(57)【要約】エクソン５３スキッピングを誘導するためにヒトジストロフィン遺伝子中の選択された標的部位に相補的なアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートが記載される。本開示は、ＣＰＰにコンジュゲートされたアンチセンスオリゴマー部分を含むアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。一態様において、本開示は、ヒトジストロフィン遺伝子中でエクソンスキッピングを誘導するために選択された標的に結合することができる１８〜２５個のサブユニットの長さのアンチセンスオリゴマーを提供し、アンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位として指定されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３標的領域に相補的である塩基の配列を含む。【選択図】図４Ａ
2021521794.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、
【化７３】
2021521794.tif 000105
またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
各Ｎｕが、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｔが、
【化７４】
2021521794.tif 000106
から選択される部分であり、
Ｒ１が、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｚが、１６〜２３の整数であり、
前記標的化配列が、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である、アンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項２】
前記アニーリング部位は、Ｚが１６であるＨ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＺが２３であるＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択される、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項３】
Ｔが、
【化７５】
2021521794.tif 000107
であり、前記標的化配列および対応するＺが、以下から選択され、
【表２４】
2021521794.tif 000108
Ｘが、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項４】
各Ｘが独立して、Ｔである、請求項３に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項５】
式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、
【化７６】
2021521794.tif 000109
またはその薬学的に許容可能な塩であって、式中、各Ｎｕが、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である標的化配列を一緒になって形成する核酸塩基である、アンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項６】
前記アニーリング部位は、Ｚが１６であるＨ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＺが２３であるＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択される、請求項５に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項７】
前記標的化配列および対応するＺが、以下から選択され、
【表２５】
2021521794.tif 000110
式中、Ａが
【化７７】
2021521794.tif 000111
であり、Ｃが
【化７８】
2021521794.tif 000112
であり、Ｇが
【化７９】
2021521794.tif 000113
であり、Ｘが
【化８０】
2021521794.tif 000114
である、請求項５に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項８】
各Ｘが独立して、
【化８１】
2021521794.tif 000115
である、請求項７に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項９】
式（ＩＶ）のアンチセンスオリゴマー、
【化８２】
2021521794.tif 000116
またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
各Ｎｕが、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｔが、
【化８３】
2021521794.tif 000117
から選択される部分であり、
Ｒ１が、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２が、Ｈまたはアセチルから選択され、
前記標的化配列が、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である、アンチセンスオリゴマー。
【請求項１０】
前記アニーリング部位は、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＺが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される、請求項９に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項１１】
Ｔが、
【化８４】
2021521794.tif 000118
であり、前記標的化配列および対応するＺが、以下から選択され、
【表２６】
2021521794.tif 000119
Ｘが、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）である、請求項９に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項１２】
各ＸがＴである、請求項１１に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項１３】
式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマー、
【化８５】
2021521794.tif 000120
またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
Ｒが、Ｈまたはアセチルから選択され、
各Ｎｕが、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である標的化配列を一緒になって形成する核酸塩基である、アンチセンスオリゴマー。
【請求項１４】
前記アニーリング部位は、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＺが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される、請求項１３に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項１５】
前記標的化配列および対応するＺが、以下から選択され、
【表２７】
2021521794.tif 000121
式中、Ａが
【化８６】
2021521794.tif 000122
であり、Ｃが
【化８７】
2021521794.tif 000123
であり、Ｇが
【化８８】
2021521794.tif 000124
であり、Ｘが
【化８９】
2021521794.tif 000125
である、請求項１３に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項１６】
各Ｘが独立して、
【化９０】
2021521794.tif 000126
である、請求項１５に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、もしくは請求項９〜１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー、またはそれらの薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療を必要としている対象においてそれを行うための方法であって、前記対象が、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有し、前記方法が、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、または請求項９〜１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマーを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１９】
エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させてジストロフィン産生を誘導する方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、または請求項９〜１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマーを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２０】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療を必要としている対象においてそれを行うための方法であって、前記対象が、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有し、前記方法が、請求項１７に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２１】
エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させてジストロフィン産生を誘導する方法であって、請求項１７に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２２】
エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ｍＲＮＡプロセシング中にジストロフィンプレｍＲＮＡからエクソン５３を排除する方法であって、請求項１７に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２３】
エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３を結合する方法であって、請求項１７に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年４月２６日に出願された米国仮出願第６２／６６３，１６２号に対する優先権を主張する。上記の出願の教示全体は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願には、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表が含まれ、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。該ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年４月２２日に作成され、名称が８１６２＿５３＿ＷＯ００＿ＳＬ．ｔｘｔ、サイズが３３，９０６バイトである。
【０００３】
本開示は、ヒトジストロフィン遺伝子中のエクソン５３スキッピングに好適な新規のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、ならびにその医薬組成物に関する。本開示はまた、新規のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを使用してエクソン５３スキッピングを誘導するための方法、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象においてジストロフィンを産生するための方法、ならびにエクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象を治療するための方法も提供する。
【背景技術】
【０００４】
アンチセンス技術は、様々な異なるレベル（転写、スプライシング、安定性、翻訳）で遺伝子発現に影響を及ぼすために、様々な化学を使用して開発されている。その研究のほとんどは、幅広い適応症における異常遺伝子または疾患関連遺伝子を修正または代償するためのアンチセンス化合物の使用に焦点を当てている。アンチセンス分子は、特異性を有して遺伝子発現を阻害することが可能であり、このため、遺伝子発現のモジュレーターとしてのオリゴマーに関する多くの研究努力が、標的遺伝子の発現またはシス作用エレメントの機能を阻害することに焦点を当てている。アンチセンスオリゴマーは典型的には、センス鎖（例えば、ｍＲＮＡ）、または一部のウイルスＲＮＡ標的の場合はマイナス鎖のいずれかのＲＮＡに対するものである。特異的な遺伝子の下方制御の所望の効果を達成するために、オリゴマーは概して、標的ｍＲＮＡの崩壊を促進するか、ｍＲＮＡの翻訳を遮断するか、またはシス作用ＲＮＡエレメントの機能を遮断し、それにより標的タンパク質のデノボ合成またはウイルスＲＮＡの複製のいずれかを効果的に防止する。
【０００５】
しかしながら、そのような技術は、目的が天然タンパク質の産生を上方制御することであるか、またはナンセンス変異またはフレームシフト変異などの翻訳の早期終結を誘導する変異を代償することである場合、有用ではない。これらの場合、欠陥遺伝子転写物は、標的分解または立体阻害に供されるべきではなく、したがって、アンチセンスオリゴマーの化学的性質は、標的ｍＲＮＡの崩壊を促進することも、翻訳を遮断することもするべきではない。
【０００６】
様々な遺伝性疾患において、遺伝子の最終的な発現に対する変異の効果は、スプライシングプロセス中の標的エクソンスキッピングプロセスを通して調節され得る。スプライシングプロセスは、プレｍＲＮＡ中の隣接するエクソン−イントロン接合部をごく接近させ、かつイントロンの末端でホスホジエステル結合の切断を行う複雑な多成分機構によって方向付けられ、一緒にスプライシングされるエクソン間のホスホジエステル結合の後続の再構成を伴う。この複雑かつ高精度なプロセスは、比較的短い半保存的ＲＮＡセグメントであるプレｍＲＮＡの配列モチーフによって媒介され、次いでスプライシング反応に関与する様々な核スプライシング因子が配列モチーフに結合する。スプライシング機構がプレｍＲＮＡプロセシングに関与するモチーフを読み取るまたは認識する方法を変化させることによって、異なるスプライシングされたｍＲＮＡ分子を作り出すことが可能である。ヒト遺伝子の大部分が、正常な遺伝子発現中に選択的にスプライシングされることが認識されているが、関与する機構は特定されていない。Ｂｅｎｎｅｔｔら（米国特許第６，２１０，８９２号）は、標的ＲＮＡのＲＮＡｓｅ  Ｈ媒介切断を誘導しないアンチセンスオリゴマー類似体を使用した野生型細胞ｍＲＮＡプロセシングのアンチセンス調節を記載している。これは、特異的エクソンを欠く選択的にスプライシングされたｍＲＮＡを生成することが可能であることに有用性が見出される（例えば、膜貫通ドメインをコードするエクソンを欠く可溶性ＴＮＦスーパーファミリーアクセプターの生成に関するＳａｚａｎｉ，Ｋｏｌｅ，ｅｔ  ａｌ．２００７に記載されるように）。
【０００７】
正常機能タンパク質が、その中の変異のために早期に終結される場合、アンチセンス技術によって一部の機能タンパク質産生を回復させるための手段は、スプライシングプロセス中の介入を通して可能であることが示されており、また、疾患を引き起こす変異に関連するエクソンが、一部の遺伝子から特異的に欠失され得る場合、同様の天然タンパク質の生物学的特性を有するか、またはエクソンに関連する変異によって引き起こされる疾患を改善するのに十分な生物学的活性を有する短縮型タンパク質産物が、時に産生され得ることが示されている（例えば、Ｓｉｅｒａｋｏｗｓｋａ，Ｓａｍｂａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９６、Ｗｉｌｔｏｎ，Ｌｌｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９９、ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ，Ｂｒｅｍｍｅｒ−Ｂｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．２００１、Ｌｕ，Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３、Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ，Ｊａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４を参照）。Ｋｏｌｅら（米国特許第５，６２７，２７４号、同第５，９１６，８０８号、同第５，９７６，８７９号、および同第５，６６５，５９３号）は、標的のプレｍＲＮＡの崩壊を促進しない修飾アンチセンスオリゴマー類似体を使用して、異常なスプライシングに対抗する方法を開示している。Ｂｅｎｎｅｔｔら（米国特許第６，２１０，８９２号）は、標的ＲＮＡのＲＮＡｓｅ  Ｈ媒介切断を誘導しないアンチセンスオリゴマー類似体を同様に使用した野生型細胞ｍＲＮＡプロセシングのアンチセンス調節を記載している。
【０００８】
標的エクソンスキッピングのプロセスは、多くのエクソンおよびイントロンが存在する、エクソンの遺伝子構成に冗長性がある、または１つ以上の特定のエクソンなしでタンパク質が機能することができる、長い遺伝子において特に有用である可能性が高い。様々な遺伝子の変異によって引き起こされる切断に関連する遺伝子疾患の治療のための遺伝子プロセシングを再指向させる努力は、（１）スプライシングプロセスに関与するエレメントと完全もしくは部分的に重複するか、または（２）そのエレメントにおいて起こる特定のスプライシング反応を正常に媒介するスプライシング因子の結合および機能を妨げるためにエレメントに十分に近い位置においてプレｍＲＮＡに結合する、アンチセンスオリゴマーの使用に焦点を当てている。
【０００９】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、タンパク質ジストロフィンの発現の欠陥によって引き起こされる。タンパク質をコードする遺伝子は、ＤＮＡの２００万を超えるヌクレオチドにわたって広げられた７９個のエクソンを含有する。エクソンのリーディングフレームを変化させるか、または停止コドンを導入するか、または全アウトオブフレームエクソン（複数可）の除去もしくは１つ以上のエクソンの重複を特徴とする、任意のエクソンの変異は、機能性ジストロフィンの産生を妨げ、ＤＭＤをもたらす可能性がある。
【００１０】
変異、典型的には１つ以上のエクソンの欠失が、全ジストロフィン転写物に沿った正しいリーディングフレームをもたらし、これにより、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳が早期に終結されない場合、より重症度の低い型の筋ジストロフィーであるベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）が生じることが分かっている。変異したジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングにおける上流および下流のエクソンの結合が、遺伝子の正しいリーディングフレームを維持する場合、結果は、ある程度の活性を保持する短い内部欠失を有するタンパク質をコードするｍＲＮＡであり、ベッカー表現型がもたらされる。
【００１１】
長年にわたって、ジストロフィンタンパク質のリーディングフレームを変化させないエクソン（複数可）の欠失がＢＭＤ表現型を生じさせる一方で、フレームシフトを引き起こすエクソン欠失がＤＭＤを生じさせることが知られている（Ｍｏｎａｃｏ，Ｂｅｒｔｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８８）。一般に、リーディングフレームを変化させ、したがって適切なタンパク質翻訳を中断する点変異およびエクソン欠失を含むジストロフィン変異は、ＤＭＤをもたらす。また、一部のＢＭＤおよびＤＭＤ患者が、複数のエクソンに及ぶエクソン欠失を有することにも留意すべきである。
【００１２】
アンチセンスオリゴリボヌクレオチドを用いた変異体ジストロフィンプレｍＲＮＡスプライシングの調節は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で報告されている（例えば、Ｍａｔｓｕｏ，Ｍａｓｕｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９９１、Ｔａｋｅｓｈｉｍａ，Ｎｉｓｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９５、Ｐｒａｍｏｎｏ，Ｔａｋｅｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．１９９６、Ｄｕｎｃｋｌｅｙ，Ｅｐｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９７；Ｄｕｎｃｋｌｅｙ，Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９８、Ｗｉｌｔｏｎ，Ｌｌｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９９、Ｍａｎｎ，Ｈｏｎｅｙｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００２、Ｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３を参照）。
【００１３】
アンチセンスオリゴマーは、ＤＭＤ遺伝子の変異のスキッピングを誘導するために、プレｍＲＮＡ、典型的にはエクソンの特定の領域を標的とし、それにより、これらのアウトオブフレーム変異をインフレームで回復させて、内部で短縮されたが機能的なジストロフィンタンパク質の産生を可能にするように特別に設計されている。そのようなアンチセンスオリゴマーは、エクソン（いわゆるエクソン内部配列）内、またはエクソンからイントロンの一部分に交差するスプライスドナーもしくはスプライスアクセプター接合部で、完全に標的とすることが知られている。
【００１４】
ＤＭＤに対するそのようなアンチセンスオリゴマーの発見および開発は、過去の研究の一分野である。これらの開発には、（１）ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  ａｎｄ  Ｓａｒｅｐｔａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（本出願の譲受人）：ＷＯ２００６／００００５７、ＷＯ２０１０／０４８５８６、ＷＯ２０１１／０５７３５０、ＷＯ２０１４／１００７１４、ＷＯ２０１４／１５３２４０、ＷＯ２０１４／１５３２２０、（２）Ａｃａｄｅｍｉｓｃｈ  Ｚｉｅｋｅｎｈｕｉｓ  Ｌｅｉｄｅｎ／Ｐｒｏｓｅｎｓａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（現ＢｉｏＭａｒｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）：ＷＯ０２／２４９０６、ＷＯ２００４／０８３４３２、ＷＯ２００４／０８３４４６、ＷＯ２００６／１１２７０５、ＷＯ２００７／１３３１０５、ＷＯ２００９／１３９６３０、ＷＯ２００９／０５４７２５、ＷＯ２０１０／０５０８０１、ＷＯ２０１０／０５０８０２、ＷＯ２０１０／１２３３６９、ＷＯ２０１３／１１２０５３、ＷＯ２０１４／００７６２０、（３）Ｃａｒｏｌｉｎａｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ：ＷＯ２０１２／１０９２９６、（４）Ｒｏｙａｌ  Ｈｏｌｌｏｗａｙ：米国第６１／０９６，０７３号および同第６１／１６４，９７８号、例えば、ＵＳ８，０８４，６０１およびＵＳ２０１７−０２０４４１３の利益を主張し、かつこれらを含む特許および出願（４）ＪＣＲ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｏ：ＵＳ６，６５３，４６６；ＪＰ２０００−１２５４４８、例えば、ＵＳ６，６５３，４６７の利益を主張し、かつこれらを含む特許および出願；ＪＰ２０００−２５６５４７、例えば、ＵＳ６，７２７，３５５の利益を主張し、かつこれらを含む特許および出願；ＷＯ２００４／０４８５７０；（５）Ｎｉｐｐｏｎ  Ｓｈｉｎｙａｋｕ：ＷＯ２０１２／０２９９８６、ＷＯ２０１３／１００１９０、ＷＯ２０１５／１３７４０９、ＷＯ２０１５／１９４５２０、ならびに（６）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｄｅ  Ｍｙｏｌｏｇｉｅ／Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  Ｐｉｅｒｒｅ  ｅｔ  Ｍａｒｉｅ  Ｃｕｒｉｅ／Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ  Ｂｅｒｎ／Ｃｅｎｔｒｅ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ／Ｓｙｎｔｈｅｎａ  ＡＧ：ＷＯ２０１０／１１５９９３、ＷＯ２０１３／０５３９２８からの開発が含まれる。
【００１５】
ＤＭＤ用の細胞膜透過性ペプチドにコンジュゲートされたアンチセンスオリゴマーの発見および開発も、一研究分野であった（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０４８５８６号、Ｗｕ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８１（２）：３９２−４００，２０１２、Ｗｕ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３５（１５）：５１８２−５１９１，２００７、Ｍｕｌｄｅｒｓ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｐｏｓｔｅｒ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｅｒｌｉｎ，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１４、Ｂｅｓｔａｓ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ７６１７５，２０１４、Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１６（９）：１６２４−１６２９，２００８、Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．８５：４４４−４５３，２０１０、Ｍｏｕｌｔｏｎ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ．３５（４）：８２６−８２８，２００７、Ｙｉｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１９（７）：１２９５−１３０３，２０１１、Ａｂｅｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．１４：４５５−４６０，２００８、Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．６０：５１７−５２９，２００８、ＭｃＣｌｏｒｅｙ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１３：１３７３−１３８１，２００６、Ａｌｔｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．１２（２）：１７５−１７７，２００６、およびＹｏｕｎｇｂｌｏｏｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２００７，１８（１），ｐｐ  ５０−６０を参照）。
細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）、例えば、アルギニンに富むペプチドの輸送部分は、例えば、ＣＰＰにコンジュゲートされたアンチセンスオリゴマーの細胞内への透過を強化するのに有効であり得る。
これらの努力にもかかわらず、ジストロフィンを産生し、ＤＭＤを治療するための治療方法に有用な可能性があるエクソン５３および対応する医薬組成物を標的とする、改善されたアンチセンスオリゴマーのニーズが依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第６，２１０，８９２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６２７，２７４号明細書
【特許文献３】米国特許第５，９１６，８０８号明細書
【特許文献４】米国特許第５，９７６，８７９号明細書
【特許文献５】米国特許第５，６６５，５９３号明細書
【特許文献６】米国特許第６，２１０，８９２号明細書
【特許文献７】国際公開第２００６／００００５７号
【特許文献８】国際公開第２０１０／０４８５８６号
【特許文献９】国際公開第２０１１／０５７３５０号
【特許文献１０】国際公開第２０１４／１００７１４号
【特許文献１１】国際公開第２０１４／１５３２４０号
【特許文献１２】国際公開第２０１４／１５３２２０号
【特許文献１３】国際公開第２００２／２４９０６号
【特許文献１４】国際公開第２００４／０８３４３２号
【特許文献１５】国際公開第２００４／０８３４４６号
【特許文献１６】国際公開第２００６／１１２７０５号
【特許文献１７】国際公開第２００７／１３３１０５号
【特許文献１８】国際公開第２００９／１３９６３０号
【特許文献１９】国際公開第２００９／０５４７２５号
【特許文献２０】国際公開第２０１０／０５０８０１号
【特許文献２１】国際公開第２０１０／０５０８０２号
【特許文献２２】国際公開第２０１０／１２３３６９号
【特許文献２３】国際公開第２０１３／１１２０５３号
【特許文献２４】国際公開第２０１４／００７６２０号
【特許文献２５】国際公開第２０１２／１０９２９６号
【特許文献２６】米国特許第８，０８４，６０１号明細書
【特許文献２７】米国特許出願公開第２０１７／０２０４４１３号明細書
【特許文献２８】米国特許第６，６５３，４６６号明細書
【特許文献２９】特開２０００−１２５４４８号公報
【特許文献３０】米国特許第６，６５３，４６７号明細書
【特許文献３１】特開２０００−２５６５４７号公報
【特許文献３２】米国特許第６，７２７，３５５号明細書
【特許文献３３】国際公開第２００４／０４８５７０号
【特許文献３４】国際公開第２０１２／０２９９８６号
【特許文献３５】国際公開第２０１３／１００１９０号
【特許文献３６】国際公開第２０１５／１３７４０９号
【特許文献３７】国際公開第２０１５／１９４５２０号
【特許文献３８】国際公開第２０１０／１１５９９３号
【特許文献３９】国際公開第２０１３／０５３９２８号
【特許文献４０】国際公開第２０１０／０４８５８６号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｓａｚａｎｉ，Ｐ．，Ｒ．Ｋｏｌｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｓｐｌｉｃｅ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＴＮＦ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ．ＰＣＴ  ＷＯ２００７０５８８９４，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ
【非特許文献２】Ｓｉｅｒａｋｏｗｓｋａ，Ｈ．，Ｍ．Ｊ．Ｓａｍｂａｄｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．“Ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｔｈａｌａｓｓｅｍｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９３（２３）：１２８４０−４．
【非特許文献３】Ｗｉｌｔｏｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｆ．Ｌｌｏｙｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．“Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍｄｘ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｍＲＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．”Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ  Ｄｉｓｏｒｄ  ９（５）：３３０−８．
【非特許文献４】ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ，Ｊ．Ｃ．，Ｍ．Ｂｒｅｍｍｅｒ−Ｂｏｕｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＤＭＤ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ．”Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １０（１５）：１５４７−５４．
【非特許文献５】Ｌｕ，Ｑ．Ｌ．，Ｃ．Ｊ．Ｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｍｏｕｎｔｓ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｅｘｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｄｘ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｍｏｕｓｅ．”Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９（８）：１００９−１４．
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【非特許文献７】Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ，Ａ．，Ａ．Ａ．Ｊａｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）．“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｕｌｔｉｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｍａｋｅｓ  ｍｏｒｅ  ｓｅｎｓｅ．”Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ７４（１）：８３−９２．
【非特許文献８】Ｍａｔｓｕｏ，Ｍ．，Ｔ．Ｍａｓｕｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）．“Ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｍＲＮＡ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｄｕｅ  ｔｏ  ａｎ  ｉｎｔｒａｅｘｏｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｋｏｂｅ．”Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８７（６）：２１２７−３１．
【非特許文献９】Ｔａｋｅｓｈｉｍａ，Ｙ．，Ｈ．Ｎｉｓｈｉｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．“Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｉｎｔｒｏｎ  ｂｙ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ａｎ  ｉｎｔｒａ−ｅｘｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  Ｋｏｂｅ．”Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９５（２）：５１５−２０．
【非特許文献１０】Ｐｒａｍｏｎｏ，Ｚ．Ａ．，Ｙ．Ｔａｋｅｓｈｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ  ａｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｔｏ  ａｎ  ｅｘｏｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．”Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２２６（２）：４４５−９．
【非特許文献１１】Ｄｕｎｃｋｌｅｙ，Ｍ．Ｇ．，Ｉ．Ｃ．Ｅｐｅｒｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．“Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＤＭＤ  ｇｅｎｅ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．”Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １６（７−９）：１６６５−１６６８．
【非特許文献１２】Ｄｕｎｃｋｌｅｙ，Ｍ．Ｇ．，Ｍ．Ｍａｎｏｈａｒａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．“Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｍｄｘ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．”Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ７（７）：１０８３−９０．
【非特許文献１３】Ｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｃ．Ｊ．Ｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．“Ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｇｅｎｅ．”Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ５（６）：５１８−２７．
【非特許文献１４】Ｗｕ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８１（２）：３９２−４００，２０１２
【非特許文献１５】Ｗｕ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３５（１５）：５１８２−５１９１，２００７
【非特許文献１６】Ｍｕｌｄｅｒｓ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｐｏｓｔｅｒ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｅｒｌｉｎ，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１４
【非特許文献１７】Ｂｅｓｔａｓ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ７６１７５，２０１４
【非特許文献１８】Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１６（９）：１６２４−１６２９，２００８
【非特許文献１９】Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．８５：４４４−４５３，２０１０
【非特許文献２０】Ｍｏｕｌｔｏｎ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ．３５（４）：８２６−８２８，２００７
【非特許文献２１】Ｙｉｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１９（７）：１２９５−１３０３，２０１１
【非特許文献２２】Ａｂｅｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．１４：４５５−４６０，２００８
【非特許文献２３】Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．６０：５１７−５２９，２００８
【非特許文献２４】ＭｃＣｌｏｒｅｙ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１３：１３７３−１３８１，２００６
【非特許文献２５】Ａｌｔｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．１２（２）：１７５−１７７，２００６
【非特許文献２６】Ｙｏｕｎｇｂｌｏｏｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２００７，１８（１），ｐｐ  ５０−６０
【発明の概要】
【００１８】
本開示は、ＣＰＰにコンジュゲートされたアンチセンスオリゴマー部分を含むアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。一態様において、本開示は、ヒトジストロフィン遺伝子中でエクソンスキッピングを誘導するために選択された標的に結合することができる１８〜２５個のサブユニットの長さのアンチセンスオリゴマーを提供し、アンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位として指定されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３標的領域に相補的である塩基の配列を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、２０〜２３サブユニットのものである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーの塩基は、モルホリノ環構造に連結され、モルホリノ環構造は、１つの環構造のモルホリノ窒素を隣接する環構造の５’環外炭素に結合するリン含有サブユニット間リンケージによって結合される。ある特定の実施形態において、細胞膜透過性ペプチドは、６アルギニン単位（「Ｒ６」）（配列番号７１）であり、リンカー部分は、グリシンである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、配列番号１〜３５から選択される塩基の配列を含む。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、配列番号３６〜７０から選択される塩基の配列を含む。
【００２１】
別の態様において、本開示は、
ヒトジストロフィン遺伝子中でエクソンスキッピングを誘導するために選択された標的に結合することができる２０〜２３個のサブユニットの長さのアンチセンスオリゴマーを含むアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供し、アンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位として指定されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３標的領域に相補的である塩基の配列を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【００２３】
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーの塩基は、モルホリノ環構造に連結され、モルホリノ環構造は、１つの環構造のモルホリノ窒素を隣接する環構造の５’環外炭素に結合するリン含有サブユニット間リンケージによって結合される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、配列番号１〜２３および２５〜３２から選択される塩基の配列を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、配列番号３６〜５８および６０〜６７から選択される塩基の配列を含む。
【００２４】
様々な態様において、本開示は、式（Ｉ）に従い得るアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、
【化１】
2021521794.tif 000003
またはその薬学的に許容される塩を提供し、式中、
各Ｎｕが、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｔが、
【化２】
2021521794.tif 000004
から選択される部分であり、
Ｒ１が、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
標的化配列は、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である。
【００２５】
別の態様において、本開示は、式（ＩＶ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、
【化３】
2021521794.tif 000005
またはその薬学的に許容される塩を提供し、式中、
各Ｎｕが、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｔが、
【化４】
2021521794.tif 000006
から選択される部分であり、
Ｒ１が、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２が、Ｈまたはアセチルから選択され、
標的化配列は、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である。
【００２６】
別の態様において、本開示は、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートと、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体は、リン酸緩衝液を含む生理食塩水である。別の態様において、本開示は、本開示のアンチセンスオリゴマーと、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体は、リン酸緩衝液を含む生理食塩水である。
【００２７】
別の態様において、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療を必要としている対象においてそれを行うための方法を提供し、対象は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有し、方法は、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを対象に投与することを含む。本開示はまた、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療のための薬剤の製造のための本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの、それを必要としている対象における使用に取り組み、対象は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する。
【００２８】
別の態様において、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療を必要としている対象においてそれを行うための方法を提供し、対象は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有し、方法は、本開示のアンチセンスオリゴマーを対象に投与することを含む。本開示はまた、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療のための薬剤の製造のための本開示のアンチセンスオリゴマーの、それを必要としている対象における使用に取り組み、対象は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する。
【００２９】
別の態様において、本開示は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させてジストロフィン産生を誘導する方法を提供し、方法は、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを対象に投与することを含む。別の態様において、本開示は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ｍＲＮＡプロセシング中にジストロフィンプレｍＲＮＡからエクソン５３を排除する方法を提供し、方法は、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを対象に投与することを含む。別の態様において、本開示は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３を結合する方法を提供し、方法は、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを対象に投与することを含む。
【００３０】
別の態様において、本開示は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させてジストロフィン産生を誘導する方法を提供し、方法は、本開示のアンチセンスオリゴマーを対象に投与することを含む。別の態様において、本開示は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ｍＲＮＡプロセシング中にジストロフィンプレｍＲＮＡからエクソン５３を排除する方法を提供し、方法は、本開示のアンチセンスオリゴマーを対象に投与することを含む。別の態様において、本開示は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３を結合する方法を提供し、方法は、本開示のアンチセンスオリゴマーを対象に投与することを含む。
【００３１】
別の態様において、本開示は、療法で使用するための、本明細書の本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療で使用するための、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、療法で使用するための薬剤の製造で使用するための、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のための薬剤の製造で使用するための、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。
【００３２】
別の態様において、本開示は、療法で使用するための、本明細書の本開示のアンチセンスオリゴマーを提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療で使用するための、本開示のアンチセンスオリゴマーを提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、療法で使用するための薬剤の製造で使用するための、本開示のアンチセンスオリゴマーを提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のための薬剤の製造で使用するための、本開示のアンチセンスオリゴマーを提供する。
【００３３】
別の態様において、本開示はまた、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療を必要としている対象においてそれを行うためのキットも提供し、対象は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有し、キットは、少なくとも好適な容器に包装された本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートと、その使用のための説明書と、を含む。
【００３４】
別の態様において、本開示はまた、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療を必要としている対象においてそれを行うためのキットも提供し、対象は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有し、キットは、少なくとも好適な容器に包装された本開示のアンチセンスオリゴマーと、その使用のための説明書と、を含む。
【００３５】
これらおよび他の目的および特徴は、本開示の以下の詳細な説明が図面と併せて読まれると、より完全に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
本特許または出願ファイルには、カラーによる少なくとも１つの図面が含まれる。カラー図面（複数可）を伴うこの特許または特許出願公報の複写は、請求および必要な料金の支払いに応じて、特許庁により提供される。
【００３７】
【図１】正常なジストロフィンプレｍＲＮＡおよび成熟ｍＲＮＡのセクションを示す。
【図２】異常なジストロフィンプレｍＲＮＡ（ＤＭＤの例）、およびその結果生じる非機能的で不安定なジストロフィンのセクションを示す。
【図３】プレｍＲＮＡの「インフレーム」リーディングの回復である、エクソン５１をスキップするように設計されたエテプリルセンを示す。
【図４Ａ】４Ａおよび４Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した、様々な濃度での本開示のアンチセンスオリゴマーによる健康なヒトのＲＤ細胞におけるエクソン５３スキッピングの割合の棒グラフを提供する。エラーバーは、平均±ＳＤを表す。
【図４Ｂ】４Ａおよび４Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した、様々な濃度での本開示のアンチセンスオリゴマーによる健康なヒトのＲＤ細胞におけるエクソン５３スキッピングの割合の棒グラフを提供する。エラーバーは、平均±ＳＤを表す。
【図５Ａ−Ｂ】図５Ａ〜図５Ｄは、異なる時点［７日目（５Ａ）、３０日目（５Ｂ）、６０日目（５Ｃ）、および９０日目（５Ｄ）］のＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの大腿四頭筋におけるジストロフィンタンパク質を測定する、ウェスタンブロット分析の代表的画像を提供する。
【図５Ｃ−Ｄ】図５Ａ〜図５Ｄは、異なる時点［７日目（５Ａ）、３０日目（５Ｂ）、６０日目（５Ｃ）、および９０日目（５Ｄ）］のＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの大腿四頭筋におけるジストロフィンタンパク質を測定する、ウェスタンブロット分析の代表的画像を提供する。
【図６Ａ−Ｂ】図６Ａは、ウェスタンブロット分析によって決定した、注射後９０日間にわたるｍｄｘマウスの大腿四頭筋におけるＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によって誘導した野生型ジストロフィンの割合を示す線グラフである。図６Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した、注射後９０日間にわたるｍｄｘマウスの大腿四頭筋におけるＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によって誘導したエクソン２３スキッピングの割合を示す線グラフである。
【図７Ａ−Ｂ】図７Ａ〜図７Ｄは、異なる時点［７日目（７Ａ）、３０日目（７Ｂ）、６０日目（７Ｃ）、および９０日目（７Ｄ）］のＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの横隔膜におけるジストロフィンタンパク質を測定する、ウェスタンブロット分析の代表的画像を提供する。
【図７Ｃ−Ｄ】図７Ａ〜図７Ｄは、異なる時点［７日目（７Ａ）、３０日目（７Ｂ）、６０日目（７Ｃ）、および９０日目（７Ｄ）］のＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの横隔膜におけるジストロフィンタンパク質を測定する、ウェスタンブロット分析の代表的画像を提供する。
【図８Ａ−Ｂ】図８Ａは、ウェスタンブロット分析によって決定した、注射後９０日間にわたるｍｄｘマウスの横隔膜におけるＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によって誘導した野生型ジストロフィンの割合を示す線グラフである。図８Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した、注射後９０日間にわたるｍｄｘマウスの横隔膜におけるＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によって誘導したエクソン２３スキッピングの割合を示す線グラフである。
【図９Ａ−Ｂ】図９Ａ〜図９Ｄは、異なる時点［７日目（９Ａ）、３０日目（９Ｂ）、６０日目（９Ｃ）、および９０日目（９Ｄ）］のＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの心臓におけるジストロフィンタンパク質を測定する、ウェスタンブロット分析の代表的画像を提供する。
【図９Ｃ−Ｄ】図９Ａ〜図９Ｄは、異なる時点［７日目（９Ａ）、３０日目（９Ｂ）、６０日目（９Ｃ）、および９０日目（９Ｄ）］のＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの心臓におけるジストロフィンタンパク質を測定する、ウェスタンブロット分析の代表的画像を提供する。
【図１０Ａ−Ｂ】図１０Ａは、ウェスタンブロット分析によって決定した、注射後９０日間にわたるｍｄｘマウスの心臓におけるＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によって誘導した野生型ジストロフィンの割合を示す線グラフである。図１０Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した、注射後９０日間にわたるｍｄｘマウスの心臓におけるＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によって誘導したエクソン２３スキッピングの割合を示す線グラフである。
【図１１】ＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によって誘導したｍｄｘマウスの左大腿四頭筋におけるジストロフィンを示す免疫組織化学分析を提供する。
【図１２Ａ−Ｂ】異なる用量：４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、および１２０ｍｇ／ｋｇの、ＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの心臓におけるジストロフィンタンパク質を測定するウェスタンブロット分析の代表的画像である。
【図１３】異なる用量：４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、および１２０ｍｇ／ｋｇでの注射の３０日後の、ウェスタンブロット分析によって決定した、ｍｄｘマウスの心臓におけるＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によって誘導した野生型ジストロフィンの割合を示す棒グラフである。
【図１４Ａ−Ｂ】図１４Ａ〜図１４Ｂは、異なる用量：４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、および１２０ｍｇ／ｋｇの、ＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの横隔膜におけるジストロフィンタンパク質を測定するウェスタンブロット分析の代表的画像である。
【図１５】異なる用量：４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、および１２０ｍｇ／ｋｇでの注射の３０日後の、ウェスタンブロット分析によって決定した、ｍｄｘマウスの横隔膜におけるＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によって誘導した野生型ジストロフィンの割合を示す棒グラフである。
【図１６Ａ−Ｂ】図１６Ａ〜図１６Ｂは、異なる用量：４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、および１２０ｍｇ／ｋｇでの、ＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの大腿四頭筋におけるジストロフィンタンパク質を測定するウェスタンブロット分析の代表的画像である。
【図１７】異なる用量：４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、および１２０ｍｇ／ｋｇでの注射の３０日後の、ウェスタンブロット分析によって決定した、ｍｄｘマウスの大腿四頭筋におけるＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によって誘導した野生型ジストロフィンの割合を示す棒グラフである。
【図１８】ｍｄｘマウスおよび野生型マウスにおける生理食塩水と比較して、ＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によって誘導したｍｄｘマウス横隔膜および心臓におけるジストロフィンおよびラミニンを示す、免疫組織化学分析を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本開示の実施形態は、概して、改善されたアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、ならびにヒトジストロフィン遺伝子においてエクソンスキッピングを誘導するように特別に設計されたその使用方法に関する。ジストロフィンは筋機能において重要な役割を果たし、様々な筋肉関連疾患がこの遺伝子の変異型を特徴とする。したがって、ある特定の実施形態において、本明細書に記載される改善されたアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）およびベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）に見られる変異ジストロフィン遺伝子などのヒトジストロフィン遺伝子の変異型においてエクソンスキッピングを誘導する。
【００３９】
変異によって引き起こされる異常なｍＲＮＡスプライシング事象により、これらの変異ヒトジストロフィン遺伝子は、欠陥のあるジストロフィンタンパク質を発現するか、または測定可能なジストロフィンを全く発現しないかのいずれかであり、これは様々な形態の筋ジストロフィーを引き起こす状態である。この状態を治療するために、本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、変異ヒトジストロフィン遺伝子の予めプロセシングされたｍＲＮＡの選択された領域にハイブリダイズし、そうでなければ異常にスプライシングされたジストロフィンｍＲＮＡにおいてエクソンスキッピングおよび差次的スプライシングを誘導し、それにより筋細胞が、機能性ジストロフィンタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写物を産生することを可能にする。ある特定の実施形態において、結果として生じるジストロフィンタンパク質は、必ずしも「野生型」形態のジストロフィンではなく、むしろ、切断されたが機能的な形態のジストロフィンである。
【００４０】
筋細胞における機能性ジストロフィンタンパク質のレベルを高めることによって、これらおよび関連する実施形態は、筋ジストロフィー、特にＤＭＤおよびＢＭＤなどの筋ジストロフィーの形態の予防および治療に有用であり、これらは、異常なｍＲＮＡスプライシングによる欠陥のあるジストロフィンタンパク質の発現を特徴とする。本明細書に記載される特定のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、他のオリゴマーよりも改善されたジストロフィン−エクソン特異的標的化をさらに提供し、それにより、関連する形態の筋ジストロフィーを治療する代替的な方法よりも有意かつ実用的な利点を提供する。
【００４１】
したがって、本開示は、
ヒトジストロフィン遺伝子中でエクソンスキッピングを誘導するために選択された標的に結合することができる１８〜２５個のサブユニットの長さのアンチセンスオリゴマーであって、アニーリング部位として指定されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３標的領域に相補的である塩基の配列を含む、アンチセンスオリゴマーと、
リンカー部分によってアンチセンスオリゴマーにコンジュゲートされた細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）と、を含む、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートに関する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択される。
【００４３】
本開示はまた、ヒトジストロフィン遺伝子中でエクソンスキッピングを誘導するために選択された標的に結合することができる１８〜２３個のサブユニットの長さのアンチセンスオリゴマーに関し、アンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位として指定されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３標的領域に相補的である塩基の配列を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【００４５】
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーの塩基は、モルホリノ環構造に連結され、モルホリノ環構造は、１つの環構造のモルホリノ窒素を隣接する環構造の５’環外炭素に結合するリン含有サブユニット間リンケージによって結合される。ある特定の実施形態において、細胞膜透過性ペプチドは、Ｒ６（配列番号７１）であり、リンカー部分は、グリシンである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、配列番号１として指定される塩基の配列を含み、ここで、各チミン塩基（Ｔ）は、任意にウラシル塩基（Ｕ）である。
【００４６】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が、本開示の実施または試験で使用され得るが、好ましい方法および材料が説明される。本開示の目的のために、以下の用語が以下に定義される。
【００４７】
Ｉ．定義
「約」とは、基準の数量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％ほどまで変化する数量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さを意味する。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、別段の定めがない限り、飽和直鎖または分岐炭化水素を指す。ある特定の実施形態において、アルキル基は、第一級、第二級、または第三級炭化水素である。ある特定の実施形態において、アルキル基は、１〜１０個の炭素原子、すなわち、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルを含む。ある特定の実施形態において、アルキル基は、１〜６個の炭素原子、すなわち、Ｃ１〜Ｃ６アルキルを含む。ある特定の実施形態において、アルキル基は、メチル、ＣＦ３、ＣＣｌ３、ＣＦＣｌ２、ＣＦ２Ｃｌ、エチル、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ３、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、および２，３−ジメチルブチルからなる群から選択される。この用語は、ハロゲン化アルキル基を含む、置換アルキル基および非置換アルキル基の両方を含む。ある特定の実施形態において、アルキル基は、フッ素化アルキル基である。アルキル基が置換され得る部分の非限定的な例は、当業者に既知のように、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＧｒｅｅｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１で教示されるように、保護されていないか、または必要に応じて保護されているかのいずれかの、ハロゲン（フルオロ、クロロ、ブロモ、もしくはヨード）、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、硫酸塩、ホスホン酸、リン酸塩、またはホスホン酸塩からなる群から選択される。
【００４９】
「エクソン５３スキッピングに適している」とは、対象または患者に関して本明細書で使用される場合、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３のスキッピングがないと、リーディングフレームをアウトオブフレームにし、それによりプレｍＲＮＡの翻訳を妨げ、対象または患者が機能性または半機能性ジストロフィンを産生することをできなくさせる、ジストロフィン遺伝子の１つ以上の変異を有する対象および患者を含むことが意図される。エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異の例としては、例えば、エクソン４２〜５２、エクソン４５〜５２、エクソン４７〜５２、エクソン４８〜５２、エクソン４９〜５２、エクソン５０〜５２、またはエクソン５２の欠失が挙げられる。患者がエクソンスキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有するかどうかを判定することは、十分に当業者の範囲内である（例えば、Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．３０：２９３−２９９、Ｇｕｒｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．２００９；３０（４）６３３−６４０、およびＦｌｅｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８（６）１２１８−１２２３を参照）。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「オリゴマー」という用語は、サブユニット間リンケージによって結合されるサブユニットの配列を指す。ある特定の例において、「オリゴマー」という用語は、「アンチセンスオリゴマー」に関連して使用される。「アンチセンスオリゴマー」について、各サブユニットは、（ｉ）リボース糖またはその誘導体、および（ｉｉ）それらに結合した核酸塩基からなり、これにより、塩基対合部分の順序は、サブユニット、サブユニット間リンケージ、または両方のいずれかが自然発生的ではないという条件で、標的配列内で核酸：オリゴマーヘテロ二本鎖を形成するために、ワトソン−クリック塩基対合によって核酸（典型的にはＲＮＡ）中の標的配列に相補的である塩基配列を形成する。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴマーはＰＭＯである。他の実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートである。他の実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、または２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）などの架橋核酸（ＢＮＡ）である。追加の例示的な実施形態は、本明細書に記載される。
【００５１】
「相補的な」および「相補性」という用語は、ワトソン−クリック塩基対ルールによって互いに関連する２つ以上のオリゴマー（すなわち、各々が核酸塩基配列を含む）を指す。例えば、核酸塩基配列「Ｔ−Ｇ−Ａ（５’→３’）」は、核酸塩基配列「Ａ−Ｃ−Ｔ（３’→５’）」に相補的である。相補性は、「部分的」であってもよく、所与の核酸塩基配列の全てには満たない核酸塩基が、塩基対合ルールに従って他の核酸塩基配列にマッチされる。例えば、いくつかの実施形態において、所与の核酸塩基配列と別の核酸塩基配列との間の相補性は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％であってもよい。または例を続けると、所与の核酸塩基配列と別の核酸塩基配列との間に「完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）」または「完全（ｐｅｒｆｅｃｔ）」（１００％）な相補性が存在してもよい。核酸塩基配列間の相補性の程度は、配列間のハイブリダイゼーションの効率および強度に有意な影響を与える。
【００５２】
「有効量」および「治療有効量」という用語は、本明細書において互換的に使用され、所望の治療効果をもたらすのに有効である、単回投与または連続投与のうちの一部のいずれかとして、哺乳動物対象に投与される、アンチセンスオリゴマーなどの治療化合物の量を指す。アンチセンスオリゴマーについて、この効果は典型的には、選択された標的配列の翻訳または天然のスプライスプロセシングを阻害することによって、または臨床的に有意な量のジストロフィン（統計的有意性）を産生することによってもたらされる。
【００５３】
いくつかの実施形態において、有効量は、対象を治療するための期間にわたって、アンチセンスオリゴマーを含む少なくとも１０ｍｇ／ｋｇまたは少なくとも２０ｍｇ／ｋｇの組成物である。いくつかの実施形態において、有効量は、対象におけるジストロフィン陽性線維の数を正常の少なくとも２０％に増加させるために、アンチセンスオリゴマーを含む少なくとも２０ｍｇ／ｋｇの組成物である。ある特定の実施形態において、有効量は、例えば、健康な同等者と比較して患者において、例えば６ＭＷＴで２０％の不足から歩行距離を安定化、維持、または改善するために、アンチセンスオリゴマーを含む１０ｍｇ／ｋｇまたは少なくとも少なくとも様々な実施形態において、標的化配列は、アニーリング２０ｍｇ／ｋｇの組成物である。様々な実施形態において、有効量は、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、または約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、有効量は、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、または約５０ｍｇ／ｋｇである。別の態様において、有効量は、少なくとも２４週間、少なくとも３６週間、または少なくとも４８週間にわたって、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、または約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇであり、それにより、対象におけるジストロフィン陽性線維の数を正常の少なくとも２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％に増加させ、健康な同等者と比較して患者において、例えば６ＭＷＴで２０％の不足から歩行距離を安定化または改善する。いくつかの実施形態において、治療は、患者においてジストロフィン陽性線維の数を正常の２０〜６０％または３０〜５０％に増加させる。
【００５４】
「増強する」もしくは「増強すること」、または「増加させる」もしくは「増加させること」、または「刺激する」もしくは「刺激すること」とは概して、上記のいずれかのアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは医薬組成物が、アンチセンスオリゴマーなし、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートなし、または対照化合物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、細胞または対象においてより大きい生理学的応答（すなわち、下流効果）をもたらすまたは引き起こす能力を指す。より大きい生理学的応答は、当該技術分野における理解および本明細書の記載から明らかな応答の中でも特に、ジストロフィンタンパク質の機能的形態の発現の増加、または筋組織におけるジストロフィン関連生物活性の増加を含み得る。筋機能の増加も測定され得、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％までの筋機能の増加または改善を含む。機能性ジストロフィンを発現させる筋線維の割合も測定され得、筋線維の約１％、２％、５％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のジストロフィン発現の増加を含む。例えば、２５〜３０％の線維がジストロフィンを発現させる場合、約４０％の筋機能の改善が起こり得ることが示されている（例えば、ＤｅｌｌｏＲｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１２９７９−１２９８４，２００２を参照）。「増加した」または「増強された」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、薬剤の非存在（アンチセンスオリゴマーもしくはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートなし）または対照化合物によって産生される量の１．１、１．２、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０倍以上（例えば、５００、１０００倍、それらの間の、かつ１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）である増加を含み得る。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「機能」および「機能性」などという用語は、生物学的、酵素的、または治療的機能を指す。
【００５６】
「機能性」ジストロフィンタンパク質とは概して、典型的には、ＤＭＤまたはＢＭＤを有する特定の対象に存在するジストロフィンタンパク質の「改変」型または「欠損」型と比較して、そうでなければ筋ジストロフィーに特徴的である筋組織の進行性分解を低減するのに十分な生物学的活性を有するジストロフィンタンパク質を指す。ある特定の実施形態において、機能性ジストロフィンタンパク質は、当該技術分野の通常の技術に従って測定されるように、野生型ジストロフィンのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの生物学的活性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％（それらの間の全ての整数を含む）を有し得る。一例として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの筋培養におけるジストロフィン関連活性は、筋管サイズ、筋原線維の組織化（または崩壊）、収縮活性、およびアセチルコリンアクセプターの自発的クラスター化に従って測定され得る（例えば、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．１１２：２０９−２１６，１９９９を参照）。また、動物モデルは、疾患の病因を研究するための貴重なリソースであり、ジストロフィン関連活性を試験するための手段を提供する。ＤＭＤ研究に最も広く使用されている動物モデルのうちの２つは、ｍｄｘマウスおよびゴールデンレトリバー筋ジストロフィー（ＧＲＭＤ）犬であり、両方ともジストロフィン陰性である（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＆  Ｍｏｒｇａｎ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ  ８４：１６５−１７２，２００３を参照）。これらおよび他の動物モデルが使用されて、様々なジストロフィンタンパク質の機能活性を測定することができる。本開示の特定のエクソンスキッピングアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの投与後に産生される形態などの、切断型ジストロフィンが含まれる。
【００５７】
「ミスマッチ」（複数可）という用語は、塩基対合ルールに従って標的プレｍＲＮＡにマッチしないオリゴマー核酸塩基配列中の１つ以上の核酸塩基（連続的であるか分離しているかにかかわらず）を指す。多くの場合、完全相補性が望ましいが、いくつかの実施形態は、標的プレｍＲＮＡに対して１つ以上、好ましくは６、５、４、３、２、または１つのミスマッチを含み得る。オリゴマー内の任意の位置における変動が含まれる。ある特定の実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、内部の末端変動付近の核酸塩基配列の変動を含み、存在する場合、典型的には、５’および／または３’末端の約６、５、４、３、２、または１個のサブユニット以内にある。
【００５８】
「モルホリノ」、「モルホリノオリゴマー」、および「ＰＭＯ」という用語は、以下の一般構造：
【化５】
2021521794.tif 000007
の、かつＳｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７：１８７−１９５（１９９７）の図２に記載されるような、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーを指す。本明細書に記載されるモルホリノは、上記の一般構造の全ての立体異性体および互変異性体を含む。モルホリノオリゴマーの合成、構造、および結合特性は、米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号、同第５，５０６，３３７号、同第８，０７６，４７６号、および同第８，２９９，２０６号に詳述されており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００５９】
ある特定の実施形態において、モルホリノは、オリゴマーの５’または３’末端で「テール」部分とコンジュゲートされて、その安定性および／または溶解性を高める。例示的なテールは、以下を含む。
【化６】
2021521794.tif 000008
【００６０】
上記の例示的なテール部分のうち、「ＴＥＧ」または「ＥＧ３」は、以下のテール部分を指す。
【化７】
2021521794.tif 000009
【００６１】
上記の例示的なテール部分のうち、「ＧＴ」は、以下のテール部分を指す。
【化８】
2021521794.tif 000010
【００６２】
本明細書で使用される場合、「−Ｇ−Ｒ６」（配列番号７２）および「−Ｇ−Ｒ６−Ａｃ」（配列番号７２）という用語は、互換的に使用され、本開示のアンチセンスオリゴマーにコンジュゲートされたペプチド部分を指す。様々な実施形態において、「Ｇ」は、アミド結合によって「Ｒ６」（配列番号７１）にコンジュゲートされたグリシン残基を表し、各「Ｒ」は、アミド結合によって一緒にコンジュゲートされたアルギニン残基を表し、これにより「Ｒ６」は、アミド結合によって一緒にコンジュゲートされた６個のアルギニン残基（配列番号７１）を意味する。アルギニン残基は、任意の立体配置を有することができ、例えば、アルギニン残基は、Ｌ−アルギニン残基、Ｄ−アルギニン残基、またはＤ−アルギニン残基とＬ−アルギニン残基の混合物であり得る。ある特定の実施形態において、「−Ｇ−Ｒ６」（配列番号７２）または「−Ｇ−Ｒ６−Ａｃ」（配列番号７２）は、本開示のＰＭＯアンチセンスオリゴマーの最も３’のモルホリノサブユニットのモルホリン環窒素にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、「−Ｇ−Ｒ６」（配列番号７２）または「−Ｇ−Ｒ６−Ａｃ」（配列番号７２）は、本開示のアンチセンスオリゴマーの３’末端にコンジュゲートされ、以下の式を有する。
【化９−１】
2021521794.tif 000011
【化９−２】
2021521794.tif 000012
【００６３】
「核酸塩基」（Ｎｕ）、「塩基対合部分」、または「塩基」という用語は、自然発生または「天然」ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、およびグアニン）で見られるプリンまたはピリミジン塩基、ならびにこれらの自然発生的プリンおよびピリミジンの類似体を指すために互換的に使用される。これらの類似体は、結合親和性などの改善された特性をオリゴマーに与えることができる。例示的な類似体としては、ヒポキサンチン（イノシンの塩基構成成分）、２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、Ｃ５−プロピニル修飾ピリミジン、１０−（９−（アミノエトキシ）フェノキサジニル）（Ｇ−クランプ）などが挙げられる。
【００６４】
塩基対合部分のさらなる例としては、ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、グアニン、およびヒポキサンチン（イノシン）（アシル保護基によって保護されたそれらのそれぞれアミノ基を有する）、２−フルオロウラシル、２−フルオロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、２，６−ジアミノプリン、アザシトシン、偽イソシトシンおよび偽ウラシルなどのピリミジン類似体、ならびに８−置換プリン、キサンチン、またはヒポキサンチン（後者の２つは自然分解生成物である）などの他の修飾核酸塩基が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃｈｉｕ  ａｎｄ  Ｒａｎａ，  ＲＮＡ，２００３，９，１０３４−１０４８；Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２２，２１８３−２１９６、およびＲｅｖａｎｋａｒ  ａｎｄ  Ｒａｏ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．７，３１３に開示される修飾核酸塩基もまた企図され、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６５】
塩基対合部分のさらなる例としては、１つ以上のベンゼン環が付加された拡大サイズの核酸塩基が挙げられるが、これらに限定されない。Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ（ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）、Ｋｒｕｅｇｅｒ  ＡＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００７，４０，１４１−１５０、Ｋｏｏｌ，ＥＴ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００２，３５，９３６−９４３、Ｂｅｎｎｅｒ  Ｓ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２００５，６，５５３−５４３、Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００３，７，７２３−７３３、およびＨｉｒａｏ，Ｉ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００６，１０，６２２−６２７（それらの内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載される核酸塩基置き換えは、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートにおいて有用であると考えられる。拡大サイズの核酸塩基の例としては、以下に示されるもの、ならびにその互変異性体が挙げられる。
【化１０】
2021521794.tif 000013
【００６６】
本明細書で使用される場合、「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、通常は注射による、腸内および局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、および胸骨内の注射および注入を含むが、これらに限定されない。
【００６７】
本明細書で使用される場合、構造式内で使用される一組の括弧は、括弧間の構造特徴が繰り返されることを示す。いくつかの実施形態において、使用される括弧は、「［」および「］」であり得、ある特定の実施形態において、繰り返す構造特徴を示すために使用される括弧は、「（」および「）」であり得る。いくつかの実施形態において、括弧間の構造特徴の繰り返し反復数は、括弧の外側に示される数、例えば、２、３、４、５、６、７などである。様々な実施形態において、括弧間の構造特徴の繰り返し反復数は、「Ｚ」などの括弧の外側に示される変数によって示される。
【００６８】
本明細書で使用される場合、構造式内のキラル炭素またはリン原子に引き寄せられた直鎖結合または曲がりくねった（ｓｑｕｉｇｇｌｙ）結合は、キラル炭素またはリンの立体化学が未定義であり、キラル中心の全ての形態を含むことが意図されていることを示す。そのような図の例が以下に示される。
【化１１】
2021521794.tif 000014
【００６９】
「薬学的に許容される」という語句は、物質または組成物が、製剤を含む他の成分ならびに／または治療される対象と化学的および／もしくは毒性学的に適合性がなければならないことを意味する。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という語句は、非毒性、不活性固体、半固体もしくは液体充填剤、希釈剤、封入材料、または任意のタイプの製剤補助剤を意味する。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの例としては、製剤者の判断に従って、糖類、例えば、ラクトース、グルコース、スクロース；デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルナトリウムセルロース、エチルセルロース、および酢酸セルロース；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐剤ワックス；油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油；グリコール、例えば、プロピレングリコールエステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギニン酸；発熱性物質除去蒸留水；等張生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；非毒性適合性潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム；着色剤；離型剤；コーティング剤；甘味剤；香味剤；芳香剤；防腐剤；および酸化防止剤がある。
【００７１】
ジストロフィン合成または産生に関する「回復」という用語は、概して、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを用いた治療後の筋ジストロフィー患者における、切断型ジストロフィンを含むジストロフィンタンパク質の産生を指す。いくつかの実施形態において、治療は、患者における新規のジストロフィン産生の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％（それらの間の全ての整数を含む）の増加をもたらす。いくつかの実施形態において、治療は、対象においてジストロフィン陽性線維の数を正常の少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％〜１００％に増加させる。他の実施形態において、治療は、対象においてジストロフィン陽性線維の数を正常の約２０％〜約６０％または約３０％〜約５０％に増加させる。治療後の患者のジストロフィン陽性線維の割合は、既知の技術を使用して筋生検によって決定され得る。例えば、筋生検は、患者の上腕二頭筋などの好適な筋肉から採取され得る。
【００７２】
陽性ジストロフィン線維の割合の分析は、治療前および／もしくは治療後、または治療過程全体を通した時点において実施され得る。いくつかの実施形態において、治療後生検は、治療前生検と対側の筋肉から採取される。治療前および治療後のジストロフィン発現分析は、好適なジストロフィンアッセイを使用して実施され得る。いくつかの実施形態において、免疫組織化学的検出は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などのジストロフィンのマーカーである抗体を使用して、筋生検からの組織切片上で実施される。例えば、ジストロフィンの高感度マーカーであるＭＡＮＤＹＳ１０６抗体が使用され得る。任意の好適な二次抗体が使用されてもよい。
【００７３】
いくつかの実施形態において、ジストロフィン陽性線維の割合は、陽性線維の数をカウントした総線維数で割ることによって計算される。正常な筋肉試料は、１００％ジストロフィン陽性の線維を有する。したがって、ジストロフィン陽性線維の割合は、正常の割合として表され得る。治療前の筋肉ならびに復帰突然変異線維におけるジストロフィンの微量レベルの存在を制御するために、治療後の筋肉におけるジストロフィン陽性線維をカウントする際に、患者からの治療前の筋肉切片を使用してベースラインが設定され得る。これは、その患者の治療後の筋肉切片におけるジストロフィン陽性線維をカウントするための閾値として使用され得る。他の実施形態において、抗体で染色された組織切片は、Ｂｉｏｑｕａｎｔ画像分析ソフトウェア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）を使用したジストロフィン定量化にも使用され得る。ジストロフィン蛍光シグナルの総強度は、正常の割合として報告され得る。また、モノクローナルまたはポリクローナル抗ジストロフィン抗体を用いたウェスタンブロット分析を使用して、ジストロフィン陽性線維の割合を決定することができる。例えば、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの抗ジストロフィン抗体ＮＣＬ−Ｄｙｓ１が使用され得る。また、ジストロフィン陽性線維の割合は、サルコグリカン複合体（β，γ）および／または神経ＮＯＳの構成成分の発現を決定することによっても分析され得る。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを用いた治療は、治療なしで予想されるＤＭＤ患者における進行性呼吸筋機能障害および／または不全を遅らせるか、または低減する。いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを用いた治療は、治療なしで予想される換気補助の必要性を低減または排除し得る。いくつかの実施形態において、疾患の経過を追跡するための呼吸機能の測定、ならびに可能性のある治療介入の評価には、最大吸気圧（ＭＩＰ）、最大呼気圧（ＭＥＰ）、および努力肺活量（ＦＶＣ）が含まれる。ＭＩＰおよびＭＥＰは、吸入および呼気中に人が発生させることができる圧力レベルをそれぞれ測定し、呼吸筋力の感度尺度である。ＭＩＰは、横隔膜の筋力低下の尺度である。
【００７５】
いくつかの実施形態において、ＭＩＰおよびＦＶＣを含む他の肺機能検査における変化の前に、ＭＥＰは低下し得る。ある特定の実施形態において、ＭＥＰは、呼吸機能障害の早期指標であり得る。ある特定の実施形態において、ＦＶＣは、最大吸気後の強制呼気中に排出される空気の総体積を測定するために使用され得る。ＤＭＤ患者では、ＦＶＣは、１０代前半まで身体的成長と同時に増加する。しかしながら、成長が病気の進行によって遅くなるまたは不良になり、筋力低下が進行すると、肺活量は下降期に入り、１０〜１２歳の後、年間約８〜８．５パーセントの平均速度で低下する。ある特定の実施形態において、予測ＭＩＰパーセント（ＭＩＰは体重で調整）、予測ＭＥＰパーセント（ＭＥＰは年齢で調整）、および予測ＦＶＣパーセント（ＦＶＣは年齢および身長で調整）は、支持的分析である。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、ＤＭＤもしくはＢＭＤ、またはこれらの状態に関連する症状のいずれか（例えば、筋線維の消失）を有する、またはそのリスクがある対象（または患者）など、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートで治療され得る症状を示す、または症状を示すリスクがある任意の動物を含む。好適な対象（または患者）には、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど）、家畜、および家庭用動物またはペット（ネコまたはイヌなど）が含まれる。非ヒト霊長類、および好ましくはヒト患者（または対象）が含まれる。また、エクソン５１スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象（または患者）において、ジストロフィンを産生する方法も含まれる。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」、および「末梢に投与される」という語句は、化合物、薬物、またはそれ以外の他の物質の中枢神経系への直接の投与を意味し、これにより患者の系内に入り、したがって代謝および例えば、皮下投与などの他の類似のプロセスの対象となる。
【００７８】
「標的化配列」という語句は、標的プレｍＲＮＡ中のヌクレオチドの配列に相補的であるオリゴマーの核酸塩基の配列を指す。本開示のいくつかにおいて、標的プレｍＲＮＡにおけるヌクレオチドの配列は、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位である。
【００７９】
本開示のいくつかにおいて、標的プレｍＲＮＡにおけるヌクレオチドの配列は、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位である。
【００８０】
対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）または細胞の「治療」は、対象または細胞の自然経過を変化させる試みにおいて使用される任意のタイプの介入である。治療は、限定するものではないが、オリゴマーまたはその医薬組成物の投与を含み、予防的に、または病理学的事象の開始もしくは病原体との接触の後のいずれかに実施され得る。治療は、ジストロフィンタンパク質に関連した疾患または状態の症状または病理に対する任意の望ましい効果を含み、例えば、治療される疾患または状態の１つ以上の測定可能なマーカーの最小限の変化または改善を含み得る。また、治療される疾患または状態の進行速度を低下させ、その疾患または状態の発症を遅延させる、またはその発症の重症度を低減することを対象とし得る「予防的」治療も含まれる。「治療」または「予防」は、必ずしも疾患もしくは状態またはその随伴症状の完全な根絶、治癒、または予防を示すものではない。
【００８１】
いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを用いた治療は、治療なしで予想され得る、新規のジストロフィン産生を増加させ、疾患進行を遅延させ、歩行不能を遅らせるかもしくは低減し、筋肉の炎症を低減し、筋肉損傷を低減し、筋機能を改善し、肺機能の喪失を低減し、かつ／または筋肉再生を増強する。いくつかの実施形態において、治療は、疾患進行を維持するか、遅延させるか、または遅らせる。いくつかの実施形態において、治療は、歩行を維持するか、または歩行不能を低減する。いくつかの実施形態において、治療は、肺機能を維持するか、または肺機能の喪失を低減する。いくつかの実施形態において、治療は、例えば、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）によって測定されるように、患者の安定した歩行距離を維持するか、または増加させる。いくつかの実施形態において、治療は、１０メートルを歩行／走行する時間（すなわち、１０メートル歩行／走行試験）を維持するか、または減少させる。いくつかの実施形態において、治療は、仰臥位から立ち上がるまでの時間（すなわち、起立時間試験）を維持するか、または低減する。いくつかの実施形態において、治療は、４つの標準階段を上る時間（４階段上昇試験）を維持するか、または低減する。いくつかの実施形態において、治療は、例えば、ＭＲＩ（例えば、脚筋のＭＲＩ）によって測定されるように、患者における筋肉の炎症を維持するか、または低減する。いくつかの実施形態において、ＭＲＩは、Ｔ２および／または脂肪画分を測定して、筋変性を特定する。ＭＲＩは、炎症、浮腫、筋肉損傷、および脂肪浸潤によって引き起こされる筋肉の構造および組成の変化を特定することができる。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを用いた治療は、新規のジストロフィン産生を増加させ、治療なしで予測される歩行不能を遅らせるか、または低減する。例えば、治療は、対象における歩行能力（例えば、歩行の安定化）を安定化するか、維持するか、改善するか、または増加させ得る。いくつかの実施形態において、治療は、例えば、ＭｃＤｏｎａｌｄら（Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ，２０１０；４２：９６６−７４（参照により本明細書に組み込まれる））によって記載される６分間歩行試験（６ＭＷＴ）によって測定されるように、患者の安定した歩行距離を維持するか、または増加させる。６分間歩行距離（６ＭＷＤ）の変化は、絶対値、変化率、または％予測値の変化として表され得る。いくつかの実施形態において、治療は、健康な同等者と比較して、対象における２０％の不足から６ＭＷＴで安定した歩行距離を維持または改善する。健康な同等者の典型的なパフォーマンスと比較した６ＭＷＴにおけるＤＭＤ患者のパフォーマンスは、％予測値を計算することによって決定され得る。例えば、％予測された６ＭＷＤは、男性について以下の方程式を使用して計算され得る：１９６．７２＋（３９．８１×年齢）−（１．３６×年齢２）＋（１３２．２８×身長（メートル））。女性の場合、％予測された６ＭＷＤは、以下の方程式を使用して計算され得る：１８８．６１＋（５１．５０×年齢）−（１．８６×年齢２）＋（８６．１０×身長（メートル））（Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｃｕｒｒ．，２０１２，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２（参照により本明細書に組み込まれる））。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーを用いた治療は、患者における安定した歩行距離を、ベースラインから３、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、または５０メートル超まで増加させる（それらの間の全ての整数を含む）。
【００８３】
ＤＭＤ患者の筋機能の喪失は、正常な小児の成長および発達の背景に対して起こり得る。実際に、ＤＭＤを有する小児は、進行性筋肉障害にもかかわらず、約１年の間に６ＭＷＴ中の歩行距離の増加を示し得る。いくつかの実施形態において、ＤＭＤ患者からの６ＭＷＤは、定型発達の対照対象、ならびに年齢および性別が一致した対象からの既存の標準データと比較される。いくつかの実施形態において、正常な成長および発達は、標準データにフィッティングされた年齢および身長に基づく方程式を使用して説明され得る。そのような方程式を使用して、ＤＭＤ患者において６ＭＷＤをパーセント予測（％予測）値に変換することができる。ある特定の実施形態において、％予測６ＭＷＤデータの分析は、正常な成長および発達を説明する方法を表し、若年齢（例えば、７歳以下）における機能の増加が、ＤＭＤ患者における能力の改善ではなく安定を表すことを示し得る（Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｃｕｒｒ．，２０１２，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２（参照により本明細書に組み込まれる））。
【００８４】
異なるアンチセンス分子を区別するために、アンチセンス分子の命名法システムが提案および公開された（Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｅｄ  ４，６４４−６５４を参照）。この命名法は、以下に示されるように、全てが同じ標的領域に向けられたいくつかのわずかに異なるアンチセンス分子を試験するときに特に重要であった：
Ｈ＃Ａ／Ｄ（ｘ：ｙ）
最初の文字は、種を示す（例えば、Ｈ：ヒト、Ｍ：マウス、Ｃ：イヌ）。「＃」は、標的ジストロフィンエクソン番号を示す。「Ａ／Ｄ」は、それぞれエクソンの始点および終点におけるアクセプターまたはドナースプライス部位を示す。（ｘ  ｙ）は、アニーリング座標を表し、「−」または「＋」は、それぞれイントロンまたはエクソン配列を示す。例えば、Ａ（−６＋１８）は、標的エクソンの前にあるイントロンの最後の６塩基、および標的エクソンの最初の１８塩基を示す。最も近いスプライス部位がアクセプターになるため、これらの座標の前に「Ａ」が付く。ドナースプライス部位におけるアニーリング座標の記載は、Ｄ（＋２−１８）であり得、最後の２エクソン塩基および最初の１８イントロン塩基が、アンチセンス分子のアニーリング部位に対応する。エクソンアニーリング座標全体は、Ａ（＋６５＋８５）、つまり、そのエクソンの始点から６５番目と８５番目との間のヌクレオチドの間の部位によって表される。
【００８５】
ＩＩ．アンチセンスオリゴマー
Ａ．エクソン５３スキッピングを誘導するように設計されたアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲート
ある特定の実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、ジストロフィン遺伝子のエクソン５３標的領域に相補的であり、エクソン５３のスキッピングを誘導する。特に、本開示は、アニーリング部位として指定されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３標的領域に相補的なアンチセンスオリゴマーコンジュゲートに関する。いくつかの実施形態では、アニーリング部位は、本明細書に記載されるものである。
【００８６】
本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、ジストロフィンプレｍＲＮＡを標的とし、エクソン５３のスキッピングを誘導するため、成熟したスプライシングされたｍＲＮＡ転写物から除外またはスキップされる。エクソン５３をスキッピングすることによって、破壊されたリーディングフレームは、インフレーム変異に回復される。ＤＭＤは様々な遺伝的サブタイプからなるが、本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３をスキッピングするように特別に設計された。エクソン５３のスキッピングに適しているＤＭＤ変異は、ＤＭＤ患者のサブグループ（８％）を含む。
【００８７】
エクソン５３のスキッピングを誘導するアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの核酸塩基配列は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３内の特定の標的配列に相補的であるように設計されている。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートのアンチセンスオリゴマーは、ＰＭＯであり、ＰＭＯの各モルホリノ環は、例えば、ＤＮＡ（アデニン、シトシン、グアニン、およびチミン）中に見られる核酸塩基を含む核酸塩基に連結される。
【００８８】
Ｂ．オリゴマー化学物質の特徴     
本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、様々なアンチセンスオリゴマー化学物質を用いることができる。オリゴマー化学物質の例としては、モルホリノオリゴマー、ホスホロチオエート修飾オリゴマー、２’−Ｏ−メチル修飾オリゴマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエートオリゴマー、２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾オリゴマー、２’−フルオロ修飾オリゴマー、２’−Ｏ，４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、トリシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡホスホロチオエートサブユニット、２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］修飾オリゴマー（上記のいずれかの組み合わせを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロチオエートおよび２’−Ｏ−Ｍｅ修飾化学物質を組み合わせて、２’−Ｏ−Ｍｅ−ホスホロチオエート骨格を生成することができる。例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ／２０１３／１１２０５３号および同第ＷＯ／２００９／００８７２５号を参照されたい。本開示のオリゴマー化学物質の例示的な実施形態が以下にさらに記載される。
【００８９】
１．ペプチド核酸（ＰＮＡ）
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、骨格がデオキシリボース骨格と構造的に同形であり、ピリミジンまたはプリン塩基が結合するＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位からなる、ＤＮＡの類似体である。天然ピリミジンおよびプリン塩基を含有するＰＮＡは、ワトソン−クリック塩基対合ルールに従い相補的なオリゴマーにハイブリダイズし、塩基対認識の点でＤＮＡを模倣する（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｂｕｃｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。ＰＮＡの骨格は、ホスホジエステル結合ではなくペプチド結合によって形成され、アンチセンス用途（以下の構造を参照）によく適したものになる。骨格は非荷電性であり、通常を超える熱安定性を示すＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ／ＲＮＡ二本鎖をもたらす。ＰＮＡは、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼによって認識されない。ＰＮＡの非限定的な例が以下に示される。
【化１２】
2021521794.tif 000015
【００９０】
自然構造に対する根本的構造変化にもかかわらず、ＰＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡへのヘリックス形態での配列特異的結合能力が可能である。ＰＮＡの特徴には、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡに対する高い結合親和性、単一塩基ミスマッチによって引き起こされる不安定化作用、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼに対する耐性、塩濃度に依存しないＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーション、およびホモプリンＤＮＡとの三重鎖形成が含まれる。ＰＡＮＡＧＥＮＥ（商標）は、その独自のＢｔｓ  ＰＮＡモノマー（Ｂｔｓ；ベンゾチアゾール−２−スルホニル基）および独自のオリゴマー化プロセスを開発してきた。Ｂｔｓ  ＰＮＡモノマーを使用したＰＮＡオリゴマー化は、脱保護、カップリング、およびキャッピングの反復サイクルから構成される。ＰＮＡは、当該技術分野において既知の任意の技術を使用して合成的に産生され得る。例えば、米国特許第６，９６９，７６６号、同第７，２１１，６６８号、同第７，０２２，８５１号、同第７，１２５，９９４号、同第７，１４５，００６号、および同第７，１７９，８９６号を参照されたい。また、ＰＮＡの調製について、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、および同第５，７１９，２６２も参照されたい。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７−１５００，１９９１で見ることができる。上記の各々は、その全体が参照により組み込まれる。
【００９１】
２．ロックド核酸（ＬＮＡ）
アンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートはまた、「ロックド核酸」サブユニット（ＬＮＡ）を含有してもよい。「ＬＮＡ」は、架橋核酸（ＢＮＡ）と呼ばれる修飾のクラスのメンバーである。ＢＮＡは、リボース環の立体構造をＣ３０−エンド（ノーザン）糖パッカーにロックする共有結合を特徴とする。ＬＮＡの場合、架橋は、２’−Ｏ位置と４’−Ｃ位置との間のメチレンから構成される。ＬＮＡは、骨格の事前組織化および塩基スタッキングを増強して、ハイブリダイゼーションおよび熱安定性を高める。
【００９２】
ＬＮＡの構造は、例えば、Ｗｅｎｇｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９８）４５５、Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９８）５４：３６０７、Ｊｅｓｐｅｒ  Ｗｅｎｇｅｌ，Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９）３２：３０１、Ｏｂｉｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９７）３８：８７３５、Ｏｂｉｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９８）３９：５４０１、およびＯｂｉｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８）１６：９２３０で見ることができ、それらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ＬＮＡの非限定的な例が以下に示される。
【化１３】
2021521794.tif 000016
【００９３】
本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１つ以上のＬＮＡを組み込み得る。場合によっては、アンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、ＬＮＡから完全に構成されてもよい。個々のＬＮＡヌクレオシドサブユニットの合成およびそれらのオリゴマーへの組み込みのための方法は、例えば、米国特許第７，５７２，５８２号、同第７，５６９，５７５号、同第７，０８４，１２５号、同第７，０６０，８０９号、同第７，０５３，２０７号、同第７，０３４，１３３号、同第６，７９４，４９９号、および同第６，６７０，４６１号に記載され、それらの各々は、参照によりその全体が組み込まれる。典型的なサブユニット間リンカーとしては、ホスホジエステル部分およびホスホロチオエート部分が挙げられる。あるいは、非リン含有リンカーが用いられてもよい。さらなる実施形態は、ＬＮＡ含有アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを含み、各ＬＮＡサブユニットは、ＤＮＡサブユニットによって分離される。ある特定のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、交互のＬＮＡおよびＤＮＡサブユニットから構成され、サブユニット間リンカーは、ホスホロチオエートである。
【００９４】
２’Ｏ，４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）は、ＢＮＡのクラスの別のメンバーである。非限定的な例が以下に示される。
【化１４】
2021521794.tif 000017
【００９５】
ＥＮＡオリゴマーおよびその調製は、Ｏｂｉｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ（１９９７）３８（５０）：８７３５に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１つ以上のＥＮＡサブユニットを組み込み得る。
【００９６】
３．アンロックド核酸（ＵＮＡ）
アンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートはまた、「アンロックド核酸」（ＵＮＡ）サブユニットを含有してもよい。ＵＮＡおよびＵＮＡオリゴマーは、サブユニットのＣ２’−Ｃ３’結合が切断されたＲＮＡの類似体である。ＬＮＡは、（ＤＮＡおよびＲＮＡに対して）立体構造的に制限されるが、ＵＮＡは非常に柔軟である。ＵＮＡは、例えば、ＷＯ２０１６／０７０１６６に開示されている。ＵＮＡの非限定的な例が以下に示される。
【化１５】
2021521794.tif 000018
【００９７】
典型的なサブユニット間リンカーとしては、ホスホジエステル部分およびホスホロチオエート部分が挙げられる。あるいは、非リン含有リンカーが用いられてもよい。
【００９８】
４．ホスホロチオエート
「ホスホロチオエート」（またはＳ−オリゴ）は、正常なＤＮＡのバリアントであり、非架橋酸素のうちの１つが硫黄によって置き換えられる。ホスホロチオエートの非限定的な例が以下に示される。
【化１６】
2021521794.tif 000019
【００９９】
ヌクレオチド間結合の硫化は、５’から３’および３’から５’のＤＮＡ  ＰＯＬ１エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＳ１およびＰ１、ＲＮａｓｅ、血清ヌクレアーゼ、ならびにヘビ毒ホスホジエステラーゼを含む、エンドおよびエキソヌクレアーゼの作用を低減する。ホスホロチオエートは、ホスホン酸水素に対する二硫化炭素中の元素硫黄の溶液の作用、または亜リン酸トリエステルをテトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）もしくは３Ｈ−１，２−ベンソジチオール−３−オン１，１−ジオキシド（ＢＤＴＤ）のいずれかで硫化する方法、の２つの主要な経路によって作製される（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５，４６９３−４６９９，１９９０を参照）。後者の方法は、ほとんどの有機溶媒中の元素硫黄の不溶性、および二硫化炭素の毒性の問題を回避する。ＴＥＴＤおよびＢＤＴＤ法はまた、より高い純度のホスホロチオエートをもたらす。
【０１００】
５．トリクリクロ−ＤＮＡおよびトリシクロ−ホスホロチオエートサブユニット
トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）は、骨格の立体構造的柔軟性を制限し、ねじれ角γの骨格形状を最適化するために、各ヌクレオチドがシクロプロパン環の導入によって修飾される、拘束されたＤＮＡ類似体のクラスである。ホモ塩基アデニンおよびチミン含有ｔｃ−ＤＮＡは、相補的ＲＮＡと非常に安定したＡ−Ｔ塩基対を形成する。トリシクロＤＮＡおよびその合成は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／１１５９９３号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１つ以上のトリシクロ−ＤＮＡサブユニットを組み込み得る。場合によっては、アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、トリシクロ−ＤＮＡサブユニットから完全に構成されてもよい。
【０１０１】
トリシクロ−ホスホロチオエートサブユニットは、ホスホロチオエートサブユニット間リンケージを有するトリシクロ−ＤＮＡサブユニットである。トリシクロ−ホスホロチオエートサブユニットおよびその合成は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０５３９２８号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１つ以上のトリシクロ−ＤＮＡサブユニットを組み込み得る。場合によっては、アンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、トリシクロ−ＤＮＡサブユニットから完全に構成されてもよい。トリシクロ−ＤＮＡ／トリシクロ−ホスホチオエートの非限定的な例が以下に示される。
【化１７】
2021521794.tif 000020
【０１０２】
６．２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−ＭＯＥ、および２’−Ｆオリゴマー
「２’−Ｏ−Ｍｅオリゴマー」分子は、リボース分子の２’−ＯＨ残基にメチル基を有する。２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡは、ＤＮＡと同じ（または類似の）挙動を示すが、ヌクレアーゼ分解から保護される。２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡはまた、さらなる安定化のためにホスホロチオエートオリゴマー（ＰＴＯ）と組み合わされ得る。２’Ｏ−Ｍｅオリゴマー（ホスホジエステルまたはホスホチオエート）は、当該技術分野の常用技術に従って合成され得る（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：２００８−１６，２００４を参照）。２’Ｏ−Ｍｅオリゴマーの非限定的な例が以下に示される。
【化１８】
2021521794.tif 000021
【０１０３】
２’−Ｏ−メトキシエチルオリゴマー（２’−Ｏ  ＭＯＥ）は、リボース分子の２’−ＯＨ残基にメトキシエチル基を有し、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７８，４８６−５０４，１９９５で考察され、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。．２’Ｏ  ＭＯＥサブユニットの非限定的な例が以下に示される。
【化１９】
2021521794.tif 000022
【０１０４】
２’−フルオロ（２’−Ｆ）オリゴマーは、２’ＯＨの代わりに２’位に蛍光ラジカルを有する。２’−Ｆオリゴマーの非限定的な例が以下に示される。
【化２０】
2021521794.tif 000023
２’−フルオロオリゴマーは、ＷＯ２００４／０４３９７７にさらに記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０５】
２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−ＭＯＥ、および２’−Ｆオリゴマーはまた、以下に図示されるように、１つ以上のホスホロチオエート（ＰＳ）リンケージを含んでもよい。
【化２１】
2021521794.tif 000024
【０１０６】
さらに、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−ＭＯＥ、および２’−Ｆオリゴマーは、例えば、以下に示される２’−Ｏ−メチルＰＳオリゴマードリサペルセンのように、オリゴマー全体にわたってＰＳサブユニット間リンケージを含んでもよい。
【化２２】
2021521794.tif 000025
【０１０７】
あるいは、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−ＭＯＥ、および／または２’−Ｆオリゴマーは、以下に図示されるように、オリゴマーの末端にＰＳリンケージを含んでもよい。
【化２３】
2021521794.tif 000026
式中、
Ｒは、ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（メトキシエチルまたはＭＯＥ）であり、
ｘ、ｙ、およびｚは、それぞれ指定された５’−ウィング、中央ギャップ、および３’−ウィングの各領域内に含有されるヌクレオチドの数を表す。
【０１０８】
本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１つ以上の２’Ｏ−メチル、２’Ｏ−ＭＯＥ、および２’−Ｆサブユニットを組み込み得、本明細書に記載されるサブユニット間リンケージのいずれかを利用し得る。場合によっては、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−ＭＯＥ、または２’−Ｆサブユニットから完全に構成され得る。本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの一実施形態は、２’−Ｏ−メチルサブユニットから完全になる。
【０１０９】
７．２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］オリゴマー（ＭＣＥ）
ＭＣＥは、本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートで有用な２’Ｏ修飾リボヌクレオシドの別の例である。ここで、２’ＯＨは、ヌクレアーゼ抵抗性を高めるために２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル部分へと誘導体化される。ＭＣＥオリゴマーの非限定的な例が以下に示される。
【化２４】
2021521794.tif 000027
ＭＣＥおよびその合成は、Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（２０１１）７６（９）：３０４２−５３で考察され、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１つ以上のＭＣＥサブユニットを組み込み得る。
【０１１０】
８．立体特異的オリゴマー
立体特異的オリゴマーは、各リン含有リンケージの立体化学が、実質的に立体的に純粋なオリゴマーが産生されるような合成方法によって固定されるものである。立体特異的オリゴマーの非限定的な例が以下に示される。
【化２５】
2021521794.tif 000028
【０１１１】
上記の例では、オリゴマーの各リンは、同一の立体配置を有する。さらなる例には、上記のオリゴマーが含まれる。例えば、ＬＮＡ、ＥＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ＭＣＥ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−ＭＯＥ、２’−Ｆ、およびモルホリノ系オリゴマーは、立体特異的リン含有ヌクレオシド間リンケージ、例えば、ホスホロチオエート、ホスホジエステル、ホスホロアミダート、ホスホロジアミデート、または他のリン含有ヌクレオシド間リンケージを用いて調製され得る。そのようなオリゴマーの調製で使用するための立体特異的オリゴマー、調製方法、キラル制御合成、キラル設計、およびキラル補助剤は、例えば、ＷＯ２０１７１９２６６４、ＷＯ２０１７１９２６７９、ＷＯ２０１７０６２８６２、ＷＯ２０１７０１５５７５、ＷＯ２０１７０１５５５５、ＷＯ２０１５１０７４２５、ＷＯ２０１５１０８０４８、ＷＯ２０１５１０８０４６、ＷＯ２０１５１０８０４７、ＷＯ２０１２０３９４４８、ＷＯ２０１００６４１４６、ＷＯ２０１１０３４０７２、ＷＯ２０１４０１０２５０、ＷＯ２０１４０１２０８１、ＷＯ２０１３０１２７８５８、およびＷＯ２０１１００５７６１に詳述されており、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
立体特異的オリゴマーは、ＲＰまたはＳＰ配置においてリン含有ヌクレオシド間リンケージを有し得る。リンケージの立体配置が制御されるキラルリン含有リンケージは、「立体純粋」と称され、リンケージの立体配置が制御されないキラルリン含有リンケージは、「立体不規則的」と称される。ある特定の実施形態において、本開示のオリゴマーは、複数の立体純粋および立体不規則的リンケージを含み、これにより得られるオリゴマーは、オリゴマーの予め指定された位置に立体純粋サブユニットを有する。立体純粋サブユニットの位置の例は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１７／０６２８６２Ａ２号において図７Ａおよび図７Ｂに提供されている。一実施形態において、オリゴマー中の全てのキラルリン含有リンケージは、立体不規則的である。一実施形態において、オリゴマー中の全てのキラルリン含有リンケージは、立体純粋である。
【０１１３】
ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のキラルリン含有リンケージの全てｎは、立体不規則的である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のキラルリン含有リンケージの全てｎは、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有リンケージのうちの少なくとも１０％（整数に四捨五入）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有リンケージのうちの少なくとも２０％（整数に四捨五入）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有リンケージのうちの少なくとも３０％（整数に四捨五入）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有リンケージのうちの少なくとも４０％（整数に四捨五入）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有リンケージのうちの少なくとも５０％（整数に四捨五入）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有リンケージのうちの少なくとも６０％（整数に四捨五入）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有リンケージのうちの少なくとも７０％（整数に四捨五入）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有リンケージのうちの少なくとも８０％（整数に四捨五入）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有リンケージのうちの少なくとも９０％（整数に四捨五入）は、立体純粋である。
【０１１４】
ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配置（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも２つの連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配置（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも３つの連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配置（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも４つの連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配置（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも５つの連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配置（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも６つの連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配置（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも７つの連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配置（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも８つの連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配置（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも９つの連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配置（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１０個の連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配置（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１１個の連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配置（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１２個の連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配置（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１３個の連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配置（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１４個の連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配置（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１５個の連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配置（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１６個の連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配置（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１７個の連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配置（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１８個の連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配置（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１９個の連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配置（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも２０個の連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。
【０１１５】
９．モルホリノオリゴマー
本開示の例示的な実施形態は、以下の一般構造：
【化２６】
2021521794.tif 000029
の、かつＳｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７：１８７−１９５（１９９７）の図２に記載されるような、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーに関する。本明細書に記載されるモルホリノは、上記の一般構造の全ての立体異性体および互変異性体を含むことが意図されている。モルホリノオリゴマーの合成、構造、および結合特性は、米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号、同第５，５０６，３３７号、同第８，０７６，４７６号、および同第８，２９９，２０６号に詳述されており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
ある特定の実施形態において、モルホリノは、オリゴマーの５’または３’末端で「テール」部分とコンジュゲートされて、その安定性および／または溶解性を高める。例示的なテールは、以下を含む。
【化２７】
2021521794.tif 000030
【０１１７】
様々な実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、式（Ｉ）に従うか、
【化２８】
2021521794.tif 000031
またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
各Ｎｕが、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｔが、
【化２９】
2021521794.tif 000032
から選択される部分であり、
Ｒ１が、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｚが、１６〜２３の整数であり、
標的化配列は、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｚが１６であるＨ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＺが２３であるＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択される。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２１の整数であり、ジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位は、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２１の整数であり、ジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位は、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＺが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【０１２１】
様々な実施形態において、ジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位は、Ｚが１６であるＨ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３６＋５６）、およびＺが２３であるＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択される。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、Ｚは、１６〜２１の整数である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２１の整数である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２３の整数である。
【０１２３】
様々な実施形態において、標的化配列および対応するＺは、以下から選択される。
【表１】
2021521794.tif 000033
ここで、Ｘが、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）である。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、各Ｘは独立して、Ｔである。
【０１２５】
様々な実施形態において、標的化配列および対応するＺは、以下から選択される。
【表２】
2021521794.tif 000034
【０１２６】
様々な実施形態において、Ｔは、
【化３０】
2021521794.tif 000035
である。
【０１２７】
様々な実施形態において、Ｒ１は、ＣＦ３、ＣＣｌ３、ＣＦＣｌ２、ＣＦ２Ｃｌ、エチル、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ３、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、または２，３−ジメチルブチルである。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、そのＨＣｌ（塩酸）塩である。ある特定の実施形態において、ＨＣｌ塩は、．６ＨＣｌ塩である。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、各Ｎｕは独立して、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、ウラシル（Ｕ）、およびヒポキサンチン（Ｉ）から選択される。
【０１３０】
例えば式（Ｉ）のいくつかの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、式（ＩＩ）に従うか、
【化３１】
2021521794.tif 000036
またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
Ｚが、１６〜２３の整数であり、
各Ｎｕが、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である標的化配列を一緒になって形成する核酸塩基である。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｚが１６であるＨ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＺが２３であるＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択される。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２１の整数であり、ジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位は、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２１の整数であり、ジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位は、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＺが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【０１３４】
様々な実施形態において、ジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位は、Ｚが１６であるＨ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３６＋５６）、およびＺが２３であるＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択される。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、Ｚは、１６〜２１の整数である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２１の整数である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２３の整数である。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、各Ｎｕは独立して、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、ウラシル（Ｕ）、およびヒポキサンチン（Ｉ）から選択される。
【０１３７】
様々な実施形態において、標的化配列および対応するＺは、以下から選択される。
【表３】
2021521794.tif 000037
ここで、Ａは
【化３２】
2021521794.tif 000038
であり、Ｃは
【化３３】
2021521794.tif 000039
であり、Ｇは
【化３４】
2021521794.tif 000040
であり、Ｘは
【化３５】
2021521794.tif 000041
である。ある特定の実施形態において、各Ｘは独立して、
【化３６】
2021521794.tif 000042
である。
【０１３８】
様々な実施形態において、標的化配列および対応するZは、以下から選択される。
【表４】
2021521794.tif 000043
ここで、Ａは
【化３７】
2021521794.tif 000044
であり、Ｃは
【化３８】
2021521794.tif 000045
であり、Ｇは
【化３９】
2021521794.tif 000046
であり、Ｔは
【化４０】
2021521794.tif 000047
である。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、そのＨＣｌ（塩酸）塩である。ある特定の実施形態において、ＨＣｌ塩は、．６ＨＣｌ塩である。
【０１４０】
例えば式（ＩＩ）のいくつかの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、式（ＩＩＩ）に従うか、
【化４１】
2021521794.tif 000048
またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
Ｚが、１６〜２３の整数であり、
各Ｎｕが、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である標的化配列を一緒になって形成する核酸塩基である。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｚが１６であるＨ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＺが２３であるＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択される。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２１の整数であり、ジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位は、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２１の整数であり、ジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位は、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＺが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【０１４４】
様々な実施形態において、ジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位は、Ｚが１６であるＨ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３６＋５６）、およびＺが２３であるＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択される。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、Ｚは、１６〜２１の整数である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２１の整数である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２３の整数である。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、各Ｎｕは独立して、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、ウラシル（Ｕ）、およびヒポキサンチン（Ｉ）から選択される。
【０１４７】
様々な実施形態において、標的化配列および対応するＺは、以下から選択される。
【表５】
2021521794.tif 000049
ここで、Ａは
【化４２】
2021521794.tif 000050
であり、Ｃは
【化４３】
2021521794.tif 000051
であり、Ｇは
【化４４】
2021521794.tif 000052
であり、Ｘは
【化４５】
2021521794.tif 000053
である。ある特定の実施形態において、各Ｘは独立して、
【化４６】
2021521794.tif 000054
である。
【０１４８】
様々な実施形態において、標的化配列および対応するＺは、以下から選択される。
【表６】
2021521794.tif 000055
ここで、Ａは
【化４７】
2021521794.tif 000056
であり、Ｃは
【化４８】
2021521794.tif 000057
であり、Ｇは
【化４９】
2021521794.tif 000058
であり、Ｔは
【化５０】
2021521794.tif 000059
である。
【０１４９】
例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ａ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｂ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｃ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｄ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｅ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｆ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｇ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｈ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｉ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｊ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｋ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｌ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｍ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｎ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｏ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｐ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｑ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｒ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｓ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｔ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｕ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｖ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｗ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｘ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｙ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｚ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ａａ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｂｂ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｃｃ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｄｄ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｅｅ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｆｆ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｇｇ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｈｈ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｉｉ．である。
【０１５０】
様々な実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーは、式（ＩＶ）に従うか、
【化５１】
2021521794.tif 000060
またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
各Ｎｕが、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｔが、
【化５２】
2021521794.tif 000061
から選択される部分であり、
Ｒ１が、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２が、Ｈまたはアセチルから選択され、
標的化配列は、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＺが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、標的化配列は、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＺが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、Ｚは、１６〜２１の整数である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２１の整数である。
【０１５５】
様々な実施形態において、Ｔは、
【化５３】
2021521794.tif 000062
である。
【０１５６】
様々な実施形態において、Ｒ１は、ＣＦ３、ＣＣｌ３、ＣＦＣｌ２、ＣＦ２Ｃｌ、エチル、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ３、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、または２，３−ジメチルブチルである。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、各Ｎｕは独立して、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、ウラシル（Ｕ）、およびヒポキサンチン（Ｉ）から選択される。
【０１５８】
様々な実施形態において、標的化配列および対応するＺは、以下から選択される。
【表７】
2021521794.tif 000063
ここで、Ｘは、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）である
【０１５９】
様々な実施形態において、標的化配列および対応するＺは、以下から選択される。
【表８】
2021521794.tif 000064
【０１６０】
様々な実施形態において、Ｔは、
【化５４】
2021521794.tif 000065
である。
【０１６１】
例えば式（ＩＶ）のいくつかの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーは、式（Ｖ）に従うか、
【化５５】
2021521794.tif 000066
またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
Ｒが、Ｈまたはアセチルから選択され、
各Ｎｕが、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である標的化配列を一緒になって形成する核酸塩基である。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＺが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＺが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、Ｚは、１６〜２１の整数である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２１の整数である。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、各Ｎｕは独立して、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、ウラシル（Ｕ）、およびヒポキサンチン（Ｉ）から選択される。
【０１６７】
様々な実施形態において、標的化配列および対応するＺは、以下から選択される。
【表９】
2021521794.tif 000067
ここで、Ａは
【化５６】
2021521794.tif 000068
であり、Ｃは
【化５７】
2021521794.tif 000069
であり、Ｇは
【化５８】
2021521794.tif 000070
であり、Ｘは
【化５９】
2021521794.tif 000071
である。ある特定の実施形態において、各Ｘは独立して、
【化６０】
2021521794.tif 000072
である。
【０１６８】
様々な実施形態において、標的化配列および対応するＺは、以下から選択される。
【表１０】
2021521794.tif 000073
ここで、Ａは
【化６１】
2021521794.tif 000074
であり、Ｃは
【化６２】
2021521794.tif 000075
であり、Ｇは
【化６３】
2021521794.tif 000076
であり、Ｔは
【化６４】
2021521794.tif 000077
である。
【０１６９】
例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ａ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｂ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｃ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｄ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｅ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｆ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｇ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｈ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｉ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｊ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｋ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｌ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｍ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｎ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｏ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｐ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｑ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｒ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｓ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｔ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｕ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｖ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｗ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｘ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｙ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｚ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ａａ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｂｂ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｃｃ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｄｄ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｅｅ．である。
【０１７０】
１０．核酸塩基修飾および置換
ある特定の実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、ＲＮＡ核酸塩基およびＤＮＡ核酸塩基（多くの場合、当該技術分野では単に「塩基」と称される）から構成される。ＲＮＡ塩基は、アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ）、およびグアニン（Ｇ）として一般的に既知である。ＤＮＡ塩基は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびグアニン（Ｇ）として一般的に既知である。様々な実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、ウラシル（Ｕ）、およびヒポキサンチン（Ｉ）から構成される。
【０１７１】
ある特定の実施形態において、オリゴマー中の１つ以上のＲＮＡ塩基またはＤＮＡ塩基は、ＲＮＡ塩基またはＤＮＡ塩基以外の塩基で修飾または置換されてもよい。修飾または置換塩基を含有するオリゴマーは、核酸中で最も一般的に見られる１つ以上のプリンまたはピリミジン塩基がそれほど一般的ではない、または非天然の塩基で置換されたオリゴマーを含む。
【０１７２】
プリン塩基は、以下の一般式によって記載されるように、イミダゾール環に融合したピリミジン環を含む。
【化６５】
2021521794.tif 000078
アデニンおよびグアニンは、核酸中で最も一般的に見られる２つのプリン核酸塩基である。他の自然発生的プリンとしては、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ２−メチルグアニン、ヒポキサンチン、および７−メチルグアニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７３】
ピリミジン塩基は、以下の一般式によって記載されるように、６員ピリミジン環を含む。
【化６６】
2021521794.tif 000079
シトシン、ウラシル、およびチミンは、核酸中で最も一般的に見られるピリミジン塩基である。他の自然発生的ピリミジンとしては、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、偽ウラシル、および４−チオウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、本明細書に記載されるオリゴマーは、ウラシルの代わりにチミン塩基を含有する。
【０１７４】
他の好適な塩基としては、２，６−ジアミノプリン、オロト酸、アグマチジン、リシジン、２−チオピリミジン（例えば、２−チオウラシル、２−チオチミン）、Ｇ−クランプおよびその誘導体、５−置換ピリミジン（例えば、５−ハロウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、５−アミノメチルウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−アミノメチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、スーパーＴ）、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、７−アザ−２，６−ジアミノプリン、８−アザ−７−デアザグアニン、８−アザ−７−デアザアデニン、８−アザ−７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、スーパーＧ、スーパーＡ、およびＮ４−エチルシトシン、またはその誘導体；Ｎ２−シクロペンチルグアニン（ｃＰｅｎｔ−Ｇ）、Ｎ２−シクロペンチル−２−アミノプリン（ｃＰｅｎｔ−ＡＰ）、およびＮ２−プロピル−２−アミノプリン（Ｐｒ−ＡＰ）、偽ウラシル、またはその誘導体；ならびに２，６−ジフルオロトルエンのような縮重もしくはユニバーサル塩基、または脱塩基部位のような非存在塩基（例えば、１−デオキシリボース、１，２−ジデオキシリボース、１−デオキシ−２−Ｏ−メチルリボース；あるいは環酸素が窒素で置き換えられたピロリジン誘導体（アザリボース））が挙げられるが、これらに限定されない。スーパーＡ、スーパーＧ、およびスーパーＴの誘導体の例は、米国特許第６，６８３，１７３号（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で見ることができ、これは、参照により完全に本明細書に組み込まれる。ｃＰｅｎｔ−Ｇ、ｃＰｅｎｔ−ＡＰ、およびＰｒ−ＡＰは、ｓｉＲＮＡに組み込まれたときに免疫賦活作用を低減することが示された（Ｐｅａｃｏｃｋ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，９２００）。偽ウラシルは、ウラシルの自然発生的異性化バージョンであり、ウリジンにおける通常のＮ−グリコシドというよりむしろＣ−グリコシドによる。偽ウリジン含有合成ｍＲＮＡは、ウリジン含有ｍＰｖＮＡと比較して、改善された安全性プロファイルを有し得る（ＷＯ２００９１２７２３０（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１７５】
ある特定の核酸塩基は、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの結合親和性を高めるために特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む）が含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されており、さらに具体的には２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合に、現在より好ましい塩基置換である。追加の例示的な修飾核酸塩基には、核酸塩基の少なくとも１つの水素原子がフッ素で置き換えられているものが含まれる。
【０１７６】
１１．アンチセンスオリゴマーコンジュゲートの薬学的に許容される塩
本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートのある特定の実施形態は、アミノまたはアルキルアミノなどの塩基性官能基を含有してもよく、したがって、薬学的に許容される酸と薬学的に許容される塩を形成することができる。この点における「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの比較的非毒性の無機酸および有機酸付加塩を指す。これらの塩は、投与ビヒクルまたは剤形製造プロセスにおいて原位置で調製される得か、または本開示の精製されたアンチセンスオリゴマーもしくはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを、その遊離塩基形態で、好適な有機酸もしくは無機酸と別々に反応させ、その後の精製中にそのようにして形成された塩を単離することによって調製され得る。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩などが挙げられる。（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ”，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照）。
【０１７７】
主題のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの薬学的に許容される塩は、例えば、非毒性の有機酸または無機酸からの、アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの従来の非毒性塩または第四級アンモニウム塩を含む。例えば、そのような従来の非毒性塩としては、無機酸に由来するもの、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸など；ならびに有機酸から調製された塩、例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸（ｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ）、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸（ｉｓｏｔｈｉｏｎｉｃ）などが挙げられる。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１つ以上の酸性官能基を含有してもよく、したがって、薬学的に許容される塩基と薬学的に許容される塩を形成することができる。これらの場合における「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの比較的非毒性の無機塩基および有機塩基付加塩を指す。これらの塩は同様に、投与ビヒクルまたは剤形製造プロセスにおいて原位置で調製され得るか、あるいは精製されたアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを、その遊離酸形態で、好適な塩基、例えば、薬学的に許容される金属カチオンの水酸化物、炭酸塩、もしくは重炭酸塩と、アンモニアと、または薬学的に許容される有機第一級アミン、第二級アミン、もしくは第三級アミンと別々に反応させることによって調製され得る。代表的なアルカリまたはアルカリ土類塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびアルミニウム塩などが挙げられる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンとしては、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが挙げられる。（例えば、上記のＢｅｒｇｅらを参照）。
【０１７９】
ＩＩＩ．製剤および投与様式
ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの治療送達に好適な製剤または医薬組成物を提供する。したがって、ある特定の実施形態において、本開示は、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤と共に製剤化した、治療有効量の本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートのうちの１つ以上を含む、薬学的に許容される組成物を提供する。本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを単独で投与することは可能であるが、アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを医薬製剤（組成物）として投与することが好ましい。一実施形態において、製剤のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、式（ＩＩＩ）に従う。
【０１８０】
本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートに適用可能である核酸分子の送達のための方法は、例えば、Ａｋｈｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，２：１３９；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．ＡＡｋｈｔａｒ，１９９５，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、およびＳｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ  ＷＯ９４／０２５９５に記載されている。これらおよび他のプロトコルは、本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを含む、実質的に任意の核酸分子の送達に利用され得る。
【０１８１】
本開示の医薬組成物は、固体または液体形態での投与のために特別に製剤化されてもよく、以下に適合したものを含む：（１）経口投与、例えば、浸漬液（水性または非水性の溶液または懸濁液）、錠剤（口腔、舌下、または全身吸収）、ボーラス、粉末、顆粒、舌に適用するためのペースト、（２）例えば、滅菌溶液もしくは懸濁液または徐放性製剤としての、例えば、皮下、筋肉内、静脈内、硬膜外注射による非経口投与、（３）例えば、皮膚に塗布されるクリーム、軟膏、または制御放出性パッチもしくはスプレーとしての局所塗布、（４）例えば、ペッサリー、クリーム、または発泡体としての膣内または直腸内、（５）舌下、（６）眼内、（７）経皮、あるいは（８）経鼻。
【０１８２】
薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの例としては、（１）糖類、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース、（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン、（３）セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース、（４）粉末状トラガカント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）賦形剤、例えば、ココアバターおよび坐剤ワックス、（９）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油、（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール、（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール、（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル、（１３）寒天、（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム、（１５）アルギニン酸、（１６）発熱性物質除去蒸留水、（１７）等張生理食塩水、（１８）リンゲル液、（１９）エチルアルコール、（２０）ｐＨ緩衝液、（２１）ポリエステル、ポリカーボネート、および／またはポリ無水物、ならびに（２２）医薬製剤で用いられる他の非毒性適合性物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８３】
本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを用いた製剤に適した薬剤の追加の非限定的な例としては、ＰＥＧコンジュゲート核酸；リン脂質コンジュゲート核酸；親油性部分を含有する核酸；ホスホロチオエート；様々な組織への薬物の侵入を増強することができるＰ糖タンパク質阻害剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ８５など）：生分解性ポリマー、例えば、埋め込み後の徐放性送達のためのポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コグリコリド）ミクロスフェア（Ｅｍｅｒｉｃｈ，Ｄ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，８，４７−５８）Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．；および負荷ナノ粒子、例えば、ポリブチルシアノアクリレートで作られるもの（血液脳関門にわたって薬物を送達することができ、神経取込み機構を変化させることができる）（Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２３，９４１−９４９，１９９９）が挙げられる。
【０１８４】
本開示はまた、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）脂質（ＰＥＧ修飾、分岐、および非分岐、もしくはそれらの組み合わせ、または長期循環型リポソームもしくはステルスリポソーム）を含有する、表面修飾リポソームを含む組成物の使用を特徴とする。本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートはまた、様々な分子量の共有結合ＰＥＧ分子も含むことができる。これらの製剤は、標的組織における薬物の蓄積を増加させるための方法を提供する。このクラスの薬物担体は、単核細胞貪食系（ＭＰＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン化および排除に抵抗し、それにより、カプセル化薬物の血液循環時間の延長および組織曝露の増強を可能にする（Ｌａｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７、Ｉｓｈｉｗａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，４３，１００５−１０１１）。そのようなリポソームは、おそらく溢血および血管新生標的組織における捕捉によって、腫瘍に選択的に蓄積することが示されている（Ｌａｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，２６７，１２７５−１２７６、Ｏｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６−９０）。長期循環型リポソームは、特にＭＰＳの組織に蓄積することが知られている従来のカチオン性リポソームと比較して、ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態および薬力学を増強する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，４２，２４８６４−２４８７０、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１０３９１号、Ａｎｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１０３９０号、Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１０３９２号）。また、長期循環型リポソームは、肝臓や脾臓などの代謝的に攻撃的なＭＰＳ組織において蓄積を回避するそれらの能力に基づいて、カチオン性リポソームと比較して、より大きい程度まで薬物をヌクレアーゼ分解から保護する可能性が高い。
【０１８５】
さらなる実施形態において、本開示は、米国特許第６，６９２，９１１号、同第７，１６３，６９５号、および同第７，０７０，８０７号に記載されるような、送達のために調製されたアンチセンスオリゴマー医薬組成物およびアンチセンスオリゴマーコンジュゲート医薬組成物を含む。この点に関して、一実施形態において、本開示は、単独で、あるいはＰＥＧ（例えば、分岐もしくは非分岐ＰＥＧ、または両方の混合物）と組み合わせて、ＰＥＧおよび標的化部分と組み合わせて、あるいは架橋剤と組み合わせた上記のいずれかの、リシンおよびヒスチジン（ＨＫ）のコポリマーを含む組成物中の本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲート（米国特許第７，１６３，６９５号、同第７，０７０，８０７号、および６，６９２，９１１号に記載）を提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、グルコン酸修飾ポリヒスチジンまたはグルコニル化ポリヒスチジン／トランスフェリン−ポリリシンを含む医薬組成物中のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。当業者であれば、ＨｉｓおよびＬｙｓに類似した特性を有するアミノ酸が組成物内で置換され得ることも認識するであろう。
【０１８６】
湿潤剤、乳化剤、および潤滑剤（ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなど）、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、防腐剤、ならびに酸化防止剤も組成物中に存在することができる。
【０１８７】
薬学的に許容される酸化防止剤の例としては、（１）水溶性酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど、（２）油溶性酸化防止剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなど、および（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
【０１８８】
本開示の製剤には、経口、経鼻、局所（口腔および舌下を含む）、直腸、膣、ならびに／または非経口投与に適した製剤が含まれる。製剤は、便利に単位剤形で提示され得、薬学の技術分野で周知の任意の方法によって調製され得る。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、治療される対象および特定の投与様式に応じて異なる。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、概して、治療効果をもたらす活性成分の量である。概して、この量は、有効成分の約０．１パーセント〜約９９パーセント、好ましくは約５パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１０パーセント〜約３０パーセントの範囲である。
【０１８９】
ある特定の実施形態において、本開示の製剤は、シクロデキストリン、セルロース、リポソーム、ミセル形成剤、例えば、胆汁酸、およびポリマー担体、例えば、ポリエステルおよびポリ無水物から選択される賦形剤と、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートと、を含む。一実施形態において、製剤のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、それぞれ式（Ｖ）または式（ＩＩＩ）に従う。ある特定の実施形態において、上記の製剤は、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを経口的にバイオアベイラビリティにする。
【０１９０】
これらの製剤または医薬組成物を調製する方法には、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを担体、および任意に１つ以上の副成分と会合させるステップを含む。概して、製剤は、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを液体担体、もしくは微粉化固体担体、またはその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで、必要に応じて生成物を成形することによって調製される。
【０１９１】
経口投与に適した本開示の製剤は、カプセル、カシェー、ピル、錠剤、トローチ（風味付けした基剤、通常はスクロースおよびアカシアもしくはトラガカント）、粉末、顆粒、または水性もしく非水性の溶液中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油または油中水の液体乳剤として、またはエリキシル剤もしくはシロップとして、または香錠（不活性塩基、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、もしくはスクロースおよびアカシア）および／もしくは口内洗浄液としての形態などであってもよく、各々は、有効成分として、所定量の本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを含有する。本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートはまた、ボーラス、舐剤、またはペーストとして投与されてもよい。
【０１９２】
経口投与のための本開示の固形剤形（カプセル、錠剤、ピル、糖剤、粉末、顆粒、トルーチなど）において、有効成分は、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、および／または以下のいずれかなどの１つ以上の薬学的に許容される担体と混合されてもよい：（１）充填剤または増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸、（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、および／またはアカシア、（３）保湿剤、例えば、グリセロール、（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム、（５）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、（６）吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物および界面活性剤、例えば、ポロキサマーおよびラウリル硫酸ナトリウム、（７）湿潤剤、例えば、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロール、非イオン性界面活性剤、（８）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイト粘土など、（９）潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸、およびそれらの混合物、（１０）着色剤、ならびに（１１）放出制御剤、例えば、クロスポビドンまたはエチルセルロース。カプセル、錠剤、およびピルの場合、医薬組成物はまた、緩衝剤を含んでもよい。類似のタイプの固体医薬組成物はまた、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用した、軟質および硬質シェルのゼラチンカプセル中の充填剤としても用いられ得る。
【０１９３】
錠剤は、任意に１つ以上の副成分との圧縮または成型によって作製され得る。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤または分散剤を使用して調製され得る。成型錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を好適な機械で成型することによって作製され得る。
【０１９４】
本開示の医薬組成物の錠剤および他の固体剤形、例えば、糖剤、カプセル、ピル、および顆粒は、任意に、コーティングおよびシェル、例えば、腸溶性コーティング、および医薬品製剤技術で周知の他のコーティングを用いて、獲得または調製され得る。また、それらは、所望の放出プロファイル、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを提供するために、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを様々な割合で使用して、その中の有効成分の徐放または制御放出を提供するように製剤化されてもよい。それらは、例えば凍結乾燥など、迅速放出のために製剤化されてもよい。それらは、例えば、細菌保持フィルタを通した濾過によって、または使用直前に滅菌水に溶解され得る滅菌固体医薬組成物の形態の滅菌剤、もしくはいくつかの他の滅菌注射用媒質を組み込むことによって滅菌され得る。また、これらの医薬組成物は任意に、不透明化剤を含有してもよく、それらが有効成分（複数可）のみを、または優先的に、消化管の特定の部分において、任意に遅延した様式で放出する組成物を有してもよい。使用され得る埋め込み組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。有効成分はまた、適切な場合、上記の賦形剤のうちの１つ以上を有する、マイクロカプセル形態であってもよい。
【０１９５】
本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの経口投与用の液体剤形は、薬学的に許容される乳剤、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤を含む。有効成分に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ソルビタンのポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物など、当該技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含有してもよい。
【０１９６】
不活性希釈剤に加えて、経口医薬組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤、ならびに防腐剤などのアジュバントも含むことができる。
【０１９７】
活性化合物に加えて、懸濁液は、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにそれらの混合物などの懸濁剤を含有してもよい。
【０１９８】
直腸投与または膣投与用の製剤は、坐剤として提示され得、これは、本開示の１つ以上の化合物を、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、坐剤ワックス、またはサリチル酸塩を含む１つ以上の好適な非刺激性賦形剤または担体と混合することによって調製され得、これは室温では固体であるが、体温では液体であり、したがって、直腸または膣腔で溶解し、活性化合物を放出する。
【０１９９】
本明細書に提供されるオリゴマーの局所投与または経皮投与のための製剤または剤形は、粉末、噴霧剤、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、および吸入剤を含む。活性アンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、滅菌条件下で、薬学的に許容される担体と、および必要とされ得る任意の防腐剤、緩衝剤、または噴射剤と混合され得る。軟膏、ペースト、クリーム、およびゲルは、本開示の活性化合物に加えて、動物性および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカンス、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、および酸化亜鉛、またはそれらの混合物などの賦形剤を含有し得る。
【０２００】
粉末および噴霧剤は、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートに加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含有することができる。噴霧剤はさらに、クロロフルオロ炭化水素などの通例の噴射剤、ならびにブタンおよびプロパンなどの揮発性非置換炭化水素を含有することができる。
【０２０１】
経皮パッチは、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの体内への制御送達を提供するというさらなる利点を有する。そのような剤形は、オリゴマーを適切な媒質に溶解するか、または分散させることによって作製され得る。吸収促進剤もまた、皮膚にわたる薬剤の流れを増加させるために使用され得る。そのような流れの速度は、当該技術分野で既知の方法の中でも特に、速度制御膜を提供すること、またはポリマーマトリックスもしくはゲル中に薬剤を分散させることのいずれかによって制御され得る。
【０２０２】
非経口投与に適した医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される滅菌等張水溶液もしくは非水溶液、分散液、懸濁液もしくは乳剤、または使用直前に滅菌注射用溶液もしくは分散液に再構成され得る滅菌粉末と組み合わせて、本開示の１つ以上のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを含んでもよく、これらは、糖、アルコール、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含有し得る。本開示の医薬組成物で用いられ得る好適な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合に必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。一実施形態において、医薬組成物のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、それぞれ式（Ｖ）または式（ＩＩＩ）に従う。
【０２０３】
また、これらの医薬組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントを含有してもよい。主題のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートに対する微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含むことによって確保され得る。また、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含むことが望ましい場合もある。さらに、注射用剤形の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど、吸収を遅延させる薬剤を含むことによってもたらされ得る。
【０２０４】
場合によっては、薬物の効果を延長するために、皮下または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましい。これは、当該技術分野で既知の方法の中でも特に、水溶性が乏しい結晶性または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって達成され得る。次いで、薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、溶解速度は、結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口的に投与された薬物形態の吸収の遅延は、薬物を油ビヒクルに溶解または懸濁することによって達成される。
【０２０５】
注射用デポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中で主題のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートのマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製され得る。ポリマーに対するオリゴマーの比率および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、オリゴマー放出の速度が制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤はまた、体内組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルションに薬物を封入することによっても調製され得る。
【０２０６】
本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートが、ヒトおよび動物に医薬品として投与されるとき、それらは、それ自体で、または例えば、薬学的に許容される担体と組み合わせた０．１〜９９％（より好ましくは１０〜３０％）のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを含有する医薬組成物として投与され得る。
【０２０７】
本開示の製剤または調製物は、経口的、非経口的、局所的、または直腸に投与され得る。これらは典型的には、各投与経路に適した形態で投与される。例えば、それらは、錠剤もしくはカプセルで、注射、吸入、目薬、軟膏、坐剤、もしくは点滴によって、ローションもしくは軟膏によって局所的に、または坐剤によって直腸に投与される。
【０２０８】
選択される投与経路にかかわらず、適切な水和形態で使用され得る本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、ならびに／または本開示の医薬組成物は、当業者に既知の従来的な方法によって薬学的に許容される剤形に製剤化され得る。本開示の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に対して許容できないほどの毒性を示すことなく、特定の患者、組成物、および投与様式に対して望ましい治療反応を達成するために有効である有効成分の量を得るために変動し得る。
【０２０９】
選択される投与量レベルは、用いられる本開示の特定のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、またはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時刻、用いられる特定のオリゴマーの排泄速度または代謝速度、吸収の速度および程度、治療期間、用いられる特定のオリゴマーと組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または材料、治療中の患者の年齢、性別、体重、条件、全般的な健康状態、および既往歴、ならびに医学技術で周知の同様の要因を含む、様々な要因に依存する。
【０２１０】
当該技術分野における通常の技術を有する医師または獣医であれば、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定および処方することができる。例えば、医師または獣医は、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルで、医薬組成物中で用いられる本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの用量を開始し、望ましい効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることができる。概して、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの好適な１日用量は、治療効果をもたらすのに有効な最低用量であるアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの量である。そのような有効用量は、概して、本明細書に記載される要因に依存する。概して、患者のための本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの経口、静脈内、脳室内、および皮下用量は、示された効果のために使用される場合、１日当たり体重１キログラム当たり約０．０００１〜約１００ｍｇの範囲である。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、概して、約１０〜１６０ｍｇ／ｋｇまたは２０〜１６０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。場合によっては、１６０ｍｇ／ｋｇを超える用量が必要である場合もある。いくつかの実施形態において、静脈内投与の用量は、約０．５ｍｇ〜１６０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、約０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、約１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２１ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２６ｍｇ／ｋｇ、２７ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、２９ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３１ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、３３ｍｇ／ｋｇ、３４ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、３６ｍｇ／ｋｇ、３７ｍｇ／ｋｇ、３８ｍｇ／ｋｇ、３９ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４１ｍｇ／ｋｇ、４２ｍｇ／ｋｇ、４３ｍｇ／ｋｇ、４４ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、４６ｍｇ／ｋｇ、４７ｍｇ／ｋｇ、４８ｍｇ／ｋｇ、４９ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５１ｍｇ／ｋｇ、５２ｍｇ／ｋｇ、５３ｍｇ／ｋｇ、５４ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、５６ｍｇ／ｋｇ、５７ｍｇ／ｋｇ、５８ｍｇ／ｋｇ、５９ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１０５ｍｇ／ｋｇ、１１０ｍｇ／ｋｇ、１１５ｍｇ／ｋｇ、１２０ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１３０ｍｇ／ｋｇ、１３５ｍｇ／ｋｇ、１４０ｍｇ／ｋｇ、１４５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１５５ｍｇ／ｋｇ、１６０ｍｇ／ｋｇ（それらの間の全ての整数を含む）の用量で投与される。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、１０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、２０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、３０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、４０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、６０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、８０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、１６０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、５０ｍｇ／ｋｇで投与される。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、概して、約１０〜１６０ｍｇ／ｋｇまたは２０〜１６０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、静脈内投与のための式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの用量は、約０．５ｍｇ〜１６０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、約０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、約１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２１ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２６ｍｇ／ｋｇ、２７ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、２９ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３１ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、３３ｍｇ／ｋｇ、３４ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、３６ｍｇ／ｋｇ、３７ｍｇ／ｋｇ、３８ｍｇ／ｋｇ、３９ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４１ｍｇ／ｋｇ、４２ｍｇ／ｋｇ、４３ｍｇ／ｋｇ、４４ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、４６ｍｇ／ｋｇ、４７ｍｇ／ｋｇ、４８ｍｇ／ｋｇ、４９ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５１ｍｇ／ｋｇ、５２ｍｇ／ｋｇ、５３ｍｇ／ｋｇ、５４ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、５６ｍｇ／ｋｇ、５７ｍｇ／ｋｇ、５８ｍｇ／ｋｇ、５９ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１０５ｍｇ／ｋｇ、１１０ｍｇ／ｋｇ、１１５ｍｇ／ｋｇ、１２０ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１３０ｍｇ／ｋｇ、１３５ｍｇ／ｋｇ、１４０ｍｇ／ｋｇ、１４５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１５５ｍｇ／ｋｇ、１６０ｍｇ／ｋｇ（それらの間の全ての整数を含む）の用量で投与される。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、１０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、２０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、３０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、４０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、６０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、８０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、１６０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、５０ｍｇ／ｋｇで投与される。
【０２１３】
必要に応じて、活性化合物の有効な１日用量は、１日を通して適切な間隔で、任意に単位剤形で別々に投与される、２、３、４、５、６回、またはそれ以上の部分用量として投与されてもよい。ある特定の状況において、投与量は１日１回の投与である。ある特定の実施形態において、投与量は、機能性ジストロフィンタンパク質の所望の発現を維持するために、必要に応じて、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日毎、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週毎、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヵ月毎に１回以上の投与である。ある特定の実施形態において、投与量は、２週間に１回以上の投与である。いくつかの実施形態において、投与量は、２週間に１回の投与である。様々な実施形態において、投与量は、毎月１回以上の投与である。ある特定の実施形態において、投与は、毎月１回の投与である。
【０２１４】
様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、２０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、３０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、４０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、６０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、８０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１００ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１６０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。本明細書で使用される場合、毎週は、１週間毎の当該技術分野で一般に認められた意味を有すると理解される。
【０２１５】
様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、２０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、３０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、４０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、６０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、８０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１００ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１６０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。本明細書で使用される場合、毎週は、１週間毎の当該技術分野で一般に認められた意味を有すると理解される。
【０２１６】
様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、２０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、３０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、４０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、６０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、８０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１００ｍｇ／ｋｇ隔週で投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１６０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。本明細書で使用される場合、隔週は、２週間毎の当該技術分野で一般に認められた意味を有すると理解される。
【０２１７】
様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、２０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、３０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、４０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、６０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、８０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１００ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１６０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。本明細書で使用される場合、隔週は、２週間毎の当該技術分野で一般に認められた意味を有すると理解される。
【０２１８】
様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１０ｍｇ／ｋｇで３週間毎に投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、２０ｍｇ／ｋｇで３週間毎に投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、３０ｍｇ／ｋｇで３週間毎に投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、４０ｍｇ／ｋｇで３週間毎に投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、６０ｍｇ／ｋｇで３週間毎に投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、８０ｍｇ／ｋｇで３週間毎に投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１００ｍｇ／ｋｇで３週間毎に投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１６０ｍｇ／ｋｇで３週間毎に投与される。本明細書で使用される場合、３週間毎は、３週間に１回の当該技術分野で一般に認められた意味を有すると理解される。
【０２１９】
様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１０ｍｇ／ｋｇで３週毎に投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、２０ｍｇ／ｋｇで３週毎に投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、３０ｍｇ／ｋｇで３週毎に投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、４０ｍｇ／ｋｇで３週毎に投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、６０ｍｇ／ｋｇで３週毎に投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、８０ｍｇ／ｋｇで３週毎に投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１００ｍｇ／ｋｇで３週毎に投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１６０ｍｇ／ｋｇで３週毎に投与される。本明細書で使用される場合、３週間毎は、３週間に１回の当該技術分野で一般に認められた意味を有すると理解される。
【０２２０】
様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、２０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、３０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、４０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、６０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、８０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１００ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１６０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。本明細書で使用される場合、毎月は、月毎の当該技術分野で一般に認められた意味を有すると理解される。
【０２２１】
様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、２０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、３０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、４０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、６０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、８０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１００ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１６０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。本明細書で使用される場合、毎月は、月毎の当該技術分野で一般に認められた意味を有すると理解される。
【０２２２】
当該技術分野で理解されるように、毎週、隔週、３週間毎、または毎月の投与は、本明細書で考察されるように、１回以上の投与または部分用量であってもよい。
【０２２３】
本明細書に記載される核酸分子、アンチセンスオリゴマー、およびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、本明細書に記載され、かつ当該技術分野において既知のような、リポソームへの封入、イオン導入、またはハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、および生体接着性ミクロスフェアなどの他のビヒクルへの組み込みが挙げられるが、これらに限定されない、当業者に既知の様々な方法によって細胞に投与され得る。ある特定の実施形態において、マイクロ乳化技術を利用して、親油性（非水溶性）医薬品のバイオアベイラビリティを改善してもよい。例としては、Ｔｒｉｍｅｔｒｉｎｅ（Ｄｏｒｄｕｎｏｏ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１７（１２），１６８５−１７１３，１９９１）、およびＲＥＶ  ５９０１（Ｓｈｅｅｎ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ８０（７），７１２−７１４，１９９１）が挙げられる。利点の中でも特に、マイクロ乳化は、循環系の代わりにリンパ系への吸収を優先的に誘導し、それにより肝臓を迂回し、肝胆道循環における化合物の破壊を防止することによって、増強されたバイオアベイラビリティを提供する。
【０２２４】
開示の一態様において、製剤は、本明細書に提供されるオリゴマーから形成されるミセルと、ミセルが約１００ｎｍ未満の平均直径を有する少なくとも１つの両親媒性担体とを含有する。より好ましい実施形態は、約５０ｎｍ未満の平均直径を有するミセルを提供し、さらに好ましい実施形態は、約３０ｎｍ未満またはさらに約２０ｎｍ未満の平均直径を有するミセルを提供する。
【０２２５】
全ての好適な両親媒性担体が企図されるが、現在好ましい担体は概して、一般的に安全と認められている（ＧＲＡＳ）状態を有し、かつ本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを可溶化すること、および溶液が複雑な水相（ヒト胃腸管に見られるものなど）と接触する後の段階でマイクロ乳化することの両方ができる担体である。これらの要件を満たす両親媒性成分は、通常、ＨＬＢ（親水性−親油性のバランス）値が２−２０であり、それらの構造は、Ｃ−６からＣ−２０の範囲の直鎖脂肪族ラジカルを含有する。例としては、ポリエチレングリコール化脂肪酸グリセリドおよびポリエチレングリコールがある。
【０２２６】
両親媒性担体の例としては、飽和および一不飽和ポリエチレングリコール化脂肪酸グリセリド、例えば、完全または部分的に水素化された様々な植物油から得られるものが挙げられる。そのような油は有利に、トリ−、ジ−、およびモノ−脂肪酸グリセリド、ならびに対応する脂肪酸のジ−およびモノ−ポリ（エチレングリコール）エステルからなり得、特に好ましい脂肪酸組成物としては、カプリン酸４〜１０％、カプリン酸３〜９％、ラウリン酸４０〜５０％、ミリスチン酸１４〜２４％、パルミチン酸４〜１４％、およびステアリン酸５〜１５％が挙げられる。別の有用なクラスの両親媒性担体としては、飽和もしくは一不飽和脂肪酸（ＳＰＡＮ（登録商標）シリーズ）または対応するエトキシ化類似体（ＴＷＥＥＮ（登録商標）シリーズ）を有する、部分的にエステル化されたソルビタンおよび／またはソルビトールが挙げられる。
【０２２７】
Ｇｅｌｕｃｉｒｅシリーズ、Ｌａｂｒａｆｉｌ、Ｌａｂｒａｓｏｌ、またはＬａｕｒｏｇｌｙｃｏｌ（全てＧａｔｔｅｆｏｓｓｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｉｎｔ  Ｐｒｉｅｓｔ，Ｆｒａｎｃｅによって製造および流通）、ＰＥＧ−モノ−オレイン酸、ＰＥＧ−ジ−オレイン酸、ＰＥＧ−モノ−ラウリン酸およびジ−ラウリン酸、レシチン、ポリソルベート８０など（米国および世界中の多くの企業によって製造および流通）を含む市販の両親媒性担体が、特に有用であり得る。
【０２２８】
ある特定の実施形態において、送達は、本開示の医薬組成物を好適な宿主細胞に導入するために、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などを使用することによって起こり得る。特に、本開示の医薬組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、ナノ粒子、または同様のもののいずれかに封入された送達用に製剤化され得る。そのような送達ビヒクルの製剤化および使用は、既知の技術および従来の技術を使用して行われ得る。
【０２２９】
本開示での使用に適した親水性ポリマーは、容易に水溶性であり、小胞形成脂質に共有結合することができ、かつ毒性作用なしにｉｎ  ｖｉｖｏで耐容性がある（すなわち、生体適合性である）ものである。好適なポリマーとしては、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ポリラクチドとも呼ばれる）、ポリグリコール酸（ポリグリコリドとも呼ばれる）、ポリ乳酸−ポリグリコール酸コポリマー、およびポリビニルアルコールが挙げられる。ある特定の実施形態において、ポリマーは、約１００もしくは１２０ダルトン〜最大で約５，０００もしくは１０，０００ダルトン、または約３００ダルトン〜約５，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。他の実施形態において、ポリマーは、約１００〜約５，０００ダルトンの重量平均分子量を有する、または約３００〜約５，０００ダルトンの重量平均分子量を有する、ポリ（エチレングリコール）である。ある特定の実施形態において、ポリマーは、約７５０ダルトンの重量平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）、例えば、ＰＥＧ（７５０）である。ポリマーは、その中のモノマーの数によっても定義され得、本開示の好ましい実施形態は、少なくとも約３つのモノマーのポリマーを利用し、３つのモノマーからなるそのようなＰＥＧポリマーは、分子量が約１３２ダルトンである。
【０２３０】
本開示での使用に適し得る他の親水性ポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ポリメトキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、および誘導体化セルロース、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースが挙げられる。
【０２３１】
ある特定の実施形態において、本開示の製剤は、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、アクリルエステルおよびメタクリルエステルのポリマー、ポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそのコポリマー、セルロース、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルソ）エステル、ポリ（ブチック酸）（ｂｕｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、多糖類、タンパク質、ポリヒアルロン酸、ポリシアノアクリレート、ならびにそれらのブレンド、混合物、またはコポリマーからなる群から選択される生体適合性ポリマーを含む。
【０２３２】
シクロデキストリンは、６、７、または８グルコース単位からなる環状オリゴ糖であり、それぞれギリシャ文字α、β、またはγによって示される。グルコース単位は、α−１，４−グルコシド結合によって連結される。糖単位の椅子型配座の結果として、全ての二次ヒドロキシル基（Ｃ−２、Ｃ−３における）が環の一方の側に位置する一方で、Ｃ−６における全ての一次ヒドロキシル基は、他方の側に位置する。結果として、外面は親水性であり、シクロデキストリンを水溶性にする。対照的に、シクロデキストリンの空洞は、それらが原子Ｃ−３およびＣ−５の水素によって、かつエーテル様酸素によって覆われているため、疎水性である。これらのマトリックスは、例えば、１７α−エストラジオールなどのステロイド化合物を含む、様々な比較的疎水性の化合物との複合体形成を可能にする（例えば、ｖａｎ  Ｕｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓ．Ｏｒｇ．Ｃｕｌｔ．３８：１−３−１１３（１９９４）を参照）。複合体形成は、ファンデルワールス相互作用および水素結合形成によって起こりる。シクロデキストリンの化学的性質に関する一般的なレビューについては、Ｗｅｎｚ，Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：８０３−８２２（１９９４）を参照されたい。
【０２３３】
シクロデキストリン誘導体の物理化学的性質は、置換の種類および程度に大きく依存する。例えば、それらの水溶性は、不溶性（例えば、トリアセチル−ベータ−シクロデキストリン）から１４７％可溶性（ｗ／ｖ）（Ｇ−２−ベータ−シクロデキストリン）の範囲である。さらに、それらは多くの有機溶媒に可溶性である。シクロデキストリンの特性は、それらの溶解度を増減させることによって、様々な製剤構成成分の溶解度の制御を可能にする。
【０２３４】
多数のシクロデキストリンおよびそれらの調製のための方法が記載されている。例えば、Ｐａｒｍｅｔｅｒ（Ｉ）ら（米国特許第３，４５３，２５９号）およびＧｒａｍｅｒａら（米国特許第３，４５９，７３１号）が、電気的中性シクロデキストリンについて記載している。他の誘導体としては、カチオン特性を有するシクロデキストリン［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩ），米国特許第３，４５３，２５７号］、不溶性架橋シクロデキストリン（Ｓｏｌｍｓ，米国特許第３，４２０，７８８号）、およびアニオン特性を有するシクロデキストリン［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩＩ），米国特許第３，４２６，０１１号］が挙げられる。アニオン特性を有するシクロデキストリン誘導体のうち、カルボン酸、亜リン酸、亜ホスフィン酸、ホスホン酸、リン酸、チオホスホン酸、チオスルフィン酸、およびスルホン酸は、親シクロデキストリンに付加されている［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩＩ）、上記参照］。さらに、スルホアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体は、Ｓｔｅｌｌａら（米国特許第５，１３４，１２７号）によって記載されている。
【０２３５】
リポソームは、水性内部区画を取り囲む少なくとも１つの脂質二重層膜からなる。リポソームは、膜のタイプおよびサイズによって特徴付けられ得る。小単ラメラ小胞（ＳＵＶ）は単一膜を有し、典型的には、直径が０．０２〜０．０５μｍの範囲であり、大単ラメラ小胞（ＬＵＶＳ）は、典型的には０．０５μｍよりも大きい。オリゴラメラ大小胞およびマルチラメラ小胞は、複数の、通常は同心性の膜層を有し、典型的には０．１μｍよりも大きい。いくつかの非同心膜を有するリポソームは、すなわち、より大きい小胞内に含有されるいくつかのより小さい小胞は、多胞体小胞と呼ばれる。
【０２３６】
本開示の一態様は、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを含有するリポソームを含む製剤に関し、リポソーム膜は、増加した担持能力を有するリポソームを提供するように製剤化される。あるいは、または加えて、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、リポソームのリポソーム二重層内に含有されてもよく、またはその上に吸着されてもよい。本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、脂質界面活性剤と凝集され、リポソームの内部空間内に担持され得る。これらの場合、リポソーム膜は、活性薬剤−界面活性剤凝集体の崩壊効果に抵抗するように製剤化される。
【０２３７】
本開示の一実施形態によると、リポソームの脂質二重層は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）で誘導体化された脂質を含有し、これによりＰＥＧ鎖は、脂質二重層の内面からリポソームによって封入された内部空間へと延在し、かつ脂質二重層の外部から周囲環境へと延在する。
【０２３８】
本開示のリポソーム内に含有される活性薬剤は、可溶化形態である。界面活性剤および活性薬剤の凝集体（対象の活性薬剤を含有するエマルションまたはミセルなど）は、本開示によるリポソームの内部空間内に閉じ込められ得る。界面活性剤は、活性薬剤を分散させ可溶化するように作用し、様々な鎖長（例えば、約Ｃ１４〜約Ｃ２０）の生体適合性リゾホスファチジルコリン（ＬＰＧ）を含むがこれに限定されない、任意の好適な脂肪族、脂環式、または芳香族界面活性剤から選択され得る。ＰＥＧ−脂質などのポリマー誘導体化脂質は、ミセル／膜融合を阻害するように作用するため、また界面活性剤分子へのポリマーの添加が界面活性剤のＣＭＣを減少させ、ミセル形成を助けるため、ミセル形成にも利用され得る。マイクロモル範囲のＣＭＯを有する界面活性剤が好ましく、より高いＣＭＣ界面活性剤を利用して、本開示のリポソーム内に閉じ込められたミセルを調製し得る。
【０２３９】
本開示によるリポソームは、当該技術分野で既知の様々な技術のいずれかによって調製され得る。例えば、米国特許第４，２３５，８７１号、公開ＰＣＴ出願第ＷＯ９６／１４０５７号、Ｎｅｗ  ＲＲＣ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９０），ｐａｇｅｓ  ３３−１０４、およびＬａｓｉｃ  ＤＤ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈｙｓｉｃｓ  ｔｏ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  ＢＶ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９３を参照されたい。例えば、本開示のリポソームは、リポソーム中で所望の誘導体化脂質の最終モルパーセントに相当する脂質濃度で、親水性ポリマーで誘導体化された脂質を予め形成されたリポソームに拡散することによって、例えば、予め形成されたリポソームを脂質グラフトポリマーから構成されるミセルに曝露することによって、調製され得る。親水性ポリマーを含有するリポソームはまた、当該技術分野で既知のように、均質化、脂質場水和、または押出技術によって形成され得る。
【０２４０】
別の例示的な製剤化手順において、活性薬剤はまず、疎水性分子を容易に可溶化するリゾホスファチジルコリンまたは他の低ＣＭＣ界面活性剤（ポリマーグラフト脂質を含む）中での音波処理によって分散される。次いで、活性薬剤の得られたミセル懸濁液を使用して、好適なモルパーセントのポリマーグラフト脂質またはコレステロールを含有する乾燥脂質試料を再水和する。次いで、脂質および活性薬剤懸濁液は、当該技術分野で既知の押出技術を使用してリポソームに形成され、得られたリポソームは、標準的なカラム分離によって封入されていない溶液から分離される。
【０２４１】
本開示の一態様において、リポソームは、選択されたサイズ範囲において実質的に均一なサイズを有するように調製される。１つの効果的なサイズ決定方法は、選択された均一な孔径を有する一連のポリカーボネート膜を通してリポソームの水性懸濁液を押し出すことを伴い、膜の孔径は、その膜を通した押出によってもたらされるリポソームの最大サイズに概ね相当する。例えば、米国特許第４，７３７，３２３号（１９８８年４月１２日）を参照されたい。ある特定の実施形態において、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）などの試薬を利用して、ポリヌクレオチドまたはタンパク質を細胞に導入し得る。
【０２４２】
本開示の製剤の放出特性は、封入材料、封入薬物の濃度、および放出調節剤の存在に依存する。例えば、放出は、例えば、胃にあるような低ｐＨ、または腸にあるような高ｐＨでのみ放出するｐＨ感受性コーティングを使用して、ｐＨ依存性になるように操作され得る。腸溶性コーティングは、胃を通過した後まで放出が起こらないように使用され得る。異なる材料に封入されたシアナミドの複数のコーティングまたは混合物を使用して、胃内で初期放出を得て、続いて腸内で後の放出を得ることができる。放出はまた、塩または細孔形成剤を含むことによっても操作され得、これは、カプセルからの拡散による水取込みまたは薬物の放出を増加させることができる。薬剤の溶解度を修正する賦形剤は、放出速度を制御するためにも使用され得る。マトリックスの分解またはマトリックスからの放出を増強する薬剤も組み込まれ得る。それらは、薬剤に添加され得るか、別個の相として添加され得るか（すなわち、微粒子として）、または化合物に応じてポリマー相で共溶解され得る。ほとんどの場合、量は、０．１〜３０パーセント（ｗ／ｗポリマー）であるべきである。分解促進剤のタイプには、硫酸アンモニウムおよび塩化アンモニウムなどの無機塩、クエン酸、安息香酸、およびアスコルビン酸などの有機酸、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸亜鉛、および水酸化亜鉛などの無機塩基、ならびにプロタミン硫酸塩、スペルミン、コリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、およびトリエタノールアミンなどの有機塩基、ならびにＴｗｅｅｎ（登録商標）およびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）などの界面活性剤が含まれる。マトリックスに微細構造を付加する細孔形成剤（すなわち、無機塩および糖類などの水溶性化合物）が、微粒子として添加される。範囲は典型的には、１〜３０パーセント（ｗ／ｗポリマー）である。
【０２４３】
また、取込みは、腸内の粒子の滞留時間を変化させることによっても操作され得る。これは、例えば、粒子を粘膜接着性ポリマーでコーティングするか、または封入材料として選択することによって達成され得る。例としては、遊離カルボキシル基を有するほとんどのポリマー、例えば、キトサン、セルロース、および特にポリアクリレート（本明細書で使用される場合、ポリアクリレートとは、アクリレート基、ならびにシアノアクリレートおよびメタクリレートなどの修飾アクリレート基を含むポリマーを指す）が挙げられる。
【０２４４】
アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、外科用または医療用のデバイスまたはインプラント内に含まれるように製剤化され得るか、またはそれによって放出されるように適合され得る。ある特定の態様において、インプラントは、アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートでコーティングされ得るか、または別の方法で処理され得る。ｓ例えば、ヒドロゲル、または生体適合性および／もしくは生分解性ポリマーなどの他のポリマーを使用して、本開示の医薬組成物でインプラントをコーティングし得る（すなわち、組成物は、ヒドロゲルまたは他のポリマーを使用して医療デバイスと共に使用するように適合され得る）。医療デバイスを薬剤でコーティングするためのポリマーおよびコポリマーは、当該技術分野で周知である。インプラントの例としては、ステント、薬剤溶出性ステント、縫合糸、人工器官、血管カテーテル、透析カテーテル、血管グラフト、人工心臓弁、心臓ペースメーカー、植込み型除細動器、ＩＶ針、接骨および骨形成用デバイス、例えば、ピン、スクリュー、プレート、および他のデバイス、ならびに創傷治癒のための人工組織マトリックスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４５】
本明細書に提供される方法に加えて、本開示による使用のためのアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、他の医薬品から類推して、ヒトまたは獣医学で使用するための任意の便利な方法で投与するために製剤化され得る。アンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、ならびにそれらの対応する製剤は、単独で、または筋芽細胞移植、幹細胞療法、アミノグリコシド系抗生物質の投与、プロテアソーム阻害剤、および上方制御療法（例えば、ジストロフィンの常染色体パラログであるユートロフィンの上方制御）などの筋ジストロフィーの治療における他の治療戦略と組み合わせて投与されてもよい。
【０２４６】
いくつかの実施形態において、追加の治療薬は、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの投与の前に、それと同時に、またはその後に投与されてもよい。例えば、アンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、ステロイドおよび／または抗生物質と組み合わせて投与されてもよい。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、バックグラウンドステロイド理論（例えば、間欠的または長期／連続的バックグラウンドステロイド療法）を受けている患者に投与される。例えば、いくつかの実施形態において、患者は、アンチセンスオリゴマーの投与前にコルチコステロイドで治療されており、ステロイド療法を受け続けてる。いくつかの実施形態において、ステロイドは、糖質コルチコイドまたはプレドニゾンである。
【０２４７】
記載される投与経路は、当業者が、任意の特定の動物および状態にとって最適な投与経路および任意の投与量を容易に決定することができるため、指針としてのみ意図される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、機能的な新しい遺伝物質を細胞に導入するための複数のアプローチが試みられている（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５−１２８０）。これらのアプローチには、発現する遺伝子の修飾レトロウイルスへの組み込み、（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）上記、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１（１８），ｓｕｐｐｌ．：５０７４Ｓ−５０７９Ｓ）、非レトロウイルスベクター（例えば、アデノ関連ウイルスベクター）への組み込み（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ，６８：１４３−１５５、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：４３１−４３４）、またはリポソームを介した異種プロモーター−エンハンサーエレメントに連結された導入遺伝子の送達（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）、上記、Ｂｒｉｇｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，２９８：２７８−２８１、Ｎａｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１２８５−１２８８、Ｈａｚｉｎｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，４：２０６−２０９、およびＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８４：７８５１−７８５５）、リガンド特異的、カチオン系輸送システムとの結合（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１４６２１−１４６２４）、またはネイキッドＤＮＡ、発現ベクターの使用（Ｎａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）、上記、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６５−１４６８）が含まれる。導入遺伝子の組織への直接注射は、局所発現のみをもたらす（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９２）上記、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）上記、Ｂｒｉｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）上記、Ｎａｂｅｌ（１９９０）上記、およびＨａｚｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）上記）。Ｂｒｉｇｈａｍらのグループ（Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．（１９８９）２９８：２７８−２８１およびＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３９（要約））は、ＤＮＡリポソーム複合体の静脈内または気管内のいずれかの投与後のマウスの肺のｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクションのみを報告している。ヒト遺伝子治療手順のレビュー文献の一例は、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：８０８−８１３である。
【０２４８】
さらなる実施形態において、本開示の医薬組成物は、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ．７，１０９８１（２０１６）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に提供されるように、同じ製剤または別の製剤のいずれかで、本開示の方法において炭水化物と同時投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、５％のヘキソース炭水化物を含んでもよい。例えば、本開示の医薬組成物は、５％のグルコース、５％のフルクトース、または５％のマンノースを含んでもよい。ある特定の実施形態において、本開示の医薬組成物は、２．５％のグルコースおよび２．５％のフルクトースを含んでもよい。いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、５体積％の量で存在するアラビノース、５体積％の量で存在するグルコース、５体積％の量で存在するソルビトール、５体積％の量で存在するガラクトース、５体積％の量で存在するフルクトース、５体積％の量で存在するキシリトール、５体積％の量で存在するマンノース、各々が２．５体積％の量で存在するグルコースとフルクトースの組み合わせ、ならびに５．７体積％の量で存在するグルコース、２．８６体積％の量で存在するフルクトース、および１．４体積％の量で存在するキシリトールの組み合わせから選択される炭水化物を含んでもよい。
【０２４９】
ＩＶ．使用方法
エクソンスキッピングを使用したジストロフィンリーディングフレームの回復
ジストロフィン遺伝子のアウトオブフレーム変異によって引き起こされるＤＭＤの治療に対する潜在的な治療アプローチは、インフレーム変異によって引き起こされるＢＭＤとして既知のより軽度な型のジストロフィン異常症によって示唆される。アウトオブフレーム変異をインフレーム変異に変換する能力は、仮定では、ｍＲＮＡリーディングフレームを保持し、内部で短縮されたが機能的なジストロフィンタンパク質を産生する。本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを、これを達成するように設計した。
【０２５０】
ＰＭＯの標的プレｍＲＮＡ配列でのハイブリダイゼーションは、プレｍＲＮＡスプライシング複合体の形成を妨げ、成熟ｍＲＮＡからエクソン５３を欠失させる。本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの構造および配座により、相補的配列に対する配列特異的塩基対合が可能となる。類似の機構により、例えば、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１をスキップするよう設計されたＰＭＯであるエテプリルセンは、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１に含有される相補的配列に対する配列特異的塩基対合を可能にする。
【０２５１】
全ての７９個のエクソンを含有する正常なジストロフィンｍＲＮＡは、正常なジストロフィンタンパク質を産生する。図１の図は、エクソン４７からエクソン５３までのジストロフィンプレｍＲＮＡおよび成熟ｍＲＮＡの小さい区分を示す。各エクソンの形状は、コドンがどのようにエクソン間で分割されるかを示す。注目すべきことに、１つのコドンは、３つのヌクレオチドからなる。長方形のエクソンは、完全なコドンで始まり、終わる。矢印形状のエクソンは、完全なコドンで始まるが、コドンのヌクレオチド＃１のみを含有する分割コドンで終わる。このコドンのヌクレオチド＃２および＃３は、シェブロン形状で始まる後続のエクソンに含有される。
【０２５２】
ジストロフィン遺伝子からエクソン全体を失っているジストロフィンｍＲＮＡは、典型的には、ＤＭＤをもたらす。図２の図は、ＤＭＤをもたらすことが知られている遺伝子変異のタイプ（エクソン５０の欠失）を示す。エクソン４９が完全なコドンで終了し、エクソン５１がコドンの第２のヌクレオチドで始まるため、エクソン４９の後のリーディングフレームはシフトされ、アウトオブフレームｍＲＮＡリーディングフレーム、および変異の下流の誤ったアミノ酸の組み込みをもたらす。その後、機能的なＣ末端ジストログリカン結合ドメインの非存在により、不安定なジストロフィンタンパク質が産生される。
【０２５３】
エテプリルセンは、エクソン５１をスキップして、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させる。エクソン４９が完全なコドンで終了し、エクソン５２がコドンの第１のヌクレオチドで始まるため、エクソン５１の欠失は、リーディングフレームを回復させ、「インフレーム」ＢＭＤ変異に類似した、無傷のジストログリカン結合部位を有する内部で短縮されたジストロフィンタンパク質の産生をもたらす（図３）。
【０２５４】
ジストロフィンｍＲＮＡオープンリーディングフレームを回復させるためにエクソンスキッピングを使用してＤＭＤ表現型を改善する実現可能性は、非臨床試験で裏付けられている。ＤＭＤのジストロフィー動物モデルにおける多くの研究は、エクソンスキッピングによるジストロフィンの回復が、筋力と筋機能の確実な改善をもたらすことを示している（Ｓｈａｒｐ  ２０１１、Ｙｏｋｏｔａ  ２００９、Ｗｕ  ２００８、Ｗｕ  ２０１１、Ｂａｒｔｏｎ−Ｄａｖｉｓ  １９９９、Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ  ２００４、Ｇｒｅｇｏｒｅｖｉｃ  ２００６、Ｙｕｅ  ２００６、Ｗｅｌｃｈ  ２００７、Ｋａｗａｎｏ  ２００８、Ｒｅａｙ  ２００８、ｖａｎ  Ｐｕｔｔｅｎ  ２０１２）。この説得力のある例は、エクソンスキッピング（ＰＭＯ使用）療法後のジストロフィンレベルを同じ組織の筋機能と比較した研究から得られるものである。ジストロフィーｍｄｘマウスでは、マウスに特異的なＰＭＯで処置した前脛骨筋（ＴＡ）筋が、ストレス誘導性収縮後にその最大許容力の約７５％を維持したのに対し、未処置の対側ＴＡ筋は、その最大許容力の約２５％しか維持しなかった（ｐ＜０．０５）（Ｓｈａｒｐ２０１１）。別の研究では、３匹のジストロフィーＣＸＭＤイヌが、２〜５ヵ月齢において、週１回で５〜７週間または隔週で２２週間、その遺伝子変異に対するＰＭＯ特異性を使用したエクソンスキッピング療法を受けた。エクソンスキッピング療法後、３匹のイヌ全てが、骨格筋におけるジストロフィンの広範囲の全身に及ぶ発現、ならびにベースラインと比較した歩行（１５ｍのランニング試験）の維持または改善を示した。対照的に、未処置の同齢のＣＸＭＤイヌは、研究にわたって歩行の著しい低下を示した（Ｙｏｋｏｔａ  ２００９）。
【０２５５】
ヒトＤＭＤ転写物全体を発現させるｍｄｘマウスおよびヒト化ＤＭＤ（ｈＤＭＤ）マウスモデルの両方において、ＰＭＯは、ホスホロチオエートよりも等モル濃度で多くのエクソンスキッピング活性を有することが示された（Ｈｅｅｍｓｋｉｒｋ  ２００９）。エクソン５１のスキッピングに適している異なる変異を有するＤＭＤ患者由来の正常なヒト骨格筋細胞または筋細胞における逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）およびウェスタンブロット（ＷＢ）を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験は、エテプリルセン（ＰＭＯ）をエクソン５１のスキッピングの強力な誘導剤として特定した。エテプリルセン誘導エクソン５１のスキッピングは、ｈＤＭＤマウスモデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで確認されている（Ａｒｅｃｈａｖａｌａ−Ｇｏｍｅｚａ  ２００７）。
【０２５６】
ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３の標的領域に相補的であり、エクソン５３のスキッピングを誘導する、アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの効果を分析するための臨床転帰は、ジストロフィン陽性線維（ＰＤＰＦ）の割合、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）、歩行不能（ＬＯＡ）、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）、肺機能検査（ＰＦＴ）、外部の支持なしで（仰臥位から）立ち上がる能力、デノボジストロフィン産生、および他の機能的尺度を含む。
【０２５７】
いくつかの実施形態において、本開示は、エクソン５３のスキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象においてジストロフィンを産生するための方法を提供し、方法は、本明細書に記載されるように、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む。ある特定の実施形態において、本開示は、エクソン５３のスキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有するデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を有する対象において、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させて、ジストロフィンタンパク質産生を誘導するための方法を提供する。タンパク質産生は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ウェスタンブロット分析、または免疫組織化学検査（ＩＨＣ）によって測定され得る。
【０２５８】
いくつかの実施形態において、本開示は、エクソン５３のスキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象においてジストロフィンを産生するための方法を提供し、方法は、本明細書に記載されるように、アンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む。ある特定の実施形態において、本開示は、エクソン５３のスキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有するデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を有する対象において、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させて、ジストロフィンタンパク質産生を誘導するための方法を提供する。タンパク質産生は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ウェスタンブロット分析、または免疫組織化学検査（ＩＨＣ）によって測定され得る。
【０２５９】
いくつかの実施形態において、本開示は、ＤＭＤの治療を必要としている対象においてそれを行うための方法を提供し、対象は、エクソン５３のスキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有し、方法は、本明細書に記載されるように、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む。
【０２６０】
いくつかの実施形態において、本開示は、ＤＭＤの治療を必要としている対象においてそれを行うための方法を提供し、対象は、エクソン５３のスキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有し、方法は、本明細書に記載されるように、アンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む。
【０２６１】
様々な実施形態において、対象の治療は、疾患進行の遅延によって測定される。いくつかの実施形態において、対象の治療は、対象における歩行の維持、または対象における歩行不能の低減によって測定される。いくつかの実施形態において、歩行は、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）を使用して測定される。ある特定の実施形態において、歩行は、ノーススタート歩行評価（ＮＳＡＡ）を使用して測定される。
【０２６２】
いくつかの実施形態において、本開示は、ＤＭＤを有する対象において肺機能を維持するか、または肺機能の喪失を低減するための方法を提供し、対象は、エクソン５３のスキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の変異を有し、方法は、本明細書に記載されるように、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む。
【０２６３】
いくつかの実施形態において、本開示は、ＤＭＤを有する対象において肺機能を維持するか、または肺機能の喪失を低減するための方法を提供し、対象は、エクソン５３のスキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の変異を有し、方法は、本明細書に記載されるように、アンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む。
【０２６４】
いくつかの実施形態において、肺機能は、最大呼気圧（ＭＥＰ）として測定される。ある特定の実施形態において、肺機能は、最大吸気圧（ＭＩＰ）として測定される。いくつかの実施形態において、肺機能は、努力肺活量（ＦＶＣ）として測定される。
【０２６５】
さらなる実施形態において、本開示の医薬組成物は、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ．７，１０９８１（２０１６）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に提供されるように、同じ製剤または別の製剤のいずれかで、本開示の方法において炭水化物と同時投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、５％のヘキソース炭水化物と同時投与されてもよい。例えば、本開示の医薬組成物は、５％のグルコース、５％のフルクトース、または５％のマンノースと同時投与されてもよい。ある特定の実施形態において、本開示の医薬組成物は、２．５％のグルコースおよび２．５％のフルクトースと同時投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、５体積％の量で存在するアラビノース、５体積％の量で存在するグルコース、５体積％の量で存在するソルビトール、５体積％の量で存在するガラクトース、５体積％の量で存在するフルクトース、５体積％の量で存在するキシリトール、５体積％の量で存在するマンノース、各々が２．５体積％の量で存在するグルコースとフルクトースの組み合わせ、ならびに５．７体積％の量で存在するグルコース、２．８６体積％の量で存在するフルクトース、および１．４体積％の量で存在するキシリトールの組み合わせから選択される炭水化物と同時投与されてもよい。
【０２６６】
様々な実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、治療有効量の非ステロイド性抗炎症化合物と同時投与される。いくつかの実施形態において、非ステロイド性抗炎症化合物は、ＮＦ−ｋＢ阻害剤である。例えば、いくつかの実施形態において、ＮＦ−ｋＢ阻害剤は、ＣＡＴ−１００４またはその薬学的に許容される塩であってもよい。様々な実施形態において、ＮＦ−ｋＢ阻害剤は、サリチル酸塩およびＤＨＡのコンジュゲートであってもよい。いくつかの実施形態において、ＮＦ−ｋＢ阻害剤は、ＣＡＴ−１０４１またはその薬学的に許容される塩である。ある特定の実施形態において、ＮＦ−ｋＢ阻害剤は、サリチル酸塩およびＥＰＡのコンジュゲートである。様々な実施形態において、ＮＦ−ｋＢ阻害剤は、
【化６７】
2021521794.tif 000080
、またはその薬学的に許容される塩である。
【０２６７】
いくつかの実施形態において、非ステロイド性抗炎症化合物は、ＴＧＦ−ｂ阻害剤である。例えば、ある特定の実施形態において、ＴＧＦ−ｂ阻害剤は、ＨＴ−１００である。
【０２６８】
ある特定の実施形態において、療法で使用するための、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートが記載されている。ある特定の実施形態において、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療で使用するための、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートが記載されている。ある特定の実施形態において、療法で使用するための薬剤の製造で使用するための、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートが記載されている。ある特定の実施形態において、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のための薬剤の製造で使用するための、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートが記載されている。
【０２６９】
Ｖ．キット
本開示はまた、遺伝的疾患を有する患者の治療のためのキットを提供し、このキットは、好適な容器に包装された、少なくともアンチセンス分子（例えば、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲート）を、その使用についての説明書と共に備える。キットは、緩衝液、安定剤などの周辺試薬も含み得る。当業者であれば、上記方法の用途が、多くの他の疾患の治療で使用するのに適したアンチセンス分子を同定するために幅広い用途を有することを理解するべきである。一実施形態において、キットは、式（ＩＩＩ）によるアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを含む。一実施形態において、キットは、式（Ｖ）によるアンチセンスオリゴマーを含む。
【実施例】
【０２７０】
上記の開示は、理解を明確にする目的で、例示および実施例によってある程度詳細に記載されてきたが、本開示の教示を踏まえて、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、ある特定の変更および修正がそれに対してなされ得ることは、当業者に容易に明らかになるであろう。以下の実施例は、例示としてのみ提供されるものであり、限定するものではない。当業者であれば、実質的に類似した結果をもたらすように変更または修正され得る様々な重要ではないパラメータを容易に認識するであろう。
【０２７１】
材料および方法
細胞および組織培養処理条件
分化ヒト筋細胞（ＺｅｎＢｉｏ，Ｉｎｃ．）を利用して、エクソンスキッピングを測定した。具体的には、筋芽細胞（ＺｅｎＢｉｏ，Ｉｎｃ．、ＳＫＢ−Ｆ）を、成長培地中（ＳＫＢ−Ｍ、ＺｅｎＢｉｏ，Ｉｎｃ．）中で３７℃および５％のＣＯ２において８０〜９０％コンフルエントに成長させた。成長培地を分化培地（ＳＫＭ−Ｄ、ＺｅｎＢｉｏ，Ｉｎｃ．）と置き換えることによって分化を開始した。エクソン５３スキッピングをアッセイするために、１×１０４個の分化細胞を２４ウェルプレートに播種し、様々な濃度のＰＭＯまたはＰＰＭＯを含む１ｍＬの分化培地（ＳＫＭ−Ｄ、ＺｅｎＢｉｏ，Ｉｎｃ．）を各ウェルに添加し、９６時間インキュベートした。
【０２７２】
ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロット分析のために、１３３μＬの緩衝液中、直径約５ｍｍで９〜１８×２０μｍの組織切片の比率において、均質化緩衝液（４％のＳＤＳ、４Ｍ尿素、１２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８））を用いて組織を均質化した。対応する溶解物を採取し、製造業者の説明書に従ってＲＣ  ＤＣタンパク質アッセイキット（ＢｉｏＲａｄカタログ番号５００−０１２２）を使用して、タンパク質定量化に供した。組織抽出物試料を、ＢＳＡ標準曲線の範囲内に入るように、均質化緩衝液を使用して１：１０に希釈した。２５μｌのタンパク質溶解物、７μｌのＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ試料緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号ＮＰ０００８、Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）、および３μｌのＮｕＰＡＧＥ還元剤（１０ｘ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号ＮＰ０００４）を使用して、３５μｌの試料が所望の量のタンパク質を含有するように、試料を調製した。タンパク質試料を９５℃で５分間加熱した後、試料を遠心分離し、ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  １０ウェル、１ｍｍ、ミニ３〜８％ポリアクリルアミドトリス−酢酸塩ゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号ＥＡ０３７５）上に、１レーン当たり最大５０μｇの全タンパク質装填量で上清を装填した。ゲルを、色素前面がゲルから流出するまで、室温において１５０ボルトで泳動した。得られたタンパク質ゲルを、ＮｕＰＡＧＥ転写緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＮＰ００６−１）、１０％メタノール、および０．１％  ＮｕＰＡＧＥ酸化防止剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＮＰ０００５）を使用して、３０ボルトで、室温において７５分間、ＰＶＤＦ膜（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号ＬＣ２００７）に移した。
【０２７３】
タンパク質転写後、ＰＶＤＦ膜をＴＴＢＳ緩衝液（１Ｘ  ＴＢＳ（Ａｍｒｅｓｃｏカタログ番号Ｊ６４０−４Ｌ）、０．１％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）に浸漬した。膜をブロッキング緩衝液（ＴＴＢＳ中の５％（ｗ／ｖ）非脂肪乾燥乳（Ｌａｂ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ｍ０８４１））に移し、静かに揺動させながら４℃で一晩浸した。ブロッキング後、膜を、ブロッキング緩衝液を使用して１：２０に希釈したＤＹＳ１（Ｌｅｉｃａカタログ番号ＮＣＬ−ＤＹＳ１）中で室温において６０分間、またはブロッキング緩衝液で１：１００，０００に希釈した抗−α−アクチニン抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号ＮＡ９３１Ｖ）中で室温において２０分間のいずれかでインキュベートし、続いて６回洗浄した（ＴＴＢＳで各５分間）。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号ＮＡ９３１Ｖ）にコンジュゲートした抗マウスＩｇＧを、ブロッキング緩衝液を使用して１：４０，０００に希釈し、膜に４５分間（ＤＹＳ１）または１５分間（α−アクチニン）添加し、続いて再び６回洗浄した。ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号ＲＰＮ２２３２）を使用して、フィルムをゲルに曝露し、それに応じて現像した。現像したフィルムを、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  Ｐｌｕｓソフトウェア（バージョン８．１）を使用してスキャンおよび分析し、Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用して線形回帰分析を実施した。
【０２７４】
各ウェスタンブロットゲルは、例えば６４％、１６％、４％、１％、および０．２５％に希釈した正常組織（マウス大腿四頭筋、横隔膜、または心臓）から抽出され（例えば、図５Ａおよび図５Ｂを参照）、ＤＭＤ組織（例えば、ｍｄｘマウス大腿四頭筋、横隔膜、もしくは心臓、またはＮＨＰ大腿四頭筋、横隔膜、もしくは平滑筋（ＧＩ））抽出物にスパイクした、総タンパク質を使用して調製された４点または５点のジストロフィン標準曲線を含む。標準曲線試料を、上記のように処理した。ジストロフィンバンド強度をゲル標準曲線と比較することによって、野生型ジストロフィンレベルのパーセント（％ＷＴ）としてのジストロフィンタンパク質レベルを決定した。
【０２７５】
ＲＴ−ＰＣＲ分析
ＲＴ−ＰＣＲ分析のために、製造業者のプロトコルに従ってＩｌｌｕｓｔｒａ  ＧＥスピンキットを使用して、ＲＮＡを細胞から単離した。ＲＮＡの濃度および純度を、ＮａｎｏＤｒｏｐを使用して決定した。エクソン５３のスキッピングを、エクソン５１／５２接合部および５４配列番号７４（５’−ＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣＡＡ−３’）を結合する順方向プライマーと、エクソン５１／５２接合部および５４配列番号  ７５（５’−ＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＣＡＡＧＴＣＡ−３’）を結合する逆方向プライマーとを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。スキップされたエクソン５３は、２０１ｂｐのアンプリコンを生じ、スキップされていないエクソン５３は、４１３ｂｐのアンプリコンを生じさせた。
マウスエクソン２３のスキッピングを、順方向プライマー配列番号７６（５’−ＣＡＣＡＴＣＴＴＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＡＧＧ−３’）、および逆方向プライマー配列番号７７（５’−ＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＴＣＣＡＴＴＴＣＴＧ−３’）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。
【０２７６】
ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲに供した後、ゲルキャピラリー電気泳動を使用するＣａｌｉｐｅｒ装置を使用して、試料を分析した。エクソンスキッピング率を、以下の方程式を使用して計算した：（スキップされたバンドの曲線下面積）／（スキップされたバンドおよびスキップされていないバンドの曲線下面積の合計）×１００。
【０２７７】
免疫組織化学検査：ジストロフィン染色：
マウス大腿四頭筋の１０ミクロンの凍結組織切片を使用して、ＰＢＳ中１０％ヤギ血清＋１％  ＢＳＡ中のジストロフィン一次抗体（希釈１：２５０、ウサギ、Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１５２７７）、および１０％ヤギ血清＋１％  ＢＳＡ中の二次抗体Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒｏ  ４８８ヤギ抗ウサギ（希釈１：１０００）によって、ジストロフィンを検出した。
【０２７８】
モルホリノサブユニットの調製
【化６８−１】
2021521794.tif 000081
【化６８−２】
2021521794.tif 000082
スキーム１を参照すると、Ｂは、塩基対合部分を表し、モルホリノサブユニットは、示されるように、対応するリボヌクレオシド（１）から調製されてもよい。モルホリノサブユニット（２）は、好適な保護基前駆体、例えば、塩化トリチルとの反応によって任意に保護されてもよい。３’保護基は概して、以下により詳細に記載されるように、固体オリゴマー合成中に除去される。塩基対合部分は、固相オリゴマー合成に対して好適に保護され得る。好適な保護基としては、アデニンおよびシトシンに対するベンゾイル、グアニンに対するフェニルアセチル、およびヒポキサンチン（Ｉ）に対するピバロイルオキシメチルが挙げられる。ピバロイルオキシメチル基は、ヒポキサンチン複素環塩基のＮ１位置に導入され得る。保護されていないヒポキサンチンサブユニットが用いられてもよいが、活性化反応における収率は、塩基が保護されている場合にはるかに優れている。他の好適な保護基には、米国特許第８，０７６，４７６号に開示されているものが含まれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２７９】
活性化されたリン化合物４と３の反応は、所望のリンケージ部分５を有するモルホリノサブユニットをもたらす。
【０２８０】
構造４の化合物は、当業者に既知の様々な方法を使用して調製され得る。次いで、モルホリノ部分とのカップリングは、上記に概説されるとおりに進む。
【０２８１】
構造５の化合物は、サブユニット間リンケージを含むオリゴマーを調製するための固相オリゴマー合成に使用され得る。そのような方法は、当該技術分野で周知である。簡潔に、構造５の化合物は、５’末端で修飾されて、固体支持体へのリンカーを含有してもよい。一旦支持されると、５の保護基（例えば、３’末端のトリチル）は除去され、遊離アミンは、構造５の第２の化合物の活性化リン部分と反応する。この配列は、所望の長さのオリゴが得られるまで繰り返される。末端の３’末端の保護基は、３’修飾が所望される場合、除去されるか、またはそのままにされるかのいずれかであってもよい。オリゴは、様々な方法、または固体支持体へのリンケージを切断するための塩基を用いた例示的な処理を使用して、固体支持体から除去され得る。
【０２８２】
本開示の一般的および具体的なモルホリノオリゴマーにおけるモルホリノオリゴマーの調製は、実施例においてより詳細に説明される。
【０２８３】
モルホリノオリゴマーの調製
本開示の化合物の調製は、スキーム２に従って、以下のプロトコルを使用して実施される。
【化６９−１】
2021521794.tif 000083
【化６９−２】
2021521794.tif 000084
【０２８４】
トリチルピペラジンフェニルカルバメート３５の調製：ジクロロメタン中の化合物１１の冷却懸濁液（６ｍＬ／ｇ  １１）に、水中の炭酸カリウム（３．２当量）の溶液（４ｍＬ／ｇ炭酸カリウム）を添加した。この二相混合物に、ジクロロメタン中のクロロギ酸フェニル（１．０３当量）の溶液（２ｇ／ｇクロロギ酸フェニル）をゆっくりと添加した。反応混合物を２０℃に加温した。反応完了時（１〜２時間）に、層を分離した。有機層を水で洗浄し、無水炭酸カリウム上で乾燥させた。生成物３５をアセトニトリルからの結晶化によって単離した。
【０２８５】
カルバメートアルコール３６の調製：水素化ナトリウム（１．２当量）を、１−メチル−２−ピロリジノン中に懸濁した（３２ｍＬ／ｇ水素化ナトリウム）。この懸濁液に、トリエチレングリコール（１０．０当量）および化合物３５（１．０当量）を添加した。得られたスラリーを９５℃に加熱した。反応完了時（１〜２時間）に、混合物を２０℃に冷却した。この混合物に、３０％ジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ｖ：ｖ）および水を添加した。生成物含有有機層を、水性ＮａＯＨ、水性コハク酸、および飽和水性塩化ナトリウムで連続的に洗浄した。生成物３６を、ジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／ヘプタンからの結晶化によって単離した。
【０２８６】
テール酸３７の調製：テトラヒドロフラン中の化合物３６の溶液（７ｍＬ／ｇ  ３６）に、コハク酸無水物（２．０当量）およびＤＭＡＰ（０．５当量）を添加した。混合物を５０℃に加熱した。反応完了時（５時間）に、混合物を２０℃に冷却し、水性ＮａＨＣＯ３を用いてｐＨ８．５に調整した。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを添加し、生成物を水層中に抽出した。ジクロロメタンを添加し、混合物を水性クエン酸でｐＨ３に調整した。生成物含有有機層を、ｐＨ＝３のクエン酸緩衝液と飽和水性塩化ナトリウムの混合物で洗浄した。この３７のジクロロメタン溶液を、化合物３８の調製において単離することなく使用した。
【０２８７】
３８の調製：化合物３７の溶液に、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）（１．０２当量）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．３４当量）、次いで１−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１．１当量）を添加した。混合物を５５℃に加熱した。反応完了時（４〜５時間）に、混合物を２０℃に冷却し、１：１の０．２Ｍクエン酸／ブラインおよびブラインで連続的に洗浄した。ジクロロメタン溶液は、アセトンへの、次いでＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドへの溶媒交換を受け、生成物を、アセトン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドから飽和水性塩化ナトリウム中への沈殿によって単離した。粗生成物を水中で数回再スラリー化して、残留Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよび塩を除去した。
【０２８８】
ＰＭＯ合成方法Ａ：ジスルフィドアンカーの使用
アンカー装填樹脂への活性化「テール」の導入を、固相合成中のサブユニットの組み込みに使用される手順によって、ジメチルイミダゾリジノン（ＤＭＩ）中で実施した。
【化７０】
2021521794.tif 000085
【０２８９】
この手順を、シラン処理したジャケット付きペプチド槽（ＣｈｅｍＧｌａｓｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）内で、粗多孔性（４０〜６０μｍ）ガラスフリット、オーバーヘッド撹拌器、およびテフロン（登録商標）三方活栓を用いて実施して、Ｎ２がフリットまたは真空抽出を通して泡立つことを可能にした。
【０２９０】
以下の手順の樹脂処理／洗浄ステップは、樹脂流動化または撹拌床反応器および溶媒／溶液抽出の２つの基本操作からなる。樹脂流動化については、Ｎ２がフリットを通って上方に流れることを可能にするように活栓を配置し、指定の樹脂処理／洗浄を反応器に加え、樹脂に浸透し、完全に湿らせた。次いで、混合を開始し、樹脂スラリーを所定時間混合した。溶媒／溶液抽出については、混合およびＮ２流動を停止し、真空ポンプを起動し、次いで、樹脂処理／洗浄の廃棄物への排出を可能にするように活栓を配置した。特に記載のない限り、樹脂処理／洗浄体積は全て、１５ｍＬ／ｇの樹脂であった。
【０２９１】
シラン処理したジャケット付きペプチド槽内のアミノメチルポリスチレン樹脂（１００〜２００メッシュ；窒素置換に基づいて約１．０ｍｍｏｌ／ｇ装填；７５ｇ、１当量、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓ，ＵＫ、部品番号１４６４−Ｘ７９９）に、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ；２０ｍＬ／ｇ樹脂）を添加し、樹脂を１〜２時間混合しながら膨潤させた。膨潤溶媒の排出後、樹脂をジクロロメタン（２×１〜２分）、２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中の５％ジイソプロピルエチルアミン（２×３〜４分）、およびジクロロメタン（２×１〜２分）で洗浄した。最終洗浄の排出後、樹脂を、１−メチル−２−ピロリジノン中のジスルフィドアンカー３４の溶液（０．１７Ｍ；１５ｍＬ／ｇ樹脂、約２．５当量）で処理し、樹脂／試薬混合物を４５℃で６０時間加熱した。反応完了時に、加熱を中断し、アンカー溶液を排出し、１−メチル−２−ピロリジノン（４×３〜４分）およびジクロロメタン（６×１〜２分）で樹脂を洗浄した。樹脂を、ジクロロメタン中の１０％（ｖ／ｖ）二炭酸ジエチルの溶液（１６ｍＬ／ｇ、２×５〜６分）で処理し、次いで、ジクロロメタン（６×１〜２分）で洗浄した。樹脂３９を、Ｎ２流下で１〜３時間、次いで、真空下で一定重量（±２％）になるまで乾燥させた。収率：原樹脂重量の１１０〜１５０％
【０２９２】
アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂の装填の決定：樹脂の装填量（潜在的に利用可能な反応部位の数）を、樹脂１グラム当たりのトリフェニルメチル（トリチル）基の数の分光アッセイによって決定する。
【０２９３】
既知の重量の乾燥樹脂（２５±３ｍｇ）をシラン処理した２５ｍＬのメスフラスコに移し、ジクロロメタン中の約５ｍＬの２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を添加する。内容物を穏やかに旋回させて混合し、３０分間放置する。体積は、さらなるジクロロメタン中の２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で最大２５ｍＬになり、内容物を完全に混合する。ポジティブディスプレイスメント式ピペットを使用して、トリチル含有溶液（５００μＬ）のアリコートを１０ｍＬのメスフラスコに移し、その体積をメタンスルホン酸で１０ｍＬにする。
【０２９４】
最終溶液中のトリチルカチオン含有量を、４３１．７ｎｍのＵＶ吸光度によって測定し、樹脂装填量を、適切な体積、希釈、消散係数（ε：４１μｍｏｌ−１ｃｍ−１）、および樹脂重量を使用して、樹脂１グラム当たりのトリチル基（μｍｏｌ／ｇ）で測定する。アッセイを三つ組で実施し、平均装填量を計算する。
【０２９５】
本実施例の樹脂装填手順は、約５００μｍｏｌ／ｇの装填量を樹脂に提供する。ジスルフィドアンカー組み込みステップを室温で２４時間実施する場合、３００〜４００μｍｏｌ／ｇの装填量を得た。
【０２９６】
テール装填量：アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂の調製と同じ設定および体積を使用して、テールを固体支持体に導入することができる。アンカー装填樹脂を最初に酸性条件下で脱保護し、カップリング前に得られた材料を中和した。カップリングステップでは、ジスルフィドアンカー溶液の代わりに、４−エチルモルホリン（ＮＥＭ、０．４Ｍ）を含有するＤＭＩ中の３８の溶液（０．２Ｍ）を使用した。４５℃で２時間後、樹脂３９を２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中の５％ジイソプロピルエチルアミンで２回、およびＤＣＭで１回洗浄した。樹脂に、無水安息香酸（０．４Ｍ）およびＮＥＭ（０．４Ｍ）の溶液を添加した。２５分後、反応器ジャケットを室温に冷却し、樹脂を２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中の５％ジイソプロピルエチルアミンで２回、およびＤＣＭで８回洗浄した。樹脂４０を濾過し、高真空下で乾燥させた。樹脂４０の装填を、テール装填量で使用される元のアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂３９の装填量と定義する。
【０２９７】
固相合成：モルホリノオリゴマーを、２ｍＬのＧｉｌｓｏｎポリプロピレン反応カラム（部品番号３９８０２７０）内のＧｉｌｓｏｎ  ＡＭＳ−４２２  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上で調製した。水流用のチャネルを備えたアルミニウムブロックを、合成器上に置いたときにカラムの周囲に配置した。ＡＭＳ−４２２は別の方法として、試薬／洗浄溶液を添加し、指定の時間保持し、真空を使用してカラムを空にする。
【０２９８】
最大約２５サブユニットの長さの範囲のオリゴマーについては、５００μｍｏｌ／ｇに近い樹脂の装填量を伴うアミノメチルポリスチレンジ−スルフィド樹脂が好ましい。より大きいオリゴマーについては、３００〜４００μｍｏｌ／ｇの樹脂の装填量を伴うアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂が好ましい。５’−テールを有する分子が所望される場合、テールが装填された樹脂は、同じ装填ガイドラインで選択される。
【０２９９】
以下の試薬溶液を調製した：
脱トリチル化溶液：４：１ジクロロメタン／アセトニトリル中の１０％シアノ酢酸（ｗ／ｖ）
中和溶液：３：１ジクロロメタン／イソプロパノール中の５％ジイソプロピルエチルアミン、ならびに
カップリング溶液：１，３−ジメチルイミダゾリジノン中の、所望の塩基およびリンケージタイプの０．１８Ｍ（または２０サブユニットよりも長く成長したオリゴマーについては０．２４Ｍ）活性化モルホリノサブユニット、および０．４Ｍ  Ｎエチルモルホリン。
【０３００】
ジクロロメタン（ＤＣＭ）を、異なる試薬溶液の洗浄を分離する移行洗浄として使用した。
【０３０１】
合成器上で、ブロックを４２℃に設定して、３０ｍｇのアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂（またはテール樹脂）を含む各カラムに、２ｍＬの１−メチル−２−ピロリジノンを点火し、室温で３０分間放置した。２ｍＬのジクロロメタンで２回洗浄した後、以下の合成サイクルを用いた。
【表２８】
2021521794.tif 000086
【０３０２】
個々のオリゴマーの配列を、各カラムが適切な配列中の適切なカップリング溶液（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｉ）を受けるように合成器にプログラムした。カラム内のオリゴマーがその最終サブユニットの組み込みを完了したとき、カラムをブロックから除去し、０．８９Ｍ  ４−エチルモルホリンを含有する４−メトキシトリフェニルメチルクロリド（ＤＭＩ中０．３２Ｍ）から構成されるカップリング溶液を用いて、手動で最終サイクルを実施した。
【０３０３】
樹脂からの切断ならびに塩基および骨格保護基の除去：メトキシトリチル化後、樹脂を２ｍＬの１−メチル−２−ピロリジノンで８回洗浄した。１−メチル−２−ピロリジノン中の０．１Ｍ  １，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）および０．７３Ｍトリエチルアミンからなる１ｍＬの切断溶液を添加し、カラムに蓋をし、室温で３０分間放置した。その後、１２ｍＬのＷｈｅａｔｏｎバイアルに排出した。大きく収縮した樹脂を３００μＬの切断溶液で２回洗浄した。溶液に、４．０ｍＬの濃縮水性アンモニア（−２０℃で保存）を添加し、バイアルにきつく蓋をし（テフロン（登録商標）ライナー付きスクリューキャップで）、混合物を旋回させて溶液を混合した。バイアルを４５℃のオーブン内に１６〜２４時間置き、塩基および骨格保護基の切断をもたらした。
【０３０４】
粗生成物精製：バイアル入りのアンモノリシス溶液をオーブンから取り出し、室温に冷却させた。溶液を２０ｍＬの０．２８％水性アンモニアで希釈し、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ＨＱ樹脂（ＢｉｏＲａｄ）を含む２．５×１０ｃｍのカラムに通した。塩勾配（Ａ：０．２８％アンモニア、Ｂ：０．２８％アンモニア中の１Ｍ塩化ナトリウム、６０分間で０〜１００％  Ｂ）を使用して、メトキシトリチル含有ピークを溶出した。組み合わせた画分をプールし、所望の生成物に応じてさらに処理した。
【０３０５】
モルホリノオリゴマーの脱メトキシトリチル化：Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ精製からのプールされた画分を１ＭのＨ３ＰＯ４で処理して、ｐＨを２．５に低下させた。最初の混合後、試料を室温で４分間放置し、その際に２．８％アンモニア／水でｐＨ１０〜１１に中和した。生成物を固相抽出（ＳＰＥ）によって精製した。
【０３０６】
ＳＰＥカラム充填および調整：Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ  ＣＧ−３００Ｍ（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）（３ｍＬ）を、２０ｍＬフリットカラム（ＢｉｏＲａｄ  Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（７３２−１０１１））に充填し、樹脂を３ｍＬの以下のものですすぐ：０．２８％  ＮＨ４ＯＨ／８０％アセトニトリル；０．５Ｍ  ＮａＯＨ／２０％エタノール；水；５０ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４／８０％アセトニトリル；水；０．５  ＮａＯＨ／２０％エタノール；水；０．２８％  ＮＨ４ＯＨ。
【０３０７】
ＳＰＥ精製：脱メトキシトリチル化からの溶液をカラムに装填し、樹脂を３〜６ｍＬの０．２８％水性アンモニアで３回すすいだ。Ｗｈｅａｔｏｎバイアル（１２ｍＬ）をカラムの下に配置し、生成物を、０．２８％水性アンモニア水中の２ｍＬの４５％アセトニトリルで２回洗浄することによって溶出した。
【０３０８】
生成物単離：溶液をドライアイス中で凍結させ、バイアルを凍結乾燥機に入れ、ふわふわした白色粉末を得た。試料を水に溶解し、０．２２ミクロンのフィルタ（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｃｒｏｄｉｓｃ  ２５ｍｍのシリンジフィルタ、０．２ミクロンのＨＴ  Ｔｕｆｆｒｙｎ膜を備える）を通して、シリンジを使用して濾過し、ＵＶ分光光度計上で光学密度（ＯＤ）を測定して、存在するオリゴマーのＯＤ単位を決定し、かつ分析用の試料を分注した。次いで、溶液を、凍結乾燥のためにＷｈｅａｔｏｎバイアルに戻した。
【０３０９】
ＭＡＬＤＩによるモルホリノオリゴマーの分析：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を使用して、精製物中の画分の組成を決定し、かつオリゴマーの同一性（分子量）の証拠を提供した。３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸（シナピン酸）、３，４，５−トリヒドキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）、またはアルファ−シアノ−４−ヒドキシケイ皮酸（ＨＣＣＡ）の溶液をマトリックスとして用いて希釈した後、試料を実験した。
【表１１】
2021521794.tif 000087
【０３１０】
ＣＰＰコンジュゲート化（以下に開示する配列番号７２および７２）
【化７１】
2021521794.tif 000088
分析手順：マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量スペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を、シナピン酸（ＳＡ）マトリックスを使用して、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｕｔｏｆｌｅｘ（商標）Ｓｐｅｅｄ上で記録した。３０００ダイオードアレイ検出器およびＰｒｏＰａｃＴＭ  ＳＣＸ−２０カラム（２５０×４ｍｍ）を備えたＴｈｅｒｍｏ  Ｄｉｏｎｅｘ  ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００システム上で、１．０ｍＬ／分の流速（ｐＨ＝２、カラム温度３０℃）を使用して、ＳＣＸ−ＨＰＬＣを実施した。移動相は、Ａ（２４ｍＭのＨ３ＰＯ４を含有する水中の２５％アセトニトリル）およびＢ（１ＭのＫＣｌおよび２４ｍＭのＨ３ＰＯ４を含有する水中の２５％アセトニトリル）であった。勾配溶出を用いた：０分、３５％  Ｂ；２分、３５％  Ｂ；２２分、８０％  Ｂ；２５分、８０％  Ｂ；２５．１分、３５％  Ｂ；３０分、３５％  Ｂ。
【０３１１】
ＰＭＯ−Ａ（１．８２ｇ、０．１７７ｍｍｏｌ、２日間の凍結乾燥により新たに乾燥させたもの、以下の表に記載）
【化７２】
2021521794.tif 000089
（式中、１〜２５および５’から３’の各Ｎｕは、（配列番号７８）である）
【表１２】
2021521794.tif 000090
【０３１２】
Ａｃ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号７２）ヘキサトリフルオロ酢酸塩（６１４．７ｍｇ、０．３５４ｍｍｏｌ）、および１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサトリフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ、１３４．４ｍｇ、０．３５４ｍｍｏｌ）の混合物に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、２０ｍＬ）を添加した。混合物を室温で３分間撹拌し、次いで、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、６８．５ｍｇ、０．５３０ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、濁った混合物は、澄明な溶液になった。反応をＳＣＸ−ＨＰＬＣによって監視した。２時間後、２０ｍＬの１０％水酸化アンモニウム溶液（２．８％  ＮＨ３）を添加した。混合物を室温でさらに２時間撹拌した。反応を４００ｍＬの水の添加によって終了した。トリフルオロエタノール（２．０ｍＬ）を溶液に添加した。
【０３１３】
溶液を２つの部分に分割し、各部分をＷＣＸカラム（カラム当たり１０ｇの樹脂）によって精製した。各ＷＣＸカラムを最初に水中の２０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）で洗浄して、ＰＭＯ＃１出発物質を除去した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析がＰＭＯ＃１シグナルの非存在を示したとき、洗浄（各カラムに対して２２５ｍＬ）を中止した。次いで、各カラムを水（カラム当たり１００ｍＬ）で洗浄した。所望の生成物、ＰＰＭＯ＃１を２．０ＭのグアニジンＨＣｌ（各カラムに対して１４０ｍＬ）で溶出した。ＰＰＭＯ＃１の精製溶液を一緒にプールし、次いで２つの部分に分割し、それぞれＳＰＥカラム（各カラムに対して１０ｇの樹脂）によって脱塩した。
【０３１４】
ＳＰＥカラムを、最初に１．０ＭのＮａＣｌ水溶液（各カラムに対して１００ｍＬ）で洗浄して、ＰＰＭＯ＃１の六塩酸塩を生成した。次いで、各ＳＰＥカラムを水（各カラムに対して２００ｍＬ）で洗浄した。最終の脱塩したＰＰＭＯ＃１を、水中の５０％アセトニトリル（ｖ／ｖ、各カラムに対して１５０ｍＬ）によって溶出した。アセトニトリルを減圧下での排出によって除去した。得られた水溶液を凍結乾燥させて、所望のコンジュゲートＰＰＭＯ＃１六塩酸塩（１．９３ｇ、収率９４．５％）を得た。
【０３１５】
実施例１：エクソン５３のｉｎ  ｖｉｔｒｏスキッピング（ＲＤ細胞）
以下の表に記載されるヒトジストロフィン（ＤＭＤ）エクソン５３を標的とするＰＭＯ化合物を、上記の方法に従って合成し、ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞においてＤＭＤエクソン５３スキッピングについて評価した。
【表１３】
2021521794.tif 000091
【０３１６】
具体的には、ヒトＲＤ細胞を、標準的な技術を使用して、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で培養した。凍結乾燥したＰＭＯを約１．０ｍＭでヌクレアーゼフリー水に再懸濁し、モル濃度を検証するために、ＰＭＯ溶液をＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。製造業者の説明書およびＳＧキット（Ｌｏｎｚａ）に従ってヌクレオポレーションを使用して、ＰＭＯをＲＤ細胞に送達した。
【０３１７】
ＰＭＯを、示されている濃度で試験し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中で２４時間培インキュベートした（２４ウェルプレートのウェル当たり４×１０５細胞（ｎ＝３））。ＲＮＡを、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＲＮＡｓｐｉｎ  ９６ウェルＲＮＡ単離キットを使用してＰＭＯ処理細胞から抽出し、以下のように、標準的な技術および示されているエクソン由来のプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲに供した。エクソン５３プライマーは、エクソン５２および５４由来であった。
【０３１８】
Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐバイオアナライザーを使用してスキッピングを測定し、以下の式によりエクソンスキッピング％（すなわち、全長ＰＣＲ産物に対するエクソンスキップされた産物のバンド強度）を計算した：
［エクソン５３スキップされた産物／（エクソン５３スキップされた産物とエクソン５３スキップされていない産物との合計）＊１００］。
結果が以下の表および図ＸおよびＹに示される。
【表１４】
2021521794.tif 000092
【表１５】
2021521794.tif 000093
【０３１９】
実施例２：  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（筋芽細胞）でのエクソン５３スキッピング
以下の表に記載されるヒトジストロフィン（ＤＭＤ）エクソン５３を標的とする実施例１のＰＭＯ化合物および対応するＰＰＭＯ化合物（上記の方法に従って調製）を、健康なヒトの筋芽細胞においてＤＭＤエクソン５３スキッピングについて評価した。
【表１６−１】
2021521794.tif 000094
【表１６−２】
2021521794.tif 000095
【表１６−３】
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【０３２０】
具体的には、健康なヒト筋芽細胞（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．から購入した継代５〜６、ＳＫＢ−Ｆ−ＳＬ）を、約４０％の密集度で播種し、ＳＫＭ−Ｍ培地（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．）中で、様々な濃度（すなわち、４０μｍ、２０μｍ、１０μｍ、５μｍ、２．５μｍ、および１．２５μｍ）のＰＭＯおよびＰＰＭＯで処理する。９６時間のインキュベーション後、筋芽細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＧＥ  ＲＮＡｓｐｉｎ  ９６キット（カタログ番号２５−０５５−７５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中のＲＡ１溶解緩衝液によって溶解する。ＲＮＡを溶出するために４０μＬのＲＮａｓｅフリー水を使用したことを除いて、製造業者の推奨に従って全ＲＮＡを単離する。
【０３２１】
エクソン５３スキッピングを決定するために、２段階エンドポイントＲＴ−ＰＣＲを実施する。具体的には、１１マイクロリットルの全ＲＮＡを、最初に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ合成キット（カタログ番号１８０９１２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、製造業者の説明書に従ってランダムヘキサマーを使用して、ｃＤＮＡに逆転写する。ヒトＤＭＤエクソン５１／５２接合部および５４を標的としたプライマー（順方向プライマー：（配列番号７４）：ＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣＡＡ；逆方向プライマー（配列番号７５）：ＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＣＡＡＧＴＣＡ）を用いて、９μＬのｃＤＮＡをＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（カタログ番号１２５３２０２４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加することによって、ＰＣＲを実施する。ＰＣＲ増幅を、ＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ９６リアルタイムサーモサイクラーを使用して、表２に示されるプログラムを使用して実施する。スキップされたＰＣＲ産物またはスキップされていないＰＣＲ産物の発現を、ＤＮＡ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（ＣＬＳ７６０６７２、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、３２μＬのＰＣＲ産物をＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸシステム上に装填することによって評価する。ＤＭＤエクソン５３スキッピングの割合を、スキップされた（２０１ｂｐ）およびスキップされていない（４１３ｂｐ）バンドの合計モル濃度と比較した、エクソン５３スキップされたバンド（２０１ｂｐ）のモル濃度（ｎｍｏｌ／Ｌ）の割合として計算する。
【０３２２】
群の平均値が各用量において互いに統計的に異なるかどうかを評価するために、両側不対スチューデントｔ検定（等分散的）を使用する。０．０５未満のＰ値は、統計的に有意であると考えられる。
【表１７】
2021521794.tif 000097
【０３２３】
実施例３：ＭＤＸマウス研究
ｍｄｘマウスは、ジストロフィン遺伝子のエクソン２３の変異を含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）について一般に認められ、よく特徴付けられた動物モデルである。Ｍ２３Ｄアンチセンス配列（配列番号７３）は、エクソン２３スキッピングを誘導し、機能的ジストロフィン発現を回復させることが知られている。６〜７週齢のＭＤＸマウスに、４０ｍｇ／ｋｇの用量で、または生理食塩水と共に、以下の表のＰＰＭＯ４２２５またはＰＭＯ４２２５のいずれかの尾静脈への単回注射を与えた。
【表１８】
2021521794.tif 000098
ＰＭＯ４２２５およびＰＰＭＯ４２２５を各々、上記のＰＭＯ方法ＡおよびＣＰＰコンジュゲーション方法によって調製した。
【０３２４】
処置したマウスを、単回投与注射の７、３０、６０、および９０日後に屠殺した（群当たりｎ＝６）。横隔膜、心臓、および右大腿四頭筋を、ジストロフィンタンパク質の産生を測定するためのウェスタンブロット分析、およびエクソンスキッピングの割合を測定するためのＲＴ−ＰＣＲ分析のために処置し、左大腿四頭筋を上記のように免疫組織化学検査およびＨ／Ｅ染色のために処置した。
【０３２５】
ジストロフィンタンパク質回復をウェスタンブロットによって定量化し、エクソン２３スキッピングの割合を上記のように各々ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。
【０３２６】
ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットの結果が、図５Ａ〜図１０Ｂおよび以下の表に示される。驚くべきことに、ＰＰＭＯ４２２５は、ＰＭＯ４２２５と比較して、有意により高く持続的なレベルのジストロフィン回復およびエクソン２３スキッピングを誘導し、最も高いレベルは、注射後３０日目に生じた。さらに驚くべきことに、ＰＭＯ４２２５が心臓内のジストロフィンレベルを増加させなかったときに、ＰＰＭＯ４２２５は、増加させた。ＰＭＯ４２２５では、全ての時点で、心臓内のジストロフィンおよびエクソンスキッピングは観察されなかった。
【表１９】
2021521794.tif 000099
【表２０】
2021521794.tif 000100
【０３２７】
免疫組織化学検査の結果が図１１に示される。ここで、ＰＰＭＯ４２２５は、大腿四頭筋全体にわたってジストロフィンを回復させるが、４２２５は「斑状」の発現パターンをもたらす。ＰＰＭＯ４２２５処置によるジストロフィンの均一な分布は、骨格筋の広範な標的化が達成可能であることを示す。ＰＰＭＯ４２２５は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＰＭＯ４２２５よりも有意に改善された送達を有する。
【０３２８】
実施例４：ＭＤＸマウス用量反応試験
６〜７週齢のＭＤＸマウスに、４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、または１２０ｍｇ／ｋｇの用量で、上記のＰＰＭＯ４２２５またはＰＭＯ４２２５のいずれかの尾静脈への単回注射を与えた（群当たりｎ＝６）。
【０３２９】
処置したマウスを、注射の３０日後に屠殺した。横隔膜、大腿四頭筋、および心臓を、ウェスタンブロット分析のために処置して、以下の修正を伴う上記のウェスタンブロットプロトコル（例えば、実施例３で使用）に基づいて、ジストロフィンタンパク質の産生を測定した。
【表２１】
2021521794.tif 000101
【０３３０】
野生型の割合としてのジストロフィンタンパク質回復が、以下の表および図１２〜図１５に示される。
【表２２】
2021521794.tif 000102
【０３３１】
驚くべきことに、データは、ＰＰＭＯ４２２５の単回投与が、ＰＭＯ４２２５よりも有意にかつ実質的に大きい程度まで、ｍｄｘマウスにおいて用量依存的にジストロフィンレベルを増加させることを示す。
【０３３２】
実施例５：横隔膜および心臓のＭＤＸマウスＩＨＣ研究
６〜７週齢のＭＤＸマウスに、８０ｍｇ／ｋｇまたは生理食塩水の用量でＰＰＭＯ４２２５の尾静脈への単回注射を与え、６〜７週齢の野生型マウスに、生理食塩水の単回注射を与えた。処置したｍｄｘマウス、生理食塩水ｍｄｘマウス、および野生型マウスを、単回投与注射の３０日後に屠殺した（群当たりｎ＝４）。免疫組織化学検査の結果が図１９に示される。ここで、結果は、ＰＰＭＯ４２２５で治療したｍｄｘマウスにおけるＤＭＤの罹患率および死亡率に関連する、組織におけるジストロフィンの均一な増加を示す。
＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊
【０３３３】
本明細書で引用される全ての出版物および特許出願は、各個々の出版物または特許出願が具体的かつ個々に参照によって組み込まれるように指示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
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【表２３−１】
2021521794.tif 000103
【表２３−２】
2021521794.tif 000104
【図１】
2021521794.tif 000127
【図２】
2021521794.tif 000128
【図３】
2021521794.tif 000129
【図４Ａ】
2021521794.tif 000130
【図４Ｂ】
2021521794.tif 000131
【図５Ａ−Ｂ】
2021521794.tif 000132
【図５Ｃ−Ｄ】
2021521794.tif 000133
【図６Ａ−Ｂ】
2021521794.tif 000134
【図７Ａ−Ｂ】
2021521794.tif 000135
【図７Ｃ−Ｄ】
2021521794.tif 000136
【図８Ａ−Ｂ】
2021521794.tif 000137
【図９Ａ−Ｂ】
2021521794.tif 000138
【図９Ｃ−Ｄ】
2021521794.tif 000139
【図１０Ａ−Ｂ】
2021521794.tif 000140
【図１１】
2021521794.tif 000141
【図１２Ａ−Ｂ】
2021521794.tif 000142
【図１３】
2021521794.tif 000143
【図１４Ａ−Ｂ】
2021521794.tif 000144
【図１５】
2021521794.tif 000145
【図１６Ａ−Ｂ】
2021521794.tif 000146
【図１７】
2021521794.tif 000147
【図１８】
2021521794.tif 000148
【配列表】
2021521794000001.app
【誤訳訂正書】
【提出日】令和3年2月10日(2021.2.10)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、
【化７３】
2021521794.tif 000149
またはその薬学的に許容される塩であって、式中、
各Ｎｕが、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｔが、
【化７４】
2021521794.tif 000150
から選択される部分であり、
Ｒ１が、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｚが、１６〜２３の整数であり、
前記標的化配列が、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
前記アニーリング部位は、Ｚが１６であるＨ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＺが２３であるＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択される、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項３】
Ｔが、
【化７５】
2021521794.tif 000151
であり、前記標的化配列および対応するＺが、以下から選択され、
【表２４】
2021521794.tif 000152
Ｘが、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項４】
各Ｘが独立して、Ｔである、請求項３に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項５】
式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、
【化７６】
2021521794.tif 000153
またはその薬学的に許容可能な塩であって、式中、各Ｎｕが、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である標的化配列を一緒になって形成する核酸塩基である、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
前記アニーリング部位は、Ｚが１６であるＨ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＺが２３であるＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択される、請求項５に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項７】
前記標的化配列および対応するＺが、以下から選択され、
【表２５】
2021521794.tif 000154
式中、Ａが
【化７７】
2021521794.tif 000155
であり、Ｃが
【化７８】
2021521794.tif 000156
であり、Ｇが
【化７９】
2021521794.tif 000157
であり、Ｘが
【化８０】
2021521794.tif 000158
である、請求項５に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項８】
各Ｘが独立して、
【化８１】
2021521794.tif 000159
である、請求項７に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項９】
式（ＩＶ）のアンチセンスオリゴマー、
【化８２】
2021521794.tif 000160
またはその薬学的に許容される塩であって、式中、
各Ｎｕが、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｔが、
【化８３】
2021521794.tif 000161
から選択される部分であり、
Ｒ１が、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２が、Ｈまたはアセチルから選択され、
前記標的化配列が、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である、アンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項１０】
前記アニーリング部位は、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＺが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される、請求項９に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項１１】
Ｔが、
【化８４】
2021521794.tif 000162
であり、前記標的化配列および対応するＺが、以下から選択され、
【表２６】
2021521794.tif 000163
Ｘが、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）である、請求項９に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項１２】
各ＸがＴである、請求項１１に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項１３】
式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマー、
【化８５】
2021521794.tif 000164
またはその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒが、Ｈまたはアセチルから選択され、
各Ｎｕが、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である標的化配列を一緒になって形成する核酸塩基である、アンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項１４】
前記アニーリング部位は、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＺが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される、請求項１３に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項１５】
前記標的化配列および対応するＺが、以下から選択され、
【表２７】
2021521794.tif 000165
式中、Ａが
【化８６】
2021521794.tif 000166
であり、Ｃが
【化８７】
2021521794.tif 000167
であり、Ｇが
【化８８】
2021521794.tif 000168
であり、Ｘが
【化８９】
2021521794.tif 000169
である、請求項１３に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項１６】
各Ｘが独立して、
【化９０】
2021521794.tif 000170
である、請求項１５に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、もしくは請求項９〜１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー、またはそれらの薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療を必要としている対象においてそれを行うための方法であって、前記対象が、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有し、前記方法が、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、または請求項９〜１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマーを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１９】
エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させてジストロフィン産生を誘導する方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、または請求項９〜１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマーを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２０】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療を必要としている対象においてそれを行うための方法であって、前記対象が、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有し、前記方法が、請求項１７に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２１】
エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させてジストロフィン産生を誘導する方法であって、請求項１７に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２２】
エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ｍＲＮＡプロセシング中にジストロフィンプレｍＲＮＡからエクソン５３を排除する方法であって、請求項１７に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２３】
エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３を結合する方法であって、請求項１７に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年４月２６日に出願された米国仮出願第６２／６６３，１６２号に対する優先権を主張する。上記の出願の教示全体は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願には、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表が含まれ、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。該ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年４月２２日に作成され、名称が８１６２＿５３＿ＷＯ００＿ＳＬ．ｔｘｔ、サイズが３３，９０６バイトである。
【０００３】
本開示は、ヒトジストロフィン遺伝子中のエクソン５３スキッピングに好適な新規のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、ならびにその医薬組成物に関する。本開示はまた、新規のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを使用してエクソン５３スキッピングを誘導するための方法、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象においてジストロフィンを産生するための方法、ならびにエクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象を治療するための方法も提供する。
【背景技術】
【０００４】
アンチセンス技術は、様々な異なるレベル（転写、スプライシング、安定性、翻訳）で遺伝子発現に影響を及ぼすために、様々な化学を使用して開発されている。その研究のほとんどは、幅広い適応症における異常遺伝子または疾患関連遺伝子を修正または代償するためのアンチセンス化合物の使用に焦点を当てている。アンチセンス分子は、特異性を有して遺伝子発現を阻害することが可能であり、このため、遺伝子発現のモジュレーターとしてのオリゴマーに関する多くの研究努力が、標的遺伝子の発現またはシス作用エレメントの機能を阻害することに焦点を当てている。アンチセンスオリゴマーは典型的には、センス鎖（例えば、ｍＲＮＡ）、または一部のウイルスＲＮＡ標的の場合はマイナス鎖のいずれかのＲＮＡに対するものである。特異的な遺伝子の下方制御の所望の効果を達成するために、オリゴマーは概して、標的ｍＲＮＡの崩壊を促進するか、ｍＲＮＡの翻訳を遮断するか、またはシス作用ＲＮＡエレメントの機能を遮断し、それにより標的タンパク質のデノボ合成またはウイルスＲＮＡの複製のいずれかを効果的に防止する。
【０００５】
しかしながら、そのような技術は、目的が天然タンパク質の産生を上方制御することであるか、またはナンセンス変異またはフレームシフト変異などの翻訳の早期終結を誘導する変異を代償することである場合、有用ではない。これらの場合、欠陥遺伝子転写物は、標的分解または立体阻害に供されるべきではなく、したがって、アンチセンスオリゴマーの化学的性質は、標的ｍＲＮＡの崩壊を促進することも、翻訳を遮断することもするべきではない。
【０００６】
様々な遺伝性疾患において、遺伝子の最終的な発現に対する変異の効果は、スプライシングプロセス中の標的エクソンスキッピングプロセスを通して調節され得る。スプライシングプロセスは、プレｍＲＮＡ中の隣接するエクソン−イントロン接合部をごく接近させ、かつイントロンの末端でホスホジエステル結合の切断を行う複雑な多成分機構によって方向付けられ、一緒にスプライシングされるエクソン間のホスホジエステル結合の後続の再構成を伴う。この複雑かつ高精度なプロセスは、比較的短い半保存的ＲＮＡセグメントであるプレｍＲＮＡの配列モチーフによって媒介され、次いでスプライシング反応に関与する様々な核スプライシング因子が配列モチーフに結合する。スプライシング機構がプレｍＲＮＡプロセシングに関与するモチーフを読み取るまたは認識する方法を変化させることによって、異なるスプライシングされたｍＲＮＡ分子を作り出すことが可能である。ヒト遺伝子の大部分が、正常な遺伝子発現中に選択的にスプライシングされることが認識されているが、関与する機構は特定されていない。Ｂｅｎｎｅｔｔら（米国特許第６，２１０，８９２号）は、標的ＲＮＡのＲＮＡｓｅ  Ｈ媒介切断を誘導しないアンチセンスオリゴマー類似体を使用した野生型細胞ｍＲＮＡプロセシングのアンチセンス調節を記載している。これは、特異的エクソンを欠く選択的にスプライシングされたｍＲＮＡを生成することが可能であることに有用性が見出される（例えば、膜貫通ドメインをコードするエクソンを欠く可溶性ＴＮＦスーパーファミリーアクセプターの生成に関するＳａｚａｎｉ，Ｋｏｌｅ，ｅｔ  ａｌ．２００７に記載されるように）。
【０００７】
正常機能タンパク質が、その中の変異のために早期に終結される場合、アンチセンス技術によって一部の機能タンパク質産生を回復させるための手段は、スプライシングプロセス中の介入を通して可能であることが示されており、また、疾患を引き起こす変異に関連するエクソンが、一部の遺伝子から特異的に欠失され得る場合、同様の天然タンパク質の生物学的特性を有するか、またはエクソンに関連する変異によって引き起こされる疾患を改善するのに十分な生物学的活性を有する短縮型タンパク質産物が、時に産生され得ることが示されている（例えば、Ｓｉｅｒａｋｏｗｓｋａ，Ｓａｍｂａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９６、Ｗｉｌｔｏｎ，Ｌｌｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９９、ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ，Ｂｒｅｍｍｅｒ−Ｂｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．２００１、Ｌｕ，Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３、Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ，Ｊａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４を参照）。Ｋｏｌｅら（米国特許第５，６２７，２７４号、同第５，９１６，８０８号、同第５，９７６，８７９号、および同第５，６６５，５９３号）は、標的のプレｍＲＮＡの崩壊を促進しない修飾アンチセンスオリゴマー類似体を使用して、異常なスプライシングに対抗する方法を開示している。Ｂｅｎｎｅｔｔら（米国特許第６，２１０，８９２号）は、標的ＲＮＡのＲＮＡｓｅ  Ｈ媒介切断を誘導しないアンチセンスオリゴマー類似体を同様に使用した野生型細胞ｍＲＮＡプロセシングのアンチセンス調節を記載している。
【０００８】
標的エクソンスキッピングのプロセスは、多くのエクソンおよびイントロンが存在する、エクソンの遺伝子構成に冗長性がある、または１つ以上の特定のエクソンなしでタンパク質が機能することができる、長い遺伝子において特に有用である可能性がある。様々な遺伝子の変異によって引き起こされる切断に関連する遺伝子疾患の治療のための遺伝子プロセシングを再指向させる努力は、（１）スプライシングプロセスに関与するエレメントと完全もしくは部分的に重複するか、または（２）そのエレメントにおいて起こる特定のスプライシング反応を正常に媒介するスプライシング因子の結合および機能を妨げるためにエレメントに十分に近い位置においてプレｍＲＮＡに結合する、アンチセンスオリゴマーの使用に焦点を当てている。
【０００９】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、タンパク質ジストロフィンの発現の欠陥によって引き起こされる。タンパク質をコードする遺伝子は、ＤＮＡの２００万を超えるヌクレオチドにわたって広げられた７９個のエクソンを含有する。エクソンのリーディングフレームを変化させるか、または停止コドンを導入するか、または全アウトオブフレームエクソン（複数可）の除去もしくは１つ以上のエクソンの重複を特徴とする、任意のエクソンの変異は、機能性ジストロフィンの産生を妨げ、ＤＭＤをもたらす可能性がある。
【００１０】
変異、典型的には１つ以上のエクソンの欠失が、全ジストロフィン転写物に沿った正しいリーディングフレームをもたらし、これにより、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳が早期に終結されない場合、より重症度の低い型の筋ジストロフィーであるベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）が生じることが分かっている。変異したジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングにおける上流および下流のエクソンの結合が、遺伝子の正しいリーディングフレームを維持する場合、結果は、ある程度の活性を保持する短い内部欠失を有するタンパク質をコードするｍＲＮＡであり、ベッカー表現型がもたらされる。
【００１１】
長年にわたって、ジストロフィンタンパク質のリーディングフレームを変化させないエクソン（複数可）の欠失がＢＭＤ表現型を生じさせる一方で、フレームシフトを引き起こすエクソン欠失がＤＭＤを生じさせることが知られている（Ｍｏｎａｃｏ，Ｂｅｒｔｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８８）。一般に、リーディングフレームを変化させ、したがって適切なタンパク質翻訳を中断する点変異およびエクソン欠失を含むジストロフィン変異は、ＤＭＤをもたらす。また、一部のＢＭＤおよびＤＭＤ患者が、複数のエクソンに及ぶエクソン欠失を有することにも留意すべきである。
【００１２】
アンチセンスオリゴリボヌクレオチドを用いた変異体ジストロフィンプレｍＲＮＡスプライシングの調節は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で報告されている（例えば、Ｍａｔｓｕｏ，Ｍａｓｕｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９９１、Ｔａｋｅｓｈｉｍａ，Ｎｉｓｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９５、Ｐｒａｍｏｎｏ，Ｔａｋｅｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．１９９６、Ｄｕｎｃｋｌｅｙ，Ｅｐｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９７；Ｄｕｎｃｋｌｅｙ，Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９８、Ｗｉｌｔｏｎ，Ｌｌｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９９、Ｍａｎｎ，Ｈｏｎｅｙｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００２、Ｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３を参照）。
【００１３】
アンチセンスオリゴマーは、ＤＭＤ遺伝子の変異のスキッピングを誘導するために、プレｍＲＮＡ、典型的にはエクソンの特定の領域を標的とし、それにより、これらのアウトオブフレーム変異をインフレームで回復させて、内部で短縮されたが機能的なジストロフィンタンパク質の産生を可能にするように特別に設計されている。そのようなアンチセンスオリゴマーは、エクソン（いわゆるエクソン内部配列）内、またはエクソンからイントロンの一部分に交差するスプライスドナーもしくはスプライスアクセプター接合部で、完全に標的とすることが知られている。
【００１４】
ＤＭＤに対するそのようなアンチセンスオリゴマーの発見および開発は、過去の研究の一分野である。これらの開発には、（１）ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  ａｎｄ  Ｓａｒｅｐｔａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（本出願の譲受人）：ＷＯ２００６／００００５７、ＷＯ２０１０／０４８５８６、ＷＯ２０１１／０５７３５０、ＷＯ２０１４／１００７１４、ＷＯ２０１４／１５３２４０、ＷＯ２０１４／１５３２２０、（２）Ａｃａｄｅｍｉｓｃｈ  Ｚｉｅｋｅｎｈｕｉｓ  Ｌｅｉｄｅｎ／Ｐｒｏｓｅｎｓａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（現ＢｉｏＭａｒｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）：ＷＯ０２／２４９０６、ＷＯ２００４／０８３４３２、ＷＯ２００４／０８３４４６、ＷＯ２００６／１１２７０５、ＷＯ２００７／１３３１０５、ＷＯ２００９／１３９６３０、ＷＯ２００９／０５４７２５、ＷＯ２０１０／０５０８０１、ＷＯ２０１０／０５０８０２、ＷＯ２０１０／１２３３６９、ＷＯ２０１３／１１２０５３、ＷＯ２０１４／００７６２０、（３）Ｃａｒｏｌｉｎａｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ：ＷＯ２０１２／１０９２９６、（４）Ｒｏｙａｌ  Ｈｏｌｌｏｗａｙ：米国第６１／０９６，０７３号および同第６１／１６４，９７８号、例えば、ＵＳ８，０８４，６０１およびＵＳ２０１７−０２０４４１３の利益を主張し、かつこれらを含む特許および出願（４）ＪＣＲ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｏ：ＵＳ６，６５３，４６６；ＪＰ２０００−１２５４４８、例えば、ＵＳ６，６５３，４６７の利益を主張し、かつこれらを含む特許および出願；ＪＰ２０００−２５６５４７、例えば、ＵＳ６，７２７，３５５の利益を主張し、かつこれらを含む特許および出願；ＷＯ２００４／０４８５７０；（５）Ｎｉｐｐｏｎ  Ｓｈｉｎｙａｋｕ：ＷＯ２０１２／０２９９８６、ＷＯ２０１３／１００１９０、ＷＯ２０１５／１３７４０９、ＷＯ２０１５／１９４５２０、ならびに（６）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｄｅ  Ｍｙｏｌｏｇｉｅ／Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  Ｐｉｅｒｒｅ  ｅｔ  Ｍａｒｉｅ  Ｃｕｒｉｅ／Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ  Ｂｅｒｎ／Ｃｅｎｔｒｅ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ／Ｓｙｎｔｈｅｎａ  ＡＧ：ＷＯ２０１０／１１５９９３、ＷＯ２０１３／０５３９２８からの開発が含まれる。
【００１５】
ＤＭＤ用の細胞膜透過性ペプチドにコンジュゲートされたアンチセンスオリゴマーの発見および開発も、一研究分野であった（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０４８５８６号、Ｗｕ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８１（２）：３９２−４００，２０１２、Ｗｕ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３５（１５）：５１８２−５１９１，２００７、Ｍｕｌｄｅｒｓ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｐｏｓｔｅｒ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｅｒｌｉｎ，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１４、Ｂｅｓｔａｓ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ７６１７５，２０１４、Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１６（９）：１６２４−１６２９，２００８、Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．８５：４４４−４５３，２０１０、Ｍｏｕｌｔｏｎ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ．３５（４）：８２６−８２８，２００７、Ｙｉｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１９（７）：１２９５−１３０３，２０１１、Ａｂｅｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．１４：４５５−４６０，２００８、Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．６０：５１７−５２９，２００８、ＭｃＣｌｏｒｅｙ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１３：１３７３−１３８１，２００６、Ａｌｔｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．１２（２）：１７５−１７７，２００６、およびＹｏｕｎｇｂｌｏｏｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２００７，１８（１），ｐｐ  ５０−６０を参照）。
細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）、例えば、アルギニンに富むペプチドの輸送部分は、例えば、ＣＰＰにコンジュゲートされたアンチセンスオリゴマーの細胞内への透過を強化するのに有効であり得る。
これらの努力にもかかわらず、ジストロフィンを産生し、ＤＭＤを治療するための治療方法に有用な可能性があるエクソン５３および対応する医薬組成物を標的とする、改善されたアンチセンスオリゴマーのニーズが依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第６，２１０，８９２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６２７，２７４号明細書
【特許文献３】米国特許第５，９１６，８０８号明細書
【特許文献４】米国特許第５，９７６，８７９号明細書
【特許文献５】米国特許第５，６６５，５９３号明細書
【特許文献６】米国特許第６，２１０，８９２号明細書
【特許文献７】国際公開第２００６／００００５７号
【特許文献８】国際公開第２０１０／０４８５８６号
【特許文献９】国際公開第２０１１／０５７３５０号
【特許文献１０】国際公開第２０１４／１００７１４号
【特許文献１１】国際公開第２０１４／１５３２４０号
【特許文献１２】国際公開第２０１４／１５３２２０号
【特許文献１３】国際公開第２００２／２４９０６号
【特許文献１４】国際公開第２００４／０８３４３２号
【特許文献１５】国際公開第２００４／０８３４４６号
【特許文献１６】国際公開第２００６／１１２７０５号
【特許文献１７】国際公開第２００７／１３３１０５号
【特許文献１８】国際公開第２００９／１３９６３０号
【特許文献１９】国際公開第２００９／０５４７２５号
【特許文献２０】国際公開第２０１０／０５０８０１号
【特許文献２１】国際公開第２０１０／０５０８０２号
【特許文献２２】国際公開第２０１０／１２３３６９号
【特許文献２３】国際公開第２０１３／１１２０５３号
【特許文献２４】国際公開第２０１４／００７６２０号
【特許文献２５】国際公開第２０１２／１０９２９６号
【特許文献２６】米国特許第８，０８４，６０１号明細書
【特許文献２７】米国特許出願公開第２０１７／０２０４４１３号明細書
【特許文献２８】米国特許第６，６５３，４６６号明細書
【特許文献２９】特開２０００−１２５４４８号公報
【特許文献３０】米国特許第６，６５３，４６７号明細書
【特許文献３１】特開２０００−２５６５４７号公報
【特許文献３２】米国特許第６，７２７，３５５号明細書
【特許文献３３】国際公開第２００４／０４８５７０号
【特許文献３４】国際公開第２０１２／０２９９８６号
【特許文献３５】国際公開第２０１３／１００１９０号
【特許文献３６】国際公開第２０１５／１３７４０９号
【特許文献３７】国際公開第２０１５／１９４５２０号
【特許文献３８】国際公開第２０１０／１１５９９３号
【特許文献３９】国際公開第２０１３／０５３９２８号
【特許文献４０】国際公開第２０１０／０４８５８６号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｓａｚａｎｉ，Ｐ．，Ｒ．Ｋｏｌｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｓｐｌｉｃｅ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＴＮＦ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ．ＰＣＴ  ＷＯ２００７０５８８９４，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ
【非特許文献２】Ｓｉｅｒａｋｏｗｓｋａ，Ｈ．，Ｍ．Ｊ．Ｓａｍｂａｄｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．“Ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｔｈａｌａｓｓｅｍｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９３（２３）：１２８４０−４．
【非特許文献３】Ｗｉｌｔｏｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｆ．Ｌｌｏｙｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．“Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍｄｘ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｍＲＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．”Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ  Ｄｉｓｏｒｄ  ９（５）：３３０−８．
【非特許文献４】ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ，Ｊ．Ｃ．，Ｍ．Ｂｒｅｍｍｅｒ−Ｂｏｕｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＤＭＤ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ．”Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １０（１５）：１５４７−５４．
【非特許文献５】Ｌｕ，Ｑ．Ｌ．，Ｃ．Ｊ．Ｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｍｏｕｎｔｓ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｅｘｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｄｘ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｍｏｕｓｅ．”Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９（８）：１００９−１４．
【非特許文献６】Ｍａｎｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｋ．Ｈｏｎｅｙｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｄｘ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．”Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ４（６）：６４４−５４．
【非特許文献７】Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ，Ａ．，Ａ．Ａ．Ｊａｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）．“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｕｌｔｉｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｍａｋｅｓ  ｍｏｒｅ  ｓｅｎｓｅ．”Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ７４（１）：８３−９２．
【非特許文献８】Ｍａｔｓｕｏ，Ｍ．，Ｔ．Ｍａｓｕｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）．“Ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｍＲＮＡ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｄｕｅ  ｔｏ  ａｎ  ｉｎｔｒａｅｘｏｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｋｏｂｅ．”Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８７（６）：２１２７−３１．
【非特許文献９】Ｔａｋｅｓｈｉｍａ，Ｙ．，Ｈ．Ｎｉｓｈｉｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．“Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｉｎｔｒｏｎ  ｂｙ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ａｎ  ｉｎｔｒａ−ｅｘｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  Ｋｏｂｅ．”Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９５（２）：５１５−２０．
【非特許文献１０】Ｐｒａｍｏｎｏ，Ｚ．Ａ．，Ｙ．Ｔａｋｅｓｈｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ  ａｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｔｏ  ａｎ  ｅｘｏｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．”Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２２６（２）：４４５−９．
【非特許文献１１】Ｄｕｎｃｋｌｅｙ，Ｍ．Ｇ．，Ｉ．Ｃ．Ｅｐｅｒｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．“Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＤＭＤ  ｇｅｎｅ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．”Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １６（７−９）：１６６５−１６６８．
【非特許文献１２】Ｄｕｎｃｋｌｅｙ，Ｍ．Ｇ．，Ｍ．Ｍａｎｏｈａｒａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．“Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｍｄｘ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．”Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ７（７）：１０８３−９０．
【非特許文献１３】Ｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｃ．Ｊ．Ｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．“Ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｇｅｎｅ．”Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ５（６）：５１８−２７．
【非特許文献１４】Ｗｕ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８１（２）：３９２−４００，２０１２
【非特許文献１５】Ｗｕ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３５（１５）：５１８２−５１９１，２００７
【非特許文献１６】Ｍｕｌｄｅｒｓ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｐｏｓｔｅｒ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｅｒｌｉｎ，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１４
【非特許文献１７】Ｂｅｓｔａｓ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ７６１７５，２０１４
【非特許文献１８】Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１６（９）：１６２４−１６２９，２００８
【非特許文献１９】Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．８５：４４４−４５３，２０１０
【非特許文献２０】Ｍｏｕｌｔｏｎ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ．３５（４）：８２６−８２８，２００７
【非特許文献２１】Ｙｉｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１９（７）：１２９５−１３０３，２０１１
【非特許文献２２】Ａｂｅｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．１４：４５５−４６０，２００８
【非特許文献２３】Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．６０：５１７−５２９，２００８
【非特許文献２４】ＭｃＣｌｏｒｅｙ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１３：１３７３−１３８１，２００６
【非特許文献２５】Ａｌｔｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．１２（２）：１７５−１７７，２００６
【非特許文献２６】Ｙｏｕｎｇｂｌｏｏｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２００７，１８（１），ｐｐ  ５０−６０
【発明の概要】
【００１８】
本開示は、ＣＰＰにコンジュゲートされたアンチセンスオリゴマー部分を含むアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。一態様において、本開示は、ヒトジストロフィン遺伝子中でエクソンスキッピングを誘導するために選択された標的に結合することができる１８〜２５個のサブユニットの長さのアンチセンスオリゴマーを提供し、アンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位として指定されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３標的領域に相補的である塩基の配列を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、２０〜２３サブユニットのものである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーの塩基は、モルホリノ環構造に連結され、モルホリノ環構造は、１つの環構造のモルホリノ窒素を隣接する環構造の５’環外炭素に結合するリン含有サブユニット間リンケージによって結合される。ある特定の実施形態において、細胞膜透過性ペプチドは、６アルギニン単位（「Ｒ６」）（配列番号７１）であり、リンカー部分は、グリシンである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、配列番号１〜３５から選択される塩基の配列を含む。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、配列番号３６〜７０から選択される塩基の配列を含む。
【００２１】
別の態様において、本開示は、
ヒトジストロフィン遺伝子中でエクソンスキッピングを誘導するために選択された標的に結合することができる２０〜２３個のサブユニットの長さのアンチセンスオリゴマーを含むアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供し、アンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位として指定されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３標的領域に相補的である塩基の配列を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【００２３】
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーの塩基は、モルホリノ環構造に連結され、モルホリノ環構造は、１つの環構造のモルホリノ窒素を隣接する環構造の５’環外炭素に結合するリン含有サブユニット間リンケージによって結合される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、配列番号１〜２３および２５〜３２から選択される塩基の配列を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、配列番号３６〜５８および６０〜６７から選択される塩基の配列を含む。
【００２４】
様々な態様において、本開示は、式（Ｉ）に従い得るアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、
【化１】
2021521794.tif 000171
またはその薬学的に許容される塩を提供し、式中、
各Ｎｕが、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｔが、
【化２】
2021521794.tif 000172
から選択される部分であり、
Ｒ１が、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
標的化配列は、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である。
【００２５】
別の態様において、本開示は、式（ＩＶ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、
【化３】
2021521794.tif 000173
またはその薬学的に許容される塩を提供し、式中、
各Ｎｕが、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｔが、
【化４】
2021521794.tif 000174
から選択される部分であり、
Ｒ１が、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２が、Ｈまたはアセチルから選択され、
標的化配列は、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である。
【００２６】
別の態様において、本開示は、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートと、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体は、リン酸緩衝液を含む生理食塩水である。別の態様において、本開示は、本開示のアンチセンスオリゴマーと、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体は、リン酸緩衝液を含む生理食塩水である。
【００２７】
別の態様において、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療を必要としている対象においてそれを行うための方法を提供し、対象は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有し、方法は、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを対象に投与することを含む。本開示はまた、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療のための薬剤の製造のための本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの、それを必要としている対象における使用に取り組み、対象は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する。
【００２８】
別の態様において、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療を必要としている対象においてそれを行うための方法を提供し、対象は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有し、方法は、本開示のアンチセンスオリゴマーを対象に投与することを含む。本開示はまた、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療のための薬剤の製造のための本開示のアンチセンスオリゴマーの、それを必要としている対象における使用に取り組み、対象は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する。
【００２９】
別の態様において、本開示は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させてジストロフィン産生を誘導する方法を提供し、方法は、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを対象に投与することを含む。別の態様において、本開示は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ｍＲＮＡプロセシング中にジストロフィンプレｍＲＮＡからエクソン５３を排除する方法を提供し、方法は、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを対象に投与することを含む。別の態様において、本開示は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３を結合する方法を提供し、方法は、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを対象に投与することを含む。
【００３０】
別の態様において、本開示は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させてジストロフィン産生を誘導する方法を提供し、方法は、本開示のアンチセンスオリゴマーを対象に投与することを含む。別の態様において、本開示は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ｍＲＮＡプロセシング中にジストロフィンプレｍＲＮＡからエクソン５３を排除する方法を提供し、方法は、本開示のアンチセンスオリゴマーを対象に投与することを含む。別の態様において、本開示は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象において、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３を結合する方法を提供し、方法は、本開示のアンチセンスオリゴマーを対象に投与することを含む。
【００３１】
別の態様において、本開示は、療法で使用するための、本明細書の本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療で使用するための、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、療法で使用するための薬剤の製造で使用するための、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のための薬剤の製造で使用するための、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。
【００３２】
別の態様において、本開示は、療法で使用するための、本明細書の本開示のアンチセンスオリゴマーを提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療で使用するための、本開示のアンチセンスオリゴマーを提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、療法で使用するための薬剤の製造で使用するための、本開示のアンチセンスオリゴマーを提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のための薬剤の製造で使用するための、本開示のアンチセンスオリゴマーを提供する。
【００３３】
別の態様において、本開示はまた、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療を必要としている対象においてそれを行うためのキットも提供し、対象は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有し、キットは、少なくとも好適な容器に包装された本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートと、その使用のための説明書と、を含む。
【００３４】
別の態様において、本開示はまた、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療
を必要としている対象においてそれを行うためのキットも提供し、対象は、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有し、キットは、少なくとも好適な容器に包装された本開示のアンチセンスオリゴマーと、その使用のための説明書と、を含む。
【００３５】
これらおよび他の目的および特徴は、本開示の以下の詳細な説明が図面と併せて読まれると、より完全に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
本特許または出願ファイルには、カラーによる少なくとも１つの図面が含まれる。カラー図面（複数可）を伴うこの特許または特許出願公報の複写は、請求および必要な料金の支払いに応じて、特許庁により提供される。
【００３７】
【図１】正常なジストロフィンプレｍＲＮＡおよび成熟ｍＲＮＡのセクションを示す。
【図２】異常なジストロフィンプレｍＲＮＡ（ＤＭＤの例）、およびその結果生じる非機能的で不安定なジストロフィンのセクションを示す。
【図３】プレｍＲＮＡの「インフレーム」リーディングの回復である、エクソン５１をスキップするように設計されたエテプリルセンを示す。
【図４Ａ】４Ａおよび４Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した、様々な濃度での本開示のアンチセンスオリゴマーによる健康なヒトのＲＤ細胞におけるエクソン５３スキッピングの割合の棒グラフを提供する。エラーバーは、平均±ＳＤを表す。
【図４Ｂ】４Ａおよび４Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した、様々な濃度での本開示のアンチセンスオリゴマーによる健康なヒトのＲＤ細胞におけるエクソン５３スキッピングの割合の棒グラフを提供する。エラーバーは、平均±ＳＤを表す。
【図５Ａ−Ｂ】図５Ａ〜図５Ｄは、異なる時点［７日目（５Ａ）、３０日目（５Ｂ）、６０日目（５Ｃ）、および９０日目（５Ｄ）］のＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの大腿四頭筋におけるジストロフィンタンパク質を測定する、ウェスタンブロット分析の代表的画像を提供する。
【図５Ｃ−Ｄ】図５Ａ〜図５Ｄは、異なる時点［７日目（５Ａ）、３０日目（５Ｂ）、６０日目（５Ｃ）、および９０日目（５Ｄ）］のＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの大腿四頭筋におけるジストロフィンタンパク質を測定する、ウェスタンブロット分析の代表的画像を提供する。
【図６Ａ−Ｂ】図６Ａは、ウェスタンブロット分析によって決定した、注射後９０日間にわたるｍｄｘマウスの大腿四頭筋におけるＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によって誘導した野生型ジストロフィンの割合を示す線グラフである。図６Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した、注射後９０日間にわたるｍｄｘマウスの大腿四頭筋におけるＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によって誘導したエクソン２３スキッピングの割合を示す線グラフである。
【図７Ａ−Ｂ】図７Ａ〜図７Ｄは、異なる時点［７日目（７Ａ）、３０日目（７Ｂ）、６０日目（７Ｃ）、および９０日目（７Ｄ）］のＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの横隔膜におけるジストロフィンタンパク質を測定する、ウェスタンブロット分析の代表的画像を提供する。
【図７Ｃ−Ｄ】図７Ａ〜図７Ｄは、異なる時点［７日目（７Ａ）、３０日目（７Ｂ）、６０日目（７Ｃ）、および９０日目（７Ｄ）］のＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの横隔膜におけるジストロフィンタンパク質を測定する、ウェスタンブロット分析の代表的画像を提供する。
【図８Ａ−Ｂ】図８Ａは、ウェスタンブロット分析によって決定した、注射後９０日間にわたるｍｄｘマウスの横隔膜におけるＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によって誘導した野生型ジストロフィンの割合を示す線グラフである。図８Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した、注射後９０日間にわたるｍｄｘマウスの横隔膜におけるＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によって誘導したエクソン２３スキッピングの割合を示す線グラフである。
【図９Ａ−Ｂ】図９Ａ〜図９Ｄは、異なる時点［７日目（９Ａ）、３０日目（９Ｂ）、６０日目（９Ｃ）、および９０日目（９Ｄ）］のＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの心臓におけるジストロフィンタンパク質を測定する、ウェスタンブロット分析の代表的画像を提供する。
【図９Ｃ−Ｄ】図９Ａ〜図９Ｄは、異なる時点［７日目（９Ａ）、３０日目（９Ｂ）、６０日目（９Ｃ）、および９０日目（９Ｄ）］のＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの心臓におけるジストロフィンタンパク質を測定する、ウェスタンブロット分析の代表的画像を提供する。
【図１０Ａ−Ｂ】図１０Ａは、ウェスタンブロット分析によって決定した、注射後９０日間にわたるｍｄｘマウスの心臓におけるＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によって誘導した野生型ジストロフィンの割合を示す線グラフである。図１０Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した、注射後９０日間にわたるｍｄｘマウスの心臓におけるＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によって誘導したエクソン２３スキッピングの割合を示す線グラフである。
【図１１】ＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によって誘導したｍｄｘマウスの左大腿四頭筋におけるジストロフィンを示す免疫組織化学分析を提供する。
【図１２Ａ−Ｂ】異なる用量：４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、および１２０ｍｇ／ｋｇの、ＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの心臓におけるジストロフィンタンパク質を測定するウェスタンブロット分析の代表的画像である。
【図１３】異なる用量：４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、および１２０ｍｇ／ｋｇでの注射の３０日後の、ウェスタンブロット分析によって決定した、ｍｄｘマウスの心臓におけるＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によって誘導した野生型ジストロフィンの割合を示す棒グラフである。
【図１４Ａ−Ｂ】図１４Ａ〜図１４Ｂは、異なる用量：４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、および１２０ｍｇ／ｋｇの、ＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの横隔膜におけるジストロフィンタンパク質を測定するウェスタンブロット分析の代表的画像である。
【図１５】異なる用量：４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、および１２０ｍｇ／ｋｇでの注射の３０日後の、ウェスタンブロット分析によって決定した、ｍｄｘマウスの横隔膜におけるＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によって誘導した野生型ジストロフィンの割合を示す棒グラフである。
【図１６Ａ−Ｂ】図１６Ａ〜図１６Ｂは、異なる用量：４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、および１２０ｍｇ／ｋｇでの、ＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）で処置したｍｄｘマウスの大腿四頭筋におけるジストロフィンタンパク質を測定するウェスタンブロット分析の代表的画像である。
【図１７】異なる用量：４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、および１２０ｍｇ／ｋｇでの注射の３０日後の、ウェスタンブロット分析によって決定した、ｍｄｘマウスの大腿四頭筋におけるＰＭＯ（ＰＭＯ４２２５）またはＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によって誘導した野生型ジストロフィンの割合を示す棒グラフである。
【図１８】ｍｄｘマウスおよび野生型マウスにおける生理食塩水と比較して、ＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ４２２５）によって誘導したｍｄｘマウス横隔膜および心臓におけるジストロフィンおよびラミニンを示す、免疫組織化学分析を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本開示の実施形態は、概して、改善されたアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、ならびにヒトジストロフィン遺伝子においてエクソンスキッピングを誘導するように特別に設計されたその使用方法に関する。ジストロフィンは筋機能において重要な役割を果たし、様々な筋肉関連疾患がこの遺伝子の変異型を特徴とする。したがって、ある特定の実施形態において、本明細書に記載される改善されたアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）およびベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）に見られる変異ジストロフィン遺伝子などのヒトジストロフィン遺伝子の変異型においてエクソンスキッピングを誘導する。
【００３９】
変異によって引き起こされる異常なｍＲＮＡスプライシング事象により、これらの変異ヒトジストロフィン遺伝子は、欠陥のあるジストロフィンタンパク質を発現するか、または測定可能なジストロフィンを全く発現しないかのいずれかであり、これは様々な形態の筋ジストロフィーを引き起こす状態である。この状態を治療するために、本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、変異ヒトジストロフィン遺伝子の予めプロセシングされたｍＲＮＡの選択された領域にハイブリダイズし、そうでなければ異常にスプライシングされたジストロフィンｍＲＮＡにおいてエクソンスキッピングおよび差次的スプライシングを誘導し、それにより筋細胞が、機能性ジストロフィンタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写物を産生することを可能にする。ある特定の実施形態において、結果として生じるジストロフィンタンパク質は、必ずしも「野生型」形態のジストロフィンではなく、むしろ、切断されたが機能的な形態のジストロフィンである。
【００４０】
筋細胞における機能性ジストロフィンタンパク質のレベルを高めることによって、これらおよび関連する実施形態は、異常なｍＲＮＡスプライシングによる欠陥のあるジストロフィンタンパク質の発現を特徴とする筋ジストロフィー、特にＤＭＤおよびＢＭＤなどの筋ジストロフィーの形態の予防および治療に有用である。本明細書に記載される特定のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、他のオリゴマーよりも改善されたジストロフィン−エクソン特異的標的化をさらに提供し、それにより、関連する形態の筋ジストロフィーを治療する代替的な方法よりも有意かつ実用的な利点を提供する。
【００４１】
したがって、本開示は、
ヒトジストロフィン遺伝子中でエクソンスキッピングを誘導するために選択された標的に結合することができる１８〜２５個のサブユニットの長さのアンチセンスオリゴマーであって、アニーリング部位として指定されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３標的領域に相補的である塩基の配列を含む、アンチセンスオリゴマーと、
リンカー部分によってアンチセンスオリゴマーにコンジュゲートされた細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）と、を含む、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートに関する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択される。
【００４３】
本開示はまた、ヒトジストロフィン遺伝子中でエクソンスキッピングを誘導するために選択された標的に結合することができる１８〜２３個のサブユニットの長さのアンチセンスオリゴマーに関し、アンチセンスオリゴマーは、アニーリング部位として指定されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３標的領域に相補的である塩基の配列を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【００４５】
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーの塩基は、モルホリノ環構造に連結され、モルホリノ環構造は、１つの環構造のモルホリノ窒素を隣接する環構造の５’環外炭素に結合するリン含有サブユニット間リンケージによって結合される。ある特定の実施形態において、細胞膜透過性ペプチドは、Ｒ６（配列番号７１）であり、リンカー部分は、グリシンである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、配列番号１として指定される塩基の配列を含み、ここで、各チミン塩基（Ｔ）は、任意にウラシル塩基（Ｕ）である。
【００４６】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が、本開示の実施または試験で使用され得るが、好ましい方法および材料が説明される。本開示の目的のために、以下の用語が以下に定義される。
【００４７】
Ｉ．定義
「約」とは、基準の数量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％ほどまで変化する数量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さを意味する。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、別段の定めがない限り、飽和直鎖または分岐炭化水素を指す。ある特定の実施形態において、アルキル基は、第一級、第二級、または第三級炭化水素である。ある特定の実施形態において、アルキル基は、１〜１０個の炭素原子、すなわち、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルを含む。ある特定の実施形態において、アルキル基は、１〜６個の炭素原子、すなわち、Ｃ１〜Ｃ６アルキルを含む。ある特定の実施形態において、アルキル基は、メチル、ＣＦ３、ＣＣｌ３、ＣＦＣｌ２、ＣＦ２Ｃｌ、エチル、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ３、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、および２，３−ジメチルブチルからなる群から選択される。この用語は、ハロゲン化アルキル基を含む、置換アルキル基および非置換アルキル基の両方を含む。ある特定の実施形態において、アルキル基は、フッ素化アルキル基である。アルキル基が置換され得る部分の非限定的な例は、当業者に既知のように、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＧｒｅｅｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１で教示されるように、保護されていないか、または必要に応じて保護されているかのいずれかの、ハロゲン（フルオロ、クロロ、ブロモ、もしくはヨード）、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、サルフェート、ホスホン酸、ホスフェート、またはホスホネートからなる群から選択される。
【００４９】
「エクソン５３スキッピングに適している」とは、対象または患者に関して本明細書で使用される場合、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３のスキッピングがないと、リーディングフレームをアウトオブフレームにし、それによりプレｍＲＮＡの翻訳を妨げ、対象または患者が機能性または半機能性ジストロフィンを産生することをできなくさせる、ジストロフィン遺伝子の１つ以上の変異を有する対象および患者を含むことが意図される。エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異の例としては、例えば、エクソン４２〜５２、エクソン４５〜５２、エクソン４７〜５２、エクソン４８〜５２、エクソン４９〜５２、エクソン５０〜５２、またはエクソン５２の欠失が挙げられる。患者がエクソンスキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有するかどうかを判定することは、十分に当業者の範囲内である（例えば、Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．３０：２９３−２９９、Ｇｕｒｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．２００９；３０（４）６３３−６４０、およびＦｌｅｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８（６）１２１８−１２２３を参照）。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「オリゴマー」という用語は、サブユニット間リンケージによって結合されるサブユニットの配列を指す。ある特定の例において、「オリゴマー」という用語は、「アンチセンスオリゴマー」に関連して使用される。「アンチセンスオリゴマー」について、各サブユニットは、（ｉ）リボース糖またはその誘導体、および（ｉｉ）それらに結合した核酸塩基からなり、これにより、塩基対合部分の状態は、サブユニット、サブユニット間リンケージ、または両方のいずれかが天然に存在しないという条件で、ワトソン−クリック塩基対合によって核酸（典型的にはＲＮＡ）中の標的配列に相補的である塩基配列を形成し、標的配列内で核酸：オリゴマーヘテロ二本鎖を形成する。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴマーはＰＭＯである。他の実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートである。他の実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、または２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）などの架橋核酸（ＢＮＡ）である。追加の例示的な実施形態は、本明細書に記載される。
【００５１】
「相補的な」および「相補性」という用語は、ワトソン−クリック塩基対ルールによって互いに関連する２つ以上のオリゴマー（すなわち、各々が核酸塩基配列を含む）を指す。例えば、核酸塩基配列「Ｔ−Ｇ−Ａ（５’→３’）」は、核酸塩基配列「Ａ−Ｃ−Ｔ（３’→５’）」に相補的である。相補性は、「部分的」であってもよく、所与の核酸塩基配列の全てには満たない核酸塩基が、塩基対合ルールに従って他の核酸塩基配列にマッチされる。例えば、いくつかの実施形態において、所与の核酸塩基配列と別の核酸塩基配列との間の相補性は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％であってもよい。または例を続けると、所与の核酸塩基配列と別の核酸塩基配列との間に「完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）」または「完全（ｐｅｒｆｅｃｔ）」（１００％）な相補性が存在してもよい。核酸塩基配列間の相補性の程度は、配列間のハイブリダイゼーションの効率および強度に有意な影響を与える。
【００５２】
「有効量」および「治療有効量」という用語は、本明細書において互換的に使用され、所望の治療効果をもたらすのに有効である、単回投与または連続投与のうちの一部のいずれかとして、哺乳動物対象に投与される、アンチセンスオリゴマーなどの治療化合物の量を指す。アンチセンスオリゴマーについて、この効果は典型的には、選択された標的配列の翻訳または天然のスプライスプロセシングを阻害することによって、または臨床的に意味のある量のジストロフィン（統計的有意性）を産生することによってもたらされる。
【００５３】
いくつかの実施形態において、有効量は、対象を治療するための期間にわたって、アンチセンスオリゴマーを含む少なくとも１０ｍｇ／ｋｇまたは少なくとも２０ｍｇ／ｋｇの組成物である。いくつかの実施形態において、有効量は、対象におけるジストロフィン陽性線維の数を正常の少なくとも２０％に増加させるための、アンチセンスオリゴマーを含む少なくとも２０ｍｇ／ｋｇの組成物である。ある特定の実施形態において、有効量は、健康な同等者と比較して患者において、例えば６ＭＷＴで２０％の不足から歩行距離を安定化、維持、または改善するための、アンチセンスオリゴマーを含む１０ｍｇ／ｋｇまたは少なくとも２０ｍｇ／ｋｇの組成物である。様々な実施形態において、有効量は、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、または約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、有効量は、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、または約５０ｍｇ／ｋｇである。別の態様において、有効量は、少なくとも２４週間、少なくとも３６週間、または少なくとも４８週間にわたって、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、または約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇであり、それにより、対象におけるジストロフィン陽性線維の数を正常の少なくとも２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％に増加させ、健康な同等者と比較して患者において、例えば６ＭＷＴで２０％の不足から歩行距離を安定化または改善する。いくつかの実施形態において、治療は、患者においてジストロフィン陽性線維の数を正常の２０〜６０％または３０〜５０％に増加させる。
【００５４】
「増強する」もしくは「増強すること」、または「増加させる」もしくは「増加させること」、または「刺激する」もしくは「刺激すること」とは概して、上記のいずれかの１つまたはそれより多いアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは医薬組成物が、アンチセンスオリゴマーなし、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートなし、または対照化合物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、細胞または対象においてより大きい生理学的応答（すなわち、下流効果）をもたらすまたは引き起こす能力を指す。より大きい生理学的応答は、当該技術分野における理解および本明細書の記載から明らかな応答の中でも特に、ジストロフィンタンパク質の機能的形態の発現の増加、または筋組織におけるジストロフィン関連生物活性の増加を含み得る。筋機能の増加も測定され得、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％までの筋機能の増加または改善を含む。機能性ジストロフィンを発現させる筋線維の割合も測定され得、筋線維の約１％、２％、５％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のジストロフィン発現の増加を含む。例えば、２５〜３０％の線維がジストロフィンを発現させる場合、約４０％の筋機能の改善が起こり得ることが示されている（例えば、ＤｅｌｌｏＲｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１２９７９−１２９８４，２００２を参照）。「増加した」または「増強された」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、薬剤の非存在（アンチセンスオリゴマーなしまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートなし）または対照化合物によって産生される量の１．１、１．２、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０またはそれより大きな倍数（例えば、５００、１０００倍、それらの間の、かつ１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）である増加を含み得る。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「機能」および「機能性」などという用語は、生物学的、酵素的、または治療的機能を指す。
【００５６】
「機能性」ジストロフィンタンパク質とは概して、典型的には、ＤＭＤまたはＢＭＤを有する特定の対象に存在するジストロフィンタンパク質の「改変」型または「欠損」型と比較して、そうでなければ筋ジストロフィーに特徴的である筋組織の進行性分解を低減するのに十分な生物学的活性を有するジストロフィンタンパク質を指す。ある特定の実施形態において、機能性ジストロフィンタンパク質は、当該技術分野の通常の技術に従って測定されるように、野生型ジストロフィンのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの生物学的活性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％（それらの間の全ての整数を含む）を有し得る。一例として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの筋培養におけるジストロフィン関連活性は、筋管サイズ、筋原線維の組織化（または崩壊）、収縮活性、およびアセチルコリンアクセプターの自発的クラスター化に従って測定され得る（例えば、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．１１２：２０９−２１６，１９９９を参照）。また、動物モデルは、疾患の病因を研究するための貴重なリソースであり、ジストロフィン関連活性を試験するための手段を提供する。ＤＭＤ研究に最も広く使用されている動物モデルのうちの２つは、ｍｄｘマウスおよびゴールデンレトリバー筋ジストロフィー（ＧＲＭＤ）犬であり、両方ともジストロフィン陰性である（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＆  Ｍｏｒｇａｎ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ  ８４：１６５−１７２，２００３を参照）。これらおよび他の動物モデルが使用されて、様々なジストロフィンタンパク質の機能活性を測定することができる。本開示の特定のエクソンスキッピングアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの投与後に産生される形態などの、切断型ジストロフィンが含まれる。
【００５７】
「ミスマッチ」（複数可）という用語は、塩基対合ルールに従って標的プレｍＲＮＡにマッチしないオリゴマー核酸塩基配列中の１つ以上の核酸塩基（連続的であるか分離しているかにかかわらず）を指す。多くの場合、完全相補性が望ましいが、いくつかの実施形態は、標的プレｍＲＮＡに対して１つ以上、好ましくは６、５、４、３、２、または１つのミスマッチを含み得る。オリゴマー内の任意の位置における変動が含まれる。ある特定の実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、内部の末端変動付近の核酸塩基配列の変動を含み、存在する場合、典型的には、５’および／または３’末端の約６、５、４、３、２、または１個のサブユニット以内にある。
【００５８】
「モルホリノ」、「モルホリノオリゴマー」、および「ＰＭＯ」という用語は、以下の一般構造：
【化５】
2021521794.tif 000175
の、かつＳｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７：１８７−１９５（１９９７）の図２に記載されるような、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーを指す。本明細書に記載されるモルホリノは、上記の一般構造の全ての立体異性体および互変異性体を含む。モルホリノオリゴマーの合成、構造、および結合特性は、米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号、同第５，５０６，３３７号、同第８，０７６，４７６号、および同第８，２９９，２０６号に詳述されており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００５９】
ある特定の実施形態において、モルホリノは、オリゴマーの５’または３’末端で「テール」部分とコンジュゲートされて、その安定性および／または溶解性を高める。例示的なテールは、以下を含む。
【化６】
2021521794.tif 000176
【００６０】
上記の例示的なテール部分のうち、「ＴＥＧ」または「ＥＧ３」は、以下のテール部分を指す。
【化７】
2021521794.tif 000177
【００６１】
上記の例示的なテール部分のうち、「ＧＴ」は、以下のテール部分を指す。
【化８】
2021521794.tif 000178
【００６２】
本明細書で使用される場合、「−Ｇ−Ｒ６」（配列番号７２）および「−Ｇ−Ｒ６−Ａｃ」（配列番号７２）という用語は、互換的に使用され、本開示のアンチセンスオリゴマーにコンジュゲートされたペプチド部分を指す。様々な実施形態において、「Ｇ」は、アミド結合によって「Ｒ６」（配列番号７１）にコンジュゲートされたグリシン残基を表し、各「Ｒ」は、アミド結合によって一緒にコンジュゲートされたアルギニン残基を表し、これにより「Ｒ６」は、アミド結合によって一緒にコンジュゲートされた６個のアルギニン残基（配列番号７１）を意味する。アルギニン残基は、任意の立体配置を有することができ、例えば、アルギニン残基は、Ｌ−アルギニン残基、Ｄ−アルギニン残基、またはＤ−アルギニン残基とＬ−アルギニン残基の混合物であり得る。ある特定の実施形態において、「−Ｇ−Ｒ６」（配列番号７２）または「−Ｇ−Ｒ６−Ａｃ」（配列番号７２）は、本開示のＰＭＯアンチセンスオリゴマーの最も３’のモルホリノサブユニットのモルホリン環窒素にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、「−Ｇ−Ｒ６」（配列番号７２）または「−Ｇ−Ｒ６−Ａｃ」（配列番号７２）は、本開示のアンチセンスオリゴマーの３’末端にコンジュゲートされ、以下の式を有する。
【化９−１】
2021521794.tif 000179
【化９−２】
2021521794.tif 000180
【００６３】
「核酸塩基」（Ｎｕ）、「塩基対合部分」、または「塩基」という用語は、天然に存在するまたは「天然」ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、およびグアニン）で見られるプリンまたはピリミジン塩基、ならびにこれらの天然に存在するプリンおよびピリミジンの類似体を指すために互換的に使用される。これらの類似体は、結合親和性などの改善された特性をオリゴマーに与えることができる。例示的な類似体としては、ヒポキサンチン（イノシンの塩基構成成分）、２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、Ｃ５−プロピニル修飾ピリミジン、１０−（９−（アミノエトキシ）フェノキサジニル）（Ｇ−クランプ）などが挙げられる。
【００６４】
塩基対合部分のさらなる例としては、ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、グアニン、およびヒポキサンチン（イノシン）（アシル保護基によって保護されたそれらのそれぞれアミノ基を有する）、２−フルオロウラシル、２−フルオロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、２，６−ジアミノプリン、アザシトシン、シュードイソシトシンおよびシュードウラシルなどのピリミジン類似体、ならびに８−置換プリン、キサンチン、またはヒポキサンチン（後者の２つは自然分解生成物である）などの他の修飾核酸塩基が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃｈｉｕ  ａｎｄ  Ｒａｎａ，  ＲＮＡ，２００３，９，１０３４−１０４８；Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２２，２１８３−２１９６、およびＲｅｖａｎｋａｒ  ａｎｄ  Ｒａｏ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．７，３１３に開示される修飾核酸塩基もまた企図され、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６５】
塩基対合部分のさらなる例としては、１つ以上のベンゼン環が付加された拡大サイズの核酸塩基が挙げられるが、これらに限定されない。Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ（ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）、Ｋｒｕｅｇｅｒ  ＡＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００７，４０，１４１−１５０、Ｋｏｏｌ，ＥＴ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００２，３５，９３６−９４３、Ｂｅｎｎｅｒ  Ｓ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２００５，６，５５３−５４３、Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００３，７，７２３−７３３、およびＨｉｒａｏ，Ｉ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００６，１０，６２２−６２７（それらの内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載される核酸塩基置き換えは、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートにおいて有用であると考えられる。拡大サイズの核酸塩基の例としては、以下に示されるもの、ならびにその互変異性体が挙げられる。
【化１０】
2021521794.tif 000181
【００６６】
本明細書で使用される場合、「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、通常は注射による、腸内および局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、および胸骨内の注射および注入を含むが、これらに限定されない。
【００６７】
本明細書で使用される場合、構造式内で使用される一組の括弧は、括弧間の構造特徴が繰り返されることを示す。いくつかの実施形態において、使用される括弧は、「［」および「］」であり得、ある特定の実施形態において、繰り返す構造特徴を示すために使用される括弧は、「（」および「）」であり得る。いくつかの実施形態において、括弧間の構造特徴の繰り返し反復数は、括弧の外側に示される数、例えば、２、３、４、５、６、７などである。様々な実施形態において、括弧間の構造特徴の繰り返し反復数は、「Ｚ」などの括弧の外側に示される変数によって示される。
【００６８】
本明細書で使用される場合、構造式内のキラル炭素またはリン原子に描かれた直鎖結合または曲がりくねった（ｓｑｕｉｇｇｌｙ）結合は、キラル炭素またはリンの立体化学が未定義であり、キラル中心の全ての形態を含むことが意図されていることを示す。そのような図の例が以下に示される。
【化１１】
2021521794.tif 000182
【００６９】
「薬学的に許容される」という語句は、物質または組成物が、製剤を含む他の成分ならびに／または治療される対象と化学的および／もしくは毒性学的に適合性がなければならないことを意味する。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という語句は、非毒性、不活性固体、半固体もしくは液体充填剤、希釈剤、封入材料、または任意のタイプの製剤補助剤を意味する。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの例としては、製剤者の判断に従って、糖類、例えば、ラクトース、グルコース、スクロース；デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐剤ワックス；油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油；グリコール、例えば、プロピレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱性物質除去蒸留水；等張生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；非毒性適合性滑沢剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム；着色剤；離型剤；コーティング剤；甘味剤；香味剤；芳香剤；防腐剤；および酸化防止剤がある。
【００７１】
ジストロフィン合成または産生に関する「回復」という用語は、概して、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを用いた治療後の筋ジストロフィー患者における、切断型ジストロフィンを含むジストロフィンタンパク質の産生を指す。いくつかの実施形態において、治療は、患者における新規のジストロフィン産生の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％（それらの間の全ての整数を含む）の増加をもたらす。いくつかの実施形態において、治療は、対象においてジストロフィン陽性線維の数を正常の少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％〜１００％に増加させる。他の実施形態において、治療は、対象においてジストロフィン陽性線維の数を正常の約２０％〜約６０％または約３０％〜約５０％に増加させる。治療後の患者のジストロフィン陽性線維の割合は、既知の技術を使用して筋生検によって決定され得る。例えば、筋生検は、患者の上腕二頭筋などの好適な筋肉から採取され得る。
【００７２】
陽性ジストロフィン線維の割合の分析は、治療前および／もしくは治療後、または治療過程全体を通した時点において実施され得る。いくつかの実施形態において、治療後生検は、治療前生検と対側の筋肉から採取される。治療前および治療後のジストロフィン発現分析は、好適なジストロフィンアッセイを使用して実施され得る。いくつかの実施形態において、免疫組織化学的検出は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などのジストロフィンのマーカーである抗体を使用して、筋生検からの組織切片上で実施される。例えば、ジストロフィンの高感度マーカーであるＭＡＮＤＹＳ１０６抗体が使用され得る。任意の好適な二次抗体が使用されてもよい。
【００７３】
いくつかの実施形態において、ジストロフィン陽性線維の割合は、陽性線維の数をカウントした総線維数で割ることによって計算される。正常な筋肉試料は、１００％ジストロフィン陽性の線維を有する。したがって、ジストロフィン陽性線維の割合は、正常の割合として表され得る。治療前の筋肉ならびに復帰突然変異線維におけるジストロフィンの微量レベルの存在を制御するために、治療後の筋肉におけるジストロフィン陽性線維をカウントする際に、患者からの治療前の筋肉切片を使用してベースラインが設定され得る。これは、その患者の治療後の筋肉切片におけるジストロフィン陽性線維をカウントするための閾値として使用され得る。他の実施形態において、抗体で染色された組織切片は、Ｂｉｏｑｕａｎｔ画像分析ソフトウェア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）を使用したジストロフィン定量にも使用され得る。ジストロフィン蛍光シグナルの総強度は、正常の割合として報告され得る。また、モノクローナルまたはポリクローナル抗ジストロフィン抗体を用いたウェスタンブロット分析を使用して、ジストロフィン陽性線維の割合を決定することができる。例えば、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの抗ジストロフィン抗体ＮＣＬ−Ｄｙｓ１が使用され得る。また、ジストロフィン陽性線維の割合は、サルコグリカン複合体（β，γ）および／または神経ＮＯＳの構成成分の発現を決定することによっても分析され得る。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを用いた治療は、治療なしで予想されるＤＭＤ患者における進行性呼吸筋機能障害および／または不全を遅らせるか、または低減する。いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを用いた治療は、治療なしで予想される換気補助の必要性を低減または排除し得る。いくつかの実施形態において、疾患の経過を追跡するための呼吸機能の測定、ならびに可能性のある治療介入の評価には、最大吸気圧（ＭＩＰ）、最大呼気圧（ＭＥＰ）、および努力肺活量（ＦＶＣ）が含まれる。ＭＩＰおよびＭＥＰは、吸入および呼気中に人が発生させることができる圧力レベルをそれぞれ測定し、呼吸筋力の感度尺度である。ＭＩＰは、横隔膜の筋力低下の尺度である。
【００７５】
いくつかの実施形態において、ＭＩＰおよびＦＶＣを含む他の肺機能検査における変化の前に、ＭＥＰは低下し得る。ある特定の実施形態において、ＭＥＰは、呼吸機能障害の早期指標であり得る。ある特定の実施形態において、ＦＶＣは、最大吸気後の強制呼気中に排出される空気の総体積を測定するために使用され得る。ＤＭＤ患者では、ＦＶＣは、１０代前半まで身体的成長と同時に増加する。しかしながら、成長が病気の進行によって遅くなるまたは不良になり、筋力低下が進行すると、肺活量は下降期に入り、１０〜１２歳の後、年間約８〜８．５パーセントの平均速度で低下する。ある特定の実施形態において、予測ＭＩＰパーセント（ＭＩＰは体重で調整）、予測ＭＥＰパーセント（ＭＥＰは年齢で調整）、および予測ＦＶＣパーセント（ＦＶＣは年齢および身長で調整）は、支持的分析である。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、ＤＭＤもしくはＢＭＤ、またはこれらの状態に関連する症状のいずれか（例えば、筋線維の消失）を有する、またはそのリスクがある対象（または患者）など、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートで治療され得る症状を示す、または症状を示すリスクがある任意の動物を含む。好適な対象（または患者）には、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど）、家畜、および家庭用動物またはペット（ネコまたはイヌなど）が含まれる。非ヒト霊長類、および好ましくはヒト患者（または対象）が含まれる。また、エクソン５１スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象（または患者）において、ジストロフィンを産生する方法も含まれる。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」、および「末梢に投与される」という語句は、化合物、薬物、または他の物質の中枢神経系への直接以外の投与を意味し、これによりそれが患者の系に入り、したがって代謝および他の類似のプロセス、例えば、皮下投与の対象となる。
【００７８】
「標的化配列」という語句は、標的プレｍＲＮＡ中のヌクレオチドの配列に相補的であるオリゴマーの核酸塩基の配列を指す。本開示のいくつかにおいて、標的プレｍＲＮＡにおけるヌクレオチドの配列は、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位である。
【００７９】
本開示のいくつかにおいて、標的プレｍＲＮＡにおけるヌクレオチドの配列は、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位である。
【００８０】
対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）または細胞の「治療」は、対象または細胞の自然経過を変化させる試みにおいて使用される任意のタイプの介入である。治療は、限定するものではないが、オリゴマーまたはその医薬組成物の投与を含み、予防的に、または病理学的事象の開始もしくは病原体との接触の後のいずれかに実施され得る。治療は、ジストロフィンタンパク質に関連した疾患または状態の症状または病理に対する任意の望ましい効果を含み、例えば、治療される疾患または状態の１つ以上の測定可能なマーカーの最小限の変化または改善を含み得る。また、治療される疾患または状態の進行速度を低下させ、その疾患または状態の発症を遅延させる、またはその発症の重症度を低減することを対象とし得る「予防的」治療も含まれる。「治療」または「予防」は、必ずしも疾患もしくは状態またはその随伴症状の完全な根絶、治癒、または予防を示すものではない。
【００８１】
いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを用いた治療は、治療なしで予想され得る、新規のジストロフィン産生を増加させ、疾患進行を遅延させ、歩行能力の喪失を遅らせるかもしくは低減し、筋肉の炎症を低減し、筋肉損傷を低減し、筋機能を改善し、肺機能の喪失を低減し、かつ／または筋肉再生を増強する。いくつかの実施形態において、治療は、疾患進行を維持するか、遅延させるか、または遅らせる。いくつかの実施形態において、治療は、歩行を維持するか、または歩行能力の喪失を低減する。いくつかの実施形態において、治療は、肺機能を維持するか、または肺機能の喪失を低減する。いくつかの実施形態において、治療は、例えば、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）によって測定されるように、患者の安定した歩行距離を維持するか、または増加させる。いくつかの実施形態において、治療は、１０メートルを歩行／走行する時間（すなわち、１０メートル歩行／走行試験）を維持するか、または減少させる。いくつかの実施形態において、治療は、仰臥位から立ち上がるまでの時間（すなわち、起立時間試験）を維持するか、または低減する。いくつかの実施形態において、治療は、４つの標準階段を上る時間（４階段上昇試験）を維持するか、または低減する。いくつかの実施形態において、治療は、例えば、ＭＲＩ（例えば、脚筋のＭＲＩ）によって測定されるように、患者における筋肉の炎症を維持するか、または低減する。いくつかの実施形態において、ＭＲＩは、Ｔ２および／または脂肪画分を測定して、筋変性を確認する。ＭＲＩは、炎症、浮腫、筋肉損傷、および脂肪浸潤によって引き起こされる筋肉の構造および組成の変化を確認することができる。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを用いた治療は、新規のジストロフィン産生を増加させ、治療なしで予測される歩行能力の喪失を遅らせるか、または低減する。例えば、治療は、対象における歩行能力（例えば、歩行の安定化）を安定化するか、維持するか、改善するか、または増加させ得る。いくつかの実施形態において、治療は、例えば、ＭｃＤｏｎａｌｄら（Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ，２０１０；４２：９６６−７４（参照により本明細書に組み込まれる））によって記載される６分間歩行試験（６ＭＷＴ）によって測定されるように、患者の安定した歩行距離を維持するか、または増加させる。６分間歩行距離（６ＭＷＤ）の変化は、絶対値、変化率、または％予測値の変化として表され得る。いくつかの実施形態において、治療は、健康な同等者と比較して、対象における２０％の不足から６ＭＷＴで安定した歩行距離を維持または改善する。健康な同等者の典型的なパフォーマンスと比較した６ＭＷＴにおけるＤＭＤ患者のパフォーマンスは、％予測値を計算することによって決定され得る。例えば、％予測された６ＭＷＤは、男性について以下の方程式を使用して計算され得る：１９６．７２＋（３９．８１×年齢）−（１．３６×年齢２）＋（１３２．２８×身長（メートル））。女性の場合、％予測された６ＭＷＤは、以下の方程式を使用して計算され得る：１８８．６１＋（５１．５０×年齢）−（１．８６×年齢２）＋（８６．１０×身長（メートル））（Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｃｕｒｒ．，２０１２，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２（参照により本明細書に組み込まれる））。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーを用いた治療は、患者における安定した歩行距離を、ベースラインから３、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、または５０メートル超まで増加させる（それらの間の全ての整数を含む）。
【００８３】
ＤＭＤ患者の筋機能の喪失は、正常な小児の成長および発達の背景に対して起こり得る。実際に、ＤＭＤを有する小児は、進行性筋肉障害にもかかわらず、約１年の間に６ＭＷＴ中の歩行距離の増加を示し得る。いくつかの実施形態において、ＤＭＤ患者からの６ＭＷＤは、定型発達の対照対象、ならびに年齢および性別が一致した対象からの既存の標準データと比較される。いくつかの実施形態において、正常な成長および発達は、標準データにフィッティングされた年齢および身長に基づく方程式を使用して説明され得る。そのような方程式を使用して、ＤＭＤ患者において６ＭＷＤをパーセント予測（％予測）値に変換することができる。ある特定の実施形態において、％予測６ＭＷＤデータの分析は、正常な成長および発達を説明する方法を表し、若年齢（例えば、７歳以下）における機能の増加が、ＤＭＤ患者における能力の改善ではなく安定を表すことを示し得る（Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｃｕｒｒ．，２０１２，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２（参照により本明細書に組み込まれる））。
【００８４】
異なるアンチセンス分子を区別するために、アンチセンス分子の命名法システムが提案および公開された（Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｅｄ  ４，６４４−６５４を参照）。この命名法は、以下に示されるように、全てが同じ標的領域に向けられたいくつかのわずかに異なるアンチセンス分子を試験するときに特に重要であった：
Ｈ＃Ａ／Ｄ（ｘ：ｙ）
最初の文字は、種を示す（例えば、Ｈ：ヒト、Ｍ：マウス、Ｃ：イヌ）。「＃」は、標的ジストロフィンエクソン番号を示す。「Ａ／Ｄ」は、それぞれエクソンの始点および終点におけるアクセプターまたはドナースプライス部位を示す。（ｘ  ｙ）は、アニーリング座標を表し、「−」または「＋」は、それぞれイントロンまたはエクソン配列を示す。例えば、Ａ（−６＋１８）は、標的エクソンの前にあるイントロンの最後の６塩基、および標的エクソンの最初の１８塩基を示す。最も近いスプライス部位がアクセプターになるため、これらの座標の前に「Ａ」が付く。ドナースプライス部位におけるアニーリング座標の記載は、Ｄ（＋２−１８）であり得、最後の２エクソン塩基および最初の１８イントロン塩基が、アンチセンス分子のアニーリング部位に対応する。エクソンアニーリング座標全体は、Ａ（＋６５＋８５）、つまり、そのエクソンの始点から６５番目と８５番目との間のヌクレオチドの間の部位によって表される。
【００８５】
ＩＩ．アンチセンスオリゴマー
Ａ．エクソン５３スキッピングを誘導するように設計されたアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲート
ある特定の実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、ジストロフィン遺伝子のエクソン５３標的領域に相補的であり、エクソン５３のスキッピングを誘導する。特に、本開示は、アニーリング部位として指定されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３標的領域に相補的なアンチセンスオリゴマーコンジュゲートに関する。いくつかの実施形態では、アニーリング部位は、本明細書に記載されるものである。
【００８６】
本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、ジストロフィンプレｍＲＮＡを標的とし、エクソン５３のスキッピングを誘導するため、成熟したスプライシングされたｍＲＮＡ転写物から除外またはスキップされる。エクソン５３をスキッピングすることによって、破壊されたリーディングフレームは、インフレーム変異に修復される。ＤＭＤは様々な遺伝的サブタイプからなるが、本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３をスキッピングするように特別に設計された。エクソン５３のスキッピングに適しているＤＭＤ変異は、ＤＭＤ患者のサブグループ（８％）を含む。
【００８７】
エクソン５３のスキッピングを誘導するアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの核酸塩基配列は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３内の特定の標的配列に相補的であるように設計されている。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートのアンチセンスオリゴマーは、ＰＭＯであり、ＰＭＯの各モルホリノ環は、例えば、ＤＮＡ（アデニン、シトシン、グアニン、およびチミン）中に見られる核酸塩基を含む核酸塩基に連結される。
【００８８】
Ｂ．オリゴマー化学物質の特徴
本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、様々なアンチセンスオリゴマー化学物質を用いることができる。オリゴマー化学物質の例としては、モルホリノオリゴマー、ホスホロチオエート修飾オリゴマー、２’−Ｏ−メチル修飾オリゴマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエートオリゴマー、２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾オリゴマー、２’−フルオロ修飾オリゴマー、２’−Ｏ，４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、トリシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡホスホロチオエートサブユニット、２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］修飾オリゴマー（上記のいずれかの組み合わせを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロチオエートおよび２’−Ｏ−Ｍｅ修飾化学物質を組み合わせて、２’−Ｏ−Ｍｅ−ホスホロチオエート骨格を生成することができる。例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ／２０１３／１１２０５３号および同第ＷＯ／２００９／００８７２５号を参照されたい。本開示のオリゴマー化学物質の例示的な実施形態が以下にさらに記載される。
【００８９】
１．ペプチド核酸（ＰＮＡ）
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、骨格がデオキシリボース骨格と構造的に同形であり、ピリミジンまたはプリン塩基が結合するＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位からなる、ＤＮＡの類似体である。天然ピリミジンおよびプリン塩基を含有するＰＮＡは、ワトソン−クリック塩基対合ルールに従い相補的なオリゴマーにハイブリダイズし、塩基対認識の点でＤＮＡを模倣する（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｂｕｃｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。ＰＮＡの骨格は、ホスホジエステル結合ではなくペプチド結合によって形成され、アンチセンス用途（以下の構造を参照）によく適したものになる。骨格は非荷電性であり、通常を超える熱安定性を示すＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ／ＲＮＡ二本鎖をもたらす。ＰＮＡは、ヌクレアーゼやプロテアーゼによって認識されない。ＰＮＡの非限定的な例が以下に示される。
【化１２】
2021521794.tif 000183
【００９０】
自然構造に対する根本的構造変化にもかかわらず、ＰＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡへのヘリックス形態での配列特異的結合能力が可能である。ＰＮＡの特徴には、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡに対する高い結合親和性、単一塩基ミスマッチによって引き起こされる不安定化作用、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼに対する耐性、塩濃度に依存しないＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーション、およびホモプリンＤＮＡとの三重鎖形成が含まれる。ＰＡＮＡＧＥＮＥ（商標）は、その独自のＢｔｓ  ＰＮＡモノマー（Ｂｔｓ；ベンゾチアゾール−２−スルホニル基）および独自のオリゴマー化プロセスを開発してきた。Ｂｔｓ  ＰＮＡモノマーを使用したＰＮＡオリゴマー化は、脱保護、カップリング、およびキャッピングの反復サイクルから構成される。ＰＮＡは、当該技術分野において既知の任意の技術を使用して合成的に産生され得る。例えば、米国特許第６，９６９，７６６号、同第７，２１１，６６８号、同第７，０２２，８５１号、同第７，１２５，９９４号、同第７，１４５，００６号、および同第７，１７９，８９６号を参照されたい。また、ＰＮＡの調製について、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、および同第５，７１９，２６２も参照されたい。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７−１５００，１９９１で見ることができる。上記の各々は、その全体が参照により組み込まれる。
【００９１】
２．ロックド核酸（ＬＮＡ）
アンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートはまた、「ロックド核酸」サブユニット（ＬＮＡ）を含有してもよい。「ＬＮＡ」は、架橋核酸（ＢＮＡ）と呼ばれる修飾のクラスのメンバーである。ＢＮＡは、リボース環の立体構造をＣ３０−エンド（ノーザン）糖パッカーにロックする共有結合を特徴とする。ＬＮＡの場合、架橋は、２’−Ｏ位置と４’−Ｃ位置との間のメチレンから構成される。ＬＮＡは、骨格の事前組織化および塩基スタッキングを増強して、ハイブリダイゼーションおよび熱安定性を高める。
【００９２】
ＬＮＡの構造は、例えば、Ｗｅｎｇｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９８）４５５、Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９８）５４：３６０７、Ｊｅｓｐｅｒ  Ｗｅｎｇｅｌ，Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９）３２：３０１、Ｏｂｉｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９７）３８：８７３５、Ｏｂｉｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９８）３９：５４０１、およびＯｂｉｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８）１６：９２３０で見ることができ、それらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ＬＮＡの非限定的な例が以下に示される。
【化１３】
2021521794.tif 000184
【００９３】
本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１つ以上のＬＮＡを組み込み得る。場合によっては、アンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、ＬＮＡから完全に構成されてもよい。個々のＬＮＡヌクレオシドサブユニットの合成およびそれらのオリゴマーへの組み込みのための方法は、例えば、米国特許第７，５７２，５８２号、同第７，５６９，５７５号、同第７，０８４，１２５号、同第７，０６０，８０９号、同第７，０５３，２０７号、同第７，０３４，１３３号、同第６，７９４，４９９号、および同第６，６７０，４６１号に記載され、それらの各々は、参照によりその全体が組み込まれる。典型的なサブユニット間リンカーとしては、ホスホジエステル部分およびホスホロチオエート部分が挙げられる。あるいは、非リン含有リンカーが用いられてもよい。さらなる実施形態は、ＬＮＡ含有アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを含み、各ＬＮＡサブユニットは、ＤＮＡサブユニットによって分離される。ある特定のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、交互のＬＮＡおよびＤＮＡサブユニットから構成され、サブユニット間リンカーは、ホスホロチオエートである。
【００９４】
２’Ｏ，４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）は、ＢＮＡのクラスの別のメンバーである。非限定的な例が以下に示される。
【化１４】
2021521794.tif 000185
【００９５】
ＥＮＡオリゴマーおよびその調製は、Ｏｂｉｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ（１９９７）３８（５０）：８７３５に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１つ以上のＥＮＡサブユニットを組み込み得る。
【００９６】
３．アンロックド核酸（ＵＮＡ）
アンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートはまた、「アンロックド核酸」（ＵＮＡ）サブユニットを含有してもよい。ＵＮＡおよびＵＮＡオリゴマーは、サブユニットのＣ２’−Ｃ３’結合が切断されたＲＮＡの類似体である。ＬＮＡは、（ＤＮＡおよびＲＮＡに対して）立体構造的に制限されるが、ＵＮＡは非常に柔軟である。ＵＮＡは、例えば、ＷＯ２０１６／０７０１６６に開示されている。ＵＮＡの非限定的な例が以下に示される。
【化１５】
2021521794.tif 000186
【００９７】
典型的なサブユニット間リンカーとしては、ホスホジエステル部分およびホスホロチオエート部分が挙げられる。あるいは、非リン含有リンカーが用いられてもよい。
【００９８】
４．ホスホロチオエート
「ホスホロチオエート」（またはＳ−オリゴ）は、正常なＤＮＡのバリアントであり、非架橋酸素のうちの１つが硫黄によって置き換えられる。ホスホロチオエートの非限定的な例が以下に示される。
【化１６】
2021521794.tif 000187
【００９９】
ヌクレオチド間結合の硫化は、５’から３’および３’から５’のＤＮＡ  ＰＯＬ１エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＳ１およびＰ１、ＲＮａｓｅ、血清ヌクレアーゼ、ならびにヘビ毒ホスホジエステラーゼを含む、エンドおよびエキソヌクレアーゼの作用を低減する。ホスホロチオエートは、ホスホン酸水素に対する二硫化炭素中の元素硫黄の溶液の作用、または亜リン酸トリエステルをテトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）もしくは３Ｈ−１，２−ベンソジチオール−３−オン１，１−ジオキシド（ＢＤＴＤ）のいずれかで硫化する方法、の２つの主要な経路によって作製される（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５，４６９３−４６９９，１９９０を参照）。後者の方法は、ほとんどの有機溶媒中の元素硫黄の不溶性、および二硫化炭素の毒性の問題を回避する。ＴＥＴＤおよびＢＤＴＤ法はまた、より高い純度のホスホロチオエートをもたらす。
【０１００】
５．トリシクロ−ＤＮＡおよびトリシクロ−ホスホロチオエートサブユニット
トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）は、骨格の立体構造的柔軟性を制限し、ねじれ角γの骨格形状を最適化するために、各ヌクレオチドがシクロプロパン環の導入によって修飾される、拘束されたＤＮＡ類似体のクラスである。ホモ塩基アデニンおよびチミン含有ｔｃ−ＤＮＡは、相補的ＲＮＡと非常に安定したＡ−Ｔ塩基対を形成する。トリシクロＤＮＡおよびその合成は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／１１５９９３号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１つ以上のトリシクロ−ＤＮＡサブユニットを組み込み得る。場合によっては、アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、トリシクロ−ＤＮＡサブユニットから完全に構成されてもよい。
【０１０１】
トリシクロ−ホスホロチオエートサブユニットは、ホスホロチオエートサブユニット間リンケージを有するトリシクロ−ＤＮＡサブユニットである。トリシクロ−ホスホロチオエートサブユニットおよびその合成は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０５３９２８号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１つ以上のトリシクロ−ＤＮＡサブユニットを組み込み得る。場合によっては、アンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、トリシクロ−ＤＮＡサブユニットから完全に構成されてもよい。トリシクロ−ＤＮＡ／トリシクロ−ホスホチオエートの非限定的な例が以下に示される。
【化１７】
2021521794.tif 000188
【０１０２】
６．２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−ＭＯＥ、および２’−Ｆオリゴマー
「２’−Ｏ−Ｍｅオリゴマー」分子は、リボース分子の２’−ＯＨ残基にメチル基を有する。２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡは、ＤＮＡと同じ（または類似の）挙動を示すが、ヌクレアーゼ分解から保護される。２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡはまた、さらなる安定化のためにホスホロチオエートオリゴマー（ＰＴＯ）と組み合わされ得る。２’Ｏ−Ｍｅオリゴマー（ホスホジエステルまたはホスホチオエート）は、当該技術分野の常用技術に従って合成され得る（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：２００８−１６，２００４を参照）。２’Ｏ−Ｍｅオリゴマーの非限定的な例が以下に示される。
【化１８】
2021521794.tif 000189
【０１０３】
２’−Ｏ−メトキシエチルオリゴマー（２’−Ｏ  ＭＯＥ）は、リボース分子の２’−ＯＨ残基にメトキシエチル基を有し、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７８，４８６−５０４，１９９５で考察され、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。．２’Ｏ  ＭＯＥサブユニットの非限定的な例が以下に示される。
【化１９】
2021521794.tif 000190
【０１０４】
２’−フルオロ（２’−Ｆ）オリゴマーは、２’ＯＨの代わりに２’位に蛍光ラジカルを有する。２’−Ｆオリゴマーの非限定的な例が以下に示される。
【化２０】
2021521794.tif 000191
２’−フルオロオリゴマーは、ＷＯ２００４／０４３９７７にさらに記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０５】
２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−ＭＯＥ、および２’−Ｆオリゴマーはまた、以下に図示されるように、１つ以上のホスホロチオエート（ＰＳ）リンケージを含んでもよい。
【化２１】
2021521794.tif 000192
【０１０６】
さらに、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−ＭＯＥ、および２’−Ｆオリゴマーは、例えば、以下に示される２’−Ｏ−メチルＰＳオリゴマードリサペルセンのように、オリゴマー全体にわたってＰＳサブユニット間リンケージを含んでもよい。
【化２２】
2021521794.tif 000193
【０１０７】
あるいは、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−ＭＯＥ、および／または２’−Ｆオリゴマーは、以下に図示されるように、オリゴマーの末端にＰＳリンケージを含んでもよい。
【化２３】
2021521794.tif 000194
式中、
Ｒは、ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（メトキシエチルまたはＭＯＥ）であり、
ｘ、ｙ、およびｚは、それぞれ指定された５’−ウィング、中央ギャップ、および３’−ウィングの各領域内に含有されるヌクレオチドの数を表す。
【０１０８】
本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１つ以上の２’Ｏ−メチル、２’Ｏ−ＭＯＥ、および２’−Ｆサブユニットを組み込み得、本明細書に記載されるサブユニット間リンケージのいずれかを利用し得る。場合によっては、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−ＭＯＥ、または２’−Ｆサブユニットから完全に構成され得る。本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの一実施形態は、２’−Ｏ−メチルサブユニットから完全になる。
【０１０９】
７．２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］オリゴマー（ＭＣＥ）
ＭＣＥは、本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートで有用な２’Ｏ修飾リボヌクレオシドの別の例である。ここで、２’ＯＨは、ヌクレアーゼ抵抗性を高めるために２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル部分へと誘導体化される。ＭＣＥオリゴマーの非限定的な例が以下に示される。
【化２４】
2021521794.tif 000195
ＭＣＥおよびその合成は、Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（２０１１）７６（９）：３０４２−５３で考察され、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１つ以上のＭＣＥサブユニットを組み込み得る。
【０１１０】
８．立体特異的オリゴマー
立体特異的オリゴマーは、各リン含有リンケージの立体化学が、実質的に立体的に純粋なオリゴマーが産生されるような合成方法によって固定されるものである。立体特異的オリゴマーの非限定的な例が以下に示される。
【化２５】
2021521794.tif 000196
【０１１１】
上記の例では、オリゴマーの各リンは、同一の立体配置を有する。さらなる例には、上記のオリゴマーが含まれる。例えば、ＬＮＡ、ＥＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ＭＣＥ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−ＭＯＥ、２’−Ｆ、およびモルホリノ系オリゴマーは、立体特異的リン含有ヌクレオシド間リンケージ、例えば、ホスホロチオエート、ホスホジエステル、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、または他のリン含有ヌクレオシド間リンケージを用いて調製され得る。そのようなオリゴマーの調製で使用するための立体特異的オリゴマー、調製方法、キラル制御合成、キラル設計、およびキラル補助剤は、例えば、ＷＯ２０１７１９２６６４、ＷＯ２０１７１９２６７９、ＷＯ２０１７０６２８６２、ＷＯ２０１７０１５５７５、ＷＯ２０１７０１５５５５、ＷＯ２０１５１０７４２５、ＷＯ２０１５１０８０４８、ＷＯ２０１５１０８０４６、ＷＯ２０１５１０８０４７、ＷＯ２０１２０３９４４８、ＷＯ２０１００６４１４６、ＷＯ２０１１０３４０７２、ＷＯ２０１４０１０２５０、ＷＯ２０１４０１２０８１、ＷＯ２０１３０１２７８５８、およびＷＯ２０１１００５７６１に詳述されており、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
立体特異的オリゴマーは、ＲＰまたはＳＰ配置においてリン含有ヌクレオシド間リンケージを有し得る。リンケージの立体配置が制御されるキラルリン含有リンケージは、「立体純粋」と称され、リンケージの立体配置が制御されないキラルリン含有リンケージは、「立体不規則的」と称される。ある特定の実施形態において、本開示のオリゴマーは、複数の立体純粋および立体不規則的リンケージを含み、これにより得られるオリゴマーは、オリゴマーの予め指定された位置に立体純粋サブユニットを有する。立体純粋サブユニットの位置の例は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１７／０６２８６２Ａ２号において図７Ａおよび図７Ｂに提供されている。一実施形態において、オリゴマー中の全てのキラルリン含有リンケージは、立体不規則的である。一実施形態において、オリゴマー中の全てのキラルリン含有リンケージは、立体純粋である。
【０１１３】
ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のキラルリン含有リンケージのｎ個全ては、立体不規則的である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のキラルリン含有リンケージのｎ個全ては、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有リンケージのうちの少なくとも１０％（最も近い整数に）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有リンケージのうちの少なくとも２０％（最も近い整数に）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有リンケージのうちの少なくとも３０％（最も近い整数に）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有リンケージのうちの少なくとも４０％（最も近い整数に）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有リンケージのうちの少なくとも５０％（最も近い整数に）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有リンケージのうちの少なくとも６０％（最も近い整数に）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有リンケージのうちの少なくとも７０％（最も近い整数に）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有リンケージのうちの少なくとも８０％（最も近い整数に）は、立体純粋である。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマー中のｎ個のリン含有リンケージのうちの少なくとも９０％（最も近い整数に）は、立体純粋である。
【０１１４】
ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも２つの連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも３つの連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも４つの連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも５つの連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも６つの連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも７つの連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも８つの連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも９つの連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１０個の連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１１個の連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１２個の連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１３個の連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１４個の連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１５個の連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１６個の連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１７個の連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１８個の連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも１９個の連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。ｎ個（ｎは１以上の整数である）のキラルリン含有リンケージを有するオリゴマーの一実施形態において、オリゴマーは、同じ立体配向（すなわち、ＳＰまたはＲＰのいずれか）の少なくとも２０個の連続的な立体純粋リン含有リンケージを含有する。
【０１１５】
９．モルホリノオリゴマー
本開示の例示的な実施形態は、以下の一般構造：
【化２６】
2021521794.tif 000197
の、かつＳｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７：１８７−１９５（１９９７）の図２に記載されるような、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーに関する。本明細書に記載されるモルホリノは、上記の一般構造の全ての立体異性体および互変異性体を含むことが意図されている。モルホリノオリゴマーの合成、構造、および結合特性は、米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号、同第５，５０６，３３７号、同第８，０７６，４７６号、および同第８，２９９，２０６号に詳述されており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
ある特定の実施形態において、モルホリノは、オリゴマーの５’または３’末端で「テール」部分とコンジュゲートされて、その安定性および／または溶解性を高める。例示的なテールは、以下を含む。
【化２７】
2021521794.tif 000198
【０１１７】
様々な実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、式（Ｉ）に従うか、
【化２８】
2021521794.tif 000199
またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
各Ｎｕが、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｔが、
【化２９】
2021521794.tif 000200
から選択される部分であり、
Ｒ１が、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｚが、１６〜２３の整数であり、
標的化配列は、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｚが１６であるＨ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＺが２３であるＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択される。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２１の整数であり、ジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位は、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２１の整数であり、ジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位は、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＺが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【０１２１】
様々な実施形態において、ジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位は、Ｚが１６であるＨ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３６＋５６）、およびＺが２３であるＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択される。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、Ｚは、１６〜２１の整数である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２１の整数である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２３の整数である。
【０１２３】
様々な実施形態において、標的化配列および対応するＺは、以下から選択される。
【表１】
2021521794.tif 000201
ここで、Ｘが、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）である。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、各Ｘは独立して、Ｔである。
【０１２５】
様々な実施形態において、標的化配列および対応するＺは、以下から選択される。
【表２】
2021521794.tif 000202
【０１２６】
様々な実施形態において、Ｔは、
【化３０】
2021521794.tif 000203
である。
【０１２７】
様々な実施形態において、Ｒ１は、ＣＦ３、ＣＣｌ３、ＣＦＣｌ２、ＣＦ２Ｃｌ、エチル、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ３、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、または２，３−ジメチルブチルである。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、そのＨＣｌ（塩酸）塩である。ある特定の実施形態において、ＨＣｌ塩は、．６ＨＣｌ塩である。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、各Ｎｕは独立して、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、ウラシル（Ｕ）、およびヒポキサンチン（Ｉ）から選択される。
【０１３０】
例えば式（Ｉ）のいくつかの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、式（ＩＩ）に従うか、
【化３１】
2021521794.tif 000204
またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
Ｚが、１６〜２３の整数であり、
各Ｎｕが、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である標的化配列を一緒になって形成する核酸塩基である。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｚが１６であるＨ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＺが２３であるＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択される。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２１の整数であり、ジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位は、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２１の整数であり、ジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位は、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＺが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【０１３４】
様々な実施形態において、ジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位は、Ｚが１６であるＨ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３６＋５６）、およびＺが２３であるＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択される。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、Ｚは、１６〜２１の整数である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２１の整数である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２３の整数である。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、各Ｎｕは独立して、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、ウラシル（Ｕ）、およびヒポキサンチン（Ｉ）から選択される。
【０１３７】
様々な実施形態において、標的化配列および対応するＺは、以下から選択される。
【表３】
2021521794.tif 000205
ここで、Ａは
【化３２】
2021521794.tif 000206
であり、Ｃは
【化３３】
2021521794.tif 000207
であり、Ｇは
【化３４】
2021521794.tif 000208
であり、Ｘは
【化３５】
2021521794.tif 000209
である。ある特定の実施形態において、各Ｘは独立して、
【化３６】
2021521794.tif 000210
である。
【０１３８】
様々な実施形態において、標的化配列および対応するZは、以下から選択される。
【表４】
2021521794.tif 000211
ここで、Ａは
【化３７】
2021521794.tif 000212
であり、Ｃは
【化３８】
2021521794.tif 000213
であり、Ｇは
【化３９】
2021521794.tif 000214
であり、Ｔは
【化４０】
2021521794.tif 000215
である。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、そのＨＣｌ（塩酸）塩である。ある特定の実施形態において、ＨＣｌ塩は、．６ＨＣｌ塩である。
【０１４０】
例えば式（ＩＩ）のいくつかの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、式（ＩＩＩ）に従うか、
【化４１】
2021521794.tif 000216
またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
Ｚが、１６〜２３の整数であり、
各Ｎｕが、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である標的化配列を一緒になって形成する核酸塩基である。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｚが１６であるＨ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３６＋５６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４８＋６９）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）、およびＺが２３であるＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択される。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２１の整数であり、ジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位は、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２１の整数であり、ジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位は、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＺが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【０１４４】
様々な実施形態において、ジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位は、Ｚが１６であるＨ５３Ａ（＋４５＋６２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３６＋５６）、およびＺが２３であるＨ５３Ａ（＋３２＋５６）からなる群から選択される。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、Ｚは、１６〜２１の整数である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２１の整数である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２３の整数である。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、各Ｎｕは独立して、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、ウラシル（Ｕ）、およびヒポキサンチン（Ｉ）から選択される。
【０１４７】
様々な実施形態において、標的化配列および対応するＺは、以下から選択される。
【表５】
2021521794.tif 000217
ここで、Ａは
【化４２】
2021521794.tif 000218
であり、Ｃは
【化４３】
2021521794.tif 000219
であり、Ｇは
【化４４】
2021521794.tif 000220
であり、Ｘは
【化４５】
2021521794.tif 000221
である。ある特定の実施形態において、各Ｘは独立して、
【化４６】
2021521794.tif 000222
である。
【０１４８】
様々な実施形態において、標的化配列および対応するＺは、以下から選択される。
【表６】
2021521794.tif 000223
ここで、Ａは
【化４７】
2021521794.tif 000224
であり、Ｃは
【化４８】
2021521794.tif 000225
であり、Ｇは
【化４９】
2021521794.tif 000226
であり、Ｔは
【化５０】
2021521794.tif 000227
である。
【０１４９】
例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ａ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｂ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｃ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｄ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｅ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｆ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｇ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｈ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｉ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｊ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｋ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｌ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｍ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｎ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｏ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｐ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｑ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｒ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｓ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｔ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｕ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｖ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｗ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｘ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｙ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｚ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ａａ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｂｂ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｃｃ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｄｄ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｅｅ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｆｆ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｇｇ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｈｈ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｉｉ．である。
【０１５０】
様々な実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーは、式（ＩＶ）に従うか、
【化５１】
2021521794.tif 000228
またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
各Ｎｕが、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｔが、
【化５２】
2021521794.tif 000229
から選択される部分であり、
Ｒ１が、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２が、Ｈまたはアセチルから選択され、
標的化配列は、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＺが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、標的化配列は、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＺが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、Ｚは、１６〜２１の整数である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２１の整数である。
【０１５５】
様々な実施形態において、Ｔは、
【化５３】
2021521794.tif 000230
である。
【０１５６】
様々な実施形態において、Ｒ１は、ＣＦ３、ＣＣｌ３、ＣＦＣｌ２、ＣＦ２Ｃｌ、エチル、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ３、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、または２，３−ジメチルブチルである。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、各Ｎｕは独立して、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、ウラシル（Ｕ）、およびヒポキサンチン（Ｉ）から選択される。
【０１５８】
様々な実施形態において、標的化配列および対応するＺは、以下から選択される。
【表７】
2021521794.tif 000231
ここで、Ｘは、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）である
【０１５９】
様々な実施形態において、標的化配列および対応するＺは、以下から選択される。
【表８】
2021521794.tif 000232
【０１６０】
様々な実施形態において、Ｔは、
【化５４】
2021521794.tif 000233
である。
【０１６１】
例えば式（ＩＶ）のいくつかの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーは、式（Ｖ）に従うか、
【化５５】
2021521794.tif 000234
またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
Ｒが、Ｈまたはアセチルから選択され、
各Ｎｕが、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｈ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位に相補的である標的化配列を一緒になって形成する核酸塩基である。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３２＋５１）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３７＋５６）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４０＋５９）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＺが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｈ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｈ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｈ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｈ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｈ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｈ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｈ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｈ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｈ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｈ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｈ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｈ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｈ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、アニーリング部位は、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２３＋４２）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２６＋４５）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋２９＋４８）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋３８＋５７）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４１＋６０）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４４＋６３）、Ｚが１８であるＨ５３Ａ（＋４７＋６６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２３＋４３）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２６＋４６）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋２９＋４９）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３２＋５２）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋３８＋５８）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４１＋６１）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４４＋６４）、Ｚが１９であるＨ５３Ａ（＋４６＋６６）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２３＋４４）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋２９＋５０）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋３８＋５９）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４１＋６２）、Ｚが２０であるＨ５３Ａ（＋４４＋６５）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３１＋５３）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３２＋５４）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３６＋５８）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋３９＋６１）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４０＋６２）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４５＋６７）、Ｚが２１であるＨ５３Ａ（＋４６＋６８）、およびＺが２１であるＨ５３Ａ（＋４７＋６９）からなる群から選択される。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、Ｚは、１６〜２１の整数である。いくつかの実施形態において、Ｚは、１８〜２１の整数である。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、各Ｎｕは独立して、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、ウラシル（Ｕ）、およびヒポキサンチン（Ｉ）から選択される。
【０１６７】
様々な実施形態において、標的化配列および対応するＺは、以下から選択される。
【表９】
2021521794.tif 000235
ここで、Ａは
【化５６】
2021521794.tif 000236
であり、Ｃは
【化５７】
2021521794.tif 000237
であり、Ｇは
【化５８】
2021521794.tif 000238
であり、Ｘは
【化５９】
2021521794.tif 000239
である。ある特定の実施形態において、各Ｘは独立して、
【化６０】
2021521794.tif 000240
である。
【０１６８】
様々な実施形態において、標的化配列および対応するＺは、以下から選択される。
【表１０】
2021521794.tif 000241
ここで、Ａは
【化６１】
2021521794.tif 000242
であり、Ｃは
【化６２】
2021521794.tif 000243
であり、Ｇは
【化６３】
2021521794.tif 000244
であり、Ｔは
【化６４】
2021521794.tif 000245
である。
【０１６９】
例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ａ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｂ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｃ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｄ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｅ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｆ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｇ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｈ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｉ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｊ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｋ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｌ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｍ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｎ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｏ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｐ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｑ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｒ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｓ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｔ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｕ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｖ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｗ．である。例えば式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｘ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｙ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｚ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ａａ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｂｂ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｃｃ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｄｄ．である。例えば式（ＩＶ）および式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含む、いくつかの実施形態において、標的化配列およびＺは、上記の表からの選択肢ｅｅ．である。
【０１７０】
１０．核酸塩基修飾および置換
ある特定の実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、ＲＮＡ核酸塩基およびＤＮＡ核酸塩基（多くの場合、当該技術分野では単に「塩基」と称される）から構成される。ＲＮＡ塩基は、アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ）、およびグアニン（Ｇ）として一般的に既知である。ＤＮＡ塩基は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびグアニン（Ｇ）として一般的に既知である。様々な実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、ウラシル（Ｕ）、およびヒポキサンチン（Ｉ）から構成される。
【０１７１】
ある特定の実施形態において、オリゴマー中の１つ以上のＲＮＡ塩基またはＤＮＡ塩基は、ＲＮＡ塩基またはＤＮＡ塩基以外の塩基で修飾または置換されてもよい。修飾または置換塩基を含有するオリゴマーは、核酸中で最も一般的に見られる１つ以上のプリンまたはピリミジン塩基がそれほど一般的ではない、または非天然の塩基で置換されたオリゴマーを含む。
【０１７２】
プリン塩基は、以下の一般式によって記載されるように、イミダゾール環に縮合したピリミジン環を含む。
【化６５】
2021521794.tif 000246
アデニンおよびグアニンは、核酸中で最も一般的に見られる２つのプリン核酸塩基である。他の天然に存在するプリンとしては、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ２−メチルグアニン、ヒポキサンチン、および７−メチルグアニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７３】
ピリミジン塩基は、以下の一般式によって記載されるように、６員ピリミジン環を含む。
【化６６】
2021521794.tif 000247
シトシン、ウラシル、およびチミンは、核酸中で最も一般的に見られるピリミジン塩基である。他の天然に存在するピリミジンとしては、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、シュードウラシル、および４−チオウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、本明細書に記載されるオリゴマーは、ウラシルの代わりにチミン塩基を含有する。
【０１７４】
他の好適な塩基としては、２，６−ジアミノプリン、オロト酸、アグマチジン、リシジン、２−チオピリミジン（例えば、２−チオウラシル、２−チオチミン）、Ｇ−クランプおよびその誘導体、５−置換ピリミジン（例えば、５−ハロウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、５−アミノメチルウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−アミノメチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、スーパーＴ）、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、７−アザ−２，６−ジアミノプリン、８−アザ−７−デアザグアニン、８−アザ−７−デアザアデニン、８−アザ−７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、スーパーＧ、スーパーＡ、およびＮ４−エチルシトシン、またはその誘導体；Ｎ２−シクロペンチルグアニン（ｃＰｅｎｔ−Ｇ）、Ｎ２−シクロペンチル−２−アミノプリン（ｃＰｅｎｔ−ＡＰ）、およびＮ２−プロピル−２−アミノプリン（Ｐｒ−ＡＰ）、シュードウラシル、またはその誘導体；ならびに２，６−ジフルオロトルエンのような縮重塩基もしくはユニバーサル塩基、または脱塩基部位のような非存在塩基（例えば、１−デオキシリボース、１，２−ジデオキシリボース、１−デオキシ−２−Ｏ−メチルリボース；あるいは環酸素が窒素で置き換えられたピロリジン誘導体（アザリボース））が挙げられるが、これらに限定されない。スーパーＡ、スーパーＧ、およびスーパーＴの誘導体の例は、米国特許第６，６８３，１７３号（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で見ることができ、これは、参照により完全に本明細書に組み込まれる。ｃＰｅｎｔ−Ｇ、ｃＰｅｎｔ−ＡＰ、およびＰｒ−ＡＰは、ｓｉＲＮＡに組み込まれたときに免疫賦活作用を低減することが示された（Ｐｅａｃｏｃｋ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，９２００）。シュードウラシルは、ウラシルの自然発生的異性化バージョンであり、ウリジンにおける通常のＮ−グリコシドというよりむしろＣ−グリコシドによる。シュードウリジン含有合成ｍＲＮＡは、ウリジン含有ｍＰｖＮＡと比較して、改善された安全性プロファイルを有し得る（ＷＯ２００９１２７２３０（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１７５】
ある特定の核酸塩基は、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの結合親和性を高めるために特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む）が含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されており、さらに具体的には２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合に、現在好ましい塩基置換である。追加の例示的な修飾核酸塩基には、核酸塩基の少なくとも１つの水素原子がフッ素で置き換えられているものが含まれる。
【０１７６】
１１．アンチセンスオリゴマーコンジュゲートの薬学的に許容される塩
本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートのある特定の実施形態は、アミノまたはアルキルアミノなどの塩基性官能基を含有してもよく、したがって、薬学的に許容される酸と薬学的に許容される塩を形成することができる。この点における「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの比較的非毒性の無機酸および有機酸付加塩を指す。これらの塩は、投与ビヒクルまたは剤形製造プロセスにおいて原位置で調製され得るか、または本開示の精製されたアンチセンスオリゴマーもしくはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを、その遊離塩基形態で、好適な有機酸もしくは無機酸と別々に反応させ、その後の精製中にそのようにして形成された塩を単離することによって調製され得る。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩などが挙げられる。（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ”，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照）。
【０１７７】
主題のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの薬学的に許容される塩は、例えば、非毒性の有機酸または無機酸からの、アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの従来の非毒性塩または第四級アンモニウム塩を含む。例えば、そのような従来の非毒性塩としては、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などに由来するもの；ならびに有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸（ｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ）、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸（ｉｓｏｔｈｉｏｎｉｃ）などから調製された塩が挙げられる。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１つ以上の酸性官能基を含有してもよく、したがって、薬学的に許容される塩基と薬学的に許容される塩を形成することができる。これらの場合における「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの比較的非毒性の無機塩基および有機塩基付加塩を指す。これらの塩は同様に、投与ビヒクルまたは剤形製造プロセスにおいて原位置で調製され得るか、あるいは精製されたアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを、その遊離酸形態で、好適な塩基、例えば、薬学的に許容される金属カチオンの水酸化物、炭酸塩、もしくは重炭酸塩と、アンモニアと、または薬学的に許容される有機第一級アミン、第二級アミン、もしくは第三級アミンと別々に反応させることによって調製され得る。代表的なアルカリまたはアルカリ土類塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびアルミニウム塩などが挙げられる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンとしては、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが挙げられる。（例えば、上記のＢｅｒｇｅらを参照）。
【０１７９】
ＩＩＩ．製剤および投与様式
ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの治療送達に好適な製剤または医薬組成物を提供する。したがって、ある特定の実施形態において、本開示は、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤と共に製剤化した、治療有効量の本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートのうちの１つ以上を含む、薬学的に許容される組成物を提供する。本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを単独で投与することは可能であるが、アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを医薬製剤（組成物）として投与することが好ましい。一実施形態において、製剤のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、式（ＩＩＩ）に従う。
【０１８０】
本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートに適用可能である核酸分子の送達のための方法は、例えば、Ａｋｈｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，２：１３９；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、およびＳｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ  ＷＯ９４／０２５９５に記載されている。これらおよび他のプロトコルは、本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを含む、実質的に任意の核酸分子の送達に利用され得る。
【０１８１】
本開示の医薬組成物は、固体または液体形態での投与のために特別に製剤化されてもよく、以下に適合したものを含む：（１）経口投与、例えば、水薬（水性または非水性の溶液または懸濁液）、錠剤（頬側、舌下、または全身吸収を目標）、ボーラス、粉末、顆粒、舌に適用するためのペースト、（２）例えば、滅菌溶液もしくは懸濁液または徐放性製剤としての、例えば、皮下、筋肉内、静脈内、硬膜外注射による非経口投与、（３）例えば、皮膚に塗布されるクリーム、軟膏、または制御放出性パッチもしくはスプレーとしての局所塗布、（４）例えば、ペッサリー、クリーム、または発泡体としての膣内または直腸内、（５）舌下、（６）眼内、（７）経皮、あるいは（８）経鼻。
【０１８２】
薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの例としては、（１）糖類、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース、（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン、（３）セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース、（４）粉末状トラガカント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）賦形剤、例えば、ココアバターおよび坐剤ワックス、（９）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油、（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール、（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール、（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル、（１３）寒天、（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム、（１５）アルギン酸、（１６）発熱性物質除去蒸留水、（１７）等張生理食塩水、（１８）リンゲル液、（１９）エチルアルコール、（２０）ｐＨ緩衝液、（２１）ポリエステル、ポリカーボネート、および／またはポリ酸無水物、ならびに（２２）医薬製剤で用いられる他の非毒性適合性物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８３】
本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを用いた製剤に適した薬剤の追加の非限定的な例としては、ＰＥＧコンジュゲート核酸；リン脂質コンジュゲート核酸；親油性部分を含有する核酸；ホスホロチオエート；様々な組織への薬物の侵入を増強することができるＰ糖タンパク質阻害剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ８５など）：生分解性ポリマー、例えば、埋め込み後の徐放性送達のためのポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コグリコリド）ミクロスフェア（Ｅｍｅｒｉｃｈ，Ｄ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，８，４７−５８）Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．；および負荷ナノ粒子、例えば、ポリブチルシアノアクリレートで作られるもの（血液脳関門にわたって薬物を送達することができ、神経取込み機構を変化させることができる）（Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２３，９４１−９４９，１９９９）が挙げられる。
【０１８４】
本開示はまた、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）脂質（ＰＥＧ修飾、分岐、および非分岐、もしくはそれらの組み合わせ、または長期循環型リポソームもしくはステルスリポソーム）を含有する、表面修飾リポソームを含む組成物の使用を特徴とする。本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートはまた、様々な分子量の共有結合ＰＥＧ分子も含むことができる。これらの製剤は、標的組織における薬物の蓄積を増加させるための方法を提供する。このクラスの薬物担体は、単核細胞貪食系（ＭＰＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン化および排除に抵抗し、それにより、カプセル化薬物の血液循環時間の延長および組織曝露の増強を可能にする（Ｌａｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７、Ｉｓｈｉｗａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，４３，１００５−１０１１）。そのようなリポソームは、おそらく溢血および血管新生標的組織における捕捉によって、腫瘍に選択的に蓄積することが示されている（Ｌａｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，２６７，１２７５−１２７６、Ｏｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６−９０）。長期循環型リポソームは、特にＭＰＳの組織に蓄積することが知られている従来のカチオン性リポソームと比較して、ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態および薬力学を増強する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，４２，２４８６４−２４８７０、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１０３９１号、Ａｎｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１０３９０号、Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１０３９２号）。また、長期循環型リポソームは、肝臓や脾臓などの代謝的に攻撃的なＭＰＳ組織において蓄積を回避するそれらの能力に基づいて、カチオン性リポソームと比較して、より大きい程度まで薬物をヌクレアーゼ分解から保護する可能性がある。
【０１８５】
さらなる実施形態において、本開示は、米国特許第６，６９２，９１１号、同第７，１６３，６９５号、および同第７，０７０，８０７号に記載されるような、送達のために調製されたアンチセンスオリゴマー医薬組成物およびアンチセンスオリゴマーコンジュゲート医薬組成物を含む。この点に関して、一実施形態において、本開示は、単独で、あるいはＰＥＧ（例えば、分岐もしくは非分岐ＰＥＧ、または両方の混合物）と組み合わせて、ＰＥＧおよび標的化部分と組み合わせて、あるいは架橋剤と組み合わせた上記のいずれかの、リシンおよびヒスチジン（ＨＫ）のコポリマーを含む組成物中の本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲート（米国特許第７，１６３，６９５号、同第７，０７０，８０７号、および６，６９２，９１１号に記載）を提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、グルコン酸修飾ポリヒスチジンまたはグルコニル化ポリヒスチジン／トランスフェリン−ポリリシンを含む医薬組成物中のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。当業者であれば、ＨｉｓおよびＬｙｓに類似した特性を有するアミノ酸が組成物内で置換され得ることも認識するであろう。
【０１８６】
湿潤剤、乳化剤、および滑沢剤（ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなど）、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、防腐剤、ならびに酸化防止剤も組成物中に存在することができる。
【０１８７】
薬学的に許容される酸化防止剤の例としては、（１）水溶性酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど、（２）油溶性酸化防止剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなど、および（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
【０１８８】
本開示の製剤には、経口、経鼻、局所（頬側および舌下を含む）、直腸、膣、ならびに／または非経口投与に適した製剤が含まれる。製剤は、便利に単位剤形で提示され得、薬学の技術分野で周知の任意の方法によって調製され得る。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、治療される対象および特定の投与様式に応じて異なる。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、概して、治療効果をもたらす活性成分の量である。概して、この量は、有効成分の約０．１パーセント〜約９９パーセント、好ましくは約５パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１０パーセント〜約３０パーセントの範囲である。
【０１８９】
ある特定の実施形態において、本開示の製剤は、シクロデキストリン、セルロース、リポソーム、ミセル形成剤、例えば、胆汁酸、およびポリマー担体、例えば、ポリエステルおよびポリ酸無水物から選択される賦形剤と、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートと、を含む。一実施形態において、製剤のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、それぞれ式（Ｖ）または式（ＩＩＩ）に従う。ある特定の実施形態において、上記の製剤は、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを経口的にバイオアベイラビリティにする。
【０１９０】
これらの製剤または医薬組成物を調製する方法には、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを担体、および必要に応じて１つ以上の副成分と会合させるステップを含む。概して、製剤は、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを液体担体、もしくは微粉化固体担体、またはその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで、必要に応じて生成物を成形することによって調製される。
【０１９１】
経口投与に適した本開示の製剤は、カプセル、カシェー、ピル、錠剤、トローチ（風味付けした基剤、通常はスクロースおよびアカシアもしくはトラガカント）、粉末、顆粒、または水性もしく非水性の溶液中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油または油中水の液体乳剤として、またはエリキシル剤もしくはシロップとして、または香錠（不活性基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、もしくはスクロースおよびアカシア）および／もしくは口内洗浄液としての形態などであってもよく、各々は、有効成分として、所定量の本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを含有する。本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートはまた、ボーラス、舐剤、またはペーストとして投与されてもよい。
【０１９２】
経口投与のための本開示の固形剤形（カプセル、錠剤、ピル、糖剤、粉末、顆粒、トルーチなど）において、有効成分は、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、および／または以下のいずれかなどの１つ以上の薬学的に許容される担体と混合されてもよい：（１）充填剤または増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸、（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、および／またはアカシア、（３）保湿剤、例えば、グリセロール、（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム、（５）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、（６）吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物および界面活性剤、例えば、ポロキサマーおよびラウリル硫酸ナトリウム、（７）湿潤剤、例えば、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロール、非イオン性界面活性剤、（８）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイト粘土など、（９）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸、およびそれらの混合物、（１０）着色剤、ならびに（１１）放出制御剤、例えば、クロスポビドンまたはエチルセルロース。カプセル、錠剤、およびピルの場合、医薬組成物はまた、緩衝剤を含んでもよい。類似のタイプの固体医薬組成物はまた、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用した、軟質および硬質シェルのゼラチンカプセル中の充填剤としても用いられ得る。
【０１９３】
錠剤は、必要に応じて１つ以上の副成分との圧縮または成型によって作製され得る。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤または分散剤を使用して調製され得る。成型錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を好適な機械で成型することによって作製され得る。
【０１９４】
本開示の医薬組成物の錠剤および他の固体剤形、例えば、糖剤、カプセル、ピル、および顆粒は、必要に応じて、コーティングおよびシェル、例えば、腸溶性コーティング、および医薬品製剤化技術で周知の他のコーティングを用いて、獲得または調製され得る。また、それらは、所望の放出プロファイル、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを提供するために、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを様々な割合で使用して、その中の有効成分の徐放または制御放出を提供するように製剤化されてもよい。それらは、例えば凍結乾燥など、迅速放出のために製剤化されてもよい。それらは、例えば、細菌保持フィルタを通した濾過によって、または使用直前に滅菌水に溶解され得る滅菌固体医薬組成物の形態の滅菌剤、もしくはいくつかの他の滅菌注射用媒質を組み込むことによって滅菌され得る。また、これらの医薬組成物は必要に応じて、不透明化剤を含有してもよく、それらが有効成分（複数可）のみを、または優先的に、消化管の特定の部分において、必要に応じて遅延した様式で放出する組成物を有してもよい。使用され得る埋め込み組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。有効成分はまた、適切な場合、上記の賦形剤のうちの１つ以上を有する、マイクロカプセル形態であってもよい。
【０１９５】
本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの経口
投与用の液体剤形は、薬学的に許容される乳剤、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤を含む。有効成分に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ソルビタンのポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物など、当該技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含有してもよい。
【０１９６】
不活性希釈剤に加えて、経口医薬組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤、ならびに防腐剤などのアジュバントも含むことができる。
【０１９７】
活性化合物に加えて、懸濁液は、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにそれらの混合物などの懸濁化剤を含有してもよい。
【０１９８】
直腸投与または膣投与用の製剤は、坐剤として提示され得、これは、本開示の１つ以上の化合物を、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、坐剤ワックス、またはサリチル酸塩を含む１つ以上の好適な非刺激性賦形剤または担体と混合することによって調製され得、これは室温では固体であるが、体温では液体であり、したがって、直腸または膣腔で溶解し、活性化合物を放出する。
【０１９９】
本明細書に提供されるオリゴマーの局所投与または経皮投与のための製剤または剤形は、粉末、噴霧剤、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、および吸入剤を含む。活性アンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、滅菌条件下で、薬学的に許容される担体と、および必要とされ得る任意の防腐剤、緩衝剤、または噴射剤と混合され得る。軟膏、ペースト、クリーム、およびゲルは、本開示の活性化合物に加えて、動物性および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、および酸化亜鉛、またはそれらの混合物などの賦形剤を含有し得る。
【０２００】
粉末および噴霧剤は、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートに加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含有することができる。噴霧剤はさらに、クロロフルオロ炭化水素などの通例の噴射剤、ならびにブタンおよびプロパンなどの揮発性非置換炭化水素を含有することができる。
【０２０１】
経皮パッチは、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの体内への制御送達を提供するというさらなる利点を有する。そのような剤形は、オリゴマーを適切な媒質に溶解するか、または分散させることによって作製され得る。吸収促進剤もまた、皮膚にわたる薬剤の流れを増加させるために使用され得る。そのような流れの速度は、当該技術分野で既知の方法の中でも特に、速度制御膜を提供すること、またはポリマーマトリックスもしくはゲル中に薬剤を分散させることのいずれかによって制御され得る。
【０２０２】
非経口投与に適した医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される滅菌等張水溶液もしくは非水溶液、分散液、懸濁液もしくは乳剤、または使用直前に滅菌注射用溶液もしくは分散液に再構成され得る滅菌粉末と組み合わせて、本開示の１つ以上のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを含んでもよく、これらは、糖、アルコール、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁化剤もしくは増粘剤を含有し得る。本開示の医薬組成物で用いられ得る好適な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合に必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。一実施形態において、医薬組成物のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、それぞれ式（Ｖ）または式（ＩＩＩ）に従う。
【０２０３】
また、これらの医薬組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントを含有してもよい。主題のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートに対する微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることによって確保され得る。また、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含むことが望ましい場合もある。さらに、注射用剤形の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど、吸収を遅延させる薬剤を含めることによってもたらされ得る。
【０２０４】
場合によっては、薬物の効果を延長するために、皮下または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましい。これは、当該技術分野で既知の方法の中でも特に、水溶性が乏しい結晶性または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって達成され得る。次いで、薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、溶解速度は、結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口的に投与された薬物形態の吸収の遅延は、薬物を油ビヒクルに溶解または懸濁することによって達成される。
【０２０５】
注射用デポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中で主題のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートのマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製され得る。ポリマーに対するオリゴマーの比率および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、オリゴマー放出の速度が制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（酸無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤はまた、体内組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルションに薬物を封入することによっても調製され得る。
【０２０６】
本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートが、ヒトおよび動物に医薬品として投与されるとき、それらは、それ自体で、または例えば、薬学的に許容される担体と組み合わせた０．１〜９９％（より好ましくは１０〜３０％）のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを含有する医薬組成物として投与され得る。
【０２０７】
本開示の製剤または調製物は、経口的、非経口的、局所的、または直腸に投与され得る。これらは典型的には、各投与経路に適した形態で投与される。例えば、それらは、錠剤もしくはカプセル形態で、注射、吸入、目薬、軟膏、坐剤、もしくは点滴によって、ローションもしくは軟膏によって局所的に、または坐剤によって直腸に投与される。
【０２０８】
選択される投与経路にかかわらず、適切な水和形態で使用され得る本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、ならびに／または本開示の医薬組成物は、当業者に既知の従来的な方法によって薬学的に許容される剤形に製剤化され得る。本開示の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、特定の患者に対して許容できないほどの毒性を示すことなく、該患者、組成物、および投与様式に対して望ましい治療反応を達成するために有効である有効成分の量を得るために変動し得る。
【０２０９】
選択される投与量レベルは、用いられる本開示の特定のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、またはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時刻、用いられる特定のオリゴマーの排泄速度または代謝速度、吸収の速度および程度、治療期間、用いられる特定のオリゴマーと組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または材料、治療中の患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康状態、および既往歴、ならびに医学技術で周知の同様の要因を含む、様々な要因に依存する。
【０２１０】
当該技術分野における通常の技術を有する医師または獣医であれば、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定および処方することができる。例えば、医師または獣医は、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルで、医薬組成物中で用いられる本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの投与を開始し、望ましい効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることができる。概して、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの好適な１日用量は、治療効果をもたらすのに有効な最低用量であるアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの量である。そのような有効用量は、概して、本明細書に記載される要因に依存する。概して、患者のための本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの経口、静脈内、脳室内、および皮下用量は、示された効果のために使用される場合、１日当たり体重１キログラム当たり約０．０００１〜約１００ｍｇの範囲である。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、概して、約１０〜１６０ｍｇ／ｋｇまたは２０〜１６０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。場合によっては、１６０ｍｇ／ｋｇを超える用量が必要である場合もある。いくつかの実施形態において、静脈内投与の用量は、約０．５ｍｇ〜１６０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、約０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、約１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２１ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２６ｍｇ／ｋｇ、２７ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、２９ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３１ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、３３ｍｇ／ｋｇ、３４ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、３６ｍｇ／ｋｇ、３７ｍｇ／ｋｇ、３８ｍｇ／ｋｇ、３９ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４１ｍｇ／ｋｇ、４２ｍｇ／ｋｇ、４３ｍｇ／ｋｇ、４４ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、４６ｍｇ／ｋｇ、４７ｍｇ／ｋｇ、４８ｍｇ／ｋｇ、４９ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５１ｍｇ／ｋｇ、５２ｍｇ／ｋｇ、５３ｍｇ／ｋｇ、５４ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、５６ｍｇ／ｋｇ、５７ｍｇ／ｋｇ、５８ｍｇ／ｋｇ、５９ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１０５ｍｇ／ｋｇ、１１０ｍｇ／ｋｇ、１１５ｍｇ／ｋｇ、１２０ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１３０ｍｇ／ｋｇ、１３５ｍｇ／ｋｇ、１４０ｍｇ／ｋｇ、１４５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１５５ｍｇ／ｋｇ、１６０ｍｇ／ｋｇ（それらの間の全ての整数を含む）の用量で投与される。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、１０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、２０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、３０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、４０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、６０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、８０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、１６０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、５０ｍｇ／ｋｇで投与される。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、概して、約１０〜１６０ｍｇ／ｋｇまたは２０〜１６０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、静脈内投与のための式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの用量は、約０．５ｍｇ〜１６０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、約０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、約１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２１ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２６ｍｇ／ｋｇ、２７ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、２９ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３１ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、３３ｍｇ／ｋｇ、３４ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、３６ｍｇ／ｋｇ、３７ｍｇ／ｋｇ、３８ｍｇ／ｋｇ、３９ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４１ｍｇ／ｋｇ、４２ｍｇ／ｋｇ、４３ｍｇ／ｋｇ、４４ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、４６ｍｇ／ｋｇ、４７ｍｇ／ｋｇ、４８ｍｇ／ｋｇ、４９ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５１ｍｇ／ｋｇ、５２ｍｇ／ｋｇ、５３ｍｇ／ｋｇ、５４ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、５６ｍｇ／ｋｇ、５７ｍｇ／ｋｇ、５８ｍｇ／ｋｇ、５９ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１０５ｍｇ／ｋｇ、１１０ｍｇ／ｋｇ、１１５ｍｇ／ｋｇ、１２０ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１３０ｍｇ／ｋｇ、１３５ｍｇ／ｋｇ、１４０ｍｇ／ｋｇ、１４５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１５５ｍｇ／ｋｇ、１６０ｍｇ／ｋｇ（それらの間の全ての整数を含む）の用量で投与される。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、１０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、２０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、３０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、４０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、６０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、８０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、１６０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたは式（Ｖ）のアンチセンスオリゴマーは、５０ｍｇ／ｋｇで投与される。
【０２１３】
所望される場合、活性化合物の有効な日用量は、１日を通して適切な間隔で、必要に応じて単位剤形で別々に投与される、２、３、４、５、６回、またはそれより多くの部分用量として投与されてもよい。ある特定の状況において、投与は１日１回の投与である。ある特定の実施形態において、投与は、機能性ジストロフィンタンパク質の所望の発現を維持するために、必要に応じて、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日毎、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週毎、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヵ月毎に１回以上の投与である。ある特定の実施形態において、投与は、２週間毎に１度、１回以上の投与である。いくつかの実施形態において、投与は、２週間毎に１度、１回の投与である。様々な実施形態において、投与は、毎月１回以上の投与である。ある特定の実施形態において、投与は、毎月１回の投与である。
【０２１４】
様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、２０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、３０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、４０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、６０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、８０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１００ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１６０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。本明細書で使用される場合、毎週は、１週間毎の当該技術分野で認められた意味を有すると理解される。
【０２１５】
様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、２０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、３０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、４０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、６０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、８０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１００ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１６０ｍｇ／ｋｇで毎週投与される。本明細書で使用される場合、毎週は、１週間毎の当該技術分野で認められた意味を有すると理解される。
【０２１６】
様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、２０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、３０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、４０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、６０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、８０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１００ｍｇ／ｋｇ隔週で投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１６０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。本明細書で使用される場合、隔週は、２週間毎の当該技術分野で認められた意味を有すると理解される。
【０２１７】
様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、２０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、３０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、４０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、６０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、８０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１００ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１６０ｍｇ／ｋｇで隔週投与される。本明細書で使用される場合、隔週は、２週間毎の当該技術分野で認められた意味を有すると理解される。
【０２１８】
様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１０ｍｇ／ｋｇで３週間毎に投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、２０ｍｇ／ｋｇで３週間毎に投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、３０ｍｇ／ｋｇで３週間毎に投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、４０ｍｇ／ｋｇで３週間毎に投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、６０ｍｇ／ｋｇで３週間毎に投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、８０ｍｇ／ｋｇで３週間毎に投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１００ｍｇ／ｋｇで３週間毎に投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１６０ｍｇ／ｋｇで３週間毎に投与される。本明細書で使用される場合、３週間毎は、３週間毎に１回の当該技術分野で認められた意味を有すると理解される。
【０２１９】
様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１０ｍｇ／ｋｇで３週毎に投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、２０ｍｇ／ｋｇで３週毎に投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、３０ｍｇ／ｋｇで３週毎に投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、４０ｍｇ／ｋｇで３週毎に投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、６０ｍｇ／ｋｇで３週毎に投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、８０ｍｇ／ｋｇで３週毎に投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１００ｍｇ／ｋｇで３週毎に投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１６０ｍｇ／ｋｇで３週毎に投与される。本明細書で使用される場合、３週間毎は、３週間毎に１回の当該技術分野で認められた意味を有すると理解される。
【０２２０】
様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、２０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、３０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、４０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、６０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、８０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１００ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、１６０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。本明細書で使用される場合、毎月は、１か月毎の当該技術分野で認められた意味を有すると理解される。
【０２２１】
様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、２０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、３０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。様々な実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、４０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、６０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、８０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、１００ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマー
は、１６０ｍｇ／ｋｇで毎月投与される。本明細書で使用される場合、毎月は、１か月毎の当該技術分野で認められた意味を有すると理解される。
【０２２２】
当該技術分野で理解されるように、毎週、隔週、３週間毎、または毎月の投与は、本明細書で考察されるように、１回もしくはそれより多くの投与または部分用量であってもよい。
【０２２３】
本明細書に記載される核酸分子、アンチセンスオリゴマー、およびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、本明細書に記載され、かつ当該技術分野において既知のような、リポソームへの封入、イオン導入、またはハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、および生体接着性ミクロスフェアなどの他のビヒクルへの組み込みが挙げられるが、これらに限定されない、当業者に既知の様々な方法によって細胞に投与され得る。ある特定の実施形態において、マイクロ乳化技術を利用して、親油性（非水溶性）医薬品のバイオアベイラビリティを改善してもよい。例としては、Ｔｒｉｍｅｔｒｉｎｅ（Ｄｏｒｄｕｎｏｏ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１７（１２），１６８５−１７１３，１９９１）、およびＲＥＶ  ５９０１（Ｓｈｅｅｎ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ８０（７），７１２−７１４，１９９１）が挙げられる。利点の中でも特に、マイクロ乳化は、循環系の代わりにリンパ系への吸収を優先的に誘導し、それにより肝臓を迂回し、肝胆道循環における化合物の破壊を防止することによって、増強されたバイオアベイラビリティを提供する。
【０２２４】
開示の一態様において、製剤は、本明細書に提供されるオリゴマーから形成されるミセルと、ミセルが約１００ｎｍ未満の平均直径を有する少なくとも１つの両親媒性担体とを含有する。より好ましい実施形態は、約５０ｎｍ未満の平均直径を有するミセルを提供し、さらに好ましい実施形態は、約３０ｎｍ未満またはさらに約２０ｎｍ未満の平均直径を有するミセルを提供する。
【０２２５】
全ての好適な両親媒性担体が企図されるが、現在好ましい担体は概して、一般的に安全と認められている（ＧＲＡＳ）状態を有し、かつ本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを可溶化すること、および溶液が複雑な水相（ヒト胃腸管に見られるものなど）と接触した後の段階でそれをマイクロ乳化することの両方ができる担体である。これらの要件を満たす両親媒性成分は、通常、ＨＬＢ（親水性−親油性のバランス）値が２−２０であり、それらの構造は、Ｃ−６からＣ−２０の範囲の直鎖脂肪族ラジカルを含有する。例としては、ポリエチレングリコール化脂肪酸グリセリドおよびポリエチレングリコールがある。
【０２２６】
両親媒性担体の例としては、飽和および一不飽和ポリエチレングリコール化脂肪酸グリセリド、例えば、完全または部分的に水素化された様々な植物油から得られるものが挙げられる。そのような油は有利に、トリ−、ジ−、およびモノ−脂肪酸グリセリド、ならびに対応する脂肪酸のジ−およびモノ−ポリ（エチレングリコール）エステルからなり得、特に好ましい脂肪酸組成物としては、カプリン酸４〜１０％、カプリン酸３〜９％、ラウリン酸４０〜５０％、ミリスチン酸１４〜２４％、パルミチン酸４〜１４％、およびステアリン酸５〜１５％が挙げられる。別の有用なクラスの両親媒性担体としては、飽和もしくは一不飽和脂肪酸（ＳＰＡＮ（登録商標）シリーズ）または対応するエトキシ化類似体（ＴＷＥＥＮ（登録商標）シリーズ）を有する、部分的にエステル化されたソルビタンおよび／またはソルビトールが挙げられる。
【０２２７】
Ｇｅｌｕｃｉｒｅシリーズ、Ｌａｂｒａｆｉｌ、Ｌａｂｒａｓｏｌ、またはＬａｕｒｏｇｌｙｃｏｌ（全てＧａｔｔｅｆｏｓｓｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｉｎｔ  Ｐｒｉｅｓｔ，Ｆｒａｎｃｅによって製造および流通）、ＰＥＧ−モノ−オレイン酸、ＰＥＧ−ジ−オレイン酸、ＰＥＧ−モノ−ラウリン酸およびジ−ラウリン酸、レシチン、ポリソルベート８０など（米国および世界中の多くの企業によって製造および流通）を含む市販の両親媒性担体が、特に有用であり得る。
【０２２８】
ある特定の実施形態において、送達は、本開示の医薬組成物を好適な宿主細胞に導入するために、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などを使用することによって行い得る。特に、本開示の医薬組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、ナノ粒子、または同様のもののいずれかに封入された送達用に製剤化され得る。そのような送達ビヒクルの製剤化および使用は、既知の技術および従来の技術を使用して行われ得る。
【０２２９】
本開示での使用に適した親水性ポリマーは、容易に水溶性であり、小胞形成脂質に共有結合することができ、かつ毒性作用なしにｉｎ  ｖｉｖｏで耐容性がある（すなわち、生体適合性である）ものである。好適なポリマーとしては、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ポリラクチドとも呼ばれる）、ポリグリコール酸（ポリグリコリドとも呼ばれる）、ポリ乳酸−ポリグリコール酸コポリマー、およびポリビニルアルコールが挙げられる。ある特定の実施形態において、ポリマーは、約１００もしくは１２０ダルトン〜最大で約５，０００もしくは１０，０００ダルトン、または約３００ダルトン〜約５，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。他の実施形態において、ポリマーは、約１００〜約５，０００ダルトンの重量平均分子量を有する、または約３００〜約５，０００ダルトンの重量平均分子量を有する、ポリ（エチレングリコール）である。ある特定の実施形態において、ポリマーは、約７５０ダルトンの重量平均分子量を有するポリ（エチレングリコール）、例えば、ＰＥＧ（７５０）である。ポリマーは、その中のモノマーの数によっても定義され得、本開示の好ましい実施形態は、少なくとも約３つのモノマーのポリマーを利用し、３つのモノマーからなるそのようなＰＥＧポリマーは、分子量が約１３２ダルトンである。
【０２３０】
本開示での使用に適し得る他の親水性ポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ポリメトキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、および誘導体化セルロース、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースが挙げられる。
【０２３１】
ある特定の実施形態において、本開示の製剤は、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、アクリルエステルおよびメタクリルエステルのポリマー、ポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそのコポリマー、セルロース、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ酸無水物、ポリ（オルソ）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、多糖類、タンパク質、ポリヒアルロン酸、ポリシアノアクリレート、ならびにそれらのブレンド、混合物、またはコポリマーからなる群から選択される生体適合性ポリマーを含む。
【０２３２】
シクロデキストリンは、６、７、または８グルコース単位からなる環状オリゴ糖であり、それぞれギリシャ文字α、β、またはγによって示される。グルコース単位は、α−１，４−グルコシド結合によって連結される。糖単位の椅子型配座の結果として、全ての二次ヒドロキシル基（Ｃ−２、Ｃ−３における）が環の一方の側に位置する一方で、Ｃ−６における全ての一次ヒドロキシル基は、他方の側に位置する。結果として、外面は親水性であり、シクロデキストリンを水溶性にする。対照的に、シクロデキストリンの空洞は、それらが原子Ｃ−３およびＣ−５の水素によって、かつエーテル様酸素によって覆われているため、疎水性である。これらのマトリックスは、例えば、１７α−エストラジオールなどのステロイド化合物を含む、様々な比較的疎水性の化合物との複合体形成を可能にする（例えば、ｖａｎ  Ｕｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓ．Ｏｒｇ．Ｃｕｌｔ．３８：１−３−１１３（１９９４）を参照）。複合体形成は、ファンデルワールス相互作用および水素結合形成によって起こりる。シクロデキストリンの化学的性質に関する一般的なレビューについては、Ｗｅｎｚ，Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：８０３−８２２（１９９４）を参照されたい。
【０２３３】
シクロデキストリン誘導体の物理化学的性質は、置換の種類および程度に大きく依存する。例えば、それらの水溶性は、不溶性（例えば、トリアセチル−ベータ−シクロデキストリン）から１４７％可溶性（ｗ／ｖ）（Ｇ−２−ベータ−シクロデキストリン）の範囲である。さらに、それらは多くの有機溶媒に可溶性である。シクロデキストリンの特性は、それらの溶解度を増減させることによって、様々な製剤構成成分の溶解度の制御を可能にする。
【０２３４】
多数のシクロデキストリンおよびそれらの調製のための方法が記載されている。例えば、Ｐａｒｍｅｔｅｒ（Ｉ）ら（米国特許第３，４５３，２５９号）およびＧｒａｍｅｒａら（米国特許第３，４５９，７３１号）が、電気的中性シクロデキストリンについて記載している。他の誘導体としては、カチオン特性を有するシクロデキストリン［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩ），米国特許第３，４５３，２５７号］、不溶性架橋シクロデキストリン（Ｓｏｌｍｓ，米国特許第３，４２０，７８８号）、およびアニオン特性を有するシクロデキストリン［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩＩ），米国特許第３，４２６，０１１号］が挙げられる。アニオン特性を有するシクロデキストリン誘導体のうち、カルボン酸、亜リン酸、亜ホスフィン酸、ホスホン酸、リン酸、チオホスホン酸、チオスルフィン酸、およびスルホン酸は、親シクロデキストリンに付加されている［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩＩ）、上記参照］。さらに、スルホアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体は、Ｓｔｅｌｌａら（米国特許第５，１３４，１２７号）によって記載されている。
【０２３５】
リポソームは、水性内部区画を取り囲む少なくとも１つの脂質二重層膜からなる。リポソームは、膜のタイプおよびサイズによって特徴付けられ得る。小単ラメラ小胞（ＳＵＶ）は単一膜を有し、典型的には、直径が０．０２〜０．０５μｍの範囲であり、大単ラメラ小胞（ＬＵＶＳ）は、典型的には０．０５μｍよりも大きい。オリゴラメラ大小胞およびマルチラメラ小胞は、複数の、通常は同心性の膜層を有し、典型的には０．１μｍよりも大きい。いくつかの非同心膜を有するリポソームは、すなわち、より大きい小胞内に含有されるいくつかのより小さい小胞は、多胞体小胞と呼ばれる。
【０２３６】
本開示の一態様は、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを含有するリポソームを含む製剤に関し、リポソーム膜は、増加した担持能力を有するリポソームを提供するように製剤化される。あるいは、または加えて、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、リポソームのリポソーム二重層内に含有されてもよく、またはその上に吸着されてもよい。本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、脂質界面活性剤と凝集され、リポソームの内部空間内に担持され得る。これらの場合、リポソーム膜は、活性薬剤−界面活性剤凝集体の崩壊効果に抵抗するように製剤化される。
【０２３７】
本開示の一実施形態によると、リポソームの脂質二重層は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）で誘導体化された脂質を含有し、これによりＰＥＧ鎖は、脂質二重層の内面からリポソームによって封入された内部空間へと延在し、かつ脂質二重層の外部から周囲環境へと延在する。
【０２３８】
本開示のリポソーム内に含有される活性薬剤は、可溶化形態である。界面活性剤および活性薬剤の凝集体（対象の活性薬剤を含有するエマルションまたはミセルなど）は、本開示によるリポソームの内部空間内に閉じ込められ得る。界面活性剤は、活性薬剤を分散させ可溶化するように作用し、様々な鎖長（例えば、約Ｃ１４〜約Ｃ２０）の生体適合性リゾホスファチジルコリン（ＬＰＧ）を含むがこれに限定されない、任意の好適な脂肪族、脂環式、または芳香族界面活性剤から選択され得る。ＰＥＧ−脂質などのポリマー誘導体化脂質は、ミセル／膜融合を阻害するように作用するため、また界面活性剤分子へのポリマーの添加が界面活性剤のＣＭＣを減少させ、ミセル形成を助けるため、ミセル形成にも利用され得る。マイクロモル濃度範囲のＣＭＯを有する界面活性剤が好ましく、より高いＣＭＣ界面活性剤を利用して、本開示のリポソーム内に閉じ込められたミセルを調製し得る。
【０２３９】
本開示によるリポソームは、当該技術分野で既知の様々な技術のいずれかによって調製され得る。例えば、米国特許第４，２３５，８７１号、公開ＰＣＴ出願第ＷＯ９６／１４０５７号、Ｎｅｗ  ＲＲＣ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９０），ｐａｇｅｓ  ３３−１０４、およびＬａｓｉｃ  ＤＤ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈｙｓｉｃｓ  ｔｏ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  ＢＶ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９３を参照されたい。例えば、本開示のリポソームは、リポソーム中で所望の誘導体化脂質の最終モルパーセントに相当する脂質濃度で、親水性ポリマーで誘導体化された脂質を予め形成されたリポソームに拡散することによって、例えば、予め形成されたリポソームを脂質グラフトポリマーから構成されるミセルに曝露することによって、調製され得る。親水性ポリマーを含有するリポソームはまた、当該技術分野で既知のように、均質化、脂質場水和、または押出技術によって形成され得る。
【０２４０】
別の例示的な製剤化手順において、活性薬剤はまず、疎水性分子を容易に可溶化するリゾホスファチジルコリンまたは他の低ＣＭＣ界面活性剤（ポリマーグラフト脂質を含む）中での音波処理によって分散される。次いで、活性薬剤の得られたミセル懸濁液を使用して、好適なモルパーセントのポリマーグラフト脂質またはコレステロールを含有する乾燥脂質試料を再水和する。次いで、脂質および活性薬剤懸濁液は、当該技術分野で既知の押出技術を使用してリポソームに形成され、得られたリポソームは、標準的なカラム分離によって封入されていない溶液から分離される。
【０２４１】
本開示の一態様において、リポソームは、選択されたサイズ範囲において実質的に均一なサイズを有するように調製される。１つの効果的なサイズ決定方法は、選択された均一な孔径を有する一連のポリカーボネート膜を通してリポソームの水性懸濁液を押し出すことを伴い、膜の孔径は、その膜を通した押出によってもたらされるリポソームの最大サイズに概ね相当する。例えば、米国特許第４，７３７，３２３号（１９８８年４月１２日）を参照されたい。ある特定の実施形態において、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）などの試薬を利用して、ポリヌクレオチドまたはタンパク質を細胞に導入し得る。
【０２４２】
本開示の製剤の放出特性は、封入材料、封入薬物の濃度、および放出調節剤の存在に依存する。例えば、放出は、例えば、胃にあるような低ｐＨ、または腸にあるような高ｐＨでのみ放出するｐＨ感受性コーティングを使用して、ｐＨ依存性になるように操作され得る。腸溶性コーティングは、胃を通過した後まで放出が起こらないように使用され得る。異なる材料に封入されたシアナミドの複数のコーティングまたは混合物を使用して、胃内で初期放出を得て、続いて腸内で後の放出を得ることができる。放出はまた、塩または細孔形成剤を含ませることによっても操作され得、これは、水取込みまたはカプセルからの拡散による薬物の放出を増加させることができる。薬剤の溶解度を修正する賦形剤は、放出速度を制御するためにも使用され得る。マトリックスの分解またはマトリックスからの放出を増強する薬剤も組み込まれ得る。それらは、薬物に添加され得るか、別個の相として添加され得るか（すなわち、微粒子として）、または化合物に応じてポリマー相で共溶解され得る。ほとんどの場合、量は、０．１〜３０パーセント（ｗ／ｗポリマー）であるべきである。分解促進剤のタイプには、硫酸アンモニウムおよび塩化アンモニウムなどの無機塩、クエン酸、安息香酸、およびアスコルビン酸などの有機酸、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸亜鉛、および水酸化亜鉛などの無機塩基、ならびにプロタミン硫酸塩、スペルミン、コリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、およびトリエタノールアミンなどの有機塩基、ならびにＴｗｅｅｎ（登録商標）およびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）などの界面活性剤が含まれる。マトリックスに微細構造を付加する細孔形成剤（すなわち、無機塩および糖類などの水溶性化合物）が、微粒子として添加される。範囲は典型的には、１〜３０パーセント（ｗ／ｗポリマー）である。
【０２４３】
また、取込みは、腸内の粒子の滞留時間を変化させることによっても操作され得る。これは、例えば、粒子を粘膜接着性ポリマーでコーティングするか、または封入材料として選択することによって達成され得る。例としては、遊離カルボキシル基を有するほとんどのポリマー、例えば、キトサン、セルロース、および特にポリアクリレート（本明細書で使用される場合、ポリアクリレートとは、アクリレート基、ならびにシアノアクリレートおよびメタクリレートなどの修飾アクリレート基を含むポリマーを指す）が挙げられる。
【０２４４】
アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、外科用または医療用のデバイスまたはインプラント内に含まれるように製剤化され得るか、またはそれによって放出されるように適合され得る。ある特定の態様において、インプラントは、アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートでコーティングされ得るか、または別の方法で処理され得る。例えば、ヒドロゲル、または生体適合性および／もしくは生分解性ポリマーなどの他のポリマーを使用して、本開示の医薬組成物でインプラントをコーティングし得る（すなわち、組成物は、ヒドロゲルまたは他のポリマーを使用して医療デバイスと共に使用するように適合され得る）。医療デバイスを薬剤でコーティングするためのポリマーおよびコポリマーは、当該技術分野で周知である。インプラントの例としては、ステント、薬剤溶出性ステント、縫合糸、人工器官、血管カテーテル、透析カテーテル、血管グラフト、人工心臓弁、心臓ペースメーカー、植込み型除細動器、ＩＶ針、接骨および骨形成用デバイス、例えば、ピン、スクリュー、プレート、および他のデバイス、ならびに創傷治癒のための人工組織マトリックスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４５】
本明細書に提供される方法に加えて、本開示による使用のためのアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、他の医薬品から類推して、ヒトまたは獣医学で使用するための任意の便利な方法で投与するために製剤化され得る。アンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲート、ならびにそれらの対応する製剤は、単独で、または筋芽細胞移植、幹細胞療法、アミノグリコシド系抗生物質の投与、プロテアソーム阻害剤、および上方制御療法（例えば、ジストロフィンの常染色体パラログであるユートロフィンの上方制御）などの筋ジストロフィーの治療における他の治療戦略と組み合わせて投与されてもよい。
【０２４６】
いくつかの実施形態において、追加の治療薬は、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの投与の前に、それと併せて、またはその後に投与されてもよい。例えば、アンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、ステロイドおよび／または抗生物質と組み合わせて投与されてもよい。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、バックグラウンドステロイド理論（例えば、間欠的または長期／連続的バックグラウンドステロイド療法）を受けている患者に投与される。例えば、いくつかの実施形態において、患者は、アンチセンスオリゴマーの投与前にコルチコステロイドで治療されており、ステロイド療法を受け続けている。いくつかの実施形態において、ステロイドは、糖質コルチコイドまたはプレドニゾンである。
【０２４７】
記載される投与経路は、当業者が、任意の特定の動物および状態にとって最適な投与経路および任意の投与量を容易に決定することができるため、指針としてのみ意図される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、機能的な新しい遺伝物質を細胞に導入するための複数のアプローチが試みられている（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５−１２８０）。これらのアプローチには、発現する遺伝子の修飾レトロウイルスへの組み込み、（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）上記、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１（１８），ｓｕｐｐｌ．：５０７４Ｓ−５０７９Ｓ）、非レトロウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクター）への組み込み（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ，６８：１４３−１５５、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：４３１−４３４）、またはリポソームを介した異種プロモーター−エンハンサーエレメントに連結された導入遺伝子の送達（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）、上記、Ｂｒｉｇｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，２９８：２７８−２８１、Ｎａｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１２８５−１２８８、Ｈａｚｉｎｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，４：２０６−２０９、およびＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８４：７８５１−７８５５）、リガンド特異的、カチオン系輸送システムとの結合（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１４６２１−１４６２４）、またはネイキッドＤＮＡ、発現ベクターの使用（Ｎａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）、上記、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６５−１４６８）が含まれる。導入遺伝子の組織への直接注射は、局所発現のみをもたらす（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９２）上記、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）上記、Ｂｒｉｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）上記、Ｎａｂｅｌ（１９９０）上記、およびＨａｚｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）上記）。Ｂｒｉｇｈａｍらのグループ（Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．（１９８９）２９８：２７８−２８１およびＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３９（要約））は、ＤＮＡリポソーム複合体の静脈内または気管内のいずれかの投与後のマウスの肺のｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクションのみを報告している。ヒト遺伝子治療手順のレビュー文献の一例は、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：８０８−８１３である。
【０２４８】
さらなる実施形態において、本開示の医薬組成物は、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ．７，１０９８１（２０１６）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に提供されるように、追加的に炭水化物を含み得る。いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、５％のヘキソース炭水化物を含んでもよい。例えば、本開示の医薬組成物は、５％のグルコース、５％のフルクトース、または５％のマンノースを含んでもよい。ある特定の実施形態において、本開示の医薬組成物は、２．５％のグルコースおよび２．５％のフルクトースを含んでもよい。いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、５体積％の量で存在するアラビノース、５体積％の量で存在するグルコース、５体積％の量で存在するソルビトール、５体積％の量で存在するガラクトース、５体積％の量で存在するフルクトース、５体積％の量で存在するキシリトール、５体積％の量で存在するマンノース、各々が２．５体積％の量で存在するグルコースとフルクトースの組み合わせ、ならびに５．７体積％の量で存在するグルコース、２．８６体積％の量で存在するフルクトース、および１．４体積％の量で存在するキシリトールの組み合わせから選択される炭水化物を含んでもよい。
【０２４９】
ＩＶ．使用方法
エクソンスキッピングを使用したジストロフィンリーディングフレームの回復
ジストロフィン遺伝子のアウトオブフレーム変異によって引き起こされるＤＭＤの治療に対する潜在的な治療アプローチは、インフレーム変異によって引き起こされるＢＭＤとして既知のより軽度な型のジストロフィン異常症によって示唆される。アウトオブフレーム変異をインフレーム変異に変換する能力は、仮定では、ｍＲＮＡリーディングフレームを保持し、内部で短縮されたが機能的なジストロフィンタンパク質を産生する。本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを、これを達成するように設計した。
【０２５０】
ＰＭＯの標的プレｍＲＮＡ配列でのハイブリダイゼーションは、プレｍＲＮＡスプライシング複合体の形成を妨げ、成熟ｍＲＮＡからエクソン５３を欠失させる。本開示のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの構造および配座により、相補的配列に対する配列特異的塩基対合が可能となる。類似の機構により、例えば、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１をスキップするよう設計されたＰＭＯであるエテプリルセンは、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１に含有される相補的配列に対する配列特異的塩基対合を可能にする。
【０２５１】
全ての７９個のエクソンを含有する正常なジストロフィンｍＲＮＡは、正常なジストロフィンタンパク質を産生する。図１の図は、エクソン４７からエクソン５３までのジストロフィンプレｍＲＮＡおよび成熟ｍＲＮＡの小さい区分を示す。各エクソンの形状は、コドンがどのようにエクソン間で分割されるかを示す。注目すべきことに、１つのコドンは、３つのヌクレオチドからなる。長方形のエクソンは、完全なコドンで始まり、終わる。矢印形状のエクソンは、完全なコドンで始まるが、コドンのヌクレオチド＃１のみを含有する分割コドンで終わる。このコドンのヌクレオチド＃２および＃３は、シェブロン形状で始まる後続のエクソンに含有される。
【０２５２】
ジストロフィン遺伝子からエクソン全体を失っているジストロフィンｍＲＮＡは、典型的には、ＤＭＤをもたらす。図２の図は、ＤＭＤをもたらすことが知られている遺伝子変異のタイプ（エクソン５０の欠失）を示す。エクソン４９が完全なコドンで終了し、エクソン５１がコドンの第２のヌクレオチドで始まるため、エクソン４９の後のリーディングフレームはシフトされ、アウトオブフレームｍＲＮＡリーディングフレーム、および変異の下流の誤ったアミノ酸の組み込みをもたらす。その後、機能的なＣ末端ジストログリカン結合ドメインの非存在により、不安定なジストロフィンタンパク質が産生される。
【０２５３】
エテプリルセンは、エクソン５１をスキップして、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させる。エクソン４９が完全なコドンで終了し、エクソン５２がコドンの第１のヌクレオチドで始まるため、エクソン５１の欠失は、リーディングフレームを回復させ、「インフレーム」ＢＭＤ変異に類似した、無傷のジストログリカン結合部位を有する内部で短縮されたジストロフィンタンパク質の産生をもたらす（図３）。
【０２５４】
ジストロフィンｍＲＮＡオープンリーディングフレームを回復させるためにエクソンスキッピングを使用してＤＭＤ表現型を改善する実現可能性は、非臨床試験で裏付けられている。ＤＭＤのジストロフィー動物モデルにおける多くの研究は、エクソンスキッピングによるジストロフィンの回復が、筋力と筋機能の確実な改善をもたらすことを示している（Ｓｈａｒｐ  ２０１１、Ｙｏｋｏｔａ  ２００９、Ｗｕ  ２００８、Ｗｕ  ２０１１、Ｂａｒｔｏｎ−Ｄａｖｉｓ  １９９９、Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ  ２００４、Ｇｒｅｇｏｒｅｖｉｃ  ２００６、Ｙｕｅ  ２００６、Ｗｅｌｃｈ  ２００７、Ｋａｗａｎｏ  ２００８、Ｒｅａｙ  ２００８、ｖａｎ  Ｐｕｔｔｅｎ  ２０１２）。この説得力のある例は、エクソンスキッピング（ＰＭＯ使用）療法後のジストロフィンレベルを同じ組織の筋機能と比較した研究から得られるものである。ジストロフィーｍｄｘマウスでは、マウスに特異的なＰＭＯで処置した前脛骨（ＴＡ）筋が、ストレス誘導性収縮後にその最大許容力の約７５％を維持したのに対し、未処置の対側ＴＡ筋は、その最大許容力の約２５％しか維持しなかった（ｐ＜０．０５）（Ｓｈａｒｐ２０１１）。別の研究では、３匹のジストロフィーＣＸＭＤイヌが、２〜５ヵ月齢において、週１回で５〜７週間または隔週で２２週間、その遺伝子変異に対するＰＭＯ特異性を使用したエクソンスキッピング療法を受けた。エクソンスキッピング療法後、３匹のイヌ全てが、骨格筋におけるジストロフィンの広範囲の全身に及ぶ発現、ならびにベースラインと比較した歩行（１５ｍのランニング試験）の維持または改善を示した。対照的に、未処置の同齢のＣＸＭＤイヌは、研究にわたって歩行の著しい低下を示した（Ｙｏｋｏｔａ  ２００９）。
【０２５５】
ヒトＤＭＤ転写物全体を発現させるｍｄｘマウスおよびヒト化ＤＭＤ（ｈＤＭＤ）マウスモデルの両方において、ＰＭＯは、ホスホロチオエートよりも等モル濃度で多くのエクソンスキッピング活性を有することが示された（Ｈｅｅｍｓｋｉｒｋ  ２００９）。エクソン５１のスキッピングに適している異なる変異を有するＤＭＤ患者由来の正常なヒト骨格筋細胞または筋細胞における逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）およびウェスタンブロット（ＷＢ）を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験は、エテプリルセン（ＰＭＯ）をエクソン５１のスキッピングの強力な誘導剤として特定した。エテプリルセン誘導エクソン５１のスキッピングは、ｈＤＭＤマウスモデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで確認されている（Ａｒｅｃｈａｖａｌａ−Ｇｏｍｅｚａ  ２００７）。
【０２５６】
ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３の標的領域に相補的であり、エクソン５３のスキッピングを誘導する、アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートの効果を分析するための臨床転帰は、ジストロフィン陽性線維（ＰＤＰＦ）の割合、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）、歩行能力の喪失（ＬＯＡ）、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）、肺機能検査（ＰＦＴ）、外部の支持なしで（仰臥位から）立ち上がる能力、デノボジストロフィン産生、および他の機能的尺度を含む。
【０２５７】
いくつかの実施形態において、本開示は、エクソン５３のスキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象においてジストロフィンを産生するための方法を提供し、方法は、本明細書に記載されるように、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む。ある特定の実施形態において、本開示は、エクソン５３のスキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有するデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を有する対象において、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させて、ジストロフィンタンパク質産生を誘導するための方法を提供する。タンパク質産生は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ウェスタンブロット分析、または免疫組織化学検査（ＩＨＣ）によって測定され得る。
【０２５８】
いくつかの実施形態において、本開示は、エクソン５３のスキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象においてジストロフィンを産生するための方法を提供し、方法は、本明細書に記載されるように、アンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む。ある特定の実施形態において、本開示は、エクソン５３のスキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有するデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を有する対象において、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させて、ジストロフィンタンパク質産生を誘導するための方法を提供する。タンパク質産生は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ウェスタンブロット分析、または免疫組織化学検査（ＩＨＣ）によって測定され得る。
【０２５９】
いくつかの実施形態において、本開示は、ＤＭＤの治療を必要としている対象においてそれを行うための方法を提供し、対象は、エクソン５３のスキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有し、方法は、本明細書に記載されるように、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む。
【０２６０】
いくつかの実施形態において、本開示は、ＤＭＤの治療を必要としている対象においてそれを行うための方法を提供し、対象は、エクソン５３のスキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有し、方法は、本明細書に記載されるように、アンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む。
【０２６１】
様々な実施形態において、対象の治療は、疾患進行の遅延によって測定される。いくつかの実施形態において、対象の治療は、対象における歩行の維持、または対象における歩行能力の喪失の低減によって測定される。いくつかの実施形態において、歩行は、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）を使用して測定される。ある特定の実施形態において、歩行は、ノーススタート歩行評価（ＮＳＡＡ）を使用して測定される。
【０２６２】
いくつかの実施形態において、本開示は、ＤＭＤを有する対象において肺機能を維持するか、または肺機能の喪失を低減するための方法を提供し、対象は、エクソン５３のスキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の変異を有し、方法は、本明細書に記載されるように、アンチセンスオリゴマーコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む。
【０２６３】
いくつかの実施形態において、本開示は、ＤＭＤを有する対象において肺機能を維持するか、または肺機能の喪失を低減するための方法を提供し、対象は、エクソン５３のスキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の変異を有し、方法は、本明細書に記載されるように、アンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む。
【０２６４】
いくつかの実施形態において、肺機能は、最大呼気圧（ＭＥＰ）として測定される。ある特定の実施形態において、肺機能は、最大吸気圧（ＭＩＰ）として測定される。いくつかの実施形態において、肺機能は、努力肺活量（ＦＶＣ）として測定される。
【０２６５】
さらなる実施形態において、本開示の医薬組成物は、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ．７，１０９８１（２０１６）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に提供されるように、同じ製剤または別の製剤のいずれかで、本開示の方法において炭水化物と共投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、５％のヘキソース炭水化物と共投与されてもよい。例えば、本開示の医薬組成物は、５％のグルコース、５％のフルクトース、または５％のマンノースと共投与されてもよい。ある特定の実施形態において、本開示の医薬組成物は、２．５％のグルコースおよび２．５％のフルクトースと共投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、５体積％の量で存在するアラビノース、５体積％の量で存在するグルコース、５体積％の量で存在するソルビトール、５体積％の量で存在するガラクトース、５体積％の量で存在するフルクトース、５体積％の量で存在するキシリトール、５体積％の量で存在するマンノース、各々が２．５体積％の量で存在するグルコースとフルクトースの組み合わせ、ならびに５．７体積％の量で存在するグルコース、２．８６体積％の量で存在するフルクトース、および１．４体積％の量で存在するキシリトールの組み合わせから選択される炭水化物と共投与されてもよい。
【０２６６】
様々な実施形態において、本開示のアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートは、治療有効量の非ステロイド性抗炎症化合物と共投与される。いくつかの実施形態において、非ステロイド性抗炎症化合物は、ＮＦ−ｋＢ阻害剤である。例えば、いくつかの実施形態において、ＮＦ−ｋＢ阻害剤は、ＣＡＴ−１００４またはその薬学的に許容される塩であってもよい。様々な実施形態において、ＮＦ−ｋＢ阻害剤は、サリチル酸塩およびＤＨＡのコンジュゲートであってもよい。いくつかの実施形態において、ＮＦ−ｋＢ阻害剤は、ＣＡＴ−１０４１またはその薬学的に許容される塩である。ある特定の実施形態において、ＮＦ−ｋＢ阻害剤は、サリチル酸塩およびＥＰＡのコンジュゲートである。様々な実施形態において、ＮＦ−ｋＢ阻害剤は、
【化６７】
2021521794.tif 000248
、またはその薬学的に許容される塩である。
【０２６７】
いくつかの実施形態において、非ステロイド性抗炎症化合物は、ＴＧＦ−ｂ阻害剤である。例えば、ある特定の実施形態において、ＴＧＦ−ｂ阻害剤は、ＨＴ−１００である。
【０２６８】
ある特定の実施形態において、療法で使用するための、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートが記載されている。ある特定の実施形態において、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療で使用するための、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートが記載されている。ある特定の実施形態において、療法で使用するための薬剤の製造で使用するための、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートが記載されている。ある特定の実施形態において、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のための薬剤の製造で使用するための、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲートが記載されている。
【０２６９】
Ｖ．キット
本開示はまた、遺伝的疾患を有する患者の治療のためのキットを提供し、このキットは、好適な容器に包装された、少なくともアンチセンス分子（例えば、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマーコンジュゲート）を、その使用についての説明書と共に備える。キットは、例えば、緩衝液、安定剤などの周辺試薬も含み得る。当業者であれば、上記方法の用途が、多くの他の疾患の治療で使用するのに適したアンチセンス分子を同定するために幅広い用途を有することを理解するべきである。一実施形態において、キットは、式（ＩＩＩ）によるアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを含む。一実施形態において、キットは、式（Ｖ）によるアンチセンスオリゴマーを含む。
【実施例】
【０２７０】
上記の開示は、理解を明確にする目的で、例示および実施例によってある程度詳細に記載されてきたが、本開示の教示を踏まえて、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、ある特定の変更および修正がそれに対してなされ得ることは、当業者に容易に明らかになるであろう。以下の実施例は、例示としてのみ提供されるものであり、限定するものではない。当業者であれば、実質的に類似した結果をもたらすように変更または修正され得る様々な重要ではないパラメータを容易に認識するであろう。
【０２７１】
材料および方法
細胞および組織培養処理条件
分化ヒト筋細胞（ＺｅｎＢｉｏ，Ｉｎｃ．）を利用して、エクソンスキッピングを測定した。具体的には、筋芽細胞（ＺｅｎＢｉｏ，Ｉｎｃ．、ＳＫＢ−Ｆ）を、成長培地中（ＳＫＢ−Ｍ、ＺｅｎＢｉｏ，Ｉｎｃ．）中で３７℃および５％のＣＯ２において８０〜９０％コンフルエントに成長させた。成長培地を分化培地（ＳＫＭ−Ｄ、ＺｅｎＢｉｏ，Ｉｎｃ．）で置き換えることによって分化を開始させた。エクソン５３スキッピングをアッセイするために、１×１０４個の分化細胞を２４ウェルプレートに播種し、様々な濃度のＰＭＯまたはＰＰＭＯを含む１ｍＬの分化培地（ＳＫＭ−Ｄ、ＺｅｎＢｉｏ，Ｉｎｃ．）を各ウェルに添加し、９６時間インキュベートした。
【０２７２】
ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロット分析のために、１３３μＬの緩衝液中、直径約５ｍｍで９〜１８×２０μｍの組織切片の比率において、均質化緩衝液（４％のＳＤＳ、４Ｍ尿素、１２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８））を用いて組織を均質化した。対応する溶解物を採取し、製造業者の説明書に従ってＲＣ  ＤＣタンパク質アッセイキット（ＢｉｏＲａｄカタログ番号５００−０１２２）を使用して、タンパク質定量に供した。組織抽出物試料を、ＢＳＡ標準曲線の範囲内に入るように、均質化緩衝液を使用して１：１０に希釈した。２５μｌのタンパク質溶解物、７μｌのＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ試料緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号ＮＰ０００８、Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）、および３μｌのＮｕＰＡＧＥ還元剤（１０ｘ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号ＮＰ０００４）を使用して、３５μｌの試料が所望の量のタンパク質を含有するように、試料を調製した。タンパク質試料を９５℃で５分間加熱した後、試料を遠心分離し、上清を、ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  １０ウェル、１ｍｍ、ミニ３〜８％ポリアクリルアミドトリス−酢酸塩ゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号ＥＡ０３７５）上に、１レーン当たり最大５０μｇの総タンパク質負荷量でロードした。ゲルを、色素前面がゲルから流出するまで、室温において１５０ボルトで泳動した。得られたタンパク質ゲルを、ＮｕＰＡＧＥ転写緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＮＰ００６−１）、１０％メタノール、および０．１％  ＮｕＰＡＧＥ酸化防止剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＮＰ０００５）を使用して、３０ボルトで、室温において７５分間、ＰＶＤＦ膜（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号ＬＣ２００７）に移した。
【０２７３】
タンパク質転写後、ＰＶＤＦ膜をＴＴＢＳ緩衝液（１Ｘ  ＴＢＳ（Ａｍｒｅｓｃｏカタログ番号Ｊ６４０−４Ｌ）、０．１％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）に浸漬した。膜をブロッキング緩衝液（ＴＴＢＳ中の５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳（Ｌａｂ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ｍ０８４１））に移し、静かに揺動させながら４℃で一晩浸した。ブロッキング後、膜を、ブロッキング緩衝液を使用して１：２０に希釈したＤＹＳ１（Ｌｅｉｃａカタログ番号ＮＣＬ−ＤＹＳ１）中で室温において６０分間、またはブロッキング緩衝液で１：１００，０００に希釈した抗−α−アクチニン抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号ＮＡ９３１Ｖ）中で室温において２０分間のいずれかでインキュベートし、続いて６回洗浄した（ＴＴＢＳで各５分間）。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号ＮＡ９３１Ｖ）にコンジュゲートした抗マウスＩｇＧを、ブロッキング緩衝液を使用して１：４０，０００に希釈し、膜に４５分間（ＤＹＳ１）または１５分間（α−アクチニン）添加し、続いて再び６回洗浄した。ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号ＲＰＮ２２３２）を使用して、フィルムをゲルに曝露し、それに応じて現像した。現像したフィルムを、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  Ｐｌｕｓソフトウェア（バージョン８．１）を使用してスキャンおよび分析し、Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用して線形回帰分析を実施した。
【０２７４】
各ウェスタンブロットゲルは、例えば６４％、１６％、４％、１％、および０．２５％に希釈した正常組織（マウス大腿四頭筋、横隔膜、または心臓）から抽出され（例えば、図５Ａおよび図５Ｂを参照）、ＤＭＤ組織（例えば、ｍｄｘマウス大腿四頭筋、横隔膜、もしくは心臓、またはＮＨＰ大腿四頭筋、横隔膜、もしくは平滑筋（ＧＩ））抽出物にスパイクした、総タンパク質を使用して調製された４点または５点のジストロフィン標準曲線を含む。標準曲線試料を、上記のように処理した。ジストロフィンバンド強度をゲル標準曲線と比較することによって、野生型ジストロフィンレベルのパーセント（％ＷＴ）としてのジストロフィンタンパク質レベルを決定した。
【０２７５】
ＲＴ−ＰＣＲ分析
ＲＴ−ＰＣＲ分析のために、製造業者のプロトコルに従ってＩｌｌｕｓｔｒａ  ＧＥスピンキットを使用して、ＲＮＡを細胞から単離した。ＲＮＡの濃度および純度を、ＮａｎｏＤｒｏｐを使用して決定した。エクソン５３のスキッピングを、エクソン５１／５２接合部および５４配列番号７４（５’−ＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣＡＡ−３’）を結合する順方向プライマーと、エクソン５１／５２接合部および５４配列番号  ７５（５’−ＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＣＡＡＧＴＣＡ−３’）を結合する逆方向プライマーとを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。スキップされたエクソン５３は、２０１ｂｐのアンプリコンを生じ、スキップされていないエクソン５３は、４１３ｂｐのアンプリコンを生じさせた。
マウスエクソン２３のスキッピングを、順方向プライマー配列番号７６（５’−ＣＡＣＡＴＣＴＴＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＡＧＧ−３’）、および逆方向プライマー配列番号７７（５’−ＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＴＣＣＡＴＴＴＣＴＧ−３’）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。
【０２７６】
ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲに供した後、ゲルキャピラリー電気泳動を使用するＣａｌｉｐｅｒ装置を使用して、試料を分析した。エクソンスキッピング率を、以下の方程式を使用して計算した：（スキップされたバンドの曲線下面積）／（スキップされたバンドおよびスキップされていないバンドの曲線下面積の合計）×１００。
【０２７７】
免疫組織化学検査：ジストロフィン染色：
マウス大腿四頭筋の１０ミクロンの凍結組織切片を使用して、ＰＢＳ中１０％ヤギ血清＋１％  ＢＳＡ中のジストロフィン一次抗体（希釈１：２５０、ウサギ、Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１５２７７）、および１０％ヤギ血清＋１％  ＢＳＡ中の二次抗体Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒｏ  ４８８ヤギ抗ウサギ（希釈１：１０００）によって、ジストロフィンを検出した。
【０２７８】
モルホリノサブユニットの調製
【化６８−１】
2021521794.tif 000249
【化６８−２】
2021521794.tif 000250
スキーム１を参照すると、Ｂは、塩基対合部分を表し、モルホリノサブユニットは、示されるように、対応するリボヌクレオシド（１）から調製されてもよい。モルホリノサブユニット（２）は、好適な保護基前駆体、例えば、塩化トリチルとの反応によって必要に応じて保護されてもよい。３’保護基は概して、以下により詳細に記載されるように、固体オリゴマー合成中に除去される。塩基対合部分は、固相オリゴマー合成に対して好適に保護され得る。好適な保護基としては、アデニンおよびシトシンに対するベンゾイル、グアニンに対するフェニルアセチル、およびヒポキサンチン（Ｉ）に対するピバロイルオキシメチルが挙げられる。ピバロイルオキシメチル基は、ヒポキサンチン複素環塩基のＮ１位置に導入され得る。保護されていないヒポキサンチンサブユニットが用いられてもよいが、活性化反応における収率は、塩基が保護されている場合にはるかに優れている。他の好適な保護基には、米国特許第８，０７６，４７６号に開示されているものが含まれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２７９】
活性化されたリン化合物４と３の反応は、所望のリンケージ部分５を有するモルホリノサブユニットをもたらす。
【０２８０】
構造４の化合物は、当業者に既知の様々な方法を使用して調製され得る。次いで、モルホリノ部分とのカップリングは、上記に概説されるとおりに進む。
【０２８１】
構造５の化合物は、サブユニット間リンケージを含むオリゴマーを調製するための固相オリゴマー合成に使用され得る。そのような方法は、当該技術分野で周知である。簡潔に、構造５の化合物は、５’末端で修飾されて、固体支持体へのリンカーを含有してもよい。一旦支持されると、５の保護基（例えば、３’末端のトリチル）は除去され、遊離アミンは、構造５の第２の化合物の活性化リン部分と反応する。この配列は、所望の長さのオリゴが得られるまで繰り返される。末端の３’末端の保護基は、３’修飾が所望される場合、除去されるか、またはそのままにされるかのいずれかであってもよい。オリゴは、様々な方法、または固体支持体へのリンケージを切断するための塩基を用いた例示的な処理を使用して、固体支持体から除去され得る。
【０２８２】
本開示の一般的および具体的なモルホリノオリゴマーにおけるモルホリノオリゴマーの調製は、実施例においてより詳細に説明される。
【０２８３】
モルホリノオリゴマーの調製
本開示の化合物の調製は、スキーム２に従って、以下のプロトコルを使用して実施される。
【化６９−１】
2021521794.tif 000251
【化６９−２】
2021521794.tif 000252
【０２８４】
トリチルピペラジンフェニルカルバメート３５の調製：ジクロロメタン中の化合物１１の冷却懸濁液（６ｍＬ／ｇ  １１）に、水中の炭酸カリウム（３．２当量）の溶液（４ｍＬ／ｇ炭酸カリウム）を添加した。この二相混合物に、ジクロロメタン中のクロロギ酸フェニル（１．０３当量）の溶液（２ｇ／ｇクロロギ酸フェニル）をゆっくりと添加した。反応混合物を２０℃に加温した。反応完了時（１〜２時間）に、層を分離した。有機層を水で洗浄し、無水炭酸カリウム上で乾燥させた。生成物３５をアセトニトリルからの結晶化によって単離した。
【０２８５】
カルバメートアルコール３６の調製：水素化ナトリウム（１．２当量）を、１−メチル−２−ピロリジノン中に懸濁した（３２ｍＬ／ｇ水素化ナトリウム）。この懸濁液に、トリエチレングリコール（１０．０当量）および化合物３５（１．０当量）を添加した。得られたスラリーを９５℃に加熱した。反応完了時（１〜２時間）に、混合物を２０℃に冷却した。この混合物に、３０％ジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ｖ：ｖ）および水を添加した。生成物含有有機層を、水性ＮａＯＨ、水性コハク酸、および飽和水性塩化ナトリウムで連続的に洗浄した。生成物３６を、ジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／ヘプタンからの結晶化によって単離した。
【０２８６】
テール酸３７の調製：テトラヒドロフラン中の化合物３６の溶液（７ｍＬ／ｇ  ３６）に、コハク酸無水物（２．０当量）およびＤＭＡＰ（０．５当量）を添加した。混合物を５０℃に加熱した。反応完了時（５時間）に、混合物を２０℃に冷却し、水性ＮａＨＣＯ３を用いてｐＨ８．５に調整した。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを添加し、生成物を水層中に抽出した。ジクロロメタンを添加し、混合物を水性クエン酸でｐＨ３に調整した。生成物含有有機層を、ｐＨ＝３のクエン酸緩衝液と飽和水性塩化ナトリウムの混合物で洗浄した。この３７のジクロロメタン溶液を、化合物３８の調製において単離することなく使用した。
【０２８７】
３８の調製：化合物３７の溶液に、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）（１．０２当量）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．３４当量）、次いで１−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１．１当量）を添加した。混合物を５５℃に加熱した。反応完了時（４〜５時間）に、混合物を２０℃に冷却し、１：１の０．２Ｍクエン酸／ブラインおよびブラインで連続的に洗浄した。ジクロロメタン溶液は、アセトンへの、次いでＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドへの溶媒交換を受け、生成物を、アセトン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドから飽和水性塩化ナトリウム中への沈殿によって単離した。粗生成物を水中で数回再スラリー化して、残留Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよび塩を除去した。
【０２８８】
ＰＭＯ合成方法Ａ：ジスルフィドアンカーの使用
アンカー充填樹脂への活性化「テール」の導入を、固相合成中のサブユニットの組み込みに使用される手順によって、ジメチルイミダゾリジノン（ＤＭＩ）中で実施した。
【化７０】
2021521794.tif 000253
【０２８９】
この手順を、粗多孔性（４０〜６０μｍ）ガラスフリット、オーバーヘッド撹拌器、およびテフロン（登録商標）三方活栓を備えた、シラン処理したジャケット付きペプチド容器（ＣｈｅｍＧｌａｓｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）内で実施して、Ｎ２がフリットを通して泡立つことまたは真空抽出を可能にした。
【０２９０】
以下の手順の樹脂処理／洗浄液ステップは、樹脂流動化または撹拌床反応器および溶媒／溶液抽出の２つの基本操作からなる。樹脂流動化については、Ｎ２がフリットを通って上方に流れることを可能にするように活栓を配置し、指定の樹脂処理／洗浄液を反応器に加え、樹脂を浸透させ、完全に湿らせた。次いで、混合を開始し、樹脂スラリーを所定時間混合した。溶媒／溶液抽出については、混合およびＮ２流動を停止し、真空ポンプを起動し、次いで、樹脂処理／洗浄液の廃棄物への排出を可能にするように活栓を配置した。特に記載のない限り、樹脂処理／洗浄液の体積は全て、１５ｍＬ／ｇの樹脂であった。
【０２９１】
シラン処理したジャケット付きペプチド容器内のアミノメチルポリスチレン樹脂（１００〜２００メッシュ；窒素置換に基づいて約１．０ｍｍｏｌ／ｇ充填；７５ｇ、１当量、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓ，ＵＫ、部品番号１４６４−Ｘ７９９）に、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ；２０ｍＬ／ｇ樹脂）を添加し、樹脂を１〜２時間混合しながら膨潤させた。膨潤溶媒の排出後、樹脂をジクロロメタン（２×１〜２分）、２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中の５％ジイソプロピルエチルアミン（２×３〜４分）、およびジクロロメタン（２×１〜２分）で洗浄した。最終洗浄液の排出後、樹脂を、１−メチル−２−ピロリジノン中のジスルフィドアンカー３４の溶液（０．１７Ｍ；１５ｍＬ／ｇ樹脂、約２．５当量）で処理し、樹脂／試薬混合物を４５℃で６０時間加熱した。反応完了時に、加熱を中断し、アンカー溶液を排出し、１−メチル−２−ピロリジノン（４×３〜４分）およびジクロロメタン（６×１〜２分）で樹脂を洗浄した。樹脂を、ジクロロメタン中の１０％（ｖ／ｖ）二炭酸ジエチルの溶液（１６ｍＬ／ｇ、２×５〜６分）で処理し、次いで、ジクロロメタン（６×１〜２分）で洗浄した。樹脂３９を、Ｎ２流下で１〜３時間、次いで、真空下で一定重量（±２％）になるまで乾燥させた。収率：元の樹脂重量の１１０〜１５０％
【０２９２】
アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂の充填の決定：樹脂の充填量（潜在的に利用可能な反応部位の数）を、樹脂１グラム当たりのトリフェニルメチル（トリチル）基の数について分光アッセイによって決定する。
【０２９３】
既知の重量の乾燥樹脂（２５±３ｍｇ）をシラン処理した２５ｍＬのメスフラスコに移し、ジクロロメタン中の約５ｍＬの２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を添加する。内容物を穏やかに旋回させて混合し、３０分間放置する。体積は、さらなるジクロロメタン中の２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で最大２５ｍＬになり、内容物を完全に混合する。ポジティブディスプレイスメント式ピペットを使用して、トリチル含有溶液（５００μＬ）のアリコートを１０ｍＬのメスフラスコに移し、その体積をメタンスルホン酸で１０ｍＬにする。
【０２９４】
最終溶液中のトリチルカチオン含有量を、４３１．７ｎｍのＵＶ吸光度によって測定し、樹脂充填量を、適切な体積、希釈、吸光係数（ε：４１μｍｏｌ−１ｃｍ−１）、および樹脂重量を使用して、樹脂１グラム当たりのトリチル基（μｍｏｌ／ｇ）で測定する。アッセイを三つ組で実施し、平均充填量を計算する。
【０２９５】
本実施例の樹脂充填手順は、約５００μｍｏｌ／ｇの充填量を樹脂に提供する。ジスルフィドアンカー組み込みステップを室温で２４時間実施する場合、３００〜４００μｍｏｌ／ｇの充填量を得た。
【０２９６】
テール充填：アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂の調製と同じ設定および体積を使用して、テールを固体支持体に導入することができる。アンカー充填樹脂を最初に酸性条件下で脱保護し、カップリング前に得られた材料を中和した。カップリングステップでは、ジスルフィドアンカー溶液の代わりに、４−エチルモルホリン（ＮＥＭ、０．４Ｍ）を含有するＤＭＩ中の３８の溶液（０．２Ｍ）を使用した。４５℃で２時間後、樹脂３９を２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中の５％ジイソプロピルエチルアミンで２回、およびＤＣＭで１回洗浄した。樹脂に、無水安息香酸（０．４Ｍ）およびＮＥＭ（０．４Ｍ）の溶液を添加した。２５分後、反応器ジャケットを室温に冷却し、樹脂を２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中の５％ジイソプロピルエチルアミンで２回、およびＤＣＭで８回洗浄した。樹脂４０を濾過し、高真空下で乾燥させた。樹脂４０の充填を、テール充填で使用される元のアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂３９の充填と定義する。
【０２９７】
固相合成：モルホリノオリゴマーを、２ｍＬのＧｉｌｓｏｎポリプロピレン反応カラム（部品番号３９８０２７０）内のＧｉｌｓｏｎ  ＡＭＳ−４２２  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上で調製した。カラムを合成器上に置いたときに、水流用のチャネルを備えたアルミニウムブロックをそのカラムの周囲に配置した。ＡＭＳ−４２２は別の方法として、試薬／洗浄溶液を添加し、指定の時間保持し、真空を使用してカラムを空にする。
【０２９８】
最大約２５サブユニットの長さの範囲のオリゴマーについては、５００μｍｏｌ／ｇ樹脂に近い充填量を伴うアミノメチルポリスチレンジ−スルフィド樹脂が好ましい。より大きいオリゴマーについては、３００〜４００μｍｏｌ／ｇ樹脂の充填量を伴うアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂が好ましい。５’−テールを有する分子が所望される場合、テールが充填された樹脂は、同じ充填ガイドラインで選択される。
【０２９９】
以下の試薬溶液を調製した：
脱トリチル化溶液：４：１ジクロロメタン／アセトニトリル中の１０％シアノ酢酸（ｗ／ｖ）
中和溶液：３：１ジクロロメタン／イソプロパノール中の５％ジイソプロピルエチルアミン、ならびに
カップリング溶液：１，３−ジメチルイミダゾリジノン中の、所望の塩基およびリンケージタイプの０．１８Ｍ（または２０サブユニットよりも長く成長したオリゴマーについては０．２４Ｍ）活性化モルホリノサブユニット、および０．４Ｍ  Ｎエチルモルホリン。
【０３００】
ジクロロメタン（ＤＣＭ）を、異なる試薬溶液の洗浄液を分離する移行洗浄液として使用した。
【０３０１】
合成器上で、ブロックを４２℃に設定して、３０ｍｇのアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂（またはテール樹脂）を含む各カラムに、２ｍＬの１−メチル−２−ピロリジノンを添加し、室温で３０分間放置した。２ｍＬのジクロロメタンで２回洗浄した後、以下の合成サイクルを用いた。
【表２８】
2021521794.tif 000254
【０３０２】
個々のオリゴマーの配列を、各カラムが適切な配列中の適切なカップリング溶液（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｉ）を受けるように合成器にプログラムした。カラム内のオリゴマーがその最終サブユニットの組み込みを完了したとき、カラムをブロックから除去し、０．８９Ｍ  ４−エチルモルホリンを含有する４−メトキシトリフェニルメチルクロリド（ＤＭＩ中０．３２Ｍ）から構成されるカップリング溶液を用いて、手動で最終サイクルを実施した。
【０３０３】
樹脂からの切断ならびに塩基および骨格保護基の除去：メトキシトリチル化後、樹脂を２ｍＬの１−メチル−２−ピロリジノンで８回洗浄した。１−メチル−２−ピロリジノン中の０．１Ｍ  １，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）および０．７３Ｍトリエチルアミンからなる１ｍＬの切断溶液を添加し、カラムに蓋をし、室温で３０分間放置した。その後、１２ｍＬのＷｈｅａｔｏｎバイアルに排出した。大きく収縮した樹脂を３００μＬの切断溶液で２回洗浄した。溶液に、４．０ｍＬの水性濃アンモニア（−２０℃で保存）を添加し、バイアルにきつく蓋をし（テフロン（登録商標）ライナー付きスクリューキャップで）、混合物を旋回させて溶液を混合した。バイアルを４５℃のオーブン内に１６〜２４時間置き、塩基および骨格保護基の切断をもたらした。
【０３０４】
粗生成物精製：バイアル入りのアンモノリシス溶液をオーブンから取り出し、室温に冷却させた。溶液を２０ｍＬの０．２８％水性アンモニアで希釈し、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ＨＱ樹脂（ＢｉｏＲａｄ）を含む２．５×１０ｃｍのカラムに通した。塩勾配（Ａ：０．２８％アンモニア、Ｂ：０．２８％アンモニア中の１Ｍ塩化ナトリウム、６０分間で０〜１００％  Ｂ）を使用して、メトキシトリチル含有ピークを溶出した。組み合わせた画分をプールし、所望の生成物に応じてさらに処理した。
【０３０５】
モルホリノオリゴマーの脱メトキシトリチル化：Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ精製からのプールされた画分を１ＭのＨ３ＰＯ４で処理して、ｐＨを２．５に低下させた。最初の混合後、試料を室温で４分間放置し、その際に２．８％アンモニア／水でｐＨ１０〜１１に中和した。生成物を固相抽出（ＳＰＥ）によって精製した。
【０３０６】
ＳＰＥカラム充填およびコンディショニング：Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ  ＣＧ−３００Ｍ（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）（３ｍＬ）を、２０ｍＬフリットカラム（ＢｉｏＲａｄ  Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（７３２−１０１１））に充填し、樹脂を３ｍＬの以下のものですすぐ：０．２８％  ＮＨ４ＯＨ／８０％アセトニトリル；０．５Ｍ  ＮａＯＨ／２０％エタノール；水；５０ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４／８０％アセトニトリル；水；０．５  ＮａＯＨ／２０％エタノール；水；０．２８％  ＮＨ４ＯＨ。
【０３０７】
ＳＰＥ精製：脱メトキシトリチル化からの溶液をカラムに充填し、樹脂を３〜６ｍＬの０．２８％水性アンモニアで３回すすいだ。Ｗｈｅａｔｏｎバイアル（１２ｍＬ）をカラムの下に配置し、生成物を、０．２８％水性アンモニア水中の２ｍＬの４５％アセトニトリルで２回洗浄することによって溶出した。
【０３０８】
生成物単離：溶液をドライアイス中で凍結させ、バイアルを凍結乾燥機に入れ、ふわふわした白色粉末を得た。試料を水に溶解し、０．２２ミクロンのフィルタ（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｃｒｏｄｉｓｃ  ２５ｍｍのシリンジフィルタ、０．２ミクロンのＨＴ  Ｔｕｆｆｒｙｎ膜を備える）を通して、シリンジを使用して濾過し、ＵＶ分光光度計上で光学密度（ＯＤ）を測定して、存在するオリゴマーのＯＤ単位を決定し、かつ分析用に試料を分配した。次いで、溶液を、凍結乾燥のためにＷｈｅａｔｏｎバイアルに戻した。
【０３０９】
ＭＡＬＤＩによるモルホリノオリゴマーの分析：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を使用して、精製物中の画分の組成を決定し、かつオリゴマーの同一性（分子量）の証拠を提供した。３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸（シナピン酸）、３，４，５−トリヒドキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）、またはアルファ−シアノ−４−ヒドキシケイ皮酸（ＨＣＣＡ）の溶液をマトリックスとして用いて希釈した後、試料を実験した。
【表１１】
2021521794.tif 000255
【０３１０】
ＣＰＰコンジュゲート化（以下に開示する配列番号７２および７２）
【化７１】
2021521794.tif 000256
分析手順：マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量スペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を、シナピン酸（ＳＡ）マトリックスを使用して、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｕｔｏｆｌｅｘ（商標）Ｓｐｅｅｄ上で記録した。３０００ダイオードアレイ検出器およびＰｒｏＰａｃＴＭ  ＳＣＸ−２０カラム（２５０×４ｍｍ）を備えたＴｈｅｒｍｏ  Ｄｉｏｎｅｘ  ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００システム上で、１．０ｍＬ／分の流速（ｐＨ＝２、カラム温度３０℃）を使用して、ＳＣＸ−ＨＰＬＣを実施した。移動相は、Ａ（２４ｍＭのＨ３ＰＯ４を含有する水中の２５％アセトニトリル）およびＢ（１ＭのＫＣｌおよび２４ｍＭのＨ３ＰＯ４を含有する水中の２５％アセトニトリル）であった。勾配溶出を用いた：０分、３５％  Ｂ；２分、３５％  Ｂ；２２分、８０％  Ｂ；２５分、８０％  Ｂ；２５．１分、３５％  Ｂ；３０分、３５％  Ｂ。
【０３１１】
ＰＭＯ−Ａ（１．８２ｇ、０．１７７ｍｍｏｌ、２日間の凍結乾燥により新たに乾燥させたもの、以下の表に記載）
【化７２】
2021521794.tif 000257
（式中、１〜２５および５’から３’の各Ｎｕは、（配列番号７８）である）
【表１２】
2021521794.tif 000258
【０３１２】
Ａｃ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号７２）ヘキサトリフルオロ酢酸塩（６１４．７ｍｇ、０．３５４ｍｍｏｌ）、および１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサトリフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ、１３４．４ｍｇ、０．３５４ｍｍｏｌ）の混合物に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、２０ｍＬ）を添加した。混合物を室温で３分間撹拌し、次いで、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、６８．５ｍｇ、０．５３０ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、濁った混合物は、澄明な溶液になった。反応をＳＣＸ−ＨＰＬＣによって監視した。２時間後、２０ｍＬの１０％水酸化アンモニウム溶液（２．８％  ＮＨ３）を添加した。混合物を室温でさらに２時間撹拌した。反応を４００ｍＬの水の添加によって終了した。トリフルオロエタノール（２．０ｍＬ）を溶液に添加した。
【０３１３】
溶液を２つの部分に分割し、各部分をＷＣＸカラム（カラム当たり１０ｇの樹脂）によって精製した。各ＷＣＸカラムを最初に水中の２０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）で洗浄して、ＰＭＯ＃１出発物質を除去した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析がＰＭＯ＃１シグナルの非存在を示したとき、洗浄（各カラムに対して２２５ｍＬ）を中止した。次いで、各カラムを水（カラム当たり１００ｍＬ）で洗浄した。所望の生成物、ＰＰＭＯ＃１を２．０ＭのグアニジンＨＣｌ（各カラムに対して１４０ｍＬ）で溶出した。ＰＰＭＯ＃１の精製溶液を一緒にプールし、次いで２つの部分に分割し、それぞれＳＰＥカラム（各カラムに対して１０ｇの樹脂）によって脱塩した。
【０３１４】
ＳＰＥカラムを、最初に１．０ＭのＮａＣｌ水溶液（各カラムに対して１００ｍＬ）で洗浄して、ＰＰＭＯ＃１の六塩酸塩を生成した。次いで、各ＳＰＥカラムを水（各カラムに対して２００ｍＬ）で洗浄した。最終の脱塩したＰＰＭＯ＃１を、水中の５０％アセトニトリル（ｖ／ｖ、各カラムに対して１５０ｍＬ）によって溶出した。アセトニトリルを減圧下での排出によって除去した。得られた水溶液を凍結乾燥させて、所望のコンジュゲートＰＰＭＯ＃１六塩酸塩（１．９３ｇ、収率９４．５％）を得た。
【０３１５】
実施例１：エクソン５３のｉｎ  ｖｉｔｒｏスキッピング（ＲＤ細胞）
以下の表に記載されるヒトジストロフィン（ＤＭＤ）エクソン５３を標的とするＰＭＯ化合物を、上記の方法に従って合成し、ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞においてＤＭＤエクソン５３スキッピングについて評価した。
【表１３】
2021521794.tif 000259
【０３１６】
具体的には、ヒトＲＤ細胞を、標準的な技術を使用して、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で培養した。凍結乾燥したＰＭＯを約１．０ｍＭでヌクレアーゼフリー水に再懸濁し、容量モル濃度を検証するために、ＰＭＯ溶液をＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。製造業者の説明書およびＳＧキット（Ｌｏｎｚａ）に従ってヌクレオポレーションを使用して、ＰＭＯをＲＤ細胞に送達した。
【０３１７】
ＰＭＯを、示されている濃度で試験し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中で２４時間インキュベートした（２４ウェルプレートのウェル当たり４×１０５細胞（ｎ＝３））。ＲＮＡを、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＲＮＡｓｐｉｎ  ９６ウェルＲＮＡ単離キットを使用してＰＭＯ処理細胞から抽出し、以下のように、標準的な技術および示されているエクソン由来のプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲに供した。エクソン５３プライマーは、エクソン５２および５４由来であった。
【０３１８】
Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐバイオアナライザーを使用してスキッピングを測定し、以下の式によりエクソンスキッピング％（すなわち、全長ＰＣＲ産物に対するエクソンスキップされた産物のバンド強度）を計算した：
［エクソン５３スキップされた産物／（エクソン５３スキップされた産物とエクソン５３スキップされていない産物との合計）＊１００］。
結果が以下の表および図ＸおよびＹに示される。
【表１４】
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【表１５】
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【０３１９】
実施例２：  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（筋芽細胞）でのエクソン５３スキッピング
以下の表に記載されるヒトジストロフィン（ＤＭＤ）エクソン５３を標的とする実施例１のＰＭＯ化合物および対応するＰＰＭＯ化合物（上記の方法に従って調製）を、健康なヒトの筋芽細胞においてＤＭＤエクソン５３スキッピングについて評価した。
【表１６−１】
2021521794.tif 000262
【表１６−２】
2021521794.tif 000263
【表１６−３】
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【０３２０】
具体的には、健康なヒト筋芽細胞（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．から購入した継代５〜６、ＳＫＢ−Ｆ−ＳＬ）を、約４０％の密集度で播種し、ＳＫＭ−Ｍ培地（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．）中で、様々な濃度（すなわち、４０μｍ、２０μｍ、１０μｍ、５μｍ、２．５μｍ、および１．２５μｍ）のＰＭＯおよびＰＰＭＯで処理する。９６時間のインキュベーション後、筋芽細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＧＥ  ＲＮＡｓｐｉｎ  ９６キット（カタログ番号２５−０５５−７５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中のＲＡ１溶解緩衝液によって溶解する。ＲＮＡを溶出するために４０μＬのＲＮａｓｅフリー水を使用したことを除いて、製造業者の推奨に従って全ＲＮＡを単離する。
【０３２１】
エクソン５３スキッピングを決定するために、２段階エンドポイントＲＴ−ＰＣＲを実施する。具体的には、１１マイクロリットルの全ＲＮＡを、最初に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ合成キット（カタログ番号１８０９１２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、製造業者の説明書に従ってランダムヘキサマーを使用して、ｃＤＮＡに逆転写する。ヒトＤＭＤエクソン５１／５２接合部および５４を標的としたプライマー（順方向プライマー：（配列番号７４）：ＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣＡＡ；逆方向プライマー（配列番号７５）：ＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＣＡＡＧＴＣＡ）を用いて、９μＬのｃＤＮＡをＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（カタログ番号１２５３２０２４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加することによって、ＰＣＲを実施する。ＰＣＲ増幅を、ＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ９６リアルタイムサーモサイクラーを使用して、表２に示されるプログラムを使用して実施する。スキップされたＰＣＲ産物またはスキップされていないＰＣＲ産物の発現を、ＤＮＡ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（ＣＬＳ７６０６７２、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、３２μＬのＰＣＲ産物をＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸシステム上に充填することによって評価する。ＤＭＤエクソン５３スキッピングの割合を、スキップされた（２０１ｂｐ）およびスキップされていない（４１３ｂｐ）バンドの合計容量モル濃度と比較した、エクソン５３スキップされたバンド（２０１ｂｐ）の容量モル濃度（ｎｍｏｌ／Ｌ）の割合として計算する。
【０３２２】
群の平均値が各用量において互いに統計的に異なるかどうかを評価するために、両側不対スチューデントｔ検定（等分散的）を使用する。０．０５未満のＰ値は、統計的に有意であると考えられる。
【表１７】
2021521794.tif 000265
【０３２３】
実施例３：ＭＤＸマウス研究
ｍｄｘマウスは、ジストロフィン遺伝子のエクソン２３の変異を含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）について一般に認められ、よく特徴付けられた動物モデルである。Ｍ２３Ｄアンチセンス配列（配列番号７３）は、エクソン２３スキッピングを誘導し、機能的ジストロフィン発現を回復させることが知られている。６〜７週齢のＭＤＸマウスに、４０ｍｇ／ｋｇの用量で、または生理食塩水と共に、以下の表のＰＰＭＯ４２２５またはＰＭＯ４２２５のいずれかの尾静脈への単回注射を与えた。
【表１８】
2021521794.tif 000266
ＰＭＯ４２２５およびＰＰＭＯ４２２５を各々、上記のＰＭＯ方法ＡおよびＣＰＰコンジュゲーション方法によって調製した。
【０３２４】
処置したマウスを、単回用量注射の７、３０、６０、および９０日後に屠殺した（群当たりｎ＝６）。横隔膜、心臓、および右大腿四頭筋を、ジストロフィンタンパク質の産生を測定するためのウェスタンブロット分析、およびエクソンスキッピングの割合を測定するためのＲＴ−ＰＣＲ分析のために処理し、左大腿四頭筋を上記のように免疫組織化学検査およびＨ／Ｅ染色のために処理した。
【０３２５】
ジストロフィンタンパク質回復をウェスタンブロットによって定量し、エクソン２３スキッピングの割合を上記のように各々ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。
【０３２６】
ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットの結果が、図５Ａ〜図１０Ｂおよび以下の表に示される。驚くべきことに、ＰＰＭＯ４２２５は、ＰＭＯ４２２５と比較して、有意により高く持続的なレベルのジストロフィン回復およびエクソン２３スキッピングを誘導し、最も高いレベルは、注射後３０日目に生じた。さらに驚くべきことに、ＰＭＯ４２２５が心臓内のジストロフィンレベルを増加させなかったときに、ＰＰＭＯ４２２５は、増加させた。ＰＭＯ４２２５では、全ての時点で、心臓内のジストロフィンおよびエクソンスキッピングは観察されなかった。
【表１９】
2021521794.tif 000267
【表２０】
2021521794.tif 000268
【０３２７】
免疫組織化学検査の結果が図１１に示される。ここで、ＰＰＭＯ４２２５は、大腿四頭筋全体にわたってジストロフィンを回復させるが、４２２５は「斑状」の発現パターンをもたらす。ＰＰＭＯ４２２５処置によるジストロフィンの均一な分布は、骨格筋の広範な標的化が達成可能であることを示す。ＰＰＭＯ４２２５は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＰＭＯ４２２５よりも有意に改善された送達を有する。
【０３２８】
実施例４：ＭＤＸマウス用量反応試験
６〜７週齢のＭＤＸマウスに、４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、または１２０ｍｇ／ｋｇの用量で、上記のＰＰＭＯ４２２５またはＰＭＯ４２２５のいずれかの尾静脈への単回注射を与えた（群当たりｎ＝６）。
【０３２９】
処置したマウスを、注射の３０日後に屠殺した。横隔膜、大腿四頭筋、および心臓を、ウェスタンブロット分析のために処理して、以下の修正を伴う上記のウェスタンブロットプロトコル（例えば、実施例３で使用）に基づいて、ジストロフィンタンパク質の産生を測定した。
【表２１】
2021521794.tif 000269
【０３３０】
野生型の割合としてのジストロフィンタンパク質回復が、以下の表および図１２〜図１５に示される。
【表２２】
2021521794.tif 000270
【０３３１】
驚くべきことに、データは、ＰＰＭＯ４２２５の単回用量が、ＰＭＯ４２２５よりも有意にかつ実質的に大きい程度まで、ｍｄｘマウスにおいて用量依存的にジストロフィンレベルを増加させることを示す。
【０３３２】
実施例５：横隔膜および心臓のＭＤＸマウスＩＨＣ研究
６〜７週齢のＭＤＸマウスに、８０ｍｇ／ｋｇの用量のＰＰＭＯ４２２５または生理食塩水の尾静脈への単回注射を与え、６〜７週齢の野生型マウスに、生理食塩水の単回注射を与えた。処置したｍｄｘマウス、生理食塩水ｍｄｘマウス、および野生型マウスを、単回用量注射の３０日後に屠殺した（群当たりｎ＝４）。免疫組織化学検査の結果が図１９に示される。ここで、結果は、ＰＰＭＯ４２２５で治療したｍｄｘマウスにおけるＤＭＤの罹患率および死亡率に関連する、組織におけるジストロフィンの均一な増加を示す。
＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊
【０３３３】
本明細書で引用される全ての出版物および特許出願は、各個々の出版物または特許出願が具体的かつ個々に参照によって組み込まれるように指示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
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【表２３−１】
2021521794.tif 000271
【表２３−２】
2021521794.tif 000272
【国際調査報告】
2021521794.tif 000273
2021521794.tif 000274
2021521794.tif 000275
2021521794.tif 000276