(57)【要約】分離デバイスが、サンプルから未知の無傷ｍＡｂまたは既知のｍＡｂクラスの還元型ｍＡｂサブユニットを分離する。イオン源デバイスが、ｍＡｂをイオン化する。質量分析計が、ＥＣＤデバイスを使用して、イオン化されたｍＡｂを断片化し、質量分析器を使用して、結果として生じる生成イオンを質量分析し、１つ以上の生成イオンスペクトルを生成する。理論的生成イオンピークが、ｍＡｂクラスの１つ以上の一定部分に関して計算される。理論的生成イオンピークは、１つ以上の生成イオンスペクトルから除去され、１つ以上の差異生成イオンスペクトルを生成する。デノボシークエンシングが、１つ以上の差異生成イオンスペクトルに適用され、ｍＡｂの１つ以上の可変部分に関して、１つ以上の候補配列を生成する。ゲノムデータベースが、１つ以上の候補配列への合致に関して検索され、１つ以上の可変部分に関して、１つ以上の合致した配列を生成する。
2021521419.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未知のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の１つ以上の可変部分を配列決定するためのシステムであって、
相同性検索のためのゲノムデータベースと、
分離デバイスと、
イオン源デバイスと、
解離デバイスと、質量分析器とを含む、質量分析計と、
プロセッサでと
を備え、
前記プロセッサは、
サンプルから未知の無傷ｍＡｂまたは既知のｍＡｂクラスの還元型ｍＡｂサブユニットを分離するように前記分離デバイスに命令することと、
前記未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットをイオン化するように前記イオン源デバイスに命令することと、
前記解離デバイスを使用して、前記イオン化された未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットを断片化し、前記質量分析器を使用して、結果として生じる生成イオンを質量分析し、１つ以上の生成イオンスペクトルを生成するように前記質量分析器に命令することと、
前記既知のｍＡｂクラスの１つ以上の一定部分に関して理論的生成イオンピークを計算することと、
前記１つ以上の生成イオンスペクトルから前記計算された理論的生成イオンピークを除去し、１つ以上の差異生成イオンスペクトルを生成することと、
デノボシークエンシングを前記１つ以上の差異生成イオンスペクトルに適用し、前記未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットの１つ以上の可変部分に関して、１つ以上の候補配列を生成することと、
前記１つ以上の候補配列への合致に関して前記ゲノムデータベースを検索し、前記１つ以上の可変部分に関して、１つ以上の合致した配列を生成することと
を行う、システム。
【請求項２】
前記プロセッサは、Ｎ末端生成イオンの理論的生成イオンピークを除去することによって、前記計算された理論的生成イオンピークを除去する、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記プロセッサは、デノボシークエンシングを前記１つ以上の差異生成イオンスペクトルの残留Ｃ生成イオンに適用し、１つ以上の候補配列を生成する、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記プロセッサは、前記１つ以上の生成イオンスペクトルからピークリストを計算する、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記プロセッサは、１価の生成イオンピークに変換される前記１つ以上の生成イオンスペクトルからピークリストを計算する、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
前記プロセッサは、前記ピークリストから前記理論的生成イオンピークを除去することによって、前記１つ以上の生成イオンスペクトルから前記計算された理論的生成イオンピークを除去し、差異ピークリストを生成する、請求項４に記載のシステム。
【請求項７】
前記プロセッサは、デノボシークエンシングを前記差異ピークリストに適用することによって、デノボシークエンシングを前記１つ以上の差異生成イオンスペクトルに適用する、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記プロセッサが、前記還元された未知のｍＡｂを分離および脱塩するように前記分離デバイスに命令する前に、化膿連鎖球菌の免疫グロブリンＧ分解酵素（ＩｄｅＳ）消化を前記無傷の未知のｍＡｂに適用し、前記還元された未知のｍＡｂを生成することをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記分離デバイスが、前記ＩｄｅＳ消化される還元された未知のｍＡｂを分離および脱塩するにつれて、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を、前記無傷の未知のｍＡｂを伴う溶液の中および前記分離デバイスの中に注入することをさらに含む、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記解離デバイスは、電子捕捉解離（ＥＣＤ）デバイスを備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記プロセッサは、０〜３ｅＶの電子エネルギーを使用し、前記ＥＣＤデバイスを使用して前記イオン化された未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットを断片化するように前記質量分析計に命令する、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記質量分析計は、前記未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットの電子およびイオンを前記ＥＣＤデバイスの中に同時に注入する、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１３】
前記ＥＣＤデバイスは、四重極、六重極、または八重極解離デバイスを備える、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１４】
未知のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の１つ以上の可変部分を配列決定するための方法であって、
プロセッサを使用して、サンプルから未知の無傷ｍＡｂまたは既知のｍＡｂクラスの還元型ｍＡｂサブユニットを分離するように分離デバイスに命令することと、
前記プロセッサを使用して、前記未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットをイオン化するようにイオン源デバイスに命令することと、
前記プロセッサを使用して、質量分析計の解離デバイスを使用して、前記イオン化された未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットを断片化し、前記質量分析計の質量分析器を使用して、結果として生じる生成イオンを質量分析し、１つ以上の生成イオンスペクトルを生成するように前記質量分析計に命令することと、
前記プロセッサを使用して、前記既知のｍＡｂクラスの１つ以上の一定部分に関して理論的生成イオンピークを計算することと、
前記プロセッサを使用して、前記１つ以上の生成イオンスペクトルから前記計算された理論的生成イオンピークを除去し、１つ以上の差異生成イオンスペクトルを生成することと、
前記プロセッサを使用して、デノボシークエンシングを前記１つ以上の差異生成イオンスペクトルに適用し、前記未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットの１つ以上の可変部分に関して、１つ以上の候補配列を生成することと、
前記プロセッサを使用して、前記１つ以上の候補配列への合致に関して前記ゲノムデータベースを検索し、前記１つ以上の可変部分に関して、１つ以上の合致した配列を生成することと
を含む、方法。
【請求項１５】
非一過性の有形コンピュータ可読記憶媒体を備えるコンピュータプログラム製品であって、そのコンテンツは、未知のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の１つ以上の可変部分を配列決定するための方法を実施するように、プロセッサ上で実行されている命令を伴うプログラムを含み、前記方法は、
システムを提供することであって、前記システムは、１つ以上の明確に異なるソフトウェアモジュールを備え、前記明確に異なるソフトウェアモジュールは、制御モジュールと、分析モジュールとを備える、ことと、
前記制御モジュールを使用して、サンプルから未知の無傷ｍＡｂまたは既知のｍＡｂクラスの還元型ｍＡｂサブユニットを分離するように分離デバイスに命令することと、
前記制御モジュールを使用して、前記未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットをイオン化するようにイオン源デバイスに命令することと、
前記制御モジュールを使用して、質量分析計の解離デバイスを使用して、前記イオン化された未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットを断片化し、前記質量分析計の質量分析器を使用して、結果として生じる生成イオンを質量分析し、１つ以上の生成イオンスペクトルを生成するように前記質量分析計に命令することと、
前記分析モジュールを使用して、前記既知のｍＡｂクラスの１つ以上の一定部分に関して理論的生成イオンピークを計算することと、
前記分析モジュールを使用して、前記１つ以上の生成イオンスペクトルから前記計算された理論的生成イオンピークを除去し、１つ以上の差異生成イオンスペクトルを生成することと、
前記分析モジュールを使用して、デノボシークエンシングを前記１つ以上の差異生成イオンスペクトルに適用し、前記未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットの１つ以上の可変部分に関して、１つ以上の候補配列を生成することと、
前記分析モジュールを使用して、前記１つ以上の候補配列への合致に関して前記ゲノムデータベースを検索し、前記１つ以上の可変部分に関して、１つ以上の合致した配列を生成することと
を含む、コンピュータプログラム製品。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願）
本願は、両方の内容が参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる、２０１８年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／６５５，５４０号、および２０１９年３月５日に出願された米国仮特許出願第６２／８１３，８７７号の利益を主張する。
【０００２】
（導入）
本明細書の教示は、未知のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変部分を配列決定するための質量分析システムおよび方法に関する。より具体的には、電子捕捉解離（ＥＣＤ）デバイスが、無傷、消化された、または還元された未知のｍＡｂを断片化し、生成質量スペクトルを生成するために使用される。ｍＡｂクラスの一定部分に関して計算される理論的生成イオンピークは、生成質量スペクトルから除去され、差異生成質量スペクトルを生成する。デノボシークエンシングが、差異生成イオンスペクトルに適用され、ｍＡｂの可変部分に関して候補配列を生成する。ゲノムデータベースが、いわゆる相同性検索を使用して、１つ以上の候補配列への合致に関して検索され、可変部分に関して合致した配列を生成する。
【０００３】
本明細書に開示されるシステムおよび方法はまた、図１のコンピュータシステム等のプロセッサ、コントローラ、マイクロコントローラ、またはコンピュータシステムと併せて実施される。
【０００４】
（モノクローナル抗体識別）
ｍＡｂは、免疫細胞によって作製されるタンパク質である。これらの抗体は、ある抗体が単一の結合部位またはパラトープのみに結合するであろうという点で、モノクローナルである。抗体は、一般に、除去のために異または罹患組織をマークするために、生物の免疫系によって使用される。逆に、自己免疫疾患では、抗体は、正常な組織に誤って付着し、その組織も除去または損傷させる。
【０００５】
ｍＡｂは、多くの異なる種に関して、研究室内で大量に生成されることができる。これらの研究室で生成されるｍＡｂは、ヒトにとって極めて効果的かつ耐容性良好な生物学的製剤となっている。それらは、多くの異なるタイプの癌および自己免疫疾患と闘うことに用途を見出しており、現在、アルツハイマー病を含む、他の疾患で試験されている。Ｃｏｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１６，８８，４００４−４０１３（以降では「Ｃｏｔｈａｍ論文」）によると、３００を超える療法的ｍＡｂ候補およびそれらの誘導体が、ようやく２０１６年になって臨床薬の開発を受けた。
【０００６】
図２は、ＩｇＧ  ｍＡｂの例示的略図２００である。図２のｍＡｂは、２つの同じ長い重鎖２１０と、２つの同じより短い軽鎖２２０とを含む。重鎖２１０および軽鎖２２０はそれぞれ、一定および可変部分を含む。ｍＡｂの一定または固定部分のアミノ酸配列は、多くの変形を有していない。例えば、ｍＡｂのＩｇＧクラスは、４つの異なるサブクラスを有する。これらの４つの異なるサブクラス毎に、ＩｇＧ  ｍＡｂの一定部分は、変動し得る。したがって、ＩｇＧクラス全体に関して一定部分の４つだけの異なる変形が存在する。
【０００７】
対照的に、ｍＡｂの可変部分は、有意に変動し、ｍＡｂに、数十億もの異なるタイプの異または罹患組織を見出し、それらに付着する、それらの一意の能力を与えることができる。これらの可変部分は、ｍＡｂの結合部位またはパラトープを含む。ヒトゲノムは、２０，０００未満の遺伝子を含むが、身体は、数十億もの異なる可変部分、より具体的には、数十億もの異なるパラトープを用いて抗体を生成することができる。Ｄｒ．Ｓｕｓｕｍｕ  Ｔｏｎｅｇａｗａ（利根川進博士）は、遺伝子の異なる部分が、これらの数十億もの異なる可変部分を生成するように選択され、組み合わせられ得ることを発見したことにより、１９８７年にノーベル生理学・医学賞を受賞した。
【０００８】
図２のＩｇＧ  ｍＡｂの各重鎖２１０は、一定部分２１１、２１２、および２１３と、１つの可変部分２１４とを含む。各軽鎖２２０は、１つの一定部分２２１と、１つの可変部分２２２とを含む。各重鎖２１０の可変部分２１４は、結合部位２１５を含み、各軽鎖２２０の可変部分２２２は、結合部位２２３を含む。
【０００９】
療法的ｍＡｂの使用の増加は、それらのアミノ酸配列を実験的に識別する必要性を増加させた。質量分析／質量分析（ＭＳ／ＭＳ）は、多くの場合、ペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列を判定するために使用される。近年、トップダウンおよびミドルダウンＭＳ／ＭＳ方法が、既知の療法的ｍＡｂの配列を識別するために使用されている。
【００１０】
例えば、Ｆｏｒｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１２  Ｄｅｃ；１１（１２）：１７５８−６７（以降では「第１のＦｏｒｎｅｌｌｉ論文」）は、無傷ｍＡｂを配列決定するためのトップダウンＭＳ／ＭＳアプローチを提案した。本アプローチは、ｍＡｂおよびそれらの翻訳後修飾（ＰＴＭ）を特性評価するために選定された。
【００１１】
図３は、第１のＦｏｒｎｅｌｌｉ論文で使用されたトップダウンＭＳ／ＭＳアプローチを示す、概略図３００である。図３のステップ３１０では、サンプルが、溶液中の既知の無傷ｍＡｂの多くの複製から調製される。ステップ３２０では、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）が、ｍＡｂを分離および脱塩するように溶液に実施される。
【００１２】
ステップ３３０では、ＭＳ／ＭＳが、分離されたｍＡｂに実施される。例えば、分離されたｍＡｂが、イオン源デバイスを使用してイオン化され３３１、ｍＡｂ前駆イオンが、線形イオントラップ（ＬＴＱ）内で電子伝達解離（ＥＴＤ）を使用して断片化される３３２。第１のＦｏｒｎｅｌｌｉ論文は、電子捕捉解離（ＥＣＤ）およびＥＴＤが、還元型ＰＴＭ損失を伴ってポリペプチド断片化を可能にする、イオン活性化技法であることを説明する。最後に、前駆および生成イオンが、オービトラップフーリエ変換質量分析計（ＦＴ−ＭＳ）を使用して検出され３３３、複数の生成イオンスペクトル３３４を生成する。
【００１３】
ステップ３４０では、複数の生成イオンスペクトル３３４内の断片化パターンの分析が、トップダウンＭＳ／ＭＳ分析ソフトウェアを使用して実施される。検索が、既知のｍＡｂの軽および重鎖の両方の既知の配列を組み込む、カスタム配列データベース３４１に対して実施される。これらの検索から、第１のＦｏｒｎｅｌｌｉ論文は、無傷の既知のｍＡｂの約３３％包括度を伴う合致する配列３４２を報告した。
【００１４】
Ｆｏｒｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１４，８６，３００５−３０１２（以降では「第２のＦｏｒｎｅｌｌｉ論文」）は、ｍＡｂを配列決定するためのミドルダウンＭＳ／ＭＳアプローチを提案した。第２のＦｏｒｎｅｌｌｉ論文は、療法としてのｍＡｂの成功が、これらのｍＡｂが、それらの安全性、効率、バッチ間一貫性、および安定性を確実にするように、構造的に十分に特性評価されることを要求していることを説明する。結果として、第１のＦｏｒｎｅｌｌｉ論文の方法の３３％配列包括度は、改良される必要があった。これを行うために、第２のＦｏｒｎｅｌｌｉ論文は、ＭＳ／ＭＳ分析の前に、ｍＡｂを大型断片またはサブユニットに化学的に還元することを提案した。本還元型ｍＡｂサブユニットの使用は、ミドルダウンＭＳ／ＭＳ分析と称される。
【００１５】
図４は、第２のＦｏｒｎｅｌｌｉ論文で使用されたミドルダウンＭＳ／ＭＳアプローチを示す、概略図４００である。図４のステップ４１０では、サンプルが、溶液中の既知の無傷ｍＡｂの多くの複製から調製される。しかしながら、ステップ４２０では、ｍＡｂの化膿連鎖球菌の免疫グロブリンＧ分解酵素（ＩｄｅＳ）消化およびジスルフィド結合還元剤を使用する消化されたｍＡｂの還元４２１が、ＬＣの前に実施される。ステップ４３０では、ＬＣが、ｍＡｂサブユニットを分離および脱塩するようにｍＡｂサブユニットに実施される。
【００１６】
ステップ４４０では、ＭＳ／ＭＳが、分離されたｍＡｂサブユニットに実施される。例えば、分離されたｍＡｂサブユニットが、イオン源デバイスを使用してイオン化され４４１、ｍＡｂサブユニット前駆イオンが、線形イオントラップ（ＬＴＱ）内で電子伝達解離（ＥＴＤ）を使用して断片化される４４２。最後に、前駆および生成イオンが、オービトラップＦＴ−ＭＳを使用して検出され４４３、複数の生成イオンスペクトル４４４を生成する。
【００１７】
ステップ４５０では、複数の生成イオンスペクトル４４４内の断片化パターンの分析が、ＭＳ分析ソフトウェアを使用して実施される。検索が、既知のｍＡｂの軽および重鎖の両方の既知の配列を組み込む、データベース４５１に対して実施される。これらの検索から、第２のＦｏｒｎｅｌｌｉ論文は、無傷の既知のｍＡｂの約５０％包括度を伴う合致する配列４５２を報告した。
【００１８】
第２のＦｏｒｎｅｌｌｉ論文のように、Ｃｏｔｈａｍ論文は、ｍＡｂの療法的有効性が、一次配列に関する構造的完全性およびＰＴＭの存在ならびに存在量によって調整されることを説明する。結果として、Ｃｏｔｈａｍ論文は、抗体一次配列の特性評価が、ＰＴＭ識別および部位の位置特定に加えて、ｍＡｂの安全性および有効性を確実にするために重要であることを見出している。Ｃｏｔｈａｍ論文は、第１のＦｏｒｎｅｌｌｉ論文および第２のＦｏｒｎｅｌｌｉ論文の方法を精査し、第２のＦｏｒｎｅｌｌｉ論文のようであるが、１９３ｎｍ紫外線光解離（ＵＶＰＤ）によって置換されるＥＴＤ断片化を伴う、ミドルダウンアプローチを提案する。
【００１９】
図５は、Ｃｏｔｈａｍ論文で使用されたミドルダウンＭＳ／ＭＳアプローチを示す、概略図５００である。図５のステップ５１０では、サンプルが、溶液中の既知の無傷ｍＡｂの多くの複製から調製される。ステップ５２０では、ｍＡｂのＩｄｅＳ消化および消化されたｍＡｂの還元ならびに変性が、ＬＣの前に実施される。ステップ５３０では、ＬＣが、ｍＡｂサブユニットに実施される。
【００２０】
ステップ５４０では、ＭＳ／ＭＳが、分離されたｍＡｂサブユニットに実施される。例えば、分離されたｍＡｂサブユニットが、イオン源デバイスを使用してイオン化され５４１、ｍＡｂサブユニット前駆イオンが、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）セル内でＵＶＰＤを使用して断片化される５４２。最後に、前駆および生成イオンが、オービトラップＦＴ−ＭＳを使用して検出され５４３、複数の生成イオンスペクトル５４４を生成する。
【００２１】
ステップ５５０では、複数の生成イオンスペクトル５４４が、ＭＳ分析ソフトウェアを使用して分析される。図５の方法を使用して、Ｃｏｔｈａｍ論文は、既知のｍＡｂの約６０％全体配列包括度を報告した。
【００２２】
ステップ５５０では、複数の生成イオンスペクトル５４４から平均される、単一のスペクトル５４５の断片化パターンの分析が、ＭＳ分析ソフトウェアを使用して実施される。検索が、既知のｍＡｂの軽および重鎖の両方の既知の配列を組み込む、データベース５５１に対して実施される。これらの検索から、Ｃｏｔｈａｍ論文は、無傷の既知のｍＡｂの約６０％包括度を伴う合致する配列５５２を報告した。
【００２３】
第１のＦｏｒｎｅｌｌｉ論文、第２のＦｏｒｎｅｌｌｉ論文、およびＣｏｔｈａｍ論文は全て、サンプル溶液中の既知のｍＡｂを識別することを対象とする。第２のＦｏｒｎｅｌｌｉ論文によって説明されるように、これらの方法は、製造されたｍＡｂが、革新製品のものに類似する物理化学特性、機能的性質、および臨床効率を有することを示すために、ｍＡｂ薬物開発で使用されることができる。
【００２４】
第１のＦｏｒｎｅｌｌｉ論文、第２のＦｏｒｎｅｌｌｉ論文、およびＣｏｔｈａｍ論文の方法は、未知のｍＡｂを配列決定することを対象としていない。換言すると、これらの方法は、ｍＡｂ創薬を対象としていない。未知のｍＡｂの配列を判定することは、溶液中の既知のｍＡｂの配列を識別または確認することよりもはるかに困難な問題である。これは、上記に説明されるように、ｍＡｂの可変部分が数十億もの異なる可能性として考えられる配列を有し得るため、はるかに困難な問題である。
【００２５】
結果として、未知のｍＡｂの配列を判定するためのシステムおよび方法の必要性が存在する。より具体的には、未知のｍＡｂの可変部分の配列を判定するためのシステムおよび方法の必要性が存在する。
【００２６】
（質量分析背景）
質量分析（ＭＳ）は、それらの化合物から形成されるイオンのｍ／ｚ値の分析に基づく、化学化合物の検出および定量化のための分析技法である。ＭＳは、サンプルからの１つ以上の着目化合物のイオン化、前駆イオンの生成、および前駆イオンの質量分析を伴う。
【００２７】
タンデム質量分析または質量分析／質量分析（ＭＳ／ＭＳ）は、サンプルからの１つ以上の着目化合物のイオン化、１つ以上の化合物の１つ以上の前駆イオンの選択、生成イオンへの１つ以上の前駆イオンの断片化、および生成イオンの質量分析を伴う。
【００２８】
ＭＳおよびＭＳ／ＭＳは両方とも、定性的および定量的情報を提供することができる。測定された前駆または生成イオンスペクトルは、着目分子を識別するために使用されることができる。前駆イオンおよび生成イオンの強度もまた、サンプルに存在する化合物の量を定量化するために使用されることができる。
【００２９】
（断片化技法背景）
電子ベースの解離（ＥｘＤ）、紫外線光解離（ＵＶＰＤ）、赤外線光解離（ＩＲＭＰＤ）、および衝突誘発解離（ＣＩＤ）が、多くの場合、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）のための断片化技法として使用される。ＥｘＤは、限定ではないが、電子捕捉解離（ＥＣＤ）または電子伝達解離（ＥＴＤ）を含むことができる。ＣＩＤは、タンデム質量分析計における解離のための最も従来的技法である。
【００３０】
上記に説明されるように、トップダウンおよびミドルダウンプロテオミクスでは、無傷または消化されたタンパク質が、イオン化され、タンデム質量分析を受ける。例えば、ＥＣＤは、ペプチドおよびタンパク質骨格を優先的に解離する解離技法である。結果として、本技法は、トップダウンおよびミドルダウンプロテオミクスアプローチを使用して、ペプチドまたはタンパク質配列を分析するための理想的なツールである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３１】
（要約）
システム、方法、およびコンピュータプログラム製品が、未知のｍＡｂの１つ以上の可変部分を配列決定するために開示される。本システムは、ゲノムデータベースと、分離デバイスと、イオン源デバイスと、１つ以上の解離デバイスを伴う質量分析計と、プロセッサとを含む。
【００３２】
プロセッサは、サンプルから未知の無傷ｍＡｂまたは既知のｍＡｂクラスの還元型ｍＡｂサブユニットを分離するように分離デバイスに命令する。プロセッサは、未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットをイオン化するようにイオン源デバイスに命令する。質量分析計は、解離デバイスと、質量分析器とを含む。解離デバイスは、好ましくは、ＥＣＤデバイスである。プロセッサは、解離デバイスを使用して、イオン化された未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットを断片化し、質量分析器を使用して、結果として生じる生成イオンを質量分析し、１つ以上の生成イオンスペクトルを生成するように質量分析器に命令する。
【００３３】
プロセッサは、既知のｍＡｂクラスの１つ以上の一定部分に関して理論的生成イオンピークを計算する。プロセッサは、１つ以上の生成イオンスペクトルから計算された理論的生成イオンピークを除去し、１つ以上の差異生成イオンスペクトルを生成する。プロセッサは、デノボシークエンシングを１つ以上の差異生成イオンスペクトルに適用し、未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットの１つ以上の可変部分に関して、１つ以上の候補配列を生成する。プロセッサは、１つ以上の候補配列への合致に関してゲノムデータベースを検索し（相同性検索）、１つ以上の可変部分に関して、１つ以上の合致した配列を生成する。
【００３４】
出願者の教示のこれらおよび他の特徴が、本明細書に記載される。
【００３５】
当業者は、下記に説明される図面が例証目的のみのためであることを理解するであろう。図面は、いかようにも本教示の範囲を限定することを意図していない。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、本教示の実施形態が実装され得る、コンピュータシステムを図示するブロック図である。
【００３７】
【図２】図２は、ＩｇＧモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の例示的略図である。
【００３８】
【図３】図３は、第１のＦｏｒｎｅｌｌｉ論文で使用されたトップダウンＭＳ／ＭＳアプローチを示す、概略図である。
【００３９】
【図４】図４は、第２のＦｏｒｎｅｌｌｉ論文で使用されたミドルダウンＭＳ／ＭＳアプローチを示す、概略図である。
【００４０】
【図５】図５は、Ｃｏｔｈａｍ論文で使用されたミドルダウンＭＳ／ＭＳアプローチを示す、概略図である。
【００４１】
【図６】図６は、種々の実施形態による、未知のｍＡｂの１つ以上の可変部分を配列決定するためのシステムを示す、例示的概略図である。
【００４２】
【図７】図７は、種々の実施形態による、電子捕捉解離（ＥＣＤ）デバイスの概略図である。
【００４３】
【図８】図８は、種々の実施形態による、ＥＣＤデバイスおよび衝突誘発解離（ＣＩＤ）衝突セルの切断３次元斜視図である。
【００４４】
【図９】図９は、種々の実施形態による、ＥＣＤ解離を使用して非還元型無傷ｍＡｂを断片化することによって生成される例示的生成イオンスペクトルである。
【００４５】
【図１０】図１０は、種々の実施形態による、１価の変換された生成イオンピークの計算されたリストから、ｍＡｂｓクラスの一定部分に関する理論的生成イオンピークを除去または減算することによって生成される、差異生成イオンピークリストを示し、差異生成イオンピークリストに対応するデノボ配列のリストを示す、例示的表である。
【００４６】
【図１１】図１１は、種々の実施形態による、未知のｍＡｂの１つ以上の可変部分を配列決定するための方法を示す、フローチャートである。
【００４７】
【図１２】図１２は、種々の実施形態による、未知のｍＡｂの１つ以上の可変部分を配列決定するための方法を実施する、１つ以上の明確に異なるソフトウェアモジュールを含む、システムの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本教示の１つ以上の実施形態が、詳細に説明される前に、当業者は、本教示が、それらの用途において、以下の詳細な説明に記載される、または図面に図示される、構造の詳細、構成要素の配列、およびステップの配列に限定されないことを理解するであろう。また、本明細書で使用される表現法および用語は、説明の目的のためであり、限定的と見なされるべきではないことを理解されたい。
【００４９】
様々な実施形態の説明
（コンピュータ実装システム）
図１は、本教示の実施形態が実装され得る、コンピュータシステム１００を図示するブロック図である。コンピュータシステム１００は、情報を通信するためのバス１０２または他の通信機構と、情報を処理するためのバス１０２と結合されるプロセッサ１０４とを含む。コンピュータシステム１００はまた、プロセッサ１０４によって実行されるべき命令を記憶するために、バス１０２に結合されるランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）または他の動的記憶デバイスであり得る、メモリ１０６も含む。メモリ１０６はまた、プロセッサ１０４によって実行されるべき命令の実行の間にテンポラリ変数または他の中間情報を記憶するために使用されてもよい。コンピュータシステム１００はさらに、プロセッサ１０４のための静的情報および命令を記憶するためのバス１０２に結合される読取専用メモリ（ＲＯＭ）１０８または他の静的記憶デバイスを含む。磁気ディスクまたは光ディスク等の記憶デバイス１１０が、情報および命令を記憶するために提供され、バス１０２に結合される。
【００５０】
コンピュータシステム１００は、情報をコンピュータユーザに表示するために、バス１０２を介して陰極線管（ＣＲＴ）または液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）等のディスプレイ１１２に結合されてもよい。英数字または他のキーを含む、入力デバイス１１４が、情報およびコマンド選択をプロセッサ１０４に通信するためにバス１０２に結合される。別のタイプのユーザ入力デバイスは、方向情報およびコマンド選択をプロセッサ１０４に通信するため、かつディスプレイ１１２上のカーソル移動を制御するためのマウス、トラックボール、またはカーソル方向キー等のカーソル制御１１６である。本入力デバイスは、典型的には、本デバイスが平面内の位置を規定することを可能にする、２つの軸、すなわち、第１の軸（すなわち、ｘ）および第２の軸（すなわち、ｙ）において２つの自由度を有する。
【００５１】
コンピュータシステム１００は、本教示を実施することができる。本教示のある実装と一致して、結果が、プロセッサ１０４がメモリ１０６内に含有される１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスを実行することに応答して、コンピュータシステム１００によって提供される。そのような命令は、記憶デバイス１１０等の別のコンピュータ可読媒体からメモリ１０６に読み込まれてもよい。メモリ１０６内に含有される命令のシーケンスの実行は、プロセッサ１０４に、本明細書に説明されるプロセスを実施させる。代替として、配線回路が、本教示を実装するために、ソフトウェア命令の代わりに、またはそれと組み合わせて、使用されてもよい。したがって、本教示の実装は、ハードウェア回路とソフトウェアのいずれの具体的組み合わせにも限定されない。
【００５２】
種々の実施形態では、コンピュータシステム１００は、ネットワーク化されたシステムを形成するように、ネットワークを横断して、コンピュータシステム１００のような１つ以上の他のコンピュータシステムに接続されることができる。ネットワークは、私設ネットワークまたはインターネット等の公衆ネットワークを含むことができる。ネットワーク化されたシステムでは、１つ以上のコンピュータシステムは、データを記憶し、他のコンピュータシステムに供給することができる。データを記憶および供給する、１つ以上のコンピュータシステムは、クラウドコンピューティングシナリオでは、サーバまたはクラウドと称されることができる。１つ以上のコンピュータシステムは、例えば、１つ以上のウェブサーバを含むことができる。データをサーバまたはクラウドに送信する、およびそこからデータを受信する、他のコンピュータシステムは、例えば、クライアントまたはクラウドデバイスと称されることができる。
【００５３】
本明細書で使用されるような用語「コンピュータ可読媒体」は、実行のために命令をプロセッサ１０４に提供することに関与する、任意の媒体を指す。そのような媒体は、限定ではないが、不揮発性媒体、揮発性媒体、および伝送媒体を含む、多くの形態をとってもよい。不揮発性媒体は、例えば、記憶デバイス１１０等の光または磁気ディスクを含む。揮発性媒体は、メモリ１０６等の動的メモリを含む。伝送媒体は、バス１０２を備えるワイヤを含む、同軸ケーブル、銅線、および光ファイバを含む。
【００５４】
コンピュータ可読媒体またはコンピュータプログラム製品の一般的形態は、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、または任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）、Ｂｌｕ−ｒａｙ（登録商標）ディスク、任意の他の光学媒体、サムドライブ、メモリカード、ＲＡＭ、ＰＲＯＭ、およびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ（登録商標）−ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップまたはカートリッジ、もしくはコンピュータが読み取り得る任意の他の有形媒体を含む。
【００５５】
コンピュータ可読媒体の種々の形態が、実行のために１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスをプロセッサ１０４に搬送することに関与し得る。例えば、命令は、最初に、遠隔コンピュータの磁気ディスク上で搬送されてもよい。遠隔コンピュータは、命令をその動的メモリの中にロードし、モデムを使用して、電話線を経由して命令を送信することができる。コンピュータシステム１００にローカルのモデルが、電話線上でデータを受信し、赤外線伝送機を使用して、データを赤外線信号に変換することができる。バス１０２に結合される赤外線検出器が、赤外線信号内で搬送されるデータを受信し、バス１０２上にデータを設置することができる。バス１０２は、メモリ１０６にデータを搬送し、そこから、プロセッサ１０４が、命令を読み出し、実行する。メモリ１０６によって受信される命令は、随意に、プロセッサ１０４による実行の前または後のいずれかに記憶デバイス１１０上に記憶されてもよい。
【００５６】
種々の実施形態によると、方法を実施するためにプロセッサによって実行されるように構成される命令が、コンピュータ可読媒体上に記憶される。コンピュータ可読媒体は、デジタル情報を記憶するデバイスであり得る。例えば、コンピュータ可読媒体は、ソフトウェアを記憶するための当技術分野内で公知であるようなコンパクトディスク読取専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）を含む。コンピュータ可読媒体は、実行されるように構成される命令を実行するために好適なプロセッサによってアクセスされる。
【００５７】
本教示の種々の実装の以下の説明が、例証および説明の目的のために提示された。これは、包括的ではなく、本教示を開示される精密な形態に限定しない。修正および変形例が、上記の教示を踏まえて可能である、または本教示の実践から入手され得る。加えて、説明される実装は、ソフトウェアを含むが、本教示は、ハードウェアとソフトウェアの組み合わせとして、またはハードウェア単独で実装され得る。本教示は、オブジェクト指向および非オブジェクト指向プログラミングシステムの両方を用いて実装され得る。
【００５８】
（ＭＡＢＳ可変部分判定）
上記に説明されるように、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のトップダウンおよびミドルダウン分析は、ｍＡｂのアミノ酸配列が把握されるときのみ実証された。未知のｍＡｂの配列を判定することは、既知のｍＡｂの配列を識別または確認することよりもはるかに困難な問題である。これは、上記に説明されるように、ｍＡｂの可変部分が数十億もの異なる可能性として考えられる配列を有し得るため、はるかに困難な問題である。
【００５９】
結果として、未知のｍＡｂの配列を判定するためのシステムおよび方法の必要性が存在する。より具体的には、未知のｍＡｂの可変部分の配列を判定するためのシステムおよび方法の必要性が存在する。
【００６０】
種々の実施形態では、システムおよび方法が、未知のｍＡｂの可変部分を配列決定するように提供される。トップダウンまたはミドルダウンＬＣ−ＭＳ／ＭＳが、使用される。トップダウンＬＣ−ＭＳ／ＭＳが、無傷ｍＡｂに適用される。ミドルダウンＬＣ−ＭＳ／ＭＳが、還元型ｍＡｂサブユニットに適用される。
【００６１】
既知のｍＡｂクラスの１つ以上の一定部分に関する理論的生成イオンピークが、計算される。これらの計算された理論的生成イオンピークは、トップダウンまたはミドルダウンＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって生成される１つ以上の生成イオンスペクトルから、除去または減算される。デノボシークエンシングが、１つ以上の差異生成イオンスペクトルに適用され、未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットの１つ以上の可変部分に関して、１つ以上の候補配列を生成する。最後に、ゲノムデータベースが、１つ以上の候補配列への合致に関して検索され（相同性検索）、未知のｍＡｂの１つ以上の可変部分に関して、１つ以上の合致した配列を生成する。種々の実施形態では、従来的なトップダウンまたはミドルダウンＭＳ／ＭＳが、１つ以上の合致した配列の正当性を立証するように、再び実施される。
【００６２】
（未知のｍＡｂの可変部分を配列決定するためのシステム）
図６は、種々の実施形態による、未知のｍＡｂの１つ以上の可変部分を配列決定するためのシステムを示す、例示的概略図６００である。図６のシステムは、ゲノムデータベース６１０と、分離デバイス６２０と、イオン源デバイス６３０と、質量分析計６４０と、プロセッサ６５０とを含む。
【００６３】
プロセッサ６５０は、サンプルから未知の無傷ｍＡｂまたは既知のｍＡｂクラスの還元型ｍＡｂサブユニットを分離するように分離デバイス６２０に命令する。種々の実施形態では、プロセッサ６５０は、分離デバイス６２０、イオン源デバイス６３０、および質量分析計６４０を制御する、またはそれらに命令を提供する、ゲノムデータベース６１０を検索する、ならびに収集されるデータを分析するために使用される。プロセッサ６５０は、例えば、１つ以上の電圧、電流、または圧力源（図示せず）を制御することによって、制御する、または命令を提供する。プロセッサ６５０は、図６に示されるような別個のデバイスであり得る、または質量分析計６４０の１つ以上のデバイスのプロセッサまたはコントローラであり得る。プロセッサ６５０は、限定ではないが、コントローラ、コンピュータ、マイクロプロセッサ、図１のコンピュータシステム、または制御信号およびデータを送信および受信し、データを分析することが可能な任意のデバイスであり得る。
【００６４】
種々の実施形態では、プロセッサ６５０は、ステップ６０１に示されるようなトップダウン方法で無傷の未知のｍＡｂを分離するように分離デバイス６２０に命令する。溶液６０３内の無傷の未知のｍＡｂが、本トップダウン方法では分離デバイス６２０に供給され、無傷の未知のｍＡｂ６２１が、分離デバイス６２０によって脱塩および分離される。
【００６５】
種々の代替実施形態では、プロセッサ６５０は、ステップ６０２に示されるようなミドルダウン方法で消化された未知のｍＡｂを分離するように分離デバイス６２０に命令する。消化溶液６０３内の無傷の未知のｍＡｂが、ＩｄｅＳを溶液６０３に適用することによって消化される。消化された未知のｍＡｂは、次いで、本ミドルダウン方法では分離デバイス６２０に供給され、消化された未知のｍＡｂ６２２は、分離デバイス６２０によって脱塩される。
【００６６】
種々の実施形態では、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）が、消化された未知のｍＡｂを還元するために使用される。例えば、ＤＴＴは、オンライン還元のために分離デバイス６２０の中に注入される。分離デバイス６２０は、未知のｍＡｂの還元型ＩｄｅＳ消化物を分離している。
【００６７】
分離デバイス６２０は、限定ではないが、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）デバイスまたはキャピラリ電気泳動デバイスであり得る。好ましい実施形態では、分離デバイス６２０は、経時的に未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットを分離および脱塩する、ＬＣカラムである。
【００６８】
プロセッサ６５０は、未知の無傷ｍＡｂ６２１または還元型ｍＡｂサブユニット６２２をイオン化するようにイオン源デバイス６３０に命令する。イオン源デバイス６３０は、エレクトロスプレーイオン源（ＥＳＩ）デバイスであり得る。イオン源デバイス６３０は、図６では質量分析計６４０の一部として示される。
【００６９】
質量分析計６４０は、いくつかあるデバイスの中でも、解離デバイス６４１と、質量分析器６４３とを含む。プロセッサ６５０は、解離デバイス６４１を使用して、イオン化された未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットを断片化し、質量分析器６４３を使用して、結果として生じる生成イオンを質量分析し、１つ以上の生成イオンスペクトル６４４を生成するように質量分析器６４０に命令する。質量分析器６４３は、限定ではないが、飛行時間（ＴＯＦ）質量分析器、四重極、イオントラップ、線形イオントラップ、オービトラップ、磁気セクタ質量分析器、ハイブリッド四重極飛行時間（Ｑ−ＴＯＦ）質量分析器、またはフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析器を含むことができる。好ましい実施形態では、質量分析器６４３は、ＴＯＦ質量分析器である。
【００７０】
解離デバイス６４１は、例えば、ＥｘＤ、ＩＲＭＰＤ、ＣＩＤ、またはＵＶＰＤを使用して、イオン化された未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットを断片化する。好ましい実施形態では、解離デバイス６４１は、ＥＣＤデバイスである。
【００７１】
図７は、種々の実施形態による、ＥＣＤデバイスの概略図７００である。ＥＣＤデバイスは、電子エミッタまたはフィラメント７１０と、電子ゲート７２０とを含む。電子が、イオン流７３０と垂直および磁場の方向７４０と平行に放出される。
【００７２】
図６に戻ると、解離デバイスを含む質量分析計は、典型的には、ＣＩＤのためのＱ２解離デバイス６４２のような別の解離デバイスを含む。Ｑ２解離デバイス６４２は、例えば、タンパク質またはペプチド以外の化合物を断片化するために使用される。タンパク質またはペプチドの分析の間に、Ｑ２解離デバイス６４２は、イオンガイドとして作用し、単に、生成イオンを解離デバイス６４１から質量分析器６４３に伝送する。
【００７３】
図８は、種々の実施形態による、ＥＣＤデバイスおよびＣＩＤ衝突セルの切断３次元斜視図８００である。図８は、イオンの断片化が、ＥＣＤデバイス８１４内の場所８１１で、またはＣＩＤ衝突セル８１５内の場所８１２で選択的に実施され得ることを示す。
【００７４】
図６に戻ると、種々の実施形態では、プロセッサ６５０は、０〜３ｅＶの電子エネルギーを使用し、ＥＣＤ解離デバイス６４１を使用してイオン化された未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットを断片化するように質量分析計６４０に命令する。質量分析計６４０は、同時に、未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットの電子およびイオンをＥＣＤ解離デバイス６４１の中に注入する。
【００７５】
種々の実施形態では、ＥＣＤ解離デバイス６４１は、四重極、六重極、または八重極解離デバイスである。
【００７６】
プロセッサ６５０は、既知のｍＡｂクラスの１つ以上の一定部分に関して理論的生成イオンピーク６５１を計算する。ｍＡｂクラスは、限定ではないが、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、およびＩｇＡを含むことができる。
【００７７】
プロセッサ６５０は、１つ以上の生成イオンスペクトル６４４から計算された理論的生成イオンピーク６５１を除去または減算し、１つ以上の差異生成イオンスペクトル６５２を生成する。
【００７８】
プロセッサ６５０は、デノボシークエンシングを１つ以上の差異生成イオンスペクトル６５２に適用し、未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットの１つ以上の可変部分に関して、１つ以上の候補配列６５３を生成する。プロセッサ６５０は、１つ以上の候補配列６５３への合致に関してゲノムデータベース６１０を検索し（相同性検索）、１つ以上の可変部分に関して、１つ以上の合致した配列６５４を生成する。
【００７９】
デノボシークエンシングでは、１つ以上のアミノ酸配列が、例えば、生成イオンスペクトル内の生成イオンに割り当てられる。デノボシークエンシングは、配列を見出すために第１のＦｏｒｎｅｌｌｉ論文、第２のＦｏｒｎｅｌｌｉ論文、およびＣｏｔｈａｍ論文によって実施されるデータベース検索と異なることに留意されたい。デノボシークエンシングにおいて候補配列を判定するためのデータベース検索は存在しない。
【００８０】
種々の実施形態では、プロセッサ６５０は、Ｃ末端生成イオンの理論的生成イオンピークを除去することによって、計算された理論的生成イオンピーク６５１を除去する。プロセッサ６５０は、デノボシークエンシングを１つ以上の差異生成イオンスペクトル６５２の残留Ｎ末端生成イオンに適用し、１つ以上の候補配列６５３を生成する。
【００８１】
下記に説明されるように、図６のシステムは、未知のｍＡｂの７０〜８０％配列包括度を生成することが見出された。種々の実施形態では、プロセッサ６５０は、１つ以上の合致した配列を未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットの１つ以上の生成イオンスペクトルとさらに比較することによって、配列包括度を判定し、１つ以上の合致した配列を確認する。
【００８２】
種々の実施形態では、プロセッサ６５０は、１つ以上の生成イオンスペクトル６４４からピークリストを計算する。例えば、プロセッサ６５０は、１価の生成イオンピークに変換される１つ以上の生成イオンスペクトル６４４からピークリストを計算することができる。プロセッサ６５０は、次いで、ピークリストから理論的生成イオンピーク６５１を除去し、差異ピークリストを生成することによって、１つ以上の生成イオンスペクトルから計算された理論的生成イオンピーク６５１を除去する。プロセッサ６５０は、デノボシークエンシングを差異ピークリストに適用することによって、デノボシークエンシングを１つ以上の差異生成イオンスペクトル６５２に適用する。
【００８３】
図９は、種々の実施形態による、ＥＣＤ解離を使用して非還元型無傷ｍＡｂを断片化することによって生成される例示的生成イオンスペクトル９００である。ＥＣＤ生成イオンスペクトル９００では、１価の生成イオンが、約５００〜１，５００ｍ／ｚの間に出現する。多価前駆イオンが、約２，１００〜４，５００ｍ／ｚの間に出現する。
【００８４】
図１０は、種々の実施形態による、１価の変換された生成イオンピークの計算されたリストから、ｍＡｂｓクラスの一定部分に関する理論的生成イオンピークを除去または減算することによって生成される、差異生成イオンピークリストを示し、差異生成イオンピークリストに対応するデノボ配列のリストを示す、例示的表１０００である。表１０００では、既知のｍＡｂクラスの一定部分に関する理論的生成イオンピークのリスト１０２０の生成イオンピークが、１価の生成イオンのリスト１０１０の生成イオンと比較される。合致するピークが、リスト１０１０から除去され、差異ピークリスト１０３０を生成する。デノボシークエンシングが、差異ピークリスト１０３０の生成イオンピークに適用され、未知のｍＡｂの可変部分のデノボ候補配列のリスト１０４０を生成する。
【００８５】
（未知のｍＡｂの可変部分を配列決定するための方法）
図１１は、種々の実施形態による、未知のｍＡｂの１つ以上の可変部分を配列決定するための方法１１００を示す、フローチャートである。
【００８６】
方法１１００のステップ１１１０では、分離デバイスが、プロセッサを使用して、サンプルから未知の無傷ｍＡｂまたは既知のｍＡｂクラスの還元型ｍＡｂサブユニットを分離するように命令される。
【００８７】
ステップ１１２０では、イオン源デバイスが、プロセッサを使用して、未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットをイオン化するように命令される。
【００８８】
ステップ１１３０では、質量分析計が、プロセッサを使用して、質量分析計の解離デバイスを使用して、イオン化された未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットを断片化し、質量分析計の質量分析器を使用して、結果として生じる生成イオンを質量分析し、１つ以上の生成イオンスペクトルを生成するように命令される。
【００８９】
ステップ１１４０では、理論的生成イオンピークが、プロセッサを使用して、既知のｍＡｂクラスの１つ以上の一定部分に関して計算される。
【００９０】
ステップ１１５０では、計算された理論的生成イオンピークが、プロセッサを使用して、１つ以上の生成イオンスペクトルから除去され、１つ以上の差異生成イオンスペクトルを生成する。
【００９１】
ステップ１１６０では、デノボシークエンシングが、プロセッサを使用して、１つ以上の差異生成イオンスペクトルに適用され、未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットの１つ以上の可変部分に関して、１つ以上の候補配列を生成する。
【００９２】
ステップ１１７０では、ゲノムデータベースが、プロセッサを使用して、１つ以上の候補配列への合致に関して検索され、１つ以上の可変部分に関して、１つ以上の合致した配列を生成する。
【００９３】
種々の実施形態において、付加的ステップ１１８０では、１つ以上の合致した配列は、１つ以上の合致した配列を確認するように、かつ１つ以上の合致した配列の包括度を判定するように、未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットの１つ以上の生成イオンスペクトルと比較される。例えば、ステップ１１８０は、図６の１つ以上の合致した配列６５４の７０〜８０％配列包括度を判定するように実施される。
【００９４】
（未知のｍＡｂの可変部分を配列決定するためのコンピュータプログラム製品）
種々の実施形態では、コンピュータプログラム製品は、そのコンテンツが、未知のｍＡｂの１つ以上の可変部分を配列決定するための方法を実施するように、プロセッサ上で実行されている命令を伴うプログラムを含む、有形コンピュータ可読記憶媒体を含む。本方法は、１つ以上の明確に異なるソフトウェアモジュールを含む、システムによって実施される。
【００９５】
図１２は、種々の実施形態による、未知のｍＡｂの１つ以上の可変部分を配列決定するための方法を実施する、１つ以上の明確に異なるソフトウェアモジュールを含む、システム１２００の概略図である。システム１２００は、制御モジュール１２１０と、分析モジュール１２２０とを含む。
【００９６】
制御モジュール１２１０は、サンプルから未知の無傷ｍＡｂまたは既知のｍＡｂクラスの還元型ｍＡｂサブユニットを分離するように分離デバイスに命令する。制御モジュール１２１０は、未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットをイオン化するようにイオン源デバイスに命令する。制御モジュール１２１０は、質量分析計の解離デバイスを使用して、イオン化された未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットを断片化するように質量分析計に命令する。制御モジュール１２１０はまた、質量分析計の質量分析器を使用して、結果として生じる生成イオンを質量分析し、１つ以上の生成イオンスペクトルを生成するように質量分析計に命令する。
【００９７】
分析モジュール１２２０は、既知のｍＡｂクラスの１つ以上の一定部分に関して理論的生成イオンピークを計算する。分析モジュール１２２０は、１つ以上の生成イオンスペクトルから計算された理論的生成イオンピークを除去し、１つ以上の差異生成イオンスペクトルを生成する。分析モジュール１２２０は、デノボシークエンシングを１つ以上の差異生成イオンスペクトルに適用し、未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットの１つ以上の可変部分に関して、１つ以上の候補配列を生成する。最後に、分析モジュール１２２０は、１つ以上の候補配列への合致に関してゲノムデータベースを検索し、１つ以上の可変部分に関して、１つ以上の合致した配列を生成する。
【００９８】
種々の実施形態では、分析モジュール１２２０はさらに、１つ以上の合致した配列を確認するように、かつ１つ以上の合致した配列の包括度を判定するように、１つ以上の合致した配列を未知の無傷ｍＡｂまたは還元型ｍＡｂサブユニットの１つ以上の生成イオンスペクトルと比較する。
【００９９】
（実験データ）
ＥＣＤは、トップダウンシークエンシング、デノボシークエンシング，グリコシル化分析、および有益なジスルフィド結合開裂等の一意の特徴を提供し、無傷抗体を分析するための理想的なツールである。ＲＦイオントラップに基づく小型および高スループットＥＣＤデバイスが、いくつかの実験で使用された。本技術は、本研究では、無傷ｍＡｂに適用された。これはまた、新規のオンラインジスルフィド結合還元技法を使用して還元された、ｍＡｂサブユニットに適用された。
【０１００】
ＥＣＤセルが、四重極ＴＯＦシステム内のＱ１とＱ２との間に配設された。ＥＣＤデバイスの中への電子ビームおよび前駆イオンの同時注入である、同時捕獲ＥＣＤモードが、高スループット分析に使用された。典型的電子ビーム照射時間は、１０ミリ秒であり、電子ビーム強度は、適切な解離効率を取得するように調整された。ＴＯＦの質量分解能は、最大Ｚ〜３０＋まで断片の同位体パターンを分解した、３５，０００〜４７，０００であった。脱塩ＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ）が、脱塩、オンライン還元、およびＬＣ分離に使用された。ヒト化モノクローナルＩｇＧ（ＮＩＳＴ−ｍＡｂ）が、実証目的のためにＮＩＳＴから取得された。
【０１０１】
ＥＣＤ−ＴＯＦシステムを使用して、トップダウン分析において最良の配列包括度を取得するために、（１）低荷電前駆体が、低断片荷電状態分布を取得するように選択されてもよく、（２）ＥＣＤが、０〜３ｅＶの電子エネルギーを用いて実施されてもよく、（３）３０〜５０％の前駆体消費が、高荷電状態における大型断片を検出するために使用されてもよい。より長い電子線照射（またはより強い電子ビーム）を使用することは、大型断片を除去し、シークエンシングのために有益ではない内部断片を生成する、一次ＥＣＤ断片の二次解離を誘発することが見出された。
【０１０２】
無傷ＮＩＳＴ−ｍＡｂが、ＬＣ−ＥＣＤ−ＴＯＦ質量分析計によって分析された。単一のＬＣ起動によって取得された無傷ＥＣＤスペクトルへのデノボシークエンシングは、３つの配列を示し、それらのうちの２つは、ヒトゲノムで見出される軽鎖および重鎖内の可変部分のＮ末端部分配列に合致した。無傷ＥＣＤスペクトルは、提案される完全配列（完全配列は、ＮＩＳＴによって提供される）を使用して、トップダウン様式でさらに分析され、データは、ｍＡｂの軽鎖および重鎖の可変部分を網羅した。３ｅＶにおけるＥＣＤは、タンパク質内のジスルフィド結合環を開裂しなかった。
【０１０３】
ほぼ完全な配列包括度を取得するために、ＩｄｅＳ酵素（Ｇｅｎｏｖｉｓ）が、供給された。ジスルフィド結合のオンライン還元に関して、ＤＴＴが、無傷ｍＡｂの中に注入され、ＩｄｅＳ消化物が、１分にわたって脱塩カラム上で捕獲された。還元を適用することによって、軽鎖に関しては８４．７％、重鎖の可変部分（Ｆｄ’）に関しては７８．３％、重鎖の固定部分（ｓｃＦｃ）に関しては８４．７％の配列包括度が、取得された。さらに、ＥＣＤは、ｓｃＦｃ内のグリコシル化部位およびその質量を示し、ＣＩＤは、グリカン組成を知らせた。
【０１０４】
本教示は、種々の実施形態と併せて説明されるが、本教示がそのような実施形態に限定されることは意図されない。対照的に、本教示は、当業者によって理解されるであろうように、種々の代替物、修正、および均等物を包含する。
【０１０５】
さらに、種々の実施形態を説明する際に、本明細書は、ステップの特定のシーケンスとして、方法および／またはプロセスを提示している場合がある。しかしながら、方法またはプロセスが本明細書に記載されるステップの特定の順序に依拠しない限りにおいて、方法またはプロセスは、説明されるステップの特定のシーケンスに限定されるべきではない。当業者が理解するであろうように、ステップの他のシーケンスも、可能であり得る。したがって、本明細書に記載されるステップの特定の順序は、請求項上の限定として解釈されるべきではない。加えて、方法および／またはプロセスを対象とする請求項は、書かれる順序でのそれらのステップの実施に限定されるべきではなく、当業者は、シーケンスが変動され、依然として、種々の実施形態の精神および範囲内に留まり得ることを容易に理解することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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