(57)【要約】被験者のがんの治療、又は予防の方法に関するもので、がんに罹患している、又は罹患しやすい被験者に、被験者の制御性Ｔ細胞（Tregs）を枯渇させる第１薬剤を投与し、次にチェックポイント阻害剤からなる第２薬剤を被験者に投与することからなる。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者のがんを治療、又は予防する方法であって、以下からなる方法：
がんに罹患している、又は罹患しやすい被験者に、被験者の制御性T細胞（Tregs）を枯渇させる第１剤を投与すること；次に
チェックポイント阻害剤からなる第２剤を被験者に投与すること；及び
被験者のがんを治療、又は予防すること。
【請求項２】
請求項１に記載の方法、ここで、がんはメラノーマである。
【請求項３】
請求項１に記載の方法で、ここで、前記第１剤は、ジフテリア毒素融合タンパク質である。
【請求項４】
請求項３に記載の方法で、ここで、前記ジフテリア毒素融合タンパク質は、ジフテリア毒素フラグメントA、又はその機能部分；ジフテリア毒素フラグメントB、又はその機能部分；又はそれらの組合わせからなる。
【請求項５】
請求項４に記載の方法で、ここで、前記ジフテリア毒素融合タンパク質は、ヒトインターロイキン配列からなる。
【請求項６】
請求項５に記載の方法で、ここで、前記ヒトインターロイキン配列はヒトIL-2タンパク質、又はその機能部分からなる。
【請求項７】
請求項５に記載の方法で、ここで、前記ジフテリア毒素融合タンパク質は、デニロイキン・ディフティトックを投与した対照被験者と比較した時、血管漏出を低下させる。
【請求項８】
請求項１に記載の方法で、ここで、前記第１剤は、SEQ ID NO:13、又はその機能部分；SEQ ID NO:58、又はその機能部分；SEQ ID NO:15、又はその機能部分；SEQ ID NO:42、又はその機能部分；又それらの組み合わせからなる。
【請求項９】
請求項１に記載の方法で、ここで前記チェックポイント阻害剤は、抗CTLA-4抗体；抗PD-1抗体；抗PD-L1抗体；又はそれらの組み合わせからなる。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法で、ここで、前記チェックポイント阻害は、イピリムマブ（抗CTLA-4）、ニボルマブ（抗PD-1）、ペンブロリズマブ（抗PD-1）、アテゾリズマブ（抗PD-L1）、アベルマブ（抗PD-L1）、及びデュルバルマブ（抗PD-L1）、又はそれらの組み合わせ含むグループから選択される。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法で、ここで、第２剤は、抗PD-１抗体である。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法で、ここで、第１剤は、SEQ ID NO:13、又はその機能部分、SEQ ID NO:58、又はその機能部分；SEQ ID NO:15、又はその機能部分、SEQ ID NO:43、又はその機能部分、；又はそれらの組み合わせからなるタンパク質配列をコードしている発現ベクターを含む。
【請求項１３】
被験者のがんを治療、又は予防する方法であって、以下からなる方法：
がん、又はがんになりやすい被験者に、被験者のTregを枯渇させる第１剤からなる医薬組成物の有効量を投与すること；次に
被験者にチェックポイント阻害剤からなる第２剤からなる医薬組成物の有効量を投与すること；及び
被験者者のがんの治療、又は予防すること。
【発明の詳細な説明】
【関連特許の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１８年３月６日に出願された米国仮特許出願６２／６３９，１９９９号の利益を主張し、これらは、本明細書に完全に記載されているかのように、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
（政府の利害関係の表明）
本発明は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）から授与された助成金番号 AI37856、HL133190、AI130595、及びCA006973は、国立衛生研究所によって授与された。 政府は、本発明に関して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
Ontak（商標） (デニロイキン・ディフティトックス) は、ジフテリア毒素フラグメント A 、及びフラグメント B の一部 (Met1-His388) の配列とヒトインターロイキン-2 (IL-2; Ala1-Thr133) の配列からなる 521 アミノ酸の組換え DNA 由来の細胞傷害性タンパク質である。 現在、大腸菌発現系で生産されており、分子量は58 kDである。ネオマイシンは発酵工程で使用されるが、最終製品では検出されない。Ontak（商標）は、静脈内（IV）投与を目的とした無菌凍結溶液として単回使用バイアルで供給され、1999年に皮膚T細胞リンパ腫（CTCL）の治療薬としてFDAによって承認された。 2011年6月には、分子量の異なるタンパク質の凝集体、過剰な残留DNA、過剰な残留界面活性剤が最終製剤に含まれていることが懸念されたため、FDAはOntak（商標）に臨床保留命令をだした。 Ontak（商標）の製造は、組換えタンパク質を大腸菌細胞質で発現させることにより行われており、この発現系では、組換えタンパク質はOntak（商標）ポリペプチドを構成する大きな不溶性の凝集体、いわゆる封入体を形成する。 封入体の変性、及びリリフォールディングを含む現在の製造プロセスでは、最終製剤中に不均一な分子量のタンパク質凝集体が依然として存在していた。 精製された形態でのこれらの凝集体の存在は、ポリペプチドの供給源として大腸菌由来の細胞質封入体を使用した結果であり、Tween 20の存在下でも毒素の膜貫通ドメインの本質的な疎水性のためである。 以下、この方法で製造されたOntak（商標）をクラシックOntak（商標）、又はc-Ontak（商標）と呼ぶ。
【０００３】
さらに、すべての細菌や植物の毒素と同様に、c-Ontak（商標）は血管漏出症候群（VLS）を誘発するアミノ酸モチーフがある。 c-Ontak（商標）を投与された患者の約30％が、急激な体重増加を伴う末梢性浮腫から低アルブミン血症、肺水腫に至るまでのVLS症状を呈する。
【０００４】
VLSの分子機構はよく理解されていない。血管内皮細胞間の細胞接合の破壊を引き起こすいくつかのメカニズムが提案されており、異なるトリガーが血管漏出を引き起こす1つ以上の経路を誘導する可能性がある。ＮＫ細胞は、溶解のために内皮細胞を標的とすることができ、NK細胞の枯渇は、マウスにおいてIL-２によって誘導された血管漏出に対して保護することが示されている（Kotasek D、Vercellotti GM、Ochoa AC、Bach FH、Wilth JG、Jacobook HS．リンホカイン活性化キラー細胞によって誘導される培養内皮傷害のメカニズム。Cancer Res. 1988; 48:5528-32 PMID: 3262010）。また、炎症性サイトカインもVLSの発症に関与する。 TNFα、IL-1、IL-2はすべてインビトロで内皮細胞層の透過性を増加させることが示されている。Balunaらは、リシン毒素、及びジフテリア毒素の特定のアミノ酸モチーフが内皮細胞に結合し、細胞-細胞間、又は細胞外マトリックス相互作用を混乱させることを示唆した。 彼らは、リシン毒素のA鎖のアミノ酸モチーフの変異は、インビトロでは内皮細胞単層の破壊の減少につながり、マウスでは血管漏出の誘導の減少につながることを発見した。しかしながら、酵素活性に対する変異の影響は評価されなかった（Baluna R, Rizo J, Gordon BE, Ghetie V, Vitetta ES. Evidence for a structural motif in toxins and interleukin-2 that may be responsible for binding to endothelial cells and initiating vascular leak syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96:3957-62. PMID: 10097145)。大腸菌由来のクラシックOntak (SEQ ID NO: 10) と C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来の分泌型Ontak (s-Ontak, SEQ ID NO:13) は、ポリペプチドの配列が 1 アミノ酸だけ異なる (大腸菌由来のタンパク質には N 末端のメチオニン残基があるが、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来のタンパク質には存在しない)。 しかし、これら2つのタンパク質は、一次アミノ酸の観点から見ても同一であり、少なくとも5つの血管漏出誘導モチーフを共有している。
【０００５】
抗生物質などの薬剤が、ヒトの細胞への巻き添えを避けながら、必須の細菌タンパク質を特異的に阻害することができる感染症とは異なり、抗がん剤は正常細胞も標的にすることが多く、免疫抑制や神経障害などの重大な副作用を引き起こすことになる。がん細胞は自己と非常によく似ているため、免疫系は腫瘍と非腫瘍を区別する上で同様の問題に遭遇し、自己免疫を防ぐ同じメカニズムが、効果的な抗腫瘍免疫応答を阻害することを可能にする。がん免疫療法は、患者の免疫応答を利用してがんと闘うことを目的としており、PD-1遮断薬などの免疫チェックポイント阻害薬を用いた臨床試験の最近の成功は、抗腫瘍応答を増強することで、一部の患者では持続的な臨床応答が得られることを明らかにしており、全体の応答率は20から40％である。現在の免疫療法に反応しない患者に対しては、臨床的に有益な効果をもたらす追加標的や併用レジメンを発見するためのさらなる研究が必要である。
【０００６】
制御性T細胞（Tregs）は、自己免疫の予防に不可欠な抑制性免疫細胞である。Tregsは有害な炎症反応から保護することができるが、その抑制機能は、がんや感染症における防御免疫応答の抑制にも寄与する。実際、腫瘍細胞はTreg活性を直接促進し、抗腫瘍免疫応答の低下を引き起す。腫瘍浸潤性Tregは、細胞傷害性CD8+T細胞、及び樹状細胞機能の阻害を含む様々なメカニズムを通じて免疫抑制を媒介する（Chen M-L, Pittet M, Gorelik L, Flavell RA, Weissleder R, Boehmer H von, et al. Regulatory T cells suppress tumor-specific CD8 T cell cytotoxicity through TGF-B signals in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102:419-424. PMID: 15623559 and Jang J, Hajdu CH, Liot C, Miller G, Dustin ML, Bar-Sagi D. Crosstalk between Regulatory T Cells and Tumor-Associated Dendritic Cells Negates Anti-tumor Immunity in Pancreatic Cancer. Cell Rep. 2017;20:558-71. PMID: 28723561)。
【０００７】
必要とされているのは、VLSの副作用を最小限に抑えた改変されたOntak様タンパク質であり、これらのタンパク質を使用することで、被験者のがんをより効果的に除去することができる、より安全ながん治療法を開発することである。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の一実施例は、以下のものからなるＤＮＡ発現ベクターである：toxP；遺伝子発現のFe介在性調節をブロックする変異toxO；及びタンパク質をコードするDNA配列であって、ここで、前記toxP、及び前記変異toxOは、タンパク質をコードするDNAセグメントの発現を調節するものである。本発明のDNA発現ベクターは、DNA発現ベクターから発現されたタンパク質が、成熟タンパク質を形成する時に一般的に切断されるシグナルペプチドを付加するように、前記シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むことが好ましい。前記好ましい変異toxOはSEQ ID NO: 1であり、前記好ましいシグナルペプチドはSEQ ID NO:5である。 本発明のDNA発現ベクターは、CRM 197、及びCRM 107のような多くの種類のタンパク質、又はそれらの組み合わせを産生するために使用することが可能である。 CRMタンパク質の配列は、SEQ ID NO: 18―21に例示される。 本発明のDNA発現ベクターは、ジフテリア毒素、又はその機能部分が受容体結合タンパク質、又はその機能部分と結合し形成されるジフテリア毒素受容体融合タンパク質をコードしていることが好ましい。 このような融合タンパク質の受容体結合タンパク質部分は、IL-2、IL−3、IL−4、IL-6、IL−7、IL-15、EGF、FGF、サブスタンスP、CD4、αMSH、GRP、TTフラグメントC、GCSF、ヘレグリンβ1、それらの機能部分、又はそれらの組み合わせからなるグループから選択されることがある。ジフテリア毒素融合タンパク質の例としては、SEQ ID NO: 11―15、30、38―40、42―43、45―46、及び58のいずれか1つに例示されるタンパク質、及びSEQ ID NO:31、41、44、及び59のいずれか1つの核酸によってコードされるタンパク質が挙げられる。
【０００９】
本発明の別の実施例は、以下からなるDNA発現ベクターである。toxP；遺伝子発現のFe介在性調節を阻害する変異toxO；シグナル配列からなるタンパク質をコードするDNA配列；ジフテリア毒素、又はその機能部分、これはジフテリア受容体結合ドメインを含まないか、又は非機能ジフテリア毒素受容体結合ドメインを持つ、及び標的受容体結合ドメインである。標的受容体結合ドメインは、IL-2、IL-3IL−4、IL-6、IL−7、IL-15、EGF、FGF、サブスタンスP、CD4、αMSH、GRP、TTフラグメントC、GCSF、ヘレグリンβ1、それらの機能部分、又はそれらの組み合わせからなるグループから選択される。ここで、toxP、及び変異toxOは、タンパク質をコードするDNA配列の発現を調節する。典型的には、本発明のＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌は、シグナルペプチドに付加したジフテリア毒素受容体結合融合タンパク質を産生し、これはシグナルペプチドによってペリプラズム、培地、又はその両方の場所に輸送される。細菌が大腸菌である場合、シグナルペプチドは、典型的には、ジフテリア毒素受容体結合融合タンパク質をペリプラズムに輸送する。菌体がCorynebacterium diphtheria（ジフテリア菌）である場合、シグナルペプチドは、ジフテリア毒素受容体結合融合タンパク質を培地に輸送する。 本発明のＤＮＡ発現ベクターは、SEQ ID NO:３を含んでおり、開裂可能なタンパク質タグをコードするＤＮＡを含んでいることがあり、ここで、開裂可能なタンパク質タグがジフテリア毒素受容体結合融合タンパク質に付加していることが好ましい。本発明のＤＮＡ発現ベクターから産生されるジフテリア毒素受容体結合融合タンパク質の例としては、SEQ ID NO:11から15、30、38から40、42から43、45から46、及び」58のいずれか１つ、並びにSEQ ID NO:31、41、44、及び５９のいずれか１つの核酸によってコードされるタンパク質が挙げられる。
【００１０】
本発明の別の実施例は、以下のステップからなる凝集物を含まない単量体ジフテリア毒素融合タンパク質を製造する方法を含む：本発明のＤＮＡ発現ベクターで細菌を形質転換するステップ；形質転換体を形成するステップ；形質転換体を培養液中でインキュベートして、培養液中に分泌されるタンパク質の発現を可能にするステップ；及び培養液からタンパク質を精製するステップ。 本方法で使用する好ましい細菌はCorynebacterium diphtheria（ジフテリア菌）である。
【００１１】
本発明の別の実施例は、以下の工程からなる凝集物を含まない単量体ジフテリア毒素融合タンパク質を製造する方法を含む。1)以下のDNAベクターでCorynebacterium diphtheriae（ジフテリア菌）株を形質転換する工程：toxP；遺伝子発現のFe-介在性調節を阻害する変異toxO；以下を含むタンパク質をコードするDNA配列：シグナルペプチド；ジフテリア毒素、又はその機能部分、その機能部分とは、機能ジフテリア受容体結合ドメインを持たないジフテリア毒素、又は非機能ジフテリア毒素受容体結合ドメインを有するジフテリア毒素である；及び標的受容体結合ドメインである。標的結合ドメインとは、IL-２、IL-３、IL-４、IL-６、IL-７、IL-15、EGF、FGF、サブスタンスP、CD4、αMSH、GRP、TTフラグメントC、GCSF、ヘレグリンβ1、TNF、TGF、その機能部分、又はそれらの組み合わせからなるグループから選択される標的受容体結合ドメインのことである。ここで、toxP、及び変異toxOは、タンパク質をコードするDNA配列の発現を調節する。；2）形質転換体を形成する工程；3）タンパク質の発現を可能にするために培養液中で形質転換体をインキュベートし、それが培養液中に分泌される工程；及び4）培養液からジフテリア毒素融合タンパク質を精製する工程。 本発明の方法によって産生されるジフテリア毒素受容体融合タンパク質の例としては、SEQ ID NO: 11から15、30、38から40、42から43、45から46、及び58のいずれか1つの核酸によってコードされるタンパク質、並びにSEQ ID NO: 31、41、44、及び59のいずれか1つの核酸によってコードされるタンパク質が挙げられる。本発明の方法で使用される好ましいCorynebacterium diphtheriae（ジフテリア菌）株は、Corynebacterium C7 beta（-）、tox（-）である。
【００１２】
本発明の別の実施例は、以下の工程からなる結核患者を治療する方法を含むものである：本出願で提供されるジフテリア毒素融合タンパク質を調製する工程；ジフテリア毒素融合タンパク質を結核患者に投与する工程。
【００１３】
本発明の別の実施例は、変異toxOプロモーターからなるDNA発現ベクターを含むものである。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、本発明のDNA発現ベクターを含むCorynebacterium diphtheriae（ジフテリア菌）株を含むものである。
【００１５】
本発明の別の実施例は、以下の工程を含むタンパク質の製造方法である：toxP、遺伝子発現のFe介在性調節を阻害する変異型toxO、シグナル配列、及びタンパク質をコードするDNA配列からなるDNA発現ベクターを提供する工程；前記DNAベクターで細菌株を形質転換して形質転換体を形成する工程；前記形質転換体を培養液中で一定時間インキュベートして培養液中に分泌されるタンパク質の発現を可能にする工程；及び該培養液からタンパク質を精製する工程。
【００１６】
本発明の別の実施例は、SEQ ID NO: 11―15、30、38―40、42―43、45―46、及び58のいずれか１つから選択されるか、又はSEQ ID NO: 31、41、44、及び59のいずれか１つの核酸によってコードされる融合タンパク質である。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、上記の融合タンパク質からなる医薬組成物である。
【００１８】
本発明の別の実施例は、前記融合タンパク質と、少なくとも１種以上の他の化学療法剤とからなる医薬組成物である。 化学療法剤の例としては、イソニアジド、リファンピン、リファブチン、リファペンチン、ピラジナミド、エタンブトール、ストレプトマイシン、アミカシン、カナマイシン、エチオナミド、プロチオナミド、テリジドン、チアセタゾン、シクロセリン、カプレオマイシン、パラアミノサリチル酸（PAS）、ビオマイシン、オブロキサシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、ベダキリン、デラマニド、リネゾリド、テデゾリド、アモキシシリン-クラヴラン酸、メロペネム、イミペネム、クラリスロマイシン、又はクロファジミンが含まれる。
【００１９】
前記融合タンパク質と、少なくとも１種以上の他の抗菌剤とからなる医薬組成物。 抗菌剤の例としては、イソニアジド、リファンピン、リファブチン、リファペンチン、ピラジンアミド、エタンブトール、ストレプトマイシン、アミカシン、カナマイシン、エチオナミド、プロティオンアミド、テリジドン、チアセタゾン、シクロセリン、カプレオマイシンなどが挙げられる。パラアミノサリチル酸（ＰＡＳ）、ビオマイシン、オブロキサシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、ベダキリン、又はデラマニド、リネゾリド、テデゾリド、アモキシシリン-クラヴラン酸、メロペネム、イミペネム、クラリスロマイシン、又はクロファジミンが含まれる。
【００２０】
本発明の別の実施例は、被験者のがんの治療、又は予防の方法である。前記方法は、SEQ ID NO: 11―15、30、38―40、42―43、45―46、及び58のいずれか1つから選択される融合タンパク質、又はSEQ ID NO:31、41、44、及び59のいずれか1つから選択される核酸によってコードされる融合タンパク質からなる医薬組成物の有効量を被験者に投与することを含むものである。
【００２１】
本発明の別の実施例は、被験者の結核の治療、又は予防の方法である。前記方法は、SEQ ID NO:11から15、30、38から40、42から43、45から46、及び58のいずれか１つから選択される融合タンパク質、並びにSEQ ID NO:31、41、44、及び59のいずれか１つから選択される核酸によってコードされる融合タンパク質からなる医薬組成物の有効量を被験者に投与することを含むものである。
【００２２】
本発明の別の実施例は、本発明のＤＮＡ発現ベクターからなる原核生物細胞株である。
【００２３】
本発明の別の実施例は、本発明のＤＮＡ発現ベクターからなるキットである。
【００２４】
本発明の別の実施形態は、SEQ ID NO: 2からなるtoxPである。
【００２５】
本発明の別の実施例は、SEQ ID NO: 11―15、30、38―40、42―43、45―46、及び58のいずれか１つのタンパク質、又はSEQ ID NO: 31、41、44、及び59のいずれか１つから選択される核酸によってコードされるタンパク質である。
【００２６】
本発明の別の実施例は、被験者のがんを治療、又は予防する方法である。前記方法は、がんに罹患しているか、又は罹患しやすい被験者に、被験者の制御性Ｔ細胞（Tregs）を減少させる第１剤を投与し、次いでチェックポイント阻害剤からなる第２剤を被験体に投与することを含むものである。本発明の方法は、例えば、結腸がん、腎細胞がん、メラノーマ、多形性膠芽腫、肺がん、固形がん、腎がん、乳がん、表皮上がん、又はそれらの組み合わせを含むがんを治療、又は予防する方法である。本発明で使用される適切な第１剤として、本明細書、又は図54、55、及び56５に記載された本発明のジフテリア毒素融合タンパク質の１つ以上が含まれる。 本発明のいくつかの実施例では、ジフテリア毒素融合タンパク質は、ジフテリア毒素フラグメントＡ、又はその機能的部分；ジフテリア毒素フラグメントＢ、又はその機能的部分；又はそれらの組み合わせからなるものである。本発明のいくつかの実施例では、ジフテリア毒素融合タンパク質は、ヒトインターロイキン配列を含んでいる。 本発明のいくつかの実施形態では、ヒトインターロイキン配列は、IL-2タンパク質、又はその機能的部分、IL-4タンパク質、又はその機能的部分、又はそれらの組み合わせからなる。いくつかの実施例では、ジフテリア毒素融合タンパク質は、デニロイキン・ディフティトックスを投与された対照と比較し、血管漏出を減少させる。本発明の方法で使用される血管漏出の減少を有する好適なジフテリアトキシン融合タンパク質の例は、明細書、及び図56に記載されており、例えば、SEQ ID NO: 10、15、43、13、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、111、113、115、117、119、1２１、121、123、125、127、129、又はそれらの機能部分、又はそれらの組み合わせが挙げられる。 第１剤の他の例としては、SEQ ID NO: 13、又はその機能部分、SEQ ID NO:58、又はその機能部分、SEQ ID NO: 15、又はその機能部分、SEQ ID NO：43、又はその機能部分、又はそれらの組み合わせが挙げられる。SEQ ID NO:13、58、15、及び43、又はその機能的部分は、上記、又は本明細書中に記載されている他の配列と組み合わせることがある。 本発明の方法において使用される適切なチェックポイント阻害剤の例は、抗CTLA-4抗体、又はその機能的部分、抗PD-1抗体、又はその機能的部分、抗PD-L1抗体、又はその機能的部分、又はそれらの組み合わせが含まれる。本発明の他の実施例において、チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ（抗CTLA-4）、ニボルマブ（抗PD-1）、ペンブロリズマブ（抗PD-1）、アテゾリズマブ（抗PD-L1）、アベルマブ（抗PD-L1）、デュルバルマブ（抗PD-L1）、又はそれらの組み合わせからなるグループから選択される。請求項１の方法は、第１剤が、SEQ ID NO:10、13、15、43、13、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、又はそれらの機能部分、又はそれらの組み合わせからなるタンパク質配列をコードする発現ベクターが含まれている。発現ベクターは、図54、55、56、本明細書に記載の本発明のＤＮＡ配列、その機能部分、又はそれらの組み合わせからなることがある。
【００２７】
本発明の別の実施例は、血管漏出を減少したジフテリア毒素融合タンパク質で、SEQ ID NO:10、15、43、13、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、又はそれらの機能部分、又はそれらの組み合わせからなるものを含むものである。
【００２８】
本発明の別の実施例は、図56に例示された減少した血管漏出を有するジフテリア毒素融合タンパク質をコードする核酸配列であり、SEQ ID NO:61、63、65、67、69、71、73、75,77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、機能的部分、又はそれらの組み合わせを含むものである。これらのDNA配列は、一般的には発現ベクターに含まれる。
【００２９】
本発明の別の実施例は、図56に記載のs-DAB1-389-IL2-V6A、s-DAB1-389-IL2-D3E、その他の一重、又は二重変異タンパク質、それらの機能的部分、又はそれらの組み合わせを血管漏出症候群に罹患している、又は罹患しやすい被験者に、投与することにより、血管リーク症候群を治療、又は予防する方法である。また、図56に記載のｓ-DAB1-389-IL2-V6A、s-DAB1-389-IL2-D3E、他の一重もしくは二重変異体タンパク質、それらの機能的部分、又はそれらの組み合わせを投与されていない対照被験者と比較して、患者の血管漏出症候群の治療、又は予防する方法である。
【００３０】
本発明の別の実施例は、結腸がん、腎がん、及び／又は乳がんに罹患しているか、又は罹患しやすい被験者に、図56に記載のs-DAB1-389-IL2-V6A、s-DAB1-389-IL2-D3E、その他の一重、又は二重変異タンパク質、それらの機能部分、又はそれらの組み合わせを投与することにより、被験者の結腸がん、腎がん、及び／又は乳がんを治療、又は予防する方法である。 また、図56に記載のs-DAB1-389-IL2-V6A、s-DAB1-389-IL2-D3E、他の単一、又は二重変異タンパク質、その機能的部分、又はそれらの組み合わせを投与されていない対照被験者と比較して、被験者のがんを治療、又は予防する方法である。
【００３１】
本発明の別の実施例は、s-DAB１-389-IL2-V6A、s-DAB1-389-IL2-D3E、DAB1-389-hIL4-Ｖ6Ａ、s-DAB1-389-hIL4-D3E、又はその組み合わせを投与することにより、被験者の骨髄由来のサプレッサー細胞を枯渇させる方法である。またs-DAB1-389-IL2-V6A、s-DAB1-389-IL2-D3E、DAB1-389-hIL4-V6A、s-DAB1-389-hIL4-D3E、又はその組み合わせを投与されていない対照被験者と比較して、被験者の骨髄由来のサプレッサー細胞を枯渇させる方法である。
【００３２】
本発明の別の実施例は、CD124+腫瘍を罹患しているか、又は罹患しやすい被験者にs-DAB1-389-IL4-V6A、s-DAB1-389-IL4-D3E、又はそれらの組み合わせを投与することにより、CD124+腫瘍を枯渇させる方法である。また、s-DAB1-389-IL4-V6A、s-DAB1-389-IL4-D3E、又はそれらの組み合わせを投与しなかった対照被験者と比較して腫瘍を枯渇させる方法である。 CD124+腫瘍の１例は、トリプルネガティブ乳がんである。
【００３３】
本発明の別の実施例は、EGFRを発現する腫瘍を有するか、又は発現する腫瘍になりやすい被験者に、s-DAB1-389-EGF-V6A、s-DAB1-389-EGF-D3E、又はそれらの組み合わせを投与するステップを含む、EGFRを発現する腫瘍を除去させる方法である。 s-DAB１-３８９-EGF-V６A、s-DAB１-３８９-EGF-D３E、又はその組み合わせを投与されていない対照被験者と比較して、被験者の腫瘍を除去する方法である。 EGFRを有する腫瘍の１例は、多形膠芽腫である。
【００３４】
（定義）
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的、及び科学的用語は、本発明が属する技術に熟練した者によって一般的に理解される意味を有する。 以下の参考文献は、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。 本明細書で使用される場合、以下の用語は、特に 明記されていない限り、それらに付随する意味を有する。
【００３５】
「活性」という用語は、必須アミノ酸トリプトファン（trp）のN-ホルミルキヌレニンへの分解を触媒するインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（酸化還元酵素）などの機能を実行する遺伝子の能力を指す。
【００３６】
「薬剤」とは、任意の低分子化合物、抗体、核酸分子、ポリペプチド、又はそれらの断片を意味する。
【００３７】
「改善する」では、疾患の発生や進行を減少させる、抑制する、減衰させる、減少させる、停止させる、又は安定させることを意味する。
【００３８】
「変化」とは、本明細書に記載されているような標準的な技術的に知られた方法によって検出されるような遺伝子、又はポリペプチドの発現レベル、又は活性の変化（増加、又は減少）を意味する。 本明細書で使用されるように、変化は、発現レベルの１０％の変化、好ましくは２５％の変化、より好ましくは４０％の変化、最も好ましくは５０％以上の変化を含む。
【００３９】
「アナログ」、「類似」とは、同一ではないが、似た機能的、又は構造的特徴を有する分子を意味する。 例えば、ポリペプチドアナログは、対応する天然に存在するポリペプチドの生物学的活性を保持する一方で、天然に存在するポリペプチドと相対的にアナログの機能を高める特定の生化学的修飾を有する。 そのような生化学的修飾は、例えばリガンド結合を変化させることなく、アナログのプロテアーゼ耐性、膜透過性、又は半減期を増加させ得る。 アナログは、非天然アミノ酸を含んでいてもよい。
【００４０】
c-は、c-デニロイキン・ディフティトックスのような用語が付けられている場合には「クラシック」を意味し、Ontak（商標）、又は市販のタンパク質を意味する。
【００４１】
「疾患」とは、細胞、組織、又は器官の正常な機能に損傷を与えたり、干渉したりするあらゆる状態、又は障害を意味する。 疾患の例としては、がんや結核などがある。
【００４２】
用語「ＤＴ」は、ジフテリア毒素を指す。
用語「ＤＴ」及び「ｓ-ＤＡＢ」は互換的に使用され、ジフテリア毒素フラグメントＡ、及びフラグメントＢの一部の分泌形態を指す。
【００４３】
「有効量」とは、未治療の患者に対して疾患の症状を改善するために必要な量を意味する。 疾患の治療的治療のために本発明を実施するために使用される活性化合物の有効量は、投与方法、対象者の年齢、体重、及び一般的な健康状態によって異なる。 最終的には、主治医、又は獣医師が適切な量、及び用量レジメンを決定する。 このような量を「有効量」という。
【００４４】
「EGF」とは、上皮成長因子を意味する。
【００４５】
「EGFR」とは、上皮成長因子受容体を意味する。
【００４６】
用語「発現」は、例えばその対応するmRNA、又はタンパク質配列を含む遺伝子産物を発現する遺伝子の能力を指す。
【００４７】
「フラグメント、断片」とは、ポリペプチド、又は核酸分子の一部を意味する。 この部分は、好ましくは、参照核酸分子、又はポリペプチドの全長の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、又は90％を含む。 フラグメント、断片は、10、20、30、40、50、60、70、80、90、又は100、200、300、400、500、600、700、800、900、又は1000個のヌクレオチド、又はアミノ酸を含んでいてもよい。
【００４８】
is-は、is-デニロイキン・ディフティトックスのような用語に付けられた場合には、シグナルペプチドを含む未成熟分泌のデニロイキン・ディフティトックスを意味する。
【００４９】
ms-は、「成熟分泌された」を意味する。ms-デニロイキン・ディフティトックスのような用語が付けられている場合、ms-デニロイキン・ディフティトックスは、処理されてシグナルペプチドを含まない成熟分泌されたデニロイキン・ディフティトックスを意味する。
【００５０】
ｎ-は、「新しい、新規の」を意味する。ｎ-デニロイキン・ディフティトックスのような用語が付けられている場合、「新しい、新規の」という意味である。
【００５１】
本明細書で使用されるように、「予防」、「防ぐ」、「予防処置」、「予防治療」等の用語は、障害、又は状態を発症していないが、障害、又は状態を発症する危険性があるか、又は発症しやすい対象者において、障害、又は状態を発症する確率を減少させることを意味する。
【００５２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書において、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。 この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸のアナログ、又は擬態であるアミノ酸ポリマー、及び天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。 ポリペプチドは、例えば、糖タンパク質を形成するための炭水化物残基の付加によって修飾され得る。 用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、非糖タンパク質と同様に、糖タンパク質を含む。
【００５３】
用語「純度」は、他のポリペプチドを含まない医薬組成物中に存在する本発明のポリペプチドの量を指す。  例えば、約80％の純度を有する医薬組成物中に存在する本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの約80％より大きい量が完全長であり、かつ約20％未満の製品関連ポリペプチド、又は非関連ポリペプチドのいずれかによって汚染されていることを意味する。 純度は、例えば、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、及びクーマシーブルーによる染色、本願に記載されている方法、又は当技術分野の当業者に知られている他の方法によって決定することができる。
【００５４】
用語「凝集体フリー、全長、単量体ポリペプチド」とは、単量体形態で医薬組成物中に存在する本発明のポリペプチドの量を意味する。 例えば、約80％より大きい凝集体フリー、完全長、モノマーポリペプチドからなる本発明の医薬組成物は、完全長ポリペプチドの約80％より多い量がモノマー形態で存在することを意味する。 凝集体フリー、全長、単量体ポリペプチドの量は、例えば、既知の単量体ポリペプチドをサイズ標準として使用するゲルパーミエーションクロマトグラフィー、又は非還元、SDSフリーのネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動、本明細書に記載されている方法、又は当技術分野の当業者に知られている他の方法によって決定することができる。
【００５５】
「削減」、「減少」、「低下」によって、少なくとも10％、25％、50％、75％、又は100％の負の変化を意味する。
【００５６】
「リファレンス、参照」とは、標準、又は対照条件を意味する。例えば、試料（ヒト細胞）、又は被験体などが、EQ ID NO:11―15のいずれかの核酸、又はタンパク質配列からなる本発明の1つ以上の組成物、又はその融合タンパク質などの薬剤に曝されていない、又は実質的にさらされていないことを意味する。
【００５７】
「参照配列」とは、配列比較の基礎として使用される定義された配列である。参照配列は、指定された配列のサブセット、又は全体であってもよく、例えば、完全長cDNA、又は遺伝子配列のセグメント、又は完全なcDNA、又は遺伝子配列である。 ポリペプチドの場合、参照ポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約16アミノ酸、好ましくは少なくとも約20アミノ酸、より好ましくは少なくとも約25アミノ酸、さらに好ましくは約35アミノ酸、約50アミノ酸、又は約100アミノ酸からなる。 核酸については、参照核酸配列の長さは、一般に、少なくとも約50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約60ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約75ヌクレオチド、さらに好ましくは約100ヌクレオチド、、又は約300ヌクレオチド、又はその間の任意の整数となる。
【００５８】
s-は、s-デニロイキン・ディフティトックスのような用語が付けられた場合に「分泌された」という意味である。分泌されたデニロイキン・ディフティトックスには、is-形態、及びm-形態が含まれる。
【００５９】
本明細書で使用されるように、用語「被験者」は、本明細書に記載された方法が実行される任意の個体、又は患者を指すことが意図される。 当業者には理解されるであろうが、一般に、被験者はヒトであるが、被験者は動物であってもよい。したがって、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモットを含む）、ネコ、イヌ、ウサギ、牛、馬、ヤギ、ヒツジ、ブタなどを含む農場動物、及び霊長類（サル、チンパンジー、オランウータン、ゴリラを含む）などの哺乳動物を含む他の動物が、被験者の定義内に含まれる。
【００６０】
「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されたアミノ酸配列のいずれか１つ）、又は核酸配列（例えば、本明細書に記載された核酸配列のいずれか１つ）と少なくとも５０％の同一性を示すポリペプチド、又は核酸分子を意味する。 好ましくは、そのような配列は、比較に使用される配列とアミノ酸レベル、又は核酸レベルで少なくとも60％、より好ましくは80％、又は85％、より好ましくは90％、95％、又はさらに好ましくは99％の同一性を示す。
【００６１】
配列同一性は、一般的には、配列解析ソフトウェア（例えば、Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705、BLAST、BESTFIT、GAP、又はPILEUP/PRETTYBOXプログラム）。このようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、及び／又は他の改変に相同性の程度を割り当てることにより、同一、又は類似の配列をマッチさせる。 保存的置換は、典型的には、以下のグループ内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定するための例示的なアプローチでは、BLASTプログラムを使用してもよく、ｅ-３とｅ-１００の間の確率スコアは、密接に関連した配列を示す。
【００６２】
本明細書で提供される範囲は、範囲内のすべての値の省略表現であると理解される。 例えば、1―50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、又は50からなる群から選択される任意の数、数の組み合わせ、又は部分範囲を含むものと理解される。
【００６３】
本明細書で使用されるように、「治療する」、「処置する」、「処理する」などの用語は、それに関連する障害、及び／又は症状を軽減、又は改善することを指す。 排除されないが、障害、又は状態を治療することは、それに関連する障害、状態、又は症状を完全に除去することを必要としないことが理解されるであろう。
【００６４】
本明細書で使用されるように、具体的に記載されているか、文脈から明らかでない限り、用語「又は」は包括的であると理解される。 本明細書で使用されるように、特に記載されていないか、文脈からは明白でない限り、用語「前記の」は、単数形、又は複数形であると理解される。
【００６５】
本明細書で使用されるように、特に記載されていない限り、又は文脈から明らかでない限り、「約」という用語は、当技術分野における通常の許容範囲内、例えば平均値の2標準偏差内であると理解される。 「約」は、記載された値の10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、又は0.01％の範囲内であると理解することができる。 文脈から明らかでない限り、本明細書で提供されるすべての数値は、約という用語によって修正される。
【００６６】
本明細書において、変数の任意の定義における化学基のリストの列挙は、その変数を任意の単一のグループ、又はリストされたグループの組み合わせとして定義することを含む。本明細書において、変数、又は側面に関する実施形態の列挙は、その実施例を、任意の単一の実施例として、又は任意の他の実施例、又はその一部と組み合わせて含む。
【００６７】
本明細書で提供される任意の組成物、又は方法は、本明細書で提供される他の組成物、及び方法のうちの１つ以上と組み合わせることができる。
【００６８】
VLM-は、デニロイキン・ディフティトックス-VLMのような用語に付着した場合、「血管漏出変異」を意味する。
【００６９】
w-は、w-デニロイキン・ディフティトックスのような用語が付けられている場合、「野生型」を意味し、w-デニロイキン・ディフティトックスは野生型-デニロイキン・ディフティトックスを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】a）本発明の変異toxO（SEQ ID NO:１）の配列図である。b）野生型toxO（SEQ ID NO: 25）の配列図である。
【図２】a）Ontak（商標）の製造に使用されるクラシック・デニロイキン・ディフティトックス（c-デニロイキン・ディフティトックス）発現ベクターの模式図である。配列はSEQ ID NO:26として開示される。ｂ）本発明のtoxプロモーター（toxP）、及び変異toxOを含む分泌型デニロイキン・ディフティトックス（s-デニロイキン・ディフティトックス）発現ベクターの模式図である。配列はSEQ ID NO:27として開示される。
【図３】c-デニロイキン・ディフティトックス-VLMは、IL2受容体を有する細胞を殺すという点で、c-デニロイキン・ディフティトックスと同等の効力を有することを示す図である。
【図４】c-デニロイキン・ディフティトックスVLMはインビトロでは血管漏出を起こさないことを示す図である。
【図５】マウス生存モデルを用いて、c-デニロイキン・ディフティトックス-VLMがc-Ontak（商標）に比べてインビトロでの急性毒性が有意に低いことを示すマウス毒性アッセイの結果のインビトロの血管漏出の結果と測定法の模式図である。
【図６】本発明のジフテリア毒素ベースの融合タンパク質毒素プラットフォーム技術を例示する模式図である。
【図７】toxプロモーター（SEQ ID NO: 2のtoxP）と変異toxオペレーター（toxO）（DNA SEQ ID NO: 1）、シグナルペプチド（DNA SEQ ID NO: 4）がｃ-デニロイキン・ジフィトックスＤＮＡ配列（DNA SEQ ID NO: 6）に付着したプラスミドpKN2.6Z-LC127を示す模式図である。
【図８】a）Ontak（商標）を大腸菌の細胞質封入体として製造する従来のプロセスの問題点の模式図である。SEQ ID NO: 28としてfMGADD配列を開示する。b）Ontak（商標）タンパク質よりも１個少ないアミノ酸を有する分泌デニロイキン・ディフティトックスを製造する簡単でクリーンな製造プロセスの模式図である。SEQ ID NO: 29としてGADD配列を開示する。
【図９】本発明の方法により調製されたs-デニロイキン・ディフティトックスがCorynebacterium diphtheriae（ジフテリア菌）株C7β(-)、tox(-)内に発現し、培養液中に分泌される本発明の方法により調製されたs-デニロイキン・ディフティトックスの免疫ブロットを示す図である。
【図１０】本発明のデニロイキン・ディフティトックスが、結核肉芽腫内のIL-2R（CD25+）発現Ｔ細胞（Tregs）を枯渇することが期待される機構の模式図である。 Tregsは、Teff細胞を阻害することにより免疫抑制性を起こす。
【図１１】マウス結核モデルを用いたOntak の結核に対する試験計画を示す図である。
【図１２】結核菌に感染した被験者（マウス）をジフテリア毒素ベースの融合タンパク質で治療した結果を示す図である。
【図１３】種々のジフテリア毒素ベースの融合タンパク質レジメンで治療した結核菌感染マウスの肺のCFUを示す図である。
【図１４】悪性黒色腫の被験者（ヒト）をジフテリア毒素ベース融合タンパク質で治療した結果を示す図である。
【図１５】His（ヒスチジンタグ）を用いたVLM s-Ontak、及び関連タンパク質の迅速な産生のための３つのコンストラクト（「His6/6x His」、及び「His9/9x His」は、それぞれSEQ ID NO: 23、及び48として開示されている）の模式図である。
【図１６】C末端His6 VLM s-Ontak-His6コンストラクト（SEQ ID NO: 23として開示されている）を用いて製造された純度97%以上の精製VLM s-Ontak-His6 SEQ ID NO:43（"His6"は、DNA SEQ ID NO:23として開示されている）の電気泳動の図である。具体的には、VLM s-Ontak-His6をコードする遺伝子コンストラクト（SEQ ID NO:23として開示されている「His6」）を保有する組換え体C. diphtheriae（ジフテリア菌）を光学密度（OD）が約12になるように培養し、培養上清を採取し、30 kDaの分子量カットオフ膜を用いたタンジェニタルフロー限外ろ過で濃縮し、上記のようにタンジェニタルフロー限外ろ過を用いてバッファー交換のために透析ろ過を行った。得られたタンパク質混合物をNi-アフィニティークロマトグラフィーで部分的に精製した後、S-100樹脂を用いたゲル浸透クロマトグラフィーで97％以上に精製した。 得られたVLM s-Ontak-His6SEQ ID NO:43（SEQ ID NO:23として開示されている「His6」）は、97％以上の純度であった。
【図１７】C末端His6 s-Ontakコンストラクト（SEQ ID NO:58-59;SEQ ID NO: 23として開示されている"His6"）を用いて製造された純度97%以上の精製s-Ontakを例示している。 具体的には、s-Ontak-His6をコードする遺伝子コンストラクト（SEQ ID NO: 23として開示されている「His6」）を保有する組換え体C．diphteriae（ジフテリア菌）をOD約12まで増殖させ、培養上清を採取し、分子量30kDaのカットオフ膜を用いたタンジェニタルフロー限外ろ過により濃縮し、上記のようにタンジェニタルフロー限外ろ過を用いたバッファー交換のために透析ろ過を行った。得られたタンパク質混合物をNi-アフィニティークロマトグラフィーで部分的に精製した後、S-100樹脂を用いたゲル浸透クロマトグラフィーで97％以上に精製した。得られたs-Ontak-His6（「His6」は、SEQ ID NO: 23として開示されている）は、97％以上の純度であり、4℃で安定であった。
【図１８】C末端His6 VLM s-Ontak-His6（SEQ ID NO: 23として開示されているHis6）を用いて製造された純度97%以上の精製VLM s-Ontak-His6（"His6"）の電気泳動図である。 具体的には、VLM s-Ontak-His6をコードする遺伝子コンストラクト（SEQ ID NO: 23として開示されている「His6」）を保有する組換え体C. diphtheriae（ジフテリア菌）をOD約12まで増殖させ、培養上清を採取し、30 kDaの分子量カットオフ膜を用いたタンジェニタルフロー限外ろ過で濃縮し、上記のようにタンジェニタルフロー限外ろ過を用いてバッファー交換のために透析ろ過を行った。得られたタンパク質混合物をNi-アフィニティークロマトグラフィーで部分的に精製した後、S-100樹脂を用いたゲル浸透クロマトグラフィーで９７％以上に精製した。得られたVLM s-Ontak-His6（「His6」は、SEQ ID NO:23として開示されている）は、97％以上の純度であった。
【図１９】s-Ontak-His6（SEQ ID NO:23として開示されている "His6"）を精製するために使用されたS-100ゲルろ過カラムの図である。VLM s-Ontak-His6（SEQ ID NO:23として開示されている "His6"）は、既知の分子量のタンパク質の保持のために較正された：g-グロブリン（158 kDa）、オバルブミン（43.5 kDa）、及びミオグロビン（17 kDa）である。s-Ontak-His6（SEQ ID NO:23として開示されている「His6」）の保持時間は94分であり、s-Ontak-His6ポリペプチドは、見掛けの分子量が58kDaであり、二量体も高次凝集体もモノクローナル抗IL-2抗体でプローブした免疫ブロットによって検出されなかった。97％以上の凝集体のない完全長の単量体ジフテリア毒素融合タンパク質であることを確認した。
【図２０】HUVEC細胞単層透過試験を使用して、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来のSEQ ID NO:43をC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来のSEQ ID NO:58と比較した場合の血管漏出の減少を示す図である。  初期継代HUVEC細胞（継代数2-4、Lonza、Walkersville、MD、カタログ番号CC-2517から購入）は、完全な単層が形成されるまで、EndoGRO（商標）-LS培地中でデュアルチャンバー24ウェルプレートのインサートウェル上で増殖した。 FITC標識デキストランビーズ（10,000ダルトンサイズ）を上側ウェルに30分間添加した。 その後、下部チャンバーの蛍光強度を測定した。蛍光強度は、490nm励起、及び520nm発光で測定した。 最大シグナルは、10g／mlのLPSで観察されたものであった。
【図２１】毎日投与し、1日あたりの体重で評価した結果、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:43のマウスの忍容性はC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:58と比較すると増加していることを示す図である。また、死亡までの時間で評価した結果、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:43のマウスの致死率はC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:58と比較すると減少したことを示す図である。図21左は、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:43、又はC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:58を毎日17日間、又は死亡するまで投与した5匹のマウスの群の体重を示す図である。図21右は、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:43、又はC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:58を毎日17日間、図に示す投与量で死亡するまで連日投与した５匹のマウスの群のKaplan-Meier生存曲線を示す図である。
【図２２】C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:43は、インビトロでの細胞死において大腸菌由来SEQ ID NO:0と同等であり、インビボでのメラノーマ腫瘍増殖抑制においてはC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:58と同等であることを示す図である。図22右：マウスB16F10メラノーマ同種移植モデルを、5匹のマウスのグループを使用して、記載の通りに行った。PBS、又は示された融合毒素を、7日目、及び10日目の腫瘍後細胞注入において、1治療あたりマウスあたり5μgの用量で投与した。C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:43で処理したマウス、及びC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:58で治療したマウスの22日目の腫瘍体積は、互いに統計的には差がなかった。しかし、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO: 43、又はC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO: 58を投与されたマウスに比べて、PBS投与マウスの腫瘍体積は統計的に大きかった（p＜0.05）。図22左：C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO: 43のHUT-102細胞（CD25強陽性のヒトT細胞リンパ腫細胞）に対するインビトロでのIC50と、大腸菌由来のSEQ ID NO:10の同細胞に対するIC50の比較の図である。
【図２３】C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:43、及びC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:58がマウスの生体内でTreg細胞を枯渇させることを示す図である。図23左：治療したマウスから調製したマウス脾臓細胞のCD25陽性、FoxP3陽性CD4細胞の割合を示す結果の図である。図２３右：処置したマウスの脾臓細胞のCD25陽性、FoxP3陰性CD4細胞の割合を示す結果の図である。示されたデータは、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来のSEQ ID NO:58であり、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:43でも同様の結果が得られた。
【図２４】C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:43 + 抗PD-1抗体との2剤逐次治療は、いずれかの薬剤を単独で使用した場合と比較して、メラノーマ腫瘍の増殖抑制を改善することを示す図である。実験は、C57BL/6マウスのB16F10メラノーマ同種移植モデルを用いて、示された用量で示された薬剤を投与して実施した。抗PD-1抗体は、マウス１匹あたり100μｇの用量で投与した。  抗PD-1抗体＋C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:43で処理したマウスの25日目の腫瘍体積は、抗PD-1アイソタイプ対照で処理したマウスの腫瘍体積よりも有意に小さく、p＜0.05であった。
【図２５】C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:58の治療がメラノーマ腫瘍の増殖を抑制し、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:58を先に投与する逐次併用療法で、腫瘍細胞移植後7日目に治療を開始した場合に抗PD1抗体の効果が追加されることを示す図である。
【図２６】抗PD-1抗体、及びC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:58を用いた治療は、抗PD-1抗体単独治療、又はC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:58単独よりも、B16F10腫瘍におけるCD8+ IFNγ+リンパ球の頻度の増加をもたらすことを示す図である。
【図２７】C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:58による治療がメラノーマ腫瘍の増殖を抑制し、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来のSEQ ID NO:58を先に投与した逐次併用療法は、腫瘍細胞チャレンジ後10日目に治療を開始すると、抗PD1抗体の効果が増強されることを示す図である。この遅い治療開始は、図25（７日目に治療を開始した場合）に示したものよりも大きな腫瘍体積をもたらす。連続的な併用療法は、単独で投与された単剤療法の効果が最小限であったにもかかわらず、これらの大きな腫瘍に対して強力な活性を示した。
【図２８】SEQ ID NO: 15、又はSEQ ID NO:43（又はSEQ ID NO:13、又はSEQ ID NO:58）を最初に使用し、続いてチェックポイント阻害剤治療を実施する逐次二剤免疫療法を行うための理論的根拠を示す漫画モデルである。図に示されるように、チェックポイント遮断時に、Teff細胞は、高親和性IL-2受容体を発現し、SEQ ID NO:15、又はSEQ ID NO:43（又はSEQ ID NO: 13、又はSEQ ID NO: 5８）に感受性である。したがって、最初にSEQ ID NO:15、又はSEQ ID NO:43（又はSEQ ID NO:13、又はSEQ ID NO:58）でTreg細胞を枯渇させ、その後のチェックポイント遮断を行うことにより、阻害性Treg細胞の非存在下でのTeff細胞の活性化が可能となり、抗腫瘍効果改善を導く。
【図２９】s-Ontak-His6（SEQ ID NO: 58）を発現するコンストラクトをもつ組換えC. diphtheriae（ジフテリア菌）の培養上清を濃縮し、部分精製したものの抗IL-2抗体によるウエスターンブロットの図である。同じように調製した培養上清を10マイクロリットル、又は50マイクロリットルを図に示すようにゲルにロードした。ブロットを、短い（5秒）、中間（15秒）、又は長い（30秒）露光時間で現像した。図は、C. diphtheriae（ジフテリア菌）C7(-)の2つの異なる株（野生型、及びDdtxR変異体）で発現された2つの異なるプロモーター-オペレーター配列（SEQ ID NO:2、及びSEQ ID NO: 83）からのタンパク質収量の比較レベルを示している。図に見られるように、DdtxR変異体で、野生型（WT）プロモーター-オペレーター配列（SEQ ID NO:83）を持つコンストラクトで、目標の全長58 kDaのs-Ontak-His6タンパク質（SEQ ID NO:58）が有意に改善されたレベで発現（赤矢印）される。
【図３０】SEQ ID NO: 15、及び関連タンパク質を部分的に精製するための疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用した例の図である。
【図３１】SEQ ID NO: 43によりトリプルネガティブ乳がんのマウス4T1細胞モデルで腫瘍内のTregs（CD3+ CD4+ CD25+ FoxP3+）、及び活性化Tregs（CD3+ CD4+ CD25+ FoxP3+ CD39+）の枯渇することを示す図である。マウスのグループは、0日目に、20,000個の4T1細胞を乳腺組織内に同所移植した。マウスは、10日目、12日目、及び14日目に、PBS（グループ1）、又は10μgのSEQ ID NO: 43（s-Ontak-V6A-His6、グループ2）のいずれかを腹腔内投与し治療した。マウスを腫瘍移植後17日目に安楽死させ、腫瘍を除去した。 除去した腫瘍を単細胞に分散調整し、フローサイトメトリーを分析した。
【図３２】マウスB16メラノーマ同系腫瘍モデルで、SEQ ID NO: 43を単剤で使用した場合、又は抗PD1抗体との二剤療法として逐次使用した場合の抗腫瘍効果を示す図である。図に見られるように、SEQ ID NO: 43は強力な単剤療法である。さらに、初期治療として使用した後、抗PD1抗体との併用療法として（投与の重複がないように）連続的に使用した場合、SEQ ID NO:43は、抗PD1抗体の有効性を大幅に高める。
【図３３】SEQ ID NO: 43の抗腫瘍効果は、腫瘍進行の後期（10日目）に使用しても維持されることを示す図である。本データは、腫瘍移植後 10日目（7日目とは対照的に）に治療を開始したマウスB16メラノーマ同系腫瘍モデルで、SEQ ID NO:43は単剤療法として、又は抗 PD1 抗体との逐次二剤療法として有効であることを示している。このように、SEQ ID NO: 43は強力な単剤療法である。さらに、SEQ ID NO: 43は、二剤逐次治療として使用される場合、抗PD1抗体の有効性を大幅に増加する。この図は、SEQ ID NO:43（単剤療法、又は二剤逐次療法として）の活性が、腫瘍の進行中の遅い時期に治療を開始した場合でも実証可能であることを示すものである。
【図３４】CT26同系結腸がんマウスモデルでSEQ ID NO:58の抗腫瘍効果を示す図である。各グループ5匹のマウスを使用し、5x105個の腫瘍細胞を０日目に移植した。次いで、抗PD1アイソタイプ対照抗体、抗PD1抗体単剤療法、SEQ ID NO:58（s-Ontak-His6）単剤療法、又はSEQ ID NO: 58＋抗PD1抗体のいずれかを、図示した日に腹腔内投与した。グラフは、腫瘍体積の経時的変化を示すものである。図に見られるように、SEQ ID NO:58による単剤療法、及びSEQ ID NO:58に続いて抗PD1を併用した二剤逐次療法は、腫瘍の増殖を良好に制御することが可能であった。
【図３５】RENCA細胞同系腎細胞がんマウスモデルでSEQ ID NO:58の抗腫瘍効果を示す。    各グループ７匹のマウスを使用し、5x105個の腫瘍細胞を０日目に移植した。  次いで、抗PD1アイソタイプ対照抗体、抗PD1抗体単剤療法、SEQ ID NO:58（s-Ontak-His6）単剤療法、又はSEQ ID NO:58＋抗PD1抗体のいずれかを、図示した日に腹腔内投与した。グラフは、腫瘍体積の経時的変化を示すものである。図に見られるように、SEQ ID NO: 58を用いた単剤療法、及びSEQ ID NO:58に続いて抗PD1を併用した二剤逐次療法は、腫瘍の増殖を良好に制御した。実際、SEQ ID NO:58の単剤療法では、7匹中5匹のマウスは、20日目の安楽死時に触知可能な腫瘍が存在しなかった（示されている点は、触知可能な腫瘍を持っていた７匹中２匹のマウスの腫瘍体積を表している）。
【図３６】エネルギー最小化構造解析により、D3E変異によりVDSモチーフのセリン残基8との距離が4.0オングストロームから3.2オングストロームに狭くなることを明らかにしたことを示す模式図である。残基間の距離を縮めることでD3E変異は残基3と残基8の水素結合を強くすることを可能にする。このより強い水素結合は、タンパク質の安定化効果を持ち、s-Ontakの残基6、7、8に存在するVDSモチーフ（既知の血管漏出誘導トリペプチド配列）の哺乳類内皮細胞への曝露を制限する可能性がある。 パネルAは、Hornakら（PMID: 16981200）によって記載されているAmber ff99SB法を使用して導出されたSEQ ID NO: 13（s-Ontak）のタンパク質構造シミュレーションの図である。下がタンパク質の構造全体を示し、アルファヘリックス1（残基D3を含む）とアルファヘリックス2（残基V6D7S8を含む）の間のループの拡大図である。  潜在的な水素結合を点線で示す。パネルBは、SEQ ID NO: 13 (s-Ontak)では、D3-S8水素結合距離が4.0オングストロームであることを示し、パネルCは、D3E置換を行うことにより、E3-S8水素結合距離が3.2オングストロームに短縮され、より強い水素結合が形成されることを示す図である。 パネルDは、開示された3つの新規変異である。  D3E（SEQ ID NO:60）、D7E（SEQ ID NO:64）、及びS8T（SEQ ID NO:68）である。V6A置換は以前に開示されている（ＳEQ ID NO:15）。
【図３７】SYPRO Orange遊離蛍光測定法を用いたサーモシフト分析により、s-Ontak-His6（SEQ ID NO:58）、並びに他の変異タンパク質V6A-His6（SEQ ID NO:43）、並びにD7E-His6（SEQ ID NO: 66）に対するD3E-His6変異タンパク質（SEQ ID NO:62）の熱安定性が強化されたことを示す図である。図に示されたように、ポリペプチドの融解温度（Tm）は、高い順に  D3E-His6（SEQ ID NO: 62）、s-Ontak-His6（SEQ ID NO: 58）、D7E-His6（SEQ ID NO: 66）、及びV6A-His6（SEQ ID NO: 43）であり、それぞれ45.5℃、43.0℃、42.5℃、及び40.0℃である。
【図３８】様々な量の基質NADの存在下でのSYPRO Orange遊離蛍光測定法を用いたサーマルシフト分析結果の図である。図に示されてように、NADの量を増加させると、SEQ ID NO:58（s-Ontak-His6）、及びSEQ ID NO: 62（D3E-His6）の熱安定性を増加させる（Tmを増加させる）。  一方、安定性の低いタンパク質SEQ ID NO: 43（V6A-His6）、SEQ ID NO: 70（S8T-His6）、又はSEQ ID NO:66(D7E-His6）については、基質の添加による影響はほとんどない。また、触媒的に不活性なG52E-His6変異体のs-Ontakは、NADの添加によるサーマルシフトをほとんど示さない。
【図３９】SEQ ID NO:62(D3E-His6)は、Corynebacterium diphtheriae（ジフテリア菌）株C7(-)発現系でSEQ ID NO:58(s-Ontak-His6)に比べ、全体のタンパク質収率が4倍高いことが明らかになった。 パネルAは、s-Ontak-His6、D3E-His6、V6A-His6、及びS8T-His6のそれぞれをコードするDNA配列を有するプラスミドを保有する野生型C. diphtheriae（ジフテリア菌） C7(-)株、及びs-Ontakの触媒的に不活性なバージョンのG52Eをコードする類似のプラスミドコンストラクトから濃縮され精製されたタンパク質の等量に対応するクーマシーブルーで染色したSDS-PAGEゲルの図である。各プラスミドは、SEQ ID NO:2として開示されているPtox(WT)-変異オペレーター配列の制御下にある。SEQ ID NO:58、62、43、66、70、及びG52Eに対応する精製タンパク質（それぞれ、s-Ontak-His6、D3E-His6、V6A-His6、及びS8T-His6タンパク質）を、同一の培地、及び成長パラメータを用いた1.2リットルの発酵槽を稼働して、それぞれ調製した。培養上清からは、Cheung et al (PMID 30718426)の記載通り、タンジェニタルフロー限外ろ過と透析ろ過による濃縮、Ni-アフィニティークロマトグラフィーによる初期精製、Amicon遠心ユニットによる再濃縮、Sephacryl S100HRゲル浸透クロマトグラフィーによる最終精製をした。矢印は、融合タンパク質の予想分子量である58 kDaを示す。パネルＢは、発酵槽培養物1.2リットル当たりミリグラム単位の純粋なタンパク質の収量を示す棒グラフである。
【図４０】SEQ ID NO: 62 (D3E-His6)は、SEQ ID NO: 58 (s-Ontak-His)と比較して、CD25+細胞を殺す活性をほぼ完全に保持する。しかしながら、以前に開示されたように、SEQ ID NO: 43 (V6A-His6)は、活性が3―5倍低い。CD25+ MT-2細胞株（成人T細胞白血病、NIH AIDS Reagent Program Catalog number 237）に対するs-Ontak-His6、及び関連する変異体タンパク質の細胞毒性活性を示す図である。MT-2細胞を調製し、Cheungら（PMID: 30718426）に記載されるように図示されるジフテリア毒素融合タンパク質で処理した。細胞増殖能の測定には、MTS 試薬（Promega）を使用した。パネルA-D、及びパネルFは、SEQ ID NO: 62、43、66、70、及び58（D3E-His6、V6A- His6、D7E- His6、S8T- His6タンパク質、及びs-Ontak- His6）について、それぞれIC50値での殺傷曲線を示している。パネルＥは、s-Ontak-G52E-His6（触媒的に不活性）についての同じデータである。パネルHは、IC50値、及びs-Ontakに対するタンパク質の相対的な効力である。図に示されるように、SEQ ID NO:62(D3E- His6)の相対的な効力は0.84であり、SEQ ID NO:43(V6A- His6)の相対的な効力は0.20である。MT-2細胞アッセイによって決定されたIC50値は、（おそらく細胞株の継代数、及びCD25受容体の存在量に起因して）多少変動する可能性があることに注意することが重要である。示されている値は、以前に開示されているものとは多少異なるが、相対的な力価は、全体としてこのアッセイと一致している。以前に開示されたデータでは、SEQ ID NO:58(s-Ontak- His6)は0.12 pMのMT-2細胞IC50を有し、SEQ ID NO:43(V6A- His6)は0.33 pMのIC50であったことに注意が必要である。この例ではV6Aのs-Ontakに対する相対的な効力は0.36であり、この値は図40の0.20の値に同等である。
【図４１】s-Ontak、及び関連タンパク質によって誘導される血管漏出のレベルを定量化するHUVEC単層透過アッセイの結果を示す図である。SEQ ID NO:62(D3E-His6）、及びSEQ ID NO:43(V6A-His6）は、SEQ ID NO:58(s-Ontak-His6）よりも有意に低いレベルの血管漏出であった。
【図４２】s-Ontakに関連するペプチドによって誘導される血管漏出のレベルを定量化するＨＵＶＥＣ単層透過アッセイの結果の図である。15アミノ酸長のペプチドを合成し、精製した。前記ペプチドは、血管リーク関連トリペプチドモチーフ(x)D(y)を含むs-Ontakの残基1から15、及び残基23から37にまたがっており、ここでxはバリン、イソロイシン、ロイシン、又はグリシンであり、yはセリン、ロイシン、又はバリンである。図は、D3E、V6A、及びD29E置換を有する15アミノ酸長のペプチドは、対応する野生型15アミノ酸長のペプチドよりも低いレベルの血管漏出であったことを示している。
【図４３】半減期の図である。D3E-His6は、マウスにおいてs-Ontak-His6よりも有意に長い半減期を有する。同様に、s-Ontak-His6の半減期はV6A-His6の半減期よりも有意に長い。 推定された半減期は、それぞれs-Ontak-His6が150分、D3E-His6が240分、V6A-His6が60分であった。これらの半減期は、図37、及び図38に示すように、それぞれのタンパク質のサーマルシフトによる安定性に対応している。マウス血清中の前記タンパク質のレベルは、種々の前記タンパク質で処理したマウスの血清中のMT-2細胞（CD25+成体Ｔ細胞白血病細胞）阻害の生物学的活性によって決定され、経時的にモニターされた。
【図４４】2つの薬剤の投与量を変化させた場合のマウスの体重と生存曲線の図である。 D3E-His6とs-Ontak-His6はマウスにおいて同様の毒性を誘導する。s-Ontak-His6、及びD3E-His6の両方とも、１日3.2ｍｇ以上の用量で投与した場合、マウスの体重減少をもたらした。s-Ontak-His6、及びD3E-His6の最小致死量は1日3.2‐10mgである。
【図４５】B16同系メラノーママウスモデルでSEQ ID NO:62(D3E-His6）の抗腫瘍効果の図である。各グループ7匹のマウスを使用し、０日目に5x105個の腫瘍細胞を移植した。次に、抗PD1アイソタイプ対照抗体、抗PD1抗体単剤療法、SEQ ID NO:62（D3E-His6）単剤療法、又はSEQ ID NO: 62＋抗PD1抗体のいずれかを、図に示された日に腹腔内投与した。グラフは、腫瘍体積の経時的変化である。SEQ ID NO:62を用いた単剤療法、及びSEQ ID NO:62に続いて抗PD1抗体を用いた２剤逐次療法は、腫瘍増を良好に制御した。
【図４６】SEQ ID NO:98(s-DAB1-389-mIL4-V6A-His6)は、C. diphtheriae（ジフテリア菌） C7(-)で発現し、培養上清から容易に精製される。SEQ ID NO:98に対応する精製タンパク質を3リットルの発酵槽を稼働して調製した。発現コンストラクトは、SEQ ID NO:2（変異オペレーターを持つPtox）とSEQ ID NO:101（s-DAB1-389-mIL4-V6A-His6をコードするDNA）の融合体であった。このタンパク質は、Cheung et al (PMID 30718426)に記載されているように培養上清からタンジェニタルフロー限外ろ過、及び透析ろ過よる濃縮、Ni-アフィニティークロマトグラフィーによる初期精製、Amicon遠心ユニットによる再濃縮、及びSephacryl S100HRゲル浸透クロマトグラフィーによる最終精製で精製した。矢印は、前記融合タンパク質の予想分子量である57.2 kDaを示している。
【図４７】SEQ ID NO:134(s-DAB1-389-mIL4-His6）は、インビトロで4T1トリプルネガティブ乳がん細胞を殺す活性があること、インビトロで4Ｔ1細胞の遊走を阻害することを示す図である。パネルAは、細胞生存率をスコア化するためにトリパンブルーを使用し、SEQ ID NO:134の4T1細胞に対するIC50を決定した結果の図である。SEQ ID NO:134による増殖阻害のIC50は10 pMであった。パネルBは、細胞が最初に接種されたウェルの中間点からの細胞移動を視覚化するためにGiemsa染色を使用するクローン原性アッセイでの4T1細胞移動をスコアリングした結果の図である。SEQ ID NO:134による遊走阻害のIC50は800 pMであった。SEQ ID NO:134の濃度（nM）は、パネルの左端に示されている。
【図４８】SEQ ID NO:134(s-DAB1-389-mIL4-His6)は、マウスの4T1トリプルネガティブ乳房腫瘍を殺す活性があり、マウスのミエロイド由来のサプレッサー細胞（MDSC）を減少させ、マウスの肺転移を減少させることを示す図である。マウスの各グループに、0日目に20,000個の4T1細胞を乳腺組織内に同所移植した。マウスを、パネルＡのスキームで示されるように、PBS（グループ1）、5μgのSEQ ID NO:134（s-DAB1-389-mIL4-His6、グループ2）、又は10μgのSEQ ID NO:134（s-DAB1-389-mIL4-His6、グループ3）のいずれかで、8、11、13、15、18、20、22、及び25日目に腹腔内投与で治療した。パネルＡは、３つのグループの腫瘍体積を経時的に示し、SEQ ID NO:134による腫瘍成長の用量依存的な阻害を示す図である。パネルＢは、SEQ ID NO:134による治療が、CD45+CD11b+Gr1+細胞であると定義されたMDSCがあるマウス脾臓でのCD124+MDSCの割合を有意に減少させたことを示す図である。パネルＣは、２７日目に安楽死させたこのモデルのマウスの肺転移の存在量を示し、SEQ ID NO:134による腫瘍転移の用量依存的な阻害であることを示す図である。
【図４９】SEQ ID NO:134(s-DAB1-389-mIL4-His6)とSEQ ID NO: 43(s-DAB1-389-IL2-V6A-His6)は、マウスの4T1トリプルネガティブ乳房腫瘍を殺すのに相加的な効果がある。各グループのマウスは、0日目に乳腺組織に20,000個の4T1細胞を移植した。グループ１のマウスは、10、12、14、17、20、23、26、及び29日目にＰＢＳを腹腔内投与した。グループ２マウスは、10、12、及び14日目にSEQ ID NO:43（s-DAB1-389-IL2-V6A-His6）を10μg腹腔内投与した。  グループ３マウスは、17、20、及び23日目に10μgのSEQ ID NO:134（s-DAB1-389-mIL4-His6）を腹腔内投与し、26、及び29日目に5μgのＳEQ ID NO:134（s-DAB1-389-mIL4-His6）を腹腔内投与した。グループ４マウスは、SEQ ID NO：134（s-DAB1-389-mIL4-His6）とSEQ ID NO: 43（s-DAB1-389-IL2-V6A-His6）の両方を、グループ２マウスに与えたのと同様にSEQ ID NO: 43を３回投与し、グループ３マウスに与えたのと同様にSEQ ID NO: 134を5回投与した。パネルAは、実験の過程で測定した4つのグループの腫瘍体積の図である。パネルBは、30日目の剖検時の腫瘍重量の図である。パネルCは実験スキームの図である：緑の矢印は腫瘍体積の評価を示し、黄丸は安楽死を示し、青の矢印はSEQ ID NO: 43の投与を示し、赤の矢印はSEQ ID NO:  134の投与を示す。  "併用 "とは、SEQ ID NO: 43の3回投与、及びSEQ ID NO: 134の5回投与の組み合わせを受けたグループ4マウスを指す。
【図５０】SEQ ID NO:134（s-DAB1-389-mIL4-His6）、SEQ ID NO:43（s-DAB1-389-IL2-V6A-His6）、及び両剤の併用療法は、トリプルネガティブ乳がんマウス4T1モデルでCD124+腫瘍細胞を枯渇させることを示す図である。マウスを、0日目に乳腺組織内の4T1乳がん腫瘍細胞を注射で同所移植し、SEQ ID NO:34（s-DAB1-389-mIL4-His6）、SEQ ID NO:43（s-DAB1-389-IL2-V6A-His6）、及び併用療法を、図49に示されるスケジュールに従って治療した。腫瘍移植後22日目に安楽死したマウスから腫瘍を除去した。腫瘍を分散させ単細胞に調物し、次いでフローサイトメトリーで分析した。腫瘍細胞をCD45-CD3-とし、CD45-CD3-細胞のうちCD124+細胞の割合を決定した（CD124=IL4レセプター）。
【図５１】SEQ ID NO:134（s-DAB1-389-mIL4-His6）、SEQ ID NO:43（s-DAB1-389-IL2-V6A-His6）、及び両剤の併用療法は、トリプルネガティブ乳がんのマウス4T1モデルにおいて、CD124+ミエロイド由来の抑制細胞（MDSC）を枯渇させることを示す図である。マウスを、0日目に乳腺組織内の4T1乳がん腫瘍細胞を注射で同所移植し、SEQ ID NO: 134（s-DAB1-389-mIL4-His6）、SEQ ID NO: 43（s-DAB1-389-IL2-V6A-His6）、及び併用療法を、図49に示すスケジュールに従って投与した。脾臓細胞は、腫瘍移植後22日目、及び30日目に安楽死したマウスから調製した。MDSCをCD45+ CD11b+ Gr1+細胞と定義し、CD45+ CD11b+ Gr1+細胞のうちCD124+細胞の割合を決定した（CD124＝IL4受容体）。
【図５２】SEQ ID NO:106(s-DAB1-389-EGF-V6A-His6)は、C. diphtheriae（ジフテリア菌） C7(-)株で発現し、培養上清から容易に精製される。SEQ ID NO:106に対応する精製タンパク質を3リットルの発酵槽を稼働して調製した。発現コンストラクトは、SEQ ID NO:2（変異オペレーターPtox）とSEQ ID NO:107（s-DAB1-389-EGF-V6A-His6をコードするDNA）の融合体であった。タンパク質は、Cheungら（PMID 30718426）によって記載されているように、タンジェニタルフロー限外ろ過、及び透析ろ過による濃縮、Ni-アフィニティークロマトグラフィーによる初期精製、Amicon遠心ユニットによる再濃縮、及びSephacryl S100HRゲル浸透クロマトグラフィーでの最終精製で、培養上清から精製された。パネルAは、β-メルカプトエタノール（ME）の非存在下及び、存在下で精製されたタンパク質をSDS-PAGEゲルで分離しクーマシーブルー染色した図である。矢印は、融合タンパク質の予想分子量である48 kDaを示す。パネルBは、β-メルカプトエタノール（βME）の非存在下、及び存在下で精製されたタンパク質を実行したSDS-PAGEゲルから調製した免疫ブロットの図である。ブロットは、EGF（α-EGF）、ジフテリア毒素（α-Diph.Toxin）、及びHis6（α-His6）に対する抗体を用いて実施した。
【図５３】SEQ ID NO: 106（s-DAB1-389-EGF-V6A-His6）は、EGF受容体（EGFR）陽性細胞を殺す活性があることを示す図である。EGFRの高レベルを発現するA431類表皮がん細胞株に対するSEQ ID NO: 106の細胞毒性活性の図である。A431細胞を調製し、Cheungら（PMID: 30718426）に記載されているように、42時間、及び72時間SEQ ID NO:106で処理した。細胞増殖能を測定するためにMTS試薬（Promega）を使用した。A431細胞に対するSEQ ID NO:106のIC50は300 pM（42時間時点）であった。
【図５４】SEQ ID NO: 1-59の生物学的配列図である。
【図５５】SEQ ID NO: 60-135の生物学的配列図である。
【図５６】血管漏出低減、新規ターゲティングドメイン、過剰発現、及び変異体などの特徴に基づいて、SEQ ID NO をグループ化した図である。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
本発明の一実施例は、向上した純度、及び品質を有する凝集体を含まない単量体のジフテリア毒素融合タンパク質を産生するプロセスの発見である。このプロセスは、好ましくはCorynebacterium diphtheria（ジフテリア菌）の株を含む細菌を、本発明のDNA発現ベクターで形質転換することを含むものである。本発明のＤＮＡ発現ベクターは、好ましくは、toxプロモーター（toxP）と重複する新規変異toxオペレーター（toxO）、好ましくはシグナル配列、及びタンパク質をコードするＤＮＡ配列からなる特定の遺伝要素を含むように設計されている。好ましくは、タンパク質は、ジフテリア毒素、又はその機能部分と、標的受容体結合ドメイン、又はその機能部分とを含む融合タンパク質である。用語「その機能部分」とは、ジフテリア毒素タンパク質のうち、毒素として作用する部分、又はその受容体に結合する標的受容体結合ドメインの部分を意味する。本発明のＤＮＡ発現ベクターは、タンパク質がtoxプロモーター（toxP）、及び変異toxオペレーター（toxO）から発現されるように設計されている。
【００７２】
（変異toxO）
toxOは、中央のシトシン（C）塩基によって中断された2つの9bpの不完全な回文腕からなる19bpのオペレーター領域である。本発明者らによって発見された野生型toxO（図1b）、及び変異toxO（図1a）のオペレーターを図１に示す。SEQ ID NO:1は、本発明の変異toxOのDNA配列の一実施例を示すものであり、toxPは、SEQ ID NO:2のDNA配列を有するプロモーターであり、SEQ ID NO:2は、toxPのDNA配列がtoxOのDNA配列を含むことを示すものである。SEQ ID NO:3は、toxP、tox0、シグナルペプチド、及びタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を例示する。SEQ ID NO:3のアスタリスクは、変異体toxOを作製するために導入された変化を示す。
【表１】
2021515774.tif 000002
【表２】
2021515774.tif 000003
【００７３】
toxOのDNAオペレーター配列は、ジフテリア毒素リプレッサーとして知られるタンパク質、DtxRに結合している。DtxRは、遺伝子発現を制御することができるグローバルな鉄活性化制御タンパク質である。鉄欠乏状態では、Fe2+とFe3+イオンがアポ-DtxRに結合して構造変化を起こし、DtxRリプレッサーのホモ二量体が形成され、このホモ二量体がtoxオペレーター（toxO）DNA配列に結合してtox遺伝子発現を抑制する。低鉄環境下では、Fe2+とFe3+イオンがDtxRから解離し、DtxRはDNA結合能力を失い、オペレータから解離することで、tox遺伝子産物の発現が可能となる。 図１ｂは、野生型toxOのDNA配列を示す。
【００７４】
Fe2+、及びFe3+イオンのtox発現抑制効果を克服するために、野生型(WT)のtoxOを変異toxOのDNA配列に置換したDNA発現ベクターを作製した。この変化は、tox遺伝子発現のFeイオン媒介制御をブロックする。図１Ａ、SEQ ID NO:１、及びSEQ ID NO:３は、本発明の変異toxOのＤＮＡ配列を示す。本発明では、toxP、及び変異toxOの制御下でジフテリア毒素融合タンパク質をコードする組換えプラスミドを宿主とする大腸菌、及びC. diphtheriae（ジフテリア菌）のような細菌は、Fe完全培地中で増殖させてもよく、高密度まで増殖させてもよく、発現を誘導するためにFe非含有培地へのシフトを必要としない。鉄欠乏性培地でのtox遺伝子産物の恒常的発現は、この分野における重要な進歩である。C. diphtheriae（ジフテリア菌）、具体的にはC7β(-)、tox(-)株は、本発明のDNA発現ベクターを用いたジフテリア毒素関連の組換えタンパク質のすべての生産のための好ましい宿主細菌である。本発明のＤＮＡ発現ベクターは、大腸菌などの他の細菌でも使用することができる。
【００７５】
DNA発現ベクター
本発明のＤＮＡ発現ベクターは、toxP、変異toxO、タンパク質をコードするＤＮＡ配列、好ましくはシグナル配列を含む。SEQ ID NO:３は、本発明のＤＮＡ発現ベクターの一部であり得るこれらの遺伝的要素を含むＤＮＡ配列の一例である。前述のように、ＳEQ ID NO:３で観察されるアスタリスクは、変異体と野生型toxOとの間の塩基対の変化の上に配置されている。SEQ ID NO:３は、toxPが1塩基から30塩基まで延び、toxOが24塩基で始まり42塩基で終わるように番号が付けられている（下線付きDNA配列の前）。下線部のDNA配列は、塩基74から塩基148までを表し、25アミノ酸シグナル配列をコードするDNAの領域である（SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、及び図2においても観察される）。本発明のDNA発現ベクターは、好ましくは、1つ以上のタンパク質がtoxP、変異toxOから発現され、N末端シグナル配列で翻訳されるように構築される。N末端シグナル配列は、分泌のために（ベクターから発現された）1つ以上のタンパク質を標的とし、N末端シグナルペプチドは後に切断されて成熟た活性タンパク質となる。SEQ ID NO:3には、分泌型デニロイキン・ディフティトックス、又はs-デニロイキン・ディフティトックスと呼ばれる新規なデニロイキン・ディフティトックスのようなタンパク質をコードするＤＮＡ配列が含まれる。ｓ-デニロイキン・ディフティトックスには、未成熟分泌型デニロイキン・ディフティトックス（is-デニロイキン・ディフティトックス）と成熟分泌型デニロイキン・ディフティトックス（ｍｓ-デニレウキンｄｉｆｔｉｔｏｘ）と呼ばれる２つの形態がある。 SEQ ID NO:12は本発明のis-デニロイキン・ディフティトックスのものであり、SEQ ID NO:13は本発明のms-デニロイキン・ディフティトックスのものである。is-デニロイキン・ディフティトックスは、処理中に切断されてms-デニロイキン・ディフティトックスを形成するシグナル配列を含む。 さらに、SEQ ID NO:3は、タンパク質、具体的にはジフテリア毒素の機能部分とIL 2の機能部分とを含む融合タンパク質をコードする、塩基149で始まり1711 で終わるDNA配列を含む。シグナル配列を切断した結果、520アミノ酸ポリペプチドになる、ジフテリア毒素フラグメントＡ、及びフラグメントＢの一部（Gly1-His387）のアミノ酸配列とヒトインターロイキン-２の配列とからなる、ms-デニロイキン・ディフティトックスと呼ばれる新しいデニロイキン・ディフティトックス融合タンパク質配列が形成される。本発明のms-デニロイキン・ディフティトックスは、クラシック-デニロイキン・ディフティトックス（c-デニロイキン・ディフティトックス）に存在する第1のメチオニンを欠いており、それによってOntak（商標）として知られるクラシック-デニロイキン・ディフティトックスタンパク質のアミノ酸配列よりも1つ短いアミノ酸を有している。SEQ ID NO:13は、新規なデニロイキン・ディフティトックスタンパク質、ms-デニロイキン・ディフティトックスのタンパク質配列で、Ontak（商標）として知られているクラシック-デニロイキン・ディフティトックス（c-デニロイキン・ディフティトックス）のタンパク質配列を含むSEQ ID NO:10と比較され得る。
【００７６】
本発明のＤＮＡ発現ベクターは、１種以上のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。本発明の好ましいタンパク質は、ジフテリア毒素（又はその機能的部分）と標的受容体結合タンパク質（又はその機能的部分）とからなる融合タンパク質である。ＤＮＡ発現から産生され得るジフテリア毒素の例としては、ジフテリア毒素の任意の機能部分、又はジフテリア毒素血管漏出変異の任意の機能部分が挙げられる。本発明のＤＮＡ発現ベクターから産生される標的受容体結合ドメインのタンパク質の例としては、IL-２、IL-３、IL-４、IL-６、IL-７、IL-１５、EGF、FGF、サブスタンスP、CD4、αMSH、GRP、TTフラグメントC、GCSF、ヘレグリンβ1、TNF、TGF、又はそれらの組み合わせが挙げられる。治療用途に応じて、他の標的受容体結合ドメインを使用してもよいが、SEQ ID NO: 9は、IL2受容体結合ドメインの機能部分をコードする好ましいDNA配列である。本発明の目的のために、ＤＮＡプラスミド、及びその遺伝的要素のいくつかを図1、図2、図6、及び図7に示す。本発明のＤＮＡ発現ベクターによってコードされる融合タンパク質の例は、SEQ ID NO:11、12、13、14、15、19、及び21を含む。
【００７７】
SEQ ID NO:３（分泌型デニロイキン・ディフティトックス、又はs-デニロイキン・ディフティトックスをコードするＤＮＡ配列。 配列は、toxP、変異toxO、シグナル配列、ジフテリア毒素の機能部分、及びIL2の機能部分を含む。  太字とアスタリスクは、変異型toxOを作成するために導入された変化を示す。
【表３−１】
2021515774.tif 000004
【表３−２】
2021515774.tif 000005
【表４】
2021515774.tif 000006
【表５】
2021515774.tif 000007
【表６−１】
2021515774.tif 000008
【表６−２】
2021515774.tif 000009
【００７８】
（血管漏出の少ない、又は全くないジフテリア毒素融合タンパク質の形成（デニロイキン・ディフティトックス-VLMs）
すべての細菌や植物の毒素と同様に、デニロイキン・ディフティトックスは、血管漏出症候群（VLS）を誘発する可能性のあるアミノ酸モチーフを持っている。Ontak（商標）の治療を受けた患者の約30％が、末梢性浮腫を伴う急激な体重増加から低アルブミン血症、肺水腫に至るまでの血管漏出症候群を発症する。Ontak（商標）のDNA配列には、米国特許第8,865,866号に記載されているような変異作成した。SEQ ID NO:10の7残基目のバリン（GTT）がSEQ ID NO:16に示されるようにアラニンに置換されるようにDNA配列を変異させることにより、融合毒素は血管漏出症候群の副作用をほとんど、又は全く示さないことが明らかになった。これらの変異体は、「血管漏出変異」（VLM）と呼ばれている。血管漏出変異、すなわちデニロイキン・ディフティトックス-VLMSは、図3のc-デニロイキン・ディフティトックスと同等の効力を有し、図4の血管漏出を起こさず、図5のc-デニロイキン・ディフティトックスよりも生体内での急性毒性が有意に少ないことが示されている。s-デニロイキン・ディフティトックス-VLMは、SEQ ID NO:14、及び15に示される第6残基でバリンを置換するアラニンを有しており、s-デニロイキン・ディフティトックス-VLMタンパク質は、c-デニロイキン・ディフティトックス-VLMタンパク質で見出されたのと同様の毒性の低下を有するはずである。
【００７９】
また、SEQ ID NO:10（c-デニロイキン・ディフティトックスのアミノ酸配列）に示される配列V29D30S31、及びI290D291S292もまた、変異した場合には、VLSを減少させる。本発見のクレームは、V29D30S31及び／又はI290D291S292におけるV29A、又はI290Aのような置換を、ジフテリア毒素融合タンパク質の対応する位置に導入してもよく、これらの置換もまた、血管漏出症候群をさらに減少させる価値を有することである。
【表７】
2021515774.tif 000010
【００８０】
クラシック Ontak（大腸菌由来）、及びs-Ontak（可溶性、単量体、分泌性、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来）は、高親和性のIL-2受容体を有する細胞を標的としたジフテリア融合毒素であり、皮膚T細胞リンパ腫（CTCL）の治療薬として承認されている。また、大腸菌由来のクラシックOntakは、患者の制御性T細胞（Tregs）を一過性に枯渇させることが確認されており、これまでの研究で、がん免疫療法としての有用性が示唆されている。大腸菌由来クラシックOntakの重篤な副作用として、血管漏出症候群（VLS）の誘発がある。 VLSは、低血圧、低アルブミン血症、及び末梢性浮腫を引き起こし、治療中止の主要な原因である。本発明者らは、大腸菌由来クラシックOntakのC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来の類似体であって、該蛋白質が完全可溶性の形態で分泌され、かつ単量体であるものを作製した。さらに、本発明者らは、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO: 15を作成し、これがV6Aアミノ酸置換を有するC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来s-Ontakである。また、V6Aアミノ酸置換を有するC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来s-Ontak-His6であるC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO: 43を作製した。本発明者らは、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:43がインビトロで血管漏出を減少させ、マウスでの毒性が低く、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来s-Ontak-His6（SEQ ID NO:58）よりも生存マウスでの忍容性が良好であることを示した。これらの結果より、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来のSEQ ID NO: 43がC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来のSEQ ID NO:58よりも毒性が低く、がん免疫療法として有望であることが明らかになった。したがって、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO: 15（V6A  hisタグなし）は、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO: 13 s-Ontak（hisタグなし）よりも毒性が低く、がん免疫療法として有望であることが期待される。
【００８１】
本発明者らは、これらのモチーフのうちの１つ以上を変異させることにより、VLＳによる薬剤の毒性が低下すると仮説を立てた。本発明者らは、予測されたモチーフの中のC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来のs-OntakにV6Aという単一アミノ酸置換を行い、この変異が血管漏出、毒性、及び活性に及ぼす影響を評価した。
【００８２】
(C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:43は、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:58よりもインビトロでHUVEC透過性の誘導が低い)
【００８３】
ジフテリア毒素の触媒ドメインは4つの予測された血管漏出誘導モチーフを持っているが、一方IL-2は1つの予測されたモチーフを持っている。大腸菌由来クラシックOntak（残基７から９）、及びC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来s-Ontak（残基６から８）のＮ末端予測モチーフは、ＡＤＰ-リボシルトランスフェラーゼ活性部位の一部ではないので、本発明者らは、触媒活性に影響を与えないように、このモチーフを変異させることを選択した。本発明者らは、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来s-Ontak-His6において、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO: 43として示される6位のValからAlaへの1つのアミノ酸置換を行った。 次に、本発明者らは、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来 SEQ ID NO:43とC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来 s-Ontak-His6（SEQ ID NO: 58）を用いて、インビトロで血管露出をモデル化したHUVEC透過性アッセイで効果を比較した。HUVEC細胞を組織培養インサート上で増殖させ、単層が無傷の場合、上部チャンバーに添加されたFITC-デキストランビーズは、下部チャンバーへの細胞層を介して拡散することができない。 C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:58を5 pM、50 pM、500 pM、5 nM、50 nMの濃度で細胞を処理した場合、用量反応関係を伴う透過性の増加が観察された。 一方、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:43を同濃度で処理した場合は、検出可能な血管リークは検出されなかった（図20）。
【００８４】
(C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:43は、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:58よりもマウスにおける致死率の低下を示し、生存マウスにおける忍容性が良好である)
【００８５】
生体内での毒性を評価するために、マウスをC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:58、又はC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:43で毎日治療した。32μgのC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:58で治療したマウスは、すべて2回投与後、治療3日目に死亡した。32μgのC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:43を毎日マウスに投与した場合、3日目に3匹のマウスが死亡したが、2匹のマウスは1-2回の追加投与の期間生存した。 1日3.2分の１にした低用量では、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:58を10μg投与したマウスはすべて体重が減少して死亡したが、C. diphtheriae（ジフテリア菌）ア由来SEQ ID NO:43を10μg投与したマウスでは死亡や体重減少は認められなかった（図21）。 さらに、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO: 58を1日3.2μg投与したマウスは、実験期間17日間で体重が減少したが、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来のSEQ ID NO:43を1日3.2μg投与したマウスは、PBSを毎日投与したコントロールマウスと区別がつかなかった（図21）。 本発明者らがReed-Muensch統計学を適用したところ、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO: 58のLD50は4.9g/日であり、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO: 43のLD50は18.2g/日であった（3.7倍低い）。以上の結果より、V6A変異がマウスにおける毒性を減少させ、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:43の方がC.ジフテリア由来のSEQ ID NO:58よりも高用量での忍容性が良好であることがわかる。
【００８６】
（V6A変異は、CD25+細胞へのインビトロ殺細胞活性、又はC. diphtheriae（ジフテリア菌由来SEQ ID NO:43のインビボB16F10マウスメラノーマモデルへの抗腫瘍活性に影響を与えない）
【００８７】
本発明者らは、CD25受容体陽性のHUT-102 T細胞リンパ腫細胞に対するC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO: 43のIC50を評価し、そのIC50が3.5 pM（3回の測定値の平均）であることを見出した。  本発明者らはまた、大腸菌由来のクラシックOntakの単位試料を試験し、同じ細胞株に対するそのIC50が1.8 pMであることを見出した（2回の測定の平均、図22）。 これらのIC50値は同等の値であり、両方とも、通常nM、又はpMの範囲のIC50値を有する他の強力な生物学的製剤、又は低分子よりも劇的に低い。  次に、本発明者らは、C57BL/6マウスのメラノーマB16F10同種移植モデルを用いて抗腫瘍活性を調べた。V6A変異がC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO: 43の活性をインビボで変化させるかどうかを試験した。   B16F10腫瘍の生着を確認して移植後7日目、及び10日目にC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO: 43、又はC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:58のいずれか5μgで治療し、腫瘍の成長を経時的に測定した。 両剤とも、同様の効果で腫瘍の増殖を有意に抑制した（図２２）。 さらに、両薬剤はマウスのリンパ節、及び脾臓のTregsを枯渇させ、その効果は同等であった（図２３）。 これらのデータは、V6A変異がインビトロではCD25+細胞への殺細胞力に有意な影響を与えず、インビボではTreg枯渇と抗腫瘍活性に影響を与えないことを示している。
【表８】
2021515774.tif 000011
【００８８】
SEQ ID NO:7 [米国特許第8,865,866号に記載されたデニロイキン・ディフティトックス-VLM]とSEQ ID NO:8 [本発明のis-デニロイキン・ディフティトックス-VLM]を比較したDNA配列のアラインメントは、SEQ ID NO: 8が1381-1437行目のコドン（3塩基）を欠いていることを示している。
【表９】
2021515774.tif 000012
【表１０】
2021515774.tif 000013
【表１１】
2021515774.tif 000014
【表１２】
2021515774.tif 000015
【表１３】
2021515774.tif 000016
【００８９】
(本発明のDNA発現ベクターを用いて生産されたタンパク質)
【００９０】
本発明の成熟活性ジフテリア毒素関連融合タンパク質の第１のアミノ酸は、SEQ ID NO:13、及び15に太字で示されるようなグリシン（アミノ酸１）である。ＳEQ ID NO:4内のシグナル配列は、成熟融合タンパク質の第１のグリシンからカウントバックして負の数で標識されており、以下のアミノ酸配列ＭＳＲＫＬＦＡＳＩＬＧＡＬＬＧＩＧＡＬＬＧＩＧＡＰＰＳＡＨＡ（SEQ ID NO:22）を有する。シグナル配列は、SEQ ID NO:11、及び12に示され、下線が引かれている。成熟分泌ジフテリア毒素融合タンパク質は、Gly1-His387のようなジフテリア毒素部分と、SEQ ID NO:3のAla388-Thr520のIL-2タンパク質のような標的受容体結合ドメインとを含む。ジフテリア毒素タンパク質（又はその機能部分）に融合されていてもよい。本発明で使用される他の標的受容体結合ドメインには、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-15、EGF、FGF、サブスタンスP、CD4、αMSH、GRP、TTフラグメントC、GCSF、ヘレグリンβ1、TNF、TGFなどが含まれるか、又はそれらの組み合わせが含まれる。 SEQ ID NO: 10は、分泌されず、大腸菌の封入体からの精製を必要とするc-デニロイキン・ディフティトックスを記載している。SEQ ID NO: 12は、シグナル配列を有する未熟な分泌されたis-デニロイキン・ディフティトックスを記載している。  SEQ ID NO: 13は、細胞外空間に分泌される過程でシグナル配列が切断されたMS-デニロイキン・ディフティトックスを記載している。
【表１４】
2021515774.tif 000017
【表１５】
2021515774.tif 000018
【表１６−１】
2021515774.tif 000019
【表１６−２】
2021515774.tif 000020
【表１７】
2021515774.tif 000021
【表１８−１】
2021515774.tif 000022
【表１８−２】
2021515774.tif 000023
【表１９】
2021515774.tif 000024
【表２０】
2021515774.tif 000025
【００９１】
本発明のSEQ ID NO:14 is-デニロイキン・ディフティトックス-VLMと比較した場合に445の位置に余分なアミノ酸（L）を有する米国特許第8,865,866号に記載されているSEQ ID NO: 16 is-デニロイキン・ディフティトックス-VLMのタンパク質アラインメント。
【表２１−１】
2021515774.tif 000026
【表２１−２】
2021515774.tif 000027
【００９２】
(タンパク質製造のためのDNA発現ベクターの利用)
【００９３】
上記のジフテリア毒素に関連するタンパク質のFe非依存的な分泌発現を利用した方法は、本発明の方法を用いてs-デニロイキン・ディフティトックスを発現させることに加えて、いくつかの商業的用途を有する。前記方法は、以下のタンパク質の発現（収量）を向上（増強）させるために利用することができる：
WTジフテリア毒素：
【００９４】
本発明のＤＮＡ発現ベクターを用いて、DTP、TDaP、及び他の組み合わせワクチンに存在するジフテリアのワクチンであるジフテリアトキソイドの製造に用いられる野生型ジフテリアトキシン（SEQ ID NO:11）を製造してもよい。SEQ ID NO:11をコードするDNAセグメントは、本発明のDNA発現ベクター中に配置され、ToxP／変異ToxO の下流に位置していてもよい。
【００９５】
（交差反応物質-197（CRM197）、及び交差反応物質-107（CRM107））
【００９６】
CRM197、及びCR107は、完全長ジフテリア毒素の変異タンパク質であり、免疫原性は高いが、毒素活性は完全に欠落している。これらは、いくつかの多糖類複合体ワクチンのキャリアとして使用されている。 例えば、ワイスとファイザーは、1990年代に肺炎球菌由来の7つの多糖類をCRM197に結合させ、2000年2月にFDAの承認を受けたオリジナルのプレブナーワクチンを作成した際に、この免疫原性を利用した。2010年には13多糖体のPrevnarがFDAに承認された。ノバルティス社の髄膜炎球菌ワクチンMenveoは、4種類のNeisseria meningitidis多糖体にCRM197を加えたものである。このワクチンは2010年にFDAの承認を取得した。がん免疫療法会社のイムジーン社（ASX：IMU）は、HER2を標的としたB細胞ペプチドがん免疫療法において、CRM197をキャリアタンパクとして使用したところ、抗体価が劇的に改善したことを報告している。 また、CRM197はドラッグデリバリータンパク質としての可能性も評価されている。スイスに本拠を置くチューリング・ファーマシューティカルズ社は、最大1,000アミノ酸の長さの治療用タンパク質とCRM197の融合コンストラクトに取り組んでいる。 本発明のＤＮＡ発現ベクターは、CRM197、及びCRM107を産生するために使用されることがある。 SEQ ID NO:18―21をコードするＤＮＡセグメントの１つ以上は、本発明のＤＮＡ発現ベクター中に配置され、ToxP／変異ToxOの下流に位置していてもよい。
【００９７】
（精製を向上させるために、開裂可能なペプチド、又はタンパク質タグを有するジフテリア毒素ベースの融合タンパク質が使用される。）
【００９８】
開裂可能なペプチドタグ（例えば、His6（SEQ ID NO:23）、又はFLAG［DYKDDDK］（SEQ ID NO:24）など）、又はタンパク質タグ（例えば、GST［グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ］、又はSUMO［小ユビキチン様修飾タンパク質］など）を、ジフテリア毒素ベースの融合タンパク質に特定のプロテアーゼ開裂部位と融合させてもよい。タグに結合する抗体、又はリガンドを用いたアフィニティークロマトグラフィー法は、タグ化されたタンパク質の迅速な精製のために用いてもよい。精製に続いて、特異的な開裂部位により、タグを所望のジフテリア毒素関連タンパク質から分離することが可能となる。そのような融合は、本発明のジフテリア毒素に基づく融合タンパク質の精製を強化することができる。
【表２２】
2021515774.tif 000028
【表２３】
2021515774.tif 000029
【表２４】
2021515774.tif 000030
【表２５】
2021515774.tif 000031
【表２６】
2021515774.tif 000032
【００９９】
(ポリペプチドのHisタグ付きバージョンを用いたVLM s-Ontakの精製)
【０１００】
Corynebacterium diphtheriae（ジフテリア菌） C7で生産されたVLM s-Ontakのいくつかの調製物で、成熟した520アミノ酸ポリペプチドのゆっくりとしたタンパク質分解が発生する。これはCorynebacterium diphtheriae（ジフテリア菌） C7で作られた分泌プロテアーゼによるものと考えられる。このタンパク質分解は、成熟した520アミノ酸VLM s-Ontakのアミノ酸390付近で起こる。
【０１０１】
VLM s-Ontakのヒスチジンタグ付き（Hisタグ付き）バージョンは、培養上清に存在する分泌プロテアーゼから逃れて目的のタンパク質の精製を促進する目的で構築されている。タバコエッチウイルス（Tobacco Etch Virus (TEV) nuclear-inclusion-a endopeptidase (EC 3.4.22.44)認識サイトもまた、これらのHisタグ付きバージョンのVLM s-Ontakに設計されている。TEV切断部位の目的は、VLM s-Ontakの最終調製においてポリHis配列を除去できるようにすることである。TEVは、アミノ酸配列ENLYFQ￥Xを認識する非常に特異的なエンドペプチダーゼであり、ここで、'\'は切断されたペプチド結合を表し、Xはグリシン（G）（SEQ ID NO: 49）のような任意の小さな疎水性、又は極性アミノ酸を表す。
【０１０２】
(TEV切断部位を持つN末端Hisタグ付きVLM s-Ontak)
【０１０３】
SEQ ID NO: 38（VLM s-OntakへのN末端Hisタグのタンパク質配列）は、そのN末端付近のVLM s-Ontakの未熟なタンパク質配列にアミノ配列HHHHHHHHENLYFQ（SEQ ID NO: 50）を付加することが可能である。このバージョンでは、配列HHHHHHHHHENLYFQ（SEQ ID NO: 50）は、26アミノ酸シグナル配列の直後、及びVLM s-Ontakの成熟配列の直前に現れる（GADDVA（SEQ ID NO: 51））。VLM s-Ontakの最初のグリシンは、Xが任意の小アミノ酸であるENLYFQX（SEQ ID NO: 49）を認識するTEVプロテアーゼのための最終的な認識残基を構成している。 このN末端Hisタグ付きVLM s-Ontakの成熟分泌されたタンパク質配列をSEQ ID: 39に示す。（シグナル配列が切断された後のVLM s-OntakへのN末端Hisタグのタンパク質配列）に示されており、これはそのHis6タグ（SEQ ID NO: 23）を有するニッケルカラムアフィニティー精製のための良い候補である。アフィニティー精製されたVLM s-Ontakは、その後、少量の純粋なTEVプロテアーゼに曝され、13個のN末端残基MHHHHHHHENLYFQ（SEQ ID NO: 52）を除去する酵素的タンパク質分解が起こり、SEQ ID NO: 40（N末端Hisタグのシグナル配列が切断され、TEV部位が切断された後のVLM s-Ontakのタンパク質配列）に示されているように、成熟した、タグされていないVLM s-Ontakが出来上がる。
【０１０４】
Corynebacterium diphtheriae （ジフテリア菌）C7の分泌プロテアーゼは、約390アミノ酸で切断されるため、N末端のHis-タグは、以下の2種のポリペプチドに付加しているだろう：完全な長さの所望のVLM s-Ontak（520アミノ酸）と390アミノ酸のN末端のブレークダウンフラグメント。これらの2つのポリペプチドは、サイズ（分子組成と同様に）が比較的近いため、サイズ排除クロマトグラフィーで分離することは困難である。 そこで、我々はVLM s-OntakのC末端にHisタグを付けたバージョンを開発した。
【０１０５】
(TEV切断部位を持たないC末端Hisタグ付きVLM s-Ontak)
【０１０６】
SEQ ID NO: 42（VLM s-OntakへのC末端Hisタグのタンパク質配列）に示されるように、VLM s-OntakのC末端の未熟なタンパク質配列にアミノ配列HHHHHHH（SEQ ID NO: 23）を付加することが可能である。このバージョンでは、配列HHHHHHHH（SEQ ID NO:23）は、VLM s-OntakのC末端スレオニンの直後に現れる（....IISTLT（SEQ ID NO: 53））。このC末端Hisタグ付きVLM s-Ontakの成熟分泌されたタンパク質配列はSEQ ID: 43（シグナル配列が切断された後のVLM s-OntakへのC末端Hisタグのタンパク質配列）に示される。これは、His6タグ（SEQ ID NO:23）を持つのでニッケルカラムアフィニティー精製の良い候補である。 
【０１０７】
(TEV開裂部位を持つC末端Hisタグ付きVLM s-Ontak)
末端Hisタグ（SEQ ID:43）によって作られた上記バージョンのVLM s-Ontakの最終ポリペプチド配列中にHis６配列（SEQ ID:23）を有することを避けるために、Hisタグ配列の除去を可能にするために、Ｃ末端にＴＥＶ認識配列を挿入することが可能である。このバージョンでは、配列ENLYFQGHHHHHHHHHHHH（SEQ ID NO:54）は、VLM s-Ontak（....IISTLT（SEQ ID NO:53））のC末端スレオニンの直後に現れる。   ニッケル親和性結合は6アミノ酸よりもさらに長いポリHis配列によって増強されるので、9個のHis残基を含むことが可能である。このTEV開裂部位を有するC末端Hisタグ付きVLM s-Ontakのアミノ酸配列をSEQ ID:45（VLM s-OntakへのC末端TEV His9タグ（SEQ ID NO:48）のタンパク質配列）に示す。TEV開裂部位を有するこのC末端TEV Hisタグ付きVLM s-Ontakの成熟分泌されたタンパク質配列をSEQ ID:46（シグナル配列が切断された後のVLM s-OntakへのC末端TEV His9タグ（SEQ ID NO:48）のタンパク質配列）を示す。His9タグ（SEQ ID NO:48）を有するのでニッケルカラムアフィニティー精製に好適な候補である。親和性精製されたVLM s-Ontakは、その後、少量の純粋なTEVプロテアーゼに曝され、10個のC末端残基GHHHHHHHHH（SEQ ID NO: 55）を除去する酵素的タンパク質分解をもたらし、SEQ ID NO:30に示されるように、成熟した、タグ付けされていないVLM s-Ontakが出来上がる。注目すべきことに、精製されたVLM s-Ontak（SEQ ID:30）のこのバージョンは、VLM s-Ontakの通常のC末端スレオニン（....IISTLT（SEQ ID:53））に融合したTEVプロテアーゼ認識配列（ENLYFQ（SEQ ID:56））の6つの追加アミノ酸を含むため、520アミノ酸（SEQ ID:15）よりもむしろ526アミノ酸の長さである。TEV開裂部位（SEQ ID:30）を有するC末端Hisタグ付きVLM s-Ontakのこのバージョンの最終産物は、C末端配列....IISTLTENLYFQ（SEQ ID NO:57）である。
【０１０８】
(Hisタグ、及びTEVプロテアーゼ部位を含むVLM s-Ontakの製造方法)
【０１０９】
上記の３つのHisタグ版（TEVプロテアーゼ部位を有するN末端His6タグ（SEQ ID NO:23）、TEVプロテアーゼ部位を有さないＣ末端His6タグ（SEQ ID NO:23）、及びTEVプロテアーゼ部位を有するＣ末端His9タグ（SEQ ID NO:48））は、VLM s-Ontakの製造方法において、Hisタグ／ニッケルカラムアフィニティークロマトグラフィーを利用する方法の一例である。 培養上清中に存在するCorynebacterium diphtheriae（ジフテリア菌） C7から分泌されたプロテアーゼのため、所望の生成物の著しい損失を避けるためには、培養上清中の他のタンパク質からVLM s-Ontakを迅速に分離精製することが重要である。  Hisタグ、及びTEVプロテアーゼ部位を含むことは、大幅な改善を表し、VLM s-Ontakのための迅速で合理化された製造プロセスを可能にする可能性がある。
【０１１０】
(VLM s-Ontakの製造改善の鍵となる分泌プロテアーゼを欠くCorynebacterium diphtheriae（ジフテリア菌） C7の作成)
【０１１１】
Corynebacterium diphtheriae（ジフテリア菌） C7のゲノム配列から、2つの分泌プロテアーゼが明らかになった。プロテアーゼ１はNCBI Reference Sequence WP_014318592.1（SEQ ID:32、33）であり、プロテアーゼ２はNCBI Reference Sequence WP_014318898.1（SEQ ID:35、36）である。これらのプロテアーゼは、Ton-ThatとScheewindの方法で遺伝子除去できることがある。（Ton-That H, Schneewind O. Assembly of pili on the surface of Corynebacterium diphtheriae. Mol Microbiol. 2003 Nov;50(4):1429-38. PubMed PMID: 14622427)や、AllenとSchmitt (Allen CE, Schmitt MP. HtaA is an iron-regulated hemin binding protein involved in the utilization of heme iron in Corynebacterium diphtheriae. J Bacteriol. 2009 Apr;191(8):2638-48.  PubMed PMID: 19201805) プロテアーゼ1とプロテアーゼ2をノックアウトするための対立遺伝子交換基質は、それぞれSEQ ID:34とSEQ ID:37に示される。これらの配列を、pk18mobsacBに挿入し、各プロテアーゼをノックアウトするコンストラクトを作成した。前記プラスミドは接合伝達、接合プラスミドで対抗選択のためのsacBを持っている。（Schafer A, Tauch A, Jager W, Kalinowski J, Thierbach G, Puhler A (1994) Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coliplasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum. Gene 145:69-73.  PMID:   8045426) プロテアーゼ1とプロテアーゼ2の両方を欠失させたCorynebacterium diphtheriaeの組換え株は、今後のVLM s-Ontakの製造方法のための貴重な生産株になる。
【０１１２】
（ジフテリア毒素をベースとした融合タンパク質の製造工程）
【０１１３】
本発明のDNAプラスミド、及び発現ベクターを用いて、従来のOntak（商標）の製造方法に関連する問題点を排除した新規なプロセスを発見した。Ontak（商標）は、現在、大腸菌発現系でDNAベクターを用いて発現されており、c-デニロイキン・ディフティトックス、又はOntak（商標）は、全長521アミノ酸、分子量58kDである。従来のOntak（商標）の製造プロセスでは、分子量の不均一なOntak（商標）凝集体の形成、残留DNA、最終製剤中の過剰な残留界面活性剤が原因となり、2011年6月にFDAはクラシックOntak（商標）を臨床保留命令を出した。図8aに見られるように、Ontak（商標）は大腸菌のプラスミドから発現し、封入体として知られる不溶性の細胞質Ontak（商標）（タンパク質）として蓄積する。本発明のプロセスを使用して、図８bは、s-デニレウキン・ジフトックスの細胞外成熟分泌タンパク質の細胞上清中への発現を例示している。この結果、図９に示されるように、容易に精製することができ、より高いタンパク質収率をもたらした。  図９は、全タンパク質のクーマシーブルー染色、及び本発明のプロセスを用いて生成されたs-デニロイキン・ディフティトックスの抗IL-2でプロービングした抗IL-2免疫ブロットの両方を示す。
【０１１４】
本発明の新規な工程は、以下からなる。1)細菌を形質転換する、好ましくはCorynebacterium diphtheriae（ジフテリア菌）株を本発明のDNA発現ベクターで形質転換し、2)形質転換体を形成する。3）前記形質転換体を、タンパク質（例えば、ジフテリア毒素ベースの融合タンパク質、及び一般的にはシグナルペプチドを含むCRM）の増殖、及び発現を可能にするために、培養液中で一定期間インキュベートすること、4）前記タンパク質の培養液中への分泌（前記タンパク質に付着したシグナルペプチドによる）、及び５）前記培養液からジフテリア毒素ベースの融合タンパク質を精製すること、からなる。前記ＤＮＡ発現ベクターはToxP、及び変異Toxoを含み少なくとも１つの以下のタンパク質の発現を調節する。前記タンパク質はジフテリア毒素融合タンパク質、CRMタンパク質、又は本発明のシグナルペプチドに付加してもよい他のタンパク質などである。
【０１１５】
（本発明のジフテリア毒素ベースの融合タンパク質の治療応用）
【０１１６】
Ontak（商標）の臨床効果は、皮膚T細胞リンパ腫、末梢性T細胞リンパ腫、ステロイド抵抗性移植片対宿主病、メトトレキサート抵抗性乾癬、メトトレキサート抵抗性関節リウマチなどで確認されている。また、図14に示すように、悪性黒色腫や卵巣がんでも臨床効果が確認されている。 本発明の方法により製造された本発明のジフテリア毒素ベース融合タンパク質（s-デニロイキン・ディフティトックス、ms-デニロイキン・ディフティトックス、is-デニロイキン・ディフティトックス-ＶＬＭ、ms-デニロイキン・ディフティトックス-ＶＬＭを含む）は、疾患の治療、又は予防の臨床効果に関して、市販されているOntak（商標）と同等、又はそれ以上の優れた性能を発揮するであろう。
【０１１７】
（結核の治療）
【０１１８】
図１０に示すように、本発明の発明者らは、本発明のジフテリア毒素融合タンパク質が結核に対して活性であると考えている。デニロイキン・ディフティトックスは、制御性Ｔ細胞（Tregs）を含むIL-２受容体（CD25+）を有する細胞を枯渇させることが知られている。  Tregs細胞はCD25やFoxP3を発現しており、Teff細胞を阻害することで免疫抑制作用を発揮する。CD4+Tヘルパー（Th）細胞やCD8+細胞傷害性Tリンパ球（CTL）などのTeff細胞は、結核菌の細菌感染を封じ込めるために結核肉芽腫内で必要とされる。結核菌感染時には、肉芽腫と呼ばれる細胞性病変が形成されて感染を封じ込める。しかしながら結核菌を完全に根絶することはできない。制御性T細胞（Tregs）は肉芽腫に誘導され、エフェクターT細胞の機能を抑制し、おそらく結核菌の持続と成長のための寛容な環境を作り出している。 本発明のジフテリア毒素融合タンパク質を、結核感染時にTregsによる免疫抑制を改善するため、IL-2受容体を発現するTregsを枯渇させるために使用する。図11は、結核に感染した被験者（マウス）のインビボ治療に使用されるジフテリア融合タンパク質を示す図である。マウスを結核菌株H37Rvにエアゾール感染させた。0日目に肺に菌数約2.8 log10 CFUの初期植込みを行った。各グループのマウスに、750 ngのc-Ontak（商標）を腹腔内（IP）、又は静脈内（IV）に1サイクル（1x、感染後2週目に投与）、又は2サイクル（2x、感染前約3日目と感染後2週目に投与）で治療した。デニロイキン・ディフティトックスの1回の治療サイクルは、35 mg/kg（一般的なマウスでは750 ng）を2日間隔で2回投与することと決定した。経口からのRHZ連日投与を２週目に開始した。Rはリファンピンで、10mg/kgでマウスに投与した。Hはイソニアジドで、10mg/kgでマウスに投与した。Ｚはピラジンアミドで、150mg/kgでマウスに投与した。 その結果が図12、及び図13である。
【０１１９】
(がん治療)
【０１２０】
Tregsはまた、抗腫瘍免疫を阻害することも示されており、腫瘍内でのTregsの細胞増殖は一般的に患者の予後不良と相関している。メラノーマ患者を対象としたデニロイキン・ディフティトックス治療は、Tregsの一過性の枯渇をもたらし、全生存期間中央値を1年増加させた。 本発明のs-デニロイキン・ディフティトックス、及びs-デニロイキン・ディフティトックス-VLMは、がん免疫療法として、Tregsが激しく浸潤している腫瘍患者のTregs枯渇に使用される。
【０１２１】
（逐次免疫療法で、IL-2受容体を標的とした融合毒素に続いて抗PD-1抗体治療を行うと、マウスのメラノーマ腫瘍の増殖が抑制される）
【０１２２】
免疫チェックポイントは、自己免疫を防ぐために必要な阻害経路であるが、有益な抗腫瘍免疫応答を阻害することもある。 これらの経路、特にPD-1/PD-L1相互作用を阻害するチェックポイント阻害薬（CPI）による抗体介在性遮断は、一部のがん患者を対象とした臨床試験で顕著な長期有効性が示されている。しかし、CPI治療を受けた患者の中には、最終的に病勢の進行、及び/又は治療抵抗性を示す患者も多く、臨床成績を改善するためには、追加の標的薬や併用薬療法が必要であることが示唆されている。デニロイキン・ディフティトックス、又は大腸菌由来クラシックOntakは、がん細胞を直接標的としたジフテリア融合毒素であり、皮膚T細胞リンパ腫の治療薬として承認されている。さらに、大腸菌由来クラシックOntakは、インビボで制御性Ｔ細胞（Tregs）を一過性に枯渇させることができ、転移性メラノーマ患者において腫瘍の退縮を誘導することが見出されている。本発明者らは、Tregsを枯渇させることにより、C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:43、及びC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:58がB16メラノーマ腫瘍の増殖を阻害し、抗PD-1抗体治療によって誘導されるエフェクターT細胞応答を増強するであろうという仮説を立てた。 本発明者らは、C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来ID NO: 43（同様にC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO: 58）の治療が、抗PD-1抗体治療による単剤療法、又は単剤療法単独よりも、確立した腫瘍の腫瘍増殖をより大きな程度に阻害し、IFNγ+CD8+リンパ球による腫瘍浸潤の増加を導くことを見出した。 治療が遅れた場合、抗PD-1抗体、及びC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:43（同様にC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:58）のいずれの単剤療法の効果がなくなったが、C. diphtheriae(ジフテリア菌)SEQ ID NO:43、及びC.ジフテリア由来のSEQ ID NO:58）、続けて抗PD-1抗体を投与する治療は、まだ腫瘍の増殖を抑制することが可能で、いずれかの単剤療法よりも優れていた。 以上の結果より、C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:43は抗腫瘍免疫応答を誘導し、単独でも免疫チェックポイント阻害剤との併用でも、がん免疫療法として有望であることが示された。
【０１２３】
大腸菌由来クラシックOntak（SEQ ID NO:10）は、高親和性IL-2受容体（CD25）陽性細胞を直接標的にして殺傷するジフテリア融合毒素であり、皮膚T細胞リンパ腫（CTCL）の治療に使用されている。以前の研究では、大腸菌由来クラシックOntak（SEQ ID NO:10）もまた、高親和性IL-2受容体を発現するTregsを一過性に枯渇させることができることが示されている（Rasku MA，Clem AL，Telang S，Taft B，Gettings K，Gragg Ｈ，ｅｔ ａｌ． Transient Ｔ cell depletion causes regression of melanoma metastases. J Transl Med. 
2008;6(12). PMID: 18334033)。本発明者らは、C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO: 43、及びC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO: 58によるTregsの枯渇が、メラノーマのマウスモデルで腫瘍増殖を抑制するかどうかを検討した。 さらに、本発明者らは、C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO: 43、及びC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:58が、免疫チェックポイント遮断、特に抗PD-1抗体を増強し得るかどうかを評価した。本発明者らは、抗PD-1抗体が主にエフェクターT細胞（Teff）の枯渇を逆転させるように作用するので、C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO: 15、又はC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO: 43（又はC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO 13、又はC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO: 58）によるTregsの枯渇が、免疫抑制の別のモードを除去し、抗PD-1抗体抗腫瘍活性を向上させるという仮説を立てた。
【０１２４】
(C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID: 43、及びC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:58は、腫瘍の増殖を抑制し、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）の頻度を増加させる)
【０１２５】
大腸菌由来クラシックOntak（SEQ ID NO:10）はFDA承認薬であるが、ミスフォールディングしたタンパク質の凝集体、及び界面活性剤による最終製剤の汚染が原因で臨床保留命令が出されている。C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:43、C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:15、C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:58、C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:13は、完全に折り畳まれた活性タンパク質を生成する製造方法で作られた新規融合毒素であり、タンパク質のリフォールディングのための界面活性剤処理が不必要である。本発明者らが製造したC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:43、及びC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:58は、市販薬と同等の活性を示し、インビボで脾臓Tregsを効果的に枯渇させた（図23）。 B16F10マウスメラノーマモデルは、免疫原性の低い腫瘍を産生し、その腫瘍はTregsが高度に浸潤している（101）。DEREGトランスジェニックマウスを用いた以前の研究では、標的としたTregの枯渇がB16F10腫瘍の増殖を抑制することが示されている。C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:43、及びC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:58がTregを枯渇させることにより抗腫瘍免疫応答を増強できるかを評価するため、生着したB16F10メラノーマ腫瘍を有するマウスを薬剤で処置し、腫瘍の成長を経時的に測定した。C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO: 43（図24）、又はC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO: 58（図25）の2回投与のみで、対照マウスと比較して、治療したマウスでは腫瘍の増殖が有意に抑制された。次に、本発明者らは、これら２つの治療が、腫瘍、及び二次リンパ系器官における異なるリンパ球集団の頻度にどのように影響するかを調べた。CD8+ T細胞は、腫瘍細胞を殺すことができる細胞傷害性リンパ球であり、CD8+ T細胞による腫瘍の浸潤は、患者におけるより良好な予後と相関している（Topalian SL, Hodi FS, Brahmer JR, Gettinger S, Smith DC, McDermott DF, et al. Safety, Activity, and Immune Correlates of Anti-PD-1 Antibody in Cancer. N Engl J Med. 2012;366(26):9-19. PMID: 22658127)。さらに、IFNγの産生は、細胞障害性CD8+T細胞の誘導に必須であることがわかっている(Mandai M, Hamanishi J, Abiko K, Matsumura N, Baba T, Konishi I. Dual faces of IFNγ in cancer progression: A Role of PD-L1 Induction in the Determination of Pro- and Antitumor Immunity. Clin Cancer Res. 2016;22(10):2329-34: PMID:27016309)。 本発明者らは、C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:58で処理したマウスは、腫瘍、及び脾臓においてIFNγ+ CD8+の頻度が増加していることを見出した（図26）。
【０１２６】
(C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID 43、及びC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:58は、PD-1遮断の抗腫瘍活性を増強する)
【０１２７】
PD-1遮断はTeff細胞枯渇の逆転をもたらすが、腫瘍Treg頻度は治療によって変化しないままである（E rdag G, Schaefer JT, Smolkin ME, Deacon DH, Shea SM, Dengel LT, et al. Immunotype and Immunohistologic Characteristics of Tumor-Infiltrating Immune Cells Are Associated with Clinical Outcome in Metastatic Melanoma. Cancer Res. 2012;72(5):1070-81.PMID.22266112)。Treg枯渇が抗PD-1抗腫瘍活性を増強するかを調べるために、 B16F10 腫瘍の生着したマウスに C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:58 を腫瘍注射後 7 日目に投与し、24 時間後に抗PD-1抗体治療を開始しました。 C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:58を介して、活性化時にCD25をアップレギュレートするTeffのクリアランスを回避するために、逐次治療を行った。 C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:58単剤療法は、抗PD1抗体治療よりも腫瘍の増殖を抑制するのに有効であり、逐次治療を行った場合、本発明者らは、いずれかの単剤療法単独で見られるよりも大きな腫瘍の減少を観察した（図25）。 同様の結果は、C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO: 43で得られた（図24）。 これまでの研究では、腫瘍が大きくなるにつれて、抗PD-1抗体などの多くの免疫療法は、マウス腫瘍モデルでは有効ではないことが示されている。より大きな腫瘍での有効性を評価するために、腫瘍注入後10日目に治療を開始した。治療が10日目に遅れ、腫瘍がより進行した場合、C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:58、及び抗PD-1単剤療法は、7日目の治療開始モデルほどの効果はなくなったが、逐次治療は腫瘍の増殖抑制において高い活性を維持した（図27）。
【０１２８】
これらのデータは、C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:43、又はC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:58のいずれかによるTregの枯渇とPD-1の遮断が重なり、抗PD-1抗体単独療法、又はC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:43、又はC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO: 58の単独療法よりも優れた強力な抗腫瘍活性をもたらすことを示している。 二剤療法は頑健であり、治療が腫瘍細胞注入後10日目まで遅れた場合でも強力な腫瘍抑制を与える。 特定の理論に拘束されるものではないが、図28は、チェックポイント阻害剤治療に先行するC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:15、C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:43、C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:13、又はC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:58との逐次二剤療法が、いずれかの単独療法よりも有益であり得るという本発明者らの提案するメカニズムの概要を示すものである。チェックポイント阻害剤の遮断後には、IL2の分泌がTeff細胞の増殖、及びIL2受容体（CD25）の発現を促進するTeff細胞の自己分泌ループが存在する。チェックポイント遮断の前に投与されるC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:15、C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:43、C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:13、又はC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:58での治療は、IL2/IL2受容体の自己分泌ループが確立する前にTregsを効果的に除去する。 C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO: 15、C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:43、C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:13、又はC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:13、又はC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO: 58をチェックポイント阻害剤治療と同時、又はチェックポイント阻害剤治療後に投与すると、Tregsと同様にTeff細胞の殺傷につながる可能性があり、チェックポイント阻害剤治療に先立ってC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:43、又はC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:58との逐次二剤療法で見られるような腫瘍抑制活性は期待できないだろう。
【０１２９】
本発明のPadronら（Age effects of distinct immune checkpoint blockade treatments in a mouse melanoma model.   Experimental Gerontology.  Published online 28-Dec-2017 doi.org/10.1016/j.exger.2017.12.025）は、本発明のような腫瘍抑制活性を認めなかった。Padronらは、マウスB16F10メラノーマモデルで、大腸菌由来のクラシックOntak（SEQ ID NO:10）と3つのチェックポイント阻害剤（抗PD1抗体、抗PDL1抗体、及び抗CTLA4抗体）との併用療法の比較分析を報告し、大腸菌由来のクラシックOntak（SEQ ID NO: 10）を二剤療法として追加した場合、チェックポイント阻害剤療法に対する腫瘍体積反応の改善が見られないことを発見した。
【０１３０】
Padronらは、チェックポイント阻害剤(CPI)と大腸菌由来クラシックOntak(SEQ ID NO:10、投与量マウス1匹あたり3mg/回)を同時に腫瘍チャレンジ後7日目から5日ごとに腹腔内(IP)投与してマウスを治療した。大腸菌由来クラシックOntak（SEQ ID NO:10）を用いてマウスＩＰを治療するPadronらの方法と、本発明の方法との間には、多くの実質的な相違点がある。例えば、Padronらは、大腸菌由来クラシックOntak（SEQ ID NO: 10）と特異的チェックポイント阻害剤を同時にマウスに投与した結果、腫瘍体積応答の改善は見られなかった。 本発明の発明者らは、被験体のTregsを枯渇させる第一剤（例えば、C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:43、又はC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:58として）を被験体に投与した後、チェックポイント阻害剤である第２剤（例えば、抗PD-1）を被験体に投与することにより、腫瘍体積応答を改善するという驚くべき発見をした。 また、Padronらは、約40％の不活性タンパク質凝集体を含む大腸菌由来クラシックOntak（SEQ ID NO: 10）を使用することを教示している。一方、本発明の方法はC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:15、C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:43、C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO: 13、又はC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:58（これらは完全に活性な単量体ポリペプチドである）を使用した。Padronらとは異なり、本発明の方法は、5mg、又はいくつかの例では10mgのC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:43、又はC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO: 58を使用した。一方Padronらは3mgの大腸菌由来クラシックOntak（SEQ ID NO: 10）の使用を教示している。本発明の方法は、C. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO:43、又はC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来SEQ ID NO: 58の単一の初期コースを使用し、7/10日目、又は8/11日目、又は10/13日目に２回の投与を行い、その後、実験の終了まで週２回のCPIを行う。 図28は、本発明者らの発見に基づく大腸菌由来クラシックOntak（SEQ ID NO:10）、又はC. diphtheriae(ジフテリア菌)由来Ontak関連分子（SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:5８）と同時にCPIを使用すると、OntakがIL2受容体を発現するTeff細胞を媒介して殺傷するため、効果が乏しいことが予想される理由を示す。
【０１３１】
(プロモーター オペレーター 菌株の組み合わせは発現を増加させる)
【０１３２】
本来のジフテリア毒素プロモーターに変異毒素オペレーター配列を組み込むことにより、高濃度の鉄を含む培地中での毒素遺伝子産物の恒常的発現が可能となる。 これは、野生型toxオペレーター配列、すなわちtoxプロモーターのすぐ下流にある19bpの倒立した回文配列を運ぶコンストラクトとは対照的である。野生型toxオペレーターの場合、鉄活性化ジフテリアtoxリプレッサーであるDtxRがオペレーターに結合し、tox遺伝子産物の発現を抑制する。 鉄によってアポ-DtxRが活性化されると、リプレッサーがtoxオペレーターに結合し、toxの発現が抑制される。 鉄が成長速度制限基質となると、鉄はリプレッサーから解離し、apo-DtxRはtoxオペレーターと結合しなくなり、toxの発現抑制を解除し、tox遺伝子産物の産生を可能にする。従って、融合タンパク質トキシン遺伝子コンストラクト（SEQ ID NO:2）の各々に変異トックスオペレーター配列を組み込むことにより、それらの恒常的発現、及び培地中へ適度な収率で分泌が可能にする。
【０１３３】
また、本発明者らは、C. diphtheriae(ジフテリア菌) C7(-) ΔdtxR変異株におけるs-Ontak関連タンパク質の発現についても検討した。前記-10プロモーターのコンセンサス配列とtoxオペレーターを形成する倒立リピートとの間には、いくつかの重複がある。 このことを考慮して、本発明者らは、野生型プロモーター-オペレーター配列を有するΔdtxR変異株を用いることにより、s-Ontak関連タンパク質の発現が増加するかを検討した。 図29に見られるように、ΔdtxR変異株で発現させたWTプロモーター・オペレーター（SEQ ID NO:108）の組み合わせは、WT C. diphtheriae(ジフテリア菌)で発現させた変異オペレーター（SEQ ID NO:2）と比較して、タンパク質収量を約５０％増加させることができた。
【０１３４】
(疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）とミメティックブルーアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを用いた精製戦略)
【０１３５】
本明細書に記載のジフテリア毒素関連融合タンパク質毒素は、すべて天然ジフテリア毒素のトランスロケーションドメインを持っている。このドメインは、大部分が疎水性であり、高塩（1M NaCl）の条件下では、これらのタンパク質のフェニルセファロースクロマトグラフィー（疎水性相互作用クロマトグラフィー、HIC）媒体への結合を可能にする。これらのタンパク質は、溶出バッファー中の塩濃度を低下させる逆グラジエントを用いることにより、部分的に精製される。s-DAB1-389-IL2-V6A（SEQ ID NO:15）の場合、融合タンパク質毒素は100mM NaClの塩濃度でマトリックスから溶出し、部分的な濃縮を示した（図30）。このように、疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）は、His6タグを欠くs-Ontak関連タンパク質を精製するための有望なアプローチであり、ニッケルカラムクロマトグラフィーの使用を避けることができる。
【０１３６】
さらに、インターロイキン2の配列を含むタンパク質を選択的に結合させるために、ミメティックブルーアフィニティークロマトグラフィーが使用される。 この例では、s-DAB1-389-IL2-V6A（SEQ ID NO:15）、及び関連する変異タンパク質は、ミメティックブルーに選択的に結合し、pH7.0のトリス-HCl緩衝液中のNaClを増加させる勾配によってマトリックスから溶出する。 これらの実施例では、IL-2はミメティックブルーマトリックスに選択的に結合し、溶出液中のNaCl濃度が約600mMに達するとカラムマトリックスから溶出する。
【０１３７】
HIC、ミメティックブルークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーの組み合わせは、His6タグを持たないs-Ontak関連タンパク質の精製方法として有望であり、ニッケルカラムクロマトグラフィーの使用を避けることができる。
【０１３８】
V6Aは一過性のTregの枯渇を導く。
【０１３９】
本発明者らは、メラノーマ（B16F10）、及びトリプルネガティブ乳がん（4T1）のマウスモデルをs-DAB1-389-IL2-V6A-His6（SEQ ID NO: 43）で処置すると、腫瘍微小環境における活性化制御性Ｔ細胞の一過性の枯渇が生じることを示した。 例えば、乳腺脂肪パッド内の生着した4T1腫瘍の場合、s-DAB1-389-IL2-V6A-His6（SEQ ID NO: 43）の投与後３日以内に、本発明者らは、腫瘍内の活性化Tregの71％の減少を見いだした（図31を参照のこと）。  この減少は一過性であり、投与後１週間以内に総制御性Ｔ細胞数は正常レベルにリバウンドする。重要なことは、循環中のs-DAB1-389-IL2-V6A-His6（SEQ ID NO:43）の生物学的半減期がわずか60分であることであり（図43）、この一過性の減少に関連した長期的な免疫学的欠損（自己免疫疾患の誘発、潜伏結核の活性化など）がないことに注意を向けることである。
【０１４０】
したがって、s-DAB1-389-IL2-V6A-His6（SEQ ID NO: 43）、又は関連タンパク質を用いた初期の臨床試験では、循環Treg細胞の枯渇を薬効のためのバイオマーカーとして使用することが魅力的であると思われる。
【０１４１】
(s-Ontak関連蛋白質の抗PD1抗体との完全逐次二重療法は、強力な抗腫瘍効果をもたらす)
【０１４２】
s-Ontak関連タンパク質と抗PD1抗体との二重逐次療法に関する以前に開示されたデータは、s-Ontak関連タンパク質の投与が抗PD1チェックポイント阻害剤と重複しているマウスの治療レジメンを使用しており（図24、25、27）、したがって、薬剤は完全逐次に投与されていなかった。図32の新しいデータにおいて、本発明者らは、抗ＰＤ１に続くs-DAB1-389-IL2-V6A-His6（SEQ ID NO:43）の完全逐次な（重複しない）二重療法が、強力な抗腫瘍効果をもたらすことを示している。
【０１４３】
本発明者らはさらに、図33に見られるように、治療開始が遅れた場合（腫瘍移植後10日目）であっても、B16メラノーマモデルにおいて二重逐次治療が有効であることを観察した。
【０１４４】
（s-DAB1-389-IL2-V6A-His6（SEQ ID NO: 43）は、メラノーマに加えて、マウスの3つの追加の腫瘍タイプで活性がある）
【０１４５】
本発明者らは、s-DAB1-389-IL2-V6A-His6（SEQ ID NO:43）が、3つのマウス腫瘍モデルにおいて、単剤療法として強力な抗腫瘍活性を有することを実証した。(i) 同系CT26結腸がん（図34）、(ii) 同系RENCA腎細胞がん（図35）、及び(iii) 同所性4T1トリプルネガティブ乳がん（図49）である。
【０１４６】
また、本発明者らは、s-DAB1-389-IL2-V6A-His6（SEQ ID NO:43）が、2つのマウス腫瘍モデルにおいて、抗PD1抗体との二重逐次療法として、強力な抗腫瘍活性を有することを実証した。(i) 同系CT26結腸がん（図34）、(ii) 同系RENCA腎細胞がん（図35）である。
【０１４７】
D3E置換は、より安定なs-Ontak関連タンパク質をもたらし、半減期の延長、血管漏出の減少、力価の保持、及びC. diphtheriae（ジフテリア菌） C7(-)株におけるより高い発現レベルをもたらす。
【０１４８】
本発明の主要な部分は、s-OntakのD3E変異体バージョンが、(i)半減期の延長、(ii)血管漏出の減少、(iii)高い効力（s-Ontakと同等の84％の活性）、及び(iv)C. diphtheriae （ジフテリア菌）C7(-)株における4倍の高い発現に関連していることを発見したことである。
【０１４９】
本発明者らは、全長ジフテリア毒素の３次元結晶構造に基づくタンパク質構造アルゴリズムを用いた。特に、本発明者らは、xがバリン、イソロイシン、ロイシン、又はグリシンであり、yがセリン、ロイシン、又はバリンである血管漏出関連トリペプチドモチーフ(x)D(y)に着目した。 s-Ontakの配列は、そのアミノ末端付近にこのような2つの(x)D(y)モチーフを含む。V6D7S8とV28D29S30である。
【０１５０】
図36に見られるように、本発明者らは、s-Ontak 3次元構造の第２のα螺旋の末端にV6D7S8が出現し、第１のα螺旋ループと水素結合相互作用を形成していることに気付いた。具体的には、第１のヘリックスのD3が第２のヘリックスのS8と水素結合を形成している。本発明者らは、残基３におけるAspに対するGluの置換、すなわちD3Eの置換は、２つの螺旋間のより強固な水素結合相互作用をもたらすであろうと仮説を立てた。さらに、本発明者らは、より強固な水素結合が存在すると、D3E置換変異体は、V6D7S8モチーフを血管内皮に露出させ無くさせ、血管漏出を生じにくくなるという仮説を立てた。
【０１５１】
実際、本発明者らは、図37に示すように、s-Ontak-D3E-His6 (Tm = 45.5)は、s-Ontak-His6 (Tm 43.0)、及びs-Ontak-V6A-His6 (Tm 40.0)よりも優れた熱安定性を有することを見出した。基質NADの結合は、s-Ontak-D3E-His6、及びs-Ontak-His6の熱安定性をさらに増加させたが、その他の置換のs-Ontakの熱安定性を変化させなかった（図38）。
【０１５２】
C. diphtheriae（ジフテリア菌） C7(-)株におけるs-Ontak-D3E-His6の発現は、s-Ontakの約4倍であった（図40）。また、図43に示すように、s-Ontak-D3E-His6はs-Ontak-His6（150分）やs-Ontak-V6A-His6（60分）よりも長い血清半減期（240分）を示したが、これはタンパク質の安定性が向上したためと考えられる。
【０１５３】
本発明者らは、s-Ontak-D3E-His6がs-Ontak-His6の84％の活性を有する高いCD25+細胞殺傷力を示したのに対し、s-Ontak-V6A-His6はs-Ontak-His6の20％の細胞殺傷力を示したことを見出した（図40）。また、s-Ontak-D3E-His6は、HUVEC透過アッセイによって測定される血管漏出がs-Ontak-His6よりも有意に少ないことを示した（図41）。
【０１５４】
HUVEC透過アッセイによる血管漏出を研究するためにペプチドを使用して、本発明者らは、V6A、及びD3Eの置換に加えて、第２のVDS配列（V28D29S30）のD29E置換による改変もまた、血管漏出の減少をもたらしたことを観察した（図４２）。
【０１５５】
まとめると、D3E置換を用いることで、(i)半減期の延長、(ii)血管漏出の低減、(iii)高活性を有するs-Ontak関連タンパク質の製造が可能になると考えられる。 また、D3Eで置換したs-Ontak関連タンパク質は、C. diphtheriae（ジフテリア菌） C7(-)株で高い発現を示し、製造が容易になる可能性がある。
【０１５６】
s-DAB1-389-mIL4-His6（SEQ ID NO: 134）、及び関連タンパク質は、骨髄由来抑制細胞（MDSC）を含むCD124陽性細胞、及びCD124を有する腫瘍（例えば、トリプルネガティブ乳がん、TNBC）を殺す活性である。
【０１５７】
本発明者らは、図46に見られるように、C. diphtheriae（ジフテリア菌）発現系を使用して、s-DAB1-389-mIL4-His6（SEQ ID NO: 134）を生成した。本発明者らは、4T1 CD124+ TNBC腫瘍細胞に対して10 pMのIC50を有することを示した（図47）。
【０１５８】
s-DAB1-389-mIL4-His6（SEQ ID NO: 134）は、4T1トリプルネガティブ乳がんの同所移植マウスモデルにおいて、単剤療法として強力な抗腫瘍活性を示し、用量依存性の明確な腫瘍抑制作用を示した（図48）。 抗腫瘍活性は、抗腫瘍免疫を抑制することが知られているミエロイド由来のサプレッサー細胞（CD124+）の減少と関連していた（図48）。さらに、s-DAB1-389-mIL4-His6（SEQ ID NO:134）は、肺への転移を予防する活性を有していた（図48）。
【０１５９】
本発明者らは、4T１トリプルネガティブ乳がんの同所移植マウスモデルにおいて、s-DAB1-389-mIL4-His6（SEQ ID NO: 134）に続いてs-DAB1-389-IL2-His6（SEQ ID NO: 43）の組み合わせを試験した。2つの薬剤は、腫瘍体積と腫瘍重量で測定されるように相加的な効果を示した（図49）。単剤療法と併用療法の両方で、CD124+腫瘍細胞が減少した（図50）。単剤療法と併用療法の両方とも、マウスの脾臓におけるCD124+ MDSC細胞を減少させた（図51）。
【０１６０】
まとめると、s-DAB1-389-mIL4-His6（SEQ ID NO:134）は、CD124を発現する腫瘍（トリプルネガティブ乳がんなど）と同様に、腫瘍微小環境（MDSCは抗腫瘍免疫を阻害することが知られている）においてMDSCを枯渇させる有望な薬剤である。s-DAB1-389-EGF-His6（SEQ ID NO:106）、及び関連タンパク質は、EGFR陽性細胞を殺す活性がある。
【０１６１】
本発明者らは、図52に示すように、C. diphtheriae（ジフテリア菌）発現系を用いて、s-DAB1-389-EGF-His6（SEQ ID NO:106）を生成した。 本発明者らは、図53に見られるように、EGF受容体（EGFR）に陽性であるA431類表皮癌細胞株4T1に対して300pMのIC50を有することを示した。s-DAB1-389-EGF-His6(SEQ ID NO: 106)、及び関連タンパク質の重要な用途は、一般的にEGF受容体を高レベルで発現する多形質膠芽腫腫瘍の治療のためであろう。
【０１６２】
(動物実験と治療)
【０１６３】
C57BL/6マウスはCharles Rivers Laboratoryから購入し、動物実験はJohns Hopkins大学のIACUC承認プロトコールに従って行った。マウスには、チェックポイント阻害剤治療に先立ち、C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO:43、又はC. diphtheriae（ジフテリア菌）由来SEQ ID NO: 58、5μgを2回、指定日に100μlの腹腔内注射で投与した。 メラノーマ実験のために、マウスを右脇腹に1×105個のB16F10細胞を皮下注射した。 抗マウスPD1抗体（Bio X Cellから購入したクローンJ43、Cat# BE0033-2）を、指定された日に100μlの容量で腹腔内投与してマウスあたり100μgを与えた。 腫瘍を電子ノギスで測定し、腫瘍体積を次の式を用いて計算した：腫瘍体積＝長さ×幅×高さ0.5326。 マウスを指定された時点で安楽死させ、リンパ節、脾臓、及び腫瘍を単離した。 単細胞懸濁液を、100μmフィルターを介した解離により調製した。
【０１６４】
(材料と方法。  フローサイトメトリーと細胞刺激)
【０１６５】
単細胞懸濁液を、LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて生存率を評価するために染色した。 細胞を、精製ラット抗マウスCD16/32(BD)でインキュベートし、FACS緩衝液(PBS、2%熱不活性化FBS、0.1%HEPES、0.1%アジ化ナトリウム)中で以下の抗体(特に断りのない限りBD)で標識した。Ax700抗CD8、APC抗CD4、及びBV421抗CD25。 細胞内染色は、製造業者のプロトコールに従って転写因子緩衝液セット（BD Biosciences）を用いて行い、FITC抗FoxP3で標識した。 インビトロ活性化は、細胞をゴルジストップ（BD）存在下、PMA（50ng/mL）、及びイオノマイシン（1μM）で37℃、4時間インキュベートして実施した。 表面染色は上記のように行い、細胞内染色は、製造業者のプロトコールに従って、固定化／パーマビライゼーションソリューションキット（BD）を用いて行い、FITC抗IFNγで標識した。 サンプルをLSRII（BD）で分析し、FlowJo（Tree Star）を用いてデータを解析した。
【０１６６】
s-Ontak-His6（SEQ ID NO: 23として開示されている "His6"）の核酸、及びタンパク質配列
【０１６７】
C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来s-Ontak-His6（"His6"はSEQ ID NO: 23として開示されている）（理論MW 58339）（太字ではIL2部分）のタンパク質配列（SEQ ID NO: 58）。
【表２７】
2021515774.tif 000033
【０１６８】
C. diphtheriae（ジフテリア菌）由来-Ontak-His6（"His6 "はSEQ ID NO: 23として開示されている）（SEQ ID NO: 59）のDNA配列。プロモーター／オペレーターへの変化は太字で星を付けている。 下線部分はシグナル配列をコードする。成熟したs-Ontak-His6（"His6"はSEQ ID NO: 23として開示されている）の最初のコドンは、より大きなフォントで塩基149から始まり、イタリック体になっている。Ｃ末端のHis6（"His6 "はSEQ ID NO: 23として開示されている）のコドンは、より大きなフォントで、イタリック体で、１７０９塩基から始まる。
【表２８】
2021515774.tif 000034
【０１６９】
本明細書で引用された出版物、特許出願、特許を含むすべての参考文献は、それぞれの参考文献が個別に参照により組み込まれることが明示されており、その全体が本明細書に記載されているかのように、同じ範囲で参照により組み込まれる。
【０１７０】
本発明を説明する文脈での用語「前記」、及び類似の参照語の使用（特に以下の特許請求の範囲の文脈で）は、本明細書に別段の記載がない限り、又は文脈によって明確に矛盾しない限り、単数形、及び複数形の両方をカバーするように解釈される。用語「構成する」、「有する」、「含む」、及び「なる」は、別段の記載がない限り、オープンエンドの用語（すなわち、「含むが、これに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。 本明細書に記載された値の範囲の暗唱は、別段の記載がない限り、範囲内に収まる各個別の値を個別に参照するための略記法として機能することを単に意図しており、各個別の値は、それが個別に本明細書に列挙されたものであるかのように本明細書に組み込まれている。 本明細書に記載されたすべての方法は、本明細書に別段の記載がない限り、又は文脈によって明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。 本明細書で提供される任意の、及びすべての例示的な、又は例示的な言語（例えば、「のような」）の使用は、単に本発明をよりよく照らすことを意図したものであり、別段の主張がない限り、本発明の範囲に制限を与えるものではない。 本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施に不可欠なものとして、いかなる非請求項の要素を示すものと解釈されるべきではない。
【０１７１】
本発明の好ましい実施例が、本発明を実施するための最良の態様を含めて本明細書に記載されている。それらの好ましい実施例のバリエーションは、前記の説明を読むと、当技術分野の通常の熟練者に明らかになるかもしれない。本発明者らは、熟練した当業者がそのようなバリエーションを適宜採用することを期待しており、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されている以外の方法で本発明を実施することを意図している。したがって、本発明は、適用法により許容されるように、添付の特許請求の範囲に記載された主題のすべての改変、及び同等物を含む。さらに、本明細書に別段の記載がない限り、又は文脈によって明確に矛盾しない限り、あらゆる可能なバリエーションの本発明の記載された要素の任意の組み合わせが本発明に包含される。
【０１７２】
本開示の実施例は、SEQ ID NO:11から15のいずれかの核酸、又はタンパク質配列、又はそれらの融合タンパク質からなる本発明の組成物を被験者に投与して、癌、及び結核などの疾患を治療、及び／又は予防するための方法、及び／又は組成物に関する。
【０１７３】
がん、及び／又は結核のような疾患を有することが知られている個人、そのような疾患を有する疑いのある個人、又はそのような疾患を有する危険性のある個人には、例えばSEQ ID NO:11―15のいずれかからなる核酸、又はタンパク質配列、又はそれらの融合タンパク質からなる本発明の組成物の有効量を提供することができる。がん、又は結核のリスクを有する者は、１つ以上の遺伝的因子を有する者であってもよく、年齢が進んでいる者であってもよく、及び／又は例えば家族歴を有する者であってもよい。
【０１７４】
本開示の特定の実施例では、個人は、SEQ ID NO:11―15の何れかの核酸、又はタンパク質配列、又はその融合タンパク質からなる本発明の組成物に加えて、癌、及び/又は結核治療のための薬剤を投与される。このような追加治療は、例えば、化学療法、又は抗菌剤を含むことができる。 SEQ ID NO:11から15の何れかの核酸、又はタンパク質配列、又はその融合タンパク質からなる本発明の組成物を用いて併用療法を行う場合、追加療法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１―から１５のいずれの一つの核酸、又は他ンパク質配列、又はその融合タンパク質からなる本発明の組成物に先立って、同時に、及び／又は後に行われてもよい。
【０１７５】
(医薬品製剤)
【０１７６】
本発明の医薬組成物は、SEQ ID NO: 1から15のいずれかからなる核酸、又ははタンパク質配列、又はそれらの融合タンパク質からなる本発明の１種以上の組成物を、薬学的に許容される担体に溶解、又は分散させた有効量からなる。「製薬的、又は薬学的に許容される」という表現は、動物、例えばヒトに投与した場合に有害、アレルギー性、又は他の望ましくない反応を生じない分子実体、及び組成物を適宜指す。SEQ ID NO:11―15のいずれか１つの核酸、又はタンパク質配列、又はそれらの融合タンパク質、又は追加の活性成分からなる本発明の少なくとも１つの組成物からなる医薬組成物の調製は、Remingtonによって例示されるように、本開示に照らして当技術分野の当業者に知られているであろう。Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed. Lippincott Williams and Wilkins, 2005、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、動物（例えば、ヒト）投与のために、製剤は、ＦＤＡ生物学的基準局によって要求されるように、無菌性、高温性、一般的な安全性、及び純度の基準を満たすべきであることが理解されるであろう。
【０１７７】
本明細書で使用されるように、「薬学的に許容される担体」には、任意、及びすべての溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば 抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香料、染料、そのような材料、及びそれらの組み合わせを含み、当技術分野の通常の熟練者には知られているであろう（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed, Mack Printing Company, 1990, pp. Mack Printing Company, 1990, pp.1289-1329（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと) 任意の従来の担体が活性成分と相容れない場合を除き、医薬組成物におけるその使用が企図される。
【０１７８】
本発明のSEQ ID NO: 11―15のいずれか一つの核酸配列、又はタンパク質配列、又はそれらの融合タンパク質からなる１種以上の本発明の組成物は、固体、液体、エアゾールのいずれの形態で投与するか、注射などの投与経路において無菌である必要があるかによって、異なる種類の担体から構成されていてもよい。本発明の組成物は、静脈内、皮内、経皮、髄腔内、動脈内、腹腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、局所、筋肉内、皮下、粘膜内、口腔内、局所、吸入（例えば、エアゾール吸入）で投与することができる。エアゾール吸入、注射、注入、連続注入、局所灌流、カテーテルを介して、ラバージを介して、クリーム中で、脂質組成物（例えば、リポソーム）中で、又は当技術分野の通常の熟練者に知られている他の方法、又はこれらの任意の組み合わせによって、標的細胞を直接、浸漬する（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed, Mack Printing Company, 1990を参照のこと。Mack Printing Company, 1990、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１７９】
SEQ ID NO:11μgから15のいずれか１つの核酸配列、又はタンパク質配列、又はその融合タンパク質からなる本発明の１つ以上の組成物は、遊離塩基、中性、又は塩の形態で組成物に製剤化することができる。薬剤学的に許容される塩としては、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成される塩、又は例えば塩酸、若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、若しくはマンデル酸などの有機酸で形成される塩が挙げられる。 遊離カルボキシル基で形成された塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は第２鉄の水酸化物のような無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、又はプロカインのような有機塩基に由来することができる。 製剤化されると、溶液は、投与量の製剤と互換性のある方法で、治療上有効であるような量で投与される。製剤は、注射液、肺への送達のためのエアロゾルなどの非経口投与用に製剤化されたもの、又は薬物放出カプセルなどの消化管投与用に製剤化されたものなど、様々な剤形で容易に投与することができる。
【０１８０】
本開示に従ってさらに、投与に適した本発明の組成物は、不活性希釈剤の有無にかかわらず、薬剤学的に許容される担体中に提供される。担体は、同化可能であるべきであり、液体、半固体、すなわちペースト、又は固体担体を含む。任意の従来の媒体、薬剤、希釈剤、又は担体が、レシピエントに有害であるか、又はそこに含まれる組成物の治療効果に有害である場合を除いて、本発明の方法を実践するための投与可能な組成物中での使用が適切である。担体、又は希釈剤の例としては、油脂、油脂、水、生理食塩水、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、充填剤など、又はそれらの組み合わせが挙げられる。組成物はまた、１種以上の成分の酸化を遅らせるために、種々の抗酸化剤を含んでいてもよい。さらに、微生物の作用の防止は、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、又はそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、種々の抗菌剤、及び抗真菌剤のような防腐剤によってもたらされ得る。
【０１８１】
本発明に従って、組成物は、任意の便利で実用的な方法、すなわち、溶液、懸濁液、乳化、混和、カプセル化、吸収などによって、担体と組み合わされる。そのような手順は、当技術分野に熟練した者にとって日常的なものである。
【０１８２】
本発明の特定の実施例では、組成物は、半固体、又は固体の担体と十分に混合されるか、又は混合される。混合は、粉砕のような任意の好都合な方法で行うことができる。治療活性の損失、すなわち胃内での変性から組成物を保護するために、安定化剤を混合工程で添加することもできる。組成物中で使用するための安定化剤の例としては、緩衝剤、グリシン、及びリジンなどのアミノ酸、ブドウ糖、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、ショ糖、マルトース、ソルビトール、マンニトールなどの炭水化物などが挙げられる。
【０１８３】
さらなる実施例では、本発明は、SEQ ID NO:11から15のいずれか一つの核酸、又はタンパク質配列、又はそれらの融合タンパク質、1つ、又は複数の脂質、及び水性溶媒からなる本発明の1つ、又は複数の組成物を含む医薬用脂質ビヒクル組成物の使用に関する。本明細書で使用されるように、用語「脂質」は、特徴的に水に不溶であり、有機溶媒で抽出可能である、広範囲の物質のいずれかを含むように定義される。この幅広いクラスの化合物は、当技術分野の当業者にはよく知られており、用語「脂質」は本明細書で使用されるように、任意の特定の構造に限定されるものではない。 例としては、長鎖脂肪族炭化水素、及びその誘導体を含む化合物が挙げられる。脂質は、天然に存在するものであってもよいし、合成されたものであってもよい（すなわち、人によって設計、又は生産されたものである）。 しかしながら、脂質は通常、生物学的物質である。生物学的脂質は当技術分野でよく知られており、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、グリコスフィンゴ脂質、糖脂質、スルファチド、エーテル、及びエステル結合脂肪酸を有する脂質、重合性脂質、及びそれらの組み合わせが含まれる。もちろん、脂質として当業者に理解される本明細書に特に記載されたもの以外の化合物もまた、本発明の組成物、及び方法によって包含される。
【０１８４】
当技術分野における通常の熟練者の一人は、脂質ビヒクル中に組成物を分散させるために採用され得る技術の範囲に精通しているであろう。例えば、SEQ ID NO.11―15のいずれか一つの核酸、又はタンパク質配列からなる本発明の1つ、又は複数の組成物、又はそれらの融合タンパク質を含む組成物は、脂質を含む溶液中に分散させることができる。11―15のいずれかの核酸、又はタンパク質配列、又はそれらの融合タンパク質からなる本発明の１種、又は複数の組成物は、脂質を含む溶液中に分散させてもよいし、脂質と溶解させてもよいし、脂質と乳化させてもよいし、脂質と混合してもよいし、脂質と結合させてもよいし、脂質と共有結合させてもよいし、脂質中に懸濁液として含有させてもよいし、ミセル、又はリポソームと含有、又は複合化させてもよいし、そうでなければ、当技術分野の通常の当業者に知られている任意の方法で脂質、又は脂質構造体と関連させてもよい。分散物は、リポソームの形成をもたらしてもよいし、そうでなくてもよい。
【０１８５】
本発明の組成物を動物の患者に投与する実際の投与量は、体重、状態の重症度、治療される疾患の種類、以前の治療的介入、又は同時治療的介入、患者のイディオパシー、及び投与経路上の物理的、及び生理学的要因によって決定され得る。 投与量、及び投与経路に応じて、好ましい投与量、及び／又は有効量の投与回数は、被験体の反応に応じて変化する。 投与を担当する当業者は、いかなる場合でも、組成物中の有効成分（複数可）の濃度、及び個々の被験体に対する適切な投与量を決定する。
【０１８６】
特定の実施例では、医薬組成物は、例えば、少なくとも約0.1%の活性化合物を含んでもよい。 他の実施形態では、活性化合物は、ユニットの重量の約2%から約75%の間、又は例えば約25%から約60%の間、及びそこから派生する任意の範囲で構成されてもよい。 当然のことながら、各治療上有用な組成物中の活性化合物（複数可）の量は、適切な投与量が化合物の任意の所与の単位用量で得られるような方法で調製されてもよい。溶解性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品の貯蔵寿命、及び他の薬理学的考慮事項のような因子は、そのような医薬製剤を調製する技術に熟練した者によって企図され、そのようなものとして、様々な投与量、及び治療レジメンが望ましいかもしれない。
【０１８７】
他の非限定的な例では、用量はまた、約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体量、約５０マイクログラム／ｋｇ／体量、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重から構成されてもよい。約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０００ミリグラム／ｋｇ／体重、又はそれ以上の投与あたりの体重、及びそこに誘導体化可能な任意の範囲が挙げられる。  本明細書に記載された数値から誘導可能な範囲の非限定的な例では、約５ｍｇ／ｋｇ／体重から約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重から約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲を、上述の数値に基づいて投与することができる。
【０１８８】
さらなる実施例では、先の実施例のいずれかに記載の本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチドの純度が約80％を超えるものからなる。 他の実施例では、医薬組成物は、約81％より大きい、約82％より大きい、約83％より大きい、約84％より大きい、約85％より大きい、約86％より大きい、約87％より大きい、約88％より大きい、約89％より大きい、約90％より大きいを含む。本発明のポリペプチドの純度は、約91％以上、約92％以上、約93％以上、約94％以上、約95％以上、約95％以上、約96％以上、約97％以上、約98％以上、約99％以上、又は約100％以上である。 他の実施形態では、医薬組成物は、本発明のポリペプチドの約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、又は約100％の純度を含む。 他の実施形態では、医薬組成物は、約80％から約100％、約80％から約97％、約80％から約95％、約80％から約90％、約80％から約85％、約85％から約100％、約85％から約97％からなる。から約８５％から約９５％、約８５％から約９０％、約９０％から約１００％、約９０％から約９７％、約９０％から約９５％、約９５％から約１００％、又は約９５％から約９７％の本発明のポリペプチドの純度、又はそれらの任意の他の範囲から選択される。
【０１８９】
さらなる実施例では、先の実施例のいずれかに記載の本発明の医薬組成物は、約80％を超える本発明の凝集物を含まない、完全長のモノマーポリペプチドからなる。他の実施例では、医薬組成物は、約81％より大きい、約82％より大きい、約83％より大きい、約84％より大きい、約85％より大きい、約86％より大きい、約87％より大きい、約88％より大きい、約89％より大きい、約90％より大きい，を含む。約91％より大きい、約92％より大きい、約93％より大きい、約94％より大きい、約95％より大きい、約95％より大きい、約96％より大きい、約97％より大きい、約98％より大きい、約99％より大きい、又は約100％の凝集物を含まない、本発明の完全長モノマーポリペプチド。他の実施形態では、医薬組成物は、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、又は約100％の本発明の凝集物を含まない、完全長のモノメリックポリペプチドからなる。 他の実施形態では、医薬組成物は、約80％から約100％、約80％から約97％、約80％から約95％、約80％から約90％、約80％から約85％、約85％から約100％、約85％から約97％、約85％から約95％からなる。約８５％から約９０％まで、約９０％から約１００％まで、約９０％から約９７％まで、約９５％から約１００％まで、又は約９５％から約９７％まで、凝集物を含まない、本発明の完全長モノマーポリペプチド、又はそれらの任意の他の範囲から選択される。
【０１９０】
さらなる実施例では、本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチド（又は本明細書に記載の任意の他の範囲、又は量）の純度が約８０％を超え、かつ本発明のポリペプチド（又は本明細書に記載の任意の他の範囲、又は量）の凝集物を含まない、完全長のモノマー性ポリペプチド（又は本明細書に記載の任意の他の範囲、又は量）の純度が約８０％を超えるものからなる。
【０１９１】
さらなる実施例では、そのような医薬組成物のポリペプチドは、ヒスチジン（His）タグからなる。いくつかの実施形態では、Hisタグは、６個、又は９個のHis残基を有する。他の実施形態では、Hisタグは、ポリペプチドのＣ末端にある。他の実施形態では、そのような医薬組成物のポリペプチドは、Ｈｉｓタグを構成しない。
【０１９２】
(栄養組成物、及び製剤)
【０１９３】
本開示の一実施形態では、SEQ ID NO：11―15のいずれか一つの核酸又はタンパク質配列、又はその融合タンパク質からなる本発明の1つ以上の組成物は、消化管経路を介して投与されるように製剤化される。消化経路とは、組成物が消化管と直接接触するすべての可能な投与経路を含む。 具体的には、本明細書に開示された医薬組成物は、経口、頬側、直腸側、又は舌下に投与することができる。このように、これらの組成物は、不活性希釈剤を用いて、又は同化可能な食用担体を用いて処方されてもよく、又はハードシェル、又はソフトシェルゼラチンカプセルに封入されてもよく、又は錠剤に圧縮されてもよく、又は食事の食物と直接組み入れてもよい。
【０１９４】
特定の実施形態では、活性化合物は、賦形剤と一緒に組み込まれ、摂取可能な錠剤、口内テーブル、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハースなどの形態で使用され得る（Mathiowitzら、1997年；Hwangら、1998年；米国特許第5,641,515号；5,580,579、及び5,792,451号、それぞれが本明細書に参照として具体的に組み込まれている）。錠剤、トローチ、錠剤、カプセル等はまた、以下のものを含むことができる。例えば、ガムトラガカンス、アカシア、コーンスターチ、ゼラチン、又はそれらの組み合わせなどの結合剤；例えば、リン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、又はそれらの組み合わせなどの賦形剤。例えば、コーンスターチ、馬鈴薯澱粉、アルギン酸又はそれらの組み合わせなどの崩壊剤；例えば、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；例えば、ショ糖、乳糖、サッカリン、又はそれらの組み合わせなどの甘味剤；例えば、ペパーミント、冬緑油、チェリー香料、オレンジ香料などの香料；などの香料。 投与単位の形態がカプセルである場合、上記のタイプの材料に加えて、液体担体を含んでいてもよい。投与ユニットの形態がカプセルである場合には、上記のタイプの材料に加えて、液体担体が含まれていてもよい。例えば、錠剤、錠剤、又はカプセルは、シェラック、砂糖、又はその両方でコーティングされていてもよい。投与形態がカプセルである場合、上記のタイプの材料に加えて、液体担体などの担体を含んでいてもよい。 ゼラチンカプセル、錠剤、又は錠剤は、腸内コーティングされていてもよい。腸内コーティングは、ｐＨが酸性である胃、又は上部腸内での組成物の変性を防止する。例えば、米国特許第5,629,001号を参照のこと。第5,629,001号を参照のこと。小腸に到達すると、そこにある塩基性ｐＨは、コーティングを溶解し、組成物が、特殊な細胞、例えば、上皮性腸球及びパイエルパッチＭ細胞によって放出され、吸収されることを可能にする。シロップ又はエリキシルは、甘味料としての活性化合物スクロース、防腐剤としてのメチル、及びプロピルパラベン、染料、及び香料、例えばチェリーフレーバー又はオレンジフレーバーを含んでいてもよい。もちろん、任意の投与単位の形態を調製するのに使用される任意の材料は、薬学的に純粋であり、採用される量で実質的に無毒であるべきである。さらに、活性化合物は、徐放性製剤、及び製剤に組み込まれてもよい。
【０１９５】
経口投与のために、本開示の組成物は、代わりに、マウスウォッシュ、デンティフライス、口唇錠剤、経口スプレー、又は舌下経口投与製剤の形態で、１種以上の賦形剤と一緒に組み入れてもよい。例えば、マウスウォッシュは、ホウ酸ナトリウム溶液（Dobell's Solution）のような適切な溶媒中に必要量の活性成分を組み込んで調製されてもよい。あるいは、活性成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリン、及び炭酸水素カリウムを含むものなどの経口溶液に組み込まれてもよいし、歯磨剤に分散されてもよいし、水、結合剤、研磨剤、香料、発泡剤、及び保湿剤を含む組成物に治療上有効な量で添加されてもよい。あるいは、組成物は、舌下に置くか、口腔内で溶解させた錠剤、又は溶液の形態に成形されてもよい。
【０１９６】
他の消化管投与方法に適した追加の製剤には、座薬が含まれる。坐薬は、直腸に挿入するための様々な重さ、及び形状の固形製剤であり、通常は薬用である。挿入後、座薬は、軟化したり、溶解したり、空洞内の液体に溶解したりする。 一般に、坐薬の場合、従来の担体は、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリド、又はそれらの組み合わせを含むことができる。特定の実施形態では、坐薬は、例えば、約0.5%から約10%、好ましくは約1%から約2%の範囲の活性成分を含む混合物から形成されてもよい。
【０１９７】
(非経口用組成物、及び製剤)
【０１９８】
さらなる実施例では、SEQ ID NO:11から15のいずれか一つの核酸、又はタンパク質配列からなる本発明の1つ以上の組成物、又はその融合タンパク質は、非経口経路を介して投与され得る。 本明細書で使用されるように、「非経口」という用語は、消化管をバイパスする経路を含む。 具体的には、本明細書に開示される医薬組成物は、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、動脈内、髄腔内、皮下、又は腹腔内に投与することができるが、これらに限定されない。（米国特許第6,7537,514号、第6,613,308号、第5,466,468号、第5,543,158号；第5,641,515号；、及び第5,399,363号,各号は、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる）。
【０１９９】
遊離塩基、又は薬学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と好適に混合された水中で調製してもよい。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物、並びに油中で調製してもよい。 保管、及び使用の通常の条件下では、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含む。 注射可能な使用に適した医薬形態には、無菌注射可能な溶液、又は分散液、及び無菌注射可能な溶液、又は分散液の即時調製のための無菌粉末が含まれる（米国特許第5,466,468号、参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）。 すべての場合において、形態は無菌でなければならず、容易な注入性が存在する程度に流動性でなければならない。それは、製造、及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌、及び真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適当な混合物、及び／又は植物油を含む溶媒、又は分散媒体であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティング剤の使用、分散の場合には必要な粒子径の維持、界面活性剤の使用等により維持することができる。微生物の作用の防止は、各種の抗菌・抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によりもたらすことができる。多くの場合、等張化剤、例えば糖類や塩化ナトリウム等を含むことが好ましい。注射可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム、及びゼラチンを組成物中に使用することによってもたらされ得る。
【０２００】
水溶液での非経口投与のためには、例えば、必要に応じて溶液を適切に緩衝化し、液体希釈剤を最初に十分な生理食塩水、又はグルコースで等張化する必要がある。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内投与に特に適している。これに関連して、採用され得る無菌水性媒体は、本開示に照らして当技術分野の当業者に知られているであろう。 例えば、１つの投与量は、等張性ＮａＣｌ溶液に溶解して、皮下溶解液を添加するか、又は輸液の提案された部位に注入してもよい（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580参照のこと）。投与量には、治療を受ける対象の状態に応じて、必然的に多少のばらつきが生じる。 投与の責任者は、いかなる場合においても、個々の被験者に対する適切な投与量を決定する。さらに、ヒトへの投与のために、製剤は、FDA Office of Biologics standardsで要求されているように、無菌性、高温性、一般的な安全性、及び純度の基準を満たすべきである。
【０２０１】
無菌注射液は、必要に応じて、上記に列挙した他の成分の中から必要とされる種々の他の成分と共に、必要な量の活性化合物を適切な溶媒中に取り入れることによって調製され、次いで、濾過滅菌が行われる。一般に、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体、及び上記に列挙された他の成分の中から必要に応じて必要な量の他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥、及び凍結乾燥技術であり、これにより、活性成分の粉末に加えて、以前に無菌濾過されたその溶液から任意の追加の所望の成分が得られる。 粉末状の組成物は、安定化剤の有無にかかわらず、例えば水、又は生理食塩水などの液体担体と組み合わされる。
【０２０２】
（その他の医薬品組成物、及び製剤）
【０２０３】
本発明の他の好ましい実施例では、SEQ ID NO：11から15のいずれか一つの核酸、又はタンパク質配列からなる本発明の1つ以上の組成物、又はその融合タンパク質は、様々な雑多な経路、例えば、局所投与（すなわち、経皮投与）、粘膜投与（経鼻投与、膣投与など）、及び／又は吸入を介して投与するために製剤化され得る。
【０２０４】
局所投与用の医薬組成物は、軟膏、ペースト、クリーム、又は粉末などの薬用適用のために製剤化された活性化合物を含んでいてもよい。軟膏には、外用適用のためのすべてのオレインジン系、吸着系、エマルジョン系、水溶性ベースの組成物が含まれ、クリーム、及びローションには、エマルジョンベースのみを含む組成物が含まれる。 局所的に投与される薬剤は、皮膚を介した有効成分の吸着を促進するために、浸透促進剤を含んでいてもよい。適切な浸透促進剤としては、グリセリン、アルコール、アルキルメチルスルホキシド、ピロリドン及びルアロカプラムが挙げられる。局所適用のための組成物のための可能な基剤としては、ポリエチレングリコール、ラノリン、コールドクリーム及びペトロラタム、並びに任意の他の適切な吸収性、乳剤、又は水溶性軟膏基剤が挙げられる。 局所適用組成物はまた、有効成分を保存し、均質な混合物を提供するために必要に応じて、乳化剤、ゲル化剤、及び抗菌性防腐剤を含んでもよい。本発明の経皮投与はまた、「パッチ」の使用を含んでもよい。例えば、パッチは、１又は複数の活性物質を所定の速度で、一定期間にわたって連続的に供給してもよい。
【０２０５】
特定の実施形態では、医薬組成物は、目薬、鼻腔内スプレー、吸入、及び／又は他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達され得る。 鼻腔エアロゾルスプレーを介して組成物を肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第5,756,353号及び第5,804,212号に記載されている。（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）同様に、経鼻マイクロ粒子樹脂（Takenagaら、1998年）及びリゾホスファチジルグリセロール化合物（米国特許第5,725,871号、参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）もまた、医薬分野でよく知られている。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は、米国特許第5,780,045号に記載されている。（具体的には参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２０６】
エアロゾルという用語は、液化、又は加圧された気体推進剤中に分散された液体粒子の細分化された固体のコロイド系を指す。 吸入用の本発明の典型的なエアロゾルは、液体推進剤中の活性成分の懸濁液、液体推進剤と適当な溶媒との混合物からなる。適切な推進剤は、炭化水素、及び炭化水素エーテルを含む。適切な容器は、推進剤の圧力要件に応じて異なる。 エアゾールの投与は、対象者の年齢、体重、及び症状の重症度、及び反応に応じて異なる。
【０２０７】
（開示のキット）
【０２０８】
本明細書に記載された組成物のいずれかは、キットで構成されていてもよい。 非限定的な例では、SEQ ID NO:11から15、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:58、又はそれらの融合タンパク質のいずれかのような核酸、又はタンパク質配列からなる本発明の１種以上の組成物は、キットで構成されてもよい。
【０２０９】
キットは、SEQ ID NO:11から15、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:58、又はそれらの融合タンパク質のような核酸、又はタンパク質配列からなる本発明の1つ以上の組成物の適切な分注物、及び場合によっては1つ以上の追加の薬剤から構成されていてもよい。 キットの成分は、水性媒体中、又は凍結乾燥形態で包装されていてもよい。キットの容器体は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ、又は他の容器体を含み、これらの容器体に成分を入れることができ、好ましくは、適切にアリコートされる。 キット中に２つ以上の成分がある場合、キットはまた、一般に、追加の成分を別々に入れてもよい第２、第３、又は他の追加の容器を含むであろう。 しかしながら、成分の様々な組み合わせがバイアル中に構成されてもよい。 本発明のキットはまた、一般的に、SEQ ID NO:11から15、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:58、又はその融合タンパク質のいずれかの核酸、又はタンパク質配列からなる本発明の1つ、又は複数の組成物を、商業販売のための密封に収容するための手段、及び他の任意の試薬容器を含むであろう。このような容器は、所望のバイアルが保持される射出成形、又はブロー成形されたプラスチック容器を含むことができる。
【０２１０】
本キットの組成物が１種、及び／又はそれ以上の液体溶液で提供される場合、液体溶液は水溶液であり、無菌水溶液が特に好ましい。 SEQ ID NO:11から15、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:58のいずれかの核酸配列、又はタンパク質配列、又はそれらの融合タンパク質からなる本発明の１種以上の組成物は、シリンジ可能な組成物に製剤化されてもよい。この場合、容器手段は、それ自体が注射器、ピペット、及び／又は他のそのような装置であってもよく、そこから製剤を体内の感染部位に適用したり、動物に注射したり、及び／又はキットの他の成分に適用したり、及び／又は混合したりしてもよい。
【０２１１】
しかし、キットの成分は乾燥粉末として提供されてもよい。試薬及び／又は成分が乾燥粉末として提供される場合、適当な溶媒の添加によって粉末を再構成することができる。溶媒はまた、別の容器手段で提供されてもよいことが想定される。
【図１】
2021515774.tif 000035
【図２】
2021515774.tif 000036
【図３】
2021515774.tif 000037
【図４】
2021515774.tif 000038
【図５】
2021515774.tif 000039
【図６】
2021515774.tif 000040
【図７】
2021515774.tif 000041
【図８】
2021515774.tif 000042
【図９】
2021515774.tif 000043
【図１０】
2021515774.tif 000044
【図１１】
2021515774.tif 000045
【図１２】
2021515774.tif 000046
【図１３】
2021515774.tif 000047
【図１４】
2021515774.tif 000048
【図１５】
2021515774.tif 000049
【図１６】
2021515774.tif 000050
【図１７】
2021515774.tif 000051
【図１８】
2021515774.tif 000052
【図１９】
2021515774.tif 000053
【図２０】
2021515774.tif 000054
【図２１】
2021515774.tif 000055
【図２２】
2021515774.tif 000056
【図２３】
2021515774.tif 000057
【図２４】
2021515774.tif 000058
【図２５】
2021515774.tif 000059
【図２６】
2021515774.tif 000060
【図２７】
2021515774.tif 000061
【図２８】
2021515774.tif 000062
【図２９】
2021515774.tif 000063
【図３０】
2021515774.tif 000064
【図３１】
2021515774.tif 000065
【図３２】
2021515774.tif 000066
【図３３】
2021515774.tif 000067
【図３４】
2021515774.tif 000068
【図３５】
2021515774.tif 000069
【図３６】
2021515774.tif 000070
【図３７】
2021515774.tif 000071
【図３８】
2021515774.tif 000072
【図３９】
2021515774.tif 000073
【図４０】
2021515774.tif 000074
【図４１】
2021515774.tif 000075
【図４２】
2021515774.tif 000076
【図４３】
2021515774.tif 000077
【図４４】
2021515774.tif 000078
【図４５】
2021515774.tif 000079
【図４６】
2021515774.tif 000080
【図４７】
2021515774.tif 000081
【図４８】
2021515774.tif 000082
【図４９】
2021515774.tif 000083
【図５０】
2021515774.tif 000084
【図５１】
2021515774.tif 000085
【図５２】
2021515774.tif 000086
【図５３】
2021515774.tif 000087
【図５４−１】
2021515774.tif 000088
【図５４−２】
2021515774.tif 000089
【図５４−３】
2021515774.tif 000090
【図５４−４】
2021515774.tif 000091
【図５４−５】
2021515774.tif 000092
【図５４−６】
2021515774.tif 000093
【図５４−７】
2021515774.tif 000094
【図５４−８】
2021515774.tif 000095
【図５４−９】
2021515774.tif 000096
【図５４−１０】
2021515774.tif 000097
【図５４−１１】
2021515774.tif 000098
【図５４−１２】
2021515774.tif 000099
【図５４−１３】
2021515774.tif 000100
【図５４−１４】
2021515774.tif 000101
【図５４−１５】
2021515774.tif 000102
【図５４−１６】
2021515774.tif 000103
【図５４−１７】
2021515774.tif 000104
【図５４−１８】
2021515774.tif 000105
【図５４−１９】
2021515774.tif 000106
【図５４−２０】
2021515774.tif 000107
【図５４−２１】
2021515774.tif 000108
【図５４−２２】
2021515774.tif 000109
【図５４−２３】
2021515774.tif 000110
【図５４−２４】
2021515774.tif 000111
【図５４−２５】
2021515774.tif 000112
【図５４−２６】
2021515774.tif 000113
【図５４−２７】
2021515774.tif 000114
【図５４−２８】
2021515774.tif 000115
【図５４−２９】
2021515774.tif 000116
【図５４−３０】
2021515774.tif 000117
【図５４−３１】
2021515774.tif 000118
【図５４−３２】
2021515774.tif 000119
【図５４−３３】
2021515774.tif 000120
【図５４−３４】
2021515774.tif 000121
【図５４−３５】
2021515774.tif 000122
【図５４−３６】
2021515774.tif 000123
【図５４−３７】
2021515774.tif 000124
【図５４−３８】
2021515774.tif 000125
【図５４−３９】
2021515774.tif 000126
【図５４−４０】
2021515774.tif 000127
【図５４−４１】
2021515774.tif 000128
【図５４−４２】
2021515774.tif 000129
【図５４−４３】
2021515774.tif 000130
【図５４−４４】
2021515774.tif 000131
【図５４−４５】
2021515774.tif 000132
【図５４−４６】
2021515774.tif 000133
【図５４−４７】
2021515774.tif 000134
【図５４−４８】
2021515774.tif 000135
【図５４−４９】
2021515774.tif 000136
【図５４−５０】
2021515774.tif 000137
【図５４−５１】
2021515774.tif 000138
【図５４−５２】
2021515774.tif 000139
【図５４−５３】
2021515774.tif 000140
【図５４−５４】
2021515774.tif 000141
【図５４−５５】
2021515774.tif 000142
【図５４−５６】
2021515774.tif 000143
【図５４−５７】
2021515774.tif 000144
【図５４−５８】
2021515774.tif 000145
【図５４−５９】
2021515774.tif 000146
【図５４−６０】
2021515774.tif 000147
【図５４−６１】
2021515774.tif 000148
【図５４−６２】
2021515774.tif 000149
【図５４−６３】
2021515774.tif 000150
【図５４−６４】
2021515774.tif 000151
【図５４−６５】
2021515774.tif 000152
【図５４−６６】
2021515774.tif 000153
【図５４−６７】
2021515774.tif 000154
【図５４−６８】
2021515774.tif 000155
【図５４−６９】
2021515774.tif 000156
【図５４−７０】
2021515774.tif 000157
【図５４−７１】
2021515774.tif 000158
【図５４−７２】
2021515774.tif 000159
【図５４−７３】
2021515774.tif 000160
【図５４−７４】
2021515774.tif 000161
【図５４−７５】
2021515774.tif 000162
【図５４−７６】
2021515774.tif 000163
【図５４−７７】
2021515774.tif 000164
【図５４−７８】
2021515774.tif 000165
【図５４−７９】
2021515774.tif 000166
【図５４−８０】
2021515774.tif 000167
【図５４−８１】
2021515774.tif 000168
【図５４−８２】
2021515774.tif 000169
【図５４−８３】
2021515774.tif 000170
【図５４−８４】
2021515774.tif 000171
【図５５−１】
2021515774.tif 000172
【図５５−２】
2021515774.tif 000173
【図５５−３】
2021515774.tif 000174
【図５５−４】
2021515774.tif 000175
【図５５−５】
2021515774.tif 000176
【図５５−６】
2021515774.tif 000177
【図５５−７】
2021515774.tif 000178
【図５５−８】
2021515774.tif 000179
【図５５−９】
2021515774.tif 000180
【図５５−１０】
2021515774.tif 000181
【図５５−１１】
2021515774.tif 000182
【図５５−１２】
2021515774.tif 000183
【図５５−１３】
2021515774.tif 000184
【図５５−１４】
2021515774.tif 000185
【図５５−１５】
2021515774.tif 000186
【図５５−１６】
2021515774.tif 000187
【図５５−１７】
2021515774.tif 000188
【図５５−１８】
2021515774.tif 000189
【図５５−１９】
2021515774.tif 000190
【図５５−２０】
2021515774.tif 000191
【図５５−２１】
2021515774.tif 000192
【図５５−２２】
2021515774.tif 000193
【図５５−２３】
2021515774.tif 000194
【図５５−２４】
2021515774.tif 000195
【図５５−２５】
2021515774.tif 000196
【図５５−２６】
2021515774.tif 000197
【図５５−２７】
2021515774.tif 000198
【図５５−２８】
2021515774.tif 000199
【図５５−２９】
2021515774.tif 000200
【図５５−３０】
2021515774.tif 000201
【図５５−３１】
2021515774.tif 000202
【図５５−３２】
2021515774.tif 000203
【図５５−３３】
2021515774.tif 000204
【図５５−３４】
2021515774.tif 000205
【図５５−３５】
2021515774.tif 000206
【図５５−３６】
2021515774.tif 000207
【図５５−３７】
2021515774.tif 000208
【図５５−３８】
2021515774.tif 000209
【図５５−３９】
2021515774.tif 000210
【図５５−４０】
2021515774.tif 000211
【図５５−４１】
2021515774.tif 000212
【図５５−４２】
2021515774.tif 000213
【図５５−４３】
2021515774.tif 000214
【図５５−４４】
2021515774.tif 000215
【図５５−４５】
2021515774.tif 000216
【図５５−４６】
2021515774.tif 000217
【図５５−４７】
2021515774.tif 000218
【図５５−４８】
2021515774.tif 000219
【図５５−４９】
2021515774.tif 000220
【図５５−５０】
2021515774.tif 000221
【図５５−５１】
2021515774.tif 000222
【図５５−５２】
2021515774.tif 000223
【図５５−５３】
2021515774.tif 000224
【図５５−５４】
2021515774.tif 000225
【図５５−５５】
2021515774.tif 000226
【図５５−５６】
2021515774.tif 000227
【図５５−５７】
2021515774.tif 000228
【図５５−５８】
2021515774.tif 000229
【図５５−５９】
2021515774.tif 000230
【図５５−６０】
2021515774.tif 000231
【図５５−６１】
2021515774.tif 000232
【図５５−６２】
2021515774.tif 000233
【図５５−６３】
2021515774.tif 000234
【図５５−６４】
2021515774.tif 000235
【図５５−６５】
2021515774.tif 000236
【図５５−６６】
2021515774.tif 000237
【図５５−６７】
2021515774.tif 000238
【図５５−６８】
2021515774.tif 000239
【図５５−６９】
2021515774.tif 000240
【図５５−７０】
2021515774.tif 000241
【図５５−７１】
2021515774.tif 000242
【図５５−７２】
2021515774.tif 000243
【図５５−７３】
2021515774.tif 000244
【図５５−７４】
2021515774.tif 000245
【図５５−７５】
2021515774.tif 000246
【図５５−７６】
2021515774.tif 000247
【図５５−７７】
2021515774.tif 000248
【図５５−７８】
2021515774.tif 000249
【図５５−７９】
2021515774.tif 000250
【図５５−８０】
2021515774.tif 000251
【図５５−８１】
2021515774.tif 000252
【図５５−８２】
2021515774.tif 000253
【図５５−８３】
2021515774.tif 000254
【図５５−８４】
2021515774.tif 000255
【図５５−８５】
2021515774.tif 000256
【図５５−８６】
2021515774.tif 000257
【図５５−８７】
2021515774.tif 000258
【図５５−８８】
2021515774.tif 000259
【図５５−８９】
2021515774.tif 000260
【図５５−９０】
2021515774.tif 000261
【図５５−９１】
2021515774.tif 000262
【図５５−９２】
2021515774.tif 000263
【図５５−９３】
2021515774.tif 000264
【図５５−９４】
2021515774.tif 000265
【図５５−９５】
2021515774.tif 000266
【図５５−９６】
2021515774.tif 000267
【図５５−９７】
2021515774.tif 000268
【図５６−１】
2021515774.tif 000269
【図５６−２】
2021515774.tif 000270
【図５６−３】
2021515774.tif 000271
【図５６−４】
2021515774.tif 000272
【国際調査報告】
2021515774.tif 000273