(57)【要約】本開示は、ミオシン１５（Ｍｙｏ１５）プロモーターの領域を含むポリヌクレオチド、及びそれを含むベクターを提供し、これを用いて、特に有毛細胞において導入遺伝子の発現を促進することができる。本明細書に記載のポリヌクレオチドを、導入遺伝子、例えば、治療用タンパク質をコードする導入遺伝子に作動可能に連結し、それにより、導入遺伝子の有毛細胞特異的発現を促進してもよい。本明細書に記載のポリヌクレオチドを、治療用の導入遺伝子に作動可能に連結し、難聴または前庭機能不全を有するかまたは発症するリスクを有する対象の治療に使用してもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３及び／または配列番号４の配列を含む、配列番号１またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する第１の領域と、それに作動可能に連結された配列番号８及び／または配列番号９の配列を含む、配列番号２またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する第２の領域を含み、場合により前記第１の領域と前記第２の領域の間に１〜１００ヌクレオチドを含むリンカーを有する、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記第１の領域が、配列番号１の配列を含むか、またはそれからなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記配列番号１の機能部分が、配列番号３の配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記配列番号１の機能部分が、配列番号４の配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記配列番号１の機能部分が、配列番号３の配列及び配列番号４の配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記配列番号１の機能部分が、配列番号５の配列を含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記配列番号１の機能部分が、配列番号６の配列を含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記配列番号１の機能部分が、配列番号７の配列を含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記第２の領域が、配列番号２の配列を含むか、またはそれからなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記配列番号２の機能部分が、配列番号８の配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記配列番号２の機能部分が、配列番号９の配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記配列番号２の機能部分が、配列番号８の配列及び配列番号９の配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記配列番号２の機能部分が、配列番号１０の配列を含む、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記配列番号２の機能部分が、配列番号１１の配列を含む、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記配列番号２の機能部分が、配列番号１２の配列を含む、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１３の配列を含むか、またはそれからなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号８及び／または配列番号９の配列を含む、配列番号２またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する第１の領域と、それに作動可能に連結された配列番号３及び／または配列番号４の配列を含む、配列番号１またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する第２の領域を含み、場合により前記第１の領域と前記第２の領域の間に１〜１００ヌクレオチドを含むリンカーを有する、ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記第１の領域が、配列番号２の配列を含むか、またはそれからなる、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記配列番号２の機能部分が、配列番号８の配列を含む、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記配列番号２の機能部分が、配列番号９の配列を含む、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
前記配列番号２の機能部分が、配列番号８の配列及び配列番号９の配列を含む、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記配列番号２の機能部分が、配列番号１０の配列を含む、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記配列番号２の機能部分が、配列番号１１の配列を含む、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記配列番号２の機能部分が、配列番号１２の配列を含む、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記第２の領域が、配列番号１の配列を含むか、またはそれからなる、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
前記配列番号１の機能部分が、配列番号３の配列を含む、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
前記配列番号１の機能部分が、配列番号４の配列を含む、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
前記配列番号１の機能部分が、配列番号３の配列及び配列番号４の配列を含む、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２９】
前記配列番号１の機能部分が、配列番号５の配列を含む、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
前記配列番号１の機能部分が、配列番号６の配列を含む、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３１】
前記配列番号１の機能部分が、配列番号７の配列を含む、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１４の配列を含むか、またはそれからなる、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３３】
配列番号３及び／または配列番号４の配列を含む、配列番号１またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する領域を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項３４】
前記領域が、配列番号１の配列を含むか、またはそれからなる、請求項３３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３５】
前記配列番号１の機能部分が、配列番号３の配列を含む、請求項３３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３６】
前記配列番号１の機能部分が、配列番号４の配列を含む、請求項３３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３７】
前記配列番号１の機能部分が、配列番号３の配列及び配列番号４の配列を含む、請求項３３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３８】
前記配列番号１の機能部分が、配列番号５の配列を含む、請求項３７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３９】
前記配列番号１の機能部分が、配列番号６の配列を含む、請求項３７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４０】
前記配列番号１の機能部分が、配列番号７の配列を含む、請求項３７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４１】
配列番号８及び／または配列番号９の配列を含む、配列番号２またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する領域を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項４２】
前記領域が、配列番号２の配列を含むか、またはそれからなる、請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４３】
前記配列番号２の機能部分が、配列番号８の配列を含む、請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４４】
前記配列番号２の機能部分が、配列番号９の配列を含む、請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４５】
前記配列番号２の機能部分が、配列番号８の配列及び配列番号９の配列を含む、請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４６】
前記配列番号２の機能部分が、配列番号１０の配列を含む、請求項４５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４７】
前記配列番号２の機能部分が、配列番号１１の配列を含む、請求項４５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４８】
前記配列番号２の機能部分が、配列番号１２の配列を含む、請求項４５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４９】
前記ポリヌクレオチドが、導入遺伝子に作動可能に連結され、有毛細胞に導入される場合に、導入遺伝子の発現を誘導する、請求項１〜４８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５０】
請求項１〜４９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、核酸ベクター。
【請求項５１】
前記ポリヌクレオチドが、導入遺伝子に作動可能に連結する、請求項５０に記載の核酸ベクター。
【請求項５２】
前記導入遺伝子が、治療用タンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項５１に記載の核酸ベクター。
【請求項５３】
前記ポリヌクレオチドが、哺乳類有毛細胞において、前記核酸配列由来の前記治療用タンパク質の有毛細胞特異的発現を指示することができる、請求項５２に記載の核酸ベクター。
【請求項５４】
前記有毛細胞が蝸牛毛細胞である、請求項５３に記載の核酸ベクター。
【請求項５５】
前記蝸牛有毛細胞が、内有毛細胞及び／または外有毛細胞である、請求項５４に記載の核酸ベクター。
【請求項５６】
前記有毛細胞が前庭有毛細胞である、請求項５３に記載の核酸ベクター。
【請求項５７】
前記治療用タンパク質が、ＡＣＴＧ１、ＦＳＣＮ２、ＲＤＸ、ＰＯＵ４Ｆ３、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＰＲＮ、ＸＩＲＰ２、ＡＴＯＨ１、ＧＦＩ１、ＣＨＲＮＡ９、ＣＩＢ３、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＫＮＣＮ、ＤＦＮＢ５９、ＯＴＯＦ、ＭＫＲＮ２ＯＳ、ＬＨＸ３、ＴＭＣ１、ＭＹＯ１５、ＭＹＯ７Ａ、ＭＹＯ６、ＭＹＯ３Ａ、ＭＹＯ３Ｂ、ＧＲＸＣＲ１、ＰＴＰＲＱ、ＬＣＥ６Ａ、ＬＯＸＨＤ１、ＡＲＴ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＣＩＢ２、ＣＡＣＮＡ２Ｄ４、ＣＡＢＰ２、ＥＰＳ８、ＥＰＳ８Ｌ２、ＥＳＰＮ、ＥＳＰＮＬ、ＰＲＰＨ２、ＳＴＲＣ、ＳＬＣ８Ａ２、ＺＣＣＨＣ１２、ＬＲＴＯＭＴ２、ＬＲＴＯＭＴ１、ＵＳＨ１Ｃ、ＥＬＦＮ１、ＴＴＣ２４、ＤＹＴＮ、ＫＣＰ、ＣＣＥＲ２、ＬＲＴＭ２、ＫＣＮＡ１０、ＮＴ３、ＣＬＲＮ１、ＣＬＲＮ２、ＳＫＯＲ１、ＴＣＴＥＸ１Ｄ１、ＦＣＲＬＢ、ＳＬＣ１７Ａ８、ＧＲＸＣＲ２、ＢＤＮＦ、ＳＥＲＰＩＮＥ３、ＮＨＬＨ１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＡＴＦ６、ＰＥＲＫ、ＩＲＥ１、及びＢＩＰからなる群から選択される、請求項５２〜５６のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
【請求項５８】
前記核酸ベクターが、プラスミド、コスミド、人工染色体、またはウイルスベクターである、請求項５０〜５７のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
【請求項５９】
前記核酸ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、及びレンチウイルスからなる群から選択されるウイルスベクターである、請求項５８に記載の核酸ベクター。
【請求項６０】
前記ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、請求項５９に記載の核酸ベクター。
【請求項６１】
前記ＡＡＶベクターの血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ｒｈ１０、ｒｈ３９、ｒｈ４３、ｒｈ７４、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＤＪ／８、ＤＪ／９、７ｍ８、ＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．ｅｂ、及びＰＨＰ．Ｓからなる群から選択される、請求項６０に記載の核酸ベクター。
【請求項６２】
請求項５０〜６１のいずれか一項に記載の核酸ベクターを含む、組成物。
【請求項６３】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
哺乳類有毛細胞における治療用タンパク質の発現の増加方法であって、前記哺乳類有毛細胞を、請求項５０〜６１のいずれか一項に記載の核酸ベクターまたは請求項６２または６３の組成物と接触させることを含む、前記増加方法。
【請求項６５】
前記治療用タンパク質の発現が、有毛細胞において特異的に増加する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記哺乳類有毛細胞がヒト有毛細胞である、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記哺乳類有毛細胞が蝸牛有毛細胞である、請求項６４〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記蝸牛有毛細胞が内有毛細胞である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記蝸牛有毛細胞が外有毛細胞である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記哺乳類有毛細胞が前庭有毛細胞である、請求項６４〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記治療用タンパク質の発現が、有毛細胞ではない内耳細胞において実質的に増加しない、請求項６４〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
難聴を有するかまたは発症するリスクを有する対象の治療方法であって、請求項５０〜６１のいずれか一項に記載の核酸ベクターまたは請求項６２もしくは６３に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、前記治療方法。
【請求項７３】
前記難聴が遺伝性難聴である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記遺伝性難聴が、常染色体優性難聴、常染色体劣性難聴、またはＸ連鎖性難聴である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記難聴が後天性難聴である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記後天性難聴が、騒音性難聴、加齢性難聴、疾患もしくは感染症関連性難聴、頭部外傷性難聴、または耳毒性薬誘発性難聴である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前庭機能不全を有するかまたは発症するリスクを有する対象の治療方法であって、請求項５０〜６１のいずれか一項に記載の核酸ベクターまたは請求項６２もしくは６３に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、前記治療方法。
【請求項７８】
前記前庭機能不全が、回転性眩暈、浮動性眩暈、または平衡失調である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
それを必要とする対象における有毛細胞の再生の促進方法であって、請求項５０〜６１のいずれか一項に記載の核酸ベクターまたは請求項６２もしくは６３に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、前記促進方法。
【請求項８０】
前記有毛細胞が蝸牛有毛細胞である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記有毛細胞が前庭有毛細胞である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
耳毒性薬誘発性の有毛細胞の損傷または細胞死の予防または軽減方法であって、請求項５０〜６１のいずれか一項に記載の核酸ベクターまたは請求項６２もしくは６３に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、前記予防または軽減方法。
【請求項８３】
前記耳毒性薬が、アミノグリコシド、抗腫瘍薬、エタクリン酸、フロセミド、サリチル酸塩、及びキニーネからなる群から選択される、請求項７６または８２に記載の方法。
【請求項８４】
耳鳴症を有する対象の治療方法であって、請求項５０〜６１のいずれか一項に記載の核酸ベクターまたは請求項６２もしくは６３に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、前記治療方法。
【請求項８５】
それを必要とする対象における有毛細胞の損傷または細胞死の予防または軽減方法であって、請求項５０〜６１のいずれか一項に記載の核酸ベクターまたは請求項６２もしくは６３に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、前記予防または軽減方法。
【請求項８６】
それを必要とする対象における有毛細胞の生存率の増加方法であって、請求項５０〜６１のいずれか一項に記載の核酸ベクターまたは請求項６２もしくは６３に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、前記増加方法。
【請求項８７】
前記核酸ベクターまたは組成物を投与する前に、前記対象の聴力を評価することをさらに含む、請求項７２〜７６、７９、８０、及び８２〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記核酸ベクターまたは組成物を投与した後に、前記対象の聴力を評価することをさらに含む、請求項７２〜７６、７９、８０、及び８２〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記核酸ベクターまたは組成物を投与する前に、前記対象の前庭機能を評価することをさらに含む、請求項７７〜７９及び８１〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記核酸ベクターまたは組成物を投与する前に、前記対象の前庭機能を評価することをさらに含む、請求項７７〜７９、８１〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記核酸ベクターまたは組成物を局所的に投与する、請求項７２〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記核酸ベクターまたは組成物を、難聴を予防もしくは軽減するか、前庭機能不全を予防もしくは軽減するか、耳鳴症を予防もしくは軽減するか、難聴の発症を遅延させるか、前庭機能不全の発症を遅延させるか、難聴の進行を遅延させるか、前庭機能不全の進行を遅延させるか、聴力を改善するか、前庭機能を改善するか、有毛細胞機能を改善するか、有毛細胞の損傷を予防もしくは軽減するか、有毛細胞の細胞死を予防もしくは軽減するか、または有毛細胞数を増加させるのに十分な量で投与する、請求項７２〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記対象がヒトである、請求項７２〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
請求項５０〜６１のいずれか一項に記載の核酸ベクターまたは請求項６２もしくは６３に記載の組成物を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において、有毛細胞（例えば、蝸牛有毛細胞、例えば、内有毛細胞及び外有毛細胞、及び／または前庭有毛細胞）内で導入遺伝子の発現を促進するために使用することができるミオシン１５（Ｍｙｏ１５）プロモーター領域を含むポリヌクレオチド、ならびにそれを含むベクターを記載する。難聴及び／または前庭機能不全を治療するために有毛細胞内で導入遺伝子の発現を達成するための本発明のポリヌクレオチド及びベクターの使用方法も開示する。
【背景技術】
【０００２】
難聴は公衆衛生上の重要な課題であり、学齢期の子供たちの１５％近く、及び６５歳までに３人に１人が影響を受けると推定されている。最も一般的なタイプの難聴は、感音難聴であり、これは、蝸牛有毛細胞などの内耳の細胞、または内耳から脳に突出する神経経路の欠陥によって引き起こされるタイプの難聴である。感音難聴は多くの場合、後天性であり、音響外傷、疾患または感染症、頭部外傷、耳毒性薬、及び老化を含む、様々な原因がある。内耳の発達及び機能に関与する遺伝子の変異など、感音難聴の遺伝的原因も存在する。常染色体劣性遺伝変異、常染色体優性遺伝変異、及びＸ連鎖パターン遺伝変異を含む、９０種類を超えるそのような遺伝子の変異が同定されている。
【０００３】
蝸牛有毛細胞の発達、生存、または完全性を破壊する要因、例えば、遺伝子変異、疾患または感染症、耳毒性薬、頭部外傷、及び老化は、同様に前庭有毛細胞に影響を与える可能性があり、したがって、回転性眩暈、浮動性眩暈、及び平衡失調などの前庭機能不全にも関係している。実際、有毛細胞の発達または機能を破壊する変異を有している患者は、難聴及び前庭機能不全の両方、またはいずれかの障害のみを呈し得る。近年、難聴を治療するための努力は、可能な解決策として遺伝子治療にますます集中してきており；しかしながら、難聴及び前庭機能不全に頻繁に関与している有毛細胞を特異的に標的とするアプローチはほとんど残っていない。感音難聴または前庭機能不全の治療をするために有毛細胞を標的とする新規治療法が必要である。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、特定の細胞型において、有毛細胞の機能または生存を促進または向上させる遺伝子として、目的の遺伝子の発現を促進するための組成物及び方法を提供する。本明細書に記載の組成物及び方法は、内耳の有毛細胞（例えば、蝸牛有毛細胞及び前庭有毛細胞）における導入遺伝子の転写を刺激するポリヌクレオチドに関する。本明細書に記載のポリヌクレオチドを、治療用の導入遺伝子に作動可能に連結してもよく、そして難聴（例えば、感音難聴）及び／または前庭機能不全（例えば、回転性眩暈、浮動性眩暈、または平衡失調）を治療または予防するために患者に投与してもよい。
【０００５】
第１の態様では、本発明は、配列番号３及び／または配列番号４の配列を含む、配列番号１またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第１の領域と、それに結合する（例えば、作動可能に連結する）配列番号８及び／または配列番号９の配列を含む、配列番号２またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第２の領域を含み、場合により、第１の領域と第２の領域の間に、１〜１００ヌクレオチド（例えば、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、１〜５０、１〜６０、１〜７０、１〜８０、１〜９０、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、１０〜７０、１０〜８０、１０〜９０、１０〜１００、２０〜３０、２０〜４０、２０〜５０、２０〜６０、２０〜７０、２０〜８０、２０〜９０、または２０〜１００ヌクレオチド）を有するリンカーを含むポリヌクレオチドを提供する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、第１の領域は、配列番号１の配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、第２の領域は、配列番号２の配列を含むか、またはそれからなる。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１３の配列を含むか、またはそれからなる。
別の態様では、本発明は、配列番号８及び／または配列番号９の配列を含む、配列番号２またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第１の領域と、それに結合する（例えば、作動可能に連結する）配列番号３及び／または配列番号４の配列を含む、配列番号１またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第２の領域を含み、場合により、第１の領域と第２の領域の間に、１〜１００ヌクレオチド（例えば、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、１〜５０、１〜６０、１〜７０、１〜８０、１〜９０、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、１０〜７０、１０〜８０、１０〜９０、１０〜１００、２０〜３０、２０〜４０、２０〜５０、２０〜６０、２０〜７０、２０〜８０、２０〜９０、または２０〜１００ヌクレオチド）を有するリンカーを含むポリヌクレオチドを提供する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、第１の領域は、配列番号２の配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、第２の領域は、配列番号１の配列を含むか、またはそれからなる。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１４の配列を含むか、またはそれからなる。
別の態様では、本発明は、配列番号３及び／または配列番号４の配列を含む、配列番号１またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する領域を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、この領域は、配列番号１の配列を含むか、またはそれからなる。
別の態様において、本発明は、配列番号８及び／または配列番号９の配列を含む、配列番号２またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する領域を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、この領域は、配列番号２の配列を含むか、またはそれからなる。
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、配列番号１の機能部分は、配列番号３の配列を含む。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、配列番号１の機能部分は、配列番号４の配列を含む。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、配列番号１の機能部分は、配列番号３の配列及び配列番号４の配列を含む。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、配列番号１の機能部分は、配列番号５の配列を含む。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、配列番号１の機能部分は、配列番号６の配列を含む。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、配列番号１の機能部分は、配列番号７の配列を含む。
【００１２】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、配列番号２の機能部分は、配列番号８の配列を含む。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、配列番号２の機能部分は、配列番号９の配列を含む。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、配列番号２の機能部分は、配列番号８の配列及び配列番号９の配列を含む。前述の態様のいずれかの実施形態では、配列番号２の機能部分は、配列番号１０の配列を含む。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、配列番号２の機能部分は、配列番号１１の配列を含む。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、配列番号２の機能部分は、配列番号１２の配列を含む。
【００１３】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを導入遺伝子に作動可能に連結し、有毛細胞に導入する場合、導入遺伝子の発現が誘導される。
別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを導入遺伝子に作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、治療用タンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、哺乳類の有毛細胞における核酸配列由来の治療用タンパク質の有毛細胞特異的発現を指示することができる。いくつかの実施形態では、有毛細胞は蝸牛有毛細胞である。いくつかの実施形態では、蝸牛有毛細胞は内有毛細胞である。いくつかの実施形態では、蝸牛有毛細胞は外有毛細胞である。いくつかの実施形態では、有毛細胞は前庭有毛細胞である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、ＡＣＴＧ１、ＦＳＣＮ２、ＲＤＸ、ＰＯＵ４Ｆ３、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＰＲＮ、ＸＩＲＰ２、ＡＴＯＨ１、ＧＦＩ１、ＣＨＲＮＡ９、ＣＩＢ３、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＫＮＣＮ、ＤＦＮＢ５９、ＯＴＯＦ、ＭＫＲＮ２ＯＳ、ＬＨＸ３、ＴＭＣ１、ＭＹＯ１５、ＭＹＯ７Ａ、ＭＹＯ６、ＭＹＯ３Ａ、ＭＹＯ３Ｂ、ＧＲＸＣＲ１、ＰＴＰＲＱ、ＬＣＥ６Ａ、ＬＯＸＨＤ１、ＡＲＴ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＣＩＢ２、ＣＡＣＮＡ２Ｄ４、ＣＡＢＰ２、ＥＰＳ８、ＥＰＳ８Ｌ２、ＥＳＰＮ、ＥＳＰＮＬ、ＰＲＰＨ２、ＳＴＲＣ、ＳＬＣ８Ａ２、ＺＣＣＨＣ１２、ＬＲＴＯＭＴ２、ＬＲＴＯＭＴ１、ＵＳＨ１Ｃ、ＥＬＦＮ１、ＴＴＣ２４、ＤＹＴＮ、ＫＣＰ、ＣＣＥＲ２、ＬＲＴＭ２、ＫＣＮＡ１０、ＮＴ３、ＣＬＲＮ１、ＣＬＲＮ２、ＳＫＯＲ１、ＴＣＴＥＸ１Ｄ１、ＦＣＲＬＢ、ＳＬＣ１７Ａ８、ＧＲＸＣＲ２、ＢＤＮＦ、ＳＥＲＰＩＮＥ３、ＮＨＬＨ１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＡＴＦ６、ＰＥＲＫ、ＩＲＥ１、及びＢＩＰを含む群から選択される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、核酸ベクターは、プラスミド、コスミド、人工染色体、またはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、核酸ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、及びレンチウイルスからなる群から選択されるウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ｒｈ１０、ｒｈ３９、ｒｈ４３、ｒｈ７４、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＤＪ／８、ＤＪ／９、７ｍ８、ＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．ｅｂ、及びＰＨＰ．Ｓを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターの血清型は、ＡＡＶ１である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターの血清型は、ＡＡＶ９である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターの血清型は、ＡＡＶ６である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターの血清型は、Ａｎｃ８０である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターの血清型は、Ａｎｃ８０Ｌ６５である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターの血清型は、ＤＪ／９である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターの血清型は７ｍ８である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターの血清型は、ＡＡＶ２である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターの血清型はＰＨＰ．Ｂである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターの血清型は、ＡＡＶ８である。
【００１６】
別の態様では、本発明は、本発明の核酸ベクターを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
別の態様では、本発明は、哺乳類有毛細胞を本発明の核酸ベクターまたは本発明の組成物と接触させることにより、哺乳類有毛細胞における治療用タンパク質の発現を増加させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質の発現を、有毛細胞において特異的に増加させる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、哺乳類有毛細胞はヒト有毛細胞である。
いくつかの実施形態では、哺乳類有毛細胞は蝸牛有毛細胞である。いくつかの実施形態では、蝸牛有毛細胞は内有毛細胞である。いくつかの実施形態では、蝸牛有毛細胞は外有毛細胞である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、哺乳類有毛細胞は前庭有毛細胞である。
いくつかの実施形態では、治療用タンパク質の発現を、有毛細胞ではない内耳細胞では実質的に増加させない。
【００１９】
別の態様では、本発明は、有効量の本発明の核酸ベクターまたは本発明の組成物を対象に投与することによって、難聴（例えば、感音難聴）を有するか、または発症するリスクを有する対象を治療する方法を提供する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、難聴は遺伝性難聴である。いくつかの実施形態では、遺伝性難聴は、常染色体優性難聴、常染色体劣性難聴、またはＸ連鎖性難聴である。
いくつかの実施形態では、難聴は後天性難聴である。いくつかの実施形態では、後天性難聴は、騒音性難聴、加齢性難聴、疾患もしくは感染症関連性難聴、頭部外傷性難聴、または耳毒性薬誘発性難聴である。いくつかの実施形態では、後天性難聴は加齢性難聴である。いくつかの実施形態では、難聴は騒音性難聴である。いくつかの実施形態では、難聴は耳毒性薬誘発性難聴である。
【００２１】
別の態様では、本発明は、有効量の本発明の核酸ベクターまたは本発明の組成物を対象に投与することによって、前庭機能不全を有するか、または発症するリスクを有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、前庭機能不全は、回転性眩暈、浮動性眩暈、または平衡失調である。
【００２２】
別の態様では、本発明は、有効量の本発明の核酸ベクターまたは本発明の組成物を対象に投与することによって、それを必要とする対象における有毛細胞の再生を促進する方法を提供する。いくつかの実施形態では、有毛細胞は蝸牛有毛細胞である。いくつかの実施形態では、有毛細胞は前庭有毛細胞である。
【００２３】
別の態様では、本発明は、有効量の本発明の核酸ベクターまたは本発明の組成物を対象に投与することによって、耳毒性薬誘発性有毛細胞の損傷または死を予防または軽減する方法を提供する。いくつかの実施形態では、耳毒性薬は、アミノグリコシド（例えば、ゲンタマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、カナマイシン、バンコマイシン、及びアミカシン）、抗腫瘍薬（例えば、プラチナ含有化学療法剤、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチン）、エタクリン酸、フロセミド、サリチル酸塩（例えば、特に高用量でのアスピリン）、及びキニンを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、有毛細胞は蝸牛有毛細胞である。いくつかの実施形態では、有毛細胞は前庭有毛細胞である。
【００２４】
別の態様では、本発明は、有効量の本発明の核酸ベクターまたは本発明の組成物を対象に投与することによって、耳鳴症を有する対象を治療する方法を提供する。
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、難聴、前庭機能不全、または耳鳴症は、有毛細胞（例えば、蝸牛有毛細胞及び／または前庭有毛細胞）の喪失に関連している。
【００２５】
別の態様では、本発明は、有効量の本発明の核酸ベクターまたは本発明の組成物を対象に投与することによって、それを必要とする対象における有毛細胞の損傷または死を予防または軽減する方法を提供する。いくつかの実施形態では、有毛細胞は蝸牛有毛細胞である。いくつかの実施形態では、有毛細胞は前庭有毛細胞である。
【００２６】
別の態様では、本発明は、有効量の本発明の核酸ベクターまたは本発明の組成物を対象に投与することによって、それを必要とする対象における有毛細胞の生存率を増加させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、有毛細胞は蝸牛有毛細胞である。いくつかの実施形態では、有毛細胞は前庭有毛細胞である。
【００２７】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、有毛細胞は蝸牛有毛細胞である。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、蝸牛有毛細胞は内有毛細胞である。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、蝸牛有毛細胞は外有毛細胞である。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、哺乳類有毛細胞は前庭有毛細胞である。
【００２８】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、核酸ベクターまたは組成物を投与する前に対象の聴力を評価する（例えば、聴力検査、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）、蝸電図検査（ＥＣＯＧ）、または耳音響放射などの標準検査を使用して聴力を評価する）工程をさらに含む。
【００２９】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、核酸ベクターまたは組成物を投与した後の対象の聴力を評価する（例えば、聴力検査、ＡＢＲ、ＥＣＯＧ、または耳音響放射などの標準検査を使用して聴力を評価する）工程をさらに含む。
【００３０】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、核酸ベクターまたは組成物を投与する前に対象の前庭機能を評価する（例えば、電気眼振図（ＥＮＧ）もしくはビデオ式眼振図（ＶＮＧ）、姿勢図検査、回転椅子検査、ＥＣＯＧ、前庭誘発筋電位（ＶＥＭＰ）、または特殊な臨床平衡機能検査などの標準検査を使用して前庭機能を評価する）工程をさらに含む。
【００３１】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、核酸ベクターまたは組成物を投与する前に対象の前庭機能を評価する（例えば、ＥＮＧもしくはＶＮＧ、姿勢図検査、回転椅子検査、ＥＣＯＧ、ＶＥＭＰ、または特殊な臨床平衡機能検査などの標準検査を使用して前庭機能を評価する）工程をさらに含む。
【００３２】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、核酸ベクターまたは組成物を、局所的に投与する（例えば、内耳に、例えば、外リンパまたは内リンパ内に、卵円窓、正円窓、または水平半規管などを介して投与する）。
【００３３】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、核酸ベクターまたは組成物を、難聴を予防もしくは軽減するか、前庭機能不全を予防もしくは軽減するか、耳鳴症を予防もしくは軽減するか、難聴の発症を遅延させるか、前庭機能不全の発症を遅延させるか、難聴の進行を遅延させるか、前庭機能不全の進行を遅延させるか、聴力を改善するか、前庭機能を改善するか、有毛細胞機能を改善するか、有毛細胞の損傷を予防もしくは軽減するか、有毛細胞の細胞死を予防もしくは軽減するか、または有毛細胞数を増加させるのに十分な量で投与する。
【００３４】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
別の態様では、本発明は、本発明の核酸ベクターまたは本発明の組成物を含むキットを提供する。
【００３５】
定義
本明細書中で使用する場合、用語「約」とは、記載する値から１０％以内で上回るかまたは下回る値を指す。
【００３６】
本明細書中で使用する場合、「投与」とは、任意の有効な経路によって、対象に治療薬（例えば、導入遺伝子に作動可能に連結されたミオシン１５（Ｍｙｏ１５）プロモーターを含む核酸ベクター）を提供するか、または与えることを指す。例示的な投与経路を、本明細書において以下に記載する。
【００３７】
本明細書中で使用する場合、用語「細胞型」とは、遺伝子発現データに基づいて統計的に分離可能な表現型を共有する細胞群を指す。例えば、一般的な細胞型の細胞は、同様の構造的特徴及び／または機能的特徴、例えば、同様の遺伝子活性化パターン及び抗原提示特性を共有している場合がある。一般的な細胞型の細胞には、生物内の一般的な組織（例えば、上皮組織、神経組織、結合組織、または筋肉組織）及び／または一般的な臓器、組織系、血管、または他の構造及び／または領域から分離された細胞が含まれ得る。
【００３８】
本明細書中で使用する場合、用語「蝸牛有毛細胞」とは、音の感知に関与する内耳内の特殊な細胞群を指す。蝸牛有毛細胞には、内有毛細胞と外有毛細胞の２種類がある。蝸牛有毛細胞への損傷と蝸牛有毛細胞の機能を破壊する遺伝子変異は、難聴及び聴覚消失に関係している。
【００３９】
本明細書中で使用する場合、用語「保存的変異」、「保存的置換」、及び「保存的アミノ酸置換」とは、１つ以上のアミノ酸から、極性、静電荷、及び立体体積などの同様の物理化学的特性を示す１つ以上の異なるアミノ酸への置換を指す。これらの特性を、天然の２０種のアミノ酸のそれぞれについて、以下の表１に要約する。
【００４０】
【表１】
2021521842.tif 000002
【００４１】
この表によれば、保存的アミノ酸のファミリーには（ｉ）Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ及びＩ；（ｉｉ）Ｄ及びＥ；（ｉｉｉ）Ｃ、Ｓ及びＴ；（ｉｖ）Ｈ、Ｋ及びＲ；（ｖ）Ｎ及びＱ；ならびに（ｖｉ）Ｆ、Ｙ及びＷが含まれる。したがって、保存的変異または置換とは、あるアミノ酸を、同じアミノ酸ファミリーのメンバーで置換する変異または置換である（例えば、ＴｈｒをＳｅｒに、またはＡｒｇをＬｙｓに置換）。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、本明細書に記載の組成物、ベクター構築物、またはウイルスベクターの「有効量」、「治療有効量」、及び「十分な量」という用語は、哺乳類、例えばヒトを含む、それを必要とする対象に投与する場合に、臨床結果を含む有益なまたは望ましい結果をもたらすのに十分な量を指し、したがって、その「有効量」またはその同義語は、それが適用されている状況に依存する。例えば、感音難聴または前庭機能不全の治療に関して、それは、組成物、ベクター構築物、またはウイルスベクターを投与せずに得られる応答と比較して、治療応答を達成するのに十分な組成物、ベクター構築物、またはウイルスベクターの量である。そのような量に対応する本明細書に記載の所与の組成物の量は、所与の薬剤、医薬製剤、投与経路、疾患もしくは障害のタイプ、対象の特性（例えば、年齢、性別、体重）または治療対象の宿主などの様々な要因に応じて変化するが、それにもかかわらず、当業者によって日常的に決定することができる。また、本明細書中で使用する場合、本開示の組成物、ベクター構築物、またはウイルスベクターの「治療有効量」は、対照と比較して、対象において有益なまたは所望の結果をもたらす量である。有効成分を組み合わせて投与する場合、組み合わせの有効量は、個別に投与した場合に有効であったであろう各成分の量を含んでいても、含んでいなくてもよいことに留意されたい。本明細書中で定義するように、本開示の組成物、ベクター構築物、またはウイルスベクターの治療有効量は、当業者であれば、当技術分野で公知の日常的な方法によって容易に決定し得る。投与計画を調整して、最適な治療応答を提供してもよい。
【００４３】
本明細書中で使用する場合、用語「内在性」とは、特定の生物（例えば、ヒト）または生物内の特定の場所（例えば、器官、組織、または細胞、例えば、ヒト細胞、例えば、ヒト有毛細胞）に天然に見出される分子（例えば、ポリペプチド、核酸、または補因子）を表す。
【００４４】
本明細書中で使用する場合、用語「発現する」とは、以下の事象の１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡテンプレートの産生（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写産物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／または３’末端プロセシング）；（３）ＲＮＡからポリペプチドまたはタンパク質への翻訳；及び（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
【００４５】
本明細書中で使用する場合、用語「外来性」とは、特定の生物（例えば、ヒト）または生物内の特定の場所（例えば、器官、組織、または細胞、例えば、ヒト細胞、例えば、ヒト有毛細胞）において、天然には見出されない分子（例えば、ポリペプチド、核酸、または補因子）を表す。外来性物質には、生物またはそこから抽出された培養物に対して、外部供給源から提供される物質が含まれる。
【００４６】
本明細書中で使用する場合、用語「有毛細胞特異的発現」とは、主に有毛細胞（例えば、蝸牛毛細胞及び／または前庭有毛細胞）内での、内耳の他の細胞型（例えば、らせん神経節ニューロン、グリア、または他の内耳細胞型）と比較したＲＮＡ転写産物またはポリペプチドの産生を指す。導入遺伝子の有毛細胞特異的発現は、任意の標準的な技術（例えば、定量的ＲＴ  ＰＣＲ、免疫組織化学、ウェスタンブロット分析、またはプロモーターに作動可能に連結されたレポーター（例えば、ＧＦＰ）の蛍光測定）を使用して、内耳の様々な細胞型の間で（例えば、有毛細胞対非有毛細胞で）導入遺伝子の発現（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質の発現）を比較することによって確認することができる。有毛細胞特異的プロモーターは、それが作動可能に連結されている導入遺伝子の発現（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質の発現）を誘導し、誘導される発現は、有毛細胞において、以下の内耳細胞型のうちの少なくとも３種（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０種、またはそれ以上）に比べて少なくとも５０％（例えば、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％以上）大きい：境界細胞、内指節細胞、内柱細胞、外柱細胞、第１列目のダイテルス細胞、第２列目のダイテルス細胞、第３列目のダイテルス細胞、ヘンゼン細胞、クラウディウス細胞、内溝細胞、外溝細胞、らせん隆起細胞、根細胞、歯間細胞、血管条の基底細胞、血管条の中間細胞、血管条の辺縁細胞、らせん神経節ニューロン、シュワン細胞。
【００４７】
本明細書中で使用する場合、用語「増加する」及び「減少する」とは、参照と比較して、それぞれ、より多いかまたはより少ない量の、機能、発現、または活性の計量をもたらす調節を指す。例えば、本明細書に記載の方法での組成物の投与に続いて、本明細書に記載の計量マーカー（例えば、導入遺伝子の発現）の量を、対象において、投与前のマーカー量に対して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％またはそれ以上、増加または減少させてもよい。一般的に、計量は、投与によって記載の効果が得られる時点、例えば、治療レジメンを開始してから、少なくとも１週間、１か月、３か月、または６か月後に測定する。
【００４８】
本明細書中で使用する場合、用語「イントロン」とは、そのヌクレオチド配列が、対応するタンパク質のアミノ酸配列に翻訳されない遺伝子のコード領域内の領域を指す。用語イントロンはまた、遺伝子から転写されたＲＮＡの対応する領域も指す。イントロンはプレｍＲＮＡに転写されるが、プロセシング中に除去され、成熟ｍＲＮＡには含まれない。
【００４９】
本明細書中で使用する場合、用語「リンカー」とは、ポリヌクレオチドの２つの異なる領域を接続する一連のヌクレオチドを指す。リンカーは、それが接続するポリヌクレオチドの２つの領域の機能を妨げない。
【００５０】
本明細書中で使用する場合、「局所的」または「局所的投与」とは、全身的効果ではなく局所的効果を目的とした身体の特定の部位での投与を意味する。局所投与の例は、対象の皮膚上、吸入、関節内、髄腔内、膣内、硝子体内、子宮内、病変内投与、リンパ節投与、腫瘍内投与、内耳への投与、及び粘膜への投与であり、その場合、投与は、全身的効果ではなく、局所的効果をもたらすことを目的とする。
【００５１】
本明細書中で使用する場合、用語「作動可能に連結された」とは、第２の分子に結合することができる第１の分子を指し、その場合、第１の分子が第２の分子の機能に影響を与えるように分子を配置する。用語「作動可能に連結された」とは、２つ以上の構成要素（例えば、プロモーターと別の配列エレメント）を並置し、それにより、両方の構成要素が正常に機能し、少なくとも１つの構成要素が少なくとも１つの他の構成要素に作用する機能を媒介することができるようにすることを含む。２つの分子は、単一の切れ目のない分子の一部であってもよく、そうでなくてもよく、隣接していても、隣接していなくてもよい。例えば、プロモーターが細胞内の目的の転写可能なポリヌクレオチド分子の転写を調節する場合、そのプロモーターは転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている。さらなる実施形態では、転写調節エレメントの２つの部分は、一方の部分の転写活性化機能が他方の部分の存在により悪影響を受けないようにそれらが結合している場合、互いに作動可能に連結している。２つの転写調節エレメントは、リンカー核酸（例えば、介在非コード核酸）を介して互いに作動可能に連結してもよく、または介在ヌクレオチドが存在せずに互いに作動可能に連結してもよい。
【００５２】
本明細書中で使用する場合、用語「プラスミド」とは、追加のＤＮＡセグメントをライゲートし得る染色体外環状二本鎖ＤＮＡ分子を指す。プラスミドとは、ベクターのタイプであり、連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子である。特定のプラスミドは、それらが導入される宿主細胞において自己複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌プラスミド及びエピソーム性哺乳類プラスミド）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれることが可能であり、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。特定のプラスミドは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を誘導することができる。
【００５３】
本明細書中で使用する場合、本明細書中で互換的に使用される用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」とは、任意の長さのヌクレオシドのポリマー形態を指す。一般的には、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって結合した、ＤＮＡまたはＲＮＡに天然に見出されるヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）から構成される。この用語には、天然の核酸に見出されるかどうかにかかわらず、化学的または生物学的に修飾された塩基、修飾された骨格などを有するヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含む分子が包含され、そのような分子は特定の用途に好ましい場合がある。本出願がポリヌクレオチドに言及する場合、ＤＮＡ、ＲＮＡの両方と、それぞれの場合における一本鎖及び二本鎖形態の両方（及び各一本鎖分子の相補体）が提供されることが理解される。本明細書中で使用する「ポリヌクレオチド配列」とは、ポリヌクレオチド物質自体及び／または特定の核酸を生化学的に特徴付ける配列情報（すなわち、塩基の略語として使用される一連の文字）を指し得る。本明細書中に提示するポリヌクレオチド配列は、特に明記しない限り、５’から３’の方向で示される。
【００５４】
本明細書中で使用する場合、核酸の「相補性」または「相補的」という用語は、その核酸塩基の配向のために、核酸の１つの鎖のヌクレオチド配列が、反対の核酸鎖上の別の配列と水素結合を形成することを意味する。ＤＮＡの相補的塩基は、通常、ＡとＴ、及びＣとＧである。ＲＮＡでは、通常、ＣとＧ、及びＵとＡである。相補性は、完全または実質的／十分であり得る。２つの核酸間の完全な相補性は、２つの核酸が二重鎖を形成することができることを意味し、その場合、二重鎖のすべての塩基がワトソン−クリックペアリングによって相補的な塩基に結合する。「実質的に」または「十分に」相補的とは、１つの鎖の配列が反対側の鎖の配列に対して完全に及び／または完璧に相補的ではないが、一連のハイブリダイゼーション条件（例えば、塩濃度及び温度）で２つの鎖の塩基間で十分な結合が起こり、安定したハイブリッド複合体を形成することを意味する。そのような条件は、配列と標準的な数学的計算を使用してハイブリダイズした鎖のＴｍ（融解温度）を予測するか、または日常的な方法を使用してＴｍを経験的に決定することにより予測することができる。Ｔｍは、２つの核酸鎖の間に形成されるハイブリダイゼーション複合体の集団の５０％が変性する（すなわち、二本鎖核酸分子の集団のうちの半数が一本鎖に解離する）温度を有する。Ｔｍより低い温度では、ハイブリダイゼーション複合体の形成が有利であり、一方、Ｔｍより高い温度では、ハイブリダイゼーション複合体中の鎖の融解または分離が有利である。核酸のＴｍは、１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液中の既知のＧ＋Ｃ含量を用いて、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）を用いて見積もってもよいが、他の既知のＴｍ計算では、核酸の構造特性を考慮する。
【００５５】
本明細書中で使用する場合、用語「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ上の認識部位を指す。ポリメラーゼは、導入遺伝子の転写を促進する。
参照ポリヌクレオチド配列または参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性の割合（％）」とは、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して、最大の配列同一性の割合を達成した後、参照ポリヌクレオチド配列または参照ポリペプチド配列内の核酸またはアミノ酸と同一である候補配列内の核酸またはアミノ酸の割合と定義される。核酸またはアミノ酸配列同一性の割合を決定することを目的としたアラインメントは、当業者の技術の範囲内にある様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、またはＭｅｇａｌｉｇｎソフトウェアなどの、公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者であれば、比較している配列の完全長にわたる最大のアラインメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含む配列アラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。例えば、配列同一性の割合の値は、配列比較コンピュータプログラムＢＬＡＳＴを使用して生成してもよい。一例として、所与の核酸またはアミノ酸配列Ａの、所与の核酸またはアミノ酸配列Ｂに対する、Ｂとの、またはＢに対しての配列同一性の割合（あるいは、所与の核酸またはアミノ酸配列Ｂに、Ｂと、またはＢに対して特定の配列同一性の割合を有する所与の核酸またはアミノ酸配列Ａとして表現することができる）は、以下のように計算される：
１００×（分数Ｘ／Ｙ）
式中、Ｘは、ＡとＢとのプログラムのアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ）によって同一の一致としてスコアリングされたヌクレオチドまたはアミノ酸の数であり、Ｙは、Ｂの核酸の総数である。核酸またはアミノ酸配列Ａの長さが核酸またはアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの配列同一性の割合は、Ａに対するＢの配列同一性の割合と等しくないと考えられる。
【００５６】
本明細書中で使用する用語「誘導体」とは、対応する完全長の野生型核酸、ペプチド、またはタンパク質と比較して、１つ以上の変異及び／または化学修飾を含む核酸、ペプチド、もしくはタンパク質、またはそのバリアントもしくは類似体を指す。核酸が関与する化学修飾の非限定的な例として、例えば、塩基部分、糖部分、リン酸部分、リン酸−糖骨格、またはそれらの組み合わせへの修飾が挙げられる。
【００５７】
本明細書中で使用する場合、用語「医薬組成物」とは、対象に影響を与えるか、または対象に影響を与える可能性のある特定の疾患または病態を予防、治療または制御するために、場合により、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、及び／または担体と組み合わせて、哺乳類、例えばヒトなどの対象に投与する治療薬を含む混合物を指す。
【００５８】
本明細書中で使用する場合、用語「薬学的に許容される」とは、過度の毒性、刺激、アレルギー反応及び他の問題となる障害がなく、妥当なベネフィット／リスク比を有し、哺乳類（例えば、ヒト）などの対象の組織との接触に適した化合物、物質、組成物、及び／または剤形を指す。好ましくは、用語「薬学的に許容される」は、哺乳類、より具体的にはヒトで使用するために、連邦または州政府の規制機関によって承認されるか、または米国薬局方または他の一般的に認められた薬局方に記載されていることを意味する。
【００５９】
本明細書中で使用する場合、用語「試料」とは、対象から分離された標本（例えば、血液、血液成分（例えば、血清または血漿）、尿、唾液、羊水、脳脊髄液、組織（例えば、胎盤または皮膚）、膵液、絨毛膜絨毛試料、及び細胞）を指す。
【００６０】
本明細書中で使用する場合、用語「転写調節エレメント」とは、目的の遺伝子の転写を少なくとも部分的に制御する核酸を指す。転写調節エレメントは、遺伝子転写を制御するか、または制御するのを支援するプロモーター、エンハンサー、及び他の核酸（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含み得る。転写調節エレメントの例は、例えば、Ｌｏｒｅｎｃｅ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｒｅｖｉｅｗｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２０１２）に記載されている。
【００６１】
本明細書中で使用する場合、用語「形質移入」とは、原核生物または真核生物の宿主細胞への外来性ＤＮＡの導入に一般的に使用される任意の多種多様な技術、例えば、電気穿孔法、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン形質移入法、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ、スクイーズポレーション、ソノポレーション、光形質移入法、マグネトフェクション、インパレフェクションなどを指す。
【００６２】
本明細書中で使用する場合、用語「対象」及び「患者」とは、動物（例えば、ヒトなどの哺乳類）、獣医対象動物（例えば、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタなど）、及び疾患の実験動物モデル（例えば、マウス、ラット）を指す。本明細書に記載の方法に従って治療する対象は、難聴（例えば、感音難聴）または前庭機能不全（例えば、浮動性眩暈、回転性眩暈、または平衡失調）と診断されている対象、またはこれらの病態を発症するリスクを有する対象であり得る。診断は、当技術分野で公知の任意の方法または技術によって実施してもよい。当業者であれば、本開示に従って治療する対象が、標準検査を受けている可能性があるか、または検査を受けていないが疾患もしくは病態に関連する１つ以上のリスク因子の存在に起因するリスクを有する対象として同定されている可能性があることを理解するであろう。
【００６３】
本明細書中で使用する場合、用語「形質導入」及び「形質導入する」とは、ベクター構築物またはその一部を細胞に導入する方法を指す。ベクター構築物が、例えば、ＡＡＶベクターなどのウイルスベクターに含まれる場合、形質導入とは、細胞のウイルス感染、及びその後のベクター構築物またはその一部の細胞ゲノムへの移入及び組み込みを指す。
【００６４】
本明細書中で使用する場合、状態、障害または病態の「治療」及び「治療すること」には：（１）状態、障害もしくは病態に罹患しているか、またはその素因がある可能性があるが、まだ臨床または無症候性の症状を経験するかまたは呈していない対象において、発症する状態、障害または病態の少なくとも１つの臨床または無症候性の症状の発症率及び／または出現可能性を予防、遅延、または低減するか；あるいは（２）状態、障害または病態を阻害する、すなわち、疾患の発症もしくはその再発またはその少なくとも１つの臨床もしくは無症候性の症状の発症を阻止、軽減または遅延させるか；あるいは（３）疾患を軽減する、すなわち、状態、障害もしくは病態、またはその臨床もしくは無症候性の症状の少なくとも１つを退行させることが含まれ得る。治療する対象のベネフィットは、統計的に有意であるか、または少なくとも患者または医師にとって知覚可能である。
【００６５】
本明細書中で使用する場合、用語「ベクター」には、核酸ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、または人工染色体などのＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、ウイルス、または任意の他の適切なレプリコン（例えば、ウイルスベクター）が含まれる。外来性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを原核生物または真核生物の細胞に送達するために、様々なベクターが開発されてきた。そのような発現ベクターの例は、例えば、Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｎｏｖｅｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｍａｒｂｌｅｈｅａｄ，ＭＡ，２００６）に記載されている。本明細書に記載の組成物及び方法での使用に適した発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列、及び、例えば、タンパク質の発現及び／または哺乳類細胞のゲノムへのこれらのポリヌクレオチド配列の組み込みに使用する追加の配列エレメントを含む。本明細書に記載の導入遺伝子の発現に使用することができる特定のベクターには、遺伝子転写を指示するプロモーター及びエンハンサー領域などの調節配列を含むベクターが含まれる。導入遺伝子の発現のための他の有用なベクターは、導入遺伝子の翻訳速度を増強するか、または遺伝子転写から生じるｍＲＮＡの安定性または核外輸送を向上させるポリヌクレオチド配列を含む。これらの配列エレメントには、例えば、発現ベクター上に組み込まれた遺伝子の効率的な転写を指示するために、５’及び３’非翻訳領域ならびにポリアデニル化シグナル部位が含まれる。本明細書に記載の組成物及び方法での使用に適した発現ベクターはまた、そのようなベクターを含む細胞を選択するためのマーカーをコードするポリヌクレオチドを含み得る。適切なマーカーの例として、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、またはノーセオスリシンなどの抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が含まれる。
【００６６】
本明細書中で使用する場合、用語「前庭有毛細胞」とは、動きの感知に関与し、平衡感覚及び空間的配向に寄与する内耳の特殊な細胞群を指す。前庭有毛細胞は、内耳の三半規管及び耳石に存在する。前庭有毛細胞への損傷及び前庭有毛細胞機能を破壊する遺伝子変異は、回転性眩暈及び平衡失調障害などの前庭機能不全に関係している。
【００６７】
本明細書中で使用する場合、用語「野生型」とは、所与の生物における特定の遺伝子について最も出現頻度が高い遺伝子型を指す。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１Ａ】サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下でＧＦＰを発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターで形質導入したマウス蝸牛の一連の蛍光画像である。６〜８週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウスに、ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＧＦＰウイルスを、後半規管を介して注入した。マウスを手術から回復させ、安楽死させ、１０日後に１０％中性緩衝ホルマリンで灌流した。内耳側頭骨を採取し、８％ＥＤＴＡ中で３日間脱灰した。脱灰した側頭骨から蝸牛を解剖し、共焦点画像解析のためにスライドに取り付けた。ユビキタスプロモーターを使用して、ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＧＦＰは、内有毛細胞、外有毛細胞、らせん神経節ニューロン、間葉細胞、及びグリアを含む蝸牛内の多くの細胞型でＧＦＰ発現を誘導した。
【図１Ｂ】Ｍｙｏ１５プロモーターの制御下でＧＦＰを発現するＡＡＶベクター（配列番号１３）で形質導入したマウス蝸牛の一連の蛍光画像である。６〜８週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウスに、ＡＡＶ−Ｍｙｏ１５−ＧＦＰウイルスを、後半規管を介して注入した。マウスを手術から回復させ、安楽死させ、１０日後に１０％中性緩衝ホルマリンで灌流した。内耳側頭骨を採取し、８％ＥＤＴＡ中で３日間脱灰した。脱灰した側頭骨から蝸牛を解剖し、共焦点画像解析のためにスライドに取り付けた。有毛細胞特異的プロモーターを使用して、ＡＡＶ−Ｍｙｏ１５−ＧＦＰは、内有毛細胞及び外有毛細胞でのみ発現を誘導した。
【図２】Ｍｙｏ１５プロモーター（配列番号１３、図２）の制御下でＧＦＰを発現するＡＡＶベクターで形質導入したマウス前庭系の領域（卵形嚢、球形嚢、後部内襞（ＰＣ）、前部内襞（ＡＣ）、及び水平内襞（ＨＣ））の蛍光画像である。６〜８週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウスに、ＡＡＶ−Ｍｙｏ１５−ＧＦＰウイルスを、後半規管を介して注入した。マウスを手術から回復させ、安楽死させ、１０日後に１０％中性緩衝ホルマリンで灌流した。内耳側頭骨を採取し、８％ＥＤＴＡ中で３日間脱灰した。脱灰した側頭骨から前庭器官を解剖し、画像解析のためにスライドに取り付けた。有毛細胞特異的プロモーターを使用して、ＡＡＶ−Ｍｙｏ１５−ＧＦＰは、前庭有毛細胞でのみ発現を誘導した（図２）。
【図３Ａ】非ヒト霊長類の蝸牛の一連の蛍光画像であり、Ｍｙｏ１５プロモーターがＧＦＰ発現を非ヒト霊長類の蝸牛の有毛細胞に限定することを示す。図３Ａは、正円窓膜を介してＡＡＶ１−ＣＭＶ−ＧＦＰの局所注射を受けた非ヒト霊長類由来の蝸牛の共焦点画像である。注射の２８日後に組織を採取した。天然のＧＦＰ蛍光を示す。ＧＦＰの発現は、臓器全体の様々な種類の細胞型で検出された。
【図３Ｂ】非ヒト霊長類の蝸牛の一連の蛍光画像であり、Ｍｙｏ１５プロモーターがＧＦＰ発現を非ヒト霊長類の蝸牛の有毛細胞に限定することを示す。図３Ｂは、ＡＡＶ１−Ｍｙｏ１５−ＧＦＰを注入し、図３Ａの蝸牛と同じ方法で処理した、非ヒト霊長類由来の蝸牛の共焦点画像である。ＧＦＰの発現は有毛細胞に限定されていた。
【図３Ｃ】非ヒト霊長類の蝸牛の一連の蛍光画像であり、Ｍｙｏ１５プロモーターがＧＦＰ発現を非ヒト霊長類の蝸牛の有毛細胞に限定することを示す。図３Ｃは、図３Ｂに示すボックス領域内の有毛細胞の拡大図である。
【図４】１．６ｋｂのＭｙｏ１５プロモーター（配列番号１３）が、Ｔｍｃ１ノックアウト（ＫＯ）マウスにおけるＡＡＶマウスＴＭＣ１ベクターの生物学的有効性を、ユビキタスＣＭＶプロモーターに比べて増強したことを示すグラフである。Ｔｍｃ１  ＫＯマウスに対し、生後２日目（Ｐ２）に注射し、指定の週齢において聴性脳幹反応（ＡＢＲ）を評価した。ＡＢＲ閾値を、ナイーブホモ接合性（白丸と淡灰色の線）及びヘテロ接合性（黒丸と濃灰色の線）Ｔｍｃ１  ＫＯマウス、ならびにＡＡＶ−ＣＭＶマウスＴＭＣ１（ＣＭＶ＿ｍＴｍｃ１；白丸と濃灰色の線）またはＡＡＶ−Ｍｙｏ１５−マウスＴＭＣ１（ＰｄＢｘ＿ｍＴｍｃ１；Ｐ２３、淡灰色の円を通る淡灰色の線；Ｐ２８、黒丸と濃灰色の線）を注射したホモ接合性Ｔｍｃ１  ＫＯマウスの刺激周波数の関数としてプロットした。ＡＢＲ閾値の回復は、ＡＡＶ−ＣＭＶ−マウスＴＭＣ１に比べて、ＡＡＶ−Ｍｙｏ１５−マウスＴＭＣ１を注射したホモ接合性Ｔｍｃ１  ＫＯマウスにおいて大幅に改善した。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
本明細書において、特に有毛細胞（例えば、蝸牛有毛細胞及び／または前庭有毛細胞）内で導入遺伝子発現を誘導するための組成物及び方法を記載する。本発明は、蝸牛有毛細胞において特異的に導入遺伝子を発現することができるミオシン１５（Ｍｙｏ１５）プロモーターの領域を含むポリヌクレオチドを特徴とする。本発明はまた、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたこれらのプロモーターを有する核酸ベクターを特徴とする。本明細書に記載の組成物及び方法を使用して、特に蝸牛有毛細胞及び前庭有毛細胞において有毛細胞タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現させることができ、したがって、本明細書に記載の組成物を、対象（例えば、哺乳類対象、例えば、ヒト）に投与して、有毛細胞の機能不全、例えば、難聴または前庭機能不全によって引き起こされる障害を治療することができる。
【００７０】
有毛細胞
有毛細胞は、内耳に存在する聴覚系及び前庭系の感覚細胞である。蝸牛有毛細胞は、聴覚系の感覚細胞であり、２つの主要な細胞型：音の感知に関与する内有毛細胞、及び低音を増幅すると考えられている外有毛細胞で構成される。前庭有毛細胞は、内耳の三半規管及び耳石器官に位置し、平衡感覚及び空間的配向に寄与する動きの感覚に関与している。有毛細胞は、細胞の頂端面から突出して有毛細胞の束を形成する不動毛にちなんで名付けられた。不動毛の偏向（例えば、蝸牛有毛細胞の音波によるか、または前庭有毛細胞の回転または線形加速による）により、機械刺激依存性イオンチャネルが開放され、有毛細胞が神経伝達物質を放出して神経を活性化し、それによって機械音または運動シグナルを、脳に伝達可能な電気シグナルに変換することができる。蝸牛有毛細胞は正常な聴力に不可欠であり、蝸牛有毛細胞の損傷及び蝸牛有毛細胞の機能を破壊する遺伝子変異は、難聴及び聴覚消失に関係している。前庭有毛細胞の損傷及び前庭有毛細胞の機能を破壊する遺伝子変異は、平衡失調及び眩暈（例えば、浮動性眩暈）などの前庭機能不全に関係している。近年、難聴及び前庭機能不全を治療するための魅力的な治療アプローチとして遺伝子治療が注目されている；しかしながら、この分野には、遺伝子治療で使用する核酸ベクターを有毛細胞に特異的に標的化する方法が存在しない。
【００７１】
ミオシン１５
Ｍｙｏ１５は、不動毛の発達を調節する、非従来型のアクチンベースの分子モーターである。Ｍｙｏ１５に変異を有するマウスは、短い不動毛と重度の難聴及び前庭機能不全を有することが認められており、ヒトオルソログであるＭｙｏ１５Ａに変異があると、非症候性の常染色体劣性難聴であるＤＦＮＢ３が引き起こされる。Ｍｙｏ１５は不動毛に局在することが観察されており、不動毛の発達と維持に不可欠である。局在化のパターンは、Ｍｙｏ１５が有毛細胞で特異的に発現している可能性があることを示している。しかしながら、Ｍｙｏ１５プロモーターは、これまでのところ、単離され、特徴付けられてはいない。発明者らは、プロモーターの調節エレメントを構成している可能性のある、オーソロガスゲノム配列内の進化的に保存されたブロックを同定し、それらが翻訳開始部位の７２００塩基対（ｂｐ）を超えて上流に位置することを発見した。このゲノム領域は、遺伝子治療のために目的の導入遺伝子を送達するために、最大パッケージ容量が４．７ｋｂであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターと組み合わせて使用するには大きすぎる。
【００７２】
本発明は、部分的に、有毛細胞（例えば、蝸牛有毛細胞及び／または前庭有毛細胞）において特異的に導入遺伝子の発現を促進するために使用することができるＭｙｏ１５翻訳開始部位の上流の領域の発見に基づく。したがって、本明細書に記載の組成物及び方法を使用して、有毛細胞において目的の遺伝子（例えば、有毛細胞の発達、機能、細胞運命の特定、再生、生存、もしくは維持に関与する遺伝子、または難聴もしくは前庭機能不全を有する対象において破壊されている、例えば、変異していることが知られている遺伝子）を発現させて、難聴（例えば、感音難聴）及び／または前庭機能不全（例えば、回転性眩暈、浮動性眩暈、または平衡失調）を有するか、または発症するリスクを有する対象を治療することができる。
【００７３】
本明細書に記載の組成物及び方法のポリヌクレオチドは、有毛細胞において特異的に導入遺伝子を発現することができるＭｙｏ１５遺伝子座の領域由来の核酸配列、またはそのバリアント、例えば、有毛細胞で特異的に導入遺伝子を発現することができるＭｙｏ１５遺伝子座の領域に対して、少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する核酸配列を有する。これらの領域は、Ｍｙｏ１５翻訳開始部位の直前の核酸配列と、Ｍｙｏ１５翻訳開始部位から５ｋｂ以上離れた上流の調節エレメントを含む。本明細書に記載の組成物及び方法のポリヌクレオチドは、場合により、有毛細胞において特異的に導入遺伝子を発現することができるＭｙｏ１５遺伝子座の領域を作動可能に連結するリンカーを含み得るか、またはＭｙｏ１５遺伝子座の領域は、介在リンカーなしで直接結合することができる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、Ｍｙｏ１５遺伝子の第１の非コードエキソン（Ｍｙｏ１５翻訳開始部位に対して−６７５５〜−７２０９の核酸であり、その配列を配列番号１に記載する）またはその機能部分もしくは誘導体を含む領域に対して、少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第１の領域（上流の調節エレメント）と、それに結合した（例えば、作動可能に連結された）Ｍｙｏ１５翻訳開始部位の直前の核酸配列（Ｍｙｏ１５翻訳開始部位に対して−１〜−１１５７の核酸であり、その配列を配列番号２に記載する）またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第２の領域を含む。配列番号１の機能部分は、Ｍｙｏ１５翻訳開始部位に対して−７１６６〜−７０９１の核酸配列（配列番号３に記載）及び／またはＭｙｏ１５翻訳開始部位に対して−７０７７〜−６９８３の核酸配列（配列番号４に記載）を有し得る。第１の領域は、配列番号５に記載の介在核酸を伴わずに配列番号４の核酸配列に融合させた配列番号３の核酸配列を含み得るか、または第１の領域は、配列番号６に記載の介在核酸を伴わずに配列番号３の核酸配列に融合させた配列番号４の核酸配列を含み得る。あるいは、第１の領域は、内在性の介在核酸配列（例えば、第１の領域は、配列番号７に記載のように、Ｍｙｏ１５翻訳開始部位に対して−７１６６〜−６９８３の核酸配列を有し得る）または核酸リンカーによって結合された配列番号３及び配列番号４の配列を含み得る。第１の領域が配列番号３及び配列番号４の両方を含むポリヌクレオチドでは、２つの配列は、任意の順序で含まれ得る（例えば、配列番号３を配列番号４に結合して（例えば、先行させて）もよく、または配列番号４を配列番号３に結合して（例えば、先行させて）もよい）。配列番号２の機能部分は、Ｍｙｏ１５翻訳開始部位に対して−５９０〜−５０９の核酸配列（配列番号８に記載）及び／またはＭｙｏ１５翻訳開始部位に対して−２６６〜−１６１の核酸配列（配列番号９に記載）を有し得る。第２の領域は、配列番号１０に記載の介在核酸を伴わずに配列番号９の核酸配列に融合させた配列番号８の核酸配列を含み得るか、または第２の領域は、配列番号１１に記載の介在核酸を伴わずに配列番号８の核酸配列に融合させた配列番号９の核酸配列を含み得る。あるいは、第２の領域は、内在性の介在核酸配列（例えば、第２の領域は、配列番号１２に記載するように、Ｍｙｏ１５翻訳開始部位に対して−５９０〜−１６１の核酸配列を有し得る）または核酸リンカーによって結合した配列番号８と配列番号９の配列を含み得る。第２の領域が配列番号８及び配列番号９の両方を含むポリヌクレオチドでは、２つの配列は、任意の順序で含まれ得る（例えば、配列番号８を配列番号９に結合して（例えば、先行させて）もよく、または配列番号９を配列番号８に結合して（例えば、先行させて）もよい）。
【００７５】
ポリヌクレオチドの第１の領域と第２の領域は、直接結合することも、核酸リンカーによって結合することもできる。例えば、ポリヌクレオチドは、介在核酸を伴わずに、配列番号２の配列またはその機能部分もしくは誘導体（例えば、配列番号８〜１２のいずれか１つ以上、例えば、配列番号８及び９）に融合させた配列番号１の配列またはその機能部分もしくは誘導体（例えば、配列番号３〜７のいずれか１つ以上、例えば、配列番号３及び４）を含み得る。例えば、配列番号１と配列番号２の直接融合から生じるポリヌクレオチドの核酸配列を、配列番号１３に示す。あるいは、リンカーを使用して、配列番号１の配列またはその機能部分もしくは誘導体（例えば、配列番号３〜７のいずれか１つ以上、例えば、配列番号３及び４）を、配列番号２の配列またはその機能部分もしくは誘導体（例えば、配列番号８〜１２のいずれか１つ以上、例えば、配列番号８及び９）に結合することができる。
【００７６】
本明細書に記載のポリヌクレオチドで使用するための核酸リンカーの長さは、約５ｋｂ以下（例えば、約５ｋｂ、４．５ｋｂ、４ｋｂ、３．５ｋｂ、３ｋｂ、２．５ｋｂ、２ｋｂ、１．５ｋｂ、１ｋｂ、９００ｂｐ、８００ｂｐ、７００ｂｐ、６００ｂｐ、５００ｂｐ、４５０ｂｐ、４００ｂｐ、３５０ｂｐ、３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ、９０ｂｐ、８０ｂｐ、７０ｂｐ、６０ｂｐ、５０ｂｐ、４０ｂｐ、３０ｂｐ、２５ｂｐ、２０ｂｐ、１５ｂｐ、１０ｂｐ、５ｂｐ、４ｂｐ、３ｂｐ、２ｂｐ、またはそれ以下）であり得る。本明細書に記載のポリヌクレオチドで使用することができる核酸リンカーは、有毛細胞において導入遺伝子の発現を誘導する本発明のポリヌクレオチドの能力を破壊しない。
【００７７】
いくつかの実施形態では、配列番号１の配列またはその機能部分もしくは誘導体（例えば、配列番号３〜７のいずれか１つ以上、例えば、配列番号３及び４）を、配列番号２の配列またはその機能部分もしくは誘導体（例えば、配列番号８〜１２のいずれか１つ以上、例えば、配列番号８及び９）に結合し（例えば、作動可能に連結し）、いくつかの実施形態では、領域の順序を逆にする（例えば、配列番号２の配列またはその機能部分もしくは誘導体（例えば、配列番号８〜１２のいずれか１つ以上、例えば、配列番号８及び９）を、配列番号１の配列またはその機能部分もしくは誘導体（例えば、配列番号３〜７のいずれか１つ以上、例えば、配列番号３及び４）に結合する（例えば、作動可能に連結する））。例えば、配列番号２と配列番号１の直接融合から生じるポリヌクレオチドの核酸配列を、配列番号１４に示す。順序に関係なく、配列番号１またはその機能部分もしくは誘導体の配列と配列番号２またはその機能部分もしくは誘導体の配列を、上記のように、直接融合または核酸リンカーによって結合することができる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、Ｍｙｏ１５遺伝子の第１の非コードエキソン（Ｍｙｏ１５翻訳開始部位に対して−６７５５〜−７２０９の核酸であり、その配列を配列番号１に示す）またはその機能部分もしくはその誘導体を含む領域に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する領域を含む。配列番号１の機能部分は、Ｍｙｏ１５翻訳開始部位に対して−７１６６〜−７０９１の核酸配列（配列番号３に記載）及び／またはＭｙｏ１５翻訳開始部位に対して−７０７７〜−６９８３の核酸配列（配列番号４に記載）を有し得る。ポリヌクレオチドは、配列番号５に記載の介在核酸を伴わずに配列番号４の核酸配列に融合させた配列番号３の核酸配列を含み得るか、またはポリヌクレオチドは、配列番号６に記載の介在核酸を伴わずに配列番号３の核酸に融合させた配列番号４の核酸配列を含み得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、内在性の介在核酸配列（例えば、第１の領域は、配列番号７に記載のように、Ｍｙｏ１５翻訳開始部位に対して−７１６６〜−６９８３の核酸配列を有し得る）または核酸リンカーによって結合された配列番号３及び配列番号４の配列を含み得る。配列番号３及び配列番号４の両方を含むポリヌクレオチドでは、２つの配列は、任意の順序で含まれ得る（例えば、配列番号３を配列番号４に結合して（例えば、先行させて）もよく、または配列番号４を配列番号３に結合して（例えば、先行させて）もよい）。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、Ｍｙｏ１５翻訳開始部位の直前の上流の核酸配列（Ｍｙｏ１５翻訳開始部位に対して−１〜−１１５７の核酸であり、その配列を配列番号２に示す）またはその機能部分もしくはその誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する領域を含む。配列番号２の機能部分は、Ｍｙｏ１５翻訳開始部位に対して−５９０〜−５０９の核酸配列（配列番号８に記載）及び／またはＭｙｏ１５翻訳開始部位に対して−２６６〜−１６１の核酸配列（配列番号９に記載）を有し得る。ポリヌクレオチドは、配列番号１０に記載の介在核酸を伴わずに配列番号９の核酸配列に融合させた配列番号８の核酸配列を含み得るか、またはポリヌクレオチドは、配列番号１１に記載の介在核酸を伴わずに配列番号８の核酸配列に融合させた配列番号９の核酸配列を含み得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、内在性の介在核酸配列（例えば、第２の領域は、配列番号１２に記載するように、Ｍｙｏ１５翻訳開始部位に対して−５９０〜−１６１の核酸配列を有し得る）または核酸リンカーによって結合した配列番号８と配列番号９の配列を含み得る。配列番号８及び配列番号９の両方を含むポリヌクレオチドでは、２つの配列は、任意の順序で含まれ得る（例えば、配列番号８を配列番号９に結合して（例えば、先行させて）もよく、または配列番号９を配列番号８に結合して（例えば、先行させて）もよい）。
【００８０】
前述の核酸配列を以下の表２にまとめる。
【００８１】
【表２−１】
2021521842.tif 000003
【００８２】
【表２−２】
2021521842.tif 000004
【００８３】
【表２−３】
2021521842.tif 000005
【００８４】
【表２−４】
2021521842.tif 000006
【００８５】
【表２−５】
2021521842.tif 000007
【００８６】
本明細書に記載の組成物及び方法と組み合わせて有用なさらなるポリヌクレオチドとして、表２に示す核酸配列及び表２に示す核酸配列の機能部分または誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する核酸分子が挙げられる。
【００８７】
前述のポリヌクレオチドを、核酸ベクターに含め、導入遺伝子に作動可能に連結して、有毛細胞（例えば、蝸牛有毛細胞及び／または前庭有毛細胞）において導入遺伝子を特異的に発現させることができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、有毛細胞の機能、有毛細胞の発達、有毛細胞の細胞運命の特定、有毛細胞の再生、有毛細胞の生存、または有毛細胞の維持に関与するタンパク質をコードしているか、あるいは導入遺伝子は、難聴、聴覚消失、聴覚神経障害、耳鳴症、または前庭機能不全（例えば、回転性眩暈、浮動性眩暈、または平衡失調）を有する対象において変異していることが見出されている遺伝子の野生型バージョンである。本明細書に記載の方法に従って、難聴及び／または前庭機能不全の治療のための治療用タンパク質をコードする導入遺伝子に作動可能に連結された前述のポリヌクレオチドの１つ以上（例えば、表２に記載のポリヌクレオチドの１つ以上）を含む組成物を対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、アクチンγ１（ＡＣＴＧ１）、ファスシンアクチンバンドリングタンパク質２、レチナール（ＦＳＣＮ２）、ラジキシン（ＲＤＸ）、ＰＯＵクラス４ホメオボックス３（ＰＯＵ４Ｆ３）、ＴＲＩＯ及びＦ−アクチン結合タンパク質（ＴＲＩＯＢＰ）、タペリン（ＴＰＲＮ）、Ｘｉｎアクチン結合リピート含有２（ＸＩＲＰ２）、Ａｔｏｎａｌ  ＢＨＬＨ転写因子１（ＡＴＯＨ１）、成長因子非依存性１転写抑制因子（ＧＦＩ１）、コリン作動性受容体ニコチンα９サブユニット（ＣＨＲＮＡ９）、カルシウム及びインテグリン結合ファミリーメンバー３（ＣＩＢ３）、カドヘリン２３（ＣＤＨ２３）、プロトカドヘリン１５（ＰＣＤＨ１５）、キノシリン（ＫＮＣＮ）、ペジバキン（ＤＦＮＢ５９）、オトフェリン（ＯＴＯＦ）、ＭＫＲＮ２反対鎖（ＭＫＲＮ２ＯＳ）、ＬＩＭホメオボックスタンパク質３（ＬＨＸ３）、膜貫通型チャネル様１（ＴＭＣ１）、ミオシン１５（ＭＹＯ１５）、ミオシン７Ａ（ＭＹＯ７Ａ）、ミオシン６（ＭＹＯ６）、ミオシンＩＩＩＡ（ＭＹＯ３Ａ）、ミオシンＩＩＩＢ（ＭＹＯ３Ｂ）、グルタレドキシンドメイン含有システインリッチタンパク質１（ＧＲＸＣＲ１）、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体タイプＱ（ＰＴＰＲＱ）、後期角化エンベロープ６Ａ（ＬＣＥ６Ａ）、リポキシゲナーゼホモロジードメイン含有タンパク質１（ＬＯＸＨＤ１）、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ１（ＡＲＴ１）、ＡＴＰアーゼ細胞膜Ｃａ２＋輸送体２（ＡＴＰ２Ｂ２）、カルシウム及びインテグリン結合ファミリーメンバー２（ＣＩＢ２）、カルシウム電位依存性チャネル補助サブユニットα２δ４（ＣＡＣＮＡ２Ｄ４）、カルシウム結合タンパク質２（ＣＡＢＰ２）、表皮成長因子受容体経路基質８（ＥＰＳ８）、ＥＰＳ８様２（ＥＰＳ８Ｌ２）、エスピン（ＥＳＰＮ）、エスピン様（ＥＳＰＮＬ）、ペリフェリン２（ＰＲＰＨ２）、ステレオシリン（ＳＴＲＣ）、溶質キャリアファミリー８メンバーＡ２（ＳＬＣ８Ａ２）、亜鉛フィンガーＣＣＨＣタイプ含有タンパク質１２（ＺＣＣＨＣ１２）、ロイシンリッチ膜貫通及びＯ−メチルトランスフェラーゼドメイン含有（ＬＲＴＯＭＴ２、ＬＲＴＯＭＴ１）、ＵＳＨ１タン��ク質ネットワーク成分ハーモニン（ＵＳＨ１Ｃ）、細胞外ロイシンリッチリピート及びフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン含有１（ＥＬＦＮ１）、テトラトリコペプチドリピートタンパク質２４（ＴＴＣ２４）、ジストロテリン（ＤＹＴＮ）、キーリン／コーディン様タンパク質（ＫＣＰ）、コイルドコイルグルタミン酸リッチタンパク質２（ＣＣＥＲ２）、ロイシンリッチリピート及び膜貫通ドメイン含有タンパク質２（ＬＲＴＭ２）、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＡメンバー１０（ＫＣＮＡ１０）、ニューロトロフィン３（ＮＴ３）、クラリン１（ＣＬＲＮ１）、クラリン２（ＣＬＲＮ２）、ＳＫＩファミリー転写コリプレッサー１（ＳＫＯＲ１）、Ｔｃｔｅｘ１ドメイン含有タンパク質１（ＴＣＴＥＸ１Ｄ１）、Ｆｃ受容体様Ｂ（ＦＣＲＬＢ）、溶質キャリアファミリー１７メンバー８（ＳＬＣ１７Ａ８）、グルタレドキシンドメイン含有システインリッチタンパク質２（ＧＲＸＣＲ２）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、セルピンファミリーＥメンバー３（ＳＥＲＰＩＮＥ３）、Ｎｅｓｃｉｅｎｔヘリックス・ループ・ヘリックス１（ＮＨＬＨ１）、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）、活性化転写因子６（ＡＴＦ６）、真核生物翻訳開始因子２αキナーゼ３（ＰＥＲＫ）、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ／エンドリボヌクレアーゼＩＲＥ１（ＩＲＥ１）、及び結合性免疫グロブリンタンパク質（ＢＩＰ）からなる群から選択されるタンパク質をコードする。
【００８８】
哺乳類細胞における外来性核酸の発現
ＭＹＯ７Ａ、ＰＯＵ４Ｆ３、ＳＬＣ１７Ａ８、及びＴＭＣ１などの様々な遺伝子の変異が感音難聴に関連しており、これらの変異の一部、例えば、ＭＹＯ７Ａの変異は前庭機能不全にも関連している。本明細書に記載の組成物及び方法を使用して、特に有毛細胞（例えば、蝸牛有毛細胞及び／または前庭有毛細胞）において、目的のタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したＭｙｏ１５プロモーターを含む核酸ベクター（例えば、配列番号１またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第１の領域及び／または配列番号２またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第２の領域、場合により第１の領域と第２の領域を結合するリンカーを含む）を投与することによって、目的の遺伝子（例えば、難聴及び／または前庭機能不全に関与する野生型の遺伝子、または有毛細胞の発達、機能、細胞運命の特定、再生、生存、もしくは維持に関与する遺伝子）によってコードされるタンパク質の発現を誘導または増加させることができる。タンパク質を哺乳類細胞に送達するための、及びタンパク質をコードする遺伝子を哺乳類細胞において安定的に発現させるための幅広い方法が確立されている。
【００８９】
本明細書に記載の組成物に関連して発現させることができるタンパク質（例えば、タンパク質をコードする導入遺伝子が、配列番号１またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第１の領域及び／または配列番号２またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第２の領域を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されている場合）は、健康な有毛細胞において発現するタンパク質（例えば、蝸牛有毛細胞及び／または前庭有毛細胞、例えば、有毛細胞の発達、機能、再生、細胞運命の特定、生存、もしくは維持に役割を果たすタンパク質、または感音難聴もしくは前庭機能不全を有する対象において欠損しているタンパク質）または他の目的の治療用タンパク質である。本明細書に記載の組成物及び方法を使用して有毛細胞において発現させることができるタンパク質として、ＡＣＴＧ１、ＦＳＣＮ２、ＲＤＸ、ＰＯＵ４Ｆ３、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＰＲＮ、ＸＩＲＰ２、ＡＴＯＨ１、ＧＦＩ１、ＣＨＲＮＡ９、ＣＩＢ３、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＫＮＣＮ、ＤＦＮＢ５９、ＯＴＯＦ、ＭＫＲＮ２ＯＳ、ＬＨＸ３、ＴＭＣ１、ＭＹＯ１５、ＭＹＯ７Ａ、ＭＹＯ６、ＭＹＯ３Ａ、ＭＹＯ３Ｂ、ＧＲＸＣＲ１、ＰＴＰＲＱ、ＬＣＥ６Ａ、ＬＯＸＨＤ１、ＡＲＴ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＣＩＢ２、ＣＡＣＮＡ２Ｄ４、ＣＡＢＰ２、ＥＰＳ８、ＥＰＳ８Ｌ２、ＥＳＰＮ、ＥＳＰＮＬ、ＰＲＰＨ２、ＳＴＲＣ、ＳＬＣ８Ａ２、ＺＣＣＨＣ１２、ＬＲＴＯＭＴ２、ＬＲＴＯＭＴ１、ＵＳＨ１Ｃ、ＥＬＦＮ１、ＴＴＣ２４、ＤＹＴＮ、ＫＣＰ、ＣＣＥＲ２、ＬＲＴＭ２、ＫＣＮＡ１０、ＮＴ３、ＣＬＲＮ１、ＣＬＲＮ２、ＳＫＯＲ１、ＴＣＴＥＸ１Ｄ１、ＦＣＲＬＢ、ＳＬＣ１７Ａ８、ＧＲＸＣＲ２、ＢＤＮＦ、ＳＥＲＰＩＮＥ３、ＮＨＬＨ１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＡＴＦ６、ＰＥＲＫ、ＩＲＥ１、及びＢＩＰが挙げられる。
【００９０】
目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
哺乳類細胞内で目的のタンパク質を治療上有効な細胞内濃度に到達させるために使用することができる１つのプラットフォームは、目的のタンパク質をコードする遺伝子を安定的に発現させる（例えば、哺乳類細胞の核ゲノムもしくはミトコンドリアゲノムへの組み込みによって、または哺乳類細胞の核におけるエピソーム鎖状体形成によって）ことによる。遺伝子は、対応するタンパク質の一次アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。外来性遺伝子を哺乳類細胞に導入するために、遺伝子をベクターに組み込むことができる。ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入、直接取り込み、粒子衝撃法、及びリポソームへのベクターのカプセル化を含む様々な方法によって、細胞に導入することができる。細胞を形質移入または形質転換する適切な方法の例として、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔法、マイクロインジェクション、感染、リポフェクション、及び直接取り込みが挙げられる。そのような方法は、例えば、Ｇｒｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２０１４）；及びＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２０１５）にさらに詳細に記載されており、それぞれの開示は参照により本明細書に援用される。
【００９１】
目的のタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを細胞膜リン脂質に標的化することにより、目的のタンパク質を哺乳類細胞に導入することもできる。例えば、すべての細胞膜リン脂質に親和性を有するウイルスタンパク質であるＶＳＶ−Ｇタンパク質にベクター分子を結合させることにより、ベクターを細胞膜の細胞外表面上のリン脂質に標的化することができる。そのような構築物は、当業者に周知の方法を使用して生成することができる。
【００９２】
目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、哺乳類ＲＮＡポリメラーゼによって認識され、結合されることは、遺伝子発現にとって重要である。したがって、ＲＮＡポリメラーゼを動員し、転写開始部位での転写複合体の集合を促進する転写因子に対して高い親和性を示す配列エレメントを、ポリヌクレオチド内に含めてもよい。そのような配列エレメントとして、例えば、哺乳類プロモーターが挙げられ、その配列は、特定の転写開始因子、そして最終的にはＲＮＡポリメラーゼによって認識され、結合され得る。哺乳類プロモーターの例は、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｓｙｓ．Ｂｉｏｌ．，３：７３（オンライン公開）に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される。本明細書に記載の方法及び組成物で使用するプロモーターは、配列番号１またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第１の領域及び／または配列番号２またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第２の領域を含み、場合により第１の領域と第２の領域の間にリンカーを含むポリヌクレオチドである。
【００９３】
目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが哺乳類細胞の核ＤＮＡに組み込まれると、このポリヌクレオチドの転写を、当技術分野で公知の方法によって誘導することができる。例えば、哺乳類プロモーターへの転写因子及び／またはＲＮＡポリメラーゼの結合を調節し、したがって遺伝子発現を調節する薬剤などの外部化学試薬に哺乳類細胞を曝露することによって、発現を誘導することができる。化学試薬は、例えば、プロモーターに結合したリプレッサータンパク質を除去することによって、哺乳類プロモーターへのＲＮＡポリメラーゼ及び／または転写因子の結合を促進するように機能することができる。あるいは、化学試薬は、ＲＮＡポリメラーゼ及び／または転写因子に対する哺乳類プロモーターの親和性を高め、それによりプロモーターの下流に位置する遺伝子の転写速度を化学試薬の存在下で増加させるように機能することができる。上記のメカニズムによってポリヌクレオチド転写を増強する化学試薬の例として、テトラサイクリン及びドキシサイクリンが挙げられる。これらの試薬は市販されており（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、確立されたプロトコールに従って遺伝子発現を促進するために哺乳類細胞に投与することができる。
【００９４】
本明細書に記載の組成物及び方法で使用するためのポリヌクレオチドに含めてもよい他のＤＮＡ配列エレメントとして、エンハンサー配列が挙げられる。エンハンサーは、ＤＮＡが、転写開始部位での転写因子及びＲＮＡポリメラーゼの結合に有利な三次元配向をとるように、目的の遺伝子を含むポリヌクレオチドの立体構造変化を誘導する別のクラスの調節エレメントを表す。したがって、本明細書に記載の組成物及び方法で使用するためのポリヌクレオチドには、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれ、さらに哺乳類のエンハンサー配列が含まれる。現在、哺乳類遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が知られており、例として、哺乳類のグロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリンをコードする遺伝子のエンハンサーが挙げられる。本明細書に記載の組成物及び方法で使用するためのエンハンサーには、真核細胞に感染することができるウイルスの遺伝物質に由来するエンハンサーも含まれる。例として、複製起点の後半側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後半側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物の遺伝子転写の活性化を誘導するさらなるエンハンサー配列として、ＣＭＶエンハンサー及びＲＳＶエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター内に、例えば、この遺伝子の５’または３’の位置にスプライシングさせてもよい。好ましい配向では、エンハンサーをプロモーターの５’側に配置し、次いでプロモーターを、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対して５’側に配置する。
【００９５】
本明細書に記載のＭｙｏ１５プロモーターを含む核酸ベクターには、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含めてもよい。ＷＰＲＥは、転写レベルで作用し、転写産物の核外輸送を促進することによって、及び／または新生の転写産物のポリアデニル化の効率を高めることによって、細胞内のｍＲＮＡの総量を増加させる。ベクターへのＷＰＲＥの付加は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、いくつかの異なるプロモーターからの導入遺伝子発現のレベルの実質的な改善をもたらし得る。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＭｙｏ１５プロモーターを含む核酸ベクターは、レポーター配列を含み、これは、例えば、細胞及び組織（例えば、蝸牛有毛細胞及び／または前庭有毛細胞）において、Ｍｙｏ１５プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の発現を検証するのに有用であり得る。導入遺伝子において提供し得るレポーター配列として、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、及び当技術分野で周知の他のレポーターをコードするＤＮＡ配列が挙げられる。レポーター配列は、それらの発現を駆動するＭｙｏ１５プロモーターなどの調節エレメントに関連付けられる場合、酵素アッセイ、放射線アッセイ、比色アッセイ、蛍光アッセイまたは他の分光アッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ、ならびに酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び免疫組織化学を含む免疫学的アッセイを含む、従来の手段によって検出可能なシグナルを提供する。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを組み込んだベクターの存在を、β−ガラクトシダーゼ活性のアッセイによって検出する。導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼである場合、シグナルを組み込んだベクターを、ルミノメーターでの色または光の生成によって視覚的に測定してもよい。
【００９７】
外来性核酸を標的細胞に送達するための方法
導入遺伝子、例えば、本明細書に記載のＭｙｏ１５プロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を標的細胞（例えば、哺乳類細胞）に導入するために使用することができる技術は、当技術分野で周知である。例えば、電気穿孔法を使用して、目的の細胞に静電ポテンシャルを印加することにより、哺乳類細胞（例えば、ヒト標的細胞）を透過性にすることができる。このようにして外部電場にさらされたヒト細胞などの哺乳類細胞は、その後、外来性核酸を取り込みやすくなる。哺乳類細胞の電気穿孔法は、例えば、Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：１３１１（１９８７）に詳細に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される。同様の技術であるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）は、真核細胞の核への外来性ポリヌクレオチドの取り込みを刺激するために印加する電場を利用する。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）及びこの技術を実施するのに有用なプロトコールは、例えば、Ｄｉｓｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １４：３１５（２００５）、及びＵＳ２０１０／０３１７１１４に詳細に記載されており、それぞれの開示は、参照により本明細書に援用される。
【００９８】
標的細胞の形質移入に有用なさらなる技術として、スクイーズポレーション法が挙げられる。この技術は、加えられたストレスに応答して形成される膜状の細孔を介した外来性ＤＮＡの取り込みを刺激するために、細胞の急速な機械的変形を誘発する。この技術は、ヒト標的細胞などの細胞への核酸の送達にベクターを必要としないという点で有利である。スクイーズポレーションは、例えば、Ｓｈａｒｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ８１：ｅ５０９８０  （２０１３）に詳細に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される。
【００９９】
リポフェクションは、標的細胞の形質移入に有用な別の技術である。この方法は、リポソームへの核酸のローディングを含み、この方法は、多くの場合、第四級アミンまたはプロトン化アミンなどの陽イオン性官能基をリポソームの外部に向かって提示する。これにより、細胞膜の陰イオン性によってリポソームと細胞との間の静電相互作用が促進され、最終的に、例えば、リポソームと細胞膜との直接融合または複合体のエンドサイトーシスによって外来性核酸が取り込まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第７，４４２，３８６号に詳細に記載されており、その開示は、参照により本明細書に援用される。細胞膜とのイオン相互作用を利用して外来性核酸の取り込みを誘発する同様の技術には、細胞を陽イオン性ポリマー−核酸複合体と接触させることが含まれる。細胞膜との相互作用に有利な正電荷を与えるようにポリヌクレオチドと会合させる例示的な陽イオン性分子として、活性化デンドリマー（例えば、Ｄｅｎｎｉｇ，Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２８：２２７（２００３）に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される）ポリエチレンイミン、及びジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストランが挙げられ、形質移入剤としてのこれらの使用は、例えば、Ｇｕｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４０：Ｉ：９．２：９．２．１（１９９７）に詳細に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される。磁気ビーズは、穏やかで効率的な方法で標的細胞を形質移入するために使用することができる別のツールであり、なぜなら、この方法論は、核酸の取り込みを指示するために磁場の印加を利用するためである。この技術は、例えば、ＵＳ２０１０／０２２７４０６に詳細に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される。
【０１００】
標的細胞による外来性核酸の取り込みを誘発するための別の有用なツールは、レーザーフェクションであり、これは光学形質移入法とも呼ばれ、細胞を穏やかに透過性にし、ポリヌクレオチドが細胞膜に浸透できるようにするために、細胞を特定の波長の電磁放射に曝露することを含む技術である。この技術の生物活性は、電気穿孔法に類似しており、いくつかの場合では電気穿孔法よりも優れていることがわかる。
【０１０１】
インパレフェクションは、遺伝物質を標的細胞に送達するために使用することができる別の技術である。この技術は、カーボンナノファイバー、カーボンナノチューブ、及びナノワイヤーなどのナノ材料の使用に依存する。針状のナノ構造を、基板の表面に対して垂直に合成する。細胞内送達を目的とした遺伝子を含むＤＮＡを、ナノ構造の表面に付着させる。次いで、これらの針のアレイを備えたチップを細胞または組織に押し付ける。ナノ構造によって刺激された細胞は、送達された遺伝子（複数可）を発現することができる。この技術の実施例は、Ｓｈａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０７：１８７０（２０１０）に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される。
【０１０２】
マグネトフェクションを使用して標的細胞に核酸を送達することもできる。マグネトフェクションの原理は、核酸を陽イオン性磁性ナノ粒子と会合させることである。磁性ナノ粒子は、完全に生分解性の酸化鉄でできており、用途に応じて異なる特定の独自の陽イオン性分子でコーティングされている。遺伝子ベクター（ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ウイルスベクターなど）とのそれらの会合は、塩によって誘発されるコロイド凝集及び静電相互作用によって達成される。次いで、磁石によって生成された外部磁場の影響により、磁性粒子が標的細胞上に濃縮される。この技術は、Ｓｃｈｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：１０２（２００２）に詳細に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される。
【０１０３】
標的細胞による外来性核酸の取り込みを誘発するための別の有用なツールは、ソノポレーションであり、これは細胞膜の透過性を改変するために音波（通常は超音波周波数）を使用することを含む技術であり、細胞を透過性にし、ポリヌクレオチドが細胞膜に浸透することを可能にする。この技術は、例えば、Ｒｈｏｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８２：３０９（２００７）に詳細に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される。
【０１０４】
微小胞は、本明細書に記載の方法に従って標的細胞のゲノムを改変するために使用することができる別の潜在的な媒体を表す。例えば、糖タンパク質ＶＳＶ−Ｇと、例えば、ヌクレアーゼなどのゲノム修飾タンパク質との共過剰発現によって誘導した微小胞を使用して、タンパク質を細胞に効率的に送達し、その後、内在性ポリヌクレオチド配列の部位特異的切断を触媒し、それにより、遺伝子または調節配列などの目的のポリヌクレオチドを共有結合によって組み込むために細胞のゲノムを調製することができる。真核細胞を遺伝子改変するためのＧｅｓｉｃｌｅとも呼ばれるそのような小胞の使用は、例えば、Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ［ａｂｓｔｒａｃｔ］  Ｉｎ：Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ［ａｂｓｔｒａｃｔ］，ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １８ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ；２０１５  Ｍａｙ  １３，Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．  １２２に詳細に記載されている。
【０１０５】
外来性核酸を標的細胞に送達するためのベクター
高速の転写及び翻訳を達成することに加えて、哺乳類細胞における外来性遺伝子の安定した発現を、その遺伝子を含むポリヌクレオチドを哺乳類細胞の核ゲノムへ組み込むことによって達成することができる。外来性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを哺乳類細胞の核ＤＮＡに送達し、組み込むための様々なベクターが開発されてきた。発現ベクターの例は、例えば、Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｎｏｖｅｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｍａｒｂｌｅｈｅａｄ，ＭＡ，２００６）に記載されている。本明細書に記載の組成物及び方法で使用する発現ベクターは、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に、及び、例えば、これらの作用物質の発現及び／またはこれらのポリヌクレオチド配列の哺乳類細胞ゲノムへの組み込みに使用する追加の配列エレメントに作動可能に連結されたＭｙｏ１５プロモーター（例えば、配列番号１またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第１の領域及び／または配列番号２またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第２の領域を含み、場合により第１の領域と第２の領域の間にリンカーを含むポリヌクレオチド）を含む。目的のタンパク質をコードする導入遺伝子に作動可能に連結されたＭｙｏ１５プロモーターを含ませることができるベクターとして、プラスミド（例えば、細胞内で自律的に複製できる環状ＤＮＡ分子）、コスミド（例えば、ｐＷＥベクターまたはｓＣｏｓベクター）、人工染色体（例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ））、及びウイルスベクターが挙げられる。目的のタンパク質の発現に使用することができる特定のベクターとして、遺伝子転写を指示するエンハンサー領域などの調節配列を含むプラスミドが挙げられる。目的のタンパク質発現に有用な他のベクターは、これらの遺伝子の翻訳速度を高めるか、または遺伝子転写から生じるｍＲＮＡの安定性もしくは核外輸送を向上させるポリヌクレオチド配列を含む。これらの配列エレメントには、例えば、発現ベクターが保有する遺伝子の効率的な転写を指示するための、５’及び３’非翻訳領域、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及びポリアデニル化シグナル部位が含まれる。本明細書に記載の組成物及び方法での使用に適した発現ベクターはまた、そのようなベクターを含む細胞を選択するためのマーカーをコードするポリヌクレオチドを含み得る。適切なマーカーの例として、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、またはノーセオスリシンなどの抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられる。
【０１０６】
核酸送達用のウイルスベクター
ウイルスゲノムは、目的の遺伝子を標的細胞（例えば、ヒト細胞などの哺乳類細胞）のゲノムに効率的に送達するために使用することができるベクターの豊富な供給源を提供する。ウイルスゲノムは、そのようなゲノム内に含まれるポリヌクレオチドが、通常、普遍形質導入または特殊形質導入によって哺乳類細胞の核ゲノムに組み込まれるため、遺伝子送達のための特に有用なベクターである。これらのプロセスは、天然のウイルス複製サイクルの一部として発生し、遺伝子の組み込みを誘導するためにタンパク質や試薬を追加する必要がない。ウイルスベクターの例として、レトロウイルス（例えば、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科ウイルスベクター）、アデノウイルス（例えば、Ａｄ５、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、及びＡｄ４８）、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス及び水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹及びセンダイ）、プラス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、ピコルナウイルス及びアルファウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス）、及びポックスウイルス（例えば、ワクシニア、変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、鶏痘及びカナリア痘）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられる。他のウイルスとして、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒト泡沫状ウイルス、及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例として：トリ白血病肉腫、トリＣ型ウイルス、哺乳類Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、オンコレトロウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群、レンチウイルス、アルファレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、スプーマウイルスが挙げられる（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６））。他の例として、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒヒ内在性ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、マソン−ファイザーサルウイルス、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス及びレンチウイルスが挙げられる。ベクターの他の例は、例えば、米国特許第５，８０１，０３０号に記載されており、その開示は、それが遺伝子治療で使用するためのウイルスベクターに属するため、参照により本明細書に援用される。
【０１０７】
核酸送達用のＡＡＶベクター
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法のポリヌクレオチドを、細胞へのそれらの導入を容易にするために、ｒＡＡＶベクター及び／またはウイルス粒子に組み込む。本明細書に記載の組成物及び方法に有用なｒＡＡＶベクターは、（１）本明細書に記載のＭｙｏ１５プロモーター（例えば、配列番号１またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第１の領域及び／または配列番号２またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第２の領域を含み、場合により第１の領域と第２の領域の間にリンカーを含むポリヌクレオチド）、（２）発現させる異種配列、及び（３）異種遺伝子の安定性及び発現を促進するウイルス配列を含む、組換え核酸構築物である。ウイルス配列は、ＤＮＡの複製及びウイルス粒子へのパッケージング（例えば、機能的ＩＴＲ）のためにシスで必要とされるＡＡＶの配列を含み得る。一般的な応用では、導入遺伝子は、有毛細胞の発達、有毛細胞の機能、有毛細胞の再生、有毛細胞の運命の特定、有毛細胞の生存、または有毛細胞の維持を促進することができる治療用タンパク質か、あるいは遺伝性難聴または前庭機能不全の形態を有する対象においては変異している有毛細胞タンパク質の野生型をコードし、これらは、難聴、聴覚消失、または前庭機能不全（例えば、浮動性眩暈、回転性眩暈、または平衡失調）に関連している変異を有する対象の聴力または前庭機能を改善するのに有用であり得る。そのようなｒＡＡＶベクターは、マーカーまたはレポーター遺伝子も含み得る。有用なｒＡＡＶベクターでは、１つ以上のＡＡＶ  ＷＴ遺伝子の全体または一部が削除されているが、機能的な隣接ＩＴＲ配列は保持されている。ＡＡＶ  ＩＴＲは、特定の応用に適した任意の血清型であり得る。本明細書に記載の方法及び組成物で使用するために、ＩＴＲはＡＡＶ２  ＩＴＲであり得る。ｒＡＡＶベクターの使用方法は、例えば、Ｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．７：２７９（２０００）、及びＭｏｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ７：２４（２０００）に記載されており、それらの各開示は、それらが遺伝子送達用のＡＡＶベクターに属するため、参照により本明細書に援用される。
【０１０８】
細胞へのポリヌクレオチドまたはベクターの導入を容易にするために、本明細書に記載のポリヌクレオチド及びベクター（例えば、目的のタンパク質をコードする導入遺伝子に作動可能に連結されたＭｙｏ１５プロモーター）をｒＡＡＶウイルス粒子に組み込むことができる。ＡＡＶのキャプシドタンパク質は、ウイルス粒子の外部の非核酸部分を構成し、ＡＡＶキャップ遺伝子によってコードされる。ｃａｐ遺伝子は、ウイルス粒子の組み立てに必要な３つのウイルスコートタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。ｒＡＡＶウイルス粒子の構築は、例えば、ＵＳ５，１７３，４１４；ＵＳ５，１３９，９４１；ＵＳ５，８６３，５４１；ＵＳ５，８６９，３０５；ＵＳ６，０５７，１５２；及びＵＳ６，３７６，２３７；ならびにＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７９１（２００２）及びＢｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：４２３（２００３）に記載されており、それらの各開示は、それらが遺伝子送達用のＡＡＶベクターに属するため、参照により本明細書に援用される。
【０１０９】
本明細書に記載の組成物及び方法と組み合わせて有用なｒＡＡＶウイルス粒子として、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、ｒｈ１０、ｒｈ３９、ｒｈ４３、ｒｈ７４、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＤＪ／８、ＤＪ／９、７ｍ８、ＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．ｅｂ、及びＰＨＰ．Ｓを含む様々なＡＡＶ血清型に由来するウイルス粒子が挙げられる。有毛細胞を標的とする場合、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＤＪ／９、７ｍ８、及びＰＨＰ．Ｂが特に有用であり得る。網膜の形質導入のために進化させた血清型もまた、本明細書に記載の方法及び組成物において使用してもよい。異なる血清型のＡＡＶベクター及びＡＡＶタンパク質の構築及び使用は、例えば、Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：６１９（２０００）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：３４２８  （２０００）；Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２２４（１９９８）；Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１５２４（２０００）；Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：６６１５（２００１）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５（２００１）に記載されており、それらの各開示は、それらが遺伝子送達用のＡＡＶベクターに属するため、参照により本明細書に援用される。
【０１１０】
本明細書に記載の組成物及び方法と組み合わせて有用なものは、偽型ｒＡＡＶベクターである。偽型ベクターには、所与の血清型（例えば、ＡＡＶ９）のＡＡＶベクターが、所与の血清型以外の血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８など）に由来するキャプシド遺伝子で偽型化されたものが含まれる。偽型ｒＡＡＶウイルス粒子の構築及び使用を含む技術は当技術分野で公知であり、例えば、Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：７６６２（２００１）；Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１５２４（２０００）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８：１５８（２００２）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５（２００１）に記載されている。
【０１１１】
ウイルス粒子のキャプシド内に変異を有するＡＡＶウイルス粒子を使用して、変異していないキャプシドウイルス粒子よりも効果的に特定の細胞型に感染させ得る。例えば、適切なＡＡＶ変異体は、ＡＡＶを特定の細胞型に標的化することを容易にするためのリガンド挿入変異を有し得る。挿入変異体、アラニンスクリーニング変異体、及びエピトープタグ変異体を含むＡＡＶキャプシド変異体の構築及び特徴決定は、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８６３５（２０００）に記載されている。本明細書に記載の方法で使用することができる他のｒＡＡＶウイルス粒子として、ウイルスの分子育種によって、及びエキソンシャッフリングによって生成されるキャプシドハイブリッドが挙げられる。例えば、Ｓｏｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２５：４３６（２０００）及びＫｏｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：４２３（２００１）を参照のこと。
【０１１２】
医薬組成物
本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、配列番号１またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第１の領域及び／または配列番号２またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第２の領域を含み、場合により第１の領域と第２の領域の間にリンカーを含むポリヌクレオチド）を、導入遺伝子（例えば、目的のタンパク質をコードする導入遺伝子）に作動可能に連結し、患者、例えば、感音難聴及び／または前庭機能不全に罹患しているヒト患者に投与するためのビヒクルに組み込んでもよい。治療用導入遺伝子に作動可能に連結された本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む、ウイルスベクターなどのベクターを含む医薬組成物は、当技術分野で公知の方法を使用して調製することができる。例えば、そのような組成物は、例えば、生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌｌｅｎ，Ｌ．Ｅｄ．（２０１３）；参照により本明細書に援用される）を使用して、所望の形態、例えば、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製することができる。
【０１１３】
治療用導入遺伝子に作動可能に連結させた、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む核酸ベクター（例えば、ウイルスベクター）の混合物（例えば、配列番号１またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第１の領域及び／または配列番号２またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第２の領域を含み、場合により第１の領域と第２の領域の間にリンカーを含むポリヌクレオチド）を、１つ以上の賦形剤、担体、または希釈剤と適切に混合した水中において調製してもよい。分散液もまた、グリセロール、液状ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物中で、及び油中で調製してもよい。これらの製剤は、通常の保存条件及び使用条件下で、微生物の増殖を阻止するための保存剤を含有してもよい。注射用途に好適な医薬形態として、注射可能な無菌溶液または無菌分散液を即時調製するための無菌水溶液または無菌分散液及び無菌粉末が挙げられる（ＵＳ５，４６６，４６８に記載されており、その開示は参照により本明細書に援用される）。任意の場合において、製剤は、無菌であってもよく、容易に注射できる程度の流動性を有していてもよい。製剤は、製造及び保管条件下で安定であってもよく、細菌及び真菌などの微生物の混入作用から保護され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコールなど）、その好適な混合物、及び／または植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の抑制は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中で使用することによってもたらされ得る。
【０１１４】
例えば、本明細書に記載の医薬組成物を含む溶液は、必要に応じて適切に緩衝され得、液体希釈剤は、最初に十分な生理食塩水またはグルコースと等張にされる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内の投与に特に好適である。これに関して、採用することができる無菌水性媒体は、本開示に照らして、当業者に公知である。例えば、１用量を１ｍｌのＮａＣｌ等張液中に溶解し、１０００ｍｌの皮下注射液に加えるか、または注入予定部位に注射してもよい。治療する対象の状態に応じて、用量にはいくらかの変動が必然的に生じる。内耳への局所投与のために、組成物を、合成外リンパ溶液を含有するように製剤化してもよい。例示的な合成外リンパ溶液は、２０〜２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１〜５ｍＭ  ＫＣｌ、０．１〜１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１〜１０ｍＭグルコース、及び２〜５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有し、ｐＨ約６〜９及び重量オスモル濃度約３００ｍＯｓｍ／ｋｇを有する。いずれにしても、投与を担当する者が個々の対象に適切な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与の場合、製剤は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ基準によって要求される無菌性、発熱性、一般的安全性、及び純度の基準を満たしていてもよい。
【０１１５】
治療方法
本明細書に記載の組成物を、感音難聴及び／または前庭機能不全を有する対象に、例えば、内耳への局所投与（例えば、卵円窓、正円窓、または三半規管（例えば、水平半規管）を介した、外リンパまたは内リンパへの投与、例えば、蝸牛有毛細胞または前庭有毛細胞への投与）、静脈内、非経口、皮内、経皮、筋肉内、鼻腔内、皮下、経皮、気管内、腹腔内、動脈内、血管内、吸入、灌流、洗浄、及び経口投与などの様々な経路によって、投与してもよい。所与の場合における投与に最も適切な経路は、投与する特定の組成物、患者、医薬製剤化方法、投与方法（例えば、投与時間及び投与経路）、患者の年齢、体重、性別、治療する疾患の重症度、患者の食事、及び患者の排泄率に依存する。組成物は、１回、または２回以上（例えば、年１回、年２回、年３回、隔月、または毎月）投与してもよい。
【０１１６】
本明細書に記載のように治療され得る対象は、感音難聴及び／または前庭機能不全を有するか、または発症するリスクを有する対象（例えば、難聴、前庭機能不全、またはその両方を有するか、または発症するリスクを有する対象）である。本明細書に記載の組成物及び方法を使用して、蝸牛有毛細胞への損傷（例えば、音響外傷、疾患もしくは感染、頭部外傷、耳毒性薬、または加齢に関連する損傷）を有するかまたは発症するリスクを有する対象、前庭有毛細胞への損傷（例えば、疾患もしくは感染、頭部外傷、耳毒性薬、または加齢に関連する損傷）を有するかまたは発症するリスクを有する対象、感音難聴、聴覚消失、またはオーディトリーニューロパチーを有するかまたは発症するリスクを有する対象、前庭機能不全（例えば、浮動性眩暈、回転性眩暈、または平衡失調）を有するかまたは発症するリスクを有する対象、耳鳴症（例えば、耳鳴症単独、または感音難聴もしくは前庭機能不全に関連する耳鳴症）を有する対象、難聴及び／または前庭機能不全に関連する遺伝子変異を有する対象、あるいは遺伝性難聴、聴覚消失、オーディトリーニューロパチー、耳鳴症、または前庭機能不全の家族歴を有する対象を治療することができる。いくつかの実施形態では、対象は、有毛細胞（例えば、蝸牛有毛細胞または前庭有毛細胞）の喪失に関連しているか、またはその結果として生じる難聴及び／または前庭機能不全を有する。本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の組成物による治療または投与の前に、難聴または前庭機能不全に関連することが知られている遺伝子の変異について対象をスクリーニングする工程を含み得る。当業者に公知の標準的な方法（例えば、遺伝子検査）を使用して、対象を遺伝子変異についてスクリーニングすることができる。本明細書に記載の方法はまた、本明細書に記載の組成物による治療または投与の前に、対象の聴覚機能及び／または前庭機能を評価する工程を含み得る。聴力検査、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）、蝸電図検査（ＥＣＯＧ）、及び耳音響放射などの標準検査を使用して、聴覚を評価することができる。前庭機能は、Ｍａｎｃｉｎｉ  ａｎｄ  Ｈｏｒａｋ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈｙｓ  Ｒｅｈａｂｉｌ  Ｍｅｄ，４６：２３９（２０１０）に記載されているような、眼球運動検査（例えば、電気眼振図（ＥＮＧ）またはビデオ式眼振図（ＶＮＧ））、姿勢図検査、回転椅子検査、ＥＣＯＧ、前庭誘発筋電位（ＶＥＭＰ）、及び特殊な臨床平衡機能検査などの標準検査を使用して評価してもよい。本明細書に記載の組成物及び方法はまた、難聴及び／または前庭機能不全を発症するリスクを有する患者、例えば、難聴または前庭機能不全の家族歴（例えば、遺伝性難聴または前庭機能不全）を有する患者、難聴または前庭機能不全に関連する遺伝子変異を有し、まだ聴覚障害または前庭機能不全を示していない患者あるいは後天性難聴（例えば、疾患もしくは感染症、頭部外傷、耳毒性薬、または加齢）または前庭機能不全（例えば、音響外傷、疾患もしくは感染症、頭部外傷、耳毒性薬、または加齢）のリスク因子にさらされている患者への予防的治療として投与してもよい。
【０１１７】
本明細書に記載の組成物及び方法を使用して、対象の有毛細胞の再生（例えば、蝸牛有毛細胞及び／または前庭有毛細胞の再生）を促進または誘導することができる。有毛細胞の再生を促進または誘導する組成物からベネフィットを得る可能性のある対象には、有毛細胞の喪失（例えば、外傷（例えば、音響外傷または頭部外傷）、疾患もしくは感染症、耳毒性薬、または加齢に関連した有毛細胞の喪失）の結果として難聴または前庭機能不全に罹患している対象、及び異常な有毛細胞（例えば、正常な有毛細胞と比較して適切に機能しない有毛細胞）、損傷した有毛細胞（例えば、外傷（例えば、音響外傷または頭部外傷）、疾患もしくは感染症、耳毒性薬、または加齢に関連した有毛細胞の損傷）を有する対象、または遺伝子変異または先天性異常によって有毛細胞数が減少している対象が含まれる。本明細書に記載の組成物及び方法を使用して、有毛細胞の生存を促進または増加させる（例えば、損傷した有毛細胞の生存率を高めるか、損傷した有毛細胞の修復を促進するか、または有毛細胞の喪失（例えば、加齢、大きな音への曝露、疾患もしくは感染、頭部外傷または耳毒性薬による有毛細胞の喪失）のリスクを有する対象の有毛細胞を保存する）こともできる。
【０１１８】
本明細書に記載の組成物及び方法を使用して、耳毒性薬で治療された対象、または耳毒性薬で現在治療を受けているかもしくは治療を開始する予定の対象において、耳毒性薬誘発性の有毛細胞の損傷または細胞死（例えば、蝸牛有毛細胞及び／または前庭有毛細胞の損傷または細胞死）を予防または軽減することもできる。耳毒性薬は、内耳細胞に対して毒性を有し、感音難聴、前庭機能不全（例えば、回転性眩暈、浮動性眩暈、または平衡失調）、耳鳴症、またはこれらの症状の併発を引き起こし得る。耳毒性が見出されている薬物として、アミノグリコシド系抗生物質（例えば、ゲンタマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、カナマイシン、バンコマイシン、及びアミカシン）、バイオマイシン、抗腫瘍薬（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチンなどのプラチナ含有化学療法剤）、ループ利尿薬（例えば、エタクリン酸及びフロセミド）、サリチル酸塩（例えば、特に高用量のアスピリン）、及びキニンが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、音響外傷、疾患もしくは感染症、頭部外傷、または加齢に関連する有毛細胞の損傷または細胞死を予防または軽減する。
【０１１９】
本明細書に記載する、対象を治療するためのＭｙｏ１５プロモーターに作動可能に連結した導入遺伝子（例えば、配列番号１またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第１の領域及び／または配列番号２またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第２の領域を含むポリヌクレオチド）は、健康な有毛細胞において発現するタンパク質（例えば、蝸牛有毛細胞及び／または前庭有毛細胞、例えば、有毛細胞の発達、機能、細胞運命の特定、再生、生存、または維持において役割を果たすタンパク質、または感音難聴及び／または前庭機能不全を有する対象において欠損しているタンパク質）または別の目的の治療用タンパク質をコードする導入遺伝子であり得る。導入遺伝子は、対象の難聴もしくは前庭機能不全の原因（例えば、対象の難聴もしくは前庭機能不全が特定の遺伝子変異に関連している場合、導入遺伝子は、対象においては変異している遺伝子の野生型とすることができ、または対象が有毛細胞の喪失に関連する難聴を有している場合、導入遺伝子は、有毛細胞の再生を促進するタンパク質をコードし得る）、対象の難聴もしくは前庭機能不全の重症度、対象の有毛細胞の健康状態、対象の年齢、対象の難聴もしくは前庭機能不全の家族歴、または他の要因に基づいて選択してもよい。本明細書に記載する、対象の治療のためのＭｙｏ１５プロモーターに作動可能に連結した導入遺伝子によって発現され得るタンパク質として、ＡＣＴＧ１、ＦＳＣＮ２、ＲＤＸ、ＰＯＵ４Ｆ３、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＰＲＮ、ＸＩＲＰ２、ＡＴＯＨ１、ＧＦＩ１、ＣＨＲＮＡ９、ＣＩＢ３、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＫＮＣＮ、ＤＦＮＢ５９、ＯＴＯＦ、ＭＫＲＮ２ＯＳ、ＬＨＸ３、ＴＭＣ１、ＭＹＯ１５、ＭＹＯ７Ａ、ＭＹＯ６、ＭＹＯ３Ａ、ＭＹＯ３Ｂ、ＧＲＸＣＲ１、ＰＴＰＲＱ、ＬＣＥ６Ａ、ＬＯＸＨＤ１、ＡＲＴ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＣＩＢ２、ＣＡＣＮＡ２Ｄ４、ＣＡＢＰ２、ＥＰＳ８、ＥＰＳ８Ｌ２、ＥＳＰＮ、ＥＳＰＮＬ、ＰＲＰＨ２、ＳＴＲＣ、ＳＬＣ８Ａ２、ＺＣＣＨＣ１２、ＬＲＴＯＭＴ２、ＬＲＴＯＭＴ１、ＵＳＨ１Ｃ、ＥＬＦＮ１、ＴＴＣ２４、ＤＹＴＮ、ＫＣＰ、ＣＣＥＲ２、ＬＲＴＭ２、ＫＣＮＡ１０、ＮＴ３、ＣＬＲＮ１、ＣＬＲＮ２、ＳＫＯＲ１、ＴＣＴＥＸ１Ｄ１、ＦＣＲＬＢ、ＳＬＣ１７Ａ８、ＧＲＸＣＲ２、ＢＤＮＦ、ＳＥＲＰＩＮＥ３、ＮＨＬＨ１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＡＴＦ６、ＰＥＲＫ、ＩＲＥ１、及びＢＩＰが挙げられる。
【０１２０】
治療は、本明細書に記載のＭｙｏ１５プロモーターを様々な単位用量で含む核酸ベクター（例えば、ＡＡＶウイルスベクター）を含む組成物の投与を含み得る。各単位用量には、通常、所定量の治療用組成物が含まれる。投与する量、ならびに特定の投与経路及び製剤化は、当業者の技術の範囲内である。単位用量は、単回注射として投与する必要はないが、設定された期間にわたる持続注入を含み得る。投与は、内耳（例えば、蝸牛）への損傷を最小限に抑えるために、シリンジポンプを用いて実施して注入速度を制御してもよい。核酸ベクターがＡＡＶベクターである場合（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ｒｈ１０、ｒｈ３９、ｒｈ４３、ｒｈ７４、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＤＪ／８、ＤＪ／９、７ｍ８、ＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．ｅｂ、またはＰＨＰ．Ｓベクター）、ウイルスベクターは、例えば、約１×１０１０ベクターゲノム（ＶＧ）〜１×１０１５ＶＧ（例えば、１×１０１０ＶＧ、２×１０１０ＶＧ、３×１０１０ＶＧ、４×１０１０ＶＧ、５×１０１０ＶＧ、６×１０１０ＶＧ、７×１０１０ＶＧ、８×１０１０ＶＧ、９×１０１０ＶＧ、１×１０１１ＶＧ、２×１０１１ＶＧ、３×１０１１ＶＧ、４×１０１１ＶＧ、５×１０１１ＶＧ、６×１０１１ＶＧ、７×１０１１ＶＧ、８×１０１１ＶＧ、９×１０１１ＶＧ、１×１０１２ＶＧ、２×１０１２ＶＧ、３×１０１２ＶＧ、４×１０１２ＶＧ、５×１０１２ＶＧ、６×１０１２ＶＧ、７×１０１２ＶＧ、８×１０１２ＶＧ、９×１０１２ＶＧ、１×１０１３ＶＧ、２×１０１３ＶＧ、３×１０１３ＶＧ、４×１０１３ＶＧ、５×１０１３ＶＧ、６×１０１３ＶＧ、７×１０１３ＶＧ、８×１０１３ＶＧ、９×１０１３ＶＧ、１×１０１４ＶＧ、２×１０１４ＶＧ、３×１０１４ＶＧ、４×１０１４ＶＧ、５×１０１４ＶＧ、６×１０１４ＶＧ、７×１０１４ＶＧ、８×１０１４ＶＧ、９×１０１４ＶＧ、１×１０１５ＶＧ）を、１μＬ〜２００μＬ（例えば、１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００μＬ）の用量で患者に投与してもよい。
【０１２１】
本明細書に記載の組成物を、聴覚を改善するか、前庭機能を改善する（例えば、平衡機能を改善するか、または浮動性眩暈もしくは回転性眩暈を軽減する）か、耳鳴症を軽減するか、導入遺伝子によってコードされる治療用タンパク質の発現を増加させるか、導入遺伝子によってコードされる治療用タンパク質の機能を増加させるか、有毛細胞の損傷を予防または軽減するか、有毛細胞の細胞死（例えば、耳毒性薬誘発性有毛細胞死、加齢性有毛細胞死、または騒音（例えば、音響外傷）関連有毛細胞死）を予防または軽減するか、有毛細胞の発達を促進または増加させるか、有毛細胞の数を増加させる（例えば、有毛細胞の再生を促進または誘導する）か、有毛細胞の生存を増加または促進するか、あるいは有毛細胞の機能を向上させるのに十分な量で投与する。聴力は、標準的な聴力検査（例えば、聴力検査、ＡＢＲ、蝸電図検査（ＥＣＯＧ）、及び耳音響放射）を使用して評価してもよく、治療前に得られる聴覚測定値に比べて５％以上（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％またはそれ以上）改善し得る。前庭機能は、平衡機能及び回転性眩暈の標準検査（例えば、眼球運動検査（例えば、ＥＮＧまたはＶＮＧ）、姿勢図検査、回転椅子検査、ＥＣＯＧ、ＶＥＭＰ、及び特殊な臨床平衡機能検査）を使用して評価してもよく、治療前に得られる測定値に比べて５％以上（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％またはそれ以上）改善し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、対象の発話を理解する能力を改善するのに十分な量で投与する。本明細書に記載の組成物はまた、感音難聴及び／または前庭機能不全の発症または進行を遅延または予防するのに十分な量で投与してもよい（例えば、難聴もしくは前庭機能不全に関連する遺伝子変異を有し、難聴もしくは前庭機能不全の家族歴（例えば、遺伝性難聴もしくは前庭機能不全）を有するか、または難聴もしくは前庭機能不全に関連するリスク要因（例えば、耳毒性薬、頭部外傷、音響外傷、または感染症）にさらされているが、難聴もしくは前庭機能不全（例えば、回転性眩暈、浮動性眩暈、または平衡失調）を示していない対象において、あるいは軽度〜中程度の難聴または前庭機能不全を示す対象において）。対象に投与する核酸ベクター中のＭｙｏ１５プロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子によってコードされる治療用タンパク質の発現を、免疫組織化学、ウェスタンブロット分析、定量的リアルタイムＰＣＲ、またはタンパク質もしくはｍＲＮＡを検出するための当技術分野で公知の他の方法を使用して評価してもよく、本明細書に記載の組成物の投与前の発現に比べて５％以上（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％またはそれ以上）増加し得る。有毛細胞数、有毛細胞機能、または対象に投与する核酸ベクターによってコードされる治療用タンパク質の機能を、聴力検査または前庭機能検査に基づいて間接的に評価してもよく、本明細書に記載の組成物の投与前の有毛細胞数、有毛細胞機能、または治療用タンパク質の機能に比べて５％以上（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％またはそれ以上）増加し得る。有毛細胞の損傷または細胞死は、未治療の対象において通常観察される有毛細胞の損傷及び細胞死に比べて５％以上（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％またはそれ以上）低減し得る。これらの効果は、本明細書に記載の組成物の投与後、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１５週間、２０週間、２５週間以内、またはそれ以上の間に生じ得る。治療に使用する用量及び投与経路に応じて、組成物を投与してから、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月またはそれ以上後に患者を評価してもよい。評価の結果に応じて、患者に追加の治療を受けさせてもよい。
【０１２２】
キット
本明細書に記載の組成物を、感音難聴または前庭機能不全の治療に使用するためのキットで提供することができる。組成物は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、配列番号１またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第１の領域及び／または配列番号２またはその機能部分もしくは誘導体に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第２の領域を含み、場合により第１の領域と第２の領域の間にリンカーを含むポリヌクレオチド）、そのようなポリヌクレオチドを含む核酸ベクター、及び目的のタンパク質（例えば、難聴及び／または前庭機能不全を治療するために有毛細胞で発現され得るタンパク質）をコードする導入遺伝子に作動可能に連結した本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む核酸ベクターを含み得る。核酸ベクターは、ＡＡＶウイルスキャプシド（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＤＪ／９、７ｍ８、またはＰＨＰ．Ｂ）にパッケージングしてもよい。キットには、キットのユーザ、例えば医師に、本明細書に記載の方法を実施するように指示する添付文書をさらに含ませることができる。キットには、場合により、組成物を投与するための注射器または他の器具を含ませてもよい。
【実施例】
【０１２３】
以下の実施例は、本明細書に記載の組成物及び方法をどのように使用し、製造し、評価し得るかについての説明を当業者に提供するために提示し、純粋に本発明を例示することを意図するものであり、発明者らが自身の発明と見なすものの範囲を限定することを意図しない。
【０１２４】
実施例１．Ｍｙｏ１５プロモーターの生成
最初に、脊椎動物Ｍｙｏ１５プロモーターの進化的保存領域をＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）を使用して同定した。Ｍｙｏ１５翻訳開始部位のすぐ上流の領域（−１〜−１１５７、配列番号１）及びＭｙｏ１５遺伝子の非コードエキソン１を含む上流領域（−６７５５〜−７２０９、配列番号２）を、ｄｅ  ｎｏｖｏ遺伝子合成により合成し、単一のＤＮＡ断片として一緒に接合させた（配列番号１３）。トランケートされたＭｙｏ１５プロモーターの合計サイズは１６１１ｂｐであるが、ゲノム領域全体では７０００ｂｐを上回る。
【０１２５】
マウス蝸牛のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターと比較したＭｙｏ１５プロモーターによる向性（細胞型標的化）ならびに導入遺伝子発現の程度及び期間を評価する実験では、Ｍｙｏ１５プロモーターで蝸牛有毛細胞における選択的発現が得られ、ＣＭＶプロモーターでは得られなかった。Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ緑色蛍光タンパク質（ＡｃＧＦＰ）の発現を駆動するＭｙｏ１５を用いてＡＡＶ構築物を作成し、ＣＭＶを用いた一致する標準的なＡＡＶ構築物と比較した遺伝子発現の進行を分析した。新生児マウス、成体マウス、及び蝸牛外植片のｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、マウス蝸牛にウイルスを送達した実験で導入遺伝子の発現を評価した。
【０１２６】
導入遺伝子の発現を評価するために、６〜８週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウスに、ＡＡＶ−Ｍｙｏ１５−ＧＦＰウイルスを、後半規管を介して注入した。マウスを手術から回復させ、安楽死させ、１０日後に１０％中性緩衝ホルマリンで灌流した。内耳側頭骨を採取し、８％ＥＤＴＡ中で３日間脱灰した。脱灰した側頭骨から蝸牛または前庭系を解剖し、画像解析のためにスライドに取り付けた。ユビキタスプロモーターを使用して、ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＧＦＰは、内有毛細胞、外有毛細胞、らせん神経節ニューロン、間葉細胞、及びグリアを含む蝸牛内の多くの細胞型でＧＦＰ発現を誘導した（図１Ａ）。有毛細胞特異的プロモーターを使用して、ＡＡＶ−Ｍｙｏ１５−ＧＦＰは、内有毛細胞及び外有毛細胞でのみ発現を誘導した（図１Ｂ）。前庭系では、ＡＡＶ−Ｍｙｏ１５−ＧＦＰは前庭有毛細胞でのみ発現を誘導した（図２）。
【０１２７】
実施例２．ミニマルＭｙｏ１５プロモーターの生成
一連のプロモーターを生成し、蛍光レポーター（例えば、ＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、またはルシフェラーゼ）の上流に配置する。生成されるプロモーターは以下を含む：
１）配列番号３と融合した配列番号２；
２）配列番号４と融合した配列番号２；
３）配列番号３と配列番号４の融合体（例えば、配列番号５、６、または７）と融合した配列番号２；
４）配列番号８と融合した配列番号９（例えば、配列番号１０、１１、または１２）。
５）配列番号１と融合した、配列番号８と配列番号９の融合体（例えば、配列番号１０、１１または１２）；
６）配列番号３と融合した、配列番号８と配列番号９の融合体（例えば、配列番号１０、１１、または１２）；
７）配列番号４と融合した、配列番号８と配列番号９の融合体（例えば、配列番号１０、１１、または１２）；
８）配列番号３と配列番号４の融合体（例えば、配列番号５、６、または７）と融合した、配列番号８と配列番号９の融合体（例えば、配列番号１０、１１、または１２）；
９）配列番号３と配列番号４の融合体（例えば、配列番号５、６、または７）；
１１）配列番号１；及び
１２）配列番号２。
【０１２８】
有毛細胞に形質導入することができるＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、またはＡｎｃ８０Ｌ６５）にプロモーター構築物をパッケージングする。
【０１２９】
ウイルスプロモーター構築物を使用して、器官型蝸牛外植片に感染させる。ウイルスとともに４８時間インキュベーションした後、移植片を画像化し、レポーターの蛍光強度を用いて分析し、有毛細胞特異的発現を測定する。
【０１３０】
実施例３．感音難聴を有する対象へのＭｙｏ１５プロモーターを含む核酸ベクターを含有する組成物の投与
本明細書に開示する方法に従って、当業者は、患者、例えば、感音難聴を有するヒト患者を治療し、それにより聴力を改善または回復させることができる。この目的のために、当業者は、治療用タンパク質をコードする導入遺伝子に作動可能に連結した、配列番号１またはその機能部分もしくは誘導体（例えば、配列番号３〜７のいずれか１つ以上、例えば、配列番号３及び４）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第１の領域及び／または配列番号２またはその機能部分もしくは誘導体（例えば、配列番号８〜１２のいずれか１つ以上、例えば、配列番号８及び９）に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有する第２の領域を含み、場合により第１の領域と第２の領域の間にリンカーを含むポリヌクレオチドを有するＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＤＪ／９、７ｍ８、またはＰＨＰ．Ｂ）を含有する組成物をヒト患者に投与することができる。例えば、治療用タンパク質をコードする導入遺伝子に作動可能に連結したポリヌクレオチドは、配列番号１３であってもよい。ＡＡＶベクターを含有する組成物を、例えば、内耳への局所投与（例えば、外リンパへの注射）によって患者に投与して、感音難聴を治療してもよい。
【０１３１】
組成物を患者に投与した後、当業者であれば、導入遺伝子によってコードされる治療用タンパク質の発現、及び治療に応答した患者の改善を様々な方法でモニタリングすることができる。例えば、医師は、組成物の投与後に、聴力検査、ＡＢＲ、蝸電図検査（ＥＣＯＧ）、及び耳音響放射などの標準検査を実施することにより、患者の聴力をモニタリングすることができる。組成物の投与前の聴力検査結果に比べて、組成物の投与後の１つ以上の検査において、患者の聴力に改善が示されることが見出される場合、患者が治療に対して好ましい応答をしていることを示す。その後の用量を必要に応じて決定し、投与することができる。
【０１３２】
実施例４．非ヒト霊長類におけるＭｙｏ１５プロモーターの特異性
Ｍｙｏ１５プロモーターの特異性を、非ヒト霊長類で検査した。３０マイクロリットルのＡＡＶ１−ＣＭＶ−ＧＦＰまたはＡＡＶ１−Ｍｙｏ１５−ＧＦＰを、正円窓膜を通して蝸牛に１５μｌ／分で注射した。ＡＡＶ注射の４週間後に動物を殺処分し、蝸牛を採取し、表面調製物として処理し、抗体を増強せずに導入遺伝子の発現を調べた。ＡＡＶ１は高い感染力を有していた。ユビキタスＣＭＶプロモーター下で、ＧＦＰは、アカゲザル蝸牛の側壁の有毛細胞、支持細胞、及び線維細胞において発現した（図３Ａ）。対照的に、１．６ｋｂのＭｙｏ１５プロモーターは、ＧＦＰ導入遺伝子の発現を、カニクイザル蝸牛の有毛細胞に制限した（図３Ｂ〜３Ｃ）。
【０１３３】
実施例５．Ｍｙｏ１５プロモーターは、ユビキタスプロモーターと比較して、Ｔｍｃ１ノックアウトマウスにおけるＡＡＶマウスＴｍｃ１の生物学的有効性を増強する
Ｔｍｃ１ノックアウト（ＫＯ）マウスをイソフルランで麻酔し、毛を刈り取り、ポビドンヨードを皮膚に塗布した。左耳の下で頬の筋肉の上から耳の後ろまで切開した。皮膚を分離し、筋肉を裂き、洗浄して、後半規管を露出させた。ドリルビットを使用して半規管に小さな穴を開け、細い綿棒を用いて骨を乾いた状態に保持した。ポリアミド／ポリエチレンチューブを穴に挿入し、骨膠で密封した。ハミルトンシリンジを備えたマイクロポンプを使用して、１μｌのベクター（ＡＡＶ−ＣＭＶ１−マウスＴＭＣ１またはＡＡＶ−Ｍｙｏ１５（配列番号１３）−マウスＴＭＣ１）と０．０５μｌのトリパンブルーを１００ｎｌ／分の速度でＩＬスペースに送達した。１μｌを送達した後、液体が蝸牛の頂点に到達するように、及び逆流と漏れを防ぐように５分経過させた。チューブを曲げて骨の近くで切断した。筋肉を元の位置に戻し、皮膚を接着した。加熱ランプ下で回復させる前に、マウスに０．０１ｃｃのメロキシカムを与えた。痛みまたは感染の徴候について、動物を術後５日間チェックした。術後２１日〜２８日の動物をケタミン及びキシラジンで麻酔し、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）を測定した。図４に示すように、ＡＡＶ−ＣＭＶ−マウスＴＭＣ１に比べて、ＡＡＶ−Ｍｙｏ１５−マウスＴＭＣ１を注射したホモ接合性Ｔｍｃ１  ＫＯマウスでは、ＡＢＲ閾値の回復が大幅に改善した。
【０１３４】
他の実施形態
本明細書に記載する本発明の様々な改変及び変形が、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明を特定の実施形態に関連して記載したが、請求される本発明は、そのような特定の実施形態に必要以上に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際に、当業者には明らかである本発明を実施するために記載する様式の様々な改変は、本発明の範囲内であることが意図される。他の実施形態は、特許請求の範囲に見出される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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