(57)【要約】  病態部位に移動する免疫細胞の能力に基づく超高感度疾患検出に有用な細胞ベースのインビボセンサーの新しいクラスを提供する遺伝子修飾免疫細胞の実施形態が本明細書に記載される。本細胞ベースのセンサーは、癌の早期検出のためのアプローチを提供し、癌を含むがこれに限定されない多様な疾患状態のモニタリングにおける改変免疫細胞の使用を可能にする。
2021514619.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種核酸を含む遺伝子修飾免疫細胞であって、前記遺伝子修飾免疫細胞を受容する動物またはヒト対象における病的状態によって誘導される代謝または分子発現変化に応答して検出可能な薬剤を発現するように構成されている、遺伝子修飾免疫細胞。
【請求項２】
前記遺伝子修飾免疫細胞が、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄細胞、幹細胞、または樹状細胞である、請求項１に記載の遺伝子修飾免疫細胞。
【請求項３】
前記異種核酸が、検出可能な薬剤をコードする核酸配列に作動可能に連結された遺伝子発現調節領域を含み、前記遺伝子発現調節領域が、病態特異的代謝変化に応答して前記検出可能な薬剤の発現を誘導する、請求項１に記載の遺伝子修飾免疫細胞。
【請求項４】
前記異種核酸が核酸ベクターである、請求項１に記載の遺伝子修飾免疫細胞。
【請求項５】
前記異種核酸がプラスミドである、請求項４に記載の遺伝子修飾免疫細胞。
【請求項６】
前記遺伝子発現調節領域が遺伝子プロモーター領域を含む、請求項１に記載の遺伝子修飾免疫細胞。
【請求項７】
前記遺伝子発現調節領域が遺伝子特異的エンハンサーをさらに含む、請求項６に記載の遺伝子修飾免疫細胞。
【請求項８】
前記遺伝子プロモーターが、ＡＲＧ１プロモーター、ＡＫＴ１プロモーター、バーシカンプロモーター、ＭＩＦプロモーター、Ｙｍ１プロモーター、ＣＤ２０６プロモーター、ＦＩＺＺ１プロモーター、ＤＣ−ＳＩＧＮプロモーター、ＣＤ２０９、プロモーター、ＭＧＬ−１プロモーター、デクチン−１プロモーター、ＣＤ２３プロモーター、ガレクチン−３プロモーター、Ｍｅｒチロシンキナーゼプロモーター、ＡＸＬ受容体タンパク質プロモーター、ＧＡＳ−６プロモーター、ＮＯＳ−２プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、ＣＤ８６プロモーター、ＣＣＬ１８プロモーター、ＣＤ１６３プロモーター、ＭＭＲ／ＣＤ２０６プロモーター、ＣＤ２００Ｒプロモーター、ＴＧＭ２プロモーター、ＤｅｃｏｙＲプロモーター、ＩＬ−１ＲＩＩプロモーター、ＩＬ−１０プロモーター、ＴＧＦ−ベータプロモーター、ＩＬ−１ｒａプロモーター、ＣＣＬ１７プロモーター、ＣＣＬ２プロモーター、またはＣＣＬ２４プロモーターである、請求項６に記載の遺伝子修飾免疫細胞。
【請求項９】
前記検出可能な薬剤が、検出可能なポリペプチドまたは分泌可能な核酸である、請求項１に記載の遺伝子修飾免疫細胞。
【請求項１０】
前記検出可能なポリペプチドが、造影剤、レポーター遺伝子に相補的な結合剤、検出可能な分子を生成する酵素、光音響レポーター、生物発光レポーター、自己蛍光レポーター、化学発光レポーター、発光レポーター、または比色レポーター、非侵襲的イメージングによって検出することができる薬剤、または検出可能な分子の蓄積を促進するトランスポーターである、請求項９に記載の遺伝子修飾免疫細胞。
【請求項１１】
前記検出可能な薬剤が分泌可能な核酸であり、前記分泌可能な核酸が、ＲＴ−ＱＰＣＲ、ＱＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、シーケンシング、または質量分析によって検出可能な構造化ＲＮＡまたは合成ｍｉＲＮＡである、請求項９に記載の遺伝子修飾免疫細胞。
【請求項１２】
前記検出可能なポリペプチドがフェリチンである、請求項１０に記載の遺伝子修飾免疫細胞。
【請求項１３】
前記検出可能なポリペプチドがガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）である、請求項１０に記載の遺伝子修飾免疫細胞。
【請求項１４】
前記検出可能なポリペプチドがＨＳＶ１−ｔｋである、請求項１０に記載の遺伝子修飾免疫細胞。
【請求項１５】
前記検出可能なポリペプチドがドーパミンＤ２受容体のＤ８０ＲＡ変異体である、請求項１０に記載の遺伝子修飾免疫細胞。
【請求項１６】
前記検出可能なポリペプチドがヒトヨウ化ナトリウムシンポーター（ｈＮＩＳ）である、請求項１０に記載の遺伝子修飾免疫細胞。
【請求項１７】
前記異種核酸が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１に記載の遺伝子修飾免疫細胞。
【請求項１８】
前記異種核酸が前記検出可能な薬剤をコードする、請求項１に記載の遺伝子修飾免疫細胞。
【請求項１９】
前記遺伝子修飾免疫細胞における腫瘍特異的代謝変化に応答して、前記遺伝子発現調節領域が前記検出可能な薬剤の発現を誘導する、請求項３に記載の遺伝子修飾免疫細胞。
【請求項２０】
前記遺伝子修飾免疫細胞における前記腫瘍特異的代謝変化が、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、肺癌、黒色腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、子宮頸癌、甲状腺癌、胃癌、脳幹神経膠腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、膠芽腫、上衣腫、ユーイング病肉腫ファミリー腫瘍、胚細胞腫瘍、頭蓋外癌、ホジキン病白血病、肝癌、髄芽腫、神経芽細胞腫、脳腫瘍、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、松果体腫瘍、視経路および視床下部膠腫、ウィルムス腫瘍、食道癌、有毛細胞白血病、腎臓癌、口腔癌、膵臓癌、皮膚癌、ならびに小細胞肺癌からなる群より選択される癌によって誘導される、請求項１９に記載の遺伝子修飾免疫細胞。
【請求項２１】
前記遺伝子修飾免疫細胞における前記病態特異的代謝変化が炎症によるものである、請求項３に記載の遺伝子修飾免疫細胞。
【請求項２２】
遺伝子修飾免疫細胞を生成する方法であって、
（ａ）ヒトまたは動物対象から病態応答性免疫細胞の集団を単離するステップと、
（ｂ）（ａ）で単離された病理応答性免疫細胞の単離された集団の病態応答性免疫細胞を異種核酸で形質転換して、前記遺伝子修飾免疫細胞を得るステップであって、前記異種核酸は検出可能な薬剤をコードし、前記遺伝子修飾免疫細胞は、前記遺伝子修飾免疫細胞を受容する動物またはヒト対象における病的状態によって誘導される代謝変化に応答して前記検出可能な薬剤を発現するように構成されているステップと、を含む、方法。
【請求項２３】
前記病態応答性免疫細胞が腫瘍応答性免疫細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記腫瘍応答性免疫細胞がマクロファージである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
動物またはヒト対象の病的状態を検出する方法であって、
請求項１〜２１のいずれかに記載の遺伝子修飾免疫細胞の集団を含む薬学的に許容される組成物を対象に投与するステップと、
前記動物またはヒト対象から生体液サンプルを得るステップと、
前記分泌可能な検出可能な薬剤の存在を前記生体液サンプル中で検出するステップと、を含み、前記存在は、前記動物またはヒト患者の病的状態との接触時に前記遺伝子修飾免疫細胞の表現型変化を誘導する病的状態を有することを示す、方法。
【請求項２６】
前記遺伝子修飾免疫細胞が腫瘍応答性マクロファージである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記病的状態が癌である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記病的状態が腫瘍である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法が、
前記病的状態に隣接するかまたは付着する病態応答性免疫細胞中の前記検出可能な薬剤からのシグナルを検出するステップと、
前記対象に対する前記検出可能なシグナルの画像を生成するステップと、
前記対象における局在化されたシグナルの位置を決定するステップと、をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記生体液が血液である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
ある量の前記検出可能な薬剤が、前記動物またはヒト患者の病的状態に隣接するかまたは付着する前記遺伝子修飾免疫細胞によって分泌されない場合に、前記方法を実施することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
キットであって、
骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）単離のための装置と、
アルギナーゼ−１（Ａｒｇ−１）プロモーターに作動可能に連結された検出可能な薬剤をコードするプラスミドのエンドトキシン不含調製物と、を含むキット。
【請求項３３】
対象の病的状態を特定するための方法であって、
（ａ）検出可能な薬剤をコードする核酸配列を有する異種核酸を含む遺伝子修飾免疫細胞を前記対象に投与することであって、前記遺伝子修飾免疫細胞は、前記対象における病的状態によって誘導される代謝変化に応答して前記検出可能な薬剤を発現することと、
（ｂ）前記対象における前記検出可能な薬剤を検出して、前記病的状態を特定することと、を含む方法。
【請求項３４】
前記遺伝子修飾免疫細胞における腫瘍特異的代謝変化に応答するとき、前記遺伝子発現調節領域が前記検出可能な薬剤の発現を誘導する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記遺伝子修飾免疫細胞における前記腫瘍特異的代謝変化が、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、肺癌、黒色腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、子宮頸癌、甲状腺癌、胃癌、脳幹神経膠腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫、膠芽腫、上衣腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、胚細胞腫瘍、頭蓋外癌、ホジキン病白血病、肝癌、髄芽腫、神経芽腫、脳腫瘍、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、松果体腫瘍、視経路および視床下部膠腫、ウィルムス腫瘍、食道癌、有毛細胞白血病、腎臓癌、口腔癌、膵臓癌、皮膚癌、ならびに小細胞肺癌からなる群から選択される癌によって誘導される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記遺伝子修飾免疫細胞における前記病態特異的代謝変化が炎症によるものである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記異種核酸が複数の異なる遺伝子発現調節領域を含み、各調節領域が多種類の検出可能な薬剤をコードする複数の核酸配列に作動可能に連結されており、前記遺伝子発現調節領域が、病態特異的代謝変化に応答して、前記検出可能な薬剤の発現を誘導し、その各前記検出可能な薬剤のレベルは、前記対象の異なる状態の指標である、請求項１に記載の遺伝子修飾免疫細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年２月２７日に出願された「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ」と題する米国仮特許出願第６２／６３５，６６４号、および２０１９年１月１８日に出願された「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ」と題する米国仮特許出願第６２／７９４，０１１号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府支援の研究または開発に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所により授与された契約ＧＭ００７３６５に基づく政府支援によって実施された。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本願には、２０１９年２月１３日に作成された「２２１９０７２４３０＿ＳＴ２５」と題するＡＳＣＩＩ．ｔｘｔファイルとして電子形式で提出された配列表が含まれる。配列表の内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０００４】
本開示は、一般に、遺伝子改変免疫細胞を含む腫瘍または他の疾患特異的プローブに関する。本開示はまた、概して、プローブを作製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
原発性疾患と再発の早期発見は、世界的な癌の負担を大幅に軽減するための有望な手段である。これまでのところ、ほとんどの早期検出の取り組みは、病状に特徴的な内因性バイオマーカーの検出に依存してきた。例えば、癌では、タンパク質、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、無細胞循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、癌由来のエキソソーム、腫瘍を含む血小板、およびマイクロＲＮＡなどのバイオマーカーが多くの研究の対象となっている。内因性バイオマーカーは、初期の疾患検出努力の最前線にあるが、多くは、疾患管理に影響を与えるために必要な感度と特異性を欠いている。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、もともと患者から単離されていてもまたは単離されていなくてもよい、新規の改変された（遺伝子修飾された）マクロファージ細胞の実施形態を包含する。遺伝子修飾は、検出可能なポリペプチドをコードする遺伝子発現カセット、またはｍｉＲＮＡなどの核酸の細胞への導入であり、腫瘍または疾患特異的な代謝因子によって誘導可能な遺伝子プロモーター／エンハンサーの発現制御下にある。
【０００７】
したがって、本開示の一態様は、遺伝子修飾免疫細胞を受けた動物またはヒト対象における病的状態によって誘導される代謝または分子発現変化に応答して検出可能な薬剤を発現するように構成された異種核酸を含む遺伝子修飾免疫細胞の実施形態を包含する。
【０００８】
本開示のこの態様のある実施形態では、遺伝子修飾免疫細胞は、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄細胞、幹細胞、または樹状細胞であってもよい。
【０００９】
本開示のこの態様のある実施形態では、異種核酸は、検出可能な薬剤をコードする核酸配列に作動可能に連結された遺伝子発現調節領域を含む少なくとも１つの遺伝子発現カセットを含んでもよく、遺伝子発現調節領域は、検出可能な薬剤の発現を誘導するために、遺伝子修飾免疫細胞における病態特異的代謝変化に応答性であってもよい。
【００１０】
本開示のこの態様のある実施形態では、異種核酸は、核酸ベクターであってもよい。
【００１１】
本開示のこの態様のある実施形態では、異種核酸はプラスミドであってもよい。
【００１２】
本開示のこの態様のある実施形態では、遺伝子発現調節領域は、遺伝子プロモーター領域を含むことができる。
【００１３】
本開示のこの態様のある実施形態では、遺伝子発現調節領域は、遺伝子特異的エンハンサーをさらに含むことができる。
【００１４】
本開示のこの態様のある実施形態では、遺伝子プロモーターは、ＡＲＧ１プロモーター、ＡＫＴ１プロモーター、バーシカンプロモーター、ＭＩＦプロモーター、Ｙｍ１プロモーター、ＣＤ２０６プロモーター、ＦＩＺＺ１プロモーター、ＤＣ−ＳＩＧＮプロモーター、ＣＤ２０９プロモーター、ＭＧＬ−１プロモーター、デクチン−１プロモーター、ＣＤ２３プロモーター、ガレクチン−３プロモーター、Ｍｅｒチロシンキナーゼプロモーター、ＡＸＬ受容体タンパク質プロモーター、ＧＡＳ−６プロモーター、ＮＯＳ−２プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、ＣＤ８６プロモーター、ＣＣＬ１８プロモーター、ＣＤ１６３プロモーター、ＭＭＲ／ＣＤ２０６プロモーター、ＣＤ２００Ｒプロモーター、ＴＧＭ２プロモーター、ＤｅｃｏｙＲプロモーター、ＩＬ−１Ｒ  ＩＩプロモーター、ＩＬ−１０プロモーター、ＴＧＦ−ベータプロモーター、ＩＬ−１ｒａプロモーター、ＣＣＬ１７プロモーター、ＣＣＬ２プロモーター、またはＣＣＬ２４プロモーターであってもよい。
【００１５】
本開示のこの態様のある実施形態では、検出可能な薬剤は、検出可能なポリペプチドまたは分泌可能な核酸であってもよい。
【００１６】
本開示のこの態様のある実施形態では、検出可能なポリペプチドは、造影剤、レポーター遺伝子に相補的な結合剤、検出可能な分子を生成する酵素、光音響レポーター、生物発光レポーター、自己蛍光レポーター、化学発光レポーター、発光レポーター、または比色レポーター、非侵襲的イメージングによって検出することができる薬剤、または検出可能な分子の蓄積を促進するトランスポーターであってもよい。
【００１７】
本開示のこの態様のある実施形態では、検出可能な薬剤は、分泌可能な核酸であってもよい。
【００１８】
本開示のこの態様のある実施形態では、分泌可能な核酸は、ＲＴ−ＱＰＣＲ、ＱＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、配列決定、または質量分析によって検出可能な構造化ＲＮＡまたは合成ｍｉＲＮＡであってもよい。
【００１９】
本開示のこの態様のある実施形態では、検出可能なポリペプチドはガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）であってもよい。
【００２０】
本開示のこの態様のある実施形態では、検出可能なポリペプチドはフェリチンであってもよい。
【００２１】
本開示のこの態様のある実施形態では、検出可能なポリペプチドは、ＨＳＶ１−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ｔｋ）であってもよい。
【００２２】
本開示のこの態様のある実施形態では、検出可能なポリペプチドは、ドーパミンＤ２受容体のＤ８０ＲＡ変異体であってもよい。
【００２３】
本開示のこの態様のある実施形態では、検出可能なポリペプチドは、ヒトヨウ化ナトリウムシンポーター（ｈＮＩＳ）であってもよい。
【００２４】
本開示のこの態様のある実施形態では、異種核酸は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有することができる。
【００２５】
本開示のこの態様のある実施形態では、遺伝子発現調節領域は、遺伝子修飾免疫細胞における腫瘍特異的代謝変化に応答して、検出可能な薬剤の発現を誘導することができる。
【００２６】
本開示のこの態様のある実施形態では、遺伝子修飾免疫細胞における腫瘍特異的代謝変化は、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、肺癌、黒色腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、子宮頸癌、甲状腺癌、胃癌、脳幹神経膠腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫、膠芽腫、上衣腫、ユーイング肉腫の家族腫瘍、胚細胞腫瘍、頭蓋外癌、ホジキン病白血病、肝癌、髄芽腫、神経芽腫、脳腫瘍、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、松果体腫瘍、視経路および視床下部膠腫、ウィルムス腫瘍、食道癌、有毛細胞白血病、腎臓癌、口腔癌、膵臓癌、皮膚癌、ならびに小細胞肺癌からなる群より選択される癌によって誘導される。
【００２７】
本開示のある実施形態では、遺伝子修飾免疫細胞における病態特異的代謝変化は、炎症由来であってもよい。
【００２８】
ある実施形態では、異種核酸は、複数の異なる遺伝子発現調節領域を含むことができ、各調節領域は、多種類の検出可能な薬剤をコードする複数の核酸配列に作動可能に連結され、遺伝子発現調節領域は、検出可能な作用物質の発現を誘導するための病態特異的代謝変化に応答し、各検出可能な作用物質のレベルは、対象の異なる状態の指標である。
【００２９】
本開示の別の態様は、遺伝子修飾免疫細胞を生成する方法であって、
（ａ）対象から病理応答性免疫細胞の集団を単離するステップと
（ｂ）（ａ）で単離された病理応答性免疫細胞の単離された集団の病理応答性免疫細胞を異種核酸で形質転換して、遺伝子修飾免疫細胞を得るステップであって、異種核酸は検出可能な薬剤をコードし、遺伝子修飾免疫細胞は、遺伝子修飾免疫細胞を受容する動物またはヒト対象における病的状態によって誘導される代謝変化に応答して検出可能な薬剤を発現するように構成されているステップと、を含む方法の実施形態を含む。
【００３０】
本開示のこの態様のある実施形態では、病変は腫瘍であってもよい。
【００３１】
本開示のこの態様のある実施形態では、腫瘍応答性免疫細胞はマクロファージである。
【００３２】
本開示のさらに別の態様は、動物またはヒト対象における病的状態を検出する方法であって、本開示に従う遺伝子修飾免疫細胞の集団を含む薬学的に許容される組成物を動物またはヒト対象に投与するステップと、動物またはヒト対象から生体液サンプルを得るステップと、生体液サンプルが、動物またはヒトの患者の病的状態と接触または近接した遺伝子修飾免疫細胞によって発現される分泌可能な検出可能な薬剤を含むかどうかを決定するステップと、を含む方法の実施形態を包含する。
【００３３】
本開示のこの態様のある実施形態では、生体液は血液であってもよい。
【００３４】
本開示のこの態様のある実施形態では、分泌可能な検出可能な薬剤の存在は、動物またはヒトが、病的状態と接触する遺伝子修飾免疫細胞に表現型変化を誘導する病的状態を有することを示す。
【００３５】
ある実施形態では、遺伝子修飾応答性免疫細胞は腫瘍応答性マクロファージである。
【００３６】
本開示のこの態様のある実施形態では、病的状態は癌であってもよい。
【００３７】
ある実施形態では、病的状態は腫瘍である。
【００３８】
本開示のこの態様のある実施形態では、方法は、病的状態に隣接するか、または病的状態に付着する病理応答性免疫細胞において検出可能な薬剤からのシグナルを検出するステップと、対象に対する検出可能なシグナルの画像を生成するステップと、対象における局所シグナルの位置を決定するステップと、をさらに含むことができる。
【００３９】
本開示のこの態様のある実施形態では、生体液は血液である。
【００４０】
ある実施形態では、この方法は、検出可能な薬剤の量が、動物またはヒト患者の病的状態に隣接するかまたはそれに付着している遺伝子修飾免疫細胞によって分泌されないときに行われる。
【００４１】
本開示のさらに別の態様は、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）単離のための装置と、アルギナーゼ−１（ＡＲＧ−１）プロモーターに作動可能に連結された検出可能な薬剤をコードするプラスミドのエンドトキシンを含まない調製物とを含むキットの実施形態を包含する。
【００４２】
本開示の別の態様は、対象の病的状態を特定する方法であって、（ａ）検出可能な薬剤をコードする核酸配列を有する異種核酸を含む遺伝子修飾免疫細胞を対象に投与するステップであって、遺伝子修飾免疫細胞は、対象の病的状態によって誘導される代謝変化に応答して検出可能な薬剤を発現するステップと、（ｂ）対象の検出可能な薬剤を検出して病的状態を同定するステップと、を含む、方法の実施形態を包含する。
【００４３】
本開示のこの態様のある実施形態では、遺伝子修飾免疫細胞における腫瘍特異的代謝変化に応答するとき、遺伝子発現調節領域は、検出可能な薬剤の発現を誘導することができる。
【００４４】
本開示のこの態様の実施形態では、遺伝子修飾免疫細胞における腫瘍特異的代謝変化は、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、肺癌、黒色腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、子宮頸癌、甲状腺癌、胃癌、脳幹神経膠腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫、膠芽腫、上衣腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、胚細胞腫瘍、頭蓋外癌、ホジキン病白血病、肝癌、髄芽腫、神経芽腫、脳腫瘍、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、松果体腫瘍、視経路および視床下部膠腫、ウィルムス腫瘍、食道癌、有毛細胞白血病、腎臓癌、口腔癌、膵臓癌、皮膚癌、ならびに小細胞肺癌からなる群から選択される癌によって誘導することができる。
【００４５】
本開示のこの態様のある実施形態では、遺伝子修飾免疫細胞における病態特異的な代謝変化は、炎症によるものである。
【００４６】
遺伝子修飾免疫細胞のある実施形態では、異種核酸は複数の異なる遺伝子発現調節領域を含み、各調節領域は多種類の検出可能な薬剤をコードする複数の核酸配列に作動可能に連結されており、遺伝子発現調節領域は、病態特異的代謝変化に応答して、検出可能な薬剤の発現を誘導し、その各検出可能な薬剤のレベルは、対象の異なる状態の指標である。
【００４７】
本開示のさらなる態様は、添付の図面と併せて、以下で説明される、その様々な実施形態の詳細な説明を検討すると、より容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】診断用養子細胞移入の模式図である。マクロファージは、「腫瘍関連」代謝プロファイルを採用すると、合成バイオマーカーを分泌するように遺伝子改変されている。改変されたマクロファージは、同系宿主に静脈内注射され、病理学の既存の部位を狙う（ｈｏｍｅ  ｉｎ）ことを許される。次に、血液検査（または他の生体液の検査）を使用して、疾患の存在を示す改変されたマクロファージからのバイオマーカーの分泌を監視することができる。このシステムは、イメージング可能な合成バイオマーカーを使用して、免疫細胞活性化の空間情報も提供することができる。「Ｍａｃｓ」という用語はマクロファージを意味する。
【図２Ａ】［図２Ａ〜２Ｆ］（ａ）Ｍ２マクロファージが広範なヒトの癌にわたって高発現していること、（ｂ）アルギナーゼ−１が癌のインビトロおよびインビボマウスモデルでＭ２マクロファージを識別することを示す。［図２Ａ］広範なヒトの癌における様々な免疫細胞の相対的割合を示すヒートマップを示す。
【図２Ｂ】マウスのＢＭＤＭが、ｑＰＣＲで測定したＩＬ−４、ＩＬ−１３、および腫瘍馴化培地に応答して、ＡＲＧ１発現の濃度依存的な増加を示す一連の棒グラフを示す。
【図２Ｃ】ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージがｑＰＣＲで測定したＩＬ−４、ＩＬ−１３、および腫瘍馴化培地に応答して、ＡＲＧ１発現の濃度依存的な増加を示す一連の棒グラフを示す。
【図２Ｄ】ＩＬ−４、ＩＬ−１３、腫瘍馴化培地（ＴＣＭ）で刺激すると、ＡＲＧ１レベルが上昇することを示すアルギナーゼ活性アッセイを示す一連の棒グラフを示す。
【図２Ｅ】内因性マクロファージと静脈注射された養子移入（ＡＣＴ）されたＲＡＷ２６４．７マクロファージが腫瘍と皮下腫瘍担持マウスの脾臓から単離され（左）、腫瘍浸潤マクロファージにおいてその脾臓対応物と比較して見られたＡＲＧ１発現の倍率の上昇をｑＰＣＲで定量化した（右）ことを示す、ＦＡＣＳプロットと棒グラフを示す。腫瘍（ＡＯ、その他すべて）の非マクロファージ細胞からのＡＲＧ１レベルも一括で測定され、脾臓マクロファージと比較して定量化された。＊はｐ＜０．０５での統計的有意性を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１での統計的有意性を示す。エラーバーは、少なくとも３つの生物学的複製の平均（ｓ．ｅ．ｍ）の標準誤差を表す。ＢＭＤＭ、骨髄由来マクロファージ；ＴＣＭ、腫瘍馴化培地；ＡＣＴ、養子細胞移入。
【図２Ｆ】内因性マクロファージと養子移入（ＡＣＴ）ＲＡＷ２６４．７マクロファージが、フローサイトメトリーにより、腫瘍、脾臓、肺、肝臓の皮下腫瘍を担持するマウスまたは健常なマウス（左上）とＭ２遺伝子のフォールドエレベーションから単離されたことを示す肝臓内在性（内因性の場合）または肝ホーミング（ＡＣＴの場合）マクロファージと比較した異なる組織での発現が示される（右上）。＊はｐ＜０．０５での統計的有意性を示し、＊＊はｐ＜０．０１での統計的有意性を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１での統計的有意性を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）を表す。ＢＭＤＭ、骨髄由来マクロファージ；ＴＣＭ、腫瘍馴化培地。
【図３Ａ】［図３Ａ〜３Ｇ］マクロファージがインビトロおよびインビボで腫瘍に向かって移動することを示す。［図３Ａ］化学誘引物質が光学顕微鏡法によるＲＡＷ２６４．７マクロファージ移動の濃度依存的な増加を明らかにし（右）、１０倍の視野あたりの移動細胞の定量化が４倍増加を超えることを明らかにした（下）ため、腫瘍馴化培地で実施したトランスウェルアッセイ（図上）を示す。マクロファージは赤い偽色で示される。スケールバーは４００μｍである。
【図３Ｂ】[図３Ｂおよび３Ｃ]腫瘍とマクロファージのシグナルが、右肩を横切る首筋からの距離の関数として、輝線トレース上に強く共存することを示す。［図３Ｂ］ＶｉｖｏＴｒａｃｋ  ６８０標識化マクロファージがインビボ蛍光顕微鏡で視覚化すると、静脈内注射後１〜５日の皮下Ｆｌｕｃ発現腫瘍における時間依存性の蓄積を証明することを示す、重ね合わせた偽色での一連のデジタル写真である。スケールバーは１ｃｍである。左と右の放射輝度スケールは、腫瘍とマクロファージシグナルにそれぞれ適用される。
【図３Ｃ】腫瘍とマクロファージのシグナルを示す距離は、右肩を横切る首筋からの距離の関数として、輝き線のトレース上に強く共存することを示す光輝対距離の図３Ｂに対応する右肩の輝き線トレースを示すグラフである。
【図３Ｄ】は、５日目以降、各サイトの常駐マクロファージの１９〜２５％が養子移入（ＶｉｖｏＴｒａｃｋ６８０陽性）によるものであり、このことは経時でマクロファージセンサーの腫瘍のコロニー形成と持続を示唆することを証明する、採取した腫瘍と脾臓のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳプロット）の結果を示す。
【図３Ｅ】５日目以降、各サイトの１９〜２５％の常駐マクロファージが養子移入によるものであり、このことは経時での腫瘍の定着とマクロファージセンサーの持続性を示唆する、ことを示す円グラフである。
【図３Ｆ】［図３Ｆおよび３Ｇ］抗ＣＣＬ２（ｎ＝４、ｐ＝０．００７７）抗体と抗ＣＳＦ１（ｎ＝３、ｐ＝０．００４９）抗体の中和量が、それぞれのアイソタイプ対照抗体よりもマクロファージの皮下腫瘍への移動を妨害することを示す。［図３Ｆ］抗ＣＣＬ２（ｎ＝４、ｐ＝０．００７７）および抗ＣＳＦ１（ｎ＝３、ｐ＝０．００４９）抗体の中和量が、それぞれのアイソタイプ対照抗体よりもマクロファージの皮下腫瘍への移動を妨害することを示す、偽色を重ね合わせデジタル写真を示す。
【図３Ｇ】バックグラウンドを差し引いた輝度値を示す棒グラフである。＊ｐ＜０．０５での統計的有意性を示し、＊＊はｐ＜０．０１での統計的有意性を示し、および＊＊＊はｐ＜０．００１での統計的有意性を示す。エラーバーは少なくとも３つの生物学的複製のｓ．ｅ．ｍを表す。ＴＣＭ、腫瘍馴化培地；Ａｂ、抗体；ＡＨ、アルメニアハムスター。
【図４Ａ】［図４Ａ〜４Ｉ］マクロファージセンサーがインビボで小さな腫瘍の検出と可視化を可能にすることを示す。［図４Ａ］ｐＡＲＧ１−Ｇｌｕｃレポーターを発現するように改変されたＲＡＷ２６４．７マクロファージが、培地からアッセイした場合、腫瘍馴化培地（左）とＩＬ−４／ＩＬ−１３（右）で刺激されたときに、時間と濃度に依存したＧｌｕｃの分泌を呈することを示す、１対の棒グラフを示す。
【図４Ｂ】限局性肺微小腫瘍において、４Ｔ１担癌マウスの血漿から分析したＲＬＵ値が、健常対照（ｎ＝７、ＡＵＣ＝０．６５７、９５％ＣＩ  ０．３３５〜０．９７９、ｐ＝０．３７２）を超えて上昇しないが、播種性疾患の有意な上昇（ｎ＝１１、ＡＵＣ＝１．００、ｐ＝０．００１８）を示すことを示す散布図である。ＲＬＵ値はバックグラウンドを差し引いて、健常な血液から非特異的なシグナルを排除する。
【図４Ｃ】活性化されたマクロファージの生物発光イメージング（ＢＬＩ）と腫瘍の播種が、マクロファージセンサーの活性化と疾患部位の顕著な共存を明らかにすることを示す、一連のデジタル写真である。
【図４Ｄ】局在化された皮下ＣＴ２６モデルで、活性化マクロファージセンサーからバックグラウンドを差し引いた血漿Ｇｌｕｃが、ＡＵＣ＝１．００（ｎ＝６、ｐ＝０．０００９）で＞５０ｍｍ３の腫瘍、およびＡＵＣ＝０．８４９（ｎ＝６、９５％ＣＩ  ０．６２０〜１．００、ｐ＝０．０２１）で２５〜５０ｍｍ３の腫瘍で確実に検出できたことを示す散布図である。
【図４Ｅ】右肩の腫瘍と活性化されたマクロファージ（白い円）の空間的な重なりが見えるＢＬＩイメージングの一連のデジタル写真である。スケールバーは１ｃｍである。
【図４Ｆ】右肩の腫瘍と活性化マクロファージ（白丸）の空間的な重なりが見える右肩の輝き線の軌跡を示すグラフである。スケールバーは１ｃｍである。図４Ｃと４Ｅの左と右の放射輝度スケールは、それぞれ活性化されたマクロファージと腫瘍シグナルに適用される。＊はｐ＜０．０５での統計的有意性を示し、＊＊はｐ＜０．０１での統計的有意性を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１での統計的有意性を示す。エラーバーは、少なくとも３つの生物学的複製のｓ．ｅ．ｍを表す。ＴＣＭ、腫瘍馴化培地；ＲＬＵ、相対発光単位；ＡＵＣ、曲線の下の面積。
【図４Ｇ】Ｍ−ＣＳＦで培養した骨髄由来細胞が単球／マクロファージ成熟マーカーＦ４／８０のレベルを増加させ、培養５日目に単球表現型を示す、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）トレースを示す。
【図４Ｈ】ｐＡＲＧ１−ＧｌｕｃレポーターでエレクトロポレーションしたＢＭＤＭが、培養培地からアッセイした腫瘍馴化培地でＧｌｕｃの時間依存性分泌を示すことを示すグラフである。
【図４Ｉ】局在化された皮下ＣＴ２６腫瘍が６０〜７５ｍｍ３の体積に達したときに、活性化ＢＭＤＭセンサーからバックグラウンドを差し引いた血漿Ｇｌｕｃが有意な上昇（ｎ＝４、ｐ＝０．０３４２）を示す散布図を示す（ＡＵＣ＝０．８１３、９５％ＣＩ  ０．５５５〜１．００、ｐ＝０．０８９４）。スケールバーは１ｃｍである。（Ｃ）と（Ｅ）の左と右の放射輝度スケールは、それぞれ活性化されたマクロファージと腫瘍シグナルに適用される。＊はｐ＜０．０５での統計的有意性を示し、＊＊はｐ＜０．０１での統計的有意性を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１での統計的有意性を示す。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表すＴＣＭ、腫瘍馴化培地；ＲＬＵ、相対発光単位；ＡＵＣ、曲線下面積。
【図５Ａ】［図５Ａ〜５Ｉ］マクロファージセンサーが炎症と創傷治癒のモデルにおける免疫学的時間枠を反映していることを示す。［図５Ａ］ＢＭＤＭとＲＡＷ２６４．７マクロファージが、ｑＰＣＲによって定量化された古典的な炎症誘発性サイトカインＩＦＮγおよびＴＮＦαへの曝露時に、ｑＰＣＲによって定量化されたＡＲＧ１  ｍＲＮＡの最小限の上昇を示すことを示す棒グラフである。ＢＭＤＭ  ＡＲＧ１レベルは同様にＬＰＳの影響を受けない。
【図５Ｂ】改変されたｐＡＲＧ１−Ｇｌｕｃ発現マクロファージセンサーが、同じ炎症誘発性サイトカインで刺激すると、培地中のＧｌｕｃレベルが顕著に増加したことを示す棒グラフである。
【図５Ｃ】テレビン油の筋肉内注射後０〜１０日後肢筋のＨ＆Ｅ染色が一次好中球による急性炎症応答（暗い矢印）と、それに続く炎症の解決の後半の段階でマクロファージの浸潤（明るい矢印）の古典的なタイムラインを示す一連のデジタル写真である。スケールバーは５０μｍである。
【図５Ｄ】炎症の１日目（ｎ＝６）または７日目（ｎ＝８）（左）に静脈内マクロファージセンサーを注入してから２４時間後にバックグラウンドを差し引いた血漿Ｇｌｕｃレベルは、急性炎症段階（１日目）に上昇がないことを示したが、回復期（７日目）には有意な上昇とマクロファージ活性化を示したことを示す散布図である。これは、急性炎症時の無差別なＡＵＣ＝０．６４３（９５％ＣＩ  ０．３３２〜０．９５３、ｐ＝０．３７１）にも反映されるが、創傷治癒段階中の堅牢なＡＵＣ＝０．９２９（９５％ＣＩ  ０．７８３〜１．００、ｐ＝０．００６）である。
【図５Ｅ】は、活性化マクロファージからの細胞内Ｇｌｕｃの画像が、バックグラウンド、センサー（対照）を注入された非炎症マウス、およびセンサーを注入された急性炎症マウス（急性Ｉｎｆ．）からの匹敵するシグナルを明らかにする、一連のデジタル生物発光イメージング（ＢＬＩ）画像である。これは、７日目の回復フェーズ中にマクロファージセンサーが注入されたときのＢＬＩ画像とは対照的であり、そこでは、創傷治癒部位（黒丸）でのマクロファージの局在的な活性化がはっきりと見える。スケールバーは１ｃｍを測定する。＊はｐ＜０．０５での統計的有意性を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１での統計的有意性を示す。エラーバーは、少なくとも３つの生物学的反復のｓ．ｅ．ｍを表す。ＲＬＵ、相対発光単位；ＡＵＣ、曲線下面積。
【図５Ｆ】ＬＰＳの鼻腔内接種後のＨ＆Ｅ染色された肺の顕微鏡写真が、７時間で好中球浸潤（緑の矢印）が存在し、その後、創傷治癒プロセスが進むにつれて、マクロファージ（黄色の矢印）で徐々に置換される急性炎症の同様のタイムラインを示す、一連のデジタル写真である。創傷治癒はＬＰＳ接種後４８時間でピークに達し、７２時間までに健常な肺構造のいくらかの回復がある。スケールバーは５０μｍである。
【図５Ｇ】ＢＭＤＭセンサーを注射されたマウスの血漿Ｇｌｕｃ測定値がＡＵＣ＝０．９７５（９５％ＣＩ  ０．９００−１．００、ｎ＝５、ｐ＝０．００５４）で４８時間にピークを示す急性炎症と創傷治癒動態を反映する散布図である。
【図５Ｈ】［図５Ｈおよび５Ｉ］ＢＭＤＭセンサーが、血漿Ｇｌｕｃ測定によるＬＰＳ誘導急性炎症の不在下（ＡＵＣ＝０．９７５、９５％ＣＩ  ０．９００〜１．００、ｎ＝５、ｐ＝０．００５４）および存在下（ＡＵＣ＝１．００、９５％ＣＩ  １．００〜１．００、ｎ＝４、ｐ＝０．００６６）の両方で（図５Ｈ）、ならびに活性化マクロファージのＢＬＩを介して（図５Ｉ）、転移性４Ｔ１腫瘍を堅牢に別することができることを示す、散布図（図５Ｈ）と一連のデジタルＢＬＩ画像（図５Ｉ）を示す。＊はｐ＜０．０５での統計的有意性を示し、＊＊はｐ＜０．０１での統計的有意性を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１での統計的有意性を示す。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表すＬＰＳ、リポ多糖；ＲＬＵ、相対発光単位；ＡＵＣ、曲線下面積。
【図５Ｉ】［図５Ｈおよび５Ｉ］ＢＭＤＭセンサーが、血漿Ｇｌｕｃ測定によるＬＰＳ誘導急性炎症の不在下（ＡＵＣ＝０．９７５、９５％ＣＩ  ０．９００〜１．００、ｎ＝５、ｐ＝０．００５４）および存在下（ＡＵＣ＝１．００、９５％ＣＩ  １．００〜１．００、ｎ＝４、ｐ＝０．００６６）の両方で（図５Ｈ）、ならびに活性化マクロファージのＢＬＩを介して（図５Ｉ）、転移性４Ｔ１腫瘍を堅牢に別することができることを示す、散布図（図５Ｈ）と一連のデジタルＢＬＩ画像（図５Ｉ）を示す。＊はｐ＜０．０５での統計的有意性を示し、＊＊はｐ＜０．０１での統計的有意性を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１での統計的有意性を示す。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表すＬＰＳ、リポ多糖；ＲＬＵ、相対発光単位；ＡＵＣ、曲線下面積。
【図６Ａ】［図６Ａ〜６Ｆ］マクロファージセンサーが臨床的に使用されている癌再発のバイオマーカーよりも優れていることを示している。［図６Ａ］皮下移植されたＬＳ１７４Ｔ腫瘍がｎｕ／ｎｕマウス（ｎ＝１２）で指数関数的増殖を示すことを示すグラフである。
【図６Ｂ】酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で検出された血漿中ＣＥＡ濃度の上昇を示すグラフである。
【図６Ｃ】血漿サンプリングの１日目に、マクロファージセンサーからのバックグラウンドを差し引いた血漿Ｇｌｕｃ測定値（左）が、ＣＥＡ測定（右）と比較して、腫瘍担持マウス（ｎ＝７）と健常なマウス（ｎ＝５）をよりよく識別することができたことを示す散布図である。
【図６Ｄ】改善された感度と特異性が、内因性バイオマーカー（０．８２９、９５％ＣＩ  ０．５９０〜１、ｐ＝０．０６２）と比較して、マクロファージセンサー（０．９１４、９５％ＣＩ  ０．７３８〜１．００、ｐ＝０．０１９）で受信者動作特性曲線（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｏｒ  ｃｕｒｖｅ）の改善されたＡＵＣ値に反映されることを示すグラフである。＊はｐ＜０．０５での統計的有意性を示す。ＡＵＣは曲線の下の面積を示す。
【図６Ｅ】ｃｆＤＮＡの血漿濃度が、皮下ＣＴ２６腫瘍体積が１５００〜２０００ｍｍ３に達するまで、健常レベルを超えて有意に増加しなかったことを示すハイブリッドである散布図／ボックスグラフを示す。
【図６Ｆ】アッセイされた変異が、腫瘍が約１３００ｍｍ３より大きい体積に達するまでマウスの血漿ｃｆＤＮＡ（ｎ＝２３、左；ｎ＝２８、右）でｑＰＣＲによってｑＰＣＲで検出できなかったことを示す、はい／いいえのプロットを示す。下向きのバーは腫瘍を有するマウスを示し、血漿ｃｆＤＮＡで変異が検出されなかった。縦のバーは変異が検出されたことを示す。
【図７Ａ】［図７Ａ〜７Ｃ］は、骨髄由来マクロファージの純度とエレクトロポレーション効率を示す。［図７Ａ］採取したＢＭＤＭが、１０ｎｇ／ｍＬのマウスコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）で５日間活性化した後、Ｆ４／８０染色で９７．４％の純度を示したことを示すＦＡＣＳプロットである。
【図７Ｂ】ＢＭＤＭが、フローサイトメトリーで定量化した場合、約４０％の効率で、ｐＡＲＧ１−Ｇｌｕｃレポータープラスミドでエレクトロポレーションされたことを示すＦＡＣＳプロットである。
【図７Ｃ】ＢＭＤＭが、フローサイトメトリーで定量化した場合、８０％以上の効率と約６０％の生存率で、ｐＡＲＧ１−Ｇｌｕｃレポータープラスミドでエレクトロポレーションされたことを示すＦＡＣＳプロットである。
【図８】ｐＡＲＧ１−Ｇｌｕｃレポータープラスミドマップを示す。ｐＡＲＧ１−Ｇｌｕｃコンストラクトには、３７８０塩基対のＡＲＧ１エンハンサー／プロモーターシーケンスのすぐ下流にガウシアＤｕｒａルシフェラーゼが含まれている。コンストラクトには、細胞ソーティングおよびトランスフェクションまたはエレクトロポレーション効率の決定のための構成的ＣＭＶプロモーターの制御下にある強化された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の遺伝子も含まれている。
【図９】ＲＡＷ２６４．７マクロファージのＶｉｖｏＴｒａｃｋ６８０標識化を示すＦＡＣＳプロットを示す。マクロファージ（青）の均一な標識化は、染色されていないマクロファージ（赤）を超える４〜５桁の蛍光で観察された。
【図１０Ａ】［図１０Ａおよび１０Ｂ］一過性にトランスフェクトされた骨髄由来マクロファージを使用して転移性乳癌の検出を説明する。［図１０Ａ］転移性乳癌（ｎ＝５）を有するマウスの血漿からのＲＬＵ値が、ＢＭＤＭセンサーの静脈内注射時に、健常対照（ｎ＝５）を越えて顕著に高い（ＡＵＣ＝０．９２０、９５％ＣＩ  ０．７３９〜１．００、ｐ＝０．０２８）ことを示す分散図である。
【図１０Ｂ】活性化されたＢＭＤＭ（白丸）のＢＬＩを示す一連のデジタル写真であり、転移性結節は後肢の共存を明らかにしている。左と右の放射輝度スケールは、それぞれ活性化されたマクロファージと腫瘍シグナルに適用される。ＲＬＵ、相対発光単位；ＡＵＣ、曲線の下の面積。
【図１１】転移性乳癌のモデルにおける肺微小腫瘍を示す。４Ｔ１細胞の静脈内注射から１週間後、ＢＬＩによって可視化されるように、疾患の負担は肺に限局する（左）。肺のエクスビボ検査でも、肺胸膜の裏張りにある高さのない微小腫瘍が明らかになる（右）。スケールバーは１ｃｍである。
【図１２Ａ】［図１２Ａ〜１２Ｃ］結腸直腸癌の皮下局在モデルにおけるマクロファージセンサーの最適化を説明する。［図１２Ａ］デジタルキャリパーで測定された腫瘍体積が、ＢＬＩで推定された腫瘍体積とよく相関していることを示すグラフである（ｒ２＝０．９１８）。破線は、線形回帰の９５％信頼区間を示す。
【図１２Ｂ】改変されたマクロファージセンサーが、１５００ｍｍ３を超える体積の目に見える壊死性腫瘍を検出できなかったことを示すグラフである。
【図１２Ｃ】５０〜２００ｍｍ３の限局性皮下腫瘍の検出を示す散布図であり、健常な対照と比較した血漿Ｇｌｕｃの上昇は、マクロファージセンサーの注入から２４時間後に明らかになったが、健常マウスと腫瘍担持マウスの両方で、シグナルが次の日に減少した。
【図１３】乳酸はマクロファージでＡＲＧ１の発現を誘導することを示す１対のボックスグラフである。１００ｍＭの乳酸は、刺激後２４時間の骨髄由来（左）マクロファージとＲＡＷ２６４．７（右）マクロファージの両方で、ＦＩＺＺ１およびＡＲＧ１  ｍＲＮＡの発現を誘導する。＊はｐ＜０．０５での統計的有意性を示し、＊＊はｐ＜０．０１での統計的有意性を示す。エラーバーは平均の標準誤差を示す。ＢＭＤＭ、骨髄由来マクロファージ。
【図１４Ａ−１】［図１４Ａおよび１４Ｂ］マクロファージ選別のためのフローサイトメトリーゲーティング戦略を示す。［図１４Ａ−１］腫瘍、脾臓、肺、肝臓における養子移入（ＶＴ６８０＋）およびネイティブ（ＶＴ６８０−）マクロファージのフローサイトメトリーゲーティング戦略を示す一連のＦＡＣＳプロットを示す。ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋細胞の集団は両方の組織で十分に分離されており、養子移入されたマクロファージは、蛍光マイナス１つの対照に基づいてゲートされた。ＦＭＯ、蛍光マイナス１。
【図１４Ａ−２】腫瘍、脾臓、肺、肝臓における養子移入（ＶＴ６８０＋）およびネイティブ（ＶＴ６８０−）マクロファージのフローサイトメトリーゲーティング戦略を示す一連のＦＡＣＳプロットを示す。ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋細胞の集団は両方の組織で十分に分離されており、養子移入されたマクロファージは、蛍光マイナス１つの対照に基づいてゲートされた。ＦＭＯ、蛍光マイナス１。
【図１４Ａ−３】腫瘍、脾臓、肺、肝臓における養子移入（ＶＴ６８０＋）およびネイティブ（ＶＴ６８０−）マクロファージのフローサイトメトリーゲーティング戦略を示す一連のＦＡＣＳプロットを示す。ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋細胞の集団は両方の組織で十分に分離されており、養子移入されたマクロファージは、蛍光マイナス１つの対照に基づいてゲートされた。ＦＭＯ、蛍光マイナス１。
【図１４Ａ−４】腫瘍、脾臓、肺、肝臓における養子移入（ＶＴ６８０＋）およびネイティブ（ＶＴ６８０−）マクロファージのフローサイトメトリーゲーティング戦略を示す一連のＦＡＣＳプロットを示す。ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋細胞の集団は両方の組織で十分に分離されており、養子移入されたマクロファージは、蛍光マイナス１つの対照に基づいてゲートされた。ＦＭＯ、蛍光マイナス１。
【図１４Ｂ】養子移入から５日後の様々な組織に存在する投与された（ＶＴ６８０＋）対内因性（ＶＴ６８０−）マクロファージの平均部分構成を示す一連の円グラフを示す。
【図１５】ＣＴ２６腫瘍における低酸素症と比較したマクロファージの局在化の免疫蛍光を示す。蛍光標識化された骨髄由来単球（下）を注入されたマウスのＣＴ２６腫瘍の免疫蛍光顕微鏡写真は、マクロファージと低酸素領域の共存を明らかにしている。ピモニダゾールを注入していない、および蛍光標識化されていない骨髄由来単球を注入したマウスからのＣＴ２６腫瘍の免疫蛍光（上）は、特異性を確認する緑または赤のチャネルにシグナルを示さない。画像は１０倍の倍率で表示され、スケールバーは２５０μｍである。ＣＢ６４０、ＣｅｌｌＢｒｉｔｅ６４０；ＢＭＤＭ、骨髄由来単球。
【図１６】静脈内注入されたマクロファージセンサーが腫瘍の進行に及ぼす影響を示す。皮下腫瘍を担持するマウス（ｎ＝４）でのＢＭＤＭセンサーの静脈内注射を示すプロットは、ビヒクルを注射したマウス（ｎ＝３）と比較した腫瘍体積の初期回帰（４日目、ｐ＝０．０５８）に続いて、指数関数的成長を再開する。左のプロットは個々の腫瘍の増殖を示し、右のプロットは平均腫瘍体積を示している。マウスは、あらゆる次元で１５ｍｍを超える腫瘍で犠牲にされ、右側のプロットの平均腫瘍体積は、グループ内のすべてのマウスがまだ生存していた時点についてのみ示される。エラーバーは平均の標準誤差を示す。ＢＭＤＭ、骨髄由来マクロファージ。
【図１７】ロックされた核酸プローブによる検出の欠失変異限界を示す１対のグラフである。ＣＴ２６と野生型Ｂａｌｂ／ｃゲノムＤＮＡのリアルタイムｑＰＣＲ増幅プロットは、染色体７（左）と１９（右）の欠失が対立遺伝子頻度０．１％と１％でそれぞれ検出することができることを示している。各条件は３つずつ表示される。ＲＦＵ、相対蛍光単位；ＡＦ、対立遺伝子頻度。
【図１８Ａ】配列番号１の核酸配列を示す。
【図１８Ｂ】配列番号１の核酸配列を示す。
【図１８Ｃ】配列番号１の核酸配列を示す。
【図１８Ｄ】配列番号１の核酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明をより詳細に説明する前に、本発明は記載された特定の実施形態に限定されず、したがって、当然のことながら変更され得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態の説明のみを目的としており、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。
【００５０】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値と下限値の間の、文脈上そうではないと明確に指示されない限りは下限値の単位の１０分の１までの各介在値、およびその記載される範囲内の任意の他の記載値または介在値が、本発明に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して、より小さな範囲に含めることができ、本発明の範囲内にさらに包含され、記載された範囲内で特に除外された制限を受ける。述べられる範囲が限界の一方または両方を備える場合、それらの含まれる限界のうちのいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
【００５１】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が関係する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料はまた、本発明の実施または試験においても使用することができるが、好ましい方法および材料をここで説明する。
【００５２】
このテキストで引用される出願および特許の各々、ならびに出願および特許の各々で引用されている各文書または参考文献（各発行された特許の審査中の「出願で引用された文書」を含む）、およびこれらの出願および特許のいずれかに対応する、および／またはそれらから優先権を主張するＰＣＴおよび外国出願または特許の各々、および出願、引用された文書の各々の引用または参照された文書の各々は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。さらに、このテキスト、特許請求の範囲の前の参考文献リスト、またはテキスト自体内で引用される文書または参考文献、これらの文書または参考文献（「本明細書で引用された参考文献」）の各々、ならびに各文書または本明細書で引用された参考文献の各々内で引用された参考文献（製造元の仕様、使用説明書などを含む）は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００５３】
本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に説明され例証された個々の実施形態の各々は、本開示の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のある実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るか、または組み合わせられ得る個別の要素および特徴を有する。いかなる列挙された方法も、列挙された事象の順序で、または論理的に可能ないかなる他の順序で実行することができる。
【００５４】
本開示の実施形態は、別段の指示がない限り、当技術分野の範囲内である医学、有機化学、生化学、分子生物学、薬理学などの技術を用いる。そのような技術は、参考文献において完全に説明される。
【００５５】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の指示対象を含むことが留意されなければならない。したがって、例えば、「担体」への言及は、複数の担体を含む。本明細書およびそれに続く特許請求の範囲では、反対の意図が明らかでない限り、以下の意味を有すると定義されるべき多くの用語が参照される。
【００５６】
本明細書で使用される場合、以下の用語は、別段の指定がない限り、それらに帰する意味を有する。この開示において、「含む」、「含むこと」、「含有すること」および「有する」などは、米国特許法においてそれらに帰する意味を有することができ、「含む」、「含むこと」などを意味する。「から本質的になる」または「本質的になる」などは、本開示に包含される方法および組成物に適用される場合、本明細書に開示されるような組成物を指すが、追加の構造群、組成物成分または方法ステップ（または上で考察されたような類似体もしくはそれらの誘導体）を含んでもよい。しかしながら、そのような追加の構造群、組成物成分または方法ステップなどは、本明細書に開示される対応する組成物または方法の特性と比較して、組成物または方法の基本的および新規の特性に実質的に影響しない。「から本質的になる」または「本質的になる」などは、本開示に包含される方法および組成物に適用される場合、米国特許法に帰する意味を有し、用語は制限がなく、記載されているもののうちの基本的または新規の特徴が記載されているもの以上の存在によって変化しない限り、記載されている以上の存在を可能にするが、先行技術の実施形態を除外する。
【００５７】
エンドポイントによって本明細書に記載されている数値範囲には、その範囲内に含まれるすべての数と分数が含まれる（例えば、１〜５には、１、１、５、２、２．７５、３、３．９０、４、および５が含まれる）。また、すべての数およびその分数は、「約」という用語によって修飾されると推定される。「約」という用語は、参照されている数のプラスまたはマイナス０．１〜５０％、５〜５０％、または１０〜４０％、好ましくは１０〜２０％、より好ましくは１０％または１５％を意味する。
【００５８】
様々な実施形態を説明する前に、以下の定義が提供されており、別段の指示がない限り使用されるべきである。
【００５９】
略語
ＳＥＡＰ、分泌型胚性アルカリホスファターゼ；ＭＲＩ、磁気共鳴画像；ＢＬＩ、生物発光イメージング；ＲＯＩ、関心領域；ＡＵＣ、曲線下面積；ＲＧ、レポーター遺伝子；ＴＳ、腫瘍特異的；Ｇｌｕｃ、ガウシアルシフェラーゼ；ＣＴＣ、循環腫瘍細胞；ｃｔＤＮＡ、循環腫瘍ＤＮＡ；ＨＳＶ１−ｔｋ、ＨＳＶ１−チミジンキナーゼ；ｈＮＩＳ、ヒトヨウ化ナトリウムシンポーター；ＡＣＴ、養子細胞移入；ＲＬＵ、相対発光単位；ＢＭＤＭ；骨髄由来マクロファージ。
【００６０】
定義
本明細書で使用される場合、「養子細胞移入（ＡＣＴ）」という用語は、患者への細胞の転送を指す。細胞は患者または別の個体に由来している可能性がある。自己癌免疫療法では、Ｔ細胞は患者から抽出され、遺伝子修飾され、インビトロで培養され、同じ患者に戻される。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「自家」という用語、個々の動物またはヒトから単離されるかまたはそれに由来し、その後、同じ個体に戻される細胞または細胞集団を指す。細胞は、個体に戻る前に遺伝子修飾または培養されている可能性がある。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「生体液」という用語は、生体液サンプルを指し、個体から得られた様々な種類の流体サンプルを包含し、診断または監視アッセイで使用することができる。定義には、血液の総量または血清）、脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液、涙、痰、呼気、尿、および生物学的起源の他の液体サンプルが含まれる。また、この定義には、個々のサンプルの混合もしくはプール、試薬による処理、可溶化、または有核細胞、非有核細胞、病原体などの特定の成分の濃縮など、調達後に何らかの方法で改変されたサンプルも含まれる。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「血液サンプル」という用語は、血液、好ましくは末梢（または循環）血液に由来する生体サンプルである。血液サンプルは、例えば、全血、血漿、血清、または細胞成分が溶解されて細胞内内容物が緩衝液または他の液体媒体に放出されているそのような流体の可溶化調製物であってもよい。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「生物発光」という用語は、生体分子、特にタンパク質による化学発光の一種の発光を指す。生物発光の必須条件は、分子酸素の存在下で基質ルシフェリンに作用し、かつこの基質を、より低いエネルギーレベルに戻る際にエネルギーを光の形態で放出する励起状態に変換するルシフェラーゼであるオキシゲナーゼの存在下で結合しているかまたは遊離している分子酸素である。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「バイオマーカー」という用語は、細胞の表面上、細胞の細胞内成分、または血清サンプル中の可溶性タンパク質などの生体液の成分または構成要素で見られ得、腫瘍または腫瘍細胞の指標として客観的に測定および評価される特性を有する、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質（単量体または多量体）等の抗原を指すがこれらに限定されない。対象のヒトまたは動物から単離された生体液または生体サンプルにおけるそのようなバイオマーカーの存在は、対象が病理（例えば、癌）の担い手であることを示し得る。そのようなバイオマーカーの発現の変化は、疾患または進行のリスクの増加、または所与の治療に対する疾患の反応の予測と相関する可能性がある。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、異常な細胞が制御なしに分裂する疾患の一般用語として、その通常の意味が与えられるものとする。特に、癌は血管新生関連の癌を指す。癌細胞は近くの組織に侵入し、血流やリンパ系を介して身体の他の部分に広がる可能性がある。
【００６７】
癌にはいくつかの主要な種類があり、例えば、癌腫は皮膚や、内臓を埋め尽くすまたは覆う組織に発生する癌である。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、またはその他の結合組織や支持組織に発生する癌である。白血病は、骨髄などの造血組織で発生する癌であり、異常な血球が大量に生成されて血流に入る。リンパ腫は免疫系の細胞で発生する癌である。
【００６８】
正常な細胞が特定の、制御され、調整されたユニットとして振る舞う能力を失うと、腫瘍が形成される。一般に、固形腫瘍は、通常は嚢胞または液体領域を含まない異常な組織の塊である（一部の脳腫瘍には、嚢胞と液体で満たされた中心壊死領域がある）。単一の腫瘍は、その内部に異なる種類の細胞を有している可能性があり、異なるプロセスが失敗している。固形腫瘍は、良性（例：非癌性）または悪性（例：癌性）の場合がある。異なる種類の固形腫瘍は、それらを形成する細胞の種類にちなんで名付けられる。固形腫瘍の例は、肉腫、癌腫、およびリンパ腫である。白血病（血液の癌）は一般に固形腫瘍を形成しない。
【００６９】
代表的な癌には、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、肺癌、黒色腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、子宮頸癌、甲状腺癌、胃癌、脳幹神経膠腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫、膠芽腫、上衣腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、胚細胞腫瘍、頭蓋外癌、ホジキン病白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、肝癌、髄芽腫、神経芽腫、一般的に脳腫瘍、非ホジキンリンパ腫、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、一般的に柔組織肉腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体腫瘍、視経路および視床下部膠腫、ウィルムス腫瘍、急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、食道癌、有毛細胞白血病、腎臓癌、多発性骨髄腫、口腔癌、膵臓癌、中枢神経原発リンパ腫、皮膚癌、ならびに小細胞肺癌などを含むが、これらに限定されない。
【００７０】
腫瘍は悪性または良性に分類することができる。どちらの場合も、細胞の異常な凝集と増殖が存在する。悪性腫瘍の場合、これらの細胞はより攻撃的に振る舞い、侵襲性の増加などの特性を獲得する。結局のところ、腫瘍細胞は、それらが発生した微視的環境から離れ、身体の別の領域に拡散し（非常に異なる環境であり、通常はその成長を促進しない）、急速な成長を続け、この新しい場所で分割する能力を獲得さえすることがある。これは転移と呼ばれる。悪性細胞が転移すると、治癒はより困難である。
【００７１】
良性腫瘍は浸潤する傾向が少なく、転移する可能性が低くなる。脳腫瘍は脳内に広がっているが、通常は脳外に転移することはない。神経膠腫は脳の内側に非常に浸潤性であり、脳半球を横切っている。ただし、制御されない様式で分割される。それらの場所によっては、悪性病変と同様に生命を脅かす可能性がある。これの例は、脳内の良性腫瘍であり、成長して頭蓋骨内の空間を占め、脳への圧力が増加する可能性がある。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「細胞または細胞の集団」という用語は、組織から切除された、または組織培養技術によってインビトロで増殖された、単離された細胞または複数の細胞を指す。最も具体的には、細胞の集団は、動物またはヒトの組織におけるインビボの細胞を指す。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「コード配列」および「選択されたポリペプチドをコードする」という用語は、例えば、核酸は生きている細胞（インビボ）に存在し、適切な規制シーケンス（または「制御要素」）の管理下に配置されるときに、（ＤＮＡの場合）転写され、（ｍＲＮＡの場合）ポリペプチドに翻訳される核酸分子を指す。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「制御要素」という用語は、転写プロモーター、転写エンハンサー要素、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終止コドンの３’に位置）、翻訳開始の最適化のための配列（コード配列の５’に位置）、および翻訳終結配列を指すが、これらに限定されない。
【００７５】
「サイトカイン」という用語は、細胞間メディエーターとして別の細胞集団に作用する、ある細胞集団から放出されたタンパク質の総称である。そのようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインには、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−アルファおよび−ベータ；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−アルファなどの神経成長因子；血小板増殖因子；胎盤成長因子、ＴＧＦ−アルファやＴＧＦ−ベータなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−１および−１１；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−アルファ、−ベータ、−ガンマなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；および顆粒球マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、およびＩＬ−３３などのインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−ベータなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦおよびキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書で使用する場合、サイトカインという用語には、天然源からの、または組換え細胞培養物からのタンパク質、および天然配列サイトカインの生物学的に活性な同等物が含まれる。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「細胞への送達」という用語は、小分子化合物、核酸、ペプチドもしくはポリペプチド、またはインビボ投与のための全身的標的化送達、またはエクスビボもしくはインビトロでのエフェクターと細胞とのインキュベーションにより阻害性核酸またはポリペプチドを発現することができる核酸での細胞の直接標的化を指す。
【００７７】
「検出可能な薬剤」という用語は、そのような薬剤の相対または絶対濃度を特異的に検出するように設計された任意のアッセイによって検出可能な分子（例えば、小分子、ペプチド、タンパク質ＲＮＡ、ＤＮＡ）を指す。ある実施形態では、検出可能な薬剤は、それが導入される免疫細胞にとって外因性のポリペプチドである。検出可能な薬剤は、ＭＲＩイメージング、ＰＥＴイメージング、ＳＰＥＣＴイメージング、および光音響レポーター、生物発光レポーター、自己蛍光レポーター、化学発光レポーターが含まれる、発光レポーター、または比色レポーターを含むがこれらに限定されない発光イメージングなどの非侵襲的イメージング法によって検出され得る。好適なＭＲＩレポーター遺伝子には、クレアチンキナーゼ；チロシナーゼ；トランスフェリン受容体；フェリチン；Ｍａｇ  Ａ．ＰＥＴイメージングレポーター遺伝子には、単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ｔｋ）；ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ；Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ；ドーパミン２受容体（Ｄ２Ｒ、変異Ｄ２ＲＡ８０を含む）；ソマトスタチン受容体；エストロゲン受容体（ｈＥＲＬ）；ドーパミントランスポーター；ヨウ化ナトリウムシンポーター；カテコールアミン輸送体；β−ガラクトシダーゼをコードするものなどが含まれるが、これらに限定されない。ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴイメージングレポーター遺伝子には、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ、およびＨＳＶ１−ｓｒ３９ｔｋなどの多数の最適化された変異体、ドーパミン２型受容体；ヨウ化ナトリウムシンポーター；ソマトスタチン２型受容体；ヒトノルエピネフリン輸送体；ヒトエストロゲン受容体α；ヒトデオキシシチジンキナーゼの変異体；ならびに組換え癌胎児性抗原が含まれるが、これらに限定されない。生物発光レポーター遺伝子には、ホタルルシフェラーゼ（ｆｌ）；ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）；合成ウミシイタケルシフェラーゼ（ｈｒｌ）；強化された緑色蛍光タンパク質（ｅｇｆｐ）；赤い蛍光タンパク質（ｒｆｐ）；単量体赤色蛍光タンパク質（ｍｒｆｐ１）などが含まれるが、これに限定されない。本開示の遺伝子コンストラクトへの組み込みに好適なレポーター遺伝子は、イメージングのマルチモダリティ法を提供することがさらに可能である。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「発現カセット」という用語は、関心の遺伝子／コード配列、ならびにｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどの非翻訳ＲＮＡを含む任意のＲＮＡ転写物の発現を指向することができる任意の核酸コンストラクトを指す。そのようなカセットは、発現カセットを標的細胞に導入するために、「ベクター」、「ベクターコンストラクト」、「発現ベクター」、または「遺伝子導入ベクター」に構築することができる。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、本明細書で使用されるタンパク質をコードするＤＮＡを発現するため、およびタンパク質を産生するために有用な核酸を指す。発現ベクターは、タンパク質をコードする遺伝子を様々な原核および／または真核宿主細胞で発現し、このタンパク質を産生する限り、限定されない。酵母、動物細胞、または昆虫細胞が宿主として使用される場合、発現ベクターは、好ましくは、少なくともプロモーター、開始コドン、タンパク質をコードするＤＮＡおよび終止コドンを含む。それはまた、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、タンパク質をコードする遺伝子の５’−および３’−非翻訳領域、スプライシングジャンクション、ポリアデニル化部位、選択マーカー領域、およびレプリコンを含んでもよい。また、発現ベクターには、必要に応じて、通常使用される遺伝子増幅用遺伝子（マーカー）が含まれてもよい。
【００８０】
細菌でタンパク質を発現するためのプロモーター／オペレーター領域は、プロモーター、オペレーター、およびシャイン・ダルガーノ（ＳＤ）配列（例えば、ＡＡＧＧ）を含む。例えば、宿主がエシェリヒア属である場合、好ましくは、Ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌａｍｂｄａ．ＰＬプロモーター、ｂ  １ｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーターなどを含む。宿主が哺乳動物細胞などの真核細胞である場合、その例としては、ＳＶ４０由来プロモーター、レトロウイルスプロモーター、ヒートショックプロモーターなどがある。もちろん、プロモーターは上記の例に限定されない。また、発現にはエンハンサーを使用することが効果的である。好ましい開始コドンは、例えば、メチオニンコドン（ＡＴＧ）である。終止コドンとしては、一般的に使用される終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＡＡ、ＴＧＡ）が例示される。通常、使用される天然または合成ターミネーターがターミネーター領域として使用される。ＳＶ４０に由来するものなど、当技術分野で通常使用されるエンハンサー配列、ポリアデニル化部位、およびスプライシングジャンクションも使用することができる。通常用いられる選択マーカーは、常法に従って使用することができる。その例は、テトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンなどの抗生物質の耐性遺伝子である。
【００８１】
本明細書で使用される発現ベクターは、少なくとも上記プロモーター、開始コドン、タンパク質をコードするＤＮＡ、終止コドン、ターミネーター領域を適切なレプリコンに連続的かつ環状に連結することにより調製することができる。必要に応じて、制限酵素による消化やＴ４  ＤＮＡリガーゼによるライゲーションなどの方法で、適切なＤＮＡ断片（リンカー、制限酵素サイトなど）を使用することができる。形質転換体は、上記の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「異種配列」または「異種核酸」という用語は、特定の宿主細胞にとって外来の供給源から生じる核酸、または同じ供給源からの場合は、その元の形態から修飾されている核酸を指す。したがって、細胞内の異種発現カセットは、特定の宿主細胞に内因性ではない発現カセットであり、例えば、染色体ＤＮＡではなく発現ベクターからのヌクレオチド配列に連結され、異種プロモーターに連結され、レポーター遺伝子などに連結される。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「炎症」という用語は、異常または異常調節された炎症反応により恒常性が破壊される急性および慢性障害を指す。これらの症状は、酸化ストレス、ケモカイン、サイトカイン、血液／組織バリアの破壊、自己免疫疾患、またはホメオスタシスメディエーターの過剰な量の細胞傷害誘発性（ｐｒｏ−ｃｅｌｌ  ｉｎｊｕｒｙ）、炎症誘発性／ディスラプターを誘導する白血球、単球／マクロファージもしくは実質細胞に関与する他の症状を含む多数の炎症性因子によって開始および介在される。これらの疾患は、広範囲の組織や臓器で発生し、現在、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、ＴＮＦモジュレーター、ＣＯＸ−２阻害剤などの抗炎症薬によって治療される。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「インビボイメージング」という用語は、生命の犠牲を必要とせずに、生物の構造的、機能的、または生理学的状態を検査可能な方法またはプロセスを指す。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「ルシフェラーゼ」という用語は、発光反応を触媒するオキシゲナーゼを指す。例えば、細菌のルシフェラーゼは、フラビンモノヌクレオチドと脂肪族アルデヒドの酸化を触媒し、その結果、反応によって光が発生する。海洋節足動物に見られる別のクラスのルシフェラーゼはキプリディナルシフェリンの酸化を触媒し、別のクラスのルシフェラーゼは甲虫類のルシフェリンの酸化を触媒する。したがって、「ルシフェラーゼ」は、生物発光反応を触媒する酵素または発光タンパク質を指す。ホタルやウミシイタケルシフェラーゼなどのルシフェラーゼは、触媒作用を発揮する酵素であり、生物発光生成反応中は変化しない。ルシフェリンが非共有結合しているエクオリンおよびオベリン発光タンパク質などのルシフェラーゼ発光タンパク質は、生物発光生成反応中に、ルシフェリンの放出によって変化する。ルシフェラーゼは、生物に自然に存在するタンパク質、または天然に存在するタンパク質とは異なる、熱安定性やｐＨ安定性などの１つ以上の特性を持つ変異誘発によって生成される変異体などの、その変異体もしくは突然変異体である。ルシフェラーゼおよびその修飾された突然変異体または変異体はよく知られている。例えば、「レニラルシフェラーゼ」への言及は、レニラ属のメンバーから単離された酵素、または他の有虫類などの他の供給源から得られた、または合成的に調製された同等の分子を意味する。「ガウシアルシフェラーゼ」への言及は、ガウシア属のメンバーから単離された酵素を意味する。
【００８６】
「生物発光タンパク質」とは、生物発光開始分子基質に作用して生物発光を生成または放出することができるタンパク質を指す。
【００８７】
「生物発光開始剤分子」は、生物発光を生成する生物発光ドナータンパク質と反応することができる分子である。生物発光開始剤分子は、セレンテラジン、その類似体、およびその機能的誘導体を含むがこれらに限定されない。セレンテラジンの誘導体は、セレンテラジン４００ａ、セレンテラジンｃｐ、セレンテラジンｆ、セレンテラジンｆｃｐ、セレンテラジンｈ、セレンテラジンｈｃｐ；セレンテラジンｉｐ、セレンテラジンｎ、セレンテラジンＯ、セレンテラジンｃ、セレンテラジンｃ、セレンテラジンｉ、セレンテラジンｉｃｐ、セレンテラジン２−メチル、ベンジル−セレンテラジンビスデオキシセレンテラジン、ディープブルーセレンテラジン（ＤＢＣ）（米国特許第６，０２０，１９２号、同第５，９６８，７５０号および同第５，８７４，３０４号に詳細が記載されている）を含むが、これらに限定されない。  
【００８８】
本明細書で使用される場合、「マクロファージ」という用語は、古典的に活性化されたマクロファージ（Ｍ１マクロファージ）および代替的に活性化されたマクロファージ（Ｍ２マクロファージ）を指す。Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：４５１−４８３（２００９）。一般に、Ｍ１マクロファージは、１型Ｔヘルパーリンパ球（Ｔｈ１）応答を連想させる強力な公金特性を示す。対照的に、Ｍ２マクロファージは２型Ｔヘルパーリンパ球（Ｔｈ２）のような応答を促進し、より少ない炎症誘発性サイトカインを分泌し、栄養因子の合成と食作用による炎症の解決を支援する。Ｍｏｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．８：９５８−９６９（２００８）。Ｍ２マクロファージは、特定のサイトカインプロファイルによって定義される３つの異なるサブクラス、すなわちＭ２ａ、Ｍ２ｂ、およびＭ２ｃにさらに分類することができる。Ｍａｎｔｏｖａｎｉ  ｅｔ  ａｌ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２５：６７７−６８６（２００４）。Ｍ２マクロファージは一般に、ＩＬ−１２などの炎症誘発性サイトカインの産生量が少ないことと、ＩＬ−１０などの抗炎症性サイトカインの産生量が多いことを特徴とするが、Ｍ２ｂマクロファージは、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６などの炎症性サイトカイン産生量が多い（Ｍｏｓｓｅｒ、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．７３：２０９−２１２（２００３））。
【００８９】
マクロファージは、それらの微小環境によって分極化され、炎症および治癒の異なる段階に関連する異なる表現型を想定することができる。Ｓｔｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：３４２−３４９（２００５）。特定のマクロファージは、創傷治癒に不可欠である。それらは、細胞動員の初期段階および組織防御の初期段階、ならびに組織恒常性および修復の後期段階に参加する。（Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．９：２５９−２７０（２００９）。末梢血単球由来のマクロファージは、難治性潰瘍の治療に使用されてきた。Ｄａｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ。３２：６３３−６４１（１９９７）；Ｚｕｌｏｆｆ−Ｓｈａｎｉ  ｅｔ  ａｌ、Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ａｐｈｅｒ．Ｓｃｉ．Ｏ：１６３−１６７（２００４）。それらの各々は、その全体が示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「遺伝子発現のレベルを修飾する」という用語は、遺伝子の転写産物または翻訳産物の量の減少または増加のいずれかである変化を生じさせることを指す。遺伝子の転写産物は、本明細書では、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物を指すことを意図しており、スプライス前またはスプライス後のいずれのｍＲＮＡであってもよい。あるいは、「遺伝子発現のレベルを修飾する」という用語は、ｓｉＲＮＡと細胞の内容との相互作用の結果として細胞によって生成されるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの量の変化を指す場合がある。例えば、限定するものではないが、遺伝子に由来するポリペプチドの量は、対応するｍＲＮＡ種が細胞に導入されたｓｉＲＮＡとの会合の結果として分解を受けやすい場合に低減され得る。
【００９１】
「調節する」という用語は、細胞増殖、増殖、アポトーシスなどを含むがこれらに限定されない細胞機能の態様に影響を与える（例えば、促進または遅延させる）組成物の活性を指す。
【００９２】
「核酸」、「核酸配列」、または「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、ポリヌクレオチドを包含する。「ポリヌクレオチド」は、一方のヌクレオシドの３’−ヒドロキシル基と２番目のヌクレオシドの５’−ヒドロキシル基の間のホスホジエステル結合によって接続されたヌクレオチドの直線鎖を指し、次にその３’−ヒドロキシル基を介して３番目のヌクレオシドの５’−ヒドロキシル基など、ホスホジエステルバックボーンで連結されたヌクレオシドで構成されるポリマーを形成する。「修飾されたポリヌクレオチド」は、天然ヌクレオチドが修飾されたヌクレオチドで部分的に置換されているポリヌクレオチドを指す。
【００９３】
「作動可能に連結された」とは、そのように記載された構成要素が、それらの通常の機能を果たすように構成されている要素の配置を指す。したがって、コード配列に機能的に連結された所与のプロモーター（例えば、レポーター発現カセット）は、適切な酵素が存在する場合、コード配列の発現に影響を与えることができる。プロモーターまたは他の制御要素は、それらがコード配列の発現を指示するように機能する限り、コード配列と連続している必要はない。例えば、介在する翻訳されないが転写される配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、プロモーター配列はなおコード配列に「作動可能に連結している」と見なされ得る。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「プライマー」という用語は、増幅または複製されるＤＮＡセグメントに相補的なオリゴヌクレオチドを指す。通常、プライマーはＰＣＲで使用される。プライマーは鋳型ＤＮＡとハイブリダイズ（または「アニール」）し、ポリメラーゼ酵素によって複製／増幅プロセスの開始点として使用される。「相補的」とは、プライマー配列が鋳型と安定な水素結合複合体を形成することができることを意味する。
【００９５】
「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチドの転写を指示するＤＮＡ配列である。典型的には、プロモーターは、転写されるポリヌクレオチドの５’領域に、そのようなポリヌクレオチドの転写開始部位の近位に位置することができる。より一般的には、プロモーターは最初のエクソンの上流の領域として、より典型的には、多数の転写開始部位の最初の上流の領域として定義される。しばしばプロモーターは、プロモーターの３’側にある相補的ＤＮＡ鎖の各々上に位置する遺伝子の転写を指示することができる。言い換えると、多くのプロモーターは双方向性を示し、いずれかの方向に存在する場合、下流の遺伝子の転写を指示することができる（すなわち、遺伝子のコード領域に対して５’から３’または３’から５’）。さらに、プロモーターはまた、上流要素などの少なくとも１つの制御要素を含んでもよい。そのような要素は、上流活性化因子領域（ＵＡＲ）と、場合により合成上流要素などのポリヌクレオチドの転写に影響を与える他のＤＮＡ配列を含む。本開示の実施形態での使用に有利なプロモーターには、ＡＫＴ１プロモーター、バーシカンプロモーター、ＭＩＦプロモーター、Ｙｍ１プロモーター、ＣＤ２０６プロモーター、ＦＩＺＺ１プロモーター、ＤＣ−ＳＩＧＮプロモーター、ＣＤ２０９プロモーター、ＭＧＬ−１プロモーター、デクチン−１プロモーター、ＣＤ２３プロモーター、ガレクチン−３プロモーター、Ｍｅｒチロシンキナーゼプロモーター、ＡＸＬ受容体タンパク質プロモーター、ＧＡＳ−６プロモーター、ＮＯＳ−２プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、ＣＤ８６プロモーター、ＣＣＬ１８プロモーター、ＣＤ１６３プロモーター、ＭＭＲ／ＣＤ２０６プロモーター、ＣＤ２００Ｒプロモーター、ＴＧＭ２プロモーター、ＤｅｃｏｙＲプロモーター、ＩＬ−１Ｒ  ＩＩプロモーター、ＩＬ−１０プロモーター、ＴＧＦ−ベータプロモーター、ＩＬ−１ｒａプロモーター、ＣＣＬ１７プロモーター、ＣＣＬ２プロモーター、またはＣＣＬ２４プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマー鎖を指す。「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、ポリペプチドという用語と互換的に使用され、アミノ酸のポリマー鎖も指す。「ポリペプチド」という用語は、天然または人工のタンパク質、タンパク質断片およびタンパク質配列のポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドは、モノマー性またはポリマー性であってもよい。
【００９７】
「ｑＰＣＲ」という用語は、リアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応を指し、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ／ｑＰＣＲ／ｑｒｔ−ＰＣＲ）とも呼ばれ、標的ＤＮＡ分子の量を増幅して同時に検出するために使用される。量は、コピー数または入力ＤＮＡに対して正規化された相対量として表現することができる。検出は、反応産物がその終点で検出される標準的なＰＣＲとは異なり、反応がリアルタイムで進行するにつれて進行する。リアルタイムＰＣＲで産物を検出するための２つの一般的な方法は、（１）二本鎖ＤＮＡを挿入する非特異的蛍光色素、および（２）蛍光レポーターで標識化され、検出後の配列特異的オリゴヌクレオチド相補的なＤＮＡターゲットへのハイブリダイゼーション、である。
【００９８】
用語「形質転換」は、外因性ＤＮＡが宿主細胞に入るプロセスを指す。形質転換は、当技術分野で周知の様々な方法を使用して、自然または人工条件下で起こる。形質転換は、原核生物または真核生物の宿主細胞に外来核酸配列を挿入するための任意の既知の方法に依拠する。この方法は、形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクション、および粒子衝撃を含み得るがこれらに限定されない。そのような「形質転換された」細胞には、挿入されたＤＮＡが自律複製プラスミドとして、または宿主染色体の一部としてのいずれかで複製することができる安定に形質転換された細胞が含まれる。また、挿入されたＤＮＡまたはＲＮＡを限られた時間一過的に発現する細胞も含まれる。
【００９９】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）には標準的な技術を使用することができる。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように実施することができる。前述の技法および手順は、本明細書全体にわたって引用および考察される様々な一般的でより具体的な参考文献に記載されている従来の方法に従って一般に実行することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ、ＮＹ）を参照。
【０１００】
「ベクター」という用語は、リンクされている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができる。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが機能的に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般的に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるため、交換可能に使用され得る。しかしながら、さらなる実施形態は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などのそのような他の形態の発現ベクターを含む。
【０１０１】
考察
現在の内因性バイオマーカーベースの癌テストは、少なくとも一部は血液からの迅速なバイオマーカーのクリアランス、健常な組織からの高いバックグラウンドシグナル、または交絡する疾患状態、および末梢循環の比較的低い濃度により、初期の悪性または前悪性の段階で疾患を確実に検出するために必要な感度と特異性に欠けている。
【０１０２】
疾患検出のための内因性バイオマーカーの検出および定量化への従来の依存に代わる診断戦略は、疾患の存在下で選択的に活性化され、続いて体液のイメージングまたはサンプリングのいずれかによって検出可能なシグナルを生成する外因性プローブの全身送達である。それらは、例えば、たまたま疾患に関連する内因性バイオマーカーの免疫学的検出可能性によって制限されないため、これらの活性化可能な外因性プローブを使用して疾患を検出するアプローチは、内因性をバイオマーカー使用するアプローチよりも高い感度とシグナル対雑音比を持っている可能性がある。これまでのところ、合成バイオマーカー戦略は、（ｉ）プローブの生体適合性、（ｉｉ）疾患の多様な部位へのプローブの効率的な送達、（ｉｉｉ）生化学的に複雑な疾患環境の多数の機能をアッセイするプローブの能力、または（ｉｖ）空間位置情報と患者サンプルからのはい／いいえの回答の両方を提供する能力、のいずれかによって制限されていた。
【０１０３】
本開示は、疾患の超高感度検出のための新しい細胞ベースのインビボセンサープラットフォームを提供する遺伝子改変免疫細胞の実施形態を包含する。「腫瘍関連」代謝プロファイルを採用すると、同系マクロファージの養子移入は合成バイオマーカーを生成するように改変される。場合によっては、このプラットフォームは２５〜５０ｍｍ３の小さな腫瘍の検出を可能にし、炎症モデルでの免疫学的応答を効果的に追跡し、臨床的に使用される腫瘍再発のバイオマーカーよりも感度が高いである。この技術は、早期の癌検出に対する高度に生体適合性があり、臨床的に翻訳可能なアプローチを確立し、癌を含むがこれに限定されない多くの疾患状態のモニタリングのための改変免疫細胞の使用のための概念的フレームワークを提供する。
【０１０４】
内因性のバイオマーカーでは、初期段階で疾患を検出し、または出現部位を確実に特定することができないため、疾患活性化可能なプローブは、疾患の早期発見、特定、モニタリングへの有望なアプローチであり続ける。本開示は、診断センサーとして改変免疫細胞を使用する、疾患の早期検出のための新規のプラットフォーム技術を提供する。マクロファージにおける疾患固有の代謝変更を活用することにより、免疫細胞センサーが少なくとも直径４ｍｍの腫瘍を検出することができ、臨床で使用されている腫瘍の再発／発生のバイオマーカーよりも高い感度を示すことが示される。本開示の改変マクロファージによって検出可能な２５〜５０ｍｍ３の腫瘍体積および直径は、現在の臨床ＰＥＴ分子イメージングの検出限界（それぞれ約２００ｍｍ３および７ｍｍ）を下回っており、このことは、マクロファージが初期の腫瘍形成におけるそれらの代謝状態に移動し、それを変更することができ、小さな腫瘍の診断センサーとして有利であることを示す。さらに、炎症のモデルを通じて、そのようなセンサーが高い特異性を潜在的に達成し、癌以外の病状のモニタリングに有用に適用することができることが示される。
【０１０５】
したがって、本開示は、元々患者から単離されていてもされていなくてもよい、改変された（例えば遺伝子修飾された）マクロファージ細胞の実施形態を包含する。場合によっては、遺伝子修飾は、腫瘍特異的代謝因子によって誘導可能な遺伝子プロモーター／エンハンサーの発現制御下で検出可能な薬剤（例えば、検出可能なポリペプチドまたは合成ＲＮＡ）をコードする遺伝子発現ベクターを細胞に導入することによって達成される。腫瘍特異的代謝因子によって誘導可能な遺伝子プロモーター／エンハンサーは、マクロファージが腫瘍の存在下にあるときにＭ２マクロファージで誘導されるＡＲＧ１の調節配列を含んでもよい。サイトカインと他の腫瘍媒介因子、例えば、酸性度の増加は、ＡＲＧ１のプロモーター活性を誘導することがある。
【０１０６】
したがって、例えば、ＡＲＧ１の発現制御下で検出可能な薬剤をコードする核酸を配置すると、改変マクロファージが腫瘍に接触するか、または腫瘍のすぐ近くにあるときに検出可能な薬剤の発現がもたらされることが見出されている。マクロファージから血流に分泌され得る検出可能な薬剤の選択は、血液サンプル中の薬剤の検出を可能にし、それにより、患者における腫瘍の存在の可能性を示すことがさらに見出されている。血液サンプル中の薬剤の検出は、有利には患者における腫瘍の存在を決定するための迅速かつ経済的なアプローチを許容するが、発現された産物のパーセンテージはまた、腫瘍と接触しているマクロファージ内に保持される。このこと、患者の体内の腫瘍の空間的検出をさらに可能にすることができる。
【０１０７】
本開示の１実施形態では、検出可能な薬剤は、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）であってもよく、他の検出方法と比較して腫瘍の検出の感度を大幅に向上させることが可能であることがわかった。しかしながら、本開示のコンストラクトによって発現可能な代替の検出可能な薬剤もまた可能である。したがって、例えば、本開示のある実施形態では、検出可能な薬剤は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）またはその誘導体であってもよく、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、または人工分泌型マイクロＲＮＡなどの非タンパク質バイオマーカーさえも使用することができるＳＥＡＰには検出可能な薬剤として多くの理想的な特性がある。それは、胚形成中にのみ発現する人工のＣ末端短縮型分泌型ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）であり、よって、通常は血中では見つからないユニークなレポーターであり、バックグラウンドがゼロに近いはずである（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ、（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６６：１−１０）。ＰＬＡＰと比較して、ＳＥＡＰは異常に熱安定性があり、したがって、サンプルを６５℃まで加熱すると、ＳＥＡＰを特異的にアッセイすることを可能にする（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ、（１９９４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：１７２−１７４、７６−１７７）。市販のＳＥＡＰ検出アッセイは、少なくとも４対数オーダーの濃度範囲で非常に感度が高く、検出限界はピコグラム／ｍｌの範囲である。ＳＥＡＰはまた、１）それが、マウスおよび大型動物における非ウイルス遺伝子導入の効果的な長期モニタリングを示し（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ、（２００８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２３：２１５−２２４）、２）そのヒト起源は、免疫適格性マウスのマウスＳＥＡＰ（ｍｕＳＥＡＰ）で示されたものと同様に、患者の免疫原性の可能性が低下またはゼロになる可能性があることを意味し（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、（２００１）Ｇｅｎｅ  ２７９：９９−１０８）、そして、３）ＳＥＡＰがＨＰＶ１６／１８  ＡＳ０４アジュバントワクチン投与後の抗体レベル監視するために臨床で使用されている（Ｋｅｍｐ  ｅｔ  ａｌ、（２００８）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２６：３６０８−３６１６）ことから、臨床への転用に有利なタンパク質ベースのレポーターでもある。
【０１０８】
本明細書に記載される開示の改変免疫細胞プラットフォームは、競合するアプローチが直面する臨床翻訳への多くのハードルを克服する。例えば、ナノ粒子ベースのセンサーと改変された細菌センサーは、癌、線維症、血栓症、インビボ炎症などの疾患プロセスをモニターするために使用されており、かなりの成功を収めている。これにもかかわらず、彼らの臨床翻訳は、不利な薬物動態（ＰＫ）、疾患部位への信頼性の低い配信、およびセンサーの固有の免疫原性によって妨げられている。
【０１０９】
対照的に、現在開示されている改変マクロファージプラットフォームは、病理部位への生化学的媒介の自然な応答を示し、生体適合性の問題を克服するために対象自身の（自己）細胞を使用することができる。さらに、分泌された腫瘍または疾患によって誘導されるバイオマーカーを生成する能力と、臨床イメージングの前に関連する血液検査を使用する方が経済的であり、すべての対象に対して費用と時間のかかる臨床イメージングを必要とするスクリーニング検査よりも効率的に投与することができる。さらに、現在説明されている、または臨床的に使用されている人工センサーのほとんどは、病理の単一の特徴（例えば、プロテアーゼの過剰発現、または１８ＦＤＧ  ＰＥＴの場合はワールブルグ効果）の監視に限定されている。対照的に、本明細書に記載の改変免疫細胞プラットフォームの細胞は、代謝環境の発現を変更するために、疾患環境（ＴＭＥなど）を構成する多数の複雑な物理的および生化学的合図を統合することができる。このようにして、細胞ベースのセンサーは、広範な改変なしで検出感度と特異性を改善する回路を提供するための自然の複雑な遺伝的および／または生化学的経路を活用することができる。
【０１１０】
本開示の組成物および方法は、病状、免疫細胞サブタイプ、およびレポーターコンストラクトの選択に適応するというさらなる利点を有する。概念実証はマクロファージの標準的な例を使用しており、関連するＭ２表現型は癌の診断代用として機能するが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞などの他の免疫サブタイプはすべて、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）および他の病状の存在下で主要な代謝遺伝子を調節する。したがって、患者の病理部位に移動し得るそのような免疫細胞はまた、腫瘍または疾患特異的細胞センサーとして作用するように、本開示の方法に従って改変され得る。特にＴ細胞は、翻訳の観点から魅力的である。すでにＣＡＲＴ細胞療法を受けている患者のために、診断コンストラクトをキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とともに導入することができるためである。これにより、治療中にＴ細胞の代謝を動的に評価して、残存する疾患の負担を検出し、またはＴ細胞の消耗などの臨床的に有効な表現型を監視することさえできる。さらに、Ｇｌｕｃはシンプルで高感度な検出方法が利用可能なため（例えば、ルシフェラーゼアッセイ）、Ｇｌｕｃは最初は合成バイオマーカーとして使用されるが、他の免疫原性の低い合成バイオマーカー（例えば、泌胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）または分泌合成ＲＮＡ／ｍｉｃｒｏＲＮＡ）を使用することができる。
【０１１１】
本研究では、活性化マクロファージからのＢＬＩシグナルと病理部位との共局在によって示されるように、本明細書に記載の改変マクロファージプラットフォームによって提供される空間情報は、臨床的意思決定に役立つ。ＰＥＴを使用してＨＳＶ１−ｔｋレポーター遺伝子を含む養子移入されたＣＡＲ  Ｔ細胞の追跡が報告されている。したがって、本明細書に記載の人工免疫細胞プラットフォームの実施形態は、ＧｌｕｃをＨＳＶ１−ｔｋで置き換え、Ｍ２分極の領域を視覚化するためにＰＥＴを実行し、ＢＬＩシグナルの空間分布を観察して患者の疾患状態を評価することによって適応することができる。そのようなイメージング手順の前例はすでに存在している。１つは、患者の好中球を放射性標識化し、ＳＰＥＣＴを用いてインビボで追跡するインジウム−１１１白血球スキャンを使用して、感染の可能性のある領域を特定する。または、酸化鉄ナノ粒子は、固形腫瘍における腫瘍関連マクロファージを磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）でイメージングするために使用されている。
【０１１２】
ここで説明するシステムには、免疫細胞プローブの個別開発が含まれる場合があるが、このシステムの一般的な適用性を改善するためのいくつかの選択肢がある。関心の免疫サブセットへのインビボ遺伝子送達などの手法により、細胞の単離や改変なしで診断センサーをインサイチュで生成することを可能にする。
【０１１３】
改変細胞
一過性および安定性の両方のトランスフェクション、および本明細書で利用されるような初代体細胞の多数の技術が確立されている。一過性の手法には、リポフェクション、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を介したトランスフェクション、およびリン酸カルシウムを介したトランスフェクション、エレクトロポレーション、またはヌクレオフェクションを介した核酸（例えば、本明細書に記載の合成バイオマーカーコンストラクトなどの合成遺伝子要素を有するＤＮＡプラスミドまたはＤＮＡミニサークル）の送達が含まれる。安定したトランスフェクションには、ウイルス技術と非ウイルス技術の両方が含まれる。ウイルス技術には、合成遺伝子要素（例えば、本明細書に記載の合成バイオマーカー構築物）を含むように改変された複製欠損ビリオンを用いる、レンチウイルスベース、アデノウイルスベース、またはアデノ随伴ウイルスベースの形質導入が含まれる。非ウイルス技術には、エピソーム維持要素を含むＤＮＡベクター（例えば、Ｓ／ＭＡＲを含むプラスミドまたはＣＥＬｉＤベクター）によるトランスフェクション、環状または線形合成ＤＮＡ分子のトランスフェクションおよびランダムな統合、およびＣＲＩＳＰＲによる切断および環状または線形合成ＤＮＡ分子を使用した相同性による修復が含まれる。
【０１１４】
アルギナーゼ−１の発現は腫瘍関連マクロファージを特定する
広く適用可能な診断センサーの場合、広範なヒトの癌にわたって広く存在する免疫細胞サブセットを選択することができる。ゲノムプロファイル（ｉＰＲＥＣＯＧ）データセットからの臨床転帰の免疫予測からの５，７８２個の腫瘍標本における腫瘍浸潤白血球の部分的有病率の分析は、Ｍ２マクロファージが固形腫瘍の大部分に存在する優勢な免疫細胞集団であることを示し、最大０．４３（髄膜腫）（図２Ａ）の部分存在比は本明細書に記載されたプラットフォームにおける汎癌診断センサーとしてのその有用性を示す。
【０１１５】
マウスでは、腫瘍関連Ｍ２分極は、免疫抑制微小環境の育成に関与する遺伝子産物（例えば、ＡＲＧ１）のアップレギュレーションを特徴とする。したがって、ＡＲＧ１式が腫瘍微小環境（ＴＭＥ）とのマクロファージの出会いの診断代理として使用することができるかどうかを調査した。ＴＭＥは、アシドーシス、低酸素症、ＩＬ−４およびＩＬ−１３を含むＴヘルパー２（Ｔｈ２）サイトカインの高濃度、腫瘍由来のサイトカインおよび代謝産物を特徴とする複雑なニッチである。ＢＭＤＭとＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞株の両方は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）（図２Ｂおよび２Ｃ）およびアルギナーゼ活性アッセイ（図２Ｄ）で測定した場合、ＩＬ−４とＩＬ−１３で刺激すると、それぞれ、ＡＲＧ１特異的ｍＲＮＡの発現と活性に同様の濃度依存的な増加を示した。この用量依存効果はまた、ＣＴ２６マウス結腸癌細胞株から腫瘍馴化培地（ＴＣＭ）への曝露時にも再現され、ＢＭＤＭはＡＲＧ１発現が６００±６５倍以上増加した（図２Ｂおよび２Ｃおよび２Ｄ）。この効果は、腫瘍由来のサイトカインとＴＣＭの酸性度の両方によって媒介される。この効果は腫瘍由来のサイトカインと乳酸を含む代謝中間体によって媒介されるようである（図１３）。
【０１１６】
養子移入されたマクロファージが担癌マウスの腫瘍関連表現型をとることができるかどうかを評価するために、同系の２５〜５０ｍｍ３皮下結腸直腸腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈注射する前に、ＲＡＷ２６４．７細胞をＶｉｖｏＴｒａｃｋ  ６８０（ＶＴ６８０）膜色素で標識化した。マクロファージの均一な標識がフローサイトメトリーによって確認された（図９）。標識化されたマクロファージの注射の５日後、腫瘍と脾臓を採取し、かつ内因性（ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋、ＶＴ６８０−）および養子移入（ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋、ＶＴ６８０＋）マクロファージをフローサイトメトリーにより単離した（図２Ｅ）。インビトロデータと一致して、内因性および養子移入腫瘍浸潤マクロファージはそれぞれ、肝臓ホーミングおよび常在マクロファージと比較して上昇（ｑＰＣＲによって約２００倍の増加）ＡＲＧ１レベルを示し、このことにより、養子移入マクロファージは、ホストに存在する病態に応答して代謝状態を変更できることが確認される。腫瘍体積が２５〜５０ｍｍ３であることは、マクロファージが腫瘍形成の初期に存在し、早期癌検出の有望な候補であることも示している。
【０１１７】
養子移入されたマクロファージは腫瘍微小環境に移動して蓄積する
プローブベースの診断の翻訳に対する障壁の１つは、疾患部位への非効率的な送達である。免疫細胞の動員は癌を含む多くの疾患状態の共通の特徴であるため、マクロファージセンサーは自然に悪性腫瘍の部位に移動すると考えられた。ＣＳＦ−１などの腫瘍由来サイトカインに対するマクロファージ走化性の報告と一致して、マクロファージは、２４時間トランスウェルアッセイにおいて、条件なし培地に比べてＴＣＭに対して最大４倍まで濃度依存的な移動を示した（図３Ａ）。インビボで、ＶＴ６８０標識化された養子移入マクロファージは、近赤外色素の蛍光イメージングによって視覚化されるように、５日間にわたって２５〜５０ｍｍ３の皮下結腸直腸腫瘍に移動した（図３Ｂ〜３Ｃ）。切除された腫瘍の免疫蛍光法により、マクロファージと低酸素領域との共局在が明らかになった（図１５）。蛍光シグナルは、右肩に沿った輝き線トレースによって証明されるように、ＦｌｕｃトランスフェクトＣＴ２６腫瘍からの生物発光シグナルと強く共存する（図３Ｄ）。脾臓と腫瘍の両方のマクロファージのフローサイトメトリー分析により、各部位に存在するマクロファージの２０〜２５％が養子移入（ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋、ＶＴ６８０＋）からのものであることがわかり、健常な臓器と疾患部位の両方にセンサーの有意なコロニー形成が示唆された（図２Ｄおよび３Ｅ）。
【０１１８】
募集のメカニズムを調査するために、ＣＳＦ１、ＣＣＬ２、およびＣＣＬ５などの移行に役割を果たすと説明されているケモカイン受容体の表面発現を分析した。内因性および養子移入腫瘍浸潤マクロファージは、脾臓マクロファージと比較して、同族受容体ＣＳＦ１Ｒ、ＣＣＲ２、およびＣＣＲ５の発現の増加を示した（図３Ｄ）。腫瘍への補充または維持の媒介におけるケモカインの役割を説明するために、ＣＣＬ２およびＣＳＦ１に対する中和用量の抗体を投与し、再びＶＴ６８０＋マクロファージの移動をモニターした。どちらかのケモカインの中和は、移動を大幅に減少させ、動員のメカニズムを確認した（図３Ｄ）。
【０１１９】
分泌されたバイオマーカーは、マクロファージ活性化の非侵襲的モニタリングを可能にする
マクロファージの分極の変化を非侵襲的にインビボでアッセイするために、ＡＲＧ１の活性化が、生きている対象の血液または末梢血サンプルでアッセイすることができる分泌バイオマーカーの生成に結びつくように、マクロファージが改変された。Ｇｌｕｃは主に（９５％）分泌された合成バイオマーカーであり、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼと比較して高感度を示し、２０分の半減期で血清中で安定しており、活性化プロセスの動的モニタリングを可能にし、ＧｌｕｃのＢＬＩによるＡＲＧ１マクロファージ発現の空間追跡の可能性も提供する細胞内に捕捉された。したがって、分泌されたＧｌｕｃの上流約３．８ｋｂ  ＡＲＧ１プロモーターとエンハンサー領域がクローン化され、Ｍ２分極の非侵襲的モニタリングのためのｐＡＲＧ１−Ｇｌｕｃレポーターコンストラクトの安定した発現を伴うＲＡＷ２６４．７細胞株に改変された。
【０１２０】
ＴＣＭ、ＩＬ−４、およびＩＬ−１３を使用したエクスビボ活性化時間経過実験では、培養液のサンプリングにより、Ｇｌｕｃ発光シグナルの濃度と時間依存性が、２４時間以上で、ＩＬ−４／ＩＬ−１３について最大２倍、「高」ＴＣＭの場合は６０倍に増加したことが明らかになった（図４Ａ）。
【０１２１】
改変されたマクロファージセンサーは５０ｍｍ３未満の腫瘍を検出することができる。
改変されたマクロファージプラットフォームがインビボで腫瘍を検出することができるかどうかを判断するために、ＡＲＧ−１型のセンサーを含む上記のマクロファージを腫瘍保有マウスに静脈内導入し、続いて活性化をモニターするためにマウスの血漿をＧｌｕｃについてアッセイした。転移性乳癌の同系モデルが採用され、静脈内注射された４Ｔ１細胞は最初に肺に限局性の微小腫瘍を形成し、その後脳、肝臓、骨に影響を与える転移性疾患が出現した。センサーは、１００％の感度と特異性（曲線下面積（ＡＵＣ）＝１．００、ｎ＝１１、ｐ＝０．００１８）で健常な対照から転移性疾患を識別し、注射２４時間後に血漿をサンプリングした（図４Ｂ）。一時的にトランスフェクトされたＢＭＤＭでも同様の結果が得られ、初代マクロファージでもアプローチの実行可能性が実証された（図１０Ａ）。このタイムスケールは、インビボでの移動と生体外でのマクロファージの活性化の動態と一致している。さらに、Ｇｌｕｃは主に分泌型バイオマーカーであるが、細胞内に濃縮されたままの約５％をＢＬＩで視覚化して、活性化マクロファージを空間的に追跡することができる。別々の日に活性化マクロファージ（Ｇｌｕｃ）と転移（Ｆｌｕｃ）の両方をイメージングすると、脳内（図４Ｃ、図１０Ｂ）を含む、活性化マクロファージと転移部位の顕著な共局在が明らかになり、マクロファージセンサーが効果的に示された病気の場所へのトラフィックと非常に制限された活性化パターンを受ける。特に、腫瘍負荷が４Ｔ１注射後早期に触知不可能な肺微小腫瘍に局在化した場合（図４Ｂ、図１１）、センサーはおそらく高酸素化肺での不十分な発達ＴＭＥによる疾患を検出しなかった。
【０１２２】
センサーで検出可能な腫瘍体積の大きさを決定するために、上記のマクロファージセンサーを、体積が０〜２５０ｍｍ３のＣＴ２６大腸癌の皮下モデルに適用した。臨床ＰＥＴは、直径約７ｍｍの腫瘍結節および約２００ｍｍ３の体積を確実に検出することができる。センサーの注入日に腫瘍のサイズをノギス（図１２Ａおよび１２Ｂ）で測定し、翌日には血漿を測定した。キャリパー測定値は、ＢＬＩで測定された腫瘍サイズと相関していた（ｒ２＝０．９１８、図１２Ａ）。センサー注入後２４時間で、体積が５０ｍｍ３を超える腫瘍（例えば、５０〜２５０ｍｍ３の平均が１１７．１９＋／−７４．８７ｍｍ３）を１００％の感度と特異性で検出でき得た（ＡＵＣ＝１．００、ｎ＝６、ｐ＝０．０００９）（図３Ｄ）。特に、体積が２５〜５０ｍｍ３（平均３９．４３＋／−７．９０）の腫瘍は、ＡＵＣ＝０．８４９（９５％ＣＩ  ０．６２０−１．００、ｎ＝６、ｐ＝０．０２１）の健常対照者からも区別され、本明細書に記載の活性化可能な免疫センサーは、現在臨床ＰＥＴで可能であるよりも低い検出限界を達成する。
【０１２３】
２５ｍｍ３未満の腫瘍体積は確実に検出されなかった。体積が約１５００ｍｍ３を超える目に見える壊死性腫瘍または潰瘍性腫瘍もセンサーでは検出されなかった（図１２Ｂ）。おそらくＴＭＥの存在下でさえ、血管新生が不十分な壊死性コアへの免疫浸潤が限られているためである。ＧｌｕｃのイメージングによりＣＴＺ基質代謝から非特異的な肝臓シグナルが得られたが、活性化マクロファージと腫瘍部位との共局在がＢＬＩで観察され（図４Ｅ）、右肩を横切る放射輝度ライントレースによって確認された（図４Ｆ）。
【０１２４】
この限局性の疾患モデルにより、活性化の特徴を調査することもできた。これは、癌の播種の変数が追加された転移モデルでは、他の方法では調査することが難しいためである。例えば、センサー注入後４日間までＧｌｕｃの血漿を分析すると、健常なマウスと腫瘍を有するマウスの両方で２４時間後にシグナルの一貫した低下が明らかになった（図１２Ｃ）。これは、おそらく、最初の日後の合成バイオマーカーの免疫原性および促進されたクリアランスに因るものである。限局性疾患の管理モデルにおけるこれらの初期の最適化は、早期の血漿サンプリングを主張し、将来の研究でさらに細胞数の線量を最適化するためのフレームワークを提供する。
【０１２５】
アプローチの翻訳可能性のさらなる証拠として、１次ＢＭＤＭによる腫瘍検出も実証された。単球は骨髄から生成され、表現型は成熟マーカーＦ４／８０の中間発現をアッセイすることで確認された（図４Ｇ）。ｐＡＲＧ１−Ｇｌｕｃコンストラクトは８０％を超える効率でエレクトロポレーションによって導入され（図７Ｂ）、得られたセンサーは「低」および「高」の両方のＴＣＭによって約１０倍活性化された（図４Ｈ）。ＢＭＤＭセンサーはまた、ＡＵＣが０．８１３（９５％ＣＩ  ０．５５５〜１．００、ｎ＝４、ｐ＝０．０８９４）で、インビボで６０〜７５ｍｍ３の低いＣＴ２６腫瘍体積（ｎ＝４、ｐ＝０．０３４２）を検出した（図．４Ｉ）。ＢＭＤＭを注射したマウスの腫瘍は初期の退行（４日目、ｐ＝０．０５８）を示したが、その後の成長動態の変更は見られず（図１６）、センサーＭ２分極が腫瘍の進行を加速しないようである。
【０１２６】
炎症と創傷治癒のモデルにおけるマクロファージセンサー
炎症は、癌の診断にとって重要な交絡疾患である。このようにして、炎症のインビトロおよびインビボモデルにおける炎症誘発性サイトカインへの曝露時の偽陽性センサー活性化の程度が調査された。免疫浸潤は多くの病的状態の特徴であるが、診断マーカーとして代謝マーカーを使用することの利点の１つは、様々な疾患状態での厳密に制御された明確な転写調節である。炎症誘発性Ｍ１マクロファージのよく特徴付けられたプロファイルと一致して、ＲＡＷ２６４．７マクロファージは、ＩＦＮγ／ＬＰＳやＴＮＦαなどの炎症性サイトカインによる刺激時に、ｑＰＣＲによる比較的最小限の上昇（３倍未満）またはＡＲＧ１発現の抑制を示した（図．５Ａ）。ＲＡＷ２６４．７  ＡＲＧ１発現は同様にＴＮＦαの影響を受けなかったが、ＩＦＮγ／ＬＰＳによって誘導された。高用量のＩＦＮγまたはＴＮＦαはＡＲＧ１発現に有意な影響を与えなかったため、この誘導は主にＬＰＳによって媒介される。これらと同じ炎症性メディエーターを用いるｐＡＲＧ１−Ｇｌｕｃ改変ＢＭＤＭおよびＲＡＷ２６４．７マクロファージの刺激は、Ｇｌｕｃ分泌の増加を最小限に抑えた（図５Ｂ）。
【０１２７】
センサーの特異性は、テレビン油で誘導された後肢の炎症のモデルでも評価された。テレビン油の筋肉内注射後１〜１０日間の後脚の筋肉の組織学は、炎症と創傷治癒の定型的なタイムラインを明らかにした、すなわち、１〜３日目は、深い好中球浸潤を特徴とする急性炎症フェーズを反映し、７〜１０日目は、デブリを除去するマクロファージのより大きな浸潤と炎症の回復を反映した（図５Ｃ）。本開示のマクロファージセンサーの１日目（急性炎症中およびテレビン油と同じ日）の静脈内投与は、２４時間後に有意に上昇した血漿Ｇｌｕｃを生じず、免疫センサーの特異性を裏付けた（図５Ｄ）。
【０１２８】
さらに、Ｍ２マクロファージは創傷治癒と炎症の回復にも関与しているため、回復フェーズ中の７日目のセンサーの注入をテストして、注入部位にセンサーの活性化があるかどうかを確認した。記載されているＭ２活性化の生態と創傷治癒プロセス中のＡＲＧ１誘導と一致して、センサーがこのフェーズ中に注入されたとき、血漿Ｇｌｕｃは有意に上昇した（ＡＵＣ＝０．９２９、９５％ＣＩ  ０．７８３〜１．００、ｎ＝８、ｐ＝０．００６）。活性化のこれらの時間的傾向は、センサー注射の２４時間後に摂取したＧｌｕｃのＢＬＩでも明らかであった（図５Ｅ）。
【０１２９】
同様の傾向は、ＬＰＳ誘導の肺炎症モデルでＢＭＤＭセンサーを使用して観察された。組織学はこのモデルの動態を確認し、急性炎症と７時間での好中球の流入、創傷治癒と４８時間でピークを迎えるマクロファージの流入、７２時間で健常な肺胞形態が徐々に回復することを明らかにした（図５Ｆ）。血漿サンプリングの７、２４、４８、または７２時間前にＬＰＳを鼻腔内投与すると、これらの動態が再現される。７時間の時点で急性炎症中に血漿Ｇｌｕｃは上昇しなかったため、センサーの特異性のさらなる証拠が得られた。予想通り、血漿Ｇｌｕｃは２４時間で創傷治癒中に徐々に上昇し（ＡＵＣ＝０．７７１、９５％ＣＩ  ０．５０１〜１．００、ｎ＝６、ｐ＝０．０９３）、最終的に４８時間でピークに達した（ＡＵＣ＝０．９７５、９５％ＣＩ  ０．９００〜１．００、ｎ＝５、ｐ＝０．００５４）（図５Ｇ）。レベルはベースラインに向かって７２時間まで減少し始め（ＡＵＣ＝０．７９２、９５％ＣＩ  ０．５４０〜１．００、ｎ＝６、ｐ＝０．０７１）、正常な肺構造が回復した。
【０１３０】
共存する炎症がインビボで腫瘍を検出するセンサーの能力に影響を与える能力も調べた。転移性４Ｔ１のモデルを採用すると、ＢＭＤＭセンサーを使用した場合、ＬＰＳ誘導急性肺炎症の不在下（ＡＵＣ＝０．９７５、９５％ＣＩ  ０．９００〜１．００、ｎ＝５、ｐ＝０．００５４）または存在下（ＡＵＣ＝１．００、９５％ＣＩ  １．００〜１．００、ｎ＝４、ｐ＝０．００６６）でも血漿Ｇｌｕｃに有意差はなかったことが観察された（図５Ｈ）。活性化されたＢＭＤＭセンサーのＢＬＩは同様に影響を受けなかった（図５Ｉ）。
【０１３１】
急性炎症時のマクロファージのイメージングでは活性化や局所的な偏りは明らかにされなかったが、右後肢のマクロファージの分極は、回復期に容易に観察できた。データは、ここで説明する免疫センサーが癌（急性炎症）の最も交絡する病状を回避することができる一方で、早期の癌検出の使用には禁忌となるであろう病的状態のコホート（創傷治癒など）があることを示している。あるいは、マクロファージ表現型シフトの頑健性は、創傷治癒のモニタリングにおける用途を含む、腫瘍検出以外の免疫センサーの拡張された使用を主張する。特定の適用はまた、プロモーターの選択に影響を及ぼし、ｐＡＲＧ１以外のプロモーターの選択により、癌の早期発見のための特異性がさらに高まる可能性がある。
【０１３２】
マクロファージセンサーは臨床的に使用されている腫瘍再発のバイオマーカーよりも優れている
最後に、免疫細胞センサーの臨床的関連性の証拠として、マクロファージセンサーが、臨床的に使用されている再発／発生のバイオマーカーよりも早く腫瘍の存在を検出する能力を評価した。免疫センサーはまずこれらの適応症に臨床的に翻訳される可能性が高いため、センサー感度を、大腸癌の治療モニタリングおよび疾患再発の検出に使用される臨床バイオマーカーである癌胎児性抗原（ＣＥＡ）と比較した。ＣＥＡ分泌天然マウス細胞株の明らかな欠如を説明するために、ＢＡＬＢ／ｃＮＵ／ＮＵマウス（ｎ＝７）の皮下局在で（ＣＥＡを放出する）ＣＥＡ分泌ヒト細胞株ＬＳ１７４Ｔを使用した結腸直腸腺癌の皮下モデルが開発された。腫瘍の平均体積が２５ｍｍ３を超えたら、腫瘍のサイズをノギスで測定し、血漿を採取してＣＥＡが酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で検出可能かどうかを確認した。この日の２４時間前にマクロファージセンサーを注入し、同じ血漿サンプルからＧｌｕｃレベルも測定した。その後、ＣＥＡの血漿を３日ごとに監視した。
【０１３３】
腫瘍の増殖は指数関数的に続き、腫瘍が平均体積１３６．６２＋／−１１０．７１ｍｍ３であった場合、ＣＥＡは血漿採取の２日目（４日目）までに検出可能であった（図６Ａおよび６Ｂ）。最初の血漿サンプリング中に、平均体積４４．８２＋／−４０．１２ｍｍ３（４日目より６７％小さい）の腫瘍は、ＣＥＡを使用して統計的有意性で検出できなかったが、マクロファージセンサーからのＧｌｕｃ測定に基づいて識別された（図６Ｃ）。これは、ＣＥＡで０．８２９（９５％ＣＩ  ０．５９０〜１、ｐ＝０．０６２）からマクロファージセンサーで０．９１４（９５％ＣＩ  ０．７３８〜１．００、ｐ＝０．０１９）に改善されたＡＵＣにも反映されている（図６Ｄ）。臨床的に使用されているバイオマーカーを上回るセンサーの能力は、モデルの固有の制限を考えると、特に有望である。１つには、ＮＵ／ＮＵモデルには、そうでなければ腫瘍へのマクロファージ移動の媒介およびＴＭＥの形成に寄与する内因性免疫細胞の手掛かりが欠けている。さらに、ＬＳ１７４Ｔは、ＡＴＣＣによって特徴付けられる２番目に高いＣＥＡ発現細胞株であり、マクロファージセンサーによる早期検出の向上は、バイオマーカーをあまり積極的に放出しない腫瘍モデルでさらに顕著になる可能性がある。
【０１３４】
次に、本明細書に記載の改変免疫細胞センサーの感度を、２番目の診断モダリティである無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の感度と比較した。ここで説明するセンサーは２５〜５０ｍｍ３のＣＴ２６腫瘍を検出することができるため（図４Ｄ）、ｃｆＤＮＡ濃度の定量化または血漿中の変異の検出のいずれかによって検出することができる最小サイズの腫瘍が決定された。ＣＴ２６細胞株の変異のデータベースを使用して、２つの欠失が特定され、対立遺伝子頻度限界がそれぞれ０．１％と１％でｑＰＣＲアッセイが設計された。これは、既存のシーケンス手法の感度と同様である（図１７）。
【０１３５】
ｃｆＤＮＡ濃度は、腫瘍が１５００〜２０００ｍｍ３の体積に達するまで、腫瘍担持マウスと健常なマウスを区別できなかった（図６Ｅ）。同様に、腫瘍が最小容積の１３００ｍｍ３に達するまで、どちらの欠失変異も血漿中で検出できなかった（図６Ｆ）。私たちのモデルの一般化可能性は、腫瘍の血管新生、細胞死の速度、腫瘍のＤＮＡ放出の速度などの変数によって制限されるが、データは、ここで説明するマクロファージセンサーがｃｆＤＮＡで可能な大きさよりも１桁小さい腫瘍を検出することができることを示す突然変異についての先見的な知識が与えられた。
【０１３６】
キット
本開示はまた、本開示の１つ以上の化合物を含むキットを企図する。本開示の態様では、本開示のキットは容器を含む。特定の態様では、本開示のキットは、容器と、緩衝液を含む第２の容器とを含む。キットには、バッファーおよび希釈剤、フィルター、針、シリンジ、およびここに開示された方法を実行するための指示を含む添付文書を含むがこれらに限定されない、商業的およびユーザーの観点から望ましい他の材料がさらに含まれる場合がある（例えば、本明細書に開示される疾患を治療するための方法）。本開示のキット中の医薬品または製剤は、本明細書に開示されている製剤または組成物のいずれかを含んでもよい。
【０１３７】
本開示の１態様は、遺伝子修飾免疫細胞を受容する動物またはヒト対象における病的状態によって誘導される代謝変化に応答して検出可能な薬剤を発現する異種核酸を含む遺伝子修飾免疫細胞の実施形態を包含する。
【０１３８】
本開示のこの態様のある実施形態では、免疫細胞は、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、または樹状細胞であってもよい。
【０１３９】
本開示のこの態様のある実施形態では、異種核酸は、検出可能な薬剤をコードする核酸配列に作動可能に連結された遺伝子発現調節領域を含む少なくとも１つの遺伝子発現カセットを含み得、遺伝子発現調節領域は、遺伝子修飾免疫細胞の代謝変化に応答して、検出可能な物質の発現を誘導する。
【０１４０】
本開示のこの態様のある実施形態では、異種核酸は、核酸ベクターであってもよい。
【０１４１】
本開示のこの態様のある実施形態では、異種核酸はプラスミドであってもよい。
【０１４２】
本開示のこの態様のある実施形態では、遺伝子発現調節領域は、遺伝子プロモーター領域を含むことができる。
【０１４３】
本開示のこの態様のある実施形態では、遺伝子発現調節領域は、遺伝子特異的エンハンサーをさらに含むことができる。
【０１４４】
本開示のこの態様のある実施形態では、遺伝子プロモーターは、ＡＲＧ１プロモーター、ＡＫＴ１プロモーター、ＣＤ１６３プロモーター、ＭＭＲ／ＣＤ２０６プロモーター、ＣＤ２００Ｒプロモーター、ＴＧＭ２プロモーター、ＤｅｃｏｙＲプロモーター、ＩＬ−１ＲＩＩプロモーター、ＩＬ−１０プロモーター、ＴＧＦ−ベータプロモーター、ＩＬ−１ｒａプロモーター、ＣＣＬ１７プロモーター、ＣＣＬ２プロモーター、またはＣＣＬ２４プロモーターであってもよい。
【０１４５】
本開示のこの態様のある実施形態では、検出可能な作用物質は、ポリペプチドまたは分泌可能な核酸であってもよい。
【０１４６】
本開示のこの態様のある実施形態では、検出可能なポリペプチドはガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）であってもよい。
【０１４７】
本開示のこの態様のある実施形態では、検出可能なポリペプチドはフェリチンであってもよい。
【０１４８】
本開示のこの態様のある実施形態では、検出可能なポリペプチドは、ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ｔｋ）であってもよい。
【０１４９】
本開示のこの態様のある実施形態では、検出可能なポリペプチドは、ドーパミンＤ２受容体のＤ８０ＲＡ変異体であってもよい。
【０１５０】
本開示のこの態様のある実施形態では、検出可能なポリペプチドは、ヒトヨウ化ナトリウムシンポーター（ｈＮＩＳ）であってもよい。
【０１５１】
本開示のこの態様のある実施形態では、検出可能なポリペプチドは、造影剤、レポーター遺伝子に相補的な結合剤、検出可能な分子を生成する酵素、または検出可能な分子の蓄積を促進するトランスポーターであってもよい。
【０１５２】
本開示のこの態様のある実施形態では、検出可能な薬剤は、分泌可能な核酸であってもよい。
【０１５３】
本開示のこの態様のある実施形態では、異種核酸は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有することができる。
【０１５４】
本開示のこの態様のある実施形態では、遺伝子発現調節領域は、遺伝子修飾免疫細胞における腫瘍特異的代謝変化に応答して、検出可能な薬剤の発現を誘導することができる。
【０１５５】
本開示のこの態様のある実施形態では、遺伝子組み換え免疫細胞における腫瘍特異的代謝変化は、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、肺癌、黒色腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、子宮頸癌、甲状腺癌、胃癌、脳幹神経膠腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫、膠芽腫、上衣腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、胚細胞腫瘍、頭蓋外癌、ホジキン病白血病、肝癌、髄芽腫、神経芽腫、脳腫瘍、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、松果体腫瘍、視経路および視床下部膠腫、ウィルムス腫瘍、食道癌、有毛細胞白血病、腎臓癌、口腔癌、膵臓癌、皮膚癌、ならびに小細胞肺癌からなる群から選択される癌によって誘導される。
【０１５６】
本開示のこの態様のある実施形態では、遺伝子修飾免疫細胞における病態特異的代謝変化は、炎症からでもよい。
【０１５７】
本開示の別の態様は、遺伝子修飾免疫細胞を生成する方法であって、病理応答性免疫細胞集団を動物またはヒト対象から単離するステップと、遺伝子修飾免疫細胞を受容する動物またはヒト対象の病的状態によって誘導される代謝変化に応答して検出可能な薬剤を発現する異種核酸で、単離された病理応答性免疫細胞集団を形質転換するステップと、を含む方法の実施形態を包含する。
【０１５８】
本開示のこの態様のある実施形態では、病変は腫瘍であってもよい。
【０１５９】
本開示のこの態様のある実施形態では、腫瘍応答性免疫細胞はマクロファージである。
【０１６０】
本開示のさらに別の態様は、動物またはヒト対象における病的状態を検出する方法であって、本開示の遺伝子修飾免疫細胞の集団を含む薬学的に許容される組成物を対象に投与するステップと、動物またはヒト対象から生体液サンプルを得るステップと、生体液サンプル中の動物またはヒト対象の病的状態と接触または近接した遺伝子修飾免疫細胞によって発現される分泌可能な検出可能な薬剤の存在を検出するステップであって、当該存在は、存在は、動物またはヒトは代謝変化を誘導する病的状態を有することを示すステップとを含む方法、の実施形態を包含する。
【０１６１】
本開示のこの態様のある実施形態では、生体液は血液であってもよい。
【０１６２】
本開示のこの態様のある実施形態では、遺伝子修飾免疫細胞は、腫瘍応答性マクロファージであってもよい。
【０１６３】
本開示のこの態様のある実施形態では、病理学的状態は癌であってもよい。
【０１６４】
本開示のこの態様のある実施形態では、病的状態は腫瘍であってもよい。
【０１６５】
本開示のこの態様のある実施形態では、方法は、病的状態に隣接するか、または病的状態に付着する免疫細胞内の検出可能な薬剤からのシグナルを検出するステップと、動物またはヒトに対する検出可能なシグナルの画像を生成するステップと、動物またはヒトにおける局在化されたシグナルの位置を決定するステップとをさらに含む。
【０１６６】
ある実施形態では、方法は、分泌の不在を検出すること、およびそのような不在を使用して、病理の不在を動物またはヒト対象に割り当てることを含むことができる。
【０１６７】
本開示のさらに別の態様は、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）単離のための装置と、ＡＲＧ−１プロモーターに作動可能に連結された検出可能な薬剤をコードするプラスミドのエンドトキシンを含まない調製物とを含むキットの実施形態を包含する。
【０１６８】
本開示の別の態様は、対象の病的状態を特定する方法であって、（ａ）検出可能な薬剤をコードする核酸配列を有する異種核酸を含む遺伝子修飾免疫細胞を対象に投与するステップであって、遺伝子修飾免疫細胞は、対象の病的状態によって誘導される代謝変化に応答して検出可能な薬剤を発現するステップと、（ｂ）対象の検出可能な薬剤を検出して病的状態を同定するステップと、を含む方法の実施形態を包含する。
【０１６９】
本開示のこの態様のある実施形態では、遺伝子修飾免疫細胞における腫瘍特異的代謝変化に応答するとき、遺伝子発現調節領域は、検出可能な薬剤の発現を誘導することができる。
【０１７０】
本開示のこの態様の実施形態では、遺伝子修飾免疫細胞における腫瘍特異的代謝変化は、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、肺癌、黒色腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、子宮頸癌、甲状腺癌、胃癌、脳幹神経膠腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫、膠芽腫、上衣腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、胚細胞腫瘍、頭蓋外癌、ホジキン病白血病、肝癌、髄芽腫、神経芽腫、脳腫瘍、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、松果体腫瘍、視経路および視床下部膠腫、ウィルムス腫瘍、食道癌、有毛細胞白血病、腎臓癌、口腔癌、膵臓癌、皮膚癌、ならびに小細胞肺癌からなる群から選択される癌によって誘導することができる。
【０１７１】
本開示のこの態様のある実施形態では、遺伝子修飾免疫細胞における病態特異的な代謝変化は、炎症によるものである。
【０１７２】
遺伝子修飾免疫細胞のある実施形態では、異種核酸は複数の異なる遺伝子発現調節領域を含み、各調節領域は多種類の検出可能な薬剤をコードする複数の核酸配列に作動可能に連結されており、遺伝子発現調節領域は、病態特異的代謝変化に応答して、検出可能な薬剤の発現を誘導し、その各検出可能な薬剤のレベルは、対象の異なる状態の指標である。
【０１７３】
本開示の実施形態は、実施例ならびに対応するテキストおよび図に関連して説明されるが、本開示をこれらの説明の実施形態に限定する意図はない。逆に、その意図は、本開示の実施形態の精神および範囲内に含まれるすべての代替、修正、および均等物を網羅することである。
【実施例】
【０１７４】
実施例１
腫瘍浸潤白血球プロファイリング：様々な癌のトランスクリプトームプロファイリングによる部分的な免疫細胞の構成は、スタンフォード大学ｉＰＲＥＣＯＧデータベースから取得した。腫瘍サンプルの多数のコホート各種癌の下にリストされているため、各コホートで分析された腫瘍サンプルの数に基づいて、免疫細胞分画の加重平均が各癌について計算した。
【０１７５】
実施例２
骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）の準備とエレクトロポレーション：６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスから大腿骨と脛骨を単離し、骨髄を５ｍＬの冷ＰＢＳで洗い流した。骨髄を繰り返しピペッティングすることにより均一な溶液に再懸濁し、４０μｍフィルターに通して破片を取り除いた。３００ｘｇで５分間遠心分離した後、骨髄を氷上で５分間、ＡＣＫ溶解バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に再懸濁した。ＡＣＫをＰＢＳで１０倍に希釈し、溶液を再び３００ｘｇで５分間遠心分離した。細胞を、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％抗菌／抗真菌（Ａ／Ａ）溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）および１０ｎｇ／ｍｌのマウスコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を補充したＩＭＤＭ  １０ｍＬの（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中に４×１０６個の細胞／１０ｃｍのペトリ皿の密度でプレートし、ダウンストリーム用のセルリフターで採取する前の５日間、３７℃の加湿、５％ＣＯ２インキュベーター中で維持した。
【０１７６】
すべてのインビボ試験でＢＭＤ単球を作製するために、細胞を６×１０６個の細胞／ウェルの密度で、６ウェルのＣｏｒｎｉｎｇ．ＲＴＭ  Ｃｏｓｔａｒ．ＲＴＭ超低接着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）で、６ｍＬの２０ｎｇ／ｍＬ  Ｍ−ＣＳＦを添加した培地で播種した。５日後、付着細胞（マクロファージ）を捨て、付着していない細胞を回収した。純度は、アイソタイプ対照と比較して、Ｆ４／８０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の染色によるフローサイトメトリーで９６％を超えると判断された（図７Ａ）。
【０１７７】
一過性のトランスフェクションは、マウスマクロファージ用のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ｌｏｎｚａ，バーゼル、スイス）を使用したエレクトロポレーションと、関連するＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ２ｂデバイスでのプロトコルＹ−００１によって行った。各反応は２×１０６個のＢＭＤＭおよび１２μｇプラスミドＤＮＡを含み、平均で約４０％の効率を達成した（図７Ｂ）。
【０１７８】
実施例３
細胞株：ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ、ＣＴ２６マウス結腸癌、４Ｔ１マウス乳癌、およびＬＳ１７４Ｔヒト結腸直腸腺癌は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、１０％ＦＢＳおよび１％抗菌／抗真菌溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を補充したＤＭＥＭ（ＲＡＷ２６４．７、ＬＳ１７４Ｔ）またはＲＰＭＩ（ＣＴ２６、４Ｔ１）で培養し、加湿した５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃に維持した。ＣＴ２６  ｅＧＦＰ−ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）および４Ｔ１  ｅＧＦＰ−Ｆｌｕｃ細胞株は、レンチウイルス形質導入とそれに続く、２．５％のｅＧＦＰ発現のための３回の選別によって生成された。ガウシアルシフェラーゼ（ｐＡＲＧ１−Ｇｌｕｃ）細胞株を駆動するＲＡＷ２６４．７アルギナーゼ−１プロモーターは、リポフェクタミン３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によるトランスフェクションと、ｅＧＦＰ発現の最大２．５％に対する３回の選別によって生成された。
【０１７９】
実施例４
インビトロマクロファージ活性化：マクロファージ（ＲＡＷ２６４．７またはＢＭＤＭ）を２．５ｍＬの培地中の６ウェルプレートに１×１０６個の細胞／ウェルの密度で播種した。２４時間後、培地を腫瘍馴化培地（ＴＣＭ）に置き換えるか、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、またはインターフェロン癌マ（ＩＦＮγ）で補充した。「高」および「低」のＴＣＭは、６ウェルプレートのウェルあたり２．５ｍＬの培地で２×１０６または３×１０６個のＣＴ２６細胞をそれぞれ２４時間培養することで生成された。馴化培地を３００ｘｇで１０分間遠心分離して、使用前に破片を取り除いた。２４時間後、ＲＮＡ単離のためにマクロファージを採取するか、２０μＬの培養培地を収集して、製造元の指示に従って、ＢｉｏＬｕｘガウシアルシフェラーゼアッセイキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用してＧｌｕｃをアッセイした。発光測定は、ＴＤ  ２０／２０ルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で行われ、１０秒間の積分と、相対発光単位（ＲＬＵ）で表される発光である。
【０１８０】
実施例５
アルギナーゼ（ＡＲＧ−１）遺伝子発現アッセイ：全ＲＮＡは、製造者の指示に従ってＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してマクロファージから抽出した。細胞培養におけるマクロファージからのＲＮＡの抽出は、ウェル内での直接溶解によるものであったが、腫瘍および脾臓浸潤マクロファージからの抽出は、フローサイトメトリー中にＲＮｅａｓｙ溶解バッファーに直接ソーティングすることで行われた。ｃＤＮＡ合成では、製造元の指示に従って、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用した。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）反応は、１ｘＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、１μＬの遺伝子特異的加水分解プローブ、２μＬのｃＤＮＡ、およびヌクレアーゼ不含水（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を含む２０μＬ容量であった。ＡＲＧ１およびＧＡＰＤＨのＦＡＭフルオロフォア共役加水分解プローブは市販されている（Ｂｉｏ−ｒａｄ）。ｃＤＮＡ合成とｑＰＣＲの両方のサーマルサイクリングは、以下のプロトコルをも使用してＣＦＸ９６リアルタイムシステムＣ１０００タッチサーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用した：２５℃で５分間、４６℃で２０分間、９５℃で１分間（ｃＤＮＡ合成）および９５℃で３分間、その後９５℃で１５秒間および５９℃で３０秒間の６０サイクル（ｑＰＣＲ）。すべてのサンプルの技術的複製を２回繰り返した。陰性対照は、ｃＤＮＡの代わりにヌクレアーゼを含まない水で行った。サイクル閾値は、自動的に決定された（ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．１を使用して）単一の閾値であり、すべてのＣｑ値がアッセイの線形定量可能範囲内にあった。
【０１８１】
実施例６
アルギナーゼ（ＡＲＧ−１）活性アッセイ：マクロファージをＰＢＳで１回洗浄し、回収して、１ｘＨａｌｔ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含む１００μＬのＰｉｅｒｃｅ  ＩＰ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＴｈｅｒｍＦｉｓｈｅｒ）で氷上で１０分間溶解した。ライセートを４℃、１０分間１４，０００ｘｇで遠心分離し、上澄みのアルギナーゼ活性を、製造元の指示に従って比色定量用のＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍアルギナーゼアッセイキット（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を使用して測定した。Ｓｙｎｅｒｇｙ  ４マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）で４３０ｎｍの光学密度を測定した。
【０１８２】
実施例７
インビトロ移動アッセイ：インビトロ移動アッセイは、８．０μＭのポアサイズのポリエステルメンブレン（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を備えた６．５ｍｍのＴｒａｎｓｗｅｌｌ組織培養処理インサートを使用して行った。１×１０５個のＲＡＷ２６４．７マクロファージを膜チャンバーの上部にある１００μＬのＤＭＥＭに播種し、チャンバーを「高」腫瘍馴化培地または非馴化培地のいずれかを含むウェルに沈める前に１０分間付着させた。２４時間後、インサートを取り外し、メンブレン上部の移動していない細胞を綿棒で取り除き、インサートを７０％エタノール６００μＬで１０分間固定した。膜を１５分間乾燥させた後、細胞染色のために６００μＬの０．２％クリスタルバイオレット（ＣＶ）溶液に１０分間浸した。最後に、メンブレンをＰＢＳで５回洗浄して過剰なＣＶを除去し、インサートから除去し、移動した細胞の数をＥＶＯＳイメージングシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の１０個のランダムな１０倍視野の明視野でカウントした。
【０１８３】
実施例８
インビボ移動アッセイ：６〜８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）に、１００μＬのＰＢＳ中の１×１０６個のＣＴ２６  ｅＧＦＰ−Ｆｌｕｃ細胞を右肩に皮下移植した。７日後、腫瘍の摂取を確認するために１００μＬのＰＢＳに３０ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリンを腹腔内注射した後、ＩＶＩＳスペクトル（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）デバイスで生物発光イメージング（ＢＬＩ）により腫瘍をイメージングした。腫瘍移植の１０日後、１×１０７個の同系ＲＡＷ２６４．７マクロファージを近赤外蛍光膜色素（ＶｉｖｏＴｒａｃｋ  ６８０、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で標識化し、１００μＬのＰＢＳに静脈内注射した。６４０ｎｍの励起と７００ｎｍの発光フィルターセットを用いるインビボ蛍光イメージングは、腫瘍への移行を視覚化するために、マクロファージ注入後１、３、および５日目にＩＶＩＳスペクトルを使用して行われた。関心領域（ＲＯＩ）とライントレースは、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．５．２ソフトウェアを使用して描画され、マクロファージの移動と腫瘍との共局在の範囲をそれぞれ、光子・ｓ−１・ｃｍ−２・ステラジアン−１の平均放射輝度に基づいて定量化した。
【０１８４】
実施例９
マクロファージ染色と細胞選別：切除した腫瘍をはさみで機械的に分離し、１０μｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と２５μｇ／ｍＬリベラーゼ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含む５ｍＬのハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で、３７℃で４５分間消化した。次に、溶液を冷たいＰＢＳで希釈し、７０μｍフィルターで濾過し、３００ｘｇで５分間遠心分離した後、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋１％Ａ／Ａ）に再懸濁した。採取した脾臓を、１ｍＬシリンジプランジャーの背面を使用して４０μｍフィルターに通し、ＰＢＳで洗浄した。３００ｘｇで５分間回転させた後、脾細胞を５ｍＬのＡＣＫ溶解バッファーに再懸濁し、氷上に５分間置いた。次に、赤血球を含まない画分を遠心分離し、ＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。
【０１８５】
マクロファージの選別実験では、腫瘍と脾臓の単一細胞懸濁液を、Ｆ４／８０およびＣＤ１１ｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対する各抗体０．２μｇを含む１００μＬのＨＢＳＳで染色し、生／死染色（ヨウ化プロピジウム）で染色し、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩベンチトップセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）で分類し、ＵｌｔｒａＣｏｍｐ  ｅＢｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）またはＶｉｖｏＴｒａｃｋ  ６８０のシングルステインセルを使用して補償した。陽性細胞と陰性細胞は、蛍光マイナス１つの対照を使用してゲートされた。
【０１８６】
実施例１０
レポータープラスミドの構築：プラスミドは、標準的なＰＣＲベースのクローニング技術を使用して構築され、シーケテック（カリフォルニア州マウンテンビュー）によってシーケンスされた。ｐＡＲＧ１−Ｇｌｕｃレポータープラスミド（図８）は、ガウシアＤｕｒａルシフェラーゼ（Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）のシーケンスの上流に以前に記載された−３１／−３８１０  ＡＲＧ１プロモーター／エンハンサー（Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）配列をクローニングすることにより形成された。ヌクレオチド配列は、図１８に示されるように、配列番号１で与えられる。
【０１８７】
実施例１１
マウス腫瘍モデルと血液採取：転移性乳癌の同系モデルは、２．５×１０５個の４Ｔ１  ｅＧＦＰ−Ｆｌｕｃ細胞を１５０μＬのＰＢＳでメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈注射することで確立された。疾患のローカライズされたモデルでは、マクロファージセンサー（３×１０６個の細胞ＲＡＷ２６４．７または１×１０６個のＢＭＤＭ）が、ＢＬＩによって可視化されるように、疾患が肺に限定されている可能性が高い７日後に注入された。転移モデルでは、腫瘍量が肺を超えて広がったら、１４日後にセンサーを注入した。センサー注射の２４時間後にマウスの下顎静脈から採血し、Ｋ３−ＥＤＴＡチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｂａｄｅｎ−Ｗｕｒｔｔｅｍｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で採血し、４℃で１０分間、１，０００ｘｇで遠心分離した。前述のように、２０μＬの血漿からＧｌｕｃをアッセイした。１５０μＬのＰＢＳで希釈した３５μｇのセレンテラジン（ＣＴＺ）基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の静脈内注射によるマクロファージ注射の４８時間後に、活性化マクロファージ（細胞内Ｇｌｕｃ）がＢＬＩによってイメージングされた。
【０１８８】
同系皮下大腸癌モデルは、改変マクロファージ注射前に０〜２５ｍｍ３、２５〜５０ｍｍ３または５０〜２００ｍｍ３のいずれかまで増殖させた腫瘍について移行研究に記載されているように確立された。腫瘍体積は、方程式Ｖ＝０．５×Ｌ×Ｗ２で概算された。ＬとＷは、腫瘍スフェロイドのすぐ垂直な長径と短径を表す。寸法はデジタルキャリパーで測定された。センサー注入後最大４日間、２４時間間隔でマウスは顎下静脈から採血（５０μＬ）され、注入から４８時間後に活性化マクロファージのＢＬＩイメージングが行われた。
【０１８９】
実施例１２
マウス炎症モデル：筋肉炎症のモデルでは、６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの右後肢に３０μＬのテレピン油（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を筋肉内注射した。ＰＢＳを注入した健常な対側の筋肉と、注入後１、３、７、１０日目に犠牲になったマウスの炎症を起こした筋肉を収集し、４８時間１０％ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色用に処理した以下の標準プロトコル（Ｈｉｓｔｏ−Ｔｅｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）。ＲＡＷ２６４．７マクロファージセンサー（３×１０６個の細胞）は、テレピン油注入後１日目または７日目に、１００μＬＰＢＳに静脈内注入され、５０μＬの血液採取、血漿Ｇｌｕｃ測定を行い、および細胞注入の２４時間後に活性化マクロファージのＢＬＩが発生した。
【０１９０】
急性肺炎症のＬＰＳ誘導モデルでは、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２０μＬＰＢＳに再懸濁した５０μｇのＬＰＳを鼻腔内接種した。生理食塩水の鼻腔内投与が肺の炎症を誘導する可能性があるため、対照マウスにはビヒクルを与えなかった。健常な肺またはＬＰＳ投与後７、２４、４８、７２時間の肺を固定し、前述のようにＨ＆Ｅ染色用に処理した。創傷治癒のモニタリングでは、ＢＭＤＭセンサー（３×１０６個の生きたトランスフェクト細胞）を１００μＬのＰＢＳで静脈内注射し、ＬＰＳを注射後０、２４、４８、または６５時間のいずれかで投与した。ＢＭＤＭセンサーからの血漿Ｇｌｕｃは注射の７２時間後に分析されたため、このスケジュールでは、それぞれ７２時間、４８時間、２４時間、または７時間の炎症でのセンサー活動の調査が可能になった。
【０１９１】
共存腫瘍と急性炎症のモデルでは、転移性４Ｔ１腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスにＢＭＤＭセンサーを注射し、６５時間後にＬＰＳを鼻腔内に接種した（血漿Ｇｌｕｃをアッセイする前の７時間）。採血直後に活性化ＢＭＤＭセンサーのＢＬＩを実施した。
【０１９２】
実施例１３
癌胎児性抗原放出モデル：ＬＳ１７４Ｔ細胞（５０μＬのＰＢＳで２×１０６個）を、女性免疫不全ＢＡＬＢ／ｃ  ＮＵ／ＮＵマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）の右肩に皮下移植した。腫瘍体積は、キャリパー測定によって概算され、血液（５０μＬ）は、移植後１０日目から開始して３日ごとに収集された。ＲＡＷ２６４．７マクロファージセンサー（ＰＢＳ  １００μＬに３×１０６個の細胞）に１日目（移植後１０日）に、ＧｌｕｃおよびＣＥＡ検出のために２４時間後に５０μＬの血液を採取した。血漿ＣＥＡ濃度は、検出限界２００ｐｇ／ｍＬの市販のＥＬＩＳＡキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で測定した。
【０１９３】
実施例１４
統計分析：ウェルチ修正を伴うパラメトリック対応のないｔ検定を使用して統計分析を実行した。すべての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン７．０３で実行された。
【０１９４】
実施例１５
免疫蛍光法：１０日齢のＣＴ２６腫瘍を担持する６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに、製造元の指示に従って、ＣｅｌｌＢｒｉｔｅ（商標）Ｆｉｘ  ６４０色素（Ｂｉｏｔｉｕｍ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）で標識化された１×１０７個のＢＭＤＭを静脈内注射した。４日後、腫瘍を低酸素状態の検出のために６０ｍｇ／ｋｇ塩酸ピモニダゾール（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＭＡ）の腹腔内注射の９０分後に採取した。切除直後に腫瘍を最適な切断温度の化合物（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）で凍結し、ミクロトームを使用して厚さ１０μｍの切片に切り、つや消しの顕微鏡スライド上にマウントした。次に、組織スライドを免疫蛍光ブロッキングバッファー（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）で３０分間ブロックした後、１：５０（１．２μｇ／ｍＬ）ＦＩＴＣ抗ピモニダゾール（Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ）で４℃で１晩染色した。スライドをＰＢＳで３回洗浄し、透明なマニキュアで密封する前に、ＤＡＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を備えたＰｒｏＬｏｎｇ  ＲＴＭ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用してカバースリップをマウントした。画像はＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ  ２．０−ＲＳ全体スライドイメージャー（Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｃｉｔｙ，Ｊａｐａｎ）を使用して取得された。
【０１９５】
実施例１６
無細胞ＤＮＡモデル：皮下ＣＴ２６腫瘍を０〜２０００ｍｍ３の体積まで成長させ、マウスの顎下静脈から最終的に出血させた。ＮｅｘｔＰｒｅｐ−Ｍａｇ（商標）ｃｆＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使用して血漿から無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を抽出し、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）高感度ｄｓＤＮＡアッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して定量化した。ｃｆＤＮＡがＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して主にモノヌクレオソームのサイズプロファイル（１４０〜１８０塩基対）を示し、大きなフラグメントのゲノムＤＮＡの混入があるサンプルを除外したことを確認した。プライマーおよびロックされた核酸（ＬＮＡ）プローブは、ＩＤＴ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から、表１に示す配列で入手した。
【表１】
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【０１９６】
ｑＰＣＲのサーマルサイクリングは、ＣＦＸ９６リアルタイムシステムＣ１０００タッチサーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、以下のプロトコルを使用して行われた：９５℃で３分間、続いて９５℃で１５秒および６９．４℃（ｃｈｒ７＿１３８７２０３９＿ｄｅｌ）または６７．９℃（ｃｈｒ１９＿３９２３７８４１＿ｄｅｌ）で１５秒間の５０サイクル。対立遺伝子頻度の検出実験は、健常なＢａｌｂ／ｃゲノムＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で希釈したＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＣＴ２６細胞から単離したゲノムＤＮＡを使用して行い、以前に報告された１００％（ｃｈｒ７＿１３８７２０３９＿ｄｅｌ）および９％（ｃｈｒ１９＿３９２３７８４１＿ｄｅｌ）の初期対立遺伝子頻度に基づいて、５％、１％および０．１％の対立遺伝子頻度を得た。反応には、５ｎｇのｃｆＤＮＡ、５００ｎＭのフォワードおよびリバースプライマー濃度、および合計２０μＬの容量で２００ｎＭのプローブ濃度が含まれていた。
【０１９７】
本開示の疾患活性化可能プローブは、内因性バイオマーカーが直面する生物学的および数学的制限が考慮される場合に有利である。例えば、ｃｆＤＮＡでは、変異対立遺伝子の頻度が疾患の負担とともに減少し、１０ｍＬの採血中に変異の単一コピーが存在しない可能性が高まる。腫瘍は、血漿４ｍＬに腫瘍ＤＮＡと同等のゲノムが１つでも存在するためには、１，０００ｍｍ３（対立遺伝子頻度０．０１％に相当）を超える量に達しなければならないと推定されている。しかしながら、本開示のマクロファージセンサーは、ｃｆＤＮＡ変異検出で可能であるよりも体積が最大５０倍小さい腫瘍を検出することができる。本開示のマクロファージセンサーを使用するバイオマーカー検出の方法は、探すべきＤＮＡ変異を知ることを必要としない。
【０１９８】
本明細書に記載されるアプローチは、疾患、免疫細胞、およびレポーターの選択におけるモジュール性の利点を有する。免疫成分を伴う他の疾患は、橋本甲状腺炎、関節リウマチ、１型糖尿病などの自己免疫疾患を含むがこれらに限定されない癌、および、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、膵炎、ＣＯＰＤ、慢性腎疾患、急性腎障害、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびクローン病、非アルコール性脂肪肝疾患、てんかん、アルツハイマー病およびパーキンソン病を含むがこれらに限定されない全身性エリテマトーデスまたは炎症性疾患を含む。マクロファージを超える他の免疫サブタイプ（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー細胞）はすべて腫瘍における代謝遺伝子を調節し、したがって、本開示の改変免疫細胞および方法を使用して有利に検出することができる。さらに、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）はレポーター、として有用であるが、分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、合成ＲＮＡまたは合成ｍｉＲＮａテンプレート、分割レポーター分子の半分などの他の非免疫原性合成バイオマーカーを使用することができる。
【０１９９】
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示して説明してきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されていることは当業者には明らかであろう。当業者は、本発明から逸脱することなく、数多くの変形、変更、および置換を思いつくであろう。本明細書に記載されている本発明の実施形態の様々な代替形態が、本発明を実施する際に用いられ得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物がそれによってカバーされることが意図されている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2021514619.tif 000006
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2021514619.tif 000008
【図２Ｅ】
2021514619.tif 000009
【図２Ｆ】
2021514619.tif 000010
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2021514619.tif 000012
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2021514619.tif 000014
【図３Ｅ】
2021514619.tif 000015
【図３Ｆ】
2021514619.tif 000016
【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図５Ａ】
2021514619.tif 000027
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ−１】
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【図１４Ａ−２】
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【図１４Ａ−３】
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【図１４Ａ−４】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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