(57)【要約】  本技術は、例えば、生物工学における標的分子の検出の改善をもたらす方法及び組成物に関する。
2021514202.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成すること、
標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、
所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する液滴を単離すること、及び
所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であること
を含む、改変産生細胞の集団を作製する方法。
【請求項２】
前記回収は、
（ａ）前記液滴を破壊すること、
（ｂ）前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
（ｃ）増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選別は、蛍光活性化液滴選別（ＦＡＤＳ）又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記回収は、
（ａ）前記液滴を選別すること、
（ｂ）前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
（ｃ）増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、請求項２又は請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記選別は、蛍光活性化液滴選別（ＦＡＤＳ）又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記液滴を破壊することは、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を封入する液滴を破壊して、前記改変産生細胞の集団を形成することを含み、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団である、請求項２〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするＤＮＡがエピソーム的にコードされている、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするＤＮＡがプラスミド上にコードされている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするＤＮＡが前記産生細胞のゲノムに組み込まれている、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーが、前記産生細胞内において、トランスフェクトされる若しくはトランスフェクトされている、形質導入される若しくは形質導入されている、形質転換される若しくは形質転換されている、又はそれ以外の方法で利用可能にされる若しくは利用可能にされている、請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記レポーターが、前記センサーをベースとしたタンパク質によってトランスに活性化される検出可能なマーカーをコードする遺伝子である、請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出可能なマーカーが酵素又は選択可能マーカーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記酵素が、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、又はアルカリホスファターゼから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記選択可能なマーカーが栄養要求株、抗生物質、耐性マーカー、毒素、又は分光的に検出可能な遺伝子産物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記選択可能なマーカーが蛍光タンパク質である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記分光的に検出可能な遺伝子産物が分光法又は分光分析により検出される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記レポーターをコードする遺伝子がエピソーム的にコードされている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記レポーターをコードする遺伝子がプラスミド上にエピソーム的にコードされている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記レポーターをコードする遺伝子が、前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードする遺伝子と同じプラスミド上にコードされている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記レポーターをコードする遺伝子がゲノムに組み込まれている、請求項１１〜請求項１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記改変産生細胞のプールが採取される、改変産生株ライブラリーを作製することをさらに含み、前記改変産生株ライブラリーは、１又は複数の標的分子を産生するように改変される、請求項１〜請求項２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
改変産生株ライブラリーは、多重自動ゲノム工学法（ＭＡＧＥ）、プラスミドをベースとした産生の変動、又は非ＧＭＯ法から選択されるゲノム多様化技術によって生成され、非ＧＭＯ法は、化学的変異誘発、放射線、及びトランスポゾンから選択される、請求項１〜請求項２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
単離された改変産生細胞を封入する前記液滴が、増殖培地及び任意の必要な誘導剤をさらに含む、請求項１〜請求項２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記改変タンパク質センサーによって提供される前記読み取りレベルがレポーターによるものである、請求項１〜請求項２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記レポーターがＧＦＰである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記改変タンパク質センサーが転写因子である、請求項１〜請求項２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記転写因子がアロステリック転写因子（ａＴＦ）である、請求項１〜請求項２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記改変タンパク質センサーが、ＬｙｓＲ、ＡｒａＣ／ＸｙｌＳ、ＴｅｔＲ、ＬｕｘＲ、ＬａｃＩ、ＡｒｓＲ、ＭｅｒＲ、ＡｓｎＣ、ＭａｒＲ、ＮｔｒＣ（ＥＢＰ）、ＯｍｐＲ、ＤｅｏＲ、Ｃｏｌｄ  ｓｈｏｃｋ、ＧｎｔＲ、及びＣｒｐファミリーメンバーから選択される改変原核生物転写調節因子ファミリーメンバーである、請求項１〜請求項２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記改変タンパク質センサーが、表１に列挙された改変ａＴＦ（ａＴＦ「外枠」）である、請求項１〜請求項２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的分子が、表１（標的分子の特性）に列挙された標的分子から選択される、請求項１〜請求項２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
改変センサープラスミドを用いて改変産生細胞のプールを形質転換することであって、前記改変センサープラスミドは改変タンパク質センサーをコードすること、
遺伝的に多様な産生細胞の前記プールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成すること、
標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、
所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する前記液滴を単離すること、及び
所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であること
を含む、改変産生細胞の集団を作製する方法。
【請求項３２】
前記回収は、
（ａ）前記液滴を破壊すること、
（ｂ）前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
（ｃ）増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記選別は、蛍光活性化液滴選別（ＦＡＤＳ）又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記回収は、
（ａ）前記液滴を選別すること、
（ｂ）前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
（ｃ）増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記選別は、蛍光活性化液滴選別（ＦＡＤＳ）又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記液滴を破壊することは、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を封入する液滴を破壊して、前記改変産生細胞の集団を形成することを含み、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団である、請求項３２〜請求項３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするＤＮＡがエピソーム的にコードされている、請求項３１〜請求項３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするＤＮＡがプラスミド上にコードされている、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするＤＮＡが前記産生細胞のゲノムに組み込まれている、請求項３１〜請求項３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーが、前記産生細胞内において、トランスフェクトされる若しくはトランスフェクトされている、形質導入される若しくは形質導入されている、形質転換される若しくは形質転換されている、又はそれ以外の方法で利用可能にされる若しくは利用可能にされている、請求項３１〜請求項３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記レポーターが、前記センサーをベースとしたタンパク質によってトランスに活性化される検出可能なマーカーをコードする遺伝子である、請求項３１〜請求項４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記検出可能なマーカーが酵素又は選択可能なマーカーである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記酵素が、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、又はアルカリホスファターゼから選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記選択可能なマーカーが栄養要求株、抗生物質、耐性マーカー、毒素、又は分光的に検出可能な遺伝子産物である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記選択可能なマーカーが蛍光タンパク質である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記分光的に検出可能な遺伝子産物が分光法又は分光分析により検出される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記レポーターをコードする遺伝子がエピソーム的にコードされている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記レポーターをコードする遺伝子がプラスミド上にエピソーム的にコードされている、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記レポーターをコードする遺伝子が、前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードする遺伝子と同じプラスミド上にコードされている、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記レポーターをコードする遺伝子がゲノムに組み込まれている、請求項４１〜請求項４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記改変産生細胞のプールが採取される、改変産生株ライブラリーを作製することをさらに含み、前記改変産生株ライブラリーは、１又は複数の標的分子を産生するように改変される、請求項３１〜請求項５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記改変産生株ライブラリーが、改変センサープラスミドで前記改変産生細胞のプールを形質転換する前に作製される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記改変産生株ライブラリーが、改変センサープラスミドで前記改変産生細胞のプールを形質転換した後に作製される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
改変産生株ライブラリーは、多重自動ゲノム工学法（ＭＡＧＥ）、プラスミドをベースとした産生の変動、又は非ＧＭＯ法から選択されるゲノム多様化技術によって生成され、非ＧＭＯ法は、化学的変異誘発、放射線、及びトランスポゾンから選択される、請求項３１〜請求項５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
単離された改変産生細胞を封入する前記液滴が、増殖培地及び任意の必要な誘導剤をさらに含む、請求項３１〜請求項５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記改変タンパク質センサーによって提供される前記読み取りレベルがレポーターによるものである、請求項３１〜請求項５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記レポーターがＧＦＰである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記改変タンパク質センサーが転写因子である、請求項３１〜請求項５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記転写因子がアロステリック転写因子（ａＴＦ）である、請求項３１〜請求項５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記改変タンパク質センサーが、ＬｙｓＲ、ＡｒａＣ／ＸｙｌＳ、ＴｅｔＲ、ＬｕｘＲ、ＬａｃＩ、ＡｒｓＲ、ＭｅｒＲ、ＡｓｎＣ、ＭａｒＲ、ＮｔｒＣ（ＥＢＰ）、ＯｍｐＲ、ＤｅｏＲ、Ｃｏｌｄ  ｓｈｏｃｋ、ＧｎｔＲ、及びＣｒｐファミリーメンバーから選択される改変原核生物転写調節因子ファミリーメンバーである、請求項３１〜請求項５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記改変タンパク質センサーが、表１に列挙された改変ａＴＦ（ａＴＦ「外枠」）である、請求項３１〜請求項５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記標的分子が、表１（標的分子の特性）に列挙された標的分子から選択される、請求項３１〜請求項６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成すること、
前記産生細胞を含む各液滴を、改変タンパク質をベースとしたセンサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、
標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、
前記融合された液滴を選別して所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を含む液滴を単離すること、及び
所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であること
を含む、改変産生細胞の集団を作製する方法。
【請求項６４】
前記回収は、
（ａ）前記液滴を破壊すること、
（ｂ）前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
（ｃ）増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記選別は、蛍光活性化液滴選別（ＦＡＤＳ）又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記回収は、
（ａ）前記液滴を選別すること、
（ｂ）前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
（ｃ）増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記選別は、蛍光活性化液滴選別（ＦＡＤＳ）又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記液滴を破壊することは、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を封入する液滴を破壊して、前記改変産生細胞の集団を形成することを含み、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団である、請求項６４〜請求項６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするＤＮＡがエピソーム的にコードされている、請求項６３〜請求項６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするＤＮＡがプラスミド上にコードされている、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするＤＮＡが前記産生細胞のゲノムに組み込まれている、請求項６３〜請求項７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーが、前記産生細胞内において、トランスフェクトされる若しくはトランスフェクトされている、形質導入される若しくは形質導入されている、形質転換される若しくは形質転換されている、又はそれ以外の方法で利用可能にされる若しくは利用可能にされている、請求項１〜請求項７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記レポーターが、前記センサーをベースとしたタンパク質によってトランスに活性化される検出可能なマーカーをコードする遺伝子である、請求項１〜請求項７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記検出可能なマーカーが酵素又は選択可能なマーカーである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記酵素が、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、又はアルカリホスファターゼから選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記選択可能なマーカーが栄養要求株、抗生物質、耐性マーカー、毒素、又は分光的に検出可能な遺伝子産物である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記選択可能なマーカーが蛍光タンパク質である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記分光的に検出可能な遺伝子産物が分光法又は分光分析により検出される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記レポーターをコードする遺伝子がエピソーム的にコードされている、請求項７３に記載の方法。
【請求項８０】
前記レポーターをコードする遺伝子がプラスミド上にエピソーム的にコードされている、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記レポーターをコードする遺伝子が、前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードする遺伝子と同じプラスミド上にコードされている、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記レポーターをコードする遺伝子がゲノムに組み込まれている、請求項７３〜請求項８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記改変産生細胞のプールが採取される、改変産生株ライブラリーを作製することをさらに含み、前記改変産生株ライブラリーは、１又は複数の標的分子を産生するように改変される、請求項６３〜請求項８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
改変産生株ライブラリーは、多重自動ゲノム工学法（ＭＡＧＥ）、プラスミドをベースとした産生の変動、又は非ＧＭＯ法から選択されるゲノム多様化技術によって生成され、非ＧＭＯ法は、化学的変異誘発、放射線、及びトランスポゾンから選択される、請求項６３〜請求項８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
単離された改変産生細胞を封入する前記液滴が、増殖培地及び任意の必要な誘導剤をさらに含む、請求項６３〜請求項８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記改変タンパク質センサーによって提供される前記読み取りレベルがレポーターによるものである、請求項６３〜請求項８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記レポーターがＧＦＰである、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記改変タンパク質センサーが転写因子である、請求項６３〜請求項８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記転写因子がアロステリック転写因子（ａＴＦ）である、請求項６３〜請求項８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記改変タンパク質センサーが、ＬｙｓＲ、ＡｒａＣ／ＸｙｌＳ、ＴｅｔＲ、ＬｕｘＲ、ＬａｃＩ、ＡｒｓＲ、ＭｅｒＲ、ＡｓｎＣ、ＭａｒＲ、ＮｔｒＣ（ＥＢＰ）、ＯｍｐＲ、ＤｅｏＲ、Ｃｏｌｄ  ｓｈｏｃｋ、ＧｎｔＲ、及びＣｒｐファミリーメンバーから選択される改変原核生物転写調節因子ファミリーメンバーである、請求項６３〜請求項８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記改変タンパク質センサーが、表１に列挙された改変ａＴＦ（ａＴＦ「外枠」）である、請求項６３〜請求項８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記標的分子が、表１（標的分子の特性）に列挙された標的分子から選択される、請求項６３〜請求項９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
改変センサープラスミドを用いて改変産生細胞のプールを形質転換することであって、前記改変センサープラスミドは改変タンパク質センサーをコードすること、
遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、
標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、
所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する液滴を単離すること、及び
所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であること
を含む、改変産生細胞の集団を作製する方法。
【請求項９４】
遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、各液滴は、
（ａ）フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、及び
（ｂ）改変センサー細胞を含み、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、
標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、
所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する前記液滴を単離すること、並びに
所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であること
を含む、改変産生細胞の集団を作製する方法。
【請求項９５】
遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、
前記産生細胞を含む各液滴を、改変タンパク質をベースとしたセンサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、
標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、
前記融合された液滴を選別して所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を含む液滴を単離すること、及び
所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であること
を含む、改変産生細胞の集団を作製する方法。
【請求項９６】
前記フッ素化をベースとした油又は乳剤が、有機油、フッ素化油、フッ素化ポリマー、フルオロカーボン中水型乳剤、パーフルオロカーボン中水型乳剤、又はそれらの組み合わせである、請求項９３〜請求項９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記フッ素化をベースとした油又は乳剤が粒子によって安定化される、請求項９３〜請求項９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記粒子が、部分的にフッ素化されたナノ粒子又は部分的に疎水性のナノ粒子である、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記部分的にフッ素化されたナノ粒子又は部分的に疎水性のナノ粒子がシリカをベースとしたナノ粒子である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記液滴がマイクロ流体制御下にある、請求項９３〜請求項９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記改変産生細胞のプールが採取される、改変産生株ライブラリーを作製することをさらに含み、前記改変産生株ライブラリーは、１又は複数の標的分子を産生するように改変される、請求項９３〜請求項１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
改変産生株ライブラリーは、多重自動ゲノム工学法（ＭＡＧＥ）、プラスミドをベースとした産生の変動、又は非ＧＭＯ法から選択されるゲノム多様化技術によって生成され、非ＧＭＯ法は、化学的変異誘発、放射線、及びトランスポゾンから選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記単離された改変産生細胞を封入する液滴が、増殖培地及び任意の必要な誘導剤をさらに含む、請求項９３〜請求項１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記改変タンパク質センサーによって提供される前記読み取りレベルがレポーターによるものである、請求項９３〜請求項１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記レポーターがＧＦＰである、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記改変タンパク質センサーが転写因子である、請求項９３〜請求項１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記転写因子がアロステリック転写因子（ａＴＦ）である、請求項９３〜請求項１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記改変タンパク質センサーが、ＬｙｓＲ、ＡｒａＣ／ＸｙｌＳ、ＴｅｔＲ、ＬｕｘＲ、ＬａｃＩ、ＡｒｓＲ、ＭｅｒＲ、ＡｓｎＣ、ＭａｒＲ、ＮｔｒＣ（ＥＢＰ）、ＯｍｐＲ、ＤｅｏＲ、Ｃｏｌｄ  ｓｈｏｃｋ、ＧｎｔＲ、及びＣｒｐファミリーメンバーから選択される改変原核生物転写調節因子ファミリーメンバーである、請求項９３〜請求項１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記改変タンパク質センサーが、表１に列挙された改変ａＴＦである、請求項９３〜請求項１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記標的分子が、表１（標的分子の特性）に列挙された標的分子から選択される、請求項９３〜請求項１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記回収は、
（ａ）前記液滴を破壊すること、
（ｂ）前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
（ｃ）増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、請求項９３〜請求項１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記選別は、蛍光活性化液滴選別（ＦＡＤＳ）又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記回収は、
（ａ）前記液滴を選別すること、
（ｂ）前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
（ｃ）増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、請求項９３〜請求項１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記選別は、蛍光活性化液滴選別（ＦＡＤＳ）又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記液滴を破壊することは、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を封入する前記液滴を破壊して、前記改変産生細胞の集団を形成することを含み、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団である、請求項１１１〜請求項１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするＤＮＡがエピソーム的にコードされている、請求項９３〜請求項１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするＤＮＡがプラスミド上にコードされている、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするＤＮＡが前記産生細胞のゲノムに組み込まれている、請求項９３〜請求項１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーが、前記産生細胞内において、トランスフェクトされる若しくはトランスフェクトされている、形質導入される若しくは形質導入されている、形質転換される若しくは形質転換されている、又はそれ以外の方法で利用可能にされる若しくは利用可能にされている、請求項９３〜請求項１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記レポーターが、前記センサーをベースとしたタンパク質によってトランスに活性化される検出可能なマーカーをコードする遺伝子である、請求項９３〜請求項１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記検出可能なマーカーが酵素又は選択可能なマーカーである、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記酵素が、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、又はアルカリホスファターゼから選択される、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記選択可能なマーカーが栄養要求株、抗生物質、耐性マーカー、毒素、又は分光的に検出可能な遺伝子産物である、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記選択可能なマーカーが蛍光タンパク質である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２５】
前記分光的に検出可能な遺伝子産物が分光法又は分光分析により検出される、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記レポーターをコードする遺伝子がエピソーム的にコードされている、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２７】
前記レポーターをコードする遺伝子がプラスミド上にエピソーム的にコードされている、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記レポーターをコードする遺伝子が、前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードする遺伝子と同じプラスミド上にコードされている、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記レポーターをコードする遺伝子がゲノムに組み込まれている、請求項１２０〜請求項１２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが前記産生細胞内にコードされている、請求項１〜請求項３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、共封入されたセンサー細胞内にコードされている、請求項１〜請求項３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、別の液滴に封入された後に改変産生細胞を含む前記液滴と融合されるセンサー細胞内にコードされている、請求項１〜請求項３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが前記産生細胞内にコードされている、請求項３１〜請求項６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、共封入されたセンサー細胞内にコードされている、請求項３１〜請求項６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、別の液滴に封入された後に改変産生細胞を含む前記液滴と融合されるセンサー細胞内にコードされている、請求項３１〜請求項６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが前記産生細胞内にコードされている、請求項６３〜請求項９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、共封入されたセンサー細胞内にコードされている、請求項６３〜請求項９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、別の液滴に封入された後に改変産生細胞を含む前記液滴と融合されるセンサー細胞内にコードされている、請求項６３〜請求項９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが前記産生細胞内にコードされている、請求項９３〜請求項１２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、共封入されたセンサー細胞内にコードされている、請求項９３〜請求項１２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、別の液滴に封入された後に改変産生細胞を含む前記液滴と融合されるセンサー細胞内にコードされている、請求項９３〜請求項１２９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年２月１５日に出願された米国仮出願第６２／６３１，０９０号、及び２０１８年９月１２日に出願された米国仮出願第６２／７３０，３５５号の利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本技術は、改変タンパク質センサー（engineered protein sensor）を使用して改変産物産生細胞（engineered producer producing cell）を検出及び濃縮するための方法及び組成物に関する。
【０００３】
政府所有権
本発明は、国防高等研究計画局（ＤＡＲＰＡ）から授与された助成金番号Ｄ１６ＰＣ００１３２に基づく米国政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
小分子の認識を転写生産に直接結びつける単一タンパク質である細菌性アロステリック転写因子（ａＴＦ）の使用は、酵素の生物学的生産及び検出を改善する代謝工学戦略における使用が提案されている（Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３（２）：１７７）。エフェクターの結合によって引き起こされるタンパク質の構造変化により、特定のオペレーターＤＮＡ配列に対するその親和性が調節され、それにより遺伝子発現が最大５０００倍まで変化する。これにより、ａＴＦセンサーは、合成生物学の多くの適用の中心となる感知及び応答の課題（ｓｅｎｓｅ−ａｎｄ−ｒｅｓｐｏｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対処するための興味深いパラダイムになる。
【０００５】
ａＴＦは迅速にリガンドを感知し、レポーター（例えば、蛍光タンパク質又は選択マーカー）の発現誘導などの標的化された転写の変化を誘発する。これにより、同族リガンドの細胞内濃度が高い細胞の濃縮が可能になる（例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）又は増殖による）。代謝工学の観点では、これにより、改変株をスクリーニング可能なスループットが大幅に向上する。
【０００６】
しかしながら、特定のゲノム工学の状況（例えば、コア代謝プロセスを対象とする大規模なゲノム操作を行う場合）では、センサーの性能の変動により、改変センサーを確実に展開できない場合がある。プラスミドをベースとしたリジンセンサー系でスクリーニングされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異体の化学的に変異誘発されたライブラリーなど、変異体間のセンサー応答変動が見られた（Ｂｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７３（Ｒ４０），１−１２，２０１２）。
【０００７】
センサーの性能は、生産機能及び感知機能を分断することによって回復され得る。例えば、一方の株が生産専用でもう一方の株が感知専用である２種類の株を共培養すると、ゲノムの変動によって生産レベルを変更できる一方で、改変されていない各センサー株は、産生株により産生される産物のレベルに対して確実な応答を提供する。しかしながら、このためには、スクリーニングされる改変産生株の各々を、センサー株を用いて独自の増殖容器で増殖させる必要があり、これは、１０６を超える独自のメンバーを有する産生株ライブラリーを使用する際に課題を提示する。
【０００８】
他の状況では（例えば、拡散性産物又は能動的に排出される産物と共に機能する場合）、改変産生株群を分離した状態で増殖させてスクリーニングし、集団中の非産生株と改善された産生株とのクロストークを回避する必要がある。例えば、大量のナリンゲニン又は少量のナリンゲニンを産生し、ＧＦＰに基づいたナリンゲニンセンサー系で形質転換される２種類の産生株を共培養すると、産生期後にＧＦＰに基づく強い蛍光及び弱い蛍光を示す２つの亜集団が生成されるべきである。しかしながら、産生後、１種類の中間蛍光集団のみが見られ、各細胞の個々の産生合計ではなく、集団全体にわたる拡散産物のバルクレベルへの応答が示唆される（実施例２、図３）。実際の選択では、この集団の平均化又はクロストークは、研究者が残りの集団から産生量のより高い改変菌株を特定する能力を阻害することとなる。この課題を克服するには、さらに各改変株を各自の増殖容器内で独自に区画化する必要がある。
【０００９】
したがって、改変産物産生細胞を検出及び濃縮するための改良された方法及び系が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本技術は、改変されたセンサー技術を使用して、バルク混合液滴又はマイクロ流体的に生成された液滴内の改変された産生株（すなわち、細胞）の増殖及び選択を改善するための方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、マイクロ流体的に生成された液滴は、大規模に改変株のための均一で単離された増殖容器を提供する。いくつかの実施形態において、液滴は、２０ｋＨｚ未満（例えば、約２０ｋＨｚ未満、約１５ｋＨｚ未満、約１０ｋＨｚ未満、又は約５ｋＨｚ未満）で生成され、毎秒２，０００〜５，０００（例えば、約２，０００、約２，５００、約３，０００、約３，５００、約４，０００、約４，５００、又は約５，０００）の固有の産生株の封入（encapsulation）が可能となり、これにより、１日に、マイクロ流体デバイスあたり５億未満の固有の産生株のスクリーニングを実施できる。
【００１１】
一態様では、本発明は、遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、改変センサープラスミドを用いて改変産生細胞のプールを形質転換することであって、前記改変センサープラスミドは改変タンパク質センサーをコードすること、遺伝的に多様な産生細胞の前記プールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する前記液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。別の態様では、本発明は、遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成すること、前記産生細胞を含む各液滴を、改変タンパク質をベースとしたセンサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、前記融合された液滴を選別して所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を含む液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、改変センサープラスミドを用いて改変産生細胞のプールを形質転換することであって、前記改変センサープラスミドは改変タンパク質センサーをコードすること、遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞それぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、各液滴は、（ａ）フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、及び（ｂ）改変センサー細胞を含み、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する前記液滴を単離すること、並びに所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、改変産生細胞の集団を作製する方法であって、遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、前記産生細胞を含む各液滴を、改変タンパク質をベースとしたセンサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、前記融合された液滴を選別して所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を含む液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
【００１６】
一態様では、本発明は、改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含むこと、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を有する液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、改変センサープラスミドを用いて改変産生細胞のプールを形質転換することであって、前記改変センサープラスミドは改変タンパク質センサーをコードすること、前記改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含むこと、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を有する前記液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含むこと、前記改変産生細胞を含む各液滴を、改変センサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記融合された液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、前記融合された液滴を選別して所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞を含む液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、改変センサープラスミドを用いて改変産生細胞のプールを形質転換することであって、前記改変センサープラスミドは改変タンパク質センサーをコードすること、前記改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含むこと、及び各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を有する前記液滴を単離すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、前記改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含み、各液滴は、（ａ）フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、及び（ｂ）改変センサー細胞を含み、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を有する前記液滴を単離すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含むこと、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、前記改変産生細胞を含む各液滴を、改変センサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記融合された液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、前記融合した液滴を選別して所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞を含む液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
【００２２】
一態様では、本発明は、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖及びアッセイするための組成物及び方法であって、各改変産生細胞は、標的分子の産生をレポート及びアッセイするための改変センサー系も含んでおり、前記センサー系はゲノム内又はプラスミド上に存在していてもよい、前記組成物及び方法に関する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、改変産生株による標的分子の産生についてレポートする別個の改変センサー株（すなわち、細胞）の存在下において、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖及びアッセイするための組成物及び方法に関する。様々な実施形態において、改変センサー株は、標的分子を検出可能なａＴＦセンサーであるセンサー系を保有する。
【００２４】
さらに別の態様では、本発明は、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖し、次いで改変産生細胞を含む液滴を、改変センサー系（例えば、細胞をベースとしたセンサー系又はインビトロセンサー系）を含む第２のレポート液滴と融合させることにより、産生レベルをアッセイするための組成物及び方法に関する。様々な実施形態において、改変センサー株は、標的分子を検出可能なａＴＦセンサーを収容する。
【００２５】
別の態様では、本技術は、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖及びアッセイするための方法であって、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれており、各改変産生細胞は、標的分子の産生をレポート及び照合する（interrogating）ための改変センサープラスミドがさらに含む、前記方法に関する。様々な実施形態では、フッ素化をベースとした油又は乳剤は、有機油、フッ素化油、フッ素化ポリマー、フルオロカーボン中水型乳剤、パーフルオロカーボン中水型乳剤、又はそれらの組み合わせである。様々な実施形態では、フッ素化をベースとした油又は乳剤は粒子によって安定化される。様々な実施形態では、粒子は、修飾シリカナノ粒子（例えば、部分的にフッ素化されたナノ粒子又は部分的に疎水性のナノ粒子）である。様々な実施形態では、部分的にフッ素化されたナノ粒子はシリカをベースとしたナノ粒子である。様々な実施形態では、粒子は部分的に疎水性のシリカをベースとしたナノ粒子である。様々な実施形態では、液滴はマイクロ流体制御下にある。
【００２６】
別の態様では、本技術は、改変産生株による標的分子の産生についてレポートする別個の改変センサー株の存在下において、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖及びアッセイするための方法であって、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれており、且つ各液滴は、改変センサー細胞を含む、前記方法に関する。様々な実施形態では、フッ素化をベースとした油又は乳剤は、有機油、フッ素化油、フッ素化ポリマー、フルオロカーボン中水型乳剤、パーフルオロカーボン中水型乳剤、又はそれらの組み合わせである。様々な実施形態では、フッ素化をベースとした油又は乳剤は粒子によって安定化される。様々な実施形態では、粒子は修飾シリカナノ粒子（例えば、部分的にフッ素化されたナノ粒子又は部分的に疎水性のナノ粒子）である。様々な実施形態では、部分的にフッ素化されたナノ粒子は、シリカをベースとしたナノ粒子である。様々な実施形態では、粒子は部分的に疎水性のシリカをベースとしたナノ粒子である。様々な実施形態では、液滴はマイクロ流体制御下にある。
【００２７】
さらに別の態様では、本発明は、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖させ、ここで、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれており、次いで前記改変産生細胞を含む液滴を、改変センサー系を含む第２のレポート液滴と融合させることにより、産生レベルをアッセイするための方法に関する。様々な実施形態では、フッ素化をベースとした油又は乳剤は、有機油、フッ素化油、フッ素化ポリマー、フルオロカーボン中水型乳剤、パーフルオロカーボン中水型乳剤、又はそれらの組み合わせである。様々な実施形態では、フッ素化をベースとした油又は乳剤は粒子によって安定化される。様々な実施形態では、粒子は、修飾シリカナノ粒子（例えば、部分的にフッ素化されたナノ粒子又は部分的に疎水性のナノ粒子）である。様々な実施形態では、部分的にフッ素化されたナノ粒子はシリカをベースとしたナノ粒子である。様々な実施形態では、粒子は部分的に疎水性のシリカをベースとしたナノ粒子である。様々な実施形態では、液滴はマイクロ流体制御下にある。
【００２８】
本明細書で開示される任意の態様又は実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様又は実施形態と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】内因的に適用されたナリンゲニンに対する３種類のＭＡＧＥ改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５変異体間のＴｔｇＲセンサー応答の変動を示すグラフである。
【図１Ｂ】内因的に適用されたナリンゲニンに対する３種類のＭＡＧＥ改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５変異体間のＴｔｇＲセンサー応答の変動を示すグラフである。
【図１Ｃ】内因的に適用されたナリンゲニンに対する３種類のＭＡＧＥ改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５変異体間のＴｔｇＲセンサー応答の変動を示すグラフである。
【図１Ｄ】内因的に適用されたナリンゲニンに対する３種類のＭＡＧＥ改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５変異体間のＴｔｇＲセンサー応答の変動を示すグラフである。
【図２Ａ】各々の同族リガンドに対する４種類の異なるアロステリック転写因子（ＴｔｇＲ（図２Ａ）、ＴｅｔＲ（図２Ｂ）、ＰｃａＶ（図２Ｃ）、又はＱａｃＲ（図２Ｄ））によって調節されるｇｆｐを有する３種類のＭＡＧＥ改変大腸菌ＭＧ１６５５変異体間のセンサー応答の変動を示すグラフである。
【図２Ｂ】各々の同族リガンドに対する４種類の異なるアロステリック転写因子（ＴｔｇＲ（図２Ａ）、ＴｅｔＲ（図２Ｂ）、ＰｃａＶ（図２Ｃ）、又はＱａｃＲ（図２Ｄ））によって調節されるｇｆｐを有する３種類のＭＡＧＥ改変大腸菌ＭＧ１６５５変異体間のセンサー応答の変動を示すグラフである。
【図２Ｃ】各々の同族リガンドに対する４種類の異なるアロステリック転写因子（ＴｔｇＲ（図２Ａ）、ＴｅｔＲ（図２Ｂ）、ＰｃａＶ（図２Ｃ）、又はＱａｃＲ（図２Ｄ））によって調節されるｇｆｐを有する３種類のＭＡＧＥ改変大腸菌ＭＧ１６５５変異体間のセンサー応答の変動を示すグラフである。
【図２Ｄ】各々の同族リガンドに対する４種類の異なるアロステリック転写因子（ＴｔｇＲ（図２Ａ）、ＴｅｔＲ（図２Ｂ）、ＰｃａＶ（図２Ｃ）、又はＱａｃＲ（図２Ｄ））によって調節されるｇｆｐを有する３種類のＭＡＧＥ改変大腸菌ＭＧ１６５５変異体間のセンサー応答の変動を示すグラフである。
【図３】産生株間の拡散による干渉を示すグラフである。ナリンゲニン高産生株（赤色）及びナリンゲニン低産生株（青色）は、一緒に培養した場合（オレンジ色）に平均化されたセンサー応答を示す。
【図４Ａ】スクリーニングのための実行可能な戦略としての産生細胞及びセンサー細胞の共培養を示すグラフである。センサー細胞は、共培養された産生細胞によって産生されるナリンゲニンに応答して、ナリンゲニン依存性増殖及びｇｆｐ産生を示す（赤色：非産生＋センサー細胞、青色：低産生＋センサー細胞、オレンジ色：高産生＋センサー細胞）
【図４Ｂ】スクリーニングのための実行可能な戦略としての産生細胞及びセンサー細胞の共培養を示すグラフである。液滴中で共培養したセンサー細胞及び非産生細胞（赤色）又は高産生細胞（オレンジ色）は、容易に区別可能な分布を示す。
【図５】ナリンゲニン産生についての液滴共培養試験を示す画像である。様々なセンサー細胞及び産生細胞との共培養におけるＧＦＰ産生の蛍光顕微鏡分析。図５ａ：センサー細胞及び非産生細胞。図５ｂ：センサー細胞及び低産生細胞。図５ｃ：センサー細胞及び高産生細胞。図５ｄ：５００μＭナリンゲニンと共に封入されたＴｔｇＲをベースとしたセンサー系を使用する、ナリンゲニンに応答してＧＦＰを産生するプラスミドを有するＫ１２センサー細胞。各蛍光ピクセルは、ナリンゲニンに応答してＧＦＰを産生した液滴内の細菌である。
【図６】２４時間共培養した２セットの液滴の蛍光を示す画像である。第１の液滴セットは５００μＭのナリンゲニンを含み、第２の液滴セットはナリンゲニンセンサー細胞を含んでいた。液滴間で拡散が発生した場合、センサー細胞は２４時間にわたって蛍光性となるであろう。
【図７】センサー株と産生細胞又は非産生細胞との混合物と共にインキュベーションした後の二重乳剤を示す顕微鏡画像である。
【図８Ａ】センサー細胞及び非産生細胞を用いて調製した二重乳剤液滴のＦＡＣＳ分析を示すグラフである。
【図８Ｂ】センサー細胞及び産生細胞を用いて調製した二重乳剤液滴のＦＡＣＳ分析を示すグラフである。
【図８Ｃ】センサー細胞と非産生細胞又は産生細胞とを用いて調製した二重乳剤液滴のＦＡＣＳ分析を示すグラフである。
【図９】液滴内で増殖する産生細胞の集団における拡散の抑制を示すグラフである。（Ａ）液滴中で増殖させた場合にナリンゲニン低産生株から生成される蛍光のＦＡＣＳ分布。（Ｂ）液滴中で増殖させた場合にナリンゲニン高産生株から生成される蛍光のＦＡＣＳ分布。（Ｃ）液滴中で成長させた場合の高産生株と低産生株の混合物の蛍光のＦＡＣＳ分布。両方の産生株による単一の液滴の占有を防ぐために、各液滴には、増殖及び産生の開始時に単一の産生細胞のみが含まれる。
【図１０】拡散を抑制するために液滴内でインキュベートした後、経路陰性対照である２Ｅ６  ｐＮＡＲｎｕｌｌｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰからのナリンゲニン高産生株２Ｅ６  ｐＮＡＲｈｉｇｈ  ｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰの濃縮を示すグラフである。
【図１１】「細胞内センサー」を有する低産生体に対する高産生体の液滴封入を示す画像であり、同一の細胞がリガンド及びセンサーの両方の産生に関与し、蛍光（緑色）の読み取り強度（高産生細胞、右）は産生されるリガンドの濃度に関連している。
【図１２】液滴システム中の低産生体又は高産生体と共に封入された「共培養センサー細胞」のシステムを示す画像である。ここで、非産生細胞のみがセンサー読み取りに寄与し産生細胞への負担を軽減しており、蛍光（緑色）の読み取り強度（高産生細胞、左）は産生リガンドの濃度に関連付けられている。
【図１３】Δｐｔｓｉ：：ｋａｎＲ  ｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰ−Ｐｔｓｉセンサー株との液滴共培養戦略を利用した、低経路対照である２Ｅ６  ｐＮＡＲｌｏｗからのナリンゲニン高産生株２Ｅ６  ｐＮＡＲｈｉｇｈの濃縮を示す画像である。
【図１４】（Ａ）〜（Ｅ）は、ＦＡＣＳを使用して、混入遊離大腸菌を避けて二重乳剤ＷＯＷ型液滴を選別するデータを示す。
【図１５】二重乳剤液滴を作成し、ＦＡＣＳを使用して明るい産生体と暗い非産生体とを区別するデータを示す。
【図１６】顕微鏡を使用したピカリング（Pickering）乳剤中の蛍光大腸菌の増殖及び検出を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
一態様では、本技術は、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖させてアッセイするための方法であって、各改変産生細胞は、標的分子の産生をレポート及び照合するための改変センサー系をさらに含む、前記方法に関する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、改変産生株ライブラリーは、限定されないが、多重自動ゲノム工学法（ＭＡＧＥ）などのゲノム多様化技術を使って、又はプラスミドをベースとした産生の変動（例えば、酵素ホモログの生物資源調査、プロモーター変動など）、非ＧＭＯ法、若しくは産生の多様性をもたらすその他のメカニズムによって生成される。その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１５／０１７８６６号及び国際公開第２００８／０５２１０１号を参照。
【００３２】
いくつかの実施形態では、改変産生株ライブラリーは、少なくとも１種類の改変センサープラスミド又はセンサー系で形質転換される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ライブラリーからの改変産生株のプールは、増殖培地、及びアラビノース、アンヒドロテトラサイクリン、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、熱、光、又は表１に記載の化合物を含むがこれらに限定されない任意の必要な誘導剤を含む液滴中に乳化される。いくつかの実施形態では、乳化された株が増殖し、所望の産物の産生が一定期間起こり、その結果、標的分子を産生可能なそれらの株のための産物が蓄積される。いくつかの実施形態では、前記一定期間は、約１〜２４時間、約４〜２０時間、約８〜１６時間、又は約１０〜１４時間である。いくつかの実施形態では、前記一定期間は、約２４〜７２時間、約２８〜６８時間、約３２〜６４時間、約３６〜６０時間、約４０〜５６時間、又は約４４〜５２時間である。いくつかの実施形態では、前記一定期間は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日間である。いくつかの実施形態では、前記一定期間は約１週間又は約２週間である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、乳化された株は、レポーターを使用して産物レベルの直接的読み取りを提供する改変センサー系を使用して応答を生成する。いくつかの実施形態では、産物レベルの直接的な読み取りは、約１μｇ／Ｌ〜１００μｇ／Ｌ、約１０μｇ／Ｌ〜９０μｇ／Ｌ、約２０μｇ／Ｌ〜８０μｇ／Ｌ、約３０μｇ／Ｌ〜７０μｇ／Ｌ、約４０μｇ／Ｌ〜６０μｇ／Ｌ、又は約４５μｇ／Ｌ〜５５μｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、産物レベルの直接的な読み取りは、約１００μｇ／Ｌ〜１０００μｇ／Ｌ、約２００μｇ／Ｌ〜９００μｇ／Ｌ、約３００μｇ／Ｌ〜８００μｇ／Ｌ、約４００μｇ／Ｌ〜７００μｇ／Ｌ、又は約５００μｇ／Ｌ〜６００μｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、産物レベルの直接的な読み取りは、約１ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ〜１８０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ〜１６０ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ〜１４０ｇ／Ｌ、約８０ｇ／Ｌ〜１２０ｇ／Ｌ、又は約９０ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、産物レベルの直接的な読み取りは、約１００ｇ／Ｌ〜５００ｇ／Ｌ、約１５０ｇ／Ｌ〜４５０ｇ／Ｌ、約２００ｇ／Ｌ〜４００ｇ／Ｌ、又は約２５０ｇ／Ｌ〜３５０ｇ／Ｌである。
【００３５】
限定する目的ではないが例として、いくつかの実施形態では、レポーターは、ＧＦＰ又は以下で説明する他の任意の例示的なレポーター系である。いくつかの実施形態では、液滴は破壊され、細胞はＦＡＣＳのような適切な選別技術を使用して選別される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、液滴は、専用の液滴選別機器を使用することによって、又は第２のバルク水乳剤を形成した後ＦＡＣＳで二重乳剤を選別することによって選別される。いくつかの実施形態では、液滴は、産生される産物のレベルに従って選別される。いくつかの実施形態では、液滴は、封入された改変産生細胞によって産生される産物の所望のレベルに従って選別される。液滴が選別されると、液滴は破壊され、濃縮された改変産生細胞が放出される。いくつかの実施形態では、選別された液滴からの改変産生細胞のゲノムは、次世代シーケンシングに供される。別の実施形態では、産生細胞のプラスミドが配列決定される（例えば、プラスミドをベースとした経路を生物資源調査する場合）。
【００３７】
いくつかの実施形態では、産生株の増殖又は生存能は、産生される産物の量に直接的に依存し比例する。非限定的な例として、一実施形態では、改変産生株ライブラリーが生成され、改変センサープラスミドで形質転換され、形質転換された改変産生株のプールは、増殖培地及び任意の必要な誘導剤を含む液滴に乳化され、前記形質転換された改変産生細胞が増殖し、産物の産生が一定期間起こり、その結果、標的分子を産生可能なそれらの細胞のための産物が蓄積され、前記形質転換された改変産生細胞は、高率で増殖するか、又は毒素を相殺する物質を産生することによって前記産物の蓄積に応答し、次いで、前記増殖し生存可能な形質転換された改変産生細胞は、改変産生細胞の濃縮された集団を形成する液滴から放出される。
【００３８】
いくつかの実施形態では、改変産生株はセンサー系を含む。非限定的な例として、一実施形態では、改変産生株ライブラリーが生成され、プラスミド上の改変センサー系で形質転換され、形質転換された改変産生株のプールは、増殖培地及び任意の必要な誘導剤を含む液滴に乳化され、前記形質転換された改変産生細胞が増殖し、産物の産生が一定期間起こり、その結果、標的分子を産生可能なそれらの細胞のための産物が蓄積され、前記形質転換された改変産生細胞のセンサー系は、ＧＦＰなどのレポーターの発現を介して前記産物の蓄積に応答し、次いで、前記改変産生細胞は、前記液滴から放出され、ＦＡＣＳで選別される。
【００３９】
別の態様では、本技術は、改変産生株による標的分子の産生についてレポートする別個の改変センサー株の存在下において、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖及びアッセイするための方法に関する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、改変産生株ライブラリーは、その内容全体が参照により援用される、ゲノム多様化技術（例えば、限定されないが、Ｆａｒｚａｄｆａｒｄ  Ｆ，Ｌｕ  ＴＫ．Ｇｅｎｏｍｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｃｏｄｅｄ  Ａｎａｌｏｇ  Ｍｅｍｏｒｙ  ｗｉｔｈ  Ｐｒｅｃｉｓｅ  Ｉｎ  ｖ／Ｖｏ  ＤＮＡ  Ｗｒｉｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）．２０１４；３４６（６２１１）：１２５６２７２．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２５６２７２に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ法、ＭＡＧＥ、ＳＣＲＩＢＥ法に関連するレトロン（Retron）をベースとした組換え手法など）を使って、又はプラスミドをベースとした産生の変動（例えば、酵素ホモログ、プロモーター変動などの生物資源調査）若しくは非ＧＭＯ法などの産生の多様性を生成するその他のメカニズムによって生成される。例として、いくつかの実施形態では、非ＧＭＯ法には、化学的変異誘発、放射線、及び転位（transposition）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ライブラリーからの改変産生株のプールは、増殖培地、任意の必要な誘導剤、及び１又は複数の改変センサー細胞を含む液滴中に乳化される。いくつかの実施形態では、細胞が増殖し、産物の産生が一定期間起こり、その結果、標的分子を産生可能なそれらの株のための産物が蓄積される。いくつかの実施形態では、改変センサー細胞は、レポーターを使用して産物レベルの直接的読み取りを提供する改変センサー系を使用して応答を生成する。限定する目的ではないが例として、いくつかの実施形態では、レポーターは、ＧＦＰである。いくつかの実施形態では、液滴は、専用の液滴選別機器を使用することによって、又は第２のバルク水乳剤を形成し、次いでＦＡＣＳで二重乳剤を選別することによって選別される。液滴が選別されると、液滴は破壊され、濃縮された改変産生細胞が放出される。いくつかの実施形態では、選別された液滴からの改変産生細胞のゲノムは、次世代シーケンシングに供される。別の実施形態では、産生細胞のプラスミドが配列決定される（例えば、プラスミドをベースとした経路を生物資源調査する場合）。
【００４２】
いくつかの実施形態では、液滴中の改変センサー細胞の増殖は、共封入された改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルに依存する。例として、いくつかの実施形態では、改変センサーは、増殖に必要な重要なタンパク質の発現を制御する。これにより、産生細胞が標的分子を作成する期間を有する前にセンサー細胞が産生栄養素を利用することが防げられることとなる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、改変センサー細胞は、センサー細胞が産生に必要な栄養素を消費することを防げるために、改変産生細胞とは別の炭素源を利用するように改変されている。
【００４４】
さらに別の態様では、本発明は、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖させ、次いで改変産生細胞を含む前記液滴を改変センサー系を含む第２のレポート液滴と融合させることによって産生レベルをアッセイするための方法に関する。いくつかの実施形態では、改変産生株ライブラリーは、ゲノム多様化技術（限定されないが、ＭＡＧＥなど）を使って、又はプラスミドをベースとした産生の変動（例えば、酵素ホモログの生物資源調査、プロモーター変動など）、非ＧＭＯ法、若しくは産生の多様性をもたらすその他のメカニズムによって生成される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、前記ライブラリーからの改変産生株のプールは液滴中に乳化され、ここで、前記液滴は増殖培地及び任意の必要な誘導剤を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞が増殖し、産物の産生が一定期間起こり、その結果、標的分子を産生可能な改変産生細胞内に産物が蓄積する。いくつかの実施形態において、改変産生細胞を含む液滴は、レポーターを産生するセンサー系（例えば、細胞をベースとしたセンサー系又はインビトロセンサー系）を含む液滴の第２のセットと融合される。
【００４６】
いくつかの実施形態では、レポーターは、改変産生細胞によって産生される産物の量に比例して産生され、融合された液滴は、レポーターレベルについてアッセイされる。いくつかの実施形態では、前記融合された液滴は、レポーターの発現レベルによって選別される。いくつかの実施形態では、前記液滴は、第２のバルク水乳剤を形成し、次いでＦＡＣＳで二重乳剤を選別することによって選別される。いくつかの実施形態では、融合された液滴は、専用の液滴選別機器を使用することによって選別される。いくつかの実施形態では、液滴が選別された後、液滴は破壊され、濃縮された産生細胞が放出される。いくつかの実施形態では、選別された液滴からの改変産生細胞のゲノムは、次世代シーケンシングに供される。いくつかの実施形態では、前記液滴は、産生される産物のレベルに従って選別される。いくつかの実施形態では、前記液滴は、封入された改変産生細胞によって産生される産物の所望のレベルに従って選別される。
【００４７】
いくつかの実施形態では、封入された改変産生細胞によって産生される産物の望ましいレベルは、約１μｇ／Ｌ〜１００μｇ／Ｌ、約１０μｇ／Ｌ〜９０μｇ／Ｌ、約２０μｇ／Ｌ〜８０μｇ／Ｌ、約３０μｇ／Ｌ〜７０μｇ／Ｌ、約４０μｇ／Ｌ〜６０μｇ／Ｌ、又は約４５μｇ／Ｌ〜５５μｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、封入された改変産生細胞によって産生される産物の望ましいレベルは、約１００μｇ／Ｌ〜１０００μｇ／Ｌ、約２００μｇ／Ｌ〜９００μｇ／Ｌ、約３００μｇ／Ｌ〜８００μｇ／Ｌ、約４００μｇ／Ｌ〜７００μｇ／Ｌ、又は約５００μｇ／Ｌ〜６００μｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、封入された改変産生細胞によって産生される産物の望ましいレベルは、約１ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ〜１８０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ〜１６０ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ〜１４０ｇ／Ｌ、約８０ｇ／Ｌ〜１２０ｇ／Ｌ、又は約９０ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、前記封入された改変産生細胞によって産生される産物の望ましいレベルは、約１００ｇ／Ｌ〜５００ｇ／Ｌ、約１５０ｇ／Ｌ〜４５０ｇ／Ｌ、約２００ｇ／Ｌ〜４００ｇ／Ｌ、又は約２５０ｇ／Ｌ〜３５０ｇ／Ｌである。
【００４８】
いくつかの実施形態では、改変産生細胞は、産生される産物の量に正比例して抗毒素を産生し、前記改変産生細胞を含む液滴は、産生段階後に一定量の毒素を有する液滴と別々に融合される。いくつかの実施形態では、所望のレベルの産物を産生した前記改変産生細胞は、第２の乳化において生存するために十分な抗毒素を産生したと考えられる。いくつかの実施形態では、短時間のインキュベーションの後、融合された液滴は破壊され、濃縮された生存可能な改変産生細胞集団が回収される。
【００４９】
別の態様では、本技術は、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖及びアッセイするための方法であって、各液滴は、有機油、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれており、各改変産生細胞は、標的分子の産生をレポート及び照合するための改変センサープラスミドを追加的に含む、前記方法に関する。
【００５０】
別の態様では、本技術は、改変産生株による標的分子の産生についてレポートする別個の改変センサー株の存在下において、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖及びアッセイするための方法であって、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれており、各液滴は、改変センサー細胞を含む、前記方法に関する。
【００５１】
さらに別の態様では、本発明は、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖させ、ここで、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれており、次いで前記改変産生細胞を含む液滴を、改変センサー系を含む第２のレポート液滴と融合させることにより、産物の産生レベルをアッセイするための方法に関する。
【００５２】
本技術のいくつかの実施形態では、フッ素化をベースとした油又は乳剤は、有機油、フッ素化油、フッ素化ポリマー、フルオロカーボン中水型乳剤、パーフルオロカーボン中水型乳剤、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、フッ素化をベースとした油又は乳剤は、所望により粒子によって安定化される。様々な実施形態では、粒子は修飾シリカナノ粒子（例えば、部分的にフッ素化されたナノ粒子又は部分的に疎水性のナノ粒子）である。いくつかの実施形態では、部分的にフッ素化されたナノ粒子は、シリカをベースとしたナノ粒子である。いくつかの実施形態では、粒子は部分的に疎水性のシリカをベースとしたナノ粒子である。いくつかの実施形態では、液滴はマイクロ流体制御下にある。
【００５３】
いくつかの実施形態では、乳剤は、水相に分散された水非混和性液体を含むピカリング乳剤（例えば、水中油型（Ｏ／Ｗ型）乳剤）である。いくつかの実施形態では、乳剤は有機油を含む。いくつかの実施形態では、水非混和性液体は、油又は有機油（例えば、鉱油、トウモロコシ油、又はヒマシ油）である。
【００５４】
いくつかの実施形態では、乳剤は、連続油相に分散された水性液滴を含むピカリング乳剤（例えば、油中水型（Ｗ／Ｏ型）乳剤）である。いくつかの実施形態では、乳剤は有機油を含む。いくつかの実施形態では、水非混和性液体は、油又は有機油（例えば、鉱油、トウモロコシ油、又はヒマシ油）である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ピカリング乳剤は、油又は有機油の鎖長を減少させることにより安定化される。いくつかの実施形態では、油又は有機油の鎖長は、少なくとも１個の炭素原子、少なくとも２個の炭素原子、少なくとも３個の炭素原子、少なくとも４個の炭素原子、少なくとも５個の炭素原子、少なくとも６個の炭素原子、少なくとも７個の炭素原子、少なくとも８個の炭素原子、少なくとも９個の炭素原子、少なくとも１０個の炭素原子、少なくとも１１個の炭素原子、少なくとも１２個の炭素原子、少なくとも１３個の炭素原子、少なくとも１４個の炭素原子、少なくとも１５個の炭素原子、少なくとも１６個の炭素原子、少なくとも１７個の炭素原子、少なくとも１８個の炭素原子、少なくとも１９個の炭素原子、又は少なくとも２０個の炭素原子が減少している。
【００５６】
いくつかの実施形態では、乳剤は、炭化水素によって安定化されたピカリング乳剤である。例えば、乳剤は、ヘキサデカン、ドデカン、デカン、オクタン、ヘプタン、及びヘキサンによって安定化してもよい。
【００５７】
いくつかの実施形態では、乳剤は、油又は有機油によって安定化されたピカリング乳剤である。例えば、乳剤は、鉱油、トウモロコシ油、又はヒマシ油などの有機油によって安定化してもよい。いくつかの実施形態では、乳剤は、Ｔｗｅｅｎ（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ２１、Ｔｗｅｅｎ  ４０、Ｔｗｅｅｎ  ６０、Ｔｗｅｅｎ  ６１、Ｔｗｅｅｎ  ６５、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｔｗｅｅｎ  ８１、Ｔｗｅｅｎ  ８５）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、ＳＰＡＮ（例えば、ＳＰＡＮ  ２０、ＳＰＡＮ  ４０、ＳＰＡＮ  ６０、ＳＰＡＮ  ６５、ＳＰＡＮ  ８０、ＳＰＡＮ  ８５）、Ａｒｌａｃｅｌ（例えば、Ａｒｌａｃｅｌ（商標）Ｐ１３５）、Ａｔｌｏｘ（例えば、Ａｔｌｏｘ（商標）４９１２）、ＡＢＩＬ（例えば、ＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ  ９０）などの非イオン性乳化剤、界面活性剤（例えば、ＡＢＩＬをベースとした界面活性剤）、又はそれらの組み合わせと組み合わせた油又は有機油によって安定化される。
【００５８】
いくつかの実施形態では、乳剤は、油又は有機油によって安定化されたピカリング乳剤である。例えば、乳剤は、鉱油、トウモロコシ油、又はヒマシ油などの有機油によって安定化してもよい。いくつかの実施形態では、乳剤は、タンパク質安定剤（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、β−ラクトグロブリン、β−カゼイン（ＢＣＮ））と組み合わせた油又は有機油によって安定化される。いくつかの実施形態では、乳剤は、非イオン性界面活性剤又は糖（例えば、グルコース、フルクトース、ラクトース）と組み合わせた油又は有機油によって安定化される。いくつかの実施形態では、タンパク質安定剤、非イオン性界面活性剤、又は糖は、第２相（例えば、水相、有機相、又は液滴相）から第１相（例えば、油性相）への有機物の拡散を低減する。
【００５９】
いくつかの実施形態では、乳剤は、Ｔｗｅｅｎ（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ２１、Ｔｗｅｅｎ  ４０、Ｔｗｅｅｎ  ６０、Ｔｗｅｅｎ  ６１、Ｔｗｅｅｎ  ６５、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｔｗｅｅｎ  ８１、Ｔｗｅｅｎ  ８５）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、ＳＰＡＮ（例えば、ＳＰＡＮ  ２０、ＳＰＡＮ  ４０、ＳＰＡＮ  ６０、ＳＰＡＮ  ６５、ＳＰＡＮ  ８０、ＳＰＡＮ  ８５）、Ａｒｌａｃｅｌ（例えば、Ａｒｌａｃｅｌ（商標）Ｐ１３５）、Ａｔｌｏｘ（例えば、Ａｔｌｏｘ（商標）４９１２）、ＡＢＩＬ（例えば、ＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ  ９０）などの非イオン性乳化剤、界面活性剤（例えば、ＡＢＩＬをベースとした界面活性剤）、又はそれらの組み合わせによって安定化されたピカリング乳剤である。
【００６０】
いくつかの実施形態では、乳剤は、タンパク質安定剤（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、β−ラクトグロブリン、β−カゼイン（ＢＣＮ））で安定化されたピカリング乳剤である。いくつかの実施形態では、乳剤は、非イオン性界面活性剤又は糖（例えば、グルコース、フルクトース、ラクトース）によって安定化される。いくつかの実施形態では、タンパク質安定剤、非イオン性界面活性剤、又は糖は、第２相（例えば、水相、有機相、又は液滴相）から第１相（例えば、油性相）への有機物の拡散を低減する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、乳剤は、固体粒子によって安定化されたピカリング乳剤である。いくつかの実施形態では、固体粒子は無機又は有機粒子である。例えば、ピカリング乳剤は、シリカ、炭酸カルシウム、粘度、金粒子及びカーボンブラック粒子、有機ラテックス、デンプン、ハイドロゲルの粒子及びコポリマーの粒子によって安定化してもよい。いくつかの実施形態では、ピカリング乳剤は、タンパク質、細菌、及び胞子粒子によって安定化される。
【００６２】
いくつかの実施形態では、乳剤は、固体粒子によって安定化されたピカリング乳剤である。いくつかの実施形態では、粒子は修飾シリカナノ粒子である。いくつかの実施形態では、修飾シリカナノ粒子は、部分的にフッ素化されたナノ粒子である。いくつかの実施形態では、修飾シリカナノ粒子は、部分的に疎水性のナノ粒子である。いくつかの実施形態では、部分的にフッ素化されたナノ粒子は、シリカをベースとしたナノ粒子である。いくつかの実施形態では、粒子は部分的に疎水性のシリカをベースとしたナノ粒子である。いくつかの実施形態では、ピカリング乳剤は、２つの非混和性相間の界面に蓄積する。いくつかの実施形態では、第１相は連続相であり、第２相は分散相である。いくつかの実施形態では、本開示の乳剤は、フルオロカーボン相又は有機油などの油をベースとした第１相、及び第２相（例えば、有機相、水相、液滴相、炭化水素相、又は気相）を含む。例えば、第１相は、少なくとも１種類のフッ素化溶媒を有するフルオロカーボン相であってもよく、第２相は、有機相、水相、液滴相、炭化水素相、又は気相など、フッ素化溶媒と非混和性であってもよい。いくつかの実施形態では、第２相は水相である。いくつかの実施形態では、第２相は炭化水素相である。
【００６３】
いくつかの実施形態では、第１相は、少なくとも１種類のフッ素化溶媒を含むフルオラス（fluorous）相であり、部分的にフッ素化されたナノ粒子は、フッ素化溶媒中に分散されている。
【００６４】
いくつかの実施形態では、第１相は、前記溶媒中に分散された部分的に疎水性のナノ粒子を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、第１相（すなわち、フルオラス相）は、ＣｘＦｙＦＩｚＸｍで表される少なくとも１種類のフルオロカーボンを含み、ここで、Ｘは任意の要素（Ｎ及びＯを含むがこれらに限定されない）であってもよく、ｘ、ｙ、ｚ、及びｍは正の整数である。いくつかの実施形態では、第１相はフルオラス相であり、ＨＦＥ−７５００（Ｃ９Ｈ５ＯＦ１５）、ＨＦＥ−７６００（Ｃ８Ｈ６ＯＦ１２）、ＦＣ−４０（Ｃ２１Ｆ４８Ｎ２）、パーフルオロヘキサン（Ｃ６Ｆ１4）、及び／又はパーフルオロメチルデカリン（ＰＦＭＤ又はＣ１１Ｆ２０）をフッ素化溶剤として含む。フッ素化溶媒は特に限定されないが、異なる物理的特性を有する多様な範囲のフッ素化化合物を含むことができる。いくつかの実施形態では、フッ素化溶媒は、ＨＦＥ−７５００及びＨＦＥ−７６００などのハイドロフルオロエーテルなど、粘度が低い部分的にフッ素化された極性溶媒を含む。いくつかの実施形態では、フッ素化溶媒は、ＦＣ−４０など、高粘度の過フッ素化極性溶媒を含む。一部の実施形態では、フッ素化溶媒は、Ｃ６Ｆ１4など、低粘度の過フッ素化非極性溶媒を含む。いくつかの実施形態では、フッ素化溶媒は、ＰＦＭＤなど、高粘度の過フッ素化非極性溶媒を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ピカリング乳剤は、少なくとも１種類のフッ素化溶媒を含むフルオロカーボン相と、フッ素化溶媒に対して非混和性の流体を含む第２相とを含み、部分的にフッ素化されたナノ粒子（例えば、シリカをベースとしたナノ粒子）が、フルオロカーボン相と第２相との界面に吸着する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ピカリング乳剤は、第１相と、第１相に対して非混和性の流体を含む第２相とを含み、部分的に疎水性のナノ粒子（例えば、シリカをベースとした疎水性ナノ粒子）は、第１相と第２相との界面に吸着する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ピカリング乳剤は、連続フルオロカーボン相と、連続フルオロカーボン相に分散された少なくとも１つの水相、有機相、炭化水素相、若しくは気相の液滴、又は少なくとも１つの気相の気泡を含む第２相とを含む。例えば、いくつかの実施形態では、乳剤は、連続フルオロカーボン相と水相とを含むか、連続フルオロカーボン相と有機相を含むか、連続フルオロカーボン相と炭化水素相とを含むか、又は連続フルオロカーボン相と気相とを含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ピカリング乳剤は、連続炭化水素相と、連続炭化水素相中に分散されたフルオロカーボン相の液滴の少なくとも１つとを含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、部分的にフッ素化されたナノ粒子（例えば、シリカをベースとしたナノ粒子）は、フルオロカーボン相などの第１相と、水性流体若しくは有機流体であってもよい第２相又は炭化水素相との界面に吸着する。
【００７１】
いくつかの実施形態では、部分的に疎水性のナノ粒子（例えば、シリカをベースとした疎水性ナノ粒子）は、第１相と、水性流体若しくは有機流体であってもよい第２相、液滴、又は炭化水素相との界面に吸着する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ピカリング乳剤はいくつかの方法で修飾可能である。例えば、ピカリング乳剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性ポリマーを分散相に導入することで修飾可能であるが、Ｆ−ＳｉＯ２ナノ粒子（ＮＰ）は連続相にあらかじめ分散されている。液滴が生成されると、Ｆ−ＳｉＯ２  ＮＰは水と油との界面に吸着し、親水性ポリマーは液滴内からＦ−ＳｉＯ２  ＮＰの表面に吸着する。例えば、ＰＥＧと吸着している部分的にフッ素化されたシリカナノ粒子は、本明細書では「ＰＥＧａｄｓ−Ｆ−ＳｉＯ２ＮＰ」と称される。いくつかの実施形態では、親水性ポリマーと共有結合でグラフトされた粒子は、連続相に分散させてもよい。例えば、ＰＥＧと共有結合でグラフトされた部分的にフッ素化されたシリカナノ粒子は、本明細書では「ＰＥＧｃｏｖａｌｅｎｔ−Ｆ−ＳｉＯ２ＮＰ」と称される。ピカリング乳剤のその他の修飾としては、親水性ポリマーを部分的にフッ素化された粒子（例えば、シリカをベースとしたナノ粒子）上に共有結合でグラフトすることが挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、親水性ポリマーは、部分的にフッ素化された粒子上に共有結合でグラフトされる。いくつかの実施形態では、親水性ポリマーは、部分的にフッ素化された粒子に共有結合されていない。
【００７３】
本開示のいくつかの実施形態では、親水性ポリマーはＰＥＧである。いくつかの実施形態では、親水性ポリマーとしては、高分子電解質、並びにホモポリマー（例えば、ポリエーテル、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ（アクリル酸）、ポリメタクリレート及び他のアクリルポリマー、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ））及びブロックコポリマーなどの非イオン性ポリマーが挙げられる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ピカリング乳剤は、連続フルオロカーボン相と、水相を含む第２相とを含む。いくつかの実施形態では、水相は、界面で部分的にフッ素化された粒子に吸着している少なくとも１種類の親水性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、水相液滴は、ＰＥＧａｄｓ−Ｆ−ＳｉＯ２ＮＰ又はＰＥＧｃｏｖａｌｅｎｔ−Ｆ−ＳｉＯ２ＮＰなど、界面で部分的にフッ素化されたナノ粒子に吸着している少なくとも１種類の親水性ポリマーを含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、第２相（例えば、水相）は、約０．０１ｍｇ／ｍＬ以上、約０．０２ｍｇ／ｍＬ以上、約０．０５ｍｇ／ｍＬ以上、約０．１ｍｇ／ｍＬ以上、約０．２ｍｇ／ｍＬ以上、約０．５ｍｇ／ｍＬ以上、約１ｍｇ／ｍＬ以上、約２ｍｇ／ｍＬ以上、約５ｍｇ／ｍＬ以上、又は約１０ｍｇ／ｍＬ以上の親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）を含む。いくつかの実施形態では、水相は、タンパク質及び酵素の液滴界面への非特異的吸着を防止してそれらの活性を維持するための有効量の親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）を含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、フッ素化をベースとした油又は乳剤は、（ａ）連続フルオラス相、（ｂ）連続フルオラス相に分散された水相、有機相、炭化水素相、若しくは気相の液滴、又は気泡の少なくとも１つ、及び（ｃ）第１相（例えば、フルオラス相）の界面に吸着している部分的にフッ素化された粒子（例えば、シリカをベースとしたナノ粒子）又は部分的に疎水性のシリカナノ粒子の少なくとも１種、及び水相、有機相、炭化水素相、若しくは気相を含み、前記シリカナノ粒子は部分的にフッ素化されているか部分的に疎水性である。
【００７７】
いくつかの実施形態では、部分的にフッ素化された粒子（例えば、シリカをベースとしたナノ粒子）は、フルオラス相と水相、有機相、炭化水素相、又は気相との界面に吸着する前に、フルオラス相に最初に分散される。いくつかの実施形態では、部分的にフッ素化された粒子は、フルオラス相と水相又は有機相との界面に吸着する前に、水相、有機相、炭化水素相、又は気相に最初に分散される。
【００７８】
いくつかの実施形態では、第１相（例えば、水相）は、緩衝液、塩、栄養素、治療薬、薬剤、ホルモン、抗体、鎮痛剤、抗凝固剤、抗炎症化合物、抗菌組成物、サイトカイン、増殖因子、インターフェロン、脂質、オリゴヌクレオチド、ポリマー、多糖類、ポリペプチド、プロテアーゼ阻害剤、細胞、核酸、ＲＮＡ、ＤＮＡ、血管収縮剤若しくは血管拡張剤、ビタミン、ミネラル、又は安定剤などの追加成分を含む。いくつかの実施形態では、化学的及び／又は生物学的反応が水相中で行われる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、乳剤（例えば、ピカリング乳剤）は、ナノ粒子などの粒子によって封入された液相を含む。いくつかの実施形態では、粒子は部分的にフッ素化されたナノ粒子である。いくつかの実施形態では、部分的にフッ素化されたナノ粒子は、シリカをベースとしたナノ粒子である。いくつかの実施形態では、粒子は部分的に疎水性のナノ粒子である。いくつかの実施形態では、部分的に疎水性のナノ粒子は、シリカをベースとしたナノ粒子である。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本開示に記載されるナノ粒子（例えば、シリカをベースとしたナノ粒子）及びそれらの組み合わせにより、液滴内部で実施可能なプロセスを妨げることなく、液滴の合体（coalescence）に対する安定化をもたらす。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本開示に記載のフッ素化をベースとした油又は乳剤は、フルオロフォア（蛍光色素分子）及び蛍光性基質（例えば、レゾルフィン、フルオレセイン、レサズリン、４−メチルウンベリフェロンなど）の分散相から連続相への漏出を効果的に防止する。いくつかの実施形態では、本開示により、フルオロフォア及び蛍光性基質（例えば、レゾルフィン、フルオレセイン、レサズリン、４−メチルウンベリフェロンなど）の漏出を、漏出から１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、１日間、２日間、３日間、４日間、又は５日間、効果的に防止する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の乳剤は、マイクロフルイディクスによって作製される。例えば、本明細書に記載の乳剤は、ホモジナイザー又は振盪によって作製され得る。
【００８３】
いくつかの実施形態では、液滴はマイクロ流体制御下にある。いくつかの実施形態では、マイクロ流体制御は、マイクロ流体チャネルを有するマイクロ流体デバイスによるものである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば、シリカをベースとしたナノ粒子）は、マイクロ流体チャネル内に存在する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子の少なくとも約５０％（例えば、数又は重量による）、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％は、部分的にフッ素化されたシリカナノ粒子である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、部分的にフッ素化されたシリカナノ粒子は、ナノ粒子の表面に共有結合されたフッ素化基を含む。いくつかの実施形態では、両親媒性粒子は、粒子の表面に結合されたフッ化アルキル基など、粒子の表面に結合されたフッ素化炭化水素基を含む。例えば、フッ素化炭化水素基としては、炭化水素基あたり１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、又は１３個以上のフッ素原子で置換されたＣ１−Ｃ２０、Ｃ２−Ｃ２０、Ｃ５−Ｃ２０、Ｃ１０−Ｃ２０、Ｃ１−Ｃ１５、Ｃ２−Ｃ１５、Ｃ５−Ｃ１５、Ｃ１０−Ｃ１５、Ｃ１−Ｃ１０、Ｃ２−Ｃ１０、Ｃ５−Ｃ１０、及びＣ５−Ｃ８炭化水素基が挙げられる。他の種類のハロゲン化炭化水素基も粒子の表面に結合していてもよい。いくつかの実施形態では、両親媒性粒子は、部分的にフッ素化又は過フッ素化されたアルキルシランの少なくとも１つで部分的に誘導体化されている。いくつかの実施形態では、両親媒性粒子は、直鎖炭素鎖を含む部分的にフッ素化又は過フッ素化されたアルキルシランの少なくとも１つで部分的に誘導体化されている。いくつかの実施形態では、両親媒性粒子は、表面上の１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロオクチルトリエトキシシラン（ＦＡＳ）で部分的に誘導体化されている。
【００８６】
いくつかの実施形態では、部分的にフッ素化されたシリカナノ粒子は、フッ素化された基に加えて又はその代わりに、粒子の表面に共有結合された親水性基を含む。いくつかの実施形態では、両親媒性粒子は、粒子の表面に共有結合されたアミン基を含む。いくつかの実施形態では、部分的にフッ素化されたシリカナノ粒子は、粒子の表面に共有結合されたその他の化学基を含み、その他の化学基としては−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、ＮＨ２、−ＣｘＨｙ、−ＳＯ３Ｈ、フルオレセインなどのフルオロフォア、ローダミン、ビオチンなどの巨大分子、ストレプトアビジン、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８７】
いくつかの実施形態では、部分的にフッ素化された又は部分的に疎水性のシリカナノ粒子に加えて、機能化可能な表面を有し、両親媒性となり得るその他の粒子も、本明細書に開示される技術の実施形態と互換性がある。例えば、そのような粒子には、貴金属、半導体、又は有機ポリマーから作製されたものが含まれる。シリカは用途が広い表面機能性を有し、経済的で生体適合性があり、光学的に不活性であるため、１つの好ましい選択肢である。
【００８８】
いくつかの実施形態では、改変産生株ライブラリーは、限定されないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ法、多重自動ゲノム工学法（ＭＡＧＥ）などのゲノム多様化技術を使って、又はプラスミドをベースとした産生の変動（例えば、酵素ホモログの生物資源調査、プロモーター変動など）、非ＧＭＯ法、若しくはこれらに限定されないが、化学的変異誘発、放射線、及び転位（transposition）など、産生の多様性をもたらすその他のメカニズムによって生成される。その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１５／０１７８６６号及び国際公開第２００８／０５２１０１号を参照。
【００８９】
いくつかの実施形態では、改変産生株ライブラリーは、プラスミド上又はゲノムに組み込まれたものなど、少なくとも１つの改変センサー系で形質転換される。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ライブラリーからの改変産生株のプールは、増殖培地、及びアラビノース、アンヒドロテトラサイクリン、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、熱、光、又は表１（標的分子の特性）に記載の化合物を含むがこれらに限定されない任意の必要な誘導剤を含む液滴中に乳化されている。いくつかの実施形態では、乳化された株が増殖し、所望の産物の産生が一定期間起こり、その結果、標的分子を産生可能なそれらの株のための産物が蓄積される。いくつかの実施形態では、前記一定期間は、約１〜２４時間、約４〜２０時間、約８〜１６時間、又は約１０〜１４時間である。いくつかの実施形態では、前記一定期間は、約２４〜７２時間、約２８〜６８時間、約３２〜６４時間、約３６〜６０時間、約４０〜５６時間、又は約４４〜５２時間である。いくつかの実施形態では、前記一定期間は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日間である。いくつかの実施形態では、前記一定期間は約１週間又は約２週間である。
【００９１】
いくつかの実施形態では、液滴中の改変センサー細胞の増殖は、共封入された改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルに依存する。例として、いくつかの実施形態では、改変センサーは、増殖に必要な重要なタンパク質の発現を制御する。これにより、産生細胞が標的分子を作成する期間を有する前にセンサー細胞が産生栄養素を利用することが防げられることとなる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、改変センサー細胞は、センサー細胞が産生に必要な栄養素を消費することを防げるために、改変産生細胞とは別の炭素源を利用するように改変されている。
【００９３】
いくつかの実施形態では、改変センサー細胞は、レポーターを使用して産物レベルの直接的読み取りを提供する改変センサー系を使用して応答を生成する。限定ではなく例として、いくつかの実施形態では、レポーターは、ＧＦＰである。
【００９４】
いくつかの実施形態では、改変産生細胞は、産生株ライブラリーが生成される前又は後で、プラスミド上又はゲノム内に存在するレポーターを産生するセンサー系で形質転換されている。いくつかの実施形態では、液滴は、他の化学物質による誘導を伴って、又は伴わずに、本明細書に記載の一定期間後に破壊され、産生細胞はＦＡＣＳでソートされ、所望の標的分子のより高産生体が分離又は濃縮される。
【００９５】
いくつかの実施形態では、液滴は、専用の液滴選別機器を使って、又は第２のバルク水乳剤を形成し、次いでＦＡＣＳで二重乳剤を選別することによって選別される。いくつかの実施形態では、液滴は、産生される産物のレベルに従って選別される。いくつかの実施形態では、液滴は、封入された改変産生細胞によって産生される産物の所望のレベルに従って選別される。液滴が選別されると、液滴は破壊され、濃縮された改変産生細胞が放出される。いくつかの実施形態では、選別された液滴からの改変産生細胞のゲノムは、次世代シーケンシングに供される。別の実施形態では、産生細胞のプラスミドは配列決定される（例えば、プラスミドをベースとした経路を生物資源調査する場合）。
【００９６】
いくつかの実施形態において、改変産生細胞を含む液滴は、レポーターを産生するセンサー系（例えば、細胞をベースとしたセンサー系又はインビトロセンサー系）を含む液滴の第２のセットと融合される。
【００９７】
いくつかの実施形態では、レポーターは、改変産生細胞によって産生される産物の量に比例して産生され、融合された液滴は、レポーターレベルについてアッセイされる。いくつかの実施形態では、融合された液滴は、レポーターの発現レベルによって選別される。いくつかの実施形態では、液滴は、第２のバルク水乳剤を形成し、次いでＦＡＣＳで二重乳剤を選別することによって選別される。いくつかの実施形態では、融合された液滴は、専用の液滴選別機器を使用することによって選別される。いくつかの実施形態では、液滴が選別された後、液滴は破壊され、濃縮された産生細胞が放出される。いくつかの実施形態では、選別された液滴からの改変産生細胞のゲノムは、次世代シーケンシングに供される。いくつかの実施形態では、液滴は、産生される産物のレベルに従って選別される。いくつかの実施形態では、液滴は、封入された改変産生細胞によって産生される産物の所望のレベルに従って選別される。
【００９８】
いくつかの実施形態では、封入された改変産生細胞によって産生される産物の望ましいレベルは、約１μｇ／Ｌ〜１００μｇ／Ｌ、約１０μｇ／Ｌ〜９０μｇ／Ｌ、約２０μｇ／Ｌ〜８０μｇ／Ｌ、約３０μｇ／Ｌ〜７０μｇ／Ｌ、約４０μｇ／Ｌ〜６０μｇ／Ｌ、又は約４５μｇ／Ｌ〜５５μｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、封入された改変産生細胞によって産生される産物の望ましいレベルは、約１００μｇ／Ｌ〜１０００μｇ／Ｌ、約２００μｇ／Ｌ〜９００μｇ／Ｌ、約３００μｇ／Ｌ〜８００μｇ／Ｌ、約４００μｇ／Ｌ〜７００μｇ／Ｌ、又は約５００μｇ／Ｌ〜６００μｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、封入された改変産生細胞によって産生される産物の望ましいレベルは、約１ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ〜１８０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ〜１６０ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ〜１４０ｇ／Ｌ、約８０ｇ／Ｌ〜１２０ｇ／Ｌ、又は約９０ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、封入された改変産生細胞によって産生される産物の望ましいレベルは、約１００ｇ／Ｌ〜５００ｇ／Ｌ、約１５０ｇ／Ｌ〜４５０ｇ／Ｌ、約２００ｇ／Ｌ〜４００ｇ／Ｌ、又は約２５０ｇ／Ｌ〜３５０ｇ／Ｌである。
【００９９】
いくつかの実施形態では、乳化された株は、レポーターを使用して産物レベルの直接的読み取りを提供する改変センサー系を使用して応答を生成する。いくつかの実施形態では、産物レベルの直接的な読み取りは、約１μｇ／Ｌ〜１００μｇ／Ｌ、約１０μｇ／Ｌ〜９０μｇ／Ｌ、約２０μｇ／Ｌ〜８０μｇ／Ｌ、約３０μｇ／Ｌ〜７０μｇ／Ｌ、約４０μｇ／Ｌ〜６０μｇ／Ｌ、又は約４５μｇ／Ｌ〜５５μｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、産物レベルの直接的な読み取りは、約１００μｇ／Ｌ〜１０００μｇ／Ｌ、約２００μｇ／Ｌ〜９００μｇ／Ｌ、約３００μｇ／Ｌ〜８００μｇ／Ｌ、約４００μｇ／Ｌ〜７００μｇ／Ｌ、又は約５００μｇ／Ｌ〜６００μｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、産物レベルの直接的な読み取りは、約１ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ〜１８０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ〜１６０ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ〜１４０ｇ／Ｌ、約８０ｇ／Ｌ〜１２０ｇ／Ｌ、又は約９０ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、産物レベルの直接的な読み取りは、約１００ｇ／Ｌ〜５００ｇ／Ｌ、約１５０ｇ／Ｌ〜４５０ｇ／Ｌ、約２００ｇ／Ｌ〜４００ｇ／Ｌ、又は約２５０ｇ／Ｌ〜３５０ｇ／Ｌである。
【０１００】
限定する目的ではないが例として、いくつかの実施形態では、レポーターは、ＧＦＰ、又は以下で説明するその他の例示的なレポーター系である。いくつかの実施形態では、液滴は破壊され、細胞は、ＦＡＣＳのような適切な選別技術を使用して選別される。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、改変産生細胞は、産生される産物の量に正比例して抗毒素を産生し、改変産生細胞を含む液滴は、産生段階後に一定量の毒素を有する液滴と別々に融合される。いくつかの実施形態では、所望のレベルの産物を産生した改変産生細胞は、第２の乳化において生存するために十分な抗毒素を産生したと考えられる。いくつかの実施形態では、短時間のインキュベーションの後、融合された液滴は破壊され、濃縮された生存可能な改変産生細胞集団が回収される。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、産生株の増殖又は生存能は、産生される産物の量に直接的に依存し比例する。非限定的な例として、一実施形態では、改変産生株ライブラリーが生成され、改変センサープラスミドで形質転換され、形質転換された改変産生株のプールは、増殖培地及び任意の必要な誘導剤を含む液滴に乳化され、前記形質転換された改変産生細胞が増殖し、産物の産生が一定期間起こり、その結果、標的分子を産生可能なそれらの細胞のための産物が蓄積され、前記形質転換された改変産生細胞は、高率で増殖するか、又は毒素を相殺する物質を産生することによって産物の蓄積に応答し、次いで、増殖し生存可能な形質転換された改変産生細胞は、前記改変産生細胞の濃縮された集団を形成する液滴から放出される。
【０１０３】
別の態様では、本発明は、改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含むこと、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を有する液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
【０１０４】
別の態様では、本発明は、改変センサープラスミドを用いて改変産生細胞のプールを形質転換することであって、前記改変センサープラスミドは改変タンパク質センサーをコードすること、前記改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含むこと、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を有する前記液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
【０１０５】
別の態様では、本発明は、改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含むこと、前記改変産生細胞を含む各液滴を、改変センサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記融合された液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、前記融合された液滴を選別して所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞を含む液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
【０１０６】
別の態様では、本発明は、改変センサープラスミドを用いて改変産生細胞のプールを形質転換することであって、前記改変センサープラスミドは改変タンパク質センサーをコードすること、前記改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含むこと、及び各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を有する前記液滴を単離すること、並びに所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
【０１０７】
別の態様では、本発明は、改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含むことであって、各液滴は、（ａ）フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、及び（ｂ）改変センサー細胞を含み、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を有する液滴を単離すること、並びに所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
【０１０８】
別の態様では、本発明は、改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含むこと、及び各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、前記改変産生細胞を含む各液滴を、改変センサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記融合された液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、前記融合した液滴を選別して所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞を含む液滴を単離すること、並びに所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、前記回収は、（ａ）前記液滴を破壊すること、（ｂ）前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び（ｃ）増殖培地で前記産生細胞を増殖させることを含む。いくつかの実施形態では、前記選別は、蛍光活性化液滴選別（ＦＡＤＳ）又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、前記回収は、（ａ）前記液滴を選別すること、（ｂ）前記選別された液滴を破壊すること、及び（ｃ）増殖培地で前記破壊された液滴をプレーティングすることを含む。いくつかの実施形態では、前記選別は、蛍光活性化液滴選別（ＦＡＤＳ）又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、前記液滴を破壊することは、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を封入する液滴を破壊して、前記改変産生細胞の集団を形成することを含み、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団である。いくつかの実施形態では、前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするＤＮＡがエピソーム的にコードされている。いくつかの実施形態では、前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするＤＮＡがプラスミド上にコードされている。いくつかの実施形態では、前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするＤＮＡが前記産生細胞のゲノムに組み込まれている。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、前記改変タンパク質をベースとしたセンサーが、前記産生細胞内において、トランスフェクトされる若しくはトランスフェクトされている、形質導入される若しくは形質導入されている、形質転換される若しくは形質転換されている、又はそれ以外の方法で利用可能にされる若しくは利用可能にされている。いくつかの実施形態では、前記レポーターが、前記センサーをベースとしたタンパク質によってトランスに活性化される検出可能なマーカーをコードする遺伝子である。いくつかの実施形態では、前記検出可能なマーカーが酵素又は選択可能なマーカーである。いくつかの実施形態では、前記酵素が、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、又はアルカリホスファターゼから選択される。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーが栄養要求株、抗生物質、耐性マーカー、毒素、又は分光的に検出可能な遺伝子産物である。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーが蛍光タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記分光的に検出可能な遺伝子産物が分光法又は分光分析により検出される。いくつかの実施形態では、前記レポーターをコードする遺伝子がエピソーム的にコードされている。いくつかの実施形態では、前記レポーターをコードする遺伝子がプラスミド上にエピソーム的にコードされている。いくつかの実施形態では、前記レポーターをコードする遺伝子が、前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードする遺伝子と同じプラスミド上にコードされている。いくつかの実施形態では、前記レポーターをコードする遺伝子がゲノムに組み込まれている。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、前記方法が、改変産生細胞のプールが採取される、改変産生株ライブラリーを作製することをさらに含み、前記改変産生株ライブラリーは、１又は複数の標的分子を産生するように改変される。いくつかの実施形態では、前記改変産生株ライブラリーが、改変センサープラスミドで前記改変産生細胞のプールを形質転換する前に作製される。いくつかの実施形態では、前記改変産生株ライブラリーが、改変センサープラスミドで前記改変産生細胞のプールを形質転換した後に作製される。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが前記産生細胞内にコードされている。いくつかの実施形態では、前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、共封入されたセンサー細胞内にコードされている。いくつかの実施形態では、前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、別の液滴に封入された後に改変産生細胞を含む前記液滴と融合されるセンサー細胞内にコードされている。
【０１１５】
一態様では、本発明は、遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
【０１１６】
別の態様では、本発明は、改変センサープラスミドを用いて改変産生細胞のプールを形質転換することであって、前記改変センサープラスミドは改変タンパク質センサーをコードすること、遺伝的に多様な産生細胞の前記プールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する前記液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。別の態様では、本発明は、遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記産生細胞を含む各液滴を、改変タンパク質をベースとしたセンサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、前記融合された液滴を選別して所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を含む液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
【０１１７】
別の態様では、本発明は、改変センサープラスミドを用いて改変産生細胞のプールを形質転換することであって、前記改変センサープラスミドは改変タンパク質センサーをコードすること、遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
【０１１８】
別の態様では、本発明は、遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、各液滴は、（ａ）フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、及び（ｂ）改変センサー細胞を含み、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する前記液滴を単離すること、並びに所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
【０１１９】
別の態様では、本発明は、遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、前記産生細胞を含む各液滴を、改変タンパク質をベースとしたセンサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースのセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、前記融合された液滴を選別して所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を含む液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが前記産生細胞内にコードされている。いくつかの実施形態では、前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、共封入されたセンサー細胞内にコードされている。いくつかの実施形態では、前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、別の液滴に封入された後に改変産生細胞を含む前記液滴と融合されるセンサー細胞内にコードされている。
【０１２１】
改変センサー株／細胞
前述の改変センサー株（又は細胞）は、少なくとも１種類の改変タンパク質センサーを発現するように形質転換された株又は細胞（例えば、細菌、酵母、藻類、植物、昆虫、又は哺乳動物（ヒト又は非ヒト）の株又は細胞）を指す。本明細書で使用される場合、「改変タンパク質センサー」は、標的に結合し、標的の検出を可能にするアロステリックタンパク質（例えば、センサー）を指し、前記アロステリックタンパク質は修飾されている。いくつかの実施形態では、アロステリックタンパク質は、１又は複数の変異によって修飾されている。いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは非転写因子（ｎｏｎ−ＴＦ）センサーである。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、株（又は細胞）は、改変タンパク質センサーをコードするプラスミド（例えば、改変センサープラスミド）によって形質転換される。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、転写因子である。いくつかの実施形態では、前記転写因子は、アロステリック転写因子（ａＴＦ）である。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、細胞又は無細胞で標的分子の検出を可能にする。
【０１２５】
改変タンパク質センサーを設計及び作成する方法は、その内容全体が参照により援用される、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４７００９号及びＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４７０１２号、並びに国際公開第２０１５／１２７２４２号及び国際公開第２０１６／１６８１８２号に記載されている。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーはａＴＦ、例えば真核生物のａＴＦである。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、例えば、ＬｙｓＲ、ＡｒａＣ／ＸｙｌＳ、ＴｅｔＲ、ＬｕｘＲ、ＬａｃＩ、ＡｒｓＲ、ＭｅｒＲ、ＡｓｎＣ、ＭａｒＲ、ＮｔｒＣ（ＥＢＰ）、ＯｍｐＲ、ＤｅｏＲ、Ｃｏｌｄ  ｓｈｏｃｋ、ＧｎｔＲ、及びＣｒｐファミリーのメンバーなどの原核生物の転写調節因子ファミリーを改変したものである。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、例えば、ＡｂｒＢ、ＡｌｐＡ、ＡｒａＣ、ＡｒｇＲ、ＡｒｓＲ、ＡｓｎＣ、ＢｅｔＲ、Ｂｈｌ、ＣｉｔＴ、ＣｏｄＹ、ＣｏｍＫ、Ｃｒｌ、Ｃｒｐ、ＣｓｏＲ、ＣｔｓＲ、ＤｅｏＲ、ＤｎａＡ、ＤｔｘＲ、Ｅｃｆ、ＦａｅＡ、Ｆｅ＿ｄｅｐ＿ｒｅｐｒｅｓｓ、ＦｅｏＣ、Ｆｉｓ、ＦｌｈＣ、ＦｌｈＤ、Ｆｕｒ、ＧｎｔＲ、ＧｕｔＭ、Ｈｎｓ、ＨｒｃＡ、ＨｘＩＲ、ＩｃＩＲ、ＫｏｒＢ、ＬａｃＩ、ＬｅｘＡ、Ｌｓｒ２、ＬｕｘＲ、ＬｙｓＲ、ＬｙｔＴＲ、ＭａｒＲ、ＭｅｒＲ、ＭｅｔＪ、Ｍｇａ、Ｍｏｒ、ＭｔＩＲ、ＮａｒＬ、ＮｔｒＣ、ＯｍｐＲ、ＰａｄＲ、Ｐｒｄ、ＰｒｒＡ、ＰｕｃＲ、ＰｕＲ、Ｒｏｋ、Ｒｏｓ＿ＭｕｃＲ、ＲｐｉＲ、ＲｐｏＤ、ＲｐｏＮ、Ｒｒｆ２、ＲｔｃＲ、Ｓａｒｐ、ＳｆｓＡ、ＳｉｎＲ、ＳｏｒＣ、ＳｐｏＯＡ、ＴｅｔＲ、ＴｒｍＢ、ＴｒｐＲ、ＷｈｉＢ、Ｘｒｅ、ＹｃｂＢ、及びＹｅｓＮファミリーのメンバーなどの原核生物の転写調節因子ファミリーを改変したものである。
【０１２９】
様々な実施形態では、改変タンパク質センサーは、ＡｃｒＲ、ＡｃｔｌＩ、ＡｍｅＲ  ＡｍｒＲ、ＡｒｐＲ、ＢｐｅＲ、ＥｎｖＲ  Ｅ、ＥｔｈＲ、ＨｙｄＲ、ＩｆｅＲ、ＬａｎＫ、ＬｆｒＲ、ＬｍｒＡ、ＭｔｒＲ、Ｐｉｐ、ＰｑｒＡ、ＱａｃＲ、ＲｉｆＱ、ＲｍｒＲ、ＳｉｍＲｅｇ、ＳｍｅＴ、ＳｒｐＲ、ＴｃｍＲ、ＴｅｔＲ、ＴｔｇＲ、ＴｔｇＷ、ＵｒｄＫ、ＶａｒＲ、ＹｄｅＳ、ＡｒｐＡ、Ａｕｒ１Ｂ、ＢａｒＡ、ＣａｌＲ１、ＣｐｒＢ、ＦａｒＡ、ＪａｄＲ、ＪａｄＲ２、ＭｐｈＢ、ＮｏｎＧ、ＰｈｌＦ、ＴｙｌＱ、ＶａｎＴ、ＴａｒＡ、ＴｙＩＰ、ＢＭ１Ｐ１、Ｂｍ１Ｐ１、Ｂｍ３Ｒ１、ＢｕｔＲ、ＣａｍｐＲ、ＣａｍＲ、ＣｙｍＲ、ＤｈａＲ、ＫｓｔＲ、ＬｅｘＡ−ｌｉｋｅ、ＡｃｎＲ、ＰａａＲ、ＰｓｂＩ、ＴｈｌＲ、ＵｉｄＲ、ＹＤＨ１、ＢｅｔＩ、ＭｃｂＲ、ＭｐｈＲ、ＰｈａＤ、Ｑ９ＺＦ４５、ＴｔＫ、Ｙｈｇｄ又はＹｉｘＤ、ＣａｓＲ、ＩｃａＲ、ＬｉｔＲ、ＬｕｘＲ、ＬｕｘＴ、ＯｐａＲ、Ｏｒｆ２、ＳｍｃＲ、ＨａｐＲ、Ｅｆ０１１３、ＨｌｙｌｌＲ、ＢａｒＢ、ＳｃｂＲ、ＭｍｆＲ、ＡｍｔＲ、ＰｓｒＡ、及びＹｊｄＣなどのＴｅｔＲファミリーの受容体のメンバーを改変したものである。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、リガンド及びＤＮＡの両方に直接結合するか、又はタンパク質カスケードを介して機能する、２成分系又はハイブリッド２成分系を改変したものである。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは真核生物のａＴＦである。いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、ＲｏｖＭ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ＨｃａＲ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ＢｌｃＲ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、ＨｅｔＲ（Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐｐ．）、ＨｅｔＲ（Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐｐ．）、ＤｅｓＲ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ＨｙｌｌｌＲ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、ＰｌｃＲ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、ＣｃｐＡ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、ＹｖｏＡ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ＡｈｒＲ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ＭｎｔＲ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ＧａｂＲ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ＳｉｎＲ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ＣｇｇＲ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ＦａｐＲ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ＯｈｒＲ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ＰｕｒＲ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｒｒｆ２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ＢｍｒＲ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ＣｃｐＮリプレッサー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ＴｒｅＲ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ＣｏｄＹ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ｙｆｉＲ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ＯｈｒＲ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｒｅｘ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、ＮｐｒＲ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、ＢｔＡｒａＲ（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、ＡｒａＲ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ  ＶＰＩ）、ＤｎｔＲ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、ＣｍｅＲ（Ｃａｍｐｌｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、ＣｖｉＲ（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、ＴｓａＲ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）、ＣＧＬ２６１２（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌａｔａｍｉｃｕｍ）、ＣｌｇＲ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ＬｌｄＲ（ＣＧＬ２９１５）（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ＮｔｃＡ（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ａｎａｂａｅｎａ）、ＨｕｃＲ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、ＬａｃＩ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＰｒｇＸ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ＮｉｋＲ（Ｈｅｌｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｎ）、ＬｍｒＲ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ＣｃｐＡ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ＭｔｂＣＲＰ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ＥｔｈＲ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ＭｏｓＲ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ＰｈｏＰ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｒｖ１８４６ｃ（Ｍｙｃｏ��ａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ＥｔｈＲ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ＬｙｓＲ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｄｉｓ）、ＮＭＢ０５７３／ＡｓｎＣ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ＴｅｔＲ−クラスＦＩ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ＭｅｘＲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ＤＮＲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ＰＡ０１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ＰＡ２１９６（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ｔｔｇＲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、Ｃｒａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、ＱｓｃＲ（Ｐｓｕｄｅｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ＡｃｔＲ（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ＳＣ００５２０（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ＣｐｒＢ（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ＳｌｙＡ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ＳｌｙＡ）、ＦａｐＲ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ＯａｃＲ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ＳａｒＺ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ＩｃａＲ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ＬｃａＲ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ＳＭＥＴ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、ＰｃａＶ（ＳＣＯ６７０４）（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ＳＣ０４００８（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ＮｄｇＲ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ＣｐｒＢ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ＳＣＯ０２５３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ＴｅｔＲファミリー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ＳＣ００５２０（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ＳＣ０４９４２（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ＳＣ０４３１３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ＴｅｔＲファミリー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ＳＣ０７２２２（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ＳＣＯ３２０５（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ＳＣＯ３２０１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ＳＴ１７１０（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ＳＴ１７１０）、ＨｒｃＡ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、ＴＭ１０３０（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、ｔｍ  １１７１（ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、ＩｃｌＲ（ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、ＣａｒＨ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ＦａｄＲ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ＳｍｃＲ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、及びＲｏｖＡ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）を改変したものである。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、ＭｐｈＲ、ＡｌｋＳ、ＡｌｋＲ、ＣｄａＲ、ＢｅｎＭ、ＲＵＮＸ１、ＭａｒＲ、ＡｐｈＡ、Ｐｅｘ、ＣａｔＭ、ＡｔｚＲ、ＣａｔＲ、ＣｌｃＲ、ＣｂｂＲ、ＣｙｓＢ、ＣｂｎＲ、ＯｘｙＲ、ＯｃｃＲ、及びＣｒｇＡを改変したものである。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、例えば、ＡｒｃＡ、ＡｔｏＣ、ＢａｅＲ、ＢａｓＲ、ＣｉｔＢ、ＣｐｘＲ、ＣｒｅＢ、ＣｕｓＲ、ＤｃｕＲ、ＤｐｉＡ、ＥｖｇＡ、ＫｄｐＥ、ＮａｒＬ、ＮａｒＰ、ＯｍｐＲ、ＰｈｏＢ、ＰｈｏＰ、ＱｓｅＢ、ＲｃｓＢ、ＲｓｔＡ、ＴｏｒＲ、ＵｈｐＡ、ＵｖｒＹ、ＹｅｄＷ、ＹｅｈＴ、ＹｆｈＫ、ＹｇｉＸ、ＹｐｄＢ、ＺｒａＲ、ＲｓｓＢ、ＡｇａＲ、ＡＭＲ（ｙｂｂＵ）、ＡｒｓＲ、ＡｓｃＧ、ＢｅｔＩ、ＢｇｌＪ、ＣａｄＣ、ＣａｉＦ、ＣｅｌＤ、ＣｕｅＲ、ＣｙｎＲ、ＥｘｕＲ、ＦｅｃＲ、ＦｕｃＲ、Ｆｕｒ、ＧａｔＲ、ＧｕｔＭ、ＧｕｔＲ（ＳｒｌＲ）、ＭｏｄＥ、ＭｔｌＲ、ＮａｇＣ、ＮａｎＲ（ｙｈｃＫ）、ＮｈａＲ、ＰｈｎＦ、ＰｕｔＡ、ＲｂｓＲ、ＲｈａＲ、ＲｈａＳ、ＲｐｉＲ（ＡｌｓＲ）、ＳｄｉＡ、ＵｉｄＲ、ＸａｐＲ、ＸｙｌＲ、ＺｎｔＲ、ＡｌｌＳ（ｙｂｂＳ）、Ａｒａｃ、ＡｒｇＲ、ＡｓｎＣ、ＣｙｓＢ、ＣｙｔＲ、ＤｓｄＣ、ＧａｌＲ、ＧａｌＳ、ＧｃｖＡ、ＧｃｖＲ、ＧｌｃＣ、ＧｌｐＲ、ＧｎｔＲ、ＩｄｎＲ、ＬｃｔＲ、Ｌｒｐ、ＬｙｓＲ、ＭｅｌＲ、ＭｈｐＲ、ＴｄｃＡ、ＴｄｃＲ、ＴｅｔＲ、ＴｒｅＲ、ＴｒｐＲ、及びＴｙｒＲなどの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＦを改変したものである。
【０１３４】
様々な実施形態では、改変タンパク質センサーは、例えば、ＡＰ２、Ｃ２Ｈ２、Ｄｏｆ、ＧＡＴＡ、ＨＤ−ＺＩＰ、Ｍ−ｔｙｐｅ、ＮＦ−ＹＡ、Ｓ１Ｆａ−ｌｉｋｅ、ＴＣＰ、ＹＡＢＢＹ、ＡＲＦ、Ｃ３Ｈ、Ｅ２Ｆ／ＤＰ、ＧＲＡＳ、ＨＲＴ−ｌｉｋｅ、ＭＩＫＣ、ＮＦ−ＹＢ、ＳＡＰ、Ｔｒｉｈｅｌｉｘ、ＺＦ−ＨＤ、ＡＲＲ−Ｂ、ＣＡＭＴＡ、ＥＩＬ、ＧＲＦ、ＨＳＦ、ＭＹＢ、ＮＦ−ＹＣ、ＳＢＰ、ＶＯＺ、ｂＨＬＨ、Ｂ３、ＣＯ−ｌｉｋｅ、ＥＲＦ、ＧｅＢＰ、ＬＢＤ、ＭＹＢ＿ｒｅｌａｔｅｄ、ＮＺＺ／ＳＰＬ、ＳＲＳ、ＷＯＸ、ｂＺＩＰ、ＢＢＲ−ＢＰＣ、ＣＰＰ、ＦＡＲ１、ＨＢ−ＰＨＤ、ＬＦＹ、ＮＡＣ、Ｎｉｎ−ｌｉｋｅ、ＳＴＡＴ、ＷＲＫＹ、ＢＥＳ１、ＤＢＢ、Ｇ２−ｌｉｋｅ、ＨＢ−ｏｔｈｅｒ、ＬＳＤ、ＮＦ−Ｘ１、ＲＡＶ、ＴＡＬＥ、及びＷｈｉｒｌｙファミリーのメンバーなどの植物転写調節因子ファミリーを改変したものである。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、例えば、Ａｂｆ１ｐ、Ａｂｆ２ｐ、Ａｃａ１ｐ、Ａｃｅ２ｐ、Ａｄｒ１ｐ、Ａｆｔ１ｐ、Ａｆｔ２ｐ、Ａｒｇ８０ｐ、Ａｒｇ８１ｐ、Ａｒｏ８０ｐ、Ａｒｒ１ｐ、Ａｓｇ１ｐ、Ａｓｈ１ｐ、Ａｚｆ１ｐ、Ｂａｓ１ｐ、Ｃａｄ１ｐ、Ｃａｔ８ｐ、Ｃｂｆ１ｐ、Ｃｅｐ３ｐ、Ｃｈａ４ｐ、Ｃｉｎ５ｐ、Ｃｒｚ１ｐ、Ｃｓｔ６ｐ、Ｃｕｐ２ｐ、Ｃｕｐ９ｐ、Ｄａｌ８０ｐ、Ｄａｌ８１ｐ、Ｄａｌ８２ｐ、Ｄｏｔ６ｐ、Ｅｃｍ２２ｐ、Ｅｃｍ２３ｐ、Ｅｄｓ１ｐ、Ｅｒｔ１ｐ、Ｆｈｌ１ｐ、Ｆｋｈ１ｐ、Ｆｋｈ２ｐ、Ｆｌｏ８ｐ、Ｆｚｆ１ｐ、Ｇａｌ４ｐ、Ｇａｔ１ｐ、Ｇａｔ３ｐ、Ｇａｔ４ｐ、Ｇｃｎ４ｐ、Ｇｃｒ１ｐ、Ｇｉｓ１ｐ、Ｇｌｎ３ｐ、Ｇｓｍ１ｐ、Ｇｚｆ３ｐ、Ｈａａ１ｐ、Ｈａｃ１ｐ、Ｈａｌ９ｐ、Ｈａｐ１ｐ、Ｈａｐ２ｐ、Ｈａｐ３ｐ、Ｈａｐ４ｐ、Ｈａｐ５ｐ、Ｈｃｍ１ｐ、Ｈｍｌａｌｐｈａ２ｐ、Ｈｍｒａ２ｐ、Ｈｓｆ１ｐ、Ｉｍｅ１ｐ、ｌｎｏ２ｐ、ｌｎｏ４ｐ、Ｉｘｒ１ｐ、Ｋａｒ４ｐ、Ｌｅｕ３ｐ、Ｌｙｓ１４ｐ、Ｍａｃ１ｐ、Ｍａｌ６３ｐ、Ｍａｔａｌｐｈａ２ｐ、Ｍｂｐ１ｐ、Ｍｃｍ１ｐ、Ｍｅｔ３１ｐ、Ｍｅｔ３２ｐ、Ｍｅｔ４ｐ、Ｍｇａ１ｐ、Ｍｉｇ１ｐ、Ｍｉｇ２ｐ、Ｍｉｇ３ｐ、Ｍｏｔ２ｐ、Ｍｏｔ３ｐ、Ｍｓｎ１ｐ、Ｍｓｎ２ｐ、Ｍｓｎ４ｐ、Ｍｓｓ１１ｐ、Ｎｄｔ８０ｐ、Ｎｈｐｌ０ｐ、Ｎｈｐ６ａｐ、Ｎｈｐ６ｂｐ、Ｎｒｇ１ｐ、Ｎｒｇ２ｐ、Ｏａｆ１ｐ、Ｐｄｒ１ｐ、Ｐｄｒ３ｐ、Ｐｄｒ８ｐ、Ｐｈｄ１ｐ、Ｐｈｏ２ｐ、Ｐｈｏ４ｐ、Ｐｉｐ２ｐ、Ｐｐｒ１ｐ、Ｐｕｔ３ｐ、Ｒａｐ１ｐ、Ｒｄｒ１ｐ、Ｒｄｓ１ｐ、Ｒｄｓ２ｐ、Ｒｅｂ１ｐ、Ｒｅｉ１ｐ、Ｒｆｘ１ｐ、Ｒｇｍ１ｐ、Ｒｇｔ１ｐ、Ｒｉｍ１０１ｐ、Ｒｌｍ１ｐ、Ｒｍｅ１ｐ、Ｒｏｘ１ｐ、Ｒｐｈ１ｐ、Ｒｐｎ４ｐ、Ｒｓｃ３０ｐ、Ｒｓｃ３ｐ、Ｒｓｆ２ｐ、Ｒｔｇ１ｐ、Ｒｔｇ３ｐ、Ｓｆｌ１ｐ、Ｓｆｐ１ｐ、Ｓｉｐ４ｐ、Ｓｋｎ７ｐ、Ｓｋｏ１ｐ、Ｓｍｐ１ｐ、Ｓｏｋ２ｐ、Ｓｐｔ１５ｐ、Ｓｒｄ１ｐ、Ｓｔｂ３ｐ、Ｓｔｂ４ｐ、Ｓｔｂ５ｐ、Ｓｔｅ１２ｐ、Ｓｔｐ１ｐ、Ｓｔｐ２ｐ、Ｓｔｐ３ｐ、Ｓｔｐ４ｐ、Ｓｕｍ１ｐ、Ｓｕｔ１ｐ、Ｓｕｔ２ｐ、Ｓｗｉ４ｐ、Ｓｗｉ５ｐ、Ｔｂｆ１ｐ、Ｔｂｓ１ｐ、Ｔｅａ１ｐ、Ｔｅｃ１ｐ、Ｔｏｄ６ｐ、Ｔｏｓ８ｐ、Ｔｙｅ７ｐ、Ｕｇａ３ｐ、Ｕｍｅ６ｐ、Ｕｐｃ２ｐ、Ｕｒｃ２ｐ、Ｕｓｖ１ｐ、Ｖｈｒ１ｐ、Ｗａｒ１ｐ、Ｘｂｐ１ｐ、ＹＥＲ０６４Ｃ、ＹＥＲ１３０Ｃ、ＹＥＲ１８４Ｃ、ＹＧＲ０６７Ｃ、ＹＫＬ２２２Ｃ、ＹＬＬ０５４Ｃ、ＹＬＲ２７８Ｃ、ＹＭＬ０８１Ｗ、ＹＮＲ０６３Ｗ、ＹＰＲ０１３Ｃ、ＹＰＲ０１５Ｃ、ＹＰＲ０２２Ｃ、ＹＰＲ１９６Ｗ、Ｙａｐ１ｐ、Ｙａｐ３ｐ、Ｙａｐ５ｐ、Ｙａｐ６ｐ、Ｙａｐ７ｐ、Ｙｏｘ１ｐ、Ｙｒｍ１ｐ、Ｙｒｒ１ｐ、及びＺａｐ１ｐなどの酵母ＴＦを改変したものである。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、例えば、ａｄａ−２、ａｈａ−１、ａｈｒ−１、ａｌｒ−１、ａｓｔ−１、ａｔｆ−２、ａｔｆ−５、ａｔｆ−６、ａｔｆ−７、ａｔｈｐ−１、ｂｌｍｐ−１、ｂｒａ−２、ｂｒｃ−１、ｃｂｐ−１、ｃｃｒ−４、ｃｄｋ−９、ｃｅｄ−６、ｃｅｈ−１、ｃｅｈ−１０、ｃｅｈ−１２、ｃｅｈ−１３、ｃｅｈ−１４、ｃｅｈ−１６、ｃｅｈ−１７、ｃｅｈ−１８、ｃｅｈ−１９、ｃｅｈ−２、ｃｅｈ−２０、ｃｅｈ−２１、ｃｅｈ−２２、ｃｅｈ−２３、ｃｅｈ−２４、ｃｅｈ−２６、ｃｅｈ−２７、ｃｅｈ−２８、ｃｅｈ−３０、ｃｅｈ−３１、ｃｅｈ−３２、ｃｅｈ−３３、ｃｅｈ−３４、ｃｅｈ−３６、ｃｅｈ−３７、ｃｅｈ−３８、ｃｅｈ−３９、ｃｅｈ−４０、ｃｅｈ−４１、ｃｅｈ−４３、ｃｅｈ−４４、ｃｅｈ−４５、ｃｅｈ−４８、ｃｅｈ−４９、ｃｅｈ−５、ｃｅｈ−６、ｃｅｈ−６０、ｃｅｈ−７、ｃｅｈ−８、ｃｅｈ−９、ｃｅｐ−１、ｃｅｓ−１、ｃｅｓ−２、ｃｅｙ−１、ｃｅｙ−２、ｃｅｙ−３、ｃｅｙ−４、ｃｆｉ−１、ｃｈｄ−３、ｃｋｙ−１、ｃｎｄ−１、ｃｏｇ−１、ｃｒｈ−１、ｄａｆ−１２、ｄａｆ−１４、ｄａｆ−１６、ｄａｆ−１９、ｄａｆ−３、ｄａｆ−８、ｄｃｐ−６６、ｄｉｅ−１、ｄｌｘ−１、ｄｍｄ−３、ｄｍｄ−４、ｄｍｄ−５、ｄｍｄ−６、ｄｎｊ−１１、ｄｐｌ−１、ｄｐｒ−１、ｄｐｙ−２０、ｄｐｙ−２２、ｄｐｙ−２６、ｄｒｏ−１、ｄｓｃ−１、ｅｆｌ−１、ｅｆｌ−２、ｅｇｌ−１３、ｅｇｌ−１８、ｅｇｌ−２７、ｅｇｌ−３８、ｅｇｌ−４３、ｅｇｌ−４４、ｅｇｌ−４６、ｅｇｌ−５、ｅｋｌ−２、ｅｋｌ−４、ｅｌｃ−１、ｅｌｔ−１、ｅｌｔ−２、ｅｌｔ−３、ｅｌｔ−４、ｅｌｔ−６、ｅｌｔ−７、ｅｎｄ−１、ｅｎｄ−３、ｅｏｒ−１、ｅｔｓ−４、ｅｔｓ−５、ｅｙａ−１、ｆａｘ−１、ｆｋｈ−１０、ｆｋｈ−２、ｆｋｈ−３、ｆｋｈ−４、ｆｋｈ−５、ｆｋｈ−６、ｆｋｈ−７、ｆｋｈ−８、ｆｋｈ−９、ｆｌｔ−１、ｆｏｓ−１、ｆｏｚｉ−１、ｇｅｉ−１１、ｇｅｉ−１３、ｇｅｉ−３、ｇｅｉ−８、ｇｆｌ−１、ｇｌａ−３、ｈａｍ−２、ｈｂｌ−１、ｈｉｆ−１、ｈｌｈ−１、ｈｌｈ−１０、ｈｌｈ−１１、ｈｌｈ−１２、ｈｌｈ−１３、ｈｌｈ−１４、ｈｌｈ−１５、ｈｌｈ−１６、ｈｌｈ−１７、ｈｌｈ−１９、ｈｌｈ−２、ｈｌｈ−２５、ｈｌｈ−２６、ｈｌｈ−２７、ｈｌｈ−２８、ｈｌｈ−２９、ｈｌｈ−３、ｈｌｈ−３０、ｈｌｈ−４、ｈｌｈ−６、ｈｌｈ−８、ｈｍｇ−１．１、ｈｍｇ−１．２、ｈｍｇ−１．２、ｈｍｇ−１１、ｈｍｇ−１２、ｈｍｇ−３、ｈｍｇ−４、ｈｍｇ−５、ｈｎｄ−１、ｈｓｆ−１、ｉｒｘ−１、ｌａｇ−１、ｌｅｔ−３８１、ｌｅｔ−４１８、ｌｆｉ−１、ｌｉｍ−４、ｌｉｍ−６、ｌｉｍ−７、ｌｉｎ−１、ｌｉｎ−１１、ｌｉｎ−２２、ｌｉｎ−２６、ｌｉｎ−２８、ｌｉｎ−３１、ｌｉｎ−３２、ｌｉｎ−３５、ｌｉｎ−３９、ｌｉｎ−４０、ｌｉｎ−４１、ｌｉｎ−４８、ｌｉｎ−４９、ｌｉｎ−５４、ｌｉｎ−５９、ｌｉｎ−６１、ｌｉｒ−１、ｌｐｄ−２、ｌｓｌ−１、ｌｓｓ−４、ｌｓｔ−３、ｍａｂ−２３、ｍａｂ−３、ｍａｂ−５、ｍａｂ−９、ｍｂｆ−１、ｍｂｒ−１、ｍｂｒ−１、ｍｄｌ−１、ｍｅｃ−３、ｍｅｄ−１、ｍｅｄ−２、ｍｅｆ−２、ｍｅｓ−２、ｍｅｓ−４、ｍｅｓ−６、ｍｅｘ−１、ｍｅｘ−５、ｍｅｘ−６、ｍｇｌ−２、ｍｌｓ−１、ｍｌｓ−２、ｍｍｌ−１、ｍｕａ−１、ｍｘｌ−１、ｍｘｌ−２、ｍｘｌ−３、ｎｆｉ−１、ｎｇｎ−１、ｎｈｒ−１、ｎｈｒ−１０、ｎｈｒ−１００、ｎｈｒ−１０１、ｎｈｒ−１０２、ｎｈｒ−１０３、ｎｈｒ−１０４、ｎｈｒ−１０５、ｎｈｒ−１０６、ｎｈｒ−１０７、ｎｈｒ−１０８、ｎｈｒ−１０９、ｎｈｒ−１１、ｎｈｒ−１１０、ｎｈｒ−１１１、ｎｈｒ−１１２、ｎｈｒ−１１３、ｎｈｒ−１１４、ｎｈｒ−１１５、ｎｈｒ−１１６、ｎｈｒ−１１７、ｎｈｒ−１１８、ｎｈｒ−１１９、ｎｈｒ−１２、ｎｈｒ−１２０、ｎｈｒ−１２１、ｎｈｒ−１２２、ｎｈｒ−１２３、ｎｈｒ−１２４、ｎｈｒ−１２５、ｎｈｒ−１２６、ｎｈｒ−１２７、ｎｈｒ−１２８、ｎｈｒ−１２９、ｎｈｒ−１３、ｎｈｒ−１３０、ｎｈｒ−１３１、ｎｈｒ−１３２、ｎｈｒ−１３３、ｎｈｒ−１３４、ｎｈｒ−１３５、ｎｈｒ−１３６、ｎｈｒ−１３７、ｎｈｒ−１３８、ｎｈｒ−１３９、ｎｈｒ−１４、ｎｈｒ−１４０、ｎｈｒ−１４１、ｎｈｒ−１４２、ｎｈｒ−１４３、ｎｈｒ−１４５、ｎｈｒ−１４６、ｎｈｒ−１４７、ｎｈｒ−１４８、ｎｈｒ−１４９、ｎｈｒ−１５、ｎｈｒ−１５０、ｎｈｒ−１５２、ｎｈｒ−１５３、ｎｈｒ−１５４、ｎｈｒ−１５５、ｎｈｒ−１５６、ｎｈｒ−１５７、ｎｈｒ−１５８、ｎｈｒ−１５９、ｎｈｒ−１６、ｎｈｒ−１６１、ｎｈｒ−１６２、ｎｈｒ−１６３、ｎｈｒ−１６４、ｎｈｒ−１６５、ｎｈｒ−１６６、ｎｈｒ−１６７、ｎｈｒ−１６８、ｎｈｒ−１６９、ｎｈｒ−１７、ｎｈｒ−１７０、ｎｈｒ−１７１、ｎｈｒ−１７２、ｎｈｒ−１７３、ｎｈｒ−１７４、ｎｈｒ−１７５、ｎｈｒ−１７６、ｎｈｒ−１７７、ｎｈｒ−１７８、ｎｈｒ−１７９、ｎｈｒ−１８、ｎｈｒ−１８０、ｎｈｒ−１８１、ｎｈｒ−１８２、ｎｈｒ−１８３、ｎｈｒ−１８４、ｎｈｒ−１８５、ｎｈｒ−１８６、ｎｈｒ−１８７、ｎｈｒ−１８８、ｎｈｒ−１８９、ｎｈｒ−１９、ｎｈｒ−１９０、ｎｈｒ−１９１、ｎｈｒ−１９２、ｎｈｒ−１９３、ｎｈｒ−１９４、ｎｈｒ−１９５、ｎｈｒ−１９６、ｎｈｒ−１９７、ｎｈｒ−１９８、ｎｈｒ−１９９、ｎｈｒ−２、ｎｈｒ−２０、ｎｈｒ−２０１、ｎｈｒ−２０２、ｎｈｒ−２０３、ｎｈｒ−２０４、ｎｈｒ−２０５、ｎｈｒ−２０６、ｎｈｒ−２０７、ｎｈｒ−２０８、ｎｈｒ−２０９、ｎｈｒ−２１、ｎｈｒ−２１０、ｎｈｒ−２１１、ｎｈｒ−２１２、ｎｈｒ−２１３、ｎｈｒ−２１４、ｎｈｒ−２１５、ｎｈｒ−２１６、ｎｈｒ−２１７、ｎｈｒ−２１８、ｎｈｒ−２１９、ｎｈｒ−２２、ｎｈｒ−２２０、ｎｈｒ−２２１、ｎｈｒ−２２２、ｎｈｒ−２２３、ｎｈｒ−２２５、ｎｈｒ−２２６、ｎｈｒ−２２７、ｎｈｒ−２２８、ｎｈｒ−２２９、ｎｈｒ−２３、ｎｈｒ−２３０、ｎｈｒ−２３１、ｎｈｒ−２３２、ｎｈｒ−２３３、ｎｈｒ−２３４、ｎｈｒ−２３７、ｎｈｒ−２３８、ｎｈｒ−２３９、ｎｈｒ−２４１、ｎｈｒ−２４２、ｎｈｒ−２４３、ｎｈｒ−２４４、ｎｈｒ−２４５、ｎｈｒ−２４６、ｎｈｒ−２４７、ｎｈｒ−２４８、ｎｈｒ−２４９、ｎｈｒ−２５、ｎｈｒ−２５０、ｎｈｒ−２５１、ｎｈｒ−２５２、ｎｈｒ−２５３、ｎｈｒ−２５４、ｎｈｒ−２５５、ｎｈｒ−２５６、ｎｈｒ−２５７、ｎｈｒ−２５８、ｎｈｒ−２６、ｎｈｒ−２６０、ｎｈｒ−２６１、ｎｈｒ−２６２、ｎｈｒ−２６３、ｎｈｒ−２６４、ｎｈｒ−２６５、ｎｈｒ−２６６、ｎｈｒ−２６７、ｎｈｒ−２６８、ｎｈｒ−２６９、ｎｈｒ−２７、ｎｈｒ−２７０、ｎｈｒ−２７１、ｎｈｒ−２７２、ｎｈｒ−２７３、ｎｈｒ−２７４、ｎｈｒ−２７５、ｎｈｒ−２７６、ｎｈｒ−２７７、ｎｈｒ−２７８、ｎｈｒ−２８、ｎｈｒ−２８０、ｎｈｒ−２８１、ｎｈｒ−２８２、ｎｈｒ−２８３、ｎｈｒ−２８５、ｎｈｒ−２８６、ｎｈｒ−２８８、ｎｈｒ−３、ｎｈｒ−３０、ｎｈｒ−３１、ｎｈｒ−３２、ｎｈｒ−３３、ｎｈｒ−３４、ｎｈｒ−３５、ｎｈｒ−３６、ｎｈｒ−３７、ｎｈｒ−３８、ｎｈｒ−３９、ｎｈｒ−４、ｎｈｒ−４０、ｎｈｒ−４１、ｎｈｒ−４２、ｎｈｒ−４３、ｎｈｒ−４４、ｎｈｒ−４５、ｎｈｒ−４６、ｎｈｒ−４７、ｎｈｒ−４７、ｎｈｒ−４８、ｎｈｒ−４９、ｎｈｒ−５、ｎｈｒ−５０、ｎｈｒ−５１、ｎｈｒ−５２、ｎｈｒ−５３、ｎｈｒ−５４、ｎｈｒ−５５、ｎｈｒ−５６、ｎｈｒ−５７、ｎｈｒ−５８、ｎｈｒ−５９、ｎｈｒ−６、ｎｈｒ−６０、ｎｈｒ−６１、ｎｈｒ−６２、ｎｈｒ−６３、ｎｈｒ−６４、ｎｈｒ−６５、ｎｈｒ−６６、ｎｈｒ−６７、ｎｈｒ−６８、ｎｈｒ−６９、ｎｈｒ−７、ｎｈｒ−７０、ｎｈｒ−７１、ｎｈｒ−７２、ｎｈｒ−７３、ｎｈｒ−７４、ｎｈｒ−７５、ｎｈｒ−７６、ｎｈｒ−７７、ｎｈｒ−７８、ｎｈｒ−７９、ｎｈｒ−８、ｎｈｒ−８０、ｎｈｒ−８１、ｎｈｒ−８２、ｎｈｒ−８３、ｎｈｒ−８４、ｎｈｒ−８５、ｎｈｒ−８６、ｎｈｒ−８７、ｎｈｒ−８８、ｎｈｒ−８９、ｎｈｒ−９、ｎｈｒ−９０、ｎｈｒ−９１、ｎｈｒ−９２、ｎｈｒ−９４、ｎｈｒ−９５、ｎｈｒ−９６、ｎｈｒ−９７、ｎｈｒ−９８、ｎｈｒ−９９、ｎｏｂ−１、ｎｔｌ−２、ｎｔｌ−３、ｎｕｒｆ−１、ｏｄｒ−７、ｏｍａ−１、ｏｍａ−２、ｐａｇ−３、ｐａｌ−１、ｐａｘ−１、ｐａｘ−３、ｐｅｂ−１、ｐｅｓ−１、ｐｈａ−１、ｐｈａ−２、ｐｈａ−４、ｐｈｐ−３、ｐｉｅ−１、ｐｏｐ−１、ｐｏｓ−１、ｐｑｎ−４７、ｐｑｎ−７５、ｐｓａ−１、ｒａｂｘ−５、ｒｂｒ−２、ｒｅｆ−１、ｒｎｔ−１、ｓｂｐ−１、ｓｄｃ−１、ｓｄｃ−２、ｓｄｃ−３、ｓｅａ−１、ｓｅｍ−４、ｓｅｘ−１、ｓｋｎ−１、ｓｋｎｒ−１、ｓｍａ−２、ｓｍａ−３、ｓｍａ−４、ｓｍｋ−１、ｓｏｐ−２、ｓｏｘ−１、ｓｏｘ−２、ｓｏｘ−３、ｓｐｒ−１、ｓｐｔｆ−２、ｓｐｔｆ−３、ｓｒａｂ−２、ｓｒｔ−５８、ｓｒｗ−４９、ｓｔａ−１、ｔａｂ−１、ｔａｆ−４、ｔａｆ−５、ｔａｇ−１５３、ｔａｇ−１８２、ｔａｇ−１８５、ｔａｇ−１９２、ｔａｇ−２９５、ｔａｇ−３３１、ｔａｇ−３４７、ｔａｇ−３５０、ｔａｇ−６８、ｔａｇ−９７、ｔｂｘ−１１、ｔｂｘ−２、ｔｂｘ−３０、ｔｂｘ−３１、ｔｂｘ−３２、ｔｂｘ−３３、ｔｂｘ−３４、ｔｂｘ−３５、ｔｂｘ−３６、ｔｂｘ−３７、ｔｂｘ−３８、ｔｂｘ−３９、ｔｂｘ−４０、ｔｂｘ−４１、ｔｂｘ−７、ｔｂｘ−８、ｔｂｘ−９、ｔｒａ−１、ｔｒａ−４、ｔｔｘ−１、ｔｔｘ−３、ｕｎｃ−１２０、ｕｎｃ−１３０、ｕｎｃ−３、ｕｎｃ−３０、ｕｎｃ−３７、ｕｎｃ−３９、ｕｎｃ−４、ｕｎｃ−４２、ｕｎｃ−５５、ｕｎｃ−６２、ｕｎｃ−８６、ｖａｂ−１５、ｖａｂ−３、ｖａｂ−７、ｘｂｐ−１、ｚａｇ−１、ｚｆｐ−１、ｚｉｍ−１、ｚｉｐ−１、ｚｉｐ−２、ｚｉｐ−３、ｚｉｐ−４、ｚｉｐ−５、及びｚｔｆ−７などの線虫ＴＦを改変したものである。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、例えば、ＡＰＥ＿０２９０．１、ＡＰＥ＿０２９３、ＡＰＥ＿０８８０ｂ、ＡＰＥ＿１６０２ａ、ＡＰＥ＿２４１３、ＡＰＥ＿２５０５、ＡＰＥ＿０６５６ａ、ＡＰＥ＿１７９９ａ、ＡＰＥ＿１４５８ａ、ＡＰＥ＿１４９５ａ、ＡＰＥ＿２５７０．１、ＡＰＥ＿０４１６ｂ．１、ＡＰＥ＿０８８３ａ、ＡＰＥ＿０５３５、ＡＰＥ＿０１４２、ＡＰＥ＿２０２１．１、ＡＰＥ＿００６０．１、ＡＰＥ＿０１９７．１、ＡＰＥ＿０７７８、ＡＰＥ＿２０１１．１、ＡＰＥ＿０１６８．１、ＡＰＥ＿２５１７．１、ＡＰＥ＿０２８８、ＡＰＥ＿０００２、ＡＰＥ＿１３６０．１、ＡＰＥ＿２０９１．１、ＡＰＥ＿０４５４、ＡＰＥ＿１８６２．１、ＡＰＥ＿０６６９．１、ＡＰＥ＿２４４３．１、ＡＰＥ＿０７８７．１、ＡＰＥ＿２００４．１、ＡＰＥ＿００２５．１、ＡＰＥ＿０１５３．１、ＡＦ０６５３、ＡＦ１２６４、ＡＦ１２７０、ＡＦ１５４４、ＡＦ１７４３、ＡＦ１８０７、ＡＦ１８５３、ＡＦ２００８、ＡＦ２１３６、ＡＦ２４０４、ＡＦ０５２９、ＡＦ０１１４、ＡＦ０３９６、ＡＦ１２９８、ＡＦ１５６４、ＡＦ１６９７、ＡＦ１８６９、ＡＦ２２７１、ＡＦ１４０４、ＡＦ１１４８、ＡＦ０４７４、ＡＦ０５８４、ＡＦ１７２３、ＡＦ１６２２、ＡＦ１４４８、ＡＦ０４３９、ＡＦ１４９３、ＡＦ０３３７、ＡＦ０７４３、ＡＦ０３６５、ＡＦ１５９１、ＡＦ０１２８、ＡＦ０００５、ＡＦ１７４５、ＡＦ０５６９、ＡＦ２１０６、ＡＦ１７８５、ＡＦ１９８４、ＡＦ２３９５、ＡＦ２２３２、ＡＦ０８０５、ＡＦ１４２９、ＡＦ０１１１、ＡＦ１６２７、ＡＦ１７８７、ＡＦ１７９３、ＡＦ１９７７、ＡＦ２１１８、ＡＦ２４１４、ＡＦ０６４３、ＡＦ１０２２、ＡＦ１１２１、ＡＦ２１２７、ＡＦ０１３９、ＡＦ０３６３、ＡＦ０９９８、ＡＦ１５９６、ＡＦ０６７３、ＡＦ２２２７、ＡＦ１５４２、ＡＦ２２０３、ＡＦ１４５９、ＡＦ１９６８、ＡＦ１５１６、ＡＦ０３７３、ＡＦ１８１７、ＡＦ１２９９、ＡＦ０７５７、ＡＦ０２１３、ＡＦ１００９、ＡＦ１２３２、ＡＦ００２６、ＡＦ１６６２、ＡＦ１８４６、ＡＦ２１４３、ＡＦ０６７４、Ｃｍａｑ＿０１４６、Ｃｍａｑ＿０９２４、Ｃｍａｑ＿１２７３、Ｃｍａｑ＿１３６９、Ｃｍａｑ＿１４８８、Ｃｍａｑ＿１５０８、Ｃｍａｑ＿１５６１、Ｃｍａｑ＿１６９９、Ｃｍａｑ＿０２１５、Ｃｍａｑ＿１７０４、Ｃｍａｑ＿１９５６、Ｃｍａｑ＿００５８、Ｃｍａｑ＿１６３７、Ｃｍａｑ＿０２２７、Ｃｍａｑ＿０２８７、Ｃｍａｑ＿１６０６、Ｃｍａｑ＿１７２０、Ｃｍａｑ＿０１１２、Ｃｍａｑ＿１１４９、Ｃｍａｑ＿１６８７、Ｃｍａｑ＿０４１１、Ｃｍａｑ＿１９２５、Ｃｍａｑ＿００７８、Ｃｍａｑ＿０３１４、Ｃｍａｑ＿０７６８、Ｃｍａｑ＿１２０６、Ｃｍａｑ＿０４８０、Ｃｍａｑ＿０７９７、Ｃｍａｑ＿１３８８、Ｃｍａｑ＿０１５２、Ｃｍａｑ＿０６０１、Ｃｍａｑ＿１１８８、Ｍｂｏｏ＿０３７５、Ｍｂｏｏ＿０４２３、Ｍｂｏｏ＿０７４９、Ｍｂｏｏ＿１０１２、Ｍｂｏｏ＿１１３４、Ｍｂｏｏ＿１１５４、Ｍｂｏｏ＿１１８９、Ｍｂｏｏ＿１２６６、Ｍｂｏｏ＿１７１１、Ｍｂｏｏ＿１９７１、Ｍｂｏｏ＿０００２、Ｍｂｏｏ＿０９５６、Ｍｂｏｏ＿１０７１、Ｍｂｏｏ＿１４０５、Ｍｂｏｏ＿１６４３、Ｍｂｏｏ＿０９７３、Ｍｂｏｏ＿１１７０、Ｍｂｏｏ＿０１５８、Ｍｂｏｏ＿０１９５、Ｍｂｏｏ＿０２７７、Ｍｂｏｏ＿１４６２、Ｍｂｏｏ＿１５７４、Ｍｂｏｏ＿１６４９、Ｍｂｏｏ＿２１１２、Ｍｂｏｏ＿００１３、Ｍｂｏｏ＿０３８６、Ｍｂｏｏ＿０９４６、Ｍｂｏｏ＿０９７７、Ｍｂｏｏ＿１０８１、Ｍｂｏｏ＿２２４１、Ｍｂｏｏ＿０１４２、Ｍｂｏｏ＿０３９６、Ｍｂｏｏ＿０４０９、Ｍｂｏｏ＿０９７６、Ｍｂｏｏ＿２２４４、Ｍｂｏｏ＿０５２６、Ｍｂｏｏ＿０３４６、Ｍｂｏｏ＿１０１８、Ｍｂｏｏ＿０９１７、Ｍｂｏｏ＿０３２３、Ｍｂｏｏ＿０９１６、Ｍｂｏｏ＿１６８０、Ｍｂｏｏ＿１２８８、Ｍｂｏｏ＿２３１１、Ｍｂｏｏ＿２０４８、Ｍｂｏｏ＿１０２７、Ｍｂｏｏ＿２３１２、ｒｒｎＡＣ０１６１、ｒｒｎＡＣ０５７８、ｒｒｎＡＣ０９６１、ｒｒｎＡＣ３４９４、ｒｒｎＢ０１１８、ｐＮＧ７０４５、ｐＮＧ６１６０、ｒｒｎＡＣ０８６７、ｒｒｎＡＣ２７２３、ｒｒｎＡＣ３３９９、ｒｒｎＡＣ３４４７、ｒｒｎＢ００５２、ｒｒｎＡＣ１６５３、ｒｒｎＡＣ２７７９、ｐＮＧ７０３８、ｒｒｎＡＣ１２５２、ｒｒｎＡＣ３２８８、ｒｒｎＡＣ３３０７、ｒｒｎＡＣ０５０３、ｒｒｎＡＣ１２６９、ｐＮＧ６０４７、ｒｒｎＡＣ２６２２、ｒｒｎＡＣ３２９０、ｒｒｎＡＣ３３６５、ｒｒｎＡＣ２３０１、ｐＮＧ６１５７、ｒｒｎＡＣ２００２、ｒｒｎＡＣ１２３８、ｒｒｎＡＣ３２０７、ｐＮＧ２０３９、ｐＮＧ７１６０、ｒｒｎＡＣ２７４８、ｒｒｎＢ０１３４、ｒｒｎＡＣ２２８３、ｒｒｎＡＣ１７１４、ｒｒｎＡＣ１７１５、ｒｒｎＡＣ２３３８、ｒｒｎＡＣ２３３９、ｒｒｎＡＣ２９００、ｒｒｎＡＣ０３４１、ｒｒｎＡＣ３１９１、ｒｒｎＡＣ１８２５、ｒｒｎＡＣ２０３７、ｒｒｎＡＣ０４９６、ｒｒｎＡＣ３０７４、ｒｒｎＡＣ２６６９、ｒｒｎＡＣ００１９、ｒｒｎＡＣ０２３１、ｒｒｎＡＣ０５６４、ｒｒｎＡＣ０６４０、ｒｒｎＡＣ１１９３、ｒｒｎＡＣ１６８７、ｒｒｎＡＣ１７８６、ｒｒｎＡＣ１８９５、ｒｒｎＡＣ１９５３、ｒｒｎＡＣ１９９６、ｒｒｎＡＣ２０１７、ｒｒｎＡＣ２０２２、ｒｒｎＡＣ２０５２、ｒｒｎＡＣ２０７０、ｒｒｎＡＣ２１６０、ｒｒｎＡＣ２４７２、ｒｒｎＡＣ２７８５、ｒｒｎＡＣ２９３６、ｒｒｎＡＣ３１６７、ｒｒｎＡＣ３４５１、ｒｒｎＡＣ３４８６、ｒｒｎＡＣ３４９０、ｒｒｎＢ０２５３、ｒｒｎＢ０２６９、ｐＮＧ７１５９、ｐＮＧ７１８８、ｐＮＧ７３５７、ｐＮＧ６１３４、ｒｒｎＡＣ０３７６、ｒｒｎＡＣ１２１７、ｒｒｎＡＣ１５４１、ｒｒｎＡＣ１６６３、ｒｒｎＡＣ３２２９、ｐＮＧ７２２３、ｒｒｎＡＣ０４４０、ｒｒｎＡＣ０５３５、ｒｒｎＡＣ１７４２、ｒｒｎＡＣ２５１９、ｒｒｎＡＣ１７６４、ｒｒｎＡＣ１７７７、ｒｒｎＡＣ２７６２、ｒｒｎＡＣ３２６４、ｒｒｎＡＣ０４１７、ｒｒｎＡＣ１３０３、ｒｒｎＢ０３０１、ｐＮＧ６１５５、ｐＮＧ７０２１、ｐＮＧ７３４３、ｒｒｎＡＣ１９６４、ｐＮＧ７１７１、ｒｒｎＡＣ１３３８、ｐＮＧ７３４４、ｒｒｎＡＣ０２３０、ｒｒｎＡＣ１９７１、ｒｒｎＢ０２２２、ｒｒｎＡＣ０３８５、ｒｒｎＡＣ０３１２、ｐＮＧ７１３３、ｒｒｎＡＣ０００６、ｒｒｎＡＣ１８０５、ｒｒｎＡＣ３５０１、ｐＮＧ７３１２、ｒｒｎＡＣ０４３５、ｒｒｎＡＣ０７６８、ｒｒｎＡＣ０９９２、ｒｒｎＡＣ２２７０、ｒｒｎＡＣ３３２２、ｒｒｎＢ０１１２、ｒｒｎＢ０１５７、ｒｒｎＢ０１６１、ｐＮＧ６０５８、ｐＮＧ６０９２、ｐＮＧ５１１９、ｐＮＧ５１４０、ｐＮＧ４０４２、ｐＮＧ２００６、ｐＮＧ１０１５、ｒｒｎＡＣ０１９９、ｒｒｎＡＣ０６８１、ｒｒｎＡＣ１７６５、ｒｒｎＡＣ１７６７、ｐＮＧ５０６７、ｐＮＧ７１８０、ｐＮＧ７３０７、ｐＮＧ７１８３、ｒｒｎＡＣ３３８４、ｐＮＧ５１３１、ｒｒｎＡＣ２７７７、ｐＮＧ５０７１、ｒｒｎＡＣ１４７２、ｐＮＧ７３０８、ｒｒｎＡＣ０８６９、ｒｒｎＢ０１４８、ｒｒｎＡＣ２０５１、ｒｒｎＡＣ００１６、ｒｒｎＡＣ１８７５、ｐＮＧ６０７２、ｐＮＧ６１２３、ｒｒｎＡＣ２７６９、ｒｒｎＡＣ１３５７、ｒｒｎＡＣ１１２６、ｒｒｎＡＣ０８６１、ｒｒｎＡＣ０１７２、ｒｒｎＡＣ０４２０、ｒｒｎＡＣ０９１４、ｒｒｎＡＣ２３５４、ｒｒｎＡＣ３３１０、ｒｒｎＡＣ３３３７、ｐＮＧ５０１３、ｐＮＧ５１３３、ｒｒｎＡＣ３０８２、ｒｒｎＢ００７４、ｐＮＧ６０７５、ｐＮＧ５０２４、ｒｒｎＡＣ０９２４、ｒｒｎＢ０２３５、ｐＮＧ７１４６、ＶＮＧ０４６２Ｃ、ＶＮＧ７１２２、ＶＮＧ７１２５、ＶＮＧ２４４５Ｃ、ＶＮＧ０５９１Ｃ、ＶＮＧ１８４３Ｃ、ＶＮＧ０３２０Ｈ、ＶＮＧ１１２３Ｇｍ、ＶＮＧ１２３７Ｃ、ＶＮＧ１２８５Ｇ、ＶＮＧ２０９４Ｇ、ＶＮＧ１３５１Ｇ、ＶＮＧ１３７７Ｇ、ＶＮＧ１１７９Ｃ、ＶＮＧ１９２２Ｇ、ＶＮＧ１８１６Ｇ、ＶＮＧ０１３４Ｇ、ＶＮＧ０１９４Ｈ、ＶＮＧ０１４７Ｃ、ＶＮＧ６１９３Ｈ、ＶＮＧ２１６３Ｈ、ＶＮＧ０１０１Ｇ、ＶＮＧ１８３６Ｇ、ＶＮＧ０５３０Ｇ、ＶＮＧ０５３６Ｇ、ＶＮＧ０８３５Ｇ、ＶＮＧ２５７９Ｇ、ＶＮＧ６３４９Ｃ、ＶＮＧ１３９４Ｈ、ＶＮＧ０１１３Ｈ、ＶＮＧ０１５６Ｃ、ＶＮＧ０１６０Ｇ、ＶＮＧ０８２６Ｃ、ＶＮＧ０８５２Ｃ、ＶＮＧ１２０７Ｃ、ＶＮＧ１４８８Ｇ、ＶＮＧ６０６５Ｇ、ＶＮＧ６４６１Ｇ、ＶＮＧ７０４８、ＶＮＧ７１６１、ＶＮＧ１４６４Ｇ、ＶＮＧ１５４８Ｃ、ＶＮＧ０２４７Ｃ、ＶＮＧ０４７１Ｃ、ＶＮＧ０８７８Ｇｍ、ＶＮＧ１０２９Ｃ、ＶＮＧ１６１６Ｃ、ＶＮＧ２１１２Ｃ、ＶＮＧ６００９Ｈ、ＶＮＧ７００７、ＶＮＧ０７０４Ｃ、ＶＮＧ１４０５Ｃ、ＶＮＧ６３１８Ｇ、ＶＮＧ０１４２Ｃ、ＶＮＧ６０７２Ｃ、ＶＮＧ６４５４Ｃ、ＶＮＧ７０５３、ＶＮＧ７１５６、ＶＮＧ０７０３Ｈ、ＶＮＧ０２５８Ｈ、ＶＮＧ０７５１Ｃ、ＶＮＧ１４２６Ｈ、ＶＮＧ２０２０Ｃ、ＶＮＧ６０４８Ｈ、ＶＮＧ６１２６Ｈ、ＶＮＧ６２３９Ｇ、ＶＮＧ６４７８Ｈ、ＶＮＧ７１０２、ＶＮＧ６０２７Ｇ、ＶＮＧ７０２３、ＶＮＧ１７８６Ｈ、ＶＮＧ２６２９Ｇ、ＶＮＧ１５９８ａ、ＶＮＧ７０３１、ＶＮＧ６０３７Ｇ、ＶＮＧ７１７１、ＶＮＧ７１１４、ＶＮＧ７０３８、ＶＮＧ２２４３Ｇ、ＶＮＧ６１４０Ｇ、ＶＮＧ７１００、ＶＮＧ６４７６Ｇ、ＶＮＧ６４３８Ｇ、ＶＮＧ６０５０Ｇ、ＶＮＧ０７２６Ｃ、ＶＮＧ１３９０Ｈ、ＶＮＧ６３５１Ｇ、ＶＮＧ２１８４Ｇ、ＶＮＧ０８６９Ｇ、ＶＮＧ０２５４Ｇ、ＶＮＧ６３８９Ｇ、ＶＮＧ０３１５Ｇ、ＶＮＧ０７３４Ｇ、ＶＮＧ０７５７Ｇ、ＶＮＧ１４５１Ｃ、ＶＮＧ１８８６Ｃ、ＶＮＧ１９０３Ｃｍ、ＶＮＧ０９８５Ｈ、ＶＮＧ６３７７Ｈ、ＨＱ２６０７Ａ、ＨＱ２６１２Ａ、ＨＱ２７７９Ａ、ＨＱ１７４０Ａ、ＨＱ１５４１Ａ、ＨＱ１４９１Ａ、ＨＱ２６１９Ａ、ＨＱ１８１１Ａ、ＨＱ３０６３Ａ、ＨＱ３３５４Ａ、ＨＱ３６４２Ａ、ＨＱ２７７３Ａ、ＨＱ１４３６Ａ、ＨＱ２２２１Ａ、ＨＱ１４１４Ａ、ＨＱ３３３９Ａ、ＨＱ２４８４Ａ、ＨＱ３２６５Ａ、ＨＱ３６２０Ａ、ＨＱ１２６８Ａ、ＨＱ１３８８Ａ、ＨＱ１８６６Ａ、ＨＱ１５６３Ａ、ＨＱ１７１０Ａ、ＨＱ１９６２Ａ、ＨＱ１０８４Ａ、ＨＱ１７３９Ａ、ＨＱ１８６１Ａ、ＨＱ１８６３Ａ、ＨＱ２７５０Ａ、ＨＱ２６６４Ａ、ＨＱ２８６９Ａ、ＨＱ３０５８Ａ、ＨＱ３３６１Ａ、ＨＱ１２７７Ａ、ＨＱ２２２５Ａ、ＨＱ１９９３Ａ、ＨＱ１９３７Ａ、ＨＱ１０８８Ａ、ＨＱ１７２４Ａ、ＨＱ１５６８Ａ、ＨＱ２１６７Ａ、ＨＱ１２３０Ａ、ＨＱ２４０７Ａ、ＨＱ３１０８Ａ、ＨＱ１９７３Ａ、ＨＱ３２６０Ａ、ＨＱ２５２７Ａ、ＨＱ３４１０Ａ、ＨＱ２３６９Ａ、ＨＱ２５６４Ａ、ＨＱ１１５３Ａ、ＨＱ１２２７Ａ、ＨＱ３６５４Ａ、ＨＱ１８６７Ａ、ＨＱ２５７１Ａ、ＨＱ１６２５Ａ、ＨＱ３４０８Ａ、ＨＱ１６８９Ａ、ＨＱ２４９１Ａ、ＨＱ２７２６Ａ、ＨＱ２９８７Ａ、ＨＱ１０４１Ａ、ＨＱ１８９８Ａ、ＨＱ１９００Ａ、ＨＱ１１１８Ａ、Ｈｂｕｔ＿１２６１、Ｈｂｕｔ＿００７３、Ｈｂｕｔ＿０００９、Ｈｂｕｔ＿０１００、Ｈｂｕｔ＿０９８７、Ｈｂｕｔ＿１３４０、Ｈｂｕｔ＿０１２０、Ｈｂｕｔ＿０９９０、Ｈｂｕｔ＿０３１６、Ｈｂｕｔ＿０６５９、Ｈｂｕｔ＿０６６０、Ｈｂｕｔ＿０３６６、Ｈｂｕｔ＿０２０４、Ｈｂｕｔ＿１４９８、Ｈｂｕｔ＿１６３０、Ｈｂｕｔ＿１４８５、Ｈｂｕｔ＿１２６０、Ｈｂｕｔ＿０９４２、Ｈｂｕｔ＿０１６３、Ｈｂｕｔ＿０１１６、Ｈｂｕｔ＿０２０７、Ｈｂｕｔ＿１５１６、Ｈｂｕｔ＿０４７６、Ｈｂｕｔ＿１１３９、Ｈｂｕｔ＿０２９９、Ｈｂｕｔ＿００３３、Ｈｂｕｔ＿０３３６、Ｈｂｕｔ＿１４７１、Ｈｂｕｔ＿１５２２、Ｈｂｕｔ＿０６０１、Ｈｂｕｔ＿０９３４、Ｈｂｕｔ＿０４５８、Ｈｂｕｔ＿００５４、Ｈｂｕｔ＿１１３６、Ｈｂｕｔ＿０６４６、Ｈｂｕｔ＿０８１５、ｌｇｎｉ＿０１２２、ｌｇｎｉ＿０４９４、ｌｇｎｉ＿０７０６、ｌｇｎｉ＿１２４９、ｌｇｎｉ＿０２２６、ｌｇｎｉ＿０３０８、ｌｇｎｉ＿０６５８、ｌｇｎｉ＿０７０２、ｌｇｎｉ＿０４８６、ｌｇｎｉ＿０６０２、ｌｇｎｉ＿１３９４、ｌｇｎｉ
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ＳＳＯ０９９４、ＳＳＯ２１３８、ＳＳＯ２５７１、ＳＳＯ０９５１、ＳＳＯ２２０６、ＳＳＯ２０８９、ＳＳＯ２５９８、ＳＳＯ２５０６、ＳＳＯ０４４６、ＳＳＯ０９４６、ＳＳＯ０２６６、ＳＳＯ０４２６、ＳＳＯ２０７３、ＳＴ０２３６、ＳＴ１０６０、ＳＴ１０６４、ＳＴ１０７６、ＳＴ１４８６、ＳＴ１６０４、ＳＴ１８８９、ＳＴＳ２２９、ＳＴ０７２０、ＳＴ０１７３、ＳＴＳ０９５、ＳＴ２５１４、ＳＴ１０２２、ＳＴ２３７２、ＳＴ０１９３、ＳＴ０４８９、ＳＴ１１１５、ＳＴ１３０１、ＳＴＳ０４２、ＳＴ１４７３、ＳＴＳ０７１、ＳＴＳ０７４、ＳＴＳ１６３、ＳＴＳ０７２、ＳＴＳ２５０、ＳＴＳ２４８、ＳＴ２０３９、ＳＴ２２３６、ＳＴ２１１４、ＳＴ２５６２、ＳＴ００５１、ＳＴ０１６４、ＳＴ０７２２、ＳＴ２５５０、ＳＴ１５９３、ＳＴ０２５６、ＳＴ０３３１、ＳＴ１２６８、ＳＴ２０８４、ＳＴ２１９０、ＳＴ１４０９、ＳＴ０８０８、ＳＴＳ０３５、ＳＴ０７５８、ＳＴ１０４３、ＳＴ１３８６、ＳＴ１７１０、ＳＴ１７１６、ＳＴ１８６７、ＳＴ１８９０、ＳＴ２３８８、ＳＴＳ０８６、ＳＴ０７４９、ＳＴ０８３７、ＳＴ０９８０、ＳＴ２０５０、ＳＴ０７５７、ＳＴ０７６６、ＳＴ２２１０、ＳＴ１７７３、ＳＴ１３４０、ＳＴ１０５４、ＳＴ１２７５、ＳＴ１００７、ＳＴ１０４１、ＳＴ０６８４、ＳＴ００７２、ＳＴ０３４９、ＳＴ１２７１、ＳＴ０３３４、ＳＴ１６３０、ＳＴ０３７１、ＴＫ００６３、ＴＫ０５５９、ＴＫ１０４１、ＴＫ１２６１、ＴＫ１８２６、ＴＫ１８８１、ＴＫ２１９０、ＴＫ１０８６、ＴＫ１８８３、ＴＫ１９５５、ＴＫ２２９１、ＴＫ２１３４、ＴＫ１２８５、ＴＫ１４８７、ＴＫ０１６８、ＴＫ１３３１、ＴＫ０５６７、ＴＫ０８３４、ＴＫ１４９１、ＴＫ１２１０、ＴＫ２１１０、ＴＫ２０５２、ＴＫ０１４３、ＴＫ１４１３、ＴＫ２２８９、ＴＫ２２７０、ＴＫ１８１５、ＴＫ１４３９、ＴＫ０６９５、ＴＫ１２５９、ＴＫ０１０７、ＴＫ０４４８、ＴＫ１０５７、ＴＫ１０５８、ＴＫ１２７２、ＴＫ０６９７、ＴＫ０１２６、ＴＫ０５３９、ＴＫ１２６６、ＴＫ１６８８、ＴＫ２１９７、ＴＫ２２１８、ＴＫ１４８９、ＴＫ１３３９、ＴＫ０１４２、ＴＫ０１６９、ＴＫ１２４６、ＴＫ０７７０、ＴＫ１４９４、ＴＫ１９２４、ＴＫ２１０７、ＴＫ１１４３、ＴＫ１６５４、ＴＫ０１５１、ＴＫ０７７９、ＴＫ２１５１、ＴＫ０１３２、ＴＫ２２８７、ＴＫ１２８０、ＴＫ２０２４、ＴＫ０４７１、ＴＫ１７６９、ＴＫ１９１３、ＴＫ１０５０、Ｔｐｅｎ＿０４６６、Ｔｐｅｎ＿０５５２、Ｔｐｅｎ＿０８６０、Ｔｐｅｎ＿１５０９、Ｔｐｅｎ＿０２３２、Ｔｐｅｎ＿０８３６、Ｔｐｅｎ＿１４９９、Ｔｐｅｎ＿０５７７、Ｔｐｅｎ＿００１８、Ｔｐｅｎ＿０５７９、Ｔｐｅｎ＿０１５０、Ｔｐｅｎ＿０３６６、Ｔｐｅｎ＿０８６９、Ｔｐｅｎ＿０６６８、Ｔｐｅｎ＿０３４８、Ｔｐｅｎ＿１２３６、Ｔｐｅｎ＿０１２４、Ｔｐｅｎ＿０１０２、Ｔｐｅｎ＿０９７３、Ｔｐｅｎ＿１６２１、Ｔｐｅｎ＿０３７８、Ｔｐｅｎ＿０５３８、Ｔｐｅｎ＿０７０７、Ｔｐｅｎ＿０７７６、Ｔｐｅｎ＿００６９、Ｔｐｅｎ＿００９０、Ｔｐｅｎ＿０１７３、Ｔｐｅｎ＿１７９６、Ｔｐｅｎ＿１３５８、Ｔｐｅｎ＿０１１５、Ｔｐｅｎ＿１４６４、Ｔｐｅｎ＿１５９５、Ｔｐｅｎ＿１４０１、Ｔｐｅｎ＿０９０１、Ｔｐｅｎ＿１８１８、Ｔｐｅｎ＿０２９３、Ｔｐｅｎ＿０６９０、Ｔｐｅｎ＿０３７４、Ｔｐｅｎ＿０７１０、Ｔｐｅｎ＿００７０、Ｔｐｅｎ＿１５５１、Ｔｐｅｎ＿１５９１、Ｔｐｅｎ＿１１５４、Ｔｐｅｎ＿１５６２、Ｔａ０４７２、Ｔａ０７３１、Ｔａ１１１０、Ｔａ０１１５、Ｔａ１１７３、Ｔａ１４４３、Ｔａ０１８５、Ｔａ０６７８、Ｔａ０６０８、Ｔａ０２５７、Ｔａ０９８１、Ｔａ００９３、Ｔａ０５５０ｍ、Ｔａ０８４２、Ｔａ０８７２、Ｔａ１３６２ｍ、Ｔａ０７３６、Ｔａ１３９４、Ｔａ０１６６、Ｔａ０６７５、Ｔａ０７４８、Ｔａ１２３１、Ｔａ１１８６、Ｔａ０１０６、Ｔａ０９４８、Ｔａ１２８２ｍ、Ｔａ１３６３、Ｔａ０１３１、Ｔａ０３２０ｍ、Ｔａ０４１１、Ｔａ１０６４、Ｔａ１１６６、Ｔａ１２１８、Ｔａ１５０３、Ｔａ０２０１、Ｔａ０３４６、Ｔａ１４９６、Ｔａ０８６８ｍ、Ｔａ１０６１ｍ、Ｔａ０８２５、Ｔａ０７９５、Ｔａ０１９９、Ｔａ１４８５、Ｔａ０９４５、Ｔａ０９４０、Ｔａ０１３４、Ｔａ０６８５、Ｔａ０８９０、Ｔａ１３２４、ＴＶＮ０１９２、ＴＶＮ０９８３、ＴＶＮ１２５１、ＴＶＮ０６５８、ＴＶＮ０２９５、ＴＶＮ１１９６、ＴＶＮ１３３７、ＴＶＮ１１２７、ＴＶＮ０１６０、ＴＶＮ０９４５、ＴＶＮ０９３８、ＴＶＮ０２９２、ＴＶＮ０２３６、ＴＶＮ０３６４、ＴＶＮ０４４７、ＴＶＮ０９０６、ＴＶＮ１４２２、ＴＶＮ０１８５、ＴＶＮ０２９１、ＴＶＮ０５１４、ＴＶＮ１０９３、ＴＶＮ０２１０、ＴＶＮ１２７２、ＴＶＮ０５１９、ＴＶＮ０６０３、ＴＶＮ１２４６、ＴＶＮ１４０８、ＴＶＮ１２０３、ＴＶＮ１１６２、ＴＶＮ０５１６、ＴＶＮ１２６５、ＴＶＮ１３９２、ＴＶＮ１４９３、ＴＶＮ０９３４、ＴＶＮ０７２８、ＴＶＮ０７０４、ＴＶＮ１３９４、ＴＶＮ００８４、ＴＶＮ１０８３、ＴＶＮ１０８９、ＴＶＮ０２１３、ＴＶＮ１１４９、ＴＶＮ０９７２、ＴＶＮ０３７７、ＬＲＣ５６７、ＲＣＩＸ１２７４、ＲＣＩＸ１４２０、ＲＣＩＸ１６５５、ＲＣ１Ｘ１６９８、ＲＣＩＸ２２１３、ＲＣＩＸ２３３６、ＲＲＣ２９８、ＲＲＣ４８６、ＲＲＣ７６、ＲＣＩＸ１１４０、ＲＣＩＸ２１９３、ＲＣＩＸ６７０、ＲＣＩＸ６８４、ＲＣ１Ｘ８０８、ＲＣ１Ｘ８２０、ＬＲＣ５８２、ＲＣＩＸ７８５、ＬＲＣ１０９、ＲＣＩＸ１０３、ＲＣＩＸ１０５、ＲＣＩＸ１０６、ＲＣＩＸ１５０８、ＲＣＩＸ１７３９、ＲＣＩＸ２２４７、ＲＲＣ４６５、ＲＣＩＸ１７４０、ＲＣＩＸ２３２８、ＲＲＣ１７８、ＬＲＣ５７５、ＲＣＩＸ１３４９、ＲＣＩＸ１５２０、ＬＲＣ５２０、ＲＣＩＸ１２５、ＲＣＩＸ１４３０、ＲＣＩＸ１４８、ＲＣＩＸ１５２７、ＲＣＩＸ１７４３、ＲＣＩＸ２４５６、ＲＣＩＸ４４９、ＲＣＩＸ５７１、ＲＲＣ２１２、ＲＣＩＸ９６０、ＬＲＣ１９０、ＲＣＩＸ１２３０、ＲＣＩＸ４１４、ＲＣＩＸ１７４７、ＬＲＣ３１９、ＲＣＩＸ１２９２、ＲＣＩＸ１３７６、ＲＣＩＸ２１７３、ＲＣＩＸ２１９６、ＲＲＣ１５４、ＲＣＩＸ１２３８、ＲＣＩＸ１０６８、ＲＣＩＸ１１９０、ＲＣＩＸ１９１４、ＲＣＩＸ２１７７、ＲＣＩＸ８２４、ＲＣＩＸ９８９、ＲＣＩＸ２１０８、ＬＲＣ２７４、ＬＲＣ３０４、ＲＣＩＸ１１８９、ＲＣＩＸ１７８５、ＲＣＩＸ１７９０、及びＲＣＩＸ９０などの古細菌ＴＦを改変したものである。
【０１３８】
様々な実施形態では、改変タンパク質センサー及び／又はスイッチは、例えば、Ａｂｈ、ＡｂｒＢ、ＡｃｏＲ、ＡｄａＡ、ＡｈｒＣ、ＡｌａＲ、ＡｌｓＲ、ＡｎｓＲ、ＡｒａＲ、ＡｒｆＭ、ＡｒｓＲ、ＡｚｌＢ、ＢｉｒＡ、ＢｋｄＲ、ＢｌｔＲ、ＢｍｒＲ、ＣｃｐＡ、ＣｃｐＢ、ＣｃｐＣ、ＣｇｇＲ、ＣｈｅＢ、ＣｈｅＶ、ＣｈｅＹ、ＣｉｔＲ、ＣｉｔＴ、ＣｏｄＹ、ＣｏｍＡ、ＣｏｍＫ、ＣｏｍＺ、ＣｓｓＲ、ＣｔｓＲ、ＤｃｔＲ、ＤｅｇＡ、ＤｅｇＵ、ＤｅｏＲ、ＤｎａＡ、ＥｘｕＲ、ＦＮＲ、ＦｒｕＲ、Ｆｕｒ、ＧａｂＲ、ＧｅｒＥ、ＧｌｃＫ、ＧｌｃＲ、ＧｌｃＴ、ＧｌｎＲ、ＧｌｐＰ、ＧｌｔＣ、ＧｌｔＲ、ＧｎｔＲ、ＧｕｔＲ、Ｈｂｓ、Ｈｐｒ、ＨｒｃＡ、ＨｔｒＡ、ＨｕｔＰ、ＨｘｌＲ、ｌｏｌＲ、Ｉｐｉ、ＫｄｇＲ、ＫｉｐＲ、ＬａｃＲ、ＬｅｖＲ、ＬｅｘＡ、ＬｉｃＲ、ＬｉｃＴ、ＬｍｒＡ、ＬｒｐＡ、ＬｒｐＢ、ＬｒｐＣ、ＬｙｔＲ、ＬｙｔＴ、ＭａｎＲ、ＭｅｃＡ、Ｍｅｄ、ＭｎｔＲ、ＭｓｍＲ、Ｍｔａ、ＭｔｌＲ、ＭｔｒＢ、ＮｈａＸ、ＰａｄＲ、ＰａｉＡ、ＰａｉＢ、ＰｅｒＲ、ファージＰＢＳＸ転写調節因子、ＰｈｏＰ、ＰｋｓＡ、ＰｕｃＲ、ＰｕｒＲ、ＰｙｒＲ、ＲｂｓＲ、ＲｅｓＤ、Ｒｈｏ、ＲｏｃＲ、Ｒｏｋ、ＲｐｌＴ、ＲｓｆＡ、ＳａｃＴ、ＳａｃＶ、ＳａｃＹ、ＳｅｎＳ、ＳｉｇＡ、ＳｉｇＢ、ＳｉｇＤ、ＳｉｇＥ、ＳｉｇＦ、ＳｉｇＧ、ＳｉｇＨ、ＳｉｇＩ、ＳｉｇＫ、ＳｉｇＬ、ＳｉｇＭ、ＳｉｇＶ、ＳｉｇＷ、ＳｉｇＸ、ＳｉｇＹ、ＳｉｇＺ、ＳｉｎＲ、Ｓｌｒ、ＳｐｌＡ、Ｓｐｏ０Ａ、Ｓｐｏ０Ｆ、ＳｐｏＩＩＩＤ、ＳｐｏＶＴ、ＴｅｎＡ、ＴｅｎＩ、ＴｎｒＡ、ＴｒｅＲ、ＴｒｎＢ−Ｇｌｙ１、ＴｒｎＢ−Ｐｈｅ、ＴｒｎＤ−Ｃｙｓ、ＴｒｎＤ−Ｇｌｙ、ＴｒｎＤ−Ｐｈｅ、ＴｒｎＤ−Ｓｅｒ、ＴｒｎＤ−Ｔｒｐ、ＴｒｎＤ−Ｔｙｒ、ＴｒｎＩ−Ｇｌｙ、ＴｒｎＩ−Ｔｈｒ、ＴｒｎＪ−Ｇｌｙ、ＴｒｎＳ−Ｌｅｕ２、ＴｒｎＳＬ−Ｔｙｒ１、ＴｒｎＳＬ−Ｖａｌ２、Ｘｐｆ、Ｘｒｅ、ＸｙｌＲ、ＹａｃＦ、ＹａｚＢ、ＹｂａＬ、ＹｂｂＢ、ＹｂｂＨ、ＹｂｄＪ、ＹｂｆＡ、ＹｂｆＩ、ＹｂｆＰ、ＹｂｇＡ、ＹｃｂＡ、ＹｃｂＢ、ＹｃｂＧ、ＹｃｂＬ、ＹｃｃＦ、ＹｃｃＨ、ＹｃｅＫ、ＹｃｇＥ、ＹｃｇＫ、ＹｃｌＡ、ＹｃｌＪ、ＹｃｎＣ、ＹｃｎＫ、ＹｃｘＤ、ＹｃｚＧ、ＹｄｃＨ、ＹｄｃＮ、ＹｄｅＢ、ＹｄｅＣ、ＹｄｅＥ、ＹｄｅＦ、ＹｄｅＬ、ＹｄｅＰ、ＹｄｅＳ、ＹｄｅＴ、ＹｄｆＤ、ＹｄｆＦ、ＹｄｆＩ、ＹｄｆＬ、ＹｄｇＣ、ＹｄｇＧ、ＹｄｇＪ、ＹｄｈＣ、ＹｄｈＱ、ＹｄｈＲ、ＹｄｉＨ、ＹｄｚＦ、ＹｅｒＯ、ＹｅｓＮ、ＹｅｓＳ、ＹｅｔＬ、ＹｅｚＣ、ＹｅｚＥ、ＹｆｈＰ、ＹｆｉＡ、ＹｆｉＦ、ＹｆｉＫ、ＹｆｉＲ、ＹｆｉＶ、ＹｆｍＰ、ＹｈｂＩ、ＹｈｃＢ、ＹｈｃＦ、ＹｈｃＺ、ＹｈｄＥ、ＹｈｄＩ、ＹｈｄＱ、ＹｈｇＤ、ＹｈｊＨ、ＹｈｊＭ、ＹｉｓＲ、ＹｉｓＶ、ＹｊｂＤ、ＹｊｄＩ、ＹｋｍＡ、ＹｋｏＧ、ＹｋｏＭ、ＹｋｖＥ、ＹｋｖＮ、ＹｋｖＺ、ＹｌａＣ、ＹｌｂＯ、ＹｌｐＣ、ＹｍｆＣ、ＹｎｅＩ、ＹｏａＵ、ＹｏｂＤ、ＹｏｂＱ、ＹｏｃＧ、ＹｏｄＢ、ＹｏｆＡ、ＹｏｎＲ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＳ、ＹｏｚＡ、ＹｏｚＧ、ＹｐｂＨ、ＹｐｌＰ、ＹｐｏＰ、ＹｐｕＨ、ＹｑａＥ、ＹｑａＦ、ＹｑａＧ、ＹｑｆＬ、ＹｑｚＢ、ＹｒａＢ、ＹｒａＮ、ＹｒｄＱ、ＹｒｈＩ、ＹｒｈＭ、ＹｒｋＰ、ＹｒｘＡ、ＹｒｚＣ、ＹｓｉＡ、ＹｓｍＢ、ＹｔｃＤ、ＹｔｄＰ、ＹｔｌＩ、ＹｔｒＡ、ＹｔｓＡ、ＹｔｔＰ、ＹｔｚＥ、ＹｕｆＭ、ＹｕｌＢ、ＹｕｒＫ、ＹｕｓＯ、ＹｕｓＴ、ＹｕｘＮ、ＹｖａＦ、ＹｖａＮ、ＹｖａＯ、ＹｖａＰ、ＹｖｂＡ、ＹｖｂＵ、ＹｖｃＰ、ＹｖｄＥ、ＹｖｄＴ、Ｙｖｆｌ、ＹｖｆＵ、ＹｖｈＪ、ＹｖｋＢ、ＹｖｍＢ、ＹｖｎＡ、ＹｖｏＡ、ＹｖｑＣ、ＹｖｒＨ、ＹｖｒＩ、ＹｖｙＤ、ＹｖｚＣ、ＹｗａＥ、ＹｗｂＩ、ＹｗｃＣ、ＹｗｆＫ、ＹｗｇＢ、ＹｗｈＡ、ＹｗｏＨ、ＹｗｑＭ、ＹｗｒＣ、ＹｗｔＦ、ＹｘａＤ、ＹｘａＦ、ＹｘｂＦ、ＹｘｄＪ、ＹｘｊＬ、ＹｘｊＯ、ＹｙａＮ、ＹｙｂＡ、ＹｙｂＥ、ＹｙｂＲ、ＹｙｃＦ、ＹｙｄＫ、及びＺｕｒなどの枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴＦを改変したものである。
【０１３９】
様々な実施形態では、改変タンパク質センサー及び／又はスイッチは、例えば、ＡＴ１Ｇ０１０６０、ＡＴ１Ｇ０１３８０、ＡＴ１Ｇ０１５３０、ＡＴ１Ｇ０２３４０、ＡＴ１Ｇ０４３７０、ＡＴ１Ｇ０６１６０、ＡＴ１Ｇ０７６４０、ＡＴ１Ｇ０９５３０、ＡＴ１Ｇ０９７７０、ＡＴ１Ｇ１０１７０、ＡＴ１Ｇ１２６１０、ＡＴ１Ｇ１２８６０、ＡＴ１Ｇ１２９８０、ＡＴ１Ｇ１３９６０、ＡＴ１Ｇ１４３５０、ＡＴ１Ｇ１４９２０、ＡＴ１Ｇ１５３６０、ＡＴ１Ｇ１６４９０、ＡＴ１Ｇ１８５７０、ＡＴ１Ｇ１９２２０、ＡＴ１Ｇ１９３５０、ＡＴ１Ｇ１９８５０、ＡＴ１Ｇ２１９７０、ＡＴ１Ｇ２２０７０、ＡＴ１Ｇ２３４２０、ＡＴ１Ｇ２４２６０、ＡＴ１Ｇ２４５９０、ＡＴ１Ｇ２５５６０、ＡＴ１Ｇ２６３１０、ＡＴ１Ｇ２６８７０、ＡＴ１Ｇ２６９４５、ＡＴ１Ｇ２７７３０、ＡＴ１Ｇ２８３００、ＡＴ１Ｇ３０２１０、ＡＴ１Ｇ３０３３０、ＡＴ１Ｇ３０４９０、ＡＴ１Ｇ３２３３０、ＡＴ１Ｇ３２５４０、ＡＴ１Ｇ３２６４０、ＡＴ１Ｇ３２７７０、ＡＴ１Ｇ３３２４０、ＡＴ１Ｇ３４３７０、ＡＴ１Ｇ３４７９０、ＡＴ１Ｇ３５５１５、ＡＴ１Ｇ４２９９０、ＡＴ１Ｇ４５２４９、ＡＴ１Ｇ４６７６８、ＡＴ１Ｇ４７８７０、ＡＴ１Ｇ５１７００、ＡＴ１Ｇ５２１５０、ＡＴ１Ｇ５２８８０、ＡＴ１Ｇ５２８９０、ＡＴ１Ｇ５３２３０、ＡＴ１Ｇ５３９１０、ＡＴ１Ｇ５４０６０、ＡＴ１Ｇ５５５８０、ＡＴ１Ｇ５５６００、ＡＴ１Ｇ５６０１０、ＡＴ１Ｇ５６６５０、ＡＴ１Ｇ６２３００、ＡＴ１Ｇ６２３６０、ＡＴ１Ｇ６３６５０、ＡＴ１Ｇ６５６２０、ＡＴ１Ｇ６６３５０、ＡＴ１Ｇ６６３９０、ＡＴ１Ｇ６６６００、ＡＴ１Ｇ６７２６０、ＡＴ１Ｇ６８６４０、ＡＴ１Ｇ６９１２０、ＡＴ  １Ｇ６９１８０、ＡＴ１Ｇ６９４９０、ＡＴ１Ｇ６９６００、ＡＴ１Ｇ７０５１０、ＡＴ１Ｇ７１０３０、ＡＴ１Ｇ７１６９２、ＡＴ１Ｇ７１９３０、ＡＴ１Ｇ７３７３０、ＡＴ１Ｇ７４９３０、ＡＴ１Ｇ７５０８０、ＡＴ１Ｇ７６４２０、ＡＴ１Ｇ７７８５０、ＡＴ１Ｇ７８６００、ＡＴ１Ｇ７９１８０、ＡＴ１Ｇ７９５８０、ＡＴ１Ｇ７９８４０、ＡＴ２Ｇ０１５００、ＡＴ２Ｇ０１５７０、ＡＴ２Ｇ０１９３０、ＡＴ２Ｇ０２４５０、ＡＴ２Ｇ０３３４０、ＡＴ２Ｇ１６９１０、ＡＴ２Ｇ１７９５０、ＡＴ２Ｇ２０１８０、ＡＴ２Ｇ２２３００、ＡＴ２Ｇ２２５４０、ＡＴ２Ｇ２２６３０、ＡＴ２Ｇ２２７７０、ＡＴ２Ｇ２３７６０、ＡＴ２Ｇ２４５７０、ＡＴ２Ｇ２６１５０、ＡＴ２Ｇ２７０５０、ＡＴ２Ｇ２７３００、ＡＴ２Ｇ２７９９０、ＡＴ２Ｇ２８１６０、ＡＴ２Ｇ２８３５０、ＡＴ２Ｇ２８５５０、ＡＴ２Ｇ２８６１０、ＡＴ２Ｇ３０２５０、ＡＴ２Ｇ３０４３２、ＡＴ２Ｇ３３８１０、ＡＴ２Ｇ３３８３５、ＡＴ２Ｇ３３８６０、ＡＴ２Ｇ３３８８０、ＡＴ２Ｇ３４７１０、ＡＴ２Ｇ３６０１０、ＡＴ２Ｇ３６２７０、ＡＴ２Ｇ３６８９０、ＡＴ２Ｇ３７２６０、ＡＴ２Ｇ３７６３０、ＡＴ２Ｇ３８４７０、ＡＴ２Ｇ４０２２０、ＡＴ２Ｇ４０９５０、ＡＴ２Ｇ４２２００、ＡＴ２Ｇ４２８３０、ＡＴ２Ｇ４３０１０、ＡＴ２Ｇ４５１９０、ＡＴ２Ｇ４５６６０、ＡＴ２Ｇ４６２７０、ＡＴ２Ｇ４６４１０、ＡＴ２Ｇ４６６８０、ＡＴ２Ｇ４６７７０、ＡＴ２Ｇ４６８３０、ＡＴ２Ｇ４６８７���、ＡＴ２Ｇ４６９７０、ＡＴ２Ｇ４７１９０、ＡＴ２Ｇ４７４６０、ＡＴ３Ｇ０１１４０、ＡＴ３Ｇ０１４７０、ＡＴ３Ｇ０２９９０、ＡＴ３Ｇ０３４５０、ＡＴ３Ｇ０４６７０、ＡＴ３Ｇ０７６５０、ＡＴ３Ｇ１０８００、ＡＴ３Ｇ１１４４０、ＡＴ３Ｇ１２２５０、ＡＴ３Ｇ１３５４０、ＡＴ３Ｇ１３８９０、ＡＴ３Ｇ１５１７０、ＡＴ３Ｇ１５２１０、ＡＴ３Ｇ１５５００、ＡＴ３Ｇ１５５１０、ＡＴ３Ｇ１６７７０、ＡＴ３Ｇ１６８５７、ＡＴ３Ｇ１７６０９、ＡＴ３Ｇ１８９９０、ＡＴ３Ｇ１９２９０、ＡＴ３Ｇ２０３１０、ＡＴ３Ｇ２０７７０、ＡＴ３Ｇ２２１７０、ＡＴ３Ｇ２３１３０、ＡＴ３Ｇ２３２５０、ＡＴ３Ｇ２４６５０、ＡＴ３Ｇ２５７１０、ＡＴ３Ｇ２６７４４、ＡＴ３Ｇ２６７９０、ＡＴ３Ｇ２７７８５、ＡＴ３Ｇ２７８１０、ＡＴ３Ｇ２７９２０、ＡＴ３Ｇ２８４７０、ＡＴ３Ｇ２８９１０、ＡＴ３Ｇ４４７５０、ＡＴ３Ｇ４６６４０、ＡＴ３Ｇ４８１６０、ＡＴ３Ｇ４８４３０、ＡＴ３Ｇ４９９４０、ＡＴ３Ｇ５０４１０、ＡＴ３Ｇ５１０６０、ＡＴ３Ｇ５４２２０、ＡＴ３Ｇ５４３２０、ＡＴ３Ｇ５４３４０、ＡＴ３Ｇ５４６２０、ＡＴ３Ｇ５５３７０、ＡＴ３Ｇ５６４００、ＡＴ３Ｇ５８０７０、ＡＴ３Ｇ５８７８０、ＡＴ３Ｇ５９０６０、ＡＴ３Ｇ６１８５０、ＡＴ３Ｇ６１８９０、ＡＴ３Ｇ６１９１０、ＡＴ３Ｇ６２４２０、ＡＴ４Ｇ００１２０、ＡＴ４Ｇ００１８０、ＡＴ４Ｇ００２２０、ＡＴ４Ｇ０１２５０、ＡＴ４Ｇ０１５４０、ＡＴ４Ｇ０２５６０、ＡＴ４Ｇ０４４５０、ＡＴ４Ｇ０８１５０、ＡＴ４Ｇ０９８２０、ＡＴ４Ｇ０９９６０、ＡＴ４Ｇ１５０９０、ＡＴ４Ｇ１６１１０、ＡＴ４Ｇ１６７８０、ＡＴ４Ｇ１７７５０、ＡＴ４Ｇ１８９６０、ＡＴ４Ｇ２０３８０、ＡＴ４Ｇ２１３３０、ＡＴ４Ｇ２１７５０、ＡＴ４Ｇ２３５５０、ＡＴ４Ｇ２３８１０、ＡＴ４Ｇ２４０２０、ＡＴ４Ｇ２４２４０、ＡＴ４Ｇ２４４７０、ＡＴ４Ｇ２４５４０、ＡＴ４Ｇ２５４７０、ＡＴ４Ｇ２５４８０、ＡＴ４Ｇ２５４９０、ＡＴ４Ｇ２５５３０、ＡＴ４Ｇ２６１５０、ＡＴ４Ｇ２７３３０、ＡＴ４Ｇ２７４１０、ＡＴ４Ｇ２８１１０、ＡＴ４Ｇ２８６１０、ＡＴ４Ｇ３００８０、ＡＴ４Ｇ３１５５０、ＡＴ４Ｇ３１８００、ＡＴ４Ｇ３１９２０、ＡＴ４Ｇ３２７３０、ＡＴ４Ｇ３２８８０、ＡＴ４Ｇ３２９８０、ＡＴ４Ｇ３４０００、ＡＴ４Ｇ３４５９０、ＡＴ４Ｇ３４９９０、ＡＴ４Ｇ３５９００、ＡＴ４Ｇ３６７３０、ＡＴ４Ｇ３６８７０、ＡＴ４Ｇ３６９２０、ＡＴ４Ｇ３６９３０、ＡＴ４Ｇ３７５４０、ＡＴ４Ｇ３７６５０、ＡＴ４Ｇ３７７５０、ＡＴ４Ｇ３８６２０、ＡＴ５Ｇ０１９００、ＡＴ５Ｇ０２０３０、ＡＴ５Ｇ０２４７０、ＡＴ５Ｇ０３１５０、ＡＴ５Ｇ０３６８０、ＡＴ５Ｇ０３７９０、ＡＴ５Ｇ０４２４０、ＡＴ５Ｇ０５４１０、ＡＴ５Ｇ０６０７０、ＡＴ５Ｇ０６１００、ＡＴ５Ｇ０６６５０、ＡＴ５Ｇ０６９５０、ＡＴ５Ｇ０６９６０、ＡＴ５Ｇ０７１００、ＡＴ５Ｇ０７６９０、ＡＴ５Ｇ０７７００、ＡＴ５Ｇ０８１３０、ＡＴ５Ｇ０９７５０、ＡＴ５Ｇ１０１４０、ＡＴ５Ｇ１０５１０、ＡＴ５Ｇ１１２６０、ＡＴ５Ｇ１１５１０、ＡＴ５Ｇ１２８７０、ＡＴ５Ｇ１３７９０、ＡＴ５Ｇ１４０１０、ＡＴ５Ｇ１４７５０、ＡＴ５Ｇ１４９６０、ＡＴ５���１５８４０、ＡＴ５Ｇ１５８５０、ＡＴ５Ｇ１６５６０、ＡＴ５Ｇ１６８２０、ＡＴ５Ｇ１７３００、ＡＴ５Ｇ１７４３０、ＡＴ５Ｇ１８５６０、ＡＴ５Ｇ１８８３０、ＡＴ５Ｇ２０２４０、ＡＴ５Ｇ２０７３０、ＡＴ５Ｇ２１１２０、ＡＴ５Ｇ２２２２０、ＡＴ５Ｇ２２５７０、ＡＴ５Ｇ２３０００、ＡＴ５Ｇ２３２６０、ＡＴ５Ｇ２６６６０、ＡＴ５Ｇ３５５５０、ＡＴ５Ｇ３５７７０、ＡＴ５Ｇ３７０２０、ＡＴ５Ｇ３７２６０、ＡＴ５Ｇ４０３３０、ＡＴ５Ｇ４０３５０、ＡＴ５Ｇ４０３６０、ＡＴ５Ｇ４１３１５、ＡＴ５Ｇ４１４１０、ＡＴ５Ｇ４２６３０、ＡＴ５Ｇ４３２７０、ＡＴ５Ｇ４５９８０、ＡＴ５Ｇ４７２２０、ＡＴ５Ｇ４８６７０、ＡＴ５Ｇ５１９９０、ＡＴ５Ｇ５２８３０、ＡＴ５Ｇ５３２００、ＡＴ５Ｇ５３２１０、ＡＴ５Ｇ５３９５０、ＡＴ５Ｇ５４０７０、ＡＴ５Ｇ５６１１０、ＡＴ５Ｇ５６２７０、ＡＴ５Ｇ５６８６０、ＡＴ５Ｇ５９５７０、ＡＴ５Ｇ５９８２０、ＡＴ５Ｇ６０６９０、ＡＴ５Ｇ６０８９０、ＡＴ５Ｇ６０９１０、ＡＴ５Ｇ６１２７０、ＡＴ５Ｇ６１４２０、ＡＴ５Ｇ６１８５０、ＡＴ５Ｇ６２０００、ＡＴ５Ｇ６２０２０、ＡＴ５Ｇ６２３８０、ＡＴ５Ｇ６２４３０、ＡＴ５Ｇ６５０５０、ＡＴ５Ｇ６６８７０、ＡＴ５Ｇ６７３００、及びＡＴ５Ｇ６７４２０などのシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＴＦを改変したものである。
【０１４０】
様々な実施形態では、改変タンパク質センサー及び／又はスイッチは、例えば、ＣＧ１０３２５、ＣＧ１１６４８、ＣＧ６０９３、ＣＧ３７９６、ＣＧ９１５１、ＣＧ１５８４５、ＣＧ３９３５、ＣＧ３１６６、ＣＧ８３７６、ＣＧ３２５８、ＣＧ６６７７、ＣＧ３６２９、ＣＧ１０３４、ＣＧ３５７８、ＣＧ１１４９１、ＣＧ１２６５３、ＣＧ１７５９、ＣＧ６３８４、ＣＧ１１９２４、ＣＧ４８８１、ＣＧ８３６７、ＣＧ１７８９４、ＣＧ８６６９、ＣＧ２７１４、ＣＧ５８９３、ＣＧ９７４５、ＣＧ５１０２、ＣＧ２１８９、ＣＧ３３１８３、ＣＧ９９０８、ＣＧ１０７９８、ＣＧ１８９７、ＣＧ１１０９４、ＣＧ２７１１、ＣＧ１０６０４、ＣＧ３２３４６、ＣＧ５７１４、ＣＧ１７６５、ＣＧ７３８３、ＣＧ３２１８０、ＣＧ８１２７、ＣＧ１００７、ＣＧ２９８８、ＣＧ９０１５、ＣＧ１４９４１、ＣＧ８３６５、ＣＧ２３２８、ＣＧ８９３３、ＣＧ１０４８８、ＣＧ６５０２、ＣＧ１０００２、ＣＧ２７０７、ＣＧ１００３４、ＣＧ２０４７、ＣＧ４０５９、ＣＧ３３１３３、ＣＧ９６５６、ＣＧ２６９２、ＣＧ３３８８、ＣＧ７９５２、ＣＧ６４９４、ＣＧ１１６０７、ＣＧ９７８６、ＣＧ４６９４、ＣＧ９７６８、ＣＧ１６１９、ＣＧ５７４８、ＣＧ１７１１７、ＣＧ１７８３５、ＣＧ２２７５、ＣＧ３３９５６、ＣＧ１０１９７、ＣＧ４７１７、ＣＧ４７６１、ＣＧ３３４０、ＣＧ３６４７、ＣＧ３７５８、ＣＧ４１５８、ＣＧ４１４８、ＣＧ７６６４、ＣＧ１０６９９、ＣＧ５９５４、ＣＧ１７７４３、ＣＧ１２６４、ＣＧ３８３９、ＣＧ３２１２０、ＣＧ１６８９、ＣＧ８３４６、ＣＧ６０９６、ＣＧ８３６１、ＣＧ１７０５、ＣＧ１４５４８、ＣＧ８３２８、ＣＧ８３３３、ＣＧ２０５０、ＣＧ１８７４０、ＣＧ９０４５、ＣＧ１０２５０、ＣＧ１１４５０、ＣＧ６５３４、ＣＧ３８５１、ＣＧ１１３３、ＣＧ７４６７、ＣＧ６８２４、ＣＧ５１０９、ＣＧ１２２１２、ＣＧ３９７８、ＣＧ１７０７７、ＣＧ９６１０、ＣＧ８２４６、ＣＧ６７１６、ＣＧ７２３０、ＣＧ６３４８、ＣＧ１０３９３、ＣＧ１８４９、ＣＧ９４９５、ＣＧ１０３０、ＣＧ８５４４、ＣＧ７７３４、ＣＧ１６４１、ＣＧ１６７３８、ＣＧ３９５６、ＣＧ３８３６、ＣＧ１１１２１、ＣＧ７８４７、ＣＧ３９９２、ＣＧ７９３８、ＣＧ１７９５８、ＣＧ６９９３、ＣＧ８５７３、ＣＧ８５９９、ＣＧ８４０９、ＣＧ８０６８、ＣＧ１１５０２、ＣＧ４２１６、ＣＧ１６７７８、ＣＧ１３７８、ＣＧ６８８３、ＣＧ８６５１、ＣＧ１３７４、ＣＧ１８５６、ＣＧ１０６１９、ＣＧ２９５６、ＣＧ１０３８８、ＣＧ２７６２、ＣＧ４３８０、ＣＧ６１７２、ＣＧ７８０３、ＣＧ１０４６、ＣＧ１０４８、ＣＧ３４１１、ＣＧ１２１５４、ＣＧ７８９５、ＣＧ３８２７、ＣＧ１１３８７、ＣＧ１７９５０、ＣＧ１２２８７、ＣＧ７４５０、ＣＧ２３６８、ＣＧ６１４３、ＣＧ６３３８、ＣＧ２９３９、ＣＧ６４６４、ＣＧ１７２２８、ＣＧ１３２２、ＣＧ１４４９、ＣＧ７６７２、ＣＧ１４３０７、ＣＧ７７７１、ＣＧ５４０３、ＣＧ３４９７、ＣＧ５４８８、ＣＧ４２２０、ＣＧ２１２５、ＣＧ１８４１２、ＣＧ７９０２、ＣＧ７９３７、ＣＧ１８０２３、ＣＧ９０９７、ＣＧ２１０２、ＣＧ１１３０、ＣＧ３２４２、ＣＧ１００２１、ＣＧ１１３２、ＣＧ３６６８、ＣＧ１１９２１、ＣＧ１１９２２、ＣＧ９３１０、ＣＧ８８８７、ＣＧ３１１４、ＣＧ６６３４、ＣＧ１４６４、ＣＧ１１０４９、ＣＧ１４５１３、ＣＧ３０９０、ＣＧ８４０４、ＣＧ３８８６、ＣＧ１２０５２、ＣＧ４３５４、ＣＧ１４５４、ＣＧ７０１８、ＣＧ５５８３、ＣＧ２９１４、ＣＧ４９５２、ＣＧ５６８３、ＣＧ４４９１、ＣＧ３３１５２、ＣＧ９９３０、ＣＧ５４４１、ＣＧ６５７０、ＣＧ３９０５、ＣＧ８７０４、ＣＧ１７９２１、ＣＧ４８１７、ＣＧ７５６２、ＣＧ２８５１、ＣＧ５９６５、ＣＧ７５０８、ＣＧ５５８０、ＣＧ５５５７、ＣＧ６９６４、ＣＧ５５７５、ＣＧ６７９４、ＣＧ２６５５、ＣＧ３０５２、ＣＧ６５４５、ＣＧ７１８７、ＣＧ１７１６１、ＣＧ８６２５、ＣＧ１２３９９、ＣＧ１７７５、ＣＧ１４２９、ＣＧ３１２４０、ＣＧ７２６０、ＣＧ５５２９、ＣＧ４６５４、ＣＧ１２２２３、ＣＧ６３７６、ＣＧ５２４７、ＣＧ１１４９４、ＣＧ３３２６１、ＣＧ１２２９６、ＣＧ８１０３、ＣＧ１０７２、ＣＧ７９５９、ＣＧ７９６０、ＣＧ８５６７、ＣＧ１８３８９、ＣＧ１１９９２、ＣＧ５０６９、ＣＧ１２２４５、ＣＧ１０６０１、ＣＧ６１０３、ＣＧ１８６４、ＣＧ２６７８、ＣＧ５２６４、ＣＧ１１９８７、ＣＧ６２１５、ＣＧ８５２２、ＣＧ７１９９、ＣＧ１１７８３、ＣＧ８３９６、ＣＧ１１７９８、ＣＧ９０１９、ＣＧ４０２９、ＣＧ１００３６、ＣＧ７９５１、ＣＧ７６５９、ＣＧ１６５０、ＣＧ１０１５９、ＣＧ１５３１９、ＣＧ５８３８、ＣＧ９３９８、ＣＧ７４１３、ＣＧ５３９３、ＣＧ１０５７１、ＣＧ１０６０５、ＣＧ１４０２９、ＣＧ６６０４、ＣＧ１７８８８、ＣＧ１３５９８、ＣＧ４２５７、ＣＧ１３９５１、ＣＧ９６４８、ＣＧ１１１８６、ＣＧ３８５８、ＣＧ９６９６、ＣＧ５７９９、ＣＧ１４９３８、ＣＧ１３４３、ＣＧ６３１２、ＣＧ５２０１、ＣＧ１００５２、ＣＧ８０１３、ＣＧ１４４７、ＣＧ３２７８８、ＣＧ１１２０２、ＣＧ９４１５、ＣＧ１５０７、ＣＧ１０２７０、ＣＧ３９９８、ＣＧ５００５、ＣＧ１０２６９、ＣＧ７３９１、ＣＧ８６６７、ＣＧ８７２７、ＣＧ５２０６、ＣＧ１３３１６、ＣＧ７８０７、ＣＧ２８１９、ＣＧ３８４８、ＣＧ１６９０２、ＣＧ６２６９、ＣＧ１００１６、ＣＧ７７６０、ＣＧ９６５３、ＣＧ１４１４、ＣＧ１５５５２、ＣＧ４０１３、ＣＧ８５２４、ＣＧ１０７１、ＣＧ５６４９、ＣＧ２７１２、ＣＧ１６０５、ＣＧ１１１８２、ＣＧ１８４５５、ＣＧ４３０３、ＣＧ９１０２、ＣＧ１７８２９、ＣＧ２９３２、ＣＧ１１５５１、ＣＧ２２６２、ＣＧ８４７４、ＣＧ６３５２、ＣＧ６１２１、ＣＧ７９５８、ＣＧ４１４３、ＣＧ１１３５４、ＣＧ５９３５、ＣＧ８２９０、ＣＧ３２５７５、ＣＧ９４１８、ＣＧ１１３５２、ＣＧ３８７１、ＣＧ６６２７、ＣＧ１０２４、ＣＧ８１０８、ＣＧ２７９０、ＣＧ１９６６、ＣＧ１１１９４、ＣＧ９７７６、ＣＧ７７５８、ＣＧ８２０８、ＣＧ２２４４、ＣＧ５０６７、ＣＧ５２２９、ＣＧ１８７８３、ＣＧ１８１２４、ＣＧ１５２８６、ＣＧ１１４０５、ＣＧ３２６８、ＣＧ１１９０２、ＣＧ５１３３、ＣＧ１５２６９、ＣＧ３４９１、ＣＧ１７３２８、ＣＧ４１８５、ＣＧ１６８６３、ＣＧ１２６３０、ＣＧ３２９０４、ＣＧ１７５９４、ＣＧ１９２２、ＣＧ１３９０６、ＣＧ１８０２４、ＣＧ９２３３、ＣＧ１２６９０、ＣＧ２８７５、ＣＧ１７５９２、ＣＧ４１３６、ＣＧ１２２３６、ＣＧ３７２６、ＣＧ３８１５、ＣＧ３８４７、ＣＧ１４４４１、ＣＧ１４４３８、ＣＧ３０７５、ＣＧ４５７５、ＣＧ３０３２、ＣＧ４６１７、ＣＧ９６５０、ＣＧ２１１６、ＣＧ２１２０、ＣＧ２１２９、ＣＧ１５３３６、ＣＧ１０９５９、ＣＧ１８２６２、ＣＧ１１２９４、ＣＧ１２０７５、ＣＧ１５３６５、ＣＧ７０４１、ＣＧ７０５５、ＣＧ２８８９、ＣＧ９８１７、ＣＧ２２０２、ＣＧ１１１２２、ＣＧ１１６９６、ＣＧ１１６９５、ＣＧ１１０８５、ＣＧ４４０４、ＣＧ４３１８、ＣＧ１５７４９、ＣＧ１７１６、ＣＧ１１１７２、ＣＧ１１０７１、ＣＧ６２１１、ＣＧ９２１５、ＣＧ８１１９、ＣＧ８９４４、ＣＧ８５７８、ＣＧ８９０９、ＣＧ８９２４、ＣＧ９６０９、ＣＧ６７６９、ＣＧ５９２７、ＣＧ６４７０、ＣＧ７１０１、ＣＧ７５５６、ＣＧ１４２００、ＣＧ９５７１、ＣＧ１１７１０、ＣＧ１５２９、ＣＧ１１６１７、ＣＧ４１３３、ＣＧ３１６７０、ＣＧ１１７２３、ＣＧ１７２５７、ＣＧ３４０７、ＣＧ１７６１２、ＣＧ１５４３５、ＣＧ１５４３６、ＣＧ９０８８、ＣＧ１３７７５、ＣＧ９２００、ＣＧ４４９６、ＣＧ３８３８、ＣＧ１３１２３、ＣＧ１８６１９、ＣＧ１８１４４、ＣＧ５０３４、ＣＧ１２２９９、ＣＧ４６２１、ＣＧ６６８６、ＣＧ６７９２、ＣＧ９９３２、ＣＧ５２０４、ＣＧ９３０５、ＣＧ７０９９、ＣＧ５９５３、ＣＧ１７９１２、ＣＧ５５４５、ＣＧ１０３４８、ＣＧ１０４３１、ＣＧ１０４４６、ＣＧ１７５６８、ＣＧ１０２６３、ＣＧ１０３６６、ＣＧ１０４６２、ＣＧ１０４４７、ＣＧ１０６３１、ＣＧ１０９４９、ＣＧ９３４２、ＣＧ１８３６２、ＣＧ１５２１６、ＣＧ１８３２、ＣＧ３１３６、ＣＧ２６８２、ＣＧ１８４５、ＣＧ１６２１、ＣＧ１６２０、ＣＧ１６０３、ＣＧ１６０２、ＣＧ１２７６９、ＣＧ１１６４１、ＣＧ８６４３、ＣＧ８２１６、ＣＧ１６６３、ＣＧ１８４４６、ＣＧ１２７４４、ＣＧ１４０７、ＣＧ１８０１１、ＣＧ１２９４２、ＣＧ１２３９１、ＣＧ１３２０４、ＣＧ１２３７０、ＣＧ８８２１、ＣＧ８８１９、ＣＧ３８５０、ＣＧ４６７６、ＣＧ６０６１、ＣＧ６７０１、ＣＧ１７３８５、ＣＧ１７３９０、ＣＧ１０２０９、ＣＧ８０８９、ＣＧ８０９２、ＣＧ１６８０１、ＣＧ８３１４、ＣＧ８３８８、ＣＧ７７８６、ＣＧ４２８２、ＣＧ１５７１０、ＣＧ１７２８７、ＣＧ１８４６８、ＣＧ４９０３、ＣＧ１５０７３、ＣＧ１１９０６、ＣＧ１３４２４、ＣＧ９９５４、ＣＧ１０５４３、ＣＧ９４３７、ＣＧ１０３２１、ＣＧ１０３１８、ＣＧ１３４９３、ＣＧ１１３０１、ＣＧ１０３４４、ＣＧ９８９５、ＣＧ９８９０、ＣＧ９８７６、ＣＧ３９４１、ＣＧ５５９１、ＣＧ３０６５、ＣＧ３３２８、ＣＧ１１４１４、ＣＧ４７０７、ＣＧ６９０５、ＣＧ１２３３、ＣＧ１７１８１、ＣＧ１３８９７、ＣＧ９１３９、ＣＧ２１９９、ＣＧ１２１０４、ＣＧ１２４４、ＣＧ１５８１２、ＣＧ１４９６２、ＣＧ１４９６５、ＣＧ１２０２９、ＣＧ１２６０５、ＣＧ１５０１１、ＣＧ５２４９、ＣＧ１７３３４、ＣＧ１３２８７、ＣＧ１３２９６、ＣＧ１０２７４、ＣＧ７３８６、ＣＧ１０１４７、ＣＧ８５９１、ＣＧ７４０４、ＣＧ７０１５、ＣＧ６６８３、ＣＧ６７６５、ＣＧ５０９３、ＣＧ５１８７、ＣＧ３８９１、ＣＧ３４４５、ＣＧ３６５４、ＣＧ７８３９、ＣＧ６２７２、ＣＧ１１７９９、ＣＧ７３６８、ＣＧ４３２８、ＣＧ１０７０４、ＣＧ１０６５４、ＣＧ１４１１７、ＣＧ１７３６１、ＣＧ１７３５９、ＣＧ７３４５、ＣＧ３９１９、ＣＧ６８５４、ＣＧ１３４５８、ＣＧ７３７２、ＣＧ１５７１５、ＣＧ９７０５、ＣＧ３２１７１、ＣＧ１８２６５、ＣＧ７２７１、ＣＧ４０７６、ＣＧ８７６５、ＣＧ１１４５６、ＣＧ１０５６５、ＣＧ７２０４、ＣＧ１１２４７、ＣＧ１４４５１、ＣＧ１４６５５、ＣＧ１４６６７、ＣＧ１２１６２、ＣＧ１０９７９、ＣＧ１０２９６、ＣＧ９７２７、ＣＧ１０２６７、ＣＧ３３３２３、ＣＧ２７０２、ＣＧ９６３８、ＣＧ７９６３、ＣＧ８１４５、ＣＧ１１７６２、ＣＧ８１５９、ＣＧ９７９３、ＣＧ９７９７、ＣＧ８３５９、ＣＧ１１９６６、ＣＧ１１９８４、ＣＧ１１０３３、ＣＧ１２９５２、ＣＧ１６７７９、ＣＧ８３０１、ＣＧ８３１９、ＣＧ１６８９９、ＣＧ８４７８、ＣＧ８４８４、ＣＧ６２５４、ＣＧ４５７０、ＣＧ４８２０、ＣＧ６６８９、ＣＧ６７９１、ＣＧ１４７１０、ＣＧ６８０８、ＣＧ１４７１１、ＣＧ６８１３、ＣＧ１８４７６、ＣＧ６９１３、ＣＧ１００４２、ＣＧ５１９６、ＣＧ５２４５、ＣＧ３３９７６、ＣＧ７５１８、ＣＧ１５８８９、ＣＧ３１４３、ＣＧ７９８７、ＣＧ１４８６０、ＣＧ６６５４、ＣＧ６２７６、ＣＧ５０８３、ＣＧ１０２７８、ＣＧ５９５２、ＣＧ１０３０９、ＣＧ３９９５、ＣＧ１７８０３、ＣＧ１７８０６、ＣＧ１７８０２、ＣＧ１７８０１、ＣＧ７３５７、ＣＧ７７８５、ＣＧ１８５９９、ＣＧ７６９１、ＣＧ１７１８６、ＣＧ４４２４、ＣＧ４８５４、ＣＧ４４１３、ＣＧ４９３６、ＣＧ４３６０、ＣＧ４２１７、ＣＧ１５６９６、ＣＧ５７３７、ＣＧ７０５６、ＣＧ７０４５、ＣＧ７０４６、ＣＧ６９９０、ＣＧ４６７７、ＣＧ３３３３６、ＣＧ４３７４、ＣＧ６１２９、ＣＧ５６６９、ＣＧ１３６１７、ＣＧ１３６２４、ＣＧ６８９２、ＣＧ１１３７５、ＣＧ１０６６９、ＣＧ４５５３、ＣＧ４７３０、ＣＧ１７１９８、ＣＧ１７１９７、ＣＧ１７１９５、ＣＧ４９５６、ＣＧ３２４７４、ＣＧ３３５０、ＣＧ５５８６、ＣＧ１６４７、ＣＧ１４５１４、ＣＧ１５５０４、ＣＧ１５５１４、ＣＧ
７９２８、ＣＧ２２２９、ＣＧ１２０７１、ＣＧ１１３１７、ＣＧ１２０５４、ＣＧ１７９２、ＣＧ２０５２、ＣＧ１１０９３、ＣＧ１１１５２、ＣＧ１１１５３、ＣＧ１７１７２、ＣＧ６８８９、ＣＧ３７４３、ＣＧ１３４７５、ＣＧ３５２６、ＣＧ１１３９８、ＣＧ１２７６７、ＣＧ１５３６７、ＣＧ３３４７３、ＣＧ１４７６７、ＣＧ３５７６、ＣＧ１２６５９、ＣＧ１３１０９、ＣＧ１２８０９、ＣＧ８８１７、ＣＧ８２５４、ＣＧ１６９１０、ＣＧ３２７４、ＣＧ１８７６４、ＣＧ３２１３９、ＣＧ３２５７７、ＣＧ２３８０、ＣＧ１５７３６、ＣＧ１３３９９、ＣＧ４４２７、ＣＧ１２２１９、ＣＧ１８６４７、ＣＧ３１７５３、ＣＧ３３７２０、ＣＧ３００１１、ＣＧ３００２０、ＣＧ３００７７、ＣＧ３０４０１、ＣＧ３０４０３、ＣＧ３０４２０、ＣＧ３０４３１、ＣＧ３０４４３、ＣＧ３１１６９、ＣＧ３１２２４、ＣＧ３１３６５、ＣＧ３１３８８、ＣＧ３１３９２、ＣＧ３１４４１、ＣＧ３１４６０、ＣＧ３１４８１、ＣＧ３１５１０、ＣＧ３１６１２、ＣＧ３１６３２、ＣＧ３１６４２、ＣＧ３１７８２、ＣＧ３１８３５、ＣＧ３１８７５、ＣＧ３１９５５、ＣＧ３２００６、ＣＧ３２０５０、ＣＧ３２１０５、ＣＧ３２１２１、ＣＧ３２２６４、ＣＧ３２２９６、ＣＧ３２５３２、ＣＧ３２７１９、ＣＧ３２７６７、ＣＧ３２７７２、ＣＧ３２７７８、ＣＧ３２８３０、ＣＧ３３６９５、ＣＧ３２９８２、ＣＧ３３１７８、ＣＧ３３２１３、ＣＧ３３２２１、ＣＧ３３５２０、ＣＧ３３５２５、ＣＧ３３５５７、ＣＧ３３９３６、ＣＧ３３９８０、ＣＧ３４０３１、ＣＧ１２６３２、ＣＧ１７４６９、ＣＧ３４１００、ＣＧ３４１４５、ＣＧ３４１４９、ＣＧ３４３４０、ＣＧ３４３４６、ＣＧ３４３６７、ＣＧ３４３７６、ＣＧ３４３９５、ＣＧ３４４０３、ＣＧ３４４０６、ＣＧ３４４０７、ＣＧ３４４１５、ＣＧ３４４１９、ＣＧ３４４２１、ＣＧ３４４２２、ＣＧ８９６１、ＣＧ９３９７、ＣＧ１００３７、ＣＧ３１２５８、ＣＧ３１６６６、ＣＧ１２１９６、ＣＧ６９３０、ＣＧ１２２３８、ＣＧ３３５４６、ＣＧ４２２３４、ＣＧ３４３６０、ＣＧ４２２６７、ＣＧ４２２７７、ＣＧ４２２８１、ＣＧ４２３１１、ＣＧ４２３３２、ＣＧ４２３４４、ＣＧ４８０７、ＣＧ７７５２、ＣＧ１２７０１、ＣＧ１７１００、ＣＧ１１９７１、ＣＧ４２５１６、ＣＧ４２５１５、ＣＧ６６６７、ＣＧ１０２８、ＣＧ３２８１、ＣＧ１２１２４、ＣＧ４２５９９、ＣＧ８５０６、ＣＧ１７８３６、ＣＧ１０７０、及びＣＧ８６７６などのキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＴＦを改変したものである。
【０１４１】
様々な実施形態では、改変タンパク質センサー及び／又はスイッチは、例えば、マウス遺伝子座１１５３８、１１５６８、１１５６９、１１６１４、１１６２２、１１６２４、１１６３２、１１６３４、１１６９４、１１６９５、１１７３３、１１７３６、１１８１９、１１８３５、１１８５９、１１８６３、１１８６４、１１８６５、１１８７８、１１９０６、１１９０８、１１９０９、１１９１０、１１９１１、１１９２０、１１９２１、１１９２２、１１９２３、１１９２４、１１９２５、１１９９１、１２０１３、１２０１４、１２０２０、１２０２１、１２０２２、１２０２３、１２０２９、１２０５１、１２０５３、１２１４２、１２１５１、１２１７３、１２１８０、１２１８９、１２１９２、１２２２４、１２２６５、１２３２６、１２３５５、１２３８７、１２３９３、１２３９４、１２３９５、１２３９９、１２４００、１２４１６、１２４１７、１２４１８、１２４５４、１２４５５、１２５６６、１２５６７、１２５７２、１２５７８、１２５７９、１２５８０、１２５８１、１２５９０、１２５９１、１２５９２、１２６０６、１２６０７、１２６０８、１２６０９、１２６１１、１２６５３、１２６７７、１２７０５、１２７５３、１２７８５、１２８４８、１２９１２、１２９１３、１２９１４、１２９１５、１２９１６、１２９５１、１３０１７、１３０１８、１３０４７、１３０４８、１３１３４、１３１６３、１３１７０、１３１７２、１３１８０、１３１９６、１３１９８、１３３４５、１３３９０、１３３９２、１３３９３、１３３９４、１３３９５、１３３９６、１３４３３、１３４３５、１３４８６、１３４９４、１３４９６、１３５５５、１３５５７、１３５５９、１３５６０、１３５９１、１３５９２、１３５９３、１３６２６、１３６５３、１３６５４、１３６５５、１３６５６、１３６６１、１３７０９、１３７１０、１３７１１、１３７１２、１３７１３、１３７１４、１３７１６、１３７９６、１３７９７、１３７９８、１３７９９、１３８１３、１３８１９、１３８６４、１３８６５、１３８７１、１３８７２、１３８７５、１３８７６、１３９８２、１３９８３、１３９８４、１４００８、１４００９、１４０１１、１４０１３、１４０２５、１４０２８、１４０２９、１４０３０、１４０５５、１４０５６、１４０８５、１４１０５、１４１０６、１４１５４、１４１５５、１４２００、１４２３３、１４２３４、１４２３５、１４２３６、１４２３７、１４２３８、１４２３９、１４２４０、１４２４１、１４２４７、１４２８１、１４２８２、１４２８３、１４２８４、１４３５９、１４３９０、１４３９１、１４４５７、１４４６０、１４４６１、１４４６２、１４４６３、１４４６４、１４４６５、１４４７２、１４４８９、１４５３１、１４５３４、１４５３６、１４５８１、１４５８２、１４６０５、１４６３２、１４６３３、１４６３４、１４６５９、１４７９７、１４８１５、１４８３６、１４８４２、１４８４３、１４８８４、１４８８５、１４８８６、１４８９６、１４９１２、１５１１０、１５１１１、１５１６１、１５１６３、１５１８１、１５１８２、１５１８３、１５１８４、１５１８５、１５１９３、１５２０５、１５２０６、１５２０７、１５２０８、１５２０９、１５２１３、１５２１４、１５２１８、１５２２０、１５２２１、１５２２３、１５２２７、１５２２８、１５２２９、１５２４２、１５２４８、１５２５１、１５２５８、１５２６０、１５２７３、１５２８４、１５２８５、１５３３１、１５３５３、１５３５４、１５３６１、１５３６４、１５３７０、１５３７１、１５３７２、１５３７３、１５３７５、１５３７６、１５３７７、１５３７８、１５３７９、１５３８４、１５３９４、１５３９５、１５３９６、１５３９７、１５３９８、１５３９９、１５４００、１５４０１、１５４０２、１５４０３、１５４０４、１５４０５、１５４０７、１５４０８、１５４１０、１５４１２、１５４１３、１５４１４、１５４１５、１５４１６、１５４１７、１５４２１、１５４２２、１５４２３、１５４２４、１５４２５、１５４２６、１５４２７、１５４２９、１５４３０、１５４３１、１５４３２、１５４３３、１５４３４、１５４３６、１５４３７、１５４３８、１５４６０、１５４９９、１５５００、１５５６３、１５５６９、１５９００、１５９０１、１５９０２、１５９０３、１５９０４、１５９５１、１５９７６、１６１５０、１６１５１、１６２０１、１６３４８、１６３６２、１６３６３、１６３６４、１６３７１、１６３７２、１６３７３、１６３９１、１６３９２、１６４７６、１６４７７、１６４７８、１６５９６、１６５９７、１６５９８、１６５９９、１６６００、１６６０１、１６６５６、１６６５８、１６７６１、１６７６４、１６８１４、１６８１５、１６８２５、１６８２６、１６８４２、１６８６９、１６８７０、１６８７１、１６８７２、１６８７３、１６８７４、１６８７５、１６８７６、１６９０９、１６９１１、１６９１７、１６９１８、１６９６９、１７０９５、１７１１９、１７１２１、１７１２２、１７１２５、１７１２６、１７１２７、１７１２８、１７１２９、１７１３０、１７１３１、１７１３２、１７１３３、１７１３４、１７１３５、１７１７２、１７１７３、１７１８７、１７１８８、１７１９１、１７１９２、１７２１５、１７２１６、１７２１７、１７２１８、１７２１９、１７２２０、１７２５７、１７２５８、１７２５９、１７２６０、１７２６１、１７２６８、１７２７４、１７２８３、１７２８５、１７２８６、１７３００、１７３０１、１７３１８、１７３４１、１７３４２、１７３４４、１７３５４、１７３５５、１７４２０、１７４２５、１７４２８、１７４８０、１７５３６、１７５３７、１７６８１、１７６８４、１７６９２、１７７０１、１７７０２、１７７０３、１７７４９、１７７６４、１７７６５、１７８５９、１７８６３、１７８６４、１７８６５、１７８６９、１７８７０、１７８７６、１７８７７、１７８７８、１７９２７、１７９２８、１７９３２、１７９３３、１７９３６、１７９３７、１７９３８、１７９７７、１７９７８、１７９７９、１７９８４、１８００２、１８０１２、１８０１３、１８０１４、１８０１８、１８０１９、１８０２０、１８０２１、１８０２２、１８０２３、１８０２４、１８０２５、１８０２７、１８０２８、１８０２９、１８０３０、１８０３２、１８０３３、１８０３４、１８０３６、１８０３７、１８０３８、１８０４４、１８０４５、１８０４６、１８０７１、１８０７２、１８０８８、１８０８９、１８０９１、１８０９２、１８０９４、１８０９５、１８０９６、１８１０９、１８１２４、１８１２８、１８１２９、１８１３１、１８１３２、１８１４０、１８１４２、１８１４３、１８１７１、１８１８１、１８１８５、１８１９３、１８１９８、１８２２７、１８２９１、１８２９２、１８３９３、１８４１２、１８４２０、１８４２３、１８４２４、１８４２６、１８４３２、１８５０３、１８５０４、１８５０５、１８５０６、１８５０７、１８５０８、１８５０９、１８５１０、１８５１１、１８５１４、１８５１５、１８５１６、１８５１９、１８５７２、１８６０６、１８６０９、１８６１２、１８６１６、１８６１７、１８６２６、１８６２７、１８６２８、１８６６７、１８６７６、１８６８５、１８７３６、１８７４０、１８７４１、１８７４２、１８７７１、１８７８９、１８８５４、１８９３３、１８９３５、１８９８３、１８９８５、１８９８６、１８９８７、１８９８８、１８９９０、１８９９１、１８９９２、１８９９３、１８９９４、１８９９５、１８９９６、１８９９７、１８９９８、１８９９９、１９００９、１９０１３、１９０１４、１９０１５、１９０１６、１９０１７、１９０１８、１９０４９、１９０５６、１９０６０、１９０８４、１９０９９、１９１２７、１９１３０、１９１８２、１９１８４、１９２０２、１９２１３、１９２３１、１９２９０、１９２９１、１９３２６、１９３３０、１９３７７、１９４０１、１９４１１、１９４３４、１９６４５、１９６５０、１９６５１、１９６６４、１９６６８、１９６８７、１９６９６、１９６９７、１９６９８、１９７０８、１９７１２、１９７２４、１９７２５、１９７２６、１９７２７、１９７６３、１９８２０、１９８２２、１９８２６、１９８８３、１９８８５、２００１６、２００１７、２００１８、２００１９、２００２０、２００２１、２００２２、２００２４、２０１２８、２０１７４、２０１８１、２０１８２、２０１８３、２０１８５、２０１８６、２０２０４、２０２１８、２０２２０、２０２３０、２０２３１、２０２３２、２０２８９、２０３７１、２０３７５、２０３８４、２０４０９、２０４２９、２０４３９、２０４６４、２０４６５、２０４６６、２０４６７、２０４７１、２０４７２、２０４７３、２０４７４、２０４７５、２０４７６、２０４８０、２０４８１、２０５８３、２０５８５、２０５８６、２０５８７、２０５８９、２０５９１、２０５９２、２０６０２、２０６１３、２０６３８、２０６６４、２０６６５、２０６６６、２０６６７、２０６６８、２０６６９、２０６７０、２０６７１、２０６７２、２０６７３、２０６７４、２０６７５、２０６７７、２０６７８、２０６７９、２０６８０、２０６８１、２０６８２、２０６８３、２０６８７、２０６８８、２０６８９、２０７２８、２０７８７、２０７８８、２０８０７、２０８１９、２０８３３、２０８４１、２０８４２、２０８４６、２０８４７、２０８４８、２０８４９、２０８５０、２０８５１、２０８５２、２０８９３、２０９０１、２０９０４、２０９２２、２０９２３、２０９２４、２０９９７、２１３３９、２１３４０、２１３４１、２１３４３、２１３４９、２１３５０、２１３７４、２１３７５、２１３８０、２１３８２、２１３８３、２１３８４、２１３８５、２１３８６、２１３８７、２１３８８、２１３８９、２１３９９、２１４００、２１４０１、２１４０５、２１４０６、２１４０７、２１４０８、２１４１０、２１４１１、２１４１２、２１４１３、２１４１４、２１４１５、２１４１６、２１４１７、２１４１８、２１４１９、２１４２０、２１４２２、２１４２３、２１４２５、２１４２６、２１４２７、２１４２８、２１４２９、２１６５２、２１６７４、２１６７６、２１６７７、２１６７８、２１６７９、２１６８５、２１７８０、２１７８１、２１７８３、２１８０４、２１８０７、２１８１５、２１８３３、２１８３４、２１８３５、２１８４３、２１８４７、２１８４８、２１８４９、２１８６９、２１８８５、２１８８６、２１８８７、２１８８８、２１９０７、２１９０８、２１９０９、２１９１７、２１９２９、２１９４５、２１９８１、２２０２５、２２０２６、２２０５１、２２０５７、２２０５９、２２０６１、２２０６２、２２０８８、２２１６０、２２２００、２２２２１、２２２５５、２２２５９、２２２６０、２２２７８、２２２８２、２２２８６、２２３２６、２２３３７、２２３８３、２２３８５、２２４３１、２２４３３、２２６０８、２２６３２、２２６３４、２２６３９、２２６４０、２２６４２、２２６４６、２２６５４、２２６５８、２２６６１、２２６６６、２２６６８、２２６７８、２２６８０、２２６８５、２２６８９、２２６９１、２２６９４、２２６９５、２２６９６、２２６９７、２２６９８、２２７００、２２７０１、２２７０２、２２７０４、２２７０９、２２７１０、２２７１２、２２７１５、２２７１７、２２７１８、２２７１９、２２７２２、２２７５０、２２７５１、２２７５４、２２７５５、２２７５６、２２７５７、２２７５８、２２７５９、２２７６１、２２７６２、２２７６４、２２７６７、２２７６８、２２７７０、２２７７１、２２７７２、２２７７３、２２７７５、２２７７６、２２７７８、２２７７９、２２７８０、２３８０８、２３８２７、２３８４９、２３８５０、２３８５６、２３８５７、２３８７１、２３８７２、２３８８５、２３８９４、２３９４２、２３９５７、２３９５８、２３９８９、２３９９４、２４０６８、２４０７４、２
４０７５、２４１１３、２４１１６、２４１３５、２４１３６、２６３５６、２６３７１、２６３７９、２６３８０、２６３８１、２６３８６、２６４０４、２６４１３、２６４１７、２６４１９、２６４２３、２６４２４、２６４２７、２６４６１、２６４６５、２６５７３、２６７５４、２６９２７、２６９３９、２７０４９、２７０５６、２７０５７、２７０５９、２７０８１、２７１４０、２７２１７、２７２２３、２７２２４、２７２７４、２７３８６、２８０１９、２９８０６、２９８０８、２９８１３、２９８６１、２９８７１、３００４６、３００５１、３０７９４、３０８４１、３０９２３、３０９２７、３０９２８、３０９４２、３０９４４、３０９４６、３０９５１、５０４９６、５０５２４、５０７２１、５０７５４、５０７７７、５０７８３、５０７９４、５０７９６、５０８１７、５０８６８、５０８８７、５０９０７、５０９１３、５０９１４、５０９１６、５０９９６、５１７９２、５１８１３、５２０２４、５２０４０、５２２３１、５２５０２、５２６０９、５２６１５、５２７０５、５２７０８、５２７１２、５２８９７、５３３１４、５３３１７、５３３５７、５３３８０、５３４１５、５３４１７、５３６２６、５３８６８、５３８６９、５３９７０、５３９７５、５４００６、５４１２３、５４１３１、５４１３２、５４１３９、５４１６９、５４３４３、５４３５２、５４３８８、５４４２２、５４４４６、５４５６２、５４６０１、５４６３３、５４６７８、５４７１１、５５９２７、５５９４２、５５９９４、５６０３０、５６０７０、５６１９６、５６１９８、５６２１８、５６２２０、５６２２２、５６２３３、５６２７５、５６３０９、５６３１２、５６３１４、５６３２１、５６３５３、５６３８０、５６３８１、５６４０４、５６４０６、５６４４９、５６４５８、５６４６９、５６４８４、５６４９０、５６５０１、５６５０３、５６５０５、５６５２２、５６５２３、５６５２５、５６６１３、５６６４２、５６７０７、５６７３６、５６７７１、５６７８４、５６７８７、５６８０５、５６８０９、５６８５６、５６８６９、５７０８０、５７２３０、５７２４６、５７３１４、５７３１６、５７３７６、５７７３７、５７７４５、５７７４８、５７７５６、５７７６５、５７７８２、５８１７２、５８１８０、５８１９８、５８２０２、５８２０６、５８２３４、５８８０５、５９００４、５９０２１、５９０２４、５９０２６、５９０３５、５９０５７、５９０５８、６０３４５、６０４０６、６０６１１、６４０５０、６４１４４、６４２９０、６４３７９、６４３８３、６４３８４、６４４０６、６４４５３、６４６８５、６５０２０、６５２４７、６５２５５、６５２５６、６５２５７、６６０５６、６６１１８、６６１３６、６６２１３、６６２３３、６６２７７、６６３５２、６６３７６、６６４２０、６６４６４、６６４９１、６６５０５、６６５５６、６６５９６、６６６２２、６６６３４、６６６４２、６６６７１、６６６９８、６６７２９、６６７９９、６６８６７、６６８８０、６６９２３、６６９３０、６６９５９、６６９７０、６６９８０、６６９８５、６７０５７、６７０６５、６７１２２、６７１５０、６７１５１、６７１５５、６７１９９、６７２３５、６７２６０、６７２７９、６７２８８、６７３６７、６７３７０、６７３７９、６７３８１、６７３８９、６７４１９、６７４３９、６７５７５、６７６５７、６７６７３、６７６９２、６７７１０、６７８１５、６７８４７、６７８７３、６７９４９、６７９８５、６７９９３、６８０４０、６８１５３、６８１９６、６８２６８、６８３４６、６８４７９、６８５５８、６８７０１、６８７０５、６８７７６、６８８３９、６８８４２、６８８５４、６８９１０、６８９１１、６８９９２、６９０２０、６９１２５、６９１６７、６９１６８、６９１８８、６９２３４、６９２４１、６９２５７、６９２６０、６９２９９、６９３１７、６９３８９、６９５３９、６９６０６、６９６５６、６９７１６、６９７９０、６９８３３、６９８９０、６９９２０、６９９４４、７００７３、７０１２２、７０１２７、７０３１５、７０３５０、７０３９２、７０４０８、７０４２８、７０４５９、７０４９７、７０５０８、７０６０１、７０６２５、７０６３７、７０６５０、７０６７３、７０７７９、７０７９６、７０７９７、７０８２３、７０８５９、７０９８１、７１０４１，７１０６３，７１１３１，７１１３７，７１１６３、７１１７６、７１２４１，７１２８０，７１３７１，７１３７５、７１４０９、７１４５８、７１４６８、７１５９２、７１５９７、７１７０２、７１７２２、７１７５２、７１７６７、７１７７７、７１７８２、７１７９３、７１８２８、７１８３４、７１８３８、７１８３９，７１９３９、７１９４９，７１９９０，７１９９１、７２０５７、７２０７４、７２１３５、７２１８０、７２１９５、７２１９９、７２２９０、７２２９３、７２３２３、７２３２５、７２３８８、７２４５９、７２４６５、７２４７５、７２５５６、７２５６７、７２６１５、７２７２０、７２７２７、７２７３９、７２８２３、７２９４９、７２９５８、７３１７８、７３１８１、７３３４０、７３３８９、７３４５１、７３４６９、７３５０３、７３６１０、７３６１４、７３８４４、７３８４５、７３９４５、７４００７、７４０６８、７４１０６、７４１２０、７４１２３、７４１４９、７４１６４、７４１６８、７４１９７、７４２８２、７４３１８、７４３２２、７４３２６、７４３３５、７４３５２、７４３７７、７４４８１、７４５３３、７４５６１、７４５７０、７４８３８、７５１９６、７５１９９、７５２１０、７５２９１、７５３０５、７５３３９、７５３８７、７５４８０、７５４８２、７５５０７、７５５７２、７５５９９、７５６０５、７５６４６、７５７２５、７５９０１、７６００７、７６０２２、７６２９４、７６３０８、７６３６５、７６３８９、７６４６７、７６５７２、７６５８０、７６７９３、７６８０３、７６８０４、７６８３４、７６８９３、７６９００、７７０５７、７７１１４、７７１１７、７７２６４、７７２８６、７７３１８、７７４８０、７７６８３、７７８８９、７７９０７、７７９１３、７８０２０、７８０８８、７８２４６、７８２５１、７８２８４、７８４５５、７８４６９、７８５４１、７８６１９、７８６５６、７８６９９、７８７０３、７８７８３、７８８２９、７８９１０、７８９１２、７８９２１、７８９２９、７９２２１、７９２３３、７９３６２、７９４０１、８０２８３、８０５０９、８０７２０、８０７３２、８０８５９、８０９０２、８１６０１、８１６３０、８１７０３、８１８４５、８１８７９、８３３８３、８３３９５、８３３９６、８３５５７、８３６０２、８３９２５、８３９９３、８４６５３、９３６７４、９３６８１、９３６８６、９３６９１、９３７５９、９３７６０、９３７６１、９３７６２、９３８３７、９３８７１、９４０４７、９４１１２、９４１８７、９４２７５、９６９７９、９７０６４、９７１６５、９８０５３、９８４０３、９９３７７、９９７３０、１０００９０、１００５６３、１００７１０、１００９７８、１０１０９５、１０１２０６、１０２１６２、１０２２０９、１０２３３４、１０３１３６、１０３８０６、１０３８８９、１０４３２８、１０４３４９、１０４３６０、１０４３８３、１０４３８４、１０４３９４、１０４８８６、１０５３７７、１０５５９４、１０５８５９、１０６７９５、１０６８９４、１０７３５１、１０７４３３、１０７４９９、１０７５０３、１０７５６８、１０７５８６、１０７７５１、１０７７６５、１０７７７１、１０７８８９、１０７９３２、１０７９５１、１０８０６０、１０８０９８、１０８１４３、１０８６５５、１０８６７２、１０８８５７、１０９１１３、１０９１１５、１０９５７５、１０９５９４、１０９６６３、１０９６７６、１０９８８９、１０９９１０、１０９９５８、１０９９７２、１０９９７３、１０９９９５、１１００５２、１１００６１、１１００６８、１１０１０９、１１０１４７、１１０５０６、１１０５２１、１１０６１６、１１０６４１、１１０６４７、１１０６４８、１１０７８４、１１０７９６、１１０８０５、１１０９１３、１１２０７７、１１４１４２、１１４５６５、１１４６０６、１１４６４２、１１４７７４、１１４８８９、１１６８１０、１１６８４８、１１６８７０、１１６８７１、１１６９１２、１１７１６８、１１７１９８、１１７５９０、１１８４４５、１４０４７７、１４０４９０、１４０５００、１４０５７７、１４０７４３、１７０５７４、１７０６４４、１７０７２９、１７０７４０、１７０７６７、１７０７８７、１７０７９１、１７０８２６、１７０９３８、１９２１９５、１９２２３１、１９２２８５、１９２６５１、１９２６５７、１９３７９６、１９５３３３、２０８０７６、２０８２５８、２０８２６６、２０８２９２、２０８４３９、２０８６７７、２０８７１５、２０９０１１、２０９３５７、２０９３６１、２０９４１６、２０９４４６、２０９４４８、２０９７０７、２１０１３５、２１０１６２、２１１３７８、２１２１６８、２１２２７６、２１２３９１、２１２７１２、２１３０１０、２１３９９０、２１４１０５、２１４１６２、２１４３８４、２１４６６９、２１４８９９、２１５０３１、２１６１５１、２１６１５４、２１６２８５、２１６４５６、２１６５５８、２１６５７８、２１７０３１、２１７０８２、２１７１２７、２１７１６６、２１７５５８、２１８０３０、２１８４４０、２１８４９０、２１８６２４、２１８７７２、２１８９８９、２１９１５０、２２３２２７、２２３６９０、２２３７０１、２２３９２２、２２４４１９、２２４５８５、２２４６５６、２２４６９４、２２４８２９、２２４９０２、２２４９０３、２２５８７６、２２５８９５、２２５９９８、２２６０４９、２２６１８２、２２６４４２、２２６６４１、２２６７４７、２２６８９６、２２７０９９、２２７６４４、２２７６５６、２２７９４０、２２８１３６、２２８５９８、２２８７３１、２２８７７５、２２８７９０、２２８８２９、２２８８３９、２２８８５２、２２８８６９、２２８８７６、２２８８８０、２２８９８０、２２９００４、２２９５３４、２２９６６３、２２９９０６、２３００７３、２３０１６２、２３０５８７、２３０６７４、２３０７００、２３０７５３、２３０９０８、２３０９３６、２３０９９１、２３１０４４、２３１０５１、２３１３２９、２３１３８６、２３１９８６、２３１９９１、２３２２３２、２３２３３７、２３２８０７、２３２８５３、２３２８５４、２３２８７８、２３２９０６、２３３０５６、２３３４１０、２３３４９０、２３３８６３、２３３８８７、２３３８９０、２３３９０８、２３３９８７、２３４７２５、２３４９５９、２３５０２８、２３５０４１、２３５０５０、２３５３２０、２３５４４２、２３５５８２、２３５６２３、２３５６８２、２３６１９３、２３７０５２、２３７３３６、２３７４０９、２３７６１５、２３７７５８、２３７９６０、２３８２４７、２３９０９９、２３９５４６、２３９６５２、２４００６４、２４０１２０、２４０２６３、２４０４２７、２４０４４２、２４０４７６、２４０５９０、２４０６９０、２４１０６６、２４１４４７、２４１５２０、２４２５２３、２４２６２０、２４２７０５、２４３１８７、２４３８３３、２４３９０６、２４３９３１、２４３９６３、２４３９８３、２４４３４９、２４４７１３、２４４８１３、２４４９５４、２４５５７２、２４５５８３、２４５５９６、２４５６８８、２４５８４１、２４６０８６、２４６１９６、２４６１９８、２４６７９１、２５２８２９、２６０２９８、２６８２８１、２６８３０１、２６８３９６、２６８４４８、２６８５６４、２６８７４１、２６８９０３、２６８９３２、２６９２５２、２６９７１３、２６９８７０、２７００７６、２７０６２７、２７１２７８、２７１３０５、２７２３４７、２７２３５９、２７２３８２、２７７３５３、３１９１９６、３１９２０７、３１９５３５、３１９５９４、３１９５９９、３
１９６０１、３１９６１５、３１９６９５、３１９７８５、３２００６７、３２０３７６、３２０４２９、３２０５８６、３２０５９５、３２０７９０、３２０７９９、３２０８７５、３２０９９５、３２８５７２、３３０３０１、３３０３６１、３３０５０２、３３２９３７、３３８３５３、３４７６９１、３５３１８７、３５３２０８、３７８４３５、３８１３１９、３５６６２６、及び３８６６５５などのマウスＴＦを改変したものである。
【０１４２】
例示的ａＴＦは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｒａｍｏｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｊｕｎｅ  ２００５，ｐ．３２６−３５６及びＴｒｏｐｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．２００４  Ｓｅｐ；６８（３）：４７４−５００に見出される。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、改変が生じることになるタンパク質センサーのアミノ酸配列は、様々な実施形態において、ＢＬＡＳＴＰ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、ＤＥＬＴＡ−ＢＬＡＳＴ、ＨＭＭＥＲ、又はＪａｃｋＨＭＭＥＲのうちの１又は複数を使用して配列相同性によって選択されてもよく、配列相同性検索によって選択された対応するヌクレオチド配列であってもよい。
【０１４４】
タンパク質センサー候補であり得るタンパク質配列を同定する方法は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１６／００６３１７７号に見出される。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、野生型アロステリックタンパク質センサーの結合活性を変更する工学的アプローチ、例えば、アロステリックタンパク質の同族リガンド（すなわち野生型アロステリックタンパク質センサーに結合するリガンド）を犠牲にして、野生型アロステリックタンパク質センサーを標的分子の結合に適するように改変することには、変異誘発が含まれる。いくつかの実施形態では、変異誘発は、例えば、置換、挿入、欠失、及び切断から独立して選択される、野生型アロステリックタンパク質センサーに１又は複数のアミノ酸変異を導入することを含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、アミノ酸変異はアミノ酸置換であり、保存的置換及び／又は非保存的置換を含み得る。
【０１４７】
「保存的置換」は、例えば、関与するアミノ酸残基の極性、電荷、大きさ、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の性質の類似性に基づいて行うことができる。２０種類の天然アミノ酸は、（１）疎水性：Ｍｅｔ，Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅの６つの標準アミノ酸群に分類できる。
【０１４８】
本明細書中で使用される場合、「保存的置換」は、上記に示される６つの標準的なアミノ酸群の同じ群内に列挙される別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。例えば、ＧｌｕによるＡｓｐの交換は、そのように修飾されたポリペプチドにおいて１つの負電荷を保持している。さらに、グリシンとプロリンは、αヘリックスを破壊するそれらの能力に基づいて、互いに置換されてもよい。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、上記に示される６つの標準アミノ酸群（１）〜（６）の異なる群に列挙される別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、置換には非古典的なアミノ酸（例えば、セレノシステイン、ピロールリシン、Ｎ−ホルミルメチオニン  β−アラニン、ＧＡＢＡ及びδ−アミノレブリン酸、４−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｙ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、ザルコシン（sarcosme）、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナーアミノ酸（β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸など）、及び一般的なアミノ酸類似体）も含まれる場合がある。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、既存のアロステリックタンパク質（例えば、ａＴＦ）の設計を使用して改変される。いくつかの実施形態では、設計にはインシリコ設計が含まれる。例示的で非限定的な設計原理は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１６／００６３１７７号に見出される。
【０１５２】
例えば、いくつかの実施形態において、分子モデリングは、アロステリックタンパク質が１又は複数の標的分子に結合することを可能にし得るアロステリックタンパク質における変異を予測するために使用される。様々な実施形態では、通常はＸ線結晶学、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、散乱、又は回折技術を含むがこれらに限定されない実験的方法によって得られる実験的に導出された三次元タンパク質構造を参照して、アロステリックタンパク質が１又は複数の標的分子に結合できるようにし得るアロステリックタンパク質中の変異がモデル化及び／又は予測される。様々な実施形態では、モデリングを支援するためにＲＯＳＥＴＴＡソフトウェアスイートが使用される（その内容全体が参照により本明細書に援用されるＫａｕｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１０  Ａｐｒ  １３；４９（１４）：２９８７−９８を参照）。あるいは、または組み合わせて、ＲＯＢＥＴＴＡ、ＴＡＳＳＥＲ、ｌ−ＴＡＳＳＥＲ、ＨＨｐｒｅｄ、ＨＨｓｅａｒｃｈ若しくはＭＯＤＥＬＬＥＲ、又はＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬなどの相同性モデリングアルゴリズムを使用してもよい。いくつかの実施形態では、（制限するものではないが）アロステリックタンパク質が実験的に導出された三次元タンパク質構造を欠いているものなど、相同性モデリングアルゴリズムを使用して、配列相同性モデルを構築することができる。様々な実施形態では、１又は複数の配列ホモログ又は構造ホモログは、三次元タンパク質構造のアミノ酸配列に対して、９０％未満のアミノ酸配列同一性、８５％未満のアミノ酸配列同一性、８０％未満のアミノ酸配列同一性、７５％未満のアミノ酸配列同一性、７０％未満のアミノ酸配列同一性、６５％未満のアミノ酸配列同一性、６０％未満のアミノ酸配列同一性、５５％未満のアミノ酸配列同一性、５０％未満のアミノ酸配列同一性、４５％未満のアミノ酸配列同一性、４０％未満のアミノ酸配列同一性、３５％未満のアミノ酸配列同一性、３０％未満のアミノ酸配列同一性、２５％未満のアミノ酸配列同一性、又はそれ以下のアミノ酸配列同一性を有する。例示的な相同性モデリング方法及び原理は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１６／００６３１７７号（例えば、段落［００８５］〜［００９３］）に見出される。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、野生型アロステリックタンパク質の構造は、（例えば、１又は複数の標的分子をアロステリックタンパク質の構造にドッキングすることにより）アロステリックタンパク質が１又は複数の標的分子に結合できるようにし得る変化について評価される。例示的なドッキング方法及び原理は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１６／００６３１７７号（例えば、段落［００９５］〜［０１０１］）に見出される。
【０１５４】
様々な実施形態において、野生型アロステリックタンパク質に対する可能性のある変異のライブラリーが作製され、ポジティブ選択又はネガティブ選択が、所望の変異体をスクリーニングするために使用される。
【０１５５】
様々な実施形態において、改変は、（その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第７，５７４，３０６号及び米国特許第８，３４０，９５１号に開示されているような）コンピュータータンパク質設計、指向性進化法、理論的突然変異誘発、又はそれらの任意の適切な組み合わせの技術を使用し得る。
【０１５６】
他の実施形態では、遺伝子シャッフリング、相同組換え、ドメインスワッピング、ディープ変異スキャニング（deep mutation scanning）、及び／又はランダム突然変異誘発などの変異技術を使用することができる。
【０１５７】
例示的なタンパク質センサー及び同族リガンドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１５／１２７２４２号（例えば、７頁の表）に見出される。
【０１５８】
様々な実施形態では、タンパク質センサーは、既存のアロステリックタンパク質（例えば、ａＴＦ）の設計を使用して改変される。様々な実施形態では、設計にはインシリコ設計が含まれる。例示的な設計原理は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１６／００６３１７７号に見出される。
【０１５９】
例えば、様々な実施形態において、分子モデリングは、アロステリックタンパク質が１又は複数の標的分子に結合することを可能にし得るアロステリックタンパク質における変異を予測するために使用される。様々な実施形態では、通常はＸ線結晶学、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、散乱、又は回折技術を含むがこれらに限定されない実験的方法によって得られる実験的に導出された三次元タンパク質構造を参照して、アロステリックタンパク質が１又は複数の標的分子に結合できるようにし得るアロステリックタンパク質中の変異がモデル化及び／又は予測される。様々な実施形態では、モデリングを支援するためにＲＯＳＥＴＴＡソフトウェアスイートが使用される（その内容全体が参照により本明細書に援用されるＫａｕｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１０  Ａｐｒ  １３；４９（１４）：２９８７−９８を参照）。
【０１６０】
あるいは、または組み合わせて、ＲＯＢＥＴＴＡ、ＴＡＳＳＥＲ、ｌ−ＴＡＳＳＥＲ、ＨＨｐｒｅｄ、ＨＨｓｅａｒｃｈ若しくはＭＯＤＥＬＬＥＲ、又はＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬなどの相同性モデリングアルゴリズムを使用してもよい。いくつかの実施形態では、（制限するものではないが）アロステリックタンパク質が実験的に導出された三次元タンパク質構造を欠いているものなど、相同性モデリングアルゴリズムを使用して、配列相同性モデルを構築することができる。様々な実施形態では、１又は複数の配列ホモログ又は構造ホモログは、三次元タンパク質構造のアミノ酸配列に対して、９０％未満のアミノ酸配列同一性、８５％未満のアミノ酸配列同一性、８０％未満のアミノ酸配列同一性、７５％未満のアミノ酸配列同一性、７０％未満のアミノ酸配列同一性、６５％未満のアミノ酸配列同一性、６０％未満のアミノ酸配列同一性、５５％未満のアミノ酸配列同一性、５０％未満のアミノ酸配列同一性、４５％未満のアミノ酸配列同一性、４０％未満のアミノ酸配列同一性、３５％未満のアミノ酸配列同一性、３０％未満のアミノ酸配列同一性、２５％未満のアミノ酸配列同一性、又はそれ以下のアミノ酸配列同一性を有する。例示的で非限定的なモデリング方法及び原理は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１６／００６３１７７号（例えば、段落［００８５］〜［００９３］）に見出される。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、アロステリックタンパク質の構造は、アロステリックタンパク質が１又は複数の標的分子に結合できるようにし得る変化について評価される（例えば、１又は複数の標的分子をアロステリックタンパク質の構造にドッキングすることにより）。例示的なドッキング方法及び原理は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１６／００６３１７７号（例えば、段落［００９５］〜［０１０１］）に見出される。
【０１６２】
様々な実施形態において、アロステリックタンパク質に対する可能性のある変異のライブラリーが作製され、ポジティブ選択又はネガティブ選択が、所望の変異体をスクリーニングするために使用される。
【０１６３】
様々な実施形態において、改変は、（その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第７，５７４，３０６号及び米国特許第８，３４０，９５１号に開示されているような）コンピュータータンパク質設計、指向性進化法、理論的突然変異誘発、又はそれらの任意の適切な組み合わせの技術を使用し得る。
【０１６４】
他の実施形態では、遺伝子シャッフリング、相同組換え、ドメインスワッピング、ディープ変異スキャニング（deep mutation scanning）、及び／又はランダム突然変異誘発などの変異技術を使用することができる。
【０１６５】
限定するものではないが例として、表１は、本発明の様々な実施形態に従って修飾し得る例示的なタンパク質センサーを提示している。例えば、様々な実施形態では、ａＴＦ（「外枠」）及び／又はネイティブリガンドを選択し、提示された代表的な構造（ＰＤＢ）を参照して、本明細書の開示に従って、標的分子又は標的分子群に対する改変タンパク質センサーを設計することができる（「標的分子の特性」の列を参照）。
【０１６６】
【表１−１】
2021514202.tif 000003
【表１−２】
2021514202.tif 000004
【表１−３】
2021514202.tif 000005
【表１−４】
2021514202.tif 000006
【０１６７】
様々な実施形態では、変異又はインシリコ設計の標的となるアミノ酸は、ドッキングを介して又はＸ線結晶学などの実験方法によって結合ポケットにモデル化されたリガンドの約３Å、約５Å、約Å７、約１０Å、又は約１２Å（例えば、約３Å〜約１２Å、約５Å〜約１２Å、約７Å〜約１２Å、約１０Å〜約１２Å、約３Å〜約５Å、約３Å〜約７Å、又は約３Å〜約１０Å）の範囲内のアミノ酸である。
【０１６８】
１又は複数の標的分子に結合可能なタンパク質センサー及び／又はスイッチであってもよい変異アロステリックタンパク質は、標準的な結合アッセイ（例えば、蛍光アッセイ、放射性アッセイなど）を使用してスクリーニング可能である。
【０１６９】
様々な実施形態では、改変タンパク質センサーは、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＴａｙｌｏｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３（２）：１７７に記載の通り改変される。
【０１７０】
改変産生株／細胞
前記改変センサー株（又は細胞）は、少なくとも１種類の目的の標的産物（又は分子）を産生するように改変された株又は細胞（例えば、細菌、酵母、藻類、植物、昆虫、又は哺乳動物（ヒト又は非ヒト）の株又は細胞）を指し、前記目的の標的産物（又は分子）は上述のセンサー系（例えば、改変センサープラスミド又は株による検出）で検出可能である。
【０１７１】
例として、いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーが改変され得る目的の標的産物（又は分子）は、その内容全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１５／０１７８６６号（例えば、段落［００１０７］〜［００１１２］）に記載されている化合物のうちの１種類又は複数種類を含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、本技術の標的分子は、細胞に対して有毒であり、及び／又は、細胞環境において検出可能な方法で改変タンパク質センサーと容易に結合又は相互作用することができない。いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、同族リガンドの同一性及び同族リガンドが有し得る標的分子との任意の共通性に基づいて選択される。例えば、いくつかの実施形態では、同族リガンドと標的分子の間の共有化学基は、同族リガンドに結合する改変タンパク質センサーに配向させて、標的分子に結合できるようにタンパク質センサーの改変をもたらし得る。
【０１７３】
限定するものではないが例として、表１（上記）は、例示的な標的分子又は標的分子群を提示している（「標的分子の特性」の列を参照）。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、標的分子（又は産物）はナリンゲニンである。
【０１７５】
レポーター
いくつかの実施形態では、本技術における有用なレポーターとしては、これらに限定されないが、マイクロタイタープレート蛍光光度計、蛍光顕微鏡、目視検査、又は蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を使用して吸光度又は蛍光を測定することによって発現を測定され得る緑色蛍光タンパク質など、固有の分光的特徴を有するタンパク質が挙げられるが。いくつかの実施形態では、レポーターとしては、これらに限定されないが、吸着、磁気及びインピーダンスなどの物理的特性、酸化還元状態の変化、並びにホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、又はガス生成酵素などの分析可能な酵素活性に基づく分光的特徴も挙げられる。あるいは、いくつかの実施形態では、レポーター及び転写因子ライブラリーメンバーをコードする直鎖状の一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡを、限定されないが、ポリメラーゼによる増幅の場合のレポーターとして使用してもよい。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、本技術はレポーター遺伝子系を含み、これには固有の分光的特徴及び／又はアッセイ可能な酵素活性を有するタンパク質が含まれる。例示的なレポーター系又は検出方法としては、これらに限定されないが、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ウミシイタケ（Renilla Reniformis）緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰｍｕｔ２、ＧＦＰｕｖ４、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、強化シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、強化青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、色素タンパク質、シトリン、イソギンチャクモドキ（Discosoma）由来の赤色蛍光タンパク質（ｄｓＲＥＤ）、赤外蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、ウンベリフェロン、ローダミン、フルオレセイン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、及びフィコエリトリンなど、化学発光または蛍光タンパク質を使用するものが挙げられる。検出可能な生物発光タンパク質の例としては、これらに限定されないが、ルシフェラーゼ（例えば、細菌、ホタル、及びカブトムシなど）、ルシフェリン、及びエクオリンなどが挙げられる。検出可能な酵素系の例としては、これらに限定されないが、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、コリンエステラーゼ、及びプロテアーゼなどが挙げられる。特定の他の実施形態では、レポーター系の検出方法は酵素を含む。特定の他の実施形態では、検出可能なマーカーは、ｑＰＣＲにより遺伝的変異について迅速にアッセイすることができる非必須遺伝子である。特定の他の実施形態では、検出可能なマーカーは、逆選択によって機能性について容易に評価することができる薬物耐性マーカーである。いくつかの実施形態では、検出可能なマーカーは、例えば、栄養要求性株における必要な代謝産物の生産、単一炭素源で増殖する能力、又は当技術分野で知られている他の増殖選択戦略などの栄養マーカーである。
【０１７７】
特定の実施形態では、レポーターは、共に存在する場合に機能的レポーターを産生する２以上の成分から構成される。例としては、スプリットＧＦＰ、並びにルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、及びジヒドロ葉酸還元酵素などの酵素が挙げられる。スプリットレポーターの１又は複数の成分を外部から導入されてもよく、より少ない成分の細胞産生の検出が可能になる。スプリットレポーターは、別のタンパク質に融合された補完的なスプリットレポーターを検出するために使用してもよく、細胞内、細胞外、又はその両方で検出可能となる。例えば、産生細胞がその補体と封入されるまで機能的なレポーターを産生する能力を持たないように、スプリットＧＦＰ融合タンパク質は、補完するレポーター成分と封入された細胞によって排出されてもよい。そのようなスプリット系の１又は複数の成分は、独立して産生されてもよく、アッセイされる細胞に検出試薬として追加されてもよい。
【０１７８】
例えば、β−グルコシダーゼ及びＡｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼは、対応する蛍光発生基質であるフルオレセインジ−（−Ｄ−グルコピラノシド）及びフルオレセイン二リン酸を含むレポーター系として使用されてもよい。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、ａＴＦ自体の結合事象は、無細胞環境での光学的方法又は非光学的方法によるａＴＦ状態の物理的な読み出しを提示するために利用される。例えば、非限定的な例では、ａＴＦは蛍光タンパク質に連結され、ＤＮＡ結合部位はクエンチャー分子に連結される。蛍光読み取りは、ａＴＦがＤＮＡ結合部位自体から放出された場合にのみ可能である。この方法では、ａＴＦ結合事象を直接読み取ることができる。この戦略はフルオロフォア−クエンチャーの組み合わせに限定されず、スプリットタンパク質などの他の読み出しを使用することも可能である。さらに、タンパク質ディスプレイ法の場合、結合事象を使用して、機能性タンパク質を非機能性タンパク質から物理的に分離してもよい。
【０１８０】
宿主株／細胞
様々な実施形態において、本技術の宿主細胞（すなわち、センサー株／細胞及び産生株／細胞）としては、細菌、酵母、藻類、植物、昆虫、哺乳動物（ヒトまたは非ヒト）の細胞などの真核細胞及び／又は原核細胞、並びに不死細胞株が挙げられる。
【０１８１】
例として、いくつかの実施形態では、宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・カステリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｓｔｅｌｌｉｉ）、クリベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クラミドモナス・レナリディティアナ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、又はカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）であってもよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞であり、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌種、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属菌種、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｎａｓ）属菌種、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属菌種、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属菌種、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属菌種、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌種、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属菌種、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌種、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属菌種、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属菌種、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌種、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属菌種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌種、ペドバクター（Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ）属菌種、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属菌種、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属菌種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属菌種、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属菌種、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属菌種、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属菌種、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌種、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属菌種、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属菌種、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属菌種、アシディチオバチルス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌種、ミクロルナタス（Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ）属菌種、ゲオバクター（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）属菌種、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌種、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属菌種、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌種、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属菌種、サッカロポリスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）属菌種、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属菌種、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属菌種、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌種、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属菌種、サッカロポリスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）属菌種、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ���属菌種、及びパンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）属菌種などである。前記細菌細胞は、大腸菌などのグラム陰性細胞、又はバチルス種などのグラム陽性細胞であってもよい。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、細胞は酵母細胞などの真菌細胞であり、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌種、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌種、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属菌種、パフィア（Ｐａｆｆｉａ）属菌種、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属菌種、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属菌種、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌種、ブレタノマイセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属菌種、パチソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属菌種、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属菌種、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属菌種、及び工業用倍数体酵母株である。好ましくは、前記酵母株は、サッカロミセス・セレビシエ株又はヤロウイア属菌種株である。真菌の他の例には、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌種、ペニシリウム（Ｐｅｎｎｉｃｉｌｉｕｍ）属菌種、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属菌種、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属菌種、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属菌種、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属菌種、ソーダリア（Ｓｏｒｄａｒｉａ）属菌種、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）属菌種、アロミセス（Ａｌｌｏｍｙｃｅｓ）属菌種、ウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属菌種、ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）属菌種、及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌種が含まれる。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、細胞は藻類細胞または植物細胞（例えば、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）、コナミドリムシ（Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、アルソスピラ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ）、Ｐ．ｔｒｉｃｏｍｕｔｕｍ、タバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）、Ｔ．ｓｕｅｃｉｃａ、Ｐ．ｃａｒｔｅｒａｅ、Ｐ．ｔｒｉｃｏｍｕｔｕｍ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓなどのクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属菌種）である。
【０１８４】
標的細胞は、トランスジェニック細胞株及び組換え細胞株を含んでいてもよい。さらに、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの異種細胞株も使用できる。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）属菌種細胞である。放線菌は、例えば、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、アクチノマジュラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、及び関連する属を含む、分岐フィラメントを形成する異種起源の細菌の集合体である。いくつかの実施形態では、アクチノマイセス種は、ストレプトマイセス種を含む。いくつかの実施形態では、放線菌属菌種細胞は、ストレプトマイセス種細胞（例えば、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）である。ストレプトマイセス属菌種には、非限定的な例として、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ、Ｓ．ｎｏｄｏｓｕｓ、Ｓ．ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ、Ｓ．ｌｉｎｃｏｌｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．ａｌｂｏｎｉｇｅｒ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓ．ｒｉｍｏｓｕｓ、Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、及びＳ．ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｅｏｇｅｎｅｓが含まれる。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、宿主細胞はバチルス属菌種細胞である。いくつかの実施形態では、バチルス属菌種細胞は、Ｂ．ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ａｌｖｅｉ、Ｂ．ａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ａｑｕａｅｍａｎｓ、Ｂ．ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ、Ｂ．ｂｏｒｏｎｉｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂ．ｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｂ．ｆｌａｖｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ｂ．ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｇａｌｌｉｃｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ、Ｂ．ｉｎｆｅｍｕｓ、Ｂ．ｌａｒｖａｅ、Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃｕｓ、Ｂ．ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓｕｓ、Ｂ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂ．ｎａｔｔｏ、Ｂ．ｐａｎｔｏｔｈｅｎｔｉｃｕｓ、Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｓｃｈｌｅｇｅｌｉｉ、Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、Ｂ．ｓｐｏｒｏｔｈｅｒｍｏｄｕｒａｎｓ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｖｕｌｇａｔｉｓ、及びＢ．ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓから選択される。
【０１８７】
改変センサー又は産生株／細胞用の液滴
分散された液滴の界面面積が大きいため、乳化剤を用いない乳剤は熱力学的に不安定な系である。乳剤液滴を安定化させるために、低分子量の界面活性剤又は界面活性ポリマーを通常、配合物に含めて、相間の界面張力を低下させる必要がある。液滴を安定させる１つの方法は、界面活性剤の代わりに固体粒子（例えば、ナノ粒子）を使用することである。固体粒子は、２種類の非混和性流体間又は非混和性液体間の界面に蓄積し、合体に対する強固なバリアを構築する。固体粒子は、合体を低減又は防止し、これにより、乳剤の安定性が向上する。卵殻と同様に、固体粒子の密な層は固いクラストを形成するため、乳剤の液滴は合体に抵抗する。
【０１８８】
ピカリング乳剤は、乳化剤の代わりに固体粒子によって安定化された乳剤である。ピカリング乳剤は、優れた安定性や低毒性など、界面活性剤によって安定化される従来の乳剤にはない多くの固有の機能を備えている。
【０１８９】
本明細書に開示されるように、本開示の方法は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相に囲まれた液滴を含む。本技術のいくつかの実施形態では、乳剤はピカリング乳剤である。次に、液滴は標的分子のレベルについてアッセイ可能であり、ここで、改変タンパク質センサーは、改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供する。本開示の方法は、所望のレベルの標的分子を産生する単離された改変産生細胞を有する液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を封入する液滴を破壊して、改変産生細胞の集団を形成することを含み、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団である。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、改変産生細胞のプールは、改変センサープラスミドで形質転換される。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、前記方法は、改変産生細胞を含む各液滴を、改変センサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生することを含む。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、液滴を囲む非混和性の連続相は、フッ素化をベースとした油又は乳剤である。いくつかの実施形態では、液滴を囲む非混和性の連続相は、有機油である。いくつかの実施形態では、フッ素化をベースとした油又は乳剤が、フッ素化油、フッ素化ポリマー、フルオロカーボン中水型乳剤、パーフルオロカーボン中水型乳剤、又はそれらの組み合わせである。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、液滴を囲む非混和性の連続相は、有機油である。
【０１９４】
ピカリング乳剤はいくつかの方法で安定化され得る。いくつかの実施形態では、ピカリング乳剤は、油又は有機油の鎖長を減少させることにより安定化される。油又は有機油の鎖長を短くすると、油又は有機油の溶解度が増加し、安定したピカリング乳剤の調製が可能になる。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、フッ素化油又は乳剤が、所望により粒子によって安定化される。いくつかの実施形態では、粒子は部分的にフッ素化されたナノ粒子である。いくつかの実施形態では、粒子は部分的に疎水性のナノ粒子（例えば、シリカをベースとした疎水性ナノ粒子）である。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、乳剤は、炭化水素（例えば、ヘキサデカン、ドデカン、デカン）によって安定化されたピカリング乳剤である。いくつかの実施形態では、乳剤は、鉱油、トウモロコシ油、又はヒマシ油などの油若しくは有機油によって安定化されたピカリング乳剤である。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、前剤は、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、ＳＰＡＮ、Ａｒｌａｃｅｌ、ＡＢＩＬなどの非イオン性乳化剤、界面活性剤、又はこれらの組み合わせと組み合わせた油又は有機油によって安定化される。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、乳剤は、タンパク質安定剤（例えば、ＢＳＡ、β−ラクトグロブリン、ＢＣＮ）と組み合わせた油又は有機油によって安定化される。いくつかの実施形態では、乳剤は、非イオン性界面活性剤又は糖（例えば、グルコース、フルクトース、ラクトース）と組み合わせた油又は有機油によって安定化される。いくつかの実施形態では、タンパク質安定剤、非イオン性界面活性剤、又は糖は、第２相（例えば、水相、有機相、又は液滴相）から第１相（例えば、油性相）への有機物の拡散を低減する。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、乳剤は、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、ＳＰＡＮ、Ａｒｌａｃｅｌ、ＡＢＩＬなどの非イオン性乳化剤、界面活性剤、又はこれらの組み合わせによって安定化される。いくつかの実施形態では、前乳剤は、タンパク質安定剤（例えば、ＢＳＡ、β−ラクトグロブリン、ＢＣＮ）によって安定化される。いくつかの実施形態では、乳剤は、非イオン性界面活性剤又は糖（例えば、グルコース、フルクトース、ラクトース）と組み合わせた油又は有機油によって安定化される。いくつかの実施形態では、ピカリング乳剤は、２つの非混和性相間の界面に蓄積する。いくつかの実施形態では、第１相は連続相であり、第２相は分散相である。いくつかの実施形態では、本開示の乳剤は、フルオロカーボン相などの油をベースとした第１相、及び第２相（例えば、有機相、水相、液滴相、炭化水素相、又は気相）を含む。例えば、第１相は、少なくとも１種類のフッ素化溶媒を有するフルオロカーボン相であってもよく、第２相は、有機相、水相、液滴相、炭化水素相、又は気相など、フッ素化溶媒と非混和性であってもよい。いくつかの実施形態では、第２相は水相である。いくつかの実施形態では、第２相は炭化水素相である。
【０２００】
いくつかの実施形態では、液滴はマイクロ流体制御下にある。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、本開示は、液体に囲まれた流体の液滴を生成するための組成物及び方法に関する。流体と液体は、多くの場合、本質的に非混和性であり得、例えば、目的の時間スケール（例えば、特定の系又はデバイスを通じて流体液滴が輸送されるのにかかる時間）では非混和性であり得る。流体はまた、他の種、例えば、細胞、粒子などの特定の分子種を含んでいてもよい。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、液滴は、第２の流体によって完全に囲まれた第１の流体の隔離された部分である。液滴は必ずしも球形である必要はないが、例えば、外部環境に応じて、他の形状をとり得ることに留意されたい。いくつかの実施形態では、液滴は、液滴が位置する流体の流れに垂直なチャネルの最大寸法に実質的に等しい最小断面寸法を有する。いくつかの実施形態では、液滴という用語は、「マイクロカプセル」という用語と互換的に使用され得る。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、本開示の液滴は、乳剤（例えば、ピカリング乳剤）、すなわち、一方の相が他方の相に分散している２つの非混和性の流体相又は液相の系から、例えば、微視的又はコロイド状のサイズの液滴として、形成される。
【０２０４】
乳剤は、非混和性液体の任意の適切な組み合わせから形成され得る。例えば、本明細書に開示される乳剤は、水性液体、及び油などの疎水性の非混和性液体を有し得る。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、本明細書は、本開示の乳剤から形成され、（ａ）連続相、及び（ｂ）連続相中に分散された少なくとも１つの液滴を含む液滴群を開示する。いくつかの実施形態では、乳剤は、（ａ）連続的な親フッ素性相、及び（ｂ）前記連続的な親フッ素性相に分散された少なくとも１つの分散された水相又は親油性相を含む。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、分散相（例えば、水相、有機相、炭化水素相、又は気相）は、少なくとも１つの改変産生細胞を含む。いくつかの実施形態では、改変産生細胞は、フルオラス相と水相、有機相、炭化水素相、又は気相との界面で、両親媒性粒子（例えば、シリカをベースとしたナノ粒子）に固定されている。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の両親媒性粒子（例えば、シリカをベースとしたナノ粒子）及びそれらの組み合わせにより、液滴内部で実施可能なプロセスを妨げることなく、液滴の合体に対して十分な安定化がもたらされる。
【０２０８】
乳剤は、１又は複数の界面活性化剤（界面活性剤）の添加により安定化され得る。これらの界面活性剤は乳化剤と呼ばれ、例えば、水／油界面で作用して、相同士の分離を防止する（又は少なくとも遅延させる）。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、乳剤は、フルオロカーボン（又はパーフルオロカーボン）連続相で構成される。例えば、界面活性剤としてＦ−アルキルジモルホリノホスフェートを使用して、安定したパーフルオロオクチル中水乳剤及びパーフルオロオクチル中水乳剤を形成することができる。非フッ素化化合物は、フルオロカーボン及びパーフルオロカーボンに本質的に不溶であり、小さな薬剤のような分子（通常＜５００Ｄａ及びＬｏｇＰ＜５）は、マイクロカプセル（例えば、液滴）間の交換がほとんど又は全くなく、フルオロカーボン中水乳剤及びパーフルオロカーボン中水乳剤の水性マイクロカプセルに非常に効果的に区画化されている。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、乳剤の作製には、通常、相を一つにさせるために機械的エネルギーを適用する必要がある。このためには、攪拌機（磁気攪拌棒、プロペラタービン攪拌機、パドル装置、及び泡立て器など）、ホモジナイザー（ローターステーターホモジナイザー、高圧バルブホモジナイザー、及びジェットホモジナイザーを含む）、コロイドミル、超音波「膜乳化」装置、及びマイクロ流体デバイスを含む種々の機械装置を利用する様々な方法がある。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、複雑な生化学的プロセス、特に遺伝子の転写及び翻訳は、本明細書に開示されているように、油中水型乳剤中に形成される水相マイクロカプセル中でも有効である。これは、遺伝子の選択について油中水型乳剤の区画化を可能にし、前記遺伝子は乳剤マイクロカプセル中で転写及び翻訳され、それらがコードするタンパク質の結合又は触媒活性によって選択される。乳剤中に形成された水性マイクロカプセルは一般に安定しており、マイクロカプセル間の核酸、タンパク質、又は酵素触媒反応産物の交換は、あるとしてもほとんど生じない。本開示のいくつかの実施形態では、本技術は、何千リットルもの工業規模までの容量の乳剤を作製するために存在する。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、「マイクロカプセル」は、異なる流体中のある流体の液滴であってもよく、閉じ込められた成分は、前記液滴に溶解するが、キャリア流体には溶解しない。いくつかの実施形態では、膜など、壁を区別する第３の材料が存在する。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、それを区切る境界が、それらがコードする遺伝子産物の機能に従って遺伝因子の選別を可能にする、本明細書に記載の分子メカニズムの成分の交換を制限する人工区画である。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルという用語は、「液滴」という用語と互換的に使用することができる。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、液滴はマイクロ流体制御下にある。いくつかの実施形態では、マイクロ流体制御は、本明細書に開示された方法を実行するために、液滴の形成及び／又は移動を指示又はそれ以外の方法で制御するマイクロ流体チャネルを有するマイクロ流体システムを含む。例えば、いくつかの実施形態では、液滴形成の「マイクロ流体制御」は、マイクロ流体デバイスを使用して第２の流体内に流体の「液滴」を形成する液滴の作製を指す。いくつかの実施形態では、マイクロ流体制御下で分類された液滴は、本明細書に記載されているように、選別手順に関連する機能の１又は複数を実行するためにマイクロ流体デバイスを使用して選別される。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、液滴はマイクロ流体制御下にあり、且つ、マイクロ流体制御は、マイクロ流体チャネルを有するマイクロ流体システムを含み、前記チャネルは、流体の流れを少なくとも部分的に方向付ける特徴を有する。チャネルは、任意の断面形状（円形、楕円形、三角形、不規則、正方形、又は長方形など）を有していてもよく、被覆されていてもされていなくてもよい。いくつかの実施形態では、チャネルは完全に被覆されていてもよく、チャネルの少なくとも一部が完全に囲まれた断面を有していてもよく、入口と出口を除いてチャネル全体が全長にわたって完全に囲まれていてもよい。チャネルは、少なくとも２：１、より一般的には少なくとも３：１、５：１、又は１０：１以上のアスペクト比（長さ対平均断面寸法）有し得る。開放チャネルには、例えば、構造的特性（細長いくぼみ）及び／又は物理的若しくは化学的特性（疎水性−親水性）などの流体輸送の制御を容易にする特性、又は流体に力（例えば、封じ込め力（containing force））を及ぼすことができるその他の特性を含む。いくつかの実施形態では、チャネル内の流体は、チャネルを部分的又は完全に満たしてもよい。いくつかの実施形態では、開放チャネルが使用され、流体は、例えば表面張力（例えば、凹状メニスカス又は凸状メニスカス）を使用して、チャネル内に保持されていてもよい。チャネルは、例えば、流体の流れに対して垂直な最大寸法が、約５ｍｍ又は２ｍｍ未満、約１ｍｍ未満、約５００ミクロン未満、約２００ミクロン未満、約１００ミクロン未満、約６０ミクロン未満、約５０ミクロン未満、約４０ミクロン未満、約３０ミクロン未満、約２５ミクロン未満、約１０ミクロン未満、約３ミクロン未満、約１ミクロン未満、約３００ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、又は約１０ｎｍ未満である、任意のサイズのものであってもよい。いくつかの実施形態では、チャネルの寸法は、流体が物品又は基材を通って自由に流れることができるように選択されてもよい。チャネルの寸法はまた、例えば、チャネル内の流体の特定の体積流量又は線形流量を可能にするように選択されてもよい。当然ながら、チャネルの数及びチャネルの形状は、当業者に公知の任意の方法によって変更することができる。いくつかの実施形態では、複数のチャネル又はキャピラリーを使用してもよい。例えば、２以上のチャネルが使用されてもよく、それらは、互いの内側に配置されるか、互いに隣接して配置されるか、互いに交差するように配置されるなどである。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、本開示の液滴は、乳剤（例えば、ピカリング乳剤）、すなわち、一方の相が他方の相に分散されている２つの非混和性の流体又は液相の系から、例えば、微視的又はコロイド状のサイズの液滴として、形成される。いくつかの実施形態では、流体は液体であり、これらの用語は交換性がある。いくつかの実施形態では、流体は、流れを可能にする任意の適切な粘度を有し得る。２種類以上の流体が存在する場合、各流体は、流体間の関係を考慮して、本質的に任意の流体（液体、気体など）の中から当業者によって独立して選択され得る。いくつかの実施形態では、流体はそれぞれ混和性又は非混和性であってもよい。例えば、２種類の流体は、流体の流れの形成の時間枠内で、又は反応や相互作用の時間枠内で非混和性であるように選択され得る。一部分がかなりの期間液体のままである場合、流体は著しく非混和性である必要がある。接触及び／又は形成後、分散した部分が重合などによって迅速に硬化可能な場合、流体は非混和性である必要はない。当業者は、本発明の技術を実行するために、接触角測定などを使用して、適切な混和性又は非混和性流体を選択することができる。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法は、複数の液滴中で改変産生細胞の集団を生成することに関する。いくつかの実施形態では、複数の液滴は、少なくとも１つの非不死細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、その内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／００６８１７０号に開示されているように、液滴内の非不死細胞によって分泌される種の特徴を決定することを含む。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、その内容全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１０／００２２４１４号に開示されているように、本明細書に開示の方法は、複数の水性液滴内で改変産生細胞の集団を生成することに関し、ここで、各液滴はサイズが均一であり、限られた量の試薬のみを消費しながら多数のアッセイを実行するのに役立つ液滴ライブラリーを含む。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、その容全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１７／００２８３６５号に開示されているように、本明細書に開示の方法は、複数の水性液滴を含む乳剤ライブラリー内で改変産生細胞の集団を生成することに関する。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、その内容全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１３／００８４５７２号に開示されているように、本明細書に開示の方法は、改変産生細胞の集団を、液滴から検出されるシグナルを使用して制御及び／又は校正される液滴をベースとしたアッセイにおいて生成することに関する。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、その内容全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１４／０１７９５４４号に開示されているように、本明細書に開示の方法は、入力流路、交差領域、及び出力流路を含む検出器デバイスを有するシステムで液滴を検出することを含む、改変産生細胞の集団を生成することに関する。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、その内容全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１８／０１０４６９３号に開示されているように、本明細書に開示の方法は、液滴中で改変産生細胞の集団を生成すること、前記液滴内のマイクロ流体液滴及び粒子を検出すること、及び前記液滴を選別することに関する。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、その内容全体が本明細書に援用される米国特許第９，０１２，３９０号に開示されているように、本明細書に開示の方法は、水性分散相、フッ素化油を含む連続相、及びアミド結合を介してポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ブロックに結合された過フッ素化ポリエーテル（ＰＦＰＥ）ブロックを含むブロックコポリマーを含む界面活性剤を含む乳剤中で改変産生細胞の集団を生成することに関し、ここで、前記界面活性剤は式−（ＣｎＦ２ｎＯ）ｘ−（ＣｍＦ２ｍ）−ＣＯＮＨ−（ｎ、ｍ、ｘ、及びｙは正の整数である）からなる。
【０２２３】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してさらに説明される。
【実施例】
【０２２４】
実施例１：大腸菌ＭＧ１６５５変異体間のセンサー応答の変動
同一バックグラウンドに由来するゲノム変異体間のセンサー変動の例として、図１Ａ〜図１Ｃは、ＭＡＧＥ改変大腸菌ＭＧ１６５５集団からランダムに選択された３つのメンバーのセンサー応答を示している。３つのクローンは、改変ｔｔｇＡｐプロモーターの制御下にＴｔｇＲ及びｇｆｐを有する中コピープラスミドで形質転換された。外因的に適用されたナリンゲニン（０μＭ、３１μＭ、６３μＭ、又は１２５μＭ）は、３つの株において異なるレベルのＧＦＰ発現を誘導した。これらの実験中にナリンゲニン経路酵素は存在せず、内因的に産生されたナリンゲニンによる干渉は排除される。センサー系をゲノムに導入した場合（図示せず）、又は高コピーセンサープラスミドへ切り替えた場合（図２Ａ）、変動は解消しなかった。
【０２２５】
図２Ａ〜図２Ｄは、図１Ａ〜図１Ｃと同じ３種類のＭＡＧＥ改変大腸菌ＭＧ１６５５変異体のセンサー応答の変動を示している。これらの変異体は、適切なａＴＦ調節オペレーターの制御下に、４種類のａＴＦ（ＴｔｇＲ（図２Ａ）、ＴｅｔＲ（図２Ｂ）、ＰｃａＶ（図２Ｃ）、又はＱａｃＲ（図２Ｄ））のうちの１種類及びｇｆｐを有する高コピープラスミドで形質転換された。図示するように、各センサー系は、種々のレベルの適切な同族リガンドによって誘導された。株についての色は全てのパネルで一致している。ＴｔｇＲセンサー系（赤色＝最も明るい、オレンジ色＝中間、青色＝暗い）に対するセンサー応答の傾向は、異なるセンサー系間で保持されておらず、原因は全体的なものではないことを示唆している。
【０２２６】
実施例２：産生変異体間での標的産生分子の拡散
図３は、産生株間の拡散による干渉を示している。「２Ｅ６」と称される大腸菌Ｋ−１２  ＭＧ１６５５変異体を、ナリンゲニン前駆体濃度の向上についてＭＡＧＥ改変し、２種類の別々のナリンゲニン経路プラスミド（ｐＮＡＲｌｏｗ及びｐＮＡＲｈｉｇｈ）で形質転換した結果、ナリンゲニン高産生株（赤色、Ｍ９  １％グルコース中での２４時間バッチ培養で約１８０μＭの産生物）及びナリンゲニン低産生株（青色、Ｍ９  １％グルコース中での２４時間バッチ培養で約６０μＭの産生物）を得た。生産性が異なるこれら２種類の株は、別々にインキュベート及び一緒にインキュベートした（オレンジ色）。高産生株及び低産生株は共培養すると平均的シグナルを示しており、株間のナリンゲニン拡散が、バルク液体培養におけるより優れた産生のスクリーニングに対して抑制的であることを示唆している。本実施例では、産生における違いは、主要代謝産物の濃度を変更する大規模なゲノム変異ではなく、ナリンゲニン経路酵素のプラスミドをベースとした改変の結果であることに注目されたい。これらの状況では、実施例１で観察されたセンサー応答の変動は観察されなかった。
【０２２７】
実施例３：産生細胞からセンサー細胞を分離する手段としての共培養
図４Ａ〜図４Ｂは、スクリーニングのための実行可能な戦略としての産生細胞とセンサー細胞の共培養を証明している。センサー細胞は、単一炭素源としてのグルコース上で増殖することができない大腸菌ＢＷ２５１１３  Δｐｔｓｌ：：ｋａｎＲバックグラウンドで改変した。グルコーストランスポーターｐｔｓｌ及び蛍光レポーターｇｆｐは、増殖及びＧＦＰシグナルの大きさがナリンゲニン依存性であるように、プラスミドｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰ−Ｐｔｓｌ上のＴｔｇＲ調節プロモーターの制御下で共シストロン的に発現された。図４Ａでは、増殖及びＧＦＰシグナルの大きさがナリンゲニン依存性であるセンサー細胞を、実施例２に記述される産生株２Ｅ６と液体中で共培養し、３種類の異なるナリンゲニン経路プラスミド、すなわち、経路陰性対照であるｐＮＡＲｎｕｌｌ（赤色）、ナリンゲニン低産生経路ｐＮＡＲｌｏｗ（青色、Ｍ９  １％グルコース中での２４時間単離バッチ培養で約６０μＭの産生物）、又はナリンゲニン高産生経路ｐＮＡＲｈｉｇｈ（オレンジ色、Ｍ９  １％グルコース中での２４時間バッチ培養で約１８０μＭの産生物）、又は対照プラスミドで形質転換した。暗い集団は、ＧＦＰシグナルを有しない産生細胞を表している。明るい集団はセンサー細胞集団を表し、共培養集団全体の比率が増加し、産生の増加に伴いＧＦＰ応答の大きさも増加している。
【０２２８】
図４Ｂでは、センサー細胞は、油中水型液滴中の経路陰性対照細胞又はナリンゲニン高産生細胞と共培養された。インキュベーション後、油中水型液滴は別の水相に封入され、標準的な蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）で観察された水中油中水型液滴を生成した。高産生細胞とセンサー細胞の共培養（オレンジ色）の分布は、非産生細胞とセンサー細胞の共培養（赤色）と容易に区別される。
【０２２９】
実施例４：液滴中での共培養
２Ｅ６  ｐＮＡＲｎｕｌｌ、２Ｅ６  ｐＮＡＲｌｏｗ、及び２Ｅ６  ｐＮＡＲｈｉｇｈを、実施例３に記載の大腸菌ＢＷ２５１１３  Δｐｔｓｌ：：ｋａｎＲ  ｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰ−Ｐｔｓｌセンサー株と共培養した。４種類の培養物をＬＢ培地で一晩増殖させ、適切な抗生物質を添加した最小培地で１〜１００倍に希釈し、その後対数期まで増殖させた。対数期に入った時点で、大腸菌を濾過済みの１×Ｍ９塩で３回すすぎ、次に、ＯＤ６００が１．０になるまで希釈した。封入された液滴のそれぞれに単一の産生株が存在することを確実にするために２Ｅ６株をＯＤ６００が０．０１になるまで希釈し、液滴のそれぞれが少なくとも５つのセンサー細胞を有することを確実にするためセンサー細胞を０．１倍に希釈した。以下の６セットの液滴、すなわち、（１）センサー細胞単独の液滴、（２）５００μＭナリンゲニンとセンサー細胞の液滴、（３）２Ｅ６  ｐＮＡＲｈｉｇｈとセンサー細胞及び１ｍＭ  ＩＰＴＧの液滴、（４）２Ｅ６  ｐＮＡＲｎｕｌｌとセンサー細胞及び１ｍＭ  ＩＰＴＧの液滴、（５）２Ｅ６  ｐＮＡＲｌｏｗとセンサー細胞及び１ｍＭ  ＩＰＴＧの液滴、及び（６）ナリンゲニン単独の液滴を生成した。細胞溶液、及びＨＦＥ７５００の１％Ｒａｎフルオロ界面活性剤で構成される油相を１ｍＬガラス製シリンジ中にロードし、２個のＨａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社製シリンジポンプに接続した。前記液体を、Ｄｏｌｏｍｉｔｅ社製の５０μｍジャンクションフローフォーカシング親フッ素性チップを使用して、油相及び水相のそれぞれについて１４μＬ／分及び１０μＬ／分の速度で乳化した。形成された液滴を５ｍＬの遠心管に収集した。形成後、液滴を転倒させながら３３℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、液滴を顕微鏡下で画像化した。５００μＭのナリンゲニンを含む陽性対照の液滴は非常に蛍光性であるが（図５ｄ）、陰性対照の液滴は暗かった（図５ａ）。ｐＮＡＲｌｏｗ及びｐＮＡＲｈｉｇｈの共培養液滴は、検出可能な蛍光を生成した（図５ｂ及び図５ｃ）。２Ｅ６  ｐＮＡＲｈｉｇｈ産生体は、２Ｅ６  ｐＮＡＲｌｏｗ産生細胞よりもナリンゲニンを産生し、より明るい共培養液滴を生じた。５００μＭナリンゲニンを含む液滴と混合されたセンサー細胞液滴は、液滴間の拡散を示さなかった（図６）。ＨＰＬＣで分析された追加の拡散データは、前記油へのナリンゲニン及びクマル酸の最小拡散が２０％未満であることを示している（データは図示せず）。分析後、Ｄｏｌｏｍｉｔｅ社製の５０μＭフローフォーカシング親水性チップを使用して、単一の乳剤をバルク水相二重乳剤に変換した。そのためには、液滴を１ｍＬガラスシリンジにロードし、２番目のガラスシリンジに新鮮な増殖培地を充填して、液滴内部と等張性のバランスをとった。前記シリンジを２つのＨａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社製シリンジポンプにロードした後、チップに接続した。シリンジあたり１５μＬ／分の流量で二重乳剤が形成され、１５ｍＬ遠心管に集めた。ＦＡＭＳ分析の前に、二重乳剤を顕微鏡下で分析した。顕微鏡下で以下の３つの液滴の集団が可視化される：（１）空の液滴、（２）蛍光センサー細胞及び産生細胞を含む液滴及び、（３）非蛍光センサー細���及び非産生細胞を含む液滴（図７）。液滴のＦＡＣＳ分析では、前記３つの集団も同様に示されている（図８Ａ〜図８Ｃ）。非産生体含有液滴は、約２，０００ＲＦＵの平均集団蛍光を示す（図８Ａ）。産生体含有液滴は、約１００，０００ＲＦＵの平均集団蛍光を示す（図８Ｂ）。両方の株の混合物を含む液滴集団は、２つの別個の蛍光亜集団を示している（図８Ｃ）。
【０２３０】
実施例５：液滴区画化を使用した主要産物の拡散の抑制
２Ｅ６  ｐＮＡＲｎｕｌｌ及び２Ｅ６  ｐＮＡＲｈｉｇｈを、ＴｓｇＲ由来のセンサーを使用してナリンゲニンに応答してＧＦＰを産生するｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰナリンゲニンセンサー系でさらに形質転換した。２つの培養物をＬＢ培地で一晩増殖させ、適切な抗生物質を添加した最小培地で１〜１００倍にさらに希釈し、その後対数期まで増殖させた。対数期に入った時点で、大腸菌を１×濾過済みＭ９塩で３回すすぎ、次に、ＯＤ６００が１．０になるまで希釈した。次に、封入された液滴のそれぞれに単一の産生株が存在することを確実にするために各２Ｅ６株をＯＤ６００が０．０１になるまで希釈した。以下の３セットの液滴、すなわち、（１）２Ｅ６  ｐＮＡＲｈｉｇｈ細胞単独、（２）２Ｅ６  ｐＮＡＲｎｕｌｌ細胞単独、及び（３）２Ｅ６  ｐＮＡＲｈｉｇｈ細胞と２Ｅ６  ｐＮＡＲｎｕｌｌ細胞の１：１混合物の液滴を生成した。細胞溶液、及びＨＦＥ７５００中の１％Ｒａｎフルオロ界面活性剤で構成される油相を１ｍＬガラス製シリンジにロードし、２個のＨａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社製シリンジポンプに接続した。前記液体を、Ｄｏｌｏｍｉｔｅ社製の５０μｍジャンクションフローフォーカシング親フッ素性チップを使用して、油相及び水相のそれぞれ１４μＬ／分及び１０μＬ／分の速度で乳化した。形成された液滴を５ｍＬの遠心管に集めた。形成後、前記液滴を転倒させながら３３℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、等量の１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロ−１−オクタノールを使用して３０秒間ボルテックスして液滴を破壊し、次いで遠心して相を分離した。回収した大腸菌を含む水相を新しいチューブに移し、ＦＡＣＳ分析用に希釈した。集団の蛍光分布をＦＡＣＳで測定した。２Ｅ６  ｐＮＡＲｎｕｌｌ細胞は、約３０，０００ＲＦＵの平均集団蛍光を示した（図９（Ａ））。２Ｅ６  ｐＮＡＲｈｉｇｈナリンゲニン産生細胞は、約３００，０００ＲＦＵの平均集団蛍光を示し（図９（Ｂ））、非産生株の１０倍であった。各産生株を分離するために液滴を使用して共に増殖させると、産物の拡散を抑制する液滴の能力及びそれによる集団平均化を示す２つの蛍光亜集団が見られる（図９（Ｃ））。
【０２３１】
図１０は、拡散を抑制するために液滴内でインキュベートした後の、経路陰性対照である２Ｅ６  ｐＮＡＲｎｕｌｌｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰからのナリンゲニン高産生株２Ｅ６  ｐＮＡＲｈｉｇｈ  ｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰの濃縮を示す。この実験で使用される液滴サイズで単一細胞のローディングを確実にするためにＯＤ６００が０．００３になるまで希釈した以外は、上記のようにして細胞を培養及び洗浄した。油相及び水相についてそれぞれ２０μＬ／分及び１２μＬ／分の速度で自社製２５μｍジャンクションフローフォーカシングＰＤＭＳチップで乳化した以外は、上記のようにして液滴を生成した。２Ｅ６  ｐＮＡＲｈｉｇｈｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰ、２Ｅ６  ｐＮＡＲｎｕｌｌ  ｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰ、並びに予め混合した２Ｅ６  ｐＮＡＲｈｉｇｈｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰと２Ｅ６  ｐＮＡＲｎｕｌｌ  ｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰについて別々の液滴セットを生成した。形成された液滴を５ｍＬの遠心管に集めた。形成後、前記液滴を転倒させながら３３℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、等量の１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロ−１−オクタノールを使用して３０秒間ボルテックスして液滴を破壊し、次いで遠心して相を分離した。回収した大腸菌を含む水相を新しいチューブに移し、ＦＡＣＳ分析及び細胞選別用に希釈した。２Ｅ６  ｐＮＡＲｈｉｇｈｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰ（青色）、２Ｅ６  ｐＮＡＲｎｕｌｌ  ｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰ（赤色）、及び２Ｅ６  ｐＮＡＲｈｉｇｈｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰと２Ｅ６  ｐＮＡＲｎｕｌｌｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰの混合物（オレンジ色）の液滴からの細胞を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｓ３Ｅ  ＦＡＣＳで分析した。分析に続いて、前記２Ｅ６  ｐＮＡＲｈｉｇｈｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰと２Ｅ６  ｐＮＡＲｎｕｌｌｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰの混合物の液滴からの細胞を、下記のゲーティング戦略を用いて選別した。選別細胞及び未選別細胞をプレーティングし、未選別集団及び選別集団からのクローンを産生培地で成長させて、経路（＋）細胞の（経路（＋）においてＧＦＰシグナルが高いこと、及び経路（−）クローンにおいて暗いことによって決定される）割合を決定した。この１回の濃縮サイクルで、経路（＋）細胞の約７倍の濃縮が観察された。
【０２３２】
図１１は、「細胞内センサー」を使用した低産生体及び高産生体の液滴封入を示す画像であり、同一の細胞がリガンド及びセンサーの両方の産生に関与し、蛍光（緑）の読み取り強度（高産生細胞、右）は産生したリガンドの濃度に関連していることを示す。
【０２３３】
実施例６：共培養センサー細胞を用いた高産生体の濃縮
図１２は、液滴システムにおいて低産生体又は高産生体と共に封入された「共培養センサー細胞」のシステムを示す画像を示す。ここで、非産生細胞のみがセンサー読み取りに寄与し、蛍光（緑色）の読み取り強度（高産生細胞、左）が産生リガンドの濃度に関連付けられている産生細胞への負担を軽減している。
【０２３４】
図１３は、実施例３に記載のΔｐｔｓｉ：：ｋａｎＲ  ｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰ−Ｐｔｓｉセンサー株との液滴共培養戦略を利用した、低経路対照２Ｅ６  ｐＮＡＲｌｏｗからのナリンゲニン高産生株２Ｅ６  ｐＮＡＲｈｉｇｈの濃縮を示す。３種類の培養物をＬＢ培地で静止期まで一晩増殖させた。次に、細胞を、１％グルコース、０．１％プルロニック（Pluronic）Ｆ−６８、及び１ｍＭ  ＩＰＴＧを含む濾過済み２×Ｍ９培地で１回洗浄した。続いて、Δｐｔｓｉ：：ｋａｎＲ  ｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰ−Ｐｔｓｉ細胞が０．２のＯＤ６００で再懸濁されるように、洗浄に使用したのと同じ濾過済み培地に細胞を再懸濁した。これに、２Ｅ６  ｐＮＡＲｈｉｇｈ又は２Ｅ６  ｐＮＡＲｌｏｗを、ＯＤ６００が０．０６６で添加し、センサー細胞の濃度が等しい（ＯＤ６００＝０．２）低産生細胞又は高産生細胞の２つの別々の混合物を作製した。ＨＦＥ  ７５００＋１％００８−ＦＳを油相として使用し、前述の細胞混合物を水相として２５μｍジャンクションフローフォーカシングを備えたＰＤＭＳチップを使用して、油相と水相についてそれぞれ２０μＬ／分及び１２μＬ／分の速度で、培養物ごとに別個に液滴を生成した。形成後、前記液滴を転倒させながら３３℃で２４時間インキュベートした。選別前に、液滴を、約［１０］：［１］［Δｐｔｓｉ：：ｋａｎＲ  ｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰ−Ｐｔｓｉ＋２Ｅ６  ｐＮＡＲｌｏｗ］：［Δｐｔｓｉ：：ｋａｎＲ  ｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰ−Ｐｔｓｉ＋２Ｅ６  ｐＮＡＲｈｉｇｈ］で混合した。次に、高電圧（約１ｋＶ）を供給可能なインジウム電極付きの４０μｍジャンクションを有する高さ４５μｍのソーターチップを備えた自社製ＰＤＭＳソーターチップで液滴を選別し、誘電泳動効果を実行して、水滴を所望のチャネルへ移動させた。液滴を６０倍の倍率でモニタリングし、ＰＭＴ電圧シグナルは自社にてプログラムしたマイクロチップを使用して分析した。これによりユーザー定義の閾値より大きいシグナルを含む液滴は、１０ｋＨｚの周波数で８００Ｖの４５０μｓパルスを印加することにより、選別されたチャネルに選別される。その後、等量の１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロ−１−オクタノールを使用して３０秒間ボルテックスして選別液滴及び未選別液滴を集めて破壊し、次いで遠心して相を分離した。ＬＢに破壊液滴混合物を加え、細胞を適切な抗生物質を含む寒天プレート上にプレーティングした。選別細胞及び未選別細胞を翌日各プレートから別々に掻き取り、一晩培養するために適切な抗生物質を含むＬＢに再接種した。集団全体を代表するＤＮＡを抽出するために、選別細胞培養物及び未選別細胞培養物のミニプレップを完了した。混合プラスミド集団の二重消化は、ｐＮＡＲｌｏｗからのプラスミドとｐＮＡＲｈｉｇｈからのプラスミドの量の差異が、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩの二重制限酵素消化により識別できることを示している（図１３（左）の理論的消化を参照）。選別ミニプレップ及び未選別ミニプレップからの等量／等濃度のＤＮＡを二重消化に供し、３０μＬの９５ｎｇ／μＬのミニプレップ完了ＤＮＡを０．６Ｕ／μＬの各酵素と１×ＣｕｔＳｍａｒｔバッファー中で、最終容量３５μＬで混合し、３７℃で３時間、その後６５℃で２０分間、さら��１２℃で保持した。次に、消化したＤＮＡを１％アガロースゲル上、９０Ｖで６０分間電気泳動し、ＳｙｂｒＳａｆｅで染色し、画像化した（図１３（右）の実験的消化を参照）。選別集団と未選別集団におけるｐＮＡＲｈｉｇｈバンドとｐＮＡＲｌｏｗバンドの存在を比較すると、濃度測定によって経路ｐＮＡＲｈｉｇｈ細胞の８倍を超える濃縮が観察された。
【０２３５】
図１４（Ａ）、図１４（Ｂ）、図１４（Ｃ）、図１４（Ｄ）、及び図１４（Ｅ）は、二重乳剤ＷＯＷ型液滴の選別を示す。フローフォーカシングマイクロ流体デバイスを使用して、初期ＯＤ６００が０．７５Ａである単一乳剤封入大腸菌細胞（Ｐ６７４、ＲＦＰ陽性）を生成した。水相流量は６．５μＬ／分、外側の油相流量は３０μＬ／分であった。デバイスの断面の形状は、幅１０μｍ、高さ５０μｍであった。油中水型（ＷＯ型）液滴の平均径は直径３０μｍであった。次に、単一乳剤のクリーム状の層を１ｍＬのＢＤプラスチックシリンジにロードし、２μＬ／分の流速で別のフローフォーカシングマイクロ流体デバイスに再注入した。３％ＰＶＡを添加したＬＢ＋ＫＡＮ培地で作成された外側の水相を、３０μＬ／分の流速で流して、幅３５μｍ及び高さ３５μｍのフローフォーカシングセクションで水中油中水型（ＷＯＷ型）液滴をつまみ取った。ＷＯＷ型液滴の平均径は直径４０μｍであった。生成されたＷＯＷ型液滴は、３％ＰＶＡを含むＬＢ＋ＫＡＮ培地で被覆された採取チューブの底に沈んだ。
【０２３６】
ＷＯＷ型産生中に生成される未封入の大腸菌からＷＯＷ型液滴が選別され得ることを示すために、ＧＦＰ発現大腸菌をＷＯＷ型懸濁液に加えた。
【０２３７】
図１４（Ａ）では、前方散乱に対する側方散乱のプロットが、サイズに基づいて３つの異なる集団を示している。原点付近の遊離大腸菌は表示された事象の３．７％を表し、軸の最大値付近のＷＯＷは表示された事象の３８％を表し、その間にＷＯＷ細片のサイズの幅広い集団が存在する。図１４（Ｂ）は、図１４（Ａ）の大腸菌サイズの集団のＧＦＰチャネル蛍光応答を示している。チャンネル間のクロストークにより、ＲＦＰ陽性大腸菌は約７５蛍光単位の集団として表示される。ＷＯＷ集団に追加されたＧＦＰ陽性大腸菌は、約１０００〜１００００の蛍光単位を示す。図１４（Ｃ）は、図１４（Ａ）のＷＯＷサイズの事象のＲＦＰチャネル蛍光を示している。ＷＯＷを含むＲＦＰ大腸菌は、約９０蛍光単位の集団として表示される。暗いＷＯＷ又はＷＯＷと同じサイズの油単独の液滴は、約２蛍光単位の集団として表示される。図１４（Ｄ）に、選別後の集団から１０，０００のＷＯＷ事象を選別したものを示す。事象の０．１％の存在によって示されるように、ＷＯＷ液滴は選別プロセスによって破壊されることに留意されたい。遊離大腸菌は、選別後に観察された事象の５４％に相当する。図１４（Ｅ）は、図１４（Ｄ）の大腸菌サイズの集団のＧＦＰチャネル蛍光応答を示している。軸上ではＲＦＰ細胞のみが観察されることに留意されたい。このことは、ＷＯＷはＦＡＣＳ選別プロセス後に残存しなかったが、ＷＯＷからの大腸菌を含むＲＦＰのみが採取チューブに選別されたことを示す。
【０２３８】
１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロ−１−オクタノールで液滴を破壊して個別の細胞事象を選別する代わりに、単一の乳剤液滴を第２の水相に封入して二重乳剤を形成し、標準的なＦＡＣＳで分析／選別することができる。図１５は、２Ｅ６  ｐＮＡＲｈｉｇｈ  ｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰと２Ｅ６  ｐＮＡＲｎｕｌｌ  ｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰの混合物の二重乳剤液滴の分析を示す。２種類の株のＬＢ一晩前培養物を洗浄し、濾過済み最小グルコースに再懸濁して、高い占有率を確保するために使用したＯＤ  ０．０４の細胞密度とした。実施例４に記載のプロトコルを用いて、２Ｅ６  ｐＮＡＲｈｉｇｈ  ｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰ及び２Ｅ６  ｐＮＡＲｎｕｌｌ  ｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰに対して単一の乳剤液滴を個別に形成した。形成後、２つの液滴セットを３０℃で１８時間転倒させながらインキュベートし、その時点でこれらを混合し、実施例４に記載のように二重乳剤を生成するために使用した。二重乳剤のＦＡＣＳ分析は、ゲーティングによる二重乳剤事象（サイズに基づいて識別されるゲートＫ）内の２つの異なるＧＦＰ（ＦＩＴＣ−Ａ−補正）集団を示し、高産生体と非産生体の混合集団の分析と一致している。
【０２３９】
典型的なフルオロ界面活性剤（通常、独自の分子／ポリマー／ブロックコポリマー）の使用に加えて、ナノ粒子をベースとしたピカリング乳剤は、油中水型液滴及び水中油型液滴の封入にも役立ち得る。図１６は、油中水ピカリング乳剤を、産生体＋相関センサー系と共に利用して蛍光シグナルを取得できることを示している。適切な抗生物質を加えたＬＢ培地からの２Ｅ６  ｐＮＡＲｈｉｇｈ  ｐＳＥＮＳＯＲＧＦＰの一晩培養物を等量で３回洗浄し、単一細胞液滴ローディング水相として使用するための最終的な再懸濁ＯＤ６００が０．００８（事前の経験的ポアソン分布測定による）となるように、濾過済み２×Ｍ９、１％グルコース、１ｍＭ  ＩＰＴＧ、０．１％プルロニックＦ６８、及び適切な抗生物質に再懸濁した。液滴は、５０μｍの深さの単一の水流液滴ジェネレータチップを使用して、ピカリング乳剤溶液（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ社製Ｆｌｕｏｒｏｐｈａｓｅ）の場合は２０μＬ／分の流量で、水相を含む細胞の場合は１２μＬ／分の流量で生成され、３５〜４０μｍの直径の液滴が生成された。液滴をオービタルシェーカーで３３℃、２４時間インキュベートした。翌日、細胞の特性／液滴の占有率を観察するために、液滴を画像化した。結果は、細胞が増殖（占有液滴あたり２個以上の細胞、明視野）と経路分子の産生に関連する蛍光レポーター（ＧＦＰチャネル）の産生との両方が可能であることを示している。
【０２４０】
均等物
本明細書の以下の記載及び添付の特許請求の範囲において、材料の量、元素含有量、反応時間及び反応温度、量の比率についてなど、数値範囲、量、値、及び割合の全ては、「約」という用語が、その値、量、又は範囲と共に明示的に表示されない場合であっても「約」という用語が前に付されているように読まれ得る。したがって、反対の意味を示されない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に示される数値パラメーターは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変動し得る近似値である。少なくとも、均等論の適用を特許請求の範囲に限定しようとするものではなく、各数値パラメーターは少なくとも、報告された有効桁数字の数を考慮して、通常の四捨五入法を適用することによって解釈されるものとする。
【０２４１】
本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメーターは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示される数値は、可能な限り正確に報告されている。しかしながら、いかなる数値にも、本質的には、その基礎となるそれぞれの試験測定値で見られる標準偏差から必然的に生じる誤差が含まれる。さらに、数値範囲が本明細書に示される場合、これらの範囲は、列挙された範囲の端点を含む（例えば、端点が使用されてもよい）。本明細書で重量パーセントが使用される場合、報告される数値は、総重量に対するものである。
【０２４２】
また、本明細書に記載の数値範囲は、その中に含まれる全ての部分範囲を含むことを意図していることを理解されたい。例えば、「１〜１０」の範囲は、列挙された最小値１と列挙された最大値１０の間の（及びそれを含む）全ての部分範囲を含むことを意図し、すなわち、最小値は１以上であり最大値は１０以下である。本明細書で使用される「１（つ）」、「ａ（単数）」、又は「ａｎ（単数）」という用語は、別段の指示がない限り、「少なくとも１」又は「１又は複数」を含むことが意図されている。
【０２４３】
本明細書で開示される任意の態様又は実施形態は、本明細書で開示される任意の他の態様又は実施形態と組み合わせることができる。
【０２４４】
参照により本明細書に援用されるとされた特許、刊行物、又は他の開示資料の全体又は一部は、援用された資料が、本開示に記載の既存の定義、提示、又は他の開示資料のセットと矛盾しない範囲でのみ本明細書に援用される。したがって、必要な範囲で、本明細書に明示的に記載の開示は、参照により本明細書に援用された矛盾する資料に優先する。参照により本明細書に援用されるとされたが、既存の定義、提示、又は本明細書に記載の他の開示資料と矛盾する任意の資料又はその一部は、その援用された資料と既存の開示資料との間に矛盾が生じない範囲でのみ援用される。
【０２４５】
本発明は、特にその好ましい実施形態を参照して示され説明されているが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細に様々な変更を加えてもよいことが当業者によって理解される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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