(57)【要約】解糖系インヒビターおよびＲＡＤ５１複合体インヒビターを使用する抗がん治療のための組成物、方法、およびキットが本明細書で提供される。抗がん治療のための組成物、方法、およびキットが、本明細書で提供される。本明細書中の開示は、がん細胞を標的化する２つの手段−代謝およびＤＮＡ修復−を組み合わせ、これら２つの領域を組み合わせて標的化することが、現在の標準治療処置より有効である総合的な致死効果を生じることを示す。具体的には、解糖系の阻害およびＲＡＤ５１の特異的阻害を通じてがん細胞を効果的に標的化するアプローチが、記載される。
2021514952.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞と解糖系インヒビターおよびＲＡＤ５１複合体インヒビターとを接触させる工程を包含する方法。
【請求項２】
前記解糖系インヒビターは、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２ＤＧ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＡＤ５１複合体インヒビターは、４，４’−ジイソチオシアノ−２，２’−スチルベンジスルホン酸（ＤＩＤＳ）、（Ｅ）−３−ベンジル−２−（２−（ピリジン−３−イル）ビニル）キナゾリン−４（３Ｈ）−オン（Ｂ０２）、および３−クロロ−１−（３，４−ジクロロフェニル）−４−（４−モルホリニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（ＲＩ−１）から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞は、がん細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記がん細胞は、解糖系依存性がん細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記がん細胞は、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）を発現する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記がん細胞は、Ｂ細胞がん細胞である、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｂ細胞がん細胞は、白血病細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記白血病細胞は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
解糖系インヒビターおよびＲＡＤ５１複合体インヒビターを含む組成物。
【請求項１１】
前記解糖系インヒビターは、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２ＤＧ）である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＲＡＤ５１複合体インヒビターは、４，４’−ジイソチオシアノ−２，２’−スチルベンジスルホン酸（ＤＩＤＳ）、Ｂ０２、およびＲＩ−１から選択される、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記解糖系インヒビターおよび前記ＲＡＤ５１複合体インヒビターの各々は、コントロール標準治療用量より低い用量で前記組成物に製剤化され、必要に応じて前記コントロール標準治療用量は、フルダラビンの標準治療用量である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
被験体に、解糖系インヒビターおよびＲＡＤ５１複合体インヒビターを投与する工程を包含する方法。
【請求項１５】
前記解糖系インヒビターは、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２ＤＧ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＡＤ５１複合体インヒビターは、４，４’−ジイソチオシアノ−２，２’−スチルベンジスルホン酸（ＤＩＤＳ）、Ｂ０２、およびＲＩ−１から選択される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験体は、がんを有する、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記がんは、解糖系依存性がんである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記がんは、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）を発現する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記がんは、Ｂ細胞がんである、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｂ細胞がんは、白血病である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記白血病は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記被験体は、ヒト被験体である、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記解糖系インヒビターおよび前記ＲＡＤ５１複合体インヒビターは、逐次的に投与される、請求項１４〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記解糖系インヒビターおよび前記ＲＡＤ５１複合体インヒビターは、同時に投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記解糖系インヒビターおよび前記ＲＡＤ５１複合体インヒビターは、コントロールと比較して、前記被験体においてＣＤ１９＋細胞を低減するために有効な量で投与される、請求項１４〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記解糖系インヒビターおよび前記ＲＡＤ５１複合体インヒビターは、コントロール標準治療用量より低い用量で投与され、必要に応じて前記コントロール標準治療用量は、フルダラビンの標準治療用量である、請求項１４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
解糖系インヒビター、ＲＡＤ５１複合体インヒビター、および必要に応じて１またはこれより多くの送達デバイスを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で２０１８年８月１７日出願の米国仮特許出願第６２／７６５，０２８号および２０１８年２月２３日出願の米国仮特許出願第６２／６３４，４００号（これらの各々は、その全体において本明細書に参考として援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
背景
解糖系は、哺乳動物細胞における主要なＡＴＰ生成経路であり、乳酸発酵またはピルビン酸酸化のいずれかにつながり得、乳酸発酵は、代謝されるグルコース１分子あたり、顕著に少ないＡＴＰ分子を生じる（１）。がん細胞は、正常細胞と比較して、高速の解糖系によって特徴づけられ、非効率なＡＴＰ生成にもかかわらず、過剰な乳酸発酵（ワーブルク効果といわれる現象）をもたらす（２−４）。この効果は、最初は新生物性の原因であると考えられていたが、今では、がんの多くのタイプにおける新生物細胞の重要な特徴と考えられている（５，６）。
非新生物細胞と比較して、がん細胞における解糖系の使用の増大が原因で、解糖系インヒビターは、がんを標的化する魅力的な手段と考えられている（７）。にもかかわらず、解糖系は、普遍的な代謝経路であるので、有効である用量での解糖系インヒビター（例えば、２−デオキシ−グルコース（２ＤＧ））によるその遮断は、有害な副作用を生じ得る（８−１０）。従って、解糖系インヒビターは、他の細胞傷害性治療との組み合わせにおいて低用量で試験されている（（１０）で総説される）。この組み合わせアプローチは、多くの悪性腫瘍を標的化するにおいて成功であることが示されているが、解糖系インヒビターと併用される大部分の化合物は、腫瘍特異的ではないので、非悪性細胞を損傷し得る（１０）。さらに、このような化合物はまた、変異または切断をもたらし得るＤＮＡ損傷を潜在的に導入し得、新悪性腫瘍（ｎｅｏｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ）を潜在的に生じる（（１０）で総説される）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Berg  JM,  Tymoczko  JL,  Stryer  L.  Biochemistry,  5th  Edition.  New  York:  W  H  Freeman;  2002.
【非特許文献２】Foley  GEL,  H.  Farber,  S.  Uzman,  B.  Adams,  R.  Studies  on  Human  Leukemia  Cells  in  Vitro.  The  Proliferation  and  Spread  of  Neoplastic  Cells.  Baltimore,  MD.:  The  Williams  &  Wilkins  Co;  1968.  p.  65  -97.
【非特許文献３】Gatenby  RA,  Gillies  RJ.  Why  do  cancers  have  high  aerobic  glycolysis?  Nat  Rev  Cancer.  2004;4(11):891-9.  Epub  2004/11/02.  doi:  10.1038/nrc1478.  PubMed  PMID:  15516961.
【非特許文献４】Vander  Heiden  MG,  Cantley  LC,  Thompson  CB.  Understanding  the  Warburg  effect:  the  metabolic  requirements  of  cell  proliferation.  Science.  2009;324(5930):1029-33.  Epub  2009/05/23.  doi:  10.1126/science.1160809.  PubMed  PMID:  19460998;  PMCID:  PMC2849637.
【非特許文献５】Pelicano  H,  Martin  DS,  Xu  RH,  Huang  P.  Glycolysis  inhibition  for  anticancer  treatment.  Oncogene.  2006;25(34):4633-46.  doi:  10.1038/sj.onc.1209597.  PubMed  PMID:  16892078.
【非特許文献６】Kim  JW,  Dang  CV.  Cancer's  molecular  sweet  tooth  and  the  Warburg  effect.  Cancer  Res.  2006;66(18):8927-30.  Epub  2006/09/20.  doi:  10.1158/0008-5472.CAN-06-1501.  PubMed  PMID:  16982728.
【非特許文献７】Chen  Z,  Lu  W,  Garcia-Prieto  C,  Huang  P.  The  Warburg  effect  and  its  cancer  therapeutic  implications.  J  Bioenerg  Biomembr.  2007;39(3):267-74.  Epub  2007/06/07.  doi:  10.1007/s10863-007-9086-x.  PubMed  PMID:  17551814.
【非特許文献８】Muley  P,  Olinger  A,  Tummala  H.  2-Deoxyglucose  induces  cell  cycle  arrest  and  apoptosisin  colorectal  cancer  cells  independent  of  its  glycolysis  inhibition.  Nutr  Cancer.  2015;67(3):514-22.  Epub  2015/03/10.  doi:  10.1080/01635581.2015.1002626.  PubMed  PMID:  25751508.
【非特許文献９】Vijayaraghavan  R,  Kumar  D,  Dube  SN,  Singh  R,  Pandey  KS,  Bag  BC,  Kaushik  MP,  Sekhar  K,  Dwarakanath  BS,  Ravindranath  T.  Acute  toxicity  and  cardio-respiratory  effects  of  2-deoxy-D-glucose:  a  promising  radio  sensitiser.  Biomedical  and  environmental  sciences  :  BES.  2006;19(2):96-103.  PubMed  PMID:  16827179.
【非特許文献１０】Zhang  D,  Li  J,  Wang  F,  Hu  J,  Wang  S,  Sun  Y.  2-Deoxy-D-glucose  targeting  of  glucose  metabolism  in  cancer  cells  as  a  potential  therapy.  Cancer  letters.  2014;355(2):176-83.  doi:  10.1016/j.canlet.2014.09.003.  PubMed  PMID:  25218591.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
要旨
抗がん治療のための組成物、方法、およびキットが、本明細書で提供される。本明細書中の開示は、がん細胞を標的化する２つの手段−代謝およびＤＮＡ修復−を組み合わせ、これら２つの領域を組み合わせて標的化することが、現在の標準治療処置より有効である総合的な致死効果を生じることを示す。具体的には、解糖系の阻害およびＲＡＤ５１の特異的阻害を通じてがん細胞を効果的に標的化するアプローチが、記載される。インヒビターのこの組み合わせは、がん細胞に対して予測外の相乗効果を生じる（例えば、実施例６を参照のこと）。
【０００５】
がんにおける解糖系経路の初期工程を標的化することは、十分に確立された治療ストラテジーである；しかし、そのがんに対して治療効果を誘発するために必要とされる用量は、その患者に対して有毒であり得る。結論として、多くの前臨床試験および臨床試験は、解糖系遮断と他の治療とを組み合わせている。しかし、これらの他の治療の大部分は、がん細胞を特異的に標的化しないので、それらはまた、正常組織に影響を及ぼす。長期間の処置では、これらの組み合わせた治療は、有害作用を生じ得る。
【０００６】
２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２ＤＧ）（非特異的解糖系インヒビター）によって効率的に標的化され得る多くの多様ながんモデル−自然発生的な患者由来の異種移植した腫瘍サンプル、または異種移植したヒトがん細胞−が本明細書で提供される。ＭＥＣ１細胞株、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）を発現する慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞株を使用して、治療用化合物のがん細胞特異性もまた、試験した。本明細書で提示されるデータは、ＭＥＣ１細胞が、４，４’−ジイソチオシアノ−２，２’−スチルベンジスルホン酸（ＤＩＤＳ）（特異的ＲＡＤ５１インヒビター）に感受性であることをさらに示した。ＲＡＤ５１は、正常な細胞機能に必要とされるが、それは相同組換え修復に必要とされることから、ＤＩＤＳは、ＡＩＤ陰性ＭＥＣ１細胞に対して有害効果を有しなかった。このことは、このＲＡＤ５１インヒビターがＡＩＤ陽性細胞にのみ影響を及ぼすことを示す。
【０００７】
解糖系インヒビターである２ＤＧをまた、自然発生的および患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）がんマウスモデルにおいて腫瘍負荷を緩和するために評価した。さらに、ここで示されるデータは、ＤＩＤＳが、異種移植した細胞株における腫瘍負荷をインビボで低減することを示した。最終的には、マウスにおいてインビボでの腫瘍負荷を低減することにおけるＤＩＤＳの有効性を、２ＤＧの効果によって増強した；ともに、有害効果のリスクを低下した投与量で使用した。これは、ＲＡＤ５１阻害および解糖系遮断の組み合わせが、ＡＩＤ陽性がんの有効な治療であることを示す。
【０００８】
２ＤＧおよびＤＩＤＳを、各々、単独で投与される場合に使用されるものより低い用量で組み合わせた場合、この組み合わせは、フルダラビン（現在ＣＬＬの標準治療処置）より有効であった。これは、２ＤＧによる解糖系の遮断が、ＤＩＤＳのような化合物でのＲＡＤ５１による相同組換えの阻害と一緒になって、正常組織に対する最小限の有害効果とともに、ＡＩＤ陽性がん細胞を標的化するための潜在的に有益な組み合わせであり得ることを示唆した。
【０００９】
解糖系インヒビターである２ＤＧ、およびＲＡＤ５１インヒビターであるＤＩＤＳは、相乗的に作用して、Ｂリンパ球ヒト慢性リンパ性白血病増殖をエキソビボで低減する。さらに、この細胞株を異種移植したマウスは、２ＤＧおよびＤＩＤＳの両方の存在下で腫瘍負荷の有意な低減を示した。これらのデータは、解糖系経路およびＤＮＡ修復が、Ｂリンパ球がんに対するよりよい化学療法を作り出すために同時に標的化され得ることを示唆する。
【００１０】
従って、本開示のいくつかの局面は、被験体（例えば、ヒト被験体）に、解糖系インヒビターおよびＲＡＤ５１複合体インヒビターを投与する工程を包含する方法を含む。いくつかの実施形態において、上記解糖系インヒビターは、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２ＤＧ）である。いくつかの実施形態において、上記ＲＡＤ５１複合体インヒビターは、４，４’−ジイソチオシアノ−２，２’−スチルベンジスルホン酸（ＤＩＤＳ）、Ｂ０２、およびＲＩ−１から選択される。いくつかの実施形態において、上記解糖系インヒビターは２ＤＧであり、上記ＲＡＤ５１複合体インヒビターはＤＩＤＳである。
【００１１】
上記被験体は、いくつかの実施形態において、がんを有する。いくつかの実施形態において、上記がんは、解糖系依存性がんである。いくつかの実施形態において、上記がんは、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）を発現する。いくつかの実施形態において、上記がんは、Ｂ細胞がんである。例えば、上記Ｂ細胞がんは、白血病であり得る。いくつかの実施形態において、上記白血病は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である。
【００１２】
本開示の他の局面は、細胞と、解糖系インヒビターおよびＲＡＤ５１複合体インヒビターとを接触させる工程を包含する方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記解糖系インヒビターは２ＤＧであり、上記ＲＡＤ５１複合体インヒビターはＤＩＤＳである。
【００１３】
上記細胞は、いくつかの実施形態において、がん細胞である。例えば、上記がん細胞は、解糖系依存性がん細胞であり得る。いくつかの実施形態において、上記がん細胞は、ＡＩＤを発現する。いくつかの実施形態において、上記がん細胞は、Ｂ細胞がん細胞である。例えば、上記Ｂ細胞がん細胞は、白血病細胞であり得る。いくつかの実施形態において、上記白血病細胞は、ＣＬＬ細胞である。
【００１４】
解糖系インヒビターおよびＲＡＤ５１複合体インヒビターを含む組成物がまた、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、上記解糖系インヒビターは２ＤＧであり、上記ＲＡＤ５１複合体インヒビターはＤＩＤＳである。いくつかの実施形態において、上記解糖系インヒビターおよび上記ＲＡＤ５１複合体インヒビターは、コントロール標準治療用量より低い用量で上記組成物に製剤化される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、上記解糖系インヒビターおよび上記ＲＡＤ５１複合体インヒビターは、逐次的に投与される。他の実施形態において、上記解糖系インヒビターおよび上記ＲＡＤ５１複合体インヒビターは、同時に投与される。
【００１６】
いくつかの実施形態において、上記解糖系インヒビターおよび上記ＲＡＤ５１複合体インヒビターは、コントロールと比較して、上記被験体においてＣＤ１９＋  細胞の数を低減するために有効な量で投与される。いくつかの実施形態において、上記解糖系インヒビターおよび上記ＲＡＤ５１複合体インヒビターは、コントロール標準治療用量より低い用量で投与される。いくつかの実施形態において、上記コントロール標準治療用量は、フルダラビンの標準治療用量である。
【００１７】
解糖系インヒビター、ＲＡＤ５１複合体インヒビター、および必要に応じて１またはこれより多くの送達デバイス（例えば、針／シリンジ）を含むキットがまた、本明細書で提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１−１】図１Ａ〜図１Ｅは、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２ＤＧ）が、自然発生的マウスがんモデルにおける腫瘍負荷を緩和したことを示すデータを提供する。図１Ａは、飲用水に溶解した２ＤＧ（６ｇ／Ｌ）で処置したＳＪＬマウスでの鼠径リンパ節腫瘍縮小を示す代表的画像である；非常に大きくなった脾臓が２ＤＧ処置によって１週間で縮小し、２週間の処置後には正常の外見に戻ったマウスの写真が示される。図１Ｂは、腫瘍退縮に対する２ＤＧの一時的効果、およびその後の再発を示す円グラフである（Ｎ＝７）。その７匹のマウスのうちの６匹が、２ＤＧ処置に十分に応答したが、そのマウスのうちのおよそ３／４は、５〜１１週間の処置の後に腫瘍復活を認めた（Ｎ＝７）。図１Ｃは、ｐ５３野生型（Ｔｒｐ５３＋／＋）マウスおよびｐ５３変異（Ｔｒｐ５３−／−）マウスのコンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンであり、胸腔における胸腺リンパ腫の最大貪食（ｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ）を示す。図１Ｄは、腹腔内注射を介して１週間に３回２ＤＧ（６７０ｍｇ／ｋｇ）またはグルコース（コントロール）で処置したＴｒｐ５３−／−マウスの生存曲線である。図１Ｅは、グルコースまたは２ＤＧ処置の間のマウスの体重を示すグラフである。
【図１−２】図１Ａ〜図１Ｅは、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２ＤＧ）が、自然発生的マウスがんモデルにおける腫瘍負荷を緩和したことを示すデータを提供する。図１Ａは、飲用水に溶解した２ＤＧ（６ｇ／Ｌ）で処置したＳＪＬマウスでの鼠径リンパ節腫瘍縮小を示す代表的画像である；非常に大きくなった脾臓が２ＤＧ処置によって１週間で縮小し、２週間の処置後には正常の外見に戻ったマウスの写真が示される。図１Ｂは、腫瘍退縮に対する２ＤＧの一時的効果、およびその後の再発を示す円グラフである（Ｎ＝７）。その７匹のマウスのうちの６匹が、２ＤＧ処置に十分に応答したが、そのマウスのうちのおよそ３／４は、５〜１１週間の処置の後に腫瘍復活を認めた（Ｎ＝７）。図１Ｃは、ｐ５３野生型（Ｔｒｐ５３＋／＋）マウスおよびｐ５３変異（Ｔｒｐ５３−／−）マウスのコンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンであり、胸腔における胸腺リンパ腫の最大貪食（ｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ）を示す。図１Ｄは、腹腔内注射を介して１週間に３回２ＤＧ（６７０ｍｇ／ｋｇ）またはグルコース（コントロール）で処置したＴｒｐ５３−／−マウスの生存曲線である。図１Ｅは、グルコースまたは２ＤＧ処置の間のマウスの体重を示すグラフである。
【００１９】
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、増殖よりむしろ解糖系感度が、肺ＰＤＸ腫瘍モデルにおける２ＤＧに対する影響されやすさを決定したことを示すデータを提供する。図２Ａは、解糖系依存性（ＴＭ００９２１）および解糖系非依存性（ＴＭ００２４４）のＰＤＸ肺腫瘍を、ＮＳＧＴＭマウスにおいて皮下に異種移植し、腫瘍成長を４週間にわたって測定したことを示す棒グラフである。成長を、各個々のマウス（Ｎ＝４〜５）に関する腫瘍の初期サイズに対して正規化し、倍率増大としてプロットした。図２Ｂは、２ＤＧまたはグルコース（コントロール）のいずれかで処置したマウスにおけるその２種の肺腫瘍の成長を示すグラフである。
【００２０】
【図３−１】図３Ａ〜３Ｄは、解糖系依存性ＭＥＣ１細胞株が、インビボでの２ＤＧに影響されやすいことを示すデータを提供する。図３Ａは、２種のＡＩＤ陽性Ｂ細胞株、ＭＥＣ１およびＣＣＲＦ−ＳＢの代謝比較のグラフである。ＣＣＲＦ−ＳＢおよびＭＥＣ１は、呼吸は等しいが、異なるレベルの解糖系を示した。ＮＲＧマウスに、ＣＣＲＦ−ＳＢ細胞またはＭＥＣ１細胞のいずれかを２週間にわたって異種移植し、６００ｍｇ／ｋｇの２ＤＧで２週間にわたって処置し、次いで、フローサイトメトリーによって負荷に関して測定した。図３Ｂは、その２種のＡＩＤ陽性Ｂ細胞株、ＭＥＣ１およびＣＣＲＦ−ＳＢが、エキソビボで類似の成長速度を有したことを示すグラフである。２回の実験においてＮ＝３。図３Ｃは、グルコースまたは２ＤＧで処理したヒトＣＤ１９＋  細胞によって測定される場合、骨髄および脾臓の腫瘍負荷を示す棒グラフである。Ｎ＝４匹のマウス。図３Ｄは、２ＤＧまたはグルコース（６ｇ／Ｌ）または通常の水（ビヒクル）で１週間にわたって処置したマウス（Ｎ＝５匹のマウス／群）の脾臓および骨髄の細胞の内部の遊離グルコースの比較のグラフである。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｄは、解糖系依存性ＭＥＣ１細胞株が、インビボでの２ＤＧに影響されやすいことを示すデータを提供する。図３Ａは、２種のＡＩＤ陽性Ｂ細胞株、ＭＥＣ１およびＣＣＲＦ−ＳＢの代謝比較のグラフである。ＣＣＲＦ−ＳＢおよびＭＥＣ１は、呼吸は等しいが、異なるレベルの解糖系を示した。ＮＲＧマウスに、ＣＣＲＦ−ＳＢ細胞またはＭＥＣ１細胞のいずれかを２週間にわたって異種移植し、６００ｍｇ／ｋｇの２ＤＧで２週間にわたって処置し、次いで、フローサイトメトリーによって負荷に関して測定した。図３Ｂは、その２種のＡＩＤ陽性Ｂ細胞株、ＭＥＣ１およびＣＣＲＦ−ＳＢが、エキソビボで類似の成長速度を有したことを示すグラフである。２回の実験においてＮ＝３。図３Ｃは、グルコースまたは２ＤＧで処理したヒトＣＤ１９＋  細胞によって測定される場合、骨髄および脾臓の腫瘍負荷を示す棒グラフである。Ｎ＝４匹のマウス。図３Ｄは、２ＤＧまたはグルコース（６ｇ／Ｌ）または通常の水（ビヒクル）で１週間にわたって処置したマウス（Ｎ＝５匹のマウス／群）の脾臓および骨髄の細胞の内部の遊離グルコースの比較のグラフである。
【００２１】
【図４−１】図４Ａ〜４Ｆは、ＲＡＤ５１感受性ＭＥＣ１細胞株が、ＲＡＤ５１インヒビターであるＤＩＤＳによってインビボで標的化されたことを示すデータを提供する。図４Ａは、ＭＥＣ１、Ｋ５６２（ＡＩＤに関する陰性コントロール）、およびＣＣＲＦ−ＳＢ細胞のＡＩＣＤＡ（ＡＩＤ）およびＲＡＤ５１の定量的ＲＴ−ＰＣＲの棒グラフである。図４Ｂは、前述の細胞株（Ｋ５６２、ＭＥＣ１およびＣＣＲＦ−ＳＢ細胞）におけるＡＩＤの細胞内染色のフローサイトメトリーである。図４Ｃは、ＤＩＤＳの異なる用量の存在下でのＭＥＣ１  Ｂ細胞のエキソビボ成長のグラフである。図４Ｄは、脾臓におけるｈＣＤ１９＋  細胞によって測定される場合、ＤＩＤＳでの２週間の処置後のＮＲＧＴＭマウスにおけるＭＥＣ１腫瘍負荷のグラフである。各点は、マウスを表す（３回の実験からプールしたデータ）。図４Ｅは、ＤＩＤＳ処置後のＭＥＣ１細胞およびＡＩＤがない（ＡＫＯ）ＭＥＣ１細胞の腫瘍負荷を示す棒グラフである（Ｎ＝５〜９匹のマウス）。図４Ｆは、ＤＩＤＳの種々の濃度でのＡＩＤ−／−  マウスのインビボでの処置、続いて、エキソビボでの放射線での脾細胞の処置の棒グラフである。これは、ＤＩＤＳがＩＲとの併用処置において機能する能力を示す（Ｎ＝５匹のマウス）。
【図４−２】図４Ａ〜４Ｆは、ＲＡＤ５１感受性ＭＥＣ１細胞株が、ＲＡＤ５１インヒビターであるＤＩＤＳによってインビボで標的化されたことを示すデータを提供する。図４Ａは、ＭＥＣ１、Ｋ５６２（ＡＩＤに関する陰性コントロール）、およびＣＣＲＦ−ＳＢ細胞のＡＩＣＤＡ（ＡＩＤ）およびＲＡＤ５１の定量的ＲＴ−ＰＣＲの棒グラフである。図４Ｂは、前述の細胞株（Ｋ５６２、ＭＥＣ１およびＣＣＲＦ−ＳＢ細胞）におけるＡＩＤの細胞内染色のフローサイトメトリーである。図４Ｃは、ＤＩＤＳの異なる用量の存在下でのＭＥＣ１  Ｂ細胞のエキソビボ成長のグラフである。図４Ｄは、脾臓におけるｈＣＤ１９＋  細胞によって測定される場合、ＤＩＤＳでの２週間の処置後のＮＲＧＴＭマウスにおけるＭＥＣ１腫瘍負荷のグラフである。各点は、マウスを表す（３回の実験からプールしたデータ）。図４Ｅは、ＤＩＤＳ処置後のＭＥＣ１細胞およびＡＩＤがない（ＡＫＯ）ＭＥＣ１細胞の腫瘍負荷を示す棒グラフである（Ｎ＝５〜９匹のマウス）。図４Ｆは、ＤＩＤＳの種々の濃度でのＡＩＤ−／−  マウスのインビボでの処置、続いて、エキソビボでの放射線での脾細胞の処置の棒グラフである。これは、ＤＩＤＳがＩＲとの併用処置において機能する能力を示す（Ｎ＝５匹のマウス）。
【００２２】
【図５−１】図５Ａ〜５Ｅは、解糖系遮断およびＲＡＤ５１阻害が、腫瘍負荷に対して相乗的で増強された抗がん効果を示したことを示すデータを提供する。ＤＩＤＳおよび２ＤＧの両方が、これら化合物の各々の高用量ではあるが、インビボでＭＥＣ１細胞を低減する。まとめると、低用量でも、ＤＩＤＳおよび２ＤＧは、エキソビボおよびインビボでＭＥＣ１細胞に対して相乗効果を示した。図５Ａは、インキュベーションの４８時間後の、種々の用量のＤＩＤＳおよび２ＤＧとともにインキュベートしたＭＥＣ１細胞のエキソビボ生存を示すグラフである。図５Ｂは、エキソビボで２ＤＧまたはＤＩＤＳで処理したＭＥＣ１およびＳｕＤＨＬ細胞の増殖のヒートマップである。その色は、５日間の増殖後の細胞の数（１００万個単位）を示す。ＭＥＣ１最初の数は、１００万個の細胞であり、ＳｕＤＨＬは、５０万個の細胞であった。図５Ｃは、低用量のＤＩＤＳおよび／もしくは２ＤＧでの、フルダラビンでの、またはグルコースでの２週間の処置後の脾臓および骨髄におけるｈＣＤ１９＋  細胞のパーセンテージによって測定される場合の、インビボでのＭＥＣ１腫瘍負荷の棒グラフである（２回の実験においてＮ＝４〜１３匹のマウス）。図５Ｄは、処置レジメンの最後での各群のマウスの平均体重を示す棒グラフである。図５Ｅは、種々の濃度の２ＤＧ中で２４時間にわたってインキュベートしたＭＥＣ１細胞のエキソビボ生存を示す棒グラフである（Ｎ＝３）。
【図５−２】図５Ａ〜５Ｅは、解糖系遮断およびＲＡＤ５１阻害が、腫瘍負荷に対して相乗的で増強された抗がん効果を示したことを示すデータを提供する。ＤＩＤＳおよび２ＤＧの両方が、これら化合物の各々の高用量ではあるが、インビボでＭＥＣ１細胞を低減する。まとめると、低用量でも、ＤＩＤＳおよび２ＤＧは、エキソビボおよびインビボでＭＥＣ１細胞に対して相乗効果を示した。図５Ａは、インキュベーションの４８時間後の、種々の用量のＤＩＤＳおよび２ＤＧとともにインキュベートしたＭＥＣ１細胞のエキソビボ生存を示すグラフである。図５Ｂは、エキソビボで２ＤＧまたはＤＩＤＳで処理したＭＥＣ１およびＳｕＤＨＬ細胞の増殖のヒートマップである。その色は、５日間の増殖後の細胞の数（１００万個単位）を示す。ＭＥＣ１最初の数は、１００万個の細胞であり、ＳｕＤＨＬは、５０万個の細胞であった。図５Ｃは、低用量のＤＩＤＳおよび／もしくは２ＤＧでの、フルダラビンでの、またはグルコースでの２週間の処置後の脾臓および骨髄におけるｈＣＤ１９＋  細胞のパーセンテージによって測定される場合の、インビボでのＭＥＣ１腫瘍負荷の棒グラフである（２回の実験においてＮ＝４〜１３匹のマウス）。図５Ｄは、処置レジメンの最後での各群のマウスの平均体重を示す棒グラフである。図５Ｅは、種々の濃度の２ＤＧ中で２４時間にわたってインキュベートしたＭＥＣ１細胞のエキソビボ生存を示す棒グラフである（Ｎ＝３）。
【図５−３】図５Ａ〜５Ｅは、解糖系遮断およびＲＡＤ５１阻害が、腫瘍負荷に対して相乗的で増強された抗がん効果を示したことを示すデータを提供する。ＤＩＤＳおよび２ＤＧの両方が、これら化合物の各々の高用量ではあるが、インビボでＭＥＣ１細胞を低減する。まとめると、低用量でも、ＤＩＤＳおよび２ＤＧは、エキソビボおよびインビボでＭＥＣ１細胞に対して相乗効果を示した。図５Ａは、インキュベーションの４８時間後の、種々の用量のＤＩＤＳおよび２ＤＧとともにインキュベートしたＭＥＣ１細胞のエキソビボ生存を示すグラフである。図５Ｂは、エキソビボで２ＤＧまたはＤＩＤＳで処理したＭＥＣ１およびＳｕＤＨＬ細胞の増殖のヒートマップである。その色は、５日間の増殖後の細胞の数（１００万個単位）を示す。ＭＥＣ１最初の数は、１００万個の細胞であり、ＳｕＤＨＬは、５０万個の細胞であった。図５Ｃは、低用量のＤＩＤＳおよび／もしくは２ＤＧでの、フルダラビンでの、またはグルコースでの２週間の処置後の脾臓および骨髄におけるｈＣＤ１９＋  細胞のパーセンテージによって測定される場合の、インビボでのＭＥＣ１腫瘍負荷の棒グラフである（２回の実験においてＮ＝４〜１３匹のマウス）。図５Ｄは、処置レジメンの最後での各群のマウスの平均体重を示す棒グラフである。図５Ｅは、種々の濃度の２ＤＧ中で２４時間にわたってインキュベートしたＭＥＣ１細胞のエキソビボ生存を示す棒グラフである（Ｎ＝３）。
【００２３】
【図６】図６は、胸腺リンパ腫腫瘍を有するコントロールＴｒｐ５３＋／＋  マウスおよびＴｒｐ５３−／−  マウスのマイクロコンピューター断層撮影画像の着色３Ｄレンダリングを示す画像である。
【００２４】
【図７−１】図７Ａ〜７Ｄは、ＡＩＤノックアウト（ＡＫＯ）  ＭＥＣ１細胞の生成および検証のデータである。図７Ａは、そのノックアウトの模式図である。図７Ｂは、そのＡＫＯのＰＣＲ検証のゲルの画像である。図７Ｃは、ＤＩＤＳに対するＡＫＯ細胞および親ＭＥＣ１細胞（ＡＩＤ＋  細胞）の感度を示すグラフである。図７Ｄは、ＤＩＤＳで処置した、ＭＥＣ１細胞を生着させたマウスおよびＡＫＯ細胞を生着させたマウスの脾臓重量を示すグラフである。
【図７−２】図７Ａ〜７Ｄは、ＡＩＤノックアウト（ＡＫＯ）  ＭＥＣ１細胞の生成および検証のデータである。図７Ａは、そのノックアウトの模式図である。図７Ｂは、そのＡＫＯのＰＣＲ検証のゲルの画像である。図７Ｃは、ＤＩＤＳに対するＡＫＯ細胞および親ＭＥＣ１細胞（ＡＩＤ＋  細胞）の感度を示すグラフである。図７Ｄは、ＤＩＤＳで処置した、ＭＥＣ１細胞を生着させたマウスおよびＡＫＯ細胞を生着させたマウスの脾臓重量を示すグラフである。
【００２５】
【図８】図８は、ＤＩＤＳおよびＢ０２  ＲＡＤ５１インヒビターでのＭＥＣ１およびＳｕＤＨＬ細胞の滴定曲線を示す。左上のグラフは、ＤＩＤＳでのＭＥＣ１細胞の滴定曲線を示す。右上のグラフは、Ｂ０２でのＭＥＣ１細胞の滴定曲線を示す。左下のグラフは、ＤＩＤＳでのＳｕＤＨＬ細胞の滴定曲線を示す。右下のグラフは、Ｂ０２でのＳｕＤＨＬ細胞の滴定曲線を示す。
【００２６】
【図９】図９は、本明細書で記載されるモデルの模式図である。
【００２７】
【図１０】図１０は、高用量のＤＩＤＳが、インビボで腫瘍負荷を低減するために必要とされることを示すデータである。ＮＲＧマウスに、ＭＥＣ１またはＭＥＣ１＿ＬＵＣを２週間にわたって異種移植し、次いで、５０ｍｇ／ｋｇ  ＤＩＤＳでまたはビヒクルで、２週間にわたって処置した。腫瘍負荷の尺度として、ルシフェラーゼ遺伝子の発現に関してマウスを画像化した。そのグラフは、ビヒクル、ＤＩＤＳまたはフルダラビンで処置したマウスの骨髄および脾臓におけるフローサイトメトリーによって測定される場合の腫瘍負荷を示した。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
本開示は、いくつかの実施形態において、解糖系およびＲＡＤ５１を特異的に阻害することによってがんを処置するための方法、組成物、およびキットを提供する。いくつかの実施形態において、その方法は、がん細胞と解糖系インヒビターおよびＲＡＤ５１複合体インヒビターとを接触させる（例えば、がん細胞を解糖系インヒビターおよびＲＡＤ５１複合体インヒビターに曝露する）工程を包含する。他の実施形態において、その方法は、がんを有する（例えば、がんと診断された）被験体に、解糖系インヒビターおよびＲＡＤ５１複合体インヒビターを投与する工程を包含する。本明細書で提供されるデータは、がん細胞において代謝およびＤＮＡ修復の両方を特異的に標的化することが、非特異的標準治療処置（これは、しばしば毒性と関連する有害な副作用を生じる）より有効であることを示す。
【００２９】
解糖系阻害
細胞は、エネルギーを生成するために多くの経路を使用する。好気的条件下では、細胞は優先的に酸素を使用して、酸化的リン酸化として公知のプロセスにおいてアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の形態でエネルギーを生成する。嫌気的条件下では、細胞は、解糖系を機能させて、酸素なしでＡＴＰを生成し得る。解糖系は、グルコースをピルビン酸へと変換する一連の反応であり、ピルビン酸は、最終的にはＡＴＰの形態でエネルギーへと変換される。がん細胞が増殖し、腫瘍が拡がっている間は、腫瘍における血管新生が制限されることから、存在する酸素が低減している。非がん細胞は、酸素を優先的に使用して、ＡＴＰを生成する。従って、理論によって拘束されないが、解糖系を阻害することは、非がん細胞に影響を及ぼすことなく、がん細胞および腫瘍の成長および拡がりを優先的に防止し得る。
【００３０】
解糖系インヒビターは、細胞における解糖系活性を減少させる薬剤（例えば、核酸、タンパク質、化学物質）である。高代謝活性を有する細胞（例えば、がん細胞）は、解糖系をより機能させて、低代謝活性を有する細胞と比較して増大したエネルギーを生成する。解糖系インヒビターは、解糖系の種々の工程を標的化し得る。いくつかの実施形態において、解糖系インヒビターは、酵素の活性を遮断する。いくつかの実施形態において、解糖系インヒビターは、ピルビン酸へと代謝され得ず、無益回路を生じる解糖系の基質である。いくつかの実施形態において、解糖系インヒビターは、解糖系における必要な基質の形成を遮断する。本開示の解糖系インヒビターの非限定的な例としては、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２ＤＧ）（例えば、Ｐｅｌｉｃａｎｏ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００６；  ２５（３４）：  ４６３３−４６４６を参照のこと）、フロレチン、ケルセチン、ＳＴＦ３１、ＷＺＢ１１７、３−３−ピリジニル）−１−（４−ピリジニル）−２−プロゲン−１−オン（３ＰＯ）、３−ブロモピルベート、ジクロロアセテート、オキサミン酸、ＮＨＩ−１、６−アミノニコチンアミド、ロニダミン、オキシチアミン塩酸塩、およびシコニンが挙げられる。
【００３１】
いくつかの実施形態において、その解糖系インヒビターは２ＤＧである。２ＤＧは、合成グルコースアナログ分子であり、ここでその２−ヒドロキシル基が水素によって置換されており、解糖系におけるそのさらなる代謝を防止する。従って、２ＤＧは、無益回路を誘発することによって解糖系を阻害する。無益回路とは、酵素によって結合されるが、代謝され得ない基質アナログを使用して経路（例えば、解糖系）を阻害することに言及する。２ＤＧは、グルコーストランスポーターによって細胞に取り込まれる。より高いグルコース取り込みを有する細胞（例えば、がん細胞）はまた、２ＤＧのより高い取り込みを有する。
【００３２】
ＲＡＤ５１複合体阻害
がん細胞は、非がん細胞より急速に成長および分裂する。細胞増殖および分裂は、ゲノムＤＮＡが損傷し、修復されない場合に阻害される。多くのＤＮＡ損傷修復タンパク質（ＲＡＤ５１、ＢＲＣＡ１、およびＢＲＣＡ２が挙げられる）は、いくつかのがん細胞において過剰発現される。従って、理論によって拘束されないが、ＤＮＡ損傷修復を阻害することは、非がん細胞と比較して、がん細胞の細胞成長および分裂を優先的に阻害し得る。
【００３３】
真核生物には、ＤＮＡ２本鎖切断（ＤＳＢ）を修復するためにＲＡＤ５１タンパク質および／またはタンパク質のＲＡＤ５１複合体を要求する多くのＤＮＡ損傷修復経路（例えば、相同組換え、鎖間架橋修復）が存在する。ＲＡＤ５１は、細菌ＲｅｃＡおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｒａｄ５１タンパク質に高度に類似の、ＲＡＤ５１遺伝子によってコードされる真核生物タンパク質である。ＲＡＤ５１ポリマーは、損傷したｓｓＤＮＡ上で核タンパク質フィラメントを形成し、それを分解から保護し、他のＤＮＡ損傷修復タンパク質を動員して、ＲＡＤ５１タンパク質複合体を形成する。ＲＡＤ５１は、いくつかのがん細胞において過剰発現され、ここでそれは、ＤＮＡ損傷修復を促進することによって、処置に対する耐性を付与する。
【００３４】
ＲＡＤ５１タンパク質複合体は、ＲＡＤ５１および少なくとも１種の他のタンパク質を含み、ＤＮＡ  ＤＳＢの修復に必要とされる。Ｒａｄ５１複合体の非限定的な例としては、Ｒａｄ５１、複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）、およびＲａｄ５２；  Ｒａｄ５１、ＰＡＬＢ２、およびＲＡＤ５１Ｃ；  ＲＡＤ５１ＣおよびＸＲＣＣ３；  Ｒａｄ５１およびＢＲＣＡ１；  Ｒａｄ５１およびＢＲＣＡ２；  Ｒａｄ５１、ＸＲＣＣ３、およびＲａｄ５４；  ＰＡＬＢ２、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１Ｃ、およびＸＲＣＣ３が挙げられる。
【００３５】
ＲＡＤ５１複合体インヒビターは、ＲＡＤ５１タンパク質複合体の活性を減少させる薬剤（例えば、核酸、タンパク質、化学物質）である。いくつかの実施形態において、ＲＡＤ５１複合体インヒビターは、ＲＡＤ５１ポリマーの形成を減少させる。いくつかの実施形態において、ＲＡＤ５１複合体インヒビターは、ＲＡＤ５１によるＡＴＰ加水分解を減少させる。いくつかの実施形態において、ＲＡＤ５１複合体インヒビターは、ＲＡＤ５１結合１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を減少させる。本開示のＲＡＤ５１インヒビターの非限定的な例としては、、４，４’−ジイソチオシアノ−２，２’−スチルベンジスルホン酸（ＤＩＤＳ）、（Ｅ）−３−ベンジル−２−（２−（ピリジン−３−イル）ビニル）キナゾリン−４（３Ｈ）−オン（Ｂ０２）（例えば、Ｈｕａｎｇ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  ＰＬＯＳ  ＯＮＥ，  ２０１４；  ９（６）：  ｅ１００９３３を参照のこと）、３−クロロ−１−（３，４−ジクロロフェニル）−４−（４−モルホリニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（ＲＩ−１）（例えば、Ｂｅｄｋｅ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０１２；  ４０（１５）：  ７３４７−５７を参照のこと）、ＩＢＲ２（例えば、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｐ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．  ２０１８；  ３６４（１）：  ４６−５４を参照のこと）、ＩＢＲ１２１およびＩＢＲ１２０（例えば、Ｚｈｕ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  ２０１５；  ９６：  １９６−２０８を参照のこと）が挙げられる。２０１６年９月９日公開のＷＯ２０１６１４０９７１Ａ１もまた参照のこと。
【００３６】
いくつかの実施形態において、そのＲＡＤ５１インヒビターは、ＤＩＤＳであり、これは、Ｒａｄ５１媒介性鎖侵入、およびＲＰＡの非存在下で相同な配列のＲＡＤ５１媒介性対合を阻害する。ＤＩＤＳは、ＲＡＤ５１に直接結合し、ＤＮＡへのＲＡＤ５１結合を有意に阻害する。従って、ＤＩＤＳは、ＲＡＤ５１のＤＮＡ結合部位近くに結合し得、ＲＡＤ５１の結合に関してＤＮＡと競合し得る。
【００３７】
いくつかの実施形態において、そのＲＡＤ５１インヒビターは、Ｂ０２であり、これは、ＲＡＤ５１のＤＮＡ鎖交換活性を効率的かつ特異的に減少させる。具体的には、Ｂ０２は、核タンパク質フィラメント形成の間にＲＡＤ５１の一次部位およびその二次的ＤＮＡ結合部位において、ｄｓＤＮＡが、相同なＤＮＡ配列を探す間に結合する場合に、ＲＡＤ５１−１本鎖ＤＮＡ相互作用を障害する。
【００３８】
いくつかの実施形態において、そのＲＡＤ５１インヒビターは、３ＲＩ−１であり、これは、ＲＡＤ５１のシステイン−３１９におけるチオール基に共有結合し、従って、モノマーＲＡＤ５１タンパク質とＡＴＰ−結合ループとの間の境界面を遮断するクロロマレイミド部分を有する。従って、ＲＩ−１は、ＲＡＤ５１−ＡＴＰ相互作用を変化させ、フィラメント形成および伸長に必須であるＲＡＤ５１−ＲＡＤ５１モノマー結合および重合を阻害する。
【００３９】
いくつかの実施形態において、そのＲＡＤ５１インヒビターは、ＤＩＤＳ、Ｂ０２、およびＲＩ−１から選択される。
【００４０】
がん／がん細胞
本開示は、細胞（例えば、がん細胞）と、解糖系インヒビターおよびＲＡＤ５１複合体インヒビターとを接触させる方法を提供する。いくつかの実施形態において、そのがんは、コントロール細胞（例えば、非がん細胞）と比較して、増大した解糖系（例えば、ニューロン、がん細胞）および／または増大したＤＮＡ損傷修復（例えば、幹細胞、がん細胞）を示す。いくつかの実施形態において、そのがん細胞は、解糖系インヒビターのみでの処置に抵抗性である。いくつかの実施形態において、そのがん細胞は、ＲＡＤ５１複合体インヒビターのみでの処置に抵抗性である。細胞は、これが薬剤の存在下で生存する場合、解糖系インヒビターまたはＲＡＤ５１複合体インヒビターのような薬剤に抵抗性であると考えられる。  
【００４１】
解糖系インヒビターおよびＲＡＤ５１複合体インヒビターで処置され得る／と接触され得るがん／がん細胞の非限定的な例としては、以下が挙げられる：白血病細胞（例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；リンパ腫細胞（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）；乳がん細胞、膵臓がん細胞、肺がん細胞、黒色腫細胞、大腸がん細胞、胃がん細胞、腎臓がん細胞、脳がん細胞、肝臓がん細胞、膀胱がん細胞、前立腺がん細胞、子宮がん細胞、卵巣がん細胞、子宮頚がん細胞、精巣がん細胞、頭頚部がん細胞、多発性骨髄腫細胞、甲状腺がん細胞、およびカルチノイドがん細胞。他のがん細胞が、本明細書で企図される。
【００４２】
いくつかの実施形態において、がん細胞は、解糖系依存性細胞であると考えられる。がん細胞は、グルコースを消費し、解糖系を機能させ、好気的環境の中ですら、ＡＴＰを非がん細胞より遙かに速い速度で生成する。好気的条件では、非がん細胞は、解糖系の代わりに、酸化的リン酸化を通じて、ＡＴＰを優先的に生成する。増大したグルコース消費は、特に好気的条件下では、がん細胞を検出するために使用され得、がん細胞と非がん細胞との間のこの代謝の差異を標的化することは、本明細書で記載されるように利用され得る。
【００４３】
いくつかの実施形態において、そのがん細胞は、活性化誘導シチジン（ＡＩＤ）を発現する。ＡＩＤは、ＡＩＣＤＡ遺伝子によってコードされ、シトシン（Ｃ）塩基をウラシル（Ｕ）（これはチミン（Ｔ）として認識される）への脱アミノ化を通じて、ＤＮＡにおける変異を生成するヒトの酵素である。従って、シトシン脱アミノ化の後に、Ｃ：Ｇ塩基対は、Ｕ：Ｇミスマッチへと変異される。Ｕは、ＤＮＡポリメラーゼタンパク質によってＴとして認識されることから、Ｕ：Ｇミスマッチは、ＡＩＤによるシトシン脱アミノ化の結果として、Ｔ：Ａ塩基対へとその後変換される。リンパ節におけるＢ細胞では、ＡＩＤは、抗体多様性を生じる変異を引き起こすが、Ｂ細胞がんをもたらす変異をも生じ得る。
【００４４】
いくつかの実施形態において、がんは、Ｂ細胞がんである。Ｂ細胞がんは、血流へと移動する前にリンパ節に由来するＢ細胞に影響を及ぼす。いくつかの実施形態において、Ｂ細胞がんは白血病である。白血病は、細胞がもはや適切に成熟せず、かつ急速に増殖する場合に、骨髄の血液形成細胞において始まるがんである。白血病細胞は、骨髄の中で増加し、健康な細胞を締め出す。リンパ性白血病は、リンパ球前駆体において始まる。がん細胞が主にリンパ節および他の組織の中に存在するリンパ腫とは異なり、リンパ性白血病では、そのがん細胞は主に骨髄および血液の中に存在する。
【００４５】
いくつかの実施形態において、その白血病は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である。ＣＬＬは、骨髄の中の細胞で始まるがんのタイプである。ＣＬＬは、骨髄、リンパ節、および血液中のＢ細胞の増加を生じる。これらの細胞は十分に機能せず、健康な血球を締め出す。ＣＬＬは、２つの主要なタイプに分けられる：  変異した免疫グロブリン可変領域重鎖（ＩＧＨＶ）遺伝子を有するもの、および変異したＩＧＨＶ遺伝子なしのもの。高リスク患者は、ＩＧＨＶ抗体遺伝子領域におけるＤＮＡの中にほとんど変異を有しない未成熟Ｂ細胞のパターンを有するのに対して、低リスク患者は、成熟リンパ球を示すその抗体遺伝子領域の中にＤＮＡのかなりの変異を示す。
【００４６】
組成物および処置方法
本開示のいくつかの局面は、解糖系インヒビターおよびＲＡＤ５１複合体インヒビターでがんを処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、被験体（例えば、がんを有するヒト被験体）に、解糖系インヒビター（例えば、２ＤＧ）およびＲＡＤ５１複合体インヒビター（例えば、ＤＩＤＳ、Ｂ０２、またはＲＩ−１）を投与する工程を包含する。その解糖系インヒビターおよびそのＲＡＤ５１複合体インヒビターは、当該分野で公知の任意の経路によって投与され得る。投与経路の非限定的な例としては、以下が挙げられる：経口（例えば、錠剤、カプセル剤）、静脈内、皮下、吸入、鼻内、髄腔内、筋肉内、動脈内、および神経内。
【００４７】
本開示の組成物（例えば、処置の方法における使用のための）は、解糖系インヒビター（例えば、２ＤＧ）およびＲＡＤ５１複合体インヒビター（例えば、（ＤＩＤＳ）、Ｂ０２、またはＲＩ−１）を含み得る。従って、いくつかの実施形態において、その解糖系インヒビターおよびそのＲＡＤ５１複合体インヒビターは、共製剤化される（同じ組成物の中に存在する）。いくつかの実施形態において、組成物は、有効量で投与される。
【００４８】
有効量（これは、治療上有効な量といわれ得る）は、所望の臨床結果（例えば、がん細胞死滅）が被験体において達成される量（例えば、用量）に言及する。有効量は、少なくとも部分的に、その標的組織、標的細胞タイプ、投与の手段、そのインヒビターの物理的特性、その組成物の他の構成要素、および他の決定因子（例えば、被験体の年齢、体重、身長、性別および健康状態）に基づく。被験体は、哺乳動物（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、アカゲザル、チンパンジー）、または齧歯類（例えば、マウスまたはラット）であり得、いくつかの実施形態において、その被験体は、ヒト被験体である。いくつかの実施形態において、その被験体は、がんを有する。いくつかの実施形態において、その被験体は、解糖系依存性がんを有する。いくつかの実施形態において、その被験体は、ＡＩＤを発現するがんを有する。
【００４９】
いくつかの実施形態において、組成物は、薬学的組成物である。薬学的組成物は、活性薬剤（例えば、解糖系インヒビターおよび／またはＲＡＤ５１複合体インヒビター）とキャリア（不活性もしくは活性）との組み合わせであり、その組成物を、インビボまたはエキソビボでの治療的使用に特に適切にする。被験体に投与された後の薬学的に受容可能なキャリアは、望ましくない生理学的効果を引き起こさない。その薬学的組成物中のキャリアはまた、その活性薬剤と適合性でありかつ安定化し得るという意味でも受容可能でなければならない。１種またはこれより多くの可溶化剤は、活性薬剤の送達のための薬学的キャリアとして利用され得る。薬学的に受容可能なキャリアの例としては、投与形態として使用可能な組成物を達成するための生体適合性ビヒクル、アジュバント、添加剤、および希釈剤が挙げられるが、これらに限定されない。他のキャリアの例としては、コロイド性二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、およびラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。さらなる適切な薬学的キャリアおよび希釈剤、ならびにそれらの使用のための薬学的必然性は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載される。本明細書で記載される製剤は、公知のまたは薬理学の分野においてこれ以降に開発される任意の方法によって調整され得る。概して、このような調製法は、その活性薬剤（例えば、インヒビター）を、賦形剤および／または１種もしくはこれより多くの他の補助成分と会合した状態にする工程、次いで、必要であれば、および／または望ましい場合には、その生成物を、所望の単一用量または複数用量単位へと分割、成形および／またはパッケージする工程を包含する。
【００５０】
本開示に従う薬学的組成物中のその活性薬剤、その薬学的に受容可能な賦形剤、および／または任意のさらなる成分の相対的な量は、その処置される被験体が何であるか、サイズ、および／もしくは状態に依存して、そしてさらにその組成物が投与されるべき経路にさらに依存して、変動する。例示によれば、その組成物は、０．１％〜１００％の間の、例えば、０．５〜５０％の間、１〜３０％の間、５〜８０％の間、または少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
【００５１】
組成物における解糖系インヒビター  対  ＲＡＤ５１複合体インヒビターの比は、変動し得る。いくつかの実施形態において、解糖系インヒビター  対  ＲＡＤ５１複合体インヒビターの比は、１：１〜１：１０、または１：１〜１：５である。例えば、解糖系インヒビター  対  ＲＡＤ５１複合体インヒビターの比は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８．、１：９、または１：１０であり得る。他の実施形態において、ＲＡＤ５１複合体インヒビター  対  解糖系インヒビターの比は、１：１〜１：１０、または１：１〜１：５である。例えば、ＲＡＤ５１複合体インヒビター  対  解糖系インヒビターの比は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、または１：１０である。
【００５２】
いくつかの実施形態において、その解糖系インヒビターおよびそのＲＡＤ５１複合体インヒビターは、逐次的に投与される。例えば、その解糖系インヒビターは、そのＲＡＤ５１複合体インヒビターの前または後に（例えば、数分、数時間、または数日程度、前または後に）投与され得る。
【００５３】
いくつかの実施形態において、その解糖系インヒビターおよびそのＲＡＤ５１複合体インヒビターは、同時に（同じ時に）投与される。例えば、その解糖系インヒビターおよびそのＲＡＤ５１複合体インヒビターは、同じ組成物に製剤化され得る。
【００５４】
いくつかの実施形態において、被験体に投与される解糖系インヒビターおよび／またはＲＡＤ５１複合体インヒビターの用量は、コントロール標準治療用量に等しいかまたはその用量より低い。いくつかの実施形態において、その解糖系インヒビターの用量は、コントロール標準治療用量より低い。いくつかの実施形態において、そのＲＡＤ５１複合体インヒビターの用量は、コントロール標準治療用量より低い。標準治療とは、医療的処置ガイドラインに言及し、全般的または特異的であり得る。「標準治療（ｄｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  ｃａｒｅ）」は、科学的根拠および所定の状態の処置に関与する医療専門家の間での協同作用に基づく適切な処置を明示する。それは、医師／臨床医がある種のタイプの患者、病気または臨床状況に対して追随するべき、診断および処置プロセスである。本明細書で提供されるとおりの標準治療用量は、医師／臨床医または他の医療専門家が、がんを処置または防止するための標準治療ガイドラインに追随しながら、がんを処置または防止するために被験体に投与する、解糖系インヒビターおよび／またはＲＡＤ５１複合体インヒビターの用量に言及する。
【００５５】
いくつかの実施形態において、被験体に投与される解糖系インヒビターの用量は、標準治療用量である。いくつかの実施形態において、被験体に投与される解糖系インヒビターのその用量は、その解糖系インヒビターの標準治療用量より少なくとも１０％少ない。例えば、被験体に投与される解糖系インヒビターのその用量は、その解糖系インヒビターの標準治療用量より少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％少ない。いくつかの実施形態において、被験体に投与される解糖系インヒビターのその用量は、その解糖系インヒビターの標準治療用量より１０％〜５０％、１０％〜４０％、１０％〜３０％、１０％〜２０％、２０％〜５０％、２０％〜４０％、２０％〜３０％、３０％〜５０％、３０％〜４０％、または４０％〜５０％少ない。
【００５６】
いくつかの実施形態において、その解糖系インヒビター、２ＤＧは、３０ｍｇ／ｋｇの用量で（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  Ｎｏ．：  ＮＣＴ００６３３０８７）または３０ｍｇ／ｋｇ未満の用量で被験体に投与される。いくつかの実施形態において、その解糖系インヒビター、２ＤＧは、４５ｍｇ／ｋｇの用量で、または４５ｍｇ／ｋｇ未満の用量で被験体に投与される。いくつかの実施形態において、その解糖系インヒビター、２ＤＧは、６０ｍｇ／ｋｇの用量で、または６０ｍｇ／ｋｇ未満の用量で被験体に投与される。いくつかの実施形態において、その解糖系インヒビター、２ＤＧは、１０〜１００ｍｇ／ｋｇの用量で被験体に投与される。いくつかの実施形態において、その解糖系インヒビター、２ＤＧは、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇの用量で被験体に投与される。
【００５７】
いくつかの実施形態において、被験体に投与されるＲＡＤ５１複合体インヒビターのその用量は、標準治療用量である。いくつかの実施形態において、被験体に投与されるＲＡＤ５１複合体インヒビターのその用量は、そのＲＡＤ５１複合体インヒビターの標準治療用量より少なくとも１０％少ない。例えば、被験体に投与されるＲＡＤ５１複合体インヒビターのその用量は、そのＲＡＤ５１複合体インヒビターの標準治療用量より少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％少ない。いくつかの実施形態において、被験体に投与されるＲＡＤ５１複合体インヒビターのその用量は、そのＲＡＤ５１複合体インヒビターの標準治療用量より１０％〜５０％、１０％〜４０％、１０％〜３０％、１０％〜２０％、２０％〜５０％、２０％〜４０％、２０％〜３０％、３０％〜５０％、３０％〜４０％、または４０％〜５０％少ない。
【００５８】
いくつかの実施形態において、そのＲＡＤ５１複合体インヒビター、Ｂ０２は、３０ｍｇ／ｋｇの用量で、または３０ｍｇ／ｋｇ未満の用量で被験体に投与される。いくつかの実施形態において、そのＲＡＤ５１複合体インヒビター、Ｂ０２は、４５ｍｇ／ｋｇの用量で、または４５ｍｇ／ｋｇ未満の用量で被験体に投与される。いくつかの実施形態において、そのＲＡＤ５１複合体インヒビター、Ｂ０２は、６０ｍｇ／ｋｇの用量で、または６０ｍｇ／ｋｇ未満の用量で被験体に投与される。いくつかの実施形態において、そのＲＡＤ５１複合体インヒビター、Ｂ０２は、１０〜１００ｍｇ／ｋｇの用量で被験体に投与される。いくつかの実施形態において、そのＲＡＤ５１複合体インヒビター、Ｂ０２は、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇの用量で被験体に投与される。
【００５９】
いくつかの実施形態において、そのＲＡＤ５１複合体インヒビター、ＲＩ−１は、３０ｍｇ／ｋｇの用量で、または３０ｍｇ／ｋｇ未満の用量で被験体に投与される。いくつかの実施形態において、そのＲＡＤ５１複合体インヒビター、ＲＩ−１は、４５ｍｇ／ｋｇの用量で、または４５ｍｇ／ｋｇ未満の用量で被験体に投与される。いくつかの実施形態において、そのＲＡＤ５１複合体インヒビター、ＲＩ−１は、６０ｍｇ／ｋｇの用量で、または６０ｍｇ／ｋｇ未満の用量で被験体に投与される。いくつかの実施形態において、そのＲＡＤ５１複合体インヒビター、ＲＩ−１は、１０〜１００ｍｇ／ｋｇの用量で被験体に投与される。いくつかの実施形態において、そのＲＡＤ５１複合体インヒビター、ＲＩ−１は、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇの用量で被験体に投与される。
【００６０】
いくつかの実施形態において、そのＲＡＤ５１複合体インヒビター、ＤＩＤＳは、３０ｍｇ／ｋｇの用量で、または３０ｍｇ／ｋｇ未満の用量で被験体に投与される。いくつかの実施形態において、そのＲＡＤ５１複合体インヒビター、ＤＩＤＳは、４５ｍｇ／ｋｇの用量で、または４５ｍｇ／ｋｇ未満の用量で被験体に投与される。いくつかの実施形態において、そのＲＡＤ５１複合体インヒビター、ＤＩＤＳは、６０ｍｇ／ｋｇの用量で、または６０ｍｇ／ｋｇ未満の用量で被験体に投与される。いくつかの実施形態において、そのＲＡＤ５１複合体インヒビター、ＤＩＤＳは、１０〜１００ｍｇ／ｋｇの用量で被験体に投与される。いくつかの実施形態において、そのＲＡＤ５１複合体インヒビター、ＤＩＤＳは、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇの用量で被験体に投与される。
【００６１】
いくつかの実施形態において、解糖系インヒビターは、フルダラビンの標準治療用量より少ない用量で被験体に投与される。いくつかの実施形態において、ＲＡＤ５１複合体インヒビターは、フルダラビンの標準治療用量より少ない用量で被験体に投与される。フルダラビンは、白血病およびリンパ腫（慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）が挙げられる）の処置において使用される化学療法剤である。フルダラビンは、リボヌクレオチドレダクターゼおよびＤＮＡポリメラーゼに干渉することによって、ＤＮＡ合成を阻害するプリンヌクレオチドアナログである。従って、急速に増殖している細胞（例えば、がん細胞）は、急速に増殖していない細胞よりフルダラビン処置によって影響を及ぼされる。ＣＬＬにおけるフルダラビンの標準治療投与量は、１５〜４０ｍｇ／ｍ２の間であり、静脈内注入によって投与される。いくつかの実施形態において、投与される解糖系インヒビターおよび／またはＲＡＤ５１複合体インヒビターの用量は、１５〜４０ｍｇ／ｍ２の間である。いくつかの実施形態において、投与される解糖系インヒビターおよび／またはＲＡＤ５１複合体インヒビターの用量は、１５〜４０ｍｇ／ｍ２未満である。いくつかの実施形態において、投与される解糖系インヒビターおよび／またはＲＡＤ５１複合体インヒビターの用量は、５ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、１５ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、３０ｍｇ／ｍ２、３５ｍｇ／ｍ２、または４０ｍｇ／ｍ２である。
【００６２】
いくつかの実施形態において、その解糖系インヒビターおよびそのＲＡＤ５１複合体インヒビターは、コントロール（例えば、ベースライン、そのインヒビターの投与前、またはそのインヒビターのうちの一方のみの投与後）と比較して、その被験体におけるＣＤ１９＋  細胞の数を低減するために有効な量で投与される。ＣＤ１９は、正常およびがん性のＢ細胞の生体マーカーとして使用される表面タンパク質である。ＣＤ１９＋  Ｂ細胞は、適応免疫応答において必須の役割を果たし、システムにおいて抗原の認識およびクリアランスを促進し、そのプロセスにおいて、免疫サーベイランスのために免疫細胞を作製する。被験体におけるＣＤ１９＋  細胞の数は、任意の数の生体マーカー検出方法を使用して（例えば、抗ＣＤ１９抗体を使用して）決定され得る。
【実施例】
【００６３】
以下の実施例は、本発明のある種の具体的実施形態を例証し、本発明の範囲を限定することを意味しない。
【００６４】
本明細書の実施形態は、以下の実施例および詳細なプロトコールによってさらに例証される。しかし、その実施例は、実施形態を例証することが意図されるに過ぎず、本明細書においてその範囲を限定するとは解釈されるべきでない。本出願全体を通じて引用される全ての参考文献、公開特許および特許出願の内容は、参考として援用される。
【００６５】
その提供される実施例は、本開示を実施するにあたって有用な種々の構成要素および方法論を例証する。その実施例は、特許請求される開示を限定しない。本開示に基づいて、当業者は、本開示を実施するために有用な他の構成要素および方法論を特定および使用し得る。
【００６６】
実施例１：  ２ＤＧは、リンパ腫生成の自然発生的マウスモデルにおいて腫瘍負荷を緩和した
ＳＪＬ／Ｊマウスは、非ホジキンリンパ腫に似たＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＢ細胞が関わる過形成障害を自然発生的に発生させ、１歳齢後に明らかになる（２７，  ２８）。インターロイキン２１を分泌する活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞が、このモデルにおいてＢ細胞を形質転換へと駆り立てると考えられる（２９）。ＣＤ８ａを欠損し、従って、ＣＤ８＋を欠いているＳＪＬ／Ｊマウスは、それらの表現型の他の側面においては何の変化もなく、Ｂ細胞リンパ腫の有意に加速した発生を示す（３０）。任意の主要の成長または維持は、エネルギーを必要とし、高度に増殖性の細胞（例えば、がん細胞）は、それらのエネルギー要求を満たすためにＡＴＰ生成の多くの様式（解糖系を含む）に依存することから（４）、細胞グルコース取り込み後の第１の工程におけるがん細胞での解糖系の遮断は、理論上は、腫瘍負荷を低減するはずである（６，  ７）。
【００６７】
２ＤＧによる解糖系の阻害が、これらの自然発生的に生じるリンパ腫を緩和する程度を試験するために、ＳＪＬ．ＣＤ８ａ−／−  雌性マウスのコホートを、１３ヶ月齢へと加齢させ、リンパ腫発生の兆候をモニターした。目に見える成長は、頚部リンパ節において最も明らかであり、いくつかの場合には、脾臓において明らかである（矢印によって示される。図１Ａ）。いったん腫瘍が触診できるほど十分に大きくなったら、マウスを、自由に提供した６ｇ／Ｌの可溶化２ＤＧを有する水に配置し、腫瘍縮小に関して１週間に１回モニターした。その平均的なマウスは、およそ４ｍＬの水を各日に消費した；よって、そのマウスの平均体重に基づけば、各マウスは、およそ９００ｍｇ／ｋｇ／日の２ＤＧの用量を受容した。その腫瘍の写真を１週間に１回撮影して、疾患退縮を記録し、その腫瘍が目に見えて収縮したか、または後に再発した時点（週単位）を記録した。そのマウスの肉眼観察を介して、体重減少、不活発、または身繕いの欠如のような、この処置の有害効果は、処置開始の直後でも、またはその処置の間のいずれの時点でも、観察されなかった。
【００６８】
この試験における７匹のマウスのうち、６匹は、２〜３週間の処置後に腫瘍退縮の証拠を示した（図１Ａおよび１Ｂ）。しかし、これら６匹のうちの４匹において、その腫瘍は、その処置の継続にも拘わらず、５〜１１週間以内に再発した。この有意な退縮は、２ＤＧで処置した固形がんのマウスモデルにおいて観察されたものに類似であり、これは、ＳＪＬリンパ腫が、リンパ系のがんに関して、比較的高い治療的用量の併用処置に部分的に応答性であることを示唆した（（１０）において総説される）。
【００６９】
次に、より均一なかつ急激に自然発生的に生じるリンパ腫を試験した。さらに、２ＤＧが、純粋にＴ細胞リンパ腫に影響を及ぼし得る程度を、試験した。これらの基準の全てを満たすために、Ｔ細胞がんの古典的なマウスモデルである、ｐ５３欠損マウス（３１）を使用した。Ｔｒｐ５３遺伝子はｐ５３タンパク質をコードし、マウスにおけるこの遺伝子の欠損は、１４週齢程度の早さで胸腺リンパ腫をもたらす（図１Ｃおよび図６）；この表現型が原因で、そのＴｒｐ５３−／−  マウスは、リ−フラウメニ症候群のモデルと考えられる｛Ｊａｃｋｓ，  １９９４  ＃１３４｝。これらの胸腺リンパ腫に対する２ＤＧの効果を試験するために、Ｃ５７ＢＬ６Ｊ．  Ｔｒｐ５３−／−  マウスを、２ＤＧ（ＤＰＢＳ中、６００ｍＭの２ＤＧを２００μＬ（６７０ｍｇ／ｋｇ））またはグルコースのいずれかで、１４週齢で開始および１０週間継続して、１週間に３回腹腔内（Ｉ．Ｐ．）に処置した。
【００７０】
２ＤＧで処置したマウスは、グルコース処置マウスと比較して、新生物を発生させることから有意に防御された（図１Ｄ）。２つの顕著な有害効果が、Ｉ．Ｐ．送達された２ＤＧ処置で観察された：第１は、注射の際に、２ＤＧ処置マウスは、１０〜６０分間にわたって不活発を示した。そして第２に、その実験が進行するにつれて、その２ＤＧ処置したマウスは、グルコース処置マウスと比較して、より低い体重増加を示したが、差異は有意に達しなかった（図１Ｅ）。
【００７１】
まとめると、自然発生的がんの２種の異なるマウスモデルに基づいて、経口投与またはＩ．Ｐ．投与された２ＤＧは、Ｂ細胞およびＴ細胞の両方の腫瘍負荷を緩和した。２ＤＧはまた、ＳＪＬ．ＣＤ８ａ−／−  マウスにおいて腫瘍を収縮させることにおいて有効であった。
【００７２】
実施例２：  肺腫瘍ＰＤＸモデルは、増殖ではなく代謝的差異が、２ＤＧに対する影響されやすさを決定することを示した
ヒト肺癌腫ＰＤＸ（患者由来の異種移植片）モデルにおける２ＤＧの効果を評価した。２ＤＧは主に解糖系に影響を及ぼすことが理解されている一方で、試験は、２ＤＧが、その代謝に対する効果とは独立して、他のシステム（例えば、細胞周期）に干渉し得ることを示した（８，  ３２，  ３３）。細胞周期における変化は、がん細胞の増殖に影響を及ぼし、最終的には、腫瘍成長に影響する。２ＤＧが、増殖とは独立して解糖系に影響を及ぼすか否かを試験するために、類似の成長動態を有する（図２Ａ）が、解糖系経路の使用においては異なる（表１）２種のＰＤＸヒト肺癌腫（ＴＭ００２４４およびＴＭ００９２１）を、試験した。
【表１】
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【００７３】
その２種の癌腫の間の全体の遺伝子発現の直接比較から、一方の癌腫、ＴＭ００２４４は、ＴＭ００９２１癌腫と比較して、代替の代謝経路の転写物を示すことが明らかになった（表１）。これら２種の癌腫に由来する腫瘍を、免疫欠損ＮＯＤ．Ｓｃｉｄ．ＩＬ２Ｒγヌル（ＮＳＧＴＭ）マウスに異種移植し、測定可能なサイズの腫瘍（＞５０ｍｍ３）が観察された後、各モデルのマウスを、６００ｍＭ  ２ＤＧまたはグルコースいずれかの２００μＬで、１週間に３回、Ｉ．Ｐ．注射を介して処置した。４週間の処置後、ＴＭ００９２１を異種移植したマウスは、グルコース処置と比較して、２ＤＧ処置で有意により小さな腫瘍容積を示したのに対して、ＴＭ００２４４を異種移植したマウスは、２ＤＧ処置マウスとグルコース処置マウスとの間で腫瘍サイズに差異を示さなかった（図２Ｂ）。これは、代謝経路使用における固有の差異−すなわち、解糖系に依拠するか否か−が、２ＤＧへの応答に影響し得ることを示唆する。
【００７４】
実施例３：  解糖系依存性Ｂ細胞がんは、２ＤＧに感受性である
ＰＤＸモデルを使用する上記の実験は、解糖系に依拠する肺腫瘍が、２ＤＧ治療に影響されやすいという強い兆候を与えたが、ＰＤＸ腫瘍の不均質性は、交絡変数であり得る。なぜなら各ＰＤＸ腫瘍は、種々の解糖系の要求を有する多数の細胞タイプを含むからである（３４，  ３５）。この細胞不均質性を制御するために、およびその知見をヒトＢ細胞へと広げるために、Ｂ細胞がん細胞株をスクリーニングし、２つの株、ＣＣＲＦ−ＳＢおよびＭＥＣ１を得た。これは、類似の好気的呼吸速度を共有したが、それらがエネルギー源として解糖系を使用することにおいて異り（図３Ａ）、エキソビボで類似の増殖速度をなお有した（図３Ｂ）（３６，  ３７）。
【００７５】
これらのデータは、ＭＥＣ１細胞（これは、ＣＣＲＦ−ＳＢ細胞より解糖系依存性であった）が、２ＤＧにより感受性であるという仮説を可能にした。その仮説を試験するために、その２つの細胞株を、インビボで２ＤＧ感度に関して試験した：  免疫欠損性ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＲＧＴＭ）マウスに、ＭＥＣ１細胞またはＣＣＲＦ−ＳＢ細胞のいずれかを異種移植し、次いで、そのマウスを、２００μＬの６００ｍＭ  ２ＤＧまたはグルコース  Ｉ．Ｐ．で、１週間に３回、２週間にわたって処置した。ＭＥＣ１細胞およびＣＣＲＦ−ＳＢ細胞はともに、脾臓および骨髄に移動し、これらのマウスはＣＤ１９＋  Ｂ細胞を発現することから、その腫瘍負荷を、その処置期間の最後に、安楽死後にフローサイトメトリーを介して、抗ヒトＣＤ１９染色によってこれらの器官において最後に測定し得る。
【００７６】
脾臓または骨髄において２ＤＧに対して有意な応答を示さなかったＣＣＲＦ−ＳＢ細胞とは対照的に、骨髄におけるＭＥＣ１細胞は、２ＤＧ処置で、数において有意な減少を示した（図３Ｃ）。興味深いことに、骨髄におけるＭＥＣ１細胞は２ＤＧに対する感受性を示したが、脾臓におけるその細胞は、示さなかった（図３Ｃ）。この後者の結果は、骨髄における２ＤＧの曝露または蓄積のいずれかに起因して、２ＤＧに対するＭＥＣ１細胞の応答において部位特異的な差異が存在し得ることを示し得る。全体的には、その結果は、解糖系依存性Ｂ細胞がんが、解糖系非依存性Ｂ細胞がんより２ＤＧに対して感受性であり、異なる部位におけるＭＥＣ１細胞がまた、２ＤＧに対するそれらの感受性において異なり得る（解糖系を利用するＢリンパ系腫瘍は、２ＤＧに対して影響されやすかった）ことを示唆した。
【００７７】
実施例４：  ＲＡＤ５１インヒビター、ＤＩＤＳは、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）異種移植細胞株の脾臓腫瘍負荷を低減した
上記で注記したように、ＡＩＤは、ＸＲＣＣ２依存性およびＲＡＤ５１依存性の相同組換えによって修復されるゲノム全体を通じて、免疫グロブリン遺伝子座非依存性ＤＮＡ切断を生成する（１５，  １６）。ＤＩＤＳが、組織培養物においてＡＩＤ陽性新生物細胞株を特異的に標的化し得ることは、以前に示された（１７）。重要なことには、ＤＩＤＳはまた、エキソビボで患者に由来する、ＡＩＤ陽性を標的化したが、ＡＩＤ陰性のヒトＣＬＬ細胞を標的化しなかった（１７）。ＤＩＤＳが、異種移植したＡＩＤ陽性ＣＬＬ細胞株をインビボで標的化し得る程度を試験するために、その解糖系ＭＥＣ１  Ｂ−細胞株を利用し、これを、エキソビボでＣＤ１９発現によって定量し得る（３６）。
【００７８】
ＭＥＣ１  Ｂ細胞のＡＩＤ陽性を、逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲを使用して確認し、次いで、ＭＥＣ１  Ｂ細胞のＡＩＤ発現を、Ｋ５６２細胞（ＡＩＤ欠損細胞株）のもの、およびＣＣＲＦ−ＳＢ（ＡＩＤ陽性ＡＬＬ細胞株）のものと比較した。ＲＮＡ投入量を制御するために、そのサンプルをまた、コントロール遺伝子Ｇａｐｄｈに関して試験した。結果は、ＭＥＣ１  Ｂ細胞が、ＡＩＤを構成的に発現することを示した（図４Ａ）。ＡＩＤはまた、ＡＩＤの細胞内染色およびフローサイトメトリーによって検出された（図４Ｂ）。エキソビボでＤＩＤＳに対するＭＥＣ１  Ｂ細胞の感受性を試験するために、ＤＩＤＳを、０〜０．２ｍＭまで、２×１０５  ＭＥＣ１  Ｂ細胞で滴定した。ＭＥＣ１  Ｂ細胞に対するＤＩＤＳの細胞傷害性効果は、０．０５ｍＭにおいて５日間程度の早さで認められ、５日後に、０．１ｍＭおよび０．２ｍＭの用量で有意な効果が観察された（図４Ｃ）．
【００７９】
ＤＩＤＳは、エキソビボでＭＥＣ１  Ｂ細胞の数を低減させることにおいて有効であったので、その有効性を、インビボで試験した。２×１０７  ＭＥＣ１細胞を、免疫欠損ＮＲＧＴＭマウスへと２週間にわたって異種移植し、次いで、マウスを、５０ｍｇ／ｋｇのＤＩＤＳまたは０．１Ｍ  炭酸水素カリウム／ＰＢＳビヒクルのいずれかでさらに２週間にわたって１週間に１回処置した。ＮＲＧＴＭマウスはＣＤ１９細胞が欠損していることから、そのマウスを使用し、その脾臓は、ＭＥＣ１  Ｂ細胞（これは全てＣＤ１９に関して陽性である）のホーミング器官であることから、ヒトＣＤ１９に関して脾臓細胞を染色することによってＭＥＣ１  Ｂ細胞の定量を可能にした。その試験したマウスの中で広い範囲の異種移植能力にも関わらず、ＤＩＤＳで処置した１１匹のマウスのうちの１０匹は、脾臓におけるＭＥＣ１細胞の数の有意な（ｐ＝０．００１）低減を示すことが観察された（図４Ｄ）。
【００８０】
実施例５：  ＭＥＣ１細胞に対するＤＩＤＳの治療効果は、ＡＩＤを要した
ＤＩＤＳの効果がＡＩＤに依存したか否かを直接決定するために、ＡＩＤのエキソン２を標的化する３種のＣＲＩＳＰＲガイドを生成した（図７Ａ）。このエキソンは、ＣＲＩＳＰＲガイドの効率的なデザインのために十分に大きい最初のエキソンであることから、これを標的化した。そのガイドを、ＭＥＣ１細胞へとトランスフェクトし、その細胞を、限界希釈によってクローニングした。その親細胞株であるＭＥＣ１に類似の速度で成長する１つのクローン（クローン＃１４）を、４つのサブクローン（クローン＃１４−１、１４−３、１４−１４および１４−１５）へとサブクローニングした。配列決定の際に、それらは全て、一方のアレルのエキソン２において２５塩基対の欠失を有し、他方ではエキソン２の完全な欠失を有することが発見された（図７Ａおよび７Ｂ）。
【００８１】
理論上は、これは、ＡＩＤノックアウトＭＥＣ１（ＡＫＯ）細胞といわれる短縮型の非機能的ＡＩＤを生じる。ＡＩＤに対するＤＩＤＳの依存性を試験するために、ＡＫＯ細胞を、ＤＩＤＳで処理し、それらの成長を、親ＭＥＣ１細胞のものと比較した。ＡＫＯ細胞の増殖に対するＤＩＤＳの影響は、親ＭＥＣ１細胞の増殖に対するその影響と有意に異なった（図７Ｃ）。さらに、その親ＭＥＣ１細胞とは異なって、ＡＫＯ細胞は、その細胞をビヒクルで処理したかまたはＤＩＤＳで処理したかに関わらず、類似の速度で成長した（図７Ｃ）。ＡＩＤが十分であることが、インビボでのＤＩＤＳ有効性に必要とされたか否かを試験するために、ＡＫＯ細胞および親細胞を、ＮＲＧＴＭマウスに異種移植し、マウスを、５０ｍｇ／ｋｇのＤＩＤＳで２週間にわたって処置した。親の異種移植したＭＥＣ１細胞と比較すると、ＡＫＯ細胞は、ヒトＣＤ１９細胞のパーセンテージ（図４Ｅ）および脾臓重量（図７Ｄ）によって測定される場合に、ＤＩＤＳにより抵抗性であった。従って、ＭＥＣ１異種移植片におけるＤＩＤＳの治療効果は、ＡＩＤに依存した。
【００８２】
上記の結果は、ＤＩＤＳが、インビボでＡＩＤ開始切断に影響を及ぼすことを示した。ＤＩＤＳが、ＡＩＤ非依存性２本鎖切断（フランクまたは１本鎖千鳥状２本鎖切断（ｆｒａｎｋ  ｏｒ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ））の修復をインビボで遮断し得るか否かを、決定した。２本鎖切断を生じる一般的方法は、電離放射線を介するものである（１，  ３８，  ３９）。このために、ＡＩＤヌルマウスを、種々の濃度のＤＩＤＳ（０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ）で８時間にわたって処置し、次いで、脾細胞を採取し、種々の線量のＩＲ（０Ｇｙ、１Ｇｙ、５Ｇｙ、１０Ｇｙ）で処理した。ＩＲの１８時間後、生きている白血球（ＣＤ４５＋  Ｔｅｒ１１９−  ＰＩ−）の数を、フローサイトメトリーによって測定した。
【００８３】
結果は、ＩＲ単独が、その細胞の生存の減少を生じることを示した；しかし、ＤＩＤＳの存在下では、その効果は、有意に大きい（図４Ｆ）。この効果は、その細胞データが、その０ｍｇ／ｋｇ  ＤＩＤＳ処置データに対して正規化される場合に、１０Ｇｙにおいて特に明らかであった。ここでＤＩＤＳの用量の１／１０ですら、細胞剥離（ｃｅｌｌ  ａｂｌａｔｉｏｎ）の厳密さを相乗的に増強し得る（図４Ｆ）。これらのデータは、ＤＩＤＳがＡＩＤ開始ＤＳＢの修復を遮断するが、ＩＲ誘導性ＤＳＢの修復をも遮断することを示した。重要なことには、その結果は、ＤＩＤＳ、または任意のＲＡＤ５１インヒビターが、電離放射線と対になって、そのＩＲ単独の治療効果を増強する潜在的可能性を有することを示した。
【００８４】
実施例６：  エキソビボおよびインビボでのＭＥＣ１細胞に対する解糖系遮断およびＲＡＤ５１阻害の迅速な相乗効果
ＤＩＤＳによるＲＡＤ５１阻害が、放射線のような補助療法によって改善されることが見出されたので、ＤＩＤＳおよび２ＤＧの併用が、インビトロおよびインビボの両方で、ＡＩＤ陽性新生物に対して相乗効果を有するか否かを試験した。ＲＡＤ５１機能が、ＡＴＰを要求するので、ＡＴＰのプールにおける低減が、ＲＡＤ５１依存性修復の効率を減少させ、急速に増殖しているＡＩＤ＋新生物細胞に対するＤＩＤＳの細胞傷害性効果を増強するはずであると論じられた（３９，  ４０）（図８Ａ〜８Ｄ）。この可能性を試験するために、２ＤＧを、ＭＥＣ１細胞に対してＤＩＤＳで滴定した。なぜならＭＥＣ１細胞は、２ＤＧおよびＤＩＤＳの両方に対して感受性であるからである。２日目までに、ＤＩＤＳの濃度が増大するにつれて、細胞数が低減した（図５Ａ）。これは、先の結果（図４Ｃ）と一致した。しかし、それ自体では効果を有しない濃度である０．２ｍＭの２ＤＧの添加（ｙ軸，  図５Ａ）は、ＤＩＤＳの細胞傷害性効果を増強した（図５Ａ）。
【００８５】
滴定の傾きから、効果を誘発するために必要とされる低濃度のＤＩＤＳに関してのみならず、動態的にも、２ＤＧがＤＩＤＳとの相乗効果を有すると推測される。なぜならその効果は、５日間とは対照的に、４８時間までに認められるからである（図５Ａ  対  図４Ｃ）。この２ＤＧ媒介性の相乗効果が、任意のＲＡＤ５１インヒビターで処理した任意のＡＩＤ陽性細胞に関して保持されている程度を決定するために、異なるＲＡＤ５１インヒビターであるＢ０２（Ｓｉｇｍａ）を、ＭＥＣ１および別のＡＩＤ陽性細胞株であるＳｕＤＨＬ細胞に対して使用した。さらに、ＤＩＤＳを、ＳｕＤＨＬ細胞に対して試験した。各実験において、ＲＡＤ５１インヒビター処理（Ｂ０２またはＤＩＤＳ）と２ＤＧ処理とを組み合わせた。まとめると、その２つの実験およびＭＥＣ１細胞をＤＩＤＳおよび２ＤＧで処理する先の実験（図５Ａ）の結果は、２ＤＧで、２種のＡＩＤ陽性細胞株のいずれを処理しても、２種の異なるＲＡＤ５１インヒビターの有効性に対して類似の相乗効果があることを示した（図５Ｂおよび図８）。重要なことには、その結果はまた、２ＤＧと任意のＲＡＤ５１インヒビターとの組み合わせが、任意のＡＩＤ陽性がんに対しても相乗的な治療効果を有することを示唆した。
【００８６】
低用量でのこの相乗効果が、インビボでもその要点が繰り返され得るか否かを試験するために、ＭＥＣ１を異種移植したマウスを、ＤＩＤＳ単独、２ＤＧ単独、またはＤＩＤＳおよび２ＤＧの組み合わせのいずれかで、全て低濃度において、または陽性コントロールもしくは陰性コントロールとともに処置した。マウスを、１週間に３回、２週間にわたってＩ．Ｐ．処置した。１）マウスに、１０ｍｇ／ｋｇ  ＤＩＤＳをＩ．Ｐ．投与した（インビボで効果を誘発するためには、その用量のうちの１／５が必要であった）（図４Ｄ）；  ２）マウスに、２２０ｍｇ／ｋｇの２ＤＧまたはグルコースをＩ．Ｐ．処置した；効果のためには、２ＤＧの用量のうちの１／３が必要であった（図３Ｃ）；  ３）マウスを、ＤＩＤＳおよび２ＤＧの両方で処置した（最初の２群では、同じ用量で使用した）；  ４）陽性コントロールとして、マウスを、３５ｍｇ／ｋｇ（効果を誘発するために一般に使用される用量）のフルダラビン（ＣＬＬを処置するために頻繁に使用される化合物）で処置した；ならびに５）陰性コントロールとして、マウスを、ＰＢＳ中のグルコースからなるビヒクルで処置した（４１）。その２週間の処置期間後に、フローサイトメトリーを介してヒトＣＤ１９陽性細胞のパーセンテージを決定することによって、骨髄および脾臓を腫瘍負荷に関して評価した（図５Ｃ）。
【００８７】
骨髄（図５Ｃ）では、ＤＩＤＳ／２ＤＧ組み合わせ処置は、ビヒクルと比較して、腫瘍負荷の有意な（ｐ＜０．００２）減少を生じ、フルダラビンでの処置と比較して同様に減少を生じたが、この減少は、統計的に有意でなかった（ｐ＝０．２６）。興味深いことには、骨髄では、２ＤＧ単独は、その組み合わせ処置と同程度の効果を誘発した（図５Ｃ）。脾臓では、その組み合わせ処置は、いずれかの化合物と別個にまたはビヒクルと比較して最良の転帰を生じ（ｐ＝０．００１）、フルダラビンよりさらに有意に成績がよかった（ｐ＝０．０３）（図５Ｃ）。まとめると、これらのデータは、低用量でのＲＡＤ５１インヒビター／解糖系インヒビターの組み合わせ処置が、ＭＥＣ１細胞をインビボで処置するにあたって、現在の処置の標準であるフルダラビンより有効であったことを示唆する。これは、有害な副作用の可能性を最小限にしながらがんを処置する有効な手段を示す。
【００８８】
さらに、ＤＩＤＳおよび２ＤＧのこれらの低減した用量では、これらの処置の一般的な有害効果（体重変化が挙げられる）が観察されなかった。なぜならその処置レジメンの最後に、その処置したマウスの体重は、その処置していないマウスまたはビヒクル処置したマウスのものに類似であったからである（図５Ｄ）。まとめると、これらの結果は、ＲＡＤ５１インヒビターであるＤＩＤＳとの組み合わせでの２ＤＧは、ＤＩＤＳ単独での処置と比較してより有効であり、それと同時に有害効果を誘発しない（これは、任意の疾患の処置に関して最良の転帰である）がんに対して細胞傷害性効果を生じるために、各化合物の低減した用量で安全に投与され得ることを示した。
【００８９】
また、２ＤＧおよびＤＩＤＳを併用することによるインビボ実験では、２ＤＧの用量は、１／４に低減され、ＤＩＤＳの用量は１／５に低減され、これは、フルダラビン（標準治療処置）を用いるより効果的に、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞株を異種移植したマウスモデルにおける腫瘍負荷を低減した。
【００９０】
本明細書で示されるように、高用量で投与した２ＤＧ単剤療法は、リンパ節の２種の異なる自然発生的マウスモデル：非ホジキンリンパ腫のＳＪＬ／ＪモデルおよびＴ細胞リンパ腫のＴｒｐ５３−／−  モデルの処置において有効であった。さらに、高用量の２ＤＧは、解糖系に対して厳密に依拠していないものより、解糖系依存性のヒトＰＤＸ肺がんおよびＢ細胞株リンパ腫異種移植片においてより大きな有効性を示した。まとめると、これらの所見は、解糖系依存性腫瘍が２ＤＧによって標的化され得るという概念を裏付ける。しかし、効果を誘発するために必要とされる２ＤＧの用量は、腫瘍縮小／抵抗性が一時的であること（図１Ａおよび１Ｂ）と合わせれば、２ＤＧ単独が有効ながん治療として制限されることを示唆した。
【００９１】
上記で述べたように、２ＤＧと他の治療との組み合わせは相乗効果の見込みを示したが、その第２の化合物のうちのいずれについてもがん細胞特異性は存在しない−それらのうちの大部分は、ＤＮＡ複製、細胞周期または転写のような基本的機能を標的化する（１０）。従って、併用療法における標準であるように、２ＤＧの量を低減し、２ＤＧと正常細胞においてよりがん細胞において特異的に標的化される治療とを組み合わせると、がん細胞の特異的標的化が有害効果を最小化することから、より有効な治療の開発がもたらされ得る。
【００９２】
この試験では、ＲＡＤ５１の、ＤＩＤＳを介する特異的阻害が、２ＤＧの一般化された抗解糖系効果と、各々、その化合物が単独で投与される場合に使用されるより低い用量において、抗解糖系インヒビターががん細胞にのみ影響するように、その特異性を狭めるという全体的な目的をもって、組み合わされる。この試験は、解糖系およびＲＡＤ５１依存性修復の同時の阻害が、ＡＩＤ＋  がんに対して特異的に総合的な致死効果を増加させ得ることを示した。全てのＣＬＬおよび非リンパ系腫瘍のおよそ半数が、ＡＩＤを発現する（１７，  １８，  ２０，  ２１，  ２３）という事実は、この治療が非リンパ系がんに使用され得ることを示す。
【００９３】
解糖系遮断およびＲＡＤ５１阻害の両方の組み合わせが、腫瘍形成に対して増強された有効性をもたらすという観察は、２つの方法で説明され得る：第１は、ＡＴＰは、修復以外にも多数のプロセスに必要とされる。従って、２ＤＧによる解糖系の低減は、ＤＩＤＳの作用にかかわらず、がん細胞を弱める。これは、ＤＩＤＳありまたはなしで、腫瘍負荷における差異が存在しなかったＭＥＣ１細胞異種移植試験における骨髄において観察された。第２に、脾臓では、ＤＩＤＳの存在は、有意差をもたらし、その２種の化合物は、相乗効果を示した。
【００９４】
最後に、解糖系の同時の遮断が観察され（２ＤＧで）、ＲＡＤ５１の阻害（ＤＩＤＳで）は、相乗効果を有するのみならず、ＤＩＤＳ単独の使用と比較して、実質的により迅速な効果を生じた。この利点は、化学療法のより短い処置時間へと解釈することができ、これは、より重篤度の小さい有害効果、より低コスト、および腫瘍がその処置に対して耐性を発生させるより小さい機会をもたらすことができた。
【００９５】
まとめると、２ＤＧを使用する解糖系遮断と、ＤＩＤＳを使用するＲＡＤ５１阻害とを、単独で投与される場合に使用される用量と比較して、各々のより低用量で組み合わせると、エキソビボおよびインビボの両方で、ＡＩＤ陽性がん細胞の数が相乗的に低減した。本明細書で示される結果は、このアプローチが、ＡＩＤ陽性でない腫瘍で使用され得ることを示唆した。なぜならＲＡＤ５１は、急速に複製している細胞においてフォークコラプスを修復するために、および２本鎖切断を修復するために使用されるからである（４８，  ４９）。さらに、ＡＩＤは、多くの癌において腫瘍促進遺伝子として関係があるとされているが、本明細書で記載される併用療法アプローチの改変は、ＡＩＤが腫瘍形成的役割を果たす可能性が小さい相同組換え陰性がん（例えば、ＢＲＣＡ変異体）において潜在的に有効であり得る（５０）。
【００９６】
具体的には、患者は、組換えＡＩＤおよび２ＤＧを同時に投与され得る。これは、染色体異常誘発性タンパク質（ｃｌａｓｔｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−ＡＩＤ−の投与を通じて、ＡＴＰプールの枯渇を介して低減したレベルの相同組換えに関する状態の生成と一緒に、そのがん細胞において致死的な組み合わせを潜在的に生じ得る。この組み合わせは、本明細書で考察される治療概念の適用を、ＡＩＤ陰性がんへと拡げ得る。まとめると、本明細書で提供されるデータは、ＡＩＤ、ＲＡＤ５１阻害、および解糖系遮断の組み合わせが、細胞特異性および動態、ならびにがん細胞に対する致死的効果を誘発するために必要なより低用量に起因して、有害効果の潜在的可能性を最小限にしながら、がんを処置するための有益な組み合わせであったことを示す。
【００９７】
材料および方法
マウス
この研究において使用したＣ５７ＢＬ／６Ｊ（カタログ番号ＪＲ０００６６４，  ＪＡＸ）、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ．１２９Ｓ２．  Ｔｒｐ５３−／−（カタログ番号００２１０１）、ＮＲＧＴＭ（Ｃａｔ．  ｎｏ．００７７９９，  ＪＡＸ）、ＮＳＧＴＭ（カタログ番号００５５５７，  ＪＡＸ）、およびＳＪＬ．Ｃｄ８ａ−／−（ＪＲ．００４０２３，  私有の系統：  Ｄｅｒｒｙ  Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ）マウスを繁殖させ、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｍａｉｎｅ）で飼育した。マウスに、飼料および水を自由給餌で提供し、１４時間明、１０時間暗のサイクルで飼育した。全ての手順は、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ動物実験委員会（ＡＣＵＣ）によって承認された。
【００９８】
雌性ＳＪＬ．ＣＤ８ａ−／−  マウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。マウスに年をとらせ、脾臓またはリンパ系の腫瘍に関して１週間に１回チェックした。有意に大きな腫瘍がいったん観察されたら、そのマウスに、６ｇ／Ｌの２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２ＤＧ）を含む水を自由に与えた。腫瘍をモニターし、疾患の退縮または進行の徴候のために１週間に１回写真を撮った。
【００９９】
細胞
ヒト末梢血急性Ｂリンパ芽球性白血病細胞（ＣＣＲＦ−ＳＢ細胞株（ＡＴＣＣ））；ヒト慢性リンパ性白血病細胞（ＭＥＣ１細胞株（カタログ番号ＡＣＣ  ４９７，  ＤＳＭＺ））；ＡＩＤ陽性腹膜滲出液Ｂリンパ芽球ＳＵＤＨＬ−４細胞；およびＫ５６２骨髄白血病細胞を、製造業者の／ドナーの推奨に従って培養した。細胞生存性計数を、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  ＩＩ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、製造業者の推奨に従って行った。
【０１００】
ＡＩＤ  ＫＯ  ＭＥＣ１細胞株の生成
ＡＩＤノックアウト（ＡＫＯ）  ＭＥＣ１細胞株を、ＡＩＤのエキソン２を以下のガイドＲＮＡ：ＣＴＴＧＡＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧ（配列番号１）、ＧＴＣＣＧＣＴＧＧＧＣＴＡＡＧＧＧＴＣ（配列番号２）、ＧＴＧＣＴＡＣＡＴＣＣＴＴＴＴＣＡＣ（配列番号３）で標的化することによって樹立した。これらのガイドを、Ｃａｓ９−ＥＧＦＰベクター、ｐＸ３３０（Ａｄｄｇｅｎｅ，  カタログ番号６６５８２）へとクローニングした。これらのベクターを、プログラムＸ−００１を使用するＡｍａｘａ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ  Ｖを使用して、および製造業者の説明書（Ｌｏｎｚａ，  カタログ番号ＶＡＣＡ−１００３）に従って、ＭＥＣ１細胞へとヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクトした細胞をＧＦＰ陽性に関してソートし、限界希釈によってクローニングして、ＡＫＯ細胞株を生成した。２種の独立したＡＫＯ細胞株（１４−１および１４−３）を、ゲノムＰＣＲおよび転写物ＰＣＲの両方を使用して、ＡＩＤヌル欠損性（ｎｕｌｌｉｚｙｇｏｓｉｔｙ）について確認した。
【０１０１】
化合物
２−デオキシ−Ｄ−グルコース（カタログ番号Ｄ８３７５）、ＲＡＤ５１インヒビターであるＢ０２（カタログ番号ＳＭＬ０３６４）、およびリン酸フルダラビン（カタログ番号１２７２２０４）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。ＤＩＤＳを、ＣｈｅｍＣｒｕｚ（カタログ番号ｓｃ−２０３９１９）から得た。
【０１０２】
構造を以下に示す：
【化１】
2021514952.tif 000004
【化２】
2021514952.tif 000005
【０１０３】
ＡＩＤおよびＲＡＤ５１の定量
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して、製造業者のプロトコ＾ル（ＱＩＡＧＥＮ，  カタログ番号７４１０４）を使用して、組織サンプルから抽出した。
【０１０４】
ＰＤＸ異種移植片および処置
患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）腫瘍を、ＪＡＸ  ＰＤＸ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅから得た。腫瘍断片を、個々に切り刻み、ＮＳＧマウスの皮下に異種移植して、Ｐ１を樹立した。その腫瘍断片が成長した際に、その腫瘍を採取し、切り刻み、多数のマウスに異種移植して、Ｐ２マウスを樹立した。全ての実験を、多数の腫瘍断片のうちの１つから生着を生じたＰ２またはより高次のマウスで行った。
【０１０５】
異種移植片試験
ヒトがん細胞株を、以下の方法でＮＲＧマウスに異種移植した：フラスコの中で成長させた細胞に、異種移植の前夜に新鮮な培地を与え、１０６  細胞／ｍＬで播種した。翌日、その細胞を、カルシウムもマグネシウムも含まないＤＰＢＳで２回洗浄し、室温において１〜２×１０８  細胞／ｍＬ  ＤＰＢＳへと再懸濁し、直ぐに１００μＬ／マウスにおいて尾静脈を介して注射した。その細胞を、７〜１０日間与えて、完全に異種移植し、その後、血液における腫瘍負荷を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ  ＩＩ）を介してヒトＣＤ１９＋  細胞に関して評価した（抗体カタログ番号５５５４１３，  ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ）。類似の腫瘍負荷を有するマウスを、種々の処置群に割り当てて、偏りを減少させ、処置にわたって腫瘍負荷をより均一にするようにした。マウスを、別段示されなければ、結果の節に記載されるように２週間にわたって処置した。安楽死させた際に、その脾臓および骨髄を採取し、ヒトＣＤ１９に関して染色し、その細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ  ＩＩでのフローサイトメトリーによって測定した。そのフローデータの分析を、Ｆｌｏｗｊｏ  バージョン８．８．７（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）によって行った。
【０１０６】
異種移植を、以下のように行った：  ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得たＮＯＤ．  Ｒａｇ１−／−  ＩＬ−２ｒｇ−／−  （ＮＲＧ）マウスに、非ホジキン白血病ＣＣＲＦＳＢ、慢性リンパ性白血病ＭＥＣ１細胞またはルシフェラーゼ遺伝子を有するＭＥＣ１細胞（ＭＥＣ１＿ＬＵＣ）を１〜２週間にわたって異種移植した。次いで、マウスを、無作為に処置コホートまたはビヒクルコホートに割り当て、２週間にわたって処置した。
【０１０７】
２ＤＧでの自然発生的腫瘍モデルの処置
ＳＪＬ．ＣＤ８ａ−／−  雌性マウスに年をとらせ、６ヶ月齢に達した後に、腫瘍発生の徴候に関して１週間に１回モニターした。腫瘍を、７ヶ月齢〜１２ヶ月齢の間にマウスで見出した。腫瘍が明らかに目に見えるサイズに一旦達したら、そのマウスに、自由に提供した６ｇ／Ｌの溶解した２ＤＧを有する水を与えた。その水中での２ＤＧのこの濃度は、そのマウスに、およそ９６０ｍｇ／ｋｇの２ＤＧという１日用量を供給した。マウスを１週間に１回モニターして、腫瘍塊の変化を決定した。その腫瘍の写真を１週間に１回撮影して、その腫瘍が、それらのサイズを収縮しているのか、拡張しているのか、または維持しているのかを測定し、そのマウスの全体的な健康状態の予測を提供した。処置を、１１週間にわたって、またはその腫瘍が戻って、マウスが病気になって試験を継続できなくなるまで、継続した。１匹のマウスの処置を、１６週間目まで行って、あるとすれば、長期の２ＤＧ曝露に伴ってどのような副作用が起こるかを決定した。この腫瘍は決して戻らず、有害効果が注記されなかった。腫瘍収縮が観察された日付、および腫瘍再発が観察された日付を記録した。
【０１０８】
統計
全ての統計パラメーターを、ＥＸＣＥＬ  バージョン１５．４を使用して計算した。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）であり、ｐ値は、別段示されなければ、スチューデントｔ検定によって計算した。
スチューデントｔ検定を使用して、ｐ値を計算した：  ＊＝ｐ≦０．１  ＊＊＝ｐ≦０．０５  ＊＊＊＝ｐ≦０．０１
【０１０９】
ｑＰＣＲによるＡＩＤおよびＲＡＤ５１の検出
緩衝液ＲＬＴ中の１％  β−メルカプトエタノールを、１００ｍｇ／１．２５ｍＬの比で組織に添加した。ｃＤＮＡの合成を、ＲＴ２  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｋｉｔを使用して、製造業者のプロトコール（ＱＩＡＧＥＮ，  カタログ番号３３０４０４）に従って行った。５００ｎｇのＲＮＡを、利用可能な場合には使用した；そうでなければ、そのサンプルセットのために次の最大量のＲＮＡを使用した。ｑＰＣＲに関して、ＧＡＰＤＨ転写物を検出するオリゴヌクレオチドは、以下であった：５’−ＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴ−３’（正方向）（配列番号４）および５’−ＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＧＣ−３’（逆方向）（配列番号５）。ＡＩＣＤＡ転写物を検出するオリゴヌクレオチドは、以下であった：５’−ＴＴＣＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＡＣＴＴＴＧＧ−３’（正方向）（配列番号６）および５’−ＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＣＣ−３’  （逆方向）（配列番号７）。ＲＡＤ５１転写物を検出するオリゴヌクレオチドは、以下であった：５’−ＣＡＡＣＣＣＡＴＴＴＣＡＣＧＧＴＴＡＧＡＧＣ−３’（正方向）（配列番号８）および５’−ＴＴＣＴＴＴＧＧＣＧＣＡＴＡＧＧＣＡＡＣＡ−３’（逆方向）（配列番号９）。各サンプルに対して、３回の２５μＬの反応を、種々のｃＤＮＡ濃度（１０μＬ、５μＬ、および１μＬ）に関して実行した。その反応を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｍｏｄｅｌ  ７５００サーモサイクラーで、ＲＴ２  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＯＸ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ，  カタログ番号３３０５２０）を使用して実行した。ＰＣＲ条件は、５０℃を２分間、９５℃を１０分間、続いて、９５℃を１５秒間、６０℃を１分間の４０サイクルであった。
【０１１０】
フローサイトメトリーによるＡＩＤの検出
３％  中性緩衝化ホルマリン（カタログ番号ＭＥＲ  ４４９９１  ＧＬ，  Ｍｅｒｃｅｄｅｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ＤＰＢＳ（カタログ番号１４１９０２５０，  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中の２％  スクロース（カタログ番号Ｓ８５０１  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中、１００万個／ｍＬの濃度において１０分間、室温において懸濁物中で、細胞を固定した。次いで、その細胞を、ＤＰＢＳで遠心分離（４００×ｇ  ×５分間）によって洗浄し、ＤＰＢＳ中の０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（カタログ番号Ｘ１００，  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で透過化し、ＤＰＢＳで１回洗浄した。その細胞を、１ｍＬの、ＤＰＢＳ中１０％  ＦＢＳとともに１時間インキュベートし、０．１ｍＬの、ＤＰＢＳ中１０％  ＦＢＳにおいて１：１００の抗ＡＩＤ抗体（ａｂ９３５９６，  Ａｂｃａｍ）で４℃において一晩染色した。その細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、０．１ｍＬの、ＤＰＢＳ中１０％  ＦＢＳ中、Ａｌｅｘａ  ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（カタログ番号Ａ２７０１６，  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の１：１０００希釈物とともに１時間、室温において遮光してインキュベートした。その細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、データを、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ  ＩＩを使用して取得し、Ｆｌｏｗｊｏ  バージョン８．８．７によって分析した。
【０１１１】
代謝測定
細胞株での好気的および解糖系の測定を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＸＦ細胞エネルギー表現型試験キットを使用して、製造業者の説明書（カタログ番号１０３３２５−１００）に従って、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦｅ９６  Ａｎａｌｙｚｅｒで行った。
【０１１２】
マイクロＣＴ画像化および画像再構築
マイクロコンピューター断層撮影（μＣＴ）を、高速インビボμＣＴスキャナー（Ｑｕａｎｔｕｍ  ＧＸ，  ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，  Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）を使用して行った。その画像を、４分間スキャン時間で高解像度スキャンモードを使用して取得した。そのＸ線源を、５０μｍボクセルサイズに対して、電流８８μＡ、電圧９０ｋＶｐ、および３６ｍｍ  ＦＯＶに設定した。画像化の間は、動物に、ノーズコーンを介して２％イソフルランで麻酔をかけた。麻酔の投与は、スキャンしている間のモーションアーチファクトを最小限にするのに役立った。動物を、完全に動けるようになるまで、３７℃の加熱パッド上に松の削りくずを置いたクリーンボックスの中で回復させ、次いで、それらのホームケージに戻した。
【０１１３】
そのμＣＴ画像を、３Ｄ  Ｖｉｅｗｅｒ（Ｑｕａｎｔｕｍ  ＧＸシステム内の既存のソフトウェア）を介して可視化した。そのグレースケール画像スライスを、各動物内でおよそ同じ位置で画像が生成されるように、肋骨および脊柱のような内部目印に基づいて選択した。これらの画像を、ＪＰＥＧファイルとして保存した。カラー化した画像を、Ｉｍａｇｅ  Ｊ３２（Ｖ１．４９）またはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ３Ｄ  Ｖｉｅｗｅｒアプリケーションを使用して再構築した。閾値を使用して、骨および軟組織へのヒストグラムの最適な分離を視覚的に決定した。このようにして、肺および腫瘍を、骨から分離して見せることができた。
【０１１４】
遺伝子発現分析
早期ＪＡＸ  ＰＤＸ腫瘍学モデルの発現分析を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（以前はＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ）  ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  ＡｒｒａｙまたはＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴ  Ａｒｒａｙを利用して行った。全てのマイクロアレイアッセイしたモデルからのアレイを、分位数正規化（ｑｕａｎｔｉｌｅ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）を使用し、バックグラウンド補正を使用せずに、ＡｆｆｙＰＬＭ  Ｒパッケージで処理し、対数強度をアレイ効果、プローブ効果、および残りの合計として扱う単純なモデルにフィットさせた。そのアレイ効果は、標準的ＲＭＡ分析によって生成されるメジアンで洗練させた値（ｍｅｄｉａｎ  ｐｏｌｉｓｈｅｄ  ｖａｌｕｅ）に等しい「要約した発現（ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」であった。モデルＴＭ００２４４およびＴＭ００９２１における各遺伝子の正規化した発現の間の差異を計算して、そのモデル間での発現における最大差を示す遺伝子を同定した。次いで、その遺伝子リストを、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアに出力したところ、そのもたらされた経路が明らかになった。
参考文献
【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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