(57)【要約】  特定の宿主細胞タンパク質の発現が低減または排除されるように遺伝子操作された哺乳動物細胞株、および低レベルの残留宿主細胞タンパク質汚染を有する組換えタンパク質の生産のための操作された哺乳動物細胞株を使用する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞タンパク質汚染のレベルが低減した組換えタンパク質産物を生産するプロセスであって、
（ａ）少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現が低減または排除されるように操作された哺乳動物細胞株において、組換えタンパク質を発現させること、および
（ｂ）組換えタンパク質を精製して組換えタンパク質産物を形成することであって、組換えタンパク質産物は、操作されていない親の哺乳動物細胞株によって生産されたタンパク質産物中のレベルよりも低い残留宿主細胞タンパク質のレベルを有する、形成すること
を含むプロセス。
【請求項２】
少なくとも１つの宿主細胞タンパク質が、カルボキシペプチダーゼＢ１、カルボキシペプチダーゼＤ、カルボキシペプチダーゼＥ、カルボキシペプチダーゼＭ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＬ１、カテプシンＺ、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４、クラスタリン、ジペプチジルペプチダーゼ３、レグマイン、ロイシンアミノペプチダーゼ３、リポタンパク質リパーゼ、リシルオキシダーゼ、メタロプロテイナーゼ阻害剤１、中性α−グルコシダーゼ、ナイドジェン１、ペルオキシダシン、ホスホリパーゼＢ様２、プロリルエンドペプチダーゼ、タンパク質アルギニンＮ−メチルトランスフェラーゼ５、タンパク質ホスファターゼ１Ｇ、セリンプロテアーゼ、シアリダーゼ１、チオレドキシン、またはチオレドキシンレダクターゼから選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
哺乳動物細胞株が、カルボキシペプチダーゼＤ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、クラスタリン、リポタンパク質リパーゼ、メタロプロテイナーゼ阻害剤１、ナイドジェン１、ペルオキシダシン、セリンプロテアーゼ、チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、またはそれらの組合せの発現が低減または排除される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現が、少なくとも１つの宿主細胞タンパク質をコードする染色体配列の少なくとも１つの対立遺伝子の不活性化を介して低減または排除される、請求項１から３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５】
少なくとも１つの宿主細胞タンパク質をコードする染色体配列の両方の対立遺伝子が不活性化されている、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
染色体配列が、標的エンドヌクレアーゼ媒介ゲノム改変技術を用いて不活性化される、請求項４または５に記載のプロセス。
【請求項７】
標的エンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲリボヌクレオタンパク質複合体または一対のジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
細胞株がヒト細胞株である、請求項１から７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項９】
ヒト細胞株が、ヒト胎児腎臓細胞２９３（ＨＥＫ２９３）細胞株、ＨＴ−１０８０ヒト結合組織株、またはＰＥＲ．Ｃ６ヒト胎児網膜細胞株である、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
細胞株が非ヒト細胞株である、請求項１から７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１１】
非ヒト細胞株が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞株、Ｓｐ２／０マウス骨髄腫細胞株、Ｃ１２７マウス乳腺細胞株、またはベロアフリカミドリザル腎臓細胞株である、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
細胞株がＣＨＯ細胞株である、請求項１から７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）における精製が、清澄化ステップおよび１つまたは複数のクロマトグラフィーステップを含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１４】
組換えタンパク質産物中の残留宿主細胞タンパク質のレベルが１００ｐｐｍ未満である、請求項１から１３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１５】
組換えタンパク質産物が、抗体、抗体断片、ワクチン、成長因子、サイトカイン、ホルモン、または凝固因子から選択される、請求項１から１４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１６】
生物的生産システムにおいて使用するための哺乳動物細胞株であって、哺乳動物細胞株は、カルボキシペプチダーゼＢ１、カルボキシペプチダーゼＤ、カルボキシペプチダーゼＥ、カルボキシペプチダーゼＭ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＬ１、カテプシンＺ、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４、クラスタリン、ジペプチジルペプチダーゼ３、レグマイン、ロイシンアミノペプチダーゼ３、リポタンパク質リパーゼ、リシルオキシダーゼ、メタロプロテイナーゼ阻害剤１、中性α−グルコシダーゼ、ナイドジェン１、ペルオキシダシン、ホスホリパーゼＢ様２、プロリルエンドペプチダーゼ、タンパク質アルギニンＮ−メチルトランスフェラーゼ５、タンパク質ホスファターゼ１Ｇ、セリンプロテアーゼ、シアリダーゼ１、チオレドキシン、またはチオレドキシンレダクターゼから選択される、１つまたは複数の宿主細胞タンパク質の発現が低減または排除されるように操作された哺乳動物細胞株。
【請求項１７】
１つまたは複数の宿主タンパク質が、カルボキシペプチダーゼＤ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、クラスタリン、リポタンパク質リパーゼ、メタロプロテイナーゼ阻害剤１、ナイドジェン１、ペルオキシダシン、セリンプロテアーゼ、チオレドキシン、またはチオレドキシンレダクターゼから選択される、請求項１６に記載の哺乳動物細胞株。
【請求項１８】
少なくとも１つの宿主細胞タンパク質の発現が、少なくとも１つの宿主細胞タンパク質をコードする染色体配列の少なくとも１つの対立遺伝子の不活性化を介して低減または排除される、請求項１６または１７に記載の哺乳動物細胞株。
【請求項１９】
少なくとも１つの宿主細胞タンパク質をコードする染色体配列の両方の対立遺伝子が不活性化されている、請求項１８に記載の哺乳動物細胞株。
【請求項２０】
染色体配列が、標的エンドヌクレアーゼ媒介ゲノム改変技術を用いて不活性化される、請求項１８または１９に記載の哺乳動物細胞株。
【請求項２１】
標的エンドヌクレアーゼが、リボヌクレオタンパク質複合体または一対のジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項２０に記載の哺乳動物細胞株。
【請求項２２】
細胞株がヒト細胞株である、請求項１６から２１のいずれか１項に記載の哺乳動物細胞株。
【請求項２３】
ヒト細胞株が、ヒト胎児腎臓細胞２９３（ＨＥＫ２９３）細胞株、ＨＴ−１０８０ヒト結合組織株、またはＰＥＲ．Ｃ６ヒト胎児網膜細胞株である、請求項２２に記載の哺乳動物細胞株。
【請求項２４】
細胞株が非ヒト細胞株である、請求項１６から２１のいずれか１項に記載の哺乳動物細胞株。
【請求項２５】
非ヒト細胞株が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞株、Ｓｐ２／０マウス骨髄腫細胞株、Ｃ１２７マウス乳腺細胞株、またはベロアフリカミドリザル腎臓細胞株である、請求項２４に記載の哺乳動物細胞株。
【請求項２６】
細胞株がＣＨＯ細胞株である、請求項１６から２１のいずれか１項に記載の哺乳動物細胞株。
【請求項２７】
細胞生存率、生細胞密度、力価、成長率、増殖応答、細胞形態、および／または一般的な細胞の健康状態が、操作されていない親哺乳動物細胞株のものと同等である、請求項１６から２６のいずれか１項に記載の哺乳動物細胞株。
【請求項２８】
抗体、抗体断片、ワクチン、成長因子、サイトカイン、ホルモン、または凝固因子から選択される組換えタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸をさらに含む、請求項１６から２７のいずれか１項に記載の哺乳動物細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生物的生産システムにおいて使用するための哺乳動物細胞株であって、従来生産されていた組換え治療用タンパク質を汚染する宿主細胞タンパク質の発現が低減または排除されるように操作されている、哺乳動物細胞株に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質生産の間、宿主細胞は、細胞成長、増殖、生存、遺伝子転写、タンパク質合成などの正常な細胞機能に関連する内因性タンパク質を同時生産する。また、内因性宿主細胞タンパク質は、細胞死／アポトーシス／溶解の結果として、細胞培養培地中に放出され得る。組換えタンパク質生産中に同時発現する内因性タンパク質はすべて、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）と呼ばれている。ＨＣＰは、モノクローナル抗体などの組換え治療用タンパク質中に存在する、プロセス関連不純物の大部分を構成している。これらのＨＣＰ不純物は、免疫原性の原因となるだけでなく、治療用タンパク質の有効性や安定性にも大きな影響を与える可能性がある。さらに、治療用タンパク質と同時精製するＨＣＰは、除去することが困難であり、その結果、下流プロセスでの処理が著しくなり、生産コストが増加する可能性がある。例えば、モノクローナル抗体の製造コストの約８０％は、下流の精製プロセスに起因すると推定されている。さらに、規制上の要件を満たすために、製造業者は、最終製品中の宿主細胞タンパク質のクリアランスが１から１００ｐｐｍの範囲内のレベルであることを実証しなければならない。
【発明の概要】
【０００３】
したがって、治療用タンパク質生産中に特定のＨＣＰを低減または排除するための手段が必要である。例えば、豊富に存在し、下流のプロセス中に除去することが困難であり、および／または製品の品質に影響を与えるＨＣＰの発現を低減または排除するように操作された宿主細胞株が必要である。そのような細胞株は、生物治療剤の生産を単純化し、コストを削減するであろう。
【０００４】
本開示の様々な態様の中で、生物的生産システムにおいて使用するための哺乳動物細胞株が提供され、哺乳動物細胞株は、カルボキシペプチダーゼＢ１、カルボキシペプチダーゼＤ、カルボキシペプチダーゼＥ、カルボキシペプチダーゼＭ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＬ１、カテプシンＺ、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４、クラスタリン、ジペプチジルペプチダーゼ３、レグマイン、ロイシンアミノペプチダーゼ３、リポタンパク質リパーゼ、リシルオキシダーゼ、メタロプロテイナーゼ阻害剤１、中性α−グルコシダーゼ、ナイドジェン１、ペルオキシダシン（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｉｎ）、ホスホリパーゼＢ様２、プロリルエンドペプチダーゼ、タンパク質アルギニンＮ−メチルトランスフェラーゼ５、タンパク質ホスファターゼ１Ｇ、セリンプロテアーゼ、シアリダーゼ１、チオレドキシン、またはチオレドキシンレダクターゼから選択される、１つまたは複数の宿主細胞タンパク質の発現を低減または排除するように操作される。一般に、１つまたは複数のタンパク質の発現は、タンパク質をコードする染色体配列の少なくとも１つの対立遺伝子の不活性化を介して低減する。染色体配列は、標的エンドヌクレアーゼ媒介ゲノム改変、例えば、ＣＲＩＳＰＲリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体またはジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて不活化され得る。
【０００５】
本開示の別の態様は、宿主細胞タンパク質汚染のレベルが低減した組換えタンパク質産物を生産するためのプロセスを包含する。本プロセスは、本明細書で開示された哺乳動物細胞株のいずれかにおいて組換えタンパク質を発現させること、組換えタンパク質を精製して組換えタンパク質産物を形成することであって、組換えタンパク質産物は、操作されていない親哺乳動物細胞株によって生産されるタンパク質産物中のレベルよりも低い残留宿主細胞タンパク質汚染のレベルを有する、形成することを含む。
【０００６】
本開示の他の態様および反復は、以下にさらに詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）またはホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）を標的とするＺＦＮの対を用いて偽トランスフェクトまたはトランスフェクトされた細胞におけるヌクレオチドミスマッチアッセイ（Ｃｅｌ１アッセイ）の結果を示す。
【図２】図２は、カテプシンＢまたはカテプシンＤを標的とするＣａｓ９  ＲＮＰを用いて偽トランスフェクトまたはトランスフェクトした細胞における、７日目または１５日目のヌクレオチドミスマッチアッセイ（Ｃｅｌ１アッセイ）の結果を示す。
【図３】図３Ａは、１０日目のフェッドバッチ試料におけるカテプシンＢノックアウトクローンの生産性と成長プロファイルを示す。図３Ｂは、１０日目のフェッドバッチ試料におけるカテプシンＤノックアウトクローンおよび野生型細胞の生産性と成長プロファイルを示す。
【図４】図４は、クラスタリンを標的としたＣａｓ９  ＲＮＰを用いて偽トランスフェクト（レーン２〜４）またはトランスフェクト（レーン５〜７）した細胞における、ヌクレオチドミスマッチアッセイ（Ｃｅｌ１アッセイ）の結果を示す。
【図５】図５Ａは、野生型クローンの生産性と成長プロファイルを示す。図５Ｂは、クラスタリンノックアウトクローンの生産性と成長プロファイルを示す。
【図６】図６は、偽トランスフェクト（レーン１および６）、チオレドキシンを標的としたＣａｓ９  ＲＮＰを用いてトランスフェクト（レーン２〜５）、またはチオレドキシンレダクターゼを標的としたＣａｓ９  ＲＮＰを用いてトランスフェクト（レーン７〜１０）した細胞におけるヌクレオチドミスマッチアッセイ（Ｃｅｌ１アッセイ）の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本開示は、前記細胞株によって生産される組換えタンパク質が、汚染宿主細胞タンパク質の非常に低いレベルを有するように、特定の宿主細胞タンパク質の発現が低減または排除されるように操作された哺乳動物細胞株を提供する。前記操作された細胞株を生産するための方法、ならびに前記操作された細胞株を使用して、低レベルの残留宿主細胞タンパク質を有する組換えタンパク質を生産する方法が提供される。
【０００９】
（Ｉ）操作された細胞株
本開示の一態様は、１つまたは複数の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の発現が低減または排除されるように操作された哺乳動物細胞株を包含する。したがって、本明細書に開示された操作された細胞株によって生産された組換えタンパク質は、操作されていない親細胞（すなわち、前記ＨＣＰの発現が変化していない親細胞）によって生産される組換えタンパク質と比較して、１つまたは複数のＨＣＰのレベルが低減される。
【００１０】
（ａ）標的ＨＣＰ
本明細書に開示された操作された細胞株は、１つまたは複数のＨＣＰの発現が低減または排除される。実施例１において以下に詳述するように、いくつかの宿主細胞株において、ＨＣＰのサブセットが同定されている。これらのＨＣＰは、非常に豊富であり、下流の精製プロセス中に除去することが困難であり、および／または製品の品質に影響を与える（例えば、残留プロテアーゼは、生物治療剤製品を劣化させ、それによってその有効性を低下させる可能性がある）。これらの特徴を持つＨＣＰは、「問題のある」ＨＣＰと呼ばれている。
【００１１】
表Ａは、操作された組換え細胞株において発現が低減または排除され得る標的ＨＣＰを列挙している。一般に、標的ＨＣＰは、細胞の生存および／または細胞機能に必須ではないタンパク質である
【００１２】
【表１】
2021521873.tif 000002
【００１３】
一部の実施形態では、操作された細胞株は、表Ａに記載された１つのタンパク質の発現が低減または排除される。他の実施形態では、操作された細胞株は、表Ａに記載された２つのタンパク質の発現が低減または排除される。さらなる実施形態では、操作された細胞株は、表Ａに記載された３つのタンパク質の発現が低減または排除される。さらに他の実施形態では、操作された細胞株は、表Ａに記載された４つのタンパク質の発現が低減または排除される。追加の実施形態では、操作された細胞株は、表Ａに記載された５つのタンパク質の発現が低減または排除される。さらなる実施形態では、操作された細胞株は、表Ａに記載された６つのタンパク質の発現が低減または排除される。さらに他の実施形態では、操作された細胞株は、表Ａに記載された７つのタンパク質の発現が低減または排除される。さらなる実施形態では、操作された細胞株は、表Ａに記載された８つのタンパク質の発現が低減または排除される。追加の実施形態では、操作された細胞株は、表Ａに記載された８またはそれ以上のタンパク質の発現が低減または排除される。
【００１４】
一実施形態では、操作された細胞株は、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＬ１、および／またはカテプシンＺの発現が低減または排除される。別の実施形態では、操作された細胞株は、ホスホリパーゼＢ様２および／またはリポタンパク質リパーゼの発現が低減または排除される。さらなる実施形態では、操作された細胞株は、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＬ１、カテプシンＺ、カルボキシペプチダーゼＤ、カルボキシペプチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＢ１、カルボキシペプチダーゼＥ、ホスホリパーゼＢ様２、リポタンパク質リパーゼ、ペルオキシダシン、セリンプロテアーゼ、中性α−グルコシダーゼ、リシルオキシダーゼ、および／またはジペプチジルペプチダーゼ３の発現が低減または排除される。
【００１５】
他の実施形態では、操作された細胞株は、カルボキシペプチダーゼＤ、カテプシンＤ、クラスタリン、リポタンパク質リパーゼ、メタロプロテイナーゼ阻害剤１、ナイドジェン、ペルオキシダシン、ホスホリパーゼＢ様２、セリンプロテアーゼ、チオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼの１つまたは複数の発現が低減または排除される。
【００１６】
本明細書に開示された、目的の１つまたは複数のＨＣＰの発現が低減または排除された細胞株は、目的のＨＣＰをコードする染色体配列を改変するように遺伝学的に操作される。目的の染色体配列は、標的エンドヌクレアーゼ媒介ゲノム編集技術を用いて改変することができ、これはセクション（ＩＩＩ）で以下に詳述する。例えば、染色体配列は、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、またはそれらの組合せを含むように改変することができ、そのため読み枠がシフトされ、タンパク質産物が生産されない（すなわち、染色体配列が不活性化される）。目的のＨＣＰをコードする染色体配列の一方の対立遺伝子の不活性化は、目的のＨＣＰの発現の低減（すなわち、ノックダウン）をもたらす。目的のＨＣＰをコードする染色体配列の両方の対立遺伝子を不活性化すると、目的のＨＣＰの発現がなくなる（すなわち、ノックアウト）。
【００１７】
一部の実施形態では、目的のＨＣＰのレベルは、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または約９９％より多く低減され得る。他の実施形態では、目的のＨＣＰのレベルは、当該分野で標準的な技術（例えば、ウェスタン免疫ブロッティングアッセイ、ＥＬＩＳＡ酵素アッセイ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動など）を使用して、非検出可能なレベルに低減され得る。
【００１８】
一般に、本明細書に開示された操作された細胞株の細胞生存率、生細胞密度、力価、成長率、増殖応答、細胞形態、アポトーシスおよびオートファジーレベル、および／または一般的な細胞の健康状態は、操作されていない親細胞株のものと類似している。
【００１９】
（ｂ）細胞タイプ
本明細書に開示された操作された細胞株は、哺乳動物細胞株である。一部の実施形態では、操作された細胞株は、ヒト細胞株に由来する可能性がある。好適なヒト細胞株の非限定的な例としては、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ）、ヒト結合組織細胞（ＨＴ−１０８０）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、ヒト胎児網膜細胞（ＰＥＲ．Ｃ６）、ヒト腎臓細胞（ＨＫＢ−１１）、ヒト肝臓細胞（Ｈｕｈ−７）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）、ヒトＵ２−ＯＳ骨肉腫細胞、ヒトＡ５４９肺細胞、ヒトＡ−４３１表皮細胞、またはヒトＫ５６２骨髄細胞が挙げられる。他の実施形態では、操作された細胞株は、非ヒト細胞株に由来する可能性がある。好適な細胞株としては、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、マウス骨髄腫ＮＳ０細胞、マウス骨髄腫Ｓｐ２／０細胞、マウス乳腺Ｃ１２７細胞、マウス胎児線維芽３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、マウスＢリンパ腫Ａ２０細胞、マウス黒色腫Ｂ１６細胞、マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞、マウス胎児間葉系Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２細胞、マウス癌ＣＴ２６細胞、マウス前立腺ＤｕＣｕＰ細胞、マウス乳房ＥＭＴ６細胞、マウス肝細胞癌Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞、マウス骨髄腫Ｊ５５８２細胞、マウス上皮ＭＴＤ−１Ａ細胞、マウス心筋ＭｙＥｎｄ細胞、マウス腎ＲｅｎＣａ細胞、マウス膵臓ＲＩＮ−５Ｆ細胞、マウス黒色腫Ｘ６４細胞、マウスリンパ腫ＹＡＣ−１細胞、ラット膠芽腫９Ｌ細胞、ラットＢリンパ腫ＲＢＬ細胞、ラット神経芽細胞腫Ｂ３５細胞、ラット肝細胞癌細胞（ＨＴＣ）、水牛ラット肝臓ＢＲＬ  ３Ａ細胞、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、イヌ乳腺（ＣＭＴ）細胞、ラット骨肉腫Ｄ１７細胞、ラット単球／マクロファージＤＨ８２細胞、サル腎臓ＳＶ−４０形質転換線維芽（ＣＯＳ７）細胞、サル腎臓ＣＶＩ−７６細胞、またはアフリカミドリザル腎臓（ＶＥＲＯ、ＶＥＲＯ−７６）細胞が挙げられる。哺乳動物細胞株の広範なリストは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎカタログ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に見出される場合がある。一部の実施形態では、本明細書に開示される細胞株は、マウス細胞株以外のものである。特定の実施形態では、操作された細胞株は、ＣＨＯ細胞株である。好適なＣＨＯ細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ、ＣＨＯ  ＧＳ−／−、ＣＨＯ  Ｓ、ＤＧ４４、ＤｕｘｘＢ１１、およびそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない。
【００２０】
様々な実施形態では、親細胞株は、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、またはそれらの組合せを欠損させることができる。例えば、ＧＳ、ＤＨＦＲ、および／またはＨＰＲＴをコードする染色体配列を不活性化することができる。特定の実施形態では、ＧＳ、ＤＨＦＲ、および／またはＨＰＲＴをコードする染色体配列はすべて、親細胞株において不活性化される。
【００２１】
（ｃ）組換えタンパク質をコードする任意の核酸
一部の実施形態では、本明細書に開示された操作された細胞株は、組換えタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸をさらに含むことができる。一般に、組換えタンパク質は異種であり、これは、タンパク質が細胞に対してネイティブではないことを意味する。組換えタンパク質は、限定されないが、抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＩｇＧ分子、ＩｇＧ重鎖、ＩｇＧ軽鎖、ＩｇＡ分子、ＩｇＤ分子、ＩｇＥ分子、ＩｇＭ分子、ワクチン、成長因子、サイトカイン、インターフェロン、インターロイキン、ホルモン、凝固（または凝血）因子、血液成分、酵素、治療用タンパク質、栄養補助タンパク質、前記のいずれかの機能性断片または機能性変異体、または前記のいずれかのタンパク質および／またはその機能性断片または変異体を含む融合タンパク質から選択される治療用タンパク質であってもよい。
【００２２】
一部の実施形態では、組換えタンパク質をコードする核酸は、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、および／またはグルタミンシンターゼ（ＧＳ）をコードする配列に連結することができ、そのようなＨＰＲＴ、ＤＨＦＲ、および／またはＧＳを、増幅可能な選択マーカーとして使用してもよい。組換えタンパク質をコードする核酸はまた、少なくとも１つの抗生物質耐性遺伝子をコードする配列および／または蛍光タンパク質などのマーカータンパク質をコードする配列に連結することができる。一部の実施形態では、組換えタンパク質をコードする核酸は、発現コンストラクトの一部であり得る。発現コンストラクトまたはベクターは、追加の発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終止配列など）、選択マーカー配列、複製開始点などを含むことができる。追加情報は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００３、または「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００１に見出すことができる。
【００２３】
一部の実施形態では、組換えタンパク質をコードする核酸は、染色体外に位置することができる。すなわち、組換えタンパク質をコードする核酸は、プラスミド、コスミド、人工染色体、ミニ染色体、または別の染色体外コンストラクトから一時的に発現させることができる。他の実施形態では、組換えタンパク質をコードする核酸は、細胞のゲノムの染色体に組み込むことができる。組み込みは、ランダムであっても、標的化されていてもよい。その結果、組換えタンパク質は、安定に発現させることができる。本実施形態の一部の反復において、組換えタンパク質をコードする核酸配列は、適切な異種発現制御配列（すなわち、プロモーター）に作動可能に連結することができる。他の反復では、組換えタンパク質をコードする核酸配列は、内因性の発現制御配列の制御下に置くことができる。組換えタンパク質をコードする核酸配列は、相同組換え、標的エンドヌクレアーゼ媒介ゲノム編集、ウイルスベクター、トランスポゾン、プラスミド、および他の公知の手段を用いて、細胞株のゲノムに組み込むことができる。追加の手引きは、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３、上記、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ２００１、上記、に見出すことができる。
【００２４】
（ＩＩ）キット
本開示のさらなる態様は、組換えタンパク質の生産のためのキットを提供し、キットは、上記のセクション（Ｉ）において詳述したいずれかの操作された細胞株を含む。キットはさらに、細胞増殖培地、トランスフェクション試薬、選択培地、組換えタンパク質精製手段、緩衝剤などを含むことができる。本明細書で提供されるキットは、一般に、細胞株を成長させ、組換えタンパク質を生産するためにそれらを使用するための使用説明書を含む。キットに含まれる使用説明書は、包装材料に貼付されていてもよいし、添付文書として含まれていてもよい。使用説明書は、一般的には文書または印刷された材料であるが、これらに限定されるものではない。そのような使用説明書を保存し、エンドユーザに伝達することが可能な任意の媒体が、本開示によって企図される。そのような媒体には、電子保存媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ）などが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「使用説明書」という用語は、使用説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
【００２５】
（ＩＩＩ）操作された細胞株の調製方法
本開示のさらに別の態様は、１つまたは複数のＨＣＰの発現が低減または排除された細胞株を調製または操作するための方法を提供し、上記のセクション（Ｉ）において詳述されている。目的のＨＣＰをコードする染色体配列は、様々な技術を用いてノックダウンまたはノックアウトされ得る。一般的に、標的エンドヌクレアーゼ媒介ゲノム改変プロセスを用いて、操作された細胞株が調製される。当業者は、前記操作された細胞株もまた、部位特異的組換えシステム、ランダム突然変異誘発、または当技術分野で公知の他の方法を用いて調製可能であることを理解している。
【００２６】
一般に、操作された細胞株は、目的の親細胞株に少なくとも１つの標的エンドヌクレアーゼまたは前記標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸を導入すること含む方法によって調製され、標的エンドヌクレアーゼは目的のＨＣＰをコードする染色体配列を標的とする。標的エンドヌクレアーゼは、特定の染色体配列を認識して結合し、二本鎖切断を導入する。一部の実施形態では、二本鎖切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復プロセスによって修復される。ＮＨＥＪは変異性であるので、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、および／または置換が起こる場合があり、それにより、タンパク質産物が生産されないような染色体配列の読み枠フレームが破壊される。他の実施形態では、標的エンドヌクレアーゼはまた、標的化された染色体配列の一部と実質的な配列同一性を有するポリヌクレオチドを同時導入することにより、相同組換え反応を介して染色体配列を変更するために使用することができる。そのような状況では、標的エンドヌクレアーゼによって導入された二本鎖切断は、染色体配列が変化または変更される方法でポリヌクレオチドと交換されるような相同性指向の修復プロセスによって修復される（例えば、外因性配列の組み込みによって）。
【００２７】
（ａ）標的エンドヌクレアーゼ
様々な標的エンドヌクレアーゼを使用して、目的のＨＣＰをコードする染色体配列を改変することができる。標的エンドヌクレアーゼは、天然に存在するタンパク質または操作されたタンパク質であり得る。好適な標的エンドヌクレアーゼには、限定されないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、キメラヌクレアーゼ、部位特異的エンドヌクレアーゼ、および人工標的化ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤が含まれる。
【００２８】
（ｉ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ
特定の実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、一対のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり得る。ＺＦＮは、特定の標的配列に結合し、標的切断部位に二本鎖切断を導入する。一般的に、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメイン（すなわち、ジンクフィンガー）および切断ドメイン（すなわち、ヌクレアーゼ）を含み、それぞれは以下に記載される。
【００２９】
ＤＮＡ結合ドメイン。ＤＮＡ結合ドメインまたはジンクフィンガーは、選択された任意の核酸配列を認識して結合するように操作され得る。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：１３５−１４１、Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  １０：４１１−４１６、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５（４３）：３３８５０−３３８６０、Ｄｏｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２６：７０２−７０８、およびＳａｎｔｉａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０５：５８０９−５８１４を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規な結合特異性を有していてもよい。工学的方法には、これらに限定されないが、合理的設計および様々なタイプの選択が挙げられる。合理的設計は、例えば、ダブレット、トリプレット、および／またはクアドラプレットヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーのアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、各ダブレット、トリプレット、またはクアドラプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドラプレット配列を結合するジンクフィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列と関連している。例えば、米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照されたく、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例として、米国特許第６，４５３，２４２号に記載のアルゴリズムを使用して、予め選択された配列を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを設計することができる。非縮重（ｎｏｎｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）認識コードテーブルを用いた合理的設計などの代替的な方法もまた、特定の配列を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを設計するために使用することができる（Ｓｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：７０７４−７０８１）。ジンクフィンガー結合ドメインの設計と同様に、ＤＮＡ配列中の潜在的な標的部位を同定するための一般に入手可能なウェブベースのツールは、当技術分野で公知である。例えば、ＤＮＡ配列中の潜在的な標的部位を同定するためのツールは、ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｔｏｏｌｓ．ｏｒｇに見い出される。ジンクフィンガー結合ドメインを設計するためのツールは、ｚｉｆｉｔ．ｐａｒｔｎｅｒｓ．ｏｒｇ／ＺｉＦｉＴに見出すことができる。（Ｍａｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ３４：Ｗ５１６−Ｗ５２３、Ｓａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ３５：Ｗ５９９−Ｗ６０５も参照されたい。）
【００３０】
ジンクフィンガー結合ドメインは、長さが約３ヌクレオチドから約２１ヌクレオチドまでの範囲のＤＮＡ配列を認識して結合するように設計することができる。一実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、長さが約９から約１８ヌクレオチドまでの範囲のＤＮＡ配列を認識して結合するように設計することができる。一般に、本明細書で使用されるジンクフィンガーヌクレアーゼのジンクフィンガー結合ドメインは、少なくとも３つのジンクフィンガー認識領域またはジンクフィンガーを含み、各ジンクフィンガーは３つのヌクレオチドを結合する。一実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、４つのジンクフィンガー認識領域を含む。別の実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、５つのジンクフィンガー認識領域を含む。さらに別の実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、６つのジンクフィンガー認識領域を含む。ジンクフィンガー結合ドメインは、任意の好適な標的ＤＮＡ配列に結合するように設計することができる。例えば、米国特許第６，６０７，８８２号、米国特許第６，５３４，２６１号および米国特許第６，４５３，２４２号を参照されたく、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３１】
ジンクフィンガー認識領域を選択する例となる方法には、ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムが含まれ、このことは米国特許第５，７８９，５３８号、米国特許第５，９２５，５２３号、米国特許第６，００７，９８８号、米国特許第６，０１３，４５３号、米国特許第６，４１０，２４８号、米国特許第６，１４０，４６６号、米国特許第６，２００，７５９号、および米国特許第６，２４２，５６８号、ならびにＷＯ９８／３７１８６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７に記載され、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、ＷＯ０２／０７７２２７に記載されており、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３２】
ジンクフィンガー結合ドメインおよび融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者公知であり、例えば、米国特許第７，８８８，１２１号に詳細に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ジンクフィンガー認識領域および／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、例えば、長さが５個またはそれを超えるアミノ酸のリンカーを含む、好適なリンカー配列を使用して一緒に連結することができる。長さ６個またはそれを超えるアミノ酸のリンカー配列の非限定的な例については、米国特許第６，４７９，６２６号、米国特許第６，９０３，１８５号、および米国特許第７，１５３，９４９号を参照されたく、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のジンクフィンガー結合ドメインは、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーの組合せを含んでもよい。
【００３３】
切断ドメイン。ジンクフィンガーヌクレアーゼはまた、切断ドメインを含む。ジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得るエンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、これらに限定されないが、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓカタログまたはＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断する追加の酵素が知られている（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、緑豆ヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅＩ、小球菌ヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ）。Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３も参照されたい。これらの酵素（またはその機能性断片）のうちの１つまたは複数を、切断ドメインの供給源として使用することができる。
【００３４】
切断ドメインはまた、上述のように、切断活性のために二量体形成を必要とする酵素またはその一部に由来するものでもよい。各ヌクレアーゼが活性酵素二量体の単量体を含むため、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼが切断に必要とされ得る。あるいは、単一のジンクフィンガーヌクレアーゼは、活性酵素二量体を生成するために両方の単量体を含むことができる。本明細書で使用される場合、「活性酵素二量体」とは、核酸分子を切断することができる酵素二量体である。２つの切断単量体は、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能性断片）に由来するものでもよく、または各単量体は、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能性断片）に由来するものでもよい。
【００３５】
２つの切断単量体を使用して活性酵素二量体を形成する場合、２つのジンクフィンガーのそれぞれの認識部位への結合が、切断単量体を互いに空間的に配向するように配置し、このことが例えば二量体化することによって、切断単量体が活性酵素二量体を形成することを可能にするように、２つのジンクフィンガーの認識部位は、好ましくは、配置される。その結果、認識部位の端近傍は、約５から約１８ヌクレオチドで分離することができる。例えば、端近傍は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８ヌクレオチドによって分離することができる。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの認識部位の間に介在し得る（例えば、約２から約５０ヌクレオチド対またはそれを超える）ことが理解されるであろう。例えば、本明細書に詳細に記載されるようなジンクフィンガーヌクレアーゼの認識部位の端近傍は、６ヌクレオチドによって分離することができる。一般に、切断部位は、認識部位の間にある。
【００３６】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、（認識部位での）ＤＮＡへの配列特異的な結合、および結合部位またはその近傍でのＤＮＡの切断が可能である。ある種の制限酵素（例えば、タイプＩＩＳ）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、タイプＩＩＳ酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上の認識部位から９ヌクレオチド、および他方の鎖上の認識部位から１３ヌクレオチドの位置で、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、米国特許第５，４３６，１５０号、および米国特許第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：４２７５−４２７９、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：２７６４−２７６８、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４ａ）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：８８３−８８７、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４ｂ）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：３１９７８−３１９８２を参照されたい。したがって、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、少なくとも１つのタイプＩＩＳ制限酵素からの切断ドメインと、１つまたは複数のジンクフィンガー結合ドメインを含むことができるが、これらのドメインは、操作されていても、操作されていなくてもよい。例となるタイプＩＩＳ制限酵素は、例えば国際公開ＷＯ０７／０１４，２７５に記載されており、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。追加の制限酵素もまた、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを含み、これらもまた、本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１：４１８−４２０を参照されたい。
【００３７】
切断ドメインが結合ドメインから分離可能なタイプＩＩＳ制限酵素の例として、ＦｏｋＩが挙げられる。この特定の酵素は、二量体として活性である（Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：１０，５７０−１０，５７５）。その結果、本開示の目的のために、ジンクフィンガーヌクレアーゼで使用されるＦｏｋＩ酵素の部分は、切断単量体であると考えられる。したがって、ＦｏｋＩ切断ドメインを使用した標的化二本鎖切断のために、ＦｏｋＩ切断単量体を含む２つのジンクフィンガーヌクレアーゼをそれぞれ使用して、活性酵素二量体を再構成することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインと２つのＦｏｋＩ切断単量体を含む単一のポリペプチド分子を使用することもできる。
【００３８】
特定の実施形態では、切断ドメインは、ホモ二量体化を最小化するかまたは防止する１つまたは複数の操作された切断単量体を含む。非限定的な例として、ＦｏｋＩの位置４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８のアミノ酸残基は、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量化に影響を与えるためのすべての標的である。絶対ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例となる操作された切断単量体は、第１の切断単量体がＦｏｋＩのアミノ酸残基位置４９０および５３８における突然変異を含む対と、第２の切断単量体がアミノ酸残基位置４８６および４９９における突然変異を含む対とを含む。
【００３９】
したがって、操作された切断単量体の一実施形態では、アミノ酸位置４９０における突然変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し、アミノ酸残基５３８における突然変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し、アミノ酸残基４８６における突然変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）に置換し、および位置４９９における突然変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換する。具体的には、ある切断単量体において、位置４９０でＥからＫへ、および位置５３８でＩからＫへ突然変異させて「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と指定された操作された切断単量体を生成することにより、および別の切断単量体において、位置４８６でＱからＥへ、および位置４９９でＩからＫへ突然変異させて「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｋ」と指定された操作された切断単量体を生成することにより、操作された切断単量体を調製することができる。上記の操作された切断単量体は、異常切断が最小化されるかまたは廃止される絶対ヘテロ二量体突然変異体である。操作された切断単量体は、好適な方法、例えば、米国特許第７，８８８，１２１号に記載され、その全体が本明細書に組み込まれる、野生型切断単量体（ＦｏｋＩ）の部位特異的変異誘発により調製することができる。
【００４０】
追加のドメイン。一部の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、少なくとも１つの核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む。ＮＬＳは、染色体中の標的配列に二本鎖切断を導入するために、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質を核内に標的化することを容易にするアミノ酸配列である。核局在化シグナルは、当技術分野で公知である（例えば、Ｌａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００７，  ２８２：５１０１−５１０５を参照されたい）。核局在化シグナルの非限定的な例としては、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）、ＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号２）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号５）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号６）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号７）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号８）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号９）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１０）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１１）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１２）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１３）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１４）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１５）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１６）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号１７）、およびＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号１８）が挙げられる。ＮＬＳは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはジンクフィンガーヌクレアーゼの内部位置に位置し得る。
【００４１】
さらなる実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼはまた、少なくとも１つの細胞貫通ドメインを含むことができる。好適な細胞貫通ドメインの例としては、限定されないが、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１９）、ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２０）、ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２１）、ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２２）、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２３）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号２４）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号２５）、ＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号２６）、ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号２７）、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２８）、ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号２９）、およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３０）が挙げられる。細胞貫通ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはジンクフィンガーヌクレアーゼの内部位置に位置し得る。
【００４２】
さらに他の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、少なくとも１つのマーカードメインをさらに含むことができる。マーカードメインの非限定的な例としては、蛍光タンパク質、精製タグ、およびエピトープタグが挙げられる。一実施形態では、マーカードメインは、蛍光タンパク質であり得る。好適な蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えばＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、およびオレンジ蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、または任意の他の好適な蛍光タンパク質、が挙げられる。別の実施形態では、マーカードメインは、精製タグおよび／またはエピトープタグであり得る。好適なタグとしては、これらに限定されないがポリ（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧ（またはＤＤＫ）タグ、Ｈａｌｏタグ、ＡｃＶ５タグ、ＡＵ１タグ、ＡＵ５タグ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、Ｅタグ、Ｅ２タグ、ＥＣＳタグ、ｅＸａｃｔタグ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＨＡタグ、ＨＳＶタグ、ＫＴ３タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＭＡＰタグ、Ｍｙｃタグ、ＮＥタグ、ＮｕｓＡタグ、ＰＤＺタグ、Ｓタグ、Ｓ１タグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ  １タグ、Ｓｏｆｔａｇ  ３タグ、Ｓｐｏｔタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＳＵＭＯタグ、Ｔ７タグ、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、チオレドキシン（ＴＲＸ）、Ｖ５タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、およびＸａタグ、が挙げられる。マーカードメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはジンクフィンガーヌクレアーゼの内部位置に位置することができる。
【００４３】
少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞貫通ドメイン、および／または少なくとも１つのマーカードメインは、１つまたは複数の化学結合（例えば、共有結合）を介してジンクフィンガーヌクレアーゼに直接連結することができる。あるいは、少なくとも１つの核局在シグナル、少なくとも１つの細胞貫通ドメイン、および／または少なくとも１つのマーカードメインは、１つまたは複数のリンカーを介して、ジンクフィンガーヌクレアーゼに間接的に連結することができる。好適なリンカーは、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、核酸、有機リンカー分子（例えば、マレイミド誘導体、Ｎ−エトキシベンジルイミダゾール、ビフェニル−３，４’，５−トリカルボン酸、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニルなど）、ジスルフィドリンカー、およびポリマーリンカー（例えば、ＰＥＧ）を含む。リンカーは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニルなどを含むがこれらに限定されない、１つまたは複数のスペーシング基を含むことができる。リンカーは、中性であってもよく、正または負の電荷を担持していてもよい。さらに、リンカーは、リンカーを別の化学基に連結するリンカーの共有結合が、ｐＨ、温度、塩濃度、光、触媒、または酵素を含む特定の条件下で破断または切断されるように、切断可能であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーであり得る。ペプチドリンカーは、可動性アミノ酸リンカーまたは剛性アミノ酸リンカーであり得る。好適なリンカーの追加の例は、当技術分野で周知であり、リンカーを設計するためのプログラムは、容易に入手可能である（Ｃｒａｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，  ２０００，  １３（５）：３０９−３１２）。
【００４４】
（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）
他の実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼであり得る。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、細菌または古細菌のＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムに由来するＲＮＡガイドヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰシステムは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを含む。
【００４５】
ヌクレアーゼ。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、タイプＩ（すなわち、ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、ＩＥ、またはＩＦ）、タイプＩＩ（すなわち、ＩＩＡ、ＩＩＢ、またはＩＩＣ）、タイプＩＩＩ（すなわち、ＩＩＩＡまたはＩＩＩＢ）、タイプＶ、またはタイプＶＩのＣＲＩＳＰＲシステムに由来するものでもよく、様々な細菌および古細菌に存在する。例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．（例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐ．（例えば、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｓｐ．、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｓｐ．、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ  ｓｐ．、Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｐ．、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｓｐ．、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｓｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｓｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｓｐ．、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐ．、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ  ｓｐ．、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ｓｐ．、またはＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ  ｓｐ．に由来するものでもよい。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、古細菌ＣＲＩＳＰＲシステム、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＸシステム、またはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＹシステムに由来すものでもよい（Ｂｕｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２０１７，  ５４２（７６４０）：２３７−２４１）。
【００４６】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに由来するものでもよい。例えば、タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質であり得る。好適なＣａｓ９ヌクレアーゼには、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ  Ｃａｓ９（ＦｎＣａｓ９）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ｃａｓ９（ＳｔＣａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ（ＳｐａＣａｓ９）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  Ｃａｓ９（ＮｍＣａｓ９）、またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ  Ｃａｓ９（ＮｃＣａｓ９）が含まれる。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼのようなタイプＶのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに由来するものでもよい。好適なＣｐｆ１ヌクレアーゼには、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ  Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）、またはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＤ２００６  Ｃｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）が含まれる。さらに別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、タイプＶＩ  ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えば、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉ  Ｃａｓ１３ａ（ＬｗａＣａｓ１３ａ）またはＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ  Ｃａｓ１３ａ（ＬｓｈＣａｓ１３ａ）に由来するものでもよい。
【００４７】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、野生型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、改変ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、または野生型もしくは改変ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの断片であり得る。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、核酸結合親和性および／または特異性を増加させ、酵素活性を変化させ、および／またはタンパク質の別の性質を変化させるように改変することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ）ドメインは、改変、削除、または不活性化することができる。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ヌクレアーゼの機能に必須ではないドメインを除去するために切断され得る。
【００４８】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、２つのヌクレアーゼドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ相補鎖を切断するＨＮＨドメインおよび非相補鎖を切断するＲｕｖＣドメインを含み、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼはＲｕｖＣドメインおよびＮＵＣドメインを含み、Ｃａｓ１３ａヌクレアーゼは２つのＨＮＥＰＮドメインを含む。両方のヌクレアーゼドメインが機能している場合、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは二本鎖切断を導入する。いずれかのヌクレアーゼドメインは、１つまたは複数の突然変異および／または欠失によって不活性化され得、それによって、二本鎖配列の１つの鎖に一本鎖切断を導入する変異体を生成する。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＲｕｂＣドメインにおける１つまたは複数の突然変異（例えば、Ｄ１０Ａ、Ｄ８Ａ、Ｅ７６２Ａ、および／またはＤ９８６Ａ）は、ガイドＲＮＡ相補鎖に切れ目を入れるＨＮＨニッカーゼをもたらし、およびＣａｓ９ヌクレアーゼのＨＮＨドメインにおける１つまたは複数の突然変異（例えば、Ｈ８４０Ａ、Ｈ５５９Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８５６Ａ、および／またはＮ８６３Ａ）は、ガイドＲＮＡ非相補鎖に切れ目を入れるＲｕｖＣニッカーゼをもたらす。同等の突然変異は、Ｃｐｆ１およびＣａｓ１３ａヌクレアーゼをニッカーゼに変換することができる。染色体配列の反対側の鎖に標的化された２つのＣＲＩＳＰＲニッカーゼを（一対のオフセットガイドＲＮＡを介して）組み合わせて使用して、染色体配列に二本鎖切断を生じさせることができる。デュアルＣＲＩＳＰＲニッカーゼＲＮＰは、標的特異性を高め、オフターゲット効果を低下することができる。
【００４９】
追加のドメイン。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、少なくとも１つの核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含むことができる。ＮＬＳは、染色体中の標的配列に二本鎖切断を導入するために、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質を核内に標的化することを容易にするアミノ酸配列である。核局在化シグナルは、当技術分野で公知である（例えば、Ｌａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００７，  ２８２：５１０１−５１０５を参照されたい）。核局在化シグナルの非限定的な例としては、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）、ＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号２）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号５）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号６）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号７）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号８）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号９）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１０）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１１）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１２）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１３）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１４）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１５）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１６）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号１７）、およびＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号１８）が挙げられる。ＮＬＳは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの内部位置に位置し得る。
【００５０】
さらなる実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはまた、少なくとも１つの細胞貫通ドメインを含むことができる。好適な細胞貫通ドメインの例としては、限定されないが、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１９）、ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２０）、ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２１）、ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２２）、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２３）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号２４）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号２５）、ＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号２６）、ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号２７）、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２８）、ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号２９）、およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３０）が挙げられる。細胞貫通ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣＲＩＳＰＲタンパク質の内部位置に位置し得る。
【００５１】
さらに他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、少なくとも１つのマーカードメインをさらに含むことができる。マーカードメインの非限定的な例としては、蛍光タンパク質、精製タグ、およびエピトープタグが挙げられる。一実施形態では、マーカードメインは、蛍光タンパク質であり得る。好適な蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えばＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、およびオレンジ蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、または任意の他の好適な蛍光タンパク質、が挙げられる。別の実施形態では、マーカードメインは、精製タグおよび／またはエピトープタグであり得る。好適なタグとしては、これらに限定されないがポリ（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧ（またはＤＤＫ）タグ、Ｈａｌｏタグ、ＡｃＶ５タグ、ＡＵ１タグ、ＡＵ５タグ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、Ｅタグ、Ｅ２タグ、ＥＣＳタグ、ｅＸａｃｔタグ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＨＡタグ、ＨＳＶタグ、ＫＴ３タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＭＡＰタグ、Ｍｙｃタグ、ＮＥタグ、ＮｕｓＡタグ、ＰＤＺタグ、Ｓタグ、Ｓ１タグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ  １タグ、Ｓｏｆｔａｇ  ３タグ、Ｓｐｏｔタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＳＵＭＯタグ、Ｔ７タグ、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、チオレドキシン（ＴＲＸ）、Ｖ５タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、およびＸａタグ、が挙げられる。マーカードメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの内部位置に位置することができる。
【００５２】
少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞貫通ドメイン、および／または少なくとも１つのマーカードメインは、１つまたは複数の化学結合（例えば、共有結合）を介してＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに直接連結することができる。あるいは、少なくとも１つの核局在シグナル、少なくとも１つの細胞貫通ドメイン、および／または少なくとも１つのマーカードメインは、１つまたは複数のリンカーを介して、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに間接的に連結することができる。好適なリンカーは、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、核酸、有機リンカー分子（例えば、マレイミド誘導体、Ｎ−エトキシベンジルイミダゾール、ビフェニル−３，４’，５−トリカルボン酸、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニルなど）、ジスルフィドリンカー、およびポリマーリンカー（例えば、ＰＥＧ）を含む。リンカーは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニルなどを含むがこれらに限定されない、１つまたは複数のスペーシング基を含むことができる。リンカーは、中性であってもよく、正または負の電荷を担持していてもよい。さらに、リンカーは、リンカーを別の化学基に連結するリンカーの共有結合が、ｐＨ、温度、塩濃度、光、触媒、または酵素を含む特定の条件下で破断または切断されるように、切断可能であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーであり得る。ペプチドリンカーは、可動性アミノ酸リンカーまたは剛性アミノ酸リンカーであり得る。好適なリンカーの追加の例は、当技術分野で周知であり、リンカーを設計するためのプログラムは、当技術分野で容易である。
【００５３】
ガイドＲＮＡ。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡによって標的部位に誘導される。ガイドＲＮＡは標的部位にハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用して、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを染色体配列中の標的部位に誘導する。標的部位は、配列がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）によって縁取られていることを除いて、配列の制限を持たない。異なる細菌種由来のＣＲＩＳＰＲタンパク質は、異なるＰＡＭ配列を認識する。例えば、ＰＡＭ配列としては、５’−ＮＧＧ（ＳｐＣａｓ９、ＦｎＣＡｓ９）、５’−ＮＧＲＲＴ（ＳａＣａｓ９）、５’−ＮＮＡＧＡＡＷ（ＳｔＣａｓ９）、５’−ＮＮＮＮＧＡＴＴ（ＮｍＣａｓ９）、５−ＮＮＮＮＲＹＡＣ（ＣｊＣａｓ９）、および５’−ＴＴＴＶ（Ｃｐｆ１）が挙げられ、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドとして定義され、ＲはＧまたはＡのいずれかとして定義され、ＷはＡまたはＴのいずれかとして定義され、ＹはＣまたはＴのいずれかとして定義され、ＶはＡ、ＣまたはＧとして定義される。Ｃａｓ９  ＰＡＭは標的部位の３’に位置し、ｃｐｆ１  ＰＡＭは標的部位の５’に位置する。
【００５４】
ガイドＲＮＡは、３つの領域：標的部位の配列に相補的な５’末端の第１の領域、ステムループ構造を形成する第２の内部領域、および本質的に一本鎖のままの第３の３’領域、を含む。各ガイドＲＮＡの第１の領域は、各ガイドＲＮＡがＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを特定の標的部位に誘導するように異なる。各ガイドＲＮＡの第２および第３の領域（足場領域とも呼ばれる）は、すべてのガイドＲＮＡにおいて同じであり得る。
【００５５】
ガイドＲＮＡの第１の領域は、ガイドＲＮＡの第１の領域が標的部位の配列と塩基対をなすことができるように、標的部位の配列（すなわち、プロトスペーサー配列）と相補的である。ガイドＲＮＡの第１の領域（すなわち、ｃｒＲＮＡ）と標的配列との間の相補性は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超であり得る。一般に、ガイドＲＮＡの第１の領域の配列と標的部位の配列との間にはミスマッチは存在しない（すなわち、相補性は完全である）。様々な実施形態では、ガイドＲＮＡの第１の領域は、約１０ヌクレオチドから約２５ヌクレオチド超までを含むことができる。例えば、ガイドＲＮＡの第１の領域と染色体配列中の標的部位との間の塩基対の領域は、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、または２５ヌクレオチド超の長さであり得る。例となる実施形態では、ガイドＲＮＡの第１の領域は、長さが約１９、２０、または２１ヌクレオチドである。
【００５６】
ガイドＲＮＡはまた、二次構造を形成する第２の領域を含む。一部の実施形態では、二次構造は、ステム（またはヘアピン）およびループを含む。ループおよびステムの長さは、変化し得る。例えば、ループは、長さが約３から約１０ヌクレオチドの範囲であり得、ステムは、長さが約６から約２０塩基対の範囲であり得る。ステムは、約１から約１０ヌクレオチドの１つまたは複数のバルジを含むことができる。したがって、第２の領域の全長は、長さが約１６から約６０ヌクレオチドの範囲であり得る。例となる実施形態では、ループは約４ヌクレオチドの長さであり、ステムは約１２塩基対を含む。
【００５７】
ガイドＲＮＡはまた、本質的に一本鎖のままの３’末端の第３の領域を含む。したがって、第３の領域は、目的の細胞内のいかなる染色体配列に対しても相補性を持たず、ガイドＲＮＡの残りの部分に対しても相補性を持たない。第３の領域の長さは、変化し得る。一般に、第３の領域の長さは、約４ヌクレオチド超である。例えば、第３の領域の長さは、約５から約６０ヌクレオチドの長さの範囲であり得る。
【００５８】
ガイドＲＮＡの第２および第３の領域（または足場）の合計した長さは、約３０から約１２０ヌクレオチドまでの長さの範囲であり得る。一態様では、ガイドＲＮＡの第２および第３の領域の合計した長さは、約７０から約１００ヌクレオチドまでの長さの範囲である。
【００５９】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、３つの領域すべてを含む１つの分子を含む。他の実施形態では、ガイドＲＮＡは、２つの別々の分子を含むことができる。第１のＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡの第１の（５’）領域、およびガイドＲＮＡの第２の領域の「ステム」の１／２を含むことができる。第２のＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡの第２の領域の「ステム」の他の半分、およびガイドＲＮＡの第３の領域を含むことができる。したがって、本実施形態では、第１および第２のＲＮＡ分子は、それぞれ、互いに相補的なヌクレオチドの配列を含む。例えば、一実施形態では、第１および第２のＲＮＡ分子は、それぞれ、機能的ガイドＲＮＡを形成するために他の配列に塩基対をなす配列（約６から約２０ヌクレオチド）を含む。
【００６０】
（ｉｉｉ）その他の標的エンドヌクレアーゼ
さらなる実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼであり得る。メガヌクレアーゼは、長い認識配列、すなわち、認識配列は、一般に約１２塩基対から約４０塩基対までの範囲であることを特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼである。この必要条件の結果として、認識配列は一般に、どのゲノムにも一度しか存在しない。メガヌクレアーゼの中でも、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧと名付けられたホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーは、ゲノムの研究およびゲノム工学のための貴重なツールとなっている（例えば、Ａｒｎｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ，  ２４（１−２）：２７−３１を参照されたい）。他の好適なメガヌクレアーゼとしては、Ｉ−ＣｒｅＩおよびＩ−ＤｍｏＩが挙げられる。メガヌクレアーゼは、当業者周知の技術を用いて認識配列を改変することにより、特定の染色体配列に標的化することができる。
【００６１】
追加の実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼであり得る。ＴＡＬＥは、新しいＤＮＡ標的に結合するように容易に操作することができる植物病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来の転写因子である。ＴＡＬＥヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮと呼ばれる標的エンドヌクレアーゼを作成するために、ＦｏｋＩなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインにＴＡＬＥまたはその切断されたバージョンを連結してもよい（Ｓａｎｊａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ，  ７（１）：１７１−１９２）、およびＡｒｎｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  ２４（１−２）：２７−３１）。
【００６２】
代替の実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、キメラヌクレアーゼであり得る。キメラヌクレアーゼの非限定的な例としては、ＺＦ−メガヌクレアーゼ、ＴＡＬ−メガヌクレアーゼ、Ｃａｓ９−ＦｏｋＩ融合体、ＺＦ−Ｃａｓ９融合体、ＴＡＬ−Ｃａｓ９融合体などが挙げられる。当業者は、そのようなキメラヌクレアーゼ融合体を生成するための手段に精通している。
【００６３】
さらに他の実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、部位特異的エンドヌクレアーゼであり得る。特に、部位特異的エンドヌクレアーゼは、認識配列がゲノム中に稀に存在する「レアカッター」エンドヌクレアーゼであり得る。あるいは、部位特異的エンドヌクレアーゼは、目的の部位を切断するように操作され得る（Ｆｒｉｅｄｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３５２：１１１０１２３）。一般に、部位特異的エンドヌクレアーゼの認識配列は、ゲノム中に一度だけ存在する。代替のさらなる実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、人工標的化ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤であり得る。
【００６４】
（ｂ）標的エンドヌクレアーゼの細胞へのデリバリー
方法は、標的エンドヌクレアーゼを目的の親細胞株に導入することを含む。標的エンドヌクレアーゼは、精製単離されたタンパク質として、または標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸として細胞に導入することができる。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。コードする核酸がｍＲＮＡである実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャッピングおよび／または３’ポリアデニル化されていてもよい。コードする核酸がＤＮＡである実施形態では、ＤＮＡは、直鎖状または環状であり得る。核酸は、プラスミドまたはウイルスベクターの一部であり得、コードするＤＮＡは、好適なプロモーターに作動可能に連結され得る。当業者は、適切なベクター、プロモーター、他の制御要素、およびベクターを目的の細胞に導入するための手段に精通している。標的エンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムは、ｇＲＮＡ−タンパク質複合体として細胞内に導入することができる。
【００６５】
標的エンドヌクレアーゼ分子は、様々な手段で細胞内に導入することができる。好適なデリバリー手段としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、微粒子銃、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、カチオン性トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、ヒートショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペイルフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、光学的トランスフェクション、核酸の固有の薬剤促進取り込み、ならびにリポソーム、免疫リポソーム、ビロソーム、もしくは人工ビリオンを介したデリバリーが挙げられる。特定の実施形態では、標的エンドヌクレアーゼ分子は、ヌクレオフェクションによって細胞内に導入される。
【００６６】
任意選択のドナーポリヌクレオチド。標的ゲノム改変または操作のための方法は、標的染色体配列に対して少なくとも１つのヌクレオチド変化を有する配列を含む少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを細胞内に導入することをさらに含むことができる。標的エンドヌクレアーゼによって導入された二本鎖切断を相同性指向の修復プロセスによって修復することができ、ドナーポリヌクレオチドの配列を染色体配列に挿入または交換することができ、それによって染色体配列を改変することができるように、ドナーポリヌクレオチドは、染色体配列中の標的部位またはその近傍の配列と実質的な配列同一性を有する。例えば、ドナーポリヌクレオチドは、標的部位の一方の側の配列に対して実質的な配列同一性を有する第１の配列、および標的部位の他方の側の配列に対して実質的な配列同一性を有する第２の配列を含むことができる。ドナーポリヌクレオチドは、標的染色体配列に組み込むためのドナー配列をさらに含むことができる。例えば、外因性配列の統合がリーディングフレームを破壊し、標的染色体配列を不活性化するように、ドナー配列は、外因性配列（例えば、マーカー配列）であり得る。
【００６７】
染色体配列中の標的部位またはその近傍の配列と実質的な配列同一性を有するドナーポリヌクレオチド中の第１および第２の配列の長さは、変化し得るし、また変化するであろう。一般に、ドナーポリヌクレオチド中の第１および第２の配列のそれぞれは、少なくとも約１０ヌクレオチドの長さである。様々な実施形態では、染色体配列と実質的な配列同一性を有するドナーポリヌクレオチド配列は、約１５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、または約１００ヌクレオチド超の長さであり得る。
【００６８】
「実質的な配列同一性」という表現は、ポリヌクレオチド中の配列が、目的の染色体配列と少なくとも約７５％の配列同一性を有することを意味する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド中の配列は、目的の染色体配列と約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【００６９】
ドナーポリヌクレオチドの長さは、変化し得るし、また変化するであろう。例えば、ドナーポリヌクレオチドは、長さが約２０ヌクレオチドから約２００，０００ヌクレオチドまでの範囲であり得る。様々な実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、長さが約２０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドまで、長さが約１００ヌクレオチドから約１０００ヌクレオチドまで、長さが約１０００ヌクレオチドから約１００００ヌクレオチドまで、長さが約１００００ヌクレオチドから約１００，０００ヌクレオチドまで、または長さが約１００，０００ヌクレオチドから約２００，０００ヌクレオチドまでの範囲であり得る。
【００７０】
一般的に、ドナーポリヌクレオチドはＤＮＡである。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡは、直鎖状または環状であり得る。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、約２００未満のヌクレオチドを含む一本鎖の直鎖状オリゴヌクレオチドであり得る。他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドはベクターの一部であり得る。好適なベクターは、ＤＮＡプラスミド、ウイルスベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、および酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む。さらに他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、リポソームまたはポロキサマーなどのデリバリー媒体と複合化したＰＣＲ断片または核酸であり得る。
【００７１】
ドナーポリヌクレオチドは、標的エンドヌクレアーゼ分子と同時に細胞に導入することができる。あるいは、ドナーポリヌクレオチドと標的エンドヌクレアーゼ分子を逐次細胞内に導入することができる。ドナーポリヌクレオチドに対する標的エンドヌクレアーゼ分子の比は、変化し得るし、また変化するであろう。一般に、ドナーポリヌクレオチドに対する標的エンドヌクレアーゼ分子の比は、約１：１０から約１０：１の範囲である。様々な実施形態では、ポリヌクレオチドに対する標的エンドヌクレアーゼ分子の比は、約１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または１０：１の範囲であり得る。一実施形態では、比は約１：１である。
【００７２】
（ｃ）細胞の培養
方法はさらに、標的エンドヌクレアーゼによって導入された二本鎖切断が、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入および／または置換によって染色体配列が改変されるような非相同末端結合修復プロセス、または適宜、（ｉｉ）染色体配列が改変されるように染色体配列がポリヌクレオチド配列と交換されるような相同性指向修復プロセス、によって修復されるように、適切な条件下で細胞を維持することを含む。標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸を細胞に導入する実施形態では、方法は、細胞が標的エンドヌクレアーゼを発現するように適切な条件下で細胞を維持することを含む。
【００７３】
一般に、細胞は、細胞増殖および／または維持のために適切な条件で維持される。好適な細胞培養条件は当技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｎｔｉａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  ＰＮＡＳ  １０５：５８０９−５８１４、Ｍｏｅｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  ＰＮＡＳ  １０４：３０５５−３０６０、Ｕｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：６４６−６５１、およびＬｏｍｂａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５：１２９８−１３０６に記載される。当業者は、細胞を培養するための方法が当技術分野で公知であり、細胞タイプに応じて異なることができ、また異なるであろうことを理解する。日常業務最適化を使用して、すべての場合において、特定の細胞タイプに対する最良の技術を決定してもよい。
【００７４】
プロセスのこのステップの間に、標的エンドヌクレアーゼは、染色体配列中の標的切断部位で二本鎖切断を認識、結合、および作成し、二本鎖切断の修復の間に、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、および／または置換が標的染色体配列に導入される。特定の実施形態では、標的染色体配列は不活性化される。
【００７５】
目的の染色体配列が改変されていることが確認された後、単一細胞クローンを単離し、（ＤＮＡ配列決定および／またはタンパク質解析を介して）遺伝子型を決定することができる。１つの改変された染色体配列を含む細胞は、追加の染色体配列を改変するために、１回または複数回の追加の標的ゲノム改変を受けることができ、それにより、ダブルノックアウト、トリプルノックアウトなどを作成することができる。
【００７６】
（ＩＶ）低レベルの残留ＨＣＰを有する組換えタンパク質の生産
本開示の別の態様は、残留ＨＣＰのレベルを低減した組換えタンパク質を生産する方法、または生物学的生産システムで生産される組換えタンパク質中のＨＣＰ汚染のレベルを低減する方法を包含する。好適な組換えタンパク質は、セクション（Ｉ）（ｃ）に記載されている。方法は、上記セクション（Ｉ）に記載のいずれかの操作された細胞株で目的の組換えタンパク質を発現させること、および発現された組換えタンパク質を精製すること、を含む。組換えタンパク質を生産または製造するための手段は、当該分野で周知である（例えば、「Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」，  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  （ｅｄ），  ２０１２，  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ；  ＩＳＢＮ：９７８−３−５２７−３３０２９−４を参照されたい）。
【００７７】
組換えタンパク質は、清澄化、例えば、濾過、およびクロマトグラフィー、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、プロテインＡ（またはＧ）クロマトグラフィー、イオン交換（すなわち、カチオンおよび／またはアニオン）クロマトグラフィーの１つまたは複数のステップを含むプロセスを介して精製することができる。当業者であれば、追加の精製プロセスとしては、限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、遠心分離、超遠心分離、沈殿、免疫沈降、抽出、相分離などが使用され得ることを理解するであろう。一般に、本明細書に開示された哺乳動物細胞株によって発現された組換えタンパク質の精製は、宿主細胞タンパク質の汚染レベルが低いため、より少ない精製ステップを含むことができる。したがって、従来の発現系と比較して、精製時間およびコストを低減することができる。
【００７８】
本明細書に開示された操作された細胞株によって生産された組換えタンパク質は、操作されていない親細胞株によって生産された組換えタンパク質と比較して、ＨＣＰのレベルが低下している。一般に、本明細書に開示された細胞株によって生産された組換えタンパク質中のＨＣＰの残留レベルは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＩＣＧ）ガイドラインに従った認証された方法を用いて測定した場合、１００ｐｐｍ未満、３０ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満、３ｐｐｍ未満、１ｐｐｍ未満、０．３ｐｐｍ未満、０．１ｐｐｍ未満、０．０３ｐｐｍ未満、０．０１ｐｐｍ未満、０．００３ｐｐｍ未満、または０．００１ｐｐｍ未満である。好適な方法としては、ウェスタン免疫ブロッティングアッセイ、ＥＬＩＳＡ酵素アッセイ、一次元または二次元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、二次元ディファレンシャルゲル電気泳動（ＤＩＧＥ）、キャピラリーゾーン電気泳動−エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析法（ＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）、二次元−液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法（２Ｄ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）などが挙げられる。
【００７９】
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （２ｎｄ  ｅｄ．  １９９４）、Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，  １９８８）、Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｒ．  Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  （１９９１）、およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，  Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９１）。本明細書で使用される場合、以下の用語は、特別の定めのない限り、それらに付随する意味を有する。
【００８０】
本開示の要素またはその好ましい実施形態を導入する場合、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「ｓａｉｄ」という冠詞は、１つまたは複数の要素が存在することを意味することが意図されている。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、包括的であることが意図されており、記載された要素以外の追加の要素が存在してもよいことを意味する。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「内因性配列」という用語は、細胞に固有の染色体配列を表す。
【００８２】
「外因性配列」という用語は、細胞に固有ではない染色体配列、または異なる染色体位置に移動した染色体配列を表す。
【００８３】
「操作された」または「遺伝子改変された」細胞とは、ゲノムが改変または操作された細胞を表し、すなわち、その細胞は、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、および／または少なくとも１つのヌクレオチドの置換を含むように操作された染色体配列を少なくとも含む。
【００８４】
「ゲノム改変」および「ゲノム編集」という用語は、それによって染色体配列が改変されるように特定の染色体配列が変えられるプロセスを表す。染色体配列は、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、および／または少なくとも１つのヌクレオチドの置換を含むように改変されてもよい。改変された染色体配列は、産物が作られないように不活性化される。あるいは、変更された産物が作られるように、染色体配列を改変することもできる。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「遺伝子」とは、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（エクソンおよびイントロンを含む）、ならびにそのような調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているか否かにかかわらず、遺伝子産物の生産を調節するすべてのＤＮＡ領域を表す。その結果、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および配列内リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製開始点、マトリックス付着部位、および遺伝子座調節領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００８６】
「異種」という用語は、目的の細胞または種に固有ではない実体を表す。
【００８７】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、直鎖状または環状の立体配座のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを表す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して制限するものとして解釈されるものではない。用語は、天然ヌクレオチドの既知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分で改変されたヌクレオチドを包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同一の塩基対特異性を有する、すなわち、ＡのアナログはＴと塩基対をなす。核酸またはポリヌクレオチドのヌクレオチドは、ホスホジエステル結合、ホスホチオエート結合、ホスホラミダイト結合、ホスホロジアミダイト結合、またはそれらの組合せによって連結されていてもよい。
【００８８】
「ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを表す。ヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、およびウリジン）またはヌクレオチドアナログであってもよい。ヌクレオチドアナログとは、改変されたプリンもしくはピリミジン塩基または改変されたリボース部分を有するヌクレオチドを表す。ヌクレオチドアナログは、天然に存在するヌクレオチド（例えば、イノシン）または非天然に存在するヌクレオチドであってもよい。ヌクレオチドの糖または塩基部分の改変の非限定的な例としては、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の付加（または除去）、ならびに塩基の炭素原子および窒素原子を他の原子（例えば、７−デアザプリン）で置換することが挙げられる。ヌクレオチドアナログはまた、ジデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびモルホリノを含む。
【００８９】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを表すために同じ意味で使用される。
【００９０】
「問題のある宿主細胞タンパク質」という用語は、（ｉ）非常に豊富であり、（ｉｉ）下流プロセスで除去することが困難であり、および／または（ｉｉｉ）製品の品質に影響を与える宿主細胞タンパク質を表す。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「標的部位」または「標的配列」という用語は、改変または編集されるべき染色体配列の一部を定義する核酸配列を表し、結合のための十分な条件が存在する場合には、標的エンドヌクレアーゼが認識および結合するように操作された核酸配列を表す。
【００９２】
「上流」および「下流」という用語は、固定位置に対する核酸配列中の位置を表す。上流とは、位置に対して５’（すなわち、鎖の５’末端付近）である領域を表し、下流とは、位置に対して３’（すなわち、鎖の３’末端付近）である領域を表す。
【００９３】
核酸およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技術は、当技術分野で公知である。一般的に、そのような技術は、遺伝子に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定し、および／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定し、これらの配列を第２のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列もまた、このような方法で決定され、比較され得る。一般に、同一性とは、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のそれぞれの正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を表す。２つまたはそれ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらのパーセント同一性を決定することによって比較することができる。核酸配列であれアミノ酸配列であれ、２つの配列のパーセント同一性は、２つのアラインメントされた配列間の完全一致の数を短い方の配列の長さで割ったものを１００倍したものである。核酸配列に対する近似的なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９  （１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｍ．Ｏ．  Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，  ５  ｓｕｐｐｌ．  ３：３５３−３５８，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．，  ＵＳＡによって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）によって正規化されたスコアリングマトリックスを用いて、アミノ酸配列に適用され得る。配列のパーセント同一性を決定するためのこのアルゴリズムの例となる実装は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．）によって「Ｂｅｓｔ  Ｆｉｔ」ユーティリティアプリケーションで提供されている。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の好適なプログラムは、一般に当技術分野で公知であり、例えば、別のアライメントプログラムは、デフォルトのパラメータで使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを用いて使用することができる：遺伝コード＝標準、フィルタ＝なし、鎖＝両方、カットオフ＝６０；期待値＝１０、マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、記載＝５０配列、ソート＝ハイスコア、データベース＝冗長性なし、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、ＧｅｎＢａｎｋのウエブサイトに見出すことができる。本明細書に記載の配列に関して、配列同一性の所望の程度の範囲は、約８０％から１００％、およびその間の任意の整数値である。一般的に、配列間のパーセント同一性は、少なくとも７０から７５％、好ましくは８０から８２％、より好ましくは８５から９０％、さらにいっそう好ましくは９２％、さらにいっそう好ましくは９５％、最も��ましくは９８％の配列同一性である。
【００９４】
本発明の範囲を逸脱することなく、上記の細胞および方法に様々な変更を加えることができるので、上述した説明および以下に示す実施例に含まれるすべての事項は、例示的なものとして解釈されることが意図されており、限定的な意味で解釈されるものではない。
【実施例】
【００９５】
以下の実施例は、本発明の特定の態様を示す。
【００９６】
実施例１
汚染宿主細胞タンパク質の同定
質量分析法を用いて、いくつかのＣＨＯ親細胞株によって生産されたＨＣＰを同定した。異なる親細胞株からフェッドバッチ上清を回収し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。同様に、Ｐｒｏ  Ａキャプチャーステップ後のサンプル溶出物を分析し、カラムに付いたタンパク質を同定した。第２の方法では、ＨＣＰプロファイルを、下流の精製ステップによって組換え発現クローンから追跡した。「問題のあるＨＣＰ」は、（ｉ）非常に豊富であり、（ｉｉ）下流プロセスで除去することが困難であり、および／または（ｉｉｉ）製品の品質に影響を与える宿主細胞タンパク質として特徴付けられた。各サンプルから同定されたタンパク質の数が多いことを考えると、主成分分析（ＰＣＡ）を実施し、ばらつきを強調してデータパターンを抽出した。表１は、同定された「問題のある」ＨＣＰのいくつかとそれらの特徴を示す。
【００９７】
【表２】
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【００９８】
いくつかのプロテアーゼが遺伝子編集の候補として同定された。宿主細胞に由来するプロテアーゼは、細胞培養液中で活性であり、製品の品質に影響を与えることができる。これらのタンパク質分解活性は、組換え発現したポリペプチドを分解する場合があり、「クリッピング」とも呼ばれ、それによって潜在的に免疫原性を有し、変更された、例えば、非機能性または機能性の低い治療用タンパク質にする。同定されたＨＣＰは、宿主細胞の増殖および生産性に必須または非必須としてさらに分類された。
【００９９】
実施例２
ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いたリポタンパク質リパーゼおよびホスホリパーゼＢ様２遺伝子のノックアウト
ＣＨＯ細胞を、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）またはホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）遺伝子を標的としたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の対をコードする核酸でトランスフェクトした。それぞれの標的部位を以下に示す（ＺＦＮ結合部位は大文字で示し、切断部位は小文字で示す）。
リポタンパク質リパーゼ
ＣＣＴＧＡＣＴＣＣＡＡＣＧＴＣＡＴＴｇｔｇｇｔＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＴＡＴＣＧＧＧＣ（対１３、１４）（配列番号３１）
ＧＧＣＴＧＴＡＴＣＧＧＧＣＣＣＡＧＣａａｃａｃｔＡＴＣＣＡＧＴＧＴＣＧＧＣＴＧＧＣＴ（対１５、１６）（配列番号３２）
ホスホリパーゼＢ様２
ＧＧＣＣＴＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧｔｇｔｇｇｔＧＧＡＧＧＣＴＴＣＴＧＴＧＴＣＴＧＡＧ（配列番号３３）
【０１００】
トランスフェクション後の所望のインキュベーション期間の後、細胞を採取し、ゲノムＤＮＡを単離した。ＺＦＮ誘導ＤＮＡ二本鎖切断の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介不完全修復の結果として、野生型から逸脱する標的遺伝子座の対立遺伝子を検出するＣｅｌ−１ヌクレアーゼアッセイを用いて、ＺＦＮ誘導切断を検証した。ＺＦＮのＬＬＰ  １３／１４対およびＰＬＢＬ２対は、偽処理した細胞には存在しなかった切断断片を生成した（図１）ことから、標的遺伝子に挿入／欠失（インデル）が導入されていることが示唆された。
【０１０１】
実施例３
Ｃａｓ９  ＲＮＰを用いたカテプシンＢおよびカテプシンＤ遺伝子ノックアウト
ＣＨＯ細胞を、カテプシンＢまたはカテプシンＤを標的とするように設計された遺伝子特異的ｇＲＮＡを含むＣａｓ９コンストラクトでトランスフェクトした。ｇＲＮＡのプロトスペーサー配列を以下に示す。
カテプシンＢ
ＣＣＣＡＣＴＧＴＣＧＧＡＴＧＡＣＣＴＧＡＴＴ（配列番号３４）
ＣＣＡＣＴＧＴＣＧＧＡＴＧＡＣＣＴＧＡＴＴＡ（配列番号３５）
ＣＡＡＣＡＡＡＣＧＧＡＡＴＡＣＧＡＣＡＴＧＧ（配列番号３６）
カテプシンＤ
ＣＣＣＣＣＴＧＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＣＴ（配列番号３７）
ＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＣＴＡＴＣＣＧＴＣＧＧ（配列番号３８）
ＣＣＴＴＡＡＧＧＧＴＣＣＣＡＴＡＡＣＣＡＣＧ（配列番号３９）
【０１０２】
トランスフェクション後７日目と１５日目に細胞を採取し、ゲノムＤＮＡを単離し、Ｃｅｌ−１ヌクレアーゼアッセイを行った。切断断片は、Ｃａｓ９  ＲＮＰ処理細胞において検出された（図２）。
【０１０３】
単一細胞ノックアウトクローンを単離した。生産性と成長プロファイルを、カテプシンＢノックアウトサブクローン（図３Ａ）、カテプシンＤノックアウトサブクローン、野生型細胞（図３Ｂ）で比較した。ノックアウトサブクローンは多少の変動性を示したが、力価と生細胞密度はノックアウトクローンと野生型細胞の間で類似していた。
【０１０４】
実施例４
Ｃａｓ９  ＲＮＰを用いたクラスタリン遺伝子ノックアウト
細胞を、クラスタリンを標的とするように設計された遺伝子特異的ｇＲＮＡを含むＣａｓ９コンストラクトでトランスフェクトした。ｇＲＮＡのプロトスペーサー配列を以下に示す。
ＧＴＣＴＣＣＧＡＣＡＡＴＧＡＧＣＴＣＡＡＧＧ（配列番号４０）
ＣＣＡＣＴＣＡＡＧＧＧＡＧＴＡＧＧＴＡＣＡＴ（配列番号４１）
ＧＧＧＡＧＴＡＧＧＴＡＣＡＴＴＡＡＴＡＡＧＧ（配列番号４２）
【０１０５】
細胞を採取し、ゲノムＤＮＡを単離し、Ｃｅｌ−１ヌクレアーゼアッセイを行った。切断断片は、Ｃａｓ９  ＲＮＰ処理細胞において検出された（図４、レーン５〜７）。野生型およびクラスタリンノックアウトクローンを単離した。生産性と成長プロファイルを、野生型サブクローン（図５Ａ）とクラスタリンノックアウトサブクローン（図５Ｂ）の間で比較した。野生型サブクローンとノックアウトサブクローンの間には変動性があったが、力価と細胞密度は野生型とノックアウト細胞の間で類似していた。
【０１０６】
野生型とクラスタリンノックアウトクローン間で製品の品質を比較した。モデル融合タンパク質を、野生型およびククラスタリンノックアウトクローンで発現させた。タンパク質産物のサイズの不均一性を、ＵＰＬＣ  ＳＥＣを用いて分析し、非常に高い分子量（例えば、下流の追加の精製ステップにつながり得る融合タンパク質の二量体または凝集体）、融合タンパク質単量体、および低分子量種を特徴付けた。結果を表１に示す。一般に、クラスタリンノックアウトクローンは、野生型クローンと同様のプロファイルを有する。
【０１０７】
【表３】
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【０１０８】
実施例５
Ｃａｓ９  ＲＮＰを用いたチオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼ遺伝子ノックアウト
細胞を、チオレドキシンまたはチオレドキシンレダクターゼを標的とするように設計された遺伝子特異的ｇＲＮＡを含むＣａｓ９コンストラクトでトランスフェクトした。ｇＲＮＡのプロトスペーサー配列を以下に示す。
チオレドキシン
ＧＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＧＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧ（配列番号４３）
ＧＣＴＴＴＴＣＡＧＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＣＧＧ（配列番号４４）
ＣＣＣＴＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＡＣＡＡ（配列番号４５）
ＣＣＡＣＡＴＧＧＴＧＴＧＧＡＣＣＡＴＧＣＡＡ（配列番号４６）
チオレドキシンレダクターゼ
ＡＡＣＴＣＣＴＣＴＣＧＧＡＡＣＴＡＧＡＴＧＧ（配列番号４７）
ＧＧＡＧＧＡＡＣＧＴＧＴＧＴＧＡＡＣＧＴＧＧ（配列番号４８）
ＣＣＡＧＧＣＧＧＣＴＴＴＧＴＴＡＧＧＡＣＡＡ（配列番号４９）
ＣＣＴＴＧＡＡＡＧＡＣＴＣＴＣＧＡＡＡＣＴＡ（配列番号５０）
【０１０９】
好適な期間のインキュベーション後、細胞を採取し、ゲノムＤＮＡを単離し、Ｃｅｌ−１ヌクレアーゼアッセイを行った。切断断片は、Ｃａｓ９  ＲＮＰ処理細胞において検出された（図６、レーン２〜５および７〜１０）。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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