(57)【要約】本発明は、治療用オリゴヌクレオチドの分析論および発見の分野に関し、オリゴヌクレオチド治療剤の発見、製造、品質保証、治療剤開発、および患者モニタリングにおいて使用され得る配列ベースの品質情報を提供する、修飾オリゴヌクレオチドのプライマーベース並列シークエンシングのための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列を配列決定するための方法:
(a)キャプチャープローブオリゴヌクレオチドを修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結する工程;
(b)キャプチャープローブからポリメラーゼを介した5’-3’第1鎖合成を行って、修飾オリゴヌクレオチドの相補鎖を含む核酸配列を生成する工程;
(c)工程(b)で得られた第1鎖合成産物のプライマーベース配列決定を行う工程。
【請求項２】
以下の工程を含む、修飾オリゴヌクレオチドの集団の塩基配列を並列シークエンシングするための方法:
(a)キャプチャープローブオリゴヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドの集団に存在する修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結する工程;
(b)キャプチャープローブからポリメラーゼを介した5’-3’第1鎖合成を行って核酸配列の集団を生成する工程であって、それぞれの核酸配列が、修飾オリゴヌクレオチドの集団に存在する修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の相補鎖を含む、工程;
(c)工程(b)で得られた第1鎖合成産物の集団のプライマーベース並列シークエンシングを行う工程。
【請求項３】
キャプチャープローブが第1のプライマー結合部位を含み、第1鎖合成前に、第1鎖合成開始のために第1のプライマーがキャプチャープローブにハイブリダイズされる、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
キャプチャープローブがセルフプライミングキャプチャープローブである、請求項1または2記載の方法。
【請求項５】
工程bの後かつ工程cの前に第1鎖合成産物がPCR増幅される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
工程(c)が、プライマーベース配列決定の前に、工程bの第1鎖合成産物または請求項5記載のPCR増幅産物のいずれかのクローン増幅を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
3’キャプチャープローブを修飾オリゴヌクレオチドに連結した後かつ第1鎖合成の前に、連結産物が、例えばゲル精製を介してまたは連結されなかった3’キャプチャープローブの酵素的分解を介して、精製される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
PCR工程がPCRプライマーペアを用いて行われ、PCRプライマーの1つが3’キャプチャープローブに特異的であり、第2のPCRプライマーが、修飾オリゴヌクレオチドに、例えば修飾オリゴヌクレオチドの5’領域に、特異的である、請求項5〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
プライマーベース配列決定工程が、クローン増幅プライマーを用いた第1鎖合成工程(b)のクローン増幅を含み、クローン増幅プライマーの1つが3’キャプチャープローブに特異的であり、第2のクローン増幅プライマーが、修飾オリゴヌクレオチドに、例えば修飾オリゴヌクレオチドの5’領域に、特異的である、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
第1鎖合成工程(b)の後または請求項7記載の精製工程の後に、アダプタープローブが第1鎖合成産物の3’末端に連結される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
PCR工程がPCRプライマーペアを用いて行われ、PCRプライマーの一方が3’キャプチャープローブに特異的であり、他方のPCRプライマーがアダプタープローブに特異的である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
キャプチャープローブおよびアダプタープローブがクローン増幅プライマー結合部位を含み、配列決定工程が、請求項10記載の第1鎖合成/アダプタープローブ連結産物または請求項11記載のPCR増幅産物のクローン増幅を含む、請求項10または11記載の方法。
【請求項１３】
クローン増幅プライマーが第1のPCRプライマーおよび第2のPCRプライマーに特異的であるか; またはクローン増幅プライマーが3’キャプチャープローブおよびアダプタープローブに特異的であるか; または、それぞれ、クローン増幅プライマーの一方がPCRプライマーの1つに特異的であり、他方のクローン増幅プライマーが3’キャプチャープローブもしくはアダプタープローブのいずれかに特異的である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
第1鎖合成工程(b)後に、第1鎖合成産物が3’末端で多核酸付加(ポリN)される、例えばポリアデニル化される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
第2の鎖が、相補的ポリ(N)配列を有するプライマー、例えばポリTプライマーを用いて合成される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
第2鎖合成プライマーが、PCRプライマー結合部位および/またはクローン増幅プライマー結合部位(またはフローセルプライマー結合部位)をさらに含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
PCR工程が、3’キャプチャープローブに特異的なプライマーと、第2鎖合成プライマーまたは第2鎖合成プライマーに特異的なPCRプライマーのいずれかとを用いて行われる、請求項14〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
配列決定工程がクローン増幅を含み、クローン増幅プライマーの1つが3’キャプチャープローブに特異的であり、第2のクローン増幅プライマーが第2鎖合成プライマーに特異的である、請求項14〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
PCRプライマーが、クローン増幅プライマー結合部位、例えばフローセルキャプチャープローブ結合部位をさらに含み、配列決定工程が、クローン増幅プライマー結合部位に相補的なクローン増幅プライマー、例えばフローセル結合プライマーを用いたクローン増幅を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
プライマーベース配列決定工程が、合成方法による配列決定を用いて行われる、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
プライマーベースの配列決定方法がサイクリックリバーシブルターミネーション法(CRT)である、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
配列決定工程がクローン増幅を含み、クローン増幅プライマーが、固体支持体、例えばフローセルに結合しているか、またはエマルジョンドロップレット内に区画化されている、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
プライマーベース配列決定工程のクローン増幅工程が、
(a)固相増幅、例えば固相ブリッジ増幅、または
(b)エマルジョン相増幅、例えばドロップレットPCR
のいずれかを含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
プライマーベース配列決定が、並列シークエンシング、例えば超並列シークエンシングを用いて行われる、請求項1〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
第1鎖合成が、ポリメラーゼとポリエチレングリコールまたはプロピレングリコールとの存在下で行われる、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
第1鎖合成に用いられるポリメラーゼが、TaqポリメラーゼもしくはVolcano2GポリメラーゼもしくはPrimeScript逆転写酵素、またはTaqポリメラーゼと少なくとも70％の同一性を有する有効なポリメラーゼである、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
修飾オリゴヌクレオチドが、2’糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、例えばLNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたは2’-O-MOEホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、請求項1〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも2個の連続した2’糖修飾ヌクレオシドを含む、請求項1〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも1個の2’-O-メトキシエチルRNA(MOE)ヌクレオシドを含む、請求項1〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも2個の連続した2’-O-メトキシエチルRNA(MOE)ヌクレオシドを含む、請求項1〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
修飾オリゴヌクレオチドが、該修飾オリゴヌクレオチドの3’に位置する少なくとも1個の2’-O-メトキシエチルRNA(MOE)ヌクレオシド、例えば該修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に位置する少なくとも2個または少なくとも3個の連続した2’-O-メトキシエチルRNA(MOE)ヌクレオシドを含む、請求項1〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも1個のLNAヌクレオシドを含む、請求項1〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも2個の連続したLNAヌクレオチドまたは少なくとも3個の連続したLNAヌクレオチドを含む、請求項1〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
修飾オリゴヌクレオチドが、LNAオリゴヌクレオチドの3’末端に位置する少なくとも1個のLNAヌクレオチド、例えば少なくとも2個のLNAヌクレオチドを含む、請求項1〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
修飾オリゴヌクレオチドがLNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、請求項1〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
修飾オリゴヌクレオチドが、LNAヌクレオシドとDNAヌクレオシドの両方、例えばLNAギャップマーまたはLNAミキシマーを含む、請求項1〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも1個の2’糖修飾Tヌクレオシド、例えばLNA-Tヌクレオシド、または少なくとも1個の2’糖修飾Cヌクレオシド、例えばLNA-Cヌクレオシドを含む、請求項1〜36のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
修飾オリゴヌクレオチドが、1つまたは複数のLNAヌクレオシドと、1つまたは複数の2’置換ヌクレオシド、例えば1つまたは複数の2’-O-メトキシエチルヌクレオシドとを含む、請求項1〜37のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
修飾オリゴヌクレオチドが、2’-O-メトキシエチルギャップマー、ミックスドウイングギャップマー、オルタネイティングフランクギャップマー、またはLNAギャップマーからなる群より選択される、請求項1〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
修飾オリゴヌクレオチドがミキシマーまたはトータルマーである、請求項1〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
修飾オリゴヌクレオチドが、コンジュゲート基、例えばGalNAcコンジュゲートを含む、請求項1〜40のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
修飾オリゴヌクレオチドが、アプタマーであるかまたはアプタマー配列を含む、請求項1〜41のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
修飾オリゴヌクレオチドが、修飾オリゴヌクレオチドコンジュゲートの集団を含み、修飾オリゴヌクレオチドコンジュゲートの集団の各メンバーが、異なるコンジュゲート基を含む、請求項1〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
以下の工程を含む、細胞における細胞取り込みが強化された修飾オリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチド配列を特定するための方法:
(ix)修飾オリゴヌクレオチドの集団を細胞に投与する工程であって、修飾オリゴヌクレオチドの集団の各メンバーが、ユニークな核酸塩基配列を含む、工程;
(x)ある期間の後に、細胞内から修飾オリゴヌクレオチドを単離する工程;
(xi)請求項2〜43のいずれか一項記載の方法を行って、工程(ii)で得られた修飾オリゴヌクレオチドを並列シークエンシングする工程;
(xii)細胞または細胞集団に豊富にある1つまたは複数の修飾オリゴヌクレオチド配列を特定する工程。
【請求項４５】
細胞がインビトロである、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
細胞がインビボである、請求項44記載の方法。
【請求項４７】
以下の工程を含む、哺乳動物の標的組織または標的細胞に豊富にある修飾オリゴヌクレオチド(配列)を特定するための方法:
(xi)修飾オリゴヌクレオチドの混合物を哺乳動物に投与する工程であって、修飾オリゴヌクレオチドの混合物の各メンバーが、ユニークな核酸塩基配列を含む、工程;
(xii)修飾オリゴヌクレオチドを該哺乳動物内で、例えば少なくとも6時間の期間にわたって、分散させる工程;
(xiii)望ましい標的組織または望ましい標的細胞を含む、該哺乳動物に由来する1つまたは複数の組織または細胞から、修飾オリゴヌクレオチドの集団を単離する工程;
(xiv)修飾オリゴヌクレオチドの集団を並列シークエンシングする工程を含む、請求項2〜38のいずれか一項記載の方法を行う工程;
(xv)該哺乳動物の望ましい標的組織または標的細胞に豊富にある修飾オリゴヌクレオチド配列を特定する工程。
【請求項４８】
修飾オリゴヌクレオチドの集団の各メンバーが、異なる(ユニークな)分子バーコード配列を含む、請求項44〜47のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
修飾オリゴヌクレオチドの集団の各メンバーが、異なるアプタマー配列を含む、請求項44〜48のいずれか一項記載の方法。
【請求項５０】
修飾オリゴヌクレオチドの集団の各メンバーが、異なるコンジュゲート部分を含む、請求項44〜48のいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
細胞、例えば標的細胞または標的組織によって優先的に取り込まれるアプタマーまたはアプタマー配列を特定するための方法である、請求項49記載の方法。
【請求項５２】
細胞、例えば標的細胞または標的組織によって優先的に取り込まれるコンジュゲート部分を特定するための方法である、請求項50記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は治療用オリゴヌクレオチドの分析論および発見の分野に関し、オリゴヌクレオチド治療剤の発見、製造、品質保証、治療剤開発、および患者モニタリングにおいて使用され得る配列ベースの品質情報を提供する、修飾オリゴヌクレオチドのプライマーベース並列シークエンシングのための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景
EP1914317A1(特許文献1)は、長さが約8〜50ヌクレオチドの短い核酸配列を定性検出および定量検出するための方法を開示する。この方法では、重複キャプチャープローブ(capture probe)のハイブリダイゼーションとポリメラーゼ伸長が用いられる。EP’317の実施例では、DNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチドG3139が用いられる。
【０００３】
WO01/34845A1(特許文献2)は、体液または抽出物からホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを定量するための方法を開示する。前記方法では、オリゴヌクレオチドに部分的にハイブリダイズするキャプチャープローブが用いられた後に、キャプチャープローブ/オリゴヌクレオチドハイブリッドの酵素的標識が行われ、その後に標識が検出される。WO’845の実施例では、DNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチドISIS2302が用いられる。
【０００４】
Caifu et al., NAR 33 (2005) E179(非特許文献1)は、キャプチャープローブ/PCRベースの増幅システムを用いた、マイクロRNAなどの未修飾の短いオリゴヌクレオチドの検出および定量を開示する。
【０００５】
Froim et al., VAR (1995) 4219-4223(非特許文献2)は、キャピラリー電気泳動とUV検出によるホスホロチオエートアンチセンスDNA配列決定のための方法を開示する。
【０００６】
Tremblay et al., Bioanalysis (2011) 3(5)(非特許文献3)は、オリゴヌクレオチド治療剤を特異的に確かめるための、および定量PCRを行って複合混合物中の個々の代謝産物を特異的に確かめるのに使用するための二重連結ベースのハイブリダイゼーションアッセイを開示する。
【０００７】
W02007/025281(特許文献3)は、キャプチャープローブハイブリダイゼーション、連結、および増幅を用いて短いオリゴヌクレオチドを検出するための方法を開示する。
【０００８】
Cheng et al., Molecular Therapey Nucleic Acids (2013) e67(非特許文献4)は、脳浸透性アプタマーを特定するためのインビボセレックス(in vivo selex)を開示する。アプタマーは、第1鎖合成のためにOneStep RT-PCRキット(Qiagen)またはSuperscript III逆転写酵素を使用するサンガー配列決定またはIllumina配列決定を用いて配列決定される2’フルオロ修飾ホスホジエステルオリゴヌクレオチドである。
【０００９】
Crouzier et al., PLoS ONE (2012)e359900(非特許文献5)は、ヌクレアーゼ耐性RNAアプタマーを作製するための、SuperscriptIIIを用いたロックド核酸ヌクレオチドの効率的な逆転写について言及している。
【００１０】
Crouzierらは、LNAアプタマーオリゴヌクレオチドの第1鎖合成から得られたPCR増幅産物を配列決定するためにサンガーベースの配列決定を使用する。注目すべきことに、LNAアプタマーには、RNAホスホジエステルヌクレオシドのバックグラウンドに1個のLNAヌクレオシドがあった。
【００１１】
本発明者らは、3’キャプチャープローブ連結と、修飾オリゴヌクレオチド、例えば、2’-O-MOEと、このような修飾オリゴヌクレオチドの超並列シークエンシングを可能にするLNA修飾オリゴヌクレオチドのポリメラーゼに基づく検出を提供した。以前に、PCT/EP2017/078695(特許文献4)で述べたように、本発明者らは、キャプチャープローブを用いた、修飾オリゴヌクレオチドの3’捕捉と、それに続く鎖伸長およびヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドの検出、定量、増幅、配列決定、またはクローニングに基づくヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチド、例えば、LNA修飾オリゴヌクレオチドを検出、定量、増幅、配列決定、またはクローニングするための方法を開発した。PCT/EP2017/078695は、鎖伸長に適した酵素としてVolcano2Gポリメラーゼの使用を開示する。
【００１２】
本発明者らが開発した方法の効率は、修飾オリゴヌクレオチドの捕捉とPCRベースの検出を可能にするだけでなく、オリゴヌクレオチド治療剤の発見、製造、品質保証、治療剤開発、および患者モニタリングにおける重要な新ツールをもたらす画期的技法である修飾オリゴヌクレオチド試料の超並列シークエンシングも初めて可能にする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】EP1914317A1
【特許文献２】WO01/34845A1
【特許文献３】W02007/025281
【特許文献４】PCT/EP2017/078695
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Caifu et al., NAR 33 (2005) E179
【非特許文献２】Froim et al., VAR (1995) 4219-4223
【非特許文献３】Tremblay et al., Bioanalysis (2011) 3(5)
【非特許文献４】Cheng et al., Molecular Therapey Nucleic Acids (2013) e67
【非特許文献５】Crouzier et al., PLoS ONE (2012)e359900
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチド、例えば、2’糖修飾オリゴヌクレオチド、例えば、LNAオリゴヌクレオチドまたは2-O-メトキシエチルオリゴヌクレオチドを配列決定するための方法であって、以下の連続工程:
(I)修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドテンプレートのポリメラーゼを介した第1鎖合成を行って、修飾オリゴヌクレオチドの相補鎖を含む核酸配列を生成する工程;
(II)工程(I)の第1鎖合成産物のプライマーベース配列決定を行う工程
を含む方法を提供する。
【００１６】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの集団、例えば、2’糖修飾オリゴヌクレオチドの集団、例えば、LNAオリゴヌクレオチドの集団または2-O-メトキシエチルオリゴヌクレオチドの集団を並列シークエンシングするための方法であって、以下の工程:
(I)オリゴヌクレオチドテンプレートの集団のポリメラーゼを介した第1鎖合成を行って核酸配列のライブラリーを生成する工程であって、集団の各メンバーが修飾オリゴヌクレオチドであるか、または修飾オリゴヌクレオチドを含み、それぞれの核酸配列が、オリゴヌクレオチドの集団に存在する修飾オリゴヌクレオチドの相補鎖を含む、工程;
(II)工程(I)の第1鎖合成産物の集団のプライマーベース配列決定を行う工程
を含む方法を提供する。
【００１７】
工程(I)の後で工程(II)の前にPCR増幅工程が行われてもよい。一部の態様では、プライマーベース配列決定工程は工程(II)の前に、または工程(II)の一部として第1鎖合成産物のクローン増幅を含んでもよい。一部の態様では、クローン増幅は固相増幅またはエマルジョン相増幅(emulsion phase amplification)を使用する。
【００１８】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列を配列決定するための方法であって、以下の工程:
a.キャプチャープローブオリゴヌクレオチドを修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結する工程;
b.キャプチャープローブからポリメラーゼを介した5’-3’第1鎖合成を行って、修飾オリゴヌクレオチドの相補鎖を含む核酸配列を生成する工程;
c.工程b)で得られた第1鎖合成産物のプライマーベース配列決定を行う工程
を含む方法を提供する。
【００１９】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの集団の塩基配列を並列シークエンシングするための方法であって、以下の工程:
a.キャプチャープローブオリゴヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドの集団に存在する修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結する工程;
b.キャプチャープローブからポリメラーゼを介した5’-3’第1鎖合成を行って核酸配列の集団を生成する工程であって、それぞれの核酸配列が、修飾オリゴヌクレオチドの集団に存在する修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の相補鎖を含む、工程;
c.工程b)で得られた第1鎖合成産物の集団のプライマーベース並列シークエンシングを行う工程
を含む方法を提供する。
【００２０】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチド、例えば、2’糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列を配列決定するための方法であって、以下の工程:
a.キャプチャープローブオリゴヌクレオチドを修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結する工程;
b.キャプチャープローブからポリメラーゼを介した5’-3’第1鎖合成を行って、修飾オリゴヌクレオチドの相補鎖を含む核酸配列を生成する工程;
c.アダプタープローブを、工程bで得られた第1鎖合成産物の3’末端に連結し、その後に、
-工程c)で得られた連結産物のプライマーベース配列決定を行う工程;または
-工程c)で得られた連結産物のPCR増幅を行い、PCR増幅産物のプライマーベース配列決定を行う工程
を含む方法を提供する。
【００２１】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの集団、例えば、2’糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの集団の核酸塩基配列を並列シークエンシングするための方法であって、以下の工程:
a.キャプチャープローブオリゴヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドの集団に存在する修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結する工程;
b.キャプチャープローブからポリメラーゼを介した5’-3’第1鎖合成を行って核酸配列の集団を生成する工程であって、それぞれの核酸配列が、修飾オリゴヌクレオチドの集団に存在する修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の相補鎖を含む、工程;
c.アダプタープローブを、工程bで得られた第1鎖合成産物の3’末端に連結し、その後に、
-工程c)で得られた連結産物のプライマーベース並列シークエンシングを行う工程;または
-工程c)で得られた連結産物のPCR増幅を行い、PCR増幅産物のプライマーベース並列シークエンシングを行う工程
を含む方法を提供する。
【００２２】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列を配列決定するための方法であって、以下の工程:
a.キャプチャープローブオリゴヌクレオチドを修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結する工程;
b.キャプチャープローブからポリメラーゼを介した5’-3’第1鎖合成を行って、修飾オリゴヌクレオチドの相補鎖を含む核酸配列を生成する工程;
c.工程b)で得られた第1鎖合成産物のプライマーベース配列決定を行う工程であって、プライマーベース配列決定工程が、クローン増幅プライマーを用いた第1鎖合成工程(b)のクローン増幅を含み、クローン増幅プライマーの1つが3’キャプチャープローブに特異的であり、第2のクローン増幅プライマーが、修飾オリゴヌクレオチドに、例えば修飾オリゴヌクレオチドの5’領域に、特異的である、工程
を含む方法を提供する。
【００２３】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの集団の塩基配列を並列シークエンシングするための方法であって、以下の工程:
a.キャプチャープローブオリゴヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドの集団に存在する修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結する工程;
b.キャプチャープローブからポリメラーゼを介した5’-3’第1鎖合成を行って核酸配列の集団を生成する工程であって、それぞれの核酸配列が、修飾オリゴヌクレオチドの集団に存在する修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の相補鎖を含む、工程;
c.工程b)で得られた第1鎖合成産物の集団のプライマーベース並列シークエンシングを行う工程であって、プライマーベース並列シークエンシング工程が、クローン増幅プライマーを用いた第1鎖合成工程(b)のクローン増幅を含み、クローン増幅プライマーの1つが3’キャプチャープローブに特異的であり、第2のクローン増幅プライマーが、修飾オリゴヌクレオチドに、例えば修飾オリゴヌクレオチドの5’領域に、特異的である、工程
を含む方法を提供する。
【００２４】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列を配列決定するための方法であって、以下の工程:
a.キャプチャープローブオリゴヌクレオチドを修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結する工程;
b.キャプチャープローブからポリメラーゼを介した5’-3’第1鎖合成を行って、修飾オリゴヌクレオチドの相補鎖を含む核酸配列を生成する工程;
c.プライマーを用いて、工程b)で得られた第1鎖合成産物のPCR増幅を行う工程であって、PCRプライマーの1つが3’キャプチャープローブに特異的であり、第2のPCRプライマーが、修飾オリゴヌクレオチドに、例えば修飾オリゴヌクレオチドの5’領域に、特異的である、工程、
d.工程c)のPCR増幅産物のプライマーベース配列決定を行う工程
を含む方法を提供する。
【００２５】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの集団の塩基配列を並列シークエンシングするための方法であって、以下の工程:
a.キャプチャープローブオリゴヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドの集団に存在する修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結する工程;
b.キャプチャープローブからポリメラーゼを介した5’-3’第1鎖合成を行って核酸配列の集団を生成する工程であって、それぞれの核酸配列が、修飾オリゴヌクレオチドの集団に存在する修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の相補鎖を含む、工程;
c.プライマーを用いて、工程b)で得られた第1鎖合成産物のPCR増幅を行う工程であって、PCRプライマーの1つが3’キャプチャープローブに特異的であり、第2のPCRプライマーが、修飾オリゴヌクレオチドに、例えば修飾オリゴヌクレオチドの5’領域に、特異的である、工程、
d.工程c)のPCR増幅産物のプライマーベース並列シークエンシングを行う工程
を含む方法を提供する。
【００２６】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列を配列決定するための方法であって、以下の工程:
a.キャプチャープローブオリゴヌクレオチドを修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結する工程;
b.キャプチャープローブからポリメラーゼを介した5’-3’第1鎖合成を行って、修飾オリゴヌクレオチドの相補鎖を含む核酸配列を生成する工程;
c.第1鎖合成産物の3’末端を多核酸付加(polynucleate)する(例えば、ポリアデニル化する)工程、
d.多核酸付加された 3’末端に相補的な配列を含むプライマー(例えば、ポリT配列を有する第2鎖合成プライマー)を用いて第2鎖合成を行う工程、
e.工程d)で得られた第2鎖合成産物のプライマーベース配列決定を行う工程
を含む方法を提供する。
【００２７】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの集団の塩基配列を並列シークエンシングするための方法であって、以下の工程:
a.キャプチャープローブオリゴヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドの集団に存在する修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結する工程;
b.キャプチャープローブからポリメラーゼを介した5’-3’第1鎖合成を行って核酸配列の集団を生成する工程であって、それぞれの核酸配列が、修飾オリゴヌクレオチドの集団に存在する修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の相補鎖を含む、工程;
c.第1鎖合成産物の3’末端を多核酸付加する(例えば、ポリアデニル化する)工程、
d.多核酸付加された3’末端に相補的な配列を含むプライマー(例えば、ポリT配列を有する第2鎖合成プライマー)を用いて第2鎖合成を行う工程、
e.工程d)で得られた第2鎖合成産物のプライマーベース並列シークエンシングを行う工程
を含む方法を提供する。
【００２８】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列を配列決定するための方法であって、以下の工程:
a.キャプチャープローブオリゴヌクレオチドを修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結する工程;
b.キャプチャープローブからポリメラーゼを介した5’-3’第1鎖合成を行って、修飾オリゴヌクレオチドの相補鎖を含む核酸配列を生成する工程;
c.第1鎖合成産物の3’末端を多核酸付加する(例えば、ポリアデニル化する)工程、
d.多核酸付加された3’末端に相補的な配列を含むプライマー(例えば、ポリT配列を有する第2鎖合成プライマー)を用いて第2鎖合成を行う工程、
e.第2鎖合成産物のPCR増幅を行う工程、
f.工程e)で得られたPCR産物のプライマーベース配列決定を行う工程
を含む方法を提供する。
【００２９】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの集団の塩基配列を並列シークエンシングするための方法であって、以下の工程:
a.キャプチャープローブオリゴヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドの集団に存在する修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結する工程;
b.キャプチャープローブからポリメラーゼを介した5’-3’第1鎖合成を行って核酸配列の集団を生成する工程であって、それぞれの核酸配列が、修飾オリゴヌクレオチドの集団に存在する修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の相補鎖を含む、工程;
c.第1鎖合成産物の3’末端を多核酸付加する(例えば、ポリアデニル化する)工程、
d.多核酸付加された3’末端に相補的な配列を含むプライマー(例えば、ポリT配列を有する第2鎖合成プライマー)を用いて第2鎖合成を行う工程、
e.第2鎖合成産物のPCR増幅を行う工程、
f.工程e)で得られたPCR産物のプライマーベース配列決定を行う工程
を含む方法を提供する。
【００３０】
適宜、PCRプライマーは、3’キャプチャープローブに特異的な第1のPCRプライマーと、第2鎖合成プライマーに特異的な第2のPCRプライマー(第2鎖合成プライマー)でもよい。
【００３１】
本発明は、共通のオリゴヌクレオチド合成操作からの、または独立したオリゴヌクレオチド合成操作のプールからの修飾オリゴヌクレオチドの集団における配列不均一性を確かめる方法であって、以下の工程:
(i)修飾オリゴヌクレオチドを入手および合成する工程、
(ii)本発明に従う修飾オリゴヌクレオチドを並列シークエンシングするための方法を実施する工程、
(iii)工程(ii)で得られた配列データを分析して修飾オリゴヌクレオチドの集団の配列不均一性を特定する工程
を含む方法を提供する。
【００３２】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの配列を検証するための方法であって、以下の工程:
(i)修飾オリゴヌクレオチドを入手および合成する工程、
(ii)本発明に従う修飾オリゴヌクレオチドを並列シークエンシングするための方法を実施する工程、
(iii)得られた配列データを分析して修飾オリゴヌクレオチドの配列を検証する工程
を含む方法を提供する。
【００３３】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの純度を確かめるための方法であって、以下の工程:
(i)修飾オリゴヌクレオチドを入手および合成する工程、
(ii)本発明に従う修飾オリゴヌクレオチドを並列シークエンシングするための方法を実施する工程、
(iii)得られた配列データを分析して修飾オリゴヌクレオチドの純度を確かめる工程
を含む方法を提供する。
【００３４】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの集団の核酸塩基配列を配列決定するための並列シークエンシング、例えば、超並列シークエンシングの使用を提供する。
【００３５】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列を配列決定するための合成配列決定による配列の使用を提供する。
【００３６】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの集団の核酸塩基配列を並列で配列決定するための合成配列決定による配列の使用を提供する。
【００３７】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの合成または製造操作の産物、例えば、治療用オリゴヌクレオチドの品質を確かめるための合成配列決定による配列の使用を提供する。
【００３８】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの合成または製造操作の産物、例えば、治療用オリゴヌクレオチドの配列中の不均一性およびそれぞれのユニークな配列の発生を確かめるための合成配列決定による配列の使用を提供する。
【００３９】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチド、例えば、治療用オリゴヌクレオチドの合成または製造操作の産物の品質を確かめるための合成配列決定による配列の使用を提供する。
【００４０】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチド、例えば、治療用オリゴヌクレオチドの合成または製造操作の産物の不均一性を確かめるための合成配列決定による配列の使用を提供する。
【００４１】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチド、例えば、治療用オリゴヌクレオチドの合成または製造操作の産物の品質を確かめるためのプライマーベース配列決定の使用を提供する。
【００４２】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの合成または製造操作の産物、例えば、治療用オリゴヌクレオチドの配列中の不均一性およびそれぞれのユニークな配列の発生を確かめるためのプライマーベース配列決定の使用を提供する。
【００４３】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの合成または製造操作の産物、例えば、治療用オリゴヌクレオチドの品質を確かめるための並列シークエンシング、例えば、超並列シークエンシングの使用を提供する。
【００４４】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの合成または製造操作の産物、例えば、治療用オリゴヌクレオチドを確かめるための並列シークエンシング、例えば、超並列シークエンシングの使用を提供する。
【００４５】
本発明は、LNA修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたは2’-O-メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含むテンプレートから第1鎖合成を行うための、Taqポリメラーゼ、例えば、SEQ ID NO 1、またはSEQ ID NO 1と少なくとも70％の同一性を有する有効なDNAポリメラーゼ酵素、例えば、Volcano2Gポリメラーゼの使用を提供する。
【００４６】
本発明は、細胞における細胞取り込みが強化された修飾オリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチド配列を特定するための方法であって、以下の工程:
i.修飾オリゴヌクレオチドの集団を細胞に投与する工程であって、修飾オリゴヌクレオチドの集団の各メンバーが、ユニークな核酸塩基配列を含む、工程;
ii.ある期間の後に、細胞内から修飾オリゴヌクレオチドを単離する工程;
iii.工程(ii)で得られた修飾オリゴヌクレオチドに対して本発明の並列シークエンシング方法を行う工程;
iv.細胞または細胞集団に豊富にある1つまたは複数の修飾オリゴヌクレオチド配列を特定する工程
を含む方法を提供する。
【００４７】
本発明は、哺乳動物の標的組織または標的細胞に豊富にある修飾オリゴヌクレオチド(配列)を特定するための方法であって、以下の工程:
i.修飾オリゴヌクレオチドの混合物を哺乳動物に投与する工程であって、修飾オリゴヌクレオチドの混合物の各メンバーが、ユニークな核酸塩基配列を含む、工程;
ii.修飾オリゴヌクレオチドを哺乳動物内で、例えば少なくとも6時間の期間にわたって、分散させる工程;
iii.望ましい標的組織または望ましい標的細胞を含む、哺乳動物に由来する1個または複数個の組織または細胞から、修飾オリゴヌクレオチドの集団を単離する工程;
iv.工程iiiで得られた修飾オリゴヌクレオチドの集団に対して本発明の並列シークエンシング方法を行う工程;
v.哺乳動物の望ましい標的組織または標的細胞に豊富にある修飾オリゴヌクレオチド配列を特定する工程
を含む方法を提供する。
【００４８】
本発明は、細胞取り込みが強化された修飾オリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチド配列を特定するための方法であって、以下の工程を含む方法を提供する。
【００４９】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、LNA修飾オリゴヌクレオチド、例えば、LNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドはLNA修飾オリゴヌクレオチド、例えば、LNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、これは、コンジュゲート基、例えば、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)部分、例えば、三価GalNAc部分をさらに含む。
【００５０】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、2’-糖修飾オリゴヌクレオチド、例えば、2’-O-メトキシエチル修飾オリゴヌクレオチド、例えば、2’-O-メトキシエチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、これは、任意で、コンジュゲート基、例えば、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)部分、例えば、三価GalNAc部分をさらに含んでもよい。
【００５１】
本発明は、1個または複数個の2’修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドのコンジュゲート、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドのコンジュゲート、例えば、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドのコンジュゲート、またはLNAオリゴヌクレオチドのコンジュゲート、例えば、LNAギャップマー(gapmer)またはミキシマー(mixmer)を提供し、前記コンジュゲートは、前記オリゴヌクレオチドと、図に示したようにグループB〜Tより選択されるコンジュゲート部分を含み、任意で、リンカー基、例えば、アルキルリンカーが前記オリゴヌクレオチドとコンジュゲート部分との間に配置されている。適宜、コンジュゲート部分はオリゴヌクレオチドの5’末端または3’末端に配置されてもよい。
【００５２】
定義
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、当業者に一般的に理解されるように、2個以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として定義される。このような共有結合したヌクレオシドはまた核酸分子またはオリゴマーとも呼ばれることがある。オリゴヌクレオチドは一般的に研究室で固相化学合成によって作られ、その後に精製される。オリゴヌクレオチドの配列について述べる時には、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分の配列もしくは順序またはその修飾が言及される。本発明の文脈では、オリゴヌクレオチドは人の手によるものであり、化学合成され、精製または単離されている場合がある。
【００５３】
修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、1つもしくは複数の糖修飾ヌクレオシドおよび/もしくは修飾ヌクレオシド間連結を含むオリゴヌクレオチドならびに/またはコンジュゲート部分の存在について述べている。
【００５４】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは治療用オリゴヌクレオチドである。
【００５５】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも2個の連続した2’糖修飾ヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、独立して、LNAおよび2’-O-メトキシエチルヌクレオシドからなる群より選択される少なくとも2個の連続した2’糖修飾ヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも2個の連続したLNAヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも2個の連続した2’-O-メトキシエチルヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、独立して、LNAおよび2’-O-メトキシエチルヌクレオシドからなる群より選択される少なくとも3個の連続した2’糖修飾ヌクレオシドを含む。
【００５６】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも3個の連続したLNAヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも3個の連続した2’-O-メトキシエチルヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、独立して、LNAおよび2’-O-メトキシエチルヌクレオシドからなる群より選択される少なくとも4個の連続した2’糖修飾ヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも4個の連続したLNAヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも4個の連続した2’-O-メトキシエチルヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、独立して、LNAおよび2’-O-メトキシエチルヌクレオシドからなる群より選択される少なくとも5個の連続した2’糖修飾ヌクレオシドを含む。
【００５７】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に少なくとも2個の連続した2’糖修飾ヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に少なくとも3個の連続した2’糖修飾ヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に少なくとも4個の連続した2’糖修飾ヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に少なくとも5個の連続した2’糖修飾ヌクレオシドを含む。
【００５８】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、3’末端に、独立して、LNAおよび2’-O-メトキシエチルヌクレオシドからなる群より選択される少なくとも2個の連続した2’糖修飾ヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは3’末端に少なくとも2個の連続したLNAヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは3’末端に少なくとも2個の連続した2’-O-メトキシエチルヌクレオシドを含む。
【００５９】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、3’末端に、独立して、LNAおよび2’-O-メトキシエチルヌクレオシドからなる群より選択される少なくとも3個の連続した2’糖修飾ヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは3’末端に少なくとも3個の連続したLNAヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、3’末端に少なくとも3個の連続した2’-O-メトキシエチルヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、3’末端に、独立して、LNAおよび2’-O-メトキシエチルヌクレオシドからなる群より選択される少なくとも4個の連続した2’糖修飾ヌクレオシドを含む。
【００６０】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも1個または複数個の糖修飾ヌクレオシド、例えば、1個または複数個のLNAヌクレオシドを含み、修飾ヌクレオシド間連結、例えば、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結をさらに含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも1個または複数個の2’置換ヌクレオシド、例えば、2’-O-メトキシエチルヌクレオシドを含み、修飾ヌクレオシド間連結、例えば、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結をさらに含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは最も3’側の位置にLNAヌクレオシドを含むか、または最も3’側の位置に2’置換ヌクレオシド、例えば、2’-メトキシエチルまたは2-O-メチルを含み、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結をさらに含んでもよい。適切な修飾オリゴヌクレオチドは、例えば、長さが7〜50個の連続したヌクレオチド、例えば、長さが7〜30個の連続したヌクレオチド、例えば、長さが10〜24個の連続したヌクレオチド、例えば、長さが12〜20個の連続したヌクレオチドでもよい。
【００６１】
骨格修飾オリゴヌクレオチド
骨格修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル以外の少なくとも1個のヌクレオシド間連結を含むオリゴヌクレオチドである。修飾オリゴヌクレオチドは、有利には、骨格修飾オリゴヌクレオチドであり、例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間のヌクレオシド間連結の少なくとも70％がホスホロチオエートヌクレオシド間連結である、例えば、ヌクレオシド間連結の少なくとも80％、例えば、少なくとも90％、例えば、全てがホスホロチオエートヌクレオシド間連結であるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。
【００６２】
糖修飾オリゴヌクレオチド
糖修飾オリゴヌクレオチドは、リボース糖が、デオキシリボース(DNAヌクレオシド)またはリボース(RNAヌクレオシド)以外の部分と取り替えられている少なくとも1個のヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドである。糖修飾オリゴヌクレオチドは、2’炭素が、水素またはヒドロキシル以外の置換基で置換されているヌクレオシド、ならびに二環式ヌクレオシド(LNA)を含む。一部の態様では、糖修飾は2’フルオロRNA以外のものである。
【００６３】
2’糖修飾ヌクレオシド
2’糖修飾ヌクレオシドは、2’位置にHまたは-OH以外の置換基を有するヌクレオシド(2’置換ヌクレオシド)であるか、または2’炭素と、リボース環にある別の炭素との間で架橋を形成することができる2’連結ビラディクル(biradicle)を含むヌクレオシド、例えば、LNA(2’-4’ビラディクル架橋)ヌクレオシドである。
【００６４】
実際に、2’糖置換ヌクレオシドの開発が大いに注目されてきており、非常に多くの2’置換ヌクレオシドがオリゴヌクレオチドに組み込まれた時に有益な特性を有すると見出されている。例えば、2’修飾糖はオリゴヌクレオチドに結合親和性の向上および/またはヌクレアーゼ耐性の増加をもたらし得る。
【００６５】
2’置換修飾ヌクレオシドの例は、2’-O-アルキル-RNA、2’-O-メチル-RNA、2’-アルコキシ-RNA、2’-O-メトキシエチル-RNA(MOE)、2’-アミノ-DNA、2’-フルオロ-RNA、アンロックド(unlocked)核酸(UNA)、および2’-F-ANAヌクレオシドである。さらなる例については、例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443、およびUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213、およびDeleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937を参照されたい。以下は、いくつかの2’置換修飾ヌクレオシドの例示である。
2021522808.tif 000002
【００６６】
本発明に関して、2’置換糖修飾ヌクレオシドはLNAのような2’架橋ヌクレオシドを含まない。
【００６７】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは2’フルオロ修飾ヌクレオチドを含まない。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、独立して、2’-O-アルキル-RNA、2’-O-2’-アルコキシ-RNA、2’-O-メトキシエチル-RNA(MOE)、2’-アミノ-DNA、およびLNAヌクレオシドからなる群より選択される少なくとも2個の連続した修飾ヌクレオチド(nucleotises)を含む。これらは、2’位置にある、かさ高い(bulky)側鎖を含む修飾ヌクレオシドである。
【００６８】
ロックド核酸(LNA)
「LNAヌクレオシド」は、リボース環のコンホメーションを制約またはロックする、前記ヌクレオシドのリボース糖環のC2’とC4’を連結するビラジカルを含む2’-修飾ヌクレオシド(「2’-4’架橋」とも呼ばれる)である。これらのヌクレオシドは文献では架橋核酸または二環式核酸(BNA)とも呼ばれる。LNAが相補的なRNA分子またはDNA分子に対するオリゴヌクレオチドに組み込まれた時に、リボースのコンホメーションのロックはハイブリダイゼーション親和性の向上(二重鎖安定化)と関連する。これは、オリゴヌクレオチド/相補鎖二重鎖の融解温度を測定することによって日常的に確かめることができる。
【００６９】
非限定的で例示的なLNAヌクレオシドは、WO99/014226、WO00/66604、WO98/039352、WO2004/046160、WO00/047599、WO2007/134181、WO2010/077578、WO2010/036698、WO2007/090071、WO2009/006478、WO2011/156202、WO2008/154401、WO2009/067647、WO2008/150729、Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76、Seth et al. J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81、およびMitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238、およびWan and Seth, J. Medical Chemistry 2016, 59, 9645-9667に開示される。
【００７０】
さらなる非限定的で例示的なLNAヌクレオシドはスキーム1に開示される。
【００７１】
スキーム1:
2021522808.tif 000003
【００７２】
個別のLNAヌクレオシドは、β-D-オキシ-LNA、6’-メチル-β-D-オキシLNA、例えば、(S)-6’-メチル-β-D-オキシ-LNA(ScET)、およびENAである。
【００７３】
特に有利なLNAはβ-D-オキシ-LNAである。
【００７４】
2’置換オリゴヌクレオチド
一部の態様では、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも1個の2’置換ヌクレオシド、例えば、少なくとも1個の3’末端2’置換ヌクレオシドを含む。一部の態様では、2’置換オリゴヌクレオチドは、ギャップマーオリゴヌクレオチド、ミキシマーオリゴヌクレオチド、またはトータルマー(totalmer)オリゴヌクレオチドである。一部の態様では、2’置換は2’メトキシエチル(2’-O-M0E)または2’-O-メチルからなる群より選択される。一部の態様では、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドの3’ヌクレオチドは、2’置換ヌクレオシド、例えば、2’-O-M0Eまたは2’-O-メチルである。一部の態様では、オリゴヌクレオチドは4個を超える連続したヌクレオシド修飾ヌクレオシドを含まない。一部の態様では、オリゴヌクレオチドは、3個を超える連続したヌクレオシド修飾ヌクレオシドヌクレオシドを含まない。一部の態様では、オリゴヌクレオチドは3’末端に2個の2’-O-M0E修飾ヌクレオチドを含む。一部の態様では、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含み、一部の態様では、オリゴヌクレオチドに存在するヌクレオシド間連結の少なくとも75％はホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。一部の態様では、修飾ヌクレオシドオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結の全てがホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。ホスホロチオエートによって連結されたオリゴヌクレオチドは、治療剤としての使用を含めて哺乳動物でのインビボ用途に広く用いられている。
【００７５】
一部の態様では、糖修飾オリゴヌクレオチドの長さは7〜30ヌクレオチド、例えば、8〜25ヌクレオチドである。一部の態様では、糖修飾オリゴヌクレオチドの長さは10〜20ヌクレオチド、例えば、12〜18ヌクレオチドである。
【００７６】
ヌクレオシドオリゴヌクレオチドは、任意で、例えば、GalNaCコンジュゲートでコンジュゲートされてもよい。オリゴヌクレオチドがコンジュゲートされている場合は、コンジュゲート基はオリゴヌクレオチドの3’位置以外に配置されることが好ましい。例えば、コンジュゲーションは5’末端にあってもよい。
【００７７】
LNAオリゴヌクレオチド
一部の態様では、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも1個のLNAヌクレオシド、例えば、少なくとも1個の3’末端LNAヌクレオシドを含む。一部の態様では、LNAオリゴヌクレオチドは、ギャップマーオリゴヌクレオチド、ミキシマーオリゴヌクレオチド、またはトータルマーオリゴヌクレオチドである。一部の態様では、LNAオリゴヌクレオチドは4個を超える連続したLNAヌクレオシドを含まない。一部の態様では、LNAオリゴヌクレオチドは3個を超える連続したLNAヌクレオシドを含まない。一部の態様では、LNAオリゴヌクレオチドは3’末端に2個のLNAヌクレオチドを含む。
【００７８】
ギャップマー
ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドは一部の態様ではギャップマーオリゴヌクレオチドでもよい。
【００７９】
本明細書で使用するギャップマーという用語は、1個または複数個のヌクレオシド修飾ヌクレオチド、例えば、(側面または周辺部にある)親和性強化修飾ヌクレオシドを含む隣接領域(「F」)が5’側および3’側に隣接するRNaseH動員オリゴヌクレオチドの領域(ギャップ-「G」)を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。ギャップマーは典型的には長さが12〜26ヌクレオチドであり、一部の態様では、少なくとも1個のヌクレオシド修飾ヌクレオチド、例えば、1〜6個のヌクレオシド修飾ヌクレオシドを含む隣接領域Fが両側に隣接する、6〜14個のDNAヌクレオシドの中心領域(G)を含んでもよい(F1-6G6-14F1-6)。ギャップ領域(例えば、DNAヌクレオシド領域)に隣接して配置された両側面にあるヌクレオシドは、ヌクレオシド修飾ヌクレオチド、例えば、LNAまたは2’-O-MOEヌクレオシドである。一部の態様では、隣接領域にあるヌクレオシドは全て、ヌクレオシド修飾ヌクレオチド、例えば、LNAおよび/または2’-O-MOEヌクレオシドである。しかしながら、側面はヌクレオシド修飾ヌクレオシドの他にDNAヌクレオシドを含んでもよく、これらは一部の態様では末端ヌクレオシドではない。
【００８０】
一部の態様では、隣接領域にある全ヌクレオシドが2’-O-メトキシエチルヌクレオシド(MOEギャップマー)である。
【００８１】
LNAギャップマー
LNAギャップマーという用語は、側面にある親和性強化修飾ヌクレオシドの少なくとも1個がLNAヌクレオシドであるギャップマーオリゴヌクレオチドである。一部の態様では、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの3’末端ヌクレオシドがLNAヌクレオシドであるLNAギャップマーである。一部の態様では、オリゴヌクレオチドの2個の最も3’側のヌクレオシドがLNAヌクレオシドである。一部の態様では、LNAギャップマーの5’側面と3’側面が両方ともLNAヌクレオシドを含み、一部の態様では、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドは、LNAオリゴヌクレオチド、例えば、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオシドがLNAまたはDNAヌクレオシドであるギャップマーオリゴヌクレオチドである。
【００８２】
ミックスドウイングギャップマー(Mixed Wing Gapmer)
ミックスドウイングギャップマーまたはミックスドフランクギャップマー(mixed flank gapmer)という用語は、隣接領域の少なくとも1個が、少なくとも1個のLNAヌクレオシドと、少なくとも1個の非LNA修飾ヌクレオシド、例えば、少なくとも1個の2’置換修飾ヌクレオシド、例えば、2’-O-アルキル-RNA、2’-O-メチル-RNA、2’-アルコキシ-RNA、2’-O-メトキシエチル-RNA(MOE)、2’-アミノ-DNA、2’-フルオロ-RNA、および2’-F-ANAヌクレオシドを含むLNAギャップマーを指す。一部の態様では、ミックスドウイングギャップマーには、LNAヌクレオシドしか含まない一方の側面(例えば、5’または3’)と、2’置換修飾ヌクレオシド、任意で、LNAヌクレオシドを含む他方の側面(それぞれ、3’または5’)がある。一部の態様では、ミックスドウイングギャップマーは側面にLNAと2’-O-MOEヌクレオシドを含む。
【００８３】
ミキシマー
ミキシマーは、ヌクレオシド修飾ヌクレオシドとDNAヌクレオシドを両方とも含むオリゴヌクレオチドであり、このオリゴヌクレオチドは4個を超える連続したDNAヌクレオシドを含まない。ミキシマーオリゴヌクレオチドは、RNAseHを介さない核酸標的調節、例えば、マイクロRNAの阻害またはスプライススイッチング調節またはプレmRNAに用いられることが多い。
【００８４】
トータルマー
トータルマーは、オリゴヌクレオチドに存在するヌクレオシドが全て修飾ヌクレオシドであるヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドである。トータルマーは1種類だけのヌクレオシド修飾を含んでもよく、例えば、完全2’-O-MOEもしくは完全2’-O-メチル修飾オリゴヌクレオチド、または完全LNA修飾オリゴヌクレオチドでもよく、異なるヌクレオシド修飾の混合物、例えば、LNAと2’-O-MOEヌクレオシドの混合物を含んでもよい。一部の態様では、トータルマーは1個または2個の3’末端LNAヌクレオシドを含んでもよい。
【００８５】
タイニー(Tiny)
タイニーオリゴヌクレオチドは、長さが7〜10ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド内にあるヌクレオシドはどれもLNAヌクレオシドである。タイニーオリゴヌクレオチドは、マイクロRNAを標的とするのに特に有効な設計であることが知られている。
【００８６】
立体選択的(stereodefined)オリゴヌクレオチド
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは立体選択的オリゴヌクレオチドである。立体選択的オリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間連結の少なくとも1つが立体選択的ヌクレオシド間連結であるオリゴヌクレオチドである。
【００８７】
立体選択的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間連結の少なくとも1つが立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間連結であるオリゴヌクレオチドである。
【００８８】
RNAiおよびsiRNA
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、siRNAまたはsiRNAセンス鎖および/もしくはアンチセンス鎖などのRNAi分子でもよい。本明細書において「RNA干渉(RNAi)分子」という用語は、RNA低減サイレンシング複合体(RNA reducing silencing complex)(RISC)を介してRNAの発現または翻訳を阻害する任意の分子を指す。低分子干渉RNA(siRNA)は、典型的には、細胞に投与された時にアンチセンス鎖がRISC複合体(siRISC)に取り込まれて、細胞内にある相補的RNA標的核酸の翻訳のRISC関連阻害または分解をもたらす、センスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む二本鎖RNA複合体である。センス鎖はパッセンジャー(passenger)鎖とも呼ばれ、アンチセンス鎖はガイド鎖とも呼ばれる。低分子ヘアピン型RNA(shRNA)は、RISCを介してmRNAを分解できるヘアピン構造を形成する1本の核酸分子である。RNAi核酸分子は化学合成されてもよく(siRNA複合体によくみられる)、インビトロ転写によって合成されてもよく、ベクターから発現されてもよい。典型的に、siRNAのアンチセンス鎖(またはshRNAのアンチセンス領域)は長さが17〜25ヌクレオチド、例えば、長さが19〜23ヌクレオチドである。siRNA複合体ではアンチセンス鎖とセンス鎖は二本鎖二重鎖を形成し、これは、例えば、1〜3ヌクレオチドの3’末端オーバーハングを含んでもよく、平滑断端にされてもよい(二重鎖の一端または両端にオーバーハングが無い)。
【００８９】
RNAiは、細胞内でsiRNAへとプロセシングされる長いdsRNA基質によって媒介され得ることが、認識されるであろう(dsRNAエンドヌクレアーゼであるダイサーが関与すると考えられているプロセス)。ダイサー基質の有効な拡張型が、参照により本明細書に組み入れられるUS8,349,809およびUS8,513,207に記載されている。
【００９０】
RNAi薬剤は、修飾ヌクレオチド間連結および高親和性ヌクレオシド、例えば、LNAおよびcETを含む2‘-4‘二環式リボース修飾ヌクレオシドを用いて化学修飾される場合がある。例えば、2’O-メチル修飾siRNAを開示するWO2002/044321、siLNAとして知られる、siRNA複合体中でのLNAヌクレオシドの使用を開示するW02004083430、およびsiLNA複合体などのsiRNA中での不連続なパッセンジャー鎖の使用を開示するW02007107162を参照されたい。W003006477は、RNAiのsiRNAおよびshRNA(stRNAとも呼ばれる)オリゴヌクレオチドメディエーターを開示する。Harborth et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2003 Apr;13(2):83-105は、低分子干渉RNAおよびショートヘアピンRNAの配列、化学、および構造バリエーションならびに哺乳動物遺伝子サイレンシングに対する効果について言及している。
【００９１】
本発明の方法はsiRNA複合体の両鎖の同時配列決定を可能にするということが、認識されるであろう。
【００９２】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００９３】
本明細書で使用する「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、標的核酸、特に、標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖でなく、従って、siRNAでもshRNAでもない。アンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。内部または相互の自己相補性の程度がオリゴヌクレオチドの完全長にわたって50％未満である限り、一本鎖オリゴヌクレオチドはヘアピンまたは分子間二重鎖構造(同じオリゴヌクレオチドの2つの分子間の二重鎖)を形成できると理解される。
【００９４】
一部の態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは糖修飾オリゴヌクレオチドである。
【００９５】
ヌクレオチド
ヌクレオチドはオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの基本要素であり、本発明の目的では、天然ヌクレオチドと非天然ヌクレオチドを含む。天然では、ヌクレオチド、例えば、DNAヌクレオチドおよびRNAヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、および1個または複数個のリン酸基(ヌクレオシドには存在しない)を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた「ユニット」または「単量体」と同義で呼ばれることがある。
【００９６】
修飾ヌクレオシド
本明細書で使用する「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」という用語は、等価なDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドと比較した時に、糖部分または(ヌクレオ)塩基部分の1個または複数個の修飾を導入することによって修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい態様において、修飾ヌクレオシドは修飾糖部分を含む。修飾ヌクレオシドという用語はまた本明細書において「ヌクレオシド類似体」または修飾「ユニット」または修飾「単量体」と同義で用いられる場合もある。未修飾のDNA糖部分またはRNA糖部分を有するヌクレオシドは本明細書においてDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドと呼ばれる。DNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドの塩基領域に修飾があるヌクレオシドはワトソン・クリック塩基対合できれば、それでもなお一般にDNAまたはRNAと呼ばれる。
【００９７】
修飾ヌクレオシド間連結
「修飾ヌクレオシド間連結」という用語は、当業者に一般的に理解されるように、2個のヌクレオシドを共有結合する、ホスホジエステル(PO)連結以外の連結として定義される。従って、本発明のオリゴヌクレオチドは修飾ヌクレオシド間連結を含んでもよい。一部の態様では、修飾ヌクレオシド間連結はホスホジエステル連結と比較してオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を高める。天然オリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間連結は、隣接するヌクレオシド間でホスホジエステル結合を作り出すリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間連結は、インビボ用途のためにオリゴヌクレオチドを安定化する際に特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチド中にある、例えば、ギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内にあるDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドの領域での、ならびに修飾ヌクレオシド領域、例えば、領域FおよびF’でのヌクレアーゼ切断から保護するのに役立つ場合がある。一態様では、前記オリゴヌクレオチドは、天然ホスホジエステルから修飾された1個または複数個のヌクレオシド間連結を含む。このような1個または複数個の修飾ヌクレオシド間連結は、例えば、ヌクレアーゼ攻撃に対する耐性が高い。ヌクレアーゼ耐性は、血清中でオリゴヌクレオチドをインキュベートすることによって、またはヌクレアーゼ耐性アッセイ(例えば、ヘビ毒液ホスホジエステラーゼ(SVPD))を使用することによって確かめることができ、両方とも当技術分野において周知である。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を高めることができるヌクレオシド間連結はヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間連結と呼ばれる。一部の態様では、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列中にあるヌクレオシド間連結の少なくとも50％が修飾され、例えば、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列中にあるヌクレオシド間連結の少なくとも60％、例えば、少なくとも70％、例えば、少なくとも80、または例えば、少なくとも90％がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間連結である。一部の態様では、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間連結の全てがヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間連結である。一部の態様では、本発明のオリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基、例えば、コンジュゲートに連結するヌクレオシドはホスホジエステルでもよいと認識されている。
【００９８】
好ましい修飾ヌクレオシド間連結はホスホロチオエートである。
【００９９】
ホスホロチオエートヌクレオシド間連結は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態、および製造のしやすさがあるために特に有用である。一部の態様では、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列中にあるヌクレオシド間連結の少なくとも50％はホスホロチオエートである。例えば、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列中にあるヌクレオシド間連結の少なくとも60％、例えば、少なくとも70％、例えば、少なくとも80％、または例えば、少なくとも90％はホスホロチオエートである。一部の態様では、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間連結の全てがホスホロチオエートである。
【０１００】
ヌクレアーゼ耐性連結、例えば、ホスホロチオエート連結は、標的核酸と二重鎖を形成する時にヌクレアーゼを動員することができるオリゴヌクレオチド領域、例えば、ギャップマーの領域Gにおいて特に有用である。しかしながら、ホスホロチオエート連結はまた、非ヌクレアーゼ動員領域および/または親和性強化領域、例えば、ギャップマーの領域FおよびF’でも有用な場合がある。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、一部の態様では、領域FもしくはF’において、または領域FとF’の両方において1個または複数個のホスホジエステル連結を含む場合があり、領域Gにおけるヌクレオシド間連結は完全ホスホロチオエートの場合がある。
【０１０１】
有利には、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間連結は全てホスホロチオエート連結である。
【０１０２】
EP2742135に開示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、(ホスホジエステルおよびホスホロチオエート以外の)他のヌクレオシド間連結、例えば、EP2742135によれば、例えば、DNAホスホロチオエートのギャップ領域において許容され得るアルキルホスホネート/メチルホスホネートヌクレオシド間を含んでもよいと認識されている。
【０１０３】
核酸塩基
核酸塩基という用語は、核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン(例えば、アデニンおよびグアニン)部分ならびにピリミジン(例えば、ウラシル、チミン、およびシトシン)部分を含む。本発明の文脈において核酸塩基という用語は、天然核酸塩基と異なる場合があるが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能する修飾核酸塩基も包含する。これに関連して「核酸塩基」は天然核酸塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、およびヒポキサンチンと非天然変種を両方とも指す。このような変種は、例えば、Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055およびBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1に記載されている。
【０１０４】
一部の態様では、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンを修飾プリンまたは修飾ピリミジン、例えば、置換プリンまたは置換ピリミジン、例えば、イソシトシン、プソイドイソシトシン、5-メチルシトシン、5-チオゾロ-シトシン、5-プロピニル-シトシン、5-プロピニル-ウラシル、5-ブロモウラシル5-チアゾロ-ウラシル、2-チオ-ウラシル、2’チオ-チミン、イノシン、ジアミノプリン、6-アミノプリン、2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、および2-クロロ-6-アミノプリンより選択される核酸塩基に変更することによって修飾される。
【０１０５】
核酸塩基部分は、それぞれの対応する核酸塩基の文字略号、例えば、A、T、G、C、またはUによって示される場合がある。それぞれの文字は、任意で、等価な機能の修飾核酸塩基を含むことがある。例えば、例示されたオリゴヌクレオチドでは、核酸塩基部分はA、T、G、C、および5-メチルシトシンより選択される。任意で、LNAギャップマーの場合、5-メチルシトシンLNAヌクレオシドが用いられる場合がある。
【０１０６】
核酸塩基配列
核酸塩基配列は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに存在する核酸塩基配列を指す。オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、通常、A、T、CおよびG核酸塩基の配列を指す。従って、オリゴヌクレオチド内にある5-メチルシトシン塩基の存在は、配列決定方法によって特定された核酸塩基配列中のシトシン残基として特定され得る。同様に、ウラシル核酸塩基は配列決定方法においてチロシン塩基として特定され得る。
【０１０７】
核酸配列
「核酸配列」という用語は、連続したヌクレオチド配列を含む核酸分子を指し、修飾オリゴヌクレオチドに存在するヌクレオチド配列またはその逆相補鎖を含む場合がある。
【０１０８】
相補性
「相補性」という用語は、ヌクレオシド/ヌクレオチドがワトソン・クリック塩基対合する能力について述べている。ワトソン・クリック塩基対は、グアニン(G)-シトシン(C)およびアデニン(A)-チミン(T)/ウラシル(U)である。オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基のあるヌクレオシドを含む場合があると理解される。例えば、5-メチルシトシンがシトシンの代わりに用いられることが多く、従って、相補性という用語は、非修飾塩基と修飾核酸塩基との間のワトソン・クリック塩基対合を包含する(例えば、Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 2055頁、およびBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1を参照されたい)。
【０１０９】
同一性(ヌクレオチド配列)
本明細書で使用する「同一性」という用語は、連続ヌクレオチド配列全体にわたって参照配列(例えば、配列モチーフ)と同一な、核酸分子(例えば、オリゴヌクレオチド)の中にある連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合(パーセントで表される)を指す。従って、同一性パーセントは、(本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列中と参照配列中にある)2つの配列間で同一のアラインメントされた塩基(マッチ)の数を計数し、この数をオリゴヌクレオチド中にあるヌクレオチドの総数で割り、100を掛けることによって計算される。従って、同一性パーセント=(マッチx100)/アラインメントされた領域の長さ(例えば、連続ヌクレオチド配列)。挿入および欠失は連続ヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算には許容されない。同一性を求める際に、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、核酸塩基の化学修飾は無視される(例えば、5-メチルシトシンは％同一性を計算する目的ではシトシンと同一だとみなされる)と理解される。
【０１１０】
ハイブリダイゼーション
本明細書で使用する「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズ」という用語は、2本の核酸鎖(例えば、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸)が反対鎖にある塩基対間で水素結合を形成し、それによって二重鎖を形成することと理解しなければならない。
【０１１１】
本明細書で使用する「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズ」という用語は、2本の核酸鎖(例えば、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸)が反対鎖にある塩基対間で水素結合を形成し、それによって二重鎖を形成することと理解しなければならない。2本の核酸鎖間の結合の親和性がハイブリダイゼーションの強度である。これは、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度と定義される融解温度(Tm)によって表されることが多い。
【０１１２】
同一性(アミノ酸配列)
同一性:2個のアミノ酸間の関連性はパラメータ「同一性」で表される。本発明の目的では、2つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、EMBOSSパッケージのNeedleプログラム(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277; http://emboss.org)、好ましくは、バージョン3.0.0以降で実行されるように、Needleman-Wunschアルゴリズム(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mo/. Biol. 5 48: 443-453)を用いて決定される。使用した任意のパラメータは、ギャップオープンペナルティ(gapopen penalty)10、ギャップエクステンションペナルティ(gap extension penalty)0.5、およびEBLOSUM62(BLOSUM62のEMBOSSバージョン)置換行列である。「最長同一性(longest identity)」と表示されたNeedleの出力（10-nobriefオプションを用いて得られる）が％同一性として用いられ、以下の通り計算される。(同一残基x100)/(アラインメント長-アラインメント中のギャップ総数)
【０１１３】
アプタマー
アプタマーは、非核酸ハイブリダイゼーション機構によって特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチド、典型的には長さが20〜60個のヌクレオチドである。本発明の修飾オリゴヌクレオチドはアプタマーでもよく、アプタマーとして機能する核酸配列領域を含んでもよい。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、独立して、LNAおよび2’-O-メトキシエチルヌクレオシドからなる群より選択される、少なくとも2個の、例えば、少なくとも3個の連続した2’糖修飾ヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に位置する、少なくとも2個の、例えば、少なくとも3個の連続した2’糖修飾ヌクレオシド、例えば、独立して、LNAおよび2’-O-メトキシエチルヌクレオシドからなる群より選択される2’糖修飾ヌクレオチドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に位置する少なくとも2個の、例えば、少なくとも3個の連続したLNAヌクレオシドを含む。
【０１１４】
連結
連結とは、2つの核酸断片、例えば、オリゴヌクレオチドの共有結合による連結を指す。連結は、典型的には、1つの核酸断片上にある3’OH基と、もう1つの核酸断片上にある5’ホスホリル基との間でリン酸結合が形成することを伴い、リガーゼ酵素、例えば、T4 DNAリガーゼによって触媒され得る。
【０１１５】
キャプチャープローブオリゴヌクレオチド
本明細書に記載のように、3’キャプチャープローブオリゴヌクレオチドはキャプチャープローブオリゴヌクレオチドとも呼ばれ、第1のプライマー結合部位を含み、かつ本発明の方法では、修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結され、それによって、テンプレートとして修飾オリゴヌクレオチドを用いるポリメラーゼベース鎖伸長を可能にするオリゴヌクレオチドである。第1のプライマー結合部位はまた、配列決定プライマー、例えば、固相結合プライマーの結合部位として用いられる場合もある。
【０１１６】
キャプチャープローブは、修飾オリゴヌクレオチドの3’領域に相補的であり(または縮重領域であり)、それによってオリゴヌクレオチドの3’領域を捕捉し、キャプチャープローブと修飾オリゴヌクレオチドとの連結を容易にする3’領域を含んでもよい。
【０１１７】
または、スプリント(splint)連結が行われる場合がある。
【０１１８】
一部の態様では、プライマーベース配列決定の場合、キャプチャープローブオリゴヌクレオチドは配列決定プライマー結合部位、例えば、固相結合プライマーをさらに含んでもよい。従って、キャプチャープローブは、超並列シークエンシングで用いられる固体支持体に結合するための結合部位、例えば、フローセル結合部位を含んでもよく、この結合部位は第1のプライマー側に共通してもよく、第1のプライマー結合部位とは別々であるか、または第1のプライマー結合部位と重複する独立した領域にあってもよい。配列決定プライマー結合部位が第1のプライマー結合部位とは異なる場合、配列決定プライマー結合部位は上流(すなわち、第1のプライマー結合部位の5’側)にあり、それによって、キャプチャープローブからの第1鎖合成において配列決定プライマー結合部位の組み込みが保証されると理解される。
【０１１９】
一部の態様では、本発明のキャプチャープローブは、切断可能な連結基、例えば、セルフプライミング(self priming)キャプチャープローブオリゴヌクレオチドにおいて使用するための切断可能な連結基を含む。セルフプライミングキャプチャープローブは、キャプチャープローブ内にある2つの領域間に、二重鎖を形成する2つの自己相補性領域(本明細書では第2の二重鎖領域と呼ばれることがある)があるために、第1のプライマーを添加することなく5’-3’鎖伸長(第1鎖合成)を開始するのに用いられる場合がある。セルフプライミングキャプチャープローブは、切断されると、5’-3’ポリメラーゼを介した鎖伸長のための基質をもたらす切断可能な連結(例えば、3’末端-OH基を含む二重鎖領域)を含む。切断可能な連結は自己相補的領域の最も3’側の領域に隣接して配置される場合がある。切断可能な連結は任意の切断可能な基でもよく、例えば、UVで切断可能でもよく、酵素的に切断されてもよい。好ましい切断基の1つは、RNaseH2酵素を用いて切断できる、ミスマッチのある(mismatched)RNAヌクレオシドを含む領域である。効率的なRNaseH2切断のために、ミスマッチのあるRNAヌクレオシドには、2つの末端の領域間で形成されるキャプチャープローブ二重鎖の一部となる3個または4個の3’(任意で、5’)ヌクレオシドが隣接してもよい。
【０１２０】
好ましい態様では、キャプチャープローブは、連結(例えば、T4 DNAリガーゼを用いて他の連結方法が用いられる場合がある)を介してヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドを「捕捉する」のに用いられる、少なくとも1個の5’DNAヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドである。捕捉は、キャプチャープローブの5’末端と、修飾ヌクレオシドオリゴヌクレオチドの3’ヌクレオチドとの連結によって生じる場合がある。一部の態様では、キャプチャープローブは、連結工程前に核酸ハイブリダイゼーション(ワトソン・クリック塩基対合)を介して標的核酸配列を捕捉するのに用いられる、標的修飾オリゴヌクレオチド配列上にある領域に相補的な領域をさらに含むことが有利な場合がある。キャプチャープローブの領域と、修飾オリゴヌクレオチド上にある相補的領域との間のハイブリダイゼーションの使用は局所基質濃度を効果的に高め、それにより連結工程の効力が向上する。PCT/EP2017/078695は、本発明の方法において使用され得るキャプチャープローブを開示する。キャプチャープローブは、本発明の方法において含む場合に、増幅工程(PCT工程)において使用するためのPCRプライマー結合部位をさらに含んでもよい。
【０１２１】
本発明は、5’-3’にかけて、
A.予め決められた配列の少なくとも3個の連続したヌクレオチドを含む5’領域であって、最も5’側のヌクレオチドが、末端5’リン酸基があるヌクレオチドである5’領域、
B.任意で、予め決められたヌクレオチド配列の領域を含む並列シークエンシング反応バーコード領域、
C.任意で、領域Bの3’側または領域Bの5’側に配置された、縮重または予め決められたヌクレオチドの領域、
D.固相配列決定プライマー結合部位、
E.任意で、第1のプライマー結合部位、
F.任意で、リンカー領域(ヌクレオチド配列でもよい)、
G.第1のセグメントの予め決められた配列Aに相補的な連続ヌクレオチド配列(第1の二重鎖領域)、
H.最も3’側のヌクレオチドが、ブロックされた3’末端基がある末端ヌクレオチドである、少なくとも2個のヌクレオチドの領域
を含む、糖修飾オリゴヌクレオチドの並列シークエンシングにおいて使用するためのキャプチャープローブオリゴヌクレオチドを提供または使用する。
【０１２２】
図による表示については図7を参照されたい。キャプチャープローブが第1のプライマー結合部位を含まない態様では、第1のプライマーは領域Dにハイブリダイズするように設計される場合がある(すなわち、領域Dは配列決定プライマー結合部位であり、かつ第1のプライマー結合部位として用いられる場合がある)。
【０１２３】
本発明は、5’-3’にかけて、
A.予め決められた配列の少なくとも3個の連続したヌクレオチドを含む5’領域であって、最も5’側のヌクレオチドが、末端5’リン酸基があるヌクレオチドである5’領域、
B.任意で、予め決められたヌクレオチド配列の領域を含む並列シークエンシング反応バーコード領域、
C.任意で、領域Bの3’側または領域Bの5’側に配置された、縮重または予め決められたヌクレオチドの領域、
D.固相配列決定プライマー結合部位、
E.任意で、第1のプライマー結合部位、
F.任意で、リンカー領域(ヌクレオチド配列でもよい)
F’第1のプライマー結合部位および/または固相配列決定プライマー結合部位と二重鎖を形成する領域であって、二重鎖が切断可能なリンカーを含む領域、
G.第1のセグメントの予め決められた配列Aに相補的な連続ヌクレオチド配列(第1の二重鎖領域)、
H.最も3’側のヌクレオチドが、ブロックされた3’末端基がある末端ヌクレオチドである、少なくとも2個のヌクレオチドの領域
を含む、糖修飾オリゴヌクレオチドの並列シークエンシングにおいて使用するための、キャプチャープローブオリゴヌクレオチドを提供または使用する。
【０１２４】
領域F’の切断可能なリンカーが切断されると、外因的に添加される第1のプライマーを使用することなく第1鎖合成に使用できる3’末端が残る(すなわち、セルフプライミングキャプチャープローブが形成する)。
【０１２５】
本発明の方法において使用され得る例示的なキャプチャープローブの一例として図7を参照されたい。
【０１２６】
領域A
一部の態様では、領域Aは、予め決められた配列の少なくとも3個の連続したヌクレオチドを含むか、またはこれらからなり、5’末端ヌクレオチドは、5’リン酸基を含むDNAヌクレオチドである。少なくとも3個の連続したヌクレオチドは領域G(第1の二重鎖領域)に相補的であり、これにハイブリダイズすることができる。一部の態様では、領域Aの少なくとも3個の連続したヌクレオチドはDNAヌクレオチドである。
【０１２７】
一部の態様では、領域Aは少なくとも3個の連続したヌクレオチド、例えば、3〜10個の連続したヌクレオチド、例えば、3〜10個のDNAヌクレオチドを含むか、またはこれらからなる。
【０１２８】
領域B
領域Bは、予め決められたヌクレオチド配列の領域、例えば、3〜20ヌクレオチド、例えば、DNAヌクレオチドの領域を含む並列シークエンシング「反応バーコード」領域として用いられる場合があるか、または並列シークエンシング「反応バーコード」領域である。キャプチャープローブは領域Bを含むことが有利である。なぜなら、領域Bは、共通の並列シークエンシング操作において配列決定される前に、プールをしようとする別々のキャプチャープローブ連結からの試料のプールを可能にするからである。それによって、別個の領域B配列を有する異なるキャプチャープローブを使用すると、別々のキャプチャープローブ連結から配列データが配列決定された後に分離することが可能になる。
【０１２９】
領域C
領域Cは、予め決められた配列もしくは縮重配列または一部の態様では予め決められた配列部分と縮重配列部分の両方を含んでもよい、領域Aの3’側に配置される任意のヌクレオチド配列である。領域Cが存在する場合、その長さは用途に応じて調節される場合がある。縮重配列が用いられる場合、後の配列決定工程での増幅産物の「分子バーコーディング」が可能になり、特定の増幅産物がユニークかどうか確かめることができる可能性がある。これにより、不均一なオリゴヌクレオチド混合物に存在する異なるオリゴヌクレオチドの比較定量が可能になる。一部の態様では、領域Cは3〜30個の縮重連続ヌクレオチド、例えば、3〜30個の縮重連続DNAヌクレオチドを含む。一部の態様では、領域Cはユニバーサルヌクレオチド、例えば、イノシンヌクレオチドを含む。
【０１３０】
配列の中には、PCR中に優先的に増幅され得るものもあることが知られており、従って、縮重配列から生じた遺伝子「バーコード配列」の出現を計数することによって増幅前相対量を求めることができる(例えば、Kielpinski & Vinter, NAR (2014) 42 (8): e70を参照されたい)。
【０１３１】
一部の態様では、領域Cは、バーコード配列と予め決められた配列の利益を可能にする半縮重配列を導入する。さらなる利益はバーコード配列の品質管理である(例えば、Kielpinski et al., Methods in Enzymology (2015) vol. 558, 153-180頁を参照されたい)。半縮重配列は、それぞれの位置に、選択された半縮重核酸塩基を有する(the Need a definition of semi-degenerateに基づいて、IUPACコード、R、Y、S、W、K、M、B、D、H、およびVを追加する)(表3を参照されたい)。
【０１３２】
一部の態様では、領域Cは縮重配列と予め決められた配列を両方とも有するか、縮重配列と半縮重配列を両方とも有するか、または予め決められた配列と半縮重配列を両方とも有するか、または縮重配列と予め決められた配列と半縮重配列を有する。
【０１３３】
領域Cが予め決められた配列を含むのであれば、例えば、第1のプライマー部位の上流に代替の(alternative)または入れ子構造のプライマー部位を提供し得るのであれば、入れ子構造のプライマー部位の使用は、PCR増幅中の非特異的結合を減らすための周知のツールである。一部の態様では、領域Cは3〜30個の予め決められた連続ヌクレオチド、例えば、3〜30個の予め決められた連続DNAヌクレオチドを含む。
【０１３４】
一部の態様では、キャプチャープローブは領域Cを含まない。
【０１３５】
機能上、領域Cは領域Bの5’側または領域Bの3’側に配置され得ると理解される。
【０１３６】
一部の態様では、領域Cが存在する場合、少なくとも3個の連続した縮重ヌクレオシド、例えば、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、もしくは10個の連続した縮重ヌクレオシドからなるか、またはこれらを含む。
【０１３７】
領域D
領域Dは、任意のクローン増幅と、その後の並列シークエンシングの前に、アダプター連結産物、または任意で、アダプター連結産物から調製されたPCR産物を、固相支持体に取り付けられたオリゴヌクレオチドに捕捉するのに用いられる、配列決定プライマー結合部位とも呼ばれる固相プライマー結合部位である。領域Dはまた、第1鎖合成を開始するための第1のプライマー結合部位として用いられる場合もある。
【０１３８】
セルフプライミングキャプチャープローブでは、領域Dと、固相支持体に結合したプライマーとの結合が損なわれない限り(すなわち、領域F’の切断後に配列決定プライマー結合部位の完全性が維持される限り)、領域Dは、切断可能な連結、例えば、ミスマッチのあるRNAヌクレオチドを含む下流(3’)領域(F’)にハイブリダイズする、二重鎖(第2の二重鎖)の一部を形成してもよい。
【０１３９】
領域E
領域Eは、第1鎖合成を開始するのに用いられる第1のプライマー結合部位である。領域Eは、領域Dが第1のプライマー結合部位として用いられる時には含まれる必要がない場合がある。従って、機能、第1のプライマー結合部位領域Eは固相(sold phase)プライマー結合部位(D)と同じでもよく、領域Dと部分的に重複してもよい。
【０１４０】
本発明のセルフプライミングキャプチャープローブでは、領域Eは、切断可能な連結、例えば、ミスマッチのあるRNAヌクレオチドを含む下流(3’)領域(F’)にハイブリダイズする、二重鎖(第2の二重鎖)の一部を形成してもよい。
【０１４１】
領域G
領域Gは、領域Aと二重鎖を形成する、領域Aに相補的なヌクレオチド領域である。領域Gが、領域Aに相補的なRNAヌクレオシドを含まないのであれば有益であり、キャプチャープローブの5’末端ヌクレオシド(領域Aの5’ヌクレオシド)に相補的であり、かつこれにハイブリダイズする領域Gに存在するヌクレオシドがDNAヌクレオシドであることも有益である。これにより、領域AとGがハイブリダイズするとDNA/DNA二重鎖が形成される。一部の態様では、領域Gの2個または3個の最も3’側のヌクレオシドはDNAヌクレオシドである。一部の態様では、領域Gのヌクレオシドの全てがDNAヌクレオシドである。一部の態様では、領域Gは、領域Aに相補的であり、かつハイブリダイズすることができる少なくとも3個の連続したヌクレオチドを含む。一部の態様では、領域Gの少なくとも3個の連続したヌクレオチドはDNAヌクレオチドである。
【０１４２】
一部の態様では、領域Gは3〜10個の連続したヌクレオチド、例えば、3〜10個のDNAヌクレオチドを含むか、またはこれらからなる。一部の態様では、領域Aおよび領域GのヌクレオチドはDNAヌクレオチドである。ハイブリダイゼーションの強度を調節するために、キャプチャープローブを最適化する相補的配列AおよびGの長さおよび組成(例えば、G/C対A/T)が用いられる場合がある。相補的配列内へのミスマッチの導入を使用してハイブリダイゼーション強度を下げることも認識されている(例えば、WO2014110272を参照されたい)。一部の態様では、領域AおよびGは連続した相補的配列を形成しないが、部分的な相補性により、一部の態様では、領域AおよびGは試料と混合された時に二重鎖を形成する。領域AおよびGの最も3’側の塩基対は相補的塩基対でなければならず、一部の態様では、領域AおよびGの2個または3個の最も塩基対が相補的塩基対である。一部の態様では、これらの3’塩基対はDNA塩基対である。
【０１４３】
領域H
領域Hは、キャプチャープローブオリゴヌクレオチドを、検出しようとする、捕捉しようとする、配列決定しようとする、および/定量しようとするヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるという目的にかなう。
【０１４４】
領域Hは、相補的配列の領域AおよびGがハイブリダイズした時に、3’オーバーハングを形成する少なくとも2個または3個のヌクレオチドの領域である。領域Hの3’末端ヌクレオシドは3’位置でブロックされている(すなわち、3’-OH基を含まない)。
【０１４５】
一部の態様では、領域Hは少なくとも3ヌクレオチドの長さを有する。領域Hの最適な長さは、少なくとも、捕捉しようとするオリゴヌクレオチドの長さによって決まる場合があり、本発明者らは、領域Hが、例えば、RNaseで処理した試料を使用した場合、2ヌクレオチドの重複を伴って機能することができる、好ましくは、少なくとも3ヌクレオチドであることを発見した。
【０１４６】
一部の態様では、領域Hは、オリゴヌクレオチド配列の予備知識なしでオリゴヌクレオチドの捕捉を可能にする、縮重配列または半縮重配列を含む。これらの配列の予備知識なしでオリゴヌクレオチドを捕捉することは、望ましい生体分布を有する異なるオリゴヌクレオチド配列のライブラリーから特定のオリゴヌクレオチドを特定する際に、または部分的なオリゴヌクレオチド分解産物を特定するために特に有用である。本発明のプローブおよび方法はまたアプタマーの捕捉および特定にも適用される場合がある。
【０１４７】
一部の態様では、領域Hは、既知の配列を有するヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドの捕捉を可能にする予め決められた配列を含む。予め決められた捕捉領域Hを使用すると、例えば、前臨床もしくは臨床での開発のために、またはその後で、患者から得られた材料中の局所組織もしくは細胞の濃度もしくは曝露を確かめるために、インビボで治療用オリゴヌクレオチドを捕捉、検出、および定量することが可能になる。
【０１４８】
患者における化合物濃度の決定は、患者における治療用オリゴヌクレオチドの投与量を最適化するのに重要な場合がある。
【０１４９】
一部の態様では、領域Hは、高親和性修飾ヌクレオシド、例えば、1個または複数個のLNAヌクレオシドを含む。領域HにおいてLNAなどの高親和性修飾ヌクレオシドを使用すると、修飾オリゴヌクレオチドを効率的に捕捉できると同時に、さらに短いヌクレオチド領域を使用することが可能になる。この点に関して、LNA修飾オリゴヌクレオチドの場合、LNA/LNAハイブリッドが特に強力である。領域Hにおいて高親和性修飾ヌクレオシドを選択的に使用することによって捕捉効力を最適化できると理解される。
【０１５０】
領域Hは予め決められたヌクレオチド配列または縮重(または部分縮重)配列の領域でもよい。修飾オリゴヌクレオチドの3’領域が既知である予め決められたヌクレオチド配列が用いられる場合がある。未知の配列の修飾オリゴヌクレオチドを連結するために領域Hの縮重配列が用いられる場合がある、または修飾オリゴヌクレオチドの集団中で3’領域内に不均一性(heterogeneitity)がある場合がある。一部の態様では、領域Hは少なくとも4個の連続した縮重ヌクレオシド、例えば、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、もしくは12個の連続した縮重ヌクレオシドを含むか、またはこれらを含む。
【０１５１】
一部の態様では、領域A、B、C、D、およびEのヌクレオシドが存在する場合、DNAヌクレオシドである。
【０１５２】
リンカー部分(F)(任意)
領域F
領域Fは任意の領域であり、図7では領域EおよびGをつなぐ細い線によって例示される。領域Eの非存在下では領域Dと領域G、または領域DもしくはEと領域F'を連結する場合がある。一部の態様では、キャプチャープローブオリゴヌクレオチドは非ヌクレオシドリンカーを含まない。
【０１５３】
領域Fは、キャプチャープローブ領域AおよびGがハイブリダイズして第1の二重鎖領域を形成するのを容易にするために用いられてもよく、ヌクレオシド領域でもよく、非ヌクレオチドリンカーを含んでもよい。一部の態様では、領域Fは存在し、少なくとも3個または4個のヌクレオチド、例えば、少なくとも3個または4個のDNAヌクレオチド、例えば、4〜25個のヌクレオチドを含む。
【０１５４】
領域Fの重要な機能は、領域AとGとの間の二重鎖形成(第1の二重鎖)を可能にすることであり、セルフプライミングキャプチャープローブ態様では、領域F’と領域E、または領域F’と領域D、または領域F'と領域DおよびEとの重複との間の第2の(seconf)二重鎖形成の形成を可能にすることである。従って、領域Fはキャプチャープローブ内で分子内ヘアピン構造を形成し得る。しかしながら、一部の態様では、例えば、領域D(任意で、領域Bおよび/またはC)が分子内ヘアピンを形成して、領域AとGとの間で二重鎖を形成することができる場合に、領域Fは必要とされないと認識されている。セルフプライミングキャプチャープローブ態様では領域Fは有利であると想定される。
【０１５５】
ヌクレオチド領域は、ポリメラーゼの読み取り(read through)を阻止する修飾(例えば、逆の(inversed)ヌクレオチド連結)を含んでもよく、含まなくてもよい。
【０１５６】
領域DからGへのDNAポリメラーゼの読み取りを、例えば、非ヌクレオチドリンカーまたはポリメラーゼ阻害修飾を介して阻止する利点は、代替テンプレート分子の形成を阻止することである。このような代替テンプレート分子は、キャプチャープローブの5’領域上での、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドに特異的なプライマーのミスプライミング(mispriming)の原因となる。
【０１５７】
本発明の一部の態様では、リンカー部分Fは、領域AおよびGがハイブリダイズするのを可能にするヌクレオチド領域でもよい。
【０１５８】
一部の態様では、領域Fは、ポリメラーゼブロッキングリンカー、例えば、C6-32ポリエチレングリコールリンカー、例えば、C18ポリエチレングリコールリンカーまたはアルキルリンカーを含む。使用され得る他の非限定的な例示的なリンカー基はPCT/EP2017/078695に開示される。
【０１５９】
スプリント連結
3’キャプチャープローブは一部の態様では直鎖キャプチャープローブでもよい。直鎖キャプチャープローブの場合、直鎖キャプチャープローブと組み合わせてスプリント連結プライマーを使用することが有利な場合がある。すなわち、スプリント連結プライマーはキャプチャープローブの5’領域と修飾オリゴヌクレオチドの3’領域にハイブリダイズし、それによって、連結しようとする末端が整列する。
【０１６０】
DNAポリメラーゼをブロックする
DNAポリメラーゼをブロックする修飾またはリンカー部分はリンカー部分または修飾を越えたポリメラーゼの読み取りを阻止し、それによって鎖伸長が終結する。
【０１６１】
特異的プライマー
特異的プライマーは、プライマー結合部位に対する相補的配列を含むプライマーである。プライマーおよびプライマー結合部位に関して「特異的な」という用語は、使おうとするテンプレート分子、すなわち、キャプチャープローブにあるプライマー結合部位を考慮に入れる必要がある場合があり、一部の態様では、キャプチャープローブまたはアダプターを含む核酸分子から調製される相補的核酸分子中にプライマー結合部位を生じるようにアダプターが操作される場合があると理解される。
【０１６２】
第1のプライマー
本明細書で使用する第1のプライマーとは、キャプチャープローブオリゴヌクレオチド/修飾オリゴヌクレオチド連結産物とハイブリダイズした時に、ポリメラーゼを介した鎖伸長(第1鎖合成)を開始するのに用いられる、キャプチャープローブの領域、例えば、本明細書に記載の領域DまたはEに特異的なプライマーを指す。従って、第1のプライマーは、キャプチャープローブオリゴヌクレオチド上の領域に相補的な配列を含み、さらなる領域、例えば、配列決定プライマー結合部位をさらに含んでもよい。第1のプライマーは、超並列シークエンシングにおいて用いられる固体支持体に結合するための結合部位、例えば、フローセル結合部位をさらに含んでもよい。第1のプライマーは、本発明の方法に含まれる場合、増幅工程(PCT工程)において使用するためのPCRプライマー結合部位をさらに含んでもよい。第1のプライマーは、例えば、長さが15〜30ヌクレオチドでもよく、例えば、DNAオリゴヌクレオチドプライマーでもよい。
【０１６３】
本明細書に記載のように一部の態様では、キャプチャープローブはセルフプライミングし、第1鎖合成を開始するために、外因的に添加される第1のプライマーは不必要である。
【０１６４】
ポリメラーゼを介した5’-3’鎖伸長
本明細書で使用するポリメラーゼを介した5‘-3’鎖伸長とは、キャプチャープローブオリゴヌクレオチド/修飾オリゴヌクレオチド連結産物にハイブリダイズした時の、第1のプライマーからのキャプチャープローブオリゴヌクレオチド/修飾オリゴヌクレオチド連結産物の相補鎖の、ポリメラーゼを介した伸長を指す。これは、DNAポリメラーゼまたは逆転写酵素などの核酸ポリメラーゼによって媒介され得るプロセスである。本明細書において例示されるように、実施例では、適切なポリメラーゼ酵素を特定するのに使用することができるアッセイと、修飾オリゴヌクレオチドを読み取ることができる(すなわち、修飾オリゴヌクレオチドの端から端まで逆転写することができる)実験条件を示す。従って、前記ポリメラーゼは、修飾オリゴヌクレオチド配列の端から端まで逆転写して、修飾オリゴヌクレオチド全体の相補的配列を含む伸長産物を提供することができる酵素である。一部の態様では、前記ポリメラーゼは、LNA修飾オリゴヌクレオチド配列、例えば、LNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチド配列の端から端まで逆転写することができる酵素である。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結によって連結された少なくとも2個の連続したLNAヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結によって連結された少なくとも2個の連続した糖修飾ヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結によって連結された少なくとも2個の連続した糖修飾ヌクレオシドを含み、糖修飾ヌクレオシドの少なくとも1個はLNAヌクレオシドである。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結によって連結された少なくとも2個の連続した2’-O-メトキシエチルヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結によって連結された少なくとも2個の連続した糖修飾ヌクレオシドを含み、糖修飾ヌクレオシドの少なくとも1個はLNAヌクレオシドであり、他方は2’-O-メトキシエチルヌクレオシドである。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドはDNAおよびLNAヌクレオシドを含む。
【０１６５】
実施例において例示されるように、修飾オリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエート、および2’糖修飾オリゴヌクレオチド、例えば、2’-O-MOEまたはLNAオリゴヌクレオチドはポリメラーゼ酵素にかなりの困難を投げかける。非常に多くの異なるDNAポリメラーゼ(逆転写酵素を含む)をスクリーニングすることによって、本発明者らは、Volcano2GポリメラーゼがDNA伸長のテンプレートとして修飾オリゴヌクレオチドを利用する際に極めて有効だと突き止めた。本発明者らはまた、ポリエチレングリコールおよび/またはプロピレングリコールの存在下で使用する時にはTaqポリメラーゼも有効だと突き止めた。本発明の方法においても用いられる場合がある、さらに適切なポリメラーゼ酵素および酵素条件を突き止めるために、実施例で使用するドロップレットPCR法が用いられる場合がある。
【０１６６】
Volcano2GポリメラーゼはmyPOLS Biotec GmbH(DE)から入手可能である。
【０１６７】
一部の態様では、本発明の方法において使用されるポリメラーゼは、野生型テルムス・アクアティクス(Thermus aquaticus)(Taq)DNAポリメラーゼに基づいた、野生型Taqのアミノ酸配列に関して変異S515R、I638F、およびM747Kを含むDNAポリメラーゼである。Taqポリメラーゼのアミノ酸配列をSEQ ID NO 1に示した。一部の態様では、前記ポリメラーゼは、(SEQ ID NO:1)またはそれに対して少なくとも70％の同一性、例えば少なくとも80％の同一性、例えば少なくとも90％の同一性、例えば少なくとも95％の同一性、例えば少なくとも98％の同一性を有する有効なポリメラーゼからなる群より選択される。実施例に示される方法を用いて、(例えば、ドロップレットPCRによって)有効なDNAポリメラーゼが確かめられる場合がある。
2021522808.tif 000004
【０１６８】
一部の態様では、前記ポリメラーゼは、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有するTaqポリメラーゼに対して少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有するDNAポリメラーゼまたはそのクレノウ断片である。このDNAポリメラーゼは、クレノウ断片のSEQ ID NO:1に示したTaqポリメラーゼのアミノ酸配列の位置487、508、536、587、および/または660に対応する1個または複数個の位置に少なくとも1個のアミノ酸置換を含む。参照により本明細書に組み入れられる、特に、SEQ ID NO 3-24として開示されているポリメラーゼを含むWO2015/082449を参照されたい。一部の態様では、DNAポリメラーゼは、SEQ ID NO 1に対して少なくとも80％の相補性、例えば、SEQ ID NO 1に対して少なくとも90％相補性を有し、前記1個または複数個のアミノ酸置換はSEQ ID NO:1のR487H/V、K508W/Y、R536K/L、R587K/I、およびR660T/Vからなる群より選択される。
【０１６９】
アダプタープローブ
本明細書で使用する「アダプタープローブ」という用語は、第1のプライマーからの、ポリメラーゼを介した5’-3’鎖伸長に由来する伸長産物の3’末端に連結されるオリゴヌクレオチドプローブを指す。アダプタープローブは、プライマーベース配列決定に直接用いられる場合がある、および/または本発明の方法に含まれる場合、増幅工程(PCT工程)において用いられる場合があるプライマー結合部位を提供する。アダプタープローブは、さらなる領域、例えば、配列決定プライマー結合部位をさらに含んでもよい。アダプタープローブは、超並列シークエンシングにおいて用いられる固体支持体に結合するための結合部位、例えば、フローセル結合部位をさらに含んでもよい。アダプタープローブは、本発明の方法に含まれる場合、増幅工程(PCR工程)において使用するためのPCRプライマー結合部位をさらに含んでもよい。
【０１７０】
PCR増幅
一部の態様では、アダプタープローブが伸長産物の3’末端に連結された後に、PCR増幅工程が行われる。PCR増幅ではPCRプライマーペアが用いられ、プライマーの一方はキャプチャープローブ上の領域(第1のプライマー結合配列でもよく、第1のプライマー結合配列の上流にあるキャプチャープローブ領域でもよい)に特異的であり、他方のPCRプライマーはアダプタープローブの領域に特異的である。一部の態様では、例えば、並列シークエンシング態様では、PCR増幅は、固体表面に取り付けられたプライマー、例えば、オンビーズ増幅または固相ブリッジ増幅を用いて行われる。一部の態様では、固相は(例えば、固相ブリッジ増幅で用いられるように、例えば、Illumina配列決定プラットフォームで用いられるように)フローセルである。固相ブリッジ増幅で用いられる固相PCRはクラスター生成(cluster generation)とも呼ばれる。すなわち、アダプタープローブ連結から得られた産物のライブラリーが、アダプタープローブおよび/またはキャプチャープローブの領域に相補的な表面結合オリゴヌクレオチドの芝生(lawn)(フローセル結合部位)の上に捕捉される。次いで、各断片が増幅されてブリッジ増幅により別個のクローンクラスターになる。クラスター生成が完了したら、テンプレートは合成による配列決定の準備が整っている。
【０１７１】
一部の態様では、それぞれのクラスターに約1000コピーがあるように、PCRサイクルの数が限定される場合がある。一部の態様では、PCR工程では低サイクルPCRを利用する。すなわち、PCRサイクルの数が2〜約25サイクル、例えば、約10〜約20のPCRサイクルに限定される。
【０１７２】
バーコーディング
バーコードは、例えば、同じキャプチャープローブ連結事象(分子バーコード)または共通のキャプチャープローブ連結反応(反応バーコード)に由来する複数配列の特定に関して、本発明の方法で得られた配列の原物を特定するのに用いられる、キャプチャープローブまたはプライマーの内部にある配列である。
【０１７３】
分子バーコード(例えば、キャプチャープローブの領域Cで用いられる場合がある)
一部の態様では、キャプチャープローブオリゴヌクレオチドおよび/またはアダプタープローブはランダムヌクレオシド配列(縮重配列)の配列を含む。キャプチャープローブ内またはアダプタープローブ内での縮重配列の使用は、PCR増幅工程後に、連結された同じ伸長産物分子の重複に起因する配列決定結果を特定するのに使用することができる。
【０１７４】
反応バーコード(例えば、キャプチャープローブの領域bで用いられる)
超並列シークエンシングの能力は配列決定テンプレートのプールを1回の配列決定実験にするのを可能にし、それによって、それぞれの配列決定操作の費用対効果が向上する。従って、配列決定データを分離して、別々の配列決定テンプレート反応から生じた配列を特定できることが望ましい。これは、それぞれのテンプレートに特有の共通識別配列を組み込むキャプチャープローブまたはPCRプライマーを使用することによって実現する可能性がある。反応バーコードの長さは、それぞれの並列シークエンシング操作にプールされる異なる配列決定テンプレートの複雑度を反映するように改変することができ、例えば、2〜20ヌクレオチド(例えば、長さがDNAヌクレオチド)、例えば、長さが4〜5ヌクレオチドでもよい。
【０１７５】
縮重ヌクレオチド
縮重ヌクレオチドとは、規定された位置で(核酸のIUPAC表記で用いられるように)複数の代替塩基を有することができる核酸配列上の位置を指す。個々の分子について、規定された位置に特定のヌクレオチドがあるが、オリゴヌクレオチド試料中にある分子の集団内では、規定された位置にあるヌクレオチドは縮重していると認識しなければならない。実際に、縮重配列が組み込まれると、オリゴヌクレオチド集団の各メンバー間でヌクレオチド配列の規定された位置が無作為化される。配列の中にはPCR中に優先的に増幅され得るものもあることが知られており、従って、縮重配列から生じた遺伝子「バーコード配列」の出現を計数することによって増幅前相対量を求めることができる(例えば、Kielpinski & Vinter, NAR (2014) 42 (8): e70を参照されたい)。一部の態様では、キャプチャープローブは、縮重ヌクレオチドの代わりに使用され得るユニバーサル塩基(例えば、イノシンヌクレオチド)の領域を含む。
【０１７６】
配列決定
配列決定とは、核酸分子内にある核酸塩基の順序(配列)を決定することを指す。本発明の文脈において、配列決定とは、修飾オリゴヌクレオチド内にある核酸塩基の配列を決定することを指す。従来の配列決定方法は、インビトロDNA複製中にDNAポリメラーゼが鎖終結ジデオキシヌクレオチドを選択的に組み込み、その後に鎖終結産物を電気泳動分離することを利用する(サンガー配列決定として知られる)チェーンターミネーション法に基づいている。それぞれが異なる鎖終結塩基(A、T、C、またはG)を用いる4種類の別々の反応を利用することで、ゲル電気泳動における4つのチェーンターミネーション(chain termination)反応産物の相対運動性を比較することによって配列が決定される。サンガー配列決定は、放射標識ヌクレオチドの組み込みと、その後のSDS-PAGE電気泳動に基づいて最初に開発され、例えば、キャピラリー電気泳動によって検出できる蛍光色素で標識されたプライマーを使用する自動DNA配列決定の基礎として商業的に開発された。ダイターミネーター配列決定を使用すると(オリジナルのサンガー法の4種類の反応ではなく)1つの反応混合物から配列決定することができ、そのため自動化が可能である。一部の態様では、本発明の方法の配列決定方法は自動配列決定を用いて行われる。一部の態様では、本発明の方法の配列決定工程は自動ダイターミネーター配列決定などのダイターミネーター配列決定を用いて行われる。
【０１７７】
サンガーベースの配列決定は現在でも使用されているが、大規模な配列決定用途の場合では「次世代」配列決定技術に取って代わられている。参照により本明細書に組み入れられる、Goodwin et al., Nature Reviews: Genetics Vol 17 (2016), 333-351を参照されたい。
【０１７８】
プライマーベース配列決定
プライマーベース配列決定とは、核酸テンプレートとハイブリダイズしたプライマーからの5’-3’ポリメラーゼベースの鎖伸長の使用を指す。プライマーベース配列決定はチェーンターミネーション法(例えば、サンガー配列決定)に基づいてもよく、有利には、合成による配列決定を用いてもよい。
【０１７９】
キャプチャープローブ/アダプターベースの配列決定
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドの集団を配列決定するための方法を提供する。一部の態様では、前記方法は、キャプチャープローブを修飾オリゴヌクレオチドに連結し、その後に、キャプチャープローブに相補的な第1のプライマーをハイブリダイズする工程を含む。その後で、第1のプライマーは、伸長産物を生成するためのポリメラーゼベース鎖伸長に用いられる。次いで、アダプターが伸長産物の3’末端に連結され、プライマー結合部位として使用され得る、5’側および3’側に既知のプローブ配列が隣接した修飾オリゴヌクレオチド相補的配列を含む核酸分子が得られる。例えば、これはプライマーベース配列決定(1分子テンプレートシークエンシング(single molecule template sequencing))に直接使用され得る、または例えば、PCRもしくは低サイクル増幅を介した配列決定(クローン増幅配列決定)の前に増幅され得る。
【０１８０】
一部の態様では、配列決定工程は「合成による配列決定」法を用いて行われる。
【０１８１】
合成による配列決定
従来のサンガーベースの配列決定はチェーンターミネーションに基づいているが、合成による配列決定は、チェーンターミネーションを開始することなく鎖伸長中に色素標識ヌクレオチドを添加することに基づいている。ユニークな色素シグナル(4種類の塩基、A、T、C、およびGそれぞれに対して1種類の色素シグナル)をリアルタイムモニタリングすることによって鎖伸長中に配列が捕捉される。合成方法による配列決定の注目すべき利点は核酸配列の複合混合物を超並列シークエンシングが可能なことである。一部の態様では、本発明の方法において用いられる配列決定方法はサイクリックリバーシブルターミネーション法または1ヌクレオチド付加法である。
【０１８２】
合成方法による配列決定は、典型的には、サイクリックリバーシブルターミネーション法(CRT)または1ヌクレオチド付加(SNA)アプローチ(Metzker, M. L. Sequencing technologies- the next generation. Nat. Rev. Genet. 11, 31-46(2010)に基づいている。
【０１８３】
サイクリックリバーシブルターミネーション(CRT)法はIllumina NGSプラットフォームおよびQiagen Intelligent BioSystems/GeneReaderプラットフォームによって用いられた時には、リボース3'-OH基がブロックされており、従って、伸長を阻止する可逆的ターミネーター分子を利用する。このプロセスを開始するために、DNAテンプレートは、アダプター領域に相補的な配列によってプライミングされ、これにより、この二本鎖DNA(dsDNA)領域とのポリメラーゼ結合が開始する。各サイクルの間に、個々に標識され、かつ3'-ブロックされた4種類全てのデオキシヌクレオチド(dNTP)の混合物が添加される。1個のdNTPが、それぞれの伸長相補鎖に組み込まれた後、結合しなかったdNTPは除去され、各クラスターで、どのdNTPが組み込まれたか特定するために表面が画像化される。次いで、フルオロフォアとブロック基を除去し、新たなサイクルを開始することができる。
【０１８４】
クローンブリッジ増幅は、本明細書の実施例において用いられるようにIlluminaシステムによって使用される。一部の態様では、本発明の方法において使用される配列決定方法はクローンブリッジ増幅である。
【０１８５】
1ヌクレオチド付加法は454パイロシークエンシングシステム(Roche)およびIon Torrent NGSシステムによって用いられた時には、伸長鎖へのdNTPの組み込みを標識するために1種類のシグナルに頼る。結果として、1種類のdNTPだけがシグナルを担当するのを確実にするために、4種類のヌクレオチドをそれぞれ配列決定反応に繰り返して添加しなければならない。さらに、配列決定反応中に次のヌクレオチドが無ければ伸長が阻止されるので、これはdNTPをブロックすることを必要としない。これに対する例外は、同一のdNTPが付加されるホモポリマー領域であり、複数のdNTPが組み込まれるので、配列の特定はシグナルの比例的増加に頼る。注目すべきことに、Ion Torrentシステムは蛍光ヌクレオチドを使用せず、その代わりに、dNTPが組み込まれるたびに放出されるH+イオンを検出する。結果として生じたpH変化は集積相補形金属酸化膜半導体(integrated complementary metal-oxide-semiconductor)(CMOS)およびイオン感応性電界効果トランジスタ(ISFET)によって検出される。
【０１８６】
並列シークエンシング
従来のサンガー配列決定では、各配列決定操作が1種類の核酸テンプレートの配列を決定するために用いられるのに対して、次世代シークエンシング方法を使用すると、不均一な核酸配列混合物を並列シークエンシングすることが可能になる。本明細書に記載のように並列シークエンシングはクローン増幅工程を使用することができ、増幅プライマー内に配列ベースの識別子を組み込むことで、それぞれのオリジナルテンプレート分子から生じた反復クローン配列を特定することができる。
【０１８７】
超並列シークエンシングは、主として、染色体全体とゲノムを含む長いポリヌクレオチド配列を迅速かつ効率的に配列決定することを可能にし、それにより個々のジェノタイピング解釈が可能なように開発されたが、本発明者らは、これらの解釈が修飾オリゴヌクレオチドの集団内にある個々の分子種の存在および比較存在量を特定する、またとない機会を提供することも突き止めた。このような方法は、非常に多くの用途、例えば、オリゴヌクレオチド治療剤発見、製造および品質保証、治療剤開発、ならびに患者モニタリングにおいて有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】パネルAは、様々なポリメラーゼがLNAオリゴを読み取る能力を試験するために作製した2本の一本鎖試験テンプレート分子の模式図を示す。LTT1は、8個のLNA塩基と11個のホスホロチオエート(phosphorotioate)骨格修飾を含有するLNAオリゴがある区間(薄い灰色)を含有する。DTT1は、LTT1と同じ塩基配列を含むが、ホスホロジエステル(phosphorodiester)骨格をもつDNA塩基だけ使用する対照テンプレートである。(B)は、サイバーゴールド(sybr gold)染色15％TBE尿素ゲルを示す。実施例1からのDCP1とオリゴLNA O1(レーンB)とDNA O1(レーンC)との間の連結反応。レーンAには、連結反応に存在するオリゴは無い。
【図２】パネルAは、実施例2の6つの異なるEva Green ddPCR反応におけるドロップレット(droplet)の蛍光強度の1Dプロットを示す。各反応に使用したテンプレート分子を、それぞれの読み取り値のレーンの上に示した。ピンク色の線は、ポジティブドロップレットとネガティブドロップレットを分ける手動で設定した閾値線を示す。
【図３】実施例3で行った異なるEva Green ddPCR反応におけるドロップレットの蛍光強度を示す。42Cで1時間、LTT1に対して1鎖コピー(1 strand copy)を生じさせるのに使用した酵素を、図表の上に示した(左側の6つのレーン)。右側の6つのレーンは、1鎖合成なしで直接テンプレートに対してddPCRを行った対照反応である。使用したテンプレートを図表の上に示した。
【図４Ａ】図4は、実施例4からの、様々な濃度の様々な添加物が存在する、LTT1テンプレートに対するevagreen ddPCRにおけるドロップレットの蛍光(fluoresence)強度を示す。添加物とその濃度を図表に示した。添加物の濃度を図表の上に示した。パネルEは、パネルA〜Dに示した反応において検出したLTT1の定量を示す。パネルGは、9％PEGと漸増量の1,2-プロパンジオールが存在する、LTT1テンプレートに対するevagreen ddPCRにおけるドロップレットの蛍光強度を示す。パネルHは、パネルGにおけるポジティブドロップレット数の定量を示す。1.2-プロパンジオールをこれ以上添加してもポジティブドロップレット数は増加しないことが示される。
【図４Ｂ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｃ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｄ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｅ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｆ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｇ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｈ】図4Aの説明を参照のこと。
【図５Ａ】図5は、実施例5からの、LTT1に対して1鎖合成した時のddPCR反応の結果を示す。図5パネルAは、PCR添加物なしで1鎖 Taqポリメラーゼ合成した時のddPCR反応を示す。PCRサイクル数を各反応の図表の下に示した。図5パネルBは、1鎖合成反応中に10％PEGと0.31Mが存在した時のddPCR反応の結果を示す。PCRサイクル数を各反応の図表の下に示した。図5パネルCは、同じ反応であるが、Taqポリメラーゼが存在しない反応を示す。PCRサイクル数を各反応の図表の下に示した。図5パネルEおよびFは、10％PEGと0.31M 1.3-プロパンジオール添加物を含む、および含まないHF緩衝液中でphusion DNAポリメラーゼを用いて1鎖合成反応した時のddPCRを示す。図5パネルDは、7種類の試験条件(A;B;C;D;E;F)を対象にした検出されたLTT1コピー数の定量を示す。
【図５Ｂ】図5Aの説明を参照のこと。
【図５Ｃ】図5Aの説明を参照のこと。
【図５Ｄ】図5Aの説明を参照のこと。
【図５Ｅ】図5Aの説明を参照のこと。
【図５Ｆ】図5Aの説明を参照のこと。
【図６Ａ】図6パネルAは、個々のキャプチャープローブと、実施例6に記載のオリゴとの間の連結反応を分離したサイバーゴールド染色15％TBE尿素ゲルを示す。白色の四角は、連結された産物を含むゲルから切断した領域を示す。パネルB〜Eは、実施例6に記載のデータ処理後の、4種類のキャプチャープローブのそれぞれを対象にした上位10位の最も頻度の高い18塩基対リードを示す。インプットLNAオリゴの配列を各表の上に示した。
【図６Ｂ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｃ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｄ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｅ】図6Aの説明を参照のこと。
【図７】例えば、糖修飾オリゴヌクレオチド、例えば、LNAオリゴヌクレオチドまたは立体選択的オリゴヌクレオチドを捕捉するための、4種類の例示的なキャプチャープローブ(i)〜(iv)の重要な設計特徴。領域A:5’末端は連結できるようにリン酸化されている。領域Aは領域Gと第1の二重鎖を形成する(非直鎖キャプチャープローブを形成する)。領域GおよびAは細胞内ループを作るように塩基対合し、それにより、5’リン酸への標的修飾オリゴヌクレオチドの配置を安定化して連結を強化する。領域Bは反応バーコードを含み、並列シークエンシングには極めて有利であるが任意である。領域Cは、縮重ヌクレオチドまたはユニバーサル塩基の領域を含んでもよく、任意で、例えば、分子バーコードとして用いられる場合がある。領域BおよびCはどちらの順序でもよい。領域Dは、例えば、固相プライマーを使用する次世代シークエンシング用途に有利であり、連結産物またはPCR増幅産物を配列決定プラットフォーム(例えば、フローセル結合プライマー)にハイブリダイズさせるのに用いられる。または、PCR増幅工程が含まれるのであれば、配列決定プラットフォーム用の結合部位を含むPCRプライマーが用いられる場合がある。領域Dはまた第1のプライマー結合部位として用いられる場合もある。領域Eは任意の第1のプライマー結合部位であり、領域Dと重複する場合がある。領域Hは、修飾オリゴヌクレオチドの3’末端とハイブリダイズし、それによって、連結の修飾オリゴヌクレオチドをキャプチャープローブの5’末端に配置する、3’ヌクレオチドの領域である。領域Hは縮重配列でもよく、本明細書に記載のような予め決められた配列でもよい。キャプチャープローブの3’末端は、自己連結を回避するために連結しないようにブロックされている。本明細書において3’アミノ修飾が例示されたが、他の3’ブロック基が用いられる場合がある。領域F’は、領域Dの下流に配置された(または領域Dと重複する場合がある)二重鎖領域内にある切断可能な連結によりキャプチャープローブがセルフプライミング(self-priming)する態様を示す。細い線は、図示した領域をつなぐ任意のヌクレオシドを表し、本明細書に記載のように、これらは非ヌクレオシドリンカーと取り替えられ得る。
【図８】パネルAは、個々のキャプチャープローブと、実施例7に記載のオリゴとの間の連結反応を分離したサイバーゴールド染色15％TBE尿素ゲルを示す。白色の四角は、連結された産物を含むゲルから切断した領域を示す。パネルB〜Eは、実施例7に記載のデータ処理後の、4種類のキャプチャープローブのそれぞれを対象にした上位10位の最も頻度の高い18塩基対リードを示す。インプットLNAオリゴの配列を各表の上に示した。
【図９】実施例8に記載した反応の上位10位の最も頻度の高い15塩基対リードを示す。
【図１０Ａ】図10パネルAは、1x45分の1鎖合成反応時に行ったEvaGreen ddPCR反応におけるドロップレットの蛍光強度を示す。検出されたコピーの定量を図10パネルBに示した。図10パネルB は1ul反応あたりのコピー単位での濃度を示す。図10パネルCは、1回、3回、または5回の1鎖合成により行った反応に対して行ったEvaGreen ddPCR反応におけるドロップレットの蛍光強度を示す。各反応における検出されたコピーの定量を図10パネルDに示した。図10パネルDは1ul反応あたりのコピー単位での濃度を示す。
【図１０Ｂ】図10Aの説明を参照のこと。
【図１０Ｃ】図10Aの説明を参照のこと。
【図１０Ｄ】図10Aの説明を参照のこと。
【図１１】皮下注射して4時間後の非コンジュゲートオリゴヌクレオチド(SEQ ID 35)と比べた肝臓濃縮倍率。GalNAc結合オリゴヌクレオチド(SEQ ID 22)ならびにSEQ ID 26は非コンジュゲートオリゴヌクレオチド(SEQ ID 35)と比較して3.5倍の肝臓濃縮を示す。
【図１２】皮下注射して4時間後の非コンジュゲートオリゴ化合物SEQ ID 35と比べた血漿濃縮。C16脂肪酸コンジュゲーションがあるオリゴヌクレオチド(SEQ ID 46)は、裸のオリゴヌクレオチドSEQ ID 35と比較して12.5倍の血漿存在量を示した。GalNAc結合オリゴヌクレオチド(SEQ ID 22)は血漿からの枯渇を示した。
【発明を実施するための形態】
【０１８９】
発明の詳細な説明
本発明は、修飾オリゴヌクレオチド、例えば、2’糖修飾オリゴヌクレオチド、例えば、LNAオリゴヌクレオチドまたは2-O-メトキシエチルオリゴヌクレオチドを配列決定するための方法を提供する。
【０１９０】
前記方法は、3’キャプチャープローブを修飾オリゴヌクレオチドに連結する工程であって、3’キャプチャープローブを使用して修飾オリゴヌクレオチドテンプレートの第1鎖合成(逆転写、または5’-3’鎖伸長とも呼ばれる)を開始して、修飾オリゴヌクレオチドに対する相補的配列と、適宜、3’キャプチャープローブの領域に相補的な領域(この領域はPCRプライマー/クローン増幅プライマー結合部位またはフローセルプライマー結合部位または配列決定プライマー結合部位として用いられる場合がある)を含む第1鎖合成産物を得る工程を含んでもよい。
【０１９１】
第1鎖合成後に第1鎖合成産物はPCR増幅される場合があり、これはクローン増幅工程でもよい。PCRでは、キャプチャープローブ由来領域に特異的な第1のPCRプライマーと、一部の態様では修飾オリゴヌクレオチドの領域(適宜、5’領域。それによって、修飾オリゴヌクレオチドの残りの3’領域の配列決定が可能になる)に特異的な場合がある第2のPCRプライマーを使用する場合がある。または、3’末端で第1鎖合成産物をさらに延ばすことによって、例えば、PCRプライマー結合部位を含むアダプタープローブを連結することによって、またはターミナルトランスフェラーゼ酵素を用いて触媒できるプロセスである多核酸付加(polynucleation)(3’末端にポリN領域が付加される)、例えば、ポリアデニル化(またはポリCおよびポリU)を介して、修飾オリゴヌクレオチド全体がPCR増幅される場合がある。第2鎖合成は、相補的ポリN配列を含む第2鎖合成プライマーを用いて行われる場合がある。第2のプライマーは第2のPCRプライマー結合部位を含んでもよい。次いで、PCR工程は、3’キャプチャープローブに特異的である第1のPCRプライマーと、ポリ(N)配列または第2鎖合成プライマーPCR結合部位のいずれかに特異的な第2のPCRプライマーを用いて行われる場合がある。PCRプライマー部位は、本発明の方法の配列決定工程の一部であるクローン増幅に、または直接プライマーベース配列決定に使用される場合があると理解される。アダプタープローブ連結態様または多核酸付加態様を使用する利点は、オリゴヌクレオチドの5’領域が未知である修飾オリゴヌクレオチドの配列決定を容易にすることである。
【０１９２】
修飾オリゴヌクレオチドの長さは、例えば、60個までの連続したヌクレオチド、例えば、50個までの連続したヌクレオチド、例えば、40個までの連続したヌクレオチドでもよい。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは長さが7〜30個のヌクレオチドのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであるか、またはこれを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは長さが7〜30個のヌクレオチドの糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであるか、またはこれを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは長さが7〜30個のヌクレオチドの2’糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは長さが7〜30個のヌクレオチドのLNAオリゴヌクレオチドである。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは長さが7〜30個のヌクレオチドのLNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは1個もしくは複数個のLNAヌクレオシド、または1個もしくは複数個の2’-O-メトキシエチルヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドの最も3’側のヌクレオシドはLNAヌクレオシドである。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドの最も3’側のヌクレオシドは2’置換ヌクレオシド、例えば、2’-O-メトキシエチルまたは2’-O-メチルヌクレオシドである。
【０１９３】
一部の態様では、配列決定工程は合成方法による配列決定を用いて行われる。
【０１９４】
一部の態様では、ポリメラーゼを介した5’-3’第1鎖合成とも呼ばれる鎖伸長工程はポリメラーゼとポリエチレングリコール(PEG)またはプロピレングリコールの存在下で行われる。このような態様では、前記ポリメラーゼは、任意で、Taqポリメラーゼ、例えば、SEQ ID NO 1に示したTaqポリメラーゼ、またはSEQ ID NO 1と少なくとも70％の同一性、例えば、少なくとも80％の同一性、例えば、少なくとも90％の同一性、例えば、少なくとも95％の同一性、例えば、少なくとも98％の同一性を有する有効なポリメラーゼでもよい。
【０１９５】
一部の態様では、ポリメラーゼを介した5’-3’第1鎖合成とも呼ばれる鎖伸長工程は100〜20,000、例えば、約2000〜約10000、例えば、約4000の平均分子量のポリメラーゼおよびポリエチレングリコール(PEG)の存在下で行われる。
【０１９６】
一部の態様では、鎖伸長反応(第1鎖合成工程)におけるPEG濃度は約2％〜約15％(w/v-すなわち、PEG重量/反応体積)、例えば、約3％〜約15％である。15％超でも効率的な伸長をもたらす可能性があるが、ドロップレットPCRシステムではドロップレットが不安定化する。一部の態様では、PEG濃度は約2％〜約20％または約3％〜30％(w/v)である。
【０１９７】
一部の態様では、鎖伸長反応混合物(第1鎖合成工程)におけるプロピレングリコール濃度は少なくとも約0.8Mであり、例えば、約0.8M〜2M、例えば、約1M〜約1.6Mでもよい。
【０１９８】
実施例において例示されるように、PEGを添加すると、プロピレングリコールの添加よりも効果的な鎖伸長/第1鎖合成が得られる場合がある。
【０１９９】
PEGおよび/またはプロピレングリコールの使用は、ある範囲のポリメラーゼ、例えば、Taqポリメラーゼおよび本明細書において開示されるようなTaqポリメラーゼに由来するポリメラーゼ、例えば、Volcano2Gポリメラーゼと使用するのに有利なことが見出されている。本明細書において開示されるアッセイは、さらなるポリメラーゼ酵素、必要に応じて、修飾オリゴヌクレオチドの長さの端から端まで効果的な第1鎖合成をもたらす反応条件を特定するのに用いられると考えられる。
【０２００】
一部の態様では、5’-3’鎖伸長(第1鎖合成工程)に用いられるポリメラーゼは、Taqポリメラーゼ、例えば、本明細書に記載のTaqポリメラーゼまたはVolcano2Gポリメラーゼである。
【０２０１】
一部の態様では、前記ポリメラーゼはPrimeScript逆転写酵素(Clontechから入手可能)である。
【０２０２】
DNAポリメラーゼ/逆転写酵素の選択は、ポリメラーゼが修飾オリゴヌクレオチド、例えば、糖修飾オリゴヌクレオチドを読み取る相対効率を評価することによって行われる場合がある。糖修飾オリゴヌクレオチドの場合、これはオリゴヌクレオチド内にある連続した糖修飾ヌクレオシドの長さに左右される場合があり、多量に修飾されたオリゴヌクレオチドの場合、Taqポリメラーゼ以外の酵素が望ましい場合があると認識されている。DNAポリメラーゼ/逆転写酵素の選択はまた試料の純度にも左右され、一部のポリメラーゼ酵素が血液などの汚染物質に対して感受性があることは周知である(例えば、Al-Soud et al, Appl Environ Microbiol. 1998 Oct; 64(10): 3748-3753を参照されたい)。
【０２０３】
有利には、DNAポリメラーゼはVolcano2G DNAポリメラーゼである。
【０２０４】
一部の態様では、第1鎖合成(伸長工程)は逆転写酵素を用いて行われる。一部の態様では、逆転写酵素は、M-MuLV逆転写酵素、改良M-MuLV逆転写酵素、SuperScript(商標)III RT、AMV逆転写酵素、Maxima H Minus逆転写酵素からなる群より選択されてもよい。一部の態様では、DNAポリメラーゼは、耐熱性ポリメラーゼ、例えば、Taqポリメラーゼ、Hottubポリメラーゼ、Pwoポリメラーゼ、rTthポリメラーゼ、Tflポリメラーゼ、Ultimaポリメラーゼ、Volcano2Gポリメラーゼ、およびVentポリメラーゼからなる群より選択されるDNAポリメラーゼである。ある特定の酵素の場合、修飾オリゴヌクレオチドの第1鎖合成を効率的に行うためには、反応条件を、例えば、PEGおよび/またはプロピレングリコールの添加を介して最適化することが必要な場合があると理解される。
【０２０５】
有利には、修飾オリゴヌクレオチドはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチド内にあるヌクレオシド間連結の少なくとも75％はホスホロチオエートヌクレオシド間連結であり、例えば、修飾オリゴヌクレオチド内にあるヌクレオシド間連結の少なくとも90％はホスホロチオエートヌクレオシド間連結であり、例えば、修飾オリゴヌクレオチド内にある全てのヌクレオシド間連結がホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。
【０２０６】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは2’糖修飾オリゴヌクレオチドである。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも2’糖修飾ヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも1個もしくは少なくとも2個の3’末端糖修飾、例えば、少なくとも1個もしくは少なくとも3’末端LNAヌクレオシド、または少なくとも1個もしくは少なくとも2個の末端2’-O-MOEヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾ヌクレオシドは少なくとも3個の2’糖修飾ヌクレオシド、例えば、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個の、またはそれより多い2’糖修飾ヌクレオシドを含む。一部の態様では、2’糖修飾ヌクレオシドは、独立して、LNAヌクレオシドと2’置換糖修飾ヌクレオシド、例えば、2’-O-MOEヌクレオシドより選択される。有利には、修飾オリゴヌクレオチドは、2’糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、例えば、LNA修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチド内にあるヌクレオシド間連結の少なくとも75％はホスホロチオエートヌクレオシド間連結であり、修飾オリゴヌクレオチド内にあるヌクレオシドの少なくとも1個はLNAヌクレオシドであり、例えば、修飾オリゴヌクレオチド内にあるヌクレオシドの2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、または12個はLNAヌクレオシドである。有利には、修飾LNAオリゴヌクレオチドの最も3’側のヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシド、例えば、LNAヌクレオシドでもよく、2’置換ヌクレオシド、例えば、2’-O-MOEヌクレオシドでもよい。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも2個の連続したLNAヌクレオシドを含む。
【０２０７】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、2’-O-アルキル-RNA、2’-O-メチル-RNA、2’-アルコキシ-RNA、2’-O-メトキシエチル-RNA(MOE)、2’-アミノ-DNA、2’-フルオロ-RNA、および2’-F-ANAヌクレオシドからなる群より選択される少なくとも1個の修飾ヌクレオシドを含む。
【０２０８】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも1個の2’-O-メトキシエチルRNA(MOE)ヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも1個の3’末端2’-O-メトキシエチルRNA(MOE)ヌクレオシドと、少なくとも1個のさらなる2’-O-メトキシエチルRNA(MOE)ヌクレオシドを含む。
【０２０９】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、2’-O-MOE修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、例えば、オリゴヌクレオチドの内部にあるヌクレオシド間連結の少なくとも75％がホスホロチオエートヌクレオシド間連結であり、修飾オリゴヌクレオチドの内部にあるヌクレオシドの少なくとも1個が2’-O-MOEヌクレオシドである、例えば、修飾オリゴヌクレオチドの内部にあるヌクレオシドの2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、または12個が2’-O-MOEヌクレオシドである2’-O-MOE修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。有利には、修飾2’-O-MOEオリゴヌクレオチドの最も3’側のヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシド、例えば、2’-O-MOEである。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも2個の連続した2’-O-MOEヌクレオシド、例えば、少なくとも3個、4個、または5個の連続した2-O-MOEヌクレオシドを含む。
【０２１０】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、例えば、同じオリゴヌクレオチド合成操作に由来してもよく、オリゴヌクレオチド合成操作のプールでもよい修飾オリゴヌクレオチドの集団である。オリゴヌクレオチド合成または製造の間に、それぞれのオリゴヌクレオチド合成操作は、オリゴヌクレオチド種、例えば、望ましいオリゴヌクレオチド産物ならびに切断バージョン、例えば、いわゆる、n-1産物の集団を含む。さらに、本明細書において例示されるように、オリゴヌクレオチド種の集団内で、異なる配列を有するオリゴヌクレオチドは、合成操作で用いられた単量体中の不純物または以前のカップリングサイクルに由来する合成カラムの汚染が原因で生じた可能性がある。従って、これらの不純物の存在を配列レベルで特徴付けることが重要である。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドの集団は、それぞれの合成操作の産物が、本発明の方法によって試験できる修飾オリゴヌクレオチドの1バッチを形成するためにプールされる一連の合成操作から得られる。
【０２１１】
一部の態様では、2’糖修飾オリゴヌクレオチドは2’糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。
【０２１２】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも2個の連続した2’糖修飾ヌクレオシドを含む。
【０２１３】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも1個の2’-O-メトキシエチルRNA(MOE)ヌクレオシドを含む。
【０２１４】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも2個の連続した2’-O-メトキシエチルRNA(MOE)ヌクレオシドを含む。
【０２１５】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドの3’に位置する少なくとも1個の2’-O-メトキシエチルRNA(MOE)ヌクレオシド、例えば、修飾オリゴヌクレオチドの3’に位置する少なくとも2個または少なくとも3個の連続した2’-O-メトキシエチルRNA(MOE)ヌクレオシドを含む。
【０２１６】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも1個のLNAヌクレオシドを含む。
【０２１７】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも2個の連続したLNAヌクレオチドまたは少なくとも3個の連続したLNAヌクレオチドを含む。
【０２１８】
一部の態様では、LNAヌクレオチドはLNAオリゴヌクレオチドの3’末端に位置する。
【０２１９】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドはLNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。
【０２２０】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドはLNAヌクレオシドとDNAヌクレオシドの両方、例えば、LNAギャップマーまたはLNAミキシマーを含む。
【０２２１】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも1個のTヌクレオシドもしくは少なくとも1個のCヌクレオシド、例えば、少なくとも1個のDNA-Cもしくは少なくとも1個のDNA-T、または少なくとも1個の2’-メトキシエチル(MOE)Cヌクレオシドもしくは少なくとも1個の2’-メトキシエチル(MOE)Tヌクレオシドを含む。
【０２２２】
一部の態様では、LNAオリゴヌクレオチドは少なくとも1個のLNA-Tヌクレオシドまたは少なくとも1個のLNA-Cヌクレオシドを含む。
【０２２３】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは1個または複数個のLNAヌクレオシドと、1個または複数個の2’置換ヌクレオシド、例えば、1個または複数個の2’-O-メトキシエチルヌクレオシドを含む。
【０２２４】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、2’-O-メトキシエチルギャップマー、ミックスドウイングギャップマー、オルタネイティングフランクギャップマー(alternating flank gapmer)、またはLNAギャップマーからなる群より選択される。
【０２２５】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドはミキシマーまたはトータルマーである。
【０２２６】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドはコンジュゲート基、例えば、GalNAcコンジュゲートを含む。
【０２２７】
一部の態様では、配列決定工程は超並列シークエンシングを使用する。
【０２２８】
一部の態様では、プライマーベース配列決定(本発明の方法のPCR工程)、例えば、超並列シークエンシングのためのテンプレートは、クローンブリッジ増幅(例えば、Illumina配列決定-リバースダイターミネーター(reversible dye terminator))、またはクローンemPCR(エマルジョンPCR、例えば、Roche 454、GS FLX Titanium、Life Technologies SOLiD4、Life Technologies Ion Proton)を用いて行われる。一部の態様では、プライマーベース配列決定のためのテンプレートは、固相テンプレートウォーキング(solid-phase template walking)(例えば、SOLiD Wildfire, Thermo Fisher)を用いて行われる。
【０２２９】
超並列シークエンシングプラットフォーム(次世代シークエンシング)は、例えば、以下の表に説明されるように(Wikipediaに列挙されるように)市販されている。
2021522808.tif 000005
【０２３０】
一部の態様では、3’キャプチャープローブが修飾オリゴヌクレオチドに連結された後に、連結産物は、第1鎖合成(鎖伸長)の前に、例えばゲル精製を介してまたは連結されなかったキャプチャープローブの酵素的分解を介して、精製される。
【０２３１】
一部の態様では、アダプタープローブが第1鎖合成産物に連結された後に、連結産物は、PCRまたは配列決定方法の前に、例えばゲル精製を介してまたは連結されなかったキャプチャープローブの酵素的分解を介して、精製される。
【０２３２】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチド/3’キャプチャープローブ連結産物は、例えばゲル精製を介してまたは連結されなかったキャプチャープローブの酵素的分解を介して、精製される。
【０２３３】
一部の態様では、第1鎖合成鎖/アダプタープローブ連結産物は、例えばゲル精製を介してまたは連結されなかったキャプチャープローブの酵素的分解を介して、精製される。
【０２３４】
一部の態様では、キャプチャープローブもしくはアダプタープローブまたはその両方はそれぞれ配列決定プライマー結合部位を含む。
【０２３５】
一部の態様では、第1のプライマーもしくはアダプタープローブまたはその両方はそれぞれ配列決定プライマー結合部位を含む。
【０２３６】
一部の態様では、前記方法はPCT増幅工程を含み、PCR工程で用いられるPCRプライマーの一方または両方は配列決定プライマー結合部位を含む。
【０２３７】
一部の態様では、キャプチャープローブおよびアダプタープローブ、または第1のプライマーおよびアダプタープローブは、フローセル結合部位をさらに含む。
【０２３８】
一部の態様では、PCR工程において用いられるPCRプライマーはフローセル結合部位をさらに含む。
【０２３９】
例示的な修飾オリゴヌクレオチド態様
修飾オリゴヌクレオチドはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドでもよい。修飾オリゴヌクレオチドはホスホロチオエート糖修飾オリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエート2’糖修飾オリゴヌクレオチド、例えば、LNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたは2’-O-メトキシエチル(MOE)ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドでもよい。
【０２４０】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは治療用オリゴヌクレオチドである。
【０２４１】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドはコンジュゲート部分、例えば、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)部分、例えば、三価GalNAc部分を含む。
【０２４２】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、コンジュゲート部分、例えば、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)部分、例えば、三価GalNAc部分を含むLNAオリゴヌクレオチドである。
【０２４３】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドはゴマー(gomer)オリゴヌクレオチド、例えば、MOEギャップマー、LNAギャップマー、ミックスドウイングギャップマー、またはオルタネイティングフランクギャップマーである。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドはミキシマーオリゴヌクレオチド、例えば、LNAミキシマーオリゴヌクレオチドである。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドはトータルマー、例えば、MOEトータルマー、またはLNAトータルマーオリゴヌクレオチドである。
【０２４４】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、糖修飾オリゴヌクレオチド、例えば、LNAもしくは2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、またはLNAと2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオチドを両方とも含むオリゴヌクレオチドである。
【０２４５】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドはLNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。
【０２４６】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドはLNAヌクレオシドとDNAヌクレオシドの両方、例えば、LNAギャップマーまたはLNAミキシマーを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも1個のβ-D-オキシLNAヌクレオシドまたは少なくとも1個の(S)cET LNAヌクレオシド(6’メチルβ-D-オキシLNA)を含む。一部の態様では、LNAオリゴヌクレオチドに存在するLNAヌクレオシドはβ-D-オキシLNAヌクレオシドまたは少なくとも1個の(S)cET LNAヌクレオシド(6’メチルβ-D-オキシLNA)である。
【０２４７】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも1個の糖修飾Tヌクレオシドおよび/または少なくとも1個の糖修飾C残基(5メチルCを含む)を含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも1個のLNA-Tヌクレオシドおよび/または少なくとも1個のLNA-C(5-メチルCを含む)ヌクレオシドを含む。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも1個の2’-O-メトキシエチルTヌクレオシドおよび/または少なくとも1個の2’-O-メトキシエチルC残基(5メチルCを含む)を含む。オリゴヌクレオチド合成において用いられるシトシンホスホルアミダイト単量体およびチミンホスホルアミダイト単量体の合成は共通中間体を介することが多く、実施例において例示されるように、これは、本発明の方法が検出することができる問題である、CホスホルアミダイトまたはTホスホルアミダイト間の汚染の原因となる可能性がある。
【０２４８】
一部の態様では、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも1個の(例えば、1個、2個、3個、4個、もしくは5個の)3’末端修飾ヌクレオシド、例えば、少なくとも1個の(例えば、1個、2個、3個、4個、もしくは5個の)LNAまたは少なくとも1個の(例えば、1個、2個、3個、4個、もしくは5個の)2’置換ヌクレオシド、例えば、2'O-MOEを含む。一部の態様では、ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも1個の非末端修飾ヌクレオシド、例えば、LNAまたは2’置換ヌクレオシド、例えば、2-O-MOEを含む。
【０２４９】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、1個または複数個のLNAヌクレオシドと、1個または複数個の2’置換ヌクレオシド、例えば1個または複数個の2’-O-メトキシエチルヌクレオシドとを含む。
【０２５０】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、コンジュゲート部分とも呼ばれるコンジュゲート基、例えば、GalNAcコンジュゲートを含む。一部の態様では、コンジュゲート部分は、修飾オリゴヌクレオチドの末端位置に、例えば、3’末端または5’末端に配置され、コンジュゲート基をオリゴヌクレオチドに共有結合により接続するヌクレオシドリンカー部分または非ヌクレオシドリンカー部分があってもよい。
【０２５１】
コンジュゲート部分
一部の態様では、コンジュゲート部分は、タンパク質、例えば、酵素、抗体または抗体断片もしくはペプチド;親油性部分、例えば、脂質、リン脂質、ステロール;ポリマー、例えば、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール;受容体リガンド;低分子;レポーター分子;および非ヌクレオシド炭水化物からなる群より選択される。
【０２５２】
一部の態様では、コンジュゲート部分は炭水化物、非ヌクレオシド糖、炭水化物複合体を含むか、または炭水化物、非ヌクレオシド糖、炭水化物複合体である。一部の態様では、炭水化物は、ガラクトース、ラクトース、n-アセチルガラクトサミン、マンノース、およびマンノース-6-リン酸からなる群より選択される。
【０２５３】
一部の態様では、コンジュゲート部分はタンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、酵素、および抗体断片を含むか、またはこれらの群より選択される。
【０２５４】
一部の態様では、コンジュゲート部分は、親油性部分、例えば、脂質、リン脂質、脂肪酸、およびステロールからなる群より選択される部分である。
【０２５５】
一部の態様では、コンジュゲート部分は、低分子薬物、毒素、レポーター分子、および受容体リガンドからなる群より選択される。
【０２５６】
一部の態様では、コンジュゲート部分は、ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコールである。
【０２５７】
一部の態様では、コンジュゲート部分は、例えば、ガラクトース、ガラクトサミン、N-ホルミル-ガラクトサミン、Nアセチルガラクトサミン、N-プロピオニル-ガラクトサミン、N-n-ブタノイル-ガラクトサミン、およびN-イソブタノイルガラクトス(isobutanoylgalactos)-アミンを含んでもよいアシアロ糖タンパク質受容体標的部分であるか、またはこれを含む。一部の態様では、コンジュゲート部分はガラクトースクラスター、例えば、N-アセチルガラクトサミン三量体を含む。一部の態様では、コンジュゲート部分は、GalNAc(N-アセチルガラクトサミン)、例えば、一価、二価、三価、または四価のGalNAcを含む。化合物に肝臓を標的とさせるために三価GalNAcコンジュゲートが用いられる場合がある(例えば、US5,994517およびHangeland et al., Bioconjug Chem. 1995 Nov-Dec;6(6):695-701、W02009/126933、WO2012/089352、W02012/083046、WO2014/118267、WO2014/179620、およびWO2014/179445を参照されたい)。
【０２５８】
コンジュゲートリンカー
連結またはリンカーは、1個または複数個の共有結合を介した、関心対象のある化学基またはセグメントと、関心対象の別の化学基またはセグメントを連結する2個の原子間のつながりである。コンジュゲート部分はオリゴヌクレオチドに直接取り付けられてもよく、連結部分(例えば、リンカーもしくはテザー(tether))を介して取り付けられてもよい。リンカーは、第3の領域を共有結合により接続するのに、例えば、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチド(例えば、領域AまたはCの末端)に共有結合により接続するのに役立つ。本発明の一部の態様では、本発明のコンジュゲートまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、オリゴヌクレオチドとコンジュゲート部分との間に配置されるリンカー領域を任意で含んでもよい。一部の態様では、コンジュゲートとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーは生物切断可能(biocleavable)である。
【０２５９】
生物切断可能リンカーは、通常遭遇する条件下で切断可能な、または哺乳動物の体内で遭遇する条件に類似する条件下で切断可能な生理学的に不安定な結合を含むか、またはこれからなる。生理学的に不安定なリンカーが化学変換(例えば、切断)される条件には、化学条件、例えば、哺乳動物細胞内で見出される、または哺乳動物細胞内で遭遇するものと類似する、pH、温度、酸化または還元の条件または薬剤、および塩濃度が含まれる。哺乳動物細胞内条件には、例えば、タンパク質分解酵素または加水分解酵素またはヌクレアーゼに由来する、哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一態様では、生物切断可能リンカーはS1ヌクレアーゼ切断に対して感受性がある。好ましい態様では、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、少なくとも2個の連続したホスホジエステル連結、例えば、少なくとも3個または4個または5個の連続したホスホジエステル連結を含む、1〜10個のヌクレオシド、例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個のヌクレオシド、より好ましくは2〜6個のヌクレオシド、最も好ましくは、2〜4個の連結ヌクレオシドを含む。好ましくは、ヌクレオシドはDNAまたはRNAである。生物切断可能リンカーを含有するホスホジエステルは(参照により本明細書に組み入れられる)WO2014/076195でさらに詳細に説明される。
【０２６０】
コンジュゲートはまた、生物切断不可能なリンカーを介してオリゴヌクレオチドに連結されてもよく、一部の態様では、コンジュゲートは、生物切断可能リンカーに共有結合により取り付けられた切断不可能なリンカーを含んでもよい。必ず生物切断可能だというわけではないが、主として、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドまたは生物切断可能リンカーに共有結合により接続するのに役立つリンカー。このようなリンカーは、反復ユニット、例えば、エチレングリコール、アミノ酸ユニットまたはアミノアルキル基の鎖構造またはオリゴマーを含んでもよい。一部の態様では、リンカー(領域Y)は、アミノアルキル、例えば、例えば、C6-C12アミノアルキル基を含むC2-C36アミノアルキル基である。一部の態様では、リンカー(領域Y)はC6アミノアルキル基である。コンジュゲートリンカー基は、アミノ修飾オリゴヌクレオチドと、コンジュゲート基上の活性化エステル基の使用を介してオリゴヌクレオチドに日常的に取り付けられ得る。
【０２６１】
品質保証用途
本発明は、同じ修飾オリゴヌクレオチド合成操作に由来する修飾オリゴヌクレオチドの集団における配列不均一性を確かめるための方法であって、以下の工程:
修飾オリゴヌクレオチドを入手および合成する工程、
本発明に従うプライマーベース配列決定方法を行う工程、
得られた配列データを分析して、修飾オリゴヌクレオチドの集団の配列不均一性を特定する工程
を含む方法を提供する。
【０２６２】
配列不均一性とは、集団内にある個々の種、例えば、集団の少なくとも0.01％、例えば、少なくとも0.05％、例えば、少なくとも0.1％、例えば、少なくとも0.5％を形成する種の配列の特定を指し、各配列の出現、任意で、それぞれの特定された種(ユニークな配列)によって形成される集団全体に対する割合に基づく。
【０２６３】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの配列を検証するための方法であって、以下の工程:
修飾オリゴヌクレオチドを入手および合成する工程、
本発明に従うプライマーベース配列決定方法を行う工程、
得られた配列データを分析して、修飾オリゴヌクレオチドの配列を検証する工程
を含む方法を提供する。
【０２６４】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの集団内の優勢な配列を検証するための方法であって、以下の工程:
修飾オリゴヌクレオチドを入手および合成する工程、
本発明に従うプライマーベース配列決定方法を行う工程、
得られた配列データを分析して、修飾オリゴヌクレオチドの配列を検証する工程
を含む方法を提供する。
【０２６５】
修飾オリゴヌクレオチドの集団は、例えば、同じ配列決定操作(バッチ)から生じてもよく、配列決定操作(バッチ)のプールから生じてもよい。
【０２６６】
検証は、例えば、誤字、または誤りもしくは合成方法工程で用いられた汚染物質に起因し得る、修飾オリゴヌクレオチド合成工程への間違った入力エラーを特定するのに用いられる場合がある。または、検証は、修飾オリゴヌクレオチドの同一性を確認するのに用いられる場合がある。例えば、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチド(例えば、治療剤の形をとる)が投与された患者から得られる場合がある。配列検証によって、間違った配列もしくは切断オリゴヌクレオチドまたは延長したオリゴヌクレオチドもしくは異常な合成産物が特定される場合がある。
【０２６７】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドの純度を確かめるための方法を提供する。
修飾オリゴヌクレオチドを入手および合成する工程、
本発明に従うプライマーベース配列決定方法を行う工程、
得られた配列データを分析して、修飾オリゴヌクレオチドの純度を確かめる工程。
【０２６８】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたは糖修飾オリゴヌクレオチド、例えば、糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、例えば、LNAおよび/または2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの集団の核酸塩基配列を配列決定するための超並列シークエンシングの使用を提供する。
【０２６９】
本発明は、治療用オリゴヌクレオチド、例えば、治療用修飾オリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたは糖修飾オリゴヌクレオチド、例えば、糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、例えば、LNAおよび/または2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの集団の核酸塩基配列を配列決定するための超並列シークエンシングの使用を提供する。
【０２７０】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたは糖修飾オリゴヌクレオチド、例えば、糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、例えば、LNAおよび/または2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの集団の核酸塩基配列を配列決定するための、合成配列決定による配列決定の使用を提供する。
【０２７１】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたは糖修飾オリゴヌクレオチド、例えば、糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、例えば、LNAおよび/または2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成または製造操作の産物の品質を確かめるための、プライマーベースポリメラーゼ配列決定の使用を提供する。
【０２７２】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたは糖修飾オリゴヌクレオチド、例えば、糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、例えば、LNAおよび/または2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成または製造操作の産物の不均一性を確かめるための、プライマーベースポリメラーゼ配列決定の使用を提供する。
【０２７３】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたは糖修飾オリゴヌクレオチド、例えば、糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、例えば、LNAおよび/または2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成または製造操作の産物の品質を確かめるための、超並列シークエンシングの使用を提供する。
【０２７４】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたは糖修飾オリゴヌクレオチド、例えば、糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、例えば、LNAおよび/または2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成または製造操作の産物の不均一性を確かめるための、合成による配列決定の使用を提供する。
【０２７５】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたは糖修飾オリゴヌクレオチド、例えば、糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、例えば、LNAおよび/または2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成または製造操作の産物の品質を確かめるための、合成による配列決定の使用を提供する。
【０２７６】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたは糖修飾オリゴヌクレオチド、例えば、糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、例えば、LNAおよび/または2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成または製造操作の産物の不均一性を確かめるための、合成による配列決定の使用を提供する。
【０２７７】
一部の態様では、本発明の方法は、修飾オリゴヌクレオチドの集団、例えば、1つのオリゴヌクレオチド合成バッチまたは複数のオリゴヌクレオチド合成バッチのプールにおける純度または不均一性の程度を確かめるためのものである。
【０２７８】
一部の態様では、本発明の方法は、修飾オリゴヌクレオチドの配列、または修飾オリゴヌクレオチドの集団、例えば、修飾オリゴヌクレオチド合成バッチもしくは複数のオリゴヌクレオチド合成バッチのプールに存在する優勢な配列を決定するための方法である。
【０２７９】
インビボおよび創薬用途
何年にもわたってオリゴヌクレオチド治療剤は、標的配列から、ワトソン・クリック塩基対合規則によって設計された薬物まで及ぶ見込みを与えてきたが、実際には、これは実現が極めて困難であり、最近になって、個々のオリゴヌクレオチド配列がオリゴヌクレオチドの薬理学的分布に大きな影響を及ぼす可能性があることが明らかになった。従って、インビトロでの抜きん出た効果に基づいて選択された化合物に、インビボで同じ抜きん出た効果があると推測することは難しい。簡単に言うと、その生体内分布が非標的組織での蓄積と標的組織での弱い薬理学的効果の原因となり得る。本発明は、LNAまたは2’-O-MOE修飾オリゴヌクレオチドを並列シークエンシングして、望ましい組織での取り込みをもたらす、および/または非標的組織での蓄積を回避する謎めいた配列を特定する方法を提供する。これは、異なる配列を有するオリゴヌクレオチドライブラリー(例えば、縮重オリゴヌクレオチドライブラリー)を作製し、哺乳動物の標的組織に豊富にあるヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチド(配列)を特定するための方法において使用することによって実現する可能性がある。
【０２８０】
本発明は、哺乳動物の標的組織に豊富にある修飾オリゴヌクレオチド(配列)を特定するための方法であって、以下の工程:
a.修飾オリゴヌクレオチドの混合物を哺乳動物に投与する工程であって、修飾オリゴヌクレオチドの混合物の各メンバーが、ユニークな核酸塩基配列を含む、工程、
b.修飾オリゴヌクレオチドを哺乳動物内で、例えば少なくとも12時間、例えば12〜96時間、例えば24〜48時間の期間にわたって、分散させる工程、
c.望ましい標的組織または望ましい標的細胞を含む、哺乳動物に由来する1つまたは複数の組織または細胞から、修飾オリゴヌクレオチドの集団を単離する工程、
d.修飾オリゴヌクレオチドの集団を配列決定する工程を含む、本発明に記載の方法を実施する工程、
e.哺乳動物の望ましい標的組織または標的細胞に豊富にある修飾オリゴヌクレオチド配列を特定する工程
を含む方法を提供する。
【０２８１】
修飾オリゴヌクレオチドはユニークな核酸塩基の領域(ユニークな核酸塩基配列)を含む。この領域は、例えば、アプタマーまたはアプタマー配列を発見するための縮重核酸塩基の領域でもよく、既知の配列の領域、例えば、(例えば、コンジュゲート部分を発見するための)分子バーコード領域でもよい。
【０２８２】
代わりに、または組み合わせて、前記方法は、哺乳動物の非標的組織における蓄積が少ない修飾オリゴヌクレオチド(配列)を特定するのに用いられる場合があり、前記方法は、
a.修飾オリゴヌクレオチドの混合物を哺乳動物に投与する工程であって、修飾オリゴヌクレオチドの混合物の各メンバーが、ユニークな核酸塩基配列を含む、工程、
b.ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドを哺乳動物内で、例えば少なくとも12時間、例えば12〜96時間、例えば24〜48時間の期間にわたって、分散させる工程、
c.非標的組織または非標的細胞を含む、哺乳動物に由来する1つまたは複数の標的組織または標的細胞から修飾オリゴヌクレオチドの集団を単離する工程、および
d.修飾オリゴヌクレオチドの集団を配列決定する工程を含む、本発明に記載の方法を実施する工程、
e.哺乳動物の非標的組織または非標的細胞における蓄積が少ない修飾オリゴヌクレオチド配列を特定する工程
を含む。
【０２８３】
上記の方法は1回のインビボ実験の中で組み合わせられ得ると理解される。
【０２８４】
前記方法は、望ましい生体内分布もしくは組織取り込みプロファイル(自己ターゲティング)を有する修飾オリゴヌクレオチドを特定するのに用いられる場合がある、または修飾オリゴヌクレオチドを標的とすることができるオリゴヌクレオチド配列(すなわち、「アプタマー」ターゲティング配列を含む修飾オリゴヌクレオチド)を特定するのに用いられる場合がある。または、本明細書に記載のように、前記方法は、修飾オリゴヌクレオチドを標的とすることによって生体内分布または組織取り込みプロファイルを強化するのに使用できるコンジュゲート部分を特定するために用いられる場合がある。
【０２８５】
インビボアッセイの代わりに、またはインビボアッセイに加えて、組織/細胞取り込みのインビトロアッセイが用いられる場合があるとさらに想定される。
【０２８６】
本発明は、細胞取り込みが強化された修飾オリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチド配列を特定するための方法であって、以下の工程:
a.修飾オリゴヌクレオチドの混合物を細胞または細胞の集団に、ある期間にわたって、例えば1〜36時間、投与する工程であって、修飾オリゴヌクレオチドの混合物の各メンバーが、ユニークな核酸塩基配列を含む、工程;
b.細胞または細胞の集団から修飾オリゴヌクレオチドの集団を単離する工程、
c.bで得られた修飾オリゴヌクレオチドの集団を配列決定する工程を含む、本発明に記載の方法を実施する工程;
d.細胞または細胞の集団に豊富にある1つまたは複数の修飾オリゴヌクレオチド配列を特定する工程
を含む方法を提供する。
【０２８７】
細胞は、哺乳動物細胞、例えば、げっ歯類細胞、例えば、マウスまたはラット細胞でもよく、霊長類細胞、例えば、サル細胞またはヒト細胞でもよい。細胞は病原体細胞、例えば、細菌細胞または寄生生物細胞、例えば、マラリア細胞でもよいとも想定される。
【０２８８】
工程aの後で工程bの前に、細胞培地に存在するオリゴヌクレオチドまたは細胞の外面に取り付けられたオリゴヌクレオチドを除去するために、細胞が洗浄される場合がある。
【０２８９】
インビトロ投与の場合、投与工程はジムノーシス(gymnosis)(補助のない取り込み)を用いて行われる場合がある。
【０２９０】
典型的に、単離する工程では、(例えば、細胞/細胞の集団から得られた、またはインビボ態様の場合では哺乳動物(もしくは患者)から得られた組織もしくは細胞から得られた)試料に由来するヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドはRNase処理され、本発明のオリゴヌクレオチド捕捉方法において使用される前に(例えば、ゲルまたはカラム精製を介して)さらに精製される場合がある。本発明のインビトロ方法またはインビボ方法は、規定された細胞下区画に蓄積する修飾オリゴヌクレオチドを特定するために標的細胞の細胞下分画をさらに含んでもよい。
【０２９１】
本発明は、望ましい細胞下区画化を有する修飾オリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチド配列を特定するための方法であって、以下の工程:
a.修飾オリゴヌクレオチドの混合物を細胞または細胞の集団に、ある期間にわたって、例えば1〜36時間、投与する工程であって、修飾オリゴヌクレオチドの混合物の各メンバーが、ユニークな核酸塩基配列を含む、工程;
b.細胞に対して細胞下分画を行う工程;
c.少なくとも1個の細胞下画分、またはある範囲の異なる細胞下画分から修飾オリゴヌクレオチドの集団を単離する工程;
d.cで得られた修飾オリゴヌクレオチドの集団を配列決定する工程を含む、本発明に記載の方法を実施する工程;
e.1つまたは複数の望ましい細胞下画分に豊富にある1つまたは複数の修飾オリゴヌクレオチド配列を特定する工程
を含む方法を提供する。
【０２９２】
本発明の方法は、アプタマー特性を有する特定された核酸配列、例えばインビボで望ましい生体内分布を有する核酸配列に適用される場合がある。従って、本発明の方法は、薬物分子を望ましい作用部位/組織にターゲティングさせることができるアプタマー配列を特定するのに用いられる場合がある。
【０２９３】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、10〜60個の縮重ヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエート連結ヌクレオチドの領域であるか、またはこれを含む。一部の態様では、縮重ヌクレオチド領域のヌクレオチドはDNAヌクレオチドである。従って、異なる核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドの混合物は10〜60個の縮重ヌクレオチドの領域を含む場合がある。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、規定された(既知の)配列の5’領域(X)と、縮重配列領域である3’領域(Y)、例えば10〜60個の縮重ヌクレオチドの領域を含む。5’領域は、例えば、本明細書に記載のように2’糖修飾オリゴヌクレオチドでもよく、治療用オリゴヌクレオチド(すなわち、薬物カーゴ(cargo))でもよい。任意で、既知のヌクレオチドの領域を含む、さらなる3’末端領域(Z)が用いられる場合がある。領域Zは3’キャプチャープローブへの連結を容易にする可能性がある。従って、修飾オリゴヌクレオチドは式[領域X-領域Y-領域Z]、または[領域X-領域-Y]、または[領域Y-領域Z]、または一部の態様では[領域Y]でもよい。望ましい特性を有するアプタマー配列が特定されたら、薬物分子、例えば、治療用オリゴヌクレオチド、例えば、siRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合により取り付けられてもよい。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは領域X-Yもしくは領域X-Y-Zを含むか、またはこれらからなる。一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。一部の態様では、領域Y内のヌクレオシド間連結はホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。一部の態様では、領域YにあるヌクレオシドはDNAヌクレオシドである。
【０２９４】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドのアプタマー領域は1個または複数個の立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む場合がある。この点に関して、修飾オリゴヌクレオチドは、立体選択的ヌクレオシド間連結、例えば、立体選択的ホスホロチオエート(phopshorotioate)ヌクレオシド間連結によって連結されたヌクレオシドの領域を含んでもよく、立体選択的でない領域をさらに含んでもよい。一部の態様では、領域Yは、立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間連結によって連結されたヌクレオシド領域を含むか、または立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間連結によって連結されたヌクレオシド領域である。立体選択的アプタマー配列を特定する(itentify)このアプローチの利点は、ユニークな立体選択的ヌクレオシド間連結モチーフのある分子の分子的特定を可能にする分子バーコード領域を修飾オリゴヌクレオチドがさらに含む可能性があることである(バーコードは特定の立体選択的ヌクレオシド間連結モチーフと関連付けられている)。この点に関して、修飾オリゴヌクレオチドの混合物は修飾オリゴヌクレオチドのライブラリーでもよく、それぞれの修飾オリゴヌクレオチドはユニークな立体選択的ヌクレオシド間連結モチーフと分子バーコードを含む。従って、ヌクレオチド配列の多様性の代わりに、またはヌクレオチド配列の多様性に加えて、修飾オリゴヌクレオチド間にあるアプタマー配列の多様性が立体選択的ヌクレオシド間連結モチーフのパターンによって作り出され得ると考えられる。
【０２９５】
ターゲティングコンジュゲートの発見:
上記の発見方法は、薬物カーゴを望ましい標的組織または標的細胞にターゲティングさせるコンジュゲート部分を特定するのに用いられる場合がある。一部の態様では、前記薬物カーゴは、siRNAおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む修飾オリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、LNAオリゴヌクレオチド、または2’-O-メトキシエチルオリゴヌクレオチドでもよい。前記方法は、後で他の薬物モダリティーに取り付けられ得るコンジュゲートを特定するのに使用することができる。この点に関して、修飾オリゴヌクレオチドは治療用オリゴヌクレオチド(または潜在的な治療用オリゴヌクレオチド)でもよく、他の薬物カーゴと後で使用するためのコンジュゲートを特定するのに用いられるツールオリゴヌクレオチドでもよい。
【０２９６】
共有結合により取り付けられた(コンジュゲートされた)バーコード付修飾オリゴヌクレオチドを配列決定することによって各コンジュゲート部分を特定できるように、前記方法は、コンジュゲート部分のライブラリーを一連のバーコード付修飾オリゴヌクレオチド(すなわち、修飾オリゴヌクレオチドは既知の配列を含む)にコンジュゲートする工程を伴う。次いで、バーコード付修飾オリゴヌクレオチドコンジュゲートのライブラリーが生物または細胞、例えば、哺乳動物、または細胞に投与され、適切な期間の後に(例えば、上記の方法を参照されたい)、コード付修飾オリゴヌクレオチドコンジュゲートの集団が細胞もしくは選択された細胞、または生物に由来する組織から単離され、修飾オリゴヌクレオチドが並列シークエンシング方法を用いて、例えば、本明細書に記載の方法に従って配列決定される。次いで、ユニークなバーコードの特定、一部の態様では、バーコード配列が特定される頻度を用いて、細胞、例えば、選択された細胞、または生物に由来する組織への取り込みを向上させるコンジュゲート部分を特定することができる。
【０２９７】
一部の態様では、例えば、コンジュゲート部分の発見用途の場合、集団内の修飾オリゴヌクレオチドは、PCRおよび/またはクローン増幅のためのプライマー結合部位を含む場合がある規定された配列である、すなわち、修飾オリゴヌクレオチドの集団内にある共通配列である5’領域(X’)と、分子バーコード領域を含む、5’領域の3’側に配置される領域(Y’)を含む。
【０２９８】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドの集団が共有する、さらなる共通配列を含む、さらなる領域(Z’)を含んでもよく、これは、PCRおよび/またはクローン増幅のためのプライマー結合部位を含む場合がある。3’プライマー結合部位領域を含めると直接のPCR増幅またはクローン増幅が可能になり、3’キャプチャープローブ連結なしで並列シークエンシングが可能になる。または、3’キャプチャープローブ連結が用いられる場合がある。適宜、異なるコンジュゲート部分のライブラリーが、任意で、リンカーおよび/または切断可能なリンカーを介して修飾オリゴヌクレオチドの5’領域にコンジュゲートされる。コンジュゲートを発見するために、修飾オリゴヌクレオチドは、3’末端2’糖修飾ヌクレオチドの領域、例えば、エキソヌクレアーゼ切断から領域X’および/またはZ’を保護する1個または複数個の2’-O-MOEヌクレオシドの領域(例えば、1個、2個、3個、4個、または4個の2’-O-MOEを含む領域)を含んでもよい。修飾オリゴヌクレオチドはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドでもよい。修飾オリゴヌクレオチドはsiRNA複合体の一部でもよく、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでもよい。
【０２９９】
ナノ粒子ターゲティングの発見:
上記の発見方法は、薬物カーゴを望ましい標的組織または標的細胞にターゲティングさせることができるナノ粒子を特製するのに用いられる場合がある。
【０３００】
それぞれのナノ粒子製剤がユニークなバーコード付オリゴヌクレオチドを含有し(すなわち、オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子を特定するのに使用できる既知の「バーコーディング」配列を含む)、その結果、ナノ粒子が含むバーコード付オリゴヌクレオチドを配列決定することによって、それぞれのナノ粒子が特定できるように、前記方法は、一連のユニークなバーコード付オリゴヌクレオチドを、ある範囲のナノ粒子製剤に製剤化する工程を伴う。バーコード付オリゴヌクレオチドはナノ粒子(例えば、カーゴ分子)の内部にあってもよく、(例えば、ナノ粒子の表面にある脂質に組み込まれた親油性コンジュゲートを介して)ナノ粒子製剤の一部を形成してもよい。
【０３０１】
オリゴヌクレオチドバーコード付ナノ粒子の集団は、製剤化されたら、バーコード付オリゴヌクレオチドナノ粒子のライブラリーを提供するようにプールされる場合があり、次いで、これが細胞、組織、または生物(例えば、哺乳動物)に投与される。
【０３０２】
次いで、本発明の並列シークエンシング方法は、標的細胞または標的組織へのナノ粒子送達レベルを確かめるのに用いられる場合がある。適宜、これは、標的細胞または標的組織からオリゴヌクレオチドを単離し、本発明の並列シークエンシング方法を実施して、それぞれのユニークなバーコード付オリゴヌクレオチドの含有量を求め、それによって、それぞれのナノ粒子製剤の送達効力を求めることによって実現する。
【０３０３】
代替的に述べると、本発明の方法において、ユニークなバーコード付修飾オリゴヌクレオチドナノ粒子のライブラリー(または集団)が生物または細胞、例えば、哺乳動物、または細胞に投与され、適切な期間の後に(例えば、上記の方法を参照されたい)、コード付修飾オリゴヌクレオチドの集団が細胞もしくは選択された細胞、または生物に由来する組織から単離され、修飾オリゴヌクレオチドが並列シークエンシング方法を用いて、例えば、本明細書に記載の方法に従って配列決定される。次いで、ユニークなバーコードの特定、一部の態様では、バーコード配列が特定される頻度を用いて、細胞、例えば、選択された細胞、または生物に由来する組織への取り込みを向上させるナノ粒子を特定することができる。
【０３０４】
次いで、標的細胞または標的組織を首尾良く標的とするナノ粒子は、薬物カーゴをターゲティングさせるのに用いられる場合がある。
【０３０５】
一部の態様では、バーコード付オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチド、例えば、2’糖修飾オリゴヌクレオチド、例えば、LNAまたは2’-O-MOE修飾オリゴヌクレオチドである。一部の態様では、バーコード付オリゴヌクレオチドはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。
【０３０６】
一部の態様では、前記薬物カーゴは、siRNAおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む修飾オリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、LNAオリゴヌクレオチド、または2’-O-メトキシエチルオリゴヌクレオチドでもよく、前記方法は、後で他の薬物モダリティーに取り付けられ得るナノ粒子を特定するのに使用することができる。この点に関して、修飾オリゴヌクレオチドは治療用オリゴヌクレオチド(または潜在的な治療用オリゴヌクレオチド)でもよく、他の薬物カーゴと後で使用するためのナノ粒子を特定するのに用いられるツールオリゴヌクレオチドでもよい。
【０３０７】
一部の態様では、例えば、ナノ粒子発見の用途の場合、ユニークなバーコード付オリゴヌクレオチドは、PCRおよび/またはクローン増幅のためのプライマー結合部位を含む場合がある規定された配列である、すなわち、修飾オリゴヌクレオチドの集団内にある共通配列である5’領域(X’)と、分子バーコード領域を含む、5’領域の3’側に配置される領域(Y’)を含む。
【０３０８】
一部の態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチド集団が共有する、さらなる共通配列を含む、さらなる領域(Z’)を含んでもよく、これは、PCRおよび/またはクローン増幅のためのプライマー結合部位を含む場合がある。3’プライマー結合部位領域を含めると直接のPCR増幅またはクローン増幅が可能になり、3’キャプチャープローブ連結なしで並列シークエンシングが可能になる。または、3’キャプチャープローブ連結が用いられる場合がある。適宜、異なるコンジュゲート部分のライブラリーが、任意で、リンカーおよび/または切断可能なリンカーを介して修飾オリゴヌクレオチドの5’領域にコンジュゲートされる。ナノ粒子を発見するために、修飾オリゴヌクレオチドは、3’末端2’糖修飾ヌクレオチドの領域、例えば、エキソヌクレアーゼ切断から領域X’および/またはZ’を保護する1個または複数個の2’-O-MOEヌクレオシドの領域(例えば、1個、2個、3個、4個、または4個の2’-O-MOEを含む領域)を含んでもよい。修飾オリゴヌクレオチドはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドでもよい。修飾オリゴヌクレオチドはsiRNA複合体の一部でもよく、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでもよい。
【０３０９】
本発明は、細胞における細胞取り込みが強化された修飾オリゴヌクレオチド配列を含むナノ粒子を特定するための方法であって、以下の工程:
i.ナノ粒子の集団を細胞に投与する工程であって、それぞれのナノ粒子が、ユニークな核酸塩基配列(バーコード)を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む、工程;
ii.ある期間の後に、細胞内から修飾オリゴヌクレオチドを単離する工程、
iii.工程(ii)で得られた修飾オリゴヌクレオチドを並列シークエンシングするために、本明細書に記載の態様または請求項のいずれか1つに記載の方法を実施する工程;
iv.細胞または細胞の集団に豊富にある1つまたは複数のナノ粒子製剤を特定する工程
を含む方法を提供する。
【０３１０】
前記方法はインビトロでもインビボでもよい。
【０３１１】
本発明は、哺乳動物の標的組織または標的細胞に豊富にある1つまたは複数のナノ粒子製剤を特定するための方法であって、以下の工程:
i.修飾オリゴヌクレオチドの混合物を哺乳動物に投与する工程であって、修飾オリゴヌクレオチドの混合物の各メンバーが、ユニークな核酸塩基配列を含み、修飾オリゴヌクレオチドの混合物の各メンバーが、異なるナノ粒子製剤に製剤化されている、工程;
ii.ナノ粒子に製剤化された修飾オリゴヌクレオチドを、例えば少なくとも6時間の期間にわたって、哺乳動物内で分散させる工程;
iii.望ましい標的組織または望ましい標的細胞を含む、哺乳動物に由来する1つまたは複数の組織または細胞から、修飾オリゴヌクレオチドの集団を単離する工程;
iv.修飾オリゴヌクレオチドの集団を並列シークエンシングする工程を含む、本明細書に記載の態様の請求項または態様のいずれか1つに記載の方法を実施する工程;
v.哺乳動物の望ましい標的組織または標的細胞に豊富にある修飾オリゴヌクレオチド配列を特定し、それによって、標的組織または標的細胞をターゲティングする1つまたは複数のナノ粒子製剤を特定する工程
を含む方法を提供する。
【０３１２】
一部の態様では、本発明の方法または使用は、細胞、例えば標的細胞または標的組織によって優先的に取り込まれるナノ粒子を特定するための方法または使用である。
【０３１３】
態様-本明細書において説明および主張される他の態様と組み合わされ得る本発明の例示的な態様を以下で説明する。
1. 以下の工程を含む、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列を配列決定するための方法:
(a)キャプチャープローブオリゴヌクレオチドを修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結する工程;
(b)キャプチャープローブからポリメラーゼを介した5’-3’第1鎖合成を行って、修飾オリゴヌクレオチドの相補鎖を含む核酸配列を生成する工程;
(c)工程(b)で得られた第1鎖合成産物のプライマーベース配列決定を行う工程。
2. 以下の工程を含む、修飾オリゴヌクレオチドの集団の塩基配列を並列シークエンシングするための方法:
(a)キャプチャープローブオリゴヌクレオチドを、修飾オリゴヌクレオチドの集団に存在する修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結する工程;
(b)キャプチャープローブからポリメラーゼを介した5’-3’第1鎖合成を行って核酸配列の集団を生成する工程であって、それぞれの核酸配列が、修飾オリゴヌクレオチドの集団に存在する修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の相補鎖を含む、工程;
(c)工程(b)で得られた第1鎖合成産物の集団のプライマーベース並列シークエンシングを行う工程。
3. キャプチャープローブが第1のプライマー結合部位を含み、第1鎖合成前に、第1鎖合成開始のために第1のプライマーがキャプチャープローブにハイブリダイズされる、態様1または2の方法。
4. キャプチャープローブがセルフプライミングキャプチャープローブである、態様1または2の方法。
5. 工程bの後かつ工程cの前に第1鎖合成産物がPCR増幅される、態様1〜4のいずれかの方法。
6. 工程(c)が、プライマーベース配列決定の前に、工程bの第1鎖合成産物または態様5のPCR増幅産物のいずれかのクローン増幅を含む、態様1〜5のいずれかの方法。
7. 3’キャプチャープローブを修飾オリゴヌクレオチドに連結した後かつ第1鎖合成の前に、連結産物が、例えばゲル精製を介してまたは連結されなかった3’キャプチャープローブの酵素的分解を介して、精製される、態様1〜6のいずれかの方法。
8. PCR工程がPCRプライマーペアを用いて行われ、PCRプライマーの1つが3’キャプチャープローブに特異的であり、第2のPCRプライマーが、修飾オリゴヌクレオチドに、例えば修飾オリゴヌクレオチドの5’領域に、特異的である、態様5〜7のいずれかの方法。
9. プライマーベース配列決定工程が、クローン増幅プライマーを用いた第1鎖合成工程(b)のクローン増幅を含み、クローン増幅プライマーの1つが3’キャプチャープローブに特異的であり、第2のクローン増幅プライマーが、修飾オリゴヌクレオチドに、例えば修飾オリゴヌクレオチドの5’領域に、特異的である、態様1〜8のいずれかの方法。
10. 第1鎖合成工程(b)の後または態様7の精製工程の後に、アダプタープローブが第1鎖合成産物の3’末端に連結される、態様1〜7のいずれかの方法。
11. PCR工程がPCRプライマーペアを用いて行われ、PCRプライマーの一方が3’キャプチャープローブに特異的であり、他方のPCRプライマーがアダプタープローブに特異的である、態様10の方法。
12. キャプチャープローブおよびアダプタープローブがクローン増幅プライマー結合部位を含み、配列決定工程が、態様10の第1鎖合成/アダプタープローブ連結産物または態様11のPCR増幅産物のクローン増幅を含む、態様10または11の方法。
13. クローン増幅プライマーが第1のPCRプライマーおよび第2のPCRプライマーに特異的であるか; またはクローン増幅プライマーが3’キャプチャープローブおよびアダプタープローブに特異的であるか; または、それぞれ、クローン増幅プライマーの一方がPCRプライマーの1つに特異的であり、他方のクローン増幅プライマーが3’キャプチャープローブもしくはアダプタープローブのいずれかに特異的である、態様12の方法。
14. 第1鎖合成工程(b)後に、第1鎖合成産物が3’末端で多核酸付加(ポリN)される、例えばポリアデニル化される、態様1〜7のいずれかの方法。
15. 第2の鎖が、相補的ポリ(N)配列を有するプライマー、例えばポリTプライマーを用いて合成される、態様14の方法。
16. 第2鎖合成プライマーが、PCRプライマー結合部位および/またはクローン増幅プライマー結合部位(またはフローセルプライマー結合部位)をさらに含む、態様15の方法。
17. PCR工程が、3’キャプチャープローブに特異的なプライマーと、第2鎖合成プライマーまたは第2鎖合成プライマーに特異的なPCRプライマーのいずれかとを用いて行われる、態様14〜16のいずれかの方法。
18. 配列決定工程がクローン増幅を含み、クローン増幅プライマーの1つが3’キャプチャープローブに特異的であり、第2のクローン増幅プライマーが第2鎖合成プライマーに特異的である、態様14〜17のいずれかの方法。
19. PCRプライマーが、クローン増幅プライマー結合部位、例えばフローセルキャプチャープローブ結合部位をさらに含み、配列決定工程が、クローン増幅プライマー結合部位に相補的なクローン増幅プライマー、例えばフローセル結合プライマーを用いたクローン増幅を含む、態様18の方法。
20. プライマーベース配列決定工程が、合成方法による配列決定を用いて行われる、態様1〜19のいずれかの方法。
21. プライマーベースの配列決定方法がサイクリックリバーシブルターミネーション法(CRT)である、態様1〜20のいずれかの方法。
22. 配列決定工程がクローン増幅を含み、クローン増幅プライマーが、固体支持体、例えばフローセルに結合しているか、またはエマルジョンドロップレット内に区画化されている、態様1〜21のいずれかの方法。
23. プライマーベース配列決定工程のクローン増幅工程が、
(a)固相増幅、例えば固相ブリッジ増幅、または
(b)エマルジョン相増幅、例えばドロップレットPCR
のいずれかを含む、態様22の方法。
24. プライマーベース配列決定が、並列シークエンシング、例えば超並列シークエンシングを用いて行われる、態様1〜23のいずれかの方法。
25. 第1鎖合成が、ポリメラーゼとポリエチレングリコールまたはプロピレングリコールとの存在下で行われる、態様1〜24のいずれかの方法。
26. 第1鎖合成に用いられるポリメラーゼが、TaqポリメラーゼもしくはVolcano2GポリメラーゼもしくはPrimeScript逆転写酵素、またはTaqポリメラーゼと少なくとも70％の同一性を有する有効なポリメラーゼである、態様1〜25のいずれかの方法。
27. 修飾オリゴヌクレオチドが、2’糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、例えばLNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたは2’-O-MOEホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、態様1〜26のいずれかの方法。
28. 修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも2個の連続した2’糖修飾ヌクレオシドを含む、態様1〜27のいずれかの方法。
29. 修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも1個の2’-O-メトキシエチルRNA(MOE)ヌクレオシドを含む、態様1〜28のいずれかの方法。
30. 修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも2個の連続した2’-O-メトキシエチルRNA(MOE)ヌクレオシドを含む、態様1〜29のいずれかの方法。
31. 修飾オリゴヌクレオチドが、該修飾オリゴヌクレオチドの3’に位置する少なくとも1個の2’-O-メトキシエチルRNA(MOE)ヌクレオシド、例えば該修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に位置する少なくとも2個または少なくとも3個の連続した2’-O-メトキシエチルRNA(MOE)ヌクレオシドを含む、態様1〜30のいずれかの方法。
32. 修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも1個のLNAヌクレオシドを含む、態様1〜31のいずれかの方法。
33. 修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも2個の連続したLNAヌクレオチドまたは少なくとも3個の連続したLNAヌクレオチドを含む、態様1〜32のいずれかの方法。
34. 修飾オリゴヌクレオチドが、LNAオリゴヌクレオチドの3’末端に位置する少なくとも1個のLNAヌクレオチド、例えば少なくとも2個のLNAヌクレオチドを含む、態様1〜33のいずれかの方法。
35. 修飾オリゴヌクレオチドがLNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、態様1〜34のいずれかの方法。
36. 修飾オリゴヌクレオチドが、LNAヌクレオシドとDNAヌクレオシドの両方、例えばLNAギャップマーまたはLNAミキシマーを含む、態様1〜35のいずれかの方法。
37. 修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも1個の2’糖修飾Tヌクレオシド、例えばLNA-Tヌクレオシド、または少なくとも1個の2’糖修飾Cヌクレオシド、例えばLNA-Cヌクレオシドを含む、態様1〜36のいずれかの方法。
38. 修飾オリゴヌクレオチドが、1つまたは複数のLNAヌクレオシドと、1つまたは複数の2’置換ヌクレオシド、例えば1つまたは複数の2’-O-メトキシエチルヌクレオシドとを含む、態様1〜37のいずれかの方法。
39. 修飾オリゴヌクレオチドが、2’-O-メトキシエチルギャップマー、ミックスドウイングギャップマー、オルタネイティングフランクギャップマー、またはLNAギャップマーからなる群より選択される、態様1〜38のいずれかの方法。
40. 修飾オリゴヌクレオチドがミキシマーまたはトータルマーである、態様1〜39のいずれかの方法。
41. 修飾オリゴヌクレオチドが、コンジュゲート基、例えばGalNAcコンジュゲートを含む、態様1〜40のいずれかの方法。
42. 修飾オリゴヌクレオチドが、アプタマーであるかまたはアプタマー配列を含む、態様1〜41のいずれかの方法。
43. 修飾オリゴヌクレオチドが、修飾オリゴヌクレオチドコンジュゲートの集団を含み、修飾オリゴヌクレオチドコンジュゲートの集団の各メンバーが、異なるコンジュゲート基を含む、態様1〜42のいずれかの方法。
44. 以下の工程を含む、細胞における細胞取り込みが強化された修飾オリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチド配列を特定するための方法:
(v)修飾オリゴヌクレオチドの集団を細胞に投与する工程であって、修飾オリゴヌクレオチドの集団の各メンバーが、ユニークな核酸塩基配列を含む、工程;
(vi)ある期間の後に、細胞内から修飾オリゴヌクレオチドを単離する工程;
(vii)態様2〜43のいずれかの方法を行って、工程(ii)で得られた修飾オリゴヌクレオチドを並列シークエンシングする工程;
(viii)細胞または細胞集団に豊富にある1つまたは複数の修飾オリゴヌクレオチド配列を特定する工程。
45. 細胞がインビトロである、態様44の方法。
46. 細胞がインビボである、態様44の方法。
47. 以下の工程を含む、哺乳動物の標的組織または標的細胞に豊富にある修飾オリゴヌクレオチド(配列)を特定するための方法:
(vi)修飾オリゴヌクレオチドの混合物を哺乳動物に投与する工程であって、修飾オリゴヌクレオチドの混合物の各メンバーが、ユニークな核酸塩基配列を含む、工程;
(vii)修飾オリゴヌクレオチドを該哺乳動物内で、例えば少なくとも6時間の期間にわたって、分散させる工程;
(viii)望ましい標的組織または望ましい標的細胞を含む、該哺乳動物に由来する1つまたは複数の組織または細胞から、修飾オリゴヌクレオチドの集団を単離する工程;
(ix)修飾オリゴヌクレオチドの集団を並列シークエンシングする工程を含む、態様2〜38のいずれかの方法を行う工程;
(x)該哺乳動物の望ましい標的組織または標的細胞に豊富にある修飾オリゴヌクレオチド配列を特定する工程。
48. 修飾オリゴヌクレオチドの集団の各メンバーが、異なる(ユニークな)分子バーコード配列を含む、態様44〜47のいずれかの方法。
49. 修飾オリゴヌクレオチドの集団の各メンバーが、異なるアプタマー配列を含む、態様44〜48のいずれかの方法。
50. 修飾オリゴヌクレオチドの集団の各メンバーが、異なるコンジュゲート部分を含む、態様44〜48のいずれかの方法。
51. 細胞、例えば標的細胞または標的組織によって優先的に取り込まれるアプタマーまたはアプタマー配列を特定するための方法である、態様49の方法。
52. 細胞、例えば標的細胞または標的組織によって優先的に取り込まれるコンジュゲート部分を特定するための方法である、態様50の方法。
【０３１４】
さらなる態様
本発明は以下の態様をさらに提供する:
態様1: 以下の工程を含む、2’糖修飾ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列を配列決定するための方法:
a. キャプチャープローブオリゴヌクレオチドを修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結する工程;
b. キャプチャープローブからポリメラーゼを介した5’-3’第1鎖合成を行って、修飾オリゴヌクレオチドの相補鎖を含む核酸配列を生成する工程;
c. アダプタープローブを、工程bで得られた第1鎖合成産物の3’末端に連結し、その後に、
- 工程c)で得られた連結産物のプライマーベース配列決定を行う工程;または
- 工程c)で得られた連結産物のPCR増幅を行い、PCR増幅産物のプライマーベース配列決定を行う工程。
態様2: 以下の工程を含む、2’糖修飾ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドの集団の塩基配列を並列シークエンシングするための方法:
a. キャプチャープローブオリゴヌクレオチドを修飾オリゴヌクレオチドの集団に存在する修飾オリゴヌクレオチドの3’末端に連結する工程;
b. キャプチャープローブからポリメラーゼを介した5’-3’第1鎖合成を行って核酸配列の集団を生成する工程であって、それぞれの核酸配列が、修飾オリゴヌクレオチドの集団に存在する修飾オリゴヌクレオチドの塩基配列の相補鎖を含む、工程;
c. アダプタープローブを、工程bで得られた第1鎖合成産物の3’末端に連結し、
その後に、
- 工程c)で得られた連結産物のプライマーベース並列シークエンシングを行う工程;または
- 工程c)で得られた連結産物のPCR増幅を行い、PCR増幅産物のプライマーベース並列シークエンシングを行う工程。
2. キャプチャープローブが第1のプライマー結合部位を含み、第1鎖合成前に、第1鎖合成開始のために第1のプライマーがキャプチャープローブにハイブリダイズされる、態様1または2の方法。
3. キャプチャープローブがセルフプライミングキャプチャープローブである、態様1または2の方法。
4. キャプチャープローブおよびアダプタープローブがクローン増幅プライマー結合部位を含み、配列決定工程が、工程cで得られた連結産物またはPCR増幅産物のクローン増幅を含む、態様1〜4のいずれかの方法。
5. PCR増幅工程がPCRプライマーペアを用いて行われ、PCRプライマーの一方がキャプチャープローブオリゴヌクレオチドに特異的であり、他方がアダプタープローブに特異的である、態様1〜5のいずれかの方法。
6. PCR増幅プライマーがクローン増幅プライマー結合部位を含み、プライマーベース配列決定工程がPCR増幅産物のクローン増幅を含む、態様6の方法。
7. クローン増幅プライマーが第1のPCRプライマーおよび第2のPCRプライマーに特異的であるか; またはクローン増幅プライマーが3’キャプチャープローブおよびアダプタープローブに特異的であるか; または、それぞれ、クローン増幅プライマーの一方がPCRプライマーの1つに特異的であり、他方のクローン増幅プライマーが3’キャプチャープローブもしくはアダプタープローブのいずれかに特異的である、態様1〜5のいずれかの方法。
8. プライマーベース配列決定工程が合成方法による配列決定を用いて行われる、態様1〜8のいずれかの方法。
9. プライマーベース配列決定方法がサイクリックリバーシブルターミネーション法(CRT)である、態様1〜9のいずれかの方法。
10. 配列決定工程がクローン増幅を含み、クローン増幅プライマーが、固体支持体、例えばフローセルに結合しているか、またはエマルジョンドロップレット内に区画化されている、態様1〜10のいずれかの方法。
11. プライマーベース配列決定工程のPCR工程が、
a. 固相増幅、例えば固相ブリッジ増幅、または
b. エマルジョン相増幅、例えばドロップレットPCR
を含む、態様1〜11のいずれかの方法。
12. プライマーベース配列決定が、並列シークエンシング、例えば超並列シークエンシングを用いて行われる、態様1〜12のいずれかの方法。
13. 第1鎖合成がポリメラーゼとポリエチレングリコールまたはプロピレングリコールの存在下で行われる、態様1〜13のいずれかの方法。
14. 第1鎖合成に用いられるポリメラーゼが、TaqポリメラーゼもしくはVolcano2GポリメラーゼもしくはPrimeScript逆転写酵素、またはTaqポリメラーゼと少なくとも70％の同一性を有する有効なポリメラーゼである、態様1〜14のいずれかの方法。
15. 修飾オリゴヌクレオチドが、2’糖修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、例えばLNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたは2’-O-MOEホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、態様1〜15のいずれかの方法。
16. 修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも2個の連続した2’糖修飾ヌクレオシドを含む、態様1〜16のいずれかの方法。
17. 修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも1個の2’-O-メトキシエチルRNA(MOE)ヌクレオシドを含む、態様1〜17のいずれかの方法。
18. 修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも2個の連続した2’-O-メトキシエチルRNA(MOE)ヌクレオシドを含む、態様1〜18のいずれかの方法。
19. 修飾オリゴヌクレオチドが、該修飾オリゴヌクレオチドの3’に位置する少なくとも1個の2’-O-メトキシエチルRNA(MOE)ヌクレオシド、例えば該修飾オリゴヌクレオチドの3’に位置する少なくとも2個または少なくとも3個の連続した2’-O-メトキシエチルRNA(MOE)ヌクレオシドを含む、態様1〜19のいずれかの方法。
20. 修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも1個のLNAヌクレオシドを含む、態様1〜20のいずれかの方法。
21. 修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも2個の連続したLNAヌクレオチドまたは少なくとも3個の連続したLNAヌクレオチドを含む、態様1〜21のいずれかの方法。
22. 修飾オリゴヌクレオチドが、LNAオリゴヌクレオチドの3’に位置する少なくとも1個のLNAヌクレオチド、例えば少なくとも2個のLNAヌクレオチドを含む、態様1〜22の方法。
23. 修飾オリゴヌクレオチドがLNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、態様1〜23のいずれかの方法。
24. 修飾オリゴヌクレオチドが、LNAヌクレオシドとDNAヌクレオシドの両方、例えばLNAギャップマーまたはLNA ミキシマーを含む、態様1〜24のいずれかの方法。
25. 修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも1個の2’糖修飾Tヌクレオシド、例えばLNA-Tヌクレオシドまたは少なくとも1個の2’糖修飾Cヌクレオシド、例えばLNA-Cヌクレオシドを含む、態様1〜25のいずれかの方法。
26. 修飾オリゴヌクレオチドが、1つまたは複数のLNAヌクレオシドと、1つまたは複数の2’置換ヌクレオシド、例えば1つまたは複数の2’-O-メトキシエチルヌクレオシドとを含む、態様1〜26のいずれかの方法。
27. 修飾オリゴヌクレオチドが、2’-O-メトキシエチルギャップマー、ミックスドウイングギャップマー、オルタネイティングフランクギャップマー、またはLNAギャップマーからなる群より選択される、態様1〜27のいずれかの方法。
28. 修飾オリゴヌクレオチドがミキシマーまたはトータルマーである、態様1〜27のいずれかの方法。
29. 修飾オリゴヌクレオチドが、コンジュゲート基、例えばGalNAcコンジュゲートを含む、態様1〜29のいずれかの方法。
30. 修飾オリゴヌクレオチドの集団、例えば1つのオリゴヌクレオチド合成バッチまたは複数のオリゴヌクレオチド合成バッチのプールにおける純度または不均一性の程度を確かめるためのものである、態様1〜30のいずれかの方法。
31. 修飾オリゴヌクレオチドの配列、または修飾オリゴヌクレオチドの集団、例えば修飾オリゴヌクレオチド合成バッチもしくは複数のオリゴヌクレオチド合成バッチのプールに存在する優勢な配列を決定するためのものである、態様1〜31のいずれかの方法。
32. 修飾オリゴヌクレオチドが、修飾オリゴヌクレオチドの集団、例えば同じオリゴヌクレオチド合成操作[もしくはバッチ]またはオリゴヌクレオチド合成操作[もしくはバッチ]のプールからの修飾オリゴヌクレオチドの集団である、態様1〜32のいずれかの方法。
33. 2’糖修飾オリゴヌクレオチドの集団の核酸塩基配列を配列決定するための、プライマーベース配列決定の使用。
34. 2’糖修飾オリゴヌクレオチドの合成または製造操作の産物の不均一性を確かめるための、プライマーベース配列決定の使用。
35. 2’糖修飾オリゴヌクレオチドの合成または製造操作の産物の品質を確かめるための、プライマーベース配列決定の使用。
36. 2’糖修飾オリゴヌクレオチドの集団の核酸塩基配列を配列決定するための、並列シークエンシングの使用。
37. 2’糖修飾オリゴヌクレオチドの合成または製造操作の産物の品質を確かめるための、並列シークエンシングの使用。
38. 2’糖修飾オリゴヌクレオチドの合成または製造操作の産物の不均一性を確かめるための、並列シークエンシングの使用。
39. 2’糖修飾オリゴヌクレオチドの集団の核酸塩基配列を配列決定するための、合成配列決定による配列決定の使用。
40. 2’糖修飾オリゴヌクレオチドの合成または製造操作の産物の不均一性を確かめるための、合成による配列決定の使用。
41. 2’糖修飾オリゴヌクレオチドの合成または製造操作の産物の品質を確かめるための、合成による配列決定の使用。
42. 2’糖修飾オリゴヌクレオチドが、態様1〜33のいずれか一つにおいて定義された通りである、態様34〜42のいずれかの使用。
43. LNA修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたは2’-O-メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含むテンプレートから第1鎖合成するための、Taqポリメラーゼ、またはSEQ ID NO 1と少なくとも70％の同一性を有するポリメラーゼ酵素の使用。
【実施例】
【０３１５】
ヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチド、例えば、LNAオリゴヌクレオチドを配列決定できるようにするために、本発明者らは、LNAオリゴヌクレオチド全体の端から端まで効率的に読み取ることができるポリメラーゼを必要とする。本発明者らは、ある特定のポリメラーゼだけがこれを行うことができ、一部のポリメラーゼについては、ある特定の添加物が存在するとヌクレオシド修飾オリゴヌクレオチドの端から端まで読み取る効力が高まることを明らかにした。ここで、本発明者らは好ましいポリメラーゼを明らかにし、ポリメラーゼが試験LNAオリゴヌクレオチドの端から端まで読み取るのを可能にするPCR反応用添加物を発見した。
【０３１６】
実施例1:LNAオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ読み取り効率を試験するための試験分子の作製
LNAオリゴヌクレオチドの端から端まで読み取る様々なポリメラーゼの能力を試験できるようにするために、本発明者らは、ホスホロチオエート骨格をもつ>20bpの通常DNA塩基の5’側と3’側の両方に、ホスホロチオエート骨格をもつLNAオリゴヌクレオチド(12塩基対)が隣接する一本鎖試験テンプレート分子を作製した(図1Aを参照されたい)。これを「LNA試験テンプレート1」(LTT1)と名付けた。後の様々な実験に、このテンプレート分子を使用した。このLNAオリゴ試験分子と並行して、本発明者らは、12塩基対が同じ配列からなるが、全ての塩基がDNAであり、骨格がホスホジエステルである同じ試験テンプレートも作製した。このテンプレートを「DNA試験テンプレート1」(DTT1)と呼び、対照オリゴとした。これらのテンプレートを、これらの分子の5’末端および3’部分にプライマーが配置される後の実験に使用した。PCR反応が発生するためには、ポリメラーゼは、プライマーを、ホスホジエステル骨格ならびに5’通常DNA部分を含有するテンプレート部分の端から端まで全体にわたって延長できなければならない。従って、このLTT1分子は、ポリメラーゼがLNAオリゴをコピーする能力を試験するのに役立つ。
【０３１７】
LTT1およびDTT1を以下の通りに作製した。
【０３１８】
以下のオリゴを合成した(LNA O1)、またはIDTから取り寄せた(DNA O1)。
2021522808.tif 000006
小文字はDNAヌクレオシドであり、大文字はβ-D-オキシLNAヌクレオシドであり、mC=5メチルシトシンβ-D-オキシLNAヌクレオシドであり、下付き文字o=ホスホジエステルヌクレオシド間連結、下付き文字s=ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。LNA O1は図1AではLTT1で図示され、DNA O1は図1AではDTT1で図示される。
【０３１９】
これらのオリゴを以下のDNAキャプチャープローブ(DCP1)に連結した。
2021522808.tif 000007
(全てのヌクレオシドはホスホジエステル連結DNAヌクレオシドである;「/5Phos/」は5’リン酸基を示す;/iSp18/は18原子ヘキサエチレングリコールスペーサーを示す;/3AmMO/は3’アミノモディファイヤーを示す)。配列表では、本明細書において開示されるプローブの塩基配列は、指定された修飾なしで示され、場合によってはRNA塩基はDNA塩基で示されることに留意のこと-矛盾がある場合には、配列表中の開示よりも、実施例にある配列および配列の修飾が優先される。
【０３２０】
連結反応:
以下の連結反応:
a:2ulのH2O+2ulのDCP1(100uM)
b:2ulのLNAO1(10uM)+2ulのDCP1(100uM)
c:2ulのLNAO1(10uM)+2uLのDCP1(100uM)
をPCRチューブ内でセットアップした。
【０３２１】
混合物を55Cで3分間加熱し、次いで、4Cまで冷却した。
【０３２２】
各チューブに以下:
2ulのT4 DNAリガーゼ緩衝液(Thermo Scientific)
6ulのPEG (50％)
6ulのH20
2ulのT4 DNAリガーゼ(Thermo Scientific)
を添加した。
【０３２３】
混合物をボルテックスし、連結を以下の条件で3Xサイクル(16C;20分、25;10分、37C;1分)、次いで、75C10分行い、次いで、4Cに保った。
【０３２４】
ゲル電気泳動:
上述した各反応には等量の2xNovex(登録商標)TBE-Urea Sample Buffer (Thermo Fisher Scientific)が添加されている。試料を95℃で2分間熱変性し、氷上に置いた。このように調製された試料15μlをNovex(登録商標)TBE-Urea Gels, 15％, 15ウェル(Thermo Fisher Scientific)にロードし、電気泳動を180Vの一定電圧で75分間行った。DNAをSYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain(Thermo Scientific)を用いて10分間染色した。ゲルをBlue Trayの上に置いてChemiDoc Touch Imaging System(Bio Rad)を用いて視覚化した(図1Bを参照されたい)。
【０３２５】
DCP1と上記のオリゴヌクレオチドとの連結産物を含有するバンドをゲルから切断した。ゲル断片を砕き、500ulのTE緩衝液に一晩浸漬し、連結されたオリゴを抽出した。浸漬後に、連結されたオリゴを洗浄し、Amicon(登録商標)Ultra-0.5 Ultracel-3メンブレン, 3kDaカラムを用いて濃縮した。2種類のテンプレートオリゴ(LTT1およびDTT1)の濃度をナノドロップ(nanodrop)で測定し、同じ濃度に正規化した。
【０３２６】
実施例2:LNAオリゴ含有テンプレートに対する標準的なPCR増幅は不可能である
LTT1、DTT1、およびキャプチャープローブ(DCP1)を、QX200(商標)ddPCR(商標)EvaGreen Supermixを用いて行った標準的なエマルジョンPCR反応においてテンプレート分子として使用した。ドロップレットを、Automated Droplet Generation Oil for EvaGreenを使用してAutoDG(BioRad)で作製した。PCRサイクリング後にドロップレットをQX200 droplet reader(BioRad)で読み取った。
【０３２７】
PCR反応を、DCP1特異的プライマー
2021522808.tif 000008
と、LTT1およびDTT1の5’末端に結合するフォワードプライマー
2021522808.tif 000009
を用いてセットアップした。追加の標準的なTaqポリメラーゼ(New England Biolabs)を添加する第2の反応も行った。これは、標準的なTaqを添加することでLTT1の読み取りが改善するかどうか調べるために行った。
【０３２８】
22ulのPCR反応セットアップ:
2021522808.tif 000010
【０３２９】
結果:
図2パネルAは、6つの異なるPCR反応におけるドロップレットの蛍光強度の1Dプロットを示す。多くのポジティブドロップレットが現れるので、DTT1テンプレートのPCR増幅は可能だということがはっきりと分かる。しかしながら、本発明者らは、LTT1またはDCP1を用いたPCR反応ではポジティブドロップレットを認めなかったか、またはごくわずかなポジティブドロップレットしか認めなかった。標準的なTaqポリメラーゼを余分に添加しても同じ結果が認められた。このことは、Taqポリメラーゼが、ホスホロチオエート骨格をもつLNA含有オリゴの端から端まで全体にわたってほとんど読み取ることができないことを示している。
【０３３０】
実施例3:LTT1の1鎖合成アッセイにおける様々な酵素の能力を試験する
Taqポリメラーゼは通常条件下でLTT1テンプレートの端から端まで読み取ることができないので、本発明者らは、逆転写酵素(RT)がLNAオリゴ区間の端から端まで読み取ることができるかどうか調べるために多数の市販の逆転写酵素(RT)ポリメラーゼを試験した。これは、プライマーとしてDCP1_プライマー1を用いて様々なポリメラーゼがLTT1をコピーしようと試みる1鎖コピー反応をセットアップすることによって行った。次に、生成されたインタクトなLTT1の1鎖コピーの量を、実施例2に記載のようにDCP1_プライマー1およびTT1_プライマー1を用いてddPCR反応で試験した。図3は、以下の6種類のポリメラーゼ:AgilentのAccuScript Hi-Fi逆転写酵素、Thermo ScientificのSuperScript IV逆転写酵素200U/ul、MyPolsのVolcano2G DNAポリメラーゼ5U/ul、Thermo ScientificのRevertAid逆転写酵素 200U/ul、New England BioLabsのAMV逆転写酵素10Units/ul、TakaraのPrimeScript逆転写酵素(PrimeScript RT Reagent Kit)を試験した結果を示す。
【０３３１】
10ulの1鎖合成反応:
全反応が、(1ulのLTT1(31pM)、0.5ulのDCP1_プライマー1(10uM)、および水添加10ulを含んだ。様々な酵素を、ベンダーから供給された緩衝液を用いて操作した。
a)1ulのAccuscript、1ulの0.1M DTT、1ulの緩衝液、1ulのdNTP(10mM)
b)0.5ulのSuperScript IV、0.5ulの0.1M DTT、2ulのfirst strand buffer、1ulのdNTP(10mM)
c)0.2ulのVulcano2G、2ulのVulcano緩衝液、1ulのdNTP(10mM)
d)0.5ulのRevertAid、2ulのReaction Buffer、1ulのdNTP(10mM)
e)0.5ulのAMV、0.5ulの0.1M DTT、2ulのcDNA合成緩衝液、1ulのdNTP(10mM)
f)0.5ulのPrimeScript、2ulのPrimeScript Buffer、1ulのdNTP(10mM)
【０３３２】
酵素以外の全ての成分を添加し、混合物を65Cまで5分間加熱し、次いで、氷上に1分間置いた後、最後にRT酵素を添加した。1鎖合成を、各条件について以下の温度(55C、54.2C、52.5C、50C、47.1C、44.6C、42.9C、42C)で1時間行った。次いで80C10分、冷却し、4Cに保った。
【０３３３】
全ての1鎖反応を水で200x希釈し、実施例2に記載のように通常のQX200(商標)ddPCR(商標)EvaGreen Supermix PCR反応のインプットとして2ulの試料を使用した。2ulのLTT1(15.5fM)、DTT1(15.5fM)、またはH2Oを負の対照および正の対照として含めた。15.5fMのインプット2ulは、1鎖合成工程から添加されたLTT1分子の数に相当する。
【０３３４】
結果:
図3は、異なるPCR反応におけるドロップレットの蛍光強度を示す。42C RT反応からの結果だけを図に示した。他の温度の結果は、AMVで認められたごくわずかな活性が52.5C超で失われた以外は各条件について同じであった。本発明者らは、RT酵素には、概して、LTT1テンプレートの端から端まで読み取る能力がないか、または極めて低い効率を示すことを確認した。しかしながら、本発明者らは、Vulcano2Gがテンプレートを読み取る効率がかなり大きいようであることを見出した。同数のインプット分子を用いたDTT1テンプレートに対するddPCRと比較してドロップレット数を定量すると、Vulcano2G酵素の読み取り効率は約10％であることが分かった。これは、Vulcano2G酵素によって10個のLLT1分子のうち1個が端から端まで全体にわたって転写されることを意味する。本発明者らは、AMVおよびPrime Script酵素については約0.1％の効率を認めた。
【０３３５】
実施例4:DNAポリメラーゼによるLNAオリゴ読み取りを可能にするPCR添加物の試験
ポリメラーゼを用いてLNAオリゴを端から端まで転写する上での困難を克服するために、本発明者らは、ポリメラーゼがLTT1中にあるLNAオリゴの端から端まで読み取るのをPCR反応中にある添加物が助けることができるかどうか試験し始めた。本発明者らは、LNAオリゴを読み取る上で有益な効果があるかどうか調べるために4種類の既知の(know)PCR添加物、すなわち、テトラメチルアンモニウム(TMA)クロリド、ポリエチレングリコール(PEG)、塩化アンモニウム、および1,2-プロパンジオール(propandiol)を試験した。添加物を、エマルジョンPCR反応において、改良TaqPolymeraseを含有するAccuStart II PCR ToughMix(QuantiBio)を用いて試験した。ドロップレットをAutoDG(BioRad)でAutomated Droplet Generation Oil for EvaGreenを用いて作製した。PCRサイクリング後にドロップレットをQX200 droplet reader(BioRad)で読み取った。別々のEvaGreen色素 (Biotiumカタログ番号31000)をPCR反応に添加した。
【０３３６】
ddPCR反応のために以下の添加物(addites)を試験した:
TMA(1mM、5mM、10mM、20mM、40mM、60mM、80mM、100mM)、PEG(0％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％)、塩化アンモニウム(1mM、5mM、10mM、20mM、40mM、60mM、80mM、100mM)、1,2-プロパンジオール(0.2M、0.4M、0.6M、0.8M、1M、1.2M、1.6M、2M)。
【０３３７】
PCR反応混合物(22ul):
11ulのAccuStart II PCR ToughMix
0.2ulのTT1_プライマー1(10uM)
0.2ulのDCP1_プライマー1(10uM)
0.5ulのEvaGreen色素(40x)
XulのPCR添加物
2ulのLTT1(100fM)
H2O 22uLまで添加(H2O ad 22uL)
2021522808.tif 000011
【０３３８】
結果:
図4は、添加物があるddPCRの結果を示す。結果を、全てのドロップレットの蛍光(Florence)強度を示した1Dプロットとして示した。結果から、TMAクロリドと塩化アンモニウムはLNA読み取りを全く改善しなかったことが分かった(図4パネルAおよびC)。しかしながら、本発明者らは、PEG濃度を増やすとポジティブドロップレット量が増加することを認めた。プラスの効果は3％PEGから開始し、4％と5％の両方について増加した(図4パネルB)。本発明者らはまた1,2-プロパンジオール添加時でもプラスの効果を観察した。本発明者らは、約0.8Mの1,2-プロパンジオールから開始してポジティブドロップレット量が増加するのを認めた(図4パネルD)。1.2-プロパンジオール濃度を1.2M超に増やすとポジティブドロップレットは少し増加したが、ポジティブドロップレットの蛍光強度の減少も起きた。まとめると、本発明者らは、PEGまたは1,2-プロパンジオールを添加すると、Taqポリメラーゼは、ホスホロチオエート骨格をもつLNAオリゴの端から端まで読み取る能力を激増させると結論づけた。図4パネルEは、検出したLTT1分子の濃度を示す。このことから、PEGはLTT1検出を明らかに増やし、LTT1テンプレートを読み取る、いくらかの増加した能力を与える1.2-プロパンジオールと比較して優れた添加物であることが分かる。
【０３３９】
本発明者らはPEGのプラスの効果の飽和を認めなかったので、同じセットアップを用いるが、反応物中のPEG濃度をさらに増やした第2の実験を実施した(図4パネルF)。PEG濃度を9％超に増やした時に、本発明者らは、ポジティブドロップレット数が同じであるがドロップレットが崩壊し始めることを認め始めた。PEG濃度が15％の時に、本発明者らはドロップレットが完全に崩壊したことを認めた。最後に、本発明者らは、PEGと1,2-プロパンジオールの組み合わせによってオリゴ読み取りがさらに増加するかどうか試験した。図4パネルGは、9％PEGと0M、0.5M、1.0M、または1.5Mの1.2-プロパンジオールを用いたddPCR反応を示す。これから、反応をさらに向上させるために1.2-プロパンジオールを一緒に添加することで、はっきりした利益は認められなかったことが分かる。概して、本発明者らは、PEG量が6％超の時に追加の1.2-プロパンジオールをddPCR反応に添加する利益を認めなかった(データ示さず)。
【０３４０】
実施例5:PEGおよび/または1.2-プロパンジオールを用いると、一部のDNAポリメラーゼがLNAオリゴを読み取ることが可能になる
実施例4では、本発明者らは、開示されていない改良Taqポリメラーゼを含有するAccustart II PCR though mix(QuantaBio)を使用した時にPEGと1.2-プロパンジオールの添加がLTT1テンプレート分子増幅の成功に有益なことを示した。PCR添加物が他のポリメラーゼのLNAオリゴ「読み取り」も可能にするかどうか調べるために、本発明者らは、LTT1テンプレートの1鎖合成を複数回行うことで通常のTaqポリメラーゼとHigh fidelity Polymerase(Phusionポリメラーゼ, Thermo Scientific)を試験した。実験2、3、4で行ったように、生成したインタクトな1鎖コピーの数をEvagreen ddPCR検出によって検出した。以下の20ulの反応をセットアップし、0回、1回、3回、5回、および10回の1鎖増幅を用いて行った。
a)0.1ulのTaqポリメラーゼ、2ulのTaq緩衝液、0.4ulのDCP1_プライマー1(10uM)、0.4ulのLTT1(10pM)
b)0.1ulのTaqポリメラーゼ、2ulのTaq緩衝液、0.4ulのDCP1_プライマー1(10uM)、0.4ulのLTT1(10pM)、0.5ulの1.2-プロパンジオール、4ulのPEG(50％)
c)2ulのTaq緩衝液、0.4ulのDCP1_プライマー1(10uM)、0.4ulのLTT1(10pM)、0.5ulの1.2-プロパンジオール、4ulのPEG(50％)
d)0.2ulのPhusionポリメラーゼ、5xHF緩衝液、0.4ulのDCP1_プライマー1(10uM)、0.4ulのLTT1(10pM)
e)0.2ulのPhusionポリメラーゼ、5xHF緩衝液、0.4ulのDCP1_プライマー1(10uM)、0.4ulのLTT1(10pM)、0.5ulの1.2-プロパンジオール、4ulのPEG(50％)
f)0.2ulのPhusionポリメラーゼ、5xGF緩衝液、0.4ulのDCP1_プライマー1(10uM)、0.4ulのLTT1(10pM)
g)0.2ulのPhusionポリメラーゼ、5xGF緩衝液、0.4ulのDCP1_プライマー1(10uM)、0.4ulのLTT1(10pM)、0.5ulの1.2-プロパンジオール、4ulのPEG(50％)
1鎖反応(reaktion)。(95℃5分;52.5 3分、95℃30秒(sek)のXサイクル;次いで、氷上)
【０３４１】
1鎖合成反応を50x希釈し、実施例2に記載のようにEvagreen ddPCR反応のインプットとして2ulを使用した。
【０３４２】
結果:
図5は、1鎖合成した時のddPCR反応の結果を示す。図5パネルAは、PCR添加物なしで1鎖Taqポリメラーゼ合成した時のddPCR反応を示す。これから分かるように1鎖合成サイクリングの結果としてポジティブドロップレット数はほとんど増加しない。この場合も、Taqポリメラーゼは通常条件下では、ホスホロチオエート骨格とLNA塩基を含有するオリゴの端から端まで読み取ることができないことを示している。図5パネルCは、同じ反応であるが、Taqポリメラーゼが存在しない反応を示す。Taqポリメラーゼ(polymerse)が存在しない1鎖反応におけるポジティブドロップレットの数は、添加物がない反応とほぼ同じである。このことから、ポジティブドロップレットの大部分が、Evagreen ddPCR反応中に生じ、1鎖合成中は生じないLNAテンプレートコピーに由来することが分かった。図5パネルBは、1鎖合成反応中に10％PEGと0.31Mが存在した時のddPCR反応の結果を示す。これから分かるように、ポジティブドロップレット数は1鎖合成サイクルの回数と共に増加する。このことから、添加物があると、標準的なTaqポリメラーゼはLTT1のLNAオリゴ部分の端から端まで読み取ることが可能になると証明される。図5パネルEおよびFは、10％PEGと0.31M 1.3-プロパンジオール添加物を含む、および含まないHF緩衝液中でphusion DNAポリメラーゼを用いて1鎖合成反応した時のddPCRを示す。これは、PEGと1.2-プロパンジオールの添加および緩衝液HFまたはGF緩衝液の使用に関係なくPhusionポリメラーゼがLTT1のLNAオリゴヌクレオチド部分の端から端まで読み取ることができないことを示している。図5パネルDは、7種類の試験条件を対象にした、検出されたLTT1コピー数の定量を示す。Taqポリメラーゼと添加物を用いた反応でしか分からないように、本発明者らはLTT1テンプレート分子の効果的な1鎖コピーを認めた。本発明者らは、これらの試験PCR添加物(PEGおよび1.2-プロパンジオール)が存在すると、一部のDNAポリメラーゼがLNAオリゴの端から端まで読み取ることが可能になると結論づけた。
【０３４３】
実施例6:LNAオリゴヌクレオチドのNGS配列決定
完全ホスホロチオエート骨格をもつLNAオリゴヌクレオチドの配列決定が可能なことを例示するために、本発明者らは、5種類のLNAオリゴヌクレオチドの混合物を配列決定する以下の方法を使用した。配列決定は、1鎖合成中にPEGを添加して、および添加せずに通常のTaq DNAポリメラーゼとVulcano2Gポリメラーゼ(myPOLS)の両方を用いて行った。
【０３４４】
以下のLNAオリゴを1:1比で混合し、それぞれ1uMの最終濃度まで希釈した:
LNA混合物:
2021522808.tif 000012
【０３４５】
キャプチャープローブ:
2021522808.tif 000013
【０３４６】
キャプチャープローブRTプライマー:
2021522808.tif 000014
【０３４７】
1.連結反応:
2ulのLNAミックスを2ulのキャプチャープローブインデックス1(10uM)と混合した
2ulのLNAミックスを2ulのキャプチャープローブインデックス2(10uM)と混合した
2ulのLNAミックスを2ulのキャプチャープローブインデックス3(10uM)と混合した
2ulのLNAミックスを2ulのキャプチャープローブインデックス4(10uM)と混合した
【０３４８】
混合物を55Cまで加熱し、次いで、4Cまで冷却した。
【０３４９】
16ulの連結混合物を各チューブに添加した:
20ulの反応につき:(2ulのT4連結緩衝液、6ulのPEG、6ulのH2O、2ulのT4リガーゼ)
【０３５０】
ゲル電気泳動:
上述した各反応物に等量の2xNovex(登録商標)TBE-Urea Sample Buffer(Thermo Fisher Scientific)を添加し、試料を95℃で2分間熱変性し、氷上に置いた。このように調製された試料15μlをNovex(登録商標)TBE-Urea Gels, 15％, 15ウェル(Thermo Fisher Scientific)にロードし、電気泳動を180Vの一定電圧で75分間行った。DNAをSYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain(Thermo Scientific)を用いて10分間染色した。ゲルをBlue Trayの上に置いてChemiDoc Touch Imaging System(Bio Rad)を用いて視覚化した(図6Aを参照されたい)。
【０３５１】
キャプチャープローブとオリゴヌクレオチドとの連結産物を含有するバンドをゲルから切断した。切断領域を図6Aに赤色の枠で示した。ゲル断片を砕き、500ulのTE緩衝液に一晩浸漬し、連結されたオリゴを抽出した。浸漬後に、連結されたオリゴを洗浄し、Amicon Ultra 0.5mL centrifugal MW CO 3 kDaフィルターを用いて濃縮した。最後に、試料をspeedvacを用いて約10ulまで濃縮した。
【０３５２】
1鎖合成および精製:
4つ異なるプロトコールを使用して、連結されたLNAオリゴの1鎖コピーを生成した。
2021522808.tif 000015
【０３５３】
1鎖合成を、サーモサイクラー(thermocycler)で以下のプログラム:
95C;3分10x(55C;5分、72C;1分)を使用して行い、次いで、4Cに保った。
【０３５４】
1鎖合成反応物を、Monarch(登録商標)PCR & DNA Cleanup Kit(New England Biolabs)を使用し、製造業者のオリゴヌクレオチドクリーンアッププロトコールを用いて精製した。試料を10ulの溶出緩衝液に溶出した。
【０３５５】
2.連結反応:
2021522808.tif 000016
【０３５６】
8ulの1鎖合成反応物を2ulのキャプチャープローブ2(1uM)と混合した。
【０３５７】
次いで、混合物を55Cまで加熱し、次いで、4Cまで冷却した。
【０３５８】
16ulの連結混合物を各チューブに添加した:
20ulの反応につき:(2ulのT4連結緩衝液、6ulのPEG、6ulのH2O、2ulのT4リガーゼ)。連結:2X(4C;2分、16C;2時間、22C5分)75C;10分、次いで、4Cに保った。
【０３５９】
NGSライブラリーのPCR増幅:
2021522808.tif 000017
【０３６０】
連結された1鎖合成のPCR増幅を、phusion DNAポリメラーゼ(polymease)とNGS_PCR_プライマー1および2を用いて行った。これらのプライマーは、illuminas TruSeq NGSプロトコールと適合する5’オーバーハングを含む。
2021522808.tif 000018
【０３６１】
PCRサイクリング:98C;30秒、15x(98C;15秒、60C;20秒、72C;20秒)、72 5分次いで、4Cに保った。
【０３６２】
PCR産物をQIAquick PCR purification kit(Qiagen)で製造業者の説明書に従って精製し、30ulのH2Oに溶出した。
【０３６３】
NGSセットアップ:
4種類の反応物を同じ濃度に正規化し、一緒にプールして、10nM NGSライブラリーを作り出した。この試料にphiXコントロールミックスを全分子の20％の最終濃度までスパイクして、後のillumine配列決定のための配列バリエーションを生じさせた。NGSライブラリーを、Illumina's Denature and Dilute Library Guide for the MiniSeq Systemに従って調製した。このライブラリーを、MIDアウトプットカセットを用いてIllumina miniSeqシステムで配列決定した。配列決定を、151サイクルを実施してリード1だけを使用し、インデックスを使用しないfastqファイルを作成するようにセットアップした。
【０３６４】
NGSデータ分析:
作成したfastqファイルをCLC Genomics Workbench 10ソフトウェア(Qiagen)にインポートした。異なるキャプチャープローブ1に組み込まれたバーコードに従ってリードを分離し、キャプチャープローブ1からの残りのリードを、このリードの5’末端から切り取った。その後に、キャプチャープローブ2から生じた配列を3’末端から切り取って、キャプチャープローブ1とキャプチャープローブ2の間に挿入された配列だけを残した。次いで、awkコマンドラインを用いて、18より短い全てのリードを切り取り、最後に、配列決定リードの3末端から塩基を取り除くことで、18bpまたは32bpより長い全てのリードを18bpまたは32bpに切り詰めた。ユニークなリードの数を定量し、上位10位の最も頻度の高いリードを図6パネルBに示した。図6では、オリジナルLNAオリゴを5’->3’センス方向で読み取るためにリードは逆相補鎖にされている。
【０３６５】
実施例7:
実施例1:品質管理(QC)としてのLNAのNGS配列決定
本発明者らは、ここで、QC提案のための完全ホスホロチオエート化LNAオリゴの配列決定が可能なことを示す。
【０３６６】
以下のLNAオリゴを配列決定に使用した。
【０３６７】
LNA混合物:
2021522808.tif 000019
【０３６８】
キャプチャープローブ:
2021522808.tif 000020
【０３６９】
キャプチャープローブ1 RTプライマー:
2021522808.tif 000021
【０３７０】
第1の連結反応:
2ulのオリゴ1を2ulのキャプチャープローブ1インデックス3(10uM)と混合した
2ulのオリゴ2を2ulのキャプチャープローブ1インデックス2(10uM)と混合した
2ulのオリゴ3を2ulのキャプチャープローブ1インデックス4(10uM)と混合した
2ulのオリゴ4を2ulのキャプチャープローブ1インデックス1(10uM)と混合した
【０３７１】
次いで、混合物を55Cまで加熱し、次いで、4Cまで冷却した。
【０３７２】
16ulの連結混合物を各チューブに添加した:
20ulの反応につき:(2ulのT4連結緩衝液、6ulのPEG、6ulのH2O、2ulのT4リガーゼ)。連結:2X(4C;2分、16C;20分、22C5分、30C1分)75C;10分、次いで、4Cに保った。
【０３７３】
ゲル電気泳動:
上述した各反応物に等量の2xNovex(登録商標)TBE-Urea Sample Buffer(Thermo Fisher Scientific)を添加し、試料を95℃で2分間熱変性し、氷上に置いた。調製された試料15μlをNovex(登録商標)TBE-Urea Gels, 15％, 15ウェル(Thermo Fisher Scientific)にロードし、電気泳動を180Vの一定電圧で75分間行った。DNAをSYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain(Thermo Scientific)を用いて10分間染色した。ゲルをBlue Trayの上に置いてChemiDoc Touch Imaging System(Bio Rad)を用いて視覚化した(図8Aを参照されたい)。
【０３７４】
キャプチャープローブとオリゴとの連結産物を含有するバンドをゲルから切断した。切断領域を図1Aに白色の枠で示した。ゲル断片を砕き、500ulのTE緩衝液に一晩浸漬し、連結されたオリゴを抽出した。浸漬後に、連結されたオリゴを洗浄し、Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal MW CO 3kDaフィルターを用いて濃縮した。最後に、試料をspeedvacを用いて約10ulまで濃縮した。
【０３７５】
1鎖合成および精製:
1鎖合成を、Vulcano2G DNAポリメラーゼを用いて20ulの反応物:
4ul: 5xVulcano2G緩衝液
0.4ul:Vulcano2Gポリメラーゼ
0.5ul:dNTP(10uM)
0.4ul:キャプチャーRTプライマー(10uM)
4ul:連結テンプレート
H20 20ulまで添加(H20 ad 20ul)
で行った。
【０３７６】
サーモサイクラーで以下のプログラム:
95C;3分10x(55C;5分、72C;1分)
を使用し、次いで、4Cに保った。
【０３７７】
1鎖合成反応物を、Monarch(登録商標)PCR & DNA Cleanup Kit(New England Biolabs)を使用し、製造業者のオリゴヌクレオチドクリーンアッププロトコールを用いて精製した。試料を10ulの溶出緩衝液に溶出した。
【０３７８】
2.連結反応:
2021522808.tif 000022
【０３７９】
8ulの1鎖合成反応物を2ulのキャプチャープローブ2(1uM)と混合した。
【０３８０】
次いで、混合物を55Cまで加熱し、次いで、4Cまで冷却した。
【０３８１】
16ulの連結混合物を各チューブに添加した:
20ulの反応につき:(2ulのT4連結緩衝液、6ulのPEG、6ulのH2O、2ulのT4リガーゼ)。連結:2X(4C;2分、16C;2時間、22C5分)75C;10分、次いで、4Cに保った。
【０３８２】
NGSライブラリーのPCR増幅:
2021522808.tif 000023
【０３８３】
連結された1鎖合成のPCR増幅を、phusion DNAポリメラーゼとNGS_PCR_プライマー1および2を用いて行った。これらのプライマーは、illuminas TruSeq NGSプロトコールと適合する5’オーバーハングを含む。
2021522808.tif 000024
【０３８４】
PCRサイクリング:98C;30s、15x(98C;15s、60C;20s、72C;20s)、72 5分、次いで、4Cに保った。PCR産物をQIAquick PCR purification kit(Qiagen)で製造業者の説明書に従って精製し、30ulのH2Oに溶出した。
【０３８５】
NGSセットアップ:
4種類の反応物を同じ濃度に正規化し、一緒にプールして、10nM NGSライブラリーを作り出した。この試料にphiXコントロールミックスを全分子の20％の最終濃度までスパイクして、後のillumine配列決定のための配列バリエーションを生じさせた。NGSライブラリーを、Illuminas Denature and Dilute Library Guide for the MiniSeq Systemに従って調製した。このライブラリーを、MIDアウトプットカセットを用いてIllumina miniSeqシステムで配列決定した。配列決定を、151サイクルを実施してリード1だけを使用し、インデックスを使用しないfastqファイルを作成するようにセットアップした。
【０３８６】
NGSデータ分析:
作成したfastqファイルをCLC Genomics Workbench 10ソフトウェア(Qiagen)にインポートした。4種類のキャプチャープローブ1に組み込まれたバーコードに従ってリードを分離し、キャプチャープローブ1からの残りのリードを、このリードの5’末端から切り取った。その後に、キャプチャープローブ2から生じた配列を3’末端から切り取って、キャプチャープローブ1とキャプチャープローブ2の間に挿入された配列だけを残した。次いで、awkコマンドラインを用いて、18より短い全てのリードを切り取り、最後に、配列決定リードの3末端から塩基を取り除くことで、18bpより長い全てのリードを18bpに切り詰めた。ユニークなリードの数を定量し、上位10位の最も頻度の高いリードを図8パネルB〜Eに示した。図8では、オリジナルLNAオリゴを5’->3’センス方向で読み取るためにリードは逆相補鎖にされている。
【０３８７】
実施例8:QCのためのGalNac-LNAのNGS配列決定
本発明者らは、ここでは、QC提案のために、5’末端においてGalNacとコンジュゲートした完全ホスホロチオエート化LNAオリゴの配列決定が可能なことを示す。
【０３８８】
以下のLNAオリゴを配列決定に使用した。
【０３８９】
LNA混合物:
2021522808.tif 000025
【０３９０】
キャプチャープローブ:
2021522808.tif 000026
【０３９１】
キャプチャープローブ1 RTプライマー:
2021522808.tif 000027
【０３９２】
第1の連結反応:
2ulのオリゴ1を2ulのキャプチャープローブ1インデックス3(10uM)と混合した。
【０３９３】
次いで、混合物を55Cまで加熱し、次いで、4Cまで冷却した。
【０３９４】
16ulの連結混合物をチューブに添加した:
20ulの反応につき:(2ulのT4連結緩衝液、6ulのPEG、6ulのH2O、2ulのT4リガーゼ)。連結:2X(4C;2分、16C;20分、22C5分、30C1分)75C;10分、次いで、4Cに保った。
【０３９５】
ゲル電気泳動:
上述した反応物に等量の2xNovex(登録商標)TBE-Urea Sample Buffer(Thermo Fisher Scientific)を添加し、試料を95℃で2分間熱変性し、氷上に置いた。調製された試料15μlをNovex(登録商標)TBE-Urea Gels, 15％, 15ウェル(Thermo Fisher Scientific)にロードし、電気泳動を180Vの一定電圧で75分間行った。DNAをSYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain(Thermo Scientific)を用いて10分間染色した。ゲルをBlue Trayの上に置いてChemiDoc Touch Imaging System(Bio Rad)を用いて視覚化した。
【０３９６】
キャプチャープローブとオリゴとの連結産物を含有するバンドをゲルから切断した。ゲル断片を砕き、500ulのTE緩衝液に一晩浸漬し、連結されたオリゴを抽出した。浸漬後に、連結されたオリゴを洗浄し、Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal MW CO 3kDaフィルターを用いて濃縮した。最後に、試料をspeedvacを用いて約10ulまで濃縮した。
【０３９７】
1鎖合成および精製:
1鎖合成を、Vulcano2G DNAポリメラーゼを用いて20ulの反応物:
4ul:5xVulcano2G緩衝液
0.4ul:Vulcano2Gポリメラーゼ
0.5ul:dNTP(10uM)
0.4ul:キャプチャーRTプライマー(10uM)
4ul:連結テンプレート
H20 20ulまで添加
で行った。
【０３９８】
サーモサイクラーで以下のプログラム:
95C;3分10x(55C;5分、72C;1分)
を使用し、次いで、4Cに保った。
【０３９９】
1鎖合成反応物を、Monarch(登録商標)PCR & DNA Cleanup Kit(New England Biolabs)を使用し、製造業者のオリゴヌクレオチドクリーンアッププロトコールを用いて精製した。試料を10ulの溶出緩衝液に溶出した。
【０４００】
2.連結反応:
2021522808.tif 000028
【０４０１】
8ulの1鎖合成反応物を2ulのキャプチャープローブ2(1uM)と混合した。
【０４０２】
次いで、混合物を55Cまで加熱し、次いで、4Cまで冷却した。
【０４０３】
16ulの連結混合物を各チューブに添加した:
20ulの反応につき:(2ulのT4連結緩衝液、6ulのPEG、6ulのH2O、2ulのT4リガーゼ)。連結:2X(4C;2分、16C;2時間、22C 5分)75C;10分、次いで、4Cに保った。
【０４０４】
NGSライブラリーのPCR増幅:
2021522808.tif 000029
【０４０５】
連結された1鎖合成のPCR増幅を、phusion DNAポリメラーゼとNGS_PCR_プライマー1および2を用いて行った。これらのプライマーは、illuminas TruSeq NGSプロトコールと適合する5’オーバーハングを含む。
2021522808.tif 000030
【０４０６】
PCRサイクリング:98C;30s、15x(98C;15秒、60C;20秒、72C;20秒)、72 5分、次いで、4Cに保った。
【０４０７】
PCR産物をQIAquick PCR purification kit(Qiagen)で製造業者の説明書に従って精製し、30ulのH2Oに溶出した。
【０４０８】
NGSセットアップ:
反応物を10nMに正規化し、異なるバーコーディングシステムを含む別のNGSライブラリーと共にプールして10nM NGSライブラリーを作り出した。この1回の反応物は全NGSライブラリーの約10％を構成した。NGSライブラリーを、Illuminas Denature and Dilute Library Guide for the MiniSeq Systemに従って調製した。このライブラリーを、MIDアウトプットカセットを用いてIllumina miniSeqシステムで配列決定した。配列決定を、151サイクルを実施してリード1だけを使用し、インデックスを使用しないfastqファイルを作成するようにセットアップした。
【０４０９】
NGSデータ分析:
作成したfastqファイルをCLC Genomics Workbench 10ソフトウェア(Qiagen)にインポートした。キャプチャープローブ1インデックス1から生じたリードを単離し、キャプチャープローブ1に由来する残ったリードを、このリードの5’末端から切り取った。その後に、キャプチャープローブ2から生じた配列を3’末端から切り取って、キャプチャープローブ1とキャプチャープローブ2の間に挿入された配列だけを残した。次いで、awkコマンドラインを用いて、15より短い全てのリードを切り取り、最後に、配列決定リードの3末端から塩基を取り除くことで、15bpより長い全てのリードを15bpに切り詰めた。ユニークなリードの数を定量し、上位5位の最も頻度の高いリードを図9に示した。図9では、オリジナルLNAオリゴを5’->3’センス方向で読み取るためにリードは逆相補鎖にされている。
【０４１０】
実施例9: SuperScript III逆転写酵素とVulcano2Gを比較する
LTT1の1鎖合成アッセイ
Crouzierらは、Superscript III逆転写酵素(RT)(Thermos Scientific)には、RNA鎖を逆転写する時にLNAヌクレオチド(LNA-TおよびLNA-A)を読み取る能力があると述べている。著者らは、SuperScript III RTがRNAテンプレートを読み取る時に、連続しないLNA-TおよびLNA-Aを組み込むことができることを示している。著者らはまた、Superscript III RTが、通常のdNTPだけを用いて、(連続しない)2つのLNA Aと2つのLNA Tを含有するRNAテンプレートを逆転写できることも示している(Crouzier et al. 2012 図3パネルCレーン2)。
【０４１１】
SuperScript III RTは、RNAホスホジエステル連結鎖の中にある、連続しないLNAを含有する鎖を逆転写できることが知られているので(Crouzier et al. 2012)、本発明者らは、ホスホロチオエート骨格も含むDNA鎖の中にある連続したLNAの端から端まで読み取ることができるかどうか調べたかった。従って、本発明者らはLTT1テンプレートの1鎖合成を実施し、その後で、実施例2に記載のようにEvaGreen ddPCRを用いて1鎖検出を実施する。本発明者らは、1コピーのLTT1を作り出すSuperScript III RTの能力をVulcano2Gポリメラーゼの能力と比較した。1鎖Superscript III RT反応の反応条件は、Crouzier et al. 2012に記載のものと同じであった。
【０４１２】
10ulの1鎖合成反応:
全反応物が、(1ulのLTT1(31pM)、0.5ulのDCP1_プライマー1(1uM)、および水添加10ulを含んだ。酵素を、ベンダーから供給された緩衝液を用いて操作した。
a)2ulの5xFirst Strand Buffer、1ulのMgCL2(50mM)、0.75ulのDTT(100mM)、0.75ulのdNTP(10mM)
b)2ulの5xFirst Strand Buffer、1ulのMgCL2(50mM)、0.75ulのDTT(100mM)、0.75ulのdNTP(10mM)、0.5 SuperScript III RT酵素
c)2ulの5x Vulcano2G緩衝液、1ulのdNTP(10mM)
d)2ulの5x Vulcano2G緩衝液、1ulのdNTP(1OmM)、0.2ulのVulcano2G
【０４１３】
酵素以外の全ての成分を添加し、混合物を65Cまで5分間加熱し、次いで、氷上に1分間置いた後、最後にRT酵素を添加した。1鎖合成を4種類の条件下で行った。
a)45分50C、5分80C、4Cに保った
b)5分50C、4Cに保った
c)(5分50C、30秒98C)の3xサイクル、次いで、4Cに保った
d)(5分50C、30秒98C)の5xサイクル、次いで、4Cに保った
【０４１４】
Vulcano2G酵素は耐熱性なので、条件cおよびdにサイクリング条件を追加した。従って、二本鎖を変性させるのに必要な高温で不活性化されるSuperscript III RTと異なり、感度を高めるために、この酵素を用いて複数回の1鎖合成を行うことができる。
【０４１５】
全ての1鎖反応物を水で100x希釈し、実施例2に記載のように通常のQX200(商標)ddPCR(商標)EvaGreen Supermix PCR反応のインプットとして2ulの試料を使用した。
【０４１６】
結果:
図10パネルAは、1x45分の1鎖合成反応時に行ったEvaGreen ddPCR反応におけるドロップレットの蛍光強度を示す。本発明者らは、酵素が無い反応でも同じポジティブドロップレット数が認められたので、SuperScript III RTがLTT1の1鎖コピーを作る能力の形跡を認めなかった。検出されたコピーの定量を図10パネルBに示した。図10パネルBは、LTT1テンプレートの1鎖コピーを作るVulcano2Gのはるかに優れた能力を示す。図10パネルCは、1回、3回、または5回の1鎖合成反応を用いて行った反応に対して行ったEvaGreen ddPCR反応におけるドロップレットの蛍光強度を示す。検出されたコピーの定量を図10パネルDに示した。図10パネルDは、熱安定性があるためにVulcano2Gが数回の1鎖合成反応を実施できることを示した。これを使用してLNA含有分子の検出を増やすことができる。この場合でも、本発明者らは、superscript III RTがLTT1テンプレートを逆転写できるという形跡を認めなかった。
【０４１７】
参考文献:
Crouzier et al. (2012) Efficient Reverse Transcription Using Locked Nucleic Acid Nucleotides towards the Evolution of Nuclease Resistant RNA Aptamers. PLoS ONE April 2012, Volume 7, Issue 4, e35990
【０４１８】
実施例10:インビボコンジュゲートの発見
バーコードを含むDNA/PSオリゴヌクレオチドとコンジュゲートした様々な化学部分のライブラリーが1匹の動物において肝臓に濃縮されるかどうか配列決定を用いて調査できるという原理証明を示したデータ。皮下注射して4時間後にGalNAc結合オリゴヌクレオチド(SEQ ID 22)が裸のオリゴ(SEQ ID 35)と比較して肝臓に豊富にあるという原理証明を示したデータ。データから、皮下注射して4時間後にSEQ ID 26が裸のオリゴSEQ ID 37と比較して肝臓に豊富にあることも明らかである。5μMの各オリゴ(以下の表)の溶液をマウス1匹につき0.25mLの用量でC57BL/6Jマウス(n=3)に皮下注射し、注射して4時間後に肝臓を収集した。
【０４１９】
表.コンジュゲーションのあるバーコード付オリゴヌクレオチドのライブラリー。特定用バーコードを太字で示した。
【０４２０】
コンジュゲーションを化学構造または言葉で示した。化学構造中にある波線は、適宜5’末端での、任意で、リンカー、例えば、C6アルキルリンカー基を介したオリゴヌクレオチドとの共有結合を表している。
【０４２１】
(表１３)
2021522808.tif 000031
2021522808.tif 000032
2021522808.tif 000033
【０４２２】
インビボ注射して4時間後に、肝臓組織試料(100mg)を、0.1M CaCl2、0.1M Tris pH 8.0、および1％NP-40を含有する緩衝液400μLに入れてTissue Lyzer(Qiagen)を用いてホモジナイズした。並行して、5μMの各オリゴを含有する溶液10μLを、上記のようにホモジナイズしたエクスビボ肝臓試料(100mg、n=3)にスパイクした。25μLのプロテイナーゼK(Sigma)を添加した後に、試料を50℃で一晩インキュベートした。次いで、1μLのRNAseif(New England Biolabs)および1μLのDNアーゼI(Qiagen)を添加し、試料を37℃で1時間インキュベートし、ヌクレアーゼ不活性化を、99℃で15分間インキュベートすることによって行った。
【０４２３】
試料を10000gで10分間遠心沈殿し、上清を、Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal MWCO 3 kDaフィルターを用いて3回洗浄し、各洗浄工程で約400μLの蒸留水を添加することによって洗浄を行った。(約50μLのうち)2μLの残っている上清を、1μLのキャプチャープローブ1(10μM)、2μLのT4リガーゼ緩衝液、6μLのPEG、1μLのT4リガーゼ(ThermoFisher Scientific)、および8μLの蒸留水を含有する第1の連結反応において使用した。各試料を、それぞれの個々の試料からの配列を後で特定するための特異的なインデックス配列がある特異的なキャプチャープローブに連結した(以下の表を参照されたい)。
【０４２４】
(表１４)特定用のキャプチャープローブ1.インデックスのライブラリーを太字で示した
2021522808.tif 000034
【０４２５】
16℃で1時間インキュベートし、75℃で15分間不活性化した後に、等量の2xNovex(登録商標)TBE-Urea Sample Buffer(Thermo Fisher Scientific)を、この第1の連結産物反応物に添加し、試料を95℃で2分間熱変性させ、氷上に置いた。調製された試料15μlをNovex(登録商標)TBE-Urea Gels, 15％, 15ウェル(Thermo Fisher Scientific)にロードし、電気泳動を180Vの一定電圧で75分間行った。DNAをSYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain(Thermo Scientific)を用いて10分間染色した。ゲルをBlue Trayの上に置いてChemiDoc Touch Imaging System(Bio Rad)を用いて視覚化した。オリゴヌクレオチドと連結したキャプチャープローブの連結産物を含有するバンドをゲルから切断した。次いで、ゲル断片を砕き、500μlの蒸留水に浸漬し、4℃で一晩放置して、連結されたオリゴを抽出した。次いで、抽出された連結オリゴヌクレオチドを、各洗浄工程でAmicon Ultra 0.5 mL centrifugal MWCO 3 kDaフィルターを用いて約400μLの蒸留水を添加することによって3x洗浄した。次いで、最終洗浄後に、濃縮されたオリゴヌクレオチドを第1鎖合成反応に使用した。第1鎖合成を、4μLのホモジナイズされた連結ゲルインプット、4μLの5xVolcano2G緩衝液(MyPols)、0.4μLの第1鎖プライマー1μM、0.5μLの10mM dNTP、0.4μLのVolcano2Gポリメラーゼ(MyPols)、および10.7μLの蒸留水を用いて行った。PCR条件は、95℃3分、その後に、95℃30秒、55℃5分、および72℃1分の15サイクルであった。
2021522808.tif 000035
【０４２６】
第1鎖PCR産物をMonarch PCRおよびDNA clean up kit(New England Biolabs)を用いて製造業者の説明書に従って精製し、10μLの溶出緩衝液に溶出させた。次いで、8μLの溶出した第1鎖産物を2μLのキャプチャープローブ2(100nM)に連結し、60℃まで5分間加熱し、その後に、ゆっくりと(0.1℃/s)4℃まで温度を下げた。次いで、2μLのT4リガーゼ緩衝液、6μLのPEG、1μLのT4リガーゼ(ThermoFisher Scientific)、および1μLの蒸留水からなる10μLを添加した。
2021522808.tif 000036
【０４２７】
16℃で1時間インキュベートし、75℃で15分間不活性化した後に、2μLの連結反応物を、4μLの5xHF緩衝液(New England Biolabs)、0.4μLの10mM dNTP、1μLの10μM Forward Seqプライマー(PE1)および1μLの10μM Reverse Seqプライマー(PE2V2)、0.2μLのPhusion DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)、ならびに11,4μL蒸留水を含有するPCR反応に適用した。PCR条件は、98℃30秒、その後に、98℃15秒、60℃20秒、および72℃20秒、最後に72℃5分の20サイクルであった。PCR産物をQIAquick PCR purification kit(Qiagen)を用いて製造業者の説明書に従って精製し、30μL蒸留水に溶出させた。
2021522808.tif 000037
【０４２８】
PCR産物をIllumina MiniSeq System(Illumina)からのプロトコールに従って配列決定した。ソフトウェアCLC Genomics Workbench,11.0.1(Qiagen)を使用することによって、異なるバーコードのリード数を突き止め、バーコードの相対存在量を計算した。最後に、インビボ肝臓の相対存在量とエクスビボスパイクイン肝臓試料の相対存在量との比を計算した。
2021522808.tif 000038
【０４２９】
(表１５)各試料(n=3)の4時間肝臓試料リード数および相対存在量
2021522808.tif 000039
【０４３０】
図11は、皮下注射して4時間後の非コンジュゲートオリゴヌクレオチド(SEQ ID 35)と比べた肝臓濃縮倍率を示す。GalNAc結合オリゴヌクレオチド(SEQ ID 22)ならびにSEQ ID 26は非コンジュゲートオリゴヌクレオチド(SEQ ID 35)と比較して3.5倍の肝臓濃縮を示す。
【０４３１】
実施例11
バーコードを含むDNA/PSオリゴヌクレオチドとコンジュゲートした様々な化学部分のライブラリーが1匹の動物において血漿に保持されるかどうか配列決定を用いて調査できるという原理証明を示したデータ。皮下注射して4時間後に、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートしたアルブミン結合C16パルミチン酸が血漿に豊富にあるという原理証明を示したデータ。データから、GalNAc結合オリゴヌクレオチドが裸のオリゴヌクレオチドと比較して循環から取り出されることも明らかである。
【０４３２】
PBSに溶解した、5μMの各オリゴヌクレオチドの溶液(以下の表を参照されたい)をマウス1匹につき0.25mLの用量でC57BL/6Jマウス8(n=3)に皮下注射し、注射して4時間後に血漿試料を採取した。
【０４３３】
表.コンジュゲーションのあるバーコード付オリゴヌクレオチドのライブラリー。特定用バーコードを太字で示した。
【０４３４】
使用した化合物は、上記の表13にあるコンジュゲートとして示されたものであり、化合物SEQ ID NO 46をさらに含めた。
2021522808.tif 000040
【０４３５】
注射して4時間後に、10μLの血漿試料を240μLのRIPA緩衝液(Pierce)に入れてTissue Lyzer(Qiagen)を用いてホモジナイズした。並行して、5μMの各オリゴを含有する溶液10μLをエクスビボ血漿試料10μLにスパイクし、上記のように試料をRIPA緩衝液240μLに入れてホモジナイズした。次いで、ホモジナイズした血漿RIPA溶液2μLを、1μLのキャプチャープローブ1(1nM)、2μLのT4リガーゼ緩衝液、6μLのPEG、1μLのT4リガーゼ(ThermoFisher Scientific)、および8μLの蒸留水を含有する第1の連結反応において使用した。各試料を、それぞれの個々の試料を後で特定するための特異的なインデックス配列がある特異的なキャプチャープローブ1に連結した。
【０４３６】
(表１６)特定用のキャプチャープローブ1.インデックスのライブラリーを太字で示した
2021522808.tif 000041
【０４３７】
16℃で1時間インキュベートし、75℃で15分間不活性化した後に、2μlの連結反応物を、2μLの連結反応物、4μLの5xVolcano緩衝液(MyPols)、0.4μLの第1鎖プライマー1μM、0.5μLの10mM dNTP、0.4μLのVolcano PG(MyPols)、および12.7μLの蒸留水を含有する第1鎖合成に使用した。PCR条件は、95℃3分、その後に、95℃30秒、55℃30分、および72℃1分の15サイクルであった。
2021522808.tif 000042
【０４３８】
全ての第1鎖PCR産物をプールし、50μLのプールした第1鎖PCR産物をMonarch PCRおよびDNA clean up kit(New England Biolabs)を用いて製造業者の説明書に従って精製し、10μLの溶出緩衝液に溶出させた。次いで、8μLの溶出した第1鎖産物を2μLのキャプチャープローブ2(100nM)に連結し、60℃まで5分間加熱し、その後に、ゆっくりと(0.1℃/s)4℃まで温度を下げた。次いで、2μLのT4リガーゼ緩衝液、6μLのPEG、1μLのT4リガーゼ(ThermoFisher Scientific)、および1μLの蒸留水からなる10μlを添加した。
2021522808.tif 000043
【０４３９】
16℃で1時間インキュベートし、75℃で15分間不活性化した後に、2μLの連結反応物を、4μLの5xHF緩衝液、0.4μLの10mM dNTP、1μLの10μM Forward Seqプライマー(PE1)および1μLの10μM Reverse Seqプライマー(PE2V2)、0.2μLのPhusion DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)、ならびに11,4μLの蒸留水を含有するPCR反応に適用した。PCR条件は、98℃30秒、その後に、98℃15秒、60℃20秒、および72℃20秒の20サイクル、最後に72℃5分であった。
2021522808.tif 000044
【０４４０】
PCR産物を、QIAquick PCR purification kit(Qiagen)を用いて製造業者の説明書に従って精製し、30μLの蒸留水に溶出させた。PCR産物を、Illumina MiniSeq System(Illumina)からのプロトコールに従って配列決定した。ソフトウェアCLC Genomics Workbench,11.0.1を使用することによって、異なるバーコードのリード数を突き止め、バーコードの相対数を計算した。最後に、エクスビボスパイクイン血漿試料と比べたインビボ血漿相対存在量の比を計算した。
【０４４１】
(表１７)各試料(n=3)の4時間血漿試料リード数および相対存在量
2021522808.tif 000045
【０４４２】
(表１８)リードの4時間血漿試料相対存在量(平均および標準偏差)ならびに血漿スパイクインと比べたインビボの比
2021522808.tif 000046
【０４４３】
図12は、皮下注射して4時間後の非コンジュゲートオリゴ化合物SEQ ID 35と比べた血漿濃縮を示す。C16脂肪酸コンジュゲーションのあるオリゴヌクレオチド(SEQ ID 46)は裸のオリゴヌクレオチドSEQ ID 35と比較して12.5倍の血漿存在量を示した。
【０４４４】
GalNAc結合オリゴヌクレオチド(SEQ ID 22)は血漿からの枯渇を示した。
【０４４５】
実施例12
バーコードを含むオリゴヌクレオチドを含むLNA/DNA/PSとコンジュゲートした様々な化学部分のライブラリーを、配列決定を用いて、1匹の動物の複数組織における組織送達特性について調査することができるという原理証明を示したデータ。データから、iv注射の3日後に、コレステロール結合オリゴヌクレオチド(SEQ ID 49および50)ならびにトコフェロール結合オリゴヌクレオチド(SEQ ID 60および61)が肝臓に豊富にあり、腎臓では少ないことも明らかである。データから、胆汁アミン(bile amine)コンジュゲーション(SEQ ID 51および52)が膵臓でのオリゴヌクレオチド含有量を増やすことも明らかである。
【０４４６】
15種類のバーコード付オリゴヌクレオチド(以下の表)のライブラリーを10mg/kgの用量(全てのオリゴヌクレオチド)でC57BL/6Jマウス(n=2)に静脈内注射した。3日後に以下の臓器:脂肪組織、皮質、眼、大腿骨、心臓、腸骨、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、膵臓、血清、脊髄、脾臓、および胃を収集し、分析した。
【０４４７】
(表１９)コンジュゲーションのあるバーコード付オリゴのライブラリー。特定用バーコードを太字で示した。
【０４４８】
コンジュゲーションを言葉で示した。LNAヌクレオチドを大文字で示した。
2021522808.tif 000047
【０４４９】
注射して3日後に、組織試料をRIPA緩衝液(Pierce)に入れてTissue Lyzer(Qiagen)を用いてホモジナイズした。組織を、その重量に応じた体積のRIPA緩衝液に入れて10mg組織/450μLのRipa緩衝液の比でホモジナイズした。次いで、ホモジナイズした肝臓、腎臓、および肺組織を蒸留水で100x希釈し、他の組織を蒸留水で10x希釈した。試料を75℃で40分間、その後に4℃で15分間インキュベートすることによってDNアーゼ不活性化を行った。並行して、参照正規化用の2つの試料は、5μM(各)オリゴヌクレオチドライブラリーを含有する溶液10μLとRIPA緩衝液490μLからなった(最終100nMの各オリゴヌクレオチド)。
【０４５０】
4μLのRIPA溶液を、2μLのキャプチャープローブ1(1nM)、2μLのT4リガーゼ緩衝液、6μLのPEG、0.25μLのT4リガーゼ(ThermoFisher Scientific)、および5.75μLの蒸留水を含有する第1の連結反応に使用した。各組織試料を、それぞれの個々の試料を後で特定するための特異的なインデックス配列がある特異的なキャプチャープローブ1に連結した。以下の表を参照されたい。
【０４５１】
(表２０)特定用の32種類のキャプチャープローブ1.インデックスのライブラリーを太字で示した
2021522808.tif 000048
2021522808.tif 000049
2021522808.tif 000050
2021522808.tif 000051
【０４５２】
16℃で1時間インキュベートし、75℃で15分間不活性化した後に、2μlの連結反応物を、2μLの連結反応物、4μLの5xVolcano緩衝液(MyPols)、0.5μLの第1鎖プライマー100nM、0.5μLの10mM dNTP、0.4μLのVolcano PG(MyPols)、および12.6μLの蒸留水を含有する反応物中で第1鎖合成に使用した。PCR条件は、95℃2分、その後に、95℃30秒および60℃30分の15サイクル、最後に72℃5分であった。
2021522808.tif 000052
【０４５３】
全ての第1鎖PCR産物をプールし、50μLのプールした第1鎖PCR産物をMonarch PCRおよびDNA clean up kit(New England Biolabs)を用いて製造業者の説明書に従って精製し、10μLの溶出緩衝液に溶出させた。4μLの溶出した第1鎖産物を4μLのキャプチャープローブ2(100nM)と混合し、60℃まで5分間加熱し、その後に、ゆっくりと(0.1℃/s)4℃まで温度を下げた。次いで、2μLのT4リガーゼ緩衝液、6μLのPEG、0.5μLのT4リガーゼ(ThermoFisher Scientific)、および3.5μLの蒸留水からなる12μLを添加した。
2021522808.tif 000053
【０４５４】
4℃で1時間インキュベートし、75℃で15分間不活性化した後に、2μLの連結反応物を、4μLの5xHF緩衝液、0.4μLの10mM dNTP、1μLの10μM Forward Seqプライマー(PE1)および1μLの10μM Reverse Seqプライマー(PE2V3)、0.2μLのPhusion DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)、ならびに11.4μLの蒸留水を含有するPCR反応に適用した。PCR条件は、98℃30秒、その後に、98℃15秒、60℃20秒、および72℃20秒の20サイクル、最後に72℃5分であった。
2021522808.tif 000054
【０４５５】
PCR産物をQiaquick PCR purification kit(Qiagen)を用いて製造業者の説明書に従って精製し、30μLの蒸留水に溶出させた。PCR産物を、Illumina MiniSeq System (Illumina)からのプロトコールに従って配列決定した。ソフトウェアCLC Genomics Workbench,11.0.1を使用することによって、異なるバーコードのリード数を突き止め、各キャプチャーインデックス(各組織試料)のバーコードの相対数を計算した。各バーコードの相対数を、試験管反応からのインデックス参照ライブラリー1におけるバーコードの相対数に対して正規化した(％)。
【０４５６】
(表２１)2匹のC57BL/6Jマウスにおけるiv注射して3日後の組織試料リード数
2021522808.tif 000055
2021522808.tif 000056
2021522808.tif 000057
2021522808.tif 000058
【０４５７】
(表２２)参照ライブラリー1のリードの相対存在量に対して正規化された、各組織試料におけるバーコードオリゴのリードの相対存在量(％)。リードの相対存在量から、トコフェロールコンジュゲーション(化合物SEQ ID 58およびSED ID 59)ならびにコレステロールコンジュゲーション(SEQ ID 47およびSEQ ID 48)は裸のオリゴSEQ ID 55、56、および57ならびに他のコンジュゲーションと比較して肝臓への肝臓分布を増やし、腎臓分布を減らしたことが分かる。胆汁アミンコンジュゲーションSEQ ID 49およびSEQ ID 50)は膵臓における含有量を増やした。
2021522808.tif 000059
2021522808.tif 000060
2021522808.tif 000061
2021522808.tif 000062
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2021522808.tif 000075
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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