(57)【要約】  本発明は、５’から３’方向に、Ｘｒｎ１エキソリボヌクレアーゼに耐性のある少なくとも１コピーのＧＵＣＡＧＲＹＣ（Ｎ７−１９）ＧＣＣＡ（Ｎ１２−１９）ＵＧＣＮＲＹＣＵＧコンセンサス配列、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）ＲＮＡ配列のコピー、およびオープンリーディングフレームを含んでなり、そのイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）転写合成のコストが大幅に低減される、キャップ分子を欠くメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’から３’方向に：
−少なくとも１コピーのＧＵＣＡＧＲＹＣ（Ｎ７−１９）ＧＣＣＡ（Ｎ１２−１９）ＵＧＣＮＲＹＣＵＧ（ｘｒＲＮＡ）コンセンサス配列を含んでなる５’−ＵＴＲ領域；
−内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）ＲＮＡ配列のコピー；および
−オープンリーディングフレーム
を含んでなる、キャップ分子を欠くメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子。
【請求項２】
２コピーのｘｒＲＮＡを含んでなる、請求項１に記載のｍＲＮＡ分子。
【請求項３】
配列番号１〜４４の少なくとも１つの配列番号を含んでなる、好ましくは、配列番号１１および配列番号２６を含んでなる、請求項１または２に記載のｍＲＮＡ分子。
【請求項４】
脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）のＩＲＥＳ配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ分子。
【請求項５】
好ましくは配列番号８７のステム−ループを含んでなり、前記ステム−ループは５’−ＵＴＲ領域の５’末端に位置する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ分子。
【請求項６】
配列番号６４の配列を有するアプタマーＡおよび配列番号６６の配列を有するアプタマーＣから選択される少なくとも１つのアプタマーを含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ分子。
【請求項７】
請求項６のアプタマーＡを含んでなるｍＲＮＡ分子であって、前記ｍＲＮＡ分子は、ポリヒスチジンタグと融合された細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）に結合し、前記ＣＰＰは好ましくは配列番号７５の配列を有するＭ１２−Ｈ６、配列番号７６の配列を有するＣＰＰ１−Ｈ６、配列番号７７の配列を有するＣＰＰ２−Ｈ６、および配列番号７８の配列を有するＣＰＰ３−Ｈ６から選択される、ｍＲＮＡ分子。
【請求項８】
オープンリーディングフレームがＨＲＶ２ウイルスの２Ａｐｒｏタンパク質をコードする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ分子。
【請求項９】
好ましくは、
−配列番号４６により表される配列を含んでなる、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター；
−配列番号５０、７１、７２、７３、８５、または８６により表される配列を含んでなる５’−ＵＴＲ領域；
−オープンリーディングフレーム；および
−配列番号５３、５４、５５、および５６により表される配列から選択される配列を含んでなる３’−ＵＴＲ領域
を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のｍＲＮＡをコードする配列を含んでなるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ分子または請求項９に記載のＤＮＡを含んでなるベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載のＤＮＡ分子を少なくとも１種類のＲＮＡポリメラーゼと接触させることを含んでなる、少なくとも１種類のｍＲＮＡのイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）生産方法。
【請求項１２】
前記ｍＲＮＡを精製する工程を含んでなる、請求項１１に記載の生産方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のｍＲＮＡと生理学的に許容される賦形剤および／またはアジュバントとを含んでなる、薬学上許容される組成物。
【請求項１４】
遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種において使用するための請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の第２のｍＲＮＡ分子を含んでなり、オープンリーディングフレームが２Ａｐｒｏタンパク質をコードする、請求項１３または１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リボ核酸の分野、より詳しくは、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）のイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）合成、その安定性および特にトランスフェクト細胞におけるポリペプチドへのその翻訳に関する。
【背景技術】
【０００２】
緒論
ｍＲＮＡは、工業規模でのポリペプチドの生産において不可欠な分子である。その安定性ならびにその転写および翻訳の効率は、下流のポリペプチドの収量、従ってそれらのコストに多大な影響を及ぼす。
【０００３】
ｍＲＮＡはまた、遺伝子療法および遺伝子ワクチン接種で使用される医薬組成物において選択される分子である。実際には、ＤＮＡ分子とは対照的に、トランスフェクト細胞のゲノムへのｍＲＮＡ分子の組込みはこれまでに実証されたことはない。しかしながら、ｍＲＮＡ分子はリボヌクレアーゼによる分解を受けやすいので、溶液中でのその安定性は低い。従って、最適な治療効力に必要とされるｍＲＮＡの量を低減し、従ってそれらのコストを低減するためにはイン・ビトロおよびイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で安定なＲＮＡ分子の合成が重要である。さらに、より少量のより安定なｍＲＮＡを使用することで治療に関連する副作用のリスクも減る。
【０００４】
イン・ビボ合成は、酵母または細菌などの培養細胞で行われる。しかしながら、この方法には多くの欠点がある。対象とする無傷のｍＲＮＡの精製は、特に、分解の問題と他の細胞ＲＮＡの存在のために高価であり、複雑となる。この方法で生成するものは一般に、イン・ビトロ転写によって得られるものよりも低収量である。
【０００５】
結果として、慣用される大規模ｍＲＮＡ合成法は、無細胞イン・ビトロ転写系である。この方法は、少数の精製化合物（すなわち、反応バッファー、遺伝子を含むＤＮＡ分子、組換えＲＮＡポリメラーゼおよび４種類のリボヌクレオチド三リン酸）を使用するだけで、生産されるＲＮＡは合成しようとするｍＲＮＡだけである。反応混合物中にＲＮアーゼが存在しないために、反応末端にｍＲＮＡ分解産物は存在しない。また、他のＲＮＡ種も存在せず、これが培養細胞によるｍＲＮＡ合成に優る主要な利点となる。従って、ｍＲＮＡの精製は大幅に簡略化される。
【０００６】
真核細胞におけるその安定性を確保するために、ｍＲＮＡはその５’末端に、エキソリボヌクレアーゼからそれを保護するキャップ分子を有する。このキャップは、２つのグアノシンがそれらの５’炭素で３つのリン酸基の鎖によって連結されたものから構成される複合分子である。末端のグアノシンは、グアニンの７位でメチル化されている。ｍＲＮＡは、Ｘｒｎ１エキソリボヌクレアーゼによって遂行される段階的な５’から３’への酵素分解に対するこのキャップの耐性によって安定化される。ｍＲＮＡの安定化におけるその役割に加え、キャップはリボソームの動員（Ｃｏｗｌｉｎｇ、２０１０）を含む他の機能も遂行する。そのために、キャップは翻訳開始因子の動員を始め、次にこの翻訳開始因子がリボソームを動員する。その後、このリボソームがｍＲＮＡをタンパク質へと翻訳する。
【０００７】
工業規模で、トランスフェクト細胞内でｍＲＮＡの安定性を高め、ｍＲＮＡのポリペプチドへの効率的な翻訳を可能とするためには、キャップ分子が５’末端に組み込まれなければならない。イン・ビトロ転写の際、キャップ分子は、転写後の段階で、ワクシニアウイルス由来の２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼなどのキャッピング酵素を用いて付加され得る（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５）。しかしながら、この付加工程は合成の複雑さを増し、キャッピング酵素の精製を要し、あまり効率的でない（Ｃｏｎｔｒｅａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）。さらに、この酵素は、水溶液中で不安定な分子であるＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンを必要とする。
【０００８】
イン・ビトロ転写を簡単にするために、従来技術においてキャップ類似体が開発されているが、しかしながら、これらは満足のいくものではない。一例として、Ｐ１−（５’−７−メチル−グアノシル）Ｐ３−（５’−（グアノシル））三リン酸）類似体またはＰ１−（５’−２，２，７−トリメチル−グアノシル）Ｐ３−（５’−（グアノシル））三リン酸）類似体を引用することができる。これらの類似体は、ファージＲＮＡポリメラーゼにより媒介される共転写キャッピングを可能とし、それにより、キャップ合成の追加工程をなくし、ｍＲＮＡの安定性も高め得る。しかしながら、類似体のタイプによって、組み込まれる５０％までの分子が逆配向を有し、７−メチルグアノシンヌクレオチドが末端の位置ではなくＲＮＡ分子に隣接し、従って、安定性およびｍＲＮＡ翻訳の効率が低下する（Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。これ以来、米国特許第７０７４５９６号に記載のものなど、「アンチリバース」型キャップ類似体（ＡＲＣＡ）が開発された。これらの類似体は、分子の逆組み込みを防ぐ。しかしながら、これらの類似体も、それらを使用するとイン・ビトロｍＲＮＡ合成の収量に実質的低下が起こるためやはり満足のいくものではない。さらに、キャップ分子およびその化学的に修飾された多くの類似体の合成は、これらの化合物の複雑さのために高価である。工業規模でのイン・ビトロ転写反応混合物にこれらの分子の１つを含めると、ｍＲＮＡ合成のコストが大幅に増す。
【０００９】
実際に、イン・ビトロ転写の際に高いキャッピング効率を確保するためには、キャップ類似体を過剰量で提供する必要があり、従って、原料の高コストの一因となる。実際に、各ｍＲＮＡ分子がキャップを有する機会を最大にするためには、ＧＴＰ分子当たりに４つのキャップ類似体分子という比率が推奨される。これにも関わらず、キャップを有するものは合成されるｍＲＮＡの８０％だけと推定される。さらに、ＧＴＰ濃度は、他の３種類のリボヌクレオチド三リン酸の５分の１となり、転写収量が５分の１となる。
【００１０】
イン・ビトロ転写の高いコストを低減する１つの方法は、この方法に使用されるＤＮＡおよび／またはＲＮＡポリメラーゼの生産コストを引き下げることである。しかしながら、得られたコスト低減はなお比較的小さい。あるいは、無細胞系でのイン・ビトロ転写により環状無キャップのｍＲＮＡを合成することも可能である（ＷＯ２０１４／１８６３３４Ａ１）。しかしながら、著者らは、トランスフェクト細胞において、環状ｍＲＮＡはキャップ付きの線状ｍＲＮＡよりも翻訳効率が低いことを示している（ＷＯ２０１４／１８６３３４Ａ１の例えば、図２および３ならびに段落［００１２１］および［００１３１］参照）。
【発明の概要】
【００１１】
結果として、高い安定性ならびに高い翻訳効率を有する、好ましくは、キャップ付きのｍＲＮＡ分子と少なくとも同等に高い安定性および翻訳効率を有するｍＲＮＡ分子がなお必要である。また、簡単な生産方法を持ち、製造コストが著しく低減されるＲＮＡ分子も必要である。
【００１２】
説明
本発明は、高い効率で翻訳され得る安定な無キャップｍＲＮＡ分子に関する。このｍＲＮＡは、その生産コストがキャップ分子またはその類似体を含んでなる従来のｍＲＮＡよりもずっと低いため特に有利である。本発明はまた、イン・ビトロ転写収量がキャップ分子またはその類似体を含んでなる従来のｍＲＮＡに比べて向上しているｍＲＮＡ分子に関する。実際に、本発明のｍＲＮＡはまた、その生産コストが著しく低減され、かつ／またはその合成収量が高まっているにもかかわらず、前記ｍＲＮＡは、培養細胞および組織にトランスフェクトする際に従来のキャップ付きのｍＲＮＡと少なくとも同等の効率であるため有利である。実際に、本発明者らは、極めて意外なことに、イン・ビボトランスフェクション後に得られる発現レベルおよび発現期間がキャップ付きのｍＲＮＡのものと少なくとも同等の高さであることを実証した。特に、Ｃａｃｏ−２細胞におけるリポータータンパク質の発現動態は、本発明のｍＲＮＡでトランスフェクトしても対照のキャップ付きのｍＲＮＡでトランスフェクトしても同じである（図２および３）。同様に、本発明者らは、極めて意外なことに、本発明のｍＲＮＡがイン・ビボにおいてマウスの真皮または筋肉にトランスフェクトされた場合に、リポータータンパク質の発現が、対照のキャップ付きのｍＲＮＡがトランスフェクトされた場合の２倍〜約１０倍であることを示した（図５および図１５）。しかしながら、この反応は、追加のキャッピング工程の必要がないため簡略化される。また、イン・ビトロ転写の際に反応混合物にキャップ類似体分子を含む必要もない。従って、本発明のｍＲＮＡ分子は、発現が少なくとも同等の高さである従来技術のｍＲＮＡに比べて、低いコストおよび容易な生産という点で明らかに有利である。
【００１３】
本願の目的において、用語「ｍＲＮＡ分子」は、いずれの直鎖リボヌクレオチドも意味する。本願において、これらの配列は、５’−ＵＴＲ領域で始まって５’から３’方向に表される。
【００１４】
「リボヌクレオチド」とは、いずれの天然リボヌクレオチド（例えば、グアニン、シチジン、ウリジン、アデノシン）、ならびにこれらのヌクレオチドの類似体ならびに化学的または生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化、アルキル化、アシル化、チオール化などによる）、インターカレートされた塩基、修飾されたリボース基および／または修飾されたリン酸基を有するヌクレオチドも意味する。
【００１５】
本発明者らは、意外にも、本明細書において、ｍＲＮＡ分子の５’末端のキャップが、フラビウイルス属のウイルスの３’−ＵＴＲ領域の由来するＸｒｎ１エキソリボヌクレアーゼ（ｘｒＲＮＡ）に耐性があり、好ましくは、オープンリーディングフレームにより内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を伴う少なくとも１コピーの配列で置換され得ることを示した。極めて有利には、このようなｍＲＮＡ分子のイン・ビトロ転写による生産コストは、キャップ付きのｍＲＮＡ分子の約３０分の１となり、その収量が向上する。さらに、本発明のｍＲＮＡ分子は、トランスフェクト細胞内で特に安定であり、しかも無キャップであっても効率的に翻訳される。
【００１６】
「キャップ」とは、ｍＲＮＡから転写された最初のヌクレオチドに５’−５’三リン酸結合により連結可能な７−メチルグアノシン（Ｎ７−メチルグアノシンまたはｍ７Ｇ）ヌクレオシドならびにその任意の突然変異体、変異体、類似体またはフラグメントを意味する。限定されるものではないが、キャップ類似体には、非メチル化類似体（例えば、Ｐ１−（グアノシル）Ｐ３−（５’−（グアノシル））三リン酸）、モノメチル化類似体（例えば、Ｐ１−（５’−７−メチル−グアノシル）Ｐ３−（５’−（グアノシル））三リン酸）、トリメチル化類似体（例えば、Ｐ１−（５’−２，２，７−トリメチル−グアノシル）Ｐ３−（５’−（グアノシル））三リン酸）、またはｍ７グアニン部分３’−ＯＨ基の３’−Ｏ−メチル基での置換を有する類似体（例えば、ＡＲＣＡ  Ｐ１−（５’−（３’−Ｏ−メチル）−７−メチル−グアノシル）Ｐ３−（５’−（グアノシル））三リン酸）が含まれる。
【００１７】
よって、第１の態様によれば、本発明は：
・少なくとも１コピーのＧＵＣＡＧＲＹＣ（Ｎ７−１９）ＧＣＣＡ（Ｎ１２−１９）ＵＧＣＮＲＹＣＵＧ（ｘｒＲＮＡ）コンセンサス配列を含んでなる５’−ＵＴＲ領域、
・少なくとも１コピーの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）ＲＮＡ配列；および
・少なくとも１つのオープンリーディングフレーム
を含んでなる、キャップ分子を欠くメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子に関する。
【００１８】
好ましくは、ＩＲＥＳ  ＲＮＡ配列は、各オープンリーディングフレームの上流に位置する。
【００１９】
好ましい実施形態によれば、本発明は、５’から３’方向に：
・少なくとも１コピーのＧＵＣＡＧＲＹＣ（Ｎ７−１９）ＧＣＣＡ（Ｎ１２−１９）ＵＧＣＮＲＹＣＵＧ（ｘｒＲＮＡ）コンセンサス配列を含んでなる５’−ＵＴＲ領域、
・内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）ＲＮＡ配列のコピー；および
・オープンリーディングフレーム
を含んでなる、キャップ分子を欠くメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子に関する。
【００２０】
好ましくは、ｍＲＮＡ分子はまた、３’−ＵＴＲ領域も含んでなる。
【００２１】
好ましくは、ｍＲＮＡ分子はまた、ｍＲＮＡ分子の細胞への、好ましくは、筋細胞への浸透を促進する少なくとも１つのＲＮＡアプタマーも含んでなる。このＲＮＡアプタマーは、直接またはペプチドを介して間接的に浸透を著しく促進し得る。
【００２２】
好ましくは、ｍＲＮＡ分子はさらに、５’末端にステム−ループを含んでなる。
【００２３】
好ましい実施形態では、本発明は、５’から３’方向に：
・少なくとも１コピーのＧＵＣＡＧＲＹＣ（Ｎ７−１９）ＧＣＣＡ（Ｎ１２−１９）ＵＧＣＮＲＹＣＵＧ（ｘｒＲＮＡ）コンセンサス配列を含んでなる５’−ＵＴＲ領域、
・内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）ＲＮＡ配列のコピー；および
・オープンリーディングフレーム
からなる、キャップ分子を欠くメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子に関する。
【００２４】
従来技術において、フラビウイルスの３’−ＵＴＲ非翻訳領域はＸｒｎ１を遮断し、従って、下流配列を保護する特性を有することが示されている（Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＲＮＡのこの領域は、それ自体で折り畳まれて、Ｘｒｎ１の進行および従ってウイルスサブゲノムＲＮＡの分解を阻害する複雑な三次元構造を形成する少なくとも１つの配列から構成される。しかしながら、このような配列は、これまでにはｍＲＮＡの５’側に挿入されたことはなかった。実際に、これらの配列はそれらの機能を遂行するためにフラビウイルスゲノムの３’−ＵＴＲと前後関係がある必要があると思われた。特に、これらの三次元構造は、フラビウイルス３’−ＵＴＲ領域の配列がもはや前後にない場合には正しく折り畳まれない可能性がある。
【００２５】
従来技術は、ｘｒＲＮＡ配列は翻訳を阻害することを示唆するが、本発明者らは、意外にも、キャップの保護機能および翻訳開始機能が、翻訳効率に影響を及ぼさずに、好ましくはＥＭＣＶウイルス由来の少なくとも１コピーのｘｒＲＮＡ配列および少なくとも１コピーのＩＲＥＳ配列に上手く置換できることを示した。意外にも、ｘｒＲＮＡ配列およびＩＲＥＳ配列の使用は、劇的に改善された翻訳効率を可能としさえする。
【００２６】
「フラビウイルス」とは、黄熱ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、ジカウイルス、日本脳炎ウイルス、ロシオウイルス、マレーバレーウイルス、バガザウイルス、ココベラウイルス、ウンタヤウイルス、ケドゥグウイルス、セピックウイルス、セントルイスウイルス、ウスツウイルス、アルファイウイルス、ウェッセルスブロンウイルス、イルヘウスウイルス、ブスクアラウイルス、テンブスウイルス、チャオヤンウイルス、ヨコセウイルス、ドウカンウイルスならびにフラビウイルス属の他のいずれかのウイルスを含む、フラビウイルス属のいずれのウイルスも意味する。
【００２７】
よって、本発明は、ｍＲＮＡの５’領域に少なくとも１コピーのｘｒＲＮＡ配列を含んでなる安定なｍＲＮＡ分子に関する。前記ｍＲＮＡは、キャップ付きの分子の場合と同等のレベルで同等の期間、効率的にタンパク質に翻訳される。本発明の好ましい実施形態によれば、ｍＲＮＡ分子は、２コピーのｘｒＲＮＡを含んでなる。
【００２８】
「Ｘｒｎ１に耐性のあるＲＮＡ配列」または「ｘｒＲＮＡ」とは、Ｘｒｎ１エキソリボヌクレアーゼによるｍＲＮＡの分解を低下、緩徐化または防止することを可能とするいずれのポリヌクレオチド配列も意味する。好ましくは、ｘｒＲＮＡ配列は、コンセンサス配列を含んでなる。
【００２９】
「コンセンサス配列」とは、５’−ＧＵＣＡＧＲＹＣ（Ｎ７−１９）ＧＣＣＡ（Ｎ１２−１９）ＵＧＣＮＲＹＣＵＧ−３’により表される配列を少なくとも含んでなるいずれの配列も意味し、ここで、各Ｎは独立にＡ、Ｃ、Ｔ、Ｇ、およびＵから選択されるヌクレオチドまたはその類似体を表し得る。各Ｒはプリンを表し、各Ｙはピリミジンを表す。保存されている塩基間のＮヌクレオチドの数は、示されているように、コンセンサス配列内で５’から３’方向に７〜１９塩基および１２〜１９塩基で可変である。前記配列は、ステム−ループ型の三次元構造を形成する。
【００３０】
好ましくは、ｍＲＮＡ分子は、配列番号１〜配列番号４４により表される配列から選択される少なくとも１コピーのｘｒＲＮＡ配列を含んでなる。ｍＲＮＡ分子が２コピー以上の前記配列を含んでなる場合、それらのコピーは同じであっても異なっていてもよい。よって、より好ましくは、ｍＲＮＡ分子は、配列番号１１および配列番号２６により表される配列の１つを少なくとも１コピー含んでなる。いっそうより好ましくは、ｍＲＮＡ分子は、配列番号１１により表される１コピーの配列および配列番号２６により表される１コピーの配列を含んでなる。
【００３１】
好ましくは、５’−ＵＴＲ領域に２つのｘｒＲＮＡ配列が存在する場合、それらはスペーサー配列により分離される。同様に、ｘｒＲＮＡ配列とＩＲＥＳ配列の間にスペーサー配列が存在してもよい。好ましくは、２つのｘｒＲＮＡ配列間のスペーサー配列は、配列番号４７に相当する。好ましくは、ｘｒＲＮＡ配列とＩＲＥＳ配列の間のスペーサー配列は、配列番号４８に相当する。ｍＲＮＡ分子が少なくとも２つのオープンリーディングフレームを含んでなる場合には、スペーサー配列は、２つのオープンリーディングフレーム間またはオープンリーディングフレームとＩＲＥＳ配列の間に存在することもできる。
【００３２】
「スペーサー配列」とは、前記ペーサー配列から上流の配列を下流配列から物理的に分離することを可能とするいずれの非コードポリヌクレオチド配列も意味する。本発明によるｍＲＮＡ分子は、特に、１以上のスペーサー配列を含んでなる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２〜３００ヌクレオチド長であり得る。好ましくは、スペーサー配列は、２〜１０ヌクレオチド、いっそうより好ましくは２〜５ヌクレオチドである。あるいは、スペーサー配列は、１０〜１５０ヌクレオチド、いっそうより好ましくは１５〜４０ヌクレオチドであり得る。好ましくは、スペーサー配列は、二次構造を形成しない。
【００３４】
本発明のｍＲＮＡはさらに、少なくとも１つの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）ＲＮＡ配列を含んでなる。
【００３５】
「内部リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」とは、ｍＲＮＡ分子の翻訳をキャップとは独立に開始させることを可能とするいずれのポリヌクレオチド配列も意味する。このような配列は、翻訳開始因子と直接相互作用し、この翻訳開始因子は次に翻訳開始コドンにリボソームを動員する。多くのＩＲＥＳ配列が知られている（Ｍｏｋｒｅｊｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。よって、当業者は、ＩＲＥＳとして機能する配列を同定し、本発明の実装形態に好適なものを選択することができる。よって、本発明によるＩＲＥＳ配列は、真核生物起源またはウイルス起源、例えば、ピコルナウイルス属由来のものであり得る。好ましくは、ＩＲＥＳ配列は、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｂｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５）またはヒトｅｌＦ４Ｇ  ｍＲＮＡ由来である。いっそうより好ましくは、ＩＲＥＳのＤＮＡ配列は、配列番号４５に相当する。
【００３６】
ＩＲＥＳ配列は通常、５’−ＵＴＲ領域に位置する。ＩＲＥＳ配列はまた、２つのオープンリーディングフレームの間に位置してもよく、これにより、単一のｍＲＮＡからバイシストロン性またはポリシストロン性の翻訳を開始させることが可能となる。好ましい実施形態では、本発明のｍＲＮＡは、前記ｍＲＮＡの５’領域に単一コピーのＩＲＥＳ配列を含んでなる。好ましい実施形態によれば、第２コピーのＩＲＥＳ配列は２つのオープンリーディングフレームの間に位置する。さらに別の好ましい実施形態によれば、本発明のｍＲＮＡは、５’領域に１コピーのＩＲＥＳ配列と２つのオープンリーディングフレームの間に１コピーのＩＲＥＳ配列を含んでなる。有利には、前記ＩＲＥＳ配列はｘｒＲＮＡ配列の下流に位置する。この構成は有利には、これらの配列をＸｒｎ１エキソリボヌクレアーゼから保護することを可能とする。ｍＲＮＡ分子が少なくとも２つのＩＲＥＳ配列を含んでなる場合、前記配列は同じであっても異なっていてもよい。特に、１以上のＩＲＥＳ配列は翻訳の開始におけるそれらの効率に応じて選択することができる。ｍＲＮＡ分子が少なくとも２つの異なるオープンリーディングフレームを含んでなり、第１のオープンリーディングフレームに望まれる翻訳効率が第２のオープンリーディングフレームに望まれる翻訳効率とは異なる場合には、２つの異なるＩＲＥＳ配列を選択することが特に有利である。
【００３７】
ＩＲＥＳエレメントもまた、複雑な三次元構造を有する。従って、ｘｒＲＮＡ配列とＩＲＥＳ配列の間の相互干渉が、これら２つの領域のそれぞれからのＲＮＡ配列間の対合の形成を介して可能となる。このような干渉は、それぞれｘｒＲＮＡ配列およびＩＲＥＳ配列の適正な構造の形成を妨げ得る。さらに、ｘｒＲＮＡ構造は、ＩＲＥＳによる翻訳開始因子およびリボソームの動員を著しく妨げ得る。いっそうより予測できないことに、本発明者らは、ｘｒＲＮＡ配列とＩＲＥＳ配列の存在がトランスフェクト細胞において、キャップ付きのｍＲＮＡ分子で得られるものと少なくとも同等のタンパク質発現収量を得ることを可能とすることを示した。従って、ｘｒＲＮＡ配列とＩＲＥＳ配列は一緒にキャップまたはキャップ類似体分子に取って代わることができる。これらの配列は、本発明のｍＲＮＡに含まれるオープンリーディングフレームの翻訳及びｍＲＮＡの安定性を確保するために不可欠である。
【００３８】
よって、トランスフェクト細胞において、本発明のｍＲＮＡは、キャップ付きのｍＲＮＡと少なくとも同等の安定であり、しかも少なくとも効率的に翻訳される。さらに、イン・ビトロ転写によるその合成のコストはキャップ付きのｍＲＮＡの場合に比べて大幅に低減される。
【００３９】
特定の実施形態によれば、本発明のｍＲＮＡは、コンセンサス配列ＧＵＣＡＧＲＹＣ（Ｎ７−１９）ＧＣＣＡ（Ｎ１２−１９）ＵＧＣＮＲＹＣＵＧ（ｘｒＲＮＡ）の上流の５’−ＵＴＲ領域に、好ましくは、ｍＲＮＡ分子の５’末端に、ステム−ループをさらに含んでなる。
【００４０】
「ステム−ループ」とは、一方の鎖の５’末端が、対合していないループを介してもう一方の鎖の３’末端に物理的に連結されている二重らせん型の構造を形成するいずれのポリヌクレオチド配列も意味する。従って、ステム−ループは、二本鎖ステムと対合していない一本鎖ループから構成される。前記の物理的結合は共有結合または非共有結合のいずれかであり得る。好ましくは、前記物理的結合は共有結合である。このＲＮＡループのサイズは、例えば、３〜３０ヌクレオチドであり得る。ループのサイズは好ましくは、少なくとも３ヌクレオチド、好ましくは少なくとも４ヌクレオチドである。二本鎖ステムの長さは、例えば５〜５０ヌクレオチドであり得る。ステムの長さは好ましくは、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２５、またはより好ましくは、５〜１０ヌクレオチドである。いっそうより好ましくは、ステムの長さは、６、７、または８ヌクレオチドである。
【００４１】
本発明に関して、ステム−ループは好ましくは、ｍＲＮＡ分子の５’末端に形成される。好ましい実施形態によれば、ステム−ループは、配列番号８７の配列を有する。ステム−ループは好ましくは、スペーサー配列によってｘｒＲＮＡ配列から分離される。好ましくは、前記スペーサー配列は、５ヌクレオチド以下（すなわち、５、４、３、または２ヌクレオチド）の長さである。実際に、本発明者らは、極めて意外なことに、ｍＲＮＡ分子の５’末端におけるステム−ループ構造の付加（本明細書では５’末端のステム−ループに関して５’−ＳＬとも呼ばれる）は、ｘｒＲＮＡ配列の近位（例えば５ヌクレオチド以下）にある場合に、イン・ビボ翻訳のさらなる向上を可能とすることを示した。実際に、発明者らは、５’末端に置かれたステム−ループがおよそ７０ヌクレオチドの長さのスペーサー配列によってｘｒＲＮＡ配列から分離されている場合には有利な効果を認めなかった（図１５参照）。
【００４２】
理論に縛られるものではないが、極めて意外なことに、ｘｒＲＮＡ配列は、少なくともこの配列がステム−ループの形態であり、近接している場合に、その５’末端をホスファターゼおよびＸｒｎ１からマスクすると推察することができる。
【００４３】
従って、好ましい実施形態では、本発明は、５’から３’方向に：
・少なくとも１コピーのＧＵＣＡＧＲＹＣ（Ｎ７−１９）ＧＣＣＡ（Ｎ１２−１９）ＵＧＣＮＲＹＣＵＧ（ｘｒＲＮＡ）コンセンサス配列を含んでなる５’−ＵＴＲ領域、
・内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）ＲＮＡ配列のコピー；および
・オープンリーディングフレーム
を含んでなり、さらに５’末端にステム−ループを含んでなる、キャップ分子を欠くメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子に関する。
【００４４】
ｍＲＮＡ分子は、第２のＩＲＥＳ配列とその後に第２のオープンリーディングフレームをさらに含んでなり得る。ｍＲＮＡ分子は、ステム−ループとｘｒＲＮＡ配列の間、好ましくはｘｒＲＮＡ配列とＩＲＥＳ配列の間に位置する、本明細書で定義されるようなＲＮＡアプタマーをさらに含んでなり得る。ｍＲＮＡ分子は、本明細書で定義されるような３’−ＵＴＲ領域をさらに含んでなり得る。
【００４５】
好ましい実施形態では、本発明は、５’から３’方向に：
・５’末端のステム−ループと、その後に少なくとも１コピーのＧＵＣＡＧＲＹＣ（Ｎ７−１９）ＧＣＣＡ（Ｎ１２−１９）ＵＧＣＮＲＹＣＵＧ（ｘｒＲＮＡ）コンセンサス配列を含んでなる５’−ＵＴＲ領域、
・場合により、ＲＮＡアプタマー；
・内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）ＲＮＡ配列のコピー；および
・オープンリーディングフレーム
を含んでなる、キャップ分子を欠くメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子に関する。
【００４６】
好ましい実施形態では、本発明は、５’から３’方向に：
・５’末端のステム−ループと、その後に少なくとも１コピーのＧＵＣＡＧＲＹＣ（Ｎ７−１９）ＧＣＣＡ（Ｎ１２−１９）ＵＧＣＮＲＹＣＵＧ（ｘｒＲＮＡ）コンセンサス配列を含んでなる５’−ＵＴＲ領域、
・場合により、ＲＮＡアプタマー；
・内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）ＲＮＡ配列のコピー；および
・オープンリーディングフレーム；および
・３’−ＵＴＲ領域
からなる、キャップ分子を欠くメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子に関する。
【００４７】
「アプタマー」とは、特にモノクローナル抗体と類似の特定の三次元構造を採るその能力に関連した認識および特異性の特性を有するいずれの核酸も意味する（例えば、Ｄｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７参照）。アプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／または修飾されたＲＮＡ、好ましくはＲＮＡから構成され得る。前記アプタマーは、上記で定義されるようなリボヌクレオチドなどの６〜５０ヌクレオチドから構成され得る。限定されない例として、アプタマーは、１回以上のイン・ビトロ選択サイクルによるかまたは反復選択法（「ＳＥＬＥＸ」技術）によるランダム配列の多数の化合物のコンビナトリアルライブラリーからのアプタマーのイン・ビトロ同定などの、当業者の周知の様々な技術に従って単離することができる。選択によるアプタマーのイン・ビトロ同定は有利には、前記アプタマーが対象とする標的を知る必要もなく、精密な効果または機能を有するアプタマーを得ることを可能とする。アプタマーの製造または選択は、例えば、欧州特許出願ＥＰ０５３３８３８に記載されている。有利には、ＲＮＡアプタマーは、本発明において、対象とする細胞、より詳しくは、組織細胞、好ましくは、筋細胞（例えば、筋線維細胞）に浸透するそれらの能力に従って同定されたものである。有利には、本発明によるアプタマーは、細胞膜、より好ましくは哺乳動物細胞の原形質膜および／またはエンドソーム膜を通過することができる。
【００４８】
本発明によるアプタマーは好ましくは、６〜５０ヌクレオチド、より好ましくは１０〜４５ヌクレオチド、２０〜４０ヌクレオチド、いっそうより好ましくは３０〜４０ヌクレオチドを含んでなる。好ましくは、アプタマーは、上記で定義されるものなどのリボヌクレオチドから構成される。好ましくは、本発明によるアプタマーは、配列番号６４の配列を有するアプタマーＡ、配列番号６５の配列を有するアプタマーＢ、または配列番号６６の配列を有するアプタマーＣと少なくとも７０％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、いっそうより好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。
【００４９】
本発明の記載に関して参照される同一性パーセンテージは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０のアルゴリズムなどの当業者に周知のいずれかのアルゴリズムを用いて、比較する配列のグローバルアラインメントに基づいて、すなわち、全長にわたって全体的に行った配列のアラインメントに対して決定される。この配列比較は、当業者に周知のいずれかのソフトウエア、例えば、１０．０に相当する「ギャップオープン」パラメーター、０．５に相当する「ギャップエクステンド」パラメーターおよびＢｌｏｓｕｍ  ６２マトリックスを用いるＮｅｅｄｌｅソフトウエアを用いて実行することができる。
【００５０】
好ましくは、本発明によるアプタマーは、配列番号６４の配列を有するアプタマーＡ、配列番号６５の配列を有するアプタマーＢ、および配列番号６６の配列を有するアプタマーＣから選択され、いっそうより好ましくは、配列番号６４の配列を有するアプタマーＡおよび配列番号６６の配列を有するアプタマーＣから選択される。
【００５１】
好ましくは、本発明によるｍＲＮＡ分子は、膜、好ましくは、哺乳動物原形質膜および／またはエンドソーム膜を通過することができる少なくとも１コピーのアプタマーを含んでなる。よって、有利には、本発明によるＲＮＡ分子がアプタマーを含んでなる場合、前記アプタマーは、細胞、好ましくは、筋細胞または皮膚細胞へのその浸透を促進する。好ましくは、本発明によるｍＲＮＡ分子は、少なくとも１コピーの配列番号６４の配列を有するアプタマーＡ、配列番号６５の配列を有するアプタマーＢ、および／または配列番号６６の配列を有するアプタマーＣを含んでなる。
【００５２】
ｍＲＮＡ分子の標的細胞への浸透を促進するアプタマーは、主として細胞のサイトゾルで起こる、エキソヌクレアーゼによる分解から必ずしも保護する必要はない。従って、特定の実施形態によれば、ｍＲＮＡ分子は、１以上のＧＵＣＡＧＲＹＣ（Ｎ７−１９）ＧＣＣＡ（Ｎ１２−１９）ＵＧＣＮＲＹＣＵＧ（ｘｒＲＮＡ）コンセンサス配列の上流の５’−ＵＴＲ領域にアプタマーを含んでなる。別の実施形態によれば、アプタマーは、１以上のＧＵＣＡＧＲＹＣ（Ｎ７−１９）ＧＣＣＡ（Ｎ１２−１９）ＵＧＣＮＲＹＣＵＧ（ｘｒＲＮＡ）コンセンサス配列の下流であって、ＩＲＥＳ配列およびオープンリーディングフレームから上流の５’−ＵＴＲ領域に位置する（これらの２つの可能性の代表的な図として図１Ｊおよび１Ｋを参照）。よって、好ましい実施形態によれば、本発明は、５’から３’方向に：
・好ましくは哺乳動物細胞の、細胞膜、好ましくは、原形質膜および／またはエンドソーム膜を通過することができる少なくとも１つのアプタマー、好ましくは、本明細書に記載のアプタマーＡ、Ｂ、およびＣから選択される少なくとも１つのアプタマーと、少なくとも１コピーのＧＵＣＡＧＲＹＣ（Ｎ７−１９）ＧＣＣＡ（Ｎ１２−１９）ＵＧＣＮＲＹＣＵＧ（ｘｒＲＮＡ）コンセンサス配列とを含んでなる５’−ＵＴＲ領域；
・内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）ＲＮＡ配列のコピー；および
・オープンリーディングフレーム
を含んでなる、キャップ分子を欠くメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子に関する。
【００５３】
好ましくは、ｍＲＮＡ分子は、ＧＵＣＡＧＲＹＣ（Ｎ７−１９）ＧＣＣＡ（Ｎ１２−１９）ＵＧＣＮＲＹＣＵＧ（ｘｒＲＮＡ）コンセンサス配列の上流の５’−ＵＴＲ領域にアプタマーを含んでなる（例えば、図１Ｆ参照）。しかしながら、ＲＮＡ分子はまた、ＧＵＣＡＧＲＹＣ（Ｎ７−１９）ＧＣＣＡ（Ｎ１２−１９）ＵＧＣＮＲＹＣＵＧ（ｘｒＲＮＡ）コンセンサス配列の下流、例えば、ｘｒＲＮＡコンセンサス配列とＩＲＥＳ配列の間にアプタマーを含んでなり得る。
【００５４】
よって、好ましい実施形態によれば、本発明は、５’から３’方向に：
・５’末端のステム−ループと、その後に少なくとも１コピーのＧＵＣＡＧＲＹＣ（Ｎ７−１９）ＧＣＣＡ（Ｎ１２−１９）ＵＧＣＮＲＹＣＵＧ（ｘｒＲＮＡ）コンセンサス配列を含んでなる５’−ＵＴＲ領域、
・細胞膜を通過することができる少なくとも１つのアプタマー；
・内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）ＲＮＡ配列のコピー；および
・オープンリーディングフレーム
を含んでなる、キャップ分子を欠くｍＲＮＡ分子に関する。
【００５５】
アプタマーＢおよびＣは筋線維細胞に浸透するそれらの能力に関して選択されたが、アプタマーＡはＴｓｕｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３により同定された「ｓｈｏｔ４７」アプタマーに相当する。アプタマーＡは有利には、ポリヒスチジン型ペプチドモチーフに高い親和性で結合する。よって、アプタマーＡは、ポリヒスチジンタグ（例えば、ＨＨＨＨＨＨモチーフ）を含んでなるいずれの分子（例えば、ペプチドまたはタンパク質）とも結合する。限定されない例として、本発明によるｍＲＮＡ分子は、「細胞浸透ペプチド」または「ＣＰＰ」（前記ＣＰＰはポリヒスチジンタグを含んでなる）などの、それが細胞により良く浸透することを可能とする分子にアプタマーＡを介して連結させることができる。
【００５６】
「細胞浸透ペプチド」または「ＣＰＰ」とは、哺乳動物細胞の細胞膜、より好ましくは、原形質膜およびエンドソーム膜を通過することができるいずれのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質も意味する。有利には、ＣＰＰは、それが別の分子、特に、ｍＲＮＡ分子に連結される場合にもこの特性を保持し、従って、そのｍＲＮＡ分子の膜通過を引き起こす。本発明に関しては、例えば、エネルギー依存性輸送機構（すなわち、能動的、例えば、エンドサイトーシス）およびエネルギー非依存性輸送機構（例えば、拡散）を含め、可能性のあるいずれの膜通過機構も企図される。一般に、ＣＰＰは陽イオンペプチドである（Ｐｏｉｌｌｏｔ  ａｎｄ  Ｄｅ  Ｗａａｒｄ，２０１１）。限定されない例として、ｍＲＮＡ分子は、その負電荷のために静電気的相互作用および／または疎水性を利用してＣＰＰに非共有結合的に結合され得る。あるいは、ｍＲＮＡ分子は、ＣＰＰに共有結合され得る。ＣＰＰは、少なくとも２つの同じまたは異なるペプチド分子からなるオリゴマーを形成し得る。本発明に関して、ＣＰＰは好ましくは、ＲＮＡアプタマーに非共有結合的に結合している。実際に、この種の結合は、ＣＰＰとｍＲＮＡ分子の単純な混合、その低コストおよびこれらの分子が完全に生分解性であるということによるその簡便性を考えれば有利である。実際に、非天然化学基および非生分解性化学基は必要でない。
【００５７】
本発明によるＣＰＰの長さは好ましくは、約８アミノ酸残基〜約６０アミノ酸残基である。より好ましくは、その長さは８〜４０アミノ酸残基、より好ましくは８〜３０アミノ酸残基、いっそうより好ましくは１０〜２５アミノ酸残基（例えば、１３または２０アミノ酸残基）である。しかしながら、当業者は、ＣＰＰの長さは上記のものに必ずしも限定されないことを認識するであろう。例えば異なる長さを有する、本明細書に記載のＣＰＰの誘導体が、特に、遺伝学的知識を考慮して当業者により作出できる。
【００５８】
限定されない例として、本発明のＣＰＰは、Ｇａｏ  Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１４により記載されているような「Ｍ１２」ＣＰＰ、Ｋａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７により記載されているような「ＣＰＰ２」または「ＣＰＰ３」ＣＰＰ、またはＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２により記載されているようなＣＰＰ「ＣＰＰ１」、ならびにこれらの任意の変異体または誘導体であり得る。好ましい実施形態によれば、前記ＣＰＰは、好ましくはスペーサーにより前記ＣＰＰに連結されたポリヒスチジンモチーフ（例えば、ヘキサヒスチジン）を含んでなる。好ましくは、スペーサーは、親水性スペーサー、有利には構造化されていないものおよび電荷を有さないもの、いっそうさらに有利にはグリシンおよびセリンから構成されるものである。好ましくは、スペーサーは、約２１アミノ酸、好ましくは２１アミノ酸の長さである。
【００５９】
好ましくは、本発明によるＣＰＰは、配列番号７５の配列を有するＭ１２−Ｈ６ペプチド、配列番号７６の配列を有するＣＰＰ１−Ｈ６ペプチド、配列番号７７の配列を有するＣＰＰ２−Ｈ６ペプチド、または配列番号７８の配列を有するＣＰＰ３−Ｈ６ペプチドと少なくとも７０％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、いっそうより好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。特定の好ましい実施形態によれば、本発明によるＣＰＰは、配列番号７５の配列を有するＭ１２−Ｈ６、配列番号７６の配列を有するＣＰＰ１−Ｈ６、配列番号７７の配列を有するＣＰＰ２−Ｈ６、および配列番号７８の配列を有するＣＰＰ３−Ｈ６から選択され、いっそうより好ましくは、配列番号７６の配列を有するＣＰＰ１−Ｈ６、配列番号７７の配列を有するＣＰＰ２−Ｈ６、および配列番号７８の配列を有するＣＰＰ３−Ｈ６から選択される。有利には、ＣＰＰは、ｍＲＮＡ分子に非共有結合的にまたは共有結合的に、好ましくは非共有結合的に連結される。有利には、ＣＰＰは、ｍＲＮＡ分子内に含まれるＲＮＡアプタマー（すなわち、ＣＰＰがポリヒスチジンタグを含んでなる場合にはアプタマーＡ）に連結される。
【００６０】
好ましくは、本発明のＣＰＰは、原形質膜を通過した後にそれらの標的細胞に対して有意な細胞傷害性効果および／または免疫原性効果を有さない、すなわち、ＣＰＰは細胞の生存力、細胞のトランスフェクションおよび／または浸透に干渉しない。用語「有意でない」は、本明細書で使用する場合、ＣＰＰに連結されたｍＲＮＡ分子が原形質膜を通過し、従って、細胞によるインターナリゼーションを受けた後に死滅する標的細胞は、５０％未満、好ましくは４０％または３０％未満、好ましくは２０％または１０％未満、特に５％未満であることを意味する。当業者は、所与の化合物の細胞傷害性および／またはそのような化合物が適用された標的細胞の生存率を決定するための方法に精通している（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１参照）。対応するアッセイキットは種々の供給者から市販されている。特定の実施形態では、本発明のＣＰＰの潜在的な固有の細胞傷害性効果および／または免疫原性効果は、例えば、化学合成または組換えＤＮＡの手段によりペプチドに１以上の修飾を導入することによって「マスク」することができる。このような修飾としては、例えば、官能基の付加、除去もしくは置換またはこれらの官能基の位置の変更を含み得る。当業者には、所与のペプチドに関してこのような「マスキング」がどのように達成され得るかは周知である。
【００６１】
よって、好ましい実施形態によれば、本発明は、５’から３’方向に：
・配列番号６４のアプタマーＡ  ＲＮＡおよび少なくとも１コピーのＧＵＣＡＧＲＹＣ（Ｎ７−１９）ＧＣＣＡ（Ｎ１２−１９）ＵＧＣＮＲＹＣＵＧ（ｘｒＲＮＡ）コンセンサス配列を少なくとも含んでなる５’−ＵＴＲ領域、
・内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）ＲＮＡ配列のコピー、および
・オープンリーディングフレーム
を含んでなり、前記ｍＲＮＡ分子はポリヒスチジンタグと融合された細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）に連結され、前記ＣＰＰは好ましくは配列番号７５の配列を有するＭ１２−Ｈ６、配列番号７６の配列を有するＣＰＰ１−Ｈ６、配列番号７７の配列を有するＣＰＰ２−Ｈ６、および配列番号７８の配列を有するＣＰＰ３−Ｈ６から選択される、キャップ分子を欠くｍＲＮＡ分子に関する。好ましくは、前記ＣＰＰは、アプタマーに非共有結合的に連結されている。
【００６２】
「オープンリーディングフレーム」とは、対象とするポリペプチドに翻訳され得るいずれのポリヌクレオチド配列も意味する。オープンリーディングフレームは、コドン（各コドンは１個のアミノ酸を表す）と呼ばれる３つの連続するヌクレオチドのブロックで読み取られる。翻訳の際、ポリペプチドは、前記オープンリーディングフレームのコドンをリボソームによって翻訳することにより合成される。
【００６３】
ポリペプチドの最初のアミノ酸は一般に、ｍＲＮＡ分子上に、オープンリーディングフレームの開始を示すＡＵＧコドンにより示されている。ＡＵＮまたはＮＵＧなどの他の開始コドンも知られており、ＮはＡ、Ｃ、ＵまたはＧに相当する。ポリペプチドの末端は、ｍＲＮＡ分子上にＵＡＡ、ＵＧＡ、またはＵＡＧ終止コドンの形で示されている。終止コドンは、ｍＲＮＡ分子上でオープンリーディングフレームの末端を示す。
【００６４】
本発明によるオープンリーディングフレームは、より詳しくは、トランスフェクト細胞内での翻訳がヒト医学または獣医学における適用に治療薬またはワクチンの対象となる産物を生成するオープンリーディングフレームである。好ましくは、治療薬の対象となる産物はタンパク質である。
【００６５】
治療薬の対象となるタンパク質のうち、あるものはより詳しくは、酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン：インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦなど（ＦＲ９２０３１２０）、増殖因子、神経伝達物質またはそれらの前駆体もしくは合成酵素、栄養因子：ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５など、アポリポタンパク質：ＡｐｏＡｌ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥなど（ＦＲ９３０５１２５）、ジストロフィンまたはミニジストロフィン（ＦＲ９１１１９４７）、腫瘍抑制タンパク質：ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖなど（ＦＲ９３０４７４５）、凝固関連因子：因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸなど、アポトーシス促進タンパク質：チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼなど、またはさらには天然もしくは人工免疫グロブリンの全てもしくは一部（Ｆａｂ、ＳｃＦｖなど、例えば、ＷＯ２０１１／０８９５２７参照）、ＲＮＡリガンド（ＷＯ９１／１９８１３）などを指し得る。
【００６６】
ｍＲＮＡによりコードされる対象とするタンパク質はまた、ワクチンの実現のためにヒトまたは動物で免疫応答を生じ得る抗原であってもよい。これらのタンパク質は、特に、エプスタイン・バーウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＥＰ１８５５７３）、偽狂犬病ウイルスに特異的な、またはさらには腫瘍に特異的な（ＥＰ２５９２１２）抗原タンパク質であり得る。最後に、対象とするタンパク質は、ワクチンの有効性を高めるために免疫応答を刺激するアジュバントタンパク質であり得る。
【００６７】
ｍＲＮＡによりコードされる対象とするタンパク質は、無キャップｍＲＮＡ分子または前記分子により発現されるタンパク質に対して有利な効果を有するタンパク質であり得る。この有利な効果は、種々の機構から得られるものであり得る。限定されない例として、無キャップｍＲＮＡによりコードされるタンパク質は、前記分子に結合することにより、またはＲＮアーゼ活性を有する少なくとも１つのタンパク質を分解することにより無キャップｍＲＮＡ分子の安定性を増強し得る。限定されない例として、無キャップｍＲＮＡによりコードされるタンパク質は、開始因子の動員を促進することにより、またはそれらの翻訳を阻害するためにキャップ付きの細胞内ｍＲＮＡと結合することにより、前記分子の翻訳を増強し得る。限定されない例として、ｍＲＮＡによりコードされる対象とするタンパク質は、ヒトライノウイルス２型（ＨＲＶ２）などのピコルナウイルス由来の２Ａｐｒｏタンパク質である。理論に縛られるものではないが、２Ａｐｒｏタンパク質は、ｅｌＦ４Ｇ開始因子のＮ末端を切断し、従って、前記開始因子がキャップ付きのｍＲＮＡを認識しないようにし、そのプロテアーゼ活性のために無キャップｍＲＮＡの発現を増強すると推測することができる。この切断は、イン・ビボにおける本発明のｍＲＮＡとキャップ付きのｍＲＮＡの間の競合の低減を可能とし得る。実際に、本発明者らは、意外にも、２Ａｐｒｏをコードする本発明による第１のｍＲＮＡとリポータータンパク質をコードする本発明による第２のｍＲＮＡでの細胞の同時トランスフェクションがそのリポータータンパク質の発現の増強を可能とすることを示した。従って、この２Ａｐｒｏタンパク質の存在は、本発明の無キャップｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の特異的発現の増強を可能とするため特に有利である（図７）。
【００６８】
好ましい実施形態によれば、本発明のｍＲＮＡは、２Ａｐｒｏタンパク質、好ましくはピコルナウイルス由来の、いっそうより好ましくはＨＲＶ２ウイルス由来の２Ａｐｒｏタンパク質をコードする。特定の実施形態によれば、２Ａｐｒｏタンパク質は、配列番号８１の配列を有する。特定の実施形態によれば、２Ａｐｒｏタンパク質は、配列番号８０の配列を有するｍＲＮＡによりコードされている。
【００６９】
オープンリーディングフレームはまた、治療ｍＲＮＡをコードしてもよい。これは、例えば、標的細胞内での発現が細胞のｍＲＮＡの転写または翻訳の制御を可能とするアンチセンス配列であり得る。このような配列は、特許ＥＰ１４０３０８に記載される技術に従い、例えば、標的細胞内で細胞のｍＲＮＡと相補的なＲＮＡに転写され、従って、それらのタンパク質への翻訳を遮断し得る。
【００７０】
好ましくは、本発明のｍＲＮＡは、ｘｒＲＮＡ配列およびＩＲＥＳ配列に加え、対象とするポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含んでなる。好ましくは、このオープンリーディングフレームは、ｘｒＲＮＡ配列の下流に位置する。当業者は、ｍＲＮＡが複数のオープンリーディングフレームを含み得ることを容易に理解するであろう。よって、ｍＲＮＡは、モノシストロン性、バイシストロン性またはポリシストロン性であり得る。ｍＲＮＡは、単一のオープンリーディングフレームしか持たない場合、モノシストロン性である。ｍＲＮＡは、２つのオープンリーディングフレームを含む場合にバイシストロン性であり、少なくとも２つのオープンリーディングフレームを含む場合にポリシストロン性である。
【００７１】
本発明のｍＲＮＡはまた、１以上の非コード領域も含み得る。これらの非コード領域は、特に、２つのオープンリーディングフレーム間の領域であり得る。この場合、ＩＲＥＳ配列は、有利には、２つのオープンリーディングフレーム間に位置するこれらの非コード領域に存在する。
【００７２】
特定の実施形態によれば、キャップまたはキャップ類似体分子を欠くメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子は、５’から３’方向に：
・少なくとも１コピーのＧＵＣＡＧＲＹＣ（Ｎ７−１９）ＧＣＣＡ（Ｎ１２−１９）ＵＧＣＮＲＹＣＵＧ（ｘｒＲＮＡ）コンセンサス配列を含んでなり、前記配列コピーの後に単一コピーの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）ＲＮＡ配列が続く５’−ＵＴＲ領域；
・オープンリーディングフレーム；および
・ポリ（Ａ）配列を含んでなる３’−ＵＴＲ領域
を含んでなる。
【００７３】
有利には、前記ｍＲＮＡ分子はまた、前記分子の標的細胞、好ましくは筋細胞への浸透を促進する少なくとも１つのＲＮＡアプタマーも含んでなる。有利には、前記ｍＲＮＡ分子は、配列番号６４の配列を有するアプタマーＡ、配列番号６５の配列を有するアプタマーＢ、および配列番号６６の配列を有するアプタマーＣから選択される少なくとも１つのアプタマーを含んでなる。
【００７４】
別の特定の実施形態によれば、キャップまたはキャップ類似体分子を欠くメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子は、５’から３’方向に：
・少なくとも１コピーのＧＵＣＡＧＲＹＣ（Ｎ７−１９）ＧＣＣＡ（Ｎ１２−１９）ＵＧＣＮＲＹＣＵＧ（ｘｒＲＮＡ）コンセンサス配列を含んでなり、前記配列コピーの後に単一コピーの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）ＲＮＡ配列が続く５’−ＵＴＲ領域；
・オープンリーディングフレーム；および
・ポリ（Ａ）配列を含んでなる３’−ＵＴＲ領域
からなる。
【００７５】
「５’−ＵＴＲ領域」とは、翻訳開始コドンの上流にある核酸のいずれの領域も意味する。この領域は非コードであるが、下流のｍＲＮＡ発現を調節するエレメントを含み得る。ｘｒＲＮＡエレメントおよびＩＲＥＳエレメントに加え、この領域はリボスイッチおよび／またはＴ−ボックスなどの他のエレメントを含んでよい。いくつかの実施形態では、５’−ＵＴＲ領域は、１０〜２０００ヌクレオチド長であり得る。好ましくは、５’−ＵＴＲ領域は、５０〜１５００ヌクレオチド、およびより好ましくは２００〜１０００ヌクレオチドを含んでなる。
【００７６】
「３’−ＵＴＲ領域」とは、翻訳終結コドンの下流に位置する核酸のいずれの領域も意味する。この領域は、ｍＲＮＡの発現および／または安定性、細胞内におけるその位置に影響を及ぼし得るか、またはタンパク質または低分子干渉ＲＮＡまたはマイクロＲＮＡのための結合部位を含み得る。この領域は、例えば、ポリアデニル化テール（ポリ（Ａ））、ヒストンステム−ループ構造、および／またはピリミジンもしくはプリンリッチな領域などのエレメントを含み得る。この領域は、コードまたは非コード配列を含み得る。いくつかの実施形態では、３’−ＵＴＲ領域は、５０〜５００ヌクレオチド長であり得る。好ましくは、３’−ＵＴＲ領域は、５０〜２００ヌクレオチド、より好ましくは５０〜１００ヌクレオチドから構成される。好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは、１０〜３００ヌクレオチド、好ましくは５０〜１００ヌクレオチドのアデニンまたはその類似体もしくは変異体のヌクレオチド配列を含んでなるポリアデニル化テール（ポリ（Ａ））を含んでなる。
【００７７】
第２の態様によれば、本発明は、本発明のｍＲＮＡ分子に転写され得るポリヌクレオチドを含んでなるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子に関する。好ましくは、ＤＮＡ分子は、配列番号５０、７１、７２、７３、８５、または８６の５’−ＵＴＲ領域を含んでなる。
【００７８】
好ましくは、前記ＤＮＡ分子は、発現カセットに含まれる。
【００７９】
「発現カセット」とは、本明細書において、例えばプロモーター配列およびエンハンサー配列などの遺伝子配列の発現を制御する１以上の調節エレメントに機能的に連結された対象とするポリヌクレオチド、例えば、本発明のｍＲＮＡ分子に転写され得るポリヌクレオチドを含んでなるＤＮＡ断片を意味する。
【００８０】
ポリヌクレオチドは、調節エレメントと、これらの異なる核酸配列が、一方の機能が他方に影響を受けるように単一の核酸断片上に組み合わせられる場合に「機能的に連結されている」。例えば、調節ＤＮＡ配列はＲＮＡまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列に、これらの２つの配列が、調節ＤＮＡ配列がＤＮＡコード配列の発現に影響を及ぼす（言い換えれば、ＤＮＡコード配列がプロモーターの転写制御下にある）ように配置されていれば、「機能的に連結されている」。コード配列は、センス配向ならびにアンチセンス配向に調節配列に機能的に連結することができる。好ましくは、本発明のコード配列は、センス配向に調節配列に機能的に連結される。
【００８１】
「調節配列」または「調節エレメント」とは、それらが連結されたコード配列の発現および成熟に影響を及ぼす必要のあるポリヌクレオチド配列を意味する。このような調節配列は、特に、転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡ成熟のシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（例えば、Ｋｏｚａｋ配列）；タンパク質の安定性を高める配列；および、必要に応じて、タンパク質分泌を高める配列を含む。
【００８２】
好ましくは、本発明の調節配列は、プロモーター配列を含んでなり、すなわち、本発明のｍＲＮＡをコードする遺伝子は好ましくは、前記の対応するｍＲＮＡの発現を可能とするプロモーターに機能的に連結される。本発明のｍＲＮＡをコードする遺伝子は、好ましくは、プロモーターの下流、すなわち、その３’側に位置する場合に、プロモーターに機能的に連結され、それにより、発現カセットを形成する。
【００８３】
用語「プロモーター」は、本明細書で使用する場合、ほとんどの場合にコード配列の上流（５’）に置かれる、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写に必要な他の因子により認識され、それにより前記コード配列の発現を制御するヌクレオチド配列を指す。「プロモーター」は、本明細書で使用する場合、特に、最小プロモーター、すなわち、ＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位の特定を可能とする他の配列から構成される短いＤＮＡ配列を含む。本発明の意味の範囲内で「プロモーター」は、最小プロモーターおよびコード配列の発現を制御し得る調節エレメントを含むヌクレオチド配列も含んでなる。例えば、本発明のプロモーター配列は、遺伝子の発現レベルに影響を及ぼし得るエンハンサー配列などの調節配列を含み得る。
【００８４】
有利には、本発明によるプロモーターは、無細胞転写系で使用されるＲＮＡポリメラーゼとともに機能するものである。例えば、ＳＰ６およびＴ７ファージのＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターは、当業者に広く知られている。よって、以下の実験の節では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターを有するｐＭＢｘ−ｌｕｃ２ベクター（Ｒｏｇｅ  ａｎｄ  Ｂｅｔｔｏｎ，２００５）を使用した。さらに、このようなプロモーターを含むベクターは市販されている。
【００８５】
特定の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの調節エレメントに機能的に連結された、本発明のｍＲＮＡをコードするＤＮＡ分子を含んでなる。好ましくは、本発明のｍＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は、上流に位置するプロモーター配列に機能的に連結され、それにより発現カセットを形成する。別の実施形態では、本発明は、上流に位置するプロモーター配列に機能的に連結された、本発明のｍＲＮＡをコードするＤＮＡ分子からなり、それにより発現カセットを形成する。
【００８６】
いっそうより好ましくは、本発明のＤＮＡ分子は：
・Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼにより認識され、配列番号４６により表される配列を含んでなるプロモーター；
・配列番号５０、７１、７２、７３、８５、または８６により表される配列を含んでなる５’−ＵＴＲ領域；
・オープンリーディングフレーム；および
・配列番号５３、５４、５５、および５６により表される配列から選択される配列を含んでなる３’−ＵＴＲ領域
を含んでなる。
【００８７】
有利には、本発明の調節配列は、転写ターミネーター配列を含んでなり、すなわち、本発明のｍＲＮＡをコードする遺伝子は好ましくは転写ターミネーターに機能的に連結されている。用語「転写ターミネーター」は、本明細書において、遺伝子またはオペロンのメッセンジャーＲＮＡへの転写の末端をマークするゲノム配列を表す。転写終結の機構は原核生物と真核生物とで異なる。当業者には、種々の細胞種に応じて使用するためのシグナルは既知である。例えば、本発明のｍＲＮＡを細菌で発現させようとする場合、Ｒｈｏ非依存性ターミネーター（逆方向反復配列とそれ続く一連のＴ（転写されたＲＮＡではウラシル））またはＲｈｏ依存性ターミネーター（Ｒｈｏタンパク質により認識されるコンセンサス配列から構成される）が使用される。本発明のｍＲＮＡをコードする遺伝子は好ましくは、それがターミネーターの上流、すなわち、その５’側に位置する場合に、ターミネーターに機能的に連結され、それにより、発現カセットを形成する。
【００８８】
有利には、本発明によるターミネーターは、無細胞転写系で使用されるＲＮＡポリメラーゼとともに機能するものである。例えば、ＳＰ６およびＴ７ファージのＲＮＡポリメラーゼにより認識されるターミネーターが当業者に広く知られている。このようなターミネーターを含むベクターは市販されている。
【００８９】
特定の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの調節エレメントおよび少なくとも１つの転写ターミネーターに機能的に連結された本発明のｍＲＮＡをコードするＤＮＡ分子を含んでなる。
【００９０】
第３の態様において、本発明はまた、少なくとも本発明によるＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子を含んでなるベクターに関する。
【００９１】
用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、それが連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子を指す。１つのタイプのベクターが「プラスミド」であり、これは付加的ＤＮＡセグメントが連結され得る一本鎖ＤＮＡの環状二重ループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、付加的ＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができる。あるいは、ウイルスベクターは、ウイルスゲノム（例えば、レトロウイルスまたはＲＮＡウイルス）内にｍＲＮＡを含んでなり得る。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞で自律的複製能を有する（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、組み込み哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、従って、宿主ゲノムとともに複製される。
【００９２】
真核生物または原核生物宿主細胞に導入し維持するために、対象とする核酸分子を挿入することができる多くのベクターが当業者に知られている。適当なベクターの選択は、このベクター（例えば、対象とする配列の複製、この配列の発現、染色体外形態でのこの配列の維持またはさらには宿主の染色体物質への組込み）、ならびに宿主細胞の性質（例えば、プラスミドは好ましくは細菌細胞に導入され、ＹＡＣは好ましくは酵母で使用される）に関して、意図される使用に依存する。これらの発現ベクターは、プラスミド、ＹＡＣ、コスミド、レトロウイルス、ＥＢＶに由来するエピソーム、および当業者が前記配列の発現に適当であると考え得る任意のベクターであり得る。本発明の好ましい実施形態では、本発明のｍＲＮＡをコードするために使用されるベクターは、細菌で増幅し得るベクターである。より好ましくは、このプラスミドは、ＳＰ６およびＴ７ファージのものなど、無細胞転写系で使用されるＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターを含んでなる。いっそうより好ましくは、このプラスミドが有するこのプロモーターは、少なくとも前記ＲＮＡポリメラーゼの存在下で本発明のｍＲＮＡの発現を命令することができる。
【００９３】
好ましくは、本発明のベクターは、宿主細胞での前記ベクターの増殖を可能とするために複製起点を含んでなる。用語「複製起点」（ｏｒｉとも呼ばれる）は、複製の開始を可能とする独特なＤＮＡ配列である。一方向または二方向複製が始まるのはこの配列からである。当業者には複製起点の構造がある種と別の種では異なることが知られ、従って、それらが全てある種の特徴を有するにもかかわらず特異的である。この配列においてタンパク質複合体が形成され、ＤＮＡの開放および複製の開始を可能とする。
【００９４】
有利には、本発明の発現カセットを含むベクターは、特に形質転換後に前記ベクターを含む細胞の同定を容易にするために、さらに選択マーカーを含んでなる。本発明による「選択マーカー」は、前記ベクターを有する細胞の同定および選択を可能とする、ベクターが有するポリヌクレオチド配列である。選択マーカーは当業者に周知である。好ましくは、選択マーカーは、抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００９５】
本発明の対象とする核酸を含んでなる本発明のベクターは、当業者により慣用されている方法によって調製される。得られたクローンは、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するために当業者に公知の標準的な方法によって適当な宿主に導入することができる。このような方法は、デキストランを用いる形質転換、リン酸カルシウムによる沈降、ポリブレンを用いるトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソームへの封入、微粒子銃注入および核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションであり得る。また、前記ＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列（単離されたまたはプラスミドもしくはウイルスベクターに挿入された）と、ナノ輸送体のような輸送体またはリポソーム調製物もしくは陽イオンポリマーなどの宿主細胞の膜を通過することを可能とする物質を組み合わせることも可能である。さらに、例えば、リポソームとエレクトロポレーションの併用によるなど、これらの方法は有利に組み合わせることができる。
【００９６】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明のベクターは、本発明のｍＲＮＡをコードするＤＮＡ分子を含んでなる。好ましくは、本発明のベクターは、プラスミドである。いっそうより好ましくは、本発明のベクターは、発現カセット、転写ターミネーター、複製起点、および選択マーカーを含んでなる。別の好ましい実施形態では、ベクターは、発現カセットからなる。
【００９７】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、ベクターは、本発明のｍＲＮＡ分子を含んでなる。好ましくは、本発明のベクターは、ウイルスベクターまたは合成ＲＮＡベクターである。
【００９８】
別の態様によれば、本発明は、前記ベクターを含んでなる宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」は、本明細書で使用する場合、組換え発現ベクターが本発明のｍＲＮＡを発現するために導入された細胞を指すものとする。この用語は、前記特定の宿主細胞だけでなくその後代も包含すると理解されるべきである。突然変異または環境の影響のために世代にわたってある種の改変が起こり得ると理解される。結果として、後代は、親細胞と全く同一でない場合があるが、やはり、本明細書で使用される用語「宿主細胞」に含まれる。
【００９９】
上記のＤＮＡおよび／またはベクターは、大量の本発明のｍＲＮＡを生産するために特に有用である。
【０１００】
別の態様によれば、本発明は、上記のＤＮＡまたはベクターを用いて本発明のｍＲＮＡを生産するための方法に関する。よって、このｍＲＮＡは当業者に公知のいずれの方法によって生産することもできる。これは、例えば、化学合成、イン・ビボ発現またはイン・ビトロ発現によって行うことができる。
【０１０１】
好ましくは、このｍＲＮＡは、イン・ビトロにて、無細胞ｍＲＮＡ発現系を用いて発現される。「無細胞ｍＲＮＡ発現系」とは、本発明に関して、細胞の不在下で本発明のｍＲＮＡの合成を可能とする生化学系を意味する。無細胞系は、外因性の遺伝情報から特定のｍＲＮＡを生産するために、生物の転写機構の使用に基づく。従って、本発明に関して、無細胞ｍＲＮＡ発現系は、細胞の不在下でｍＲＮＡを生産するために必要なエレメントを全て含む。この機構が抽出される生物は多く、様々であり、原核生物および真核生物に由来する。
【０１０２】
特に、この系は、とりわけ、細胞由来の転写機構を含んでなる。より詳しくは、この系は、上記の発現カセットのプロモーターを認識し得るＲＮＡポリメラーゼを含んでなる。よって、適当なヌクレオチドの存在下、かつ、適当なイオン条件下で、このＲＮＡポリメラーゼは、本発明のｍＲＮＡをコードする遺伝子の転写を命令することができる。このような系は、数十年間、当業者に周知である（総説としては、例えば、Ｂｅｃｋｅｒｔ  ａｎｄ  Ｍａｓｑｕｉｄａ，２０１１参照）。無細胞系においてＤＮＡをＲＮＡに転写するために多くの方法が利用可能である。また、多くの会社によって提供されるキットを使用することも可能である：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎなど。
【０１０３】
ＲＮＡポリメラーゼに加え、無細胞イン・ビトロ転写系は、反応バッファーを含む。有利には、前記系は、４種類のリボヌクレオチド三リン酸のそれぞれを含んでなる。極めて有利には、これらの４種類のリボヌクレオチド三リン酸は、同一の濃度で存在する。特に、ＧＴＰの濃度は、他の３種類のリボヌクレオチド三リン酸の濃度と同一である。よって、本発明のｍＲＮＡのイン・ビトロ転写の収量は、イン・ビトロ反応から得られるキャップ付きのｍＲＮＡの収量よりもはるかに高く、これがｍＲＮＡ合成のコストを大幅に低減する。
【０１０４】
好ましくは、この生産方法は、前記ｍＲＮＡを精製する工程を含んでなる。
【０１０５】
好ましい実施形態では、ファージＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターと、その後に対象とするｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含んでなるプラスミドＤＮＡを無細胞イン・ビトロ転写系でファージＲＮＡポリメラーゼと接触させる。次に、前記方法により合成されたｍＲＮＡを精製することができる。好ましくは、前記プラスミドＤＮＡは、無細胞イン・ビトロ転写系でＲＮＡポリメラーゼと接触させる前に線状化される。より好ましくは、前記ＤＮＡは、３’−ＵＴＲ領域の下流での酵素消化によって線状化される。いっそうより好ましくは、前記ＤＮＡは、Ｓｓｐ１またはＥｃｏ５３ｋＩでの酵素消化によって線状化される。
【０１０６】
好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである。
【０１０７】
このｍＲＮＡ分子は、それが導入される真核生物において対象とするポリペプチドの生産を命令することができる。従って、このｍＲＮＡ分子は、遺伝子療法または遺伝子ワクチン接種に特に好適である。よって、本発明のｍＲＮＡ分子は、薬物またはワクチンとして使用することができる。
【０１０８】
別の態様によれば、本発明はまた、医薬組成物またはワクチン組成物に関する。
【０１０９】
よって、より詳しくは、本発明は、本発明のｍＲＮＡを含んでなる医薬またはワクチン組成物に関する。組成物中に含まれるｍＲＮＡは細胞をトランスフェクトし、これが次にタンパク質に翻訳され得る。好ましくは、これらのタンパク質は、予防活性または治療活性を有する。
【０１１０】
実際に、本発明者らは、意外にも、本発明によるｍＲＮＡが組織トランスフェクションの際に従来のキャップ付きのｍＲＮＡよりも有効であることを示した。実際に、本発明者らは、極めて意外なことに、イン・ビボトランスフェクション後に得られた発現のレベルおよび期間がキャップ付きのｍＲＮＡの場合と少なくとも同等であることを示した。特に、マウスの真皮または筋肉での本発明のｍＲＮＡのイン・ビボ発現は、対照のキャップ付きのｍＲＮＡよりも大きい（図５、図１５）。さらに、本発明者らは、極めて意外なことに、本発明によるｍＲＮＡが細胞内で長期間（すなわち、７週間を超えて）持続することを示した。最後に、本発明者らは、意外にも、２Ａｐｒｏタンパク質をコードする本発明による第１のｍＲＮＡと第２のタンパク質をコードする本発明による第２のｍＲＮＡでの細胞の同時トランスフェクションがこの第２のタンパク質の翻訳の増強を可能とすることを示した。
【０１１１】
よって、本発明の別の態様によれば、医薬組成物は、２Ａｐｒｏタンパク質または前記タンパク質をコードするｍＲＮＡを含んでなる。好ましくは、２Ａｐｒｏタンパク質は、配列番号８１の配列を有する。好ましくは、前記タンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号８０の配列を有する。本発明の特定の実施形態によれば、医薬組成物は、５’から３’方向に：
・少なくとも１コピーのＧＵＣＡＧＲＹＣ（Ｎ７−１９）ＧＣＣＡ（Ｎ１２−１９）ＵＧＣＮＲＹＣＵＧ（ｘｒＲＮＡ）コンセンサス配列を含んでなる５’−ＵＴＲ領域、
・内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）ＲＮＡ配列のコピー；および
・オープンリーディングフレーム
を含んでなる、無キャップメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の少なくとも２つの異なる分子を含んでなり、これらのｍＲＮＡ分子の少なくとも一方が２Ａｐｒｏタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含んでなる。
【０１１２】
好ましくは、前記医薬組成物は、２Ａｐｒｏタンパク質をコードするリーディングフレームを含んでなる第１のｍＲＮＡ分子と、対象とする第２のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含んでなる少なくとも１つの第２のｍＲＮＡ分子とを含んでなる。より好ましくは、対象とする前記第２のタンパク質は、２Ａｐｒｏタンパク質でない。いっそうより好ましくは、対象とする前記第２の分子は、上記で定義されるものなどの抗原または治療タンパク質である。本発明の特定の実施形態によれば、第１のｍＲＮＡと第２のｍＲＮＡのモル比は、５４０：１〜２４０：１、好ましくは５４０：１〜３１５：１、いっそうより好ましくは４６５：１である。
【０１１３】
好ましくは、前記組成物には、賦形剤および／または薬学上許容されるビヒクルが添加される。本明細書において、薬学上許容されるビヒクルという用語は、医薬組成物中に含まれる、副作用を引き起こさず、かつ、例えば、有効化合物の投与の容易さの改善、体内でのその寿命および／もしくは有効性の増大、溶液中でのその溶解度の増大またはさらには保存の向上を可能とする化合物または化合物の組合せを指す。これらの薬学上許容されるビヒクルは周知であり、選択された有効化合物の性質および投与様式に応じて、当業者によって適合される。本明細書において、用語「薬学上許容される賦形剤」は、医薬組成物中に含まれ、副作用を引き起こさず、かつ、例えば、有効化合物の投与の容易さの改善、生物中でのその寿命および／もしくは有効性の増大、溶液中でのその溶解度の増大またはさらには保存の向上を可能とする化合物または化合物の組合せを指す。前記賦形剤は、特に、例えば、ＲＮＡが凍結乾燥物の形態で保存される場合に、投与直前に組成物に加えることができる。薬学上許容される賦形剤／ビヒクルは周知であり、選択された有効化合物の性質および投与様式に応じて、当業者によって適合される。様々な賦形剤が特に、The Science and Practice of Pharmacy by Remington, 第22版, Pharmaceutical Press, London, UK (2013)に記載されている。一例として、薬学上許容される組成物は、賦形剤として無菌水および／またはクロロキンを含んでなる。「クロロキン」賦形剤はまた、プリマキンなどのそのいずれの変異体または類似体も含む。
【０１１４】
実際に、本発明者らは、意外にも、特定の条件下で、クロロキンとｍＲＮＡの同時注入がトランスフェクション効率の向上を可能とすることを示した。特に、トランスフェクション効率は、「ＣＰＰ」型ペプチドと組み合わせたｍＲＮＡで向上した（図１０参照）。
【０１１５】
好ましい実施形態によれば、医薬組成物は、クロロキンをさらに含んでなる。限定されない例として、医薬組成物は、１：０．５〜１：４のｍＲＮＡ：クロロキンの重量比、より詳しくは１：１のｍＲＮＡ：クロロキンの重量比を含んでなる。限定されない例として、医薬組成物は、５μｇのＲＮＡ：２．５〜２０μｇのクロロキンをさらに含んでなる。
【０１１６】
好ましい実施形態によれば、医薬組成物は、本発明によるｍＲＮＡ分子に非共有結合的に連結された、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＰＰをさらに含んでなる。有利には、ＣＰＰは、ｍＲＮＡの標的細胞への浸透を促進するように選択される（例えば、器官または細胞株のタイプ、例えば、筋肉か皮膚細胞かによる）。
【０１１７】
好ましくは、これらの組成物は、筋肉内、皮内、腹腔内または皮下経路によるか、呼吸器経路によるか、または局所経路によって投与される。これらの組成物は好ましくは、哺乳動物組織、いっそうより好ましくはヒトへの注射を意図する。これらの組成物は好ましくは、当業者に公知の方法に従って、筋肉内、静脈内、皮内、腹腔内または皮下経路により注射されることを意図する。本発明の医薬組成物は、経時的に交互に数回投与してよい。その投与様式、用量および最適な剤形は、例えば、患者の年齢または体重、患者の健康状態の重篤度、処置に対する忍容性、および見られる副作用など、患者に適合した処置を確立する上で一般に考慮される基準に従って決定され得る。
【０１１８】
非経口的に投与可能な形態としては、薬理学的に適合する分散剤および／または湿潤剤を含有し得る水性懸濁液、等張性生理食塩水、または無菌注射溶液が含まれる。呼吸器経路により投与可能な形態としては、エアロゾルが含まれる。局所的に投与可能な形態としては、パッチ、ゲル、クリーム、軟膏、ローション、スプレー、点眼剤が含まれる。
【０１１９】
非経口的に投与可能な化合物を調製するための方法は当業者に既知または自明であり、例えば、Pharmaceutical Sciences of Remington, 第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)ならびにその第１８版および第１９版により詳細に記載されている。薬学上有効な物質のための媒体および薬剤の使用は当技術分野で周知である。投与に好適な薬学上許容される組成物を得るためには、前記組成物は、治療上有効とするに十分な量のｍＲＮＡ分子を含んでなる。
【０１２０】
本発明の化合物の有効用量は、例えば、選択される投与経路、体重、年齢、性別、治療される病態の進行状態、および治療される個体の感受性などの多くのパラメーターによって異なる。
【０１２１】
特定の態様によれば、本発明は、遺伝子療法におけるその使用のための前記組成物に関する。本発明の組成物は、様々な疾患、例えば、癌、遺伝病（血友病、サラセミア、アデノシンデアミナーゼ欠乏症、アルファ−１アンチトリプシン欠乏症など）、糖尿病、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの脳障害、アレルギー、自己免疫疾患、および心血管疾患の治療または調整において使用され得る。
【０１２２】
別の態様によれば、本発明は、遺伝子ワクチン接種におけるその使用のための前記組成物に関する。一例として、本発明の組成物は、癌およびインフルエンザ、ならびに他のウイルスおよび細菌病原体に対するワクチン接種において使用することができる。ワクチン接種は、ヒトならびにペットおよび家畜に関するものであり得る。
【０１２３】
本発明者らは、特に、本発明のｍＲＮＡがイン・ビボで安定であることを示した。実際に、本発明のｍＲＮＡは、イン・ビボにおいてキャップ付きのｍＲＮＡの場合と少なくとも同等の量のタンパク質の合成を誘導し、Ｘｒｎ１に対するその耐性がキャップ付きのｍＲＮＡの場合と少なくとも同等の効率であることを示す。さらに、本発明者らは、特に、本発明のｍＲＮＡが細胞内で長期間持続することを示した。このようなｍＲＮＡ分子はまた、その生産コストがキャップ付きのｍＲＮＡ分子の生産コストよりもはるかに低いため極めて有利である。最後に、本発明者らは、細胞に直接浸透するＲＮＡアプタマー（例えば、ＲＮＡアプタマーＣ）またはＣＰＰペプチドを介して浸透するＲＮＡアプタマー（例えば、ＲＮＡアプタマーＡ）を含んでなるｍＲＮＡがより効率的に細胞をトランスフェクトし、これが対象とする１以上のタンパク質の生産を向上させることを示した。
【０１２４】
以下、実施例により本発明をより詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１：メッセンジャーＲＮＡのスキーム。（Ａ）キャップ付きＭＢ５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、５’末端および３’−ＵＴＲ領域にポリ（Ａ）テールを含んでなるキャップ類似体を有する、ルシフェラーゼをコードする従来のメッセンジャーＲＮＡに相当する。（Ｂ）ＭＢ５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、それがキャップ類似体を欠いていること以外は（Ａ）と同じである。（Ｃ）ＭＢ７−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、キャップを欠き、５’末端にステム−ループおよびＥＭＣＶウイルスの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有する。（Ｄ）ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、キャップを欠き、５’ＵＴＲ領域にステム−ループ、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）由来の２つのＸｒｎ１耐性配列（ｘｒＲＮＡ１およびｘｒＲＮＡ２）およびＥＭＣＶウイルス由来のＩＲＥＳを有する。（Ｅ）ＭＢ９−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、その３’−ＵＴＲおよびポリ（Ａ）がクンジンウイルス（ＫＵＮ）由来の３’−ＵＴＲで置換されていること以外は（Ｄ）と同様である。（Ｆ）無キャップＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、５’領域において西ナイルウイルス（ＷＮＶ）由来の２つのＸｒｎ１耐性配列（ｘｒＲＮＡ１およびｘｒＲＮＡ２）およびＥＭＣＶウイルスのＩＲＥＳの上流にアプタマーＡが付加されていること、およびステム−ループを有さないこと以外は（Ｄ）と同様である。ＭＢ１３−ｌｕｃ２（Ｇ）およびＭＢ１４−ｌｕｃ２（Ｈ）ｍＲＮＡは、この同じ構成を有するが、５’ステム−ループとその後にそれぞれＲＮＡアプタマーＢおよびＣを含んでなる。（Ｉ）キャップ付きＭＢ１５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、５’領域においてキャップの後にアプタマーＡが付加されていること以外は（Ａ）と同様である。（Ｊ）ＭＢ１７−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、５’側のステム−ループとｘｒＲＮＡ配列の間にアプタマーＡが付加されていること以外は（Ｄ）と同様である。（Ｋ）ＭＢ１８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、５’領域においてｘｒＲＮＡ配列の下流、ＩＲＥＳ配列の上流にＡアプタマーが置かれていること以外は（Ｊ）と同様である。
【図２】図２：４日間にわたるＣａｃｏ−２細胞におけるルシフェラーゼ発現動態。  コンフルエントのＣａｃｏ−２細胞をＭＢ５−ｌｕｃ２キャップ付き（◆）および無キャップ（●）ｍＲＮＡ、ならびにＭＢ７−ｌｕｃ２（▲）およびＭＢ８−ｌｕｃ２（■）ｍＲＮＡでトランスフェクトした。発現動態を４日間追跡した。
【図３】図３：１０日間にわたるＣａｃｏ−２細胞におけるルシフェラーゼ発現動態。  コンフルエントのＣａｃｏ−２細胞をキャップ付きＭＢ５−ｌｕｃ２（◆）、ＭＢ８−ｌｕｃ２（■）およびＭＢ９−ｌｕｃ２（▲）ｍＲＮＡでトランスフェクトした。発現動態を１０日間追跡した。
【図４】図４：ヒト間葉系幹細胞における長期ルシフェラーゼ発現動態。  間葉系幹細胞を、４８ウェルプレートで、ｐｅｐＭＢ１ペプチド正電荷：ｍＲＮＡ負電荷比約２．２：１でｐｅｐＭＢ１ペプチドと複合体を形成したＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ  １ウェル当たり２μｇで１時間トランスフェクトした。その後、ルシフェラーゼ活性をおよそ４８日間、経過観察した。
【図５】図５：マウス筋肉および真皮のトランスフェクション。  雄ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスの筋肉および真皮を、それぞれ１０μｇおよび５μｇの無キャップＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡまたはキャップ付きＭＢ５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡでトランスフェクトした。注入のそれぞれ１６時間および１８時間後に筋肉および皮膚で、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【図６】図６：ＭＢ８−２Ａｐｒｏ  ｍＲＮＡの毒性試験。  ２Ａｐｒｏタンパク質発現の細胞傷害効果を評価するために、Ｃ２Ｃ１２細胞にＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ単独またはＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡとＭＢ８−２Ａｐｒｏ  ｍＲＮＡの４６５：１または９：１比の混合物でトランスフェクトした。細胞傷害性は、細胞外培地へ放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を測定することにより決定した。ＬＤＨ活性は、４９０ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定する。陰性対照：溶解を行わない、非トランスフェクト細胞またはＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ単独でトランスフェクトした細胞。陽性対照：Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で溶解した非トランスフェクト細胞。
【図７】図７：ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ：ＭＢ８−２Ａｐｒｏ  ｍＲＮＡモル比に応じた、ルシフェラーゼ発現に対する２Ａｐｒｏタンパク質の効果。  Ｃ２Ｃ１２細胞に、漸増量のＭＢ８−２Ａｐｒｏ  ｍＲＮＡの存在下、ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡでトランスフェクトした。ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ：ＭＢ８−２Ａｐｒｏ  ｍＲＮＡのモル比は、５４０：１〜２４０：１であった。トランスフェクトしたｍＲＮＡの総量は、ウェル当たり７５０ｎｇであった。トランスフェクションの１８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。
【図８】図８：ＭＢ８−２Ａｐｒｏ  ｍＲＮＡの存在下または不在下での７日間にわたるルシフェラーゼ発現動態。  コンフルエントのＣ２Ｃ１２細胞に、ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ単独で（黒線）またはＭＢ８−２Ａｐｒｏ  ｍＲＮＡと組み合わせて（グレーの点線）トランスフェクトした。ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ：ＭＢ８−２Ａｐｒｏ  ｍＲＮＡのモル比は４６５：１である。ルシフェラーゼ活性のレベルにより測定される発現動態を７日間にわたって追跡した。
【図９】図９：種々のメッセンジャーＲＮＡのルシフェラーゼ発現に対する２Ａｐｒｏタンパク質の効果  種々のメッセンジャーＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対する２Ａｐｒｏタンパク質の効果を評価した。各場合において、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを単独でトランスフェクトするか（−）または２Ａｐｒｏタンパク質をコードし、最適モル比４６５：１で同じ特徴を有する第２のｍＲＮＡで同時にトランスフェクトした（＋）。（１）ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ単独；（２）ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡとＭＢ８−２Ａｐｒｏ  ｍＲＮＡの同時トランスフェクション；（３）キャップ付きＭＢ５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ単独；（４）キャップ付きＭＢ５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡと無キャップＭＢ８−２Ａｐｒｏ  ｍＲＮＡの同時トランスフェクション；（５）キャップ類似体を欠くＭＢ５−ｌｕｃ２単独；（６）キャップ類似体を欠くＭＢ５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡとキャップ類似体を欠くＭＢ８−２Ａｐｒｏ  ｍＲＮＡの同時トランスフェクション；（７）ＭＢ７−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ単独；（８）ＭＢ７−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡとＭＢ８−２Ａｐｒｏ  ｍＲＮＡの同時トランスフェクション。トランスフェクションの１８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。
【図１０】図１０：筋肉におけるキャップ付きｍＲＮＡ分子のトランスフェクション効率に対する種々のアプタマーの効果。  雄ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスの筋肉に５μｇのクロロキンの存在下、５μｇのＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ、ＭＢ１３−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ、ＭＢ１４−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ、ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡとＭ１２−Ｈ６ペプチドの複合体、またはＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡとＭ１２−Ｈ６ペプチドの複合体でトランスフェクトした。注入の１６時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。
【図１１】真皮におけるＣＰＰ３−Ｈ６ペプチド：ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡのモル比に応じたｍＲＮＡのトランスフェクション効率。  雄ＯＦ１マウスの真皮に漸増モル比（１：８〜１１２５：１のＣＰＰ３−Ｈ６：ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡモル比）でＣＰＰ３−Ｈ６ペプチドと複合体を形成したＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ  ５．６μｇでトランスフェクトした。注入の１８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。最適なトランスフェクションを可能とするモル比は、１  ＣＰＰ３−Ｈ６：４  ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡであった。
【図１２】図１２：真皮におけるＣＰＰ１−Ｈ６ペプチド：ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡのモル比に応じたｍＲＮＡのトランスフェクション効率。  雄ＯＦ１マウスの真皮に漸増モル比（１：８〜３：１のＣＰＰ１−Ｈ６：ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡモル比）でＣＰＰ１−Ｈ６ペプチドと複合体を形成したＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ  ５．６μｇでトランスフェクトした。注入の１８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。最適なトランスフェクションを可能とするモル比は、１  ＣＰＰ１−Ｈ６：４  ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡであった。
【図１３】図１３：真皮におけるＣＰＰ２−Ｈ６ペプチド：ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡのモル比に応じたｍＲＮＡのトランスフェクション効率。  雄ＯＦ１マウスの真皮に漸増モル比（１：４〜２．７５：１のＣＰＰ２−Ｈ６：ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡモル比）でＣＰＰ２−Ｈ６ペプチドと複合体を形成したＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ  ５．６μｇでトランスフェクトした。注入の１８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。最適なトランスフェクションを可能とするモル比は、２  ＣＰＰ２−Ｈ６：１  ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡであった。
【図１４】図１４：真皮におけるキャップ付きｍＲＮＡ分子のトランスフェクション効率に対するアプタマーＡの効果。  従来のキャップ付きＭＢ５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲにＲＮＡアプタマーＡを挿入してキャップ付きＭＢ１５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡを作出した。雄ＯＦ１マウスの真皮に、これまでに得られた結果（図１２参照）を考慮して、２  ＣＰＰ２−Ｈ６：１  ＭＢ１５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡのモル比でＣＰＰ２−Ｈ６ペプチドと複合体を形成した、または形成しないキャップ付きＭＢ１５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ  ５．６μｇでトランスフェクトした。ＡアプタマーまたはＣＰＰ２−Ｈ６ペプチドの存在下でも不在下でもこの構築物でトランスフェクションは改善されなかった。
【図１５】図１５：真皮におけるｍＲＮＡ分子のトランスフェクション効率に対する５’−ＳＬの効果。  ステム−ループを欠くｍＲＮＡ（ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ）およびステム−ループがｘｒＲＮＡ１のさらに７０ヌクレオチド上流に位置するｍＲＮＡ（ＭＢ１７−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ）と比較した、ステム−ループの５ヌクレオチド下流にｘｒＲＮＡ１配列が続く場合（ＭＢ８−ｌｕｃ２およびＭＢ１８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ）の場合のトランスフェクション効率に対するステム−ループ（ここでは、配列番号８７の配列を有する「５’−ＳＬ」）の効果。従来のＭＢ５−ｌｕｃ２キャップ付きｍＲＮＡは、５’−ＳＬの後に２つのｘｒＲＮＡ配列が続く場合の有効性の対照となる。雄ＯＦ１マウスの真皮に、種々のｍＲＮＡそれぞれ５．６μｇでトランスフェクトし、注入の１８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。ＭＢ１１−ｌｕｃ２のアプタマーＡはペプチドに連結されておらず、従って、このｍＲＮＡのトランスフェクション効率に効果を及ぼさない。
【実施例】
【０１２６】
本発明を以下の限定されない例により説明する。これらの教示は、当業者に認識されるように、代替、改変および等価物を含む。
【０１２７】
実施例１：プラスミドの構築
配列番号４９、配列番号５０、または配列番号５１の５’非コード配列に相当するＤＮＡ配列を化学合成し、ＤＮＡベクターに組み込み、ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘにより配列決定を行った。ＤＮＡ断片を制限酵素で切断した。ｐＭＢｘ−ｌｕｃ２系のプラスミドを同じ制限酵素で消化し、ＤＮＡ断片をＴ４  ＤＮＡリガーゼの作用によってこれらのプラスミドに組み込んだ。これらのプラスミドは、バクテリオファージＴ７プロモーターの下流に挿入されたルシフェラーゼ酵素をコードする遺伝子（配列番号６２）を含有する。配列番号５３の、短い非コード３’−ＵＴＲ配列とそれに続く転写ポリアデニル化配列は、ルシフェラーゼ遺伝子の下流に位置する。種々の非コード５’−ＵＴＲ配列が、プロモーターをルシフェラーゼ遺伝子から分離している。このようにして構築されたプラスミドを増幅し、確認し、制限酵素により、転写ポリアデニル化配列の下流で線状化した。
【０１２８】
実施例２：プラスミドの線状化およびｍＲＮＡのイン・ビトロ転写
Ｓｓｐ１制限部位は各プラスミドのポリ（Ａ）のすぐ下流に位置する（配列番号５４参照）。１０μｇのプラスミドを１倍ＣｕｔＳｍａｒｔバッファー中、３７℃で４時間、２０単位のＳｓｐ１−ＨＦ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｒａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。
【０１２９】
次に、Ｓｓｐ１−ＨＦにより線状化した８μｌのプラスミドを２μｌの１０倍Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ反応バッファー、各２μｌの４種類のヌクレオチド三リン酸（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰ）および２μｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ溶液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と混合した。キャップ付きｍＲＮＡの合成に関しては、この反応混合物にキャップ類似体を含めた。無キャップｍＲＮＡの合成に関しては、これを除いた。
【０１３０】
転写には３〜１０時間かかり、３７℃のブロックヒーターで行った。次に、プラスミドを分解するために１μＬのＴＵＲＢＯ  ＤＮアーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｓｈｅｒ）を加え、この混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。
【０１３１】
ＭＢ５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、ルシフェラーゼをコードする従来のｍＲＮＡである。これは翻訳の最適な開始のために選択された配列番号５７の５’非コード配列（ＵＴＲ）、ならびに配列番号６０のポリ（Ａ）テールを含んでなる３’−ＵＴＲ領域を有する。このｍＲＮＡをキャップ有りまたは無しで合成した（図１（Ａ）および（Ｂ）参照）。
【０１３２】
無キャップＭＢ７−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、その５’末端に、ＭＢ５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲの代わりに、５’末端にステム−ループとその後にＥＭＣＶウイルスのＩＲＥＳ配列を有する。よって、前記は、キャップが存在しないにもかかわらず、リボソームを効率的に動員することができる。しかしながら、このｍＲＮＡはＸｒｎ１酵素に感受性があると思われる（図１（Ｃ）参照）。ＭＢ７−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ領域は配列番号５８に相当し、３’−ＵＴＲ領域は配列番号６０に相当する。
【０１３３】
無キャップＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、その５’末端にステム−ループと、その後の５’−ＵＴＲ領域にｘｒＲＮＡ１およびｘｒＲＮＡ２（Ｋｉｅｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）と呼ばれるフラビウイルスＷＮＶの３’−ＵＴＲに由来するＸｒｎ１耐性の２つの連続配列を有する。これらの配列にＥＭＣＶウイルスのＩＲＥＳの配列が続き、従って、これはＸｒｎ１耐性の２つの配列により保護される（図１（Ｄ）参照）。ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ領域は配列番号５９に相当し、３’−ＵＴＲ領域は配列番号６０に相当する。無キャップＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡを生産するコストは、キャップ付きｍＲＮＡを生産するコストの約３０分の１である。
【０１３４】
無キャップＭＢ９−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、その３’末端だけが無キャップＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡと異なる。実際には、ＭＢ８−ｌｕｃ２の３’−ＵＴＲおよびポリ（Ａ）配列は、クンジンウイルスの３’−ＵＴＲ領域で置換されている。この領域はポリ（Ａ）配列を有さない（図１（Ｅ）参照）。ＭＢ９−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ領域は配列番号６１に相当する。
【０１３５】
無キャップＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、５’末端にステム−ループが存在せず、５’領域の、Ｘｒｎ１耐性の２つの連続配列の上流にアプタマーが存在するだけが無キャップＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡと異なる（図１（Ｆ）参照）。ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、配列番号６４のＡアプタマーを含んでなり、よって、ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ領域は配列番号６７に相当する。
【０１３６】
無キャップＭＢ１３−ｌｕｃ２およびＭＢ１４−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、５’領域の、Ｘｒｎ１耐性の２つの連続配列の上流にアプタマーが存在することだけが無キャップＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡと異なる（図１（Ｇ、Ｈ）参照）。ＭＢ１３−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、配列番号６５のＢアプタマーを含んでなり、よって、ＭＢ１３−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ領域は、配列番号６８に相当する。ＭＢ１４−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは配列番号６６のＣアプタマーを含んでなり、よって、ＭＢ１４−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ領域は配列番号６９に相当する。
【０１３７】
ＭＢ１５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、５’−ＵＴＲ領域にＡアプタマー（配列番号６４）が挿入されているキャップ付きＭＢ５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡに相当し（図１（Ｉ）参照）、よって、ＭＢ１５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ領域は配列番号７０に相当する。
【０１３８】
ＭＢ１７−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、５’末端のアプタマーＡの上流にステム−ループが存在することだけが無キャップＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡと異なる（図１（Ｊ）参照）。ＭＢ１７−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、配列番号６４のＡアプタマーを含んでなり、よって、ＭＢ１７−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ領域は配列番号８３に相当する。
【０１３９】
無キャップＭＢ１８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、５’領域のＸｒｎ１耐性の２つの連続配列とＩＲＥＳ配列の間にアプタマーが存在することでだけが無キャップＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡと異なる（図１（Ｋ）参照）。ＭＢ１８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、配列番号６４のＡアプタマーを含んでなり、従って、ＭＢ１８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ領域は配列番号８４に相当する。
【０１４０】
実施例３：メッセンジャーＲＮＡの精製
種々のルシフェラーゼｍＲＮＡの精製は、ＭｅｇａＣｌｅａｒキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。７９μｌの溶出溶液、３５０μｌの結合溶液濃縮物および２５０μｌの１００％エタノールを２１μｌの従前の混合物に加えた。これら７００μｌをフィルターカートリッジに載せ、１０，０００ｘｇで１分間遠心分離した。フィルターはメッセンジャーＲＮＡを保持した。５００μｌの洗浄溶液を用い、１０，０００ｘｇで１分間遠心分離して２回の洗浄を行った。次に、５０μｌの溶出溶液を２回加え、ブロックヒーターで１０分間７０℃に加熱することにより、フィルターからＲＮＡを溶出させた。溶出は、１０，０００ｘｇで１分間の遠心分離により得られた。
【０１４１】
第２の精製工程は、塩化リチウムを用いた沈澱により行った。６０μｌのＬｉＣｌ沈澱溶液を１００μｌの溶出液に加えた。この混合物を−２０℃で１時間冷却した後、最大速度にて４度で１５分間遠心分離した。ペレットを５００μｌの７０％エタノールで洗浄し、最大速度にて４度で５分間、最終の遠心分離を行った。メッセンジャーＲＮＡペレットを数分間風乾し、無菌脱イオン水に再懸濁させた。このｍＲＮＡ溶液の濃度を、分光光度計を用い、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定した。
【０１４２】
実施例４：メッセンジャーＲＮＡ／ｐｅｐＭＢ１複合体の構築
陽イオンペプチドｐｅｐＭＢ１を合成し、精製し、ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘにより凍結乾燥させた。そのアミノ酸配列は以下の通りである：ＣＲＲＲＲＲＲＲＲＣ。この凍結乾燥物を無菌脱イオン水に再懸濁させた。
【０１４３】
５μｇのルシフェラーゼｍＲＮＡを５μｇのｐｅｐＭＢ１とＲＮＡ終濃度２０μｇ／ｍｌで混合した。混合物を室温（２０〜２５℃）で１５分間インキュベートした後、−８０℃で凍結させた。次に、ｍＲＮＡ／ｐｅｐＭＢ１複合体を約２０時間凍結乾燥させた。
【０１４４】
実施例５：Ｃａｃｏ−２またはＣ２Ｃ１２細胞のトランスフェクション
材料および方法：
ａ）Ｃａｃｏ−２株またはＣ２Ｃ１２株の細胞の培養および播種
全ての細胞操作は層流フード下で行った。Ｃａｃｏ−２細胞株（ＥＣＡＣＣ）は、非必須アミノ酸、抗生物質混合物ならびに抗真菌剤、およびウシ胎児血清（最終１５％）を添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。培養は、３７℃、７５ｃｍ２フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内で行った。
【０１４５】
４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種するために必要な細胞数に達した際に、３ｍｌのＴｒｙＰＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  １Ｘ（Ｇｉｂｃｏ）を用い、３７℃で５分間、細胞をフラスコの底から剥離した。７ｍｌのＤＭＥＭを加えてＴｒｙＰＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  １Ｘを中和した。これらの細胞を室温で１０分間、１００ｘｇで遠心分離した。次に、細胞ペレットを１０ｍｌの培養培地に再懸濁させた。２５０μｌのこの細胞懸濁液を４８ウェルプレートの各ウェルに導入し、これを、５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーターに入れた。
【０１４６】
Ｃ２Ｃ１２細胞は、播種後約１２日間、４８ウェルプレートウェルで、コンフルエントで維持することができる。この期間を過ぎると、これらの細胞は腸管上皮へ分化し、ｍＲＮＡ翻訳に影響が出る。これに対して、ヒト間葉系幹細胞は、７週間を超えてコンフルエントの培養で保存することができる。このようにして、間葉系幹細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ））を４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の使用準備済み培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、間葉系幹細胞増殖培地）中で４８日間まで培養した。トランスフェクション後５日より後に溶解させる細胞については、培養培地を週に３回交換した。
【０１４７】
ｂ）Ｃａｃｏ−２細胞またはＣ２Ｃ１２細胞のトランスフェクション
Ｃａｃｏ−２細胞の場合、各ｍＲＮＡでのトランスフェクションは５つの異なるウェルで行った。ｍＲＮＡ／ｐｅｐＭＢ１複合体（Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｉｘ）の凍結乾燥物を７５０μｌのトランスフェクションバッファー（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、４０ｍＭ  ＫＣＩおよび１００ｍＭトリフルオロ酢酸塩）に再懸濁させた。
【０１４８】
Ｃ２Ｃ１２細胞の場合、ＭＢ８  ｍＲＮＡでのトランスフェクションは以下に示すように行う。ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ／ｐｅｐＭＢ１複合体（Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｉｘ）を、正電荷ペプチド：負電荷ｍＲＮＡ比およそ２．２のペプチドの存在下、室温で３０分間、ｍＲＮＡをインキュベートすることにより構築した。次に、この溶液を３倍ＤＭＥＭで希釈して最終ＤＭＥＭを１倍とした。
【０１４９】
両場合とも、１５０μｌのＲＮＡ／ｐｅｐＭＢ１複合体溶液（Ｃａｃｏ−２細胞の場合にはウェル当たり１μｇのｍＲＮＡに相当し、Ｃ２Ｃ１２細胞の場合にはウェル当たり２μｇに相当する）を導入するために、ウェルが含んでいた培養培地を空にした。細胞をＣＯ２インキュベーターにて３７℃で３０分間（Ｃａｃｏ−２細胞）または１時間（Ｃ２Ｃ１２細胞）インキュベートした。次に、ｍＲＮＡ／ｐｅｐＭＢ１複合体溶液を吸引し、２５０μｌの培養培地に置き換えた。その後、細胞をＣＯ２インキュベーターにて３７℃で、細胞種によって６時間〜４８日間インキュベートした。
【０１５０】
ｃ）Ｃａｃｏ−２細胞またはＣ２Ｃ１２細胞の溶解およびルシフェラーゼ活性の測定
トランスフェクションの６時間〜４８日後に、ルシフェラーゼタンパク質の発現動態を調べるために細胞を溶解させた。培養培地を吸引し、２５０μｌの溶解バッファー（ルシフェラーゼアッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ）に置き換えた。２０μｌの各細胞溶解液をルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に好適なチューブに入れた。ルミノメーターにより、１００μｌのルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を細胞溶解液に加えた。次に、これはルシフェラーゼにより触媒される酵素反応によって発せられた光の量を測定した。結果は相対発光量（ＲＬＵ）で表される。ルシフェラーゼｍＲＮＡによってＣａｃｏ−２細胞またはＣ２Ｃ１２細胞が生産したルシフェラーゼタンパク質の量を、６６０ｎｍタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて総細胞タンパク質をアッセイすることにより正規化した。このために、１００μｌの細胞溶解液を１．５ｍｌの試薬と混合し、６６０ｎｍで吸光度を測定した。較正範囲はウシ血清アルブミン溶液を用いて定めた。よって、ルシフェラーゼ活性はタンパク質１ミリグラム当たりのＲＬＵで表される。
【０１５１】
結果：
結果を図２、３および４に示す。無キャップＭＢ５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、Ｃａｃｏ−２細胞において、ルシフェラーゼタンパク質の低く短い発現を誘導する。キャップが存在しないと、ｍＲＮＡはタンパク質にまれにしか翻訳されず、Ｘｒｎ１によって急速に分解される（図２参照）。
【０１５２】
無キャップＭＢ７−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、Ｃａｃｏ−２細胞において、無キャップＭＢ５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡよりも強く、持続するルシフェラーゼタンパク質発現を示す。ＩＲＥＳ領域はリボソームを動員するが、有意なＸｒｎ１耐性は与えない（図２参照）。
【０１５３】
無キャップＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、キャップ付きＭＢ５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡで得られたものと同様のルシフェラーゼ発現動態を誘導する（図２および３参照）。これは、ＷＮＶウイルスのＸｒｎ１に耐性のある２つの配列の付加が、ｍＲＮＡにＭＢ５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡキャップと同様のＸｒｎ１耐性を与えることを意味する。キャップおよびＸｒｎ１に耐性の配列を欠くＭＢ７−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、無キャップＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡと無キャップＭＢ５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡの間の中間のルシフェラーゼ発現を誘導する（図２参照）。
【０１５４】
ＭＢ９−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、その３’−ＵＴＲ末端がポリ（Ａ）を欠くことでＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡと異なる。それがＣａｃｏ−２細胞において誘導するルシフェラーゼ発現は、ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡによって誘導されるものよりも著しく低く、持続性も低い（図３参照）。
【０１５５】
ヒト間葉系幹細胞では、ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、意外なことに有利にも、極めて長期間持続するルシフェラーゼ発現を誘導する。実際に、発現が経時的に低下するとしても、それはトランスフェクションの４８日後でもなお検出可能である（図４参照）。
【０１５６】
実施例６：マウス筋肉および真皮のトランスフェクション
材料および方法：
ａ）動物の飼育：
筋肉の場合、８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスをオープンケージで、ケージ当たり５個体として飼育した。昼／夜サイクルは自動装置で管理した（１２時間昼／１２時間夜）。マウスに餌をやり、濾過水を自由に摂らせた。皮膚の場合、６週齢雄ＯＦ１マウスをオープンケージで、ケージ当たり４個体として飼育した。
【０１５７】
ｂ）ｍＲＮＡサンプル即時調製：
各筋肉内注射のために、２３０ｍＭのＮａＣｌを含有する裸のｍＲＮＡ溶液１００μｌを調製した。
【０１５８】
各皮内注射のために、１６０ｍＭのＮａＣｌを含有する裸のｍＲＮＡ溶液１７μｌを調製した。
【０１５９】
ＣＰＰ−Ｈ６ペプチドを用いた場合、これをｍＲＮＡと混合し、５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５および０．７ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下、室温で３０分間インキュベートした。
【０１６０】
ｃ）ｍＲＮＡの皮内注射および筋肉内注射：
マウスの麻酔はイソフルランを用いて行った。筋肉内注射の場合、ブプレノルフィンの注射によって鎮痛を与えた。皮内注射の場合、背部の皮膚を３〜４日早く剃った（詳細は実施例１０を参照）。
【０１６１】
１００μｌおよび１７μｌのｍＲＮＡ溶液をそれぞれ大腿二頭筋および皮膚に注射した。動物を翌朝までケージに戻した。
【０１６２】
ｄ）皮膚および筋肉サンプル：
筋肉の場合、注射の１６時間後にマウスをＣＯ２で安楽死させた。皮膚の場合、マウスをイソフルランで麻酔し、注射の１８時間後に頚椎脱臼により安楽死させた。皮膚および筋肉注射部位を採取した。これらの生検を生理食塩水で洗浄し、細片とし、溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有するチューブに入れた。これらのチューブを液体窒素中ですぐに凍結させた。
【０１６３】
ｅ）皮膚および筋肉生検からの細胞の溶解：
各皮膚および筋肉生検に対して３回の凍結／解凍サイクルを行った。実際には、生検と溶解バッファーを含有するチューブを−８０℃で１０分間凍結させた。次に、それらを水浴中、室温で２分間解凍し、ボルテックスを用いて軽く混合した。組織残渣を沈降させ、細胞溶解液の明澄な上清を得るためにチューブを５０００ｘｇ、２０℃で５分間遠心分離した。
【０１６４】
ｆ）ルシフェラーゼ活性の測定：
２０μｌの各細胞溶解液を各生検でルシフェラーゼ発現を測定するために使用した。チューブルミノメーターは各サンプルに１００μｌのルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、発せられた光の量を１０秒間測定した。結果は、相対発光量すなわちＲＬＵで表す。
【０１６５】
次に、６６０ｎｍタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いるタンパク質アッセイのために、細胞溶解液を８〜２０倍希釈した。１００μｌの希釈細胞溶解液を１．５ｍｌの試薬と６分間混合し、吸光度を６６０ｎｍで測定した。較正範囲は０〜７５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンで行った。
【０１６６】
結果：
結果を図５に示す。骨格筋（Ａ）および皮膚（Ｂ）では、無キャップＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、それらの注射の１６時間後（筋肉の場合）または１８時間後（真皮の場合）にキャップ付きＭＢ５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡよりも大きいルシフェラーゼ発現を誘導する。これらの結果は、これら２つのｘｒＲＮＡ配列（ここではＷＮＶウイルス由来）およびＩＲＥＳ（ここではＥＭＣＶ由来）の存在が、ｍＲＮＡにイン・ビボにおいてＭＢ５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡのキャップよりも優れたＸｒｎ１耐性および翻訳効率を与えることを示す。実際に、極めて意外にも、マウスの筋肉組織における１０μｇのＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡのトランスフェクションは、同用量のキャップ付きＭＢ５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡで見られるものの２．６倍高いルシフェラーゼ発現をもたらす（図５Ａ参照）。同様に、皮膚における５μｇのＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡのトランスフェクションは、同用量のキャップ付きＭＢ５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡで見られるものの９．３倍高いルシフェラーゼ発現をもたらす（図５Ｂ参照）。
【０１６７】
従って、ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、キャップ付きＭＢ５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡに完全に取って代わることができ、しかもより有利でありさえする。
【０１６８】
実施例７：ＭＢ８−２Ａｐｒｏ  ｍＲＮＡの細胞毒性
材料および方法：
哺乳動物細胞における２Ａｐｒｏタンパク質の発現は、アポトーシスまたはネクローシスにより細胞死を引き起こすまでに毒性を誘導し得る（Ｇｏｌｄｓｔａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。これらの過程で、細胞は乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を細胞外環境に放出する。このＬＤＨ活性は市販のキットＣｙｔｏＴｏｘ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定することができる。
【０１６９】
ＭＢ８−２Ａｐｒｏ  ｍＲＮＡ（配列番号８０）は、ヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）ゲノム由来の２Ａ非構造タンパク質（配列番号８１の配列を有する２Ａｐｒｏ）をコードするｍＲＮＡである。このｍＲＮＡは、ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡのものと同一の配列番号５７の５’非コード配列（ＵＴＲ）、ならびにポリ（Ａ）テールを含んでなる配列番号６０の３’−ＵＴＲ領域を有する。
【０１７０】
実施例４に記載されるように、７５０ｎｇのＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ単独またはＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡとＭＢ８−２Ａｐｒｏ  ｍＲＮＡの混合物を、ｐｅｐＭＢ１ペプチドとの複合体とした。
【０１７１】
ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ単独またはＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡとＭＢ８−２Ａｐｒｏ  ｍＲＮＡの２種類の異なるモル比での混合物をＣ２Ｃ１２細胞にトランスフェクトした。具体的には、４８ウェルプレートの１ウェルからのＣ２Ｃ１２細胞をｍＲＮＡ／ｐｅｐＭＢ１複合体とともに１時間インキュベートした。１８時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した（図６）。非トランスフェクト・非溶解Ｃ２Ｃ１２細胞を陰性対照とし、培養培地へ全てのＬＤＨを放出させるためにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で溶解した非トランスフェクトＣ２Ｃ１２細胞を陽性対照とした。
【０１７２】
結果：
ｍＲＮＡ混合物は、最高のモル比（ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ：ＭＢ８−２Ａｐｒｏ  ｍＲＮＡ比９：１）であっても細胞傷害性を誘導しなかった。これはウイルスプロテアーゼの発現が細胞傷害性を誘導しないことを示す（図９）。
【０１７３】
実施例８：ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡおよびＭＢ８−２Ａｐｒｏ  ｍＲＮＡの同時トランスフェクションにより最適化されたルシフェラーゼ発現動態
材料および方法：
上記の方法に従い、毒性なく、ＭＢ８−ｌｕｃ２ｍＲＮＡとＭＢ８−２Ａｐｒｏ  ｍＲＮＡは種々の比率でＣ２Ｃ１２細胞に同時トランスフェクトされた。１８時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した（図７）。次に、上記の方法に従い、トランスフェクション後わずか１８時間にルシフェラーゼ発現の改善が見られたかどうかを決定するために、トランスフェクション後６時間〜７日の動態を調べた。
【０１７４】
結果：
意外にも、ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡとＭＢ８−２Ａｐｒｏ  ｍＲＮＡの同時トランスフェクションは、Ｃ２Ｃ１２細胞において、全ての試験比で少なくとも２．５倍、ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡのルシフェラーゼ発現を増強した。最良のＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ：ＭＢ８−２Ａｐｒｏ  ｍＲＮＡモル比は４６５：１であり、ルシフェラーゼ発現を３．４倍増強した。
【０１７５】
トランスフェクション後６時間〜７日に調べた動態は、意外にも、ルシフェラーゼ発現の改善が少なくとも１週間見られたことを示す。実際に、ルシフェラーゼ発現は平均で２．４倍に増大した（図７）。
【０１７６】
実施例９：筋肉におけるｍＲＮＡトランスフェクションの効率に対するＲＮＡアプタマーの効果
本発明によるｍＲＮＡ分子のインターナリゼーションを改善するために、種々のアプタマーを、下記のようにＲＮＡ分子に組み込んだ。次に、ルシフェラーゼ発現の改善が見られ得るかどうかを決定するためにこれらのアプタマーの効果をイン・ビボで評価した。
【０１７７】
材料および方法：
アプタマーの選択
Ｃ２Ｃ１２細胞に浸透するアプタマーを選択した。まず、５’プライマーをハイブリダイズさせた後に一本鎖ＤＮＡライブラリーから一本鎖ＤＮＡを伸張させることによって二本鎖ＤＮＡを作出した。このようにして得られた二本鎖ＤＮＡを次に、当業者に周知の方法に従って、沈降させ、精製した。
【０１７８】
次に、精製した断片を、Ｔ７  ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ転写キット（２０μｌ／回）を用いて転写した後、ｓｓＤＮＡおよびＲＮＡ精製キットを用いてＲＮＡ精製を行うことによってＲＮＡアプタマーライブラリーを得た。最後に、混入ＤＮＡを除去するために、この溶液をＤＮアーゼＩで処理する。アプタマーを１倍ＤＭＥＭ＋ＩＴＳに８μＭ  ＲＮＡ（１２８８μｇ／５ｍｌ）で溶解させる。アプタマーを選択するために、抗生物質または血清不含のＤＭＥＭで予め２回洗浄した細胞に５ｍｌのＤＭＥＭ／ＩＴＳ／ＲＮＡ溶液を加える。混合物を含有するフラスコを１５分毎に軽く振盪しながら、細胞を３７℃で１時間インキュベートする。細胞を含有するフラスコを次に氷上に置き、細胞に浸透しなかったＲＮＡアプタマーを除去するために細胞を１５ｍＬの冷１倍ＰＢＳで５回洗浄する。その後、細胞をＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で溶解させ、フェノール−クロロホルム法により全ＲＮＡを抽出する。内在ＲＮＡをＲＮアーゼＡで消化すると３’プライマーとハイブリダイズしたＲＮＡが残り、スーパースクリプトＩＩＩ酵素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により逆転写した後、５’プライマー（１００μＭ）、３’プライマー（１００μＭ）、Ｑ５  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）および１倍濃度のＱ５  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘバッファーの存在下でＰＣＲ増幅を行う。アプタマーＲＮＡライブラリーの取得を可能とするこれらの工程の全てを繰り返す。よって、Ｃ２Ｃ１２細胞に浸透するＲＮＡアプタマーの２サイクルの選択が実行される。
【０１７９】
Ｃ２Ｃ１２細胞に浸透する２つのＲＮＡアプタマー（ＢおよびＣ）を選択し、配列決定を行った（それぞれ配列番号６５および６６）。次に、ＲＮＡアプタマーＢおよびＣをＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ中のｘｒＲＮＡ１の上流に挿入して、それぞれＭＢ１３−ｌｕｃ２およびＭＢ１４−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡを作出した。
【０１８０】
ポリヒスチジンペプチドモチーフに強く結合するアプタマー
ｍＲＮＡのインターナリゼーションを向上させることを狙いとした第２の戦略は、マグネシウムの存在下でポリヒスチジンペプチドモチーフに強く結合し得る別のＲＮＡアプタマー（アプタマーＡ）をＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ中のｘｒＲＮＡ１の上流に挿入することからなった。ＲＮＡアプタマーＡを組み込んだｍＲＮＡはＭＢ１１−ｌｕｃ２と呼称した。マウス筋線維浸透ペプチドＭ１２（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４参照）は、スペーサーを介して（ここでは、グリシンおよびセリンアミノ酸を含んでなる）ヘキサヒスチジンモチーフと連結した。種々のスペーサーは，例として、配列番号７５（ＲＲＱＰＰＲＳＩＳＳＨＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＨＨＨＨＨＨ）、配列番号７６（ＰＱＲＤＴＶＧＧＲＴＴＰＰＳＷＧＰＡＫＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＨＨＨＨＨＨ）、配列番号７７（ＧＰＦＨＦＹＱＦＬＦＰＰＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＨＨＨＨＨＨ）または配列番号７８（ＧＳＰＷＧＬＱＨＨＰＰＲＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＨＨＨＨＨＨ）（スペーサー配列に下線）の配列により示される。このようにして形成されたペプチドはＭ１２−Ｈ６（配列番号７５）と呼称した。ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡを室温で３０分間、Ｍ１２−Ｈ６ペプチドとともにインキュベートした後、マウスの大腿二頭筋に注射した。
【０１８１】
イン・ビボトランスフェクション
雄ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスの大腿二頭筋に、クロロキンの存在下または不在下、５μｇのＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ、ＭＢ１３−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ、ＭＢ１４−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ、またはＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡとＭ１２−Ｈ６ペプチドの複合体でトランスフェクトした。注射の１６時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１８２】
結果：
ＭＢ１３−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡとまさに同様に筋肉にトランスフェクトした（図１０）。極めて有利なことに、Ｃアプタマーを含んでなるＭＢ１４−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは、ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡよりも２．１倍効率的に大腿二頭筋にトランスフェクトした。従って、ＲＮＡアプタマーＣは、筋線維に挿入されたｍＲＮＡ分子のインターナリゼーションを向上させた。
【０１８３】
ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡのトランスフェクション効率は中程度であった（図１０）。意外にも、しかしながら、５μｇのＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ、Ｍ１２−Ｈ６ペプチドおよび５μｇのクロロキンの同時注射は、クロロキンを含まない、ペプチドの存在下のＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡに比べて、トランスフェクション効率を３１倍向上させた。さらに、Ｍ１２−Ｈ６およびクロロキンの存在下のＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡで見られたルシフェラーゼ発現は、極めて有利なことに、ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡで見られたものの２．７倍高かった。
【０１８４】
理論に縛られるものではないが、ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ＲＮＡとＭ１２−Ｈ６ペプチドと複合体の、クロロキンの存在下での高いトランスフェクション効率は、ｍＲＮＡが細胞に浸透した後のクロロキンによるエンドソームの酸性化の遅延によって有利となったと推定できる。クロロキンは、酸性ｐＨでヘキサヒスチジンのプロトン化を遅延させることができ、従って、ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡとＭ１２−Ｈ６ペプチドの間の複合体の不安定化を防ぐ。結果として、エンドソームから逃れたｍＲＮＡは、なお複合体を形成しているＭ１２−Ｈ６の助けでエンドソーム膜を通過することによってサイトゾルへの侵入が促進され得、そこでｍＲＮＡが翻訳される。
【０１８５】
実施例１０：マウスにおける皮内注射プロトコール
ａ−溶液の調製
２０μｇのｍＲＮＡを含有する６０μｌの溶液を各マウスに対して調製した。このために、脱塩水、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（１／８のＨｅｐｅｓ、７／８のナトリウムＨｅｐｅｓ）、ＮａＣｌ（最終１６０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２、ｍＲＮＡ、および場合によりペプチドを混合した。室温で３０分のインキュベーション後、ペプチドはＲＮＡに結合することができた。ｍＲＮＡがペプチドと複合体を形成しない場合は、インキュベーションは無かった。ｍＲＮＡ溶液は、注射されるまで保存のために−８０℃で凍結させた。
【０１８６】
ｂ−皮内注射および生検採取
６週齢の雄ＯＦ１マウスを使用した（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）。これらのマウスを皮内注射の３〜４日前に剃毛した。麻酔は、マスクを用いて行った。麻酔の誘導は４％イソフルラン（Ｐｉｒａｍａｌ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ）で達成した。２％のイソフルランで麻酔を維持した。注射前、予め剃毛した背部の皮膚をアルコールワイプで清浄にした。０．３ｍｍ×８ｍｍ  Ｕ−１００（３０Ｇ）インスリンシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に充填するために、ｍＲＮＡ溶液を室温でゆっくり解凍した。各マウスの剃毛した背部の皮膚に、およそ１７μｌのＲＮＡ溶液の注射を３回行った。丘疹が生じた後に消散した。翌日に生検を行う皮膚領域を特定することを可能とするために油性マーカーを用いてこれらの輪廓を描いた。また、同じケージの動物間の識別を行うためにマーカーを用いてテールにタグ付けを行った。
【０１８７】
注射の１８時間後に、注射領域から皮膚生検を採取した。このために、マウスを麻酔した後、頚椎脱臼により安楽死させた。細胞の溶解を容易にするためにハサミを用いて生検を細片とし、５００μｌの１倍溶解バッファー（５倍Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｙｓｉｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、水で希釈）を含有するチューブに入れた。各チューブを次の工程まで−２０℃で凍結させた。
【０１８８】
ｃ−細胞溶解、ルシフェラーゼおよびタンパク質アッセイ
採集した組織の溶解は、３回の凍結／解凍サイクル（−８０℃で１０分間、水浴にて室温で３分）を行い、ボルテックスミキサーを用いて数秒間混合することによって得た。次に、チューブを２０℃にて５０００ｘｇで５分間遠心分離して組織残渣を沈降させた。上清を別のチューブに移した。
【０１８９】
ルシフェラーゼアッセイは、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。２０μｌの各サンプルを、ルミノメーター用チューブ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ＡｕｔｏＬｕｍａｔ  Ｐｌｕｓ  ＬＢ  ９５３）に入れた。この装置は１００μｌの基質を注入し、発せられた光の量（ＲＬＵ）を測定した。
【０１９０】
タンパク質アッセイは、Ｐｉｅｒｃｅ  ６６０ｎｍタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。較正範囲はウシ血清アルブミン（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および希釈剤としての１倍溶解バッファーで行った。この範囲には１００〜５００μｇタンパク質／ｍｌの範囲が含まれた。ブランクは１００μｌの１倍溶解バッファーを用いて得た。場合によっては、溶解液を１倍溶解バッファーで希釈した。１００μｌの各サンプルをタンパク質アッセイに使用した。１．５ｍｌの試薬をブランクおよびサンプルに加えた。室温、暗所での正確に５分のインキュベーションの後に、各サンプルの吸光度を、分光光度計を用いて６６０ｎｍで測定した。
【０１９１】
実施例１１：皮膚におけるｍＲＮＡトランスフェクションの効率に対するＣＰＰの効果
細胞浸透ペプチド（ＣＰＰ）をＲＮＡアプタマーＡに結合させることにより裸のｍＲＮＡのインターナリゼーションを向上させる戦略は、上記実施例９に記載されるように筋肉に限定されない。ここでは、この戦略を、種々のＣＰＰを用いてマウスの皮膚に適用した。
【０１９２】
材料および方法：
ここでは３種類のＣＰＰを使用した：ＣＰＰ１、ＣＰＰ２およびＣＰＰ３（Ｋａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２参照）。それらをグリシンおよびセリンから構成されるスペーサーによりヘキサヒスチジンに連結して、それぞれ配列番号７６、７７、および７８の配列を有するペプチドＣＰＰ１−Ｈ６、ＣＰＰ２−Ｈ６およびＣＰＰ３−Ｈ６を形成した。
【０１９３】
ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡを、１６０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．７ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを含んでなる予め最適化したバッファー中、漸増量のＣＰＰ３−Ｈ６、ＣＰＰ１−Ｈ６、またはＣＰＰ２−Ｈ６ペプチドとともに３０分間インキュベートした。１６０ｍＭのＮａＣｌを添加した無菌の超純粋脱イオン水に希釈したＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ単独およびＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡも注射し、ここで対照として使用した。
【０１９４】
実施例１０に詳説したプロトコールに従い、ＯＦ１マウスに５．６μｇのＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡまたはＭＢ１１−ｌｕｃ２の皮内注射を行った。また、皮内注射後に、ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ中に存在するＲＮＡアプタマーＡからＣＰＰ３−Ｈ６ペプチドが解離可能であるかどうかを決定するために、マウス皮膚に、１：１比のＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡとＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡの混合物、および０．５モル比の場合と同量のＣＰＰ３−Ｈ６の注射も行った。注射の１８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１９５】
結果：
予想されたように、ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡの注射は、効率的な皮膚トランスフェクションをもたらした。ＣＰＰ３−Ｈ６、０．７ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５ｍＭ  ＨｅｐｅｓとＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡを同時注射してもトランスフェクション効率に有意な影響はなかった（図１１）。
【０１９６】
ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ単独に比べて転写効率を有利にも９．２倍に増大させるＣＰＰ３−Ｈ６ペプチドの最適量は、１  ＣＰＰ３−Ｈ６ペプチド：２  ｍＲＮＡのモル比に相当する（図１１）。さらに、ルシフェラーゼ活性は極めて有利には、ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡで得られるものの２．１倍高く、および従来のＭＢ５−ｌｕｃ２キャップ付きｍＲＮＡで得られるものの１９．５倍高い。
【０１９７】
いずれの２つのｍＲＮＡも一方がＣＰＰ３−Ｈ６と結合しなければ、トランスフェクションは１２．３分の１に低下する（図１１、各２．８μｇのＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡおよびＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ）。これは、皮内注射後にＣＰＰ３−Ｈ６ペプチドは、ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ中に存在するＲＮＡアプタマーＡから解離し得ることを意味する。ｍＲＮＡの半数がＲＮＡアプタマーＡを欠く場合（ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ）、ＣＰＰ３−Ｈ６は効果的にトランスフェクションを向上させることができない。
【０１９８】
ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡはまた、種々のモル比のＣＰＰ１−Ｈ６ペプチドとともにインキュベートした。最良のモル比は、１  ＣＰＰ１−Ｈ６ペプチド：４  ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡであった（図１２）。トランスフェクション効率は、ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ単独の５．４倍に増大した。
【０１９９】
よって、ＣＰＰ１−Ｈ６は、ＣＰＰ３−Ｈ６よりも低い結果であった。これは、皮膚細胞の原形質膜中に存在する各ＣＰＰの受容体のコピー数およびその受容体に対する各ＣＰＰの親和性によって説明することができる。
【０２００】
最後に、ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡをＣＰＰ２−Ｈ６とも種々のモル比でインキュベートした。最良のモル比は、２  ＣＰＰ２−Ｈ６ペプチド：１  ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡであった（図１３）。トランスフェクション効率はＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ単独の１０．６倍に増大し、ＣＰＰ３−Ｈ６ペプチドで得られたものよりも高い。よって、ルシフェラーゼ発現は、従来のＭＢ５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡで得られるものの２２．８倍高い。
【０２０１】
実施例１２：皮膚におけるキャップ付きｍＲＮＡのトランスフェクション効率に対するＣＰＰ−Ｈ６の効果
材料および方法：
キャップ付きｍＲＮＡのトランスフェクション効率に対するＣＰＰ（ここでは、ＣＰＰ２−Ｈ６）の効果を評価するために、アプタマーＡを従来のキャップ付きＭＢ５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲに挿入し、配列番号７０の配列を有するキャップ付きＭＢ１５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡを作出した。実施例１１で上記したように、ＭＢ１５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡを、０．７ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを含んでなるバッファー中で３０分間、ＣＰＰ２−Ｈ６とともにインキュベートした。
【０２０２】
実施例１０で詳説したプロトコールに従い、ＯＦ１マウスで、５．６μｇのＭＢ１５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡの皮内注射を行った。注射の１８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。
【０２０３】
結果：
ＣＰＰ２−Ｈ６ペプチドの不在下で、キャップ付きＭＢ１５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡで得られたルシフェラーゼ発現は、キャップ付きＭＢ５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡで得られたものの１．６８分の１低い。
【０２０４】
キャップ付きＭＢ１５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡとＣＰＰ２−Ｈ６ペプチドの、ｍＲＮＡ当たり２ペプチドのモル比での同時注射は、ＭＢ１５−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡ単独の１．４８倍にトランスフェクション効率を向上させるに過ぎなかった。これは、従来のキャップ付きｍＲＮＡの５’−ＵＴＲへのＲＮＡアプタマーＡの挿入およびこのＲＮＡアプタマーへのＣＰＰ−Ｈ６ペプチドの結合が、キャップ付きｍＲＮＡであるＭＢ１１−ｌｕｃ２で見られるものに比べてトランスフェクション効率を向上させないことを示す（１０．６倍）。キャップ付きｍＲＮＡ分子（アプタマーを含むまたは含まない、ＣＰＰ２−Ｈ６  ＣＰＰに連結されているまたはされていない）にかかわらず、トランスフェクション効率はＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡおよびＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡに関して見られたものよりずっと低いままである。従って、キャップ付きｍＲＮＡ分子よりも本発明のｍＲＮＡ分子を使用することが極めて有利である。
【０２０５】
実施例１３：皮膚におけるイン・ビボルシフェラーゼ発現に対する５’−ＳＬの効果
材料および方法：
上記の実施例１０に詳説したプロトコールに従い、以下のｍＲＮＡ：ＭＢ８−ｌｕｃ２、ＭＢ１１−ｌｕｃ２、ＭＢ１７−ｌｕｃ２、ＭＢ１８−ｌｕｃ２、およびキャップ付きＭＢ５−ｌｕｃ２を皮膚に注射し、注射の１８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。
【０２０６】
結果：
図１５に示すように、少なくとも１つのｘｒＲＮＡ配列およびＩＲＥＳ配列を含んでなる本発明によるｍＲＮＡ（ＭＢ１１−ｌｕｃ２）は、皮膚におけるルシフェラーゼ発現を、キャップ付きｍＲＮＡ（ＭＢ５−ｌｕｃ２）のおよそ２倍増大させる。極めて意外なことに、ステム−ループ（ここでは、配列番号８７の配列を有する５’−ＳＬ）の付加は、ステム−ループがｘｒＲＮＡ１配列の５ヌクレオチド上流に位置する場合には（ＭＢ８−ｌｕｃ２およびＭＢ１８−ｌｕｃ２）、皮膚におけるルシフェラーゼ発現を、ｘｒＲＮＡおよびＩＲＥＳ配列単独の場合（ＭＢ１１−ｌｕｃ２）のさらに約４．３増大させる。
【０２０７】
しかしながら、ステム−ループがｘｒＲＮＡ配列のおよそ７０ヌクレオチド上流位置する場合には、このステム−ループは、そのステム−ループが存在しない場合にすでに見られるものを超えて効率を向上させることはない。実際に、ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡとＭＢ１７−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡの翻訳効率は同等である。ｘｒＲＮＡ配列とＩＲＥＳ配列の間にアプタマーＡが位置すると（ＭＢ１８−ｌｕｃ２）、極めて意外なことに、ＭＢ１１−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡおよびＭＢ１７−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡに比べていっそう翻訳効率が高まる。よって、ＭＢ８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡおよびＭＢ１８−ｌｕｃ２  ｍＲＮＡは同等の翻訳効率を有する。
【０２０８】
結論：
本発明によるｍＲＮＡ分子は、少なくとも２倍、好ましくは約１０倍増大するタンパク質発現収量を持ちつつ、キャップ付きｍＲＮＡ分子のおよそ３０分の１の合成コストである。さらに、本発明のｍＲＮＡは、キャップ付きｍＲＮＡと少なくとも同等に安定であり、イン・ビトロ転写によるその生産は、キャップ分子またはその類似体が存在しないことで簡単となる。ＨＲＶ２の２Ａプロテアーゼをコードする本発明のｍＲＮＡは、対象とするタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳を、これらの２つの分子が同時トランスフェクトされた場合に増強することを可能とする。さらに、筋肉または皮膚などの組織におけるトランスフェクションの効率は、例えば、本発明によるｍＲＮＡ分子の５’−ＵＴＲ領域に、細胞に直接浸透するＲＮＡアプタマー、ＣＰＰ（上記のようなＲＮＡアプタマーに結合）を挿入することにより、および／またはｘｒＲＮＡ配列の上流の５’−ＵＴＲ領域の５’末端にステム−ループを付加することによって向上させることができる。
【０２０９】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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