(57)【要約】  本発明は、眼圧及び頭蓋内圧の調節、並びに緑内障及び水頭症のような関連病態の治療のための材料及び方法に関する。より具体的には、本発明は、血清型ＳｈＨ１０のアデノウイルスベクター、及びＣＲＩＳＰＲシステムを毛様体又は脈絡叢に形質導入してアクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子の発現を調節することにおけるそれらの療法上の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清型ＳｈＨ１０のＡＡＶベクタービリオンであって、
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含んでなる、前記ＡＡＶベクタービリオン。
【請求項２】
眼圧又は房水産生を調節する方法に使用するためのＡＡＶベクタービリオンであって、血清型ＳｈＨ１０のものであり、そして
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含む、前記ＡＡＶベクタービリオン。
【請求項３】
前記使用が、高眼圧及び／又は緑内障の治療における使用である、請求項２に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項４】
前記緑内障が、原発性又は続発性緑内障である、請求項３に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項５】
前記原発性緑内障が、開放角緑内障、閉塞隅角緑内障、又は正常眼圧緑内障（ＮＴＧ）である、請求項３又は４に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項６】
アクアポリン（ＡＱＰ）遺伝子が、ＡＱＰ１、ＡＱＰ２、ＡＱＰ３、ＡＱＰ４、ＡＱＰ５、ＡＱＰ６、ＡＱＰ７、又はＡＱＰ１１である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＡＡＶベクタービリオン又は使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項７】
アクアポリン遺伝子が、ＡＱＰ１、ＡＱＰ４、又はＡＱＰ５である、請求項６に記載のＡＡＶベクタービリオン又は使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項８】
炭酸脱水酵素（ＣＡＲ）遺伝子が、ＣＡＲ２、ＣＡＲ３、ＣＡＲ４、ＣＲ５ｂ、ＣＡＲ６、ＣＡＲ８、ＣＡＲ９、ＣＡＲ１０、ＣＡＲ１２、又はＣＡＲ１４である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＡＡＶベクタービリオン又は使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項９】
ＣＡＲ遺伝子が、ＣＡＲ２、ＣＡＲ３、ＣＡＲ４、ＣＡＲ１２、又はＣＡＲ１４である、請求項８に記載のＡＡＶベクタービリオン又は使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１０】
頭蓋内圧又はＣＳＦ産生を調節する方法に使用するためのＡＡＶベクタービリオンであって、血清型ＳｈＨ１０のものであり、そして
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含む、前記ＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１１】
前記使用が、水頭症又は特発性頭蓋内圧亢進症の治療における使用である、請求項１０に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１２】
前記水頭症が、交通性水頭症又は非交通性水頭症である、請求項１１に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１３】
前記水頭症が、正常圧水頭症である、請求項１１又は１２に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１４】
前記水頭症が、先天性又は後天性である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１５】
アクアポリン（ＡＱＰ）遺伝子が、ＡＱＰ１、ＡＱＰ２、ＡＱＰ３、ＡＱＰ４、ＡＱＰ５、ＡＱＰ６、ＡＱＰ７、又はＡＱＰ１１である、請求項１に記載のＡＡＶベクタービリオン又は請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１６】
アクアポリン遺伝子が、ＡＱＰ１又はＡＱＰ４である、請求項１５に記載のＡＡＶベクタービリオン又は使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１７】
炭酸脱水酵素（ＣＡＲ）遺伝子が、ＣＡＲ２、ＣＡＲ３、ＣＡＲ４、ＣＲ５ｂ、ＣＡＲ６、ＣＡＲ８、ＣＡＲ９、ＣＡＲ１０、ＣＡＲ１２、又はＣＡＲ１４である、請求項１又は請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のＡＡＶベクタービリオン又は使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１８】
ＣＡＲ遺伝子が、ＣＡＲ２、ＣＡＲ３、ＣＡＲ４、ＣＡＲ１２、又はＣＡＲ１４である、請求項１７に記載のＡＡＶベクタービリオン又は使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１９】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９酵素である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＡＡＶベクタービリオン又は使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項２０】
Ｃａｓ９酵素が、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、髄膜炎菌Ｃａｓ９（ＮＭ  Ｃａｓ９）、サーモフィルス菌Ｃａｓ９（ＳＴ  Ｃａｓ９）、トレポネーマ・デンティコラＣａｓ９（ＴＤ  Ｃａｓ９）、又はそれらの変異体である、請求項１９に記載のＡＡＶベクタービリオン又は使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項２１】
変異体が、ＳｐＣａｓ９  Ｄ１１３５Ｅ、ＳｐＣａｓ９  ＶＲＥＲ、ＳｐＣａｓ９  ＥＱＲ、又はＳｐＣａｓ９  ＶＱＲである、請求項２０に記載のＡＡＶベクタービリオン又は使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項２２】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、触媒的に活性である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のＡＡＶベクタービリオン又は使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項２３】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、触媒的に活性でなく、転写抑制ドメインをさらに含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のＡＡＶベクタービリオン又は使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項２４】
転写抑制ドメインが、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＣＳドメイン、ＷＲＰＷドメイン、ＭＸＩ１、ｍＳｉｎ３相互作用ドメイン、又はヒストン脱メチル化酵素ＬＳＤ１ドメインである、請求項２３に記載のＡＡＶベクタービリオン又は使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項２５】
エンドヌクレアーゼが、哺乳動物細胞において有効な核局在化配列をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のＡＡＶベクタービリオン又は使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか１項において定義されるようなＡＡＶベクタービリオンを、医薬的に許容される担体と組み合わせて含んでなる、医薬組成物。
【請求項２７】
眼内注射用に製剤化される、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
硝子体内又は前房内注射用に製剤化される、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
中枢投与用に製剤化される、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
髄腔内注射、頭蓋内注射、頭蓋内注入、脳室内注射、又は脳室内注入用に製剤化される、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１〜２５のいずれか１項に定義されるようなＡＡＶベクタービリオンを産生する、パッケージング細胞。
【請求項３２】
請求項１〜２５のいずれか１項に定義されるような第１及び第２のＡＡＶベクタービリオンを含んでなる治療用キットであって、前記第１及び第２のＡＡＶベクタービリオンは、それぞれ異なる第１及び第２の標的配列に相補的な、それぞれ異なる第１及び第２のガイドＲＮＡをコードする、前記治療用キット。
【請求項３３】
第１及び第２の標的配列が、同一のアクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子に由来する、請求項３２に記載の治療用キット。
【請求項３４】
第１及び第２のベクタービリオンが、コードされたガイドＲＮＡ以外は同一である、請求項３２又は３３に記載の治療用キット。
【請求項３５】
前記第１及び第２のベクタービリオンが、それぞれ医薬的に許容される担体と組み合わせて別々の組成物に製剤化される、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の治療用キット。
【請求項３６】
前記第１及び第２のベクタービリオンが、医薬的に許容される担体と組み合わせて同一の組成物に製剤化される、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の治療用キット。
【請求項３７】
（ａ）血清型ＳｈＨ１０の第１のＡＡＶベクタービリオンであって：
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の第１の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記第１の標的配列へ指向させることが可能な第１のガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含んでなる、前記第１のＡＡＶベクタービリオン；並びに
（ｂ）血清型ＳｈＨ１０の第２のＡＡＶベクタービリオンであって：
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の第２の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記第２の標的配列へ指向させることが可能な第２のガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含んでなる、前記第２のＡＡＶベクタービリオン、
を含んでなる、治療用キット。
【請求項３８】
第１及び／又は第２の標的配列が、アクアポリン（ＡＱＰ）遺伝子に由来する、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
アクアポリン（ＡＱＰ）遺伝子が、ＡＱＰ１、ＡＱＰ２、ＡＱＰ３、ＡＱＰ４、ＡＱＰ５、ＡＱＰ６、ＡＱＰ７、又はＡＱＰ１１である、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
アクアポリン遺伝子が、ＡＱＰ１、ＡＱＰ４、又はＡＱＰ５である、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
第１及び／又は第２の標的配列が、炭酸脱水酵素（ＣＡＲ）遺伝子に由来する、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４２】
炭酸脱水酵素（ＣＡＲ）遺伝子が、ＣＡＲ２、ＣＡＲ３、ＣＡＲ４、ＣＲ５ｂ、ＣＡＲ６、ＣＡＲ８、ＣＡＲ９、ＣＡＲ１０、ＣＡＲ１２、又はＣＡＲ１４である、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
ＣＡＲ遺伝子が、ＣＡＲ２、ＣＡＲ３、ＣＡＲ４、ＣＡＲ１２、又はＣＡＲ１４である、請求項４２に記載のキット。
【請求項４４】
前記又はそれぞれのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９酵素である、請求項３７〜４３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４５】
Ｃａｓ９酵素が、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、髄膜炎菌Ｃａｓ９（ＮＭ  Ｃａｓ９）、サーモフィルス菌Ｃａｓ９（ＳＴ  Ｃａｓ９）、トレポネーマ・デンティコラＣａｓ９（ＴＤ  Ｃａｓ９）、又はそれらの変異体である、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
変異体が、ＳｐＣａｓ９  Ｄ１１３５Ｅ、ＳｐＣａｓ９  ＶＲＥＲ、ＳｐＣａｓ９  ＥＱＲ、又はＳｐＣａｓ９  ＶＱＲである、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
前記又はそれぞれのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、触媒的に活性である、請求項３７〜４６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４８】
前記又はそれぞれのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、触媒的に活性でなく、転写抑制ドメインをさらに含む、請求項３７〜４６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４９】
転写抑制ドメインが、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＣＳドメイン、ＷＲＰＷドメイン、ＭＸＩ１、ｍＳｉｎ３相互作用ドメイン、又はヒストン脱メチル化酵素ＬＳＤ１ドメインである、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記又はそれぞれのエンドヌクレアーゼが、哺乳動物細胞において有効な核局在化配列をさらに含む、請求項３７〜４９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５１】
第１及び第２の標的配列が、同一の遺伝子に由来する、請求項３７〜５０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５２】
眼圧又は房水産生を調節する方法に使用するためのＡＡＶベクタービリオンであって、血清型ＳｈＨ１０のものであり、そして
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の第１の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記第１の標的配列へ指向させることが可能な第１のガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含み；
血清型ＳｈＨ１０の第２のＡＡＶベクタービリオンと組み合わせて投与するためのものであり、前記第２のＡＡＶベクタービリオンは：
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の第２の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記第２の標的配列へ指向させることが可能な第２のガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含んでなる、前記ＡＡＶベクタービリオン。
【請求項５３】
前記使用が、高眼圧及び／又は緑内障の治療における使用である、請求項５２に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項５４】
前記緑内障が、原発性又は続発性緑内障である、請求項５３に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項５５】
前記原発性緑内障が、開放角緑内障、閉塞隅角緑内障、又は正常眼圧緑内障（ＮＴＧ）である、請求項５３又は５４に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項５６】
第１及び／又は第２の標的配列が、アクアポリン（ＡＱＰ）遺伝子に由来する、請求項５２〜５５のいずれか１項に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項５７】
アクアポリン遺伝子が、ＡＱＰ１、ＡＱＰ２、ＡＱＰ３、ＡＱＰ４、ＡＱＰ５、ＡＱＰ６、ＡＱＰ７、又はＡＱＰ１１である、請求項５６に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項５８】
アクアポリン遺伝子が、ＡＱＰ１、ＡＱＰ４、又はＡＱＰ５である、請求項５７に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項５９】
第１及び／又は第２の標的配列が、炭酸脱水酵素（ＣＡＲ）遺伝子に由来する、請求項５２〜５８のいずれか１項に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項６０】
ＣＡＲ遺伝子が、ＣＡＲ２、ＣＡＲ３、ＣＡＲ４、ＣＲ５ｂ、ＣＡＲ６、ＣＡＲ８、ＣＡＲ９、ＣＡＲ１０、ＣＡＲ１２、又はＣＡＲ１４である、請求項５９に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項６１】
ＣＡＲ遺伝子が、ＣＡＲ２、ＣＡＲ３、ＣＡＲ４、ＣＡＲ１２、又はＣＡＲ１４である、請求項６０に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項６２】
頭蓋内圧又はＣＳＦ産生を調節する方法に使用するためのＡＡＶベクタービリオンであって、血清型ＳｈＨ１０のものであり、そして
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の第１の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記第１の標的配列へ指向させることが可能な第１のガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含み；
血清型ＳｈＨ１０の第２のＡＡＶベクタービリオンと組み合わせて投与するためのものであり、前記第２のＡＡＶベクタービリオンは、
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の第２の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記第２の標的配列へ指向させることが可能な第２のガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含んでなる、前記ＡＡＶベクタービリオン。
【請求項６３】
前記使用が、水頭症又は特発性頭蓋内圧亢進症の治療における使用である、請求項６２に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項６４】
前記水頭症が、交通性水頭症又は非交通性水頭症である、請求項６３に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項６５】
前記水頭症が、正常圧水頭症である、請求項６３又は６４に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項６６】
前記水頭症が、先天性又は後天性である、請求項６２〜６５のいずれか１項に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項６７】
第１及び／又は第２の標的配列が、アクアポリン（ＡＱＰ）遺伝子に由来する、請求項６２〜６６のいずれか１項に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項６８】
アクアポリン（ＡＱＰ）遺伝子が、ＡＱＰ１、ＡＱＰ２、ＡＱＰ３、ＡＱＰ４、ＡＱＰ５、ＡＱＰ６、ＡＱＰ７、又はＡＱＰ１１である、請求項６２〜６７のいずれか１項に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項６９】
アクアポリン遺伝子が、ＡＱＰ１又はＡＱＰ４である、請求項６８に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項７０】
第１及び／又は第２の標的配列が、炭酸脱水酵素（ＣＡＲ）遺伝子に由来する、請求項６２〜６９のいずれか１項に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項７１】
炭酸脱水酵素（ＣＡＲ）遺伝子が、ＣＡＲ２、ＣＡＲ３、ＣＡＲ４、ＣＲ５ｂ、ＣＡＲ６、ＣＡＲ８、ＣＡＲ９、ＣＡＲ１０、ＣＡＲ１２、又はＣＡＲ１４である、請求項７０に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項７２】
ＣＡＲ遺伝子が、ＣＡＲ２、ＣＡＲ３、ＣＡＲ４、ＣＡＲ１２、又はＣＡＲ１４である、請求項７１に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項７３】
前記又はそれぞれのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９酵素である、請求項５２〜７２のいずれか１項に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項７４】
Ｃａｓ９酵素が、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、髄膜炎菌Ｃａｓ９（ＮＭ  Ｃａｓ９）、サーモフィルス菌Ｃａｓ９（ＳＴ  Ｃａｓ９）、トレポネーマ・デンティコラＣａｓ９（ＴＤ  Ｃａｓ９）、又はそれらの変異体である、請求項７３に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項７５】
変異体が、ＳｐＣａｓ９  Ｄ１１３５Ｅ、ＳｐＣａｓ９  ＶＲＥＲ、ＳｐＣａｓ９  ＥＱＲ、又はＳｐＣａｓ９  ＶＱＲである、請求項７４に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項７６】
前記又はそれぞれのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、触媒的に活性である、請求項５２〜７５のいずれか１項に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項７７】
前記又はそれぞれのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、触媒的に活性でなく、転写抑制ドメインをさらに含む、請求項５２〜７５のいずれか１項に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項７８】
転写抑制ドメインが、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＣＳドメイン、ＷＲＰＷドメイン、ＭＸＩ１、ｍＳｉｎ３相互作用ドメイン、又はヒストン脱メチル化酵素ＬＳＤ１ドメインである、請求項７７に記載のキット。
【請求項７９】
前記又はそれぞれのエンドヌクレアーゼが、哺乳動物細胞において有効な核局在化配列をさらに含む、請求項５２〜７８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８０】
第１及び第２の標的配列が、同一の遺伝子に由来する、請求項５２〜７９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８１】
（ａ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含んでなる、血清型ＳｈＨ１０の第１のＡＡＶベクタービリオン；及び
（ｂ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含んでなる、血清型ＳｈＨ１０の第２のＡＡＶベクタービリオン、
を含んでなる、治療用キット。
【請求項８２】
アクアポリン（ＡＱＰ）遺伝子が、ＡＱＰ１、ＡＱＰ２、ＡＱＰ３、ＡＱＰ４、ＡＱＰ５、ＡＱＰ６、ＡＱＰ７、又はＡＱＰ１１である、請求項８１に記載のキット。
【請求項８３】
アクアポリン遺伝子が、ＡＱＰ１、ＡＱＰ４、又はＡＱＰ５である、請求項８２に記載のキット。
【請求項８４】
炭酸脱水酵素（ＣＡＲ）遺伝子が、ＣＡＲ２、ＣＡＲ３、ＣＡＲ４、ＣＲ５ｂ、ＣＡＲ６、ＣＡＲ８、ＣＡＲ９、ＣＡＲ１０、ＣＡＲ１２、又はＣＡＲ１４である、請求項８１に記載のキット。
【請求項８５】
ＣＡＲ遺伝子が、ＣＡＲ２、ＣＡＲ３、ＣＡＲ４、ＣＡＲ１２、又はＣＡＲ１４である、請求項８４に記載のキット。
【請求項８６】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９酵素である、請求項８１〜８５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８７】
Ｃａｓ９酵素が、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、髄膜炎菌Ｃａｓ９（ＮＭ  Ｃａｓ９）、サーモフィルス菌Ｃａｓ９（ＳＴ  Ｃａｓ９）、トレポネーマ・デンティコラＣａｓ９（ＴＤ  Ｃａｓ９）、又はそれらの変異体である、請求項８６に記載のキット。
【請求項８８】
変異体が、ＳｐＣａｓ９  Ｄ１１３５Ｅ、ＳｐＣａｓ９  ＶＲＥＲ、ＳｐＣａｓ９  ＥＱＲ、又はＳｐＣａｓ９  ＶＱＲである、請求項８７に記載のキット。
【請求項８９】
前記又はそれぞれのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、触媒的に活性である、請求項８１〜８８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９０】
前記又はそれぞれのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、触媒的に活性でなく、転写抑制ドメインをさらに含む、請求項８１〜８９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９１】
転写抑制ドメインが、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＣＳドメイン、ＷＲＰＷドメイン、ＭＸＩ１、ｍＳｉｎ３相互作用ドメイン、又はヒストン脱メチル化酵素ＬＳＤ１ドメインである、請求項９０に記載のキット。
【請求項９２】
前記エンドヌクレアーゼが、哺乳動物細胞において有効な核局在化配列をさらに含む、請求項８１〜９１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９３】
前記第２のベクタービリオンが、異なる標的配列にそれぞれ相補的な複数のガイドＲＮＡをコードする、請求項８１〜９２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９４】
前記標的配列が、同一の遺伝子に由来する、請求項９３に記載のキット。
【請求項９５】
眼圧又は房水産生を調節する方法に使用するためのＡＡＶベクタービリオンであって、血清型ＳｈＨ１０のものであり、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み、そして血清型ＳｈＨ１０の第２のＡＡＶベクタービリオンと併せて投与するためのものであり、前記第２のベクタービリオンは、アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含んでなる、前記ベクタービリオン。
【請求項９６】
眼圧又は房水産生を調節する方法に使用するためのＡＡＶベクタービリオンであって、血清型ＳｈＨ１０のものであり、アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的でＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含み、そして血清型ＳｈＨ１０の第２のＡＡＶベクタービリオンと併せて投与するためのものであり、前記第２のベクタービリオンは、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含んでなる、前記ベクタービリオン。
【請求項９７】
前記使用が、高眼圧及び／又は緑内障の治療における使用である、請求項９５又は９６に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項９８】
前記緑内障が、原発性又は続発性緑内障である、請求項９７に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項９９】
前記原発性緑内障が、開放角緑内障、閉塞隅角緑内障、又は正常眼圧緑内障（ＮＴＧ）である、請求項９７又は９８に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１００】
アクアポリン（ＡＱＰ）遺伝子が、ＡＱＰ１、ＡＱＰ２、ＡＱＰ３、ＡＱＰ４、ＡＱＰ５、ＡＱＰ６、ＡＱＰ７、又はＡＱＰ１１である、請求項９５〜９９のいずれか１項に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１０１】
アクアポリン遺伝子が、ＡＱＰ１、ＡＱＰ４、又はＡＱＰ５である、請求項１００に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１０２】
炭酸脱水酵素（ＣＡＲ）遺伝子が、ＣＡＲ２、ＣＡＲ３、ＣＡＲ４、ＣＲ５ｂ、ＣＡＲ６、ＣＡＲ８、ＣＡＲ９、ＣＡＲ１０、ＣＡＲ１２、又はＣＡＲ１４である、請求項９５〜９９のいずれか１項に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１０３】
ＣＡＲ遺伝子が、ＣＡＲ２、ＣＡＲ３、ＣＡＲ４、ＣＡＲ１２、又はＣＡＲ１４である、請求項１０２に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１０４】
頭蓋内圧又はＣＳＦ産生を調節する方法に使用するためのＡＡＶベクタービリオンであって、血清型ＳｈＨ１０のものであり、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み、そして血清型ＳｈＨ１０の第２のＡＡＶベクタービリオンと併せて投与するためのものであり、前記第２のベクタービリオンは、アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含んでなる、前記ベクタービリオン。
【請求項１０５】
頭蓋内圧又はＣＳＦ産生を調節する方法に使用するためのＡＡＶベクタービリオンであって、血清型ＳｈＨ１０のものであり、アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的でＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含み、そして血清型ＳｈＨ１０の第２のＡＡＶベクタービリオンと併せて投与するためのものであり、前記第２のベクタービリオンは、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含んでなる、前記ベクタービリオン。
【請求項１０６】
前記使用が、水頭症又は特発性頭蓋内圧亢進症の治療における使用である、請求項１０４又は１０５に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１０７】
前記水頭症が、交通性水頭症又は非交通性水頭症である、請求項１０６に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１０８】
前記水頭症が、正常圧水頭症である、請求項１０６又は１０７に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１０９】
前記水頭症が、先天性又は後天性である、請求項１０６〜１０８のいずれか１項に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１１０】
アクアポリン（ＡＱＰ）遺伝子が、ＡＱＰ１、ＡＱＰ２、ＡＱＰ３、ＡＱＰ４、ＡＱＰ５、ＡＱＰ６、ＡＱＰ７、又はＡＱＰ１１である、請求項１０４〜１０９のいずれか１項に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１１１】
アクアポリン遺伝子が、ＡＱＰ１又はＡＱＰ４である、請求項１１０に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１１２】
炭酸脱水酵素（ＣＡＲ）遺伝子が、ＣＡＲ２、ＣＡＲ３、ＣＡＲ４、ＣＲ５ｂ、ＣＡＲ６、ＣＡＲ８、ＣＡＲ９、ＣＡＲ１０、ＣＡＲ１２、又はＣＡＲ１４である、請求項１０４〜１０９のいずれか１項に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１１３】
ＣＡＲ遺伝子が、ＣＡＲ２、ＣＡＲ３、ＣＡＲ４、ＣＡＲ１２、又はＣＡＲ１４である、請求項１１２に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１１４】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９酵素である、請求項９５〜１１３のいずれか１項に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１１５】
Ｃａｓ９酵素が、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、髄膜炎菌Ｃａｓ９（ＮＭ  Ｃａｓ９）、サーモフィルス菌Ｃａｓ９（ＳＴ  Ｃａｓ９）、トレポネーマ・デンティコラＣａｓ９（ＴＤ  Ｃａｓ９）、又はそれらの変異体である、請求項１１４に記載の使用のためのＡＡＶベクタービリオン。
【請求項１１６】
変異体が、ＳｐＣａｓ９  Ｄ１１３５Ｅ、ＳｐＣａｓ９  ＶＲＥＲ、ＳｐＣａｓ９  ＥＱＲ、又はＳｐＣａｓ９  ＶＱＲである、請求項１１５に記載のキット。
【請求項１１７】
前記又はそれぞれのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、触媒的に活性である、請求項９５〜１１６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１８】
前記又はそれぞれのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、触媒的に活性でなく、転写抑制ドメインをさらに含む、請求項９５〜１１６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１９】
転写抑制ドメインが、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＣＳドメイン、ＷＲＰＷドメイン、ＭＸＩ１、ｍＳｉｎ３相互作用ドメイン、又はヒストン脱メチル化酵素ＬＳＤ１ドメインである、請求項１１８に記載のキット。
【請求項１２０】
エンドヌクレアーゼが、哺乳動物細胞において有効な核局在化配列をさらに含む、請求項９５〜１１９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１２１】
ガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、異なる標的配列にそれぞれ相補的な複数のガイドＲＮＡをコードする、請求項９５〜１２０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１２２】
前記標的配列が、同一の遺伝子に由来する、請求項１２１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳｈＨ１０血清型のウイルスベクターと、眼圧及び頭蓋内圧の調節並びに緑内障及び水頭症のような関連病態の治療のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
緑内障は全世界で不可逆な失明の主因であり、２０２０年までにこの疾患によって１１２０万人が両眼を失明すると推定される。現在、直接医療費は、米国だけで年間３０億ドルと推定され、その費用の４５％を処方薬剤費が占める。英国も同等であり、緑内障の罹患率は４０歳以上の全国民の２％と推定されている。現行の治療選択肢は不十分であり、診断後の終生の経過観察及び治療の必要性によって深刻化する。
【０００３】
初期の病態は多様であり、決定的な療法は存在しない。しかしながら、これまでの臨床試験では、長期にわたって眼圧（ＩＯＰ）を十分に低下させれば、視神経への継続的な傷害を止めることにより進行と視力喪失が概ね予防されることが示されている。
【０００４】
水頭症又は頭蓋内圧の上昇は、広範囲の神経系障害によって引き起こされる重要な病態である。統一的な原因は、脳脊髄液（ＣＳＦ）の産生と漏出との間の不均衡である。先天性奇形、髄膜炎、及び脳腫瘍のような多くの病態が水頭症を引き起こす可能性がある。特発性頭蓋内圧亢進症のような他の病態も、ＣＳＦ圧の上昇によって重大な疾病及び失明をもたらす可能性がある。
【０００５】
現行の治療法に経口医薬品が含まれるが、多くの受容し難い副作用によってそれらの使用は制限されている。シャント術式の外科的介入は、失敗及び合併症の比率が高い（ある研究では、５歳以上の小児で４８％、成人で２７％に達する）。
【０００６】
従って、緑内障、水頭症、及び関連病態へのさらなる治療選択肢が求められている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、周囲組織に優先して毛様体と脈絡叢に形質導入することが可能なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに関する。より詳細には、アデノ随伴ウイルスのＳｈＨ１０血清型は、毛様体及び脈絡叢への効果的で特異的な形質導入をもたらし得ることが見出されている。
【０００８】
毛様体は、眼における房水の産生に関与しており、房水産生を低下させることによって眼圧（ＩＯＰ）を下げることを目的とした、緑内障に対する数多くの療法の標的となっている。
【０００９】
脈絡叢は、生理学的には毛様体に酷似しており、脳脊髄液（ＣＳＦ）の産生を担っている。脳にＣＳＦが蓄積すると、頭蓋内圧（ＩＣＰ）の上昇と特発性頭蓋内圧亢進症及び水頭症のような病態をもたらす可能性がある。
【００１０】
他のアデノウイルス血清型を含めた他種のウイルスは、毛様体と脈絡叢に形質導入することが全くできないか又はこれらの組織に対して十分に特異的でないため、臨床使用への実行可能な選択肢とならない。
【００１１】
故に、本発明のウイルスベクターは、眼圧若しくは頭蓋内圧の低下及び／又は房水若しくはＣＳＦの産生の低下から利益を受け得る、緑内障及び水頭症のような病態の治療への高度に標的指向された遺伝子編集アプローチを可能にする。
【００１２】
本発明は、血清型ＳｈＨ１０のＡＡＶベクタービリオンを提供し、該ＡＡＶベクタービリオンは：
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含んでなる。
【００１３】
本発明はまた、眼圧又は房水産生を調節する方法に使用するためＡＡＶベクタービリオンを提供し、該ＡＡＶベクターは、血清型ＳｈＨ１０のものであり：
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含む。
【００１４】
本発明はまた、頭蓋内圧又はＣＳＦ産生を調節する方法に使用するためのＡＡＶベクタービリオンを提供し、該ＡＡＶベクターは、血清型ＳｈＨ１０のものであり、そして
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含む。
【００１５】
本発明はまた、眼圧又は房水産生を調節するための医薬品の製造におけるＡＡＶベクタービリオンの使用を提供し、該ＡＡＶベクタービリオンは、血清型ＳｈＨ１０のものであり：
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含む。
【００１６】
本発明はまた、頭蓋内圧又はＣＳＦ産生を調節するための医薬品の製造におけるＡＡＶベクタービリオンの使用を提供し、該ＡＡＶベクターは、血清型ＳｈＨ１０のものであり：
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含む。
【００１７】
本発明はまた、ＡＡＶベクタービリオンを被験者へ投与することを含んでなる、眼圧又は房水産生を調節する方法を提供し、該ＡＡＶベクターは、血清型ＳｈＨ１０のものであり、そして
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含む。
【００１８】
本発明はまた、ＡＡＶベクタービリオンを被験者へ投与することを含んでなる、頭蓋内圧又はＣＳＦ産生を調節する方法を提供し、該ＡＡＶベクターは、血清型ＳｈＨ１０のものであり：
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含む。
【００１９】
このように、本発明のベクター及び方法は、眼圧、頭蓋内圧、房水産生、又はＣＳＦ産生の調節から利益を受け得るか又はそれによって軽減され得る病態又は症状の治療に有用である。治療は、療法的（既存の病態又は症状に対して）又は予防的（そのリスク状態にある個体における病態又は症状の発症を予防、阻害、又は遅延させることを模索する）であり得る。本発明の文脈における「調節」は、典型的には関連特性の低下を示すが、増加を阻害する傾向を示す場合もある。従って、調節は、関連特性の絶対的な低下を構成し得るが、関連特性の定常状態を維持すること又は治療しない場合に生じるより遅い増加速度をもたらすことを構成する場合もある。
【００２０】
眼圧の上昇（高眼圧）は、緑内障の発症における主要な危険因子である。眼圧（ＩＯＰ）の低下は、ＩＯＰが正常範囲内である緑内障のタイプにおいてさえ有用であることが示されている。従って、本発明のベクター及び方法は、高眼圧及び／又は緑内障の治療に有用である。
【００２１】
緑内障は、原発性又は続発性であり得る。
原発性緑内障は、開放角緑内障、閉塞隅角緑内障、又は正常眼圧緑内障（ＮＴＧ）であり得る。
【００２２】
頭蓋内圧の上昇、ＣＳＦの過剰産生、又はＣＳＦ漏出の障害は、水頭症及び特発性頭蓋内圧亢進症のような病態をもたらす場合がある。従って、本発明のベクター及び方法は、水頭症及び特発性頭蓋内圧亢進症の治療に有用である。
【００２３】
水頭症は、正常圧水頭症を含めた交通性水頭症又は非交通性水頭症であり得る。いずれの症例も、先天性又は後天性であり得る。
ＡＡＶベクタービリオンは、逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接する「ペイロード」配列を含んでなる、１本鎖ＤＮＡゲノムを含有する。従って、特定の核酸配列を含んでなるベクタービリオンに本明細書が言及する場合、そのベクタービリオンは、そのような配列を含んでなる１本鎖ＤＮＡゲノム分子を含有すると理解される。ベクタービリオンが２以上の特定の核酸配列を含有すると述べられる場合、それらの配列は、典型的には、同一の１本鎖ＤＮＡゲノム分子の一部を形成するものである。同様に、ベクタービリオンが特定の分子（例えばＲＮＡ又はタンパク質）をコードすると述べられる場合、そのベクタービリオンは、その分子をコードする配列を含んでなる１本鎖ＤＮＡゲノムを含有すると理解される。
【００２４】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、髄膜炎菌Ｃａｓ９（ＮＭ  Ｃａｓ９）、サーモフィルス菌Ｃａｓ９（ＳＴ  Ｃａｓ９）、トレポネーマ・デンティコラＣａｓ９（ＴＤ  Ｃａｓ９）、又はＳｐＣａｓ９  Ｄ１１３５Ｅ、ＳｐＣａｓ９  ＶＲＥＲ、ＳｐＣａｓ９  ＥＱＲ、若しくはＳｐＣａｓ９  ＶＱＲなどのそれらの変異体のようなＣａｓ９酵素であり得る。
【００２５】
ＳａＣａｓ９及びその変異体は比較的小さいサイズであるために、ＡＡＶゲノムの制限されたコード能に鑑みて好ましい場合がある。
しかしながら、Ｃｐｆ１のような他のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼも有用であり得る。
【００２６】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、典型的には触媒的に活性である。しかしながら、ある状況では、触媒的に活性でないＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが利用される場合がある。触媒的に活性でないＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＣＳドメイン、ＷＲＰＷドメイン、ＭＸＩ１、ｍＳｉｎ３相互作用ドメイン、又はヒストン脱メチル化酵素ＬＳＤ１ドメインのような転写抑制ドメインも含み得る。従って、このベクターゲノムは、触媒的に活性でないＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ及び抑制ドメインを含んでなる融合タンパク質をコードする遺伝子を含有する。
【００２７】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、哺乳動物細胞において有効な核局在化配列をさらに含み得る。
ガイドＲＮＡは、特にエンドヌクレアーゼがＣａｓ９酵素である場合、典型的にはｓｇＲＮＡであろう。
【００２８】
しかしながら、ガイドＲＮＡは、あるいはｃｒＲＮＡであってもよい。そのような状況では、エンドヌクレアーゼ活性に必要ならば、例えば、エンドヌクレアーゼがＣａｓ９酵素である場合は、ベクタービリオンは、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする核酸配列も含み得る。Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要としないと考えられている。
【００２９】
アクアポリン遺伝子は、その産物が毛様体又は脈絡叢において発現される、ＡＱＰ１、ＡＱＰ２、ＡＱＰ３、ＡＱＰ４、ＡＱＰ５、ＡＱＰ６、ＡＱＰ７、又はＡＱＰ１１のような、いずれのアクアポリン（ＡＱＰ）遺伝子でもよい。
【００３０】
毛様体では、ＡＱＰ１、ＡＱＰ４、及びＡＱＰ５が最も高度に発現されるアクアポリンであり、眼の病態への特に良好な標的を代表し得る。
ＡＱＰ１及びＡＱＰ４は、脈絡叢においても発現されるため、脳の病態への特に良好な標的になり得る。
【００３１】
いくつかの態様では、アクアポリン遺伝子はＡＱＰ１であり、その標的配列はエクソン１内に位置している。例えば、ガイドＲＮＡは、配列：ＧＡＴＧＡＴＧＴＡＣＡＴＧＡＣＡＧＣＣＣＧ、ＧＡＴＣＧＣＴＡＣＴＣＴＧＧＣＣＣＡＡＡＧＴ、ＧＡＴＧＴＧＡＣＣＣＡＣＡＣＴＴＴＧＧＧＣ、ＴＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧ、ＡＣＣＡＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡ、若しくはＴＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＧＣＣＣＧＡを含んでなるか又はそれらから成るｃｒＲＮＡ部分を含み得る。
【００３２】
例えば、ガイドＲＮＡは、配列：ＧＡＴＧＡＴＧＴＡＣＡＴＧＡＣＡＧＣＣＣＧ又はＧＡＴＣＧＣＴＡＣＴＣＴＧＧＣＣＣＡＡＡＧＴを含んでなるか又はそれらから成るｃｒＲＮＡ部分を含み得る。
【００３３】
ＡＱＰ１遺伝子を標的とする２つのガイドＲＮＡの送達に関わる本発明の側面では、配列：ＧＡＴＧＡＴＧＴＡＣＡＴＧＡＣＡＧＣＣＣＧ及びＧＡＴＣＧＣＴＡＣＴＣＴＧＧＣＣＣＡＡＡＧＴのような、これらｃｒＲＮＡ配列の２つを使用し得る。
【００３４】
上に示したｃｒＲＮＡ配列は、マウスＡＱＰ１に対する相補性のために設計されたが、ヒトのような他の哺乳動物種においても作動することが期待され得る。当業者であれば、どの所与の生物種においても、選択される遺伝子を標的とするのに適した配列を設計することが可能であろう。例えば、ヒトＡＱＰ１を標的とする際に使用するためのｇＲＮＡは、配列：ＣＴＧＡＧＣＡＴＣＧＣＣＡＣＧＣＴＧＧＣＧ、ＡＣＣＧＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＡＡ、又はＣＣＧＣＣＧＴＣＴＧＧＴＴＧＴＴＣＣＣＣＡを含むか又はそれらから成り得る。
【００３５】
同様に、炭酸脱水酵素（ＣＡＲ）遺伝子は、その産物が毛様体又は脈絡叢において発現される、ＣＡＲ２、ＣＡＲ３、ＣＡＲ４、ＣＲ５ｂ、ＣＡＲ６、ＣＡＲ８、ＣＡＲ９、ＣＡＲ１０、ＣＡＲ１２、又はＣＡＲ１４のような、いずれのＣＡＲ遺伝子でもよい。ＣＡＲ１５は、マウスの毛様体においても発現される。ＣＡＲ２、ＣＡＲ３、ＣＡＲ４、ＣＡＲ１２、及びＣＡＲ１４、例えばＣＡＲ２、ＣＡＲ３、及びＣＡＲ１４は、眼において特に良好な標的を代表し得る。ＣＡＲ２、ＣＡＲ４、及びＣＡＲ１２は、脈絡叢において高度に発現されると考えられている。
【００３６】
本発明はさらに、記載のようなベクタービリオンを医薬的に許容される担体と組み合わせて含んでなる医薬組成物を提供する。
医薬組成物は、眼内注射用に、より詳細には、硝子体内注射又は前房内注射用に（例えば緑内障の治療のような眼科適用のために）製剤化され得る。医薬組成物は、中枢投与、即ち中枢神経系（ＣＮＳ）への直接投与用に製剤化され得る。中枢投与用の組成物は、例えば、髄腔内注射、又は例えば脳室内注射又は注入による頭蓋内注射若しくは注入用に製剤化され得る。そのような投与は、水頭症の治療に特に適していよう。
【００３７】
本発明はさらに、記載のようなＡＡＶベクタービリオンを産生するパッケージング細胞を提供する。
本発明はまた、記載のようなベクタービリオンの複数の集団を含んでなる治療用キットを提供し、各集団は異なるガイドＲＮＡをコードする。異なる集団によってコードされるガイドＲＮＡは、同一の遺伝子内又は異なる遺伝子内の標的配列へ指向され得る。同一の遺伝子へ指向される異なるガイドＲＮＡをコードするベクタービリオンの少なくとも２つの集団を提供することが特に望ましい場合があるのは、これが、例えば遺伝子の一部を欠失させることによる、遺伝子不活性化の効率を高めることができるからである。典型的には、このアプローチは、触媒的に活性のあるエンドヌクレアーゼを必要とする。
【００３８】
このように、該キットは、記載のような第１及び第２のＡＡＶベクタービリオン（又はベクタービリオンの集団）を含むことができ、前記第１及び第２のベクター（又はベクタービリオンの集団）は、それぞれ異なる第１及び第２の標的配列に相補的なそれぞれ異なる第１及び第２のガイドＲＮＡをコードしており、第１及び第２の標的配列は、同一のアクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子に由来し得る。
【００３９】
異なるベクタービリオン又はベクタービリオンの集団は、それらがコードするガイドＲＮＡ以外は同一であり得る。
異なるベクタービリオン又はベクタービリオンの集団は、同じ組成物の一部として提供されても、別々の組成物において提供されてもよい。それぞれの組成物は、独立して、それぞれのベクタービリオン又はベクタービリオンの集団を、医薬的に許容される担体と組み合わせて含んでなる医薬組成物であり得る。
【００４０】
従って、本発明は、
（ａ）血清型ＳｈＨ１０の第１のＡＡＶベクタービリオンであって：
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の第１の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを第１の前記標的配列へ指向させることが可能な第１のガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含んでなる、第１のＡＡＶベクタービリオン；並びに
（ｂ）血清型ＳｈＨ１０の第２のＡＡＶベクタービリオンであって：
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の第２の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを第２の前記標的配列へ指向させることが可能な第２のガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含んでなる、前記第２のＡＡＶベクタービリオン、
を含んでなる、治療用キットを提供する。
【００４１】
本発明はまた、眼圧又は房水産生を調節する方法に使用するためのＡＡＶベクタービリオンを提供し、ＡＡＶベクタービリオンは、血清型ＳｈＨ１０のものであり、そして
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の第１の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記第１の標的配列へ指向させることが可能な第１のガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含み；
血清型ＳｈＨ１０の第２のＡＡＶベクタービリオンと組み合わせて投与するためのものであり、前記第２のＡＡＶベクタービリオンは：
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の第２の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記第２の標的配列へ指向させることが可能な第２のガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含んでなる。
【００４２】
本発明はまた、頭蓋内圧又はＣＳＦ産生を調節する方法に使用するためのＡＡＶベクタービリオンを提供し、該ＡＡＶベクタービリオンは、血清型ＳｈＨ１０のものであり、そして
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の第１の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記第１の標的配列へ指向させることが可能な第１のガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含み；
血清型ＳｈＨ１０の第２のＡＡＶベクタービリオンと組み合わせて投与するためのものであり、前記第２のＡＡＶベクタービリオンは：
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の第２の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記第２の標的配列へ指向させることが可能な第２のガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含んでなる。
【００４３】
本発明はまた、眼圧又は房水産生を調節するための医薬品の製造におけるＡＡＶベクタービリオンの使用を提供し、ＡＡＶベクタービリオンは、血清型ＳｈＨ１０のものであり、そして
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の第１の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記第１の標的配列へ指向させることが可能な第１のガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含み；
血清型ＳｈＨ１０の第２のＡＡＶベクタービリオンと組み合わせて投与するためのものであり、前記第２のＡＡＶベクタービリオンは：
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の第２の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記第２の標的配列へ指向させることが可能な第２のガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含んでなる。
【００４４】
本発明はまた、頭蓋内圧又はＣＳＦ産生を調節するための医薬品の製造におけるＡＡＶベクタービリオンの使用を提供し、ＡＡＶベクタービリオンは、血清型ＳｈＨ１０のものであり、そして
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の第１の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記第１の標的配列へ指向させることが可能な第１のガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含み；
血清型ＳｈＨ１０の第２のＡＡＶベクタービリオンと組み合わせて投与すらためのものであり、前記第２のＡＡＶベクタービリオンは：
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の第２の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記第２の標的配列へ指向させることが可能な第２のガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含んでなる。
【００４５】
本発明はまた、第１及び第２のＡＡＶベクタービリオンを被験者へ投与することを含んでなる、眼圧又は房水産生を調節する方法を提供し、第１のＡＡＶベクタービリオンは、血清型ＳｈＨ１０のものであり、そして
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の第１の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記第１の標的配列へ指向させることが可能な第１のガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含み；
第２のＡＡＶベクタービリオンは、血清型ＳｈＨ１０のものであり、そして
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の第２の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記第２の標的配列へ指向させることが可能な第２のガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含む。
【００４６】
本発明はまた、第１及び第２のＡＡＶベクタービリオンを被験者へ投与することを含んでなる、頭蓋内圧又はＣＳＦ産生を調節する方法を提供し、第１のＡＡＶベクタービリオンは、血清型ＳｈＨ１０のものであり、そして
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の第１の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記第１の標的配列へ指向させることが可能な第１のガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含み；
第２のＡＡＶベクタービリオンは、血清型ＳｈＨ１０のものであり、そして
（ｉ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
（ｉｉ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の第２の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記第２の標的配列へ指向させることが可能な第２のガイドＲＮＡをコードする核酸配列、
を含む。
【００４７】
すべてのそのような場合において、第１及び第２の標的配列は異なっており、同一の遺伝子に由来しても異なる遺伝子に由来してもよい。上記のように、第１及び第２の標的配列が同一の遺伝子に由来することが望ましい場合があるのは、これが、例えば遺伝子の一部を欠失させることによる、遺伝子不活性化の効率を高めることができるからである。
【００４８】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡを別々のベクターの同時投与によって送達することも可能である。
従って、本発明はまた：
（ａ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含んでなる、血清型ＳｈＨ１０の第１のＡＡＶベクタービリオン；及び
（ｂ）アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含んでなる、血清型ＳｈＨ１０の第２のＡＡＶベクタービリオン、
を含んでなる、治療用キットを提供する。
【００４９】
第２のベクタービリオンは、異なる標的配列にそれぞれ相補的な複数のガイドＲＮＡ、例えば２つのガイドＲＮＡをコードし得る。標的配列は、同一の遺伝子に由来しても異なる遺伝子に由来してもよい。上記のように、２つの標的配列が同一の遺伝子に由来することが望ましい場合があるのは、これが、例えば該遺伝子の一部を欠失させることによる、遺伝子不活性化の効率を高めることができるからである。
【００５０】
それぞれのガイドＲＮＡは、ｓｇＲＮＡでもｃｒＲＮＡでもよい。
ベクターが複数のｓｇＲＮＡをコードする場合、ｓｇＲＮＡは、同一のｃｒＲＮＡ成分をそれぞれ含み得る。
【００５１】
当該ベクターが１つのｃｒＲＮＡ又は複数のｃｒＲＮＡをコードする場合、第１のベクターにコードされるエンドヌクレアーゼの活性に必要であるならば、適合可能なｔｒａｃｒＲＮＡをコードすることもできる。しかしながら、いずれのｔｒａｃｒＲＮＡも、追加的又は選択的に第１のベクターにコードされ得る。
【００５２】
第１及び第２のベクタービリオンは、同じ組成物の一部として提供されても、別々の組成物において提供されてもよい。それぞれの組成物は、独立して、それぞれのベクタービリオン又は複数のビリオンを医薬的に許容される担体と組み合わせて含んでなる医薬組成物であり得る。
【００５３】
本発明はまた、眼圧又は房水産生を調節する方法に使用するためのＡＡＶベクタービリオンを提供し、前記ＡＡＶベクタービリオンは、血清型ＳｈＨ１０のものであり、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み、そして血清型ＳｈＨ１０の第２のＡＡＶベクタービリオンと併せて投与するためのものであり、前記第２のベクタービリオンは、アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含んでなる。
【００５４】
本発明はさらに、眼圧又は房水産生を調節する方法に使用するためのＡＡＶベクタービリオンを提供し、前記ＡＡＶベクタービリオンは、血清型ＳｈＨ１０のものであり、アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的でＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含み、そして血清型ＳｈＨ１０の第２のＡＡＶベクタービリオンと併せて投与するためのものであり、前記第２のベクタービリオンは、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含んでなる。
【００５５】
本発明はまた、頭蓋内圧又はＣＳＦ産生を調節する方法に使用するためのＡＡＶベクタービリオンを提供し、前記ＡＡＶベクタービリオンは、血清型ＳｈＨ１０のものであり、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み、そして血清型ＳｈＨ１０の第２のＡＡＶベクタービリオンと併せて投与するためのものであり、前記第２のベクタービリオンは、アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含んでなる。
【００５６】
本発明はさらに、頭蓋内圧又はＣＳＦ産生を調節する方法に使用するためのＡＡＶベクタービリオンを提供し、前記ＡＡＶベクタービリオンは、血清型ＳｈＨ１０のものであり、アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的でＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含み、そして血清型ＳｈＨ１０の第２のＡＡＶベクタービリオンと併せて投与するためのものであり、前記第２のベクタービリオンは、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含んでなる。
【００５７】
本発明はまた、眼圧又は房水産生を調節するための医薬品の製造におけるＡＡＶベクタービリオンの使用を提供し、前記ＡＡＶベクタービリオンは、血清型ＳｈＨ１０のものであり、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み、そして血清型ＳｈＨ１０の第２のＡＡＶベクタービリオンと併せて投与するためのものであり、前記第２のベクタービリオンは、アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含んでなる。
【００５８】
本発明はさらに、眼圧又は房水産生を調節するための医薬品の製造におけるＡＡＶベクタービリオンの使用を提供し、前記ＡＡＶベクタービリオンは、血清型ＳｈＨ１０のものであり、アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的でＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含み、そして血清型ＳｈＨ１０の第２のＡＡＶベクタービリオンと併せて投与するためのものであり、前記第２のベクタービリオンは、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含んでなる。
【００５９】
本発明はまた、頭蓋内圧又はＣＳＦ産生を調節するための医薬品の製造におけるＡＡＶベクタービリオンの使用を提供し、前記ＡＡＶベクタービリオンは、血清型ＳｈＨ１０のものであり、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み、そして血清型ＳｈＨ１０の第２のＡＡＶベクタービリオンと併せて投与するためのものであり、前記第２のベクタービリオンは、アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的で前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含んでなる。
【００６０】
本発明はさらに、頭蓋内圧又はＣＳＦ産生を調節するための医薬品の製造におけるＡＡＶベクタービリオンの使用を提供し、前記ＡＡＶベクタービリオンは、血清型ＳｈＨ１０のものであり、アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の標的配列に相補的でＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含み、そして血清型ＳｈＨ１０の第２のＡＡＶベクタービリオンと併せて投与するためのものであり、前記第２のベクタービリオンは、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含んでなる。
【００６１】
本発明はさらに、第１及び第２のＡＡＶベクタービリオンを被験者へ投与することを含んでなる、眼圧又は房水産生を調節する方法を提供し、第１のＡＡＶベクタービリオンは、血清型ＳｈＨ１０のものであり、アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の第１の標的配列に相補的でＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記第１の標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含み；そして第２のＡＡＶベクタービリオンは、血清型ＳｈＨ１０のものであり、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む。
【００６２】
本発明はさらに、第１及び第２のＡＡＶベクタービリオンを被験者へ投与することを含んでなる、頭蓋内圧又はＣＳＦ産生を調節する方法を提供し、第１のＡＡＶベクタービリオンは、血清型ＳｈＨ１０のものであり、アクアポリン遺伝子又は炭酸脱水酵素遺伝子由来の第１の標的配列に相補的でＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを前記第１の標的配列へ指向させることが可能なガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含み；そして第２のＡＡＶベクタービリオンは、血清型ＳｈＨ１０のものであり、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む。
【００６３】
当該ビリオンは好適な用量で投与することができ、当業者は、使用される特定のベクターと臨床状況に依拠して、適正な用量を決定することが可能であろう。例えば、前記又はそれぞれのベクターの１×１０７〜１×１０１１ゲノムコピー（ｇｃ）、例えば前記又はそれぞれのベクターの５×１０７〜５×１０１０ｇｃ、例えば前記又はそれぞれのベクターの１×１０８〜１×１０１０ｇｃの単回用量が好適であり得る。しかしながら、より低い力価もあり得る。
【００６４】
本発明のベクターが眼に投与される場合、そのような投与量は、ミュラーグリア細胞への形質導入が相対的に低いレベルであっても、毛様体の形質導入には良好なレベルを提供することが見出されている。
【００６５】
「患者」、「被験者」、及び「個体」という用語は、交換可能的に使用し得る。本発明の組成物及び方法が適用される被験者は、典型的には哺乳動物であり、ヒト、又は非ヒト霊長動物（例えば類人猿、旧世界猿、又は新世界猿）、家畜動物（例えばウシ又はブタ）、伴侶動物（例えばイヌ又はネコ）、若しくは齧歯動物（例えばマウス又はラット）のような実験動物などの非ヒト哺乳動物でもよい。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】公表されたマイクロアレイデータの解析より、マウス毛様体では、アクアポリン１、４、５、並びに炭酸脱水酵素２、３、及び１４が、最も豊富なアイソフォームであることを確認する。ＣＥＬデータファイルをＧＥＯレポジトリ（GSE 10246-Lattin JE et al. Expression analysis of G Protein-Coupled Receptors in mouse macrophages［マウスマクロファージにおけるＧタンパク質共役受容体の発現解析］, Immunome Res. 2008 Apr 29;4:5.）より直接ダウンロードして、Ｐａｒｔｅｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｕｉｔｅ  ６．６（Ｐａｒｔｅｋ社）へ読み込んだ。ロバストマルチアレイ平均法のバックグラウンド補正（ｍｅｄｉａｎ  ｐｏｌｉｓｈ法で縮約する分位数正規化）を使用して、データを正規化した。次いで、毛様体について、チップ上のすべてのＡＱＰ遺伝子及びＣＡＲ遺伝子の発現のヒストグラムを作成した。他の眼組織全体と比較して、毛様体ではＡＱＰ４、ＡＱＰ５、並びにＣａｒ２、３、６、及び１４が特に豊富であった。
【図２】マウス毛様体では、アクアポリン及び炭酸脱水酵素の主要なアイソフォームが検出可能である。Ａ）切開したマウス眼組織のウェスタンブロット解析により、Ａｑｐ１、４、及びＣａｒ２タンパク質の角膜、網膜、及びＲＰＥ間の相対レベルを同定する。Ｂ）切開マウス眼組織に対するＴａｑｍａｎプローブを使用した定量的ＰＣＲは、ＲＮＡ転写産物の同等な組織レベルを示す（各群につきｎ＝３個の眼）。
【図３】Ｔ７エンドヌクレアーゼ１ゲノム切断アッセイによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験により、いくつかの活性なＳａＣａｓ９  ｓｇＲＮＡガイドを同定する。異なるｐＡＡＶ−ＳａＣａｓ９−ｓｇＲＮＡプラスミドをマウスＢ６−ＲＰＥ細胞株へリポフェクタミン３０００トランスフェクションした後３日目にゲノム切断アッセイを実施した。ＤＮＡ  １０００  ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎを使用してＤＮＡ切断産物の相対強度を評価し、対応領域における相対的なゲノム挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）発生率の計算を可能にした。
【図４−１】Ａ）ＡＡＶ−ＳａＣａｓ９プラスミドｍＡｑｐ１エクソン１ガイド１Ｂのプラスミドマップ。
【図４−２】Ｂ）ＡＡＶ−ＳａＣａｓ９プラスミドｍＡｑｐ１エクソン１ガイド１Ｂの配列。
【図４−３】Ｂ）ＡＡＶ−ＳａＣａｓ９プラスミドｍＡｑｐ１エクソン１ガイド１Ｂの配列（続き）。
【図５−１】Ａ）ＡＡＶ−ＳａＣａｓ９プラスミドｍＡｑｐ１エクソン１ガイド１Ｅのプラスミドマップ。
【図５−２】Ｂ）ＡＡＶ−ＳａＣａｓ９プラスミドｍＡｑｐ１エクソン１ガイド１Ｅの配列。
【図５−３】Ｂ）ＡＡＶ−ＳａＣａｓ９プラスミドｍＡｑｐ１エクソン１ガイド１Ｅの配列（続き）。
【図６−１】アクアポリン１は、マウス毛様体において発現され、ＣＲＩＳＰＲ−ＳａＣａｓ９によって破壊することができる。マウスの眼は、角膜、毛様体、及びＲＰＥにおいてアクアポリン１（Ａｑｐ１）を優勢的に発現する。Ａ）代表的なウェスタンブロット、Ｂ）タンパク質、及びＣ）定量的ＰＣＲ（ｎ＝３〜４個の眼）。
【図６−２】Ｄ）試験したショートガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の配列及び位置を表示する、マウスＡｑｐ１のエクソン１の概略図。
【図６−３】Ｅ）各ｓｇＲＮＡのｉｎｄｅｌ生成効率を同定する、プラスミドトランスフェクションされたマウスＡｑｐ１  ｓｇＲＮＡのＴ７エンドヌクレアーゼ１アッセイ。ラベルＢ及びＥを、ＳｈＨ１０血清型ＡＡＶベクターへパッケージして、マウスＢ６−ＲＰＥ細胞株に個別に及び組み合わせて感染させるために使用した。Ｆ）Ｔ７エンドヌクレアーゼ１アッセイ、及びＧ）定量的ＰＣＲを、ｍＡｑｐ１について実施した。ｓｇＲＮＡをＥ単独で、及びＢと組み合わせて（Ｍｉｘ）使用すると、Ａｑｐ１の発現が有意に低下した。ダンの多重比較法を用いるクラスカル・ウォリス検定。＊＊＊ｐ＝０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝１０〜１２。
【図６−４】Ｈ）Ｍｉｘ  ｓｇＲＮＡで処理したＢ６−ＲＰＥ細胞より配列決定したオンターゲットゲノムＤＮＡ改変のグラフ表示。プラスミドライゲーション及び配列決定法を使用して、介在８３ｂｐ領域の完全な切除と塩基挿入が主たる変化であることを実証する。
【図７】マウスでは、毛様体アクアポリン１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性の破壊により眼圧が低下する。ｍＡｑｐ１  ｓｇＲＮＡ  Ｂ及びＥを同比率でコードするＳｈＨ１０ウイルス（Ｍｉｘ）の２×１０１０ゲノムコピーを野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの片眼へ硝子体内注射してから３週間後、Ａ）Ｔ７エンドヌクレアーゼ１アッセイにより、処理した眼から切除した毛様体にのみゲノムＤＮＡの切断があることを実証する。Ｂ）ＳａＣａｓ９  ＤＮＡも、注射した眼由来の毛様体組織にのみＰＣＲによって検出可能である。Ｃ）ｍＡｑｐ１破壊により、眼圧（ＩＯＰ）は平均２．９ｍｍＨｇ低下する（対応のあるｔ検定、ｎ＝１８対）。Ｄ）ＩＯＰは、対照のＳｈＨ１０  ＣＭＶ−ＧＦＰウイルス注射によって変化しない（片側ＡＮＯＶＡ、ｎ＝１２〜４２個の眼）。単離した毛様体におけるＡｑｐ１タンパク質の低下を示す、Ｅ）代表的なウェスタンブロット、及びＦ）デンシトメトリー（対応のあるｔ検定、ｐ＝０．００９、ｎ＝７対）。Ｇ）角膜又はＨ）網膜のいずれにおいても、厚さの有意な「オフターゲット」増加は見られない（対応のあるｔ検定、ｎ＝９対。ＵＮ＝非注射、ＭＩＸ＝ＳｈＨ１０−ＣＭＶ−ＳａＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ  Ｂ及びＥ）。
【図８】２種の緑内障実験モデルでは、毛様体アクアポリン１の破壊により眼圧が低下する。マイクロビーズモデルを使用して、各試行あたり３〜５匹のマウスについての３回の独立した実験から表示データをプールする。Ａ）未処理（ＵＮ）の眼とＳｈＨ１０−ＣＭＶ−ＳａＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ  Ｂ及びＥ（Ｍｉｘ）で処理した眼の眼圧（ＩＯＰ）。高眼圧の誘発後１週目に注射すると、その処理によりＩＯＰの上昇が縮小した（両側ＡＮＯＶＡ，ｐ＝０．０００３、ｎ＝１２匹のマウス）。Ｂ）最終時点での分析は、ＩＯＰの平均３．９ｍｍＨｇの低下を示した（対応のあるｔ検定、ｐ＝０．００２、ｎ＝１２対）。点線は、０日目における１２．７ｍｍＨｇの平均ベースラインＩＯＰを表す。処理した眼におけるレベル低下を実証する対応付けたｅｘ  ｖｉｖｏ毛様体のｍＡＱＰ１タンパク質の、Ｃ）代表的なウェスタンブロット、及びＤ）デンシトメトリー（対応のあるｔ検定、ｐ＝０．０００８、ｎ＝１２）。コルチコステロイド誘発高眼圧モデルを使用して、各試行あたり５及び６匹のマウスについての２回の独立した実験から表示データをプールする。Ｅ）Ｍｉｘで処理した眼では、ステロイド誘発の３週間後にＩＯＰが平均２．９ｍｍＨｇ低下している（対応のあるｔ検定、ｐ＜０．０００１、ｎ＝１１）。点線は、０日目における１１．３ｍｍＨｇの平均ベースラインＩＯＰを表す。ｍＡＱＰ１タンパク質レベルの低下を実証するｅｘ  ｖｉｖｏ毛様体の、Ｆ）代表的なウェスタンブロット、及びＧ）デンシトメトリー（対応のあるｔ検定、ｐ＝０．００２５、ｎ＝１１）。
【図９】ヒト毛様体は、アクアポリン１を発現しており、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性遺伝子破壊を可能にするためにＳｈＨ１０ウイルスの標的とすることができる。６名のドナーに由来する、角膜移植の残りのヒトｅｘ  ｖｉｖｏ毛様体組織を入手して、７日間まで培養で維持した。Ａ）即時切除を施行した２名のドナーに由来する、アクアポリン１（ｈＡＱＰ１）についての代表的なウェスタンブロット。Ｂ）全ドナーに由来する組織の、プールしたｑＰＣＲ発現データ（ｎ＝２〜６）。ＡＱＰ１は、毛様体及び角膜内皮において豊富であった。ｈＡＱＰ１のエクソン１を標的とする３つのヒトｓｇＲＮＡを同様に作製して、Ｃ）２９３Ｔ細胞において、プラスミドトランスフェクション及びＴ７エンドヌクレアーゼ１アッセイによって試験した。Ｄ）ｓｇＲＮＡ  Ｋを選択して、ＳｈＨ１０ウイルスへパッケージした。感染性の２９３Ｔ細胞は、Ｔ７エンドヌクレアーゼ１アッセイによると、さらに高いｉｎｄｅｌ形成率を示した。ヒト毛様体を、ユビキタスＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰを発現するＳｈＨ１０ウイルスとともに培養した。
【発明の詳細な説明】
【００６７】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ及びＣＲＩＳＰＲシステム
本発明では、ＣＲＩＳＰＲ（「clustered regularly interspaced short palindromic repeats」：クリスパー）システムを使用して、標的遺伝子の発現を調節する。
【００６８】
ＣＲＩＳＰＲ（又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）システムは、原核生物のＲＮＡ誘導型防御システムに由来する。少なくとも１１種の異なるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムがあり、これらは３種の主要型（Ｉ〜ＩＩＩ）へグループ分けされている。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ゲノム工学ツールとして採用されている。
【００６９】
ほとんどのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、３種の成分を利用する：
−ＤＮＡニッカーゼ活性を有しているタンパク質エンドヌクレアーゼＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ随伴タンパク質）、本明細書では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（又はＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）と表す；
−典型的にはおよそ２０ヌクレオチドで、標的遺伝子内の標的配列（「プロトスペーサー」）に相補的な短鎖配列を含んでなる、「標的指向性（targeting）」又は「ガイド」ＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ）；及び
−ｃｒＲＮＡと相互作用してＣａｓエンドヌクレアーゼを動員する「足場」ＲＮＡ（トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ）。
【００７０】
これら成分の組立て及びｃｒＲＮＡと染色体内の標的配列とのハイブリダイゼーションにより、典型的にはその標的配列又はその近傍でエンドヌクレアーゼによる染色体の切断を生じる。
【００７１】
切断には、標的ＤＮＡが、ｃｒＲＮＡ標的配列の十分近傍に、典型的には標的配列の３’端のすぐ隣に位置した、Ｃａｓ酵素の認識部位（プロトスペーサー隣接モチーフ、又はＰＡＭ）を含有することも必要とする。
【００７２】
ＤＮＡ破断の細胞修復は、その標的座位での塩基の挿入／欠失／変異及び突然変異をもたらし得て、その遺伝子座の不活性化をもたらすことも多い。
この３成分システムは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを一緒に融合して、キメラ一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ又は単にｇＲＮＡと略される）を創出することによって簡素化されている。ｓｇＲＮＡの標的配列とのハイブリダイゼーションが、ＰＡＭ部位の隣接／上流での標的ＤＮＡの切断をもたらす。故に、ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ成分（標的配列を決定する）とｔｒａｃｒＲＮＡ成分（エンドヌクレアーゼを動員する）を含んでなるとみなすことができる。従って、本明細書に記載のような使用のためのベクターは、同一のｔｒａｃｒＲＮＡ成分をそれぞれ有する、複数のｓｇＲＮＡをコードし得る。
【００７３】
ＳａＣａｓ９によって認識される、ｓｇＲＮＡ由来のｔｒａｃｒＲＮＡ成分の例は、以下の配列：
ＧＴＴＴＴＡＧＴＡＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＴＧＴＴＴＡＴＣＴＣＧＴＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＧＣＧＡＧＡＴＴＴＴＴ
を有して、以下の実施例に記載のベクターにおいて使用される。
【００７４】
本発明の文脈において有用なＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの大多数で、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質である。例としては、黄色ブドウ球菌（ＳａＣａｓ９）、化膿連鎖球菌（ＳｐＣａｓ９）、髄膜炎菌（ＮＭ  Ｃａｓ９）、サーモフィルス菌（ＳＴ  Ｃａｓ９）、トレポネーマ・デンティコラ（ＴＤ  Ｃａｓ９）、又はＳｐＣａｓ９のＤ１１３５Ｅ、ＶＲＥＲ、ＥＱＲ、又はＶＱＲ変異体のような変異体が挙げられる。
【００７５】
これらの酵素によって認識されるＰＡＭ配列は、以下の通りである：
【００７６】
【表１】
2021526839.tif 000002
【００７７】
比較的小さなサイズであるため、ＳａＣａｓ９とその変異体は、ＡＡＶゲノムの制限されたコード能に照らして、好ましい場合がある。例えば、Ran et al., Nature 520, 186-191 (2015)、及びその中で引用された参考文献を参照のこと。
【００７８】
ある種のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ｔｒａｃｒＲＮＡを機能に必要としない場合がある。例えば、Ｃｐｆ１は、クラス２ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの１本鎖ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであって、Ｃａｓ９とは異なる特徴を有するロバストＤＮＡ干渉に媒介すると報告されており、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせず、ＴリッチＰＡＭ配列を認識する。それは、ねじれ型（staggered）２本鎖破断を介してＤＮＡを切断する。Zetsche et al., Cell, Volume 163(3), p759-771, 2015年10月22日（最初にオンラインで公表されたのは2015年9月25日）を参照のこと。
【００７９】
本明細書において、「ガイドＲＮＡ」という用語は、ｃｒＲＮＡとｓｇＲＮＡを包含するように使用される。典型的には、本発明のベクターは、関連する標的部位へ指向されるｓｇＲＮＡをコードする。しかしながら、エンドヌクレアーゼが機能するのに必要とするならば、ｔｒａｃｒＲＮＡも提供される限りにおいて、ｃｒＲＮＡを利用するベクターも使用してよい。必要とされる場合、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡと同じベクターか又はエンドヌクレアーゼと同じベクターによって適宜コードされ得る。
【００８０】
ＣＲＩＳＰＲシステムのタンパク質成分は、エンドヌクレアーゼとして表され、適正なＲＮＡ因子と結合する場合に、酵素活性（即ちＤＮＡニッカーゼ活性）を有し得る。このような態様において、エンドヌクレアーゼは、染色体のＤＮＡを関連する標的部位で切断するものである。
【００８１】
触媒的に活性のあるエンドヌクレアーゼを使用する場合、ガイドＲＮＡによって認識される標的配列は、切断によって遺伝子の不活性化が生じる場合は、その遺伝子のどの部分にあってもよい。ある態様では、標的配列が遺伝子の転写部分に位置していて、場合によってはコーディング配列の内部にあることが望ましい場合がある。
【００８２】
アクアポリン遺伝子、特にＡＱＰ１の場合、標的配列（又は２つのガイドＲＮＡを利用する場合は、両方の標的配列）は、第１エクソン配列内に位置することが望ましい場合がある。
【００８３】
本明細書に記載されるいくつかのアプローチでは２つの異なるガイドＲＮＡを利用し、単一細胞へ送達され、同じ遺伝子内の異なる標的配列をそれぞれ指向する。このことは、関連遺伝子の一部の欠失を引き起こすことによる遺伝子不活性化の効率を高める場合がある。そのような場合、両方の標的配列は、同じ遺伝子の転写部分に位置しており、場合により同じ遺伝子のコーディング配列内にともに位置してもよい。
【００８４】
ガイドＲＮＡによって特定される切断部位は、好適な距離、例えば１ｋｂより長く、１ｋｂ以下、５００ｂｐ以下、又は２５０ｂｐ以下、例えば５０ｂｐ〜２５０ｂｐ離れていてもよい。それらは、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも２５ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ離れていてもよい。
【００８５】
しかしながら、エンドヌクレアーゼタンパク質は、酵素的に活性である必要はない。触媒的に不活性（又は「活性でない」）エンドヌクレアーゼタンパク質も、ガイドＲＮＡの標的となるプロトスペーサー部位で結合する能力を保有するため、本発明の文脈では使用することができる。結合すると、触媒的に活性でないエンドヌクレアーゼは、転写の開始（例えばプロトスペーサー部位が遺伝子のプロモーター内にある場合）又は伸張（それがエクソン又はイントロン内部にある場合）を立体的に阻害する場合がある。あるいは、触媒的に活性でないエンドヌクレアーゼは、標的遺伝子の発現を阻害するために、転写抑制ドメインへ融合させてもよい。そのような抑制ドメインは、ＤＮＡメチル化又は異質染色質化、又はヒストン脱アセチル化を含めた様々な機序を介して転写の抑制又はサイレンシングを引き起こす場合がある。関連する機序に依拠して、エンドヌクレアーゼ−リプレッサー融合体は、転写領域（エクソン配列とイントロン配列が含まれる）、並びにプロモーター、及び転写エンハンサーなどの他の転写因子結合部位を含めた調節配列を含めた、関連遺伝子の異なる部分へ（適正なガイドＲＮＡの設計によって）標的指向し得る。例としては、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン（例えばＫｏｘ１タンパク質由来）、ＨＰ１αタンパク質のＣＳ（クロモシャドウ）ドメイン、Ｈｅｓ１タンパク質のＷＲＰＷドメイン、ＭＸＩ１（Ｍａｘ相互作用タンパク質）、ｍＳｉｎ３相互作用ドメイン、及びヒストン脱メチル化酵素ＬＳＤ１（エンハンサー領域へ標的指向し得る、Ｌｙｓ特異的ヒストン脱メチル化酵素１）が挙げられる。
【００８６】
エンドヌクレアーゼ−リプレッサー融合体は、複数の抑制ドメインを含み得る。例えばそれは、同じ抑制ドメインの複数コピー、例えば、同じ抑制ドメインの２、３、４、又は５個の連続した反復配列を含み得る。例えば、４個の連結したｍＳｉｎ３相互作用ドメインの配列は、ＳＩＤ４Ｘと表記される。
【００８７】
転写抑制ドメイン、及び触媒的に活性でないエンドヌクレアーゼとのそれらの使用のさらなる詳細については、例えば、Gilbert et al., Cell 154, 442-451 (2013)；Dominguez et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology 17, 5-15, (2016)、及びそれらの中で引用された参考文献を参照のこと。
【００８８】
故に、「エンドヌクレアーゼ」という用語は、文脈が他に求めなければ、触媒的に活性のあるタンパク質と触媒的に活性のないタンパク質の両方を包含するように使用される。触媒的に活性のないエンドヌクレアーゼは、接頭辞の「ｄ」によって、例えばｄＣａｓ、ｄＣａｓ９、又はｄＣｐｆ１と示される場合がある。遺伝子発現を阻害するための触媒的に活性のないエンドヌクレアーゼの使用は（抑制ドメインと一緒であるかどうかに関わりなく）、ＣＲＩＳＰＲ干渉又は「ＣＲＩＳＰＲｉ」としばしば表される。
【００８９】
エンドヌクレアーゼは、配列ＰＫＫＫＲＫＶを有する、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳのような、哺乳動物細胞において有効な核局在化配列（ＮＬＳ）を含み得る。当業者には、多くの他の哺乳動物ＮＬＳ配列が公知である。エンドヌクレアーゼは、複数コピーのＮＬＳ、例えば２又は３コピーのＮＬＳを含み得る。複数ＮＬＳ配列が存在する場合、それらは、典型的には同じＮＬＳの反復配列である。
【００９０】
典型的には、ＡＡＶベクターゲノム内では、システムのエンドヌクレアーゼ成分をコードする遺伝子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、例えばウイルス又はヒトのＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの転写制御下にある。例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）若しくはＳＶ４０のプロモーター、又は哺乳動物の「ハウスキーピング」プロモーターが挙げられる。ＲＮＡ成分（ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、又はｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする遺伝子は、典型的にはＵ６又はＨ１プロモーターのようなＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えばヒトＲＮＡポリメラーゼＵＩＩプロモーター）、又は亢進された活性を保持するか又は有するその変異体の転写制御下にある。
【００９１】
ある状況では、上記で考察したように、主として、ＡＡＶベクターが担い得るゲノムの比較的制限されたサイズによって課される制約のために、異なるペイロードを担う複数のベクタービリオンを利用することが有益であり得る。
【００９２】
例えば、同じ遺伝子内の異なる標的配列をそれぞれ指向する２つの異なるガイドＲＮＡを単一細胞へ送達することは、関連する遺伝子の一部の欠失を引き起こすことによる遺伝子不活性化の効率を高める場合がある。しかしながら、サイズ制約のために、単一のベクターゲノムでは、エンドヌクレアーゼと複数のガイドＲＮＡをコードすることが可能でない場合がある。１つの可能な解決法は、エンドヌクレアーゼと１つのガイドＲＮＡをそれぞれコードする２個のベクタービリオンを利用することを包含する。別の解決法は、エンドヌクレアーゼをコードする１つのビリオンと２個（以上）のガイドＲＮＡコードするもう１つのビリオンを利用することを包含する。それぞれのビリオンが単独で完全なＣＲＩＳＰＲ装置を担い、標的遺伝子の発現を下方制御することが可能になるはずであるため、第１の選択肢（エンドヌクレアーゼと１つのガイドＲＮＡをそれぞれコードする２個のベクタービリオン）の方がより魅力的であり得る。エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡを異なるベクターへ分離するこの「スプリット」アプローチは、それぞれのタイプの１つのベクターによって形質導入されて下方制御を達成する細胞に依拠する。唯１個のビリオン単独での形質導入では、効果が無いであろう。
【００９３】
あるいは、大きなエンドヌクレアーゼの使用には、エンドヌクレアーゼが１つのベクターにコードされ、ガイドＲＮＡ（又は複数のガイドＲＮＡ）が別のベクターにコードされることが必要になり得る。例えば、エンドヌクレアーゼが転写抑制ドメインを含むＣＲＩＰＳＲｉアプローチを利用する場合、ＡＡＶベクターゲノムには、ガイドＲＮＡもコードする十分な能力がなく、ガイドＲＮＡをコードするさらなるベクターの使用が必要になるかもしれない。
【００９４】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損性のパルボウイルスであって、その１本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチドの末端逆位配列（ＩＴＲ）を含めて約４．７ｋｂの長さである。ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Srivastava el al., J Virol, 45: 555-564 (1983)に提示され、Ruffing el al., J Gen Virol, 75: 3385-3392 (1994)によって訂正されている。ＩＴＲ内には、ウイルスのＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体組込みを指向するシス作用性の配列が含まれる。３個のＡＡＶプロモーター（その相対的なマップ位置により、ｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と命名される）が、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーデングフレームの発現を推進する。２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）は、単一のＡＡＶイントロンの（ヌクレオチド２１０７及びヌクレオチド２２２７での）選択的スプライシングと共役して、ｒｅｐ遺伝子から４種のｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。Ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を保有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターより発現され、３種のカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位が、この３種の関連カプシドタンパク質の産生に関与する。ＶＰ２及びＶＰ３は、ＶＰ１タンパク質が徐々に短くなったバージョンであり、同一のＣ末端を有するが、ＶＰ１のＮ末端由来の配列を徐々に長く欠失している。
【００９５】
ＡＡＶ複製、ゲノムのカプシド形成、及び組込みを指向するシグナルは、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるため、ゲノムの内部配列（複製及び構造カプシドタンパク質ｒｅｐ−ｃａｐをコードする）の一部又は全部を発現カセットのような外来ＤＮＡに置換して、ｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質をトランスで提供することができる。本明細書では、ＡＡＶベクターゲノムのＩＴＲ間に位置する配列を「ペイロード」と表す。
【００９６】
特定のＡＡＶ粒子の実際の収容能は、利用するウイルスタンパク質に依って変動し得る。典型的には、ベクターゲノム（ＩＴＲが含まれる）は、約０．７ｋｂ〜約５ｋｂ、例えば約５ｋｂ以下、例えば約４．９ｋｂ以下、約４．８ｋｂ以下、又は約４．７ｋｂ以下である。
【００９７】
野生型のＡＡＶ  ＩＴＲは、それぞれ典型的には、長さ１４５塩基であるが、より短い配列も機能的であり得る。例えば、以下の実施例に記載されるベクターは、野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲと機能的に同等である１３０塩基の配列を利用する。従って、ペイロードは、典型的には、長さ約４．７ｋｂ以下、約４．６ｋｂ以下、約４．５ｋｂ以下、又は約４．４ｋｂ以下である。好ましくは長さ４．４ｋｂ以下である。
【００９８】
故に、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、最大約４．７ｋｂ、約４．６ｋｂ、約４．５ｋｂ、又は約４．４ｋｂのユニークなペイロード配列を含有し得る。
標的細胞の感染後、ベクターからのタンパク質発現及び複製には、相補的ＤＮＡ鎖を合成して２本鎖ゲノムを形成することが必要である。この第２鎖の合成は、導入遺伝子の発現における律速工程を代表する。
【００９９】
第２鎖合成の必要性は、いわゆる「自己相補的ＡＡＶ」（ｓｃＡＡＶ）ベクターを使用することによって回避することができる。ここでは、ペイロードが２コピーの同じ導入遺伝子ペイロードを互いに反対の配向で含有する。即ち、第１のペイロード配列にその配列の逆相補体が続く。これらのｓｃＡＡＶゲノムは、相補的ペイロード配列が互いに分子内でハイブリダイズするヘアピン構造、又は２個のゲノム分子が互いにハイブリダイズした２本鎖複合体のいずれかを採用可能である。そのようなｓｃＡＡＶからの導入遺伝子発現は、慣用のｒＡＡＶよりずっと効率的であるが、ベクターゲノムの有効なペイロード収容能は、ペイロード配列の２つの相補的コピーを担うゲノムの必要性の故に半分になる。
【０１００】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子は、典型的には大きすぎてｓｃＡＡＶベクターに収容されないが、ｓｃＡＡＶベクターには、ガイドＲＮＡ配列（及び、必要であればｔｒａｃｒＲＮＡ）を担うことに用途を見出す場合があり、エンドヌクレアーゼは、別のベクターよりトランスで提供される。
【０１０１】
ｓｃＡＡＶベクターゲノムには、ＩＴＲ配列の１つに１以上の突然変異を含有することで１つの末端反復配列での分解を阻害し、結果としてｓｃＡＡＶ産生の収率を高める場合がある。従って、ｓｃＡＡＶ内のＩＴＲの１つを末端分解部位のために欠失させても、不活性化突然変異を末端分解部位に含有してもよい。例えば、Wang et al., Gene Therapy (2003) 10, 2105-2111及びMcCarty et al., Gene Therapy (2003) 10, 2112-2118を参照のこと。故に、ＡＡＶゲノムの両端にある２つのＩＴＲ配列は、同一である必要はないことが明らかであろう。
【０１０２】
ｓｃＡＡＶについては、McCarty, Molecular Therapy, 16(10), 2008, 1648-1656に概説されている。
本明細書において、「ｒＡＡＶベクター」という用語は、一般に、１コピーの所与のペイロード配列のみを有するベクターを表すために使用され（即ち、ｒＡＡＶベクターはｓｃＡＡＶベクターではない）、「ＡＡＶベクター」という用語は、ｒＡＡＶベクター及びｓｃＡＡＶベクターの両方を包含するために使用される。
【０１０３】
ＡＡＶベクターゲノム内のＡＡＶ配列（例えばＩＴＲ）は、限定されるものではないが、ＡＡＶ血清型のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶ  ＰＨＰ．Ｂを含めた組換えウイルスを導くことができるどのＡＡＶ血清型に由来してもよい。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は当該技術分野において公知である。例えば、ＡＡＶ１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＣ＿００２０７７に提供され；ＡＡＶ２の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＣ＿００１４０１及び Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983)に提供され；ＡＡＶ３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＣ＿１８２９に提供され；ＡＡＶ４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＣ＿００１８２９に提供され；ＡＡＶ５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦ０８５７１６に提供され；ＡＡＶ６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＣ＿００１８６２に提供され；ＡＡＶ７ゲノム及びＡＡＶ８ゲノムの少なくとも一部は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９にそれぞれ提供され；ＡＡＶ９ゲノムは、Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)に提供され；ＡＡＶ１０ゲノムは、Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006)に提供され；ＡＡＶ１１ゲノムは、Virology, 330(2) :375-383 (2004)に提供され；ＡＡＶ  ＰＨＰ．Ｂは、Deverman et al., Nature Biotech. 34(2), 204-209に記載され、その配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＵ０５６４７３．１で寄託されている。
【０１０４】
ＩＴＲ配列は、いかなる好適なＡＡＶ型に由来してもよい。例えば、それらは、ＡＡＶ２に由来しても、その機能的同等物であってもよい。以下の実施例に記載されるｓｃＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲに対して機能的に同等であって、以下の配列：
ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ
及び
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧ
を有するＩＴＲを含有する。
【０１０５】
ＡＡＶベクターは、第１の血清型（「Ａ」）由来のゲノムＩＴＲ及び第２の血清型（「Ｂ」）由来のタンパク質を有し得る。そのようなベクターは、「ＡＡＶ  Ａ／Ｂ」型と表す場合がある。しかしながら、ウイルスタンパク質がビリオン粒子の血清学的特性を主に決定するため、そのようなベクターは、依然として血清型Ｂのものであると表す場合がある。従って、本実施例に記載されるベクターは２型／ＳｈＨ１０のものであるが、一般的には、そのカプシドタンパク質の故に、血清型ＳｈＨ１０のものであるとみなされる。
【０１０６】
本発明のベクターゲノムを含んでなるビリオン粒子は、典型的には、ウイルスゲノムの複製、ウイルスタンパク質（例えばｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質）の発現、及びビリオン粒子の組み立てが可能なパッケージング細胞において産生される。パッケージング細胞は、例えばアデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、又はヘルペスウイルス由来のヘルパーウイルス機能を必要とする場合もある。当該技術分野では、パッケージング細胞においてＡＡＶベクター粒子を産生する技術は標準技術である。例えばＷＯ０１／８３６９２号には、偽型ＡＡＶの産生について開示されている。様々な態様では、ＡＡＶカプシドタンパク質を修飾して組換えベクターの送達を高めることができる。当該技術分野では、カプシドタンパク質に対する修飾が一般的に公知である。例えばＵＳ２００５／００５３９２２号及びＵＳ２００９／０２０２４９０号を参照のこと。
【０１０７】
パッケージング細胞を産生する１つの方法は、ＡＡＶ粒子産生に必要な成分をすべて安定的に発現する細胞株を創出することである。例えば、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子とｃａｐ遺伝子を欠いたＡＡＶゲノム、ＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶのｒｅｐ遺伝子とｃａｐ遺伝子、及びネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能マーカーを含んでなる１つのプラスミド（又は複数のプラスミド）を細胞のゲノムへ組み込む。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73）、又は直接的な平滑末端ライゲーション（Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666）のような手順によって、細菌プラスミドへ導入されている。次いで、パッケージング細胞株にアデノウイルスのようなヘルパーウイルスを感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能で、ＡＡＶの大量産生に適していることである。他の好適な方法の例では、プラスミドではなくアデノウイルス又はバキュロウイルスを利用して、ＡＡＶゲノム及び／又はｒｅｐ遺伝子とｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞のへ導入する。
【０１０８】
あるいは、ＡＡＶゲノム、ＡＡＶタンパク質、及び必要とされるヘルパーウイルス機能をコードする１以上のプラスミドで好適な細胞を単に形質転換させることによって、パッケージング細胞を産生することができる。いわゆる「３重トランスフェクション」法では、これら遺伝子セットの１つをそれぞれ担う３種のプラスミドを利用する。Grieger et al., Nature Protocols 1(3), 1412-128 (2006)、及びその中で引用された参考文献を参照のこと。
【０１０９】
ＡＡＶ産生の一般的な原理については、例えば、Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539；及びMuzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial, and Immunol., 158: 97-129に概説されている。様々なアプローチが、Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4: 2072 (1984)；Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6466 (1984)；Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3251 (1985)；McLaughlin et al., J. Virol., 62: 1963 (1988)；及びLebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7: 349 (1988)；Samulski et al. (1989, J. Virol., 63: 3822-3828)；米国特許第５，１７３，４１４号；ＷＯ９５／１３３６５号と対応の米国特許第５，６５８．７７６号；ＷＯ９５／１３３９２号；ＷＯ９６／１７９４７号；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００号；ＷＯ９７／０９４４１号（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３号）；ＷＯ９７／０８２９８号（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２号）；ＷＯ９７／２１８２５号（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７号）；ＷＯ９７／０６２４３号（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４号）；ＷＯ９９／１１７６４号；Perrin et al. (1995) Vaccine 13: 1244-1250；Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4: 609-615；Clark et al. (1996）Gene Therapy 3: 1124-1132；米国特許第５，７８６，２１１号；米国特許第５，８７１，９８２号；及び米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。
【０１１０】
ｓｃＡＡＶ産生の技術については、Grieger et al., Molecular Therapy  24(2), 287-297, 2016に記載されている。
このように、本発明は、本明細書に記載される個々の感染性ＡＡＶビリオン粒子を産生可能なパッケージング細胞を提供する。パッケージング細胞は、典型的には、哺乳動物細胞、例えば霊長動物細胞、例えばヒト細胞のような真核細胞である。典型的には、それは細胞株である。１つの態様では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞（ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞）、及びＰｅｒＣ．６細胞（同族の２９３株）のような安定的に形質転換された癌細胞であり得る。別の態様では、パッケージング細胞は、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換したヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ−５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ−３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、及びＦＲｈＬ−２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）のように、形質転換された癌細胞ではない細胞である。
【０１１１】
ＳｈＨ１０血清型
本発明のＡＡＶビリオン粒子は、Klimcsak et al., (2009), A Novel Adeno-Associated Viral Variant for Efficient and Selective intravitreal Transduction of Rat Muler Cells［ラットミュラー細胞の効率的及び選択的な硝子体内形質導入のための新規アデノ随伴ウイルス変異体］．PloS ONE 4(10): e7467（doi: 10. 1371/journal.pone.0007467）に記載のようなＳｈＨ１０血清型である。この血清型は、毛様体及び脈絡叢の効率的で特異的な形質導入を提供することが見出されている。
【０１１２】
ＡＡＶベクタービリオンにおける血清型の主たる決定因子は、カプシドタンパク質である。ＳｈＨ１０カプシドタンパク質ＶＰ１の公表配列は下記の通りであり、本明細書では、「ネイティブ」ＳｈＨ１０ＶＰ１配列と表す：
ＶＰ１：
【０１１３】
【化１】
2021526839.tif 000003
【０１１４】
この配列は、残基：Ｖ３１９（ＡＡＶ６ではＩ）、Ｄ４５１（ＡＡＶ６ではＮ）、Ｎ５３２（ＡＡＶ６ではＤ）、及びＮ６４２（ＡＡＶ６ではＨ）以外は、ＡＡＶ６のＶＰ１カプシドタンパク質と同一である。
【０１１５】
ＡＡＶ６（Rutledge et al., J. Virol., 72(1), 309-319, 1998）との類推によって、ＶＰ２及びＶＰ３のネイティブ配列は以下の通りであると考えられる：
ＶＰ２：
【０１１６】
【化２】
2021526839.tif 000004
【０１１７】
ＶＰ３：
【０１１８】
【化３】
2021526839.tif 000005
【０１１９】
従って、本発明のＡＡＶビリオンは、典型的には、上記ネイティブＶＰ１配列を有するか又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＰ１カプシドタンパク質を含む。ＶＰ１カプシドタンパク質は、ネイティブ配列に対して少なくとも９０％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し得る。典型的には、ＶＰ２カプシドタンパク質は、残基：Ｖ３１９、Ｄ４５１、Ｎ５３２、及びＮ６４２のうち１、２、３、又は４個すべてを含有することが望ましく、これら残基の４個すべてを含有することが好ましいであろう。
【０１２０】
追加的又は代替的に、本発明のＡＡＶビリオンは、典型的には、上記ネイティブＶＰ２配列を有するか又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＰ２カプシドタンパク質を含む。ＶＰ２カプシドタンパク質は、ネイティブ配列に対して少なくとも９０％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し得る。典型的には、ＶＰ２カプシドタンパク質は、残基Ｖ：１８２、Ｄ３１４、Ｎ３９５、及びＮ５０５のうち１、２、３、又は４個すべてを含有することが望ましく、これら残基の４個すべてを含有することが好ましいであろう。
【０１２１】
追加的又は代替的に、本発明のＡＡＶビリオンは、典型的には、上記ネイティブＶＰ３配列を有するか又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有するＶＰ３カプシドタンパク質を含む。ＶＰ３カプシドタンパク質は、ネイティブ配列に対して少なくとも９０％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し得る。典型的には、ＶＰ３カプシドタンパク質は、残基：Ｖ１１７、Ｄ２４９、Ｎ３３０、及びＮ４４０のうち１、２、３、又は４個すべてを含有することが望ましく、これら残基の４個すべてを含有することが好ましいであろう。
【０１２２】
典型的には、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のタンパク質の全３種は、それぞれのネイティブ配列に対して少なくとも９０％の同一性、例えば、ネイティブ配列に対して少なくとも９０％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する。
【０１２３】
追加的又は代替的に、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のタンパク質の全３種は、残基：Ｖ１１７、Ｄ２４９、Ｎ３３０、及びＮ４４０（ＶＰ１配列のように番号付け）のうち１、２、３、又は４個すべてを含有し、好ましくはこれら残基の４個すべてを含有し得る。
【０１２４】
上記に提示される候補配列と参照配列の間のアミノ酸配列同一性％は、両配列を並置させて必要であればギャップを導入し、保守的置換を配列同一性の一部として考慮せずに、最適アライメントを達成した後で、参照配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。同一性（％）値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Altschul et al., Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996)）によって決定し得る。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、そのほとんどがデフォルト値へ設定される、いくつかの検索パラメータを使用する。調整可能パラメータは以下の数値で設定される：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１。アミノ酸配列同一性（％）の値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって決定されるような一致する同一残基数を、参照配列の全残基数（アライメントスコアを最大化するためにＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって参照配列へ導入されるギャップは無視する）で割り、１００を掛けることによって決定される。
【０１２５】
保存的置換は、アミノ酸クラス内での置換及び／又はＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスにおいて陽性スコアとなる置換として定義され得る。
ある分類によれば、アミノ酸クラスは、酸性、塩基性、非荷電極性、及び非極性であり、酸性アミノ酸はＡｓｐ及びＧｌｕであり；塩基性アミノ酸はＡｒｇ、Ｌｙｓ、及びＨｉｓであり；非荷電極性アミノ酸はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＴｙｒであり；そして非極性アミノ酸はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、及びＣｙｓである。
【０１２６】
別の分類によれば、アミノ酸クラスは、低親水性、酸／酸アミド／親水性、塩基性、低疎水性、及び芳香族性であり、低親水性アミノ酸はＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、及びＧｌｙであり；酸／酸アミド／親水性アミノ酸はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、及びＧｌｎであり；塩基性アミノ酸はＨｉｓ、Ａｒｇ、及びＬｙｓであり；低疎水性アミノ酸はＭｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、及びＶａｌであり；そして芳香族アミノ酸はＰｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐである。
【０１２７】
ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスにおいてスコアが陽性になる置換は以下の通りである：
【０１２８】
【表２】
2021526839.tif 000006
【０１２９】
アクアポリン（ＡＱＰ）
アクアポリンは、水分子が生体膜を通過する輸送を促進する膜内在性タンパク質である。それらは、６個の膜貫通へリックスの束が５つのループ領域に連結し、ループ領域のうち２つは、保存されたアスパラギン−プロリン−アラニン（ＮＰＡ）モチーフを保有して膜の各側にそれぞれ位置している、共通の全体構造を共有する。
【０１３０】
水輸送におけるその役割の故に、それらは、房水及びＣＳＦなどの細胞外液の産生を含めた様々な機能に関与している。ＡＱＰ１ノックアウトマウスは、正常マウスと比較して低下したＩＯＰを示し（Zhang et al., J. Gen. Physiol., 2002, 119: 561-569）、ＡＱＰ４に対するｓｉＲＮＡは、ＩＯＰを低下させるための療法として提唱されている（ＷＯ２００８／０６７３８２号）が、効力は実証されていない。
【０１３１】
哺乳動物は、１３種の異なるアクアポリン遺伝子を保有すると考えられている。ヒト及びマウスのアクアポリン遺伝子の詳細を以下の表１及び表２に示す。
毛様体及び／又は脈絡叢では、少なくともアクアポリンＡＱＰ１、ＡＱＰ２、ＡＱＰ３、ＡＱＰ４、ＡＱＰ５、ＡＱＰ６、ＡＱＰ７、及びＡＱＰ１１を発現すると考えられている。故に、これらのいずれも治療の標的を代表し得る。
【０１３２】
毛様体では、ＡＱＰ１、ＡＱＰ４、及びＡＱＰ５が最も高度に発現するアクアポリンであり、眼の病態への特に良好な標的を代表し得る。
ＡＱＰ１とＡＱＰ４は、脈絡叢でも高度に発現しているため、脳の病態への特に良好な標的になり得る。
【０１３３】
【表３】
2021526839.tif 000007
【０１３４】
【表４】
2021526839.tif 000008
【０１３５】
炭酸脱水酵素（ＣＡＲ）
炭酸脱水酵素は、二酸化炭素及び水の重炭酸イオン及びプロトンへの相互変換を触媒する酵素のファミリーである。アセタゾラミド、メタゾラミド、ドルゾラミド、及びブリンゾラミドのような局所炭酸脱水酵素阻害剤が緑内障の治療に使用されているのは、主に房水の産生に対するそれらの阻害効果の故である。
【０１３６】
酵素の細胞内局在は多様である。それらは、細胞質性（ＣＡＲ１、２、３、７、及び１３）、ミトコンドリア性（ＣＡＲ５ａ及び５ｂ）、分泌性（ＣＡＲ６）、又は膜結合性であり得る（ヒト及びチンパンジー以外の種ではＣＡＲ４、９、１２、１４と、及び１５）。ＣＡＲ８、１０、及び１１の機能は不明なままであり、触媒活性を有さないかもしれない。ＣＡＲ１５は、ヒト及びチンパンジーでは発現していないようである。
【０１３７】
ヒト及びマウスの炭酸脱水酵素遺伝子についての詳細を以下の表３及び表４に示す。毛様体及び／又は脈絡叢では、ＣＡＲ２、ＣＡＲ３、ＣＡＲ４、ＣＲ５ｂ、ＣＡＲ６、ＣＡＲ８、ＣＡＲ９、ＣＡＲ１０、ＣＡＲ１２、及びＣＡＲ１４が発現していると考えられている。マウスの毛様体では、ＣＡＲ１５も発現している。毛様体では、ＣＡＲ２、ＣＡＲ３、及びＣＡＲ１４が最も高度に発現していると考えられているため、良好な標的の代表となる。緑内障において炭酸脱水酵素を低下させるためのｓｉＲＮＡの使用に関わる以前の研究（Jimenez et al., RNAi: A New Strategy for Treating Ocular Hypertension Silencing Carbonic Anhydrases［炭酸脱水酵素を沈静化することによって高眼圧を治療するための新たな戦略］ARVO Abnr 405, 2006）では、ＣＡＲ２、ＣＡＲ４、及びＣＡＲ１２に対するｓｉＲＮＡがウサギにおいてＩＯＰを低下させると報告されている。従って、ＣＡＲ４及びＣＡＲ１２も、良好な標的の代表になり得る。
【０１３８】
脈絡叢では、ＣＡＲ２、ＣＡＲ４、及びＣＡＲ１２が最も高度に発現していると考えられている。
【０１３９】
【表５】
2021526839.tif 000009
【０１４０】
【表６】
2021526839.tif 000010
【０１４１】
緑内障
緑内障は、視神経に傷害が生じる、眼に悪影響を及ぼす病態であって、失明につながる可能性がある。
【０１４２】
緑内障は、原発性又は続発性であり得る（続発性緑内障では、ＩＯＰの上昇が別の病態又は損傷の結果として生じる）。
原発性緑内障のサブタイプには、開放角緑内障（最も一般的なタイプ）、閉塞隅角緑内障、及び正常眼圧緑内障（ＮＴＧ、低眼圧緑内障又は正常圧緑内障としても知られている）が含まれる。
【０１４３】
続発性緑内障は、例えば、眼損傷、炎症（例えばブドウ膜炎）、白内障、糖尿病（糖尿病性網膜症）、網膜中心静脈閉塞、血管新生（例えば新生血管緑内障をもたらす虹彩の血管新生）、及び腫瘍のように眼への血流を制限する病態より生じ得る。
【０１４４】
いずれの場合でも、視神経への傷害の主因は、眼圧（ＩＯＰ）である。眼圧（ＩＯＰ）の低下は、視神経への継続的な傷害を止めることによって、進行及び失明を概ね予防する。このことは、ＩＯＰが正常範囲内にある、正常眼圧緑内障にも当てはまる（Anderson DR; Normal Tension Glaucoma Study. Collaborative normal tension glaucoma study.［正常眼圧緑内障研究：正常眼圧緑内障についての共同研究］Curr. Opin. Ophthalmol. 2003 Apr; 14(2): 86-90）。
【０１４５】
現在、ＩＯＰを低下させるための治療アプローチの大多数は、例えば線維柱帯網又はシュレム管を介した、房水の眼からの漏出（又は流出）を改善させることが中心である。毛様体による房水産生を低下させることが比較的無視されてきたのは、おそらく好適なアプローチがまだ同定されていないためであろう。しかしながら、本発明の材料及び方法は、房水産生を阻害するための簡便で直截的な手段を提供する。ＩＯＰを低下させること又はその増加を阻害することより、すべてのタイプの緑内障が恩恵を受ける可能性があるため、本明細書に記載されるベクター及び方法は、（限定されるものではないが）上記の緑内障を含めた多様な緑内障の治療に使用するための可能性を有すると考えられる。
【０１４６】
本明細書に記載される材料及び方法は、新生血管緑内障、網膜中心静脈閉塞、眼虚血症候群、及び慢性網膜剥離のような、虹彩ルべオーシス（虹彩血管新生）を引き起こす病態にも有益であり得る。それらは、「盲目の痛みを伴う眼」を引き起こす病態にも使用を見出すかもしれない。
【０１４７】
ＣＳＦ産生及び頭蓋内圧に関連した病態
脳脊髄液（ＣＳＦ）は、毛様体と生理学的に酷似している脈絡叢によって産生される。結果として、本明細書に記載されるベクター及び方法は、ＣＳＦ産生を阻害すれば病理又は症状が改善される病態を治療するために使用することができる。
【０１４８】
水頭症は、脳内に脳脊髄液（ＣＳＦ）が蓄積する病態であり、典型的には、必ずではないが、頭蓋内圧の上昇をもたらす。水頭症は、「交通性」（髄液循環への再吸収又は漏出における欠陥によって引き起こされる）又は「非交通性」（脳内のＣＳＦ流における欠陥によって引き起こされる）として分類することができ、いずれも先天性又は後天性であり得る。
【０１４９】
後天性水頭症は、髄膜炎、脳腫瘍、及び神経系障害を含めた広範囲の病態によって引き起こされ得る。
正常圧水頭症は、ＣＳＦ圧が正常境界内にあるか又はごく間欠的に上昇する、交通性水頭症の特定の形態である。
【０１５０】
現行の治療法には経口医薬品が含まれるが、現行の薬剤は受容し難い多くの副作用を示し、その使用を制限する。脳室と腹部の間にシャントを導入することによる外科的介入も可能であるが、そのような手技は、失敗及び合併症の比率が高い（ある研究では、５歳以上の小児で最大４８％、成人で２７％）。
【０１５１】
病態の根本原因に拘らず、ＣＳＦ産生を阻害することは、頭蓋内圧を低下させることに役立ち、それ故に療法上の利益を提供するはずである。
ＣＳＦ産生を阻害することから恩恵を受ける可能性がある他の関連病態には、良性頭蓋内亢進症（ＢＩＨ）又は偽性脳腫瘍（ＰＴＣ）としても知られる特発性頭蓋内圧亢進症（ＩＩＨ）が含まれる。ＩＩＨの患者は、頭痛、悪心、嘔吐、及び耳鳴りを示す。治療しないでおくと、この病態は、視神経円板の腫脹から失明を引き起こす可能性がある。
【０１５２】
医薬組成物及び投与経路
本明細書に記載の核酸、ビリオン等は、医薬組成物に製剤化することができる。
投与は、末梢性、例えば静脈内、皮膚、若しくは皮下、経鼻、筋肉内、又は腹腔内であり得る。しかしながら、典型的には、緑内障を治療するための投与は、硝子体内又は前房内の注射によるものであり、水頭症を治療するための投与は、例えば髄腔内注射又は頭蓋内への注射若しくは注入、例えば脳室内への注射又は注入による、中枢性、即ち、中枢神経系（ＣＮＳ）への直接投与であろう。
【０１５３】
医薬組成物は、上記の物質の１つに加えて、医薬的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定化剤、又は当業者に周知の他の材料を含み得る。そのような材料は、無害であるべきで、有効成分の効力に干渉してはならない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路に依拠する場合がある。
【０１５４】
静脈内、皮膚、又は皮下注射の場合、有効成分は、発熱物質を含まず、好適なｐＨ、等張性、及び安定性を有する、非経口的に許容される水溶液剤の形態であろう。当業者は、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液のような等張性のビヒクルを使用して、好適な溶液剤を調製することが十分可能である。保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤、及び／又は他の添加剤を必要に応じて含めてよい。
【０１５５】
ＣＮＳへ直接投与するための組成物は、典型的には、保存剤や他の賦形剤を欠いた最小限の組成物であって、投与時に特別に調製され得る。
投与は、好ましくは、「予防有効量」又は「治療有効量」（場合に応じて）でなされ、これは、その個体が恩恵を示すのに十分な量である。投与される実際量と投与の速度及び時間経過は、個々の被験者とその病態の本質及び重篤度に依拠し得る。治療薬の処方、例えば投与量の決定等は、医療従事者と他の医師の責任の範囲内にあり、典型的には治療すべき障害、個々の患者の病態、送達部位、投与方法、及び医療従事者に公知の他の因子が考慮される。
【０１５６】
上記した技術及びプロトコールの例については、「レミントン製薬科学（Remington’s Pharmaceutical Sciences）」第２０版（2000）、出版元：リッピンコット、ウィリアム＆ウィルキンス（Lippincott, Williams & Wilkins）に見出すことができる。
【実施例】
【０１５７】
材料及び方法：
ＤＮＡクローニング
ｓｇＲＮＡガイドを挿入するためのアクセプター部位を有するＡＡＶ−ＳａＣａｓ９をコードするプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅ（https://www.addgene.org/61591）より購入した。Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ法を使用して合成オリゴヌクレオチド（シグマ、英国）を挿入し、様々なＲＮＡガイドを創出した。Ｍａｘｉ  Ｐｒｅｐプラスミドキット（キアゲン、英国）を使用して、プラスミドを増やした。
【０１５８】
【表７】
2021526839.tif 000011
【０１５９】
細胞培養
自然に形質転換されるマウスのＲＰＥ（網膜色素上皮）細胞株Ｂ６−ＲＰＥ０７１及びヒト  ミュラー細胞株（ＵＣＬＢ、英国ロンドン）を、１０％熱不活化胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）、２ミリモル／Ｌ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（いずれもＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オーストリア、パッシングより購入）を含有するＤＭＥＭ培地において、５％ＣＯ２雰囲気にて３７℃で培養した。
【０１６０】
マウス飼育
すべてのｉｎ  ｖｉｖｏ実験において、６〜８週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを使用した。マウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより入手し、英国内務省からの許可の下にブリストル大学で維持した。１５０μｌのケタミン／Ｒｏｍｐｕｎ混合物の腹腔内注射により麻酔した後、Ｍｉｃｒｏｎ  ＩＶプラットフォーム（Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｓ、米国）での基底部造影又はＴｏｎｏｌａｂ反跳式眼圧計による測定（ｉＣａｒｅ、フィンランド）のようなｉｎ  ｖｉｖｏ手技を実施した。
【０１６１】
マウス及びヒトのｓｇＲＮＡの設計
Ｅｎｓｅｍｂｌ（https://www.ensembl.org）より出力したマウスＡｑｐ１  ｃＤＮＡ配列をＢｅｎｃｈｌｉｎｇ（https://benchling.com）に読み込んだ。各標的についてコンピュータで予測されるオフターゲット部位に基づいて、最適なｓｇＲＮＡのいくつかを選択し、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙプロトコル（ニュー・イングランド・バイオラボ）を使用して、プラスミドへクローニングした。簡潔に言えば、Ｔ４  ＰＮＫ酵素とＴ４リガーゼバッファー（ニュー・イングランド・バイオラボ）を使用して、選択したｓｇＲＮＡをアニーリングさせてＤＮＡ断片のピースにした後、Ｔ７リガーゼ酵素とＴ７リガーゼバッファー（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）をＢｓａｌ−ＨＦ酵素（ニュー・イングランド・バイオラボ）とともに使用して、ＳａＣａｓ９−ＡＡＶプラスミドへ挿入した。次に、クローニングしたプラスミドをコンピテント大腸菌（インビトロジェン）へ形質転換して溶原培地（ＬＢ）にて培養し、さらなる実験のために多量のプラスミドを産生した。製造業者のプロトコールに従って、プラスミド・ミニプレップキット（シグマ）又はマキシプレップキット（キアゲン）によってプラスミドＤＮＡを抽出した。すべてのクローン化プラスミドＤＮＡについて配列決定し（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、ｓｇＲＮＡが成功裡に挿入されたことを確認した。
【０１６２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏプラスミドトランスフェクション
マウスＲＰＥ細胞とヒト  ミュラー細胞を２．５×１０４個／ｃｍ２の濃度で播き、６０〜７０％の細胞集密度に達するまで培養した。トランスフェクション効率を向上させるために、トランスフェクションの当日、培地を半量まで減少させて単純ＤＭＥＭに交換した。各ウェルの細胞に対して、１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ギブコ、英国）中の１〜２μｇのプラスミドＤＮＡを、０．５〜０．７５μｌのリポフェクタミン３０００（インビトロジェン、英国）とともに加えた。細胞を４８時間トランスフェクトした後で次の実験に進んだ。
【０１６３】
アデノ随伴ウイルス及び眼内注射
血清型ＡＡＶ２／１、２／２、２／５、２／６、及び２／８をコードするＡＡＶ−ＣＭＶ−ｅＧＦＰは、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｉｏｌａｂｓ（米国）より購入した。ＳｈＨ１０血清型のベクターはＵＣＬ眼科研究所（ロンドン）にて産生されたものであり、カプシドプラスミドは、米国カリフォルニア州バークレイ大学のＪｏｈｎ  Ｆｌａｎｎｅｒｙの贈与品であり、Ａｄｄｇｅｎｅ（https://www.addgene.org/64867）にて入手可能である。３重プラスミドトランスフェクションによってＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にてＳｈＨ１０ウイルスを産生した後、ＡＶＢミディアムＦＰＬＣカラム（ＧＥライフサイエンス）を使用して精製した。すべてのウイルスを１×１０１３ゲノムコピー／ｍｌの出発濃度に調整し、手術用顕微鏡下で３２ゲージ針とハミルトンシリンジを使用して２μｌの容量で硝子体内注射した。
【０１６４】
免疫組織化学
頸椎脱臼による安楽死の後、眼を取り出して、冷４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で３０分間固定し、次いでｏｐｔｉｍａｌ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ（サーモ・サイエンティフィック、英国）に入れて凍結切片を作製し（ライカ、Ｍ３０５０Ｓ）、１２μｍ厚の各眼の広域断片図を提供した。この眼切片は、ＧＦＰ検出のために即座にマウントするか又は免疫組織化学分析用に染色した。
【０１６５】
ウェスタンブロット（ＷＢ）
製造業者のプロトコールに従って、細胞又は組織よりＣｅｌｌｙｔｉｃ  ＭＴバッファー（シグマ）によってタンパク質を抽出した。タンパク質の濃度は、ＢＣＡキット（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）を使用して測定した。４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル電気泳動（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）の後で、タンパク質をｉＢｌｏｔ  ＰＶＤＦ膜（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）へ転写した。０．１％ＴＢＳＴ中の５％ミルクで１時間ブロッキングした後、ブロッキングバッファー中の抗Ａｑｐ１抗体（１：１０００、アブカム）で膜を４℃にて一晩染色した。０．１％ＴＢＳＴで洗浄後、ＨＲＰ結合２次抗体（セル・シグナリング、米国マサチューセッツ州）又はＤｙＬｉｇｈｔ８００  ２次抗体（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）とともに膜をインキュベートした。シグナルは、ＥＣＬ試薬（シグマ）で発色させて、電子画像システム（コニカ・ミノルタ）又はＬｉ−Ｃｏｒ画像システム（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に保存した。β−アクチン（セル・シグナリング）又はラミンＢ１（アブカム）をハウスキーピング対照として使用した。
【０１６６】
ＲＮＡ単離及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ
マウスＲＥＰ、角膜、毛様体、脈絡膜、及び網膜などのマウス眼組織より、ＲＮｅａｓｙミニキット（キアゲン、ドイツ、ハンブルグ）を製造業者のプロトコールに記載されるように使用して、全ｍＲＮＡを精製した。ワンステップＴａｑＭａｎ  ｑ−ＰＣＲ法（アプライドバイオシステムズ）を使用して、Ａｑｐ１遺伝子発現について試験した。同一の試料において結果を測定し、各処理群からの産物の蛍光強度の相対比について、２−ΔΔＣｔ法２を使用して刺激によって算出した。
【０１６７】
ＧｅｎｅＡｒｔゲノム切断アッセイ
ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキット（キアゲン）を使用して、トランスフェクトされた細胞よりゲノムＤＮＡを抽出した。遺伝子特異的な２本鎖破断が起きた遺伝子座を、Ｑ５高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ）と以下のフォワードプライマー：５’−ＧＧＡＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＣ−３’；リバースプライマー：５’−ＣＴＡＧＡＧＴＧＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＣＣＣＴ−３’を使用するＰＣＲで増幅させた。ＰＣＲ産物を変性して再度アニーリングさせ、ｉｎｄｅｌのある鎖がｉｎｄｅｌが無いか又は異なるｉｎｄｅｌがある鎖へ再アニーリングされるようにミスマッチを産生した。続いて、ミスマッチを検出し、Ｔ７エンドヌクレアーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ）によって３７℃で２０分間切断し、プロテイナーゼＫ（ニュー・イングランド・バイオラボ）による３７℃で５分間のインキュベーションによって終結させた。続いて、アガロースゲル電気泳動で断片を分析した。切断活性のより正確な結果のために、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ  １０００アッセイ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）用にＰＣＲ反応物をブリストル大学ゲノミクス研究施設へ送付した。結果を、ＩｍａｇｅＪ  １．４６ｒ（米国国立衛生研究所）を使用して定量した。
【０１６８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験
Ｖｅｔｅｌａｒ（ケタミン塩酸塩１００ｍｇ／ｍＬ、ファイザー、英国）及びＲｏｍｐｕｎ（キシラジン塩酸塩２０ｍｇ／ｍＬ、バイエル、英国）と無菌水との比０．６：１：８４の混合物の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって、成体のＣ５７ＢＬ／６マウスを麻酔した。滅菌３３ゲージ針を装着したハミルトンマイクロシリンジを使用して、ＳｈＨ１０−Ａｑｐ１（２種のプラスミドを混合）を２μｌの容量で片眼に硝子体内注射した。対照として役立つ反対側の眼は、未処理のままにするか又はＳｈＨ１０−ＧＦＰを硝子体内注射した。眼異常を発症したごく数匹のマウスは、除外した。
【０１６９】
２．５％イソフルランを１００％酸素とともに使用してマウスを麻酔し、Ｔｏｎｏｌａｂ反跳式眼圧計（ＴｏｎｏＶｅｔ）によってＩＯＰを測定した。ＩＯＰは、午後遅く（午後４時頃）に測定した。処理後３週間又は６週間でさらなる分析のためにマウスをと殺した。
【０１７０】
この方法は、承認済みのブリストル大学研究ガイドラインに準拠して行われ、内務省プロジェクトライセンス３０／３０４５及び３０／３２８１の下での実験プロトコールはすべてブリストル大学の倫理審査会によって承認された。
【０１７１】
高眼圧モデル
成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＶｅｔｅｌａｒ及びＲｏｍｐｕｎで麻酔した。既報３の手順に従って、各マウスの両眼の眼周囲結膜脳弓を通して、デキサメタゾン−２１−アセテート（ＤＥＸ−Ａｃ）（シグマ、２００μｇ／眼）を注射した。同じＤＥＸＡ処理を週１回施して、ＩＯＰをある一定レベルに安定させた。ＤＥＸ−Ａｃ処理の２週間後に、各マウスの片眼へＡＡＶ処理物を無作為に硝子体内注射した。
【０１７２】
マイクロビーズ閉塞モデルの誘導とマイクロビーズ（インビトロジェン）の調製については、既報４の通りである。マイクロビーズ注射の前にＩＯＰベースラインを測定した。トロピカミド点眼剤によって瞳孔を拡張させた後で、各眼の前眼房へ約３×１０６個のビーズを注射した。マイクロビーズ注射の１週間後に、各マウスの片眼へＡＡＶ処理物を無作為に硝子体内注射した。
【０１７３】
ＡＡＶ処理後３週目に、すべてのマウスのＩＯＰを測定した。実験の終点で、Ｍｉｃｒｏｎ  ＩＶ（Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｓ）を使用して、網膜と角膜の厚さを測定した。次いで、毛様体におけるＡｑｐ１タンパク質発現と網膜中の神経節細胞計数のためにマウスをと殺した。
【０１７４】
免疫蛍光及び免疫組織化学
マウスの両眼を切り出して、２％パラホルムアルデヒド（サーモフィッシャー）で４℃にて一晩固定し、エタノールで脱水後、パラフィン包埋とヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色のために、ブリストル大学の組織学研究所へ送付した。
【０１７５】
マウスの両眼を、ドライアイスを使用して、ＯＣＴ（optimal cutting temperature compound、サーモ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）において瞬間凍結させた。１２μｍ厚の凍結切片を４％ＰＦＡで１０分間固定し、ウサギ抗マウスＡｑｐ１抗体（１：１００希釈、アブカム）、及びヤギ抗マウスＣＤ４５抗体（１：１００希釈、ＢＤバイオサイエンス）を、２次抗体（１：２００希釈、ライフテクノロジーズ）とともに用いて免疫染色した。マウス網膜を切開して、４％ＰＦＡで２時間固定した。２％Ｔｒｉｔｉｏｎ及び２％ＢＳＡで１時間ブロッキング後、網膜をＢｒｎ−３α（１：５０希釈、サンタクルズ）で一晩染色し、フラットマウントした。すべての画像をライカＳＰ５−ＡＯＢＳ共焦点レーザー走査型顕微鏡で撮影した。Ｂｒｎ−３αによる神経節細胞の計数は、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ（バージョン６．２．１）によって解析した。
【０１７６】
臭素化チミジン類似体５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）アッセイ
ＢｒｄＵ溶液（ＢＤバイオサイエンス）を各マウスへ１００μｌ（１μｇ）ｉ．ｐ．注射した。２４時間後、眼の凍結切片のためにマウスをと殺した。凍結切片を４％ＰＦＡで１０分間固定した。ＰＢＳで洗浄後、切片を２Ｎ  ＨＣｌとともに３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、ＰＢＳ洗浄に続き、切片を抗ＢｒｄＵビオチン化抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とともに室温で２時間インキュベートし、ＢｒｄＵに対するストレプトアビジンｅＦｌｕｏｒ  ５７０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でインキュベーションした。最後に、切片を共焦点イメージング（ライカＳＰ５−ＡＯＢＳ）用にマウントした。
【０１７７】
ヒト組織の培養及びトランスフェクション
正常ドナーの眼よりヒト眼組織を単離した。いずれのドナーの眼も、ドナーの家族からインフォームドコンセントを受諾後にブリストル・アイバンクより入手し、ヒト組織に関わる研究に対するヘルシンキ宣言のガイドラインに従って管理した。単離したヒト毛様体を上皮細胞培池（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において培養した。毛様体は、経時的インキュベーションの間、ＳｈＨ１０−ＧＦＰ又はＳｈＨ１０−Ａｑｐ１で処理した。毛様体組織を凍結切片のために採取し、２４時間、７２時間、及び７日間の培養でのＧＦＰ発現を検出した。切断活性とＡｑｐ１タンパク質発現についても検出し、処理した毛様体組織において最終時点で定量した。
【０１７８】
統計処理
したがって、結果を平均±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）として提示する。２つの個別実験群の比較は、対応のないスチューデントのｔ検定とマン・ホイットニー検定によって実施した。多重比較については、ノンパラメトリック解析を、片側ＡＮＯＶＡ検定をダン検定とともに使用して実施した。いずれの解析も、グラフパッドプリズム６（グラフパッド・ソフトウェア、バージョン６．０１、米国、ラホヤ）を使用して実施した。全体を通して、両側検定を使用した。Ｐ≦０．０５で有意差有りとみなした。
【０１７９】
１．  Chen, M. et al. Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-PRE07（自発性マウス網膜色素上皮細胞株：B6-PRE07 の特性決定）．Investigative ophthalmology & visual science 49, 3699-3706, doi: 10.1167/ivos.07-1522 (2008).
２．  Livak, K. J, & Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T) Method（リアルタイム定量的ＰＣＲと２（−ΔΔＣ（Ｔ））法を使用する、相対的な遺伝子発現データの解析）．Methods (San Diego, Calif.) 25. 402-408, doi: 10.1006/meth.2001. 1262 (2001).
３．  Patel, G. C. et al. Dexamethasone-induced Ocular Hypertension in Mice: Effects of Myocilin and Route of Adminisitration（マウスにおけるデキサメタゾン誘発高眼圧：ミオシリンと投与経路の効果）．The American journal of pathology 187, 713-723, doi: 10.1016/j.ajpath.2016.12.003 (2017).
４．  Ito, Y. A., Belforte, N., Cueva Vargas, J. L. & Di Polo, A. A Magnetic Microbead Occulsion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice（マウスにおいて高眼圧依存性緑内障を誘発する磁気マイクロビーズ閉塞モデル）．Journal of Visualized experiments: JoVE, e53731, doi: 10.3781/53731 (2016).
結果：
ＡＡＶは有糸分裂後細胞における永続的な発現を可能にし、毛様体上皮のターンオーバーはほとんど無いため、これらの細胞への遺伝子送達は持続するはずである。我々は、マウスにおいてＳｈＨ１０血清型の硝子体内注射が効率的な毛様体形質導入をもたらし、毛様体を硝子体内経路より感染させることが可能な、試験した中で唯一の血清型であることを確認した（表１）。オフターゲットの眼組織についても特性決定した。５×１０１３、５×１０１２、及び５×１０１１ゲノムコピー／ｍｌの力価で２μｌのＳｈＨ１０−ＣＭＶ−ｅＧＦＰを硝子体内注射してから３週間後、両眼についてＧＦＰシグナルの存在を凍結切片によって試験した。毛様体上皮細胞ではＧＦＰ発現を観察したが、網膜の形質導入レベルは、投与に使用する力価が低下するにつれて低減した（データ示さず）。また、ドナーの眼由来のｅｘ  ｖｉｖｏ組織を使用して、ＳｈＨ１０がヒト毛様体上皮を感染させることができることを確認した。死後２４時間以内に入手したドナーの眼より強膜骨環を切り出し、培養で４８時間維持した後で、ビヒクル又は１×１０１３ゲノムコピー／ｍｌで２μｌのＳｈＨ１０−ＣＭＶ−ｅＧＦＰを加えた。４８時間培養後の蛍光顕微鏡検査法は、ウイルス無しの培養物ではＧＦＰシグナルが無いことを示したが、１×１０１３ｇｃ  ＳｈＨ１０−ＣＭＶ−ｅＧＦＰで処理した培養物は、広範な低レベルシグナルと、周辺領域での強シグナルの焦点を示した（データ示さず）。
【０１８０】
その後の実験は、１×１０１１ｇｃ／ｍｌの濃度で２μｌのボーラス量により、ミュラーグリア細胞はほとんど感染させることなく、良好なレベルの毛様体形質導入を達成できることを示している。
【０１８１】
マイクロアレイデータベースを解析し、マウス眼におけるアクアポリン及び炭酸脱水酵素のアイソフォームの相対発現マップを構築した。これにより、Ａｑｐ１、４、５、並びにＣａｒ２、３、及び１４を最も豊富な転写産物として同定し、したがって、これらは、房水産生において重要な役割を果たす可能性がある（図１）。マウス眼について、主要なアクアポリン及び炭酸脱水酵素のアイソフォームのタンパク質及びＲＮＡの発現並びに組織分布を決定した（図２）。これにより、遺伝子標的の毛様体発現とガイド選択を確認した。
【０１８２】
ＡＡＶへパッケージすることが可能な新たに記載されたＳａＣａｓ９を使用するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムについて試験した。このシステムは、ＲＮＡガイド（ｓｇＲＮＡ）を使用して、ＳａＣａｓ９が２本鎖ＤＮＡ破断を引き起こして、典型的にはｉｎｄｅｌ形成と未熟な終止コドンをもたらすように標的遺伝子へ指向させる。Ａｑｐ１及びＣａｒ２を標的とするいくつかのＳａＣａｓ９ガイドＲＮＡについて、マウス眼細胞株を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ切断アッセイによって、ｉｎｄｅｌ効率が最大２６％に達する数種の活性ガイドＲＮＡを同定した（図３）。２種の有望なガイドＲＮＡを産生して、ＳｈＨ１０ベクターへパーケージした。プラスミドのマップと配列を図４と図５に示す。
【０１８３】
Ａｑｐ１は、マウスの毛様体に豊富であるが、角膜にも存在している。レベルについて、定量的ＰＣＲとウェスタンブロットによって特性決定した（図６Ａ〜６Ｃ）。マウスＡｑｐ１のエクソン１を標的とするいくつかのＳａＣａｓ９特異的ｓｇＲＮＡを設計して、マウスＢ６−ＲＰＥ細胞株に対してＴ７エンドヌクレアーゼ１アッセイを使用してその効力を試験した。Ｂ６−ＲＰＥ細胞におけるＡｑｐ１転写物の破壊効率が他のｓｇＲＮＡより良好であり、エクソン１でのスペーシングが最適であるために、２つのＡｑｐ１  ｓｇＲＮＡ（ＢとＥ、１Ｂと１Ｅとしても知られている）を選択して、ベクターへパッケージした。この２つのベクターの混合物を使用してＢ６−ＲＰＥ細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで感染させ、７２時間後に未処理細胞又はＧＦＰウイルス感染細胞と比較して、Ａｑｐ１  ＲＮＡ転写産物の破壊を確認した（図６Ｆ）。また、ＳａＣａｓ９とｓｇＲＮＡ  １Ｂ及び１Ｅとをコードするウイルスである５０：５０混合物（「Ｍｉｘ」と称する）をＢ６−ＲＰＥ細胞株に使用することによって、Ａｑｐ１  ＲＮＡ転写産物の破壊を確認した（図６Ｇ）。介在エクソン１領域の完全切除を含めたオンターゲット効果を確認した（図６Ｈ）。
【０１８４】
Ａｑｐ１のエクソン１を標的とする２種のＳｈＨ１０ベクターの同じ混合物（「Ｍｉｘ」）を野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの硝子体腔へ注射した。注射から３週間後、選択した眼より毛様体を切除して、Ａｑｐ１遺伝子座のゲノム編集、ＳａＣａｓ９  ＤＮＡの存在、及び平均２．９ｍｍＨｇのＩＯＰ低下を観察した（図７Ｃ）。対照のＧＦＰ発現性ＳｈＨ１０ウイルスを使用すると、ＩＯＰの低下を観測しなかった。Ａｑｐ１について、ウェスタンブロットによって、毛様体のＡｑｐ１タンパク質レベルを試験した（図７Ｅ〜７Ｆ）。ＣＲＩＳＰＲ処理した眼では、対照の眼と比較して、Ａｑｐ１のレベルが低下した。完全な破壊を見ることができないのは、ウェスタンブロッティングのために着色されていない、ウイルスを形質導入された毛様体上皮のみを切除することが容易でないからである。ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＯＣＴイメージングを使用すると、角膜の浮腫及び肥厚化又は網膜浮腫を含めたオフターゲット効果は見られなかった（図７Ｇ〜７Ｈ）。
【０１８５】
２匹の高眼圧モデルマウスの片眼へＳｈＨ１０−ＳａＣａｓ９ベクターの同じ混合物を導入した。ベクター処理から３週間後、いずれのモデルでも、ＩＯＰの有意な低下と毛様体でのＡｑｐ１タンパク質発現の有意な低下があった。平均のＩＯＰ低下は、マイクロビーズモデル及びステロイドモデルにおいてそれぞれ３．９ｍｍＨｇ及び２．９ｍｍＨｇであった（図８）。
【０１８６】
ｅｘ  ｖｉｖｏドナーのヒト眼を使用すると、Ａｑｐ１は、ウェスタンブロッティング及び定量的ＰＣＲによりヒト毛様体でも検出されて豊富である（図９Ａ〜９Ｂ）。故に、いくつかのヒトｓｇＲＮＡガイドを設計して、ヒト２９３Ｔ細胞株に対して試験した。数多くのｓｇＲＮＡの中で最も有効なものとしてヒトＡｑｐ１の１つのｓｇＲＮＡ  Ｋを選択し、これをＳｈＨ１０ベクターへさらにパッケージしてから２９３Ｔ細胞に対して試験して、ヒトＡｑｐ１遺伝子座におけるゲノム編集を確認した（図９Ｄ）。我々はまた、ＧＦＰをコードするＳｈＨ１０ウイルスをユビキタスＣＭＶプロモーターの制御下で使用して、７日間までの共培養によって、ＳｈＨ１０がヒト毛様体に感染して形質導入することが可能であることを示した（データ示さず）。
【０１８７】
【表８】
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【０１８８】
ＣＭＶプロモーター下でｅＧＦＰを発現する１×１０１３ｇｃ／ｍｌの様々なＡＡＶ血清型２μｌをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに硝子体内注射した。３週間後、両眼を摘出し、１６μｍの厚さで凍結切開し、マウントして、共焦点顕微鏡法によって画像処理した。各血清型を注射した５個の独立した眼について試験し、その結果の概要を示した（ＮＤ＝検出せず）。
【０１８９】
さらなる調査を行って、脈絡叢での脳脊髄液形成を調節するための、例えば水頭症の療法として我々のアプローチの適切性について調査した。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの側脳室由来の脈絡叢を切り出して組織培養した。ＣＭＶ−ＧＦＰをコードするＳｈＨ１０を５×１０１１ゲノムコピー加えて、７２時間インキュベートした。脈絡叢上皮に沿ってＧＦＰ発現が見られ、ＳｈＨ１０がこれらの細胞種を感染させる能力を有することを実証した（データ示さず）。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス脳の冠状凍結切片に対する免疫組織化学により、Ａｑｐ１及びＡｑｐ４の脈絡叢での存在が実証された。Ａｑｐ４が皮質ニューロンに存在するのに対し、Ａｑｐ１発現は脈絡叢のみに限定されているように見えた（データ示さず）。
【０１９０】
本発明について上記の例示態様と共に記載してきたが、本開示により、当業者には多くの等価な修飾態様と変形態様が明らかであろう。従って、説明された本発明の例示態様は、例証用のものであって限定するものではないとみなされる。記載の態様に対して、本発明の精神及び範囲より逸脱することなく、様々な変更を施してよい。本明細書に引用したすべての文書は明示的に援用される。
【０１９１】
特許出願及び登録特許を含めた、本願のすべての参考文献の教示は、本明細書に完全に援用される。本願が優先権を主張するいずれの特許出願も、出版物及び参考文献について本明細書に記載されるやり方で、その全体が本明細書に援用される。
【０１９２】
疑念の回避のために、「〜を含んでなる（comprising）」、「〜を含む（comprise）」、及び「〜を含む（comprises）」という本明細書の用語は、それぞれ「〜から成っている（consisting of）」、「〜から成る（consist of）」、及び「〜から成る（consists of）」という用語といかなる場合でも置換可能でもよいと本発明者によって企図される。「約（about）」（又は「概ね（around）」）という用語は、すべての数値において５％の変動を許容する。即ち、約１．２５％という値は、１．１９％〜１．３１％を意味する。
【０１９３】
本明細書に記載される特別な態様は、本発明の例証として示すのであって、それを限定するものとして示すのではないと理解されたい。本発明の主たる特徴は、本発明の範囲より逸脱することなく、様々な態様に利用することができる。当業者は、定型的な試験だけを使用して、本明細書に記載される具体的な手順に対する数多くの均等物を認識するか又は確認することができるだろう。そのような均等物は、本発明の範囲内にあるとみなされ、特許請求の範囲によって網羅される。本明細書において言及されるすべての出版物及び特許出願は、本発明が属する技術分野における当業者の技術水準を示している。出版物及び特許出願は、いずれもそれぞれ個別の出版物又は特許出願が具体的かつ個別的に援用されると示されるのと同じ程度に、本明細書に援用される。
【０１９４】
「１つの（a）」又は「１つの（an）」という語の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書において「〜を含んでなる（comprising）」という用語と共に使用される場合、「１つ（one）」を意味し得るが、それはまた、「１以上（one or more）」、「少なくとも１つ（at least one）」、及び「１又は１より多い（one or mor than one）」の意味と一致する。特許請求の範囲における「又は（or）」という用語は、選択肢のみを表すと明確に示されるわけでも選択肢が互いに排他的であるわけでもなければ「及び／又は（and/or）」を意味するために使用されるが、本開示では、選択肢のみと「及び／又は」を表す定義を支持する。本願を通して、「約」という用語は、値を決定するために利用される測定、方法に固有の変動誤差、又は研究対象間に存在する変動が値に含まれることを示すために使用される。
【０１９５】
本明細書及び特許請求の範囲において使用されるように、「〜を含んでなる（comprising）」（及び「〜を含む（comprise）」と「〜を含む（comprises）」などの「含んでなる」のあらゆる形）、「〜を有している（having）」（及び「〜を有する（have）」と「〜を有する（has）」などの「〜を有している」のあらゆる形）、「〜を包含している（including）」（及び「〜を包含する（includes）」と「〜を包含する（include）」などの「〜を包含している」のあらゆる形）、又は「〜を含有している（containing）」（及び「〜を含有する（（contains）」と「〜を含有する（contain）」などの「〜を含有している」のあらゆる形）という語は、包括的又は非制限的（open-ended）であって、列挙されない追加の要素又は方法工程を排除するものではない。
【０１９６】
本明細書において使用されるような「又はそれらの組合せ」という用語は、その用語に先行する列挙項目のすべての順列及び組合せを表す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はそれらの組合せ」には、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣの少なくとも１つが含まれ、ある特定の文脈において順序が重要であれば、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、又はＣＡＢも含まれると企図される。この例に続けば、ＢＢ、ＡＡＡ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢ等のような１以上の項目又は用語の繰返しを含有する組合せが明らかに含まれる。当業者は、典型的には、文脈から他に明らかでなければ、どの組合せにおいても項目又は用語の数に制限が無いことを理解されよう。
【０１９７】
本明細書に開示され特許請求された組成物及び／又は方法はすべて、本開示に照らせば、過度の実験をすることなく作製及び実施することが可能である。本発明の組成物及び方法を好ましい態様に関して記載してきたが、当業者には、この組成物及び／又は方法に対して、そして本明細書に記載の方法の工程又は工程の連続において、本発明の概念、精神、及び範囲より逸脱することなく、種々の変更を適用し得ることが明らかであろう。当業者に明らかなこのような類似の置換態様及び修飾態様はすべて、添付の特許請求項によって規定される本発明の精神、範囲、及び概念の範囲内にあると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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