(57)【要約】  速度を上げるための多重化と、アッベ限界の２倍の３Ｄ分解能を達成するための操作されたコヒーレント照射及び検出を有する、迅速な、無標識の、ナノスケールの化学イメージング及びトモグラフィ（３Ｄ）のための方法及びシステムである。変調された赤外光の光源を用いてサンプルを光熱加熱し、結果として生じるプローブビーム変調を１つ以上の可視レーザプローブで測定する。赤外波長を変化させることにより、サンプルの化学組成を特徴づけるスペクトルが得られる。随意的に、さらなる化学情報を得るべく、プローブビームがサンプルと相互作用する結果として生じた非弾性散乱光を同時に収集する。【選択図】図２
2021521446.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分光イメージングのための方法であって、
ａ．サンプルの領域を光熱加熱するべく変調された赤外ビームを光路に沿って誘導するステップと、
ｂ．前記変調された赤外ビームによって加熱された領域内に入射するように、それぞれ前記赤外ビームよりも短い波長を有する、１つよりも多いプローブビームを前記サンプルに誘導するステップと、
ｃ．各プローブビームの反射光、透過光、非弾性再放射光、又はその任意の組み合わせの光を測定するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記サンプルと前記プローブビームが相互に移動され、前記サンプルの２Ｄ又は３Ｄ化学画像を作成するべく前記ステップａ〜ｃが複数回繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プローブビームがコヒーレントであり、前記各コヒーレントプローブビームが振幅及び位相を含む開口関数を有し、前記各コヒーレントプローブの開口関数の振幅、位相、又はその両方が、収差を補正する、前記プローブビームのアッベ限界を超える空間分解能を達成する、又は他の方法で点拡がり関数を操作するべく変更され、前記開口関数の振幅及び位相が、前記サンプルの前又は後のいずれかで変更される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルと前記プローブビームが相互に移動され、前記サンプルの２Ｄ又は３Ｄ化学画像を作成するべく前記ステップａ〜ｃが複数回繰り返される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
透明又は部分的に透明なサンプルの分光イメージングのための方法であって、
ａ．サンプルの領域を光熱加熱するべく変調された赤外ビームを光路に沿って誘導するステップと、
ｂ．プローブビーム間の干渉により空間分解能を増強するため、前記変調された赤外ビームによって加熱される領域内に入射するように前記プローブビームの光熱により誘起される変調を増強するため、又はその両方のために、前記赤外ビームよりも短い波長を有するプローブビームを前記サンプル上の位置を通るように１回又は複数回誘導するステップと、
ｃ．前記各プローブビームの反射光、透過光、非弾性再放射光、又はその任意の組み合わせの光を測定するステップと、
を含む方法。
【請求項６】
前記サンプルと前記プローブビームが相互に移動され、前記サンプルの２Ｄ又は３Ｄ化学画像を作成するべく前記ステップａ〜ｃが複数回繰り返される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
１つよりも多いプローブビームがサンプル上の位置を通るように１回又は複数回誘導され、各プローブビームはサンプル上の異なる位置に誘導される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルと前記プローブビームが相互に移動され、前記サンプルの２Ｄ又は３Ｄ化学画像を作成するべく前記ステップａ〜ｃが複数回繰り返される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記プローブビームがコヒーレントであり、前記各コヒーレントプローブビームが振幅及び位相を含む開口関数を有し、前記コヒーレントプローブビームの開口関数の振幅、位相、又はその両方が、収差を補正する、前記各プローブビームのアッベ限界を超える空間分解能を達成する、又は他の方法で点拡がり関数を操作するべく変更される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルと前記プローブビームが相互に移動され、前記サンプルの２Ｄ又は３Ｄ化学画像を作成するべく前記ステップａ〜ｃが複数回繰り返される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プローブビームがコヒーレントであり、前記コヒーレントプローブビームが振幅及び位相を含む開口関数を有し、前記コヒーレントプローブビームの開口関数の振幅、位相、又はその両方が、収差を補正する、前記各プローブビームのアッベ限界を超える空間分解能を達成する、又は他の方法で点拡がり関数を操作するべく変更される、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルと前記プローブビームが相互に移動され、前記サンプルの２Ｄ又は３Ｄ化学画像を作成するべく前記ステップａ〜ｃが複数回繰り返される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
光熱分光イメージングのための方法であって、
ａ．サンプルの領域を光熱加熱するべく変調された赤外ビームを光路に沿って誘導するステップと、
ｂ．前記変調された赤外ビームによって加熱された領域内に入射するように、それぞれ前記赤外ビームよりも短い波長を有し、且つ振幅及び位相を含む開口関数を有する、１つ以上のコヒーレントプローブビームを前記サンプルに誘導するステップと、
ｃ．各プローブビームの反射光、透過光、非弾性再放射光、又はその任意の組み合わせの光を測定するステップと、
を含み、前記各コヒーレントプローブビームの開口関数の振幅及び位相が、収差を補正する、前記プローブビームのアッベ限界を超える空間分解能を達成する、又は他の方法で点拡がり関数を操作するべく変更され、前記開口関数の振幅及び位相が、前記サンプルの前又は後のいずれかで変更される、方法。
【請求項１４】
前記サンプルと前記プローブビームが相互に移動され、前記サンプルの２Ｄ又は３Ｄ化学画像を作成するべく前記ステップａ〜ｃが複数回繰り返される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
システムであって、
ａ．変調された赤外光の光源と、
ｂ．それぞれ振幅及び位相を含む開口関数を有する１つ以上のコヒーレントプローブビームを生成するための光学系と、
ｃ．赤外ビーム及びプローブビームをサンプルに誘導するための手段と、
ｄ．プローブビームとサンプルを相互に移動させるための装置と、
ｅ．各プローブビームのための光検出器及びフィルタリング光学系と、
ｆ．各プローブビームのための復調及びデジタル化電子装置と、
ｇ．収差を補正する、プローブビームのアッベ限界を超える空間分解能を達成する、又は他の方法で点拡がり関数を操作するべく各コヒーレントプローブビームの開口関数の振幅及び位相を変更するための手段と、
を備えるシステム。
【請求項１６】
前記赤外ビーム及びプローブビームを誘導する手段が、ミラー、レンズ、又はその両方を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記開口関数の振幅及び位相を変更する手段が、透明又は部分的に透明なマスク（アポダイザ）、ホログラフィック光学系、レンズ、ミラー、又はその任意の組み合わせを含む受動光学系を備える、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記開口関数の振幅及び位相を変更する手段が、可変形状ミラー、空間光変調器、マイクロミラーアレイ、又はその任意の組み合わせを含む能動光学系を備える、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記光学系が１つよりも多いプローブビームを生成する、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２０】
前記赤外ビーム及びプローブビームをサンプルに誘導するための手段が、プローブビーム間の干渉により空間分解能を増強するため、前記プローブビームの光熱により誘起される変調を増強するため、又はその両方のために、各プローブビームを前記サンプル上の位置を通るように１回又は複数回誘導するための手段を含む、請求項１５に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、迅速な、無標識の、ナノスケールの化学イメージング及びトモグラフィ（３Ｄ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学（可視）顕微鏡法は、材料科学において非常に価値のあるツール、また、生物学において標準的な技術としての地位を確立した。特にライフサイエンスにおける光学顕微鏡法の有用性は、主に、数百ナノメートルのオーダーの分解能が生体細胞内の構造を研究するのに非常に適していることによるものである。それにもかかわらず、光学顕微鏡画像には、サンプルの化学組成についての明確な情報が不足している。化学的コントラストをもたらすべく光学顕微鏡を拡張することは、長い間、顕微鏡法の分野では見果てぬ夢のようなものであった。残念なことに、これまでに開発されたソリューションは、以下のいずれかであった：
・関心ある特定の化学物質を強調するために操作された化学「標識」を必要とする。
・化学動態を研究するには遅すぎる。
・三次元イメージング（トモグラフィ）ができない。
・最高の光学顕微鏡（約１００ｎｍ）よりも顕著に低い空間分解能をもたらす。
【０００３】
ここで説明するように、従来技術では上記の点のうちの１つ以上を完全に乗り越えることはできない。
【０００４】
化学染料、特に蛍光マーカの使用を通じて異なる化学種間のコントラストを達成するために多大な努力が費やされてきた。まさにその性質から、これらの技術は、調査しているサンプルと特定の実験での問題に合わせて調整されなければならない。例えば、慎重に選択された蛍光マーカは、関心ある化学構造を強調するかもしれない。留意すべきことは、適切な染料の実用性と入手可能性は、些細なことではない、しばしば途轍もない実験の障壁であることである。このような染料の必要性をなくすことは、生物学及びバイオテクノロジーの基礎研究から病理学及び診断までの、生物学及び医学に革命をもたらす可能性を秘めている。
【０００５】
ラマン分光法は、蛍光分光法のようにサンプルによる光子の非弾性散乱を利用する。その利点は、ラマンスペクトルが固有の化学指紋を構成することである。したがって、ラマン顕微鏡法は、従来の光学顕微鏡に匹敵する分解能を達成する真に無標識の化学顕微鏡法である。しかしながら、約百万個の入射光子あたり１つのみの光子がラマン散乱を受ける。この極めて低い相互作用確率は、ポンプレーザがサンプルの損傷閾値を下回る出力で用いられるときに、ラマンイメージング速度に制限を課すことになる。何時間又はさらには何日ものイメージング時間は珍しくない。
【０００６】
蛍光顕微鏡法とラマン顕微鏡法を一緒に用いようとするときに厄介な問題がある。ラマン断面と蛍光断面は、サンプルに応じて大きさが数桁変わることがあるため、これらの技術はすべての実用的な目的で相互に排他的である。例えば、より高度に蛍光標識されているサンプルでは、これらのフルオロフォアによって放出された高度に非弾性散乱した光は、フルオロフォアが存在しないポイントであってもラマンスペクトルの品質を損なうことになる。その実験結果は、標識された化学物質が存在する状況を解明するべく無標識の化学物質画像を同時に取得することがかなり有用であるにもかかわらず、２つの技術を効果的に組み合わせることはできないということである。
【０００７】
競合する無標識の技術は赤外顕微鏡法である。化学種中の原子は、その固有の化学構造に特徴的な周波数、すなわち、基準モードで振動する。特定の基準モードが双極子モーメント（奇数パリティ）を含むならば、これらの振動のうちの１つを励起するのに同じ時間周波数の単一の光子を用いることができる。種々の赤外周波数での材料の応答を測定することにより、構造の振動の指紋を測定することができる。偶数パリティの基準モードの場合、振動を励起するのに複数の光子が同時に相互作用しなければならない（すなわち、ラマン散乱）。したがって、赤外分光法とラマン分光法は、それぞれ適切なパリティの振動モードの組を特徴とする相補的な技術である。赤外吸収の単一光子の性質は、ラマン散乱よりも大きさが数桁上のはるかに高い相互作用確率をもたらす。しかしながら、スペクトルのこの指紋領域での波長は、ラマン分光法で用いられる可視光及び近可視光の波長よりも１０〜１００倍長い。結果として、赤外顕微鏡法での分解能はかなり低く、細胞内構造をイメージングするには完全に不適切である。この低い分解能は、顕微鏡法ツールとしての赤外分光法の有用性を制限してきた。しかし、空間分解能よりも速度と広い視野が優先されるいくつかの用途が見つかっている。
【０００８】
文献において大きな影響を与える赤外回折限界を下回る空間分解能をもつ赤外マイクロ分光法を実現する走査プローブ技術が最近開発されている。２つの最も成熟した技術である、ＡＦＭ−ＩＲ（Ｈａｍｍｉｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ，“Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ＦＴ−ＩＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：  Ａ  Ｓｔｅｐ  Ｔｏｗａｒｄｓ  ＦＴ−ＩＲ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ａｔ  ａ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂｅｈｅｒ  Ｔｈａｎ  ｔｈｅ  Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｌｉｍｉｔ，”  Ａｐｐｌ．  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．，  ５３，  ８１０−８１５  （１９９９）及びＨｉｌｌ  ａｔ  ａｌ，“Ｓｕｂｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｃａｎｎｉｎｇ−ｐｒｏｂｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ａｎｄ  ａｎ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒ  ｌａｓｅｒ，”  Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．，  ３４，  ４３１−４３３  （２００９））と、散乱型の走査型近接場光学顕微鏡法（ｓ−ＳＮＯＭ）（Ｋｅｉｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，“Ｎｅａｒ−ｆｉｅｌｄ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｂｙ  ｅｌａｓｔｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ａ  ｔｉｐ，”  Ｐｈｉｌｏｓ．  Ｔｒａｎｓ．  Ｒ．  Ｓｏｃ．  Ｌｏｎｄｏｎ  Ｓｅｒ．  Ａ−Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｐｈｙｓ．  Ｅｎｇ．  Ｓｃｆ，  ３６２，  ７８７−８０５  （２００４）；  Ａｍａｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ，“Ｍｉｄ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｎｅａｒ−ｆｉｅｌｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，”  Ｏｐｔ．  Ｅｘｐｒｅｓｓ，  １７，  ２１７９４−２１８０１  （２００９）；  Ｈｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ，“Ｎａｎｏ−ＦＴＩＲ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ  ａｔ  ２０  ｎｍ  ｓｐａｔｉａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，”  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，  １２，  ３９７３−７８  （２０１２）；及びＢｅｃｈｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ，“Ｕｌｔｒａｂｒｏａｄｂａｎｄ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｎａｎｏｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ，”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  １１１，  ７１９１−９６  （２０１４））が、それぞれソフト及びハードマターサンプルを調べるのに最も適切な相補的な技術として機能する。前者は、サンプルが赤外光によって加熱される際の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）チップの振れ（ｄｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）を測定する。後者は、金属コーティングされたＡＦＭチップとサンプルとの相互作用により光の散乱を測定する。これらの効果は両方ともかなり局所的であるため、両方とも分解能はチップの半径によって決まる。
【０００９】
共に、それらの集合的な影響を軽視することはできない。相関酸化物における相共存などの系（Ｑａｚｉｌｂａｓｈ  ｅｔ  ａｌ，“Ｍｏｔｔ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ＶＣｈ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  ｎａｎｏ−ｉｍａｇｉｎｇ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３１８，  １７５０−５３  （２００７）及びＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ，“Ａｎｉｓｏｔｒｏｐｉｃ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｓｔａｔｅ  ｖｉａ  Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒａｉｎｅｄ  Ｖａｎａｄｉｕｍ  Ｄｉｏｘｉｄｅ  Ｆｉｌｍｓ，”  Ｐｈｙｓ．  Ｒｅｖ．  Ｌｅｔｔ．，  １１１，  ９６６０２  （２０１３））、高分子光触媒（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ，“ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｐｈｏｔｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｕｎｄｅｒ  ｖｉｓｉｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ，”  Ｎａｔ．  Ｍａｔｅｒ．，  １４，  ５０５−５１１  （２０１５））、及び２次元材料：グラフェン及び窒化ホウ素におけるプラズモン（Ｆｅｉ  ｅｔ  ａｌ，“Ｔｕｎｎｅｌｉｎｇ  Ｐｌａｓｍｏｎｉｃｓ  ｉｎ  Ｂｉｌａｙｅｒ  Ｇｒａｐｈｅｎｅ，”  ＮＡＮＯ  Ｌｅｔｔ．，  １５，  ４９７３−７８  （２０１５）；  Ｄａｉ  ｅｔ  ａｌ，“Ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｏｎ  ｈｅｘａｇｏｎａｌ  ｂｏｒｏｎ  ｎｉｔｒｉｄｅ  ａｓ  ａ  ｔｕｎａｂｌｅ  ｈｙｐｅｒｂｏｌｉｃ  ｍｅｔａｍａｔｅｒｉａｌ，”  Ｎａｔ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ，  １０，  ６８２−６８６  （２０１５）；  Ｆｅｉ  ｅｔ  ａｌ，“Ｇａｔｅ−ｔｕｎｉｎｇ  ｏｆ  ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｐｌａｓｍｏｎｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｎａｎｏ−ｉｍａｇｉｎｇ，”  Ｎａｔｕｒｅ，  ４８７，  ８２−８５  （２０１２）；及びＤａｉ  ｅｔ  ａｌ，“Ｔｕｎａｂｌｅ  Ｐｈｏｎｏｎ  Ｐｏｌａｒｉｔｏｎｓ  ｉｎ  Ａｔｏｍｉｃａｌｌｙ  Ｔｈｉｎ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ  Ｃｒｙｓｔａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｒｏｎ  Ｎｉｔｒｉｄｅ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３４３，  １１２５−１１１２９  （２０１４））は、文献に大きな影響を与えた。それにもかかわらず、どちらの技術も、ＡＦＭに基づく性質に起因した制限を共有する：
・どちらも本質的に表面ベースの技術であり、バルクのサンプル内の化学組成についての情報を提供しない。ｓ−ＳＮＯＭでは、ｚ方向の波数ベクトルは虚数である。この特性により、ｓ−ＳＮＯＭは回折限界をはるかに超える分解能を達成することができるが、サンプルへの電界が指数関数的に減衰することにより、表面のいくつかのチップ半径（通常は５０〜７５ｎｍ）内の領域を除くすべての領域のキャラクタライゼーションができなくなる。ＡＦＭ−ＩＲでは、チップの下のサンプルの熱膨張が赤外光に応答して測定される。測定された膨張は、チップの下の種々の化学成分にわたって平均される。したがって、ｚ方向の実効分解能は、遠隔場赤外技術と同等である。
・理想的な条件であっても、どちらの技術でもスペクトルを取得するには数秒を要する。この速度では、３秒／ピクセルとすると、２００ｘ２００ピクセルのハイパースペクトル画像は取得するのに３３時間を要することになる。したがって、最大分解能で、約１ミクロン（約５０ｘ５０ピクセル）を超える空間サイズ範囲のサンプルの分析は実用的ではない。したがって、これらの技術の実践者は、大抵は、線又は個々の点に沿った分光データの取得に頼らざるを得ないが、画像自体は単色光で取得される。ｓ−ＳＮＯＭの場合、検出器（光起電力ＭＣＴ）がバックグラウンドリミテッドであり、ソース（シンクロトロン）がＡＦＭチップの金属コーティングを溶かす恐れがあるほど強力であるため、このデータ取得速度はかなり厳しい上限となる（Ｂｅｃｈｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ，“Ｕｌｔｒａｂｒｏａｄｂａｎｄ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｎａｎｏｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ，”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  １１１，  ７１９１−９６  （２０１４））。
・どちらの技術も、調査できるサンプルに関してかなり限定的である。どちらの技術も、特に平坦なサンプルを必要とする。表面粗さが１００ｎｍを超えるサンプルは、測定に時間がかかり、ＡＦＭチップを損傷するリスクが高くなる。より粗いサンプルは、測定が不可能ではないにしても、すぐに実用的ではなくなる。
・特に、極端な温度などの理想的でない環境では、実験上の大きな課題がある。例えば、１０年以上にわたって積極的に詳細に調べられてきたにもかかわらず、低温のｓ−ＳＮＯＭはごく最近になって現実のものになった（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，“Ａ  ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ−ｔｙｐｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｎｅａｒ−ｆｉｅｌｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，”  Ｒｅｖ．  Ｓｃｉ．  Ｉｎｓｔｒｕｍ．，  ８４，  ２３７０１  （２０１３）及びＭｃｌｅｏｄ  ｅｔ  ａｌ，“Ｎａｎｏｔｅｘｔｕｒｅｄ  ｐｈａｓｅ  ｃｏｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ｉｎｓｕｌａｔｏｒ  Ｖ２Ｏ３，”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，  １３，  ８０−８６  （２０１６））。これらの技術は専門家にとって極めて有力であるが、非専門家による適用はこれまでのところ制限されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これらの制限を回避するための相補的なＡＦＭベースではない技術が必要である。最近、このすき間を埋める可能性を示す新しい技術が実証されている。この技術では、パルス量子カスケードレーザ（ＱＣＬ）によって生成された単色赤外光がサンプルにポンプされる。サンプル内の種々の化学成分は、ＱＣＬによって生成された赤外光の周波数がその化学構造の振動モードのうちの１つに等しいときにその赤外光を吸収する。これが起こるときに、材料が加熱され、すべての波長で材料の複素屈折率が変わる。この変化は、はるかにより短い波長の光で観察することができ、ＩＲ回折限界を劇的に改善する。これまでに、反射ジオメトリ（Ｆｕｒｓｔｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，“ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｍｉｃｒｏｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，”  Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｖ，  ８３７４，  ８３７４１１  （２０１２））と透過ジオメトリ（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，“Ｄｅｐｔｈ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｍｉｄ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｂｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ  ｓｐａｔｉａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，”  Ｓｃｉ．  Ａｄｖ．，  ２，  １−８  （２０１６））との両方が実現されている。
【００１１】
透過型顕微鏡法のジオメトリは、プローブビームとして７８５ｎｍレーザ光を用いて実現されている（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，“Ｄｅｐｔｈ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｍｉｄ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｂｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ  ｓｐａｔｉａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，”  Ｓｃｉ．  Ａｄｖ．，  ２，  １−８  （２０１６））。屈折率の変化がプローブビームの強度及び経路に乱れを生じ、これを、フォトダイオードと適切な光学系を介して検出することができる。各ＱＣＬパルスに応答してサンプルが加熱及び冷却される際に、フォトダイオード信号がＱＣＬ繰返し率で変調される。次いで、ＱＣＬの各周波数（υ）でのプローブビームの変調の振幅（ΔＰ／ｐｒ）をサンプルの各位置（ｘ，ｙ）で記録し、各スペクトルが上手く作表されたＩＲ吸収スペクトルに比例する、ハイパースペクトル画像を取得することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
「理想的な」顕微鏡に関する前述の基準は、本発明においてクリアされ、これを光学超解像赤外イメージング分光法（Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  Ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ＩｎｆｒａＲｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＯＳＩＲＩＳ）と呼ぶ。主に、「Ｎ」個の複数のプローブビームを用いて画像取得速度をＮ倍に増加させることにより、化学動態を研究するのに十分な速度がもたらされる。この方法は、チャネル毎の費用効果の高い復調回路の使用を通じて実用化される。随意的に、プローブビームによって各サンプル位置が複数「Ｍ」回問い合わせされる。これは、光熱により誘起される変調をＭ倍増強する。単一のプローブビームを有するシングルパス光熱顕微鏡に比べて、画像取得速度がＮＭ２だけ向上する。このように、１０００倍を超えるイメージング速度の向上がかなり実現可能である。この速度の増強は、動的サンプル（例えば、速く動く細胞又は他の微生物）の研究を可能にする。サンプルが電動ステージ又は走査ミラーのいずれかによってビームに対して移動されることにより３Ｄハイパースペクトル画像が得られる。さらに分析すると３Ｄ化学画像又は濃度マップが得られる。加えて、コヒーレント照射及び検出を用いてプローブビームのアッベ限界の２倍の横方向空間分解能で（ハイパースペクトル）画像を収集することができ、以下「超解像」と呼ぶ。高コヒーレントマルチパスプローブビームが用いられるときに、定在波が形成され、光軸方向の「ｚ」方向にも同様の解像が可能となる。このような画像には、光の伝播によって達成できる最大の可能な空間情報が含まれる。サンプルとの相互作用の前又は後の両方で、高コヒーレントプローブビームの振幅及び／又は位相を変更することにより、点拡がり関数を最適化する（例えば、イメージング速度と解像度とのバランスをとる、又はサンプル内の深部にトモグラフィを実行するときに生じる収差を補正する）ことができる。
【００１３】
本発明は従来技術を上回る利点を有する。１つの主な利点は、約１００ｎｍの等方性空間分解能でリアルタイム３Ｄ化学マッピング（トモグラフィ）を実行できることである。これは現在どの機器でも不可能である。この空間分解能は、コヒーレント照射と、マルチパス（４Ｐｉのような）ジオメトリによってサンプルに生じた定在波を用いて達成される。トモグラフィの場合、ボクセルは、従来の共焦点顕微鏡法で達成されるボクセルの２８分の１である。プローブビームの多重化は、走査速度をこれまでになく増加させることができる。さらに、本発明は、ＯＳＩＲＩＳスペクトル画像と同時に非弾性散乱スペクトル画像を同じ解像度で容易に取得する。データセットは、場合によっては互いに補完し合い、本発明が当該技術分野の明らかに進歩的な改善であることを保証する。
【００１４】
この技術の最終目標と、それが従来技術をどのように改善するかについての説明を、図１Ａ〜図１Ｃに示す。化学画像の１つの可能な視覚化において、各ピクセルの色は、その場所での材料を表す。本発明は、標準的な微視的表現（細胞など）に完全な無標識の化学情報を追加する。図１Ａ〜図１Ｃは、明視野光学顕微鏡法及び蛍光顕微鏡法を本発明の無標識の化学マップと比較する。これらの３つの技術は、顕微鏡法の分野における主要な画期的技術を構成する。図１Ａは、従来の広視野光学顕微鏡法によって得られた画像である。図１Ｂは、蛍光顕微鏡法によって得られた画像である。関心ある化学種が蛍光マーカで標識され、画像に化学成分が付記されている。図１Ｃは、各ピクセルでの各化学種の濃度を視覚化する抽象化学マップである。このような化学マップは、ＯＳＩＲＩＳ実験の最終生成物であり、完全な化学的状況を提供する。これは、関連する化学物質が事前に分かっていない状況に大いに適用可能である。
【００１５】
本発明のこれらの及び他の特徴及び利点、並びに本発明自体は、以下の詳細な説明、付属の請求項、及び添付の図面を参照することでより良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａ〜図１Ｃでは、光学顕微鏡法及び蛍光顕微鏡法を本発明の無標識のフル化学マップと比較する。図１Ａは、光学顕微鏡法によって得られた画像である。図１Ｂは、蛍光顕微鏡法によって得られた画像である。図１Ｃは、化学マップの概念図である。各化学種の濃度が各ピクセルで記録されている。
【図２】ＯＳＩＲＩＳ顕微鏡の概略図である。
【図３】透過モダリティの概略図である。
【図４】反射型共焦点プローブを２パスのトモグラフィプローブと比較する概略図である。
【図５】単一プローブを複数プローブと比較する概略図である。
【図６】環状照射の利点を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、迅速な、無標識の、ナノスケールの化学イメージング及びトモグラフィ（３Ｄ）のための非接触且つ非破壊の方法及びシステムを提供する。ＩＲレーザを用いてサンプルを光熱加熱し、結果として生じる温度の上昇を、サンプルと相互作用した後の１つ以上の可視プローブの変調により測定する。コヒーレント照射及び検出を用いて「超解像」及びより良好な画質をもたらす。
【００１８】
プローブビームにより生成された非弾性散乱光が、ダイクロイックミラーを介して検出アームで分離され、高ゲイン光検出器を介して検出される。この光のスペクトル解析は、複数のフィルタ及びダイクロイックミラー、回折格子、又は干渉手法のいずれかの使用を通じて、様々な方法で行うことができる（明確にするために抑制されている）。このようなスキームは、同じ機器で蛍光顕微鏡法とラマン顕微鏡法のすべての利点へのアクセスを提供する。
【００１９】
光学超解像赤外イメージングスペクトル（ＯＳＩＲＩＳ）顕微鏡法
ＯＳＩＲＩＳ顕微鏡法では、ＩＲレーザを用いてサンプルを光熱加熱する。サンプル内の種々の化学成分は、赤外光の周波数がその化学構造の振動モードのうちの１つに等しいときにその赤外光を吸収する。これが起こるときに、材料が加熱され、膨張し、すべての波長で材料の複素屈折率が変わる。この変化は、はるかにより短い波長の光で観察することができる。変調された赤外光が用いられるとき、結果として生じるサンプル温度の変調が、サンプルから反射した又はサンプルを透過した短波長レーザプローブの変調を介して測定される。可視レーザプローブ（持続波（ｃｗ）モードで動作する）が、ＩＲビームと共にサンプルに合焦される。
【００２０】
図２は、顕微鏡の略図を示す。ＱＣＬからの赤外光が、ダイクロイックフィルタを用いてレーザ（一例では約４０５ｎｍ）からの出力と組み合わされる。両方のビームが、反射対物レンズ（一例では０．７８ＮＡ）を用いてサンプル上に合焦される。サンプルは電動ステージ上に水平に置かれる。可視光が、透明サンプルを透過し、第２の対物レンズを用いてコリメートされ、レトロリフレクタを用いてサンプル上の同じ場所を通るように反射される。代替的に、可視光は、不透明サンプルから反射することができる。反射光が、光をフォトダイオードに伝送するマルチモード光ファイバ（コアサイズ１００μｍ）上に合焦される。マルチパスのジオメトリ（サンプルの下に第２の対物レンズとレトロリフレクタを追加）は、光軸方向の分解能の向上とＯＳＩＲＩＳ信号強度の増加を可能にする。サンプルをビームに対して動かすことにより、３Ｄハイパースペクトル画像が得られる。
【００２１】
トモグラフィ分解能
コヒーレント照射及び検出とマルチパスジオメトリとの組み合わせは、光の伝播で可能な最高分解能での透明又は半透明サンプルの３Ｄイメージングを可能にする。例えば、４０５ｎｍの光及び０．７８Ｎ．Ａ．の対物レンズによるコヒーレント照射及び検出を用いる走査型顕微鏡は、およそ１２３ｎｍの理論分解能を有する。この増強は、反射ジオメトリ又は透過ジオメトリのいずれの場合でも有効である。
【００２２】
ボクセル分解能は、透明及び半透明サンプルの場合にさらに向上させることができる。プローブは、サンプルを２回（又はそれ以上）通過することができ、光軸（ｚ方向）に沿って定在波を生じる。この場合の分解能は、本質的にλ／４ｎであり、ここで、ｎは、サンプル媒体の屈折率である。つまり、この方向の分解能は、液浸光学系と半球全体からの照射で達成される、より馴染みのある横分解能に等しい。例示するために、水中（ｎ＝１．３３）では、理論上の光軸方向の分解能は、およそ７６ｎｍとなる。図３は、２パスのモダリティの例を示し、図４は、反射型共焦点プローブを２パスのトモグラフィプローブと比較している。
【００２３】
これらの２つの改善を用いると、結果として得られるボクセルは、共焦点顕微鏡法で通常達成されるボクセルのおよそ２８分の１となる。アスペクト比の低いボクセルは、トモグラフィに特に良く適している。しかしながら、サンプル内の様々な深度で実際に高い空間分解能を達成することは、焦点面がサンプルを通して走査される際に生じる球面収差とその他の収差との両方により困難である。これは、（複素）開口関数を適宜修正するべく補償光学系によって補正されなければならない。
【００２４】
超解像のための構造化された（環状）照射
前のセクションで説明した横方向分解能の向上は理論上のものである。無視できないノイズレベルとプローブビームパワーを制限するための損傷閾値を有する実際の実験では、得られる実際の分解能は、必然的にこの理論上の限界よりも低くなる。特に有用な選択肢の１つは、環状開口関数で照射することである。対物レンズによって許容される最高値に近い狭い入射角度範囲内の光をサンプルに照射する。図６は、点拡がり関数で環状照射の利点を示す概略図である。このＰＳＦに対応する伝達関数は、λ／４Ｎ．Ａ．よりも低い分解能に対応するすべての空間周波数で一次である。結果として、すべての空間周波数が同様の時間内に同様のＳＮＲで取得される。このプローブ光の効率的な使用は、プローブの強度が損傷閾値によって制限される実際のサンプルで、可能な限り迅速に高分解能でイメージングするのに重要である。さらに従来の照射手法によれば、画像の高分解能成分は、極めて低い効率で収集され、画像取得速度の増加を優先して従来は犠牲にされている。
【００２５】
分解能の増強に加えて、単一の入射角が、検出アームを除いて補償光学系の要件を緩和する。つまり、サンプルへの深度の増加によって照射中に誘起される球面収差は計画的に補正され、いくらかの焦点距離のシフトがあるが、所与の入射角の光線は常に或る点に合焦する。トモグラフィに固有の課題であるこのような収差の補正は、ナノスケール（１００ｎｍ以下）で３Ｄ分解能を達成するのに重要である。
【００２６】
多重化
可視レーザプローブを１つだけ用いる代わりに、複数プローブを用いてもよい。非接触の設計と大きいＩＲスポットサイズは、事実上制限のない多重化を可能にする。図５は、単一プローブを複数プローブと比較する概略図である。多重化を用いると、画像を約５０μｓのピクセル時間で取得することができる（＜５ｍＷ  ＩＲ＜＜１ｍＷプローブ）。レーザが、回折光学系を用いて複数のスポットに合焦される。個々のスポットは十分に分離されているため、共焦点性／超解像が維持される。複数のスポットからの光が、（ファイバ束及びフォトダイオードアレイで）同期して検出される。これは、共振信号処理によって可能にされ得る。多重化は、速度を最高１０３速くすることができる。図４に示したシナリオでは、速度は、単一プローブ構成に比べて複数プローブ構成では２９倍速いであろう。
【００２７】
高速データ取得及びトモグラフィ
成熟した光熱顕微鏡技術は、大きな可能性を秘めている。最終的には、解像度がおよそ１００ｎｍの三次元の化学物質固有のビデオを想像することができる。このような技術は、細胞内の化学プロセスの直接観察を可能にするであろう。このような技術が医薬品開発、医学研究、及びバイオテクノロジーに与える影響は軽視できないであろう。現在、トモグラフィは、サンプルを三次元のすべてにおいて走査することによって達成されている（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，“Ｄｅｐｔｈ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｍｉｄ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｂｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ  ｓｐａｔｉａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，”  Ｓｃｉ．  Ａｄｖ．，  ２，  １−８  （２０１６））。これは自然な手法であるが、全視野を取得するのに必要なメカニカルステージは、走査速度をピクセルあたり約２００μｓに制限する。走査ステージの制限は、光路内のミラーをディザリングすることによってサンプル自体ではなく焦点スポットを走査することにより回避することができる。
【００２８】
最も大幅な速度の増加は、多重化によって実現される。僅かに異なる角度の複数のプローブビームがサンプル上に入射する。次いで、個々のビームがコヒーレントに検出され、復調される。したがって、ピクセルあたりの実効時間はＮだけ減少し、ここで、Ｎは、チャネルの数である。最終的に、１００ｎｓ未満／ピクセル／スペクトル成分の画像取得速度が現在実現可能である。復調／データ取得スキームが成熟するにつれて、さらなる向上が現実的なものとなる。
【００２９】
同時のデータ取得
ＯＳＩＲＩＳ信号と同時に収集される複数の信号が存在する。プローブビームのＤＣ強度は、サンプルのトポグラフィと内部表面に関する情報を提供する。さらに、プローブ光子の一部は、蛍光又はラマン散乱のいずれかに起因して非弾性的に散乱される。用いられるサンプル及び調製に応じて、この光のスペクトル特性は、ＯＳＩＲＩＳスペクトルと組み合わせて大きな効果を得ることができる。例えば、
・低蛍光サンプルの場合、ラマン及び赤外ハイパースペクトル画像には、共に、プローブビームの分解能で完全な無標識の化学情報が含まれる。
・関心ある特定の化学物質（又は複数の化学物質）を強調するためにサンプルに蛍光マーカ（又は複数のマーカ）がつけられていると仮定する。ＯＳＩＲＩＳデータは、多くの有力な蛍光顕微鏡技術のうちの１つを同時に実行可能でありながら、化学的状況についての情報を提供するのに役立つ。
【００３０】
その結果、時間、スペクトル波長、及び三次元位置の関数としての、ＯＳＩＲＩＳ信号、ＤＣ（走査共焦点）信号、及び非弾性散乱（ラマン／蛍光）信号を含む、極めてリッチなデータセットとなる。このような完全なキャラクタライゼーションは、研究用途において非常に望ましい。
【００３１】
改善
より高調波の光熱信号（ａｃフォトダイオード信号）を記録することにより、信号ノイズを低減することができる。これは、最高の高調波の周波数まで動作する高速ロックインを必要とする。ＳＮＲを高めるために、１つ以上の高調波を同時に収集し、加算（単純和又は加重和）することができる。
【００３２】
対物レンズの光軸（ｚ軸）に沿ってサンプルをディザリングすると、顕微鏡がサンプル表面の動きにあまり敏感でなくなる可能性がある。光熱モダリティでは、ＩＲレーザがサンプルを加熱し、これにより、該レーザ波長でのサンプルの吸収係数に比例した量だけサンプル表面が上昇し得る。この波長選択的な表面の動きを信号特徴として使用し、後で解析することができるが、前述のディザリングによって除去することもできる。対物レンズ（又はその一部）、又は集光路に沿った任意の適切な光学系（レンズ、ピンホール）をディザリングすることによって、サンプルのディザリングと同等の効果を達成することができる。
【００３３】
変調されたＩＲレーザが同じスポットに過度にとどまると、焦点スポットでの（また焦点スポットから或る程度離れたところまでの）平均サンプル温度が継続的に上昇することになる。これは、サンプルの動きに起因する共焦点信号の変化として現れる。これが問題になる場合、ガルボミラーを用いて、現在の測定スポットから、最後のスポットから遠く離れたスポットへ迅速に移動して、サンプルが過度に加熱されないようにすることで解決することができる。ラスタ走査では依然として隣接するスポットを訪れるため、ラスタ走査での熱負荷はより高い。ガルボを用いると、ピクセルをランダムに（又はその他の非順次の、非ラスタの様態で）測定することによってサンプル画像を構築することができる。これのさらなる利点は、信号ドリフトが画像全体にランダムに分散されるので、走査により生じる線アーチファクトが画像に存在しないことである。
【００３４】
信号アライメントを行うときに、ＩＲレーザは同じスポットにとどまり、したがって該スポットを加熱することになる。これは走査中に起こるのと同じレジームではない（生じる加熱がより少ない）ため、ＩＲと共焦点信号との間のアライメントが損なわれる場合がある。これを解決するために、上記の技術と同様にガルボがサンプルの小さな領域を横断することによるアライメントモードを実行することができる。
【００３５】
ガルボスキャナミラーの速度（帯域幅）を増加させるために、リサジュー又は他の非ラスタ走査パターンを用いてサンプルを走査することができる。ラスタ走査では、高速ミラーが鋸歯状に前後に移動し、他は一方向にゆっくりと走査する。方向転換点での高速ミラーの加速度は非常に高く、これは全体的な走査周波数を制限する。さらに、一方のミラーが常に高速で走査し、他方のミラーが低速であることは、一方のガルボの過熱及び早期の故障を引き起こす。リサジュー型走査では、２つのガルボが同様の負担を共有する。ガルボ位置は、或る時間Ｔｓｃａｎ内にそれらがサンプル全体を横断するように、いくつかの関数ｘ（ｔ）及びｙ（ｔ）により与えられる。走査中の任意の所与の時点でのガルボの位置を（検出器からの信号と共に）記録することにより、画像を容易に再構築することができる。画像の各ピクセルにおいて、ガルボがプローブビームを該ピクセル内に配置したときの信号の部分が平均される。関数ｘ（ｔ）及びｙ（ｔ）は、時間０〜Ｔｓｃａｎでの均一な画像カバレッジを最適化することによって見つけ出すことができる。１つの可能な関数の選択肢は、
【数１】
2021521446.tif 000003
であろう。その場合、タスクは、ｍａｘ（ｖｉ）及びｍａｘ（ｗｉ）を十分に低く保ちながら画像を最も一様にカバーするＮ、Ｍ、Ａ、Ｂ、ｗ、及びｖを選択することである。これを、一般化されたリサジューパターンと考える。関数ｘ及びｙがＴｓｃａｎ内で周期的であることは有用であるが重要ではない。従来のリサジューパターンは、Ｎ＝Ｍ＝１であり、最初の位置に戻る（すなわち周期的である）。カバレッジの均一性を増加させるための別のオプションは、より大きい面積を効果的にカバーするためにリサジュー型走査中のステージの動きを用いることである。小さなステージの動きをガルボ走査と組み合わせることによって、走査速度をさらに低減することができる。
【００３６】
低速ステージへの依存を最小にするために、ステージが静止した状態で小さいパッチをガルボ走査することによって画像が構築される、ハイブリッドスティッチング手法を用いることができる。各パッチの取得後に、走査は次の「タイル」に移動する。タイルは重なることもでき、これはカバレッジと、カバレッジの均一性を増加させる。
【００３７】
上記の説明は、本発明の好ましい実施形態のものである。本発明の精神及びより広い態様から逸脱することなく、上記の教示に照らして様々な修正及び変形が可能である。したがって、特許請求される発明は、具体的に説明した以外の方法で実施され得ることが理解されるべきである。例えば、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、又は「前記」を用いる単数形のクレーム要素への言及は、要素を単数形に限定するものとして解釈されるべきではない。
【図１】
2021521446.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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