(57)【要約】本発明は、抗ＰＬＡ２−ＧＩＢ抗体およびその使用、特に試料中のヒトＰＬＡ２−ＧＩＢを検出するためのものに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２を含む軽鎖可変領域および配列番号４を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体１４Ｇ９のヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対する結合を競合阻害する、ヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質に結合するモノクローナル抗体、またはその変異体もしくは断片。
【請求項２】
ｓＰＬＡ２−ＧＩＢを阻害する、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項３】
配列番号２６を参照して、ヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質のＷ３、Ｒ６、Ｋ７、Ｋ１０、Ｃ７７、Ｙ７５、Ｇ７９およびＳ８０から選択された少なくとも１つのアミノ酸残基を含むエピトープに結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項４】
ヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質のＷ３、Ｒ６、Ｋ７、Ｋ１０、Ｃ７７、Ｙ７５、Ｇ７９およびＳ８０から選択された少なくとも１つのアミノ酸残基を含むエピトープに結合する、モノクローナル抗体またはその断片。
【請求項５】
配列番号２の前記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号４の前記重鎖可変境域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項６】
配列番号５の前記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号７の前記重鎖可変境域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項７】
配列番号１１の前記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号１３の前記重鎖可変境域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項８】
配列番号１５を含む軽鎖可変領域および配列番号１７を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体８Ｇ１１のヒトプロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢに対する結合を競合阻害する、ヒトプロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質に結合するモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項９】
配列番号１５の前記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号１７の前記重鎖可変境域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む、請求項８に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項１０】
ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質の分泌型（ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ）およびプロ型（プロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢ）の両方に結合するモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項１１】
配列番号１９を含む軽鎖可変領域および配列番号２１を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体１Ｃ１１の分泌および／またはプロ型ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質に対する結合を競合阻害する、請求項１０に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項１２】
配列番号１９の前記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号２１の前記重鎖可変境域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む、請求項１１に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項１３】
配列番号２３を含む軽鎖可変領域および配列番号２５を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体７Ａ１０の分泌および／またはプロ型ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質への結合を競合阻害する、請求項１１に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項１４】
配列番号２３の前記軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域、並びに配列番号２５の前記重鎖可変境域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む、請求項１３に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体を含む組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体、その軽鎖もしくは重鎖、またはその可変ドメインをコードする核酸。
【請求項１７】
試料中のヒトＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質を検出するための方法であって、
（ｉ）前記試料を請求項１〜１４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体と接触させ、
（ｉｉ）工程（ｉ）で形成された抗体−抗原複合体の存在を検出する、方法。
【請求項１８】
前記試料を反復して分割し、前記成熟分泌型（ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ）、前記プロ型（プロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢ）、および／または前記ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質の両方の型を別々に検出する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記成熟分泌型（ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ）、前記プロ型（プロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢ）、および／または前記ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質全体の量を投与する、または監視する、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
免疫反応もしくは抗体−抗原複合体を実行、検出または定量化するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体の少なくとも１つまたはその断片、および試薬を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＰＬＡ２−ＧＩＢ抗体およびその使用、特に、試料中のヒトＰＬＡ２−ＧＩＢを検出するためのものに関する。本発明は、特に、ＰＬＡ２−ＧＩＢの成熟分泌型およびプロ型を識別できる、または、ＰＬＡ２―ＧＩＢの両方の型を結合できる新規なモノクローナル抗体を開示する。本発明はまた、そのような抗体またはその断片を使用して試料中のＰＬＡ２−ＧＩＢを検出する、または投与する方法、さらにそのプロ型および分泌型を区別する方法ならびにそれらの方法を実施するのに適したキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
グループＩＢ膵臓ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２−ＧＩＢ）は、低分子量（１４ｋＤ）で、非常に安定（７ジスルフィド結合）な分泌タンパク質であり、リン脂質のｓｎ−２脂肪アシル結合の加水分解を触媒して、遊離脂肪酸およびリゾリン脂質（ＬａｍｂｅａｕおよびＧｅｌｂ、２００８）を放出する。ヒトでは、ＰＬＡ２−ＧＩＢ遺伝子は主に膵臓で発現され、十二指腸、空腸、および胃では発現レベルが低くなる（Ｅｓｋｏｌａ等、１９８３ａ）（ＮｅｖａｌａｉｎｅｎおよびＨａａｐａｎｅｎ、１９９３）。辺縁部の発現では、肺、目（Ｋｏｌｋｏ等、２００７）、精巣など他の組織で報告されている。ヒト膵臓では、ＰＬＡ２−ＧＩＢは、主に膵腺房細胞の頂端チモーゲン顆粒部分で合成される（Ｅｓｋｏｌａ等、１９８３ａ）。ＰＬＡ２−ＧＩＢは、膵島β細胞のインスリン分泌顆粒でも検出され、グルコース刺激膵島からのインスリンと共に分泌される（Ｒａｍａｎａｄｈａｍ等、１９９８）。
【０００３】
ＰＬＡ２−ＧＩＢは、最初、不活性なプロ型（プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ）として膵液中に分泌され、プロペプチドのタンパク質分解切断によって活性化され、活性な成熟分泌型（ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ）に至る。生体外実験では、トリプシンおよびプラスミンがプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢを良好な効力で活性化できることが示唆された（Ｎａｋａｎｏ等、１９９４）。
【０００４】
ＰＬＡ２−ＧＩＢは、消化管での役割に加えて、ヒト血漿においても循環している（（Ｎｉｓｈｉｊｉｍａ等、１９８３）（Ｅｓｋｏｌａ等、１９８３ｂ）（Ｓｔｅｒｎｂｙ、１９８４）（Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ等、１９８５）（Ｋｉｔａｇａｗａ等、１９９１））。本発明者らは以前に、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢを免疫応答の主要な内因性因子として特徴付けた。それらにおいて、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢは、例えばウイルス血症ＨＩＶ感染患者で観察されるＣＤ４Ｔリンパ球の不応答に潜む機序に重要な役割を果たしていることを実証した。
【０００５】
したがって、ＰＬＡ２−ＧＩＢの正確かつ高感度な検出を可能にする方法が必要とされている。また、プロ型および成熟分泌型ＰＬＡ２−ＧＩＢを識別できる方法およびキットが必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明により、新規な抗ＰＬＡ２−ＧＩＢ抗体およびその使用を提供する。本発明により、また、そのような抗体を使用したＰＬＡ２−ＧＩＢの検出または投与方法、ならびにそれを含むキットを提供する。
【０００７】
第１の態様では、本発明は、モノクローナル抗体、またはその断片に関し、より具体的には、ヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質に結合し、かつヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢへの配列番号２を含む軽鎖可変領域および配列番号４を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体（１４Ｇ９）の結合を競合阻害する、モノクローナル抗体、またはその断片に関する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、ヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質のエピトープに結合するモノクローナル抗体、またはその断片に関し、当該エピトープは、配列番号２６を参照して、ヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質のＷ３、Ｒ６、Ｋ７、Ｋ１０、Ｃ７７、Ｙ７５、Ｇ７９およびＳ８０から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つを含む。
【０００９】
さらなる態様では、本発明は、ヒトプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質に結合し、かつヒトプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢへの配列番号１５を含む軽鎖可変領域および配列番号１７を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体（８Ｇ１１）の結合を競合阻害する、モノクローナル抗体、またはその断片に関する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質の分泌型（ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ）およびプロ型（プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ）の両方に結合するモノクローナル抗体またはその断片に関する。特に、実施形態では、前述の抗体もしくは断片は、（ｉ）配列番号１９を含む軽鎖可変領域および配列番号２１を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体（１Ｃ１１）、または、（ｉｉ）配列番号２３を含む軽鎖可変領域および配列番号２５を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体（７Ａ１０）、のプロ型および／もしくは分泌型ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質への結合を競合阻害する。
【００１１】
本発明の抗体の特定の例としては、例えば、１４Ｇ９、２４Ｂ２、２２Ｃ６、２８Ａ１、２８Ａ３、３４Ｇ３、２２Ｈ５、７Ｃ５、８Ｇ１１、１８Ｄ９、１Ｃ１１、４Ｇ１１、７Ｈ１２、７Ｅ２、７Ａ１０、３６Ｇ１０、３Ｂ２、１８Ａ６および１３Ｈ８、ならびにそれらの断片がある。
【００１２】
本発明は、さらに、本発明の抗体またはその断片をコードする単離された核酸、および、好ましくは、プロモーターに作動可能に連結されたこのような核酸を含むベクターに関する。
【００１３】
本発明はさらに、上記で定義された核酸またはベクターを含む宿主細胞に関する。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体を産生する方法に関し、当該抗体の発現に適した条件下において上記で定義された宿主細胞を培養し、かつ場合により当該抗体を回収する方法を含む。
【００１５】
別の態様では、本発明は、上記で定義された抗体、核酸、ベクターまたは宿主細胞を含む組成物に関する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、対象の病態診断、予防又は治療に使用する上記で定義された抗体または組成物、特に、ＰＬＡ２−ＧＩＢの活性に関連する条件に関する。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は上記で定義された抗体または断片を使用してヒトＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質を検出するための方法に関する。当該方法を、成熟分泌型（ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ）、プロ型（プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ）および／または両方の型のヒトＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質の存在を検出するために使用し、実施し得る。そのような方法または抗体を、試料中のＰＬＡ２−ＧＩＢの存在もしくは量を検出または投与（または定量化）し、さらに、そのプロ型および成熟分泌型の比率を評価するために使用し得る。この方法は、特に、ＰＬＡ２−ＧＩＢの活性と関連する対象の病態を検出し、または監視するのに有用である。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、免疫反応、もしくは抗体−抗原複合体を実行、検出または定量化するための、本明細書に記載した抗体の少なくとも１つ、またはその断片、および試薬を含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】＃１４Ｇ９抗体によるｓＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性の阻害を示す。データに４ＰＬロジスティック非線形回帰モデルをフィッティングさせ、モデルから相対ＩＣ５０値を推定した。
【図１Ｂ】＃６Ｆ７抗体によるｓＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性の阻害を示す。
【図１Ｃ】＃１Ｃ１１抗体によるｓＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性の阻害を示す。
【図２Ａ】間接ＥＬＩＳＡにおける抗ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ抗体の希釈曲線を示す。データに４ＰＬロジスティック非線形回帰モデルをフィッティングさせ、モデルから相対ＥＣ５０値を推定した。
【図２Ｂ】間接ＥＬＩＳＡにおける抗ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ抗体の希釈曲線を示す。データに４ＰＬロジスティック非線形回帰モデルをフィッティングさせ、モデルから相対ＥＣ５０値を推定した。
【図２Ｃ】間接ＥＬＩＳＡにおける抗ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ抗体の希釈曲線を示す。データに４ＰＬロジスティック非線形回帰モデルをフィッティングさせ、モデルから相対ＥＣ５０値を推定した。
【図２Ｄ】間接ＥＬＩＳＡにおける抗ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ抗体の希釈曲線を示す。データに４ＰＬロジスティック非線形回帰モデルをフィッティングさせ、モデルから相対ＥＣ５０値を推定した。
【図２Ｅ】間接ＥＬＩＳＡにおける抗ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ抗体の希釈曲線を示す。データに４ＰＬロジスティック非線形回帰モデルをフィッティングさせ、モデルから相対ＥＣ５０値を推定した。
【図２Ｆ】間接ＥＬＩＳＡにおける抗ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ抗体の希釈曲線を示す。データに４ＰＬロジスティック非線形回帰モデルをフィッティングさせ、モデルから相対ＥＣ５０値を推定した。
【図３Ａ】競合ＥＬＩＳＡによる抗体の比較を示す。
【図３Ｂ】競合ＥＬＩＳＡによる抗体の比較を示す。
【図３Ｃ】競合ＥＬＩＳＡによる抗体の比較を示す。
【図３Ｄ】競合ＥＬＩＳＡによる抗体の比較を示す。
【図３Ｅ】競合ＥＬＩＳＡによる抗体の比較を示す。
【図３Ｆ】競合ＥＬＩＳＡによる抗体の比較を示す。
【図４】１ｍｇのモノクローナル抗体１４Ｇ９による、マウス脾細胞から分離されたＣＤ４Ｔ細胞におけるリン酸化ＳＴＡＴ５の核移行に対する１００μｇのｓＰＬＡ２−ＧＩＢの阻害効果の生体内阻害を示す。９００μｇのアイソタイプ対照ｍＡｂを注入しても、有意な影響は観察されなかった。
【図５】エピトープ同定を示す。Ｆａｂ＃２Ｂ２／ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ複合体の非共有結合、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢバックボーンは黄色、＃２Ｂ２のＦａｂ軽鎖は水色、＃２Ｂ２のＦａｂ重鎖は緑である。
【００２０】
表１は、プロ型ｓＰＬＡ２−ＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＩＢに対する３６のｍＡｂについての説明である。免疫に使用される抗原、アイソタイプ、ｓＰＬＡ２酵素活性阻害および間接ＥＬＩＳＡによって決定されたプロ型ｓＰＬＡ２およびｓＰＬＡ２−ＩＢに対する各サブクローンの相対的な親和性を記載する。
表２は、競合ＥＬＩＳＡによって決定された組換えヒトｓＰＬＡ２−ＩＢおよび組換えヒトプロ型ｓＰＬＡ２−ＩＢに対するＥＬＩＳＡ  ＩＣ５０値を示す。
表３は、表面プラズモン共鳴による組換えヒトｓＰＬＡ２−ＩＢおよび組換えヒトプロ型ｓＰＬＡ２−ＩＢに対するＫｄの決定値を示す。
表４は、競合ＥＬＩＳＡによるエピトープマッピングを示す。結果は、自己競合のシグナルを差し引いた後のシグナルのパーセンテージとして表され、０％は最大競合、１００％は競合が無いことを表す。
表５は、プロ型ｓＰＬＡ２−ＩＢ、ｓＰＬＡ２−ＩＢ、または両方の型に特化したサンドイッチＥＬＩＳＡの分析性能の概要を示す。
表６は、明らかに健康な男性および女性間のプロ型ｓＰＬＡ２−ＩＢ、総ｓＰＬＡ２−ＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＩＢの分布、ならびに年齢およびＢＭＩとの相関関係を示す。
表７は、明らかに健康な男性と女性の間のプロ型ｓＰＬＡ２−ＩＢ、ｓＰＬＡ２−ＩＢおよび両方の型のパーセンタイル分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（定義）
本明細書で使用する場合、「ＰＬＡ２−ＧＩＢ」という用語は、グループＩＢの膵臓ホスホリパーゼＡ２を指す。ＰＬＡ２−ＧＩＢは、さまざまな哺乳動物種から同定され、かつ複製されてきた。ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質は、例えば、ＬａｍｂｅａｕおよびＧｅｌｂ（２００８）に開示されている。その配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＮＰ＿０００９１９で入手できる。
【００２２】
ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢのアミノ酸配列の一例を以下に示す（配列番号１）。
ＭＫＬＬＶＬＡＶＬＬ  ＴＶＡＡＡ  ＤＳＧＩＳ  ＰＲ  ＡＶＷＱＦＲＫＭ  ＩＫＣＶＩＰＧＳＤＰ  ＦＬＥＹＮＮＹＧＣＹ  ＣＧＬＧＧＳＧＴＰＶ  ＤＥＬＤＫＣＣＱＴＨ  ＤＮＣＹＤＱＡＫＫＬ  ＤＳＣＫＦＬＬＤＮＰ  ＹＴＨＴＹＳＹＳＣＳ  ＧＳＡＩＴＣＳＳＫＮ  ＫＥＣＥＡＦＩＣＮＣ  ＤＲＮＡＡＩＣＦＳＫ  ＡＰＹＮＫＡＨＫＮＬ  ＤＴＫＫＹＣＱＳ
【００２３】
配列番号１のアミノ酸１〜１５位はシグナル配列であり、配列番号１のアミノ酸１６〜２２位は、プロペプチド配列である。
【００２４】
本発明の文脈内で、「ＰＬＡ２−ＧＩＢ」という用語は、好ましくは、ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢを指す。
【００２５】
ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質は、２つの異なる形態で存在する可能性がある。すなわち、不活性なプロ型（プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ）は、プロペプチドのタンパク質分解開裂によって活性化され、成熟した分泌型（ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ）になる。ＰＬＡ２−ＧＩＢという用語は、プロ型および／または成熟型などのタンパク質の任意の形態を含む。典型的には、成熟分泌型は、配列番号１（配列番号２６）のアミノ酸残基２３〜１４８位の配列、または多型性もしくは組み換えから生じる変異体などのその任意の天然変異体を含む。「プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ」または「プロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢ」の用語は、好ましくは、配列番号１のアミノ酸残基１６〜１４８位の配列を含むタンパク質、または多型性もしくは組み換えから生じる変異体などのその任意の天然変異体を指す。
【００２６】
一般に、「抗体」という用語は、重鎖および軽鎖を含む任意の免疫グロブリン型分子を指す。典型的な抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖からなる基本的な単量体「Ｈ２Ｌ２」構造を持つ。重鎖のそれぞれは軽鎖とペアになる。重鎖および軽鎖は、「可変領域」または「可変ドメイン」を含む。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と呼ばれることがある。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と呼ばれる場合がある。これらのドメインは、一般的に抗体の最も変化しやすい部分であり、抗原結合部位を含む。軽鎖または重鎖可変領域（ＶＬまたはＶＨ）は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる３つの超可変領域によって遮られたフレームワーク領域から成る。
【００２７】
抗体の「断片」は、抗原結合を与える抗体の任意の部分を指す。断片は通常、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＳｃＦｖ、ナノ体、またはＣＤＲを指す。
【００２８】
抗体の変異体は、抗原特異性を保持して化学的又は生物学的に修飾された任意の抗体を含む。特定の変異体は、標識された抗体であり、抗体の検出または捕捉を可能にする標識（マーカー、トレーサー、タグなど）を運ぶ。このような変異体の例としては、融合分子の検出、または定量化を可能にするレポーターペプチドのような１つ以上のタンパク質又はペプチドと共有結合または非共有結合によって関連付けられた抗体によって形成された融合分子が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体変異体をビオチン化などで操作し、検出及び／又は定量化可能である。
【００２９】
好ましい実施形態では、本発明の抗体および断片ならびに変異体は、単離される。「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。特に、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって決定されるように、９５％または９９％を超える純度まで精製され得る。抗体純度の評価方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ等によるＪ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ８４８：７９−８７（２００７）を参照されたい。
【００３０】
抗体は、抗原に対して「選択的」であるか、またはそのような抗体が他の分子と比較して前記抗原への優先的な結合を示す場合、抗原を「選択的に結合」する。選択性は、競合ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）アッセイによって決定できる。選択性を示す親和性／結合力の違いは、検出可能な選好性、たとえば１：１．１を超える比、または約１：５、１：１０、１：１００、１：１０００以上を超える比などである。
【００３１】
「競合的に阻害する」という用語は、抗体が参照抗体のｓＰＬＡ２−ＧＩＢへの結合を低減または阻害または置換できることを示す。競合アッセイは、例えば、競合ＥＬＩＳＡまたは他の結合アッセイなどの標準的な技術を使用して実行することができる。典型的には、競合的結合アッセイは、一般に固体基質または細胞のいずれかに結合した精製標的抗原、非標識試験抗体および標識参照抗体を含む。競合阻害は、試験抗体の存在下で結合した標識抗体の量を測定することによって測定される。通常、試験抗体は、参照抗体の量の約５〜５００倍など、過剰に存在する。典型的には、ＥＬＩＳＡの場合、試験抗体は１００倍過剰であり、酵素的方法の場合、試験抗体は１０倍過剰である。過剰に存在する試験抗体が抗原への参照抗体の結合の少なくとも７０％を阻害または置換する場合、それは前述の参照抗体を競合的に阻害すると見なされる。特定の実施形態では、１００倍過剰に存在する試験抗体が、ＥＬＩＳＡにおいて抗原への参照抗体の結合の少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％を阻害または置換する場合、それは前述の参照抗体を競合的に阻害すると見なされる。好ましい競合抗体は、共通のアミノ酸残基を共有するエピトープに結合する。
【００３２】
（発明を実施するための形態）
本発明は、ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質に結合する新規なモノクローナル抗体、そのような抗体の断片、およびそれらの使用、特に試料中のＰＬＡ２−ＧＩＢを検出、定量化または監視するための使用、およびｓＰＬＡ２−ＧＩＢを阻害するための使用に関する。
【００３３】
発明者らは以前、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢを、ウイルス血症ＨＩＶ感染患者などのＣＤ４Ｔリンパ球の不応答に潜む機序で重要な役割を果たすと特定した。発明者は、今回、異なる種類の免疫原を使用して抗ＰＬＡ２−ＧＩＢモノクローナル抗体を生成した。当該免疫原は、特に、本質的にプロ領域を含むペプチドを使用して、適切な特異性を持つ抗体を生成するように設計された。本発明者らは、約４０のモノクローナル抗体の製造および試験をし、最も適切な特異性、親和性および活性を有する抗体を選択した。選択した抗体の配列、およびいくつかのエピトープを決定した。これらの抗体により、単独でも組み合わせでも、ＰＬＡ２−ＧＩＢの効率的な検出および／または阻害が可能になる。また、それらを、試料中のプロおよび分泌型ＰＬＡ２−ＧＩＢを識別する方法を設計するために使用することができる。
【００３４】
第１の態様では、本発明は、このようにヒトＰＬＡ２−ＧＩＢに結合するモノクローナル抗体、またはその断片に関する。本発明の特定の抗体は、成熟分泌型ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢに選択的に結合する。本発明の他の特定の抗体は、プロ型ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢ、または成熟分泌型およびプロ型ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢの両方に選択的に結合する。本発明のモノクローナル抗体または断片を、ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢの型を識別するために使用し得る。それらをまた、成熟分泌型ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢを特異的に阻害するために使用し得る。
【００３５】
（ｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対しての抗体）
ある特定の態様では、本発明は、成熟分泌型ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢ（ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ）に結合し、好ましくはｓＰＬＡ２−ＧＩＢに選択的に結合するモノクローナル抗体、またはその断片に関する。
【００３６】
そのような抗体の特定の例は、１４Ｇ９である。抗体１４Ｇ９を、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢを用いた免疫化によって生成した。１４Ｇ９抗体を、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対する非常に高い親和性、強力な中和活性、およびその選択性に基づいて選択した。１４Ｇ９の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を決定し、この抗体の組換え産生が可能となった。さらに、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ上の１４Ｇ９のエピトープも決定した。
【００３７】
試験の結果、１４Ｇ９はｓＰＬＡ２−ＧＩＢに選択的に結合できることが判明した。また、１４Ｇ９は、生体外および生体内でｓＰＬＡ２−ＧＩＢを阻害できることも判明した。したがって、この抗体は、当該タンパク質を選択的に検出または阻害するための優れた特性を示す。本発明者らが調製したさらなるモノクローナル抗体について、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢへの１４Ｇ９の結合を競合的に阻害する能力について試験した。モノクローナル抗体２４Ｂ２、２２Ｃ６、２８Ａ１、２８Ａ３、３４Ｇ３、２２Ｈ５および７Ｃ５は、実際、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢへの１４Ｇ９の結合を競合的に阻害できることが判明した（表４を参照）。さらに、このような競合する抗体がＰＬＡ２−ＧＩＢに結合して中和できることを確認し（表１を参照）、この抗体グループの関連性を確認した。
【００３８】
ある特定の態様では、本発明は、成熟分泌型ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢに結合し、ヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢへのモノクローナル抗体１４Ｇ９の結合を競合的に阻害する、任意のモノクローナル抗体、変異体またはその断片に関する。
【００３９】
さらに特定の実施形態では、本発明は、ヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質の（配列番号２６を参照して）Ｗ３、Ｒ６、Ｋ７、Ｋ１０、Ｃ７７、Ｙ７５、Ｇ７９およびＳ８０から選択したアミノ酸残基の少なくとも１つを含むエピトープに結合するモノクローナル抗体、変異体、またはその断片に関する。好ましい態様では、本発明の抗体、変異体および断片は、ヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質のＷ３、Ｒ６、Ｋ７、Ｋ１０、Ｃ７７、Ｙ７５、Ｇ７９およびＳ８０から選択したアミノ酸残基の少なくとも２、３、４、５、６、７つ又は全てを含むエピトープに結合する。モノクローナル抗体１４Ｇ９のエピトープは、本発明者が決定したように、軽鎖に結合するアミノ酸残基Ｗ３、Ｒ６、およびＫ７、ならびに重鎖に結合するアミノ酸残基Ｋ１０、Ｃ７７、Ｙ７５、Ｇ７９及びＳ８０を含むことが判明した。したがって、本発明はまた、それらのエピトープ中に１４Ｇ９のエピトープの少なくとも１つのアミノ酸残基、好ましくは少なくとも２つ以上を有する抗体およびその断片に関する。
【００４０】
より特定の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、抗体１４Ｇ９またはその変異体もしくは断片である。
【００４１】
抗体１４Ｇ９の軽及び重鎖の可変領域はそれぞれ、配列番号２および４で提供されている。
【００４２】
より特定の実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体であって、（ｉ）配列番号２の軽鎖可変領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域、および（ｉｉ）配列番号４の重鎖可変領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含むものに関する。
【００４３】
配列番号２を参照すると、３つのＣＤＲ領域は、以下のアミノ酸残基に対応する。
・ＣＤＲ−Ｌ１：アミノ酸残基ＱＤＶＳＴＡ（配列番号２７）
・ＤＲ−Ｌ２：アミノ酸残基ＷＡＳ（配列番号２８）
・ＤＲ−Ｌ３：アミノ酸残基ＱＱＤＹＳＴＰＰＴ（配列番号２９）
【００４４】
配列番号４を参照すると、３つのＣＤＲ領域は、以下のアミノ酸残基に対応する。
・ＣＤＲ−Ｈ１：アミノ酸残基ＧＹＴＦＴＮＹＷ（配列番号３０）
・ＣＤＲ−Ｈ２：アミノ酸残基ＩＤＰＳＤＴＲＴ（配列番号３１）
・ＣＤＲ−Ｈ３：アミノ酸残基ＡＲＱＴＬＹＹＥＡＬＤＹ（配列番号３２）
【００４５】
より特定の実施形態では、本発明は、配列番号２から成る、もしくは本質的に成る軽鎖可変領域、および／または、配列番号４から成る、もしくは本質的に成る重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体に関する。
【００４６】
別の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、抗体２２Ｃ６、またはその変異体もしくは断片である。
【００４７】
２２Ｃ６の軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７および９で提供されている。
【００４８】
より特定の実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体であって、（ｉ）配列番号７の軽鎖可変領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域、および（ｉｉ）配列番号９の重鎖可変領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含むものに関する。
【００４９】
配列番号７を参照すると、３つのＣＤＲ領域は、以下のアミノ酸残基に対応する。
・ＣＤＲ−Ｌ１：アミノ酸残基ＳＳＩＳＰＮＦ（配列番号３３）
・ＣＤＲ−Ｌ２：アミノ酸残基ＲＴＳ（配列番号３４）
・ＣＤＲ−Ｌ３：アミノ酸残基ＨＱＧＮＳＬＰＬＴ（配列番号３５）
【００５０】
配列番号９を参照すると、３つのＣＤＲ領域は、以下のアミノ酸残基に対応する。
・ＣＤＲ−Ｈ１：アミノ酸残基ＧＨＳＩＴＤＤＮＹＹ（配列番号３６）
・ＣＤＲ−Ｈ２：アミノ酸残基ＩＴＳＡＧＮＴ（配列番号３７）
・ＣＤＲ−Ｈ３：アミノ酸残基ＡＲＤＳＴＤＧＤＦＹＦＥＫ（配列番号３８）
【００５１】
より特定の実施形態では、本発明は、配列番号７から成る、もしくは本質的に成る軽鎖可変領域、および／または、配列番号９から成る、もしくは本質的に成る重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体に関する。
【００５２】
別のより特定の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、抗体２４Ｂ２、またはその変異体もしくは断片である。
【００５３】
２４Ｂ２の軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１１および１３で提供されている。
【００５４】
より特定の実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体であって、（ｉ）配列番号１１の軽鎖可変領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域、および（ｉｉ）配列番号１３の重鎖可変領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含むものに関する。
【００５５】
配列番号１１を参照すると、３つのＣＤＲ領域は、以下のアミノ酸残基に対応する。
・ＣＤＲ−Ｌ１：アミノ酸残基ＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦ（配列番号３９）
・ＣＤＲ−Ｌ２：アミノ酸残基ＲＡＳ（配列番号４０）
・ＣＤＲ−Ｌ３：アミノ酸残基ＱＱＳＳＲＤＬＦＴ（配列番号４１）
【００５６】
配列番号１３を参照すると、３つのＣＤＲ領域は、以下のアミノ酸残基に対応する。
・ＣＤＲ−Ｈ１：アミノ酸残基ＧＨＳＩＴＤＤＮＹＹ（配列番号４２）
・ＣＤＲ−Ｈ２：アミノ酸残基ＩＴＳＳＧＳＴ（配列番号４３）
・ＣＤＲ−Ｈ３：アミノ酸残基ＡＲＤＳＴＤＧＤＦＹＦＥＫ（配列番号４４）
【００５７】
より特定の実施形態では、本発明は、配列番号１１から成る、もしくは本質的に成る軽鎖可変領域、および／または、配列番号１３から成る、もしくは本質的に成る重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体に関する。
【００５８】
ｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対する抗体は選択的であり、本質的にはそのタンパク質の成熟分泌型のみに結合する。特に、１４Ｇ９はｓＰＬＡ２−ＧＩＢに結合し、本質的にそのプロ型には結合しない。
【００５９】
（プロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢに対する抗体）
ある特定の態様では、本発明は、プロ型ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢ（プロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢ）に結合し、好ましくはプロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢに選択的に結合するモノクローナル抗体、またはその断片に関する。
【００６０】
そのような抗体の特定の例は、８Ｇ１１である。抗体８Ｇ１１を、ＰＬＡ２−ＧＩＢのＮ末端部を含むペプチドを用いた免疫化によって生成した。当該抗体を、プロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢに対する非常に高い親和性およびプロ型に対する選択性に基づいて選択した。８Ｇ１１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を決定し、この抗体の組換え産生が可能になった。本発明者らが調製したさらなるモノクローナル抗体について、プロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢへの８Ｇ１１の結合を競合的に阻害する能力について試験した。モノクローナル抗体１８Ｄ９は、実際、プロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢへの８Ｇ１１の結合を競合的に阻害できることが判明した（表４を参照）。
【００６１】
ある特定の実施形態では、本発明は、このように、プロ型ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢに結合し、ヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢへのモノクローナル抗体８Ｇ１１の結合を競合的に阻害する、任意のモノクローナル抗体、またはその変異体もしくは断片に関する。
【００６２】
より特定の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、抗体８Ｇ１１、またはその変異体もしくは断片である。
【００６３】
８Ｇ１１の軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１５および１７に提供されている。
【００６４】
より特定の実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体であって、（ｉ）配列番号１５の軽鎖可変領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域、および（ｉｉ）配列番号１７の重鎖可変領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含むものに関する。
【００６５】
配列番号１５を参照すると、３つのＣＤＲ領域は、以下のアミノ酸残基に対応する。
・ＣＤＲ−Ｌ１：アミノ酸残基ＫＳＶＳＴＳＧＹＳＹ（配列番号４５）
・ＣＤＲ−Ｌ２：アミノ酸残基ＬＶＳ（配列番号：４６）
【００６６】
配列番号１７を参照すると、３つのＣＤＲ領域は、以下のアミノ酸残基に対応する。
・ＣＤＲ−Ｈ１：アミノ酸残基ＧＹＴＦＮＤＤＥ（配列番号４７）
・ＣＤＲ−Ｈ２：アミノ酸残基ＩＤＰＥＴＧＧＴ（配列番号４８）
・ＣＤＲ−Ｈ３：アミノ酸残基ＱＬＩＦＨＧＮＰＹＹＣＭＤＹ（配列番号４９）
【００６７】
より特定の実施形態では、本発明は、配列番号１５から成る、もしくは本質的に成る軽鎖可変領域、および／または、配列番号１７から成る、もしくは本質的に成る重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体に関する。
【００６８】
プロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢに対する抗体は選択的であり、本質的にはそのタンパク質のプロ型のみに結合する。特に、８Ｇ１１はプロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢに結合し、本質的に当該タンパク質のｓＰＬＡ２−ＧＩＢの型には結合しない。
【００６９】
（ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびプロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢに対する２重抗体）
特定の態様では、本発明は、ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢの成熟分泌型（ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ）およびプロ型（プロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢ）の両方に結合するモノクローナル抗体、またはその断片に関する。
【００７０】
そのような抗体の特定の例は、１Ｃ１１である。抗体１Ｃ１１を、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢを用いた免疫化によって生成した。当該抗体を、プロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢの両方に対する非常に高い親和性に基づいて選択した。１Ｃ１１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を決定し、この抗体の組換え産生が可能になった。本発明者らが調製したさらなるモノクローナル抗体について、プロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢおよび／またはｓＰＬＡ２−ＧＩＢへの１Ｃ１１の結合を競合的に阻害する能力について試験した。モノクローナル抗体４Ｇ１１、７Ｈ１２および７Ｅ２は、実際、１Ｃ１１の結合を競合的に阻害できることが判明した（表４を参照）。
【００７１】
ある特定の実施形態では、本発明は、このように、ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢに結合し、モノクローナル抗体１Ｃ１１のヒトプロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢおよび／またはヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢへの結合、好ましくはヒトプロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢおよびヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢへの結合を競合的に阻害する、任意のモノクローナル抗体、またはその変異体もしくは断片に関する。
【００７２】
より特定の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、抗体１Ｃ１１、またはその変異体もしくは断片である。
【００７３】
１Ｃ１１の軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１９および２１に提供されている。
【００７４】
より特定の実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体であって、（ｉ）配列番号１９の軽鎖可変領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域、および（ｉｉ）配列番号２１の重鎖可変領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含むものに関する。
【００７５】
配列番号１９を参照すると、３つのＣＤＲ領域は、以下のアミノ酸残基に対応する。
・ＣＤＲ−Ｌ１：アミノ酸残基ＳＳＶＳＹ（配列番号５０）
・ＣＤＲ−Ｌ２：アミノ酸残基ＥＩＳ（配列番号５１）
・ＣＤＲ−Ｌ３：アミノ酸残基ＱＳＷＮＦＯＬＬＳ（配列番号５２）
【００７６】
配列番号２１を参照すると、３つのＣＤＲ領域は、以下のアミノ酸残基に対応する。
・ＣＤＲ−Ｈ１：アミノ酸残基ＧＹＡＦＳＳＦＷ（配列番号５３）
・ＣＤＲ−Ｈ２：アミノ酸残基ＩＹＰＧＤＧＤＩ（配列番号５４）
・ＣＤＲ−Ｈ３：アミノ酸残基ＶＲＧＷＡＷＦＰＹ（配列番号５５）
【００７７】
より特定の実施形態では、本発明は、配列番号１９から成る、もしくは本質的に成る軽鎖可変領域、および／または、配列番号２１から成る、もしくは本質的に成る重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体に関する。
【００７８】
そのような抗体の別の例は、７Ａ１０である。抗体７Ａ１０を、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢを用いた免疫化によって生成した。当該抗体を、プロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢの両方に対する非常に高い親和性に基づいて選択した。７Ａ１０の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を決定し、この抗体の組換え産生が可能になった。本発明者らが調製したさらなるモノクローナル抗体について、プロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢおよび／またはｓＰＬＡ２−ＧＩＢへの７Ａ１０の結合を競合的に阻害する能力について試験した。モノクローナル抗体３６Ｇ１０、３Ｂ２、１８Ａ６および１３Ｈ８は、実際、７Ａ１０の結合を競合的に阻害できることが判明した（表４を参照）。
【００７９】
ある特定の実施形態では、本発明は、このように、ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢに結合し、モノクローナル抗体７Ａ１０のヒトプロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢおよび／またはヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢへの結合、好ましくはヒトプロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢおよびヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢへの結合を競合的に阻害する、任意のモノクローナル抗体、またはその変異体もしくは断片に関する。
【００８０】
より特定の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、抗体７Ａ１０、またはその変異体もしくは断片である。
【００８１】
７Ａ１０の軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号２３および２５に提供されている。
【００８２】
より特定の実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体であって、（ｉ）配列番号２３の軽鎖可変領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域、および（ｉｉ）配列番号２５の重鎖可変領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３のそれぞれから成る、または本質的に成るＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、および／もしくはＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含むものに関する。
【００８３】
配列番号２３を参照すると、３つのＣＤＲ領域は、以下のアミノ酸残基に対応する。
・ＣＤＲ−Ｌ１：アミノ酸残基ＱＧＩＳＩＷ（配列番号５６）
・ＣＤＲ−Ｌ２：アミノ酸残基ＫＡＳ（配列番号５７）
・ＣＤＲ−Ｌ３：アミノ酸残基ＬＱＳＱＳＹＰＬＴ（配列番号５８）
【００８４】
配列番号２５を参照すると、３つのＣＤＲ領域は、以下のアミノ酸残基に対応する。
・ＣＤＲ−Ｈ１：アミノ酸残基ＧＦＳＬＴＳＹＧ（配列番号５９）
・ＣＤＲ−Ｈ２：アミノ酸残基ＩＷＧＤＧＳＴ（配列番号６０）
・ＣＤＲ−Ｈ３：アミノ酸残基ＡＫＥＧＧＬＲＲＧＶＹＦＤＹ（配列番号６１）
【００８５】
より特定の実施形態では、本発明は、配列番号２３から成る、もしくは本質的に成る軽鎖可変領域、および／または、配列番号２５から成る、もしくは本質的に成る重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体に関する。
【００８６】
本発明の抗体は、典型的には免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体である。ＩｇＧ抗体は、重鎖の定常領域のアミノ配列の違いに応じて、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の４つのアイソタイプに分類できる。本発明の抗体は、任意のＩｇＧアイソタイプに属し得る。
【００８７】
（核酸、ベクター、宿主細胞）
また、本発明は、上記で定義された抗体またはその断片をコードする複数の核酸、およびそのような核酸を含む複製もしくは発現ベクター、ならびに組換え宿主細胞に関する。
【００８８】
別の態様では、本発明は、本発明の抗体をコードする核酸分子、または前記コード配列に相補的な核酸に関する。好ましくは、当該核酸は、単離または精製された核酸である。
【００８９】
核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡもしくはｇＤＮＡ）、ＲＮＡ、またはそれらの混合物であり得る。それは、一本鎖型もしくは二本鎖型またはその２つの混合であり得る。それは、例えば、修飾された結合、修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基、または修飾された糖などを含む、修飾されたヌクレオチドを含むことができる。それは、化学合成、組換え、および突然変異誘発を含む、当業者に公知の任意の方法によって調製され得る。本発明に係る核酸を、本発明に係る抗体の配列から推定することができ、核酸が転写される宿主細胞に従ってコドン使用頻度を適合させることができる。これらの工程は、当業者に周知の方法に従って実行することができ、それらのいくつかは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等による参照マニュアル（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｄ．Ｒｕｓｓｅｌｌ編、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」、第３版、コールドスプリングハーバー社、２００１）に記載されている。
【００９０】
本発明の核酸は、前述の抗体の軽鎖を含むアミノ酸配列および／もしくは重鎖を含むアミノ酸配列をコードしてもよく、またはそのようなコード配列に相補的であってもよい。
【００９１】
そのような核酸配列の特定の例は、配列番号３、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４のいずれか、およびその相補的な配列を含む。
【００９２】
本発明はさらに、本発明の核酸を含むベクターを提供する。必要に応じて、ベクターは、本発明のいくつかの核酸を含み得る。特に、当該ベクターは、調節領域、すなわち１つ以上の制御配列を含む領域に作動可能に連結された本発明の核酸を含み得る。必要に応じて、当該ベクターは、いくつかの調節領域に作動可能に連結された本発明のいくつかの核酸を含み得る。
【００９３】
「制御配列」という用語は、コード領域の発現に必要な核酸配列を意味する。制御配列は、内因性または異種であり得る。周知の制御配列であり、当業者によって現在使用されているものが好ましい。そのような制御配列には、プロモーター、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターが含まれるが、これらに限定されない。
【００９４】
「作動可能に連結された」という用語は、制御配列がコード領域の発現を指示するように、制御配列がコード配列に対して適切な位置に配置される構成を意味する。
【００９５】
本発明はさらに、宿主細胞を形質転換、形質移入または形質導入するための、本発明に係る核酸またはベクターの使用に関する。
【００９６】
本発明はまた、本発明の１つもしくはいくつかの核酸および／または本発明の１つもしくはいくつかのベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００９７】
「宿主細胞」という用語はまた、複製中に生じる突然変異のために親宿主細胞と同一ではない親宿主細胞の任意の子孫を包含する。
【００９８】
抗体をコードしているベクターの複製または発現に適した宿主細胞には、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が含まれる。
【００９９】
例えば、特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要とされない場合、抗体は細菌において産生され得る。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号、および第５，８４０，５２３号明細書を参照されたい（また、Ｃｈａｒｌｔｏｎによる「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．  Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００３）、ｐｐ．２４５〜２５４の大腸菌における抗体断片の発現についての記載も参照）。発現後、抗体を、可溶性画分で細菌細胞溶解物から単離することができ、さらに精製することができる。
【０１００】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、グリコシル化経路が「ヒト化」されている真菌および酵母菌株を含む、抗体をコードするベクターにとって適切な複製または発現宿主であり、部分的なまたは完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体を産生する。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓによる「Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２２」、１４０９〜１４１４、２００４、およびＬｉ等による「Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２４」、２１０〜２１５、２００６を参照されたい。
【０１０１】
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が含まれる。特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質移入のために、昆虫細胞と組み合わせて使用できる多数のバキュロウイルス株が確認された。植物細胞培養物も宿主として利用できる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５，９７８号、および第６，４１７，４２９号明細書を参照されたい。
【０１０２】
脊椎動物細胞も宿主として使用できる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例には、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えば、グラハム等による「Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．」、３６：５９、１９７７に記載されているように２９３個または２９３細胞）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、メイザーによる「Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ２３」、２４３〜２５１、１９８０に記載されたＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２）、例えばメイザー等による「Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ３８３」、４４〜６８、１９８２に記載されたＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、およびＦＳ４細胞がある。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ等による「Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ」、７７：４２１６、１９８０）、およびＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２／０などの骨髄腫細胞株がある。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概観については、例えば、ＹａｚａｋｉおよびＷｕによる「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｖｏｌ．２４８（ＢＫＣ  Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）、ｐｐ．２５５〜２６８、２００３を参照されたい。
【０１０３】
本発明はまた、本発明の核酸または本発明のベクターを含む宿主細胞を、上記で提供されるように、抗体の発現に適した条件下で培養すること、および場合により当該宿主細胞または宿主細胞培養培地から前述の抗体を回収することを含む、本発明の抗体を産生する方法に関する。必要に応じて、回収された抗体はさらに精製または単離され得る。適切な培地、培養条件および産生方法は当業者に周知であり、宿主細胞および産生される抗体に従って容易に選択することができる。
【０１０４】
（検出、投与、診断の方法）
さらなる態様では、本発明は、上記で定義した抗体または断片を使用してヒトＰＬＡ２−ＧＩＢを検出するための方法に関する。この方法は、成熟分泌型（ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ）、プロ型（プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ）、および／または両方の型のヒトＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質の存在を検出するために使用または実施することができる。そのような方法または抗体は、試料中のＰＬＡ２−ＧＩＢの存在または量を検出または投与（または定量化）するため、およびそのプロ型および成熟分泌型の比率を評価するために使用され得る。当該方法は、ＰＬＡ２−ＧＩＢの活性に関連する対象の病態を検出または監視するのに特に有用である。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、当該方法は、ａ）試料を提供し、およびｂ）上記で定義した抗体または断片を使用して、試料中のヒトＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質について、成熟分泌型（ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ）、プロ型（プロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢ）および／もしくは両方の型の存在または量を検出する。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、前述の抗体として、１４Ｇ９、２４Ｂ２、２２Ｃ６、２８Ａ１、２８Ａ３、３４Ｇ３、２２Ｈ５および７Ｃ５、またはそれらの断片もしくは変異体から選択し、そして前述の方法により、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢの存在または量を検出することが可能である。
【０１０７】
別の特定の実施形態では、前述の抗体として、８Ｇ１１および１８Ｄ９、またはそれらの断片もしくは変異体から選択し、前述の方法により、プロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢの存在または量を検出することが可能である。
【０１０８】
別の特定の実施形態では、前述の抗体として、１Ｃ１１、７Ａ１０、３６Ｇ１０、３Ｂ２、１８Ａ６、１３Ｈ８、４Ｇ１１、７Ｈ１２および７Ｅ２、またはそれらの断片もしくは変異体から選択し、前述の方法により、ＰＬＡ２−ＧＩＢの総量を検出することが可能である。
【０１０９】
典型的には、検出工程ｂ）は、（ｉ）試料または試料の生物学的複製を、本明細書に記載のモノクローナル抗体またはその断片もしくは変異体のいずれかと接触させる工程、および（ｉｉ）工程（ｉ）で形成された抗体−抗原複合体の存在を検出する工程を含む。
【０１１０】
抗体−抗原複合体の存在の検出は、当業者にそれ自体周知であり、文献に広く記載されている任意の技術によって実施することができる。典型的には、検出は、好ましくは第１の捕捉抗体のエピトープとは異なるエピトープに結合する、ＰＬＡ２−ＧＩＢに対する第２の抗体を用いて行うことができる。あるいは、当該捕捉抗体に標識を付し、前述の検出工程で、典型的には未結合の抗体を除去した後に、反応中の標識された量を測定することを含み得る。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、本発明の抗体、変異体または断片の任意の組み合わせを使用して、試料中のヒトＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質について、成熟分泌型（ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ）、プロ型（プロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢ）および／または両方の型を別々に検出するように、当該試料を複製に分割する。
【０１１２】
より特定の実施形態では、当該試料を少なくとも２つの複製に分割し、１つの複製を、１４Ｇ９、２４Ｂ２、２２Ｃ６、２８Ａ１、２８Ａ３、３４Ｇ３、２２Ｈ５および７Ｃ５から選択した抗体、またはその断片もしくは変異体と接触させることにより、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢの存在または量の検出が可能であり、１つの複製を、８Ｇ１１および１８Ｄ９から選択した抗体、またはその断片もしくは変異体と接触させることにより、プロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢの存在または量の検出が可能である。
【０１１３】
より特定の実施形態では、当該試料を、さらなる複製に分割し、１Ｃ１１、７Ａ１０、３６Ｇ１０、３Ｂ２、１８Ａ６、１３Ｈ８、４Ｇ１１、７Ｈ１２および７Ｅ２から選択した抗体、またはその断片もしくはその変異体と接触させることにより、ＰＬＡ２−ＧＩＢの総量の検出が可能である。
【０１１４】
ある好ましい実施形態では、本方法は、１４Ｇ９またはその変異体もしくは断片をｓＰＬＡ２−ＧＩＢの存在または量の検出に、８Ｇ１１またはその変異体もしくは断片をプロ型ＰＬＡ２−ＧＩＢの存在または量の検出に、７Ａ１０またはその変異体もしくは断片を試料中のＰＬＡ２−ＧＩＢの総量の検出に、利用する。
【０１１５】
前述の抗体を、表面または粒子上に固定しても、しなくてもよい。反応は、マイクロプレートなどの任意の適切な支持体または容器で、チップ上、ボトル内などで行うことができる。
【０１１６】
好ましくは、検出工程（ｉｉ）では、例えば、レポーター基に結合され、または検出可能に操作された、標識抗体を利用し、より好ましくは、当該抗体をビオチン化する。より特定の実施形態では、前述の複合体を検出するために使用する抗体を、モノクローナル抗体１Ｃ１１、４Ｇ１１、７Ｈ１２および７Ｅ２、ならびにその変異体および断片から選択し、より好ましくは、ビオチン化抗体１Ｃ１１とする。
【０１１７】
前述の方法は、血清試料、血漿試料、全血、生物学的流体などの任意の生物学的試料のような任意の試料で使用することができる。より特定の実施形態では、上述の方法のいずれかにおいて使用する試料を、対象から得る。当該試料を、検出の前に、希釈、濃縮などにより処理してもよい。本発明の方法で使用する前に、凍結乾燥、滅菌、凍結などしてもよい。
【０１１８】
特定の実施形態では、この方法を、ＰＬＡ２−ＧＩＢのプロ型および成熟分泌型の比の評価に使用する。
【０１１９】
他の特定の実施形態では、上記方法を、ＰＬＡ２−ＧＩＢの活性に関連する対象の病態を監視するために使用することができる。ＰＬＡ２−ＧＩＢの活性に関連する病態の例には、例えば、ウイルス血症ＨＩＶ感染患者のＣＤ４Ｔリンパ球の不応答がある。
【０１２０】
さらなる態様では、本発明は、免疫反応もしくは抗体−抗原複合体を実施、検出または定量するための、本明細書に記載される少なくとも１つの抗体またはその断片、および試薬を含むキットに関する。
【０１２１】
本発明のさらなる態様および利点について、以下の実験の項で開示する。
【実施例】
【０１２２】
（材料および方法）
１−ヒト組換えプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質の産生
ヒトのプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢを、公開された手順（Ｓｉｎｇｅｒ等、２００２；Ｒｏｕａｕｌｔ等、２００７）に従って産生した。
【０１２３】
２−抗ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよび抗プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ抗体の生成
最初の一連の免疫を、組換えヒトｓＰＬＡ２および組換えヒトプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢでマウスを免疫することにより、行った。２回目の一連の免疫を、ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢプロペプチドに対応する１８個のアミノ酸ペプチド（配列ＮＨ２−ＤＳＧＩＳＰＲＡＶＷＱＦＲＫＭＩＫＣ−ＣＯＯＨ、配列番号６２）でマウスを免疫し、その後、成熟活性ｓＰＬＡ２−ＧＩＢの最初の１１個のアミノ酸（配列番号１のアミノ酸残基１６〜３３位を参照）で免疫することにより、行った。ｍＡｂを、プロテインＡ親和性により精製し、定量化した。ｍＡｂのＩｇ類を、製造元の指示に従って市販のマウスｍＡｂアイソタイピングキットで決定した。
【０１２４】
３−ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性の阻害
異なるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によるｓＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性の阻害を、公開された手順（Ｒｏｕａｕｌｔ等、２００７）に従って試験した。要するに、組換えヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢ（０．１ｎＭ）について、ハイブリドーマ細胞培養上清（データを示さない）の量を増やしながら、またはヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢを標的とする精製ウサギポリクローナル免疫血清もしくは精製モノクローナル抗体の量を増やしながら（０．１、０．３、１、および３μｇ）、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、［３Ｈ］−オレイン酸で放射標識し加圧滅菌した大腸菌の膜をｓＰＬＡ２−ＧＩＢ活性緩衝液のリン脂質基質として用いて、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性を測定した。３００μＬの停止緩衝液を加えて反応を停止後、混合物を１００００ｇで５分間遠心分離し、放出された［３Ｈ］−オレイン酸を含む上清を数えた。
【０１２５】
結果を、市販の蛍光酵素活性アッセイを使用して確認した。組換えヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢ（３ｎＭ）を、室温で１２０分間精製モノクローナル抗体を増加させながらインキュベートした。ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性を、その後、選択的蛍光測定法（ＡｔｅｒｏＤＸ（登録商標）ｓＰＬＡ２活性、Ａｔｅｒｏｖａｘ社、パリ、フランス）を用いて測定した。結果は、試料１ｍＬあたりのユニット（Ｕ／ｍＬ）で表され、１ユニットは、１分で１ｎｍｏｌの生成物の放出を触媒するｓＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素の量として定義される。アッセイの検出限界は１７Ｕ／ｍＬで、線形分析範囲の上限は２３２Ｕ／ｍＬ、機能感度（２０％）は２１Ｕ／ｍＬである。平均実行内変動および平均アッセイ内変動はそれぞれ、５．９％および８．９％である。両方法の結果を、Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ）を使用した４パラメーターフィット分析で分析し、ＩＣ５０として報告した。
【０１２６】
４−間接ＥＬＩＳＡ
マイクロプレートウェルを、通常、一晩４℃、ｐＨ７．５のＰＢＳ中で１００ｎｇの組換えヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢにより、コーティングした。試料ウェルを０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。最終洗浄後、試料ウェルをＰＢＳ緩衝液中で１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むブロッキング溶液により室温で６０分間処理した。０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳで洗浄後、ヒトのプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対して、ｍＡｂを（１０ｎｇ／ｍＬから最大３μｇ／ｍＬまで）増量しながら抗原がコーティングされたウェルに加え、室温で１２０分間インキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳで洗浄した後、ＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＡポリクローナル抗体試薬でｍＡｂの結合を検出し、比色基質を使用して現像した。溶液中の抗原濃度に対するシグナルの依存性を、Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ）を使用した４パラメーターフィット分析で分析し、ＥＣ５０として報告した。
【０１２７】
５−競合ＥＬＩＳＡ
プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対する抗体の結合親和性を、プレートベースの競合免疫測定法によって測定した。競合ＥＬＩＳＡのために、要するに、様々なレベルの抗体の一定量を、抗原タンパク質であるヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢの０〜１０μｇ／ｍｌの範囲の連続希釈物と予備混合し、室温で２時間インキュベートし、抗体および抗原の間の擬似結合平衡に到達させた。これらの溶液を、次いで、９６ウェルのｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢを予めコーティングしたプレートに移し、混合物中の遊離抗体をプレートにコーティングしたｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢに結合させた。プレートは、通常、一晩４℃のＰＢＳ溶液中で３０〜１００ｎｇのヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質でコーティングをし、続いてＢＳＡ非特異的ブロッキングを行った。溶液中の過剰な抗体を洗い流した後、プレート結合抗体をＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＡポリクローナル抗体試薬で検出し、比色基質を使用して現像した。溶液中の抗原濃度に対するシグナルの依存性を、Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ）を使用した４パラメーターフィット分析で分析し、ＩＣ５０として報告した。
【０１２８】
６−ＳＰＲによる親和性の決定
上記の選択した抗体へのプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢの結合の親和定数（ＫＤ）を、リアルタイムバイオセンサー表面プラズモン共鳴アッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））での表面速度論により決定した。より具体的には、ヒトプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対する前述の抗体の親和性をＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００を用いて測定した。前述の抗体を抗マウスＩｇＧ表面上で捕捉し、様々な濃度の組換えプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質に曝露した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用した速度論的分析を行って、会合および解離速度定数を求めた。
【０１２９】
７−エピトープマッピングおよびｍＡｂ競合
マイクロプレートウェルを、通常、一晩４℃、ｐＨ７．５のＰＢＳ中で１０ｎｇの組換えヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢにより、コーティングした。試料ウェルを０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。最終洗浄後、試料ウェルをＰＢＳ緩衝液中で１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むブロッキング溶液により室温で６０分間処理した。０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳで洗浄後、ビオチン化ｍＡｂ（＃１４Ｇ９、＃１Ｃ１１、＃８Ｇ１１または＃７Ａ１０）１０ｎｇを１μｇの非ビオチン化ｍＡｂの存在下で抗原がコーティングされたウェルに添加し、室温で１２０分間インキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳで洗浄後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ共役体でｍＡｂの結合を検出し、比色基質を使用して現像した。
【０１３０】
８−ｍＡｂ可変領域の配列化
ｍＡｂｓの可変領域を、古典的な手順に従って配列化した。要するに、ハイブリドーマ細胞から高純度のＲＮＡを抽出し、高忠実度の逆転写酵素を使用して相補的なＤＮＡ鎖を合成した。高忠実度ＰＣＲを使用して生成されたＰＣＲ産物と、抗体重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡを特異的にターゲットする縮重プライマーを直接配列化（二重鎖配列化）した。ｃＤＮＡ配列を分析し、組み立てた。ペプチド配列を、抗体の構造に応じて翻訳し検証した。
【０１３１】
９−ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢサンドイッチＥＬＩＳＡの開発
上記のｍＡｂを使用することにより、プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたは両方の型に特化したサンドイッチＥＬＩＳＡを構築した。プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ検出のため、＃８Ｇ１１ｍＡｂを捕捉抗体として使用し、＃１Ｃ１１ｍＡｂを曝露ｍＡｂとして使用した。ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ検出のため、＃１４Ｇ９ｍＡｂを捕捉抗体として使用し、＃１Ｃ１１ｍＡｂを曝露ｍＡｂとして使用した。両方の型を検出するために、＃７Ａ１０ｍＡｂを捕捉抗体として使用し、＃１Ｃ１１ｍＡｂを曝露ｍＡｂとして使用した。マイクロプレートの性質、ウェルの最終容量、インキュベートの時間と温度、ストレプトアビジン−ＨＲＰの性質と濃度、アッセイ緩衝液の組成、添加した界面活性剤の性質と濃度などのさまざまなパラメータを検討して、アッセイを最適化した。典型的なアッセイ条件は次のとおりである。すなわち、＃８Ｇ１１または＃１４Ｇ９がコーティングされたマイクロプレートを、組換えヒトプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはｓＰＬＡ２−ＧＩＢ標準（アッセイ緩衝液中のタンパク質濃度が様々である）と１時間インキュベートして、較正曲線を作成した。ＥＤＴＡ血漿試料を希釈緩衝液でそれぞれのウェルに希釈（５〜５０倍）し、ＥＬＩＳＡプレートを室温で１時間インキュベートした。吸引後、ウェルを０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、ビオチン化＃１Ｃ１１共役体を室温で３０分間ウェルに添加した。０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳで洗浄した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ共役体により室温で１５分間処理することにより、ｍＡｂの結合を検出した。ＴＭＢを加え、反応を停止し、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでの吸光度を決定した。Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ）を使用して、４パラメーターフィット分析でシグナルを分析した。
【０１３２】
１０−ヒト血漿試料中のｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ濃度の測定
年齢、性別、ボディマス指数（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  ＩＶＴ社）が既知の明らかに健康な９９人のドナーからなる商業コホートのＥＤＴＡ血漿試料を、上記で開発した条件によるプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ、および両方の型（総ＰＬＡ２−ＧＩＢ）を検出する３つの異なるＥＬＩＳＡアッセイで試験した。パラメータ間の相関を、ノンパラメトリック検定（Ｒ．  Ｓｐｅａｒｍａｎ）を使用して評価した。
【０１３３】
（結果）
（抗ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ抗体および抗プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ抗体の生成）
モノクローナル抗体を、組換えヒトプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ、組換えヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢプロペプチドに対応する１８アミノ酸ペプチドおよびその後の成熟活性ｓＰＬＡ２−ＧＩＢの最初の１１アミノ酸でマウスを免疫することによって産生した。各サブクローンの生成に使用した抗原を表１に示す。
【０１３４】
（ｓＰＬＡ２酵素活性の阻害による抗体のスクリーニング）
異なるｍＡｂのｓＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性を阻害する能力について、精製モノクローナル抗体を増量させながら、放射標識された膜を組み換えヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢでインキュベートすることによって試験した。結果を、試験した最高濃度のｍＡｂで観察された酵素活性の阻害率として表し、表１に示す。
【０１３５】
（間接ＥＬＩＳＡによる抗体の比較）
異なるｍＡｂについて、間接的ＥＬＩＳＡ法において、ヒトのｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢによりマイクロプレートをコーティングし、結合したｍＡｂをＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体試薬により検出することによって、比較した。典型的なシグナル曲線の例を図２に示し、それらのプロファイルから推定したＥＣ５０を表１に示す。
【０１３６】
（競合ＥＬＩＳＡによる抗体の親和性決定）
ヒトプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびヒトｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対する抗体の結合親和性について、それぞれ、プレートベースの競合免疫測定法によって測定した。要するに、様々なレベルの抗体の一定量を、抗原タンパク質の連続希釈物と予備混合し、抗体と抗原の間の擬似結合平衡に到達させた。これらの溶液を、次いで、抗原を予めコーティングしたプレートに移し、混合物中の遊離抗体をプレートにコーティングしたｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢに結合させた。プレート結合抗体をＨＲＰ共役ポリクローナル抗体試薬で検出した。滴定曲線の例を図３に示す。データを４ＰＬロジスティック非線形回帰モデルでフィッティングし、当該モデルから相対ＩＣ５０値を推定した（表２）。
【０１３７】
（ＳＰＲによる抗体の親和性測定）
上記の選択した抗体へのプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢの結合の親和定数（ＫＤ）を、リアルタイムバイオセンサー表面プラズモン共鳴アッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））での表面速度論により決定した。より具体的には、ヒトプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対する前述の抗体の親和性をＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００を用いて測定した。前述の抗体を抗マウスＩｇＧ表面上で捕捉し、様々な濃度の組換えプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質に曝露した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用した速度論的分析を行って、会合および解離速度定数を求めた（表３）。
【０１３８】
（エピトープマッピングおよびｍＡｂ競合）
＃１４Ｇ９、＃１Ｃ１１、＃８Ｇ１１、および＃７Ａ１０ｍＡｂのエピトープマッピングを競合ＥＬＩＳＡで評価した。ビオチン化ｍＡｂである＃１４Ｇ９、＃１Ｃ１１、＃８Ｇ１１または＃７Ａ１０を、過剰な非ビオチン化ｍＡｂの存在下で、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢをコーティングしたプレートに添加した。その後、結合したｍＡｂをストレプトアビジン−ＨＲＰ共役体で検出した。結果を、自己競合を差し引いた後のシグナルのパーセンテージとして表し、０％は最大競合、１００％は競合が無いことを表す（表４）。
【０１３９】
（可変領域の配列化）
本発明の抗体の軽鎖および重鎖の可変領域のアミノ酸および核酸配列を決定し、配列表に提示している。
【０１４０】
（サンドイッチＥＬＩＳＡによるプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたは両方の型の検出）
プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたは両方の型に特化したサンドイッチＥＬＩＳＡを、適合するｍＡｂのペアを用いて開発した（表５を参照）。チモーゲン不活性型酵素を特異的に捕捉するため＃８Ｇ１１ｍＡｂを使用し、成熟型酵素を捕捉するため成熟型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢに非常に特異なｍＡｂとして＃１４Ｇ９サブクローンを使用し、両方の型を捕捉するため＃７Ａ１０ｍＡｂを使用した。高親和性＃１Ｃ１１サブクローンのビオチン化共役体を使用して、捕捉した抗原を検出した。異なるアッセイ条件を最適化し、３つの異なるサンドイッチＥＬＩＳＡの分析性能を評価した。それぞれ、プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよび両方の型に特化したものである。これら３つの異なるアッセイの分析性能の概要を表５に示す。
【０１４１】
アッセイの精度について、２つのヒト血清試料にプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはｓＰＬＡ２−ＧＩＢを添加して試験した。３つのアッセイでの回収率は８０％から１２０％であり、マトリックスの効果が限定的であることを示す。検出のアッセイ限界について、ゼロキャリブレーターからの平均＋３ＳＤ評価に基づいて推定し、プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたは両方の型において、それぞれ０．１ｎｇ／ｍＬ、０．０２ｎｇ／ｍＬ、０．１０ｎｇ／ｍｌと決定した。ヒト血清試料は、内因的な量のプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢを含むので、下限の定量化を試験する前に、まず、＃８Ｇ１１または＃１４Ｇ９ｍＡｂでヒト血清試料を枯渇させた。ＬＬＯＱについて、枯渇したヒト血清の平均光学密度に基づいて、プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ、または両方の型のアッセイにおいて、それぞれ０．０４ｎｇ／ｍＬ、０．０２ｎｇ／ｍＬ、０．０８ｎｇ／ｍＬと推定した。ＨＬＯＱについて、組換えプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたはｓＰＬＡ２−ＧＩＢを増量して添加した試料の評価に基づいて、プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ、または両方の型のアッセイにおいて、それぞれ５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍＬまたは５ｎｇ／ｍＬと決定した。実行内および実行間ＣＶ（アッセイ精度）について、ダイナミックレンジ全体に分布する３つのヒト血清を繰り返し試験することによって決定した。実行内および実行間ＣＶは、２．３％〜１４．５％間の範囲であることが判明した（詳細は表５を参照）。３つの異なるアッセイで、高リウマチ因子レベル（最大６００ＵＩ／ｍＬ）の６つのヒト試料を試験したところ、有意な干渉は観察されなかった。アッセイの直線性について、連続的に希釈した高レベルの試料を試験することによって決定した。回収の平均％は８０％および１２０％の間であり、３つのアッセイで良好な直線性を示した。
【０１４２】
（ヒト血漿試料中のプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたは両方の型の濃度測定）
上記のＥＬＩＳＡサンドイッチ法を使用して、２５〜５９歳の臨床的に適切な年齢範囲内の５０人の明らかに健康な男性および４９人の明らかに健康な女性からの合計９９試料で、年齢、性別、およびボディマス指数（ＢＭＩ）によるプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびｓＰＬＡ２−ＧＩＢ分布を調べた。この集団の平均（標準偏差ＳＤ）年齢は４１．５（９．８）歳で、平均（ＳＤ）ＢＭＩは３０．５（７．９）であった。
【０１４３】
分析した母集団全体で、プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢレベルは、１．０〜１６．３ｎｇ／ｍＬの範囲であった。平均（ＳＤ）のプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢレベルは、７．８（２．８）ｎｇ／ｍＬ、中央値は７．５ｎｇ／ｍＬであった。ｓＰＬＡ２−ＧＩＢのレベルは、２５ｐｇ／ｍＬ〜１．３ｎｇ／ｍＬ、および平均（ＳＤ）は、２８７（２４３）ｐｇ／ｍＬ、中央値は２３１ｐｇ／ｍＬであった。総ｓＰＬＡ２−ＧＩＢレベルは、２．５〜２０．５ｎｇ／ｍＬの範囲で、平均（ＳＤ）は、９．３（３．２）ｎｇ／ｍＬ、中央値は９．１ｎｇ／ｍＬであった。
【０１４４】
患者特性を表６に提示し、性別および年齢によるパーセンタイル分布、およびプロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ、両方の型（総量）レベルの平均（ＳＤ）を表７に示す。表６に示されるように、プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢまたは両方の型のレベルおよび性別、年齢、もしくはＢＭＩの間の相関は、試験した母集団内では観察されなかった。
【０１４５】
プロ型ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよび総ｓＰＬＡ２−ＧＩＢレベルは強く相関し（スピアマンＲ＝０．９３８、ｐ＜０．０００１）、一方、プロ型ｓＰＬＡ２およびｓＰＬＡ２−ＧＩＢレベルは弱くしか相関しなかった（スピアマンＲ＝０．３１８、ｐ＝０．００２）。
【０１４６】
（ｓＰＬＡ２−ＩＢによるリン酸化ＳＴＡＴ５の核移行の阻害に対する＃１４Ｇ９ｍＡｂの生体内効果）
ＣＤ４Ｔ細胞中でのＩＬ−７誘導リン酸化ＳＴＡＴ５の核移行に対するｓＰＬＡ２−ＩＢ注入の阻害効果を生体内で相殺する＃１４Ｇ９ｍＡｂの能力について試験し、マウスに最初、１ｍｇの＃１４Ｇ９ｍＡｂを注入し、その後、１００μｇのｓＰＬＡ２−ＧＩＢを注入した。処置されたマウスの脾細胞から単離されたＣＤ４Ｔ細胞におけるリン酸化ＳＴＡＴ５の核移行を、その後、共焦点顕微鏡によって分析した。
【０１４７】
図４に示すように、マウスに１００μｇのｓＰＬＡ２−ＧＩＢを注入すると、脾細胞から分離されたＣＤ４Ｔ細胞中のリン酸化ＳＴＡＴ５の核移行が６０％阻害された。この効果は、先に１ｍｇの＃１４Ｇ９ｍＡｂを注入することによって完全に無効になったが、対照の注入では有意な効果は観察されなかった。
【０１４８】
（エピトープの定義）
ヒト化型＃１４Ｇ９の抗原結合性（Ｆａｂ）断片をその抗原と一緒に共結晶化し、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢおよびその共結晶のＸ線回折データをソレイユ  シンクロトロン（サン・トーバン、フランス）のＰＲＯＸＩＭＡ−１ビームラインで収集した。結晶は、非対称ユニットごとに２つのｓＰＬＡ２−ＧＩＢ／Ｆａｂ複合体を持つＰ２１空間グループ（ａ＝７１．９Å、ｂ＝８３．８Å、ｃ＝１０３．９Å；α＝β＝９９．５８°）に属する。ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ／Ｆａｂ複合体構造の解明により、複合体における非共有相互作用に関与する重要な残基の同定およびエピトープの定義が可能になった。図５に示すように、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢにおいて、Ｗ３、Ｒ６、およびＫ７は、抗原結合性軽鎖との相互作用に関与し、Ｋ１０、Ｃ７７、Ｙ７５、Ｇ７９およびＳ８０は、抗原結合性重鎖との相互作用に関与する。
【０１４９】
（配列リスト）
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【０１５０】
【表１】
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【０１５１】
【表２】
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【０１５２】
【表３】
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ｎ．ｄ．：不検出．ｔ1/2：半減期定数（＝１／ｋｏｆｆ）． 
【０１５３】
【表４】
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【０１５４】
【表５】
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【０１５５】
【表６】
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【０１５６】
【表７】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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