(57)【要約】本発明は、ＣＤ７９に特異的に結合するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を提供する。本発明はさらに、上記ＣＡＲをコードする核酸配列およびベクターをさらに提供する。本発明はさらに、細胞表面において上記ＣＡＲを発現する細胞を提供する。上記ＣＡＲは、ｓｃＦｖ、ＦａｂおよびｄＡｂ抗原結合ドメインから選択される抗原結合ドメインを含み得る。上記抗原結合ドメインは、Ｆａｂ、ｄＡｂまたはｓｃＦｖであってもよいし、これらを含んでいてもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ７９Ｂに特異的に結合し、配列番号１４６として示されるＣＤ７９Ｂエクトドメインのスプライシングされていない部分に特異的に結合する、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）。
【請求項２】
ｓｃＦｖ、ＦａｂおよびｄＡｂ抗原結合ドメインから選択される抗原結合ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項３】
前記抗原結合ドメインは、ｄＡｂである、請求項２に記載のＣＡＲ。
【請求項４】
前記抗原結合ドメインは、Ｆａｂである、請求項２に記載のＣＡＲ。
【請求項５】
前記抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである、請求項２に記載のＣＡＲ。
【請求項６】
以下：
ａ）以下の配列：
ＣＤＲ１−ＧＦＴＦＳＮＡＡ（配列番号１１３）；
ＣＤＲ２−ＩＲＴＫＰＮＮＹＡＴ（配列番号１１４）；
ＣＤＲ３−ＴＹＹＤＧＳＳＹＡＭＤＡ（配列番号１１５）
を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；および
以下の配列：
ＣＤＲ１−ＱＳＬＥＹＳＤＧＹＴＹ（配列番号１１６）；
ＣＤＲ２−ＥＶＳ；
ＣＤＲ３−ＦＱＡＴＨＤＰＹＴ（配列番号１１７）
を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；または
ｂ）以下の配列：
ＣＤＲ１−ＧＦＴＦＳＨＴＡ（配列番号１２１）；
ＣＤＲ２−ＩＲＩＱＰＫＮＹＡＴ（配列番号１２２）；
ＣＤＲ３−ＴＡＡＧＦＧＦＤＹ（配列番号１２３）
を有するＣＤＲを有するＶＨ；および
以下の配列：
ＣＤＲ１−ＱＳＬＥＹＳＤＧＮＴＹ（配列番号１２４）；
ＣＤＲ２−ＥＶＳ；
ＣＤＲ３−ＬＱＡＴＨＤＰＦＴ（配列番号１２５）
を有するＣＤＲを有するＶＬ；または
ｃ）  以下の配列：
ＣＤＲ１−ＧＦＴＦＳＮＡＡ（配列番号１１３）；
ＣＤＲ２−ＩＲＴＫＰＮＮＹＡＴ（配列番号１１４）；
ＣＤＲ３−ＴＡＤＧＧＹＧＦＤＹ（配列番号１２９）
を有するＣＤＲを有するＶＨ；および
以下の配列：
ＣＤＲ１−ＱＳＬＥＹＳＤＧＹＴＹ（配列番号１１６）；
ＣＤＲ２−ＥＶＳ；
ＣＤＲ３−ＦＱＧＴＨＤＰＹＴ（配列番号１３０）
を有するＣＤＲを有するＶＬ；または
ｄ）以下の配列：
ＣＤＲ１−ＧＦＴＦＳＮＡＡ（配列番号１１３）；
ＣＤＲ２−ＩＲＴＫＰＮＮＹＡＴ（配列番号１１４）；
ＣＤＲ３−ＴＹＹＤＧＳＳＹＡＭＤＡ（配列番号１１５）
を有するＣＤＲを有するＶＨ；および
以下の配列：
ＣＤＲ１−ＱＳＬＥＹＳＤＧＹＴＹ（配列番号１１６）；
ＣＤＲ２−ＥＩＳ；
ＣＤＲ３−ＦＱＡＴＨＤＰＹＴ（配列番号１１７）
を有するＣＤＲを有するＶＬ；または
ｅ）以下の配列：
ＣＤＲ１−ＧＦＴＦＳＮＴＡ（配列番号１３６）；
ＣＤＲ２−ＩＲＩＱＰＫＮＹＡＴ（配列番号１２２）；
ＣＤＲ３−ＴＡＡＧＦＧＦＤＹ（配列番号１２３）
を有するＣＤＲを有するＶＨ；および
以下の配列：
ＣＤＲ１−ＱＲＬＥＹＳＤＧＮＴＹ（配列番号１３７）；
ＣＤＲ２−ＥＶＳ；
ＣＤＲ３−ＬＱＡＴＨＤＰＦＴ（配列番号１２５）
を有するＣＤＲを有するＶＬ；または
ｆ）以下の配列：
ＣＤＲ１−ＧＦＴＦＳＳＡＡ（配列番号１４１）；
ＣＤＲ２−ＩＲＴＫＰＮＮＹＡＴ（配列番号１１４）；
ＣＤＲ３−ＴＹＹＤＧＳＳＹＡＭＤＡ（配列番号１１５）
を有するＣＤＲを有するＶＨ；および
以下の配列：
ＣＤＲ１−ＱＳＬＥＹＳＤＧＹＴＹ（配列番号１１６）；
ＣＤＲ２−ＥＶＳ；  
ＣＤＲ３−ＦＱＡＴＨＤＰＹＴ（配列番号１１７）
を有するＣＤＲを有するＶＬ、
を含む抗原結合ドメインを含む、請求項１、２、４または５のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項７】
前記抗原結合ドメインは、配列番号１２０、１２８、１３３、１３５、１４０および１４４から選択される配列を含む、請求項６に記載のＣＡＲ。
【請求項８】
細胞表面において請求項１〜７のいずれかに記載のＣＡＲを発現する、細胞。
【請求項９】
細胞表面において第２のＣＡＲを共発現し、ここで前記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ７９以外の抗原に特異的に結合する、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１９またはＣＤ２２に特異的に結合する、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
細胞表面において第３のＣＡＲをさらに発現し、ここで前記第３のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ７９以外の抗原に特異的に結合する、請求項８〜１０に記載の細胞。
【請求項１２】
前記第３のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１９またはＣＤ２２に特異的に結合する、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に特異的に結合し、前記第３のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２に特異的に結合する、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
１つのＣＡＲの抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、もう１つのＣＡＲの抗原結合ドメインはｄＡｂであり、もう１つのＣＡＲの抗原結合ドメインはＦａｂである、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１５】
前記第１のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ７９に特異的に結合し、かつｄＡｂであり、前記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に特異的に結合し、かつｓｃＦｖであり、前記第３のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２に特異的に結合し、かつＦａｂである、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１６】
前記第１のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ７９に特異的に結合し、かつｓｃＦｖであり、前記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に特異的に結合し、かつｓｃＦｖであり、前記第３のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２に特異的に結合し、かつｓｃＦｖである、請求項１１〜１３のいずれかに記載の細胞。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれかに記載のＣＡＲをコードする、核酸配列。
【請求項１８】
請求項１７に記載の第１の核酸配列、ならびに請求項９、１０および１３〜１５のいずれかに規定されるとおりの第２のＣＡＲをコードする第２の核酸配列を含む、核酸構築物。
【請求項１９】
請求項１１〜１５のいずれかに規定されるとおりの第３のＣＡＲをコードする第３の核酸配列を含む、請求項１８に記載の核酸構築物。
【請求項２０】
請求項１７に記載の核酸配列または請求項１８または１９のいずれかに記載の核酸構築物を含む、ベクター。
【請求項２１】
請求項１７に記載の第１の核酸配列、請求項１８に規定されるとおりの第２の核酸配列、および請求項１９に規定されるとおりの第３の核酸配列を含む、キット。
【請求項２２】
（ｉ）請求項１７に記載の第１の核酸配列を含む第１のベクター；および
（ｉｉ）請求項１８に規定されるとおりの第２の核酸構築物を含む第２のベクター；
ならびに必要に応じて
（ｉｉｉ）請求項１９に規定されるとおりの第３の核酸構築物を含む第３のベクター、
を含む、キット。
【請求項２３】
請求項８〜１６のいずれかに記載の細胞を作製するための方法であって、前記方法は、請求項１７に記載の核酸配列、および必要に応じて、請求項１８に規定されるとおりの核酸配列、および必要に応じて、請求項１９に規定されるとおりの核酸配列；または請求項１８もしくは１９のいずれかに記載の核酸構築物；または請求項２０に記載のベクター；または請求項２２に規定されるとおりの、第１のベクター、および必要に応じて、第２のベクター、および必要に応じて第３のベクターを、細胞に導入する工程を包含する、方法。
【請求項２４】
前記細胞は、被験体から単離されたサンプルに由来する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項８〜１６のいずれかに記載の複数の細胞を含む、薬学的組成物。
【請求項２６】
疾患を処置するおよび／または防止するための方法であって、前記方法は、請求項８〜１６のいずれかに記載の細胞、または請求項２５に記載の薬学的組成物を、被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
以下の工程：
（ｉ）細胞含有サンプルを被験体から単離する工程；
（ｉｉ）請求項２４に記載の方法の後に、前記細胞を形質導入するまたはトランスフェクトする工程；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において得た細胞を、前記被験体に投与する工程、
を包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
疾患を処置するおよび／または防止することにおける使用のための、請求項８〜１６のいずれかに記載の細胞、または請求項２５に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
疾患を処置するおよび／または防止するための医薬の製造における請求項８〜１６のいずれかに記載の細胞の使用。
【請求項３０】
前記疾患はがんである、請求項２６または２７のいずれかに記載の方法、または請求項２８に記載の使用のための細胞、または請求項２８に記載の使用のための薬学的組成物、または請求項２９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、表面抗原分類７９（ＣＤ７９）に特異的に結合するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）に関する。本発明はまた、Ｂ細胞悪性疾患の処置において有用な細胞および薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、免疫結合体化ｍＡｂ、放射性物質結合体化ｍＡｂおよび二重特異的Ｔ細胞結合因子（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ）を含む、多くの免疫治療剤が、がん処置における使用に関して記載されている。代表的には、これらの免疫治療剤は、単一の抗原を標的化する：例えば、リツキシマブは、ＣＤ２０を標的とする；Ｍｙｅｌｏｔａｒｇは、ＣＤ３３を標的とする；そしてアレムツズマブは、ＣＤ５２を標的とする。
【０００３】
キメラ抗原レセプターは、それらの通常の形式において、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性をＴ細胞のエフェクター機能にグラフト化するタンパク質である。それらの通常の形態は、抗原認識アミノ末端、スペーサー、膜貫通ドメインが全て、Ｔ細胞生存および活性化シグナルを伝達する複合エクトドメインに接続された、Ｉ型膜貫通ドメインタンパク質の形態である。
【０００４】
これらの分子の最も一般的な形態は、スペーサーおよび膜貫通ドメインを介してシグナル伝達エンドドメインに融合された、標的抗原を認識するモノクローナル抗体に由来する１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の融合物である。このような分子は、ｓｃＦｖによるその標的の認識に応じて、Ｔ細胞の活性化を生じる。Ｔ細胞がこのようなＣＡＲを発現する場合、それらは、上記標的抗原を発現する標的細胞を認識し、殺滅する。いくつかのＣＡＲは、腫瘍関連抗原に対して開発されており、このようなＣＡＲ発現Ｔ細胞を使用する養子移入アプローチは現在、種々のがんの処置に関する臨床試験中である。
【０００５】
ヒトＣＤ１９抗原は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する９５ｋＤａ  膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ１９は、Ｂ細胞分化において非常に早期に発現され、形質細胞への最終Ｂ細胞分化においてのみ失われる。結論として、ＣＤ１９は、多発性骨髄腫を除いて、全てのＢ細胞悪性疾患上で発現される。通常のＢ細胞区画の喪失は、受容可能な毒性であることから、ＣＤ１９は、Ｂ細胞白血病およびリンパ腫にとって魅力的なＣＡＲ標的である。
【０００６】
ＣＤ１９標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞治療は、臨床において有効であると判明しており、近年、米国食品医薬品局によって、ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞治療の認可が、再発性／難治性ＡＬＬの処置に関して（チサゲンレクロイセル（ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ））および再発性／難治性びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫に関して（アキシカブタゲンシロロイセル（ａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅ  ｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌ））もたらされた。
【０００７】
ＣＤ１９に対して標的化されるＣＡＲ  Ｔ細胞治療に伴う問題は、Ｂ細胞悪性疾患が変異し、ＣＤ１９陰性になり得ることである。ＣＤ１９抗原エスケープは、差次的スプライシング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ）、ミスセンス変異または系統切り替え（ｌｉｎｅａｇｅ  ｓｗｉｔｃｈ）を含む、異なる機構によって生じ得る。ＣＤ１９抗原エスケープは、上記治療に応答性でないＣＤ１９陰性がんに伴う再発を生じる。例えば、１つの小児科研究において、Ｇｒｕｐｐ  ｅｔ  ａｌ．は、Ｂ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）のＣＤ１９標的化キメラ抗原レセプター治療後の全再発のうちの半分がＣＤ１９陰性疾患に起因することを報告した（５６ｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ）。
【０００８】
同様の問題が、Ｂ細胞抗原ＣＤ２２を標的化するＣＡＲ−Ｔ細胞アプローチに伴って観察されている。ＣＤ２２は、ＣＤ１９のように、Ｂ−ＡＬＬのようなＢ細胞悪性疾患上で発現され、通常は、ＣＤ１９喪失後に保持される。しかし、ＣＤ２２  ＣＡＲを使用する臨床試験は、患者のうちの７３％において完全寛解が当初認められるが、低下したＣＤ２２部位密度と関連して、再発が６ヶ月後に観察されることが示された。ＣＤ２２抗原密度の低減は、ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞による殺滅からのＣＤ２２＋細胞エスケープを可能にしたと考えられる（Ｆｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１８，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２４：２０−８）。標的抗原の喪失はまた、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）において認識される。
【０００９】
従って、抗原エスケープを介して再発しにくい改善されたＣＡＲ−Ｔ細胞治療が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｆｒｙら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ（２０１８）２４：２０〜８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の局面の要旨
本発明者らは、Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）のタンパク質構成要素であるＣＤ７９に特異的に結合するＣＡＲを開発した。ある種のＢ細胞悪性疾患が、生存に関するＢＣＲシグナル伝達に依存する（Ｂｕｒｇｅｒ  ＆  Ｗｉｅｓｔｎｅｒ，  ２０１８）ことを考慮すると、悪性Ｂ細胞が、抗ＣＤ１９または抗ＣＤ２２  ＣＡＲからより、抗ＣＤ７９  ＣＡＲからの腫瘍エスケープの傾向が低いことが推測される。
【００１２】
従って、第１の局面において、本発明は、ＣＤ７９に結合するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を提供する。
【００１３】
上記ＣＡＲは、ＣＤ７９Ａに特異的に結合し得る。例えば、それは、ＣＤ７９Ａエクトドメインのスプライシングされていない部分（配列番号１０５の残基３３〜１４３）に結合し得る。
【００１４】
上記ＣＡＲは、ＣＤ７９Ｂに特異的に結合し得る。例えば、それは、ＣＤ７９Ｂエクトドメインのスプライシングされていない部分（配列番号１０６の残基２９〜１５９）に結合し得る。
【００１５】
上記ＣＡＲは、ｓｃＦｖ、ＦａｂおよびｄＡｂ抗原結合ドメインから選択される抗原結合ドメインを含み得る。上記抗原結合ドメインは、Ｆａｂ、ｄＡｂまたはｓｃＦｖであってもよいし、これらを含んでいてもよい。
【００１６】
上記ＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを含み得る：
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１−ＧＦＴＦＳＮＡＡ（配列番号１１３）；
ＣＤＲ２−ＩＲＴＫＰＮＮＹＡＴ（配列番号１１４）
ＣＤＲ３−ＴＹＹＤＧＳＳＹＡＭＤＡ（配列番号１１５）；および
以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１−ＱＳＬＥＹＳＤＧＹＴＹ（配列番号１１６）；
ＣＤＲ２−ＥＶＳ
ＣＤＲ３−ＦＱＡＴＨＤＰＹＴ（配列番号１１７）；
または
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有するＶＨ：
ＣＤＲ１−ＧＦＴＦＳＨＴＡ（配列番号１２１）；
ＣＤＲ２−ＩＲＩＱＰＫＮＹＡＴ（配列番号１２２）；
ＣＤＲ３−ＴＡＡＧＦＧＦＤＹ（配列番号１２３）；および
以下の配列を有するＣＤＲを有するＶＬ：
ＣＤＲ１−ＱＳＬＥＹＳＤＧＮＴＹ（配列番号１２４）；
ＣＤＲ２−ＥＶＳ；
ＣＤＲ３−ＬＱＡＴＨＤＰＦＴ（配列番号１２５）；
または
ｃ）以下の配列を有するＣＤＲを有するＶＨ：
ＣＤＲ１−ＧＦＴＦＳＮＡＡ（配列番号１１３）；
ＣＤＲ２−ＩＲＴＫＰＮＮＹＡＴ（配列番号１１４）；
ＣＤＲ３−ＴＡＤＧＧＹＧＦＤＹ（配列番号１２９）；および
以下の配列を有するＣＤＲを有するＶＬ：
ＣＤＲ１−ＱＳＬＥＹＳＤＧＹＴＹ（配列番号１１６）；
ＣＤＲ２−ＥＶＳ；
ＣＤＲ３−ＦＱＧＴＨＤＰＹＴ（配列番号１３０）；
または
ｄ）以下の配列を有するＣＤＲを有するＶＨ：
ＣＤＲ１−ＧＦＴＦＳＮＡＡ（配列番号１１３）；
ＣＤＲ２−ＩＲＴＫＰＮＮＹＡＴ（配列番号１１４）；
ＣＤＲ３−ＴＹＹＤＧＳＳＹＡＭＤＡ（配列番号１１５）；および
以下の配列を有するＣＤＲを有するＶＬ：
ＣＤＲ１−ＱＳＬＥＹＳＤＧＹＴＹ（配列番号１１６）；
ＣＤＲ２−ＥＩＳ
ＣＤＲ３−ＦＱＡＴＨＤＰＹＴ（配列番号１１７）
または
ｅ）以下の配列を有するＣＤＲを有するＶＨ：
ＣＤＲ１−ＧＦＴＦＳＮＴＡ（配列番号１３６）；
ＣＤＲ２−ＩＲＩＱＰＫＮＹＡＴ（配列番号１２２）；
ＣＤＲ３−ＴＡＡＧＦＧＦＤＹ（配列番号１２３）；および
以下の配列を有するＣＤＲを有するＶＬ：
ＣＤＲ１−ＱＲＬＥＹＳＤＧＮＴＹ（配列番号１３７）；
ＣＤＲ２−ＥＶＳ；
ＣＤＲ３−ＬＱＡＴＨＤＰＦＴ（配列番号１２５）；
または
ｆ）以下の配列を有するＣＤＲを有するＶＨ：
ＣＤＲ１−ＧＦＴＦＳＳＡＡ（配列番号１４１）；
ＣＤＲ２−ＩＲＴＫＰＮＮＹＡＴ（配列番号１１４）；
ＣＤＲ３−ＴＹＹＤＧＳＳＹＡＭＤＡ（配列番号１１５）；および
以下の配列を有するＣＤＲを有するＶＬ：
ＣＤＲ１−ＱＳＬＥＹＳＤＧＹＴＹ（配列番号１１６）；
ＣＤＲ２−ＥＶＳ  ；
ＣＤＲ３−ＦＱＡＴＨＤＰＹＴ（配列番号１１７）。
【００１７】
上記抗原結合ドメインは、配列番号１２０、１２８、１３３、１３５、１４０および１４４から選択される配列を含み得る。
【００１８】
第２の局面において、本発明は、本発明の第１の局面に従うＣＡＲを発現する細胞を提供する。
【００１９】
上記細胞は、ＣＤ７９以外の抗原に結合する、細胞表面において第２のＣＡＲを共発現し得る。例えば、上記第２のＣＡＲは、ＣＤ１９またはＣＤ２２に結合し得る。
【００２０】
上記細胞は、ＣＤ７９以外の抗原に結合し得る、細胞表面において第３のＣＡＲをさらに発現し得る。例えば、上記第３のＣＡＲは、ＣＤ１９またはＣＤ２２に結合し得る。
【００２１】
好ましい実施形態において、上記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、上記第３のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２に結合する。
【００２２】
本発明のＣＡＲを含む３方向ＯＲゲート（３−ｗａｙ  ＯＲ  ｇａｔｅ）において、１つのＣＡＲの抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み得、もう１つのＣＡＲの抗原結合ドメインは、ｄＡｂを含み得、もう１つのＣＡＲの抗原結合ドメインは、Ｆａｂを含み得る。
【００２３】
特に、上記細胞は、第１の、第２のおよび第３のＣＡＲを含み得、ここで上記第１のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ７９に結合し、ｄＡｂである；上記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、ｓｃＦｖであり、上記第３のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２に結合し、Ｆａｂである。
【００２４】
第３の局面において、本発明は、本発明の第１の局面に従うＣＡＲをコードする核酸配列を提供する。
【００２５】
第４の局面において、本発明の第３の局面に従う第１の核酸配列および上記で規定されるとおりの第２のＣＡＲをコードする第２の核酸配列を含む核酸構築物が、提供される。
【００２６】
上記核酸構築物は応じて、上記で規定されるとおりの第３のＣＡＲをコードする第３の核酸配列を含み得る。
【００２７】
第５の局面において、本発明の第３の局面に従う核酸配列を含むベクターまたは本発明の第４の局面に従う核酸構築物が提供される。
【００２８】
第６の局面において、本発明の第３の局面に従う第１の核酸配列、上記で規定されるとおりの第２の核酸配列、および上記で規定されるとおりの第３の核酸配列を含むキットが、提供される。
【００２９】
第７の局面において、
（ｉ）本発明の第３の局面に従う第１の核酸配列を含む第１のベクター；および
（ｉｉ）上記で規定されるとおりの第２の核酸構築物を含む第２のベクター；
および必要に応じて、
（ｉｉｉ）上記で規定されるとおりの第３の核酸構築物を含む第３のベクター、
を含むキットが提供される。
【００３０】
第８の局面において、本発明の第２の局面に従う細胞を作製するための方法が提供され、上記方法は、本発明の第３の局面に従う核酸配列、および必要に応じて第２のＣＡＲをコードする核酸配列、および必要に応じて第３のＣＡＲをコードする核酸配列；または本発明の第４の局面に従う核酸構築物；または本発明の第５の局面に従うベクター；または上記で規定されるとおりの、第１のベクター、および必要に応じて第２のベクター、および必要に応じて第３のベクターを、細胞に導入する工程を包含する。
【００３１】
上記細胞は、被験体から単離されたサンプルに由来し得る。
【００３２】
第９の局面において、本発明の第３の局面に従う複数の細胞を含む薬学的組成物が提供される。
【００３３】
第１０の局面において、疾患を処置するおよび／または防止するための方法であって、上記方法は、本発明の第９の局面に従う薬学的組成物を被験体に投与する工程を包含する方法が提供される。
【００３４】
上記方法は、以下の工程：
（ｉ）細胞含有サンプルを被験体から単離する工程；
（ｉｉ）本発明の第８の局面に従う方法の後に、上記細胞を形質導入するまたはトランスフェクトする工程；ならびに
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）において得た細胞を、上記被験体に投与する工程、
を包含し得る。
【００３５】
第１１の局面において、疾患を処置するおよび／または防止することにおける使用のための、本発明の第９の局面に従う薬学的組成物が提供される。
【００３６】
第１２の局面において、疾患を処置するおよび／または防止するための医薬の製造における、本発明の第３の局面に従う細胞の使用が提供される。
【００３７】
上記疾患は、がん（例えば、Ｂ細胞白血病またはリンパ腫）であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１．  キメラ抗原レセプターおよびそれらのエンドドメインの概要（ａ）キメラ抗原レセプターの基本スキーム；（ｂ）第１世代レセプター；（ｃ）第２世代レセプター；（ｄ）第３世代レセプター。
【００３９】
【図２】図２．  キメラ抗原レセプターの異なる結合ドメイン形式（ａ）Ｆａｂ  ＣＡＲ形式；（ｂ）ｄＡｂ  ＣＡＲ形式；（ｃ）ｓｃＦｖ  ＣＡＲ形式。
【００４０】
【図３】図３．  ＣＤ１９、ＣＤ２２およびＣＤ７９を標的化するＣＡＲ  ＯＲゲート（ａ）トリシストロンカセットを、２つのＦＭＤ−２Ａ配列を使用する２つのレセプターのコード配列を分離することによって生成し得る；（ｂ）全３種のレセプターがｓｃＦｖ  ＣＡＲであるＯＲゲート。各々は、異なるエンドドメインを有し得る。
【００４１】
【図４】図４．  異なる形式のＣＡＲを使用するＣＤ１９、ＣＤ２２およびＣＤ７９を標的化するＣＡＲ  ＯＲゲート。（ａ）トリシストロンカセットを、２つのＦＭＤ−２Ａ配列を使用する２つのレセプターのコード配列を分離することによって生成し得る；（ｂ）３種の異なる形式：  ＣＤ１９についてはｓｃＦｖ−ＣＡＲ、ＣＤ２２についてはＦａｂ  ＣＡＲおよびＣＤ７９についてはｄＡｂ  ＣＡＲを組み合わせるＯＲゲート。
【００４２】
【図５】図５．  Ｒａｊｉ、ＤａｕｄｉおよびＭＭ１．ｓ細胞株上でのＣＤ７９ｂの細胞表面発現のフローサイトメトリー分析。Ｓｅｃ  Ａｂ：二次抗体。
【００４３】
【図６】図６．  抗ＣＤ７９ｂ  ＣＡＲの機能的特徴付け。ＭＭ１．ｓまたはＲａｊｉ細胞の存在下でインキュベートされる抗ＣＤ７９ｂ  ３Ｈ２および１０Ｃ１１ベースのＣＡＲ−Ｔ細胞による（Ａ）ＩＦＮ−γおよび（Ｂ）ＩＬ−２の生成。ポラツズマブベースのＣＡＲを、コントロールとして使用した。
【００４４】
【図７】図７．  Ｒａｊｉ細胞と共インキュベートされる抗ＣＤ７９ｂ  ３Ｈ２および１０Ｃ１１ベースのＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性活性。ポラツズマブベースのＣＡＲをコントロールとして使用した。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
発明の詳細な説明
本発明は、ＣＤ７９に特異的に結合するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）に関する。
【００４６】
１．  ＣＤ７９
用語「ＣＤ７９」または「表面抗原分類（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）７９」とは、２種の膜貫通タンパク質、ＣＤ７９ａおよびＣＤ７９ｂを含み、ジスルフィド結合したヘテロダイマーを形成し、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子スーパーファミリーのメンバーである、Ｂ細胞の表面にあるタンパク質に関する。上記膜貫通ＣＤ７９ａおよびＣＤ７９ｂタンパク質は、５種の異なるタイプの膜貫通Ｉｇ分子（ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＡ）のうちのいずれか１種と細胞外末端において連結し、２個のＩｇ重鎖および２個のＩｇ軽鎖から構成されるジスルフィド結合したタンパク質である。ＣＤ７９およびＢ細胞表面上の免疫グロブリンのこの組み合わせは、Ｂ細胞シグナル伝達レセプター（ＢＣＲ）を形成する。ＣＤ７９ａおよびＣＤ７９ｂの細胞質内ドメインは、抗原誘導性ＢＣＲ凝集の際にＢ細胞に活性化シグナルを伝達する免疫受容活性化チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＡＭ）を含む。
【００４７】
ＣＤ７９発現は、プレＢ細胞および成熟Ｂ細胞（形質細胞を除く）に制限される。ＣＤ７９はまた、Ｂ細胞由来悪性疾患の大部分で発現される。この狭い発現パターンは、正常組織への標的化を最小限にしながら、ＣＤ７９をがん標的化治療の有望な標的にする。
【００４８】
用語「ＣＤ７９ａ」または「ＣＤ７９Ａ」とは、Ｉｇ−α、ＭＢ−１膜糖タンパク質、膜結合免疫グロブリン関連タンパク質、および表面ＩｇＭ関連タンパク質としても公知の、Ｂ細胞抗原レセプター複合体関連タンパク質α鎖をいう。ＣＤ７９ａのヒトアイソフォームは、アクセッション番号Ｐ１１９１２．１（アイソフォーム１またはロング）およびＰ１１９１２．２（アイソフォーム２またはショート）の下で、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースに２０１８年４月２０日に示されている。
【００４９】
用語「ＣＤ７９ｂ」または「ＣＤ７９Ｂ」とは、Ｉｇ−β、Ｂ細胞特異的糖タンパク質Ｂ２９、および免疫グロブリン関連Ｂ２９タンパク質としても公知の、Ｂ細胞抗原レセプター複合体関連タンパク質β鎖をいう。ＣＤ７９ｂのヒトアイソフォームは、アクセッション番号Ｐ４０２５９−１（アイソフォームロング）、Ｐ４０２５９−２（アイソフォームショート）およびＰ４０２５９−３（アイソフォーム３）の下で、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースに２０１８年４月２０日に示されている。
【００５０】
活性化Ｂリンパ球は、ショートまたは短縮型ＣＤ７９アイソフォームの増大した量を有する。特定の実施形態において、本発明は、ＣＤ７９ａに特異的に結合するＣＡＲに関する。好ましい実施形態において、上記ＣＡＲは、スプライシングされていない部分またはＣＤ７９ａエクトドメイン、すなわち、配列番号１０５として（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ１１９１２．１）として以下に示されるＣＤ７９ａアイソフォーム１の残基３３〜１４３に結合する。別の特定の実施形態において、本発明は、ＣＤ７９ｂに特異的に結合するＣＡＲに関する。別の好ましい実施形態において、上記ＣＡＲは、スプライシングされていない部分またはＣＤ７９ｂエクトドメイン、すなわち、配列番号１０６（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ４０２５９−１）として以下に示されるＣＤ７９ｂアイソフォームロングの残基２９〜１５９に結合する。
【００５１】
【化１】
2021527395.tif 000002
【００５２】
２．  キメラ抗原レセプター
旧来のキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、細胞外抗原認識ドメイン（結合因子）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に接続するキメラＩ型膜貫通タンパク質である。上記結合因子は、代表的には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に由来する１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であるが、抗体様抗原結合部位を含む他の形式に基づき得る。スペーサードメインは、通常は、上記結合因子を上記膜から隔離し、適切な配向を可能にするために必要である。使用される一般的なスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。より小型のスペーサーは、抗原に応じて、例えば、ＣＤ８αのストークおよびＩｇＧ１ヒンジ単独だけで十分であり得る。膜貫通ドメインは、上記タンパク質を細胞膜の中にアンカーし、上記スペーサーをエンドドメインに接続する。
【００５３】
初期のＣＡＲデザインは、ＦｃεＲ１またはＣＤ３ζのγ鎖いずれかの細胞内部分に由来するエンドドメインを有した。結論として、これらの第１世代レセプターは、同族の標的細胞のＴ細胞殺滅を誘発するために十分であるが、上記Ｔ細胞を十分に活性化して、増殖および生存することはできない免疫学的シグナル１を伝達した。この制限を克服するために、複合エンドドメインを構築した：Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分をＣＤ３ζの細胞内ドメインに融合したものは、抗原認識後と同時に活性化および共刺激シグナルを伝達し得る第２世代レセプターを生じる。最も一般に使用される上記共刺激ドメインは、ＣＤ２８のものである。これは、Ｔ細胞増殖を誘発する最も強力な共刺激シグナル、すなわち、免疫学的シグナル２を供給する。いくつかのレセプターがまた記載されており、そのレセプターとしては、ＴＮＦレセプターファミリーエンドドメイン（例えば、生存シグナルを伝達する、密接に関連したＯＸ４０および４１ＢＢ）が挙げられる。ここでさらにより強力な第３世代のＣＡＲがここで記載されており、これは、活性化、増殖および生存シグナルを伝達し得るエンドドメインを有する。
【００５４】
上記ＣＡＲが標的抗原に結合する場合、上記ＣＡＲは、これが発現されるＴ細胞への活性化シグナルの伝達を生じる。従って、上記ＣＡＲは、上記Ｔ細胞の特異性および細胞傷害を、その標的化された抗原を発現する腫瘍細胞に向かって指向する。
【００５５】
従って、ＣＡＲは代表的には、（ｉ）抗原結合ドメイン；（ｉｉ）スペーサー；（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；および（ｉｉｉ）シグナル伝達ドメインを含むかまたは会合する細胞内ドメインを含む（図１を参照のこと）。
【００５６】
ＣＡＲは、以下の一般構造を有し得る：
抗原結合ドメイン−スペーサードメイン−膜貫通ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）。
【００５７】
１．１．  シグナルペプチド
本発明のＣＡＲは、上記ＣＡＲが細胞（例えば、Ｔ細胞）内部で発現される場合に、その新生タンパク質が小胞体に、その後、その新生タンパク質が発現される細胞表面に指向されるように、シグナルペプチドを含み得る。
【００５８】
上記シグナルペプチドのコアは、単一のαヘリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長いストレッチを含み得る。上記シグナルペプチドは、トランスロケーションの間にポリペプチドの適切なトポロジーを強化する助けとなるアミノ酸の正に荷電した短いストレッチで始まり得る。上記シグナルペプチドの末端には、代表的には、シグナルペプチダーゼによって認識され切断されるアミノ酸のストレッチが存在する。シグナルペプチダーゼは、トランスロケーション中またはトランスロケーションの完了後のいずれかに切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成し得る。上記遊離シグナルペプチドは、次いで、特異的プロテアーゼによって消化される。
【００５９】
上記シグナルペプチドは、分子のアミノ末端に存在し得る。
【００６０】
上記シグナルペプチドは、配列番号１、２、３もしくは４、または５個、４個、３個、２個もしくは１個のアミノ酸変異（挿入、置換または付加）を有するその改変体を含み得るが、ただし上記シグナルペプチドは、上記ＣＡＲの細胞表面発現を引き起こすようになお機能する。
配列番号１：  ＭＧＴＳＬＬＣＷＭＡＬＣＬＬＧＡＤＨＡＤＧ
【００６１】
配列番号７のシグナルペプチドは、小型および高度に効率的である。それは、末端グリシンの後ろで約９５％切断を与え、シグナルペプチダーゼによる効率的除去を与えると推測される。
配列番号２：  ＭＳＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ
【００６２】
配列番号８のシグナルペプチドは、ＩｇＧ１に由来する。
配列番号３：  ＭＡＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣ
【００６３】
配列番号９のシグナルペプチドは、ＣＤ８に由来する。
配列番号４：  ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ
【００６４】
上記第１のＣＡＲのシグナルペプチドは、上記第２のＣＡＲのシグナルペプチドとは（および第３のＣＡＲおよび第４のＣＡＲなどとは）異なる配列を有し得る。
【００６５】
１．２．  抗原結合ドメイン
上記抗原結合ドメインは、抗原を認識する上記ＣＡＲの一部である。多くの抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合部位に基づくものを含め、当該分野で公知である。上記抗体は、ＣＤ７９に結合し得る、全長抗体、１本鎖抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨＨ／ナノボディー、ナノボディー、アフィボディー（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、フィブロネクチン人工抗体足場、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ）、ＤＡＲＰｉｎ、ＶＮＡＲ、ｉＢｏｄｙ、アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒ）、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、ドメイン抗体（ＤＡｂ）、アブジュリン（ａｂｄｕｒｉｎ）／ナノ抗体（ｎａｎｏａｎｔｉｂｏｄｙ）、センチリン（ｃｅｎｔｙｒｉｎ）、アルファボディー（ａｌｐｈａｂｏｄｙ）、ナノフィチン（ｎａｎｏｆｉｔｉｎ）またはＤドメインであり得る。上記抗体は、ＣＤ７９ａまたはＣＤ７９ｂに結合し得る。
【００６６】
上記抗体または抗原結合ドメインは、非ヒト、キメラ、ヒト化または完全ヒトのものであり得る。
【００６７】
旧来のＣＡＲにおいて、抗原結合ドメインは、以下を含む：モノクローナル抗体に由来する１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）（図２ｃを参照のこと）。ＣＡＲはまた、ドメイン抗体（ｄＡｂ）（図２ｂを参照のこと）またはＦａｂ（図２ａを参照のこと）とともに生成され得る。
【００６８】
本発明のＣＡＲは、ＣＤ７９に特異的に結合する、ｓｃＦｖ、ＦａｂおよびｄＡｂから選択される抗原結合ドメインを含み得る。
【００６９】
多くの抗ＣＤ７９抗体は、リンパ腫異種移植片モデルのＢ細胞悪性疾患の処置において試験されている（Ｐｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｂｌｏｏｄ  １１０：６１６−２３）：
【表２】
2021527395.tif 000003
【００７０】
Ｐｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７およびＤｏｒｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９（Ｂｌｏｏｄ  １１４：２７２１−９）は、非結合体化抗ＣＤ７９抗体が、大部分の環境下で有効ではないが、異種移植片モデルにおいて有効であると判明した薬物結合体を有する抗体を供給することを報告した。
【００７１】
抗体２Ｆ２は、ヒト化されており、このヒト化バージョンであるポラツズマブは、モノメチルオーリスタチンＥとの抗体薬物結合体として臨床研究の最中である。利用可能なデータは制限されているが、Ｐａｌａｎｃａ−Ｗｅｓｓｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５（Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  １６：７０４−１５）は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を有する患者においてある程度の有効性を報告したが、グレード３〜４の有害作用が、ポラツズマブベドチンで処置した５８％の患者において、およびリツキシマブと併用したポラツズマブベドチンで処置した７７％の患者において観察された。慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する患者においては、客観的応答は観察されなかった。従って、ＣＤ７９発現Ｂ細胞悪性疾患を処置するために改善された治療アプローチが必要である。
【００７２】
ＣＤ７９に対して特異性を有する抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、ＦａｂおよびｄＡｂ）の生成については、当該分野で利用可能な手順は多く存在する。例としては、マウスをＣＤ７９またはＣＤ７９に由来するペプチドで免疫化することによる、ハイブリドーマの生成が挙げられる。他の種は、この目的のために都合良く免疫化され得、上記種としては、ラット、ラクダ類およびサメ類が挙げられるが、これらに限定されない。ｓｃＦｖ、ＦａｂおよびｄＡｂは通常、ＶドメインのＰＣＲクローニングによって生成され、Ｆａｂが生成される場合、免疫化した動物から得られる血液、リンパ節、または脾臓ｃＤＮＡのＣＨ１およびＣＬレパートリーからも生成される。上記配列は、その後のタンパク質発現のために適切なベクターへとクローニングされる。この目的のために都合良く免疫化され得る動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ラクダ類およびサメ類が挙げられるが、これらに限定されない。上記抗原結合ドメインがＣＤ７９に結合する能力は、当該分野で利用可能な多くのアッセイによって決定され得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞のクローンによって生成されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、競合ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、免疫組織化学（ＩＨＣ））によって、または免疫蛍光技術（例えば、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリー）によって決定される。
【００７３】
当業者は、上記ポリペプチドの一次配列が変化しているとしても、上記抗原結合ドメインがＣＤ７９に結合する能力が維持されるように、上記抗原結合ドメインのアミノ酸配列が、１またはこれより多くのアミノ酸置換を含み得ることを理解する。上記置換は、保存的置換であり得、一般に、１つのアミノ酸を、類似の特性を有する別のアミノ酸で置換することを示すために適用される（例えば、グルタミン酸をアスパラギン酸で置換することは、保存的アミノ酸置換である）。
【００７４】
本発明のＣＡＲは、ＣＤ７９に特異的に結合するｓｃＦｖを含み得る。
【００７５】
多くの抗ＣＤ７９抗体は、以前に記載されている（例えば、ＪＣＢ１１７、ＳＮ８、ＣＢ３．１、２Ｆ２（ポラツズマブ））。
【００７６】
上記抗原結合ドメインは、抗体の軽鎖および重鎖の各対の可変領域、すなわち、それぞれ、その結合部位を形成するＶＨドメインおよびＶＬドメインであり得る。それらは、相補性決定領域（ＣＤＲ）といわれる３個の超可変領域によって結合されたフレームワーク（ＦＲ）といわれる比較的保存された領域によって構成された同じ一般構造によって特徴づけられる（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  第５版，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ．；  Ｃｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，  １９８７，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１−１７）。用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とは、本明細書で使用される場合、抗原の形状を補完する抗体内の領域をいう。従って、ＣＤＲは、特異的抗原に対するタンパク質の親和性および特異性を決定する。各対の２つの鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によって整列され、特異的エピトープを結合する機能を獲得する。結論として、ＶＨおよびＶＬドメインの場合には、重鎖および軽鎖の両方が、それぞれ、３個のＣＤＲ、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬｌ、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３によって特徴づけられる。
【００７７】
上記ＣＤＲの多くの定義が、一般に使用されている。Ｋａｂａｔの定義は、配列可変性に基づいており、最も一般に使用される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／を参照のこと）。ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（ＩＭＧＴ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇを参照のこと）もまた使用され得る。このシステムによれば、相補性決定領域（ＣＤＲ−ＩＭＧＴ）は、可変ドメインのループ領域であり、ＶドメインのＩＭＧＴ固有番号付けに従って区切られる。可変ドメインには、３つのＣＤＲ−ＩＭＧＴが存在する：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ（ループＢＣ）、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ（ループＣ’Ｃ”）、およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ（ループＦＧ）。ＣＤＲの他の定義も開発されている（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、ＡｂＭの定義および接触の定義（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇを参照のこと）。上記の定義のうちのいずれかに従うＣＤＲの決定は、当業者に利用可能な多くの方法を使用して行われ得る。同様に、当業者は、どの定義がＣＤＲ配列の任意の所定のセットのために使用されるかを特定し得る。
【００７８】
上記ＣＤＲは、１０〜約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドで接続された、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質である１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の形式にあり得る。本発明のｓｃＦｖは、配向ＶＨ−ＶＬにあり得、すなわち、上記ＶＨは、ＣＡＲ分子のアミノ末端にあり、上記ＶＬドメインは、上記スペーサー、次に、上記膜貫通ドメインおよびエンドドメインに連結されるか、またはＶＬ−ＶＨ配向にあり得る。
【００７９】
本発明の抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、これらの抗ＣＤ７９抗体のうちの１種に由来するｓｃＦｖタイプ抗原結合ドメインのような抗原結合ドメインを含み得る。
【００８０】
上記ＣＤ７９結合ドメインは、以下を含み得る：
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１−ＳＤＹＡＷＮ（配列番号５）；
ＣＤＲ２−ＮＩＷＹＳＧＳＴＴＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号６）
ＣＤＲ３−ＭＤＦ（配列番号７）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１−ＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＫＴＦＭＨＷＨ（配列番号８）；
ＣＤＲ２−ＲＶＳＮＬＥＳ（配列番号９）
ＣＤＲ３−ＱＱＳＮＥＤＰＦＴ（配列番号１０）。
【００８１】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
【化２】
2021527395.tif 000004
【００８２】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
【化３】
2021527395.tif 000005
【００８３】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
【化４】
2021527395.tif 000006
【００８４】
あるいは、上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを含み得る
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１−ＳＹＷＩＥ（配列番号１４）；
ＣＤＲ２−ＥＩＬＰＧＧＧＤＴＮＹＮＥＩＦＫＧ（配列番号１５）
ＣＤＲ３−ＲＶＰＶＹＦＤＹ（配列番号１６）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１−ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＦＬＮ（配列番号１７）；
ＣＤＲ２−ＡＡＳＮＬＥＳ（配列番号１８）
ＣＤＲ３−ＱＱＳＮＥＤＰＬＴ（配列番号１９）。
【００８５】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
【化５】
2021527395.tif 000007
【００８６】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
【化６】
2021527395.tif 000008
【００８７】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
【化７】
2021527395.tif 000009
【００８８】
あるいは、上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを含み得る
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１−ＳＹＷＩＥ（配列番号１４）；
ＣＤＲ２−ＥＩＬＰＧＧＧＤＴＮＹＮＥＩＦＫＧ（配列番号１５）
ＣＤＲ３−ＲＶＰＩＲＬＤＹ（配列番号２３）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１−ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＦＬＮ（配列番号１７）；
ＣＤＲ２−ＡＡＳＮＬＥＳ（配列番号１８）
ＣＤＲ３−ＱＱＳＮＥＤＰＬＴ（配列番号１９）。
【００８９】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
【化８】
2021527395.tif 000010
【００９０】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
【化９】
2021527395.tif 000011
【００９１】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
【化１０】
2021527395.tif 000012
【００９２】
あるいは、上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを含み得る
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１−ＳＹＷＩＥ（配列番号１４）；
ＣＤＲ２−ＥＩＬＰＧＧＧＤＴＮＹＮＥＩＦＫＧ（配列番号１５）
ＣＤＲ３−ＲＶＰＩＲＬＤＹ（配列番号２３）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１−ＫＡＳＱＳＶＤＹＥＧＤＳＦＬＮ（配列番号２６）；
ＣＤＲ２−ＡＡＳＮＬＥＳ（配列番号１８）
ＣＤＲ３−ＱＱＳＮＥＤＰＬＴ（配列番号１９）。
【００９３】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
【化１１】
2021527395.tif 000013
【００９４】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
【化１２】
2021527395.tif 000014
【００９５】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
【化１３】
2021527395.tif 000015
【００９６】
あるいは、上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを含み得る
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１−ＳＹＷＩＥ（配列番号１４）；
ＣＤＲ２−ＥＩＬＰＧＧＧＤＴＮＹＮＥＩＦＫＧ（配列番号１５）
ＣＤＲ３−ＲＶＰＩＲＬＤＹ（配列番号２３）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１−ＫＡＳＱＳＶＤＹＳＧＤＳＦＬＮ（配列番号２９）；
ＣＤＲ２−ＡＡＳＮＬＥＳ（配列番号１８）  
ＣＤＲ３−ＱＱＳＮＥＤＰＬＴ（配列番号１９）。
【００９７】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
【化１４】
2021527395.tif 000016
【００９８】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
【化１５】
2021527395.tif 000017
【００９９】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
【化１６】
2021527395.tif 000018
【０１００】
あるいは、上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを含み得る
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１−ＳＹＷＩＥ（配列番号１４）；
ＣＤＲ２−ＥＩＬＰＧＧＧＤＴＮＹＮＥＩＦＫＧ（配列番号１５）
ＣＤＲ３−ＲＶＰＶＹＦＤＹ（配列番号１６）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１−ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＦＬＮ（配列番号１７）；
ＣＤＲ２−ＡＡＳＮＬＥＳ（配列番号１８）  
ＣＤＲ３−ＱＱＳＮＥＤＰＬＴ（配列番号１９）。
【０１０１】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
【化１７】
2021527395.tif 000019
【０１０２】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
【化１８】
2021527395.tif 000020
【０１０３】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
【化１９】
2021527395.tif 000021
【０１０４】
あるいは、上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを含み得る
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１−ＳＹＷＩＥ（配列番号１４）；
ＣＤＲ２−ＥＩＬＰＧＧＧＤＴＮＹＮＥＩＦＫＧ（配列番号１５）
ＣＤＲ３−ＲＶＰＩＲＬＤＹ（配列番号２３）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１−ＫＡＳＱＳＶＤＹＥＧＤＳＦＬＮ（配列番号２６）；
ＣＤＲ２−ＡＡＳＮＬＥＳ（配列番号１８）  
ＣＤＲ３−ＱＱＳＮＥＤＰＬＴ（配列番号１９）。
【０１０５】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
【化２０】
2021527395.tif 000022
【０１０６】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
【化２１】
2021527395.tif 000023
【０１０７】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
【化２２】
2021527395.tif 000024
【０１０８】
あるいは、上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを含み得る
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１−ＮＹＧＭＮ（配列番号１０７）；
ＣＤＲ２−ＲＩＹＰＧＳＧＳＴＮＹＱＫＦＫＧ（配列番号１０８）  
ＣＤＲ３−ＹＡＭＤＹ（配列番号３５）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１−ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号１０９）；
ＣＤＲ２−ＫＶＳＮＲＰＳ（配列番号１１０）
ＣＤＲ３−ＦＱＧＳＨＶＰＷＴ（配列番号１１１）。
【０１０９】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
【化２３】
2021527395.tif 000025
【０１１０】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
【化２４】
2021527395.tif 000026
【０１１１】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
【化２５】
2021527395.tif 000027
【０１１２】
あるいは、上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを含み得る
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１−ＧＦＴＦＳＮＡＡ（配列番号１１３）；
ＣＤＲ２−ＩＲＴＫＰＮＮＹＡＴ（配列番号１１４）
ＣＤＲ３−ＴＹＹＤＧＳＳＹＡＭＤＡ（配列番号１１５）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１−ＱＳＬＥＹＳＤＧＹＴＹ（配列番号１１６）；
ＣＤＲ２−ＥＶＳ  配列番号
ＣＤＲ３−ＦＱＡＴＨＤＰＹＴ（配列番号１１７）。
【０１１３】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
【化２６】
2021527395.tif 000028
【０１１４】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
【化２７】
2021527395.tif 000029
【０１１５】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
【化２８】
2021527395.tif 000030
【０１１６】
あるいは、上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを含み得る
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１−ＧＦＴＦＳＨＴＡ（配列番号１２１）；
ＣＤＲ２−ＩＲＩＱＰＫＮＹＡＴ（配列番号１２２）
ＣＤＲ３−ＴＡＡＧＦＧＦＤＹ（配列番号１２３）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１−ＱＳＬＥＹＳＤＧＮＴＹ（配列番号１２４）；
ＣＤＲ２−ＥＶＳ  配列番号
ＣＤＲ３−ＬＱＡＴＨＤＰＦＴ（配列番号１２５）。
【０１１７】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
【化２９】
2021527395.tif 000031
【０１１８】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
【化３０】
2021527395.tif 000032
【０１１９】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
【化３１】
2021527395.tif 000033
【０１２０】
あるいは、上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを含み得る
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１−ＧＦＴＦＳＮＡＡ（配列番号１１３）；
ＣＤＲ２−ＩＲＴＫＰＮＮＹＡＴ（配列番号１１４）
ＣＤＲ３−ＴＡＤＧＧＹＧＦＤＹ（配列番号１２９）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１−ＱＳＬＥＹＳＤＧＹＴＹ（配列番号１１６）；
ＣＤＲ２−ＥＶＳ  配列番号
ＣＤＲ３−ＦＱＧＴＨＤＰＹＴ（配列番号１３０）。
【０１２１】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
【化３２】
2021527395.tif 000034
【０１２２】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
【化３３】
2021527395.tif 000035
【０１２３】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
【化３４】
2021527395.tif 000036
【０１２４】
あるいは、上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを含み得る
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１−ＧＦＴＦＳＮＡＡ（配列番号１１３）；
ＣＤＲ２−ＩＲＴＫＰＮＮＹＡＴ（配列番号１１４）
ＣＤＲ３−ＴＹＹＤＧＳＳＹＡＭＤＡ（配列番号１１５）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１−ＱＳＬＥＹＳＤＧＹＴＹ（配列番号１１６）；
ＣＤＲ２−ＥＩＳ  配列番号
ＣＤＲ３−ＦＱＡＴＨＤＰＹＴ（配列番号１１７）。
【０１２５】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
【化３５】
2021527395.tif 000037
【０１２６】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
【化３６】
2021527395.tif 000038
【０１２７】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
【化３７】
2021527395.tif 000039
【０１２８】
あるいは、上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを含み得る
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１−ＧＦＴＦＳＮＴＡ（配列番号１３６）；
ＣＤＲ２−ＩＲＩＱＰＫＮＹＡＴ（配列番号１２２）
ＣＤＲ３−ＴＡＡＧＦＧＦＤＹ（配列番号１２３）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１−ＱＲＬＥＹＳＤＧＮＴＹ（配列番号１３７）；
ＣＤＲ２−ＥＶＳ  配列番号
ＣＤＲ３−ＬＱＡＴＨＤＰＦＴ（配列番号１２５）。
【０１２９】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
【化３８】
2021527395.tif 000040
【０１３０】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
【化３９】
2021527395.tif 000041
【０１３１】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
【化４０】
2021527395.tif 000042
【０１３２】
あるいは、上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを含み得る
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１−ＧＦＴＦＳＳＡＡ（配列番号１４１）；
ＣＤＲ２−ＩＲＴＫＰＮＮＹＡＴ（配列番号１１４）
ＣＤＲ３−ＴＹＹＤＧＳＳＹＡＭＤＡ（配列番号１１５）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１−ＱＳＬＥＹＳＤＧＹＴＹ（配列番号１１６）；
ＣＤＲ２−ＥＶＳ  配列番号
ＣＤＲ３−ＦＱＡＴＨＤＰＹＴ（配列番号１１７）。
【０１３３】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
【化４１】
2021527395.tif 000043
【０１３４】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
【化４２】
2021527395.tif 000044
【０１３５】
上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
【化４３】
2021527395.tif 000045
【０１３６】
１またはこれより多くの変異（置換、付加または欠失）を、ＣＤ７９結合活性に負の影響を及ぼすことなく、各ＣＤＲに導入することは可能であり得る。各ＣＤＲは、例えば、１個、２個または３個のアミノ酸変異を有し得る。
【０１３７】
上記ＣＤＲは、ヒト抗体またはｓｃＦｖのフレームワーク上にグラフト化され得る。
【０１３８】
本発明のＣＡＲは、ＣＤ７９に特異的に結合するｄＡｂを含み得る。
【０１３９】
用語「ｄＡｂ」、「ＶＨＨ」、「ドメイン抗体（ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「ナノボディー（ｎａｎｏｂｏｄｙ）」とは、本発明の状況において区別せずに使用される。
【０１４０】
本発明のＣＡＲは、ＣＤ７９に特異的に結合するＦａｂを含み得る。上記Ｆａｂフラグメントは、例えば、モノクローナル抗体に由来する（図２ａを参照のこと）。得られるＦａｂＣＡＲは、２つの鎖を含む：一方は、抗体様軽鎖可変領域（ＶＬ）および定常領域（ＣＬ）を有する；一方は、重鎖可変領域（ＶＨ）および定常領域（ＣＨ）を有する。１つの鎖はまた、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。上記ＣＬとＣＨとの間の会合は、レセプターのアセンブリを引き起こす。
【０１４１】
Ｆａｂ  ＣＡＲの２つの鎖は、以下の一般構造を有し得る：
ＶＨ−ＣＨ−スペーサー−膜貫通ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメイン；および
ＶＬ−ＣＬ
または
ＶＬ−ＣＬ−スペーサー−膜貫通ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメイン；および
ＶＨ−ＣＨ
【０１４２】
本明細書で記載されるＦａｂタイプのキメラレセプターに関して、上記抗原結合ドメインは、１つのポリペプチドの鎖からのＶＨおよび別のポリペプチド鎖からのＶＬから構成される。
【０１４３】
上記ポリペプチド鎖は、ＶＨ／ＶＬドメインとＣＨ／ＣＬドメインとの間にリンカーを含み得る。上記リンカーは、可撓性であり得、ＶＨ／ＶＬドメインをＣＨ／ＣＬドメインから空間的に分離するように働き得る。
【０１４４】
可撓性リンカーは、小さな非極性残基（例えば、グリシン、スレオニンおよびセリン）から構成され得る。上記リンカーは、グリシン−セリンリンカーの１またはこれより多くの反復（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカー（配列番号１１２）、ここでｎは反復回数である）を含み得る。上記または各リンカーは、長さが５０、４０、３０、２０または１０未満のアミノ酸であり得る。
【０１４５】
ヒトには２タイプの軽鎖：カッパ（κ）鎖およびラムダ（λ）鎖が存在する。上記λクラスは、４つのサブタイプを有する：λ１、λ２、λ３およびλ４。Ｆａｂタイプキメラレセプターの軽鎖定常領域は、これらの軽鎖タイプのうちのいずれかに由来し得る。
【０１４６】
本発明のキメラレセプターの軽鎖定常ドメインは、κ鎖定常ドメインである、配列番号３９として示される配列を有し得る。
【化４４】
2021527395.tif 000046
【０１４７】
哺乳動物免疫グロブリン重鎖は５つのタイプ：γ、δ、α、μおよびεが存在し、これらは、それぞれ、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥのクラスを規定する。重鎖γ、δおよびαは、３つのタンデムＩｇドメインから構成される定常ドメインを有し、可撓性付加のためのヒンジを有する。重鎖μおよびεは、４つのドメインから構成される。
【０１４８】
本発明のＦａｂタイプキメラレセプターのＣＨドメインは、γ免疫グロブリン重鎖に由来する、配列番号４０として示される配列を含み得る。
【化４５】
2021527395.tif 000047
【０１４９】
本発明はまた、本発明の範囲内に入る、本明細書において同定された抗原結合ドメインの配列の改変体を使用することを企図する。本明細書で使用される場合、用語「改変体」または「機能的改変体」とは、その同族抗原に結合するその能力（すなわち、その親和性および／または特異性／選択性）を実質的に維持する、実質的に類似の配列に言及する。抗原結合ドメインの改変体は、１またはこれより多くのアミノ酸の付加、欠失または置換を含む、本明細書で同定されたポリペプチド配列誘導体であり得る。抗体の置換変異誘発のための最も目的の部位は、超可変領域を含むが、フレームワーク変化も企図される。本発明によれば、配列番号５〜３８および１１３〜１４４のうちの１つに示されるアミノ酸配列を含む抗原結合ドメインの改変体は、配列番号５〜３８および１１３〜１４４のうちの１つに示される相当するアミノ酸配列と少なくともおよそ８０％の配列同一性、好ましくは、配列番号５〜３８および１１３〜１４４のうちの１つに示される相当するアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗原結合ドメインを含む。改変体が、抗原結合ドメインのＮ末端、またはＣ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方において、少なくとも１個のアミノ酸、または少なくとも２個のアミノ酸、または少なくとも３個のアミノ酸、または少なくとも４個のアミノ酸、または少なくとも５個のアミノ酸、またはより多くのアミノ酸からなる付加を含むことも企図される。同様に、改変体が、抗原結合ドメインのＮ末端、またはＣ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方において、少なくとも１個のアミノ酸、または少なくとも２個のアミノ酸、または少なくとも３個のアミノ酸、または少なくとも４個のアミノ酸、または少なくとも５個のアミノ酸、またはより多くのアミノ酸からなる欠失を含むことも企図される。本発明に従う抗体の機能的改変体は、好ましくは、上記抗原結合ドメインのその同族標的に結合する能力の、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を有する。２つのポリペプチド配列間の同一性パーセンテージは、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいて無料で利用可能であるＢＬＡＳＴのようなプログラムによって容易に決定され得る。
【０１５０】
１．３．  スペーサードメイン
ＣＡＲは、上記抗原結合ドメインを上記膜貫通ドメインと接続し、上記抗原結合ドメインを上記エンドドメインから空間的に分離するためにスペーサー配列を含む。可撓性スペーサーは、上記抗原結合ドメインが、異なる方向に配向して、結合を容易にすることを可能にする。
【０１５１】
本発明のＣＡＲにおいて、上記スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはヒトＣＤ８ストークまたはマウスＣＤ８ストークを含み得る。上記スペーサーは、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと類似の長さおよび／またはドメインスペーシング特性を有する代替のリンカー配列を代わりに含み得る。ヒトＩｇＧ１スペーサーは、Ｆｃ結合モチーフを除去するために変化され得る。上記スペーサーは、例えば、ＷＯ２０１６／１５１３１５に記載されるように、コイルドコイルドメインを含み得る。
【０１５２】
本発明のＣＡＲは、配列番号４１〜４５として示される配列から選択される配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその改変体を含み得る。
【化４６】
2021527395.tif 000048
【化４７】
2021527395.tif 000049
【０１５３】
１．４．  膜貫通ドメイン
上記膜貫通ドメインは、膜にまたがるＣＡＲの配列である。
【０１５４】
膜貫通ドメインは、膜の中で熱力学的に安定である任意のタンパク質構造であり得る。これは、代表的には、いくつかの疎水性残基から構成されるαヘリックスである。任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインは、本発明の膜貫通部分を供給するために使用され得る。タンパク質の膜貫通ドメインの存在および範囲は、ＴＭＨＭＭアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）を使用して、当業者によって決定され得る。さらに、タンパク質の膜貫通ドメインが比較的単純な構造である、すなわち、ポリペプチド配列が、上記膜にまたがる十分な長さの疎水性αヘリックスを形成すると推測されることを考慮すると、人工的にデザインされたＴＭドメインがまた、使用され得る（ＵＳ  ７０５２９０６  Ｂ１は、合成膜貫通構成要素を記載する）。
【０１５５】
上記膜貫通ドメインは、良好なレセプター安定性を与える、ＣＤ２８、ＣＤ８ａまたはＴＹＲＰ−１に由来し得る。
【０１５６】
ある実施形態において、上記膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａに由来する。
配列番号４６：  ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン
ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴ
【０１５７】
別の実施形態において、上記膜貫通ドメインは、ＴＹＲＰ−１に由来する。
配列番号４７：  ＴＹＲＰ−１  膜貫通ドメイン
ＩＩＡＩＡＶＶＧＡＬＬＬＶＡＬＩＦＧＴＡＳＹＬＩ
【０１５８】
１．５．  エンドドメイン
エンドドメインは、ＣＡＲのシグナル伝達部分である。抗原認識後に、レセプタークラスター、天然のＣＤ４５およびＣＤ１４８は、シナプスから排除され、シグナルが細胞へと伝達される。最も一般に使用されるエンドドメイン構成要素は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３ζのものである。これは、抗原が結合された後に、活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＤ３ζは、完全に能力のある活性化シグナルを提供しなくてもよく、さらなる共刺激シグナル伝達が必要とされてもよい。共刺激ドメインの例としては、増殖／生存シグナルを伝達するためにＣＤ３ζとともに使用され得る、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、およびＩＣＯＳに由来するエンドドメインが挙げられる。
【０１５９】
ある実施形態において、少なくとも１つの共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζとともに使用される。特定の実施形態において、上記共刺激エンドドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、およびＩＣＯＳに由来するエンドドメインからなる群より選択される。
【０１６０】
別の実施形態において、少なくとも２つの共刺激エンドドメインは、ＣＤ３ζとともに使用される。特定の実施形態において、上記２つの共刺激エンドドメインは、任意の組み合わせおよび順序において、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、およびＩＣＯＳに由来するエンドドメインからなる群より選択される。特に適した組み合わせとしては、ＣＤ２８およびＣＤ３ζに由来するエンドドメイン、ＯＸ４０およびＣＤ３ζのエンドドメイン、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζのエンドドメイン、ＣＤ２８、ＯＸ４０およびＣＤ３ζに由来するエンドドメイン、ならびにＣＤ２８、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζに由来するエンドドメインが挙げられる。
【０１６１】
活性化エンドドメインを有するＣＡＲの膜貫通ドメインおよび細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）は、配列番号４８〜５２として示される配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその改変体を含み得る。
【化４８】
2021527395.tif 000050
【化４９】
2021527395.tif 000051
【０１６２】
改変体配列は、配列番号４８〜５２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得るが、ただし上記配列は、有効な膜貫通ドメインおよび有効な細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを提供する。
【０１６３】
３．ロジックゲート
本発明のＣＡＲは、１またはこれより多くの他の活性キメラ抗原レセプターまたは阻害キメラ抗原レセプターとの組み合わせにおいて使用され得る。例えば、それらは、「ロジックゲート（ｌｏｇｉｃ−ｇａｔｅ）」において１またはこれより多くの他のＣＡＲとの組み合わせ、細胞、例えばＴ細胞によって発現される場合、少なくとも２つの標的抗原の発現の特定のパターンを検出し得るＣＡＲ組み合わせにおいて使用され得る。上記少なくとも２つの標的抗原が、抗原Ａおよび抗原Ｂとして任意に示されるとすると、３つの考えられる選択肢は、以下のとおりである：
「ＯＲゲート（ＯＲ  ＧＡＴＥ）」−Ｔ細胞は、抗原Ａまたは抗原Ｂのいずれかが標的細胞上に存在する場合に誘発する。
「ＡＮＤゲート（ＡＮＤ  ＧＡＴＥ）」−Ｔ細胞は、抗原Ａおよび抗原Ｂの両方が標的細胞に存在する場合にのみ誘発する。
「ＡＮＤ  ＮＯＴゲート（ＡＮＤ  ＮＯＴ  ＧＡＴＥ）」−Ｔ細胞は、抗原Ａが標的細胞に単独で存在する場合に誘発するが、抗原Ａおよび抗原Ｂの両方が標的細胞に存在する場合には誘発しない。
【０１６４】
これらのＣＡＲ組み合わせを発現する操作されたＴ細胞は、がん細胞の２またはこれより多くのマーカーの特定の発現（または発現の欠如）に基づいて、がん細胞に精巧に特異的であるように調整され得る。
【０１６５】
このような「ロジックゲート」は、例えば、ＷＯ２０１５／０７５４６９、ＷＯ２０１５／０７５４７０およびＷＯ２０１５／０７５４７０に記載される。
【０１６６】
「ＯＲゲート」は、２またはこれより多くの活性ＣＡＲ（各々、標的細胞によって発現される別個の標的抗原に指向される）を含む。ＯＲゲートの利点は、有効な標的化可能な抗原が、効果的に抗原Ａ＋抗原Ｂ、必要に応じて、＋抗原Ｃなどであることから、標的細胞上で増大されることである。これは、標的細胞上で変動するかまたは低い密度で発現される抗原にとっては特に重要である。なぜなら単一の抗原のレベルは、ＣＡＲ−Ｔ細胞による有効な標的化に必要とされる閾値を下回り得るからである。また、ＯＲゲートは、抗原エスケープの現象を防止する。例えば、いくつかのリンパ腫および白血病は、ＣＤ１９標的化後にＣＤ１９陰性になる：別の抗原との組み合わせにおいてＣＤ１９を標的化するＯＲゲートを使用すると、これが起こった場合に、「バックアップ」抗原が提供される。
【０１６７】
ＯＲゲートにおけるＣＡＲの各々は、独立して、Ｔ細胞を活性化し得る。上記Ｔ細胞は、このようにして、いずれかの抗原単独の存在によって活性化される。上記２またはこれより多くのＣＡＲは、両方のＣＡＲの活性化が、活性化および共刺激シグナルを提供するために必要であるという意味において、「補完的」ではない。
【０１６８】
本発明のＣＤ７９に特異的に結合するＣＡＲは、標的細胞によって発現される第２の標的抗原に対する第２のＣＡＲと組み合わせて、ＯＲゲートにおいて使用され得る。
【０１６９】
抗ＣＤ７９  ＣＡＲに関して、上記ＯＲゲートは、Ｂ細胞において発現される第２の抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２、好ましくはＣＤ１９およびＣＤ２２）に対するＣＡＲを含み得る。
【０１７０】
上記第２のＣＡＲは、任意の適切な抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ、ｄＡｂまたはＦａｂに基づく結合ドメインを有し得る。
【０１７１】
上記第２のＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインから空間的に分離し、ある程度の可撓性を提供するためにスペーサーを含み得る。種々の配列が、ＣＡＲのスペーサーとして一般に使用される（例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはヒトＣＤ８ストーク（上記のとおり））。上記スペーサーは、例えば、ＷＯ２０１６／１５１３１５に記載されるように、コイルドコイルドメインを含み得る。
【０１７２】
上記第２のＣＡＲは、活性化エンドドメインを含む。それは、例えば、ＣＤ３ζに由来するエンドドメインを含み得る。それは、上記に記載されるとおりの１またはこれより多くの共刺激ドメインを含み得る。例えば、それは、ＣＤ２８、ＯＸ−４０または４−１ＢＢに由来するエンドドメインを含み得る。
【０１７３】
本発明のＣＡＲは、第２の抗原に対する第２のＣＡＲおよび標的細胞によって発現される第３の抗原に対する第３のＣＡＲを含む、三重ＯＲゲートにおいて使用され得る。上記第２のＣＡＲおよび第３のＣＡＲは、独立して、任意の適切な抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ、ｄＡｂまたはＦａｂに基づく結合ドメインを有し得る。
【０１７４】
抗ＣＤ７９  ＣＡＲに関して、三重ＯＲゲートは、ＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２、好ましくはＣＤ１９およびＣＤ２２のような、Ｂ細胞において発現される第２のおよび第３の抗原に対するＣＡＲを含み得る。
【０１７５】
特に、本発明は、以下を含む三重ＯＲゲートを提供する：
（ｉ）抗ＣＤ７９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ；
（ｉｉ）抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ；および
（ｉｉｉ）抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ（図３ｂを参照のこと）。
【０１７６】
特に、本発明は、以下を含む三重ＯＲゲートを提供する：
（ｉ）抗ＣＤ７９  ｄＡｂ  ＣＡＲ；
（ｉｉ）抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ；および
（ｉｉｉ）抗ＣＤ２２  ＦａｂＣＡＲ（図４ｂを参照のこと）。
【０１７７】
３．１．  ＣＤ７９結合因子
ＣＤ７９に特異的な結合因子は、本発明のＣＡＲの状況において記載され、それらの特定の好ましい特徴は、ロジックゲートの状況において等しくあてはまる。
【０１７８】
３．２．  ＣＤ１９結合因子
いくつかの抗ＣＤ１９抗体は、ｆｍｃ６３、４Ｇ７、ＳＪ２５Ｃ１、ＣＡＴ１９（ＷＯ２０１６／１３９４８７に記載されるとおり）およびＣＤ１９ＡＬＡｂ（ＷＯ２０１６／１０２９６５に記載されるとおり）のような、ＣＡＲ形式において以前に記載されている。
【０１７９】
本発明の二重または三重ＯＲゲートにおける使用のための抗ＣＤ１９  ＣＡＲは、これらの抗ＣＤ１９抗体のうちの１つに由来する抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖタイプ抗原結合ドメイン）を含み得る。
【０１８０】
上記ＣＤ１９−結合ドメインは、以下を含み得る：
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１−ＧＹＡＦＳＳＳ（配列番号５３）；
ＣＤＲ２−ＹＰＧＤＥＤ（配列番号５４）
ＣＤＲ３−ＳＬＬＹＧＤＹＬＤＹ（配列番号５５）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１−ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号５６）；
ＣＤＲ２−ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号５７）
ＣＤＲ３−ＱＱＷＮＩＮＰＬＴ（配列番号５８）。
【０１８１】
１またはこれより多くの変異（置換、付加または欠失）をＣＤ１９結合活性に負の影響を及ぼすことなく、各ＣＤＲに導入することは、可能であり得る。各ＣＤＲは、例えば、１個、２個または３個のアミノ酸変異を有し得る。
【０１８２】
上記ＣＤＲは、１０〜約２５アミノ酸残基の短いリンカーペプチドで接続された、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質である１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の形式にあり得る。上記ｓｃＦｖは、配向ＶＨ−ＶＬにあり得る。すなわち、上記ＶＨは、ＣＡＲ分子のアミノ末端にあり、上記ＶＬドメインは、スペーサーに、次に、膜貫通ドメインおよびエンドドメインに連結される。
【０１８３】
上記ＣＤＲは、ヒト抗体またはｓｃＦｖのフレームワーク上にグラフト化され得る。例えば、本発明のＣＡＲは、以下の配列のうちの１つからなるかまたは含むＣＤ１９−結合ドメインを含み得る。
【０１８４】
上記抗ＣＤ１９  ＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：
【化５０】
2021527395.tif 000052
【０１８５】
上記抗ＣＤ１９  ＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：
【化５１】
2021527395.tif 000053
【０１８６】
上記抗ＣＤ１９  ＣＡＲは、以下のｓｃＦｖ配列を含み得る：
【化５２】
2021527395.tif 000054
【０１８７】
あるいは、上記抗ＣＤ１９  ＣＡＲは、以下を含む抗原結合ドメインを含み得る
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１−ＳＹＷＭＮ（配列番号６２）；
ＣＤＲ２−ＱＩＷＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫ（配列番号６３）
ＣＤＲ３−ＲＥＴＴＴＶＧＲＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号６４）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１−ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮ（配列番号６５）；
ＣＤＲ２−ＤＡＳＮＬＶＳ（配列番号６６）
ＣＤＲ３−ＱＱＳＴＥＤＰＷＴ（配列番号６７）。
【０１８８】
１またはこれより多くの変異（置換、付加または欠失）を、ＣＤ１９結合活性に負の影響を及ぼすことなく、上記または各ＣＤＲに導入することは可能であり得る。各ＣＤＲは、例えば、１個、２個または３個のアミノ酸変異を有し得る。
【０１８９】
本発明のＣＡＲは、以下のアミノ酸配列のうちの１つを含み得る：
【化５３】
2021527395.tif 000055
【０１９０】
上記ｓｃＦｖは、ＶＨ−ＶＬ配向（配列番号６８、６９および７０に示されるとおり）またはＶＬ−ＶＨ配向にあり得る。
【０１９１】
本発明のＣＡＲは、以下のＶＨ配列のうちの１つを含み得る：
【化５４】
2021527395.tif 000056
【０１９２】
抗ＣＤ１９  ＣＡＲは、以下のＶＬ配列のうちの１つを含み得る：
【化５５】
2021527395.tif 000057
【０１９３】
上記ＣＡＲは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する、配列番号６８〜７５として示される配列の改変体を含み得るが、ただし上記改変体配列は、ＣＤ１９に結合する能力を保持する（適切であれば、相補的なＶＬまたはＶＨドメインとともにある場合）。
【０１９４】
２つのポリペプチド配列間の同一性パーセンテージは、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいて無料で入手可能なＢＬＡＳＴのようなプログラムによって容易に決定され得る。
【０１９５】
３．３．  ＣＤ２２結合因子
ＣＤ２２は、Ｉｇドメイン１〜Ｉｇドメイン７として一般に同定される７つの細胞外ＩｇＧ様ドメインを有し、Ｉｇドメイン７は、Ｂ細胞膜に最も近位にあり、Ｉｇドメイン１は、Ｉｇ細胞膜から最も遠位にある。
【０１９６】
ＣＤ２２のアミノ酸配列（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ２０２７３）に関するＩｇドメインの位置は、以下の表にまとめられる：
【表３】
2021527395.tif 000058
【０１９７】
ｍ９７１、ＨＡ２２およびＢＬ２２  ｓｃＦｖに由来する抗原結合ドメインを有する抗ＣＤ２２  ＣＡＲの例は、Ｈａｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｌｏｏｄ；  ２０１３；  １２１（７））によって記載される。抗体ＨＡ２２およびＢＬ２２は、ＣＤ２２のＩｇドメイン５上のエピトープに結合する。
【０１９８】
他の抗ＣＤ２２抗体が公知である（例えば、マウス抗ヒトＣＤ２２抗体１Ｄ９−３、３Ｂ４−１３、７Ｇ６−６、６Ｃ４−６、４Ｄ９−１２、５Ｈ４−９、１０Ｃ１−Ｄ９、１５Ｇ７−２、２Ｂ１２−８、２Ｃ４−４および３Ｅ１０−７；ならびにヒト化抗ヒトＣＤ２２抗体ＬＴ２２およびイノツズマブ（Ｇ５＿４４））。表１は、ＶＨ配列、ＶＬ配列およびＣＤＲ配列（太字および下線）、ならびに各抗体に関するＣＤ２２上の標的エプトープの位置をまとめる。
表１
【表１Ａ−１】
2021527395.tif 000059
【表１Ａ−２】
2021527395.tif 000060
【表１Ａ−３】
2021527395.tif 000061
【表１Ａ−４】
2021527395.tif 000062
【表１Ａ−５】
2021527395.tif 000063
【０１９９】
ＣＤ２２に結合するＦａｂＣＡＲの抗原結合ドメインは、表１に列挙されるＣＤ２２抗体のうちのいずれかに由来するＶＨおよび／もしくはＶＬ配列、または少なくとも７０％、８０％、９０％または９０％の配列同一性を有するその改変体（その改変体は、ＣＤ２２に結合する能力を保持する）を含み得る。
【０２００】
４．  核酸
本発明はまた、本発明のＣＡＲをコードする核酸配列を提供する。
【０２０１】
本発明のＣＡＲが、例えば、ｓｃＦｖまたはｄＡｂ抗原結合ドメインを有する場合、本発明のＣＡＲをコードする核酸配列は、以下の配列を含み得る：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１
ここで
−  ＡｇＢは、上記ＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
−  スペーサーは、上記ＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
−  ＴＭは、上記ＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
−  ｅｎｄｏは、上記ＣＡＲの細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列である。
【０２０２】
４ｂ．  核酸構築物
本発明はまた、必要に応じて別のポリペプチド（例えば、別のＣＡＲ）といっしょに本発明のＣＡＲをコードする核酸構築物を提供する。
【０２０３】
例えば、本発明のＣＡＲがＦａｂ抗原結合ドメインを有する場合、上記ＣＡＲをコードする核酸構築物は、以下の構造を有し得る：  
ＶＨ−ＣＨ−スペーサー−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＬ−ＣＬまたは
ＶＬ−ＣＬ−スペーサー−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＶＨ−ＣＨ
ここで：
−  ＶＨは、重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
−  ＣＨは、重鎖定常領域をコードする核酸配列であり
−  スペーサーは、スペーサーをコードする核酸であり；
−  ＴＭは、膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
−  ｅｎｄｏは、エンドドメインをコードする核酸配列であり；
−  ｃｏｅｘｐｒは、上記第１のおよび第２のポリペプチドの共発現を可能にする核酸配列であり；
−  ＶＬは、軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；そして
−  ＣＬは、軽鎖定常領域をコードする核酸配列である。
【０２０４】
上述の構造の両方に関して、上記２つのポリペプチドをコードする核酸配列は、上記構築物においていずれかの順序にあり得る。
【０２０５】
上記ＣＡＲの抗原結合ドメイン、スペーサー、膜貫通ドメインおよび細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインの詳細は、本発明のＣＡＲの状況において記載され、本発明のＣＡＲをコードする核酸配列に等しくあてはまる。
【０２０６】
ＯＲゲートをコードする核酸構築物がまた、提供され、この構築物は、２またはこれより多くの（ｔｗｏ  ｏｆ  ｍｏｒｅ）ＣＡＲ（そのうちの少なくとも１つは、本発明に従うＣＡＲである）を含む。
【０２０７】
二重ＯＲゲートをコードする核酸構築物は、以下の構造を有し得る：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１−ｃｏｅｘｐｒ−ＡｂＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２
ここで：
−  ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり、ここで上記第１のＣＡＲは、本発明に従うＣＡＲであり；
−  スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
−  ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
−  ｅｎｄｏ１は、第１のＣＡＲの細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列であり；
−  ｃｏｅｘｐｒは、両方のＣＡＲの共発現を可能にする核酸配列であり
−  ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
−  スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
−  ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
−  ｅｎｄｏ２は、第２のＣＡＲの細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列である。
【０２０８】
上記抗原結合ドメインＡｇＢ１は、Ｆａｂであってもよく、上記ＣＡＲをコードする核酸構築物は、以下の構造を有していてもよい：  
ＶＨ−ＣＨ−スペーサー１−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１−ｃｏｅｘｐｒ１−ＶＬ−ＣＬ−ｃｏｅｘｐｒ２−ＡｇＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２；または
ＶＬ−ＣＬ−スペーサー−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１−ｃｏｅｘｐｒ１−ＶＨ−ＣＨ−ｃｏｅｘｐｒ２−ＡｇＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２
ここで：
−  ＶＨは、第１のＣＡＲの重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
−  ＣＨは、第１のＣＡＲの重鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
−  スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
−  ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
−  ｅｎｄｏ１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
−  ｃｏｅｘｐｒ１およびｃｏｅｘｐｒ２は、同じであっても異なっていてもよく、第１のＣＡＲの第１のおよび第２のポリペプチド；ならびに第１のおよび第２のＣＡＲの共発現を可能にする核酸配列であり；
−  ＶＬは、第１のＣＡＲの軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；  
−  ＣＬは、第１のＣＡＲの軽鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
−  ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
−  スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
−  ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；そして
−  ｅｎｄｏ２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である。
【０２０９】
上記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、例えば、ｓｃＦｖまたはｄＡｂであり得る。
【０２１０】
あるいは、上記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインＡｇＢ２は、Ｆａｂであり得る。上記第１のＣＡＲの抗原結合ドメインは、例えば、ｓｃＦｖまたはｄＡｂであり得る。上記ＣＡＲをコードする核酸構築物は、以下の構造を有し得る：  
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１−ｃｏｅｘｐｒ１−ＶＨ−ＣＨ−スペーサー２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２−ｃｏｅｘｐｒ２−ＶＬ−ＣＬ；または
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１−ｃｏｅｘｐｒ１−ＶＬ−ＣＬ−スペーサー２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２−ｃｏｅｘｐｒ２−ＶＨ−ＣＨ
ここで：
−  ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
−  スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
−  ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
−  ｅｎｄｏ１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
−  ｃｏｅｘｐｒ１およびｃｏｅｘｐｒ２は、同じであっても異なっていてもよく、第１のＣＡＲの第１のおよび第２のポリペプチド；ならびに第１のおよび第２のＣＡＲの共発現を可能にする核酸配列であり；
−  ＶＬは、第２のＣＡＲの軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；  
−  ＣＬは、第２のＣＡＲの軽鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
−  ＶＨは、第２のＣＡＲの重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
−  ＣＨは、第２のＣＡＲの重鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
−  スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
−  ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；そして
−  ｅｎｄｏ２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である。
【０２１１】
上述の４つの構造に関して、上記第１のＣＡＲの２つのポリペプチドをコードする核酸配列；ならびに上記第１のおよび第２のＣＡＲをコードする核酸配列は、上記構築物において任意の順序にあり得る。
【０２１２】
３つのＣＡＲ（そのうちの１つは、本発明に従うＣＡＲである）を含む三重ＯＲゲートをコードする核酸構築物がまた、提供される。
【０２１３】
三重ＯＲゲートをコードする核酸構築物は、以下の構造を有し得る：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１−ｃｏｅｘｐｒ１−ＶＨ−ＣＨ−スペーサー２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２−ｃｏｅｘｐｒ２−ＶＬ−ＣＬ−ｃｏｅｘｐｒ３−ＡｇＢ３−スペーサー３−ＴＭ３−ｅｎｄｏ３；または
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１−ｃｏｅｘｐｒ１−ＶＬ−ＣＬ−スペーサー２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２−ｃｏｅｘｐｒ２−ＶＨ−ＣＨ−ｃｏｅｘｐｒ３−ＡｇＢ３−スペーサー３−ＴＭ３
ここで：
−  ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
−  スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
−  ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
−  ｅｎｄｏ１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
−  ｃｏｅｘｐｒ１、ｃｏｅｘｐｒ２およびｃｏｅｘｐｒ３は、同じであっても異なっていてもよく、第２のＣＡＲの第１のおよび第２のポリペプチド；ならびに第１のおよび第３のＣＡＲの共発現を可能にする核酸配列であり；
−  ＶＬは、第２のＣＡＲの軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
−  ＣＬは、第２のＣＡＲの軽鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
−  ＶＨは、第２のＣＡＲの重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
−  ＣＨは、第２のＣＡＲの重鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
−  スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
−  ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
−  ｅｎｄｏ２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
−  ＡｇＢ３は、第３のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
−  スペーサー３は、第３のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
−  ＴＭ３は、第３のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；そして
−  ｅｎｄｏ３は、第３のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である。
【０２１４】
上記第１のおよび第３のＣＡＲの抗原結合ドメインは、例えば、ｓｃＦｖまたはｄＡｂであり得る。特に、一方のＣＡＲは、ｄＡｂ抗原結合ドメインを有していてもよく、他方は、ｓｃＦｖ抗原結合ドメインを有していてもよい。
【０２１５】
あるいは、上記第３のＣＡＲの抗原結合ドメインＡｇＢ３は、Ｆａｂであり得る。上記第１のおよび第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、例えば、ｓｃＦｖまたはｄＡｂであり得る。上記ＣＡＲをコードする核酸構築物は、以下の構造を有し得る：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１−ｃｏｅｘｐｒ１−ＡｇＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２−ｃｏｅｘｐｒ２−ＶＨ−ＣＨ−スペーサー３−ＴＭ２−ｅｎｄｏ３−ｃｏｅｘｐｒ３−ＶＬ−ＣＬ；または
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１−ｃｏｅｘｐｒ１−ＡｇＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２−ｃｏｅｘｐｒ２−ＶＬ−ＣＬ−スペーサー３−ＴＭ２−ｅｎｄｏ３−ｃｏｅｘｐｒ３−ＶＨ−ＣＨ；  
ここで：
−  ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
−  スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
−  ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
−  ｅｎｄｏ１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
−  ｃｏｅｘｐｒ１、ｃｏｅｘｐｒ２およびｃｏｅｘｐｒ３は、同じであっても異なっていてもよく、第３のＣＡＲの第１のおよび第２のポリペプチド；ならびに第１のおよび第２のＣＡＲの共発現を可能にする核酸配列であり；
−  ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
−  スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
−  ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
−  ｅｎｄｏ２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
−  ＶＬは、第３のＣＡＲの軽鎖可変領域をコードする核酸配列であり；  
−  ＣＬは、第３のＣＡＲの軽鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
−  ＶＨは、第３のＣＡＲの重鎖可変領域をコードする核酸配列であり；
−  ＣＨは、第３のＣＡＲの重鎖定常領域をコードする核酸配列であり；
−  スペーサー３は、第３のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
−  ＴＭ３は、第３のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；そして
−  ｅｎｄｏ３は、第３のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である。
【０２１６】
特に、上記構築物は、図４ａに図示されるとおりであり得る。上記構築物は、図４ｂに図示されるとおりの３つのＣＡＲ、すなわち、ＣＤ７９に対するｄＡｂ  ＣＡＲ、ＣＤ１９に対するｓｃＦｖ  ＣＡＲおよびＣＤ２２に対するＦａｂＣＡＲをコードし得る。
【０２１７】
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」とは、互いと同義語であることが意図される。
【０２１８】
多くの異なるポリヌクレオチドおよび核酸が、遺伝コードの縮重の結果として同じポリペプチドをコードし得ることは、当業者によって理解される。さらに、当業者が、慣用的技術を使用して、ここで記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を作製して、上記ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用法を反映させ得ることは、理解されるべきである。
【０２１９】
本発明の核酸配列および構築物は、相同組換えを回避するために、同じまたは類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域において代替のコドンを含み得る。
【０２２０】
本発明に従う核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。それらは、１本鎖であっても２本鎖であってもよい。それらはまた、上記核酸内に、合成ヌクレオチドまたは改変されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対する改変の多くの異なるタイプが、当該分野で公知である。これらは、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、上記分子の３’末端および／または５’末端におけるアクリジンまたはポリリジン鎖の付加を含む。本明細書で記載されるとおりの使用の目的で、上記ポリヌクレオチドが、当該分野で利用可能な任意の方法によって改変され得ることは、理解されるべきである。このような改変は、目的のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増強するために行われ得る。
【０２２１】
ヌクレオチド配列に関連して、用語「改変体」、「ホモログ」または「誘導体」は、上記配列の１個（またはこれより多くの）核酸の任意の置換、そのバリエーション、その改変、その置き換え、その欠失またはその付加を含む。
【０２２２】
上記の構造において、「ｃｏｅｘｐｒ」は、別個の実体として２つのポリペプチドの共発現を可能にする核酸配列である。それは、上記核酸構築物が、切断部位によって結合された両方のペプチドを生成するようにする、切断部位をコードする配列であり得る。上記切断部位は、上記ポリペプチドが生成される場合に、それがいかなる外部の切断活性の必要性もなしに、個々のペプチドへと直ぐに切断されるようにする、自己切断性であり得る。
【０２２３】
上記切断部位は、上記２つのポリペプチドが分離されることを可能にする任意の配列であり得る。
【０２２４】
用語「切断」とは、便宜上本明細書で使用されるが、切断部位は、ペプチドを、旧来の切断以外の機構によって個々の実体へと分離させ得る。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断ペプチド（以下を参照のこと）に関して、種々のモデルが、「切断」活性を説明するために提唱されている：宿主細胞プロテイナーゼによるタンパク質分解、自己タンパク質分解または翻訳効果（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ  （２００１）  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８２：１０２７−１０４１）。このような「切断」の正確な機構は、タンパク質をコードする核酸配列の間に配置される場合、上記切断部位が上記タンパク質を別個の実体として発現させる限りにおいて、本発明の目的にとって重要ではない。
【０２２５】
切断部位は、例えば、フリン切断部位、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断部位であり得るか、または自己切断ペプチドをコードし得る。
【０２２６】
「自己切断ペプチド」は、タンパク質および自己切断ペプチドを含むポリペプチドが生成される場合に、上記ポリペプチドが、いかなる外部の切断活性をも必要とせずに、別個のかつ不連続の第１のおよび第２のポリペプチドへと直ぐに「切断」または分離されるように機能するペプチドをいう。
【０２２７】
上記自己切断ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルスに由来する２Ａ自己切断ペプチドであり得る。アフトウイルスおよびカルジオウイルスの主要な２Ａ／２Ｂ切断は、それ自体のＣ末端における２Ａ「切断」によって媒介される。口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびウマ鼻炎Ａウイルスのようなアフトウイルスでは、２Ａ領域は、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存されたプロリン残基）と一緒に、それ自体のＣ末端において「切断」を媒介し得る自律性のエレメントを表す、約１８アミノ酸の短いセクションである（上記のＤｏｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ  （２００１））。
【０２２８】
「２Ａ様」配列は、アフトウイルスまたはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナイウルス様」昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルスならびにＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐｐ内の反復配列および細菌配列において見出されている（上記のＤｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ  （２００１））。
【０２２９】
上記切断部位は、配列番号１０４（ＲＡＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）として示される２Ａ様配列を含み得る。
【０２３０】
５．  キット
本発明はまた、キット、すなわち、核酸配列または構築物のキットを提供する。上記キットは、本発明に従うＣＡＲ、第２のＣＡＲ、および必要に応じて、ロジックゲートの状況において記載されるとおりの第３のＣＡＲをコードする１またはこれより多くの核酸配列または構築物を含む。
【０２３１】
本発明に従うキットは、以下を含み得る：
第１のＣＡＲをコードする第１の核酸配列または構築物；および
ロジックゲートの状況において規定されるとおりの第２のＣＡＲをコードする第２の核酸配列または構築物；
および必要に応じて
ロジックゲートの状況において規定されるとおりの第３のＣＡＲをコードする第３の核酸配列または構築物。
【０２３２】
上記キットは、相同組換えを回避するために、同じまたは類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域において代替のコドンを含み得る。
【０２３３】
６．  ベクター
本発明はまた、本発明に従うＣＡＲをコードする１またはこれより多くの核酸配列を含むベクター、またはベクターのキットを提供する。このようなベクターは、本発明の第１の局面に従うキメラポリペプチドを発現するように、上記核酸配列を宿主細胞へと導入するために使用され得る。
【０２３４】
上記ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）、またはトランスポゾンベースのベクターまたは合成ｍＲＮＡであり得る。
【０２３５】
上記ベクターは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞をトランスフェクトまたは形質導入することができてもよい。
【０２３６】
７．  細胞
本発明は、本発明のキメラ抗原レセプターを含む細胞を提供する。上記細胞は、２またはこれより多くのＣＡＲを含み得る。例えば、それは、上記に記載されるとおりの二重ＯＲまたは三重ＯＲゲートを含み得る。
【０２３７】
上記細胞は、本発明の核酸またはベクターを含み得る。
【０２３８】
上記細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞のような細胞溶解性免疫細胞であり得る。
【０２３９】
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の１タイプである。それらは、細胞表面上のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）の存在によって、他のリンパ球（例えば、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞））から区別され得る。以下でまとめられるように、Ｔ細胞には種々のタイプが存在する。
【０２４０】
ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）は、形質細胞およびメモリーＢ細胞へのＢ細胞の成熟化、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫学的プロセスにおいて他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、それらの表面上にＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、それらが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原とともに提示される場合に活性化される。これらの細胞は、異なるサイトカインを分泌して、免疫応答の異なるタイプを促進する、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨを含むいくつかのサブタイプのうちの１つに分化し得る。
【０２４１】
細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、またはＣＴＬ）は、ウイルス感染した細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶にも関わる。ＣＴＬは、それらの表面においてＣＤ８を発現する。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上で提示されるＭＨＣクラスＩと会合した抗原への結合によってそれらの標的を認識する。ＩＬ−１０、アデノシンおよび調節性Ｔ細胞によって分泌される他の分子を通じて、ＣＤ８＋  細胞は、アネルギー状態へと不活性化され得、実験的自己免疫脳脊髄炎のような自己免疫疾患を防止する。
【０２４２】
メモリーＴ細胞は、感染が解決した後に長期間持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、それらの同族抗原への再曝露の際に多数のエフェクターＴ細胞へと迅速に拡大し、従って、免疫系に、過去の感染に対する「メモリー」を提供する。メモリーＴ細胞は、３つのサブタイプ：セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）および２タイプのエクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。メモリーＴ細胞は、代表的には、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
【０２４３】
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）（以前は、サプレッサーＴ細胞として公知）は、免疫寛容の維持にとって極めて重要である。それらの主要な役割は、免疫反応の終了に向かってＴ細胞媒介性免疫を停止させることおよび胸腺における負の選択のプロセスを逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【０２４４】
ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞の２つの主要なクラス−天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適合性Ｔｒｅｇ細胞が記載されている。
【０２４５】
天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋  Ｔｒｅｇ細胞としても公知）は、胸腺において生じ、発生中のＴ細胞間の、ＴＳＬＰで活性化された骨髄系樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋）および形質細胞様樹状細胞（ＣＤ１２３＋）の両方との相互作用に関連している。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３といわれる細胞内分子の存在によって、他のＴ細胞から区別され得る。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異は、調節性Ｔ細胞発生を防止し得、致命的な自己免疫疾患ＩＰＥＸを引き起こし得る。
【０２４６】
適合性Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても公知）は、正常な免疫応答の間に発生し得る。
【０２４７】
上記細胞は、ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）であり得る。ＮＫ細胞は、先天的免疫系の一部を形成する。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ非依存性様式において、ウイルス感染した細胞からの先天的シグナルに対する迅速な応答を提供する。
【０２４８】
ＮＫ細胞（先天的リンパ系細胞の群に属する）は、大顆粒性リンパ球（ＬＧＬ）として規定され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生成する共通するリンパ系前駆体から分化した第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、これらが循環へと入る場所である骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺において分化および成熟することが公知である。
【０２４９】
本発明の細胞は、上述の細胞タイプのうちのいずれかであり得る。
【０２５０】
本発明の第１の局面に従うＴ細胞またはＮＫ細胞は、患者自体の末梢血（第一者）から、またはドナー末梢血に由来する造血幹細胞移植（第二者）の状況において、または関係のないドナーの末梢血（第三者）から、のいずれかでエキソビボで作製し得る。
【０２５１】
あるいは、本発明の第１の局面に従うＴ細胞またはＮＫ細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞への誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のエキソビボ分化から得られ得る。あるいは、その溶解性機能を保持し、治療剤として作用し得る不死化Ｔ細胞株が、使用され得る。
【０２５２】
全てのこれらの実施形態において、キメラポリペプチド発現細胞は、上記キメラポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを、ウイルスベクターでの形質導入、ＤＮＡもしくはＲＮＡでのトランスフェクションを含む多くの手段のうちの１つによって導入することによって生成される。
【０２５３】
本発明の細胞は、被験体に由来するエキソビボのＴ細胞またはＮＫ細胞であり得る。上記Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプルに由来し得る。Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、本発明の第１の局面に従うキメラポリペプチドを提供する分子をコードする核酸で形質導入する前に、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処理によって、活性化および／または拡大され得る。
【０２５４】
本発明のＴ細胞またはＮＫ細胞は、以下によって作製され得る：
（ｉ）Ｔ細胞またはＮＫ細胞含有サンプルの、被験体または上記に列挙した他の供給源からの単離；および
（ｉｉ）上記Ｔ細胞またはＮＫ細胞の、キメラポリペプチドをコードする１またはこれより多くの核酸配列での形質導入またはトランスフェクション。
【０２５５】
上記Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、次いで、精製され得る、例えば、抗原結合ポリペプチドの抗原結合ドメインの発現に基づいて選択され得る。
【０２５６】
８．  薬学的組成物
本発明はまた、本発明に従う複数の細胞を含む薬学的組成物に関する。
【０２５７】
上記薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。上記薬学的組成物は、必要に応じて、１またはこれより多くのさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含み得る。このような製剤は、例えば、静脈内注入に適した形態にあり得る。
【０２５８】
９．  処置方法
本発明は、本発明の細胞（例えば、上記で記載されるとおりの薬学的組成物中の）を被験体に投与する工程を包含する、疾患を処置および／または防止するための方法を提供する。
【０２５９】
疾患を処置するための方法は、本発明の細胞の治療上の使用に関する。本明細書において、上記細胞は、既存の疾患または状態を有する被験体に、上記疾患と関連する少なくとも１つの症状を減少させる、低減するもしくは改善するおよび／または上記疾患の進行を遅らせる、低減するもしくは遮断するために、投与され得る。
【０２６０】
疾患を防止するための方法は、本発明の細胞の予防上の使用に関する。本明細書において、このような細胞は、上記疾患に未だ罹っていないおよび／または上記疾患のいかなる症状をも示していない被験体に投与されて、上記疾患の原因を防止するもしくは減じるか、または上記疾患と関連する少なくとも１つの症状の発生を低減または防止し得る。上記被験体は、上記疾患の素因を有していてもよいし、上記疾患を発生させるリスクにあると考えられていてもよい。
【０２６１】
上記方法は、以下の工程を包含し得る：
（ｉ）Ｔ細胞またはＮＫ細胞含有サンプルを単離する工程；
（ｉｉ）このような細胞を、本発明によって提供される核酸配列またはベクターで形質導入するかまたはトランスフェクトする工程；
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）からの細胞を被験体に投与する工程。
【０２６２】
上記Ｔ細胞またはＮＫ細胞含有サンプルは、被験体からまたは他の供給源から、例えば、上記で記載されるように、単離され得る。上記Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、被験体自体の末梢血から（第一者）、またはドナー末梢血からの造血幹細胞移植の状況において（第二者）、または無関係のドナーからの末梢血から（第三者）、単離され得る。
【０２６３】
本発明は、疾患を処置および／または防止することにおける使用のための、本発明のＣＡＲ、核酸、キットまたはベクターを含む細胞を提供する。上記細胞は、２またはこれより多くのＣＡＲを含み得る、例えば、それは、上記で記載されるとおりの二重または三重ＯＲゲートを含み得る。
【０２６４】
本発明はまた、疾患の処置および／または防止のための医薬の製造における、本発明のＣＡＲ、核酸、キットまたはベクターを含む細胞の使用に関する。上記細胞は、２またはこれより多くのＣＡＲを含み得る、例えば、それは、上記で記載されるとおりの二重または三重ＯＲゲートを含み得る。
【０２６５】
本発明の方法によって処置および／または防止される疾患は、がん性疾患（例えば、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん（腎細胞）、白血病、肺がん、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、前立腺がんおよび甲状腺がん）であり得る。
【０２６６】
上記疾患は、多発性骨髄腫（ＭＭ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、神経芽腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）またはびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）であり得る。
【０２６７】
本発明の細胞は、標的細胞（例えば、がん細胞）を殺滅する能力があり得る。上記標的細胞は、標的細胞の近傍における腫瘍分泌リガンドまたはケモカインリガンドの存在によって特徴づけられ得る。上記標的細胞は、標的細胞表面において腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現とともに、可溶性リガンドの存在によって特徴づけられ得る。
【０２６８】
本発明の細胞および薬学的組成物は、上記の疾患の処置および／または防止における使用のためのものであり得る。
【０２６９】
本出願は、２０１８年５月１５日出願の英国出願第１８０７８７０．９号の利益を主張する。本出願は、その全体において本明細書に参考として援用される。
【０２７０】
上記の明細書中で言及される全ての刊行物は、本明細書に参考として援用される。本発明の記載される方法およびシステムの種々の改変およびバリエーションは、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は、具体的な好ましい実施形態に関連して記載されているが、特許請求されるとおりの発明が、このような具体的な実施形態に過度に限定されるべきではないことは理解されるべきである。実際に、分子生物学または関連分野の当業者に明らかな発明を実施するための記載される態様の種々の改変は、以下の請求項の範囲内にあることが意図される。
【０２７１】
本発明は、ここで実施例によってさらに記載され、この実施例は、本発明を行うにあたって当業者を助けるように働くことが意味され、本発明の範囲を限定するとは如何様にも意図されない。
【実施例】
【０２７２】
実施例１：  ＣＤ７９ａまたはＣＤ７９ｂに特異的な単一ドメイン抗体の生成
ＣＤ７９ａまたはＣＤ７９ｂに特異的な単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）を生成するために、ラマを、ＣＤ７９ａ由来またはＣＤ７９ｂ由来のペプチドおよびＤＮＡのいずれかの組み合わせで免疫化する。
【０２７３】
免疫化した動物の血清を、各免疫化の前後に単離して、上記免疫原に対する免疫応答を追跡する。
【０２７４】
約２００ｍｌの血液サンプルを、免疫化したラマから採取し、富化したリンパ球集団を、Ｆｉｃｏｌｌ不連続勾配遠心分離を介して得る。これらの細胞から、全ＲＮＡを、酸性チオシアン酸グアニジウム抽出によって単離する。第１鎖ｃＤＮＡ合成後に、重鎖可変フラグメントおよびロングまたはショートヒンジ領域の一部をコードするＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによって増幅する。単一ドメイン抗体配列の増幅したプールを、制限酵素ＰｓｔＩおよびＮｏｔＩを使用して消化し、ファージミドベクターｐＳＯＳ１１へとライゲーションする。
【０２７５】
単一ドメイン抗体ファージミドライブラリーの構築後に、抗体を、Ｍ１３Ｋ０７での感染後にファージ上で発現させる。上記ファージライブラリーを、結合因子の存在について、それぞれ、ＣＤ７９ａもしくはＣＤ７９ｂに結合体化した固相上で、または１００ｎＭ  ビオチン化ＣＤ７９ａもしくはビオチン化ＣＤ７９ｂを有する溶液中で、パニングした。
【０２７６】
パニング後、全ファージライブラリーを、全ファージＥＬＩＳＡによってＣＤ７９ａまたはＣＤ７９ｂに対する富化に関して評価する。個々のファージクローンを、特異性に関してさらにスクリーニングし、分析して、特異的単一ドメイン抗体配列を決定する。
【０２７７】
実施例２：  ＣＤ７９ａまたはＣＤ７９ｂに特異的なｄＡｂ  ＣＡＲの生成
実施例１に記載されるように、４１ＢＢおよびＣＤ３ζエンドドメイン、ならびに抗ＣＤ７９ａまたは抗ＣＤ７９ｂ  ｄＡｂを含む抗原結合ドメインを有する第２世代ＣＡＲをデザインする。正常ドナーに由来する初代ヒトＴ細胞を、上記抗ＣＤ７９  ＣＡＲまたは陰性コントロールとしての無関係のＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲを発現するレトロウイルスベクターで形質導入する。上記細胞がいずれかのＣＤ７９発現標的細胞を殺滅する能力を、フローサイトメトリーを使用して調査する。
【０２７８】
Ｔ細胞増殖を、７２時間の共培養後に測定し、サイトカイン（例えば、ＩＦＮγおよびＩＬ−２）の放出を、ＣＤ７９発現標的細胞との２４時間の共培養後に測定する。
【０２７９】
実施例３：  ＣＤ７９  ＣＡＲでの抗原陰性エスケープ（ａｎｔｉｇｅｎ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｅｓｃａｐｅ）の調査
ＮＡＬＭ６細胞、すなわち、Ｂ−ＡＬＬ細胞株を、異なるクローンへのレトロウイルス形質導入およびＣｒｉｓｐＲ／ＣＡＳ９編集によって操作して、以下の表現型を得る：  
−  ＣＤ１９＋ＣＤ２２＋ＣＤ７９＋、または
−  ＣＤ１９＋ＣＤ２２−ＣＤ７９＋、または
−  ＣＤ１９−ＣＤ２２＋ＣＤ１７９＋、または
−  ＣＤ１９−ＣＤ２２−ＣＤ７９＋。
【０２８０】
これらのクローンをまた操作して、ホタルルシフェラーゼを発現させる。
【０２８１】
ＮＳＧマウスに、尾静脈注射を介して野生型ＮＡＬＭ６細胞、上記のクローンまたはその混合物を生着させる。ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＣＤ２２  ＣＡＲ、ＣＤ１９  ＯＲ  ＣＤ２２  ＣＡＲ、またはＣＤ１９  ＯＲ  ＣＤ２２  ＯＲ  ＣＤ７９  ＣＡＲを発現するように形質導入したヒトＴ細胞を、尾静脈注射を介してマウスに投与する。ＣＡＲ  Ｔ細胞に対する異種移植片の応答を、生体発光画像化によって最初に決定する。固定した時点において、マウスを屠殺し、残っているＮＡＬＭ６集団を、フローサイトメトリーによって研究する。
【０２８２】
実施例４：  ＣＤ７９ａまたはＣＤ７９ｂに特異的なモノクローナル抗体の生成
ＣＤ７９ａおよびＣＤ７９ｂの核酸配列を、２ａ自己切断ペプチドによって分離されたベクターｐＶＡＣ２にクローニングした。３匹のＷｉｓｔａｒラットを、金ナノ粒子に吸着させたＣＤ７９ａ／ｂヘテロダイマーをコードするプラスミドＤＮＡで免疫化した。Ｇｅｎｅ−ＧｕｎＴＭ（Ｂｉｏｒａｄ）システムを使用して、上記被覆した金ナノ粒子を筋肉内に送達した。ラットを、２８日間の過程で３回ブーストした。ラットからの試験採血を、抗ＣＤ７９ｂ抗体の力価に関して、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによってスクリーニングした。
【０２８３】
ＣＤ７９ｂ陽性血清を有するラットを、Ｂ細胞単離およびハイブリドーマ生成のために脾臓を採取する前に、最終の免疫化ブーストのために選択した。選択したラットに由来するリンパ球との１０×９６ウェルプレートのハイブリドーマ融合を、行った。ハイブリドーマ上清を、組換えヒト精製タンパク質および目的の標的領域を表すペプチドに対するＥＬＩＳＡによって、反応性抗ＣＤ７９ｂ抗体についてスクリーニングした。ＥＬＩＳＡ陽性ハイブリドーマ上清を、ＣＤ７９ｂを内因的に発現するＤａｕｄｉ細胞上でのフローサイトメトリーによって試験した。候補ハイブリドーマを拡大した。
【０２８４】
フリーサイトメトリーによって最強の抗ＣＤ７９ｂ応答を発現するハイブリドーマを、同定し、拡大し、ストックをクローニングして、モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを生成した。ハイブリドーマクローンを、限界希釈によって得た。
【０２８５】
全ＲＮＡを、ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＲＮＡｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，製品番号２５０５００７１）を使用して、製造業者の指示に従ってモノクローナルハイブリドーマ細胞から単離した。上記全ＲＮＡを、アガロースゲル電気泳動によって分析し、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００Ｃを使用して濃度を評価した。全ＲＮＡを、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  製品番号１８０６４０２２）を使用して、テンプレートースイッチオリゴの存在下で、製造業者の指示に従って、ｃＤＮＡへと逆転写した。ＶＨおよびＶＬの抗体フラグメントを、５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ法を使用して増幅した。ＤＮＡフラグメントを、ＣｌｏｎｅＪＥＴ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  製品番号Ｋ１２３１）を使用して、製造業者の指示に従ってベクターへと平滑末端化してクローニングした。重鎖および軽鎖の各々の５つのクローンを配列決定し、コンセンサス配列を得た。
【０２８６】
実施例５：  可溶性抗体発現および抗ＣＤ７９ｂ抗体の精製
抗ＣＤ７９ｂ抗体を、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃへとフォーマットした。再フォーマットした抗体を、関連するプラスミド構築物の共トランスフェクション後に、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞株上での一過性発現によって発現させた。発現させ、選択した抗ＣＤ７９ｂ抗体は、ポラツズマブ、ならびに実施例４において得たクローン２Ｅ８、３Ｈ２、４Ｇ１１、７Ｇ４、９Ｆ１、および１０Ｃ１１である。
【０２８７】
トランスフェクトしたＥｘｐｉＣＨＯ細胞の上清を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。簡潔には、ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲＥ  １ｍｌカラムを、５カラム容量のＰＢＳ  ｐＨ７．４で平衡化した。上清を、ＡｋｔａＴＭ  Ｐｕｒｅシステムを使用して１ｍＬ／分の流量でカラムに加えた。上清を加えた後に、上記カラムを２０カラム容積のＰＢＳで洗浄した。次いで、結合したタンパク質を、３ｍｌのＩｇＧ溶離緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ，  カタログ番号２１００４）で１ｍＬ／分において上記カラムから溶離し、ＰＢＳ中で予め平衡化した２つのＨｉＴｒａｐ  ５ｍｌ脱塩カラムに直接加え、画分コレクターユニットを使用して９６ウェルプレートに集めた。抗体生成物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して決定した。
【０２８８】
実施例６：  ＣＤ７９ｂに対する結合親和性の決定
組換え抗ＣＤ７９ｂ抗体ポラツズマブおよび新たに生成した抗体２Ｅ８、３Ｈ２、および７Ｇ４を、Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上の個々のフローセル上に、Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋ機器を使用して１５０〜２８０  ＲＵの密度へと固定化した。ＨＢＳ−Ｐ＋緩衝液を、全ての実験条件下で泳動緩衝液として使用した。既知の濃度の組換え精製ＣＤ７９ｂ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を、「検体」として使用し、３０μｌ／分の流量および一定温度２５℃において１５０ｓ接触時間および３００ｓ解離で、それぞれのフローセルに注入した。各実験において、フローセル１は、非改変であり、参照減算（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）のために使用した。緩衝液単独の「０濃度」センサーグラムを、二重参照減算として使用して、ドリフトに関して因数分解した。データを、１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルへと適合させた。
【０２８９】
表１に示される結果は、新たに生成した抗体２Ｅ８、３Ｈ２、および７Ｇ４が、ポラツズマブのものに匹敵する親和性でＣＤ７９ｂに結合することを明らかにした。
表１：  ＣＤ７９ｂに対する抗ＣＤ７９ｂ抗体の結合の動態
【表１Ｂ】
2021527395.tif 000064
【０２９０】
実施例７：  細胞株上での内因性ＣＤ７９ｂ発現の評価
Ｒａｊｉ細胞株、Ｄａｕｄｉ細胞株およびＭＭ１．ｓ細胞株上でのＣＤ７９ｂの細胞表面発現を、フローサイトメトリーを介して決定した。簡潔には、細胞を、５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ７９ｂ抗体ポラツズマブで染色し、ＡＰＣに結合体化した抗マウスＦｃ二次抗体を介して検出した。染色した細胞を、ＭＡＣＳ  ｑｕａｎｔ  Ｘ機器で獲得した。
【０２９１】
結果から、Ｒａｊｉ細胞が、それぞれ、高レベルおよび低レベルのＣＤ７９ｂを発現するＤａｕｄｉ細胞株またはＭＭ１．ｓ細胞株と比較して、中程度のレベルのＣＤ７９ｂ抗原を発現することが明らかにされた（図５）。
【０２９２】
実施例８：  抗ＣＤ７９ｂ  ＣＡＲの生成
第２世代ＣＡＲ構築物を、抗ＣＤ７９ｂ抗体であるポラツズマブ、３Ｈ２および１０Ｃ１１に基づいて生成した（図２ｃ）。ＣＡＲ構築物を、ヒトＣＤ８ストークスペーサー、ＣＤ８膜貫通ドメインおよび４１ＢＢ−ＣＤ３ｚエンドドメインに連結されたｓｃＦｖ  抗ＣＤ７９ｂ細胞外結合ドメインを含むようにデザインした。これらのＣＡＲ構築物を、レトロウイルスベクターにクローニングし、４名の健常ドナーから得た活性化ＰＢＭＣを形質導入するために使用した。
【０２９３】
実施例９：  抗ＣＤ７９ｂ  ＣＡＲの機能的特徴付け：サイトカイン生成
ＣＤ７９ｂに向かう抗ＣＤ７９ｂ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の機能的能力を評価するために、標的細胞（ＭＭ１．ｓ細胞またはＲａｊｉ細胞）を、実施例８から得た抗ＣＤ７９ｂ  ＣＡＲ−Ｔ細胞とともに、１：１  エフェクター：標的比において共インキュベートした。７２時間後、培養上清を集め、ＩＦＮ−γ生成をＥＬＩＳＡによって測定した。
【０２９４】
図６ａにおいて、抗ＣＤ７９ｂ  ３Ｈ２および１０Ｃ１１ベースのＣＡＲ−Ｔ細胞は、低いおよび中程度のＣＤ７９ｂ発現細胞（それぞれ、ＭＭ１．ｓ細胞およびＲａｊｉ細胞）の両方におけるポラツズマブベースのＣＡＲと比較した場合、より大きなＩＦＮ−γ放出を示した。同様に、ＩＬ−２生成は、ポラツズマブベースのＣＡＲと比較して３Ｈ２および１０Ｃ１１ベースのＣＡＲ−Ｔ細胞の両方に関してより高かったが、この効果は、中程度発現のＣＤ７９ｂ細胞、すなわち、Ｒａｊｉ細胞に対してより顕著であった（図６ｂ）。
【０２９５】
実施例１０：  抗ＣＤ７９ｂ  ＣＡＲの機能的特徴付け：Ｒａｊｉ細胞に対する殺滅アッセイ
抗ＣＤ７９ｂ  ＣＡＲがＣＤ７９ｂ発現細胞を殺滅する能力を決定するために、細胞傷害アッセイを、抗ＣＤ７９ｂ  ３Ｈ２および１０Ｃ１１ベースのＣＡＲ−Ｔ細胞と共培養したＲａｊｉ細胞を使用して、コントロールとしてポラツズマブベースのＣＡＲを使用して設定した。ＣＡＲ−Ｔ細胞を、Ｒａｊｉ細胞と１：１（Ｅ：Ｔ）比で培養した。標的細胞回収を、７２時間後培養物をフローサイトメトリーによって測定し、ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害能力を確立するために使用した。
【０２９６】
３Ｈ２または１０Ｃ１１ベースのＣＡＲ−Ｔ細胞を含む培養物は、コントロールポラツズマブＣＡＲ−Ｔ細胞を含む培養物によって示されたものに匹敵する、Ｒａｊｉ標的細胞の生存を示した（図７）。
【図１】
2021527395.tif 000065
【図２】
2021527395.tif 000066
【図３】
2021527395.tif 000067
【図４】
2021527395.tif 000068
【図５】
2021527395.tif 000069
【図６】
2021527395.tif 000070
【図７】
2021527395.tif 000071
【配列表】
2021527395000001.app
【国際調査報告】
2021527395.tif 000072
2021527395.tif 000073
2021527395.tif 000074