(57)【要約】本発明は、軟骨損傷関連の疾患を処置するための、ヒアルロン酸及び間葉系幹細胞を含む医薬組成物に関する。ヒアルロン酸及び間葉系幹細胞が混合物として投与される場合と比較して、本発明に従ってヒアルロン酸を最初に投与した後に間葉系幹細胞を投与することで、関節炎に罹患した関節組織における疾患症状を軽減することに優位な効果を呈し、その上、体重による膝への負荷を減少させることができる。したがって、本発明の医薬組成物は、軟骨損傷関連の疾患の処置において有益に使用することができる。【選択図】  図５
2021526137.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸；及び
間葉系幹細胞
を含む、軟骨損傷関連の疾患を処置するための医薬組成物であって、
医薬組成物がそれを必要とする患者に投与される場合、ヒアルロン酸が最初に投与され、その後に間葉系幹の投与が続く、
医薬組成物。
【請求項２】
ヒアルロン酸が、０．５％（ｗ／ｖ）〜２．０％（ｗ／ｖ）の濃度を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
間葉系幹細胞が、１．０×１０５細胞／ｍｌ〜１．０×１０８細胞／ｍｌの量で含有される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ヒアルロン酸が、０．５％（ｗ／ｖ）〜２．０％（ｗ／ｖ）の濃度を有し、間葉系幹細胞が、１．０×１０５細胞／ｍｌ〜１．０×１０８細胞／ｍｌの量で含有される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
間葉系幹細胞が、臍帯血から誘導される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
軟骨損傷関連の疾患が、変形性関節症、半月板断裂、変形関節炎又は軟骨軟化症である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
変形性関節症が起こる部位が、顎関節、肩関節、肘関節、手首関節、手指関節、脊椎関節、股関節、膝関節、足首関節又はつま先関節である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
関節内投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
（ｉ）ヒアルロン酸を個体に投与するステップ；及び
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の後で間葉系幹細胞を個体に投与するステップ
を含む、軟骨損傷関連の疾患を処置するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸及び幹細胞を含む、軟骨損傷関連の疾患を処置するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
変形性関節炎は、関節を保護する軟骨の漸進的損傷及び変性変化により、関節を構成する骨、靱帯などが損傷されることで、炎症及び疼痛を引き起こす疾患である。変形性関節炎のための薬物治療レジメンのうちの１つとして使用されているヒアルロン酸（ＨＡ）は、関節軟骨におけるマトリックスの構成成分であり、プロテオグリカンを作製するのに関与するムコ多糖類の型である。現在では、ヒアルロン酸ナトリウム（ヒルラン（Ｈｙｒｕｒａｎ）（登録商標））は、関節軟骨を再生するために使用されている。
【０００３】
加えて、幹細胞に対する研究調査が２０００年代以降に活発になると、ヒアルロン酸が０．５％の濃度で、骨髄又は脂肪誘導間葉系幹細胞と混合されるとともに変形性関節症モデルに投与される研究が行われた（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｍａｔｈｉｅｓｓｅｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｈｅｒａｐｙ．、１９：１８、２０１７；Ｅｖａ  Ｋｒｉｓｔｏｎ−Ｐａｌら、Ｔｈｅ  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．、８１：７３〜７８、２０１７）。
【０００４】
さらに、間葉系幹細胞及びヒアルロン酸は、間葉系幹細胞が４％の濃度のヒアルロン酸と混合されるとともに混合物が損傷軟骨部域に充填されるというような方式で、外科手術に使用されている。しかしながら、ヒアルロン酸ナトリウムの関節内投与は、過敏症反応、一時的な疼痛、腫脹及び発熱感覚などの有害作用が伴うことがある（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋｏｒｅａｎ  Ｐａｉｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００４．１７．１７０〜１７４）。加えて、４％の濃度のヒアルロン酸は、こうした濃度が相対的に高いという点で不利な点を有し、したがって、ヒアルロン酸が注射製剤として使用されることに不都合を引き起こす。
【０００５】
そのため、ヒアルロン酸及び幹細胞を使用する関節炎の処置に関して、最適化された処置方法に対する連続的な研究調査の必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、ヒアルロン酸及び間葉系幹細胞を使用して軟骨損傷関連疾患を有効に処置するための方法を見出すために集中的な研究を行ってきた。結果として、本発明者らは、変形性関節症誘発ラットについて、ヒアルロン酸が最初に投与され、その後に間葉系幹細胞の投与が続く場合、ヒアルロン酸及び間葉系幹細胞が添加混合物で投与される場合と比較して、関節炎に対する優れた治療効果が観察されることを同定し；したがって、本発明を完了した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様において、ヒアルロン酸及び間葉系幹細胞を含む、軟骨損傷関連の疾患を処置するための医薬組成物であって、医薬組成物がそれを必要とする患者に投与される場合、ヒアルロン酸は最初に投与され、その後に間葉系幹の投与が続く、医薬組成物が提供される。
【０００８】
本発明の別の態様において、（ｉ）ヒアルロン酸を個体に投与するステップ；及び（ｉｉ）ステップ（ｉ）の後で、間葉系幹細胞を個体に投与するステップを含む、軟骨損傷関連の疾患を処置するための方法が提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に従って、ヒアルロン酸が最初に投与され、その後に間葉系幹細胞の投与が続く場合において、こうした順序で行われる投与は、関節炎に罹患した関節組織において優れた疾患症状寛解効果をもたらすことができ、ヒアルロン酸及び間葉系幹細胞が添加混合物で投与される場合と比較して、膝に負荷をかける重量の減少をもたらすことができる。そのため、本発明の医薬組成物は、軟骨損傷関連の疾患を処置するのに有効に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）、サフラニン−Ｏ、並びに抗ＩＩ型コラーゲン抗体を用いてＧ１群からＧ５群におけるラットの関節組織の染色を行うことによって得られる写真を例示する図である。
【図２】Ｇ１群からＧ５群におけるラットの関節組織の染色を行うこと、及び次いで、病変の重症度に依存して組織をスコア化することによって得られた結果をグラフとして例示する図である。
【図３】重量負荷が、Ｐａｎｌａｂインキャパシタンス（Ｉｎｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）試験器を使用してラットにおいて測定されている光景を例示する図である。
【図４】０週目及び１６週目でラットにおける重量負荷を測定することによって得られた結果を例示する図である。
【図５】Ｇ１群からＧ５群におけるラットの関節組織の、マイクロＣＴによって撮られた写真を例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
後文に、本発明が詳細に記載される。
【００１２】
本発明の一態様において、ヒアルロン酸及び間葉系幹細胞を含む、軟骨損傷関連の疾患を処置するための医薬組成物であって、医薬組成物がそれを必要とする患者に投与される場合、ヒアルロン酸が最初に投与され、その後に間葉系幹細胞の投与が続く、医薬組成物が提供される。
【００１３】
ヒアルロン酸は、モノマー、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＤ−グルクロン酸が互いに反復して連結されている線状多糖類ポリマーである。ヒアルロン酸は、創傷を治癒するのを助ける生体適合性物質である。
【００１４】
加えて、ヒアルロン酸は、エーテル結合の形成を介する水溶液に不溶性であり、その上、ヒアルロン酸がある特定の時間期間の間体内でヒアルロン酸の形状を維持した後に生体内で分解及び吸収されるのを可能にする優れた粘弾性及び高い水分吸収能力を有する。しかしながら、天然ヒアルロン酸は、体内に注射されるとヒアルロニダーゼによって急速に分解される。したがって、こうした分解速度を調節するため、天然ヒアルロン酸は、様々な手段で架橋することができる、又はベンジルアルコールなどの化学物質を使用する構造的修飾によってヒアルロン酸誘導体に作製し、次いで使用することができる。
【００１５】
ヒアルロン酸は、天然ヒアルロン酸、その塩、その誘導体又はその混合物であり得る。ヒアルロン酸の塩は、生体への適用に適当な任意の塩形態であり得、その例としては、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛、ヒアルロン酸コバルト、ヒアルロン酸テトラブチルアンモニウム、又はその任意の組合せを挙げることができる。加えて、ヒアルロン酸の誘導体は、架橋剤を使用して天然ヒアルロン酸又はその塩を架橋することによって得られるヒアルロン酸架橋生成物であり得る。
【００１６】
ヒアルロン酸は、溶液として注射製剤に調製し、使用することができる。ヒアルロン酸溶液は、天然ヒアルロン酸、その塩、その混合物又はその誘導体を、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水又は生体適合性生理食塩水に溶解させることによって得られる溶液を指す。ヒアルロン酸溶液は、投与の目的に依存して、希釈液、分散剤、界面活性剤、バインダー及び滑沢剤の添加によって、水溶液、懸濁液又はエマルジョンなどの注射製剤に調製することができる。
【００１７】
ヒアルロン酸溶液中のヒアルロン酸の濃度は、０．５％（ｗ／ｖ）〜２．０％（ｗ／ｖ）、０．７％（ｗ／ｖ）〜１．８％（ｗ／ｖ）、０．８％（ｗ／ｖ）〜１．６％（ｗ／ｖ）、又は１．０％（ｗ／ｖ）〜１．５％（ｗ／ｖ）であり得る。ヒアルロン酸溶液が上に記載されている濃度範囲内である場合において、ヒアルロン酸溶液は、優れた治療効果を呈することができ、シリンジ又はアンプルの容器に充填されるのに適当な粘度を有することができるので、ヒアルロン酸溶液は、個体の患部に容易に投与することができる。ヒアルロン酸は、関節内投与することができる。本発明のある実施形態において、ヒアルロン酸溶液を０．５％（ｗ／ｖ）の濃度で、シリンジに充填し、関節内投与した。
【００１８】
間葉系幹細胞は、様々な供給源から得られる間葉系幹細胞であり得る。具体的に、間葉系幹細胞は、ヒトを含めた哺乳動物から得ることができる。加えて、間葉系幹細胞は、様々な起源の組織から誘導される間葉系幹細胞であり得る。好ましくは、間葉系幹細胞は、臍帯血から誘導することができる。
【００１９】
間葉系幹細胞は、ヒアルロン酸溶液から別々の溶液として注射製剤に調製し、使用することができる。具体的に、間葉系幹細胞溶液は、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、生体適合性生理食塩水又は培養培地に間葉系幹細胞を懸濁させることによって得られる溶液であり得る。加えて、間葉系幹細胞溶液は、冷凍貯蔵されていた間葉系幹細胞が解凍された後、その凍結する溶液がそのまま含有されている状態の溶液であり得る。間葉系幹細胞溶液は、投与の目的に依存して、希釈液、分散剤、界面活性剤、バインダー及び滑沢剤の添加によって、水溶液、懸濁液又はエマルジョンなどの注射製剤に調製することができる。
【００２０】
間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞溶液中に、１×１０５細胞／ｍｌ〜１×１０８細胞／ｍｌの量で含有することができる。具体的に、間葉系幹細胞は、１×１０５細胞／ｍｌ〜１×１０８細胞／ｍｌ、２×１０５細胞／ｍｌ〜５×１０７細胞／ｍｌ、５×１０５細胞／ｍｌ〜２×１０７細胞／ｍｌ、１×１０６細胞／ｍｌ〜１×１０７細胞／ｍｌ、又は２×１０６細胞／ｍｌ〜５×１０６細胞／ｍｌの量で含有することができる。本発明のある実施形態において、５×１０４細胞で間葉系幹細胞を含有する溶液をシリンジに充填し、関節内投与した。
【００２１】
間葉系幹細胞は、個体の患部へのヒアルロン酸の投与の直後に投与することができる、又は間葉系幹細胞の投与は、１時間〜４８時間、３時間〜３６時間、６時間〜２４時間、又は９時間〜１２時間の間隔で行うことができる。
【００２２】
軟骨損傷関連の疾患は、機械的刺激又は炎症応答によって引き起こされる軟骨又は軟骨組織の損傷、変性症、損失又は欠損により起こる疾患を指す。軟骨損傷関連疾患は、軟骨若しくは軟骨組織の損傷、変性症、損失若しくは欠損によって引き起こされる疾患であり得る、又は軟骨若しくは軟骨組織の任意の損傷、変性症、損失若しくは欠損なく周辺の滑膜若しくは関節包の炎症によって引き起こされる疾患であり得る。具体的に、軟骨損傷関連の疾患としては、以下に限定されないが、変形性関節症、半月板断裂、変形関節炎又は軟骨軟化症を挙げることができる。
【００２３】
変形性関節症が起こる部位は、顎関節、肩関節、肘関節、手首関節、手指関節、脊椎関節、股関節、膝関節、足首関節又はつま先関節であり得る。医薬組成物は、関節に関節内投与することができる。
【００２４】
本発明の別の態様において、（ｉ）ヒアルロン酸を個体に投与するステップ；及び（ｉｉ）ステップ（ｉ）後で、間葉系幹細胞を個体に投与するステップを含む、軟骨損傷関連の疾患を処置するための方法が提供される。
【００２５】
ヒアルロン酸及び間葉系幹細胞は、医薬組成物において上に記載されているのと同じである。加えて、軟骨損傷関連の疾患は、医薬組成物において上に記載されているのと同じである。
【００２６】
個体は、軟骨損傷関連の疾患を患う個体であり得る。加えて、個体は、哺乳動物、具体的にヒトであり得る。
【００２７】
ヒアルロン酸の用量は、０．５ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇであり得る。本発明のある実施形態において、２５μｌのヒアルロン酸溶液を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、体重３００ｇ〜３５０ｇのラットに投与した。ここで、１匹のラットに投与されたヒアルロン酸の量は、体重１ｋｇ当たり０．７ｍｇ／ｋｇ〜０．８ｍｇ／ｋｇの用量に対応する０．２５ｍｇである。
【００２８】
加えて、間葉系幹細胞の用量は、１×１０６細胞／個体〜１×１０８細胞／個体であり得る。間葉系幹細胞の用量は、処置されるべき軟骨損傷部域のサイズに依存して増加又は減少することができる。一般に、約２ｃｍ２のサイズを有する成人膝関節について、間葉系幹細胞は約２×１０６〜１×１０８細胞で、投与することができる。
【００２９】
具体的に、間葉系幹細胞の用量は、５×１０４細胞／ｋｇ〜１×１０６細胞／ｋｇ、１×１０５細胞／ｋｇ〜７×１０５細胞／ｋｇ、又は２×１０５細胞／ｋｇ〜５×１０５細胞／ｋｇであり得る。加えて、ヒアルロン酸の用量は０．５ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇであり得、間葉系幹細胞の用量は１×１０６細胞／個体〜１×１０８細胞／個体であり得る。
【００３０】
ヒアルロン酸及び間葉系幹細胞は、必要ならば、当技術分野において使用される従来の方法、投与経路及び投与量に従って、個体に適切に投与することができる。投与経路の例として、関節内投与が記述され得る。加えて、適切な投与量及び投与数は、当技術分野において知られている方法に従って選択することができ、実際に投与されるべき組成物の量及び投与数は、防止又は処置されるべき症状の型、投与経路、性別、健康状態、食療法、個体の年齢及び体重、並びに疾患の重症度などの様々な因子によって適切に決定することができる。
【実施例】
【００３１】
後文に、以下の実施例を経てより詳細に、本発明が記載される。しかしながら、以下の実施例は、例示的な目的のみのためであり、本発明の範囲は、実施例に限定されない。
【００３２】
実施例１：変形性関節症誘発ラットの生成及び薬物投与
変形性関節症誘発ラットを生成するため、スプラーグドーリーラットに、５ｍｇ／ｋｇの用量でＺｏｌｅｔｉｌ  ５０（ＶＩＲＢＡＣ、Ｆｒａｎｃｅ）及び２．５ｍｇ／ｋｇの用量でキシラジン（ロンプン（Ｒｏｍｐｕｎ）（登録商標））、Ｂａｙｅｒ  ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の腹腔内投与によって麻酔をかけた。次いで、クリッパーを使用して、両膝の周りの部域を剃毛した。切開されるべき部域をポビドン及び７０％アルコールで消毒し、次いで、膝皮膚を切開した。周辺の皮膚組織を鈍的切開にかけることで、右大腿骨の遠位端部で関節表面を露出した。次いで、前十字靱帯を剪刀でカットし、４〜０ナイロンを使用して創傷を縫合した。７日後、軟骨の破壊及び疼痛を引き起こすヨード酢酸一ナトリウム（ＭＩＡ）を１ｍｌのシリンジに充填し、５０μｌの量にて６０ｍｇ／ｍｌの濃度で関節内投与した。左膝については、前十字靱帯をカットすることなくＭＩＡの投与のみを行った。
【００３３】
正常ラットモデル及び変形性関節症誘発ラットモデルを使用して、合計５つの群を作製した。各群におけるラットに、５ｍｇ／ｋｇの用量でＺｏｌｅｔｉｌ  ５０及び２．５ｍｇ／ｋｇの用量でキシラジンの腹腔内投与によって麻酔をかけた。投与の部域である右膝を、ポビドン及び７０％アルコールで消毒した。次いで、関節腔をＣアーム（ＡＲＣＡＤＩＳ  Ｖａｒｉｃ、ＳＩＥＭＥＮＳ  ＡＧ）で同定し、３１ゲージ針が備えられているインスリンシリンジを使用して薬物を右膝関節腔に投与した。投与後１６週目に、組織病理学的検査及び重量負荷試験（インキャパシタンス試験）を行った。
【００３４】
ここで、ヒアルロン酸を溶液として１０ｍｇ／ｍｌ（０．５％）の濃度で調製し、各々２５μｌの量で投与した。加えて、１ラットにつき、間葉系幹細胞を５×１０４細胞で投与した。使用された間葉系幹細胞（ＭＥＤＩＰＯＳＴ、Ｋｏｒｅａ）は、最初に臍帯血から単離されるとともに次いで液体窒素中で冷凍貯蔵された間葉系幹細胞を解凍することによって得られたものである。
【００３５】
加えて、Ｇ１群は、薬物が投与されなかった正常ラット群であり、Ｇ２群は、薬物が投与されなかった変形性関節症誘発ラット群であった。加えて、Ｇ３群は、ヒアルロン酸が０．５％（ｗ／ｖ）の濃度で投与された変形性関節症誘発ラット群であり、Ｇ４群は、０．５％（ｗ／ｖ）の濃度でヒアルロン酸、及び臍帯血誘導間葉系幹細胞が添加混合物で投与された変形性関節症誘発ラット群であった。Ｇ５群は、０．５％（ｗ／ｖ）の濃度でヒアルロン酸が最初に投与され、その後に臍帯血誘導間葉系幹細胞の投与が続いた変形性関節症誘発ラット群であった。
実施例２：組織病理学的検査
各群におけるラットを１６週目に屠殺し、関節組織を回収した。次いで、組織を脱ミネラル化、トリミング、脱水、パラフィン包埋及びミクロトームカッティングにかけることで、組織病理学的検査のための標本を調製した。次いで、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）、サフラニン−Ｏ、並びに抗ＩＩ型コラーゲン抗体を使用して染色を行い、光学顕微鏡（オリンパスＢＸ５３、日本）を使用して観察を行った（図１及び図２）。
【００３６】
加えて、染色を行うことによって得られた結果の、光学顕微鏡によって撮られた写真に基づいて、組織病理学的検査を行った。変形性関節症において観察された変化を評価することによって、組織病理学的検査を行い、ここで、以下の通りに分類されている７項目の点で、変化を評価した：ｉ）関節表面不規則性、ｉｉ）関節表面潰瘍化、ｉｉｉ）軟骨の細線維化、ｉｖ）軟骨損失によって引き起こされた肋軟骨下骨の露出、ｖ）変性症又は壊死、ｖｉ）軟骨染色の低減、及びｖｉｉ）線維軟骨の置換。各病変の重症度を以下の合計４グレードで評価した：病変がないのには０、軽度の病変には１、中程度の病変には２、及び重度の病変には３。それぞれの群について平均値を算出することによって得られた評価結果は、下記の表１に示されている。
【表１】
2021526137.tif 000003
【００３７】
表１に示されている通り、Ｇ５群は、潰瘍化、軟骨変性症、及び軟骨染色の低減の点で、Ｇ４群よりも有意に低くかった。加えて、Ｇ５群は、残りの項目の大部分の点でさえも、Ｇ４群よりも低い傾向を示した。
【００３８】
最初に、ｉ）関節表面不規則性に関して、Ｇ５群は、Ｇ４群よりも低いことが示された。全ての関節炎誘発群（Ｇ２〜Ｇ５）は、関節表面不規則性の点で、Ｇ１群（ｐ＜０．００１）よりも有意に高いことが観察された。
【００３９】
加えて、ｉｉ）関節表面潰瘍化に関して、Ｇ５群は、Ｇ２群（ｐ＜０．０５）よりも有意に低いことが示され；Ｇ４群は２．４を有し、一方、Ｇ５群は、Ｇ４群よりも低い１．９を有することが示された。全ての関節炎誘発群（Ｇ２〜Ｇ５）は、関節表面潰瘍化の点でＧ１群（ｐ＜０．００１）よりも有意に高いことが観察された。
【００４０】
さらに、ｉｉｉ）軟骨の細線維化に関して、Ｇ４群は２．９を有し、一方、Ｇ５群は、Ｇ４群よりも低い２．６を有していることが示された。全ての関節炎誘発群（Ｇ２〜Ｇ５）は、軟骨の細線維化の点でＧ１群（ｐ＜０．００１）よりも有意に高いことが示された。
【００４１】
加えて、ｉｖ）肋軟骨下骨の露出に関して、Ｇ５群は、Ｇ４群よりも低いことが示された。全ての関節炎誘発群（Ｇ２〜Ｇ５）は、肋軟骨下骨の露出の点で、Ｇ１群（ｐ＜０．００１又はｐ＜０．０１）よりも有意に高いことが示された。
【００４２】
さらに、ｖ）変性症に関して、Ｇ５群は、Ｇ４群よりも低いことが示された。全ての関節炎誘発群（Ｇ２〜Ｇ５）は、変性症の点で、Ｇ１群（ｐ＜０．００１又はｐ＜０．０１）よりも有意に高いことが示された。
【００４３】
加えて、ｖｉ）軟骨染色の低減に関して、Ｇ５群は、Ｇ４群よりも低いことが示された。全ての関節炎誘発群（Ｇ２〜Ｇ５）は、軟骨染色の低減の点で、Ｇ１群（ｐ＜０．００１又はｐ＜０．０１）よりも有意に高いことが示された。
【００４４】
さらに、ｖｉｉ）線維軟骨の置換に関して、Ｇ５群は、Ｇ４群よりも低いことが示された。全ての関節炎誘発群（Ｇ２〜Ｇ５）は、線維軟骨の置換の点で、Ｇ１群（ｐ＜０．００１又はｐ＜０．０１）よりも有意に高いことが示された。
実施例３：重量負荷試験
Ｐａｎｌａｂインキャパシタンス試験器を使用し、薬物投与後０週目及び１６週目にプラスチック固定具をラットに６０度の傾斜で直立させるようにすること、及び次いで、各群におけるラットの後肢に１０秒間適用された力の平均を算出することによって、重量負荷試験を行った。薬物が注射された後肢に分布された体重の百分率を、以下の算出式を介して測定した（図３）。
【００４５】
［算出式１］
2021526137.tif 000004
結果として、薬物投与後１６週目で、全ての関節炎誘発群（Ｇ２〜Ｇ５）は、重量負荷の点で、Ｇ１群（ｐ＜０．００１）よりも統計的に有意に低いことが示された。加えて、Ｇ４群は、Ｇ３群（ｐ＜０．０５）と比較して、有意に改善された重量負荷を有していた。さらに、Ｇ５群は、Ｇ３群及びＧ４群（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．００１）と比較して、有意に改善された重量負荷を有していた。これらの結果から、ヒアルロン酸が最初に投与され、その後に間葉系幹細胞の投与が続いた場合において、こうした順序で行われた投与は、重量負荷によって引き起こされる疼痛を緩和し得ることが同定された（図４）。
実施例４：マイクロコンピューター断層撮影（マイクロＣＴ）
薬物投与の前に及び１６週目で屠殺の後にマイクロＣＴによって、膝関節における損傷部域の写真を撮った。プログラム（ＨＰ  ＤＥＣｗｉｎｄｏｗｓ  Ｍｏｔｉｆ  ｆｏｒ  ＯｐｅｎＶＭＳ、バージョン１．７）を用いて、脛骨及び大腿骨の横断面画像における構造要素及び骨密度を分析することによって、膝関節の評価を行った。
【００４６】
最初に、それぞれの群について平均値を算出することによって得られた、脛骨についての分析結果は、下記の表２に示されている。
【表２】
2021526137.tif 000005
【００４７】
表２に示されている通り、薬物投与後１６週目で、Ｇ５群は、Ｇ２群及びＧ４群（ｐ＜０．０１）よりも有意に高い骨体積／合計体積を有していた。加えて、Ｇ５群は、Ｇ４群よりも低い骨表面部域／骨体積を有していた。
【００４８】
さらに、１６週目で、Ｇ５群は、骨梁厚を除く骨梁数及び骨梁分離の両方の点で、Ｇ４群と比較して、有意な差異又は改善が観察された傾向を有することが見出された。
【００４９】
加えて、それぞれの群について平均値を算出することによって得られた、大腿骨についての分析結果は、下記の表３に示されている。
【表３】
2021526137.tif 000006
【００５０】
表３に示されている通り、薬物投与後１６週目で、Ｇ５群は、Ｇ２群（ｐ＜０．０１）よりも有意に高い骨体積／合計体積を有し、その上、Ｇ４群よりも高い骨体積／合計体積を有していた。加えて、Ｇ５群は、Ｇ４群よりも低い骨表面部域／骨体積を有し、Ｇ５群は、Ｇ４群よりも高い骨梁数を有することが示された。Ｇ５群は、Ｇ２群（ｐ＜０．０５）よりも有意に低い骨梁分離を有し、その上、Ｇ４群よりも低い骨梁分離を有することが示された。
【００５１】
さらに、１６週目で、Ｇ５群は、骨梁厚を除く全ての試験項目の点で、Ｇ４群と比較して、有意な差異又は改善が観察された傾向を有することが同定された（図５）。
【図１】
2021526137.tif 000007
【図２】
2021526137.tif 000008
【図３】
2021526137.tif 000009
【図４】
2021526137.tif 000010
【図５】
2021526137.tif 000011
【国際調査報告】
2021526137.tif 000012
2021526137.tif 000013
2021526137.tif 000014
2021526137.tif 000015
2021526137.tif 000016
2021526137.tif 000017