(57)【要約】  本開示の実施形態は、概して、細胞表現型を調節および／または検出するための、標的細胞（例えば、心筋細胞が挙げられるがこれに限定されない心臓細胞や、ニューロン細胞、眼内に位置する細胞、膵臓細胞、ＰＳＣ、ＩＰＳＣ、ＥＳＣ、および／またはＰＳＣ心筋細胞など）におけるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現に関するものであり、より具体的には、（ｉ）分化因子、転写因子、および／または表現型センサーをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ（または、その組み合わせ）と、（ｉｉ）例えば、カチオン性脂質、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）誘導体、ポリマー、ポリペプチドもしくはペプチド、ナノ粒子、および／または脂質系粒子などが挙げられるがこれらに限定されない送達媒体と、を含む、組成物の使用であって、該組成物が標的細胞に送達される、組成物の使用に関する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）分化因子、転写因子、および／または表現型センサーをコードする少なくとも１つのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、
（ｉｉ）カチオン性脂質、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）誘導体、ポリマー、ポリペプチドもしくはペプチド、ナノ粒子、または脂質系粒子を含む送達媒体と、
を含む、組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１つのｍＲＮＡは、Ｔｂｘ１８、Ｔｂｘ３、Ｔｂｘ５、およびＳＨＯＸ２、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される分化因子をコードする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記少なくとも１つのｍＲＮＡは、オプシンおよび細胞の電気生理現象を感知できるタンパク質、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される表現型センサーをコードする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記表現型センサーは、Ｑｕａｓａｒ、Ｊａｗｓ、Ｃａｔｃｈ−Ｖ５、ＣｈＲ２、Ａｒｃｈｅｒ１、ＦｌｉｃＲ１、ＡｒｃＤ９５Ｈ、ＧＣａＭＰ６ｆ、およびｃＴＮＴ−Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つのｍＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、キャップ、少なくとも１つの非翻訳領域、ポリアデニンテール、および／またはコドン最適化をもたらす少なくとも１つの変異を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記送達媒体は、リポフェクタミンを含むカチオン性脂質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記送達媒体は、直鎖ＰＥＩ誘導体からなる群から選択されるポリエチレンイミン誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記送達媒体は、ウイルス様ポリマーからなる群から選択されるポリマーを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記送達媒体は、ウイルスおよびウイルス様粒子からなる群から選択されるナノ粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記送達媒体は、リポソームおよびナノリポソームからなる群から選択される脂質系粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのｍＲＮＡに結合する小分子をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記小分子は、先天性免疫センサーの阻害剤からなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
細胞表現型を調節する方法であって、
（ｉ）組成物を調製するステップであって、該組成物は、
分化因子、転写因子、および／または表現型センサーをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを発現するベクター、ならびに
カチオン性脂質、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）誘導体、ポリマー、ポリペプチドもしくはペプチド、ナノ粒子、または脂質系粒子を含む送達媒体、
を含む、ステップと、
（ｉｉ）標的細胞に、前記組成物を形質移入によって投与するステップと、
（ｉｉｉ）場合によっては、前記標的細胞の表現型を検出するステップと、
を含む、方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのｍＲＮＡは、Ｔｂｘ１８、Ｔｂｘ３、Ｔｂｘ５、およびＳＨＯＸ２、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される分化因子をコードする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのｍＲＮＡは、オプシンおよび細胞の電気生理現象を感知できるタンパク質、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される表現型センサーをコードする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記表現型センサーは、Ｑｕａｓａｒ、Ｊａｗｓ、Ｃａｔｃｈ−Ｖ５、ＣｈＲ２、Ａｒｃｈｅｒ１、ＦｌｉｃＲ１、ＡｒｃＤ９５Ｈ、ＧＣａＭＰ６ｆ、およびｃＴＮＴ−Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのｍＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、キャップ、少なくとも１つの非翻訳領域、ポリアデニンテール、および／またはコドン最適化をもたらす少なくとも１つのヌクレオチド変異を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記送達媒体は、リポフェクタミンを含むカチオン性脂質を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記送達媒体は、直鎖ＰＥＩ誘導体からなる群から選択されるポリエチレンイミン誘導体を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記送達媒体は、ウイルス様ポリマーからなる群から選択されるポリマーを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記送達媒体は、ウイルスおよびウイルス様粒子からなる群から選択されるナノ粒子を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記送達媒体は、リポソームおよびナノリポソームからなる群から選択される脂質系粒子を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのｍＲＮＡに結合する小分子をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記小分子は、先天性免疫センサーの阻害剤からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的細胞は、心臓細胞、心筋細胞、ニューロン細胞、眼内に位置する細胞、膵臓細胞、ＰＳＣ、ＩＰＳＣ、ＥＳＣ、およびＰＳＣ心筋細胞からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的細胞は、心臓細胞、心筋細胞、ＰＳＣ、ＩＰＳＣ、ＥＳＣ、またはＰＳＣ心筋細胞であり、前記標的細胞の表現型は、前記標的細胞を心房筋細胞、心室筋細胞、および／または心臓ペースメーカー細胞へと分化させるように変更されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
分化済心臓ペースメーカー細胞は、それを必要とする被験体に提供される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記被験体は、不整脈、心臓ペーシング障害、房室ブロック、または洞不全症候群を患っている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
心臓障害の治療および／または予防を必要とする被験体において心臓障害を治療および／または予防する方法であって、該方法は、
（ｉ）組成物を調製するステップであって、該組成物は、
分化因子、転写因子、および／または表現型センサーをコードする少なくとも１つのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ならびに
カチオン性脂質、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）誘導体、ポリマー、ポリペプチドもしくはペプチド、ナノ粒子、または脂質系粒子を含む送達媒体、
を含む、ステップと、
（ｉｉ）心臓細胞、心筋細胞、ＰＳＣ、ＩＰＳＣ、ＥＳＣ、およびＰＳＣ心筋細胞からなる群から選択される標的細胞に、前記組成物を形質移入によって投与するステップと、
（ｉｉｉ）場合によっては、前記表現型センサーの活性を検出することで、前記形質移入を行った標的細胞の表現型を検出するステップと、
（ｉｉｉ）場合によっては電動ペースメーカー装置を装着している前記被験体に、前記形質移入を行った標的細胞を再移植するステップと、
を含む、方法。
【請求項３０】
前記心臓障害は、房室ブロック、洞不全症候群、および典型的には電動ペースメーカー装置の埋め込みを必要とするその他の不整脈からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記形質移入を行った心臓細胞の表現型を検出するステップは、前記細胞に対して多電極アレイ（ＭＥＡ）解析を行うこと、活動電位プロファイルおよび／またはＣａ２＋の一過性動態を測定すること、ならびに／あるいは蛍光ｃＴＮＴを測定すること、のうちの１つ以上を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つのｍＲＮＡは、Ｔｂｘ１８、Ｔｂｘ３、Ｔｂｘ５、およびＳＨＯＸ２、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される分化因子をコードする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つのｍＲＮＡは、オプシンおよび細胞の電気生理現象を感知できるタンパク質、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される表現型センサーをコードする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記表現型センサーは、Ｑｕａｓａｒ、Ｊａｗｓ、Ｃａｔｃｈ−Ｖ５、ＣｈＲ２、Ａｒｃｈｅｒ１、ＦｌｉｃＲ１、ＡｒｃＤ９５Ｈ、ＧＣａＭＰ６ｆ、およびｃＴＮＴ−Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１つのｍＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、キャップ、少なくとも１つの非翻訳領域、ポリアデニンテール、および／またはコドン最適化をもたらす少なくとも１つのヌクレオチド変異を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記送達媒体は、リポフェクタミンを含むカチオン性脂質を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記送達媒体は、直鎖ＰＥＩ誘導体からなる群から選択されるポリエチレンイミン誘導体を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記送達媒体は、ウイルス様ポリマーからなる群から選択されるポリマーを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記送達媒体は、ウイルスおよびウイルス様ポリマーからなる群から選択されるナノ粒子を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
前記送達媒体は、リポソームおよびナノリポソームからなる群から選択される脂質系粒子を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも１つのｍＲＮＡに結合する小分子をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
前記小分子は、先天性免疫センサーの阻害剤からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
細胞表現型を決定する方法であって、
（ｉ）組成物を調製するステップであって、該組成物は、
表現型センサーをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを発現するベクター、および
カチオン性脂質、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）誘導体、ポリマー、ポリペプチドもしくはペプチド、ナノ粒子、または脂質系粒子を含む送達媒体、
を含む、ステップと、
（ｉｉ）標的細胞に、前記組成物を形質移入によって投与するステップと、
（ｉｉｉ）前記標的細胞の表現型を検出するステップと、
を含む、方法。
【請求項４４】
前記標的の表現型を検出するステップは、前記細胞に対して多電極アレイ（ＭＥＡ）解析を行うこと、活動電位プロファイルおよび／またはＣａ２＋の一過性動態を測定すること、ならびに／あるいは蛍光ｃＴＮＴを測定すること、を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記表現型センサーは、オプシンおよび細胞の電気生理現象を感知できるタンパク質、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記表現型センサーは、Ｑｕａｓａｒ、Ｊａｗｓ、Ｃａｔｃｈ−Ｖ５、ＣｈＲ２、Ａｒｃｈｅｒ１、ＦｌｉｃＲ１、ＡｒｃＤ９５Ｈ、ＧＣａＭＰ６ｆ、およびｃＴＮＴ−Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記少なくとも１つのｍＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、キャップ、少なくとも１つの非翻訳領域、ポリアデニンテール、および／またはコドン最適化をもたらす少なくとも１つのヌクレオチド変異を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記送達媒体は、リポフェクタミンを含むカチオン性脂質を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記送達媒体は、直鎖ＰＥＩ誘導体からなる群から選択されるポリエチレンイミン誘導体を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
前記送達媒体は、ウイルス様ポリマーからなる群から選択されるポリマーを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
前記送達媒体は、ウイルスおよびウイルス様粒子からなる群から選択されるナノ粒子を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５２】
前記送達媒体は、リポソームおよびナノリポソームからなる群から選択される脂質系粒子を含む、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１８年３月１日に出願された米国仮特許出願第６２／６３７，００５号に基づく優先権を主張するものであり、その開示全体が、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
（政府による助成）
本発明は、ＤＡＲＰＡによって授与された補助金番号ＨＲ００１１−１６−２−００１６、および国立衛生研究所（国立心肺血液研究所）によって授与された補助金番号１Ｒ０１ＨＬ１１１６４６−０１Ａ１（ＨＬ１１１６４６）のもと、政府の助成を受けて成されたものである。政府は、本開示において一定の権利を有する。
【０００３】
（本開示の分野）
本開示の実施形態は、概して、細胞表現型を調節および／または検出するための、例えば、心臓細胞、ニューロン、視細胞、膵臓細胞、および／または多能性幹細胞（例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣまたはＩＰＳＣ）や胚性幹細胞（ＥＳＣ））などが挙げられるがこれらに限定されない細胞におけるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現に関するものであり、より具体的には、（ｉ）分化因子、転写因子、および／または表現型センサーをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ（または、その組み合わせ）と、（ｉｉ）例えば、カチオン性脂質、ポリエチレンイミン誘導体、ポリペプチドもしくはペプチド、ナノ粒子、および／または脂質系粒子などが挙げられるがこれらに限定されない送達媒体と、を含む、組成物の使用であって、該組成物が、例えば、心臓細胞、および／または細胞系もしくはエキソビボの初代細胞のいずれかから生成され得るＰＳＣを含むモデルシステムなどが挙げられるがこれに限定されない細胞に送達される、組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
分化因子によって、細胞は、心室心筋細胞、心房心筋細胞、またはペースメーカー心筋細胞に対応する表現型を発現する（カプール（Kapoor）ら、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）、２０１３）。表現型センサーを用いて、筋収縮力（歪感受性蛍光タンパク質）や膜電位（電圧感受性蛍光タンパク質）などの細胞メトリクスが測定される。
【０００５】
特に虚血性心不全の後、心臓再生のために幹細胞を移植することは、現在、多くの研究と少しの臨床試験の対象となっている。しかしながら、これまでの研究では、異なる種類の幹細胞を移植することに焦点が当てられており、細胞の特異的な表現型には焦点は当てられていない。また、表現型を、特に移植後に評価できないことや、特定の表現型を生じさせることまたは幹細胞を調達することにおける安全性の問題に悩まされている。ウイルスまたはＤＮＡを用いる方法と比較して強力な安全プロファイルを有するｍＲＮＡの使用や一過性発現によって、表現型の制御およびモニタリングのいずれもが可能になる。発現プロファイルに基づいて細胞を分類することが可能になり、その結果、移植される細胞は、同じ表現型を持つ均一な集団となる。損傷を受けた心臓組織が一旦「修復」されると、筋細胞は、元の状態へと回復し得、かつ／または患者−宿主の環境に基づいて再分化し得る。さらに、インビボの組織において表現型を評価することができ、治療前および治療後のいずれにおいても、罹患組織の状態をよりよく理解することができるようになる。
【０００６】
疾患のシミュレーションおよび／または治療用化合物および治療用製剤のテストを行うための、インビトロにおける心臓モデリングの現在最新のモデルシステムは、ウイルスベクターを用いた心臓細胞またはｉＰＳＣの形質移入を含む。しかしながら、ウイルスベクターでは、（１）形質移入の速度が遅く、試験を行うことができるようになるまでに１〜２週間の遅延があること、（２）ウイルスによる形質移入が半永久性であること、および（３）高度に制御された様式で複数の遺伝子を発現させられないこと、が原因となって、テストの変更可能な量が制限される。ｍＲＮＡを用いて遺伝子を発現させると、化学量論的様式で、複数の遺伝子を迅速（１〜２日）かつ一過的に、同時に発現させることができ（これは、表現型のより良い制御をもたらし得る）、かつ複数回投与によって発現期間を制御することができる。
【０００７】
心拍異常の新規症例は、米国だけで３００万件を超える。不整脈に対する既存の薬物療法では、しばしば、オフターゲットな効果が生じ、新規薬剤開発の損耗率は極めて高い。他の臓器を標的とする薬剤は、心臓毒性について安全であることが証明される必要がある。しかしながら、現在の心筋細胞プラットフォームは、インビトロにおける薬剤テストには、かなり不十分である。心筋細胞の機能を評価する方法は非常に多様であり得、そのため、標準化が困難である。ヒトｉＰＳＣからは、常に心筋細胞を生じさせることができるので、ヒト心臓細胞は、その量を制限されることなく提供され、また胚性幹細胞（ＥＳＣ）の倫理的問題は回避される。あいにく、幹細胞由来の心筋細胞は、心房心筋細胞、心室心筋細胞およびペースメーカー心筋細胞のランダムな混合物となり得る。このような固有の異質性は、薬剤スクリーニングや心臓再生のための細胞療法にとって問題である。
【０００８】
したがって、必要とされるのは、心臓細胞、ニューロン、視細胞、膵臓細胞、および／またはＰＳＣの表現型を変更および／または検出するための改善された方法である。この方法は、これらの細胞種への形質移入を行う公知の技術を利用するが、形質移入の効率およびｍＲＮＡの発現を改善することによって、インビボにおける細胞表現型を調節および検出するための最適化された方法を提供するものであるべきである。このような最適化された方法を提供する組成物は、（ｉ）分化因子（例えば、ＴＢＸ１８、ＴＢＸ３、ＴＢＸ、およびＳＨＯＸ２などが挙げられるがこれらに限定されない）、転写因子、および／または表現型センサー（例えば、Ｑｕａｓａｒ、Ｊａｗｓ、Ｃａｔｃｈ−Ｖ５、および／またはＣｈＲ２などのオプシン、あるいはＡｒｃｈｅｒ１、ＦｌｉｃＲ１、ＡｒｃＤ９５Ｈ、ＧＣａＭＰ６ｆ、および／またはｃＴＮＴ−Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎなどのセンサータンパク質が挙げられるが、これらに限定されない）をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ（またはその組み合わせ）と、（ｉｉ）例えば、カチオン性脂質（例えば、リポフェクタミン）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）誘導体（例えば、直鎖ＰＥＩ誘導体）、ポリマー（例えば、ＶｉｒｏＲｅｄ（登録商標）などのウイルス様ポリマー）、ポリペプチドもしくはペプチド（例えば、ウイルスポリペプチドもしくはウイルスタンパク質）、ナノ粒子（例えば、ウイルスもしくはウイルス様粒子）、ナノ粒子（例えば、ウイルス様粒子）、および／または脂質系粒子（例えば、リポソームもしくはナノリポソーム）などが挙げられるがこれらに限定されない送達媒体と、を含む、組成物であって、該組成物は、例えば、心臓細胞、および／または細胞系もしくはエキソビボの初代細胞のいずれかから生成され得るＰＳＣを含む心臓モデルシステムなどが挙げられるがこれに限定されない標的細胞に送達される。場合によっては、組成物は、標的細胞の細胞環境を調節するか、または発現および／もしくは細胞表現型を測定するためのリポーターとして働く、タンパク質をコードするｍＲＮＡ、ならびに／あるいは上記少なくとも１つのｍＲＮＡに結合する小分子を含み得る。また、本開示の組成物を用いて、例えば、房室ブロック、洞不全症候群、徐脈性不整脈やその他の不整脈、および洞房結節が心拍を開始することについての異常などが挙げられるがこれらに限定されない、典型的にはペースメーカー装置の埋め込みを必要とする心臓疾患を治療することもできる。また、疾患のシミュレーションおよび／または治療用化合物や治療用製剤のテストを行うためのインビトロにおける心臓モデリングに、本開示の組成物を用いることもできる。本開示の実施形態が目的とするのは、このような組成物ならびに細胞表現型を調節および／または検出する方法である。
【発明の概要】
【０００９】
「背景」の欄に記載されているように、当該技術分野においては、心臓細胞、ニューロン、視細胞、膵臓細胞、および／または多能性幹細胞の表現型を変更および／または検出するための技術を特定し、これを理解することによってこのような調節および／または検出のための新規組成物ならびに新規方法を開発することが、大いに必要とされている。本開示は、このような必要性やその他の必要性を満たすものである。本開示の実施形態は、概して、例えば、心臓組織における細胞表現型が挙げられるがこれらに限定されないインビボにおける細胞表現型を、調節および検出する最適化された方法に関する。このような最適化された方法を提供する組成物は、（ｉ）分化因子（例えば、ＴＢＸ１８、ＴＢＸ３、ＴＢＸ５、およびＳＨＯＸ２などが挙げられるがこれらに限定されない）、転写因子、および／または表現型センサー（例えば、Ｑｕａｓａｒ、Ｊａｗｓ、Ｃａｔｃｈ−Ｖ５、および／またはＣｈＲ２などが挙げられるがこれらに限定されないオプシンなどが挙げられるがこれに限定されないオプシン、あるいはＡｒｃｈｅｒ１、ＦｌｉｃＲ１、ＡｒｃｈＤ９５Ｈ、ＧＣａＭＰ６ｆ、および／またはｃＴＮＴ−Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎなどが挙げられるがこれらに限定されないその他のセンサータンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない）をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ（またはその組み合わせ）と、（ｉｉ）例えば、カチオン性脂質（例えば、リポフェクタミン）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）誘導体（例えば、直鎖ＰＥＩ誘導体）、ポリマー（例えば、ＶｉｒｏＲｅｄ（登録商標）などのウイルス様ポリマー）、ポリペプチドもしくはペプチド（例えば、ウイルスポリペプチドもしくはウイルスタンパク質）、ナノ粒子（例えば、ウイルス様粒子）、および／または脂質系粒子（例えば、リポソームもしくはナノリポソーム）などが挙げられるがこれらに限定されない送達媒体と、を含む、組成物であって、該組成物は、例えば、心臓細胞、および／または細胞系もしくはエキソビボの初代細胞のいずれかから生成され得るＰＳＣを含む心臓モデルシステムなどが挙げられるがこれに限定されない標的細胞に送達される。場合によっては、組成物は、標的細胞の細胞環境を調節するか、または発現および／もしくは細胞表現型を測定するためのリポーターとして働く、タンパク質をコードするｍＲＮＡ、ならびに／あるいは上記少なくとも１つのｍＲＮＡに結合する小分子を含み得る。また、本開示の組成物を用いて、例えば、房室ブロックまたはヒス束ブロックなどの、徐脈性不整脈の原因となる心房伝導系および心室伝導系における電流ブロック、洞不全症候群などの、洞房結節が心拍を開始することについての異常、ならびにその他の不整脈などが挙げられるがこれらに限定されない、典型的にはペースメーカー装置の埋め込みを必要とする心臓疾患を治療することもできる。また、疾患のシミュレーションおよび／または治療用化合物や治療用製剤のテストを行うためのインビトロにおける心臓モデリングに、本開示の組成物を用いることもできる。
【００１０】
一態様において、本開示は、（ｉ）分化因子、転写因子、および／または表現型センサーをコードする少なくとも１つのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、（ｉｉ）カチオン性脂質、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）誘導体、ポリマー、ポリペプチドもしくはペプチド、ナノ粒子、または脂質系粒子を含む送達媒体と、を含む、組成物を提供する。
【００１１】
別の態様において、本開示は、細胞表現型を調節する方法であって、（ｉ）分化因子、転写因子、および／または表現型センサーをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを発現するベクター、ならびにカチオン性脂質、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）誘導体、ポリマー、ポリペプチドもしくはペプチド、ナノ粒子、または脂質系粒子を含む送達媒体を含む、組成物を調製するステップと、（ｉｉ）標的細胞に、前記組成物を形質移入によって投与するステップと、（ｉｉｉ）場合によっては、前記標的細胞の表現型を検出するステップと、（ｉｖ）場合によっては、適切な表現型の標的細胞を１つ以上、患者に与えて、疾患を治療および／または予防するステップと、を含む、方法を提供する。
【００１２】
別の態様において、本開示は、心臓障害の治療および／または予防を必要とする被験体において心臓障害を治療および／または予防する方法であって、（ｉ）分化因子、転写因子、および／または表現型センサーをコードする少なくとも１つのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ならびにカチオン性脂質、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）誘導体、ポリマー、ポリペプチドもしくはペプチド、ナノ粒子、または脂質系粒子を含む送達媒体を含む、組成物を調製するステップと、（ｉｉ）心臓細胞、心筋細胞、ＰＳＣ、ＩＰＳＣ、ＥＳＣ、およびＰＳＣ心筋細胞からなる群から選択される標的細胞に、前記組成物を形質移入によって投与するステップと、（ｉｉｉ）場合によっては、前記表現型センサーの活性を検出することによって、前記形質移入を行った標的細胞の表現型を検出するステップと、（ｉｖ）場合によっては電動ペースメーカー装置を装着している前記被験体に、前記形質移入を行った標的細胞を再移植するステップと、を含む、方法を提供する。
【００１３】
別の態様において、本開示は、細胞表現型を決定する方法であって、（ｉ）表現型センサーをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを発現するベクター、およびカチオン性脂質、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）誘導体、ポリマー、ポリペプチドもしくはペプチド、ナノ粒子、または脂質系粒子を含む送達媒体を含む、組成物を調製するステップと、（ｉｉ）標的細胞に、前記組成物を形質移入によって投与するステップと、（ｉｉｉ）前記標的細胞の表現型を検出するステップと、を含む、方法を提供する。
【００１４】
本開示のこのような目的、特徴、および利点、ならびにその他の目的、特徴、および利点は、添付の説明、特許請求の範囲、および図面と共に以下の明細書を読めば、より明らかになるであろう。
【００１５】
本明細書に援用され、その一部を構成する添付の図は、以下で述べるいくつかの態様を説明するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｂは、ｈｉＰＳＣからのＡＭ、ＶＭ、およびＰＭの特異的誘導を示す。図１Ａは、レチノイン酸媒介経路によって、心房筋細胞（ＲＡ群における斜線入りのＡ様領域）または心室筋細胞（ＲｉＲＡ群における白地の領域）が決定されたことを示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜図１Ｂは、ｈｉＰＳＣからのＡＭ、ＶＭ、およびＰＭの特異的誘導を示す。図１Ｂは、Ｓｈｏｘ２媒介経路によって、６０％を超えるペースメーカー筋細胞（ＰＭ）が生じたことを示す。
【図２】図２は、アグリウェル（Aggrewell）プレート上でのペースメーカー心筋細胞（ＰＭ）スフェロイドの生成を示す。細胞を播種し、スフェロイド１つあたり１０００個のＰＭを得た。スフェロイドは、時間がたつにつれて小型になり、４週間を超えて生存し、自発的かつ周期的なペーシングを示した。
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｄは、多電極アレイ（ＭＥＡ）上のヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞におけるｍＲＮＡ発現オプシンの機能テストを示す。（３Ａ）３３３ｎｇのＣｈＲ２−ｍＲＮＡを形質移入し、形質移入から２４時間後に分析された、三連のウェルのうちの１つにおける電気スパイク活性。
【図３Ｂ】図３Ａ〜図３Ｄは、多電極アレイ（ＭＥＡ）上のヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞におけるｍＲＮＡ発現オプシンの機能テストを示す。（３Ｂ）青色励起光の段階的頻度増加による、拍動速度の完全な制御。
【図３Ｃ】図３Ａ〜図３Ｄは、多電極アレイ（ＭＥＡ）上のヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞におけるｍＲＮＡ発現オプシンの機能テストを示す。（３Ｃ）３連のウェルのうち、ＣｈＲ２ ｍＲＮＡを形質移入した細胞の捕捉が成功（拍動速度の完全同期）したもの。最も捕捉成功率が高いのは、送達媒体の量が最も多いものであり、拍動速度を５００ｍｓまで上げることができる。
【図３Ｄ】図３Ａ〜図３Ｄは、多電極アレイ（ＭＥＡ）上のヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞におけるｍＲＮＡ発現オプシンの機能テストを示す。（３Ｄ）オレンジ色の光を照射した際の、本来のスパイクの抑止で説明される、心筋細胞におけるＪＡＷＳ−ｍＲＮＡの機能発現（ウェルは２連）。
【図４】図４は、生存率、α−ＳＡ、およびＣａｔＣｈ−Ｖ５３について染色を行った、ＣａｔＣｈ ｍＲＮＡを発現する心室筋細胞を示す。細胞は、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを用いて測定した。
【図５Ａ】図５Ａは、ＣａｔＣｈ量を増加させた場合（細胞１０００個あたり０．１ｎｇ）の経時的なＮＲＶＭの捕捉率および捕捉閾値を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＣａｔＣｈ量を増加させた場合（細胞１０００個あたり１ｎｇ）の経時的なＮＲＶＭの捕捉率および捕捉閾値を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＣａｔＣｈ量を増加させた場合（細胞１０００個あたり１０ｎｇ）の経時的なＮＲＶＭの捕捉率および捕捉閾値を示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜図６Ｂは、ＦｌｉｃＲ ＲＮＡを形質移入した単一細胞に由来する、試料の活動電位シグナルを示す。（６Ａ）試料の蛍光シグナル。
【図６Ｂ】図６Ａ〜図６Ｂは、ＦｌｉｃＲ ＲＮＡを形質移入した単一細胞に由来する、試料の活動電位シグナルを示す。（６Ｂ）平均活動電位。
【図７】図７は、ＣｈＲ２ ｍＲＮＡを形質移入したＮＲＶＭと、ＣａｔＣＨ ｍＲＮＡを形質移入したＮＲＶＭとの間での励起強度の比較を示す。ＭＥＡプレートに播種してから１日後に、ＣｈＲ２ ｍＲＮＡまたはＣａｔＣＨ ｍＲＮＡのいずれかを、ＮＲＶＭに形質移入した。励起光に対するオプシンの感度は、応答を喚起するのに必要なＬＥＤ強度パーセントに反比例する。ＣａｔＣＨでは、形質移入後２４時間で感度が最高となり、このとき、５％強度のＬＥＤ光に応答する。これは、ＣｈＲ２の場合に必要なＬＥＤ強度の１５倍である。
【図８】図８は、ＣｈＲ２ ｍＲＮＡを形質移入したＮＲＶＭと、ＣａｔＣＨ ｍＲＮＡを形質移入したＮＲＶＭとの間での最大拍動速度の比較を示す。ＭＥＡプレートに播種してから１日後に、ＣｈＲ２ ｍＲＮＡまたはＣａｔＣＨ ｍＲＮＡのいずれかを、ＮＲＶＭに形質移入した。これらの細胞を、ＬＥＤパルスによって１ｈｚ、２ｈｚ、および３ｈｚで駆動した。ここで、最大強度の励起光を用いた際に、三連のウェルすべてが示した速度で拍動することができた場合に、応答を記録した。この間ずっと、ＣａｔＣＨは、より高い周波数を持続することができた。
【図９】図９は、ＣｈＲ２およびＪＡＷＳをコードするｍＲＮＡを形質移入したｉＰＳ由来の心筋細胞を示す。ここでは、励起（矢印）および阻害（横棒）の両方を示す。
【図１０】図１０は、本明細書で説明されるｍＲＮＡ発現システムを用いた導入遺伝子の発現が、経時的に弱まるＧＦＰシグナルからも分かるように、一過性であったということを示す。
【図１１】図１１は、ＴＢＸ１８ ＩＶＴ ｍＲＮＡが、首尾良くかつ効率的に、心筋細胞に一過的に入ることを示す。
【図１２】図１２は、ＴＢＸ１８ ＩＶＴ ｍＲＮＡ遺伝子送達によって、ＴＢＸ１８タンパク質が、心筋細胞において効率的かつ一過的に発現されることを示す。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜図１３Ｃは、ＴＢＸ１８ ＩＶＴ ｍＲＮＡ遺伝子送達によって、ＴＢＸ１８タンパク質が、心筋細胞の核に正しく局在化することを示す。１３Ａ：１μｇのＩＶＴ ｍＲＮＡ＋０．２μｌのＶｉｒｏＭｅｒ Ｒｅｄ。１３Ｂ：０．５μｇのＩＶＴ ｍＲＮＡ＋０．２μｌのＶｉｒｏＭｅｒ Ｒｅｄ。１３Ｃ：１μｇのＩＶＴ ｍＲＮＡ＋０．１μｌのＶｉｒｏＭｅｒ Ｒｅｄ。核ＴＢＸ１８陽性心筋細胞（ＦＬＡＧ陽性）は、１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃにおいて、それぞれ２１％、４％、および２％であった（スケールバー：５０μｍ）。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜図１３Ｃは、ＴＢＸ１８ ＩＶＴ ｍＲＮＡ遺伝子送達によって、ＴＢＸ１８タンパク質が、心筋細胞の核に正しく局在化することを示す。１３Ａ：１μｇのＩＶＴ ｍＲＮＡ＋０．２μｌのＶｉｒｏＭｅｒ Ｒｅｄ。１３Ｂ：０．５μｇのＩＶＴ ｍＲＮＡ＋０．２μｌのＶｉｒｏＭｅｒ Ｒｅｄ。１３Ｃ：１μｇのＩＶＴ ｍＲＮＡ＋０．１μｌのＶｉｒｏＭｅｒ Ｒｅｄ。核ＴＢＸ１８陽性心筋細胞（ＦＬＡＧ陽性）は、１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃにおいて、それぞれ２１％、４％、および２％であった（スケールバー：５０μｍ）。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜図１３Ｃは、ＴＢＸ１８ ＩＶＴ ｍＲＮＡ遺伝子送達によって、ＴＢＸ１８タンパク質が、心筋細胞の核に正しく局在化することを示す。１３Ａ：１μｇのＩＶＴ ｍＲＮＡ＋０．２μｌのＶｉｒｏＭｅｒ Ｒｅｄ。１３Ｂ：０．５μｇのＩＶＴ ｍＲＮＡ＋０．２μｌのＶｉｒｏＭｅｒ Ｒｅｄ。１３Ｃ：１μｇのＩＶＴ ｍＲＮＡ＋０．１μｌのＶｉｒｏＭｅｒ Ｒｅｄ。核ＴＢＸ１８陽性心筋細胞（ＦＬＡＧ陽性）は、１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃにおいて、それぞれ２１％、４％、および２％であった（スケールバー：５０μｍ）。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜図１４Ｂは、ＴＢＸ１８ ＩＶＴ ｍＲＮＡ遺伝子移入によって、固有心筋細胞が新規ペースメーカー細胞に転換される（１４Ｂ）が、コントロールでは転換されない（１４Ａ）ことを示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜図１４Ｂは、ＴＢＸ１８ ＩＶＴ ｍＲＮＡ遺伝子移入によって、固有心筋細胞が新規ペースメーカー細胞に転換される（１４Ｂ）が、コントロールでは転換されない（１４Ａ）ことを示す。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜図１５Ｃは、ＩＶＴ ｍＲＮＡの直接心筋注入によって、インビボにおける局所的心臓遺伝子送達が達成されることを示す。（１５Ａ）注入前の心筋層。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜図１５Ｃは、ＩＶＴ ｍＲＮＡの直接心筋注入によって、インビボにおける局所的心臓遺伝子送達が達成されることを示す。（１５Ｂ）注入中の心筋層。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜図１５Ｃは、ＩＶＴ ｍＲＮＡの直接心筋注入によって、インビボにおける局所的心臓遺伝子送達が達成されることを示す。（１５Ｃ）注入後の心筋層。
【図１６】図１６は、ラットの完全心臓ブロックモデルにおいて、ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡによって心室ペーシングが引き起こされたことを示す。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｂは、ラットの完全心臓ブロックモデルにおいて、ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡ遺伝子移入によって心室ペーシングが引き起こされたことを、動物の心拍数（１７Ａ）および心拍数のヒストグラム（１７Ｂ）を連続的に記録することによって示す。
【図１８】図１８は、ブタのモデルにおいて、ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡによって心室ペーシングが引き起こされたことを示す（生物学的薬剤送達から７〜１０日後）。
【図１９】図１９は、ブタのモデルにおいて、Ａ８３−０１を伴うＴＢＸ１８ ｍＲＮＡによって心室ペーシングが引き起こされたことを示す（生物学的薬剤送達から１０日後）。
【図２０】
【発明を実施するための形態】
【００１７】
「背景」の項に記載されているように、当該技術分野においては、心臓細胞、ニューロン、視細胞、膵臓細胞、および／またはＰＳＣ（ＩＰＳＣおよびＥＳＣを含む）の表現型を変更および／または検出するための技術を特定し、これを理解することによってこのような調節および／または検出のための新規組成物ならびに新規方法を開発することが、大いに必要とされている。本開示は、このような必要性やその他の必要性を満たすものである。本開示の実施形態は、概して、例えば、心臓組織における細胞表現型が挙げられるがこれらに限定されないインビボにおける細胞表現型を、調節および検出する最適化された方法に関する。このような最適化された方法を提供する組成物は、（ｉ）分化因子（例えば、ＴＢＸ１８、ＴＢＸ３、ＴＢＸ５、およびＳＨＯＸ２などが挙げられるがこれらに限定されない）、転写因子、および／または表現型センサー（例えば、Ｑｕａｓａｒ、Ｊａｗｓ、Ｃａｔｃｈ−Ｖ５、ＣｈＲ２、ＦｌｉｃＲ１、Ａｒｃｈｅｒ１、ＡｒｃｈＤ９５Ｈ、ＧＣａＭＰ６ｆ、および／またはｃＴＮＴ−Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎなどが挙げられるがこれらに限定されない）をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ（またはその組み合わせ）と、（ｉｉ）例えば、カチオン性脂質（例えば、リポフェクタミン）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）誘導体（例えば、直鎖ＰＥＩ誘導体）、ポリマー（例えば、ＶｉｒｏＲｅｄ（登録商標）などのウイルス様ポリマー）、ポリペプチドもしくはペプチド（例えば、ウイルスポリペプチドもしくはウイルスタンパク質）、ナノ粒子（例えば、ウイルス様粒子）、および／または脂質系粒子（例えば、リポソームもしくはナノリポソーム）などが挙げられるがこれらに限定されない送達媒体と、を含む、組成物であって、該組成物は、例えば、心臓細胞、および／または細胞系もしくはエキソビボの初代細胞のいずれかから生成され得るＰＳＣを含む心臓モデルシステムなどが挙げられるがこれに限定されない標的細胞に送達される。場合によっては、組成物は、標的細胞の細胞環境を調節するか、または発現および／もしくは細胞表現型を測定するためのリポーターとして働く、タンパク質をコードするｍＲＮＡ、ならびに／あるいは上記少なくとも１つのｍＲＮＡに結合する小分子を含み得る。また、本開示の組成物を用いて、例えば、房室ブロックまたはヒス束ブロックなどの、徐脈性不整脈の原因となる心房伝導系および心室伝導系における電流ブロック、洞不全症候群などの、洞房結節が心拍を開始することについての異常、ならびにその他の不整脈などが挙げられるがこれらに限定されない、典型的にはペースメーカー装置の埋め込みを必要とする心臓疾患を治療することもできる。また、疾患のシミュレーションおよび／または治療用化合物や治療用製剤のテストを行うためのインビトロにおける心臓モデリングに、本開示の組成物を用いることもできる。
【００１８】
本発明は、心臓モデルシステムなどのインビトロのシステムにおける細胞表現型を調節および検出する、合成ｍＲＮＡの新規の使用法を提供する。本手法は、心臓細胞、ニューロン、視細胞、膵臓細胞、および／またはＰＳＣなどの標的細胞にこのようなｍＲＮＡを形質移入することと共に、本明細書で説明されるような組成物の使用を含む。ｍＲＮＡを用いて遺伝子を発現させると、化学量論的様式で、複数の遺伝子を迅速（１〜２日）かつ一過的に、同時に発現させることができ（これは、表現型のより良い制御をもたらし得る）、かつ複数回投与によって発現期間を制御することができる。
【００１９】
発明者らは、非常に高い形質移入効率（＞９８％）により、心臓細胞におけるｍＲＮＡ発現を最適化した。また、発明者らは、ｍＲＮＡを用いて分化因子であるＴＢＸ１８を発現させることで、他の分化因子と同様、インビトロにおいて、ラット新生児心室筋細胞が、ペースメーカーの細胞表現型を呈するように誘導されることも実証した。このことは、収縮反応を、イメージングを用いて観察および定量化することにつながった。また、発明者らは、ＰＳＣ由来の心筋細胞において首尾良くｍＲＮＡを発現させ、多電極アレイを用いて電気活性を観察した。電気的読み出しをイメージング法と組み合わせて表現型を評価することによって、研究開発（R&D）段階において医薬品を評価および最適化するための、高度に堅固なシステムが作成される。インビボにおける表現型センサーおよび分化遺伝子の発現によって、移植後の幹細胞の機能をより理解するための手段が提供されるだけでなく、心臓障害を診断および治療する新規の方法が開発される。
【００２０】
本開示の多様な実施形態の原理や特徴を容易に理解できるように、以下で多様な説明的実施形態について説明する。本開示の例示的な実施形態について詳細に説明するが、他の実施形態を検討することは理解されるべきである。したがって、本開示の範囲を、以下の記述や実施例で説明された詳細な構成要素の構造および配置に限定することは、意図されない。本開示は、他の実施形態が可能であり、かつ様々な方法で実現または実行することが可能である。また、例示的な実施形態について説明する際に、明確性のために、特定の専門用語が用いられる。
【００２１】
また、本明細書および添付の請求の範囲において使用される、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈が明らかに他のものを指示していない限り、複数の言及を含むことに留意が必要である。例えば、一構成要素（a component）に対する言及は、複数の構成要素からなる構成を含むことも意図される。「一」要素（"a" constituent）を含む構成要素に対する言及は、言及されたその１つ以外に他の要素を含むことが意図される。換言すると、「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」なる語は、数量の限定を示すものではなく、むしろ、言及されたアイテムが「少なくとも１つ」存在することを示す。
【００２２】
本明細書で用いられる用語「および／または（and/or）」は、「および（and）」を意味する場合もあるし、「または（or）」を意味する場合もあるし、「排他的なまたは（exclusive-or）」を意味する場合もあるし、「１つ（one）」を意味する場合もあるし、「いくつか、でもすべてではない（some, but not all）」を意味する場合もあるし、「いずれでもない（neither）」を意味する場合もあるし、かつ／または「いずれも（both）」を意味する場合もある。「または（or）」なる語は、非排他的な「または」（inclusive "or"）を意味することが意図される。
【００２３】
また、例示的な実施形態について説明する際に、明確性のために、専門用語が用いられる。各用語は、当業者によって理解される最も広い意味を意図したものであって、同様の様式で作動して同様の目的を達成する技術的等価物をすべて含むことが意図される。開示された技術の実施形態は、こられの具体的詳細を用いることなく実行されてもよいということは、理解されるべきである。他の例において、本説明の理解を曖昧にしないように、公知の方法、構造、および技術については、詳細に示さなかった。「一実施形態（one embodiment）」「ある実施形態（an embodiment）」、「いくつかの実施形態」、「特定の実施形態」、「多様な実施形態」などへの言及は、そのように記載されている開示された技術の実施形態が、特定の特徴、構造、または特性を有していてもよいが、すべての実施形態が、その特定の特徴、構造、または特性を必ずしも有しているわけではないということを示す。さらに、「一実施形態において」という語句を繰り返し用いることは、同一の実施形態のことをいう場合もあるが、必ずしもそうではない。
【００２４】
本明細書において、範囲は、「おおよそ（about）」もしくは「大体（approximately）」もしくは「実質的に（substantially）」ある特定の値から、および／または、「おおよそ（about）」もしくは「大体（approximately）」もしくは「実質的に（substantially）」他の特定の値までとして表現される場合がある。このような範囲を表現する場合、他の例示的な実施形態は、ある特定の値から、および／または、他の特定の値まで、を含む。さらに、「おおよそ（about）」なる語は、当業者が決定した、特定の値に対する許容可能な誤差範囲（これは、その値がどのように測定または決定されたか、すなわち、測定システムの制約に部分的に依存する）内にあることを意味する。例えば、「おおよそ（about）」は、当該技術分野における慣習どおり、許容可能な標準偏差内にあることを意味し得る。あるいは、「おおよそ（about）」は、所与の値の±２０％までの範囲、好ましくは±１０％までの範囲、より好ましくは±５％までの範囲、さらに好ましくは±１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システムまたは生物学的プロセスに関しては、この語は、ある値の１桁分以内、好ましくは２倍以内にあることを意味し得る。本出願および特許請求の範囲において特定の値が説明されている場合は、他に言及されていない限り、「おおよそ（about）」なる語は、黙示的であって、この文脈において、特定の値に対する許容可能な誤差範囲内にあることを意味する。
【００２５】
同様に、本明細書で用いられる、何かを「実質的に含まない」または「実質的に純粋である」などの描写は、何かを「少なくとも実質的に含まない」または「少なくとも実質的に純粋である」ということと、何かを「完全に含まない」または「完全に純粋である」ということとのいずれをも含み得る。
【００２６】
「含む（comprising）」または「含む（containing）」または「含む（including）」という語句は、少なくとも言及された化合物、要素、粒子、または方法ステップが、組成物、物品、または方法に存在していることを意味するが、他の化合物、物質、粒子、または方法ステップが、言及されたものと同じ機能を有する場合であっても、その存在を排除しない。
【００２７】
本説明を通じて、特定の値または特定のパラメータを有するものとして、多様な組成物を特定する場合があるが、これらのアイテムは、例示的な実施形態として提供される。さらに言えば、多くの同等なパラメータ、サイズ、範囲、および／または値が実現されてもよいので、例示的な実施形態は、本開示の多様な態様および概念を限定するものではない。「第１の（first）」、「第２の（second）」などの用語、「第１（primary）」、「第２（secondary）」などの用語は、順序、量、または重要性を示すのではなく、むしろ、ある要素を別の要素と区別するために用いられる。
【００２８】
なお、本明細書において、「具体的には」、「好ましくは」、「典型的には」、「一般的には」、および「しばしば」といった語を用いることで、請求項に係る開示の範囲は限定されないし、請求項に係る開示の構造もしくは機能にとって、ある特徴が不可欠であるということ、または必須であるということは含意されず、重要であるということさえ含意されない。むしろ、これらの語によって、本開示の特定の実施形態において用いられても用いられなくてもよい別の特徴または追加的な特徴を強調することが、単に意図されるに過ぎない。また、「実質的に」および「おおよそ」といった語は、本明細書において、定量比較や定量値、定量的測定、またはその他の表記に含まれる場合がある固有の不確実性度を表現するのに用いられる。
【００２９】
本明細書に開示される寸法および値は、列挙された正確な数値に厳密に限定されるものとして理解されるべきではない。その代わり、他に言及されていない限り、このような各寸法は、列挙された値およびその値周辺の機能的に等価な範囲の両方を意味することが意図される。例えば、「５０ｍｍ」と開示された寸法は、「おおよそ５０ｍｍ」を意味することが意図される。
【００３０】
また、１つ以上の方法ステップについての言及は、明白に特定されたそれらのステップ間の追加的方法ステップまたは中間的方法ステップの存在を除外しないことが、理解されるべきである。また、同様に、組成物中の１つ以上の成分についての言及は、明白に特定された成分以外の追加的な成分の存在を除外しないことが、理解されるべきである。
【００３１】
本開示の多様な要素を構成するものとして以下で述べる物質は、限定的なものではなく、例示的なものであることが意図される。本明細書で説明される物質と同一または類似の機能を果たすであろう多くの適切な物質が、本開示の範囲に包含されることが意図される。本明細書で説明されないこのようなその他の物質としては、例えば、本開示が開発された後に開発された物質を挙げることができるが、これらに限定されない。多様な図面に挙げられた寸法は、いずれも、あくまでも例示であって、限定することを意図するものではない。他の寸法および比率が、本開示の範囲に含まれることが検討および意図される。
【００３２】
本明細書で用いられる「被験体」または「患者」なる語は、哺乳類のことをいい、ヒトおよび獣医学的動物が挙げられるがこれらに限定されない。好適な実施形態において、被験体はヒトである。
【００３３】
「疾患」とは、被験体が恒常性を維持することができず、かつ、その疾患が改善されない場合には、被験体の健康が悪化し続けるような、被験体の健康状態である。それとは対照的に、被験体における「障害」とは、被験体は恒常性を維持することができるが、被験体の健康状態は、その障害がない場合よりも好ましいものではない、健康状態である。障害を治療せずにおいても、必ずしも、障害のために被験体の健康状態がさらに低下するということはない。
【００３４】
状態、障害、または病状を「治療する」またはそれらに対する「治療」なる語は、（１）その状態、障害、または病状に苦しんでいてもよいし、それらに罹患しやすくてもよいが、まだその状態、障害、または病状の臨床的症状または亜臨床的症状を経験または呈示していない被験体において進展する、その状態、障害、または病状の少なくとも１つの臨床的症状または亜臨床的症状の発現を予防するまたは遅延させること、あるいは（２）その状態、障害、または病状を阻害すること、すなわち、疾患の発症もしくはその再発（維持療法の場合）、またはその少なくとも１つの臨床的症状もしくは亜臨床的症状を抑止する、低減する、または遅延させること、あるいは（３）疾患を緩和すること、すなわち、その状態、障害、もしくは病状、または少なくとも１つの臨床的症状もしくは亜臨床的症状を退行させること、を含む。統計的に有意であるか、または少なくとも患者もしくは医師が知覚可能であれば、治療される被験体にとって有益ということである。
【００３５】
本明細書で用いられる「治療用の」なる語は、治療法および／または予防法を意味する。治療効果は、疾患状態を抑制、軽減、緩和、または根絶することによって得られる。
【００３６】
本明細書で用いられる、投与量または量に適用される「治療効果のある」なる語は、状態、障害、または病状の治療（例えば、予防または改善）のために被験体に投与する際に、このような治療を達成するのに十分な、化合物または医薬組成物の量のことをいう。「治療効果のある量」は、投与される化合物または類似体に応じて変動するだけでなく、疾患やその重症度、ならびに治療される哺乳類の年齢、体重、体調、および応答性に応じても変動する。
【００３７】
医療分野の観点において、「予防する」なる語は、疾患由来の死亡または罹患による負担を低減するいずれの行為をも包含する。予防は、一次予防の段階、二次予防の段階、および三次予防の段階において行われ得る。一次予防によって疾患の発症が回避され、その一方、予防の二次段階および三次段階は、疾患の進展および症状の発現を予防することを目的とした行為だけでなく、機能を回復し、疾患に関連する合併症を低減することで、既存の疾患の悪影響を低減することを目的とした行為をも包含する。
【００３８】
本明細書で用いられる、本開示に係る組成物と少なくとも第２の薬学的に活性を有する成分との「組み合わせ」なる語は、少なくとも２つの化合物の、任意の所望の組み合わせが、同時または順次に（例えば、２４時間以内に）送達され得ることを意味する。本開示の意味の範囲において、「併用投与」なる語は、本開示に係る組成物と、別の治療薬とを、１つの組成物として同時に投与すること、または異なる組成物として同時に投与すること、または順次に投与する（好ましくは、２４時間以内に）こと、をいう。
【００３９】
本明細書で用いられる「発現」なる語は、プロモーターによって駆動される、特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳と定義される。
【００４０】
「発現ベクター」とは、発現するヌクレオチド配列に動作可能に連結された発現制御配列を有する組み換えポリヌクレオチドを含むベクターのことをいう。発現ベクターは、十分な発現用シスエレメントを含み、他の発現用エレメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ発現システムにおいて、供給され得る。発現ベクターとしては、当該技術分野において公知のものがすべて挙げられ、例えば、組み換えポリヌクレオチドを組み込んだコスミド、プラスミド（例えば、裸のプラスミド、またはリポソームに含まれるプラスミド）、およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス）が挙げられる。
【００４１】
本明細書で用いられる「形質移入した」または「形質転換した」または「形質導入した」なる語は、外因性の核酸を宿主細胞に移入または導入するプロセスのことをいう。「形質移入した」または「形質転換した」または「形質導入した」細胞は、外因性の核酸を形質移入、形質転換、または形質導入した細胞である。細胞としては、初代被験細胞およびその後代が挙げられる。
【００４２】
本開示によると、当該技術分野における従来の分子生物学的技術や微生物学的技術、組み換えＤＮＡ技術が用いられてもよい。このような技術は、文献で完全に説明されている。とりわけ、例えば、サンブルック（Sambrook），フリッチュ（Fritsch）およびマニアティス（Maniatis），モレキュラー・クローニング：ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）第２版（１９８９），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press），コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク（本明細書では「サンブルックら、１９８９」とする）；ＤＮＡクローニング：プラクティカル・アプローチ（DNA Cloning: A Practical Approach），Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．グローバー（D.N. Glover）編，１９８５）；オリゴヌクレオチド・シンセシス（Oligonucleotide Synthesis）（Ｍ．Ｊ．ガイト（M.J. Gait）編，１９８４）；ヌクレイック・アシッド・ハイブリダイゼーション（Nucleic Acid Hybridization）（Ｂ．Ｄ．ヘイムズ（B.D. Hames）およびＳ．Ｊ．ヒギンス（S.J. Higgins）編、（１９８５）；トランスクリプション・アンド・トランスレーション（Ｂ．Ｄ．ヘイムズおよびＳ．Ｊ．ヒギンス編、（１９８４）；アニマル・セル・カルチャー（Animal Cell Culture）（Ｒ．Ｉ．フレッシュニー（R.I. Freshney）編（１９８６）；イモビライズド・セル・アンド・エンザイム（Immobilized Cells and Enzymes）（ＩＲＬプレス（IRL Press）（１９８６）；Ｂ．パーバル（B. Perbal），プラクティカル・ガイド・トゥ・モレキュラー・クローニング（A Practical Guide To Molecular Cloning）（１９８４）；Ｆ．Ｍ．アウスベル（F.M. Ausubel）ら（編），カレント・プロトコール・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology），ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（John Wiley & Sons, Inc.）（１９９４）を参照のこと。
【００４３】
本開示の組成物
本開示に係る組成物は、核酸と、このような核酸を含む発現ベクターと、核酸または発現ベクターのいずれかを含む細胞と、を含む。
【００４４】
一態様において、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子である核酸が提供される。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ分子は、例えば、ＴＢＸ１８、ＴＢＸ３、ＴＢＸ５、およびＳＨＯＸ２などが挙げられるがこれらに限定されない分化因子を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、転写因子を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、例えば、オプシンや細胞における表現型（例えば、電圧変化、カルシウム変化、および収縮性または運動性などが挙げられるがこれらに限定されない）の変化を検出し得るタンパク質などが挙げられるがこれらに限定されない表現型センサーを含む。オプシンの限定されない例としては、Ｑｕａｓａｒ、Ｊａｗｓ、Ｃａｔｃｈ−Ｖ５、および／またはＣｈＲ２が挙げられる。センサータンパク質の限定されない例としては、ＦｌｉｃＲ１、Ａｒｃｈｅｒ１、ＡｒｃｈＤ９５Ｈ（赤方偏移した電圧センサータンパク質）、ＧＣａＭＰ６ｆ（緑方偏位したＣａ２＋センサータンパク質）、および／またはｃＴＮＴ−Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ（遠赤方偏移した心臓収縮性タンパク質）などが挙げられる。いくつかの実施形態において、異なる分化因子および／または転写因子および／または表現型センサーを含むｍＲＮＡの組み合わせが、同じ細胞に形質移入される。
【００４５】
一態様において、分化因子、転写因子、および／または表現型センサーを発現するためのｍＲＮＡ発現ベクターが提供され、ｍＲＮＡ発現ベクターは、本明細書で説明される分化因子、転写因子、および／または表現型センサーをコードする核酸配列を含む。ｍＲＮＡ発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーターが挙げられるがこれに限定されない異種起源のプロモーターを含んでいてもよい。ｍＲＮＡ発現ベクターは、コザック配列を含んでいてもよい。当業者であれば、分化因子、転写因子、および／または表現型センサーを適切に発現させるために、任意のプロモーターまたは制御配列が選択されてもよいということを理解するであろう。理論に拘束されることを望むものではないが、発明者らは、ｍＲＮＡによって、さらなる試験（例えば、所望の細胞種へのＰＳＣの分化を誘導しその細胞種を特異的に特定する能力の試験、または光刺激に応じた細胞の電気活性の試験）のために、細胞内においてこれらのタンパク質を発現する優れた方法が提供されることを見出した。ｍＲＮＡ発現ベクターによって、わずか３時間でタンパク質を発現することができ、この発現は、７日間持続することができる。説明するｍＲＮＡ発現の多様な様式では、例えば細胞にウイルスを導入しないため、細胞の正常な機能性に与える影響は最小限である。いくつかの実施形態において、異なる分化因子、および／または転写因子、および／または表現型センサーをコードするｍＲＮＡ発現ベクターは、同じ細胞に形質移入される。
【００４６】
いくつかの実施形態において、分化因子は、遺伝子（Ｔｂｘ遺伝子）をコードするＴ−ｂｏｘ転写因子である。Ｔｂｘ遺伝子の限定されない例としては、Ｔｂｘ１８、Ｔｂｘ３、およびＴｂｘ５が挙げられる。いくつかの実施形態において、分化因子は、特定のホメオボックスタンパク質である。特定のホメオボックスタンパク質の限定されない例としては、ＳＨＯＸ２が挙げられる。
【００４７】
いくつかの実施形態において、表現型センサーはオプシンである。いくつかの実施形態において、オプシンは、興奮性オプシンである。いくつかの実施形態において、オプシンは、抑制性オプシンである。興奮性オプシンの限定されない例としては、Ｑｕａｓａｒ、チャネル−ロドプシンＩＩ（ＣｈＲ２）、およびＣａｔＣｈが挙げられるが、これらは、青色のパルス光によって活性化する。抑制性オプシンの限定されない例としては、Ｊａｗｓが挙げられるが、これは、橙色または赤色の連続光によって活性化する。オプシンのその他の例としては、Ｉ型オプシン（例えば、バクテリオロドプシン、キサントロドプシン、ハロロドプシン、ロドプシンＩ、ロドプシンＢ、チャネルロドプシン（ＣｈＲ）、アーキアロドプシン（Ａｒｃｈ）や、ＩＩ型オプシン（例えば、毛様体オプシン、ピノプシン、ロドプシン（Ｒｈ１）、長波長感受性（ＯＰＮ１ＬＷ）オプシン、中波長感受性（ＯＰＮ１ＭＷ）オプシン、短波長感受性（ＯＰＮ１ＳＷ）オプシン、パラピノプシン、パリエトプシン、パノプシン（ＯＰＮ３）、硬骨魚類多組織（ＴＭＴ）オプシン、ｒ−オプシン、メラノプシン、Ｇｏ−オプシン、ＲＧＲオプシン、ペロプシン、およびニューロプシン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
いくつかの実施形態において、表現型センサーは、例えば、膜電位、細胞内カルシウムハンドリング、またはミトコンドリアなどの細胞小器官の生理機能などが挙げられるがこれらに限定されない細胞の電気生理現象の変化を検出することができるタンパク質である。このようなタンパク質の限定されない例としては、ＦｌｉｃＲ１、Ａｒｃｈｅｒ１、ＡｒｃｈＤ９５Ｈ（赤方偏移した電圧センサータンパク質）、ＧＣａＭＰ６ｆ（緑方偏位したＣａ２＋センサータンパク質）、および／またはｃＴＮＴ−Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ（遠赤方偏移した心臓収縮性タンパク質）などが挙げられる。用いられてもよい他の電圧インジケータータンパク質としては、ＦｌａＳＨ、ＶＳＦＰ１、ＳＰＡＲＣ、ＶＳＦＰ２、Ｆｌａｒｅ、ＶＳＦＰ３．１、Ｍｅｒｍａｉｄ、ｈＶＯＳ、ＰＲＯＰＳ、ＡｒｃＬｉｇｈｔ、Ａｒｃｈ、ＥｌｅｃｔｒｉｃＰｋ、ＶＳＦＰ−Ｂｕｔｔｅｒｆｌｙ、ＶＳＦＰ−ＣＲ、Ｍｅｒｍａｉｄ２、Ｍａｃ ＧＥＶＩ、ＱｕａｓＡｒ１、ＱｕａｓＡｒ２、Ａｒｃｈｅｒ、ＡＳＡＰ１、Ａｃｅ ＧＥＶＩ、 Ｐａｄｏ、およびＡＳＡＰ２ｆなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ発現ベクターは、キャッピングされている。キャップは、任意のキャップ構造を有し得る。例えば、５'三リン酸末端の酵素的Ｎ７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）キャッピングによってｍＲＮＡがキャッピングされて、キャップ０が作成される。キャップ０において、ＲＮＡ２'−Ｏ−リボースメチルトランスフェラーゼが触媒する反応により、一番目のヌクレオシドのリボース２'−ヒドロキシル（２'−Ｏ）がさらにメチル化されて、キャップ１構造が形成される。５'末端に２'−Ｏメチル化アデノシンを含むキャップ１構造において、Ｎ６の位置がさらにメチル化される。キャップ１において、同様の酵素によって二番目のヌクレオシドのリボース２'−Ｏの位置がさらにメチル化されることで、キャップ２構造が形成される。キャップ４構造が形成されるためには、転写物の１番目のヌクレオシド（アデニン）において、いまだ同定されていない酵素およびリボース２'−Ｏ特異的メチルトランスフェラーゼ（ＴｂＭＴｒ１）がそれぞれ触媒する反応により、Ｎ６およびリボース２'−Ｏの位置がさらにメチル化されて、６，６，２トリメチルアデニンが生成する。次いで、続く３つのヌクレオシド（ウラシル）において、さらなる２つのリボース２'−Ｏ特異的メチルトランスフェラーゼ（ＴｂＭＴｒ２およびＴｂＭＴｒ３）によりリボース２'−Ｏの位置がメチル化されて、キャップ４合成が完了する。このようなキャッピングによって、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）またはＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）タンパク質ファミリーの他のメンバーが、ｍＲＮＡを感知して望まない先天性免疫応答を引き起こす能力が抑制される場合がある。例えば、５'三リン酸末端のキャッピングがなければ、ＲＩＧ−Ｉは、ｍＲＮＡを素早く感知し、分解することができるであろう。このようなキャッピングによって、ｍＲＮＡ発現ベクターは、ＲＩＧ−ＩおよびＲＬＲタンパク質ファミリーのその他のメンバーによる検出を免れることができる。多様な実施形態において、ｍＲＮＡ発現ベクターの５'三リン酸末端のキャッピングは、ＲＩＧ−ＩまたはＲＬＲタンパク質ファミリーのメンバーを含む細胞への形質移入後少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、および少なくとも６日間、ｍＲＮＡ発現ベクターが所望のタンパク質を発現するのに有効である。
【００５０】
いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオシドがｍＲＮＡに組み込まれ、この修飾ヌクレオシドの組み込みは、ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）および２'−５'−オリゴアデニル酸シンセターゼ（ＯＡＳ）の活性化を抑制するのに有効である。修飾ヌクレオシドは、２−チオウリジン、５−メチルシチジン（５ｍｅＣ）、およびシュードウリジン（例えば、Ｎ１−メチルシュードウリジン）のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、５ｍｅＣおよびシュードウリジンの両方を含む。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオシドは、ジアミノプリン（ＤＡＰ）、Ｎ６−メチル−２−アミノアデノシン（ｍｅ６ＤＡＰ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍｅ６Ａ）、５−カルボキシシチジン（５ｃａＣ）、５−ホルミルシチジン（５ｆＣ）、５−ヒドロキシシチジン（５ｈａＣ）、５−ヒドロキシメチルシチジン（５ｈｍＣ）、５−メトキシシチジン（５ｍａＣ）、５−メチルシチジン（５ｍｅＣ）、Ｎ４−メチルシチジン（ｍｅ４Ｃ）、チエノグアノシン（ｔｙＧ）、５−カルボキシメチルエステルウリジン（５ｃａｍＵ）、５−ホルミルウリジン（５ｆＵ）、５−ヒドロキシメチルウリジン（５ｈｍＵ）、５−メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、または５−メチルウリジン（５ｍｅＵ）である。
【００５１】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ分子は、ポリＡテールを含む。ポリＡテールが、ｍＲＮＡ分子に付加されていてもよい。ｍＲＮＡ分子中にすでに存在しているポリＡテールを、さらに長くしてもよい。限定されない例として、ポリＡテールは、酵素的に付加されていてもよい。ポリＡテールの長さは、１から１２００塩基までの範囲であってもよい。ポリＡテールの長さは、１〜７５塩基であってもよいし、７５〜１００塩基であってもよいし、８５〜１１０塩基であってもよいし、１００〜１２５塩基であってもよいし、１１０〜１３５塩基であってもよいし、１２５〜１５０塩基であってもよいし、１３５〜１６０塩基であってもよいし、１５０〜１７５塩基であってもよいし、１７０〜２２０塩基であってもよいし、１７５〜２２５塩基であってもよいし、２００〜２５０塩基であってもよいし、２２５〜２７５塩基であってもよいし、２５０〜３００塩基であってもよいし、２７５〜３２５塩基であってもよいし、３００〜３５０塩基であってもよいし、３２５〜３７５塩基であってもよいし、３５０〜４００塩基であってもよいし、３７５〜４２５塩基であってもよいし、４００〜４５０塩基であってもよいし、４２５〜４７５塩基であってもよいし、４５０〜５００塩基であってもよいし、４７５〜５２５塩基であってもよいし、５００〜５５０塩基であってもよいし、５５０〜６００塩基であってもよいし、６００〜６５０塩基であってもよいし、６５０〜７００塩基であってもよいし、７００〜７５０塩基であってもよいし、７５０〜８００塩基であってもよいし、８００〜８５０塩基であってもよいし、８５０〜９００塩基であってもよいし、９００〜９５０塩基であってもよいし、９５０〜１０００塩基であってもよいし、１０００〜１０５０塩基であってもよいし、１０５０〜１１００塩基であってもよいし、１１００〜１１５０塩基であってもよいし、１１５０〜１２００塩基であってもよい。
【００５２】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ分子は、分子の５'末端または３'末端のいずれか、またはその両方に、少なくとも１つの非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態において、ＵＴＲは、例えばＲＮＡ結合タンパク質の結合部位、および／またはマイクロＲＮＡ部位を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ分子は、結果としてコードされたポリペプチドのコドン最適化をもたらす少なくとも１つのヌクレオチド変異を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ分子は、小分子と併用される。いくつかの実施形態において、小分子は、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達の阻害剤であり、例えばＡ８３−０１である。いくつかの実施形態において、小分子は、先天性免疫センサーの阻害剤である。
【００５５】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ分子は、配列番号１〜８のいずれかを含むヌクレオチド配列を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ発現ベクターは、例えば、カチオン性脂質、ポリエチレンイミン誘導体、ポリペプチドもしくはペプチド、ポリマー、ナノ粒子、および／または脂質系粒子を含む送達媒体が挙げられるがこれに限定されない送達媒体に収容されている。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質はリポフェクタミンである。いくつかの実施形態において、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）誘導体は、直鎖ＰＥＩ誘導体である。いくつかの実施形態において、ポリマーは、ＶｉｒｏＲｅｄ（登録商標）などのウイルス様ポリマーである。いくつかの実施形態において、ポリペプチドまたはペプチドは、ウイルスポリペプチドまたはウイルスタンパク質である。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、ウイルス様粒子である。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ発現ベクターは、リポソームなどの脂質系粒子に収容されている。リポソームは、ナノリポソームであってもよい。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ発現ベクターは、ナノ粒子に収容されている。ナノ粒子は、脂質ナノ粒子であってもよい。
【００５７】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ発現ベクターは、一過性形質移入の前に精製される。精製は、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって行われてもよい。例えばＨＰＬＣによる精製によって、免疫活性化の抑制および翻訳可能性の増加のうちの一方またはその両方と、細胞培養におけるＴＬＲシグナル伝達の抑制とが可能になる場合がある。
【００５８】
他の態様において、ｍＲＮＡ発現ベクターを含む細胞が提供され、ｍＲＮＡ発現ベクターは、分化因子、転写因子、および／または表現型センサーをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、例えば、心筋細胞が挙げられるがこれに限定されない心臓細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ニューロン細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、眼に見出される。いくつかの実施形態において、細胞は、膵臓細胞である。いくつかの実施形態において、細胞はＰＳＣであり、例えば、ＩＰＳＣまたはＥＳＣである。いくつかの実施形態において、細胞は、ＰＳＣ心筋細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＦｌｉｃＲなどの電圧インジケータータンパク質をコードする核酸配列を含む第２のｍＲＮＡ発現ベクターを含む。
【００５９】
上述の事項のうちのいずれかにおいて、組成物を単独で、または薬学的に許容できる担体および／または第２の治療薬と組み合わせて投与することで、不整脈または不適切な心臓のペーシング、あるいは、例えば、房室ブロックもしくはヒス束ブロックなどの、徐脈性不整脈の原因となる心房伝導系および心室伝導系における電流ブロック、ならびに／または洞不全症候群などの、洞房結節が心拍を開始することについての異常などが挙げられるがこれらに限定されない、不整脈または不適切な心臓のペーシングに伴う障害を治療および／または予防することができる。いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、電動ペースメーカー装置を装着している被験体に提供されてもよい。
【００６０】
本開示の方法
他の態様において、分化因子、転写因子、および／または表現型センサーを発現するためのｍＲＮＡ発現ベクターを細胞に導入することを含む、細胞において分化因子、転写因子、および／または表現型センサーを一過的に発現させるための方法が提供される。いくつかの実施形態において、導入ステップは、細胞をｍＲＮＡ発現ベクターで一過的に形質移入することを含む。
【００６１】
一態様において、治療用途で用いることができる所望の細胞種を作製するために、細胞表現型を調節する方法が提供される。例えば、心筋細胞またはＰＳＣを、生物学的ペースメーカーとして用いることができ、これを必要とする被験体に提供することができる、心臓ペースメーカー細胞へと分化させることができるが、これに限定されない。このような生物学的ペースメーカーを用いて、例えば、不整脈もしくは不適切な心臓のペーシング、房室ブロックもしくはヒス束ブロックなどの、徐脈性不整脈の原因となる心房伝導系および心室伝導系における電流ブロック、ならびに／または洞不全症候群などの、洞房結節が心拍を開始することについての異常などが挙げられるがこれらに限定されない多様な心臓病を治療することができる。いくつかの実施形態において、既存の電動ペースメーカーを装着している被験体に、生物学的ペースメーカーを提供することができる。いくつかの実施形態において、既存の電動ペースメーカーを装着していない被験体に、生物学的ペースメーカーを提供することができる。いくつかの実施形態において、同様の心臓病を治療する第２の治療法も併用している被験体に、生物学的ペースメーカーを提供することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で説明される細胞表現型を決定するための方法を用いて、得られた分化済細胞の表現型を決定することができる。
【００６２】
いくつかの実施形態において、本方法は、標的細胞の表現型を調節するために、分化因子または転写因子を含むｍＲＮＡを一過的に発現させることを含む。限定されない例として、分化因子を含むｍＲＮＡは、配列番号１を含む核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、標的細胞は心筋細胞であり、本方法は、心筋細胞が心臓ペースメーカー細胞となり、心拍を開始することと維持することとを含む心臓ペースメーカー細胞の機能をすべて果たすことができるように、心筋細胞の表現型を調節することを含む。いくつかの実施形態において、標的はＰＳＣであり、本方法は、所望の細胞種へと分化するように、ＰＳＣの表現型を調節することを含む。いくつかの実施形態において、ＰＳＣ由来の細胞は均一であり、このことは、それらが単一のサブタイプであることを意味する。例えば、本明細書で説明されるｍＲＮＡ発現ベクターは、心筋細胞を心房筋細胞、心室筋細胞、または心臓ペースメーカー細胞へと分化させるために、心筋細胞またはＩＰＳＣに形質移入され得るが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、結果として得られる細胞は、均一であり得、このことは、細胞が心房筋細胞または心室筋細胞のいずれかであることを意味する。いくつかの実施形態において、本明細書で説明される細胞表現型を検出するための方法を用いて、細胞の表現型を決定し、これらを分類することができる。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ発現ベクターは、分化因子または転写因子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、分化因子は、遺伝子（Ｔｂｘ遺伝子）をコードするＴ−ｂｏｘ転写因子である。Ｔｂｘ遺伝子の限定されない例として、ＴＢＸ１８、Ｔｂｘ３、およびＴｂｘ５が挙げられる。いくつかの実施形態において、分化因子は、特定のホメオボックスタンパク質である。特定のホメオボックスタンパク質の限定されない例として、ＳＨＯＸ２（Ｓｂｘ２）が挙げられる。いくつかの実施形態において、異なる分化因子および／または転写因子をコードする核酸配列を含む、異なるｍＲＮＡ発現ベクターが、同じ細胞に一過的に形質移入される。いくつかの実施形態において、オプシン（例えば、Ｑｕａｓａｒ、Ｊａｗｓ、Ｃａｔｃｈ−Ｖ５、および／またはＣｈＲ２）またはセンサータンパク質（例えば、ＦｌｉｃＲ１、Ａｒｃｈｅｒ１、ＡｒｃｈＤ９５Ｈ、ＧＣａＭＰ６ｆ、および／またはｃＴＮＴ−Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ）などの表現型センサーをコードする核酸配列を含む、第２のｍＲＮＡ発現ベクターが、細胞に一過的に形質移入される。
【００６４】
一態様において、例えば、膜電位や細胞内カルシウムハンドリング、ミトコンドリアなどの細胞小器官の生理機能といった細胞の電気生理現象が挙げられるがこれに限定されない細胞表現型を検出する方法が提供される。一実施形態において、本明細書で説明される方法で行われるような心筋細胞またはＰＳＣの分化によって得られる心臓ペースメーカー細胞は、心房筋細胞、心室筋細胞、または心臓ペースメーカー細胞に分類することができる。他の実施形態において、潜在的薬剤の心臓毒性は、１つ以上のオプシンまたは本明細書で説明される他のセンサータンパク質を発現する細胞においてスクリーニングされる。
【００６５】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ発現ベクターは、オプシンであるセンサータンパク質をコードする核酸配列を含む。限定されない例として、オプシンを含むｍＲＮＡは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号７および／または配列番号８を含む核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、オプシンは、興奮性オプシンである。いくつかの実施形態において、オプシンは、抑制性オプシンである。いくつかの実施形態において、オプシンは、Ｑｕａｓａｒ、Ｊａｗｓ、Ｃａｔｃｈ−Ｖ５、および／またはＣｈＲ２である。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ発現ベクターは、例えば、細胞の電気生理現象が挙げられるがこれに限定されない細胞の生理的状態を検出することを可能にするセンサータンパク質をコードする核酸配列をコードする。限定されない例として、このようなセンサータンパク質を含むｍＲＮＡは、配列番号３および配列番号５を含む核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、センサータンパク質によって、細胞の電圧、膜電位、およびイオン濃度（例えばＣａ２＋、Ｎａ＋、Ｋ＋）の変化を検出することが可能になる。いくつかの実施形態において、センサータンパク質は、ＦｌｉｃＲ１、Ａｒｃｈｅｒ１、ＡｒｃｈＤ９５Ｈ、ＧＣａＭＰ６ｆ、および／またはｃＴＮＴ−Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎである。
【００６６】
いくつかの実施形態において、第２のセンサータンパク質をコードする核酸配列を含む第２のｍＲＮＡ発現ベクターが、細胞に一過的に形質移入される。
【００６７】
いくつかの実施形態において、一過性形質移入は、エレクトロポレーションを含む。いくつかの実施形態において、一過性形質移入は、リポフェクションを含む。いくつかの実施形態において、一過性形質移入は、例えば、ＪＥＴ−ＰＥＩのような直鎖ＰＥＩ誘導体が挙げられるがこれに限定されない修飾ＰＥＩ媒介送達を含む。いくつかの実施形態において、一過性形質移入は、ｍＲＮＡとウイルス様ポリマー（例えば、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標） Ｒｅｄ）との複合体を形成することを含む。いくつかの実施形態において、リポフェクションは、修飾ｍＲＮＡ（例えば、５ｍｅＣおよびシュードウリジンで修飾されたｍＲＮＡ）を用いて行われ、これは、細胞内において、ｍＲＮＡ由来の転写物の発現を向上するのに有効である。
【００６８】
いくつかの実施形態において、他の送達方法および送達媒体が用いられ、これらは、カチオン性脂質、ポリエチレンイミン誘導体、ポリペプチドもしくはペプチド、ポリマー、ナノ粒子、および／または脂質系粒子を含む送達媒体を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質は、リポフェクタミンである。いくつかの実施形態において、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）誘導体は、直鎖ＰＥＩ誘導体である。いくつかの実施形態において、ポリマーは、ＶｉｒｏＲｅｄ（登録商標）などのウイルス様ポリマーである。いくつかの実施形態において、ポリペプチドまたはペプチドは、ウイルスポリペプチドまたはウイルスタンパク質である。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、ウイルス様粒子である。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ発現ベクターは、リポソームなどの脂質系粒子に収容されている。リポソームは、ナノリポソームであってもよい。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ発現ベクターは、ナノ粒子に収容されている。ナノ粒子は、脂質ナノ粒子であってもよい。
【００６９】
いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオシドがｍＲＮＡ発現ベクターに組み込まれ、この修飾ヌクレオシドの組み込みは、ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）および２'−５'−オリゴアデニル酸シンセターゼ（ＯＡＳ）の活性化を抑制するのに有効である。修飾ヌクレオシドは、２−チオウリジン、５−メチルシチジン（５ｍｅＣ）、およびシュードウリジン（例えば、Ｎ１−メチルシュードウリジン）のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、５ｍｅＣおよびシュードウリジンの両方を含む。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオシドは、ジアミノプリン（ＤＡＰ）、Ｎ６−メチル−２−アミノアデノシン（ｍｅ６ＤＡＰ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍｅ６Ａ）、５−カルボキシシチジン（５ｃａＣ）、５−ホルミルシチジン（５ｆＣ）、５−ヒドロキシシチジン（５ｈａＣ）、５−ヒドロキシメチルシチジン（５ｈｍＣ）、５−メトキシシチジン（５ｍａＣ）、５−メチルシチジン（５ｍｅＣ）、Ｎ４−メチルシチジン（ｍｅ４Ｃ）、チエノグアノシン（ｔｙＧ）、５−カルボキシメチルエステルウリジン（５ｃａｍＵ）、５−ホルミルウリジン（５ｆＵ）、５−ヒドロキシメチルウリジン（５ｈｍＵ）、５−メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、または５−メチルウリジン（５ｍｅＵ）である。多様な実施形態において、ｍＲＮＡ発現ベクターは、ｍＲＮＡ発現ベクターが一過的に発現される細胞の細胞膜に局在する。
【００７０】
他の態様において、オプシンまたは本明細書で説明される他のセンサータンパク質を発現するためのｍＲＮＡ発現ベクターのいずれかを発現する細胞を、機能的に特徴付けるための方法が提供される。本方法は、ｍＲＮＡ発現ベクターを発現する細胞に対して多電極アレイ（ＭＥＡ）解析を行うことを含んでいてもよい。ＭＥＡ解析は、コントロールとして、ｍＲＮＡ発現ベクターを発現しない同様の細胞に対して行うこともできる。ＭＥＡ解析は、本明細書で説明されるように、電場電位、例えば、細胞におけるスパイキング活性を検出することを含んでいてもよい。ＭＥＡ解析は、例えば、４８ウェルプレートのウェル１つあたり１６個の電極の測定および光励起が同時に可能なアクシオン・バイオシステムズ社（Axion Biosystems）のマエストロ（Maestro）（登録商標）装置のような、複数の区画において試料の測定及び光励起を同時に行うことができる装置上で行われてもよい。本方法は、細胞内Ｃａ２＋染料を添加し、形質移入を行った細胞のタイムラプス写真を適切なカメラおよびイメージングスイートを用いて撮影することで、活動電位プロファイルおよび／またはＣａ２＋の一過性動態を測定することを含んでいてもよい。本方法は、蛍光ｃＴＮＴによって、筋細胞における収縮および弛緩の最大速度を測定することをさらに含んでいてもよい。
【００７１】
他の態様において、薬剤をスクリーニングし、かつ／または表現型センサーを発現する細胞を機能的に特徴付けることに対する効果について、１つ以上の薬剤を試験するための方法が提供される。薬剤は、心臓細胞（例えば、心筋細胞が挙げられるが、これに限定されない）、ニューロン細胞、眼に見出される細胞、膵臓細胞、ＰＳＣ（例えば、ＩＰＳＣまたはＥＳＣ）、および／またはＰＳＣ心筋細胞に適用されてもよい。心臓障害、神経障害、眼障害、および／または膵臓障害を治療するための候補となる薬剤を発見するために、薬剤スクリーニングが用いられてもよい。本方法は、スクリーニングまたは試験を行う薬剤が適用される、ｍＲＮＡ発現ベクターを発現する細胞に対して、多電極アレイ（ＭＥＡ）解析を行うことを含んでいてもよい。ＭＥＡ解析は、ｍＲＮＡ発現ベクターを発現するが薬剤は適用されない同様の細胞に対して行うこともできる。ＭＥＡ解析は、電場電位、例えば、細胞におけるスパイキング活性を検出することを含んでいてもよい。ＭＥＡ解析は、例えば、４８ウェルプレートのウェル１つあたり１６個の電極の測定および光励起が同時に可能なアクシオン・バイオシステムズ社のマエストロ（登録商標）装置のような、複数の区画において試料の測定及び光励起を同時に行うことができる装置上で行われてもよい。オプシン（例えば、ＣｈＲ２）などのセンサータンパク質の機能発現は、電気活性と、ＭＥＡ装置に組み込まれたＬＥＤによるパルス光励起との間の同期イベントとして測定され得る。細胞が心臓細胞である場合には、ＭＥＡ解析は、拍動速度または電気的応答を定量的に試験することを含み得る。例えば、ｍＲＮＡ発現ベクターを発現する心臓細胞を、１Ｈｚ、２Ｈｚ、または３Ｈｚなど、多様な拍動速度でペーシングさせることができる。また、ＭＥＡ装置からの異なる光のパターンを用いて、不整脈または他の異常をシミュレーションすることができる。本方法は、細胞内Ｃａ２＋染料を添加し、形質移入を行った細胞のタイムラプス写真を適切なカメラおよびイメージングスイートを用いて撮影することで、活動電位プロファイルおよび／またはＣａ２＋の一過性動態を測定することを含んでいてもよい。本方法は、蛍光ｃＴＮＴによって、筋細胞における収縮および弛緩の最大速度を測定することをさらに含んでいてもよい。
【００７２】
いくつかの実施形態において、本方法は、薬剤をスクリーニングし、かつ／または、例えば、オプシンが挙げられるがこれに限定されないセンサータンパク質を発現する心臓細胞における不整脈に対する効果について、１つ以上の薬剤を試験するための方法である。理論に拘束されることを望むものではないが、非常に多くの薬物療法が、不整脈惹起性の副作用に悩まされている。少なくとも、第ＩＩＩ類の抗不整脈剤を処方された患者のうち、致死率の高い病状であるトルサード・ド・ポワントを発症する患者が１％を超えるという理由から、薬剤が、不整脈を増加または悪化させる場合があるかどうかを評価することが必要である。このような患者にとってどの薬剤が危険であるかをよりよく理解することによって、死者数を減少させることができる。
【００７３】
本方法は、長期的なリアルタイム研究において、例えば、初代心筋細胞または幹細胞由来の心筋細胞が挙げられるがこれらに限定されない標的細胞の特性を研究する、最新の方法を提供することができる。本方法は、少なくとも１つのセンサータンパク質（例えば、オプシン）と、細胞の電気生理現象（例えば、電圧）を測定または表示することができる少なくとも１つの第２のセンサータンパク質と、を心臓細胞に形質移入することを含んでいてもよい。オプシンは、可視光を電気的応答に変換することができ、電圧インジケータータンパク質は、電圧の変化に応じて、蛍光強度を検出可能な変化として示すことができる。電圧インジケータータンパク質およびオプシンの両方の形質移入は、例えば、直鎖ＰＥＩなどの修飾ＰＥＩまたはウイルス様ポリマー（例えば、Ｖｉｒｏｍｅｒ Ｒｅｄ（登録商標））などのポリマーなどが挙げられるがこれらに限定されない、本明細書で説明される送達媒体を用いて行うことができる。発現されたタンパク質の局在については、顕微鏡検査法および／またはフローサイトメトリーによって分析してもよい。
【００７４】
多様な実施形態において、形質移入を行った細胞の機能が評価される。形質移入を行った細胞は、オプシンを刺激することができる様々な光強度の光に曝露され、かつ／またはセンサータンパク質を刺激する様々な条件に曝露されてもよい。例えば、ＣａｔＣＨは、４７５ｎｍの青色光を用いて刺激されてもよい。多様な刺激継続時間が用いられてもよく、それは、０．５〜３０ミリ秒であってもよいし、１〜１５ミリ秒であってもよいし、１〜５ミリ秒であってもよいし、４〜１０ミリ秒であってもよいし、１０〜１５ミリ秒であってもよいし、１５〜３０ミリ秒であってもよい。多様な周波数において、単相矩形波を連続して用いることができる。
【００７５】
［実施例］
本開示を、以下の実施例によって、さらに説明および実証する。しかしながら、本明細書にあるこれらの実施例およびその他の実施例の使用は、単なる例示であり、本開示または例示的な用語の範囲および意味を限定するものでは決してない。また、本開示は、ここで述べる特定の好ましい実施形態のいずれにも限定されない。さらに言えば、本明細書を読めば、本開示の多くの変更および修正が当業者には明らかであり、本開示の趣旨または範囲から離れることなく、このような修正を行うことができる。したがって、本開示は、請求の範囲が権利を与えられる均等物の全範囲と共に、添付の請求の範囲の用語によってのみ限定されるものである。
【００７６】
実施例１：ＴＢＸ１８をコードするｍＲＮＡのインビボでの使用による、ラットの心臓ブロックモデルにおける新規ペースメーカー（洞房結節）細胞の生成
この実験で、発明者らは、ラットの完全房室ブロック（ＣＡＶＢ）モデルを作成した。ラットを１週間モニターし、ＣＡＶＢが安定かつ持続性であることを確認した。
材料および方法
【００７７】
０日目に、Ａ８３−０１（ＴＧＦ−ベータ阻害剤、シグマ・アルドリッチ社（Sigma Aldrich））を放出する浸透圧ポンプをラットに埋め込んだ。１日目に、ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡをラットに注入し、また、遠隔測定装置を埋め込んだ。ラットに投与したＴＢＸ１８ ｍＲＮＡの量は２種類とした。すなわち、（ｉ）６８．４μｌのＲＮＡ非含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１００μｇのＴＢＸ１８ ｍＲＮＡを添加した低用量、または（ｉｉ）２０５μｌのＲＮＡ非含有ＰＢＳに３００μｇのＴＢＸ１８ ｍＲＮＡを添加した高用量である。遠隔測定装置の埋め込み後、各ラットの心電図（ＥＣＧ）を、２１日間、連続的に遠隔で記録した。さらに、７日目、１４日目、および２１日目に、イソプロテレノールへの曝露を行いながら、麻酔をかけた動物に対して三電極体表面ＥＣＧを行った。２１日目に、各動物から心臓を摘出した。
【００７８】
実施例２：センサータンパク質をコードするｍＲＮＡの開発
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）は、新規に心筋細胞を生じ得るが、得られた筋細胞は、しばしば、心房筋細胞、心室筋細胞、および結節ペースメーカー筋細胞のランダムな混合物となる。このことは、薬剤スクリーニングアッセイや、心臓再生のための細胞療法の進展を妨げるという点で問題となる。初期の心筋細胞についての多モードでリアルタイムな機能的読み出しの欠如が、さらにこの問題を複雑にし得る。本実施例は、ｉ）心室系統、心房系統、またはペースメーカー系統の心筋細胞の特異的誘導、およびｉｉ）インビトロ転写（ＩＶＴ）修飾ｍＲＮＡ技術による筋細胞機能の光学的測定のすべて、によって、これらの問題の両方に対処することを意図するものである。
【００７９】
世界中で何百万人の人が、異常に速い心拍または異常に遅い心拍を患っており、新規症例は米国だけで３００万件を越える。不整脈に対する既存の薬物療法は、オフターゲットな効果を伴い、新規薬剤開発の損耗率は極めて高い。他の臓器を標的とするように設計された薬剤は、心臓毒性について安全であることが証明される必要がある。しかしながら、現在の心筋細胞プラットフォームは、かなり不十分である。齧歯類動物由来の初代心筋細胞は、しばしば、培養するのが困難であり、また、電気生理現象が種特異的に異なることで悩まされることが多い。ヒトｉＰＳＣは、新規心筋細胞を制限なく供給可能であるが、得られる筋細胞は、心房筋細胞、心室筋細胞、および結節筋細胞のランダムな混合物からなる。このような異質性は、薬剤スクリーニングの結果が偽陽性／偽陰性となる主な原因である。場合によっては、心臓安全性／心臓毒性のデータが偽陰性となると、しばしば生命を脅かす事象を引き起こす、望まない心室性頻拍が表面化しないことがある。問題が複雑になるのは、信頼できる、多モードでリアルタイムな心筋細胞機能の読み出しが欠如しているためであるが、この機能は、不可欠な筋細胞の２つの特性、すなわち電気的興奮およびそれに続く収縮にかかっている。現在の心筋細胞機能測定法は良いものではあるが、単独で行われるか侵襲的であるかのいずれかであり得、したがって、長期にわたり複数の時点で筋細胞の特性を測定することは不可能である。
【００８０】
本実施例は、発明者らが、２つの強力な技術をどのように利用して、幹細胞由来の心筋細胞の製造を開発し標準化したかを説明するものである。小分子に基づく技術を利用して、ｈｉＰＳＣ系統からサブタイプ特異的心筋細胞を得た。新規ヒト心筋細胞は、その特定のサブタイプに合わせた電気的機能および収縮機能を発揮し、その遺伝子型／表現型は、二次元培養において６週間を越えて安定であった。初代哺乳類細胞における体細胞遺伝子移入のためのＩＶＴ ＲＮＡ技術によって、重要品質特性（ＣＱＡ）が決定される。ウイルスベクターを用いないので、ＩＶＴ ＲＮＡ法は、導入遺伝子の持続発現にとって効率的で、エピソーム的で、多重化可能であって、一過的ではあるが安定である。
【００８１】
さらに、本実施例は、光に基づく細胞の分化または成熟を促進する手段として、心筋細胞においてオプシン、すなわち光操作タンパク質をｍＲＮＡに基づいて発現させる最適化された方法について説明するものである。オプシンは、電気活性を示すかまたは電気活性に応答する細胞を制御するのに用いることができる、光応答性イオンチャネルである。オプシンを心臓へ応用する最新の使用は、発現に用いるベクターによって制限される。最初のオプシン発現ベクターは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはアデノウイルスベクターを含む。このため、用いられる各ウイルスに固有の制限がもたらされ、このことは、発現の永続性、強力な先天性免疫応答の誘導、および宿主ゲノムへの組み込みの可能性を含み得る。特に、後々細胞をヒトへ移植するような場合に、ｍＲＮＡ発現ベクターによって、安全性のリスクがより少ない状態でオプシンを一過的に発現させることが可能になる。一般的に用いられるオプシンとしては、青色のパルス光で活性化する、興奮性オプシンであるチャネルロドプシンＩＩ（ＣｈＲ２）や、橙色または赤色の連続光によって活性化する、抑制性オプシンであるＪＡＷＳが挙げられる。
【００８２】
オプシンを形質移入した細胞を適切に特徴付けるために、タンパク質発現に加えて、他の計量、機能が、発現ベクターとしてのｍＲＮＡの使用を適切に最適化する助けとなり得る。多電極アレイ（ＭＥＡ）を用いて、機能的特徴付けを行うことができる。ＭＥＡ装置は、電極を用いて近傍の細胞の電場電位を測定する。心筋細胞における電場電位の変化を、ピックアップ電極に応じて、振幅および位置特異的に検出することができる。用いたＭＥＡ装置、アクシオン・バイオシステムズ社のマエストロでは、４８ウェルプレートのウェル１つあたり１６個の電極の測定および光励起が同時に可能である。初代ラット新生児心室心筋細胞（ＮＲＶＭ）を用いることによって、ＣｈＲ２などのオプシンの機能発現が、電気活性と、アクシオン・ルーモス（Axion Lumos）装置に組み込まれたＬＥＤによるパルス光励起との間の同期イベントとして測定され得る。
【００８３】
二次元培養条件下および三次元培養条件下の２つのｈｉＰＳ系統からの心房サブタイプ、心室サブタイプ、および結節サブタイプのヒト心筋細胞の取得
発明者らは、特定の心筋細胞系統、すなわち、心室細胞（ｈｉＰＳＣ−ＶＭ）、心房細胞（ＡＭ）、および結節ペースメーカー細胞（ＰＭ）を分化させるための、小分子に基づく専門的技術を開発した。ＡＭ心筋細胞およびＶＭ心筋細胞は、その心筋層を再現する二次元細胞シートとして得られ、一方、ＰＭ心筋細胞は、ペースメーカー細胞の結節構造を模倣する三次元スフェロイド内で生成された。
【００８４】
発明者らは、レチノイン酸シグナルの制御によって、ｈｉＰＳＣおよびｈＥＳＣから、ＶＭまたはＡＭを特異的に取得することができることを発見した。さらに、古典的Ｗｎｔ経路の活性化によって、しばしば、心臓ペースメーカー細胞集団の富化が選択的に導かれた（図１Ａ〜図１Ｂ）。本明細書で説明される、心筋細胞の特定の系統を分化させるための、このような小分子に基づく方法は、新規で容易な方法であり、複数のｈｉＰＳＣ系統／ｈＥＳＣ系統に一般化可能である。
【００８５】
下流の機能アッセイ用に、新規のＡＭおよびＶＭは、二次元細胞シートとして得られ、一方、ｈｉＰＳＣ−ＰＭは、三次元スフェロイドとして得られた。発明者らは、常に、少量のｈｉＰＳＣ−ＡＭおよびｈｉＰＳＣ−ＶＭを細胞シートとして、ｈｉＰＳＣ−ＰＭをスフェロイドとして得た（図２）。発明者らは、２０００を越える心筋細胞からなるスフェロイドが、長期にわたる（２週間を越える）培養期間中に、スフェロイドのコアにおいて壊死し始めることを確認した。心室表現型、心房表現型、およびペースメーカー表現型の機能的特徴付けのために、単一層に加えて、幹細胞由来のヒト心臓組織を用いた。
【００８６】
電気的興奮が生じると、心筋細胞の膜電位は非線形に脱分極し、その後静止状態へと再分極する。一般的に、パッチクランプ技術によってこの活動電位を測定することで、心筋細胞のサブタイプが決定される。しかしながら、この技術は、低スループットであり、新規心筋細胞のサブタイプをスクリーニングするのには適していない。対照的に、本明細書で説明されるような光学式記録では、多細胞組織だけでなく、単一の筋細胞のレベルにおいても、膜電位の変化を出力することができる。
【００８７】
新規細胞の主要な特徴の光操作測定を可能にするＩＶＴ修飾ｍＲＮＡの開発および合成
発明者らは、心筋細胞特異的な、活動電位、細胞内Ｃａ２＋ハンドリング、および収縮性の機能的読み出しのために、ＩＶＴ ｍＲＮＡを開発した。ＩＶＴ光操作ｍＲＮＡは、異なる分光特性を示すことで、同一筋細胞集団の３回の測定すべてを多重化できるように設計された。合成されたｍＲＮＡは、２日を越えて導入遺伝子が持続発現されるように修飾され得るが、この期間は、ｈｉＰＳＣ−ＶＭ、ｈｉＰＳＣ−ＡＭ、またはｈｉＰＳＣ−ＰＭを機能的に特徴付けるのに必要な時間よりも十分に長い。
【００８８】
６週間にわたる長期的なリアルタイム分析を行って、新規心筋細胞の電気的機能および収縮機能を測定した。最初の分化から２週間後、４週間後、および６週間後の３回、ＩＶＴ ｍＲＮＡをｉＰＳＣ心筋細胞に形質移入した。活動電位プロファイルおよびＣａ２＋の一過性動態を、心筋細胞の電気生理学的読み出しとした。蛍光ｃＴＮＴによる同一細胞における収縮性の平行測定は、筋細胞が生み出す力の程度を反映した。このプラットフォームが自然な分化の工程に干渉しないということを実証するために、発明者らは、３週目、５週目、および７週目に、ＩＶＴ ｍＲＮＡを形質移入したｉＰＳＣ心筋細胞と形質移入していないｉＰＳＣ心筋細胞の遺伝子発現プロファイルを確認した。
【００８９】
最適化５'−ＵＴＲ（非翻訳領域）、カスタムコドン最適化オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、さらに細胞種特異的３'ＵＴＲを含むカスタムＤＮＡテンプレートから、ＩＶＴ ｍＲＮＡを作製した。翻訳効率およびｍＲＮＡの安定性は、Ｃａｐ１酵素を用いて９５％を超える効率で５'キャッピングを行うこと、および２００ヌクレオチド（ｎｔｓ）を越えるテールを用いた３'ポリアデニル化を行うことによって実現された。インターフェロンおよび炎症誘発性サイトカインの生成による宿主の免疫応答は、（１）望まないｄｓＲＮＡを除去する逆相ＨＰＬＣ、（２）コドン最適化、および（３）修飾ヌクレオチドを用いること、で軽減させた。発明者らは、本明細書で説明される修飾の成功を、首尾良く特定した。また、発明者らは、一連の送達システムを試験し、修飾ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）製剤が最適であり得ることを確認した。
【００９０】
ヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を、４８ウェルのアクシオン（Axion）ＭＥＡプレートに播種し、完全に同期した電気活性（拍動速度）が観察されるまで、２週間培養した。修飾ＰＥＩ誘導体（リポカリクス社（Lypocalyx Gmbh））を用いて、ＣｈＲ２ ｍＲＮＡ、ＪＡＷｓ ｍＲＮＡ、送達媒体のみ、または両方のｍＲＮＡの混合物を細胞に形質移入した。形質移入してから６時間後および２４時間後に、アクシオン・マエストロＭＥＡおよびルーモス光励起装置を用いて、形質移入を行った細胞を分析した。分析は、刺激を行わない場合、青色光で刺激した場合（ＣｈＲ２を形質移入した細胞を発火させる）、橙色光で刺激した場合（ＪＡＷｓを形質移入した細胞の発火を阻害する）、または橙色の連続光とともに青色光のインパルス刺激を行った場合のいずれかの電気的読み出し（１ウェルあたり１６個の電極）を含むものであった。
【００９１】
予備ステップとして、発明者らは、細胞の形質移入を行う送達媒体について、ＣｈＲ２の場合は拍動速度の完全な制御として定義され、逆に、ＪＡＷｓの場合は発火の完全な阻害として定義される、発現されたｍＲＮＡの機能を十分に発揮させるのに最適な量を求めた。形質移入してから６時間後に、心筋細胞において拍動速度の変化が観察されたが、完全な捕捉（発火との同期または完全な阻害）は、送達媒体の量が２番目に高い場合および最も高い場合で２４時間が経過するまで観察されなかった（図３Ａ〜図３Ｄ）。送達媒体のみでは、本来の細胞拍動速度に影響はなく、したがって、オプシン機能をより素早く必要とする場合には、より多量のタンパク質が生成され得るであろう。ＣｈＲ２ ｍＲＮＡを形質移入した細胞に適用する青色光スパイク刺激の速度を上昇させると、拍動間間隔が５００ｍｓに完全に同期して、拍動速度が上昇した（図３Ａ〜図３Ｂ）。拍動速度をより速くしようと試みると、誤って拍動速度は遅くなったが、このことは、連続発火における最小リセット時間を暗示する。０．１μｌの送達媒体を用いると、３つのウェルすべて（１００％）が、光でペーシングされた（図３Ｃ）。ＪＡＷＳ ｍＲＮＡを形質移入した細胞では、橙色光を連続的にあてた１０秒間、拍動が完全に阻害された（図３Ｄ）。同様の機能は、ＪＡＷＳ ｍＲＮＡおよびＣｈＲ２ ｍＲＮＡの両方を形質移入した心筋細胞で観察された。
【００９２】
発明者らは、オプシンをコードするｍＲＮＡが心筋細胞において発現した場合の機能および時間依存性を示した。オプシン発現ウイルスベクターと比較すると、ウイルスベクターの場合は数週間かかるのとは対照的に、機能発現は１日で実現可能である。これらの結果を受けて、発明者らは、ＣｈＲｈ２（光操作性電気的興奮）、ＡｒｃｈＤ９５Ｈ（赤方偏移した電圧センサータンパク質）、ＧｃａＭＰ６ｆ（緑方偏位したＣａ２＋センサータンパク質）、およびｃＴＮＴ−Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ（遠赤方偏移した心臓収縮性タンパク質）に対するＩＶＴ ｍＲＮＡを生成した。
【００９３】
６週間にわたる長期的なリアルタイム分析を行って、新規心筋細胞の電気的機能および収縮機能を測定した。次に、発明者らは、非侵襲的かつすべて光学的な様式で、心筋細胞の主要な２つの機能的読み出しを評価した。最初の分化から２週間後、４週間後、および６週間後の３回、ＩＶＴ ｍＲＮＡをｉＰＳＣ心筋細胞に形質移入した。活動電位プロファイルおよびＣａ２＋の一過性動態を、心筋細胞の電気生理学的特徴とした。ライカ（LEICA）ＤＭｉ８オプティクスと組み合わせた高感度高解像度ＯＲＣＡ４．０ ｓＣＭＯＳカメラを用いて、７００ｆｐｓを越えるフレームレートで、電圧シグナルおよびＣａ２＋シグナルを収集した。
【００９４】
第１のステップとして、発明者らは、ＩＶＴ ｍＲＮＡを用いて、ラット新生児心室心筋細胞（ＮＲＶＭ）においてＣａｔＣｈを発現させた。形質移入の条件は、ＧＦＰ ｍＲＮＡを用いて変化させた。形質移入に最適な媒体（Ｖｉｒｏｍｅｒ Ｒｅｄ）を特定した後、対象のタンパク質であるＣａｔＣｈ−Ｖ５の発現を、ｍＲＮＡパルスの２４時間後に評価した。イメージングの時間経過から、発明者らは、ＮＲＶＭにおいてＣａｔＣｈ−Ｖ５が強力に発現されていることを理解したが、これは、アルファ−ＳＡ（心筋細胞のマーカー）の発現によって特定された。ＣａｔＣｈ−Ｖ５は、形質移入してからおよそ１２時間後に、形質移入を行った細胞の膜に局在した。発現は２４時間で最大となり、５日目までに有意に低下した。図４に示すフローサイトメトリーは、培養下で、ＮＲＶＭの形質移入が線維芽細胞よりも効率的であったことを示し、また、時間経過プロファイルは、時間経過を表す図で見られるものと一致した。次に、発明者らは、形質移入を行ったＮＲＶＭの機能を評価した。ＣａｔＣｈはオプシンであり、青色光による刺激に応じて膜の脱分極を誘導する。４７５ｎｍの青色ＬＥＤ照明を用いて、ＣａｔＣｈを形質移入したＮＲＶＭを様々な光強度（０〜１００％強度）に曝露した。発明者らは、各光強度において、様々な刺激継続時間（１〜１５ミリ秒）を調査した。周波数が２Ｈｚの連続単相矩形波を、合計で３０秒間用いた。発明者らは、ＣａｔＣｈの捕捉速度を、一般的に用いられるオプシンであるチャネルロドプシン２（ＣｈＲ２）と比較した。ＣａｔＣｈは優れた感度を示し、光強度がより低く、パルス幅がより短い状態で、捕捉細胞の比率がより高くなった。その後、細胞を青色光で刺激し、形質移入する量および形質移入する時点を変えて、捕捉について分析した。図５Ａ〜図５Ｃは、この実験の結果を示し、ある期間にわたって確実なペーシングを実現するには、細胞１０００個あたり１ｎｇのＲＮＡ投与量が最適であり、形質移入してから１〜３日後に、最も低い刺激閾値において、最も高い捕捉速度が可能となったことを示す。
【００９５】
次に、発明者らは、光を用いてＮＲＶＭの電気的特性を特徴付けることが可能であることを実証しようとした。ＦｌｉｃＲは、細胞膜の電位に応じて異なる強度で蛍光を発する電圧インジケータータンパク質である。ＦｌｉｃＲをコードするｍＲＮＡを細胞に形質移入することによって、顕微鏡検査法を用いて、多数の細胞においてその活動電位の特色を評価することができる。発明者らは、このタンパク質をコードするｍＲＮＡをＮＲＶＭに形質移入し、生きた培養物において、掃引フィールド顕微鏡でイメージングを行った。一連の画像を１００Ｈｚで取得し、各細胞の対象領域において、輝度を経時的に測定した。カスタムＭＡＴＬＡＢスクリプトを用いてシグナルを処理した。図６Ａ〜図６Ｂは、単一細胞の活動電位を経時的に示す試料のグラフ（図６Ａ）およびその細胞における捕捉活動電位の平均（図６Ｂ）を示す。ＦｌｉｃＲ強度をイメージングしつつ、特定の速度で細胞の単層全体をペーシングさせるのに、電気的ペーシングシステムを用いることもできる。ＦｌｉｃＲ ｍＲＮＡシステムを用いて、ヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞の電気的表現型を特徴付け、すべて光操作的に、その重要品質特性を得ることができる。
【００９６】
心筋細胞をペーシングさせることで、制御された環境における新規薬剤のスクリーニングが可能となり、薬剤の存在下／非存在下における予測値をもとに、拍動周波数および拍動波形への効果を測定することができる。発明者らは、ＣｈＲ２、およびアミノ酸が１つ置換されたＣｈＲ２であるＣａｔＣＨをコードするｍＲＮＡを、ラット新生児心室筋細胞（ＮＲＶＭ）に形質移入した。ＮＲＶＭをＭＥＡプレートに播種し、翌日、Ｖｉｒｏｍｅｒ Ｒｅｄ（リポカリクス社）を用いて、三連のウェルで、異なる濃度のＣｈＲ２ ｍＲＮＡまたはＣａｔＣＨ ｍＲＮＡを形質移入した。形質移入してから２４時間後、ＣａｔＣＨを形質移入した細胞は、ＣｈＲ２と比べて１５倍弱い光に対して電気的応答を示した（図７）。さらに、１ｈｚ、２ｈｚ、および３ｈｚの励起速度で応答させると、ＣａｔＣＨを形質移入した細胞は、ＣｈＲ２を形質移入した細胞と比べて、形質移入してから７２時間後まで、より速い拍動速度（３ｈｚ）での駆動が可能であった（図８）。ｍＲＮＡの量およびオプシンの構造は、非常に近いので、この相違は、オプシン感度の向上によるものであり、心臓活動電位を駆動するのに必要な細胞あたりのオプシンが、より少なくなったと推測することができる。例えば、形質移入してから数日後の時点で、オプシンの発現が低い場合では、心臓細胞は、１ｈｚと遅い速度でしか、首尾良く駆動することができなかった。
【００９７】
したがって、ｍＲＮＡは、効率よく心筋細胞に形質移入され、形質移入してから１４４時間後まで発現が持続し、ＭＥＡ測定に基づく光感度がより高くなった。ＣｈＲ２と比べると、非常に少ないｍＲＮＡ量で（ＣｈＲ２が１０００ｎｇであるのに対し、ＣａｔＣＨは１２５ｎｇ）、ＣａｔＣＨの感度はより高かった。
【００９８】
次に、発明者らは、ｉＰＳ由来の心筋細胞におけるＣｈＲ２およびＪＡＷＳ（抑制性オプシン）の発現および機能を試験した。ここで、ＣｈＲ２およびＪＡＷＳのそれぞれ５００ｎｇを、ＭＥＡプレートのｉＰＳ由来心筋細胞に送達した（図９）。翌日、青色パルス光による刺激によって、細胞をペーシングさせた（矢印）。同時に、数秒間（横棒）、橙色光を用いて心筋細胞の拍動を妨げた。この結果、二重形質移入において、両方のオプシンが機能することが示された。
【００９９】
実施例３：分化因子をコードするｍＲＮＡの開発および心臓ブロックの動物モデルにおいて心筋細胞の分化を引き起こす能力
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のＩＶＴ ｍＲＮＡを、新たに単離したラット新生児心室心筋細胞に形質移入した。ラット新生児心室心筋細胞を播種した９６ウェルプレートのウェルに、形質移入試薬であるＶｉｒｏＭｅｒ Ｒｅｄとともに３３３ｎｇのＧＦＰ ＩＶＴ ｍＲＮＡを添加することで、体細胞遺伝子移入を行った。遺伝子移入、および導入遺伝子のタンパク質発現が成功したことを確認するために、形質移入後、表示時間に、ＧＦＰが放射する蛍光のイメージングを行った。心筋細胞のうち、９８％を越える細胞が、ＩＶＴ ｍＲＮＡで形質移入され、外因性のタンパク質を安定して発現しており、導入遺伝子の発現は、経時的に弱まるＧＦＰシグナルによって証明されるように、一過性であった（図１０）。
【０１００】
次に、発明者らは、ＴＢＸ１８ ＩＶＴ ｍＲＮＡが心筋細胞を形質移入する能力について検討し、このｍＲＮＡが、首尾良くかつ効率的に、一過的に心筋細胞に入ったことを見出した（図１１）。ヒトＴＢＸ１８遺伝子のＩＶＴ ｍＲＮＡを、新たに単離したラット新生児心室心筋細胞に形質移入した。ラット新生児心室心筋細胞を播種した９６ウェルプレートのウェルに、形質移入試薬であるＶｉｒｏＭｅｒ Ｒｅｄとともに３３３ｎｇのＴＢＸ１８ ＩＶＴ ｍＲＮＡを添加することで、体細胞遺伝子移入を行った。心筋細胞に首尾良く入ったＴＢＸ１８ ＩＶＴ ｍＲＮＡを、定量リアルタイムＰＣＲによって定量し、ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡレベルを、内因性ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨに対して経時的に正規化した。このデータによって、ＴＢＸ１８ ＩＶＴ ｍＲＮＡが効率的に入ったこと、および送達されたｍＲＮＡが一過性であることが示された。
【０１０１】
その後、ＴＢＸ１８タンパク質の発現をモニターし、ＴＢＸ１８タンパク質が心筋細胞において、効率的かつ一過的に発現していることがわかった（図１２）。ヒトＴＢＸ１８遺伝子のＩＶＴ ｍＲＮＡを、新たに単離したラット新生児心室心筋細胞に形質移入した。ラット新生児心室心筋細胞を播種した９６ウェルプレートのウェルに、形質移入試薬であるＶｉｒｏＭｅｒ Ｒｅｄとともに３３３ｎｇのＴＢＸ１８ ＩＶＴ ｍＲＮＡを添加することで、体細胞遺伝子移入を行った。心筋細胞における、形質移入したＩＶＴ ｍＲＮＡからのＴＢＸ１８タンパク質の発現を、ＴＢＸ１８に対する特異抗体によって免疫ブロットで定量し、内因性ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨに対して正規化した。このデータによって、形質移入してから６時間経過するまでに、ＴＢＸ１８タンパク質が効率よく急速に発現されたことが示された。ＴＢＸ１８タンパク質の発現も、送達されたｍＲＮＡの発現動態と一致して、一過性であった。このＴＢＸ１８の一過性発現は、胚発生時の本来の発現に非常によく似ており、意図された目的のために、固有心筋細胞を、特殊化した心臓ペースメーカー細胞へ転換するリプログラミング試薬として理想的である。図１２において、Ｄは、形質移入後の日数を示し、各時点で、技術的反復は２回である。
【０１０２】
次に、発明者らは、蛍光顕微鏡検査法を用いて、ＴＢＸ１８の局在を確認し、ＴＢＸ１８が細胞核に間違いなく局在していることを見出した（図１３Ａ〜図１３Ｃ）。ＴＢＸ１８は転写因子であるので、ｍＲＮＡから適切に翻訳されると、核を標的とする。ヒトＴＢＸ１８遺伝子のＩＶＴ ｍＲＮＡを、新たに単離したラット新生児心室心筋細胞に形質移入した。ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡは、ＴＢＸ１８のＣ−末端にタグペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号９、「ＦＬＡＧ」エピトープとしても知られている）を融合し、ＦＬＡＧに対する抗体により細胞内でＴＢＸ１８が認識されるように設計された。筋節アルファ−アクチニン（α−ＳＡ）およびＤＡＰＩを用いて、心筋細胞およびすべての核をそれぞれ標識した。矢印（ＦＬＡＧおよびＤＡＰＩの共局在）は、ＴＢＸ１８タンパク質の核局在を示す。２４ウェルプレートで３つの形質移入条件を試験し、形質移入してから２４時間後に免疫染色を行った。
【０１０３】
その後、発明者らは、心筋細胞においてＴＢＸ１８ ｍＲＮＡを発現させる効果を確認し、ＴＢＸ１８ ＩＶＴ ｍＲＮＡ遺伝子移入によって、固有心筋細胞が新規ペースメーカー細胞へと転換されたことを見出した（図１４Ａ〜図１４Ｂ）。ラット新生児心室筋細胞の自発的電気活性を、非侵襲的多電極アレイプラットフォームで記録した。コントロール心筋細胞（１４Ａ）の活性は、希発かつ低速であった。ＴＢＸ１８ ＩＶＴ ｍＲＮＡを遺伝子移入すると（１４Ｂ）、心筋細胞において、高活性で高速なペースメーカー活性が誘発された。電気活性数（カウント）を、心筋細胞の自発的拍動速度（１分当たりの拍動、ＢＰＭ）の関数としてプロットした。
【０１０４】
次に、発明者らは、試験用ＩＶＴ ｍＲＮＡを、心筋組織に直接注入した（図１５Ａ〜図１５Ｃ）。ＧＦＰ ＩＶＴ ｍＲＮＡは、ラットの心臓に生物学的薬剤を注入する前（１５Ａ）、注入中（１５Ｂ）、および注入後（１５Ｃ）に、ｍＲＮＡを視覚化するために、赤外部と結合させた。黒矢印で示す、明るく輝くｍＲＮＡを、生存手術で開いた胸部の心筋層へ直接注入した。注入１回分が、心臓の注入部位に局所的に残存した（白楕円）。
【０１０５】
次に、発明者らは、ラットの完全房室ブロックモデルにＴＢＸ１８ ｍＲＮＡを投与する効果について検討した。インビトロ転写ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡの局所的心筋内注入を行うと、このラットモデルにおいて、インビボで、生物学的心臓ペーシングが引き起こされることがわかった。この研究では、発明者らは、ラットの完全房室ブロック（ＣＡＶＢ）モデルを作成し、ラットを１週間モニターして、ＣＡＶＢが安定かつ持続性であることを確認した。次に、各ラットの心尖部にＴＢＸ１８ ｍＲＮＡを注入し、遠隔測定装置を埋め込んだ。ラットのうちの何匹かに、２０５μｌのＲＮＡ非含有ＰＢＳに３００μｇのＴＢＸ ｍＲＮＡを添加した、高用量のＴＢＸ１８ ｍＲＮＡを与えた。発明者らは、２１日間連続して、心電図を含む遠隔測定装置からのデータをモニターし、記録した。発明者らは、７日目、１４日目、および２１日目に、イソプロテレノールへの曝露を行いながら、麻酔をかけた動物に対して三電極体表面ＥＣＧを行い、２１日目に心臓を摘出した。
【０１０６】
発明者らは、順行伝導（心臓伝導の方向が、ＳＡ結節、ＡＶ結節から生じて心尖へと向かうことを意味する）、または逆行伝導（心臓伝導の方向が、左心室尖部であるＴＢＸ１８送達部位から生じることを意味する）があるかを確認した。これを確認するために、発明者らは、ラットが麻酔で眠っている間に三電極体表面ＥＣＧを１０分間記録することで、ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡを注入する前の麻酔下でのベースラインＥＣＧを確認した。この記録によって、各ＱＲＳ群間に複数のＰ波があり、Ｐ−Ｒ間隔は一貫性がなく、３００ｂｐｍを越えるラットの健常な心拍数と比較して心拍数が１００ｂｐｍと比較的低いということから、ＡＶ伝導ブロックが存在することが確認された。ＥＣＧの記録における心軸マッピングは、平均伝導ベクトルが７７度であることを示し、これは、正常な順行伝導経路（心房から心室に向かう）に沿うものである。
【０１０７】
ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡを注入してから１週間後、三電極体表面ＥＣＧを再度記録したところ、平均心拍数が１２０ｂｐｍに上昇していた。さらに、観察されていたＡＶブロックは、心房と心室との間の伝導が２：１を示しており、このことは、心臓ブロックの重症度が改善したことを示している。ＥＣＧの記録における心軸マッピングは、伝導ベクトルが４９度へと少しシフトしたことを示し、これは、まだ、正常な順行伝導とみなされる。これらの値を、エピネフリン類似体であるイソプロテレノールを投与されたラットと比較した。イソプロテレノールを投与されたラットでは、ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡを注入してから１週間後に行った三電極体表面ＥＣＧは、ＡＶ伝導ブロックの特徴（Ｐ−Ｒ間隔の一貫性がない）をいまだ残しつつ、心拍数が２２９ｂｐｍに上昇していることを示した。ＱＲＳ群の極性および形状は、それぞれ、負極性および広がった形状へと変化していた。これにより、ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡの注入部位である心尖の近傍に由来する逆行伝導が示された。
【０１０８】
ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡを注入してから３週間後、三電極体表面ＥＣＧの記録は、心室性期外収縮（ＰＶＣ）だけでなく、遅い接合部補充調律も示した。平均心拍数は、１３７ｂｐｍと計算された。ＥＣＧの記録における心軸マッピングは、伝導ベクトルの表現型を２つ表示し、これは、競合する伝導源があることを示している。正常なＱＲＳ群の順行伝導ベクトルは４８度であり、一方、ＰＶＣの逆行伝導ベクトルは−１１６度である。これらの値を再度、イソプロテレノールを投与されたラットと比較した。イソプロテレノールを投与されたラットでは、ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡを注入してから３週間後に行った三電極体表面ＥＣＧは、イソプロテレノールの注入により、ＥＣＧを記録している間、一過性ＱＲＳ群がいくつか誘導されたことを示した。これらの一過性ＱＲＳ群は、−１１０度の逆行伝導ベクトルを生成したが、これは、ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡの注入部位である心尖からのペーシングを示す。
【０１０９】
その後、ＥＣＧのデータを、遠隔測定データと比較した。ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡを注入する前に、遠隔測定生体電位電極を胸壁に縫合し、ラットの腹腔内に収容した。意識があり、覚醒しているラットについて、遠隔測定二電極ＥＣＧシグナルを無線で記録した。ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡを注入する前日、平均心拍数が１２０ｂｐｍであるＥＣＧの記録において、ＡＶブロックが存在しており、これらの値をベースラインとして用いた。
【０１１０】
ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡを送達してから１週間後、遠隔測定ＥＣＧの記録によって、イソプロテレノール処理中の逆行ＱＲＳ群が明らかになった。イソプロテレノールは、心拍数を２６５ｂｐｍまで上昇させた。ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡを送達してから２週間後、遠隔測定ＥＣＧの記録によって、再度、イソプロテレノール処理中の逆行ＱＲＳ群が明らかになった。イソプロテレノールは、心拍数を２０６ｂｐｍまで上昇させた。ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡを送達してから３週間後、意識のあるラットは、イソプロテレノール処理中、依然として逆行ＱＲＳ群を示し、心拍数は、再度２６０ｂｐｍまで上昇した。
【０１１１】
その後、発明者らは、ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡとともに小分子ＴＧＦ−ベータ阻害剤を含むことが心室ペーシングに及ぼす効果について確認した（図１６）。ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡを投与することで、ラットの完全心臓ブロックモデルにおいて、完全心室ブロックが引き起こされることがわかった。小分子ＴＧＦ−ベータ阻害剤であるＡ８３−０１を投与することで、このブロックは元に戻った。
【０１１２】
さらに、発明者らは、注入してから２１日間、動物の心拍数（図１７）および心拍数のヒストグラム（図１８）を連続的に記録することで、ラットの完全心臓ブロックモデルにおいて、ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡ遺伝子移入により心室ペーシングが引き起こされたことを実証した。
【０１１３】
次に、発明者らは、より大きい動物、具体的にはブタの、完全心臓ブロックモデルにおいて、ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡを試験しようとした。発明者らは、ＧＦＰ ｍＲＮＡ＋Ａ８３−０１をコントロールとして用いた。１日目に、発明者らは、ペースメーカーを埋め込むことで心臓内地図を作成し、ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡまたはコントロールを投与した。投与してから２週間後、４週間後、および６週間後に、ペースメーカーの信号解読およびイソプロテレノールへの曝露を行って、動物の最大心拍数（ｍａｘ ＨＲ）を測定した。６週目に、不整脈試験および心臓内マッピングを行い、重要臓器を摘出した。発明者らは、ｍＲＮＡを送達してから７〜１０日以内に、ブタモデルにおいて、ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡによって心室ペーシングが引き起こされることを見出した（図１９）。また、発明者らは、ＴＢＸ１８ ｍＲＮＡをＡ８３−０１とともに用いると、ブタモデルにおいて心室ペーシングが引き起こされること（生物学的薬剤送達から１０日後）、ブタモデルに注入されたＴＢＸ１８ ｍＲＮＡは、ブタが朝覚醒するにつれ、より短いＲ−Ｒ間隔（より速い心拍）を示すことを見出した。ＴＢＸ１８を注入したブタにおける適切な日周応答は、図１８の平均心拍数のデータと一致する。
【０１１４】
実施形態一覧
１．（ｉ）分化因子、転写因子、および／または表現型センサーをコードする少なくとも１つのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、
（ｉｉ）カチオン性脂質、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）誘導体、ポリマー、ポリペプチドもしくはペプチド、ナノ粒子、または脂質系粒子を含む送達媒体と、
を含む、組成物。
２．前記少なくとも１つのｍＲＮＡは、Ｔｂｘ１８、Ｔｂｘ３、Ｔｂｘ５、およびＳＨＯＸ２、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される分化因子をコードする、実施形態１の組成物。
３．前記少なくとも１つのｍＲＮＡは、オプシンおよび細胞の電気生理現象を感知できるタンパク質、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される表現型センサーをコードする、実施形態１または実施形態２の組成物。
４．前記表現型センサーは、Ｑｕａｓａｒ、Ｊａｗｓ、Ｃａｔｃｈ−Ｖ５、ＣｈＲ２、Ａｒｃｈｅｒ１、ＦｌｉｃＲ１、ＡｒｃＤ９５Ｈ、ＧＣａＭＰ６ｆ、およびｃＴＮＴ−Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態３の組成物。
５．前記少なくとも１つのｍＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、キャップ、少なくとも１つの非翻訳領域、ポリアデニンテール、および／またはコドン最適化をもたらす少なくとも１つのヌクレオチド変異を含む、実施形態１から実施形態４のうちのいずれかの組成物。
６．前記送達媒体は、リポフェクタミンを含むカチオン性脂質を含む、実施形態１から実施形態５のうちのいずれかの組成物。
７．前記送達媒体は、直鎖ポリエチレンイミン誘導体からなる群から選択されるポリエチレンイミン誘導体を含む、実施形態１から実施形態５のうちのいずれかの組成物。
８．前記送達媒体は、ウイルス様ポリマーからなる群から選択されるポリマーを含む、実施形態１から実施形態５のうちのいずれかの組成物。
９．前記送達媒体は、ウイルスおよびウイルス様粒子からなる群から選択されるナノ粒子を含む、実施形態１から実施形態５のうちのいずれかの組成物。
１０．前記送達媒体は、リポソームおよびナノリポソームからなる群から選択される脂質系粒子を含む、実施形態１から実施形態５のうちのいずれかの組成物。
１１．前記少なくとも１つのｍＲＮＡに付着する小分子をさらに含む、実施形態１から実施形態１０のうちのいずれかの組成物。
１２．前記小分子は、先天性免疫センサーの阻害剤からなる群から選択される、実施形態１１の組成物。
１２Ａ．前記少なくとも１つのｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ発現ベクター内に存在している、実施形態１から実施形態１２のうちのいずれかの組成物。
１２Ｂ．実施形態１から実施形態１２Ａの組成物のいずれかを形質移入する宿主細胞。
１２Ｃ．前記宿主細胞は、心臓細胞、心筋細胞、ニューロン細胞、眼内に位置する細胞、膵臓細胞、ＰＳＣ、ＩＰＳＣ、ＥＳＣ、およびＰＳＣ心筋細胞からなる群から選択される、実施形態１２Ｂの宿主細胞。
１３．細胞表現型を調節する方法であって、
（ｉ）組成物を調製するステップであって、該組成物は、
分化因子、転写因子、および／または表現型センサーをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを発現するベクター、ならびに
カチオン性脂質、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）誘導体、ポリマー、ポリペプチドもしくはペプチド、ナノ粒子、または脂質系粒子を含む送達媒体、
を含む、ステップと、
（ｉｉ）標的細胞に、前記組成物を形質移入によって投与するステップと、
（ｉｉｉ）場合によっては、前記標的細胞の表現型を検出するステップと、
（ｉｖ）場合によっては、適切な表現型の標的細胞を１つ以上、患者に与えて、疾患を治療および／または予防するステップと、
を含む、方法。
１４．前記少なくとも１つのｍＲＮＡは、Ｔｂｘ１８、Ｔｂｘ３、Ｔｂｘ５、およびＳＨＯＸ２、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される分化因子をコードする、実施形態１３の方法。
１５．前記少なくとも１つのｍＲＮＡは、オプシンおよび細胞の電気生理現象を感知できるタンパク質、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される表現型センサーをコードする、実施形態１３または実施形態１４の方法。
１６．前記表現型センサーは、Ｑｕａｓａｒ、Ｊａｗｓ、Ｃａｔｃｈ−Ｖ５、ＣｈＲ２、Ａｒｃｈｅｒ１、ＦｌｉｃＲ１、ＡｒｃＤ９５Ｈ、ＧＣａＭＰ６ｆ、およびｃＴＮＴ−Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態１５の方法。
１７．前記少なくとも１つのｍＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、キャップ、少なくとも１つの非翻訳領域、ポリアデニンテール、および／またはコドン最適化をもたらす少なくとも１つのヌクレオチド変異を含む、実施形態１３から実施形態１６のうちのいずれかの方法。
１８．前記送達媒体は、リポフェクタミンを含むカチオン性脂質を含む、実施形態１３から実施形態１７のうちのいずれかの方法。
１９．前記送達媒体は、直鎖ＰＥＩ誘導体からなる群から選択されるポリエチレンイミン誘導体を含む、実施形態１３から実施形態１７のうちのいずれかの方法。
２０．前記送達媒体は、ウイルス様ポリマーからなる群から選択されるポリマーを含む、実施形態１３から実施形態１７のうちのいずれかの方法。
２１．前記送達媒体は、ウイルスおよびウイルス様粒子からなる群から選択されるナノ粒子を含む、実施形態１３から実施形態１７のうちのいずれかの方法。
２２．前記送達媒体は、リポソームおよびナノリポソームからなる群から選択される脂質系粒子を含む、実施形態１３から実施形態１７のうちのいずれかの方法。
２３．前記少なくとも１つのｍＲＮＡに結合する小分子をさらに含む、実施形態１３から実施形態２２のうちのいずれかの方法。
２４．前記小分子は、先天性免疫センサーの阻害剤からなる群から選択される、実施形態２３の方法。
２５．前記標的細胞は、心臓細胞、心筋細胞、ニューロン細胞、眼内に位置する細胞、膵臓細胞、ＰＳＣ、ＩＰＳＣ、ＥＳＣ、およびＰＳＣ心筋細胞からなる群から選択される、実施形態１３から実施形態２４のうちのいずれかの方法。
２６．前記標的細胞は、心臓細胞、心筋細胞、ＰＳＣ、またはＰＳＣ心筋細胞であり、前記標的細胞の表現型は、前記標的細胞を心房筋細胞、心室筋細胞、および／または心臓ペースメーカー細胞へと分化させるように変更されている、実施形態２５の方法。
２７．分化済心臓ペースメーカー細胞は、それを必要とする被験体に提供される、実施形態２５の方法。
２８．前記被験体は、不整脈、心臓ペーシング障害、房室ブロック、または洞不全症候群を患っている、実施形態２７の方法。
２９．心臓障害の治療および／または予防を必要とする被験体において心臓障害を治療および／または予防する方法であって、該方法は、
（ｉ）組成物を調製するステップであって、該組成物は、
分化因子、転写因子、および／または表現型センサーをコードする少なくとも１つのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ならびに
カチオン性脂質、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）誘導体、ポリマー、ポリペプチドもしくはペプチド、ナノ粒子、または脂質系粒子を含む送達媒体、
を含む、ステップと、
（ｉｉ）心臓細胞、心筋細胞、ＰＳＣ、ＩＰＳＣ、ＥＳＣ、およびＰＳＣ心筋細胞からなる群から選択される標的細胞に、前記組成物を形質移入によって投与するステップと、
（ｉｉｉ）場合によっては、前記表現型センサーの活性を検出することで、前記形質移入を行った標的細胞の表現型を検出するステップと、
（ｉｖ）場合によっては電動ペースメーカー装置を装着している前記被験体に、前記形質移入を行った標的細胞を再移植するステップと、
を含む、方法。
３０．前記心臓障害は、房室ブロック、洞不全症候群、および典型的には電動ペースメーカー装置の埋め込みを必要とするその他の不整脈からなる群から選択される、実施形態２９の方法。
３１．前記形質移入を行った心臓細胞の表現型を検出するステップは、前記細胞に対して多電極アレイ（ＭＥＡ）解析を行うこと、活動電位プロファイルおよび／またはＣａ２＋の一過性動態を測定すること、ならびに／あるいは蛍光ｃＴＮＴを測定すること、のうちの１つ以上を含む、実施形態２９または実施形態３０の方法。
３２．前記少なくとも１つのｍＲＮＡは、Ｔｂｘ１８、Ｔｂｘ３、Ｔｂｘ５、およびＳＨＯＸ２、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される分化因子をコードする、実施形態２９から実施形態３１のうちのいずれかの方法。
３３．前記少なくとも１つのｍＲＮＡは、オプシンおよび細胞の電気生理現象を感知できるタンパク質、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される表現型センサーをコードする、実施形態２９から実施形態３２のうちのいずれかの方法。
３４．前記表現型センサーは、Ｑｕａｓａｒ、Ｊａｗｓ、Ｃａｔｃｈ−Ｖ５、ＣｈＲ２、Ａｒｃｈｅｒ１、ＦｌｉｃＲ１、ＡｒｃＤ９５Ｈ、ＧＣａＭＰ６ｆ、およびｃＴＮＴ−Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態３３の方法。
３５．前記少なくとも１つのｍＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、キャップ、少なくとも１つの非翻訳領域、ポリアデニンテール、および／またはコドン最適化をもたらす少なくとも１つのヌクレオチド変異を含む、実施形態２９から実施形態３４のうちのいずれかの方法。
３６．前記送達媒体は、リポフェクタミンを含むカチオン性脂質を含む、実施形態２９から実施形態３５のうちのいずれかの方法。
３７．前記送達媒体は、直鎖ＰＥＩ誘導体からなる群から選択されるポリエチレンイミン誘導体を含む、実施形態２９から実施形態３５のうちのいずれかの方法。
３８．前記送達媒体は、ウイルス様ポリマーからなる群から選択されるポリマーを含む、実施形態２９から実施形態３５のうちのいずれかの方法。
３９．前記送達媒体は、ウイルスおよびウイルス様ポリマーからなる群から選択されるナノ粒子を含む、実施形態２９から実施形態３５のうちのいずれかの方法。
４０．前記送達媒体は、リポソームおよびナノリポソームからなる群から選択される脂質系粒子を含む、実施形態２９から実施形態３５のうちのいずれかの方法。
４１．前記少なくとも１つのｍＲＮＡに結合する小分子をさらに含む、実施形態２９から実施形態３５のうちのいずれかの方法。
４２．前記小分子は、先天性免疫センサーの阻害剤からなる群から選択される、実施形態４１の方法。
４３．細胞表現型を決定する方法であって、
（ｉ）組成物を調製するステップであって、該組成物は、
表現型センサーをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを発現するベクター、および
カチオン性脂質、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）誘導体、ポリマー、ポリペプチドもしくはペプチド、ナノ粒子、または脂質系粒子を含む送達媒体、
を含む、ステップと、
（ｉｉ）標的細胞に、前記組成物を形質移入によって投与するステップと、
（ｉｉｉ）前記標的細胞の表現型を検出するステップと、
を含む、方法。
４４．前記標的の表現型を検出するステップは、前記細胞に対して多電極アレイ（ＭＥＡ）解析を行うこと、活動電位プロファイルおよび／またはＣａ２＋の一過性動態を測定すること、ならびに／あるいは蛍光ｃＴＮＴを測定すること、を含む、実施形態４３の方法。
４５．前記表現型センサーは、オプシンおよび細胞の電気生理現象を感知できるタンパク質、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態４３または実施形態４４の方法。
４６．前記表現型センサーは、Ｑｕａｓａｒ、Ｊａｗｓ、Ｃａｔｃｈ−Ｖ５、ＣｈＲ２、Ａｒｃｈｅｒ１、ＦｌｉｃＲ１、ＡｒｃＤ９５Ｈ、ＧＣａＭＰ６ｆ、およびｃＴＮＴ−Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態４５の方法。
４７．前記少なくとも１つのｍＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの非翻訳領域、および／またはコドン最適化をもたらす少なくとも１つの変異を含む、実施形態４３から実施形態４６のうちのいずれかの方法。
４８．前記送達媒体は、リポフェクタミンを含むカチオン性脂質を含む、実施形態４３から実施形態４７のうちのいずれかの方法。
４９．前記送達媒体は、直鎖ＰＥＩ誘導体からなる群から選択されるポリエチレンイミン誘導体を含む、実施形態４３から実施形態４７のうちのいずれかの方法。
５０．前記送達媒体は、ウイルス様ポリマーからなる群から選択されるポリマーを含む、実施形態４３から実施形態４７のうちのいずれかの方法。
５１．前記送達媒体は、ウイルスおよびウイルス様粒子からなる群から選択されるナノ粒子を含む、実施形態４３から実施形態４７のうちのいずれかの方法。
５２．前記送達媒体は、リポソームおよびナノリポソームからなる群から選択される脂質系粒子を含む、実施形態４３から実施形態４７のうちのいずれかの方法。
【０１１５】
可能な実施形態をいくつか上述したが、本開示の実施形態は、そのように限定されるものではない。これらの例示的な実施形態は、網羅的であること、または本開示の範囲を不必要に限定することを意図するものではないが、その代わり、当業者が本開示を実行し得るように、本開示の原理を説明するために選択され、かつ説明された。さらに言えば、本明細書で説明したもの以外の様々な本開示の変更が、前述の説明から、当業者には明らかであろう。このような変更は、添付の請求の範囲内に含まれることが意図される。さらに、本明細書で用いた専門用語は、例示的な実施形態を説明する目的でのみ用いており、限定することを意図するものではない。何故なら、本開示の様々な実施形態の範囲は、添付の請求の範囲およびその等価物によってのみ限定されるためである。
【０１１６】
本明細書において引用された特許、出願、出版物、試験方法、文献、およびその他の試料は、すべて、本明細書に物理的に存在しているかのように、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０１１７】
配列表
配列番号１
Ｔｂｏｘ１８を含む合成ＤＮＡ
ＧＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＴＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＣＡＣＧＣＣＴＴＣＡＧＣＧＴＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＡＴＣＧＧＣＧＣＴＧＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＣＧＧＡＡＧＣＴＧＧＧＣＧＣＣＧＡＡＧＡＧＧＣＣＧＣＴＡＧＡＧＣＴＧＴＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣＧＧＣＴＧＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＡＧＡＡＧＧＧＡＴＣＴＴＣＴＧＡＡＧＧＣＧＡＣＧＡＧＧＧＣＧＣＴＧＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＡＧＡＡＧＣＧＧＣＧＣＴＧＡＣＣＴＧＧＡＡＡＧＡＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＡＴＧＧＡＴＴＴＣＡＧＣＡＧＧＧＣＧＣＴＡＧＣＣＣＡＣＴＧＧＣＴＡＧＣＣＣＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＣＣＴＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＣＣＣＴＧＧＣＣＡＧＡＣＣＴＧＧＡＡＣＡＣＣＴＣＴＧＣＣＴＡＧＣＣＣＴＣＡＧＧＣＣＣＣＴＡＧＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＣＡＧＧＧＧＧＣＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＡＡＧＡＧＡＴＴＣＣＡＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣＡＣＣＧＡＡＡＴＧＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧＣＡＧＡＣＧＧＡＴＧＴＴＣＣＣＣＧＣＣＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＧＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＡＣＣＣＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＴＡＣＴＡＴＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＣＧＴＧＣＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＡＡＧＡＧＡＴＡＣＡＧＡＴＡＣＧＴＧＴＡＣＣＡＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＣＣＧＧＣＡＡＣＧＣＣＧＡＣＴＣＴＣＣＣＧＴＧＣＣＴＣＣＴＡＧＡＧＴＧＴＡＣＡＴＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＧＣＣＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＡＧＡＣＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＣＡＡＧＴＧＡＴＣＡＧＣＴＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＡＣＣＡＧＧＧＣＣＡＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＣＡＴＧＣＡＣＡＡＧＴＡＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＴＧＣＡＣＧＴＧＡＴＣＡＧＡＡＡＧＧＡＣＴＧＣＧＧＣＧＡＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＡＴＣＡＡＧＣＣＴＧＴＧＣＣＴＡＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＧＴＧＡＡＧＧＣＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＣＧＡＧＡＣＡＧＴＧＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＡＧＡＴＣＡＣＣＡＧＡＣＴＧＡＡＧＡＴＣＧＡＣＡＧＡＡＡＣＣＣＣＴＴＣＧＣＣＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＧＡＧＡＣＡＧＣＧＧＣＡＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＴＡＣＧＣＣＴＴＴＴＧＧＡＧＧＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＡＣＡＴＣＣＣＣＧＧＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＧＴＡＧＣＡＣＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＧＡＡＣＣＧＧＡＡＡＣＧＧＣＧＴＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＴＧＴＴＣＴＣＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＧＣＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＴＣＴＧＧＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＧＡＧＡＣＡＴＡＣＡＡＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＣＧＧＣＧＡＧＡＣＴＴＴＣＧＣＣＣＣＴＣＣＴＡＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＣＴＡＣＧＴＧＧＧＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＴＧＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＣＡＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣＧＧＣＡＴＧＡＧＣＣＣＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＡＧＣＣＣＴＡＧＣＡＧＣＡＡＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＡＣＣＡＧＡＣＡＣＡＣＣＡＧＧＧＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＡＣＣＴＴＣＣＧＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＣＣＴＴＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＧＡＴＣＧＴＧＴＣＴＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＣＴＴＴＣＴＧＧＧＣＡＧＣＴＣＣＣＣＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＴＧＣＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＴＡＧＣＧＧＡＧＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＴＴＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＧＣＣＣＡＣＡＴＧＧＴＧＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＴＡＧＣＧＡＡＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＧＣＴＡＡＣＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＡＧＴＧＴＧＡＴＡＡＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＣＧＧＧＧＣＴＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＣＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣＴＣＣＣＴＴＧＣＡＣＣＴＧＴＡＣＣＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＴＧＡＡＴＡＡＡＧＣＣＴＧＡＧＴＡＧＧＡＡＧＧＣ−（ポリＡテール）
【０１１８】
配列番号２
ＣａｔＣｈを含む合成ＤＮＡ
ＧＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＧＧＣＧＧＡＧＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＡＡＣＣＣＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＡＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＴＧＴＴＡＣＴＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＡＴＣＧＡＧＡＧＣＡＧＡＧＧＣＡＣＡＡＡＣＧＧＣＧＣＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＴＣＴＡＡＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＴＴＣＴＡＣＧＣＣＴＡＣＣＡＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＣＴＡＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＴＡＣＧＴＧＴＧＣＧＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＧＧＴＣＡＡＡＧＴＧＡＴＣＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＡＴＧＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＣＡＣＡＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＴＡＣＧＣＣＧＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＣＣＧＴＧＡＴＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＡＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＡＧＡＣＧＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＧＣＡＣＡＡＴＣＧＴＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＡＣＡＡＧＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＴＡＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＴＧＣＴＡＣＧＧＣＧＣＣＡＡＣＡＣＡＴＴＣＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＡＴＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＣＡＧＴＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＧＴＧＡＣＡＧＧＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＴＧＴＴＣＣＣＣＡＴＣＣＴＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＡＧＧＧＣＴＴＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＴＣＴＧＴＧＴＡＣＧＧＣＴＣＴＡＣＣＧＴＧＧＧＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＡＣＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＧＧＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＣＡＣＧＧＣＧＡＣＡＴＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＴＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＧＡＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＴＧＧＣＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＣＣＧＣＴＧＣＴＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＣＧＧＴＣＴＣＧＡＴＴＣＴＡＣＧＴＧＡＴＡＡＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＣＧＧＧＧＣＴＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＣＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣＴＣＣＣＴＴＧＣＡＣＣＴＧＴＡＣＣＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＴＧＡＡＴＡＡＡＧＣＣＴＧＡＧＴＡＧＧＡＡＧＧＣ−（ポリＡテール）
【０１１９】
配列番号３
ＦｌｉｃＲ１を含む合成ＤＮＡ
ＧＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＧＣＴＴＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＡＴＴＴＴＴＣＣＣＣＴＣＣＴＧＣＣＧＡＴＣＴＣＧＴＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＧＧＡＧＣＣＧＴＧＡＴＧＡＧＡＡＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧＡＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＧＣＴＣＣＴＡＧＡＡＡＧＴＣＣＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＣＡＣＴＧＧＡＡＣＧＡＣＧＴＧＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＣＴＡＧＣＧＡＧＡＡＧＣＣＣＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＡＡＴＣＧＡＣＡＴＣＣＣＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＴＴＴＧＧＴＧＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＡＧＣＡＴＧＧＴＧＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＣＧＧＡＴＧＧＡＡＡＴＣＣＣＴＡＣＡＡＣＡＧＧＣＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＣＡＧＴＴＴＡＧＡＧＴＧＣＧＧＧＣＣＧＴＧＡＴＴＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＡＧＡＧＣＣＴＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＴＴＧＡＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＡＡＧＡＧＣＧＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＴＴＣＴＡＴＧＡＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＴＡＣＴＴＣＡＴＧＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＣＣＴＧＡＧＡＡＴＣＴＴＣＧＣＣＴＡＣＧＧＡＣＣＣＡＡＧＡＡＣＴＴＣＴＴＣＡＣＡＡＡＣＣＣＣＴＧＧＧＡＡＧＴＣＧＣＣＧＡＣＧＧＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＴＣＡＣＣＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡＧＴＡＣＴＴＣＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＣＧＣＣＧＡＴＧＧＡＣＴＧＧＧＡＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＧＡＧＴＣＧＴＣＡＧＡＣＴＧＧＣＣＡＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＡＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＡＧＧＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＡＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＡＣＡＣＴＡＴＧＣＴＧＣＣＧＴＧＧＴＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＧＣＧＣＣＴＡＣＡＴＣＧＴＧＧＡＴＡＴＣＡＡＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＴＧＴＣＣＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＡＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＡＣＡＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＡＣＡＴＴＣＴＡＣＡＧＧＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＡＧＧＣＧＧＡＡＣＡＧＧＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＡＡＧＧＣＧＡＧＧＡＡＧＴＧＡＡＣＡＡＧＧＣＣＡＴＴＡＴＣＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＧＧＴＴＣＡＡＧＧＴＣＣＡＣＡＴＧＧＡＡＧＧＣＡＧＣＧＴＧＡＡＣＧＧＣＣＡＣＧＡＧＴＴＣＧＡＧＡＴＴＧＡＡＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧＡＧＧＧＴＡＧＡＣＣＣＴＡＣＧＡＧＧＣＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＡＧＴＧＡＣＣＡＡＡＧＧＣＧＧＣＣＣＴＣＴＧＣＣＴＴＴＣＧＣＣＴＧＧＧＡＴＡＴＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＴＴＴＡＴＧＴＡＣＧＧＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＣＣＣＣＧＣＣＧＡＣＡＴＴＣＣＣＧＡＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＴＣＣＣＣＧＡＧＧＧＣＴＴＣＡＧＡＴＧＧＧＡＧＡＧＡＧＴＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＧＡＧＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＧＡＡＣＣＡＧＧＡＴＡＧＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＧＧＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＡＣＡＡＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＧＧＣＡＣＣＡＡＣＴＴＴＣＣＡＣＣＴＧＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＧＡＴＧＣＡＧＡＡＡＡＡＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＣＣＡＣＣＡＧＡＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＡＣＡＴＡＴＣＣＣＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＣＡＧＡＣＴＡＣＧＣＣＴＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＣＧＧＧＧＣＴＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＣＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣＴＣＣＣＴＴＧＣＡＣＣＴＧＴＡＣＣＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＴＧＡＡＴＡＡＡＧＣＣＴＧＡＧＴＡＧＧＡＡＧＧＣＴＣＧＣＴＴＴＣＴＴＧＣＴＧＴＣＣＡＡＴＴＴＣＴＡＴＴＡＡＡＧＧＴＴＣＣＴＴＴＧＴＴＣＣＣＴＡＡＧＴＣＣＡＡＣＴＡＣＴＡＡＡＣＴＧＧＧＧＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＡＧＧＧＣＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＣＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＧＣＧＣ−（ポリＡテール）
【０１２０】
配列番号４
Ｊａｗｓを含む合成ＤＮＡ
ＧＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＣＴＡＣＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＣＡＣＡＧＡＧＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＡＧＣＡＡＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＴＧＧＧＴＣＡＡＣＡＴＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＧＴＴＧＴＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＧＣＧＡＴＣＴＧＧＡＡＡＧＣＣＣＴＡＧＡＧＣＣＡＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＧＧＴＣＧＣＣＡＣＡＡＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＧＴＧＴＣＴＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＣＣＧＧＡＣＴＧＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＴＧＡＣＡＧＴＧＧＧＣＴＴＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＡＣＧＣＣＣＴＧＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＣＴＣＣＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＧＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣＣＣＴＡＴＧＡＴＴＣＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＡＴＡＣＡＧＡＴＡＴＣＧＣＣＡＧＣＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＣＧＧＧＡＴＧＴＧＴＧＴＧＡＣＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＣＴＧＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＴＧＴＴＣＴＡＣＧＧＡＡＴＣＡＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＣＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣＣＴＧＣＣＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＣＣＴＣＴＧＡＧＡＴＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＧＧＣＴＡＣＣＣＴＡＴＴＣＴＧＴＴＴＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＣＴＧＡＡＧＧＣＧＴＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＧＧＧＣＴＡＴＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＡＡＡＴＡＣＧＴＧＴＴＣＧＣＣＴＴＴＣＴＧＣＴＣＣＴＣＡＧＡＴＧＧＧＴＣＧＣＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＡＡＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＴＧＧＧＣＡＴＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＴＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＣＣＴＡＴＣＣＴＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＣＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＴＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＣＧＧＧＧＣＴＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＣＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣＴＣＣＣＴＴＧＣＡＣＣＴＧＴＡＣＣＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＴＧＡＡＴＡＡＡＧＣＣＴＧＡＧＴＡＧＧＡＡＧＧＣＴＣＧＣＴＴＴＣＴＴＧＣＴＧＴＣＣＡＡＴＴＴＣＴＡＴＴＡＡＡＧＧＴＴＣＣＴＴＴＧＴＴＣＣＣＴＡＡＧＴＣＣＡＡＣＴＡＣＴＡＡＡＣＴＧＧＧＧＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＡＧＧＧＣＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＣＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＧＣＧＣ−（ポリＡテール）
【０１２１】
配列番号５
Ａｒｃｈｅｒ１を含む合成ＤＮＡ
ＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＧＧＣＧＧＡＧＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＡＡＣＣＣＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＡＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＴＧＴＴＡＣＴＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＡＴＣＧＡＧＡＧＣＡＧＡＧＧＣＡＣＡＡＡＣＧＧＣＧＣＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＴＣＴＡＡＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＴＴＣＴＡＣＧＣＣＴＡＣＣＡＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＣＴＡＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＴＡＣＧＴＧＴＧＣＧＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＧＧＴＣＡＡＡＧＴＧＡＴＣＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＡＴＧＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＣＡＣＡＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＴＡＣＧＣＣＧＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＣＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＡＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＡＧＡＣＧＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＧＣＡＣＡＡＴＣＧＴＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＡＣＡＡＧＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＴＡＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＴＧＣＴＡＣＧＧＣＧＣＣＡＡＣＡＣＡＴＴＣＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＡＴＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＣＡＧＴＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＧＴＧＡＣＡＧＧＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＴＧＴＴＣＣＣＣＡＴＣＣＴＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＡＧＧＧＣＴＴＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＴＣＴＧＴＧＴＡＣＧＧＣＴＣＴＡＣＣＧＴＧＧＧＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＡＣＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＧＧＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＣＡＣＧＧＣＧＡＣＡＴＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＴＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＧＡＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＴＧＧＣＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＣＣＧＣＴＧＣＴＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＣＧＧＴＣＴＣＧＡＴＴＣＴＡＣＧＴＧＡＴＡＡＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＣＧＧＧＧＣＴＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＣＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣＴＣＣＣＴＴＧＣＡＣＣＴＧＴＡＣＣＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＴＧＡＡＴＡＡＡＧＣＣＴＧＡＧＴＡＧＧＡＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＡＡＡＡ
【０１２２】
配列番号６
Ｃａｔｃｈ−Ｖ５を含む合成ＤＮＡ
ＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＧＧＣＧＧＡＧＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＡＡＣＣＣＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＡＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＴＧＴＴＡＣＴＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＡＴＣＧＡＧＡＧＣＡＧＡＧＧＣＡＣＡＡＡＣＧＧＣＧＣＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＴＣＴＡＡＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＴＴＣＴＡＣＧＣＣＴＡＣＣＡＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＣＴＡＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＴＡＣＧＴＧＴＧＣＧＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＧＧＴＣＡＡＡＧＴＧＡＴＣＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＡＴＧＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＣＡＣＡＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＴＡＣＧＣＣＧＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＣＣＧＴＧＡＴＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＡＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＡＧＡＣＧＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＧＣＡＣＡＡＴＣＧＴＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＡＣＡＡＧＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＴＡＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＴＧＣＴＡＣＧＧＣＧＣＣＡＡＣＡＣＡＴＴＣＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＡＴＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＣＡＧＴＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＧＴＧＡＣＡＧＧＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＴＧＴＴＣＣＣＣＡＴＣＣＴＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＡＧＧＧＣＴＴＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＴＣＴＧＴＧＴＡＣＧＧＣＴＣＴＡＣＣＧＴＧＧＧＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＡＣＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＧＧＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＣＡＣＧＧＣＧＡＣＡＴＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＴＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＧＡＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＴＧＧＣＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＣＣＧＣＴＧＣＴＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＣＧＧＴＣＴＣＧＡＴＴＣＴＡＣＧＴＧＡＴＡＡＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＣＧＧＧＧＣＴＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＣＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣＴＣＣＣＴＴＧＣＡＣＣＴＧＴＡＣＣＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＴＧＡＡＴＡＡＡＧＣＣＴＧＡＧＴＡＧＧＡＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＡＡＡＡ
【０１２３】
配列番号７
ＣｈＲ２を含む合成ＤＮＡ
ｔｔｔｔａａｇｃｔｔＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＧＧＣＧＧＡＧＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＡＡＣＣＣＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＡＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＴＧＴＴＡＣＴＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＡＴＣＧＡＧＡＧＣＡＧＡＧＧＣＡＣＡＡＡＣＧＧＣＧＣＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＴＣＴＡＡＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＴＴＣＴＡＣＧＣＣＴＡＣＣＡＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＣＴＡＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＴＡＣＧＴＧＴＧＣＧＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＧＧＴＣＡＡＡＧＴＧＡＴＣＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＡＴＧＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＣＡＣＡＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＴＡＣＧＣＣＧＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＣＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＡＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＡＧＡＣＧＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＧＣＡＣＡＡＴＣＧＴＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＡＣＡＡＧＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＴＡＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＴＧＣＴＡＣＧＧＣＧＣＣＡＡＣＡＣＡＴＴＣＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＡＴＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＣＡＧＴＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＧＴＧＡＣＡＧＧＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＴＧＴＴＣＣＣＣＡＴＣＣＴＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＡＧＧＧＣＴＴＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＴＣＴＧＴＧＴＡＣＧＧＣＴＣＴＡＣＣＧＴＧＧＧＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＡＣＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＧＧＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＣＡＣＧＧＣＧＡＣＡＴＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＴＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＧＡＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＴＧＧＣＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＣＣＧＣＴＧＣＴＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＣＧＧＴＣＴＣＧＡＴＴＣＴＡＣＧＴＧＡＴＡＡｇｃｔｇｃｃｔｔｃｔｇｃｇｇｇｇｃｔｔｇｃｃｔｔｃｔｇｇｃｃａｔｇｃｃｃｔｔｃｔｔｃｔｃｔｃｃｃｔｔｇｃａｃｃｔｇｔａｃｃｔｃｔｔｇｇｔｃｔｔｔｇａａｔａａａｇｃｃｔｇａｇｔａｇｇａａｇｇｃｇｇｃｃｇｃｇｔｃｇａｃａａａａａ
【０１２４】
配列番号８
Ｑｕａｓａｒを含む合成ＤＮＡ
ＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＧＧＣＧＧＡＧＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＡＡＣＣＣＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＡＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＴＧＴＴＡＣＴＧＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＡＴＣＧＡＧＡＧＣＡＧＡＧＧＣＡＣＡＡＡＣＧＧＣＧＣＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＴＣＴＡＡＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＴＴＣＴＡＣＧＣＣＴＡＣＣＡＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＣＴＡＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＴＡＣＧＴＧＴＧＣＧＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＧＧＴＣＡＡＡＧＴＧＡＴＣＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＡＴＧＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＣＡＣＡＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＴＡＣＧＣＣＧＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＣＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＡＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＡＧＡＣＧＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＧＣＡＣＡＡＴＣＧＴＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＡＣＡＡＧＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＴＡＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＴＧＣＴＡＣＧＧＣＧＣＣＡＡＣＡＣＡＴＴＣＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＡＴＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＣＡＧＴＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧＡＣＡＧＧＴＣＧＴＧＡＣＡＧＧＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＴＧＴＴＣＣＣＣＡＴＣＣＴＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＡＧＧＧＣＴＴＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＴＣＴＧＴＧＴＡＣＧＧＣＴＣＴＡＣＣＧＴＧＧＧＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＡＣＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＧＧＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＣＡＣＧＧＣＧＡＣＡＴＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＴＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＧＡＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＴＧＧＣＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＣＣＧＣＴＧＣＴＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＣＧＧＴＣＴＣＧＡＴＴＣＴＡＣＧＴＧＡＴＡＡＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＣＧＧＧＧＣＴＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＣＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣＴＣＣＣＴＴＧＣＡＣＣＴＧＴＡＣＣＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＴＧＡＡＴＡＡＡＧＣＣＴＧＡＧＴＡＧＧＡＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＡＡＡＡ
【０１２５】
配列番号９
ＦＬＡＧタグ
ＤＹＫＤＤＤＤＫ
【図１Ａ】
2021515808.tif 000003
【図１Ｂ】
2021515808.tif 000004
【図２】
2021515808.tif 000005
【図３Ａ】
2021515808.tif 000006
【図３Ｂ】
2021515808.tif 000007
【図３Ｃ】
2021515808.tif 000008
【図３Ｄ】
2021515808.tif 000009
【図４】
2021515808.tif 000010
【図５Ａ】
2021515808.tif 000011
【図５Ｂ】
2021515808.tif 000012
【図５Ｃ】
2021515808.tif 000013
【図６Ａ】
2021515808.tif 000014
【図６Ｂ】
2021515808.tif 000015
【図７】
2021515808.tif 000016
【図８】
2021515808.tif 000017
【図９】
2021515808.tif 000018
【図１０】
2021515808.tif 000019
【図１１】
2021515808.tif 000020
【図１２】
2021515808.tif 000021
【図１３Ａ】
2021515808.tif 000022
【図１３Ｂ】
2021515808.tif 000023
【図１３Ｃ】
2021515808.tif 000024
【図１４Ａ】
2021515808.tif 000025
【図１４Ｂ】
2021515808.tif 000026
【図１５Ａ】
2021515808.tif 000027
【図１５Ｂ】
2021515808.tif 000028
【図１５Ｃ】
2021515808.tif 000029
【図１６】
2021515808.tif 000030
【図１７】
2021515808.tif 000031
【図１８】
2021515808.tif 000032
【図１９】
2021515808.tif 000033
【図２０】
2021515808.tif 000034
【国際調査報告】
2021515808.tif 000035
2021515808.tif 000036
2021515808.tif 000037