(57)【要約】  本発明は、がん患者における免疫チェックポイント阻害剤に対する応答性のための、予後のバイオマーカーとしてのフィブリノーゲン様タンパク質１（ＦＧＬ１）の特定に関する。より具体的には、本発明は、フィブリノーゲン様タンパク質１（ＦＧＬ１）のリンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ３）との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体を投与することを含む、ヒト患者におけるがんを処置する方法に関し、ここで、がんは、ＦＧＬ１発現がんである。さらに、本発明は、患者からのサンプルにおけるＦＧＬ１発現を検出することを含む、がん患者におけるＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体を用いる処置に対する感受性を評価するか又は応答性を予測する方法に関し、そしてＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体から利益を得るであろうがん患者を選択するためのキットに関する。ＦＧＬ１とＬＡＧ３との間の相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体は、ヒトＦＧＬ１に対する抗体又はヒトＬＡＧ３に対する抗体であり得、場合により抗ＰＤ１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体などの他の免疫チェックポイント阻害性抗体と組み合わせ得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリノーゲン様タンパク質１（ＦＧＬ１）のリンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ３）との相互作用を特異的に阻害する抗体の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者におけるがんを処置する方法。
【請求項２】
ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体の有効量を、患者に投与することを含む、請求項１記載のヒト患者におけるがんを処置する方法であって、該がん患者が上昇したＦＧＬ１発現を有している、方法。
【請求項３】
がん患者が、上昇したＦＧＬ１発現を有していると決定されている、請求項１記載の方法。
【請求項４】
患者からのサンプルが、上昇したＦＧＬ１発現を有していると決定されている、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ａ）患者からのサンプルにおいて、ＦＧＬ１発現が上昇しているかどうかを決定すること、及び
ｂ）ＦＧＬ１発現が上昇している場合、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体の有効量を該患者に投与すること
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ａ）がんの処置を必要とする患者を特定すること、及び
ｂ）該患者が上昇したＦＧＬ１発現を有していると決定すること、続いて
ｃ）ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体の有効量を該患者に投与すること
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体を含む、がん患者のための処置を選択する方法であって、該方法は、該患者からのサンプルにおけるＦＧＬ１発現のレベルを決定すること、及び該ＦＧＬ１発現のレベルが上昇している場合、該患者のための前記処置を選択することを含む、方法。
【請求項８】
ＦＧＬ１発現が対照と比較して上昇している、請求項２〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
ａ）患者からのサンプルを提供すること、
ｂ）前記サンプルにおけるＦＧＬ１発現のレベルを測定すること、
ｃ）ＦＧＬ１発現を対照と比較すること、
ｄ）ＦＧＬ１発現のレベルが該対照と比較して上昇していると測定された場合、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する少なくとも１つの抗体による処置に応答する可能性が高いと該患者を特定すること、及び
ｅ）ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する前記抗体の有効量を該患者に投与すること
を含む、ヒト患者におけるがんを処置する方法。
【請求項１０】
ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する前記抗体が、抗ＦＧＬ１抗体又は抗ＬＡＧ３抗体である、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
ヒトＦＧＬ１に結合する抗体の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者におけるがんを処置する方法。
【請求項１２】
抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＩＤＯ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗Ｔｉｍ−３抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体及び抗ＯＸ４０抗体からなる群より選択される少なくとも１つのさらなる免疫チェックポイント阻害性抗体を投与することを含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
患者が、
（ｉ）抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＩＤＯ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗Ｔｉｍ−３抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体及び抗ＯＸ４０抗体からなる群より選択される少なくとも１つのチェックポイント阻害性抗体に対する原発性又は後天性の耐性を有するか、又は
（ｉｉ）患者がＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害に対する原発性又は後天性の耐性を有する、
請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
がんが、脳がん、結腸直腸がん、黒色腫、前立腺がん又は肺がんであり、好ましくは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
処置が、化学療法又は放射線療法をさらに伴う、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
免疫チェックポイント阻害性抗体、好ましくはＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体を用いる処置に対するがん患者の感受性を評価する方法であって、
（ａ）該患者からのサンプルを提供すること、
（ｂ）該サンプルにおけるＦＧＬ１発現を検出すること、及び
（ｃ）工程（ｂ）において決定された前記ＦＧＬ１発現を対照と比較すること、ここで前記サンプルにおける前記ＦＧＬ１発現が前記対照と比較して上昇している
を含む、方法。
【請求項１７】
患者の腫瘍を分類する方法であって、
（ａ）該患者からのサンプルを提供すること、
（ｂ）前記サンプルにおけるＦＧＬ１発現を検出すること、及び
（ｃ）免疫チェックポイント阻害性抗体、好ましくはＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体を用いる処置のための候補として該腫瘍を特定すること
を含む、方法。
【請求項１８】
方法がインビトロ法である、請求項１６又は請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）患者からのサンプルを提供すること、
（ｂ）前記サンプルにおけるＦＧＬ１発現のレベルを決定すること、
（ｃ）ＦＧＬ１発現を対照と比較すること、
（ｄ）ＦＧＬ１発現のレベルが該対照と比較して上昇していると決定された場合、免疫チェックポイント阻害性抗体、好ましくはＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体による処置に応答する可能性が高いと該患者を特定するか、又はＦＧＬ１発現が該対照と比較して上昇していないと決定された場合、応答する可能性が低いと該患者を特定すること、及び場合により
（ｅ）さらに、該がん患者に免疫チェックポイント阻害性抗体、好ましくはＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体を投与すること
を含む、ヒトがん患者の応答を予測する方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害性抗体の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者におけるがんを処置する方法であって、ここで該がん患者が上昇したＦＧＬ１発現を有している、方法。
【請求項２１】
（ａ）好ましくは、少なくともヒトＦＧＬ１のフィブリノーゲンドメインを含む、ＦＧＬ１タンパク質を提供すること、
（ｂ）好ましくは、少なくともヒトＬＡＧ３のドメイン１及び２を含む、ＬＡＧ３タンパク質を提供すること、
（ｃ）スクリーニングされる抗体の存在下で、前記ＦＧＬ１タンパク質と前記ＬＡＧ３タンパク質とを接触させること、
（ｄ）前記ＦＧＬ１タンパク質の前記ＬＡＧ３タンパク質への結合を決定すること、及び
（ｅ）前記ＦＧＬ１タンパク質の前記ＬＡＧ３タンパク質への結合が、前記スクリーニングされる抗体の非存在下での前記ＦＧＬ１タンパク質の前記ＬＡＧ３タンパク質への結合に比べて減少している場合、前記ＦＧＬ１タンパク質の前記ＬＡＧ３タンパク質との相互作用を特異的に阻害する抗体として該スクリーニングされる抗体を特定すること
を含む、免疫チェックポイント阻害性抗体をスクリーニングするための方法。
【請求項２２】
（ａ）好ましくは、少なくともヒトＦＧＬ１のフィブリノーゲンドメインを含む、ＦＧＬ１タンパク質を提供すること、
（ｂ）好ましくは、少なくともヒトＬＡＧ３のドメイン１及び２を含む、ＬＡＧ３タンパク質を提供すること、
（ｃ）例えば化合物ライブラリーからの、例えばハイスループットスクリーンの形式での小分子の存在下で、前記ＦＧＬ１タンパク質と前記ＬＡＧ３タンパク質とを接触させること、
（ｄ）前記小分子の存在下及び非存在下で、前記ＦＧＬ１タンパク質の前記ＬＡＧ３タンパク質への結合を決定すること、及び
（ｅ）ＦＧＬ１−ＬＡＧ３チェックポイント阻害分子として、前記ＦＧＬ１タンパク質の前記ＬＡＧ３タンパク質への結合を特異的に阻害する小分子を特定すること
を含む、
ＦＧＬ１のＬＡＧ３への結合を阻害する小分子をスクリーニングする方法。
【請求項２３】
免疫チェックポイント阻害性抗体、好ましくはＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体から利益を得るであろうがん患者を選択するためのキットであって、ここで該キットが、
（ａ）がん患者からのサンプルにおけるＦＧＬ１発現を定量的に検出するための手段、及び
（ｂ）対照
を含む、キット。
【請求項２４】
対照が、
（ａ）増強したＦＧＬ１発現を検出するための参照サンプル、
（ｂ）ベースラインのＦＧＬ１発現を検出するための参照サンプル、
（ｃ）ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体に対する感受性と相関している、ＦＧＬ１発現の所定の参照レベルを含む指図、
（ｄ）ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体に対する感受性がないことと相関している、ＦＧＬ１発現の所定の参照レベルを含む指図、及び／又は
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の組み合わせ
からなる群より選択される、請求項２３記載のキット。
【請求項２５】
がん患者からのサンプルにおけるＦＧＬ１発現を定量的に検出するための手段が、
（ａ）ＦＧＬ１に特異的な抗体、
（ｂ）ＦＧＬ１に特異的なプライマー対、及び場合により増幅産物にハイブリダイズするプローブ、ならびに／又は
（ｃ）ＦＧＬ１標的配列にハイブリタイズするプローブ
である、請求項２３記載のキット。
【請求項２６】
ヒトＦＧＬ１のヒトＬＡＧ３への結合を阻害する、ヒトＦＧＬ１に結合する抗体。
【請求項２７】
ヒトＬＡＧ３のヒトＦＧＬ１への結合を阻害する、ヒトＬＡＧ３に結合する抗体。
【請求項２８】
ヒトＬＡＧ３のヒトＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用をさらに阻害する、請求項２７記載の抗体。
【請求項２９】
がんの処置における使用のための抗ＦＧＬ１抗体。
【請求項３０】
がん疾患の処置における使用のための請求項２９記載の抗ＦＧＬ１抗体であって、
ここで、該がん疾患が、固形腫瘍、血液がん、及び転移巣からなる群より、そしてより具体的には、白血病、ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、多発性骨髄腫を含む骨髄腫、肉腫及び腺がん、結腸がん、直腸がん、腎細胞がん、肝臓がん、非小細胞肺がん、小腸がん、脳がん、結腸直腸がん、黒色腫、前立腺がん、頭頸部がん、再発性又は転移性頭頸部扁平上皮がん、肺扁平上皮がん、肺腺がん、子宮頚部扁平上皮子がん、胃がん、食道がん、及び甲状腺がんを含むがん腫からなる群より選択される、
抗体。
【請求項３１】
ヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項２９又は請求項３０記載の抗ＦＧＬ１抗体。
【請求項３２】
抗ＦＧＬ１抗体で処置されるがん患者が、上昇したＦＧＬ１発現を有している、請求項２９又は請求項３０記載の抗ＦＧＬ１抗体。
【請求項３３】
がん患者が、上昇したＦＧＬ１発現を有していると決定されている、請求項３２記載の抗ＦＧＬ１抗体。
【請求項３４】
がん患者からのサンプルが、上昇したＦＧＬ１発現を有していると決定されている、請求項３３記載の抗ＦＧＬ１抗体。
【請求項３５】
処置が、
（ａ）患者からのサンプルにおいて、ＦＧＬ１発現が上昇しているかどうかを決定すること、及び
（ｂ）ＦＧＬ１発現が上昇している場合、抗ＦＧＬ１抗体の有効量を該患者に投与すること
を含む、請求項３４記載の抗ＦＧＬ１抗体。
【請求項３６】
（ａ）患者からのサンプルを提供すること、
（ｂ）前記サンプルにおけるＦＧＬ１発現のレベルを測定すること、
（ｃ）ＦＧＬ１発現を対照と比較すること、
（ｄ）ＦＧＬ１発現のレベルが該対照と比較して上昇していると決定された場合、抗ＦＧＬ１抗体による処置に応答する可能性が高いと該患者を特定すること、及び
（ｅ）抗ＦＧＬ１抗体の有効量を該患者に投与すること
を含む、ヒト患者におけるがんを処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん患者の処置のための標的としての、また免疫チェックポイント阻害剤に対するそのようながん患者の応答性を予測するための予後のバイオマーカーとしてのフィブリノーゲン様タンパク質１（ＦＧＬ１）の特定に関する。より具体的には、本発明は、フィブリノーゲン様タンパク質１（ＦＧＬ１）のリンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ３）との相互作用を特異的に阻害する抗体、及び／又はＦＧＬ１に特異的に結合する抗体を投与することを含む、ヒト患者におけるがん（好ましくは該がんはＦＧＬ１発現がんである）を処置する方法に関する。さらに、本発明は、がん患者における免疫チェックポイント阻害性抗体を用いる処置に対する感受性を評価する、又はその応答性を予測する方法であって、前記患者からのサンプルにおけるＦＧＬ１発現を検出することを含む方法に関する。さらに本発明は、免疫チェックポイント阻害性抗体から利益を得るであろうがん患者を選択するためのキットに関する。免疫チェックポイント阻害性抗体は、ヒトＦＧＬ１に対する抗体又はヒトＬＡＧ３に対する抗体であり得、場合により抗ＰＤ１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体などの、他の免疫チェックポイント阻害性抗体と組み合わせ得る。
【背景技術】
【０００２】
抑制性受容体（ＩＲ）のアップレギュレートされた発現は、共刺激性受容体活性のバランスをとり、Ｔ細胞の活性化を制限し、それによって自己免疫、自己炎症、及び組織損傷を防ぐために不可欠である。しかしながら、腫瘍は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞によって誘発される抗腫瘍免疫応答に対する防御として、これらのいわゆる免疫チェックポイント機構を乗っ取ることができる。最近のがん免疫療法のアプローチは、抑制性受容体を標的にして免疫寛容性を克服し、腫瘍に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答の再活性化を可能にすることによって、そのような疲弊を逆転させることを目的としている。
【０００３】
細胞障害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）又はプログラムされた死−１（programmed death-1）（ＰＤ−１）及びそのリガンド（ＰＤ−Ｌ１）などの免疫系チェックポイントを標的とする抗体を中心とした数多くの免疫調節剤が、悪性黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、古典的ホジキンリンパ腫、及び再発性若しくは転移性の頭頸部扁平上皮がんを含む複数のがんの処置のための規制当局の承認を受けている。しかしながら、チェックポイント阻害剤により処置された患者のかなりの割合は、ほとんど、あるいは全く利益を有さず、且つこれらの処置は高額であり、いくつかの関連した毒性を有し得る。したがって、患者の選択を最適化するために、さらなるチェックポイント阻害剤、チェックポイント阻害剤の新しい組み合わせ、及び／又はがん治療における免疫チェックポイント阻害性抗体に対する処置応答を予測するための予後のバイオマーカーが必要とされている。
【０００４】
別の免疫チェックポイント受容体は、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ３、ＣＤ２２３）である。ＬＡＧ３のアップレギュレーションは、免疫系の過剰活性化を制御し、自己免疫を防ぐために必要である。これは、Ｔ細胞に対するその負の制御的役割を果たす故に、潜在的ながん免疫療法の標的である。ＬＡＧ３は、細胞表面のＴ細胞抑制タンパク質であり、主要な組織適合性複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）との相互作用を介して機能すると考えられている。現在、ＬＡＧ３−Ｆｃ融合タンパク質ＩＭＰ３２１や抗ＬＡＧ３抗体ＢＭＳ−９８６０１６などの、臨床及び前臨床開発の様々な段階にあるいくつかのＬＡＧ３修飾免疫療法がある。現在の抗ＬＡＧ３治療は、その唯一の公知のリガンドであるＭＨＣクラスＩＩとの相互作用を標的としている。しかしながら、ＭＨＣ−ＩＩとの相互作用は、様々な実験環境においてＬＡＧ３誘導抑制機能のために必要とされるようには見えず、したがって、潜在的な追加の機能的なＬＡＧ３リガンドについての思索が可能である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、肝細胞マイトジェン活性及び代謝機能を有する肝臓に富む可溶性タンパク質であるフィブリノーゲン様プロテイン１（ＦＧＬ１）を、がん免疫療法にとって重要な意味を持つＬＡＧ３結合パートナーとして特定した。抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１療法を受けた原発性耐性の患者におけるＦＧＬ１の高発現を考慮すると、ＦＧＬ１／ＬＡＧ３経路は、免疫回避のための更なる潜在的なメカニズムであり得る。したがって、ＦＧＬ１及びそのＬＡＧ３との相互作用は、治療剤のための潜在的な標的であり、ＦＧＬ１の発現は、ＦＧＬ１とＬＡＧ３との間の相互作用を阻害する抗体などの、免疫チェックポイント阻害剤を用いる処置に対する応答を予測するための有望な予後のバイオマーカーである。ＦＧＬ１／ＬＡＧ３チェックポイント阻害は、少なくともＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害を補完するようであり、ＦＧＬ１はまた、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体などの他の免疫チェックポイント阻害性抗体のための負の予後マーカーであり得る。
【０００６】
１つの局面では、フィブリノーゲン様タンパク質１（ＦＧＬ１）のリンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ３）との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者におけるがんを処置する方法が提供される。また、ヒトＦＧＬ１に特異的に結合する抗体の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者におけるがんを処置する方法も提供される。特定の実施態様では、がん患者は、上昇したＦＧＬ１発現を有し、好ましくはがん患者は、上昇したＦＧＬ１発現を有していると決定されている。より具体的には、患者からのサンプルは、上昇したＦＧＬ１発現を有していると決定されており、好ましくは患者からのサンプルは、対照と比較して上昇したＦＧＬ１発現を有していると決定されている。該方法は、患者からのサンプルにおけるＦＧＬ１発現を決定すること、及びＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する、抗ＦＧＬ１抗体若しくは免疫チェックポイント阻害性抗体の有効量を患者に投与することを含み得る。１つの実施態様では、該方法は、患者からのサンプルにおいてＦＧＬ１発現が上昇しているかどうかを判定すること、及びＦＧＬ１発現が上昇している場合、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する、抗ＦＧＬ１抗体若しくは免疫チェックポイント阻害性抗体の有効量を患者に投与することを含む。
【０００７】
また、ヒト患者のがんの処置における使用のための、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体（これは、免疫チェックポイント経路と相互作用するので、「免疫チェックポイント阻害性抗体」であると見なされる）も提供される。さらに、ヒト患者のがんの処置における使用のための、ヒトＦＧＬ１に特異的に結合する抗体が提供される。特定の実施態様では、がん患者は上昇したＦＧＬ１発現を有し、好ましくはがん患者は、上昇したＦＧＬ１発現を有していると決定されている。より具体的には、患者からのサンプルが、上昇したＦＧＬ１発現を有していると決定されており、好ましくは患者から得たサンプルが、対照と比較して上昇したＦＧＬ１発現を有していると決定されている。好ましくは、上昇したＦＧＬ１発現は、インビトロで患者からのサンプルにおいて決定されている。使用のための抗体は、抗ＦＧＬ１抗体又はＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体を患者に投与する前に、患者からのサンプルにおけるＦＧＬ１発現を決定することを含み得る。１つの実施態様では、該使用は、患者からのサンプルにおいてＦＧＬ１発現が上昇しているかどうかを決定すること、及びＦＧＬ１発現が上昇している場合、抗ＦＧＬ１抗体若しくはＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体を患者に投与すると決定することを含む。
【０００８】
さらに、本発明は、ａ）患者からのサンプルを提供すること、ｂ）前記サンプルにおけるＦＧＬ１発現のレベルを測定すること、ｃ）ＦＧＬ１発現を対照と比較すること、ｄ）ＦＧＬ１発現のレベルが、対照と比較して上昇していると測定された場合、抗ＦＧＬ１抗体若しくはＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体による処置に応答する可能性があると患者を特定すること、及びｅ）前記抗ＦＧＬ１抗体若しくはＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する前記抗体の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者におけるがんを処置する方法又は使用のための抗体に関する。
【０００９】
さらに、本発明は、がん患者のために、抗ＦＧＬ１抗体又はＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体を含む処置を選択する方法であって、該方法が、患者からのサンプルにおけるＦＧＬ１発現のレベルを決定し、ＦＧＬ１発現のレベルが上昇している場合、該患者のための前記処置を選択することを含む方法に関する。
【００１０】
本発明の使用のための方法又は抗体によるＦＧＬ１発現は、好ましくは対照と比較して上昇している。対照は、がんを有しない少なくとも１人の被験体又は非がん性組織サンプルからのベースライン発現のための参照値又は参照サンプルであり得、ここで非がん性組織サンプルは、好ましくはがんと同じ器官に由来し、そしてより好ましくはがん患者に由来する。本発明による方法又は使用において使用される患者からのサンプルは、好ましくは腫瘍サンプル及び／又は血液サンプルである。
【００１１】
本発明の方法又は処置において使用される、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体は、抗ＦＧＬ１抗体、抗ＬＡＧ３抗体、又はそれらの組み合わせであり得る。ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体は、単独で、又は抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１（抗Ｂ７−Ｈ１）抗体、抗ＩＤＯ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗Ｔｉｍ−３抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、及び抗ＯＸ４０抗体からなる群より選択される少なくとも１つのさらなる免疫チェックポイント阻害性抗体と組み合わせて使用し得る。特定の実施態様では、少なくとも１つのさらなる免疫チェックポイント阻害抗体は、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。特定の実施態様では、前記患者は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＩＤＯ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗Ｔｉｍ−３抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、及び抗ＯＸ４０抗体からなる群より選択される少なくとも１つのチェックポイント阻害性抗体に対する原発性又は後天性の耐性を有し得る。より具体的には、該患者はＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害に対する原発性又は後天性の耐性を有し得る。
【００１２】
上記に言及されるがんは、脳がん、結腸直腸がん、黒色腫、前立腺がん又は肺がんであり得るが、これらに限定されない。好ましくは該がんは肺がん又は前立腺がんである。より好ましくは、肺がんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。前記処置は、化学療法又は放射線療法をさらに伴い得る。
【００１３】
別の局面では、ヒトがん患者における上昇したＦＧＬ１発現を検出する方法が提供され、前記方法は、患者からのサンプルを提供すること、及び該サンプルにおけるＦＧＬ１発現を検出することを含み、ここで、該サンプルにおいて検出されたＦＧＬ１発現は、好ましくは対照と比較される。該方法は、場合により、ＦＧＬ１発現が対照と比較して上昇していると決定された場合、抗ＦＧＬ１抗体又はＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体を用いる処置に感受性がある可能性が高いと患者を特定することをさらに含み得る。
【００１４】
また、本明細書では、患者において抗ＦＧＬ１抗体又はＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体を用いる処置に対する感受性を評価する方法も提供され、該方法は、ａ）場合により該患者からのサンプルを提供すること、ｂ）サンプルにおけるＦＧＬ１発現を検出すること、ｃ）工程（ｂ）において決定されたＦＧＬ１発現を対照と比較することを含み、ここで該サンプルにおけるＦＧＬ１発現が対照と比較して上昇し、そして場合により該ＦＧＬ１発現が対照と比較して上昇していると決定された場合、抗ＦＧＬ１抗体又はＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体を用いる処置に対して感受性がある可能性が高いと患者を特定することを、さらに含む。
【００１５】
また、（ａ）場合により患者からのサンプルを提供すること、（ｂ）該サンプルにおけるＦＧＬ１発現を検出すること、及び（ｃ）抗ＦＧＬ１抗体又は免疫チェックポイント阻害性抗体、好ましくはＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体を用いる処置のための候補として腫瘍を特定することを含む、患者の腫瘍を分類する方法も提供されている。場合により、該方法は、工程（ｂ）において決定されたＦＧＬ１発現を対照と比較する工程をさらに含み、ここで、対照と比較したサンプルにおける上昇したＦＧＬ１発現は、抗ＦＧＬ１抗体又は免疫チェックポイント阻害性抗体、好ましくはＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体を用いる処置のための候補として腫瘍を特定する。
【００１６】
また、（ａ）場合により、患者からのサンプルを提供すること、（ｂ）該サンプルにおけるＦＧＬ１発現のレベルを決定すること、（ｃ）ＦＧＬ１発現を対照と比較すること、及び（ｄ）ＦＧＬ１発現のレベルが対照と比較して上昇していると測定された場合、抗ＦＧＬ１抗体による又はＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体による処置に応答する可能性が高いと患者を特定すること、又はＦＧＬ１発現のレベルが対照と比較して上昇していると測定されなかった場合、応答する可能性が低いと患者を特定することを含む、ヒトがん患者の応答性を予測する方法も提供される。
【００１７】
また、（ａ）場合により、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害性抗体を用いて処置された、若しくは以前に処置された患者からのサンプルを提供すること、（ｂ）該サンプルにおけるＦＧＬ１発現のレベルを決定すること、（ｃ）ＦＧＬ１発現を対照と比較すること、及び（ｄ）ＦＧＬ１発現のレベルが対照と比較して上昇していると決定された場合、前記少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害性抗体を用いる処置に対して応答する可能性が低いと患者を特定することを含む、ヒトがん患者の応答性を予測する方法も提供される。
【００１８】
本発明による、上昇したＦＧＬ１発現を検出する方法、感受性を評価する方法、分類する方法及び応答性を予測する方法は、典型的には、及び好ましくは、インビトロ法である。特定の実施態様では、サンプルを提供する患者は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＩＤＯ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗Ｔｉｍ−３抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、及び抗ＯＸ４０抗体からなる群より選択される少なくとも１つのチェックポイント阻害性抗体に対する原発性又は後天性の耐性を有し得る。より具体的には、該患者は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害に対する原発性又は後天性の耐性を有し得る。これらの方法は、抗ＦＧＬ１抗体若しくはＦＧＬ１のＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体をがん患者に投与する工程をさらに含み得るか、又はその工程が後に続き得る。いずれか１つの方法において使用されるサンプルは、好ましくは腫瘍又は血液サンプルである。ＦＧＬ１発現は、（ａ）サンプルと抗ＦＧＬ１抗体とを接触させること、及びＦＧＬ１（ＦＧＬ１タンパク質）と抗体との間の結合を検出することによって、又は（ｂ）サンプルにおいてＦＧＬ１をコードするｍＲＮＡの量を検出することによって、サンプルにおいて検出し得る。特定の実施態様では、前記対照は、がんを有しない少なくとも１つの被験体若しくは非がん性組織サンプルからのベースライン発現のための参照値又は参照サンプルであり、ここで非がん性組織サンプルは、好ましくはがんと同じ器官に、そしてより好ましくはがん患者に由来する。特定の実施態様では、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体は、抗ＬＡＧ３抗体又は抗ＦＧＬ１抗体である。
【００１９】
また、抗ＦＧＬ１抗体の、又はＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者におけるがんを処置する方法も提供され、ここで該がん患者は、本明細書に記載のいずれか１つの診断方法を使用して決定される上昇したＦＧＬ１発現を有する。
【００２０】
さらに別の局面では、免疫チェックポイント阻害性抗体、好ましくは抗ＦＧＬ１抗体又はＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体から利益を得るであろうがん患者を選択するためのキットが提供され、ここで、該キットは、がん患者からのサンプル、及び対照におけるＦＧＬ１発現を定量的に検出するための手段を含む。該対照は、（ａ）増強したＦＧＬ１発現を検出するための参照サンプル、（ｂ）ベースラインのＦＧＬ１発現を検出するための参照サンプル、（ｃ）免疫チェックポイント阻害性抗体、好ましくは抗ＦＧＬ１抗体若しくはＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体に対する感受性と相関しているＦＧＬ１発現の所定の参照レベルを含む指図、（ｄ）免疫チェックポイント阻害性抗体、好ましくは抗ＦＧＬ１抗体若しくはＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体に感受性がないことと相関しているＦＧＬ１発現の所定の参照レベルを含む指図、及び／又は（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の組み合わせからなる群より選択され得る。１つの実施態様では、がん患者からのサンプルにおけるＦＧＬ１発現を定量的に検出するための手段は、（ａ）ＦＧＬ１に特異的な抗体、（ｂ）ＦＧＬ１に特異的なプライマー対及び場合により増幅産物にハイブリダイズするプローブ、及び／又は（ｃ）ＦＧＬ１配列にハイブリダイズするプローブである。
【００２１】
さらに別の局面では、
（ａ）好ましくは、少なくともヒトＦＧＬ１のフィブリノーゲンドメインを含む、ＦＧＬ１タンパク質を提供すること、
（ｂ）好ましくは、少なくともヒトＬＡＧ３のドメイン１及び２を含む、ＬＡＧ３タンパク質を提供すること、
（ｃ）スクリーニングされる抗体の存在下で、ＦＧＬ１タンパク質とＬＡＧ３タンパク質とを接触させること、
（ｄ）ＦＧＬ１タンパク質とＬＡＧ３タンパク質の結合を決定すること、及び
（ｅ）ＦＧＬ１タンパク質のＬＡＧ３タンパク質への結合が、前記スクリーニングされる抗体の非存在下でのＦＧＬ１タンパク質のＬＡＧ３タンパク質への結合と比較して減少している場合、ＦＧＬ１タンパクのＬＡＧ３タンパク質との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体としてスクリーニングされる抗体を特定すること
を含む、免疫チェックポイント阻害性抗体のためのスクリーニング方法が提供される。好ましくは、該抗体は、ヒト又はヒト化抗体である。
【００２２】
さらに別の局面では、
ａ）好ましくは、少なくともヒトＦＧＬ１のフィブリノーゲンドメインを含む、ＦＧＬ１タンパク質を提供すること、
ｂ）好ましくは、少なくともヒトＬＡＧ３のドメイン１及び２を含む、ＬＡＧ３タンパク質を提供すること、
ｃ）例えば化合物ライブラリーからの、例えばハイスループットスクリーンの形式での小分子の存在下で、ＦＧＬ１タンパク質とＬＡＧ３タンパク質とを接触させること、
ｄ）前記小分子の存在下及び非存在下で、ＦＧＬ１タンパク質のＬＡＧ３タンパク質への結合を決定すること、及び
ｅ）前記がん疾患の処置のための薬剤を開発するのに適した、ＦＧＬ１−ＬＡＧ３チェックポイント阻害分子として、前記ＦＧＬ１タンパク質の前記ＬＡＧ３タンパク質との相互作用を特異的に阻害する小分子を特定することを含む、
（ヒト）ＦＧＬ１の（ヒト）ＬＡＧ３への結合を阻害する小分子をスクリーニングする方法が提供される。
【００２３】
上記の方法により、（ヒト）ＦＧＬ１の（ヒト）ＬＡＧ３への結合の阻害剤であると特定され、従ってこのような免疫チェックポイント経路に作用する薬剤として使用することができるか、又は薬剤に開発することができ、そしてそれによって前記のようながん疾患の（免疫）処置において使用することができる小分子は、同様に、本発明に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１−１】図１．新規なＬＡＧ３結合パートナーとしてのＦＧＬ１の特定。（ａ）以下の工程におけるゲノムスケール受容体アレイスクリーニングの概略図：（１）原形質膜遺伝子と可溶性遺伝子の両方をコードするｃＤＮＡライブラリーの収集。選択した可溶性遺伝子を人工膜貫通ドメインと融合させて、膜の発現及びアレイの検出を容易にした。（２）１５３６ウェルプレートを用いたロボットベースの受容体アレイの調製。（３）超高速オービタルシェーカーをベースにした手順による受容体アレイにおける、遺伝子ライブラリーのリバーストランスフェクション。このアッセイには、いくつかの免疫関連アダプターを過剰発現する改変された２９３Ｔ細胞株である２９３Ｔ．２Ａを使用した。（４）ＬＡＧ３−Ｉｇのための受容体アレイスクリーニング、アレイ結果の収集及び分析。ヒトＦｃ受容体は、スクリーニングされた融合タンパク質のための各プレート内の内部ポジティブコントロールとして機能した。（ｂ）マウスＬＡＧ３の安定的に感染した２９３Ｔ．２Ａ（１）又はモック（Mock）細胞（２）に結合したＦＧＬ１−Ｉｇの代表的なフローサイトメトリードットプロット。マウスＬＡＧ３発現細胞に結合するコントロールＩｇを示す（３）。すべてのサンプルを抗ＬＡＧ３で染色した。（ｃ）固定化されたマウスＬＡＧ３融合タンパク質に結合するマウスＦＧＬ１の代表的なオクテットセンサグラム（Octet sensorgram）。（ｄ）〜（ｅ）ＦＧＬ１とＬＡＧ３の間の相互作用。ｙ軸に示すように、２９３Ｔ．２Ａ細胞を、完全長のヒト又はマウスのＦＧＬ１−ＴＭ（ＦＧＬ１（２３−３１２）に融合したＦＩＢＣＤ１（１−５７））（ｄ）又はＬＡＧ３（ｅ）でトランスフェクトした。ｘ軸に示すように、融合タンパク質を培養物に加え、細胞検出システム（ＣＤＳ）によりトランスフェクタントに対する結合を評価した。ＣＤＳ解析ソフトウェアによって捕捉された、個々のウェルのスクリーンショットを示した。（ｆ）ヒトＦＧＬ１−ＬＡＧ３相互作用のオクテット分析（Octet analysis）。オクテットタンパク質Ａセンサー（Octet Protein A sensor）にヒトＬＡＧ３−Ｆｃを加え、次いで、示したようにヒトＦＬＡＧ−ＦＧＬ１との結合速度を試験した。Ｋｄ値を、１：１結合比を使用したオクテットソフトウェア（Octet software）によって計算した。（ｇ）コントロール抗体（対照）又は抗ＬＡＧ３（Ｃ９Ｂ７Ｗ）の存在下で、マウスＬＡＧ３でトランスフェクトした２９３Ｔ．２Ａ細胞に結合するＦＧＬ１−Ｉｇを、ＦＡＣＳにより試験した。コントロールＦｃ融合タンパク質結合は、ネガティブコントロール（影線）として機能した。
【図１−２】図１．新規なＬＡＧ３結合パートナーとしてのＦＧＬ１の特定。（ａ）以下の工程におけるゲノムスケール受容体アレイスクリーニングの概略図：（１）原形質膜遺伝子と可溶性遺伝子の両方をコードするｃＤＮＡライブラリーの収集。選択した可溶性遺伝子を人工膜貫通ドメインと融合させて、膜の発現及びアレイの検出を容易にした。（２）１５３６ウェルプレートを用いたロボットベースの受容体アレイの調製。（３）超高速オービタルシェーカーをベースにした手順による受容体アレイにおける、遺伝子ライブラリーのリバーストランスフェクション。このアッセイには、いくつかの免疫関連アダプターを過剰発現する改変された２９３Ｔ細胞株である２９３Ｔ．２Ａを使用した。（４）ＬＡＧ３−Ｉｇのための受容体アレイスクリーニング、アレイ結果の収集及び分析。ヒトＦｃ受容体は、スクリーニングされた融合タンパク質のための各プレート内の内部ポジティブコントロールとして機能した。（ｂ）マウスＬＡＧ３の安定的に感染した２９３Ｔ．２Ａ（１）又はモック（Mock）細胞（２）に結合したＦＧＬ１−Ｉｇの代表的なフローサイトメトリードットプロット。マウスＬＡＧ３発現細胞に結合するコントロールＩｇを示す（３）。すべてのサンプルを抗ＬＡＧ３で染色した。（ｃ）固定化されたマウスＬＡＧ３融合タンパク質に結合するマウスＦＧＬ１の代表的なオクテットセンサグラム（Octet sensorgram）。（ｄ）〜（ｅ）ＦＧＬ１とＬＡＧ３の間の相互作用。ｙ軸に示すように、２９３Ｔ．２Ａ細胞を、完全長のヒト又はマウスのＦＧＬ１−ＴＭ（ＦＧＬ１（２３−３１２）に融合したＦＩＢＣＤ１（１−５７））（ｄ）又はＬＡＧ３（ｅ）でトランスフェクトした。ｘ軸に示すように、融合タンパク質を培養物に加え、細胞検出システム（ＣＤＳ）によりトランスフェクタントに対する結合を評価した。ＣＤＳ解析ソフトウェアによって捕捉された、個々のウェルのスクリーンショットを示した。（ｆ）ヒトＦＧＬ１−ＬＡＧ３相互作用のオクテット分析（Octet analysis）。オクテットタンパク質Ａセンサー（Octet Protein A sensor）にヒトＬＡＧ３−Ｆｃを加え、次いで、示したようにヒトＦＬＡＧ−ＦＧＬ１との結合速度を試験した。Ｋｄ値を、１：１結合比を使用したオクテットソフトウェア（Octet software）によって計算した。（ｇ）コントロール抗体（対照）又は抗ＬＡＧ３（Ｃ９Ｂ７Ｗ）の存在下で、マウスＬＡＧ３でトランスフェクトした２９３Ｔ．２Ａ細胞に結合するＦＧＬ１−Ｉｇを、ＦＡＣＳにより試験した。コントロールＦｃ融合タンパク質結合は、ネガティブコントロール（影線）として機能した。
【図２】図２．ＦＧＬ１−ＬＡＧ３相互作用の特性評価。（ａ）マウスのＦＧＬ１−Ｉｇ、コイルドコイルドメイン（ＣＣＤ）を有する、若しくはフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）を有するＦＧＬ１−Ｉｇの、マウスＬＡＧ３でトランスフェクトした２９３Ｔ．２Ａ細胞への結合を、細胞検出システムにより測定した。（ｂ）完全長マウスＬＡＧ３、又は異なる細胞外ドメイン欠失を有するＬＡＧ３でトランスフェクトした２９３Ｔ．２Ａ細胞に対する、ＦＧＬ１−Ｉｇの結合。ＬＡＧ３完全長タンパク質は、４つの細胞外Ｉｇドメイン（Ｄ１〜Ｄ４）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び細胞内ドメイン（ＩＣ）からなる。結合強度は、「＋＋＋」（強い）、「＋＋」（中間）、「＋」（弱い）、及び「−」（結合なし）で示した。（ｃ）２９３Ｔ．２Ａ細胞を、完全長マウスＬＡＧ３でトランスフェクトした。示したように異なるドメイン欠失又はコントロールＦｃ融合タンパク質を有するＦＧＬ１−Ｉｇを培養物に加え、トランスフェクタントへのそれらの結合をＣＤＳにより測定した。（ｄ）（ｃ）におけると同様な、ＬＡＧ３ドメイン欠失／変異型に結合するＦＧＬ１のＣＤＳソフトウェアによる定量。
【図３】図３．ＦＧＬ１は、Ｔ細胞に対してＬＡＧ３依存性の阻害活性を示す。（ａ）ＷＴ又はＬＡＧ３−ＫＯマウスからの脾臓Ｔ細胞を、可溶性ＦＧＬ１−Ｉｇ又はコントロールＩｇ（５μg/mL）の存在下で、３日間、最適以下の濃度で、固定化した抗ＣＤ３抗体により活性化した後、３Ｈ−ｄＴＲを加えた。増殖したＴ細胞のチミジン取り込みを１６時間後に分析した。（ｂ）  ３Ａ９−ＬＡＧ３マウスＴ細胞ハイブリドーマ細胞を、ＨＥＬペプチド、及び異なる濃度（０、５、５０ng/mLの範囲）の組換えＦＧＬ１の存在下で、ＣｅｌｌＧｒｏ血清無しの培地中で、ＬＫ３５．２Ｂ細胞株と共培養した。２４時間後の上清におけるＩＬ−２レベルに対する阻害の正規化されたパーセンテージを示す（０％阻害のときＦＧＬ１無し）。（ｃ）抗体：ＦＧＬ１比を変化させたときの、抗ＦＧＬ１、抗ＬＡＧ３、又はコントロール抗体の存在下での、マウスＦＬＡＧ−ＦＧＬ１（１００ng/mL）のマウスＬＡＧ３でトランスフェクトした２９３Ｔ．２Ａ細胞への結合をＣＤＳにより定量した。（ｄ）３Ａ９−ＬＡＧ３マウスＴ細胞ハイブリドーマ細胞を、ＨＥＬペプチド及び組換えＦＧＬ１（５０ng/mL）、抗ＦＧＬ１、及び抗ＬＡＧ３抗体（１μg/mL）の存在下で、（ｃ）と同様にＬＫ３５．２Ｂ細胞株と共培養した。２４時間後の上清におけるＩＬ−２レベルを示す。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；ＮＳ、有意ではない。
【図４】図４．抗ＦＧＬ１は、インビボで抗原特異的Ｔ細胞応答を増強する。（ａ）実験計画の概略図。ＯＴ−１／Ｒａｇ２ＫＯマウスからの２×１０ｅ６の脾細胞を、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに静脈内注射で移し、続いて１日後にＯＶＡペプチド（マウスあたり５００μg）で処理した。対照、抗ＦＧＬ１抗体、又は抗ＬＡＧ３抗体の注入は、１日目と２日目に行った。（ｂ）４日目の血漿サイトカインレベルをＣＢＡによって測定した。＊、ｐ＜０．０５；ＮＳ、有意ではない。
【図５】図５．ＦＧＬ１−ＫＯマウスは、炎症誘発性の表現型を付与する。（ａ）〜（ｂ）ＢｉｏＧＰＳマイクロアレイデータベースにおいて示される、異なるマウス組織及び免疫細胞サブセットにおけるＦＧＬ１発現値。
【図６】図６．ＦＧＬ１−ＫＯマウスの血中の増強した免疫応答。（ａ）ＷＴ及びＦＧＬ１−ＫＯマウスの末梢血からのＣＤ４５コンパートメントを示す免疫系統の頻度。（ｂ）ＷＴ（塗りつぶし）及びＦＧＬ１ ＫＯ（縞模様）マウスの末梢血中の示された免疫サブセットの定量化。＊、ｐ＜０．０５
【図７−１】図７．ＦＧＬ１の欠損又は遮断は、腫瘍の増殖を遅らせる。（ａ）〜（ｂ）０日目に、ＦＧＬ１−ＫＯ、ＬＡＧ３−ＫＯ、又はＷＴ同腹仔（ＷＴ）に、ＭＣ３８腫瘍細胞（マウスあたり０．５×１０ｅ６）を接種した。腫瘍接種後に、示された日におけるこれらのマウスの平均腫瘍径（ａ）及び生存率（ｂ）をモニターした。（ｃ）〜（ｆ）Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、０日目に、ＭＣ３８腫瘍細胞（マウスあたり０．５×１０ｅ６）を接種し、６日目〜１８日目まで４日ごとに、抗ＦＧＬ１、抗ＬＡＧ３、又はコントロールｍＡｂで処置した。腫瘍応答（ｃ）及び腫瘍１mgあたりのＣＤ４５（左パネル）、ＣＤ８（中央パネル）及びＣＤ４（右パネル）細胞の絶対数（ｄ）を示す。また、グラフの棒（ｅ）は、ＦＧＬ−１ＫＯ及び抗ＦＧＬ−１で処置したマウスからの腫瘍におけるＣＤ８ＴＩＬの機能的表現型を示した。（ｆ）ＷＴ又はＦＧＬ１−ＫＯマウスに、ＭＣ３８腫瘍細胞を接種し、（ｃ）と同様に抗ＬＡＧ３抗体又はコントロール抗体で処置した。これらのマウスの平均腫瘍径を示した。（ｇ）ＬＡＧ３−ＫＯマウスにＭＣ３８腫瘍細胞を接種し、（ｃ）と同様に抗ＦＧＬ１抗体又は対照抗体で処置した。これらのマウスの平均腫瘍径を示した。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５；＊＊＊＊、ｐ＜０．００１；ＮＳ、有意ではない。
【図７−２】図７．ＦＧＬ１の欠損又は遮断は、腫瘍の増殖を遅らせる。（ａ）〜（ｂ）０日目に、ＦＧＬ１−ＫＯ、ＬＡＧ３−ＫＯ、又はＷＴ同腹仔（ＷＴ）に、ＭＣ３８腫瘍細胞（マウスあたり０．５×１０ｅ６）を接種した。腫瘍接種後に、示された日におけるこれらのマウスの平均腫瘍径（ａ）及び生存率（ｂ）をモニターした。（ｃ）〜（ｆ）Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、０日目に、ＭＣ３８腫瘍細胞（マウスあたり０．５×１０ｅ６）を接種し、６日目〜１８日目まで４日ごとに、抗ＦＧＬ１、抗ＬＡＧ３、又はコントロールｍＡｂで処置した。腫瘍応答（ｃ）及び腫瘍１mgあたりのＣＤ４５（左パネル）、ＣＤ８（中央パネル）及びＣＤ４（右パネル）細胞の絶対数（ｄ）を示す。また、グラフの棒（ｅ）は、ＦＧＬ−１ＫＯ及び抗ＦＧＬ−１で処置したマウスからの腫瘍におけるＣＤ８ＴＩＬの機能的表現型を示した。（ｆ）ＷＴ又はＦＧＬ１−ＫＯマウスに、ＭＣ３８腫瘍細胞を接種し、（ｃ）と同様に抗ＬＡＧ３抗体又はコントロール抗体で処置した。これらのマウスの平均腫瘍径を示した。（ｇ）ＬＡＧ３−ＫＯマウスにＭＣ３８腫瘍細胞を接種し、（ｃ）と同様に抗ＦＧＬ１抗体又は対照抗体で処置した。これらのマウスの平均腫瘍径を示した。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００５；＊＊＊＊、ｐ＜０．００１；ＮＳ、有意ではない。
【図８】図８．固形がんにおいてＦＧＬ１発現がアップレギュレートされる。（ａ）ＢｉｏＧＰＳマイクロアレイデータベース（ｍＲＮＡ）に示されている異なるヒト組織におけるＦＧＬ１の発現値。（ｂ）主要な固形がんにおける、対照物の正常な組織と比較したがん病変におけるＦＧＬ１遺伝子のアップレギュレーション又はダウンレギュレーション（Ｐ値＜０．０５、倍率変化＞３又は＜０．３をカットオフとする）を用いた多くの研究結果を、Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータベースに基づいたＲプログラムによって解析した。（ｃ）対照物の正常組織（右側）と比較した、肺腺がん及びその他の固形がん（左側）のＦＧＬ１発現値（ｍＲＮＡ）を、ＴＣＧＡがんデータベースを使用して解析した。
【図９】図９．ＦＧＬ１は、ヒトがんにおいてアップレギュレーションされ、予後の価値を有する。（ａ）ＦＧＬ１、ＤＡＰＩ核及びサイトケラチンを染色するＹＴＭＡ２５０ＮＳＣＬＣがん組織アレイにおける、定量的免疫蛍光（ＱＩＦ）染色によって示されるＦＧＬ１発現分布。正常な肺組織からの発現値の中央値を、ＦＧＬ１アップレギュレーションのカットオフとして使用した。（ｂ）定量的免疫蛍光によって定量化された腫瘍ＦＧＬ１発現とＹＴＭＡ２５０肺がんにおける全患者生存率との関連性。（ｃ）ＮＳＣＬＣがん患者及び健康なドナーのスペインのコホートにおける血漿ＦＧＬ１レベルをＥＬＩＳＡにより試験した。（ｄ）〜（ｅ）ＦＧＬ１の高い若しくはＦＧＬ１の低いＮＳＣＬＣ（ｄ）又はメラノーマ（ｅ）患者の、抗ＰＤ１療法後の生存率分析。
【図１０】図１０．ＦＧＬ１標的化の抗ＰＤ療法との相乗効果。（ａ）Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、０日目に、ＭＣ３８腫瘍細胞（マウスあたり０．５×１０ｅ６）を接種し、続いて６日目〜１８日目まで４日ごとに、抗ＦＧＬ１、抗ＬＡＧ３、又はコントロール抗体を用いて処置した。いくつかのグループでは、マウスはまた、６日目に抗Ｂ７−Ｈ１（１０Ｂ５）の単回投与で処置した。これらのグループにおけるマウスの生存率を示した。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。（ｂ）Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、０日目に、ＭＣ３８腫瘍細胞（マウスあたり０．５×１０ｅ６）を接種し、続いて、６日目〜１８日目まで４日ごとに、抗ＦＧＬ１、抗ＬＡＧ３、又はコントロール抗体で処置した。いくつかのグループでは、マウスはまた、６日目に抗Ｂ７−Ｈ１（１０Ｂ５）の単回投与で処置した。２２日目に、示されたマウスのグループにおける平均腫瘍径を示した。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
一般的な実施態様の「含んでいる」又は「含んだ」は、より具体的な実施態様の「からなる」を包含する。さらに、単数形及び複数形は、限定的に使用されない。本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、単数形のみを指定することが明示的に記載されていない限り、単数及び複数の両方を指す。
【００２６】
本明細書で使用される用語「タンパク質」は、「アミノ酸残基配列」又は「ポリペプチド」と互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。これらの用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、糖化又はタンパク質プロセッシングを含むが、これらに限定されない反応を通して翻訳後修飾されるタンパク質も含む。修飾及び変更（例えば他のタンパク質への融合、アミノ酸配列の置換、欠失又は挿入など）は、分子がその生物学的機能的活性を維持している間は、ポリペプチドの構造において行うことができる。例えば、特定のアミノ酸配列の置換は、ポリペプチド又はその基礎となる核酸コード配列において行うことができ、そして同じ特性でタンパク質を得ることができる。用語「ポリペプチド」は、典型的には１０個以上のアミノ酸を有する配列を指し、用語「ペプチド」は、１０個までのアミノ酸の長さを有する配列を意味する。しかしながら、これらの用語は互換的に使用し得る。
【００２７】
本明細書で使用される用語「遺伝子」は、機能産物として発現されることによって又は遺伝子発現の調節によって、生物の形質に影響を与える遺伝性ゲノム配列のＤＮＡ座を指す。遺伝子及びポリヌクレオチドは、ゲノム配列にあるようにイントロン及びエクソンを含み得るか、あるいは開始コドン（メチオニンコドン）及び翻訳停止コドンを含むオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）などのｃＤＮＡにあるようにコード配列をまさに含み得る。また、遺伝子及びポリヌクレオチドは、転写開始、翻訳、及び転写終結などのそれらの発現を制御する領域も含むことができる。従って、また、プロモーターなどの調節要素も含まれる。
【００２８】
本明細書で互換的に使用される用語「増強した」、「増加した」及び「上昇した」は、対照と比較したとき、少なくとも約１０％の増加、例えば、対照と比較したとき、少なくとも約２０％の増加、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約１００％、又は少なくとも約２００％、又は少なくとも約３００％、又は１０〜３００％の間の任意の整数の減少を指す。本明細書で使用される場合、「対照」は、がんを有しない少なくとも１つの被験体又は非がん性組織サンプルからのベースライン発現のための参照値又は参照サンプルであり、ここで、非がん性組織サンプルは、好ましくはがんと同じ器官に由来し、より好ましくはがん患者に由来する。
【００２９】
ＦＧＬ１のようなマーカーのカットオフ値を確立するため、及び分析される個人又は患者から得たサンプルにおけるＦＧＬ１レベルを測定するために使用される方法及びサンプルの種類は、互いに一致するか、又は同一である。カットオフ値、すなわち、それを超えると上昇した発現又は過剰発現（例えば、対照と比較したＦＧＬ１の上昇した発現）が認められる値は、対照グループにおいて得ることができる。カットオフ値の基礎となる対照グループは、調査下の個人／患者のグループと一致するように選択される。
【００３０】
「ベクター」とは、異種ポリヌクレオチドを細胞に導入するために使用することができる核酸である。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは、追加の核酸セグメントを結合することができる直鎖状又は環状の二本鎖ＤＮＡ分子を指す。別の種類のベクターは、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）であり、ここで、追加のＤＮＡ又はＲＮＡセグメントはウイルスゲノムに導入することができる。
【００３１】
用語「コードする」及び「コード化する」は、高分子化した高分子における情報を使用して、第１の分子とは異なる第２の分子の生成を指示する、任意のプロセスを広く指す。他の局面では、ＤＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードすることが出来る（例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素を使用する転写のプロセスによって）。また、翻訳のプロセスにおけるように、ＲＮＡ分子は、ポリペプチドをコードすることができる。翻訳のプロセスを説明するために使用される場合、用語「コードする」はまた、アミノ酸をコードするトリプレットコドンにも拡張される。いくつかの局面では、ＲＮＡ分子は、例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを組み込んだ逆転写のプロセスによって、ＤＮＡ分子をコードすることができる。別の局面では、ＤＮＡ分子はポリペプチドをコードすることができ、ここで、その場合に使用される「コードする」は、転写及び翻訳の両方のプロセスを組み込むことが理解される。
【００３２】
用語「対立遺伝子」は、遺伝子、遺伝子標的領域又は一般に単一の遺伝子座におけるＤＮＡ配列、すなわち染色体位置の異なる形態のいずれか１つを指す。これは、コード化配列、非コード化配列及び調節配列を含む。ゲノム内の異なる対立遺伝子は、ヌクレオチド配列において必ずしも同一であるとは限らない。
【００３３】
用語「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされた１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認識された免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミューの定数領域遺伝子ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、本明細書において交換可能に使用される。用語「抗体」は、本明細書において最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を包含する。用語「抗体」はまた、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２又は抗体の他の抗原結合サブシーケンス、すなわち、元の又は「全長の」抗体の抗原結合フラグメントなどの抗体フラグメントを包含する。また用語「抗体」は、ナノボディ（R）（Nanobodies(R)）、すなわちラクダ抗体に由来するヒト化ＶＨＨドメイン、ならびに「ドメイン抗体」または「単一ドメイン抗体」、すなわち１つの単一の免疫グロブリンドメインを介して（そして２つの対のＶＨ／ＶＬドメインによらず）その抗原と結合することができる免疫グロブリン、などの組み換え分子を包含する。さらに用語「抗体」は、抗体コンジュゲートを包含する。古典的な４本鎖で完全長の「抗体」又は「免疫グロブリン」は、一般的に約１５０kDaのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖から構成されている。各軽鎖は、１つの共有結合性のジスルフィド結合によって重鎖に連結されており、一方、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンのアイソタイプの重鎖の間で変化する。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的に間隔を置いた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、アミノ末端可変ドメイン（ＶＨ）に続いて、３つのカルボキシ末端定常ドメイン（ＣＨ）を有する。各軽鎖は、可変のＮ末端ドメイン（ＶＬ）及び単一のＣ末端定常ドメイン（ＣＬ）を有する。さらに用語「抗体」は、同一の特異性（可変ドメイン）を有しかつ同一の定常ドメインを有する複数の個々の抗体を含む種類の抗体を指す。
【００３４】
用語「免疫チェックポイント阻害性抗体」は、上記で定義されているように、阻害性受容体（ＩＲ）に結合するか、又は阻害性受容体とそのリガンドとの間の相互作用をより広範に阻害する抗体を指し、ここで、阻害性受容体は、共刺激性受容体の活性をバランスさせ、Ｔ細胞の活性化を制限するために不可欠である。したがって、そのような抗体は、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）、プログラムされた死−１（programmed death-1）（ＰＤ−１）又はそのリガンド（ＰＤ−Ｌ１）などの免疫系チェックポイントを標的とする。本発明における使用に好適な免疫チェックポイント阻害性抗体の例は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＩＤＯ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗Ｔｉｍ−３抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ４０抗体又は抗ＬＡＧ３抗体であるが、これらに限定されない。さらに、抗ＦＧＬ１抗体は、免疫チェックポイント阻害剤と見なし得る。ほとんどの場合、免疫チェックポイント阻害性抗体は、アンタゴニスト抗体又はブロッキング抗体、すなわち、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＩＤＯ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗Ｔｉｍ−３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、及び抗ＢＴＬＡ抗体からなる群より選択されるブロッキング抗体である。しかしながら、免疫チェックポイント阻害性抗体はまた、抗ＧＩＴＲ抗体又は抗ＯＸ４０抗体などのアゴニスト抗体であり得る。抗ＬＡＧ３抗体に関しては、この抗体は、ＬＡＧ３とＭＨＣクラスＩＩ分子の相互作用を選択的に阻害する抗体、又はＬＡＧ３のＦＧＬ１との相互作用を選択的に阻害する抗体、又はＬＡＧ３のＦＧＬ１及びＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用を阻害する抗体であり得る。好ましくは、免疫チェックポイント阻害性抗体は、ＩｇＧ抗体であり、より好ましくは、ヒト又はヒト化ＩｇＧ抗体であり、さらにより好ましくは、ヒト若しくはヒト化のＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体である。
【００３５】
「融合タンパク質」は、２つ以上の元々別々の天然若しくは修飾された異種のタンパク質の完全な配列若しくはその配列の任意の部分を含むタンパク質、又は２つ以上の元々別々の天然若しくは修飾された異種のタンパク質の完全な配列若しくはその配列の任意の部分の組成として定義される。融合タンパク質は、２つ以上の元々別々の天然若しくは異種タンパク質、又はその部分を元来コードする、２つ以上の遺伝子、又はその部分を融合させることにより、遺伝子工学的アプローチによって構築することができる。これによって、最初のタンパク質のそれぞれに由来する機能的特性を有する融合タンパク質が得られる。融合タンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される融合タンパク質はまた、Ｆｌａｇ融合タンパク質であり得る。ＦＧＬ１融合タンパク質又はＬＡＧ３融合タンパク質などの融合タンパク質もまた、免疫阻害性抗体の代わりに、又は免疫阻害性抗体に加えて、本発明によるがんの処置における、処置の方法若しくは使用において、使用され得る。好ましくは、融合タンパク質は、ＦＧＬ１−Ｆｃ（ＦＧＬ１−Ｉｇ）又はＬＡＧ３−Ｆｃ（ＬＡＧ３−Ｉｇ）タンパク質である。
【００３６】
用語「サイトカイン」は、細胞により放出され、細胞内媒介物として作用する、例えば、分泌細胞の周囲の細胞の挙動に影響を与える、小さなタンパク質を指す。サイトカインは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及びマクロファージ、又は他の細胞などの免疫により分泌され得る。サイトカインは、自己分泌シグナル伝達、パラ分泌シグナル伝達及び内分泌シグナル伝達などの細胞間のシグナル伝達イベントに関与し得る。サイトカインは、免疫、炎症、及び造血を含むがこれらに限定されない、一連の生物学的プロセスを媒介し得る。サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン又は腫瘍壊死因子であり得る。
【００３７】
本明細書で使用される用語「発現」又は「発現する」は、宿主細胞内での核酸配列の転写及び／又は翻訳を指す。がん又はがん患者における対象の遺伝子産物の発現のレベルは、提供されたサンプル中に存在する対応するｍＲＮＡの量、又は選択された遺伝子によって、具体的にはＦＧＬ１をコードする遺伝子によってコードされるタンパク質の量のいずれかに基づいて決定され得る。例えば、ＦＧＬ１遺伝子などの遺伝子から転写されたＲＮＡは、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼＲＮＡ保護、細胞ＲＮＡへのインサイチューハイブリダイゼーション、又はｑＰＣＲなどのＰＣＲによって定量することができる。ＦＧＬ１遺伝子などの遺伝子によってコードされるタンパク質は、様々な方法によって（例えばＥＬＩＳＡによって、ウエスタンブロッティングによって、放射線イムノアッセイによって、免疫沈降、免疫組織化学によって、タンパク質の生物学的活性の試験によって、タンパク質の免疫染色に続くＦＡＣＳ分析によって又は均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイによって）定量することができる。
【００３８】
本明細書で使用される用語「がん患者は上昇したＦＧＬ１発現を有する」は、ＦＧＬ１発現がん、具体的には上昇したＦＧＬ１発現を有するがん、より具体的には対照と比較して上昇したＦＧＬ１発現を伴うがんを患者が有していることを指す。ＦＧＬ１発現は、がん性組織の生検におけるように、がんのサンプルにおいて検出又は決定することができる。しかしながら、ＦＧＬ１発現はまた、血漿又は血清サンプルなどのがん患者の血液サンプルにおいて検出又は決定され得る。ＦＧＬ１は、結合及び／又は遊離（可溶性）形態で存在し得る。したがって、用語「がん患者は上昇したＦＧＬ１発現を有する」は、患者が上昇したＦＧＬ１発現を有するがんを有すること、及び／又は患者が血中に上昇したＦＧＬ１レベルを有することを包含する。したがって、１つの実施態様では、患者は、特に、前記患者の同じ組織の非がん性参照サンプル又は少なくとも１人の参照被験体の同じ組織の参照サンプル、好ましくは２人以上の参照被験体の同じ組織の参照サンプルにおける非癌性参照サンプルあるいは参照値などの対照と比較して、上昇したＦＧＬ１発現を有するがんを有する。該参照値は、少なくとも１人の参照被検体の同じ組織の参照サンプル、好ましくは２人以上の参照被検体の同じ組織の参照サンプルに基づき得る。少なくとも１人の参照被検体は、好ましくはがんを有さない被検体である。増強した発現は、組織サンプルにおけるＦＧＬ１に対して陽性の細胞の増加したシグナル又は増加した割合（腫瘍比率スコア（ＴＰＳ））として検出され得る。別の実施態様では、又は前の実施態様に加えて、該患者は、血清及び／又は血漿中などの、血中の上昇したＦＧＬ１発現、具体的には上昇したＦＧＬ１レベル、より具体的には上昇したＦＧＬ１タンパク質レベルを有する。好ましくは、該ＦＧＬ１発現は、少なくとも１人の参照被検体の血清又は血漿サンプルなどの非がん性参照血液サンプル、好ましくは２人以上の参照被検体の非癌性血液参照血液サンプル、又は参照値におけるような対照と比較して、上昇している。該参照値は、少なくとも１人の参照被検体の参照血液サンプル、好ましくは２人以上の参照被検体の参照血液サンプルに基づき得る。少なくとも１人の参照被検体は、好ましくはがんを有さない被検体である。好ましくは、参照被検体は、さらに肝障害を有さない。１つの実施態様では、該患者は、ＦＧＬ１を発現するがんを有し、ここで、該がんは肝臓がんではない。好ましくは該患者は、上昇したＦＧＬ１発現を伴うがんを有し、ここで、該がんは肝臓がんではなく、より具体的には、対照と比較して上昇したＦＧＬ１発現を伴うがんであり、ここで該がんは肝臓がんではない。
【００３９】
用語「遺伝子産物」は、遺伝子又はＤＮＡポリヌクレオチドによってコードされるＲＮＡポリヌクレオチド及びポリペプチドの両方を指す。
【００４０】
本明細書で使用される用語「サンプル」は、組織サンプル又は血液サンプルなどの体液サンプルを指す。組織サンプルは、身体の器官又は組織の切片であり、典型的にはいくつかの細胞の種類を含み、場合により細胞を一緒に保持する細胞骨格構造を伴う。組織サンプルは、例えば、切断、スライス、又はパンチによるものを含む生検によって得ることができる。それは、試験のためのサンプル細胞又は組織の抽出を含む。しかしながら、用語「サンプルを提供すること」、「患者からのサンプル」又は「患者から得たサンプル」は、能動的な工程である組織又は血液の抽出を含まず、むしろ、既に抽出されたサンプルの提供、すなわち、患者からのエクスビボサンプルの提供を指す。さらに、組織サンプルは、好ましくは同じ組織からの、腫瘍サンプル又はそれぞれの対照サンプルであり得る。好ましくは該組織サンプルは、ホルマリン固定された、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）されたサンプルとして使用される。血液サンプルは、血清又は血漿サンプルであり得、好ましくは血漿サンプルである。しかしながら、血液サンプルはまた、例えば、末梢血塗抹などの完全血球計算及び血球試験のための細胞画分を含み得る。血液に加えて、他の体液サンプルは、粘液、精液、唾液、喀痰、気管支洗浄液、母乳、胆汁及び尿を含むがこれ等に限定されない。サンプルは、さらに骨髄生検又は吸引物又は脳脊髄液であり得る。該サンプルは、例えば、異なる種類の細胞内または上に見られる特定の物質と反応する化学染色（色素）のような細胞化学、抗体の染色を使用するようなフローサイトメトリー及び免疫組織化学、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はＥＬＩＳＡによって分析され得るが、これ等に限定されない。本明細書で使用される用語「患者から得たサンプル」は、エクスビボ、すなわち採取後のサンプルを指し、「患者からのサンプルを提供する」又は「患者からのエクスビボサンプルを提供する」と同義である。
【００４１】
本明細書で使用される用語「ＦＧＬ１発現を検出すること」、「ＦＧＬ１発現を決定すること」は、当業者に公知の任意の手段又は方法によってＦＧＬ１発現のレベルを測定することを指し、ここで、ＦＧＬ１発現は、タンパク質又はｍＲＮＡレベルで決定され得る。好ましくはＦＧＬ１発現を測定するための手段又は方法は、ＦＧＬ１発現、好ましくはヒトＦＧＬ１発現を定量的に検出又は決定することができる。ＦＧＬ１発現を定量的に検出又は決定することは、相対量又は絶対量を検出又は決定することを含む。ＦＧＬ１発現を定量的に検出及び決定するのに適した方法は、サンプルと抗ＦＧＬ１抗体とを接触させること、及び例えばＥＬＩＳＡ若しくはＩＨＣにより、ＦＧＬ１と抗体との結合を検出すること、又はサンプルにおけるＦＧＬ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの量を、例えばＰＣＲにより、検出することを含む。特定の実施態様では、特に、抗体が例えば放射性の、蛍光性の、又はその他の方法で標識化されている場合、ＦＧＬ１発現又は上昇したＦＧＬ１発現を検出又は決定することは、抗ＦＧＬ１抗体を患者に投与すること、及びインビボで画像化することを含む。
【００４２】
ＦＧＬ１として略される用語「フィブリノーゲン様タンパク質１」（同義語ＬＦＩＲＥ−１、ＨＦＲＥＰＩ、Ｈｅｐａｓｓｏｃｉｎ、ＨＰ−０４１）は、フィブリノーゲン様タンパク質２並びに凝固因子Ｖ、ＶＩＩＩ、及びＸＩＩＩも含むタンパク質のフィブリノーゲンファミリーを指す。しかしながら、用語「ＦＧＬ１発現」は、別段の記載がない限り、ヒトにおけるタンパク質及びｍＲＮＡ発現の両方を指す。ＦＧＬ１は、ＦＧＬ１遺伝子によってコードされる。ＦＧＬ−１は、そのＣ末端部分にフィブリノーゲン関連ドメインを含み、このドメインは、フィブリノーゲンファミリーのすべてのメンバーに共通する４つの保存されたシステインを含む。しかしながら、ＦＧＬ−１は、フィブリノーゲンファミリーの他のメンバーがフィブリン血栓形成を助けることを可能にする血小板結合部位、架橋領域、及びトロンビン感受性部位を欠いている。ＦＧＬ１は再生肝臓でアップレギュレートされ、血栓形成後のフィブリンマトリックスに十分に関与している。ＦＧＬ１の大部分が血漿中に見られる一方、ＦＧＬ１の約２０％は血液凝固後に血清中に残存する。ヒトＦＧＬ１前駆体は、ＩＤ番号ＮＰ ００４４５８．３に基づくＮＣＢＩ参照配列データベースにより提供されるアミノ酸配列を有し、ここで、アミノ酸１〜２２はシグナルペプチドに対応し、アミノ酸２３〜３１２は成熟タンパク質に対応する。フィブリノーゲンのＣ末端球状ドメインは、アミノ酸７８〜３０４に対応する。
【００４３】
本明細書で使用される、用語「リンパ球活性化遺伝子３タンパク質」（ＬＡＧ３と略される）は、Ｔ細胞の活性化、増殖及び恒常性の調整に関与する抑制性分子を指す。それはまた、ＣＤ２２３とも呼ばれる。ＬＡＧ３は、免疫チェックポイント受容体として作用するＣＤ４関連の活性化誘導細胞表面分子である。ＬＡＧ３は、活性化Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｂ細胞及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）に発現している。このタンパク質はＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１と同様の方法で、増殖、活性化及び恒常性をネガティブに調節する。ＬＡＧ３は、制御性Ｔ細胞（Treg）の抑制機能の役割を果たし、ＣＤ８＋Ｔ細胞が免疫寛容原性の状態を維持する助けとなることが報告されている。ＬＡＧ３は、ＣＤ４と構造的に関連しており、ＭＨＣクラスＩＩ分子に高い親和性を持って結合する。保存された「ＫＩＥＥＬＥ」モチーフ内の単一のリジン残基（Ｋ４６８）は、下流のシグナル伝達分子との相互作用に不可欠である。それは、Ｄ１ドメインとＤ３ドメイン、及びＤ２ドメインとＤ４ドメインの間の保存された構造モチーフを伴う４つの細胞外Ｉｇ様ドメインを有する。最初のドメインは、Ｉｇ様Ｖ型ドメインであり、それに続く３つのドメインは、Ｉｇ様Ｃ２型ドメインである。ヒトＬＡＧ３は、マウスＬＡＧ３と約７０％の相同性を有する。ＬＡＧ３のユニークな識別形態は、Ｄ１ドメインのＣ鎖とＣ’β鎖の間にあるプロリンが豊富な３０−ａａのループである。ヒトＬＡＧ３及びマウスＬＡＧ３の両方がこのループを持っているが、それらの相同性は、この領域で最も低い。ヒトＬＡＧ３は、ＩＤ番号ＡＡＨ５２５８９に基づくＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋデータベースにより提供されるアミノ酸配列を有している。
【００４４】
用語「ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体」は、ヒトＦＧＬ１又はヒトＬＡＧ３に結合し、それによってＦＧＬ１のＬＡＧ３への結合をブロックする、上記で定義された抗体を指す。抗体のこのブロッキング若しくはアンタゴニスト活性は、ＬＡＧ３に対するＦＧＬ１の、又は代りにＦＧＬ１に対するＬＡＧ３の結合ポケット（又は結合界面）に結合することに起因し得るか、又はＦＧＬ１のＬＡＧ３への結合を伴う任意な他の立体的な相互作用に起因し得るが、これらに限定されない。抗ＬＡＧ３抗体については、この抗体は、ＬＡＧ３とＦＧＬ１との相互作用を選択的に阻害するアンタゴニスト抗体であるか、あるいは、ＬＡＧ３のＦＧＬ１及びＭＨＣＩＩとの相互作用を阻害するアンタゴニスト抗体であり得る。好ましくはＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体は、ＩｇＧ抗体であり、より好ましくは、ヒト又はヒト化ＩｇＧ抗体であり、さらにより好ましくは、ヒト又はヒト化ＩｇＧ１抗体である。
【００４５】
本明細書で使用される用語「プログラムされた死−１（programmed death-1）（ＰＤ−１）」は、抗原に対する過剰な免疫応答を制限し、自己免疫を防ぐ免疫チェックポイントに関する。ＰＤ−１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、活性化単球及び樹状細胞（ＤＣ）を含む様々な免疫細胞上で発現することができる。ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞の表面に発現するが、休止Ｔ細胞には発現せず、２つの公知のリガンド、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２を有する。ＰＤ−Ｌ１は、活性化Ｔ細胞、ＤＣ、単球及び骨髄系細胞上で発現し、造血系外では、ＰＤ−Ｌ１は、肺、血管内皮、肝臓の非実質細胞、胎盤の合胞体栄養細胞、及びケラチノサイトにおいて発現する。ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１相互作用を標的とする多くの薬剤が、様々な段階で臨床開発中である。ニボルマブ及びペムブロリズマブは、切除不能又は進行性の悪性黒色腫（ＭＭ）、プラチナ製剤をベースとした化学療法中又はその後に進行する非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、プラチナ製剤をベースとした化学療法中又はその後に進行する再発性又は転移性の頭頸部扁平上皮がん（ＳＣＣＨＮ）を対象に、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）及び欧州医療機関（ＥＭＡ）から既に承認を受けているヒト化ＰＤ−１ブロッキング抗体である。さらに、ニボルマブは、先の治療後に進行した進行性腎細胞がん（ＲＣＣ）、及び自家造血幹細胞移植（ＨＳＴＣ）後に再発又は進行した古典的ホジキンリンパ腫の処置薬として承認されている。さらに、ペムブロリズマブは、５０％以上（ＴＰＳ≧５０％）のＰＤ−Ｌ１発現率を有する患者の第一選択処置として承認されている。アテゾリズマブは、完全ヒト化ＰＤ−Ｌ１ブロッキング抗体であり、先にプラチナを含む化学療法を受けた後に局所進行性又は転移性の尿路上皮がん（ＵＣ）を有する患者若しくはシスプラチン不適格と判断された患者、及び先の化学療法後に局所進行性又は転移性の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を有する患者を対象に、ＦＤＡ及びＥＭＡによって承認されている。更なる抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、デュルバルマブ及びアベルマブである。
【００４６】
免疫チェックポイント阻害性抗体の使用
本発明では、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体の、及び／又は抗ＦＧＬ１抗体（後者の場合、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用の直接的な阻害を観察することが出来るかどうかには無関係である）の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者におけるがんを処置する方法が提供される。
【００４７】
免疫チェックポイント阻害性抗体、好ましくはＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する抗体、及び／又は抗ＦＧＬ１抗体の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者におけるがんを処置する方法もまた提供され、ここでがん患者は上昇したＦＧＬ１発現を有し、好ましくはここでがん患者は上昇したＦＧＬ１発現を有すると決定されている。特定の実施態様では、該患者から得たサンプルは、上昇したＦＧＬ１発現を有すると決定されている。上昇したＦＧＬ１発現は、典型的には対照と比較して上昇している。該方法は、患者から得たサンプルにおけるＦＧＬ１発現を決定すること、及びＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体、又は抗ＦＧＬ１抗体の有効量を患者に投与することを含み得る。さらに、該方法は、患者から得たサンプルにおいてＦＧＬ１発現が上昇しているかどうかを決定すること、及びＦＧＬ１発現が上昇している場合、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体の有効量、又は抗ＦＧＬ１抗体の有効量を患者に投与することを含み得る。
【００４８】
ヒト患者のがんの処置における使用のための、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体、又は抗ＦＧＬ１抗体もまた提供される。特定の実施態様では、がん患者は上昇したＦＧＬ１発現を有しており、好ましくはがん患者はＦＧＬ１発現が上昇していると決定されている。特定の実施態様では、患者からのサンプルは、上昇したＦＧＬ１発現を有していると決定されている。上昇したＦＧＬ１発現は、典型的には対照と比較して上昇している。好ましくは、上昇したＦＧＬ１発現は、インビトロでの患者からのサンプルにおいて決定されている。使用のための抗体は、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体、又は抗ＦＧＬ１抗体を、患者に投与する前に、患者からのサンプルにおけるＦＧＬ１発現を決定することを含み得る。さらに、使用のための抗体は、患者からのサンプルにおいてＦＧＬ１発現が上昇しているかどうかを決定すること、及びＦＧＬ１発現が上昇している場合に、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体、又は抗ＦＧＬ１抗体を患者に投与することを含み得る。
【００４９】
別の局面では、ヒトＦＧＬ１に結合する抗体の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者におけるがんを処置するための方法が提供される。また、ヒト患者のがんの処置における使用のためのヒトＦＧＬ１に結合する抗体も提供される。特定の実施態様では、がん患者は上昇したＦＧＬ１発現を有し、好ましくはがん患者は上昇したＦＧＬ１発現を有すると決定されている。特定の実施態様では、患者からのサンプルは、上昇したＦＧＬ１発現を有すると決定されている。上昇したＦＧＬ１発現は、典型的には対照と比較して上昇している。好ましくはＦＧＬ１抗体は、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を阻害する。
【００５０】
さらに、使用のための方法又は抗体は、ａ）がんの処置を必要とする患者を特定すること、ｂ）患者は上昇したＦＧＬ１発現を有すると決定すること、及びｃ）ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体の、又は抗ＦＧＬ１抗体の有効量を患者に投与することを含み得る。さらに、使用のための方法又は抗体は、患者からのサンプルにおいてＦＧＬ１発現が上昇していると決定することを含み得る。さらに、使用ための方法又は抗体は、患者からのサンプルを提供してＦＧＬ１発現を決定することを含み得る。
【００５１】
本発明はさらに、ａ）場合により患者からのサンプルを提供すること、ｂ）前記サンプルにおけるＦＧＬ１発現のレベルを測定すること、ｃ）ＦＧＬ１発現を対照と比較すること、ｄ）ＦＧＬ１発現のレベルが対照と比較して上昇していると測定された場合、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体を用いる、又は抗ＦＧＬ１抗体を用いる処置に応答する可能性が高いと患者を特定すること、及びｅ）ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体の、又は抗ＦＧＬ１抗体の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者におけるがんを処置する方法、又は使用のための抗体に関する。
【００５２】
本発明はさらに、がん患者のための、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体、又は抗ＦＧＬ１抗体を含む、処置を選択する方法に関し、該方法は、患者から得たサンプルにおけるＦＧＬ１発現のレベルを測定すること及びＦＧＬ１発現のレベルが上昇している場合に、患者のための前記処置を選択することを含む。
【００５３】
本発明の使用のための方法又は抗体によるＦＧＬ１発現は、好ましくは対照と比較して上昇している。対照は、少なくとも１人のがんを有しない被検体又は非がん性の細胞サンプルからのベースライン発現のための参照値又は参照サンプルであり得、ここで非がん性の組織サンプルは、好ましくはがんと同じ器官に由来し、そしてより好ましくはそのがん患者に由来する。本発明による方法又はその使用において使用される患者からのサンプルは、好ましくは組織サンプル及び／又は血液サンプルであり、好ましくは腫瘍又は血液サンプルである。したがって、１つの実施態様では、患者は、特に、前記患者の同じ組織の非がん性の参照サンプル、又は少なくとも１人の参照被検体の同じ組織の参照サンプル、好ましくは２人以上の参照被検体の同じ組織の参照サンプルにおける非癌性の参照サンプル、あるいは参照値などの対照と比較して、上昇したＦＧＬ１発現を有する。該参照値は、少なくとも１人の参照対象の同じ組織の参照サンプル、好ましくは少なくとも２人以上の参照被検体の同じ組織の参照サンプルに基づき得る。少なくとも１人の参照被検体は、好ましくはがんを有さない被検体である。増強した発現は、ＦＧＬ１に対して陽性の細胞の増加したシグナル又は増加した割合（腫瘍比率スコア（ＴＰＳ））として検出され得る。別の実施態様では、又は前の実施態様に加えて、患者は、血清又は血漿中などの血中において、上昇したＦＧＬ１発現、具体的には上昇したＦＧＬ１レベル、より具体的には上昇したＦＧＬ１タンパク質レベルを有する。好ましくはＦＧＬ１発現は、少なくとも１人の参照被検体の血清又は血漿サンプルなどの参照血液サンプル、好ましくは２人以上の参照被検体の参照血液サンプル中にあるような対照、又は参照値などの、対照と比較して上昇している。参照値は、少なくとも１人の参照被検体の参照血液サンプル、好ましくは２人以上の参照被検体の参照血液サンプルに基づき得る。少なくとも１人の参照被検体は、好ましくはがんを有さない被検体である。好ましくは、参照被検体は、さらに肝障害を有さない。１つの実施態様では、患者は、ＦＧＬ１を発現するがんを有し、ここで、該がんは肝臓がんではない。好ましくは、該患者は、上昇したＦＧＬ１発現を伴うがんを有し、ここでがんは、肝臓がんではなく、より具体的には対照と比較して上昇したＦＧＬ１発現を有するがんであり、ここでがんは肝臓がんではない。組織又は腫瘍サンプルは、ＦＧＬ１検出のためのホルマリン固定、パラフィン包埋サンプルとして使用され得る。
【００５４】
ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体は、抗ＬＡＧ３抗体、又は抗ＦＧＬ１抗体、又はそれらの組み合わせであり得る。特定の実施態様では、免疫チェックポイント阻害性抗体は、抗ＬＡＧ３抗体であり、ここで抗ＬＡＧ３抗体は、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を阻害する。別の特定の実施態様では、免疫チェックポイント阻害性抗体は、抗ＦＧＬ１抗体である。さらに別の特定の実施態様では、免疫チェックポイント阻害性抗体は、抗ＬＡＧ３抗体及び抗ＦＧＬ１抗体である。好ましくは、抗ＬＡＧ３抗体及び抗ＦＧＬ１抗体は、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を阻害する。特定の実施態様では、抗ＦＧＬ１抗体は、ヒト患者におけるがんを処置するために使用される。
【００５５】
本発明による方法又は処置において使用される、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体、及び／又は抗ＦＧＬ１抗体はまた、少なくとも１つのさらなる免疫チェックポイント阻害性抗体（この用語は、再度、それらの抗原結合断片を含む）と併せて使用され得、ここで、さらなる免疫チェックポイント阻害性抗体は、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体、又は抗ＦＧＬ１抗体のそれぞれ以外の任意のチェックポイント阻害性抗体であり得る。好ましくは少なくとも１つのさらなる免疫チェックポイント阻害性抗体は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＩＤＯ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗Ｔｉｍ−３抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ４０抗体及び抗ＬＡＧ３抗体からなる群より選択される。具体的には、ここで抗ＬＡＧ３抗体は、ＬＡＧ３のＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用を選択的に阻害する。より好ましくは少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害性抗体は、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体であり、さらにより好ましくは少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害性抗体は、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【００５６】
免疫チェックポイント阻害性抗体及び少なくとも１つのさらなる免疫チェックポイント阻害性抗体は、全身的に（例えば、経口、非経口、皮下、静脈内、直腸内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経皮的に、又は吸入若しくは体腔内設置により）、局所的に、又は鼻、喉及び気管支などの粘膜に塗布することにより、患者に投与することができる。好ましくは、免疫チェックポイント阻害性抗体及び少なくとも１つのさらなる免疫チェックポイント阻害性抗体は、静脈内投与又は皮下投与される。２つ以上の免疫チェックポイント阻害性抗体を使用する場合、それぞれの免疫チェックポイント阻害性抗体は、好適な投与の経路で、好ましくは静脈内又は皮下に、独立して投与される。免疫チェックポイント阻害性抗体及び少なくとも１つのさらなる免疫チェックポイント阻害性抗体は、同時に投与され得るか、互いに別々に投与され得る。典型的には、それらは別々の製剤又は剤形で提供され、投与前に組み合わせ得るか、別々に投与され得る。
【００５７】
特定の実施態様では、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体、又は抗ＦＧＬ１抗体によって処置されるがんは、固形腫瘍、血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫、例えば、多発性骨髄腫）、及び転移巣を含むが、これらに限定されない。１つの実施態様では、がんは固形腫瘍である。固形腫瘍の例は、悪性腫瘍、例えば、肉腫及びがん腫、例えば、肺、乳房、卵巣、リンパ系、消化管（例えば、結腸）、肛門、生殖器及び尿生殖器管（例えば、腎、尿路上皮、膀胱細胞、前立腺）、咽頭部、中枢神経系（CNS）（例えば、脳、神経又は膠細胞）、頭頸部、皮膚（例えば、黒色腫（melanoma））、及び膵臓に影響を与えるこれ等の様々な器官系の腺がん、ならびに結腸がん、直腸がん、腎細胞がん、肝臓がん、非小細胞肺がん、小腸のがん及び食道のがんなどの悪性腫瘍を含む腺がん、を含む。好ましくはがんは、脳がん、結腸直腸がん、悪性黒色腫（melanoma）、前立腺がん又は肺がんである。より好ましくはがんは、肺がん又は前立腺がんであり、さらにより好ましくは、肺がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。さらに、該処置は、化学療法又は放射線療法を伴い得る。該がんは、早期、中期、末期、又は転移性がんであり得る。特定の実施態様では、がんは、例えば慢性ウイルス性肝炎などのウイルス感染を伴う又は伴わない、肝細胞がんなどの肝臓がんではない。
【００５８】
１つの実施態様では、がんは、肺がん（例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）（例えば、扁平上皮及び／又は非扁平上皮組織診断を伴うＮＳＣＬＣ、又はＮＳＣＬＣ腺がん）、黒色腫（例えば、進行性黒色腫）、腎がん（例えば、腎細胞がん）、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、前立腺がん、乳がん（例えば、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、又はＨｅｒ２／ｎｅｕの１つ、２つ又は全てを発現しない乳がん、例えば、三種陰性乳がん）、結腸直腸がん、膵臓がん、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ））、肛門がん、胃食道がん、甲状腺がん、子宮頸部がん、リンパ増殖性疾患（例えば、移植後リンパ増殖性疾患）、脳がん又は血液がん、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又は白血病（例えば、骨髄性白血病又はリンパ性白血病）から選択される。
【００５９】
別の実施態様では、がんは、がん腫（例えば、進行性又は転移性がん腫）、黒色腫、又は肺がん腫、例えば、非小細胞肺がん腫から選択される。１つの実施態様では、がんは、肺がん、例えば、非小細胞肺がん又は小細胞肺がんであり、好ましくは非小細胞肺がんである。１つの実施態様では、がんは、黒色腫、例えば、進行性の黒色腫である。１つの実施態様では、がんは、他の治療法に応答しない進行性又は切除不能な黒色腫である。別の実施態様では、がんは、前立腺がん、例えば、進行性の前立腺がんである。さらに別の実施態様では、がんは骨髄腫、例えば、多発性骨髄腫である。さらに別の実施態様では、がんは、腎がん、例えば、腎細胞がん（ＲＣＣ）（例えば、転移性ＲＣＣ又は腎明細胞がん（ＣＣＲＣＣ））である。
【００６０】
特定の実施態様では、がんのための処置される患者は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＩＤＯ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗Ｔｉｍ−３抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、及び抗ＯＸ４０抗体からなる群より選択される少なくとも１つのチェックポイント阻害性抗体に対する原発性又は後天性の耐性を有し得る。いくつかの実施態様では、患者は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害に対する原発性又は後天性の耐性を有する。チェックポイント阻害に対する原発性の（先天的な）耐性を有する患者はまた、非応答者と呼ばれ得る。しかしながら、いくつかの場合には、遅発性の再発が観察され、これは処置に対する後天性の（二次的な）耐性を示す。
【００６１】
好ましくは、がん患者は、上昇したＦＧＬ１発現を有するか、又は有していると特定される。特定の実施態様では、がん患者は、上昇したＦＧＬ１発現を有している腫瘍を有するか、又は有していると特定される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の方法は、上昇したＦＧＬ１発現を有するか、又は上昇したＦＧＬ１発現を有する腫瘍を有することに基づいて、免疫チェックポイント阻害性抗体を用いる処置に好適ながん患者を特定することをさらに含む。いくつかの実施態様では、がん患者は、ＦＧＬ１に対して陽性であるがん細胞の高い割合を有するか、又は有していると特定される。
【００６２】
いくつかの実施態様では、さらに、本明細書に記載の方法は、上昇したＦＧＬ１発現を有するか、又はＦＧＬ１陽性であるがん細胞の高い割合を有することに基づいてがん患者を特定し、肺がん、例えば肺扁平上皮がん又は肺腺がん；頭頸部がん；子宮頚部扁平上皮子がん；胃がん；食道がん；甲状腺がん；黒色腫、脳がん、結腸直腸がん、前立腺がん及び／又は上咽頭がん（ＮＰＣ）、好ましくは脳がん、結腸直腸がん、黒色腫、前立腺がん又は肺がんのうちの１つ以上を特定することを含む。本明細書に開示された方法及び抗体は、上昇したＦＧＬ１発現を有し、かつ前記がんに関連する転移巣を処置するために有用である。
【００６３】
また、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体、又は抗ＦＧＬ１抗体の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者におけるがんを処置するための方法も提供され、ここで、がん患者は本明細書に記載の診断方法のいずれか１つに従って決定される上昇したＦＧＬ１発現を有する。
【００６４】
本発明の抗体が、ＦＧＬ１に、好ましくはヒトＦＧＬ１に結合する抗体である場合、抗体は、ＦＧＬ１の（ヒト）ＬＡＧ３への結合を直接的又は非直接的に阻害し得る。該抗体は、ＦＧＬ１への結合のためにヒトＬＡＧ３と競合、又は非競合し得る。そのような非競合性抗体がその免疫調節効果を行使する際に介する分子のメカニズムは完全には明らかではないが、そのような抗体は、それにもかかわらず、ＦＧＬ１に結合するためにＬＡＧ３と競合する抗ＦＧＬ１抗体と同様の治療効果を有し得る。
【００６５】
さらに別の局面では、（抗体がヒトＬＡＧ３のヒトＦＧＬ１との相互作用を阻害する）ヒトＬＡＧ３に結合する抗体（抗ＬＡＧ３）が提供される。
【００６６】
好ましくは、本発明による抗ＦＧＬ１抗体及び／又は抗ＬＡＧ３抗体は、ヒト若しくはヒト化抗体であり、より好ましくはヒト若しくはヒト化のＩｇＧ１抗体若しくはＩｇＧ４抗体である。
【００６７】
診断方法
ヒトがん患者における上昇したＦＧＬ１発現の上昇を検出する方法が、本明細書に提供され、該方法は、患者からのサンプルを提供すること、及びサンプルにおけるＦＧＬ１発現を検出することを含み、ここで、サンプルにおける定量的に検出されたＦＧＬ１発現は、好ましくは対照と比較され、ここでさらに、該方法は、場合により、ＦＧＬ１発現が対照と比較して上昇していると決定された場合、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体を用いる処置、又は抗ＦＧＬ１抗体を用いる処置に感受性がある可能性が高いと患者を特定することを含み得る。
【００６８】
また、（ａ）患者からのサンプルを提供すること、（ｂ）サンプルにおけるＦＧＬ１発現を検出すること、（ｃ）工程（ｂ）において決定されたＦＧＬ１発現を対照と比較することを含み、（ここでサンプルにおけるＦＧＬ１発現は対照と比較して上昇している）、そしてさらに、場合により、ＦＧＬ１発現が対照と比較して上昇していると決定された場合、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体を用いる、又は抗ＦＧＬ１抗体を用いる処置に対して感受性がある可能性が高いと患者を特定することを含む、がん患者における免疫チェックポイント阻害性抗体を用いる処置に対する感受性を評価する方法も、本明細書に提供される。
【００６９】
また、（ａ）患者からのサンプルを提供すること、（ｂ）サンプルにおけるＦＧＬ１発現を検出すること、及び（ｃ）ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体を用いる、又は抗ＦＧＬ１を用いる処置のための候補として腫瘍を特定することを含む、患者の腫瘍を分類する方法も提供され、ここでさらに、該方法は、場合により、工程（ｂ）で決定されたＦＧＬ１発現を対照と比較する工程を含み、ここで、対照と比較したサンプルにおける上昇したＦＧＬ１発現は、そのような処置のための候補として腫瘍を特定する。同時に、また、サンプルにおける上昇したＦＧＬ１発現のレベルは、該腫瘍が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＩＤＯ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗Ｔｉｍ−３抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＧＩＴＲ抗体及び抗ＯＸ４０抗体などの別の免疫チェックポイント阻害性抗体を用いる処置を回避したことも示し得る。そのような場合、そういった他の免疫チェックポイント阻害性抗体を、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体と一緒に、又は抗ＦＧＬ１抗体と一緒に併用して使用することは、このような他の免疫チェックポイント阻害性抗体に対する原発性又は後天性の耐性を克服し得、したがって、上昇したＦＧＬ１発現に関連する予後不良を克服し得る。
【００７０】
また、（ａ）患者からのサンプルを提供すること、（ｂ）前記サンプルにおけるＦＧＬ１発現のレベルを測定すること、（ｃ）ＦＧＬ１発現を対照と比較すること、及び（ｄ）ＦＧＬ１発現のレベルが対照と比較して上昇していると決定された場合、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体を用いる、又は抗ＦＧＬ１抗体を用いる処置に応答する可能性が高いと患者を特定すること、又はＦＧＬ１発現が対照と比較して上昇していると決定されなかった場合に、応答する可能性が低いと患者を特定することを含む、ヒトがん患者の応答性を予測する方法も提供される。
【００７１】
また、（ａ）少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害性抗体を用いて処置された、又は以前に処置された患者からのサンプルを提供すること、（ｂ）前記サンプルにおけるＦＧＬ１発現のレベルを決定すること、（ｃ）ＦＧＬ１発現のレベルを対照と比較すること、及び（ｄ）ＦＧＬ１発現のレベルが対照と比較して上昇していると決定された場合に、前記少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害性抗体を用いる処置に対して応答する可能性が低いと患者を特定することを含む、ヒトがん患者の応答性を予測する方法も提供される。ここで、少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害性抗体は、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体以外の免疫チェックポイント阻害抗体であり、抗ＦＧＬ１抗体以外の免疫チェックポイント阻害抗体であるが、好ましくは、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＩＤＯ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗Ｔｉｍ−３抗体、抗ＧＩＴＲ抗体及び抗ＯＸ４０抗体からなる群より選択される。より好ましくは、抗体は、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体からなる群より選択され、より好ましくは、抗体は、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。上昇したＦＧＬ１発現に関連した予後不良は、本発明による、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体又は抗ＦＧＬ１抗体を用いる追加療法により克服され得る。
【００７２】
免疫チェックポイント経路間の様々な相互作用を考慮すると、増強した又は上昇したＦＧＬ１発現はまた、（拮抗的な）抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＩＤＯ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗Ｔｉｍ−３抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ４０抗体、又は抗ＶＩＳＴＡ抗体を含む、任意の免疫チェックポイント阻害剤を用いるそのような患者の処置が、がん疾患の処置における治療的効果をもたらし得ることも示し得る。したがって、本発明の別の局面により、処置の方法、ヒトがん患者の応答性を予測する方法、腫瘍又はがん疾患の感受性を評価する方法、患者の腫瘍を分類する方法などが提供され、ここで、増強した又は上昇したＦＧＬ１発現は、例えば、上述の、（拮抗的な）抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＩＤＯ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗Ｔｉｍ−３抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ４０抗体、又は抗ＶＩＳＴＡ抗体などの、免疫チェックポイント阻害剤によってそのような患者、腫瘍又はがん疾患を処置することが出来ることを示す指標として使用される。
【００７３】
本発明による、上昇したＦＧＬ１発現を検出する方法、感受性を評価する方法、分類する方法及び応答性を予測する方法は、好ましくはインビトロ法である。さらに具体的には、ＦＧＬ１発現を検出する工程は、好ましくは患者からのサンプルにおけるＦＧＬ１発現又はＦＧＬ１発現のレベルを定量的に検出することを含む。さらに、該方法は、ＦＧＬ１のＬＡＧ３との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体又は抗ＦＧＬ１抗体をがん患者に投与する工程を含み得るか、又はそれに続き得る。該サンプルは、好ましくは組織及び／又は体液サンプルであり、好ましくは組織及び／又は血液サンプルであり、より好ましくは腫瘍及び／又は血液サンプルである。該ＦＧＬ１発現は、例えば、（ａ）サンプルと抗ＦＧＬ１抗体とを接触させること及びＦＧＬ１（ＦＧＬ１タンパク質）と抗体との結合を検出することにより、又は（ｂ）サンプルにおけるＦＧＬ１をコードするｍＲＮＡの量を検出することにより、サンプルにおいて定量的に検出され得る。さらに、ＦＧＬ１コピー数の増加が決定され得る。１つの実施態様では、対照は、がんを有さない少なくとも１人の参照被検体又は非がん性組織サンプルからのベースライン発現のための参照値又は参照サンプルであり、ここで、非がん性組織サンプルは、好ましくはがんと同じ器官に由来し、そしてより好ましくはがん患者に由来する。
【００７４】
本方法によって検出されるＦＧＬ１発現は、好ましくは対照と比較して上昇している。対照は、がんを有さない少なくとも１人の参照被検体又は非がん性組織サンプルからのベースライン発現のための参照値又は参照サンプルであり得、ここで、非がん性組織サンプルは、好ましくはがんと同じ器官に由来し、より好ましくはそのがん患者に由来する。本発明による方法において使用される患者からのサンプルは、好ましくは組織サンプル及び／又は血液サンプルであり、好ましくは腫瘍及び／又は血液サンプルである。
【００７５】
したがって、１つの実施態様では、患者は、特に、前記患者の同じ組織の非がん性の参照サンプル、又は少なくとも１人の参照被検体の同じ組織の参照サンプル、好ましくは２人以上の参照被検体の同じ組織の参照サンプルにおける非がん性の参照サンプル、又は参照値などの対照と比較して、上昇したＦＧＬ１発現を有するがんを有する。また、参照値は、カットオフ値とも呼ばれる。参照値は、少なくとも１人の参照被検体の同じ組織の参照サンプル、好ましくは２人以上の参照被検体の同じ組織の参照サンプルに基づき得る。少なくとも１人の参照被検体は、好ましくはがんを有さない被検体である。増強した発現は、ＦＧＬ１に対して陽性の細胞の増加したシグナル又は増加した割合（腫瘍比率スコア（ＴＰＳ））として検出され得る。
【００７６】
別の実施態様では、又は前の実施態様に加えて、患者は、血清又は血漿中などの血中の上昇したＦＧＬ１発現、具体的には上昇したＦＧＬ１レベル、より具体的には上昇したＦＧＬ１タンパク質レベルを有する。好ましくはＦＧＬ１発現は、少なくとも１人の参照被検体の血清又は血漿サンプル、好ましくは２人以上の参照被検体の参照血液サンプルなどの参照血液サンプル中にあるような対照、又は参照値などの対照と比較して上昇している。参照値は、少なくとも１人の参照被検体の参照血液サンプル、好ましくは２人以上の参照被検体の参照血液サンプルに基づき得る。少なくとも１人の参照被検体は、好ましくはがんを有さない被検体である。好ましくは、さらに、参照被検体は、肝障害を有さない。
【００７７】
１つの実施態様では、患者はＦＧＬ１発現のがんを有し、ここで、がんは肝臓がんではない。好ましくは患者は、上昇したＦＧＬ１発現を伴うがんを有しており、ここで、がんは肝臓がんではなく、より具体的には、対照と比較して上昇したＦＧＬ１発現を伴うがんであり、ここで、がんは肝臓がんではない。
【００７８】
特定の実施態様では、ＦＧＬ１発現は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＩＤＯ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗Ｔｉｍ−３抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、及び抗ＯＸ４０抗体からなる群より選択される少なくとも１つのチェックポイント阻害性抗体に対する原発性又は後天性の耐性を有する患者からの、又はＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害に対する原発性又は後天性の耐性を有する患者からのサンプルにおいて検出される。
【００７９】
上昇したＦＧＬ１発現を有するがん患者は、ＦＧＬ１を発現するがん、具体的には上昇したＦＧＬ１発現を伴うがん、より具体的には対照と比較して上昇したＦＧＬ１発現を伴うがんを有する患者であり得る。該ＦＧＬ１発現は、がん組織の生検におけるように、がんのサンプルにおいて検出又は決定することができる。しかしながら、また、ＦＧＬ１発現は、血漿又は血清サンプルなどのがん患者の血液サンプルにおいて検出又は決定され得る。ＦＧＬ１は、結合した及び／又は遊離した（可溶性）形態で存在し得る。
【００８０】
１つの実施態様では、患者は、具体的には、前記患者の同じ組織の非がん性の参照サンプル、又は少なくとも１人の参照被検体の同じ組織の参照サンプル、好ましくは２人以上の参照被検体の同じ組織の参照サンプルにおける非がん性の参照サンプル又は参照値などの、対照と比較して、上昇したＦＧＬ１発現を有するがんを有する。該参照値は、少なくとも１人の参照被検体の同じ組織の参照サンプル、好ましくは少なくとも２人以上の参照被検体の同じ組織の参照サンプルに基づき得る。少なくとも１人の参照被験体は、好ましくは、がんを有さない被験体である。増強した発現は、ＦＧＬ１に対して陽性の細胞の増加したシグナル（染色強度）及び／又は増加した割合（腫瘍比率スコア（ＴＰＳ））として腫瘍サンプルにおいて検出され得る。典型的には、サンプルは、例えば、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）切片などのホルマリン固定、パラフィン包埋の組織サンプルの形態で存在する。患者のＴＰＳを評価するためのＦＧＬ１染色を用いた腫瘍細胞の割合は、０％と１００％の間である。ＴＰＳは、サンプル中に存在するすべての生存可能な腫瘍細胞（陽性及び陰性）に対する部分的又は完全な染色を示す生存可能な腫瘍細胞の割合である。浸潤性免疫細胞、正常細胞、壊死細胞及び破片はスコアリングから除外する必要がある。ＦＧＬ１発現を決定するには、最低１００個の生存可能な腫瘍細胞が必要である。検体のＦＧＬ１発現のレベルは、「ＦＧＬ１発現なし：ＴＰＳ＜１％」、「ＦＧＬ１発現：ＴＰＳ≧１％」、「高ＦＧＬ１発現：ＴＰＳ≧５０％」と解釈できる。他の関連する因子は、発現のレベル（染色強度）であり得る。染色は、好ましくは当技術分野で公知の方法を使用する、インサイチューハイブリダイゼーション、好ましくは蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、又は免疫組織化学（ＩＨＣ）を使用して行い得る。ＩＨＣの場合、ホルマリン固定、パラフィン包埋の組織サンプルの切片は、典型的には脱パラフィン化し、再水和する必要がある。抗原賦活化後、内因性ペルオキシダーゼは、抗ＦＧＬ１抗体又はＬＡＧ３融合タンパク質と反応する前に、例えば過酸化水素を用いてクエンチする必要がある。また、更なる関連する因子は、ＦＩＳＨを用いて特定され得るように（Inoue, Y. et al., Clinical significance of PD-L1 and PD-L2 copy number gains in non-small-cell lung cancer, Oncotarget, 7(22): 32113-32128）、遺伝子コピー数の増加（ゲノムにおける追加の遺伝子コピー）であり得る。さらに、ＥＤＴＡ抗凝固末梢全血に由来するような血漿からの無細胞循環腫瘍ＤＮＡ（circulating-free tumor DNA）は、定量的に検出し得る。また、原発腫瘍サンプルに加えて、ＦＧＬ１発現は、転移性局所リンパ節サンプルにおいて決定され得る。また、リンパ腫又は白血病の患者の場合は、リンパ節を分析し得る。
【００８１】
核酸ハイブリダイゼーションは、プローブ（例えば、オリゴヌクレオチド又はより大きなポリヌクレオチド）とその相補的な標的が、相補的な塩基対を介して安定なハイブリッド二重鎖を形成できる条件下で、プローブと標的核酸とを接触させることを単に含む。本明細書で使用される場合、ハイブリダイゼーション条件は、核酸分子が類似の核酸分子を特定するために使用される標準的なハイブリダイゼーション条件を指す。そのような標準条件は、例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labs Press（その全体が参照により組み込まれるが、具体的には９．３１〜９．６２ページを参照のこと）に開示されている。さらに、ヌクレオチドのミスマッチの程度を変化させることを可能にするハイブリダイゼーションを達成するための、適切なハイブリダイゼーション及び洗浄条件を計算するための式が、例えば、 Meinkoth et al. (1984) Anal. Biochem. 138, 267-284に開示されている。ハイブリッド二重鎖を形成しない核酸は、ハイブリダイズされた核酸から洗い流され、次いで、ハイブリダイズされた核酸は、典型的には、結合した検出可能な標識の検出を介して検出することができる。核酸は、核酸を含む緩衝液の温度を上昇させるか、又は塩濃度を低下させることによって変性される。低ストリンジェンシー条件下（例えば、低温又は高塩分、又はその両方）では、アニーリングされた配列が完全に相補的でない場合でも、ハイブリッド二重鎖（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、又はＲＮＡ：ＤＮＡ）が形成される。したがって、ハイブリダイゼーションの特異性は、より低いストリンジェンシーで低下する。逆に、より高いストリンジェンシー（例えば、より高い温度やより低い塩分）では、ハイブリダイゼーションを成功させるためには、より少ないミスマッチが必要となる。
【００８２】
別の実施態様では、又は組織サンプルに加えて、患者は、血清及び／又は血漿中などの、血中の、上昇したＦＧＬ１発現、具体的には上昇したＦＧＬ１レベル、より具体的には上昇したＦＧＬ１タンパク質レベルを有する。好ましくはＦＧＬ１発現は、少なくとも１人の参照被験体の血清又は血漿サンプル、好ましくは２人以上の参照被験体の血液サンプルのような非がん性の参照血液サンプル中にある対照、又は参照値などの対照と比較して上昇している。該参照値は、少なくとも１人の参照被験体の参照血液サンプル、好ましくは２人以上の被験体の参照血液サンプルに基づき得る。少なくとも一人の参照被験体は、好ましくはがんを有さない被験体である。好ましくは、さらに参照被験体は、肝障害を有さない。血清及び／又は血漿におけるＦＧＬ１発現は、例えば、検出剤として抗ＦＧＬ１抗体又はＬＡＧ３融合タンパク質を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して検出し得、これらは当技術分野で公知である。血清中のＦＧＬ１の濃度は、ng/mLの範囲である。
【００８３】
ハイブリダイズされた核酸又は抗体は、サンプルの核酸又は抗体に結合した１つ以上の標識を検出することによって検出される。標識は、当業者に周知の多くの手段のいずれかにより組み込まれ得る。本発明における使用に好適な検出可能な標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的手段によって検出可能な任意な組成物を含む。本発明における有用な標識は、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒｓ、Ｓｐｅｃｔｒｕ色素など）、量子ドット、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３２Ｐ）、及び比色標識を含む。そのような標識を検出する手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、放射性標識は、写真フィルム又はシンチレーションカウンターを使用して検出され得、蛍光標識は、放射光を検出するための光検出器及び蛍光顕微鏡又はフローサイトメトリーを用いて検出され得る。比色標識は、着色された標識を単に可視化することによって検出される。好ましくは、ハイブリダイズした核酸は、蛍光標識によって検出され、最も好ましくは、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイの環境で検出される。ＦＩＳＨアッセイは、当技術分野で周知である。抗体は、好ましくは蛍光標識又は比色標識によって検出される。
【００８４】
１つの実施態様では、患者はＦＧＬ１発現のがんを有し、ここで、がんは肝臓がんではない。好ましくは、患者は、上昇したＦＧＬ１発現を伴うがんを有し、ここで、がんは肝臓がんではなく、より具体的には対照と比較して上昇したＦＧＬ１発現を伴うがんであり、ここで、がんは肝臓がんではない。本発明の方法に好適ながん患者は、免疫チェックポイント阻害性抗体の治療的使用に特定されるがんを有する。
【００８５】
スクリーニングの方法
また、
（ａ）好ましくは少なくともヒトＦＧＬ１のフィブリノーゲンドメインを含む、ＦＧＬ１タンパク質を提供すること、
（ｂ）好ましくは、少なくともヒトＬＡＧ３のドメイン１及び２を含む、ＬＡＧ３タンパク質を提供すること、
（ｃ）スクリーニングされる抗体の存在下で、ＦＧＬ１タンパク質とＬＡＧ３タンパク質とを接触させること、
（ｄ）ＦＧＬ１タンパク質のＬＡＧ３タンパク質への結合を決定すること、及び
（ｅ）ＦＧＬ１タンパク質とＬＡＧ３タンパク質との結合が、スクリーニングされる前記抗体の非存在下でのＦＧＬ１タンパク質とＬＡＧ３タンパク質との結合に比べて減少している場合、ＦＧＬ１タンパク質のＬＡＧ３タンパク質との相互作用を特異的に阻害する免疫チェックポイント阻害性抗体としてスクリーニングされる抗体を特定すること
を含む、免疫チェックポイント阻害性抗体をスクリーニングするための方法も、本明細書に提供される。好ましくは、該抗体は、ヒト又はヒト化抗体である。
【００８６】
さらに、
（ａ）好ましくは少なくともヒトＦＧＬ１のフィブリノーゲンドメインを含む、ＦＧＬ１タンパク質を提供すること、
（ｂ）好ましくは少なくともヒトＬＡＧ３のドメイン１及び２を含む、ＬＡＧ３タンパク質を提供すること、
（ｃ）例えば化合物ライブラリーからの、例えばハイスループットスクリーンの形式での、小分子の存在下で、該ＦＧＬ１タンパク質と該ＬＡＧ３タンパク質とを接触させること、
（ｄ）前記小分子の存在下及び非存在下におけるＦＧＬ１タンパク質のＬＡＧ３タンパク質への結合を決定すること、及び
（ｅ）前述の、がん疾患の処置のための薬剤を開発するのに好適な、ＦＧＬ１−ＬＡＧ３チェックポイント阻害分子として、前記ＦＧＬ１タンパク質の前記ＬＡＧ３タンパク質への結合を特異的に阻害する小分子を特定すること
を含む、（ヒト）ＦＧＬ１の（ヒト）ＬＡＧ３への結合を阻害する小分子をスクリーニングする方法が、本明細書に提供される。
【００８７】
さらに、本発明は、（ヒト）ＦＧＬ１の（ヒト）ＬＡＧ３への結合の阻害剤であることが上述の方法によって特定された小分子を包含し、したがってそれは薬物として使用することができるか、又は薬物に開発することが出来、それは、そのような免疫チェックポイント経路に作用することであり、そしてそれによって前述のようにがん疾患の（免疫）処置に使用することができる。
【００８８】
特定の実施態様では、可溶性タンパク質のＦＧＬ１（例えば、完全長ヒトＦＧＬ１又は３ｘＦＬＡＧタグ付きＦＧＬ１タンパク質などの標識化されたＦＧＬ１）のＬＡＧ３（ＬＡＧ３−Ｆｃ融合タンパク質などの、ヒトＬＡＧ３の融合タンパク質）への結合が測定される。該結合又は相互作用は、例えば、オクテット装置（Octet instrument）などの、バイオセンサーを使用して測定され得る。
【００８９】
他の実施態様では、タンパク質の少なくとも１つは、膜の発現を容易にするための膜貫通ドメインを含み、他の結合パートナーは可溶性タンパク質である。ヒトＬＡＧ３は、膜貫通タンパク質であり、したがって膜貫通ドメインを含む。ＦＧＬ１は、膜の発現を容易にするために、ＦＩＢＣＤ１遺伝子（Ｎ末端へのＡＴＭ挿入）又はＢ７−Ｈ６遺伝子（Ｃ末端へのＡＴＭ挿入）からなどの人工膜貫通ドメイン（ＡＴＭ）と融合され得る可溶性タンパク質である。好ましくは人工膜貫通ドメインと融合したＦＧＬ１は、膜発現を容易にする、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＲgamma、及びＣＤ３epsilonなどのいくつかの免疫関連アダプターを過剰発現する細胞に、例えば２９３Ｔ．２Ａ細胞にトランスフェクトされる。可溶性タンパク質は、場合により、タグ（例えば、３ｘＦＬＡＧタグ）、Ｆｃドメイン又は蛍光標識などの検出可能な標識で標識化されたＦＧＬ１であり得るか、又は二次抗体を使用して検出され得る。あるいは、可溶性タンパク質は、ＬＡＧ３−Ｆｃ融合タンパク質などのＬＡＧ３の可溶性融合タンパク質であり得、直接標識化されるか、又は二次抗体若しくは当技術分野で公知の任意の他の二次試薬で検出されるかのどちらかであり得る。好ましい実施態様では、ＦＧＬ１タンパク質は、ＩＤ番号ＮＰ ００４４５８．３に基づくＮＣＢＩ参照配列データベースにより提供されるアミノ酸配列のアミノ酸７８〜３０４又はアミノ酸２３〜３１２を含む。タンパク質−タンパク質相互作用を決定するための方法は、当技術分野で公知であり、細胞検出システム（ＣＤＳ）、蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリーの使用を含み得るが、これらに限定されない。
【００９０】
キット
さらに別の局面では、免疫チェックポイント阻害性抗体から利益を得るであろうがん患者を選択するためのキットが提供され、ここでキットは、がん患者からのサンプル及び対照におけるＦＧＬ１発現を定量的に検出するための手段を含む。該対照は、（ａ）増強されたＦＧＬ１発現を検出するための参照サンプル、（ｂ）ベースラインのＦＧＬ１発現を検出するための参照サンプル、（ｃ）免疫チェックポイント阻害性抗体に対する感受性と相関しているＦＧＬ１発現の所定の参照レベルを含む指図、（ｄ）免疫チェックポイント阻害性抗体に対する感受性がないことと相関しているＦＧＬ１発現の所定の基準レベルを含む指図、及び／又は（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の組み合わせからなる群より選択し得る。１つの実施態様では、がん患者からのサンプルにおけるＦＧＬ１発現を定量的に検出するための手段は、（ａ）ＦＧＬ１に特異的な抗体、（ｂ）ＦＧＬ１に特異的なプライマー対、及び場合により増幅産物にハイブリダイズするプローブ、及び／又はＦＧＬ１標的配列、好ましくはＦＧＬ１ｍＲＮＡ標的配列にハイブリダイズするプローブである。
【実施例】
【００９１】
方法
動物
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスを、Charles River (Wilmington, MA)から購入した。ＦＧＬ１条件付きノックアウトマウスはEuropean Mouse Mutant Archive (EMMA)から入手し、このマウス系統の相同の標的化を、遺伝子組み換えしたＣ５７／ＢＬ６ＥＳ細胞(Agouti JM8A)において行った。ＦＧＬ１全身ノックアウトマウス（Ｆｇｌ１−／−、本明細書ではＦＧＬ１−ＫＯと呼ぶ）は、ＣＭＶ−Ｃｒｅマウス（Jackson Lab）と交配することにより作成した。すべてのマウスのプロトコルは、ＮＩＨガイドラインに準拠しており、イェール大学医学部の動物ケア及び使用委員会によって承認された。
【００９２】
プラスミド、融合タンパク質、及び抗体
最大６５００の完全長の原形質膜遺伝子及び最大１３００の可溶性遺伝子をコードするヒトｃＤＮＡライブラリーは、Genecopeia (Rockville, MD)、Open Biosystems (Huntsville, AL)から収集したか、又は個別にクローニングした。以下に記載した超ハイスループット受容体アレイに使用するすべての遺伝子は、哺乳動物発現ベクターにクローニングした。ヒト及びマウス融合タンパク質は、ヒトＦｃ若しくは３ｘＦＬＡＧを用いて細胞外ドメインをコードする関連遺伝子を標的化することにより生成し、２９３Ｔ細胞において発現させ、そしてアフィニティーカラムにより精製した。ＦＧＬ１及びＬＡＧ３のためのドメイン欠失プラスミドは、ＰＣＲ又はＧｅｎｅＡｒｔ合成(Thermo Fisher, Waltham, MA)により作成した。フローサイトメトリー及びインビトロ研究において使用した抗体は、BD Biosciences (San Jose, CA)、BioLegend (San Diego, CA)、又はThermo Fisher (Waltham, MA)から購入した。抗ＬＡＧ３モノクローナル抗体（Ｃ９Ｂ７Ｗ；マウスＬＡＧ３に対するもの）のハイブリドーマは、Dario Vignali博士（University of Pittsburgh）からのものである。マウスＦＧＬ１に対するラットｍＡｂ、及びヒトＦＧＬ１に対するマウスｍＡｂは、ＦＧＬ１融合タンパク質を用いた動物免疫によって生成した。
【００９３】
超ハイスループット受容体アレイ技術
原形質膜遺伝子を除く、可溶性遺伝子は、それらの発現プロファイル、公知の免疫関連分子との相同性（ＢｉｏＧＰＳ、Ｉｍｍｇｅｎ、ＨＰＭ、ＵＣＳＣゲノムブラウザ及びＮＣＢＩデータベースを使用したバイオインフォマティクス解析）に基づいて選択し、その後、膜発現を容易にするために、ＦＩＢＣＤ１遺伝子（Ｎ末端へのＡＴＭ挿入）又はＢ７−Ｈ６遺伝子（Ｃ末端へのＡＴＭ挿入）からの人工膜貫通ドメイン（ＡＴＭ）と融合した。それぞれの受容体アレイプレートを構築するために、ｃＤＮＡライブラリープラスミドをＯｐｔｉＭＥＭ（４μg/mL）中に個別に希釈した後、各ウェルに２００μLのプラスミド溶液と共に３８４ディープウェルプレート（ＶＷＲ）に移した。４枚の３８４プレートのそれぞれのウェルから２マイクロリットル（μL）のプラスミド溶液を、ロボット液体ハンドリングシステム（PlateMate, Thermo Fisher）により、１５３６ウェルプレート（Greiner）に移した。全体のヒト受容体アレイは、５枚の１５３６プレートを含んだ。特に指定がない限り、これらの１５３６プレートにさらにフォイルをかけ、−８０℃で保存した。受容体アレイのスクリーニングのために、アレイプレートを−８０℃から取り出し、溶液の解凍が完了するまでインキュベーター中に置いた。このアレイプレートを遠心沈殿させ（６００ｇ、２分間）、Multidrop Combi robotic dispenser (Thermo Fisher)を用いて、１ウェルあたり、リポフェクタミン３０００（１mLあたり７μLのリポフェクタミン）を含む２μLのＯｐｔｉＭＥＭを分注し、超高速のorbital shakerで１分間迅速に振盪した。すべてのプレートを室温で２０分間保存し、続いて、２９３Ｔ．２Ａ細胞（膜の発現を容易にする、幾つかの免疫関連アダプター、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＲγ、及びＣＤ３εを過剰発現する２９３Ｔ細胞） ２×１０ｅ３ を、Multidrop Combiにより、ウェルあたり４μL ＤＭＥＭ培地中に加えた。このプレートを、さらに遠心沈殿させ（１０００ｇ、４分間）、各ウェル内の気泡を処理した後に、３７℃でインキュベートした。トランスフェクションの１８時間後に、ＬＡＧ３−Ｆｃ融合タンパク質（ヒト又はマウス） ２ng及び抗Ｆｃ二次抗体 ３ngを各ウェルに加えた。これらのプレートを、６〜８時間後にＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ８２００細胞検出システム（ＣＤＳ）を使用して読み取り、ＣＤＳ ８２００ソフトウェアを使用して解析した。ヒトＦｃ受容体は、スクリーニングされた融合タンパク質のための各プレート内の内部ポジティブコントロールとして機能した。
【００９４】
タンパク質−タンパク質相互作用分析
タンパク質の相互作用を、Octet Red instrument (PALL, NY)を用いて測定及び分析したが、これらは室温で実施した。オクテットタンパク質Ａセンサーをマウス又はヒトＬＡＧ３−Ｆｃ融合タンパク質（１０μg/mL）を含む溶液に浸漬し、次いで、異なる濃度の３ｘＦＬＡＧタグ付きＦＧＬ１タンパク質（１０μg/mLから始まる２倍連続希釈）を加えた。タンパク質の会合及び解離は、オクテットソフトウェアを用いてモニターし、解析した。
【００９５】
インビトロＴ細胞機能アッセイ
抗マウスＣＤ３ ｍＡｂ（eBiosciences）を９６ウェルプレートに指示された濃度でプレコートした。Ｃ５７／ＢＬ６マウス又はＬＡＧ３−ＫＯマウスからのマウス脾細胞を各ウェルに３×１０ｅ５／ウェルで、ＦＧＬ１−Ｆｃ融合タンパク質又はアイソタイプにマッチしたコントロールＦｃ ５μg/mLの存在下で加え、３日間培養した。３Ｈ−ＴｄＲを、培養の最終１６時間前に加え、チミジンの取り込みを、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ液体シンチレーションカウンター（PerkinElmer, Waltham, MA）を用いて計数した。
【００９６】
抗原特異的Ｔ細胞実験のために、３Ａ９Ｔ細胞ハイブリドーマ、又は３Ａ９過剰発現マウスＬＡＧ３完全長遺伝子を、ＨＥＬペプチド（１．５μg/mL）の存在下でＬＫ３５．２細胞株と共にインキュベートした。また、インビトロでの機能を試験するために、指示された濃度のＦＧＬ１融合タンパク質又は対照も含んだ。いくつかのグループでは、抗ＦＧＬ１抗体又は抗ＬＡＧ３抗体（５μg/mL）を適用して、拮抗効果をモニターした。細胞共培養２４時間後の上清中のＩＬ−２レベルをＣＢＡキット（BD Pharmingen）により分析した。
【００９７】
インビボ腫瘍実験
８〜１０週齢のＬＡＧ３−ＫＯ、ＦＧＬ１−ＫＯマウス、又は対照同腹仔を、インビボ腫瘍実験に使用した。腫瘍を０日目にＭＣ３８又はＨｅｐａ１−６細胞の単回皮下注射により接種し（ＭＣ３８では５×１０５細胞、Ｈｅｐａ１−６では１×１０６細胞）、６、１０、１４及び１８日目に、１００μgの抗ＦＧＬ１抗体又は抗ＬＡＧ３（Ｃ９Ｂ７Ｗ）抗体を用いて、生理食塩水又はラットＩｇを対照として、マウスを腹腔内で処置した。抗ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）の併用療法のために、さらに、６日目に、ＰＤ−Ｌ１に対するハムスターｍＡｂ（クローン１０Ｂ５；１００μg）を用いて、マウスを処置した。腫瘍の増殖を、週に２回、電子ノギスによりモニターし、平均腫瘍直径：（長さ＋幅）／２を使用して測定した。
【００９８】
バイオインフォマティクス
固形がん病変及びそれに対応する正常組織のマイクロアレイデータ（１４種類のヒトがんを包含する合計２５４のデータセット）をOncomine (Thermo Fisher)から収集し、さらに、各がんのデータセットにおけるＦＧＬ１のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションの頻度（カットオフ値として、アップレギュレーションでは倍数変化＞３、又はダウンレギュレーションでは＜０．３、及びＰ値＜０．０５）をＲプログラムにより解析した。さらに、対応する正常組織と比較した、いくつかのがんからの個々のＦＧＬ１発現を、ＴＣＧＡがんデータベースを利用して実行した。元のマイクロアレイデータは、がんブラウザ(https://genome-cancer.ucsc.edu/)により正規化した後、Ｒにより解析した。
【００９９】
組織学及び免疫組織化学
ナイーブマウス又は坦腫瘍マウスから組織を切除し、Ｈ＆Ｅ又は免疫組織化学染色のためにパラフィンに埋め込み、厚さ５μmの切片に切断した。ＦＧＬ１染色のために、組織を脱パラフィン化し、抗原賦活化の前に再水和した。次いで、組織切片を抗ＦＧＬ１抗体（１７７Ｒ４）で染色し、続いて増幅システム (DakoCytomation, Glostrup, Denmark)でインキュベートした。
【０１００】
統計解析
スチューデントのｔ検定及び二元配置分散分析を統計解析のために使用し、Ｐ値は対照サンプル内での比較を反映している。０．０５未満のＰ値は統計的に有意であるとみなした。図中のエラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【実施例１】
【０１０１】
リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ３）は、細胞表面のＴ細胞抑制タンパク質であり、主要組織適合性複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）との相互作用を介して機能すると考えられる。しかしながら、この相互作用は、様々な実験設定において、ＬＡＧ３誘発の抑制機能には必要でなく、追加の機能的なＬＡＧ３リガンドの存在を示唆している。ゲノムスケールの受容体アレイシステムを使用して、本発明者らは、肝細胞マイトジェン活性及び代謝機能を有する肝臓に富む可溶性タンパク質であるフィブリノーゲン様プロテイン１（ＦＧＬ１）を、ＬＡＧ３結合パートナーとして特定した。
【０１０２】
免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃタグ付きＬＡＧ３細胞外ドメイン融合タンパク質を使用して、新しいＬＡＧ３結合タンパク質を探索するために、ゲノムスケールの受容体アレイプラットフォーム（ＲＡＰ）を採用した（図１ａ）。ＲＡＰは、膜貫通性及び可溶性タンパク質をコードする個々のヒトｃＤＮＡを２９３Ｔ細胞の表面上に一時的に過剰発現させることができる半自動の大規模遺伝子発現系である（Yao,S.B7-h2 is a costimulatory ligand for CD28 in humhepatocyte mitogenic activityan.Immunity 34, 729-740, (2011)）。ＲＡＰの現在のバージョンは、ヒトの膜貫通性（最大６，５００）及び可溶性（最大１，３００）をコードするすべての注釈付き遺伝子の９０％以上を含む。膜発現を容易にするために、いくつかの免疫アダプター遺伝子（ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＲγ、及びＣＤ３ε）を２９３Ｔ細胞に導入し、可溶性タンパク質をコードする遺伝子を人工膜貫通ドメインに融合させ、細胞表面での発現を可能にした（図１ａ）。また、３８４ウェルプレートフォーマットの最初のプラットフォームも効率を高めるために１，５３６ウェルプレートフォーマットに変更した。分泌タンパク質であるＦＧＬ１は、ＲＡＰスクリーニングにおけるＬＡＧ３−Ｆｃのための主要な結合タンパク質であることを示した。
【実施例２】
【０１０３】
相互作用は、ヒトとマウスでは種を超えて維持されているように見えた（図１ｄ及びｅ）。ＦＧＬ１／ＬＡＧ３相互作用は、フローサイトメトリーによって（図２ｂ）及びオクテットバイオレイヤー干渉法（Octet bio-layer interferometry）において最大１．５nMのＫｄ（図１ｄ）で検証することができ、高親和性の相互作用を示している。マウス及びヒトの両方の結合における遅い解離速度は、この相互作用の安定性の可能性を示している（図１ｃ及びｆ）。Ｔｒｅｇ機能の調節に関与する、ＦＧＬ２を含む他のＦＧＬ１ホモログ、ならびにいくつかのアンジオポエチン関連ファミリーメンバーは、ＬＡＧ３との相互作用を示さず（データは示していない）、これはＦＧＬ１／ＬＡＧ３相互作用の高度に特異的な性質を示している。
【０１０４】
本発明者らは、ＦＧＬ１のＬＡＧ３への結合ドメインを決定し、これが、ＭＨＣ−ＩＩ相互作用に影響を与えるかどうかを調べた。ＦＧＬ１はコイルドコイルドメイン（ＣＣＤ）及びフィブリノーゲン様ドメイン（ＦＤ）から構成されている（Yamamoto, T. et al. Molecular cloning and initial characterization of a novel fibrinogen-related gene, HFREP-1. Biochem Biophys Res Commun 193, 681-687, (1993)）。ドメイン欠失実験を通じて、本発明者らは、ＣＣＤではなくＦＤが、ＬＡＧ３の結合に関与していることを実証した（図２ａ及びｃ）。ＬＡＧ３タンパク質は、４つのＩｇ様ドメイン（Ｄ１−Ｄ４）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び細胞内ドメイン（ＩＣ）からなる（Huard, B. et al. Characterization of the major histocompatibility complex class II binding site on LAG-3 protein. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 5744-5749, (1997); Triebel, F. et al. LAG-3, a novel lymphocyte activation gene closely related to CD4. J Exp Med 171, 1393-1405, (1990)）（図２ｂ）。ＬＡＧ３におけるＤ３−Ｄ４ドメインの欠失はＦＧＬ１結合に影響を与えなかった一方、Ｄ１又はＤ２のどちらか一方が単独で結合を部分的に減少させたことから（図２ｂ及びｄ）、Ｄ１及びＤ２の両方が、ＦＧＬ１／ＬＡＧ３相互作用に寄与していることが示唆された。以前の研究は、マウスＬＡＧ３のＤ１ドメインのＣ’鎖における単一点変異（Ｙ７３Ｆ）（ヒトＬＡＧ３におけるＹ７７Ｆに対応）が、ＭＨＣクラスＩＩ結合を分断することを実証した（Huard, B. et al. Characterization of the major histocompatibility complex class II binding site on LAG-3 protein. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 5744-5749, (1997); Workman, C. J., Dugger, K. J. & Vignali, D. A. Cutting edge: molecular analysis of the negative regulatory function of lymphocyte activation gene-3. J Immunol 169, 5392-5395, (2002)）。興味深いことに、本発明者らは、ＦＧＬ１−Ｆｃが、ＬＡＧ３ ＷＴと同様に強くＬＡＧ３ Ｙ７３Ｆ変異体に結合していることを見出した（図２ｂ及びｄ）。さらに、本発明者らは、ＬＡＧ３／ＭＨＣクラスＩＩ相互作用を阻害することなくマウスＬＡＧ３のＤ２ドメインに結合することが報告されている抗ＬＡＧ３ ｍＡｂ（Ｃ９Ｂ７Ｗクローン）を利用した (Andrews, L. P., Marciscano, A. E., Drake, C. G. & Vignali, D. A. LAG3 (CD223) as a cancer immunotherapy target. Immunol Rev 276, 80-96, (2017); Workman, C. J., Rice, D. S., Dugger, K. J., Kurschner, C. & Vignali, D. A. Phenotypic analysis of the murine CD4-related glycoprotein, CD223 (LAG-3). Eur J Immunol 32, 2255-2263, (2002); Cemerski, S., Zhao, S., Chenard, M., Laskey, J., Cui, L., Shukla, R., Haines, B., Hsieh, E., Beaumont, M., Mattson, J., Blumenschein, W., Hirsch, H., Fayadat-Dilman, L., Liang, L., De Waal Malefyt, R., T cell activation and anti-tumor efficacy of anti-LAG-3 antibodies is independent of LAG-3-MHCII blocking capacity. Journal for Immunotherapy of Cancer 3(Suppl 2), 183, (2015))。２９３Ｔ ＬＡＧ３＋細胞をＣ９Ｂ７Ｗでプレインキュベートした後、本発明者らは、ＦＧＬ１／ＬＡＧ３結合の完全な抑止を見出した（図１ｇ）。これらのデータは、ＦＧＬ１が、広い領域において、Ｄ１及びＤ２の両方に関与するＬＡＧ３と相互作用することを示唆している。
【０１０５】
ＦＧＬ１及びＭＨＣクラスＩＩがＬＡＧ３の結合と競合するかどうかを直接試験するために、本発明者らは、高濃度のＦＧＬ１（最大１００倍に増加）と組み合わせたＭＨＣクラスＩＩ Ｉ−Ａｂ融合タンパク質を用いてＬＡＧ３＋細胞を培養したが、有意な競合は観察されなかった（データは示していない）。これらのデータは、ＦＧＬ１が、フィブリノーゲンＣ末端領域を介して、ＭＨＣクラスＩＩ結合に非冗長であるＤ１及びＤ２の両方に広い領域で関与するＬＡＧ３と相互作用することを示唆している。
【実施例３】
【０１０６】
さらに、競合アッセイにおいて、既存のモノクローナル抗ＬＡＧ３抗体がＦＧＬ１−ＬＡＧ３の相互作用をブロックするかどうかを決定した。抗ＣＤ３抗体で活性化してＬＡＧ３発現を誘導する、ヒトＬＡＧ３を発現するＣＨＯ細胞又は初代Ｔ細胞を、抗ＬＡＧ３抗体（抗ＬＡＧ３−Ａ４８８抗体；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ １０μg/mL）の存在下又は非存在下で、蛍光標識されたＦＧＬ１（ＦＧＬ−Ａ６４７ １μg/mL）で染色し、ＦＧＬ１のＬＡＧ３への結合と競合するかどうかを決定した。ＦＧＬ１の結合は、抗ＬＡＧ３抗体の存在下では減少しなかった（データは示していない）ため、ＦＧＬ１：ＬＡＧ３相互作用を妨害するようには見えない。
【実施例４】
【０１０７】
次に、本発明者らは、インビトロでＴ細胞上のＦＧＬ１／ＬＡＧ３相互作用の機能を分析した。ＬＡＧ３は活性化後にＴ細胞上で高発現している。フローサイトメトリーで分析したところ、ＦＧＬ１−Ｆｃ融合タンパク質は、ＷＴからの活性化されたＴ細胞とは結合していたが、ＬＡＧ３−ＫＯマウスからの活性化されたＴ細胞とは結合していなかった（データは示していない）。ＦＧＬ１−Ｆｃは、抗ＣＤ３の刺激により脾臓Ｔ細胞の増殖を抑制したが、その抑制活性はＬＡＧ３−ＫＯ脾細胞では失われた（図３ａ）。同様に、ＦＧＬ１融合タンパク質は、マウスの３Ａ９−ＬＡＧ３＋Ｔ細胞株の抗原特異的活性化を用量依存的に抑制することができた（図３ｂ）。したがって、ＦＧＬ１は、インビトロでＴ細胞の増殖及び機能を阻害する。ＦＧＬ１／ＬＡＧ３経路のＴ細胞阻害への依存性をさらに実証するために、本発明者らは、抗ＬＡＧ３と同様の方法で、ＦＧＬ１融合タンパク質のＬＡＧ３発現２９３Ｔ細胞への結合をブロックする特異的な抗ＦＧＬ１ ｍＡｂ（クローン１７７Ｒ４）を生成した（図３ｃ）。ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの増加した血漿レベルによって決定されることから、両方の抗体は、３Ａ９−ＬＡＧ３細胞からのＩＬ−２産生に対するＦＧＬ１の抑制効果を抑止し（図２ｄ）、インビボでの抗原特異的Ｔ細胞活性化を促進する（図４ａ及びｂ）。本発明者らの結果は、ＦＧＬ１及びＬＡＧ３が、Ｔ細胞応答をネガティブに調節する受容体／リガンドの対として機能することを支持している。
【０１０８】
同様の結果が、活性化されたヒト初代Ｔ細胞において得られた。ＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞は、２４時間以内に１μg/mL以上の抗ＣＤ３抗体で刺激した場合、増強したＬＡＧ３発現を示した。フローサイトメトリーにより分析すると、ＬＡＧ３発現は、１又は３μg/mLの抗ＣＤ３刺激後、少なくとも７２時間維持された（データは示していない）。さらに、活性化された初代Ｔ細胞上のＬＡＧ３発現は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８でコートしたビーズを用いた活性化の後、４日目に、ヒトＰＢＭＣから単離したＴ細胞を使用したＦＧＬ１−Ｆｃ染色（１０μg/mL）により検出可能であった（データは示していない）。
【０１０９】
免疫系の調節におけるＦＧＬ−１の潜在的な役割を評価するために、アグーチ着色遺伝子改変マウス胚性幹細胞株（ＪＭ８）を使用した、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおけるＦＧＬ１ノックアウト（ＦＧＬ１−ＫＯ）を作成した(Pettitt, S. J. et al. Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nat Methods 6, 493-495, (2009))。野生型（ＷＴ）のマウスでは、ＦＧＬ１は肝臓において選択的に発現し、免疫系によっては発現しない（図５ａ） (Yan, J. et al. Cloning and characterization of a mouse liver-specific gene mfrep-1, up-regulated in liver regeneration. Cell Res 12, 353-361, (2002); Li, C. Y. et al. Recombinant human hepassocin stimulates proliferation of hepatocytes in vivo and improves survival in rats with fulminant hepatic failure. Gut 59, 817-826, (2010); Liu, Z. & Ukomadu, C. Fibrinogen-like protein 1, a hepatocyte derived protein is an acute phase reactant. Biochem Biophys Res Commun 365, 729-734, (2008))。ＷＴ同腹仔と比較したＦＧＬ１−ＫＯマウスにおける、ウェスタンブロットによる肝臓ＦＧＬ−１発現の欠如及びＥＬＩＳＡによる血漿ＦＧＬ−１レベルを確認した（データは示していない）。ＦＧＬ１−ＫＯマウスは、全体的に正常な外見、器官のサイズ、及び同腹仔を有し、ＦＧＬ１が、マウスの発育及び成長に全体的に影響を与えないことを示した。しかしながら、ＦＧＬ１−ＫＯは、明らかなリンパ球を伴う皮膚炎の高い発生率を有する。２０匹中の８匹のＦＧＬ１ ＫＯマウス（１２〜１６ヶ月齢）が皮膚炎を発症した一方、１５匹中の１匹のＷＴ同腹仔のみが皮膚炎を発症した。８匹中の５匹の１２〜１６ヶ月齢のメスは、（オスではない）、血清中の上昇した抗二本鎖ＤＮＡ自己抗体を有していた（データは示していない）。質量サイトメトリーによる末梢血単核細胞分析(Bendall, S. C. et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science 332, 687-696, (2011))は、ＦＧＬ−１ＷＴとの比較において、ＦＧＬ−１ＫＯマウスにおける、より高いＣＤ８Ｔ細胞の頻度の傾向を示したが、ＣＤ４Ｔ細胞又は他の免疫サブセットではその傾向は示さなかった（図６ａ及びｂ）。対照的に、脾臓又は肝臓などの末梢組織におけるＴ細胞サブセットにおいては、有意な違いはなかった（データは示していない）。これらのデータは、内在性ＦＧＬ１が発育及び成長に影響を与えない一方、生理的な免疫応答の調節に関与し得ることを示唆している。
【実施例５】
【０１１０】
がん免疫療法における標的としてのＬＡＧ３の将来有望な役割、及びＴ細胞免疫の抑制におけるＦＧＬ１／ＬＡＧ３経路の新たに特定された役割を考慮して、本発明者らは、腫瘍免疫におけるＦＧＬ１の欠損又は遮断を試験した。免疫原性ＭＣ３８マウス結腸がんモデルを使用して、本発明者らは、ＦＧＬ１又はＬＡＧ３のいずれかが欠損したマウスは、すべての野生型（ＷＴ）マウスにおける腫瘍の増殖と比較して、３５日目の大多数のＫＯマウスにおける移植腫瘍に対して、耐性があることを見出した（図７ａ）。全てのＷＴマウスは６０日以内にエンドポイント（１５ｍｍの平均腫瘍径）に達したが、最大５０％のＦＧＬ１−ＫＯマウス又はＬＡＧ３−ＫＯマウスは１５０日を超えて腫瘍がなかった（図７ｂ）。また、抗ＦＧＬ１及び抗ＬＡＧ３（クローンＣ９Ｂ７Ｗ） ｍＡｂも、皮下移植したＭＣ３８マウス結腸がん（図７ｃ）及び同型のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＨｅｐａ１−６マウス肝臓がんの（データは示していない）細胞株の増殖を有意に阻害した。特定のｍＡｂによるＣＤ８＋又はＣＤ４＋Ｔ細胞のいずれかの枯渇が、ＭＣ３８モデルにおけるＦＧＬ１及びＬＡＧ３ ｍＡｂの両方の抗腫瘍効果を排除した（データは示していない）ことは、抗腫瘍効果がＴ細胞依存性であることを示唆している。質量サイトメトリーによる腫瘍浸潤性白血球（ＴＩＬ）分析を通して、本発明者らは、対照グループとは対照的に、処置した（抗ＦＧＬ１又は抗ＬＡＧ３）マウスにおける、腫瘍１mgあたりの白血球（ＣＤ４５＋細胞）、ＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞の絶対数の有意な増加を観察した（図７ｄ）。また、対照マウスに対して、処置した（抗ＦＧＬ１又は抗ＬＡＧ３）腫瘍中のエフェクターメモリーＴ細胞集団の個体数で顕著な増加が観察されたが、腫瘍排出リンパ節及び脾臓においては観察されなかった（データは示していない）。ＴＩＬにおけるＦＧＬ１の欠損又はＦＧＬ１の遮断の機能的変化を特徴付けると、対照グループと比較して、ＦＧＬ１−ＫＯマウスと抗ＦＧＬ１処置マウスの両方において、機能マーカー（グランザイムＢ、ＣＤ４４、Ｌｙ６Ｃ、ＦＡＳ）の有意な増加及びＬＡＧ−３の減少が観察された（図７ｅ）。
【０１１１】
他のＬＡＧ３リガンドの影響を厳密に排除するために、本発明者らは、ＦＧＬ１ ＫＯマウスにおけるＣ９Ｂ７Ｗの抗腫瘍効果を試験した。抗ＬＡＧ３ ｍＡｂ（Ｃ９Ｂ７Ｗ）は、ＷＴマウスにおけるＭＣ３８の腫瘍の増殖を明らかに遅らせたが、ＦＧＬ１ ＫＯマウスにおいてはこの効果は排除された（図７ｆ）。したがって、抗ＬＡＧ３ ｍＡｂＣ９Ｂ７Ｗの抗腫瘍効果は、ＭＨＣクラスＩＩ又は他のＬＡＧ３リガンドではなく、ＦＧＬ１の遮断を介して媒介されている。さらに、本発明者らは、この抗体がＬＡＧ３−ＫＯマウスにおいて腫瘍耐性を付与できなかったことから、抗ＦＧＬ１の効果もまたＬＡＧ３に依存していることを見出した（図７ｇ）。したがって、本発明者らの知見は、抗腫瘍免疫の制御における、機能的かつ相互依存的な対としてのＦＧＬ１／ＬＡＧ３の重要な役割を支持する。
【実施例６】
【０１１２】
マウスがんモデルにおけるＦＧＬ１／ＬＡＧ３の関連性を考慮して、本発明者らは、臨床現場における新規な抗腫瘍標的としてのＦＧＬ１の可能性を調査した。健康な個人では、ＦＧＬ１発現は、組織マイクロアレイデータベース（図８ａ）及び最近報告されたヒトプロテオーム分析(Kim, M. S. et al. A draft map of the human proteome. Nature 509, 575-581, (2014))に基づくと、おもに肝臓に限定される。Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータベースのメタ分析は、肺がんデータセットにおける最も高い発現（８／２３、又は３５％）によって、いくつかの固形腫瘍におけるＦＧＬ１ｍＲＮＡのアップレギュレーションを明らかにした（図８ｂ）。さらに、ＦＧＬ１は、ＴＣＧＡ肺腺がんＴＣＧＡデータベースにおいて、そして肝臓がんを除く多くの他のがんにおいて、最もアップレギュレートされた遺伝子の１つであることが実証された（図８ｃ）。ＦＧＬ１を確実に測定するために、本発明者らは、ＦＧＬ１でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞、ならびに、閾値発現カットポイントを確立するために使用した腫瘍及び正常な肺組織を使用した免疫蛍光アッセイを検証した。次に、ＦＧＬ１発現を、２７５の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）例を、２７５のうちの３０に対して対になった正常肺組織と伴に、多重定量免疫蛍光（ＱＩＦ）により分析した。ＦＧＬ１発現は、腫瘍細胞のコンパートメントに限定され、その間質においては発現は最小限であり、正常なペアの肺組織においては陰性染色であった（データは示していない）。すべての肺がん例の中で、本発明者らは、検体の最大１５％において陽性染色を見出し（図９ａ）、腫瘍生検において高ＦＧＬ１発現を伴う腫瘍は予後不良と関連していた（図９ｂ）。また、本発明者らは、ＥＬＩＳＡにより分析して、２つの独立したコホート（Ｎａｖａｒｒａ大学（図９ｃ）からのコホート＃１及び福建医科大学（データは示していない）からのコホート＃２）において、健康なドナーと比較してＮＳＣＬＣ患者におけるより高い血漿ＦＧＬ１レベルを見出した。しかしながら、肝障害のある患者若しくはない患者（ＡＬＴ≧４０Ｕ／Ｌ、ＡＬＴ＜４０Ｕ／Ｌ）において、及び転移の有る患者若しくは無い患者（データは示さず）においては、血漿ＦＧＬ１レベルに差はなかった。
【実施例７】
【０１１３】
さらに、ＦＧＬ１／ＬＡＧ−３経路が、Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）／ＰＤ−１経路と独立して、又は協調して作用する腫瘍微小環境における代替的な抑制経路であり得るかどうかを試験した。すなわち、本発明者らは、転移性ＮＳＣＬＣ患者（コホート＃１）における、ベースラインの血漿ＦＧＬ１レベルと抗ＰＤ−１療法の有効性との関連を分析した。ＦＧＬ１のより高い発現は、抗ＰＤ−１ ｍＡｂで処置された患者における全生存率の悪化と関連していた（図９ｄ）。同様の結果が、抗ＰＤ−１ ｍＡｂで処置された転移性黒色腫患者の独立したコホート（エール大学からのコホート＃３）において観察された（図９ｅ）。
【０１１４】
さらに、本発明者らは、ＭＣ３８腫瘍モデルを使用して、抗Ｂ７−Ｈ１遮断の状況における抗ＦＧＬ１／抗ＬＡＧ３の役割を試験した。単剤の抗Ｂ７−Ｈ１ ｍＡｂは腫瘍の増殖を遅らせ、生存率を改善し、９０日以内に死亡した（図１０ａ）。同様に、単剤の抗ＦＧＬ１又は抗ＬＡＧ３ ｍＡｂの処置は、３ヶ月を超えて生存を延長することができなかった。驚くべきことに、抗ＦＧＬ１又は抗ＬＡＧ３ ｍＡｂと併用した抗Ｂ７−Ｈ１ ｍＡｂは、単剤の治療と比較して、生存期間（図１０ａ）及び腫瘍負荷（図１０ｂ）を有意に改善した。さらに、３０％を超えるマウスは１５０日を越えて腫瘍がなかった（図１０ａ）。これらすべてのデータは共に、抗ＰＤ１／ＰＤＬ１治療で処置されたがん患者における原発の耐性メカニズムとしてＦＧＬ１／ＬＡＧ−３経路の役割を支持する。その結果、抗ＦＧＬ１又は抗ＬＡＧ３ブロッキング抗体は、Ｔ細胞媒介の腫瘍免疫を増強し、受容体−リガンド相互依存的な方法で、いくつかのマウスモデルにおける腫瘍の増殖を抑制し、そしてＢ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）／ＰＤ−１遮断療法との相乗効果を発揮する。
【０１１５】
概要
公知の抗ＬＡＧ３療法は、その唯一の公知のリガンドであるＭＨＣクラスＩＩとの相互作用を標的とする。本発明者らは、がん免疫療法にとって潜在的に重要な意味を有するＦＧＬ１を含む代替的で、独立したＬＡＧ３経路を提案する。ＦＧＬ１は、Ｔ細胞応答を阻害し、そして（アンタゴニストの）抗ＦＧＬ１又は抗ＬＡＧ３ブロッキング抗体は、腫瘍の増殖を阻害する。ＦＧＬ１は、正常組織において限定的な発現を有するが、肺がん及び黒色腫を含むいくつかのヒト固形がんにおいて高発現し、重要な予後的価値を有する。抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１治療に対する原発性の耐性患者におけるＦＧＬ１の高発現を考慮すると、ＦＧＬ１／ＬＡＧ３経路は、免疫回避のための潜在的メカニズムであることが出来る。さらに、データは、ＦＧＬ１発現が、ＦＧＬ１／ＬＡＧ３免疫チェックポイント経路を妨害する薬剤を用いる処置を成功させるためのバイオマーカーとして、また、抗ＰＤ−１応答を予測し、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１治療における予後不良を予測し、また他のチェックポイント阻害性分子も潜在的に予測するためのバイオマーカーとして、予後的な価値を有することを示唆する。
【図１−１】
2021527082.tif 000002
【図１−２】
2021527082.tif 000003
【図２】
2021527082.tif 000004
【図３】
2021527082.tif 000005
【図４】
2021527082.tif 000006
【図５】
2021527082.tif 000007
【図６】
2021527082.tif 000008
【図７−１】
2021527082.tif 000009
【図７−２】
2021527082.tif 000010
【図８】
2021527082.tif 000011
【図９】
2021527082.tif 000012
【図１０】
2021527082.tif 000013
【国際調査報告】
2021527082.tif 000014
2021527082.tif 000015
2021527082.tif 000016
2021527082.tif 000017
2021527082.tif 000018