(57)【要約】Ｂ型肝炎ウイルス由来ポリペプチド及びその用途に係り、一様相によるポリペプチドは、第Ｉ型インターフェロン発現を増大させ、抗ＨＩＶ−１及び抗ＨＢＶだけではなく、全てのウイルスに対する抗ウイルス効果を示すだけではなく、既存の抗ウイルス剤と併用投与されて相乗的な効果があり、ＡＩＤＳまたは肝疾患のようなウイルス関連疾患の治療に有用に使用することができる効果がある。【選択図】図１
2021522807.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）重合酵素に由来するものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、抗ウイルス活性を有するものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリペプチドを含む抗ウイルス用薬学的組成物。
【請求項６】
前記ウイルスは、アデノウイルス、天然痘ウイルス、小児麻痺ウイルス、はしかウイルス、重症熱性血小板減少症侯群ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（hepatitis Ｃ virus）、ヒト免疫欠乏ウイルス−１（ＨＩＶ−１）及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記ポリペプチドは、抗ウイルス活性を有し、前記ウイルスは、ヒト免疫欠乏ウイルス−１（ＨＩＶ−１）及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
抗ウイルス剤をさらに含む、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記抗ウイルス剤は、アシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、アンプレナビル、アバカビル、アンサマイシン、シドフォビル、ダルナビル、デラビルジン、エファビレンツ、エトラビリン、ファムシクロビル、ヒペリシン、インジナビル、ラミブジン、ロブカビル、ネルフィナビル、ネビラピン、ノバフェロン、リトナビル、サキナビル、スタブジン、チプラナビル、ビラゾール、リバビリン、ザルシタビン、ジドブジン、マラビロク、ラルテグラビル、エルビテグラビル、ジダノシン、テノホビル、エムトリシタビン、ロピナビル、アタザナビル、エンフビルチド、クレブジン、エンテカビル及びアデホビルからなる群から選択される少なくとも一つである、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記抗ウイルス剤は、エンテカビルである、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記ポリペプチドは、ウイルスの増殖を抑制するものである、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記ポリペプチドは、ＨＩＶ−１挿入酵素のアセチル化を阻害し、前記酵素の活性を抑制するものである、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記ポリペプチドは、細胞内ミトコンドリアの活性酸素を増加させるものである、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記ポリペプチドは、第Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−Ｉ）の発現を増大させるものである、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記ポリペプチドは、ＨＢＶのＨＢｃＡｇまたはヌクレオカプシドの合成を抑制するものである、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリペプチドを含む後天性免疫欠乏症（ＡＩＤＳ）の予防用または治療用薬学的組成物。
【請求項１７】
前記後天性免疫欠乏症はＨＩＶ−１感染から発病されるものである、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載のポリペプチドを含む肝疾患の予防用または治療用薬学的組成物。
【請求項１９】
前記肝疾患は、肝炎、肝硬変症及び肝臓癌からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記肝疾患は、Ｂ型肝炎である、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記肝疾患はＨＢＶ感染から発病されるものである、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
請求項１に記載のポリペプチドを含む抗ウイルス用健康機能食品。
【請求項２３】
請求項５に記載の薬学的組成物を個体に投与する工程を含む、ウイルス感染症及びそれと関連した症状を予防または治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス由来ポリペプチド及びその抗ウイルス用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
後天性免疫欠乏症（ＡＩＤＳ：acquired immune deficiency syndrome）を誘発するヒト免疫欠乏ウイルス（ＨＩＶ：human immunodeficiency virus）は、２０１５年基準で、３千８万人を感染させるが、全世界的に関心が必要な感染原である。ＨＡＡＲＴ（highly active antiretroviral therapy）の導入にもかかわらず、完全な治療が困難である実情である。
【０００３】
伝統的な薬剤は、逆転写酵素（ＲＴ：reverse transcriptase）、蛋白質分解酵素（protease）やインテグラーゼ（ＩＮ：integrase）のようなウイルス酵素をターゲットとしてきた。ラルテグラビル（Raltegravir，ＩＳＥＮＴＲＥＳＳ／ＭＫ−０５１８）は、ウイルス負荷（viral load）を強く低減させ、臨床的使用が承認された統合酵素抑制剤（ＩＮＳＴＩ：prototypical integrase strand transfer inhibitor）である。しかし、ラルテグラビルに対する抵抗性が、臨床だけではなく、最適化されたＨＡＡＲＴ方法でも確認されている。
【０００４】
一方、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ：hepatitis Ｂ virus）は、全世界的に約２億４千万人から３億５千万人が感染しており、これは、無症状感染、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌に移行する多様な臨床経過を示す。全体肝細胞癌発生原因の５３％を占めているＨＢＶは、特に、アジアで高い感染を示す。アジアほとんどの国家において、保菌者の比率が５〜３５％に上る。ＨＢＶ感染による臨床症状と関連あるものとして、宿主因子、ウイルス因子や環境因子などがある。
【０００５】
現在使用される慢性肝炎治療剤としては、免疫調節剤（immunomodulators）であるインターフェロンや、ヌクレオシド類似体（nucleoside analogue）であるラミブジンなどがある。それらのうち、これまで十数年間効果が認められたインターフェロン−αは、高価で会って副作用があり、出生直後、感染が問題になるアジア地域患者には、その効果が下がってしまうという短所を有する。また、他の治療剤であるヌクレオシド類似体の場合、経口投与することができる長所を有するが、ＤＮＡポリメラーゼに作用し、ウイルス増殖を抑制するために、非増殖型ウイルスには、直接作用することができず、体内からＨＢＶを完全に除去し難く、耐性発生などの問題点が知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そのような技術的背景下において、抗ＨＩＶ−１効果及び抗ＨＢＶ効果を介して、ＡＩＤＳまたは肝疾患などを緩和させることができる新たな治療剤の発掘が必要な実情である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一様相は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供するものである。
【０００８】
他の様相は、前記ポリペプチドを含む抗ウイルス用薬学的組成物を提供するものである。
【０００９】
さらに他の様相は、前記ポリペプチドを含む後天性免疫欠乏症（ＡＩＤＳ）の予防用または治療用の薬学的組成物を提供するものである。
【００１０】
さらに他の様相は、前記ポリペプチドを含む肝疾患の予防用または治療用の薬学的組成物を提供するものである。
【００１１】
さらに他の様相は、前記ポリペプチドを含む抗ウイルス用健康機能食品を提供するものである。
【００１２】
さらに他の様相は、前記薬学的組成物を個体に投与する工程を含む、ウイルス感染症、及びそれと関連した症状を予防または治療する方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
一様相によるポリペプチドは、第Ｉ型インターフェロン発現を増大させ、抗ＨＩＶ−１及び抗ＨＢＶだけではなく、全てのウイルスに対する抗ウイルス効果を示すだけではなく、既存の抗ウイルス剤と併用投与されて相乗的な効果があり、ＡＩＤＳまたは肝疾患のようなウイルス関連疾患の治療に有用に使用することができるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ａ）は、一様相によるＢ型肝炎ウイルス由来ポリペプチド（Ｐｏｌｙ５、Ｐｏｌｙ６及びＰｏｌｙ７）の位置に係わる模式図であり、Ｂ）は、抗ＨＩＶ−１効果分析結果を示した図である。
【図２】Ａ）は、一様相によるポリペプチドの細胞毒性評価であり、Ｂ）は、一様相によるポリペプチドによる抗ＨＩＶ−１活性評価であり、Ｃ）は、一様相によるポリペプチドによるＨＩＶ−１ ＧＦＰ発現抑制評価であり、Ｄ）及びＥ）は、ＡＺＴ、及び一様相によるポリペプチドの細胞変性抑制効果評価を示した図である。
【図３】Ａ）は、一様相によるポリペプチド、及び他の抗ＨＩＶ−１製剤によるＨＩＶ−１ ＧＦＰ発現抑制評価であり、Ｂ）は、一様相によるポリペプチド、及び他の抗ＨＩＶ−１製剤によるｐ２４発現抑制評価であり、Ｃ）は、一様相によるポリペプチド、及び他の抗ＨＩＶ−１製剤によるＨＩＶ−１レベル抑制評価を示した図である。
【図４Ａ】一様相によるポリペプチド、及び他の抗ＨＩＶ−１製剤による経時的ＨＩＶ−１ level抑制評価を示した図である。
【図４Ｂ】一様相によるポリペプチド、及び他の抗ＨＩＶ−１製剤による経時的ＨＩＶ−１ level抑制評価を示した図である。
【図５】Ａ）は、一様相によるポリペプチド、及び他の抗ＨＩＶ−１製剤による２−ＬＴＲリング、及び挿入されたｃＤＮＡ量に係わる比較データであり、Ｂ）は、一様相によるポリペプチド、及び他の抗ＨＩＶ−１製剤によるｐ３００発現比較データであり、Ｃ）は、一様相によるポリペプチド、及び他の抗ＨＩＶ−１製剤による挿入酵素のアセチル化いかん比較データを示した図である。
【図６Ａ】ポリペプチド候補Ｐｏｌｙ５，Ｐｏｌｙ６，Ｐｏｌｙ７、及び各物質の抗ウイルス効果比較を示した図であり、ここで、一様相によるＢ型肝炎ウイルス由来ポリペプチド（Ｐｏｌｙ６）及び候補ポリペプチド（Ｐｏｌｙ５、Ｐｏｌｙ７）のｓ／ｅ抗原減少効果を比較した図である。
【図６Ｂ】一様相によるポリペプチドによる細胞生存力分析結果を示した図である。
【図７】慢性感染段階において、一様相によるポリペプチドによるＨＢＶ複製の抑制、及びＨＢＶ感受性細胞において、一様相によるポリペプチドによる抗ＨＢＶ効果評価を示した図であり、Ａ）は、ＨＢｓＡｇのレベルであり、Ｂ）は、ＨＢｅＡｇのレベルであり、Ｃ）は、ウイルス力価であり、Ｄ）は、サザンブロット結果であり、Ｅ）は、一様相によるポリペプチドの投与量とＨＢＶ複製との関係（ＩＣ５０）を示した図である。
【図８】Ｆ）は、ＰＢＳ、ＥＴＶ、及び一様相によるポリペプチドの処理後、コアタンパク質及びカプシドの形成を確認した結果であり、Ｇ）は、ＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ−Ｃ４において、各物質と共に、ＨＢＶビリオンを用量によって感染させた後、ＨＢｓＡｇを測定した結果であり、Ｈ）は、感染モデルにおいて、一様相によるポリペプチドの用量による抗ＨＢＶ効果を確認するために、ウイルスＤＮＡを測定した結果を示した図である。
【図９Ａ】マウスモデルに対する、一様相によるポリペプチドによるＨＢＶ抑制効果を示した図であり、ＰＢＳ、ラミブジン（３ＴＣ）、及び一様相によるポリペプチドの処理によるＨＢｓＡｇレベルである。
【図９Ｂ】マウスモデルに対する、一様相によるポリペプチドによるＨＢＶ抑制効果を示した図であり、ＰＢＳ、ラミブジン（３ＴＣ）、及び一様相によるポリペプチドの処理によるＨＢＶ ＤＮＡのレベルを示した図である。
【図１０】一様相によるポリペプチドによるミトコンドリアの酸化ストレス生成評価を示した図であり、Ａ）は、各物質処理による時間別ミトコンドリア活性酸素（ｍｔＲＯＳ）レベル（Rotenoneは、ミトコンドリア酸化ストレスに係わる陽性対照群である）を示し、Ｂ）は、一様相によるポリペプチドによる濃度別ミトコンドリア活性酸素レベルを示し、Ｃ）は、一様相によるポリペプチドの処理及び酸化ストレス阻害剤（ＭｉｔｏＴｅｍｐｏ）処理によるミトコンドリア活性酸素レベルを示した図である。
【図１１Ａ】一様相によるポリペプチドによるＩ型インターフェロン（Type１ ＩＦＮ）の増加様相を確認した図であり、前記ポリペプチド処理によるＩＦＮ−β、ＲＩＧ−Ｉ及びＩＳＧ１５のｍＲＮＡレベルを示す図である。
【図１１Ｂ】一様相によるポリペプチドによるＩ型インターフェロン（Type１ ＩＦＮ）の増加様相を確認した図であり、Ｂ）は、ｈＭＨ５５−２９３−ＩＳＲＥ細胞に各物質処理を施した細胞上澄み液を処理した後、ルシフェラーゼ（luciferase）の発現レベルを示し、Ｃ）は、マウスモデルにおいて、各物質処理によるＩＦＮ−βｍＲＮＡ発現レベルを評価した図である。
【図１２】中和Ｉ型インターフェロン受容体を介したｐｏｌｙ６の抗ＨＢＶ効果の遮断を示した図であり、Ａ）は、一様相の処理によって低下したｅ抗原及び細胞外ＨＢＶ ＤＮＡのレベルが、中和抗体処理によって回復することを示し、Ｂ）は、一様相の処理によって上昇したＩ型インターフェロンｍＲＮＡレベルが低下することを示した図である。
【図１３】一様相によるポリペプチドとエンテカビル（ＥＴＶ）との併用処理による抗ウイルス薬剤相乗効果（synergistic antiviral effects）を示した図であり、Ａ）は、併用処理による細胞外ＨＢＶ ＤＮＡ低下幅上昇効果であり、Ｂ）は、併用処理による細胞毒性テストであり、Ｃ）は、併用処理によるｓ抗原及びｅ抗原の低減レベルを示した図である。
【図１４】エンテカビル（ＥＴＶ）と、一様相によるポリペプチドとの併用処理によるＩインターフェロンの増加様相の相乗効果を確認した図であり、Ａ）は、併用処理によるＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＴＮＦ−αのｍＲＮＡレベルであり、Ｂ）は、ｈＭＨ５５−２９３−ＩＳＲＥ細胞に併用処理を施した細胞上澄み液を処理した後、ルシフェラーゼの発現レベルを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
一様相は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。
【００１６】
前記用語「ポリペプチド（polypeptide）」は、アミド結合（または、ペプチド結合）で連結された２個以上のアミノ酸からなるポリマーを意味する。前記ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列によってもなり、具体的には、配列番号２のアミノ酸配列によってもなる。前記配列番号１、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列と、それぞれ約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９２％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列相同性を有するポリペプチドを含んでもよい。
【００１７】
また、さらに良好な化学的安定性、強化された薬理特性（半減期、吸水性、力価、効能など）、変更された特異性（例えば、広範囲な生物学的活性スペクトル）、低減された抗原性を獲得するために、前記ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に保護基が結合されてもいる。前記保護基は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でもあるが、ポリペプチドの改質を、特に、ポリペプチドの安定性を増進させることができる成分であるならば、制限なしに含んでもよい。
【００１８】
前記用語「安定性」は、生体内タンパク質切断酵素の攻撃から、本発明のポリペプチドを保護するインビボ（in vivo）安定性だけではなく、保存安定性（例えば、常温保存安定性）も意味するものでもある。
【００１９】
同時に、前記ポリペプチドは、標的化配列、タグ（tag）、標識された残基のための特定目的に製造されたアミノ酸配列も追加して含んでもよい。
【００２０】
前記用語「相同性（homology）」は、野生型アミノ酸配列との類似程度を示すためのものであり、そのような相同性の比較は、当業界で広く知られた比較プログラムを利用して行うことができ、２個以上の配列間相同性を百分率（％）で計算することができる。
【００２１】
前記ポリペプチドは、天然から由来するものでもあり、当該分野に広く公知された多様なポリペプチド合成方法で獲得することができる。一例として、ポリヌクレオチド組み換えとタンパク質発現システムとを利用して製造するか、あるいはペプチド合成のような化学的合成を介して、試験管内で合成する方法、及び無細胞タンパク質合成法などによっても製造される。また、一例として、前記ポリペプチドは、ペプチド、植物由来の組織や細胞の抽出物、微生物（例えば、細菌類または真菌類、そして特に、酵母）の培養で得られた生産物でもあり、具体的には、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ：hepatitis Ｂ virus）重合酵素に由来することでもあり、さらに具体的には、ＨＢＶ重合酵素のｐｒｅＳ１領域に由来するものでもある。
【００２２】
前記ポリペプチドは、抗ウイルス活性を有することができる。例えば、前記ウイルスは、アデノウイルス、天然痘ウイルス、小児麻痺ウイルス、はしかウイルス、重症熱性血小板減少症侯群（severe fever with thrombocytopenia syndrome）ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（hepatitis Ｃ virus）、ヒト免疫欠乏ウイルス−１（ＨＩＶ−１：human immunodeficiency virus−１）及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）からなる群から選択される少なくとも一つでもあり、具体的には、ヒト免疫欠乏ウイルス−１（ＨＩＶ−１）及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）からなる群から選択される少なくとも一つでもある。
【００２３】
他の様相は、前記ポリペプチドを含む抗ウイルス用薬学的組成物を提供する。
【００２４】
前記薬学的組成物において、前記「ポリペプチド」などについては、前述の通りである。
【００２５】
また、前記組成物は、抗ウイルス剤をさらに含んでもよい。
【００２６】
前記抗ウイルス剤は、例えば、アシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、アンプレナビル、アバカビル、アンサマイシン、シドフォビル、ダルナビル、デラビルジン、エファビレンツ、エトラビリン、ファムシクロビル、ヒペリシン、インジナビル、ラミブジン、ロブカビル、ネルフィナビル、ネビラピン、ノバフェロン、リトナビル、サキナビル、スタブジン、チプラナビル、ビラゾール、リバビリン、ザルシタビン、ジドブジン、マラビロク、ラルテグラビル、エルビテグラビル、ジダノシン、テノホビル、エムトリシタビン、ロピナビル、アタザナビル、エンフビルチド、クレブジン、エンテカビル、アデホビル、オセルタミビル、ザナミビル、ペラミビル、アマンタジン及びテルビブジンからなる群から選択される少なくとも一つでもあり、具体的には、クレブジン、エンテカビル及びアデホビルからなる群から選択される少なくとも一つでもあり、さらに具体的には、エンテカビルでもある。
【００２７】
前記組成物が前記抗ウイルス剤をさらに含むことにより、抗ウイルス効果が顕著に上昇し、相乗効果を示すことができる。例えば、前記抗ウイルス剤がエンテカビルである場合、抗ＨＢＶ効果、及び第Ｉ型インターフェロン発現に対する効果が相乗効果として顕著に増大する。
【００２８】
また、前記ウイルスは、アデノウイルス、天然痘ウイルス、小児麻痺ウイルス、はしかウイルス、重症熱性血小板減少症侯群ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（hepatitis Ｃ virus）、ヒト免疫欠乏ウイルス−１（ＨＩＶ−１）及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）などからなる群から選択される少なくとも一つでもあり、具体的には、ヒト免疫欠乏ウイルス−１（ＨＩＶ−１）及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）からなる群から選択される少なくとも一つでもある。
【００２９】
前記ポリペプチドは、ウイルスの増殖を抑制するものでもある。具体的には、前記ポリペプチドは、ＨＩＶ−１挿入酵素のアセチル化を阻害し、前記酵素の活性を抑制し、ＨＩＶ−１の増殖を抑制することができる。また、前記ポリペプチドは、細胞内ミトコンドリアの活性酸素を増加させ、第Ｉ型インターフェロンに含まれるＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βの発現を増大させることができ、それを介して、ＨＢＶのＨＢｃＡｇまたはヌクレオカプシド（nucleocapsid）の合成を抑制することにより、ＨＢＶの増殖を抑制することができる。
【００３０】
特定理論に制限されることがなく、ＩＦＮの抗ウイルス作用の役割を行うＩＦＮ誘導タンパク質は、ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）、２’，５’−オリゴアデニル酸合成酵素（ＯＡＳ）並びにＲＮａｓｅ Ｌ及びＭｘタンパク質ＧＴＰａｓｅである。二本鎖ＲＮＡは、それぞれＩＦＮ誘導性ＰＫＲキナーゼ及び２’−５’−オリゴアデニル酸塩依存性ＲＮａｓｅＬによって触媒されたタンパク質リン酸化及びＲＮＡ分解を調整し、またＩＦＮ誘導性ＲＮＡ特異的アデノシンジアミナーゼ（ＡＤＡＲ１）によるＲＮＡ編集の役割を行う。ＩＦＮは、また誘導性酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ２）、並びに主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）Ｉ及びＩＩタンパク質を誘導し、それらは、いずれも感染に対する免疫反応の役割を行う（Clin Microbiol Rev. 2001 Oct; 14 (4): 778-809参照）。前記文献は、その全体が参照として、本明細書に含まれる。
【００３１】
従って、一具体例によるポリペプチドは、ＩＦＮの発現を増大させ、全てのウイルスに対する抗ウイルス活性を有することができる。
【００３２】
前記用語「予防」は、一様相による薬学的組成物の投与により、個体のウイルスによる疾病を抑制させたり、発病を遅延させたりする全ての行為を意味する。
【００３３】
前記用語「治療」は、一様相による薬学的組成物の投与により、個体のウイルスによる疾病に対する症状が好転するか、あるいは好ましく変更される全ての行為を意味する。
【００３４】
一様相によれば、前記ポリペプチドは、ＨＩＶ−１挿入酵素のアセチル化を抑制することにより、ＨＩＶ−１の増殖を抑制する。ＨＩＶ−１の増殖が抑制されることにより、ＡＩＤＳ治療効果を示すことができる。
【００３５】
また、一様相によれば、前記ポリペプチドは、ミトコンドリアストレスを増大させ、細胞内活性酸素を増加させ、Ｉ型インターフェロン（TypeＩ interferon）の発現を増大させ、ヌクレオカプシドの合成を抑制することにより、ＨＢＶの増殖が抑制されながら、肝疾患治療効果を示すことができる。
【００３６】
前記薬学的組成物は、有効成分を単独で含むか、あるいは１以上の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含み、薬学的組成物としても提供される。
【００３７】
具体的には、前記担体は、例えば、コロイド懸濁液、粉末、食塩水、脂質、リポソーム、微小球体（microspheres）またはナノ球形粒子でもある。それらは、運搬手段と複合体を形成したり、それらに係わったりすることができ、脂質、リポソーム、微細粒子、金、ナノ粒子、ポリマー、縮合反応剤、多糖類、ポリアミノ酸、デンドリマー、サポニン、吸着増進物質または脂肪酸のような当業界に公知された運搬システムを使用して生体内にも運搬される。
【００３８】
前記薬学的組成物は、薬学的に許容される担体、すなわち、製剤化される場合、一般的に利用されるラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含んでもよい。
【００３９】
また、前記薬学的組成物が製剤化される場合には、一般的に使用する潤滑剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁液剤、保存剤、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤のような希釈剤または賦形剤を使用しても調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、そのような固形製剤は、前記組成物に少なくとも１以上の賦形剤、例えば、澱粉、カルシウムカーボネート（calcium carbonate）、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜても調剤される。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤としては、懸濁液剤、耐溶液剤、乳剤、シロップ剤などがあり、一般的に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、さまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁液剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれてもよい。非水性溶剤、懸濁液剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されてもよい。坐剤の基剤としては、ウイテブゾール（Witepsol）、マクロゴール、ツイン（Tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用され、点眼剤形態での製造時、公知の希釈剤または賦形剤などが使用されもする。
【００４０】
前記用語「薬学的に許容される」というのは、前記組成物に露出される細胞やヒトに毒性がない特性を示すことを意味する。
【００４１】
また、前記薬学的組成物は、従来に知られている抗ウイルス用組成物と混合しても提供される。すなわち、本薬学的組成物は、白内障抗ウイルス効果を有する公知の組成物と併行して投与することができる。
【００４２】
前記用語「投与」というのは、適切な方法で個体に所定物質を導入することを意味する。
【００４３】
前記用語「個体」は、ウイルスによる疾病の治療を必要とする対象を意味し、さらに具体的には、ヒト、または非ヒトである霊長類、マウス（mouse）、犬、猫、馬及び牛などの哺乳類を意味する。
【００４４】
前記薬学的組成物は、目的とする方法により、経口投与したり、非経口投与（例えば、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮下、皮内または局所に適用する）したりし、投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び時間によって異なるが、当業者によって適切にも選択される。
【００４５】
前記薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。前記用語「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険の比率により、疾患治療に十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出の比率、治療期間、同時使用される薬物を含んだ要素、及びその他医学分野に周知の要素によっても決定される。具体的には、前記薬学的組成物は、０．０１ないし１，０００ｍｇ／ｋｇ／日であり、さらに具体的には、０．１ないし５００ｍｇ／ｋｇ／日で投与されもする。前記投与は、一日に１回投与されるものでもあり、数回に分けて投与されるものでもある。
【００４６】
一様相による薬学的組成物は、個別治療剤として投与するか、あるいは他の抗炎症剤と併用しても投与され、従来の抗炎症剤とは、同時に、別途に、または順次にも投与され、単一または多重にも投与される。前記要素をいずれも考慮し、副作用なしに、最小限量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、それは、当業者によって容易に決定されるであろう。
【００４７】
具体的には、前記薬学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、状態、体重、体内における活性成分の吸収度、不活性率、排泄速度、疾病種類、併用される薬物によっても異なり、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などによっても増減される。
【００４８】
さらに他の様相は、前記ポリペプチドを含む後天性免疫欠乏症（ＡＩＤＳ：acquired immune deficiency syndrome）の予防用または治療用の薬学的組成物を提供する。
【００４９】
前記後天性免疫欠乏症（ＡＩＤＳ）は、ＨＩＶ−１感染からも発病される。
【００５０】
さらに他の様相は、前記ポリペプチドを含む肝疾患の予防用または治療用の薬学的組成物を提供する。
【００５１】
前記肝疾患は、ＨＢＶ感染から発病されるものでもあり、具体的には、肝炎、肝硬変症及び肝臓癌からなる群から選択される少なくとも一つでもあり、さらに具体的には、Ｂ型肝炎から発展するものでもある。
【００５２】
さらに他の様相は、前記ポリペプチドを含む抗ウイルス用健康機能食品を提供する。
【００５３】
前記健康機能食品において、前記「ポリペプチド」、「ＡＩＤＳ」及び「肝疾患」、「ウイルス」などについては、前述の通りである。
【００５４】
前記用語「改善」というのは、治療される状態と係わるパラメータ、例えば、症状の程度を少なくとも低減させる全ての行為を意味する。このとき、前記健康機能食品は、ＡＩＤＳまたは肝疾患の予防または改善のために、当該疾患の発病段階以前または発病後、治療のための薬剤と同時にまたは別個にも使用される。
【００５５】
前記健康機能食品において、有効成分は、食品にそのまま添加したり、他の食品または食品成分と共に使用されたりし、一般的な方法によっても適切に使用される。有効成分の混合量は、その使用目的（予防用または改善用）によって適切にも決定される。一般的に、食品または飲料の製造時、前記健康機能食品は、原料に対して、具体的には、約１５重量％以下、さらに具体的には、約１０重量％以下の量にも添加される。しかし、健康及び衛生を目的にするか、あるいは健康調節を目的とする長期間摂取の場合には、前記量は、前記範囲以下でもある。
【００５６】
前記健康機能食品は、担体、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤、賦形剤または添加剤のうち１以上をさらに含み、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤及び液剤剤形からなる群から選択された一つによっても剤形される。前記添加されうる食品としては、各種食品類、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、シロップ剤、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康機能性食品類などがある。
【００５７】
前述の担体、賦形剤、希釈剤及び添加剤の具体的な例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、エリトリトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、水、砂糖シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルからなる群から選択される少なくとも一つでもある。
【００５８】
前記健康機能食品は、前記有効成分を含む以外、特別な制限なしに、他の成分を必須成分として含んでもよい。例えば、通常の飲料と共に、さまざまな香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含んでもよい。前述の天然炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など、ジサッカライド、例えば、マルトース、スクロースなど、及びポリサッカライド、例えば、デキストリン、シクロデキストリンのような一般的な糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールのような糖アルコールでもある。前述以外の香味剤として、天然香味剤（ソーマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、グリシルヒジンなど））及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に使用することができる。前記天然炭水化物の比率は、当業者の選択によって適切にも決定される。
【００５９】
前述のところ以外にも、一様相による健康機能食品は、さまざまな栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤のような風味剤、着色剤及び充填剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含んでもよい。そのような成分は、独立的して、または組み合わせて使用することができ、そのような添加剤の比率も、当業者によって適切にも選択される。
【００６０】
さらに他の様相は、前記薬学的組成物を個体に投与する工程を含む、ウイルス感染症、及びそれと関連した症状を予防または治療する方法を提供する。
【００６１】
前述の「ポリペプチド」、「個体」、「投与」、「薬学的組成物」、「ウイルス」などは、前述の通りである。
【００６２】
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００６３】
実施例１．抗ＨＩＶ−１効能の確認
参照例．統計分析
対照群と試験群との統計的比較は、一元分散分析（one-way ＡＮＯＶＡ）を使用して分析した。統計的有意性ｐ値は、次のように設定された。ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）または ＜０．００１（＊＊＊）。全ての実験は、独立して３回反復した。
【００６４】
実験例１．抗ＨＩＶ−１効果を示すＨＢＶ重合酵素由来ペプチドの確認
本実験例においては、ＨＢＶ重合酵素由来ペプチドが、抗ＨＩＶ−１効果を有するか否かということを確認するものである。具体的には、遺伝子型Ｃ２感染を有した慢性患者のＢ型肝炎ウイルスにおいて、ｐｒｅＳ１開始部位の１５、１８及び２１個のヌクレオチド欠失が、ウイルスの増殖を調節し、疾病進行に寄与し、本実験例において、それぞれ１５、１８及び２１個のヌクレオチド欠失された配列に相応する重合酵素地域から、３種類のペプチド候補物質を選別した。そして、それらペプチドを、Ｐｏｌｙ５（ＧＲＬＶＦ、配列番号１）、Ｐｏｌｙ６（ＧＲＬＶＦＱ、配列番号２）またはＰｏｌｙ７（ＧＲＬＶＦＱＴ、配列番号３）を命名し（図１Ａ））、各ペプチドは、９−フルオレニルメチルオキシカルボルニル（Ｆｍｏｃ）基盤の固体相方法で、Peptron Ｉｎｃ．で合成され、実施例で使用された全てのペプチドの純度、高性能液体クロマトグラフィによって測定されたように、９５％以上であった。前記３個のポリペプチドの抗ＨＩＶ−１効果を評価するために、細胞基盤抗ウイルス効果を分析した。ＭＴ−４細胞（４×１０５細胞数）に、ＨＩＶ−１（４×１０５ＣＣＩＤ５０）を１時間感染させた。前記ＭＴ−４細胞は、ＮＩＨ／ＡＩＤＳResearch and Reference Reagent Programから提供された。ＨＩＶ−１は、２９３ＦＴ細胞に、単一バイシストロニックＲＮＡから、Ｎｅｆと強化された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を共発現するｐＢＲ＿ＨＩＶ−１＿Ｍ＿ＮＬ４−３＿ＩＲＥＳ＿ｅＧＦＰベクター（ＤＳ４４１）を、Lipofectamine ２０００試薬（Life Technologies）を使用し、４８時間形質感染させた後、ウイルス前駆体であるＨＩＶ−１を含む上澄み液を収去し、ウイルス力価をｐ２４ ＥＬＩＳＡ（ＡＢＩ）で測定した。感染性ＨＩＶ−１を増幅させるために、ＭＴ−４細胞に、ウイルス前駆体であるＨＩＶ−１を、多数感染濃度（ＭＯＩ）である０．５の濃度で７２時間感染させた。その後、収集した上澄み液を遠心分離及び濾過した後、感染性ウイルスの力価を測定するために、ｐ２４ ＥＬＩＳＡを使用し、使用直前まで−７０℃で保管した。
【００６５】
細胞をＰＢＳで洗浄した後、感染された細胞に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アジドチミジン（ＡＺＴ（３−アジド−３−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、及びＰｏｌｙ５ないしＰｏｌｙ７を処理した。このとき、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とアジドチミジン（ＡＺＴ）は、Sigma−Aldrichから購入した。２日間培養した後、蛍光顕微鏡を使用してＧＦＰイメージを確認した。相対的なＧＦＰ強度は、ImageＪソフトウェアプログラム（National Institutes of Health）を使用し、面積当たりピクセル単位で決定した。上澄み液と細胞とを取り、ＲＮＡを抽出した後、ＲＴ−ｑＰＣＲを実施し、ウイルス力価を決定し、上澄み液に生成されたウイルスを測定するために、ｐ２４ ＥＬＩＳＡを使った。処理した試薬に対する細胞の生存力は、ＭＴＴ分析を利用して進めた。
【００６６】
Ｐｏｌｙ５ないしＰｏｌｙ７の抗ウイルス効果において、ＨＳＰ９０（Cell Signaling）の役割を確認するために、ＭＴ−４細胞をＨＩＶ−１に１時間感染させた後、１時間、ＨＳＰ９０抗体（１μｇ／ｍｌ）または１７−ＡＡＧ（Calbiochem、１μＭ）を処理し、ＨＳＰ９０の活性を遮断し、ＤＭＳＯ、ＡＺＴまたはＰｏｌｙ６を接種した細胞を４８時間接種した。ＨＩＶ−ＬＴＲ依存的なＧＦＰ合成は、ＧＦＰ抗体（Santa Cruz Biotechnology）を使用し、ウェスタンブロット分析で確認した。
【００６７】
ＤＭＳＯ（０．５％）、ＡＺＴ（５ｎＭ）または３種候補物質１０μＭを、ＨＩＶ−１が感染されたＭＴ−４細胞において処理し、２日後、ＧＦＰ映像及びｐ２４ ＥＬＩＳＡを実施し、ＨＩＶ−１の力価を確認した結果、ウイルス生産は、Ｐｏｌｙ５及びＰｏｌｙ７によって低減され、特に、Ｐｏｌｙ６により、相当に低減されたということを確認することができた（図１Ｂ））。
【００６８】
実験例２．細胞毒性分析
本実験例においては、Ｐｏｌｙ６の効果を調査する前、非特異的に細胞毒性により、Ｐｏｌｙ６がＨＩＶ−１増殖に影響を及ぼす可能性を排除するために、細胞に対するＰｏｌｙ６の毒性効果を測定した。具体的には、ＭＴ−４細胞を、１×１０４細胞数になるようにし、Ｐｏｌｙ６を濃度別に処理し、５日間培養し、ＭＴＴ分析キット（Promega）を使用し、細胞毒性いかんを測定した。ＨＩＶ−１感染により、細胞毒性によって細胞死滅が発生する場合、Ｐｏｌｙ６による抗細胞毒性効果を分析するために、ＭＴ−４細胞（１×１０４細胞数）にＨＩＶ−１（１×１０４ＣＣＩＤ５０）を感染させ、５日間培養後、細胞生存能を分析した。それと共に、上澄み液においてＨＩＶ−１力価を評価するために、ｐ２４ ＥＬＩＳＡを遂行した。その結果、Ｐｏｌｙ６は、５日間、２５μＭ濃度までＭＴ−４細胞に、有意な細胞毒性を起こさなかった（図２Ａ））。２９３ＦＴ細胞からＨＩＶ−１を生成するために、ｐＢＲ＿ＨＩＶ−１＿Ｍ＿ＮＬ４−３＿ＩＲＥＳ＿ｅＧＦＰベクターを形質感染させ、ＭＴ−４細胞における、Ｐｏｌｙ６による抗ＨＩＶ−１活性を、ｐ２４ ＥＬＩＳＡで評価した。ＨＩＶ−１増殖は、Ｐｏｌｙ６により、濃度によって阻害され、平均５０％抑制濃度（ＩＣ５０）は、約０．２６６４μＭであった（図２Ｂ））。また、ＨＩＶ−１ＬＴＲの活性によるＧＦＰ発現もＰｏｌｙ６によって濃度によって漸次的に減少された（図２Ｃ）。ＨＩＶ−１が感染されたＭＴ−４細胞は、ウイルス増殖により、細胞自滅信号伝達経路が活性化され、細胞が破壊される。従って、ＡＺＴ処理後、ＭＴ−４細胞は、ＡＺＴによる抗ウイルス効果のために、窮極的に細胞保護効果を示したということが分かった。ＡＺＴと同様に、ＨＩＶ−１に感染されたＭＴ−４細胞に対するＰｏｌｙ６の細胞変性抑制効果を分析した結果、図２でのように、ＡＺＴ（図２Ｄ））及びＰｏｌｙ６（図２Ｅ））において、濃度により、有意な細胞保護効果を確認した。５μＭ濃度のＰｏｌｙ６は、ＨＩＶ−１によって誘導される細胞死滅から、細胞を約１００％健康に維持するのに十分であった。Ｐｏｌｙ６の抗ＨＩＶ−１効果による細胞保護能の増大により、細胞の上澄み液におけるウイルスｐ２４の量は、相対的に、ＨＩＶ−１の抑制によって減少した（図２Ｅ）。すなわち、そのような実験結果を総合すれば、本実験例においては、Ｐｏｌｙ６がＨＩＶ−１の増殖を抑制し、細胞変性を抑制することにより、ＭＴ−４細胞の生存能を保護する中枢的な役割を行っているということが分かった。
【００６９】
実験例３．人末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）でのＨＩＶ−１増殖抑制効果の確認
本実験例においては、ex−vivoでＰｏｌｙ６の抗ＨＩＶ−１効果を確認するために行われた。具体的には、ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ）にＨＩＶ−１を感染させた。Ｂｉｏｃｏｌｌ（BIOCHROME）を使用し、ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離し、１０％ ＦＢＳと１μｇ／ｍｌフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、Sigma−Aldrich）、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ、PEPROTECH）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で３日間培養した。ＰＨＡ−刺激ＰＢＭＣ細胞を、０．１の多数感染濃度（ＭＯＩ：multiplicity of infection）でＨＩＶ−１に感染させ、試薬を処理した後、５日間培養した。ＰＢＭＣｓにおけるウイルス力価を決定するために、細胞からウイルスＲＮＡを分離し、記述されたように、ＲＴ−ｑＰＣＲによって分析した。ＧＦＰ発現は、蛍光顕微鏡で観察し、ＧＦＰ抗体を使用し、ウェスタンブロット分析を行った。
【００７０】
このとき、ＨＩＶ−１ウイルスの力価を評価するために、ｐ２４ ＥＬＩＳＡ（ＡＢＬ、Rockville、ＭＤ）を製造社のプロトコルによって遂行した。細胞を培養した上澄み液、及び細胞のＨＩＶ−１ＲＮＡを、ＱＩＡａｍｐ UltraSens Virus kit（QIAGEN）を使用して精製し、ＨＩＶ−１のＧａｇ地域に特異的なプライマーを使用し、ＲＴｑＰＣＲで定量した。グリセリンアルデヒドホスフェート脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）は、標準化のための基準遺伝子として使用された。ＧａｇＦ、ＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧＴＴＡＡＡＡＧＡＧ（正方向、配列番号４）、ＧａｇＲ、ＴＣＣＣＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＴＧＧ（逆方向、配列番号５）、ＧＡＰＤＨ−Ｆ、ＡＡＴＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡ（正方向、配列番号６）、及びＧＡＰＤＨ−Ｒ、ＴＧＧＡＣＴＣＣＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＡ（逆方向、配列番号７）のようなプライマーセットをＲＴｑＰＣＲに使用した。ＨＩＶ−１ Ｇｅｎｅｓｉｇ標準キット（Primer design）を使用し、ウイルス力価を標準化した。
【００７１】
ＰＢＭＣ細胞をＨＩＶ−１に感染させた後、５日間、ＤＭＳＯ（０．５％）、ＡＺＴ（５ｎＭ）、ラルテグラビル（１０ｎＭ）またはＰｏｌｙ６（１０μＭ）と共に培養した後、ＤＭＳＯと比較するとき、ＡＺＴまたはラルテグラビルで見ることができる類似したレベルで、ＰＢＭＣ細胞内において、ＧＦＰ及びｐ２４タンパク質の発現が、Ｐｏｌｙ６により、有意に低減するということを発見した（図３Ａ及び図３Ｂ））。また、ＰＢＭＣ細胞におけるＨＩＶ−１増殖が、ＤＭＳＯと比較し、Ｐｏｌｙ６により、ＡＺＴまたはラルテグラビルにおいて示す類似したレベルで有意に低減するということを確認した（図３Ｃ））。そのような結果は、Ｐｏｌｙ６がＭＴ−４細胞だけではなく、ヒトＰＢＭＣにおいても、ＨＩＶ−１増殖を抑制することができるということを示す。
【００７２】
実験例４．ＨＩＶ−１挿入抑制効果の確認
本実験例においては、ＨＩＶ−１ＤＮＡの宿主遺伝体内挿入を分析するために、２つの長い末端反復配列（２−ＬＴＲ）と、Ａｌｕ ＰＣＲが遂行された。具体的には、２−ＬＴＲ ＰＣＲは、細胞質において、挿入されずに残って発生する円形ウイルスＤＮＡの検出に使用され、Ａｌｕ ＰＣＲは、挿入されたウイルスＤＮＡの増幅のために遂行された。４８時間の試薬処理後、ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Virus Spin Kit（QIAGEN）を使用し、ＨＩＶ−１に感染されたＭＴ−４細胞からウイルスＤＮＡを抽出した。２−ＬＴＲ ＰＣＲ分析のためのプライマー及び探針として、２−ＬＴＲＦ（ＭＨ５３５）、ＡＡＣＴＡＧＧＧＡＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＧ（正方向、配列番号８）、２−ＬＴＲＲ（ＭＨ５３６）、ＴＴＣＡＣＡＧＡＴＣＡＡＧＧＡＴＡＴＣＴＴＧＴＣ（逆方向、配列番号９）、及び２−ＬＴＲの探針として、ＦＡＭ−ＡＣＡＣＴＡＣＴＴＧＡＡＧＣＡＣＴＣＡＡ−ＴＡＭＲＡ（配列番号１０）が使用され、Ａｌｕ−１Ｆ、ＴＣＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＧＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧ（正方向、配列番号１１）、Ａｌｕ−１Ｒ、ＣＣＣＴＡＧＴＴＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＴＣＣＣＡ（逆方向、配列番号１２）及び２次Ａｌｕ ＰＣＲフォワードプライマー、Ａｌｕ−２Ｆ、ＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴＡＧＣＡＴＴＴＣＧＴ（正方向、配列番号１３）、Ａｌｕ−２Ｒ、ＡＧＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＴＴＧＴＡＧＡ（逆方向、配列番号１４）、及びＡｌｕ ＰＣＲの探針として、ＦＡＭ−ＡＧＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＧＡＣＣＣＧ−ＴＡＭＲＡ（配列番号１５）が使用された。
【００７３】
また、本実験例においては、Ｐｏｌｙ６による挿入抑制のメカニズムを明らかにするために、挿入酵素及びｐ３００抗体（Santa Cruz Biotechnology）を使用し、ウェスタンブロット及び免疫沈澱分析を行った。免疫沈澱分析のために、ＭＴ−４細胞をＨＩＶ−１に１時間感染させた後、ＤＭＳＯ（０．５％）、ＡＺＴ（５ｎＭ）、ラルテグラビル（１０ｎＭ）またはＰｏｌｙ６（１０μＭ）で４８時間処理した。細胞に、ＲＩＰＡ（Ａｂｃａｍ）緩衝液を処理し、細胞を溶解させた後、全体溶解液を１０μｌのProtein Ａ／Ｇ ＰＬＵＳ−Agarose（ｓｃ２００３、Santa Cruz）で事前に洗浄し、上澄み液を収集した。上澄み液を、４℃で１時間２０μｇの抗体と共に恒温培養した後、１０μｌのProtein Ａ／Ｇ ＰＬＵＳ−Agaroseを添加し、４℃で３６０゜回転させながら、一晩培養した。最終洗浄後、免疫沈殿物を収集し、生成された沈殿物をウェスタンブロット分析のためにローディングした。
【００７４】
一方、ＭＴ−４細胞にＨＩＶ−１が感染されれば、ＨＩＶ−１の増殖は、さまざまな段階を介して進められる。ウイルスの付着、挿入、転写、またはウイルス合成のようなＨＩＶ−１生命周期にいくつかの段階があるために、新たに開発される抗ＨＩＶ−１試薬の多様な作用メカニズムが存在している。それにより、Ｐｏｌｙ６によるＨＩＶ−１抑制の基本メカニズムをさらに詳細に明らかにするため、Ｐｏｌｙ６及びＡＺＴ（逆転写酵素抑制）、ラルテグラビル（挿入酵素抑制）、リトナビル、Ｔ２０（ウイルス出現阻害）のように、ＭＴ−４細胞において、ＨＩＶ−１生命周期の多様な段階を抑制することができる多様な抗ＨＩＶ−１薬物を使用し、ＴＯＡ（time-of-addition）分析を行った。このとき、Ｔ−２０、ラルテグラビル及びリトナビルは、ＮＩＨ／ＡＩＤＳ研究及び参照試薬プログラム（ＮＩＨ）から得た。ＴＯＡ分析は、それぞれの代表薬物によるＨＩＶ−１増殖の抑制が、各薬物によって標的化された増殖段階に対応する時点において良好に確認され、Ｐｏｌｙ６は、６時間ないし８時間の間、薬物効果がなくなり始めた（図４Ａ）。類似抑制メカニズムを有した挿入酵素抑制剤であるラルテグラビルのＴＯＡ結果から分かるように、細胞内ＧＦＰ分析も、ＴＯＡ結果（図４Ｂ）を裏付け、そのような結果を総合すれば、Ｐｏｌｙ６は、ウイルス挿入酵素の活性を抑制することにより、抗ＨＩＶ−１効果を示すということが分かった。
【００７５】
実験例５．Ｐｏｌｙ６のＨＩＶ−１活性抑制メカニズムの具体的な確認
本実験例は、Ｐｏｌｙ６によるＨＩＶ−１挿入酵素抑制に係わるＴＯＡデータを証明するために遂行された。具体的には、Ａｌｕ ＰＣＲ及び２−ＬＴＲ ＰＣＲを使用し、ＨＩＶ−１に感染されたＭＴ−４細胞において、挿入酵素リング形成を検出した。ＨＩＶ−１ｃＤＮＡが細胞内核に入ったとき、挿入が起こらなければ、それは、自ら複製し、２−ＬＴＲリングを形成すると知られている。挿入酵素抑制剤であるラルテグラビルと異なり、２−ＬＴＲリングのレベルは、Ｐｏｌｙ６によって上昇し、ＨＩＶ−１が感染されたＭＴ−４細胞においては、挿入されたｃＤＮＡの数が顕著に減少した（図５Ａ））。該結果は、Ｐｏｌｙ６が、挿入酵素の統合過程を遮断することにより、ＨＩＶ−１増殖を抑制するものであることを示す。ウイルスの細胞内挿入段階において、ｐ３００のような細胞内因子により、挿入酵素がアセチル化される過程は、すでに知られており、Ｐｏｌｙ６作用による統合抑制活性に係わる根本的なメカニズムを確認するために、まず、免疫ブロッティングにより、Ｐｏｌｙ６が感染されていないＭＴ−４細胞と、ＨＩＶ−１に感染されたＭＴ−４細胞とにおいて、ｐ３００タンパク質発現がいかなる影響を受けるかということを調査した結果、感染されていないＭＴ−４細胞において、Ｐｏｌｙ６が、ＤＭＳＯ、ＡＺＴまたはラルテグラビルより、さらに効率的にｐ３００発現を低減させるということを発見した（図５Ｂ））。次に、低減されたｐ３００が、挿入酵素による免疫沈澱後、ウイルス挿入酵素アセチル化に対する抑制効果を起こすことができるか否かということを確認するために、抗体は、ＤＭＳＯ、ＡＺＴ、ラルテグラビルまたはＰｏｌｙ６に処理された感染されたＭＴ−４細胞の細胞に適用した。次に、アセチル化されたリシン（Cell Signaling）に特異的な抗体を使用し、免疫ブロッティングを行った。その結果、Ｐｏｌｙ６とラルテグラビルとが挿入酵素のアセチル化を抑制しているということを確認することができた（図５Ｃ）。
【００７６】
そのような結果を総合するとき、Ｐｏｌｙ６は、ＨＩＶ−１の活性抑制は、ｐ３００による挿入酵素のアセチル化を抑制することによってなされるということが分かった。
【００７７】
実施例２．抗ＨＢＶ効能の確認
実験例１．抗ＨＢＶ効果を示すＨＢＶ重合酵素由来ペプチドの確認、及び細胞生存力の分析
本実験例においては、抗ＨＢＶ効果を示すＨＢＶ重合酵素由来ペプチドを確認し、その処理時、細胞生存力を分析するものである。前述のＰｏｌｙ５（ＧＲＬＶＦ、配列番号１）、Ｐｏｌｙ６（ＧＲＬＶＦＱ、配列番号２）またはＰｏｌｙ７（ＧＲＬＶＦＱＴ、配列番号３、図１Ａ））の３個候補ペプチドによる抗ウイルス効果を評価するために、ＨｅｐＧ２．２．１５（ヒト由来肝臓癌細胞であるＨｅｐＧ２細胞とＨＢＶとが永久に挿入されている）やｐＨＢＶ−１．２Ｘ−ＷＴ（wild type）（Genotype Ｃ）が一時的に形質感染されたＨｅｐＧ２細胞に（製造社のプロトコルにより、Lipofectamine ２０００試薬（Life Technologies）を使用する）、ＰＢＳ（０．５％）、エンテカビル（ＥＴＶ、Sigma−Aldrich、３０ｎＭ）、または３個の候補（１０μＭ）を２日間処理した後、定量的ＰＣＲ及びＥＬＩＳＡを実施し、ビリオン複製及び肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を確認した。このとき、各ペプチドは、基盤固体相方法でPeptron Ｉｎｃ．で合成され、各ペプチドの純度は、高速液体クロマトグラフィによって測定されたように、９５％以上であった。また、ＴａｑＭａｎ probe hybridization ＰＣＲのための定量的リアルタイムＰＣＲ及びプローブ用オリゴヌクレオチドを下記表１に示した。
【００７８】
【表１】
2021522807.tif 000003
【００７９】
その結果、Ｐｏｌｙ５、Ｐｏｌｙ６及びＰｏｌｙ７を４８時間処理した全てのグループにおいて、ｓ抗原とｅ抗原とが減少したが、Ｐｏｌｙ６群において、さまざまな濃度を比較したとき、最も目立つ抗原低減効果を示し、２４時間処理時においては、ＥＴＶと比較しても、Ｐｏｌｙ６処理群においてのみ、有意に外被抗原低減効果を確認することができた（図６Ａ）。従って、本実験においては、ｐｒｅＳ１ １８個のヌクレオチド（ｎｔ）欠失と重畳された重合酵素領域に由来したＰｏｌｙ６ペプチドを選択し、抗ＨＢＶ効果を確認した。
【００８０】
Ｐｏｌｙ６による抗ウイルス効果を調査する前、本実験例においては、Ｐｏｌｙ６が非特異的な細胞毒性により、ＨＢＶ増殖に影響を及ぼす可能性を確認するために、Ｐｏｌｙ６による細胞生存力を観察した。
【００８１】
具体的には、ＨｅｐＧ２，ＨｅｐＧ２．２．１５及びＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ−Ｃ４細胞（細胞膜にＮＴＣＰ受容体を発現する）を、９６マイクロプレートにプレーティングし（１ｘ１０４細胞／ウェル）、ＥＴＶ（３０ｎＭ）及びＰｏｌｙ６の濃度を５日間上昇させて培養した。ＭＴＳ分析のために、Cell−Titer ９６Aqueous One Solutionを各ウェルに直接添加し、プレートを３時間培養した。プレートを４９０ｎｍで判読し、それぞれの分析は、３回反復して行った。このとき、ＨＢＶ感染分析のために、２％ ＤＭＳＯを含んだＨｅｐＧ２．２．１５細胞の上澄み液を、３日ごとに１５日間収集し、６％ ＰＥＧ８０００で、氷で１時間ビリオンを沈澱させ、４℃で１００，０００ｇで、３時間ウルトラ遠心分離器を使用して濃縮させた。ペレットを、１０％ ＦＢＳが含有された１Ｘ ＰＢＳで再構成して使用するまで、−８０℃で保管した。細胞を６ウェルプレートに播種し、４％ ＰＥＧ８０００の存在下、８ｘ１０４ＧＥｑ／細胞で一日晩接種した。翌日、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、分析が行われるまで、ＰＢＳ（０．５％）、ＥＴＶ（３０ｎＭ）またはＰｏｌｙ６（１０μＭ）を５日間処理した。
【００８２】
その結果、日付経過により、Ｐｏｌｙ６は、ＨｅｐＧ２，ＨｅｐＧ２．２．１５及びＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ−Ｃ４細胞に対し、１０μＭまで有意に細胞毒性を示さず、細胞生存力にも影響を及ぼさなかった（図６Ｂ）。
【００８３】
実験例２．in vitroシステムにおける、Ｐｏｌｙ６による抗ウイルス効能の確認
慢性ＨＢＶ感染は、急性感染とは異なり、肝硬化及び肝細胞癌のような深刻な肝疾患を誘発すると知られている。従って、慢性感染を克服する抗ＨＢＶに対する薬物を開発することが重要である。しかし、ＨＢＶゲノムが宿主染色体に挿入されているために、ヒトの肝及び血清から、ウイルスの完全な除去が困難であるという問題で残っている。従って、本実験例においては、Ｐｏｌｙ６による抗ウイルス効果を評価するために、ＨＢＶを持続的に発現するＨｅｐＧ２．２．１５永久細胞株にＰｏｌｙ６を処理した。また、ＨｅｐＧ２細胞を６ウェルプレートに接種した後、ＨｅｐＧ２細胞を、ｐＨＢＶ−１．２Ｘ−ＷＴで一時的に形質感染させた。ｐＨＢＶ−１．２Ｘ−ＷＴを有するＨｅｐＧ２細胞またはＨｅｐＧ２−２．１５細胞を、２４時間または４８時間、ＰＢＳ（０．５％）、ＥＴＶ（３０ｎＭ）またはＰｏｌｙ６（１０μＭ）で処理し、上澄み液及びペレットを使用し、多様な分析を行った。分泌されたＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇを、培養上澄み液から測定するために提供された実験方法により、ＨＢｓＡｇ（ＢＩＯＫＩＴ）及びＨＢｅＡｇ（ＡｃｃｕＤｉａｇ）のＥＬＩＳＡを遂行した。８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）活性の検出のために、８−ＯＨｄＧ分析キット（ＯｘｉＳｅｌｅｃｔ Oxidative ＤＮＡ Damage ＥＬＩＳＡ kit、Cell Biolabs）及びＥＬＩＳＡを、製造プロトコルによって遂行した。
【００８４】
その結果、ＰＢＳ、ＥＴＶ及びＰｏｌｙ６を２日間処理した後、細胞外部へのＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇのレベルが、Ｐｏｌｙ６処理群において、統計的に有意に低下し、ウイルス増殖レベルは、Ｐｏｌｙ６の場合、さらに顕著に低下した。ＥＴＶによっても、ウイルス増殖が低減されたが、ＥＴＶとＰＢＳとの間には、統計的有意性はなかった（図７Ａないし図７Ｃ）、図８Ｇ及び図８Ｈ）。
【００８５】
また、細胞外部に分泌されたビリオンの量を測定するために、サザンブロット分析を行い、それは、具体的には、４℃で３時間２４，０００ｒｐｍで、超遠心分離する前、細胞破片を除去した後、氷で１時間８％ ＰＥＧ６０００（Sigma）を使用し、上澄み液からのビリオンを沈澱させた。ペレットをＰＢＳで収去して、製造社の指示により、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキット（QIAGEN）を使用し、ＨＢＶ ＤＮＡを収集した。ウイルス性ＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を使用して測定された。ＰＣＲ増幅は、ａ１０１−ｂｐ生成物を増幅するように考案された小さい表面遺伝子を標的にするＱＰＣＲプライマーセットによって遂行された（表２）。Ｑ−ＰＣＲは、商業用ＳｅｎｓｉＦＡＳＴ ＳＹＢＲ Ｌｏ−ＲＯＸキット（BIOLINE）とＨＢＶ Ｇｅｎｅｓｉｇ標準キット（Primer design）とを使用して遂行し、ウイルス負荷を補正した。また、細胞外ＨＢＶ ＤＮＡを検出するために、上澄み液を収集し、ＨＢＶ粒子を、前述のように、６％ ＰＥＧ８０００（Sigma）を使用して沈澱させた。ウイルスペレットをＰＢＳで収去し、ＤＮＡを、溶解緩衝液（０．２５％ ＳＤＳ、２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４及び２５０ｍＭ ＥＤＴＡ）で抽出した。精製されたＨＢＶ ＤＮＡを、１％アガロースゲルで分離し、サザンブロッティングにより、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋、Amersham）に移し、３２Ｐ標識された野生型の全長ＨＢＶ ＤＮＡプローブとハイブリッド化させた。無作為プライマーＤＮＡラベリングキット（TAKARA）を使用して分析した。オートラジオグラフィ（autoradiography）は、ＢＡＳ２５００イメージ分析器（Fuji Photo Film）を利用して行われて分析された。
【００８６】
【表２】
2021522807.tif 000004
【００８７】
その結果、サザンブロット分析から、細胞外部に分泌されたビリオンの量は、ＰＢＳ条件と比較し、Ｐｏｌｙ６とＥＴＶとにおいて明確に減少した（図７Ｄ）。濃度による変化を確認した結果、Ｐｏｌｙ６によるＨＢＶのＩＣ５０は、約２．４６８μＭであった（図７Ｅ）。
【００８８】
実験例３．Ｐｏｌｙ６のＨＢＶ抑制メカニズムの具体的な確認
本実験例においては、ヌクレオカプシド発現分析、ミトコンドリア活性酸素測定、及び第１型インターフェロンに係わる実験を介して、細胞における、Ｐｏｌｙ６の抗ウイルスメカニズムを確認した。
【００８９】
具体的には、抗ＨＢｃ抗体（Ｄａｋｏ、Agilent Tech）でウェスタンブロット分析を行った結果、ＰＢＳ及びＥＴＶに対比させ、Ｐｏｌｙ６を処理したグループにおいて、有意にＨＢｃＡｇ及びカプシドが減るということを確認した。それをImageＪプログラムで数値化させて見たときにも、統計的有意性を確認することができた（図８Ｆ）。
【００９０】
試薬が細胞内に吸収されて酸化ストレスが誘導されれば、Ｉ型インターフェロンのような細胞因子を発現させることにより、増殖、細胞死滅または抗ウイルス効果を含めた多様な反応を起こしうるというメカニズムが明らかにされている。それにより、Ｐｏｌｙ６の酸化ストレス媒介作用による抗ウイルス効果のメカニズムを明らかにするために、ｐＨＢＶ−１．２Ｘ−野生型形質感染されたＨｅｐＧ２細胞またはＨｅｐＧ２．２．１５細胞で、６ウェル培養プレート上に、４ｘ１０５細胞／ウェルで２４時間接種し、ＰＢＳ、ＥＴＶまたはＰｏｌｙ６で処理した。適切な時間、細胞を培養した後、細胞を３７℃で３０分間、５μＭのＭｉｔｏＳｏｘ（Molecular probes）と共に恒温処理した。流動細胞計測分析のために、細胞ペレットをＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ内に１％ ＦＢＳ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁させ、４％パラホルムアルデヒドで固定させた。ミトコンドリア機能障害を予防するために、１０μＭのＭｉｔｏＴｅｍｐｏ（Sigma Aldrich）を１２時間前処理し、０．５μＭのロテノン（SigmaAldrich）試薬を、ミトコンドリアストレスを介したＲＯＳ誘導に対する陽性対照群とした使用した。
【００９１】
その結果、ＨｅｐＧ２細胞において、ミトコンドリアストレスによる活性酸素（ｍｔＲＯＳ）の生産が、ＰＢＳに比べ、ロテノンとＰｏｌｙ６との処理群において、２時間から２４時間までの間に有意に増加した（図１０Ａ）。Ｐｏｌｙ６処理によるミトコンドリアの活性酸素増加が、濃度依存性を示すということを確認した（図１０Ｂ））。一方、エンテカビル処理群においては、ミトコンドリア活性酸素の増加様相が観察されなかった。ロテノンとＰｏｌｙ６との処理によって増加したミトコンドリア活性酸素は、ｍｔＲＯＳ特異的恒産化物質であるＭｉｔｏＴＥＭＰＯの処理によってさらに減少した（図１０Ｃ））。
【００９２】
第Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−Ｉ）は、ウイルス感染を調節するために、宿主細胞によって誘導される（Stetson ＆ Medzhitov、２００６）。従って、ＨｅｐＧ２−２．１５細胞及びマウス肝臓において、Ｐｏｌｙ６によるＩＦＮ−Ｉの発生影響を確認するために、ＩＦＮ−β、ＲＩＧ−Ｉ及びＩＳＧ１５のｍＲＮＡレベルを検査した。
【００９３】
その結果、Ｐｏｌｙ６処理群において、ＩＦＮ−β、ＲＩＧ−Ｉ、ＩＳＧ１５のｍＲＮＡレベルが、ＰＢＳ群と比較し、有意に上昇するということを観察し、エンテカビル処理群においては、統計的有意性を確認することができなかった（図１１Ａ）。また、Ｉ型インターフェロン生物検定及び中和分析のために、間接的にルシフェラーゼリポータ遺伝子を使用し、ＩＦＮレベルを測定するために、５μｇのプロマイシン（SigmaAldrich）を使用し、３’末端に、ルシフェラーゼリポータ遺伝子と係わるインターフェロン敏感反応要素（ＩＳＲＥ）を挿入したｈＭＨ５５−２９３−ＩＳＲＥ細胞を使用した。２４時間または４８時間、各試薬で処理された細胞から上澄み液を収集した後、上澄み液をｈＭＨ５５−２９３−ＩＳＲＥ細胞に６時間添加した。培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、リポータ溶解緩衝液（reporter lysis buffer、Ｅ１５００、Promega）により、室温で３０分間溶解させた。ルシフェラーゼ分析試薬（Ｅ１５００、Promega）を添加し、発光をＴＥＣＡＮ ｍ２００判読機（ＴＥＣＡＮ）を使用して測定した。翌日、ＰＢＳ（０．５％）、ＥＴＶ（３０ｎＭ）及びＰｏｌｙ６（１０μＭ）を４８時間細胞に添加した。その結果、ルシフェラーゼ発現レベルが、Ｐｏｌｙ６処理により、２４時間で有意に上昇するということを確認した（図１１ＢのＢ）。
【００９４】
一方、中和Ｉ型インターフェロン受容体を介して、インターフェロンと受容体との相互作用を遮断した後、Ｐｏｌｙ６による抗ＨＢＶ効果の変化を調査するために、ＰＢＳ、ＥＴＶ、Ｐｏｌｙ６を処理する２時間前、中和抗体を処理し、受容体の活性化を遮断して培養した。各物質処理後、４８時間培養後、抗ＨＢＶ効果を、ＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲで評価した。その結果、ＧＡＰＤＨ抗体処理において、Ｐｏｌｙ６によって低下したＨＢｅＡｇのレベルは、ＩＦＮ受容体を遮断するや否や、さらに有意に上昇したということを確認し、ＨＢＶ ＤＮＡレベルも、ＰＢＳ処理群レベルで回収されたということを確認した（図１２Ａ）。それと同様に、Ｐｏｌｙ６の処理によって上昇したＩＦＮ−β、ＲＩＧ−Ｉ及びＩＳＧ１５のｍＲＮＡレベルも、中和抗体の処理により、さらに低下するということを観察することにより（図１２Ｂ）、Ｐｏｌｙ６が、Ｉ型ＩＦＮ−Ｉの発現に直接／間接的な影響を及ぼすということを確認した。
【００９５】
結論として、以上の結果を基に、Ｐｏｌｙ６が、細胞内ミトコンドリアの活性酸素を増加させることにより、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−Ｉ）経路を介してＩＦＮ−βを刺激し、それにより、ＨＢＶ複製を抑制する一方、ＨＢｃＡｇ及び蛋白外被を抑制するメカニズムを有するということを立証することができた。
【００９６】
実験例４．ＩｎｖｉｖｏシステムでＰｏｌｙ６による抗ウイルス効能の確認
マウスモデル（in vivo）において、Ｐｏｌｙ６効果を確認するために、本実験例を遂行した。まず、形質転換されたマウスモデルを構築するために、ＨＢＶ Ｗ４Ｐ突然変異を発現するトレンスジェニックマウスをマクロジェン（Macrogen）で生成させ、マウスをランダムに相互培養し、マクロジェンで病菌がない状態に維持させた。実験動物は、特定病源菌がない実験動物センターに保管された。簡潔に述べれば、ＰＭＳＧ（７．５ＩＵ）とｈＣＧは、過排卵のために、５〜８週間、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎメスマウスに、４８時間ごとの間隔（５ＩＵ）で腹腔内注射された。注射後、それらメスマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎオスマウスと交配させた。翌日、処女プラグがあるメスマウスを犠牲にし、受精された胚芽を収穫し、ＨＢＶ Ｗ４Ｐ完全ゲノムを、遺伝子変形マウス生産のための標準マイクロ注入手続き（Macrogen）を使用し、１つの細胞胚芽に共同微細注入させた。微細注入器を利用し、精子髄核に、微細注入のためのＨＢＶ ＤＮＡ（４ｎｇ／μｌ）を直接注射した後、微細注入された胚芽を、１時間ないし２時間３７℃で培養した。１４個から１６個の注入された１細胞段階の胚芽を外科的方法でＩＣＰ（pseudopregnant recipient mice）の卵管に移植した。Ｆ０が生まれた後、移植遺伝子（transgene）の存在に係わる尾カットサンプルを使用してテストした遺伝型分析（genotyping）を行い、フェノール抽出方法を介した遺伝体ＤＮＡ（genomic ＤＮＡ）ＰＣＲスクリーニングをＰＣＲ分析で確認した。
【００９７】
その後、ｐｒｅＳ１領域（Genotype Ａ、ｐＨＹ９２−Ｗ４Ｐ）において、Ｗ４Ｐ突然変異を含むＨＢＶビリオンを発現する形質転換マウスモデルに、Ｐｏｌｙ６（５０μｇ／ｋｇ）と３ＴＣ（ラミブジン、Sigma−Aldrich、５００μｇ／ｋｇ）とを、１週間に２回ずつ静脈内投与した。ＨＢＶ ＤＮＡとＨＢｓＡｇとの数値は、４週目と８週目とに眼窩副鼻洞血液収集を介して、マウス血清から測定された。
【００９８】
その結果、Ｐｏｌｙ６及び３ＴＣを注射したマウスの血清からのＨＢｓＡｇのレベルは、４週目にＰＢＳを注射したマウスと比較して類似していたが、３ＴＣと比較し、Ｐｏｌｙ６に対するＨＢｓＡｇレベルは、８週目において有意に低下した（図９Ａ）。また、ＨＢＶ ＤＮＡレベルは、８週の間、ＰＢＳと比較し、Ｐｏｌｙ６及び３ＴＣにおいて、約２倍低下した（図９Ｂ）。最後に、マウスモデルの肝臓において、ＩＦＮ−βのｍＲＮＡレベルを評価した。ＩＦＮ−βｍＲＮＡレベルは、３ＴＣ及びＰｏｌｙ６を処理した群の４週目及び８週目の肝組織で有意に上昇し、それは、ｐｏｌｙ６を処理した群において、さらに高く発現されたということを観察した（図１１ＢのＣ）。
【００９９】
前記結果を総合するとき、Ｐｏｌｙ６が、ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶのビリオンレベルが低下する生体内形質転換マウスモデルシステムに影響を及ぼすということが分かった。
【０１００】
実験例５．Ｐｏｌｙ６のエンテカビル併用処理による第１型インターフェロン増加相乗効果、及びそれによる抗ＨＢＶ効果
核において、ＨＢＶ重合酵素の活性を抑制し、リン酸化形態に転換させるメカニズムを介して、現在ＨＢＶ抗ウイルス剤として商用されているエンテカビルと、第Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−Ｉ）とを増加させると確認されたＰｏｌｙ６と併用処理による抗ＨＢＶ効果と、第１型インターフェロン増加相乗効果とを確認した。ＨｅｐＧ２−２．１５細胞で、６ウェル培養プレート上において、５ｘ１０５細胞／ウェルで２４時間培養し、ＰＢＳ、ＥＴＶ、Ｐｏｌｙ６の単独処理、または２つの物質を併用して処理した。４８時間細胞を培養した後、上澄み液を収集し、ＥＬＩＳＡ、ｑＰＣＲ、ＬＤＨ assayを進めた。
【０１０１】
その結果、ＥＴＶとＰｏｌｙ６とを単独で処理したとき、細胞外ＨＢＶ ＤＮＡレベルがＰＢＳに比べ、統計的に有意に低下したが、２つの物質を併用処理したとき、さらに顕著な低下効果を示し、それは、各単独処理群との比較時にも、有意な差を確認した（図１３Ａ）。細胞外のｓ抗原及びｅ抗原のレベル測定結果、ＥＴＶ処理群においては、ＰＢＳ群対比で、有意な低下効果を示すことができなかったが、Ｐｏｌｙ６単独処理群において、統計的有意性を確認し、２つの物質を併用したとき、各単独処理群に比べ、有意的な低下現象を観察した（図１３Ｃ）。
【０１０２】
一方、各物質の単独処理及び併用処理による非特異的細胞毒性レベルを確認するために、ＬＤＨレベルを測定し、対照群に比べ、有意な差を示さないことにより、細胞毒性の不在を確認した（図１３Ｂ）。
【０１０３】
一方、第１型インターフェロンの上昇レベルに対し、２物質併用による相乗効果を確認するために、単独処理群及び併用処理群のｍＲＮＡを抽出し、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＴＮＦ−αの発現レベルを観察し、その結果、単処理群においてよりも、併用処理群において、有意に第１型インターフェロン関連ｍＲＮＡレベルが上昇するということを確認した（図１４Ａ）。また、ｈＭＨ５５−２９３−ＩＳＲＥ細胞のルシフェラーゼリポータ遺伝子を使用し、ＩＦＮレベルを間接的に測定し、前述の結果と一貫するように、ＥＴＶとＰｏｌｙ６との併用処理群において、ＰＢＳ及び各物質単独の処理群に比べ、統計的に有意なルシフェラーゼ発現レベルの増上昇を確認した（図１４Ｂ）。
【０１０４】
以上の結果を基に、Ｐｏｌｙ６のエンテカビル併用処理による第１型インターフェロンの上昇、及びそれによるＨＢＶに対する抗ウイルス効果の相乗効果を立証し、従って、併用投与時の肝疾患抑制効果の相乗作用を期待することができると予想される。
【図１】
2021522807.tif 000005
【図２】
2021522807.tif 000006
【図３】
2021522807.tif 000007
【図４Ａ】
2021522807.tif 000008
【図４Ｂ】
2021522807.tif 000009
【図５】
2021522807.tif 000010
【図６Ａ】
2021522807.tif 000011
【図６Ｂ】
2021522807.tif 000012
【図７】
2021522807.tif 000013
【図８】
2021522807.tif 000014
【図９Ａ】
2021522807.tif 000015
【図９Ｂ】
2021522807.tif 000016
【図１０】
2021522807.tif 000017
【図１１Ａ】
2021522807.tif 000018
【図１１Ｂ】
2021522807.tif 000019
【図１２】
2021522807.tif 000020
【図１３】
2021522807.tif 000021
【図１４】
2021522807.tif 000022
【配列表】
2021522807000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年11月6日(2020.11.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
以上の結果を基に、Ｐｏｌｙ６のエンテカビル併用処理による第１型インターフェロンの上昇、及びそれによるＨＢＶに対する抗ウイルス効果の相乗効果を立証し、従って、併用投与時の肝疾患抑制効果の相乗作用を期待することができると予想される。
本発明は以下の態様を含む。
＜１＞  配列番号１、配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなるポリペプチド。
＜２＞  前記ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなる、＜１＞に記載のポリペプチド。
＜３＞  前記ポリペプチドは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）重合酵素に由来するものである、＜１＞に記載のポリペプチド。
＜４＞  前記ポリペプチドは、抗ウイルス活性を有するものである、＜１＞に記載のポリペプチド。
＜５＞  ＜１＞に記載のポリペプチドを含む抗ウイルス用薬学的組成物。
＜６＞  前記ウイルスは、アデノウイルス、天然痘ウイルス、小児麻痺ウイルス、はしかウイルス、重症熱性血小板減少症侯群ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（hepatitis Ｃ virus）、ヒト免疫欠乏ウイルス−１（ＨＩＶ−１）及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）からなる群から選択される少なくとも一つである、＜５＞に記載の薬学的組成物。
＜７＞  前記ポリペプチドは、抗ウイルス活性を有し、前記ウイルスは、ヒト免疫欠乏ウイルス−１（ＨＩＶ−１）及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）からなる群から選択される少なくとも一つである、＜５＞に記載の薬学的組成物。
＜８＞  抗ウイルス剤をさらに含む、＜５＞に記載の薬学的組成物。
＜９＞  前記抗ウイルス剤は、アシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、アンプレナビル、アバカビル、アンサマイシン、シドフォビル、ダルナビル、デラビルジン、エファビレンツ、エトラビリン、ファムシクロビル、ヒペリシン、インジナビル、ラミブジン、ロブカビル、ネルフィナビル、ネビラピン、ノバフェロン、リトナビル、サキナビル、スタブジン、チプラナビル、ビラゾール、リバビリン、ザルシタビン、ジドブジン、マラビロク、ラルテグラビル、エルビテグラビル、ジダノシン、テノホビル、エムトリシタビン、ロピナビル、アタザナビル、エンフビルチド、クレブジン、エンテカビル及びアデホビルからなる群から選択される少なくとも一つである、＜８＞に記載の薬学的組成物。
＜１０＞  前記抗ウイルス剤は、エンテカビルである、＜８＞に記載の薬学的組成物。
＜１１＞  前記ポリペプチドは、ウイルスの増殖を抑制するものである、＜５＞に記載の薬学的組成物。
＜１２＞  前記ポリペプチドは、ＨＩＶ−１挿入酵素のアセチル化を阻害し、前記酵素の活性を抑制するものである、＜５＞に記載の薬学的組成物。
＜１３＞  前記ポリペプチドは、細胞内ミトコンドリアの活性酸素を増加させるものである、＜５＞に記載の薬学的組成物。
＜１４＞  前記ポリペプチドは、第Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−Ｉ）の発現を増大させるものである、＜５＞に記載の薬学的組成物。
＜１５＞  前記ポリペプチドは、ＨＢＶのＨＢｃＡｇまたはヌクレオカプシドの合成を抑制するものである、＜５＞に記載の薬学的組成物。
＜１６＞  ＜１＞に記載のポリペプチドを含む後天性免疫欠乏症（ＡＩＤＳ）の予防用または治療用薬学的組成物。
＜１７＞  前記後天性免疫欠乏症はＨＩＶ−１感染から発病されるものである、＜１６＞に記載の薬学的組成物。
＜１８＞  ＜１＞に記載のポリペプチドを含む肝疾患の予防用または治療用薬学的組成物。
＜１９＞  前記肝疾患は、肝炎、肝硬変症及び肝臓癌からなる群から選択される少なくとも一つである、＜１８＞に記載の薬学的組成物。
＜２０＞  前記肝疾患は、Ｂ型肝炎である、＜１８＞に記載の薬学的組成物。
＜２１＞  前記肝疾患はＨＢＶ感染から発病されるものである、＜１８＞に記載の薬学的組成物。
＜２２＞  ＜１＞に記載のポリペプチドを含む抗ウイルス用健康機能食品。
＜２３＞  ＜５＞に記載の薬学的組成物を個体に投与する工程を含む、ウイルス感染症及びそれと関連した症状を予防または治療する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）重合酵素に由来するものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、抗ウイルス活性を有するものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリペプチドを含む抗ウイルス用薬学的組成物。
【請求項６】
前記ウイルスは、アデノウイルス、天然痘ウイルス、小児麻痺ウイルス、はしかウイルス、重症熱性血小板減少症侯群ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（hepatitis Ｃ virus）、ヒト免疫欠乏ウイルス−１（ＨＩＶ−１）及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
抗ウイルス剤をさらに含む、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記抗ウイルス剤は、アシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、アンプレナビル、アバカビル、アンサマイシン、シドフォビル、ダルナビル、デラビルジン、エファビレンツ、エトラビリン、ファムシクロビル、ヒペリシン、インジナビル、ラミブジン、ロブカビル、ネルフィナビル、ネビラピン、ノバフェロン、リトナビル、サキナビル、スタブジン、チプラナビル、ビラゾール、リバビリン、ザルシタビン、ジドブジン、マラビロク、ラルテグラビル、エルビテグラビル、ジダノシン、テノホビル、エムトリシタビン、ロピナビル、アタザナビル、エンフビルチド、クレブジン、エンテカビル及びアデホビルからなる群から選択される少なくとも一つである、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチドは、ウイルスの増殖を抑制するものである、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドは、ＨＩＶ−１挿入酵素のアセチル化を阻害し、前記酵素の活性を抑制するものである、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記ポリペプチドは、細胞内ミトコンドリアの活性酸素を増加させるものである、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記ポリペプチドは、第Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−Ｉ）の発現を増大させるものである、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記ポリペプチドは、ＨＢＶのＨＢｃＡｇまたはヌクレオカプシドの合成を抑制するものである、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載のポリペプチドを含む後天性免疫欠乏症（ＡＩＤＳ）の予防用または治療用薬学的組成物。
【請求項１５】
前記後天性免疫欠乏症はＨＩＶ−１感染から発病されるものである、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリペプチドを含む肝疾患の予防用または治療用薬学的組成物。
【請求項１７】
前記肝疾患は、肝炎、肝硬変症及び肝臓癌からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記肝疾患はＨＢＶ感染から発病されるものである、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
請求項１に記載のポリペプチドを含む抗ウイルス用健康機能食品。
【国際調査報告】
2021522807.tif 000023
2021522807.tif 000024
2021522807.tif 000025
2021522807.tif 000026
2021522807.tif 000027
2021522807.tif 000028
2021522807.tif 000029
2021522807.tif 000030
2021522807.tif 000031
2021522807.tif 000032