組織移植を受けているかまたは受けた患者、免疫欠損患者、児童、妊娠女性、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、心臓状態を有する患者、および免疫抑制薬等を服用中の患者）への投与のために安全である可能性がある。一部の実施形態では、ワクチンは、ウイルスの複製を抑制するために、１つまたは複数の抗ウイルス処置と組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、ワクチンは、ウイルスの複製を抑制するために、ブリンシドフォビル処置と組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、ワクチンは、ウイルスの複製を抑制するために、テコビリマット／ＳＩＧＡ−２４６処置と組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、ワクチンは、非環式ヌクレオシドホスホネート（シドフォビル）、非環式ヌクレオシドまたはホスホネートの経口アルコキシアルキルプロドラッグ（ブリンシドフォビルまたはＣＭＸ００１）と組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、ワクチンは、ワクシニア免疫グロブリン（ＶＩＧ）と組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、ワクチンは、ＶＡＣＶ、ＶＡＲＶまたはＨＰＸＶから誘導されたペプチドまたはタンパク質抗原によって以前に免疫化された被験体において使用することができる。一部の実施形態では、ワクチンは、死滅または不活化ＶＡＣＶによって以前に免疫化された被験体において使用することができる。一部の実施形態では、ワクチンは、複製欠損／欠陥ＶＡＣＶウイルス株、ＭＶＡ（改変されたウイルスＡｎｋａｒａ）によって以前に免疫化された被験体において使用することができる。一部の実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶを含むワクチン製剤は、生のまたは不活化ｓｃＶＡＣＶを含むことができる。
【０１２１】
一実施形態では、本開示のｓｃＶＡＣＶを含む組成物は、天然痘ワクチンとして使用される。ｓｃＶＡＣＶは、ＡＣＡＭ２０００（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＡＹ３１３８４７）、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＮＣ００６９９８；Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＡＹ２４３３１２）、ＣＬ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＡＹ３１３８４８）、Ｔｉａｎ  Ｔｉａｎ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＡＦ０９５６８９．１）、Ｔｉａｎ  ＴｉａｎクローンＴＰ５（ＪＸ４８９１３６）、ＴＰ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＫＣ２０７８１０）およびＴＰ５（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＫＣ２０７８１１）、ＮＹＣＢＨ、Ｗｙｅｔｈ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託Ｍ３５０２７）、ＮＹＣＢＨクローンＡｃａｍｂｉｓ  ２０００（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＡＹ３１３８４７）、Ｌｉｓｔｅｒ  １０７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＤＱ１２１３９４）Ｌｉｓｔｅｒ−ＬＯ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＡＹ６７８２７６）、改変されたワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託Ｕ９４８４８；Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＡＹ６０３３５５）、ＭＶＡ−ＢＮ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＤＱ９８３２３８）、Ｌｅｄｅｒｌｅ、ＴａｓｈｋｅｎｔクローンＴＫＴ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＫＭ０４４３０９）およびＴＫＴ４（ＫＭ０４４３１０）、ＵＳＳＲ、Ｅｖａｎｓ、Ｐｒａｈａ、ＬＩＶＰ、Ｉｋｅｄａ、ＩＨＤ−Ｗ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＫＪ１２５４３９）、ＬＣ１６ｍ８（ＡＹ６７８２７５）、ＥＭ−６３、ＩＣ、Ｍａｌｂｒａｎ、Ｄｕｋｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＤＱ４３９８１５）、３７３７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＤＱ３７７９４５）、ＣＶ−１、Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＶＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＡＭ５０１４８２）、Ｓｅｒｒｏ  ２ウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＫＦ１７９３８５）、Ｃａｎｔａｇｌｏウイルス分離株ＣＭ−０１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＫＴ０１３２１０）、ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１５（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＪＮ６５４９８１）、ＤＰＰ２０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＪＮ６５４９８５）、ＤＰＰ１３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＪＮ６５４９８０）、ＤＰＰ１７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＪＮ６５４９８３）、ＤＰＰ２１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＪＮ６５４９８６）およびＩＯＣ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＫＴ１８４６９０およびＫＴ１８４６９１）から選択されるＶＡＣＶ株に基づくことができる。一実施形態では、天然痘ワクチンとして使用されるｓｃＶＡＣＶは、ＡＣＡＭ２０００株（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＡＹ３１３８４７）に基づく。一実施形態では、天然痘ワクチンとして使用されるｓｃＶＡＣＶは、ＶＡＣＶ−ＩＯＣ株（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＫＴ１８４６９０およびＫＴ１８４６９１）に基づく。一実施形態では、天然痘ワクチンとして使用されるｓｃＶＡＣＶは、ＭＶＡ株（Ｇｅｎｂａｎｋ受託Ｕ９４８４８；Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＡＹ６０３３５５）に基づく。一実施形態では、天然痘ワクチンとして使用されるｓｃＶＡＣＶは、ＭＶＡ−ＢＮ株（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＤＱ９８３２３８）に基づく。一部の実施形態では、本開示のｓｃＶＡＣＶを含むワクチン製剤は、生のまたは不活化ｓｃＶＡＣＶを含むことができる。
【０１２２】
一部の実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶを含む組成物は、ＶＡＣＶ感染症、ＭＰＸＶ感染症またはＣＰＸＶ感染症に対するワクチンとして使用される。
【０１２３】
一部の実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶは、異種の抗原またはエピトープを発現するように設計することができ、そのような抗原および／またはエピトープの供給源生物体に対するワクチンとして使用することができる。
【０１２４】
本開示の免疫原性製剤（例えば、ワクチン）は、有効量のｓｃＶＡＣＶおよび薬学的に許容される担体を含む。用語「薬学的に許容される」は、連邦もしくは州政府の規制機関に承認されたこと、または、動物、より詳細にはヒトでの使用のために米国薬局方もしくは他の公認の薬局方に掲載されていることを意味する。用語「担体」は、医薬組成物（例えば、免疫原性またはワクチンの製剤）が一緒に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液を、液体担体として、特に注射液として用いることもできる。好適な賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。好適な医薬担体の例は、E.  W.  Martinによる"Remington's  Pharmaceutical  Sciences"に記載される。製剤は、投与様式に適するべきである。特定の製剤は、ｓｃＶＡＣＶが生であるかまたは不活化されているかに依存することもできる。一部の実施形態では、本発明の精製されたｓｃＶＡＣＶは、後の使用のために凍結乾燥することができるか、または医薬溶液に直ちに調製することができる。ｓｃＶＡＣＶは、アジュバントまたは担体の有無にかかわらず、無菌食塩水などの生理的に許容される溶液に希釈することもできる。
【０１２５】
一態様では、本発明の免疫原性製剤（例えば、ワクチン）は、乱切法によって患者に投与することができる。ワクチンは、任意の他の標準の投与経路によって投与することもできる。免疫原性製剤（例えば、ワクチン）を導入するために多くの方法を使用することができ、これらには、限定されずに、鼻腔内、気管内、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、結膜および皮下経路が含まれる。鳥類では、方法は、後鼻孔接種をさらに含むことができる。非経口投与に代わるものとして、本発明の態様は、例えば飲料水を通してかまたは噴霧剤での農業目的のための大量投与の経路も包含する。代わりに、本開示のｓｃＶＡＣＶをその天然の感染経路を通して導入することが好ましいかもしれない。一部の実施形態では、本発明の免疫原性製剤は、注射液、ワクチンを発現する消費できるトランスジェニック植物、持続的放出ゲルまたは植込み可能なカプセル化組成物、固体インプラントまたは核酸として投与される。免疫原性製剤は、クリーム、ローション、軟膏、皮膚パッチ、ロゼンジまたは経口液体、例えば、懸濁物、溶液およびエマルジョン（水中油または油中水）で投与することもできる。生の複製する天然痘ワクチンのための容認された投与経路は皮膚の乱切法であり、それはワクチン接種部位で数日間持続する、ウイルスを排出する外傷を生成する。外傷は、生ワクチンの投与が禁忌であり得る個体へのワクチンの接触伝播の可能な供給源である。したがって、免疫原性製剤の筋肉内投与は、利点を提供することができる。好ましい実施形態では、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の投与は、筋肉内である。別の好ましい実施形態では、投与は皮膚の乱切法による。筋肉内投与は、合成キメラ馬痘ウイルス（ｓｃＨＰＸＶ）などの他の合成キメラオルソポックスウイルスのために使用することもできる。筋肉内投与の場合、筋肉塊に到達し、皮下組織にしみ込まないように正しい長さの針を使用することが重要である。筋肉内注射を投与するとき、針は９０°の角度で挿入するべきである。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、本開示の免疫原性製剤（例えば、ワクチン）は、感染症からの完全な防御をもたらさないが、未処置の被験体と比較して病原体（例えば、病原性のポックスウイルス）のより低い力価または低減された数をもたらす。ある特定の実施形態では、本開示の免疫原性製剤の投与は、未処置の被験体と比較して、病原体の力価の０．５倍、１倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１２５倍、１５０倍、１７５倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、７５０倍または１，０００倍またはそれより大きな低減をもたらす。病原体の力価、数または全体の負荷における低減の恩恵には、限定されずに、感染症の症状のより低い重症度、および感染症に関連した疾患または状態の長さの低減が含まれる。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、本開示の免疫原性製剤（例えば、ワクチン）は、感染症からの完全な防御をもたらさないが、未処置の被験体と比較して、より少ない数の症状もしくは症状の強さの低下、または低下した罹病率もしくは低下した死亡率をもたらす。
【０１２８】
様々な実施形態では、本発明の免疫原性製剤（例えば、ワクチン）または本開示のｓｃＶＡＣＶによって生成される抗体は、感染症（例えば、病原性のポックスウイルス感染症）の予防のための１つまたは複数の他の療法（例えば、抗ウイルスまたは免疫調節性の療法）と組み合わせて被験体に投与される。他の実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶによって生成される免疫原性製剤または抗体は、感染症（例えば、病原性のポックスウイルス感染症）の処置のための１つまたは複数の他の療法（例えば、抗ウイルスまたは免疫調節性の療法）と組み合わせて被験体に投与される。さらに他の実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶによって生成される免疫原性製剤または抗体は、感染症（例えば、病原性のポックスウイルス感染症）の管理および／または改善のための１つまたは複数の他の療法（例えば、抗ウイルスまたは免疫調節性の療法）と組み合わせて被験体に投与される。具体的な実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶによって生成される免疫原性製剤または抗体は、天然痘の予防のための１つまたは複数の他の療法（例えば、抗ウイルスまたは免疫調節性の療法）と組み合わせて被験体に投与される。別の具体的な実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶによって生成される免疫原性製剤または抗体は、天然痘の処置のための１つまたは複数の他の療法（例えば、抗ウイルスまたは免疫調節性の療法）と組み合わせて被験体に投与される。一部の実施形態では、ワクチンは、ウイルス複製を抑制するために、１つまたは複数の抗ウイルス処置と組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、ワクチンは、ウイルスの複製を抑制するために、ブリンシドフォビル処置と組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、ワクチンは、ウイルスの複製を抑制するために、テコビリマット／ＳＩＧＡ−２４６処置と組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、ワクチンは、非環式ヌクレオシドホスホネート（シドフォビル）、非環式ヌクレオシドまたはホスホネートの経口アルコキシアルキルプロドラッグ（ブリンシドフォビルまたはＣＭＸ００１）と組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、ワクチンは、ワクシニア免疫グロブリン（ＶＩＧ）と組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、ワクチンは、ＶＡＣＶ、ＶＡＲＶまたはＨＰＸＶから誘導されたペプチドまたはタンパク質抗原によって以前に免疫化された被験体において使用することができる。一部の実施形態では、ワクチンは、死滅または不活化ＶＡＣＶによって以前に免疫化された被験体において使用することができる。一部の実施形態では、ワクチンは、複製欠損／欠陥ＶＡＣＶウイルス株、ＭＶＡ（改変されたウイルスＡｎｋａｒａ）によって以前に免疫化された被験体において使用することができる。
【０１２９】
当業者に周知である任意の抗ウイルス剤を、本発明の様々な態様の製剤（例えば、ワクチン製剤）および方法において使用することができる。抗ウイルス剤の非限定的な例には、その受容体へのウイルスの付着、細胞内へのウイルスの内在化、ウイルスの複製または細胞からのウイルスの放出を阻害および／または低減するタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質抗体、核酸分子、有機分子、無機分子および小分子が含まれる。詳細には、抗ウイルス剤には、限定されずに、細胞外ウイルス成熟をブロックする抗ウイルス薬（テコビリマット／ＳＩＧＡ−２４６）、非環式ヌクレオシドホスホネート（シドフォビル）、非環式ヌクレオシドホスホネートの経口アルコキシアルキルプロドラッグ（ブリンシドフォビルまたはＣＭＸ００１）またはワクシニア免疫グロブリン（ＶＩＧ）が含まれる。一部の実施形態では、抗ウイルス剤には、限定されずに、ヌクレオシド類似体（例えば、ジドブジン、アシクロビル、ガンシクロビル（gangcyclovir）、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジンおよびリバビリン）、フォスカーネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、リトナビル、アルファ−インターフェロンおよび他のインターフェロン、ならびにＡＺＴが含まれる。
【０１３０】
用量および投与レジメンは、処置される被験体の必要性によって当業者が決定することができる。熟練者は、被験体の年齢または体重、処置される疾患または状態の重症度、および処置への被験体の応答などの因子を考慮することができる。一部の実施形態では、本発明の組成物は、例えば必要に応じて、または毎日投与することができる。投与は、様々な期間にわたって行うことができる。例えば、投与レジメンは、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週またはそれより長い期間、持続することができる。一部の実施形態では、投与レジメンは、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月またはそれより長い期間、持続する。
【０１３１】
一部の態様では、本発明のｓｃＶＡＣＶは、受動免疫療法、診断または予後イムノアッセイ等のために有益な抗体を製造するために使用することもできる。抗体の製造方法は、当技術分野で周知である。抗体は、免疫療法での使用の前にさらに改変することができる（例えば、キメラ化、ヒト化等）。
【０１３２】
腫瘍溶解剤
本開示で使用される「腫瘍溶解性ウイルス」または「腫瘍溶解剤」は、腫瘍細胞を感染させることによって前記腫瘍細胞（非耐性）を死滅させることが一般的にできる、任意のウイルスと考えられている。
【０１３３】
一態様では、本発明の合成キメラポックスウイルス（ｓｃＶＡＣＶ）は、がん細胞の中で選択的に複製して死滅させる腫瘍溶解剤として使用することができる。別の態様では、本発明は、被験体において腫瘍溶解性応答を誘導するための方法であって、被験体に本開示のｓｃＶＡＣＶを含む組成物を投与するステップを含む方法に関する。がん細胞などの急速に分裂する細胞は、非分裂細胞よりポックスウイルス感染症に対して一般的に許容性である。ポックスウイルスの多くの特徴、例えば、ヒトにおける安全性、高力価株の製造の容易さ、ウイルス調製物の安定性、および腫瘍細胞の中での複製の後に抗腫瘍免疫を誘導する能力は、ポックスウイルスを望ましい腫瘍溶解剤にする。本発明の様々な方法によって製造されるｓｃＶＡＣＶは、それらをがんの処置のために好適にさせる、１つまたは複数の改変を含むことができる。したがって、一態様では、本開示は、がん細胞において死滅を誘導する方法であって、細胞を単離されたｓｃＶＡＣＶまたは本開示のｓｃＶＡＣＶを含む医薬組成物と接触させるステップを含む方法を提供する。一態様では、本開示は、がんを処置する方法であって、それを必要とする患者に本開示のｓｃＶＡＣＶの治療的有効量を投与するステップを含む方法を提供する。別の態様は、がんの処置または新生物障害において死滅を誘導することにおいて使用するための、本明細書に記載されるｓｃＶＡＣＶまたは組成物を含む。別の態様は、がん細胞などの新生物障害細胞において死滅を誘導するための、またはがんなどの新生物障害を処置するための、本明細書に記載されるｓｃＶＡＣＶまたは組成物の使用を含む。一部の実施形態では、ポックスウイルス腫瘍溶解療法は、１つまたは複数の従来のがん療法（例えば、手術、化学療法、放射線療法、温熱療法および生物学的／免疫学的療法）と組み合わせて投与される。具体的な実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、ｓｃＶＡＣＶ  ＮＹＣＢＨ株、クローンＡｃａｍｂｉｓ  ２０００またはＡＣＡＭ２０００である。
【０１３４】
本出願の方法を使用して、１つまたは複数の望ましい遺伝子を容易に導入することができ、１つまたは複数の望ましくない遺伝子をｓｃＶＡＣＶゲノムから容易に欠失させることができる。一部の実施形態では、腫瘍溶解剤としての使用のための本発明のｓｃＶＡＣＶは、それらの免疫反応性、抗腫瘍標的化および／または効力、細胞間拡散および／またはがん特異性を強化するために、導入遺伝子を発現するように設計される。一部の実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶは、免疫調節性遺伝子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＴＮＦ機能をブロックするウイルス遺伝子）を発現するように設計されるかまたは操作される。一部の実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶは、病原性を減弱させる因子を発現する遺伝子を含むように設計される。一部の実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶは、治療剤（例えば、ｈＥＰＯ、ＢＭＰ−４、特異的腫瘍抗原またはその一部に対する抗体等）を発現するように設計されるかまたは操作される。一部の実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶは、ｇｍＣＳＦ遺伝子を含むように設計されているかまたは操作されている。一部の実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶは、弱毒化のために改変されている。一部の実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶは、ウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を欠くように設計されるかまたは操作される。一部の実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶは、リボヌクレオチド還元酵素遺伝子を欠くように設計されるかまたは操作される。一部の実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶは、ワクシニア増殖因子遺伝子を欠くように設計されるかまたは操作される。一部の実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶは、ヘマグルチニン遺伝子を欠くように設計されるかまたは操作される。
【０１３５】
一態様では、本発明のｓｃＶＡＣＶは、様々な新生物障害および／またはがんを処置するのに有益である。一部の実施形態では、がんのタイプには、限定されずに、骨がん、乳がん、膀胱がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、神経膠腫、胃がん、胃腸がん、頭頸部がん、肝がん、例えば肝細胞癌、白血病、肺がん、リンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎臓がん、皮膚がん、例えば黒色腫、精巣がん等、または、処置できる任意の他の腫瘍もしくは前新生物病巣が含まれる。
【０１３６】
別の実施形態では、本方法は、新生物障害またはがん細胞における、および／あるいは本明細書に記載される単離されたかもしくは組換えのウイルスまたは組成物を投与された被験体からの試料における、投与されたｓｃＶＡＣＶの存在を検出するステップをさらに含む。例えば、本明細書に記載されるｓｃＶＡＣＶまたは組成物の投与の前および／または投与の後に、例えば感染の進行を調査するために被験体を試験することができる。一部の実施形態では、本開示のｓｃＶＡＣＶは検出カセットを含み、投与されたキメラＶＡＣＶの存在を検出することは、検出カセットでコードされるタンパク質を検出することを含む。例えば、検出カセットが蛍光性タンパク質をコードする場合、被験体または試料は、蛍光を可視化する方法を使用して画像化される。
【０１３７】
一態様では、本発明の腫瘍溶解性製剤は、有効量の本開示のｓｃＶＡＣＶおよび薬学的に許容される担体を含む。用語「薬学的に許容される」は、前のセクションにおいて既に上で説明されている。
【０１３８】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、ポックスウイルス処置施設において投与される。ある特定の態様では、ポックスウイルス処置施設は、本開示の組成物または方法による免疫化または処置を必要とする被験体を、免疫化もしくは処置の予定がないか、または処置被験体から潜在的に感染する可能性がある（例えば、看護者および家族）他の被験体から彼らが隔離されるような環境で免疫化または処置することができる施設である。一部の実施形態では、免疫化の予定がないかまたは処置被験体に感染する可能性のある被験体には、ＨＩＶ患者、化学療法を受けている患者、がん、リウマチ性障害または自己免疫性障害の処置を受けている患者、臓器または組織移植を受けているかまたは受けた患者、免疫欠損患者、児童、妊娠女性、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、心臓状態を有する患者、および免疫抑制薬等を服用中の患者が含まれる。一部の実施形態では、ポックスウイルス処置施設は、オルソポックスウイルス処置施設である。一部の実施形態では、ポックスウイルス処置施設は、天然痘処置施設である。
【０１３９】
一部の実施形態では、ｓｃＶＡＣＶを含む本発明の組成物は、天然痘有害事象の専門家によって投与される。一部の実施形態では、天然痘有害事象には、限定されずに、種痘湿疹（eczema  vaccinatum）、進行性種痘疹、ワクチン後脳炎、心筋炎および拡張型心筋症が含まれる。
【０１４０】
組換え遺伝子発現のためのウイルスベクター
一態様では、本発明の合成キメラポックスウイルス（ｓｃＶＡＣＶ）は、異種配列を有するように操作することができる。異種配列は、異なるポックスウイルス種から、または任意の非ポックスウイルスの供給源からであってよい。一態様では、異種配列は、任意の非ポックスウイルスの供給源から選択される抗原エピトープである。本出願で使用される非ポックスウイルスの供給源とは、ポックスウイルスと異なる生物体を指す。一部の実施形態では、組換えウイルスは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ミコバクテリア、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、ＭＲＳＡ、ラブドウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、パラミキソウイルス、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスのファミリーのウイルスを限定されずに含む、非ポックスウイルスの供給源、または出血熱を引き起こすウイルス、例えばハンタウイルスもしくはフィロウイルス、すなわち、エボラもしくはマールブルグウイルスからの１つまたは複数の抗原エピトープを発現することができる。別の態様では、異種配列は、異なるポックスウイルス種からの抗原エピトープである。これらのウイルス配列は、ｓｃＶＡＣＶの宿主スペクトルまたは免疫原性を改変するために使用することができる。
【０１４１】
一部の実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶは、治療的核酸（例えば、アンチセンス核酸）または治療的ペプチド（例えば、所望の生物活性を有するペプチドまたはタンパク質）を発現する異種遺伝子／核酸をコードすることができる。
【０１４２】
一部の実施形態では、異種核酸配列の発現は、好ましくは、しかし排他的ではなく、ポックスウイルスプロモーターの転写制御下にある。一部の実施形態では、異種核酸配列は、好ましくはウイルスゲノムの非必須領域に挿入される。異種配列をポックスウイルスのゲノムに挿入する方法は、当業者に公知である。一部の実施形態では、異種核酸は、化学合成によって導入される。例示的な実施形態では、異種核酸は、本開示のｓｃＶＡＣＶのＶＡＣＶ１０５／Ｊ２Ｒ遺伝子座にクローニングすることができる。
【０１４３】
本発明の一態様のｓｃＶＡＣＶは、標的細胞への異種核酸配列の導入のために使用することができ、配列は標的細胞に相同または異種である。標的細胞への異種核酸配列の導入は、配列によってコードされる異種ペプチドまたはポリペプチドおよび／または完全なウイルスをｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造するために使用することができる。一実施形態では、この方法は、本発明のｓｃＶＡＣＶによる宿主細胞の感染；好適な条件の下での感染宿主細胞の培養；ならびに、宿主細胞によって生成されるペプチド、タンパク質および／またはウイルスの単離および／または富化を含む。異種ペプチドまたはポリペプチドを発現させるための、ｓｃＶＡＣＶ感染宿主細胞の培養のための好適な条件は当技術分野で周知であり、使用する宿主細胞によって変動する（例えば、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  second  edition  (Sambrook  et  al.,  1989)を参照）。
【０１４４】
記載された本出願の実施形態は、本出願の原理の適用のいくつかを単に例示するだけであることを理解すべきである。本出願の真の精神および範囲を逸脱せずに本明細書に提示される教示に基づいて、当業者は多数の改変を加えることができる。
【０１４５】
以下の実施例は、本出願を代表するものとして示される。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈するべきでないが、その理由は、これらのおよび他の同等の実施形態は、本開示、図面および付随する実施形態に照らして明らかになるからである。
【実施例】
【０１４６】
（実施例１  ウイルスゲノムの重複する断片の選択および設計）
ＶＡＣＶ  ＷＲ株のヘアピンおよび二重鎖配列を含有する合成キメラＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００（ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰ）
ｓｃＶＡＣＶゲノムの設計は、ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００［ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＹ３１３８４７］の以前に記載されたゲノム配列に基づいた（Osborne  JD  et  al.  Vaccine.  2007;  25(52):8807-32）。ゲノムは、９つの重複する断片に分割された（図１）。これらの断片は、それらが隣接した各断片と少なくとも１．０ｋｂｐの重複する配列を共有して（すなわち相同性）、相同組換えが完全長ゲノムのアセンブリーを促進する部位を提供するように設計された（表１）。これらの重複配列は、同時トランスフェクトされた断片の間での組換えを正確に実行するのに十分な相同性を提供した（Yao  XD,  Evans  DH.  Journal  of  Virology.  2003;77(13):7281-90）。
表1:  この研究で使用されるVACV  ACAM2000ゲノム断片。VACV  ACAM2000ゲノム[GenBank受託AY313847]の中のサイズおよび配列が記載される。
【表１】
2021522784.tif 000003
【０１４７】
これらの断片のサブクローニングを支援するために、２つのＩＴＲコード断片を除く全ての断片において、ＡａｒＩおよびＢｓａＩ制限部位をサイレント変異させた。２つのＩＴＲコード断片中のＢｓａＩ制限部位は変異させなかったが、それは、これらの領域が、効率的なＤＮＡ複製およびコンカテマー分解能にとって重要であるヌクレオチド配列特異的認識部位を含有する場合である。
【０１４８】
蛍光顕微鏡の下でＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００（ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：１０５）の再活性化を可視化することが容易であるように、ポックスウイルスの初期後期プロモーターの制御下のＹＦＰ／ｇｐｔカセットを、チミジンキナーゼ遺伝子座に導入した。ｇｐｔ遺伝子座は、薬物選択を使用した再活性化ウイルスの選択のための潜在的ツールも提供した。
【０１４９】
伝統的に、末端ヘアピンはクローニングおよび配列決定が困難だったので、ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ゲノムの公開された配列が完全でないことは意外でない。公開されたＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００株の最末端領域の検査により、ＡＣＡＭ２０００と非常に良く特徴付けられたＶＡＣＶ  ＷＲ株（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２４３３１２）の間に多少の差があるようであった（図２）。ＷＲ株では、ＶＡＣＶゲノムの５’末端および３’末端に位置する、共有結合で閉じられたヘアピンループの直ぐ下流に、７０ｂｐのタンデムリピート配列がある。これらの後に、２つの１２５ｂｐ反復配列および８つの５４ｂｐ反復配列が続く（図２Ａ）。しかし、公開されたＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００配列では、４つの５４ｂｐ反復配列だけが同定された（図２Ｂ）。７０ｂｐ、１２５ｂｐおよび５４ｂｐの反復配列の存在は、配列決定後にＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の野生型分離株において確認され（Ｉｌｌｕｍｉｎａを使用）、ＡＣＡＭ２０００の現在公開されている配列が不完全であることを示す。Ｉｌｌｕｍｉｎａ読み取りデータの短い読み取り長（＜３００ヌクレオチド）のために、本発明者らは、この約３ｋｂｐの中の実際のＡＣＡＭ２０００ゲノム配列が何であったかを正確に決定することができなかった。その代わり、本発明者らは、Ｃ２３Ｌ遺伝子の末端ヘアピンから停止コドンの直前までのＶＡＣＶ  ＷＲに類似した配列を有していた、ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ウイルスを再形成することに決めた（図２）。これは、公開されたＡＣＡＭ２０００配列に含まれていないが、ｗｔＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の次世代Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定を実行したときに検出された、１２５ｂｐおよび５４ｂｐの両方のタンデムリピート配列を含んでいた。改変されたＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の左および右のＩＴＲ断片の５’末端には、７０ｂｐタンデムリピート配列をＩＴＲ末端に直接的に付着させることを可能にするだろう、ＮｈｅＩ制限部位も含まれた（実施例２で議論される）。ｗｔＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００のＦおよびＳ末端ヘアピンループ配列は、図９に、ならびに配列番号２０および１９にそれぞれ示す。
【０１５０】
ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００株のヘアピンおよび二重鎖配列を含有する合成キメラＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００（ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰ）
ｓｃＶＡＣＶゲノムの設計は、ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００［ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＹ３１３８４７］の以前に記載されたゲノム配列に基づいた（Osborne  JD  et  al.  Vaccine.  2007;  25(52):8807-32）。ゲノムは、９つの重複する断片に分割した（図１）。これらの断片は、それらが隣接した各断片と少なくとも１．０ｋｂｐの重複する配列を共有して（すなわち相同性）、相同組換えが完全長ゲノムのアセンブリーを促進する部位を提供するように設計された。（表１）。これらの重複配列は、同時トランスフェクトされた断片の間での組換えを正確に実行するのに十分な相同性を提供した（Yao  XD,  Evans  DH.  Journal  of  Virology.  2003;77(13):7281-90）。
【０１５１】
これらの断片のサブクローニングを支援するために、２つのＩＴＲコード断片を除く全ての断片において、ＡａｒＩおよびＢｓａＩ制限部位をサイレント変異させた。２つのＩＴＲコード断片中のＢｓａＩ制限部位は変異させなかったが、それは、これらの領域が、効率的なＤＮＡ複製およびコンカテマー分解能にとって重要であるヌクレオチド配列特異的認識部位を含有する場合である。
【０１５２】
蛍光顕微鏡の下でＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００（ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：１０５）の再活性化を可視化することが容易であるように、ポックスウイルスの初期後期プロモーターの制御下のＹＦＰ／ｇｐｔカセットを、チミジンキナーゼ遺伝子座に導入した。ｇｐｔ遺伝子座は、薬物選択を使用した再活性化ウイルスの選択のための潜在的ツールも提供した。
【０１５３】
ｗｔＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００のＦおよびＳ末端ヘアピンループ配列は、図９に、ならびに配列番号２０および１９にそれぞれ示す。
【０１５４】
（実施例２）
ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の右および左のＩＴＲ断片へのＶＡＣＶ  ＷＲのＦおよびＳ末端ヘアピンループのライゲーション
ＶＡＣＶ  ＷＲ株と同一の７０ｂｐ反復配列断片を合成した（図２Ｃ；配列番号１０）。ＶＡＣＶ  ＷＲヘアピン配列ならびにＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の右および左のＩＴＲ断片のそれぞれへのライゲーションを促進するために、ＳａｐＩおよびＮｈｅＩ制限部位が７０ｂｐタンデムリピート断片の５’および３’末端に含まれた。ＶＡＣＶ  ＷＲ末端ヘアピンループを７０ｂｐタンデムリピート断片にライゲーションできる前に、ＩＤＴ技術によって合成された二重鎖配列を使用してループをさらに５８ｂｐ延長しなければならなかった（図３Ａ）。これは、ＶＡＣＶ株ＷＲに見出される最初の７０ｂｐ反復配列の前の、コンカテマー分解部位の直ぐ下流にある余分の配列のためであった。二重鎖配列は、一緒にアニールしたときに、５’末端に５’−ＴＧＴオーバーハングおよび３’末端に５’−ＧＧＴオーバーハングを有する二重鎖ＤＮＡ分子を生成する、２つの一本鎖ＤＮＡ分子を合成することによって生成された（図３Ａ；配列番号１１および配列番号１２）。ＶＡＣＶ  ＷＲのＦおよびＳ末端ヘアピンループは、それらの末端ループで３’−ＡＣＡオーバーハングを生成するので、７０ｂｐ反復配列の始まりまでのＶＡＣＶ  ＷＲ株で見出される配列と同一に見える約１３０ｂｐの末端ヘアピンループを生成するために、５８ｂｐ二重鎖をヘアピンにライゲーションした（図３Ｂ）。このヘアピン／二重鎖断片をゲル精製し、次いでその後、７０ｂｐ反復配列断片のＳａｐＩで消化した末端にライゲーションした。ＳａｐＩによる７０ｂｐタンデムリピート断片の消化は、末端ヘアピン／二重鎖構造の５’ＧＧＴオーバーハングに相補的である、３塩基オーバーハング（５’−ＣＣＡ）を形成した。７０ｂｐタンデムリピートを、ＤＮＡリガーゼの存在下で、Ｆ末端ヘアピン／二重鎖構造（図４、レーン４）またはＳ末端ヘアピン／二重鎖構造（図４、レーン５）と、７０ｂｐタンデムリピート断片に対して約５倍モル過剰で混合した。これは、７０ｂｐだけの反応（図４、レーン３）と比較してＤＮＡ電気泳動ゲルにおける上方シフトをもたらし、末端ヘアピン／二重鎖が７０ｂｐタンデムリピート断片に首尾よくライゲーションされたことを示す（図４）。
【０１５５】
この末端ヘアピン／二重鎖／７０ｂｐタンデムリピート断片は、ＮｈｅＩ制限部位を含むようにそれらの末端が以前に改変された、７０ｂｐのＡＣＡＭ２０００の左または右のＩＴＲ断片の上にその後ライゲーションされた。この断片が消化されたとき、５’−ＣＴＡＧオーバーハングはそれらの５’末端に残された。７０ｂｐタンデムリピート断片の３’末端では、この断片をＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ＤＮＡ断片のＬＩＴＲおよびＲＩＴＲ領域に直接的にライゲーションするために、ＮｈｅＩ部位が使用される。ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の左および右のＩＴＲ断片の消化の後、１：１のモル比でＤＮＡリガーゼを使用して、１６℃で一晩、Ｓ末端ヘアピン／二重鎖／７０ｂｐタンデムリピート断片またはＦ末端ヘアピン／二重鎖／７０ｂｐタンデムリピート断片を、左または右のＩＴＲ断片に別々にライゲーションした。その後、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）感染ＢＧＭＫ細胞にトランスフェクトする前に、ＤＮＡリガーゼを６５℃で熱不活化した。
【０１５６】
ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の右および左のＩＴＲ断片へのＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００のＦおよびＳ末端ヘアピンループのライゲーション
ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００株と同一の７０ｂｐ反復配列断片を合成した。ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ヘアピン配列ならびにＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の右および左のＩＴＲ断片のそれぞれへのライゲーションを促進するために、ＳａｐＩおよびＮｈｅＩ制限部位が７０ｂｐタンデムリピート断片の５’および３’末端に含まれた。ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００末端ヘアピンループを７０ｂｐタンデムリピート断片にライゲーションできる前に、ＩＤＴ技術によって合成された二重鎖配列を使用してループをさらに５８ｂｐ延長しなければならなかった。これは、ＶＡＣＶ株ＡＣＡＭ２０００に見出される最初の７０ｂｐ反復配列の前の、コンカテマー分解部位の直ぐ下流にある余分の配列のためであった。二重鎖配列は、一緒にアニールしたときに、５’末端に５’−ＴＧＴオーバーハングおよび３’末端に５’−ＧＧＴオーバーハングを有する二重鎖ＤＮＡ分子を生成する、２つの一本鎖ＤＮＡ分子を合成することによって生成された（配列番号２１および配列番号２２）。ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００のＦおよびＳ末端ヘアピンループは、それらの末端ループで３’−ＡＣＡオーバーハングを生成するので、約１３０ｂｐの末端ヘアピンループを生成するために、５８ｂｐ二重鎖をヘアピンにライゲーションした。このヘアピン／二重鎖断片をゲル精製し、次いでその後７０ｂｐ反復配列断片のＳａｐＩで消化した末端にライゲーションした。ＳａｐＩによる７０ｂｐタンデムリピート断片の消化は、末端ヘアピン／二重鎖構造の５’ＧＧＴオーバーハングに相補的である、３塩基オーバーハング（５’−ＣＣＡ）を形成した。７０ｂｐタンデムリピートを、ＤＮＡリガーゼの存在下で、Ｆ末端ヘアピン／二重鎖構造またはＳ末端ヘアピン／二重鎖構造と、７０ｂｐタンデムリピート断片に対して約５倍モル過剰で混合した。これは、７０ｂｐだけの反応と比較してＤＮＡ電気泳動ゲルにおける上方シフトをもたらし、末端ヘアピン／二重鎖が７０ｂｐタンデムリピート断片に首尾よくライゲーションされたことを示す。
【０１５７】
この末端ヘアピン／二重鎖／７０ｂｐタンデムリピート断片は、ＮｈｅＩ制限部位を含むようにそれらの末端が以前に改変された、ＡＣＡＭ２０００の左または右のＩＴＲ断片の上にその後ライゲーションされた。この左または右のＩＴＲ断片が消化されたとき、５’−ＣＴＡＧオーバーハングはそれらの５’末端に残された。７０ｂｐタンデムリピート断片の３’末端では、この断片をＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００のＤＮＡ断片のＬＩＴＲおよびＲＩＴＲ領域に直接的にライゲーションするために、ＮｈｅＩ部位が使用される。ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の左および右のＩＴＲ断片の消化の後、１：１のモル比でＤＮＡリガーゼを使用して、１６℃で一晩、Ｓ末端ヘアピン／二重鎖／７０ｂｐタンデムリピート断片またはＦ末端ヘアピン／二重鎖／７０ｂｐタンデムリピート断片を、左または右のＩＴＲ断片に別々にライゲーションした。その後、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）感染ＢＧＭＫ細胞にトランスフェクトする前に、ＤＮＡリガーゼを６５℃で熱不活化した。
【０１５８】
（実施例３  ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の重複ＤＮＡ断片の調製）
制限酵素Ｉ−ＳｃｅＩを使用して、表１のＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の重複ＤＮＡ断片の各々をＧｅｎｅＡｒｔから提供されるプラスミドにクローニングした。ＢＧＭＫ細胞へのこれらの合成ＤＮＡ断片のトランスフェクションの前に、プラスミドをＩ−ＳｃｅＩで消化し、生成物をゲルに流して、ＤＮＡ断片が首尾よく線状化されたことを確認した（図５）。３７℃で２時間の消化の後、反応を６５℃でその後熱不活化した。末端ヘアピン／二重鎖／７０ｂｐタンデムリピート／ＩＴＲ断片が形成されるまで、試料は氷上または４℃で保存した（上に記載される）。
【０１５９】
（実施例４  化学合成されたｄｓＤＮＡ断片からの再活性化）
ＳＦＶ株ＫａｓｚａおよびＢＳＣ−４０は、元はアメリカ培養細胞系統保存機関から得られた。バッファローミドリザル腎臓（ＢＧＭＫ）細胞を、Ｇ．ＭｃＦａｄｄｅｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｌｏｒｉｄａ）から得た。Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質および抗真菌剤、および５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を追加した最少必須培地（ＭＥＭ）において、ＢＳＣ−４０およびＢＧＭＫ細胞を５％ＣＯ２の３７℃で増殖させる。
【０１６０】
ショープ線維腫ウイルス感染細胞におけるｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰまたはｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰの再活性化
バッファローミドリザル腎臓（ＢＧＭＫ）細胞は、それらが概ね８０％の集密度に到達するまで、ＭＥＭ含有６０ｍｍ組織培養シャーレの中で増殖させた。無血清ＭＥＭにおいて細胞を３７℃で１時間、０．５のＭＯＩでショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）に感染させた。接種材料は５％ＦＣＳを含有する３ｍｌの温かいＭＥＭと交換し、さらなる１時間、インキュベーターに戻した。一方、トランスフェクション反応は、以下の通りに設定した。３７℃で概ね２時間の後、ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ゲノムを含んだ各断片の長さに基づくモル等量で、線状化ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００断片をＳＦＶに感染したＢＧＭＫ細胞の中にトランスフェクトさせた（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用した）。異なる量の全ＤＮＡが試みられ、５、６および７．５μｇのＤＮＡがこれらの重複ＤＮＡ断片からのＡＣＡＭ２０００を首尾よく再活性化することができた。複合体を室温で１０分の間インキュベートし、次いで、ＳＦＶに以前に感染したＢＧＭＫ細胞に滴下添加した。感染から概ね２４時間後、５％ＦＣＳを含有する新鮮なＭＥＭと培地を交換した。細胞は、３７℃でさらに３〜４日（合計４〜５日）の間培養した。
感染細胞を細胞培養培地の中にかきとり、３サイクルの凍結および解凍を実行することによって、ウイルス粒子を回収した。粗抽出物を無血清ＭＥＭで１０−２に希釈し、４ｍｌの接種材料をＢＳＣ−４０細胞の９〜１６枚の１５０ｍｍ組織培養プレートに平板培養して、再活性化されたｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：１０５を回収する。感染から１時間後、５％ＦＣＳおよび０．９％のノーブルアガーを含有するＭＥＭと接種材料を交換した。黄色蛍光プラークを倒立顕微鏡の下で可視化し、さらなる分析のために個々のプラークを選び出した。ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：１０５のプラークは、黄色蛍光選択で３回プラーク精製された。
４日後、ＳＦＶおよびＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００クローンの両方を含有する感染したプレートを採収し、続いて３回の凍結解凍サイクルによりウイルスを放出させ、次いで連続的に希釈して、ＳＦＶウイルスと比較してＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ウイルスの増殖を優先的に促進するＢＳＣ−４０細胞の上へ平板培養した。３回のプラーク精製を実行し、続いて、１０〜１５０ｍｍ組織培養プレートにおいてウイルス株の増大を行った。その後これらの細胞からウイルスを溶解させ、３６％スクロースクッションで分離し、続いて２４％〜４０％スクロース密度勾配でさらに精製した。これらの精製されたゲノムからゲノムＤＮＡを単離し、合成ウイルスゲノムの配列を確認するために次世代Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定を実行した。
【０１６１】
（実施例４  野生型ＡＣＡＭ２０００ウイルスと比較した増殖特性）
単離された合成キメラＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰ、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰおよび野生型ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ウイルスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ多段階増殖曲線を、サル腎臓上皮（ＢＳＣ−４０）細胞で実行した。細胞を感染多重度０．０３で感染させ、示した時間（３時間、６時間、１２時間、２１時間、４８時間および７２時間）にウイルスを採収し、ＢＳＣ−４０細胞でウイルスを滴定した。図６に示すデータは、３件の独立した実験を表す。図６に示すように、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰおよびｗｔＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ウイルスは、７２時間の期間にわたって区別できない増殖動態で増殖した。
【０１６２】
ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰ（ＹＦＰ−ｇｐｔマーカー）、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰ（ＹＦＰ−ｇｐｔマーカー）、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰ（マーカーなし）（Ｊ２Ｒ遺伝子配列で置き換えたＹＦＰ−ｇｐｔマーカー）、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰ（マーカーなし）（Ｊ２Ｒ遺伝子配列で置き換えたＹＦＰ−ｇｐｔマーカー）およびｗｔＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の増殖曲線間の比較は、ｗｔＡＣＡＭ２０００  ＶＡＣＶと比較してこれらのウイルスの増殖特性においていかなる差も統計的にないことを示す（図７）。
【０１６３】
（実施例５  ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：１０５ゲノム配列のＰＣＲおよび制限断片分析による確認）
制限消化および続くパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）によるｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：１０５ゲノムのさらなる分析を、スクロース勾配精製を使用して単離されたゲノムＤＮＡで実行した（Yao  XD,  Evans  DH.  Methods  Mol  Biol.  2004;269:51-64）。２つの独立したｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰクローン、ならびにＪ２Ｒ遺伝子配列がＹＦＰ−ｇｐｔマーカーで置き換えられたＶＡＣＶ＿ＷＲΔＪ２Ｒ対照、およびｗｔＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００対照（ＶＡＣ＿ＡＣＡＭ２０００）を精製し、次いで消化せずに放置したか、ＢｓａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩまたはＮｏｔＩおよびＰｖｕＩで消化した。ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰおよびｗｔＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の両方からの単離されたゲノムＤＮＡは、ＢｓａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ゲノムのＢｓａＩ部位のほとんどはサイレント変異されていたので、ＢｓａＩ消化の後にほとんどインタクトな約２００ｋｂｐの断片が観察された（図８、レーン８および９）。これは、ＢｓａＩで処置したときに広範に消化されたｗｔＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００およびｗｔＶＡＣＶ  ＷＲ対照（ＶＡＣ＿ＷＲΔＪ２Ｒ）ゲノムと異なっている（図８、レーン６および７）。ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰゲノムを別の酵素でなお消化することができることを確認するために、これらのゲノムをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、それは、ｓｃＶＡＣＶＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰクローンから多数のバンドを生成した（図８、レーン１２および１３）。ＩＴＲ領域の中の７０ｂｐタンデムリピートエレメントの存在を確認するために、ゲノムＤＮＡをＮｏｔＩおよびＰｖｕＩで消化した（図８、レーン１４〜１７）。
ｗｔＶＡＣＶ  ＷＲ対照（ＶＡＣ＿ＷＲΔＪ２Ｒ）試料では、約３．６ｋｂｐのバンド（アスタリスクで印を付けた）が検出され、それは、ＶＡＣのＷＲ株の７０ｂｐタンデムリピートの全てを包含する。ＶＡＣＶ  ＷＲ株がＩＴＲ反復配列エレメントの合成を設計するための鋳型として使用されたことを考えると、ＷＲ株で見られたのと同じサイズの近くで、ＮｏｔＩ／ＰｖｕＩ処理ｓｃＶＡＣＶＡＣＡＭ２０００クローンでいくつかのバンドが検出されると予想された。２つのｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰクローンを比較したとき、この領域のサイズの差が観察され、７０ｂｐ反復配列の全てが再構築された各ゲノムに組み込まれたとは限らないことを示唆する（図７、レーン１６および１７）。細胞培養における選択圧の下でこれらの反復配列エレメントは増大および収縮することができることを他の者が示していることを考慮すると、これは予想外でない（Paez  and  Esteban  (1988).  Virology;163(1):145-54）。
【０１６４】
全体として、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：１０５ゲノムのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析は、化学合成されたＤＮＡ断片からのＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰの再活性化が成功したこと、およびｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰウイルスがｗｔＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ウイルスのようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで振る舞うことを示唆した。
【０１６５】
（実施例６  全ゲノム配列分析によるｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：１０５ゲノム配列の確認）
ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰの２つのクローンおよびｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰの２つのクローンを配列決定した。ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（バージョン１１）を３５または６１のワードサイズで使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ読み取りデータを新規にアセンブルした。アセンブルされたコンティグを次いでＳｎａｐｇｅｎｅソフトウェアにインポートし、ＧｅｎｅＡｒｔによって提供された合成断片に基づいて予想されるｓｃＡＣＡＭ２０００配列の参照配列の上へ整列させた。
【０１６６】
ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰのクローン１の場合、コンティグ１は１６，３１７ｂｐであり、ＩＴＲ領域の大部分（タンデムリピート配列を除いて）に対応した。コンティグ２は１６７，０２０ｂｐであり、ゲノムの中央の保存領域（ヌクレオチドの１９，４６７位〜１８６，４８６位）と整列した。ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰのクローン２の場合、コンティグ３は１６，３２２ｂｐであり、ＩＴＲ領域の大部分（タンデムリピート配列を除いて）に対応した。コンティグ１は１６７，０２０ｂｐであり、ゲノムの中央の保存領域（ヌクレオチドの１９，４６７位〜１８６，４８６位）と整列した。クローン２のコンティグのヌクレオチド１３６７９１位に、単一ヌクレオチド置換（ＣからＡ）があった。これは、ｓｃＡＣＡＭ２０００ゲノム配列のヌクレオチド１５６，２５６位に対応し、ＶＡＣ＿ＡＣＡＭ２０００＿１７７におけるＡｓｐからＴｙｒへのアミノ酸変化（Ａ４１Ｌ）をもたらした。
【０１６７】
ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰのクローン１の場合、コンティグ１は１６７，０２０ｂｐであり、ゲノムの中央の保存領域（ヌクレオチドの１９，４６９位〜１８６，４８８位）と整列した。コンティグ２は１６，１５０ｂｐであり、ＩＴＲ領域の大部分（タンデムリピート配列を除いて）に対応した。このコンティグをＳｎａｐｇｅｎｅの参照ゲノムにマッピングしたとき、配列中のギャップが２６３３〜３４１７位、およびヌクレオチドの１５，１７５〜１５２２０位で観察された。第１のギャップ領域は５４ｂｐ反復配列領域に対応し、それは、新規のアセンブリーツールを使用してこれらの領域を正確にアセンブルすることができないことによる可能性が高い。生のＩｌｌｕｍｉｎａ読み取りデータの参照ゲノムへの直接マッピングは、いずれの領域の中でいかなるギャップももたらさなかった。ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰのクローン２の場合、コンティグ１は１６，０７５ｂｐであり、ＩＴＲ領域の大部分（タンデムリピート配列を除いて）に対応した。コンティグ２は１６７，０７８ｂｐであり、ゲノムの中央の保存領域（ヌクレオチドの１９，４６９〜１８６，５４６位）と整列した。ヌクレオチドの１５，１７６〜１５，２２０位のコンティグ２で観察されたギャップがあった。しかし、生のＩｌｌｕｍｉｎａ読み取りデータの参照ゲノムへの直接マッピングは、この領域の中でいかなるギャップももたらさなかった。ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰのいずれの配列決定されたクローンも、ゲノムの中のいかなる位置でもいかなる他のヌクレオチド変異も示さなかった。
【０１６８】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ読み取りデータは、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓの参照マップにもマッピングした。Ｉｌｌｕｍｉｎａ読み取りデータは参照配列の完全長を網羅し、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰのクローン１および２の平均カバレージはそれぞれ１９２５および２５３３であり、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰのクローン１および２の平均カバレージはそれぞれ２１９５および１６０２であった。
【０１６９】
全体として、配列決定データはｉｎ  ｖｉｔｒｏゲノム分析データを確証し、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２００００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰおよびｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰがＳＦＶ感染細胞において首尾よく再活性化されたことを確認する。
【０１７０】
（実施例７  ＹＦＰ／ｇｐｔ選択マーカーの除去）
ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：１０５の再活性化の後、チミジンキナーゼ遺伝子座のｙｆｐ／ｇｐｔ選択マーカーを除去することができる。
【０１７１】
（実施例８  様々なＶＡＣＶ株の間のＩＴＲの末端ヘアピンおよび二重鎖領域の中のヌクレオチド配列変動）
ＶＡＣＶ  ＷＲ株、ＡＣＡＭ  ２０００、ＤｒｙｖａｘおよびＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株におけるコンカテマー分解部位の直ぐ下流の「二重鎖」領域におけるヌクレオチド配列変動を、図９に示す。配列変動は、ＷＲ株と比較した、ｗｔＡＣＡＭ２０００、Ｄｒｙｖａｘ  ＤＰＰ１５、ＴｉａｎＴａｎおよびＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株の間の、４ヌクレオチド置換および３ヌクレオチド欠失として見られる。
【０１７２】
（実施例９  マウス鼻腔内モデルにおける、または尾乱切法を通した病原性の決定）
ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰおよびｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰの毒性作用をこの研究で決定する。この実験のために、Ｂａｌｂ／ｃマウスの６群に、実施例１〜７に記載されるｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２００００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰおよびｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰの３つの異なる用量を投与し、ＰＢＳ対照群、ならびにｗｔＶＡＣＶ（ＷＲ）対照群およびｗｔＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００対照群（合計１２処置群）と比較する。この実験には、研究期間中にいかなる処置も受けない３匹の追加のマウスが含まれる。全てのマウスは、実験全体を通して所定の時点で血液のために試料を採取し、追加のマウスは血清分析のためにベースラインの役割をする。
【０１７３】
Ｂａｌｂ／ｃマウスの接種の前に、全てのウイルス株をＢＳＣ−４０細胞（アフリカミドリザル腎臓）で増殖させ、トリプシン処理によって採収し、ＰＢＳで洗浄し、ダウンス型ホモジナイゼーションによって細胞から抽出し、超遠心分離によって３６％スクロースクッションを通して精製し、ＰＢＳに再懸濁させ、最終濃度が１０７ＰＦＵ／ｍｌから１０９ＰＦＵ／ｍｌの間にあるように滴定する。
【０１７４】
この研究のために選択された用量（１０５ＰＦＵ／用量、１０６ＰＦＵ／用量および１０７ＰＦＵ／用量）は、ＤｒｙｖａｘおよびＩＯＣを含むＶＡＣＶの公知のワクチン株を使用した以前の研究に基づく（Medaglia  ML,  Moussatche  N,  Nitsche  A,  Dabrowski  PW,  Li  Y,  Damon  IK,  et  al.  Genomic  Analysis,  Phenotype,  and  Virulence  of  the  Historical  Brazilian  Smallpox  Vaccine  Strain  IOC:  Implications  for  the  Origins  and  Evolutionary  Relationships  of  Vaccinia  Virus.  Journal  of  virology.  2015;89(23):11909-25；Qin  L,  Favis  N,  Famulski  J,  Evans  DH.  Evolution  of  and  evolutionary  relationships  between  extant  vaccinia  virus  strains.  Journal  of  virology.  2015;89(3):1809-24）。
【０１７５】
ウイルスは、鼻腔内にまたは尾乱切法を通して投与される。下の実施例１０および１１の詳細を参照する。
【０１７６】
（実施例１０  鼻腔内接種を通して投与されるｓｃＶＡＣＶが致死性のＶＡＣＶ−ＷＲチャレンジに対する免疫防御を付与するかどうか決定する）
体重減少はマウスにおける病原性の尺度として使用されるので、ｗｔＶＡＣＶ（ＷＲ株）は、概ね２０〜３０％の体重減少につながる、５×１０３ＰＦＵの用量で鼻腔内に投与される。ＶＡＣＶ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１５も１０７ＰＦＵ／用量で鼻腔内に投与されるので、この周知の天然痘ワクチンの病原性は、合成バージョンｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２００００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰおよびｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰと直接的に比較することができる。マウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、受領後、ウイルス投与前の少なくとも１週間、それらの環境に馴化させる。
【０１７７】
各マウスは、麻酔下の鼻腔内注射を通して投与されるウイルスの単一の用量（約１０μｌ）を受ける。マウスは、腫脹、排泄または他の異常などの感染の徴候について、３０日の期間、毎日モニタリングする。各マウスは、ウイルス投与から毎日、体重減少について特にモニタリングする。他の罹病因子に加えてそれらの体重の２５％超を失うマウスは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌｂｅｒｔａの本発明者らの動物ヘルスケア施設プロトコールに従って安楽死させる。
【０１７８】
試験されるｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２００００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰおよびｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰの最も高い用量でさえ、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて病気のいかなる明白な徴候もないかもしれない。ＶＡＣＶ株の１つ（ブラジルの天然痘ワクチン株ＩＯＣ）は、一部の場合には１０７ＰＦＵでいかなる疾患も引き起こさなかった（Medaglia  ML,  Moussatche  N,  Nitsche  A,  Dabrowski  PW,  Li  Y,  Damon  IK,  et  al.  Genomic  Analysis,  Phenotype,  and  Virulence  of  the  Historical  Brazilian  Smallpox  Vaccine  Strain  IOC:  Implications  for  the  Origins  and  Evolutionary  Relationships  of  Vaccinia  Virus.  Journal  of  virology.  2015;89(23):11909-25）。１０９ＰＦＵ／ｍＬを上回る力価を有する精製された株を作製する困難のために、これよりはるかに高い用量を試験することは、実際的でない。
【０１７９】
ウイルス接種の３０日後、鼻腔内接種により、ＶＡＣＶ−ＷＲの致死量（１０６ＰＦＵ／用量）でマウスをその後チャレンジする。上記の通り感染の徴候についてマウスを綿密にモニタリングする。マウスを毎日計量し、他の罹病因子に加えてそれらの体重の２５％超を失うマウスは安楽死させる。ＶＡＣＶ−ＷＲの致死量の投与の前にＰＢＳで接種されるマウスは、接種から７〜１０日以内にかなりの体重減少および他の罹病因子の徴候を示すと予想される。ＶＡＣＶ−ＷＲによる致死性のチャレンジから概ね１４日後、標準のプラーク低減アッセイにより血清中のＶＡＣＶ特異的中和抗体の存在を確認するために、全マウスを安楽死させ、血液を収集する。
【０１８０】
（実施例１１  尾乱切法を通して投与されるｓｃＶＡＣＶが致死性のＶＡＣＶ−ＷＲチャレンジに対する免疫防御を付与するかどうか決定する）
尾乱切法処置の開始の前に、免疫適格Ｂａｌｂ／Ｃ動物に麻酔をかける。尾の基部に、１〜２ｃｍ長にわたり２５ゲージ針の先端を使用して、一連の１５〜２０個のかき傷／突き傷を付ける。３〜５μＬの体積の異なるウイルスを、乱切部位に適用する。
【０１８１】
ウイルスが乱切部位に吸収される見込みがあるまで、マウスは麻酔にかかったままにする。２８日の期間にわたって、マウスを体重減少の徴候について毎日モニタリングする。乱切法から約８〜１０日後の尾乱切法の部位に膿疱が形成される（「取得」として知られる）。
【０１８２】
ウイルス接種の２８日後、鼻腔内接種により、ＶＡＣＶ−ＷＲの致死量（１０６ＰＦＵ／用量）でマウスをその後チャレンジする。上記の通り感染症の徴候についてマウスを綿密にモニタリングする。マウスを毎日計量し、他の罹病因子に加えてそれらの体重の２５％超を失うマウスは安楽死させる。ＶＡＣＶ−ＷＲの致死量の投与の前にＰＢＳを接種されるマウスは、接種から７〜１０日以内にかなりの体重減少および他の罹病因子の徴候を示すと予想される。ＶＡＣＶ−ＷＲによる致死性のチャレンジから概ね１４日後、標準のプラーク低減アッセイにより血清中のＶＡＣＶ特異的中和抗体の存在を確認するために、全マウスを安楽死させ、血液を収集する。
【０１８３】
ワクチン非接種動物の全ては、ウイルスチャレンジから７日以内に、ＶＡＣＶ  ＷＲのこの致死量のために死亡する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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