(57)【要約】  汚染物質による皮膚損傷防止活性、皮膚の抗老化及びしわ改善活性を有する新規ペプチド、及び汚染物質によって誘発される疾患の予防または治療や、皮膚老化の改善と係わるペプチドの用途に係り、具体的には、該新規ペプチドは、ダイオキシン、微細ほこり、タバコ煙のような汚染物質の皮膚細胞内流入を抑制し、皮膚老化と係わる遺伝子の発現を調節することにより、汚染物質によって発生する癌、皮膚疾患、肺疾患などや、皮膚老化関連疾患を予防または治療する薬学的組成物の有効成分として使用されるか、あるいは汚染物質による皮膚損傷防止効果または皮膚老化改善効果のための化粧料組成物の有効成分としても有用に使用される長所がある。
2021526145.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含む、汚染物質による皮膚損傷防止用ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、汚染物質の皮膚内流入抑制活性を有するものである、請求項１に記載の汚染物質による皮膚損傷防止用ペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドは、汚染物質と吸着するものである、請求項１に記載の汚染物質による皮膚損傷防止用ペプチド。
【請求項４】
前記汚染物質は、ダイオキシン、微細ほこり及びタバコ煙抽出物からなる群から選択されるものである、請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載の汚染物質による皮膚損傷防止用ペプチド。
【請求項５】
配列番号１のアミノ酸配列を含む、皮膚抗老化用ペプチド。
【請求項６】
前記皮膚抗老化は、皮膚のしわまたは弾力の改善である、請求項５に記載の皮膚抗老化用ペプチド。
【請求項７】
請求項１に記載のペプチドを有効成分として含む、汚染物質によって誘発される疾患の予防用または治療用の薬学的組成物。
【請求項８】
前記汚染物質によって誘発される疾患は、癌、アトピー皮膚炎、接触性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、にきび、皮膚乾燥症、乾癬、致死、免疫毒性、末梢神経系損傷、中枢神経系損傷、内分泌腺異常、生殖器官障害、嬰児及び乳児の発達障害、貧血、気管支炎、肺気腫、肺機能減退、喘息、慢性気管支炎、不整脈、心臓麻痺、狭心症、及び心筋梗塞症で構成された群から選択されるいずれか１以上である、請求項７に記載の汚染物質によって誘発される疾患の予防用または治療用の薬学的組成物。
【請求項９】
請求項５に記載のペプチドを有効成分として含む、皮膚老化改善用薬学的組成物。
【請求項１０】
前記皮膚老化改善は、しわの改善である、請求項９に記載の皮膚老化改善用薬学的組成物。
【請求項１１】
請求項１または請求項５に記載のペプチドのうちいずれか一つを有効成分として含む、汚染物質による皮膚損傷防止用または皮膚老化改善用の化粧料組成物。
【請求項１２】
前記化粧料組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、ゲル、ローション、エッセンス、クリーム、パウダー、せっけん、シャンプー、リンス、パックマスク、界面活性剤含有クレンジング、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、オイル、リキッドファウンデーション、クリームファウンデーション及びスプレーからなる群から選択される１種の剤形を有するものである、請求項１１に記載の汚染物質による皮膚損傷防止用または皮膚老化改善用の化粧料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、汚染物質による皮膚損傷防止活性及び抗老化効果を有する新規ペプチド、並びにその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代社会において、大都市形成と産業化とによる大気汚染が深刻な社会的問題として認識され、大気中の汚染物質が、呼吸器を始めとする人間の全般的な健康に悪影響を及ぼしうるという各種研究結果が報告されている。特に、最近になり、韓国における大気中において、微細ほこりの濃度が、例年に比べて顕著に上昇しながら、それに係わる言論報道が続いていることにより、大気汚染の深刻性に対する大衆の関心と心配とが高まっている。
【０００３】
大気中の汚染物質は、人体内部の臓器のうち呼吸器に最大の影響を及ぼすが、直接には、汚染物質と接する表面積が最も広く、持続的な露出が起きる皮膚は、汚染物質の主な標的になる臓器のうち一つである。一般的には、外部環境による皮膚健康悪化問題は、太陽光に含まれた紫外線によって誘発される問題に集中されてきたが、だんだんと悪化していく大気汚染問題と、空気中の汚染物質増加現象とにより、これ以上関連研究をおろそかにすることができない実情であり、大気汚染物質から皮膚を保護して回復させることができる物質や、それを含む化粧品などの研究と開発との必要性が叫ばれている。
【０００４】
アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ：aryl hydrocarbon receptor）は、大気汚染物質が皮膚に接触したとき、細胞内において有害信号を伝達し、皮膚損傷を誘導する役割を行う核心的な受容体であり、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＴＣＤＤ）のようなダイオキシン類や、多環芳香族炭素（ＰＡＨｓ）などが人体の皮膚に露出されれば、前記ＡｈＲに結合し、ステロイドホルモンの作用メカニズムのように、細胞核に移動し、毒性メカニズムを起こす。ＡｈＲと結合されたダイオキシン複合体は、核内に存在するＡｒｎｔ（ＡｈＲ nuclear translocator）蛋白質と結合するが、ＡｈＲ／Ａｒｎｔ複合体は、Cytochrome Ｐ４５０ｓ（Ｐ４５０またはｃｙｐｓ（ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ１Ｂ１））を含む標的遺伝子の転写調節領域にあるＤＲＥまたあはＸＲＥ（drug/xenobiotic responsive element）と呼ばれる塩基配列と結合し、さまざまな遺伝子群の転写を誘導し、それによって毒性を示す。
【０００５】
一方、皮膚細胞は、各種原因により、老化現象が起こり、該皮膚細胞の老化により、しわが発生しうる。生物学的過程によって経時的に示される自然老化である年代学的老化（内因的老化）と、太陽光に露出される部位で発生する退行性変化と、前記年代学的老化とが複合的に示される光老化（光因性老化）とに区分されうる。細胞の成長と係わる各種因子の発現または活性が阻害される場合、自然な細胞の老化が発生し、太陽光に含まれた２８０ｎｍ波長ないし４００ｎｍ波長の光により、皮膚細胞の光老化が進む。そのうちでも、特に、２８０ｎｍないし３２０ｎｍ範囲の波長を有するＵＶＢのような紫外線の照射により、皮膚や線維の損傷が発生し、皮膚が黒く日焼けする煤塵現象が発生しうる。ＵＶＢが照射されれば、皮膚細胞内のＲＯＳ及び自由ラジカルの蓄積が促進され、ラジカルにより、細胞内信号伝逹体系を刺激し、ＤＮＡ、蛋白質、脂質のような生体分子に酸化的ストレスを誘発させ、それにより、皮膚組織の損傷が発生してしまう。
【０００６】
皮膚細胞の酸化的ストレスが増大すれば、表皮の角質細胞や、真皮の線維芽細胞に刺激が発生し、一連の細胞内信号伝達過程を経て、コラーゲン分解酵素であるＭＭＰ（matrix metalloproteinase）のような遺伝子の発現が増大され、皮膚の主要構成成分であり、真皮の９０％を占め、皮膚に、強度、張力を付与し、外部刺激や力から皮膚を保護する役割を行うコラーゲンの低減が誘発され、それにより、皮膚の老化やしわが形成されうる。従って、前記コラーゲンのような線維蛋白質の合成や分解に係わる遺伝子の発現調節を介して皮膚細胞の老化を防止し、しわの改善効果を期待することができる。
【０００７】
太陽光に含まれた紫外線の照射による細胞の老化作用や、前述のような大気汚染物質の細胞内流入は、単に皮膚の損傷により、美容的な側面で問題を発生させるだけではなく、細胞のＤＮＡ損傷により、癌を誘発したり、中枢神経系及び末梢神経系の損傷、免疫システム破壊、生殖器官障害、嬰児及び乳児の発達障害、並びに塩素ざ瘡のような皮膚疾患を起こし、深刻な健康上の問題も発生しうるが、それに対する解決策が至急である。
【０００８】
前述のような問題点を解決するために、さまざまな種類の物質が開発され、多様な種類の植物や微生物から得た抽出物を利用し、前述のような問題点を克服しようとする試みがなされてきた。しかし、多くの場合、自然物から得た抽出物内において、具体的に、どの物質が皮膚細胞の保護効果や、老化現象からの回復効果を導き出すことができるかということを確認することができず正確な構成を知ることができず、未知の物質も共に含んでいる抽出物組成物を利用している実情である。人体に直接接触させたり適用させたりして使用しなければならない特性上、副作用を最小化させ、人体に対する安全性が確保されなければならないが、前述のような問題点を解決することができる効果を有する単一物質を正確に究明し、人体の皮膚細胞などに適用しなければならない必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ダイオキシン、微細ほこり、タバコ煙のような汚染物質の細胞流入を阻害することにより、汚染物質によって発生する皮膚損傷を防止し、皮膚細胞を保護する用途に利用することができるペプチドを提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明は、自然に発生するか、あるいは太陽光の紫外線によって発生する皮膚細胞の老化現象を減らし、それにより、皮膚しわを改善させるための用途に利用することができるペプチドを提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は、前述のようなペプチドを有効成分として含み、汚染物質によって誘発される疾患を予防または治療するか、あるいは皮膚老化を改善させることができる薬学的組成物を提供することを目的とする。
【００１２】
また、本発明は、前述のようなペプチドを有効成分として含み、汚染物質による皮膚損傷を防止し、皮膚老化を改善させることができる化粧料組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前述の目的を達成するために、本発明の一側面は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、汚染物質による皮膚損傷防止用ペプチドを提供することである。
【００１４】
本発明の他の側面は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、皮膚抗老化用ペプチドを提供することである。
【００１５】
本発明の他の側面は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、汚染物質によって誘発される疾患の予防用または治療用の薬学的組成物を提供することである。
【００１６】
本発明の他の側面は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、皮膚老化改善用薬学的組成物を提供することである。
【００１７】
本発明の他の側面は、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含む、汚染物質による皮膚損傷防止用または皮膚老化改善用の化粧料組成物を提供することである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明で提供するペプチドは、大気中に存在するダイオキシン、微細ほこり、タバコ煙のような汚染物質の細胞内流入を防止し、皮膚細胞の老化現象を抑制するので、汚染物質によって誘発されうる癌、皮膚疾患、肺疾患などを予防または治療するか、あるいは皮膚老化を改善させる薬学的組成物の有効成分としても有用に使用され、汚染物質から皮膚を保護し、皮膚老化及びしわを改善させるための化粧料組成物の有効成分として使用されうる効果がある。
【００１９】
ただし、本発明の効果は、前述のところで言及した効果に制限されるものではなく、言及されていない他の効果は、下記の記載から当業者に明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを処理したＨａＣａＴ細胞に対し、ＴＣＤＤを処理した場合のＡｈＲ核移動量を確認して示したウェスタンブロッティング結果である。以下、Ｃｏｎは、control、ＮＣは、negative controlを意味する。
【図１Ｂ】配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを処理したＨａＣａＴ細胞に対し、ＰＭを処理した場合のＡｈＲ核移動量を確認して示したウェスタンブロッティング結果である。以下、Ｃｏｎは、control、ＮＣは、negative controlを意味する。
【図１Ｃ】配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを処理したＨａＣａＴ細胞に対し、ＣＳＥを処理した場合のＡｈＲ核移動量を確認して示したウェスタンブロッティング結果である。以下、Ｃｏｎは、control、ＮＣは、negative controlを意味する。
【図１Ｄ】配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを処理したＡ５４９細胞に対し、ＣＳＥを処理した場合のＡｈＲ核移動量を確認して示したウェスタンブロッティング結果である。
【図２Ａ】配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを処理したＨａＣａＴ細胞に対し、ＴＣＤＤを処理した場合のＣＹＰ１Ａ１及びＣＯＸ−２遺伝子の発現量を確認して示したＲＴ−ＰＣＲ結果である。
【図２Ｂ】配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを処理したＨａＣａＴ細胞に対し、ＰＭを処理した場合のＣＹＰ１Ａ１及びＣＯＸ−２遺伝子の発現量を確認して示したＲＴ−ＰＣＲ結果である。
【図２Ｃ】配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを処理したＨａＣａＴ細胞に対し、ＣＳＥを処理した場合のＣＹＰ１Ａ１及びＣＯＸ−２遺伝子の発現量を確認して示したＲＴ−ＰＣＲ結果である。
【図３Ａ】配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを処理したＨａＣａＴ細胞に対し、ＴＣＤＤを処理した場合のＭＭＰ−１及びＣＯＸ−２の蛋白質量を確認して示したウェスタンブロッティング結果である。
【図３Ｂ】配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを処理したＨａＣａＴ細胞に対し、ＰＭを処理した場合のＭＭＰ−１及びＣＯＸ−２の蛋白質量を確認して示したウェスタンブロッティング結果である。
【図４Ａ】配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドがＰＭと吸着して沈澱されるか否かということを確認した写真である。
【図４Ｂ】配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドがＣＳＥと吸着して沈澱されるか否かということを確認した写真である。
【図５Ａ】配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを処理したＨａＣａＴ細胞のｐ−Ａｋｔ、ｐ−ＥＲＫの蛋白質量を確認して示したウェスタンブロッティング結果である。
【図５Ｂ】配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを処理したＨａＣａＴ細胞のＳＩＲＴ１遺伝子の発現量を確認して示したＲＴ−ＰＣＲ結果である。
【図６Ａ】配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを処理したＮＩＨ３Ｔ３細胞のｐ−Ａｋｔ、ｐ−ＥＲＫの蛋白質量を確認して示したウェスタンブロッティング結果である。
【図６Ｂ】配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを処理したＮＩＨ３Ｔ３細胞のコラーゲン（Ｃｏｌ１ａ１）遺伝子、フィブロネクチン（fibronectin）遺伝子、エラスチン（elastin）遺伝子の発現量を確認して示したＲＴ−ＰＣＲ結果である。
【図７】ＵＶＢを照射し、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを処理したＨａＣａＴ細胞のＳＩＲＴ１遺伝子及びＡＱＰ３遺伝子の発現量を確認して示したＲＴ−ＰＣＲ結果である。
【図８Ａ】ＵＶＢを照射し、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを処理したＮＩＨ３Ｔ３細胞のコラーゲン（Ｃｏｌ１ａ１）遺伝子、フィブロネクチン（fibronectin）遺伝子、エラスチン（elastin）遺伝子の発現量を確認して示したＲＴ−ＰＣＲ結果である。
【図８Ｂ】ＵＶＢを照射し、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを処理したＮＩＨ３Ｔ３細胞のＭＭＰ−１蛋白質の量を確認して示したウェスタンブロッティング結果と、ＭＭＰ−２蛋白質の量を確認して示したゼラチンザイモグラフィ結果とである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２２】
１．汚染物質による皮膚損傷防止用または皮膚抗老化用のペプチド
本発明の一側面は、汚染物質による皮膚損傷を防止することができる新規ペプチドを提供するものである。
【００２３】
本発明の他の側面は、皮膚の老化を抑制することができる新規ペプチドを提供するものである。
【００２４】
前記ペプチドは、ペプチド結合で連結された２個以上のアミノ酸からなるポリマーを意味するが、ペプチド自体サイズが過度に大きく、標的組織または標的細胞に効果的に流入されなかったり、半減期が短く、短期間に体内で消滅したりするという短所があるので、本発明の前記ペプチドは、汚染物質の細胞流入抑制活性を有する、２０個以下、例えば、１５個以下または１０個以下のアミノ酸からなる。
【００２５】
本発明のペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、前記ペプチドの汚染物質による皮膚損傷抑制活性、及び皮膚の抗老化活性に影響を及ぼさない範囲内において、アミノ酸残基の欠失、挿入、置換、またはそれらの組み合わせにより、異なる配列を有するアミノ酸の変異体または断片でもある。前記ペプチドの汚染物質による皮膚損傷抑制活性、及び皮膚の抗老化活性を全体的に変更させないペプチドレベルでのアミノ酸交換は、当該分野に公知されている。場合によっては、リン酸化（phosphorylation）、硫酸化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、糖化（glycosylation）、メチル化（methylation）、ファルネシル化（farnesylation）などによっても変形される。従って、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドと実質的に同一なアミノ酸配列を含むペプチド、及びその変異体またはその活性断片を含む。前記実質的に同一な蛋白質とは、前記配列番号１のアミノ酸配列と、それぞれ７５％以上、例えば、８０％以上、９０％以上、９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を意味する。また、前記ペプチドには、標的化配列、タグ（tag）、標識された残基、半減期またはペプチド安定性を増大させるための特定目的によって製造されたアミノ酸配列が追加しても含まれる。
【００２６】
また、本発明の前記ペプチドは、当該分野で広く公知された多様な方法で獲得することができる。一例として、ポリヌクレオチド組み換えと蛋白質発現システムとを利用して製造するか、あるいはペプチド合成のような化学的合成を介し、試験管内で合成する方法、及び無細胞蛋白質合成法などによっても製造される。
【００２７】
また、さらに良好な化学的安定性、強化された薬理特性（半減期、吸水性、力価、効能など）、変更された特異性（例えば、広範囲な生物学的活性スペクトル）、低減された抗原性を獲得するために、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に、保護基が結合されてもいる。例えば、前記保護基は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でもあるが、ペプチドの改質、特に、ペプチドの安定性を増進させることができる成分であるならば、制限なしにも含まれる。前記「安定性」は、生体内蛋白質切断酵素の攻撃から、本発明のペプチドを保護するインビボにおける安定性だけではなく、保存安定性（例えば、常温保存安定性）も意味する。
【００２８】
本発明の前記汚染物質は、ダイオキシン（ＴＣＤＤ）、微細ほこり（ＰＭ：particulate matter）、またはタバコ煙抽出物（ＣＳＥ：cigarette smoke extract）でもあるが、それらに制限されるものではなく、外部から細胞内に流入され、細胞の成長過程と正常代謝過程とを妨害しうる毒性を有したゼノバイオティクス（xenobiotics）であるならば、いずれも含まれる。汚染物質による皮膚損傷防止は、汚染物質を細胞内部に流入させないことによっても達成され、それにより、細胞内において、汚染物質が毒性を示すことができなくできる。
【００２９】
また、本発明のペプチドは、前記汚染物質との吸着を介し、汚染物質の細胞内流入を阻害することができる。前記ダイオキシンのような汚染物質は、細胞内部に流入されれば。ＡｈＲと結合し、さまざまな遺伝子群の発現を誘導することができ、それにより、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＯＸ−２、ＭＭＰｓなどの発現が増大されて示されるが、前述のような遺伝子の発現量変化を確認することにより、前記汚染物質の細胞内流入抑制を介する本発明の前記ペプチドの細胞保護効果を確認することができる。
【００３０】
本発明の前記皮膚抗老化は、皮膚細胞の老化現象を抑制する効果を意味する。前記老化は、経時的に細胞において自然に発生する老化でもあり、太陽光によって発生する光老化でもあり、特に、紫外線によって発生する光老化でもある。また、前記老化は、多様な原因によって発生しうる細胞内酸化的ストレス現象によっても誘導され、それにより、細胞成長抑制や細胞死滅が進められ、皮膚細胞において、該皮膚細胞を構成する各種線維蛋白質の合成が阻害され、分解酵素発現が増大されうる。特に、紫外線照射により、皮膚細胞においては、ＳＩＲＴ１、ＡＱＰ３、Ｃｏｌ１ａ１、フィブロネクチン、エラスチンのような遺伝子の発現が抑制され、ＭＭＰ−１遺伝子、ＭＭＰ−２遺伝子の発現が促進され、皮膚細胞の光老化及びしわ発生を誘発しうる。
【００３１】
本発明のペプチドは、皮膚細胞内において、細胞増殖と係わる経路の遺伝子発現を増大させたり、線維蛋白質合成遺伝子の発現増大、線維蛋白質分解遺伝子の発現抑制を誘導したりすることができる。従って、前記ペプチドは、線維蛋白質合成を増大させることにより、皮膚のしわ及び弾力性を改善させることができ、皮膚障壁を改善させることにより、皮膚の抗老化活性を有するようにする。皮膚の老化が進行されることにより、皮膚細胞内において、発現量が変化する細胞増殖と係わる蛋白質、抗老化遺伝子、線維蛋白質、及びその分解酵素関連遺伝子の発現量を確認することにより、本発明の前記ペプチドの抗老化効果及び皮膚しわ改善効果を確認することができる。
【００３２】
本発明の前記ペプチドが有する汚染物質による皮膚損傷防止効果を確認するために、本発明の具体的な実施例においては、角質形成細胞と線維芽細胞とに、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドと共に、ダイオキシン、微細ほこり、タバコ煙抽出物を処理し、ＡｈＲ（aryl hydrocarbon receptor）の核移動量、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＯＸ−２及びＭＭＰ−１の発現量を確認した結果、前記ダイオキシン、前記微細ほこり、前記タバコ煙抽出物のような汚染物質の細胞内流入が抑制され、汚染物質の流入によるＡｈＲの核移動量と、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＯＸ−２及びＭＭＰ−１の発現量とが、本発明のペプチド処理依存的に減少することを確認した（図１Ａないし図３Ｂ）。
【００３３】
また、本発明の前記ペプチドと、汚染物質との吸着いかんを確認するために、本発明の具体的な実施例においては、微細ほこりとタバコ煙抽出物とを、本発明の配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドと混合させて肉眼で観察した結果、本発明のペプチドは、前記微細ほこり、タバコ煙抽出物のような汚染物質と吸着して沈澱されることを確認することができ、前記ペプチドの量に依存して吸着が起こることを確認した（図４Ａ及び図４Ｂ）。
【００３４】
また、本発明の前記ペプチドが有する皮膚細胞の自然老化抑制効果を確認するために、本発明の具体的な実施例においては、角質形成細胞と線維芽細胞とに、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを処理し、リン酸化された形態のＡｋｔ及びＥＲＫの量、ＳＩＲＴ１、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチンの発現量を確認した結果、リン酸化された形態のＡｋｔ及びＥＲＫの量、ＳＩＲＴ１蛋白質の量と、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチンのような線維蛋白質の発現量とが、本発明のペプチド処理依存的に増加することを確認した（図５Ｂないし図６Ｂ）。
【００３５】
併せて、本発明の前記ペプチドが有する紫外線（ＵＶ）照射による皮膚細胞の光老化現状の回復効果を確認するために、本発明の具体的な実施例においては、角質形成細胞と線維芽細胞とに、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを処理し、減少されたＳＩＲＴ１、ＡＱＰ３、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチンの発現量がさらに増加するか否かということ、そして増加されたＭＭＰ１、ＭＭＰ２の発現量がさらに減少するか否かということを確認した結果、ＳＩＲＴ１、ＡＱＰ３、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチンの発現量が、本発明のペプチド処理依存的に増加し、紫外線の照射によって減少された発現量が回復されることを確認し（図７及び図８Ａ）、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２の発現量が、本発明のペプチド処理依存的に減少し、紫外線の照射によって増加された発現量が回復されすることを確認した（図８Ｂ参照）。
【００３６】
従って、本発明の前記ペプチドは、ＴＣＤＤ、ＰＭ、ＣＳＥのような汚染物質の細胞内流入を抑制し、皮膚損傷を防止し、皮膚細胞の自然老化現象や、紫外線によって発生する光老化現象と係わる遺伝子の発現を調節することにより、抗老化活性を介し、皮膚のしわを改善させることができる活性を有することが明らかであり、従って、本発明の前記ペプチドは、汚染物質による皮膚損傷防止、抗老化及び皮膚しわ改善のための組成物の有効成分としても有用に使用される。
【００３７】
２．汚染物質によって誘発される疾患の予防用または治療用、皮膚老化改善用の薬学的組成物
本発明の他の側面は、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含む汚染物質によって誘発される疾患の予防用または治療用の薬学的組成物を提供するものである。
【００３８】
本発明のさらに他の側面は、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含む皮膚老化改善用薬学的組成物を提供するものである。
【００３９】
前記配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドは、前記「１．汚染物質に対する細胞保護用または皮膚細胞抗老化用のペプチド」項目で説明したペプチドと同一であるが、具体的な説明は、前述の「１．汚染物質に対する細胞保護用または皮膚細胞抗老化用のペプチド」項目を援用し、以下においては、汚染物質によって誘発される疾患の予防用または治療用、皮膚老化改善用の薬学的組成物に独特な構成についてのみ説明することにする。
【００４０】
本発明の前記ペプチドは、汚染物質の細胞内流入を阻害し、皮膚細胞の老化を抑制する効果があるが、前記ペプチドを有効成分として含む薬学的組成物は、汚染物質によって誘発される疾患を予防するか、あるいは治療する用途に利用することができ、皮膚細胞の老化を改善させ、しわを低減させ、皮膚の弾力を改善させるための用途に利用することができる。
【００４１】
前記汚染物質によって誘発される疾患は、汚染物質、例えば、ダイオキシン、微細ほこり、タバコ煙のような大気汚染物質によっても誘発される疾患を意味するものであり、皮膚疾患、肺疾患、神経系疾患、生殖系疾患、心血管系疾患などを含み、癌、アトピー皮膚炎、接触性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、にきび、皮膚乾燥症、乾癬、致死、免疫毒性、末梢神経系損傷、中枢神経系損傷、内分泌腺異常、生殖器官障害、嬰児及び乳児の発達障害、貧血、気管支炎、肺気腫、肺機能減退、喘息、慢性気管支炎、不整脈、心臓麻痺、狭心症または心筋梗塞症を含む。
【００４２】
本発明の前記薬学的組成物は、汚染物質の細胞流入を阻害することにより、 前記汚染物質によって誘発される疾患が発生しないように予防するか、前記疾患の患者の細胞に追加して流入される汚染物質を抑制して症状を緩和するか、あるいは病状の悪化を阻害し、疾患を治療するための用途にも使用される。
【００４３】
前記皮膚老化は、皮膚細胞の自然老化または光老化によって誘発されう皮膚状態の否定的変化を意味するものであり、皮膚のしわ、微細線、皮膚弾性及び／または緊張の低下、しわしわになること、薄くなること、つやと光沢との低減のような生理学的及び／または化学線的な老化でもあり、紫外線に露出されて真皮が薄くなる内部皮膚劣化（internal skin degradation）、特に、コラーゲン線維の劣化のように、老化による皮膚の外形的な変化でもある。
【００４４】
本発明の前記薬学的組成物は、皮膚細胞で発生しうる老化現象を抑制することにより、自然に、または光によって誘発された前記皮膚老化と係わり、皮膚弾力を正常なレベルに戻すというように、医学的に良好な皮膚状態に復旧させ、皮膚老化を改善させる用途にも使用される。
【００４５】
一方、本発明の前記ペプチドを有効成分として含む薬学的組成物は、本発明が属する技術分野で当業者が容易に実施することができる方法により、薬学的に許容される担体及び／または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位用量形態に製造されるか、あるいは多用量容器内に内入させても製造される。このとき、剤形は、オイル内または水性媒質内の溶液、懸濁液状または乳化液状でもあり、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤またはゲル（例えば、ヒドロゲル）状でもあり、分散剤または安定化剤を追加して含んでもよい。
【００４６】
また、前記薬学的組成物が含む前記ペプチドは、コロイド懸濁液、粉末、食塩水、脂質、リポソーム、微小球体（microspheres）またはナノ球形粒子のような薬学的に許容されうる担体によっても運搬される。それらは、運搬手段と複合体を形成するか、あるいは係わり、脂質、リポソーム、微細粒子、金、ナノ粒子、ポリマー、縮合反応剤、多糖類、ポリアミノ酸、デンドリマー、サポニン、吸着増進物質または脂肪酸のような、当業界に公知された運搬システムを使用しても生体内運搬される。
【００４７】
それ以外にも、薬学的に許容される担体は、製剤時に一般的に利用されるラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシア、ゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含んでもよいが、それらに制限されるのではない。また、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁液剤、保存剤などを追加で含んでもよい。
【００４８】
本発明による薬学的組成物は、臨床投与時、経口または非経口で投与が可能であり、一般的な医薬品製剤の形態でも使用される。すなわち、本発明の薬学的組成物は、実際の臨床投与時、経口及び非経口のさまざまな剤形によっても投与されるが、製剤化する場合には、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤のような希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、そのような固形製剤は、生薬抽出物または生薬発酵物に、少なくとも１以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤としては、懸濁液剤、耐溶液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、一般的に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外のさまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁液剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されうる。坐剤の基剤としては、ウィテプソル、マクロゴール、ツイン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチンなどが使用されうる。
【００４９】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険の比率で疾患を治療するに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出の比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素、及びその他医学分野に周知された要素によっても決定される。本発明の他の薬学的組成物は、個別治療剤で投与するか、あるいは他の汚染物質によって誘発される疾患の治療剤、または皮膚老化改善のための治療剤と併用しても投与され、従来の治療剤とは、同時、別途または順次に投与され、単一または多重で投与されうる。前記要素をいずれも考慮し、副作用なしに、最小限量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、それは、当業者によって容易に決定されうる。
【００５０】
具体的には、本発明の薬学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、状態、体重、体内への活性成分吸収度、不活性率、排泄速度、疾病種類、併用される薬物によっても異なり、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などによっても増減され、一例として、本発明のペプチドを１日当たり患者体重１ｋｇ当たり約０．０００１μｇないし５００ｍｇ、例えば、０．０１μｇないし１００ｍｇで投与することができる。また、医師または薬剤師の判断により、日程時間間隔で、１日数回、例えば、１日に２回ないし３回分割投与されうる。
【００５１】
３．汚染物質による皮膚損傷防止用または皮膚老化改善用の化粧料組成物
本発明のさらに他の側面は、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含む汚染物質による皮膚損傷防止用または皮膚老化改善用の化粧料組成物を提供するものである。
【００５２】
前記配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドは、前記「１．汚染物質に対する細胞保護用または皮膚細胞抗老化用のペプチド」項目で説明したペプチドと同一であるが、具体的な説明は、前述の「１．汚染物質に対する細胞保護用または皮膚細胞抗老化用のペプチド」項目を援用し、以下においては、汚染物質による皮膚損傷防止用または皮膚老化改善用の化粧料組成物の独特な構成についてのみ説明する。
【００５３】
本発明の前記ペプチドは、汚染物質の細胞内流入を阻害し、皮膚細胞の老化を抑制する効果があるが、前記ペプチドを有効成分として含む化粧料組成物は、汚染物質によって発生しうる皮膚損傷を防止する用途に利用することができ、皮膚細胞の老化を改善させ、しわを低減させ、皮膚の弾力を改善させるための用途に利用することができる。
【００５４】
前記ペプチドは、化粧料組成物全体１００重量％において、０．００１ないし３０重量％にも含有され、例えば、０．１ないし２０重量％、０．１ないし１０重量％、１ないし１０重量％、または２ないし５重量％にも含有されるが、それらに制限されるものではない。
【００５５】
本発明の前記ペプチドを有効成分として含む化粧料組成物は、前記ペプチドの汚染物質の細胞流入抑制活性、及び皮膚細胞の老化改善活性に影響を及ぼさない範囲内において、例えば、前記ペプチドの活性に相乗効果を与えることができる特徴がある他の成分を追加で含んでもよい。例えば、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤及びゲルカ剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型または非イオン型の乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤及びキレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、香料、親水性または親油性の活性剤、脂質小胞、または化粧品に一般的に使用される任意の他の成分のように、化粧品分野や皮膚科学分野において、一般的に使用される補助剤を含み、前記成分は、化粧品分野や皮膚科学分野において、一般的に使用される量にも含有される。
【００５６】
本発明の前記化粧料組成物は、当業界で一般的に製造されるいかなる剤形にも製造され、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ゲル、ローション、エッセンス、クリーム、パウダー、せっけん、シャンプー、リンス、パックマスク、界面活性剤含有クレンジング、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、オイル、リキッドファウンデーション、クリームファウンデーションまたはスプレーなどの化粧料にも剤形化される。
【００５７】
前記剤形が、溶液または乳濁液である場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が利用され、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルが利用されうる。前記剤形が懸濁液である場合には、担体成分として、水・エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁液剤、アルミニウムメタヒドロキシド、微小結晶性セルロース、ベントナイト、アガールまたはトラカントなどが利用されうる。前記剤形がクリームまたはゲルである場合には、担体成分として、ワックス、パラフィン、トラカント、動物性油、澱粉、セルロース誘導体、シリコン、ベントナイト、ポリエチレングリコール、シリカ、酸化亜鉛またはタルクなどが利用されうる。前記剤形がパウダーまたはスプレーである場合には、担体成分として、シリカ、タルク、アルミニウムヒドロキシ基、ラクトース、ケイ酸カルシウム、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体を含んでもよい。前記剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合には、担体成分として、脂肪族アルコールスルフェート、脂肪族アルコールエーテルスルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イミダゾリニウム誘導体、イセチオネート、メチルタウリン、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルスルフェート、脂肪族アルコール、アルキルアミドベタイン、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが利用されうる。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明について実施例によって詳細に説明する。
【００５９】
ただし、下記実施例は、本発明を具体的に例示するものであり、本発明の内容は、下記実施例によって限定されるものではない。
【００６０】
［製造例］ペプチド作製
自動ペプチド合成器（Milligen ９０５０、Millipore、米国）を利用し、下記表１に記載された配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを合成し、Ｃ１８逆相高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）（Waters Associates、米国）を利用し、それら合成されたペプチドを精製分離した。カラムは、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ３００Ｃ１８（２．１ｍｍ×１００ｍｍ、１．７μｍ、Waters Ｃｏ、米国）を利用した。
【表１】
2021526145.tif 000003
【００６１】
［実験例１］ペプチド処理によるＡｈＲの核移動量減少確認
汚染物質の細胞内流入抑制効果を確認するために、ダイオキシン（以下、「ＴＣＤＤ」とする）、微細ほこり（ＰＭ）及びタバコ煙抽出物（ＣＳＥ）を細胞に処理した後、ＡｈＲ）の核移動量を確認した。前記ＡｈＲは、細胞外部から流入されたゼノバイオティクスが存在する場合、それと結合し、転写因子として作用し、細胞内核に移動することになるので、ＡｈＲの核移動量を確認することにより、前記汚染物質の細胞内流入量を確認することができる。ＨａＣａＴ細胞（human keratinocyte）を対象に、ＴＣＤＤ、ＰＭ、ＣＳＥをそれぞれ処理して確認し、Ａ５４９細胞（human alveolar epithelial cell）を対象に、ＣＳＥを処理して確認した。ＴＣＤＤ、ＰＭ、ＣＳＥは、本発明のペプチドと混合し、無血清培地（ＳＦＭ：serum−free media）上において、１時間事前に反応させておいた後で使用した。
【００６２】
ＴＣＤＤを処理した場合の実験結果を確認するために、まず、７４継代（passage）のＨａＣａＴ細胞を、３×１０５／ウェルの細胞密度で、６ウェルプレートに播種（seeding）した後、１６時間培養させ、培養液を無血清培地（ＳＦＭ）で交換した後、そこに、事前に反応させておいたＴＣＤＤと、前記ペプチドの混合物とを１時間処理した。ＴＣＤＤは、０．１μＭの濃度で処理したしペプチドは、それぞれ１０，５０，１００μＭの濃度で処理した。陰性対照区（negative control）は、ペプチドは、処理せず、ＴＣＤＤだけ処理し、陽性対照区（positive control）は、ＴＣＤＤと共に、ＣＨ２２３１９１を１０μＭの濃度で処理した。細胞を前記混合物と１時間反応させた後、細胞を溶解させ、細胞質及び核蛋白質を分離することができるキット（Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents Kit、Thermo scientific、米国）を利用し、核蛋白質のみを分離した後、抗ＡｈＲ抗体（Santacruz biotechnology、米国）と抗ＨＤＡＣ抗体（Santacruz biotechnology、米国）とを使用し、ＡｈＲに対するウェスタンブロッティングを進めた。実験に使用した核蛋白質総量を比較するために、ＨＤＡＣも共に確認した。
【００６３】
ＰＭとＣＳＥとを処理した場合の実験過程も、前述のＴＣＤＤを処理した場合と同一方法を介して進められ、ＰＭは、５０μｇ／ｃｍ２の濃度、ＣＳＥは、２％の濃度でそれぞれ処理した。前記ＣＳＥは、減圧フラスコに、５０ｍｌのＰＢＳを充填して入れ、フラスコを真空ポンプに連結し、タバコ４０本に火をつけて調製したものを利用した。Ａ５４９細胞を対象にＣＳＥを処理して確認した実験も、前述の実験過程と類似しており、４８継代のＡ５４９細胞を、５×１０５／ウェルの細胞密度で６ウェルプレートに播種した後、ＣＳＥを処理して分離した核蛋白質を対象にウェスタンブロッティングを進めた。
【００６４】
その結果、図１Ａないし図１Ｄのウェスタンブロッティング結果から分かるように、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを処理せず、ＴＣＤＤ、ＰＭまたはＣＳＥのみを処理した陰性対照区（negative control）においては、核蛋白質において、ＡｈＲが多量存在するところに反し、前記ペプチドを処理した場合には、ペプチド濃度が上昇するにつれ、だんだんとＡｈＲ核内に存在する量が減少することを確認した。
【００６５】
前述のような結果を介して、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドにより、ＨａＣａＴ細胞及びＡ５４９細胞において、ＴＣＤＤ、ＰＭ、ＣＳＥのような汚染物質の流入が阻害され、それにより、ＡｈＲの核移動量も、減少したということを知ることができる。
【００６６】
［実験例２］ペプチド処理によるＣＹＰ１Ａ１及びＣＯＸ−２の発現量減少確認
汚染物質の細胞内流入抑制効果を、他の方法を介して確認するために、ＴＣＤＤ、ＰＭ及びＣＳＥをＨａＣａＴ細胞に処理した後、ＣＹＰ１Ａ１及びＣＯＸ−２の発現量を確認した。ＴＣＤＤのような汚染物質により、ＡｈＲの活性が促進されれば、ＡｈＲが転写因子として作用し、ＣＹＰ１Ａ１及びＣＯＸ−２の発現を増大させるので、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＯＸ−２の遺伝子がどれほど発現されたということを確認することにより、前記汚染物質の細胞内流入程度と、ＡｈＲの活性いかんとを確認することができる。ＴＣＤＤ、ＰＭ、ＣＳＥは、本発明のペプチドと混合し、無血清培地（ＳＦＭ）上において、１時間事前に反応させておいた後で使用した。
【００６７】
ＴＣＤＤを処理した場合の実験結果を確認するために、まず、７８継代のＨａＣａＴ細胞を、３×１０５／ウェルの細胞密度で６ウェルプレートに播種した後、１６時間培養させ、培養液を無血清培地（ＳＦＭ）で交換した後、そこに、事前に反応させておいたＴＣＤＤと前記ペプチドとの混合物を２時間処理した。ＴＣＤＤは、０．１μＭの濃度で処理し、ペプチドは、それぞれ１０，５０，１００μＭの濃度で処理した。陰性対照区（negative control）は、ペプチドは、処理せずにＴＣＤＤだけ処理し、陽性対照区（positive control）は、ＴＣＤＤと共に、ＣＨ２２３１９１を１０μＭの濃度で処理した。細胞を前記混合物と２時間反応させた後、ＲＮＡを分離した。培養液を除去した後、細胞を培養したプレートに、ＴＲＩｚｏｌ（Thermo Fisher Scientific、米国）を処理し、スクレーパを利用し、ＲＮＡを含む試料を得た後、クロロホルムを処理し、遠心分離を介して上澄み液を得た。上澄み液にイソプロパノールを処理し、さらに遠心分離し、底のＲＮＡペレットを確認し、そこに７０％のエタノールを処理し、ペレットを洗浄した後、十分に乾燥させ、ＲＮＡを分離した。分離されたＲＮＡは、ＲＮａｓｅ−free water（Corning、米国）に溶かして使用した。分離されたＲＮＡをｃＤＮＡで逆転写させ、ＣＹＰ１Ａ１及びＣＯＸ−２のプライマー（表２）を利用し、ＲＴ−ＰＣＲを遂行した（ｃＤＮＡ重合キット及びＰＣＲ ｐｒｅ−ｍｉｘ：Intron、韓国）。各処理群の全体ＲＮＡ量比較のために使用されたＧＡＰＤＨのプライマーは、下記表２の配列を有したものを利用した。
【００６８】
ＰＭとＣＳＥとを処理した場合の実験過程も、前述のＴＣＤＤを処理した場合と同一方法を介して進められ、ＰＭは、２５μｇ／ｃｍ２の濃度、ＣＳＥは、２％の濃度でそれぞれ処理した。前記ＣＳＥは、減圧フラスコに５０ｍｌのＰＢＳを充填して入れ、フラスコを真空ポンプに連結し、タバコ４０本に火をつけて調製したものを利用した。
【表２】
2021526145.tif 000004
その結果、図２Ａないし図２ＣのＲＴ−ＰＣＲ結果から分かるように、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを処理せず、ＴＣＤＤ、ＰＭまたはＣＳＥのみを処理した陰性対照区（negative control）においては、ＣＹＰ１Ａ１及びＣＯＸ−２の遺伝子が多量発現されたところに反し、前記ペプチドを処理した場合には、ペプチド濃度が上昇するにつれ、だんだんとＣＹＰ１Ａ１とＣＯＸ−２との発現量が減少することを確認した。
【００６９】
前述のような結果を介して、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドにより、ＨａＣａＴ細胞において、ＴＣＤＤ、ＰＭ、ＣＳＥのような汚染物質の流入が阻害され、それにより、ＣＹＰ１Ａ１及びＣＯＸ−２の発現量も減少したということを知ることができる。
【００７０】
［実験例３］ペプチド処理によるＭＭＰ−１及びＣＯＸ−２の蛋白質量減少の確認
汚染物質の細胞内流入抑制効果を、他の方法を介して確認するために、ＴＣＤＤ及びＰＭをＨａＣａＴ細胞に処理した後、ＭＭＰ−１蛋白質及びＣＯＸ−２蛋白質の量を確認した。前記ＭＭＰ−１は、コラーゲン分解酵素であり、ＴＣＤＤのような汚染物質によってＡｈＲの活性が促進されれば、ＡｈＲが転写因子として作用し、ＭＭＰ−１及びＣＯＸ−２の発現を増大させるので、ＭＭＰ−１、ＣＯＸ−２の遺伝子がどれほど発現されたかをいうことを確認することにより、前記汚染物質の細胞内流入程度と、ＡｈＲの活性いかんとを確認することができる。ＴＣＤＤ、ＰＭは、本発明のペプチドと混合し、無血清培地（ＳＦＭ）上において、１時間事前に反応させておいた後で使用した。
【００７１】
ＴＣＤＤを処理した場合の実験結果を確認するために、まず、８０継代のＨａＣａＴ細胞を、３×１０５／ウェルの細胞密度で６ウェルプレートに播種した後、１６時間培養させ、培養液を無血清培地（ＳＦＭ）で交換した後、そこに、事前に反応させておいたＴＣＤＤと前記ペプチドとの混合物を２４時間処理した。ＴＣＤＤは、０．１μＭの濃度で処理し、ペプチドは、それぞれ１０，５０，１００μＭの濃度で処理した。陰性対照区（negative control）は、ペプチドは、処理せずにＴＣＤＤだけ処理し、陽性対照区（positive control）は、ＴＣＤＤと共に、ＣＨ２２３１９１を１０μＭの濃度で処理した。細胞を前記混合物と２４時間反応させた後、細胞から溶解物を得て、抗ＭＭＰ−１抗体（Cell Signaling、米国）と抗ＣＯＸ−２抗体（Santacruz biotechnology、米国）とを使用し、ＭＭＰ−１及びＣＯＸ−２に対するウェスタンブロッティングを進めた。
【００７２】
β−アクチンは、実験に使用した蛋白質総量を比較するために、抗β−アクチン抗体（Santacruz biotechnology、米国）を利用して確認した。
【００７３】
ＰＭを処理した場合の実験過程も、前述のＴＣＤＤを処理した場合と同一方法を介して進められ、ＰＭは、５０μｇ／ｃｍ２の濃度で処理した
【００７４】
その結果、図３Ａ及び図３Ｂのウェスタンブロッティング結果から分かるように、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを処理せず、ＴＣＤＤまたはＰＭのみを処理した陰性対照区（negative control）においては、ＭＭＰ−１及びＣＯＸ−２の蛋白質量が多量であることに反し、前記ペプチドを処理した場合には、ペプチド濃度が上昇するにつれ、だんだんとＭＭＰ−１及びＣＯＸ−２の蛋白質量が減少することを確認した。
【００７５】
前述のような結果を介して、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドにより、ＨａＣａＴ細胞において、ＴＣＤＤ、ＰＭのような汚染物質の流入が阻害され、それにより、ＭＭＰ−１及びＣＯＸ−２の蛋白質量も減少したということを知ることができる。
【００７６】
［実験例４］ペプチドの環境汚染物質との吸着効果確認
本発明のペプチドが汚染物質と吸着されるか否かということを確認するために、ペプチドと汚染物質との混合物が沈澱される様相を肉眼で観察した。
【００７７】
まず、微細ほこりの吸着程度を確認するために、１００μｇ／ｍｌのＰＭと、それぞれ１００，２００μＭの前記ペプチドとを混合して沈澱される様相を観察し、タバコ４０本煙を利用して調製したＣＳＥと、２００μＭのペプチドとを混合して肉眼観察した。
【００７８】
その結果、図４Ａ及び図４Ｂの結果から分かるように、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを処理せず、ＰＭまたはＣＳＥのみを処理した場合には、混合物内のＰＭとＣＳＥとが混合され、そのまま存在することに反し、前記ペプチドを処理した場合には、ペプチド濃度が上昇するにつれ、だんだんと沈澱し、下方に沈む程度が上昇することを確認した。
【００７９】
前述のような結果を介し、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドは、ＰＭやＣＳＥのような汚染物質分子を捕らえて吸着される効果があり、前記汚染物質分子の皮膚内流入を阻害する効果があるということを知ることができる。
【００８０】
［実験例５］自然老化抑制ペプチド処理による角質形成細胞の活性促進確認
角質形成細胞（keratinocyte）を対象に、細胞において自然に進められる細胞老化現状を、本発明のペプチドが抑制させることができるか否かということを確認するために、自然老化と係わる蛋白質の量、及び遺伝子の発現量を確認した。
【００８１】
＜５−１＞増殖関連信号蛋白質のリン酸化いかん確認
Ａｋｔ及びＥＲＫは、細胞の増殖と係わる信号伝達過程に関与する蛋白質の一種であり、リン酸化された形態（それぞれｐ−Ａｋｔ、ｐ−ＥＲＫ）において活性を示すが、本発明のペプチドを処理する場合、リン酸化されたＡｋｔ、ＥＲＫが増加し、細胞老化現象を抑制することができるか否かということを確認した。
【００８２】
まず、８１継代のＨａＣａＴ細胞を、３×１０５／ウェルの細胞濃度で６ウェルプレートに播種した後、２４時間無血清培地（ＳＦＭ）で培養した後、本発明のペプチドを、それぞれ１０，５０，１００μＭの濃度で１５分間処理した。陽性対照区（positive control）は、前記ペプチドの代わりに、成長因子であるｂＦＧＦ１００ｎＭ及びＩＧＦ１００ｎＭを処理したものにした。細胞を前記混合物と１５分間反応させた後、細胞から溶解物を得て、抗ｐ−Ａｋｔ抗体（Cell Signaling、米国）と抗ｐ−ＥＲＫ抗体（Cell Signaling、米国）とを使用し、ｐ−Ａｋｔ及びｐ−ＥＲＫに対するウェスタンブロッティングを進めた。
【００８３】
β−アクチンは、実験に使用した蛋白質総量を比較するために、抗β−アクチン抗体（Santacruz biotechnology、米国）を利用して確認した。
【００８４】
その結果、図５Ａのウェスタンブロッティング結果から分かるように、前記ペプチドを処理した場合、ペプチド濃度が上昇するにつれ、だんだんとＡｋｔ及びＥＲＫのリン酸化程度が上昇することを確認した。
【００８５】
前述のような結果を介し、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドにより、ＨａＣａＴ細胞において、Ａｋｔ及びＥＲＫのリン酸化程度が上昇し、それは、細胞の成長が促進されることを意味するが、前記ペプチドを処理することにより、細胞の自然老化現象を抑制しうることを知ることができる。
【００８６】
＜５−２＞ＳＩＲＴ１（抗老化遺伝子）の発現増大確認
老化を防止する役割を行うＳＩＲＴ１遺伝子の発現量増加いかんを確認することにより、本発明のペプチドを処理する場合、細胞老化現象を抑制することができるか否かということを確認した。
【００８７】
７８継代のＨａＣａＴ細胞を、３×１０５／ウェルの細胞濃度で６ウェルプレートに播種した後、２４時間無血清培地（ＳＦＭ）で培養した後、本発明のペプチドを、それぞれ１０，５０，１００μＭの濃度で２４時間処理した。陽性対照区（positive control）は、前記ペプチドの代わりに、成長因子であるｂＦＧＦ１００ｎＭ及びＩＧＦ１００ｎＭを処理したものにした。細胞を前記混合物と２４時間反応させた後、細胞から前記実験例２と同一方法を介してＲＮＡを分離した後、分離されたＲＮＡをｃＤＮＡで逆転写させ、ＳＩＲＴ１のプライマー（表３）を利用し、ＲＴ−ＰＣＲを遂行した（ｃＤＮＡ重合キット及びＰＣＲ ｐｒｅ−ｍｉｘ：Intron、韓国）。各処理群の全体ＲＮＡ量比較のために使用されたＧＡＰＤＨのプライマーは、前記表２の配列を有したものを利用した。
【表３】
2021526145.tif 000005
【００８８】
その結果、図５ＢのＲＴ−ＰＣＲ結果から分かるように、前記ペプチドを処理した場合、ペプチド濃度が上昇するにつれ、だんだんとＳＩＲＴ１遺伝子の発現量が増加することを確認した。
【００８９】
前述のような結果を介し、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドにより、ＨａＣａＴ細胞において、抗老化遺伝子であるＳＩＲＴ１遺伝子の発現量が増加し、細胞の自然老化現象が抑制される効果があるということを知ることができる。
【００９０】
［実験例６］自然老化抑制ペプチド処理による線維芽細胞の活性促進確認
線維芽細胞（fibroblast）を対象に、細胞において自然に進められる細胞老化現状を、本発明のペプチドが抑制させることができるか否かということを確認するために、自然老化と係わる蛋白質の量、及び遺伝子の発現量を確認した。
【００９１】
＜６−１＞増殖関連信号蛋白質のリン酸化いかん確認
Ａｋｔ及びＥＲＫは、細胞の増殖と係わる信号伝達過程に関与する蛋白質の一種であり、リン酸化された形態（それぞれｐ−Ａｋｔ、ｐ−ＥＲＫ）で活性を示すが、本発明のペプチドを処理する場合、リン酸化されたＡｋｔ、ＥＲＫが増加し、細胞老化現象を抑制することができるか否かということを確認した。
【００９２】
まず、３８継代のＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス線維芽細胞）を、３×１０５／ウェルの細胞密度で６ウェルプレートに播種した後、２４時間無血清培地（ＳＦＭ）で培養した後、本発明のペプチドを、それぞれ１０，５０，１００μＭの濃度で１５分間処理した。陽性対照区（positive control）は、前記ペプチドの代わりに、成長因子であるｂＦＧＦ５０ｎＭ及びＩＧＦ２５ｎＭを処理したものにした。細胞を前記混合物と１５分間反応させた後、細胞から溶解物を得て、抗ｐ−Ａｋｔ抗体（Cell Signaling、米国）と抗ｐ−ＥＲＫ抗体（Cell Signaling、米国）とを使用し、ｐ−Ａｋｔ及びｐ−ＥＲＫに対するウェスタンブロッティングを進めた。β−アクチンは、実験に使用した蛋白質総量を比較するために、抗β−アクチン抗体（Santacruz biotechnology、米国）を利用して確認した。
【００９３】
その結果、図６Ａのウェスタンブロッティング結果から分かるように、前記ペプチドを処理した場合、ペプチド濃度が上昇するにつれ、だんだんとＡｋｔ及びＥＲＫのリン酸化程度が上昇することを確認した。
【００９４】
前述のような結果を介し、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドにより、ＮＩＨ３Ｔ３細胞において、Ａｋｔ及びＥＲＫのリン酸化程度が上昇し、それは、細胞の成長が促進されることを意味するが、前記ペプチドを処理することにより、細胞の自然老化現象を抑制しうることを知ることができる。
【００９５】
＜６−２＞真皮構成成分（コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン）の発現増大確認
真皮を構成する成分の一種として、線維形成と係わるコラーゲン遺伝子、フィブロネクチン遺伝子及びエラスチン遺伝子の発現量増加いかんを確認することにより、本発明のペプチドを処理する場合、細胞老化現象を抑制することができるか否かということを確認した。ＣＯＬ１Ａ１は、コラーゲンＩを暗号化する遺伝子である。
【００９６】
２６継代のＮＩＨ３Ｔ３細胞を、３×１０５／ウェルの細胞濃度で６ウェルプレートに播種した後、２４時間無血清培地（ＳＦＭ）で培養した後、本発明のペプチドを、それぞれ１０，５０，１００μＭの濃度で２４時間処理した。陽性対照区（positive control）は、前記ペプチドの代わりに、成長因子であるｂＦＧＦ１００ｎＭ及びＴＧＦ−／５ｎｇ／ｍｌを処理したものにした。細胞を前記混合物と２４時間反応させた後、細胞から、前記実験例２と同一方法を介してＲＮＡを分離した後、分離されたＲＮＡをｃＤＮＡで逆転写させ、Ｃｏｌ１ａ１、フィブロネクチン、エラスチンのプライマー（表４）を利用し、ＲＴ−ＰＣＲを遂行した（ｃＤＮＡ重合キット及びＰＣＲｐｒｅ−ｍｉｘ：Intron、韓国）。各処理群の全体ＲＮＡ量比較のために使用されたＧＡＰＤＨのプライマーは、前記表２の配列を有したものを利用した。
【表５】
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【００９７】
その結果、図７のＲＴ−ＰＣＲ結果から分かるように、前記ペプチドを処理した場合、ＵＶＢの照射によって阻害されたＳＩＲＴ１遺伝子及びＡＱＰ３遺伝子の発現量が、ペプチド濃度が上昇するにつれ、だんだんと増加することを確認した。
【００９８】
前述のような結果を介し、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドにより、ＨａＣａＴ細胞において、減少された抗老化遺伝子であるＳＩＲＴ１、及び皮膚障壁構成遺伝子であるＡＱＰ３の発現量が増加してさらに回復され、細胞の光老化現象が抑制される効果があるということを知ることができる。
【００９９】
［実験例７］光老化抑制紫外線によって抑制された線維芽細胞の活性回復確認
＜７−１＞真皮構成成分（コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン）の発現回復確認
ＵＶが照射されれば、真皮を構成するコラーゲン遺伝子、フィブロネクチン遺伝子、エラスチン遺伝子の発現が阻害されるので、本発明のペプチドを処理する場合、コラーゲン遺伝子、フィブロネクチン遺伝子、エラスチン遺伝子の発現量がさらに回復されて増加するか否かということを確認することにより、細胞の光老化現象を抑制することができるか否かということを確認した。
【０１００】
まず、３４継代のＮＩＨ３Ｔ３細胞を、５×１０５／ウェルの細胞密度で６ウェルプレートに播種した後、１６時間無血清培地（ＳＦＭ）で培養した後、本発明のペプチドを、それぞれ１０，５０，１００μＭの濃度で１時間処理した。ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳを充填した後、さらに６Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡを１時間事前に照射した。そして、さらに、本発明のペプチドを、それぞれ前述の濃度で６時間処理した。陽性対照区（positive control）は、前記ペプチドの代わりに、ＮａＣ ２．５ｍＭ及びクェルセチン（quercetin）５０μＭを処理したものにした。細胞を前記ペプチドと６時間反応させた後、細胞から、前記実験例２と同一方法を介してＲＮＡを分離した後、分離されたＲＮＡをｃＤＮＡで逆転写させ、コラーゲン（Ｃｏｌ１ａ１）、フィブロネクチン、エラスチンのプライマー（表４）を利用し、ＲＴ−ＰＣＲを遂行した（ｃＤＮＡ重合キット及びＰＣＲｐｒｅ−ｍｉｘ：Intron、韓国）。各処理群の全体ＲＮＡ量比較のために使用されたＧＡＰＤＨのプライマーは、前記表２の配列を有したものを利用した。
【０１０１】
その結果、図８ＡのＲＴ−ＰＣＲ結果から分かるように、前記ペプチドを処理した場合、ペプチド濃度が上昇するにつれ、だんだんとコラーゲン（Ｃｏｌ１ａ１）遺伝子、フィブロネクチン遺伝子、エラスチン遺伝子の発現量が増加することを確認した。
【０１０２】
前述のような結果を介し、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドにより、ＮＩＨ３Ｔ３細胞において、ＵＶＡの照射によって減少されたコラーゲン（Ｃｏｌ１ａ１）遺伝子、フィブロネクチン遺伝子、エラスチン遺伝子の発現量が増加してさらに回復され、細胞の光老化現象が抑制されることにより、前記遺伝子から発現される蛋白質により、皮膚のしわが改善される効果があるということを知ることができる。
【０１０３】
＜７−２＞ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２の発現阻害確認
コラーゲン分解と係わる蛋白質を暗号化するＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２は、紫外線の照射によって発現が増大されるが、本発明のペプチドを処理する場合、前記ＭＭＰ−１蛋白質及び前記ＭＭＰ−２蛋白質の合成がさらに抑制され、細胞老化現象を抑制することができるか否かということを確認した。
【０１０４】
３１継代のＮＩＨ３Ｔ３細胞を、５×１０５／ウェルの細胞密度で６ウェルプレートに播種した後、１６時間無血清培地（ＳＦＭ）で培養した後、本発明のペプチドを、それぞれ１０，５０，１００μＭの濃度で１時間処理した。ＰＢＳで洗浄してＰＢＳを充填した後、さらに６Ｊ／ｃｍ２のＵＶＢを１時間の照射した。そして、さらに本発明のペプチドを、それぞれ前述の濃度で４８時間処理した。陽性対照区（positive control）は、前記ペプチドの代わりに、ＮａＣ２．５ｍＭ及びクェルセチン５０μＭを処理したものにした。細胞を前記混合物と４８時間反応させた後、細胞から溶解物を得て、抗ＭＭＰ−１抗体（Cell Signaling、米国）を使用し、ＭＭＰ−１に対するウェスタンブロッティングを進めた。β−アクチンは、実験に使用した蛋白質総量を比較するために、抗β−アクチン抗体（Santacruz biotechnology、米国）を利用して確認した。
【０１０５】
また、ＭＭＰ−２の量を分析するために、前述のところで得た細胞の溶解物を準備した後、ゼラチンザイモグラフィ（gelatin zymography）を遂行した。ゼラチン（２ｍｇ／ｍｌ）を基質にし、蛋白質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）をまず施した後、２．５％のトリトンＸ−１００に３０分間処理した後、さらに緩衝剤（５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、０．２Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１％トリトンＸ−１００）で２４時間３７℃で処理した。処理されたゲルは、クマシーブリリアントブルー（Coomassie brilliant blue）Ｒ２５０（Sigma）で染色し、脱色バッファ（５％エタノール、７．５％酢酸及び蒸溜水）で処理した。その後、ゼラチンが加水分解されることによって示されるゲル相の空いているバンドを観察することにより、ＭＭＰ−２の活性を確認した。
【０１０６】
その結果、図８Ｂのウェスタンブロッティング結果及びザイモグラフィ結果から分かるように、前記ペプチドを処理した場合、ペプチド濃度が上昇するにつれ、だんだんとＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２の蛋白質量が減少することを確認した。
【０１０７】
前述のような結果を介し、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドにより、ＮＩＨ３Ｔ３細胞において、ＵＶＡの照射によって増加されたＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２の蛋白質量がさらに減少して回復され、コラーゲンの量がさらに増加され、細胞の光老化現象が抑制されることにより、皮膚しわの改善効果があるということを知ることができる。
【０１０８】
以上、本発明は、記載された実施例についてのみ詳細に説明されたが、本発明の技術思想範囲内において、多様な変形及び修正が可能であるということは、当業者において明白なことであり、そのような変形及び修正が、特許請求の範囲に属することは、言うまでもない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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