(57)【要約】担体との共製剤化のために微生物を選択するための方法が提供される。一部の例では、本方法は、１つもしくは複数のジピコリン酸（ＤＰＡ）合成酵素遺伝子を含む微生物、１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素タンパク質を発現する微生物、および／またはＤＰＡを生成する微生物を同定すること；および担体との共製剤化のために微生物を選択することを含む。本方法は、必要に応じて、選択された微生物を担体と共製剤化することを含む。一部の例では、本方法は、微生物中の１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素遺伝子または１つもしくは複数のＤｐａＡおよび／もしくはＤｐａＢタンパク質を検出することを含む。他の例では、本方法は、例えば、蛍光アッセイを使用して、微生物または微生物を含有する培地中でＤＰＡを検出することを含む。
2021526855.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Bacillus  amyloliquefaciens、Bacillus  firmus、Bacillus  flexus、Bacillus  licheniformis、Bacillus  megaterium、Bacillus  pumilus、Bacillus  koreensis、Bacillus  drentensis、Bacillus  subtilis、Clostridium  bifermentans、Clostridium  beijerinckii、Clostridium  pasteurianum、Lactobacillus  paracasei、Fontibacillus  sp.(panacisegetis)、Oceanobacillus  oncorhynchi、Paenibacillus  lautus、Paenibacillus  azoreducens、Paenibacillus  chibensis、Paenibacillus  cookii、Paenibacillus  sp.(chitinolyticus)、Paenibacillus  sp.(P1XP2)、Pseudomonas  sp.およびStreptomyces  griseusのそれぞれを含むかまたはそれからなる微生物種の細胞を含む組成物。
【請求項２】
配列番号３〜２５のそれぞれと少なくとも９９％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列を有する微生物を含むかまたはそれらからなる微生物種の細胞を含む組成物。
【請求項３】
配列番号３〜２５のそれぞれの１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列を有する微生物を含むかまたはそれらからなる微生物種の細胞を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
アメリカンタイプカルチャーコレクションの寄託番号ＰＴＡ−１２５９２４を含む組成物。
【請求項５】
キチン、キトサン、グルコサミン、アミノ酸、および液体肥料のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
土壌、植物、植物の部分、または種子を請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む方法。
【請求項７】
前記土壌、植物、植物の部分、または種子をキチン、キトサン、グルコサミン、およびアミノ酸のうちの１つまたは複数と接触させることをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記土壌、植物、植物の部分、または種子を液体肥料と接触させることをさらに含む、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記土壌、植物、植物の部分、または種子を１つもしくは複数の農薬、１つもしくは複数の殺真菌剤、１つもしくは複数の除草剤、１つもしくは複数の殺虫剤、１つもしくは複数の植物ホルモン、１つもしくは複数の植物誘導因子、またはそれらの２つもしくはそれより多くの組合せと接触させることをさらに含む、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記土壌、植物、植物の部分、または種子を前記組成物と接触させる前に、前記組成物中の前記微生物種を活性化させることをさらに含む、請求項６から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物および担体または種子を含む組成物。
【請求項１２】
前記担体が、尿素、カリ、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、粘土、ピート、石炭、無機土壌、木炭、おがくず、コムギ／ダイズ／エンバクのふすま、堆肥、コココイヤー、パーライト、バーミキュライト、ベントナイト、Ａｚｏｍｉｔｅ（登録商標）、カオリン、シリケート、軽石、タルク、液体肥料または液体防塵化学物質を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記種子が、トウモロコシ種子、ヒマワリ種子、セイヨウアブラナ種子、コムギ種子、キュウリ種子、トマト種子、イネ種子、および／またはワタ種子を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
１つまたは複数の殺虫剤および／または殺真菌剤をさらに含む、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
担体または種子との共製剤化のために微生物を選択するための方法であって：
１つまたは複数のジピコリン酸（ＤＰＡ）合成酵素遺伝子を含む微生物、１つまたは複数のＤＰＡ合成酵素タンパク質を発現する微生物、および／またはＤＰＡを生成する微生物を同定すること；および
担体または種子との共製剤化のために前記微生物を選択すること
を含む、方法。
【請求項１６】
前記選択された微生物を前記担体または前記種子と共製剤化することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つまたは複数のＤＰＡ合成酵素遺伝子が、ＤＰＡ合成酵素サブユニットＡ（ＤｐａＡ）遺伝子および／またはＤＰＡ合成酵素サブユニットＢ（ＤｐａＢ）遺伝子を含む、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤｐａＡ遺伝子が、配列番号２６〜４１のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも２０％の配列同一性を有するＤｐａＡタンパク質をコードするか、または前記ＤｐａＢ遺伝子が、配列番号４２〜５６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも２０％の配列同一性を有するＤｐａＢタンパク質をコードする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤｐａＡ遺伝子が、配列番号２６〜４１のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するＤｐａＡタンパク質をコードするか、または前記ＤｐａＢ遺伝子が、配列番号４２〜５６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するＤｐａＢタンパク質をコードする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＤｐａＡ遺伝子が、配列番号２６〜４１のアミノ酸配列のいずれか１つを含むかもしくはそれらからなるＤｐａＡタンパク質をコードするか、または前記ＤｐａＢ遺伝子が、配列番号４２〜５６のアミノ酸配列のいずれか１つを含むかもしくはそれらからなるＤｐａＢタンパク質をコードする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つまたは複数のＤＰＡタンパク質が、ＤＰＡ合成酵素サブユニットＡ（ＤｐａＡ）タンパク質および／またはＤＰＡ合成酵素サブユニットＢ（ＤｐａＢ）タンパク質を含む、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤｐａＡタンパク質が、配列番号２６〜４１のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも２０％の配列同一性を含むかまたは前記ＤｐａＢタンパク質が、配列番号４２〜５６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも２０％の配列同一性を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＤｐａＡタンパク質が、配列番号２６〜４１のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むかまたは前記ＤｐａＢタンパク質が、配列番号４２〜５６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＤｐａＡタンパク質が、配列番号２６〜４１のアミノ酸配列のいずれか１つを含むかもしくはそれらからなり、または前記ＤｐａＢタンパク質が、配列番号４２〜５６のアミノ酸配列のいずれか１つを含むかもしくはそれらからなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
１つまたは複数のジピコリン酸（ＤＰＡ）合成酵素遺伝子を含む微生物を同定することが、前記１つまたは複数のＤＰＡ合成酵素遺伝子をコードする核酸または核酸配列を検出することを含む、請求項１５から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸が、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸を検出することが、核酸配列決定、核酸増幅、核酸ハイブリダイゼーション、およびマイクロアレイ解析のうちの１つまたは複数を含む、請求項２５または請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記１つまたは複数のＤＰＡ合成酵素タンパク質を発現する微生物を同定することが、イムノアッセイまたは質量分析を含む、請求項１５から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記イムノアッセイが、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、または免疫組織化学を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＤＰＡを生成する微生物を同定することが、前記微生物中または前記微生物を含有する培地中でＤＰＡを検出することを含む、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
ＤＰＡを検出することが、蛍光アッセイを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記蛍光アッセイが、テルビウム−ＤＰＡ蛍光アッセイを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＤＰＡを生成する微生物を同定することが、１つもしくは複数のＥｔｆＡもしくはＩｓｆ遺伝子を含むおよび／または１つもしくは複数のＥｔｆＡもしくはＩｓｆタンパク質を発現する微生物を同定することを含む、請求項１５または請求項１５に記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｉｓｆタンパク質が、配列番号５７〜６６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも２０％の配列同一性を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｉｓｆタンパク質が、配列番号５７〜６６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記Ｉｓｆタンパク質が、配列番号５７〜６６のアミノ酸配列のいずれか１つを含むかまたはそれからなる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記選択された微生物が、担体または種子と共製剤化される場合に、１つもしくは複数のジピコリン酸（ＤＰＡ）合成酵素遺伝子を含まない、１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素タンパク質を発現しない、および／またはＤＰＡを生成しない微生物と比較して、生存能力を増加させた、請求項１５から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記選択された微生物を前記担体または種子と共製剤化することが、１種または複数種の選択された微生物を前記担体または種子と接触させることを含む、請求項１６から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記１種または複数種の選択された微生物が、液体培地中にある、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記１種または複数種の選択された微生物が、固体または乾燥形態である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記担体または種子を１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素遺伝子を含まない、１つもしくは複数のＤＰＡタンパク質を発現しない、および／またはＤＰＡを生成しない１種または複数種の微生物と接触させることをさらに含む、請求項３８から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記担体が、乾燥または固体担体を含む、請求項１６から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記乾燥または固体担体が、乾燥肥料、土壌由来物質、有機物質、不活性材料、またはこれらの２つまたはそれより多くの混合物を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記乾燥肥料が、尿素、カリ、リン酸アンモニウム、および／もしくは硝酸アンモニウムを含み、前記土壌由来物質が、粘土、ピート、石炭、もしくは無機土壌を含み；前記有機物質が、木炭、おがくず、コムギ／ダイズ／エンバクのふすま、堆肥、もしくはコココイヤーを含み；または前記不活性材料が、パーライト、バーミキュライト、ベントナイト、Ａｚｏｍｉｔｅ（登録商標）、カオリン、シリケート、軽石、もしくはタルクを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記液体担体が、液体肥料または液体防塵化学物質を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記種子が、トウモロコシ種子、ヒマワリ種子、セイヨウアブラナ種子、コムギ種子、キュウリ種子、トマト種子、イネ種子、および／またはワタ種子を含む、請求項１６から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記処理された種子が、１つもしくは複数の殺虫剤および／または殺真菌剤をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１８年６月６日に出願された米国仮出願第６２／６８１，４６９号の利益を主張する。
【０００２】
分野
本開示は、ジピコリン酸を生成する微生物および生存能力の向上した微生物を同定する方法、微生物を担体と共に共製剤化する方法、ならびに微生物および／または共製剤を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
微生物を基礎とする植物バイオスティミュラントは、生体系の健康を保護する持続可能な農業実践をもたらす。さらに、植物および土壌のマイクロビオームを有益な微生物で補充することは、植物の成長および植物の適応度を促進する、生産性を増加させる、土壌肥沃度を改善する、ならびに化学物質の投入を低減する潜在性を有し、より持続可能な農業実践をもたらす。現在の農業実践では、微生物バイオスティミュラントを、多数の湿潤または乾燥した担体と共施用および／または共製剤化することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
微生物接種剤は、使用される担体（複数可）の化学的性質に影響を受けやすい場合がある。さらに、施用前の保管状態および保管期間も微生物に影響を及ぼし得る。これらの因子は、それらの生存能力に負の影響を与え、最終的に本技術分野におけるそれらの有効性を限定し得る。微生物の生存の改善および／または微生物の担体もしくは種子との共製剤化の改善をもたらす組成物および方法が本明細書に開示される。一部の実施形態では、本方法は、単独でおよび／または１つもしくは複数の担体もしくは種子との共製剤化のいずれかで、生存能力または生存時間が拡大された１種または複数種の微生物を選択することを含む。
【０００５】
一部の実施形態では、ジピコリン酸（ＤＰＡ）を生成する微生物およびこのような微生物を含む組成物が本明細書に開示される。一例では、組成物としては、Bacillus  amyloliquefaciens、Bacillus  firmus、Bacillus  flexus、Bacillus  licheniformis、Bacillus  megaterium、Bacillus  pumilus、Bacillus  koreensis、Bacillus  drentensis、Bacillus  subtilis、Clostridium  bifermentans、Clostridium  beijerinckii、Clostridium  pasteurianum、Lactobacillus  paracasei、Fontibacillus  sp.(panacisegetis)、Oceanobacillus  oncorhynchi、Paenibacillus  lautus、Paenibacillus  azoreducens、Paenibacillus  chibensis、Paenibacillus  cookii、Paenibacillus  sp.(chitinolyticus)、Paenibacillus  sp.(P1XP2)、Pseudomonas  sp.およびStreptomyces  griseusが挙げられる（一部の例では、本明細書において「ＤＦＣ」コンソーシアムと称される）。一実施形態では、本組成物は、２０１９年５月１６日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ））に寄託され、寄託番号ＰＴＡ−１２５９２４が付与された微生物種の細胞を含む。他の実施形態では、開示される微生物コンソーシアまたは組成物は、配列番号３〜２５と少なくとも９５％の同一性（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、またはそれより高い割合の同一性）を有する１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を有する２種またはそれより多い（例えば、５種もしくはそれより多い、１０種もしくはそれより多い、１５種もしくはそれより多い、２０種もしくはそれより多い、またはすべて）微生物を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。
【０００６】
本開示の微生物またはコンソーシア（例えば、ＤＦＣコンソーシアム）および１つもしくは複数の担体（例えば、乾燥担体または液体担体）または１種もしくは複数種の種子を含む組成物も開示される。一部の例では、担体として、液体肥料もしくは乾燥肥料、土壌由来物質、有機物質、不活性材料、防塵化学物質、またはそれらの２つまたはそれより多くの混合物が挙げられる。
【０００７】
一部の実施形態では、本方法は、１つもしくは複数のジピコリン酸（ＤＰＡ）合成酵素遺伝子を含む微生物、１種もしくは複数種のＤＰＡ合成酵素タンパク質を発現する微生物、および／または検出可能な量のＤＰＡを生成する微生物を同定することを含む、担体または種子との共製剤化のために微生物を選択すること；ならびに担体との共製剤化のために微生物を選択することを含む。一部の実施形態では、本方法は、選択された微生物を担体または種子と共に共製剤化することも含む。一部の例では、選択された微生物は、以下に限定されないが、表２６に列挙されたもののすべてを含む、表２５または２６に含まれるものの１つまたは複数を含む。
【０００８】
一部の例では、本方法は、微生物中の、１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素遺伝子（例えば、ＤＰＡ合成酵素サブユニットＡ（ＤｐａＡ）遺伝子および／またはＤＰＡ合成酵素サブユニットＢ（ＤｐａＢ）遺伝子）または１つもしくは複数のＤｐａＡおよび／もしくはＤｐａＢタンパク質を検出することを含む。ＤｐａＡ遺伝子は、図１のアミノ酸配列（例えば、配列番号２６〜４１）のいずれか１つに対して少なくとも２０％（例えば、少なくとも６０％）の配列同一性を有するＤｐａＡタンパク質をコードする核酸を含む。ＤｐａＢ遺伝子は、図２のアミノ酸配列（例えば、配列番号４２〜５６）のいずれか１つに対して少なくとも２０％（例えば、少なくとも６０％）の配列同一性を有するＤｐａＢタンパク質をコードする核酸を含む。ＤｐａＡタンパク質は、図１のアミノ酸配列（例えば、配列番号２６〜４１）のいずれか１つに対して少なくとも２０％（例えば、少なくとも６０％）の配列同一性を有するＤｐａＡタンパク質を含む。ＤｐａＢタンパク質は、図２のアミノ酸配列（例えば、配列番号４２〜５６）のいずれか１つに対して少なくとも２０％（例えば少なくとも６０％）の配列同一性を有するＤｐａＢタンパク質を含む。さらなる例では、本方法は、微生物中の１つまたは複数のＩｓｆ遺伝子またはタンパク質を検出することを含む。Ｉｓｆ遺伝子は、図３のアミノ酸配列（例えば、配列番号５７〜６７）のいずれか１つに対して少なくとも２０％（例えば、少なくとも６０％）の配列同一性を有するＩｓｆタンパク質をコードする核酸を含む。Ｉｓｆタンパク質は、図３のアミノ酸配列（例えば、配列番号５７〜６７）のいずれか１つに対して少なくとも２０％（例えば、少なくとも６０％）の配列同一性を有するＩｓｆタンパク質を含む。他の例では、本方法は、例えば、蛍光アッセイを利用して、微生物または微生物を含有する媒体中でＤＰＡを検出することを含む。
【０００９】
一部の実施形態では、本方法は、液体形態または乾燥形態で選択された微生物（以下に限定されないが、本明細書に開示される微生物コンソーシアを含む）を１つまたは複数の液体担体または乾燥担体と接触させることによって、１種または複数種の選択された微生物を担体と共に共製剤化することを含む。一部の例では、担体として、液体肥料もしくは乾燥肥料、土壌由来物質、有機物質、不活性材料、防塵化学物質、またはそれらの２つもしくはそれより多くの混合物が挙げられる。他の例では、本方法は、種子を１種または複数種の選択された微生物（以下に限定されないが、本明細書に開示される微生物コンソーシアを含む）で処理することを含む。一部の例では、本方法は、１種または複数種の選択された微生物ならびに１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素遺伝子を含まない、１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素タンパク質を発現しない１種もしくは複数種の微生物、および／または検出可能な量のＤＰＡを生成しない微生物を担体または種子と共に共製剤化することをさらに含む。
【００１０】
本開示の前記および他の特徴は、以下の詳細な説明から、それに続く添付の図面を参照して、より明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１は、示された細菌由来のＤｐａＡタンパク質配列のアライメントである。１３株に由来する１４個のＤｐａＡ配列（配列番号２６〜３９）を、デフォルト設定を有するＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇ／ｏｍｅｇａ）を使用して整列させた。次いで、６０％の最小配列の同一性閾値を使用して、コンセンサス配列を作成した（「コンセンサス６０」；配列番号４０）。ＰＲＫ０８３０６（配列番号４１）は、ＮＣＢＩ  ＣＤＤ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｆａｍｉｌｙデータベース（ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｃｄｄｓｒｖ．ｃｇｉ）から取得したＤｐａＡスーパーファミリーのコンセンサス配列である。
【図１Ｂ】図１は、示された細菌由来のＤｐａＡタンパク質配列のアライメントである。１３株に由来する１４個のＤｐａＡ配列（配列番号２６〜３９）を、デフォルト設定を有するＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇ／ｏｍｅｇａ）を使用して整列させた。次いで、６０％の最小配列の同一性閾値を使用して、コンセンサス配列を作成した（「コンセンサス６０」；配列番号４０）。ＰＲＫ０８３０６（配列番号４１）は、ＮＣＢＩ  ＣＤＤ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｆａｍｉｌｙデータベース（ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｃｄｄｓｒｖ．ｃｇｉ）から取得したＤｐａＡスーパーファミリーのコンセンサス配列である。
【００１２】
【図２】図２は、示された細菌由来のＤｐａＢタンパク質配列のアライメントである。１３株に由来する１３個のＤｐａＢ配列（配列番号４２〜５４）を、デフォルト設定を有するＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇ／ｏｍｅｇａ）を使用して整列させた。次いで、６０％の最小配列の同一性閾値を使用して、コンセンサス配列を作成した（「コンセンサス６０」；配列番号５５）。ＰＲＫ０８３０５（配列番号５６）は、ＮＣＢＩ  ＣＤＤ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｆａｍｉｌｙデータベース（ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｃｄｄｓｒｖ．ｃｇｉ）から取得したＤｐａＢスーパーファミリーのコンセンサス配列である。
【００１３】
【図３】図３は、５種の細菌由来の１０個のＩｓｆタンパク質配列（配列番号５７〜６６）およびコンセンサス配列（配列番号６７）のアライメントを示す。
【００１４】
【図４】図４は、示した担体と組み合わせた細菌の生存をまとめたグラフである。
【００１５】
【図５】図５は、パーライトまたは微生物コンソーシアム（ＡＭＣ１）を含浸したパーライトで処理した植物における３２日目のキュウリのシュートの乾燥重量を示すグラフである。
【００１６】
【図６】図６は、パーライト、ＤＦＣ微生物コンソーシアムを含浸したパーライト、ベントナイト、およびＤＦＣ微生物コンソーシアムを含浸したベントナイトで処理した植物における３２日目のキュウリのシュートの乾燥重量を示すグラフである。
【００１７】
【図７】図７は、未処理の植物、液体ＤＦＣコンソーシアムで処理した植物、およびＤＦＣ微生物コンソーシアムを含浸したパーライトで処理した植物における３２日目のキュウリのシュートの乾燥重量を示すグラフである。
【００１８】
【図８】図８は、殺虫剤／殺真菌剤処理と共に、トウモロコシおよびダイズ種子と組み合わせたＤＦＣコンソーシアム由来の細菌の生存を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
配列表
本明細書または添付の配列表に列挙された任意の核酸およびアミノ酸配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に定義されているヌクレオチドおよびアミノ酸の標準的な文字の略記を使用して示されている。少なくとも一部の事例では、各核酸配列の一本鎖のみが示されているが、示された鎖のいずれかを参照して、相補鎖が含まれていると理解される。
【００２０】
配列番号１は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡコンセンサス核酸配列である。
【００２１】
配列番号２は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡコンセンサス核酸配列である。
【００２２】
配列番号３は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列である。
【００２３】
配列番号４は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｚｏｒｅｄｕｃｅｎｓ由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡコンセンサス核酸配列である。
【００２４】
配列番号５は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列である。
【００２５】
配列番号６は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌｅｘｕｓ由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列である。
【００２６】
配列番号７は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列である。
【００２７】
配列番号８は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列である。
【００２８】
配列番号９は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列である。
【００２９】
配列番号１０は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列である。
【００３０】
配列番号１１は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｒｅｎｔｅｎｓｉｓ由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列である。
【００３１】
配列番号１２は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列である。
【００３２】
配列番号１３は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列である。
【００３３】
配列番号１４は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列である。
【００３４】
配列番号１５は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列である。
【００３５】
配列番号１６は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列である。
【００３６】
配列番号１７は、Ｆｏｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．（ｐａｎａｃｉｓｅｇｅｔｉｓ）由来の部分的な１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列である。
【００３７】
配列番号１８は、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｉ由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列である。
【００３８】
配列番号１９は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列である。
【００３９】
配列番号２０は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｉｂｅｎｓｉｓ由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列である。
【００４０】
配列番号２１は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｏｋｉｉ由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列である。
【００４１】
配列番号２２は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．（ｃｈｉｔｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列である。
【００４２】
配列番号２３は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．（Ｐ１ＸＰ２）由来の部分的な１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列である。
【００４３】
配列番号２４は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列である。
【００４４】
配列番号２５は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡ核酸配列である。
【００４５】
配列番号２６〜３９は、ＤｐａＡアミノ酸配列である。
【００４６】
配列番号４０〜４１は、ＤｐａＡコンセンサスアミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号４２〜５４は、ＤｐａＢアミノ酸配列である。
【００４８】
配列番号５５〜５６は、ＤｐａＢコンセンサスアミノ酸配列である。
【００４９】
配列番号５７〜６６は、Ｉｓｆアミノ酸配列である。
【００５０】
配列番号６７は、Ｉｓｆコンセンサスアミノ酸配列である。
【００５１】
詳細な説明
胞子を形成しない微生物は、胞子を形成する微生物よりも、処理および圃場施用の間に生じる有害因子の影響をより受けやすいことが多い。多大な微生物の目録から、胞子を形成する微生物を同定するための選択プロセスは、冗長で時間を浪費する場合がある。これは、通常、生存可能性および最終製品の貯蔵寿命の延長についての保障が限定された、生存可能性（例えば、選択した担体との共製剤における）についてのウェットラボ試験を含む。
【００５２】
単体のバイオスティミュラント製剤としておよび／または湿潤した担体もしくは乾燥した担体もしくは種子との共製剤において、高い信頼度で貯蔵寿命が延長された微生物を選択し、よって、圃場試験において試験する新たな生産品のリードタイムを有意に加速させるための新たな戦略および方法が本明細書において開示される。本明細書に記載されているように、ＤＰＡ遺伝子もしくはタンパク質が同定されかつ／またはＤＰＡを生成する胞子形成細菌は、ＤＰＡ遺伝子が同定されずかつＤＰＡ生成が検出できない株よりも、経時的な担体との共製剤における生存可能性に関し、より性能が優れている。最後に、ＤＰＡ生成株を含む微生物のコンソーシアムについて記載される。
【００５３】
Ｉ．用語
別段に言及されていなければ、技術用語は、従来の慣用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Krebs  et  al.,  Lewin's  Genes  XI,  published  by  Jones  and  Bartlett  Learning,  2012  (ISBN  1449659853)；Kendrew  et  al.  (eds.),  The  Encyclopedia  of  Molecular  Biology,  published  by  Blackwell  Publishers,  1994  (ISBN  0632021829)；Robert  A.  Meyers  (ed.),  Molecular  Biology  and  Biotechnology:  a  Comprehensive  Desk  Reference,  published  by  Wiley,  John  &  Sons,  Inc.,  2011  (ISBN  8126531789)；およびGeorge  P.  Redei,  Encyclopedic  Dictionary  of  Genetics,  Genomics,  and  Proteomics,  2nd  Edition,  2003  (ISBN:  0-471-26821-6)に見い出すことができる。
【００５４】
用語および方法についての以下の説明は、本開示をより十分に説明するためおよび本開示を実践するよう当業者を導くために提供される。単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別段に明示していなければ、１つまたは１つより多くを指す。例えば、「細胞を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａ  ｃｅｌｌ）」という用語は、単一または複数の細胞を含み、「少なくとも１つの細胞を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｃｅｌｌ）」という語句に等しいと見なされる。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。よって、「ＡまたはＢを含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ａ  ｏｒ  Ｂ）」は、追加の要素を除外することなく、「Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢを含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ａ，Ｂ，ｏｒ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ）」を意味する。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献は、参照によりすべての目的でその全体が組み込まれる。矛盾する場合には、用語の説明を含む本明細書が支配する。
【００５５】
本明細書に記載のものに対して類似するまたは均等な方法および材料を本開示の技術を実践または試験するために使用することができるが、好適な方法および材料が以下に記載される。材料、方法、および例は、例示のみを目的とし、限定されることを意図するものではない。
【００５６】
この開示の様々な実施形態の再調査を容易にするために、特定の用語についての以下の説明が提供される：
【００５７】
担体：微生物、例えば、本明細書に記載の微生物または微生物コンソーシアに対して送達ビヒクルとして（例えば、共製剤中でまたは接種剤として）使用することができる物質（本明細書において、「農業担体（ａｇｒｏ−ｃａｒｒｉｅｒ）」とも称される）。担体は、液体または固体（乾燥）であってもよい。例示的な担体として、液体または乾燥肥料、土壌由来物質（例えば、木炭、粘土、泥炭）、有機物質（例えば、おがくず、コムギ／ダイズ／エンバクのふすま、堆肥）および不活性材料（例えば、パーライト、バーミキュライト、ベントナイト、Ａｚｏｍｉｔｅ（登録商標）、カオリン、シリケート、タルク）が挙げられる。一部の例では、種子も担体として言及され得る。
【００５８】
接触させること：固体および／または液体形態のいずれかを含めて、直接的な物理的結合下に置くこと。例えば、接触させることは、１種または複数種の微生物（例えば、微生物コンソーシアムにおける微生物）と担体または種子とで生じ得る。接触させることはまた、１種もしくは複数種の微生物、微生物／担体共製剤、または微生物／種子共製剤と土壌、植物、および／もしくは植物の部分（例えば、葉、茎、苗、根、および／または種子）とで生じ得る。
【００５９】
培養すること：炭素、窒素および無機塩の同化可能な供給源の存在下において、１つまたは複数の生物または細胞を意図的に成長させること。例では、このような成長は、固体もしくは半固体栄養培地中、または養分が溶解もしくは懸濁された液体培地中で起こり得る。さらなる例では、培養することは、表面でまたは沈水培養で起こり得る。栄養培地は、複雑な養分から構成され得るかまたは化学的に定義され得る。
【００６０】
ジピコリン酸（ピリジン−２，６−ジカルボン酸；ＤＰＡ）：以下の構造を有する化合物
【化１】
2021526855.tif 000003
ほとんどの微生物では、酵素ジピコリン酸合成酵素によってジヒドロジピコリネートをＤＰＡに変換することによってＤＰＡが生成される。ＤＰＡ合成酵素は、２つのサブユニット、サブユニットＡ（ＤｐａＡまたはｓｐｏＶＦＡ）およびサブユニットＢ（ＤｐａＢまたはｓｐｏＶＦＢ）を有する。例示的なＤｐａＡおよびＤｐａＢのアミノ酸配列を本明細書に提供する（図１および２）。
【００６１】
いくつかの細菌（例えば、いくつかのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）は、識別可能なＤｐａＡ遺伝子およびＤｐａＢ遺伝子が欠如しているにもかかわらず、ＤＰＡを合成することができる。理論に拘束されないが、これらの細菌は、構造的に関連するタンパク質、すなわち、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）酸化還元酵素である電子伝達フラビンタンパク質（ｅｔｆＡ）を利用することが提唱される。ＥｔｆＡは、ジヒドロジピコリネートをジピコリン酸に変換することによって生合成経路の最終工程を触媒すると考えられる（Orsburn  et  al.,  Mol.  Microbiol.  75:178-186,  2010）。あるいは、いくつかの細菌は、ＤＰＡの生成において、鉄−硫黄フラビンタンパク質（Ｉｓｆ）を利用することができる。
【００６２】
異種：異なる遺伝源または種に由来する。例えば、細胞に対して異種である核酸は、それが発現される細胞以外の生物または種に由来する。異種核酸を細菌細胞中に導入するための方法は、例えば、電気穿孔、リポフェクション、およびパーティクルガン法（particle  gun  acceleration）を含む、核酸に関する形質転換を含む。
【００６３】
異種という用語の使用についての別の例では、異種プロモーターに作動可能に連結した核酸は、プロモーターが属する生物、種、または遺伝子以外の生物、種、または遺伝子に由来する。異種という用語の使用についての他の例では、ポリペプチドまたはその部分をコードする核酸は、例えば、天然に存在しない融合タンパク質を形成するために、第２のポリペプチドまたはその部分をコードする異種核酸に作動可能に連結している。
【００６４】
単離された：「単離された」生物学的構成成分（例えば、核酸、タンパク質または生物）は、他の生物学的構成成分（例えば、他の細胞、細胞デブリ、または他のタンパク質もしくは核酸）から実質的に分離されるか精製されている。「単離された」生物学的構成成分としては、標準的な精製方法によって精製されたこれらの構成成分が挙げられる。この用語は、組換え核酸、タンパク質、または微生物、および化学合成された核酸またはペプチドも包含する。「単離された」（または「富化された」もしくは「精製された」）という用語は、至純を必要とせず、少なくとも５０％単離された、例えば、少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはさらには１００％単離された微生物または分子を含み得る。
【００６５】
微生物：以下に限定されないが、細菌、古細菌、真菌、および藻類（例えば、微細藻類）を含む微生物。一部の例では、微生物は、単細胞生物（例えば、細菌、藍藻類、一部の真菌、または一部の藻類）である。他の例では、微生物という用語は、多細胞生物、例えば、特定の真菌または藻類（例えば、多細胞糸状菌または多細胞藻類）を含む。
【００６６】
微生物組成物：少なくとも１つのタイプ（または種）の微生物の細胞（または少なくとも１つのタイプの微生物の細胞集団）を含む組成物（固体、液体、または少なくとも部分的にその両方であってもよい）。一部の例では、微生物組成物は、液体（例えば、保存、培養、もしくは発酵培地または液体肥料）中の１つまたは複数のタイプ（種）の微生物（または１つもしくは複数の微生物集団）の細胞を、例えば、液体中の懸濁物として含む。他の例では、微生物組成物は、固体またはゼラチン培地（以下に限定されないが、培養プレートを含む）またはスラリーもしくはペーストの表面にまたはそれに埋め込まれて、１つまたは複数のタイプ（種）の微生物（または１つもしくは複数の微生物集団）の細胞を含む。他の例では、微生物組成物は、乾燥材料または種子に関連する、例えば、乾燥材料または種子の表面にまたはそれに含浸させた１つまたは複数のタイプ（または種）の微生物（または１つもしくは複数の微生物集団）の細胞を含む。
【００６７】
微生物コンソーシアム：一部の場合には、お互いに物理的に接触している２つまたはそれより多い微生物種の細胞の混合物、群集、または集合。コンソーシアム中の微生物は、直接的な物理的接触によってもしくは生化学的相互作用により、またはその両方で互いに影響を及ぼし得る。例えば、コンソーシアム中の微生物は、養分、代謝物、または気体をお互いに交換し得る。よって、一部の例では、コンソーシアム中の微生物の少なくとも一部は、代謝的に相互に依存する。このような相互に依存する相互作用は、時間と共におよび培養条件を変化させながら、特徴および程度が変化し得る。
【００６８】
形質導入および形質転換した：ウイルスまたはベクターは、細胞中に核酸を移入する場合、細胞に「形質導入する」。細胞は、ＤＮＡが細胞によって複製される場合に、核酸を細胞中に形質導入することによって、細胞ゲノム中に核酸を組み込むことによって、またはエピソーム複製によって「形質転換される」。本明細書で使用される場合、形質転換という用語は、細菌のコンジュゲーション、ウイルスベクターによるトランスフェクション、プラスミドベクターによる形質転換、ならびに電気穿孔、リポフェクション、およびパーティクルガン法による裸のＤＮＡの導入を含む、核酸分子がこのような細胞中に導入され得るすべての技法を包含する。
【００６９】
ベクター：宿主細胞中に導入され、それによって、形質転換または形質導入された宿主細胞を生成し得る核酸分子。組換えＤＮＡベクターは、組換えＤＮＡを含むベクターである。ベクターは、宿主細胞における複製を可能とする核酸配列、例えば、複製起点を含み得る。ベクターは、１つもしくは複数の選択可能なマーカー遺伝子、異種核酸の導入のためのクローニング部位、プロモーター（例えば、作動可能に連結した核酸の発現のための）、および／または当技術分野で公知の他の遺伝子エレメントも含み得る。ベクターは、グラム陰性および／またはグラム陽性細菌の細胞内での発現のためのプラスミドを含むプラスミドベクターを含む。例示的なベクターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて使用するためのものが挙げられる。
【００７０】
生存能力：成長または繁殖のために適切な条件下で、成長または繁殖する細胞（例えば、微生物細胞）の能力。一部の例では、「生存」または「生存可能性」は、液体もしくは乾燥状態において、単独で、他の微生物細胞との混合物中で、および／または担体もしくは種子と共製剤化された場合に、一定期間の保管後の細胞（例えば、微生物細胞）の生存能力を指す。
【００７１】
ＩＩ．共製剤中で生存能力を有する微生物を同定する方法
液体または固体担体と共製剤化した場合に、生存できるかまたは生存可能なままである微生物を同定する方法が本明細書に開示される。微生物は、個々に、担体もしくは種子と共製剤化されてもよく（例えば、微生物の単一の株または種は担体または種子と共製剤化される）または担体もしくは種子と共製剤化されるコンソーシアムもしくは微生物の混合物（例えば、微生物の２つもしくはそれより多い株または種）の一部であってもよい。他の実施形態では、本方法は、コンソーシアム（単体のコンソーシアムとしてまたは担体もしくは種子と共製剤化した）において長期間、生存できるかまたは生存可能なままである微生物を同定することを含む。
【００７２】
一部の例では、本明細書に開示される方法により同定した微生物、例えば、１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素遺伝子を含み、１つもしくは複数のＤＰＡタンパク質を発現し、および／または検出可能な量のＤＰＡを生成する微生物は、１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素遺伝子を含まない、１つもしくは複数のＤＰＡ合成タンパク質を発現しない、および／または検出可能な量のＤＰＡを生成しない微生物よりも生存能力が改善された（単独でまたは共製剤中で）。一部の例では、本明細書に開示される方法により同定した微生物は、１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素遺伝子を含まない、１つもしくは複数のＤＰＡ合成タンパク質を発現しない、および／または検出可能な量のＤＰＡを生成しない微生物と比較して、少なくとも１０％増加した生存能力（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、またはより多く増加した生存能力）を有する。増加した生存能力は、一定期間後のより多数の生存できる細胞および／またはより長期間の生存能力を含み得る。
【００７３】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、そのゲノム中に、ＤＰＡ合成酵素をコードする１つもしくは複数の遺伝子を含み、１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素タンパク質を発現し、および／または検出可能な量のＤＰＡを生成する微生物を同定することを含む。このような微生物は、個々にまたは液体もしくは固体担体と共製剤化される場合に、生存できるかまたは生存可能なままであり得る微生物として同定される（例えば、ＤＰＡ合成酵素をコードする遺伝子を含まない、１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素タンパク質を発現しない、および／または検出可能な量のＤＰＡを生成しない１種または複数種の微生物と比較して）。同定された微生物を下流での使用のために、例えば、液体または固体担体または種子との共製剤化のためにさらに選択することができる。一部の例では、微生物は、少なくとも１日、少なくとも３日、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも１０日、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月、少なくとも５カ月、少なくとも６カ月、少なくとも８カ月、少なくとも１０カ月、少なくとも１年、少なくとも２年、またはそれより長い期間（例えば、少なくとも１〜２８日、少なくとも５〜２１日、少なくとも２〜６週間、少なくとも４〜８週間、少なくとも２〜６カ月、少なくとも３〜９カ月、少なくとも４〜１０カ月、少なくとも６カ月から１年、少なくとも１〜２年、またはそれより長い期間）生存できるかまたは生存可能なままである（個々にまたは担体もしくは種子と共製剤化される場合に）。
【００７４】
微生物の生存能力または生存を決定する方法は、培養中の微生物の成長を検出することを含む。一部の例では、微生物細胞を含有する調製物（液体もしくは乾燥状態で、または担体もしくは種子との共製剤中で）を液体培地中で接種し、微生物成長に好適な条件下でインキュベートし、定義された期間後の微生物の存在および／または量を測定する。他の例では、微生物細胞を含有する調製物（液体もしくは乾燥状態で、または担体もしくは種子との共製剤中で）を固体または半固体培地を含有するプレート上に画線し、微生物成長に好適な条件下でインキュベートし、微生物の存在および／または量（例えば、コロニーの存在、サイズ、および／または数）を測定する。一部の例では、微生物は、例えば、ＰＣＲ法を使用して同定される。微生物細胞の生存能力および同一性を決定するための例示的な方法を実施例１に提供する。
【００７５】
さらなる実施形態では、本方法は、１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素遺伝子を含む、１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素タンパク質を発現する、および／または検出可能な量のＤＰＡを生成する１種または複数種の微生物を選択すること、および必要に応じて、１種または複数種の選択された微生物を１つまたは複数の担体または種子と共製剤化することを含む。一部の例では、本方法は、１種または複数種の選択された微生物の、１つまたは複数の担体または種子との共製剤を調製することを含む。本方法は、１種または複数種の微生物を１つまたは複数の担体または種子と、例えば、固体（乾燥）または液体形態で接触させることを含む。一部の例では、担体（複数可）または種子（複数可）を微生物の混合物と接触させる。混合物は、ＤＰＡ合成酵素を発現するかまたはＤＰＡを生成する微生物（例えば、以下に限定されないが、ＤＦＣを含む、本明細書に記載の方法を使用して選択または生成される微生物）を含み、ＤＰＡ合成酵素を発現しないかまたはＤＰＡを生成しない１種または複数種の微生物を含んでもよい。一部の例では、担体を１ｍＬ当たり約１０３〜１０９個またはそれより多くの細胞（例えば、１ｍＬ当たり約１×１０３個の細胞、１ｍＬ当たり約５×１０３個の細胞、１ｍＬ当たり約１×１０４個の細胞、１ｍＬ当たり約５×１０４個の細胞、１ｍＬ当たり約１×１０５個の細胞、１ｍＬ当たり約５×１０５個の細胞、１ｍＬ当たり約１×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり約５×１０６個の細胞、１ｍＬ当たり約１×１０７個の細胞、１ｍＬ当たり約５×１０７個の細胞、１ｍＬ当たり約１×１０８個の細胞、１ｍＬ当たり約５×１０８個の細胞、１ｍＬ当たり約１×１０９個の細胞、１ｍＬ当たり約５×１０９個の細胞またはそれより多く）の各微生物を含む液体と接触させる。
【００７６】
一部の実施形態では、選択された微生物の１種または複数種（および必要に応じて、１種または複数種の追加の微生物）を含む液体を１つまたは複数の乾燥担体または種子と接触させて配置する。一部の例では、微生物を含む液体は、新鮮なもしくは凍結した細菌培養液であるかまたは新鮮なもしくは凍結した細菌培養液の混合物である。他の例では、微生物を含む液体は、凍結乾燥した微生物が添加された液体である。１種または複数種の微生物を含む液体は、乾燥担体または種子中に浸される。一部の例では、１種または複数種の微生物を含む液体の量は、乾燥担体または種子が飽和されるように使用され、例えば、担体または種子全体に微生物の相対的に均一な分布がもたらされる。しかし、飽和しない量の液体が使用されてもよい。非限定的な例では、量は、約３５μＬ／ｇから６ｍＬ／ｇである。一部の例では、微生物を含浸した担体または種子を乾燥させ（例えば、室温でまたは約３０〜３５℃で）、周囲温度で保管する（例えば、閉じたまたは密閉した容器内で）。
【００７７】
他の実施形態では、選択した微生物の１種または複数種（および必要に応じて、１種または複数種の追加の微生物）を含む液体を１つまたは複数の液体担体と混合する。一部の例では、微生物を含む液体は、新鮮なもしくは凍結した細菌培養液であるかまたは新鮮なもしくは凍結した細菌培養液の混合物である。他の例では、微生物を含む液体は、凍結乾燥した微生物が添加された液体である。微生物を含む液体を、いずれかの選択された量、例えば、０．１％〜９０％（ｖ／ｖ）、例えば、０．５〜１％、１〜５％、２〜１０％、３〜６％、４〜８％、５〜１５％、８〜２０％、１０〜２５％、２０〜４０％、３０〜５０％、４０〜６０％、５０〜７５％、または７０〜９０％（ｖ／ｖ）で液体担体と混合することができる。一部の例では、微生物を約０．１％、約０．２％、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％（ｖ／ｖ）で液体担体と混合する。非限定的な一例では、微生物の混合物は、０．５％（ｖ／ｖ）または１：１８０の比で液体担体に添加される。別の非限定的な例では、微生物の混合物を９０％（ｖ／ｖ）で濃縮した液体担体（例えば、１０倍に濃縮した液体担体）に添加し、液体担体の１倍の濃度をもたらす。混合物中の微生物細胞の量を調整して、使用される希釈係数に応じて、所望の最終濃度の微生物細胞を達成することができる。微生物の混合物を周囲温度で保管する（例えば、閉じたまたは密閉した容器内で）。
【００７８】
一部の実施形態では、微生物の乾燥調製物（例えば、凍結乾燥した微生物）を乾燥担体または種子との共製剤中で使用する。一部の例では、凍結乾燥した微生物を乾燥担体または種子と混合する（例えば、１ｋｇの担体または種子当たり約４０ｍｇの微生物から１ｋｇの担体または種子当たり約１ｇの微生物）。この実施形態の一部の例では、凍結乾燥した微生物を液体に添加し、次いで、乾燥担体または種子と接触させる。他の例では、凍結乾燥した微生物を液体に添加し、次いで、上記の乾燥担体または種子と接触させる。
【００７９】
Ａ．ＤＰＡ合成酵素核酸の検出
一部の実施形態では、本方法は、微生物または微生物集団における１つまたは複数のＤＰＡ合成酵素核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）の存在を特定することを含む。一部の例では、本方法は、微生物のゲノムにおいて１つまたは複数のＤＰＡ合成酵素遺伝子（例えば、ＤｐａＡおよび／またはＤｐａＢ）を検出することを含む。一部の例では、微生物は、ＤｐａＡ遺伝子とＤｐａＢ遺伝子の両方を含む。例示的なＤＰＡ合成酵素遺伝子としては、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのＤｐａＡ（２０１８年６月３日のＧｅｎＢａｎｋに存在するものとして参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００９６４．３、１７４４３６７−１７４５２６０）およびＤｐａＢ（２０１８年６月３日のＧｅｎＢａｎｋに存在するものとして参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００９６４．３、１７４５２３６−１７４５８６５）が挙げられる。一部の例では、ＤｐａＡ遺伝子は、図１に示されているタンパク質または図１に示されているタンパク質（例えば、配列番号２６〜３９）と少なくとも２０％の配列同一性（例えば、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはそれより高い割合）を有するタンパク質をコードする。一部の例では、ＤｐａＢ遺伝子は、図２に示されているタンパク質または図２に示されているタンパク質（例えば、配列番号４２〜５４）と少なくとも２０％の配列同一性（例えば、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはそれより高い割合）を有するタンパク質をコードする。一部の例では、ＤｐａＡまたはＤｐａＢタンパク質は、それぞれ、図１および２において「コンセンサス６０」配列において特定される１つまたは複数の保存された領域を有する（それぞれ、配列番号４０および５５）。
【００８０】
他の実施形態では、本方法は、ＤＰＡ合成の代替経路に含まれる１つまたは複数の核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ）の存在を特定することを含む。一部の例では、本方法は、電子伝達フラビンタンパク質（例えば、ＥｔｆＡ）または鉄−硫黄フラビンタンパク質（例えば、Ｉｓｆ）をコードする１つまたは複数の核酸の存在または発現を特定することを含む。電子伝達フラビンタンパク質は、アルファおよびベータサブユニットからなるヘテロダイマーであり、アデニンヌクレオチドアルファ加水分解酵素スーパーファミリーの一部である。例示的な細菌のＥｔｆＡ核酸配列としては、そのそれぞれが２０１８年６月３日のＧｅｎＢａｎｋに存在するものとして参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＰ０００３１２．１（２５０８３８２−２５０９３８９）、ＮＣ＿００４５７８．１（２４０７７６８−２４０８６９７）、ＮＣ＿００９０８９．１（９７７９０５−９７８９２７）、ＮＣ＿０１９３８２．１（１３５７７３８−１３５６８０９、補体）、ＮＣ＿００３０３０．１（２８３３６９６−２８３３２６８、補体）、ＮＣ＿００２９７１．４（１０６２５５７−１０６１６１３、補体）、およびＮＣ＿００３０６３．２（６５０４４７−６５１３７６）が挙げられる。例示的な細菌のＥｔｆＡアミノ酸配列としては、そのそれぞれが２０１８年６月３日のＧｅｎＢａｎｋに存在するものとして参照により本明細書に組み込まれるＡＢＧ８６９３９、ＮＰ＿７９２００７．１、ＹＰ＿００１０８７２８２．１、ＹＰ＿００６９６７３３６．１、ＮＰ＿３４９３１５．１、ＮＰ＿８２０１１６．１、およびＮＰ＿３５７０１６．２が挙げられる。例示的なＩｓｆ核酸およびタンパク質配列としては、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＰ０１６３１８（３０６０７００−３０６１３０８）およびＡＲＥ６３６０７（２０１８年６月３日のＧｅｎＢａｎｋに存在するものとして参照により本明細書に組み込まれる）ならびに図３に示されたもの（例えば、配列番号５７〜６６）が挙げられる。
【００８１】
一部の例では、ＤＰＡ合成酵素核酸（またはＥｔｆＡもしくはＩｓｆ核酸）は、微生物の配列解析（例えば、ゲノムシーケンシングおよび／またはＤＰＡ合成酵素に特異的なオリゴヌクレオチドを使用するシーケンシング）によって同定され得る。一部の例では、配列解析は、ＧｅｎＢａｎｋ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／）、ＥＮＳＥＭＢＬ（ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、ＩＭＧ（ｉｍｇ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ）、ＭｉｃｒｏｂｅｓＯｎｌｉｎｅ（ｍｉｃｒｏｂｅｓｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ）、ＳＥＥＤ（ｔｈｅｓｅｅｄ．ｏｒｇ）、またはＧＯＬＤ（ｇｏｌｄ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｇｏｖ）を含む１つまたは複数のデータベースに存在する配列を使用して実施される。ＤＰＡ合成酵素遺伝子を同定する例示的な方法は、以下の実施例１において提供される。同様の方法を使用して、ＥｔｆＡまたはＩｓｆ遺伝子を同定することができる。
【００８２】
一部の例では、微生物または微生物集団由来の核酸を検出前に単離するか、増幅させるか、またはその両方を行う。一部の例では、増幅および発現の検出は、同時にまたはほぼ同時に行う。一部の例では、核酸の発現は、ＰＣＲ（例えば、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲまたは定量的ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出することができる。例えば、市販のキットを用いることによって、核酸を単離および増幅させることができる。ある例では、ＤｐａＡおよび／またはＤｐａＢ（またはＥｔｆＡもしくはＩｓｆ）核酸の増幅を、このような産物の増幅を可能にするのに十分な条件下で、可能にするプライマーと共に、核酸をインキュベートすることができる。得られるアンプリコンを検出することができる。
【００８３】
別の例では、微生物または微生物集団由来の核酸を、非常に厳密な条件下で、ＤｐａＡおよび／またはＤｐａＢ（またはＥｔｆＡもしくはＩｓｆ）核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ））に結合することができるプローブと共にインキュベートする。次いで、得られるハイブリダイゼーションを検出することができる。他の例では、微生物または微生物集団は、微生物（複数可）から得られる単離された核酸分子をアレイに適応することによってスクリーニングされる。一例では、このアレイは、ＤｐａＡおよび／またはＤｐａＢ（またはＥｔｆＡもしくはＩｓｆ）核酸に相補的なオリゴヌクレオチドを含む。一例では、微生物核酸分子を、単離された核酸分子とオリゴヌクレオチドプローブの間でのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な時間、ＤｐａＡおよび／またはＤｐａＢ（またはＥｔｆＡもしくはＩｓｆ）に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含むアレイと共にインキュベートし、それによって、単離された核酸分子：オリゴヌクレオチド複合体を形成する。次いで、単離された核酸分子：オリゴヌクレオチド複合体を解析して、核酸が試料中に存在するかどうかを決定する。
【００８４】
Ｂ．ＤＰＡ合成酵素タンパク質の検出
ＤＰＡ合成酵素核酸を検出する代替として、またはそれに加えて、イムノアッセイ（例えば、ウエスタンブロット、免疫組織化学、フローサイトメトリー、またはＥＬＩＳＡ）または質量分析などの方法を使用して、タンパク質を検出することができる。一部の例では、ＤｐａＡタンパク質は、図１に示されているタンパク質（例えば、配列番号２６〜３９）と少なくとも２０％の配列同一性（例えば、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはそれより高い割合）を有するタンパク質を含む。一部の例では、ＤｐａＢタンパク質は、図２に示されているタンパク質（例えば、配列番号４２〜５４）と少なくとも２０％の配列同一性（例えば、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはそれより高い割合）を有するタンパク質を含む。一部の例では、ＤｐａＡまたはＤｐａＢタンパク質は、それぞれ、図１および２の「コンセンサス６０」配列（それぞれ、配列番号４０および５５）において特定される１つまたは複数の保存された領域を有する。他の例では、Ｉｓｆタンパク質は、図３に示されているタンパク質（例えば、配列番号５７〜６６）と少なくとも２０％の配列同一性（例えば、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはそれより高い割合）を有するタンパク質を含む。
【００８５】
一部の例では、タンパク質は、検出前に精製される。一例では、ＤｐａＡおよび／またはＤｐａＢ（またはＩｓｆ）タンパク質は、微生物試料をＤｐａＡおよび／またはＤｐａＢ（またはＩｓｆ）と特異的に結合する抗体と共にインキュベートすることによって検出され得る。抗体（「一次抗体」）は、検出可能な標識を含み得る。例えば、一次抗体は、直接標識されてもよく、または次に、試料を標識される（例えば、蛍光標識で）二次抗体と共にインキュベートしてもよい。次いで、標識を、例えば、顕微鏡法、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、または分光光度法によって検出することができる。別の例では、試料を、ＤｐａＡおよび／またはＤｐａＢタンパク質の発現を検出するためのウエスタンブロットによって解析する。ＤｐａＡ、ＤｐａＢ、またはＩｓｆに対する抗体を、例えば、図１〜３のアミノ酸配列を使用して、当業者は作製することができる。
【００８６】
抗体または二次抗体に対する好適な標識としては、種々の酵素、接合団、蛍光材料、発光材料、磁気剤および放射性材料が挙げられる。好適な酵素の非限定的な例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。好適な接合団複合体の非限定的な例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。好適な蛍光材料の非限定的な例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが挙げられる。非限定的な例示的発光材料は、ルミノールであり；非限定的な例示的磁気剤はガドリニウムであり、および非限定的な例示的放射性標識としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【００８７】
Ｃ．ＤＰＡの検出
一部の実施形態では、本方法は、ＤＰＡ（例えば、検出可能なレベルのＤＰＡ）を生成する微生物または微生物集団を同定することを含む。一部の例では、本方法は、少なくとも１ｎＭのＤＰＡ（例えば、少なくとも２ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも２５ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭのＤＰＡ、またはそれより多く）を検出することを含む。一例では、本方法は、テルビウム−ＤＰＡ蛍光アッセイを使用してＤＰＡを検出することを含む（例えば、Rosen,  Anal.  Chem.  69:1082-1085,  1997；Pellegrino  et  al.,  Anal.  Chem.  70:1755-1760,  1998；Ammann  et  al.,  Int.  J.  Microbiol.  2011:435281,  2011を参照されたい）。簡潔には、ＤＰＡをテルビウム（ＩＩＩ）と接触させることにより、テルビウム（ＩＩＩ）と比較して蛍光光度が増加した複合体が形成され、試料中のＤＰＡの検出および／または定量が可能となる。例示的なテルビウム−ＤＰＡアッセイは、実施例１に記載されている。
【００８８】
ＩＩＩ．微生物および共製剤
そのゲノム内に１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素遺伝子を含み、１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素タンパク質を発現し、および／またはＤＰＡを生成する微生物が本明細書に開示される。一部の例では、微生物は、そのゲノム内に１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素遺伝子を含み、１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素タンパク質を発現し、および／またはＤＰＡを生成するように改変される。微生物の１つまたは複数の担体または種子との共製剤も開示される。
【００８９】
Ａ．微生物
１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素遺伝子を有する、１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素タンパク質を発現する、および／またはＤＰＡを生成する微生物としては、以下に限定されないが、Bacillus  amyloliquefaciens、Bacillus  flexus,  Bacillus  licheniformis、Bacillus  megaterium、Bacillus  subtilis、Bacillus  sp.  (B.  kochii、B.  pocheonensisおよびBacillus  sp.(R-27341株)に密接に関連している)、Clostridium  beijerinckii、Oceanobacillus  oncorhynchi、Paenibacillus  chibensis、Paenibacillus  cookii、Paenibacillus  lautus、Virgibacillus  halophilus、Paenibacillus  azoreducensおよびBacillus  firmusが挙げられる。一部の例では、これらの細菌は、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ２０１８／０４５００４号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているものを含む。追加の微生物としては、表２５および２６に列挙されたものが挙げられる。一部の例では、これらの微生物は、胞子形成能力も有するが、しかし、胞子形成能力および識別可能なＤＰＡ合成酵素遺伝子の存在またはＤＰＡ生成は完全には一致しない（例えば、表６を参照されたい）。
【００９０】
追加の実施形態では、１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素遺伝子を有する、１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素タンパク質を発現する、および／またはＤＰＡを生成する微生物を含む組成物、例えば乾燥製剤コンソーシアム（Ｄｒｙ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ；ＤＦＣ）と本明細書で言及されるものなどが開示される。ＤＦＣにおける微生物としては、以下に限定されないが、Bacillus  amyloliquefaciens、Bacillus  firmus、Bacillus  flexus、Bacillus  licheniformis、Bacillus  megaterium、Bacillus  pumilus、Bacillus  koreensis、Bacillus  drentensis、Bacillus  subtilis、Clostridium  bifermentans、Clostridium  beijerinckii、Clostridium  pasteurianum、Lactobacillus  paracasei、Fontibacillus  sp.(panacisegetis)、Oceanobacillus  oncorhynchi、Paenibacillus  lautus、Paenibacillus  azoreducens、Paenibacillus  chibensis、Paenibacillus  cookii、Paenibacillus  sp.(chitinolyticus)、Paenibacillus  sp.(P1XP2)、Pseudomonas  sp.およびStreptomyces  griseusが挙げられる。一実施形態では、本組成物は、２０１９年５月１６日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ））に寄託され、寄託番号ＰＴＡ−１２５９２４が付与された微生物種の細胞を含む。
【００９１】
当業者であれば、特に種または株レベルでの微生物の同定が常に可能でないことを認識する。一部の例では、本明細書に記載の組成物中の微生物は、１６Ｓ  ｒＤＮＡシーケンシングおよび全ゲノムシーケンシング、それに続く、公共データベースにおける配列の比較によって解析された。しかし、配列データベースにおける情報が限定されていることによって（一部の種もしくは株についての情報が少ないかもしくはないことおよび／または経時的に命名法が変化することを含む）、最終的に種または株を同定することが困難な場合がある。よって、一部の実施形態では、本開示の組成物中に含まれる微生物種は、本明細書において提供される１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（配列番号３〜２５）に対する配列同一性によって同定される。一部の例では、本開示の微生物コンソーシアまたは組成物は、配列番号３〜２５に対して少なくとも９５％の同一性（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い割合の）を有する１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を有する微生物のうちの２種またはそれより多く（例えば、５種もしくはそれより多く、１０種もしくはそれより多く、１５種もしくはそれより多く、２０種もしくはそれより多く、またはすべて）を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。
【００９２】
１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素遺伝子を有する、１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素タンパク質を発現する、および／または検出可能な量のＤＰＡを生成する微生物は、１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素遺伝子を天然に有さない、１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素タンパク質を発現しない、および／またはＤＰＡを生成しないが、そうであるように改変される微生物も含む。一部の例では、１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素遺伝子を天然に有さない、１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素タンパク質を発現しない、および／またはＤＰＡを生成しない微生物は、１つもしくは複数の異種ＤＰＡ合成酵素遺伝子、例えば、ＤｐａＡおよび／またはＤｐａＢまたは１つもしくは複数のＩｓｆ遺伝子を発現するように改変される。例示的なＤｐａＡおよびＤｐａＢ遺伝子およびタンパク質ならびにＩｓｆ遺伝子およびタンパク質は、セクションＩＩおよび図１〜３に記載されている（配列番号２６〜６７を含む）。
【００９３】
１つもしくは複数の異種ＤＰＡ合成酵素遺伝子を発現するよう改変することができる細菌としては、以下に限定されないが、Azotobacter(例えばAzotobacter  vinelandii)、Clostridium(例えば、Clostridium  pasteurianum)、Streptomyces(例えば、Streptomyces  griseus、Streptomyces  venezuelae、Streptomyces  pratensis)、Sporolactobacillus  spp.(例えば、Sporolactobacillus  dextrus)、Sporosarcina  spp.(例えば、Sporosarcina  halophila)、Desulfotomaculum  spp.(例えば、Desulfotomaculum  guttoideum)、Nocardiopsis  Spp.(例えば、Nocardiopsis  sinuspersici)、Promicromonospora  spp.(例えば、Promicromonospora  enterophila、Promicromonospora  soli)、Brevibacillus  spp.(例えば、Brevibacillus  centrosporus)、Rummeliibacillus  spp.(例えば、Rummeliibacillus  pycnus)、Lysinibacillus  spp.、Terribacillus  spp.(例えば、Terribacillus  shanxiensis)、Micromonospora  spp.(例えば、Micromonospora    fulva、Micromonospora  palomenea)、Saccharopolyspora  spp.(例えば、Saccharopolyspora  spinose、Saccharopolyspora  indica)およびFontibacillus  spp.(例えば、Fontibacillus  panacisegetis)が挙げられる。一部の例では、これらの細菌は、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ２０１８／０４５００４号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているものを含む。
【００９４】
一部の例では、異種ＤｐａＡおよび／またはＤｐａＢ遺伝子は、プロモーターの制御下に置かれる。一部の例では、プロモーターは構成的プロモーターであるが、他の例では、プロモーターは誘導性である（例えば、誘導性Ｔ７プロモーター）。追加の例では、プロモーターは、アラビノース誘導性プロモーター（例えば、ｐＢＡＤシステム）、ｌａｃプロモーター（ＩＰＴＧ／ラクトース直接誘導）、ｔｒｃプロモーター（ＩＰＴＧ／ラクトース直接誘導）、テトラサイクリン誘導性プロモーター、またはｐｈｏプロモーター（リン酸欠乏誘導性）である。異種ＤｐａＡおよび／またはＤｐａＢ遺伝子は、例えば、プロモーターに作動可能に連結したベクター中に含まれ得る。同様の方法をＥｔｆＡまたはＩｓｆ遺伝子について使用することができる。
【００９５】
複数の遺伝子（例えば、２つまたはそれより多いＤＰＡ合成酵素および／またはＩｓｆ遺伝子）が細菌中で同時に発現され得る。単一経路に由来する複数の酵素の適切かつ同等な産生を保証するために、異種遺伝子をコードする各核酸を必要に応じて、誘導性Ｔ７プロモーターなどの単一の種類のプロモーターの制御下に置く。一例は、Ｄｕｅｔ（商標）ベクター（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）であり、これは、単一細胞において４つのプラスミドの有効な増殖および維持のために適合性レプリコンおよび薬物耐性遺伝子に関して設計されている。これにより、最大８つの異なるタンパク質の共発現が可能となる。他の例では、ベクターは、ｐＥＴベクター、例えば、ｐＥＴ２１またはｐＥＴ２８ベクターである。ｐＥＴおよびｐＥＴを基礎とするベクターは、例えば、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、またはＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）から市販されている。
【００９６】
一例では、ベクターは、ｐＥＴ２１ａまたはｐＥＴ２８ａである。一部の例では、ｐＥＴベクターは、耐性マーカー（例えば、アンピシリンまたはカナマイシン耐性）およびＴ７プロモーターを含む。複数のクローニング部位は、１つより多い遺伝子（例えば、２、３、４、またはそれより多い）が単一のベクターから発現され得るように操作されている。一部の例では、遺伝子は、単一のｍＲＮＡおよび生成された複数のポリペプチドを含むマルチシストロン性生成物（例えば、バイシストロン性、トリシストロン性などの生成物）として発現される。他の例では、遺伝子は、個々のｍＲＮＡおよび各遺伝子に対して生成されたポリペプチドを含む複数のモノシストロン性生成物として発現される。適切なベクターは、発現される遺伝子（複数可）および形質転換される宿主細胞に応じて選択することができる。
【００９７】
一部の例では、プラスミドは染色体外に導入され、宿主微生物内で複製される。他の例では、プラスミドの導入後、二重相同組換え事象が起こり、１つまたは複数の遺伝子がゲノム中に挿入される。
【００９８】
組換えＤＮＡによる細菌細胞の形質転換が行われてもよい。宿主が細菌である場合、ＤＮＡ取り込みの可能なコンピテント細胞は、指数成長期後に回収された細胞から調製され、次に、当技術分野で周知の手順を使用してＣａＣｌ２法によって処理することができる。あるいは、ＭｇＣｌ２またはＲｂＣｌが使用されてもよい。細菌は、電気穿孔、コンジュゲーション、または形質導入によっても形質転換することができる。
【００９９】
Ｂ．担体および種子の処理
１種または複数種の微生物を１つまたは複数の担体と共製剤化するための方法および、１種または複数種の微生物および１つまたは複数の担体を含む組成物が本明細書において開示される。担体は、液体または固体（乾燥）であってもよい。担体としては、液体または乾燥肥料（例えば、尿素、カリ、リン酸アンモニウム、および／または硝酸アンモニウムを含む肥料）、土壌由来物質（例えば、粘土、ピート、石炭、無機土壌）、有機物質（例えば、木炭、おがくず、コムギ／ダイズ／エンバクのふすま、堆肥、コココイヤー（coco  coir））、および／または不活性材料（例えば、パーライト、バーミキュライト、ベントナイト、Ａｚｏｍｉｔｅ（登録商標）、カオリン、シリケート、軽石、タルク）が挙げられる。例示的な担体としては、Ａｚｏｍｉｔｅ（登録商標）、パーライト、バイオ炭、乾燥肥料（例えば、尿素、ＭＯＰ、またはＭＡＰ）、液体肥料（例えば、ＵＡＮ）、および防塵化学物質（例えば、ＡｒｒＭａｚ、ＦＬ、ＵＳＡから入手可能なもの）が挙げられる。追加の例示的な担体としては、モンモリロナイト、アタパルジャイト、含水アルミノシリケート（Ａｇｓｏｒｂ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｇｒｏｕｐ、ＩＬ、ＵＳＡ）、赤玉土（akadama）（Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｌｅａｆ  Ｉｎｃ、ＣＡ、ＵＳＡ）、Ｓｅｒａｍｉｓ  Ｃｌａｙ顆粒（Ｇｒｅｅｎｓ  ｈｙｄｒｏｐｏｎｉｃｓ、ＵＫ）、Ａｑｕａｓｍａｒｔ（商標）Ｐｒｏ（Ａｑｕａｓｍａｒｔ、ＴＸ、ＵＳＡ）、Ｐｙｒｏ−Ｇｒｏ（Ｇｒｅｅｎ  Ａｉｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＯＲ、ＵＳＡ）、砕いた溶岩、クレイペブルスが挙げられる。
【０１００】
一部の実施形態では、担体との共製剤は、ＷＯ２０１８／０４５００４に記載された２２種の微生物のコンソーシアム（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる；本明細書においてＡＭＣ１と称される）および本明細書に記載の担体のうちの１つまたは複数を含む。他の実施形態では、担体との共製剤は、本明細書に開示される２３種の微生物のコンソーシアム（例えば、表２６またはＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ−１２５９２４に列挙された微生物）および１つまたは複数の担体を含む。共製剤はまた、１種または複数種の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、またはそれより多くの種の）微生物および本明細書に記載の担体のうちの１つまたは複数を含む。一部の例では、共製剤は、１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素および／またはＩｓｆ遺伝子（複数可）を含むかまたは発現する（またはＤＰＡを生成する）少なくとも１種の微生物および担体を含む。他の例では、共製剤は、ＤＰＡ合成酵素遺伝子（複数可）を含むかもしくは発現するまたはＤＰＡを生成する少なくとも１種の微生物およびＤＰＡ合成酵素遺伝子（複数可）を含まないし発現もしないまたはＤＰＡを生成しない少なくとも１種の微生物を担体と共に含む。担体および１種または複数種の微生物を共製剤化する方法は、１つまたは複数の担体を１種または複数種の微生物と接触させることを含む。一部の例では、１種または複数種の微生物は、液体形態であるか（例えば、液体培地中にあるか）または固体もしくは乾燥形態である。
【０１０１】
１種または複数種の微生物で種子を処理する（例えば、１種または複数種の微生物を１種または複数種の種子と共製剤化する）ための方法および１種または複数種の微生物および１種または複数種の種子を含む組成物も本明細書に開示される。このような実施形態では、種子は、微生物にとっての「担体」である。一部の実施形態では、種子処理は、ＷＯ２０１８／０４５００４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている２２種の微生物のコンソーシアムおよび１種または複数種の種子を含む。他の実施形態では、種子処理は、本明細書に開示される２３種の微生物のコンソーシアム（例えば、表２６またはＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ−１２５９２４に列挙された微生物）および１種または複数種の種子を含む。他の例では、共製剤は、１つもしくは複数のＤＰＡ合成酵素および／またはＩｓｆ遺伝子（複数可）を含むかまたは発現する（またはＤＰＡを生成する）少なくとも１種の微生物および種子を含む。他の例では、共製剤は、ＤＰＡ合成酵素遺伝子（複数可）を含むかもしくは発現するまたはＤＰＡを生成する少なくとも１種の微生物およびＤＰＡ合成酵素遺伝子（複数可）を含まないし発現もしないまたはＤＰＡを生成しない少なくとも１種の微生物ならびに種子を含む。１種または複数種の微生物で処理することができる例示的な種子としては、以下に限定されないが、トウモロコシ種子、ヒマワリ種子、セイヨウアブラナ種子、コムギ種子、キュウリ種子、トマト種子、イネ種子、およびワタ種子が挙げられる。
【０１０２】
一部の例では、微生物で処理した種子は、微生物を種子に直接施用すること（例えば、種子を１種または複数種の微生物と接触させること）によって調製される。他の例では、微生物で処理した種子は、オーバーコートとしての微生物を殺虫剤および／または殺真菌剤で前もって処理した種子に施用すること（例えば、殺虫剤および／または殺真菌剤で処理した種子を１種または複数種の微生物と接触させること）によって調製される。またさらなる例では、微生物で処理した種子は、微生物を殺虫剤および／または殺真菌剤（例えば、殺虫剤／殺真菌剤スラリー）と混合することならびに混合物を種子に施用すること（例えば、種子と殺虫剤および／または殺真菌剤の混合物および１種または複数種の微生物を接触させること）によって調製される。微生物と組み合わせて使用することができる例示的な殺虫剤および殺真菌剤としては、以下に限定されないが、メタラキシル、トリフロキシストロビン、イピコナゾール、クロチアニジン、チアメトキサム、フルジオキソニル、メフェノキサム、アゾキシストロビン、チアベンダゾール、ピラクロストロビン、イミダクロプリド、フルキサピロキサド、および／またはセデキサンが挙げられる。一部の例では、種子に施用された１種または複数種の微生物は液体形態であるか（例えば、液体培地中にあるか）または固体もしくは乾燥形態である。処理した種子を調製する方法としては、以下に限定されないが、Seed  Treatment:  Oregon  Pesticide  Applicator  Training  Manual(Paulsrud  et  al.,  Urbana,  Illinois,  2001)および実施例１３に記載されているものが挙げられる。
【０１０３】
ＩＶ．  使用方法
本開示の微生物組成物は、単独でまたは１つもしくは複数の液体もしくは乾燥担体との共製剤中で使用して、土壌、植物、または植物の部分（例えば、根、茎、葉、種子、または苗）を処理することができる。他の例では、本開示の微生物組成物を、処理した種子の形態で使用することができる。
【０１０４】
一部の例では、本開示の組成物および／または本開示の組成物で処理した担体もしくは種子による処理によって、植物の成長が改善され、ストレス耐性が改善され、および／または作物収量が増加する。一部の実施形態では、本方法は、土壌、植物（例えば、植物の葉、茎、根、苗、または他の植物の部分）、または種子を本明細書に開示される微生物組成物または共製剤と接触させることを含む。他の実施形態では、本方法は、本開示の組成物で処理した種子を播種することを含む。本方法は、処理した植物、植物の部分、もしくは種子を成長させることおよび／または処理した土壌中で植物、植物の部分、もしくは種子を栽培することも含み得る。
【０１０５】
一部の例では、組成物（複数可）の量は、単独でまたは１種もしくは複数種の微生物および施用される（例えば、エーカーまたはヘクタール当たり）担体もしくは種子の共製剤として算出され、組成物は、処理される面積に噴霧または灌漑する（組成物が液体である場合）のに十分な量まで水（または一部の例では、液体肥料）中で希釈される。組成物は、播種の際に、１エーカー当たり０．５〜２リットル（例えば、１エーカー当たり０．５Ｌ、１エーカー当たり１Ｌ、１エーカー当たり１．５Ｌ、または１エーカー当たり２Ｌ）の比率で施用することができる。組成物はまた、成長中に１回またはそれより多い回数で、同じかまたは異なる量で、土壌（例えば、植物の根付近）または植物に施用することができる。他の例では、組成物は、希釈した除草剤、殺虫剤、農薬、または植物成長調節化学物質と混合されてもよい。施用される組成物が固体（例えば、乾燥製剤）である場合、固体は、土壌、植物、もしくは植物の部分に直接施用されてもよく、または使用前に水（または他の液体）中に懸濁もしくは溶解されてもよい。
【０１０６】
一部の例では、土壌、種子、植物、または植物の部分の本開示の組成物による処理によって、植物の成長（例えば、全体的な植物のサイズ、葉の量、根の数、根の直径、根の長さ、分げつの生成、果実の生成、花粉の生成、および／または種子の生成）を少なくとも約５％（例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、またはそれより多く）が増加する。他の例では、本開示の方法は、作物の生産を、未処理の作物と比較して、約１０〜７５％（例えば、約２０〜６０％または約３０〜５０％）増加させる。作物の性能についての他の尺度としては、果実の品質、収量、デンプンまたは固体の含有量、糖の含有量またはブリックス、果実または収穫可能な生産物の貯蔵寿命、販売可能な収量または標的サイズの生産、果実または生産物の品質、草の分げつおよび芝の徒歩での往来に対する耐性、受粉および実止まり、開花、花の数、花の寿命、開花の品質、発根および根量、倒伏に対する作物の耐性、熱、干ばつ、寒さに対する非生物的ストレスへの耐性ならびにストレス後の回復、痩せた土壌への適応性、光合成および緑化のレベル、ならびに植物の健康が挙げられる。生産効率を決定するために、対照は、並行して実施される、微生物を添加しない同じ農耕法を含む。
【０１０７】
本開示の方法および組成物および／または共製剤をいずれかの作物と併せて使用することができる（例えば、直接的な作物処理または播種前後の土壌処理）。例示的な作物としては、以下に限定されないが、アルファルファ、アーモンド、バナナ、オオムギ、ブロッコリ、キャベツ、アサ、セイヨウアブラナ、ニンジン、柑橘類および果樹木の作物、トウモロコシ、ワタ、キュウリ、花および観賞植物、ニンニク、ブドウ、ホップ、園芸植物、リーキ、メロン、アブラヤシ、タマネギ、ピーナッツおよびマメ科植物（legume）、パイナップル、ポプラ、マツおよび台木（wood-bearing  tree）、ジャガイモ、ラズベリー、イネ、ゴマ、モロコシ、ダイズ、カボチャ、イチゴ、サトウキビ、ヒマワリ、トマト、芝および牧草、スイカ、コムギ、およびユーカリが挙げられる。
【実施例】
【０１０８】
以下の例は、ある特定の特徴および／または実施形態を例証するために提供される。これらの例は、本開示を記載された特定の特徴または実施形態に限定するものと解釈されるべきではない。
【０１０９】
（実施例１）
材料および方法
微生物の単離および同定：すべての微生物は、Ａｇｒｉｎｏｓ微生物コレクション（ＡＭＣ）に由来し、本明細書に記載の４つの追加の微生物以外は、以前にＷＯ２０１８／０４５００４に記載されたものである。これらの追加の微生物を以下に記載した通りに単離した。
【０１１０】
細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅをバルク土壌（Ｎ３８°  ３８’  ４９．４０２”、Ｗ１２１°  ４０”  ５．７７５”）から単離した。簡潔には、土壌試料を連続希釈する前に、滅菌リン酸緩衝食塩水−ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０溶液中に懸濁させ、いくつかの種類の半固体培地上にプレーティングした。３０℃で最長３日間インキュベートした後に、Ｓ．ｐｒａｔｅｎｓｉｓおよびＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅをマンニトール（ＨＩＭＥＤＩＡ  番号Ｍ３７２）プレートを含むＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ寒天培地から単離した。これらの株を同質遺伝子型になるまで半固体ＭＰ培地（以下を参照されたい）上に繰り返し画線した。
【０１１１】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓを肥料（ＵＡＮ３２）と１：１８０の比で前もって混合したＨＹＴ（登録商標）Ａ（Ａｇｒｉｎｏｓ  ＡＳ）の試料から単離した。室温で３週間インキュベートした後、混合物のアリコートをいくつかの種類の半固体培地上にプレーティングし、３０℃で最長３日間インキュベートした。Ｂ．ｆｉｒｍｕｓのコロニーをＰｉｋｏｖｓｋａｙａの寒天培地プレート（ＨＩＭＥＤＩＡ  番号Ｍ５２０）から採取した。この株を同質遺伝子型になるまで半固体ＭＰ培地（以下を参照されたい）上に繰り返し画線した。
【０１１２】
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｚｏｒｅｄｕｃｅｎｓをＨＹＴ（登録商標）Ａ（Ａｇｒｉｎｏｓ  ＡＳ）の試料から単離した。Ｐ．ａｚｏｒｅｄｕｃｅｎｓを１〜１０ｍＭの硫酸アンモニウム寒天培地（ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中０．５８５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．０７５ｇ／ＬのＫＣｌ、０．１４７ｇ／ＬのＣａＣｌ２、０．０４９ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、１．３２〜０．１３２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０５４ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４）上で成長するコロニーとして単離した。この株を同質遺伝子型になるまで半固体ＭＰ培地（以下を参照されたい）上に繰り返し画線した。
【０１１３】
新たに記載した微生物の分類学上の分類：４つの新たに記載した株のすべてについて、生物学的に純粋な分離株の全ゲノムシーケンシングを以下に記載した通り実施した。Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｐｒｏｃｅｓｓ（ＨＧＡＰ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ  ＵＳＡ）により、ｄｅ  ｎｏｖｏゲノムアセンブリーを実施した。
【０１１４】
１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列を使用して、最初は分類学的同定を行った。ＲＮＡｍｍｅｒ（ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＲＮＡｍｍｅｒ／）を使用して、ｄｅ  ｎｏｖｏゲノムアセンブリー内で、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を最初に同定した。次いで、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴｎ、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＲＤＰ）Ｎａｉｖｅ  Ｂａｙｅｓｉａｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ（Wang  et  al.  Appl.  Environ.  Microbiol.  73:5261-5267,  2007）、およびＧｒｅｅｎｇｅｎｅｓのｄｅ  ｎｏｖｏ系統樹の構築およびランクマッピング（DeSantis  et  al.  Appl.  Environ.  Microbiol.  72:5069-502,  2006）によるペアワイズアラインメントを使用して、１６Ｓ配列を分類した。次いで、３つの方法のコンセンサスを使用して、種を割り当てた。
【０１１５】
上記に基づいて、以下のように微生物を同定した：
−  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ。１６Ｓ配列を使用して、全ゲノムの分類学的分類も実施した。タンパク質コード配列をＰｒｏｄｉｇａｌ（Hyatt  et  al.  BMC  Bioinformatics,  11:119,  2010）を使用して同定した。分類には、特定のゲノムにマッチングする対応する配列のセットを見い出すために、４９個の保存されたＣｌｕｓｔｅｒｓ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｒｏｕｐｓ（ＣＯＧ）ファミリー（Tatsuov  et  al.  Science  278:631-637,  1997）のセットを利用した。次いで、選択したゲノムに由来する配列を参照アラインメント中に挿入し、最も近隣のものを抽出および濃縮し、ＦａｓｔＴｒｅｅ２（近似最大尤度法；Price  et  al.  PLoS  One  5:e9490,  2010）を使用して、それらから樹を与えた。この厳密な分類方法によって、最も適切な参照種として、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓが選択された。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ  ＡＴＣＣ  ３３３３１に対する参照ゲノムをＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑからダウンロードし、ＭＵＭｍｅｒ（ｍｕｍｍｅｒ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）を使用して、得られた全ゲノム配列に対してアラインした。アラインメントにより、広範囲の全体的一致が明らかになり、２つの配列が、ゲノムワイドスケールで非常に密接に関連していることを確認した。コンセンサス１６Ｓ配列が配列番号１として提供される。
【０１１６】
−  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ。すべての解析の結果が、この分離株をＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅとして同定することを強く支持した。コンセンサス１６Ｓ配列が配列番号２として提供される。
【０１１７】
−  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ。すべての解析の結果が、この分離株をＢ．ｆｉｒｍｕｓとして同定することを強く支持した。コンセンサス１６Ｓ配列が、配列番号３として提供される。
【０１１８】
−  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｚｏｒｅｄｕｃｅｎｓ。すべての解析の結果が、この分離株をＰ．ａｚｏｒｅｄｕｃｅｎｓとして同定することを強く支持した。コンセンサス１６Ｓ配列が、配列番号４として提供される。
【０１１９】
微生物の代謝活性能の同定：すべての潜在的な微生物代謝活性を、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１８／０４５００４に記載されている通りの実験室アッセイを使用して評価した。微生物が、代謝プロセスの間に硫黄含有化合物を硫化物に還元するかどうかを決定するために、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘのＡＰＩ（登録商標）識別製品を、製造業者（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｉｎｃ．、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ  ＵＳＡ）の推奨に従って使用した。新たに同定した微生物をプロファイリングする重要な代謝活性の結果を表１に示す。
【０１２０】
【表１】
2021526855.tif 000004
【０１２１】
細菌におけるジピコリン酸（ＤＰＡ）生成の評価：目的の細菌株におけるＤＰＡ生成の評価を、基本的には、Ｒｏｓｅｎ（Anal.  Chem.  69:1082-1085,  1997）；Pellegrino  et  al.(Anal.  Chem.  70:1755-1760,  1998)；およびAmmann  et  al.(Int.  J.  Microbiol.  2011:435281,  2011)に記載されているように、テルビウム−ＤＰＡ蛍光アッセイにより実施した。簡潔には、各同質遺伝子株を好気的または嫌気的のいずれかで寒天培地（表２を参照されたい）上で成長させた。好気性株を３０℃で最長３日間成長させ、一方、嫌気性株をＰａｃｋ−Ａｎａｅｒｏの嫌気性ガス発生サシェ（三菱ガス化学株式会社、東京、日本）を有するＢＤ  ＧａｓＰａｋ  ＥＺコンテナシステム（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ  ＵＳＡ）中で、３５℃にて最長３日間成長させた。ＤＰＡアッセイのために、およそ５μＬの細菌をプレート上で成長しているコロニーから採取し、１０ｍＬの酢酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ５）中に再懸濁させた。懸濁液を１２１℃、１５ｐｓｉｇで１５分間オートクレーブし、室温で約３０分間冷却した。次に、等体積のオートクレーブした懸濁液および３０μＭのテルビウム（ＩＩＩ）クロリド六水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ  ＵＳＡ）溶液を混合した。次いで、Ｃｙｔａｔｉｏｎ  ５  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ  ＵＳＡ）を使用して蛍光度を測定した（２７２ｎｍの励起、５４５ｎｍの発光）。
【０１２２】
半固体培地上でこの研究において使用される細菌の培養：マスター細胞バンクとして−８０℃で保管した同質遺伝子細菌株を個々のコロニーの形成が観察されるまで寒天培地（表２）上で成長させた。簡潔には、好気性株を３０℃で最長３日間成長させ、一方、嫌気性株をＰａｃｋ−Ａｎａｅｒｏの嫌気性ガス発生サシェ（三菱ガス化学株式会社、東京、日本）を有するＢＤ  ＧａｓＰａｋ  ＥＺコンテナシステム（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ  ＵＳＡ）中で、３５℃にて最長３日間成長させた。
【０１２３】
【表２】
2021526855.tif 000005
【０１２４】
液体培地中でこの研究において使用される個々の細菌株の培養：寒天成長株から選択したコロニーを適切な滅菌液体培地（表３）中に接種し、最長３日間インキュベートした。好気性株を３０℃で振盪（１２５〜１７５ｒｐｍ）させながら培養し、一方、嫌気性株を３５℃で撹拌せずに密封した血清ボトルまたはＨｕｎｇａｔｅチューブ中Ｎ２ガス下で培養した。必要な場合は、等体積の個別に成長させた株を混合することによって微生物コンソーシアを生産した。株毎の１ｍＬ当たりの細胞数を示す典型的な結果（以下を参照されたい）を表４にまとめる。ＷＯ２０１８／０４５００４に記載されているように、Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  Ｆｏｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用するＤｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって、微生物含量を決定した。
【０１２５】
【表３】
2021526855.tif 000006
【０１２６】
【表４】
2021526855.tif 000007
【０１２７】
発酵によって共培養した微生物コンソーシアの生成：好気性および／または嫌気性細菌の両方を、ホスフェート、ナトリウム、カリウムおよび塩化物（市販のリン酸緩衝食塩水の形態で）などの必須元素ならびに食品グレードのホエイ粉末（０．１％ｗ／ｖ）および酵素によって生成した非ＧＭＯダイズ抽出物（０．２５％ｗ／ｖ；Ｆｅｒｔｉ−Ｎｉｔｒｏ  Ｐｌｕｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｎ；Ｆｅｒｔｉ−Ｏｒｇａｎｉｃ、Ｂｒｏｗｎｓｖｉｌｌｅ、ＴＸ  ＵＳＡ）の形態のアミノ酸、窒素およびペプチド／タンパク質を補充した２％のモラセスを含有する培地中で培養した。塩化ナトリウムの濃度は、０〜４％ｗ／ｖの範囲であった。上記表４からの株（本明細書においてＡＭＣ１と称される）を、各株に対するＯＤ６００が６．６７Ｅ−０５から６．６７Ｅ−０４の間の範囲である最終接種量で、１．５リットルの作業容積を有する２ＬのＤＡＳＧＩＰバイオリアクター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｈａｕｐｐａｕｇｅ、ＮＹ）中に接種した。水酸化アンモニウムおよびリン酸をそれぞれ塩基および酸溶液として使用し、ｐＨをｐＨ５．５から６．９の間に維持した。温度は、２８℃から３５℃の間に制御した。嫌気的発酵をＮ２ガスで継続的にスパージして、嫌気的環境を維持し、一方、スパージした空気を発酵期間中（典型的には最長３日間）微生物に対する酸素供給源として好気的発酵において使用した。一部の実験では、発酵後に、様々な株を含有するバッチをプールして、１つの完全な２２種の株の細菌混合物を生成した。株毎の１ｍＬ当たりの細胞数を示す典型的な結果（以下を参照されたい）を表５にまとめる。発酵液における微生物含量をＷＯ２０１８／０４５００４に記載されているように（as  described  describes）、Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  Ｆｏｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用するＤｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって決定した。
【０１２８】
【表５】
2021526855.tif 000008
【０１２９】
凍結乾燥した微生物コンソーシアムの生成：一部の実験では、生成した微生物コンソーシアムを農業担体との共製剤における実験の前に凍結乾燥した。等体積の個々に培養した細菌をプールするかまたは共培養した発酵液を使用するかのいずれかによって、コンソーシアを生成した（上記）。凍結乾燥は、基本的には、ＷＯ２０１８／０４５００４に記載されているように実施した。簡潔には、製造業者の推奨の通りに、液体微生物コンソーシアをマンニトール／凍結防止剤溶液（ＯＰＳ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）と混合し、微生物懸濁液を凍結乾燥バイアル（ＯＰＳ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）中にアリコートすることによって、凍結乾燥した微生物製剤を生成した。−８０℃で６０分後に、混合物をＦｒｅｅＺｏｎｅ６凍結乾燥システム（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ、ＭＯ）中に配置し、真空にして、試料中の水分を昇華させた。必要になるまで、試料を４℃で保管した。一部の実験では、最終濃度を０．７５ｇ／ＬのＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）、１０ｇ／Ｌのショ糖（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）および５ｇ／Ｌのスキムミルク（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ、Ｎｅｓｔｌｅ  Ｓ．Ａ、ＣＨ）とするために、上記の化学物質を微生物培養液に添加することによって、凍結保護溶液を調製した。
【０１３０】
農業担体との微生物の共製剤：上記のように生成した液体微生物コンソーシア（共培養または個々に成長させてから生成し、次いで、プールした）または個々の細菌株をパーライト、Ａｚｏｍｉｔｅ（登録商標）（Ａｚｏｍｉｔｅ、ＵＴ、ＵＳＡ）、軽石、第一リン酸アンモニウム肥料（ＭＡＰ；Ｍｏｓａｉｃ、ＭＮ、ＵＳＡ）、塩化カリウム肥料（Ｍｕｒｉａｔｅ  ｏｆ  ｐｏｔａｓｈ  ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ）（ＭＯＰ；Ｍｏｓａｉｃ、ＭＮ、ＵＳＡ）、およびバイオ炭（Ｃｏｏｌ  Ｔｅｒｒａ（登録商標）；Ｃｏｏｌ  Ｐｌａｎｅｔ  Ｅｎｅｒｇｙ  ｓｙｓｔｅｍ、ＣＯ、ＵＳＡ）などの農業担体上に含浸させた。担体の水分保持の特性に応じて、様々な体積の微生物コンソーシアを使用して、１グラム当たり３５μＬ程度から最大１グラム当たり６ｍＬで担体を飽和させた。次いで、さらなる貯蔵寿命についての微生物の生存可能性研究および植物アッセイのために、気密容器中に保管する前に、微生物／農業担体混合物を３０℃〜３５℃で一晩乾燥させた。
【０１３１】
水中の尿素および硝酸アンモニウム（ＵＡＮ３２；ＴＧＩ、ＣＡ、ＵＳＡ）などの液体農薬または肥料防塵剤（ＤＵＳＴＲＯＬ；ＡｒｒＭａｚ  ＦＬ、ＵＳＡ）との共製剤の場合には、保管および微生物生存可能性解析（microbial  survivability  analysis）の前に、上記において詳述したように生成した液体微生物コンソーシアを様々な比（以下の実施例において記載した）で混合した。すべての作業は、夾雑を最小限にするために衛生条件下で実施した。
【０１３２】
一部の場合には、担体の化学的性質への培養ブロスの影響を最小限にするために、凍結乾燥した細菌コンソーシアを使用した。詳細は、適宜実施例において記載する。
【０１３３】
ＤＰＡ合成酵素生成に関する細菌ゲノムの分析
微生物ゲノムＤＮＡ抽出：様々な種の細菌細胞を成長させ、最適化した液体ブロスおよび培養条件から回収した。ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ  ＤＮＡ単離キット（ＭＯ  ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ  ＵＳＡ）を小規模ゲノムＤＮＡ抽出のために使用した。大規模ゲノムＤＮＡ抽出のために、ＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ  ＵＳＡ）またはＱｉａｇｅｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＳｅｔおよびＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ  ５００／Ｇ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者に推奨される方法に従って使用した。次に、得られるゲノムＤＮＡを等体積のイソプロパノールで沈殿させ、７０％のエタノールで洗浄し、空気乾燥させ、ＴＥ緩衝液中に再懸濁させた。
【０１３４】
全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）：生物学的に純粋な分離株の全ゲノムシーケンシングを、シーケンスライブラリー調製およびシーケンシングのために製造業者の推奨する方法に従って、ＰａｃＢｉｏ  ＲＳＩＩシステム（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ  ＵＳＡ）を使用して実施した。微生物分離株から、平均して２４ｋｂ長の平均７３，０００個のリードを作成し、続いて、Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｐｒｏｃｅｓｓ（ＨＧＡＰ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ  ＵＳＡ）によるｄｅ  ｎｏｖｏゲノムアセンブリーを作成した。
【０１３５】
選択した細菌株におけるＤＰＡ合成酵素コード配列の同定：初期のバイオインフォマティクス解析には、綱Ｂａｃｉｌｌｉの選択したメンバーを含んだ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌｅｘｕｓ）、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）。第１に、以前に獲得した全ゲノム配列を使用して、ＢＰＧＡ−Ｖｅｒｓｉｏｎ−１．３（ｉｉｃｂ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｂｐｇａ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を使用して細菌汎ゲノム解析を実施し、ゲノムの多様性を評価し、コア（保存）、アクセサリー（必ずしも必要でない）、およびユニーク（株特異的）遺伝子プールを決定した。次いで、アクセサリー遺伝子セットにおいて、任意のジピコリン酸合成酵素サブユニットＡ（ＤｐａＡ）に対して検索を実施した。これに続いて、カスタムＢａｓｈスクリプト（Ｆｒｅｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２００７）を使用する、ＤｐａＡおよびＤｐａＢに関する表１の株についての全検索を実施した。
【０１３６】
簡潔には、タンパク質コード遺伝子を２段階でアノテートした。Ｐｒｏｄｉｇａｌ（ＰＲＯｋａｒｙｏｔｉｃ  ＤＹｎａｍｉｃ  ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  Ｇｅｎｅ−ｆｉｎｄｉｎｇ  ＡＬｇｏｒｉｔｈｍ（Hyatt  et  al.,  BMC  Bioinformatics  11:119,  2010））を使用して、候補遺伝子の座標を特定したが、推定遺伝子産物については記載されていない。次いで、これらの候補遺伝子を、より小さい信頼できるデータベースから出発し、中間サイズであるがドメイン特異的なデータベース、および最終的にタンパク質ファミリーの精選モデルに移行する階層的方法で大規模データベースと比較した。デフォルトによって、１０−６のｅ値の閾値を以下の一連のデータベースで使用した：
【０１３７】
１．実際のタンパク質または転写物のエビデンスを有し、断片ではないＵｎｉＰｒｏｔにおけるすべての細菌タンパク質。ＢＬＡＳＴ＋を検索に使用する。
【０１３８】
２．特定の属についてＲｅｆＳｅｑで解読した細菌ゲノムからのすべてのタンパク質。ＢＬＡＳＴ＋を検索に使用する。
【０１３９】
３．Ｐｆａｍ（Punta  et  al.,  2012）およびＴＩＧＲＦＡＭｓ（Haft  et  al.,  2013）を含む一連の隠れマルコフモデルプロファイルデータベース。これは、ＨＭＭＥＲ３．１パッケージ（Eddy,  2011）からのｈｍｍｓｃａｎを使用して実施する。
【０１４０】
４．一致（match）を見い出すことができない場合、「仮想タンパク質」と表示する。
【０１４１】
次いで、これらのデータを、ＤＰＡ合成酵素と生存能との間の相関を確立するために、胞子形成能力および乾燥製剤の生存可能性と共に作表した（表６を参照されたい）。次いで、ＤｐａＡおよびＤｐａＢ遺伝子のアラインメントをＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）およびアミノ酸組成およびＳｅａｖｉｅｗ４（Gouy  et  al.  Mol.  Biol.  Evol.  27:221-224,  2010）を使用して計算した頻度統計を使用して実施した。次いで、ＤｐａＡおよびＤｐａＢアミノ酸アラインメントを使用して、パッケージＢｉｏｓｔｒｉｎｇｓ  ａｎｄ  ｓｅｑｉｎｒ（Pages  et  al.,  2016;  Charif  and  Lobry,  Structural  Approaches  to  Sequence  Evolution,  pp.  207-232,  2007;R  Core  Team,  2016）を使用して、コンセンサス配列およびＲの確率マトリックスを計算した。
【０１４２】
【表６】
2021526855.tif 000009
【０１４３】
コンソーシア生存可能性アッセイにおける細菌
液体共製剤試料の調製：各貯蔵寿命時点について、１ｍＬの共製剤（農薬／細菌コンソーシアム）を滅菌ペプトン水中で１０−１から１０−５に連続希釈した。
【０１４４】
乾燥製剤試料の調製：各貯蔵寿命の時点では、０．０３〜１ｇの乾燥製剤（農業担体／細菌コンソーシアム）を最大３ｍＬのペプトン水などの培養ブロスまたは他の適切な培地中に懸濁させ、室温で最長１時間インキュベートした。一部の場合には、穏やかな超音波処理（３５ｋｈｚ）を使用し、水浴超音波処理機（ＶＷＲ超音波洗浄機）を使用して乾燥マトリックスから細菌を放出させた。次に、懸濁液を滅菌ペプトン水または他の種類の培養ブロス中で１０−１から１０−５に連続希釈した。他の事例では、乾燥材料を成長のための液体培地に直接添加した。
【０１４５】
生存可能性アッセイ：処理（複数可）を受ける細菌株に増殖する機会を与えた。コンソーシアムにおける各株の成長潜在性を最大にするために、ｃｈＡ（半乾燥キチン、５ｇ／Ｌ；Ｋ２ＨＰＯ４、０．７ｇ／Ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、０．３ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ４．５Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／Ｌ；ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ；ＺｎＳＯ４、０．００１ｇ／Ｌ；ＭｎＣｌ２、０．００１ｇ／Ｌおよび寒天、１５ｇ／Ｌ）、ＲＣＭ、ＮＡ、ＭＰ、ＹＰＤ、ＲｈＸ、ＡＭＡＳ、および／またはＢＨＩＳなどのいくつかの異なる寒天培地を使用した。一部の例では、上記で生成した各連続希釈液を、二連で、１つまたは複数の寒天培地上にプレーティングして広げた。他の事例では、上記で生成した乾燥材料を、六連で、１つまたは複数の液体培地中に懸濁させた。プレート培養では、プレートを静止インキュベーター中でインキュベートし、一方を３０℃で好気条件に、他方を３５℃で嫌気条件に３日間設定した。液体培養では、チューブを３０℃で好気的に振盪しながら、または３５℃で嫌気的に静的に７日間インキュベートした。その処理（複数可）を受けて生き延びた細菌は、コロニーを形成するかまたは液体培地中で増殖することによって成長し、次いで、この成長についてサンプリングし、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用して同定した。
【０１４６】
ＤＮｅａｓｙ  ＰｏｗｅｒＬｙｚｅｒ  ＰｏｗｅｒＳｏｉｌキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ  ＵＳＡ）を製造業者の推奨に従って使用して、回収した細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。次いで、Ｑｕａｎｔａｓ  ＦｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒおよびＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ  ｄｓＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ  ＵＳＡ）を使用して、ＤＮＡを定量し、株に特異的なプローブをｄｄＰＣＲと併せて使用して、同定および定量のために処理した（Dreo  et  al.,  Anal.  Bioanal.  Chem.  406:6513-6528,  2014；Yin,  et  al.,  Journal  of  Microbiological  Methods  65:21-31,  2006）。簡潔には、ＤＮＡ試料、プライマー、およびプローブ（１６Ｓ遺伝子からの特有の配列および／または参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１８／０４５００４において以前に記載されたように、ＷＧＳゲノムアセンブリーから同定した特有のコード遺伝子配列を使用して設計した）を、製造業者の推奨に従ってＢｉｏ−Ｒａｄ’ｓ  ｄｄＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｂｅｓと組み合わせて、ｄｄＰＣＲ反応物を調製した。次いで、製造業者の推奨に従って、ＱＸ２００（商標）ドロップレットジェネレーターまたはＡｕｔｏＤＧ（商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔのいずれかを使用して、ドロップレットを作成した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ’ｓ  ｄｄＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｂｅｓから推奨される温度サイクル条件を使用するＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ｎｅｘｕｓ勾配を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲプロトコールの後に、ＱＸ２００ドロップレットリーダーを使用して反応物を読み出した。最後に、濃縮物をＱｕａｎｔａＳｏｆｔ（商標）ソフトウェアにより解析した。
【０１４７】
液体または乾燥農業担体との共製剤化の後に、単一株の生存可能性を特定する事例では、表２に記載した所与の株に最も適合する寒天培地を使用して、単回のプレーティングを実施した。
【０１４８】
（実施例２）
選択した細菌株におけるＤＰＡ合成酵素コード配列の同定
ジピコリン酸合成酵素サブユニットＡ（ＤｐａＡ）：細菌株からのＤｐａＡのアミノ酸アラインメントによって、保存されたアミノ酸は２８．４％に過ぎず、アミノ酸アラインメントが多様であることが明らかになった。結果を表７〜９および図１にまとめる。Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｉは、ほとんどの他の株よりも多様であることが明らかになった。アラインされた位置として定義された分母を用いてパーセント同一性を計算することによって、Ｏ．ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｉは、ＢＬＯＳＵＭ６２を使用して、コンセンサス配列との５８％のパーセント同一性を有した。さらに、これらのアミノ酸変化は、解析された株のほとんどについて保存された領域にあるようであった。ＤｐａＡのアミノ酸アラインメントによって、Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓが、遺伝子の２つのコピー（遺伝子の複製による可能性が高い）を有することも明らかになった。第１のコピーは高度に多様であり（コンセンサス配列との５１％の同一性、上記と同じ方法）、第２のコピーは、著しいアミノ酸変化に加えて、２９個のアミノ酸で切断されたようであった。さらに、ＤｐａＡのすべての他の例は、オペロンの一部としてＤｐａＢに連続して位置したが、Ｖ．ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓでは２つの遺伝子は、５３９個の他の遺伝子によって分離されている。
【０１４９】
【表７】
2021526855.tif 000010
【０１５０】
【表８】
2021526855.tif 000011
【０１５１】
【表９】
2021526855.tif 000012
【０１５２】
ジピコリン酸合成酵素サブユニットＢ（ＤｐａＢ）：細菌株からのＤｐａＢのアミノ酸アラインメントによって、保存されたアミノ酸は４５．５％であり、アミノ酸アラインメントがＤｐａＡより保存されている（more  conserved  that  DpaA）ことが明らかになった。結果を表１０〜１２および図２にまとめる。複製も主要な切断も検出されなかった。上述したように、ＤｐａＢのすべてのコピーは、ＤｐａＢがＤｐａＡから５３９遺伝子上流にあるＶ．ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓを除き、オペロンの一部としてＤｐａＡと連続して位置した。
【０１５３】
【表１０】
2021526855.tif 000013
【０１５４】
【表１１】
2021526855.tif 000014
【０１５５】
【表１２】
2021526855.tif 000015
【０１５６】
ＤＰＡの生成（上記アッセイにおける）とＤＰＡ遺伝子の存在との間の相関：表６に記載されているように、テルビウム−ＤＰＡ蛍光アッセイによってＤＰＡ生成株としてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉを検出したが、ＤｐａＡとＤｐａＢはいずれもそのゲノムにおいて識別可能ではなかった。本発明者らは、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉが、先にＤＰＡ生成に関係するＥｔｆＡと構造的に関連する鉄−硫黄フラビンタンパク質（Ｉｓｆ）を有することを見い出した（Orsburn  et  al.,  Mol.  Microbiol.  75:178-186,  2010）。鉄−硫黄フラビンタンパク質の６つのコピーをＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉのゲノム内で検出した。次いで、これらの配列を、４つの異なる細菌：Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、およびＰｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅからのＩｓｆ配列と共にアラインした（図３）。このＩｓｆタンパク質は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍには存在せず、ＤＰＡの生成は、Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍにおいて検出されなかった。ＤＰＡ生成におけるＩｓｆの役割に関するさらなる支持は、実施例１２に提供される。
【０１５７】
（実施例３）
担体上の選択された単一株の生存
個々の株を含浸させたＡｚｏｍｉｔｅ（登録商標）における細菌の生存可能性の評価を実施した。４つの株は、ｌａｂアッセイにおけるおよび／またはＤＰＡ遺伝子同定の結果に関するそれらのＤＰＡを生成する能力に基づいて選択した。細菌の生存可能性を評価する前に、含浸された材料を乾燥して５日間保管した。結果は、表１３に示した通りである。ＤＰＡ生成が検出できる株の１００％（２／２）が、５日間生存可能なままであった。ＤＰＡ生成が検出不能である株については、５０％（１／２の株）が、５日間生存可能なままであった。
【０１５８】
【表１３】
2021526855.tif 000016
【０１５９】
第２の実験では、株の数を拡大した。含浸後のＡｚｏｍｉｔｅ（登録商標）における細菌の生存可能性の評価を１カ月の期間にわたって実施した。簡潔には、Ａｚｏｍｉｔｅ（登録商標）に個々の同質遺伝子株を含浸させ、乾燥させ、細菌の生存能解析のために試料を３、７、１４、２１、および２８日目に採取した。結果は、表１４に示した通りであり、ＤＰＡ遺伝子が同定され、ＤＰＡを生成する細菌の１００％（４／４）が１カ月間生存可能なままであったことを示す。ＤＰＡ遺伝子が同定されず、ＤＰＡ生成が検出不能である株については、４０％（２／５の株）が１カ月間生存可能なままであった。
【０１６０】
【表１４】
2021526855.tif 000017
【０１６１】
次いで、第２の農業担体（パーライト）を試験した。Ａｚｏｍｉｔｅ（登録商標）に関して以前に記載したように、微生物の生存可能性評価を１カ月間にわたって実施した。結果は、表１５に示した通りであり、同定したＤＰＡ遺伝子を有し、ＤＰＡを生成する細菌の１００％（４／４）は１カ月間生存可能なままであったことを示す。検出されるＤＰＡ遺伝子を有さず、ＤＰＡ生成が検出不能である株については、６０％（３／５の株）が１カ月間生存可能なままであった。
【０１６２】
【表１５】
2021526855.tif 000018
【０１６３】
（実施例４）
担体上の微生物コンソーシアの生存
以下の実験では、２２種の細菌を個々に成長させ、次に、混合して、上記のようにコンソーシアムを生成した。ペレット化形態の乾燥Ａｚｏｍｉｔｅ（登録商標）に０．２３〜０．４ｍＬのコンソーシアムを含浸させ（ペレットの完全性を保存するため）、乾燥させ、２週間保管した後、コンソーシアムからの微生物の生存能をアッセイするためのアッセイを使用して、どの細菌が生存したかを解析した（実施例１）。２回の独立した試験を行い、結果を表１６にまとめる。本発明者らは、ＤＰＡ遺伝子が同定されかつ／またはＤＰＡを生成する細菌株の８３％および９２％が、Ａｚｏｍｉｔｅ（登録商標）に関する含浸の２週間後に生存可能なままであったことを観察した。２つの試験で一致した生存能を示していないようであった株は、Ｏ．ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｉであった。上述したように、Ｏ．ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｉのＤＰＡ合成酵素サブユニットＡは、ＢＬＯＳＵＭ６２を使用して、コンセンサス配列との５８％のパーセント同一性を有し、ほとんどの他の調査した株より多様であるようである。ＤＰＡ遺伝子が同定されず、ＤＰＡ生成が検出できない株については、結果では、同じ期間内に生存可能なままである細菌が６０％から７０％の間で変動した。２つの試験の間での再現性は低く、含浸の時点でこのセットの微生物の様々な代謝状態に起因し得る。
【０１６４】
【表１６−１】
2021526855.tif 000019
【表１６−２】
2021526855.tif 000020
【０１６５】
上記Ａｚｏｍｉｔｅ（登録商標）に関する実験と同様に、２２種の細菌を個々に成長させ、次に、混合してコンソーシアムを生成した。パーライトに２〜６ｍＬのコンソーシアムを含浸させ、乾燥させ、２週間保管した後、コンソーシアムからの微生物の生存能をアッセイするためのアッセイを使用して、どの細菌が生存したかを解析した（実施例１）。２回の独立した試験を行い、結果を表１７にまとめる。本発明者らは、ＤＰＡ遺伝子が同定されかつ／またはＤＰＡを生成する細菌株の５８％および１００％が、パーライトに関する含浸の２週間後に生存可能なままであったことを観察した。ＤＰＡ遺伝子が同定されず、ＤＰＡ生成が検出できない株については、結果では、同じ期間内に生存可能なままである細菌が６０％から８０％の間で変動した。Ａｚｏｍｉｔｅ（登録商標）実験と比較して、ＤＰＡ遺伝子が同定されかつ／またはＤＰＡを生成する細菌は、異なる含浸基質を使用した場合でさえ、良好な再現性を示した。これらは、また本発明者らのアッセイにおいて、ＤＰＡ遺伝子が同定されないかまたはＤＰＡ生成が検出できないものよりも性能が優れていた。
【０１６６】
【表１７】
2021526855.tif 000021
【０１６７】
（実施例４）
液体防塵剤と共製剤化した微生物コンソーシアの生存：以下の実験では、目的の細菌株を上記の培地を使用する半固体寒天プレート上で成長させた（表２を参照されたい）。防塵化学物質／細菌共製剤は、寒天プレートから削り取った１μＬのループフル（ｌｏｏｐｆｕｌ）を２００μＬの滅菌ペプトン水中に懸濁させ、次いで、５％ｖ／ｖの比率で防塵化学物質と混合することによって作製した。次いで、共製剤における各株の生存可能性を、細菌／農薬混合物を新鮮な培地（表３）に接種し、成長の徴候をスコア化することによって決定した。
【０１６８】
ＭＤＣ−２００と共製剤化した細菌の生存可能性：防塵剤ＭＤＣ−２００（ＡｒｒＭａｚ、ＦＬ、ＵＳＡ）との共製剤化後の細菌の生存能の評価を１カ月の期間にわたって実施した。結果は、表１８に示した通りである。本発明者らは、ＤＰＡ遺伝子が同定されかつ／またはＤＰＡを生成する細菌の９２％（１１／１２）が１カ月間生存可能なままであったことを観察した。ＤＰＡ遺伝子が同定されず、ＤＰＡ生成が検出不能である株については、０％（０／１０の株）が１カ月間生存可能なままであった。
【０１６９】
ＤＵＳＴＲＯＬ（登録商標）３２７５と共製剤化した細菌の生存可能性：ＤＵＳＴＲＯＬ（登録商標）３２７５（ＡｒｒＭａｚ、ＦＬ、ＵＳＡ）との共製剤化後の細菌の生存能の評価を１カ月間の期間にわたって実施した。結果は、表１８に示した通りである。本発明者らは、ＤＰＡ遺伝子が同定されかつ／またはＤＰＡを生成する細菌の１００％（１２／１２）が１カ月間生存可能なままであったことを観察した。ＤＰＡ遺伝子が同定されず、ＤＰＡ生成が検出不能である株については、０％（０／１０の株）が１カ月間生存可能なままであった。
【０１７０】
ＤＵＳＴＲＯＬ（登録商標）３１３３と共製剤化した細菌の生存可能性：ＤＵＳＴＲＯＬ（登録商標）３１３３（ＡｒｒＭａｚ、ＦＬ、ＵＳＡ）との共製剤化後の細菌の生存能の評価を１カ月間の期間にわたって実施した。結果は、表１８に示した通りである。本発明者らは、ＤＰＡ遺伝子が同定されかつ／またはＤＰＡを生成する細菌の１００％（１２／１２）が１カ月間生存可能なままであったことを観察した。ＤＰＡ遺伝子が同定されず、ＤＰＡ生成が検出不能である株については、０％（０／１０の株）が１カ月間生存可能なままであった。
【０１７１】
ＤＵＳＴＲＯＬ（登録商標）３１３９と共製剤化した細菌の生存可能性：ＤＵＳＴＲＯＬ（登録商標）３１３９（ＡｒｒＭａｚ、ＦＬ、ＵＳＡ）との共製剤化後の細菌の生存能の評価を１カ月間の期間にわたって実施した。結果は、表１８に示した通りである。本発明者らは、ＤＰＡ遺伝子が同定されかつ／またはＤＰＡを生成する細菌の９２％（１１／１２）が１カ月間生存可能なままであったことを観察した。ＤＰＡ遺伝子が同定されず、ＤＰＡ生成が検出不能である株については、０％（０／１０の株）が１カ月間生存可能なままであった。
【０１７２】
ＤＵＳＴＲＯＬ（登録商標）３００１と共製剤化した細菌の生存可能性：ＤＵＳＴＲＯＬ（登録商標）３００１（ＡｒｒＭａｚ、ＦＬ、ＵＳＡ）との共製剤化後の細菌の生存能の評価を１カ月間の期間にわたって実施した。結果は、表１８に示した通りである。本発明者らは、ＤＰＡ遺伝子が同定されかつ／またはＤＰＡを生成する細菌の３３％（４／１２）が１カ月間生存可能なままであったことを観察した。ＤＰＡ遺伝子が同定されず、ＤＰＡ生成が検出不能である株は、０％（０／１０の株）が１カ月間生存可能なままであった。この実験において低下した生存は、ＤＵＳＴＲＯＬ（登録商標）３００１の１つまたは複数の構成成分との微生物（ＤＰＡを生成するか否かにかかわらず）の不適合に起因し得る。
【０１７３】
ＤＵＳＴＲＯＬ（登録商標）３０１０と共製剤化した細菌の生存可能性：ＤＵＳＴＲＯＬ（登録商標）３０１０（ＡｒｒＭａｚ、ＦＬ、ＵＳＡ）との共製剤化後の細菌の生存能の評価を１カ月間の期間にわたって実施した。結果は、表１８に示した通りである。本発明者らは、ＤＰＡ遺伝子が同定されかつ／またはＤＰＡを生成する細菌の７５％（９／１２）が１カ月間生存可能なままであったことを観察した。ＤＰＡ遺伝子が同定されず、ＤＰＡ生成が検出不能である株については、２０％（２／１０の株）が１カ月間生存可能なままであった。
【０１７４】
【表１８−１】
2021526855.tif 000022
【表１８−２】
2021526855.tif 000023
【０１７５】
（実施例５）
液体ＵＡＮ肥料と共製剤化した微生物コンソーシアの生存
液体ＵＡＮ肥料と共製剤化した後の細菌の生存能の評価を、１カ月の期間にわたり様々な時点で実施した。簡潔には、各同質遺伝子株を、好気的または嫌気的のいずれかで液体培地（上記の通り）中で成長させた。次いで、培養物を等比率で混合し、次いで、混合物を１：１８０（微生物：ＵＡＮ）の比でＵＡＮ３２と組み合わせた。微生物の生存可能性を０、７、１４、および２８日目に評価し、表１９にまとめる。０日目の時点で（共製剤化の約１時間後）、ＤＰＡ遺伝子が同定されかつ／またはＤＰＡを生成する細菌株の８３％（１０／１２）が生存可能なままであった。ＤＰＡ生成が検出できない細菌については、２０％（２／１０の株）のみが、０日目の時点で生存可能なままであった。７日目の時点では、ＤＰＡ遺伝子が同定されかつ／またはＤＰＡを生成する細菌株の６７％（８／１２）が生存可能なままであった（remained  viable  remained  viable）。７日目の後には、このセットの株について、生存能に変化はなかった。ＤＰＡ生成が検出できない細菌については、１０％（１／１０の株）のみが、７日目の時点で生存可能なままであった。
【０１７６】
【表１９−１】
2021526855.tif 000024
【表１９−２】
2021526855.tif 000025
【０１７７】
（実施例６）
バイオ炭と共製剤化した微生物コンソーシアの生存
この実験では、表４に示した２２種の細菌を個々に成長させ、次に、混合して、上述したように、コンソーシアムを生成した。１グラムのバイオ炭（Ｃｏｏｌ  Ｔｅｒｒａ（登録商標）；Ｃｏｏｌ  Ｐｌａｎｅｔ  Ｅｎｅｒｇｙ  ｓｙｓｔｅｍ、ＣＯ、ＵＳＡ）に約０．５ｍＬのコンソーシアムを含浸させ、乾燥させ、７日間保管した後、以前に記載した生存可能性アッセイを使用して、どの細菌が生存したかを解析した。結果を表２０にまとめる。ＤＰＡ遺伝子が同定されかつ／またはＤＰＡを生成する細菌の６６．７％（７／１２の株）がバイオ炭に関する含浸の７日後も生存可能なままであった。ＤＰＡ遺伝子が同定されず、ＤＰＡ生成が検出できない株については、３０％（３／１０の株）が同一の時間枠内で生存可能なままであった。
【０１７８】
【表２０】
2021526855.tif 000026
【０１７９】
（実施例７）
乾燥肥料顆粒と共製剤化した微生物コンソーシアの生存
この実験では、表４に示した２２種の細菌を個々に成長させ、次に、混合して、上述したように、コンソーシアムを生成し、３５μＬ／ｇの比率でＭＯＰ（０−０−６０）乾燥肥料に含浸させた。次いで、肥料を室温で保管し、周期的にサンプリングして、以前に記載したように微生物の生存可能性を評価した。結果を表２１にまとめる。ＤＰＡ遺伝子が同定されかつ／またはＤＰＡを生成する細菌の６６．７％（８／１２の株）が、最長７日間生存可能なままであった。ＤＰＡ遺伝子が同定されず、ＤＰＡ生成が検出できない株については、３０％（３／１０の株）が同一の時間枠内で生存可能なままであった。
【０１８０】
【表２１−１】
2021526855.tif 000027
【表２１−２】
2021526855.tif 000028
【０１８１】
表４に示した２２種の細菌もまた個々に成長させ、次に、混合して、上述したように、コンソーシアムを生成し、３５μＬ／ｇの比率でＭＡＰ（１１−５２−０）に含浸させた。次いで、肥料を室温で保管し、周期的にサンプリングして、以前に記載したように微生物の生存可能性を評価した。結果を表２２にまとめる。この事例では、ＤＰＡ遺伝子が同定されかつ／またはＤＰＡを生成する細菌の５８．３％（７／１２の株）が、最長７日間生存可能なままであった。ＤＰＡ遺伝子が同定されず、ＤＰＡ生成が検出できない株については、４０％（４／１０の株）が同一の時間枠内で生存可能なままであった。
【０１８２】
【表２２】
2021526855.tif 000029
【０１８３】
（実施例９）
ＤＰＡ発現／生成と比較したコンソーシアム由来の細菌の生存
この実験では、表４に示した２２種の細菌を個々に成長させ、次に、混合して、上述したように、コンソーシアムを生成した。次いで、コンソーシアムを室温で保管し、周期的にサンプリングして、前述したように、微生物の生存可能性を評価した。結果を表２３にまとめる。
【０１８４】
２週目に、ＤＰＡ遺伝子が同定されかつ／またはＤＰＡを生成する細菌の８３％（１０／１２の株）が生存可能なままであった。ＤＰＡ遺伝子が同定されず、ＤＰＡ生成が検出できない株については、６０％（６／１０の株）が同一の時間枠内で生存可能なままであった。７．５週後に、ＤＰＡ遺伝子が同定されかつ／またはＤＰＡを生成する細菌の５８％（７／１２の株）が生存可能なままであった。ＤＰＡ遺伝子が検出されず、ＤＰＡ生成が検出できない株については、５０％（５／１０の株）がこの期間内で生存可能なままであった。
【０１８５】
【表２３−１】
2021526855.tif 000030
【表２３−２】
2021526855.tif 000031
【０１８６】
（実施例１０）
微生物の生存のまとめ
試験したすべての例では、ＤＰＡ遺伝子が同定されかつ／またはＤＰＡを生成する胞子形成細菌は、液体または乾燥製剤としてのいずれかで、農業担体との共製剤における経時的な生存可能性について、ＤＰＡ遺伝子が同定されず、ＤＰＡ生成が検出できない株より優れた性能を有した（表２４および図４）。したがって、農業担体（湿潤したおよび／または乾燥した）との共製剤化のためのまたは種子処理として、選択された植物／土壌の有益な形質を伴う微生物コンソーシアの合理的設計では、胞子を形成し、かつＤＰＡを生成する微生物の選択は、所望の微生物の機能（例えば、以下に限定されないが、窒素代謝、硫黄代謝、塩耐性、鉱物塩可溶性、セルロース分解、キチン分解、植物ホルモン産生、鉄代謝、有機物質の脱リン酸化）が生存している微生物において保持されることをもたらす助けとなり得る。一部の例では、このことにより、標的作物、土壌、および施用実施の必要性ならびに地理的課題および規制上の課題に応じるために、合理的に設計したコンソーシアムに存在する微生物の機能において十分な冗長性を保障することができる。
【０１８７】
【表２４】
2021526855.tif 000032
【０１８８】
（実施例１１）
植物の成長を促進する活性の評価
Ｓｅｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ（Ｌｕｂｂｏｃｋ、ＴＸ）から購入したキュウリの種子を液体肥料の希釈混合物（水中２５ｐｐｍのＮＰＫ）を含浸させたロール発芽紙（rolled  germination  paper）（Ａｎｃｈｏｒ  Ｐａｐｅｒ、Ｓａｉｎｔ  Ｐａｕｌ、ＭＮ）において、２２〜２４℃で４日間、予め発芽させた。ポッティング培地（Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  Ｍｉｘ）をＨｏａｇｌａｎｄ溶液（Hoagland,  Calif.  Agric.  Exp.  Stn.  Bull.  347:36-39,  1938）で前処理し、Ｐ、３０．９７ｐｐｍ；Ｋ、３９．１ｐｐｍ；Ｃａ、４０．０ｐｐｍ；Ｍｇ、１４．５９ｐｐｍ；Ｓ、２０．１４３ｐｐｍ；Ｆｅ、１．０１０ｐｐｍ；Ｃｕ、０．０１９ｐｐｍ；Ｃｏ、０．０１２ｐｐｍ；Ｂ、２．４４ｐｐｍ；Ｍｎ、０．４９４ｐｐｍ；Ｍｏ、０．００１ｐｐｍおよびＺｎ、０．０５６ｐｐｍを含有するように改変した。１ポンド当たり１Ｌの比率のポッティング培地を使用した。各ポットに、１０％ｗ／ｖ尿素溶液１ｍＬを加えてから、同様の長さを有する予め発芽させたキュウリの苗を移植した。各処理について（対照を含む）、１７〜１８個の植物を定義した成長条件で、平地で無作為化し、温度（１６〜２４℃）および１２時間の明期を制御した。対照のポットは、未処理のパーライト２ｇを含有した。実験ポットを表４に示した２２種の細菌２ｍＬを含浸させたパーライトで処理した。含浸させたパーライトをこのアッセイで使用する前に、２週間乾燥させて保管した。平地に、改変したＨｏａｇｌａｎｄ溶液で週に３回、水まきした。２８から３２日後に、シュートを乾燥させ、各植物について重量を記録した。一元ＡＮＯＶＡ（分散分析）でデータを解析し、事後チューキー検定を用いて、実験内で試料を比較した。シュートの乾燥重量は、微生物を含浸させたパーライトで処理した植物において増加したが、統計的な有意性には達しなかった（図５）。主に実施例４（表１７）において記載したように、ＤＰＡ遺伝子が同定されかつ／またはＤＰＡ生成が検出できる微生物は、出発コンソーシアムのサブセットである含浸させたパーライト上で生存した。
【０１８９】
（実施例１２）
ＤＰＡ生成コンソーシアム
追加のＤＰＡ生成コンソーシアムを設計する際に使用するのに好適な株を同定するために、組織内の微生物コレクションをスクリーニングした。胞子を形成することが公知である属に由来する株を細菌のグリセロールストックから適切な培地上に復活させ、最長３日間成長させた。次いで、単一のコロニーを選択し、少なくとも３回継代し、純度を評価した。実施例１に記載したように、テルビウム−ＤＰＡ蛍光アッセイを使用して、ＤＰＡ生成について株を試験した。ＤＰＡを生成することが示された株を全ゲノムシーケンシングのために選択した。生物学的に純粋な分離株の全ゲノムシーケンシングを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｏｖａＳｅｑ  ６０００シーケンシングシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  ＵＳＡ）を、シーケンスライブラリーの調製およびシーケンシングについての製造業者の推奨した方法に従って使用して、実施した。平均して長さ８７ｂｐの平均５，１３３，９２８リードを微生物分離株から作成した。ｄｅ  ｎｏｖｏゲノムアセンブリーを、ＳＰＡｄｅｓ３．１２．０を使用して実施した（Nurk  et  al.,  J.  Comput.  Biol.  20:714-737,  2013）。次いで、アッセンブルしたコンティグをＰＲＯＫＫＡでアノテートした（Seemann,  Bioinformatics  30(14):2068-2069,  2014）。次いで、アノテートしたゲノムをジピコリン酸合成酵素サブユニットＡ（ＤｐａＡ）およびジピコリン酸合成酵素サブユニットＢ（ＤｐａＢ）および鉄−硫黄フラビンタンパク質（Ｉｓｆ、表２５）の存在について評価した。ほとんどの事例では、ＤＰＡを生成した株は、ＤｐａＡとＤｐａＢ遺伝子の両方を有し、Ｉｓｆ遺伝子を欠いていた。ＤＰＡを生成し、ＤｐａＡおよびＤｐａＢを欠いていたすべての株は、１つまたは複数のＩｓｆ遺伝子のコピーを有した。３つの事例では、株は、３つすべて（ＤｐａＡ、ＤｐａＢ、およびＩｓｆ）の遺伝子を有した。したがって、テルビウム−ＤＰＡ蛍光アッセイによるＤＰＡ生成の検出は、ＤｐａＡ、ＤｐａＢ、および／またはＩｓｆ遺伝子の存在と完全に相関した。
【０１９０】
【表２５−１】
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【表２５−２】
2021526855.tif 000034
【表２５−３】
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【０１９１】
ＤＰＡ生成が陽性であるかを試験した株については、潜在的な微生物代謝活性（例えば、以下に限定されないが、窒素代謝、硫黄代謝、塩耐性、鉱物塩可溶性、セルロース分解、キチン分解、植物ホルモン産生、鉄代謝、有機物質の脱リン酸化）を、ＷＯ２０１８／０４５００４および実施例１に記載されたように、実験室アッセイを使用して評価した。最大数の代謝活性を有する株を、ＤＰＡ生成を欠く５種の株と共に、微生物コンソーシアにおける共発酵（co-fermentation）について選択し、それらを代謝活性について選択した（実施例１を参照されたい）。本明細書において乾燥製剤コンソーシアム（ＤＦＣ）とも称される、コンソーシアム（表２６を参照されたい）における共発酵に適していることが証明されたこれらの株を、ベントナイト、パーライトおよび／または尿素などの担体との共製剤化のために選択した。
【０１９２】
この実施例に含まれるすべてのコンソーシアは、以下のように発酵させた。好気性と嫌気性の両方の細菌株を２〜１０％の糖供給源を含有する培地で培養した。アミノ酸、窒素およびペプチドは、以下のうちの１つまたは複数の形態で与えた：食品グレードのホエイ粉末（０．１〜０．５％ｗ／ｖ）、酵母抽出物（０．１〜０．５％ｗ／ｖ）、酵素によって生成した非ＧＭＯダイズ抽出物（０．１〜０．５％ｗ／ｖ；Ｆｅｒｔｉ−Ｎｉｔｒｏ  Ｐｌｕｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｎ；Ｆｅｒｔｉ−Ｏｒｇａｎｉｃ、Ｂｒｏｗｎｓｖｉｌｌｅ、ＴＸ  ＵＳＡ）、スピルリナ（０．１〜０．５％ｗ／ｖ）、および／またはペプトン（０．１〜０．５％ｗ／ｖ）。必要な場合には、追加のビタミン類および微量栄養素をケルプ抽出物（０．１〜０．５％ｗ／ｖ）、精製ビタミンＢ（Ｓｉｇｍａ）、および／またはＷｏｌｆｅの微量金属溶液によって与えた。必要な場合には、追加の塩類をリン酸緩衝食塩水および／または塩化ナトリウム添加（０〜４％ｗ／ｖ）として添加した。ＡＭＣ１（上記した）からの株を１．５リットルの作業容積を有する２ＬのＤＡＳＧＩＰバイオリアクター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｈａｕｐｐａｕｇｅ、ＮＹ）中に接種した。発酵中のｐＨを５．０から７．０の間で維持した。発酵中の通気条件は、目標の酸素移動速度（ｋＬａを使用して推定した）を得るために、撹拌、ガス組成（空気および／または窒素ガス）およびガス流量を変化させることによって制御し、ｋＬａ（時間当たり）を０から１１０の範囲にした。温度は、２８℃から３５℃の間で制御した。
【０１９３】
【表２６−１】
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【表２６−２】
2021526855.tif 000037
【０１９４】
共製剤を生成するために、ＤＦＣ発酵液をベントナイトまたはパーライトに適用し、次いで、およそ２４時間乾燥させた。一部の事例では、適用前に、遠心分離によって発酵液を濃縮した。次いで、生存能について共製剤を試験した。さらに、特定の共製剤を植物成長室試験で試験し、植物の有益な特徴を評価した。
【０１９５】
担体とのＤＦＣおよびＡＭＣ１の生存能：ＤＦＣ液、ＡＭＣ１液、ＤＦＣを含浸させたパーライト、ＡＭＣ１を含浸させたパーライト、ＤＦＣを含浸させたベントナイト、およびＡＭＣ１を含浸させたベントナイトを含んだ圃場試験のための調製物では、ＤＦＣおよびＡＭＣ１はそれぞれ共発酵し、パーライトまたはベントナイト担体に、それぞれ、２ｍＬ／ｇまたは１ｍＬ／ｇを含浸させた。含浸させたパーライトおよびベントナイトを１から３週間乾燥させて保管し、その時点で生存能アッセイを実施して、施用時点で生存可能である株の数を決定した。さらに、液体を１週間保管し、その時点で生存能アッセイを実施して、施用時点で生存可能である株の数を決定した。液体中では、２３種のＤＦＣ株のうちの１６種は、２２種のＡＭＣ１株のうちの１４種に対して、１週間後に生存可能であった（表２７）。
【０１９６】
【表２７−１】
2021526855.tif 000038
【表２７−２】
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【０１９７】
含浸させたパーライトでは、２２種のＡＭＣ１株のうちの１４種に対する、２３種のＤＦＣ株のうちの１７種が最長３週間後も生存可能であった（表２８）。
【０１９８】
【表２８−１】
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【表２８−２】
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【０１９９】
含浸させたベントナイトでは、２２種のＡＭＣ１株のうちの１４種に対する、２３種のＤＦＣ株のうちの１７種は、最長３週間後に生存可能であった（表２９）。このことは、液体中で保存された場合、およびパーライトまたはベントナイトなどの担体上で乾燥された場合に、どのようなＤＰＡ生成株が改善された生存能を維持するかを示している。
【０２００】
【表２９−１】
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【表２９−２】
2021526855.tif 000043
【０２０１】
３カ月のエイジング後に、ＤＦＣを含浸させたパーライトでは、１５株が生存可能と示され、ＡＭＣ１を含浸させたパーライトでは、１１株のみが生存可能と示され、そのうちの１株のみがＤＰＡを生成しなかった（表３０および３１）。
【０２０２】
【表３０−１】
2021526855.tif 000044
【表３０−２】
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【０２０３】
同じ３カ月のエイジング後に、ＤＦＣを含浸させたベントナイトでは、１９株が生存可能と示され、一方、ＡＭＣ１を含浸させたパーライトでは、１３株について生存可能と示され、そのうちの３株のみがＤＰＡを生成しなかった（表３０および３１）。
【０２０４】
【表３１−１】
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【表３１−２】
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【０２０５】
ＤＦＣ植物の有益な活性の評価：Ｓｅｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ（Ｌｕｂｂｏｃｋ、ＴＸ）から購入したキュウリの種子を液体肥料の希釈混合物（水中２５ｐｐｍのＮＰＫ）を含浸させたロール発芽紙（Ａｎｃｈｏｒ  Ｐａｐｅｒ、Ｓａｉｎｔ  Ｐａｕｌ、ＭＮ）において、２２℃で４日間、予め発芽させた。種子の準備時に、ポッティング培地（Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  Ｍｉｘ）を、１ヘクタール当たり６７．６０ｋｇのリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）および改変したＨｏａｇｌａｎｄ溶液（Hoagland,  Calif.  Agric.  Exp.  Stn.  Bull.  347:36-39,  1938）の前処理で調製した。このＨｏａｇｌａｎｄ溶液、ＮＫ＋は、Ｎ、５６．０３ｐｐｍ；Ｐ、０ｐｐｍ；Ｋ、３９．１ｐｐｍ；Ｃａ、４０．０ｐｐｍ；Ｍｇ、１４．５９ｐｐｍ；Ｓ、２０．１４３ｐｐｍ；Ｆｅ、１．０１０ｐｐｍ；Ｃｕ、０．０１９ｐｐｍ；Ｃｏ、０．０１２ｐｐｍ；Ｂ、２．４４ｐｐｍ；Ｍｎ、０．４９４ｐｐｍ；Ｍｏ、０．００１ｐｐｍおよびＺｎ、０．０５６ｐｐｍを含有するように改変し、１ポンド当たり１Ｌの比率のポッティング培地を適用した。対照の処理は、ポッティング培地１ポンド当たり１０ｇの未処理パーライトまたは２０ｇの未処理ベントナイトも含有した。比較すると、実験ポットは、対照ポットと同じ量のパーライトまたはベントナイトを有したが、これらの担体には、それぞれ、２ｍＬ／ｇのＤＦＣまたは１ｍＬ／ｇのＤＦＣを含浸させた。含浸させたパーライトとベントナイトは、このアッセイで使用する前に２週間、乾燥して保管し、その時点で生存能アッセイを実施して、施用時点で生存可能であるＤＦＣからの株の数を決定した。大多数の株（２３種の生存可能な株のうちの１５〜１８種）が共製剤化およびエイジングプロセスで生存した。
【０２０６】
キュウリ種子の前発芽に続き、同様の長さの苗を選択し、１つを各ポットに移植した。各処理について（対照を含む）、１８個の植物を定義した成長条件で、平地で無作為化し、温度（１６〜２４℃）および１２時間の明期を制御した。平地に、改変したＨｏａｇｌａｎｄ溶液（Ｎ、０ｐｐｍ；Ｐ、１４．４９ｐｐｍ；Ｋ、１９．５５ｐｐｍ；Ｃａ、２０．０ｐｐｍ；Ｍｇ、１４．５９ｐｐｍ；Ｓ、２０．１４３ｐｐｍ；Ｆｅ、１．０１０ｐｐｍ；Ｃｕ、０．０１９ｐｐｍ；Ｃｏ、０．０１２ｐｐｍ；Ｂ、２．４４ｐｐｍ；Ｍｎ、０．４９４ｐｐｍ；Ｍｏ、０．００１ｐｐｍおよびＺｎ、０．０５６ｐｐｍを含有するＰＫ＋）で移植の３日後にはじめて水まきした。次いで、平地に、ＮＫ＋  Ｈｏａｇｌａｎｄ溶液で１週間に３回水まきした。３２日後に、シュートを回収し、各植物について乾燥重量を記録した。一元ＡＮＯＶＡ（分散分析）でデータを解析し、事後チューキー検定を用いて、実験内で試料を比較した。これらの試験は、２つの別々の状況で２回実施した。
【０２０７】
最初の試験の結果は、ＤＦＣを含浸させたパーライトとＤＦＣを含浸させたベントナイトの両方で、対照と比較した場合のシュート重量の有意な増加を示した（図６）。２回目の試験の結果は、ＤＦＣ液処理とＤＦＣを含浸させたパーライトの両方でシュート重量の有意な増加も示し、ＤＦＣを含浸させたパーライトは、ＤＦＣ液処理よりも良好な（better  that）性能を示したが、これらに有意差はなかった（図７）。よって、担体との共製剤は、新たな液体製品と比較した際に有効性に影響を及ぼさなかった。
【０２０８】
（実施例１３）
微生物による種子処理
微生物による種子処理をバッチ処理機ＳＧＳ（ＳＧＳ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｂｒｏｏｋｉｎｇｓ、ＳＤ  ＵＳＡ）を使用して、トウモロコシおよびダイズ種子に施用した。各処理について１ｋｇの種子を処理した。別々の種子処理では、微生物を未処理の種子に直接施用するか、殺虫剤／殺真菌剤パッケージで予め処理した種子にオーバーコートとして施用するか、または種子に施用する前に殺虫剤／殺真菌剤スラリーと混合した。トウモロコシでは、殺虫剤／殺真菌剤処理は、メタラキシル、トリフロキシストロビン、イピコナゾール、およびクロチアニジンを含有するＡｃｃｅｌｅｒｏｎミックス、またはＣｒｕｉｓｅｒ（チアメトキサム）、フルジオキソニル、メフェノキサム、アゾキシストロビン、およびチアベンダゾールを含有するＣｒｕｉｓｅｒＭａｘｘミックスのいずれかからなった。ダイズでは、殺虫剤／殺真菌剤処理は、メタラキシル、ピラクロストロビン、イミダクロプリド、およびフルキサピロキサドを含有するＡｃｃｅｌｅｒｏｎミックス、またはＣｒｕｉｓｅｒ（チアメトキサム）、メフェノキサム、フルジオキソニル、およびセデキサンを含有するＣｒｕｓｉｅｒＭａｘｘミックスのいずれかからなった。
【０２０９】
種子処理後、４８時間以内およびその後３週間以内に生存能を試験した（実施例１におけるように）。圧倒的大多数の株（２３種の生存可能な株のうちの１９〜２０種）が最初の共製剤化プロセスで生存した。３週間後、わずかな生存能の低下のみが観察された（２３種の生存可能な株のうちの１７〜１８種；図８）。このことは、ＤＰＡ生成株を選択することが、ベントナイトおよびパーライトなどの乾燥肥料に対して有効なだけでなく、種子処理にも有効であることも示した。さらに、発芽について種子を試験して、発芽能に関する種子処理の影響を決定した。１００個の種子についての４つの複製を発芽について試験する低温成長力試験（cold  vigor  test）を実施した。１００個の種子の複製それぞれを湿らせたクレープセルロース紙上に播種し、１０℃で一晩冷やした。次いで、種子を１インチの滅菌されていない、７０％の水分保持能まで湿らせた砂で覆い、光を与えずに７日間１０℃に戻した。次いで、種子を４日間２５℃に変化させた。砂から発芽した苗を評価した。結果は、ＡＯＳＡルールに従って正常であると分類された苗の数を表すパーセンテージとして報告した。８２％またはそれより高いスコアは、Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｓｅｅｄ  ＬａｂおよびＳＧＳに従ってトウモロコシ種子ロットを市販するために許容される最小値であると考えられる。すべての処理は、少なくとも８３．８％またはそれより高い発芽パーセンテージを有した（表３２）。このことは、種子処理の形態での性能が良好であることに加え、ＤＰＡ生成株が前記種子の発芽に負の影響を与えなかったことを示す。
【０２１０】
【表３２】
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【０２１１】
本開示の原理を適用することができる多くの可能な実施形態を鑑みて、示した実施形態は例に過ぎず、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではないことが認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、これらの請求項の範囲および趣旨に合致するすべてを本発明者らの発明として主張する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2021526855.tif 000055
【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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