(57)【要約】  本発明は、マイクロコッカス属細菌由来小胞及びその用途に関し、本発明者らは、正常ヒトに比べて胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、及び糖尿病患者のサンプルに前記小胞が有意に減少しており、前記菌株から分離した小胞を投与したとき、大腸菌由来小胞のような病原性小胞による炎症メディエーターの分泌を顕著に抑制することを実験的に確認したところ、本発明によるマイクロコッカス属細菌由来小胞は、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、又は糖尿病の診断方法、及び前記疾患などに対する予防、改善又は治療用組成物を開発するための目的で有用に用いられる。【選択図】図１６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のステップを含む、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、又は糖尿病の診断のための情報提供方法：
（ａ）正常ヒト及び被検者のサンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出するステップ；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ  ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて製作したプライマーペアを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った後、それぞれのＰＣＲ産物を収得するステップ；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通して正常ヒトに比べてマイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来細胞外小胞の含有量が低い場合、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、又は糖尿病に分類するステップ。
【請求項２】
前記ステップ（ａ）でのサンプルは、血液であることを特徴とする、請求項１に記載の情報提供方法。
【請求項３】
マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来小胞を有効成分として含む、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、アトピー性皮膚炎、乾癬、にきび、脱毛、黄斑変性、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、及び糖尿病からなる群より選ばれる１つ以上の疾病の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項４】
前記小胞は、平均直径が１０〜２００ｎｍであることを特徴とする、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記小胞は、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌から自然的又は人工的に分泌されることを特徴とする、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来小胞は、マイクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）由来小胞であることを特徴とする、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来小胞を有効成分として含む、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、アトピー性皮膚炎、乾癬、にきび、脱毛、黄斑変性、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、及び糖尿病からなる群より選ばれる１つ以上の疾病の予防又は改善用食品組成物。
【請求項８】
前記小胞は、平均直径が１０〜２００ｎｍであることを特徴とする、請求項７に記載の食品組成物。
【請求項９】
前記小胞は、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌から自然的又は人工的に分泌されることを特徴とする、請求項７に記載の食品組成物。
【請求項１０】
前記マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来小胞は、マイクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）由来小胞であることを特徴とする、請求項７に記載の食品組成物。
【請求項１１】
マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来小胞を有効成分として含む、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、アトピー性皮膚炎、乾癬、にきび、脱毛、黄斑変性、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、及び糖尿病からなる群より選ばれる１つ以上の疾病の予防又は治療用吸入剤組成物。
【請求項１２】
マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来小胞を有効成分として含む、アトピー性皮膚炎、乾癬、にきび、及び脱毛からなる群より選ばれる１つ以上の疾病の予防又は改善用化粧料組成物。
【請求項１３】
下記のステップを含む、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、又は糖尿病の診断方法：
（ａ）正常ヒト及び被検者のサンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出するステップ；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ  ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて製作したプライマーペアを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った後、それぞれのＰＣＲ産物を収得するステップ；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通して正常ヒトに比べてマイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来細胞外小胞の含有量が低い場合、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、又は糖尿病と判定するステップ。
【請求項１４】
マイクロコッカス属細菌由来小胞を有効成分として含む薬学的組成物を個体に投与するステップを含む、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、アトピー性皮膚炎、乾癬、にきび、脱毛、黄斑変性、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症及び糖尿病よりなる群からなる群より選ばれる１つ以上の疾病の予防又は治療方法。
【請求項１５】
マイクロコッカス属細菌由来小胞の、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、アトピー性皮膚炎、乾癬、にきび、脱毛、黄斑変性、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症及び糖尿病からなる群より選ばれる１つ以上の疾病の予防又は治療用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロコッカス属細菌由来ナノ小胞及びその用途に関し、より具体的に、マイクロコッカス属細菌に由来するナノ小胞を用いた胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症又は糖尿病などの診断方法、及び前記小胞を含む前記疾患の予防、改善又は治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
２１世紀に入って過去伝染病と認識された急性感染性疾患の重要性が低下することになる反面、ヒトと共生微生物との不調和によって発生する免疫機能の異常を伴った慢性疾患が生活の質と人間の寿命を決める主な疾患に疾病パターンが変わった。２１世紀難治性慢性疾患として、癌、心血管疾患、慢性肺疾患、代謝疾患、及び神経精神疾患が人間の寿命と生活の質を決める主な疾患として国民保健に大きい問題になっている。前記難治性慢性疾患は、原因因子による免疫機能異常を伴った慢性炎症を特徴とする。
【０００３】
人体に共生する微生物は１００兆に達し、ヒト細胞より１０倍多く、微生物の遺伝子数は、人間の遺伝子数の１００倍を超えるとされている。微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａあるいは、ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）は、与えられた生息域に存在する真正細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、古細菌（ａｒｃｈａｅａ）、真核生物（ｅｕｋａｒｙａ）を含む微生物集団（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）を言う。
【０００４】
人体に共生する細菌及び周辺環境に存在する細菌は、他の細胞への遺伝子、低分子化合物、タンパク質などの情報を交換するために、ナノメートルのサイズの小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）を分泌する。粘膜は、２００ナノメートル（ｎｍ）サイズ以上の粒子は通過できない物理的な防御膜を形成する。粘膜に共生する細菌である場合には、粘膜を通過しないが、細菌由来小胞は、サイズが１００ナノメートルサイズ以下であるので、比較的自由に粘膜を通じて上皮細胞を通過して人体に吸収される。局所的に分泌された細菌由来小胞は、粘膜の上皮細胞を通じて吸収されて局所炎症反応を誘導すると共に、上皮細胞を通過した小胞は、リンパ管を通じて全身的に吸収されて各臓器に分布し、分布した臓器で免疫及び炎症反応を調節する。例えば、大腸菌（Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のような病原性グラム陰性細菌に由来する小胞は、局所的に大腸炎を起こし、血管で吸収された場合に、血管内皮細胞の炎症反応を通じて全身的な炎症反応及び血液凝固を促進させ、また、インスリンが作用する筋肉細胞などに吸収されて、インスリン抵抗性と糖尿病を誘発する。反面、有益な細菌に由来する小胞は、病原性小胞による免疫機能及び代謝機能の異常を調節して疾病を調節することができる。
【０００５】
細菌に由来する小胞などの因子に対する免疫反応は、インターロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ、以下、ＩＬという）−１７サイトカインの分泌を特徴とするＴｈ１７免疫反応が発生するが、これは、細菌由来小胞に露出時にＩＬ−６が分泌され、これは、Ｔｈ１７免疫反応を誘導する。Ｔｈ１７免疫反応による炎症は、好中球の浸潤を特徴とし、炎症が発生する過程でマクロファージなどの炎症細胞で分泌される腫瘍壊死因子アルファ（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ、以下、ＴＮＦ−αという）が重要な役割を担当する。
【０００６】
マイクロコッカス属細菌は、マイクロコッカス科に属するグラム陽性細菌であって、水、ホコリ、土壌などのような自然に広く分布する細菌である。これらのうち、マイクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）は、ピリジンのような毒性有機汚染物質で成長するとき、リボフラビンを生成し、ルテイン色素を通じて紫外線を吸収するものと知られている。マイクロコッカス属細菌は、乳製品及びビールからも分離され、乾燥した環境や高塩環境でも成長し、胞子を形成しないが、冷蔵庫のような冷蔵温度でも長期間生存するものと知られている。しかしながら、まだマイクロコッカス属細菌が細胞外に小胞を分泌するという事実が報告されていないし、特に癌、心血管疾患、アレルギー性慢性肺疾患、認知症、又は代謝疾患の診断及び治療に応用した事例は報告されたことがない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、前記のような従来の問題点を解決するために鋭意研究した結果、メタゲノム分析を通して正常ヒトに比べて胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、及び糖尿病患者由来サンプルでマイクロコッカス属細菌由来小胞の含有量が有意に減少していることを確認した。また、マイクロコッカス属細菌に属するマイクロコッカス・ルテウス菌から小胞を分離してマクロファージに処理したとき、病原性小胞によるＩＬ−６及びＴＮＦ−αの分泌を顕著に抑制することを確認し、これに基づいて本発明を完成した。
【０００８】
これより、本発明は、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症又は糖尿病の診断のための情報提供方法を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明は、マイクロコッカス属細菌由来小胞を有効成分として含む胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、アトピー性皮膚炎、乾癬、にきび、脱毛、黄斑変性、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、又は糖尿病の予防、改善又は治療用組成物を提供することを他の目的とする。
【００１０】
しかしながら、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、下記のステップを含む、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、又は糖尿病の診断のための情報提供方法を提供する：
（ａ）正常ヒト及び被検者のサンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出するステップ；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ  ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて製作したプライマーペアを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った後、それぞれのＰＣＲ産物を収得するステップ；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通して正常ヒトに比べてマイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来細胞外小胞の含有量が低い場合、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、又は糖尿病に分類するステップ。
【００１２】
また、本発明は、下記のステップを含む、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、又は糖尿病の診断方法を提供する：
（ａ）正常ヒト及び被検者サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出するステップ；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ  ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて製作したプライマーペアを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った後、それぞれのＰＣＲ産物を収得するステップ；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通して正常ヒトに比べてマイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来細胞外小胞の含有量が低い場合、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、又は糖尿病と判定するステップ。
【００１３】
本発明の一具現例において、前記ステップ（ａ）でのサンプルは、血液でありうる。
【００１４】
本発明の他の具現例において、前記ステップ（ｂ）でのプライマーペアは、配列番号１及び配列番号２のプライマーでありうる。
【００１５】
また、本発明は、マイクロコッカス属細菌由来小胞を有効成分として含む、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、アトピー性皮膚炎、乾癬、にきび、脱毛、黄斑変性、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、又は糖尿病の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【００１６】
本発明の一具現例において、前記薬学的組成物は、眼科用組成物を含むことができる。
【００１７】
また、本発明は、マイクロコッカス属細菌由来小胞を有効成分として含む、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、アトピー性皮膚炎、乾癬、にきび、脱毛、黄斑変性、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、又は糖尿病の予防又は改善用食品組成物を提供する。
【００１８】
また、本発明は、マイクロコッカス属細菌由来小胞を有効成分として含む、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、アトピー性皮膚炎、乾癬、にきび、脱毛、黄斑変性、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、又は糖尿病の予防又は治療用吸入剤組成物を提供する。
【００１９】
また、本発明は、マイクロコッカス属細菌由来小胞を有効成分として含む、アトピー性皮膚炎、乾癬、にきび又は脱毛の予防又は改善用化粧料組成物を提供する。
【００２０】
また、本発明は、マイクロコッカス属細菌由来小胞を有効成分として含む薬学的組成物を個体に投与するステップを含む、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、アトピー性皮膚炎、乾癬、にきび、脱毛、黄斑変性、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、又は糖尿病の予防又は治療方法を提供する。
【００２１】
また、本発明は、マイクロコッカス属細菌由来小胞の、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、アトピー性皮膚炎、乾癬、にきび、脱毛、黄斑変性、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、又は糖尿病の予防又は治療用途を提供する。
【００２２】
本発明の一具現例において、前記小胞は、平均直径が１０〜２００ｎｍのものでありうる。
【００２３】
本発明の他の具現例において、前記小胞は、マイクロコッカス属細菌から自然的又は人工的に分泌されるものでありうる。
【００２４】
本発明のさらに他の具現例において、前記マイクロコッカス属細菌由来小胞は、マイクロコッカス・ルテウス由来小胞でありうる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明者らは、腸内細菌である場合には、体内に吸収されないが、細菌由来小胞である場合には、上皮細胞を通じて体内に吸収されて、全身的に分布し、腎臓、肝臓、肺を通じて体外に排泄されることを確認し、患者の血液に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を通して胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、及び糖尿病患者の血液に存在するマイクロコッカス属細菌由来小胞が正常ヒトに比べて有意に減少していることを確認した。また、マイクロコッカス属細菌の一種であるマイクロコッカス・ルテウスを体外で培養して小胞を分離して、体外で炎症細胞に投与したとき、病原性小胞による炎症メディエーターの分泌を有意に抑制することが観察された。これらから、本発明によるマイクロコッカス属細菌由来小胞は、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症又は糖尿病に対する診断方法、及び前記疾患などに対する予防、改善又は治療用組成物に有用に用いられるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１ａは、マウスに細菌と細菌由来小胞（ＥＶ）を口腔で投与した後、時間別に細菌と小胞の分布様相を撮影した写真であり、図１ｂは、口腔で投与した後１２時間目に、血液、腎臓、肝臓、及び様々な臓器を摘出して、細菌と小胞の体内分布様相を評価した図である。
【図２】図２は、胃癌患者及び正常ヒトの血液に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を実施した後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を比較した結果である。
【図３】図３は、すい臓癌患者及び正常ヒトの血液に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を実施した後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を比較した結果である。
【図４】図４は、胆管癌患者及び正常ヒトの血液に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を実施した後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を比較した結果である。
【図５】図５は、乳癌患者及び正常ヒトの血液に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を実施した後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を比較した結果である。
【図６】図６は、卵巣癌患者及び正常ヒトの血液に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を実施した後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を比較した結果である。
【図７】図７は、膀胱癌患者及び正常ヒトの血液に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を実施した後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を比較した結果である。
【図８】図８は、心筋梗塞患者及び正常ヒトの血液に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を実施した後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を比較した結果である。
【図９】図９は、心筋症患者及び正常ヒトの血液に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を実施した後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を比較した結果である。
【図１０】図１０は、心房細動患者及び正常ヒトの血液に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を実施した後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を比較した結果である。
【図１１】図１１は、異型狭心症患者及び正常ヒトの血液に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を実施した後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を比較した結果である。
【図１２】図１２は、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）患者及び正常ヒトの血液に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を実施した後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を比較した結果である。
【図１３】図１３は、認知症患者及び正常ヒトの血液に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を実施した後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を比較した結果である。
【図１４】図１４は、糖尿病患者及び正常ヒトの血液に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を実施した後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を比較した結果である。
【図１５】図１５は、マイクロコッカス・ルテウス由来小胞の炎症誘発効果を評価するために、マイクロコッカス・ルテウス由来小胞をマクロファージ（Ｒａｗ２６４．７  ｃｅｌｌ）に処理して、炎症メディエーターであるＩＬ−６及びＴＮＦ−αの分泌程度を病原性小胞である大腸菌小胞（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＶ）と比較した結果である。
【図１６】図１６は、マイクロコッカス・ルテウス由来小胞の抗炎症及び免疫調節効果を評価するために、病原性小胞である大腸菌小胞（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＶ）の処理前にマイクロコッカス・ルテウス由来小胞を前処理して、大腸菌小胞による炎症メディエーターであるＩＬ−６及びＴＮＦ−αの分泌に及ぼす影響を評価した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、マイクロコッカス属細菌由来小胞及びその用途に関する。
【００２８】
本発明者らは、メタゲノム分析を通してマイクロコッカス属細菌由来小胞が、正常ヒトに比べて胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、及び糖尿病患者の臨床サンプルに有意に減少していることを確認して、疾病を診断することができることを確認した。また、マイクロコッカス・ルテウスから小胞を分離し、特性を分析した結果、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、アトピー性皮膚炎、黄斑変性、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、及び糖尿病などの疾患に対する予防、改善又は治療用組成物として用いられることを確認した。
【００２９】
これより、本発明は、下記のステップを含む、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、又は糖尿病の診断のための情報提供方法を提供する：
（ａ）正常ヒト及び被検者のサンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出するステップ；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ  ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて製作したプライマーペアを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った後、それぞれのＰＣＲ産物を収得するステップ；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通して正常ヒトに比べてマイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来細胞外小胞の含有量が低い場合、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、又は糖尿病に分類するステップ。
【００３０】
本発明において使用される用語「診断」とは、広い意味では、患者の病の実態をすべての面にわたって判断することを意味する。判断の内容は、病名、病因、病型、軽重、病床の詳細な様態、合併症の有無、及び予後などである。本発明において診断は、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、及び／又は糖尿病などの発病の有無及び疾患の水準などを判断することである。
【００３１】
本発明において使用される用語「ナノ小胞（Ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅ）あるいは小胞（Ｖｅｓｉｃｌｅ）」とは、多様な細菌から分泌されるナノサイズの膜からなる構造物を意味する。グラム陰性菌（ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ）由来小胞、又は外膜小胞体（ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ，ＯＭＶｓ）は、内毒素（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）だけでなく、毒性タンパク質及び細菌ＤＮＡとＲＮＡも有しており、グラム陽性菌（ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ）由来小胞は、タンパク質と核酸の他にも、細菌の細胞壁の構成成分であるペプチドグリカン（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ）とリポタイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）も有している。本発明において、ナノ小胞あるいは小胞は、マイクロコッカス属細菌から自然的に分泌されたり、又は人工的に生産されるものであって、球形の形態であり、１０〜２００ｎｍの平均直径を有している。
【００３２】
本発明において使用される用語「メタゲノム（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ）」とは、「群遺伝子」とも言い、土、動物の腸など孤立した地域内のすべてのウイルス、細菌、カビなどを含む遺伝子の総和を意味するものであって、主に培養にならない微生物を分析するために、シーケンサーを使用して一度に多くの微生物を同定することを説明するゲノムの概念に使用される。特に、メタゲノムは、一種のゲノム又は遺伝子を言うものではなく、一つの環境単位のすべての種の遺伝子であって、一種の混合遺伝子を言う。これは、オミックス的に生物学が発展する過程で一種を定義するとき、機能的に既存の一種だけでなく、多様な種が互いに相互作用して完全な種を作るという観点から出た用語である。技術的には、速い配列分析法を利用して、種に関係なく、すべてのＤＮＡ、ＲＮＡを分析して、一つの環境内でのすべての種を同定し、相互作用、代謝作用を糾明する技法の対象である。
【００３３】
本発明において、前記サンプルは、血液でありうるが、これに制限されるものではない。
【００３４】
本発明の他の様態として、本発明は、マイクロコッカス属細菌由来小胞を有効成分として含む、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、アトピー性皮膚炎、乾癬、にきび、脱毛、黄斑変性、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、又は糖尿病の予防、治療又は改善用組成物を提供する。前記組成物は、食品、吸入剤、化粧料及び薬学的組成物を含む。
【００３５】
また、本発明において前記食品組成物は、健康機能食品組成物を含み、前記薬学的組成物は、眼科用組成物を含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００３６】
本発明において使用される用語「予防」とは、本発明による組成物の投与により胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、アトピー性皮膚炎、乾癬、にきび、脱毛、黄斑変性、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、及び／又は糖尿病などを抑制させたり発病を遅延させるすべての行為を意味する。
【００３７】
本発明において使用される用語「治療」とは、本発明による組成物の投与により胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、アトピー性皮膚炎、乾癬、にきび、脱毛、黄斑変性、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、又は糖尿病などに対する症状が好転したり有利に変更されるすべての行為を意味する。
【００３８】
本発明において使用される 用語「改善」とは、治療される状態と関連したパラメーター、例えば症状の程度を少なくとも減少させるすべての行為を意味する。
【００３９】
前記小胞は、マイクロコッカス属細菌を含む培養液を遠心分離、超高速遠心分離、高圧処理、押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍−解凍、電気穿孔、機械的分解、化学物質処理、フィルターによる濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、フリーフロー電気泳動、及びキャピラリー電気泳動よりなる群から選はれた一つ以上の方法を使用して分離することができる。また、不純物の除去のための洗浄、収得された小胞の濃縮などの過程をさらに含むことができる。
【００４０】
本発明による薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。前記薬学的に許容可能な担体は、製剤時に通常的に用いられるものであって、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、シクロデキストリン、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソームなどを含むが、これに限定されず、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液など他の通常の添加剤をさらに含むことができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤などを付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒、又は錠剤に製剤化することができる。適合した薬学的に許される担体及び製剤化に関しては、レミントンの文献に開示されている方法を用いて各成分によって好適に製剤化することができる。本発明の薬学的組成物は、剤形に特別な制限はないが、注射剤、吸入剤、皮膚外用剤、眼科用、又は経口摂取剤などに製剤化することができる。
【００４１】
本発明の薬学的組成物は、目的とする方法によって経口投与したり非経口投与（例えば、静脈内、皮下、皮膚、鼻腔、気道に適用）することができ、投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び時間によって異なるが、当業者により適宜選択され得る。
【００４２】
本発明による薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、薬学的に有効な量は、医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスクの割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量の水準は、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素及びその他医学分野によく知られた要素によって決定され得る。本発明による組成物は、個別治療剤として投与したり他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次又は同時に投与され得、単一又は多重投与され得る。上記した要素を全部考慮して副作用なしに最小の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって容易に決定され得る。
【００４３】
具体的に、本発明による薬学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、体重によって変わり得、一般的には、体重１ｋｇ当たり０．００１〜１５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１００ｍｇを毎日又は隔日投与したり１日１〜３回に分けて投与することができる。しかしながら、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などによって増減され得るので、前記投与量がいかなる方法でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００４４】
本発明の吸入剤組成物は、有効成分を吸入剤にそのまま添加したり他の成分と共に使用され得、通常の方法によって適宜使用され得る。有効成分の混合量は、その使用目的（予防又は治療用）によって適宜決定され得る。
【００４５】
本発明の食品組成物は、健康機能食品組成物を含む。本発明による食品組成物は、有効成分を食品にそのまま添加したり他の食品又は食品成分と共に使用され得、通常の方法によって適切に使用され得る。有効成分の混合量は、その使用目的（予防又は改善用）によって適宜決定され得る。一般的に、食品又は飲料の製造時に、本発明の組成物は、原料に対して１５重量％以下、好ましくは１０重量％以下の量で添加される。しかしながら、健康及び衛生を目的としたり又は健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、前記量は、前記範囲以下でありうる。
【００４６】
本発明の食品組成物は、指示された割合で必須成分として前記有効成分を含有すること他に、他の成分には特別な制限がなく、通常の飲料のように様々な香味剤又は天然炭水化物などをさらなる成分として含有することができる。上述した天然炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など；ジサッカライド、例えばマルトース、スクロースなど；及びポリサッカライド、例えばデキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。上述したもの以外の香味剤として天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えばレバウジオシドＡ、グリシルリジンなど）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルタムなど）を有利に使用することができる。前記天然炭水化物の比率は、当業者の選択によって適切に決定され得る。
【００４７】
前記の他に本発明の食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。このような成分は、独立して、又は組み合わせて使用することができる。このような添加剤の比率も、当業者によって適宜選択され得る。
【００４８】
本発明の前記化粧料組成物は、マイクロコッカス属細菌由来小胞だけでなく、化粧料組成物に通常用いられる成分を含むことができ、例えば抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、及び香料のような通常の補助剤、そして担体を含むことができる。
【００４９】
また、本発明の組成物は、マイクロコッカス属細菌由来小胞以外に、マイクロコッカス属細菌由来小胞と反応して皮膚保護効果を損傷させない限度で従来から使用されてきた有機紫外線遮断剤を混合して使用することもできる。前記有機紫外線遮断剤としては、グリセリルＰＡＢＡ、ドロメトリゾールトリシロキサン、ドロメトリゾール、ジガロイルトリオレエート、フェニルジベンズイミダゾールテトラスルホン酸二ナトリウム、ジエチルヘキシルブタミドトリアゾン、ジエチルアミノヒドロキシベンゾイルヘキシルベンゾエート、ＤＥＡ−メトキシシンナメート、ローソンとジヒドロキシアセトンの混合物、メチレンビスベンゾトリアゾリルテトラメチルブチルフェノール、４−メチルベンジリデンカンファ、メンチルアントラニレート、ベンゾフェノン−３（オキシベンゾン）、ベンゾフェノン−４、ベンゾフェノン−８（ジオキシフェニルベンゾン）、ブチルメトキシジベンゾイルメタン、ビスエチルヘキシルオキシフェノールメトキシフェニルトリアジン、シノキサート、エチルジヒドロキシプロピルＰＡＢＡ、オクトクリレン、エチルヘキシルジメチルＰＡＢＡ、エチルヘキシルメトキシシンナメート、エチルヘキシルサリシレート、エチルヘキシルトリアゾン、イソアミル−ｐ−メトキシシンナメート、ポリシリコン−１５（マロン酸ジメチコジエチルベンザル）、テレフタリリデンジカンフルスルホン酸及びその塩類、ＴＥＡ−サリシレート及びアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）からなる群より選ばれる１種以上を使用することができる。
【００５０】
本発明の化粧料組成物を添加できる製品としては、例えば、収れん化粧水、柔軟化粧水、栄養化粧水、各種クリーム、エッセンス、パック、ファンデーションなどのような化粧品類と、クレンジング、洗顔剤、石鹸、トリートメント、美容液などがある。本発明の化粧料組成物の具体的な剤形としては、スキンローション、スキンソフトナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、乳液、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、エッセンス、栄養エッセンス、パック、石鹸、シャンプー、クレジングフォーム、クレジングローション、クレンジングクリーム、ボディーローション、ボディクレンザー、乳液、リップスティック、メイクアップベース、ファンデーション、プレスパウダー、ルースパウダー、アイシャドウなどの剤形を含む。
【００５１】
本発明の一実施例では、細菌及び細菌由来小胞をマウス経口で投与して、細菌及び小胞の体内吸収、分布、及び排泄様相を観察したところ、細菌である場合には、腸粘膜を通じて吸収されないのに対し、小胞は、投与５分以内に吸収されて全身的に分布し、腎臓、肝臓などを通じて排泄されることを確認した（実施例１参照）。
【００５２】
本発明の他の実施例では、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、及び糖尿病患者に年齢と性別をマッチングした正常ヒトの血液から分離した小胞を用いて細菌メタゲノム分析を実施した。その結果、正常ヒトサンプルに比べて、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、及び糖尿病患者の臨床サンプルにマイクロコッカス属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（実施例３〜１５参照）。
【００５３】
本発明のさらに他の実施例では、マイクロコッカス・ルテウス菌株を培養してこれから分泌された小胞が免疫調節及び抗炎症効果を示すかを評価したが、多様な濃度のマイクロコッカス・ルテウス由来小胞をマクロファージに処理した後、炎症疾患の原因因子である大腸菌由来小胞を処理して炎症メディエーターの分泌を評価した結果、マイクロコッカス・ルテウス由来小胞が大腸菌由来小胞によるＩＬ−６及びＴＮＦ−αの分泌を効率的に抑制することを確認した（実施例１８参照）。
【００５４】
以下、本発明の理解を助けるために好適な実施例を提示する。しかしなが、下記の実施例は、本発明をさらに容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が制限されるものではない。
【実施例】
【００５５】
［実施例１．腸内細菌及び細菌由来小胞の体内吸収、分布、及び排泄様相の分析］
腸内細菌と細菌由来小胞が胃腸管を通じて全身的に吸収されるかを評価するために、次のような方法で実験を行った。マウスの胃腸に蛍光で標識した腸内細菌と腸内細菌由来小胞をそれぞれ５０μｇの用量で胃腸管に投与し、０分、５分、３時間、６時間、１２時間後に蛍光を測定した。マウス全体イメージを観察した結果、図１ａに示されたように、細菌である場合には、全身的に吸収されないが、細菌由来小胞である場合には、投与後５分に全身的に吸収され、投与３時間後には、膀胱に蛍光が濃く観察されて、小胞が泌尿器系に排泄されることが分かった。また、小胞は、投与１２時間まで体内に存在することが分かった。
【００５６】
また、腸内細菌と腸内細菌由来小胞が全身的に吸収された後、様々な臓器に浸潤された様相を評価するために、蛍光で標識した５０μｇの細菌と細菌由来小胞を前記の方法のように投与した後、投与１２時間後に血液、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、脂肪、筋肉を採取した。採取した組織から蛍光を観察した結果、図１ｂに示されたように、細菌由来小胞が、血液、心臓、肺、肝臓、脾臓、脂肪、筋肉、腎臓に分布したが、細菌は吸収されないことが分かった。
【００５７】
［実施例２．臨床サンプルで細菌由来小胞メタゲノム分析］
血液のような臨床サンプルをまず１０ｍｌのチューブに入れて遠心分離法（３，５００ｘｇ、１０ｍｉｎ、４℃）で浮遊物を沈め、上澄み液だけを新しい１０ｍｌチューブに移した。０．２２μｍのフィルターを使用して細菌及び異物を除去した後、セントリプレップチューブ（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒｓ  ５０ｋＤ）に移して１５００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離して、５０ｋＤより小さい物質は捨てて、１０ｍｌまで濃縮させた。さらに０．２２μｍのフィルター（ｆｉｌｔｅｒ）を使用してバクテリア及び異物を除去した後、Ｔｙｐｅ  ９０ｔｉローターで１５０，０００×ｇ、４℃で３時間の間超高速遠心分離方法を使用して上澄み液を捨てて、固まったペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を生理食塩水（ＰＢＳ）で溶かした。
【００５８】
前記方法で分離した小胞１００μｌを１００℃で沸かして内部のＤＮＡを脂質外に出るようにし、その後、氷に５分間冷ました。そして、残った浮遊物を除去するために、１０，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上澄み液だけを集めた。そして、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＤＮＡ量を定量した。その後、前記抽出されたＤＮＡに細菌由来ＤＮＡが存在するかを確認するために、下記表１に示した１６ｓ  ｒＤＮＡ  ｐｒｉｍｅｒでＰＣＲを行って、前記抽出された遺伝子に細菌由来遺伝子が存在することを確認した。
【００５９】
【表１】
2021514989.tif 000003
【００６０】
前記方法で抽出したＤＮＡを前記の１６Ｓ  ｒＤＮＡプライマーを使用して増幅した後、シーケンシングを行い（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）、結果をＳｔａｎｄａｒｄ  Ｆｌｏｗｇｒａｍ  Ｆｏｒｍａｔ（ＳＦＦ）ファイルで出力し、ＧＳ  ＦＬＸ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ２．９）を利用してＳＦＦファイルをｓｅｑｕｅｎｃｅファイル（．ｆａｓｔａ）とｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｑｕａｌｉｔｙｓｃｏｒｅファイルに変換した後、リードの信用度評価を確認し、ｗｉｎｄｏｗ（２０ｂｐｓ）平均ｂａｓｅ  ｃａｌｌ  ａｃｃｕｒａｃｙが９９％未満（Ｐｈｒｅｄ  ｓｃｏｒｅ＜２０）である部分を除去した。Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  Ｕｎｉｔ（ＯＴＵ）分析のためには、ＵＣＬＵＳＴとＵＳＥＡＲＣＨを利用してシークエンス類似度によってクラスタリングを行い、属（ｇｅｎｕｓ）は９４％、科（ｆａｍｉｌｙ）は９０％、目（ｏｒｄｅｒ）は８５％、綱（ｃｌａｓｓ）は８０％、門（ｐｈｙｌｕｍ）は７５％シークエンス類似度を基準としてクラスタリングを行い、各ＯＴＵの門（ｐｈｙｌｕｍ）、綱（ｃｌａｓｓ）、目（ｏｒｄｅｒ）、科（ｆａｍｉｌｙ）、属（ｇｅｎｕｓ）レベルの分類を行い、ＢＬＡＳＴＮとＧｒｅｅｎＧｅｎｅｓの１６Ｓ  ＲＮＡシークエンスデータベース（１０８，４５３シークエンス）を利用して属水準で９７％以上のシークエンス類似度を有する細菌をプロファイリングした（ＱＩＩＭＥ）。
【００６１】
［実施例３．胃癌患者の血液内細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で胃癌患者６６人の血液と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１９８人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて胃癌患者の血液にマイクロコッカス属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表２及び図２参照）。
【００６２】
【表２】
2021514989.tif 000004
【００６３】
［実施例４．すい臓癌患者の血液細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法ですい臓癌患者１７６人の血液と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト２７１人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べてすい臓癌患者の血液にマイクロコッカス属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表３及び図３参照）。
【００６４】
【表３】
2021514989.tif 000005
【００６５】
［実施例５．胆管癌患者の血液細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で胆管癌患者７９人の血液と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト２５９人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて胆管癌患者の血液にマイクロコッカス属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表４及び図４参照）。
【００６６】
【表４】
2021514989.tif 000006
【００６７】
［実施例６．乳癌患者の血液細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で乳癌患者９６人の血液と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１９２人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて乳癌患者の血液にマイクロコッカス属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表５及び図５参照）。
【００６８】
【表５】
2021514989.tif 000007
【００６９】
［実施例７．卵巣癌患者の血液細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で卵巣癌患者１３７人の血液と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１３９人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて卵巣癌患者の血液にマイクロコッカス属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表６及び図６参照）。
【００７０】
【表６】
2021514989.tif 000008
【００７１】
［実施例８．膀胱癌患者の血液細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で膀胱癌患者９１人の血液と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１７６人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて膀胱癌患者の血液にマイクロコッカス属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表７及び図７参照）。
【００７２】
【表７】
2021514989.tif 000009
【００７３】
［実施例９．心筋梗塞患者の血液細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で心筋梗塞患者５７人の血液と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１６３人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて心筋梗塞患者の血液にマイクロコッカス属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表８及び図８参照）。
【００７４】
【表８】
2021514989.tif 000010
【００７５】
［実施例１０．心筋症患者の血液細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で心筋症患者７２人の血液と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１６３人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて心筋症患者の血液にマイクロコッカス属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表９及び図９参照）。
【００７６】
【表９】
2021514989.tif 000011
【００７７】
［実施例１１．心房細動患者の血液細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で心房細動患者３４人の血液と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト６２人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて心房細動患者の血液にマイクロコッカス属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表１０及び図１０参照）。
【００７８】
【表１０】
2021514989.tif 000012
【００７９】
［実施例１２．異型狭心症患者の血液細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で異型狭心症患者８０人の血液と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト８０人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて異型狭心症患者の血液にマイクロコッカス属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表１１及び図１１参照）。
【００８０】
【表１１】
2021514989.tif 000013
【００８１】
［実施例１３．ＣＯＰＤ患者の血液細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法でＣＯＰＤ患者２０５人の血液と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト２３１人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べてＣＯＰＤ患者の血液にマイクロコッカス属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表１２及び図１２参照）。
【００８２】
【表１２】
2021514989.tif 000014
【００８３】
［実施例１４．認知症患者の血液細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で認知症患者６７人の血液と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト７０人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて認知症患者の血液にマイクロコッカス属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表１３及び図１３参照）。
【００８４】
【表１３】
2021514989.tif 000015
【００８５】
［実施例１５．糖尿病患者の血液細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で糖尿病患者６１人の血液と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１２２人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、マイクロコッカス属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて糖尿病患者の血液にマイクロコッカス属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表１４及び図１４参照）。
【００８６】
【表１４】
2021514989.tif 000016
【００８７】
［実施例１６．マイクロコッカス・ルテウス培養液から小胞分離］
前記実施例に基づいて、マイクロコッカス・ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）菌株を培養した後、その小胞を分離して特性を分析した。マイクロコッカス・ルテウスを３７℃好気性チャンバーで吸光度（ＯＤ６００）が１．０〜１．５になるまでＭＲＳ（ｄｅ  Ｍａｎ−Ｒｏｇｏｓａ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐｅ）培地で培養した後、サブカルチャーした。次に、前記菌株が含まれている培地の上澄み液を回収して１０，０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離して菌株を除去し、０．２２μｍのフィルターに濾過し、前記濾過した上澄み液を１００ｋＤａ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ２  Ｃａｓｓｅｔｔｅフィルターメンブレイン（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳ）でＭａｓｔｅｒＦｌｅｘ  ｐｕｍｐ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ，ＵＳ）を利用して限外濾過によって５０ｍｌの体積に濃縮した。次に、前記濃縮させた上澄み液をさらに０．２２μｍのフィルターで濾過してＢＣＡ（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）アッセイを利用してタンパク質を定量し、得られた小胞に対して下記実験を実施した。
【００８８】
［実施例１７．マイクロコッカス・ルテウス由来小胞の炎症誘発効果］
炎症細胞でマイクロコッカス・ルテウス由来小胞の炎症メディエーター（ＩＬ−６、ＴＮＦ−α）の分泌に対する影響を調べるために、マウスマクロファージ細胞株であるＲａｗ  ２６４．７細胞にマイクロコッカス・ルテウス由来小胞を多様な濃度（０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）で処理した後、ＥＬＩＳＡを行った。
【００８９】
より具体的に、４８−ｗｅｌｌ細胞培養プレート内に４×１０４個ずつ分注したＲａｗ  ２６４．７細胞にＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）無血清培地を入れた多様な濃度のマイクロコッカス・ルテウス由来小胞を処理して、１２時間の間培養した。次いで、細胞培養液を１．５ｍｌのチューブに集めて３０００ｇで５分間遠心分離し、上澄み液を集めて−８０℃に保管しておいた後、ＥＬＩＳＡを行った。
【００９０】
ＥＬＩＳＡを行うために、捕捉抗体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈して、９６ｗｅｌｌポリスチレンプレートに作用濃度に合うように５０μｌずつ分注した後、４℃で一晩中反応させた。その後、ＰＢＳＴ（０．０５％  ｔｗｅｅｎ−２０が入っているＰＢＳ）溶液１００μｌで３回ずつ洗浄した後、ＲＤ（１％  ＢＳＡが入っているＰＢＳ）溶液１００μｌを分注して、常温で１時間の間ブロッキングした後、サンプル及びステンダードを濃度に合うように５０μｌずつ分注し、常温で２時間の間反応させた。次に、ＰＢＳＴ  １００μｌで３回洗浄した後、検出抗体をＲＤで希釈して、作用濃度に合うように５０μｌずつ分注して、常温で２時間の間反応させた。
【００９１】
次に、ＰＢＳＴ  １００μｌで３回洗浄した後、Ｓｔｒｐｅｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ，ＵＳＡ）をＲＤに１／４０で希釈して、５０μｌずつ分注して、常温で２０分間反応させ、最後に、ＰＢＳＴ  １００μｌで３回洗浄した後、ＴＭＢ基質（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，ＵＳＡ）５０μｌを分注し、５分から２０分後、発色を進行させてから、１Ｍ硫酸溶液を５０μｌずつ分注して、反応を中止し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ３  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）を利用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００９２】
その結果、図１５に示されたように、マイクロコッカス・ルテウス由来小胞をマクロファージ細胞株に処理したとき、炎症メディエーターの分泌は、病原性小胞である大腸菌由来小胞（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＶ）より顕著に低いことを確認した。
【００９３】
［実施例１８．マイクロコッカス・ルテウス由来小胞の抗炎症効果］
前記実施例１７の結果に基づいて、マイクロコッカス・ルテウス由来小胞が、炎症細胞で炎症メディエーターの分泌に対する抗炎症効果を調べるために、マウスマクロファージ細胞株であるＲａｗ  ２６４．７細胞にマイクロコッカス・ルテウス由来小胞を多様な濃度（０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）で処理した後、炎症疾患病原性小胞である大腸菌由来小胞（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＶ）を処理して、炎症メディエーター（ＩＬ−６、ＴＮＦ−αなど）の分泌量を測定した。
【００９４】
より具体的に、Ｒａｗ  ２６４．７細胞を１×１０５個ずつ２４−ｗｅｌｌ細胞培養プレートに分注した後、２４時間の間ＤＭＥＭ完全培地で培養させた。その後、培養上澄み液を１．５ｍｌのチューブに集めて３０００ｇで５分間遠心分離して、上澄み液を集めて４℃に保管しておいた後、ＥＬＩＳＡ分析を進めた。その結果、図１６に示されたように、マイクロコッカス・ルテウス由来小胞を前処理した場合、大腸菌由来小胞によるＩＬ−６及びＴＮＦ−αの分泌が顕著に抑制されることを確認した。これは、大腸菌由来小胞のような病原性小胞により誘導される炎症の発生をマイクロコッカス・ルテウス由来小胞が効率的に抑制することができることを意味する。
【００９５】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明によるマイクロコッカス属細菌由来小胞は、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症又は糖尿病に対する診断方法だけでなく、前記疾患などに対する予防、改善又は治療用組成物として用いられるので、関連医療、美容及び食品産業分野において有用に活用可能なものと期待される。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年10月8日(2020.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のステップを含む、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症及び糖尿病からなる群より選ばれる１つ以上の疾病の診断のための情報提供方法：
（ａ）正常ヒト及び被検者のサンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出するステップ；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ  ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて製作したプライマーペアを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った後、それぞれのＰＣＲ産物を収得するステップ；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通して正常ヒトに比べてマイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来細胞外小胞の含有量が低い場合、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症及び糖尿病からなる群より選ばれる１つ以上の疾病に分類するステップ。
【請求項２】
前記ステップ（ａ）でのサンプルは、血液であることを特徴とする、請求項１に記載の情報提供方法。
【請求項３】
マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来小胞を有効成分として含む、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、アトピー性皮膚炎、乾癬、にきび、脱毛、黄斑変性、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、及び糖尿病からなる群より選ばれる１種以上の疾病の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項４】
前記小胞は、平均直径が１０〜２００ｎｍであることを特徴とする、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記小胞は、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌から自然的又は人工的に分泌されることを特徴とする、請求項３又は４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来小胞は、マイクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）由来小胞であることを特徴とする、請求項３〜５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来小胞を有効成分として含む、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、アトピー性皮膚炎、乾癬、にきび、脱毛、黄斑変性、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、及び糖尿病からなる群より選ばれる１種以上の疾病の予防又は改善用食品組成物。
【請求項８】
前記小胞は、平均直径が１０〜２００ｎｍであることを特徴とする、請求項７に記載の食品組成物。
【請求項９】
前記小胞は、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌から自然的又は人工的に分泌されることを特徴とする、請求項７又は８に記載の食品組成物。
【請求項１０】
前記マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来小胞は、マイクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）由来小胞であることを特徴とする、請求項７〜９のいずれか一項に記載の食品組成物。
【請求項１１】
マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来小胞を有効成分として含む、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、アトピー性皮膚炎、乾癬、にきび、脱毛、黄斑変性、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、及び糖尿病からなる群より選ばれる１つ以上の疾病の予防又は治療用吸入剤組成物。
【請求項１２】
マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来小胞を有効成分として含む、アトピー性皮膚炎、乾癬、にきび、及び脱毛からなる群より選ばれる１つ以上の疾病の予防又は改善用化粧料組成物。
【請求項１３】
マイクロコッカス属細菌由来小胞の、胃癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、アトピー性皮膚炎、乾癬、にきび、脱毛、黄斑変性、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症及び糖尿病からなる群より選ばれる１種以上の疾病の予防又は治療用薬剤の製造のための使用。
【国際調査報告】
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