(57)【要約】プロバイオティック微生物を含む核、ならびに水溶性フィルム形成ポリマー内に均等に分散された食用脂肪分子および食用メディエータを含むハイブリッド固体分散体を含むコーティング層を含むプロバイオティックマイクロカプセルが提供され、前記食用メディエータは、デンプンオクテニルスクシネートである。【選択図】図１
2021521249.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロバイオティックマイクロカプセルであって、以下：
プロバイオティック微生物を含む核；ならびに
水溶性フィルム形成ポリマーおよび食用メディエータ内に均等に分散された食用脂肪分子を含むハイブリッド固体分散体を含み、前記食用メディエータがデンプンオクテニルスクシネートである、コーティング層
を含む、プロバイオティックマイクロカプセル。
【請求項２】
前記水溶性フィルム形成ポリマーがヒドロキシプロピルデンプンである、請求項１に記載のプロバイオティックマイクロカプセル。
【請求項３】
前記プロバイオティック微生物がビフィズス菌を含む、請求項２に記載のプロバイオティックマイクロカプセル。
【請求項４】
前記食用脂肪分子が、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミテート、パルミトレエート、ヒドロキシパルミテート、アラキジン酸、オレイン酸、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシオクタコサニルヒドロキシステアレート、長鎖のオレイン酸エステル、脂肪酸のエステル、脂肪族アルコール、エステル化脂肪族ジオール、ヒドロキシル化脂肪酸、水素化脂肪酸（飽和または部分的飽和脂肪酸）、部分的に水素化された大豆、部分的に水素化された綿実油、脂肪族アルコール、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン、脂肪酸のトリエステル、ココナッツ油、水素化ココナッツ油、カカオバター；ヤシ油；脂肪酸共晶；モノグリセリドおよびジグリセリド、ポロキサマー、ポリエチレングリコールおよびポリエステルのブロックコポリマーまたはそれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項３に記載のプロバイオティックマイクロカプセル。
【請求項５】
前記食用脂肪分子がココアバターである、請求項４に記載のプロバイオティックマイクロカプセル。
【請求項６】
前記食用脂肪分子がステアリン酸である、請求項４に記載のプロバイオティックマイクロカプセル。
【請求項７】
前記ハイブリッド固体分散体が単一ハイブリッド固体分散体である、請求項１に記載のプロバイオティックマイクロカプセル。
【請求項８】
マイクロカプセルを調製するための方法であって、以下：
ビフィズス菌を含むマイクロカプセル核を調製するステップ；
ヒドロキシプロピルデンプン（ＨＰＳ）ココアバター（ＣＢ）およびデンプンオクテニルスクシネートを含む低水蒸気透過率（ＷＶＴＲ）値を含む少なくとも１つのコーティングを調製し、前記核を前記少なくとも１つのコーティングでコーティングするステップ
を含む方法。
【請求項９】
ＨＰＳを加熱蒸留水（８５〜９０℃）に添加することによって、ヒドロキシプロピルデンプン（ＨＰＳ）の５％ｗ／ｗ溶液を調製するステップ；
加熱した蒸留水にＳＯＳを加え、均一な透明な溶液が得られるまで継続的に撹拌することにより、デンプンオクテニルスクシネート（ＳＯＳ）の溶液を調製するステップ；
機械的撹拌機を用いて撹拌しながらココアバター（ＣＢ）を予備溶融して、溶融したＣＢを提供するステップ；ならびに
前記ＳＯＳ溶液および前記溶融したＣＢを、ホモジナイザーを用いて前記ＨＰＳの５％ｗ／ｗ溶液中にホモジナイズするステップ
を含む、少なくとも１つのコーティングを調製する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ココアバター（ＣＢ）の予備溶融が５０℃で行われる、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロバイオティック顆粒のコーティングの分野に、より詳細には、比較的高いレベルの水分活性を有する食料品中に混合されることを意図したプロバイオティック顆粒に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境水分からの栄養および栄養補助剤形の保護は、活性物質が水の存在によって悪影響を受ける場合に重要である。湿気の負の影響は、湿式造粒および／またはコーティングを含むプロセスなどの一般的な製造プロセス中に生じ得る。あるいは、水分は、貯蔵中に活性物質を損傷し、最終製品の貯蔵寿命に悪影響を及ぼし得る。
【０００３】
プロバイオティクスに関して、水分は、多くのプロバイオティック細菌の安定性および貯蔵寿命において特に重要な因子である。多くの場合、そのようなプロバイオティクスをあるレベルの湿度に曝露すると、細菌の不活性化がもたらされ得る。その結果、そのような細菌を包含することができる食品、特に高レベルの水分活性を有する食品の範囲が制限され、貯蔵寿命がかなり短くなる。
【０００４】
活性物質に対する損傷を制限することを目的とする一般的なアプローチは、マイクロカプセル、錠剤、カプセルなどの種々の包装要素中に感湿性活性物質を含有する剤形の包装を含む。しかしながら、特に、気候が非常に湿気の多い場所では、特別な包装は、上述の包装の内側に捕捉された湿気のために、完全な湿気保護を提供しない。水分によって引き起こされ得る損傷を防止または減少させ、かつ特殊な包装の必要性を減少させるための別の方法は、固体剤形を、水分障壁特性を有する材料でコーティングすることである。
【０００５】
このような材料は、本質的に低い水蒸気透過（ＷＶＰ）または低い水蒸気転移速度（ＷＶＴＲ）を有する。これらのコーティングは、通常、活性物質の崩壊時間および放出プロフィールなどの剤形の基本的特性に影響を及ぼさない。水分感受性薬物の例としては、アトルバスタチン、ラニチジン、テマゼパム、ほとんどのビタミン、多数のハーブ、不飽和脂肪酸およびプロバイオティック細菌が挙げられる。水分に起因して生じ得る損傷には、例えば、加水分解による活性物質の分解、プロバイオティック細菌の破壊、またはＣＦＵ（コロニー形成単位）値の有意な減少、貯蔵時の剤形の外観の変化、剤形の劣化および／または溶解時間の変化が含まれ得る。したがって、このような損傷から剤形を保護するために、防湿層コーティングが適用される。
【０００６】
防湿層コーティングを達成するために、通常、疎水性の水不溶性ポリマーが使用される。この目的のために一般に使用されるポリマーは、ポリ酢酸ビニル、ゼイン、セラック、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、およびメチルメタクリレートを２：１：１の比率でベースとするカチオン性コポリマーであるＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｅ  １００、エチルセルロース（ＥＣ）などである。しかし、このようなポリマーは、投与後の体内での剤形の崩壊を延長し、したがって、活性物質またはプロバイオティック細菌の放出を遅延させる。同様に、これらのポリマーでのコーティングは、このような物質を安全に取り扱うために、このようなプロセスが空調機器、爆発防止設備などに関連する追加の費用を強いるので、望ましくない有機溶媒の使用の関与を必要とする。防湿コーティングを達成するための別の方法は、水溶性ポリマーと親油性物質との組み合わせである。疎水性または親油性物質粒子は、コーティングまたはフィルム形成後に水溶性フィルム中に埋め込まれる。フィルム中の親油性物質粒子の存在は、水蒸気転移を減少させ得るが、それらは、フィルムの全ての領域を覆うことができず、従って、水蒸気は、依然として、粒子間の空間を通って容易に浸透し得る。
【０００７】
プロバイオティクス全般は、湿気に弱い微生物であり、他よりも弱い特定の菌株が存在する。
【０００８】
ＢＢ−１２は、Ｃｈｒｉｓ  Ｈａｎｓｅｎによって培養されるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓの特定株であり、ＬＧＧ（Ｃｈｒｉｓ  Ｈａｎｓｅｎによって培養されるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（ＬＧＧ）の特定株）は、水分、特に高い水分活性（ａｗ）を有する環境に対して高度に感受性であると考えられる。結果として、これらの細菌の生存性は、それらが比較的高レベルの水分活性を有する食品中で組み合わされる場合、非常に短時間でかなり減少する。
【０００９】
ビフィズス菌は、ヒト、乳児および成人の結腸に常在する嫌気性の棒形状のグラム陽性菌である（非特許文献１）。病原体の定着防止による腸内フローラの改善、免疫系の活性化、タンパク消化の亢進および下痢または便秘の改善を含む、ビフィズス菌の有益な作用が報告されている（非特許文献２）。ビフィズス菌は数十年間発酵食品で消費されており、現在の市販株にはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ（Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ）ｓｓｐ乳酸菌株Ｂｆ−６、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）ＢＢ−１２、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ  ＤＲ１０（ＨＮＯ１９）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）ＢＢ５３６、Ｂ．ｂｒｅｖｅ  Ｙａｋｕｌｔ、Ｂ．ｂｒｅｖｅ  ＳＢＴ−２９２８、およびＢ．ｂｒｅｖｅ  Ｃ５０が含まれる。米国では、種々のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種が、従来の食品および乳児用調合乳に使用するためのＧＲＡＳであることが決定されており、選択された食品に使用するためのＢ．ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｓｐ乳酸菌Ｂｆ−６（ＧＲＮ  ３７７；１０１１ｃｆｕ／従来の食品の給食）；生後４ヶ月以上の乳児用調製粉乳に使用するためのＢ．ｌａｃｔｉｓ  Ｂｂ−１２（ＧＲＮ  ４９；１０７〜１０８ｃｆｕ／ｇ乳児用調製粉乳）ならびに選択された食品および乳児用調製粉乳に使用するためのＢ．ｌｏｎｇｕｍ  ＢＢ５３６（ＧＲＮ  ２６８；１０１０ｃｆｕ／従来の食品の給食；１０１０ｃｆｕ／ｇ正期産乳児用調製粉乳）が含まれる。ヒトの健康に有益な影響を及ぼす市販乳製品中の生存可能なビフィズス菌の最低レベルは、およそ１０５〜１０７ｃｆｕ／ｍｌであることが知られている（非特許文献３）。最近、乳児用食品、特に粉末式乳児用調製粉乳（ＰＩＦ）におけるビフィズス菌の適用における動機付けが増加している（Ｄｕｎｃｋｅｒ，２０１３）。これは、主に、乳児における有益な微生物叢を維持するためであり、特に、自然の微生物叢を損傷する抗生物質の処置に際して有益な微生物叢を維持するためである（非特許文献４）。
【００１０】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ  Ｍ−１６Ｖ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）は、Ｙ字型のグラム陽性嫌気性細菌である。この微生物は、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）とともに寄託され、ＬＭＧ  ２３７２９と表示された。Ｂ．ｂｒｅｖｅは、乳児および成人の便中に検出されている。Ｂ．ｂｒｅｖｅ  Ｍ−１６Ｖは、１９７６年に日本で最初に商業的に入手可能であった。Ｂ．ｂｒｅｖｅ  Ｍ−１６Ｖの最初の凍結培養物は、株の純度および安定性を確実にするために厳密に制御される。製品仕様は、Ｂ．ｂｒｅｖｅ  Ｍ−１６Ｖが、ターム乳児用調製粉乳、免除ターム乳児用調製粉乳、および医療食品を含む食品での使用に適していることを保証する。Ｂ．ｂｒｅｖｅ  Ｍ−１６Ｖ培養物を用いて製造された最終製品は、再現性よく組成標準を満たし、食品グレード成分に適した汚染物質の限界に適合する。Ｂ．ｂｒｅｖｅ  Ｍ−１６Ｖは、食品におけるプロバイオティック使用のための微生物の評価に関する国連／世界保健機関（ＦＡＯ／ＷＨＯ）ガイドラインの食品農業機関によって列挙された安全基準を満たす。結果から、Ｂ．ｂｒｅｖｅ  Ｍ−１６Ｖは毒性も病原性もなく、したがって食品への使用は安全であることが示される。
【００１１】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ亜種Ｌａｃｔｉｓ（ＢＢ−１２としても商業的に知られている）は、本明細書では「ビフィズス菌」と呼ばれ、カタラーゼ陰性の棒形状細菌である。これを、１９８３年にＣｈｒ．Ｈａｎｓｅｎの細胞培養バンクに寄託した。単離の時点で、ビフィズス菌は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ種に属すると考えられた。現代の分子分類技術は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓとしてＢＢ−１２を再分類し、その後新しい種のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓに分類した。Ｂ．ｌａｃｔｉｓ種は、後に種の基準を満たさないことが示され、代わりに亜種としてＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓに含められた。したがって、今日ではＢＢ−１２は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓに分類される。長年にわたる名称の変化にもかかわらず、ＢＢ−１２株は、変化していない。
【００１２】
ビフィズス菌は、Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎの酪農培養の収集に由来する。これは、プロバイオティクス乳製品の製造のためにＣｈｒ．Ｈａｎｓｅｎによって特別に選択された株である。ビフィズス菌は、乳児用調製粉乳、栄養補助食品、および発酵乳製品に世界中で使用されている。この株は、発酵活性、高い空気耐性、良好な安定性、ならびに高い酸および胆汁耐性を発現し、また、栄養補助食品中の凍結乾燥製品としても、技術的によく適している。さらに、ビフィズス菌は、食物の味覚、外観または口感に有害な影響を及ぼさず、消費までプロバイオティック食物中で生存することができる。
【００１３】
Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎは、もっぱらビフィズス菌の生産菌であり、これは、常に最も重要であり、最も広く研究されているプロバイオティック細菌株の１つである。この特定の株は、現在、種々の栄養補助食品および食品、例えば、乳児用調製粉乳および発酵乳製品において使用されている。
【００１４】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓは、短いグラム陽性のヘテロ発酵性通性嫌気性無芽胞桿菌であり、しばしば鎖状に現れる。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧ（ＡＴＣＣ  ５３１０３）は胃および腸の酸および胆汁に生存でき、消化管にコロニー形成し、腸ミクロフローラのバランスをとると主張されている一方、証拠はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓが過渡状態住民であり、自生ではない可能性が高いことを示唆している。それにもかかわらず、それは、多くのレベルで作用することから、各種疾患の処置に有用なプロバイオティクスと考えられている。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧは、腸粘膜に結合する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｓｉｍｏｎ  ＧＬ  ａｎｄ  Ｇｏｒｂａｃｈ  ＳＬ．Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｆｌｏｒａ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，１９８４；８６：１７４−１９３
【非特許文献２】Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ  Ｎ  ａｎｄ  Ｓｈｉｍａｍｕｒａ  Ｓ．Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ：Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｊａｐａｎ．Ｆｏｏｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌ，１９９３；６：１２６−１３６
【非特許文献３】Ｃｕｉ  ＪＨ，Ｓｈｉｍ  ＪＭ，Ｌｅｅ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ａｎｄ  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｄｒｉｎｋ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ  ｙｏｇｕｒｔｓ．Ｋｏｒ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００；３６：１６１−１６５
【非特許文献４】森永乳業、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ  ＆  Ｈｅａｌｔｈ．Ｊａｐａｎ：１９９７年８月、ｐｐ．４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、以下に示す詳細な説明および添付の図面から完全に理解されるようになり、これらは、例示および例としてのみ与えられ、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、継続中の安定性試験が実施されているのと同じ条件で維持された、コーティングされていない細菌と比較した、マイクロカプセル封入された細菌の含水量を実証するグラフを示し、また乾燥損失（ＬＯＤ）法を使用して経時的に測定された。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
いくつかの実証的な実施形態によれば、本明細書では、プロバイオティック微生物を含む核と、水溶性フィルム形成ポリマー内に均一に分散された食用脂肪分子および食用メディエータを含むハイブリッド固体分散体を含むコーティング層とを含むプロバイオティックマイクロカプセルが提供され、前記食用メディエータは、デンプンオクテニルスクシネートである。
【００１９】
いくつかの実証的な実施形態によれば、水溶性フィルム形成ポリマーは、ヒドロキシプロピルデンプンであってもよい。
【００２０】
いくつかの実施形態によれば、プロバイオティック微生物は、ビフィズス菌を含むことができる。
【００２１】
いくつかの実施形態によれば、食用脂肪分子は、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミテート、パルミトレエート、ヒドロキシパルミテート、アラキジン酸、オレイン酸、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシオクタコサニルヒドロキシステアレート、長鎖のオレイン酸エステル、脂肪酸のエステル、脂肪族アルコール、エステル化脂肪族ジオール、ヒドロキシル化脂肪酸、水素化脂肪酸（飽和または部分的飽和脂肪酸）、部分的に水素化された大豆、部分的に水素化された綿実油、脂肪族アルコール、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン、脂肪酸のトリエステル、ココナッツ油、水素化ココナッツ油、カカオバター；ヤシ油；脂肪酸共晶；モノグリセリドおよびジグリセリド、ポロキサマー、ポリエチレングリコールおよびポリエステルのブロックコポリマーまたはそれらの組み合わせを含む群から選択され得る。
【００２２】
いくつかの好ましい実施形態によれば、食用脂肪分子は、ココアバターおよび／またはステアリン酸であってもよい。
【００２３】
いくつかの実施形態によれば、ハイブリッド固体分散体は、単一のハイブリッド固体分散体であってもよい。
【００２４】
いくつかの実証的な実施形態によれば、プロバイオティクスを含む核と、プロバイオティクスを湿気から保護する少なくとも１つのコーティング層とを含むマイクロカプセル（本明細書では顆粒とも呼ばれる）が提供される。
【００２５】
いくつかの例示的な実施形態によれば、顆粒は、食品、主に、例えば、水ベースの食品、液体乳児用調合乳、ヨーグルト、乳製品、ネクター、フルーツジュースなどを含む液体食品中に包含され得る。
【００２６】
いくつかの例証的な実施形態によれば、マイクロカプセルは、好ましくは、比較的高いレベルの水活性を有する食品中に包含され得る。
【００２７】
いくつかの実証的な実施形態によれば、プロバイオティクスは、一般に腸内細菌叢を改善または回復させることによって、消費された場合に健康上の利益を提供することが意図される任意の適切な生きた微生物、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ビフィズス菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓから選択される属を含んでもよい。
【００２８】
いくつかの実施形態によれば、プロバイオティクスは、好ましくはビフィズス菌および／またはＬＧＧ細菌である。
【００２９】
いくつかの実証的な実施形態によれば、少なくとも１つのコーティングは、食用脂肪分子が例えば食用メディエータを使用して水溶性フィルム形成ポリマー内に均等に分散されているハイブリッド固体分散体を含む特定の封止フィルムコーティングを含み得る。
【００３０】
いくつかの実証的な実施形態によれば、脂肪分子は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミテート、パルミトレエート、ヒドロキシパルミテート、アラキジン酸、オレイン酸、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシオクタコサニルヒドロキシステアレート、長鎖のオレイン酸エステル、脂肪酸のエステル、脂肪族アルコール、エステル化脂肪族ジオール、ヒドロキシル化脂肪酸、水素化脂肪酸（飽和または部分的飽和脂肪酸）、部分的に水素化された大豆、部分的に水素化された綿実油、脂肪族アルコール、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン、脂肪酸のトリエステル、ココナッツ油、水素化ココナッツ油、ココアバター；ヤシ油；脂肪酸共晶；モノグリセリドおよびジグリセリド、ポロキサマー、ポリエチレングリコールおよびポリエステルのブロックコポリマーまたはそれらの組み合わせを含む、任意の適切な食用脂肪酸を含んでもよい。
【００３１】
いくつかの実施形態によれば、脂肪分子は、好ましくはココアバターおよび／またはステアリン酸である。
【００３２】
いくつかの実証的な実施形態によれば、水溶性フィルム形成ポリマーは、例えば、ヒドロキシプロピルデンプン（ＨＰＳ）、ポリ−Ｎ−置換アクリルアミド誘導体、ポリプロピレンオキシド、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコールの部分的にアセチル化された生成物、メチルセルロース（ＭＣ）、ヒドロキシルプロピルセルロース（ＨＰＣ）、メチルヒドロキシエチルセルロース（ＭＨＥＣ）、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルエチルセルロース（ＨＰＥＣ）、ヒドロキシメチルプロピルセルロース（ＨＭＰＣ）、エチルヒドロキシエチルセルロース（ＥＨＥＣ）（エツロース）、ヒドロキシエチルメチルセルロース（ＨＥＭＣ）、ヒドロキシメチルエチルセルロース（ＨＭＥＣ）、プロピルヒドロキシエチルセルロース（ＰＨＥＣ）、疎水的に修飾されたヒドロキシエチルセルロース（ＮＥＸＴＯＮ）、アミロース、アミロペクチン、ポリ（オルガノホスファゼン）、キシログルカン、合成エラスチン誘導体タンパク質、および親水性または疎水性モノマーでさらに置換された上記のポリマーのいずれかの１つ以上を含むことができる。
【００３３】
いくつかの実施形態によれば、ポリ−Ｎ−置換アクリルアミド誘導体は、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）、ポリ−Ｎ−アクリロイルピペリジン、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド）（ＰＤＥＡＡｍ）、ポリ（Ｎ−ビニルカプロラクタム）（ＰＶＣＬ）、ポリ［２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］（ＰＤＭＡＥＭＡ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、ＰＥＧメタクリレートポリマー（ＰＥＧＭＡ）、ポリ−Ｎ−プロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリ−Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−アクリロイルピロリジン、ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド、ポリ−Ｎシクロプロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−エチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ置換メタクリルアミド誘導体、Ｎ置換アクリルアミド誘導体およびＮ置換メタクリルアミド誘導体を含むコポリマー、ならびにＮ−イソプロピルアクリルアミドおよびアクリル酸のコポリマーのうちの１つ以上を含むことができる。
【００３４】
いくつかの実証的な実施形態では、親水性モノマーは、Ｎ−ビニルピロリドン、ビニルピリジン、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシメチルアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチル−メタクリレート、酸性基を有するメタクリル酸およびアクリル酸、ならびにこれらの酸の塩、ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル−アクリルアミドなどの塩基性基を有する誘導体、ならびにこれらの誘導体の塩のうちの１つ以上を含むことができる。
【００３５】
いくつかの実証的な実施形態では、疎水性モノマーは、エチルアクリレート、メチルメタクリレート、およびグリシジルメタクリレート；Ｎ−ｎ−ブチルメタクリルアミドなどのＮ置換アルキルメタクリルアミド誘導体；塩化ビニル、アクリロニトリル、スチレン、酢酸ビニルのうちの１つ以上を含み得る。
【００３６】
いくつかの実施形態によれば、水溶性フィルム形成ポリマーは、ＨＰＳおよび／またはＨＰＣである。
【００３７】
いくつかの実施形態によれば、食用メディエータは、例えば、デンプンオクテニルスクシネート（ＳＯＳ）を含んでもよい。
【００３８】
いくつかの実証的な実施形態によれば、食用メディエータは、水溶性フィルム形成ポリマーと食用脂肪分子との間の界面張力を低下させることができる。いくつかの実施形態によれば、表面張力を低下させることにより、水溶性フィルム形成ポリマーと食用脂肪分子との間に緊密な一体化を生じさせることができ、例えば、マイクロカプセルの核を取り囲む均一、堅固かつ整数のフィルムコートの形成を確実にすることができる。
【００３９】
いくつかの実施形態によれば、デンプンオクテニルスクシネートは、親水性成分および疎水性成分の驚くべき接着を可能にする少なくとも２つの部分を含む。具体的には、いくつかの実施形態におけるデンプンオクテニルスクシネートは、水溶性フィルム形成ポリマーに付着し得る親水性部分、および食用脂肪分子に付着する少なくとも１つの疎水性部分を含み得る。
【００４０】
いくつかの実施形態によれば、デンプンオクテニルスクシネートのこれらの独特の特徴は、水分障壁として作用し、前記マイクロカプセルの核への湿気の浸透を防止する単一のハイブリッド固体分散体の生成を可能にする。
【００４１】
いくつかの実施形態によれば、ハイブリッド固体分散体は、水を核への浸透からはじく本質的に均一なコーティングを提供する。
【００４２】
いくつかの実施形態によれば、単一のハイブリッド固体分散体は、例えば、別個の保護層と比較して優れた特性を提供することができ、例えば、別個の層は、例えば、積層中に、および／または各層の不均一な被覆のために、湿気の浸透のためのより高い電位を有することができる。
【００４３】
いくつかの実証的な実施形態によれば、プロバイオティクスは、マイクロカプセルの重量から１０〜６０％ｗ／ｗの範囲の量で存在してもよい。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、核は、充填剤をさらに含んでもよい。充填剤の例としては、微結晶性セルロース、糖、例えば、ラクトース、グルコース、ガラクトース、フルクトース、もしくはスクロース；リン酸二カルシウム；糖アルコール、例えば、ソルビトール、マニトール、マンチトール、ラクチトール、キシリトール、イソマルト、エリスリトール、および水素化デンプン加水分解物；トウモロコシデンプン；ジャガイモデンプン；ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、および酢酸セルロース、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、充填剤はラクトースである。
【００４５】
いくつかの実証的な実施形態によれば、充填剤は、マイクロカプセルの重量から６０〜７０％ｗ／ｗの範囲の量で存在してもよい。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、核は、結合剤をさらに含んでもよい。
【００４７】
結合剤の例としては、非限定的な例として、ポビドン（ＰＶＰ：ポリビニルピロリドン）、コポビドン（ビニルピロリドンと酢酸ビニルとのコポリマー）、ポリビニルアルコール、低分子量ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、低分子量ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、低分子量ヒドロキシメチルセルロース（ＭＣ）、低分子量ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低分子量ヒドロキシエチルセルロース、低分子量ヒドロキシメチルセルロース、酢酸セルロース、ゼラチン、加水分解ゼラチン、ポリエチレンオキシド、アカシア、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン、ならびに水溶性ポリアクリレートおよびポリメタクリレート、低分子量エチルセルロース、またはそれらの混合物が挙げられる。好ましい実施形態では、結合剤はマルトデキストリンである。
【００４８】
いくつかの実証的な実施形態によれば、結合剤は、マイクロカプセルの重量から１０〜１５％ｗ／ｗの範囲の量で存在してもよい。
【００４９】
いくつかの実証的な実施形態によれば、マイクロカプセルは、例えば、マイクロカプセル内に含まれるプロバイオティクスを害することなく、高い水分活性を有する食品中に包含されてもよい。
【００５０】
水分活性またはａｗは、物質中の水の部分蒸気圧を水の標準状態部分蒸気圧で割ったものである。食品科学の分野では、標準状態は、ほとんどの場合、同じ温度での純水の部分蒸気圧として定義される。純粋な蒸留水は、正確に１の水分活性を有する。
【００５１】
いくつかの実証的な実施形態によれば、本明細書において、感受性プロバイオティック細菌の不活性化を妨げ、したがって貯蔵寿命を延ばすために、湿気に対して優れた保護を有する感受性プロバイオティック細菌を提供するマイクロカプセル化製剤が提供される。これは、次に、細菌が包含される製品の貯蔵寿命を、高温でさえも延ばすことができる。
【００５２】
この予備研究は、室温で比較的高い湿度を有する環境において感受性プロバイオティック細菌を保護するように設計された、この特定のマイクロカプセル化についての概念の強固な証明を提供する。この技術の実現可能性は、マイクロカプセル化されたプロバイオティック細菌を室温で長時間空気に曝露すること、およびＬＯＤ方法を用いた水分量によって証明された。同様に、マイクロカプセル化プロセスは、細菌の最初の数が最初のものの最初の数と同様に保持された場合、全体的に安全であることが見出された。
【００５３】
いくつかの実証的な実施形態によれば、水分からプロバイオティクスを保護するためのマイクロカプセルを調製するための方法が本明細書で提供され、この方法は、以下を含む：
ビフィズス菌を含むマイクロカプセル核を調製するステップ；
低い水蒸気透過率（ＷＶＴＲ）値を含む少なくとも１つのコーティングで核をコーティングし、少なくとも１つのコーティングは、ヒドロキシプロピルデンプン（ＨＰＳ）ココアバター（ＣＢ）およびデンプンオクテニルスクシネートを含むステップ。
【００５４】
いくつかの実施形態によれば、この方法は、加熱された蒸留水（８５〜９０℃）にＨＰＳを添加することによって、ＨＰＳの５％ｗ／ｗ溶液を調製することを含み得る；
加熱した蒸留水にデンプンオクテニルスクシネートを加え、均質な透明な溶液が得られるまで絶えず撹拌し、機械的撹拌機を用いて撹拌しながらココアバターを予備溶融する。
【００５５】
いくつかの実施形態によれば、ココアバターを５０℃で予備溶融した。
【００５６】
いくつかの実施形態によれば、得られたデンプンオクテニルスクシネート溶液および溶融したＣＢは、ホモジナイザーを使用して５％ｗ／ｗのＨＰＳ溶液にホモジナイズされる。
【００５７】
Ｃ）方法：
ｉ）フィルム調製：フィルム形成ポリマーとしてのヒドロキシプロピルデンプン（ＨＰＳ）に基づく。
種々のフィルム配合物を調製し、水蒸気透過速度（ＷＶＴＲ）によって特徴付けた。
【００５８】
ＨＰＳ、ココアバター（ＣＢ）およびデンプンオクテニルスクシネート（商業的にＥｍｆｉｘとも呼ばれる）を正確に秤量して、ＨＰＳ：ＣＢ：デンプンオクテニルスクシネートの特定の比率を得た。表２は、本研究で調製された、様々な比率のＨＰＳ：ＣＢ：デンプンオクテニルスクシネートを有する、種々のフィルムの配合物を提示する。最初に、所望量のＨＰＳを、加熱した蒸留水（８５〜９０℃）に、マグネチックスターラーを用いて混合しながら添加して、５％ｗ／ｗのポリマーを作製した。撹拌は、均一な透明な溶液が得られるまで続けた（８５〜９０℃で１５〜３０分）。次いで、加熱した蒸留水に所望量のデンプンオクテニルスクシネートを添加し、均一な透明な溶液が得られるまで撹拌を続けた。機械的撹拌機を用いて撹拌しながら、ココアバターを５０℃で予備溶融した。次に、得られたデンプンオクテニルスクシネート溶液および溶融ＣＢを、ホモジナイザーを用いて５％ｗ／ｗのＨＰＳ溶液中に９０秒間ホモジナイズし、ホモジナイザー速度は、３５００  ＲＰＭであった（ホモジナイザー、ＨＳＩＡＮＧ  ＴＡＩ  ＭＡＣＨＩＮＥＲＹ  ＩＮＤＵＳＴＲＹ、モデル：ＨＧ−３００、最高速度２６０００ｒｐｍ）。次いで、後者の分散体を３２〜３６℃に冷却し、さらに２０分間撹拌したままにして、ポリマーの完全な溶解を可能にした。
【実施例】
【００５９】
実施例１−核およびコーティング組成物の実施形態−（溶液ベースの核形成）。
核およびコーティングの両方の例を、以下の表１に列挙する。
【００６０】
【表１】
2021521249.tif 000003
【００６１】
実施例２−ビフィズス菌を含む核のマイクロカプセル化方法。
一実施形態では、マイクロカプセル化の方法は以下の通りである。
【００６２】
Ａ）フィルムコーティングの配合物。
最高の障壁能力を提供する適切な配合物を見出すために、コーティング成分の種々の組み合わせを調製し、Ｖｅｒｓａｐｅｒｍ  Ｌｔｄ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍａｉｄｅｎｈｅａｄ，ＵＫ）の水蒸気透過速度（ＷＶＴＲ）について試験した。
【００６３】
Ｂ）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎの調製。
最初に、ビフィズス菌を含む核を、所望のように配合物を用いて調製した。次に、得られた核を、最も低いＷＶＴＲ値を提示する当該特定のコーティング配合物を用いてコーティングした。同様に、マイクロカプセル化プロセスは、ＷＶＴＲ試験性能に必要とされた遊離のフィルムを形成する能力にもかかわらず、特定のコーティング配合物がプロセス中に核をコーティングすることができるかどうかを見出すために計画された。実験のこの部分からの結果は、コーティングプロセスは非常に円滑かつ高速に行うことができ、依然として粒度および粒度分布が完全に必要な範囲にあり得ることを示した。ＬＯＤ（乾燥損失）値は、細菌の長期にわたる安定性を可能にする範囲で制御し、調整することができる。
【００６４】
Ｃ）方法：
ｉ）フィルム調製：フィルム形成ポリマーとしてのヒドロキシプロピルデンプン（ＨＰＳ）に基づく。
種々のフィルム配合物を調製し、水蒸気透過速度（ＷＶＴＲ）によって特徴付けた。
【００６５】
ＨＰＳ、ココアバター（ＣＢ）およびデンプンオクテニルスクシネート（商業的にＥｍｆｉｘとも呼ばれる）を正確に秤量して、ＨＰＳ：ＣＢ：デンプンオクテニルスクシネートの特定の比率を得た。表２は、本研究で調製された、様々な比率のＨＰＳ：ＣＢ：デンプンオクテニルスクシネートを有する、種々のフィルムの配合物を提示する。最初に、所望量のＨＰＳを、加熱した蒸留水（８５〜９０℃）に、マグネチックスターラーを用いて混合しながら添加して、５％ｗ／ｗのポリマーを作製した。撹拌は、均一な透明な溶液が得られるまで続けた（８５〜９０℃で１５〜３０分）。次いで、加熱した蒸留水に所望量のデンプンオクテニルスクシネートを添加し、均一な透明な溶液が得られるまで撹拌を続けた。機械的撹拌機を用いて撹拌しながら、ココアバターを５０℃で予備溶融した。次に、得られたデンプンオクテニルスクシネート溶液および溶融ＣＢを、ホモジナイザーを用いて５％ｗ／ｗのＨＰＳ溶液中に９０秒間ホモジナイズし、ホモジナイザー速度は、３５００  ＲＰＭであった（ホモジナイザー、ＨＳＩＡＮＧ  ＴＡＩ  ＭＡＣＨＩＮＥＲＹ  ＩＮＤＵＳＴＲＹ、モデル：ＨＧ−３００、最高速度２６０００ｒｐｍ）。次いで、後者の分散体を３２〜３６℃に冷却し、さらに２０分間撹拌したままにして、ポリマーの完全な溶解を可能にした。
【００６６】
最後に、分散体をペトリ皿（直径１００ｍｍ）に注ぎ、フード内の空気流下、室温で少なくとも９６時間乾燥させた。
【００６７】
【表２】
2021521249.tif 000004
【００６８】
表２は、種々の比率のＨＰＳ：ＣＢ：デンプンオクテニルスクシネートに基づく種々のフィルム製剤のいくつかの実施形態を示す。
【００６９】
ｉｉ）フィルム調製：フィルム形成ポリマーとしてのＨＰＣ（ヒドロキシプロピルセルロース）に基づく。
ＨＰＣ、ココアバター（ＣＢ）およびデンプンオクテニルスクシネートを正確に秤量して、ＨＰＣ：ＣＢ：デンプンオクテニルスクシネートの特定の比率を得た。表３は、本研究で調製された、様々な比率のＨＰＣ：ＣＢ：デンプンオクテニルスクシネートを有する、種々のフィルムの配合物を提示する。最初に、所望量のデンプンオクテニルスクシネートを、加熱した蒸留水に添加し、撹拌は、均一な透明な溶液が得られるまで続けた。機械的撹拌機を用いて撹拌しながら、ココアバターを５０℃で予備溶融した。次いで、得られた混合物を、ホモジナイザーを使用して、上述のように、７５℃の予備加熱した蒸留水中で調製した５％ｗ／ｗのＨＰＣ  ＬＦ分散体にホモジナイズした。次に、後者の分散体をポリマーのＬＣＳＴ未満に冷却し、さらに３０分間撹拌し続けて、ポリマーを完全に溶解させた。最後に、分散体をペトリ皿（直径１００ｍｍ）に注ぎ、フード内の空気流下、室温で少なくとも９６時間乾燥させた。
【００７０】
【表３】
2021521249.tif 000005
【００７１】
表３は、ＨＰＣ：ＣＢ：デンプンオクテニルスクシネートの種々の比率に基づく種々のフィルム配合物のいくつかの実施形態を示す。
【００７２】
ｉｉｉ）水蒸気透過率（ＷＶＴＲ）試験。
この試験の概念は、規定された条件下における単位時間あたりの試験フィルム試験片の単位面積を透過する水蒸気の量の測定に基づいている。水蒸気透過率は、グラム毎平方メートル、２４時間［ｇ／（ｍ２・２４ｈ）］で表される。電解検出センサーを備えた１０ｃｍ２の測定領域を備えた（Ｖｅｒｓａｐｅｒｍ  Ｌｔｄ．，Ｍａｉｄｅｎｈｅａｄ，ＵＫ）のＶｅｒｓａｐｅｒｍ  ＭｋＶ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＷＶＴＲ  Ｍｅｔｅｒを使用して、さまざまなフィルムのＷＶＴＲを測定した。この方法は、ＩＳＯ  １５１０６−３：２００３に基づいた。
試験１−試験を４０℃、湿度１００％で２４時間行った。
試験２−試験を室温（２３〜２５℃、湿度１００％）で２４時間行った。
【００７３】
ｉｖ）マイクロカプセル化プロセスのためのハイブリッド固体分散を含まないフィルムの調製。
ＨＰＳ、ココアバター（ＣＢ）およびデンプンオクテニルスクシネートを正確に秤量して、ＨＰＳ：ＣＢ：デンプンオクテニルスクシネートの特定の比率を得た。表４は、本研究で調製された、様々な比率のＨＰＳ：ＣＢ：デンプンオクテニルスクシネートを有する、種々のフィルムの配合物を提示する。最初に、所望量のＨＰＳを、予備加熱した蒸留水（８５〜９０℃）に、マグネチックスターラーを用いて混合しながら添加して、５％ｗ／ｗのポリマーを作製した。撹拌は、均一な透明な溶液が得られるまで続けた（８５〜９０℃で１５〜３０分）。
【００７４】
次いで、加熱した蒸留水に所望量のデンプンオクテニルスクシネートを添加し、均一な透明な溶液が得られるまで撹拌を続けた。機械的撹拌機を用いて撹拌しながら、ココアバターを５０℃で予備溶融した。次に、得られたデンプンオクテニルスクシネート溶液および溶融ＣＢを、ホモジナイザーを用いて５％ｗ／ｗのＨＰＳ溶液中に９０秒間ホモジナイズし、ホモジナイザー速度は、３５００ＲＰＭであった（ホモジナイザー、Ｈｓｉａｎｇ  Ｔａｉ  Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、モデル：ＨＧ−３００、最高速度２６０００ｒｐｍ）。次いで、得られた分散体を３２〜３６℃に冷却し、さらに２０分間撹拌したままにして、ポリマーの完全な溶解を可能にした。
【００７５】
【表４】
2021521249.tif 000006
【００７６】
ｖ）マイクロカプセル化調製プロセス
マイクロカプセル化プロセスは、核を作製し、続いてコーティングプロセスを行うことによって開始された：
【００７７】
１）核調製
核は、湿式造粒法により調製した。結合剤（例えば、マルトデキストリン）の水溶液を、細菌および充填剤からなる粉末混合物上に噴霧して、粒子を固化させて、凝集体を形成した。マイクロカプセルの調製に使用した成分を、表５にまとめる。
【００７８】
【表５】
2021521249.tif 000007
【００７９】
２）コーティングプロセス
コーティングは、前の段階から得られた核上にポリマー溶液を直接噴霧することによって行った。
【００８０】
核調製およびコーティングプロセスの両方を、Ｉｎｎｏｊｅｔ  Ｖｅｎｔｉｌｕｓ  ２．５（Ｒｏｍａｃｏ−Ｈｕｔｔｌｉｎ，Ｅｓｔｅｉｎｅｎ−Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った。
【００８１】
層の厚さは、以下の式に従ってコーティングプロセス前の初期基材の重量に対するコーティングプロセスで得られた％重量増加（ＷＧ）によって表された：
【数１】
2021521249.tif 000008
式中、ＷｄおよびＷ０は、それぞれ、コーティングプロセス後および前の基材の重量であり、ＷＧは、重量増加である。
【００８２】
【表６】
2021521249.tif 000009
【００８３】
【表７】
2021521249.tif 000010
【００８４】
ｖｉ）乾燥損失（ＬＯＤ）試験
特定の時間（４％の重量増加ごと）でのコーティングプロセス中に、２ｇｒのマイクロカプセルを、ＬＯＤ試験（ＬＯＤデバイス（ＭＢ−５０−１−２５０、ＭＲＣ））に供した。
【００８５】
ｖｉｉ）安定性試験。
１）部屋の条件：
コーティングされていないビフィズス菌およびマイクロカプセル化されたビフィズス菌を、室温条件（温度および湿度を変えて）に曝露し、毎週６マウントの期間、微生物学的試験にサンプリングする。
【００８６】
２）０．７９５Ａｗの水分活性：
コーティングされていないビフィズス菌およびマイクロカプセル化されたビフィズス菌の０．７９５Ａｗ条件への曝露（デシケーターの底部に０．７９５ａｗ溶液を有するデシケーターを用いる）および２日毎に２週間の微生物学的試験へのサンプリング。
【００８７】
３）０．６１２Ａｗの水分活性：
コーティングされていないビフィズス菌およびマイクロカプセル化されたビフィズス菌の０．６１２Ａｗ条件への曝露（デシケーターの底部に０．７９５ａｗ溶液を有するデシケーターを使用）および２日ごとに数週間、微生物学的試験へのサンプリング。
【００８８】
４）水蒸気透過率（ＷＶＴＲ）試験
この試験の概念は、規定された条件下における単位時間あたりの試験フィルム試験片の単位面積を透過する水蒸気の量の測定に基づいている。水蒸気透過率は、グラム毎平方メートル、２４ｈ［ｇ／（ｍ２・２４ｈ）］で表された。電解検出センサーを備えた１０ｃｍ２の測定領域を備えたＶｅｒｓａｐｅｒｍ  ＭｋＶ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＷＶＴＲ  Ｍｅｔｅｒ（Ｖｅｒｓａｐｅｒｍ  Ｌｔｄ．Ｍａｉｄｅｎｈｅａｄ，ＵＫ）を使用して、さまざまなフィルムのＷＶＴＲを測定した。試験は、室温、湿度１００％で２４時間行った。当該方法は、ＩＳＯ  １５１０６ｅ３：２００３に基づいた。簡単に述べると、試験片を、２つの異なるチャンバー、すなわち乾燥チャンバーと制御湿度チャンバーとの間に挿入した。試料の乾燥側は、乾燥キャリアガスの流れによって掃引され、制御湿度チャンバーから試験片を透過する水蒸気は、キャリアガスによって電解槽に運ばれる。この電池は、キャリアガスによって運ばれる水蒸気を定量的に吸収し、電極に印加される直流電圧によってそれを水素および酸素に電解分解的に分解する２つのスパイラルワイヤ電極を含む。試料を透過し、単位時間当たりに分解される水分の質量は、必要とされる電解電流から計算される。
【００８９】
ｖｉｉｉ）ＷＶＴＲ試験結果。
【表８】
2021521249.tif 000011
【００９０】
【表９】
2021521249.tif 000012
【００９１】
ｘｉ）安定性試験結果
１）製造プロセス中の安定性（造粒コア形成中の結合剤の水溶液に基づくマイクロカプセル化プロセス）
微生物学的試験結果は、細菌の数が、その高い感受性にもかかわらずマイクロカプセル化プロセス中に減少せず、プロセスの開始時と同じままであることを示した（１．５×１０１１ｃｆｕ／ｇビフィズス菌でプロセスを開始し、１．５５×１０１１ｃｆｕ／ｇビフィズス菌で終了する）−２０％体重増加（非常に有意な達成）。
【００９２】
表９は、マイクロカプセル化プロセス中の（核形成プロセス中の結合剤の水溶液に基づく）ＬＧＧおよび別の菌株のラクトバチルス・ラムノサス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の安定性の結果を提示する。
【００９３】
【表１０】
2021521249.tif 000013
【００９４】
２）経時的な継続的な安定性
マイクロカプセル化された細菌の粒子を、そのまま［裸（未包装）］で、室温（２０〜２２℃、約３５〜４５％ＲＨ）で空気に曝露し、ＣＦＵ／ｇ細菌を決定するために、計数試験のために種々の時点で試料を採取した。結果を、同じ条件下で保持した純粋なビフィズス菌（マイクロカプセル化していない、または保護されていない細菌）と比較した。結果を、表１０．１に１８０日間までまとめる。
【００９５】
この結果に基づけば、そのままのビフィズス菌（保護されていない細菌）ビフィズス菌は、わずか３週間後に４〜５対数損失し、時間の経過とともに依然としてほとんど変化しないことが明確に注目できる。ビフィズス菌粉末は、細菌が互いに付着した結果として、時間の経過に伴って表面に一見したところ剛性であり、硬い層を作り出し、これは、色（オフホワイトから帯黄色および後に淡褐色）ならびに触感の大幅な変化によって明らかになることは注目に値する。この新しい層は、細菌の保護および経時的な対数減少における減少の原因であると考えられる。この点は、約３週間（１０＾６）後に変化しないままである場合に、対数の安定化の主な理由であり得る。
【００９６】
いくつかの特定のマイクロカプセル化製剤について、細菌は、約１３週間後に１対数のみの損失が見られた場合に、全体的に安定化されることもまた、見られ得る。この事実は、マイクロカプセル化製剤が、湿度に対する必要な保護を経時的に提供することを示す。
【００９７】
表１０．１は、さまざまな配合物を使用してマイクロカプセル化された細菌と、室温および約３５〜４５％ＲＨでさまざまな持続時間裸（包装されていない）に保たれた純粋なビフィドバクテリアラクチス（ビフィズス菌）の両方で行われた列挙試験の結果を要約する。
【００９８】
【表１１（１）】
2021521249.tif 000014
【表１１（２）】
2021521249.tif 000015
【表１１（３）】
2021521249.tif 000016
【表１１（４）】
2021521249.tif 000017
【００９９】
【表１２】
2021521249.tif 000018
【０１００】
【表１３】
2021521249.tif 000019
【０１０１】
【表１４】
2021521249.tif 000020
【０１０２】
【表１５（１）】
2021521249.tif 000021
【表１５（２）】
2021521249.tif 000022
【０１０３】
４）経時的な水分含有量測定
進行中の安定性試験が行われているのと同じ条件で保持された純粋な細菌と比較した、ある配合物を有するマイクロカプセル化細菌の水分含有量も、乾燥損失（ＬＯＤ）法を用いて経時的に測定した。水分含有量のいかなる増加も、粉末によって起こる吸水率、したがって、乏しい障壁能力を示すことができることに留意されたい。対照的に、ＬＯＤ値の変化がないことは、湿度に対する良好な保護を意味し得る。
【０１０４】
水分含有量の結果を表１１にまとめ、ＢＢ−１２について図１にグラフで示す。
【０１０５】
【表１６】
2021521249.tif 000023
【０１０６】
ここで、図１を参照すると、図１は、進行中の安定性試験が行われているのと同じ条件に保たれ、乾燥損失（ＬＯＤ）法を使用して経時的に測定された、純粋な細菌と比較した特定の製剤を含むマイクロカプセル化細菌の含水量を示す。
【０１０７】
図１に示されるように、マイクロカプセル化配合物は、水分吸収に対する適切な障壁を提供し、その結果、マイクロカプセル化ビフィズス菌の含水量の有意な増加は、経時的に観察され得なかった。対照的に、空気に２４時間曝露した後の保護されていない細菌は、約１１４％の水分を吸収し、これは、経時的にほぼ一定のままであった。
【０１０８】
保護されていない（そのままのＬＧＧ）およびマイクロカプセル化されたＬＧＧの両方について同じ実験を行い、結果を表１１．２に示す。
【０１０９】
【表１７】
2021521249.tif 000024
【０１１０】
本発明をいくつかの具体例に関して説明したが、多くの修正および変形が可能である。したがって、添付の特許請求の範囲内で、本発明は、具体的に記載された以外の方法で実現されてもよいことが理解される。
【０１１１】
実施例２−核およびコーティング組成物の実施形態（溶融ベースの核形成）。
核は、溶融造粒法によって調製した。結合剤（例えば、ココアバター）の溶融液体を、細菌および充填剤からなる粉末混合物上に噴霧して、粒子を固化させて凝集体を形成した。マイクロカプセルの調製に使用した成分を、表１２にまとめる。
【０１１２】
【表１８】
2021521249.tif 000025
【０１１３】
【表１９】
2021521249.tif 000026
【０１１４】
【表２０】
2021521249.tif 000027
【０１１５】
製造工程中の安定性
マイクロカプセル化プロセス中の細菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の安定性を決定するために、計数試験のために試料を採取した。結果を表１５にまとめる。
【０１１６】
【表２１】
2021521249.tif 000028
【０１１７】
本発明をいくつかの具体例に関して説明したが、多くの修正および変形が可能である。したがって、添付の特許請求の範囲内で、本発明は、具体的に記載された以外の方法で実現されてもよいことが理解される。
【図１】
2021521249.tif 000029
2021521249.tif 000030
【国際調査報告】
2021521249.tif 000031
2021521249.tif 000032
2021521249.tif 000033
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