(57)【要約】  本発明は、新規のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質、新規キャプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子、これらのキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びこれらのキャプシドタンパク質を発現するＡＡＶベクターに関する。また、本発明は、本明細書中に記載の本発明の新規キャプシドタンパク質を発現するＡＡＶベクターの作製方法及び関連するその治療的使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（AAV）であって、該キャプシドタンパク質が、（i）配列番号:1-7のいずれか1つ、（ii）配列番号:1-7のいずれか1つのVP2領域、又は（iii）配列番号:1-7のいずれか1つのVP3領域と少なくとも95%一致するアミノ酸配列を含み、かつ該AAVが、宿主細胞中で異種遺伝子の発現を制御する調節配列と作用可能に連結された該異種遺伝子を含む導入遺伝子をさらに含む、前記AAV。
【請求項２】
前記キャプシドタンパク質が、（i）配列番号:1-7のいずれか1つ、（ii）配列番号:1-7のいずれか1つのVP2領域、又は（iii）配列番号:1-7のいずれか1つのVP3領域のアミノ酸配列を含む、請求項1記載のAAV。
【請求項３】
キャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（AAV）であって、該キャプシドタンパク質が、配列番号:1-7のいずれか1つの機能的断片を含み、かつ該AAVが、宿主細胞中で異種遺伝子の発現を制御する調節配列と作用可能に連結された該異種遺伝子を含む導入遺伝子をさらに含む、前記AAV。
【請求項４】
前記キャプシドが、配列番号:1-7のいずれか1つのアミノ酸配列の可変領域（VR）、可変領域の間に位置する定常領域、GBSドメイン、及びGHループの1以上を含む、請求項3記載のAAV。 
【請求項５】
キャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（AAV）であって、該キャプシドタンパク質が、（i）配列番号:8-14のいずれか1つのヌクレオチド配列、（ii）配列番号:1-7のいずれか1つのアミノ酸配列のVP2領域をコードするヌクレオチド配列、又は（iii）配列番号:1-7のいずれか1つのアミノ酸配列のVP3領域をコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ該AAVが、宿主細胞中で異種遺伝子の発現を制御する調節配列と作用可能に連結された該異種遺伝子を含む導入遺伝子をさらに含む、前記AAV。
【請求項６】
AAV逆向き末端反復配列をさらに含む、請求項1〜5のいずれか1項記載のAAV。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれか1項記載のAAV及び生理的適合性を有する担体を含む組成物。
【請求項８】
細胞に導入遺伝子を送達する方法であって、該細胞を、請求項1〜6のいずれか1項記載のAAVと接触させることを含む、前記方法。
【請求項９】
細胞に導入遺伝子を送達するための請求項1〜6のいずれか1項記載のAAVを含む組成物。
【請求項１０】
細胞に導入遺伝子を送達するための医薬の調製のための、請求項1〜6のいずれか1項記載のAAVの使用。 
【請求項１１】
前記細胞が、肝細胞である、請求項8〜10のいずれか１項に記載の方法、組成物、又は使用。
【請求項１２】
内在のタンパク質の異常な活性と関連する障害又は疾患に罹患する対象の治療方法であって、該対象に有効量のキャプシドタンパク質を含むAAVを投与することを含み、ここで該キャプシドタンパク質が、（i）配列番号:1-7のいずれか1つ、（ii）配列番号:1-7のいずれか1つのVP2領域、又は（iii）配列番号:1-7のいずれか1つのVP3領域と少なくとも95%一致するアミノ酸配列を含み、かつ該AAVが、タンパク質の生物活性を有するコピーをコードする導入遺伝子を含む、前記方法。
【請求項１３】
内在のタンパク質の異常な活性と関連する障害又は疾患に罹患する対象の治療方法であって、該対象に有効量の請求項1〜8のいずれか1項記載のAAVを投与することを含む、前記方法。
【請求項１４】
前記障害又は疾患が肝細胞中で発現する内在の遺伝子の異常な活性と関連する、請求項12又は13記載の方法。
【請求項１５】
前記障害又は疾患が血友病A、血友病B、ウィルソン病、遺伝性血管浮腫（HAE）、α1アンチトリプシン欠損症及び乳糖血症からなる群から選択される、請求項12〜14のいずれか1項記載の方法。
【請求項１６】
（i）配列番号:1-7のいずれか1つ、（ii）配列番号:1-7のいずれか1つのVP2領域、又は（iii）配列番号:1-7のいずれか1つのVP3領域と少なくとも95%一致するアミノ酸配列を有するアデノ随伴ウイルス（AAV）キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含む、ベクター。
【請求項１７】
ヌクレオチド配列が、（i）配列番号:8-14のいずれか1つの核酸配列、（ii）配列番号:1-7のいずれか1つのVP2領域をコードするヌクレオチド配列、又は（iii）配列番号:1-7のいずれか1つのVP3領域をコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズする、アデノ随伴ウイルス（AAV）キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含む、ベクター。
【請求項１８】
キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含むベクターであって、該キャプシドタンパク質が、配列番号:1-7のいずれか1つの機能的断片を含む、前記ベクター。
【請求項１９】
前記キャプシドが、配列番号:1-7のいずれか1つのアミノ酸配列の可変領域（VR）、可変領域の間に位置する定常領域、GBSドメイン、及びGHループの1以上を含む、請求項18記載のベクター。 
【請求項２０】
前記核酸配列が、宿主細胞中で前記キャプシドタンパク質の発現を制御する異種調節エレメントと作用可能に連結されている、請求項16〜19のいずれか1項記載のベクター。
【請求項２１】
請求項16〜20のいずれか1項記載のベクターを含む細胞。
【請求項２２】
障害又は疾患の治療のための医薬の調製のための、請求項1〜8のいずれか1項記載のAAVの使用。
【請求項２３】
前記障害又は疾患が、内在のタンパク質の異常な活性と関連し、かつさらに前記AAVが前記タンパク質の生物活性を有するコピーをコードする導入遺伝子を含む、請求項22記載の使用。
【請求項２４】
前記障害又は疾患が血友病A、血友病B、ウィルソン病、遺伝性血管浮腫（HAE）、α1アンチトリプシン欠損症及び乳糖血症からなる群から選択される、請求項22又は23記載の使用。
【請求項２５】
疾患又は障害の治療のための、請求項1〜8のいずれか1項記載のAAVを含む組成物。
【請求項２６】
前記障害又は疾患が、内在のタンパク質の異常な活性と関連し、かつさらに前記AAVが前記タンパク質の生物活性を有するコピーをコードする導入遺伝子を含む、請求項25記載の組成物。
【請求項２７】
前記障害又は疾患が血友病A、血友病B、ウィルソン病、遺伝性血管浮腫（HAE）、α1アンチトリプシン欠損症及び乳糖血症からなる群から選択される、請求項26記載の組成物。
【請求項２８】
請求項1〜8のいずれか1項記載のアデノ随伴ウイルス（AAV）を生産する方法であって：
（a）宿主細胞中で異種遺伝子の発現を制御する調節配列と作用可能に連結された異種遺伝子を含む導入遺伝子と隣接する5'及び3' AAV逆向き末端反復配列を含む、第1の核酸ベクター、及びAAV rep及びcap核酸配列を含む第2の核酸ベクターを導入したウイルス生産細胞を培養することであって、前記cap核酸配列が配列番号:1-7のいずれかと少なくとも95%一致するAAVキャプシドをコードする、前記培養すること；並びに
（b）ウイルス生産細胞培養物の上清から、該AAVを回収すること、を含む、前記方法。
【請求項２９】
前記ウイルス生産細胞が哺乳動物細胞である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
前記哺乳動物細胞が、HEK293、HeLa、CHO、NS0、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 1080、A549、Cos-7、ARPE-19、及びMRC-5細胞からなる群から選択される、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳動物細胞がHEK293細胞である、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
請求項28〜31のいずれか1項記載の方法によって生産される、アデノ随伴ウイルス（AAV）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本件出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、2018年5月14日に提出された米国仮出願第62/671,265号を基礎とする優先権を主張する。
【０００２】
（電子提出された資料の参照による組み込み）
本件出願は、本開示の別個の部分として、参照により完全に組み込まれ、かつ以下：ファイル名：53120_Seqlisting.txt；サイズ：68,361バイト；2019年5月10日作成のように識別される、コンピュータ可読形式の配列表を含む。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、新規のアデノ随伴ウイルス（AAV）キャプシドタンパク質、新規キャプシドタンパク質を含むAAV粒子、これらのキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びこれらのキャプシドタンパク質を発現するAAVベクターに関する。また、本発明は、本明細書中に記載の本発明の新規キャプシドタンパク質を発現するAAVベクターの作製方法及び関連するその治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
（背景）
AAVは、複製欠陥パルボウイルスであり、その1本鎖DNAゲノムの長さは約4.7 kbであり、145ヌクレオチドの逆向き末端反復配列（ITR）を含む。AAV血清型2（AAV2）ゲノムのヌクレオチド配列は、Srivastavaらの文献、J. Virol., 45:555-564 (1983)で発表されており、 Ruffingらの文献、J. Gen. Virol., 75:3385-3392(1994)によって修正されている。ウイルスDNAの複製（rep）、キャプシド形成/パッケージング、及び宿主細胞の染色体への統合を導くシス作用配列が、ITRの中に含まれている。3つのAAVプロモーター、p5、p19、及びp40（これらの相対マップ位置にちなんで命名されている）は、rep及びcap遺伝子をコードする2つのAAV内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。2つのrepプロモーター（p5及びp19）により、（ヌクレオチド2107及び2227にある）単一のAAVイントロンの示差的スプライシングと合わせて、rep遺伝子から4つのrepタンパク質（rep 78、rep 68、rep 52、及びrep 40）が生産される。repタンパク質は、最終的にはウイルスゲノムの複製を担う複数の酵素特性を有する。cap遺伝子はp40プロモーターから発現され、3つのキャプシドタンパク質VP1、VP2、及びVP3をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位が、3つの関連するキャプシドタンパク質の生産を担う。AAVゲノムのマップ位置95には、単一のコンセンサスポリアデニル化部位が位置する。AAVのライフサイクル及び遺伝学は、Muzyczkaの文献、Current Topics in Microbiology and Immunology, 158：97-129 (1992)において総説されている。
【０００５】
AAVがヒト細胞に感染すると、ウイルスゲノムは19番染色体に統合され、細胞への潜伏感染につながり得る。感染性ウイルスの生産は、細胞がヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス又はヘルペスウイルス）に感染しない限り起こらない。アデノウイルスの場合、遺伝子E1A、E1B、E2A、E4、及びVAがヘルパーとしての機能を提供する。ヘルパーウイルスに感染すると、AAVプロウイルスはレスキューされ、増幅され、かつAAV及びアデノウイルスの両方が生産される。
【０００６】
AAVは、免疫原性ペプチド/ポリペプチドを発現するワクチンベクターとして、及び細胞への外来DNAの送達、例えば遺伝子治療のためのベクターとして、AAVを魅力的なものとする特有の機能を有する。培養中の細胞へのAAVの感染は非細胞変性性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は休止性かつ無症候である。さらに、AAVは多くの哺乳動物細胞に感染し、インビボで多くの異なる組織を標的化することが可能である。AAVプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中のクローニングされたDNAとして感染性を示す。さらに、AAVの複製、ゲノムへのキャプシド形成、及び統合を導くシグナルはAAVゲノムのITRの中に含まれているため、ゲノム内部のおよそ4.3 kbの一部又は全て（複製及び構造キャプシドタンパク質、rep-capをコードする）を、外来DNA、例えばプロモーター、関心対象とするDNA、及びポリアデニル化シグナルを含む遺伝子カセットで置き換えることができる。rep及びcapタンパク質は、トランスに提供することができる。AAVのもう1つの重要な特徴は、AAVが極めて安定性の高い、頑健なウイルスであることである。AAVはアデノウイルスを不活化するために使用される条件（56℃〜65℃で数時間）に容易に耐え、rAAVベクターの低温保存による不安定性はより小さい。AAVは凍結乾燥することすらできる。最後に、AAV感染細胞は重複感染に耐性がない。
【０００７】
AAVベクターには、多くの哺乳動物の遺伝子治療への応用における使用が見いだされており、遺伝子治療への応用的使用が見いだされる新規及び/又は改変されたAAVベクター及び関連するウイルスに対するニーズが存在する。本発明は、本発明の新規AAVキャプシドタンパク質を発現する新規AAV ベクター、及びそれらのベクター又はキャプシドタンパク質を含む、天然に存在しない新規AAVビリオンを提供する。 
【発明の概要】
【０００８】
（発明の概要） 
本発明は、新規VP1、VP2、又はVP3キャプシドタンパク質であり得る新規AAVキャプシドタンパク質、これらのキャプシドタンパク質のいずれかを含む天然に存在しないAAVウイルス、並びに遺伝子治療への応用及び遺伝子治療への応用のための医薬の調製における使用のためのそのようなAAVウイルスの使用を提供する。いくつかの実施態様において、AAVキャプシドタンパク質は、様々な哺乳動物組織から単離及び同定した。特定の哺乳動物由来の新規AAVキャプシドVP1タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号:1-7として記載され、それぞれのVP2及びVP3配列の関連する位置についても本明細書に記載する。本明細書においては、これらの新規キャプシドタンパク質を、総称して「本発明のAAVキャプシドタンパク質」と呼ぶ。
【０００９】
一実施態様において、本発明は、キャプシドタンパク質を有するアデノ随伴ウイルス（AAV）であって、該キャプシドタンパク質が、（i）配列番号:1-7のいずれか1つ、（ii）配列番号:1-7のいずれか1つのVP2領域、又は（iii）配列番号:1-7のいずれか1つのVP3領域と少なくとも95%一致するアミノ酸配列を有し、かつ該AAVが、宿主細胞中で異種遺伝子の発現を制御する調節配列と作用可能に連結された該異種遺伝子から構成される導入遺伝子をさらに有する、前記AAVを提供する。別の実施態様において、前記キャプシドタンパク質が、（i）配列番号:1-7のいずれか1つ、（ii）配列番号:1-7のいずれか1つのVP2領域、又は（iii）配列番号:1-7のいずれか1つのVP3領域のアミノ酸配列を有する。さらに別の実施態様において、AAVはAAV逆向き末端反復配列を有する。さらなる実施態様において、AAVは生理的適合性を有する担体と混合する。
【００１０】
別の実施態様において、本発明は、細胞に導入遺伝子を送達する方法であって、細胞を本明細書で開示する任意のAAVと接触させる工程を含む、前記方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、内在のタンパク質の異常な活性と関連する障害又は疾患に罹患する対象を治療する方法であって、対象に有効量の本明細書で開示するAAVを投与する工程であって、該AAVがタンパク質の生物活性を有するコピーをコードする導入遺伝子を有する、前記工程を含む、前記方法を提供する。さらに別の実施態様において、方法は、肝細胞に導入遺伝子を送達することを含む。 
【００１１】
さらなる実施態様において、本発明は、細胞、例えば肝細胞に導入遺伝子を送達するための、本発明のAAVのいずれかを含む組成物を提供する。さらに、本発明は、細胞に導入遺伝子を送達するための医薬の調製のための、本発明のAAVのいずれかの使用を提供する。
【００１２】
一実施態様において、本発明は単離アデノ随伴ウイルス（AAV）キャプシドタンパク質であって、（i）配列番号：1-7のいずれか1つのVP1アミノ酸配列又は配列番号：1-7のいずれか1つのVP2若しくはVP3領域と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%一致するアミノ酸配列、あるいは（ii）配列番号：1-7のいずれか1つを含むVP1アミノ酸配列又は配列番号：1-7のいずれか1つのVP2若しくはVP3領域を含む、前記キャプシドタンパク質を提供する。ある実施態様において、キャプシドタンパク質は異種アミノ酸配列と連結される。また、本発明は、これらのキャプシドタンパク質のいずれかを有する、又は含む、天然に存在しないAAV粒子を提供する。ある実施態様において、上記VP1、VP2、又はVP3キャプシドタンパク質のいずれかを含む天然に存在しないAAV粒子は、AAV逆向き末端反復配列及び宿主細胞中で異種遺伝子の発現を導く調節配列と作用可能に連結された該異種遺伝子を含む導入遺伝子を有する核酸を含む。他の実施態様において、本明細書に記載のVP1、VP2、又はVP3キャプシド配列のいずれかを含む天然に存在しないAAV粒子は、宿主細胞中で導入遺伝子の発現を制御する調節配列と作用可能に連結された異種導入遺伝子を含む。本明細書で使用する、「異種遺伝子」又は「異種調節配列」という用語は、指示されている遺伝子又は調節配列がAAVベクター又は粒子中に天然に存在せず、その中に人為的に導入されていることを意味する。「導入遺伝子」という用語は、異種遺伝子及び宿主細胞中で遺伝子の発現を制御する異種遺伝子と作用可能に連結された調節配列の両方を含む核酸を指す。
【００１３】
また、本発明はアデノ随伴ウイルス（AAV）キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、該キャプシドタンパク質が、（i）配列番号：1-7のいずれか1つのVP1アミノ酸配列又は配列番号：1-7のいずれか1つのVP2若しくはVP3領域と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%一致するアミノ酸配列、あるいは（ii）配列番号：1-7のいずれか1つを含むVP1アミノ酸配列又は配列番号：1-7のいずれか1つのVP2若しくはVP3領域を含み、ここで該ポリヌクレオチドが異種調節制御配列と作用可能に連結されている、前記ポリヌクレオチドを提供する。このように、本発明のポリヌクレオチドは天然に存在していないことが理解される。また、本発明は、異種調節配列と作用可能に連結されたこれらのポリヌクレオチド配列のいずれかを含むAAVベクター、及びこれらのAAVベクターを含む、医薬組成物などの組成物を提供する。 
【００１４】
別の実施態様において、本発明はキャプシドタンパク質及び異種導入遺伝子配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターであって、該キャプシドタンパク質が、（i）配列番号：1-7のいずれか1つのVP1アミノ酸配列又は配列番号：1-7のいずれか1つのVP2若しくはVP3領域と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%一致するアミノ酸配列、あるいは（ii）配列番号：1-7のいずれか1つを含むVP1アミノ酸配列又は配列番号：1-7のいずれか1つのVP2若しくはVP3領域を含む、前記ベクターを提供する。また、本発明は、これらのAAVベクターを含む、医薬組成物などの組成物を提供する。
【００１５】
別の実施態様において、本発明はキャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（AAV）であって、該キャプシドタンパク質が、配列番号:1-7のいずれか1つの機能的断片を含み、かつ該AAVが、宿主細胞中で異種遺伝子の発現を制御する調節配列と作用可能に連結された該異種遺伝子を含む導入遺伝子をさらに含む、前記AAVを提供する。例えば、機能的断片は、配列番号:1-7のいずれか1つのアミノ酸配列の可変領域（VR）、可変領域の間に位置する定常領域、GBSドメイン、及びGHループの1以上を含む。また、本発明は、これらのAAVベクターを含む、医薬組成物などの組成物を提供する。
【００１６】
さらなる実施態様において、本発明は、キャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（AAV）であって、該キャプシドタンパク質が、（i）配列番号:1-7のいずれか1つのアミノ酸配列、（ii）配列番号:1-7のいずれか1つのアミノ酸配列のVP2領域、又は配列番号:1-7のいずれか1つのアミノ酸配列のVP3領域をコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ該AAVが、宿主細胞中で異種遺伝子の発現を制御する調節配列と作用可能に連結された該異種遺伝子を含む導入遺伝子をさらに含む、前記AAVを提供する。例えば、ヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件で、本発明のキャプシドタンパク質又はキャプシドタンパク質の機能的断片をコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズした。また、本発明は、これらのAAVベクターを含む、医薬組成物などの組成物を提供する。
【００１７】
「可変領域」とは、AAVキャプシドタンパク質のVP1配列中の9つの可変領域を指す。本明細書において可変領域（VR）は、VR I、VR II、VR III、VR IV、VR V、VR VI、VR VII、VR VIII、及びVR IXと呼び、それらの様々なVP1配列中のそれぞれの位置を本明細書中に記載する。VRは、AAV VP1キャプシド配列中で最も大きな配列及び構造の変化を示し、また受容体結合、導入遺伝子の転写の活性化、組織への形質導入、及び抗原性における役割を有し得る。
【００１８】
「グリカン結合配列（GBS）」又は「GBSドメイン」又は「GBS領域」は、ウイルスキャプシドのグリカン結合特異性を支配するVR IV及びVR Vの間に位置するアミノ酸配列を指す。様々なAAV VP1アミノ酸配列におけるGBS領域の位置を、本明細書中に記載する。他のAAV VP1アミノ酸配列に由来するGBS領域は当該技術分野において公知であり、かつ/又は定例の手順により識別可能である。
【００１９】
「GHループ」とは、キャプシドタンパク質の内部β-バレル中でβ-ストランドG及びβ-ストランドHと隣接するループ配列を指す。「GHループ」配列は、包含されるGBS配列及びドナー由来の全ての散在する保存的骨格配列を含む、可変領域VR IV〜VR VIIIを含む。様々なAAV VP1アミノ酸配列におけるGHループ領域の位置を、本明細書中に記載する。他のAAV VP1アミノ酸配列に由来するGHループ領域は定例の手順により識別可能である。
【００２０】
本明細書に記載するVR、GBS、及びGHループ領域の位置に関して、これらの領域のN末端及び/又はC末端の位置は、本明細書中（特に表2中）に明確に記載されているように、これらの領域のアミノ酸位置から最大1アミノ酸、2アミノ酸、3アミノ酸、4アミノ酸、又は5アミノ酸だけ異なり得ることが留意される。本明細書中で定義されているN末端及び/又はC末端の最大5アミノ酸が異なっている置換されたVR、GBS、及び/又はGHループ領域を含む新規キャプシド配列は、本発明に包含される。
【００２１】
本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（AAV）粒子を生産する方法であって：本発明のAAVベクターのいずれかを用いてトランスフェクションされた細胞を培養する工程、及びトランスフェクションされた細胞の上清から組換えAAV粒子を回収する工程を含む、前記方法を提供する。さらに、本発明は、本発明のウイルスベクター又はキャプシドタンパク質のいずれかを含むウイルス粒子及びこれらのウイルスベクターを含む細胞を提供する。
【００２２】
本発明の一実施態様は、宿主細胞中で異種遺伝子の発現を制御する調節配列と作用可能に連結された異種遺伝子を有する導入遺伝子と隣接する5'及び3' AAV逆向き末端反復配列を有する、第1の核酸ベクター、並びにAAV rep及びcap核酸配列を有する第2の核酸ベクターを導入したウイルス生産細胞を培養することであって、前記cap核酸配列が配列番号:1-7のいずれかと少なくとも95%一致するAAVキャプシドをコードする、前記培養すること；並びに
ウイルス生産細胞培養物の上清から、該AAVを回収すること、によって本明細書に記載の組換えAAVのいずれかを生産する方法を提供する。別の実施態様において、ウイルス生産細胞は哺乳動物のものである。好ましい実施態様において、昆虫細胞はHEK293細胞である。 
【００２３】
別の実施態様において、本発明は、障害又は疾患に罹患する患者の治療方法であって、患者に有効量の本発明のAAVベクター又はウイルスのいずれかを投与することを含む、前記方法を提供する。
【００２４】
さらなる実施態様において、本発明は障害又は疾患の治療のための医薬の調製のための本発明のAAVベクター又はウイルスのいずれかの使用を提供する。また、本発明は疾患又は障害の治療のための本発明のAAVベクター又はウイルスのいずれかを含む組成物を提供する。
【００２５】
さらに別の実施態様において、対象における疾患又は障害は内在のタンパク質の異常な活性に関連する。本明細書で使用する「内在のタンパク質」とは、疾患又は障害に罹患する対象のゲノムによってコードされたタンパク質又は遺伝子産物を意味する。
【００２６】
「AAVビリオン」、「AAVウイルス粒子」、「AAVベクター粒子」、又は「AAVウイルス」とは、少なくとも1つのAAVキャプシドタンパク質及びキャプシド形成したポリヌクレオチドAAVベクターから構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型AAVゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば哺乳動物細胞に送達されることとなる導入遺伝子）を含む場合、通常は「AAVベクター粒子」又は単に「AAVベクター」と呼ぶ。従って、そのようなベクターはAAVベクター粒子中に含まれるため、AAVベクター粒子の生産には、必然的にAAVベクターの生産が含まれる。 
【００２７】
また、本発明は、本発明のAAVベクターのいずれかを含む細胞及び本発明のこれらの細胞によって生産されたウイルス粒子を提供する。 
【００２８】
本明細書で使用する「逆向き末端反復配列（ITR）」という用語は、DNA複製起点として、及びウイルスゲノムのパッケージングシグナルとして、シスに機能するAAVゲノムの5'及び3'末端に見いだされる、当該技術分野でよく認識された領域を指す。AAV ITRは、AAV repコード領域とともに、プラスミドベクターからの効率的な切り出し及びレスキュー、並びに2つの隣接するITR間に挟まれたヌクレオチド配列の宿主細胞ゲノムへの統合を提供する。特定のAAV関連ITRの配列は、参照により完全に本明細書に組み込まれているYanらの文献、J. Virol. 79(1):364-379 (2005)で開示されている。
【００２９】
本明細書で使用する「増殖性のAAV感染を生じるためのヘルパー機能」というフレーズは、発現されると増殖性AAVの複製のためにトランスに機能するAAVの遺伝子産物を提供し得る、AAV由来のコード配列を指す。従って、AAVヘルパー機能には、rep及びcap領域がある。rep発現産物は、とりわけAAV DNA複製起点の認識、結合、及びニック形成；DNA ヘリカーゼ活性；及びAAV（又は他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む、多くの機能を有することが示されている。cap発現産物は、必要なパッケージング機能を供給する。本明細書ではAAVヘルパー機能を使用して、AAV ベクターから失われているトランスのAAV機能を捕捉する。増殖性AAV感染を生じるためのヘルパー機能には、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、又はワクシニアウイルス由来の特定のヘルパー機能があり得る。
【００３０】
いくつかの実施態様において、ウイルスコンストラクトは、AAV rep及びcap遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３１】
本明細書で使用する「AAV rep遺伝子」という用語は、ウイルスのゲノムを複製し、潜伏感染時に宿主ゲノムにウイルスゲノムを挿入するために要求されるウイルスの複製タンパク質をコードする、AAVゲノムの当該分野でよく認識された領域を指す。AAV repコード領域のさらなる記述については、例えばそれらの開示が参照により完全に本明細書に組み込まれているMuzyczkaらの文献、Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129 (1992); Kotinらの文献、Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)を参照されたい。本明細書で使用するrepコード領域は、任意のウイルス血清型、例えば上記AAV血清型に由来し得る。好適なレシピエント細胞中で発現させた場合にrep遺伝子が所望の機能的特徴を保持する限り、この領域は野生型遺伝子の全体を含む必要はなく、例えばヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換により改変されていてもよい。
【００３２】
本明細書で使用する「AAV cap遺伝子」という用語は、ウイルスゲノムのパッケージングに要求されるウイルスの外被タンパク質をコードする、AAVゲノムの当該技術分野でよく認識された領域を指す。capコード領域のさらなる記述については、例えばそれらの開示が参照により完全に本明細書に組み込まれているMuzyczkaらの文献、Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129 (1992); Kotinらの文献、Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)を参照されたい。本明細書で使用するAAV capコード領域は、上記の任意のAAV血清型に由来し得る。宿主細胞中にAAVベクターとともに存在する場合に遺伝子が十分なパッケージング機能を提供する限り、この領域は野生型cap遺伝子の全体を含む必要はなく、例えばヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換により改変されていてもよい。
【００３３】
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来DNAの取込みを指すように使用する。細胞は、細胞膜内部に外因のDNAが導入されると、「トランスフェクション」される。いくつかのトランスフェクション技術が、当該技術分野において一般に公知である。例えば、それらの開示が参照により完全に本明細書に組み込まれている、Grahamらの文献、Virology 52:456 (1973); Sambrookらの文献、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」, Cold Spring Harbor Laboratories, New York (1989); Davisらの文献、「分子生物学の基本的方法（Basic Methods in Molecular Biology）」, Elsevier (1986); Chuらの文献、Gene 13:197 (1981)を参照されたい。そのような技術を使用して、1以上の外因のDNA成分、例えばヌクレオチド統合ベクター及び他の核酸分子を好適な宿主細胞に導入することができる。この用語は、化学的、電気的、及びウイルス仲介性のトランスフェクション手順を表現する。
【００３４】
さらに別の態様において、本明細書に記載の方法によって生産されるAAV粒子を本明細書に記載する。いくつかの実施態様において、AAV粒子はそのゲノム中に、異種タンパク質をコードする少なくとも1つのヌクレオチドを含む。
【００３５】
「異種タンパク質又はペプチド」という用語は、いくつか例を挙げると、野生型AAVによって発現されない6×ヒスチジン、FLAG、myc 、ポリヒスチジンなどのタグ、又は標識若しくは免疫原、アジュバント、選択マーカー、治療用タンパク質、又は標的タンパク質若しくはペプチドを含む任意のタンパク質を指す。 
【００３６】
本明細書に記載の例示的な異種タンパク質には、これらに限定はされないが、β-グロビン、ヘモグロビン、組織プラスミノゲン活性化因子、及び凝固因子；コロニー刺激因子（CSF）、インターロイキン、例えばIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9など；成長因子、例えばケラチノサイト増殖因子（KGF）、幹細胞因子（SCF）、線維芽細胞増殖因子（FGF、例えば塩基性FGF及び酸性FGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、インスリン様増殖因子（IGF）、骨形成タンパク質（BMP）、上皮増殖因子（EGF）、増殖分化因子 -9 （GDF-9）、肝細胞腫由来増殖因子（HDGF）、ミオスタチン（GDF-8）、神経成長因子（NGF）、神経栄養因子、血小板由来増殖因子（PDGF）、トロンボポエチン（TPO）、トランスフォーミング増殖因子α（TGF-α）、トランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）など；可溶性受容体、例えば可溶性TNF-α受容体、可溶性インターロイキン受容体（例えば可溶性IL-1受容体及び可溶性II型IL-1受容体）、可溶性γ/Δ T 細胞受容体、可溶性受容体のリガンド結合断片など；酵素、例えばα-グルコシダーゼ、イミグルセラーゼ、β-グルコセレブロシダーゼ、及びアルグルセラーゼ；酵素活性化因子、例えば組織プラスミノゲン活性化因子；ケモカイン、例えばIP-10、インターフェロン-γによって誘導されるモノカイン（Mig）、Groα/IL-8、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、PF-4など；血管新生剤、例えば血管内皮増殖因子（VEGF、例えばVEGF121、VEGF165、VEGF-C、VEGF-2）、神経膠腫由来増殖因子、アンジオゲニン、アンジオゲニン-2など；抗血管新生剤、例えば可溶性VEGF受容体；タンパク質ワクチン、 向神経活性ペプチド、例えば神経成長因子（NGF）、ブラジキニン、コレシストキニン、ガスチン、セクレチン、オキシトシン、ゴナドトロピン放出ホルモン、β-エンドルフィン、エンケファリン、サブスタンスP 、ソマトスタチン、プロラクチン、ガラニン、成長ホルモン放出ホルモン、ボンベシン、ダイノルフィン、ワルファリン、ニューロテンシン、モチリン、甲状腺刺激ホルモン、ニューロペプチドY、黄体形成ホルモン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン、バソプレシン、アンジオテンシンII、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、血管作用性小腸ペプチド、スリープペプチド（sleep peptide）など；血栓溶解剤；心房性ナトリウム利尿ペプチド、リラクシン、グリア線維酸性タンパク質、卵胞刺激ホルモン（FSH）；ヒトα-1アンチトリプシン；白血病抑制因子（LIF）、組織因子、黄体形成ホルモン、マクロファージ活性化因子、腫瘍壊死因子（TNF）、好中球走化性因子（NCF）；組織メタロプロテイナーゼ阻害剤；血管作用性小腸ペプチド；アンジオゲニン；アンジオトロピン；フィブリン；ヒルジン、IL-1受容体アンタゴニスト；毛様体神経栄養因子（CNTF）；脳由来神経栄養因子（BDNF）；神経栄養因子3及び4/5（NT-3及び4/5）；グリア細胞由来神経栄養因子（GDNF）；芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（AADC）；第VIII因子、第IX因子、及び第X因子；ジストロフィン又はミニジストロフィン（nini-dystrophin）；リソソーム酸性リパーゼ；フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（PAH）；糖原病関連酵素、例えばグルコース-6-ホスファターゼ、酸性マルターゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、筋グリコーゲンホスホリラーゼ、肝グリコーゲンホスホリラーゼ、筋ホスホフルクトキナ���ゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グルコーストランスポーター、アルドラーゼA、β-エノラーゼ、グリコーゲンシンターゼ；及びリソソーム酵素がある。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
（図面の説明）
【図１】指定された新規キャプシドタンパク質を有するAAVの感染力の相対的組織特異性を示すセットの表である。データは、各組織中の総流束（光子/秒/cm2/ラジアン）として提示する。各組織について、上の行は平均流束を表し、下の行は標準偏差を表す。
【００３８】
【図２】新規キャプシド：Bba-45、Bba-46、Bba-47、Bba-50、及びBba-51並びに対照ペプチド：AAV5、AAV8、及びAAV9についてのIVIG中和アッセイからのデータを提供する。このアッセイでは、新規キャプシドがIVIG抵抗性を示したことを実証する。
【００３９】
【図３】新規キャプシド：Bba-45、Bba-46、Bba-47、Bba-50、及びBba-51並びに対照キャプシド：AAV5、AAV8、及びAAV9についての形質導入データを提供する。このデータは複数の実験で作成され、各キャプシドの複数のデータ点は異なる実験を表す。新規キャプシドを有するAAVは、AAV5と比較して肝細胞に対して有意に高度の特異性を有する。データは、各臓器系へのAAVの感染力の尺度である総流束活性として示されている。
【００４０】
【図４】新規キャプシド：Bba-45、Bba-46、Bba-47、Bba-50、及びBba-51並びに対照キャプシド：AAV5、AAV8、及びAAV9についての複数の組織における形質導入データを提供する。このデータは、新規キャプシドを有するAAVは、AAV5と比較して肝細胞に対して有意に高度の特異性を有することを実証する。
【００４１】
【図５】新規キャプシド：Bba-45、Bba-46、Bba-47、Bba-49、及びBba-50、並びに対照キャプシド：AAV8、AAV-rh10、及びAAV-anc80L65の注射後の血漿bCGタンパク質のレベルを提供する。
【００４２】
【図６】新規キャプシド：Bba-45、Bba-46、Bba-47、Bba-49、及びBba-50、並びに対照キャプシド：AAV8、AAV-rh10、及びAAV-anc80L65の注射後の肝臓及び血漿におけるbCGタンパク質のレベルを提供する。
【００４３】
【図７】図7A-7Cは、新規キャプシド：Bba-45、Bba-46、Bba-47、Bba-49、及びBba-50並びに対照キャプシド：AAV8、AAV-rh10、及びAAV-anc80L65の注射後の肝臓におけるbCG DNA（パネルA）、bCG RNA（パネルB）、及びbCGタンパク質（パネルC）のレベルを提供する。
【００４４】
【図８】図8A-8Bは、新規キャプシド：Bba-45、Bba-46、Bba-47、Bba-49、及びBba-50並びに対照キャプシド：AAV8、AAV-rh10、及びAAV-anc80L65の注射後の肝臓におけるbCG DNA及びbCG RNAのレベルが、肝臓におけるbCGタンパク質のレベルと相関することを実証する。
【００４５】
【図９】新規キャプシド：Bba-45、Bba-46、Bba-47、Bba-49、及びBba-50、並びに対照キャプシド：AAV8、AAV-rh10、及びAAV-anc80L65の注射後に免疫組織化学により決定されたAAVにより形質導入された肝細胞のパーセンテージを提供する。
【００４６】
【図１０】新規キャプシド：Bba-45、Bba-46、Bba-47、Bba-49、及びBba-50、並びに対照キャプシド：AAV8、AAV-rh10、及びAAV-anc80L65の注射後の肝細胞の免疫組織化学染色結果を示す例示的な写真を提供する。
【００４７】
【図１１】新規キャプシドBba-49及び様々な供給源由来のAAV5キャプシドを有するAAVにより形質導入された、肝細胞のパーセンテージを提供する。これらのAAVを用いて、-AGXT導入遺伝子を肝細胞に形質導入した。AAV.Bba-49.AGXTにより、肝細胞の約96%が形質導入された。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
（詳細な説明）
本発明は、新規AAVキャプシドタンパク質、これらのキャプシドタンパク質をコードする核酸、及びこれらの新規キャプシドタンパク質を含むAAVウイルスを提供する。いくつかの実施態様において、AAVキャプシドタンパク質は、様々な哺乳動物組織から単離及び同定した。新規AAVキャプシドVP1タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号:1-7として記載され、関連するVP2及びVP3領域の位置は、本明細書に開示する。
（AAVベクター）
本明細書で使用する「AAV」という用語は、アデノ随伴ウイルスの標準的な略称である。アデノ随伴ウイルスは、特定の機能が共感染ヘルパーウイルスによって提供された細胞内でのみ増殖する一本鎖DNAパルボウイルスである。以下表1に示すように、現在少なくとも13種の特性評価されたAAVの血清型が存在する。AAVの一般的な情報及び総説例えばCarterの文献、「パルボウイルスの手引き（Handbook of Parvoviruses）」, Vol. 1, pp. 169-228 (1989), 及びBernsの文献、「ウイルス学（Virology）」, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York, 1990)に見いだすことができる。しかしながら、様々な血清型が構造的にも機能的にも、さらに遺伝的レベルにおいてさえも非常に密接に関連していることが周知されていることから、これらの同じ原理はAAVのさらなる血清型にも適用可能であることが十分に期待される。（例えば、Blackloweの文献、「パルボウイルス及びヒト疾患（Parvoviruses and Human Disease）」、J.R. Pattison編(1988) pp. 165-174；及びRoseの文献、Comprehensive Virology 3:1-61(1974)を参照されたい）。例えば、AAV血清型は全て、相同なrep遺伝子によって仲介される、明らかに非常に類似した複製特性を示し；かつ全てがAAV6が発現するキャプシドタンパク質のような3つの関連するキャプシドタンパク質を有している。関連性の程度は、ゲノム長にわたる血清型間の拡張的クロスハイブリダイゼーションを明らかにするヘテロ二本鎖解析；及び「逆向き末端反復配列」（ITR）に対応する末端部にある類似の自己アニーリングセグメントの存在によってさらに示唆される。また、感染パターンが類似していることも、各血清型における複製機能が類似した調節制御下にあることを示唆する。 
【００４９】
本明細書で使用する「AAVベクター」とは、AAV末端反復配列（ITR）と隣接する1以上の関心対象とするポリヌクレオチド（又は導入遺伝子）を含むベクターを指す。そのようなAAVベクターは、rep及びcap遺伝子産物をコードし、発現するベクターを用いてトランスフェクションされた宿主細胞中に存在する場合に複製され、パッケージングされて感染性ウイルス粒子となることができる。
【００５０】
「AAVビリオン」、「AAVウイルス粒子」、「AAVベクター粒子」、又は「AAVウイルス」とは、少なくとも1つのAAVキャプシドタンパク質及びキャプシド形成したポリヌクレオチドAAVベクターから構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型AAVゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば哺乳動物細胞に送達されることとなる導入遺伝子）を含む場合、通常は「AAVベクター粒子」又は単に「AAVベクター」と呼ぶ。従って、そのようなベクターはAAVベクター粒子中に含まれるため、AAVベクター粒子の生産には、必然的にAAVベクターの生産が含まれる。 
【００５１】
AAV「rep」及び「cap」遺伝子はそれぞれ、複製とキャプシド形成タンパク質をコードする遺伝子である。AAV rep及びcap遺伝子はこれまでに調べられ、本明細書及び引用される参考文献中に記載される全てのAAV血清型において見いだされている。野生型AAVでは、rep及びcap遺伝子は一般にウイルスゲノム内で互いに隣接していることが見いだされ（すなわち、それらは隣接し、又は重複する転写ユニットとして一緒に「結合」されている）、それらは一般にAAV血清型間で保存されている。また、AAV rep及びcap遺伝子は、個別に及び総称して、「AAVパッケージング遺伝子」と呼ばれる。本発明のAAV cap遺伝子は、rep及びアデノヘルパー機能の存在下でAAVベクターをパッケージングすることができ、かつ標的細胞受容体と結合することができるCapタンパク質をコードする。いくつかの実施態様において、AAV cap遺伝子は、特定のAAV血清型、例えば表1に示す血清型に由来するアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質をコードする。 
（表1 AAV血清型）
【表１】
2021522842.tif 000002
【００５２】
AAVの生産に利用するAAV配列は、いずれのAAV血清型のゲノムに由来していてもよい。一般に、AAV血清型はアミノ酸及び核酸レベルでの相同性の顕著なゲノム配列を有し、類似したセットの遺伝的機能を提供し、本質的に物理的及び機能的に等価なビリオンを生成し、事実上同一のメカニズムによって複製し、かつ組み立てられる。AAV血清型のゲノム配列及びゲノム類似性の考察については、例えばGenBank受託番号U89790; GenBank受託番号J01901; GenBank受託番号AF043303; GenBank受託番号AF085716; Chloriniらの文献、J. Vir. 71:6823-33(1997); Srivastavaらの文献、J. Vir. 45:555-64 (1983); Chloriniらの文献、J. Vir. 73:1309-1319 (1999); Rutledgeらの文献、J. Vir. 72:309-319 (1998); 及びWuらの文献、J. Vir. 74:8635-47 (2000)を参照されたい。
【００５３】
全ての既知のAAV血清型のゲノム構成は非常に類似している。AAVのゲノムは、長さ約5,000ヌクレオチド（nt）未満の線状一本鎖DNA分子である。逆向き末端反復配列（ITR）は、非構造複製（Rep）タンパク質及び構造（VP）タンパク質についての特有のコード化ヌクレオチド配列と隣接する。VPタンパク質はキャプシドを形成する。末端145 ntは自己相補的であり、T字型ヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内二本鎖を形成し得るように構成されている。これらのヘアピン構造は、ウイルスDNAの複製起点として機能し、細胞のDNAポリメラーゼ複合体のプライマーとしての役割を果たす。Rep遺伝子はRepタンパク質であるRep78、Rep68、Rep52、及びRep40をコードする。Rep78及びRep68はp5プロモーターから転写され、Rep52及びRep40はp19プロモーターから転写される。cap遺伝子はVPタンパク質であるVP1、VP2、及びVP3をコードする。cap遺伝子はp40プロモーターから転写される。
【００５４】
いくつかの実施態様において、AAVキャプシドタンパク質をコードする核酸配列は、特定の細胞種、例えばSf9又はHEK細胞における発現用の調節発現制御配列と作用可能に連結される。昆虫宿主細胞又は哺乳動物宿主細胞に外来遺伝子を発現させるための当業者に公知の技術を用いて、本発明を実践することができる。昆虫細胞における分子工学及びポリペプチドの発現の方法論については、例えばSummers及びSmithの文献、「バキュロウイルスベクターのための方法及び昆虫培養手順のマニュアル（A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures）」, Texas Agricultural Experimental Station Bull. No. 7555, College Station, Tex. (1986); Prokopらの文献、「バキュロウイルスベクターの組換えDNA技術を用いた昆虫細胞における異種遺伝子のクローニング及び発現並びに応用（Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications）」, 97-152 (1986)中のLuckowの文献、1991. ; King, L. A.及びR. D. Posseeの文献、「バキュロウイルス発現系（The baculovirus expression system）」, Chapman及びHallの文献、United Kingdom (1992); O'Reilly, D. R., L. K. Miller, V. A. Luckowの文献,「バキュロウイルス発現ベクター：実験室マニュアル（Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual）」, New York (1992); W.H. Freeman及びRichardson, C. D.の文献, 「バキュロウイルス発現プロトコル、分子生物学における方法（Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology）」, volume 39 (1995); 米国特許第4,745,051号; US2003148506; 及びWO 03/074714に記載されている。AAVキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写に特に好適なプロモーターは、例えばpolyhedronプロモーターである。しかしながら、当該技術分野で公知の昆虫細胞において活性を示す他のプロモーター、例えばp10、p35、又はIE-1プロモーター及び上記参考文献中に記載されたさらなるプロモーターも、意図するものである。 
【００５５】
核酸、例えばベクター、例えば昆虫細胞適合性ベクターをそのような細胞に導入する方法及びそのような細胞を培養中で維持する方法のような、異種タンパク質の発現のための昆虫細胞の使用については、十分に実証されている。例えば、「分子生物学における方法（METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY）」, Richard編, Humana Press, NJ (1995); O'Reillyらの文献、「バキュロウイルス発現ベクター：実験室マニュアル（BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS, A LABORATORY MANUAL）」, Oxford Univ. Press (1994); Samulskiらの文献、J. Vir. 63:3822-8 (1989); Kajigayaらの文献、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88:4646-50 (1991); Ruffingらの文献、J. Vir. 66:6922-30 (1992); Kirnbauerらの文献、Vir. 219:37-44 (1996); Zhaoらの文献、Vir. 272:382-93 (2000);及びSamulskiらの文献、米国特許第6,204,059号を参照されたい。いくつかの実施態様において、昆虫細胞中でAAVをコードする核酸コンストラクトは、昆虫細胞適合性ベクターである。本明細書で使用する「昆虫細胞適合性ベクター」又は「ベクター」とは、昆虫又は昆虫細胞の生産的形質転換又はトランスフェクションが可能な核酸分子を指す。例示的生物学的ベクターには、プラスミド、線状核酸分子、及び組換えウイルスがある。昆虫細胞への適合性がある限り、任意のベクターを利用することができる。ベクターは昆虫細胞のゲノムと統合されてもよいが、昆虫細胞中におけるベクターの存在は永続的である必要はなく、一過的なエピソームベクターも含まれる。ベクターは、任意の公知の手段、例えば細胞の化学的処理、エレクトロポレーション、又は感染により導入することができる。いくつかの実施態様において、ベクターはバキュロウイルス、ウイルスベクター、又はプラスミドである。より好ましい実施態様において、ベクターはバキュロウイルスであり、すなわちコンストラクトはバキュロウイルスベクターである。バキュロウイルスベクター及びそれらの使用方法は、先に引用した昆虫細胞の分子工学についての参考文献に記載されている。
【００５６】
バキュロウイルスは節足動物のエンベロープ型DNAウイルスであり、そのうちの2つのメンバーが細胞培養中で組換えタンパク質を生産するための周知されている発現ベクターである。バキュロウイルスは、操作することにより特定の細胞に大きなゲノム内容物を送達することが可能となる、環状二本鎖ゲノム（80-200 kbp）を有する。ベクターとして使用されるウイルスは、一般にオートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）多キャプシド核多角体病ウイルス（AcMNPV）又はカイコ（Bombyx mori）（Bm）NPVである（Katoらの文献、Appl. Microbiol. Biotechnol. 85(3):459-470 (2010)）。バキュロウイルスは一般的に、組換えタンパク質の発現用の、昆虫細胞への感染に使用される。特に、昆虫における異種遺伝子の発現は、例えば米国特許第4,745,051号; Friesenらの文献、Curr. Top. Microbiol. Immunol. 131:31-49.(1986); EP 127,839; EP 155,476; Millerらの文献、Ann. Rev. of Microbiol. 42:177-199 (1988); Carbonellらの文献、Gene 73(2):409-18 (1988); Maedaらの文献、Nature 315(6020):592-4 (1985); Lebacq-Verheydenらの文献、Mol. Cell. Biol. 8(8):3129-35 (1988); Smithらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 82(24):8404-8 (1985); Miyajimaらの文献、Gene 58(2-3):273-81 (1987); 及びMartinらの文献、DNA 7(2):99-106 (1988)に記載の通り達成することができる。 タンパク質の生産に使用可能な多くのバキュロウイルス株及び変異株、並びに対応する許容性昆虫宿主細胞は、Luckowらの文献、Nature Biotechnology 6:47-55(1988) 及びMaedaらの文献、Nature 315(6020):592-4 (1985) に記載されている。
【００５７】
（新規AAVキャプシドタンパク質）
第一の態様において、本発明は様々な哺乳動物組織から単離した新規AAVキャプシドタンパク質を提供する。新規AAVキャプシドVP1タンパク質は、配列番号:1-7として提供され、関連するVP2及びVP3領域の位置は、本明細書に記載する。また、本発明は、これらの新規AAVキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明は、新規AAVキャプシドタンパク質（本明細書中では総称して「本発明のAAVキャプシドタンパク質」と呼ぶ）のアミノ酸配列、及び本発明のAAVキャプシドタンパク質をコードする核酸配列を提供する。また、本発明のこれらのAAVキャプシド核酸配列及びアミノ酸配列の断片を提供する。これらの各配列は、様々なベクター系及び宿主細胞で容易に利用可能である。キャプシドVP1タンパク質の所望の断片には、VP2、VP3及び可変領域、GBSドメイン及びGHループ、並びにこれらのタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列がある。これらの断片は、様々なベクター系及び宿主細胞において容易に利用可能である。そのような断片は、単独で、他のAAV配列若しくは断片と組み合わせて、又は他のAAV若しくは非AAVウイルス配列由来のエレメントと組み合わせて使用することができる。特定の望ましい一実施態様において、ベクターは、本発明のAAVキャプシド配列を含む。 
【００５８】
本発明のAAVキャプシド配列及びその断片は、rAAVの生産に有用であり、かつアンチセンス送達ベクター、遺伝子治療ベクター、又はワクチンベクターとしても有用である。本発明はさらに、核酸分子、遺伝子送達ベクター、及び本発明の新規AAVキャプシド配列を含む宿主細胞を提供する。 
【００５９】
好適な断片は、本明細書で提供する情報を使用して決定することができる。アラインメントは、様々な公開され、又は商業的に利用可能なマルチプル配列アラインメントプログラムのいずれか、例えばインターネット上のウェブサーバを通じてアクセス可能な「Clustal W」を使用して実施する。あるいは、Vector NTIユーティリティも使用する。また、上記プログラムに含まれるアルゴリズムを含め、ヌクレオチド配列の一致を測定するために使用可能な当該技術分野で公知のいくつかのアルゴリズムが存在する。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、GCGバージョン6.1のプログラムであるFASTAを使用して比較することができる。FASTAは、クエリー及び検索配列の間のアラインメント及びそれらの間で最も重複している領域の配列一致率を提供する。例えば、核酸配列間の配列一致率は、本明細書に参照により組み込まれているGCGバージョン6.1で提供される、そのデフォルトパラメータ（ワードサイズ6及びスコアマトリックス用のNOPAM係数）を用いるFASTAを使用して決定することができる。アミノ酸配列については、同様のプログラム、例えば「Clustal X」プログラムが利用可能である。使用可能な追加の配列アライメントツールは、（タンパク質配列アライメント；（ http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/））及び（核酸アライメント； http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html）によって提供される。一般に、これらのプログラムのいずれかはデフォルト設定で使用されるが、当業者は、必要に応じてこれらの設定を変更することができる。あるいは、当業者であれば、参照されたアルゴリズム及びプログラムによって提供されるような、少なくとも一致のレベル又はアラインメントを提供する別のアルゴリズム又はコンピュータプログラムを利用することができる。 
【００６０】
核酸又はその断片を参照する場合、「相当な一致」、「相当な相同性」、又は「相当な類似性」という用語は、別の核酸（又はその相補鎖）を有する適切なヌクレオチドの挿入又は欠失と最適にアラインした場合、アラインされた配列の少なくとも約95〜99%のヌクレオチド配列一致、例えば95%の一致、96%の一致、97%の一致、98%の一致、及び99%の一致が存在することを示す。好ましくは、相同性は比較する2つの配列の全長、又はそのオープンリーディングフレーム、又は少なくとも15ヌクレオチド長である別の好適な断片にわたる。好適な断片の例を、本明細書に記載する。また、本発明の核酸配列には、天然のバリアント及び本発明のAAVキャプシドをコードする核酸の操作された修飾体、及びその相補鎖が含まれる。そのような修飾には、例えば当該技術分野で公知の標識、メチル化、及び縮重ヌクレオチドを有する天然に存在する1以上のヌクレオチドの置換がある。
【００６１】
アミノ酸又はその断片を参照する場合、「相当な一致」、「相当な相同性」、又は「相当な類似性」という用語は、別のアミノ酸（又はその相補鎖）を有する適切なアミノ酸の挿入又は欠失と最適にアラインした場合、アラインされた配列の少なくとも約95〜99%のアミノ酸配列一致、例えば95%の一致、96%の一致、97%の一致、98%の一致、及び99%の一致が存在することを示す。好ましくは、相同性は比較する2つの配列の全長、又はそのタンパク質、例えばcapタンパク質、repタンパク質、又は少なくとも8アミノ酸長、又はより望ましくは少なくとも15アミノ酸長であるそれらの断片にわたる。好適な断片の例を、本明細書に記載する。 
【００６２】
「高度に保存されている」という用語は、少なくとも80%の一致、好ましくは90%の一致、及びより好ましくは97%超の一致を意味する。一致度は当業者であれば当業者に公知のアルゴリズム及びコンピュータプログラムを頼みにすることによって容易に決定される。
【００６３】
核酸配列又はアミノ酸配列の文脈において、「配列一致率」又は「一致」という用語は、アラインして対応を最大にさせた場合に同じとなる2つの配列中の残基を指す。配列一致の比較の長さは、比較する2つの配列の全長、遺伝子コード配列の全長、又は望ましくは少なくとも約500〜5000ヌクレオチドの断片にわたり得る。しかしながら、比較的小さい断片、例えば少なくとも約9ヌクレオチド、通常は少なくとも約20〜24ヌクレオチド、少なくとも28〜32ヌクレオチド、少なくとも36以上のヌクレオチドの間の一致も、望ましい場合がある。同様に、「配列一致率」は、アミノ酸配列についても、タンパク質の全長、又はその断片にわたり、容易に決定することができる。好適には、断片は少なくとも約8アミノ酸長であり、最大約700アミノ酸であり得る。好適な断片の例を、本明細書に記載する。 
【００６４】
本発明の新規キャプシドは、ポリペプチドの生物活性及び/又は免疫原性活性に影響を及ぼさない1以上の追加の保存的アミノ酸置換を含み得る。「保存的アミノ酸置換」という用語は、ネイティブなアミノ酸残基を、天然に存在する、及び天然に存在しないアミノ酸を含む非ネイティブ残基で置換することであって、その結果その位置でのアミノ酸残基の極性又は電荷に対する影響がほとんどないか、全くない置換を指す。例えば、保存的置換は、ポリペプチド中の非極性残基を任意の他の非極性残基により置換することで発生する。さらにまた、ポリペプチド中の任意のネイティブな残基は、「アラニンスキャン突然変異誘発」法に従いアラニンで置換してもよい。天然に存在するアミノ酸は、それらの側鎖に基づいて以下のように特徴づけられる：塩基性：アルギニン、リジン、ヒスチジン；酸性：グルタミン酸、アスパラギン酸；非荷電極性：グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン、チロシン；及び非極性：フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、グリシン、アラニン、バリン、プロリン、メチオニン、ロイシン、ノルロイシン、イソロイシン。アミノ酸置換の一般則は、以下の表に記載されている。
（保存的アミノ酸置換）
【表２】
2021522842.tif 000003
【００６５】
本発明の新規キャプシドは、配列番号1-7のアミノ酸配列をコードする核酸配列と実質的に等価なポリヌクレオチドによってコードされ得る。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の改変ポリペプチドアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列と、例えば少なくとも少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、 少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、又は89%、より典型的には少なくとも90%、91%、92%、93%、又は94%、及びさらにより典型的には少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%の配列一致を有し得る。
【００６６】
本発明の核酸配列の範囲内には、ストリンジェントな条件で本発明の新規キャプシドをコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズする核酸配列断片を含む。該断片は約5ヌクレオチド超、好ましくは7ヌクレオチド、より好ましくは、9ヌクレオチド超、かつ最も好ましくは17ヌクレオチド超である。例えば選択的な（すなわち、本発明のポリヌクレオチドのいずれか1つと特異的にハイブリダイズする）15、17、又は20ヌクレオチド超の断片を意図するものである。ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることができるプローブは、本発明のポリヌクレオチド配列を同じファミリーの遺伝子の他のポリヌクレオチド配列から差別化することができ、又は遺伝子を他の細菌遺伝子から差別化することができ、かつ好ましくは特有のヌクレオチド配列に基づく。 
【００６７】
「ストリンジェントな」という用語は、当該技術分野において一般的にストリンジェントであると理解される条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に温度、イオン強度、及びホルムアミドなどの変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーション及び洗浄のストリンジェントな条件の例として、0.015 M塩化ナトリウム、0.0015 Mクエン酸ナトリウム中65〜68℃又は0.015 M塩化ナトリウム、0.0015 Mクエン酸ナトリウム、及び50% ホルムアミド中42℃がある。Sambrookらの文献、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」, 上掲、第2版 Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989)を参照されたい。また、よりストリンジェントな条件（例えば高い温度、低いイオン強度、高いホルムアミド又はその他の変性剤）を使用することもできるが、ハイブリダイゼーション率に影響する。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが問題となる場合、追加の例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、6×SSC 0.05%ピロリン酸ナトリウム中37℃（14塩基オリゴの場合）、48℃（17塩基オリゴの場合）、55℃（20塩基オリゴの場合）、及び60℃（23塩基オリゴの場合）での洗浄を含む。 
【００６８】
非特異的及び/又はバックグラウンドハイブリダイゼーションを低減する目的で、他の作用剤をハイブリダイゼーション及び洗浄バッファーに含めることができる。例として、0.1%ウシ血清アルブミン、0.1%ポリビニルピロリドン、0.1%ピロリン酸ナトリウム、0.1%ドデシル硫酸ナトリウムNaDodSO4（SDS）、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理サケ精子DNA（又は他の非相補的DNA）、及びデキストラン硫酸があるが、他の好適な作用剤も使用できる。これらの添加剤の濃度及び種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を及ぼすことなく変更することができる。ハイブリダイゼーション実験は通常pH 6.8-7.4で実施されるが、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーション率はほとんどpHに依存しない。Andersonらの文献、「核酸ハイブリダイゼーション：実践的アプローチ（Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach）」, Ch. 4, IRL Press Limited (Oxford, England)を参照されたい。これらの変数に対応し、異なる配列関連性を有するDNAにハイブリッド形成させるため、ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整することができる。 
【００６９】
本明細書に記載する、本発明のAAVキャプシドタンパク質を含む（containing）、又は含む（comprising）本発明のベクターは、中和抗体により他のAAV血清型ベースベクター並びに他のウイルスベクターの有効性が低下してしまう用途における使用に特に好適である。本発明のrAAVベクターは、rAAVの再投与及び反復遺伝子治療に特に有利である。 
【００７０】
また、本発明のAAVキャプシドタンパク質をコードする核酸の断片、それらの相補的な鎖、それらに相補的なcDNA及びRNAを本発明に含める。好適な断片は少なくとも15ヌクレオチド長で、機能的断片、すなわち生物学的関心の対象とする断片を包含する。そのような断片には、選択的スプライスバリアントであるキャプシドの3つの可変タンパク質（VP）：VP1、VP2及びVP3をコードする配列がある。本発明のAAVキャプシドをコードする核酸の他の好適な断片には、キャプシドタンパク質の開始コドンを含む断片及び本明細書に記載するVP1キャプシドタンパク質の可変領域をコードする断片がある。 
【００７１】
本発明は、本発明のAAV核酸配列から発現されるAAVキャプシドアミノ酸配列、ペプチド、及びタンパク質に限定されず、例えば化学合成、他の合成技術、又は他の方法を含む当該技術分野で公知の他の方法によって生成されるアミノ酸配列、ペプチド、及びタンパク質を包含する。例えば、本明細書に記載するいずれかのキャプシドの配列は、様々な技術を使用して容易に生成することができる。 
【００７２】
好適な生産技術は当業者に周知されている。例えば、Sambrookらの文献、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, N.Y.)を参照されたい。あるいはまた、ペプチドは、周知の固相ペプチド合成法（Merrifieldの文献、J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1962); Stewart及びYoungの文献、「固相ペプチド合成（Solid Phase Peptide Synthesis）」 Freeman, (San Francisco, 1969) pp. 27-62.によって合成することができる。これら及び他の好適な生産方法は、当業者の知識の範囲内にあり、本発明を限定するものではない。 
【００７３】
AAVキャプシドは、選択的スプライスバリアントである3つのタンパク質VP1、VP2、及びVP3から構成される。全長キャプシド配列をVP1と呼び、VP2及びVP3と呼ばれるスプライスバリアント包含する。本発明はまた、その発明のAAVキャプシドタンパク質の他の機能的断片も提供する。他の望ましいキャプシドタンパク質の断片は、可変領域（VR）、可変領域の間に位置する定常領域、GBSドメイン、及びGHループを含む。キャプシドタンパク質の他の望ましい断片には、HPVそれ自体を含む。
【００７４】
AAV2における配列分岐領域を決定するためのアルゴリズムを開発した。（Chioriniらの文献、J. Virol, 73:1309-19 (1999); Rutledgeらの文献、J. Virol., 72:309-319 (1998)）。本明細書に記載するこのアルゴリズム及び/又はアライメント技術を使用して、新規AAVキャプシド配列のVRを決定する。Clustal Xプログラムをデフォルト設定で使用して実行された、本明細書で提供するアラインメントを使用して、又は他の市販の若しくは公開され利用可能なアラインメントプログラムをデフォルト設定で使用して、当業者であれば本発明の新規AAVキャプシドの対応する断片を容易に決定することができる。 
【００７５】
好適には、AAVキャプシドタンパク質の断片は、少なくとも8アミノ酸長、少なくとも9アミノ酸長、少なくとも10アミノ酸長、少なくとも20アミノ酸長、30 アミノ酸長、少なくとも50アミノ酸長、少なくとも75アミノ酸長、少なくとも100アミノ酸長、200アミノ酸長、250アミノ酸長、300アミノ酸長、350アミノ酸長、又は400アミノ酸長である。しかしながら、他の所望の長さの断片を容易に利用可能である。本発明の全ての断片は、キャプシドAAVタンパク質の生物活性を保持する。そのような断片は、組換えにより、又は他の好適な手段、例えば化学合成により生産することができる。
【００７６】
本発明の配列、タンパク質、及び断片は、組換え生産、化学合成、又は他の合成手段を含む任意の好適な手段によって生産することができる。そのような生産方法は、当業者の知識の範囲内にあり、本発明を限定するものではない。
【００７７】
図面及び配列表で提供される核酸配列を含むことに加えて、本発明は、本発明のAAVキャプシドタンパク質のアミノ酸配列、タンパク質、ペプチドを発現するように設計された核酸分子及び配列を含む。従って、本発明は、以下のAAVキャプシドアミノ酸配列をコードする核酸配列及びこれらの配列を使用して生成させた人工AAVキャプシドタンパク質、及び/又はそれらの特有の断片を含む。 
【００７８】
（本発明のキャプシドタンパク質を有するAAVの生産）
本発明は、AAVキャプシドタンパク質の配列及びこれらのタンパク質をコードする核酸を包含する。これらのタンパク質は、これらのウイルスが自然界において関連しているDNA及び/又は細胞物質を含まない。別の態様において、本発明は、その断片を含む、本発明の新規AAV配列を利用する、異種遺伝子又は他の核酸配列を標的細胞に送達するのに有用な分子を生産するための分子を提供する。 
【００７９】
別の態様において、本発明は、その断片を含む、本発明のAAVキャプシドタンパク質配列を利用する、異種遺伝子又は他の核酸配列を標的細胞に送達するのに有用なウイルスベクターを生産するための分子を提供する。 
【００８０】
AAVキャプシド核酸配列を含む本発明の分子は、宿主細胞に送達され得る任意の遺伝的エレメント（ベクター）、例えばそれらに担持される配列を導入する、ネイキッドDNA、プラスミド、ファージ、トランスポソン、コスミド、エピソーム、非ウイルス性送達ビヒクル（例えば、脂質ベース担体）中のタンパク質、ウイルスなどを含む。選択されたベクターは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速DNAコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によって送達することができる。本発明の任意の実施態様の構築に使用される方法は、核酸操作の分野の当業者に公知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術を含む。例えば、Sambrookらの文献、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, N.Y.)を参照されたい。 
【００８１】
一実施態様において、本発明のベクターは最低限、本発明のAAVキャプシド又はその断片をコードする配列を含む。別の実施態様において、本発明のベクターは、最低限AAV repタンパク質又はその断片をコードする配列を含む。任意に、そのようなベクターはAAV cap及びrepタンパク質の両方を含み得る。AAV rep及びcapの両方が提供されるベクターでは、AAV rep及びAAV cap配列の両方を同じAAV血清型起源とすることができる。あるいは、本発明は、rep配列がcap配列を提供するAAV血清型とは異なるAAV血清型由来であるベクターを提供する。一実施態様において、rep及びcap配列は別個の供給源（例えば、別個のベクター、又は宿主細胞及びベクター）から発現させる。別の実施態様において、これらのrep配列はインフレームで異なるAAV血清型のcap配列と融合し、キメラAAVベクターを形成する。 
【００８２】
従って、一実施態様において、本明細書に記載のベクターは、アミノ酸配列配列番号：1-7のいずれか1つのインタクトなAAVキャプシドタンパク質をコードする核酸配列を含む。別の例において、VP3タンパク質の開始コドンをGTGに変更することが望ましい場合がある。あるいは、rAAVは、本発明の1以上のAAVキャプシドタンパク質の1以上の可変領域、又は他の断片を含み得る。これらの改変は、選択された発現系における発現、収量の増加、及び/又は精製の改善のため、又は別の所望の目的のため（例えば、向性を変え、又は中和抗体エピトープを変更するため）のものであり得る。 
【００８３】
本明細書に記載のベクター、例えばプラスミドは、様々な目的に有用であるが、AAV配列又はその断片を含むキャプシドを含むrAAVの生産における使用に、特によく適合する。rAAVを含むこれらのベクター、それらのエレメント、構造、及び使用は、本明細書に詳細に記載する。 
【００８４】
（新規キャプシドタンパク質のVP1）
新規AAV VP1キャプシドタンパク質はヒヒ肝臓から単離した。
【００８５】
ヒヒから単離した新規AAVキャプシド（Bba.45と表記）のVP1配列は、配列番号：1（アミノ酸1-742）と記載し、関連する可変領域及びGBS及びGHループ領域の位置は、以下の表2で定義する。VP2キャプシドタンパク質は、配列番号：1のアミノ酸138-742に及び、VP3キャプシドタンパク質は配列番号：1のアミノ酸206-742に及ぶ。
【化１】
2021522842.tif 000004
【００８６】
ヒヒから単離した新規AAVキャプシド（Bba.46と表記）のVP1配列は、配列番号：2（アミノ酸1-742）と記載し、関連する可変領域及びGBS及びGHループ領域の位置は、以下の表2で定義する。VP2キャプシドタンパク質は、配列番号：2のアミノ酸138-742に及び、VP3キャプシドタンパク質は配列番号：2のアミノ酸206-742に及ぶ。
【化２】
2021522842.tif 000005
【００８７】
ヒヒから単離した新規AAVキャプシド（Bba.47と表記）のVP1配列は、配列番号：3（アミノ酸1-742）と記載し、関連する可変領域及びGBS及びGHループ領域の位置は、以下の表2で定義する。VP2キャプシドタンパク質は、配列番号：3のアミノ酸138-742に及び、VP3キャプシドタンパク質は配列番号：3のアミノ酸206-742に及ぶ。
【化３】
2021522842.tif 000006
【００８８】
ヒヒから単離した新規AAVキャプシド（Bba.48と表記）のVP1配列は、配列番号：4（アミノ酸1-742）と記載し、関連する可変領域及びGBS及びGHループ領域の位置は、以下の表2で定義する。VP2キャプシドタンパク質は、配列番号：4のアミノ酸138-742に及び、VP3キャプシドタンパク質は配列番号：4のアミノ酸206-742に及ぶ。
【化４】
2021522842.tif 000007
【００８９】
ヒヒから単離した新規AAVキャプシド（Bba.49と表記）のVP1配列は、配列番号：5（アミノ酸1-742）と記載し、関連する可変領域及びGBS及びGHループ領域の位置は、以下の表2で定義する。VP2キャプシドタンパク質は、配列番号：5のアミノ酸138-742に及び、VP3キャプシドタンパク質は配列番号：5のアミノ酸206-742に及ぶ。
【化５】
2021522842.tif 000008
【００９０】
ヒヒから単離した新規AAVキャプシド（Bba.50と表記）のVP1配列は、配列番号：6（アミノ酸1-742）と記載し、関連する可変領域及びGBS及びGHループ領域の位置は、以下の表2で定義する。VP2キャプシドタンパク質は、配列番号：6のアミノ酸138-742に及び、VP3キャプシドタンパク質は配列番号：6のアミノ酸206-742に及ぶ。
【化６】
2021522842.tif 000009
【００９１】
ヒヒから単離した新規AAVキャプシド（Bba.51と表記）のVP1配列は、配列番号：7（アミノ酸1-742）と記載し、関連する可変領域及びGBS及びGHループ領域の位置は、以下の表2で定義する。VP2キャプシドタンパク質は、配列番号：7のアミノ酸138-742に及び、VP3キャプシドタンパク質は配列番号：7のアミノ酸206-742に及ぶ。
【化７】
2021522842.tif 000010
【００９２】
先に参照したキャプシドタンパク質をコードする対応する核酸配列は、配列番号：8/Bba.45; 配列番号：9/Bba.46; 配列番号：10/Bba.47; 配列番号：11/Bba.48; 配列番号：12/Bba.49; 配列番号：13/Bba.50; 及び配列番号：14/Bba.51である。
【００９３】
配列番号：8（Bba.45）
【化８】
2021522842.tif 000011
【００９４】
配列番号：9（Bba.46）
【化９】
2021522842.tif 000012
【００９５】
配列番号：10（Bba.47）
【化１０】
2021522842.tif 000013
【００９６】
配列番号：11（Bba.48）
【化１１】
2021522842.tif 000014
【００９７】
配列番号：12（Bba.49）
【化１２】
2021522842.tif 000015
【００９８】
配列番号：13（Bba.50）
【化１３】
2021522842.tif 000016
【００９９】
配列番号：14（Bba.51）
【化１４】
2021522842.tif 000017
【０１００】
すぐ下の表2において、「VR」は可変領域を指し、数字は可変領域又はGBS及びGHループ領域がアミノ酸配列中にまたがるアミノ酸残基を指す。
（表2）
【表３】
2021522842.tif 000018
【０１０１】
（導入遺伝子）
導入遺伝子は、関心対象とするポリペプチド、タンパク質、又は他の産物をコードする、導入遺伝子と隣接するベクター配列に対し異種である核酸配列である。核酸コード配列は、宿主細胞における導入遺伝子の転写、翻訳、及び/又は発現を可能にする様式で、調節性構成要素と作用可能に連結される。 
【０１０２】
導入遺伝子配列の構成は、結果として得られるベクターを用いる用途に応じて決まる。例えば、導入遺伝子配列の一種にはレポーター配列があり、発現に際して検出可能なシグナルが発生する。そのようなレポーター配列には、限定されることなく、それに対し高親和性の抗体が存在するか、又は従来の方法によって生成させることができるβ-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼ（LacZ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ルシフェラーゼ、例えば、CD2、CD4、CD8を含む膜結合タンパク質、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質その他当該技術分野で周知のものをコードするDNA配列、及びとりわけヘマグルチニン又はMyc由来の抗原タグドメインと適切に融合させた膜結合タンパク質を含む融合タンパク質がある。 
【０１０３】
これらのコーディング配列は、それらの発現を駆動する調節エレメントに関連付けられると、酵素、X線撮影、比色定量、蛍光、又は他の分光分析アッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ、並びに酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、及び免疫組織化学を含む免疫学的アッセイを含む、従来の方法で検出可能なシグナルを提供する。例えば、マーカー配列がLacZ遺伝子である場合、シグナルを担持するベクターの存在がβ-ガラクトシダーゼ活性のアッセイによって検出される。導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質又はルシフェラーゼである場合、シグナルを担持するベクターは、ルミノメータにおいて色又は光の生成によって視覚的に測定し得る。 
【０１０４】
しかしながら、導入遺伝子は望ましくは生物学及び医学において有用な産物、例えばタンパク質、ペプチド、RNA、酵素、ドミナントネガティブ突然変異体、又は触媒RNAをコードする非マーカー配列である。望ましいRNA分子には、tRNA、dsRNA、リボソームRNA、触媒RNA、siRNA、低分子ヘアピンRNA、トランススプライシングRNA、及びアンチセンスRNAがある。有用なRNA配列の一例は、処置動物における標的核酸配列の発現を抑制又は消去する配列である。典型的に、好適な標的配列には腫瘍性標的及びウイルス性疾患がある。そのような標的の例については、以下の免疫原に関する節で特定された腫瘍性標的及びウイルスを参照されたい。 
【０１０５】
導入遺伝子は、遺伝子の欠損の修正又は改善に使用することができる。遺伝子の欠損には、正常な遺伝子が正常なレベル未満で発現している欠陥、又は機能的遺伝子産物が発現しない欠陥を含み得る。好ましい型の導入遺伝子配列は、宿主細胞において発現される治療用タンパク質又はポリペプチドをコードする。本発明はさらに、例えば多サブユニットタンパク質によって引き起こされる遺伝子欠陥を修正又は改善するために、複数の導入遺伝子を使用することも含む。特定の状況では、異なる導入遺伝子を使用して、タンパク質の各サブユニットをコードさせたり、又は異なるペプチド若しくはタンパク質をコードさせたりすることができる。これは、タンパク質サブユニットをコードするDNAのサイズが大きい場合、例えば免疫グロブリン、血小板由来増殖因子、又はジストロフィンタンパク質について、望ましい。細胞に多サブユニットタンパク質を生産させるため、細胞に異なるサブユニットの各々を含む組換えウイルスを感染させる。あるいは、タンパク質の異なるサブユニットを同じ導入遺伝子によってコードさせることもできる。この場合、単一の導入遺伝子は各サブユニットをコードするDNAを含み、各サブユニットのDNAは内部リボザイム進入部位（internal ribozyme entry site）（IRES）で隔てられている。これは、各サブユニットをコードするDNAのサイズが小さい場合、例えばサブユニットをコードするDNA及びIRESの合計サイズが5キロベース未満の場合に望ましい。IRESの代わりに、DNAを翻訳後事象において自己切断される、2Aペプチドをコードする配列によって隔ててもよい。例えば、Donnellyらの文献、J. Gen. Virol., 78(Pt 1):13-21 (January 1997); Furlerらの文献、Gene Ther., 8(11):864-873 (June 2001); Klumpらの文献、Gene Ther., 8(10):811-817 (May 2001)を参照されたい。この2AペプチドはIRESよりも大幅に小さく、スペースが制限因子となる場合の使用によく適する。より多くの、導入遺伝子が大きく、多サブユニットからなる場合、又は2つの導入遺伝子を共送達する場合、所望の導入遺伝子又はサブユニットを担持するrAAVを共投与して、それらをインビボでコンカテマー形成させて単一のベクターゲノムを形成させる。そのような実施態様においては、第1のAAVが単一の導入遺伝子を発現する発現カセットを担持し、第2のAAVが宿主細胞内で共発現させるための異なる導入遺伝子を発現する発現カセットを担持し得る。しかしながら、選択された導入遺伝子は、任意の生物活性を有する産物又は他の産物、例えば研究に望ましい産物をコードし得る。 
【０１０６】
好適な導入遺伝子は当業者によって容易に選択することができる。導入遺伝子の選択は、本発明を制限するものとはみなされない。
【０１０７】
いくつかの実施態様において、導入遺伝子は異種タンパク質であり、この異種タンパク質は治療用タンパク質である。例示的な治療用タンパク質には、これらに限定はされないが、血液因子、例えばβ-グロビン、ヘモグロビン、組織プラスミノゲン活性化因子、及び凝固因子；コロニー刺激因子（CSF）、インターロイキン、例えばIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9など；成長因子、例えばケラチノサイト増殖因子（KGF）、幹細胞因子（SCF）、線維芽細胞増殖因子（FGF、例えば塩基性FGF及び酸性FGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、インスリン様増殖因子（IGF）、骨形成タンパク質（BMP）、上皮増殖因子（EGF）、増殖分化因子-9 （GDF-9）、肝細胞腫由来増殖因子（HDGF）、ミオスタチン（GDF-8）、神経成長因子（NGF）、神経栄養因子、血小板由来増殖因子（PDGF）、トロンボポエチン（TPO）、トランスフォーミング増殖因子α（TGF-α）、トランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）など；可溶性受容体、例えば可溶性TNF-α受容体、可溶性VEGF受容体、可溶性インターロイキン受容体（例えば可溶性IL-1受容体及び可溶性II型IL-1受容体）、可溶性γ/δ T 細胞受容体、可溶性受容体のリガンド結合断片など；酵素、例えばα-グルコシダーゼ、イミグルカラーゼ（imiglucarase）、β-グルコセレブロシダーゼ、及びアルグルセラーゼ；酵素活性化因子、例えば組織プラスミノゲン活性化因子；ケモカイン、例えばIP-10、インターフェロン-γによって誘導されるモノカイン（Mig）、Groα/IL-8、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、PF-4など；血管新生剤、例えば血管内皮増殖因子（VEGF、例えばVEGF121、VEGF165、VEGF-C、VEGF-2）、神経膠腫由来増殖因子、アンジオゲニン、アンジオゲニン-2など；抗血管新生剤、例えば可溶性VEGF受容体；タンパク質ワクチン、 向神経活性ペプチド、例えば神経成長因子（NGF）、ブラジキニン、コレシストキニン、ガスチン、セクレチン、オキシトシン、ゴナドトロピン放出ホルモン、β-エンドルフィン、エンケファリン、サブスタンスP 、ソマトスタチン、プロラクチン、ガラニン、成長ホルモン放出ホルモン、ボンベシン、ダイノルフィン、ワルファリン、ニューロテンシン、モチリン、甲状腺刺激ホルモン、ニューロペプチドY、黄体形成ホルモン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン、バソプレシン、アンジオテンシンII、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、血管作用性小腸ペプチド、スリープペプチド（sleep peptide）など；血栓溶解剤；心房性ナトリウム利尿ペプチド、リラクシン、グリア線維酸性タンパク質、卵胞刺激ホルモン（FSH）；ヒトα-1アンチトリプシン；白血病抑制因子（LIF）、組織因子、黄体形成ホルモン、マクロファージ活性化因子、腫瘍壊死因子（TNF）、好中球走化性因子（NCF）；組織メタロプロテイナーゼ阻害剤；血管作用性小腸ペプチド；アンジオゲニン；アンジオトロピン；フィブリン；ヒルジン、IL-1受容体アンタゴニストなどがある。関心対象とするタンパク質のいくつかの他の非限定的な例には、毛様体神経栄養因子（CNTF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）、神経栄養因子3及び4/5（NT-3及び4/5）、グリア細胞由来神経栄養因子（GDNF）、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（AADC）、第VIII因子、第IX因子、及び第X因子などの血友病関連の凝固タンパク質、ジストロフィン、ミニジストロフィン、又はマイクロジ���トロフィン；リソソーム酸性リパーゼ；フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（PAH）；糖原病関連酵素、例えばグルコース-6-ホスファターゼ、酸性マルターゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、筋グリコーゲンホスホリラーゼ、肝グリコーゲンホスホリラーゼ、筋ホスホフルクトキナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ（例えば、PHKA2）、グルコーストランスポーター（例えば、GLUT2）、アルドラーゼA、β-エノラーゼ、及びグリコーゲンシンターゼ；リソソーム酵素（例えば、β-N-アセチルヘキソサミニダーゼA）；及びそれらの任意のバリアントがある。 
【０１０８】
（調節制御エレメント）
また、AAV ベクターには、プラスミドベクターをトランスフェクションした、又は本発明によって生産されたウイルスに感染させた細胞におけるその転写、翻訳及び/又は発現を可能にする様式で導入遺伝子と作用可能に連結された、従来の制御エレメント又は配列がある。本明細書で使用する、「作用可能に連結された」配列には、関心対象とする遺伝子と隣接する発現制御配列及び関心対象とする遺伝子をトランスに、又は遠くから制御するように作用する発現制御配列の両方がある。 
【０１０９】
発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；スプライシング及びポリアデニル化（ポリA）シグナルなどの効率的なRNAプロセシングシグナル、細胞質mRNAを安定させる配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Kozakコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を高める配列；及び望ましい場合、コードされた産物の分泌を増強する配列を含む。ネイティブ、構成的、誘導性、及び/又は組織特異的なプロモーターを含む、多くの発現制御配列が当該技術分野において公知であり、利用することができる。 
【０１１０】
構成的プロモーターの例には、限定されることなく、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（RSV）LTRプロモーター（任意にRSVエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター（任意にCMVエンハンサーを含む）（例えば、Boshartらの文献、Cell, 41:521-530 (1985)を参照されたい）、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β-アクチンプロモーター、ホスホスグリセロールキナーゼ（PGK）プロモーター、及びEF1プロモーター[Invitrogen]がある。誘導性プロモーターは遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給される化合物、温度などの環境因子、又は特定の生理的状態の存在、例えば急性期、細胞の特定の分化状態、又は複製細胞においてのみによって調節できる。誘導性プロモーター及び誘導システムは、限定されることなく、Invitrogen、Clontech、及びAriadを含む、様々な商業的供給源から入手可能である。多くの他のシステムが記述されており、当業者によって容易に選択することができる。外因的に供給された化合物によって調節される誘導性プロモーターの例には、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（metallothionine）（MT）プロモーター、デキサメタゾン（Dex）誘導性マウス乳癌ウイルス（MMTV）プロモーター、 T7ポリメラーゼプロモーターシステム[WO 98/10088]、エクダイソン昆虫プロモーター[Noらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. 
USA, 93:3346-3351 (1996)]、テトラサイクリンにより抑制可能なシステム[Gossenらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)]、テトラサイクリンにより誘導可能なシステム[Gossenらの文献、Science, 268:1766-1769 (1995)、Harveyらの文献、Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)も参照されたい]、RU486誘導性システム[Wangらの文献、Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)及びWangらの文献、Gene Ther., 4:432-441 (1997)]、及びラパマイシン誘導性システム[Magariらの文献、J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)]がある。この状況で有用となり得る他の型の誘導性プロモーターには、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態、又は複製細胞においてのみなどの特定の生理的状態によって調節されるものがある。 
【０１１１】
別の実施態様において、導入遺伝子についてネイティブのプロモーターを使用する。導入遺伝子の発現がネイティブの発現を模倣することが望ましい場合、ネイティブのプロモーターが好ましい場合がある。ネイティブプロモーターは、導入遺伝子の発現を一時的又は発達期において、又は組織特異的な様式で、又は特定の転写刺激に応答して調節しなくてはならない場合に使用することができる。さらなる実施態様において、他のネイティブな発現制御エレメント、例えばエンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位、Kozakコンセンサス配列を使用して、ネイティブの発現を模倣することができる。 
【０１１２】
導入遺伝子の別の実施態様は、組織特異的プロモーターと作用可能に連結された遺伝子を含む。例えば、骨格筋における発現が望ましい場合、筋肉で活性を示すプロモーターを使用すべきである。これらには、骨格β-アクチン、ミオシン軽鎖2A、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼ並びに天然に存在するプロモーターよりも活性が高い合成筋プロモーター（Liらの文献、Nat. Biotech., 17:241-245 (1999)を参照されたい）をコードする遺伝子由来のプロモーターがある。組織特異的プロモーターの例は、とりわけ肝臓（アルブミン、Miyatakeらの文献、J. Virol., 71:5124-32 (1997)；B 型肝炎ウイルスコアプロモーター、Sandigらの文献、Gene Ther., 3:1002-9 (1996)；α-フェトタンパク質（AFP）、Arbuthnotらの文献、Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)）、骨オステオカルシン（Steinらの文献、Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)）;骨シアロタンパク質（Chenらの文献、J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)）、リンパ球（CD2, Hansalらの文献、J. Immunol., 161:1063-8 (1998);免疫グロブリン重鎖; T細胞受容体鎖）、神経細胞、例えば神経特異的エノラーゼ（NSE）プロモーター（Andersenらの文献、Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)）、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子（Piccioliらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)）、及び神経特異的vgf遺伝子（Piccioliらの文献、Neuron, 15:373-84 (1995)）について公知である。 
【０１１３】
任意にまた、治療上有用な導入遺伝子を担持するプラスミドは、選択可能なマーカーを含み得、又はレポーター遺伝子は、とりわけジェネティシン、ハイグロマイシン、又はピューリマイシン（purimycin）抵抗性をコードする配列を含み得る。そのような選択可能なレポーター又はマーカー遺伝子（好ましくは、本発明の方法によってレスキューされるウイルスゲノムの外側に位置する）、例えばアンピシリン抵抗性を使用して、細菌細胞内でのプラスミドの存在を示すことができる。プラスミドの他の構成要素には、複製起点を含み得る。これらの及び他のプロモーター及びベクターエレメントの選択は一般的であり、多くのそのような配列が利用可能である（例えば、Sambrookらの文献及びそこで引用される参考文献を参照されたい）。 
【０１１４】
（組換えAAVを生産する方法）
本開示は、昆虫又は哺乳動物細胞で組換えAAVを生産するための材料及び方法を提供する。いくつかの実施態様において、ウイルスコンストラクトはプロモーター及びプロモーターの下流の、1以上の関心対象とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入を可能にする、制限部位をさらに含み、ここでプロモーター及び制限部位が5'AAV ITRの下流かつ3'AAV ITRの上流に位置する。いくつかの実施態様において、ウイルスコンストラクトは制限部位の下流かつ3'AAV ITRの上流に転写後調節エレメントをさらに含む。いくつかの実施態様において、ウイルスコンストラクトは制限部位に挿入され、かつプロモーターと作用可能に連結されたポリヌクレオチドをさらに含み、ここでポリヌクレオチドは、関心対象とするタンパク質のコード領域を含む。当業者であれば認識するように、本件出願において開示するAAVベクターのいずれか1つを組換えAAVの生産のためのウイルスコンストラクトとして、方法において使用することができる。 
【０１１５】
いくつかの実施態様において、ヘルパー機能はアデノウイルス又はバキュロウイルスヘルパー遺伝子を含む1以上のヘルパープラスミド又はヘルパーウイルスによって提供する。アデノウイルス又はバキュロウイルスヘルパー遺伝子の非限定的な例には、これらに限定はされないが、AAVパッケージングにヘルパー機能を提供可能なE1A、E1B、E2A、E4、及びVAがある。 
【０１１６】
AAVのヘルパーウイルスは当該技術分野において公知であり、例えばアデノウイルス科及びヘルペスウイルス科由来のウイルスを含む。AAVのヘルパーウイルスの例には、これらに限定はされないが、米国公開公報第20110201088号（その開示は参照により本明細書に組み込まれている）に記載のSAdV-13ヘルパーウイルス及びSAdV-13様ヘルパーウイルス、ヘルパーベクターpHELP（Applied Viromics）がある。当業者であれば、AAVに適切なヘルパー機能を提供可能なAAVの任意のヘルパーウイルス又はヘルパープラスミドを、本明細書で使用可能であることを認識するであろう。
【０１１７】
いくつかの実施態様において、AAV cap遺伝子は、プラスミド中に存在する。プラスミドは AAV rep遺伝子をさらに含み得る。任意のAAV血清型（これらに限定はされないが、AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13及びそれらの任意の変異株を含む）由来のcap遺伝子及び/又はrep遺伝子を本明細書で使用して、組換えAAVを生産することができる。いくつかの実施態様において、AAV cap遺伝子は、血清型1、血清型2、血清型4、血清型5、血清型6、血清型7、血清型8、血清型9、血清型10、血清型11、血清型12、血清型13、又はそれらの変異株由来のキャプシドをコードする。 
【０１１８】
いくつかの実施態様において、昆虫又は哺乳動物細胞にヘルパープラスミド又はヘルパーウイルス、ウイルスコンストラクト及びAAV cap遺伝子をコードするプラスミドをトランスフェクションすることができ；組換えAAVウイルスは共トランスフェクション後様々な時点で回収することができる。例えば、組換えAAVウイルスは共トランスフェクション後、約12時間、約24時間、約36時間、約48時間、約72時間、約96時間、約120時間、又はこれらの2つの時点のいずれかの間の時間で回収することができる。 
【０１１９】
また、組換えAAVは、感染性組換えAAVの生産に好適な当該技術分野で公知の任意の従来法を使用して生産することができる。いくつかの例において、組換えAAVは、 AAV粒子の生産に必要な構成要素の一部を安定発現する昆虫又は哺乳動物細胞を使用することにより生産することができる。例えば、AAV rep及びcap遺伝子、及びネオマイシン抵抗性遺伝子などの選択可能なマーカーを含むプラスミド（又は複数のプラスミド）を、細胞のゲノムに統合することができる。続いて、昆虫又は哺乳動物細胞に、ヘルパーウイルス（例えば、ヘルパー機能を提供するアデノウイルス又はバキュロウイルス）並びに5'及び3' AAV ITR（及び所望する場合は異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列）を含むウイルスベクターを共感染させることができる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、組換えAAVの大規模生産に適していることである。別の非限定的な例として、プラスミドではなくアデノウイルス又はバキュロウイルスを使用して、rep及びcap遺伝子をパッケージング細胞に導入することができる。さらに別の非限定的な例として、5'及び3' AAV LTR並びにrep-cap遺伝子を含むウイルスベクターの両方を、プロデューサー細胞のDNAに安定的に統合することができ、ヘルパー機能を野生型アデノウイルスによって提供して組換えAAVを生産することができる。 
【０１２０】
（AAVの生産において使用する細胞種） 
本発明のAAVベクターを含むウイルス粒子は、AAV又は生物学的産物の生産を可能とし、培養物中で維持することができる任意の無脊椎動物細胞種を使用して生産し得る。例えば、使用する昆虫細胞株は、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）由来、例えばSf9、SF21、SF900＋とすることができ、ショウジョウバエ（drosophila）細胞株、カ細胞株、例えばヒトスジシマカ（Aedes albopictus）由来の細胞株、飼育カイコ細胞株、例えばカイコ細胞株、キンウワバ（Trichoplusia ni）細胞株、例えばHigh Five細胞、又はチョウ目（Lepidoptera）細胞株、例えばブラックウィッチ（Ascalapha odorata）細胞株とすることができる。好ましい昆虫細胞は、High Five、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf900＋、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、Hz2E5 and Ao38を含む、バキュロウイルス感染の影響を受けやすい昆虫種由来の細胞である。
【０１２１】
バキュロウイルスは節足動物のエンベロープ型DNAウイルスであり、そのうちの2つのメンバーが細胞培養中で組換えタンパク質を生産するための周知されている発現ベクターである。バキュロウイルスは、操作することにより特定の細胞に大きなゲノム内容物を送達することが可能となる、環状二本鎖ゲノム（80-200 kbp）を有する。ベクターとして使用されるウイルスは、一般にオートグラファ・カリフォルニカ多キャプシド核多角体病ウイルス（AcMNPV）又はカイコ（Bm-NPV）である（Katoらの文献、2010）。
【０１２２】
バキュロウイルスは一般的に、組換えタンパク質の発現用の、昆虫細胞への感染に使用される。特に、昆虫における異種遺伝子の発現は、例えば米国特許第4,745,051号; Friesenらの文献(1986); EP 127,839; EP 155,476; Vlakらの文献(1988);Millerらの文献(1988); Carbonellらの文献(1988); Maedaらの文献(1985); Lebacq-Verheydenらの文献(1988); Smithらの文献(1985); Miyajimaらの文献(1987); 及びMartinらの文献(1988)に記載の通り達成することができる。タンパク質の生産に使用可能な多くのバキュロウイルス株及び変異株、並びに対応する許容性昆虫宿主細胞は、Luckowらの文献(1988)、Millerらの文献(1986);Maedaらの文献(1985)、及びMcKennaの文献(1989) に記載されている。 
【０１２３】
また本発明の別の態様において、本発明の方法は、AAVの複製又は生物学的産物の生産を可能とし、培養物中で維持することができる任意の哺乳動物細胞種を用いて実施する。使用する好ましい哺乳動物細胞は、HEK293、HeLa、CHO、NS0、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 1080、A549、Cos-7、ARPE-19、及びMRC-5細胞であり得る。
【０１２４】
（インビトロでの異種タンパク質の生産）
非限定的な例として、本明細書で開示する組換えAAVを使用して、インビトロで、例えば細胞培養中で関心対象とするタンパク質を生産することができる。非限定的な一例として、いくつかの実施態様において、インビトロで関心対象とするタンパク質を生産するための方法は、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えAAVを提供すること；及び組換えAAVを細胞培養物中の細胞と接触させることを含み、それにより組換えAAVが細胞中で関心対象とするタンパク質を発現する。関心対象とするタンパク質をコードするヌクレオチド配列のサイズは変化し得る。例えば、ヌクレオチド配列は少なくとも約1.4 kb、少なくとも約1.5 kb、少なくとも約1.6 kb、少なくとも約1.7 kb、少なくとも約1.8 kb、少なくとも約2.0 kb、少なくとも約2.2 kb、少なくとも約2.4 kb、少なくとも約2.6 kb、少なくとも約2.8 kb、少なくとも約3.0 kb、少なくとも約3.2 kb、少なくとも約3.4 kb、少なくとも約3.5 kb長、少なくとも約4.0 kb長、少なくとも約5.0 kb長、少なくとも約6.0 kb長、少なくとも約7.0 kb長、少なくとも約8.0 kb長、少なくとも約9.0 kb長、又は少なくとも約10.0 kb長であり得る。いくつかの実施態様において、ヌクレオチドは少なくとも約1.4 kb長である。
【０１２５】
（インビボでの異種タンパク質の生産）
本明細書で開示する組換えAAVを使用して、インビボで、例えば哺乳動物などの動物において関心対象とするタンパク質を生産することができる。いくつかの実施態様は、インビボで関心対象とするタンパク質を生産するための方法を提供し、ここで方法は、関心対象とするタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えAAVを提供すること；及び組換えAAVを対象に投与することを含み、それにより組換えAAVが対象において関心対象とするタンパク質を発現する。いくつかの実施態様において、対象は非ヒト哺乳動物、例えばサル、イヌ、ネコ、マウス、又はウシであり得る。関心対象とするタンパク質をコードするヌクレオチド配列のサイズは変化し得る。例えば、ヌクレオチド配列は少なくとも約1.4 kb、少なくとも約1.5 kb、少なくとも約1.6 kb、少なくとも約1.7 kb、少なくとも約1.8 kb、少なくとも約2.0 kb、少なくとも約2.2 kb、少なくとも約2.4 kb、少なくとも約2.6 kb、少なくとも約2.8 kb、少なくとも約3.0 kb、少なくとも約3.2 kb、少なくとも約3.4 kb、少なくとも約3.5 kb長、少なくとも約4.0 kb長、少なくとも約5.0 kb長、少なくとも約6.0 kb長、少なくとも約7.0 kb長、少なくとも約8.0 kb長、少なくとも約9.0 kb長、又は少なくとも約10.0 kb長であり得る。いくつかの実施態様において、ヌクレオチドは少なくとも約1.4 kb長である。 
【０１２６】
（治療用途）
記載された方法によって生産した組換えAAVを使用して、様々な疾患又は障害を治療するための１以上の治療用タンパク質を発現させることができる。疾患の非限定的な例には、癌、例えば癌、肉腫、白血病、リンパ腫；及び自己免疫性疾患、例えば多発性硬化症がある。非限定的な癌の例には、食道癌；肝細胞癌；基底細胞癌、扁平上皮癌（様々な組織）；移行上皮癌を含む膀胱癌；気管支原性肺癌；結腸癌；結腸直腸癌；胃癌；肺の小細胞癌及び非小細胞癌を含む肺癌；副腎皮質癌；甲状腺癌、膵癌；乳癌；卵巣癌；前立腺癌；腺癌；汗腺癌；皮脂腺癌；乳頭癌；乳頭腺癌；嚢胞腺癌；髄様癌；腎細胞癌；乳管内上皮内癌又は胆管癌；絨毛癌；セミノーマ；胎児癌；ウィルムス腫瘍；子宮頸癌；子宮癌；精巣癌；骨原性癌；上皮癌；及び鼻咽頭癌がある。肉腫の非限定的な例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨原性肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、及び他の軟組織肉腫がある。固形腫瘍の非限定的な例には、神経膠腫、星細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫がある。白血病の非限定的な例には、慢性骨髄増殖性症候群、急性骨髄性白血病、B細胞CLL、T細胞CLLを含む慢性リンパ球性白血病、前リンパ球性白血病、及びヘアリー細胞白血病；並びに急性リンパ芽球性白血病がある。リンパ腫の例には、これらに限定はされないが、B細胞リンパ腫、例えばバーキットリンパ腫；ホジキンリンパ腫などがある。本明細書で開示するAAVベクター、組換えウイルス、及び方法の使用により治療することができる疾患の他の非限定的な例には、鎌状赤血球貧血症、嚢胞性線維症、リソソーム酸性リパーゼ（LAL）欠損症1、テイ・サックス病、フェニルケトン尿症、ムコ多糖症、糖原病（GSD、例えばGSD I型、II型、III型、IV型、V型、VI型、VII型、VIII型、IX型、X型、XI型、XII型、XIII型、及びXIV型）、乳糖血症、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー）、及び血友病、例えば血友病A（古典的血友病）や血友病B（クリスマス病）、ウィルソン病、ファブリー病、ゴーシェ病、及び遺伝性血管性浮腫（HAE）、及びα1アンチトリプシン欠損症を含む、遺伝性障害がある。さらに、本明細書で開示するAAVベクター、組換えウイルス及び方法は、肝臓中の導入遺伝子の局所発現又は肝臓若しくは肝細胞からの分泌タンパク質の発現により治療可能な他の障害に対して使用することができる。
【０１２７】
対象（例えば、対象の血清）において発現する異種タンパク質の量は変化し得る。例えば、いくつかの実施態様において、タンパク質を少なくとも約9 μg/ml、少なくとも約10 μg/ml、少なくとも約50 μg/ml、少なくとも約100 μg/ml、少なくとも約200 μg/ml、少なくとも約300 μg/ml、少なくとも約400 μg/ml、少なくとも約500 μg/ml、少なくとも約600 μg/ml、少なくとも約700 μg/ml、少なくとも約800 μg/ml、少なくとも約900 μg/ml、又は少なくとも約1000 μg/mlの量で対象の血清中に発現させることができる。いくつかの実施態様において、関心対象とするタンパク質は、約9 μg/ml、約10 μg/ml、約50 μg/ml、約100 μg/ml、約200 μg/ml、約300 μg/ml、約400 μg/ml、約500 μg/ml、約600 μg/ml、約700 μg/ml、約800 μg/ml、約900 μg/ml、約1000 μg/ml、約1500 μg/ml、約2000 μg/ml、約2500 μg/ml、又はこれらの値のいずれか2つの間の範囲の量で対象の血清中に発現させる。当業者であれば、関心対象とするタンパク質について方法が効果的となるために必要とされる発現レベルは、非限定的な因子、例えば対象とする特定のタンパク質及び治療を受ける対象によって異なり得ること、及びタンパク質の有効量は、当該技術分野で公知の従来法を使用して、過度の実験を要さずに当業者により容易に決定され得ることを理解するだろう。 
【実施例】
【０１２８】
（実施例） 
（実施例1）
（新規の天然に存在するキャプシドタンパク質の単離）
新規の天然に存在するキャプシドタンパク質はヒヒ肝臓から単離した。凍結肝臓組織を、Texas Biomedical又はニューイングランド霊長類研究センター（the New England Primate Research Center）から得た。ゲノムDNAを、DNeasy血液・組織キット（Qiagenカタログ#69504）を用いて、肝臓組織から調製した。
【０１２９】
以下のプライマー：プライマーrep-1397-F
【化１５】
2021522842.tif 000019
及びプライマーcap-2872-R
【化１６】
2021522842.tif 000020
を、以下の条件：初期インキュベーション：97℃、120秒、変性ステップ：97℃、15秒、アニーリングステップ：58℃、60℃、又は62℃、15秒、伸長ステップ：72℃、240秒を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）をゲノムDNAに対して実施した。変性、アニーリング、及び伸長ステップは、35サイクルにわたり実施した。その後、反応を72℃で7分インキュベートし、解析まで4℃で保存した。PCR産物は1%アガロースゲル上での電気泳動により分離し、製造業者の指示書に従ってゲル抽出キット（Qiagenカタログ#28704）を使用して単離し、かつpCR4-TOPO-TA（Invitrogenカタログ#450030）にクローニングした。大腸菌（E. coli）NEB5α細胞への形質転換後、アンピシリン抵抗性コロニーからDNAを調製し、両端から配列決定して、インサートがAAV関連配列にコードされている否かを決定した。
【０１３０】
pCR4-TOPO TA中のインサートがAAV配列に関連している場合、配列特異的プライマーを配列のrep部分に設計し、完全なキャプシド遺伝子を取得するために、「エピソーム周囲PCR」（以下「ATE PCR」）を実施した。ATE PCRは、持続性AAVゲノムが動物組織中で環状エピソームを形成するという概念に基づく。したがって、rep遺伝子中の配列に対応する「発散」プライマーセットを使用してポリメラーゼ連鎖反応を実施し、そのエピソーム中に存在し得る任意のAAV配列のほとんど又は全てを単離することができるが、特に連続した完全なキャプシド遺伝子を単離することができる。例えば相同組換えにより、エピソームのマルチマーが形成される場合があり、その場合、単一のATE PCR反応から（通常は同じでない）複数のキャプシド遺伝子を単離することが可能となる。
【０１３１】
標準的ポリメラーゼ連鎖反応装置でのATE PCRを、以下の2ステッププログラム：初期インキュベーション：95℃、240秒、変性ステップ：97℃、30秒、アニーリング/伸長ステップ：72℃、300秒を使用して、実施した。変性及び組み合わせたアニーリング/伸長ステップは、40サイクルにわたり実施した。その後、反応を72℃で7分インキュベートし、解析まで4℃で保存した。PCR産物を1%アガロースゲル上で電気泳動した。AAVゲノム（約4.5キロベース）のマルチマーの長さを示すPCR産物をゲルから切り出し、製造業者の指示書に従ってQIAquickゲル抽出キット（Qiagenカタログ#28704）を用いて精製し、pCR4-TOPO-TA（Invitrogenカタログ#450030）にクローニングした。大腸菌NEB5α細胞への形質転換後、アンピシリン抵抗性コロニーからDNAを調製し、インサート全体の配列を決定した。
【０１３２】
上記2ステッププログラムにより正しいサイズのPCR産物が生産されなかった場合は、以下の3ステッププログラム：初期インキュベーション：95℃、240秒、変性ステップ：95℃、30秒、アニーリングステップ：62℃、64℃、66℃、又は68℃、30秒、伸長ステップ：72℃、300秒を使用した。変性、アニーリング、及び伸長ステップは、40サイクルにわたり実施した。その後、反応を72℃で7分インキュベートし、上記の通り解析まで4℃で保存した。
【０１３３】
pCR4-TOPO TA中の完全なインサート配列が決定されたら、BLASTアルゴリズム（NCBIウェブサイトで入手可能）を使用してAAVキャプシド遺伝子であることを特定した。それらの既知のAAVとの関係を、Clustal Omega（EBIウェブサイトで入手可能）又はVector NTI（Invitrogen、Inc.）などの様々なヌクレオチド又はアミノ酸配列アラインメントプログラムを使用して決定した。
【０１３４】
AAVを生産するために、特有のAAVキャプシド遺伝子を発現プラスミド（pAAV-RC；Agilent、Inc.）にサブクローニングし、続いて293細胞にベクター（pAAVルシフェラーゼ）及びアデノウイルスヘルパープラスミド（pHELPER；Agilent、Inc.）とともにトランスフェクションした。AAVの生産を3日間にわたり行わせ、続いて細胞を3回凍結融解することにより粗溶解物を作製した。残渣をペレット化し、上清（粗製AAV）中の力価をQ-PCRにより測定してゲノム力価（キャプシドが組み立てられDNAパッケージングすることができることを確認する）を決定し、続いてこれを使用して様々な細胞でのAAVによる形質導入を評価した。
【０１３５】
同定された新規哺乳動物組織由来AAVキャプシドタンパク質のVP1アミノ酸配列を本明細書では配列番号:1-7と記載する。また、関連するVP2及びVP3領域の位置を本明細書に記載する。本発明は、(i)配列番号:1-7のVP1キャプシド配列のいずれか、又は配列番号:1-7のキャプシド配列のいずれかのVP2若しくはVP3領域と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%の配列一致を有する単離AAVキャプシドタンパク質、あるいは(ii)配列番号:1-7のVP1キャプシド配列のいずれか、又は配列番号:1-7のキャプシド配列のいずれかのVP2若しくはVP3領域を含む、又はそれらからなる単離AAVキャプシドタンパク質を対象とする。本発明はまた、上記のAAVキャプシドタンパク質のいずれかを含むAAV粒子を対象とし、AAV粒子は、（i）AAV逆向き末端反復配列及び宿主細胞中で異種遺伝子の発現を導く調節配列と作用可能に連結された異種遺伝子を含む導入遺伝子を有する核酸、又は（ii）宿主細胞中で異種遺伝子の発現を制御する調節配列と作用可能に連結された異種遺伝子を含む核酸をさらに含む。 
【０１３６】
また、ヒト血清中の抗体による本発明の新規AAV粒子の中和について調べた。HEK293T細胞を、密度5×104細胞/ウェルで播種し、一晩インキュベートした。精製rAAVを希釈して最終力価2×106 vg/uLとし、IVIGの連続希釈物（0〜10 mg/mL）と1時間混合した。組換えAAVをMOI 1000を使用してHEK293T細胞に加え、37℃でインキュベートした。感染から72時間後、IVIGによる中和を相対的ルシフェラーゼユニット（RLU）読取値に基づいて解析した。本試験ではエトポシドは使用しなかった。結果を表3で提供する。予想通り、AAV2による形質導入（陽性対照）はヒトIVIGの追加により無効化された（データは示さない）。 対照的に、試験した特定の新規AAVは、IVIG抵抗性を示した。
表3：IVIG中和データ：
【表４】
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【０１３７】
さらに、表3に列記したキャプシドを有する組換えAAV粒子（「新規キャプシド」と表記）の中和を対照キャプシド：AAV5、AAV8、及びAAV9を有する組換えAAV粒子の中和と比較するため、IVIG中和アッセイを繰り返した。図2に示すように、本明細書で開示するキャプシドを有するAAVは、IVIG抵抗性を示した。
【０１３８】
本明細書で開示するAAVキャプシドの組織特異的感染力を決定するため、キャプシドの各々を含み、かつルシフェラーゼ導入遺伝子を発現するAAVを作製した（AAV-RSV-egfp-T2A-Fluc2）。雄性Balb/CマウスをCharles River Breeding Laboratoriesから購入した。8週齢マウスの尾静脈に2×1013 vg/kgの用量のAAV-RSV-egfp-T2A-Fluc2ベクターを注射した。注射から3及び5週間後、インビボ生物発光イメージングを、インビボイメージング装置（PerkinElmer Inc., Waltham, MAから入手したIVIS Lumina LT）を使用して実施した。簡潔に説明すると、マウスを2%イソフルラン及び酸素で麻酔した。150 μlの30 mg/ml RediJect D-ルシフェリン生物発光基質を腹腔内に注射した。基質注入から10分後、冷却電荷結合素子（CCD）カメラを使用して、動物をインビボイメージング装置でイメージングした。画像は動物の背側位置で撮影した。イソフルラン-酸素の送達による麻酔は、耐光性イメージングチャンバ内でのイメージングセッションの全体を通じて維持した。
【０１３９】
マウスをAAVの注射後5週間でのイメージングセッションの後に屠殺した。様々な臓器を収集し、イメージング装置を使用してイメージングした。測定条件は、インビボイメージングに使用した条件と同じとした。イメージングのために、動物のグレースケール写真を取得し、続いて生物発光画像を取得した。画像データを、ライブイメージングソフトウェアバージョン4.5.2（PerkinsElmer、 Waltham、MA）を使用して処理及び解析した。各動物並びに個々の臓器の周囲の対象領域（ROI）をトレースし、ルシフェラーゼ活性によって放出される総流束（TF）（光子/秒）を定量化した。総流束活性は、各臓器系へのAAV感染力の尺度であり、各AAVキャプシドについて図1に示す。データは、新規キャプシドが肝細胞への高度の特異性を有する組換えAAVを生産することを実証する。
【０１４０】
上記の追加実験は、本明細書で開示する以下のキャプシドを有するAAVを用いて実施し（Bba.45、Bba.46、Bba.47、Bba.49、Bba.50、及びBba.51）、かつ形質導入率を以下の対照キャプシド：AAV5、AAV8、及びAAV9を有するAAVと比較した。図3に示すように、新規キャプシドを有するAAVは、AAV5又はAAV12由来のキャプシドを有するAAVと比較して、形質導入効率の増加を示す。例えば、新規キャプシドは、AAV5キャプシドを有するAAVと比較して、形質導入効率が1〜4割（10-40% fold）増加している。さらに、図4は、新規キャプシドを有するAAVが、AAV5と比較して肝細胞に対して有意に高度の特異性を有することを実証する。さらに、新規キャプシドを有するAAVは、AAV8又はAAV9キャプシドを有するAAVについて観察される形質導入率と同程度の肝細胞への形質導入率を示した。 
【０１４１】
（実施例2）
（天然に存在する新規キャプシドタンパク質の生体分布及び活性の評価）
本明細書で開示するAAVキャプシドの生体分布及び活性を評価するために、ApoE-hAATプロモーター下でキャプシド、絨毛性ゴナドトロピンサブユニットβ（cyno-CG-Beta）導入遺伝子を含むAAV（AAV-ApoE-hAAT-Cyno-CG-Beta）を作製した。雄性C57BL/6JマウスはJackson Laboratoriesから購入した。8週齢マウスの尾静脈に2×1013 vg/kgの用量のAAV-ApoE-hAAT-Cyno-CG-Betaを注射した。本試験は、以下のキャプシドタンパク質：Bba-45、Bba-46、Bba-47、Bba-49、Bba-50（総称して「新規キャプシド」と表記する）及びAAV5、AAV8、AAV-Rh10、及びAAV-anc80L65（総称して「対照キャプシド」と表記する）を有するAAVを用いて実施した。 ビヒクル対照は、AAVベクターを加えずに投与した。
【０１４２】
注射から5週間後、質量分析法を用いてbCGタンパク質の血漿レベルを測定することにより、cyno-CG導入遺伝子の発現を評価した。図5に示すように、新規キャプシドを有するAAVは、AAV5キャプシドを有するAAVの発現と同程度のレベルで導入遺伝子を発現する。しかしながら、肝臓中のbCGタンパク質の発現は、AAV5キャプシドを有するAAVを注射したマウスと比較して、新規キャプシドを有するAAVを注射したマウスにおいて増加した（図6）。新規キャプシドを有するAAVを注射したマウスの肝臓中のcyno-CG導入遺伝子のDNA及びRNAコピーの数は、AAV5キャプシドを有するAAVを注射したマウスとは顕著に異なっていなかった（図7A-7C）。DNA及びRNAデータはbCGタンパク質データとよく相関する（図8A-8Bを参照されたい）。
【０１４３】
新規キャプシドBba-45〜Bba-50は、対照キャプシド（AAV5、AAV8、AAV-Rh10、AAV-anc80L65）と比較して、有意に高い形質導入率又は転写レベルを導かない。しかしながら、全ての新規キャプシドを比較すると、Bba-49は最高の転写物及び形質導入レベルを達成した。Bba-49キャプシドはAAV5キャプシドと比較して約2倍高い転写物レベル（RNA）を達成したが、この差は有意ではない（図7B）。Bba-49のAAV5に対する比は、表4に記載されている：
（表4）
【表５】
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【０１４４】
肝細胞中の導入遺伝子bCGの発現は、免疫組織化学を用いて評価した。全ての新規キャプシドは、AAV5キャプシドよりbCGを発現する肝細胞のパーセンテージを高めた。さらに、新規キャプシドを有するAAVによる肝細胞への形質導入率は、対照キャプシドとするAAV8、AAV-Rh10、及びAAV-anc80L65と同程度であった（図9及び10）。 
【０１４５】
Bba-49キャプシド、ApoE-hAATプロモーター、アラニングリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（AGXT）導入遺伝子を含むAAVを作製した。AAV-AGXTの1E14 vg/kgの用量を3〜4週齢AGXT/-/- C57BL/6J雄性マウスの尾静脈に注射した。肝細胞の形質導入は、様々な供給源に由来するAAV5キャプシドを有するAAVと比較した。肝細胞中の導入遺伝子AGXTの発現は、免疫組織化学を用いて評価した。図11に示すように、Bba-49キャプシドは、試験したAAV5キャプシドよりも高いパーセンテージのAGXT発現肝細胞を生じた。AAV.Bba-49.AGXTにより、肝細胞の約96%が形質導入された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年3月17日(2021.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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