(57)【要約】  本発明は、核酸をシーケンシングする新規の方法であって、部分的に一本鎖の直鎖状アダプターを含有する二本鎖標的核酸のライブラリーを作るステップと、これをシーケンシングするステップとを伴う方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖標的核酸の各鎖を個別にシーケンシングする方法であって、
ａ）反応混合物中で、二本鎖標的核酸を、アダプターへと接続して、アダプター付加標的核酸を形成するステップであって、アダプターが、一体にアニーリングされ、二本鎖領域と、１つだけの不対合鎖を含む一本鎖領域とを形成する短鎖と長鎖とを含み、一本鎖領域が、プライマー結合性部位を含むステップと；
ｂ）プライマーを、各アダプター内の、プライマー結合性部位へとアニーリングするステップと；
ｃ）プライマーを伸長させ、これにより、アダプター付加標的核酸の各鎖をシーケンシングするステップと
を含む方法。
【請求項２】
アダプターが、少なくとも１つのバーコードを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アダプターが、二本鎖領域内に、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
修飾ヌクレオチドが、５’リン酸化末端ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
修飾ヌクレオチドが、アダプターの二本鎖領域の融解温度を修飾する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
標的エンリッチメントステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
エンリッチメントが、標的特異的プライマーを伴う増幅によるエンリッチメントである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップｂ）の前に、反応混合物を、グリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼから選択されるＤＮＡ損傷特異的切断剤と接触させ、これにより、損傷したＤＮＡを切断するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
標的核酸が、標的配列の、２つまたはこれを超えるコピーのコンカテネートを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
コンカテネートの配列から、標的核酸のコンセンサス配列を構築するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試料中の二本鎖標的核酸から、核酸のライブラリーを作る方法であって、反応混合物中で、二本鎖標的核酸を、アダプターへと接続して、アダプター付加標的核酸を形成するステップであって、アダプターが、一体にアニーリングされ、二本鎖領域と一本鎖領域とを形成する短鎖と長鎖とを含み、一本鎖領域が、単一の鎖だけを含み、一本鎖領域が、プライマー結合性部位を含むステップを含む方法。
【請求項１２】
試料中の標的核酸のライブラリーの配列を決定する方法であって、
ａ）請求項１１に記載の方法により、一本鎖環状標的核酸のライブラリーを形成するステップと；
ｂ）プライマーを、各アダプター付加標的核酸のプライマー結合性部位へとアニーリングするステップと；
ｃ）プライマーを伸長させ、これにより、ライブラリー内の標的核酸の各鎖をシーケンシングするステップと
を含む方法。
【請求項１３】
二本鎖標的核酸をシーケンシングする方法であって、
ａ）反応混合物中で、標的特異的プライマーの対により、標的核酸を増幅し、これにより、単位複製配列を形成するステップと；
ｂ）単位複製配列を、アダプターへと接続して、アダプター付加標的核酸を形成するステップであって、アダプターが、一体にアニーリングされ、二本鎖領域と一本鎖領域とを形成する短鎖と長鎖とを含み、一本鎖領域が、単一の鎖だけを含み、一本鎖領域が、プライマー結合性部位を含むステップと；
ｃ）シーケンシングプライマーを、プライマー結合性部位へとアニーリングするステップと；
ｄ）プライマーを伸長させ、これにより、標的核酸をシーケンシングするステップと
を含む方法。
【請求項１４】
標的核酸のライブラリーを作る方法であって、
ａ）反応混合物中で、標的特異的プライマーの対により、標的核酸を増幅し、これにより、単位複製配列を形成するステップと；
ｂ）単位複製配列を、アダプターへと接続して、アダプター付加標的核酸を形成するステップであって、アダプターが、アニーリングされた短鎖と長鎖とを含み、一本鎖領域が、単一の鎖だけを含み、プライマー結合性部位をさらに含むステップと
を含む方法。
【請求項１５】
試料中の標的核酸のライブラリーの配列を決定する方法であって、
ａ）請求項１４に記載の方法により、アダプター付加標的核酸のライブラリーを形成するステップと；
ｂ）プライマーを、各アダプター付加標的核酸のプライマー結合性部位へとアニーリングするステップと；
ｃ）プライマーを伸長させ、これにより、ライブラリー内の各標的核酸をシーケンシングするステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸解析の分野に関し、より具体的に、核酸シーケンシングのための鋳型の調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノポアシーケンシングを含む単一分子核酸シーケンシングは、典型的に、環状鋳型を利用する。米国特許第７，３０２，１４６号および同第８，１５３，３７５号を参照されたい。直鎖状核酸は、増幅、ならびに後続の検出および定量のために、環状形態へと転換される（米国再発行特許第４４２６５号を参照されたい）。環状鋳型形状は、直鎖状のコンフォメーションが好ましい長鎖の標的分子には理想的でない。本発明は、新規のアダプターデザインを使用して、直鎖状の標的配列のライブラリーを作製し、シーケンシングする方法である。方法は、下記で詳細に記載される、複数の利点を有する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
一実施形態では、本発明は、二本鎖標的核酸の各鎖を個別にシーケンシングする方法であって、反応混合物中で、二本鎖標的核酸を、アダプターへと接続して、アダプター付加標的核酸を形成するステップであって、アダプターが、一体にアニーリングされ、二本鎖領域と、１つだけの不対合鎖を含む一本鎖領域とを形成する短鎖と長鎖とを含み、一本鎖領域が、プライマー結合性部位を含むステップと；プライマーを、各アダプター内の、プライマー結合性部位へとアニーリングするステップと；プライマーを伸長させ、これにより、アダプター付加標的核酸の各鎖をシーケンシングするステップとを含む方法である。アダプターへと接続するステップは、ライゲーションにより接続するステップでありうる。アダプターは、少なくとも１つのバーコードを含みうる。アダプターは、二本鎖領域内に、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含みうる。修飾ヌクレオチドは、５’リン酸化末端ヌクレオチドの場合もあり、ホスホロチオエート基の場合もあり、アダプターの二本鎖領域の融解温度を修飾する場合もある。一部の実施形態では、方法は、例えば、固体支持体へと結合させた標的特異的プローブを介する捕捉による標的エンリッチメントステップ、または標的特異的プライマーを伴う増幅による、標的エンリッチメントステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、反応混合物を、グリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼから選択されるＤＮＡ損傷特異的切断剤と接触させ、これにより、損傷したＤＮＡを切断するステップをさらに含む。一部の実施形態では、標的核酸は、標的配列の、２つまたはこれを超えるコピーのコンカテネートを含む。一部の実施形態では、方法は、コンカテネートの配列から、標的核酸のコンセンサス配列を構築するステップをさらに含む。
【０００４】
別の実施形態では、本発明は、試料中の二本鎖標的核酸から、核酸のライブラリーを作る方法であって、反応混合物中で、二本鎖標的核酸を、アダプターへと接続して、アダプター付加標的核酸を形成するステップであって、アダプターが、一体にアニーリングされ、二本鎖領域と一本鎖領域とを形成する短鎖と長鎖とを含み、一本鎖領域が、単一の鎖だけを含み、一本鎖領域が、プライマー結合性部位を含むステップを含む方法である。
【０００５】
さらに別の実施形態では、本発明は、試料中の標的核酸のライブラリーの配列を決定する方法であって、前出の段落で記載された通りに、一本鎖環状標的核酸のライブラリーを形成するステップと；プライマーを、各アダプター付加標的核酸のプライマー結合性部位へとアニーリングするステップと、プライマーを伸長させ、これにより、ライブラリー内の標的核酸の各鎖をシーケンシングするステップとを含む方法である。
【０００６】
さらに別の実施形態では、本発明は、二本鎖標的核酸をシーケンシングする方法であって、反応混合物中で、標的特異的プライマーの対により、標的核酸を増幅し、これにより、単位複製配列を形成するステップと；単位複製配列を、アダプターへと接続して、アダプター付加標的核酸を形成するステップであって、アダプターが、一体にアニーリングされ、二本鎖領域と一本鎖領域とを形成する短鎖と長鎖とを含み、一本鎖領域が、単一の鎖だけを含み、一本鎖領域が、プライマー結合性部位を含むステップと；シーケンシングプライマーを、プライマー結合性部位へとアニーリングするステップと；プライマーを伸長させ、これにより、標的核酸をシーケンシングするステップとを含む方法である。
【０００７】
さらに別の実施形態では、本発明は、標的核酸のライブラリーを作る方法であって、反応混合物中で、標的特異的プライマーの対により、標的核酸を増幅し、これにより、単位複製配列を形成するステップと；単位複製配列を、アダプターへと接続して、アダプター付加標的核酸を形成するステップであって、アダプターが、アニーリングされた短鎖と長鎖とを含み、一本鎖領域が、単一の鎖だけを含み、プライマー結合性部位をさらに含むステップとを含む方法である。
【０００８】
さらに別の実施形態では、本発明は、試料中の標的核酸のライブラリーの配列を決定する方法であって、前出の段落で記載された通りに、アダプター付加標的核酸のライブラリーを形成するステップと；プライマーを、各アダプター付加標的核酸のプライマー結合性部位へとアニーリングするステップと；プライマーを伸長させ、これにより、ライブラリー内の各標的核酸をシーケンシングするステップとを含む方法である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】配列番号１および２によってもまた表される、新規のアダプターを例示する図である。
【図２】図１に示されるアダプターを伴う、単一の長い標的配列のシーケンシングを例示する図である。
【図３】図１または図４に示されるアダプターを使用する、短い標的配列のためのコンカテネーション戦略を例示する図である。
【図４】非ヌクレオチドリンカーを伴う、図１の新規のアダプターを例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
定義
以下の定義は、本開示の理解の一助となる。
「試料」という用語は、標的核酸を含有するか、またはこれを含有することが推測される、任意の組成物を指す。これは、個体から単離された組織または体液、例えば、皮膚、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、滑液、尿、泪、血液細胞、臓器、および腫瘍の試料を含み、また、個体から採取された細胞から確立されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物の試料であって、ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）、およびＦＦＰＥＴから単離された核酸を含む試料も含む。試料はまた、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含有する無細胞血液画分などの無細胞物質も含みうる。
【００１１】
「核酸」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなど、それらのサブカテゴリーを含む、ヌクレオチドのポリマー（例えば、天然および非天然両方の、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチド）を指す。核酸は、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり、場合によって、ヌクレオチド類似体は、他の連結を有しうるが、一般に、５’−３’ホスホジエステル結合を含有する。核酸は、天然に存在する塩基（アデノシン、グアノシン、シトシン、ウラシル、およびチミジン）のほか、非天然塩基を含みうる。非天然塩基の一部の例は、例えば、Ｓｅｅｌａら（１９９９）、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、８２：１６４０において記載されている例を含む。非天然塩基は、特定の機能、例えば、核酸二重鎖の安定性の増大、ヌクレアーゼによる消化の阻害、またはプライマーの伸長もしくは鎖の重合化の遮断を有しうる。
【００１２】
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、一本鎖核酸または二本鎖核酸である。オリゴヌクレオチドは、場合によって、短いポリヌクレオチドについて記載するのに使用される用語である。オリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の、任意の適切な方法、例えば、Ｎａｒａｎｇら（１９７９）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：９０〜９９；Ｂｒｏｗｎら（１９７９）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：１０９〜１５１；Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、２２：１８５９〜１８６２；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら（１９８１）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０３：３１８５〜３１９１において記載されている、直接的化学合成を伴う方法により調製される。
【００１３】
「プライマー」という用語は、標的核酸内の配列（「プライマー結合性部位」）とハイブリダイズし、このような合成に適する条件下で、核酸の相補鎖に沿った合成の開始点として作用することが可能な、一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。
【００１４】
「アダプター」という用語は、別の配列へと付加されうるヌクレオチド配列であって、この配列へと、さらなる特性を取り入れるように付加されうるヌクレオチド配列を意味する。アダプターは、典型的に、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり、一本鎖部分および二本鎖部分の両方を有する場合もある、オリゴヌクレオチドである。
【００１５】
「ライゲーション」という用語は、２つの核酸鎖を接続する縮合反応であって、１つの分子の５’リン酸基が、別の分子の３’ヒドロキシル基と反応する縮合反応を指す。ライゲーションは、典型的に、リガーゼまたはトポイソメラーゼにより触媒される酵素反応である。ライゲーションは、２つの一本鎖を接続して、１つの一本鎖分子を創出しうる。ライゲーションはまた、各々が二本鎖分子に属する２つの鎖も接続し、これにより、２つの二本鎖分子を接続する場合もある。ライゲーションはまた、二本鎖分子の両方の鎖を、別の二本鎖分子の両方の鎖にも接続し、これにより、２つの二本鎖分子を接続する場合もある。ライゲーションはまた、二本鎖分子内の鎖の２つの末端も接続し、これにより、二本鎖分子内のニックを修復する場合もある。
【００１６】
「バーコード」という用語は、検出および同定されうる核酸配列を指す。バーコードは、多様な核酸へと組み込まれうる。バーコードは、試料中で、バーコードを組み込む核酸が、バーコードに従い、識別または群分けされうるように、十分に長い、例えば、２、５、２０ヌクレオチドである。
【００１７】
「マルチプレックス識別子」または「ＭＩＤ」という用語は、標的核酸の供給源（例えば、核酸が由来する試料）を同定するバーコードを指す。同じ試料に由来する、全ての標的核酸、または実質的に全ての標的核酸は、同じＭＩＤを共有する。異なる供給源または試料に由来する標的核酸も、同時に、混合およびシーケンシングされうる。ＭＩＤを使用して、配列リードは、標的核酸が由来する、個々の試料へと割り当てられうる。
【００１８】
「固有分子識別子」または「ＵＩＤ」という用語は、バーコードが接合された核酸を同定するバーコードを指す。同じ試料に由来する、全ての標的核酸、または実質的に全ての標的核酸は、異なるＵＩＤを有する。同じ元の標的核酸に由来する、娘分子（例えば、単位複製配列）の全て、または実質的に全ては、同じＵＩＤを共有する。
【００１９】
「ユニバーサルプライマー」および「ユニバーサルプライミング結合性部位」または「ユニバーサルプライミング部位」という用語は、異なる標的核酸内に存在する（典型的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける付加を介して）、プライマーおよびプライマー結合性部位を指す。ユニバーサルプライミング部位は、アダプターを使用して、または５’部分において、ユニバーサルプライミング部位を有する、標的特異的（非ユニバーサル）プライマーを使用して、複数の標的核酸へと付加される。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライミング部位に結合し、ユニバーサルプライミング部位からのプライマーの伸長を導きうる。
【００２０】
より一般に、「ユニバーサル」という用語は、任意の標的核酸へと付加され、標的核酸配列に関わらず、その機能を果たしうる核酸分子（例えば、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチド）を指す。ユニバーサル分子は、相補体とハイブリダイズすることにより、例えば、ユニバーサルプライマーを、ユニバーサルプライマー結合性部位とハイブリダイズさせることにより、またはユニバーサル環化オリゴヌクレオチドを、ユニバーサルプライマー配列とハイブリダイズさせることにより、その機能を果たしうる。
【００２１】
本明細書で使用された、「標的配列」、「標的核酸」、または「標的」という用語は、検出または解析される、試料中の核酸配列の部分を指す。標的という用語は、標的配列の全ての変異体、例えば、１つまたは複数の突然変異体および野生型変異体を含む。
【００２２】
「増幅」という用語は、標的核酸のさらなるコピーを作る工程を指す。増幅は、１つを超えるサイクル、例えば、指数関数的増幅の複数のサイクルを有しうる。増幅は、１つだけのサイクル（標的核酸の単一のコピーを作るサイクル）を有しうる。コピーは、さらなる配列、例えば、増幅に使用されるプライマー内に存在する配列を有しうる。増幅はまた、一方の鎖だけのコピーをもたらす場合（線形的増幅）もあり、一方の鎖のコピーを優先的にもたらす場合（非対称ＰＣＲ）もある。
【００２３】
「シーケンシング」という用語は、標的核酸内のヌクレオチドの配列を決定する、任意の方法を指す。
本発明は、単一分子長鎖読取り型シーケンシングに適する二本鎖配列鋳型を作出する方法である。既存のライブラリー調製法、例えば、環状鋳型を利用する調製法（米国特許第７，３０２，１４６号および同第８，１５３，３７５号を参照されたい）と比較して、本発明の方法は、とりわけ、長い単位複製配列に有利である。
【００２４】
本発明は、試料中の標的核酸の検出を含む。一部の実施形態では、試料は、対象または患者に由来する。一部の実施形態では、試料は、例えば、生検による、対象または患者に由来する、固形組織または充実性腫瘍の断片を含みうる。試料はまた、体液（例えば、尿、痰、血清、血漿またはリンパ、唾液、痰、汗、涙液、脳脊髄液、羊水、滑液、心膜液、腹水、胸水、嚢胞液、胆汁、胃液、腸液、および／または糞便の試料）も含みうる。試料は、全血液を含む場合もあり、腫瘍細胞が存在しうる血液画分を含む場合もある。一部の実施形態では、試料、とりわけ、液体試料は、無細胞腫瘍ＤＮＡまたは無細胞腫瘍ＲＮＡを含む、無細胞ＤＮＡまたは無細胞ＲＮＡなどの無細胞物質を含みうる。本発明は、とりわけ、稀少標的および少量標的を解析するために適する。一部の実施形態では、試料は、無細胞試料、例えば、無細胞腫瘍ＤＮＡまたは無細胞腫瘍ＲＮＡが存在する、無細胞血液由来試料である。他の実施形態では、試料は、培養試料、例えば、感染作用物質または感染作用物質に由来する核酸を含有するか、またはこれらを含有することが疑われる、培養物または培養物上清である。一部の実施形態では、感染作用物質は、細菌、原虫、ウイルス、またはマイコプラズマである。
【００２５】
標的核酸は、試料中に存在しうる、目的の核酸である。一部の実施形態では、標的核酸は、遺伝子または遺伝子断片である。他の実施形態では、標的核酸は、遺伝子変異体、例えば、一塩基多型もしくは一塩基変異体（ＳＮＰまたはＳＮＶ）を含む多型、または、例えば、遺伝子融合を結果としてもたらす遺伝子再配列を含有する。一部の実施形態では、標的核酸は、バイオマーカーを含む。他の実施形態では、標的核酸は、特定の生物に特徴的である、例えば、病原性生物の同定の一助となるか、または病原性生物、例えば、薬物感受性または薬物耐性に特徴的である。さらに他の実施形態では、標的核酸は、ヒト対象、例えば、対象の固有のＨＬＡ遺伝子型またはＫＩＲ遺伝子型を規定する、ＨＬＡ配列またはＫＩＲ配列に特徴的である。さらに他の実施形態では、試料中の全ての配列は、例えば、ショットガンゲノムシーケンシングにおける標的核酸である。
【００２６】
本発明の実施形態では、二本鎖標的核酸は、本発明の鋳型形状へと転換される。一部の実施形態では、標的核酸は、天然において、一本鎖形態（例えば、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ウイルスＲＮＡを含むＲＮＡ；または一本鎖ウイルスＤＮＡ）で生じる。一本鎖標的核酸は、特許請求される方法のさらなるステップを可能とするように、二本鎖形態へと転換される。
【００２７】
一部の適用において、長いリードを達成するのに、長鎖標的核酸が所望でありうるが、長鎖標的核酸は、断片化されうる。本発明は、長鎖核酸標的に、とりわけ有利である。
一部の実施形態では、本発明は、標的エンリッチメントステップを含む。エンリッチメントは、１つまたは複数の標的特異的プローブを介して、標的配列を捕捉することによるエンリッチメントでありうる。試料中の核酸は、変性させられ、一本鎖標的特異的プローブと接触されうる。プローブは、アフィニティー捕捉部分をもたらすことにより、ハイブリダイゼーション複合体が形成された後で、それらが捕捉されるように、アフィニティー捕捉部分に対するリガンドを含みうる。一部の実施形態では、アフィニティー捕捉部分は、アビジンまたはストレプトアビジンであり、リガンドは、ビオチンである。一部の実施形態では、部分は、固体支持体に結合させる。下記で、さらに詳細に記載される通り、固体支持体は、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）磁気ビーズなどの超常磁性球形ポリマー粒子、または磁性ガラス粒子を含みうる。
【００２８】
本発明の一部の実施形態では、アダプター分子は、標的核酸へとライゲーションされる。ライゲーションは、平滑末端ライゲーションの場合もあり、より効率的な粘着末端ライゲーションの場合もある。標的核酸は、鎖フィリング、すなわち、ＤＮＡポリメラーゼにより、３’末端を伸長させて、５’突出を消失させることを含む、「末端修復」により、平滑末端化されうる。一部の実施形態では、平滑末端化核酸は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたは末端トランスフェラーゼによる、アダプターの３’末端への単一のヌクレオチドの付加、および標的核酸の３’末端への単一の相補性ヌクレオチドの付加により粘着化されうる。さらに他の実施形態では、アダプターおよび標的核酸は、制限エンドヌクレアーゼを伴う消化により、粘着末端（突出）を獲得しうる。制限酵素認識部位は、固有の場合もあり、配列へと操作される場合もある。一部の実施形態では、ライゲーションを達成するのに、他の酵素ステップも要求されうる。一部の実施形態では、５’リン酸を、標的核酸分子およびアダプター分子へと付加するのに、ポリヌクレオチドキナーゼが使用されうる。
【００２９】
一部の実施形態では、図１に示されるアダプターが使用される。アダプターは、一本鎖領域と二本鎖領域とを有し、この場合、一本鎖領域は、プライマー結合性部位（例えば、シーケンシングプライマー結合性部位）を含む。アダプターの、二本鎖標的核酸へのライゲーションを可能とするために、アダプターの５’末端がリン酸化されうる。シーケンシングプライマー結合性部位へと結合させたシーケンシングプライマーを伸長させるポリメラーゼによる、アダプターの短鎖の分解を防止するために、アダプターの短鎖の３’末端は、短鎖の３’末端またはこの近傍において、修飾ヌクレオチドを含有しうる。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチドである。
【００３０】
一部の実施形態では、アダプターの二本鎖領域は、アダプター分子の融解温度（Ｔｍ）を修飾する（例えば、上昇させる）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、メチル−ｄＣまたはプロピニル−ｄＵなどの修飾ピリミジンである。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、修飾プリン、例えば、Ｇクランプである。
【００３１】
一部の実施形態では、アダプターの一本鎖領域内のプライマー結合性部位は、プライマー結合性部位へと結合させたプライマーの融解温度（Ｔｍ）を修飾する（例えば、上昇させる）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、メチル−ｄＣまたはプロピニル−ｄＵなどの修飾ピリミジンである。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、修飾プリン、例えば、Ｇクランプである。
【００３２】
図１は、直鎖状アダプターの配列および構造の例を例示する。アダプターは、標的インサートへのライゲーションを容易とする、５’リン酸および単一の３’−Ｔ突出を伴う、短い二本鎖部分を含む。アダプターは、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エクソヌクレアーゼ活性による消化を回避するように、ホスホロチオエート修飾（アステリスク）を伴う長いアームを含む。長いアームは、ポリメラーゼの、標的インサートへの結合およびシーケンシングを可能とするように、シーケンシングプライマーのための結合性部位をさらに含有する。
【００３３】
図２は、図１に示されるアダプターを伴う、単一の長い標的配列のシーケンシングを例示する。直鎖状アダプターは、鋳型の両端においてライゲーションされ、矢印は、鋳型へのシーケンシングの方向を示す。コンセンサスは、複数の小孔からのリードを使用して達成される（分子間コンセンサス）。
【００３４】
図３は、短い標的配列のためのコンカテネーション戦略を例示する。固有分子ＩＤ（ＵＩＤ）を伴うアダプターは、コンカテネーションの前に、各標的配列へとライゲーションされる。コンセンサスは、複数の小孔からのリードを使用し、各リード内で、ＵＩＤを使用して達成される。
【００３５】
図４は、１８炭素の非ヌクレオチドリンカー（ＨＥＧ）を有するアダプターの配列および構造を例示する。
一部の実施形態では、アダプター分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて合成された人工配列である。他の実施形態では、アダプター分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて合成された天然に存在する配列である。さらに他の実施形態では、アダプター分子は、単離された天然に存在する分子である。
【００３６】
一部の実施形態では、方法は、アダプターライゲーションの前に、標的核酸を増幅するステップを含む。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による指数関数的増幅の場合もあり、一方の鎖だけの線形的増幅の場合もあり、オリゴヌクレオチドプライマーを利用する、他の任意の方法による増幅の場合もある。多様なＰＣＲ条件が、ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ、Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ、およびＪ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ編、１９９５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、１４章；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ、Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ、Ｊ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ、およびＴ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９９０）において記載されている。
【００３７】
一部の実施形態では、増幅は、標的配列へと導入される、ユニバーサルプライマー結合性部位を利用する。他の実施形態では、遺伝子特異的（標的特異的）プライマーまたはプライマー対が使用される。増幅された標的核酸は、本明細書で記載されるアダプターへとライゲーションされる。
【００３８】
一部の実施形態では、標的核酸は、長鎖核酸へとコンカテネートされる。例えば、１キロベースの長さ（例えば、１００、２００、３００ベースの長さなど）より短い短鎖核酸は、数キロベースの長さの断片へとコンカテネートされうる。コンカテネーションの前に、標的核酸の末端は、バーコードを含有する二本鎖アダプターへとライゲーションされる。結果として得られるコンカテネートは、アダプター配列により中断された、２つまたはこれを超える標的核酸配列を含む分子である。同じ標的核酸のコピーがコンカテネートされる場合、コンセンサス配列は、このようなコンカテネートの単一のリードから構築されうる。
【００３９】
一部の実施形態では、コンカテネーションは、特異的制限酵素認識部位における、ＩＩ型制限酵素によるアダプター末端の消化により達せられる。酵素は、複数のアダプター付加標的核酸が、ＤＮＡリガーゼによりライゲーションされることを可能とする粘着末端を作出する。他の実施形態では、コンカテネーションは、Ｇｉｂｓｏｎによるアセンブリー法（Ｇｉｂｓｏｎら、（２００９）、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｐ  ｔｏ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｈｕｎｄｒｅｄ  ｋｉｌｏｂａｓｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、６（５）：３４３〜３４８および米国特許第８，９６８，９９９号）により、核酸配列に依存せずに達せられる。
【００４０】
一部の実施形態では、本発明は、標的核酸への、バーコードの導入を含む。個々の分子のシーケンシングは、典型的に、例えば、米国特許第７，３９３，６６５号、同第８，１６８，３８５号、同第８，４８１，２９２号、同第８，６８５，６７８号、および同第８，７２２，３６８号に記載されている分子バーコードなどの分子バーコードを要求する。固有分子バーコードは、典型的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける操作の最初期段階において、患者試料などの試料中の各分子へと付加される、短い人工配列である。バーコードは、分子およびその娘分子をマーキングする。固有分子バーコード（ＵＩＤ）は、複数の使用を有する。バーコードは、例えば、生検なしに、がんを検出およびモニタリングするために、患者の血液中の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）分子の存在および量を評価するように、試料中の各個別の核酸分子を追跡することを可能とする。米国特許出願第１４／２０９，８０７号および同第１４／７７４，５１８号を参照されたい。固有分子バーコードはまた、シーケンシングエラーを補正するためにも使用されうる。単一の標的分子の全娘分子は、同じバーコードでマーキングされ、バーコード処理ファミリーを形成する。バーコード処理ファミリーの全てのメンバーにより共有されない配列の変動は、アーチファクトであり、真の突然変異ではない変動として棄却される。全ファミリーは、元の試料中の単一分子を表すので、バーコードはまた、ポジショナルデデュプリケーションおよび標的の定量のためにも使用されうる。同上を参照されたい。
【００４１】
一部の実施形態では、アダプターは、１つまたは複数のバーコードを含む。他の実施形態では、増幅プライマー（例えば、アダプターのライゲーションの前の増幅において使用される増幅プライマー）は、プライマーの５’部分におけるバーコードを含む。バーコードは、混合された（マルチプレックス化された）試料の供給源を同定するのに使用される、マルチプレックス試料ＩＤ（ＭＩＤ）でありうる。バーコードはまた、元の各分子およびその娘分子を同定するのに使用される固有分子ＩＤ（ＵＩＤ）としても用いられる。バーコードはまた、ＵＩＤとＭＩＤとの組合せでもありうる。一部の実施形態では、単一のバーコードが、ＵＩＤおよびＭＩＤの両方として使用される。
【００４２】
一部の実施形態では、各バーコードは、あらかじめ規定された配列を含む。他の実施形態では、バーコードは、ランダム配列を含む。バーコードは、１〜２０ヌクレオチドの長さでありうる。
【００４３】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で記載される、シーケンシングの準備ができたアダプター付加二本鎖標的核酸のライブラリーを作る方法、および方法により作製されるライブラリーである。具体的に、ライブラリーは、試料中に存在する核酸に由来する、アダプター付加二本鎖分子のコレクションを含む。ライブラリーの分子は、アダプター配列と接続された標的配列を含む。
【００４４】
一部の実施形態では、本発明は、核酸シーケンシングによる、試料中の標的核酸の検出を含む。試料中の全ての核酸を含む、複数の核酸は、本発明の鋳型形状へと転換され、シーケンシングされうる。一部の実施形態では、一本鎖環状分子のライブラリーは、核酸シーケンシングにかけられうる。
【００４５】
一部の実施形態では、方法は、シーケンシングリードの品質および長さを改善するために、損傷または分解した標的を消失させるステップをさらに含む。ステップは、このような損傷した標的核酸を分解するために、反応混合物を、ウラシルＤＮＡ  Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧまたはＵＤＧ）またはＡＰヌクレアーゼと接触させることを含みうる。一部の実施形態では、方法は、シーケンシングリードの品質および長さを改善するために、ライブラリーから、損傷または分解した標的を消失させるステップをさらに含む。ステップは、このような損傷した標的核酸を分解するために、ライブラリーを、ウラシルＤＮＡ  Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧまたはＵＤＧ）、ＡＰヌクレアーゼ、および８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼとしてもまた公知の、Ｆｐｇ（ホルムアミドピリミジン［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ）のうちの１つまたは複数と接触させることを含みうる。
【００４６】
上記で記載した通り、アダプターまたは標的特異的プライマーは、各鎖のシーケンシングリードを起始しうる、シーケンシングプライマー結合性部位を含みうる。
シーケンシングは、当技術分野で公知の、任意の方法により実施されうる。とりわけ有利なのは、環状標的核酸を読み取ることが可能な、ハイスループット単一分子シーケンシングである。このような技術の例は、ＳＭＲＴ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌ．）を利用するＰａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓプラットフォーム、またはＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）製もしくはＲｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｇｅｎｉａ）（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌ．）製のプラットフォームなど、ナノポア技術を利用するプラットフォーム、および合成によるシーケンシングを伴うかまたは伴わない、他の任意の既存のＤＮＡシーケンシング技術または将来のＤＮＡシーケンシング技術を含む。シーケンシングステップは、プラットフォーム特異的シーケンシングプライマーを利用しうる。これらのプライマーのための結合性部位は、本明細書で記載される、本発明の方法に導入されうる、すなわち、第２のアダプターまたは増幅プライマーの一部であることを介して導入されうる。
解析およびエラーの補正
一部の実施形態では、シーケンシングステップは、配列をアライメントするステップを含む、配列解析を伴う。一部の実施形態では、アライメントするステップは、複数の配列、例えば、同じバーコード（ＵＩＤ）を有する複数の配列から、コンセンサス配列を決定するのに使用される。一部の実施形態では、バーコード（ＵＩＤ）は、全てが同一なバーコード（ＵＩＤ）を有する、複数の配列からコンセンサスを決定するのに使用される。他の実施形態では、バーコード（ＵＩＤ）は、アーチファクト、すなわち、同一なバーコード（ＵＩＤ）を有する、一部の配列ではあるが全ての配列ではない配列内に存在する変動を消失させるのに使用される。ＰＣＲエラーまたはシーケンシングエラーから生じる、このようなアーチファクトは、消失させられうる。
【００４７】
一部の実施形態では、試料中の各配列の数は、試料中の、各バーコード（ＵＩＤ）を伴う配列の相対数を定量することにより定量されうる。各ＵＩＤは、元の試料中の単一分子を表し、各配列変異体と関連する、異なるＵＩＤをカウントすることは、元の試料中の各配列の割合を決定しうる。当業者は、コンセンサス配列を決定するのに必要な配列リードの数を決定することができるであろう。一部の実施形態では、問題とする数は、正確な定量結果に必要な、ＵＩＤ  １つ当たりのリードの数（「配列深度」）である。一部の実施形態では、所望の深度は、ＵＩＤ  １つ当たりのリード５〜５０である。
【００４８】
一部の実施形態では、本発明は、標的核酸の複数のリードに基づき、コンセンサス配列を構築するステップを含む。一部の実施形態では、標的核酸の各コピーは、アダプターへとライゲーションされ、１回シーケンシングされる。コンセンサス配列は、１回読み取られた、標的核酸の各々のいくつかのコピーのリードを比較することにより、分子間でアセンブルされる。例えば、約１ｋｂまたはこれを超える長さの核酸は、このようにしてシーケンシングされる。一部の実施形態では、標的核酸のいくつかのコピーは、併せてライゲーションされる（コンカテネートされる）。次いで、コンカテネートは、アダプターへとライゲーションされ、１回シーケンシングされる。コンセンサス配列は、コンカテネート内の標的核酸のいくつかのコピーに由来するリードを比較することにより、分子間でアセンブルされる。例えば、１ｋｂ未満の長さの核酸は、このようにしてシーケンシングされる。
【実施例】
【００４９】
実施例１
鋳型の調製
シーケンシング鋳型は、直鎖化ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡ（２．７ｋｂ）、または５００ｂｐおよび１．１５ｋｂのＨＩＶ単位複製配列であった。インプットＤＮＡは、Ｑｕｂｉｔ蛍光測定解析（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。ＤＮＡ  １２０００キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌ．）を伴うバイオアナライザーを使用して、ＤＮＡのサイズ、品質、および数量を評価した。クリーンアップは、製造元の指示書に従い、ＫＡＰＡ  ＰｕｒｅＢｅａｄｓ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）による精製を使用して実施した。
【００５０】
実施例２
Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＲＳＩＩプラットフォーム上の、ライブラリーの調製およびシーケンシング
ＫＡＰＡ  ＨｙｐｅｒＰｒｅｐキットによるライブラリー調製を使用して、アダプターのライゲーションのために、鋳型ＤＮＡ（１ｕｇのプラスミドまたは単位複製配列）を調製した。略述すると、製造元の指示書に従い、精製された直鎖化プラスミドＤＮＡを末端修復し、Ａテール処理した。このステップの直後に、直鎖状アダプターまたはＨＥＧアダプターを使用して、アダプターライゲーションを行った（図１または図４）。同じ試験管内で、ライゲーションマスターミックスおよびアダプターを添加し、反応混合物を、２０℃で３０分間にわたりインキュベートした。６５℃で１０分間にわたる、さらなるインキュベーションにより、リガーゼ酵素を不活化させた。全てのアダプターは、１：２００の鋳型：アダプターライゲーション比で存在した。ライゲーションに続き、０．８倍濃度のＫＡＰＡ  ＰｕｒｅＢｅａｄｓによる、ビーズによる最終クリーンアップステップを行った。ライブラリーの収量は、Ｑｕｂｉｔ蛍光測定解析（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して定量し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＨＳキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して、サイズについて点検した。精製されたアダプター付加鋳型は、製造元の指示書に従い、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＲＳＩＩプラットフォーム上でシーケンシングし、Ｒｏｃｈｅナノポアプラットフォーム上でもシーケンシングした。異なるサイズの単位複製配列を伴うＲＳＩＩ結果を表１に示し、表２は、Ｒｏｃｈｅナノポアプラットフォーム上の結果を示す。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
【表２】
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【００５３】
実施例３
新規のアダプターを使用する、コンカテネートされた直鎖状鋳型のシーケンシング
本実施例では、出発標的配列は、１８７ｂｐの長鎖である、ＮＲＡＳエクソン３の単位複製配列であり、この単位複製配列を、新規のアダプター（図１）へとコンカテネートおよびライゲーションし、シーケンシングした。この実験の対照は、ｐＵＣ２．７ｋｂプラスミドであり、ＳＭＲＴＢｅｌｌ（商標）アダプターとライゲーションして、環状ライブラリーを作出した。コンカテネーションのロバスト性についてさらに調べるために、本発明者らは、異なるサイズの腫瘍学単位複製配列をコンカテネートした。１１のさらなる腫瘍学単位複製配列（異なるサイズである）を、新規のアダプターへとコンカテネートおよびライゲーションし、ナノポアプラットフォーム上でシーケンシングした。１１の単位複製配列は、ＮＲＡＳエクソン３、ＮＲＡＳエクソン４．１、ＮＲＡＳエクソン４．２、ＫＲＡＳエクソン２、ＫＲＡＳエクソン３、ＫＲＡＳエクソン４、ＢＲＡＦエクソン１１、ＰＩＫ３ＣＡエクソン９、ＥＧＦＲエクソン１８、ＥＧＦＲエクソン２０、ＥＧＦＲエクソン２１であった。鋳型は、ＲＳＩＩプラットフォーム上およびＲｏｃｈｅナノポアプラットフォームでシーケンシングした。ＲＳＩＩ測定器からの結果を、表３に示し、Ｒｏｃｈｅナノポアプラットフォームからの結果を、表４に示す。
コンカテネートされた鋳型のシーケンシング
【００５４】
【表３】
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【００５５】
【表４】
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【００５６】
実施例４
ＨＥＧアダプターライブラリーの構築およびシーケンシング
本実施例では、直鎖化プラスミドｐＵＣ１９（２．７ｋｂ）を使用した。ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）による１８炭素リンカー（図４）を使用する、新規のダンベル型アダプターを使用して、ライブラリーを作った。ＳＭＲＴＢｅｌｌアダプターは、対照として使用した。５０ｕＭの直鎖状アダプターまたはＨＥＧアダプターは、ライブラリーの調製時に使用した。ＨＥＧ／直鎖状アダプターをライゲーションしたライブラリーを、ビオチニル化シーケンシングプライマーと共にインキュベートして、４５℃で３０秒間にわたりアニーリングし、０．１℃／秒の減温速度で２０℃へと冷却した。これに続き、（ポリメラーゼおよび小孔）複合体へと結合させた。エンリッチメントは、ストレプトアビジンカップリングビーズを使用して、ビオチニル化プライマー複合体に結合させることにより達成し、シーケンシングの準備ができた複合体をエンリッチした。シーケンシングは、Ｒｏｃｈｅナノポアプラットフォーム上で実施した。結果を、表５に示す。
【００５７】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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