(57)【要約】  明細書において、熱安定性ルシフェリンアナログと共に生物発光アッセイに使用するための増強されたルシフェラーゼ酵素が提供される。特に、本開示は、５，５−二置換ルシフェリンアナログなどの熱安定性ルシフェリンに適合する増強された高活性ルシフェラーゼ酵素を使用した生物発光アッセイを実行するための組成物、アッセイ、及び方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で配列番号１のルシフェラーゼポリペプチドにより生成される生物発光シグナルと比較して増加した生物発光シグナルを前記５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で生成することができるルシフェラーゼポリペプチドであって、天然に存在しない前記ルシフェラーゼポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号２との少なくとも７０％の配列同一性、及び配列番号１との１００％未満の配列同一性を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較して、２４４位、２４９位、３３７位、及び３３９位での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｈ２４４Ｗ、Ｈ２４４Ｇ、及びＨ２４４Ｒ、及び／または前記少なくとも１つのアミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションから選択される、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較して、２４０位、２５４位、及び３４４位での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｉ２４０Ｌ、Ｙ２５４Ｓ、及びＴ３４４Ａ、及び／または前記少なくとも１つのアミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションから選択される、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較して３００位及び３９６位での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１〜３及び５のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｖ３００Ｇ及びＩ３９６Ｋ、及び／または前記少なくとも１つのアミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションから選択される、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較して２４５位、２８５位、及び３１５位での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１〜３、５及び７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｇ２４５Ａ、Ｌ２８５Ｉ、及びＧ３１５Ａ、及び／または前記少なくとも１つのアミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションから選択される、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較して１０９位、１９３位、２１４位、２１８位、２２８位、２３４位、２６２位、２８７位、２９４位、３０５位、３０６位、３０９位、３１６位、３３５位、及び５３３位での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１〜３、５、７、及び９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｉ１０９Ｖ、Ｓ１９３Ａ、Ｉ２１４Ｌ、Ｆ２１８Ｌ、Ｎ２２８Ｄ、Ｓ２３４Ｔ、Ｖ２６２Ａ、Ｖ２８７Ｉ、Ｌ２９４Ｈ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｋ３０９Ｅ、Ａ３１６Ｓ、Ｖ３３５Ｇ、及び／またはＶ５３３Ｍ、及び／または前記少なくとも１つのアミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションから選択される、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較して１３３位、２３３位、２３６位、及び５０３位での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１〜３、５、７、９、及び１１のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｑ１３３Ｈ、Ｔ２３３Ｓ、Ｉ２３６Ｖ、及び／またはＳ５０３Ｒ、及び／または前記少なくとも１つのアミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションから選択される、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較して１０７位及び１２１位での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１〜３、５、７、９、１１、及び１３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｋ１０７Ｑ及び／またはＫ１２１Ｎ、及び／または前記少なくとも１つのアミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションから選択される、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、表１に列挙する配列番号２〜１２４のいずれか１つにおけるアミノ酸置換を含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、配列番号１の前記ルシフェラーゼポリペプチドのデヒドロルシフェリン及びその誘導体による阻害と比較して、前記デヒドロルシフェリン及びその誘導体による阻害に対する耐性を示す、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記ルシフェラーゼポリペプチドにより生成される前記生物発光シグナルが、配列番号１の前記ルシフェラーゼポリペプチドにより生成される前記生物発光シグナルと比較して少なくとも１０倍増加する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｉ２４０Ｌ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、及びＩ３９６Ｋ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｎ７４Ｎ、Ｈ２４４Ｒ、Ｖ３００Ｇ、及びＩ３９６Ｋ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、及びＩ３９６Ｋ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｔ３４４Ａ、及びＩ３９６Ｋ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｔ３４４Ａ、Ｉ３９６Ｋ、Ｖ３００Ｇ、Ｌ３０５Ｐ、及びＳ３０６Ｐ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｔ３４４Ａ、Ｉ３９６Ｋ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、及びＩ１０９Ｖ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｉ２３０Ｆ、Ｖ３３５Ｇ、及びＩ４１０Ｍ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｃ３８Ｓ、Ｙ１０８Ｆ、及びＴ３７６Ｉ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｃ３８Ｓ、Ｆ５５Ｉ、Ｖ２６２Ａ、及びＩ４２２Ｖ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｙ１０８Ｆ、Ｖ２６１Ａ、Ｎ４２７Ｄ、及びＦ４３１Ｖ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、及びＩ２３０Ｆ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、及びＱ４８７Ｒ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ２６１Ａ、及びＩ４１０Ｍ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｙ１８３Ｃ、Ｖ２６１Ａ、及びＴ２８９Ｓ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、及びＹ３２Ｃ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｆ２４６Ｙ、及びＶ２６１Ａ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、及びＩ２３０Ｆ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｋ１２１Ｑ、Ｆ２４６Ｙ、及びＶ２６１Ａ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｋ１２１Ｑ、Ｖ２６１Ａ、及びＶ２８７Ｉ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してＶ３４８Ｉ、Ａ３１６Ｍ、Ａ３１６Ｗ、Ｙ３３９Ｍ、Ｔ３４２Ｓ、Ａ３４４Ｉ、Ｋ１２１Ｑ、Ｖ２６１Ａ、Ｖ２８７Ｉ、Ｋ１０７Ｎ、及びＴ２８９Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの追加のアミノ酸置換、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ａ３１６Ｗ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを更に含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してＣ３８Ｒ、Ｆ５５Ｉ、Ａ３１６Ｗ、Ｔ３４２Ｓ、Ｖ３４８Ｉ、Ｋ２０５Ｎ、Ｉ３９６Ｉ、Ｋ１２１Ｑ、Ｙ３３９Ｍ、Ｔ３４４Ｉ、及びＹ１０８Ｆからなる群から選択される少なくとも１つの追加のアミノ酸置換、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｃ３８Ｒ、Ｆ５５Ｉ、Ａ３１６Ｗ、Ｔ３４２Ｓ、及びＶ３４８Ｉ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを更に含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｃ３８Ｒ、Ｆ５５Ｉ、Ｙ１０８Ｆ、Ａ３１６Ｗ、Ｙ３３９Ｍ、及びＴ３４４Ｉ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを更に含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較して、Ｔ３４４Ｉ、Ｃ３８Ｒ、Ｆ５５Ｉ、Ａ３１６Ｗ、Ｔ３４２Ｓ、Ｖ３４８Ｉ、Ｙ１０８Ｆ、Ｙ３３９Ｍ、Ｉ２４０Ｖ、Ｔ２８４Ａ、Ｔ２８９Ｒ、Ｔ２８９Ｓ、Ｋ３５３Ｒ、Ｄ４３５Ｇ、Ｌ４３７Ｒ、Ｗ５１０Ｒ、Ｃ２５７Ｒ、及びＳ３１３Ｔからなる群から選択される少なくとも１つの追加のアミノ酸置換、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｔ３４４Ｉ、Ｉ３９６Ｋ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｃ３８Ｒ、Ｆ５５Ｉ、Ａ３１６Ｗ、Ｔ３４２Ｓ、及びＶ３４８Ｉ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｃ３８Ｒ、Ｆ５５Ｉ、Ｙ１０８Ｆ、Ａ３１６Ｗ、及びＹ３３９Ｍ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを更に含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｃ３８Ｒ、Ｆ５５Ｉ、Ａ３１６Ｗ、Ｔ３４２Ｓ、及びＶ３４８Ｉ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｃ３８Ｒ、Ｆ５５Ｉ、Ｙ１０８Ｆ、Ａ３１６Ｗ、Ｙ３３９Ｍ、Ｔ３４２Ｓ、及びＶ３４８Ｉ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｃ３８Ｒ、Ｆ５５Ｉ、Ｙ１０８Ｆ、Ａ３１６Ｗ、Ｙ３３９Ｍ、Ｔ３４２Ｓ、Ｖ３４８Ｉ、Ｔ２８９Ｓ、Ｋ３５３Ｒ、Ｄ４３５Ｇ、及びＷ５１０Ｒ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
前記ポリペプチドが、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｃ３８Ｒ、Ｆ５５Ｉ、Ｙ１０８Ｆ、Ａ３１６Ｗ、Ｙ３３９Ｍ、Ｔ３４２Ｓ、Ｖ３４８Ｉ、Ｃ２５７Ｒ、Ｔ２８４Ａ、Ｔ２８９Ｓ、Ｓ３１３Ｔ、Ｋ３５３Ｒ、Ｄ４３５Ｇ、Ｌ４３７Ｒ、及びＷ５１０Ｒ、及び／または前記アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
生物発光アッセイのための試薬組成物であって、
５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で配列番号１のルシフェラーゼポリペプチドにより生成される生物発光シグナルと比較して増加した生物発光シグナルを前記５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で生成することができるルシフェラーゼポリペプチドと、
前記ルシフェラーゼポリペプチドの基質と、を含む前記試薬組成物。
【請求項５３】
前記基質がラセミ体ルシフェリンである、請求項５２に記載の試薬組成物。
【請求項５４】
前記基質がルシフェリンアナログである、請求項５２に記載の試薬組成物。
【請求項５５】
前記ルシフェリンアナログが５，５−二置換ルシフェリンアナログである、請求項５２に記載の試薬組成物。
【請求項５６】
マグネシウムを更に含む、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５７】
緩衝液、脱泡剤、ＡＴＰアーゼインヒビター、Ｌ−ルシフェリン、アザチオチミン、酵素安定剤、界面活性剤、ＡＴＰ生成酵素のインヒビター、細胞溶解剤、ＡＴＰ抽出剤、補酵素Ａ、チオール試薬、金属イオンキレート剤、プロテアーゼインヒビター、ピロリン酸、フッ化ナトリウム、デヒドロルシフェリン、及び塩からなる群から選択される１種以上の追加成分を更に含む、請求項５２または請求項５３に記載の組成物。
【請求項５８】
前記試薬組成物が、単一の液体試薬である、請求項５２〜５７のいずれかに記載の組成物。
【請求項５９】
前記試薬組成物が、単一の乾燥試薬である、請求項５２〜５７のいずれかに記載の組成物。
【請求項６０】
固体成分及び液体成分を含む、請求項５２〜５７のいずれかに記載の組成物。
【請求項６１】
請求項５２〜５７のいずれかに記載の試薬組成物を含むキット。
【請求項６２】
生物発光アッセイを実行するための使用説明書を更に含む、請求項６１に記載のキット。
【請求項６３】
前記生物発光アッセイが、カスパーゼ活性アッセイ、キナーゼ活性アッセイ、Ｐ４５０アッセイ、活性酸素種の測定、ヌクレオチドの検出もしくは定量化、細胞生存率の検出もしくは定量化、細胞障害性の検出もしくは定量化、または過酸化水素の検出もしくは定量化を含む、請求項６１に記載のキット。
【請求項６４】
５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で配列番号１のルシフェラーゼポリペプチドにより生成される生物発光シグナルと比較して増加した生物発光シグナルを前記５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で生成することができるルシフェラーゼポリペプチドと、
５，５−二置換ルシフェリンアナログと、を含むキット。
【請求項６５】
試料中のＡＴＰを検出または定量化するためのアッセイ系であって、
５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で配列番号１のルシフェラーゼポリペプチドにより生成される生物発光シグナルと比較して増加した生物発光シグナルを前記５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で生成することができるルシフェラーゼポリペプチドを含む試薬組成物と、
５，５−二置換ルシフェリンアナログと、
ＡＴＰを含むか、または含むことが疑われる試料と、を含む、前記アッセイ系。
【請求項６６】
生物発光の検出及び／または測定のための装置を更に含む、請求項６５に記載のアッセイ系。
【請求項６７】
前記試料が、細胞可溶化物試料、無細胞調製物試料、または精製酵素配合試料のうちの１種以上である、請求項６５または請求項６６に記載のアッセイ系。
【請求項６８】
前記試料が、環境試料、土壌試料、水試料、工業化学試料、法医学試料、食品ベースの試料、液体試料、飲料ベースの試料、または生化学試料のうちの１種以上である、請求項６５または請求項６６に記載のアッセイ系。
【請求項６９】
試料中のＡＴＰを検出または定量化する方法であって、
請求項６５〜６８のいずれかに記載のアッセイ系を、ＡＴＰを含むか、または含むことが疑われる前記試料に添加することと、
前記生物発光シグナルを検出または定量化することと、を含む前記方法。
【請求項７０】
試料中の標的酵素活性を検出または定量化するためのアッセイ系であって、
５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で配列番号１のルシフェラーゼポリペプチドにより生成される生物発光シグナルと比較して増加した生物発光シグナルを前記５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で生成することができるルシフェラーゼポリペプチドを含む試薬組成物と、
５，５−二置換ルシフェリンアナログと、
標的酵素を含むか、または含むことが疑われる試料と、を含む前記アッセイ系。
【請求項７１】
前記５，５−二置換ルシフェリンアナログが、前記標的酵素の基質に結合されている、請求項７０に記載のアッセイ系。
【請求項７２】
前記標的酵素が、プロテアーゼ、カスパーゼ、キナーゼ、シトクロム４５０、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、またはモノアミンオキシダーゼである、請求項７０または請求項７１に記載のアッセイ系。
【請求項７３】
生物発光の検出及び／または測定のための装置を更に含む、請求項７０〜７２のいずれかに記載のアッセイ系。
【請求項７４】
前記試料が細胞可溶化物である、請求項７０〜７３のいずれかに記載のアッセイ系。
【請求項７５】
前記試料が、環境試料、工業化学試料、法医学試料、食品ベースの試料、または生化学試料である、請求項７０〜７３のいずれかに記載のアッセイ系。
【請求項７６】
試料中の標的酵素活性を検出または定量化する方法であって、
請求項７０〜７５のいずれかに記載のアッセイ系を、標的酵素活性を含むか、または含むことが疑われる前記試料に添加することと、
前記生物発光シグナルを検出または定量化することと、を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年６月５日に出願の米国特許仮出願第６２／６８０，８９９号の優先権及び利益を主張し、これはその全体が全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書において、熱安定性ルシフェリンアナログと共に生物発光アッセイに使用するための増強されたルシフェラーゼ酵素バリアントが提供される。特に、本開示は、５，５−二置換ルシフェリンアナログなどの熱安定性ルシフェリンに適合する増強された高活性ルシフェラーゼ酵素を使用した生物発光アッセイを実行するための組成物、アッセイ、及び方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
生物発光アッセイは、細胞生理、遺伝子発現、タンパク質−タンパク質相互作用の研究、及び分析物検出において広範に使用される。特に、ルシフェラーゼレポーター酵素は、この分野において非常に有用なツールであり、現在まで、精力的なタンパク質改変が、低分子、頑強、安定、かつ環境に非感受性である、生物発光アッセイに有用であり得るルシフェラーゼを取得するために行われてきた。ホールセルバイオセンサー測定、ハイスループットスクリーニングによる医薬品の発見、及びインビボイメージングを容易にする多数の効果的なルシフェラーゼレポーターが存在し、これらは生細胞におけるタンパク質−タンパク質相互作用、アポトーシス、及び細胞生存率の研究も可能にする。ルシフェリン及びルシフェリンアナログを基質として使用するルシフェラーゼは、その明るさ及びホールセルへの適用が受け入れられていることに起因して広く使用されているシステムである。ホタルルシフェラーゼ及び様々な甲虫ルシフェラーゼは、例えば、ルシフェリン、マグネシウムイオン、酸素、及びＡＴＰの存在下で発光を生成する。しかしながら、現行のルシフェリンベースの生物発光試薬は、ルシフェリン基質のラセミ化及びルシフェラーゼの活性に対して阻害性であり得る生成物への分解に起因するその熱不安定性により制限される。特に、ルシフェリンの分解は、製品の性能及び寿命、ならびにこれらの試薬を利用する、特に、構成成分が液体として、及び／または周囲温度で保存されるフォーマットでのアッセイの性能及び寿命の制限をもたらし得る。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書において、熱安定性ルシフェリンアナログと共に生物発光アッセイに使用するための増強されたルシフェラーゼ酵素バリアントが提供される。特に、本開示は、５，５−二置換ルシフェリンアナログなどの熱安定性ルシフェリンに適合する増強された高活性ルシフェラーゼ酵素バリアントを使用した生物発光アッセイを実行するための組成物、アッセイ、及び方法を提供する。
【０００５】
本開示の実施形態には、５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で配列番号１のＰｈｏｔｕｒｉｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ（Ｐｐｅ）の熱安定性ルシフェラーゼバリアントにより生成される生物発光シグナルと比較して、増加した生物発光シグナルを当該５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で生成することができるルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドであって、天然に存在しない当該ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドが含まれる。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号２との少なくとも７０％の配列同一性及び配列番号１との１００％未満の配列同一性を含む。
【０００６】
幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して２４４位、２４９位、３３７位、及び３３９位での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｈ２４４Ｗ、Ｈ２４４Ｇ、及びＨ２４４Ｒ、及び／または少なくとも１つのアミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションから選択される。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して２４０位、２５４位、及び３４４での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｉ２４０Ｌ、Ｙ２５４Ｓ、及びＴ３４４Ａ、及び／または少なくとも１つのアミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションから選択される。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して３００位及び３９６位での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｖ３００Ｇ及びＩ３９６Ｋ及び／または少なくとも１つのアミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションから選択される。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して２４５位、２８５位、及び３１５位での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｇ２４５Ａ、Ｌ２８５Ｉ、及びＧ３１５Ａ、及び／または少なくとも１つのアミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションから選択される。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して１０９位、１９３位、２１４位、２１８位、２２８位、２３４位、２６２位、２８７位、２９４位、３０５位、３０６位、３０９位、３１６位、３３５位、及び５３３位での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｉ１０９Ｖ、Ｓ１９３Ａ、Ｉ２１４Ｌ、Ｆ２１８Ｌ、Ｎ２２８Ｄ、Ｓ２３４Ｔ、Ｖ２６２Ａ、Ｖ２８７Ｉ、Ｌ２９４Ｈ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｋ３０９Ｅ、Ａ３１６Ｓ、Ｖ３３５Ｇ、及び／またはＶ５５３Ｍ、及び／または少なくとも１つのアミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションから選択される。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して１３３位、２３３位、２３６位、及び５０３位での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｑ１３３Ｈ、Ｔ２３３Ｓ、Ｉ２３６Ｖ、及び／またはＳ５０３Ｒ、及び／または少なくとも１つのアミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションから選択される。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較して１０７位及び１２１位での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｋ１０７Ｑ及び／またはＫ１２１Ｎ及び／または少なくとも１つのアミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションから選択される。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、表１に列挙する配列番号２〜１２４のいずれかにおけるアミノ酸置換を含む。
【０００７】
幾つかの実施形態では、上記のルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドのうちの１種以上は、配列番号１のルシフェラーゼポリペプチドのデヒドロルシフェリン及びその誘導体による阻害と比較して、当該デヒドロルシフェリン及びその誘導体による阻害に対して耐性を示す。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドにより生成される生物発光シグナルは、配列番号１のルシフェラーゼポリペプチドにより生成される生物発光シグナルと比較して少なくとも１０倍増加する。
【０００８】
幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｉ２４０Ｌ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、及びＩ３９６Ｋ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｎ７４Ｎ、Ｈ２４４Ｒ、Ｖ３００Ｇ、及びＩ３９６Ｋ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、及びＩ３９６Ｋ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｔ３４４Ａ、及びＩ３９６Ｋ、及び／またはアミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。
【０００９】
幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｔ３４４Ａ、Ｉ３９６Ｋ、Ｖ３００Ｇ、Ｌ３０５Ｐ、及びＳ３０６Ｐ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｔ３４４Ａ、Ｉ３９６Ｋ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、及びＩ１０９Ｖ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｉ２３０Ｆ、Ｖ３３５Ｇ、及びＩ４１０Ｍ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｃ３８Ｓ、Ｙ１０８Ｆ、及びＴ３７６Ｉ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。
【００１０】
幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｃ３８Ｓ、Ｆ５５Ｉ、Ｖ２６２Ａ、及びＩ４２２Ｖ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｙ１０８Ｆ、Ｖ２６１Ａ、Ｎ４２７Ｄ、及びＦ４３１Ｖ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、及びＩ２３０Ｆ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、及びＱ４８７Ｒ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。
【００１１】
幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ２６１Ａ、及びＩ４１０Ｍ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｙ１８３Ｃ、Ｖ２６１Ａ、及びＴ２８９Ｓ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、及びＹ３２Ｃ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｆ２４６Ｙ、及びＶ２６１Ａ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、及びＩ２３０Ｆ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。
【００１２】
幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｋ１２１Ｑ、Ｆ２４６Ｙ、及びＶ２６１Ａ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｋ１２１Ｑ、Ｖ２６１Ａ、及びＶ２８７Ｉ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＶ３４８Ｉ、Ａ３１６Ｍ、Ａ３１６Ｗ、Ｙ３３９Ｍ、Ｔ３４２Ｓ、Ａ３４４Ｉ、Ｋ１２１Ｑ、Ｖ２６１Ａ、Ｖ２８７Ｉ、Ｋ１０７Ｎ、及びＴ２８９Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの追加のアミノ酸置換、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。
【００１３】
幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ａ３１６Ｗ及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＣ３８Ｒ、Ｆ５５Ｉ、Ａ３１６Ｗ、Ｔ３４２Ｓ、Ｖ３４８Ｉ、Ｋ２０５Ｎ、Ｉ３９６Ｉ、Ｋ１２１Ｑ、Ｙ３３９Ｍ、Ｔ３４４Ｉ、及びＹ１０８Ｆからなる群から選択される少なくとも１つの追加のアミノ酸置換、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｃ３８Ｒ、Ｆ５５Ｉ、Ａ３１６Ｗ、Ｔ３４２Ｓ、及びＶ３４８Ｉ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｃ３８Ｒ、Ｆ５５Ｉ、Ｙ１０８Ｆ、Ａ３１６Ｗ、Ｙ３３９Ｍ、及びＴ３４４Ｉ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。
【００１４】
幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してＴ３４４Ｉ、Ｃ３８Ｒ、Ｆ５５Ｉ、Ａ３１６Ｗ、Ｔ３４２Ｓ、Ｖ３４８Ｉ、Ｙ１０８Ｆ、Ｙ３３９Ｍ、Ｉ２４０Ｖ、Ｔ２８４Ａ、Ｔ２８９Ｒ、Ｔ２８９Ｓ、Ｋ３５３Ｒ、Ｄ４３５Ｇ、Ｌ４３７Ｒ、Ｗ５１０Ｒ、Ｃ２５７Ｒ、及びＳ３１３Ｔからなる群から選択される少なくとも１つの追加のアミノ酸置換、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｔ３４４Ｉ、Ｉ３９６Ｋ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｃ３８Ｒ、Ｆ５５Ｉ、Ａ３１６Ｗ、Ｔ３４２Ｓ、及びＶ３４８Ｉ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｃ３８Ｒ、Ｆ５５Ｉ、Ｙ１０８Ｆ、Ａ３１６Ｗ、及びＹ３３９Ｍ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｃ３８Ｒ、Ｆ５５Ｉ、Ａ３１６Ｗ、Ｔ３４２Ｓ、及びＶ３４８Ｉ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。
【００１５】
幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｃ３８Ｒ、Ｆ５５Ｉ、Ｙ１０８Ｆ、Ａ３１６Ｗ、Ｙ３３９Ｍ、Ｔ３４２Ｓ、及びＶ３４８Ｉ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｃ３８Ｒ、Ｆ５５Ｉ、Ｙ１０８Ｆ、Ａ３１６Ｗ、Ｙ３３９Ｍ、Ｔ３４２Ｓ、Ｖ３４８Ｉ、Ｔ２８９Ｓ、Ｋ３５３Ｒ、Ｄ４３５Ｇ、及びＷ５１０Ｒ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、Ｉ１０９Ｖ、Ｃ３８Ｒ、Ｆ５５Ｉ、Ｙ１０８Ｆ、Ａ３１６Ｗ、Ｙ３３９Ｍ、Ｔ３４２Ｓ、Ｖ３４８Ｉ、Ｃ２５７Ｒ、Ｔ２８４Ａ、Ｔ２８９Ｓ、Ｓ３１３Ｔ、Ｋ３５３Ｒ、Ｄ４３５Ｇ、Ｌ４３７Ｒ、及びＷ５１０Ｒ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む。
【００１６】
本明細書において、生物発光アッセイを実行するための組成物及び方法が提供される。これらの実施形態によれば、組成物は、配列番号１のルシフェラーゼポリペプチドによって、５，５−二置換ルシフェリンアナログ及び当該ルシフェラーゼポリペプチドの基質の存在下で生成される生物発光シグナルと比較して増加した生物発光シグナルを当該５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で生成することができるルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドを含む。幾つかの実施形態では、基質は、ラセミ体ルシフェリンである。幾つかの実施形態では、基質は、ルシフェリンアナログである。幾つかの実施形態では、ルシフェリンアナログは、５，５−二置換ルシフェリンアナログである。幾つかの実施形態では、組成物は、マグネシウムを更に含む。幾つかの実施形態では、組成物は、緩衝液、脱泡剤、ＡＴＰアーゼインヒビター、Ｌ−ルシフェリン、アザチオチミン（ＡＴＴ）、酵素安定剤、界面活性剤、ＡＴＰ生成酵素のインヒビター、細胞溶解剤、ＡＴＰ抽出剤、補酵素Ａ、チオール試薬、金属イオンキレート剤、プロテアーゼインヒビター、ピロリン酸、フッ化ナトリウム、デヒドロルシフェリン、及び塩からなる群から選択される１種以上の追加の構成成分を更に含む。幾つかの実施形態では、試薬組成物は、単一の液体試薬である。幾つかの実施形態では、試薬組成物は、単一の乾燥試薬である。幾つかの実施形態では、組成物は、固体構成成分及び液体構成成分を含む。
【００１７】
本明細書において、上記の試薬組成物のいずれかを含むキットが提供される。幾つかの実施形態では、キットは、生物発光アッセイを実行するための使用説明書を含む。幾つかの実施形態では、生物発光アッセイにより、カスパーゼ活性、キナーゼ活性、ＣＹＰ４５０酵素活性、活性酸素種、ヌクレオチド検出もしくは定量化、細胞生存率、細胞障害性、または過酸化水素検出もしくは定量化が測定／検出される。
【００１８】
本明細書において、配列番号１のルシフェラーゼポリペプチドによって、５，５−二置換ルシフェリンアナログ及び当該ルシフェラーゼポリペプチドの基質の存在下で生成される生物発光シグナルと比較して増加した生物発光シグナルを当該５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で生成することができるルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドを含むキットが提供される。
【００１９】
本明細書において、配列番号１のルシフェラーゼポリペプチドによって、５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で生成される生物発光シグナルと比較して増加した生物発光シグナルを当該５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で生成することができるルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドを含む試薬組成物、当該ルシフェラーゼポリペプチドの基質、及びＡＴＰを含むか、または含むことが疑われる試料を含む、試料中のＡＴＰを検出または定量するためのアッセイ系が提供される。幾つかの実施形態では、アッセイ系は、生物発光の検出及び／または測定のための装置を更に含む。幾つかの実施形態では、試料は、細胞可溶化試料、無細胞調製試料、または精製酵素配合試料のうちの１種以上である。幾つかの実施形態では、試料は、環境試料、土壌試料、水試料、工業化学試料、法医学試料、食品ベースの試料、液体試料、飲料ベースの試料、または生化学試料のうちの１種以上である。
【００２０】
本明細書において、上記のアッセイ系のいずれかを使用して試料中のＡＴＰを検出または定量化する方法が提供される。幾つかの実施形態では、アッセイは、ＡＴＰを含むか、または含むことが疑われる試料に対して実行され、生物発光シグナルを検出または定量化することを含む。
【００２１】
本明細書において、試料における標的酵素活性を検出または定量化するためのアッセイ系が提供される。これらの実施形態によれば、アッセイ系は、配列番号１のルシフェラーゼポリペプチドによって、５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で生成される生物発光シグナルと比較して増加した生物発光シグナルを当該５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で生成することができるルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドを含む試薬組成物、当該ルシフェラーゼポリペプチドの基質、及び標的酵素を含むか、または含むことが疑われる試料を含む。幾つかの実施形態では、５，５−二置換ルシフェリンアナログは、標的酵素の基質に結合されている。幾つかの実施形態では、標的酵素は、プロテアーゼ、カスパーゼ、キナーゼ、シトクロム４５０（ＣＹＰ４５０）、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、またはモノアミンオキシダーゼである。幾つかの実施形態では、アッセイは、生物発光の検出及び／または測定のための装置を更に含む。幾つかの実施形態では、試料は、細胞可溶化物である。幾つかの実施形態では、試料は、環境試料、工業化学試料、法医学試料、食品ベースの試料、または生化学試料である。
【００２２】
本明細書において、試料における標的酵素活性を検出または定量化する方法が提供される。これらの実施形態によれば、本方法は、上記のアッセイ系のいずれかを、標的酵素活性を含むか、または含むことが疑われる試料に添加すること、及び生物発光シグナルを検出または定量化することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】は、５，５−二置換ルシフェリンアナログの代表的な構造を含む。
【図２Ａ】は、本開示のルシフェラーゼポリペプチド間の関係をＰｐｅの熱安定性バリアント（配列番号１；ＡＴＧ−２２８７）と比較したそれらのアミノ酸置換に基づいて示す代表的な模式図を含む。
【図２Ｂ】は、本開示のルシフェラーゼポリペプチド間の関係をＰｐｅの熱安定性バリアント（配列番号１；ＡＴＧ−２２８７）と比較したそれらのアミノ酸置換に基づいて示す代表的な模式図を含む。
【図２Ｃ】は、本開示のルシフェラーゼポリペプチド間の関係をＰｐｅの熱安定性バリアント（配列番号１；ＡＴＧ−２２８７）と比較したそれらのアミノ酸置換に基づいて示す代表的な模式図を含む。
【図３】は、ルシフェラーゼポリペプチド（配列番号１）に対する高親和性を有するルシフェリンアナログを同定するための、ルシフェリンアナログがラセミ体ルシフェリンと競合する競合阻害アッセイの結果の代表的なグラフを含む。
【図４】は、配列番号１のルシフェラーゼの活性部位の代表的画像（左）、示された位置での様々なアミノ酸置換を含む表（中央）、及びラセミ体ルシフェリンを基質として使用して試験されたバリアントの各々の活性レベルを示すグラフ（右）を含む。
【図５】は、ＣＳ０３３３を用いて試験されたルシフェラーゼバリアントの活性レベル及びそれらの配列番号１の２４４位でのアミノ酸置換の比較を示す代表的な表（左）及び対応するグラフ（右）を含む。
【図６Ａ】は、５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下でＰｐｅの熱安定性バリアント（配列番号１）及びコメツキムシ緑色（ＣＢＧ９９）の活性を比較している代表的なグラフを含む。
【図６Ｂ】は、５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下でＰｐｅの熱安定性バリアント（配列番号１）及びコメツキムシ緑色（ＣＢＧ９９）の活性を比較している代表的なグラフを含む。
【図６Ｃ】は、５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下でＰｐｅの熱安定性バリアント（配列番号１）及びコメツキムシ緑色（ＣＢＧ９９）の活性を比較している代表的なグラフを含む。
【図７】は、配列番号１の２４４位及び３３９位でのアミノ酸置換を有するルシフェラーゼ酵素バリアントの、５，５−二置換ルシフェリンアナログ基質の存在下での活性を評価している代表的なグラフを含む。
【図８】は、ルシフェラーゼ酵素バリアントＡＴＧ−２６２４及びＡＴＧ−２６２５の、５，５−二置換ルシフェリンアナログ基質の存在下での活性を評価している代表的なグラフを含む。
【図９Ａ】は、ルシフェラーゼ酵素バリアントＡＴＧ−２８７７、ＡＴＧ−２６２４、及びＡＴＧ−２８９０の、５，５−二置換ルシフェリンアナログ基質の存在下での活性を評価している代表的なグラフを含む。
【図９Ｂ】は、ルシフェラーゼ酵素バリアントＡＴＧ−２８７７、ＡＴＧ−２６２４、及びＡＴＧ−２８９０の、５，５−二置換ルシフェリンアナログ基質の存在下での活性を評価している代表的なグラフを含む。
【図９Ｃ】は、ルシフェラーゼ酵素バリアントＡＴＧ−２８７７、ＡＴＧ−２６２４、及びＡＴＧ−２８９０の、５，５−二置換ルシフェリンアナログ基質の存在下での活性を評価している代表的なグラフを含む。
【図９Ｄ】は、ルシフェラーゼ酵素バリアントＡＴＧ−２８７７、ＡＴＧ−２６２４、及びＡＴＧ−２８９０の、５，５−二置換ルシフェリンアナログ基質の存在下での活性を評価している代表的なグラフを含む。
【図１０Ａ】は、５，５−二置換ルシフェリンアナログ基質の存在下での様々なルシフェラーゼ酵素バリアントの活性に対するアミノ酸置換の効果を評価している代表的なグラフを含む。
【図１０Ｂ】は、５，５−二置換ルシフェリンアナログ基質の存在下での様々なルシフェラーゼ酵素バリアントの活性に対するアミノ酸置換の効果を評価している代表的なグラフを含む。
【図１１Ａ】は、ルシフェラーゼ酵素バリアントＡＴＧ−２８８９及びコメツキムシ緑色（ＣＢＧ９９）と共に使用した、ＣＳ０３３３ルシフェリンアナログのアミノバージョン及びフルオロバージョンの効果を評価している代表的なグラフを含む。
【図１１Ｂ】は、ルシフェラーゼ酵素バリアントＡＴＧ−２８８９及びコメツキムシ緑色（ＣＢＧ９９）と共に使用した、ＣＳ０３３３ルシフェリンアナログのアミノバージョン及びフルオロバージョンの効果を評価している代表的なグラフを含む。
【図１１Ｃ】は、ＣＳ０３３３でのＡＴＧ−２８８９活性に対する異なる緩衝液組成物の効果を評価している代表的なグラフを含む。
【図１２Ａ】は、ｅｐＰＣＲ及びＤＮＡシャフリングにより同定された様々なルシフェラーゼ酵素バリアントの５，５−二置換ルシフェリンアナログでの活性試験の代表的結果を含む。
【図１２Ｂ】は、ｅｐＰＣＲ及びＤＮＡシャフリングにより同定された様々なルシフェラーゼ酵素バリアントの５，５−二置換ルシフェリンアナログでの活性試験の代表的結果を含む。
【図１３】は、アミノ酸置換Ｖ３００Ｇ、Ｌ３０５Ｆ、及びＳ３０６ＰのＣＳ０３３３アナログでの酵素活性に対する効果の代表的なグラフを含む。
【図１４】は、線形回帰及び組み合わせ解析を使用して同定された様々なルシフェラーゼ酵素バリアントの５，５−二置換ルシフェリンアナログでの活性試験の代表的結果を含む。
【図１５】は、ルシフェラーゼ酵素バリアントＡＴＧ−２６７１のＤ／Ｌ−ルシフェリンでの動力学的活性の代表的なグラフを含む。
【図１６Ａ】は、２種の緩衝液組成物における、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）のルシフェリンでの動力学解析及びＡＴＧ−２２８９バリアントのＣＳ０３３３での動力学解析の代表的結果を含む。
【図１６Ｂ】は、２種の緩衝液組成物における、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）のルシフェリンでの動力学解析及びＡＴＧ−２２８９バリアントのＣＳ０３３３での動力学解析の代表的結果を含む。
【図１７】は、２種の緩衝液組成物における、配列番号１のＰｐｅバリアントの熱安定性ルシフェラーゼバリアント、ＡＴＧ−２８８９、ＡＴＧ−３５５２、及びＣ４５８４Ｄ７（Ｐ１Ｂ１０）酵素のルシフェリン及びＣＳ０３３３での動力学解析の代表的結果を含む。
【図１８】は、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）及びＡＴＧ−３６７４酵素の、それぞれＡＴＰと組み合わせたルシフェリン及びＣＳ０３３３での動力学解析の代表的結果を含む。飽和基質でのＡＴＰに対するＫｍが測定された。
【図１９Ａ】は、ｅｐＰＣＲを使用して同定された様々なルシフェラーゼ酵素バリアントの活性データ及び動力学解析の代表的結果を含む。
【図１９Ｂ】は、ｅｐＰＣＲを使用して同定された様々なルシフェラーゼ酵素バリアントの活性データ及び動力学解析の代表的結果を含む。バリアントＡＴＧ−３７０７のＣＳ０３３３基質での増強された活性を強調する。
【図１９Ｃ】は、ｅｐＰＣＲを使用して同定された様々なルシフェラーゼ酵素バリアントの活性データ及び動力学解析の代表的結果を含む。バリアントＡＴＧ−３７０７のＣＳ０３３３基質での増強された活性を強調する。
【図１９Ｄ】は、ｅｐＰＣＲを使用して同定された様々なルシフェラーゼ酵素バリアントの活性データ及び動力学解析の代表的結果を含む。バリアントＡＴＧ−３７０７のＣＳ０３３３基質での増強された活性を強調する。
【図１９Ｅ】は、ｅｐＰＣＲを使用して同定された様々なルシフェラーゼ酵素バリアントの活性データ及び動力学解析の代表的結果を含む。バリアントＡＴＧ−３７０７のＣＳ０３３３基質での増強された活性を強調する。
【図２０Ａ】は、増加する濃度のデヒドロルシフェリン、及びＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液（図２０Ａ）の存在下での様々なルシフェラーゼ酵素バリアントの発光のグラフを含む。
【図２０Ｂ】は、増加する濃度のデヒドロルシフェリン、及びＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液（図２０Ｂ）の存在下での様々なルシフェラーゼ酵素バリアントの発光のグラフを含む。
【図２０Ｃ】は、増加する濃度のデヒドロルシフェリン、及びＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液（図２０Ａ）またはＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液（図２０Ｂ）の存在下での様々なルシフェラーゼ酵素バリアントの発光のグラフから得られたＩＣ５０値（μＭ）を示す表（図２０Ｃ）を含む。
【図２１Ａ】は、増加する濃度のデヒドロルシフェリン、及びＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液（図２１Ａ）の存在下での様々なルシフェラーゼ酵素バリアントの発光のグラフを含む。
【図２１Ｂ】は、増加する濃度のデヒドロルシフェリン、及びＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液（図２１Ｂ）の存在下での様々なルシフェラーゼ酵素バリアントの発光のグラフを含む。
【図２１Ｃ】は、増加する濃度のデヒドロルシフェリン、及びＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液（図２１Ａ）またはＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液（図２１Ｂ）の存在下での様々なルシフェラーゼ酵素バリアントの発光のグラフから得られたＩＣ５０値（μＭ）を示す表（図２１Ｃ）を含む。
【図２２】は、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）及びＡＴＧ−２６７１バリアントに対するＣＳ０２８０（ジメチルルシフェリン）の阻害効果を実証する代表的結果を含む。
【図２３Ａ】は、ルシフェリン及び様々な５，５−二置換ルシフェリンアナログ有り無しの両方でのＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）の活性試験の代表的結果を含む。
【図２３Ｂ】は、ルシフェリン及び様々な５，５−二置換ルシフェリンアナログ有り無しの両方でのＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）の活性試験の代表的結果を含む。
【図２３Ｃ】は、ルシフェリン及び様々な５，５−二置換ルシフェリンアナログ有り無しの両方でのＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）の活性試験の代表的結果を含む。
【図２４Ａ】は、ルシフェリン及び様々な５，５−二置換ルシフェリンアナログ有り無しの両方でのＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）の活性試験の代表的結果を含む。
【図２４Ｂ】は、ルシフェリン及び様々な５，５−二置換ルシフェリンアナログ有り無しの両方でのＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）の活性試験の代表的結果を含む。
【図２５】は、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）、ＡＴＧ−２８８９、及びＡＴＧ−３５５２のＣＳ０３３３及びその分解生成物の存在下でのＫｉ値の要約を含む。
【図２６】は、アミノ酸置換Ｖ３００Ｇを含むルシフェラーゼ酵素バリアントのデヒドロ−Ｆ−ルシフェリンの存在下でのＩＣ50値を含む。
【図２７Ａ】は、カスパーゼ−３活性化アッセイにおける、プロルシフェリンである５，５−二置換ルシフェリンアナログ及びＡＴＧ−３７０７バリアントの有効性を実証する代表的結果を含む。
【図２７Ｂ】は、カスパーゼ−３活性化アッセイにおける、プロルシフェリンである５，５−二置換ルシフェリンアナログ及びＡＴＧ−３７０７バリアントの有効性を実証する代表的結果を含む。
【図２８Ａ】は、β−グルコシダーゼ活性化アッセイにおける、プロルシフェリンである５，５−二置換ルシフェリンアナログ及びＡＴＧ−３７０７バリアントの有効性を実証する代表的結果を含む。
【図２８Ｂ】は、β−グルコシダーゼ活性化アッセイにおける、プロルシフェリンである５，５−二置換ルシフェリンアナログ及びＡＴＧ−３７０７バリアントの有効性を実証する代表的結果を含む。
【図２９】は、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）及びＡＴＧ−２８７７バリアントの示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）解析の代表的結果を含む。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本開示の実施形態は、熱安定性ルシフェリンアナログと共に生物発光アッセイに使用するための増強されたルシフェラーゼ酵素バリアントを含む。特に、本開示は、５，５−二置換ルシフェリンアナログなどの熱安定性ルシフェリンに適合する増強された高活性ルシフェラーゼ酵素バリアントを使用した生物発光アッセイを実行するための組成物、アッセイ、及び方法を提供する。
【００２５】
現行のルシフェリンベースの生物発光試薬は、ルシフェリン基質のラセミ化及びルシフェラーゼの活性に対して阻害性であり得る生成物への分解に起因するその熱不安定性により制限される。特に、ルシフェリンのデヒドロルシフェリンへの分解は、ナノモルレベルでさえルシフェラーゼ酵素（例えば、ＵｌｔｒａＧｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼ；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の強力な阻害をもたらすことを示した。この分解は、特に、構成成分が液体として、及び／または周囲温度（またはより低い温度、非凍結温度、もしくはより高い温度など）で保存される場合などの保存条件下で、最終的にこれらの試薬を使用した製品の性能及び寿命を制限する。様々な化学修飾によりデヒドロルシフェリンに分解しないルシフェリンアナログが作製されてきた。例えば、ルシフェリンを含有する生物発光試薬の安定性を改善及び増強するためにルシフェリンの５位に修飾が組み込まれたルシフェリンアナログが開発されてきた（例えば、米国特許出願第１５／８２９，５８１号／ＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６４２８４号（これらは全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の５，５−二置換ルシフェリン及びルシフェリンアナログ）。しかしながら、これらのルシフェリンアナログは、多数のルシフェラーゼ酵素の貧基質であり（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｌｅｓｓｏｎｓ  Ｌｅａｒｎｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｌｕｍｉｎｏｕｓ  Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎｓ  ａｎｄ  Ｌａｔｅｎｔ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｓ．”  ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１８  Ｆｅｂ  １９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、非常に少ない生物発光を示すか、または生物発光を示さず、場合によっては、ルシフェラーゼ酵素のその天然の基質（ルシフェリン）に対する競合阻害を示す。
【００２６】
この項及び本明細書における全ての開示内容において使用されている見出しは、単に編成のためであり、限定することを意図しない。
【００２７】
定義
特に定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含め、本文書が優先する。本明細書に記載されるものと同様または同等な方法及び材料が本開示の実施または試験に使用され得るが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書において開示される材料、方法、及び例は例示にすぎず、限定することを意図しない。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」、及びこれらの変化形は、追加の行為または構造の可能性を排除しない開放型の移行句、専門用語、または単語であることを意図する。単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈で明確に指示されない限り、複数形を含む。本明細書における多数の実施形態が、オープンランゲージ「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用して記載される。かかる実施形態は、複数のクローズドな「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」及び／または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」実施形態を包含し、代替的に、これらはかかるランゲージを使用して特許請求または記載される。本開示はまた、明示的に記載されているかどうかにかかわらず、本明細書において述べられる実施形態または要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」、及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」他の実施形態も意図する。
【００２９】
本明細書における数値範囲の記載では、それらの間にある同程度の精度の各数値が明示的に意図される。例えば、６〜９の範囲では、６及び９に加えて７及び８の数値が意図され、６．０〜７．０の範囲では、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０の数値が明示的に意図される。
【００３０】
「アミノ酸」は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及びアミノ酸アナログを指し、特に明記しない限り、全てがＤ及びＬ立体異性体である（それらの構造がかかる立体異性体形態を可能にする場合）。
【００３１】
天然アミノ酸としては、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、及びバリン（ＶａｌまたはＶ）が挙げられる。
【００３２】
非天然アミノ酸としては、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、ナフチルアラニン（「ｎａｐｈ」）、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、三級ブチルグリシン（「ｔＢｕＧ」）、２，４−ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン（「ｈＰｒｏ」または「ｈｏｍｏＰ」）、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン（「３Ｈｙｐ」）、４−ヒドロキシプロリン（「４Ｈｙｐ」）、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルアラニン（「ＭｅＡｌａ」または「Ｎｉｍｅ」）、Ｎ−メチルグリシンが含まれるＮ−アルキルグリシン（「ＮＡＧ」）、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシンが含まれるＮ−アルキルペンチルグリシン（「ＮＡＰＧ」）、Ｎ−メチルバリン、ナフチルアラニン、ノルバリン（「Ｎｏｒｖａｌ」）、ノルロイシン（「Ｎｏｒｌｅｕ」）、オクチルグリシン（「ＯｃｔＧ」）、オルニチン（「Ｏｒｎ」）、ペンチルグリシン（「ｐＧ」または「ＰＧｌｙ」）、ピペコリン酸、チオプロリン（「ＴｈｉｏＰ」または「ｔＰｒｏ」）、ホモリジン（「ｈＬｙｓ」）、及びホモアルギニン（「ｈＡｒｇ」）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
「アミノ酸アナログ」は、Ｃ末端カルボキシ基、Ｎ末端アミノ基、及び側鎖生理活性基のうちの１つ以上が可逆的もしくは不可逆的に、化学的にブロックされているか、またはそうでない場合には別の生理活性基に修飾されている天然または非天然アミノ酸を指す。例えば、アスパラギン酸−（β−メチルエステル）は、アスパラギン酸のアミノ酸アナログであり、Ｎ−エチルグリシンは、グリシンのアミノ酸アナログであり、アラニンカルボキサミドは、アラニンのアミノ酸アナログである。他のアミノ酸アナログとしては、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システイン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システインスルホキシド、及びＳ−（カルボキシメチル）−システインスルホンが挙げられる。
【００３４】
「見かけのシグナル安定性」は、特定の一連の条件下（例えば、インヒビターの存在下）での酵素（例えば、ルシフェリン及びＡＴＰと組み合わせたルシフェラーゼ）からのシグナル（例えば、発光）の持続性を指す。「増強された見かけのシグナル安定性」は、参照条件下でルシフェリン及びＡＴＰと組み合わせた酵素（例えば、ルシフェラーゼ）からのシグナルの持続性と比較した、特定の一連の条件下でのルシフェリン及びＡＴＰと組み合わせた同一酵素からのシグナル（例えば、発光シグナル）の持続性の増加を指す。例えば、ルシフェリン及びＡＴＰと組み合わせたバリアントルシフェラーゼは、インヒビターの存在下で増強された見かけのシグナル安定性を示し得る（例えば、ルシフェラーゼからの最初のシグナルを低下させることによって、時間経過によるシグナルの損失が減少する）。幾つかの実施形態では、ルシフェリン及びＡＴＰと組み合わせたバリアントルシフェラーゼが、ルシフェリン及びＡＴＰと組み合わせた参照ルシフェラーゼと比較して（例えば、配列番号１などの参照ルシフェラーゼと比較して）、見かけのシグナル安定性のより大きな増強を示す場合、ルシフェリン及びＡＴＰと組み合わせたバリアント酵素は、「見かけのシグナル安定性の増強の増加」を示す。
【００３５】
「生物発光」は、酵素、タンパク質、タンパク質複合体、または他の生体分子（例えば、生物発光複合体）により触媒されるか、または可能にされる化学反応による光の生成及び放出を指す。典型的な実施形態では、生物発光主体（例えば、生物発光タンパク質または生物発光複合体）の基質は、当該生物発光主体によって不安定な形態に変換され、その後に当該基質が発光する。
【００３６】
「増強された」は、特定の特性における、参照のそれと比較した改善を指す。例えば、ルシフェラーゼバリアントの特性（例えば、発光、シグナル安定性、生体適合性、タンパク質安定性（例えば、酵素安定性）、またはタンパク質発現）を記載するために使用する場合、「増強された」は、参照ルシフェラーゼ（配列番号１など）と比較したその特性における改善（例えば、１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、５０％、７５％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、もしくはそれ以上、またはそれらの間の範囲）を指す。バリアントルシフェラーゼは、「増強された発光」、「増強されたシグナル安定性」、「増強された酵素安定性」、「増強されたタンパク質発現」などのうちの１つ以上を示し得る（例えば、配列番号２）。
【００３７】
「増強されたシグナル安定性」は、シグナル持続時間（例えば、ルシフェリン及びＡＴＰと組み合わせた参照酵素（例えば、配列番号１）と比較した、酵素（例えば、ルシフェリン及びＡＴＰと組み合わせたルシフェラーゼ）からのシグナル強度（例えば、発光シグナル）の持続性）の増加を指す。
【００３８】
「酵素安定性」は、特定の一連の条件（例えば、温度、ｐＨ、イオン濃度、インヒビターなど）への曝露後に活性を維持する酵素の能力を指す。例えば、対照酵素と比較して増強された安定性を示す酵素は、一連の条件への曝露に際して、当該対照酵素と比べて活性のより小さな損失を示す。
【００３９】
「インヒビター耐性」及び「インヒビターに対する増強された耐性」は、インヒビターまたは酵素活性の存在下で、酵素の参照バージョン（例えば、当該酵素の天然の野生型バージョン）と比べてより高い活性を保持する当該酵素を指す。インヒビター耐性酵素は、必ずしもインヒビターに対して１００％耐性があるわけではない。例えば、「インヒビター耐性ルシフェラーゼ」は、参照ルシフェラーゼ（例えば、配列番号１）と比較した場合に、ＡＴＰ及びルシフェラーゼインヒビター（例えば、デヒドロルシフェリン、フルオロデヒドロルシフェリン、アミノデヒドロルシフェリン、Ｌ−ルシフェリンなど）の存在下で、より高いルシフェラーゼ活性（例えば、ルシフェリンのオキシルシフェリンへの変換、ＲＬＵ出力など）を保持する（例えば、より小さな損失百分率を示す）ポリペプチドである。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「単離ポリヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチド（例えば、ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくは合成由来のポリヌクレオチド、またはそれらの組合せ）であって、その供給源によって、当該単離ポリヌクレオチドが、当該「単離ポリヌクレオチド」が天然に見出されるポリヌクレオチドの全てもしくは一部と会合していないか、天然に連結されていないポリヌクレオチドに操作可能に連結されているか、またはより長い配列の一部として天然に生じない、当該ポリヌクレオチドを意味する。
【００４１】
「ルシフェリン」は、以下の構造：
2021526800.tif 000002
を有する化合物を指す。
【００４２】
ルシフェリンは「Ｌ−ルシフェリン」もしくは「Ｄ−ルシフェリン」またはＬ形態及びＤ形態のルシフェリンのラセミ混合物として存在し得る。特に明記しない限り（例えば、「Ｌ−ルシフェリン」、「ラセミルシフェリン混合物」など）、用語「ルシフェリン」はＤ−形態を指す。用語「ルシフェリン類」は、ホタルルシフェラーゼの基質として機能する生物発光化合物（またはそのキラル姉妹）のクラスをより広範に指し、これには、例えば、ルシフェリンの誘導体、例えば、アミノルシフェリン、フルオロルシフェリンなどが含まれる。
【００４３】
「ルシフェリン誘導体」または「ルシフェリンアナログ」は、構造的にルシフェリンに関連し、同様の環状構造を有し、同様であるが、必ずしも同一ではない置換基を有する化合物のクラスを指す。ルシフェリン誘導体は、通常、環状構造における二重結合の存在もしくは非存在及び／または異なる置換基（例えば、ハロゲン基、オキソ基、アミノ基、ＯＨ基、ＣＨ3基、ＣＮなど）の存在によってルシフェリンと異なる。一部のルシフェリン誘導体は、ホタルルシフェラーゼの基質であり、他はホタルルシフェラーゼのインヒビターである。ルシフェリン誘導体及びルシフェリンアナログを開示している参考文献としては、例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｌｅｓｓｏｎｓ  Ｌｅａｒｎｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｌｕｍｉｎｏｕｓ  Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎｓ  ａｎｄ  Ｌａｔｅｎｔ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｓ．”  ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１８  Ｆｅｂ  １９；及びＲａｔｈｂｕｎ，Ｃ．Ｍ．ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｐｒｅｓｃｈｅｒ  （２０１７）．“Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｂｅｙｏｎｄ  ｔｈｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｄｉｓｈ．“  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５６（３９）：５１７８−５１８４が挙げられる。更なるアナログが、Ｒａｔｈｂｕｎ，Ｃ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）．“Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｔｏｏｌｓ．”  ＡＣＳ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３（１２）：１２５４−１２６１に記載されている。
【００４４】
「ルシフェリン反応生成物」は、ホタルルシフェラーゼの基質ではないルシフェリン誘導体を指し、ルシフェリンからのこれらの生成は、光生成反応においてルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ）により触媒される。ルシフェリン反応生成物の例としては、オキシルシフェリン、アミノオキシルシフェリン、フルオロオキシルシフェリンなどが挙げられる。
【００４５】
「ルシフェリン分解生成物」は、ホタルルシフェラーゼの基質ではないルシフェリン誘導体を指し、これらの生成は、通常、ルシフェラーゼにより触媒されず、顕著な光の生成をもたらさない反応においてルシフェリンの化学的分解により起こる。ルシフェリン反応生成物の例としては、デヒドロルシフェリン、アミノデヒドロルシフェリン、フルオロデヒドロルシフェリンなどが挙げられる。
【００４６】
「ペプチド」は、ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸のオリゴマーから短いポリマーまでを指す。他のアミノ酸ポリマー（例えば、タンパク質、ポリペプチドなど）とは対照的に、ペプチドは約５０アミノ酸長以下である。ペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸アナログ、及び／または修飾アミノ酸を含み得る。ペプチドは天然に存在するタンパク質または非天然（人工的な）配列の部分配列であり得る。
【００４７】
「ポリペプチド」は、約５０アミノ酸長を超える、ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸のポリマーを指す。ポリペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸アナログ、及び／または修飾アミノ酸を含み得、天然に存在する配列もしくは非天然（人工的な）配列、または天然に存在するタンパク質もしくは非天然（人工的な）配列の部分配列であり得る。「人工的な」は、人によって設計または調製され、かつ天然に存在しない組成物及びシステムを指す。例えば、人工的な配列は、天然に存在しないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列（例えば、天然に存在するタンパク質またはその断片と１００％同一でないポリペプチド）を指す。「保存的」アミノ酸置換は、ペプチドまたはポリペプチドにおけるアミノ酸の、同様の化学的性質、例えば、サイズまたは電荷を有する別のアミノ酸との置換を指す。本開示の目的では、以下の８つの群の各々は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）及びグリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、及びバリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ）；ならびに
８）システイン（Ｃ）及びメチオニン（Ｍ）。
【００４８】
天然に存在する残基は、共通する側鎖の性質に基づいて、例えば、以下のクラスに分類され得る：極性正電荷（または塩基性）（ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、及びアルギニン（Ｒ））；極性負電荷（または酸性）（アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ））；極性中性（セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ））；非極性脂肪族（アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ））；非極性芳香族（フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ））；プロリン及びグリシン；ならびにシステイン。本明細書で使用する場合、「半保存的」アミノ酸置換は、ペプチドまたはポリペプチドにおけるアミノ酸の、同一クラス内の別のアミノ酸との置換を指す。
【００４９】
幾つかの実施形態では、特に明記しない限り、保存的または半保存的アミノ酸置換は、天然の残基と同様の化学的性質を有する天然に存在しないアミノ酸残基も包含し得る。これらの非天然の残基は、通常、生物学的系における合成ではなく化学的なペプチド合成によって組み込まれる。これらとしては、ペプチド模倣体、及び他の反転形態または逆形態のアミノ酸部分が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書における実施形態は、幾つかの実施形態では、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及び／またはアミノ酸アナログに限定され得る。非保存的置換は、１つのクラスのメンバーの、別のクラスのメンバーとの交換を伴い得る。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「試料」、「試験試料」、「検体」、「対象由来の試料」、及び「患者試料」は、互換的に使用され得、全血などの血液試料、組織、尿、血清、血漿、羊水、脳脊髄液、胎盤細胞もしくは組織、内皮細胞、白血球、または単球であり得る。試料は、患者から取得される際に直接使用され得るか、または本明細書において述べられるか、もしくはそうでなければ当該技術分野において公知の幾つかの様式に試料の特徴を改変するために、例えば、濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、干渉する構成成分の不活性化、試薬の添加などによって前処理され得る。
【００５１】
「シグナル持続時間」は、例えば、時間経過におけるシグナルの減衰の半減期、または（例えば、検出可能な減衰の前の）シグナルが一定を維持する時間の長さよって測定される、シグナルの持続性を指す。用語「シグナル安定性」は、酵素（例えば、ルシフェラーゼ）の固有のシグナル持続時間を指す。
【００５２】
「配列同一性」は、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸など）が同一の単量体サブユニットの配列組成を有する程度を指す。用語「配列類似性」は、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸など）が類似のポリマー配列を有する程度を指す。例えば、類似のアミノ酸とは、同一の生物物理学的特性を共有するものであり、例えば、酸性（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び非荷電極性（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）ファミリーに分類され得る。「配列同一性パーセント」（または「配列類似性パーセント」）は、（１）２つの最適にアラインメントした配列を比較ウインドウ（例えば、より長い配列の長さ、より短い配列の長さ、指定されたウインドウ）にわたって比較すること、（２）同一の（類似の）単量体を含む位置（例えば、同一のアミノ酸が両方の配列に見出される位置、類似のアミノ酸が両方の配列に見出される位置）の数を決定して、一致した位置の数を得ること、及び（３）一致した位置の数を比較ウインドウ（例えば、より長い配列の長さ、より短い配列の長さ、指定されたウインドウ）内の位置の総数で割ること、（４）結果に１００を乗じて配列同一性パーセントまたは配列類似性パーセントを得ること、により算出される。例えば、ペプチドＡ及びペプチドＢが両方とも２０アミノ酸長であり、１つの位置を除いて同一のアミノ酸を有する場合、ペプチドＡ及びペプチドＢは９５％の配列同一性を有する。同一でない位置でのアミノ酸が同一の生物物理学的特性（例えば、両方が酸性である）を共有する場合、ペプチドＡ及びペプチドＢは１００％の配列類似性を有する。別の例として、ペプチドＣが２０アミノ酸長であり、ペプチドＤが１５アミノ酸長であり、ペプチドＤにおける１５アミノ酸のうち１４アミノ酸がペプチドＣの一部のアミノ酸と同一である場合、ペプチドＣ及びペプチドＤは７０％の配列同一性を有するが、ペプチドＤはペプチドＣの最適な比較ウインドウに対して９３．３％の配列同一性を有する。本明細書における「配列同一性パーセント」（または「配列類似性パーセント」）を算出する目的上、アラインメントされた配列における任意のギャップはその位置でのミスマッチとして処理される。参照配列ＩＤ番号との特定の配列同一性パーセントまたは配列類似性パーセント（例えば、少なくとも７０％）を有すると本明細書に記載されるいずれのポリペプチドも、その参照配列に対して最大数の置換（または末端欠失）を有すると表現され得る。例えば、「配列番号Ｚと少なくともＹ％の配列同一性を有する」配列は、配列番号Ｚと比較してＸまでの置換を有し得、従って、「配列番号Ｚと比較してＸ以下の置換を有する」とも表現され得る。
【００５３】
「保存安定性」は、様々な時点で測定される場合（例えば、終点測定）の酵素（例えば、ルシフェリン及びＡＴＰと組み合わせたルシフェラーゼ）からのシグナル（例えば、発光）の一貫性を指す。例えば、保存されたルシフェラーゼ（例えば、基質と共に水溶液中に保存された）のアリコートの発光が、ルシフェラーゼの保存に関連する様々な時点（例えば、日、週など）で、（例えば、ルシフェリン及びＡＴＰの存在下で）測定され、経時的により一貫性（例えば、より少ないシグナル損失、減衰前のより長い持続時間など）をもたらす酵素または一連の条件は、「増強された保存安定性」を示す。バリアント酵素（例えば、インヒビター耐性バリアント）が野生型酵素と比較して増強された保存安定性を示し得、及び／または特定の一連の条件（例えば、インヒビターの存在下）が参照条件と比較して増強された保存安定性をもたらし得る。一部のルシフェラーゼは、ルシフェリンの存在下で保存した場合、ルシフェラーゼに対して阻害性であるルシフェリン分解生成物の形成に起因して、制限された保存安定性を示す。幾つかの実施形態では、インヒビター耐性ルシフェラーゼは、増加した保存安定性を示す。幾つかの実施形態では、ルシフェリン基質及びインヒビター（例えば、デヒドロルシフェリン、フルオロデヒドロルシフェリン、アミノデヒドロルシフェリン、Ｌ−ルシフェリンなど）の両方を含む保存条件は、例えば、早い時点のシグナルを減少させて、遅い時点のシグナルをより密接に反映することによって増強された保存安定性をもたらす。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「対象」及び「患者」は、哺乳動物及びヒトが含まれるがこれらに限定されない任意の脊椎動物を互換的に指す。幾つかの実施形態では、対象は、ヒトまたはヒト以外であり得る。対象または患者は、複数の処置法を受けていてもよい。本明細書で使用する場合、「哺乳動物」は、限定されるものではないが、ヒトならびにチンパンジーならびに他の類人猿及びサル種などの非ヒト霊長類；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラマ、ラクダ、及びウマなどの家畜；イヌ及びネコなどの家庭用動物；げっ歯動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモットなどが含まれる実験動物が挙げられる哺乳綱の任意のメンバーを指す。この用語は、特定の年齢または性別を意味しない。従って、雄性または雌性にかかわらず、胎児に加えて成体及び新生児の対象が、この用語の範囲内に含まれることを意図する。
【００５５】
「部分配列」は、別のより長いペプチドまたはポリペプチドと１００％の配列同一性を有するペプチドまたはポリペプチドを指す。部分配列は、より長いアミノ酸鎖の一部と完全に配列が一致する。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「実質的に」は、記載された特性、パラメータ、及び／または値が正確に達成される必要はないが、例えば、許容誤差、測定誤差、測定精度限界、及び当業者に公知の他の要因を含む偏差または変動が、特徴が提供することを意図した効果を排除しない量で起こり得ることを意味する。実質的に存在しない（例えば、実質的に非発光性の）特性または特徴とは、ノイズの範囲内であるか、バックグラウンドより低いか、使用されているアッセイの検出能力未満であるか、または顕著な特性（例えば、生物発光タンパク質または生物発光複合体の発光強度）のほんの小数（例えば、＜１％、＜０．１％、＜０．０１％、＜０．００１％、＜０．００００１％、＜０．０００００１％、＜０．００００００１％）である、特性または特徴である。
【００５７】
「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持するペプチドまたはポリペプチドを表現するために本明細書において使用される。「ＳＮＰ」は、一塩基多型であるバリアントを指す。「生物活性」の代表例としては、特異的抗体により結合されるか、または免疫反応を促進する能力が挙げられる。またバリアントは、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を表現するために本明細書において使用される。アミノ酸の保存的置換（例えば、アミノ酸を、同様の特性（例えば、荷電領域の親水性、程度、及び分布）の異なるアミノ酸と置き換えること）は、微小な変化を一般的に伴うものと当該技術分野において認識されている。これらの微小な変化は、当該技術分野において理解されている通り、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することによって、ある程度同定され得る。アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性及び電荷の考慮に基づく。同程度の疎水性親水性指標のアミノ酸が置換されてもまだ、タンパク質機能を保持できることが、当技術分野において公知である。一態様では、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸が置換される。またアミノ酸の親水性は、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらすであろう置換を明らかにするために使用され得る。ペプチドという文脈でのアミノ酸の親水性の考慮は、抗原性及び免疫原性とよく相関することが報告されている有用な尺度である、そのペプチドの最大の局所的平均親水性の算出を可能にする。同程度の親水性値を有するアミノ酸の置換は、当該技術分野において理解されているように、生物活性、例えば、免疫原性を保持するペプチドをもたらし得る。互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸での置換が実施され得る。アミノ酸の疎水性指標と親水性値のいずれも、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。この知見と一致して、生物学的機能に適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、大きさ、及び他の性質によって明らかにされる、アミノ酸、特にそのアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存することが理解されよう。
【００５８】
本明細書で定義されない限り、本開示に関して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。例えば、本明細書に記載される、細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質及び核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関して使用される任意の専門用語及びそれらの技術は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。用語の意味及び範囲は明確でなければならない。しかしながら、潜在的な曖昧さがある場合には、本明細書において提供される定義が任意の辞書または外部からの定義に優先する。更に、文脈により必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。
【００５９】
熱安定性ルシフェリンアナログ
本開示の実施形態は、熱安定性５，５−二置換ルシフェリンアナログと組み合わされる場合に高い活性（例えば、１０倍〜１００，０００，０００倍の改善）を付与する変異を含有する改善及び増強されたルシフェラーゼ酵素バリアント（例えば、配列番号１のＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアントのバリアント）を含む。これらの増強されたルシフェラーゼ酵素の熱安定性ルシフェリンアナログとの組み合わせは、改善された熱的安定性、活性、及び寿命を有する生物発光アッセイを実行するための生物発光アッセイ系／プラットフォームを含む。この増強された生物発光アッセイ系／プラットフォームは、例えば、現行の制限を越える幅広い温度領域で一定期間安定している簡略化された単一の液体試薬配合物を最小限の性能の損失で可能にすることによって、現在利用可能なシステム／プラットフォームを超える顕著な利点を提供する。熱安定性ルシフェリンアナログとしては、図１に示す５，５−二置換ルシフェリンまたはルシフェリンアナログが挙げられる。５，５−二置換ルシフェリンまたはルシフェリンアナログは予想外の熱的安定性を示し、ルシフェリン分解生成物（例えば、デヒドロルシフェリン）によって引き起こされる阻害が実質的に低減されたルシフェラーゼ検出システムを提供し得る。
【００６０】
Ｄ−ルシフェリンは、ホタルルシフェラーゼ及びコメツキムシルシフェラーゼの天然の基質であり、ルシフェラーゼレポーター酵素を用いた生物発光アッセイにおいて基質として使用され得る。しかしながら、Ｄ−ルシフェリンは、熱的に不安定であり、周囲温度にて原液中で経時的に分解する。デヒドロルシフェリンは、ルシフェリンの分解生成物として同定された。これらのデヒドロルシフェリンはルシフェラーゼの強力なインヒビターであり、ルシフェラーゼベースの生物発光アッセイにおいて光出力の減少を引き起こし得る。幾つかの実施形態では、５，５−二置換ルシフェリンは、ルシフェリンが長期間にわたり周囲温度で溶液中に保存されることを必要とする用途に特に有用である。幾つかの実施形態では、５，５−二置換ルシフェリンは、多数の生細胞生物発光アッセイまたは生細胞イメージング法において増加した安定性及び反応性を提供する。幾つかの実施形態では、５，５−二置換ルシフェリンは、甲虫（例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ（Ｐｐｙ）及びＰｈｏｔｕｒｉｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ（Ｐｐｅ）（北米のホタル）、Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ（Ｐｐｌ）（ジャマイカのコメツキムシ））、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（シーパンジー）、及び幾つかの細菌（例えば、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ及びＶｉｂｒｉｏ属菌種）などの様々な生物において見出されるルシフェラーゼ及び発光タンパク質が含まれるが、これらに限定されない、ルシフェリンを利用して発光を生じるルシフェラーゼ酵素（「ルシフェリンを利用する酵素」）の基質である。５，５−二置換ルシフェリンは、歴史的に、ホタルルシフェラーゼにより媒介されるプロセスにより光を生成することができないと考えられている。具体的には、５，５−二置換ルシフェリンは、一般に、酵素プロセスによって（例えば、ホタルルシフェラーゼによって）ではなく、化学発光プロセスによってのみ光を生成すると考えられている。幾つかの実施形態では、本開示の化合物は、コメツキムシルシフェラーゼにより利用されて酵素プロセスにより発光を生じることができる。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼは、様々な立体異性体形態及び混合物（例えば、Ｌ−型及びＤ−型）の５，５−二置換ルシフェリンアナログを効率的に利用して生物発光を生じ、広範なｐＨ範囲にわたり機能する。幾つかの実施形態では、これは、ラセミ化によりシグナル安定性が損なわれ得る用途におけるラセミ体の使用を提供する。
【００６１】
熱安定性
幾つかの実施形態では、５，５−二置換ルシフェリンは、他の公知のルシフェリンより優れた熱的安定性を示す。デヒドロルシフェリンは、溶液中での経時的なＤ−ルシフェリンの分解によりもたらされる主な生成物として同定された。デヒドロルシフェリンはルシフェラーゼを阻害し、このことは、光出力の減少をもたらし、ルシフェラーゼアッセイへの顕著な影響を引き起こす。５，５−ジメチルルシフェリンでは（例えば、６−ＯＨ化合物及び６−ＮＨ2化合物では）ごくわずかな分解しか起こらないが、非置換ルシフェリンでは、対応するデヒドロルシフェリンの生成を伴う顕著な分解が起こるために、本開示の５，５−二置換ルシフェリンアナログは、溶液中で改善された熱的安定性を示す。幾つかの実施形態では、５，５−二置換は、デヒドロルシフェリン形成の可能性を排除することにより、ルシフェリンアナログ化合物の全体的な熱的安定性を改善する。
【００６２】
本明細書で使用する場合、ルシフェリン／ルシフェリンアナログに関する「熱的安定性」または「熱安定性」は、一般に、ルシフェリンアナログ化合物が、ある期間にわたり溶液中でどの程度ルシフェラーゼ存在下（例えば、ルシフェラーゼを使用した生細胞アッセイが含まれる）で光を生成する能力を維持するように安定しているかを指す。ルシフェリンアナログの溶液としては、ルシフェラーゼが存在する液体培地、例えば、ルシフェラーゼアッセイに使用するための水性緩衝液系が挙げられ得る。本開示の化合物の安定性は、特定の環境における化合物の経時的な分解百分率により実証され得る。幾つかの実施形態では、特定の化合物の純度百分率は、当業者に公知の種々の技術により決定される。これらの技術としては、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が挙げられる。幾つかの実施形態では、本開示の化合物の熱的安定性は、特定の化合物の溶液が、ある温度にてある一定期間にわたりルシフェラーゼの非存在下または存在下で保存された後に決定される。保存中の温度は、５℃以上、１０℃以上、１５℃以上、２０℃以上、３０℃以上、４０℃以上、５０℃以上、６０℃以上、または７０℃以上であり得る。幾つかの実施形態では、ルシフェリンアナログ化合物は、なんらのヌクレオチド三リン酸（例えば、ＡＴＰ）またはヌクレオチド三リン酸を形成することができる化学種も含有しない溶液中でルシフェラーゼ（またはルシフェラーゼを含有する試料）と組み合わされ得、一定期間ある温度（２０℃〜７０℃など）で維持され得る。
【００６３】
５，５−二置換ルシフェリンアナログ化合物は、５，５−二置換を欠くルシフェリンアナログと比較して、同一期間にわたる優れた熱的安定性を実証する。幾つかの実施形態では、本発明の化合物は、ルシフェリンまたは５，５−二置換を欠くルシフェリンアナログと比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、または少なくとも５００％改善された熱的安定性を示す。これらのルシフェリンアナログ化合物の顕著な安定性により、ルシフェリンアナログが分解することなくより長い保存が可能となり、これは発光アッセイの種々の強化のために使用され得る。
【００６４】
幾つかの実施形態では、本発明の化合物の熱安定性は、本発明の化合物を添加剤と共に溶液中で保存することにより増強され得る。これらの添加剤は、酸化的分解または他の形態の分解を防止することによりルシフェリンアナログ化合物の安定性を増強し得る。安定性の増強は、還元により酸化化合物を変換し元の化合物に戻すことによって、または他の機構によって、酸素または過酸化水素などの活性酸素種を除去することによるものであり得る。幾つかの実施形態では、これらの添加剤は、本発明のルシフェリンアナログ化合物とルシフェラーゼとの反応に適合し、光生成の減少を引き起こさない。幾つかの実施形態では、これらの添加剤は、米国特許出願番号第６２／５４１，３５０号（これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような、アザチオチミジン（ＡＴＴ）またはそのアナログである。幾つかの実施形態では、添加剤は、チオ尿素または別の炭素−硫黄二重結合含有化合物である。
【００６５】
本明細書で使用する場合、本明細書に記載される酵素バリアントに関する「熱的安定性」または「熱安定性」は、一般に、様々な温度及び様々な時点で測定される場合の、酵素バリアント（例えば、ルシフェリン及びＡＴＰと組み合わせたルシフェラーゼバリアント）からのシグナル（例えば、発光）の一貫性を指す。例えば、（例えば、基質と共に水溶液中に保存された）ルシフェラーゼバリアントのアリコートの発光は、様々な時点（例えば、分、時間、日、週など）及び様々な温度で、（例えば、ルシフェリン及びＡＴＰの存在下で）測定され、経時的に、かつ所与の温度でより一貫性（例えば、より少ないシグナル損失、減衰前のより長い持続時間など）をもたらす酵素または一連の条件は、「熱安定性」を示し得る。場合によっては、酵素バリアントの熱安定性は、参照ルシフェラーゼ酵素または参照ルシフェラーゼバリアント酵素の熱安定性と対照して、またはそれらと比較して測定され、熱安定性は、参照酵素を基準として、経時的に、かつ所与の温度で改善または増強され得る（例えば、より少ないシグナル損失、減衰前のより長い持続時間など）。
【００６６】
光生成
５，５−二置換ルシフェリンアナログ化合物は、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントと共に使用された場合に十分な光を生成して、ルシフェラーゼアッセイに使用するための好適な基質となる。幾つかの実施形態では、本明細書において開示されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、様々な条件下のルシフェラーゼアッセイにおいて、５，５−ジメチルルシフェリンを用いて他のルシフェラーゼにより見られるよりも非常に強い光シグナルを提供する。本開示以前では、任意の特定の５，５−二置換ルシフェリンアナログがルシフェラーゼアッセイで有用となるのに十分な光を生成するかどうかが、以前の研究からは明らかでなかった。
【００６７】
幾つかの実施形態では、ルシフェリンアナログ化合物は、周囲温度または高い温度（例えば、３０〜７０℃）にて溶液中で、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも８０時間、少なくとも１００時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１５０時間、少なくとも２００時間、少なくとも２５０時間、少なくとも３００時間、少なくとも３５０時間、または少なくとも４００時間の間、安定した発光シグナルを提供する。幾つかの実施形態では、ルシフェリンアナログ化合物は、周囲温度にてルシフェラーゼアッセイ培地中で１００〜４００時間の間、安定した発光シグナルを提供する。溶液中での改善された熱的安定性を有する本開示のルシフェリンアナログ化合物により、ルシフェリン溶液中の周囲温度での経時的な長期保存が必要とされる用途が可能となる。ルシフェリンアナログ化合物は、デヒドロルシフェリンの形成が顕著かつ有害である用途、例えば、活性酸素種（ＲＯＳ）検出アッセイまたはチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ４５０）アッセイに特に有用であり得る。
【００６８】
増強されたルシフェラーゼ酵素
本開示の実施形態は、生物発光アッセイにおいて熱安定性５，５−二置換ルシフェリンアナログと組み合わされた場合に高い活性（例えば、１０倍〜１，０００，０００倍以上の改善）を付与するアミノ酸置換を含有する、改善及び増強されたルシフェラーゼ酵素バリアント（例えば、配列番号１のＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアントのバリアント）を提供する。熱安定性５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で配列番号１のルシフェラーゼポリペプチドにより生成される生物発光シグナルと比較して改善された活性（例えば、生物発光シグナル）を有するバリアントを同定する試みの一部として、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドが、図２Ａ〜２Ｂに示すように、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（ＡＴＧ−２２８７または配列番号１）の配列に基づいて作製された。図２Ａ及び２Ｂは、活性部位飽和スクリーニング、合理的突然変異誘発、デヒドロＬＨ2耐性スクリーニング、組み合わせ解析、線形回帰解析、ならびにエラープローンＰＣＲ及びＤＮＡシャフリングを使用した、これらのルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドの作製を要約する。本開示のルシフェラーゼポリペプチドにおいて同定される配列番号１と比較したアミノ酸置換を、以下の表１に提供する。
表１：増強されたルシフェラーゼポリペプチド
【００６９】
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【００７０】
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【００７１】
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【００７２】
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【００７３】
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【００７４】
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【００７５】
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【００７６】
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【００７７】
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【００７８】
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【００７９】
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【００８０】
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【００８１】
幾つかの実施形態では、本開示のルシフェラーゼ酵素バリアントは、５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下でＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）により生成される生物発光シグナルと比較して増加した生物発光シグナルを５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で生成することができるルシフェラーゼポリペプチドを含む。これらの実施形態によれば、ルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドは、天然に存在しない。幾つかの実施形態では、５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で配列番号１のルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドにより生成される生物発光シグナルは、ほぼバックグラウンドレベル（例えば、発光基質の非存在下で生成される生物発光シグナルの量）であるか、またはバックグラウンドレベル未満（ルシフェリンアナログにより阻害される）である。
【００８２】
幾つかの実施形態では、本開示のルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号２のポリペプチドとの少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはそれらの間の範囲）の配列同一性を含むルシフェラーゼポリペプチドを含む。幾つかの実施形態では、本開示のルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１のポリペプチドとの１００％未満（例えば、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、またはそれらの間で範囲）の配列同一性を含むルシフェラーゼポリペプチドを含む。幾つかの実施形態では、本開示のルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１との少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはそれらの間の範囲）の配列類似性（例えば、保存的または半保存的）を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較して１００以下（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれらの間の範囲）のアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較して１００以下（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれらの間の範囲）の非保存的置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較して１００以下（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれらの間の範囲）の半保存的置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較して１００以下（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれらの間の範囲）の保存的置換を含む。
【００８３】
幾つかの実施形態では、本開示のルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較して２４４位、２４９位、３３７位、及び３３９位での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較して２４４位、２４９位、３３７位、及び３３９位でのアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＨ２４４Ｗ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＨ２４４Ｇ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＨ２４４Ｒ置換を含む。
【００８４】
幾つかの実施形態では、本開示のルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較して２４０位、２５４位、及び３４４位での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較して２４０位、２５４位、及び３４４位でのアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＩ２４０Ｌ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＹ２５４Ｓ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＴ３４４Ａ置換を含む。
【００８５】
幾つかの実施形態では、本開示のルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較して３００位及び３９６位での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較して３００位及び３９６位でのアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＶ３００Ｇ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＩ３９６Ｋ置換を含む。
【００８６】
幾つかの実施形態では、本開示のルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較して２４５位、２８５位、及び３１５位での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較して２４５位、２８５位、及び３１５位でのアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＧ２４５Ａ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＬ２８５Ｉ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＧ３１５Ａ置換を含む。
【００８７】
幾つかの実施形態では、本開示のルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較して１０９位、１９３位、２１４位、２１８位、２２８位、２３４位、２６２位、２８７位、２９４位、３０５位、３０６位、３０９位、３１６位、３３５位、及び５３３位での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較して１０９位、１９３位、２１４位、２１８位、２２８位、２３４位、２６２位、２８７位、２９４位、３０５位、３０６位、３０９位、３１６位、３３５位、及び５３３位でのアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＩ１０９Ｖ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＳ１９３Ａ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＩ２１４Ｌ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＦ２１８Ｌ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＮ２２８Ｄ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＳ２３４Ｔ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＶ２６２Ａ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＶ２８７Ｉ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＬ２９４Ｈ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＬ３０５Ｆ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＳ３０６Ｐ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＫ３０９Ｅ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＡ３１６Ｓ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＶ３３５Ｇ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＶ５５３Ｍ置換を含む。
【００８８】
幾つかの実施形態では、本開示のルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較して１３３位、２３３位、２３６位、及び５０３位での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較して１３３位、２３３位、２３６位、及び５０３位でのアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＱ１３３Ｈ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＴ２３３Ｓ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＩ２３６Ｖ置換を含む。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してＳ５０３Ｒ置換を含む。
【００８９】
幾つかの実施形態では、本開示のルシフェラーゼ酵素バリアントは、表１に列挙するルシフェラーゼ酵素バリアントに対応するアミノ酸置換の組み合わせのいずれかが含まれる、上述のアミノ酸置換の任意の組み合わせを含む。
【００９０】
幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｉ２４０Ｌ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、及びＩ３９６Ｋ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む（例えば、ＡＴＧ−２６２４）。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｎ７４Ｎ、Ｈ２４４Ｒ、Ｖ３００Ｇ、及びＩ３９６Ｋ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む（例えば、ＡＴＧ−２６２５）。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む（例えば、ＡＴＧ−２８７７）。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、及びＩ３９６Ｋ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む（例えば、ＡＴＧ−２８７９）。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｔ３４４Ａ、及びＩ３９６Ｋ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む（例えば、ＡＴＧ−２８８９）。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｔ３４４Ａ、Ｉ３９６Ｋ、Ｖ３００Ｇ、Ｌ３０５Ｐ、及びＳ３０６Ｐ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む（例えば、ＡＴＧ−３５５２）。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１と比較してアミノ酸置換Ｈ２４４Ｗ、Ｙ２５４Ｓ、Ｔ３４４Ａ、Ｓ１９３Ａ、Ｎ２２８Ｄ、Ｌ３０５Ｆ、Ｓ３０６Ｐ、及びＩ１０９Ｖ、及び／または当該アミノ酸置換の任意の保存的もしくは半保存的バリエーションを含む（例えば、ＡＴＧ−３７０７）。
【００９１】
幾つかの実施形態では、本明細書において、熱的に安定である（例えば、０℃を超える保存温度（例えば、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、またはそれらの間の範囲）で安定である）ルシフェラーゼ酵素バリアントが提供される。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、０℃を超える温度（例えば、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、またはそれらの間の範囲）で１〜３６５日間（例えば、１日、２日、５日、１０日、２０日、３０日、４０日、５０日、７５日、１００日、１５０日、２００日、２５０日、３００日、３５０日、３６５日、またはそれらの間の範囲）保存される場合に、２０％未満（例えば、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下、またはそれらの間の範囲（例えば、５％以下））の活性の損失を示す。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１のルシフェラーゼと比較して増強された熱的安定性を示す。
【００９２】
幾つかの実施形態では、本明細書において、熱的に安定である（例えば、室温を超えるインキュベーション温度（例えば、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、またはそれらの間の範囲）で安定である）ルシフェラーゼ酵素バリアントが提供される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、室温を超える温度（例えば、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、またはそれらの間の範囲）での１〜１００分間（例えば、１分、２分、５分、１０分１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、９０分、９５分、１００分、またはそれらの間の範囲）のインキュベーション後に、２０％未満（例えば、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下、またはそれらの間の範囲（例えば、５％以下））の活性の損失を示す。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、配列番号１のルシフェラーゼと比較して増強された熱的安定性を示す。
【００９３】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、ルシフェリン（例えば、Ｄ−ルシフェリン、ラセミ体ルシフェリン混合物）及び／またはルシフェリン誘導体（例えば、５，５−二置換ルシフェリンアナログ）の存在下で保存される場合に安定である。幾つかの実施形態では、本明細書におけるルシフェラーゼ酵素バリアントは、ルシフェリン及び／またはルシフェリン誘導体（例えば、５，５−二置換ルシフェリンアナログ）の存在下で、１〜３６５日間（例えば、１日、２日、５日、１０日、２０日、３０日、４０日、５０日、７５日、１００日、１５０日、２００日、２５０日、３００日、３５０日、３６５日、またはそれらの間の範囲）保存される場合に、２０％未満（例えば、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下、またはそれらの間の範囲（例えば、５％以下））の活性の損失を示す。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、ルシフェリン及び／またはルシフェリン誘導体（例えば、５，５−二置換ルシフェリンアナログ）の存在下で、配列番号１のルシフェラーゼと比較して増強された安定性を示す。
【００９４】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、ルシフェリン分解生成物（例えば、デヒドロルシフェリン）及び／またはルシフェリン誘導体の分解生成物（例えば、フルオロデヒドロルシフェリン、アミノデヒドロルシフェリン、５，５−二置換ルシフェリンアナログの分解生成物など）の存在下で安定である。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、ルシフェリン分解生成物（例えば、デヒドロルシフェリン）及び／またはルシフェリン誘導体の分解生成物（例えば、フルオロデヒドロルシフェリン、アミノデヒドロルシフェリン、５，５−二置換ルシフェリンアナログの分解生成物など）の存在下で１〜３６５日間（例えば、１日、２日、５日、１０日、２０日、３０日、４０日、５０日、７５日、１００日、１５０日、２００日、２５０日、３００日、３５０日、３６５日、またはそれらの間の範囲）保存される場合に、２０％未満（例えば、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下またはそれらの間の範囲（例えば、５％以下））の活性の損失を示す。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、ルシフェリン分解生成物（例えば、デヒドロルシフェリン）及び／またはルシフェリン誘導体の分解生成物（例えば、フルオロデヒドロルシフェリン、アミノデヒドロルシフェリン、５，５−二置換ルシフェリンアナログの分解生成物など）による阻害に対する、配列番号１のルシフェラーゼと比較して増強された耐性を示す。
【００９５】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、Ｌ−ルシフェリン及び／またはラセミ体ルシフェリン混合物の存在下で安定である。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、Ｌ−ルシフェリン及び／またはラセミ体ルシフェリン混合物の存在下で１〜３６５日間（例えば、１日、２日、５日、１０日、２０日、３０日、４０日、５０日、７５日、１００日、１５０日、２００日、２５０日、３００日、３５０日、３６５日、またはそれらの間の範囲）保存される場合に、２０％未満（例えば、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下、またはそれらの間の範囲（例えば、５％以下））の活性の損失を示す。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、Ｌ−ルシフェリン及び／またはラセミ体ルシフェリン混合物による阻害に対する、配列番号１のルシフェラーゼと比較して増強された耐性を示す。幾つかの実施形態では、配列番号１のルシフェラーゼは、Ｌ−ルシフェリン及び／またはラセミ体ルシフェリン混合物の存在下での１〜３６５日間（例えば、１日、２日、５日、１０日、２０日、３０日、４０日、５０日、７５日、１００日、１５０日、２００日、２５０日、３００日、３５０日、３６５日、またはそれらの間の範囲）の保存後に、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントと比較して減少した活性を示す。
【００９６】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、ルシフェリン（例えば、Ｄ−ルシフェリン、ラセミ体ルシフェリン混合物）及び／またはルシフェリン誘導体（例えば、フルオロルシフェリン、アミノルシフェリン、ラセミ体ルシフェリン、５，５−二置換ルシフェリンアナログなど）の存在下で保存される場合に、熱的に安定である。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、ルシフェリン（例えば、Ｄ−ルシフェリン、ラセミ体ルシフェリン混合物）及び／またはルシフェリン誘導体（例えば、フルオロルシフェリン、アミノルシフェリン、５，５−二置換ルシフェリンアナログなど）の存在下で、０℃超（例えば、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、またはそれらの間の範囲）で１〜３６５日間（例えば、１日、２日、５日、１０日、２０日、３０日、４０日、５０日、７５日、１００日、１５０日、２００日、２５０日、３００日、３５０日、３６５日、またはそれらの間の範囲）保存される場合に、２０％未満（例えば、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下、またはそれらの間の範囲（例えば、５％以下））の活性の損失を示す。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、ルシフェリン（例えば、Ｄ−ルシフェリン、ラセミ体ルシフェリン混合物）及び／またはルシフェリン誘導体（例えば、フルオロルシフェリン、アミノルシフェリン、５，５−二置換ルシフェリンアナログなど）の存在下で、配列番号１のルシフェラーゼと比較して増強された熱的安定性を示す。
【００９７】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、ルシフェリン分解生成物（例えば、デヒドロルシフェリン）及び／またはルシフェリン誘導体の分解生成物（例えば、フルオロデヒドロルシフェリン、アミノデヒドロルシフェリン、５，５−二置換ルシフェリンアナログの分解生成物など）の存在下で熱的に安定である。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、ルシフェリン分解生成物（例えば、デヒドロルシフェリン）及び／またはルシフェリン誘導体の分解生成物（例えば、アミノデヒドロルシフェリン、フルオロデヒドロルシフェリン、５，５−二置換ルシフェリンアナログの分解生成物など）の存在下で、０℃超（例えば、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、またはそれらの間の範囲）で１〜３６５日間（例えば、１日、２日、５日、１０日、２０日、３０日、４０日、５０日、７５日、１００日、１５０日、２００日、２５０日、３００日、３５０日、３６５日、またはそれらの間の範囲）保存される場合に、２０％未満（例えば、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下、またはそれらの間の範囲（例えば、５％以下））の活性の損失を示す。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、ルシフェリン分解生成物（例えば、デヒドロルシフェリン）及び／またはルシフェリン誘導体の分解生成物（例えば、アミノデヒドロルシフェリン、フルオロデヒドロルシフェリン、５，５−二置換ルシフェリンアナログの分解生成物など）の存在下で、配列番号１のルシフェラーゼと比較して増強された熱的安定性を示す。
【００９８】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、Ｌ−ルシフェリン及び／またはラセミ体ルシフェリン混合物の存在下で熱的に安定である。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼバリアントは、Ｌ−ルシフェリン及び／またはラセミ体ルシフェリン混合物の存在下で、０℃超（例えば、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、またはそれらの間の範囲）で１〜３６５日間（例えば、１日、２日、５日、１０日、２０日、３０日、４０日、５０日、７５日、１００日、１５０日、２００日、２５０日、３００日、３５０日、３６５日、またはそれらの間の範囲）保存される場合に、２０％未満（例えば、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下、またはそれらの間の範囲（例えば、５％以下））の活性の損失を示す。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、Ｌ−ルシフェリン及び／またはラセミ体ルシフェリン混合物の存在下で、配列番号１のルシフェラーゼと比較して増強された熱的安定性を示す。
【００９９】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、ルシフェリンの存在下でインキュベートされる場合に、熱的に安定である。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、ルシフェリンの存在下で、室温超（例えば、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、またはそれらの間の範囲）で、１〜１００分間（例えば、１分、２分、５分、１０分１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、９０分、９５分、１００分、またはそれらの間の範囲）インキュベートされる場合に、２０％未満（例えば、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下、またはそれらの間の範囲（例えば、５％以下））の活性の損失を示す。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、ルシフェリンの存在下でインキュベートされる場合に、配列番号１のルシフェラーゼと比較して増強された熱的安定性を示す。
【０１００】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、ルシフェリン分解生成物（例えば、デヒドロルシフェリン）及び／またはルシフェリン誘導体の分解生成物（例えば、アミノデヒドロルシフェリン、フルオロデヒドロルシフェリン、５，５−二置換ルシフェリンアナログの分解生成物など）の存在下でインキュベートされる場合に、熱的に安定である。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、ルシフェリン分解生成物（例えば、デヒドロルシフェリン）及び／またはルシフェリン誘導体の分解生成物（例えば、アミノデヒドロルシフェリン、フルオロデヒドロルシフェリン、５，５−二置換ルシフェリンアナログの分解生成物など）の存在下で、室温超（例えば、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、またはそれらの間の範囲）で、１〜１００分間（例えば、１分、２分、５分、１０分１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、９０分、９５分、１００分、またはそれらの間の範囲）インキュベートされる場合に、２０％未満（例えば、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下、またはそれらの間の範囲（例えば、５％以下））の活性の損失を示す。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、ルシフェリン分解生成物（例えば、デヒドロルシフェリン）及び／またはルシフェリン誘導体の分解生成物（例えば、アミノデヒドロルシフェリン、フルオロデヒドロルシフェリン、５，５−二置換ルシフェリンアナログの分解生成物など）の存在下でインキュベートされる場合に、配列番号１のルシフェラーゼと比較して増強された熱的安定性を示す。
【０１０１】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、Ｌ−ルシフェリン及び／またはラセミ体ルシフェリン混合物の存在下でインキュベートされる場合に、熱的に安定である。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼバリアントは、Ｌ−ルシフェリン及び／またはラセミ体ルシフェリン混合物の存在下で、室温超（例えば、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、またはそれらの間の範囲）で、１〜１００分間（例えば、１分、２分、５分、１０分１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、９０分、９５分、１００分、またはそれらの間の範囲）インキュベートされる場合に、２０％未満（例えば、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下、またはそれらの間の範囲（例えば、５％以下））の活性の損失を示す。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、Ｌ−ルシフェリン及び／またはラセミ体ルシフェリン混合物の存在下でインキュベートされる場合に、配列番号１のルシフェラーゼと比較して増強された熱的安定性を示す。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、１種以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種以上、またはそれらの間の範囲）のルシフェリン分解生成物、ルシフェリン反応生成物、及び他の非基質の（例えば、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ）の基質でない）ルシフェリン誘導体、例えば、限定されるものではないが、デヒドロルシフェリン、アミノデヒドロルシフェリン、フルオロデヒドロルシフェリン、Ｌ−ルシフェリン、オキソルシフェリン、フルオロオキソルシフェリン、アミノオキソルシフェリン、５，５−二置換ルシフェリンアナログなどによる阻害に対する耐性を示す。
【０１０３】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、参照ルシフェラーゼ（例えば、配列番号１）と比較される場合に、増強されたシグナル安定性を示す（例えば、時間経過におけるシグナルの減衰の半減期により測定される（例えば、１０％の増加、２０％の増加、３０％の増加、４０％の増加、５０％の増加、６０％の増加、７０％の増加、８０％の増加、９０％の増加、２倍の増加、３倍の増加、４倍の増加、５倍の増加、６倍の増加、７倍の増加、８倍の増加、９倍の増加、１０倍の増加、２０倍の増加、５０倍の増加、１００倍の増加、１０００倍以上の増加、またはそれらの間の範囲））。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、インヒビターの非存在下での見かけのシグナル安定性と比較される場合に、当該インヒビターの存在下で、増強された見かけのシグナル安定性を示す（例えば、時間経過におけるシグナルの減衰の半減期により測定される（例えば、１０％の増加、２０％の増加、３０％の増加、４０％の増加、５０％の増加、６０％の増加、７０％の増加、８０％の増加、９０％の増加、２倍の増加、３倍の増加、４倍の増加、５倍の増加、６倍の増加、７倍の増加、８倍の増加、９倍の増加、１０倍の増加、２０倍の増加、５０倍の増加、１００倍の増加、１０００倍以上の増加、またはそれらの間の範囲））。幾つかの実施形態では、インヒビターは、デヒドロルシフェリン（例えば、デヒドロルシフェリン、デヒドロオキソルシフェリン、デヒドロアミノルシフェリン、及びデヒドロアミノオキソルシフェリン）のうちの１種以上である。
【０１０５】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントは、インヒビターの存在下での参照ルシフェラーゼ（例えば、配列番号１）のシグナル安定性の増強と比較される場合に、当該インヒビターの非存在下での見かけのシグナル安定性と比較した時に、当該インヒビターの存在下で、見かけのシグナル安定性の増強の増加を示す（例えば、時間経過におけるシグナルの減衰の半減期により測定される（例えば、１０％の増加、２０％の増加、３０％の増加、４０％の増加、５０％の増加、６０％の増加、７０％の増加、８０％の増加、９０％の増加、２倍の増加、３倍の増加、４倍の増加、５倍の増加、６倍の増加、７倍の増加、８倍の増加、９倍の増加、１０倍の増加、２０倍の増加、５０倍の増加、１００倍の増加、１０００倍以上の増加、またはそれらの間の範囲））。
【０１０６】
幾つかの実施形態では、配列番号６９〜１３４が含まれ、配列番号２〜１２４のポリペプチド配列をコードする、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）が、本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）を含むベクターが、本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドを発現する細胞が、本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントポリペプチドを含む融合タンパク質が、本明細書において提供される。
【０１０７】
幾つかの実施形態では、発光を測定し、これにより、特定のルシフェラーゼ酵素バリアント（またはルシフェラーゼ酵素バリアントを含む試薬組成物）の活性を決定するために、試薬組成物が試料と組み合わされた後に、ルシフェラーゼ酵素バリアント反応により生成される関心対象の時点での相対発光量（ＲＬＵ）の値が測定され得る。幾つかの実施形態では、（例えば、ルシフェラーゼの活性の安定性を決定するために）相対光出力が対照の値と比較され得る。
【０１０８】
アッセイ構成成分、キット、及び配合物
幾つかの実施形態では、試薬組成物は、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント及び／またはルシフェリンアナログ（及び場合によりルシフェリンアナログ分解生成物）に加えて、保存（例えば、酵素安定性のため）、取り扱い（例えば、試薬組成物の分配を容易にするため）、及び／またはアッセイ性能のための追加の構成成分を更に含む。幾つかの実施形態では、試薬組成物は、塩または金属イオン（例えば、Ｍｇ2+）、界面活性剤、緩衝液などを追加的に含む。幾つかの実施形態では、追加の構成成分は、試薬組成物の一部であり、ルシフェラーゼ酵素バリアント及びルシフェリンと同一の容器に保存される。幾つかの実施形態では、試薬組成物（例えば、ルシフェラーゼ酵素バリアント及びルシフェリンを含む）は、キットの一部として提供され、当該キットは、当該試薬組成物とは別個の容器に保存される追加の構成成分／試薬を含む。
【０１０９】
幾つかの実施形態では、キットまたは試薬組成物は、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント、ならびにチオ尿素及び／またはアザチオチミジン（ＡＴＴ）、またはチオ尿素及びＡＴＴの１種以上のアナログもしくは誘導体を含む。幾つかの実施形態では、キットまたは試薬組成物は、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント及び５，５−二置換ルシフェリンアナログを含む。幾つかの実施形態では、キットまたは試薬組成物は、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント、ＡＴＴ、及び５，５−二置換ルシフェリンアナログを含む。幾つかの実施形態では、キットまたは試薬組成物は、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント、ＡＴＴ、５，５−二置換ルシフェリンアナログ、及びＭｇ2+を含む。
【０１１０】
幾つかの実施形態では、キットまたは試薬組成物は、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント、Ｄ−ルシフェリン、及びＡＴＴを含む。幾つかの実施形態では、キットまたは試薬組成物は、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント、Ｄ−ルシフェリン、及び５，５−二置換ルシフェリンアナログを含む。幾つかの実施形態では、キットまたは試薬組成物は、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント、Ｄ−ルシフェリン、ＡＴＴ、及び５，５−二置換ルシフェリンアナログを含む。幾つかの実施形態では、キットまたは試薬組成物は、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント及びラセミ体ルシフェリン混合物を含む。幾つかの実施形態では、キットまたは試薬組成物は、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント及びラセミ体ルシフェリン混合物を含む。幾つかの実施形態では、キットまたは試薬組成物は、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント、５，５−二置換ルシフェリンアナログ、及びラセミ体ルシフェリン混合物を含む。幾つかの実施形態では、キットまたは試薬組成物は、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント、ＡＴＴ、及びラセミ体ルシフェリン混合物を含む。幾つかの実施形態では、キットまたは試薬組成物は、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント、ＡＴＴ、５，５−二置換ルシフェリンアナログ、及びラセミ体ルシフェリン混合物を含む。上述の実施形態のいずれかにおいて、ルシフェリンは、他のルシフェリン基質（例えば、アミノルシフェリン、フルオロルシフェリンなど）と置き換えられ得、及び／または５，５−二置換ルシフェリンアナログは、５，５−二置換ルシフェリンアナログ分解生成物と置き換えられ得る。
【０１１１】
幾つかの実施形態では、キットまたは試薬組成物は、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント、ルシフェリン（例えば、Ｄ−ルシフェリン）、及び１種以上の５，５−二置換ルシフェリンアナログを含む。幾つかの実施形態では、キットまたは試薬組成物が１種以上の５，５−二置換ルシフェリンアナログを含むことにより、発光シグナル持続時間、発光シグナル強度、見かけの酵素安定性（例えば、熱安定性）、及び／または保存安定性のうちの１つ以上の増強が提供される。幾つかの実施形態では、１種以上の５，５−二置換ルシフェリンアナログに対するルシフェラーゼ酵素バリアントの増強された活性は、増強された発光シグナル持続時間、発光シグナル強度、見かけの酵素安定性（例えば、熱安定性）、及び／または保存安定性のうちの１つ以上を有すると共にアッセイ及び他の用途において有用となるのに十分なシグナルを提供する試薬組成物またはキットを提供する。
【０１１２】
幾つかの実施形態では、キットまたは試薬組成物は、１種以上の好適な緩衝液（例えば、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）  ＢｕｆｆｅｒまたはＲｅａｇｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）を含む。検量線用溶液に好適なｐＨを維持し、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を顕著に妨害しない任意の緩衝液が意図される。好ましいｐＨ範囲は、約ｐＨ４．５〜約ｐＨ９．０（例えば、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ８．０（例えば、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、及びそれらの間の範囲））である。好適な緩衝液としては、ＭＥＳ、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、トリス−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ホウ酸塩が挙げられ、当業者に公知の任意の他の緩衝液が好適であり得る。適切な緩衝液の選択は、ｐＨ緩衝能及びルシフェラーゼ−ルシフェリン反応との相互作用によって決まる。
【０１１３】
幾つかの実施形態では、キットまたは試薬組成物は、１種以上の脱泡剤を含む。脱泡剤は、特に発光を定量する用途において、泡が生物発光の検出に干渉することを防止するために望ましい。ＭＡＺＵなどの脱泡剤は、有機系またはシリコーン系であり得る。脱泡剤の選択は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応に干渉することなく泡を除去するそれらの能力によって決まる。
【０１１４】
幾つかの実施形態では、キットまたは試薬組成物は、マグネシウムを含む。ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応は、ＡＴＰにだけでなく、マグネシウムイオンにも依存する。幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼ活性を確実にするために、マグネシウムが外来的に供給される。硫酸マグネシウムに加えて、塩化マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、臭化マグネシウム、炭酸マグネシウムなどのマグネシウムの他の塩、または試薬組成物もしくは試料中で解離してルシフェラーゼが利用できるＭｇ2+イオンを生じ、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応に干渉しない任意のマグネシウム錯体が、意図される。幾つかの実施形態では、マグネシウムに加えて、またはその代わりに、カルシウム及びマンガンなどの他の陽イオンが提供される。幾つかの実施形態では、試料の内在的なマグネシウムが、ＡＴＰの存在下でルシフェラーゼ−ルシフェリン生物発光を可能にするのに十分であり、かかる実施形態では、マグネシウムが、キットまたは試薬組成物に含まれていなくてもよい。
【０１１５】
幾つかの実施形態では、キットまたは試薬組成物は、溶液中の１種以上のＡＴＰアーゼインヒビターを含有する構成成分を含み、この溶液は、他の機能的構成成分、例えば、緩衝液、脱泡剤、酵素安定剤などを任意に含有する。この構成成分は、検量線用溶液または濃縮物として供給され得る。幾つかの実施形態では、ＡＴＰアーゼインヒビターは、荷電基を有する界面活性剤（例えば、カチオン界面活性剤（例えば、ＤＴＡＢ（臭化ドデシルトリメチルアンモニウム）、塩化ベンザルコニウム、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、ＢＤＤＡＢｒ（臭化ベンジルジメチルドデシルアンモニウム）など）、アニオン界面活性剤（例えば、デオキシコール酸塩またはＳＤＳ）、または両性イオン界面活性剤（例えば、スルホベタイン３−１０）など）である。かかるインヒビターは、例えば、ルシフェラーゼがＡＴＰをルシフェラーゼ−ルシフェリン反応に利用できる前に、試料中のＡＴＰアーゼがＡＴＰをアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）及びアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）にプロセシングすることを防止する。ＡＴＰアーゼインヒビターは、直接または間接的にＡＴＰアーゼを不活性化し得る。それらは活性部位においてＡＴＰアーゼに結合し、これにより基質の結合を防止し得るか、もしくは例えば、変性界面活性剤によりＡＴＰアーゼを変性させ得るか、またはそれらは基質からＡＴＰアーゼを選択的に隔離し得る。
【０１１６】
幾つかの実施形態では、キットまたは試薬組成物は、ＡＴＰ生成酵素の１種以上のインヒビターを含有する構成成分を含む。一部の試料において、キナーゼなどの酵素は活性であり得、ＡＴＰの継続的な生成を可能にする。ＡＴＰ濃度は特定の時点で決定されるため、かかる酵素活性はＡＴＰ濃度の過剰評価をもたらし得る。幾つかの実施形態では、かかるＡＴＰ生成活性に対処するために、本明細書における試薬組成物及び／またはキットは、ＡＴＰ生成のインヒビターを含む。有用な化合物の例としては、ＮａＦが挙げられ、これは、少なくとも１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ以上、またはそれらの間の範囲の濃度で有用である。任意のかかるインヒビターが使用され得、ただし、それは本明細書における実施形態の有用性の範囲を超えるようにルシフェラーゼに有害な影響を及ぼさない場合である。ＡＴＰ生成酵素の他のインヒビターとしては、バナジン酸、パラニトロフェニルリン酸、及びジクロロ酢酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
幾つかの実施形態では、キットまたは試薬組成物は、細胞溶解剤及び／またはＡＴＰ抽出剤を含む。試料が細胞を含み、細胞内ＡＴＰの検出／定量化が望まれる実施形態では、細胞を溶解するため、及び／または細胞からＡＴＰを遊離させるための試薬が提供され得る。幾つかの実施形態では、細胞内のＡＴＰを遊離させるため、及び／または試料中の細胞を溶解させるために、非イオン性界面活性剤などの細胞溶解剤が含まれる。他の非イオン性界面活性剤（例えば、トリトン系界面活性剤）、カチオン、アニオン、及び両性イオン界面活性剤、胆汁酸塩、カオトロープ、及びオキシリジンなどの細菌毒素が含まれる細胞膜を破壊する任意の他の薬剤が含まれる、任意の細胞溶解剤が意図される。あるいは、細胞からのＡＴＰ抽出を可能にする任意の薬剤（例えば、ＣＴＡＢ）が意図される。細胞からのＡＴＰの抽出を可能にする薬剤としては、細胞膜を透過性にし、細胞内のＡＴＰが周囲の培地に浸出するのを可能にする濃度で存在するが、細胞可溶化物を生成する濃度では存在しない界面活性剤が挙げられる。
【０１１８】
幾つかの実施形態では、キットまたは試薬組成物は１種以上の安定化剤を含む。幾つかの実施形態では、安定化剤は、ルシフェラーゼが分解しないように安定化する任意の化合物であり得る。好適な安定化剤としては、タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン、ゼラチンなど）、界面活性剤（例えば、ＴＨＥＳＩＴなどの非イオン性界面活性剤）などが挙げられる。
【０１１９】
幾つかの実施形態では、他の薬剤が本明細書におけるキットまたは試薬組成物に含まれ得る。例えば、キットまたは試薬組成物は、ルシフェラーゼ反応に起因する発光の持続時間を増強することが知られている物質、例えば、補酵素Ａ（ＣｏＡ）、チオール試薬、例えば、ジチオトレイトール、βメルカプトエタノール、及びシグナルを延長するためのＥＤＴＡなどの金属イオンキレート剤、プロテアーゼインヒビター、または塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ2ＳＯ4、ＮＡＨＣＯ3、ＮａＨ2ＰＯ4など）を含み得る。
【０１２０】
幾つかの実施形態では、試薬組成物及び／またはキットの他の構成成分は、１つ以上の容器または入れ物に含まれる。幾つかの実施形態では、試薬組成物の構成成分は単一の容器または入れ物の中に含まれる。幾つかの実施形態では、キットは、試薬組成物を含む複数の容器または入れ物を含み得る。幾つかの実施形態では、キットは、試薬組成物（上記を参照のこと）以外の試薬を含む１つ以上の容器または入れ物を含む。幾つかの実施形態では、キットに含まれる構成成分及び試薬は、種々の構成成分の寿命が保たれ、容器の材料により吸着または変化されないような任意の種類の容器で供給される。容器または入れ物は、任意の好適な材料、例えば、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、または試薬を保持するのに通常用いられる任意の他の材料を含んでもよく、またはそれらから構成されていてもよい。好適な容器の例としては、アンプル、ボトル、薬袋、試験管、バイアル、フラスコ、ビン、シリンジなどが挙げられる。
【０１２１】
幾つかの実施形態では、キットは適切な使用説明資料を含み、及び／または試薬組成物は適切な使用説明資料と共に提供される。使用説明書は、紙もしくは他の基材に印刷され得、及び／または電子読み取り可能な媒体、例えば、フロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどとして供給され得る。詳細な使用説明書はキットに物理的に付随していなくてもよく、その代わりに、ユーザーはキットの製造者もしくは販売業者によって指定されたインターネットウェブサイトに誘導されてもよく、または電子メールとして供給されてもよい。幾つかの実施形態では、使用説明書は、試薬組成物（例えば、ルシフェラーゼとルシフェリンとを含む）を試料と組み合わせてＡＴＰを検出または定量化するようにユーザーに指示する。
【０１２２】
幾つかの実施形態では、試薬組成物は、液体試薬として提供される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される安定なルシフェラーゼ酵素バリアント及びルシフェリンを単一の予備混合された液体試薬で提供することによって、凍結乾燥された試薬を再水和することによりもたらされるばらつきが排除される。他の実施形態では、試薬組成物は、凍結乾燥形態で提供される。幾つかの実施形態では、本明細書におけるキットの他の構成成分は、１つまたは複数の液体組成物または乾燥組成物として提供され得る。
【０１２３】
幾つかの実施形態では、生物発光アッセイのための試薬組成物は、５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で配列番号１のルシフェラーゼポリペプチドにより生成される生物発光シグナルと比較して増加した生物発光シグナルを５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で生成することができるルシフェラーゼ酵素バリアント、及び５，５−二置換ルシフェリンアナログを含む。幾つかの実施形態では、試薬組成物は、マグネシウムを含む。幾つかの実施形態では、試薬組成物は、緩衝液、脱泡剤、ＡＴＰアーゼインヒビター、Ｌ−ルシフェリン、アザチオチミジン、酵素安定剤、界面活性剤、ＡＴＰ生成酵素のインヒビター、細胞溶解剤、ＡＴＰ抽出剤、補酵素Ａ、チオール試薬、金属イオンキレート剤、プロテアーゼインヒビター、及び塩からなる群から選択される１種以上の追加の成分を含む。これらの実施形態によれば、緩衝液は、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒ及びＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）  Ｂｕｆｆｅｒから選択される。
【０１２４】
幾つかの実施形態では、試薬組成物は、本明細書に記載されるようにキットに含まれる。幾つかの実施形態では、キットは、生物発光アッセイ、例えば、限定されるものではないが、ＡＴＰ検出及び／または定量化のためのアッセイ、カスパーゼ活性を測定するためのアッセイ、またはキナーゼ活性を測定するためのアッセイを実行するための使用説明書を含む。幾つかの実施形態では、キットは、５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で配列番号１のルシフェラーゼポリペプチドにより生成される生物発光シグナルと比較して増加した生物発光シグナルを５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で生成することができるルシフェラーゼ酵素バリアント、及び当該５，５−二置換ルシフェリンアナログを含む。
【０１２５】
生物発光アッセイ及び方法
本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント及び試薬組成物（例えば、ルシフェラーゼバリアント及び５，５−二置換ルシフェリンアナログを含む）は、なんらの特定の方法または用途における使用に限定されないが、それらの安定性及び活性（分解生成物の存在下での安定性及び活性を含む）のために、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント及び試薬組成物は、試料中のＡＴＰの検出及び標的酵素活性の検出または定量化に特に有用である。
【０１２６】
ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応はＡＴＰ依存性であるため、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント及び試薬組成物は、ＡＴＰを検出及び／または定量化するためのアッセイに使用される。ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応は、わずか１０〜１６モルのＡＴＰまたはそれ以下のＡＴＰを含有する試料におけるＡＴＰを検出することを可能にする。幾つかの実施形態では、本明細書において、細胞のＡＴＰレベルを効率的かつ正確に検出及び定量するために使用される方法、組成物、及びキットが提供される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント及び試薬組成物は、衛生監視などのための非細胞性試料（例えば、水）における表面のＡＴＰの検出に使用される。
【０１２７】
幾つかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント及びルシフェリン（及び任意に５，５−二置換ルシフェリンアナログ）を含む単一の試薬組成物の、試料（例えば、ＡＴＰを含むか、またはおそらく含むと疑われる試料）への添加、及び発光を検出することを含む。幾つかの実施形態では、追加の構成成分及び／または試薬（上記を参照のこと）が試薬組成物と共に含まれるか、または別々に添加される（例えば、キナーゼインヒビター、ＡＴＰの蓄積を防止する化合物、細胞溶解剤（例えば、ＴＨＥＳＩＴなどのポリオキシエチレン）、ＡＴＰ抽出剤、マグネシウム、緩衝液、塩など）。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント及びルシフェリンを単一の試薬に含めることにより、ＡＴＰの検出が早まり、アッセイ及び取り扱いが簡略化され、及び／または再現性が高まる。
【０１２８】
本明細書において述べるように、本明細書における方法、組成物、及びキットは、試料中のＡＴＰ（またはルシフェラーゼ基質として機能することができるＡＴＰアナログ）の定性的または定量的検出に特に有用である。幾つかの実施形態では、試薬組成物（例えば、本明細書に記載されルシフェラーゼ酵素バリアント及び５，５−二置換ルシフェリンアナログを含む）を使用して試料中で発光が生成される単純な定性的実験は、ＡＴＰの存在を示す。幾つかの実施形態では、試料中のＡＴＰの量が定量化されるアッセイが提供される。本明細書におけるルシフェラーゼ、試薬組成物、及び／またはキットを使用して、単一の時点で、複数の時点で、またはリアルタイムでＡＴＰが検出（例えば、定性的に）及び／または定量化され得る。
【０１２９】
幾つかの実施形態では、試料は、ＡＴＰまたは好適なＡＴＰアナログを含有するか、または含有することが疑われるあらゆるもの、例えば、細胞可溶化物、インタクトな細胞、生検、食物、飲料、水、表面、例えば、動物、植物、または無生物の表面を拭ったスワブなどである。幾つかの実施形態では、試料は、細胞可溶化試料、無細胞調製試料、または精製酵素配合試料のうちの１種以上である。他の実施形態では、試料は、環境試料、土壌試料、水試料、工業化学試料、法医学試料、食品ベースの試料、液体試料、飲料ベースの試料、または生化学試料のうちの１種以上である。
【０１３０】
試料の他の例としては、既知のＡＴＰ濃度の組成物が挙げられる。細胞または細胞可溶化物は、任意の原核生物または真核生物に由来し得る。試料には、精製酵素の調製物（例えば、細胞成分を含まない）も含まれ得る。真核細胞は、植物、動物、真菌、昆虫など、またはかかる生物由来の培養細胞に由来し得る。これらの例は、例としてのみ提供され、限定することを意図しない。
【０１３１】
細胞可溶化物は、認識できるインタクトな細胞構造にもはや組織化されない細胞成分を含む。細胞可溶化物は、可溶性成分及び不溶性成分を有し得、これらのいずれも可溶化物を使用する前に除去され得る。可溶化物は、超音波処理、ダウンス型ホモジナイザー、乳鉢及び乳棒、凍結融解サイクル、または細胞の物理的完全性を破壊する他の装置またはプロセスを使用する物理的破壊を含む任意の手段によって；または界面活性剤、例えば、ルシフェラーゼ活性が維持される界面活性剤、例えば、両性イオン及び非イオン性界面活性剤、もしくはカチオン界面活性剤ＤＴＡＢもしくはＣＴＡＢによる溶解によって調製され得る。好ましくは、細胞可溶化物は、細胞が収集された時点でのＡＴＰ濃度の完全性が保持されるような方法で作製される。
【０１３２】
幾つかの実施形態では、試料中のＡＴＰを正確に検出するために、細胞のＡＴＰを分解する酵素またはＡＴＰを生成する酵素は、好ましくは阻害されるか、または除去される。ＡＴＰ生成酵素、例えば、キナーゼの活性のなどの、生成物または副産物としてＡＴＰを有する酵素のインヒビターが、試薬組成物（例えば、ルシフェラーゼバリアント及びルシフェリンアナログを含む）または試薬組成物を含むキットに組み込まれ得る。
【０１３３】
本明細書におけるルシフェラーゼ、試薬組成物、方法、及びキットは、ユーザーが、発光の量を定量化することによって試料中のＡＴＰの量を定量化するのを可能にする。幾つかの実施形態では、関心対象の試料を試験するために、（単一の組成物中の）ルシフェラーゼバリアント及びルシフェリンアナログが適用される。幾つかの実施形態では、（単一の組成物中の）ルシフェラーゼバリアント及びルシフェリンアナログは、既知の量のＡＴＰを含有する試料（対照）にも適用される。試験試料から生成されるシグナルの大きさは、試料中のＡＴＰの濃度と相関する。幾つかの実施形態では、未知のＡＴＰ濃度の試料からの発光シグナルの大きさが、内部標準（既知の量のＡＴＰの試料への添加及びその後の発光を測定すること）または既知のＡＴＰ濃度の幾つかの試料の発光を測定し、それらをグラフにプロットすることにより生成される外部標準曲線のいずれかによって生成されるシグナルと相関される。
【０１３４】
幾つかの実施形態では、試料中のＡＴＰを検出または定量するためのアッセイ系は、５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で配列番号１のルシフェラーゼポリペプチドにより生成される生物発光シグナルと比較して増加した生物発光シグナルを５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で生成することができるルシフェラーゼ酵素バリアントを含む試薬組成物、５，５−二置換ルシフェリンアナログ、及びＡＴＰを含むか、または含むことが疑われる試料を含む。幾つかの実施形態では、アッセイ系は、生物発光の検出及び／または測定のための装置を含む。
【０１３５】
幾つかの実施形態では、本開示のアッセイ及び方法は、試料中のＡＴＰを検出または定量化する方法を含む。これらの実施形態によれば、本方法は、本明細書に述べる試薬組成物のいずれかを、ＡＴＰを含むか、または含むことが疑われる試料に添加すること、及び生物発光シグナルを検出または定量化することを含む。
【０１３６】
幾つかの実施形態では、本開示は、試料中の標的酵素活性を検出または定量化するためのアッセイ系を含む。これらの実施形態によれば、アッセイ系は、５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で配列番号１のルシフェラーゼポリペプチドにより生成される生物発光シグナルと比較して増加した生物発光シグナルを５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下で生成することができるルシフェラーゼ酵素バリアントを含む試薬組成物、当該５，５−二置換ルシフェリンアナログ、及び標的酵素を含むか、または含むことが疑われる試料を含む。幾つかの実施形態では、アッセイ系は、標的酵素の基質に結合されている１種以上の５，５−二置換ルシフェリンアナログを含む。これらの実施形態によれば、標的酵素は、プロテアーゼ、カスパーゼ、キナーゼ、シトクロム４５０（ＣＹＰ４５０）、またはモノアミンオキシダーゼである。幾つかの実施形態では、アッセイ系は、生物発光の検出及び／または測定のための装置を更に含む。
【０１３７】
幾つかの実施形態では、本開示のアッセイ及び方法は、試料中の標的酵素活性を検出または定量化する方法を含む。これらの実施形態によれば、本方法は、本明細書に述べる試薬組成物のいずれかを、標的酵素活性を含むか、または含むことが疑われる試料に添加すること、及び生物発光シグナルを検出または定量化することを含む。
【０１３８】
Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）及び本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアント（例えば、配列番号１のバリアント）の発光は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細胞において酵素を発現させること、及び寒天プレート上で個々のコロニーを成長させることにより測定され得る。次いで、寒天プレート上のコロニーに、ルシフェリン及び／またはルシフェリンアナログが噴霧され得、目またはＣＣＤカメラなどの光学装置による発光の目視が可能となり得る。ルシフェリンアナログのプロルシフェリンバージョンも、プロルシフェリンを分解させてルシフェリンまたはルシフェリンアナログを修飾部分から分離することによりプロルシフェリンを活性化する酵素を含むアッセイにおいて利用され得る。これらのアッセイとしては、カスパーゼ及びＢ−ガラクトシダーゼ（例えば、図２７Ａ〜２７Ｂ及び２８Ａ〜２８Ｂを参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、これらの方法により酵素活性を分析することは、様々な病原体の存在を同定及び／または検出するために使用され得る。
【実施例】
【０１３９】
本明細書に記載される本開示の方法の他の好適な改変及び適合が容易に適用可能かつ明らかであり、本開示の範囲または本明細書において開示される態様及び実施形態を逸脱しない範囲で好適な等価物を使用してなされ得ることが当業者にとって容易に明らかとなるであろう。以上、本開示を詳細に記載したが、同じことが、単に本開示の幾つかの態様及び実施形態を例示することのみを目的とし、本開示の範囲を限定するものとみなされるべきでない以下の実施例を参照することでより明確に理解されるであろう。本明細書において参照される全ての学術誌参考文献、米国特許、及び刊行物の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４０】
本開示は、以下の非限定的な実施例により例示される複数の態様を有する。
【０１４１】
ルシフェリンアナログの活性
本開示のルシフェリンアナログ化合物（例えば、米国特許出願番号第１５／８２９，５８１号／ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６４２８４号に記載されている（これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））を試験して、コメツキムシ緑色ルシフェラーゼ、コメツキムシ赤色ルシフェラーゼ、配列番号１のＰｐｅバリアントの熱安定性ルシフェラーゼバリアント、及びホタルルシフェラーゼが含まれる様々なルシフェラーゼ酵素の基質としてのそれらの活性を決定した。各酵素の０．０５ｍｇ／ｍＬの溶液を、３ｍＭのＡＴＰを含有するＢＲＩＧＨＴ−ＧＬＯ（商標）アッセイ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ２６３Ａ）中に調製した。次いで、各酵素の３倍連続希釈物を、３ｍＭのＡＴＰを含有するＢＲＩＧＨＴ−ＧＬＯ（商標）アッセイ緩衝液中に調製し、各ストックの３００μＬを、７００μＬの緩衝液中に連続希釈した。各基質の溶液（０．５ｍＭ）を、ルシフェリンを含まない水中に調製し、５０μＬの各基質溶液を、５０μＬの酵素希釈物と組み合わせた。試料を室温で１分間インキュベートし、発光をＧＬＯＭＡＸ（登録商標）−Ｍｕｌｔｉ＋プレートルミノメーターで測定した。試験された酵素（コメツキムシ緑色ルシフェラーゼ、コメツキムシ赤色ルシフェラーゼ、配列番号１のＰｐｅバリアントの熱安定性ルシフェラーゼバリアント、及びホタルルシフェラーゼ）は、本開示のジメチル基質を利用して光を生成することができた。これらの試験において、コメツキムシ酵素は、ジメチル基質を利用して、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）及びホタルルシフェラーゼよりも強いシグナルを生成した。
【０１４２】
基質の結合親和性を比較する手段として、亜飽和Ｄ−ルシフェリンの存在下で、更なる試験を、様々な基質濃度で実施した。０．００５ｍｇ／ｍｌのコメツキムシ緑色ルシフェラーゼ（ＣＢＧ）またはＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）の溶液を、３ｍＭのＡＴＰを含有するＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）アッセイ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ２６３Ａ）中に調製した。次いで、各基質の２ｍＭの溶液を、Ｄ−ルシフェリン（亜飽和）を含有する水中に調製した。場合によっては、基質はラセミ体ルシフェリン（Ｄ／Ｌ混合物）を含んだ。各基質を、ルシフェリンを含まない水中に２倍連続希釈した。５０μＬの各基質希釈物の試料を、５０μＬの酵素溶液と組み合わせた。試料を室温で１分間インキュベートし、発光をＧＬＯＭＡＸ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ＋プレートルミノメーターで測定した。５，５位置により大きな側鎖を有する基質は、より高い見かけのＲＬＵmax値を有し、このことは、それらがより小さな５，５二置換側鎖と比較してＤ−ルシフェリンに対する阻害性が低いことを示す。見かけのＫm値は、より小さな５，５位側鎖を有するアナログが、より大きな５，５位の置換と比較して、Ｄ−ルシフェリンの存在下でより密接にルシフェラーゼ酵素に結合することを示唆する。
【０１４３】
様々なｐＨでのルシフェリンアナログ化合物の活性も試験した。２５ｍＭの緩衝液：クエン酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、及びＴＡＰＳのうちの１つを含有するストック緩衝液を調製した。この緩衝液は、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｅｒｇｉｔｏｌ、０．０５％のＭａｚｕ  ＤＦ２０４、及び１０ｍＭのＭｇＳＯ4も含有した。緩衝液を分取し、ＮａＯＨを様々な量で添加して、ｐＨ系列を得た。各溶液の正確なｐＨを、ｐＨメーターにより決定した。ＡＴＰ（１ｍＭ）及びコメツキムシ緑色ルシフェラーゼ（ＣＢＧ、０．０１ｍｇ／ｍＬ）をｐＨ系列の各緩衝液に添加した。各ジメチル基質（０．２ｍＭ）のラセミ混合物を、ルシフェリンを含まない水中に調製した。希釈された各基質（５０ｕＬ）及びｐＨ系列の各緩衝液（５０ｕＬ）を三重反復で組み合わせ、即時に（ｔ＝０）及び室温での１５分のインキュベート後にＧＬＯＭＡＸ（登録商標）−Ｍｕｌｔｉ＋プレートルミノメーターを使用して発光を測定した。結果は、ジメチル基質のラセミ混合物が、約ｐＨ５．６から約ｐＨ８．３までのｐＨ範囲にわたり活性なルシフェラーゼ基質であることを示した。従って、本開示の化合物は、Ｌ及びＤ形態の両方において、広範囲なｐＨにわたりホタルルシフェラーゼまたはコメツキムシルシフェラーゼにより利用されて、生物発光を生成し得る。
【０１４４】
５，５位での置換を有するルシフェリンアナログが、配列番号１のＰｐｅバリアントの熱安定性ルシフェラーゼバリアントの基質であり得るかを決定するため、アルキル基の様々な二置換及び閉環構造を含有するアナログを発光アッセイに用いて試験を実行した。１×ＴＢＳ＋１％のＰｒｉｏｎｅｘ中に調製された０．００５ｍｇ／ｍｌのＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）の溶液を、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）アッセイ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ２６３Ａ）中の０．５ｍＭのＡＴＰと組み合わせた。全ての基質をＤＭＳＯ中に２０ｍＭまで別々に希釈した。室温での３０分間のインキュベート後、希釈された基質を１ｍＭの最終濃度となるように反応物に添加し、ピペット操作により混合した。反応物を室温で更に１分間インキュベートし、ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）−Ｍｕｌｔｉ＋プレートルミノメーターで発光を測定した。５，５位により大きな置換（例えば、シクロヘキシル（ＣＳ０３９２）、ジベンジル（ＣＳ０３９６）、及びジエチル（ＣＳ０３８８））を有するルシフェリンアナログの幾つかは、全て測定可能な発光値を示し、Ｐｐｅバリアントの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）がこれらを基質として利用することができることを実証した。
【０１４５】
ルシフェラーゼ酵素バリアントの活性部位飽和スクリーニング
図３は、Ｐｐｅバリアントの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）に対して高親和性を有するルシフェリンアナログを同定するための競合阻害アッセイの結果の代表的なグラフを含む。より具体的には、図３は、ルシフェリンアナログＣＳ０２８０、ＣＳ０３３３、ＣＳ０５１０、ＣＳ０３２６、ＣＳ０３２５、及びＣＳ０４３１の非存在または存在下でのＤ／Ｌ−ルシフェリンによるＰｐｅバリアントの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）の正規化された発光を含む。これらの生物発光実験のための試薬組成物は、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ２６３Ａ）中の０．００５ｍｇ／ｍＬの配列番号１のＰｐｅバリアントの熱安定性ルシフェラーゼバリアント、０．５ｍＭのＡＴＰ、及び１００ｎＭのＬＨ2を含み、これに０または１ｍＭの５，５−二置換ルシフェリンアナログが添加された。
【０１４６】
配列番号１のＰｐｅバリアントの熱安定性ルシフェラーゼバリアントの５，５−二置換ルシフェリンアナログでの試験は、ほとんど発光を示さず、ルシフェリンの存在下では減少した光出力を示し、このことは、配列番号１のＰｐｅバリアントの熱安定性ルシフェラーゼバリアントの競合阻害を示した。これらの実験の結果に基づいて、以下の５，５−二置換ルシフェリンアナログが、配列番号１のＰｐｅバリアントの熱安定性ルシフェラーゼバリアントの活性部位に対するそれらの親和性に基づいて、更なる実験のために選択された：ＣＳ０２８０（５，５−ジメチル）、ＣＳ０３３３（５，５−シクロプロピル）及びＣＳ０３２６（５，５−シクロブチル）。これらの５，５−二置換ルシフェリンアナログを使用して、生物発光アッセイに使用するための改善または増強された特性を有する、配列番号１のルシフェラーゼ酵素のバリアントを作製した。
【０１４７】
図４は、配列番号１のルシフェラーゼの活性部位の代表的画像（左）、示された位置での様々なアミノ酸置換を含む表（中央）、及び試験されたバリアントの各々の活性レベルを示すグラフ（右）を含む。Ｐｐｅバリアントの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（ＡＴＧ−２２８７；配列番号１）の１２個の位置を、それらが活性部位に近いことから部位飽和スクリーニングに選択した。バリアントは、２０種のアミノ酸全てを使用して作製された。ライブラリーを、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｖ８９２１）中のＡＴＰと共に１００ｎＭのＤ／Ｌ−ルシフェリンを含有するＥ．ｃｏｌｉ可溶化液でスクリーニングした。示すように、２４４、２４９、３３７、及び３３９位での変異が明るさの改善を示した。
【０１４８】
図５は、ＣＳ０３３３を用いて試験されたルシフェラーゼ酵素バリアントの活性レベル及びそれらのアミノ酸置換の比較を示す代表的な表（左）及び対応するグラフ（右）を含む。Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）の近縁ホモログであるＬ．ｃｒｕｃｉａｔａのルシフェラーゼの構造解析に基づいて、発光基質（例えば、５，５−二置換ルシフェリンアナログ）が結合すると予測される酵素の活性部位近くの残基を標的とした、部位飽和変異誘発ライブラリーを構築した。これらの実験のための試薬組成物は、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液中の１００ｎＭのＤ、Ｌ−ルシフェリン、または０．２５ｕＭのＣＳ０３３３を含んだ。２４４位の部位飽和ライブラリーを、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液中のＡＴＰと共にＣＳ０３３３を含有するＥ．ｃｏｌｉ可溶化液でスクリーニングし、改善された活性を有する変異を配列決定した。示すように、２４４位でのＴｒｐ、Ａｒｇ、及びＧｌｙのアミノ酸置換（Ｈ２４４Ｗ、Ｈ２４４Ｒ、Ｈ２４４Ｇ）は、Ｐｐｅバリアントの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）において見出されるＨｉｓと比較して改善された活性を有した。これは、配列番号１のＰｐｅバリアントの熱安定性ルシフェラーゼバリアントのＡＴＧ−２８８９（Ｈ２４４Ｗ）バリアント（配列番号５）をもたらした。
【０１４９】
図６Ａ〜６Ｃは、５，５−二置換ルシフェリンアナログの存在下でのＰｐｅの熱安定性バリアント（配列番号１）及びコメツキムシ緑色（ＣＢＧ９９）の活性を比較している代表的なグラフを含む。試薬組成物は、１×ＴＢＳ＋１％のＰｒｉｏｎｅｘ中に希釈した０．００５ｍｇ／ｍｌのＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）またはＣＢＧ９９（コメツキムシ緑色ルシフェラーゼ）酵素を含んだ。ＡＴＰを、１ｍＭまで緩衝液（図６Ａ及び６ＢについてＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液及び図６ＣについてＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒ）中に希釈し、ルシフェラーゼアナログ化合物を、緩衝液＋１ｍＭのＡＴＰ中に希釈し、５０μｌの希釈された化合物と組み合わせた５０μｌの希釈された化合物を、緩衝液＋ＡＴＰ中に希釈した。発光を、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）  Ｍｕｌｔｉルミノメーターを使用して３分の時点で読み取った。基質を含有しない対照試料（「ルシフェリン無し」対照）において観察された多量の発光は、真の基質特異的なシグナルを明らかにするために反応の間に使い尽くされる（「消費し尽くされる」）必要があった反応緩衝液中のルシフェリンが混入したためである可能性が高かった。図６Ａに示すように、対照レベルより低いルシフェリンアナログを含有する試料は、Ｐｐｅバリアント及びＣＢＧ９９の両方の活性の阻害を示す。
【０１５０】
図６Ｂ〜６Ｃにおいて、混入したルシフェリンがベースラインレベルまで３０分間消費し尽くされ、次いで、特異的な発光活性を測定するために基質が添加された。図６Ｂにおいて実証されるように、Ｐｐｅバリアントでは、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液中のルシフェリンアナログでごくわずかなシグナルしか検出されなかった。しかしながら、顕著な発光がＣＢＧ９９及びルシフェリンアナログにより観察された。図６Ｃに示すように、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液の代わりのＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒの使用は、Ｐｐｅバリアントでより高い量の活性をもたらしたが、傾向は同様である。
【０１５１】
増加した活性及びデヒドロルシフェリンに対する耐性を有するルシフェラーゼ酵素バリアントの組み合わせ
図７は、配列番号１の２４４位及び３３９位でのアミノ酸置換を有するルシフェラーゼ酵素バリアントの、５，５−二置換ルシフェリンアナログ基質の存在下での活性を評価している代表的なグラフを含む。アッセイは、酵素を発現するＥ．ｃｏｌｉの一晩培養物をＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ＋ＡＴＰ＋基質（ルシフェリンアナログ化合物ＣＳ０２８０、ＣＳ０３３３、ＣＳ０５１０、及びＣＳ０３２６）と組み合わせることにより調製し、発光を３分の時点で読み取った。試薬組成物は、配列番号１のＰｐｅバリアントの熱安定性ルシフェラーゼバリアントの５０μｌの可溶化液、０．５ｍＭの基質、及び１ｍＭのＡＴＰを含んだ。これらのデータは、Ｅ．ｃｏｌｉ可溶化液を使用した実験が、ＡＴＧ−２８８９（Ｈ２４４Ｗ）の活性が、ＣＳ０３３３でバックグラウンドの約２８５倍超であり、その活性は、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）のＣＳ０３３３でのバックグラウンドより低かった（阻害された）活性より顕著に高かったことを実証することを示す。
【０１５２】
図８は、ルシフェラーゼ酵素バリアントＡＴＧ−２６２４及びＡＴＧ−２６２５の、５，５−二置換ルシフェリンアナログ基質の存在下での活性を評価している代表的なグラフを含む。Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）の２４４（Ｈ２４４Ｒ）位での変異が、デヒドロルシフェリンに対する耐性を示すだけでなく、改善された活性も示したため、同様の変異を有するバリアントも試験した。具体的には、ＡＴＧ−２６２４（Ｉ２４０Ｌ＋Ｙ２５４Ｓ＋Ｔ３４４Ａ＋Ｉ３９６Ｋ）及びＡＴＧ−２６２５（Ｈ２４４Ｒ＋Ｖ３００Ｇ＋Ｉ３９６Ｋ）を、細胞可溶化物中でのルシフェリンアナログに対する活性について試験した。アッセイは、酵素を発現するＥ．ｃｏｌｉの一晩培養物をＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ＋ＡＴＰ＋基質（ルシフェリンアナログ化合物ＣＳ０２８０、ＣＳ０３３３、ＣＳ０５１０、及びＣＳ０３２６）と組み合わせることにより調製し、発光を３分の時点で読み取った。試薬組成物は、Ｐｐｅルシフェラーゼ可溶化液（配列番号１）の熱安定性ルシフェラーゼバリアントの５０μｌの可溶化液、０．５ｍＭの基質、及び１ｍＭのＡＴＰを含んだ。これらのデータは、ＡＴＧ−２６２４バリアントがルシフェリンアナログ化合物で観察可能な活性を示したことを示し、その変異のうちの１つ以上が活性を付与したことを示す。
【０１５３】
部位飽和スクリーニングの間に同定されたＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）におけるＨ２４４Ｗアミノ酸置換をデヒドロルシフェリン耐性バリアントであるＡＴＧ−２６２４と組み合わせて、５，５−二置換ルシフェリンアナログでのその活性を試験し、これらのアミノ酸置換が相加効果を有したかどうか決定した（ＡＴＧ−２８９０）。図９Ａは、ルシフェラーゼ酵素バリアントＡＴＧ−２８７７、ＡＴＧ−２６２４、及びＡＴＧ−２８９０の、５，５−二置換ルシフェリンアナログ基質の存在下での活性を評価している代表的なグラフを含む。ルシフェリンアナログ化合物を、反応緩衝液（Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）またはＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液のいずれか）中で５０ｍＭ〜２０ｍＭに希釈した。ルシフェラーゼ酵素を、１×ＴＢＳ＋１％のＰｒｉｏｎｅｘ中に０．０１ｍｇ／ｍｌまで希釈した。試薬組成物は、５０μｌのＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ＋ＡＴＰを含み、これを５０μｌの希釈された酵素と組み合わせた。プレートを室温で３０分間インキュベートして、バックグラウンドを最小限にし、５μｌのルシフェリンアナログ基質を１ｍＭの最終濃度に添加した。プレートを、化合物添加前後の３分及び２０分時点で読み取った。精製酵素フォーマットでのこれらの実験の結果は、ＡＴＧ−２８９０が、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液及びＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液の両方において、ＣＳ０２８０及びＣＳ０３３３の両方で光出力の相加的改善を示し、その活性は、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）のこれらのアナログでのバックグラウンドより低かった（阻害された）活性より顕著に高かったことを示す。
【０１５４】
図９Ａと同様の設定を使用して実験を実施して、ルシフェラーゼ酵素バリアントＡＴＧ−２８７７（Ｈ２４４Ｗ）及びＡＴＧ−２８９０（ＡＴＧ−２６２４＋Ｈ２４４Ｗ）の活性に対するＣＳ０２８０及びＣＳ０３３３ルシフェリンアナログの両方の効果を試験した（図９Ｂ）。これらの結果により、ＡＴＧ−２８７７（Ｈ２４４Ｗ）及びＡＴＧ−２８９０（ＡＴＧ−２６２４＋Ｈ２４４Ｗ）バリアントのジメチル及びシクロプロピルルシフェリンアナログでの改善された光出力が確認された。ＡＴＧ−２８７７及びＡＴＧ−２８９０の両方で、これらのアナログでの酵素活性は、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）の活性より顕著に高かった。
【０１５５】
図９Ｃ及び９Ｄにおいて、これらの結果を確認するために更なる実験を実施した。図９Ｃに示すように、ＡＴＧ−２８９０バリアントは、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）  Ｂｕｆｆｅｒにおいて、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）と比較してＣＳ０２８０で活性の１２０倍の増加及びＣＳ０３３３で活性の１，４７０倍の増加を示した。更に、図９Ｄに示すように、ＡＴＧ−２８９０バリアントは、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒにおいて、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）を比較してＣＳ０２８０で活性の６倍の増加及びＣＳ０３３３で活性の３，０５０倍の増加を示した。
【０１５６】
増強されたルシフェラーゼ酵素活性に重要なアミノ酸置換の決定
図１０Ａ〜１０Ｂは、５，５−二置換ルシフェリンアナログ基質の存在下での様々なルシフェラーゼ酵素バリアントの活性に対するアミノ酸置換の効果を評価している代表的なグラフを含む。具体的には、図１０Ａは、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液を使用した実験の結果を含み、図１０Ｂは、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液を使用した実験の結果を含む。ルシフェリンアナログ化合物は、ＤＭＳＯ中で５０ｍＭ〜２０ｍＭに希釈された。ルシフェラーゼ酵素を、１×ＴＢＳ＋１％のＰｒｉｏｎｅｘ中に０．０１ｍｇ／ｍｌまで希釈した。試薬組成物は、５０μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）またはＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液中１ｍＭのアナログ化合物＋１ｍＭのＡＴＰ＋０．５ｍＭの化合物を含み、これを１×ＴＢＳ＋１％のＰｒｉｏｎｅｘ中に希釈された５０μｌの酵素と組み合わせた。プレートを３分の時点で読み取った。図１０Ａ及び１０Ｂの両方に示すように、アミノ酸置換の試験された全ての組み合わせは、ＣＳ０２８０（ジメチルルシフェリン）またはＣＳ０３３３（シクロプロピルルシフェリン）のいずれかの利用において、Ｐｐｅ（配列番号１）の熱安定性ルシフェラーゼバリアントと比較して改善された活性を有するルシフェラーゼ酵素バリアントをもたらした。ＡＴＧ−２８８９バリアントは、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒにおいて両方のアナログに対して最も高い活性を有するため、これを更なる進化スクリーニングに選択した。
【０１５７】
ＣＳ０３３３のアミノバージョン及びフルオロバージョンの効果
ルシフェラーゼバリアントＡＴＧ−２８８９（Ｈ２４４Ｗ＋Ｔ３４４Ａ＋Ｉ３９６Ｋ）の活性を、ルシフェリンアナログで活性を示した唯一の既知のルシフェラーゼであったコメツキムシ緑色（ＣＢＧ９９）と比較した。図１１Ａ〜１１Ｂは、ルシフェラーゼ酵素バリアントＡＴＧ−２８８９及びコメツキムシ緑色（ＣＢＧ９９）と共に使用した、ＣＳ０３３３ルシフェリンアナログのアミノバージョン（６９１６−０１）及びフルオロバージョン（９６２６−０１）の効果を評価している代表的なグラフを含む。具体的には、図１１Ａは、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液を使用した実験の結果を含み、図１１Ｂは、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液を使用した実験の結果を含む。ルシフェリンアナログ化合物は、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＢｕｆｆｅｒまたはＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液中で５０ｍＭ〜２０ｍＭに希釈された。ルシフェラーゼ酵素を、１×ＴＢＳ＋１％のＰｒｉｏｎｅｘ中に０．０１ｍｇ／ｍｌまで希釈した。試薬組成物は、５０μｌのＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ＋ＡＴＰを含み、これを５０μｌの希釈された酵素と組み合わせた。プレートを室温で３０分間インキュベートして、バックグラウンドを最小限にし、５μｌのルシフェリンアナログ基質を１ｍＭ（ＯＨ−ルシフェリンについては１００ｎＭ）の最終濃度に添加した。プレートを、化合物添加前後の３分及び２０分時点で読み取った。図１１Ａ及び１１Ｂの両方に示すように、ＡＴＧ−２８８９バリアントは、ルシフェリンアナログでＣＢＧ９９と比較して増強された活性を示し、またＡＴＧ−２８８９は、配列番号１のＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアントのバリアントであるため、ＣＢＧ９９と比較して増強された熱安定性及び緩衝液に対する耐性も示す。更に、ＣＳ０３３３のアミノバージョン（６９１６−０１）及びフルオロバージョン（９６２６−０１）は、それらがＣＢＧ９９で同程度の活性を示した場合であっても、ＡＴＧ−２８８９バリアントではより明るくなかった。
【０１５８】
図１１Ｃは、ＣＳ０３３３でのＡＴＧ−２８８９活性に対する異なる緩衝液組成物の効果を評価している代表的なグラフを含む。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液及びＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液を試験することに加えて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｕｆｆｅｒ＃１及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｕｆｆｅｒ＃２も試験した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｕｆｆｅｒ＃１は、１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、５ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．２％のＴｅｒｇｉｔｏｌ、１０％のグリセロール、及び０．２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含んだ。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｕｆｆｅｒ＃２は、１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．２％のＴｅｒｇｉｔｏｌ、０．４％のＰｒｉｏｎｅｘ、及び１ｍＭのＤＴＴを含んだ。示すように、ＡＴＧ−２８８９の活性は、試験された緩衝液の間で顕著な差はなかった。
【０１５９】
ｅｐＰＣＲ、ＤＮＡシャフリング、及び組み合わせ解析を使用して同定されたルシフェラーゼ酵素バリアントの評価
Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）に基づいたエラープローンＰＣＲ（ｅｐＰＣＲ）ライブラリー、続いて、アミノ酸置換の最適な組み合わせを見つけるためのトップヒットのＤＮＡシャフリングを使用して、指向性進化（ＤＥ）スクリーニングにより酵素活性の更なる改善を付与するアミノ酸置換を有するバリアントを同定した。図１２Ａは、ＣＳ０２８０、ＣＳ０３３３、及びＣＳ０５１０ルシフェリンアナログを使用したこれらのバリアントの活性試験の代表的な結果を含む。これらの実験を実施するために、試薬組成物は、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）（ＢＧ）緩衝液またはＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＲ）緩衝液中の０．００５ｍｇ／ｍｌの酵素＋１ｍＭのＡＴＰ＋１ｍＭの基質を含んだ。示すように、幾つかのクローンがスクリーニングにより同定され、精製されたタンパク質を用いて、ＣＳ０２８０（ジメチルルシフェリン）及びＣＳ０３３３（シクロプロピルルシフェリン）による改善された明るさを有することが確認された。テーブルは、各列の中での相対的な発光値に従って赤色〜緑色のスペクトルにわたる色がつけられており、最も低い値は赤色に着色され、最も高い値は緑色に着色されている。
【０１６０】
ｅｐＰＣＲの後に、ＤＮＡシャフリングを使用して、同定されたルシフェラーゼ酵素バリアントの改善された活性を付与するアミノ酸置換を同定した。図１２Ｂに示すように、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液及びＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液の両方において、Ｎ２２８Ｄ、Ｖ３００Ｇ、Ｌ３０５Ｆ、及びＳ３０６Ｐが含まれるＡＴＧ−２８８９バリアントの明るさと比較して、ＣＳ０３３３での改善された明るさを付与した幾つかの追加のアミノ酸置換が同定された。
【０１６１】
図１３は、アミノ酸置換Ｖ３００Ｇ、Ｌ３０５Ｆ、及びＳ３０６ＰのＣＳ０３３３アナログでの酵素活性に対する効果の代表的なグラフを含む。試薬組成物は、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液中の０．００５ｍｇ／ｍｌの酵素＋１ｍＭのＡＴＰ＋１００ｎＭ〜１ｍＭの基質を含んだ。示すように、ＡＴＧ−２８８９、ＡＴＧ−３５４９、ＡＴＧ−３５５０、ＡＴＧ−３５５１、ＡＴＧ−３５５２、及びＡＴＧ−３５５３含め、全ての試験したバリアントは、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）と比較して、ＣＳ０３３３での改善された活性を示し、ＡＴＧ−３５５０が最も高い活性を示した。
【０１６２】
上記のＤＮＡシャフリング実験からの配列データの線形回帰解析により、ＣＳ０３３３での改善された酵素活性に関連する追加のアミノ酸置換が予測された。図１４は、線形回帰及び組み合わせ解析を使用して同定された様々なルシフェラーゼ酵素バリアントの５，５−二置換ルシフェリンアナログでの活性試験の代表的結果を含む。試薬組成物は、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液中の５０μｌの０．００５ｍｇ／ｍｌの酵素＋５０μｌの１ｍＭの５，５−シクロプロピルルシフェリン＋１ｍＭのＡＴＰを含んだ。示すように、少数の組み合わせを試験することにより、ＡＴＧ−２８８９バリアントバックグラウンドにＳ１９３Ａ＋Ｎ２２８Ｄ＋Ｌ３０５Ｆを組み込むことによって、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液及びＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液の両方におけるＣＳ０３３３での明るさが更に改善されるという発見がもたらされた。
【０１６３】
ルシフェラーゼ酵素バリアントの動力学的試験
合理的突然変異誘発を使用して、ルシフェラーゼ酵素バリアントＡＴＧ−２６７１（Ｇ２４５Ａ＋Ｌ２８５Ｉ＋Ｇ３１５Ａ）におけるアミノ酸置換が同定され、改善された活性を付与すると仮定された。これを試験するために、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）及びＡＴＧ−２６７１の両方のＶｍａｘ及びＫｍを比較した。図１５は、ルシフェラーゼ酵素バリアントＡＴＧ−２６７１のＤ／Ｌ−ルシフェリンでの動力学的活性の代表的なグラフを含む。試薬組成物は、１×ＴＢＳ＋１％のＰｒｉｏｎｅｘ中に０．０１ｍｇ／ｍｌまで希釈された酵素、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液中に２ｍＭまで希釈されたＡＴＰ、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液＋ＡＴＰ中に連続希釈されたＯＨ−ルシフェリンを含み、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液＋ＡＴＰ中の５０μｌの基質が、１×ＴＢＳ＋１％のＰｒｉｏｎｅｘ中に希釈された５０μｌの酵素と組み合わされた。組成物を、３分間インキュベートし、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）  Ｍｕｌｔｉ＋プラットフォーム上で読み取った。ＡＴＧ−２６７１は、ルシフェリンアナログ（データ非表示）では活性を示さなかったが、Ｄ／Ｌ−ルシフェリンではＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）と同程度の活性及び動力学を示し、ＡＴＧ−２６７１がルシフェリンアナログを利用することができないのは酵素活性の欠如のためではなかったことを示唆する。
【０１６４】
図１６Ａ〜１６Ｂは、２種の緩衝液組成物における、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）のルシフェリンでの動力学解析及びＡＴＧ−２２８９バリアントのＣＳ０３３３での動力学解析の代表的結果を含む。図１６Ａに示すように、ＡＴＧ−２８８９は、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液において、Ｄ／Ｌ−ルシフェリンでは、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）とほぼ同じ動態を示すが、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液では、明るさがわずかに小さい。ＡＴＧ−２８８９の基質に対するＫｍは、両方の緩衝液において、配列番号１のＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアントと比較して改善されている。ＣＳ０３３３（シクロプロピルルシフェリン）では、ＡＴＧ−２８８９は、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）と比較して顕著に高い活性も示す。（ＣＳ０３３３は、熱安定性ルシフェラーゼであるＰｐｅバリアントの活性を阻害する）
【０１６５】
図１６Ｂは、同様の結果を提供する。試薬組成物は、１×ＴＢＳ＋１％のＰｒｉｏｎｅｘ中に０．０１ｍｇ／ｍｌまで希釈された酵素、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液中に２ｍＭまで希釈されたＡＴＰ、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液＋ＡＴＰ中に連続希釈されたＯＨ−ルシフェリンを含み、（Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液＋ＡＴＰ中の）５０μｌの基質が、１×ＴＢＳ＋１％のＰｒｉｏｎｅｘ中に希釈された５０μｌの酵素と組み合わされた。組成物を、定量化の前に３分間インキュベートした。示すように、ＣＳ０３３３（ＣＳ０３３３−０２及びＣＳ０３３３−０２−Ｎａ）では、ＡＴＧ−２８８９の活性は、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアントと比較して顕著に高かった（ＣＳ０３３３は、配列番号１のＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアントの活性を阻害する）。しかしながら、ＡＴＧ−２８８９のＣＳ０３３３（ＣＳ０３３３−０２及びＣＳ０３３３−０２−Ｎａ）でのＶｍａｘは、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液においてルシフェリンでのＶｍａｘより２３．１倍低く、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液においてルシフェリンでのＶｍａｘより４２．９倍低かった。
【０１６６】
図１７は、２種の緩衝液組成物（Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液及びＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液）における、配列番号１のＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント、ＡＴＧ−２８８９、ＡＴＧ−３５５２、及びＣ４５８４Ｄ７（Ｐ１Ｂ１０）酵素のルシフェリン及びＣＳ０３３３での動力学解析の代表的結果を含む。示すように、いずれの緩衝液においても、ＡＴＧ−２８８９、ＡＴＧ−３５５２、及びＣ４５８４Ｄ７（Ｐ１Ｂ１０）バリアントは、ルシフェリンでＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）と同様であるか、またはそれと比較して改善された動力学を示す。
【０１６７】
更に、保存的または半保存的とみなされないものが含まれる、幾つかの他のアミノ酸置換が、以下の表２に示すように、ＡＴＧ−２８８９になされた。ＡＴＧ−２８８９のこれらのバリアントは、ＣＳ０３３３で、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）と比較して顕著に高い活性を示した（右端の列）。
表２：熱安定性ＡＴＧ−２８８９バリアントの増強された活性
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【０１６８】
図１８は、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）及びＡＴＧ−３６７４酵素の、それぞれＡＴＰと組み合わせたルシフェリン及びＣＳ０３３３での動力学解析の代表的結果を含む。試薬組成物は、１ｍＭの基質、１００ｆＭ〜１００ｕＭのＡＴＰ（１０倍希釈物）、及び０．１ｍｇ／ｍｌの酵素を含んだ。示すように、ＡＴＧ−３６７４のＣＳ０３３３との組み合わせは、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）のルシフェリンとの組み合わせと比較して、ＡＴＰに対する同等のＫｍ値〜改善されたＫｍ値を示し、ＡＴＧ−３６７４におけるアミノ酸置換がＡＴＰ検出の感度に影響を及ぼさないことを示した。従って、ＡＴＧ−３６７４ルシフェラーゼ酵素バリアントの熱安定性ルシフェリンアナログ基質ＣＳ０３３３との組み合わせは、ＡＴＰ検出／定量化アッセイに効果的であろう。
【０１６９】
様々なアミノ酸置換を有するルシフェラーゼ酵素バリアントの更なる解析は、ＡＴＧ−３７０７バリアント（Ｈ２４４Ｗ＋Ｙ２５４Ｓ＋Ｔ３４４Ａ＋Ｓ１９３Ａ＋Ｎ２２８Ｄ＋Ｌ３０５Ｆ＋Ｓ３０６Ｐ＋Ｉ１０９Ｖ）の同定をもたらした。図１９Ａ〜１９Ｄは、ｅｐＰＣＲを使用して同定された様々なルシフェラーゼ酵素バリアントの活性データ及び動力学解析の代表的結果を含み、図１９Ｂ〜１９Ｃは、バリアントＡＴＧ−３７０７の増強された活性を強調する。
【０１７０】
図１９Ａは、ｅｐＰＣＲを使用して同定された様々なルシフェラーゼ酵素バリアントの、５，５−シクロプロピルルシフェリンを使用した動力学解析の代表的結果を含む。試薬組成物は、１×ＴＢＳ＋０．５％のＰｒｉｏｎｅｘ中の０．００５ｍｇ／ｍｌの酵素、１ｍＭのＡＴＰ、及び１０ｆＭ〜１ｍＭの基質を含んだ（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液中の連続希釈物）。示すように、ｅｐＰＣＲの間に同定されたバリアントからの追加のアミノ酸置換組み合わせは、Ｉ１０９Ｖも酵素活性も更に改善し、ＡＴＧ−３７０７（Ｈ２４４Ｗ＋Ｙ２５４Ｓ＋Ｔ３４４Ａ＋Ｓ１９３Ａ＋Ｎ２２８Ｄ＋Ｌ３０５Ｆ＋Ｓ３０６Ｐ＋Ｉ１０９Ｖ）をもたらすことを明らかにした。加えて、１０９位、２１４位、３３５位でのアミノ酸置換の全てが、Ｖｍａｘを増加させた。
【０１７１】
図１９Ｂ〜１９Ｃは、３種の緩衝液組成物において、ルシフェリンを用いたＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）及びＣＳ０３３３を用いたＡＴＧ−３７０７バリアントを比較した活性試験の代表的結果を含む。試薬組成物は、１ｘＴＢＳ＋０．５％Ｐｒｉｏｎｅｘ中の０．００５ｍｇ／ｍｌの酵素、緩衝液中の１ｍＭの基質、及び１ｍＭのＡＴＰを含んだ。図１９Ｂにおいて、ＡＴＧ−３７０７バリアントは、バリアント間で最も高い活性を示し、示すようにＣＳ０３３でのその活性は、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液及びＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液の両方において、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）のルシフェリンでの活性と同等（例えば、１０倍以内）であった。図１９Ｃにおいて、ＡＴＧ−３７０７バリアントは、ＣＳ０３３３で最も高い活性を示し、ＣＳ０２８０及びＣＳ０５１０が後に続き、Ｄ／Ｌ−ルシフェリンでよりもＣＳ０３３３でより高い活性を示した。これは、ＡＴＧ−３７０７バリアントにおけるアミノ酸置換が、ルシフェリンの代わりにＣＳ０３３３及び他のルシフェリンアナログを高効率で利用する能力を付与することを実証する。図１９Ｄは、ＣＳ０３３３と比較したＤ／Ｌ−ルシフェリンでのＡＴＧ−３７０７の性能の一部の損失（約１対数暗い）を実証している代表的な動力学データ、６００ｎｍでの光出力の赤方偏移した波長ピーク、及び試験された精製バリアントの最も高いＶｍａｘを含む。
【０１７２】
図１９Ｅは、ルシフェリンまたはＣＳ０３３３のいずれか、及び様々なヌクレオチド（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、ｄＡＴＰ及びｄＧＴＰ）を用いて、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）及びＡＴＧ−３７０７バリアントを比較している活性試験の代表的結果を含む。試薬組成物は、１×ＴＢＳ＋０．５％Ｐｒｉｏｎｅｘ中に０．０１ｍｇ／ｍｌまで希釈された酵素を含んだ。基質を、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液中に２ｍＭまで希釈し、個々のヌクレオチドを水中に２２ｍＭまで希釈した。約５０μｌの希釈された酵素を、５０μｌの希釈された基質と組み合わせた。反応物を、室温で約９０分間インキュベートした。約１１μｌのヌクレオチドを、示された反応物に添加し、発光を３分後に読み取った。これらのデータは、ルシフェラーゼバリアントＡＴＧ−３７０７が（Ｐｐｅバリアントと同様に）全てのヌクレオチドを触媒作用に利用できることを実証する。しかしながら、Ｐｐｅバリアントとは異なり、ＡＴＧ−３７０７は、ＣＳ０３３３が基質として存在する場合も全てのヌクレオチドを触媒作用に利用することができる。
【０１７３】
Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）及びＡＴＧ−３７０７（配列番号２）の異なる基質でのＶｍａｘ及びＫｍの要約を、表３（以下）に提供する。ＡＴＧ−３７０７バリアントは、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液及びＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ緩衝液において、ラセミ体ルシフェリンで、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）より低いＫｍを示す。
表３：配列番号１のＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント及びＡＴＧ−３７０７のＶｍａｘ及びＫｍ値
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【０１７４】
ルシフェラーゼ酵素バリアントＡＴＧ−３７０７の改善された活性を付与するアミノ酸置換を同定するために、ｅｐＰＣＲの第２ラウンドを実行した。以下の表４に示すように、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）緩衝液、及びＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液における、ＣＳ０３３３での改善された明るさを付与した幾つかの追加のアミノ酸置換が同定された（図２Ｃも参照のこと）。試薬組成物は、２ｍＭのＡＴＰを含有する反応緩衝液中に２０ｍＭ〜２ｍＭに希釈されたＣＳ０３３３を含んだ。精製酵素を、１×ＴＢＳ＋１％のＰｒｉｏｎｅｘ中に０．０１ｍｇ／ｍｌまで希釈し、５０μｌの希釈された酵素を、各ウェル中で反応緩衝液中に混合された５０μｌの希釈されたＣＳ０３３３＋ＡＴＰと組み合わせた。反応物を２５℃で３分間インキュベートし、発光を読み取り、次いで、並行して試験されたＡＴＧ−３７０７の活性に正規化した。示すように、同定された全てのルシフェラーゼ酵素バリアントは、試験された緩衝液のうちの１種以上において、ＡＴＧ−３７０７と比較して少なくとも１０％の改善を示した。
表４：改善された活性を有するＡＴＧ−３７０７のバリアント
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【０１７５】
更に、表５（以下）は、上記に示したＡＴＧ−３７０７のバリアントの動力学解析を含む。試薬組成物は、２ｍＭのＡＴＰを含有する反応緩衝液中で１ｍＭから１０ｆＭまで１０倍に連続希釈されたＣＳ０３３３を含んだ。精製酵素を、１×ＴＢＳ＋１％のＰｒｉｏｎｅｘ中に０．０１ｍｇ／ｍｌまで希釈し、５０μｌの希釈された酵素を、各ウェル中で反応緩衝液中に混合された５０μｌの希釈されたＣＳ０３３３＋ＡＴＰと組み合わせた。反応物を２５℃で３分間インキュベートし、発光を読み取り、次いで、並行して試験されたＡＴＧ−３７０７の活性に正規化した。示すように、Ｃ２１５７Ｄ２を除く全てのバリアントは、ＡＴＧ−３７０７と比較して改善されたＶｍａｘ値を示した。Ｃ２１５７Ｄ２は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）緩衝液におけるＡＴＧ−３７０７と比較して改善された明るさのために選択されたため、依然として有益な特性を有した。これらのＡＴＧ−３７０７のバリアントの幾つかは、ＣＳ０３３３基質に対するより低いＫｍ値を示し、従って、それらが基質とより密接に結合しそうであることを示す。
表５：ＡＴＧ−３７０７バリアントの動力学解析
2021526800.tif 000019
【０１７６】
ＣＳ０２８０（ジメチルルシフェリン）及びＣＳ０３３３（シクロプロピルルシフェリン）アナログに対する改善された活性を付与するアミノ酸置換を同定するために、ｅｐＰＣＲ／ＤＮＡシャフリング実験により得られた結果に対して更なるスクリーニングを実行した（表６）。これらの実験は、各ルシフェラーゼ酵素バリアントを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、１ｍＭのＡＴＰ＋５００μＭの基質を含有するＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ中に溶解させることを含んだ。細胞可溶化物を、室温で３分間インキュベートし、発光を読み取った。生の発光測定値を、このスクリーニングにおいて対照として使用したＡＴＧ−２８８９のプレート上での発光に正規化した。（正規化された発光＝（変異体のＲＬＵ／ＡＴＧ２８８９のＲＬＵ））。以下の表６に示すように、全てのルシフェラーゼ酵素バリアントは、試験された２種の基質の一方または両方で少なくとも３．５倍以上の発光を示し、幾つかのクローンは明るさの顕著な増加を示した。
表６：ＣＳ０２８０及びＣＳ０３３３で改善された活性を示すバリアント
2021526800.tif 000020
【０１７７】
ルシフェラーゼ酵素バリアントの阻害
図２０Ａ〜２０Ｂ及び２１Ａ〜２１Ｂは、ＡＴＧ−２６２４及びＡＴＧ−２６２５がデヒドロ−Ｆ−ルシフェリンにより阻害されるが、配列番号１のＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアントよりは阻害されず、配列番号１のＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアントと比べてデヒドロ−Ｆ−ルシフェリンに対する増強された耐性を示すが、完全な耐性は示さないことを示す。図２０Ｃ及び２１Ｃは、図２０Ａ〜２０Ｂ及び２１Ａ〜２１Ｂのデータの定量化を提供し、それぞれの緩衝液における、これらのルシフェラーゼ酵素バリアントのデヒドロ−Ｆ−ルシフェリンに対するＫｉ値を示す。変異酵素のより高い値により、それらがＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）と比べてより耐性を示すことが確認された（すなわち、それらを阻害するのにより多くのデヒドロ−Ｆ−ルシフェリンを必要とする）。
【０１７８】
以前の実験は、ルシフェリン依存的な発光の阻害を示すために、１つの高い濃度のルシフェリンアナログを使用したが、図２２に示す実験は、任意の阻害を観察するのに必要なアナログの相対量を決定するためにＣＳ０２８０の濃度範囲を試験した。図２２は、ＡＴＧ−２６７１（幾つかは活性部位にある合理的変異を有する）がルシフェリンアナログでの増強された発光活性を有さないが、低濃度のＣＳ０２８０により阻害されることを示し、配列番号１のＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアントより密接にこのアナログに結合することを示唆する。
【０１７９】
図２３Ａ〜２３Ｃは、ルシフェリン及び様々な５，５−二置換ルシフェリンアナログ有り無しの両方でのＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）の活性試験の代表的結果を含む。より具体的には、図２３Ａ〜２３Ｃは、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）のＣＳ０２８０−０１、ＣＳ０３２５−０３、ＣＳ０３２５−０２−Ｒ、及びＣＳ０４３１−０２−Ｒでの阻害を試験した。試薬組成物は、ＤＭＳＯ中で５０ｍＭ〜２０ｍＭに希釈されたルシフェリンアナログ化合物を含んだ。酵素を、１×ＴＢＳ＋１％のＰｒｉｏｎｅｘ中に０．０１ｍｇ／ｍｌまで希釈した。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液＋ＡＴＰ中の約５０μｌのルシフェリンアナログ化合物を、１×ＴＢＳ＋１％のＰｒｉｏｎｅｘ中に希釈された５０μｌの酵素と組み合わせた。約５μｌのルシフェリンアナログ化合物を添加して、１ｍＭの最終濃度にした。酵素活性を、ルシフェリンアナログ化合物の添加前後で読み取った。図２３Ａは、０ｎＭの出発濃度のルシフェリンを含み、図２３Ｂは、１０ｎＭの出発濃度のルシフェリンを含み、図２３Ｃは、１００ｎＭの出発濃度のルシフェリンを含んだ。実証されるように、ルシフェリンアナログ化合物の添加有り無しの両方において、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）による発光は、ほとんどまたは全く生成されない（図２３Ａ）。ルシフェリンの濃度が１０ｎＭ（図２３Ｂ）から１００ｎＭ（図２３Ｃ）まで増加するにつれて、ルシフェリンアナログ化合物の存在下でのＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）による発光が減少し、ルシフェリンアナログ化合物がＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）に結合しており、ルシフェリンと競合していることを示す。
【０１８０】
図２４Ａ〜２４Ｂは、ルシフェリン及び様々な５，５−二置換ルシフェリンアナログ有り無しの両方でのＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）の活性試験の代表的結果を含む。より具体的には、図２４Ａ〜２４Ｂは、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）のＣＳ０２８０−０１、ＣＳ０３３３−０１−２、ＣＳ０５１０−０１−２、及びＣＳ０３２６−０１−２での阻害を試験した。試薬組成物は、ＤＭＳＯ中で５０ｍＭ〜２０ｍＭに希釈されたルシフェリンアナログ化合物を含んだ。酵素を、１×ＴＢＳ＋１％のＰｒｉｏｎｅｘ中に０．０１ｍｇ／ｍｌまで希釈した。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液＋ＡＴＰ中の約５０μｌのルシフェリンアナログ化合物を、１×ＴＢＳ＋１％のＰｒｉｏｎｅｘ中に希釈された５０μｌの酵素と組み合わせた。約５μｌのルシフェリンアナログ化合物を添加して、１ｍＭの最終濃度にした。酵素活性を、ルシフェリンアナログ化合物の添加前後で読み取った。図２４Ａは、０ｎＭの出発濃度のルシフェリンを含み、図２４Ｂは、１００ｎＭの出発濃度のルシフェリンを含んだ。実証されるように、ルシフェリンの濃度が０ｎＭ（図２４Ａ）から１００ｎＭ（図２４Ｂ）まで増加するにつれて、ルシフェリンアナログ化合物の存在下でのＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）による発光が減少し、ルシフェリンアナログ化合物がＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）に結合しており、ルシフェリンと競合していることを示す。またＣＳ０３３３は、最も強いインヒビターであると思われ、配列番号１のＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアントに最も高い親和性で結合することを示唆した。
【０１８１】
ＣＳ０３３３の結合強度を考慮して、その分解生成物の酵素活性を阻害する能力を調査するために、更なる試験を実施した。より具体的には、図２５は、配列番号１のＰｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント、ＡＴＧ−２８８９、及びＡＴＧ−３５５２のＣＳ０３３３及びその分解生成物の存在下でのＫｉ値の要約を含む。試薬組成物は、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液の１０ｎＭのＯＨ−ルシフェリン、１ｍＭのＡＴＰ、０．００５ｍｇ／ｍｌの酵素、及び０．００３２〜２３８０．９５μＭのデヒドロルシフェリンを含んだ。ＣＳ０３３３の分解生成物としては、ＣＳ０５６５−１、ＣＳ０５６５−２、ＣＳ０５６５−３、及びＣＳ０５６５−４が挙げられる。図２５において実証されるように、５，５−シクロプロピルルシフェリンの分解生成物の幾つか（ＣＳ０５６５−３、ＣＳ０５６５−４）は、ラセミ体ルシフェリンの存在下で、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）と比べてＡＴＧ−２８８９バリアントに対してより強い競合因子である。ＡＴＧ−２８８９では、全ての分解生成物が、ルシフェリンと比べて５，５−シクロプロピルルシフェリンの存在下でより阻害性が低い。加えて、全ての分解生成物は、デヒドロ−ＯＨ−ルシフェリンと比較される場合に少なくとも１６倍以下の阻害を有し、これらの分解生成物は阻害性であるが、阻害は１桁高い濃度を超える濃度で起こり、溶液中でデヒドロルシフェリンよりもゆっくりと蓄積するため、それらが完全に液体の試薬として、ルシフェリンベースの配合物と比較して改善された安定性をもたらすはずであることを示す。
【０１８２】
ルシフェラーゼ酵素バリアントＡＴＧ−２８８９（Ｈ２４４Ｗ＋Ｔ３４４Ａ＋Ｉ３９６Ｋ）を使用して、デヒドロ−Ｆ−ルシフェリン（図２６）による阻害に対する耐性を付与したＶ３００Ｇアミノ酸置換を含む追加のルシフェラーゼ酵素バリアント（ＡＴＧ−３５５０、ＡＴＧ−３５５１、ＡＴＧ−３５５２、及びＡＴＧ−３５５３）を作製した。試薬組成物は、０．０２２μＭ〜３６６．９７μＭまで漸増するデヒドロ−Ｆ−ルシフェリン、１ｍＭのＡＴＰ、１μＭのＦ−ルシフェリン、及び０．００５ｍｇ／ｍｌの酵素を含む。図２６に示すように、ルシフェラーゼ酵素バリアントにおける試験された全てのアミノ酸置換の組み合わせは、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）と比較したインヒビターに対するより高いＩＣ50値により認められるように、（使用された緩衝液にかかわらず）デヒドロ−Ｆ−ルシフェリンに対する改善された耐性を示した。アミノ酸置換Ｌ３０５Ｆ及びＳ３０６Ｐの両方は、個別に及び組み合わせにおいて、インヒビターに対する改善された耐性を付与した。
【０１８３】
酵素アッセイにおける、プロルシフェリンである５，５−二置換ルシフェリンアナログの使用
ルシフェリンアナログのプロルシフェリンバージョンも、プロルシフェリンを分解させて、ルシフェリンまたはルシフェリンアナログから修飾部分を分離する（次いで、ルシフェリンまたはルシフェリンアナログは、本明細書に記載されるルシフェラーゼ酵素バリアントの発光基質として機能する）ことによってプロルシフェリンを活性化する酵素（例えば、カスパーゼ−３、β−グルコシダーゼなど）と共に使用され得る。図２７Ａ〜２７Ｂは、カスパーゼ−３活性化アッセイにおける、プロルシフェリンである５，５−二置換ルシフェリンアナログ及びＡＴＧ−３７０７バリアントの有効性を実証する代表的結果を含む。試薬組成物は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ4、２ｍＭのＡＴＰ中に５０ｍＭから１ｍＭまで希釈されたルシフェリンアナログ化合物を含んだ。ＡＴＧ−３７０７を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ4中に０．２ｍｇ／ｍｌまで希釈した。カスパーゼ−３を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ4中に１Ｕ／μｌから０．００１Ｕ／μｌまで１０倍連続希釈した。次に、５０μｌの希釈されたＡＴＧ−３７０７を、５０μｌの希釈されたＣＳ０６７０＋ＡＴＰ混合物と組み合わせた。（図２７ＡにおけるＨＥＰＥＳベースの緩衝液の代わりに、再構成緩衝液（１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．２％のＴｅｒｇｉｔｏｌ、０．００２％のアジ化ナトリウム）を、図２７Ｂにおいて使用した）。発光測定を６０秒毎に行いながら、反応物を２５℃で７３分間インキュベートした。約５０μｌのカスパーゼ−３の各連続希釈物を反応物に添加し、混合し、１５２分の総実験時間の間、発光を６０秒毎に測定した。示すように、発光はカスパーゼ−３の添加後に増加し、カスパーゼ−３は、ＣＳ０６７０アナログの対応する前駆体からの分離を促進し、ＡＴＧ−３７０７の活性化を可能にした。従って、プロルシフェリンアナログ（例えば、シクロプロピルアナログ）は、本明細書に記載されるルシフェラーゼバリアントに対する効果的な基質であり得る。
【０１８４】
図２８Ａ〜２８Ｂは、β−グルコシダーゼ活性化アッセイにおける、プロルシフェリンである５，５−二置換ルシフェリンアナログ及びＡＴＧ−３７０７バリアントの有効性を実証する代表的結果を含む。試薬組成物は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ4、２ｍＭのＡＴＰ中に５０ｍＭから１ｍＭまで希釈されたルシフェリンアナログ化合物を含んだ。ＡＴＧ−３７０７を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ4中に０．２ｍｇ／ｍｌまで希釈した。β−グルコシダーゼを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ4中に２５００Ｕ／μｌから２．５Ｕ／μｌまで１０倍連続希釈した。次に、５０μｌの希釈されたＡＴＧ−３７０７を、５０μｌの希釈されたＣＳ０６７３＋ＡＴＰ混合物と組み合わせた。（図２８ＡにおけるＨＥＰＥＳベースの緩衝液の代わりに、再構成緩衝液（１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．２％のＴｅｒｇｉｔｏｌ、０．００２％のアジ化ナトリウム）を、図２８Ｂにおいて使用した）。発光測定を６０秒毎に行いながら、反応物を２５℃で７３分間インキュベートした。約５０μｌのβ−グルコシダーゼの各連続希釈物を反応物に添加し、混合し、１５２分の総実験時間の間、発光を６０秒毎に測定した。示すように、発光はβ−グルコシダーゼの添加後に増加し、β−グルコシダーゼは、ＣＳ０６７３アナログの対応する前駆体からの分離を促進し、ＡＴＧ−３７０７の活性化を可能にした。従って、プロルシフェリンアナログ（例えば、シクロプロピルアナログ）は、本明細書に記載されるルシフェラーゼバリアントに対する効果的な基質であり得る。
【０１８５】
示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）解析
図２９は、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）及びＡＴＧ−２８７７バリアントの示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）解析の代表的結果を含む。実験を実施するために、Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ（５０００Ｘ）を水中に３倍希釈し、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ中に５×の最終濃度で保存された酵素と組み合わせた。反応物を１分毎に１℃で３０〜９５℃に加熱しながら蛍光を６０秒間隔で読み取った。各分での蛍光の変化を算出し、上記範囲の各温度に対してプロットした。示すように、ＡＴＧ−２８７７におけるＨ２４４Ｗアミノ酸置換は、ＤＳＦ解析による精製タンパク質の融解転移温度を変化させず、このアミノ酸置換が熱安定性の損失変化を引き起こさないことを示した。
【０１８６】
ルシフェラーゼ酵素バリアントの評価
追加のルシフェラーゼ酵素バリアントを作製し、それらの安定性及び活性を評価した。追加のルシフェラーゼ酵素バリアントを評価するために、０．００５ｍｇ／ｍｌのルシフェラーゼ酵素バリアントを、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）（ＢＧ）緩衝液またはＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＲ）緩衝液中の１ｍＭのＡＴＰ＋１ｍＭの基質と混合した。以下の表７Ａ及び７Ｂに示すように、幾つかのバリアントは、ＡＴＧ−３７０７と比較してＣＳ０２８０及びＣＳ０３３３基質で改善された明るさを示した。（表７Ａは、各列の中での相対的な発光値に従って赤色〜緑色のスペクトルにわたる色がつけられており、最も低い値は赤色に着色され、最も高い値は緑色に着色されている。）
表７Ａ：ＣＳ０２８０及びＣＳ０３３３で改善された活性を示すバリアント
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表７Ｂ：ＣＳ０２８０及びＣＳ０３３３で改善された活性を示すバリアント
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【０１８７】
上記の表７Ａ及び７Ｂに提供される代表的結果に示すように、作製されたルシフェラーゼ酵素バリアントを、ＤＳＦ解析も使用して評価した。実験を実施するために、Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ（５０００Ｘ）を水中に３倍希釈し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ中に５×の最終濃度で保存された酵素と組み合わせた。反応物を１分毎に１℃で３０〜９５℃に加熱しながら蛍光を６０秒間隔で読み取った。各分での蛍光の変化を算出し、上記範囲の各温度に対してプロットした。これらのデータにより実証されるように、酵素バリアントの幾つかは、熱安定性を保持すると共に、ＡＴＧ−３７０７と比較して改善された明るさを示した。
【０１８８】
これらのルシフェラーゼ酵素バリアントの動力学的試験も実施した。同定されたルシフェラーゼ酵素バリアントが改善された活性を示すかどうかを調べるために、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）、ＡＴＧ−３７０７、及びＡＴＧ−４１１７のＶｍａｘ及びＫｍを比較した。試薬組成物は、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）（ＢＧ）緩衝液またはＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＲ）緩衝液中の０．００５ｍｇ／ｍｌのルシフェラーゼ酵素バリアント＋１ｍＭのＡＴＰ、及び０．１ｆＭ〜１ｍＭの基質を含んだ。組成物を、３分間インキュベートし、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）  Ｍｕｌｔｉ＋プラットフォーム上で読み取った。
【０１８９】
以下の表８は、Ｐｐｅの熱安定性ルシフェラーゼバリアント（配列番号１）、ＡＴＧ−３７０７、及びＡＴＧ−４１１７の動力学解析の代表的結果を含む。Ｐｐｅバリアント（配列番号１）をＤ／Ｌ−ルシフェリンで試験し、ＡＴＧ−３７０７及びＡＴＧ−４１１７を、ＣＳ０２８０及びＣＳ０３３３で試験した。実証されるように、ＡＴＧ−４１１７は、ＡＴＧ−３７０７と比較してルシフェリンアナログＣＳ０２８０及びＣＳ０３３３でより高い最大発光（Ｖｍａｘ）を示した。
表８：ＡＴＧ３７０７及びＡＴＧ４１１７のＣＳ０２８０及びＣＳ０３３３での活性
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【０１９０】
個々のアミノ酸変異の効果を含む、様々なルシフェラーゼ酵素バリアントの活性を評価及び比較するための実験も実施した。ルシフェラーゼ酵素バリアントに対する個々の変異の効果を評価するために、０．００５ｍｇ／ｍｌのルシフェラーゼ酵素バリアントを、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＲ）緩衝液中の１ｍＭのＡＴＰ＋１０ｆＭ〜１ｍＭのＣＳ０３３３と混合した。以下の表９Ａ及び９Ｂに示すように、ＡＴＧ−３７０７を構成する個々の点変異のＰｐｅバリアントへの導入は、バックグラウンドを約５倍超える改善を示したＨ２４４Ｗ変異を除いて、ＰｐｅバリアントのＣＳ０３３３での最大発光を顕著に増加させなかった。代替法として、ＡＴＧ−３７０７を構成する点変異からの個々の点変異の除去は、ＣＳ０３３３での最大発光に対する個々の変異の寄与を示した。Ｈ２４４Ｗ及びＴ３４４Ａ置換は、それらの置換をＰｐｅバリアントにおける元のアミノ酸に戻した際に、ＣＳ０３３３での活性の最大の減少を示した。
表９Ａ：個々のアミノ酸置換及びアミノ酸置換の様々な組み合わせのＣＳ０３３３でのルシフェラーゼ酵素バリアントに対する効果
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表９Ｂ：個々のアミノ酸置換及びアミノ酸置換の様々な組み合わせのＣＳ０３３３でのルシフェラーゼ酵素バリアントに対する効果
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【０１９１】
ルシフェラーゼ酵素バリアントの動力学的試験
上記のＰｐｅ（配列番号１）の様々な熱安定性ルシフェラーゼバリアントの活性（すなわちＶｍａｘ及びＫｍ）を評価するための実験も実施した。これらの実験の代表的結果を以下に表に提供する。
【０１９２】
表１０及び１１は、熱安定性バリアントのＤ／Ｌルシフェリン、ＣＳ０３３３、及びＣＳ０２８０での動力学解析の代表的結果を含む。示すように、ＭＫ０１３３は、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液及びＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液において、Ｄ／Ｌ−ルシフェリンでのＰｐｅバリアントを超えるＣＳ０３３３での最大発光（Ｖｍａｘ）値という予想外な特性を示した代表的なバリアントである。ＭＫ０１３４は、同程度の高い活性を示したが、ＣＳ０２８０に対してより特異的であり、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液におけるＰｐｅバリアントとＤ／Ｌ−ルシフェリンの組み合わせでの明るさに近かった。ＭＫ０１３５及びＭＫ０１３７は、それぞれＭＫ０１３３及びＭＫ０１３４と比較して熱安定性を改善するアミノ酸置換を有すると共に、ルシフェリンアナログＣＳ０３３３及びＣＳ０２８０に対する活性を保持する。
表１０：試薬組成物は、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液またはＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液中の０．００５ｍｇ／ｍｌのルシフェラーゼ酵素バリアント＋１ｍＭのＡＴＰ、及び１００ｆＭ〜１ｍＭの基質を含んだ。組成物を、３分間インキュベートし、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）  Ｍｕｌｔｉ＋プラットフォーム上で読み取った。
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表１１：試薬組成物は、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液またはＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液中の０．００５ｍｇ／ｍｌのルシフェラーゼ酵素バリアント＋１ｍＭのＡＴＰ、及び１ｍＭの基質を含んだ。組成物を、３分間インキュベートし、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）  Ｍｕｌｔｉ＋プラットフォーム上で読み取った。
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【０１９３】
表１２は、熱安定性バリアントの４００ｆＭ〜４ｍＭのＣＳ０２８０での動力学解析の代表的結果を含む。酵素バリアントのこのパネルは、それらの原型の酵素バリアントであるＭＫ１３４及びＭＫ１３７と比較してＣＳ０２８０での改善された熱安定性及び明るさの組み合わせを有する。
表１２：試薬組成物は、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液またはＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液中の０．００５ｍｇ／ｍｌのルシフェラーゼ酵素バリアント＋４ｍＭのＡＴＰ、及び４００ｆＭ〜４ｍＭの基質を含んだ。組成物を、３分間インキュベートし、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）  Ｍｕｌｔｉ＋プラットフォーム上で読み取った。
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【０１９４】
表１３及び１４は、熱安定性バリアントのＤ／Ｌルシフェリン、ＣＳ０３３３、及びＣＳ０２８０での動力学解析の代表的結果を含む。酵素バリアントのパネルは、異なる緩衝液における、試験された異なる基質（Ｄ／Ｌ−ルシフェリン、ＣＳ０３３３、及びＣＳ０２８０）でのＭＫ０１３７の最大発光（Ｖｍａｘ）またはＫｍを更に改善するアミノ酸置換を強調する。特に、酵素バリアントＭＫ０１５１及びＭＫ１５３は、複数の緩衝液にわたって、複数の基質でＭＫ０１３７と比較した改善を示す。
表１３：試薬組成物は、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ緩衝液中の０．００５ｍｇ／ｍｌのルシフェラーゼ酵素バリアント＋２ｍＭのＡＴＰ、及び２００ｆＭ〜２ｍＭの基質を含んだ。組成物を、３分間インキュベートし、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）  Ｍｕｌｔｉ＋プラットフォーム上で読み取った。
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表１４：試薬組成物は、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）緩衝液中の０．００５ｍｇ／ｍｌのルシフェラーゼ酵素バリアント＋２ｍＭのＡＴＰ、及び２００ｆＭ〜２ｍＭの基質を含んだ。組成物を、３分間インキュベートし、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）  Ｍｕｌｔｉ＋プラットフォーム上で読み取った。
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【０１９５】
前述の発明を実施するための形態及び付随する実施例は単に例示的なものであり、添付の特許請求の範囲及びその等価物によってのみ定義される本開示の範囲に対する限定とみなされるべきではないことが理解されよう。
【０１９６】
本開示の実施形態に対する様々な変更及び改変が、当業者には明らかとなるであろう。かかる変更及び改変は、限定されるものではないが、化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、配合物、または本開示の使用方法に関するものを含め、本開示の要旨及び範囲を逸脱しない範囲でなされ得る。
【図１】
2021526800.tif 000033
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
2021526800.tif 000043
【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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