(57)【要約】【解決手段】本組成物及び方法は、フィターゼの無機リン酸塩による熱安定化、及びフィターゼを含有する熱処理食品又は動物飼料ペレットの製造中のフィターゼの回復の増加に関する。リン酸塩は固体組成物に導入される。リン酸塩及びフィターゼは機能的に近接しており、且つモル比は少なくとも５０：１である。多層顆粒が教示されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体組成物中のフィターゼの安定性、又はそのような固体組成物を含むペレット化プロセスにおける前記フィターゼの回復を増加させる方法であって、リン酸塩を前記固体組成物に導入することを含み、前記リン酸塩及びフィターゼは機能的に近接していて、且つモル比は少なくとも５０：１であり、前記固体組成物はフィターゼに対するモル比が１０：１未満のイノシトール又はイノシトールリン酸を含む方法。
【請求項２】
前記フィターゼ及びリン酸塩は、固体担体を形成するか、又は固体担体に組み込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フィターゼ及びリン酸塩は、顆粒を形成するか、又は顆粒に組み込まれる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記顆粒はマトリックス顆粒である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記顆粒は多層顆粒である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記フィターゼ及びリン酸塩は前記多層顆粒の単一の層に組み込まれる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記フィターゼ及びリン酸塩は前記顆粒のコアに組み込まれる、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記顆粒は食品又は動物飼料ペレットに含まれ、蒸気ペレット化後の、熱処理後の活性回復率は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％若しくはそれ以上である、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記顆粒は食品又は動物飼料ペレットに含まれ、食品又は動物飼料ペレット化後に回復した活性の相対的改善率は、同じ食品又は動物飼料ペレットにおいて、機能的に近接し、且つ少なくとも５０：１のモル比のリン酸塩及びフィターゼを有さない顆粒を使用して回復した活性と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％若しくはそれ以上である、請求項３〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
液体組成物中のフィターゼの安定性、又はそのような液体組成物を含むペレット化プロセスにおける前記フィターゼの回復を増加させる方法であって、リン酸塩を前記組成物に導入することを含み、前記リン酸塩及びフィターゼは機能的に近接していて、且つ前記リン酸塩は５０ｍＭ以上の濃度で存在し、前記液体組成物は１０ｍＭ未満のイノシトール又はイノシトールリン酸を含む方法。
【請求項１１】
前記フィターゼ及びリン酸塩は溶液中又は懸濁液中にある、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記フィターゼ及びリン酸塩は食品又は動物飼料ペレットに含まれ、食品又は動物飼料蒸気ペレット化後の活性の回復率は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記フィターゼ及びリン酸塩は食品又は動物飼料ペレットの表面に適用され、食品又は動物飼料蒸気ペレット化後の活性の回復率は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
食品又は動物飼料ペレット化後に回復した活性の相対的改善率は、同じ食品又は動物飼料ペレットにおいて、機能的に近接しリン酸塩が５０ｍＭ以上の濃度で存在するリン酸塩及びフィターゼを含まない顆粒を使用して回復した活性と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記リン酸塩は前記固体組成物又は前記液体組成物中に存在するフィチン酸塩の加水分解生成物ではない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記固体組成物又は前記液体組成物はイノシトール又はイノシトールリン酸を実質的に含まない、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記リン酸塩は一リン酸塩である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記フィターゼのＤＳＣ  Ｔｍは、リン酸塩対フィターゼの濃度モル比が少なくとも５０：１であるか、又はリン酸塩の濃度が少なくとも５０ｍＭであるリン酸塩によって安定化されていない対照フィターゼと比較して、少なくとも２．７℃増加する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
リン酸塩及びフィターゼを含み、前記リン酸塩及びフィターゼは機能的に近接し、且つ少なくとも５０：１のモル比であるか、又はリン酸塩は少なくとも５０ｍＭリン酸塩の量で存在する顆粒組成物。
【請求項２０】
前記顆粒はマトリックス顆粒である、請求項１９に記載の顆粒。
【請求項２１】
前記顆粒は多層顆粒である、請求項１９に記載の顆粒。
【請求項２２】
前記フィターゼ及びリン酸塩は多層顆粒の単一層に組み込まれる、請求項２１に記載の顆粒。
【請求項２３】
前記フィターゼ及びリン酸塩は前記顆粒のコアに組み込まれる、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の顆粒。
【請求項２４】
前記リン酸塩は前記固体組成物又は前記液体組成物中に存在するフィチン酸塩の加水分解生成物ではない、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の顆粒。
【請求項２５】
前記固体組成物又は前記液体組成物はフィチン酸塩を含有しない、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の顆粒。
【請求項２６】
前記リン酸塩は一リン酸塩である、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の顆粒。
【請求項２７】
請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の顆粒を含むペレット組成物。
【請求項２８】
機能的に近接し、且つモル比が少なくとも５０：１のフィターゼ及びリン酸塩を含むか、又は少なくとも５０ｍＭの濃度でリン酸塩が存在するペレット組成物であって、前記リン酸塩は前記ペレット組成物中に存在するフィチン酸塩の加水分解生成物ではないペレット組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本組成物及び方法は、フィターゼのリン酸塩による熱安定化、及びフィターゼを含有する熱処理食品又は動物飼料ペレットの製造中のフィターゼの回復の増加に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品及び動物飼料における酵素などの活性剤の使用は一般的である。酵素は、食品又は動物飼料の消化性を改善し、食物及び動物飼料における抗栄養因子を減少させ、且つ動物生産性を改善することが知られている。
【０００３】
乾燥飼料ミックスと比較した場合、飼料ペレットは飼料品質の向上、病原体の減少、製造中のより低い粉塵レベル、取り扱いやすさ、及びより均一な成分投与など、産業に好ましい特性を有する。
【０００４】
好ましい産業ペレット化プロセスでは、蒸気注入によって、水分を添加し温度を上昇させるコンディショニングとして知られるプロセスを行い、その後に、蒸気加熱した飼料原料又はコンディショニングされたマッシュをダイに通してペレット化する工程を行う。ペレット化プロセスの温度は一般に約７０℃〜１００℃以上である。
【０００５】
ペレット化プロセスで使用する蒸気、温度、圧縮力、及び化学物質のために、酵素の活性又は効力は、多くの場合、プロセス中に著しく低下する。酵素がプロセス後に再活性化する場合には、不活性化は少なくとも部分的に可逆的であり、プロセス後に触媒活性が再活性化しない場合には不可逆的である。酵素の不可逆的な不活性化は、ペレット化などのプロセスにおいて非常に望ましくない。
【０００６】
食品及び飼料産業において、酵素活性が顕著に喪失することなく蒸気ペレット化プロセスに供される製剤中の成分として働く、安定で耐久性のある酵素顆粒が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本組成物及び方法は、リン酸塩による組成物中のフィターゼの安定性、及び蒸気ペレット化によって製造された動物飼料ペレットからのフィターゼの回復の増加に関する。
１．一態様では、固体組成物中のフィターゼの安定性、又はそのような固体組成物を含むペレット化プロセスにおけるフィターゼの回復を増加させる方法であって、リン酸塩を固体組成物に導入することを含み、リン酸塩及びフィターゼは機能的に近接していて、且つモル比は少なくとも５０：１であり、固体組成物はフィターゼに対するモル比が１０：１未満のイノシトール又はイノシトールリン酸を含む方法が提供される。
２．段落１に記載の方法のいくつかの実施形態において、フィターゼ及びリン酸塩は、固体担体を形成するか、又は固体担体に組み込まれる。
３．段落１又は２に記載の方法のいくつかの実施形態において、フィターゼ及びリン酸塩は、顆粒を形成するか、又は顆粒に組み込まれる。
４．段落３に記載の方法のいくつかの実施形態において、顆粒はマトリックス顆粒である。
５．段落３に記載の方法のいくつかの実施形態において、顆粒は多層顆粒である。
６．段落１〜５のいずれかに記載の方法のいくつかの実施形態において、フィターゼ及びリン酸塩は多層顆粒の単一の層に組み込まれる。
７．段落３〜６のいずれかに記載の方法のいくつかの実施形態において、フィターゼ及びリン酸塩は顆粒のコアに組み込まれる。
８．段落３〜７のいずれかに記載の方法のいくつかの実施形態において、顆粒は食品又は動物飼料ペレットに含まれ、蒸気ペレット化後の、熱処理後の活性回復率は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％若しくはそれ以上である。
９．段落３〜８のいずれかに記載の方法のいくつかの実施形態において、顆粒は食品又は動物飼料ペレットに含まれ、食品又は動物飼料ペレット化後に回復した活性の相対的改善率は、同じ食品又は動物飼料ペレットにおいて、機能的に近接し、且つ少なくとも５０：１のモル比のリン酸塩及びフィターゼを有さない顆粒を使用して回復した活性と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％若しくはそれ以上である。
１０．別の態様では、液体組成物中のフィターゼの安定性、又はそのような液体組成物を含むペレット化プロセスにおけるフィターゼの回復を増加させる方法であって、リン酸塩を組成物に導入することを含み、リン酸塩及びフィターゼは機能的に近接していて、且つリン酸塩は５０ｍＭ以上の濃度で存在し、液体組成物は１０ｍＭ未満のイノシトール又はイノシトールリン酸を含む方法が提供される。
１１．段落１０に記載の方法のいくつかの実施形態において、フィターゼ及びリン酸塩は溶液中又は懸濁液中にある。
１２．段落１０又は１１の方法のいくつかの実施形態において、フィターゼ及びリン酸塩は、食品又は動物飼料ペレットに含まれ、食品又は動物飼料蒸気ペレット化後の活性の回復率は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％である。
１３．段落１０〜１２のいずれかの方法のいくつかの実施形態において、フィターゼ及びリン酸塩は、食品又は動物飼料ペレットの表面に適用され、食品又は動物飼料蒸気ペレット化後の活性の回復率は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％である。
１４．段落１０〜１３のいずれかの方法のいくつかの実施形態において、食品又は動物飼料ペレット化後に回復した活性の相対的改善率は、同じ食品又は動物飼料ペレットにおいて、機能的に近接しリン酸塩が５０ｍＭ以上の濃度で存在するリン酸塩及びフィターゼを含まない顆粒を使用して回復した活性と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％である。
１５．段落１〜１４のいずれかの方法のいくつかの実施形態において、リン酸塩は固体組成物又は液体組成物中に存在するフィチン酸塩の加水分解生成物ではない。
１６．段落１〜１５のいずれかの方法のいくつかの実施形態において、固体組成物又は液体組成物はイノシトール又はイノシトールリン酸を実質的に含まない。
１７．段落１〜１６のいずれかの方法のいくつかの実施形態において、リン酸塩は一リン酸塩である。
１８．段落１〜１７のいずれかの方法のいくつかの実施形態において、フィターゼのＤＳＣ  Ｔｍは、リン酸塩対フィターゼの濃度モル比が少なくとも５０：１であるか、又はリン酸塩の濃度が少なくとも５０ｍＭであるリン酸塩によって安定化されていない対照フィターゼと比較して、少なくとも２．７℃増加する。
１９．別の態様では、リン酸塩及びフィターゼを含み、リン酸塩及びフィターゼは機能的に近接し、且つ少なくとも５０：１のモル比であるか、又はリン酸塩は少なくとも５０ｍＭリン酸塩の量で存在する顆粒組成物が提供される。
２０．段落１９に記載の顆粒のいくつかの実施形態において、顆粒はマトリックス顆粒である。
２１．段落１９に記載の顆粒のいくつかの実施形態において、顆粒は多層顆粒である。
２２．段落２１に記載の顆粒のいくつかの実施形態において、フィターゼ及びリン酸塩は多層顆粒の単一の層に組み込まれる。
２３．段落１９〜２２のいずれかに記載の顆粒のいくつかの実施形態において、フィターゼ及びリン酸塩は顆粒のコアに組み込まれる。
２４．段落１９〜２２のいずれかに記載の顆粒のいくつかの実施形態において、リン酸塩は固体組成物又は液体組成物中に存在するフィチン酸塩の加水分解生成物ではない。
２５．段落１９〜２２のいずれかに記載の顆粒のいくつかの実施形態において、固体組成物又は液体組成物はフィチン酸塩を含有しない。
２６．段落１９〜２２のいずれかに記載の顆粒のいくつかの実施形態において、リン酸塩は一リン酸塩である。
２７．別の態様では、段落１９〜２６のいずれかの顆粒を含むペレット組成物が提供される。
２８．別の態様では、機能的に近接し、且つモル比が少なくとも５０：１のフィターゼ及びリン酸塩を含むか、又は少なくとも５０ｍＭの濃度でリン酸塩が存在するペレット組成物であって、リン酸塩はペレット組成物中に存在するフィチン酸塩の加水分解生成物ではないペレット組成物が提供される。
【０００８】
本組成物及び方法のこれら及び他の態様及び実施形態は、添付の図面を含む説明から明らかになるのであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、フィターゼに対するフィチン酸ナトリウムの濃度の増加が液体状態にある酵素の融解温度に及ぼす影響を示すグラフである。
【００１０】
【図２】図２は、リン酸ナトリウム濃度の増加に伴うフィターゼＵＦＣの融解温度プロファイルを示すグラフである。
【００１１】
【図３】図３は、フィターゼに対するリン酸ナトリウムの濃度の増加が液体状態にある酵素の融解温度に及ぼす影響を示すグラフである。
【００１２】
【図４】図４は、液体状態にあるフィターゼの融解温度に対する、アニオン当量で正規化した異なる賦形剤の比較を示すグラフである。
【００１３】
【図５】図５は、液体状態にあるフィターゼの融解温度に対する、電荷当量で正規化した異なる賦形剤の比較を示すグラフである。
【００１４】
【図６】図６は、リン酸ナトリウムレベルの増加に伴うフィターゼＵＦＣの熱不活性化プロファイルを示すグラフである。
【００１５】
【図７】図７は、クエン酸ナトリウムレベルの増加に伴うフィターゼＵＦＣの熱不活性化プロファイルを示すグラフである。
【００１６】
【図８】図８は、フィチン酸基質の存在下でのリン酸ナトリウムレベルの増加に伴うフィターゼの競合的阻害を示すグラフである。
【００１７】
【図９】図９は、フィチン酸基質の存在下でのクエン酸ナトリウムレベルの増加に伴うフィターゼの競合的阻害を示すグラフである。
【００１８】
【図１０】図１０は（Ａ）受容物質なし、（Ｂ）フィチン酸塩又は（Ｃ）リン酸塩を含む顆粒の蒸気シミュレーター回復を示すグラフである。
【００１９】
【図１１】図１１は（Ａ）受容物質なし、（Ｂ）フィチン酸塩又は（Ｃ）リン酸塩を含む顆粒の飼料中ペレット化回復を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
Ｉ．定義及び略語
本菌株及び方法を詳細に説明する前に、明確にするために以下の用語を定義する。定義されていない用語は、当該技術分野において使用されるそれらの通例の意味に一致するはずである。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「フィチン酸」という用語は、イノシトール六リン酸（ＩＰ６）を指し、これには、イノシトール五リン酸（ＩＰ５）、イノシトール四リン酸（ＩＰ４）、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）、イノシトール二リン酸（ＩＰ２）、及びイノシトール一リン酸（ＩＰ１）、それらの塩、並びにそれらの混合物を含む、ＩＰ６の異化生成物であるイノシトールリン酸が少量（すなわち、１０％未満）含まれてもよい。「フィチン酸」という用語には、イノシトール（ＩＰ０）又は無機リン酸塩は包含されない。但し、ＩＰ１、ＩＰ２、ＩＰ３、ＩＰ４、ＩＰ５及びＩＰ６は全て「イノシトールリン酸」という。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「リン酸塩」（ＰＯ４３−）という用語は、リン酸の無機化学物質及び塩形成アニオンを指す。「リン酸塩」という用語には、ＩＰ６、ＩＰ５、ＩＰ４、ＩＰ３、ＩＰ２、ＩＰ１又はＩＰ０は含まれない。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「食品」という用語は広義で使用され、ヒト用の食品及び食製品、並びに非ヒト動物用の食品（すなわち、飼料）を包含する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「飼料」という用語は、家畜の飼育において動物に給与される製品に関して使用される。「飼料」及び「動物飼料」という用語は、互換的に使用される。動物は反芻動物であっても非反芻動物であってもよい。反芻動物の例は、ウシ、ヒツジ、ヤギ及びウマである。非反芻動物の例は、ブタ、家禽（ニワトリ、シチメンチョウなど）、魚（サケなど）、イヌ、ネコ及びヒトなどの単胃動物である。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「食品成分又は飼料成分」という用語には、食品又は食材に添加されるか又は添加され得る処方物が含まれ、また広範な種々の製品に低レベルで使用され得る処方物が含まれる。この食品成分は、用途、及び／又は利用方法、及び／又は投与方法に応じて、溶液の形態とすることも固体とすることもできる。本明細書に記載される酵素は、食品成分若しくは飼料成分として、又は調製若しくは製造において使用され得る。酵素は、栄養補助食品であっても栄養補助食品に添加されてもよい。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸配列」という用語は、「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」という用語と同義語であり、互換的に使用される。そのようなアミノ酸配列が活性を示す場合、それらは「酵素」と呼ぶことができる。アミノ酸残基に対しては従来型の１文字コード又は３文字コードが使用され、アミノ酸配列は、標準のアミノからカルボキシ末端方向（すなわち、Ｎ→Ｃ）で表示される。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「実質的に類似（の）」及び「実質的に同一（の）」という語句は、少なくとも２つの核酸又はポリペプチドとの関連では、通常、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、参照（すなわち、野生型）配列と比較して、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約７５％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、又は少なくとも約９９％若しくはそれ以上の同一性を有する配列を含むことを意味する。配列同一性パーセントは、デフォルトパラメーターを有するＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムを使用して計算される。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０を参照されたい。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムのためのデフォルトパラメーターは、次の通りである：
ギャップオープニングペナルティ：１０．０
ギャップ伸長ペナルティ：０．０５
タンパク質ウエイトマトリックス：ＢＬＯＳＵＭシリーズ
ＤＮＡウエイトマトリックス：ＩＵＢ
ディレイ発散配列（％）：４０
ギャップ分離距離：８
ＤＮＡトランジションウエイト：０．５０
親水性残基リスト：ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ
ネガティブマトリックスの使用：オフ
トグル残基特異的ペナルティ：オン
トグル親水性ペナルティ：オン
トグル末端ギャップ分離ペナルティ  オフ。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「フィターゼ」という用語は、フィチン酸塩／フィチン酸を含むリン酸エステルの加水分解を触媒し、無機リン酸を放出することができるタンパク質又はポリペプチドを意味する。
【００２９】
本明細書で使用される場合、ポリペプチドに関連した「野生型」、「親（の）」又は「参照」という用語は、１つ以上のアミノ酸の位置での人為的な置換、挿入又は欠失を含まない、天然に存在するポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関連した「野生型」、「親（の）」又は「参照」という用語は、人為的なヌクレオシド変化を含まない天然に存在するポリヌクレオチドを指す。しかし、野生型、親又は参照ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドに限定されず、野生型、親又は参照ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドを包含することに留意されたい。
【００３０】
本明細書で使用される場合、ポリペプチドに関連した「バリアント」という用語は、１つ以上のアミノ酸の位置での人為的置換、挿入又は欠失を含むという点で、特定の野生型、親又は参照ポリペプチドとは異なるポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関連した「バリアント」という用語は、ヌクレオチド配列が特定の野生型、親又は参照ポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドを指す。野生型、親又は参照ポリペプチド又はポリヌクレオチドの同一性は、文脈から明らかになるであろう。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「精製（された）」という用語は、相当に純粋な状態、例えば、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９８％純粋又は少なくとも約９９％純粋でさえある物質（例えば、単離ポリペプチド又はポリヌクレオチド）を指す。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「改変」及び「変更」という用語は互換的に使用され、変えること又は変化させることを意味する。ポリペプチドを改変する又は変更するという文脈では、これらの用語は、アミノ鎖配列を直接的に若しくはコードする核酸を変えることにより変えること、又は例えば酵素をグリコシル化することによりポリペプチドの構造を変えることを意味し得る。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「固体担体」という用語は、例えば、噴霧、混合、吸収、又は他の方法で顆粒若しくは粉末などの粒子を形成することによって、フィターゼ及びリン酸塩を組み込むことができる不活性な固体材料を指す。固体担体の例としては、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、顆粒スクロース、デンプン−スクロースノンパレイユ（ＡＳＮＰ）及びマルトデキストリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「顆粒」という用語は、物質の小さなコンパクト粒子を指す。粒子は、物質のマトリックスから作製されてもよく、１つ以上の任意のコーティング層を有するコアを含んでもよい。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「多層顆粒」という用語は、コア及び少なくとも１つのコーティング層を含む組成物を指す。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「マトリックス顆粒」は、マトリックス物質及び均質に分散された酵素を含む均質な構造を有する顆粒を指す。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「コア」という用語は、「シード」という用語と置き換え可能である。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「コーティング層」及び「層」という用語は互いに置き換え可能である。コーティング層は、一般に、表面にコーティングされていない領域がほとんどないか又は全くないようにコアを包み込み、実質的に連続した層を形成する。顆粒及び／又は多層顆粒に使用される材料（例えば、本明細書に詳述される薬剤、成分及び酵素）は、食品及び／又は動物飼料における使用に好適なものである。材料は、食品グレード又は飼料グレードであり得る。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「外側コーティング層」という用語は、コアから最も遠い多層顆粒のコーティング層（すなわち、適用される最後のコーティング層）を指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「酵素コーティング層」又は「酵素層」という用語は、少なくとも１つの酵素を含む酵素層を指す。いくつかの実施形態では、酵素層が少なくとも２つの酵素を含む。いくつかの実施形態では、酵素層が少なくとも３つの酵素を含む。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「機能的近接」という用語は、リン酸塩がフィターゼを安定化することができるほどにリン酸塩とフィターゼが近接していることを意味する。例えば、リン酸塩及びフィターゼは両方とも顆粒の同じ層にある、すなわち、例えば、リン酸塩及びフィターゼは両方ともコアにある、及び／又はリン酸塩及びフィターゼは両方とも同じコーティング層にある。別の例では、リン酸塩及びフィターゼは顆粒の隣接するコーティング層にある。さらなる例では、フィターゼはコアにあり、且つリン酸塩は隣接するコーティング層中にある。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「熱処理」という用語は、蒸気ペレット化又は９０℃を超える温度の乾燥した熱に暴露することを指す。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「ペレット」及び「ペレット化」という用語は、固体の、丸みを帯びた、球形の及び円筒状の錠剤又はペレット、並びにそのような固体形状、特に飼料ペレット及び固体の押出動物飼料を形成するためのプロセスを指す。知られた食品及び動物飼料のペレット化製造プロセスには一般に、食品成分又は飼料成分を室温で約１〜約５分間一緒に混合すること、得られた混合物をサージビンに移送すること、混合物を蒸気コンディショナーに搬送すること、任意選択で蒸気コンディショニングされた混合物を膨張機に移すこと、混合物をペレットミル又は押出機に移送すること、及び最後にペレットをペレットクーラーに移送することが含まれる。Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，Ｄ．１９９４．Ｃｈａｐｔｅｒ  １０，Ｐｅｌｌｅｔｉｎｇ  Ｃｏｓｔ  Ｃｅｎｔｅｒ．Ｉｎ  Ｆｅｅｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩＶ．（ＭｃＥｌｌｈｉｎｅｙ，ｅｄ．），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｅｅｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｖａ．，ｐｐ．１１０−１３９。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「熱処理された食品又は動物飼料ペレット」という用語は、一般的には低くとも９０℃の温度で少なくとも３０秒間の熱処理（蒸気コンディショニングなど）を受けた、ペレット化されていない混合物を指す。混合物は、その後押出され、動物飼料ペレットを形成することができる。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「安定性」という用語は、フィターゼ酵素の酵素活性又は他の機能特性が有益に維持又は改善される様々な効果のいずれかを指す。フィターゼは、「回復活性」、「熱安定性」、及び／又は「不活性可逆性」のいずれかの改善を示すことによって安定性を示すことができる。また、「安定性」は、飼料又は飼料ペレットと組み合わせる前又は組み合わせた後のフィターゼ組成物中に維持される活性を指し得る。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「回復活性」という用語は、熱処理前のフィターゼの活性量と比較した、熱処理後のフィターゼの活性量を指す。回復活性は、パーセンテージとして表すことができる。回復活性パーセントは、以下のように計算される：
【数１】
2021521835.tif 000002
【００４７】
本明細書で使用される場合、「回復活性の相対的改善」という用語は、安定化されていないフィターゼの回復活性量と比較した、安定化フィターゼの回復活性量を指す。回復活性は、パーセンテージとして表すことができる。回復の相対的増加は以下のように計算される：
【数２】
2021521835.tif 000003
【００４８】
本明細書で使用される場合、「ＦＴＵ」若しくは「フィターゼターンオーバー単位」又は「フィターゼ活性単位」若しくは「単位」は、ｐＨ５．５及び３７℃で過剰のフィチン酸ナトリウムから１分当たり１μｍｏｌの無機リンを生成することができる酵素の量である。フィターゼ活性は、“Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｙｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｆｅｅｄ  ｂｙ  ａ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ：ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｓｔｕｄｙ”Ｅｎｇｅｌｅｎ，Ａ．Ｊ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｅｆｔ，Ｆ．Ｃ．，Ｒａｎｄｓｄｏｒｐ  Ｐ．Ｈ．，Ｓｏｍｅｒｓ，Ｗ．Ａ．，Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｊ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖａｔ，Ｂ．Ｊ．Ｊ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔ．２００１  Ｍａｙ−Ｊｕｎｅ；８４：６２９−３３に記載されているように、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ（ＡＯＡＣ）ＯｆｆｉｃｉａｌＭｅｔｈｏｄ２０００．１２に従ってアッセイされる。簡潔に記すと、粉砕した試料を２２０ｍＭ  酢酸ナトリウム三水和物、６８．４ｍＭ  塩化カルシウム二水和物、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５．５中で抽出する。次いで、上清をアッセイする。アッセイは、３７℃で６０分間、ｐＨ５．５でイネフィターゼからの無機リン酸の放出を測定する。酸性モリブデン酸塩／バナジン酸塩試薬でアッセイを停止し、リン酸塩をバナドモリブドリン酸塩の黄色着色複合体の強度によって定量する。
【００４９】
本明細書で使用される場合、酵素の「融解温度（Ｔｍ）」は、酵素タンパク質の５０％が非天然の折り畳まれていない状態になる温度、すなわち、折り畳まれた状態と折り畳まれていない状態の自由エネルギーが等しくなる温度であり、当該技術分野で知られている手法によって測定することができる。１つの好適な手法は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）である。融解温度を測定する他の好適な手法としては、光散乱、円偏光二色性及び酵素学的実験が挙げられる。
【００５０】
参照を容易にするために、本組成物及び方法の要素は、１つ以上の見出しの下に配置され得る。各見出しの下の組成物及び方法は、他の見出しの下の組成物及び方法にも適用されることに留意されたい。
【００５１】
本明細書で使用される場合、単数の冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、別途文脈が明確に指示しない限り複数の指示対象を包含する。本明細書に引用されている全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。以下の略語／頭字語は、他に特に規定しない限り、以下の意味を有する。
℃  摂氏温度
ｇ又はｇｍ  グラム
ｇ／Ｌ  グラム／リットル
ｇ／ｍｏｌ  グラム／モル
ｍｏｌ／ｍｏｌ  モル：モル比
ＨＰＬＣ  高速液体クロマトグラフィー
ｈｒ又はｈ  時間
ｋｇ  キログラム
Ｍ  モル濃度
ｍｇ  ミリグラム
ｍＬ又はｍｌ  ミリリットル
ｍｉｎ  分
ｍＭ  ミリモル濃度
ｃｍ  センチメートル
ｍｍ  ミリメートル
ｎｍ  ナノメートル
ＰＣＲ  ポリメラーゼ連鎖反応
ｒｐｍ  毎分回転数
μｇ  マイクログラム
μＬ及びμｌ  マイクロリットル
μＭ  マイクロモル濃度
ｗ／ｖ  重量／体積
ＦＴＵ／ｇ  フィターゼ単位／グラム
ＵＦＣ  限外濾過濃縮物
ｋＷ  キロワット
ａｔｍ  気圧
モル比  ｍｏｌ：ｍｏｌ。
【００５２】
ＩＩ．リン酸塩を用いたフィターゼの安定化
本組成物及び方法は、フィターゼ酵素の熱安定性がフィターゼに対してモル過剰の無機リン酸塩とのプレインキュベーション後に増加するという驚くべき観察に基づく。リン酸塩は安価な処方成分であり、有利なことに、フィチン酸塩などのより高価なフィターゼ安定化賦形剤に取って代わることができる。組成物及び方法の態様及び実施形態を以下に記載する。
【００５３】
Ａ．リン酸塩源
フィターゼを安定化するために使用されるリン酸塩は、ナトリウム、カルシウム、カリウム、又はアルミニウム塩などの無機塩、又は有機化合物に由来することができる。リン酸塩源は、本組成物及び方法にとって重要ではない。好適なリン酸塩としては、少なくとも、リン酸ナトリウム（一塩基性又は二塩基性）などの一リン酸塩、ヘキサメタリン酸ナトリウム及びトリメタリン酸ナトリウムなどのポリリン酸塩、並びに二リン酸ジナトリウム、二リン酸トリナトリウム、及び二リン酸テトラナトリウムなどのピロリン酸塩が挙げられる。例えば、リン酸、ピロリン酸塩及びその他のカリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩及びアンモニア塩のような他のリン酸塩形態が作用する可能性がある。
【００５４】
本組成物及び方法に従ってフィターゼを安定化するために使用されるリン酸塩は、ペレット化前に、フィチン酸塩がフィターゼ（液体、粉末、マトリックス顆粒、又は多層顆粒の形態など）と混合される食品又は動物飼料の成分中に通常又は本質的に存在するであろうものより著しく高いレベルで添加される必要がある。言い換えれば、フィターゼを安定化するために使用されるリン酸塩は外因性リン酸塩であり、食品又は動物飼料の成分中に存在するリン酸塩は内因性リン酸塩である。本組成物及び方法におけるリン酸塩の計算量には、微量の内因性リン酸塩は含まれない。本組成物及び方法の主題であるリン酸塩は、フィターゼを安定化する目的のためにフィターゼに機能的に近接して配置された外因性リン酸塩である。
【００５５】
さらに、本組成物及び方法に従ってフィターゼを安定化するために使用されるリン酸塩は、例えば、フィターゼを安定化するために使用されたフィチン酸塩又は他のイノシトールリン酸を含む、フィチン酸塩又はフィチン酸塩のいかなる加水分解生成物にも由来しない。フィチン酸塩、ＩＰ５、ＩＰ４、ＩＰ３、ＩＰ２、又はＩＰ０（イノシトール）を、フィターゼ及びリン酸塩を含む組成物にさらに添加してもよいが、それはリン酸塩源ではない。或いは、本組成物は、フィチン酸塩、ＩＰ５、ＩＰ４、ＩＰ３、ＩＰ２、及び／又はＩＰ０を特に含まなくてもよいか、又はわずかに低レベルのイノシトール若しくはイノシトールリン酸、すなわち１０ｍＭ未満若しくは５ｍＭ未満、又はイノシトール若しくはイノシトールリン酸対フィターゼ比が１０：１未満若しくは５：１未満のイノシトール若しくはイノシトールリン酸を含んでもよい。
【００５６】
フィターゼを安定化するために必要なリン酸塩の量は、フィターゼと比較して５０：１のモル比であるか、又は５０ｍＭ以上の濃度である。これは、本組成物及び方法を、１０ミリモルのフィチン酸塩を必要とする、Ｇｅｂｅｒｔ（国際公開第２０１３／１１９４６８号パンフレット）によって記載されたものと区別する。フィチン酸塩と比較してリン酸塩のコストがはるかに低い（フィチン酸塩と比較して１０〜２０倍）こと、及びリン酸塩を所与の量のフィターゼに対し、より低い質量パーセンテージで添加することができるという事実のために、本組成物及び方法は、処方コストを大幅に低減する。リン酸塩はまた、フィチン酸よりもはるかに高い純度で入手可能であり、これにより処方生成物の一貫性が向上する。リン酸塩は、特殊化学品としてよりむしろバルク商品として広く入手可能であり、イノシトール又はイノシトールリン酸のようななどの最終生成物を生成しない。
【００５７】
いくつかの実施形態では、フィターゼは顆粒化前の液体フィターゼ組成物（例えば、ＵＦＣ）に関して、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも１５０ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも２５０ｍＭ、少なくとも３００ｍＭ、少なくとも３５０ｍＭ、少なくとも４００ｍＭ、少なくとも４５０ｍＭ、少なくとも５００ｍＭ、少なくとも５５０ｍＭ、又は少なくとも６００ｍＭのリン酸塩によって安定化される。
【００５８】
いくつかの実施形態では、機能的に近接したリン酸塩と全フィターゼタンパク質とのモル比は、固体又は液体フィターゼ組成物に関して、少なくとも５０：１、少なくとも１００：１、少なくとも１５０：１、少なくとも２００：１、少なくとも２５０：１、又は少なくとも３００：１である。
【００５９】
いくつかの実施形態において、リン酸塩安定化フィターゼの回復活性の相対的改善は、本明細書で提供される回復活性％式による計算で、リン酸塩によって安定化されていない点以外は同一のフィターゼと比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、又はそれ以上である。
【００６０】
フィターゼにリン酸塩を提供するために、すなわち、リン酸塩及びフィターゼを機能的に近接させて配置するために、任意の手段を使用することができる。例えば、リン酸塩を含む液体は、フィターゼを含む液体と混合することができる。さらなる例では、フィターゼ及びリン酸塩は、固体担体上に噴霧乾燥される。特定の実施形態では、フィターゼ及びリン酸塩は顆粒、例えば多層顆粒又はマトリックス顆粒中で機能的に近接している。リン酸塩は、塩の形態で、例えば、リン酸の一塩基塩又は二塩基塩として、リン酸として、又は上記の任意の組み合わせで添加され得る。
【００６１】
Ｂ．好適なフィターゼ
フィターゼは、フィチン酸塩などのイノシトールリン酸塩におけるものを含むリン酸エステルの加水分解を触媒することができるタンパク質又はポリペプチドであり、加水分解によって無機リン酸塩が放出される。いくつかのフィターゼはまた、ＩＰ５、ＩＰ４、ＩＰ３、ＩＰ２、ＩＰ１又はＩＰ０などの、中程度のリン酸化度のイノシトールリン酸の少なくともいくつかを加水分解することができる。フィターゼ酵素は、リン酸塩の利用可能性を増加させ、それにより製品の栄養価を増加させるために、食品及び動物飼料に添加される。食品又は動物飼料を、例えば、高温高圧下で加工すると、フィターゼを変性させ、その活性を低下させることがある。
【００６２】
本組成物及び方法において使用されるフィターゼは、食品又は動物飼料における使用に好適な任意のフィターゼであり得る。いくつかの実施形態では、酵素は６−フィターゼ（４−フィターゼ又はフィチン酸６−ホスファターゼとも呼ばれる）である。いくつかの実施形態では、酵素はヒスチジン酸フィターゼ（ＨＡＰ）であり、これは原核生物（例えば、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のａｐｐＡフィターゼ）及び真核生物（アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種由来のｐｈｙＡ及びｐｈｙＢ、酵母及び植物由来のＨＡＰフィターゼ）の間で見出されるメンバーを含む群である。ＨＡＰフィターゼはＮ末端に共通の活性部位モチーフを共有し、Ｃ末端にモチーフを共有する。
【００６３】
一実施形態では、フィターゼは、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シトロバクター・ブラアキ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａａｋｉｉ）、ペニオフォラ・リシ（Ｐｅｎｉｏｐｈｏｒａ  ｌｙｃｉｉ）又はアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来である。いくつかの実施形態では、フィターゼは、ブティラウクセラ属（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）種由来であり、例えば、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１２４８で寄託されたブティラウクセラ属（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）種のＰ１−２９株由来のフィターゼ、又はＢＰ−１１、ＢＰ１７及びＢＰ−１１１などのそのバリアントである。
【００６４】
受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１２４８で寄託されたブティラウクセラ属（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）種のＰ１−２９株の野生型フィターゼのアミノ酸配列を、以下に配列番号１として示す：
【化１】
2021521835.tif 000004
【００６５】
野生型酵素（配列番号１）と比較して１１個のアミノ酸置換を含む、ブティラウクセラ属（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）種のバリアントフィターゼであるＢＰ−１１のアミノ酸配列を、配列番号２として以下に示す：
【化２】
2021521835.tif 000005
【００６６】
野生型酵素（配列番号１）と比較して１２個のアミノ酸置換を含む、ブティラウクセラ属（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）種のバリアントフィターゼであるＢＰ−１７のアミノ酸配列を、配列番号３として以下に示す：
【化３】
2021521835.tif 000006
【００６７】
野生型（配列番号１）と比較して２１個のアミノ酸置換を含む、ブティラウクセラ属（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）種のバリアントフィターゼであるＢＰ−１１１のアミノ酸配列を、配列番号４として以下に示す：
【化４】
2021521835.tif 000007
【００６８】
いくつかの実施形態では、フィターゼは、ＱＵＡＮＴＵＭ（登録商標）、ＱＵＡＮＴＵＭ（登録商標）ＢＬＵＥ、ＰＨＹＺＹＭＥＸＰ（商標）、ＡＸＴＲＡ（登録商標）ＰＨＹ、ＲＯＮＯＺＹＭＥ（商標）ＨＩＰＨＯＳ又はＮＡＴＵＰＨＯＳの１つ以上である。フィターゼは、例えば、国際公開第２００６／０３８１２８号パンフレット、米国特許出願公開第２０１７／１４３００４号明細書、米国特許出願公開第２００６／１４１５６２号明細書、米国特許出願公開第２０１６／３６２６６６号明細書、米国特許出願公開第２０１６／２８９６５５号明細書、米国特許第９３６５８４０号明細書、米国特許第８６６３９６３号明細書及び米国特許出願公開第２０１５／１５９１４９号明細書に記載されている。
【００６９】
本明細書に記載されているように使用するフィターゼは、その場合にはシグナル配列を含む「前駆体」、「未成熟」若しくは「完全長」、又はその場合にはシグナル配列を欠如している「成熟」である可能性がある。ポリペプチドの成熟形態が、一般に、最も有用である。他に特に規定されていない限り、本明細書で使用するアミノ酸残基の番号付けは、各フィターゼポリペプチドの成熟形態を指す。本フィターゼポリペプチドはまた、結果として生じるポリペプチドがフィターゼ活性を保持する限り、Ｎ末端又はＣ末端を除去するためにトランケートされていてもよい。
【００７０】
フィターゼは一般に、微生物細胞、例えば、細菌細胞又は真菌細胞において産生される。いくつかの実施形態では、フィターゼがトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞中で産生される。いくつかの実施形態では、フィターゼは、フィターゼを含むタンパク質からＮ結合型グリコシル化を除去する酵素をコードするエンド−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子（「エンド−Ｔ」と呼ばれることもある）の欠失を含むトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞中で産生される。例示的なエンド−Ｔ欠失株は、国際公開第０９／１１４３８０号パンフレットに記載されている。
【００７１】
食品又は動物飼料に添加されるフィターゼ単位の量は、食物又は飼料自体の組成に依存するであろう。利用可能なリンの含有量が少ない食品及び飼料は一般に、より多量のフィターゼ活性を必要とするであろう。当業者は必要とする外因性フィターゼの量を決定することができる。いくつかの実施形態では、食品又は動物飼料に組み込まれるフィターゼの量は、食品又は動物飼料１グラム当たり０．１〜２０単位のフィターゼ活性である。一般的には、フィターゼの量は、食品又は動物飼料１メートルトン（１，０００ｋｇ）当たり約５０グラム（１２，０００Ｕ／ｇフィターゼ顆粒）であり、これは食品又は動物飼料１グラム当たり０．６単位フィターゼに相当する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、フィターゼは溶液中にある。他の実施形態では、フィターゼは固体状態である。さらなる実施形態では、フィターゼは、固体担体上に噴霧乾燥されるか、又は粉末に組み込まれる。他の実施形態では、フィターゼはマトリックス顆粒又は多層顆粒などの顆粒に組み込まれる。ほとんどの実施形態において、フィターゼは最終的に食品又は動物飼料に組み込まれる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、フィターゼは、リン酸塩を少なくとも０．５ｗ／ｗ％、少なくとも１．０ｗ／ｗ％、少なくとも１．５ｗ／ｗ％、少なくとも２．０ｗ／ｗ％、少なくとも２．５ｗ／ｗ％、少なくとも３．０ｗ／ｗ％、少なくとも３．５ｗ／ｗ％、少なくとも４．０ｗ／ｗ％、少なくとも４．５ｗ／ｗ％、さらには少なくとも５．０ｗ／ｗ％、又はそれ以上の量で含有する液体組成物又は固体組成物中に存在する。
【００７４】
ＩＩＩ．フィターゼ及びリン酸塩を含む組成物
フィターゼ及びリン酸塩を含む組成物としては、液体組成物及び固体組成物、例えば、粉末（噴霧乾燥粉末を含む）及び顆粒（固体顆粒及び多層顆粒を含む）が挙げられる。このような組成物の例を記載する。
【００７５】
Ａ．液体の食品及び動物飼料組成物
いくつかの実施形態では、食品又は動物飼料は液体飼料などの液体である。他の実施形態では、食品又は動物飼料は固体である。本明細書で使用される場合、動物という用語には全ての動物が含まれ、その例としては、非反芻動物（すなわち、ブタ並びに家禽、魚、イヌ、ネコ及びヒトなどの単胃動物）及び反芻動物（ウシ、ヒツジ、ヤギ及びウマなど）が挙げられる。
【００７６】
食品又は動物飼料は、植物性タンパク質を含んでもよい。好適な植物性タンパク質源は、大豆、大豆ミール、穀類（トウモロコシ（コーン）、小麦、オート麦、大麦、ライ麦及びソルガムなど）、穀類ミール（コーンミール、小麦ミール、オート麦ミール、大麦ミール、ライ麦ミール、ソルガムミール、及びキャノーラミールなど）、ふすま（小麦ふすま、オート麦ふすまなど）、油糧種子（ナタネ及びヒマワリ種子など）、油糧種子ミール（ナタネミールなど）、綿実ミール、キャベツ、ビート及びテンサイである。
【００７７】
食品又は動物飼料は、動物性タンパク質を含んでもよい。好適な動物性タンパク質としては、魚粉及びホエーが挙げられる。食品又は動物飼料は、添加剤を含んでもよい。好適な添加剤としては、酵素阻害剤、ビタミン、微量ミネラル、マクロミネラル、着色剤、芳香化合物、抗微生物ペプチド（ロイコシンＡ、タナチン及びトリトルプチチンなど）、及び酵素が挙げられる。
【００７８】
液体フィターゼ組成物は、ペレット化の前に飼料マッシュ中に直接混合することによって、又は完成したペレット上への液体フィターゼのペレット化後液体塗布（ＰＰＬＡ）によって、固体動物飼料組成物に適用することができる。
【００７９】
Ｂ．固体の食品及び動物飼料組成物
１．製造の種類及び方法
固体担体及び顆粒は、様々な製造技術により、様々な材料から製造することができる。固体担体には、例えば、噴霧、混合、吸収、又は他の方法で顆粒若しくは粉末などの粒子に形成することによって、フィターゼ及びフィチン酸が組み込まれる不活性な固体材料が含まれる。固体担体の例としては、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、顆粒スクロース、デンプン−スクロースノンパレイユ（ＡＳＮＰ）及びマルトデキストリンが挙げられるが、これらに限定されない。コアに使用される材料は、食品及び／又は動物飼料に使用するのに好適でなければならない。
【００８０】
顆粒は、例えば、回転霧化法、湿式造粒法、乾式造粒法、噴霧乾燥、ディスク造粒法、押出法、パンコーティング、球状化、ドラム造粒法、流動床凝集、高剪断造粒法、流動床噴霧コーティング、結晶化、沈殿、エマルションゲル化、回転ディスク霧化法及び他のキャスティング法、並びにプリリング造粒法によって作製され得る。例えば、米国特許第４６８９２９７号明細書、米国特許第５３２４６４９号明細書、米国特許第４５４３３２号明細書、米国特許第６２４８７０６号明細書、米国特許第６５３４４６６号明細書、欧州特許第６５６０５８Ｂ１号明細書及び欧州特許第８０４５３２Ｂ１号明細書を参照されたい。顆粒のコアは顆粒自体であってもよく、層状顆粒の内部の核であってもよい。コアに使用される材料は、食品及び／又は動物飼料に使用するのに好適でなければならない。
【００８１】
２．粒子コア
コアは、１種以上の水溶性又は水分散性物質（例えば、以下に限定されないが、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、及び硫酸アンモニウム）、クエン酸、糖（例えば、スクロース、ラクトース、グルコース、顆粒スクロース、マルトデキストリン、及びフルクトース）、可塑剤（例えば、ポリオール、尿素、フタル酸ジブチル、及びフタル酸ジメチル）、繊維状物質（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、及びヒドロキシルエチルセルロースなどのセルロース及びセルロース誘導体）、リン酸塩、並びにそれらの組み合わせを含み得る。好適な分散性物質としては、クレー、ノンパレイユ（糖とデンプンの組み合わせ、例えば、デンプン−スクロースノンパレイユ−ＡＳＮＰ）、タルク、ケイ酸塩、カルボキシメチルセルロース、デンプン、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
いくつかの実施形態では、コアは主に硫酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、コアは実質的に硫酸ナトリウムからなる。特定の実施形態では、コアは硫酸ナトリウムのみからなる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、コアは、機能的に近接したフィターゼ及びリン酸の両方を含む。他の実施形態では、コアは、フィターゼに加えて１種以上の酵素を含む。他の実施形態では、コアは、フィターゼ以外の酵素を１種以上含む。他の実施形態では、コアは、不活性であり、酵素を含まない。
【００８４】
いくつかの実施形態では、コアは、酵素を含有するＵＦＣを含む酵素粉末である。酵素粉末は噴霧乾燥されてもよく、また、任意選択により、本明細書に列挙される水溶性又は水分散性物質のいずれかと混合されてもよい。酵素は、安定化すべきフィターゼであっても含んでもよく、その場合、酵素粉末はリン酸塩をさらに含むであろう。
【００８５】
３．コーティング層
いくつかの実施形態では、コアが少なくとも１つのコーティング層でコーティングされる。特定の実施形態では、コアが少なくとも２つのコーティング層でコーティングされる。別の特定の実施形態では、コアが少なくとも３つのコーティング層でコーティングされる。コーティング層に使用される材料は食品及び／又は動物飼料に使用するのに好適であり得る（例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１２４５８６号明細書、国際公開第９９／３２５９５号パンフレット及び米国特許第５３２４６４９号明細書を参照）。
【００８６】
いくつかの実施形態では、コーティング層は以下の物質の１つ以上を含む：無機塩（例えば、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、及び硫酸アンモニウム）、クエン酸（例えば、スクロース、ラクトース、グルコース、及びフルクトース）、可塑剤（例えば、ポリオール、尿素、フタル酸ジブチル、及びフタル酸ジメチルフ）、繊維状物質（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、及びヒドロキシルエチルセルロースなどのセルロース及びセルロース誘導体）、クレー、ノンパレイユ（糖とデンプンの組み合わせ）、ケイ酸塩、カルボキシメチルセルロース、リン酸塩、デンプン（例えば、トウモロコシデンプン）、脂肪、油（例えば、ナタネ油、及びパラフィン油）、脂質、ビニルポリマー、ビニルコポリマー、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、可塑剤（例えば、ポリオール、尿素、フタル酸ジブチル、フタル酸ジメチル、及び水）、抗凝集剤（例えば、タルク、クレー、アモルファスシリカ、及び二酸化チタン）、消泡剤（ＦＯＡＭＢＬＡＳＴ  ８８２（登録商標）及びＥＲＯＬ  ６０００Ｋ（登録商標））、並びにタルク。米国特許出願公開第２０１０／０１２４５８６号明細書、国際公開第９９／３２５９５号パンフレット、及び米国特許第５３２４６４９号明細書は、コーティング層に好適な成分を詳述している。
【００８７】
いくつかの実施形態では、コーティング層は、糖（例えば、スクロース、ラクトース、グルコース、顆粒スクロース、マルトデキストリン及びフルクトース）を含む。いくつかの実施形態では、コーティング層がポリビニルアルコール（ＰＶＡ）などのポリマーを含む。多層顆粒のコーティング層に組み込むのに好適なＰＶＡには、部分的に加水分解された、完全に加水分解された、及び中程度に加水分解された、低粘度から高粘度のものが含まれる。いくつかの実施形態では、コーティング層は、硫酸ナトリウムなどの無機塩を含む。いくつかの実施形態では、コーティング層はリン酸塩を含む。
【００８８】
４．酵素コーティング層
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのコーティング層は酵素コーティング層である。いくつかの実施形態では、コアは少なくとも２つの酵素層でコーティングされる。別の実施形態では、コアは少なくとも３つ以上の酵素層でコーティングされる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、酵素は、フィターゼ、キシラナーゼ、ホスファターゼ、アミラーゼ、エステラーゼ、レドックス酵素、リパーゼ、トランスフェラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ベータ−グルカナーゼ、オキシダーゼ（例えば、ヘキソースオキシダーゼ及びマルトースオキシドレダクターゼ）、プロテアーゼ及びこれらの混合物からなる群より選択される１つ以上のさらなる酵素と組み合わせたフィターゼである。一般に、少なくとも１つの酵素コーティング層は、少なくとも１つのフィターゼ、及びリン酸塩を含む。
【００９０】
上記の酵素リストは単なる例であり、排他的であることを意味しない。本明細書に記載の顆粒には、細菌、真菌、酵母、植物、昆虫及び動物を源とする野生型、組み換え及びバリアント酵素、並びに酸性、中性又はアルカリ性酵素を含む任意の酵素を使用することができる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、酵素コーティング層は、以下からなる群から選択される１つ以上の追加の物質をさらに含んでもよい：糖（例えば、スクロース、ラクトース、グルコース、顆粒スクロース、マルトデキストリン及びフルクトース）、デンプン（例えば、トウモロコシデンプン）、脂肪、油（例えば、ナタネ油及びパラフィン油）、脂質、ビニルポリマー、ビニルコポリマー、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、可塑剤（例えば、ポリオール、尿素、フタル酸ジブチル、フタル酸ジメチル、及び水）、抗凝集剤（例えば、タルク、クレー、非晶質シリカ、及び二酸化チタン）、消泡剤（例えば、Ｏｕｖｒｉｅ  ＰＭＣ、Ｌｅｓｑｕｉｎ、Ｆｒａｎｃｅから入手可能なＦＯＡＭＢＬＡＳＴ  ８８２（登録商標）及びＥＲＯＬ  ６０００Ｋ（登録商標））、並びにタルク。米国特許出願公開第２０１０／０１２４５８６号明細書、国際公開第９９／３２５９５号パンフレット、及び米国特許第５３２４６４９号明細書は、顆粒に好適な成分を詳述している。ＦＯＡＭＢＬＡＳＴ  ８８２（登録商標）は、食品グレード成分を用いて製造された消泡剤であり、Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｆｏａｍ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＬＬＣから入手可能である。
【００９２】
５．顆粒中のリン酸塩の位置と分布
顆粒がコーティングされている場合、いくつかの実施形態では、コアはフィターゼ及びリン酸の両方を含む。いくつかの実施形態では、コーティングがフィターゼ及びリン酸塩の両方を含む。いくつかの実施形態では、コアがフィターゼを含み、コーティングがリン酸塩を含む。いくつかの実施形態では、コアがリン酸塩を含み、コーティングがフィターゼを含む。いくつかの実施形態では、単一の酵素コーティング層が、リン酸塩及びフィターゼの両方を含む。いくつかの実施形態では、複数の酵素コーティング層が、リン酸及びフィターゼの両方を含む。いくつかの実施形態では、リン酸塩及びフィターゼは隣接する層にあり、したがって、機能的に近接している。
【００９３】
Ｃ．食品及び動物飼料ペレット
ペレットは、様々な既知のペレット化方法のいずれかに従って、本明細書に記載の顆粒及び／又は多層顆粒を含むことができ、その例を以下にさらに記載する。いくつかの実施形態では、ペレットは、フィターゼ、リン酸塩、及び少なくとも１つの食品又は飼料成分を含む。いくつかの実施形態では、ペレットは、少なくとも１つの食品又は飼料成分と、リン酸塩及びフィターゼを含む顆粒とを含む。
【００９４】
本組成物及び方法のペレットは、細菌を死滅させるために飼料混合物の温度を高レベルに上げる方法によって製造され得る。温度は、多くの場合、ペレット化前の蒸気処理（コンディショニングとして知られるプロセス）によって上昇される。続いて、コンディショニングされた飼料混合物をダイに通して、特定のサイズのペレットを製造することができる。飼料混合物は、本明細書に記載の顆粒及び／又は多層顆粒を、本明細書に記載の食品又は動物飼料と混合することによって調製することができる。
【００９５】
一般に、蒸気コンディショナーは、約８５℃〜約９５℃又はそれ以上で、約２０〜約９０秒間、及び数分まで、混合物を処理する。蒸気の量は、食品又は動物飼料ミックスの水分量及び初期温度に応じて変えることができる。ペレット化プロセスにおいて約４％〜約６％の添加蒸気が報告されており、その量はペレット化前にマッシュ中に約１８％未満の水分を生成するように、又は押出を意図したマッシュ中に約２８％までの水分を生成するように選択される。
【００９６】
任意選択による膨張プロセスは、約１００℃〜約１４０℃の温度範囲で約４〜約１０秒間行うことができる。製造プロセスのペレットミル部分は、通常、約８５℃〜約９５℃の温度で約３〜約５秒間作動する。
【００９７】
ペレット化の前、ペレット化されていない混合物（いわゆるプレミックス又は前駆体、ベースミックス、マッシュ、及びペレット用希釈剤）は、通常、ビタミン及び微量ミネラルを含有する。ベースミックスは、通常、リン酸二カルシウム、石灰石、塩、並びにビタミン及びミネラルのプレミックスなどの食品及び動物飼料成分を含有するが、穀物及びタンパク質成分は含有しない。希釈剤としては、穀物（例えば、小麦のミドリング粉及び米ぬか）及びクレー、例えば、フィロケイ酸塩（ケイ酸マグネシウムセピオライト、ベントナイト、カオリン、モンモリロナイト、ヘクトライト、サポナイト、バイデライト、アタパルガイト、及びステベンサイト）が挙げられるが、これらに限定されない。クレーはまた、食品及び動物飼料プレミックスのための担体及び流動化剤、又は希釈剤としても機能する。マッシュは、通常、完全な動物食を含む。例えば、マッシュは、トウモロコシ、ダイズミール、ダイズ油、塩、ＤＬメチオニン、石灰石、リン酸二カルシウム、並びにビタミン及びミネラルを含むか、又はこれらからなる。一例では、マッシュは、６１．１０％のトウモロコシ、３１．４３％のダイズミール４８．４％のダイズ油、０．４０％の塩、０．２０％のＤＬメチオニン、１．１６％の石灰石、１．４６％のリン酸二カルシウム、並びに０．２５％のビタミン及びミネラルからなる。
【００９８】
一実施形態では、食品又は動物飼料は、少なくとも１つの食品又は飼料成分（マッシュなど）をフィターゼ及びリン酸塩と溶液中で混合し、得られた混合物を蒸気コンディショニングし、続いて混合物をペレット化することによって製造される。液体フィターゼ組成物を、ペレット化の前に飼料マッシュに直接混合することによって、又は完成したペレット上への液体フィターゼのペレット化後液体塗布（ＰＰＬＡ）によって、固体動物飼料組成物に適用することができる。
【００９９】
一実施形態では、食品又は動物飼料は、少なくとも１つの食品又は動物飼料成分（マッシュなど）を固体状態（多層顆粒などの顆粒など）のフィターゼ及びリン酸塩と混合し、得られた混合物を蒸気コンディショニングし、続いて混合物をペレット化することによって製造される。
【０１００】
例えば、コーンミール及び大豆ミール（６０％のコーンミール及び４０％のダイズミールなど）のペレット化されていない混合物を、フィターゼ及びリン酸塩を含む多層顆粒と混合し、次いで９０℃で３０秒間の蒸気コンディショニングに供することができる。混合物は、その後、押出され、動物飼料ペレットが形成される。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、本組成物及び方法の組成物は、熱処理された食品又は動物飼料ペレット中に存在することができる。このような熱処理された食品又は動物飼料ペレットは、少なくとも９０℃の温度で少なくとも３０秒間（例えば、９０℃〜１００℃で少なくとも３０〜６０秒間）熱処理（蒸気コンディショニングなど）に供することができる。混合物は、その後押出され、動物飼料ペレットを形成することができる。
【０１０２】
ＩＶ．リン酸塩を使用してフィターゼを安定化する方法及びプロセス
本発明の組成物の使用方法は、主として、蒸気ペレット化などによって熱処理しなければならない食品及び動物飼料製品へのフィターゼの添加に関する。液体状態及び／又は固体状態におけるフィターゼの安定性は、リン酸塩の使用によって安定化されていないフィターゼと比較して、大きく改善され得る。本方法は、少なくとも１０ミリモルのフィチン酸塩を必要とする、Ｇｅｂｅｒｔ（国際公開第２０１３／１１９４６８号パンフレット）によって記載されたものに対する改善である。フィターゼ（ｐｙｔａｓｅ）を安定化するのに必要なリン酸塩の量はフィチン酸塩の必要量よりも多いが、フィチン酸塩と比較してリン酸塩のコストがはるかに低いことは製剤コストに極めて有益である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、フィターゼは顆粒化前の液体フィターゼ組成物（例えば、ＵＦＣ）に関して、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも１５０ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも２５０ｍＭ、少なくとも３００ｍＭ、少なくとも３５０ｍＭ、少なくとも４００ｍＭ、少なくとも４５０ｍＭ、少なくとも５００ｍＭ、少なくとも５５０ｍＭ、又は少なくとも６００ｍＭのリン酸塩によって安定化される。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、機能的に近接したリン酸塩と全フィターゼタンパク質とのモル比（すなわち、ｍｏｌ：ｍｏｌ）は、固体又は液体フィターゼ組成物に関して、少なくとも５０：１、少なくとも１００：１、少なくとも１５０：１、少なくとも２００：１、少なくとも２５０：１、又は少なくとも３００：１である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、フィターゼは、リン酸塩を少なくとも０．５ｗ／ｗ％、少なくとも１．０ｗ／ｗ％、少なくとも１．５ｗ／ｗ％、少なくとも２．０ｗ／ｗ％、少なくとも２．５ｗ／ｗ％、少なくとも３．０ｗ／ｗ％、少なくとも３．５ｗ／ｗ％、少なくとも４．０ｗ／ｗ％、少なくとも４．５ｗ／ｗ％、さらには少なくとも５．０ｗ／ｗ％の量で含有する液体組成物又は固体組成物中に存在する。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、熱処理後のリン酸塩安定化フィターゼの回復活性は、本明細書で提供される回復活性％式による計算で、リン酸塩によって安定化されていない点以外は同一のフィターゼと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、又はそれ以上である。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、リン酸塩安定化フィターゼの回復活性の相対的改善は、本明細書で提供される回復活性％式による計算で、リン酸塩によって安定化されていない点以外は同一のフィターゼと比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、又はそれ以上である。
【０１０８】
Ｖ．様々な実施形態の組み合わせ
本明細書に記載される組成物及び方法の実施形態（異なる見出し項目の下で記載されるものを含む）、並びに当業者に明らかである他の実施形態は、その組み合わせが本組成物及び方法について主張している目的及び利点を損なわない限り、組み合わすことができる。
【実施例】
【０１０９】
以下の実施例は本組成物及び方法の実施形態を例示することを意図しており、限定するものと決して解釈されるべきではない。
【０１１０】
実施例１．賦形剤存在下でのフィターゼ融解温度の測定
熱暴露中の種々の賦形剤の添加が液体状態のフィターゼ酵素の融解温度を上昇させるかどうかを決定する実験を行った。賦形剤溶液をそれらの最高溶解度で調製し、次いで、フィターゼＵＦＣに添加する前に最高濃度から最低濃度まで量を調整した。次いで、酵素／賦形剤の組み合わせを２１〜９５℃の温度プロファイルに暴露し、示差走査蛍光測定法によって融解温度を測定した。
【０１１１】
材料
以下の装置及び試薬を使用した：
・ＢＰ−１７フィターゼＵＦＣ（７０，０００ＦＴＵ／ｇ又は１２３．４ｇ／Ｌフィターゼ）
・リン酸ナトリウム、二塩基性、無水物（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ＬｏｔＶ３１１４９，ＦＷ１４１．９６）
・ｐＨ調整用濃リン酸
・フィチン酸ナトリウム塩水和物（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ８８１０−５００Ｇ）
・クエン酸ナトリウム二水和物（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ＦＷ  ２９４．１）
・ｐＨ調整用濃縮クエン酸
・硫酸ナトリウム、無水粉末（ＦＷ  １４２．０４）
・ｐＨ調整用硫酸
・ポリリン酸ナトリウム、ガラス状（スペクトル、Ｓ０１６９、６０〜７１％Ｐ２Ｏ５）
・ｐＨ調整用１０％ＮａＯＨ
・ｐＨメーター
・Ｗｈａｔｍａｎ  Ａｕｔｏｖｉａｌシリンジレスフィルター、０．４５μＭ
・標準キャピラリーを備えたＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ  ＮＴ．４８  ｎａｎｏＤＳＦ（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
・Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３６４１  ９６ウェル透明平底ポリスチレン非結合表面マイクロプレート
・Ｃｏｒｎｉｎｇ  １５ｍＬ遠心管、ポリプロピレン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【０１１２】
ＵＦＣの調製
ＵＦＣ中のフィターゼ濃度は、ＨＰＬＣによって１２３．９ｇ／Ｌと測定された。２２μＬの１０％ＮａＯＨを５ｍＬのＵＦＣに添加することによって、ＵＦＣのｐＨを５．０３から５．４９に調整し、フィターゼ濃度を１２３．３６ｇ／Ｌに希釈した。
【０１１３】
安定剤の調製
１グラムのフィチン酸を５ｍＬの０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解して、２０％フィチン酸溶液を調製した。２０％ＮａＯＨを用いてｐＨを４．２から５．４７に調整し、次いで、溶液を０．４５μＭシリンジレスフィルターを用いて濾過した。５グラムを２０ｍＬの水に溶解することによって、２５％無水硫酸ナトリウム溶液を調製した。硫酸を用いてｐＨを５．６に調整し、次いで、溶液を０．４５μＭシリンジレスフィルターを用いて濾過した。５グラムを２５ｍＬの水に溶解することによって、２０％ポリリン酸ナトリウム溶液を調製した。濃リン酸を用いてｐＨを５．６に調整し、次いで、溶液を０．４５μＭシリンジレスフィルターを用いて濾過した。５グラムを２０ｍＬの水に溶解することによって、２５％クエン酸ナトリウム溶液を調製した。８０％クエン酸を用いてｐＨを５．６に調整し、次いで、溶液を０．４５μＭシリンジレスフィルターを用いて濾過した。２グラムを１０ｍＬの水に溶解することによって、２０％二塩基性リン酸ナトリウム溶液を調製した。濃リン酸を用いてｐＨを５．６に調整し、次いで、溶液を０．４５μＭシリンジレスフィルターを用いて濾過した。
【０１１４】
賦形剤希釈のためのプレートセットアップ
１００μＬの体積の賦形剤原液を９６ウェルプレートの列１のウェルＡに入れた。５０μＬの体積の水を、同じ９６ウェルプレートの列１の各ウェルＢ−Ｈに入れた。５０μＬをそれぞれ次のウェルに移すことによってプレートの列で賦形剤原液を２倍希釈した。８０μＬの体積のｐＨ調整済ＵＦＣを、新しい９６ウェルプレートの列１の各ウェルに入れた。２０μＬの体積を、量を調整した賦形剤の各ウェルから、ＵＦＣを含有する対応するウェルに直接移した。
【０１１５】
示差走査蛍光測定法のセットアップ
酵素及び賦形剤の組み合わせを含有する９６ウェルプレートを、プレートシェーカー上で５秒間混合した。ナノＤＳＦ用の標準キャピラリーを、９６ウェルプレートの各ウェルにキャピラリーを浸漬して充填し、次いで、Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ装置にロードした。Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ装置を、１℃／分のランプにより１０％の励起出力及び２１〜９５℃で作動するようにプログラムした。Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ装置は、３３０ｎｍ及び３５０ｎｍの波長を測定することによって、アンフォールディング時のタンパク質の固有トリプトファン蛍光のシフトをモニターする。タンパク質融点（Ｔｍ）は、蛍光強度の比（Ｆ３５０／Ｆ３３０）の変化を分析することによって決定され、蛍光対温度曲線の導関数の最大値である。
【０１１６】
図１に示すように、フィチン酸ナトリウムとフィターゼのモル比１４：１の存在下で、フィターゼのＴｍは約２．７℃上昇した。図２及び３に示すように、リン酸ナトリウムとフィターゼのモル比１３０：１の存在下で、フィターゼの融解温度は約５．５℃上昇した。リン酸塩は、クロマトグラムの第１のピークで示されるフィターゼＵＦＣ中に存在する安定化バックグラウンドタンパク質ではなく、むしろクロマトグラムの第２のピークで示されるフィターゼ酵素に特異的に影響を及ぼしているようである。図４に示すように、リン酸ナトリウムの安定化効果は、陰イオン当量で正規化した場合、フィターゼに対する当量モル比でフィチン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、及び硫酸ナトリウムの安定化効果よりも大きい。さらに、Ｔｍの上昇は硫酸塩よりむしろリン酸塩の存在下ではるかに高いので、安定化のメカニズムは、ホフマイスター効果、すなわち、塩が、塩析、又はタンパク質の周囲の溶媒和水と相互作用することによってタンパク質構造を物理的に安定化する際に、リオトロープとして作用する程度に関連してはいないようである（例えば、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ  Ｆ（１８８８）Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２４：２４７−２６０（Ｚｈａｎｇ  Ｙ．ａｎｄ  Ｃｒｅｍｅｒ  Ｐ．Ｓ．（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１０：６５８−６３に概説されている）を参照されたい）。
【０１１７】
図５に示すように、電荷当量で正規化した場合、融解温度の上昇はクエン酸塩よりもリン酸塩の存在下ではるかに高いので、安定化のメカニズムもまた電荷効果ではないようである。
【０１１８】
実施例２：安定化塩の存在下でのＢＰ−１７フィターゼの熱不活性化
熱ストレス条件下における賦形剤の添加がフィターゼ酵素の活性の保持を可能にするかどうかを決定する実験を行った。フィターゼ酵素が、賦形剤の非存在下で３０分のインキュベーション後に完全に不活性化される温度を選択した。賦形剤溶液をそれらの最高溶解度で調製し、次いで、フィターゼＵＦＣに添加する前に最高濃度から最低濃度まで量を調整した。次いで、酵素／賦形剤の組み合わせを７０℃の温度に曝露し、比色活性アッセイにより、２、５、１０、２０、３０、及び６０分間のインキュベーション後の残存活性を測定した。
【０１１９】
材料
以下の装置及び試薬を使用した：
・ＢＰ−１７フィターゼＵＦＣ（７０，０００ＦＴＵ／ｇ又は１２３．４ｇ／Ｌフィターゼ）
・ＢＰ−１７フィターゼ標準（２２，０００ＦＴＵ／ｇ）
・ＢＰ−１７フィターゼ対照（３６，５００ＦＴＵ／ｇ）
・１２ウェルを有する０．２ｍＬ  ＰＣＲストリップチューブ（ＶＷＲ  ５３５０９−３０６）
・オートクレーブ水
・温度勾配機能付き温度サイクラー
・９６ウェルＰＣＲプレップラック
・大型ベンチトップ遠心分離機
・無水二塩基性リン酸ナトリウム（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、１４１．９６ｇ／ｍｏｌ
・クエン酸ナトリウム二水和物（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）、２９４．１ｇ／ｍｏｌ
・ｐＨ調整用リン酸及びクエン酸
・ｐＨメーター
・アッセイ用緩衝液：０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）
・基質緩衝液：０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）
・フィチン酸ナトリウム塩水和物（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）
・Ｐｉ青色停止溶液：ＰＯＰＢ−５００（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＵＳ）
・Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３６４１、９６ウェル透明平底ポリスチレン非結合表面マイクロプレート
・ＶＷＲ（登録商標）９６ウェルプレート用アルミ箔
・ｉＥＭＳインキュベーター
・ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ３４０  マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）。
【０１２０】
安定剤塩溶液の調製
５ｇの無水二塩基性リン酸ナトリウムを２５ｍＬの水に溶解して、２０％（又は１．４１Ｍ）リン酸ナトリウム溶液を調製した。濃リン酸を用いてｐＨを５．５に調整した。５グラムのクエン酸ナトリウム二水和物を２０ｍＬの水に溶解して、２５％（又は０．８５Ｍ）クエン酸ナトリウム溶液を調製した。８０％クエン酸を用いてｐＨを５．５に調整した。
【０１２１】
ＰＣＲストリップの調製
８０μＬの体積の２０％リン酸ナトリウム原液を、８つの異なる１２ウェルＰＣＲストリップの第１のウェルに入れた。４０μＬの容量の−Ｑ水を、各ＰＣＲストリップの２、３、４、５及び６のウェルに入れた。リン酸ナトリウム原液を、ウェル１からウェル６まで連続的に２倍希釈した。８０μＬの容量の２５％クエン酸ナトリウム原液を、各ＰＣＲストリップのウェル７に入れた。４０μＬの容量の水を、各ＰＣＲストリップの８、９、１０、１１及び１２のウェルに入れた。クエン酸ナトリウム原液をウェル７からウェル１１まで連続的に順々に２倍希釈し、ウェル１２を残して水のみを含有させた。ＢＰ−１７フィターゼＵＦＣは、オートクレーブ水で５０倍に希釈した。４０μＬの体積の希釈ＵＦＣを、希釈した賦形剤を含有する８つの異なる１２ウェルＰＣＲストリップの各ウェルに加えた。
【０１２２】
熱不活性化
温度サイクラーを７０℃の温度にプログラムした。１つのＰＣＲストリップを密封し、時間ゼロ測定のために直ちに氷上に置いた。残りのＰＣＲストリップを密封し、ＰＣＲ内に置き、様々に増加させた時間（０．５、２、５、１０、２０、３０、及び６０分）インキュベートし、次いで、ＰＣＲから取り出し、直ちに氷上に置いた。各ＰＣＲストリップを氷上に集めた後、９６ウェルＰＣＲチューブラック上に置き、３５００ｒｐｍで２分間遠心分離した。
【０１２３】
フィターゼ活性アッセイ
熱不活性化の間にいくらかの沈殿が生じたので、ＰＣＲストリップを遠心分離にかけ、上清を取り、アッセイ緩衝液（０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）＋０．０５ｗ／ｖ％のＴｗｅｅｎ２０）で希釈して、非結合（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３６４１）９６ウェルプレート中に０．０１２ＦＴＵ／ｍＬの最終活性を得た。４０μＬの体積を酵素希釈プレートから別の反応プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ９０１７、培地結合）に移した。次いで、４０μＬの体積の基質（１５０μＭのフィチン酸ナトリウム）を、反応プレートの各ウェルに加えた。反応プレートを密封し、２５℃、９００ｒｐｍで１０分間インキュベートした。次いで、１７０μＬの体積のＰｉ青色停止／発色試薬（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＵＳによるＰＯＰＢ−５００）を、反応プレートの各ウェルに添加して、反応を停止させた。プレートを密封し、発色のために２５℃及び４００ｒｐｍで３０分間インキュベートし、次いで、分光光度計にて６２０ｎｍで読み取った。
【０１２４】
図６に示すように、３５２ｍＭリン酸ナトリウムの存在下、６０分間のインキュベーション後、約９０％の相対残存フィターゼ活性（本明細書に記載される回復活性％を使用して計算される）が保持される。その濃度の半分の存在下では、６０分間のインキュベーション後、約６０％のフィターゼ活性が保持される。この濃度未満では、フィターゼ酵素はほとんど不活性化されるようである。図７に示すように、４２５ｍＭクエン酸ナトリウムの存在下で、６０分間のインキュベーション後、約９０％のフィターゼ活性が保持される。その濃度の半分の存在下では、６０分間のインキュベーション後、約５０％又はそれ以下のフィターゼ活性が保持される。この濃度未満では、フィターゼ酵素は不活性化されるようである。熱応力条件の間に同様の活性プロファイルを達成するために、リン酸ナトリウムと比較してより高い濃度のクエン酸ナトリウムが必要とされる。この点に関して、リン酸ナトリウムは、クエン酸ナトリウムよりもフィターゼに対してより良好な安定剤であるようである。
【０１２５】
実施例３．阻害のメカニズム
フィターゼ酵素に対するリン酸ナトリウムとクエン酸ナトリウムの両方の安定化のメカニズムを、調整した基質濃度及び調整した賦形剤濃度の両方の存在下でフィターゼ活性を測定することによって決定するため、動態解析を行った。
【０１２６】
材料
以下の装置及び試薬を使用した：
・ＢＰ−１７フィターゼＵＦＣ（７０，０００ＦＴＵ／ｇ又は１２３．４ｇ／Ｌフィターゼ）
・無水二塩基性リン酸ナトリウム（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、１４１．９６ｇ／ｍｏｌ
・クエン酸ナトリウム二水和物（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）、２９４．１ｇ／ｍｏｌ
・ｐＨ調整用リン酸及びクエン酸
・ｐＨメーター
・希釈緩衝液：０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）
・リン酸４−ニトロフェニルジ（トリス）塩（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）
・基質緩衝液：０．２５Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）
・停止緩衝液：２００ｍＭホウ酸塩（ｐＨ１０．２）
・Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３６４１、９６ウェル透明平底ポリスチレン非結合表面マイクロプレート
・ＶＷＲ９６ウェルプレート用アルミ箔
・マイクロプレートブロックを備えたＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（商標）Ｒ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
・ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ３４０  マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）。
【０１２７】
酵素及び基質の調製
ＢＰ−１７フィターゼＵＦＣを０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）で７，０００倍に希釈した。
【０１２８】
０．９２３グラムのリン酸４−ニトロフェニルジ（トリス）塩を５ｍＬの０．２５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解して、基質原液（４００ｍＭ）を調製した。２００μＬの体積の基質原液を９６ウェルプレートの列１及び列７に入れた。１００μＬの体積の０．２５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を、同じ９６ウェルプレートの列２〜６及び８〜１２に入れた。１００μＬを９６ウェルプレートの列１から列２に移し、次いで、この希釈パターンをプレートの列６まで繰り返すことによって連続希釈を行い、以下の基質濃度を作製した：４００、２００、１００、５０、２５、及び１２．５ｍＭ。同じ連続希釈を、プレートの後半の列７から列１２まで行った。
【０１２９】
リン酸ナトリウムの調製
５ｇの無水二塩基性リン酸ナトリウムを２５ｍＬの０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解して、２０％（又は１．４１Ｍ）リン酸ナトリウム溶液を調製した。次いで、１ｍＬの原液を６ｍＬの０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）と合わせることによって、２０％リン酸ナトリウム溶液を７倍に希釈し、２００ｍＭの濃度を作製した。２００μＬの体積のリン酸ナトリウム溶液（２００ｍＭ）を、９６ウェルプレートの行Ａの各ウェルに入れた。１００μＬの体積の０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を、同じ９６ウェルプレートの行Ｂ〜Ｈの各ウェルに入れた。１００μＬを９６ウェルプレートの行Ａから行Ｂに移し、次いで、この希釈パターンをプレートの行Ｇまで繰り返すことによって連続希釈（２倍）を行い、以下のリン酸ナトリウム濃度を作製した：２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、及び０ｍＭ。
【０１３０】
クエン酸ナトリウムの調製
５グラムのクエン酸ナトリウム二水和物を２０ｍＬの０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解して、２５％（又は０．８５Ｍ）クエン酸ナトリウム溶液を調製した。２００μＬの体積のクエン酸ナトリウム溶液（０．８５Ｍ）を、新しい９６ウェルプレートの行Ａの各ウェルに入れた。１００μＬの体積の０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を、同じ９６ウェルプレートの行Ｂ〜Ｈの各ウェルに入れた。１００μＬを９６ウェルプレートの行Ａから行Ｂに移し、次いで、この希釈パターンをプレートの行Ｇまで繰り返すことによって連続希釈（２倍）を行い、以下のクエン酸ナトリウム濃度を作製した：８５０、４２５、２１２．５、１０６．２５、５３．１３、２６．５６、１３．２８、及び０ｍＭ。
【０１３１】
基質／賦形剤プレートの調製
２つの同一の９６ウェル基質プレートを、２５μＬの量を調整した基質濃度を両方のプレートの列１〜６及び列７〜１２に添加することによって調製した。７５μＬの体積の量調整を行ったリン酸ナトリウム濃度を、第１の基質プレートの対応する各ウェルに移し、以下の濃度の基質及び賦形剤を作製した：
１００、５０、２５、１２．５、６．２５、及び３．１２５ｍＭ  基質
１５０、７５、３７．５、１８．７５、９．３８、４．６９、及び２．３４ｍＭ  リン酸ナトリウム。
【０１３２】
７５μＬの体積の量調整を行ったクエン酸ナトリウム濃度を、第２の基質プレートの対応する各ウェルに移して、以下の濃度の基質及び賦形剤を作製した：
１００、５０、２５、１２．５、６．２５、及び３．１２５ｍＭ  基質
６３７．５、４２５、２１２．５、１０６．２５、５３．１３、２６．５６、及び１３．２８ｍＭ  クエン酸ナトリウム。
【０１３３】
ＰＮＰＰアッセイ
５μＬの体積の７，０００倍希釈ＢＰ−１７フィターゼＵＦＣを、空の９６ウェルプレートの列１〜６に入れた。５μＬの体積の０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を、同じ９６ウェルプレートの列７〜１２に入れて、ブランクとして供した。同じプレートを同じ方法で準備した。５５μＬの体積の基質／リン酸塩の組み合わせを、希釈したＵＦＣを含有する第１の９６ウェルプレートの対応する各ウェルに加えた。５５μＬの体積の基質／クエン酸塩の組み合わせを、希釈したＵＦＣを含有する第２の９６ウェルプレートの対応する各ウェルに加えた。２つの９６ウェル反応プレートを密封し、２５℃、６５０ｒｐｍで、１５分間、サーモミキサーに置いた。反応が完了したところで、７０μＬの体積のホウ酸塩停止緩衝液（２００ｍＭ）（ｐＨ１０．２）を各ウェルに添加した。プレートを密封し、プレートシェーカー上に２５℃及び６５０ｒｐｍで１分間置き、次いで、分光光度計にて４０５ｎｍで読み取った。ＰＮＰＰアッセイは、リン酸ｐ−ニトロフェニルのｐ−ニトロフェノールへの脱リン酸化を測定するものであり、これは、４０５ｎｍの波長で分光光度計により測定することができる黄色の可溶性生成物になる。
【０１３４】
図８に示すように、リン酸ナトリウムの濃度の増加により、周囲アッセイ条件下でフィチン酸基質の濃度を増加させた場合に、フィターゼ酵素の活性が低下した。１５０ｍＭリン酸ナトリウム及び１００ｍＭフィチン酸基質の濃度では、フィターゼ酵素はほとんど活性を示さない。リン酸ナトリウムはフィチン酸基質の存在下で酵素の活性を阻害するので、したがって酵素の活性部位を競い合っていると考えられる。図９に示すように、周囲アッセイ条件下、フィチン酸基質の濃度を増加させた場合に、クエン酸ナトリウムは低濃度で、フィターゼ酵素の活性を低下させ始めるが、２６ｍＭ以上の濃度で活性の損失は横ばい状態になるようである。したがって、クエン酸ナトリウムの安定化のメカニズムは、フィターゼ酵素に対するリン酸ナトリウムのそれとは異なると考えられる。
【０１３５】
実施例４．造粒及びペレット化性能
米国特許第５，３２４，６４９号明細書（米国特許出願公開第２０１５／０３７４９１号明細書もまた参照されたい）（これらは参照により組み込まれる）に記載されるように、流動床噴霧法を用いて多層酵素顆粒を作製した。表１に要約するように、（Ａ）受容物なし、（Ｂ）フィチン酸塩又は（Ｃ）リン酸塩を用いて顆粒を調製した。
【表１】
2021521835.tif 000008
【０１３６】
ペレット化の前に、蒸気シミュレーターデバイス蒸気プロセスシミュレーターを使用して顆粒の回復活性を比較し、本出願人らはペレット化安定性が予測可能であることを見出した。この蒸気プロセスシミュレーターは、直径が約６インチの受入チャンバを供給する三方バルブに配管された内径約１／４インチの可撓性ホースに配管された飽和蒸気源からなり、受入チャンバの上には直径が一致する篩網を配置することができる。三方弁はまた真空ラインに配管され、真空ラインが作動すると同時に入口蒸気供給のスイッチを瞬時に切ることができる。
【０１３７】
蒸気プロセスシミュレーター試験を実施するために、約１〜２グラムのフィターゼ酵素顆粒を篩網上に置いた。蒸気供給ラインを開くと、蒸気が網を通ってゆっくりと上方に流れ、酵素顆粒と所定の秒数接触し、その後、三方弁を回して供給を遮断し、顆粒を横切る周囲空気の逆流を誘発し、それにより、蒸気との接触を即座に停止し、急速な冷却及び乾燥を誘発した。篩網及び蒸気顆粒を蒸気プロセスシミュレーターから取り出し、一晩風乾した。次いで、顆粒を、保持されたフィターゼ活性についてアッセイし、フィターゼ活性回復を、蒸気処理前の初期の非蒸気処理顆粒のフィターゼ活性率として、保持されたフィターゼ活性を算出する。図１０は、４８秒間の模擬蒸気処理を受けた顆粒中で回復したフィターゼ活性のパーセントを、模擬ストリーミングを受けなかった顆粒と比較して示す。リン酸塩による安定化は、フィチン酸塩による安定化よりも１１％良好な回復を提供した。
【０１３８】
顆粒を、６０％コーンミール及び４０％ダイズミール（すなわち、マッシュ）の混合物と、顆粒６０グラム対コーン−ダイズミール１２０キログラムの比で合わせ、ペレット化前の混合物中のフィターゼの最終活性を約５単位／グラムとした。
【０１３９】
次いで、この混合物を動物飼料ペレッターでペレット化した。顆粒とコーン−ダイズミールとを、水平リボンミキサー中で約８分間ブレンドした。ペレットミルは、内径１７．３ｃｍのダイを取り付けた、ペレット孔直径３ｍｍの、モノロールタイプのＳｉｍｏｎ  Ｈｅｅｓｅｎであった。ダイ速度は５００ｒｐｍで、７．５ｋＷモータで駆動した。通常の供給速度は３００ｋｇ／時であった。コンディショナー内の温度を＋／−０．１℃に保ち、コンディショナーからの供給出口で測定した。コンディショナーはカスケード型ミキサーシステムを有した。コンディショニング温度は１００℃であった。蒸気入口圧力は２ａｔｍで、コンディショナー内の温度は蒸気送出を調整する３つのバルブの手動調整で制御した。コンディショナー中の滞留時間は３０秒又は６０秒である。目標温度に達したら、システムを約５〜１０分間運転した後、サンプリングを行った。試料を、５〜７．５ｋｇのペレット化飼料に相当する１〜１．５分間採取し、直ちに、多孔底及び１５００立方メートル／時の空気流を有する冷却ボックスに入れた。１５分間冷却した後、試料分取器を用いて試料を５回小型化し、実験室試験のために２５０ｇを採取した。ペレット化及び冷却後、ペレットを粉砕し、フィターゼ活性についてアッセイした。
【０１４０】
本明細書に示す回復活性％式を使用して、非ペレット化顆粒中のフィターゼ活性と比較して、１００℃で３０秒又は６０秒間でペレット化した顆粒中の回復フィターゼ活性パーセントを図１１に示す。リン酸塩による安定化は、３０秒後のフィチン酸塩による安定化よりも４％良好な回復を与え、６０秒後では１１％良好な回復を与えた。
【０１４１】
上記の組成物及び方法は明確さ及び理解の目的のために、例示及び実施例によって詳細に記載しているが、本組成物及び方法の精神及び範囲から逸脱することなく、特定の変更及び修正を行い得ることは明らかである。したがって、記載は、添付の特許請求の範囲によって描写される本組成物及び方法の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用された全ての刊行物、特許、及び特許出願は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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