(57)【要約】  １又は複数のオートファジー誘導剤を用いて、対象において毛髪再生を改善若しくは刺激し；脱毛を治療、阻害若しくは低減し；発毛を改善若しくは刺激し；色素沈着欠損を治療、阻害若しくは低減し；及び／又は色素沈着生成を改善若しくは刺激する方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において毛髪再生を改善若しくは刺激し；脱毛を治療、阻害若しくは低減し；発毛を改善若しくは刺激し；色素沈着欠損を治療、阻害若しくは低減し；及び／又は色素沈着生成を改善若しくは刺激するための方法であって、１又は複数のオートファジー誘導剤を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記１又は複数のオートファジー誘導剤は、ＡＴＰシンターゼ阻害剤、ＴＯＲ阻害剤、ＡＭＰＫアクチベーター及び／又はＴＯＲ非依存性のオートファジーエンハンサーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１又は複数のオートファジー誘導剤は、マクロライド、例えばオリゴマイシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１又は複数のオートファジー誘導剤は、ラパマイシン又はラパマイシン誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記１又は複数のオートファジー誘導剤は、ビグアナイド、例えばメトホルミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記１又は複数のオートファジー誘導剤は、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチド（ＡＩＣＡＲ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記１又は複数のオートファジー誘導剤は、ＳＭＥＲ２８である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記１又は複数のオートファジー誘導剤は、マクロライド、例えばオリゴマイシン、ラパマイシン又はラパマイシン誘導体、ビグアナイド、例えばメトホルミン、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチド（ＡＩＣＡＲ）、ＳＭＥＲ２８及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記１又は複数のオートファジー誘導剤は、経口、非経口又は局所投与のために製剤化される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記１又は複数のオートファジー誘導剤は、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、ペースト剤又はローション剤として製剤化される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]  関連出願の相互参照
[0002]  本願は、２０１８年４月１６日に出願された米国特許出願第６２／６５８，１１３号（その全体が参照により本明細書中に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
[0003]  ＥＦＳ−ＷＥＢにより提出された配列表の参照
[0004]  サイズが１．１３ｋｂである、「20190415_034044_183WO1_seq_ST25」という名称のＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表の内容が２０１９年４月１５日に作成され、EFS-Webを介して本願ととともに電子的に提出され、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【０００３】
[0005]  政府支援の承認
[0006]  本発明は、政府の支援を得て、アメリカ国立衛生研究所によって付与された認可番号ＨＬ０９０５５３及びＡＧ０４９７５３の下で作成された。政府は、本発明における特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
[0007]  発明の背景
[0008]  毛髪の生物学的及び心理学的重要性は、十分に理解されている。哺乳類の発毛は、毛包の休止期（静止）相、成長期（再生）相及び退行期（退化）相の環状的反復からなる。この毛包サイクルは、毛包幹細胞（ＨＦＳＣ）の静止及び活性化を制御する内因性及び外因性シグナルの両方により調節される。不適切なＨＦＳＣの活性化及び増殖が、老化を含む極めて多数の生物学的及び病理学的状態下での脱毛症の根底にある。ＨＦＳＣの活性化及び成長期の開始を促進し得る分子は、毛髪再生がどのように調節されるかを明らかにすることと、治療的及び美容的介入をもたらすこととの両方に役立つことがあることから、集中的に探索されている。
【０００５】
[0009]  細胞成分を分解し、再利用するための基本的プロセスとして、オートファジーは、栄養飢餓及び他の有害な環境条件への適応にとって重大な意味を有するとともに、かかるシグナルによって調節される。オートファジーは、ミスフォールド又は損傷したタンパク質及び損傷した細胞小器官の除去を通したタンパク質恒常性の品質管理にとっても重要である。オートファジーの欠損は、必然的に神経変性及び他の疾患に関連することがある。オートファジーは、年齢とともに減少し、高齢者におけるオートファジー関連疾患（例えば、がん及び神経変性疾患）の有病率上昇に寄与する可能性が高い。静止状態及び幹細胞性を維持するため、造血幹細胞内での健常な活性ミトコンドリアのオートファジー除去が求められ、オートファジーは、静止状態の筋肉幹細胞の活性化における栄養要求を満たす。皮膚では、オートファジーは、上皮及び真皮幹細胞の自己再生及び分化にとって必要であるが、毛包幹細胞内でのその役割は、議論の余地を残している。一方で、オートファジーは、オートファジー関連遺伝子７（Ａｔｇ７）欠損マウスからの皮膚移植片が異常な発毛を示すことから、発毛にとって必要とされることがある。他方で、心理学的ストレスは、オートファジー及び毛髪サイクルの遅延を誘導することがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
[0010]  脱毛又は脱毛症は、世界中で数百万人を悩ませ、老化、ホルモン機能障害、自己免疫のために又はがん治療の副作用として生じ得る。毛髪を再生させるために用いることができる方法及び組成物は、高度に探求されているが、不十分である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
[0011]  発明の概要
[0012]  いくつかの実施形態では、本発明は、毛髪再生の刺激を、それを必要とする対象において行う方法であって、１又は複数のオートファジー誘導剤を対象に投与することを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、新たな発毛の刺激を、それを必要とする対象において行う方法であって、１又は複数のオートファジー誘導剤を対象に投与することを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、対象において脱毛を治療、阻害又は低減するための方法であって、１又は複数のオートファジー誘導剤を対象に投与することを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、対象において発毛を改善又は刺激するための方法であって、１又は複数のオートファジー誘導剤を対象に投与することを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、対象において色素沈着欠損を治療、阻害又は低減するための方法であって、１又は複数のオートファジー誘導剤を対象に投与することを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、対象において色素沈着生成を改善又は刺激するための方法であって、１又は複数のオートファジー誘導剤を対象に投与することを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、脱毛は、老化している対象の結果である。いくつかの実施形態では、色素沈着欠損は、老化している対象の結果である。いくつかの実施形態では、対象は、老化しつつあり、及び／又は対象は、老化した対象である。いくつかの実施形態では、１又は複数のオートファジー誘導剤は、治療有効量で投与される。いくつかの実施形態では、治療有効量は、所与の期間にわたる数用量、例えば１週間又はそれを超えて一日量として投与される。
【０００８】
[0013]  いくつかの実施形態では、１又は複数のオートファジー誘導剤は、対象上の新たな発毛が所望される領域に投与される。いくつかの実施形態では、その領域は、より早期に存在した量より少ない毛髪量を有する。いくつかの実施形態では、その領域は、毛髪が存在しない。いくつかの実施形態では、その領域は、発毛を低減又は阻害する疾患又は状態に起因して毛髪が存在しない。いくつかの実施形態では、その領域は、損傷に起因して毛髪が存在しない。いくつかの実施形態では、その領域は、化学療法及び／又は放射線療法に起因して毛髪が存在しない。いくつかの実施形態では、その領域は、手術に起因して毛髪が存在しない。いくつかの実施形態では、対象は、甲状腺障害を有する。いくつかの実施形態では、対象は、下垂体障害を有する。いくつかの実施形態では、対象は、円形脱毛症を有する。いくつかの実施形態では、対象は、成長期脱毛及び／又は休止期脱毛を有する。
【０００９】
[0014]  いくつかの実施形態では、治療有効量は、単回用量として投与される。いくつかの実施形態では、治療有効量は、少なくとも２回の用量、少なくとも３回の用量、少なくとも４回の用量、少なくとも５回の用量又はそれを超える用量で投与される。いくつかの実施形態では、治療有効量は、毎日投与される。いくつかの実施形態では、治療有効量は、一日おきに投与される。
【００１０】
[0015]  いくつかの実施形態では、方法は、補足剤を対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、補足剤は、１又は複数の成長因子を含む。いくつかの実施形態では、成長因子は、ＴＧＦ−β２、ＩＧＦ−１、ＫＧＦ又はＨＧＦを含む。いくつかの実施形態では、補足剤は、１又は複数のオートファジー誘導剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、補足剤は、１又は複数のオートファジー誘導剤とともに順次投与される。いくつかの実施形態では、補足剤及び１又は複数のオートファジー誘導剤は、統合された剤形として投与される。いくつかの実施形態では、補足剤及び１又は複数のオートファジー誘導剤は、別個の剤形として投与される。いくつかの実施形態では、剤形は、成長期に移行するように細胞を刺激するために製剤化される。
【００１１】
[0016]  いくつかの実施形態では、１又は複数のオートファジー誘導剤の投与後の対象における毛包の数は、１又は複数のオートファジー誘導剤の投与前の対象における毛包の数と比べてより多い。いくつかの実施形態では、１又は複数のオートファジー誘導剤の投与後の対象における毛髪の重量は、１又は複数のオートファジー誘導剤の投与前の対象における毛髪の重量と比べてより大きい。いくつかの実施形態では、１又は複数のオートファジー誘導剤の投与後の対象における毛髪の毛幹長は、１又は複数のオートファジー誘導剤の投与前の対象における毛髪の毛幹長と比べてより迅速に増加する。いくつかの実施形態では、１又は複数のオートファジー誘導剤の投与後の対象における毛髪の成長速度は、１又は複数のオートファジー誘導剤の投与前の対象における毛髪の成長速度と比べて増加する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
【００１２】
[0017]  いくつかの実施形態では、１又は複数のオートファジー誘導剤は、組成物の形態で投与される。いくつかの実施形態では、１又は複数のオートファジー誘導剤は、経口、非経口又は局所投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、１又は複数のオートファジー誘導剤は、局所投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、１又は複数のオートファジー誘導剤は、ゲル剤として製剤化される。いくつかの実施形態では、１又は複数のオートファジー誘導剤は、クリーム剤として製剤化される。いくつかの実施形態では、１又は複数のオートファジー誘導剤は、軟膏剤として製剤化される。いくつかの実施形態では、１又は複数のオートファジー誘導剤は、ローション剤として製剤化される。
【００１３】
[0018]  前述の概要及び以下の詳細な説明の両方は、あくまで例示的且つ説明的であり、特許請求の範囲に従い、本発明のさらなる説明を提供することが意図される。添付の図面は、本発明のさらなる理解を提供するために含まれ、内包され、本明細書の一部を構成し、本発明のいくつかの実施形態を例示し、且つ説明ととともに本発明の原理を説明する。
【００１４】
[0019]  図面の説明
[0020]  本発明は、以下の図面を参照することによってさらに理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１−１】[0021]α−ＫＧを用いる局所的処置により毛髪再生が誘導される。パネル（Ａ）は、α−ＫＧの構造式である。パネル（Ｂ）では、α−ＫＧは、毛髪再生を誘導する。雄マウスは、出生後４４日目（休止期）に剪毛され、媒体対照（約２５０μＬのＰＬＯ基剤中のＤＭＳＯ）又はα−ＫＧ（ＤＭＳＯ中に溶解され、次いで３２ｍＭの最終時に約２５０μＬのＰＬＯ基剤に添加された）で一日おきに３９日にわたり局所的に処置された。処置による成長期誘導を示す、α−ＫＧ処置動物の皮膚におけるメラニン色素沈着は、早くも１２日目に視認可能になり；媒体処置マウスは、少なくとも３９日間、有意な色素沈着を示さなかった。α−ＫＧ処置マウスの色素性皮膚領域からの発毛が約５〜７日以内に視認できた。示される写真は、処置後３９日目に撮られ、そのときまでに、α−ＫＧで処置されたマウスは、全体的な発毛を示した一方、対照マウスは、一部の動物でのランダムな毛髪パッチを除き、全体的に依然として毛髪を有しなかった。動物の総数：対照（３２）、α−ＫＧ（３４）。雌マウスでは、α−ＫＧによる類似効果が認められた（図６、パネルＤに示される）。パネル（Ｃ）は、α−ＫＧで処置されたマウス皮膚対対照で処置されたマウス皮膚における（成長期の発症を示す）メラニン色素沈着の外観についての定量化である。色素沈着スコア化が方法中に記載される。パネル（Ａ）に示される動物の数：対照（４）、α−ＫＧ（４）。
【図１−２】パネル（Ｄ）は、３２ｍＭのα−ＫＧで処置されたマウスからのヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色皮膚組織切片のマイクロ写真であり、新しい毛包及び拡大した毛球、細長い毛幹及び肥厚した皮層を示す。ヘマトキシリンは、核酸をパープリッシュブルーに染色する塩基性色素であり；エオシンは、細胞質及び細胞外マトリックス（例えば、コラーゲン）を淡紅色に染色する酸性色素である。細胞増殖についてのマーカーであるＫｉ−６７に対する免疫組織化学によると、新しい毛包の形成がさらに示された。ＩＬ−６及びＦ４／８０は、それぞれ炎症性サイトカイン及びマクロファージマーカーである。ＩＬ−６及びＦ４／８０陽性の炎症性皮膚に対する対照が図６のパネルＥに示される。
【図１−３】パネル（Ｅ）は、６時間、２４時間及び５日にわたる、α−ＫＧで処置されたマウスの休止期皮膚における、ＬＣ３、ｐ６２及びリン酸化されたBeclin 1を含むオートファジー関連マーカーの誘導である。皮膚色素沈着の欠如によって確認される通り、皮膚は、処置期間中の休止期において維持される。各レーンは、異なる動物から得られる。動物の数：各処置において４匹。
【図２−１】[0022]オリゴマイシン及びラパマイシンを用いる局所的処置により毛髪再生が誘導される。パネル（Ａ）は、オリゴマイシンの構造である。パネル（Ｂ）では、オリゴマイシン（１００μＭ）により毛髪再生が誘導される。雄マウスは、出生後４４日目に剪毛され、一日おきに局所的に処置された。示される写真は、処置後２３日目に撮られた。動物の数：対照（２３）、オリゴマイシン（２３）。雌マウスでは、オリゴマイシンによる類似の効果が認められた（図６、パネルＤ）。パネル（Ｃ）は、オリゴマイシンで処置されたマウス皮膚対対照で処置されたマウス皮膚におけるメラニン色素沈着の外観についての定量化である。動物の数：対照（３）、オリゴマイシン（３）。
【図２−２】パネル（Ｄ）は、１００μＭのオリゴマイシンで処置されたマウスからのＨ＆Ｅ及びＫｉ−６７染色皮膚組織切片のマイクロ写真である。パネル（Ｅ）は、指定化合物で５日間処置されたマウスの休止期皮膚におけるオートファジー関連マーカーのウエスタンブロット解析である。Ctrl、対照；Oligo、オリゴマイシン；Rapa、ラパマイシン。
【図２−３】パネル（Ｆ）は、ラパマイシンの構造である。パネル（Ｇ）では、ラパマイシン（１．６μＭ）により毛髪再生が誘導される。雄マウスは、出生後４３日目に剪毛され、一日おきに局所的に処置された。写真は、処置後３７日目に撮られた。動物の数：対照（１８）、ラパマイシン（１７）。１００ｎＭのラパマイシンにより、１．６μＭと類似の結果が得られた（図７）。雌マウスでは、ラパマイシンによる類似の効果が認められた（図７、パネルＢ）。しかし、１６μＭのラパマイシンの結果、脱毛及び開いた創傷が生じ（データは示さず）、これは、ＨＦＳＣ活性化にとって必要とされることが報じられたｍＴＯＲのより重度の阻害に起因することがある。パネル（Ｈ）は、ラパマイシン（１．６μＭ）で処置されたマウス皮膚対対照で処置されたマウス皮膚におけるメラニン色素沈着の外観についての定量化である。動物の数：対照（３）、ラパマイシン（３）。パネル（Ｉ）は、パネル（Ｇ）に示されるマウスからのＨ＆Ｅ及びＫｉ−６７染色皮膚組織切片のマイクロ写真である。
【図３−１】[0023]毛髪再生は、ＡＩＣＡＲ、メトホルミン及びα−ＫＢにより誘導される。パネル（Ａ）は、ＡＩＣＡＲの構造である。パネル（Ｂ）では、ＡＩＣＡＲ（１６ｍＭ）により毛髪再生が誘導される。雄マウスは、出生後４４日目に剪毛され、一日おきに局所的に処置された。写真は、処置後４１日目に撮られた。動物の数：対照（１２）、ＡＩＣＡＲ（１１）。雌では、類似の効果が認められた（非表示）。パネル（Ｃ）は、パネル（Ｂ）からのマウスにおける皮膚色素沈着についての定量化である。動物の数：対照（３）、ＡＩＣＡＲ（３）。パネル（Ｄ）は、１６ｍＭのＡＩＣＡＲで処置されたマウスからのＨ＆Ｅ及びＫｉ−６７染色皮膚組織切片である。パネル（Ｅ）は、メトホルミンの構造である。パネル（Ｆ）では、メトホルミン（１６０ｍＭ）により毛髪再生が誘導される。雄マウスは、出生後４３日目に剪毛され、メトホルミン又は媒体対照（この実験ではＨ２Ｏ）で一日おきに局所的に処置された。写真は、処置後４８日目に撮られた。動物の数：対照（１３）、メトホルミン（１２）。雌では、類似の効果が認められた（非表示）。
【図３−２】[0024]  パネル（Ｇ）は、パネル（Ｆ）からのマウスにおける皮膚色素沈着についての定量化である。動物の数：対照（３）、メトホルミン（３）。パネル（Ｈ）は、パネル（Ｆ）に示されるマウスからのＨ＆Ｅ及びＫｉ−６７染色皮膚組織切片である。パネル（Ｉ）は、α−ＫＢの構造である。パネル（Ｊ）では、経口α−ＫＢ（飲料水中８ｍＭ）処置により、高齢雌マウスにおける脱毛がなくなる。写真は、１３１週齢時に撮られた。動物の数：対照（５）、α−ＫＢ（５）。パネル（Ｋ）では、局所α−ＫＢ（３２ｍＭ）により、若齢雄マウスにおける毛髪再生が誘導される。マウスは、出生後４４日目に剪毛され、一日おきに局所的に処置された。写真は、処置後３９日目に撮られた。動物の数：対照（１８）、α−ＫＢ（１８）。雌では、類似の効果が認められた（非表示）。パネル（Ｌ）は、パネル（Ｋ）からのマウスにおける皮膚色素沈着についての定量化である。動物の数：対照（４）、α−ＫＢ（４）。
【図３−３】パネル（Ｍ）は、３２ｍＭのα−ＫＢで処置されたマウスからのＨ＆Ｅ及びＫｉ−６７染色皮膚組織切片である。パネル（Ｎ）は、指定化合物で５日間処置されたマウスの休止期皮膚におけるオートファジー関連マーカーのウエスタンブロット解析である。
【図４−１】[0025]ＳＭＥＲ２８は、オートファジー依存性に毛髪再生を誘導する。パネル（Ａ）は、ＳＭＥＲ２８の構造である。パネル（Ｂ）は、１ｍＭのＳＭＥＲ２８で５日間処置されたマウスの休止期皮膚におけるオートファジー関連マーカーのウエスタンブロット解析である。各レーンは、別々のマウスからに相当する。パネル（Ｃ）では、雄マウスが出生後４５日目に剪毛され、１ｍＭのＳＭＥＲ２８で毎日処置され；処置後２３日目に写真が撮られた。一日おきの処置によると、類似の結果が示された（非表示）。動物の数：対照（６）、ＳＭＥＲ２８（６）。雌において、類似の効果が認められた（非表示）。
【図４−２】パネル（Ｄ）では、ＳＭＥＲ２８（２ｍＭ）に誘導された毛髪再生は、オートフィニブ（autophinib）（４ｍＭ）との共処置により阻害される。マウスは、出生後５１日目に剪毛され、一日おきに局所的に処置された。処置後２０日目に写真が撮られ；対応する皮膚組織切片の組織学が示された。動物の数：対照（２０）、ＳＭＥＲ２８（１６）、ＳＭＥＲ２８＋オートフィニブ（７）、オートフィニブ（７）。
【図５】[0026]オートファジーレベルは、毛包サイクルステージを示し、成長期誘導時に上昇した。マウスは、雄について出生後９３日目、雌について出生後９２日目に剪毛され、毛髪サイクル進行について監視された。指定された各ステージ時のマウスは、オートファジーマーカーのウエスタンブロット解析のために屠殺された。Ｔ、休止期；Ａ、成長期；Ｃ、退行期。
【図６−１】[0027]雄及び雌マウスの両方において、α−ＫＧ又はオリゴマイシン処置により毛髪再生が誘導され得る。図１に関して、パネル（Ａ）は、毛髪再生についての陽性対照としてのミノキシジル（ＰＬＯ基剤中５％）である。示される写真は、処置後２２日目に撮られた。動物の数：対照（３）、ミノキシジル（３）、α−ＫＧ（３）。
【図６−２】パネル（Ｂ）では、α−ＫＧは、８週齢動物において、図１のパネルＡ中の６．５週齢マウスと比べてより迅速な毛髪再生を誘導する。雄マウスは、出生後５７日目（休止期）に剪毛され、３２ｍＭのα−ＫＧで一日おきに局所的に処置された。示される写真は、処置後２０日目に撮られた。動物の数：対照（４）、α−ＫＧ（３）。パネル（Ｃ）は、（Ａ）からのマウスにおける皮膚色素沈着についての定量化である。α−ＫＧ処置動物の色素沈着は、早くも７日目に視認可能になり、背側の毛髪範囲全体が処置後２０日目に認められた。動物の数：対照（３）、α−ＫＧ（３）。パネル（Ｄ）では、α−ＫＧ及びオリゴマイシンによっても雌動物において毛髪再生が刺激される。雌マウスは、出生後５８日目（休止期）に剪毛され、媒体対照（ＤＭＳＯ）、α−ＫＧ（１６ｍＭ）又はオリゴマイシン（１０μＭ）で一日おきに局所的に処置された。示される写真は、処置後２６日目に撮られた。動物の数：対照（９）、α−ＫＧ（９）、オリゴマイシン（１０）。
【図６−３】パネル（Ｅ）は、損傷皮膚におけるＩＬ−６及びＦ４／８０を示す陽性対照である。皮膚病変、例えば喧嘩傷又は咬傷を有する８週齢雄マウスが用いられた。パネル（Ｆ）は、α−ＫＧ（＊Ｐ＝０．０２６；ｔ検定、両側、２サンプル不等分散による）及びＳＭＥＲ２８（＊Ｐ＝０．０１７；ｔ検定、両側、２サンプル不等分散による）処置皮膚におけるｐ６２転写物レベルの上昇を示す定量ＲＴ−ＰＣＲである。内部対照として、ハウスキーピング遺伝子Ｂ２ｍ（β２−ミクログロブリン）が用いられた。平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）がプロットされる。
【図７】[0028]毛髪再生に対するラパマイシンの効果。図２に関連する。パネル（Ａ）では、１００ｎＭのラパマイシンによっても毛髪再生が促進される。雄マウスは、出生後４５日目（休止期）に剪毛され、媒体対照（ＤＭＳＯ）又は１００ｎＭのラパマイシンで一日おきに局所的に処置された。示される写真は、処置後２３日目に撮られた。動物の数：対照（７）、ラパマイシン（７）。パネル（Ｂ）では、ラパマイシンによっても雌動物で毛髪再生が促進される。雌マウスは、出生後５８日目（休止期）に剪毛され、媒体対照（ＤＭＳＯ）又はラパマイシン（１．６μＭ）で一日おきに局所的に処置された。動物の数：対照（９）、ラパマイシン（１１）。
【図８】[0029]α−ＫＧが毛髪再生を誘導するため、オートファジーが必要とされる。図４に関連する。パネル（Ａ）では、オートフィニブは、α−ＫＧによる毛髪再生を阻害する。雄マウスは、出生後５３日目（休止期）に剪毛され、媒体対照（ＤＭＳＯ）、オートフィニブ（４ｍＭ）、α−ＫＧ（６４ｍＭ）又はα−ＫＧ（６４ｍＭ）及びオートフィニブ（４ｍＭ）で一緒に一日おきに局所的に処置された。示される写真は、処置後２０日目に撮られた。動物の数：各処置あたり４匹。パネル（Ｂ）は、処置後５日目のマウス皮膚におけるオートファジー関連マーカーのウエスタンブロット解析である。パネル（Ｃ）では、バフィロマイシンＡ１もα−ＫＧによる毛髪再生を阻害する。雄マウスは、出生後５２日目（休止期）に剪毛され、バフィロマイシン（２００μＭ）と一緒に媒体対照（ＤＭＳＯ）、バフィロマイシン（２００μＭ）、α−ＫＧ（６４ｍＭ）又はα−ＫＧ（６４ｍＭ）で一緒に一日おきに局所的に処置された。示される写真は、処置後２１日目に撮られた。動物の数：各処置あたり４匹。
【図９】０〜１００のマウス毛髪サイクル進行スコアを表す画像。図１〜図３に関連する。マウスは、剪毛され、毛髪サイクル進行について監視された。皮膚色素沈着レベル及び毛幹密度に基づき、０〜１００の任意の値が割り当てられ、０は、発毛なし（及び色素沈着なし）を示し、より大きい数は、高密な発毛のより暗い皮膚及びより大きい領域に対応する。例えば、５０のスコアは、背側皮膚領域の５０％に対する完全な長さの発毛又は背側皮膚領域の１００％に対する色素沈着があり、毛幹を依然として伴わない場合に割り当てられた。７０のスコアは、背側皮膚の７０％に対する完全な長さの発毛又は背側皮膚の１００％に対する色素沈着があり、約３０〜４０％の毛幹を伴う場合に割り当てられた。１００の値は、背側皮膚の１００％に対する完全な長さの発毛を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
[0030]  発明の詳細な説明
[0031]  オートファジーを誘導し、それにより他に休止期皮膚における毛髪再生（例えば、発毛及び毛包再生）を刺激する化合物が本明細書に開示される。それは、α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）、α−ケト酪酸（α−ＫＢ）であり、ＴＯＲ及びＡＭＰＫシグナル伝達を侵害するラパマイシン及びメトホルミンなどの薬剤は、オートファジーを誘導し、それにより毛髪再生を刺激する。これらの薬剤による毛髪再生の刺激は、特定のオートファジー阻害剤により遮断され、オートファジーと毛髪再生との間の機構的結合が示唆される。この考えに合致して、増強されたオートファジーは、天然毛包サイクル中の成長期移行時に検出される。本明細書における実験では、オートファジーの誘導を強いることにより、休止期毛包の休止が活性化され得ることが示される。
【００１７】
[0032]  本明細書に開示される通り、α−ＫＧ、オリゴマイシン、ラパマイシン及びＳＭＥＲ２８で処置されたマウスでは、ときに背側の休止期皮膚全体に対して迅速な成長期移行が認められたが、α−ＫＢ、メトホルミン又はＡＩＣＡＲで処置されたマウスでも媒体対照マウスでも認められなかった。一時的に、α−ＫＢ、ＡＩＣＡＲ又はメトホルミンによる色素沈着（成長期移行）の誘導は、はるかに長く、例えば時間尺度でα−ＫＧ、オリゴマイシン又はラパマイシンによる約５〜１４日と比べて約１２〜１８日かかる。これは、オートファジーの調節に対するｍＴＯＲ阻害による差次的効果及びＡＭＰＫ活性化による差次的効果を反映する可能性がある。代謝とオートファジーとの間のクロストークは、複雑である。オートファジーは、一般に、ＡＴＰの有効性における制限又はグルコース及びアミノ酸を含む必須栄養素の欠乏によって誘導されるが、ＡＴＰは、オートファジーに要求される。飢餓及びそれに続くエネルギー負荷の減少及びＲＯＳレベルの上昇は、オートファジーの強力なアクチベーターである。
【００１８】
[0033]  オートファジーの誘導は、長寿に対する食事制限（ＤＲ）の効果に関連又は関与している同じ細胞エネルギー代謝制御因子の一部によって媒介される。代謝産物α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）は、虫及び培養された哺乳動物細胞の両方においてオートファジーを増強する。したがって、本明細書に開示される通り、α−ＫＧが毛髪再生を刺激し得るか否かは、インビボＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス背側皮膚モデルを用いて試験された。脱毛パターンを処置するために用いられる血管拡張薬であるミノキシジルは、典型的には毛髪研究に関する多数の論文中で陽性対照として用いられていることから、比較対象に含められた（図６、パネルＡ）。６．５週齢（出生後４４日目）の雄マウスは、背側皮膚毛包が休止期相にあるとき、背中を剪毛された。α−ＫＧ又は媒体対照処置が一日おきに局所的に適用された。α−ＫＧ処置により毛髪再生が強烈に増強される（図１、パネルＡ〜Ｂ）。黒マウスにおける成長期は、濾胞性メラノサイトのメラニン形成活性が毛髪サイクルの成長期段階に厳密に共役されることから、皮膚を通して視認できるメラニン色素により巨視的に認識可能である。図１のパネルＢに示される実験では、α−ＫＧによる処置後１２日目までに皮膚色素沈着が視認できた（図１、パネルＣ）。それに対し、媒体処置対照マウスでは、動物が組織学的及び生化学的分析のために屠殺されたときである少なくとも３９日目まで、色素沈着がないか又は散在する色素斑がわずか数か所であることは、明白であった。約５〜７日以内のα−ＫＧ処置マウスの色素性皮膚領域から毛髪が成長し、処置後３９日目までに、α−ＫＧ処置マウスは、強力な発毛を示し；それに対し、対照マウスは、発毛を全体的にほとんどか又は全く示さなかった（図１、パネルＢ）。成長期開始及び毛髪再生に対するα−ＫＧの効果は、マウスが後に８週齢時の休止期に処置されたときでもより劇的であった（図６、パネルＢ〜Ｃ）。α−ＫＧの発毛刺激は、性別非依存性であり；α−ＫＧは、雌マウスにおいて同様の毛髪刺激効果を示した（図６、パネルＤ）。
【００１９】
[0034]  α−ＫＧ処置マウスにおける毛包の形成及び分化は、同様に組織学的分析によって実証された（図１、パネルＤ）。さらなる濾胞及び高増殖マーカーＫｉ−６７の発現がα−ＫＧ処置群において認められ、成長期相の誘導が示された（図１、パネルＤ）。休止期皮膚において、α−ＫＧは、早くも処置後７日目に新たな成長期の波を開始させた。炎症及び創傷の修復は、毛髪再生など、組織を刺激することが知られていることから、本明細書中の実験では、皮膚損傷又は他の異常な皮膚状態を生じさせない分子が注目された。（別段の指示がない限り）この試験に記載のα−ＫＧ又は他の小分子処置による皮膚刺激又は炎症の証拠は、外観検査により、またＩＬ−６及びＦ４／８０染色による確認として認められなかった（図１、パネルＤ及び図６、パネルＥ）。
【００２０】
[0035]  再生実験用マウスとして同齢のマウスも急性処置され、早期の生化学的変化について分析された。処置の２４時間後及び５日後の両方において、α−ＫＧ処置マウス皮膚におけるオートファジー誘導の増強がＬＣ３のウエスタンブロット解析により支持された（図１、パネルＥ）。マウス皮膚において、オートファジー分解の指標として汎用されるオートファジー基質ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１の発現もα−ＫＧによるオートファジー誘導（図１、パネルＥ）及びラパマイシン誘導性オートファジー（下記を参照されたい）とともに増強された。これは、ｐ６２転写の上方制御を通した補償に起因する可能性が高い（図６、パネルＦ）。
【００２１】
[0036]  α−ＫＧによる寿命増加は、分子レベルにおいて、高度に保存されたミトコンドリアＡＴＰシンターゼ／ＡＴＰアーゼ（複合体Ｖ）の直接的阻害及びその後の下流のラパマイシンの標的（ＴＯＲ）活性の低下を通して媒介されることが見出された。α−ＫＧによる毛髪再生もＡＴＰシンターゼ阻害によって媒介されることがあるか否かについても試験された。複合体Ｖ阻害剤オリゴマイシンを用いる局所的処置により、雄（図２、パネルＡ〜Ｄ）及び雌（図６、パネルＤ）マウスの両方で毛髪再生が同様に促進された。さらに、α−ＫＧと同様に、オリゴマイシン処置により、ＴＯＲ阻害及びオートファジー活性化がもたらされる。ＬＣ３発現によって示される通り、オートファジーの増強が局所的オリゴマイシン処置マウス皮膚において検出された（図２、パネルＥ）。
【００２２】
[0037]  ラパマイシンの標的（ＴＯＲ）タンパク質は、長寿におけるＤＲの効果に関する主なメディエーターである。例えば、ラパマイシンによるＴＯＲの阻害は、オートファジーを誘発する。したがって、ラパマイシンが毛髪再生を増強するか否かについても試験された。図２のパネルＦ〜Ｉ及び図７に示される通り、局所的ラパマイシン処置により、肉眼的及び組織学的方法の両方による判定として毛髪再生が促進された。ラパマイシン処置マウスの休止期皮膚において、オートファジー性のＬＣ３、ｐ６２及びｍＴＯＲ依存性のリン酸化されたBeclin 1 S14が増加した（図２、パネルＥ）。一貫して、Beclin 1 S14リン酸化は、α−ＫＧ（図１、パネルＥ）及びオリゴマイシン（図２、パネルＥ）を用いる処置後５日目でのマウス皮膚でも増加した。まとめると、これらの結果は、ＴＯＲ経路活性の間接的又は直接的阻害のいずれか及びオートファジーの誘導により、毛髪再生が促進され得ることを示す。
【００２３】
[0038]  ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）は、α−ＫＧ及びオリゴマイシンの別の一般的な下流エフェクターである。ＡＭＰＫは、主要な細胞エネルギーセンサであり、例えばグルコース飢餓及び多数の他の細胞ストレス条件時、細胞エネルギー負荷における減少により活性化される。ＡＭＰＫは、オートファジーも上昇させる。こうした理解に合致して、Ｓ９１に対するＡＭＰＫ依存性Beclin 1リン酸化は、α−ＫＧ及びオリゴマイシンで処置されたマウス皮膚において増強された（図１、パネルＥ及び図２、パネルＥ）。さらに、図３のパネルＡ〜Ｄに示される通り、成長期誘導及び毛髪再生は、ＡＭＰＫアクチベーター、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチド（ＡＩＣＡＲ）、ＡＭＰ類似体を用いる局所的処置によっても刺激された。ＡＭＰＫの別の作動薬であるメトホルミンは、オートファジー及び毛髪再生を同様に誘導した（図３、パネルＥ〜Ｈ）。
【００２４】
[0039]  機構的に、メトホルミンは、電子輸送鎖におけるミトコンドリア複合体Ｉを阻害することが示されている。興味深いことに、長寿命線虫（C. elegans）のミトコンドリア突然変異体は、エクソメタボロームにおいて様々なα−ケト酸代謝産物を蓄積させる。３０週にわたる飲料水へのα−ケト酪酸（α−ＫＢ）の添加により、高齢マウスにおいて毛髪コーティングが大幅に改善された（図３、パネルＩ〜Ｊ）。高齢マウスに対する局所的処置を試験するパイロット実験では、局所的α−ＫＢ処置のみにより、剪毛された高齢動物において発毛が中程度に促進された一方、局所的α−ＫＧ又はラパマイシンにより、毛髪再生は、見かけ上、増強されなかった（又は全く変化しなかったどころかやや低減した）（データは示さず）。それに対し、若齢マウスでは、α−ＫＧ及びラパマイシン処置と同様に、局所的α−ＫＢ処置により、皮膚色素沈着及び毛髪再生が実質的に誘導された（図３、パネルＫ〜Ｍ）。処置された皮膚において、上昇したＬＣ３及びリン酸化されたBeclin 1により示される通り、オートファジーも誘導された（図３、パネルＮ）。
【００２５】
[0040]  ｍＴＯＲは、ＨＦＳＣ活性化及び成長期移行に必要とされることが以前に報告されている。しかし、本明細書で開示される結果は、オートファジー誘導を伴うラパマイシンによるｍＴＯＲの中等度阻害により毛髪再生が刺激されることを示す。かかるディコトミーは、ミトコンドリア調節のために存在することもある。ミトコンドリア呼吸は、ＨＦＳＣサイクルにとって必要とされるが、ミトコンドリア機能の遺伝的攪乱は、毛髪再生をなくす。複合体Ｖ阻害剤のオリゴマイシンが毛髪再生を実際に促進することを示す実験は、軽度のミトコンドリア阻害が有利と判明し得ることを示唆する。ミトコンドリア複合体Ｖが線虫（C. elegans）からドロソフィラ種（Drosophila spp.）及びヒトにかけてＴＯＲの上流で作用し、ミトコンドリア複合体Ｖ阻害及びＴＯＲ阻害の両方によりオートファジーが誘導されることから（図２、パネルＥ）、毛髪再生を誘発するのにオートファジー誘導単独で十分なことがあるか否かが試験された。
【００２６】
[0041]  本明細書に開示される通り、オートファジー誘導単独が毛髪再生を誘発することになるか否かを判定するため、ＴＯＲ非依存性のオートファジーを誘導する小分子のＳＭＥＲ２８が用いられた。局所的ＳＭＥＲ２８投与により、マウス背側皮膚においてＬＣ３及びｐ６２のオートファジー誘導が増強された（図４、パネルＡ〜Ｂ及び図６、パネルＦ）。ｍＴＯＲに依存するBeclin 1 Ser14リン酸化のレベルは、ＳＭＥＲ２８処置皮膚において増加せず（図４、パネルＢ）、ＳＭＥＲ２８によるｍＴＯＲ非依存性のオートファジー誘導効果が示された。加えて、Beclin 1 S91リン酸化についてもＳＭＥＲ２８処置皮膚において増加しなかったことから、ＳＭＥＲ２８は、ＡＭＰＫに影響することによりオートファジーを誘導するように見えなかった（図４、パネルＢ）。注目すべきことに、ＳＭＥＲ２８は、毛髪再生も著しく誘導した（図４、パネルＣ）。これらの知見は、毛髪再生を刺激する場合のオートファジーの役割を強力に支持する。
【００２７】
[0042]  オートファジーが、ＳＭＥＲ２８で刺激される毛髪再生にとって必要であるか否かを試験するため、ＶＰＳ３４及びオートファゴソーム形成を阻害するオートフィニブが用いられた。オートフィニブとの共処置により、ＳＭＥＲ２８による毛髪再生が阻止され（図４、パネルＤ）、オートファジーが毛髪再生にとって重要であることが示された。同様に、空胞性Ｈ（＋）−ＡＴＰアーゼ（Ｖ−ＡＴＰアーゼ）依存性酸性化及びＣａ−Ｐ６０Ａ／ＳＥＲＣＡ依存性オートファゴソーム−リソソーム融合を阻害することによりオートファジーフラックスを破壊する、オートフィニブ及びバフィロマイシンＡ１との共処置によって示される通り、オートファジーは、α−ＫＧによる毛髪再生を刺激するために重要である（図８）。
【００２８】
[0043]  オートファジーが天然毛包サイクルにとって不可欠なことがあるか否かを理解するため、異なる毛包段階にわたるオートファジーが試験され、オートファジーは、毛包が成長期を通して天然に進行するにつれて上昇し；オートファジーは、退行期において減少し、休止期では低値を維持する（図５）。
【００２９】
[0044]  要するに、本明細書中の実験は、オートファジーを誘導することにより毛髪再生が刺激され得ることを示す。
【００３０】
[0045]  したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、毛髪再生の刺激を、それを必要とする対象において行うことを対象とし、それは、１又は複数のオートファジー誘導剤を対象に投与することにより、対象においてオートファジーを誘導することを含む。本明細書で使用する場合、「必要とする」対象は、延長された休止期相、短縮された成長期相及び／又は妨害された成長期誘導の結果として脱毛を有する対象並びに毛髪再生、発毛及び／又は改善された毛髪色素沈着を望む対象を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、対象において脱毛を治療、阻害若しくは低減し；発毛を改善若しくは刺激し；色素沈着欠損を治療、阻害若しくは低減し；及び／又は色素沈着生成を改善若しくは刺激するための方法であって、１又は複数のオートファジー誘導剤を対象に投与することを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、対象において脱毛を治療、阻害若しくは低減し；発毛を改善若しくは刺激し；色素沈着欠損を治療、阻害若しくは低減し；及び／又は色素沈着生成を改善若しくは刺激するための組成物を対象とし、前記組成物は、１又は複数のオートファジー誘導剤を含む。
【００３１】
[0046]  いくつかの実施形態では、対象は、動物である。いくつかの実施形態では、対象は、齧歯類又は非ヒト霊長類などの動物である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、老化している。いくつかの実施形態では、対象は、老化した対象である。本明細書で使用する場合、「老化している」対象は、非処置対照対象が身体的、精神的及び／又は生物学的に悪化し始める生涯の時期にある対象を指す。いくつかの実施形態では、老化している対象は、暦年齢が非処置対照対象の平均寿命の少なくとも中点である対象である。本明細書で使用する場合、「老化」対象は、暦年齢が非処置対照対象の平均余命の少なくとも３分の２である対象である。例えば、実験マウスの所与の株の平均余命が２年である場合、その株の高齢マウスは、少なくとも１６月齢であり、また実験マウスの別の株の平均余命が３年である場合、その株の高齢マウスは、２４月齢である。ヒトでは、ヒトの平均余命が約８０年である場合、高齢ヒトは、約５３歳である。老化している対象は、老化した対象であっても又はなくてもよいことに留意されたい。
【００３２】
[0047]  本明細書で使用する場合、「オートファジー誘導剤」は、陰性対照と比べて、オートファジーを誘導する化合物を指す。オートファジー誘導剤は、ＡＴＰシンターゼ阻害剤、ＴＯＲ阻害剤、ＡＭＰＫアクチベーター及びＴＯＲ非依存性のオートファジーエンハンサーを含む。しかし、国際公開第２０１８０６４４６８号に記載のようなα−ケト酪酸化合物及びグルタル酸化合物は、本明細書で定義されるような「オートファジー誘導剤」から明示的に除外される。いくつかの実施形態では、２つ以上のオートファジー誘導剤が対象に共投与される。本明細書で使用する場合、「共投与される」は、少なくとも２つの異なる薬剤、例えば第１のオートファジー誘導剤及び第２のオートファジー誘導剤の対象への投与を指す。いくつかの実施形態では、共投与は、同時である。同時の共投与を含む実施形態では、薬剤は、単一組成物、例えば混合物として又は２つの分離した組成物として投与され得る。いくつかの実施形態では、第１の薬剤は、第２の薬剤の投与前及び／又は後に投与される。共投与が連続的である場合、第１の薬剤及び第２の薬剤の投与は、ある期間、例えば数分、数時間又は数日で分割され得る。当業者は、用いられる様々な薬剤又は治療薬の製剤及び／又はそれらの投与経路が変化し得ることを理解する。共投与に適した用量は、当業者により容易に決定され得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤が共投与されるとき、各薬剤は、それらの単独投与に適した用量よりも低い用量で投与される。
【００３３】
[0048]  本明細書で使用する場合、「ＡＴＰシンターゼ阻害剤」は、対照と比べて、ＡＴＰシンターゼを阻害する化合物を指す。ＡＴＰシンターゼ阻害剤の例として、α−ヘリカル塩基性ペプチド阻害剤、アンジオスタチン、エンテロスタチン、テントキシン、テントキシン類似体、ロイシノスタチン、エフラペプチン、スチルベン、フラボン、イソフラボン、ステロイドエストラジオール、エストロゲン代謝産物、ポリケチド阻害剤（例えば、マクロライド）、有機スズ化合物、α−ピロン及びその誘導体、両親媒性カチオン性色素などが挙げられる。例えば、Hong, et al., (2008) Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR, 72(4): 590-641を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＡＴＰシンターゼ阻害剤は、（任意のタイプ、例えばＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦの）オリゴマイシンなどのマクロライド、ペリオマイシン、（任意のタイプ、例えばＡ、Ｂ又はＸの）ベンツリシジン、オサマイシン、アポプトリジン及びシトバリシンである。いくつかの実施形態では、ＡＴＰシンターゼ阻害剤は、オリゴマイシンである。いくつかの実施形態では、オリゴマイシンは、オリゴマイシンＡである。
【００３４】
[0049]  本明細書で使用する場合、「ＴＯＲ阻害剤」は、対照と比べて、ＴＯＲ（ラパマイシンの標的）を阻害する化合物を指す。ＴＯＲ阻害剤の例として、ラパマイシン、ラパマイシン誘導体（例えば、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムスなど）、ダクトリシブ、ＧＳＫ２１２６４５８、ＸＬ７６５、ＡＺＤ８０５５、ＩＮＫ１２８／ＭＬＮ０１２８．ＯＳＩ０２７、RapaLinkなどが挙げられる。例えば、Xie, et al. (2016) F1000Research, 5, F1000 Faculty Rev-2078を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシン又はラパマイシン誘導体である。
【００３５】
[0050]  本明細書で使用する場合、「ＡＭＰＫアクチベーター」は、対照と比べて、ＡＭＰＫ（ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ）を活性化する化合物を指す。ＡＭＰＫアクチベーターの例として、間接ＡＭＰＫアクチベーター（例えば、国際公開第２００９１２４６３６号、国際公開第２００９１００１３０号、国際公開第２０１１０２９８５５号、国際公開第２０１１１３８３０７号、国際公開第２０１１０８０２７７号、国際公開第２０１１０３２３２０号、国際公開第２０１１０３３０９９号において開示された化合物）、ビグアナイド（例えば、メトホルミン）、チアゾリジンジオン、ポリフェノール、ジンセノサイド、α−リポ酸、直接ＡＭＰＫアクチベーター（例えば、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチド（ＡＩＣＡＲ）、チエノピリドン、ベンズイミダゾール、サリチル酸塩、化合物１３、ＰＴ−１、ＭＴ６３−７８（Debio0930））、チエノピリドン及びその誘導体、ベンズイミダゾール及びその誘導体、５−（５−ヒドロキシル−イソキサゾール−３−イル）−フラン−２−ホスホン酸（Ｃ−２）などが挙げられる。例えば、Kim, et al. (2016) Experimental & molecular medicine, 48(4): e224を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＡＭＰＫアクチベーターは、直接ＡＭＰＫアクチベーターである。いくつかの実施形態では、ＡＭＰＫアクチベーターは、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチド（ＡＩＣＡＲ）である。いくつかの実施形態では、ＡＭＰＫアクチベーターは、ビグアナイドである。いくつかの実施形態では、ＡＭＰＫアクチベーターは、メトホルミンである。
【００３６】
[0051]  本明細書で使用する場合、「ＴＯＲ非依存性のオートファジーエンハンサー」は、ＴＯＲシグナル伝達経路から独立して、対照と比べてオートファジーを誘導又は増強する化合物を指す。ＴＯＲ非依存性のオートファジーエンハンサーの例として、ＳＭＥＲ２８が挙げられ、インビボでオートファジーを誘導するクロロキン及び３−ＭＡなども含まれる。
【００３７】
[0052]  組成物
[0053]  １又は複数のオートファジー誘導剤を含む医薬組成物を含む組成物が本明細書で検討される。用語「医薬組成物」は、対象における薬学的使用に適した組成物を指す。医薬組成物は、一般に有効量の活性薬剤、例えば１又は複数のオートファジー誘導剤及び薬学的に許容できる担体を含む。用語「有効量」は、所望の結果をもたらすのに十分な用量又は量を指す。所望の結果は、その用量又は量のレシピエントにおける客観的又は主観的改善、例えば長期生存、病態の有効な予防などを含み得る。医薬組成物は、１又は複数のオートファジー誘導剤に加えて、１又は複数の補足剤を含み得る。好適な補足剤の例として、国際公開第２０１８０６４４６８号に記載のようなα−ケト酪酸化合物及びグルタル酸化合物、成長因子（例えば、ＴＧＦ−β２、ＩＧＦ−１、ＫＧＦ、ＨＧＦ）などが挙げられる。
【００３８】
[0054]  いくつかの実施形態では、組成物は、１又は複数のオートファジー誘導剤を含むか、それらから本質的になるか又はそれらからなる。本明細書で使用する場合、語句「〜から本質的になる」は、１又は複数のオートファジー誘導剤から本質的になる組成物に関連して、オートファジー以外の生物学的活性又は機能を示す他の成分が、その成分が１又は複数のオートファジー誘導剤の活性を有意に改変しない限り含まれ得ることを意味する。本明細書で使用する場合、語句「〜からなる」は、１又は複数のオートファジー誘導剤からなる組成物に関連して、組成物が、治療中の対象に対して効果を有するように意図された生物学的活性又は機能を示す他の成分を除外し、例えば他の活性医薬成分が除外されるが、組成物が、組成物自体、担体、希釈剤、結合剤などの中でも、細菌及び真菌増殖を予防することが意図された抗菌剤及び抗真菌剤を含み得ることを意味する。
【００３９】
[0055]  １又は複数のオートファジー誘導剤は、好ましくは、医薬組成物の形態で対象に投与され得る。好ましくは、対象は、哺乳類であり、より好ましくは、対象は、ヒトである。好ましい医薬組成物は、少なくとも１つのオートファジー誘導剤を治療有効量において且つ薬学的に許容できる媒体中に含むものである。
【００４０】
[0056]  本明細書で使用する場合、「治療有効量」は、対照、例えばプラセボと比べて、対象における所与の疾患又は状態、例えば脱毛を治療、予防又は阻害するのに用いられ得る量を指す。また、当業者は、脱毛の度合い、以前の治療、対象の一般健康及び年齢などを含む特定の要素が、対象を有効に治療するのに必要とされる量に影響を及ぼすことがあることを理解するであろう。それにもかかわらず、治療有効量は、当技術分野における方法により容易に決定され得る。いくつかの実施形態では、オートファジー誘導剤の治療有効量は、非経口製剤において、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１〜約３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１〜約２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約１ｍｇ／ｋｇ又は約０．０１〜約０．５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。経口投与における治療有効量は、最大で約１０倍より高いことができる。治療有効量での対象の治療は、単回用量として又は一連の数回用量として施され得ることに留意されたい。治療に用いられる用量は、所与の治療中に増加又は減少し得る。所与の条件セットにおける最適用量は、当技術分野における用量決定試験及び／又は診断アッセイを用いて当業者により確認され得る。用量決定試験及び／又は診断アッセイは、治療中に用量を監視及び調節するために用いられ得る。
【００４１】
[0057]  医薬組成物は、当技術分野で公知の方法を用いて、静脈内、筋肉内、腹膜内、皮下、眼内、くも膜下腔内、関節内、関節滑液嚢内、大槽、肝内、病変内注射、頭蓋内注射、注入及び／又は投与の吸入経路を含む、意図される送達経路に応じて製剤化され得る。医薬組成物は、ｐＨ緩衝液、アジュバント（例えば、保存剤、浸潤剤、乳化剤及び分散剤）、リポソーム製剤、ナノ粒子、分散剤、懸濁液又はエマルジョン並びに滅菌注射可能溶液若しくは分散剤への再構成のための滅菌散剤の１又は複数を含み得る。組成物及び製剤は、当技術分野における方法を用いて、安定性及び有効性の増強を意図して最適化され得る。例えば、Carra et al., (2007) Vaccine 25:4149-4158を参照されたい。
【００４２】
[0058]  組成物は、経口、経皮、皮下、鼻腔内、吸入、筋肉内及び血管内投与を含む任意の好適な経路により、対象に投与され得る。好ましい投与経路及び医薬製剤は、対象の状態及び年齢、治療されるべき状態の性質、所望の治療効果並びに用いられる特定のオートファジー誘導剤とともに変化することが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、１又は複数のオートファジー誘導剤は、対象上の治療されるべき部位に局所的に投与される。
【００４３】
[0059]  本明細書で使用する場合、「薬学的に許容できる媒体」又は「薬学的に許容できる担体」は、互換可能に用いられ、薬学的投与に適合し、薬学的投与のための適用可能な基準及び規制、例えば米国薬局方及び国民医薬品集（ＵＳＰ−ＮＦ）ブックに示される薬局方収載標準品に従う溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを指す。したがって、例えば少なくとも静脈内投与では、薬学的に許容できる担体として、非滅菌水は、除外される。薬学的に許容できる媒体は、当技術分野で公知のものを含む。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th ed (2000) Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MDを参照されたい。
【００４４】
[0060]  医薬組成物は、用量単位形態で提供され得る。本明細書で使用する場合、「用量単位形態」は、治療されるべき対象に対する単位用量として適する物理的分離単位を指し；各単位は、必要とされる薬学的に許容できる担体と関連して所望の治療効果をもたらすように算出された所定量の１又は複数のオートファジー誘導剤を含有する。本発明の用量単位形態における仕様は、所与のオートファジー誘導剤に固有の特性及び達成されるべき所望の治療効果並びに個体の治療のためのかかる活性化合物を配合する技術分野における本質的な制限により指示され、それらに直接的に依存する。
【００４５】
[0061]  本発明に従うオートファジー誘導剤及びその組成物の毒性及び治療効果は、細胞培養液及び／又は実験動物並びに当技術分野における薬学的手順を用いて判定され得る。例えば、当技術分野における方法により、致死量、ＬＣ５０（集団の５０％が死亡する濃度×曝露期間として表される用量）又はＬＤ５０（集団の５０％が死亡する用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を判定し得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、それは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きい治療指数を示すオートファジー誘導剤が好ましい。有毒な副作用をもたらすオートファジー誘導剤を用い得るが、非感染細胞に対する潜在的損傷を最小化し、それにより副作用を低減するように、治療部位に向けてかかる化合物を標的にする送達系を設計するには、注意が払われるべきである。
【００４６】
[0062]  細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータは、ヒトにおける使用のための用量範囲を配合する場合に用いることができる。好ましい用量は、毒性をほとんどか又は全く伴わない、ＥＤ５０を含む循環濃度範囲を提供する。その用量は、利用される剤形及び利用される投与経路に応じて変化し得る。１又は複数のオートファジー誘導剤の治療有効量及び用量は、最初に細胞培養アッセイから評価され得る。細胞培養下での判定として、ＩＣ５０（即ち症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を得るため、用量は、動物モデルにおいて配合され得る。かかる情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に判定するために用いることができる。血漿中レベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーにより測定され得る。加えて、所与の対象に適した用量は、様々な臨床的因子に基づき、主治医又は認定医師により決定され得る。
【００４７】
[0063]  キット
[0064]  いくつかの実施形態では、本発明は、１又は複数のオートファジー誘導剤を任意選択的に組成物中において又は１又は複数の補足剤と組み合わせて含み、対象における脱毛を予防、阻害、低減又は治療するための１又は複数の試薬又は薬剤送達装置と一緒にパッケージングされたキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、１又は複数のオートファジー誘導剤を、任意選択的に１又は複数の単位剤形でパックとして及び／又は薬剤送達デバイス、例えば予備充填シリンジにおいて一緒にパッケージングされて含む。
【００４８】
[0065]  いくつかの実施形態では、キットは、１又は複数の容器、例えばバイアル、チューブなどを受けるために区画化され得る担体、パッケージ又は容器を含む。いくつかの実施形態では、キットは、任意選択的に、識別のための説明若しくはラベル又はその使用に関する説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書で検討されたような化合物及び組成物の製造、使用又は販売を規制する、政府機関によって規定された情報を含む。
【００４９】
[0066]  以下の実施例は、本発明を例示しても限定しないことが意図される。
【実施例】
【００５０】
[0067]  実施例  −  方法
[0068]  マウスにおける毛髪再生についてのアッセイ
[0069]  雄及び雌マウスの両方において、すべての化合物を試験した。あらゆる実験は、独立しており、少なくとも２回反復した。異なる薬剤によるいくつかの処置は、共有対照群と同時に実施した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスは、６又は８週齢時にJackson Laboratories（Bar Harbor, ME）から得た。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスは、８週齢時にJackson Laboratories（Bar Harbor, ME）から得た。マウスに標準の固形飼料食餌を与え、試験全体を通して食物及び水への自由なアクセスを提供した。休止期におけるマウスを、雄において出生後の約４３〜４５日目（別段の指示がない限り）及び雌において５８日目にそれぞれ背側を剪毛した。媒体対照（別段の指示がない限り、２５μＬのＤＭＳＯ）又は試験化合物（別段の指示がない限り、２５μＬのＤＭＳＯ中）を実験の持続期間（３〜６週）にわたり（別段の指示がない限り）一日おきに剪毛皮膚に局所適用した。皮膚色素沈着及び発毛の外観を監視し、写真及び映像により記録した。進行についても色素沈着レベル及び毛幹密度に基づいて０〜１００の値に割り当て、０は、発毛なし（及び色素沈着なし）を示し、より大きい数は、高密な発毛のより暗い皮膚及びより大きい領域に対応する。異なるスコアを表す画像を図９に提示する。各マウスに対して、約２５０μＬのPremium Lecithin Organogel（ＰＬＯ）基剤（Transderma Pharmaceuticals Inc.）中のα−ＫＧ（Sigma, 75890）、オリゴマイシン（Cell Signaling, 9996L）、ラパマイシン（Selleckchem, S1039）、ＡＩＣＡＲ（Selleckchem, S1802）、メトホルミン（Sigma, PHR1084）、α−ＫＢ（Sigma, K401）、ＳＭＥＲ２８（Selleckchem, S8240）、オートフィニブ（Selleckchem, S8596）、バフィロマイシンＡ１（Selleckchem, S1413）又は指定の組み合わせを用いた。溶媒ＤＭＳＯは、局所適用のため、ＰＬＯ基剤とも混合した。毛髪サイクルのタイミングは、ＰＬＯ基剤＋ＤＭＳＯ対ＰＬＯ基剤単独を用いて改変されなかった。
【００５１】
[0070]  高齢マウス
[0071]  経口α−ＫＢ処置では、高齢雄及び雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを８７週齢時に得た（ＮＩＡの高齢齧歯類コロニー）。マウスは、ＵＣＬＡの制御されたＳＰＦ施設（２２±２℃、６：００〜１８：００、１２時間／１２時間の明／暗サイクル）に収容した。マウスに標準の固形飼料食餌を与え、試験全体を通して食物及び水への自由なアクセスを提供した。水（媒体対照）又は飲料水中のα−ＫＢ（９０ｍｇ／ｋｇ体重）のいずれかによる処置は、マウスが１０１週齢に達したときに開始した。局所的α−ＫＢ処置では、高齢雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを２１月齢時に得て（ＮＩＡの高齢齧歯類コロニー）、翌週に剪毛し、α−ＫＢ（３２ｍＭ）で１か月間、一日おきに局所的に処置した。すべての実験は、UCLA Chancellor’s Animal Research Committeeによって認可された。
【００５２】
[0072]  組織学及び顕微鏡
[0073]  マウス背側皮膚を、組織学的及び分子的分析のために収集する前に剪毛した。次に、全厚皮膚組織を１０％ホルマリン溶液（Sigma，HT501128）で一晩固定し、脱水し、パラフィンで包埋した。５μｍのパラフィン切片に対して、ヘマトキシリン／エオシン染色及び免疫組織化学をＫｉ−６７（Cell Signaling, 12202）、ＩＬ−６（Abcam, ab6672）又はＦ４／８０（Bio-Rad, MCA497G）について実施した。Ｘ２０の倍率でのLeica Aperio ScanScope AT明視野システムにより、画像を取得した。
【００５３】
[0074]  ウエスタンブロッティング
[0075]  雄マウスを剪毛し、出生後４３日目から一日おきに処置した。５日後、休止期皮膚サンプルを収集し、ステージを確認した。マウス皮膚組織ライセートを、FastPrep 24（MP Biomedicals）による、プロテアーゼ阻害剤（Roche, 11836153001）及びホスファターゼ阻害剤（Sigma, P5726）を有するT-PER Tissue Protein Extraction Buffer（Thermo Scientific, 78510）中での均質化により調製した。遠心分離により組織及び細胞片を除去し、５％β−メルカプトエタノールを含有する１×ＳＤＳ負荷緩衝液中でライセートを５分間煮沸した。次に、サンプルに対して、NuPAGE Novexの１２％ビス−トリスゲル（Invitrogen, NP0343BOX）上でＳＤＳ−ＰＡＧＥを施し、ＬＣ３（Novus, NB100 2220）、ｐ６２（Sigma, P0068）、Phospho-Beclin-1（Ｓｅｒ１５）（マウスにおけるＳｅｒ１４に対応する）（Cell Signaling, 84966）、Phospho-Beclin-1（Ｓｅｒ９３）（マウスにおけるＳｅｒ９１に対応する）（Cell Signaling, 14717）、Beclin-1（Abcam, ab207612）又はＧＡＰＤＨ（Ambion, AM4300）に対する抗体を用いて、ウエスタンブロッティングを実施した。
【００５４】
[0076]  定量的逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）
[0077]  処置後２４時間後、休止期皮膚サンプルを収集し、TRIzol試薬（Invitrogen）を用いて全厚マウス皮膚組織から全ＲＮＡを単離した。iScript Reverse Transcription Supermix（Bio-Rad）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。定量的ＲＴ−ＰＣＲのためにiTaq Universal SYBR Green Supermix（Bio-Rad）及びBio-Rad CFX Connect機器を用いた。ＲＴ−ｑＰＣＲに用いたプライマー配列は、以下の通りである。
ｐ６２フォワード：
配列番号１：ＧＡＡＧＡＡＴＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴＧＧ
ｐ６２リバース：
配列番号２：ＴＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＴＴＣＴＧＧ
Ｂ２ｍフォワード：
配列番号３：ＣＡＧＣＡＴＧＧＣＴＣＧＣＴＣＧＧＴＧＡＣ
Ｂ２ｍリバース：
配列番号４：ＣＧＴＡＧＣＡＧＴＴＣＡＧＴＡＴＧＴＴＣＧ
【００５５】
[0078]  統計分析
[0079]  すべての処置を少なくとも２回反復した。データは、生物学的複製を表す。あらゆる図面において、適切な統計学的検定を用いた。データは、各図面において記載の統計学的検定の前提を満たす。すべての図面において、平均±標準偏差をプロットする。
【００５６】
[0080]  参考文献
[0081]  必要に応じて、以下の参考文献は、参照により本明細書中に援用される。
１．Barzilai, N., et al. (2016). “Metformin as a Tool to Target Aging.” Cell Metab 23(6): 1060-1065.
２．Belleudi, F., et al. (2014). “FGF7/KGF regulates autophagy in keratinocytes: A novel dual role in the induction of both assembly and turnover of autophagosomes.” Autophagy 10(5): 803-821.
３．Burkewitz, K., et al. (2014). “AMPK at the nexus of energetics and aging.” Cell Metab 20(1): 10-25.
４．Butler, J. A., et al. (2010). “Long lived mitochondrial (Mit) mutants of Caenorhabditis elegans utilize a novel metabolism.” FASEB J 24(12): 4977-4988.
５．Castilho, R. M., et al. (2009). “mTOR mediates Wnt induced epidermal stem cell exhaustion and aging.” Cell Stem Cell 5(3): 279-289.
６．Chikh, A., et al. (2014). “iASPP is a novel autophagy inhibitor in keratinocytes.” J Cell Sci 127(Pt 14): 3079-3093.
７．Chin, R. M., et al. (2014). “The metabolite alpha ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR.” Nature 509(7505): 397-401.
８．Chueh, S. C., et al. (2013). “Therapeutic strategy for hair regeneration: hair cycle activation, niche environment modulation, wound induced follicle neogenesis, and stem cell engineering.” Expert Opin Biol Ther 13(3): 377-391.
９．Cuervo, A. M. and J. F. Dice (2000). “Age related decline in chaperone mediated autophagy.” J Biol Chem 275(40): 31505-31513.
１０．Deng, Z., et al. (2015). “mTOR signaling promotes stem cell activation via counterbalancing BMP mediated suppression during hair regeneration.” J Mol Cell Biol 7(1): 62-72.
１１．Fernandez, A. F., et al. (2018). “Disruption of the beclin 1 BCL2 autophagy regulatory complex promotes longevity in mice.” Nature 558(7708): 136-140.
１２．Forni, M. F., et al. (2017). “Caloric Restriction Promotes Structural and Metabolic Changes in the Skin.” Cell Rep 20(11): 2678-2692.
１３．Fu, X., et al. (2015). “2 Hydroxyglutarate Inhibits ATP Synthase and mTOR Signaling.” Cell Metab 22(3): 508-515.
１４．Galluzzi, L., et al. (2014). “Metabolic control of autophagy.” Cell 159(6): 1263-1276.
１５．Gilhar, A., et al. (2012). “Alopecia areata.” N Engl J Med 366(16): 1515-1525.
１６．Hamanaka, R. B., et al. (2013). “Mitochondrial reactive oxygen species promote epidermal differentiation and hair follicle development.” Sci Signal 6(261): ra8.
１７．Hansen, M., et al. (2008). “A role for autophagy in the extension of lifespan by dietary restriction in C. elegans.” PLoS Genet 4(2): e24.
１８．Hardie, D. G., et al. (2012). “AMPK: a nutrient and energy sensor that maintains energy homeostasis.” Nat Rev Mol Cell Biol 13(4): 251-262.
１９．Harel, S., et al. (2015). “Pharmacologic inhibition of JAK STAT signaling promotes hair growth.” Sci Adv 1(9): e1500973.
２０．Hirano, T., et al. (1990). “Biological and clinical aspects of interleukin 6.” Immunol Today 11(12): 443-449.
２１．Ho, T. T., et al. (2017). “Autophagy maintains the metabolism and function of young and old stem cells.” Nature 543(7644): 205-210.
２２．Huang, J., et al. (2016). Ketobutyrate compounds and compositions for treating age related symptoms and diseases. Google Patents, Google Patents.
２３．Ito, M., et al. (2007). “Wnt dependent de novo hair follicle regeneration in adult mouse skin after wounding.” Nature 447(7142): 316-320.
２４．Jia, K. and B. Levine (2007). “Autophagy is required for dietary restriction mediated life span extension in C. elegans.” Autophagy 3(6): 597-599.
２５．Kabeya, Y., et al. (2000). “LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.” EMBO J 19(21): 5720-5728.
２６．Kellenberger, A. J. and M. Tauchi (2013). “Mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) may modulate the timing of anagen entry in mouse hair follicles.” Exp Dermatol 22(1): 77-80.
２７．Keyes, B. E., et al. (2013). “Nfatc1 orchestrates aging in hair follicle stem cells.” Proc Natl Acad Sci U S A 110(51): E4950-4959.
２８．Kim, J., et al. (2013). “Differential regulation of distinct Vps34 complexes by AMPK in nutrient stress and autophagy.” Cell 152(1 2): 290-303.
２９．Kloepper, J. E., et al. (2015). “Mitochondrial function in murine skin epithelium is crucial for hair follicle morphogenesis and epithelial mesenchymal interactions.” J Invest Dermatol 135(3): 679-689.
３０．Knowler, W. C., et al. (2002). “Reduction in the incidence of type 2 diabetes with lifestyle intervention or metformin.” N Engl J Med 346(6): 393-403.
３１．Levine, B. and G. Kroemer (2008). “Autophagy in the pathogenesis of disease.” Cell 132(1): 27-42.
３２．Liang, X. H., et al. (1999). “Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin 1.” Nature 402(6762): 672-676.
３３．Magerl, M., et al. (2001). “Patterns of proliferation and apoptosis during murine hair follicle morphogenesis.” J Invest Dermatol 116(6): 947-955.
３４．Mauvezin, C. and T. P. Neufeld (2015). “Bafilomycin A1 disrupts autophagic flux by inhibiting both V ATPase dependent acidification and Ca P60A/SERCA dependent autophagosome lysosome fusion.” Autophagy 11(8): 1437-1438.
３５．Messenger, A. G. and J. Rundegren (2004). “Minoxidil: mechanisms of action on hair growth.” Br J Dermatol 150(2): 186-194.
３６．Mizushima, N., et al. (2008). “Autophagy Fights disease through cellular self digestion.” Nature 451(7182): 1069-1075.
３７．Muller Rover, S., et al. (2001). “A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages.” J Invest Dermatol 117(1): 3-15.
３８．Ohsumi, Y. (2014). “Historical landmarks of autophagy research.” Cell Res 24(1): 9-23.
３９．Ou, H. T., et al. (2016). “Metformin improved health related quality of life in ethnic Chinese women with polycystic ovary syndrome.” Health Qual Life Outcomes 14(1): 119.
４０．Owen, M. R., et al. (2000). “Evidence that metformin exerts its anti diabetic effects through inhibition of complex 1 of the mitochondrial respiratory chain.” Biochem J 348 Pt 3: 607-614.
４１．Parodi, C., et al. (2018). “Autophagy is essential for maintaining the growth of a human (mini )organ: Evidence from scalp hair follicle organ culture.” PLoS Biol 16(3): e2002864.
４２．Petukhova, L., et al. (2010). “Genome wide association study in alopecia areata implicates both innate and adaptive immunity.” Nature 466(7302): 113-117.
４３．Robke, L., et al. (2017). “Phenotypic Identification of a Novel Autophagy Inhibitor Chemotype Targeting Lipid Kinase VPS34.” Angew Chem Int Ed Engl 56(28): 8153-8157.
４４．Russell, R. C., et al. (2013). “ULK1 induces autophagy by phosphorylating Beclin 1 and activating VPS34 lipid kinase.” Nat Cell Biol 15(7): 741-750.
４５．Sahani, M. H., et al. (2014). “Expression of the autophagy substrate SQSTM1/p62 is restored during prolonged starvation depending on transcriptional upregulation and autophagy derived amino acids.” Autophagy 10(3): 431-441.
４６．Salemi, S., et al. (2012). “Autophagy is required for self renewal and differentiation of adult human stem cells.” Cell Res 22(2): 432-435.
４７．Sarkar, S., et al. (2007). “Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington’s disease models.” Nat Chem Biol 3(6): 331-338.
４８．Schneider, M. R., et al. (2009). “The hair follicle as a dynamic miniorgan.” Curr Biol 19(3): R132-42.
４９．Shahebrahimi, K., et al. (2016). “Comparison clinical and metabolic effects of metformin and pioglitazone in polycystic ovary syndrome.” Indian J Endocrinol Metab 20(6): 805-809.
５０．Shyh Chang, N., et al. (2013). “Lin28 enhances tissue repair by reprogramming cellular metabolism.” Cell 155(4): 778-792.
５１．Slominski, A. and R. Paus (1993). “Melanogenesis is coupled to murine anagen: toward new concepts for the role of melanocytes and the regulation of melanogenesis in hair growth.” J Invest Dermatol 101(1 Suppl): 90S-97S.
５２．Solanas, G., et al. (2017). “Aged Stem Cells Reprogram Their Daily Rhythmic Functions to Adapt to Stress.” Cell 170(4): 678-692 e620.
５３．Sun, X., et al. (2014). “A mitochondrial ATP synthase subunit interacts with TOR signaling to modulate protein homeostasis and lifespan in Drosophila.” Cell Rep 8(6): 1781-1792.
５４．Tang, A. H. and T. A. Rando (2014). “Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation.” Embo Journal 33(23): 2782-2797.
５５．Walpoth, B. H., et al. (2001). “Prevention of neointimal proliferation by immunosuppression in synthetic vascular grafts.” Eur J Cardiothorac Surg 19(4): 487-492.
５６．Wang, H., et al. (2006). “Activated macrophages are essential in a murine model for T cell mediated chronic psoriasiform skin inflammation.” J Clin Invest 116(8): 2105-2114.
５７．Wang, L., et al. (2015). “Oxidative stress and substance P mediate psychological stress induced autophagy and delay of hair growth in mice.” Arch Dermatol Res 307(2): 171-181.
５８．Wheaton, W. W., et al. (2014). “Metformin inhibits mitochondrial complex I of cancer cells to reduce tumorigenesis.” Elife 3: e02242.
５９．Yoshihara, N., et al. (2015). “The significant role of autophagy in the granular layer in normal skin differentiation and hair growth.” Arch Dermatol Res 307(2): 159-169.
６０．Zhang, C. S., et al. (2017). “Fructose 1,6 bisphosphate and aldolase mediate glucose sensing by AMPK.” Nature 548(7665): 112-116.
【００５７】
[0082]  本願中に用いられるすべての科学技術用語は、特に指定されない限り、当技術分野で一般に用いられる意味を有する。
【００５８】
[0083]  本明細書で使用する場合、用語「対象」、「患者」及び「個体」は、ヒト及び非ヒト動物を指すように互換可能に用いられる。用語「非ヒト動物」は、すべての脊椎動物、例えば哺乳類及び非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ウマ、ヒツジ、イヌ、雌ウシ、ブタ、ニワトリ及び他の動物対象並びに試験動物を含む。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
【００５９】
[0084]  本明細書で使用する場合、用語「診断すること」は、診断について、別の団体、例えば患者に通知する、即ち口頭で又は（例えば、紙若しくは電子媒体での）書面により伝える身体的且つ能動的ステップを指す。同様に、「予後を提供すること」は、予後について、別の団体、例えば患者に通知する、即ち口頭で又は（例えば、紙若しくは電子媒体での）書面により伝える身体的且つ能動的ステップを指す。
【００６０】
[0085]  単数形の使用は、特に具体的に述べられない限り、複数形を含み得る。本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる通り、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その」は、文脈上特に明示されない限り、複数の参照対象を含み得る。
【００６１】
[0086]  本明細書で使用する場合、「及び／又は」は、「及び」又は「又は」を意味する。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、「Ａ、Ｂ又はＡ及びＢの両方」を意味し、「Ａ、Ｂ、Ｃ及び／又はＤ」は、「Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はそれらの組み合わせ」を意味し、前記「Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はそれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの任意のサブセット、例えば単一メンバーのサブセット（例えば、Ａ、又はＢ、又はＣ、又はＤ）、２つのメンバーのサブセット（例えば、Ａ及びＢ；Ａ及びＣなど）、又は３つのメンバーのサブセット（例えば、Ａ、Ｂ及びＣ；又はＡ、Ｂ及びＤなど）、又は４つすべてのメンバー（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）を意味する。
【００６２】
[0087]  本明細書で使用する場合、語句「〜の１又は複数」、例えば「Ａ、Ｂ及び／又はＣの１又は複数」は、「Ａの１又は複数」、「Ｂの１又は複数」、「Ｃの１又は複数」、「Ａの１又は複数及びＢの１又は複数」、「Ｂの１又は複数及びＣの１又は複数」、「Ａの１又は複数及びＣの１又は複数」及び「Ａの１又は複数、Ｂの１又は複数及びＣの１又は複数」を意味する。
【００６３】
[0088]  語句「Ａを含むか、それから本質的になるか又はそれからなる」は、余分な頁及び翻訳料を回避するための手段として用いられ、いくつかの実施形態では、所与の問題事項がＡを含むか、Ａから本質的になるか又はＡからなることを意味する。例えば、「いくつかの実施形態では、組成物は、Ａを含むか、それから本質的になるか又はそれからなる」という文章は、あたかも以下の３つの分かれた文章：「いくつかの実施形態では、組成物は、Ａを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Ａから本質的になる。いくつかの実施形態では、組成物は、Ａからなる」として記述されるように解釈されるべきである。
【００６４】
[0089]  同様に、一連の代替形態を列挙する文章は、一連の文章が、あたかも所与の各代替形態がある文章内に単独で提供されるように提供されるものとして解釈されるべきである。例えば、「いくつかの実施形態では、組成物は、Ａ、Ｂ又はＣを含む」という文章は、以下の３つの分かれた文章：「いくつかの実施形態では、組成物は、Ａを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｂを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｃを含む」として記述されるように解釈されるべきである。別の例として、「いくつかの実施形態では、組成物は、少なくともＡ、Ｂ又はＣを含む」という文章は、以下の３つの分かれた文章：「いくつかの実施形態では、組成物は、少なくともＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくともＢを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくともＣを含む」として記述されるように解釈されるべきである。
【００６５】
[0090]  本発明の開示を理解するか又は完成させるのに必要な程度まで、本明細書中に言及されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、あたかも各々が個別にそのように援用されるのと同じ程度まで、参照により本明細書中に明示的に援用される。
【００６６】
[0091]  本発明の例示的な実施形態をこのように説明したが、本開示中の実施形態は、あくまで例示的なものであり、且つ様々な他の代替形態、適応形態及び修飾形態は、本発明の範囲内でなされ得ることが当業者によって留意されるべきである。したがって、本発明は、本明細書で例示されるような具体的な実施形態に限定されないが、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１−１】
2021521241.tif 000002
【図１−２】
2021521241.tif 000003
【図１−３】
2021521241.tif 000004
【図２−１】
2021521241.tif 000005
【図２−２】
2021521241.tif 000006
【図２−３】
2021521241.tif 000007
【図３−１】
2021521241.tif 000008
【図３−２】
2021521241.tif 000009
【図３−３】
2021521241.tif 000010
【図４−１】
2021521241.tif 000011
【図４−２】
2021521241.tif 000012
【図５】
2021521241.tif 000013
【図６−１】
2021521241.tif 000014
【図６−２】
2021521241.tif 000015
【図６−３】
2021521241.tif 000016
【図７】
2021521241.tif 000017
【図８】
2021521241.tif 000018
【図９】
2021521241.tif 000019
【配列表】
2021521241000001.app
【国際調査報告】
2021521241.tif 000020