(57)【要約】  CTL培養物及び調製物を調製及び特性決定するための方法が本明細書に提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を含むレスポンダー細胞の調製物が活性ウイルスを本質的に含まないと同定する方法であって、
（i）ウイルスによって形質導入された刺激細胞を含むレスポンダー細胞の培養物を調製するステップ、
（ii）前記培養物から少なくとも1つのサンプルを採取するステップ、
（iii）前記サンプルの、感受性レポーター細胞株でウイルスプラークを形成する能力を評価するステップ、及び
（iv）前記サンプルにおけるウイルスmRNAの有無を決定するステップ
を含み、
前記サンプルがウイルスプラークを形成せず、前記ウイルスmRNAが検出されない場合、前記培養物が活性ウイルスを本質的に含まないと同定される、方法。
【請求項２】
レスポンダー細胞とともに培養するステップに先立って、刺激細胞を、1つ以上のサイトカインとともにインキュベートするステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
レスポンダー細胞とともに培養するステップに先立って、刺激細胞にガンマ線を照射するステップをさらに含む、請求項1から2のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
レスポンダー細胞及び刺激細胞が各々、末梢血単核細胞(PBMC)を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
レスポンダー細胞及び刺激細胞が各々、同一ドナーに由来する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
レスポンダー細胞及び刺激細胞が各々、異なるドナーに由来する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
刺激細胞が、B細胞、抗原提示T細胞、樹状細胞又は人工抗原提示細胞及び/又はaK562細胞を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
刺激細胞が、ヘルペスウイルス抗原をコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターを発現する、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
アデノウイルスベクターが複製不能である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
アデノウイルスベクターが、1つ以上のEBV抗原をコードする核酸配列を含む、請求項8又は9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
刺激細胞が、1つ以上のEBV抗原を発現する、請求項8から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
アデノウイルスベクターがAdE1-LMPpolyである、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
1つ以上のEBV抗原が、LMP1ペプチド若しくはその断片、LMP2Aペプチド若しくはその断片及び/又はEBNA1ペプチド若しくはその断片を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
サンプルを採取するステップの前に、前記培養物中にレスポンダー細胞を、少なくとも24時間、少なくとも5日、少なくとも8日、少なくとも11日、少なくとも14日、少なくとも17日又は少なくとも20日維持するステップを含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
サンプルを採取するステップの前に、レスポンダー細胞が、前記培養物中に少なくとも20日間維持される、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
培養物を維持するステップが、培養物を少なくとも20日間維持するステップを含み、評価するステップ及び決定するステップが、培養物を20日間維持するステップの後に実施される、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
サンプルがウイルスプラークを形成せず、前記ウイルスmRNAが検出されない場合、使用及び/又は保存に先立って必要に応じて処理するためにCTLを回収するステップをさらに含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
サンプルがウイルスプラークを形成する、及び/又は前記ウイルスmRNAが検出される場合、培養物を所定のプロトコールに従って再播種、排除又は廃棄するステップをさらに含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
前記ウイルスに対して感受性であるレポーター細胞株において、サンプルがウイルスプラークを形成しないことを確認することによって、調製物が、ウイルスを本質的に含まないと同定するステップを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
レポーター細胞株がA549である、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルスに対して感受性であるレポーター細胞株において、サンプルがウイルスプラークを形成しないことを確認することによって、調製物が、組換えの複製不能ウイルスを本質的に含まないと同定するステップを含み、レポーター細胞株が、内因性E1タンパク質を発現する、請求項1に記載の方法。
【請求項２２】
レポーター細胞株がAD293である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
サンプルが前記ウイルスのmRNAを含まないことを確認することによって、調製物が、活性ウイルスを本質的に含まないと同定するステップを含む、請求項17から22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
活性ウイルスが、組換えアデノウイルスである、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
ウイルスmRNAが、RT-PCRアッセイを使用して検出される、請求項23又は24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
RT-PCRアッセイが、
（i）RNAをサンプルから抽出するステップ、
（ii）ステップ（i）から抽出されたRNAからcDNAを調製するステップ、
（iii）cDNAを、ウイルスに固有の特異的なプライマーセットを用いて増幅するステップ、
（iv）ステップ（iii）の増幅された産物を、標識プローブとハイブリダイズするステップ、及び
（v）標識プローブの、増幅された産物とのハイブリダイゼーションを検出し、定量化するステップ
を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２７】
プライマーセットが、AdE1-LMPpolyに特異的な核酸配列又は野生型内因性ウイルスに共通の核酸配列とハイブリダイズし、増幅するように設計される、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
プライマーセットが、EBNA1及びE1-LMPpolyポリエピトープの接合部でAdE1-LMPpolyの核酸配列を増幅するように設計される、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
プライマーセットが、配列番号27及び配列番号28である、請求項27又は28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
標識プローブが、蛍光標識オリゴプローブである、請求項26から29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
オリゴプローブが、フルオロフォア及びクエンチャー対を含む、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
オリゴプローブが、配列番号29である、請求項30又は31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
調製物が、8日目で活性ウイルスを本質的に含まない、請求項14から32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
調製物が、CTL回収で活性ウイルスを本質的に含まない、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
活性ウイルスを本質的に含まない細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を含む調製物を生成する方法であって、
（i）刺激細胞に、1つ以上の抗原をコードする1つ以上のウイルスベクターを形質導入するステップ、
（ii）レスポンダー細胞を、形質導入された刺激細胞とともに所定のインキュベーション時間にわたり培養することによって、抗原特異的CTL増殖を誘導するステップ、
（iii）培養物のサンプルを採取するステップ、
（iv）前記サンプルの、複数のレポーター細胞株でウイルスプラークを形成する能力を評価するステップ、及び
（v）前記サンプルにおけるウイルスmRNAの有無を決定するステップ
を含み、
前記サンプルがウイルスプラークを形成せず、前記ウイルスmRNAの存在が検出されない場合、前記調製物が、活性ウイルスを本質的に含まないと同定され、前記調製物が活性ウイルスを含むと同定される場合、調製物が、所定のプロトコールに従って再播種、排除又は廃棄される、方法。
【請求項３６】
ステップ（i）において刺激細胞を、1つ以上のサイトカインとともにインキュベートするステップをさらに含む、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ（ii）に先立って、刺激細胞にガンマ線を照射するステップをさらに含む、請求項35に記載の方法。
【請求項３８】
レスポンダー細胞及び刺激細胞が各々、末梢血単核細胞(PBMC)を含む、請求項35から37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
レスポンダー細胞及び刺激細胞が、同一ドナーに由来する、請求項35から38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
レスポンダー細胞及び刺激細胞が、異なるドナーに由来する、請求項35から38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
刺激細胞が、B細胞、抗原提示T細胞、樹状細胞、人工抗原提示細胞及び/又はaK562細胞を含む、請求項35から40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ステップ（i）のウイルスベクターが、ヘルペスウイルス抗原をコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターである、請求項35から41のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
アデノウイルスベクターが複製不能である、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
ウイルスベクターが、1つ以上のEBV抗原をコードする核酸配列を含む、請求項42及び43のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
刺激細胞が、1つ以上のEBV抗原を発現する、請求項42から44のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
アデノウイルスベクターが、AdE1-LMPpolyである、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
1つ以上のEBV抗原が、LMP1ペプチド若しくはその断片、LMP2Aペプチド若しくはその断片及び/又はEBNA1ペプチド若しくはその断片を含む、請求項45又は46のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
所定のインキュベーション時間が、サンプルを採取するステップに先立って、少なくとも24時間、少なくとも5日、少なくとも8日、少なくとも11日、少なくとも14日、少なくとも17日又は少なくとも20日である、請求項35から47のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
所定のインキュベーション時間が、サンプルを採取するステップに先立って、少なくとも20日である、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
前記ウイルスに対して感受性であるレポーター細胞株において、サンプルがウイルスプラークを形成しないことを確認することによって、調製物が、活性ウイルスを本質的に含まないと同定するステップを含む、請求項35に記載の方法。
【請求項５１】
レポーター細胞株がA549である、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
前記ウイルスに対して感受性であるレポーター細胞株において、サンプルがウイルスプラークを形成しないことを確認することによって、調製物が、組換えの複製不能ウイルスを本質的に含まないと同定するステップを含み、レポーター細胞株が、内因性E1タンパク質を発現する、請求項35に記載の方法。
【請求項５３】
レポーター細胞株がAD293である、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
サンプルが前記ウイルスのmRNAを含まないことを確認することによって、調製物が、活性ウイルスを本質的に含まないと同定するステップを含む、請求項50から53のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
活性ウイルスが、組換えアデノウイルスである、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
ウイルスmRNAが、RT-PCRアッセイを使用して検出される、請求項54又は55のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
RT-PCRアッセイが、
（i）RNAをサンプルから抽出するステップ、
（ii）ステップ（i）から抽出されたRNAからcDNAを調製するステップ、
（iii）cDNAを、ウイルスに固有の特異的なプライマーセットを用いて増幅するステップ、
（iv）ステップ（iii）の増幅された産物を、標識プローブとハイブリダイズするステップ、及び
（v）標識プローブの、増幅された産物とのハイブリダイゼーションを検出し、定量化するステップ
を含む、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
プライマーセットが、AdE1-LMPpolyに特異的な核酸配列又は野生型内因性ウイルスに共通の核酸配列とハイブリダイズし、増幅するように設計される、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
プライマーセットが、EBNA1及びE1-LMPpolyポリエピトープの接合部でAdE1-LMPpolyの核酸配列を増幅するように設計される、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
プライマーセットが、配列番号27及び配列番号28である、請求項58又は59のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
標識プローブが、蛍光標識オリゴプローブである、請求項60に記載の方法。
【請求項６２】
オリゴプローブが、フルオロフォア及びクエンチャー対を含む、請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
オリゴプローブが、配列番号29である、請求項61又は62のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
調製物が、8日のインキュベーション時間後に活性ウイルスを本質的に含まない、請求項48から63のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
調製物が、CTL回収で活性ウイルスを本質的に含まない、請求項64に記載の方法。
【請求項６６】
レシピエントに投与するのに適した細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の治療用調製物を同定する方法であって、
（i）CTLの治療用調製物のサンプルを得るステップ、
（ii）調製物の、複数のレポーター細胞株でウイルスプラークを形成する能力を評価するステップ、及び
（iii）調製物におけるウイルスmRNAの有無を決定するステップ
を含み、
前記サンプルがウイルスプラークを形成せず、前記ウイルスmRNAが検出されない場合、前記調製物が、レシピエントに投与するのに適していると同定される、方法。
【請求項６７】
レシピエントに投与するのに先立って実施される、請求項66に記載の方法。
【請求項６８】
ウイルスプラークの形成及び/又はウイルスmRNAの存在が、アデノウイルスによるものである、請求項66に記載の方法。
【請求項６９】
アデノウイルスが、ヘルペスウイルス抗原をコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターを含む、請求項68に記載の方法。
【請求項７０】
アデノウイルスベクターが複製不能である、請求項69に記載の方法。
【請求項７１】
アデノウイルスベクターが、1つ以上のEBV抗原をコードする核酸配列を含む、請求項69又は70のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
アデノウイルスがAdE1-LMPpolyである、請求項68から70のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
CTLが、レシピエントに由来する、請求項67から72のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
CTLが、レシピエントではないドナーに由来する、請求項67から72のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
CTLが、クラスI MHC上に提示された1つ以上のEBV抗原に特異的に結合するT細胞受容体を発現する、請求項66に記載の方法。
【請求項７６】
1つ以上のEBV抗原が、LMP1ペプチド若しくはその断片、LMP2Aペプチド若しくはその断片及び/又はEBNA1ペプチド若しくはその断片を含む、請求項75に記載の方法。
【請求項７７】
前記ウイルスに対して感受性であるレポーター細胞株において、サンプルがウイルスプラークを形成しないことを確認することによって、調製物が、ウイルスを本質的に含まないと同定するステップを含む、請求項66に記載の方法。
【請求項７８】
レポーター細胞株がA549である、請求項77に記載の方法。
【請求項７９】
前記活性ウイルスに対して感受性であるレポーター細胞株において、サンプルがウイルスプラークを形成しないことを確認することによって、調製物が、組換えの複製不能ウイルスを本質的に含まないと同定するステップを含み、レポーター細胞株が、内因性E1タンパク質を発現する、請求項66に記載の方法。
【請求項８０】
レポーター細胞株がAD293である、請求項79に記載の方法。
【請求項８１】
サンプルが前記ウイルスのmRNAを含まないことを確認することによって、調製物が、活性ウイルスを本質的に含まないと同定するステップを含む、請求項77から80のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
活性ウイルスが、組換えアデノウイルスである、請求項81に記載の方法。
【請求項８３】
ウイルスmRNAが、RT-PCRアッセイを使用して検出される、請求項81又は82のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
RT-PCRアッセイが、
（i）RNAをサンプルから抽出するステップ、
（ii）ステップ（i）から抽出されたRNAからcDNAを調製するステップ、
（iii）cDNAを、ウイルスに固有の特異的なプライマーセットを用いて増幅するステップ、
（iv）ステップ（iii）の増幅された産物を、標識プローブとハイブリダイズするステップ、及び
（v）標識プローブの、増幅された産物とのハイブリダイゼーションを検出し、定量化するステップ
を含む、請求項83に記載の方法。
【請求項８５】
プライマーセットが、AdE1-LMPpolyに特異的な核酸配列又は野生型内因性ウイルスに共通の核酸配列とハイブリダイズし、増幅するように設計される、請求項84に記載の方法。
【請求項８６】
プライマーセットが、EBNA1及びE1-LMPpolyポリエピトープの接合部でAdE1-LMPpolyの核酸配列を増幅するように設計される、請求項84に記載の方法。
【請求項８７】
プライマーセットが、配列番号27及び配列番号28である、請求項85又は86のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
標識プローブが、蛍光標識オリゴプローブである、請求項87に記載の方法。
【請求項８９】
オリゴプローブが、フルオロフォア及びクエンチャー対を含む、請求項88に記載の方法。
【請求項９０】
オリゴプローブが、配列番号29である、請求項88又は89のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
ヒト対象においてEBV抗原関連状態を処置する方法であって、対象に、請求項66から90のいずれか一項に記載の方法によって活性ウイルスを実質的に含まないと同定されるCTLを投与するステップを含む、方法。
【請求項９２】
ヒト対象においてEBV抗原関連状態を処置する方法であって、請求項66から90のいずれか一項に記載の方法を実施するステップ、及び対象に、活性ウイルスを実質的に含まないと同定されるCTLを投与するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、参照によりその全文が組み込まれる、2018年6月13日に出願の米国特許仮出願第62/684,277号の優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
養子免疫療法には、疾患関連細胞を認識し、標的化し、破壊することを目的として、個体に疾患特異的T細胞、例えば、細胞傷害性T細胞(CTL)を埋め込むこと又は注入することが含まれる。養子免疫療法(例えば、T細胞療法)は、がん、移植後リンパ増殖性障害、感染性疾患(例えば、ウイルス感染症)及び自己免疫疾患を含む多数の疾患及び障害の処置のための有望なアプローチとなっている。
【０００３】
エプスタインバーウイルス(EBV)は、ヒトヘルペスウイルス4としても知られる遍在性ヘルペスウイルスである。最近、EBVに対する曝露は、多発性硬化症(MS)及び全身性自己免疫疾患(SAD)及び炎症性腸疾患(IBD)を含む自己免疫疾患の素因となるか、又はそうでなければ、その病態形成にある役割を果たす可能性があることが示されている。このような病態(すなわち、MS、SAD及びIBD)は、身体自身の組織に対する異常な免疫応答に起因する。MSは、身体自身の免疫細胞による神経線維の周囲の保護的脂質殻であるミエリンの分解を特徴とする。SADは、関節リウマチ(RA)、全身性エリテマトーデス(SLE)及びシェーグレン症候群(SS)を含む多様な症状を有する結合組織疾患の群である。IBDは、クローン病、セリアック病及び潰瘍性大腸炎を含む結腸及び小腸の炎症状態の群である。例えば、最近の研究によって、MSと診断された個体は、健常な個体よりも、神経組織に凝集されたB細胞に、より高いレベルのEBV関連タンパク質を示すことがわかっている。
【０００４】
CTLによる免疫監視も、広範な悪性細胞の検出及び死滅において重要な役割を果たす(Gottschalkら、2005年. Leuk Lymphoma. 46巻:1〜10頁;Ochsenbeinら、2002年. Cancer Gene Ther. 9巻:1043〜10頁)。悪性細胞の生存及び蔓延は、このような細胞のCTLによる認識から逃れる能力と関連している(Bubenikら、2003年. Oncol. Rep. 10巻:2005〜2008頁;Reesら、1999年.Cancer Immunol. Immunother. 48巻:374〜381頁)。特に、抗原プロセシング及び提示機能は、EBV関連悪性腫瘍、例えば、ホジキンリンパ腫及び鼻咽頭癌において無傷のままである(Khannaら、1998. Cancer Res. 58:310〜314頁、Leeら、1998. Blood 92巻:1020〜1030頁)。最近の研究によって、免疫監視(及びその後の応答)は、制御性T細胞によって媒介されるEBV特異的T細胞の抑制によって破壊される可能性があり、悪性細胞の除去の失敗につながることが示唆されている。したがって、CTLの養子移入によるがん関連抗原に対するT細胞応答の増強は、現在の処置戦略の魅力的な代替法を提供し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ウイルス感染(例えば、EBVによる)と複数の状態、例えば、がん及び自己免疫疾患の病態形成の間の関連によって、いくつかの群が同種（allogeneic）(例えば、参照により本明細書に組み込まれるWO2017/203368を参照のこと)及び自己（autologous）(例えば、Penderら、Multiple Sclerosis Journal. 2014年;20巻(11号):1541〜1544頁を参照のこと)抗原特異的CTLの産生を発達させる誘発要因が提供された。このようなCTL調製物が、投与の前にヒト医薬において使用するのに適した品質のものである(例えば、残存するウイルスベクター、例えば、アデノウイルスを実質的に含まない)ことを確実にする改善された方法の開発は極めて重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
クラスI MHC上に提示されたEBVペプチドに特異的に結合するT細胞受容体を発現する同種又は自己細胞傷害性T細胞(CTL)を生成する方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、CTLは、CTLを含むサンプル(レスポンダー細胞、例えば、PBMCサンプル)を、クラスI MHC(例えば、対象中に存在するHLA対立遺伝子によってコードされるクラスI MHC)上にEBVペプチドを提示する抗原提示細胞(APC、すなわち、刺激細胞)とともにインキュベートし、それによって、サンプルにおいてペプチド特異的CTLの増殖を誘導することによって生成される。一部の実施形態では、刺激細胞は、PBMCをEBVペプチドをコードするウイルスベクターとともにインキュベートし、それによって、刺激細胞がEBVペプチドを提示することを誘導することによって、EBVペプチドを提示するように作製される。一部の実施形態では、EBVペプチドは、LMP1ペプチド若しくはその断片、LMP2Aペプチド若しくはその断片及び/又はEBNA1ペプチド若しくはその断片を含む。一部の実施形態では、EBVペプチドは、表1に列挙される配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、組換え複製不能アデノウイルス(例えば、AdE1-LMPpoly)である。一部の実施形態では、刺激細胞は、B細胞、抗原提示T細胞、樹状細胞又は人工抗原提示細胞(例えば、CD80、CD83、41BB-L及び/又はCD86を発現する細胞株、例えば、aK562細胞)であり得る。一部の実施形態では、刺激細胞は、放射線照射される。
【０００７】
また、クラスI MHC上に提示されたEBVペプチドに特異的に結合するT細胞受容体を発現するCTLの調製後に、微量のウイルスベクター(例えば、AdE1-LMPpoly)の有無を決定する方法も本明細書において提供される。複製能を有するアデノウイルス又はAdE1-LMPpolyの存在を検出するアッセイ(ウイルス複製アッセイ)と並行して、活性ウイルスを示すウイルスmRNA転写物の存在について試験するために、高感度逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)技術が使用される。活性ウイルスは、抗原提示細胞によるT細胞へのウイルスエピトープの提示につながるので、製造方法の早期段階で存在する可能性がある。しかし、この方法は、後の時点でウイルスmRNAの有無を同定することができる。
【０００８】
一部の態様では、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を含むレスポンダー細胞の調製物が、活性ウイルスを本質的に含まないかどうかを評価する方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、ウイルスによって形質導入された刺激細胞を含むレスポンダー細胞の培養物が調製される。一部のこのような実施形態では、少なくとも1つのサンプルが、前記培養物から採取され、活性ウイルスの存在について評価される。例えば、ウイルス複製アッセイにおいて、前記サンプルの、複数のレポーター細胞株でウイルスプラークを形成する能力が評価される。好ましくは、前記サンプルにおけるウイルスmRNAの有無が決定される。一部のこのような実施形態では、サンプルがウイルスプラークを形成しない、及び/又は前記ウイルスmRNAが検出されない場合、培養物は、活性ウイルスを本質的に含まないと同定される。一部の態様では、活性ウイルスを本質的に含まない細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を含む調製物を生成する方法が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、抗原特異的CTL増殖は、レスポンダー細胞を、ウイルスによって形質導入された刺激細胞とともに所定のインキュベーション時間にわたり培養することによって誘導される。好ましくは、刺激細胞に、1つ以上の抗原をコードする1つ以上のウイルスベクターが形質導入される。一部の実施形態では、培養物のサンプルが採取され、複数のレポーター細胞株でウイルスプラークを形成する能力について評価される。好ましくは、培養物のサンプルは、ウイルスmRNAの有無について評価される。サンプルがウイルスプラークを形成しない、及び/又はウイルスmRNAの存在が検出されない場合、調製物は、活性ウイルスを本質的に含まないと同定される。好ましい実施形態では、調製物が活性ウイルスを含むと同定される場合、調製物は、所定のプロトコールに従って再播種、排除又は廃棄される。
【０００９】
ある特定の態様では、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の治療用調製物は投与に適していると同定する方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、CTLの治療用調製物のサンプルが得られ、複数のレポーター細胞株でウイルスプラークを形成する能力について評価される。好ましくは、サンプルにおけるウイルスmRNAの有無が決定される。サンプルがウイルスプラークを形成しない、及び/又はウイルスmRNAが検出されない場合、調製物はレシピエントへの投与に適していると同定される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】手順及び実験群を概説するフローダイヤグラムを示す図である。
【図２】感染後経時的推移にわたる、RT-PCRによるAdE1-LMPpoly E1PT mRNA転写物の検出を示す図である。3ドナーのデータが得られた。NDは、データなし(抽出されたRNAが不十分)を示す。
【図３】ローディングコントロールのためのハウスキーピング遺伝子転写物の検出を示す図である。Ctは、サイクル閾値(すなわち、遺伝子の検出が可能になるPCRサイクル)を示す。NDは、データが集められなかったこと(抽出されたRNAが不十分)を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一般
クラスI MHC上に提示されたペプチドに特異的に結合するT細胞受容体を発現するCTLの製造は、定義された抗原に対するT細胞増大を必要とする。抗原送達は、組換えウイルスを用いる、健常ドナー由来の末梢血単核細胞(PBMC)のサンプルのウイルス形質導入によってであり得る。形質導入されたPBMCは、抗原提示細胞として働き、「刺激細胞」と呼ばれる。刺激細胞を形質導入するために使用されるウイルスベクターは、組換えの複製不能ウイルス(例えば、アデノウイルス、例えば、AdE1-LMPpoly)であり得る。PBMCの別個のサンプル(例えば、形質導入に使用されない同一ドナー由来のPBMC又は異なる健常ドナー由来のPBMCのサンプル)は、「レスポンダー」と呼ばれ、クラスI MHC上に提示されたペプチドに特異的に結合するT細胞受容体を発現するCTLの活性成分となるT細胞を含有する。刺激細胞画分内の抗原提示細胞は、T細胞に対して抗原を提示し、したがって、レスポンダー画分の抗原特異的T細胞の増殖を活性化し、誘導する。
【００１２】
したがって、例えば、クラスI MHC上に提示されたEBVペプチドに特異的に結合するT細胞受容体を発現する同種又は自己細胞傷害性T細胞(CTL)を生成する方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、APCは、例えば、アデノウイルスベクター、例えば、AdE1-LMPpolyによるPBMC(刺激細胞)のウイルス感染によって生成される。AdE1-LMPpolyベクターは、Gly-Alaリピートが枯渇したEBNA1配列と融合しているLMP1及びLMP2由来の定義されたCTLエピトープのポリエピトープをコードする。AdE1-LMPpolyベクターは、例えば、各々参照により本明細書に組み込まれる、Smithら、Cancer Research 72巻:1116頁(2012年);Duraiswamyら、Cancer Research 64巻:1483〜9頁(2004年);及びSmithら、J. Immunol 117巻:4897〜4906頁(2006年)に記載されている。一部の実施形態では、刺激細胞が、T細胞を含有する非感染PBMC(レスポンダー)と混合されて、T細胞に対してEBVポリエピトープを提示する。一部の実施形態では、EBVポリエピトープを提示されたウイルス特異的T細胞が、増殖に向けて活性化され、誘導される。
【００１３】
本発明のある特定の態様では、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を含むレスポンダー細胞の調製物は、活性ウイルスを本質的に含まないと同定する方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、ウイルスによって形質導入された刺激細胞を含むレスポンダー細胞の培養物が調製される。ある特定の実施形態では、少なくとも1つのサンプルが前記培養物から採取され、活性ウイルスの存在について評価される。好ましくは、例えば、ウイルス複製アッセイにおいて、前記サンプルの、複数のレポーター細胞株でウイルスプラークを形成する能力が評価される。より好ましくは、前記サンプルにおけるウイルスmRNAの有無が決定される。一部のこのような実施形態では、サンプルがウイルスプラークを形成しない、及び/又は前記ウイルスmRNAが検出されない場合、培養物は、活性ウイルスを本質的に含まないと同定される。ある特定の態様では、活性ウイルスを本質的に含まない細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を含む調製物を生成する方法が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、抗原特異的CTL増殖は、レスポンダー細胞を、ウイルスによって形質導入された刺激細胞とともに所定のインキュベーション時間にわたり培養することによって誘導される。好ましくは、刺激細胞に、1つ以上の抗原をコードする1つ以上のウイルスベクターが形質導入される。一部の実施形態では、培養物のサンプルが採取され、複数のレポーター細胞株でウイルスプラークを形成する能力について評価される。好ましくは、培養物のサンプルは、ウイルスmRNAの有無について評価される。調製物は、サンプルがウイルスプラークを形成しない、及び/又はウイルスmRNAの存在が検出されない場合、活性ウイルスを本質的に含まないと同定される。好ましくは、調製物は、調製物が活性ウイルスを含むと同定される場合、所定のプロトコールに従って再播種、排除又は廃棄される。
【００１４】
ある特定の態様では、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の治療用調製物は、レシピエントに投与するのに適していると同定する方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、CTLの治療用調製物のサンプルが得られ、複数のレポーター細胞株でウイルスプラークを形成する能力について評価される。好ましくは、サンプルにおけるウイルスmRNAの有無が決定される。このような実施形態では、調製物は、サンプルがウイルスプラークを形成しない、及び/又は前記ウイルスmRNAが検出されない場合、レシピエントに投与するのに適していると同定される。好ましくは、ウイルスプラーク及びウイルスmRNAは、アデノウイルスによる。最も好ましくは、本明細書において提供されるような方法は、レシピエントにCTLを投与することに先立って実施される。
【００１５】
一部の実施形態では、レスポンダー細胞及び刺激細胞は各々、末梢血単核細胞(PBMC)に由来する。一部のこのような実施形態では、レスポンダー細胞及び刺激細胞は各々、同一ドナー由来のPBMCに由来する。他の実施形態では、レスポンダー細胞及び刺激細胞は各々、異なるドナー由来のPBMCに由来する。
【００１６】
レスポンダー細胞に対する提示に先立って、刺激細胞に、ヘルペスウイルス抗原をコードする核酸配列を含むウイルスベクター、好ましくは、アデノウイルスベクターが形質導入される。一部のこのような実施形態では、アデノウイルスベクターは複製不能である。より好ましくは、アデノウイルスベクターは、1つ以上のEBV抗原をコードする核酸配列を含む。1つ以上のEBV抗原は、LMP1ペプチド若しくはその断片、LMP2Aペプチド若しくはその断片及び/又はEBNA1ペプチド若しくはその断片を含み得る。最も好ましくは、アデノウイルスベクターは、AdE1-LMPpolyであり、Gly-Alaリピートが枯渇したEBNA1配列と融合しているLMP1及びLMP2由来の定義されたCTLエピトープのポリエピトープをコードする。一部の実施形態では、刺激細胞は、レスポンダー細胞(例えば、非感染PBMC)とともに培養すること(すなわち、それに対する提示)に先立って、1つ以上のサイトカインとともにインキュベートされる。このような刺激細胞は、B細胞、抗原提示T細胞、樹状細胞、人工抗原提示細胞及び/又はaK562細胞を含み得る。
【００１７】
抗原特異的T細胞は、刺激細胞画分によって抗原を提示されると、活性化及び増殖を達成するが、このような刺激細胞は、最終回収CTL産物において望ましいものではない。さらに、能力のある（コンピテント）ウイルスの形成につながる、細胞を増殖させることにおける任意のウイルス組換え事象のリスクを最小化するために、刺激細胞PBMCは、その増殖を阻害するために、例えば、ガンマ線を用いる照射又は薬剤、例えばマイトマイシンCに対する曝露によって、レスポンダーとともに培養することに先立って処置及び/又は改変される。このような培養条件では、レスポンダー細胞のウイルス特異的T細胞に、非増殖性刺激細胞によってEBVポリエピトープが提示される。一部のこのような実施形態では、培養物は、サンプルを採取する前の少なくとも24時間、少なくとも5日、少なくとも8日、少なくとも11日、少なくとも14日、少なくとも17日又は少なくとも20日にわたり維持される。好ましくは、培養物は、8日のインキュベーション時間後に活性ウイルスを本質的に含まない。ある特定の実施形態では、培養物は再播種される。好ましい実施形態では、培養物は、抗原性再刺激を用いて(例えば、新鮮な、非増殖性抗原提示刺激細胞を用いて)再播種される。一部のこのような実施形態では、培養物は、必要に応じて再播種され、前記再播種培養物は、サンプルを採取する前の少なくとも24時間、少なくとも5日、少なくとも8日、少なくとも11日、少なくとも14日、少なくとも17日又は少なくとも20日にわたり維持される。当業者ならば、培養物における細胞増殖は変わり得るものであり、栄養分及び酸素の必要量によって、並びに廃棄物、例えば二酸化炭素及び乳酸の蓄積によって制限されるということは理解するであろう。そのようなものとして、当業者ならば、本発明のCTLを達成するために、適当な培養及び(必要に応じて)再播種スケジュールを経験的に決定することができるであろう。ある特定の実施形態では、培養物は、所定のCTL回収日まで維持される。一部のこのような実施形態では、培養物の評価及び活性ウイルスの有無の決定は、回収日に先立って及び/又は回収日当日に行う。最も好ましくは、本明細書において開示される培養物及び/又は調製物は、CTL回収の時点で活性ウイルスを本質的に含まない。
【００１８】
一部の実施形態では、レスポンダー(CTL)培養物の評価及び活性ウイルスの検出は、ウイルス複製アッセイによって実施される。ある特定の実施形態では、レスポンダー培養物のサンプルは、レポーター細胞株とともにインキュベートされる。一部のこのような実施形態では、サンプルは、培養上清(例えば、レスポンダー培養物から採取された培地)を含む。好ましくは、サンプルは、細胞溶解物から調製される。ある特定の好ましい実施形態では、レポーター細胞株は、複製不能ウイルスの成長を可能にする許容細胞株である。例えば、アデノウイルス(例えば、AD293)のE1領域によってコードされる遺伝子を発現するレポーター細胞株は、組換えアデノウイルスベクター(例えば、AdE1-LMPpoly)におけるE1欠失を補完する。ある特定の実施形態では、レポーター細胞株は、複製能を有するウイルスに対して感受性である非許容細胞株、例えば内因性E1を産生せず、したがって、E1欠失を含む組換えアデノウイルスベクターの複製を支持することができないA549細胞である。したがって、レスポンダー培養物サンプルとともにインキュベーション後、レポーター細胞株は、顕微鏡検査によって細胞変性効果について評価される。細胞変性効果は、観察、例えば細胞の丸み（rounding）及び/又は単層の透明化を含む。細胞変性効果は、レポーター細胞培養物の単層におけるウイルスプラーク(例えば、細胞破壊の局在領域)として存在し得る。したがって、好ましい実施形態では、ウイルスに対して感受性であるレポーター細胞株において、サンプルが、細胞変性効果を生成しない、又はウイルスプラークを形成しないことを確認することによって、調製物は、活性ウイルスを本質的に含まないと同定される。当業者ならば、適当なウイルスベクター及びレポーター細胞株は、このような細胞変性効果の外観及び質に基づいて、本発明の実施に含めるために選択されることを理解するであろう。例えば、ウイルスプラークの外観は、レポーター細胞株、ウイルス及び培養条件に応じて変わる。高病原性又は溶解性ウイルスは、透明なプラークをもたらし、一方で、レポーター株の一部を死滅させるだけ、又は細胞成長の速度を低減するだけのウイルスは、濁ったプラークをもたらす。
【００１９】
ある特定の実施形態では、核酸増幅技術は、CTLにおいて微量の活性ウイルスが存在しないことを実証するために使用される。一部の実施形態では、微量の活性ウイルスを検出するために使用される技術は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)である。ある特定の好ましい実施形態では、定量的RT-PCRは、微量の活性アデノウイルスが、CTL培養物に、又は最終CTL産物に最終的に存在しないことを実証するために使用される。RT-PCRは、適宜設計されたプライマーとともに、いくつかの逆転写酵素のうちのいずれか1つによって、RNA分子(又はその標的化される配列)が、その相補的DNA(cDNA)配列に変換され、新たに合成されたcDNAが、PCR手順を使用して増幅される技術である。逆転写及びPCRによる増幅を支持するために、転写物が、サンプル(例えば、培養上清又は細胞溶解物)中に存在しなければならない。一部の実施形態では、RT-PCRにおいて使用するためにサンプルからRNAが抽出される。PCRの非常に高い感度を考慮すると、非常に低い存在量で存在する転写物の検出及び定量化に特に適合している。一部の実施形態では、RT-PCRを使用するmRNAの定量化は、逆転写酵素反応/cDNA合成からPCR増幅への全反応が単一容器中で起こる1ステップ反応として達成される。他の実施形態では、RT-PCRを使用するmRNAの定量化は、逆転写酵素反応及びPCR増幅が、別個の容器中で逐次実施される2ステップ反応として達成される。好ましい実施形態では、使用される技術は、固定サイクル数後に蓄積された標的配列の量よりも、標的配列の増幅が最初に検出されるPCRサイクリングの間の特定の時点（point in time）にあることによって増幅反応が特徴付けられる定量的RT-PCRである。より好ましくは、増幅産物は、蛍光色素を使用して検出される。例えば、5'末端にレポーターフルオロフォアを、3'末端にクエンチャー色素を含むオリゴヌクレオチドプローブが構築され得る。空間を介する蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)によって、プローブは無傷でありながら、クエンチャー色素の近接が、レポーター色素によって発せられる蛍光を大幅に低減する。好ましい実施形態では、オリゴプローブは、配列番号29を含む。標的配列(例えば、AdE1-LMPpolyのEBNA1及びE1-LMPpolyポリエピトープの接合部)が存在する場合、プローブは、プライマー部位の1つから下流にアニーリングし、プライマーが伸長されるにつれ、Taq DNAポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性によって切断される。プローブの切断は、蛍光色素をクエンチャー色素から分離し、したがって、標的配列の増幅サイクルごとに、定量可能な蛍光シグナル強度を増大する。一部の実施形態では、プライマーは、AdE1-LMPpolyに特異的な核酸配列又は野生型内因性ウイルスに共通の核酸配列とハイブリダイズし、増幅するように設計される。好ましくは、プライマーセットは、EBNA1及びE1-LMPpolyポリエピトープの接合部でAdE1-LMPpolyの核酸配列を増幅するように設計される。より好ましい実施形態では、プライマーは、配列番号27及び配列番号28を含む。増幅されるべき公知の標的配列を考慮すると、本明細書に記載されるような本発明を実施するためのプライマーの選択及び設計は、当業者の範囲内である。
【００２０】
好ましい実施形態では、培養サンプルが適当なレポーター細胞株でウイルスプラークを形成しない、及び/又はサンプルが検出可能なウイルスmRNAを有さない場合、CTLは、使用及び/又は保存に先立って処理するために培養物から回収される。逆に、一部の実施形態では、培養サンプルが適当なレポーター細胞株でウイルスプラークを形成する、及び/又は前記サンプルにおいてウイルスmRNAが検出される場合、培養物は、所定のプロトコールに従って再播種、排除及び/又は廃棄される。
【００２１】
定義
便宜上、本明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語をここに集める。
【００２２】
冠詞「1つの(a)」及び「1つの(an)」は、本明細書において、その冠詞の文法的目的語の1つ又は1つ超(すなわち、少なくとも1つ)を指すために使用される。例として、「1つの要素」とは、1つの要素又は1を超える要素を意味する。
【００２３】
本明細書で使用するとき、用語「投与する」とは、医薬品又は組成物を対象に提供することを意味し、限定されないが、医療従事者による投与及び自己投与が含まれる。このような薬剤には、例えば、本明細書に記載のペプチド、本明細書において提供される抗原提示細胞及び/又は本明細書において提供されるCTLが含有され得る。
【００２４】
「結合する」又は「相互作用する」という用語は、例えば生理学的条件下での静電相互作用、疎水性相互作用、イオン性相互作用及び/又は水素結合相互作用による、2つの分子間、例えば、TCRとペプチド/MHCとの間の、安定な会合(association)であり得る、会合を指す。
【００２５】
「生物学的サンプル（生体サンプル）」、「組織サンプル」、又は単に「サンプル」という用語は、それぞれ、対象の組織から得られた細胞の集合物を指す。組織サンプルの供給源は、新鮮な、凍結された及び/又は保存された臓器、組織サンプル、生検又は吸引物からのような固体組織、血液又は任意の血液成分、血清、血液、体液、例えば、脊髄液、羊水、腹水又は間質液、又は対象の妊娠若しくは発生の任意の時点からの細胞であり得る。
【００２６】
本明細書で使用するとき、用語「サイトカイン」とは、細胞の機能に影響を及ぼし、免疫、炎症又は造血反応において細胞間の相互作用を調節する分子である任意の分泌型ポリペプチドを指す。サイトカインは、どの細胞がそれらを産生するかにかかわらず、モノカイン及びリンホカインを含むがこれらに限定されない。例えば、モノカインは、一般に、マクロファージ及び/又は単球などの単核細胞によって産生及び分泌されるものである。しかしながら、ナチュラルキラー細胞、線維芽細胞、好塩基球、好中球、内皮細胞、脳アストロサイト、骨髄間質細胞、表皮ケラチノサイト及びBリンパ球などの他の多くの細胞もモノカインを産生する。リンホカインは一般にリンパ球細胞によって産生されるものである。サイトカインの例としては、限定されるものではないが、インターロイキン-1（IL-1）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-8（IL-8）、腫瘍壊死因子アルファ（TNFα）、及び腫瘍壊死因子ベータ（TNFβ）が挙げられる。
【００２７】
用語「エピトープ」とは、抗体又はTCRに特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常、分子の化学的に活性な表面基、例えば、アミノ酸又は糖側鎖からなる。特定のエピトープは、抗体が結合することができるアミノ酸の特定の配列によって規定することができる。
【００２８】
本明細書で使用するとき、「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴わないで、合理的な利益/リスク比に見合った、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに適した薬剤、化合物、材料、組成物、及び/又は剤形を指す。
【００２９】
本明細書で使用するとき、「薬学的に許容される担体」という語句は、1つの臓器若しくは生体の部分から別の臓器若しくは生体の部分に運ぶか又は輸送することに関与する、薬学的に許容される材料、組成物又はビヒクル、例えば、液体若しくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、又は溶媒をカプセル化している材料などを意味する。それぞれの担体は、製剤の他の成分と相溶性を有し、患者に有害でないという意味で「許容される」ものでなければならない。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料の一部の例としては、以下が挙げられる:(1)糖、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース、(2)デンプン、例えば、トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン、(3)セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース、(4)粉末状トラガカント、(5)麦芽、(6)ゼラチン、(7)タルク、(8)賦形剤、例えば、カカオバター及び坐薬ワックス、(9)油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油、(10)グリコール、例えば、プロピレングリコール、(11)ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール、(12)エステル、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル、(13)寒天、(14)緩衝化剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム、(15)アルギン酸、(16)発熱物質不含水、(17)等張性生理食塩水、(18)リンゲル液、(19)エチルアルコール、(20)pH緩衝化溶液、(21)ポリエステル、ポリカーボネート及び/又はポリ無水物、及び(22)医薬製剤に使用される他の非毒性適合物質。
【００３０】
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」なる語は互換的に用いられる。それらは、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド又はそれらの類似体のいずれであれ、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を指す。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有してもよく、任意の機能を果たしうる。以下のものはポリヌクレオチドの非限定的な例である:遺伝子又は遺伝子断片のコード又は非コード領域、連鎖解析から定められる遺伝子座（複数可）、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含みうる。ヌクレオチド構造に対する修飾は、存在する場合には、重合体（ポリマー）の構築の前又は後で施されうる。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分との結合(コンジュゲート化)によって、さらに修飾されうる。本明細書で提供されている全ての核酸配列において、UヌクレオチドはTヌクレオチドと交換可能である。
【００３１】
本明細書で使用するとき、状態を「予防する」治療薬は、障害又は状態の発症前に統計サンプル(statistical sample)に投与された場合、処置されていない対照サンプルと比較して、処置されたサンプルにおける障害若しくは状態の発生を低下させ、又は処置されていない対照サンプルと比較して、障害若しくは状態の1つ以上の症状の発症を遅延させるか若しくはその重症度を低下させる化合物を指す。
【００３２】
本明細書で使用するとき、「特異的結合」とは、TCRがMHC（例えばクラスI MHC又はクラスII MHC）上に提示されたペプチドに結合する能力を指す。典型的には、TCRは、少なくとも約10-4M以下のKDのアフィニティでそのペプチド/MHCに特異的に結合し、そして非特異的かつ無関係のペプチド/MHC複合体（例えば、BSAペプチド又はカゼインペプチドを含むもの）への結合に対するアフィニティよりも少なくとも10倍小さい、少なくとも100倍小さい、又は少なくとも1000倍小さいアフィニティ（KDにより表されるようなもの）で所定の抗原/結合パートナーに結合する。
【００３３】
本明細書で使用するとき、用語「対象」は、処置又は治療のために選択されたヒト又は非ヒト動物を意味する。
【００３４】
本明細書で使用するとき、用語「処置」は、臨床病理の経過中に処置される個体の自然経過を変化させるように設計された臨床的介入を指す。処置の望ましい効果には、進行速度の低下、病理学的状態の改善若しくは緩和、及び特定の疾患、障害若しくは状態の寛解若しくは改善された予後が含まれる。個体は、例えば、特定の疾患、障害又は状態に関連する1つ以上の症状が緩和されるか又は除去された場合に、成功的に「処置」される。
【００３５】
用語「ベクター」とは、それによって生物、細胞又は細胞成分間で核酸を増殖及び/又は移動させることができる手段を指す。ベクターとしては、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、及び人工染色体などが挙げられ、これらは自律的に複製することができてもできなくてもよく、又は宿主細胞の染色体に組み込まれてもよい。
【００３６】
ペプチド
一部の実施形態では、自己免疫障害（例えばMS、SAD及び/又はIBD）を処置するための、クラスI MHC上に提示されるEBVエピトープを含むペプチドに特異的に結合するTCRを発現する同種（allogeneic）又は自己（autologous）CTLを生成する方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、CTLは、CTLを含むサンプル(すなわち、PBMCサンプル)を、本明細書に記載されているEBVエピトープの1つ以上を提示する抗原提示細胞(APC)(例えば、クラスI MHC複合体上にEBVエピトープを含む本明細書に記載されているペプチドを提示するAPC)とともにインキュベートすることによって、生成される。
【００３７】
一部の実施形態では、本明細書において提供されるペプチドは、任意のEBVウイルスタンパク質の配列(例えば、任意のEBVタンパク質の少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個の連続したアミノ酸の配列)を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるペプチドは、EBVウイルスタンパク質の25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11又は10個以下の連続したアミノ酸を含む。
【００３８】
一部の実施形態では、本明細書において提供されるペプチドは、LMP1の配列(例えば、LMP1の少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個の連続したアミノ酸の配列)を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるペプチドは、LMP1の25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11又は10個以下の連続したアミノ酸を含む。例示的なLMP1アミノ酸配列を以下(配列番号1)に提供する:
1  mdldlergpp gprrpprgpp lssyialall llllallfwl yiimsnwtgg allvlyafal
61  mlviiiliif ifrrdllcpl galcllllmi tlllialwnl hgqalylgiv lfifgcllvl
121 giwvyfleil wrlgatiwql lafflaffld illliialyl qqnwwtllvd llwlllflai
181 liwmyyhgqr hsdehhhdds lphpqqatdd ssnhsdsnsn egrhhllvsg agdapplcsq
241 nlgapgggpd ngpqdpdntd dngpqdpdnt ddngphdplp qdpdntddng pqdpdntddn
301 gphdplphnp sdsagndggp pnlteevenk ggdrgppsmt dggggdphlp tlllgtsgsg
361 gddddphgpv qlsyyd
【００３９】
一部の実施形態では、本明細書において提供されるペプチドは、LMP2Aの配列(例えば、LMP2Aの少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個の連続したアミノ酸の配列)を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるペプチドは、LMP2Aの25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11又は10個以下の連続したアミノ酸を含む。例示的なLMP2Aアミノ酸配列を以下(配列番号2)に提供する:
1 mgslemvpmg agppspggdp dgddggnnsq ypsasgsdgn tptppndeer esneeppppy
61 edldwgngdr hsdyqplgnq dpslylglqh dgndglpppp ysprddssqh iyeeagrgsm
121 npvclpviva pylfwlaaia ascftasvst vvtatglals llllaavass yaaaqrkllt
181 pvtvltavvt ffaicltwri edppfnsllf allaaagglq giyvlvmlvl lilayrrrwr
241 rltvcggimf lacvlvlivd avlqlspllg avtvvsmtll llafvlwlss pgglgtlgaa
301 lltlaaalal laslilgtln lttmfllmll wtlvvllics scsscpltki llarlflyal
361 allllasali aggsilqtnf kslsstefip nlfcmllliv agilfilail tewgsgnrty
421 gpvfmclggl ltmvagavwl tvmtntllsa wiltagflif ligfalfgvi rccryccyyc
481 ltleseerpp tpyrntv
【００４０】
一部の実施形態では、本明細書において提供されるペプチドは、EBNA1の配列(例えば、EBNA1の少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個の連続したアミノ酸の配列)を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるペプチドは、EBNA1の25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11又は10個以下の連続したアミノ酸を含む。例示的なEBNA1アミノ酸配列を以下(配列番号3)に提供する:
1 pffhpvgead yfeylqeggp dgepdvppga ieqgpaddpg egpstgprgq gdggrrkkgg
61 wfgkhrgqgg snpkfeniae glrvllarsh vertteegtw vagvfvyggs ktslynlrrg
121 talaipqcrl tplsrlpfgm apgpgpqpgp lresivcyfm vflqthifae vlkdaikdlv
181 mtkpaptcni kvtvcsfddg vdlppwfppm vegaaaegdd gddgdeggdg degeegqe
【００４１】
一部の実施形態では、ペプチドは、表1に列挙されたエピトープの配列を含む。
【００４２】
【表１】
2021526826.tif 000002
【００４３】
一部の実施形態では、本明細書において提供されるペプチドは、2つ以上のEBVエピトープを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるペプチドは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個のEBVエピトープを含む。例えば、一部の実施形態では、本明細書において提供されるペプチドは、リンカー(例えば、ポリペプチドリンカー)によって連結された2つ以上のEBVエピトープを含む。
【００４４】
一部の実施形態では、ペプチドの配列は、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個以上)の保存的配列修飾を除いてEBVウイルスタンパク質配列を含む。本明細書で使用するとき、用語「保存的配列修飾」は、TCRとMHC上に提示されたアミノ酸配列を含有するペプチドとの間の相互作用に有意に影響しないか又はそれを変更しないアミノ酸修飾を指すことが意図される。このような保存的修飾には、アミノ酸の置換、付加(例えば、ペプチドのN末端又はC末端へのアミノ酸の付加)及び欠失(例えば、ペプチドのN末端又はC末端からのアミノ酸の欠失)が含まれる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。したがって、本明細書に記載されているペプチドの1つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置換することができ、変更されたペプチドは、当該技術分野において公知である方法を使用してTCR結合の保持について試験することができる。修飾は、当該技術分野において公知である標準的な技術、例えば、部位特異的突然変異誘発及びPCR媒介性突然変異誘発によって抗体に導入することができる。
【００４５】
一部の実施形態では、本明細書において提供されるペプチドは、EBVウイルスタンパク質配列(例えば、EBVウイルスタンパク質の断片の配列)と少なくとも80%、85%、90%、95%又は100%同一である配列を含む。2つのアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列は、最適な比較目的のためにアライメントされる(例えば、最適なアライメントのために第1及び第2のアミノ酸配列の一方又は両方にギャップを導入することができ、非同一配列は、比較目的のために無視することができる)。次に、対応するアミノ酸位置のアミノ酸残基を比較する。第1の配列における位置が第2の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基によって占有される場合、それらの分子はその位置で同一である。2つの配列間の同一性パーセントは、2つの配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れた上での、配列によって共有される同一位置の数の関数である。
【００４６】
一部の実施形態では、ペプチドは、キメラペプチド又は融合ペプチドである。本明細書で使用するとき、「キメラペプチド」又は「融合ペプチド」は、天然では連結されていない配列を有する別個のペプチドに連結された、本明細書において提供される配列を有するペプチドを含む。例えば、別個のペプチドは、本明細書において提供されるペプチドのN末端又はC末端に、ペプチド結合を介して直接的に、又は化学リンカーを介して間接的に融合することができる。一部の実施形態では、本明細書において提供されるペプチドは、別個のEBVエピトープを含む別のペプチドに連結される。一部の実施形態では、本明細書において提供されるペプチドは、他のウイルス性疾患及び/又は感染性疾患由来のエピトープを含むペプチドに連結される。
【００４７】
本明細書において提供されるキメラペプチド又は融合ペプチドは、標準的な組換えDNA技術によって産生することができる。例えば、異なるペプチド配列をコードするDNA断片は、従来の技術に従って、例えば、ライゲーションのための平滑末端化又は突出末端化(stagger-ended)末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて付着端の補完、望ましくない接続を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、及び酵素ライゲーションを使用することによって、インフレームでライゲートされる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動DNA合成装置を含む従来の技術によって合成することができる。あるいは、遺伝子断片のPCR増幅は、2つの連続した遺伝子断片の間に相補的な突出部を生じさせるアンカープライマーを使用して行うことができ、その後、アニーリングし、再増幅してキメラ遺伝子配列を生成することができる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、John Wiley & Sons: 1992を参照されたい)。さらに、すでに融合部分をコードする多数の発現ベクターが市販されている。
【００４８】
本明細書において提供されるペプチドは、標準的なタンパク質精製技術を使用して適切な精製スキームによって細胞又は組織源から単離することができ、組換えDNA技術によって産生することができ、且つ/又は標準的なペプチド合成技術を使用して化学的に合成することができる。本明細書に記載されているペプチドは、本発明のペプチド(複数可)をコードするヌクレオチドの発現によって、原核宿主細胞又は真核宿主細胞において産生することができる。あるいは、このようなペプチドは、化学的方法によって合成することができる。組換え宿主における異種ペプチドの発現、ペプチドの化学合成、及びインビトロ翻訳の方法は、当該技術分野において周知であり、さらに、参照により本明細書に組み込まれるManiatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989)、第2版、Cold Spring Harbor, N. Y.、Berger及びKimmel、Methods in Enzymology、152巻、Guide to Molecular Cloning Techniques (1987)、Academic Press, Inc.、San Diego、Calif.、Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91:501、Chaiken I. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11:255、 Kaiserら(1989) Science 243:187、Merrifield, B. (1986) Science 232:342、Kent, S. B. H. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:957、Offord, R. E. (1980) Semisynthetic Proteins、Wiley Publishingに記載されている。
【００４９】
特定の態様では、本明細書に記載されているペプチドをコードする核酸分子が本明細書において提供される。一部の実施形態では、核酸分子はベクターである。一部の実施形態では、核酸分子は、本明細書に記載されている核酸分子を含むウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベースの発現ベクターである。一部の実施形態では、本明細書において提供されるベクターは、本明細書において提供される複数のエピトープ(例えば、ポリエピトープとして)をコードする。一部の実施形態では、本明細書において提供されるベクターは、本明細書において提供される少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個のエピトープ(例えば、表1に提供されるエピトープ)をコードする。
【００５０】
一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、例としてAdE1-LMPpoly）である。AdE1-LMPpolyベクターは、Gly-Ala反復欠乏型EBNA1配列に融合させたLMP1及びLMP2由来の規定されたCTLエピトープのポリエピトープをコードする。AdE1-LMPpolyベクターは、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれるSmithら、Cancer Research 72:1116 (2012)、Duraiswamyら、Cancer Research 64:1483〜9 (2004)、Smithら、J. Immunol 117:4897〜4906 (2006)に記載されている。
【００５１】
本明細書で使用するとき、用語「ベクター」とは、それに連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの1つのタイプは「プラスミド」であり、追加のDNAセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖DNAループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、追加のDNAセグメントはウイルスゲノムにライゲートされ得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的複製することができる(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、エピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムとともに複製することができる。さらに、特定のベクターは、遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」(又は単に「発現ベクター」)と呼ばれる。一部の実施形態では、発現ベクター中で1つ以上の調節配列(例えば、プロモーター)に機能的に連結された核酸が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、細胞は、本明細書において提供される核酸を転写し、それにより本明細書に記載されているペプチドを発現する。核酸分子は、細胞のゲノムに組み込まれ得、又はそれは染色体外にあり得る。
【００５２】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている核酸(例えば、本明細書に記載されているペプチドをコードする核酸)を含有する細胞が本明細書において提供される。細胞は、例えば、原核生物、真核生物、哺乳動物、鳥類、マウス及び/又はヒトであり得る。一部の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞はAPC(例えば、抗原提示T細胞、樹状細胞、B細胞、又はaK562細胞)である。本方法において、本明細書に記載されている核酸は、例えば送達ビヒクルを伴わない核酸として、送達試薬と組み合わせて、細胞に投与することができる。一部の実施形態では、当該技術分野において公知である任意の核酸送達方法を、本明細書に記載されている方法において使用することができる。適した送達試薬としては、限定されないが、例えば、Mirus Transit TKO親油性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン(例えば、ポリリジン)、アテロコラーゲン、ナノプレックス及びリポソームが挙げられる。本明細書に記載されている方法の一部の実施形態では、リポソームが、細胞又は対象に核酸を送達するために使用される。本明細書に記載されている方法における使用に適したリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成することができ、これは、一般的に、中性又は負に荷電したリン脂質及びステロール、例えば、コレステロールを含む。脂質の選択は、一般的に、因子、例えば、所望のリポソームサイズ及び血流中のリポソームの半減期を考慮することによって導かれる。リポソームを調製するための種々の方法が公知であり、例えば、それらの開示全体が参照により本明細書に組み込まれるSzokaら、(1980)、Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467、並びに米国特許第4,235,871号、同第4,501,728号、同第4,837,028号及び同第5,019,369号に記載されている。
【００５３】
細胞傷害性CTL
クラスI MHC上に提示されるEBVペプチドに特異的に結合するT細胞受容体を発現する同種（allogeneic）又は自己（autologous）CTLを対象に投与することにより、自己免疫疾患（例えばMS、SAD、IBD）を処置する方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、CTLは、細胞バンクからのものである。一部の実施形態では、MHCはクラスI MHCである。一部の実施形態では、クラスII MHCは、HLA-DMA、HLA-DOA、HLA-DPA、HLA-DQA又はHLA-DRAであるα鎖ポリペプチドを有する。一部の実施形態では、クラスII MHCは、HLA-DMB、HLA-DOB、HLA-DPB、HLA-DQB又はHLA-DRBであるβ鎖ポリペプチドを有する。一部の実施形態では、CTLは、対象に投与される前に細胞ライブラリ又はバンクに保存される。
【００５４】
一部の実施形態では、本明細書に記載されているペプチド(例えば、LMP1、LMP2A、又はEBNA1エピトープ配列を含むペプチド)を提示するAPCが本明細書において提供される。一部の実施形態では、APCは、B細胞、抗原提示T細胞、樹状細胞、又は人工抗原提示細胞(例えば、aK562細胞)である。
【００５５】
本プロセスで使用するための樹状細胞は、患者サンプルからPBMCを採取し、それらをプラスチックに付着させることによって調製することができる。一般的に、単球集団は留まり、他の全ての細胞を洗い流すことができる。次に、付着細胞集団をIL-4及びGM-CSFで分化させ、単球由来の樹状細胞を産生させる。これらの細胞は、IL-1β、IL-6、PGE-1及びTNF-α(樹状細胞の表面上の重要な共刺激分子をアップレギュレートする)の添加によって成熟され得、その後、本明細書において提供されるペプチドの1つ以上で形質導入される。
【００５６】
いくつかの実施形態では、APCは、人工抗原提示細胞、例えばaK562細胞などである。いくつかの実施形態では、人工抗原提示細胞は、CD80、CD83、41BB-L及び/又はCD86を発現するように操作されている。aK562細胞などの人工抗原提示細胞の例は、米国特許出願公開第2003/0147869号（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。
【００５７】
特定の態様において、本明細書に記載のEBVエピトープを含むペプチド及び/又はEBVエピトープをコードする核酸とAPCとを接触させることを含む、1つ以上のEBVエピトープを提示するAPCの生成方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、APCは照射される。一部の実施形態では、本明細書に記載されているペプチド(例えば、LMP1、LMP2A又はEBNA1エピトープ配列を含むペプチド)を提示するAPC。本明細書に記載されているペプチドを提示する細胞は、当該技術分野において公知である標準的な技術によって産生することができる。例えば、細胞にパルスを与えてペプチド取り込みを促進し得る。一部の実施形態では、細胞は、本明細書において提供されるペプチドをコードする核酸をトランスフェクトされる。本明細書に記載されているペプチドで細胞をパルスするステップを含む、抗原提示細胞(APC)を産生する方法が本明細書において提供される。抗原提示細胞を産生する例示的な例は、WO2013088114号に見ることができ、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００５８】
一部の実施形態において、MHC上に提示された本明細書に記載のペプチドを認識するTCR（例えば、αβTCR又はγδTCR）を発現するT細胞（例えば、CD4 T細胞及び/又はCD8 T細胞）が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、T細胞は、クラスI MHC上に提示される本明細書に記載のペプチドを認識するTCRを発現するCD8 T細胞（CTL）である。いくつかの実施形態では、T細胞は、クラスII MHC上に提示される本明細書に記載のペプチドを認識するCD4 T細胞（ヘルパーT細胞）である。
【００５９】
一部の実施形態では、本明細書に記載のEBVエピトープの1つ以上を認識するT細胞(例えば、CTL)を生成する、活性化する及び/又は増殖を誘導する方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、CTLを含むサンプル(すなわち、PBMCサンプル)は、本明細書において提供されるAPC(例えば、クラスI MHC複合体上にEBVエピトープを含むペプチドを提示するAPC、例えば、本明細書に記載のようにウイルス形質導入されたPBMC)とともに培養物中でインキュベートされる。一部の実施形態では、APCは、T細胞が得られた対象に対して自己である。一部の実施形態では、APCは、T細胞が得られた対象に対して自己（autologous）ではない。一部の実施形態では、T細胞を含有するサンプルは、本明細書において提供されるAPCとともに2回以上インキュベートされる。一部の実施形態では、T細胞は、少なくとも1つのサイトカインの存在下でAPCとともにインキュベートされる。一部の実施形態では、サイトカインは、IL-4、IL-7及び/又はIL-15である。APCを使用してT細胞の増殖を誘導するための例示的な方法は、例えば、米国特許出願公開第2015/0017723号に提供され、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６０】
一部の実施形態では、有効量の組成物を対象に投与することにより対象において自己免疫疾患を処置及び/又は予防するために使用される、本明細書において提供されるT細胞及び/又はAPCを含む組成物（例えば治療用組成物）が、本明細書において提供される。いくつかの態様では、組成物（例えば、同種（allogeneic）CTLを含む組成物などの医薬組成物）を使用して自己免疫障害を処置する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書に提供されている複数の（例えば、2つ以上の）CTLの組み合わせを含む。
【００６１】
治療方法
一部の実施形態では、本明細書において提供される同種CTLを対象に投与することによって、対象における自己免疫障害を処置する方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態において、同種CTLは、細胞バンク（例えば予め生成された第三者ドナー由来のエピトープ特異的CTLのバンク）から選択される。
【００６２】
一部の実施形態では、本明細書において提供される方法を使用して任意の自己免疫疾患を処置することができる。自己免疫疾患の例としては、例えば、糸球体腎炎、関節炎、拡張型心筋症様疾患、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、クローン病、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、スティル病、多発性硬化症、乾癬、アレルギー性接触皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、白斑尋常性ざ瘡、ベーチェット病、橋本病、アジソン病、皮膚筋炎、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、悪性貧血、無菌性疾患、天疱瘡、自己免疫性血小板性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、活動性慢性肝炎、アジソン病、抗リン脂質抗体症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性無酸症、セリアック病、クッシング症候群、皮膚筋炎、円板状エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、特発性副腎萎縮、特発性血小板減少症、インスリン依存性糖尿病、ランバート-イートン症候群、ルポイド肝炎、リンパ球減少症、複合性結合組織疾患、類天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、水晶体起因性ブドウ膜炎、結節性多発動脈炎、多腺性自己免疫性症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、レイノー症候群、再発性多発性軟骨炎、シュミット症候群、限局性強皮症(又はクレスト症候群)、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎、甲状腺中毒症、B型インスリン抵抗性、I型糖尿病、潰瘍性大腸炎及びヴェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【００６３】
一部の実施形態では、本明細書において提供される方法は、MSを処置するために使用される。一部の実施形態では、MSは、再発寛解型MS、二次進行型MS、一次進行型MS又は進行性再発型MSである。
【００６４】
一部の実施形態では、本明細書において提供される方法は、SADを処置するために使用される。例えば、特定の実施形態では、本明細書において提供される方法は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス及び/又はシェーグレン症候群を処置するために使用される。
【００６５】
一部の実施形態では、本明細書において提供される方法は、IBDを処置するために使用される。例えば、特定の実施形態では、本明細書において提供される方法は、クローン病(局所性腸疾患、例えば、不活性型及び活性型)、セリアック病（例えば、不活性型及び活性型)、及び/又は潰瘍性大腸炎(例えば、不活性型及び活性型)を処置するために使用される。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法は、過敏性腸症候群、顕微鏡的大腸炎、リンパ球プラズマ細胞性腸炎、セリアック病、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎、好酸球性腸炎、不確定性大腸炎、感染性大腸炎(ウイルス性、細菌性又は原生動物、例えば、アメーバ性大腸炎)(例えば、クロストリジウム・ディフィシル(clostridium dificile)大腸炎)、偽膜性大腸炎(壊死性大腸炎)、虚血性炎症性腸疾患、ベーチェット病、サルコイドーシス、強皮症、IBD関連異形成、異形成関連塊又は病変、及び/又は原発性硬化性胆管炎を処置するために使用される。
【００６６】
一部の実施形態では、本明細書に記載の治療用CTL調製物を対象に投与することにより対象において癌を処置する方法が本明細書に提供される。
【００６７】
一部の実施形態では、本明細書において提供される方法は、任意の癌を処置するために使用することができる。例えば、一部の実施形態において、本明細書に記載されている方法及びCTLは、任意の癌性又は前癌性腫瘍を処置するために使用され得る。一部の実施形態では、癌は固形腫瘍を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法及び組成物によって処置され得る癌には、限定されないが、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸管、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頚部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌又は子宮由来の癌細胞が含まれる。加えて、癌は、特に、以下の組織学的タイプであり得るが、これらに限定されない:新生物、悪性;癌腫;癌腫、未分化;巨細胞癌及び紡錘細胞癌、小細胞癌、乳頭癌、扁平上皮癌、リンパ上皮癌、基底細胞癌、毛母癌、移行上皮癌、乳頭状移行上皮癌、腺癌、ガストリン産生腫瘍、悪性;胆管癌、肝細胞癌、肝細胞癌及び胆管癌の合併、索状腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫性ポリープにおける腺癌、腺癌、家族性結腸ポリポーシス、固形癌、カルチノイド腫瘍、悪性;細気管支肺胞腺癌、乳頭状腺癌、色素嫌性癌、好酸性癌、好酸性腺癌、好塩基性癌、明細胞腺癌、顆粒細胞癌、濾胞腺癌、乳頭腺癌及び濾胞腺癌、非被包性硬化性癌、副腎皮質癌、類内膜癌、皮膚付属器癌、アポクリン腺癌、皮脂腺癌、耳垢腺癌、粘膜表皮癌、嚢胞腺癌、乳頭嚢胞腺癌、乳頭漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、粘液性腺癌、印環細胞癌、浸潤性導管癌、髄様癌、小葉癌、炎症性癌、乳房のパジェット病、腺房細胞癌、腺扁平上皮癌、扁平上皮化生を伴う腺癌、悪性胸腺腫、悪性の卵巣間質腫、悪性莢膜細胞腫、悪性顆粒膜細胞腫、悪性男性ホルモン産生細胞腫（malignant roblastoma）、セルトリ細胞腫、悪性ライディッヒ細胞腫、悪性脂質細胞腫瘍、悪性傍神経節腫、悪性乳房外傍神経節腫、褐色細胞腫、血管球血管肉腫、悪性黒色腫、無色素性黒色腫、表在拡大型黒色腫、巨大色素性母斑における悪性黒色腫、類上皮細胞黒色腫、悪性青色母斑、肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胎児性横紋筋肉腫、胞巣状横紋筋肉腫、間質肉腫、悪性混合腫瘍、ミュラー管混合腫瘍、腎芽腫、肝芽腫、癌肉腫、悪性間葉腫、悪性ブレンナー腫瘍、悪性葉状腫瘍、滑膜肉腫、悪性中皮腫、未分化胚細胞腫、胎児性癌、悪性奇形腫、悪性卵巣甲状腺腫、絨毛癌、悪性中腎腫、血管肉腫、悪性血管内皮腫、カポジ肉腫、悪性血管外皮腫、リンパ管肉腫、骨肉腫、傍骨性骨肉腫、軟骨肉腫、悪性軟骨芽細胞腫、間葉性軟骨肉腫、骨巨細胞腫、ユーイング肉腫、悪性歯原性腫瘍、エナメル芽細胞歯牙肉腫、悪性エナメル上皮腫、エナメル芽細胞線維肉腫、悪性松果体腫、脊索腫、悪性神経膠腫、上衣腫、星状細胞腫、原形質性星状細胞腫、線維性星細胞腫、星状芽細胞腫、神経膠芽腫、乏突起細胞腫、乏突起膠芽細胞腫、原始神経外胚葉性、小脳肉腫、神経節芽細胞腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、嗅神経原性腫瘍、悪性髄膜腫、神経線維肉腫、悪性神経鞘腫、悪性顆粒細胞腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、側肉芽腫、小リンパ球性悪性リンパ腫、びまん性大細胞悪性リンパ腫、濾胞性悪性リンパ腫、菌状息肉腫、他の指定される���ホジキンリンパ腫、悪性組織球増殖症、多発性骨髄腫、肥満細胞肉腫、免疫増殖性小腸疾患、白血病、リンパ性白血病、形質細胞白血病、赤白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、骨髄性白血病、好塩基球性白血病、好酸球性白血病、単球性白血病、肥満細胞性白血病、巨核芽球性白血病、骨髄肉腫、並びにヘアリー細胞白血病。
【００６８】
一部の実施形態では、本明細書において提供される方法は、EBV関連癌を処置するために使用される。一部の実施形態では、EBV関連癌は、EBV関連NPCである。一部の実施形態では、EBV関連癌は、移植後リンパ増殖性障害(PTLD)、NK/T細胞リンパ腫、EBV+胃癌、又はEBV+平滑筋肉腫である。
【００６９】
一部の実施形態では、対象は、ウイルス粒子が対象の血液中で検出可能であるようなウイルス（例えば、EBV）に曝露されたものである。一部の実施形態では、方法はさらに、（例えば、ペプチド特異的CTLを対象に投与する前又は後に）対象中のウイルス負荷を測定することを含む。対象中のウイルス負荷の決定は、免疫療法の有効性のための良好な予後マーカーであり得る。一部の実施形態では、CTLの選択は、さらに、対象中の（例えば、組織又は血液サンプル中の）ウイルスDNAコピーの数を決定することを含む。一部の実施形態では、ウイルス負荷は、2回以上測定される。
【００７０】
本明細書において提供される医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に毒性ではなく、特定の患者についての所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量、組成、及び投与様式を達成するように変化させ得る。
【００７１】
選択された投薬量レベルは、使用される特定の薬剤の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排出又は代謝速度、処置期間、使用される特定の化合物と併用して使用される他の薬物、化合物及び/又は材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康状態及び以前の病歴、並びに医学分野において周知である同様の因子などの様々な因子に依存する。
【００７２】
一部の実施形態では、本方法は、細胞バンク(例えば、エピトープ特異的CTLの予め生成された第三者ドナー由来のバンク)から同種（allogeneic）CTLを選択するステップを含む。一部の実施形態では、対象に存在するHLA対立遺伝子によってコードされるクラスI MHCに拘束されたTCRを発現するため、そのCTLが選択される。一部の実施形態では、CTL及び対象が少なくとも2つの(例えば、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つの)HLA対立遺伝子を共有し、CTLは共有HLA対立遺伝子によって拘束される場合に、そのCTLが選択される。一部の実施形態では、本方法は、予め生成された第三者ドナー由来のエピトープ特異的T細胞(すなわち、同種T細胞)のTCRレパートリーをフローサイトメトリーで試験するステップを含む。一部の実施形態では、エピトープ特異的T細胞は、四量体アッセイ、ELISAアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、蛍光顕微鏡アッセイ、エドマン分解アッセイ及び/又は質量分析アッセイ(例えば、タンパク質配列決定)を使用して検出される。一部の実施形態では、TCRレパートリーは、核酸プローブ、核酸増幅アッセイ及び/又は配列決定アッセイを使用して分析される。
【００７３】
[実施例]
[実施例1]
エピトープ特異的CTLの生成及びウイルス複製アッセイ
同種潜伏-2(latency-2)EBV標的化細胞傷害性Tリンパ球(同種L2 EBV CTL)、又はATA188（同種EBV-CTL産物）は、潜伏膜タンパク質1(LMP1)、LMP2及びEBNA1を含むEBVタンパク質抗原に特異的な、HLA適合の、インビトロ拡大増殖された抗原特異的T細胞である。健康なEBV血清陽性ドナーの末梢血単核球細胞(PBMC)から、ATA188を産生する。
【００７４】
健常ドナー由来の凍結PBMCを解凍し、RPMI培地中に回収した。細胞を2つの画分に分けた;細胞の1/3(刺激細胞(Stimulators))に、AdE1-LMPpolyアデノウイルスを37℃で1時間感染させた。次いで、刺激細胞を2回洗浄し、RPMI/AB血清培養培地に再懸濁し、2500cGy(2500ラド)で照射した。細胞の残りの2/3(レスポンダー)をRPMI/AB血清培地に移し、それらが刺激細胞と混合され得るまで37℃で保持した。9×106個の刺激細胞と2.1×107個のレスポンダー細胞との比で6ウェル(10cm2)GRex培養プレートにおいて、培養を開始した。1つのウェルを取り出し、内容物を1、5、8、11、14、17及び20日目の各々でサンプリングした。試験のためのサンプルをウイルス複製及びRT-PCRアッセイの間で分けた。活性ウイルスは、抗原提示細胞(刺激細胞)によるT細胞(レスポンダー細胞)に対するウイルスエピトープの提示につながるので、製造方法の早期段階で存在し、非増殖性刺激細胞が最終的に死滅するので、減少するはずであると予想される。しかし、前述のアッセイは、活性ウイルス(例えば、AdE1-LMPpoly)及び/又はウイルスmRNAが、CTL培養の後期の時点で及び/又は最終CTL産物において依然として検出され得るかどうかを決定するために使用された。実験概要のまとめは、図1に示されている。
【００７５】
[実施例2]
AdE1-LMPpoly及びウイルス複製アッセイ
2つのレポーター細胞株を使用して、残存するウイルス、AD293及びA549を検出する。AD293細胞株(Cell Biolabs, Inc.、カタログ番号AD-100から入手可能)は、ヒトアデノウイルス5型DNAで形質転換された初代胚ヒト腎臓から確立された永久株である。これらの細胞は、これらの細胞が組換えアデノウイルスベクター中のE1欠失を補完することを可能にするアデノウイルスのE1領域(E1a及びE1b)によってコードされる遺伝子を発現し、複製不能AdE1-LMPpolyのウイルス複製を可能にする。A549株(Sigma-Aldrich(登録商標)から入手可能)は、E1Aを欠くアデノウイルスの複製を測定するためのアッセイにおいて陰性対照として(例えば、細胞株AD293)、及び複製能を有するアデノウイルスを検出するための標的細胞株として適したヒト肺がん組織の外植された培養物に由来する永久株である。A549細胞は、さまざまな分子研究、例えば、抗腫瘍薬透過性及び有効性解析、感染アッセイ、呼吸免疫毒性試験、細胞老化研究及びサイトカイン発現プロファイリングにおけるその使用によって十分に特徴付けられている。細胞変性効果(例えば、プラーク形成)を、各細胞株で対照AdE1-LMPpoly及び野生型アデノウイルスとともに評価して、CTL培養物及び/又は調製物中に複製能を有する及び/又は複製不能アデノウイルスが存在するかどうかを決定する。
【００７６】
プレアッセイ調製物:
ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)、10%胎児ウシ血清(FCS)及びゲンタマイシンを含む細胞培養培地を、使用当日に新鮮なものにした。各細胞株(AD293及びA549)のバイアルを液体窒素保存から回収し、ドライアイス中に直ちに保持し、その後解凍した。バイアルを37℃の水浴中で迅速に解凍し、各々直ちにピペットで9mlの細胞培養培地に入れて、400gで10分間遠心分離した。上清を吸引し、各細胞株を10mlの細胞培養培地に再懸濁した。AD293及びA549細胞の各々を、標識したT25フラスコ中にピペットで入れ、最長3日間インキュベートした(37℃/6.5%±1% CO2)。
【００７７】
サンプル調製物:
最初の培養物(例えば、自己CTL増大培養物の1×106個細胞及び同種CTL増大培養物の1×107個細胞)からのサンプルを、400gで10分間遠心分離した。上清を吸引し、細胞ペレットを、1mLの血清不含(すなわち、FCSなし)DMEMに再懸濁した。
【００７８】
エタノール及びドライアイスを含む浴を準備した。再懸濁した細胞ペレットを、交互に、細胞を含有するチューブをエタノール-ドライアイス浴に入れて凍結し、続いて、37℃水浴中で解凍することによる3サイクルの凍結融解に供した。得られた溶解物を、400gで10分間遠心分離し、上清(細片を含まない細胞溶解物)を新しい10mLチューブに移した。さらに2mLの血清不含DMEMを添加して、3mLの総容量を達成した。これによって、各細胞株(すなわち、AD293及びA549)の96ウェルプレートの10試験ウェルに十分な溶解物及び保存のためのおよそ1mLの保持サンプルを得た。
【００７９】
アッセイ調製物:
最長3日後、滑らかな単層を形成した、オーバーコンフルエントではなかったAD293及びA549細胞の培養物を、インキュベーターから取り出し、生物学的安全キャビネットに移動して、継代(分割)した。単層を乱すことなく、培養フラスコをPBSで洗浄し、単層を3mLのヴェルセンでおよそ10分間解離させた。取り外したら、細胞を12mLの細胞培養培地を入れたチューブに移し、ボルテックス処理して再懸濁を確実にした。細胞カウントのために、50μLの細胞懸濁液を50μLのトリパンブルーで希釈し、それから、10μLを血球計算器に移した。細胞数に基づいて、AD293細胞及びA549細胞を希釈して、それぞれ、100μLの培養培地あたり0.5×104個細胞及び0.2×104個細胞の細胞濃度を達成した。
【００８０】
平底96ウェルプレートの各ウェルに、100μLのAD293細胞培養物(0.5×104個細胞)を添加した。同様に、別のプレートにおいて、各ウェルに100uLのA549細胞培養物(0.2×104個細胞)を添加した。次いで、プレートをパラフィルムで包んで蒸発を防ぎ、37℃/6.5%±1% CO2で一晩インキュベートした。翌日、50〜80%のコンフルエンシーを有する滑らかな単層についてプレートを検査した。80%よりも大きいコンフルエンシーを有するプレートを廃棄し、新しいプレートを調製した。
【００８１】
アッセイ
翌日、50〜80%のコンフルエンシーを有する滑らかな単層についてプレートを検査した。80%よりも大きいコンフルエンシーを有するプレートを廃棄し、新しいプレートを調製した。各プレート(すなわち、AD293及びA549)の10ウェルの各々に100μLのサンプル溶解物を添加した(すなわち、試験ウェル)。以下のとおりに、各プレートにおいて対照ウェルの3つの10ウェルセット(すなわち、1つの陰性及び2つの陽性対照)も調製した。陰性対照ウェルには、100μLの血清不含DMEMのみを与え、サンプル溶解物は与えなかった。陽性ウイルス対照ウェルは、試験ウェルと隣接しないウェルで以下のとおりに調製した。AdE1-LMPpolyアデノウイルス粒子の懸濁液は、1/1000希釈物を作製することによってAdE1-LMPpolyストックVMC606(ワーキングウイルスバンク)から調製した、すなわち、10μLのAdE1-LMPpolyを9.990mLの血清不含DMEMに希釈し、完全に混合した。AD293細胞でのAdE1-LMPpolyの成長の陽性対照として、各プレートからの10ウェルに、100μLの希釈AdE1-LMPpoly懸濁液を与えた。ヒトアデノウイルス5(ATCC(登録商標)VR-1516(商標))アデノウイルス粒子の懸濁液を、10μLのヒトアデノウイルス5ストックを9.99mLの血清不含DMEMにピペットで入れることによって調製し、十分に混合した。第2の希釈物は、第1の希釈物から10μLを取り、それを9.99mLの血清不含DMEMに添加し、懸濁液を完全に混合することによって調製した。各96ウェルのさらなる10ウェルに、複製能を有するアデノウイルスの陽性対照として100μLの希釈ヒトアデノウイルス5懸濁液を与えた。96ウェルプレートをパラフィルムで包み、インキュベーター(37℃/6.5%±1% CO2)に10〜12日間戻した。
【００８２】
顕微鏡を使用して、各ウェルを細胞変性効果(CPE)、例えば、細胞の丸み及び/又は単層の透明化(例えば、プラーク形成)について評価した。各細胞株の複製ウェルの各セットについて、CPEについて陽性のウェル数をカウントし、陽性ウェルのパーセンテージを算出した。手短には、アッセイを合格するには、AD293又はA549細胞のいずれか(陰性対照)における非感染細胞生存力対照ウェルにおいて陽性ウェルがあってはならない。試験ウェルを、細胞の丸み及び/又は単層の透明化(例えば、プラーク形成)が対照ウェルと目に見えて異なっている場合、CPEについて陽性とスコア付けした。AdE1-LMPpolyの陽性対照ウェルは、AD293培養物において100%陽性であるとスコア付けされるべきである。A549ウェルでは、このウイルスは、これらの細胞では不能であり、成長しないので、AdE1-LMPpolyについて陽性ウェルはあってはならない。このウイルスは、複製能を有し、両方の細胞株において成長するので、ヒトアデノウイルス5の陽性対照ウェルは、AD293及びA549細胞の両方において100%陽性であるべきである。合格した試験サンプルについて、A549細胞でサンプル溶解物ウェルにおいて陽性ウェルはあってはならないが、これは、能力を有する(感染性)アデノウイルスでの汚染を示すからである。
【００８３】
結果
3つのT細胞培養物経時的推移のすべての1日目に、細胞変性効果によって許容AD293細胞株においてAdE1-LMPpolyが検出された。3つの培養物のうちの1つのみ(AT0019)が、5日目及び8日目に検出可能なAdE1-LMPpolyを有していた。培養物のうち、8日目後に検出可能なAdE1-LMPpolyを有していたものはなかった。
【００８４】
A549細胞株における複製能を有するアデノウイルスの検出は、T細胞培養物からどの時点でも可能ではなかった(表2)。
【００８５】
AdE1-LMPpoly及び複製能を有するアデノウイルス(系統AD-5)両方の陽性対照を実験に含めた(表3)。
【００８６】
【表２】
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【００８７】
【表３】
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【００８８】
[実施例3]
RT-PCRによるAdE1-LMPpoly転写物の検出
Qiagen RNeasyキット(カタログ番号74136)を使用して細胞RNAを抽出し、Nanodrop分光光度計を使用してRNA量を決定した。RNAをDNアーゼ処置して、PCRに先立って残存するDNAを除去した。各PCRに同等RNA量を使用した(30ng)。PCR反応のためにQiagen OneStep RT-PCRキットを使用した。1ステップRT-PCR反応は、特異的3'プライマーを利用する30分の逆転写酵素を有する。定量的PCR反応を、40サイクルの間実施した。
【００８９】
プライマー及びプローブ
蛍光6-カルボキシフルオレセイン(FAM)及びブラックホールクエンチャー1(BQ1)蛍光標識オリゴプローブ及びプライマーは、表4に示されている。E1PTプライマーセットは、E1-LMPpoly遺伝子のEBNA1及びポリエピトープ領域の接合部にわたるPCRのために設計した。任意の野生型内因性アデノウイルスと、AdE1-LMPpolyの間を識別するように設計されている。対照GAPDハウスキーピング遺伝子のために、市販のプライマーセットをThermoFisher(カタログ番号4333764F)から購入した。
【００９０】
【表４】
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【００９１】
AdE1-LMPpoly特異的cDNA(mRNA)を、24時間及び8日の培養物の間でPBMCにおいて検出することができた(図2)。コピー数はこの期間の間に低減した。シグナルは、8日目後には検出不能であった(50コピーの検出限界未満)。細胞GAPDH遺伝子を、内部ローディングコントロールとして使用して、どの時点でも同等量のmRNAを実証した。mRNAローディングは、すべての時点で同等であると示され、結果は、図3に示されている。
【００９２】
結果
E1LMPpoly mRNA転写物を、24時間の早期から培養8日目まで検出することができた。感染刺激細胞によるAdE1-LMPpoly遺伝子の発現は、刺激細胞の抗原提示機能にとって必要であり、したがって、培養開始後の一定期間のこれらの遺伝子の発現が予想される。
【００９３】
最長8日目まで許容AD293細胞株において培養上清から残存するAdE1-LMPpolyウイルスを検出することができ、これは、RT-PCR結果と一致する。T細胞培養物から複製能を有するアデノウイルスをどの時点でも検出することができなかった(すなわち、複製能を有するアデノウイルスの、能力を有するアデノウイルスへの復帰につながる組換え事象がなかった)。
【００９４】
参照による組み込み
本明細書に記載のすべての刊行物、特許、特許出願及び配列受託番号は、個々の刊行物、特許又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的に、個別に示されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本明細書の定義を含め、本出願が支配する。
【００９５】
等価物
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態の多数の等価物を認識する、又は通常の実験のみを使用して確認することができる。このような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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