(57)【要約】  皮膚扁平上皮がん（CSCC）、腎細胞がん（RCC）、非小細胞肺がん（NSCLC）、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）、小細胞肺がん（SCLC）、進行再発頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん（SCCHN）、上咽頭がん（NPC）、肝細胞がん（HCC）、肛門がん、結腸直腸がん（CRC）、基底細胞がん（BCC）、メルケル細胞がん、虫垂がん、皮膚肉腫、手術後の再発性メラノーマ、進行性若しくは転移性の尿路上皮がん、肝転移、高頻度マイクロサテライト不安定性がん（MSI-H）、混合型進行性固形がん、ウイルス性がん、局所領域進行がん、小児がん、既存の抗がん免疫がないか若しくは最小限の患者におけるがん、第一選択療法としてのがん、既治療患者におけるがん、チェックポイント遮断（療法を受けていない患者におけるがん、及び／又はチェックポイント遮断療法を受けた患者におけるがんを処置又は予防する方法における使用のための腫瘍溶解性ウイルスであって、  腫瘍溶解性ウイルスが、同じウイルス種の3つ以上の臨床分離株のパネルの、2つ以上の腫瘍細胞株の腫瘍細胞を死滅させる能力をインビトロで比較し、2つ以上の腫瘍細胞株の細胞を、前記パネル中の他の臨床分離株のうちの1つ以上よりもインビトロで迅速に及び/又は低用量で死滅させることができる臨床分離株を選択することによって選択された臨床分離株であるか、又はそれに由来する；（i）融合誘導性タンパク質をコードする遺伝子、及び（ii）免疫刺激分子又は免疫刺激分子をコードする遺伝子を含む；（i）GM-CSFをコードする遺伝子、及び（ii）免疫共刺激経路活性化分子又は免疫共刺激経路活性化分子をコードする遺伝子を含む；並びに/あるいはCTLA-4阻害剤をコードする遺伝子を含む、腫瘍溶解性ウイルス。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚扁平上皮がん（CSCC）、腎細胞がん（RCC）、非小細胞肺がん（NSCLC）、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）、小細胞肺がん（SCLC）、進行再発頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん（SCCHN）、上咽頭がん（NPC）、肝細胞がん（HCC）、肛門がん、結腸直腸がん（CRC）、基底細胞がん（BCC）、メルケル細胞がん、虫垂がん、皮膚肉腫、手術後の再発性メラノーマ、進行性若しくは転移性の尿路上皮がん、肝転移、高頻度マイクロサテライト不安定性がん（MSI-H）、混合型進行性固形がん、ウイルス性がん、局所領域進行がん、小児がん、既存の抗がん免疫がないか若しくは最小限の患者におけるがん、第一選択療法としてのがん、既治療患者におけるがん、チェックポイント遮断（blockade）療法を受けていない患者におけるがん、及び／又はチェックポイント遮断療法を受けた患者におけるがんを処置又は予防する方法における使用のための腫瘍溶解性ウイルスであって、
（a）腫瘍溶解性ウイルスが、同じウイルス種の3つ以上の臨床分離株のパネルの、2つ以上の腫瘍細胞株の腫瘍細胞を死滅させる能力をインビトロで比較し、2つ以上の腫瘍細胞株の細胞を、前記パネル中の他の臨床分離株のうちの1つ以上よりもインビトロで迅速に及び/又は低用量で死滅させることができる臨床分離株を選択することによって選択された臨床分離株であるか、又はそれに由来する；
（b）腫瘍溶解性ウイルスが、（i）融合誘導性タンパク質をコードする遺伝子、及び（ii）免疫刺激分子又は免疫刺激分子をコードする遺伝子を含む；
（c）腫瘍溶解性ウイルスが、（i）GM-CSFをコードする遺伝子、及び（ii）免疫共刺激経路活性化分子又は免疫共刺激経路活性化分子をコードする遺伝子を含む；並びに/あるいは
（d）腫瘍溶解性ウイルスが、CTLA-4阻害剤をコードする遺伝子を含む、
腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２】
改変された臨床分離株である、請求項1に記載の使用のためのウイルス。
【請求項３】
前記パネルが5種以上の異なる臨床分離株を含む、請求項１又は2に記載の使用のためのウイルス。
【請求項４】
前記細胞株が、U87MG（グリオーマ）、HT29（結腸直腸）、LNCaP（前立腺）、MDA-MB-231（乳房）、SK-MEL-28（メラノーマ）、Fadu（扁平上皮がん）、MCF7（乳房）、A549（肺）、MIAPACA-2（膵臓）、CAPAN-1（膵臓）、及びHT1080（線維肉腫）からなる群から選択されるヒト腫瘍細胞株である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用のためのウイルス。
【請求項５】
（a）1以上の免疫刺激分子若しくは1以上の免疫刺激分子をコードする遺伝子、及び/又は
（b）1以上の融合誘導性タンパク質をコードする遺伝子
を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の使用のためのウイルス。
【請求項６】
（a）前記融合誘導性タンパク質が、水疱性口内炎ウイルス（VSV）Gタンパク質、シンシチン-1、シンシチン-2、シミアンウイルス5（SV5）Fタンパク質、麻疹ウイルス（MV）Hタンパク質、MV Fタンパク質、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）Fタンパク質、及びRペプチドが欠失しているテナガザル（gibbon ape）白血病ウイルス（GALV）、マウス白血病ウイルス（MLV）、Mason-Pfizerサルウイルス（MPMV）又はウマ感染性貧血ウイルス（EIAV）由来の糖タンパク質からなる群から選択される；
（b）前記免疫刺激分子が、GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-24、I型インターフェロン、インターフェロンガンマ、III型インターフェロン、TNFアルファ、TGFベータのアンタゴニスト、免疫チェックポイントアンタゴニスト、又は免疫増強経路のアゴニスト、例えば、CD40、ICOS、GITR、4-1-BB、OX40若しくはflt3のアゴニストである；並びに/あるいは
（c）前記免疫共刺激経路活性化分子をコードする遺伝子が、CD40、ICOS、GITR、4-1-BB、OX40若しくはflt3のアゴニスト、例えば、CD40リガンド（CD40L）、ICOSリガンド、GITRリガンド、4-1-BBリガンド、OX40リガンド、TL1A、CD30リガンド、CD27若しくはflt3リガンド若しくはそれらのいずれかの改変バージョンをコードする、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の使用のためのウイルス。
【請求項７】
前記CTLA-4阻害剤が抗CTLA-4抗体又はその抗原結合断片である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の使用のためのウイルス。
【請求項８】
前記断片がscFvを含む、請求項7に記載の使用のための腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項９】
前記断片が1以上のIgG1定常領域と連結したscFv分子である、請求項7又は8に記載の使用のためのウイルス。
【請求項１０】
前記抗体又は断片が、IgG重鎖に連結した軽鎖可変領域配列を含む、請求項7〜9のいずれか1項に記載の使用のためのウイルス。
【請求項１１】
前記抗体又は断片が、（a）配列番号46に示される軽鎖可変領域配列及び配列番号48に示される重鎖可変領域配列；又は（b）配列番号56に示される軽鎖可変領域配列及び配列番号57に示される重鎖可変領域配列を含む、請求項7〜10のいずれか1項に記載の使用のためのウイルス。
【請求項１２】
前記抗体又は断片が、（a）配列番号54のアミノ酸配列；又は（b）配列番号59のアミノ酸配列を含む、請求項11に記載の使用のためのウイルス。
【請求項１３】
前記抗体又は断片が、（a）配列番号55のヌクレオチド配列；又は（b）配列番号60のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項7に記載の使用のためのウイルス。
【請求項１４】
（a）前記融合誘導性タンパク質が、テナガザル白血病ウイルス（GALV）由来の糖タンパク質であり、R膜貫通ペプチドが突然変異又は除去されている（GALV-R-）、及び/又は
（b）前記免疫刺激分子が、（i）GM-CSF、CD40リガンド（CD40L）、ICOSリガンド、GITRリガンド、4-1-BBリガンド、OX40リガンド若しくはflt3リガンド又はそれらのいずれかの改変バージョン、又は（ii）CTLA-4阻害剤、例えばCTLA-4抗体若しくはその断片である、
請求項1〜13のいずれか1項に記載の使用のためのウイルス。
【請求項１５】
1を超える融合誘導性タンパク質及び/又は1を超える免疫刺激分子及び/又は1を超える免疫共抑制経路活性化分子をコードする、請求項1〜14のいずれか1項に記載の使用のためのウイルス。
【請求項１６】
ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス及びレオウイルスからなる群から選択される、請求項1〜15のいずれか1項に記載の使用のためのウイルス。
【請求項１７】
単純ヘルペスウイルス（HSV）である、請求項1〜16のいずれか1項に記載の使用のためのウイルス。
【請求項１８】
HSV1である、請求項17に記載の使用のためのウイルス。
【請求項１９】
前記臨床分離株が、
受託番号ECACC16121904を有するRH018A株、
受託番号ECACC16121902を有するRH004A株、
受託番号ECACC16121907を有するRH031A株、
受託番号ECACC16121908を有するRH040B株、
受託番号ECACC16121903を有するRH015A株、
受託番号ECACC16121905を有するRH021A株、
受託番号ECACC16121906を有するRH023A株、又は
受託番号ECACC16121909を有するRH047A株
である、請求項18に記載の使用のためのウイルス。
【請求項２０】
受託番号ECACC16121904を有するRH018A株である、請求項19に記載の使用のためのウイルス。
【請求項２１】
前記ウイルスが、
（a）機能的ICP34.5を発現しない、
（b）機能的ICP47を発現しない、及び/又は
（c）US11遺伝子を前初期遺伝子として発現する、
請求項17〜20のいずれか1項に記載の使用のためのウイルス。
【請求項２２】
（a）融合誘導性タンパク質をコードする遺伝子及び/若しくは免疫刺激分子をコードする遺伝子、又はGM-CSFをコードする遺伝子及び免疫共刺激経路活性化分子をコードする遺伝子、又は抗CTLA-4阻害タンパク質をコードする遺伝子が、それぞれ別々の制御調節下で、挿入、又は部分的な若しくは完全な欠失のいずれかによって、場合により互いに関して背中合わせの向き（back to back orientation）で、ICP34.5をコードする遺伝子座に挿入されている、並びに/あるいは
（b）融合誘導性タンパク質をコードする遺伝子の配列、免疫刺激分子をコードする遺伝子の配列、GM-CSFをコードする遺伝子の配列、免疫共刺激経路活性化分子をコードする遺伝子の配列、及び/又は抗CTLA-4阻害剤をコードする遺伝子の配列が、標的細胞における発現レベルを増加させるようにコドン最適化されている、並びに/あるいは
（c）抗CTLA-4阻害タンパク質をコードする遺伝子が、1つ以上の免疫刺激遺伝子、例えばGM-CSF、及び/又は免疫共刺激経路活性化分子をコードする遺伝子、及び/又は融合誘導性タンパク質をコードする遺伝子も含むカセットに含まれる、
請求項21に記載の使用のためのウイルス。
【請求項２３】
皮膚扁平上皮がん（CSCC）、腎細胞がん（RCC）、非小細胞肺がん（NSCLC）、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）、小細胞肺がん（SCLC）、進行再発頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん（SCCHN）、上咽頭がん（NPC）、肝細胞がん（HCC）、肛門がん、結腸直腸がん（CRC）、基底細胞がん（BCC）、メルケル細胞がん、虫垂がん、皮膚肉腫、手術後の再発性メラノーマ、進行性若しくは転移性の尿路上皮がん、肝転移、高頻度マイクロサテライト不安定性がん（MSI-H）、混合型進行性固形がん、ウイルス性がん、局所領域進行がん、小児がん、既存の抗がん免疫がないか若しくは最小限の患者におけるがん、第一選択療法としてのがん、既治療患者におけるがん、チェックポイント遮断療法を受けていない患者におけるがん、及び／又はチェックポイント遮断療法を受けた患者におけるがんを処置又は予防する方法における使用のためのウイルスであって、前記ウイルスが3つの異種遺伝子を発現し、3つの異種遺伝子の各々が、CMVプロモーター、RSVプロモーター、SV40プロモーター及びレトロウイルスLTRプロモーターから選択される異なるプロモーターによって駆動される、ウイルス。
【請求項２４】
3つの異種遺伝子を発現し、3つの異種遺伝子の各々が、CMVプロモーター、RSVプロモーター、SV40プロモーター及びレトロウイルスLTRプロモーターから選択される異なるプロモーターによって駆動される、請求項1〜23のいずれか1項に記載の使用のためのウイルス。
【請求項２５】
CMVプロモーター、RSVプロモーター、SV40プロモーター及びレトロウイルスLTRプロモーターの各々によってそれぞれ駆動される4つの異種遺伝子を発現する、請求項23又は24に記載の使用のためのウイルス。
【請求項２６】
レトロウイルスLTRがMMLV由来である、請求項23〜25のいずれか1項に記載の使用のためのウイルス。
【請求項２７】
皮膚扁平上皮がん（CSCC）、腎細胞がん（RCC）、非小細胞肺がん（NSCLC）、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）、小細胞肺がん（SCLC）、進行再発頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん（SCCHN）、上咽頭がん（NPC）、肝細胞がん（HCC）、肛門がん、結腸直腸がん（CRC）、基底細胞がん（BCC）、メルケル細胞がん、虫垂がん、皮膚肉腫、手術後の再発性メラノーマ、進行性若しくは転移性の尿路上皮がん、肝転移、高頻度マイクロサテライト不安定性がん（MSI-H）、混合型進行性固形がん、ウイルス性がん、局所領域進行がん、小児がん、既存の抗がん免疫がないか若しくは最小限の患者におけるがん、第一選択療法としてのがん、既治療患者におけるがん、チェックポイント遮断療法を受けていない患者におけるがん、及び／又はチェックポイント遮断療法を受けた患者におけるがんを処置又は予防する方法における使用のためのウイルスであって、前記ウイルスが3つの異種遺伝子を発現し、3つの異種遺伝子の各々が、BGH、SV40、HGH及びRBGポリアデニル化配列から選択される異なるポリアデニル化配列によって終結される、ウイルス。
【請求項２８】
3つの異種遺伝子を発現し、3つの異種遺伝子の各々が、BGH、SV40、HGH及びRBGポリアデニル化配列から選択される異なるポリアデニル化配列によって終結される、請求項1〜27のいずれか1項に記載の使用のためのウイルス。
【請求項２９】
BGH、SV40、HGH及びRBGポリアデニル化配列の各々によってそれぞれ終結される4つの異種遺伝子を発現する、請求項27又は28に記載の使用のためのウイルス。
【請求項３０】
（a）HSV、
（b）HSV1、又は
（c）ポックスウイルス
である、請求項23〜29のいずれか1項に記載の使用のためのウイルス。
【請求項３１】
がんを処置する方法における使用のための請求項1〜30のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルスであって、該方法がチロシンキナーゼ阻害剤を投与することを含む、ウイルス。
【請求項３２】
前記チロシンキナーゼ阻害剤がMEK阻害剤又はBRAF阻害剤である、請求項31に記載の使用のためのウイルス。
【請求項３３】
前記がんが固形がんである、請求項31又は32に記載の使用のためのウイルス。
【請求項３４】
前記方法が、さらなる抗がん剤を投与することを含む、請求項1〜33のいずれか1項に記載の使用のためのウイルス。
【請求項３５】
前記さらなる抗がん剤が、免疫共抑制経路のアンタゴニスト、免疫共刺激経路のアゴニスト、放射線療法及び/又は化学療法、腫瘍において生じる特定の遺伝子突然変異を標的とする薬剤、1つ以上の腫瘍抗原又はネオ抗原に対する免疫応答を誘導することが意図された薬剤、T細胞又はNK細胞に由来する細胞生成物、STING、cGAS、TLR又は他の自然免疫応答及び/若しくは炎症経路を刺激することが意図された薬剤、第2のウイルス、場合により腫瘍溶解性ウイルス、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）経路の阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、並びにそれらの組み合わせから選択される、請求項34に記載の使用のためのウイルス。
【請求項３６】
免疫共抑制経路のアンタゴニストが、CTLA-4阻害剤、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤、LAG-3阻害剤、TIM-3阻害剤、VISTA阻害剤、aCSF1R阻害剤、IDO阻害剤、CD47阻害剤、KIR阻害剤、SLAMF7阻害剤若しくはCEACAM1阻害剤であり、及び／又は免疫共刺激経路のアゴニストが、GITRアゴニスト、4-1-BBアゴニスト、OX40アゴニスト、CD40アゴニスト、ICOSアゴニスト、及び／若しくはflt3アゴニストであり、及び／又は前記チロシンキナーゼ阻害剤がMEK阻害剤若しくはBRAF阻害剤である、請求項35に記載の使用のためのウイルス。
【請求項３７】
さらなる抗がん剤が抗体である、請求項34〜36のいずれか1項に記載の使用のためのウイルス。
【請求項３８】
前記方法が、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）経路の阻害剤及び免疫共抑制経路のさらなるアンタゴニスト、又は免疫共刺激経路のアゴニストを投与することを含む、請求項34〜37のいずれか1項に記載の使用のためのウイルス。
【請求項３９】
ウイルス及びさらなる抗がん剤が別々に投与される、請求項34〜38のいずれか1項に記載の使用のためのウイルス。
【請求項４０】
ウイルス及びさらなる抗がん剤が同時に投与される、請求項34〜39のいずれか1項に記載の使用のためのウイルス。
【請求項４１】
皮膚扁平上皮がん（CSCC）、腎細胞がん（RCC）、非小細胞肺がん（NSCLC）、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）、小細胞肺がん（SCLC）、進行再発頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん（SCCHN）、上咽頭がん（NPC）、肝細胞がん（HCC）、肛門がん、結腸直腸がん（CRC）、基底細胞がん（BCC）、メルケル細胞がん、虫垂がん、皮膚肉腫、手術後の再発性メラノーマ、進行性若しくは転移性の尿路上皮がん、肝転移、高頻度マイクロサテライト不安定性がん（MSI-H）、混合型進行性固形がん、ウイルス性がん、局所領域進行がん、小児がん、既存の抗がん免疫がないか若しくは最小限の患者におけるがん、第一選択療法としてのがん、既治療患者におけるがん、チェックポイント遮断療法を受けていない患者におけるがん、及び／又はチェックポイント遮断療法を受けた患者におけるがんを処置又は予防する方法における使用のための、請求項1〜30のいずれか1項に記載のウイルス及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項４２】
がんを処置する方法であって、その必要がある患者に請求項1〜30のいずれか1項に記載のウイルス又は請求項41に記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含み、がんが、皮膚扁平上皮がん（CSCC）、腎細胞がん（RCC）、非小細胞肺がん（NSCLC）、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）、小細胞肺がん（SCLC）、進行再発頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん（SCCHN）、上咽頭がん（NPC）、肝細胞がん（HCC）、肛門がん、結腸直腸がん（CRC）、基底細胞がん（BCC）、メルケル細胞がん、虫垂がん、皮膚肉腫、手術後の再発性メラノーマ、進行性若しくは転移性の尿路上皮がん、肝転移、高頻度マイクロサテライト不安定性がん（MSI-H）、混合型進行性固形がん、ウイルス性がん、局所領域進行がん、小児がん、既存の抗がん免疫がないか若しくは最小限の患者におけるがん、第一選択療法としてのがん、既治療患者におけるがん、チェックポイント遮断療法を受けていない患者におけるがん、及び／又はチェックポイント遮断療法を受けた患者におけるがんからなる群より選択される、方法
【請求項４３】
がんを処置する方法であって、その必要がある患者に請求項1〜30のいずれか1項に記載のウイルス又は請求項41に記載の医薬組成物の治療有効量をチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与することを含む、方法。
【請求項４４】
前記チロシンキナーゼ阻害剤がMEK阻害剤又はBRAF阻害剤である、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
前記がんが固形腫瘍である、請求項43に記載の方法。
【請求項４６】
その必要がある患者にさらなる抗がん剤の治療有効量を投与することをさらに含む、請求項42に記載の方法。
【請求項４７】
さらなる抗がん剤が、免疫共抑制経路のアンタゴニスト、免疫共刺激経路のアゴニスト、放射線療法及び/又は化学療法、腫瘍において生じる特定の遺伝子突然変異を標的とする薬剤、1つ以上の腫瘍抗原又はネオ抗原に対する免疫応答を誘導することが意図された薬剤、T細胞又はNK細胞に由来する細胞生成物、STING、cGAS、TLR又は他の自然免疫応答及び/若しくは炎症経路を刺激することが意図された薬剤、第2のウイルス、場合により腫瘍溶解性ウイルス、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）経路の阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、並びにそれらの組み合わせから選択される、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
免疫共抑制経路のアンタゴニストが、CTLA-4阻害剤、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤、LAG-3阻害剤、TIM-3阻害剤、VISTA阻害剤、aCSF1R阻害剤、IDO阻害剤、CEACAM阻害剤、KIR阻害剤、SLAMF7阻害剤、若しくはCD47阻害剤であり、及び/又は免疫共刺激経路のアゴニストが、GITRアゴニスト、4-1-BBアゴニスト、OX40アゴニスト、CD40アゴニスト若しくはICOSアゴニストであり、及び/又はチロシンキナーゼ阻害剤が、MEK阻害剤若しくはBRAF阻害剤である、請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
さらなる抗がん剤が抗体を含む、請求項47又は48に記載の方法。
【請求項５０】
ウイルス及びさらなる抗がん剤が別々に投与される、請求項47〜49のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５１】
ウイルス及びさらなる抗がん剤が同時に投与される、請求項47〜49のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍溶解性免疫療法剤、及びがんの処置における腫瘍溶解性免疫療法剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスは、高い効率で細胞に侵入する固有の能力を有する。細胞への侵入後、ウイルス遺伝子が発現され、ウイルスが複製する。これは、通常、感染した細胞の死滅、及び、死滅すると細胞が破裂するため、細胞の抗原成分の放出をもたらす。結果として、ウイルス媒介性の細胞死は、宿主細胞に由来するものとウイルス自体によってコードされるもの若しくはそれに組み込まれたものの両方を含む、これらの細胞成分に対する免疫応答をもたらす傾向がある。免疫応答はまた、宿主による、免疫応答の活性化を支援するいわゆる損傷関連分子パターン（DAMP）の認識のために増大される。
【０００３】
ウイルスはまた、例えば、宿主に対する免疫原性シグナルでもあるインターフェロン応答の活性化及び炎症をもたらす、トール様受容体、cGAS/STINGシグナル伝達、及び/又は病原体関連分子パターン（PAMP）の認識を通じたウイルス感染の認識に対する宿主応答の一部として、自然免疫応答の種々のメディエーターと関わる。これらの免疫応答は、腫瘍抗原に対する免疫応答が、微小転移性疾患を含むウイルスに感染していない腫瘍の処置をもたらす全身的な全体的利益を提供し、再発に対するワクチン接種を提供するように、がん患者に免疫原性の利益をもたらし得る。
【０００４】
ウイルスの組み合わせた直接的（「腫瘍溶解性」）効果、及び腫瘍抗原（非自己の「ネオ抗原」を含む、すなわち個々の腫瘍における特定の突然変異遺伝子に由来する）に対する免疫応答は、「腫瘍溶解性免疫療法」と呼ばれる。
【０００５】
ウイルスはまた、感染細胞中のウイルスゲノムに挿入された異種遺伝子を発現させるための送達ビヒクル（「ベクター」）として使用することができる。これらの特性は、様々なバイオテクノロジー及び医療用途にウイルスを有用なものにする。例えば、異種治療遺伝子を発現するウイルスを遺伝子治療に使用することができる。腫瘍溶解性免疫療法に関連して、送達される遺伝子は、特定の腫瘍抗原をコードする遺伝子、ウイルス複製及び細胞死後に免疫応答を誘導し若しくは放出された抗原の免疫原性を増加させることが意図された遺伝子、生成される免疫応答を形成することが意図される遺伝子、腫瘍の一般的な免疫活性化状態を増加させる遺伝子、又はウイルスの直接腫瘍溶解特性（すなわち、細胞毒性効果）を増加させる遺伝子を含み得る。重要なことに、ウイルスは、全身性抗腫瘍免疫応答を腫瘍に直接的及び選択的に開始、増大又は形成するのを助けることが意図された、コードされた分子を送達する能力を有する。これは、例えば、毒性の減少、又は同じ経路を標的とするこれらの同じ分子の全身投与又は他の分子の全身投与と比較して、正常（すなわち、非がん性）組織におけるオフターゲット効果というよりはむしろ、腫瘍（ウイルスに感染していないものを含む）に有益な効果を集中させるという利益を有し得る。
【０００６】
例えば、単純ヘルペスウイルス（HSV）などの多数のウイルスががんの腫瘍溶解処置に有用性を有することが実証されている。がんの腫瘍溶解処置に使用するためのHSVは、もはや病原性ではないが、腫瘍細胞に侵入して死滅させ得るように無効にしなければならない。ICP34.5、ICP6、及び/又はチミジンキナーゼをコードする遺伝子の破壊を含む、HSVに対する多数の無効化突然変異は同定されており、これは、ウイルスが培養中又はインビボで腫瘍組織内で複製することを阻止しないが、正常組織における有意な複製を阻止する。ICP34.5遺伝子のみが破壊されているHSVは、インビトロで多くの腫瘍細胞型において複製し、マウス腫瘍モデルにおいて、腫瘍組織において選択的に複製するが、周辺組織では複製しない。欠失されたICP34.5、又は欠失されたICP34.5及びICP6、HSVの臨床試験はまた、ヒトの腫瘍組織において安全性及び選択的複製を示している。
【０００７】
上記で議論したように、HSVなどの腫瘍溶解性ウイルスはまた、がんの処置において治療遺伝子を送達するために使用され得る。ICP47についてさらに欠失され、GM-CSFの異種遺伝子をコードするこのタイプのICP34.5が欠失したウイルスはまた、ヒトにおける安全性及び有効性が示されたメラノーマにおける第3相試験を含む臨床試験において試験されている。GM-CSFは、単球が循環を逃れ、そこで増殖しマクロファージ及び樹状細胞へ成熟する組織へ移動するのを刺激することを含む複数の機能を有する炎症性サイトカインである。GM-CSFは、抗原提示細胞の増殖及び成熟にとって重要であり、その活性は、抗腫瘍免疫応答の活性化に必要である。試験データは、腫瘍の応答が、注射された腫瘍において見られ、注射されていない腫瘍においてはその程度は低いことを実証した。応答は耐久性が高い（数カ月〜数年）傾向があり、応答している患者において生存利益が達成されているようであった。これらの各々は、直接腫瘍溶解性効果に加えて、がんの処置における免疫系の関与を示した。しかしながら、腫瘍溶解性ウイルスに関するこのデータ及び他のデータは、一般的に、全ての腫瘍が処置に応答するわけではなく、全ての患者が生存の利点を達成するわけではないことを示した。したがって、腫瘍溶解療法及び腫瘍溶解免疫療法の当該技術に対する改善が明らかに必要とされている。これらは、療法の直接的な腫瘍溶解効果、治療の抗腫瘍免疫刺激効果、又はこれらの効果の両方を一緒に増加させるのに役立ち得る。
【０００８】
近年、腫瘍溶解性免疫療法は、免疫チェックポイント遮断（blockade）（すなわち、免疫チェックポイント経路の阻害又は「拮抗作用」）と併用して相加的又は相乗的な治療効果をもたらすことができることが示されており、免疫共抑制経路遮断とも呼ばれる。チェックポイント（免疫共抑制経路）遮断は、通常、自己免疫の発生を阻止するのに役立つ宿主の免疫抑制機構を遮断することを意図している。しかしながら、がん患者において、これらの機構はまた、腫瘍に誘導される任意の免疫応答の潜在的に有益な効果を遮断（例えばその誘導を阻害）するのに役立ち得る。あるいは、免疫応答は、活性化の欠如又は免疫増強経路の完全な活性化の欠如のために、完全には増強されない可能性がある。したがって、これらの遮断を緩和する（「免疫共抑制経路」を阻害する）、又は免疫増強経路を刺激する（すなわち、「免疫共刺激経路」を活性化し若しくは「アゴニスト」となる）薬剤は、がん処置の試験及び開発にとって魅力的である。このような承認された又は実験的な薬物の標的は、CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、VISTA、CSF1R、IDO、CEACAM1、GITR、4-1-BB、KIR、SLAMF7、OX40、CD40、ICOS又はCD47を含む。
【０００９】
CTLA-4、PD-1、又はPD-L1を標的とする薬剤によるこれらの経路の全身的な遮断は、メラノーマ及び肺がんを含む、多くの腫瘍タイプに有効性を示している。しかしながら、当然、その作用機序に基づいて、自己免疫の誘導によってオフターゲットの毒性が生じ得る。そうであっても、これらの薬剤は、かなりの臨床的有用性を提供するのに十分に許容できる。薬剤（主に抗体）が開発されている他の免疫共抑制経路及び関連標的には、LAG-3、TIM-3、VISTA、CSF1R、IDO、CEACAM1、CD47が挙げられる。これらの薬剤、例えばPD1、PDL1、LAG-3、TIM-3、VISTA、CSF1R、IDO、CD47、CEACAM1の最適な臨床的活性には、その作用機序（すなわち、免疫エフェクター細胞と腫瘍の接点の標的化、又は腫瘍の/における他の免疫抑制機構を含む）によって、全ての腫瘍における全身的投与又は存在を必要とし得る。幾つかの場合において、例えば幾つかの腫瘍のみにおける、又は幾つかのリンパ節におけるより局所化された存在、例えばCTLA-4を標的とする薬剤もまた、最適に有効であり得る。
【００１０】
がん患者において抗腫瘍免疫応答を増加させるための代替的なアプローチは、免疫共刺激経路を標的化（活性化）することであり、すなわち免疫共抑制経路を阻害するのとは対照的である。これらの経路は、T細胞及び他の免疫細胞に活性化シグナルを送り、通常これは抗原提示細胞（APC）における関連リガンドとT細胞及び他の免疫細胞の表面の関連受容体の相互作用から生じる。リガンド/受容体に依存するこれらのシグナルは、特定のサブタイプを含むT細胞及び/又はAPC及び/又はNK細胞及び/又はB細胞の増加した活性化、特定のサブタイプを含むT細胞及び/又はAPC及び/又はNK細胞及び/又はB細胞の増加した分化及び増殖、又は制御性T細胞などのT細胞の免疫抑制活性の抑制をもたらし得る。したがって、これらの経路の活性化は、増大した抗腫瘍免疫応答をもたらすと予測されるが、これらの経路の全身的活性化、すなわち特異的又は選択的な抗腫瘍免疫応答ではなく、全体的な免疫応答の活性化は、非腫瘍組織におけるかなりのオフターゲット毒性をもたらしことが予測され得、このようなオフターゲット毒性の程度は、標的とされる特定の免疫共抑制経路に依存する。それにもかかわらず、免疫共抑制経路を標的とする薬剤（主にアゴニスト抗体、又はそれほど頻繁ではないが問題の受容体に対する可溶性リガンド）、例えばGITR、4-1-BB、OX40、CD40又はICOSを標的とする薬剤であって、全身的な使用（すなわち、静脈内送達）が意図されるものは、臨床的開発されているか、或いは臨床的開発について提案されている。
【００１１】
これらのアプローチを成功させるためには、腫瘍に対する既存の免疫応答が必要であり、すなわち、それにより、既存の免疫応答が増強され得、又は抗腫瘍免疫応答に対する遮断が軽減され得る。このような進行中の応答を示す、炎症を起こした腫瘍微小環境の存在もまた必要である。腫瘍ネオ抗原に対する既存の免疫応答は、免疫共抑制経路遮断及び関連する薬物の活性にとって特に重要であるようである。幾らかの患者だけが、ネオ抗原及び/又は炎症を起こした腫瘍微小環境を含む、腫瘍抗原に対する進行中の免疫応答を有し得、両者はこれらの薬物の活性、例えば最適な活性のために必要とされる。したがって、ネオ抗原を含む腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導することができ、及び/又は炎症を起こした腫瘍微小環境を誘導することができる腫瘍溶解剤は、免疫共抑制経路遮断及び免疫増強薬剤と組み合わせて用いることが魅力的である。これは、これまでに観察されている、マウス及びヒトにおける腫瘍溶解剤及び免疫共抑制経路遮断の有望な組み合わせ抗腫瘍効果を説明するであろう。
【００１２】
インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）経路は、T細胞の直接的な抑制、及び局所的な制御性T細胞（Treg）媒介性の免疫抑制の増強の両方によって、腫瘍及び腫瘍排出リンパ節における寛容原性環境を作り出すことにより腫瘍誘導性寛容に寄与する。IDOは、キヌレニン経路に沿ったトリプトファン分解の律速段階を触媒し、局所トリプトファン濃度の減少と免疫調節性トリプトファン代謝産物の生成の両方が、IDOの免疫抑制効果に寄与する。IDOは、より広範な疾患と相関する、IDO活性化を有する多くのがん患者において慢性的に活性化される。また、抗腫瘍免疫の他のアクチベーターに対するアンタゴニストとして機能することができる。したがって、IDO経路の阻害剤は、特に、CTLA-4、PD-1又はPDL-1を標的とするものなどのチェックポイント遮断剤と組み合わせて、抗がん剤として開発されている。IDO阻害剤は、他の免疫チェックポイント又は免疫共刺激経路を標的とする薬剤と共に用いる場合を含む腫瘍溶解免疫療法と相乗的であり得る。
【００１３】
上記の議論は、腫瘍溶解剤、及び腫瘍溶解剤を使用するがん治療を改善するための余地が依然として多いことを実証する。
【発明の概要】
【００１４】
本開示は、改善された腫瘍溶解性ウイルスを提供する。改善された腫瘍溶解性ウイルスは、改善された直接的腫瘍溶解効果を有する。本開示のウイルスによって提供される改善された直接的腫瘍溶解効果はまた、改善された全身性抗腫瘍免疫効果ももたらすだろう。本開示のウイルスによって提供される改善された直接的腫瘍溶解効果はまた、患者における改善された治療効果ももたらすだろう。腫瘍細胞における複製及び腫瘍細胞の死滅の増大は、増大した腫瘍抗原放出及び放出された抗原に対する増大した全身性免疫応答をもたらすだろう。直接的な腫瘍溶解効果及び/又は免疫刺激を増強するために挿入される任意の遺伝子の発現レベルもまた、増大するだろう。
【００１５】
ウイルス種は通常、天然の集団中において、少数又は多数のヌクレオチドによって異なり得る一方で、依然として抗原特性、及び依然として同じウイルス種として認識されるのに十分な配列同一性を維持する様々な変異体（バリアント）（株）として存在する。これらの株は、それらの異なる配列のために、様々な範囲の特性、例えばそれらの天然の宿主において自然選択によって選択されてきた特性（例えば、問題のウイルスの標的細胞種で感染、複製し、これらの細胞において伝播し、又は宿主自然又は獲得免疫系から逃れ、又は宿主種の感染個体間を伝播する能力）、及び特に選択されていない特性（例えば、腫瘍又は他の非標的細胞種又は組織を含む、問題のウイルスの天然の標的ではない細胞種で複製し、死滅させ、又は伝播する能力）を示し得る。本発明者は、天然の宿主集団に存在する特定のウイルス種の様々なウイルス株（ヒトに感染するウイルスの場合、本明細書では「臨床分離株」と呼ぶ）をサンプリングし、それらを互いに比較して、それが用いられる意図される目的について最も良い特性（例えば、腫瘍細胞の感染及び死滅）を有する株を選択することが、その目的のために最適な特性を有するウイルス（すなわち、ウイルス株）を同定するのに用いられ得ることを認識した。最適な特性は、治療剤として用い得るウイルスを産生するための開発の最もよい出発点を提示する特性であり得る。このアプローチによって同定されるウイルスは、ウイルス株の広範囲の群から、必要とされる特性（1若しくは複数）について選択されていない「プロトタイプ」又は「実験室」ウイルス株又は臨床株よりも、意図される目的についてより最適な特性を有する可能性が高い。これは、天然のウイルス集団に存在する配列バリエーションの程度を踏まえれば、特に特定の所望の特性（1若しくは複数）に関する、天然の集団における完全な生物学的複雑性が、所望の特性（1若しくは複数）をスクリーニングするための狭いアプローチを採用することによってサンプルされる可能性が低いことによる。特に、これらは、個々の感染した宿主間で、又は異なる地理的に隔離されたウイルス集団間で、感染した宿主内の配列において変動し得る（いわゆる擬似種（quasi-species）がしばしば存在するRNA又はレトロウイルス集団においてよくある様に）。
【００１６】
したがって、本開示のウイルスは、特定のウイルス種の天然の集団に存在する様々なウイルス株をサンプリングし、所望の特性（1若しくは複数）（例えば、腫瘍細胞に感染し、死滅させる能力）についてこれらを互いに試験することによって選択された。意図される目的のために最も良い特性を有するウイルス株（1若しくは複数）が、さらなる開発のために用いられる。
【００１７】
意図される用途が腫瘍溶解性ウイルス療法である場合、そのようなアプローチを採用することで、有利なウイルス株のさらなる操作を必要としうる、腫瘍溶解剤の開発のための改善された出発点が提供される。そのような操作として、例えば腫瘍選択性をもたらすウイルス遺伝子の欠失、及び/又は腫瘍溶解特性若しくは免疫増強特性をさらに改善するための外因性遺伝子の挿入が挙げられる。
【００１８】
したがって、本開示のウイルスは、ウイルス種の新規な臨床分離株を含み、該臨床分離株は、該臨床分離株が比較され、その比較を通して該臨床分離株が同定される、他の臨床分離株よりも優れた抗腫瘍効果を有する。特に、本開示の臨床分離株は、同じウイルスタイプの参照臨床分離株よりも、インビトロで迅速に及び/又は低用量で腫瘍細胞株を死滅させる。典型的に、本開示の臨床分離株は、必要とされる特性（1若しくは複数）についての、ウイルス種の>5の臨床分離株の比較を通じて、好ましくはウイルス種の>10の臨床分離株の比較を通じて、より好ましくはウイルス種の>20の臨床分離株の比較を通じて同定されるだろう。本開示の臨床分離株は、典型的に試験したウイルス株の、3/5、6/10、又は11/20番目よりも優れた、好ましくは4/5、8/10又は17/20番目よりも優れた、より好ましくは9/10又は19/20番目よりも優れた腫瘍細胞死滅活性を示す。
【００１９】
典型的に、本開示の臨床分離株は、0.01〜0.001以下の感染多重度（MOI）での感染の24〜48時間後内に、インビトロで2つ以上の腫瘍細胞株を死滅させ得る。
【００２０】
本開示の臨床分離株は、それらの抗腫瘍効果をさらに高めるために改変され得る。本開示の臨床分離株のゲノムは、1つ以上のウイルス遺伝子の発現を欠失し、又は変更する様に改変され得、及び/又は臨床分離株のゲノムは、1以上の異種遺伝子、例えば融合誘導性タンパク質及び/又は免疫刺激分子（1若しくは複数）をコードする遺伝子を発現するように改変され得る。
【００２１】
本開示は、融合誘導性タンパク質及び少なくとも1つの免疫刺激分子を発現する腫瘍溶解性ウイルスを提供する。
【００２２】
本開示の腫瘍溶解性ウイルスは、（i）抗腫瘍免疫応答の誘導のために放出されるネオ抗原を含む腫瘍抗原の量を増加させ、（ii）ウイルスにコードされた免疫刺激分子の発現を増強する、直接的な腫瘍溶解効果、ウイルス複製及び腫瘍での伝播の改善を通じたがんの改善された処置を提供する。ウイルスによる免疫刺激分子の発現は、抗腫瘍免疫効果をさらに増大及び増強し得る。ウイルスによる融合誘導性タンパク質の発現は、腫瘍によるウイルスの伝播をさらに増大させ得る。ウイルスによる融合誘導性タンパク質の発現は、腫瘍細胞死滅をさらに増大させ得る。融合誘導性遺伝子がウイルスによって発現される場合、腫瘍による伝播は融合誘導性タンパク質によって媒介され得る。
【００２３】
一実施形態において、本開示は、CTLA-4の阻害剤を発現する腫瘍溶解性ウイルスを提供する。ウイルスはさらに他の免疫調節剤を含んでもよい。特に、ウイルスは、GM-CSF及び/又は免疫共刺激経路を標的とする少なくとも1つの分子を含んでもよい。CTLA-4阻害剤は共抑制経路をブロックするよう作用し、すなわち、CTLA-4とB7との相互作用を妨げる。GM-CSFは、炎症性腫瘍微小環境の誘導を助け、樹状細胞などの抗原提示細胞の増殖及び成熟を刺激し、抗腫瘍免疫応答の誘導を助ける。これらの免疫応答は、腫瘍溶解性ウイルスによっても送達される免疫共刺激経路活性化分子（1若しくは複数）を使用する免疫共刺激経路（1若しくは複数）の活性化により増幅され得る。
【００２４】
腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍内で複製し、腫瘍細胞の溶解及び腫瘍抗原の放出を引き起こし、局所炎症及び自然免疫応答の活性化と組み合わされ、これらの全てが抗腫瘍免疫応答の活性化、及びCTLA-4/B7相互作用の阻害剤の活性に有益となる。
【００２５】
CTLA-4/B7相互作用を阻害する分子を、流入領域リンパ節への輸送が予想される場合を含め、免疫応答開始腫瘍へ直接送達することで、阻害剤による免疫増強作用を腫瘍に、つまり腫瘍内に存在する腫瘍抗原に集中させ、全身毒性を減少させて、そうでなければ免疫応答開始部位でT細胞活性化を阻害する調節性T細胞（Treg）の活性化を阻止する。
【００２６】
腫瘍溶解性ウイルスを使用して、腫瘍に対する免疫共刺激経路を標的とする分子、例えばCTLA-4を標的とする分子を送達することで、抗腫瘍免疫応答での免疫効果の増強を狙い、非腫瘍抗原に対する免疫応答の増強を減少させる。したがって、腫瘍及び腫瘍流入領域リンパ節における免疫細胞は、一般的な免疫細胞よりも免疫共刺激経路を活性化する分子により選択的にかみ合う（engaged）。この結果、免疫共刺激経路の活性化及び抗腫瘍免疫応答増幅の効果が高まり、標的外毒性の減少も可能となる。これは、全身性免疫共抑制経路遮断及び免疫共刺激経路活性化の併用の効果を腫瘍に集中させる、つまり、そこから共抑制遮断が放出される増強された免疫応答が、非腫瘍抗原に対する応答ではなく抗腫瘍免疫応答であるためにも重要である。
【００２７】
本開示は、腫瘍溶解性ウイルスによって送達された場合に、異種遺伝子の発現、例えば免疫共刺激経路活性化及びGM-CSF発現及び/又はCTLA-4の遮断などの作用部位が腫瘍及び/又は腫瘍流入領域リンパ節であるが、そのような活性化の結果（増幅された全身的抗腫瘍免疫応答）が全身的であるという事実を利用する。これは、腫瘍溶解性ウイルスが、異種遺伝子によってコードされる分子（1若しくは複数）、例えば免疫共刺激経路（1若しくは複数）及びGM-CSF及び/又はCTLA-4阻害剤を標的化する分子（1若しくは複数）などを送達した腫瘍だけでなく、腫瘍を全体的に標的とする。したがって、本開示の腫瘍溶解性ウイルスは、改善した腫瘍に集中する免疫応答の生成を介して、改善したがんの処置をもたらす。本開示の腫瘍溶解性ウイルスは、微小転移性病態を含む腫瘍溶解によって破壊されない腫瘍に対する免疫媒介性の効果が増強するように、改善した抗腫瘍免疫刺激効果を提供し、これは、将来の再発を防ぎ、全生存期間を改善する、これらの腫瘍のより効果的な破壊、及びより有効な長期間の抗腫瘍ワクチン接種をもたらす。
【００２８】
本開示の腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効力は、ウイルスが単一の薬剤として使用される場合、またウイルスが他の抗がんモダリティ、例えば、化学療法、標的化された薬剤による処置、放射線、免疫チェックポイント遮断（すなわち、免疫共抑制経路の1つ以上のアンタゴニスト、例えばPD1若しくはPD-L1に対する抗体の投与）及び/又は免疫増強剤（例えば、免疫共刺激経路の1つ以上のアゴニスト）と組み合わせて使用される場合に達成される。本開示のウイルスの改善された直接的な腫瘍溶解効果（すなわち、腫瘍細胞でのウイルス複製、伝播、及び直接的死滅）、及び改善された全身的抗腫瘍免疫効果は、腫瘍溶解療法と免疫共抑制経路の遮断及び/又は免疫共刺激経路の活性化との組み合わせ利益を改善する。
【００２９】
従って、皮膚扁平上皮がん（CSCC）、腎細胞がん（RCC）、非小細胞肺がん（NSCLC）、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）、小細胞肺がん（SCLC）、進行再発頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん（SCCHN）、上咽頭がん（NPC）、肝細胞がん（HCC）、肛門がん、結腸直腸がん（CRC）、基底細胞がん（BCC）、メルケル細胞がん、虫垂がん、皮膚肉腫、手術後の再発性メラノーマ、進行性若しくは転移性の尿路上皮がん、肝転移、高頻度マイクロサテライト不安定性がん（MSI-H）、混合型進行性固形がん、ウイルス性がん、局所領域進行がん、小児がん、既存の抗がん免疫がないか若しくは最小限の患者におけるがん、第一選択療法としてのがん、既治療患者におけるがん、チェックポイント遮断（blockade）療法を受けていない患者におけるがん、及び／又はチェックポイント遮断療法を受けた患者におけるがんを処置又は予防する方法における使用のための腫瘍溶解性ウイルスであって、
（a）腫瘍溶解性ウイルスが、同じウイルス種の3つ以上の臨床分離株のパネルの、2つ以上の腫瘍細胞株の腫瘍細胞を死滅させる能力をインビトロで比較し、2つ以上の腫瘍細胞株の細胞を、前記パネル中の他の臨床分離株のうちの1つ以上よりもインビトロで迅速に及び/又は低用量で死滅させることができる臨床分離株を選択することによって選択された臨床分離株であるか、又はそれに由来する；
（b）腫瘍溶解性ウイルスが、（i）融合誘導性タンパク質をコードする遺伝子、及び（ii）免疫刺激分子又は免疫刺激分子をコードする遺伝子を含む；
（c）腫瘍溶解性ウイルスが、（i）GM-CSFをコードする遺伝子、及び（ii）免疫共刺激経路活性化分子又は免疫共刺激経路活性化分子をコードする遺伝子を含む；並びに/あるいは
（d）CTLA-4阻害剤をコードする、
腫瘍溶解性ウイルスが提供される。
【００３０】
臨床分離株は改変され得る。改変された臨床分離株は、ウイルスゲノム中の欠失などの突然変異を有し得る、及び/又は1つ以上の異種遺伝子を発現し得る。
【００３１】
ウイルスは、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、又はレオウイルスの株を含む、がんの腫瘍溶解処置について用いられ得る任意のウイルス種の株であり得る。ウイルスは、好ましくはHSV1などの単純ヘルペスウイルスである。HSVは典型的に、機能的ICP34.5及び/又は機能的ICP47を発現しない、及び/又はUS11遺伝子を前初期遺伝子として発現する。
【００３２】
ウイルスは、（i）融合誘導性タンパク質をコードする遺伝子、及び/又は（ii）免疫刺激分子又は免疫刺激分子をコードする遺伝子を含み得る。ウイルスは、1を超える融合誘導性タンパク質及び/又は1を超える免疫刺激分子をコードし得る。融合誘導性タンパク質をコードする遺伝子は、非ウイルス性遺伝子であり、すなわち異種遺伝子である。免疫刺激分子をコードする遺伝子は、非ウイルス性遺伝子であり、すなわち異種遺伝子である。融合誘導性タンパク質は、好ましくはテナガザル（gibbon ape）白血病ウイルス（GALV）由来の糖タンパク質であり、R膜貫通ペプチドが突然変異又は除去されている（GALV-R-）。免疫刺激分子は、好ましくはGM-CSF、及び/又はGITRL、4-1-BBL、OX40L、ICOSL、CD40L若しくはflt3などの免疫共刺激経路のアゴニスト、又はその任意の改変されたバージョンである。改変されたバージョンの例としては、膜に結合するのではなく分泌される共刺激経路のアゴニスト、及び／又はタンパク質の多量体が形成されるように改変されたアゴニストが挙げられる。免疫刺激分子は、CTLA-4を介したシグナル伝達を遮断することができるタンパク質、例えば、CTLA-4に結合する抗体又はその断片であり得る。
【００３３】
ウイルスは、1を超える免疫共刺激経路活性化分子/遺伝子をコードし得る。免疫共刺激経路活性化分子は、好ましくは、GITR、4-1-BB、OX40、ISCOL、CD40又はflt3のアゴニスト、例えば、GITRL、4-1-BBL、OX40L、ICOSL、CD40L若しくはflt3リガンド若しくはそれらのいずれかの改変バージョン、又はCTLA-4を介したシグナル伝達を遮断することができるタンパク質、例えばCTLA-4と結合する抗体である。改変されたバージョンの例としては、膜に結合するのではなく分泌される共刺激経路のアゴニスト、及び／又はタンパク質の多量体が形成されるように改変されたアゴニストが挙げられる。
【００３４】
CTLA-4阻害剤は、好ましくは、抗CTLA-4抗体若しくは抗体様分子、又はその抗原結合断片である。
【００３５】
また、以下が提供される：
−がんを処置する方法における使用のための本開示のウイルスであって、この方法は、さらなる抗がん剤を投与することを含み、さらなる抗癌剤がチロシンキナーゼ阻害剤である、ウイルス；
−皮膚扁平上皮がん（CSCC）、腎細胞がん（RCC）、非小細胞肺がん（NSCLC）、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）、小細胞肺がん（SCLC）、進行再発頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん（SCCHN）、上咽頭がん（NPC）、肝細胞がん（HCC）、肛門がん、結腸直腸がん（CRC）、基底細胞がん（BCC）、メルケル細胞がん、虫垂がん、皮膚肉腫、手術後の再発性メラノーマ、進行性若しくは転移性の尿路上皮がん、肝転移、高頻度マイクロサテライト不安定性がん（MSI-H）、混合型進行性固形がん、ウイルス性がん、局所領域進行がん、小児がん、既存の抗がん免疫がないか若しくは最小限の患者におけるがん、第一選択療法としてのがん、既治療患者におけるがん、チェックポイント遮断（blockade）療法を受けていない患者におけるがん、及び／又はチェックポイント遮断療法を受けた患者におけるがんを処置又は予防する方法における使用のための、本開示のウイルス及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物；
−皮膚扁平上皮がん（CSCC）、腎細胞がん（RCC）、非小細胞肺がん（NSCLC）、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）、小細胞肺がん（SCLC）、進行再発頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん（SCCHN）、上咽頭がん（NPC）、肝細胞がん（HCC）、肛門がん、結腸直腸がん（CRC）、基底細胞がん（BCC）、メルケル細胞がん、虫垂がん、皮膚肉腫、手術後の再発性メラノーマ、進行性若しくは転移性の尿路上皮がん、肝転移、高頻度マイクロサテライト不安定性がん（MSI-H）、混合型進行性固形がん、ウイルス性がん、局所領域進行がん、小児がん、既存の抗がん免疫がないか若しくは最小限の患者におけるがん、第一選択療法としてのがん、既治療患者におけるがん、チェックポイント遮断（blockade）療法を受けていない患者におけるがん、及び／又はチェックポイント遮断療法を受けた患者におけるがんを処置又は予防する方法における使用のための本開示のウイルスであって、場合により、この方法は、さらなる抗がん剤と組み合わせて前記ウイルスを投与することを含み、場合によりさらなる抗癌剤がチロシンキナーゼ阻害剤である、ウイルス；
−がんを処置する方法であって、その必要がある患者に本開示のウイルス又は医薬組成物の治療有効量を投与することを含み、がんが、皮膚扁平上皮がん（CSCC）、腎細胞がん（RCC）、非小細胞肺がん（NSCLC）、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）、小細胞肺がん（SCLC）、進行再発頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん（SCCHN）、上咽頭がん（NPC）、肝細胞がん（HCC）、肛門がん、結腸直腸がん（CRC）、基底細胞がん（BCC）、メルケル細胞がん、虫垂がん、皮膚肉腫、手術後の再発性メラノーマ、進行性若しくは転移性の尿路上皮がん、肝転移、高頻度マイクロサテライト不安定性がん（MSI-H）、混合型進行性固形がん、ウイルス性がん、局所領域進行がん、小児がん、既存の抗がん免疫がないか若しくは最小限の患者におけるがん、第一選択療法としてのがん、既治療患者におけるがん、チェックポイント遮断（blockade）療法を受けていない患者におけるがん、及び／又はチェックポイント遮断療法を受けた患者におけるがんからなる群より選択され、場合により、この方法は、さらなる抗がん剤を投与することを含み、場合により、さらなる抗癌剤は、免疫共抑制経路のアンタゴニスト、又は免疫共刺激経路のアゴニスト、及び／又はチロシンキナーゼ阻害剤である、方法；
−がんを処置する方法であって、その必要がある患者に本開示のウイルス又は医薬組成物の治療有効量をチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与することを含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図1は、ICP34.5遺伝子座に挿入されたGALV-R-をコードする遺伝子及びGM-CSFをコードする遺伝子を含む、例示的なウイルスの構造を示す図であり、ICP47遺伝子は、US11遺伝子がICP47前初期プロモーターの調節下にあるように欠失されている（上のパネル）。図1はまた、GALV-R-をコードする遺伝子のみ（第2パネル）、又はGM-CSFをコードする遺伝子のみ（第3パネル）を発現する類似の例示的なウイルスを示す。また、ICP34.5遺伝子及びICP47遺伝子は欠失しているが、挿入された遺伝子は含まれていない例示的なウイルスが示されている。
【図２】GALV-R-をコードする遺伝子、GM-CSFをコードする遺伝子及びCD40Lをコードする遺伝子を含む、例示的なウイルスの構造を示す図である。
【図３】図3は、図に示されるようにMOIが0.1、0.01又は0.001である感染から24時間又は48時間後にクリスタルバイオレット染色によって評価した、Fadu、SK-mel-28、A549、HT1080、MIA-PA-CA-2、HT29及びMDA-MB-231ヒト腫瘍細胞株を死滅させる、8種の上位にランク付けされたHSV1臨床分離株の異なる能力を示す図である。各々の細胞株で1番目と2番目にランク付けされたウイルス株が示されている。ウイルスRH018Aは、Fadu、HT1080、MIA-PA-CA-2及びHT29細胞株の各々について1番目にランク付けされ、SK-mel-28、A549及びMDA-MB-231細胞株の各々について2番目にランク付けされた。RH004Aは、HT29細胞株についてRH018A及びRH015Aともに1番目にランク付けされ、SK-mel-28及びA549細胞株について1番目にランク付けされ、Fadu細胞株について2番目にランク付けされた。RH023Aは、MDA-MB-231細胞株について1番目にランク付けされ、HT1080細胞株について2番目にランク付けされた。RH031Aは、MIA-PA-CA-2及びHT29細胞株の各々について2番目にランク付けされた。RH040Aは、HT29細胞株についてともに2番目にランク付けされた。
【図４】試験した全ての株のうちで1番目にランク付けされた株であるRH018A株と、スクリーニングからの「平均」株（すなわちRH065A株）との比較を示す図である。SK-mel-28、HT1080、MDA-MB-231、Fadu、MIA-PA-CA-2及びA549細胞株における、MOIが0.1、0.01及び0.001である感染から24又は48時間後のクリスタルバイオレット染色によって示されるように、RH065A株の必要とされたものよりも等しい割合の細胞を死滅させるために必要とされるRH018A株は約10倍少なかった。
【図５Ａ】US11遺伝子がICP457前初期プロモーターの調節下にあり、異種遺伝子をICP34.5遺伝子座に含むように、ICP34.5及びICP47の欠失によって改変されたHSV1ウイルスの構造を示す図である。ウイルスは、図に特に記載がない限り、RH018A株を用いて構築された。
【図５Ｂ】図５Ａの続きである。
【図５Ｃ】図５Ａの続きである。
【図５Ｄ】図５Ａの続きである。
【図５Ｅ】図５Ａの続きである。
【図５Ｆ】図５Ａの続きである。
【図５Ｇ】図５Ａの続きである。
【図５Ｈ】図５Ａの続きである。
【図５Ｉ】図５Ａの続きである。
【図５Ｊ】図５Ａの続きである。
【図５Ｋ】図５Ａの続きである。
【図６】ウイルス16（mGM-CSF及びGALVR-）、ウイルス17（hGM-CSF及びGALVR-）及びウイルス19（mGM-CSF）に感染させたBHK細胞からの上清中のヒト又はマウスGM-CSFの発現を検出するELISAの結果を示す図である。
【図７Ａ】低倍率で3つの細胞株においてクリスタルバイオレット染色によって決定した場合の、ICP34.5を欠失し、GALVR-及びGFPを発現するRH018A株（ウイルス10）と、GFPのみを発現するウイルス（ウイルス12）の細胞死滅能力の比較を示す図である。
【図７Ｂ】図７Ａの続きである。
【図８Ａ】4つの細胞株においてクリスタルバイオレット染色によって決定した場合の、ICP34.5及びICP47を欠失し、GALVR-及びGM-CSFを発現するRH018A株（ウイルス17）と、同じ改変を有する従来の株の細胞死滅能力の比較を示す図である。
【図８Ｂ】図８Ａの続きである。
【図９】両側面にA20リンパ腫腫瘍を有するマウスの処置におけるウイルス16（ICP34.5及びICP47を欠失し、GALVR-及びmGM-CSFを発現する）の有効性を示す図である。右側面の腫瘍にウイルス又はビヒクルを注射し、腫瘍サイズに対する効果を30日間観察した。ウイルスは、注射された腫瘍と注射されていない腫瘍の両方に対して有効であった。
【図１０】クリスタルバイオレット染色によって評価した場合の、インビトロでのラット9L細胞に対するウイルス15（ICP34.5及びICP47を欠失し、GALVR-及びGFPを発現する）及びウイルス24（ICP34.5及びICP47を欠失し、GFPを発現する）の効果を実証する図である。GALVを発現するウイルス（ウイルス15）は、GALVを発現しないウイルス（ウイルス24）と比較して、インビトロでのラット9L細胞の死滅の増大を示した。
【図１１Ａ】左右の側面にマウスCT26腫瘍を有するBalb/cマウスにおけるウイルス16の抗腫瘍効果を示す図である。次に、10匹のマウスの群を以下で処置した：ビヒクル（1日おきに右側面腫瘍に3回注射）、1日おきに右側面腫瘍に注射された5×106pfuのウイルス16（mRP1）、抗マウスPD1単独（10mg/kg、腹腔内、3日毎に、BioXCellクローンRMP1-14）、抗マウスCTLA-4（3mg/kg、腹腔内、3日毎、BioXCellクローン9D9）、抗マウスPD1と共にウイルス16、抗マウスCTLA4と共にウイルス16、1-メチルトリプトファン（trypotophan）（I-MT、IDO阻害剤（飲料水中5mg/ml））、抗マウスPD1と共に1-メチルトリプトファン、又は抗マウスPD1と共に1-メチルトリプトファン及びウイルス16。腫瘍サイズに対する効果をさらに30日間観察した。ウイルス及びチェックポイント遮断の組み合わせで処置された動物において、単一処置群よりも大きな腫瘍の減少が見られた。図11Aは、ウイルス16及び抗PD1を併用することにより、抗PD1又はウイルス単独のいずれかよりも優れた抗腫瘍効果を有することを示す。
【図１１Ｂ】図11Bは、抗CTLA-4と組み合わせたウイルス16の抗腫瘍効果が、ウイルス16又は抗CTLA-4単独のいずれかの抗腫瘍効果よりも良好であることを示す。
【図１１Ｃ】図11Cは、ウイルスの非存在下での抗PD1及び1-MT阻害と比較して、ウイルス16と共に抗PD1とIDO阻害の両方を用いて増強された腫瘍の減少が観察されたことを示す。
【図１２Ａ】ウイルス単独又はチェックポイント遮断単独（抗PD1）のいずれかと比較して、Balb/cマウスの両側面のマウスA20腫瘍における免疫チェックポイント遮断と組み合わせたウイルス16の増強された抗腫瘍活性を示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ａの続きである。
【図１２Ｃ】図１２Ａの続きである。
【図１２Ｄ】図１２Ａの続きである。
【図１３】GALVR-、GM-CSF及びコドン最適化された抗マウス又は抗ヒトCTLA-4抗体構築物（ヒト又はマウスIgG1 Fc領域に連結した分泌型scFv分子）を発現するICP34.5及びICP47欠失ウイルスの構造を示す図である。scFvは、抗体9D9（US2011044953：マウスバージョン）由来及びイピリムマブ（US20150283234、ヒトバージョン）由来の連結された（[G4S]3）軽鎖及び重鎖可変鎖を含有する。得られたCTLA-4阻害剤の構造も示されている。
【図１４】ヒト異種移植モデル（A549）におけるウイルス16及びウイルス19の抗腫瘍効果を示す図である。3回の異なる用量レベルで1週間にわたって、ウイルス16、ウイルス19又はビヒクルを3回注射した（N＝10/群）。使用されるウイルスの用量が示されている。GALVを発現するウイルス16の抗腫瘍効果は、GALVを発現しないウイルス19の抗腫瘍効果よりも良好であった。
【図１５】Fischer 344ラットの側面での9L細胞におけるGALVR-を発現するウイルスの効果を示す図である。以下の処置をラットの群（群あたり10匹）に、各々のラットの一側面に3週間、週3回のみ投与した：50μlのビヒクル、50μlの107pfu/mlのウイルス19（mGM-CSFを発現するが、GALV R-を発現しない）、又は50μlの107pfu/mlのウイルス16（マウスGM-CSFとGALV-R-の両方を発現する）。次に、腫瘍増殖に対する効果をさらに30日間観察した。優れた腫瘍制御及び縮小が、GM-CSF単独を発現するウイルスと比較して、GM-CSF及びGALV-R-を発現するウイルスで観察された。
【図１６】ウイルス16（GALV及びmGM-CSFを発現する）と比較して、各々がmGM-CSF及びGALV-R-も有する、抗mCTLA-4（ウイルス27）、mCD40L（ウイルス32）、mOX4OL（ウイルス35）、m4-2BBL（ウイルス33）を発現するウイルスの抗腫瘍効果を示す図である。
【図１７Ａ】図17は、コドン最適化された、ヒト又はマウスIgG1のFc領域に連結された分泌scFv分子である抗マウス又は抗ヒトCTLA-4構築物を含む本発明の例示的なウイルスを構築するために使用されるウイルスの構造を示す。scFvは、15量体[G4S]3（GGGGSGGGGSGGGGS）により連結された、9D9（CTLA-4を検証するために初めて使用された最初のマウス抗体；WO2007/123737：マウスバージョン）、又はイピリムマブ（WO2014/066532；ヒトバージョン）由来の軽鎖及び重鎖可変部を含む。このウイルスはHSV1 RH018A株（臨床株18）の改変型である。ICP34.5遺伝子とICP47遺伝子はウイルスにおいて不活性化されている。US11遺伝子はICP47プロモーターの欠失によりICP47前初期遺伝子プロモーターの制御下に置かれる。発現カセットはICP34.5遺伝子座へ挿入される。ウイルス17では、発現カセットは、CMVプロモーターの制御下にあるヒトGM-CSF遺伝子及びRSVプロモーターの制御下にあるGALV遺伝子を含む。ウイルス16はマウスGM-CSFの代わりにヒトGM-CSFが含まれることを除き、ウイルス17と同じである。ウイルス25及び29は、各々が発現カセットにおいてMMLVプロモーターの制御下にあるGFP遺伝子をさらに含むことを除き、それぞれウイルス16及び17と同じである。ウイルス27及び31は、GFP遺伝子がマウス抗CTLA4及びヒト抗CTLA4と置換されていることを除き、それぞれウイルス25及び29と同じである。
【図１７Ｂ】図１７Ａの続きである。
【図１８Ａ】図18は、本発明の例示的なウイルスを構築するために使用されるプラスミドの構造を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ａの続きである。
【図１８Ｃ】図１８Ａの続きである。
【図１８Ｄ】図１８Ａの続きである。
【図１９】図19は、コドン最適化された、ヒト又はマウスIgG1のFc領域に連結された分泌scFv分子である抗マウス又は抗ヒトCTLA-4構築物の構造を示す。
【図２０】図20は、抗マウスCTLA-4がウイルス27から発現されることを証明するウェスタンブロットである。使用したゲルは還元変性PVDF膜トリスグリシンゲルであった。抗-CTLA-4はアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG1抗体を使用して検出した。レーン1： spectra broad rangeラダー；レーン2  ウイルス27、未希釈の上澄；レーン3  ウイルス27、上澄の2倍希釈；レーン4  ウイルス27、上澄の4倍希釈；レーン5  ウイルス27、上澄の8倍希釈；レーン6  ウイルス27、上澄の16倍希釈；レーン7  ウイルス27、上澄の32倍希釈；レーン8  陰性対照ウイルス、未希釈の上澄；抗-CTLA-4（還元）の予想サイズは57kDaである。
【図２１】図21は、抗mCTLA-4を発現するウイルス（ウイルス27）の未注入腫瘍における優れた腫瘍制御と腫瘍縮小を、CTLA-4を発現しない点以外は同一のウイルス（ウイルス16）と比較して示す。使用したウイルスの用量は、5x104pfu（各ケースで1x106pfu/mlの50ul）で1週間にわたり3回投与した。ウイルスのこの用量レベルは未注入腫瘍に対してはウイルス16の治療量以下であり、これによりウイルス27によりコードされた追加分子の送達の利点を明確に見ることが可能となる。
【図２２】図22は、抗mCTLA-4を発現するウイルス（ウイルス27）の注入腫瘍及び未注入腫瘍における優れた腫瘍制御と腫瘍縮小を、CTLA-4を発現しない点以外は同一のウイルス（ウイルス16）と比較して示す。使用したウイルスの用量は、CTLA-4を発現しない点以外は同一のウイルス（ウイルス16）と比較して、抗mCTLA-4を発現するウイルス（ウイルス27）の右の腫瘍に対して、1週間で5x104pfuだった。各線はそれぞれ異なるマウスを表す。
【図２３−１】図23は、抗PD1、並びにmGM-CSF、GALVR及び抗mCTLA-4を発現するウイルス27を使用した、両側マウスA20腫瘍の併用処置の効果を示す。上のパネルは、注入（右）及び未注入（左）腫瘍の両方に対する抗PD1単独の効果を示す。中央のパネルは、注入（右）及び未注入（左）腫瘍の両方に対するウイルス27単独の効果を示す。下のパネルは、抗PD1及びウイルス27が両方とも右側の腫瘍に注入された時に達成された優れた腫瘍制御及び腫瘍縮小を示す。併用処置により抗腫瘍効果が増強されることは、注入（右）及び未注入（左）腫瘍の両方において観察される。各線はそれぞれ異なるマウスを表す。
【図２３−２】図２３−１の続きである。
【図２４】図24は、ヒトCTLA-4を発現するノックインマウスにおけるマウスMC38腫瘍において、hGM-CSFとGALVRのみを発現するウイルス17と比較した、hGM-CSF、GALVR及び抗ヒトCTLA-4を発現するウイルス31の優れた腫瘍制御及び腫瘍縮小効果を示す。ウイルス31の抗腫瘍効果は、ウイルスが単独で又は抗PD1と組み合わせて投与された場合に観察される。注入腫瘍における優れた腫瘍制御及び腫瘍縮小は、抗ヒトCTLA-4を発現しない点以外は同一のウイルスと比較して、抗ヒトCTLA-4を発現するウイルス31で得られる（左パネル）。ウイルスによる処置が抗PD1処置と併用される場合、この効果はさらに高まる。一方のウイルスでの処置が抗PD1での処置と併用される場合、優れた腫瘍制御及び腫瘍縮小が未注入腫瘍でも観察される（右のパネル）。この改善は、抗CTLA-4を発現しないウイルス17よりも抗CTLA-4を発現するウイルス31で顕著に高い。各線はそれぞれ異なるマウスを表す。
【図２５】図25は、hGM-CSF、GALVR及び抗ヒトCTLA-4を発現するウイルス31を抗PD1処置と組み合わせて用いて得られた抗腫瘍効果の持続性を示す図である。Aは、併用療法により腫瘍を排除した後、マウスの左の腫瘍に再チャレンジしたところ、15匹中14匹が腫瘍の再チャレンジから保護されたことを示す。Bは、同じ日に腫瘍細胞でチャレンジした10の腫瘍及びウイルス未投与マウスがすべて腫瘍を成長させたことを示す。Cは、抗PD-1単独で処置したマウスが抗腫瘍応答を示さないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
配列表の簡単な説明
配列番号1は、マウスGM-CSFのヌクレオチド配列である。
配列番号2は、マウスGM-CSFのコドン最適化バージョンのヌクレオチド配列である。
配列番号3は、ヒトGM-CSFのヌクレオチド配列である。
配列番号4は、ヒトGM-CSFのコドン最適化バージョンのヌクレオチド配列である。
配列番号5は、マウスGM-CSFのアミノ酸配列である。
配列番号6は、ヒトGM-CSFのアミノ酸配列である。
配列番号7は、GALV-R-のヌクレオチド配列である。
配列番号8は、GALV-R-のコドン最適化バージョンのヌクレオチド配列である（最初の3つのヌクレオチドは任意である）。
配列番号9は、GALV-R-のアミノ酸配列である。
配列番号10は、CD40Lのヒト膜結合型バージョンのコドン最適化バージョンのヌクレオチド配列である。
配列番号11は、CD40Lのヒト膜結合型バージョンのアミノ酸配列である。
配列番号12は、ヒトCD40Lの多量体分泌型バージョンのコドン最適化バージョンのヌクレオチド配列である。
配列番号13は、ヒトCD40Lの多量体分泌型バージョンのアミノ酸配列である。
配列番号14は、マウスCD40Lの多量体分泌型バージョンのコドン最適化バージョンのヌクレオチド配列である。
配列番号15は、マウスCD40Lの多量体分泌型バージョンのアミノ酸配列である。
配列番号16は、野生型ヒトCD40Lのヌクレオチド配列のコドン最適化バージョンである。
配列番号17は、野生型ヒトCD40Lのアミノ酸配列である。
配列番号18は、野生型マウスCD40Lのヌクレオチド配列のコドン最適化バージョンである。
配列番号19は、野生型マウスCD40Lのアミノ酸配列である。
配列番号20は、マウス4-1BBLのコドン最適化バージョンのヌクレオチド配列である。
配列番号21は、ヒト4-1BBLのコドン最適化バージョンのヌクレオチド配列である。
配列番号22は、分泌型マウス4-1BBLのコドン最適化バージョンのヌクレオチド配列である。
配列番号23は、ヒト分泌型4-1BBLのコドン最適化バージョンのヌクレオチド配列である。
配列番号24は、マウスGITRLのコドン最適化バージョンのヌクレオチド配列である。
配列番号25は、ヒトGITRLのコドン最適化バージョンのヌクレオチド配列である。
配列番号26は、分泌型マウスGITRLのコドン最適化バージョンのヌクレオチド配列である。
配列番号27は、分泌型ヒトGITRLのコドン最適化バージョンのヌクレオチド配列である。
配列番号28は、マウスOX40Lのコドン最適化バージョンのヌクレオチド配列である。
配列番号29は、ヒトOX40Lのコドン最適化バージョンのヌクレオチド配列である。
配列番号30は、分泌型マウスOX40Lのコドン最適化バージョンのヌクレオチド配列である。
配列番号31は、分泌型ヒトOX40Lのコドン最適化バージョンのヌクレオチド配列である。
配列番号32は、マウスICOSLのコドン最適化バージョンのヌクレオチド配列である。
配列番号33は、ヒトICOSLのコドン最適化バージョンのヌクレオチド配列である。
配列番号34は、マウスscFv CTLA-4抗体のヌクレオチド配列である。最初の6ヌクレオチド及び最後の8ヌクレオチドは、クローニング目的のために付加された制限部位である。
配列番号35はマウスscFv CTLA-4抗体のヌクレオチド配列である。最初の6ヌクレオチド及び最後の8ヌクレオチドは、クローニング目的のために付加された制限部位である。
配列番号36は、CMVプロモーターのヌクレオチド配列である。
配列番号37は、RSVプロモーターのヌクレオチド配列である。
配列番号38は、BGHポリAのヌクレオチド配列である。
配列番号39は、SV40後期ポリAのヌクレオチド配列である。
配列番号40は、SV40エンハンサープロモーターのヌクレオチド配列である。
配列番号41は、ウサギβ-グロブリン（RBG）ポリAのヌクレオチド配列である。
配列番号42は、GFPのヌクレオチド配列である。
配列番号43は、MoMuLV LTRプロモーターのヌクレオチド配列である。
配列番号44は、EF1aプロモーターのヌクレオチド配列である。
配列番号45は、HGHポリAのヌクレオチド配列である。
配列番号46は、実施例において使用されるヒトCTLA-4抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列である。
配列番号47は、実施例において使用されるヒトCTLA-4抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む完全な軽鎖アミノ酸配列である。
配列番号48は、実施例において使用されるヒトCTLA-4抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列である。
配列番号49は、実施例において使用されるヒトCTLA-4抗体の重鎖CH1アミノ酸配列である。
配列番号50は、実施例において使用されるヒトCTLA-4抗体の重鎖CH2/3アミノ酸配列である。
配列番号51は、実施例において使用されるヒトCTLA-4抗体の完全な重鎖アミノ酸配列である。
配列番号52は、実施例のCTLA-4抗体中に存在するシグナルペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号53は、実施例のCTLA-4抗体において、軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間に存在するリンカーのアミノ酸配列である。
配列番号54は、実施例のヒトscFv  CTLA-4抗体のアミノ酸配列である。
配列番号55は、実施例のヒトscFv  CTLA-4抗体のヌクレオチド配列である。
配列番号56は、実施例において使用されるマウスCTLA-4抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列である。
配列番号57は、実施例において使用されるマウスCTLA-4抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列である。
配列番号58は、実施例において使用されるマウスCTLA-4抗体の完全な重鎖アミノ酸配列である。
配列番号59は、実施例のマウスscFv  CTLA-4抗体のアミノ酸配列である。
配列番号60は、実施例のマウスscFv  CTLA-4抗体のヌクレオチド配列である。
配列番号61は、例示的なウイルスに存在する、クローニング目的でN及びC末端に制限部位を挿入した実施例のマウスscFv  CTLA-4抗体のヌクレオチド配列である。制限部位は配列の最初の6つ及び最後の8つのヌクレオチドである。
配列番号62は、例示的なウイルスに存在する、クローニング目的でN及びC末端に制限部位を挿入した実施例のヒトscFv  CTLA-4抗体のヌクレオチド配列である。制限部位は配列の最初の6つ及び最後の8つのヌクレオチドである。
【００３８】
発明の詳細な説明
腫瘍溶解性ウイルス
本開示のウイルスは腫瘍溶解性である。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞に感染及び複製し、それにより腫瘍細胞を死滅させるウイルスである。したがって、本開示のウイルスは複製可能である。好ましくは、ウイルスは、腫瘍組織において選択的に複製可能である。ウイルスは、非腫瘍組織よりも腫瘍組織においてより効果的に複製する場合、腫瘍組織において選択的に複製可能である。異なる組織タイプで複製するウイルスの能力は、当該技術分野において標準的な技術を用いて決定することができる。
【００３９】
腫瘍溶解効果は、最初に感染した細胞中で複製し、それを死滅させるウイルス、及び、他の腫瘍細胞に感染しそして死滅させ続け、結果として腫瘍内で増殖する子孫ビリオンに依存する。したがって、本開示のウイルスが腫瘍細胞を効果的に死滅させ、腫瘍内で増殖する能力は、最適である直接的な抗腫瘍効果をもたらす。また、効率的な増殖及びウイルス複製に伴う腫瘍細胞の溶解は、放出される腫瘍抗原の量を最大にし、したがって、誘導された抗腫瘍免疫応答の効力も最大にする。
【００４０】
本開示のウイルスは、これらの特性を有する任意のウイルス、例えばヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス若しくはレオウイルス、又はこれらのより大きな群内の任意の種若しくは株であり得る。本開示のウイルスは、野生型（すなわち、親ウイルス種から変更されていない）であってもよく、又は遺伝子破壊若しくは遺伝子付加を有してもよい。これらのうちのどちらであるかは、使用されるウイルス種に依存する。好ましくは、ウイルスはヘルペスウイルスの種であり、より好ましくはHSV1及びHSV2の株を含むHSVの株であり、最も好ましくはHSV1の株である。特に好ましい実施形態において、本開示のウイルスは、使用されるウイルス種の臨床分離株に基づく。臨床分離株は、がんの処置のために特に有利な特性を有するものに基づいて選択されている場合がある。
【００４１】
本開示の臨床分離株/ウイルスは、他の患者から単離された同じウイルスの他の株と比較して、驚くほど良好な抗腫瘍効果を有し、ここで、患者は試験されるウイルス種を有する個体である。本開示のウイルスを同定するために比較に使用されるウイルス株は、患者又はそうでなければ（すなわち、試験されるウイルス種を有する以外）健常なボランティア、好ましくはそうでなければ健常なボランティアから単離され得る。本開示のウイルスを同定するために使用されるHSV1株は、典型的には、HSV1を有する個体の口唇ヘルペス（cold sore）から、典型的には、例えば、輸送媒体を含有するVirocult（Sigma）ブランドのスワブ/容器を用いてスワブを採取することによって単離され、続いて、さらなる試験に使用するために施設へ輸送される。
【００４２】
比較されるウイルスを個体から単離した後、ウイルスのストックは、典型的には、例えば、BHK細胞又はベロ細胞上で、単離されたウイルスを増殖させることによって調製される。好ましくは、これは、さらなる使用のためにウイルスストックを調製するために、サンプルを採取することと、例えば、BHK又はベロ細胞上で増殖させることとの間に、3サイクル以下の凍結融解後に行われる。より好ましくは、ウイルスサンプルは、さらなる使用のためのストックの調製前に、2サイクル又は2サイクル未満の凍結融解、より好ましくは1サイクルの凍結融解を受けていて、最も好ましくは凍結融解のサイクルを受けていない。単離後にこのようにして調製されたウイルスに感染した細胞株由来の溶解物は、典型的には、インビトロで腫瘍細胞株を死滅させるウイルスの能力について試験することによって比較される。あるいは、ウイルスストックは、試験前に、適切な条件下、例えば凍結により保存することができる。本開示のウイルスは、他の個体から単離された同じウイルスの他の株と比較して、好ましくは5を超える個体、より好ましくは10を超える他の個体、最も好ましくは20を超える他の個体から単離されたものと比較して、驚くほど良好な抗腫瘍効果を有し得る。
【００４３】
本開示のウイルス又は本開示のウイルスを産生するために改変するためのウイルス（すなわち、それらが比較された他のウイルス株と比較して腫瘍細胞を死滅させるための驚くほど良好な特性を有する）として同定された臨床分離株のストックは、改変の前後で、適切な条件下で保存され、必要に応じて、さらなるストックを生成するために使用され得る。
【００４４】
臨床分離株は、その天然宿主から単離されたウイルス種の株である。臨床分離株は、好ましくは、所望の特性、本開示のウイルスの場合にはヒト腫瘍細胞を死滅する能力について、臨床分離株とそのウイルス種の他の臨床分離株を試験し、比較する目的で単離されている。また、比較のために使用され得る臨床分離株には、臨床レポジトリーに存在する、すなわち、臨床診断又は他の目的のために以前に採取された、臨床試料由来のものが含まれる。いずれの場合においても、本開示のウイルスの比較及び同定に使用される臨床分離株は、好ましくは、所望の特性について試験される前に、インビトロで最小限の培養を受けていて、好ましくは、比較試験目的のために十分なストックを生成し得るのに十分な培養のみを受けている。このように、本開示のウイルスを同定するために比較に使用されるウイルスはまた、寄託株を含み得、ここで、寄託株は、患者から単離されていて、好ましくは、患者の口唇ヘルペスから単離されたHSV1株である。
【００４５】
本開示のウイルスは、同じウイルス種の3つ以上の臨床分離株のパネルの、2つ以上の腫瘍細胞株の腫瘍細胞を死滅させる能力をインビトロで比較し、2つ以上の腫瘍細胞株の細胞を、前記パネル中の1つ以上の参照臨床分離株よりもインビトロで迅速に及び/又は低用量で死滅させることができる臨床分離株を選択することによって選択された臨床分離株である、又はそれに由来する、腫瘍溶解性ウイルスである。したがって、ウイルスは、同じ種のウイルスの1つ以上の参照臨床分離株よりも、インビトロで2つ以上の腫瘍細胞株をより迅速に及び/又はより低用量で死滅させる臨床分離株であるか、あるいはそのような臨床分離株の改変型バージョンであり得る。改変された臨床分離株は、典型的には、臨床的に分離された株と実質的に同じ腫瘍細胞殺傷活性を保持するが、その抗腫瘍特性を改善するために本明細書に開示されているような1つ以上の異種遺伝子を発現する、及び／又は腫瘍細胞に対する選択性を改善するために1つ以上のウイルス遺伝子が欠失されたものである。
【００４６】
典型的には、本開示の臨床分離株は、0.1以下の感染多重度（MOI）で、好ましくは0.01以下のMOIで、より好ましくは0.001以下のMOIで、感染の72時間以内、好ましくは48時間以内、より好ましくは24時間以内に2つ以上の腫瘍細胞株を死滅させる。好ましくは、臨床分離株は、広範囲の腫瘍細胞株、例えば、以下のヒト腫瘍細胞株：U87MG（グリオーマ）、HT29（結腸直腸）、LNCaP（前立腺）、MDA-MB-231（乳房）、SK-MEL-28（メラノーマ）、Fadu（扁平上皮がん）、MCF7（乳房）、A549（肺）、MIAPACA-2（膵臓）、CAPAN-1（膵臓）、HT1080（線維肉腫）のうちの2、3、4、5、6、7、8、9、10個、又は例えば全てを死滅させる。
【００４７】
したがって、本開示のウイルスは、2つ以上、例えば3、4、5、6、7つ以上の異なるタイプの腫瘍由来の、例えば、2つ以上、例えば3、4、5、6、7つ以上の固形腫瘍由来の細胞を死滅させることができ、上記細胞には、限定されないが、結腸直腸腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、メラノーマ細胞、扁平上皮がん細胞、肺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、肉腫細胞及び/又は線維肉腫細胞が含まれる。
【００４８】
腫瘍細胞株死滅は、任意の適切な方法によって決定することができる。典型的には、サンプルは、最初に患者から、好ましくはHSV1の場合には口唇ヘルペスから単離され、BHK細胞、又はベロ細胞などの別の適切な細胞株に感染させるために使用される。陽性サンプルは、典型的には、感染後24〜72時間で、例えば、感染後48時間で、細胞変性効果（CPE）の存在によって同定され、例えば免疫組織化学又はPCRによって標的ウイルス種であることが確認される。次に、ウイルスストックを陽性サンプルから生成する。ウイルスストックからのサンプルは、典型的には、試験され、異なる患者からのスワブを用いて同様に生成された他のサンプルと比較される。試験は、ある範囲の感染多重度（MOI）及び感染後の様々な時間点で達成されるCPEのレベルを決定することによって行うことができる。
【００４９】
例えば、80％コンフルエントの細胞株を、1、0.1、0.01及び0.001のMOIでウイルスサンプルに感染させ、二重のプレートを、24及び48時間、37℃、5％CO2でインキュベートし、その後、ウイルス細胞死滅の程度を決定し得る。これは、例えば、標準的な方法を用いてグルタルアルデヒドで細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色することによって決定することができる。次に、細胞溶解のレベルを肉眼観察、顕微鏡（細胞計数）及び写真撮影などの標準的な方法によって評価し得る。この方法は、細胞死滅が決定される前に、より短い期間、例えば8、12若しくは16時間、又はより長い期間、例えば72時間、又は0.0001以下などの追加のMOIで、インキュベートされた細胞を用いて反復され得る。
【００５０】
増殖曲線実験はまた、インビトロで腫瘍細胞株において複製する種々の臨床分離株の能力を評価するために実施され得る。例えば、80％コンフルエントの細胞株を1、0.1、0.01及び0.001のMOIでウイルスサンプルに感染させ、37℃、5％CO2でインキュベートし、典型的には感染の0、8、16、24及び48時間後に凍結/融解により細胞を溶解し、その後、ウイルス細胞死滅の程度を決定する。これは、例えば、標準的なプラークアッセイによってウイルス力価を評価することによって決定され得る。
【００５１】
本開示の臨床分離株は、それが比較される他の臨床分離株、好ましくは、同じウイルス種の2、3、4、5若しくは10個又はそれを超える他の臨床分離株よりも、感染した腫瘍細胞株をより迅速に及び/又はより低いMOIで死滅させることができる。本開示の臨床分離株は、典型的には、特定のMOI及び時間点で存在する腫瘍細胞を、同じMOI及び時間点で比較された同じウイルスタイプの少なくとも1個の、好ましくは2、3、4、5若しくは10個又はそれを超える他の臨床分離株よりも10％、25％又は50％大きな割合で死滅させる。本開示の臨床分離株は、典型的には、同じ時間点、典型的には12、24及び/又は48時間での比較のために使用される同じウイルス種の1個以上の、好ましくは2、3、4、5、10若しくは15個又はそれを超える他の臨床分離株が同じ割合の腫瘍細胞を死滅させるMOIの半分又は半分未満であるMOIで、同じ割合又はより大きな割合の腫瘍細胞を死滅させる。好ましくは、本開示の臨床分離株は、典型的には、同じ時間点、典型的には12、24及び/又は48時間での比較のために使用される同じウイルスの1個以上の、好ましくは2、3、4、5、10若しくは15個又はそれを超える他の臨床分離株が同じ割合の腫瘍細胞を死滅させるMOIよりも5又は10倍低いMOIで、同じ割合又はより大きな割合の腫瘍細胞を死滅させる。本開示のウイルスの改善された腫瘍細胞死滅能力は、典型的には、比較のために使用される、同じウイルス種の他の臨床分離株の少なくとも50％、75％又は90％と比較して達成される。ウイルスは、好ましくは、同じ種の少なくとも4個の他のウイルス株、例えば、他の7、9、19、39又は49個のウイルス株と比較される。
【００５２】
単離された株は、例えば、一度に4〜8つのウイルス株のバッチで、例えば、一度に4〜8つの腫瘍細胞株について試験することができる。実験の各々のバッチに関して、達成される死滅の程度は、その実験において比較されるウイルスについて、最良（すなわち、各々の時間点での最少生存細胞/MOI）から最悪（すなわち、各々の時間点での最多生存細胞/MOI）で各々の細胞株についてランク付けされる。次に、試験された腫瘍細胞株の範囲全体で最良の結果を示す（すなわち、細胞株を死滅させる際に一貫して最良のものの1つとしてランク付けされている）各々の実験からのウイルス株は、他の臨床分離株及び/又は他の腫瘍細胞株を用いたさらなる実験において直接比較され、全体で、例えば20個を超える、サンプリングしたウイルス株において最良のウイルス株を同定し得る。全体として最良のものとしてランク付けされるものは、本開示のウイルスである。
【００５３】
好ましい実施形態において、本開示のウイルスは、以下から選択される株である：
受託番号ECACC16121904を有するRH018A株、
受託番号ECACC16121902を有するRH004A株、
受託番号ECACC16121907を有するRH031A株、
受託番号ECACC16121908を有するRH040B株、
受託番号ECACC16121903を有するRH015A株、
受託番号ECACC16121905を有するRH021A株、
受託番号ECACC16121906を有するRH023A株、及び
受託番号ECACC16121909を有するRH047A株。
【００５４】
より好ましくは、本開示のウイルスは、以下から選択される株である：
受託番号ECACC16121904を有するRH018A株、
受託番号ECACC16121902を有するRH004A株、
受託番号ECACC16121907を有するRH031A株、
受託番号ECACC16121908を有するRH040B株、及び
受託番号ECACC16121903を有するRH015A株。
【００５５】
最も好ましくは、本開示のウイルスは、受託番号ECACC16121904を有するRH018A株である。寄託された株のいずれか1つを本明細書で定義するように改変し得る。
【００５６】
本開示のHSVは、ヒト腫瘍などの腫瘍において選択的に複製することができる。典型的には、HSVは標的腫瘍において効率的に複製するが、非腫瘍組織においては効率的に複製しない。このHSVは、正常組織における複製を阻害するが、依然として腫瘍における複製を可能にする1つ以上のウイルス遺伝子における1つ以上の突然変異を含み得る。突然変異は、例えば、HSVによって、機能的ICP34.5、ICP6及び/又はチミジンキナーゼの発現を阻止する突然変異であり得る。
【００５７】
1つの好ましい実施形態において、ICP34.5をコードする遺伝子は、HSVに選択的な腫瘍溶解活性を付与するように突然変異される。機能的ICP34.5の発現を妨げるICP34.5をコードする遺伝子の突然変異は、参照により本明細書に組み込まれるChouら(1990) Science 250:1262-1266、Macleanら(1991) J. Gen. Virol. 72:631-639及びLiuら(2003) Gene Therapy 10:292-303に記載されている。また、ICP6をコードする遺伝子及び/又はチミジンキナーゼをコードする遺伝子は不活性化され得、これは、このような不活性化がウイルスの感染又は腫瘍内での複製を妨げない限り、他の遺伝子と同様である。
【００５８】
HSVは、腫瘍におけるHSVの複製を増強するさらなる突然変異（1若しくは複数）を含有し得る。腫瘍におけるウイルス複製の結果として生じる増強は、ウイルスによる直接的な「腫瘍溶解性」腫瘍細胞死滅の改善をもたらすだけでなく、異種（すなわち、ウイルスに挿入される遺伝子、例えば融合誘導性タンパク質、免疫調節分子、例えばGM-CSF、又は免疫共刺激経路活性化分子をコードする遺伝子、並びに／又はCTLA-4阻害剤をコードする遺伝子）遺伝子発現のレベルも増強させ、腫瘍細胞が死滅した場合に放出される腫瘍抗原の量を増加させる。これらの両者はまた、がんの処置のための治療の免疫原性特性を改善し得る。例えば、本開示の好ましい実施形態において、ICP47をコードする遺伝子の発現を通常調節する前初期プロモーターの調節下にUS11遺伝子を置く様式でのICP47をコードする遺伝子の欠失は、腫瘍における複製の増強をもたらす（参照により本明細書に組み込まれる、Liuら, 2003を参照されたい）。
【００５９】
ウイルス複製に依存しないプロモーターの調節下に、HSV後期遺伝子であるUS11をコードする配列を置く他の突然変異もまた、本開示のウイルスに導入され得る。このような突然変異は、HSV複製が起こる前にUS11の発現を可能にし、腫瘍におけるウイルス複製を増強する。特に、このような突然変異は、機能的なICP34.5をコードする遺伝子を欠損しているHSVの複製を増強する。
【００６０】
したがって、一実施形態において、本開示のHSVは、プロモーターに機能的に連結されたUS11遺伝子を含み、プロモーターの活性はウイルス複製に依存しない。プロモーターは、哺乳動物の、好ましくはヒトの腫瘍細胞において活性である、前初期（IE）プロモーター又は非HSVプロモーターであり得る。プロモーターは、例えば、哺乳動物、好ましくはヒトのゲノムに由来するプロモーターなどの真核生物プロモーターであり得る。プロモーターは、普遍的プロモーター（β-アクチン又はチューブリンのプロモーターなど）又は細胞特異的プロモーター、例えば腫瘍特異的プロモーターであり得る。プロモーターは、モロニーマウス白血病ウイルスの長い末端反復（MMLV LTR）プロモーター又はヒト若しくはマウスのサイトメガロウイルス（CMV）IEプロモーターなどのウイルスプロモーターであり得る。HSV前初期（IE）プロモーターは当該技術分野において周知である。HSV IEプロモーターは、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27又はICP47の発現を駆動するプロモーターであり得る。
【００６１】
上記に言及されている遺伝子は、その機能不活性化がウイルスに対して腫瘍選択性の特性を提供し、任意の適切な方法によって、例えば、遺伝子及び/若しくはその遺伝子の調節配列の全部又は一部を欠失又は置換させることよって、あるいは遺伝子及び/若しくはその遺伝子の調節配列中に又はその代わりに1つ以上の核酸を挿入することによって機能的に不活性な状態とすることができる。例えば、当該技術分野において標準的である相同組換え法を用いて、本開示のウイルスを作製することができる。あるいは、細菌人工染色体（BAC）ベースのアプローチを使用してもよい。
【００６２】
本明細書で使用するとき、用語「遺伝子」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列、すなわち遺伝子のコード配列を意味することが意図される。上記に言及されている種々の遺伝子は、遺伝子それ自体又は遺伝子に隣接する調節配列、例えばプロモーター配列を突然変異させることによって非機能的な状態にすることができる。欠失は、遺伝子の1つ以上の部分、遺伝子全体、又は遺伝子全体及び調節配列の全部又は一部を除去することができる。例えば、フレームシフトをもたらす遺伝子内のただ1つのヌクレオチドの欠失を生じさせ得る。しかしながら、より大きな欠失、例えば、全コード配列及び/又は非コード配列の少なくとも約25％、より好ましくは少なくとも約50％の欠失を生じさせ得る。1つの好ましい実施形態において、機能的に不活性な状態である遺伝子が欠失されている。例えば、遺伝子全体及び場合により隣接配列の一部をウイルスから除去することができる。遺伝子の2つ以上のコピーがウイルスゲノム中に存在する場合、遺伝子の両方のコピーが機能的に不活性な状態にされる。
【００６３】
遺伝子は、他の配列を置換することによって、例えば、内因性遺伝子の全部又は一部を異種遺伝子及び場合によりプロモーター配列で置換することによって、不活性化することができる。プロモーター配列が置換されていない場合、異種遺伝子は、非機能的な状態にされた遺伝子のプロモーターによって調節されるように、挿入され得る。本開示のHSVにおいて、ICP34.5をコードする遺伝子は、異種の遺伝子（1若しくは複数）、及びそれに機能的に連結されるプロモーター配列（1若しくは複数）、及び場合により他の制御エレメント、例えば、ポリアデニル化配列を、ICP34.5をコードする遺伝子座の各々に挿入することによって非機能的な状態にすることが好ましい。
【００６４】
本開示のウイルスは、腫瘍において融合誘導性タンパク質及び/又は免疫刺激タンパク質を発現させるために使用される。本開示のウイルスは、腫瘍においてGM-CSF及び免疫共刺激経路活性化分子を発現させるために使用される。本開示のウイルスは、腫瘍においてCTLA-4阻害剤、及び場合によりGM-CSF、融合誘導性タンパク質及び／又は免疫刺激タンパク質を発現させるために使用することができる。これは、典型的には、融合誘導性タンパク質をコードする異種遺伝子及び/又は免疫刺激タンパク質をコードする異種遺伝子を、選択的複製可能なウイルスのゲノムに挿入することによって達成される。これは、典型的には、GM-CSFをコードする異種遺伝子及び免疫共刺激経路活性化分子をコードする異種遺伝子を、選択的複製可能なウイルスのゲノムに挿入することによって達成される。これは、典型的には、CTLA-4阻害剤をコードする異種遺伝子、及び場合によりGM-CSFをコードする異種遺伝子及び/又は免疫共刺激経路活性化分子をコードする異種遺伝子を、選択的複製可能なウイルスのゲノムに挿入することによって達成される。各々の遺伝子がプロモーター配列の調節下にある。このようなウイルスの複製が腫瘍組織において選択的に生じるため、ウイルスによる異種遺伝子によってコードされるタンパク質の発現はまた、体の非腫瘍組織と比較して腫瘍組織において増強される。増強された発現は、発現が体の他の組織と比較して腫瘍においてより大きい場合に起こる。腫瘍溶解性ウイルスによって発現されたタンパク質は、腫瘍溶解性ウイルスが感染した腫瘍流入領域リンパ節に存在することも予想され、これは腫瘍由来の抗原提示細胞中又は上での発現されたタンパク質及びウイルスのトラフィッキング（trafficking）によるものも含まれる。したがって、本開示は、腫瘍溶解性ウイルス複製によって提供される抗腫瘍効果と組み合わせて、腫瘍において選択的に、融合誘導性タンパク質及び/又は免疫刺激タンパク質の両方を発現するという利益を提供する。したがって、本開示は、腫瘍溶解性ウイルス複製によって提供される抗腫瘍効果と組み合わせて、腫瘍及び腫瘍流入領域リンパ節において選択的に、GM-CSF及び免疫共刺激経路活性化分子の両方を発現するという利益を提供する。したがって、本開示は、腫瘍溶解性ウイルス複製によって提供される抗腫瘍効果と組み合わせて、腫瘍及び腫瘍流入領域リンパ節において選択的に、GM-CSF及び免疫共刺激経路活性化分子を発現するという利益を提供する。
【００６５】
本開示のウイルスは、融合誘導性タンパク質及び免疫刺激タンパク質に加えて、1つ以上のさらなる異種遺伝子、例えばさらなる融合誘導性又は免疫刺激タンパク質を含み得る。
【００６６】
本開示のウイルスは、GM-CSFを含む。異種タンパク質をコードする遺伝子、例えばGM-CSFをコードする遺伝子の配列は、変更されていない配列を用いる場合と比べて、標的細胞におけるそれぞれのタンパク質の発現レベルを増加させるようにコドン最適化され得る。
【００６７】
融合誘導性タンパク質
本開示のウイルスは、融合誘導性タンパク質をコードする遺伝子を含み得る。融合誘導性タンパク質は、本開示のウイルスに感染した細胞の、別の細胞への融合を促進することができる任意の異種タンパク質であり得る。融合誘導性タンパク質、好ましくは野生型又は改変されたウイルス性糖タンパク質（すなわち、その融合誘導特性を高めるように改変されたもの）は、それが発現される細胞の細胞間融合（合胞体（syncitia）形成）を誘導することができるタンパク質である。融合誘導性糖タンパク質の例としては、VSV-G、シンシチン-1（ヒト内因性レトロウイルス-W（HERV-W）由来）又はシンシチン-2（HERVFRDE1由来）、パラミクソウイルスSV5-F、麻疹ウイルス-H、麻疹ウイルス-F、RSV-F、レトロウイルス又はレンチウイルス、例えば、テナガザル（gibbon ape）白血病ウイルス（GALV）、マウス白血病ウイルス（MLV）、Mason-Pfizerサルウイルス（MPMV）及びウマ感染性貧血ウイルス（EIAV）由来の糖タンパク質が挙げられ、これらは、R膜貫通ペプチドが除去されている（R-バージョン）。好ましい実施形態において、融合誘導性タンパク質はGALV由来であり、Rペプチドが除去されている（GALV-R-）。
【００６８】
本開示のウイルスは、複数コピーの融合誘導性タンパク質をコードする遺伝子、好ましくは1又は2コピーを含むことができる。ウイルスは、上記に列挙した融合誘導性タンパク質のいずれかを含む、2つ以上の異なる融合誘導性タンパク質を含み得る。
【００６９】
本開示のウイルスによって発現される融合誘導性タンパク質（1若しくは複数）は、天然に存在するタンパク質と同一であってもよく、又は改変されたタンパク質であってもよい。
【００７０】
融合誘導性タンパク質をコードする遺伝子（融合誘導性遺伝子）は、天然に存在する核酸配列又は改変された配列を有し得る。融合誘導性遺伝子の配列は、例えば、コードされたタンパク質の融合誘導特性を高めるために、又はコドン最適化を提供し、したがって、コードされたタンパク質の発現効率を高めるために改変され得る。
【００７１】
免疫刺激分子
本開示のウイルスは、1つ以上の免疫刺激分子、及び/又は免疫刺激分子、例えば免疫共刺激経路活性化分子などをコードする1つ以上の遺伝子を含み得る。免疫刺激分子には、免疫応答の誘導を支援し得るタンパク質、免疫応答の誘導又は有効性に対する阻害シグナルを緩和し得るタンパク質、及び免疫抑制分子の発現を阻害するRNA分子（例えば、shRNA、アンチセンスRNA、RNAi又はマイクロRNA）が含まれる。免疫共刺激経路活性化分子には、タンパク質及び核酸分子（例えば、アプタマー配列）が含まれる。
【００７２】
免疫刺激分子の例としては、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-24、CD40リガンド、GITRリガンド、4-1-BBリガンド、OX40リガンド、ICOSリガンド、flt3リガンド、TL1A、CD30リガンド、CD70、インターフェロンアルファ及びインターフェロンベータを含むI型インターフェロン、インターフェロンガンマ、III型インターフェロン（IL-28、IL-29）、TNFアルファ又はGM-CSFなどの他のサイトカイン、TGFベータ又は免疫チェックポイントアンタゴニストが挙げられる。免疫チェックポイントアンタゴニストには、これらの分子（CD40、GITR、4-1-BB、OX40、ICOS、flt3、DR3、CD30、CD27）のそれぞれの受容体を標的化する抗体、一本鎖抗体、及びRNA1/siRNA/microRNA/アンチセンスRNAノックダウンアプローチが含まれる。CD40L、GITRL、4-1-BBL、OX40L、ICOSL、ft3L、TL1A、CD30L又はCD70Lは、そのいずれかの改変バージョン、例えば可溶性バージョンであってもよい。
【００７３】
免疫増強/共刺激経路のアゴニストには、突然変異型又は野生型、可溶性、分泌型及び/又は膜結合型リガンド、並びに一本鎖抗体を含むアゴニスト抗体が含まれる。免疫共抑制経路又は免疫共刺激経路の標的化に関して、CTLA-4（アンタゴニスト）、PD-1（アンタゴニスト）、PD-L1（アンタゴニスト）、LAG-3（アンタゴニスト）、TIM-3（アンタゴニスト）、VISTA（アンタゴニスト）、CSF1R（アンタゴニスト）、IDO（アンタゴニスト）、CEACAM1（アンタゴニスト）、GITR（アゴニスト）、4-1-BB（アゴニスト）、KIR（アンタゴニスト）、SLAMF7（アンタゴニスト）、OX40（アゴニスト）、CD40（アゴニスト）、ICOS（アゴニスト）又はCD47（アンタゴニスト）を標的とするタンパク質又は他の分子（場合に依存するアゴニスト又はアンタゴニスト）が特に好ましい。したがって、本開示のウイルスは、好ましくは、これらの分子の1つ以上をコードする。より好ましくは、本開示のウイルスは、GM-CSF、及び/又はCD40L、ICOSL、4-1-BBL、GITRL又はOX40Lの野生型若しくは改変バージョン、最も好ましくはGM-CSFをコードする。
【００７４】
共抑制経路の阻害剤は、CTLA-4阻害剤であり得る。CTLA-4阻害剤は、典型的には、CTLA-4に結合し、B7による活性化の低減などによりCTLA-4によるシグナル伝達を低減若しくは遮断するペプチド又はタンパク質などの分子である。CTLA-4シグナル伝達を低減させることにより、阻害剤は、CTLA-4による免疫刺激経路の遮断を減少させ又は除去する。
【００７５】
CTLA-4阻害剤は、好ましくは、抗体又はその抗原結合断片である。
【００７６】
本明細書において言及される用語「抗体」には、全抗体及び任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）又はそれらの一本鎖が含まれる。抗体とは、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも2つの重（H）鎖及び2つの軽（カッパ）（L）鎖を含む糖タンパク質又はその抗原結合部分を指す。各々の重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではVHと略記する）及び重鎖定常領域で構成される。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではVLと略記する）及び軽鎖定常域で構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。VH及びVL領域は、フレームワーク領域（FR）と呼ばれる、より保存された領域が点在する、相補性決定領域（CDR）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的な補体系の第1成分（C1q）を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００７７】
抗体は、典型的にはモノクローナル抗体である。抗体はキメラ抗体であってもよい。抗体は、好ましくはヒト化抗体であり、より好ましくはヒト抗体である。
【００７８】
抗体の「抗原結合断片」という用語は、CTLA-4に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つ以上の断片を指す。抗原結合断片はまた、CTLA-4を阻害する能力を保持し、したがって、刺激性免疫応答のCTLA-4遮断を低減又は除去する能力を保持する。適切な断片の例には、Fab断片、F(ab')2断片、Fab'断片、Fd断片、Fv断片、dAb断片及び単離された相補性決定領域（CDR）が含まれる。scFvなどの一本鎖抗体及びVHH及びラクダ抗体などの重鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれることが意図される。好ましい実施形態において、抗体はscFvである。適切なscFv分子の例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるWO2007/123737及びWO2014/066532に開示されている。scFvは、配列番号34に示されるヌクレオチド配列、配列番号35に示されるヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【００７９】
抗体をコードする配列は、典型的にはN末端シグナル配列を有する抗体又は抗体断片をコードする。シグナル配列は、配列番号52に示されるアミノ酸配列を有し得る。例えば、このシグナル配列は、配列番号54に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号55に示されるヌクレオチド配列によりコードされるscFv、及び、配列番号59に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号60に示されるヌクレオチド配列によりコードされるscFvに含まれる。
【００８０】
抗体又は抗体断片において、軽鎖及び重鎖配列はアミノ酸リンカーにより連結され得る。リンカーは典型的には、約15個〜約25個のアミノ酸、例えば約18個又は20個のアミノ酸を含む。グリシン及びセリン残基を含むリンカー、例えば配列番号53に示されるアミノ酸配列などの任意の適切なリンカーを使用できる。例えば、このリンカーは、配列番号54に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号55に示されるヌクレオチド配列によりコードされるscFv、及び、配列番号59に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号60に示されるヌクレオチド配列によりコードされるscFvに含まれる。両者とも好ましい抗体断片である。
【００８１】
類似の構造を有する他の抗体断片も好ましい。したがって、ウイルスは軽鎖可変領域、リンカー、重鎖可変領域、重鎖CH1ドメイン、重鎖CH2ドメイン及び重鎖CH3ドメインを含むか、又はこれらから本質的になる抗体又は断片をコードし得る。ウイルスはさらに抗体のN末端にシグナル配列をコードし得る。
【００８２】
ウイルスの抗体又は抗体断片は、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4領域、IgG1領域であるFc領域を含み得る。抗体は、好ましくはscFvがIgG重鎖CH2及びCH3ドメインに連結されるscFv抗体である。
【００８３】
好ましいCTLA-4抗体又は断片は、配列番号48に示される重鎖可変領域、及び/若しくは配列番号46に示される軽鎖可変領域、又は配列番号56に示される重鎖可変領域及び/若しくは配列番号57に示される軽鎖可変領域を含む。抗体は、配列番号4に示されるアミノ酸配列を有する重鎖CH1ドメイン、及び/又は配列番号50に示されるCH2/CH3ドメインを含み得る。抗体は、配列番号47に示される軽鎖アミノ酸配列を含み得る。抗体は代替的にこれらの重鎖若しくは軽鎖可変領域又はCDR配列のうちの1つの変異体（バリアント）を含み得る。例えば、変異体（バリアント）は、上記アミノ酸配列のいずれかの置換、欠失、又は付加変異体であってもよい。
【００８４】
変異体（バリアント）抗体は本明細書で記載の抗体の活性を維持しながら、上記特定の配列及び断片から1、2、3、4、5、10まで、20まで、30まで、又はそれ以上のアミノ酸の置換及び/又は欠失を含み得る。「欠失」変異体は、例えば1、2、3、4又は5個の個々のアミノ酸の欠失、又は2、3、4又は5個のアミノ酸等の小さなアミノ酸群の1つ以上の欠失を含み得る。「置換」変異体は、1つ以上アミノ酸を同数のアミノ酸で置換し保存的アミノ酸置換を行うことを含むのが好ましい。例えば、アミノ酸は、類似の特性を有する代替アミノ酸、例えば、別の塩基性アミノ酸、別の酸性アミノ酸、別の中性アミノ酸、別の荷電アミノ酸、別の親水性アミノ酸、別の疎水性アミノ酸、別の極性アミノ酸、別の芳香族アミノ酸又は別の脂肪族アミノ酸で置換され得る。
【００８５】
本開示のウイルスは、CTLA-4阻害剤をコードする1つ以上のポリヌクレオチド配列を含む。ポリヌクレオチド配列は適切なプロモーターの制御下にある。ウイルスは抗体重鎖可変領域をコードする第1のポリヌクレオチド配列、及び抗体軽鎖可変領域をコードする第2のポリヌクレオチドを含み得る。第1のポリヌクレオチドは重鎖全長をコードでき、及び/又は第2のポリヌクレオチドは軽鎖全長をコードできる。第1及び第2のポリヌクレオチドは、場合によりIRESと共に、単一のプロモーターの制御下にあってもよく、又は2つの別個のプロモーターの制御下にあってもよい。別個のプロモーターは同一であっても異なるものであってもよい。
【００８６】
第1のポリヌクレオチドは配列番号54に示される重鎖可変領域のコード配列を含んでもよく、若しくはこのコード配列から本質的になってもよく、若しくはこのコード配列からなるものであってもよく、及び/又は第2のポリヌクレオチドは配列番号55に示される重鎖可変領域のコード配列を含んでもよく、若しくはこのコード配列から本質的になってもよく、若しくはこのコード配列からなるものであってもよい。第1のポリヌクレオチドは配列番号2に示される重鎖可変領域のコード配列を含んでもよく、若しくはこのコード配列から本質的になってもよく、若しくはこのコード配列からなるものであってもよく、及び/又は第2のポリヌクレオチドは配列番号3に示される重鎖可変領域のコード配列を含んでもよく、若しくはこのコード配列から本質的になってもよく、又はこのコード配列からなるものであってもよい。
【００８７】
第1及び/又は第2のポリヌクレオチド配列は、配列番号54、55、2又は3の変異体（バリアント）であってもよい。例えば、変異体は、これら核酸配列のいずれかの置換、欠失又は付加変異体であってもよい。変異体ポリヌクレオチドは配列番号54、55、2又は3の1、2、3、4、5、10まで、20まで、30まで、40まで、50まで、75まで、又はそれ以上の核酸置換及び/又は欠失を含んでもよい。
【００８８】
適切な変異体（バリアント）は、本明細書に開示された核酸配列のいずれか1つのポリヌクレオチドと少なくとも70％相同であってもよく、好ましくは少なくとも80又は90％、より好ましくは少なくとも95％、97％又は99％相同であってもよい。これらのレベルの相同性及び同一性は少なくともポリヌクレオチドのコード領域に関して存在するのが好ましい。相同性を測定する方法は当技術分野においてよく知られており、現在の状況では、相同性が核酸同一性に基づいて計算されることは当業者に理解されるだろう。そのような相同性は、少なくとも15、好ましくは少なくとも30、例えば少なくとも40、60、100、200又はそれ以上の連続するヌクレオチドの領域にわたって存在し得る。そのような相同性は未修飾ポリヌクレオチド配列の全長にわたって存在し得る。
【００８９】
ポリヌクレオチドの相同性又は同一性を測定する方法は当技術分野において知られている。例えば、UWGCGパッケージは、相同性を計算するために使用できるBESTFITプログラムを提供する（例えば、デフォルト設定で使用）（Devereuxら(1984)Nucleic Acids Research 12、p387-395）。
【００９０】
例えば、Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300； Altschul,S,Fら(1990)J Mol Biol 215:403-10に記載されている様に、PILEUP及びBLASTアルゴリズムを用いても、相同性を計算したり、配列を並べることができる（デフォルト設定での使用が一般的である）。
【００９１】
BLAST解析を行うためのソフトウェアは、National Centre for Biotechnology Information（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から公的に入手可能である。このアルゴリズムでは、データベース配列内の同じ長さの文字とアライメントさせた場合の、何らかの正の値の閾値スコアTと一致するか、これを満たす検索配列内にある長さWの短い文字列を同定し、ハイスコアの配列対（HSP）をまず同定することを含む。Tは隣接文字スコア閾値と呼ばれる（Altschulら、前出）。この最初の隣接文字ヒットが、それらを含むHSPの検索を開始するためのシードとして作用する。合計したアライメントスコアが増加する限り、文字ヒットを各配列に沿って両方向に伸長させる。両方向への文字列検索の伸長は、1つ以上の負のスコア残基アライメントの増加によりアライメントスコアの合計が0以下となった場合、又は、いずれかの配列の終端に到達した場合、停止する。BLASTアルゴリズムのパラメーターW、T及びXにより、アライメントの感度及び速度が決定される。BLASTプログラムはデフォルトで11の文字長（W）とBLOSUM62スコア行列（Henikoff及びHenikoff(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919を参照）、アラインメント50（B）、期待値（E）10、M＝5、N＝4、及び両鎖の比較を使用する。
【００９２】
BLASTアルゴリズムは、2つの配列間の類似性の統計分析を行う。例えば、Karlin及びAltschul(1993)Proc. Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787を参照のこと。BLASTアルゴリズムが提供する類似性の基準の1つは最小合計確率（P(N)）であり、これは2つのヌクレオチド又はアミノ酸配列が偶然に類似する確率を示す。例えば、第1の配列と第2の配列を比較した際の最小合計確率が、約1未満、好ましくは約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合、ある配列は別の配列に類似していると考えられる。
【００９３】
一実施形態では、変異体（バリアント）配列は、遺伝コードにおける縮重性により配列表にある特定の配列とは異なり得る。DNAコードでは4つの主な核酸残基（A、T、C及びG）があり、これを使用して3つの文字からなるコドンを「綴り」、これが生物の遺伝子においてコードされるタンパク質のアミノ酸を表す。DNA分子に沿ったコドンの直線的配列は、これら遺伝子によってコードされるタンパク質におけるアミノ酸の直線的配列に翻訳される。20の天然アミノ酸をコードする61のコドンと「停止」シグナルを表す3つのコドンがあり、コードは縮重性が高い。したがって、ほとんどのアミノ酸は、1より多いコドンによりコードされ、実際に幾つかは、4つ以上の異なるコドンによりコードされる。したがって、本発明の変異体ポリヌクレオチドは本発明の別のポリヌクレオチドと同じポリペプチド配列をコードし得るが、同じアミノ酸をコードするために異なるコドンを使用することによって異なる核酸配列を有し得る。改変していない配列を使用した場合と比較して、標的細胞においてコードされるタンパク質の発現レベルを増加させるために、コドンを最適化してもよい。
【００９４】
本開示のウイルスは、GM-CSFを含むのが好ましい。GM-CSFをコードする遺伝子の配列は、改変していない配列を使用した場合と比較して、標的細胞におけるコードされるタンパク質の発現レベルを増加させるために、コドン最適化され得る。
【００９５】
本開示のウイルスは、1つ以上の免疫共刺激経路活性化分子及び/又は免疫共刺激経路活性化分子をコードする1つ以上の遺伝子を含むのが好ましい。免疫共刺激経路活性化分子はタンパク質及び核酸分子（例えばアプタマー配列）を含む。免疫共刺激経路活性化分子の例としては、CD40リガンド、GITRリガンド、4-1-BBリガンド、OX40リガンド、ICOSリガンド、flt3リガンド、TL1A、CD30リガンド、CD70、及びこれらの分子（CD40、GITR、4-1-BB、OX40、ICOS、flt3、DR3、CD30、CD27）の各受容体を標的とする一本鎖抗体を含む。
【００９６】
免疫共刺激経路の活性化因子としては、突然変異体又は野生型、可溶性、分泌及び/又は膜結合リガンド、及び一本鎖抗体を含むアゴニスト抗体がある。本発明のウイルスは、CD40L、ICOSL、4-1-BBL、GITRL又はOX40Lの1つ以上をコードするのが好ましい。
【００９７】
本開示のウイルスは、1つ以上の免疫刺激分子、好ましくは1、2、3又は4つの免疫刺激分子、より好ましくは1又は2つの免疫刺激分子をコードし得る。
【００９８】
本開示のウイルスは、1つ以上の免疫共刺激経路活性化分子、好ましくは1、2、3又は4つの免疫共刺激経路活性化分子、より好ましくは1又は2つの免疫共刺激経路活性化分子をコードし得る。
【００９９】
例えば、ウイルスは、
-  CD40L、及びICOSL、4-1-BBL、GITRL、OX40L及びCTLA-4阻害剤の1つ以上、
-  ICOSL、及びCD40L、4-1-BBL、GITRL、OX40L及びCTLA-4阻害剤の1つ以上、
-  4-1-BBL、及びCD40L、ICOSL、GITRL、OX40L及びCTLA-4阻害剤の1つ以上、
-  GITRL、及びCD40L、ICOSL、4-1-BBL、OX40L及びCTLA-4阻害剤の1つ以上、
-  OX40L、及びCD40L、ICOSL、4-1-BBL、GITRL及びCTLA-4阻害剤の1つ以上、
-  CTLA-4阻害剤、及びCD40L、ICOSL、4-1-BBL、GITRL及びOX40Lの1つ以上、
をコードする遺伝子を含み得る。
【０１００】
免疫刺激分子、例えば免疫共刺激経路活性化分子などをコードする遺伝子の配列は、改変されていない配列が使用される場合と比較して、標的細胞中のそれぞれのタンパク質の発現レベルを増加させるようにコドン最適化され得る。
【０１０１】
一部の実施形態において、本開示のウイルスは、GM-CSF及び/又は免疫共刺激経路活性化分子及び/又はCTLA-4阻害剤に加えて1つ以上のさらなる異種遺伝子を含み得る。好ましい実施形態では、ウイルスは、GALVR-などの融合誘導性タンパク質をさらに含み得る。
【０１０２】
融合誘導性タンパク質は、本開示のウイルスに感染した細胞の、別の細胞への融合を促進することができる任意の異種タンパク質であり得る。融合誘導性タンパク質、好ましくは野生型又は改変されたウイルス性糖タンパク質（すなわち、その融合誘導特性を高めるように改変されたもの）は、それが発現される細胞の細胞間融合（合胞体（syncitia）形成）を誘導することができるタンパク質である。融合誘導性糖タンパク質の例としては、VSV-G、シンシチン-1（ヒト内因性レトロウイルス-W（HERV-W）由来）又はシンシチン-2（HERVFRDE1由来）、パラミクソウイルスSV5-F、麻疹ウイルス-H、麻疹ウイルス-F、RSV-F、レトロウイルス又はレンチウイルス、例えば、テナガザル（gibbon ape）白血病ウイルス（GALV）、マウス白血病ウイルス（MLV）、Mason-Pfizerサルウイルス（MPMV）及びウマ感染性貧血ウイルス（EIAV）由来の糖タンパク質が挙げられ、これらは、R膜貫通ペプチドが除去されている（R-バージョン）。好ましい実施形態において、融合誘導性タンパク質はGALV由来であり、Rペプチドが除去されている（GALV-R-）。
【０１０３】
本開示のウイルスは、場合により複数コピーの融合誘導性タンパク質をコードする遺伝子、好ましくは1又は2コピーを含むことができる。ウイルスは、上記に列挙した融合誘導性タンパク質のいずれかを含む、2つ以上の異なる融合誘導性タンパク質を含み得る。
【０１０４】
本開示のウイルスによって場合により発現される融合誘導性タンパク質（1若しくは複数）は、天然に存在するタンパク質と同一であってもよく、又は改変されたタンパク質であってもよい。
【０１０５】
融合誘導性タンパク質をコードする遺伝子（融合誘導性遺伝子）は、天然に存在する核酸配列又は改変された配列を有し得る。融合誘導性遺伝子の配列は、例えば、コードされたタンパク質の融合誘導特性を高めるために、又はコドン最適化を提供し、したがって、コードされたタンパク質の発現効率を高めるために改変され得る。
【０１０６】
ウイルス株の改変
本開示の改変されたウイルスは、ウイルスの改変バージョン、例えば比較のために用いられた他のウイルス株と比較して腫瘍細胞の死滅について有利な特性を有するとして同定された臨床分離株の改変バージョンなどである。本開示の改変されたウイルスは、当該技術分野において周知の方法を用いて構築される。例えば、パッケージングされるウイルスゲノムをコードするプラスミド（より小さなウイルス及び単一及び複数のゲノム成分RNAウイルス用）又はBACS（ヘルペスウイルスを含むより大きなDNAウイルス用）は、適切な制御調節下で所望の異種遺伝子、例えば融合誘導性分子及び/又は免疫刺激分子をコードする任意の遺伝子を含み、標準的な分子生物学技術によって構築され、組換えウイルスを回収することができる許容細胞にトランスフェクトされ得る。
【０１０７】
あるいは、好ましい実施形態において、意図された挿入部位に隣接するDNA領域を含有するプラスミドを構築し、次に、ウイルスゲノムDNAとともに許容細胞に同時トランスフェクションし得、それにより、プラスミド中の標的挿入部位の隣接領域と親ウイルス（親の臨床分離株など）の同じ領域との間で相同組換えが生じる。次に、組換えウイルスは、例えば、意図された挿入部位での親ウイルスからのGFP又はlacZなどのマーカー遺伝子の挿入又は欠失によるなどの、改変に使用されるプラスミドによって挿入又は欠失された機能の喪失又は付加を介して、選択及び精製することができる。最も好ましい実施形態において、挿入部位はHSVのICP34.5遺伝子座であり、したがって、操作に使用されるプラスミドは、この挿入部位に隣接するHSV配列を含有し、その間に少なくとも1つの異種タンパク質、例えば融合誘導性タンパク質及び免疫刺激分子、又はGM-CSF及び免疫共刺激経路活性化分子、及び/又はCTLA-4阻害剤などをコードする発現カセットがある。この場合、親ウイルス（親の臨床分離株など）は、ICP34.5の代わりにGFPをコードするカセットを含有し得、組換えウイルスプラークはGFPの発現の消失によって選択される。最も好ましい実施形態において、HSVのUS11遺伝子もまた、IE遺伝子として発現される。これは、ICP47コード領域の欠失を介して、又は他の手段によって達成され得る。
【０１０８】
異種遺伝子、例えば融合誘導性タンパク質をコードする配列、免疫刺激分子をコードする配列、例えばCTLA-4阻害剤をコードする配列、GM-CSFをコードする配列及び/又は免疫共刺激経路活性化分子をコードする配列は、適切な制御調節下でウイルスゲノムに挿入され得る。これは、種及び挿入部位に依存して、使用される本開示のウイルス種の天然プロモーターの制御調節下に、又は好ましくは異種プロモーターの調節下にあり得る。適切な異種プロモーターには、IEF2aプロモーター又はアクチンプロモーターなどの哺乳動物プロモーターが含まれる。CMV IEプロモーター、RSV LTR、MMLV LTR、他のレトロウイルスLTRプロモーター、又はSV40由来のプロモーターなどの強力なウイルスプロモーターがより好ましい。好ましくは、各々の外来遺伝子（例えば、融合誘導性タンパク質、免疫調節分子、GM-CSF、免疫共刺激経路活性化分子及び/又はCLT-4阻害剤をコードする）は、別個のプロモーター調節下にあるが、また、例えば、タンパク質コード配列間に内部リボソーム侵入部位（IRES）を挿入することによって、単一のRNA転写物から発現され得る。各々のプロモーター由来のRNAは、典型的には、ポリアデニル化配列（例えば、ウシ若しくはヒト成長ホルモン（BGH）ポリA配列、合成ポリアデニル化配列、ウサギベータグロビンポリアデニル化配列などの哺乳動物配列、又はSV40初期若しくは後期ポリアデニル化配列などのウイルス配列）を用いて終結される。
【０１０９】
本開示はまた、少なくとも3つの異種遺伝子を発現するウイルス、例えばポックスウイルス又はHSV、好ましくはHSV1などを提供し、3つの異種遺伝子の各々は、CMVプロモーター、RSVプロモーター、EF1aプロモーター、SV40プロモーター及びレトロウイルスLTRプロモーターから選択される異なるプロモーターによって駆動される。ウイルスは、例えば、4つの異種遺伝子を発現し得、4つの異種遺伝子の各々は、CMVプロモーター、RSVプロモーター、EF1aプロモーター、SV40プロモーター及びレトロウイルスLTRプロモーターから選択される異なるプロモーターによって駆動される。レトロウイルスLTRは、好ましくは、MoMuLVとしても知られているMMLV（配列番号43）由来である。異種遺伝子は、ポリアデニル化配列によって終結され得る。ポリアデニル化配列は同一であってもよく又は異なっていてもよい。好ましくは、各々の異種遺伝子は、好ましくはBGH、SV40、HGH及びRBGポリアデニル化配列から選択される異なるポリアデニル化配列によって終結される。
【０１１０】
本開示はまた、少なくとも3つの異種遺伝子を発現するウイルス、例えばポックスウイルス又はHSV、好ましくはHSV1などを提供し、3つの異種遺伝子の各々は、BGH、SV40、HGH及びRBGポリアデニル化配列から選択される異なるポリアデニル化配列によって終結される。ウイルスは、例えば、それぞれ、BGH、SV40、HGH及びRBGポリアデニル化配列の各々によって終結される4つの異種遺伝子を発現し得る。
【０１１１】
ウイルス中の異種遺伝子のそれぞれは、典型的にはプロモーターの制御下である。異種遺伝子の発現を制御するプロモーターは、同じであっても異なっていてもよい。例えば、抗CTLA-4、並びにGM-CSF、融合誘導性遺伝子、及び免疫共刺激経路活性化分子をコードする遺伝子の1つ以上はそれぞれ、CMVプロモーター、RSVプロモーター、EF1aプロモーター、SV40プロモーター、又はレトロウイルスLTRプロモーターの制御下であり得る。あるいは、例えば、抗CTLA-4はMMLVプロモーター等のレトロウイルスLTRプロモーターの制御下であり、GM-CSFはCMVプロモーターの制御下であり、及び/又はGALVR-等の融合誘導性遺伝子は、RSVプロモーターの制御下であり得る。
【０１１２】
少なくとも3つの異種遺伝子を、例えばCTLA-4阻害剤、GM-CSFをコードする遺伝子、免疫共刺激経路活性化分子をコードする遺伝子、及び融合誘導性遺伝子から選択してもよい。3つの異種遺伝子の例としては、CTLA-4阻害剤、GM-CSFをコードする遺伝子、及び免疫共刺激経路活性化分子をコードする遺伝子；CTLA-4阻害剤、GM-CSFをコードする遺伝子及び融合誘導性遺伝子；並びにCTLA-4阻害剤、免疫共刺激経路活性化分子をコードする遺伝子、及び融合誘導性遺伝子がある。4つの異種遺伝子は、例えば、CTLA-4阻害剤、GM-CSFをコードする遺伝子、免疫共刺激経路活性化分子をコードする遺伝子、及び融合誘導性遺伝子であり得る。3つ又は4つの異種遺伝子は、例えば、免疫共刺激経路活性化分子をコードする2つ以上の遺伝子及び/又は2つ以上の融合誘導性遺伝子を含み得る。
【０１１３】
一実施形態において、3つの異種遺伝子の発現を制御するプロモーターはCMV、RSV及びMMLVプロモーターである。例えば、好ましいウイルスは、CMVプロモーター制御下のGM-CSF遺伝子、RSVプロモーター制御下のGALV遺伝子、及びMMLVプロモーター制御下のCTLA-4阻害剤を含み得る。
【０１１４】
一実施形態において、少なくとも3つの異種遺伝子を終結させるポリアデニル化配列は、SV40、BGH及びRBGポリアデニル化配列である。3つの異種遺伝子の発現を制御するのはCMV、RSV及びMMLVプロモーターである。例えば、好ましいウイルスは、BGHポリアデニル化配列により終結するGM-CSF遺伝子、SV40ポリアデニル化配列により終結するGALV遺伝子、及びRGBポリアデニル化配列により終結するCTLA-4阻害剤を含み得る。
【０１１５】
様々なプロモーター及びポリアデニル化配列の任意の組み合わせを異種遺伝子のうちのいずれかと一緒に使用し得る。例えば、好ましいウイルスは、CMVプロモーター制御下でBGHポリアデニル化配列により終結するGM-CSF遺伝子、RSVプロモーター制御下でSV40ポリアデニル化配列により終結するGALV遺伝子、及び、MMLVプロモーター制御下でRGBポリアデニル化配列により終結するCTLA-4阻害剤を含み得る。
【０１１６】
医薬組成物
本開示は、本開示のウイルス及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。適切な担体及び希釈剤には、等張性生理食塩水、例えば、リン酸緩衝生理食塩水が含まれる。組成物は、製品の安定性などの特性を改善するために、糖又はタンパク質などの他の成分をさらに含み得る。あるいは、使用前に薬学的に許容される担体又は希釈剤中で再構成される凍結乾燥製剤を使用し得る。
【０１１７】
必要に応じて、担体の選択は、しばしば組成物の送達経路の関数である。本開示の範囲内で、組成物は、任意の適切な経路及び投与手段のために製剤化され得る。薬学的に許容される担体又は希釈剤は、腫瘍内投与、静脈内/動脈内投与、脳への投与又は体腔（例えば、膀胱、胸腔又は腹腔内投与）への投与に適した組成物に使用されるものである。組成物は、任意の適切な形態で、好ましくは液体として投与することができる。
【０１１８】
本開示はまた、本開示のウイルスを滅菌バイアル、アンプル又はシリンジ中に含む製造物を提供する。
【０１１９】
医療用途/処置の方法
本開示は、特にがんを処置する方法において使用するための、治療によるヒト又は動物の体の処置における使用のための本開示のウイルスを提供する。がんは、典型的には、哺乳動物、好ましくはヒトに存在する。このウイルスは、感染した腫瘍細胞を、ウイルス媒介傷害性によって、例えば溶解、壊死又はアポトーシスによって、好ましくは溶解又は壊死によって、そしてウイルスが融合誘導性タンパク質をコードする場合には感染した腫瘍細胞を互いに融合させることによって死滅させる。本開示のウイルスはまた、がん細胞も死滅させる免疫刺激分子の発現により、例えばGM-CSF及び免疫共刺激経路活性化分子の発現により、増強された全身性抗腫瘍免疫応答を誘発する。
【０１２０】
本開示はまた、治療有効量の本開示のウイルスを、その必要がある個体に投与することを含む、がんを処置する方法を提供する。
【０１２１】
本開示はさらに、がんを処置するための医薬の製造における本開示のウイルスの使用を提供する。
【０１２２】
本開示のウイルスは、任意の腺癌、癌腫、メラノーマ又は肉腫を含む任意の固形腫瘍の処置に特に有用である。例えば、本開示のウイルスは、頭頸部、前立腺、乳房、卵巣、肺、肝臓、子宮内膜、膀胱、胆嚢、膵臓、結腸、腎臓、胃（stomach）/胃（gastric）、食道又は子宮頚部のがん、中皮腫、メラノーマ又は他の皮膚がん、リンパ腫、神経膠腫若しくは神経系の他のがん、又は軟部肉腫などの肉腫の処置に有用である。
【０１２３】
がんは、好ましくは、皮膚扁平上皮がん（CSCC）、腎細胞がん（RCC）、非小細胞肺がん（NSCLC）、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）、小細胞肺がん（SCLC）、進行再発頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん（SCCHN）、上咽頭がん（NPC）、肝細胞がん（HCC）、肛門がん、結腸直腸がん（CRC）、基底細胞がん（BCC）、メルケル細胞がん、虫垂がん、皮膚肉腫、手術後の再発性メラノーマ、進行性若しくは転移性の尿路上皮がん、肝転移、高頻度マイクロサテライト不安定性がん（MSI-H）、混合型進行性固形がん、ウイルス性がん、局所領域進行がん、及び小児がんから選択される。基底細胞がんは、例えば、皮膚の基底細胞がんであり得る。NMSCは、例えば、隆起性皮膚線維肉腫、皮膚血管肉腫、非HIV関連カポジ肉腫、皮脂腺細胞がん、又はエクリンがんのうちのいずれか1つのような稀な皮膚悪性腫瘍であり得る。MSI-H腫瘍は、例えば、以下のがんタイプ：子宮内膜、卵巣（ovarian）、胃、結腸直腸、膵臓、卵巣（ovary）、前立腺、中枢神経系及びNSCLCのいずれかに発生し得る。ウイルス性がんは、例えば、HBV又はHPVに起因するものであり得る。肝転移は、どのような腫瘍タイプのものであってもよい。がんは、既存の抗がん免疫がないか若しくは最小限の患者、既治療患者、チェックポイント遮断療法を受けていない患者、又はチェックポイント遮断療法を受けた患者であってもよい。例えば、既治療患者には、白金含有化学療法に失敗した膀胱がんの患者が含まれる。治療は、第一選択療法であり得る。
【０１２４】
本開示のウイルスは、元の腫瘍の部位から転移した腫瘍を含む悪性腫瘍を処置するために使用され得る。この実施形態において、ウイルスは、原発腫瘍又は1つ以上の二次腫瘍に投与され得る。
【０１２５】
本開示のウイルスは、化学療法、標的化療法、免疫療法（免疫共抑制経路の遮断（免疫チェックポイントの遮断）又は免疫共刺激経路活性化、例えば免疫共抑制経路の1つ以上のアンタゴニスト及び/又は免疫共刺激経路の1つ以上のアゴニストの使用などを含む）を含む他の治療剤と組み合わせて、及び/又は放射線療法と組み合わせて、及び/又はこれらの任意の組み合わせと組み合わせて投与することができる。治療剤は、好ましくは抗がん剤である。
【０１２６】
治療剤は、チロシンキナーゼ阻害剤、例えばMEK阻害剤（例えばトラメチニブ）、BRAF阻害剤（例えばベルラフェニブ及び／又はダブラフェニブ）、及び／又はPI3キナーゼ阻害剤であり得る。
【０１２７】
本開示のウイルスは、第2の腫瘍溶解性ウイルスなどの第2のウイルスと組み合わせて投与され得る。
【０１２８】
例えば、治療剤は、腫瘍細胞、特に腫瘍ネオ抗原に対する免疫応答、例えば、細胞性又は体液性の免疫応答をさらに刺激するために、免疫原（それがコードされているDNA若しくはRNAとして送達される、このような抗原又は抗原の組み合わせを含む、組換え又は天然に存在する抗原を含む）を含み得る。治療剤は、サイトカイン、免疫チェックポイント経路を阻害し、若しくは免疫増強経路を刺激することが意図された薬剤、又は制御性T細胞（Tregs）若しくは骨髄由来サプレッサー細胞（MDSC）の活性を阻害する薬剤などの免疫応答を増加又は増強することが意図された薬剤であり得る。
【０１２９】
治療剤は、既存のがん治療処置における使用が公知である薬剤であり得る。治療剤は、放射線療法剤又は化学療法剤であり得る。治療剤は、シクロホスファミド（cyclophosmamide）、アルキル化様薬剤、例えば、シスプラチン又はメルファラン、植物アルカロイド及びテルペノイド、例えば、ビンクリスチン又はパクリタキセル（タキソール）、代謝拮抗剤、例えば、5-フルオロウラシル、トポイソメラーゼ阻害剤タイプI又はII、例えば、カンプトテシン又はドキソルビシン、細胞傷害性抗生物質、例えば、アクチノマイシン、アントラサイクリン、例えば、エピルビシン、グルココルチコイド、例えば、トリアムシノロン、タンパク質、DNA及び/又はRNA合成の阻害剤、例えば、メトトレキセート及びダカルバキシン、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤、又は任意の他の化学療法剤から選択され得る。
【０１３０】
治療剤は、以下のうちの1つ又は組み合わせであり得る：免疫療法剤又は免疫調節剤、例えば、TLRアゴニスト；T制御細胞をダウンレギュレートする薬剤、例えば、シクロホスファミド；又は免疫チェックポイントを遮断し又は免疫増強経路を刺激するように設計された薬剤、例えば、限定されないが、モノクローナル抗体、例えば、CTLA-4阻害剤、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤、LAG-3阻害剤、TIM-3阻害剤、VISTA阻害剤、CSF1R阻害剤、IDO阻害剤、CEACAM1阻害剤、GITRアゴニスト、4-1-BBアゴニスト、KIR阻害剤、SLAMF7阻害剤、OX40アゴニスト、CD40アゴニスト、ICOSアゴニスト又はCD47阻害剤。好ましい実施形態において、治療剤は、CTLA-4阻害剤、例えば、抗CTLA-4抗体、PD1阻害剤、例えば、抗PD-1抗体、又はPD-L1阻害剤、例えば抗PD-L1抗体である。このような阻害剤、アゴニスト及び抗体は、当該技術分野において公知である標準的な方法によって生成及び試験することができる。
【０１３１】
好適な抗PD-1抗体の例としては、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、及びセミプリマブが挙げられる。好適な抗PD-L1抗体の例としては、アベルマブ、デュルバルマブ及びアテゾリズマブが挙げられる。
【０１３２】
免疫療法剤はまた、二重特異性抗体、樹状細胞に基づく細胞に基づく治療、NK細胞又は操作されたT細胞、例えば、CAR-T細胞又は操作されたT細胞受容体を発現するT細胞を含み得る。免疫療法剤はまた、腫瘍において生じる特異的遺伝子突然変異を標的とする薬剤、特定の腫瘍抗原又は腫瘍抗原の組み合わせ、例えばネオ抗原に対する免疫応答を誘発することが意図された薬剤、並びに/又はSTING/cGAS経路、TLR又は他の自然免疫応答及び/又は炎症性経路を活性化することが意図された薬剤、例えば腫瘍内薬剤を含む。
【０１３３】
例えば、本開示のウイルスは、メラノーマを処置するために、ダカルバジン、BRAF阻害剤及び/又はCTLA-4、PD1若しくはPD-L1遮断剤と組み合わせて；乳がんを処置するためにタキソール、ドキソルビシン、ビノレルビン、シクロホスファミド及び/又はゲムシタビンと組み合わせて；結腸直腸がんを処置するために5-フルオロウラシル、並びに場合によりロイコボリン、イリノテカン及び/又はオキサリプラチンと組み合わせて；肺がんを処置するためにタキソール、カルボプラチン、ビノレルビン及び/又はゲムシタビン、PD-1若しくはPD-L1遮断剤と組み合わせて；頭頸部がんを処置するためにシスプラチン及び/又は放射線療法と組み合わせて使用され得る。
【０１３４】
治療剤は、インドールアミン（idoleamine）2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）経路の阻害剤であり得る。IDO阻害剤の例には、エプカドスタット（INCB024360）、1-メチル-トリプトファン、インドキシモド（1-メチル-D-トリプトファン）、GDC-0919又はF001287が含まれる。
【０１３５】
抗腫瘍免疫応答を抑制する際のIDOの作用機序はまた、腫瘍溶解性ウイルス療法後に生じる免疫応答を抑制し得る。IDO発現は、トール様受容体（TLR）活性化及びインターフェロン-γによって誘導され、その両方は腫瘍溶解性ウイルス感染に起因し得る。がん処置のための腫瘍溶解性ウイルス療法の使用の1つの実施形態は、免疫刺激タンパク質（1若しくは複数）及び/又は誘導誘導性タンパク質を発現するウイルス、あるいはGM-CSF及び免疫共刺激経路活性化分子（1若しくは複数）及び/又は1以上の追加のタンパク質コード配列、例えばGALVR-などの融合誘導性タンパク質をコードする配列を発現するウイルス、並びに／あるいはCTLA-4阻害剤を発現するウイルスを含む腫瘍溶解性ウイルスと、IDO経路の阻害剤と、場合により、CTLA-4、PD-1及び/若しくはPD-L1を標的とするものを含む、免疫共抑制経路の1つ以上のアンタゴニスト及び/又は免疫共刺激経路の1つ以上のアゴニストとの組み合わせを含む。
【０１３６】
本開示はまた、治療有効量の腫瘍溶解性ウイルス、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）経路の阻害剤、並びに免疫共抑制経路のさらなるアンタゴニスト、及び/又は免疫共刺激経路のアゴニストを、その必要がある患者に投与することを含む、がんを処置する方法を提供する。
【０１３７】
腫瘍溶解性ウイルスは、好ましくは、改変された臨床分離株である。腫瘍溶解性ウイルスは、好ましくはポックスウイルスであり、より好ましくはHSV、例えば、HSV1並びに/又はICP34.5及び/若しくはICP47に対して機能的に不活性な状態にされたHSVである。腫瘍溶解性ウイルスは、免疫刺激分子、例えばGM-CSF、及び/又は共刺激経路をコードする分子、例えばCD4OL、GITRL、OX4OL、4-I-BBL、ICOSL又はflt3、及び/又はCTLA-4の阻害剤、及び/又は融合誘導性タンパク質、例えばR配列が突然変異若しくは欠失されているGALV融合誘導性糖タンパク質を発現し得る。免疫共抑制経路のさらなるアンタゴニストは、好ましくは、CTLA-4のアンタゴニスト、PD1のアンタゴニスト又はPD-L1のアンタゴニストである。例えば、免疫共抑制経路のさらなるアンタゴニストは、PD1とPD-L1の間の相互作用の阻害剤であり得る。
【０１３８】
治療剤及び/又は放射線療法が本開示のウイルスとともに使用される場合、ウイルス及び治療剤の投与並びに/又は放射線療法は、同時に行われてもよく、又は時間によって分けられてもよい。本開示の組成物は、治療剤又は放射線療法の前、同時又は後に投与され得る。がんを処置する方法は、本開示のウイルス及び/又は治療薬及び/又は放射線療法の複数回投与を含み得る。熟練した医師は、ウイルス及び治療剤の好適な投与過程（courses of administration）を容易に決定することができるだろう。
【０１３９】
好ましい実施形態において、免疫共抑制経路の1つ以上のアンタゴニスト（チェックポイントの遮断）、免疫共刺激経路の1つ以上のアゴニスト、及び/又は他の免疫増強剤との組み合わせの場合、本開示のウイルスは、その後の免疫共抑制経路のアンタゴニスト（免疫チェックポイントの遮断）、免疫共刺激経路のアゴニスト、及び/又は他の免疫増強剤（1若しくは複数）の同時投与の前に1回又は複数回投与され、あるいは本開示のウイルスの事前投与なしに、免疫共抑制経路のアンタゴニスト（免疫チェックポイントの遮断）、免疫共刺激経路のアゴニスト、及び/又は他の免疫増強剤（1若しくは複数）の投与と同時に投与される。
【０１４０】
本開示のウイルスは、任意の適切な経路によって対象に投与され得る。典型的には、本開示のウイルスは、直接腫瘍内注射によって、例えば腫瘍（1若しくは複数）を標的化するための画像誘導（imaging guidance）を使用して、投与される。腫瘍内注射には、表皮、皮下又は結節の腫瘍への直接注射、並びに、例えば内臓器官及び他の場所に、沈着物をより深く又はより強固に局在化させるための画像誘導化（CT、MRI又は超音波など）注射を含む。ウイルスは、体腔に、例えば、胸膜腔、膀胱に又は腹腔内投与によって投与され得る。ウイルスは、血管内、好ましくは腫瘍を供給する血管内に注射され得る。
【０１４１】
本開示のウイルスと組み合わせることができる治療剤は、様々な公知の経路及び技術を用いてインビボでヒト又は動物対象に投与することができる。例えば、組成物は、注射可能な溶液、懸濁液又はエマルジョンとして提供され、従来の針及び注射器を用いて又は液体噴射注射システムを用いて、非経口、皮下、経口、表皮、皮内、筋肉内、動脈内、腹腔内、静脈内注射を介して投与され得る。組成物は、鼻、気管内、腸、舌下、直腸又は膣などの皮膚又は粘膜組織に局所的に投与され得、又は呼吸若しくは肺投与に適した細かく分割された噴霧として提供され得る。異なる実施形態において、組成物は、静脈内注入によって、経口的に、又は腫瘍に直接的に投与される。ウイルスを直接腫瘍に投与することが好ましい。
【０１４２】
ウイルス及び/又は治療剤は、治療的に有効な用量組成物と適合する量で対象に投与され得る。本開示のウイルスの投与は、「治療」目的のためである。本明細書において使用する場合、用語「治療」又は「処置」には、その目的として以下のいずれか1つ以上を含む：任意の転移又は生じるさらなる転移の予防、症状の軽減又は排除、腫瘍若しくはがんの減少又は完全な排除、患者のがんの進行までの時間の増加、処置後の再発までの時間の増加、あるいは生存時間の増加。
【０１４３】
治療的処置は、ステージI、II、III又はIVのがん、好ましくはステージII、III又はIV、より好ましくはステージIII又はIVに対して、外科的介入の前又は後（例えば、ネオアジュバント療法として、例えば手術後の腫瘍の再発又は不完全な除去後）、好ましくは外科的介入前（原発性又は再発性/転移性の疾患の切除のいずれかのため）、又は手術後の再発後若しくは疾患の不完全な外科的除去後、すなわち残留腫瘍が残っている間に与えられる。
【０１４４】
治療的処置は、ウイルス組成物を、腫瘍であり得る標的組織に、体腔に、又は血管に直接注射した後に行うことができる。指針として、投与されるウイルスの量は、HSVの場合、104〜1010pfu、好ましくは105〜109pfuの範囲、例えば104、105又は106pfuなどである。HSVの場合、最初の低用量（例えば104〜107pfu、例えば106pfuなど）は、HSVについて血清反応陰性である患者を血清転換するため、及び血清陽性である患者の免疫を高めるために与えられ、続いて、より高用量（例えば106〜109pfu、例えば108pfuなど）がその後に与えられ得る。典型的には、ウイルス及び薬学的に許容される適切な担体又は希釈剤から本質的になる、最大20mlの医薬組成物は、腫瘍に直接注射するために使用され得、又は最大50ml（投与前に、適切な希釈剤中へのさらなる希釈に供されてもよい）は、体腔に投与するために、又は血流に投与するために使用され得る。しかしながら、いくつかの腫瘍溶解療法用途については、腫瘍並びに投与経路及び部位に依存して、より大きい又はより小さい容量もまた使用され得る。
【０１４５】
記載された投与経路及び投薬量は、熟練した医師が最適な投与経路及び投薬量を容易に決定することができるため、指針としてのみ意図される。用量は、様々なパラメータに従って、特に腫瘍の位置、腫瘍の大きさ、処置される患者の年齢、体重及び状態、並びに投与経路に従って決定され得る。好ましくは、ウイルスは、腫瘍への直接注射によって投与される。ウイルスはまた、血管内又は体腔内への注射によって投与され得る。最適な投与経路は、腫瘍の位置及び大きさに依存する。複数回の用量は、免疫学的又は臨床的効果を達成するために必要とされ得、これは、必要に応じて、典型的には、2日〜12週間の間隔、好ましくは3日〜3週間の間隔で投与される。処置されている腫瘍のタイプの応答速度及び特定の患者の応答、また、与えられ得る任意の併用（組み合わせ）療法に依存して、最大5年以上、好ましくは最大1カ月〜2年間の反復投与が与えられ得る。
【０１４６】
以下の実施例は、本発明を説明するものである。
【実施例】
【０１４７】
［実施例1］改善された抗腫瘍効果を有する臨床分離株
本発明を例示するために使用されるウイルス種はHSVであり、具体的にはHSV1である。口唇ヘルペススワブを20を超えるそれ以外は健常なボランティアから採取した。各スワブのサンプルを、BHK細胞を感染させるために用いた。HSV1を含むサンプルを、感染24〜72時間後に細胞変性効果（CPE）の存在及び免疫組織化学によって同定し、原発の臨床分離株のウイルスストックを、陽性サンプルから作製した。
【０１４８】
ヒト腫瘍由来の細胞株のパネルを死滅させるHSV1の原発の臨床分離株の能力を試験し、広範囲のこれらを迅速に、かつ低用量で死滅させる能力が最も高いウイルス株を選択する。この比較に使用される腫瘍細胞株は、HT29（結腸直腸）、MDA-MB-231（乳房）、SK-MEL-28（メラノーマ）、Fadu（扁平上皮がん）、MCF7（乳房）、A549（肺）、MIAPACA-2（膵臓）、CAPAN-1（膵臓）、HT1080（線維肉腫）である。細胞株は、各々の原発の臨床分離株について、様々なMOI及び感染後時間で達成されるCPEのレベルを試験する。
【０１４９】
より具体的には、腫瘍細胞株を、感染の日に約80％コンフルエントになるように、マルチウェル組織培養プレートに播種するために用いる。各腫瘍細胞株由来の代表的なウェルを、トリプシン処理し、ウェル中の細胞の数を決定する。これらの細胞数を、1、0.1、0.01及び0.001のMOIを与えるのに必要な各臨床株の容量を決定するために用いる。腫瘍細胞株の別々のウェルに、これらのMOIで臨床分離株を感染させ、増殖培地及びカルボキシメチルセルロースで重層する。全ての感染を4重で行う。2重のウェルを24時間インキュベーションし、2重のウェルを48時間インキュベーションし、その両方を37℃、5％CO2で行い、その後細胞をグルタルアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色する。その後、細胞溶解のレベルを、全体観察、顕微鏡（細胞数）及び写真又は代謝アッセイ、例えばMTTアッセイの使用によって評価する。
【０１５０】
増殖曲線実験もまた、インビトロで腫瘍細胞株において複製する異なる臨床分離株の能力を評価するために行う。腫瘍細胞株を、感染の日に約80％コンフルエントになるように、マルチウェル組織培養プレートに播種するために用いる。細胞数を上記の通り決定し、1、0.1、0.01及び0.001のMOIを与えるウイルスの容量を決定するために用いる。腫瘍細胞株を、MOI及び時点で2重で感染させる。感染させた細胞を37℃、5％CO2でインキュベーションし、細胞を感染の0、8、16、24及び48時間後に凍結/融解によって溶解させる。ウイルス力価を標準的なプラークアッセイによって評価する。
【０１５１】
［実施例2］臨床分離株の改変
この実施例では、実施例1で選択した臨床分離株を、その間にGFPをコードする、HSV1ヌクレオチド145300〜145582（HSV1ヌクレオチド145300〜145582は欠失される配列である；HSV1株17配列GenbankファイルNC 001806.2）に隣接する領域を含むプラスミドによる相同組換えを用いてウイルスゲノムからICP47を欠失させることにより改変する。GFP発現ウイルスプラークを選択し、次に、空の隣接領域を用いた相同組換えによりGFPが除去され、GFPを発現しないプラークが選択される。これは、US11が、ここではICP47プロモーターの調節下にあるため、IEタンパク質として発現されるICP47欠失ウイルスをもたらす。次に、ICP34.5は、その間にGFPがコードされる、HSV1ヌクレオチド124953〜125727（HSV1ヌクレオチド124953〜125727は欠失される配列である；HSV1株17配列GenbankファイルNC 001806.2）に隣接する領域を含むプラスミドによる相同組換えを用いて欠失される。GFPを発現するウイルスプラークを再度選択し、次に、同じ隣接領域（ただし、その間に、ここでは、背中合わせの向き（back to back orientation）で、それぞれCMV IEプロモーター及びRSVプロモーターによって駆動されるマウスGM-CSF配列のコドン最適化バージョン及びGALV R-配列のコドン最適化バージョンを含む発現カセットがある）を用いた相同組換えによってGFPは除去され、再度、GFPを発現しないウイルスプラークを選択する。このウイルス構築は、当該技術分野において標準的な方法を用いて行われる。
【０１５２】
GFPを発現するウイルスプラークを再び選択し、GFPは、その後、同じ隣接領域（ただし、その間に、ここでは背中合わせの向き（back to back orientation）で、CMV IEプロモーター及びRSVプロモーターによってそれぞれ駆動されるマウスGM-CSF配列のコドン最適化バージョンとGALV R-配列のコドン最適化バージョンを含む発現カセットがある）との相同組換えによって除去され、GFPを発現しないウイルスプラークを再び選択する。このウイルス構築は、当該技術分野で標準的な方法を用いて行われる。
【０１５３】
得られたウイルスの構造を図1に示す（上部パネル）。mGM-CSF及びGALV-R-配列をそれぞれ配列番号2及び8に示す。得られたウイルスの構造を制限消化及びサザンブロットによって確認し、GM-CSF発現をELISAによって確認し、GALV-R-発現をヒトHT1080腫瘍細胞の感染及び合胞体（syncitial）プラークの観察によって確認する。
【０１５４】
ウイルスはまた、ICP34.5への挿入がなく、又はマウスGM-CSF若しくはGALV-R-の遺伝子のみが挿入されている類似の手順を用いて構築される。これらのウイルスの構造も図1に示す。
【０１５５】
ヒトの使用には、hGM-CSFが使用され、そのコドン最適化バージョンの配列は配列番号4に示される。
【０１５６】
［実施例3］融合誘導性タンパク質を発現するウイルスからの2つの免疫刺激分子の発現
上記のGALV-R-及びmGM-CSFを発現するウイルスと同様だが、さらにCD40Lのバージョンを発現するウイルスが構築される。ここで、ICP34.5隣接領域、並びにCMV及びRSVプロモーターによって駆動されるGM-CSF及びGALV-R-を含む発現カセットを含有するプラスミドを使用する代わりに、ICP34.5隣接領域、並びにCMV、RSV及びSV40プロモーターによって駆動されるGM-CSF、GALV及びCD40Lを含む発現カセットを含有するプラスミドが、ICP34.5に挿入されたGFPを含有するウイルスを用いる組換えに使用され、GFPを発現しないプラークが再度選択される。
【０１５７】
より詳細には、その間にGFPをコードする、HSV1ヌクレオチド145300〜145582（HSV1ヌクレオチド145300〜145582は欠失される配列である；HSV1株17配列GenbankファイルNC 001806.2）に隣接する領域を含むプラスミドによる相同組換えを用いてウイルスゲノムからICP47を欠失させる。GFP発現ウイルスプラークを選択し、次に、空の隣接領域を用いた相同組換えによりGFPが除去され、GFPを発現しないプラークが選択される。これは、US11が、ここではICP47プロモーターの調節下にあるため、IEタンパク質として発現されるICP47欠失ウイルスをもたらす。次に、ICP34.5は、その間にGFPがコードされる、HSV1ヌクレオチド124953〜125727（HSV1ヌクレオチド124953〜125727は欠失される配列である；HSV1株17配列GenbankファイルNC 001806.2）に隣接する領域を含むプラスミドによる相同組換えを用いて欠失される。GFPを発現するウイルスプラークを再度選択し、次に、同じ隣接領域（ただし、その間に、ここでは、それぞれCMVプロモーター、RSVプロモーター及びSV40プロモーターによって駆動されるマウスGM-CSF配列のコドン最適化バージョン、GALV R-配列のコドン最適化バージョン及びマウス可溶性多量体CD40Lのコドン再液化バージョンを含む発現カセットがある）を用いた相同組換えによってGFPは除去される。GFPを発現しないウイルスプラークを選択する。
【０１５８】
得られたウイルスの構造を図2に示す。マウスGM-CSF、マウスCD40L及びGALV-R-配列をそれぞれ配列番号2、14及び8に示す。得られたウイルスの構造を制限消化及びサザンブロットによって確認し、GM-CSF及びCD40L発現をELISAによって確認し、GALV-R-発現をヒトHT1080腫瘍細胞の感染及び合胞体（syncitial）プラークの観察によって確認する。
【０１５９】
ヒトの使用には、hGM-CSF及びhCD40Lが使用され、そのコドン最適化バージョンの配列は配列番号4及び13に示される。
【０１６０】
［実施例4］マウス腫瘍モデルにおける腫瘍溶解性ウイルスからの融合誘導性タンパク質及び免疫刺激分子の組み合わせ発現の効果
GALV R-タンパク質は、ヒト細胞において細胞間融合を引き起こすが、マウス細胞においては引き起こさない。これは、細胞融合を引き起こすために必要なPiT-1受容体が、マウスにおいて、細胞融合が起こらない配列を有するためである。結果として、ヒトPiT-1を発現するマウス腫瘍細胞が、当該技術分野において標準的な方法を用いて最初に調製される。ヒトPiT-1は、選択マーカー遺伝子も含むレンチウイルスベクターにクローニングされる。ベクターは、標的CT26マウス結腸直腸がん腫瘍細胞にトランスフェクトされ、選択マーカーに耐性のクローンを選択してCT26/PiT-1細胞を生成する。PiT-1発現は、トランスフェクションされていない細胞、及びPiT-1を発現するレンチウイルスでトランスフェクトされた細胞におけるウエスタンブロッティングによって、そしてGALV-R-を発現するプラスミドのトランスフェクション及び細胞融合が起こることの確認によって確認される。
【０１６１】
本発明の有用性は、Balb/cマウスの両側面にCT26/PiT-1細胞を投与し、CT26/PiT-1腫瘍を直径約0.5cmまで増殖させることによって実証される。
【０１６２】
次に、以下の処置が、マウスの群（群あたり5匹）に、2週間にわたり、3回/週だけ、各々のマウスの一側面に投与される：
-  50μlの生理食塩水（1群）、
-  遺伝子が挿入されていないHSV、50μlの105pfu/ml、106pfu、又は107pfu/ml（3群）、
-  マウスGM-CSFのみが挿入されているHSV、50μlの105pfu/ml、106pfu/ml、又は107pfu/ml（3群）、
-  GALV-R-のみが挿入されているウイルス、50μlの105pfu/ml、106pfu/ml、又は107pfu/ml（3群）、又は
-  マウスGM-CSFとGALV-R-の両方が挿入されているウイルス、50μlの105pfu/ml、106pfu/ml、又は107pfu/ml（3群）。
【０１６３】
次に、腫瘍増殖に対する効果が最大1カ月間観察される。他の群と比較して、GM-CSF及びGALV-R-を発現するウイルスを注射された腫瘍と注射されていない腫瘍の両方における、改善された用量応答曲線を通じるものを含む、優れた腫瘍制御及び縮小が観察される。
【０１６４】
［実施例5］マウス腫瘍モデルにおける腫瘍溶解性ウイルスからのGM-CSF及び免疫共刺激経路活性化分子の組み合わせ発現の効果
GALV R-タンパク質は、ヒト細胞において細胞間融合を引き起こすが、マウス細胞においては引き起こさない。これは、細胞融合を引き起こすために必要なPiT-1受容体が、マウスにおいて、細胞融合が起こらない配列を有するためである。結果として、ヒトPiT-1を発現するマウス腫瘍細胞が、当該技術分野において標準的な方法を用いて最初に調製される。ヒトPiT-1は、選択マーカー遺伝子も含むレンチウイルスベクターにクローニングされる。ベクターは、標的CT26マウス結腸直腸がん腫瘍細胞にトランスフェクトされ、選択マーカーに耐性のクローンを選択してCT26/PiT-1細胞を生成する。PiT-1発現は、トランスフェクションされていない細胞、及びPiT-1を発現するレンチウイルスでトランスフェクトされた細胞におけるウエスタンブロッティングによって、そしてGALV-R-を発現するプラスミドのトランスフェクション及び細胞融合が起こることの確認によって確認される。
【０１６５】
本発明の有用性は、Balb/cマウスの両側面にCT26/PiT-1細胞を投与し、CT26/PiT-1腫瘍を直径約0.5cmまで増殖させることによって実証される。
【０１６６】
次に、以下の処置が、マウスの群（群あたり5匹）にわたり、2週間、3回/週だけ、各々のマウスの一側面に投与される：
-  50μlの生理食塩水（1群）、
-  GALV-R-のみが挿入されているHSV、50μlの105pfu/ml、106pfu/ml、又は107pfu/ml（3群）、
-   GALV-R-及びマウスGM-CSFのみが挿入されているHSV、50μlの105pfu/ml、106pfu/ml、又は107pfu/ml（3群）、
-  GALV-R-とマウスGM-CSF及びCD40Lの両方が挿入されているウイルス、50μlの105pfu/ml、106pfu/ml、又は107pfu/ml（3群）。
【０１６７】
次に、腫瘍増殖に対する効果が最大1カ月間観察される。他の群と比較して、GM-CSF及びCD40Lを発現するウイルスを注射された腫瘍と注射されていない腫瘍の両方における、改善された用量応答曲線を通じるものを含む、優れた腫瘍制御及び縮小が観察される。
【０１６８】
［実施例6］マウス腫瘍モデルにおける免疫チェックポイント遮断の治療効果に対する、腫瘍溶解性ウイルスからの融合誘導性タンパク質及び免疫刺激分子の組み合わせ発現の効果
上記の実施例4における実験を繰り返すが、マウスは、マウスPD-1を標的とする抗体（10mg/kg；ウイルス投薬と同日にBioxcell RMP-1-14）、又はマウスCTLA-4を標的とする抗体（10mg/kg；ウイルス投薬と同日にBioxcell 9H10）を用いて腹腔内経路により2週間毎に追加投薬される。抗体処置を受けない追加のマウス群が追加される。より具体的には、マウス群は、（1）生理食塩水、（2）遺伝子が挿入されていないHSV、（3）実施例3のようにGM-CSFとGALV-R-が挿入されたHSV、（4）PD-1抗体、（5）CTLA-4抗体、（6）遺伝子が挿入されていないHSV+PD-1抗体、（7）遺伝子が挿入されていないHSV+CTLA-4抗体、（8）GM-CSFとGALV-R-を伴うHSV及びPD-1抗体、又は（9）GM-CSFとGALV-R-を伴うHSV及びCTLA-4抗体を受ける。他の群と比較して、GM-CSF及びGALV-R-を発現するウイルスと共に抗PD-1抗体又は抗CTLA-4抗体を注射された腫瘍と注射されていない腫瘍の両方における、改善された用量応答曲線を通じるものを含む、優れた腫瘍制御及び縮小が観察される。
【０１６９】
［実施例7］マウス腫瘍モデルにおける免疫チェックポイント遮断の治療効果に対する、腫瘍溶解性ウイルスからのGM-CSF及び免疫共刺激経路活性化分子の組み合わせ発現の効果
上記の実施例5における実験を繰り返すが、マウスは、マウスPD-1を標的とする抗体（10mg/kg；ウイルス投薬と同日にBioxcell RMP-1-14）、又はマウスCTLA-4を標的とする抗体（10mg/kg；ウイルス投薬と同日にBioxcell 9H10）を用いて腹腔内経路により2週間毎に追加投薬される。抗体処置を受けない追加のマウス群が追加される。より具体的には、マウス群は、（1）生理食塩水、（2）実施例5のようにGALV-R-が挿入されたHSV、（3）実施例2のようにGM-CSFとGALV-R-が挿入されたHSV、（4）実施例2のようにGM-CSF、CD40L及びGALV-R-が挿入されたHSV、（5）PD-1抗体、（6）CTLA-4抗体、（7）GALV-R-が挿入されたHSV＋PD-1抗体、（8）GALV-R-が挿入されたHSV＋CTLA-4抗体、（9）GM-CSFとGALV-R-を伴うHSV及びPD-1抗体、又は（10）GM-CSFとGALV-R-を伴うHSV及びCTLA-4抗体、（11）GM-CSF、CD40L及びGALV-R-を伴うHSV及びPD-1抗体、又は（12）GM-CSF、CD40L及びGALV-R-を伴うHSV及びCTLA-4抗体を受ける。他の群と比較して、GM-CSF及びCD40Lを発現するウイルスと共に抗PD-1抗体又は抗CTLA-4抗体を注射された腫瘍と注射されていない腫瘍の両方における、改善された用量応答曲線を通じるものを含む、優れた腫瘍制御及び縮小が観察される。
【０１７０】
［実施例8］臨床分離株の回収
本開示を例示するために使用されるウイルス種はHSVであり、具体的にはHSV1である。再発性口唇ヘルペス（cold sore）を患った181名のボランティアを募集した。これらのボランティアにサンプル回収キット（Sigma Virovult回収チューブを含む）を与え、これらを用いて、口唇ヘルペスが出現した場合にそれを拭き取り（スワブ採取し）、その後、これらのサンプルをReplimune（オックスフォード、英国）に出荷した。2015年6月から2016年2月まで、72人のボランティアからスワブを受け取った。各々のスワブのサンプルを用いて、BHK細胞を感染させた。これらのうち、36個の生きたウイルスサンプルは、BHK細胞上に播種し、増殖させた後に回収された。これらのサンプルは表1に詳述されている。
【０１７１】
【表１】
2021527694.tif 000002
2021527694.tif 000003
2021527694.tif 000004
2021527694.tif 000005
記号表示A、B、Cなどは、同一のボランティア由来の複数のスワブを指す。
【０１７２】
［実施例9］抗腫瘍効果が改善された臨床分離株の同定
ヒト腫瘍由来の細胞株のパネルを死滅させるためのHSV1の原発の臨床分離株の能力を試験した。この比較のために用いられた腫瘍細胞株は、HT29（結腸直腸）、MDA-MB-231（乳房）、SK-MEL-28（メラノーマ）、Fadu（扁平上皮がん）、MCF7（乳房）、A549（肺）、MIAPACA-2（膵臓）及びHT1080（線維肉腫）であった。細胞株を使用して、原発の臨床分離株の各々について、ある範囲のMOI及び感染後の時間で達成されたCPEレベルを試験した。
【０１７３】
実験は、同時に5〜8種類の新しいウイルス株を用いて並行して行われた。ウイルス株をある範囲のMOI（0.001〜1）で2重にして播種し、クリスタルバイオレット染色後のCPEの程度を感染24時間後及び48時間後に評価した。腫瘍細胞株を死滅させる際に最も有効であるウイルス株を採点し、5〜8株の各々のスクリーニングから最も効果的な2株又は3株を同定し、さらなる開発のための最上位株を同定するためのさらなる実験で並行して比較した。
【０１７４】
最初のスクリーニングは、様々な腫瘍細胞株を死滅させる、異なる株の能力の実質的な変動性を実証した。試験した最初の29株のうち、目的とする8株が、さらなる比較のために、最初のスクリーニングにおいて同定された。これらは、RH004A、RH015A、RH018A、RH021A、RH023A、RH31A、RH040A、及びRH047A株であった。
【０１７５】
さらなる比較のための8株は、腫瘍細胞株のパネルについて並行して試験され、これらの腫瘍細胞株を死滅させるそれらの相対能力は、クリスタルバイオレット染色及びCPEについての観察後に評価された。図3は、観察された標的腫瘍細胞株を死滅するためのウイルスの異なる能力を実証する、各々の細胞株に対する各々のウイルスについて、これらのウイルスの代表的な時間点及びMOIを示す。
【０１７６】
株の間には実質的なバリエーションがあり、特定の株が1つの細胞株を死滅させる際に特に有効である場合もある一方で、他の細胞株も死滅させる際に必ずしも特に有効であるわけではないことが見出され、さらに、異なるタイプの腫瘍細胞を死滅させる、HSVの臨床株の能力における変動性の程度を実証する。
【０１７７】
図3はまた、いずれのウイルス株が、細胞株の各々を死滅させる際に最良であり、及び次に最良であるのかを示し、ウイルス株が全体として細胞株のパネルを死滅させる、それらの全体の相対的な能力に関して順位付けされることを可能にする。この分析は、RH004A、RH015A、RH018A、RH031A及びRH040A株が他の株よりも相対的に効果的であることを実証し、これらの5株が、腫瘍溶解剤としてのさらなる開発の可能性のために選択された。これらの上位5株のうち、細胞株のパネル全体で死滅させるそれらの能力に基づく相対的な順位は、RH018A＞RH004A＞RH031A＞RH040A＞RH015Aであった。
【０１７８】
より具体的には、これらの実験において、腫瘍細胞株を使用して、感染の日に約80％コンフルエントになるように、マルチウェル組織培養プレートに播種した。各々の腫瘍細胞株由来の代表的なウェルをトリプシン処理し、ウェル中の細胞数を決定した。これらの細胞計数は、MOIが1、0.1、0.01及び0.001になるのに必要とされる各々の臨床分離株の容量を決定するために使用される。腫瘍細胞株の別々のウェルは、これらのMOIで臨床分離株を感染させた。全ての感染は4重にして行われる。2重のウェルを24時間インキュベートし、2重のウェルを48時間インキュベートし、両者は37℃、5％CO2で行われ、その後、細胞をグルタルアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色した。次に、細胞溶解のレベルを肉眼観察、顕微鏡（細胞計数）及び写真撮影によって評価した。
【０１７９】
RH018A株は、試験された全ての株のうち1位にランク付けされた株であり、スクリーニングからの「平均」株（すなわち、上位8にはないが、最も効果的でなく、腫瘍細胞株のパネルを死滅させなかった一群の株にもなかった株）と比較された。この比較は、RH018A株が、腫瘍細胞株を死滅させる際に、この平均株（RH065A株）よりも約10倍効果的であったことを示した（すなわち、RH018A株の約10分の1がRH065A株について必要されたものよりも等比率の細胞を死滅させるのに必要とされた）。これを図4に示す。
【０１８０】
［実施例10］臨床分離株の改変
この実施例において、実施例9で選択された臨床分離株は、その間にGFP及びGALV-R-融合誘導性糖タンパク質をコードする、ICP34.5をコードする遺伝子（ヌクレオチド143680-145300及び145,582-147,083；HSV1株17配列GenbankファイルNC 001806.2）に隣接する領域を含有するプラスミドを用いた相同組換えにより、ウイルスゲノムからICP34.5を欠失させることによって改変された。このウイルス（ウイルス10）の構造を図5に示す。
【０１８１】
また、RH018A株に基づく追加のウイルスを構築し、これは、ICP34.5とICP47の両方（ヌクレオチド123464-124953及び125727-126781を含有する隣接領域を用いる；HSV1株17配列GenbankファイルNC 001806.2）が欠失されていた（US11を、ICP47プロモーターの調節下に置くことになる）。これらのウイルスを構築するために、ICP47の代わりにGFPが発現される、GFP発現ウイルスプラークを最初に選択した。次に、空の隣接領域を用いた相同組換えによってGFPを除去し、GFPを発現しないプラークを選択した。これは、ICP47欠失ウイルスをもたらし、これは、US11が、ここでは、ICP47プロモーターの調節下にあるため、IEタンパク質として発現される。次に、ICP34.5は、その間にGFPをコードしている、HSV1（ヌクレオチド143680-145300及び145,582-147,083；HSV1株17配列GenbankファイルNC 001806.2）に隣接している領域を含有するプラスミドを用いた相同組換えにより欠失された。GFPを発現するウイルスプラークを再度選択し、次に、GFPを同じ隣接領域（ただし、その間に、ここでは、挿入される遺伝子を含む発現カセットが存在する）を用いた相同組換えによって除去した。構築されたウイルスを図1及び5に示す。これらは、背中合わせの向きで、それぞれCMV IEプロモーター及びRSVプロモーターによって駆動されるマウスGM-CSF配列のコドン最適化バージョン及びGALV R-配列のコドン最適化バージョンを含み、再度、GFPを発現しないウイルスプラークを選択した。このウイルス構築は、当該技術分野において標準的な方法を用いて行われた。
【０１８２】
mGM-CSF及びGALV-R-配列をそれぞれ配列番号2及び8に示す。得られたウイルスの構造をPCRによって確認し、GM-CSF発現をELISAによって確認し、GALV-R-発現をヒトHT1080腫瘍細胞の感染及び合胞体（syncitia）プラークの観察によって確認した。
【０１８３】
ヒト使用のために、hGM-CSFが使用され、そのコドン最適化バージョンの配列を配列番号4に示す。このウイルスの構造を図5に示す。ウイルス16、17及び19からのマウス又はヒトGM-CSFの発現を図6に示す。
【０１８４】
［実施例11］腫瘍溶解の使用のために改変され、融合誘導性糖タンパク質を発現するウイルスは、融合誘導性糖タンパク質を発現しないウイルスと比較して、インビトロで増大された腫瘍細胞死滅を示す
ICP34.5が欠失し、GALVR-及びGFPを発現する臨床株RH018Aに基づくウイルス10（図5参照）は、インビトロでGFPのみを発現するウイルス（ウイルス12）と比較された。図7に示されるように、ウイルス10は、ウイルス12と比較して、ヒト腫瘍細胞株のパネルで増大された死滅を示した。
【０１８５】
［実施例12］腫瘍溶解の使用ために改変されたウイルスは、同様に改変された既知のウイルスと比較して、増大された腫瘍細胞死滅を示す
ICP34.5及びICP47が欠失し、GALVR-及びGM-CSFを発現する臨床株RH018Aに基づくウイルス17（図5参照）は、インビトロで、やはりICP34.5及びICP47が欠失しているが、既知の株に由来し、GM-CSFのみを発現する公知のウイルスと比較された。図8に示されように、ウイルス17は、以前のウイルスと比較して、ヒト腫瘍細胞株のパネルで増大された死滅を示した。
【０１８６】
［実施例13］腫瘍溶解の使用のために改変されたウイルスは、インビボでマウス腫瘍を効果的に処置する
ウイルス16は、左右の側面にA20リンパ腫腫瘍を有するマウスにおいて試験された。100万個の腫瘍細胞をBalb/cマウスの両側面に最初に移植し、腫瘍を直径0.5〜0.7cmまで増殖させた。次に、右側面の腫瘍は、ビヒクル（10匹のマウス）又はウイルス16の5×106pfu（10匹のマウス）のいずれかで3回（1日おき）注射され、腫瘍サイズに対する効果をさらに30日間観察した。これは、注射された腫瘍と注射されていない腫瘍の両方がウイルス16で効果的に処置されたことを実証した（図9参照）。
【０１８７】
［実施例14］ラット腫瘍モデルにおける腫瘍溶解性ウイルスからの融合誘導性タンパク質及び免疫刺激分子の組み合わせ発現の効果
GALV R-タンパク質は、ヒト細胞において細胞間融合を引き起こすが、マウス細胞においては引き起こさない。しかしながら、GALV R-はラット細胞において融合を引き起こす。
【０１８８】
本発明の有用性は、Fischer 344ラットの側面に9L細胞を投与し、9L腫瘍を直径約0.5cmまで増殖させることによってさらに実証された。
【０１８９】
次に、以下の処置が、ラットの群（群あたり10匹）に、3週間にわたり、3回/週、各々のラットの一側面のみに投与された：
-  50μlのビヒクル、
-  50μlの107pfu/mlのウイルス19（mGM-CSFを発現するが、GALV R-を発現しない）、
-  50μlの107pfu/mlのウイルス16（マウスGM-CSFとGALV-R-の両方を発現する）。
【０１９０】
次に、腫瘍増殖に対する効果をさらに約30日間観察した。これは、注射された腫瘍と注射されていない腫瘍の両方において、GALV-R-を発現するウイルスによる優れた腫瘍制御及び縮小を実証し、全身効果の改善を実証した。これを図15に示す。図10は、GALVを発現するウイルス（ウイルス15）はまた、GALVを発現しないウイルス（ウイルス24）と比較して、インビトロでラット9l細胞の増大した死滅を示すことを示す。
【０１９１】
［実施例15］腫瘍溶解の使用のために改変されたウイルスは、マウス腫瘍モデルにおける免疫チェックポイント遮断と相乗的である
ウイルス16は、左右の側面にCT26腫瘍を有するマウスにおいて試験された。100万個の腫瘍細胞をBalb/cマウスの両側面に最初に移植し、腫瘍を直径0.5〜0.6cmまで増殖させた。
【０１９２】
次に、10匹のマウスの群を以下で処置した：
-  ビヒクル（1日おきに右側面の腫瘍に3回注射）、
-  1日おきに右側面の腫瘍に注射される5×106pfuのウイルス16、
-  抗マウスPD1単独（10mg/kg i.p.、3日毎、BioXCellクローンRMP1-14）、
-  抗マウスCTLA-4（3mg/kg i.p.、3日毎、BioXCellクローン9D9）、
-  抗マウスPD1と共にウイルス16、
-  抗マウスCTLA4と共にウイルス16、
-  1-メチルトリプトファン（trypotophan）（IDO阻害剤（飲料水中5mg/ml））、
-  抗マウスPD1と共に1-メチルトリプトファン、
-  抗マウスPD1と共に1-メチルトリプトファン及びウイルス16。
【０１９３】
腫瘍サイズに対する効果をさらに30日間観察した。単一処置群で処置された動物よりも、ウイルスとチェックポイント遮断の組み合わせを用いて処置された動物においてより大きな腫瘍減少が実証された（図11参照）。ウイルス16と共に抗PD1のみと比較して、ウイルス16と共に抗PD1とIDO阻害の両方による腫瘍減少の増大も実証された（図11参照）。
【０１９４】
また、免疫チェックポイント遮断と組み合わせたウイルス16の増大された活性はA20腫瘍においても見られた（図12）。
【０１９５】
［実施例16］免疫不全マウスにおけるヒト異種移植モデルでの腫瘍溶解性ウイルスからの融合誘導性タンパク質の発現の効果
GALV R-タンパク質は、ヒト細胞において細胞間融合を引き起こすが、マウス細胞においては引き起こさない。しかしながら、免疫不全マウスにおいて増殖させたヒト異種移植腫瘍を用いて、抗腫瘍効果に対するGALV発現の効果を評価することができる。
【０１９６】
したがって、本発明の有用性は、A549ヒト肺がん細胞をヌードマウスの側面に投与し、腫瘍を直径約0.5cmまで増殖させることによってさらに実証された。
【０１９７】
次に、以下の処置が、マウスの群（群あたり10匹）に、1週間にわたって3回、各々のマウスの腫瘍を含有する側面に投与された：
-  50μlのビヒクル、
-  50μlの107pfu/mlのウイルス16（マウスGM-CSFとGALV-R-の両方を発現する）、
-  50μlの106pfu/mlのウイルス16、
-  50μlの105pfu/mlのウイルス16、
-  50μlの107pfu/mlのウイルス19（マウスGM-CSFのみを発現する）、
-  50μlの106pfu/mlのウイルス19、
-  50μlの105pfu/mlのウイルス19。
【０１９８】
次に、腫瘍増殖に対する効果をさらに約30日間、観察した。この実験は、両方の腫瘍モデルにおいて、GALV-R-を発現するウイルスによる優れた腫瘍制御及び縮小を実証した（図14参照）。
【０１９９】
［実施例17］融合誘導性タンパク質を発現するウイルスからの2つの免疫刺激分子の発現
上記されるGALV-R-及びmGM-CSFを発現するウイルス（ウイルス16）に類似するが、CD40L（ウイルス32）、ICOSL（ウイルス36）、OX40L（ウイルス35）、4-1BBL（ウイルス33）及びGITRL（ウイルス34）のマウスバージョンをさらに発現するウイルスを構築した。ここで、ICP34.5隣接領域、並びにCMV及びRSVプロモーターによって駆動されるGM-CSF及びGALV-R-を含む発現カセットを含有するプラスミドを使用する代わりに、ICP34.5隣接領域、並びにそれぞれCMV、RSV及びMMLVプロモーターによって駆動されるGM-CSF、GALV及び追加のタンパク質を含む発現カセットを含有するプラスミドが、ICP34.5に挿入されたGM-CSF、GALV及びGFPを含有するウイルスを用いる組換えに使用された。GFPを発現しないプラークが再度選択された。正確な挿入をPCRによって確認し、追加の挿入遺伝子についてウエスタンブロッティング及び/又はELISAによって発現を確認した。これらのウイルスを図5に示す。同様に、GALV及びmGM-CSFに加えて抗マウス及び抗ヒトCTLA-4を発現するウイルスもまた構築した（図5におけるウイルス27及び31、並びに図13も参照されたい）。インビボでのmGM-CSF及びGALVR-に加えて、抗マウスCTLA-4（ウイルス27）、mCD40L（ウイルス32）、m4-1BBL（ウイルス33）又はmOX40L（ウイルス35）を発現するウイルスの効果を図16に示す。これは、ウイルス16（mGM-CSF及びGALVR-を発現する）と比較して、A20腫瘍において強化された活性を示した。これらの実験において、腫瘍はマウスの両側面に誘導され、ウイルス又はビヒクルは右側面の腫瘍にのみ注射された。使用されたウイルスの用量は、5×104pfu（各々の場合において50μlの1×106pfu/ml）であり、1週間にわたって3回与えられた。この用量レベルのウイルスは、ウイルス16について注射されていない腫瘍に対して治療量以下で、これによって、ウイルス27、32、33及び35によってコードされる追加の分子の送達の利点が明確に見出され得る。
【０２００】
［実施例18］例示的なウイルスの構築
例示的なウイルス種はHSV、具体的にはHSV1である。
【０２０１】
使用するプラスミドの模式図を図18に示す。ウイルスの模式図を図17に示す。全ウイルスをHSV1株RH018Aを用いて構築した。ウイルスの構築に使用したプラスミドは、Genscript Inc.により実施された遺伝子合成及びサブクローニングの組み合わせにより作製された。
【０２０２】
マウスGM-CSFとGALVと共に抗マウスCTLA4を発現するウイルスを次のように構築した。プラスミド77とウイルス16 DNAとを共トランスフェクションし、GFPを発現するプラークを選抜してウイルス16にGFPを挿入し、ウイルス25を得た。その後、プラスミド119をウイルス25 DNAと共トランスフェクションすることで、ウイルス25からGFPをノックアウトした。これによりウイルス27を得た。
【０２０３】
ヒトGM-CSFとGALVと共に抗ヒトCTLA4を発現するウイルスを次のように構築した。プラスミド78とウイルス17 DNAとを共トランスフェクションし、GFPを発現するプラークを選抜してウイルス17にGFPを挿入し、ウイルス29を得た。その後、ウイルス29 DNAとプラスミド122とを共トランスフェクションすることで、GPFをウイルス29からノックアウトした。これによりウイルス31を得た。
【０２０４】
マウスGM-CSF及びGALVと共に抗マウスCTLA-4及び共刺激リガンドを発現するウイルスを、マウスGM-CSFと抗マウスCTLA-4コード配列の間にあるSV40プロモーターによって駆動されるGFPをコードするプラスミドとウイルス27を共トランスフェクションすることで構築した。その後、GFPの代わりに、個々のマウスの共刺激リガンドの各々をコードするプラスミドで、得られたウイルスからGFPをノックアウトした。
【０２０５】
ヒトGM-CSFとGALVと共に抗ヒトCTLA4と共刺激リガンドを発現するウイルスを、ヒトGM-CSFと抗ヒトCTLA-4コード配列の間にあるSV40プロモーターによって駆動されるGFPをコードするプラスミドとウイルス31を共トランスフェクションすることで構築した。その後、GFPの代わりに、個々のヒト共刺激リガンドの各々をコードするプラスミドで得られたウイルスからGFPをノックアウトした。
【０２０６】
図20は、ウイルス27からの抗マウスCTLA-4の発現を実証するウェスタンブロットを示す。
【０２０７】
［実施例19］腫瘍溶解性ウイルスからのGALV、GM-CSF及び抗CTLA4の組み合わせ発現の効果
本発明の有用性は以下の方法で実証される。A20細胞をBalb/cマウスの両側側面へ投与し、A20腫瘍を直径約0.5cmまで成長させた。
【０２０８】
その後、マウス群の各マウスの片方の側面（右の腫瘍）にのみ、1週間にわたり週3回、次の処置を実施した。
−ビヒクル50μl（1群）；
−マウスGM-CSF及びGALVR-のみが挿入されたHSV（ウイルス16）106pfu/mlを50μl；
−GALVR-、マウスGM-CSF及び抗マウスCTLA-4抗体が挿入されたHSV（ウイルス27）106pfu/mlを50μl。
【０２０９】
その後、腫瘍成長に対する効果を最長一ヶ月間観察した。使用したウイルスの用量は、5x104pfu（各ケースで1x106pfu/mlを50ul）であり、1週間に3回投与した。このウイルスの用量レベルは未注入腫瘍に対してはウイルス16の治療量以下であり、これによりウイルス27によりコードされた追加分子の送達の利点を明確に見ることが可能となる。図21及び22は、CTLA-4を発現しないウイルス16と比較して、抗CTLA-4を発現するウイルスの未注入腫瘍における優れた腫瘍制御及び腫瘍縮小を示す。
【０２１０】
［実施例20］腫瘍溶解性ウイルスからのGALV、GM-CSF及び抗CTLA4の組み合わせ発現と抗PD-1との効果
A20細胞をBalb/cマウスの両側側面へ投与し、A20腫瘍は直径約0.5cmまで成長させた。
【０２１１】
その後、マウス群（各群10個体）の各マウスの片方の側面にのみ1週間にわたり週3回、次の処置を実施した。
−ビヒクル50μl；
−腹腔内抗マウスPD1（Bioxcell、RMP-1-14、10mg/kgを3日毎）；
−GALVR-、マウスGM-CSF及び抗マウスCTLA-4抗体が挿入されたHSV（ウイルス27）107pfu/mlを50μl；
−GALVR-、マウスGM-CSF及び抗マウスCTLA-4抗体が挿入されたHSV（ウイルス27）107pfu/mlを50μlと共に、腹腔内抗マウスPD1（10mg/kgを3日毎）（3群）
【０２１２】
その後、腫瘍成長に対する効果を最長80日間観察した。ウイルスでの処置が抗PD1での処置と併用された場合、注入及び未注入腫瘍のどちらにおいても優れた腫瘍制御及び腫瘍縮小があった。このデータを図23に示す。
【０２１３】
［実施例21］腫瘍溶解性ウイルスからのGALV、GM-CSF及び抗ヒトCTLA4の組み合わせ発現単独の効果と抗PD-1との組み合わせの効果
MC38細胞を、マウスCTLA-4ではなくヒトCTLA-4を発現するよう遺伝子編集によって改変されたC57BL/6マウスの両側側面へ投与した。これによりマウスはイピリムマブなどの抗ヒトCTLA-4抗体に感受性を示す。MC38腫瘍は直径約0.5cmまで成長させた。
【０２１４】
その後、マウス群（各群10個体）の各マウスの片方の側面にのみ、2週間にわたり週3回、次の処置を実施した。
−ビヒクル50μl；
−ウイルス17（すなわち、hGM-CSF及びGALV発現）108pfu/mlを50μl；
−ウイルス31（すなわち、hGM-CSF、GALV、及び抗ヒトCTLA-4発現）108pfu/mlを50μl；
−ウイルス17の108pfu/mlを50μlと共に腹腔内抗マウスPD1（10mg/kgを3日毎）；
−ウイルス31の108pfu/mlを50μlと共に腹腔内抗マウスPD1（10mg/kgを3日毎）。
【０２１５】
その後、腫瘍成長に対する効果を最長35日間観察した。抗ヒトCTLA-4を発現するウイルスを注入された腫瘍において優れた腫瘍制御及び腫瘍縮小が見られ、抗PD1との併用処置でその効果はさらに高められた。いずれかのウイルスによる処置と抗PD1とを組み合わせた場合、未注入腫瘍において優れた腫瘍制御及び腫瘍縮小が観察された。この改善は抗CTLA4を発現するウイルスでさらに顕著である。このデータを図24に示す。
【０２１６】
［実施例22］抗CTLA4を発現する腫瘍溶解性ウイルス及び抗PD1療法による腫瘍の処置に続く記憶免疫応答の誘導
ウイルス31と抗PD-1抗体を併用した更なる実験では、腫瘍を根絶したマウスにおける抗腫瘍応答の持続性を評価し、これらのマウスが腫瘍細胞による再チャレンジに対して保護されたかどうかを決定した。これは記憶免疫応答が誘導されたことを示すだろう。
【０２１７】
この実験では、抗PD-1抗体と組み合わせたウイルス31の投与により両側の腫瘍が治癒した15匹のマウスを、実験開始から108日目まで観察し、その後、腫瘍細胞で再チャレンジして、マウスが新たな腫瘍の形成から保護されているかどうかを評価した。抗腫瘍効果は実験を通して維持され、15匹のマウスのうち14匹は腫瘍細胞による再チャレンジに対して保護された。結果を図25に示す。抗PD-1単独での処置は、このモデルでは抗腫瘍効果を有さない。
【０２１８】
［実施例23］腫瘍溶解性ウイルスからのGALV、GM-CSF、抗CTLA4及び免疫共刺激経路活性化分子の組み合わせ発現の効果
上述の実施例20の実験を繰り返すが、マウスには、GALV、mGM-CSF及び抗CTLA4の発現に加え免疫共刺激経路リガンドをさらに発現するウイルスを投与する。
【０２１９】
より具体的には、マウス群には以下を投与する：
（1）ビヒクル；
（2）腹腔内抗マウスPD1；
（3）実施例2のmGM-CSF、GALVR-、及び抗CTLA4を挿入したHSV；
（4）mGM-CSF、GALVR-、抗CTLA4及びマウスCD40Lを挿入したHSV；
（5）mGM-CSF、GALVR-、抗CTLA4及びマウス4-1BBLを挿入したHSV；
（6）mGM-CSF、GALVR-、抗CTLA4及びマウスGITRLを挿入したHSV；
（7）mGM-CSF、GALVR-、抗CTLA4及びマウスOX40Lを挿入したHSV；
（8）mGM-CSF、GALVR-、抗CTLA4及びマウスICOSLを挿入したHSV；
（9）実施例2のmGM-CSF、GALVR-、及び抗CTLA4を挿入したHSVと共に腹腔内抗PD1；
（10）mGM-CSF、GALVR-、抗CTLA4及びマウスCD40Lを挿入したHSVと共に腹腔内抗PD1；
（11）mGM-CSF、GALVR-、抗CTLA4及びマウス4-1BBLを挿入したHSVと共に腹腔内抗PD1；
（12）mGM-CSF、GALVR-、抗CTLA4及びマウスGITRLを挿入したHSVと共に腹腔内抗PD1；
（13）mGM-CSF、GALVR-、抗CTLA4及びマウスOX40Lを挿入したHSVと共に腹腔内抗PD1；又は、
（14）mGM-CSF、GALVR-、抗CTLA4及びマウスICOSLを挿入したHSVと共に腹腔内抗PD1。
【０２２０】
優れた腫瘍制御は免疫共刺激リガンドを発現するウイルスで見られる。
【０２２１】
寄託情報
以下のHSV1株は、Replimune Limitedによって2016年12月19日に英国ソールズベリーのポートンダウンSP4 0JGにあるECACC, Culture Collections, Public Health Englandに寄託され、示した受託番号が割り当てられた。
RH004A-受託番号16121902
RH015A-受託番号16121903
RH018A-受託番号16121904
RH021A-受託番号16121905
RH023A-受託番号16121906
RH031A-受託番号16121907
RH040B-受託番号16121908
RH047A-受託番号16121909
【図１】
2021527694.tif 000006
【図２】
2021527694.tif 000007
【図３】
2021527694.tif 000008
【図４】
2021527694.tif 000009
【図５Ａ】
2021527694.tif 000010
【図５Ｂ】
2021527694.tif 000011
【図５Ｃ】
2021527694.tif 000012
【図５Ｄ】
2021527694.tif 000013
【図５Ｅ】
2021527694.tif 000014
【図５Ｆ】
2021527694.tif 000015
【図５Ｇ】
2021527694.tif 000016
【図５Ｈ】
2021527694.tif 000017
【図５Ｉ】
2021527694.tif 000018
【図５Ｊ】
2021527694.tif 000019
【図５Ｋ】
2021527694.tif 000020
【図６】
2021527694.tif 000021
【図７Ａ】
2021527694.tif 000022
【図７Ｂ】
2021527694.tif 000023
【図８Ａ】
2021527694.tif 000024
【図８Ｂ】
2021527694.tif 000025
【図９】
2021527694.tif 000026
【図１０】
2021527694.tif 000027
【図１１Ａ】
2021527694.tif 000028
【図１１Ｂ】
2021527694.tif 000029
【図１１Ｃ】
2021527694.tif 000030
【図１２Ａ】
2021527694.tif 000031
【図１２Ｂ】
2021527694.tif 000032
【図１２Ｃ】
2021527694.tif 000033
【図１２Ｄ】
2021527694.tif 000034
【図１３】
2021527694.tif 000035
【図１４】
2021527694.tif 000036
【図１５】
2021527694.tif 000037
【図１６】
2021527694.tif 000038
【図１７Ａ】
2021527694.tif 000039
【図１７Ｂ】
2021527694.tif 000040
【図１８Ａ】
2021527694.tif 000041
【図１８Ｂ】
2021527694.tif 000042
【図１８Ｃ】
2021527694.tif 000043
【図１８Ｄ】
2021527694.tif 000044
【図１９】
2021527694.tif 000045
【図２０】
2021527694.tif 000046
【図２１】
2021527694.tif 000047
【図２２】
2021527694.tif 000048
【図２３−１】
2021527694.tif 000049
【図２３−２】
2021527694.tif 000050
【図２４】
2021527694.tif 000051
【図２５】
2021527694.tif 000052
【配列表】
2021527694000001.app
【国際調査報告】
2021527694.tif 000053
2021527694.tif 000054
2021527694.tif 000055
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2021527694.tif 000057