(57)【要約】  ミトコンドリアを単離する自動単離デバイスは、生存可能なミトコンドリア溶液用のホルダ、及び該デバイスのプロセッサによって制御され、ホルダを冷却する冷却システムを具備する、インキュベーションステーションを備える。該デバイスは、溶液をホルダから濾過ステーションに移送する、プロセッサで制御される移送システム、及び一連のフィルタを具備する濾過ステーションを備える。該デバイスは、濾過ステーションの出口に流体連結されたキュベットを照明するよう配置された分光計、及びプロセッサに結合され、キュベットの、分光計と反対側の一方の側に配置された検出器を具備する、プロセッサで制御される分光測定ステーションを備える。該デバイスは、分光測定ステーションから遠心分離機に溶液を移送する、プロセッサで制御される移送システムを備える。遠心分離機は、プロセッサで制御され、濾液を遠心分離して、上澄みから生存可能なミトコンドリアを分離するよう構成されている。
2021521858.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液から生存可能なミトコンドリアを単離する自動単離デバイスであって、
プロセッサと、
生存可能なミトコンドリアを含む溶液のためのホルダ、及び
該ホルダを冷却する冷却システムであって、該プロセッサによって制御される冷却システム
を含む、インキュベーションステーションと、
該インキュベーションステーションの該ホルダから濾過ステーションに溶液を移送する第１の移送システムであって、該プロセッサによって制御される第１の移送システムと、
一連の複数のフィルタを含む該濾過ステーションと、
第１の波長の光でキュベットを照射するよう配置されたラマン分光計であって、該キュベットは、該濾過ステーションの出口に流体連結されており、該プロセッサによって制御されるラマン分光計、及び
該ラマン分光計と反対側の、該キュベットの一方の側に配置された検出器であって、該プロセッサに結合されている検出器
を含む、分光測定ステーションと、
該分光測定ステーションから遠心分離機に溶液を移送する第２の移送システムであって、該プロセッサによって制御される第２の移送システムと、
該遠心分離機を含む遠心分離ステーションであって、該遠心分離機は、該プロセッサによって制御され、該遠心分離機は、濾液を遠心分離して、上澄みから生存可能なミトコンドリアを分離するよう構成される、遠心分離ステーションと
を含む、自動単離デバイス。
【請求項２】
前記冷却システムは、前記プロセッサによって制御される熱電ペルチェ冷凍冷却システムを含む、請求項１に記載の自動単離デバイス。
【請求項３】
前記ペルチェ冷凍冷却システムは、アナログ‐デジタル変換器によって前記プロセッサに結合されるペルチェプレートを含む、請求項２に記載の自動単離デバイス。
【請求項４】
前記ペルチェ冷凍冷却システムは、放熱デバイスを含む、請求項２又は３に記載の自動単離デバイス。
【請求項５】
前記第１の移送システムは、
前記インキュベーションステーションの前記ホルダを前記濾過ステーションに流体連結する、第１の流体流路と、
該第１の流体流路を通して溶液をポンプ移送するポンプであって、前記プロセッサによって制御される、ポンプと
を含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の自動単離デバイス。
【請求項６】
前記第１の流体流路は、針を含み、該針の第１の端部は、前記インキュベーションステーションの前記ホルダにアライメントされており、該針の第２の端部は、前記一連の複数のフィルタへの入口に連結する管に連結されている、請求項５に記載の自動単離デバイス。
【請求項７】
前記針に連結された(coupled with)アクチュエータを含み、該アクチュエータは、前記プロセッサによって制御される、請求項６に記載の自動単離デバイス。
【請求項８】
前記アクチュエータが作動することにより、前記針は、前記インキュベーションステーションの前記ホルダに向かって進む、請求項７に記載の自動単離デバイス。
【請求項９】
前記一連の複数のフィルタの、連続するフィルタのそれぞれの孔径は、先行するフィルタよりも小さい、請求項１から８までのいずれか一項に記載の自動単離デバイス。
【請求項１０】
前記一連の複数のフィルタの第１のフィルタの孔径は、３０μｍから５０μｍの間である、請求項１から９までのいずれか一項に記載の自動単離デバイス。
【請求項１１】
前記一連の複数のフィルタの第２のフィルタの孔径は、２０μｍから４０μｍの間である、請求項１０に記載の自動単離デバイス。
【請求項１２】
前記一連の複数のフィルタの第３のフィルタの孔径は、１０μｍから３０μｍの間である、請求項１１に記載の自動単離デバイス。
【請求項１３】
前記一連の複数のフィルタの第４のフィルタの孔径は、１μｍから１０μｍの間である、請求項１２に記載の自動単離デバイス。
【請求項１４】
前記濾過ステーションは、前記一連の複数のフィルタを冷却するフィルタ冷却システムを含む、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の自動単離デバイス。
【請求項１５】
前記フィルタ冷却システムは、熱電ペルチェ冷凍冷却システムを含む、請求項１４に記載の自動単離デバイス。
【請求項１６】
前記濾過ステーションは、前記一連の複数のフィルタの出口に流体連結された貯蔵器を含み、該貯蔵器の出口は、前記キュベットに流体連結されている、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の自動単離デバイス。
【請求項１７】
前記分光測定ステーションは、前記ラマン分光計と前記キュベットとの間に配置されたフィルタを含む、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の自動単離デバイス。
【請求項１８】
その中で細胞培養物が培養され得る生体インキュベータを含む、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の自動単離デバイス。
【請求項１９】
前記生体インキュベータは、前記プロセッサによって制御される攪拌機を含む、請求項１８に記載の自動単離デバイス。
【請求項２０】
前記生体インキュベータは、前記プロセッサによって制御される加熱デバイスを含む、請求項１８又は１９に記載の自動単離デバイス。
【請求項２１】
前記生体インキュベータは、酸素キャニスタを含む、請求項１８から２０までのいずれか一項に記載の自動単離デバイス。
【請求項２２】
前記生体インキュベータは、分光計を含む、請求項１８から２１までのいずれか一項に記載の自動単離デバイス。
【請求項２３】
前記生体インキュベータを前記インキュベーションステーションに流体連結する第３の移送システムを含む、請求項１８から２２までのいずれか一項に記載の自動単離デバイス。
【請求項２４】
複数の生体インキュベータを含む、請求項１８から２３までのいずれか一項に記載の自動単離デバイス。
【請求項２５】
前記プロセッサを前記インキュベーションステーションの前記冷却システムに結合するアナログ‐デジタル変換器を含む、請求項１から２４までのいずれか一項に記載の自動単離デバイス。
【請求項２６】
前記プロセッサに結合されたリレーチャネルを含み、該リレーチャネルは、複数のリレーを備え、各リレーは、前記プロセッサによって制御される前記自動単離デバイスの対応する構成要素に結合されている、請求項１から２５までのいずれか一項に記載の自動単離デバイス。
【請求項２７】
前記プロセッサに、事前にプログラムされたシーケンスで前記リレーチャネルの前記リレーを起動又は停止させる、命令を格納する非一時的コンピュータ可読記憶媒体を含む、請求項２６に記載の自動単離デバイス。
【請求項２８】
ディスプレイを含む、請求項１から２７までのいずれか一項に記載の自動単離デバイス。
【請求項２９】
溶液から生存可能なミトコンドリアを単離する方法であって、
自動単離デバイスのインキュベーションステーション内で、生存可能なミトコンドリア及びプロテアーゼ酵素の溶液をインキュベーションするステップと、
プロセッサによって制御される第１の移送システムによって、該インキュベーションされた溶液を該自動単離デバイスの濾過ステーションに自動的に移送するステップと、
該インキュベーションされた溶液を、溶液中の生存可能なミトコンドリアを含む濾液を得るために、該濾過ステーション内の一連の複数のフィルタを通して濾過するステップと、
該自動単離デバイスの分光測定ステーションで、該プロセッサによって制御されるラマン分光測定ユニットを使用して、該濾液中の該生存可能なミトコンドリアの定量的特性を判定するために、該濾液を分析するステップと、
該濾液中の該生存可能なミトコンドリアの該定量的特性が基準を満たす場合、該プロセッサによって制御される第２の移送システムによって、該濾液を該自動単離デバイスの遠心分離ステーションに自動的に移送するステップと、
該遠心分離ステーションにおいて、該生存可能なミトコンドリアを上澄みから分離するために、該プロセッサによって制御される遠心分離機で該濾液を遠心分離するステップと
を含む、方法。
【請求項３０】
前記溶液をインキュベーションするステップは、
事前設定された、コンピュータ制御された期間に、前記溶液をインキュベーションするステップと、
前記インキュベーションされた溶液を、該期間の終わりに、前記濾過ステーションに自動的に移送するステップと
を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記溶液をインキュベーションするステップは、前記プロセッサによって制御される熱電ペルチェ冷凍冷却システムで前記溶液を冷却するステップを含む、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記溶液を冷却するステップは、前記プロセッサに結合されたアナログ‐デジタル変換器によって、前記熱電ペルチェ冷凍冷却システムのペルチェプレートへの電流を制御するステップを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記溶液を冷却するステップは、前記溶液を１℃から約１０℃の間の温度まで冷却するステップを含む、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記インキュベーションされた溶液を前記濾過ステーションに移送するステップは、前記インキュベーションされた溶液を、前記プロセッサによって制御されるポンプによって、前記濾過ステーションに流体連結された針を通してポンプ移送するステップを含む、請求項２９から３３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記インキュベーションされた溶液を前記濾過ステーションに移送するステップは、前記プロセッサによって制御されるアクチュエータによって、前記針を前記インキュベーションされた溶液内に進めるステップを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記一連の複数のフィルタを通して前記インキュベーションされた溶液を濾過するステップは、そのそれぞれが先行するフィルタよりも小さい孔径を有する連続するフィルタを通して、前記インキュベーションされた溶液を濾過するステップを含む、請求項２９から３５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記インキュベーションされた溶液を濾過するステップは、前記濾過ステーションを１℃から１０℃の間の温度まで冷却するステップを含む、請求項２９から３６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記濾過ステーションを冷却するステップは、前記プロセッサによって制御される熱電ペルチェ冷凍冷却システムで前記濾過ステーションを冷却するステップを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記濾液を分析するステップは、
ラマン分光計から放射される第１の波長の光で、キュベットの第１の側から前記濾液を照射するステップと、
該キュベットの反対側の第２の側で光を検出するステップと
を含む、請求項２９から３８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
光を検出するステップは、電流を生成する光電子増倍管で該光を受け取るステップを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記生成される電流は、前記検出される光の波長に依存する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記濾液の中に生存可能なミトコンドリアがある場合、前記検出された波長は、前記第１の波長とは異なる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記検出された波長によって生成された電流と、前記第１の波長によって生成された電流との差異に基づいて、前記濾液中の前記生存可能なミトコンドリアの前記定量的特性を判定するステップを含む、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記定量的特性を判定するステップは、単位容積当りの生存可能なミトコンドリアの数を判定するステップを含む、請求項２９から４３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記定量的特性が前記基準を満たしていることを判定するステップを含み、該ステップは、単位容積当りの生存可能なミトコンドリアの前記数が安定していることを判定するステップを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記溶液を保持する容器を前記インキュベーションステーション内に受容するステップを含み、前記容器は、ユーザによって前記インキュベーションステーション内に挿入される、請求項２９から４５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記溶液には、前記生存可能なミトコンドリアを含むホモジナイズされた組織及び前記プロテアーゼ酵素が含まれる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記自動単離デバイス内の生体インキュベータから前記インキュベーションステーション内に、前記溶液を受け取るステップを含む、請求項２９から４７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記溶液は、前記生体インキュベータ内で増殖した細胞培養物を含み、該細胞培養物中の細胞は、その中に生存可能なミトコンドリアを有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記プロテアーゼ酵素を、前記プロセッサによって制御されるポンプによって、前記インキュベーションステーション内の前記細胞培養物の中へポンプ移送するステップを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記生体インキュベータ内で細胞培養物を培養するステップを含み、前記生体インキュベータは、前記プロセッサによって制御されている、請求項４８から５０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記生体インキュベータ内で細胞を培養するステップは、前記プロセッサによって制御される攪拌機を使用して、前記生体インキュベータ内で前記細胞培養物を攪拌するステップを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記生体インキュベータ内で細胞を培養するステップは、前記プロセッサによって制御される加熱デバイスを使用して、前記生体インキュベータ内で前記細胞培養物を加熱するステップを含む、請求項５１又は５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記プロセッサによって制御される分光計で、前記細胞培養物を分析するステップを含む、請求項５１から５３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞培養物を分析するステップは、前記細胞培養物の単位容積当りの細胞の個体数を判定するステップを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記分光計での前記細胞培養物の複数回の分析の結果に基づいて、細胞増殖曲線を判定するステップを含む、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞増殖曲線が増殖の基準を満たす場合に、前記自動単離デバイスの前記インキュベーションステーション向けの前記溶液として、前記細胞培養物を供給するステップを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞増殖曲線が対数増殖期にあるとき、前記細胞培養物を供給するステップを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記インキュベーションを開始する前に、前記自動単離デバイスの前記ステーションへの接近を防ぐために、前記自動単離デバイスの扉をロックするステップと、
前記遠心分離後に、前記自動単離デバイスの該扉をロック解除するステップと
を含む、請求項２９から５８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記自動単離デバイスのステータスを示す情報を、ディスプレイ上に表示するステップを含む、請求項２９から５９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
命令を格納する非一時的コンピュータ可読記憶媒体であって、該命令によりコンピュータ処理システムは、
溶液から生存可能なミトコンドリアを単離する自動単離デバイス内で実施される、自動単離プロセスを開始し、
該自動単離デバイスのインキュベーションステーション内で、該インキュベーションステーションの温度の制御を含め、該溶液のインキュベーションを制御し、
インキュベーション期間が経過した後、該インキュベーションステーションから該自動単離デバイスの濾過ステーションへの、事前設定された容量の該溶液の移送を制御し、
該濾過ステーションの温度を制御し、
該濾過ステーションから排出される濾液のラマン分光分析の制御であって、
該自動単離デバイスの分光測定ステーション内のラマン分光計を、該濾液を収めるキュベットを該キュベットの第１の側から第１の波長の光で照射するよう制御すること、
該キュベットの、反対側の第２の側で受光された第２の波長の光から、電流を生成すること、及び
該生成された電流と該第１の波長の光から生成された電流との差異に基づいて、該濾液の定量的特性を判定すること
を含む、制御を行い、
該濾液の該定量的特性が基準を満たしていることを判定し、
該分光測定ステーションから、該自動単離デバイスの遠心分離ステーション内の複数の遠心分離管のそれぞれへの、該濾液の事前設定された容量分の移送を制御し、
該遠心分離管内の該濾液を遠心分離するために、事前設定された回転速度で、事前設定された期間動作するように、遠心分離機を制御することを含め、該遠心分離ステーション内の該遠心分離機の動作を制御し、該濾液の該遠心分離により、上澄みから該生存可能なミトコンドリアが分離される、
非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究又は開発
本発明は、国立衛生研究所、国立心肺血液研究所によって授与された、助成金番号５Ｒ０１ＨＬ１０３６４２の下での米国政府の支援を受けてなされたものである。米国政府は、本発明において、一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、赤血球を除く体内のすべての細胞内に存在し、多くの重要な細胞及び代謝プロセスに関与している。こうした多くの機能のために、ミトコンドリアの損傷は有害な影響を与える可能性がある。ミトコンドリアの損傷に起因する患者への悪影響を治療するために、健康なミトコンドリアを患者の組織から単離し、患者のミトコンドリアの損傷部位に移植して戻すことができる。ミトコンドリアの単離には、組織のホモジナイゼーション及び分画遠心分離などのプロセスが含まれ得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示は、少なくとも部分的に、生存可能なミトコンドリアを、完全に自動化されたプロセスで、組織又は培養細胞から単離することができるという発見に基づいている。コンピュータの制御下で、ホモジナイズされた組織又は培養細胞の溶液が、低温で一定期間インキュベーションされ、次いで、自動的に濾過ステーションに移送される。濾過ステーションでは、次第により小さくなる孔を有する一連のフィルタを使用して、インキュベーションされた溶液を濾過し、それによって溶液から大きな細胞小器官及び破片を除去する。濾液は、コンピュータ制御されたラマン分光測定によって分析され、濾液中の生存可能なミトコンドリアの数が定量化される。生存可能なミトコンドリアの数が基準を満たしている（たとえば、溶液中の生存可能なミトコンドリアの数が安定しており、インキュベーションされた溶液の濾過が完了したことを示す）場合、濾液は自動的に遠心分離機に移送され、遠心分離機は、コンピュータ制御下で自動的に動作し、上澄みから生存可能なミトコンドリアを分離する。遠心分離後、ユーザは、生存可能なミトコンドリアを、患者に移植するために、清浄な溶液中で再懸濁できる。
【０００４】
一態様では、溶液から生存可能なミトコンドリアを単離する自動単離デバイスは、プロセッサを備える。自動単離デバイスは、生存可能なミトコンドリアを含む溶液用のホルダ、及びホルダを冷却する冷却システムを具備するインキュベーションステーションを備え、冷却システムは、プロセッサによって制御される。自動単離デバイスは、インキュベーションステーションのホルダから濾過ステーションに溶液を移送する第１の移送システムを備え、第１の移送システムは、プロセッサによって制御される。自動単離デバイスは、一連の複数のフィルタを具備する濾過ステーションを備える。自動単離デバイスは、第１の波長の光でキュベットを照射するように配置されたラマン分光計であって、キュベットが、濾過ステーションの出口に流体連結されており、プロセッサによって制御されるラマン分光計と、ラマン分光計と反対側のキュベットの一方の側に配置される検出器であって、プロセッサに結合されている検出器とを具備する、分光測定ステーションを備える。自動単離デバイスは、分光測定ステーションから遠心分離機に溶液を移送する第２の移送システムを備え、第２の移送システムは、プロセッサによって制御される。自動単離デバイスは、遠心分離機を具備する遠心分離ステーションを備え、遠心分離機は、プロセッサによって制御され、遠心分離機は、濾液を遠心分離して、上澄みから生存可能なミトコンドリアを分離するよう構成される。
【０００５】
実施形態は、以下の特徴のうちの１つ又は複数を含み得る。
【０００６】
冷却システムは、プロセッサによって制御される熱電ペルチェ冷凍冷却システムを備える。ペルチェ冷凍冷却システムは、アナログ‐デジタル変換器によってプロセッサに結合されるペルチェプレートを備える。ペルチェ冷凍冷却システムは、放熱デバイスを備える。
【０００７】
第１の移送システムは、インキュベーションステーションのホルダを濾過ステーションに流体連結する第１の流体流路、及び第１の流体流路を通して溶液をポンプ移送するポンプを備え、ポンプは、プロセッサによって制御される。第１の流体流路は、針を備え、針の第１の端部は、インキュベーションステーションのホルダにアライメントされており、針の第２の端部は、一連の複数のフィルタへの入口に連結する管に連結される。自動単離デバイスは、針に連結されたアクチュエータを備え、アクチュエータは、プロセッサによって制御される。アクチュエータが作動することにより、針は、インキュベーションステーションのホルダに向かって進む。
【０００８】
一連の複数のフィルタの、連続するフィルタのそれぞれの孔径は、先行するフィルタよりも小さい。
【０００９】
一連の複数のフィルタの第１のフィルタの孔径は、３０μｍから５０μｍの間である。一連の複数のフィルタの第２のフィルタの孔径は、２０μｍから４０μｍの間である。一連の複数のフィルタの第３のフィルタの孔径は、１０μｍから３０μｍの間である。一連の複数のフィルタの第４のフィルタの孔径は、１μｍから１０μｍの間である。
【００１０】
濾過ステーションは、一連の複数のフィルタを冷却するフィルタ冷却システムを備える。フィルタ冷却システムは、熱電ペルチェ冷凍冷却システムを備える。
【００１１】
濾過ステーションは、一連の複数のフィルタの出口に流体連結された貯蔵器を備え、貯蔵器の出口は、キュベットに流体連結されている。
【００１２】
分光測定ステーションは、ラマン分光計とキュベットとの間に配置されたフィルタを備える。
【００１３】
自動単離デバイスは、その中で細胞培養物が培養され得る、生体インキュベータを備える。生体インキュベータは、プロセッサによって制御される攪拌機を備える。生体インキュベータは、プロセッサによって制御される加熱デバイスを備える。生体インキュベータは、酸素キャニスタを備える。生体インキュベータは、分光計を備える。自動単離デバイスは、生体インキュベータをインキュベーションステーションに流体連結する第３の移送システムを備える。自動単離デバイスは、複数の生体インキュベータを備える。
【００１４】
自動単離デバイスは、プロセッサをインキュベーションステーションの冷却システムに結合するアナログ・デジタル変換器を備える。
【００１５】
自動単離デバイスは、プロセッサに結合されたリレーチャネルを備え、リレーチャネルは複数のリレーを具備し、各リレーは、プロセッサによって制御される、自動単離デバイスの対応する構成要素に結合されている。自動単離デバイスは、プロセッサに、事前にプログラムされたシーケンスでリレーチャネルのリレーを起動又は停止させるための、命令を格納する非一時的コンピュータ可読記憶媒体を備える。
【００１６】
自動単離デバイスは、ディスプレイを備える。
【００１７】
一態様では、溶液から生存可能なミトコンドリアを単離する方法は、自動単離デバイスのインキュベーションステーション内で、生存可能なミトコンドリア及びプロテアーゼ酵素の溶液をインキュベーションするステップと、プロセッサによって制御された第１の移送システムを使って、インキュベーションされた溶液を自動単離デバイスの濾過ステーションに自動的に移送するステップとを含む。該方法は、溶液中に生存可能なミトコンドリアを含む濾液を得るために、インキュベーションされた溶液を、濾過ステーション内の一連の複数のフィルタを通して濾過するステップと、濾液中の生存可能なミトコンドリアの定量的特性を判定するために、プロセッサによって制御されるラマン分光測定ユニットを使用して、自動単離デバイスの分光測定ステーションで濾液を分析するステップとを含む。該方法は、濾液中の生存可能なミトコンドリアの定量的特性が基準を満たす場合、プロセッサによって制御される第２の移送システムによって、濾液を自動単離デバイスの遠心分離ステーションに自動的に移送するステップを含む。該方法は、遠心分離ステーションで、生存可能なミトコンドリアを上澄みから分離するために、プロセッサによって制御される遠心分離機で濾液を遠心分離するステップを含む。
【００１８】
実施形態は、以下の特徴のうちの１つ又は複数を有し得る。
【００１９】
溶液をインキュベーションするステップは、事前設定された、コンピュータ制御された期間、溶液をインキュベーションするステップと、該期間の終わりに、インキュベーションされた溶液を濾過ステーションに自動的に移送するステップとを含む。
【００２０】
溶液をインキュベーションするステップは、プロセッサによって制御される熱電ペルチェ冷凍冷却システムで溶液を冷却するステップを含む。溶液を冷却するステップは、プロセッサに結合されたアナログ‐デジタル変換器によって、熱電ペルチェ冷凍冷却システムのペルチェプレートへの電流を制御するステップを含む。溶液を冷却するステップは、溶液を１℃から約１０℃の間の温度まで冷却するステップを含む。
【００２１】
インキュベーションされた溶液を濾過ステーションに移送するステップは、プロセッサによって制御されるポンプによって、濾過ステーションに流体連結された針を通じてインキュベーションされた溶液をポンプ移送するステップを含む。インキュベーションされた溶液を濾過ステーションに移送するステップは、プロセッサによって制御されるアクチュエータによって、針をインキュベーションされた溶液内に進めるステップを含む。
【００２２】
一連の複数のフィルタを通してインキュベーションされた溶液を濾過するステップは、そのそれぞれが先行するフィルタよりも小さい孔径を有する連続するフィルタを通して、インキュベーションされた溶液を濾過するステップを含む。
【００２３】
インキュベーションされた溶液を濾過するステップは、濾過ステーションを１℃から１０℃の間の温度まで冷却するステップを含む。濾過ステーションを冷却するステップは、プロセッサによって制御される熱電ペルチェ冷凍冷却システムを使って濾過ステーションを冷却するステップを含む。
【００２４】
濾液を分析するステップは、キュベットの第１の側より、ラマン分光計から放射された第１の波長の光で濾液を照射するステップ、及びキュベットの反対側の第２の側で光を検出するステップを含む。光を検出するステップは、電流を生成する光電子増倍管で受光するステップを含む。生成される電流は、検出される光の波長に依存する。濾液の中に生存可能なミトコンドリアがある場合、検出された波長は、第１の波長とは異なる。該方法は、検出された波長によって生成された電流と第１の波長によって生成された電流との差異に基づいて、濾液中の生存可能なミトコンドリアの定量的特性を判定するステップを含む。
【００２５】
定量的特性を判定するステップは、単位容積当りの生存可能なミトコンドリアの数を判定するステップを含む。該方法は、定量的特性が基準を満たしていることを判定するステップを含み、基準を満たしていることを判定するステップは、単位容積当りの生存可能なミトコンドリアの数が安定していることを判定するステップを含む。
【００２６】
方法は、溶液を保持する容器をインキュベーションステーション内に受容するステップを含み、容器は、ユーザによってインキュベーションステーション内に挿入される。溶液には、生存可能なミトコンドリアを含むホモジナイズされた組織及びプロテアーゼ酵素が含まれる。
【００２７】
方法は、自動単離デバイス内の生体インキュベータからインキュベーションステーション内へ、溶液を受け取るステップを含む。溶液には、生体インキュベータ内で増殖した細胞培養物が含まれ、細胞培養物中の細胞は、その中に生存可能なミトコンドリアを有する。方法は、プロテアーゼ酵素を、プロセッサによって制御されるポンプによって、インキュベーションステーション内の細胞培養物の中へポンプ移送するステップを含む。方法は、生体インキュベータ内で細胞培養物を培養するステップを含み、生体インキュベータは、プロセッサによって制御される。生体インキュベータ内で細胞を培養するステップは、プロセッサによって制御される攪拌機を使用して、生体インキュベータ内で細胞培養物を攪拌するステップを含む。生体インキュベータ内で細胞を培養するステップは、プロセッサによって制御される加熱デバイスを使用して、生体インキュベータ内で細胞培養物を加熱するステップを含む。方法は、プロセッサによって制御される分光計で細胞培養物を分析するステップを含む。細胞培養物を分析するステップは、細胞培養物中の単位容積当りの細胞の個体数を判定するステップを含む。該方法は、分光計で細胞培養物を複数回分析した結果に基づいて、細胞増殖曲線を判定するステップを含む。該方法は、細胞増殖曲線が増殖の基準を満たす場合に、自動単離デバイスのインキュベーションステーション向けの溶液として、細胞培養物を供給するステップを含む。方法は、細胞増殖曲線が対数増殖期にあるとき、細胞培養物を供給するステップを含む。
【００２８】
方法は、インキュベーションを開始する前に自動単離デバイスのステーションへの接近を防ぐために、自動単離デバイスの扉をロックするステップと、遠心分離後に、自動単離デバイスの扉をロック解除するステップとを含む。
【００２９】
方法は、自動単離デバイスのステータスを示す情報を、ディスプレイ上に表示するステップを含む。
【００３０】
一態様では、非一時的コンピュータ可読記憶媒体は命令を格納しており、該命令によりコンピュータ処理システムは、溶液から生存可能なミトコンドリアを単離する自動単離デバイス内で実施される自動単離プロセスを開始し、インキュベーションステーションの温度の制御を含む、自動単離デバイスのインキュベーションステーション内での溶液のインキュベーションを制御し、インキュベーション期間が経過した後、インキュベーションステーションから自動単離デバイスの濾過ステーションへの、事前設定された容量の溶液の移送を制御し、濾過ステーションの温度を制御する。該命令により、コンピュータ処理システムは、自動単離デバイスの分光測定ステーション内のラマン分光計を、濾液を収めるキュベットをキュベットの第１の側から第１の波長の光で照射するよう制御すること、キュベットの、反対側の第２の側で受光された第２の波長の光から、電流を生成すること、並びに該生成された電流と第１の波長の光から生成された電流との差異に基づいて、濾液の定量的特性を判定することを含め、濾過ステーションから排出される濾液のラマン分光分析を制御し、濾液の定量的特性が基準を満たしていることを判定する。該命令により、コンピュータ処理システムは、分光測定ステーションから自動単離デバイスの遠心分離ステーション内の複数の遠心分離管のそれぞれへの、濾液の事前設定された容量分の移送を制御し、且つ遠心分離管内の濾液を遠心分離するために、事前設定された回転速度で、事前設定された期間動作するように、遠心分離機を制御することを含め、遠心分離ステーション内の遠心分離機の動作を制御する。濾液の遠心分離により、上澄みから生存可能なミトコンドリアが分離される。
【００３１】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語は、この発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明で使用するために、方法及び材料が本明細書に記載されているが、当該分野で公知の他の好適な方法及び材料も使用できる。材料、方法、及び例は、例示的なものにすぎず、限定的であることを意図しない。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含め、本明細書が優先されることになる。
【００３２】
組織又は培養細胞からの生存可能なミトコンドリアの自動単離へのアプローチには、以下の１つ又は複数の利点があり得る。プロセスが迅速であり、損傷を受けていない生存可能なミトコンドリアが、比較的高収率で得られる。該プロセスは、プロセスが開始されるとユーザの操作を必要とせず、完全に自動化されており、それにより他の臨床業務のために人的リソースを解放し、人為的ミスの可能性を低減する。培養細胞からのミトコンドリアの自動単離は、患者からの組織生検を必要とせずに生存可能なミトコンドリアを取得でき、したがって、緊急事態の患者、又は生検が有害若しくは危険である患者への、ミトコンドリアの移植を可能にするというさらなる利点を提供する。
【００３３】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図、並びに特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】組織から生存可能なミトコンドリアを単離する自動単離デバイスのブロック図である。
【図２】自動単離デバイスの図である。
【図３】移送システムの一部の図である。
【図４】濾過ステーションの図である。
【図５】分光測定ステーションの図である。
【図６】自動単離デバイスの動作のプロセスの流れ図である。
【図７】培養細胞から生存可能なミトコンドリアを単離する自動単離デバイスのブロック図である。
【図８】自動単離デバイスの図である。
【図９】ディスプレイの例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
図１を参照すると、組織から生存可能なミトコンドリアを単離する自動単離デバイス１００において、ホモジナイズされた筋肉組織などのホモジナイズされた組織の溶液が、インキュベーションステーション１０２内で、低温でインキュベーションされる。いくつかの例では、溶液は、酵素、たとえばプロテアーゼなどの添加剤の存在下でインキュベーションできる。酵素は、たとえば、細胞から小胞体を切断する非特異的プロテアーゼである、スブチリシンＡであり得る。インキュベーションにより、より大きな望ましからざる細胞の破片が溶液の底に落下し、生存可能なミトコンドリアが溶液中に浮遊したままにすることができる。
【００３６】
インキュベーション後、溶液は、自動ポンプを備える移送システム１０４によって濾過ステーション１０６に移送され、そこで溶液は、連続するフィルタのそれぞれの孔径が先行するフィルタよりも小さい、一連のフィルタを通して濾過される。濾過プロセスの際に、より大きな望ましからざる細胞小器官（たとえば、細胞壁、細胞膜、核、リボソーム、小胞体、又は他の大きい細胞小器官若しくは破片）が溶液から徐々に濾過され、生存可能なミトコンドリアの高度に精製された溶液である濾液が残る。いくつかの例では、分光測定ステーション１０８、たとえば、ラマン分光計は、濾液を分析して、溶液中の生存可能なミトコンドリアの数など、溶液中のミトコンドリアの定量的特性を取得できる。
【００３７】
精製されたミトコンドリアの溶液は、自動ポンプを備える移送システム１１０によって、溶液から精製されたミトコンドリアを単離する、遠心分離ステーション１１２に移送される。遠心分離が完了すると、精製されたミトコンドリアを回収し、新鮮な溶液中で再懸濁し、患者に、たとえば、心臓又は肺組織などのミトコンドリアの損傷を受けている組織に移植できる。
【００３８】
図２は、組織サンプルから生存可能なミトコンドリアを自動的に単離する、自動単離デバイス２００の例を示す。自動単離デバイス２００は、卓上に収まるサイズで作られ得るフレーム２０２内に収容されている。自動単離デバイス２００は、最小限のユーザ操作で動作するように設計されており、それにより、他の患者の治療業務を行うための臨床医のリソースを解放し、且つ人為的ミスのリスクを低減する。ユーザの作業は、たとえば、自動単離デバイス２００をオンにすること、使い捨て構成要素（たとえば、インキュベーション容器、フィルタユニット、及び１つ又は複数の遠心分離管）及び組織サンプルを置くこと、自動単離プロセスを起動させること、及びプロセスの完了後、精製された生存可能なミトコンドリアを回収することを含み得る。
【００３９】
あるステーションから次のステーションへのミトコンドリア溶液の移送を含む、自動単離プロセス自体の実行は、コンピュータ制御下で実行される、自動プロセスである。図２の例では、自動単離デバイス２００の一部である（たとえば、フレーム２０２内に収容されるか、又はフレーム２０２に取り付けられた）マイクロプロセッサ２０４は、自動単離デバイス２００の動作を制御する。いくつかの例では、自動単離デバイス２００は、有線又は無線接続を介して、臨床環境におけるラップトップ若しくはデスクトップコンピュータ、又は携帯型コンピュータ処理デバイス、或いは遠隔サーバなどの、遠隔コンピュータ処理デバイスと接続でき、遠隔コンピュータ処理デバイスは、自動単離デバイスの動作を制御できる。本明細書で使用される「コンピュータ制御された」構成要素は、マイクロプロセッサ２０４によって、又は自動単離デバイス２００に接続された遠隔コンピュータ処理デバイスによって制御される構成要素である。
【００４０】
液晶ディスプレイ（ＬＣＤ：ｌｉｑｕｉｄ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｄｉｓｐｌａｙ）などのディスプレイ２０１は、自動単離プロセスの進捗状況を示すステータス情報を表示できる。いくつかの例では、ステータス情報は、視覚的インジケータ（たとえば、ステータス情報を通知するために所与のパターンで点滅又は点灯する１つ若しくは複数のライト）又は聴覚的インジケータ（たとえば、警報又はステータス情報を通知する話し言葉）などを使った、他のやり方で提供され得る。いくつかの例では、自動単離デバイスが遠隔コンピュータ処理デバイスに接続されている場合、ステータス情報を遠隔コンピュータ処理デバイスのディスプレイ上に表示できる。時に、ディスプレイ２０１上の情報の表示が参照されるが、これは、自動単離デバイスのディスプレイ２０１上若しくは遠隔コンピュータ処理デバイスのディスプレイ上での情報の表示を包含するものとして、又は視覚的若しくは聴覚的インジケータを介した情報通知として、理解されるべきである。
【００４１】
自動単離デバイス２００は、ホモジナイズされた組織の溶液が、事前設定されコンピュータ制御された時間及び事前設定されコンピュータ制御された温度でインキュベーションされる、インキュベーションステーション１０２を備える。インキュベーションステーション１０２は、ユーザによって挿入された使い捨て解離Ｃ管（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｃ  ｔｕｂｅ）などのインキュベーション容器２１４を受容するサイズで作られた、インキュベーションホルダ２１２を備える。インキュベーション容器２１４は、ホモジナイズされた組織、及びプロテアーゼなどの酵素、たとえば、スブチリシンＡの溶液を収める。
【００４２】
インキュベーション温度は、コンピュータ制御された冷却システム２１６によって調節される。冷却システム２１６は、インキュベーションホルダ２１２を冷却する冷却デバイス、及び、たとえばディスプレイ２０１上に、表示されるべき温度読取り値を提示できる熱センサ（図示せず）を備え得る。いくつかの例では、熱センサは、マイクロプロセッサ２０２又は遠隔コンピュータ処理デバイスに結合され、閉ループ式の温度フィードバックを提供し、それによって、冷却デバイスのリアルタイム制御を可能にする。図２の例では、冷却デバイスは、熱電ペルチェ冷凍冷却システムである。ペルチェ冷却システムは、電流を温熱及び冷熱エネルギーに変換するペルチェプレート２１８を備える。ペルチェプレート２１８は、第１の側面（たとえば、インキュベーションホルダ２１２に面するか又は接触する側面）から、たとえば、鋼製貯蔵器に冷熱エネルギーを放射し、反対の第２の側面から温熱を放射する。ペルチェプレート２１８の第２の側面に配置されたヒートシンク２２０及びファン２２２は、インキュベーションステーション１０２から熱を放散させる。ペルチェプレート２１８への電流、すなわちインキュベーションホルダ２１２が冷却される温度は、以下でさらに論じられるアナログ‐デジタル（ＡＣ‐ＤＣ：ａｎａｌｏｇ−ｔｏ−ｄｉｇｉｔａｌ）変換器２０６を使って電子的に制御できる。他の種類の冷却システムも使用できる。
【００４３】
第１のコンピュータ制御された移送システム１０４は、インキュベーションが完了すると、溶液をインキュベーション容器２１４から濾過ステーション１０６に移送する。第１の移送システム１０４は、マイクロプロセッサ２０２からの信号によって起動されると、針２２８をインキュベーション容器２１４内へ進めるアクチュエータ２２６を備える。図３も参照すると、アクチュエータ２２６は、バタフライなどの停止機構２２７を備えることができ、これにより、アクチュエータ２２６が、針２２８をインキュベーション容器２１４の底部まで完全に前進させることを防止する。たとえば、停止機構は、インキュベーション容器２１４の底部から約１ｍｍで、針を停止するように位置し得る。これは、インキュベーションプロセスの際に分離されたより大きな好ましからざる細胞の破片が、より大きな破片がフィルタを詰まらせる可能性がある濾過ステーション１０６にポンプ移送されることを防止する。第１の移送システムはまた、蠕動ポンプなどのコンピュータ制御されたポンプ２３０を備え、該ポンプは、インキュベーションされた溶液を、インキュベーション容器２１４から送達管を通して濾過ステーション１０６にポンプ移送する。
【００４４】
図２及び４を参照すると、インキュベーションされた溶液は、第１の移送システム１０４の流入経路を介して濾過ステーション１０６に供給される。流入経路は、針２２８及び送達管４０４を備え、これらを通じて、溶液がポンプによってインキュベーション容器から引き出される。
【００４５】
濾過ステーション１０６は、ペルチェ冷却システムなどの冷却システム２３２によって冷却される、使い捨てフィルタユニット４０２を備える。ペルチェ冷却システム２３２は、電流を温熱及び冷熱エネルギーに変換するペルチェプレートを備える。ペルチェプレートは、第１の側面（たとえば、フィルタユニット４０２に面するか又は接触する側面）から冷熱エネルギーを放射し、反対の第２の側面から温熱を放射する。ペルチェプレートの第２の側面に配置されたヒートシンク及びファンは、フィルタユニット４０２から熱を放散させる。ペルチェプレートへの電流、すなわちフィルタユニット４０２が冷却される温度は、ＡＣ〜ＤＣ変換器２０６を使って電子的に制御される。たとえば、ペルチェプレートは、フィルタユニット４０２を約１℃から約１０℃の間の目標温度、たとえば、１℃、２℃、４℃、６℃、８℃、又は１０℃まで冷却できる。冷却システム２３２はまた、たとえば、ディスプレイ２０１上に表示されるべき温度読取り値を提供できる熱センサ（図示せず）も備え得る。いくつかの例では、熱センサは、マイクロプロセッサ２０２又は遠隔コンピュータに結合され、閉ループ式の温度フィードバックを提供し、それによって、ペルチェプレートのリアルタイム制御を可能にする。他の種類の冷却システムも使用できる。
【００４６】
使い捨てフィルタユニット４０２は、フィルタユニットホルダ４０６によって、たとえば、フィルタユニット４０２の円筒形端部が連結されることで、所定の位置に保持される、４段フィルタシステムなどの多段フィルタシステムである。フィルタユニット４０２は、送達管４０４が取り付けられる細い管腔を有する、先細の（たとえば、円錐形の）上部などの上部４０８を備える。フィルタユニットは、ほぼ円形、若しくは楕円形、正方形、長方形、三角形、又は別の形状などの、別の形状の断面を有し得る。フィルタユニットは、ポリプロピレン又はポリスチレンなどの生体適合性材料で作製され得る。いくつかの例では、フィルタユニットは使い捨てであり、自動単離デバイスの供給コストを抑えるために、比較的低コストの材料で作製される。
【００４７】
フィルタユニット４０２の内部を通って延在する管腔は、送達管４０４に連結されている。送達管からフィルタユニット４０２内に受容された溶液は、管腔を通って移動し、複数の連続するフィルタのそれぞれによって濾過され、フィルタユニット４０２を出て、管腔の下端に連結された収集貯蔵器４１０に入ることになる。２つ、３つ、４つ、又は５つ以上のフィルタなどの複数のフィルタ４１２〜４１６は、直列に配置され、管腔を通って移動する溶液が複数のフィルタのそれぞれによって濾過されるように、フィルタユニット４０２の管腔内に固定されている。各フィルタは、フィルタユニット４０２の管腔内で、少なくとも又は約０．５ｍｍ、たとえば、少なくとも又は約１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、８ｍｍ、１ｃｍ、２ｃｍ、若しくは５ｃｍ、隣り合うフィルタから離れた間隔で配置され得るか、或いは隣り合うフィルタと接触し得る。いくつかの例では、隣り合うフィルタの各ペア間の間隔は均一であり、またいくつかの例では、隣り合うフィルタのペアの１つ又は複数の間隔は異なり得る。フィルタは、接着剤、圧着を使用して、又はフィルタが管腔内に保持されるように管腔の壁を成形することによって（たとえば、管腔の壁を、隆起又は溝などの保持要素を備えるよう設計することにより）、フィルタユニットの管腔内に固定され得る。
【００４８】
連続するフィルタのそれぞれの孔径は、先行するフィルタよりも小さく、それによって、より大きな望ましからざる細胞小器官（たとえば、細胞壁、細胞膜、核、リボソーム、小胞体、又は他のより大きい細胞小器官若しくは破片）を、溶液から徐々に濾過する。複数の連続した濾過の後に得られた濾液は、生存可能なミトコンドリアの高度に精製された溶液であり、フィルタユニット４０２を出て収集貯蔵器４１０内に入る。複数のフィルタ４１２〜４１６のそれぞれを備えるフィルタユニット４０２は、滅菌的であり得る。
【００４９】
一例では、第１のフィルタ４１２は、約３０μｍから約５０μｍの間、たとえば、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、約４５μｍ、又は約５０μｍの孔径を有する。第１のフィルタ４１２と隣り合い、第１のフィルタの下にある、フィルタユニット４０２の管腔内に配置された第２のフィルタ４１４は、約２０μｍから約４０μｍの間、たとえば、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、又は約４０μｍの孔径を有する。第２のフィルタ４１４と隣り合い、第２のフィルタの下にある、フィルタユニット４０２の管腔内に配置された第３のフィルタ４１６は、約１０μｍから約３０μｍの間、たとえば、約１０μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、又は約３０μｍの孔径を有する。第３のフィルタ４１６と隣り合い、第３のフィルタの下ある、フィルタユニット４０２の管腔内に配置された第４のフィルタ（図示せず）は、約１μｍから約１０μｍの間、たとえば、約１μｍ、約２μｍ、約４μｍ、約６μｍ、約８μｍ、又は約１０μｍの孔径を有する。フィルタは、濾過プロセスの際に、真空の発生を取り除く優れた開口部を有する、実質的に下向きの円錐形を有し得る。フィルタは、たとえば、ナイロン、マイラー、ステンレス鋼、ワイヤメッシュ、アルミニウム、合成メッシュ、スペクトル、ケブラー、プラスチック、紙、又はこれらの任意の組合せを含む、様々なフィルタ材料のいずれかで形成され得る。各フィルタは、約１ｍＬから約１０ｍＬの間の溶液、たとえば、約１ｍＬ、約５ｍＬ、又は約１０ｍＬを収めることができる。フィルタユニットのさらなる説明については、２０１６年１２月１３日に出願された米国特許出願公開第２０１７／０１２０２３７号に見ることができ、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５０】
収集貯蔵器４１０は、収集貯蔵器４１０を、ラマン分光測定用キュベットなどの分光キュベット４１８に流体連結する開口部を有し得る。たとえば、キュベット４１８は、両端に開口部を有する細い管腔を有し得る。第１の開口部は、収集貯蔵器に流体連結されており、第２の開口部は、送達管４２０に固定されている。
【００５１】
ここで図２及び図５を参照すると、キュベット４１８内の濾液中のミトコンドリアの生存率を定量化するために、ラマン分光測定ユニットなどのコンピュータ制御された分光測定ステーション１０８内のラマン分光測定を使用する。ミトコンドリアの生存率は、呼吸電子伝達鎖（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｃｈａｉｎ）の最終的な酵素であるシトクロムＣの存在によって判定される。生存不能な(non-viable)ミトコンドリアは、シトクロムＣを持っていない。シトクロムＣは、赤外線の範囲のすぐ下の、約６００〜８００ｃｍ−１の波長を有する光子をラマン散乱する、大きな膜貫通タンパク質複合体である。シトクロムＣの存在、すなわち生存可能なミトコンドリアの存在は、この波長範囲の光で濾液を照射し、濾液を透過する光の量を測定し、シトクロムＣを含まない濾液を透過した光量と比較することによって、検出及び定量化され得る。
【００５２】
分光測定ステーション１０８は、約６００ｃｍ−１から約８００ｃｍ−１の間の波長（たとえば、６００ｃｍ−１、６５０ｃｍ−１、７００ｃｍ−１、７５０ｃｍ−１、又は８００ｃｍ−１の波長）を放射するラマン分光計５０２を備える。分光キュベット４１８内の濾過された溶液を透過する、分光計から放射された光子は、光電子増倍管（ＰＭＴ：ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  ｔｕｂｅ）５０４によって補捉され、そこで光子が電流に変換される。具体的には、ＰＭＴ５０４内の光電陰極は、受け取った光子を吸収して電子を放出し、該電子は、ＰＭＴ内の電極のチェーンによって増倍される。このチェーンの終わりで、陽極からグランドに流れる電流は、光電陰極によって生成される光電子束に正比例する。いくつかの例では、ＰＭＴ５０４の代わりに、電荷結合素子（ＣＣＤ：ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ）管などの、別の検出デバイスが使用され得る。
【００５３】
シトクロムＣを含まない濾液に対してラマン分光法を実行すると、分光計５０２から放射された光子はキュベット４１８を透過し、ＰＭＴ５０４に入射し、ＰＭＴは、入射光の波長（「基準波長」と呼ばれる）に基づいて電流（「基準電流」と呼ばれる）を生成する。分光キュベット４１８内の濾液が生存可能なミトコンドリアを含む（したがって、シトクロムＣを含む）場合、分光計５０２から放射される光子の一部は、シトクロムＣによってラマン散乱され、それにより第２の別の波長（「ラマンシフト波長」と呼ばれる）の光子がＰＭＴ５０４に到達する。ラマンシフト波長の光がＰＭＴ５０４に入射することにより、ＰＭＴ５０４は、基準電流よりも低いレベルの電流（「新電流」と呼ばれる）を生成する。基準電流と新電流との差異は、シトクロムＣの量、つまり濾液中の生存可能なミトコンドリアの数に正比例する。生存可能なミトコンドリアの数は、分光測定の結果を使用して計算できる。いくつかの例では、ノッチフィルタ又はエッジフィルタなどのフィルタ５０６が、分光計５０２とキュベット４１８との間に配置され、電子伝達鎖に対するシトクロムＣの作用に影響を及ぼし、したがって結果の精度に影響を与える可能性がある、分光計５０２によるどんなラマン散乱をも遮断する。
【００５４】
濾液が溜まるにつれて、ＰＭＴで検出される波長が変化する。検出される波長が安定すると、マイクロコントローラは、基準の標準電流と新電流との差異を使用して、所与の容量の溶液中の生存可能なミトコンドリアの数を判定することになる。たとえば、特定のアルゴリズムを使用して、生存可能なミトコンドリアの数を判定できる。判定された生存可能なミトコンドリアの数は、ディスプレイ２０１に表示され得る。
【００５５】
再び図２及び図４を参照すると、第２のコンピュータ制御された移送システム１１０は、溶液を分光測定ステーション１０８のキュベット４１８から遠心分離ステーション１１２に移送する。第２の移送システムは、アクチュエータ２４２を備え、これは、マイクロプロセッサ２０２からの信号によって起動されると、針２４４を、遠心分離機２４８のロータに保持された遠心分離管２４６（たとえば、エッペンドルフ管、たとえば、２．５ｍＬエッペンドルフ管）内へ進める。アクチュエータ２４２は、アクチュエータが遠心分離管２４６内へ延出し過ぎることを防止する、バタフライなどの停止機構２５０を備え得る。第２の移送システムはまた、蠕動ポンプなどのコンピュータ制御されたポンプ２５２を備え、該ポンプは、濾過された溶液を、キュベット４１８から送達管４２０を通して遠心分離管２４６内にポンプ移送する。図２の例では、遠心分離機２４８は２本の遠心分離管２４６を保持し、アクチュエータは、溶液を遠心分離管２４６のそれぞれの中に移送するために、遠心分離機２４８に対して移動できる。いくつかの例では、遠心分離機２４８は、ただ１本の遠心分離管しか保持できず、またいくつかの例では、遠心分離機２４８は、２本、４本、６本、８本、又は１０本以上の管など、複数の遠心分離管を保持できる。
【００５６】
遠心分離機２４８は、生存可能なミトコンドリアを溶液から分離するのに十分な速度で回転できる、コンピュータ制御されたモータを備える。たとえば、モータは、毎分約５，０００回転（ＲＰＭ：ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ）から約１５，０００ＲＰＭの間の速度、たとえば、５，０００ＲＰＭ、１０，０００ＲＰＭ、又は１５，０００ＲＰＭで回転できる。遠心分離後、生存可能なミトコンドリアのペレットが、各遠心分離管２４６の底に残る。
【００５７】
自動単離デバイス２００の動作を制御するために、マイクロプロセッサ２０４又は遠隔コンピュータ処理デバイスは、リレーチャネル２０８と電子的に通信する。電力が、ＡＣ〜ＤＣ変換器２０６によってリレー２０８に供給される。リレーチャネル２０８の各リレーは、ディスプレイ２０１、ポンプ２３０、２５２、アクチュエータ２２６、２４２、遠心分離機のモータ２５４、ラマン分光計５０２、及びＰＭＴ５０４を含む、自動単離デバイス２００の構成要素のうちの１つの動作を制御する。マイクロプロセッサ２０４又は遠隔コンピュータ処理デバイスは、各リレーが起動及び停止されるべきシーケンス、並びに各リレーが作動状態で保持される期間を指定する、事前にプログラムされたシーケンスで、各リレーを起動及び停止する。たとえば、事前にプログラムされたシーケンスは、自動単離デバイス２００内又は遠隔コンピュータ処理デバイスにある、非一時的コンピュータ可読媒体などのメモリに格納され得る。インキュベーションステーション及び濾過ステーションは、マイクロコントローラ２０４又は遠隔コンピュータ処理デバイスによって起動されるのではなく、むしろ、これらのステーションの低温維持を可能にするために、ＡＣ〜ＤＣ変換器２０６によって直接給電される。
【００５８】
図６は、図２の自動単離デバイス２００の動作の例示的なプロセスを示す。図６では、ユーザが実行する動作は破線で示され、自動化されたコンピュータ制御の下で実行される動作は実線で示されている。
【００５９】
ユーザは、自動単離デバイスを使用できるように準備する（６００）。準備は、動作の前に、たとえば、約５分、１０分、１５分、２０分、３０分、又は別の時間前に、自動単離デバイスをオンにする（たとえば、プラグを差し込むことによって）ことを含み得る。動作前に自動単離デバイスをオンにすることで、単離プロセスが始まる前に、インキュベーションステーションと濾過ステーションとの両方がオンになり、目標温度に到達するのに十分な時間が与えられる。いくつかの例では、ディスプレイは、単離ステーション及び濾過ステーションの温度を表示できる。目標温度に達すると、ディスプレイは、アラート、たとえば、準備完了のメッセージ若しくは信号、又はユーザに準備を続行させる指示を表示できる。
【００６０】
自動単離デバイスをオンにする前に、又はデバイスの準備ができると、ホモジナイズされた組織及び酵素の溶液を調合できる（６０１）。特定の例では、組織サンプルは、ヒトの筋肉組織の６ｍｍの生検サンプルであり得る。組織サンプルは、ホモジナイジング緩衝液、たとえば、３００ｍＭスクロース、１０ｍＭ  Ｋ−ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）を含む（たとえば、それらからなる）ｐＨ７．２の溶液である溶液Ａでホモジナイズされ、ｐＨを水酸化カリウム）及び１ｍＭ  Ｋ−ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）で調節され、ｐＨを水酸化カリウムで調節される
【００６１】
ホモジナイズされた組織サンプル及びプロテアーゼなどの酵素、たとえば、スブチリシンＡなどの添加剤の溶液が調合され、インキュベーション容器（たとえば、解離Ｃ管）に加えられる。溶液は、たとえば、溶液Ａ中の５ｍＬのホモジナイズされた組織、及び１ｍＬのスブチリシンＡからなり得る。いくつかの例では、添加剤は使用されない。
【００６２】
自動単離デバイスの準備ができると、ユーザは、（図２参照）組織及び酵素のホモジナイズされた溶液を保持するインキュベーション容器２１４、フィルタユニット４０２、及び遠心分離管２４６（たとえば、エッペンドルフ管）を含む、デバイスの使い捨て構成要素を挿入する（６０２）。いくつかの例では、ディスプレイは、使い捨て構成要素のステータスの表示、たとえば、構成要素が存在するか、存在しないか、又は誤って置かれているかどうかの指標を表示できる。いくつかの例では、依然として図２を参照して、使い捨てフィルタユニット４０２を自動単離デバイス内に挿入するために、ユーザは、フィルタユニットを、フィルタユニットのハンドルを使用して、自動単離デバイスの濾過ステーション１０６のフィルタユニットホルダ４０６上にスナップ留めする。加えて、ユーザは、針２２８、２４４から安全キャップを取り外し、各針を対応する停止機構２２７、２５０に挿入し、送達管４０４、４２０を各ポンプ２３０、２５２に取り付ける。
【００６３】
すべての使い捨て構成要素が挿入された後、ユーザは、自動単離デバイスの扉を閉じ、たとえば、スイッチ若しくはボタンを押すことによって、ディスプレイと対話することによって、自動単離デバイスに接続された遠隔コンピュータ処理デバイスからプロセスを開始させることによって、又は別のやり方で、単離プロセスを開始させる（６０４）。いくつかの例では、ディスプレイは、インキュベーションプロセスが開始されたことを示すステータスを表示できる。
【００６４】
ユーザが単離プロセスを開始させると、プロセスが完了しない限り、プロセスはコンピュータ制御下で、ユーザのさらなる操作なしで進行する。いくつかの例では、自動単離デバイスの扉は、プロセスが完了するまでロックされた状態で保持される。いくつかの例では、ユーザがプロセスを開始しようとしたときに扉が適切に閉じられていない場合、視覚的アラート（たとえば、ライト、ディスプレイ上の情報）又は聴覚的アラート（たとえば、警報）などのアラートが与えられ得る。
【００６５】
インキュベーションステーションにおいて、ホモジナイズされた組織及び酵素の溶液は、事前設定されコンピュータ制御された時間、事前設定されコンピュータ制御された低温（たとえば、約１℃から約１０℃の間、たとえば、１℃、２℃、４℃、６℃、８℃、又は１０℃）で、ある期間（たとえば、約２分から約３０分の間、たとえば２分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、又は別の時間）インキュベーションされ（６０６）、これにより、より大きな望ましからざる細胞の破片が溶液の底に落下し、生存可能なミトコンドリアが溶液中に浮遊したままになり得る。事前設定されたインキュベーション時間が経過すると、ディスプレイに、インキュベーションプロセスが完了したことを示すステータスが表示され得る。
【００６６】
インキュベーションの後に、第１の移送システムが起動され、インキュベーションされた溶液をインキュベーション容器から濾過ステーションに移送する（６０８）。コンピュータは、第１の移送システムのアクチュエータを起動し、針をインキュベーション容器内へ引き込む。針が目標距離に達すると（たとえば、コンピュータによって制御されると、又は停止機構によって針の進みが停止されると）、コンピュータはアクチュエータを停止し、アクチュエータは延出された位置で留まる。次いで、コンピュータは、事前設定された時間（たとえば、約１秒から約３０秒の間、たとえば、１秒、２秒、５秒、１０秒、１５秒、２０秒、２５秒、３０秒、又は別の時間）ポンプを作動させ、インキュベーションされた溶液を、インキュベーション容器から濾過ステーションにポンプ移送する。事前設定された時間は、設定された容量の溶液、たとえば、約１ｍＬから約１０ｍＬの間、たとえば、１ｍＬ、２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、又は別の溶液量をポンプ移送するのに十分であり得る。ポンプ移送時間が経過すると、コンピュータはポンプをオフにし、アクチュエータを起動して針を引っ込める。ディスプレイには、濾過プロセスが開始されたことを示すステータスが表示され得る。
【００６７】
インキュベーションされた溶液は、濾過ステーションで、フィルタユニットの一連の複数の（たとえば、２つ、３つ、４つ、又は５つの）フィルタのそれぞれを、順次通過することによって濾過される（６１０）。連続するフィルタのそれぞれの孔径は、先行するフィルタよりも小さく、それによってより大きな望ましからざる細胞小器官（たとえば、細胞壁、細胞膜、核、リボソーム、小胞体、又は他のより大きい細胞小器官若しくは破片）を、溶液から徐々に濾過する。溶液は、たとえば重力又は毛細管現象によって、一連のフィルタを通って進行する。複数の連続した濾過の後に得られた濾液は、生存可能なミトコンドリアの高度に精製された溶液であり、フィルタユニットを出て収集貯蔵器内に、そして分光キュベット内に入る。フィルタユニット内の一連の複数のフィルタを通る濾過は、標準的な分画遠心分離プロトコルを使用する濾過よりも、ミトコンドリアにかかる機械的ストレスを軽減する。濾過ステーションは、コンピュータ制御された低温（たとえば、約１℃から約１０℃の間、たとえば、１℃、２℃、４℃、６℃、８℃、又は１０℃）で維持できる。
【００６８】
コンピュータは、ラマンユニット内のラマン分光計及びＰＭＴを起動して、基準波長を取得する（６１２）。いくつかの例では、ラマン分光計及びＰＭＴは、インキュベーション容器から濾過ステーションへの流体の送達とほぼ同時に起動され得る。分光計は、ラマンフィルタ（存在する場合）及びキュベットを通し、ＰＭＴに向けて、一定波長の光を安定して連続的に放射する。ＰＭＴは、標準の一定波長の光を継続的に吸収し、この情報を電流として中継し、マイクロコントローラに戻す。この初期波長は、ミトコンドリアの生存率の測定の基礎となる、基準波長である。
【００６９】
濾過後、濾液がキュベット内に溜まり始めると、濾液中の生存可能なミトコンドリアの個体数がラマン単位で測定される（６１４）。濾液が溜まるにつれて、濾液中の生存可能なミトコンドリアのシトクロムＣによるラマン散乱のために、ＰＭＴで検出される波長が（すなわち、ラマンシフト波長に）変化する。ＰＭＴによって検出された波長が安定すると（第１の時点と第２の時点との間で、検出された波長に著しい変化がないことを意味する）、マイクロコントローラは、基準波長とラマンシフト波長との差異を使用して、所与の容量の溶液中の生存可能なミトコンドリアの数を判定する。溶液中のミトコンドリアの安定した数が取得されると（第１の時点と第２の時点との間で、判定された生存可能なミトコンドリアの数に著しい変化がないことを意味する）、濾過プロセスは完了し、コンピュータは分光計及びＰＭＴをオフにする。いくつかの例では、ディスプレイは、濾過プロセスが完了したことを示すステータスを表示できる。いくつかの例では、ディスプレイは、計算された容積当りのミトコンドリアの数を表示できる。
【００７０】
濾過の後に、第２の移送システムが起動され、インキュベーションされた溶液をキュベットから遠心分離ステーションに移送する（６１６）。コンピュータは、移送システムのアクチュエータを起動し、アクチュエータは、針を、針とアライメントされている(aligned with)遠心分離管のうちの１本の中に引き入れる。針が目標距離に達すると（たとえば、コンピュータによって制御されると、又は停止機構によって針の進みが停止されると）、コンピュータはアクチュエータを停止し、アクチュエータは延出された位置で留まる。次いで、コンピュータは、事前設定された時間（たとえば、約１秒から約１５秒の間、たとえば１秒、２秒、５秒、１０秒、１５秒、又は別の時間）ポンプを作動させ、濾過された溶液を、キュベットから遠心分離管にポンプ移送する。事前設定された時間は、設定された容量の溶液、たとえば、約１ｍＬから約５ｍＬの間、たとえば、１ｍＬ、２ｍＬ、２．５ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、又は別の溶液量をポンプ移送するのに十分であり得る。ポンプ移送時間が経過すると、コンピュータはポンプをオフにし、アクチュエータを起動して針を引っ込め、遠心分離管の別の１本が針と一列に並ぶように、遠心分離機のモータを起動して遠心分離機を回転させる。該プロセスを繰り返して、濾過された溶液を次の遠心分離機管に移す。すべての遠心分離管に溶液が入ったとき、又はキュベット内に溶液が残っていないとき、ＬＣＤ画面に、濾液が移されたことを示すステータスを表示できる。
【００７１】
濾過された溶液を遠心分離する（６１８）。コンピュータは、遠心分離機のモータを起動して、毎分約５，０００回転（ＲＰＭ）から約１５，０００ＲＰＭの間、たとえば５，０００ＲＰＭ、１０，０００ＲＰＭ、又は１５，０００ＲＰＭで、事前設定された時間、たとえば、約１分から約１５分の間、たとえば、１分、５分、１０分、１５分、又は別の時間、回転させる。遠心分離プロセスの際に、ディスプレイは、遠心分離の残り時間を表示できる。
【００７２】
遠心分離が完了すると、コンピュータは、遠心分離機のモータをオフにし、インジケータ（たとえば、視覚的インジケータ（たとえば、ライト、ディスプレイ画面上の情報）又は聴覚的インジケータ）を提供して、ユーザに単離プロセスが完了したことを通知する（６２０）。扉のロックは解除される。
【００７３】
自動単離プロセスが完了すると、ユーザは、遠心分離管から好ましからざる上澄み溶液を除去し、各管の中に残っている、溶液、たとえば溶液Ａなどの均質化溶液中で再懸濁できる（６２２）、生存可能なミトコンドリアのペレットを残す。これで、生存可能なミトコンドリアを患者に移植する準備が整う（６２４）。プロセスを完了するために、ユーザは、自動単離デバイスから、フィルタユニット、ポンプ、針、管、及びインキュベーション容器などの使い捨て構成要素を取り外す。
【００７４】
いくつかの例では、自動単離プロセスは、３０分以下など、たとえば、１０分、１５分、２０分、２５分、又は３０分で、比較的迅速に完了し得る。自動単離プロセスは、生存可能な呼吸能力のあるミトコンドリアを、比較的高収率で生成できる。たとえば、自動単離プロセスでは、０．１８±０．０４ｇ（湿重量）の組織サンプルから約２×１０１０の生存可能なミトコンドリアが得られ得る。
【００７５】
図７を参照すると、培養細胞から生存可能なミトコンドリアを自動単離する自動単離デバイス７００において。自動単離デバイス７００は、最初に患者から組織サンプルを取得することなく、患者に移植するための生存可能なミトコンドリアを、単離することを可能にする。たとえば、生体インキュベーションされた（ｂｉｏ−ｉｎｃｕｂａｔｅｄ）細胞から生存可能なミトコンドリアを採取することは、小児科の患者又は硬組織若しくは虚血組織を有する患者など、ミトコンドリアを含有する組織のサンプルを取得する場所を見つけることが困難な可能性がある患者の治療に有用であり得る。生体インキュベーションされた細胞から生存可能なミトコンドリアを採取することは、救急車両内又は救急病棟内など、患者から組織サンプルを取得して均質化する時間がない可能性がある、緊急事態でも役立ち得る。
【００７６】
自動単離デバイス７００では、細胞は、生体インキュベータ７０２で培養される。生存可能なミトコンドリアが要求されるのに応じて、培養細胞は、生体インキュベータから自動単離デバイスのインキュベーションステーション７０４へポンプ移送される。インキュベーションステーションでは、培養細胞は、酵素、たとえば、スブチリシンＡなどのプロテアーゼなどの添加剤の存在下で、溶液（たとえば、溶液Ａ）中で、低温でインキュベーションされる。インキュベーションにより、より大きな望ましからざる細胞の破片が溶液の底に落下し、生存可能なミトコンドリアが溶液中に浮遊したままになり得る。
【００７７】
インキュベーション後、溶液は、自動ポンプを備える移送システム７０６によって濾過ステーション７０８に移送され、そこで溶液は、連続するフィルタのそれぞれの孔径が先行するフィルタよりも小さい、一連のフィルタを通して濾過される。濾過プロセスの際に、より大きな望ましからざる細胞小器官（たとえば、細胞壁、細胞膜、核、リボソーム、小胞体、又は他の大きい細胞小器官若しくは破片）が溶液から徐々に濾過され、生存可能なミトコンドリアの高度に精製された溶液である濾液が残る。いくつかの例では、分光測定ステーション７１０、たとえば、ラマン分光計は、濾液を分析して、溶液中の生存可能なミトコンドリアの数など、溶液中のミトコンドリアの定量的特性を取得できる。
【００７８】
精製されたミトコンドリアの溶液は、自動ポンプを備える移送システム７１２によって、溶液から精製されたミトコンドリアを単離する、遠心分離ステーション７１４に移送される。遠心分離が完了すると、精製されたミトコンドリアを回収し、新鮮な溶液中で再懸濁し、患者、たとえば、心組織などのミトコンドリアの損傷を受けている組織に移植できる。
【００７９】
図８は、生体インキュベーションされた細胞から生存可能なミトコンドリアを自動的に単離する、自動単離デバイス８００の例を示す。自動単離デバイス８００では、細胞培養物は生体インキュベータ内で増殖され、生存可能なミトコンドリアが、こうした培養細胞から単離される。自動単離デバイス８００への入力として、患者の組織を使用する必要はない。
【００８０】
自動単離デバイス８００は、最小限のユーザ操作で動作するよう設計されており、コンピュータ制御下で動作する。図８の例では、自動単離デバイス８００の一部であるマイクロプロセッサ８０４が、自動単離デバイスの動作を制御する。いくつかの例では、自動単離デバイス８００は、有線又は無線接続を介して、臨床環境におけるラップトップ若しくはデスクトップコンピュータ、又は遠隔サーバなどの遠隔コンピュータ処理デバイスと接続でき、遠隔コンピュータ処理デバイスは、自動単離デバイスの動作を制御できる。マイクロプロセッサ８０４は、たとえば、図２に関して上記で説明されたリレーチャネル２０８と同様に動作する、アナログ‐デジタル変換器８０６によって給電されるリレーチャネル８０８を使って、自動単離デバイス８００の構成要素を制御できる。ＬＣＤなどのディスプレイ８０１は、自動単離プロセスの進捗状況及び生体インキュベータ内の細胞培養物の増殖を示す、ステータス情報を表示できる。
【００８１】
自動単離デバイス８００の生体インキュベーションステーション７０２は、ミトコンドリア単離の準備として細胞が培養される、１つ又は複数の生体インキュベータ８６０を備える。細胞及び細胞培養培地を、たとえば、スケジュール通りに（たとえば、１日１回、１日２回、若しくは別の頻度で）又は必要に応じて懸濁液に、両方の生体インキュベータ８６０へ添加し、増殖させるためにインキュベーションできる。細胞は、培地を含む滅菌的な、コードが付けられたパッケージで冷凍して供給され得る。いくつかの例では、少なくとも２つの生体インキュベータが存在し、重複して細胞培養物を提供する。たとえば、一方の生体インキュベータは、培養物のまま残すことができ、継続的に増殖を最適化できるが、他方の生体インキュベータは、ミトコンドリアを単離するために細胞を放出する。たとえば、細胞培養物が細胞増殖曲線の対数増殖期にある場合、細胞を生体インキュベータから放出でき、細胞増殖曲線の他の段階では、細胞を生体インキュベータ内に維持してさらに培養できる。いくつかの例では、単一の生体インキュベータしか使用され得ない。
【００８２】
各生体インキュベータ８６０は、細胞が、増殖させるために培養される、回転フラスコ８６２を備える。各回転フラスコは、酸素キャニスタ８６４に取り付けられ、攪拌機８６６、たとえば、ホットプレート攪拌機によって制御される。攪拌機は、スピナ８６８の回転速度を制御でき、一方回転フラスコ８６２を、細胞培養物に寄与する温度、たとえば、約３５℃から約４０℃の間、たとえば、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、又は４０℃に加熱することもできる。攪拌機８６６は、たとえば、リレーチャネル８０８を使ってコンピュータ制御される。いくつかの例では、攪拌及び加熱機能は、２つの別個のデバイスによって提供される。
【００８３】
いくつかの例では、細胞培養物のサンプル（たとえば、１ｍＬのサンプル）を、分光測定を用いて分析し、サンプル中の単位容積当りの培養細胞の数を測定できる。たとえば、サンプルは、１５分ごとに１度、３０分ごとに１度、１時間ごとに１度、２時間ごとに１度、又は別の間隔など、頻繁な時間間隔で取得できる。細胞の個体数の分光分析は、自動化されコンピュータ制御されたプロセスであり得る。各生体インキュベータ８６０は、分光計８７０及びＰＭＴ（図示せず）を備え得る。分光計８７０は、細胞培養物中の生存可能な細胞によって反射される波長で、光を放射できる。生存可能な細胞が存在しない場合、ＰＭＴは、分光計８７０から放射された光子を、光電陰極を通して吸収し、光電陰極は、電極のチェーンによって増倍される電子を放出する。結果として生じる電流は、光電陰極によって生成された光電子束に比例する。生存可能な細胞を含むサンプルが分光計８７０とＰＭＴとの間に置かれると、細胞は、ＰＭＴとは反対側へ光子の一部を反射し、したがってＰＭＴが吸収する光はより少なく、それにより生成する電流はより小さい。ＰＭＴによって吸収される光量の差異、つまり生成される電流の差異は、サンプル内の生存可能な細胞の数に正比例する。したがって、生存可能な細胞の数は、分光測定の結果を使用して計算できる。さらに、増殖曲線は、各サンプルが分析される時間に基づいて判定できる。増殖曲線を標準化された増殖曲線と比較して、細胞の数及び細胞の純度を判定できる。いくつかの例では、細胞増殖時間及び容積当りの細胞数などのデータを、自動単離デバイス８００に接続されたコンピュータ画面上に表示できる。
【００８４】
細胞増殖時間及び細胞数データなどの分光測定によって得られたデータを使用して、単離された生存可能なミトコンドリアが要求されるのに応じて、細胞を提供するためにどちらの生体インキュベータ８６０（もしあれば）が利用可能かを、判定できる。たとえば、生体インキュベータは、その生体インキュベータ内にある細胞が増殖曲線の対数増殖期にある場合、利用可能であり得る。容積当りの細胞数が安定している、増殖曲線の定常期に達すると、生体インキュベータは使用できなくなり、増殖期にある細胞を有する別の生体インキュベータから細胞が提供され得る。
【００８５】
ユーザは、自動単離デバイスに接続されたコンピュータのコンピュータインタフェースを介して、ボタン又はスイッチを押すことにより、ＬＣＤ画面を操作する（たとえば、タップする）ことにより、又は別のやり方で、単離された生存可能なミトコンドリアを要求できる。ミトコンドリアの要求を受信したのに応じて、コンピュータは、所望の数のミトコンドリアを得るために、提供されるべき細胞の目標数を計算する。各生体インキュベータ８６０は、生体インキュベータをインキュベーションステーション７０４内のインキュベーション管８１４に連結する空気圧弁８６９を備える。利用可能な生体インキュベータのための空気圧弁８６９は、コンピュータ制御下で、目標数の細胞をインキュベーション管８１４に移送するのに十分な時間、開かれる。たとえば、細胞は、コンピュータ制御された蠕動ポンプなどのポンプ８７４によって、空気圧弁８６９を通って生体インキュベータ８６０からインキュベーション管８１４へポンプ移送され得る。
【００８６】
酵素（たとえば、スブチリシンＡ）などのインキュベーション添加剤、及び溶液（たとえば、溶液Ａ）はそれぞれ、貯蔵器８７６内のインキュベーション管８７５に滅菌的な溶液として保存される。貯蔵器８７６の温度は、熱電ペルチェ冷凍冷却システム（たとえば、図２に関して説明された冷却システム２１６と同様の冷却システム）などの冷却システム８７８によって調節される。いくつかの例では、インキュベーション管の温度を、ＬＣＤ上又はコンピュータディスプレイ上に表示できる。細胞がインキュベーション管８１４内にポンプ移送されるとき、適切な容量の添加剤及び溶液（たとえば、スブチリシンＡ及び溶液Ａ）が、コンピュータ制御された蠕動ポンプなどのポンプ８８０によって、貯蔵器８７６からインキュベーション管８１４にポンプ移送される。いくつかの例では、添加剤（たとえば、スブチリシンＡ）の容積は、コンピュータによって計算的に制御できる空気圧式流量制御弁などの流量制御デバイスによって測定できる。
【００８７】
インキュベーションステーション７０４の構成要素及び機能は、図２に関して上記で説明されたインキュベーションステーション１０２のものと同じである。たとえば、インキュベーションの温度は、コンピュータ制御された熱電ペルチェ冷凍冷却システムなどの冷却システム２１６によって調節される。添加剤及び溶液（たとえば、スブチリシンＡ及び溶液Ａ）を加えた細胞のインキュベーションは、図２に関して上記で説明されたように進行する。インキュベーションにより、より大きな望ましからざる細胞の破片が溶液の底に落下し、生存可能なミトコンドリアが溶液中に浮遊したままになり得る。
【００８８】
インキュベーションの後に、溶液は、第１の移送システムによって、インキュベーションステーション７０４から濾過ステーション７０８に移送される。第１の移送システムの構成要素及び機能は、図２に関連して上記で説明されている。濾過ステーション７０８の構成要素及び機能は、図４に関して上記で説明された濾過ステーション１０６のものと同じである。たとえば、濾過ステーション７０８のフィルタユニットは、複数のフィルタを備え、連続するフィルタのそれぞれの孔径は、先行するフィルタよりも小さく、その結果、より大きな望ましからざる細胞小器官が、溶液から徐々に除去される。複数回の連続する濾過の後に得られた濾液は、生存可能なミトコンドリアの高度に精製された溶液である。
【００８９】
濾液は、濾液中のミトコンドリアの生存率を定量化するために、ラマンユニット７１０内でのラマン分光測定によって分析され得る。ラマンユニット７１０の構成要素及び機能は、図５に関して上記で説明されたラマンユニット１０８のものと同じである。
【００９０】
第２の移送システムは、濾液を、ラマンユニット７１０のキュベット４１８から遠心分離ステーション７１４に移送する。第２の移送システムの構成要素及び機能は、図２に関連して上記で説明されている。遠心分離ステーション７１４の構成要素及び機能は、図２に関して上記で説明された遠心分離ステーション１１２のものと同じである。遠心分離後、生存可能なミトコンドリアのペレットが、各遠心分離管２４６の底に残る。
【００９１】
自動単離プロセスが完了すると、ユーザは、遠心分離管から好ましからざる上澄み溶液を除去し、各管に残っている、溶液Ａなどの溶液中で再懸濁できる生存可能なミトコンドリアのペレットを残す。これで、生存可能なミトコンドリアを患者に移植する準備が整う。プロセスを完了するために、ユーザは、自動単離デバイスから、フィルタユニット、ポンプ、針、管、及びインキュベーション容器などの使い捨て構成要素を取り外す。
【００９２】
図９は、自動単離デバイスのディスプレイ上に示される情報の例である。ディスプレイは、インキュベーションステーション及び濾過ステーションの冷却システム（たとえば、ペルチェプレート）の温度、１つ又は複数の生体インキュベータのステータス、１つ又は複数の生体インキュベータ内の細胞培養物の増殖期、１つ又は複数の生体インキュベータ内の細胞数、１つ又は複数の生体インキュベータ内の細胞培地のステータス、インキュベーションステーション内の溶液の組成（たとえば、スブチリシンＡが添加されているかどうか）、自動単離プロセスの１つ又は複数の段階（たとえば、インキュベーション、濾過、及び遠心分離）のそれぞれのステータス、並びにラマン分光測定によって判定された、濾液中の生存可能なミトコンドリアの数などの情報を通知できる。追加情報を表示できる。いくつかの例では、図９に示されているよりも少ない情報を表示する場合がある。いくつかの例では、この情報の一部又はすべては、ライト又は聴覚的アラート、或いはデスクトップ若しくはラップトップコンピュータ又は携帯型コンピュータ処理デバイスなどの遠隔コンピュータ処理デバイスのインタフェースへの表示など、他のやり方法で通知できる。
【００９３】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と併せて説明されてきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を説明することを意図しており、限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び修正形態は、添付の特許請求の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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