(57)【要約】  本発明は、食用の燕の巣からの抽出物を製造する方法、燕の巣抽出物、及び燕の巣抽出物の使用に関する。上記方法は、食用の燕の巣（ＥＢＮ）混合物を製造し、該混合物と抽出溶液とを接触させて該混合物中の分子を結合することを含み、該抽出溶液は、オプソニン結合部分、補体タンパク質結合部分、レクチン結合部分、フィコリン結合部分、コレクチン結合部分、及びペントラキシン結合部分よりなる群から選択される少なくとも１種の結合部分を含む。
2021521276.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
食用の燕の巣から抽出物を製造する方法であって、次の工程：
（ａ）食用の燕の巣（ＥＢＮ）の混合物を製造し、及び
（ｂ）前記混合物と抽出溶液とを接触させて前記混合物中の分子を結合させること
を含み、前記抽出溶液は、オプソニン結合部分、補体タンパク質結合部分、レクチン結合部分、フィコリン結合部分、コレクチン結合部分、及びペントラキシン結合部分よりなる群から選択される少なくとも１種の結合部分を含む方法。
【請求項２】
前記混合物が海藻及び／又はハスマをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オプソニン結合部分が１０ｋＤａ〜７５０ｋＤａの分子量を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記オプソニン結合部分が配列番号１を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記補体タンパク質結合部分が２０ｋＤａ〜７０００ｋＤａの分子量を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記補体タンパク質結合部分が配列番号２を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記レクチン結合部分が２０ｋＤａ〜１０００ｋＤａの分子量を有する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記レクチン結合部分が配列番号３を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記フィコリン結合部分が１５ｋＤａ〜９００ｋＤａの分子量を有する、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記フィコリン結合部分が配列番号４を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記コレクチン結合部分が１５ｋＤａ〜９００ｋＤａの分子量を有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記コレクチン結合部分が配列番号５を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記ペントラキシン結合部分が２０ｋＤａ〜１０００ｋＤａの分子量を有する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ペントラキシン結合部分が配列番号６を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１種の結合部分が、以下のものから選択されるいずれか１つを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法：
（ｉ）前記レクチン結合部分及び前記オプソニン結合部分、
（ｉｉ）前記レクチン結合部分、前記補体タンパク質結合部分、前記オプソニン結合部分、前記フィコリン結合部分、前記コレクチン結合部分、及び前記ペントラキシン結合部分、
（ｉｉｉ）前記レクチン結合部分、前記補体タンパク質結合部分、及び前記オプソニン結合部分、
（ｉｖ）前記オプソニン結合部分及び前記ペントラキシン結合部分、
（ｖ）前記フィコリン結合部分、前記コレクチン結合部分、及び前記ペントラキシン結合部分、
（ｖｉ）前記補体タンパク質結合部分、前記フィコリン結合部分、及び前記コレクチン結合部分；並びに
（ｖｉｉ）前記レクチン結合部分、前記オプソニン結合部分、及び前記コレクチン結合部分。
【請求項１６】
前記少なくとも１種の結合部分が、以下のものから選択されるいずれか１種を含む、請求項１５に記載の方法：
（ｉ）前記結合部分の７０％レクチン及び前記結合部分の３０％オプソニン、
（ｉｉ）前記結合部分の２０％レクチン、前記結合部分の２０％補体タンパク質、前記結合部分の２０％オプソニン、前記結合部分の２０％ペントラキシン、前記結合部分の１０％フィコリン、及び前記結合部分の１０％コレクチン、
（ｉｉｉ）前記結合部分の５０％補体タンパク質、前記結合部分の２５％レクチン、及び前記結合部分の２５％オプソニン、
（ｉｖ）前記結合部分の５０％オプソニン及び前記結合部分の５０％ペントラキシン、
（ｖ）前記結合部分の４０％フィコリン、前記結合部分の３０％コレクチン及び前記結合部分の３０％ペントラキシン、
（ｖｉ）前記結合部分の１０％フィコリン、前記結合部分の２０％コレクチン及び前記結合部分の７０％補体タンパク質；並びに
（ｖｉｉ）前記結合部分の７０％コレクチン、前記結合部分の２０％オプソニン、及び前記結合部分の１０％レクチン。
【請求項１７】
前記ＥＢＮ混合物を製造する工程が、前記混合物を洗浄し、及び洗浄された混合物をろ過する工程を含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記洗浄工程が前記混合物を第１酵素溶液に暴露し、前記混合物及び前記第１酵素溶液を水に浸漬することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１酵素溶液が亜硝酸レダクターゼを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＥＢＮ混合物を製造する工程が、前記接触工程の前に前記ＥＢＮ混合物を油に浸漬することを含む、請求項１７〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記ＥＢＮ混合物を製造する工程が、前記接触工程の前に、洗浄されたＥＢＮ混合物を滅菌することをさらに含む、請求項１７〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記接触工程をアスコルビン酸及び金ナノ粒子の存在下で実施する、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記接触工程を４℃〜３７℃の間で少なくとも２０分間実施する、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
結合分子を酸性溶液で加水分解することをさらに含む、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記混合物から前記少なくとも１種の結合部分及び結合分子を分離し、前記結合分子を脱離させ、及び脱離した分子を透析によって取得することをさらに含む、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記透析された分子を、植物プロテアーゼ及び／又は果実プロテアーゼを含む第２酵素溶液で処理することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
以下の条件のうちの少なくとも１つを含む、請求項２６に記載の方法：
（ａ）前記第２酵素溶液の濃度が約１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである；及び
（ｂ）前記単離された分子の前記第２酵素溶液による処理を４５℃で６０分間にわたってｐＨ６．５〜９．０で実施し、前記第２酵素溶液を変性させる。
【請求項２８】
分子を乾燥させることをさらに含む、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれかに記載の方法で得ることができる燕の巣抽出物。
【請求項３０】
オプソニン、補体タンパク質、レクチン、フィコリン、コレクチン、及びペントラキシンよりなる少なくとも２つの群から選択される複数の分子を含む燕の巣抽出物。
【請求項３１】
前記複数の分子は、以下のものから選択されるいずれか１種である、請求項３０に記載の燕の巣抽出物：
（ｉ）レクチン及びオプソニン、
（ｉｉ）レクチン、補体タンパク質、オプソニン、フィコリン、コレクチン、及びペントラキシン、
（ｉｉｉ）レクチン、補体タンパク質、及びオプソニン、
（ｉｖ）オプソニン及びペントラキシン、
（ｖ）フィコリン、コレクチン、及びペントラキシン、
（ｖｉ）補体タンパク質、フィコリン、及びコレクチン、並びに
（ｖｉｉ）レクチン、オプソニン、及びコレクチン。
【請求項３２】
前記複数の分子が、以下ものから選択されるいずれか１種である、請求項３１に記載の燕の巣抽出物：
（ｉ）レクチン７０％、及びオプソニン３０％、
（ｉｉ）レクチン２０％、補体タンパク質２０％、オプソニン２０％、フィコリン１０％、コレクチン１０％、及びペントラキシン２０％、
（ｉｉｉ）レクチン２５％、補体タンパク質５０％、及びオプソニン２５％、
（ｉｖ）オプソニン５０％、及びペントラキシン５０％、
（ｖ）フィコリン４０％、コレクチン３０％、及びペントラキシン３０％、
（ｖｉ）補体タンパク質７０％、フィコリン１０％、及びコレクチン２０％、並びに
（ｖｉｉ）レクチン１０％、オプソニン２０％、及びコレクチン７０％。
【請求項３３】
前記複数の分子が酸性溶液及び／又は酵素溶液での処理によって加水分解されている、請求項３０〜３２に記載の燕の巣抽出物。
【請求項３４】
マルトデキストリンをさらに含む、請求項２９〜３３に記載の燕の巣抽出物。
【請求項３５】
請求項２９〜３４のいずれかに記載の燕の巣抽出物と、薬学的に許容されるキャリア、賦形剤又は希釈剤とを含む組成物。
【請求項３６】
対象の免疫系を調節するのに使用するための栄養補助食品であって、請求項２９〜３４のいずれかに記載の燕の巣抽出物を含む栄養補助食品。
【請求項３７】
内科的治療に使用するための、請求項２９〜３４のいずれかに記載の燕の巣抽出物。
【請求項３８】
デングウイルスの複製を阻害するために使用するための、又は対象の免疫系を調節するのに使用するための、又はインターフェロン調節因子３のリン酸化を誘導するのに使用するための、請求項３７に記載の燕の巣抽出物。
【請求項３９】
前記免疫系を調節することが、炎症性サイトカインの産生を誘導すること、又はＮＦ−ｋＢ経路及び／又はＭＡＰＫ経路を誘導することによって行われる、請求項３８に記載の燕の巣抽出物。
【請求項４０】
医薬品の製造における、請求項２９〜３４のいずれかに記載の燕の巣抽出物の使用。
【請求項４１】
デングウイルス複製を阻害する方法、又は対象の免疫系を調節する方法、又はインターフェロン調節因子３のリン酸化を誘導する方法であって、請求項２９〜３４のいずれかに記載の燕の巣抽出物を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、燕の巣原料と、任意に他の材料とを含む混合物から免疫学的抽出物を製造する方法、及び当該方法から得ることのできる抽出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
燕の巣（ＥＢＮ）は、東南アジア地域で自然に見られるアナツバメの唾液からなる巣である。放棄された巣は、野生から又はアナツバメのために特別に建てられた建物から収穫される。ＥＢＮは、マイトジェン応答、上皮成長因子（ＥＧＦ）様活性、抗インフルエンザウイルス、血球凝集抑制活性、レクチン結合活性、骨強度や皮膚厚みの改善、及びホルモン含有量の可能性を含めた様々な生物活性及び栄養価を示すことが報告されている。ＥＢＮの処理加工は、用途によって異なる場合がある。燕の巣の生物学的及び医学的機能を解明するために、継続的な調査が行われている。
【０００３】
現在、ＥＢＮは、ＥＢＮを水中で沸騰させることによってスープその他の飲み物の形で使用され、消費されている。このような状況では、ＥＢＮの分子は、身体が消化吸収するのが困難な大きな生体高分子である。そのため、このような方法で製造されたＥＢＮの有益な成分の生物学的利用能は低く、ＥＢＮの有益な効果は最大化されない。
【０００４】
しかし、ＥＢＮ全体を摂取すると、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）仲介アナフィラキシーが引き起こされる可能性があり（Ｇｏｈ外，２００１，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．，１０７（６），１０８２−１０８８）、ＥＢＮは、子供の生命を脅かす可能性のある食物誘発性アナフィラキシー症状の最も一般的な原因であると考えられている。
【０００５】
粗ＥＢＮの別の問題は、自然の原因又は処理中に意図的に添加された望ましくない化合物が存在することである。ＥＢＮの不純物混和は一般的に行われており、ＥＢＮの品質が低下する。使用される不純混和物としては、豚皮、寒天、紅藻、カラヤゴムが挙げられる。不純混和物や廃棄物をカモフラージュするために、漂白剤が添加される場合が多い。
【０００６】
特に懸念されるのは、主にアナツバメの糞便に由来する亜硝酸塩の存在である。処理中に亜硝酸塩を白色の燕の巣に添加して、商業的により価値のある赤色の燕の巣に変えることもできる。過剰な亜硝酸塩の摂取は癌に関連する（Ｂｒｙａｎ外，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０１２，５０（１０），３６４６−３６５４）。
【０００７】
ウイルス、細菌類、真菌類は、処理中に野生又は工場においてＥＢＮを汚染する可能性がある。野鳥の鳥インフルエンザに関する懸念から、ＥＢＮ全体の輸入が制限される可能性がある。
【０００８】
したがって、品質全体及び消費者にとって有益な特性を改善するために、ＥＢＮの処理を改善する必要がある。ＥＢＮから望ましい化合物を抽出及び分離することによって、ＥＢＮの治療効果を最大化しつつ、有害な影響を回避又は最小化できる。
【０００９】
さらに、オプソニン、補体タンパク質、レクチン、フィコリン、コレクチン、ペントラキシンなどの生体活性分子は、主として動物の部分又はバイオリアクターでクローン化された遺伝子組み換え微生物から抽出される。抽出された製品の純度、収量及び安全の面で一貫する基準が欠如している。ここで説明するプロセスは、食用の燕の巣（ＥＢＮ）又はハスマ及びサンゴ・海藻を含有するＥＢＮ混合物が非常に豊富で、かつ、このような生物活性因子の豊富な供給源であるため、安全性及び持続可能性の課題を解決する。
【００１０】
本明細書における明確な先行技術文献のリスト又は議論は、必ずしもその文献が技術常識の一部である又は一般的な知識であることの承認として解釈されるべきではない。
【００１１】
本明細書で参照される任意の文献は、その全体が参照により本明細書において援用される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｇｏｈ外，２００１，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．，１０７（６），１０８２−１０８８
【非特許文献２】Ｂｒｙａｎ外，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０１２，５０（１０），３６４６−３６５４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の概要
本発明の第１の態様では、食用の燕の巣から抽出物を製造する方法であって、食用の燕の巣（ＥＢＮ）混合物を製造し、前記混合物と抽出溶液とを接触させて前記混合物中の分子を結合させることを含み、前記抽出溶液は、オプソニン結合部分、補体タンパク質結合部分、レクチン結合部分、フィコリン結合部分、コレクチン結合部分、及びペントラキシン結合部分よりなる群から選択される少なくとも１種の結合部分を含む方法が提供される。
【００１４】
用語「接触」とは、互いに相互作用するＥＢＮ混合物及び抽出溶液の成分をいい、好ましくは、この相互作用は、結合部分と標的分子との可逆的な結合の形成をもたらす。
【００１５】
用語「結合部分」とは、目的の分子を選択的に標的にしかつ結合する任意の分子及び／又は官能基をいう。例えば、オプソニン結合部分は、オプソニン分子に結合する任意の分子である。好適な結合部分の例としては、抗体、抗体フラグメント、抗体ミメティック、受容体を有する細胞、及び受容体の結合機能を模倣する分子を挙げることができる。例えば、「レクチン結合部分」は、細胞表面にレクチン結合受容体を発現する細胞などとすることができる。別の例では、「レクチン結合部分」としては、レクチンに結合する抗体、又は抗体、抗体フラグメント、又は抗体ミメティックなどのレクチン（抗原）結合部位が挙げられる。結合部分は、好ましくは、マイクロモル以下の範囲のＫDで分子に結合すべきである。例えば、結合部分は、１０-4未満、１０-5、１０-6、１０-7、１０-8、１０-9、１０-10、１０-11、１０-12以下のＫDで分子に結合できる。ＫD値が低いほど、結合親和性は強い。抽出溶液の結合部分は、好ましくは、別の非標的分子への結合に対する親和性よりも少なくとも２倍、１０倍、５０倍、１００倍又はそれ以上の親和性でその標的に結合できる。
【００１６】
使用される結合部分は、天然型、半合成又は合成のものとすることができ、例えば、ＥＢＮ混合物からの結合部分の分離を容易にすることができるタグ化結合部分を使用することができる。さらに、標的分子を抽出するために使用される結合部分は、固体支持体に結合されていてもよい。固体支持体は、強磁性材料又は従来の不活性支持体材料製であることができる。結合部分は市販のものであってもよく、そのまま使用してもよい。結合部分の修飾を望む場合には、文献において一般に知られているように、修飾して所望の特性を得る多くの方法が存在する。
【００１７】
図９は、所望の受容体を有する細胞がどのように生成されるかを示す。図９のパネル（ａ）では、全てのｍＲＮＡを目的の受容体を正常に発現する細胞から抽出し、二本鎖ｃＤＮＡに逆転写している。このｃＤＮＡの全ポピュレーションを、プラスミド発現ベクターの転写の強力なプロモーターとターミネーターとの間に挿入する。プラスミドを、目的の受容体を正常に発現しない細菌細胞にトランスフェクトする。得られたｃＤＮＡライブラリーをプールに分割し、各プールには約１０００の異なるｃＤＮＡが含有される。図９のパネル（ｂ）は、各プール中のプラスミドが、目的の受容体を欠失する培養細胞（例えばＣＯＳ細胞）の集団にトランスフェクトされていることをさらに示す。所望の受容体をコードするｃＤＮＡを含有するトランスフェクト細胞のみがそれを合成する。他のトランスフェクト細胞は無関係なタンパク質を産生する。所望の受容体を産生する少数の細胞を検出するために、受容体に対して特異的な放射性標識リガンドを、トランスフェクト細胞を含む培養皿に添加する。細胞を固定し、オートラジオグラフィーを行う。この特異的受容体を合成する陽性細胞を、多くの粒子で被覆する。あるいは、トランスフェクト細胞を蛍光標識リガンドで処理し、蛍光活性化セルソーターに通すことができる。この受容体を発現する細胞は蛍光標識に結合し、結合しない細胞から分離される。陽性シグナルを生じさせるプラスミドｃＤＮＡプールを細菌内で維持し、より小さなプールに細分化し、そのそれぞれを培養細胞へのトランスフェクションによって再スクリーニングする。陽性ｃＤＮＡプールのスクリーニング及び細分化を数サイクル行った後に、所望の受容体をコードする純粋なｃＤＮＡクローンが得られる。詳細な方法は、Ａ．Ａｒｕｆｆｏ及びＢ．Ｓｅｅｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ＣＤ２８  ｃＤＮＡ  ｂｙ  ａ  ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＣＯＳ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８７，８４，８５７３；及びＡ．Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，Ｈ．Ｆ．Ｌｏｄｉｓｈ，及びＧ．Ｗｏｎｇ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｃｅｌｌ，１９８９，Ｖｏｌ．５７，２７７に記載されており、これらの文献は両方とも参照により本明細書において援用される。次に、純粋なｃＤＮＡクローンを使用して、目的の所望の受容体を有する細胞を生じさせることができる。
【００１８】
ｃＤＮＡとは、相補的ＤＮＡをいい、所望のコーディングポリヌクレオチド、例えば、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子をいう。用語「相補的」とは、相補的領域全体にわたって特定された他のものとワトソン及びクリック塩基対を形成することができるポリヌクレオチドの配列をいう。相補的塩基は、一般に、Ａ及びＴ（Ａ及びＵ）、又はＣ及びＧである。所望のコーディングポリヌクレオチドは、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する配列を含む。
【００１９】
一例では、結合部分は、発現系におけるｃＤＮＡの発現によって産生されるタンパク質とすることができる。発現系の一般的な例としては、細胞ベースの系と無細胞系が挙げられる。細胞ベースの系としては、細菌、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞及び糸状菌に由来するものが挙げられる。細菌発現系の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。真核生物系の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどの酵母、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｍｙｃｅｌｉｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅなどの糸状菌、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞由来のＳｆ９及びＳｆ２１などのバキュロウイルスに感染した昆虫細胞及びそれらに感染していない昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞などの哺乳類細胞が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の無細胞生産は、細胞及び／又は細胞ベースの発現系から合成により得ることができる、精製されたＲＮＡポリメラーゼ、リボソーム、ｔＲＮＡ、及びリボヌクレオチドを使用して試験管内で実施することもできる。これらの異なる発現系にはそれぞれ独自の利点があり、発現系の選択はタンパク質の性質と使用目的に部分的に依存する。例えば、タンパク質の翻訳後修飾が必要な場合には、一般的に真核生物系の方がよい選択である。複数の細胞を発現系で使用してタンパク質を産生することも可能な場合がある。多くの場合、発現系は、発現されたタンパク質の精製を容易にするためにタンパク質に付着したアフィニティータグを含む。これらのアフィニティータグは、例えば固体支持体に固定化された特定のパートナーリガンドと特異的に結合するため、アフィニティータグとタンパク質構築物との分離が可能になる。発現されたタンパク質は、アフィニティータグを使用して、又はアフィニティータグを切断して所望のタンパク質を脱離させることによって単離できる。非限定的な例としては、Ｈｉｓタグ及びＳｔｒｅｐタグが挙げられる。Ｈｉｓタグはニッケルやコバルトなどの２価の金属イオンに強く結合するのに対し、Ｓｔｒｅｐタグは操作されたストレプトアビジンに特異的に結合する。必要に応じて、他の精製方法も利用できる。
【００２０】
抗体を使用する場合には、抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体を含めた様々な形態で存在することができる。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、線状抗体、一本鎖（ｓｃＦｖ）抗体、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）が挙げられる。これらの結合部分を生成する方法は、任意の適切な方法によって行うことができる。抗体を取得する方法の一つは、適切な宿主動物を免疫原で免疫化し、ポリクローナル又はモノクローナル抗体産生の標準的な手順に従うことである。免疫原は、細胞表面上での免疫原の提示を容易にする。適切な宿主の免疫化は多数の方法で実施できる。ポリペプチド又はその免疫原性フラグメントをコードする核酸配列を、宿主の免疫細胞によって取り込まれる送達ビヒクル中で宿主に提供することができる。次に、細胞は細胞表面上に受容体を発現し、宿主内において免疫原性応答を生じさせる。あるいは、ポリペプチドをコードする核酸配列又はその免疫原性表面を試験管内において細胞内で発現させることができ、その後、ポリペプチドを単離し、抗体を産生する適切な宿主にポリペプチドを投与することができる。あるいは、ポリペプチドに対する抗体を抗体ファージディスプレイライブラリーから誘導することができる。バクテリオファージは細菌内で感染及び再生することができ、ヒト抗体遺伝子と組み合わさると、ヒト抗体タンパク質を提示するように操作することができる。ファージディスプレイは、ファージがヒト抗体タンパク質をその表面上に「表示」させるプロセスである。ヒト抗体遺伝子ライブラリーからの遺伝子をファージの集団に挿入する。各ファージは異なる抗体に対する遺伝子を保持するため、その表面に異なる抗体を表示する。
【００２１】
当該技術分野で知られている任意の方法によって作製された抗体を宿主からさらに精製することができる。抗体精製法としては、塩析沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、及び、例えば、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、ヒドロキシアパタイト及び抗免疫グロブリンを用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
【００２２】
抗体は、抗体を発現するように操作されたハイブリドーマ細胞から産生することが便利な場合がある。ハイブリドーマを作製する方法は当該技術分野において周知である。ハイブリドーマ細胞は適切な培地で培養することができ、使用済み培地を抗体源として使用することができる。続いて、目的の抗体をコードするポリヌクレオチドを、抗体を産生するハイブリドーマから得ることができ、その後、抗体をこれらのＤＮＡ配列から合成によって又は組換えによって産生できる。大量の抗体を産生するためには、一般的に腹水液を得る方が便利である。腹水液を生じさせる方法は、一般に、ハイブリドーマ細胞を免疫学的にナイーブな組織適合性又は免疫耐性の哺乳動物、特にマウスに注射することを含む。哺乳動物は、適切な組成物（例えば、プリスタン）の事前投与によってすぐに腹水液製造に使えるようにしておくことができる。
【００２３】
用語「抗体ミメティック」又は「抗体模倣物」とは、抗原に特異的に結合するが、ただし抗体とは構造的に関連しない分子を意味する。典型的には、標的に特異的に結合する抗体ミメティックは、変異誘発された分子骨格のライブラリーをスクリーニングすることによって生成される。分子骨格の例としては、フィブロネクチンＩＩＩ（ＦＮ３）ドメインが挙げられるが、これに限定されない。分子骨格は、典型的には、抗体よりも小分子である（例えば約５０〜２００残基）。抗体ミメティックの例としては、アフィボディ、アフィリン、アフィチン、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、クニッツドメイン由来ペプチド、ノッチン、及びモノボディが挙げられるが、これらに限定されない。モノボディは、分子骨格としてフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）を含む。モノボディは、ファージディスプレイ及び酵母表面ディスプレイ技術を利用することによって、高度に調整されたアミノ酸の混合物を使用してＦＮ３骨格の一部が多様化されたコンビナトリアルライブラリーから生成される。
【００２４】
本発明において、用語「レクチン」とは、炭水化物結合タンパク質のことであり、フィコリン及びコレクチンは除外される。用語「オプソニン」とは、食作用を増強する任意の化合物又は分子をいうが、ただし、補体タンパク質、レクチン、フィコリン、コレクチン、及びペントラキシンを除くものとする。
【００２５】
好ましくは、混合物は、海藻及び／又はハスマをさらに含む。ハスマ（ハシマ）は、アカガエルの卵管付近の乾燥脂肪組織から作られる。海藻又は大型藻類とは、巨視的で多細胞の海藻のいくつかの種をいい、食用のもののみが含まれる。使用できる一般的な食用海藻としては、紅藻、褐藻及び緑藻が挙げられる。
【００２６】
好ましくは、オプソニン結合部分は、約１０ｋＤａ〜約７５０ｋＤａの分子量を有する。一例では、オプソニン結合部分は、配列番号１を含む。
【００２７】
好ましくは、補体タンパク質結合部分は、約２０ｋＤａ〜約７０００ｋＤａの分子量を有する。補体タンパク質結合部分の例としては、約５０ｋＤａ〜約７０００ｋＤａの分子量のもの、及び約２０ｋＤａ〜約１０００ｋＤａの分子量のものが挙げられる。一例では、補体タンパク質結合部分は、配列番号２を含む。
【００２８】
好ましくは、レクチン結合部分は、約２０ｋＤａ〜約１０００ｋＤａの分子量を有する。一例では、レクチン結合部分は、配列番号３を含む。
【００２９】
好ましくは、フィコリン結合部分は、約１５ｋＤａ〜約９００ｋＤａの分子量を有する。一例では、フィコリン結合部分は、配列番号４を含む。
【００３０】
好ましくは、コレクチン結合部分は、約１５ｋＤａ〜約９００ｋＤａの分子量を有する。一例では、コレクチン結合部分は、配列番号５を含む。
【００３１】
好ましくは、ペントラキシン結合部分は、約２０ｋＤａ〜約１０００ｋＤａの分子量を有する。一例では、ペントラキシン結合部分は、配列番号６を含む。
【００３２】
好ましくは、結合部分は受容体タンパク質である。一例では、受容体タンパク質は細胞に固定されており、又は精製された形態で単離できる。上記結合部分の分子量とは、受容体タンパク質の分子量をいう。
【００３３】
好ましくは、少なくとも１種の結合部分は、以下のものから選択されるいずれか１種を含む：
（ｉ）レクチン結合部分及びオプソニン結合部分；
（ｉｉ）レクチン結合部分、補体タンパク質結合部分、オプソニン結合部分、フィコリン結合部分、コレクチン結合部分、及びペントラキシン結合部分；
（ｉｉｉ）レクチン結合部分、補体タンパク質結合部分、及びオプソニン結合部分；
（ｉｖ）オプソニン結合部分、及びペントラキシン結合部分；
（ｖ）フィコリン結合部分、コレクチン結合部分、及びペントラキシン結合部分；
（ｖｉ）補体タンパク質結合部分、フィコリン結合部分、及びコレクチン結合部分；及び
（ｖｉｉ）レクチン結合部分、オプソニン結合部分、及びコレクチン結合部分。
【００３４】
より好ましくは、少なくとも１種の結合部分は、以下のものから選択されるいずれか１種を含む：
（ｉ）レクチン結合部分を５０％〜９０％及びオプソニン結合部分を１０％〜５０％；
（ｉｉ）レクチン結合部分を１０％〜３０％、補体タンパク質結合部分を１０％〜３０％、オプソニン結合部分を１０％〜３０％、フィコリン結合部分を５％〜１５％、コレクチン結合部分を５％〜１５％、及びペントラキシン結合部分を１０％〜３０％；
（ｉｉｉ）レクチン結合部分を５％〜４５％、補体タンパク質結合部分を３５％〜６５％、及びオプソニン結合部分を５％〜４５％；
（ｉｖ）オプソニン結合部分を１０％〜９０％、及びペントラキシン結合部分を１０％〜９０％；
（ｖ）フィコリン結合部分を３０％〜５０％、コレクチン結合部分を１０％〜５０％、及びペントラキシン結合部分を１０％〜５０％；
（ｖｉ）補体タンパク質結合部分を５５％〜８５％、フィコリン結合部分を５％〜１５％、及びコレクチン結合部分を１０％〜３０％；並びに
（ｖｉｉ）レクチン結合部分を５％〜１５％、オプソニン結合部分を１０％〜３０％、及びコレクチン結合部分を５５％〜８５％。各結合部分について与えたパーセンテージは、存在する結合部分の総重量に対する各結合部分の重量パーセントである。したがって、結合部分は、水又は緩衝液のような溶媒に溶解できるが、上記パーセンテージは、存在する結合部分／部分に関するものである。
【００３５】
好ましくは、少なくとも１種の結合部分は、以下ものから選択されるいずれか１種を含む：
（ｉ）結合部分の７０％レクチン及び結合部分の３０％オプソニン；
（ｉｉ）結合部分の２０％レクチン、結合部分の２０％補体タンパク質、結合部分の２０％オプソニン、結合部分の２０％ペントラキシン、結合部分の１０％フィコリン、及び結合部分の１０％コレクチン；
（ｉｉｉ）結合部分の５０％補体タンパク質、結合部分の２５％レクチン、及び結合部分の２５％オプソニン；
（ｉｖ）結合部分の５０％オプソニン及び結合部分の５０％ペントラキシン；
（ｖ）結合部分の４０％フィコリン、結合部分の３０％コレクチン及び結合部分の３０％ペントラキシン；
（ｖｉ）結合部分の１０％フィコリン、結合部分の２０％コレクチン及び結合部分の７０％補体タンパク質；並びに
（ｖｉｉ）結合部分の７０％コレクチン、結合部分の２０％オプソニン、及び結合部分の１０％レクチン。
【００３６】
好ましくは、ＥＢＮ混合物を製造する工程は、混合物を洗浄し、及び洗浄された混合物を濾過することを含む。
【００３７】
より好ましくは、洗浄工程は、混合物を第１酵素溶液に暴露し、混合物及び第１酵素溶液を水に浸漬することを含む。例えば、暴露工程は周囲温度で約５分間行い、浸漬工程はさらに５分間行う。周囲温度又は室温とは、２０〜３０℃の範囲の温度をいう。さらに好ましくは、第１酵素溶液は亜硝酸レダクターゼを含む。一実施形態では、水は逆浸透プロセスから得られる。より好ましくは、洗浄工程は、混合物を酸素化水中で約１０分間洗浄すること、続いて７０℃で約１２時間にわたる乾燥期間を含む。
【００３８】
好ましくは、ＥＢＮ混合物を製造する工程は、接触工程の前に、特に混合物を洗浄した後に、混合物を油に浸漬することを含む。油は食用油、つまり植物油のように食用に適した油でなければならない。油の存在は、混合物が油に取り囲まれて結合部分と標的分子との親和性を高めることを確保することによって、接触工程を容易にすることができる。油の存在は、混合物をより脂質許容性にし、細胞膜、主に脂質構造に関連することが多い標的分子との相溶性を高めると考えられる。
【００３９】
好ましくは、ＥＢＮ混合物を製造する工程は、接触工程の前に、任意に１２１℃で少なくとも１０分間、例えば約１０〜２０分間にわたって、洗浄されたＥＢＮ又はＥＢＮ混合物を滅菌することを含む。
【００４０】
好ましくは、接触工程は、アスコルビン酸及び金ナノ粒子の存在下で実施される。アスコルビン酸は抗酸化特性を付与するのに対し、金ナノ粒子は安定な非反応性環境を付与する。アスコルビン酸と金のナノ粒子は、個別に又は組み合わせて、標的分子への変化を最小限に抑えて又はまったく変化させずに、抽出物混合物の完全性を維持及び保存する。
【００４１】
好ましくは、接触工程は、４℃〜３７℃の間で少なくとも２０分間実施される。例えば、接触工程は、２５℃〜３７℃で約２０〜１２０分間実施される。
【００４２】
好ましくは、この方法は、結合分子を酸性溶液で加水分解することをさらに含む。
【００４３】
好ましくは、分子を単離する工程は、混合物から少なくとも１種の結合部分及び結合分子を分離し、結合分子を脱離させ、及び脱離した分子を透析によって取得することを含む。
【００４４】
好ましくは、この方法は、透析された分子を、植物プロテアーゼ及び／又は果実プロテアーゼを含む第２酵素溶液で処理することをさらに含む。
【００４５】
好ましくは、この方法は、以下の条件のうちの少なくとも１つを含む：
（ａ）第２酵素溶液の濃度は約１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである；及び
（ｂ）単離された分子の第２酵素溶液による処理は、４５℃で６０分間、ｐＨ６．５〜９．０で実施され、第２酵素溶液、すなわち第２酵素溶液中の酵素のみを変性させ、標的分子は変性させない。
【００４６】
好ましくは、この方法は、分子を乾燥させることをさらに含む。乾燥は、分子を単離した後に行う必要があり、典型的には、分子の品質及び特性を保存するために凍結乾燥によって実施される。
【００４７】
本発明の第２の態様では、第１の態様の方法から得られる燕の巣抽出物が提供される。一実施形態では、燕の巣抽出物は、海藻及び／又はハスマからの抽出物をさらに含むことができる。
【００４８】
本発明の第３の態様では、オプソニン、補体タンパク質、レクチン、フィコリン、コレクチン、及びペントラキシンよりなる少なくとも２つの群から選択される複数の分子を含む燕の巣抽出物が提供される。一実施形態では、燕の巣抽出物は、海藻及び／又はハスマからの抽出物をさらに含むことができる。
【００４９】
好ましくは、複数の分子は、以下のものから選択されるいずれか１種である：
（ｉ）レクチン及びオプソニン；
（ｉｉ）レクチン、補体タンパク質、オプソニン、フィコリン、コレクチン、及びペントラキシン；
（ｉｉｉ）レクチン、補体タンパク質、及びオプソニン；
（ｉｖ）オプソニン及びペントラキシン；
（ｖ）フィコリン、コレクチン、及びペントラキシン；
（ｖｉ）補体タンパク質、フィコリン、及びコレクチン；並びに
（ｖｉｉ）レクチン、オプソニン、及びコレクチン。
【００５０】
より好ましくは、複数の分子は、以下ものから選択されるいずれか１種である：
（ｉ）レクチンを５０％〜９０％、及びオプソニンを１０％〜５０％；
（ｉｉ）レクチンを１０％〜３０％、補体タンパク質を１０％〜３０％、オプソニンを１０％〜３０％、フィコリンを５％〜１５％、コレクチンを５％〜１５％、及びペントラキシンを１０％〜３０％；
（ｉｉｉ）レクチンを５％〜４５％、補体タンパク質を３５％〜６５％、及びオプソニンを５％〜４５％；
（ｉｖ）オプソニンを１０％〜９０％、及びペントラキシンを１０％〜９０％；
（ｖ）フィコリンを３０％〜５０％、コレクチンを１０％〜５０％、及びペントラキシンを１０％〜５０％；
（ｖｉ）補体タンパク質を５５％〜８５％、フィコリンを５％〜１５％、及びコレクチンを１０％〜３０％；並びに
（ｖｉｉ）レクチンを５％〜１５％、オプソニンを１０％〜３０％、及びコレクチンを５５％〜８５％。
各タイプの分子について与えたパーセンテージは、存在するタイプの分子の総重量に対する各タイプの分子の重量パーセントである。
【００５１】
より好ましくは、複数の分子は、以下のものから選択されるいずれか１種である：
（ｉ）レクチン７０％、及びオプソニン３０％；
（ｉｉ）レクチン２０％、補体タンパク質２０％、オプソニン２０％、フィコリン１０％、コレクチン１０％、及びペントラキシン２０％；
（ｉｉｉ）レクチン２５％、補体タンパク質５０％、及びオプソニン２５％；
（ｉｖ）オプソニン５０％、及びペントラキシン５０％；
（ｖ）フィコリン４０％、コレクチン３０％、及びペントラキシン３０％； 
（ｖｉ）補体タンパク質７０％、フィコリン１０％、及びコレクチン２０％；並びに
（ｖｉｉ）レクチン１０％、オプソニン２０％、及びコレクチン７０％。
【００５２】
好ましくは、燕の巣抽出物は、酸性溶液及び／又は酵素溶液での処理によって加水分解される。これにより、抽出された分子がより小さな分子に分解され、体に吸収されやすくなる。一例では、加水分解された生成物は、分子量が１０００ダルトン、７５０ダルトン、５００ダルトン、又は３００ダルトン未満のペプチド及び／又は遊離アミノ酸を含む。
【００５３】
好ましくは、燕の巣抽出物は、マルトデキストリンをさらに含む。
【００５４】
第２及び第３の態様に係る燕の巣抽出物と、薬学的に許容されるキャリア、賦形剤又は希釈剤とを含む組成物を提供することができる。本明細書で使用するときに、「薬学的に許容されるキャリア」には、生理学的に適合性のある全ての溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。
【００５５】
好ましい薬学的に許容されるキャリアは、水性キャリア又は希釈剤を含む。本発明の医薬組成物に使用することができる適切な水性キャリアの例としては、水、緩衝水及び生理食塩水が挙げられる。他のキャリアの例としては、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤の使用、分散液の場合に必要な粒度の維持、及び界面活性剤の使用によって維持できる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、又は塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。
【００５６】
好ましくは、組成物又は配合物は、有効成分の１日用量又は１日単位、１日副用量又はその適切な画分を含む単位用量である。本発明の組成物は、通常、経口又は任意の非経口経路によって、免疫学的濃縮物を含む医薬組成物の形態で、任意に非毒性有機若しくは無機酸又は有機若しくは無機塩基、付加塩の形態で、薬学的に許容される剤形で投与できる。治療を受ける状態、障害及び患者並びに投与経路に応じて、組成物は様々な用量で投与できる。
【００５７】
ヒトの治療の際に、本発明の免疫学的濃縮物／抽出物又は組成物は、単独で投与できるが、一般に、目的の投与経路及び標準的な製薬慣行に関して選択される好適な医薬賦形剤、希釈剤又はキャリアと混合して投与される。これらのものは、経口（錠剤及びカプセルによって）又は非経口的に、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、脳室内、幹内、頭蓋内、筋肉内又は皮下に投与でき、あるいは注入技術によって投与できる。これらのものは、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩又はグルコースを含有することができる滅菌水溶液の状態で最もよく使用される。水溶液は、必要に応じて適切に緩衝化する必要がある（好ましくはｐＨ３〜９）。無菌条件下での適切な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な医薬技術によって容易に達成される。
【００５８】
非経口投与に好適な組成物又は配合物としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び配合物を目的の患者の血液と等張にすることができる溶質を含むことができる水性及び非水性滅菌懸濁液と、懸濁剤及び増粘剤を含むことができる水性及び非水性滅菌懸濁液とが挙げられる。また、これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などの補助剤を含むこともできる。微生物の存在の予防は、上記の滅菌手順と、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることとの両方によって確保できる。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含めることも望ましい場合がある。さらに、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を含有させることによって、注射可能な剤形の長期吸収が可能になる。治療用組成物は、典型的には、製造及び保管の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に好適な他の規則構造として処方できる。
【００５９】
配合物を単位用量又は複数用量の容器、例えば密封されたアンプル及びバイアルで与えることができ、そして無菌液体キャリア、例えば注射用水を添加することのみを必要とする凍結乾燥（高減圧凍結乾燥）状態で使用直前に保存できる。即時注射溶液及び懸濁液は、上記の種類の無菌の粉末、顆粒及び錠剤から調製できる。
【００６０】
ヒト患者への経口及び非経口投与について、本発明の化合物の１日用量レベルは、通常、１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇである。したがって、例えば、本発明の化合物の錠剤又はカプセルは、必要に応じて、一度に単独で又は２回以上投与するための活性化合物の用量を含むことができる。いずれにせよ、医師は個々の患者に最も適した実際の用量を決定するが、これは特定の患者の年齢、体重、応答によって異なる。上記の用量は、平均的な場合の例示である。もちろん、個別の場合には、これよりも多い又は少ない用量範囲にメリットがあり、このような範囲は本発明の範囲内にある。
【００６１】
あるいは、本発明の組成物は、坐剤又はペッサリーの形態で投与でき、又はローション、溶液、クリーム、軟膏又はダスティングパウダーの形態で局所的に適用できる。また、本発明の組成物、特に燕の巣抽出物は、例えば、皮膚パッチの使用によって経皮投与することもできる。また、これらのものは、特に眼の疾患を治療するために、眼経路によっても投与できる。皮膚に局所的に適用するために、本発明の化合物は、例えば、鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレンコンパウンド、乳化ワックス及び水のうちの１種以上との混合物に懸濁又は溶解された活性化合物を含む適切な軟膏として処方できる。あるいは、これらのものは、例えば、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、液体パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水のうちの１種以上の混合物に懸濁又は溶解された適切なローション又はクリームとして処方できる。
【００６２】
一般に、ヒトでは、本発明の組成物の経口又は局所投与が好ましい経路であり、最も便利である。患者が嚥下障害又は経口投与後の薬物吸収障害に苦しんでいる状況では、薬物は非経口的、例えば舌下、頬側、経粘膜又は経皮的手段で投与できる。
【００６３】
一実施形態では、第２及び第３の態様に係る燕の巣抽出物は、栄養補助食品又は健康補助食品として消費できる。例えば、対象の免疫系を調節するのに使用するための栄養補助食品は、本発明の第２又は第３の態様に係る燕の巣抽出物を含む栄養補助食品である。抽出物は、粉末として消費することや、他の食品又は飲料と組み合わせて消費することもできる。
【００６４】
本発明の第４の態様では、第２及び第３の態様の燕の巣抽出物は、内科的治療又は医薬品の製造において使用できる。
【００６５】
好ましくは、燕の巣抽出物は、デングウイルスの複製を阻害するために使用でき、又は対象の免疫系を調節するために使用でき、又はインターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）のリン酸化を誘導するために使用できる。対象は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトとすることができる。より好ましくは、免疫系の調節は、炎症性サイトカインの産生を誘導すること、又はＮＦ−ｋＢ経路及び／又はＭＡＰＫ経路を誘導することによって行う。デングウイルス複製を阻害するとは、好ましくは、デングウイルスの少なくとも５０％が複製するのを阻害し、デングウイルスの少なくとも６０％が複製するのを阻害し、デングウイルスの少なくとも７０％が複製するのを阻害し、デングウイルスの少なくとも８０％が複製するのを阻害し、デングウイルスの少なくとも９０％が複製するのを阻害し、デングウイルスの少なくとも９５％が複製するのを阻害し、又はデングウイルスの本質的に１００％が複製するのを阻害することである。
【００６６】
あるいは、燕の巣抽出物は、デングウイルス複製を阻害する方法、又は対象の免疫系を調節する方法、又はインターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）のリン酸化を誘導する方法で使用でき、この方法は、第２及び第３の態様の燕の巣抽出物を特に生物学的に有効な量で対象に投与することを含む。
【００６７】
上記方法は、海藻及び／又はハスマを含んでいてよい燕の巣の抽出物の製造を可能にし、これは、天然の燕の巣と比較して化合物が豊富である。さらに、この方法は抽出された生成物を加水分解して、消費後に純度が高くかつ生物学的利用能が高い化合物を供給する。抽出される化合物は、抽出溶液を変更することによって、異なる目的のために変更可能である。この方法で単離された製品は、作用部位への生物活性分子の効果的かつ迅速な送達を可能にするために、様々な態様及び方法で使用者に送達されやすい。燕の巣抽出物は、免疫力を高める効果と抗ウイルス特性とを提供することができ、かつ、栄養補助食品又は健康製品として消費できる。これらの製品は、低コストの医薬品有効成分（ＡＮＩ）の供給源であるが、医薬品有効成分（ＡＰＩ）の高い効能を備える。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は燕の巣から濃縮物を製造する方法のフローチャートを示す。
【図２】図２は、燕の巣抽出物（Ｅ１）の１０％混合物がマクロファージにおけるデングウイルス（ＤＶ１）の複製の阻害に及ぼす影響を示す。ＤＶ１マイナス鎖（ＤＶ１ｎｅｇ）ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＴアッセイを、ＤＶ１感染の７２時間後に行った。ＧＡＰＤＨはローディングコントロールとして機能した。
【図３】図３は、燕の巣抽出物（Ｅ２）の１０％混合物がマクロファージに及ぼす影響を示す。この図は、Ｅ２がマクロファージにおいてＩＦＮ−β及び他の炎症性サイトカインの産生を誘発できることを示す。パネルＡ〜Ｅは、Ｅ２と、ポジティブコントロールとして２株（０１１１：Ｂ４及び０５５：Ｂ５）のポリ（Ｉ：Ｃ）及びＬＰＳとで処理した後のマクロファージのｑＰＣＲ結果を示す。ボックスは、Ｅ２による様々なサイトカイン遺伝子発現の誘導を強調するものである。
【図４】図４は、ＥＢＮ誘導マクロファージのウエスタンブロット分析を示す。パネルＡは、ネガティブコントロール（ＳＦ）の１０％混合物のレーンにｐＩＲＦ３バンドが存在しないことを示す。パネルＢは、燕の巣抽出物（Ｅ３）の１０％混合物のレーンにｐＩＲＦ３バンドが存在することを示す。
【図５】図５は、パネルＡ及びＢにおいて、それぞれＮＦｋＢ経路とＭＡＰＫ経路で食用燕の巣抽出物（Ｅ４）の５０％混合物及びネガティブコントロール（ＳＦ）の５０％混合物誘導マクロファージのウエスタンブロット分析を示す。
【図６】図６は、４時間の時点での食用燕の巣抽出物（Ｅ５）の１０％混合物誘導Ｂリンパ球におけるサイトカインの相対的発現を示す。パネルＡはＩＦＮβ、パネルＢはＩＬ−１０、パネルＣはＴＮＦα、パネルＤはＩＬ−６、パネルＥはＩＬ−１２を示す。
【図７】図７は、サイトカイン産生についてＢ細胞に及ぼす用量依存的影響を示す。一晩で集めた食用燕の巣抽出物（Ｅ６）の１０％及び５０％混合物誘導Ｂリンパ球におけるサイトカインの相対的発現を示す。パネルＡはＩＦＮβ、パネルＢはＩＬ−１０、パネルＣはＴＮＦα、パネルＤはＩＬ−６、パネルＥはＩＬ−１２を示す。
【図８】図８は、食用燕の巣抽出物（Ｅ７）で処理した後のＢリンパ球のｑＰＣＲ結果を示す。アクチンを、全ての遺伝子発現が正規化された内因性コントロールとして使用した。標的遺伝子の発現を、ポジティブコントロールとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びＬＰＳ（０１１１：Ｂ４）を含む培地と比較した。
【図９】図９は、プラスミド発現クローニングによる、所望の細胞表面受容体をコードするｃＤＮＡの同定及び単離を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
詳細な説明
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者によって一般的に理解される意味を有する。
【００７０】
「約」、「おおよそ」、「実質的に」という用語は、本願全体の文脈を参照して読む必要があり、このような用語で修飾された特定の専門用語が当該分野において通常有する意味を考慮しなければならない。例えば、特定のパラメータ、機能、効果、又は結果は、特定の許容範囲内で実行又は取得でき、関連する技術分野の当業者は、このような用語の許容範囲を取得する方法を知っていると解される。
【００７１】
以下の説明では、本発明の様々な例示実施形態の完全な理解を与えるために、多数の特定の詳細な説明が示されている。しかしながら、当業者であれば、本発明の実施形態は、これらの特定の詳細な説明の一部又は全部なしで実施できることが分かるであろう。なお、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とするものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。図面において、同様の符号は、いくつかの図面全体にわたって同一又は類似の機能又は特徴を指す。
【００７２】
ヒトの免疫系は、外来生物から身体を保護し、自然免疫系及び適応免疫系を含む。自然免疫系は感染に対する即時の防御を与えるのに対し、適応免疫系は特定の外来生物に対する長期的な免疫を付与する。Ｐａｒｋｉｎ及びＣｏｈｅｎ（Ｌａｎｃｅｔ  ２００１，３５７，１７７７−１７８９）には、人体における免疫系及び主要成分の概要が提供されている。
【００７３】
自然免疫系の主な機能としては、サイトカインなどの化学的因子の産生を介して感染部位に免疫細胞を動員し、外来生物の除去を促進すること；補体カスケードの活性化；及び適応免疫システムの活性化が挙げられる。
【００７４】
オプソニンは、食作用を増強する任意の分子であり、抗体、補体タンパク質、及び循環タンパク質（例えば、ペントラキシン、コレクチン、及びフィコリン）を包含する。オプソニンは、典型的には免疫応答の抗原をマークし、又はリサイクルのために死細胞をマークする。全てではないにしても、ほとんどの細胞膜は非ゼロの膜電位を維持し、２個の細胞が一緒になるのを困難にする。オプソニンは、一般に、その標的細胞に結合することによって機能し、食作用を増強する。すなわち、オプソニンはリンカーとして機能する。補体系は免疫系の一部であり、抗体及び食細胞が微生物及び損傷した細胞を生物から取り除くことのできる能力を高める。補体系は、不活性な前駆体として血中を循環し、生化学的経路によって活性化される多数の補体タンパク質を含む。ペントラキシン、コレクチン、及びフィコリンは、可溶性の自然免疫パターン認識タンパク質であり、死滅しつつある細胞の表面上で非自己又は変化した自己の分子パターンを識別し、マクロファージ及び他の食細胞によってプログラム細胞死（アポトーシスなど）及び死滅しつつある細胞と細胞物質とのクリアランスを促進する。上で定義したように、本発明の文脈における「オプソニン」という用語は、補体タンパク質、レクチン、フィコリン、コレクチン及びペントラキシンを除外する。
【００７５】
レクチンは炭水化物結合タンパク質であり、細胞レベル及び分子レベルで認識を実行する。動物レクチンのうち、Ｃ型レクチンが最も豊富であり、セレクチン、コレクチン、エンドサイトーシスレクチンの３つの主要なファミリーに分類される。コレクチンは、呼吸器ウイルス及び病原菌のパターン認識に関与していると考えられている。例としては、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）などのコラーゲンレクチン、肺サーファクタントＳＰ−Ａ及びＳＰ−Ｄ、コングルチニンなどが挙げられる。ＭＢＰは、細菌及び真菌の細胞表面オリゴ糖のオリゴマンノース残基に結合できる保護コレクチンの例である。また、ＭＢＰは、古典的な及び別の補体経路を活性化することもできる。別の内因性コレクチンはマンノース受容体であり、マクロファージ及び樹状細胞表面上で発現し、細菌を認識して結合することができる。上で定義したように、本発明の文脈における「レクチン」という用語は、フィコリン及びコレクチンを除外する、すなわち、フィコリン及びコレクチン以外のレクチンである。
【００７６】
図１は、目的の生物活性分子を食用燕の巣（ＥＢＮ）から抽出及び分離する方法を示す：
（ａ）ＥＢＮを洗浄して汚染物質を除去する；
（ｂ）洗浄したＥＢＮを粉砕し、メッシュを通して篩い分けする；
（ｃ）ＥＢＮ粉末を水中に入れてＥＢＮ混合物を得る；ハスマ及び／又は海藻を必要に応じて洗浄し、ＥＢＮ混合物に添加してもよい；
（ｄ）ＥＢＮ又はＥＢＮ混合物を滅菌する；
（ｅ）ＥＢＮ又はＥＢＮ混合物を油に浸す；
（ｆ）ＥＢＮ混合物を少なくとも１種の結合部分を含む抽出溶液で処理し、結合部分は、オプソニン結合部分、補体タンパク質結合部分、レクチン結合部分、フィコリン結合部分、コレクチン結合部分、及びペントラキシン結合部分よりなる群から選択される；
（ｇ）結合した分子を酸性溶液で部分的に加水分解する；
（ｈ）結合部分と生物活性分子とをＥＢＮ混合物から分離する；
（ｉ）高分子量のペプチドの添加により結合分子を脱離させる；
（ｊ）脱離された生物活性分子を透析によって取得する；
（ｋ）透析から単離された画分を第２酵素溶液で処理して、生物活性分子をさらに分解する；
（ｌ）第２酵素溶液の酵素を変性除去する；
（ｍ）単離された画分を乾燥させて固体生成物を得る。
【００７７】
上記の特定の手順は、省略したり、別の順序で実行したりすることができる。例えば、工程（ａ）〜（ｅ）は、個別に又は組み合わせて、抽出溶液で処理する（又は接触させる）ためのＥＢＮ混合物を調製する工程とみなすことができる。標的分子の加水分解は、それらの生物学的効果を最大化するのに有益である。プロセスの時間及び温度を変更して、酵素、結合部分、及び抽出される生物活性分子に応じて最適なパラメータを決定することができる。
【００７８】
粗ＥＢＮ（１個は約１０〜５０ｇ）を水に浸すことによって洗浄して、亜硝酸塩、ダニその他の汚染物質を除去する。除去される他の汚染物質としては、重金属、漂白剤、及び汚れを含めた他の微細な破片を挙げることができる。
【００７９】
亜硝酸塩を除去するために効果的な方法は、果物、植物及び土壌由来の亜硝酸レダクターゼ酵素を含む溶液を使用することである。さらに、溶液は、亜硝酸塩を生成する付随する任意の細菌を不活化するための別の酵素を含有していてもよい。ダニを除去するために、特別なフルーツプロテイナーゼを含む溶液を使用する。このような例としては、パパイヤ（パパイン）、キウイフルーツ（アクチニジン）、パイナップル（ブロメライン）、イチジク（フィシン）などからの当該任意のプロテアーゼが挙げられる。これらのプロテアーゼは、細菌の不活化を可能にする任意の適切な濃度で使用できる。
【００８０】
ＥＢＮ混合物を、室温から４０℃まで少なくとも５分間にわたって各酵素溶液で順次処理した。得られたＥＢＮの酵素溶液懸濁液をナノバブリングすると、分解された細胞破片が水面に浮き上がり、そこで簡単に除去できる。続いて、酵素溶液を固体ＥＢＮから除去する。固体ＥＢＮをさらに洗浄して、いかなる残留酵素や汚染物質も除去することができる。洗浄したＥＢＮを好ましくは７０℃で１２時間乾燥させて余分な水分を除去する。
【００８１】
洗浄したＥＢＮを粉砕し、メッシュを通して篩いにかける。メッシュのサイズは、残留する大きな不純物を除去するのに十分である必要があり、好ましくは２００〜７００μｍのサイズにする必要がある。最も好ましくは、メッシュサイズは６００μｍである。
【００８２】
ＥＢＮ粉末を、水中、好ましくは蒸留水又は脱イオン水中に５℃で５時間配置する。適切な濃度は、１０００ｍＬの水中において２５ｇのＥＢＮである。必要に応じて、混合物を１２１℃で１０〜２０分間さらに滅菌することができる。ハスマ及び／又は海藻も上記のように洗浄し、ＥＢＮとの混合物に浸すことができる。あるいは、ハスマ及び／又は海藻を別々に調製し、ＥＢＮ混合物に添加することができる。続いて、ＥＢＮ混合物を油に浸漬して、結合部分と生物活性分子との相互作用及び親和性の増強を通じて、結合部分による後の処理において結合を増強する。
【００８３】
ＥＢＮ混合物を、４〜３７℃の温度範囲で少なくとも２０分間にわたって少なくとも１種の結合部分を含む水溶液で処理する。２５〜３７℃の温度では、２０〜１２０分で十分であるが、それよりも低い温度で一晩、より長く保持することができる。４℃の温度で、抗体とＥＢＮとの混合物を少なくとも９時間保持する。一般に、温度が低いほど、結合部分溶液が標的化合物に完全に結合するのに必要な時間が長くなる。結合部分は、オプソニン結合部分、補体タンパク質結合部分、レクチン結合部分、フィコリン結合部分、コレクチン結合部分、及びペントラキシン結合部分よりなる群から選択される。一実施形態では、ＥＢＮ混合物と結合部分との接触又は混合工程は、アスコルビン酸及び／又は金ナノ粒子の存在下で実施される。アスコルビン酸は、抗酸化特性を付与し、例えば活性酸素種からの生物活性分子の分解を防止又は最小化する。金ナノ粒子は、標的分子と結合部分との結合を強化する安定かつ非反応性の環境を付与する。抽出溶液中に存在する少なくとも１種の結合部分は、標的分子に結合し、結合した分子をＥＢＮ混合物から抽出するのを可能にする。
【００８４】
結合部分の例
オプソニン結合部分タンパク質の例は、肺サーファクタントタンパク質Ｄの推定オプソニン受容体であるＧＰ−３４０である。このタンパク質は、分子量２６０．７９ｋＤａの以下の配列（配列番号１）を有する：
2021521276.tif 000003
【００８５】
補体タンパク質結合部分タンパク質の例は、補体受容体２型アイソフォーム１前駆体［ホモサピエンス］である。このタンパク質は、分子量が１１９．１８ｋＤａの次の配列（配列番号２）を有する。
2021521276.tif 000004
【００８６】
レクチン結合部分タンパク質の例は、ｃキラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＢメンバー１である。このタンパク質は、分子量２５．４２ｋＤａの以下の配列（配列番号３）を有する。
2021521276.tif 000005
【００８７】
フィコリン結合部分タンパク質の例は、分子量３５．０８ｋＤａの以下の配列（配列番号４）を有する。
2021521276.tif 000006
【００８８】
コレクチン結合部分タンパク質の例は、コレクチン−１２である。このタンパク質は、分子量８１．５３ｋＤａの以下の配列（配列番号５）を有する。
2021521276.tif 000007
【００８９】
ペントラキシン結合部分タンパク質の例は、ニューロンのペントラキシン受容体（ホモサピエンス）である。このタンパク質は、分子量５２．８６ｋＤａの以下の配列（配列番号６）を有する。
2021521276.tif 000008
【００９０】
上記の結合部分と共に使用することができる好適な抽出溶液の例としては、次のものが挙げられる：
抽出溶液１：レクチン結合部分を５０％〜９０％及びオプソニン結合部分を１０％〜５０％；
抽出溶液２：レクチン結合部分を１０％〜３０％、補体タンパク質結合部分を１０％〜３０％、オプソニン結合部分を１０％〜３０％、フィコリン結合部分を５％〜１５％、コレクチン結合部分を５％〜１５％、及びペントラキシン結合部分を１０％〜３０％；
抽出溶液３：レクチン結合部分を５％〜４５％、補体タンパク質結合部分を３５％〜６５％、及びオプソニン結合部分を５％〜４５％；
抽出溶液４：オプソニン結合部分を１０％〜９０％、及びペントラキシン結合部分を１０％〜９０％；
抽出溶液５：フィコリン結合部分を３０％〜５０％、コレクチン結合部分を１０％〜５０％、及びペントラキシン結合部分を１０％〜５０％；
抽出溶液６：補体タンパク質結合部分を５５％〜８５％、フィコリン結合部分を５％〜１５％、及びコレクチン結合部分を１０％〜３０％；及び
抽出溶液７：レクチン結合部分を５％〜１５％、オプソニン結合部分を１０％〜３０％、及びコレクチン結合部分を５５％〜８５％；
抽出溶液８：レクチン結合部分を７０％及びオプソニン結合部分を３０％；
抽出溶液９：レクチン結合部分を２０％、補体タンパク質結合部分を２０％、オプソニン結合部分を２０％、フィコリン結合部分を１０％、コレクチン結合部分を１０％、及びペントラキシン結合部分を２０％；
抽出溶液１０：レクチン結合部分を２５％、補体タンパク質結合部分を５０％、及びオプソニン結合部分を２５％；
抽出溶液１１：オプソニン結合部分を５０％、及びペントラキシン結合部分を５０％；
抽出溶液１２：フィコリン結合部分を４０％、コレクチン結合部分を３０％、及びペントラキシン結合部分を３０％；
抽出溶液１３：補体タンパク質結合部分を７０％、フィコリン結合部分を１０％、及びコレクチン結合部分を２０％；及び
抽出溶液１４：レクチン結合部分を１０％、オプソニン結合部分を２０％、及びコレクチン結合部分を７０％。
【００９１】
各結合部分について与えられるパーセンテージは、存在する結合部分の総重量に対する各結合部分の重量パーセントである。１種以上の結合部分は、任意の適切な溶媒に溶解でき、又は混合物として使用できる。溶媒の例としては、水及び緩衝液が挙げられる。
【００９２】
接触又は混合工程の後に、混合物をホモジナイザーでホモジナイズし、酸性溶液で処理し、１００℃に加熱して、標的化合物の部分的な加水分解を生じさせる。酸は、好ましくは食用の酸、例えばアスコルビン酸、クエン酸、リンゴ酸、酢酸、酒石酸、フマル酸、及び乳酸である。混合物を室温にまで冷却し、ｐＨ７に中和する。
【００９３】
加水分解後に、少なくとも１種の結合部分及び結合分子を、一般的に知られている方法のうち任意のものによって混合物から分離できる。これらの方法のいくつかとしては、物理化学的分画、クラス特異的親和性、及び抗原特異的親和性が挙げられる。物理化学的分画としては、抗体のサイズ、電荷その他の共有化学的特性に基づく免疫グロブリンの示差沈殿、サイズ排除又は固相結合が挙げられる。クラス特異的親和性としては、免疫グロブリンに対して特異的な親和性を有する固定化生物学的リガンドによる特定の抗体クラス（例えば、ＩｇＧ）の固相結合が挙げられる。抗原特異的親和性としては、特定の抗原を使用して、特定の抗原結合ドメインを介して抗体を精製することが挙げられる。
【００９４】
結合した化合物は、より大きな過剰ペプチドを添加することによって、少なくとも１種の結合部分から脱離される。例えば、より大きなペプチドの最小分子量は５０ｋＤａであり、天然のグリコサミノグリカンや他のタンパク質が挙げられる。
【００９５】
続いて、脱離された化合物は、透析バッグを使用することによって、添加されたペプチド、酵素、及び少なくとも１種の結合部分から単離される。
【００９６】
あるいは、ＥＢＮ含有混合物を、異なる結合部分を含む抽出溶液で連続的に処理し、分離して、所望の化合物を順次抽出することができる。これにより、ＥＢＮ、海藻、ハスマの最適な使用が確保され、無駄がなくなる。
【００９７】
単離／濃縮された化合物は、植物性及び／又は食品プロテアーゼを用いて、４５℃で１時間、ｐＨ６．５〜９．０でさらに加水分解することができる。使用する酵素の濃度は、効果的な加水分解のために少なくとも１０μｇ／ｍＬ、好ましくは１００μｇ／ｍＬまでにする必要がある。好適な酵素の例としては、トウモロコシ及びトウモロコシ粒末端プロテアーゼが挙げられる。続いて、混合物を７０℃で５分間加熱することによって酵素を変性させる。酵素は５５℃を超える温度で沈殿するため、混合物を、５５℃を超える温度でろ過して、ろ液溶液として目的の化合物を得ることができる。
【００９８】
所望の化合物の溶液を乾燥させて、化合物を粉末として得る。好ましくは、化合物を凍結乾燥又は噴霧乾燥によって乾燥させる。凍結乾燥は、液体窒素又はドライアイスで溶液を−１８０℃〜−７０℃の温度に冷却し、凍結した混合物を真空にして氷を昇華させることによって実施される。必要に応じて凍結乾燥を繰り返して、乾燥粉末製品を得ることができる。
【００９９】
上記のプロセスにより得られた燕の巣の濃縮物又は抽出物は、上記のプロセスにより抽出された生物活性分子を含む。いくつかの実施形態では、生物活性分子は分解されていている可能性があり、特徴付けることが困難な場合がある。いくつかの実施形態では、生物活性分子は、大部分が無傷であってよい。
【０１００】
このように、燕の巣抽出物は、次の群：オプソニン、補体タンパク質、レクチン、フィコリン、コレクチン、及びペントラキシンの少なくとも２種から選択される複数の分子を含む。燕の巣抽出物は、ハスマ及び／又は海藻からの抽出物をさらに含むことができる。
【０１０１】
一実施形態では、燕の巣抽出物は、以下のものから選択されるいずれか１種を含む：
（ｉ）レクチン及びオプソニン；
（ｉｉ）レクチン、補体タンパク質、オプソニン、フィコリン、コレクチン、及びペントラキシン；
（ｉｉｉ）レクチン、補体タンパク質、及びオプソニン；
（ｉｖ）オプソニン及びペントラキシン；
（ｖ）フィコリン、コレクチン、及びペントラキシン；
（ｖｉ）補体タンパク質、フィコリン、及びコレクチン；並びに
（ｖｉｉ）レクチン、オプソニン、及びコレクチン。
【０１０２】
特に、燕の巣抽出物は、以下のものから選択されるいずれか１種を含む：
（ｉ）レクチンを５０％〜９０％、及びオプソニンを１０％〜５０％；
（ｉｉ）レクチンを１０％〜３０％、補体タンパク質を１０％〜３０％、オプソニンを１０％〜３０％、フィコリンを５％〜１５％、コレクチンを５％〜１５％、及びペントラキシンを１０％〜３０％；
（ｉｉｉ）レクチンを５％〜４５％、補体タンパク質を３５％〜６５％、及びオプソニンを５％〜４５％；
（ｉｖ）オプソニンを１０％〜９０％、及びペントラキシンを１０％〜９０％；
（ｖ）フィコリンを３０％〜５０％、コレクチンを１０％〜５０％、及びペントラキシンを１０％〜５０％；
（ｖｉ）補体タンパク質を５５％〜８５％、フィコリンを５％〜１５％、及びコレクチンを１０％〜３０％；
（ｖｉｉ）レクチンを５％〜１５％、オプソニンを１０％〜３０％、及びコレクチンを５５％〜８５％。
与えられたパーセンテージは、存在する生物活性分子を総重量に対する特定の生物活性分子の重量パーセントである。
【０１０３】
次の燕の巣抽出物１〜７を、それぞれ抽出溶液８〜１４を使用して上記のプロセスに基づいて製造した。これらの抽出物は、これらの例を包含する範囲の抽出物が持つ特性を反映するものである。
抽出物１はＥＢＮを使用して製造され、レクチンを７０％及びオプソニンを３０％含む；
抽出物２はＥＢＮ、ハスマ、海藻を使用して製造され、レクチンを２０％、補体タンパク質を２０％、オプソニンを２０％、フィコリンを１０％、コレクチンを１０％、ペントラキシンを２０％含む；
抽出物３はＥＢＮ及び海藻を使用して製造され、レクチンを２５％、補体タンパク質を５０％、及びオプソニンを２５％含む；
抽出物４はＥＢＮ及び海藻を使用して製造され、オプソニンを５０％及びペントラキシンを５０％含む；
抽出物５はＥＢＮを使用して製造され、フィコリンを４０％、コレクチンを３０％、及びペントラキシンを３０％含む；
抽出物６はＥＢＮ及びハスマを使用して製造され、補体タンパク質を７０％、フィコリンを１０％、及びコレクチンを２０％含む；
抽出物７はＥＢＮ及びハスマを使用して製造され、レクチンを１０％、オプソニンを２０％、コレクチンを７０％含む。
【０１０４】
乾燥した粉末製品と他の添加物とを混合して、食品又は医薬品を得ることができる。あるいは、生成物を他の添加剤と共に水に溶解することができる。
【０１０５】
乾燥した製品を、次のような様々な配合でマルトデキストリンと混合することができる：
１．７５％のＥＢＮ／ＥＢＮ混合物濃縮物／抽出物及び２５％のマルトデキストリン；
２．５０％のＥＢＮ／ＥＢＮ混合物濃縮物／抽出物及び４５％のマルトデキストリン；
３．５０％のＥＢＮ／ＥＢＮ混合物濃縮物／抽出物及び５０％のマルトデキストリン；
４．３０％のＥＢＮ／ＥＢＮ混合物濃縮抽出物及び７０％のマルトデキストリン。
【０１０６】
この製品は、ＥＢＮ濃縮物／抽出物製品とマルトデキストリンとを含むことが分かる。好ましくは、３０〜７５重量％のＥＢＮ濃縮物／抽出物及び２５〜７０重量％のマルトデキストリンを含む。
【０１０７】
これらの生物活性分子の生物学的利用能は、それらの高い水溶性のために一般に非常に貧弱である。皮膚及び関節への局所適用を介した一般的な投与経路又は経口投与は、皮膚又は腸の疎水性膜を通る透過性が低いために妨げられる。生物活性分子が体内の必要な部位に到達して所望の効果を発揮することは困難である。他の投与方法も利用できるが、一般的に医療専門家なしで投与するのには適していない。酸加水分解及び／又は酵素的加水分解による部分的な生物活性分子の加水分解は、分子をより吸収しやすい化合物に分解して抽出物をより有益なものにするのに有益であることが実証できる。
【０１０８】
特に好適な配合物によって、それぞれの独自の免疫学的濃縮物を、痛み及び炎症の部位に効果的かつ有用な用量で送達することができる。
【０１０９】
脂質形態で配合されると、本発明の濃縮物／抽出物を使用して、経皮性でかつ安全で持続可能な生物活性分子から構成され、天然物であるがただしＥＢＮ／ＥＢＮ混合物のリサイクル粉の豊富な供給物から精製／抽出された、市場で最初の経済的な製品を生産することができる。
【０１１０】
抽出物１〜７（Ｅ１〜Ｅ７）を、試験管内でマクロファージ／Ｂ細胞の細胞培養で試験して、１型ＩＦＮの産生、サイトカイン産生、及びデングウイルス複製に及ぼすそれらの影響を決定した。本願において、マクロファージ／Ｂ細胞とは、マウス大腿骨の骨髄前駆細胞に由来する分化した初代マクロファージ／Ｂ細胞をいう。これらの特徴の全ては、試験管内でのマクロファージ／Ｂ細胞の防御免疫応答について一般的に使用される指標である。
【実施例】
【０１１１】
生物学的アッセイの方法及び結果
１．細胞培養及びデングウイルス複製アッセイの方法
骨髄由来のマクロファージ培養
骨髄細胞を、培養液を大腿骨及び脛骨に注入することによって得た。１０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離することによって、全ての細胞をスピンダウンした。赤血球を除去するために、細胞を氷上でインキュベートすることによって１ｍｌの赤血球溶解緩衝液で５分間処理した。細胞を１０ｍｌの培地で洗浄し、１０００ｒｐｍで５分間４℃で遠心分離することによって収集した。血球計算盤を使用して骨髄細胞をカウントし、１０ｍｌのＭＣＳＦ含有培地を含む１０ｃｍ培養プレート上で１０6個の細胞を６日間分化させた。
【０１１２】
マクロファージのデングウイルス感染
デング１型ウイルス（シンガポール株Ｓ２７５／９０、Ｄ１）をＣ６／３６細胞内で増殖させた。骨髄由来マクロファージ（３×１０6）を６ウェル組織培養プレート（ＮＵＮＣ）の各ウェルに播種した。一晩のインキュベーション後、マクロファージを感染多重度（ＭＯＩ）１で２日間Ｄ１に感染させた。マイナス鎖Ｄ１ＲＮＡを検出するために、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＤ１感染細胞から全ＲＮＡを抽出した。１μｇの全ＲＮＡをプライマー５’−ＧＴＧＣＴＧＣＣＴＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣ−３’で逆転写し、その後、プライマー対５’−ＡＧＡＡＣＣＴＧＴＴＧＡＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣ−３’及び５’−ＣＡＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＣＧＣＡＴＧＧ−３でＰＣＲフラグメントを合成するためのテンプレートとして使用した。逆転写酵素ＰＣＲによるＧＡＰＤＨの検出のために、オリゴｄＴプライマーを用いて上記全ＲＮＡから細胞ｃＤＮＡを合成した。ＧＡＰＤＨフラグメントを、それぞれマウスＧＡＰＤＨ、５’−ＧＡＣＡＡＣＴＴＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＧＡＡ−３’及び５’−ＣＣＡＧＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＴＧＡＣＡ−３’のプライマーを使用して合成した。
【０１１３】
図２を参照すると、上記のアッセイにおいて抽出物１（Ｅ１）で処理されたマクロファージの中央レーンは、白いバンドが存在しないこと又は弱く存在することを示しているが、これは、抽出物１がマクロファージにおいてデングウイルスの複製を制限していることを示す。これは、デングウイルスの複製を制御する手段として使用できる。
【０１１４】
２．細胞培養、リアルタイム遺伝子発現定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）の方法
骨髄由来のマクロファージ培養
骨髄細胞を、培養液を大腿骨及び脛骨に注入することによって得た。１０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離することによって、全ての細胞をスピンダウンした。赤血球を除去するために、細胞を氷上でインキュベートすることによって１ｍｌの赤血球溶解緩衝液で５分間処理した。細胞を１０ｍｌの培地で洗浄し、１０００ｒｐｍで５分間４℃で遠心分離することによって収集した。血球計算盤を使用して骨髄細胞をカウントし、１０ｍｌのＭＣＳＦ含有培地を含む１０ｃｍ培養プレート上で１０6個の細胞を６日間分化させた。
【０１１５】
定量的リアルタイムＰＣＲ
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳ）の６ウェルプレートに２×１０6個細胞／ｍｌの骨髄マクロファージを播種した。細胞を５０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、ＵＳ）、１μｇ／ｍｌのＬＰＳ  ０１１１：Ｂ４（ＬＰＳ  ０１１１：Ｂ４から精製）及び１μｇ／ｍｌのＬＰＳ  ０５５：Ｂ５（Ｓｉｇｍａ、ＵＳ）で２時間刺激してから、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳ）を使用してＲＮＡ抽出した。１μｇのｃＤＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳ）を使用して、製造元のプロトコルに従って全ＲＮＡから合成した。ｑＰＣＲを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ６ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステムでサイトカイン特異的プライマーを使用して実施した。
【０１１６】
図３を参照すると、ポジティブコントロールがＩＦＮβ、ＴＮＦα、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、及びＩＬ−１２の産生を様々な程度にまで誘発していることが分かる。抽出物２（Ｅ２）は、マクロファージにおいてＩＦＮβ及び炎症性サイトカインの産生を誘発し、最も完全な免疫バランスのプラットフォームを提供し、それによって、主要な免疫分子を収集して様々な炎症誘発性及び抗炎症性分子のオーケストレーションに影響を与え、マクロファージだけでなく他の重要な細胞によっても現れる免疫系のバランスの取れた状態を実現できる。この免疫分子のシンフォニーは、微生物感染の予防のみならず癌の良好な管理の効果を高めると考えられる。抽出物２はおそらく抗デング熱特性も有する可能性がある。
【０１１７】
３．マクロファージにおけるＩＲＦ３のリン酸化
抽出物３（Ｅ３）をマクロファージに適用すると、図４のパネルＢに示すように、マクロファージにおいてＩＲＦ３のリン酸化が誘導される。ウエスタンブロット分析においてＥ３とマークされたレーンは、ポジティブコントロールのポリ（Ｉ：Ｃ）及びＬＰＳと同じＩＲＦ３のリン酸化を示す。図４のパネルＡは、ＳＦマークのレーンのネガティブコントロールを示す。活性化されたＩＲＦ３は、ＩＲＦ７との相互作用を通じて、抗癌及びウイルス予防特性の強化と関連する。様々な範囲のトリガー免疫ペプチドの採用により適切に調節されると、これは心筋梗塞後の心臓保護にもうまく利用できる可能性がある。
【０１１８】
ネガティブコントロール（ＳＦ）は、抽出プロセスを経ていない食用の燕の巣であり、食用の燕の巣を水に浸し、試験する抽出物と同じ質量濃度にすることで調製できる。ＳＦコントロールは、他のアッセイについても同様に調製できる。
【０１１９】
４．免疫細胞におけるＮＦ−ｋＢ及びＭＡＰＫ経路の誘導
抽出物４（Ｅ４）を免疫細胞に適用すると、図５に示すように、免疫細胞においてＮＦｋＢ及びＭＡＰＫ経路の誘導が誘発される。ウエスタンブロット分析では、抽出物４で処理した免疫細胞は、抽出物４でマークされたレーンに示されるようにｐ６５、ＪＮＫ、ＥＲＫ、及びｐ３８のリン酸化を誘導するのに対し、ネガティブコントロール（ＳＦレーン）のレーンはリン酸化バンドを示さないことが分かる。
【０１２０】
ＮＦ−ｋＢは、感染に対する免疫応答の調節に重要な役割を果たす。ＮＦ−ｋＢの不適切な調節は、癌、炎症性疾患及び自己免疫疾患、敗血症性ショック、ウイルス感染、及び不適切な免疫発達に関連している。ＮＦ−ｋＢは、シナプス可塑性及び記憶のプロセスにも関与する。
【０１２１】
ＭＡＰＫは、マイトジェン、浸透圧ストレス、熱ショック、炎症性サイトカインなどの様々な刺激に対する細胞応答を指向するのに関与する。これらのものは、増殖、遺伝子発現、分化、有糸分裂、細胞生存、及びアポトーシスを含めた細胞機能を調節する。
【０１２２】
抽出物４は、様々な形態のストレス、熱ショック、及び敗血症性ショックの管理の強化に使用できる。
【０１２３】
５．サイトカインを産生するためのＢ細胞の誘導
抽出物５（Ｅ５）は、図６に示すように、培養でＢ細胞にサイトカインを産生させる可能性がある。図６では、１０％の抽出物５（水溶液中の抽出物５の１０重量％）とマークされたレーンは、ネガティブコントロール（培地）及び１０％ＳＦ（ネガティブコントロール）と比較して、ＩＦＮβ、ＴＮＦα、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、及びＩＬ−１２産生の増加を示していることが分かる。ペントラキシンはＢ細胞と関連するが、フィコリン及びコレクチンは関連していない可能性がある。しかし、３つの異なるタイプの生物活性分子の存在は、様々なＢ細胞の幅広いプールを誘導して非常に多様なサイトカインを生成して、糖尿病、関節炎、多発性硬化症などの非常に困難な様々な慢性疾患にうまく対処する可能性がある。
【０１２４】
６．サイトカイン産生についてＢ細胞に及ぼす用量依存的効果
抽出物６（Ｅ６）は、Ｂ細胞に適用されると、図７に示すようにサイトカイン産生について、特にＩＦＮβ、ＩＬ−１０、及びＩＬ−６について、Ｂ細胞に及ぼす用量依存的効果を示す。ペントラキシンを補体タンパク質、すなわちＢ細胞と密接に関連していない可能性のある免疫ペプチドの組み合わせと置き換えることによって、サイトカイン産生についてＢ細胞に及ぼす用量依存的効果を達成することができる。これらの用量依存的で長期にわたる一晩の効果は、上記の抽出物５の代わりに抽出物６を使用して明らかになる可能性がある。その理論的根拠は、全てのフィコリン、コレクチン及び補体タンパク質が自然免疫の非液性アーム、すなわち自然免疫の初期段階の構成要素であり、それらの全体的な効果は、初期段階でカバーされた時間がより多く占める場合があるため、この組成物の操作期間のスパンが長くなるにつれてより持続可能になると考えられる。
【０１２５】
７．Ｂ細胞におけるＩＦＮβ、ＴＮＦα、及びＩＬ−６（ただしＩｌ−１０及びＩＬ−１２ではない）の選択的誘導
抽出物７（Ｅ７）は、Ｂ細胞に適用されると、図８に示すように、Ｂ細胞においてＩＦＮβ、ＴＮＦα、ＩＬ−６を選択的に誘導するが、ただしＩｌ−１０及びＩＬ−１２を誘導しない。ＩＦＮβ、ＴＮＦα、及びＩＬ−６の発現増加をボックスでマークして、抽出物７の有益な効果を示している。
【０１２６】
ＴＮＦの主な役割は免疫細胞の調節にある。内因性発熱物質であるＴＮＦは、発熱、アポトーシス細胞死、悪液質、炎症を誘発し、腫瘍形成及びウイルス複製を阻害し、ＩＬ１及びＩＬ６産生細胞を介して敗血症に応答することができる。
【０１２７】
インターフェロンベータ（ＩＦＮβ）は、脳内において炎症誘発因子及び抗炎症因子の発現のバランスを取り、血液脳関門を通過する炎症細胞の数を減らす。全体として、インターフェロンベータによる治療はニューロンの炎症の軽減につながる。さらに、神経成長因子の産生を増加させ、その結果、ニューロンの生存を改善するとも考えられている。
【０１２８】
インターロイキン６（ＩＬ−６）は、炎症誘発性サイトカイン及び抗炎症性ミオカインの両方として機能するインターロイキンである。インターロイキン６は、Ｔ細胞及びマクロファージから分泌されて免疫反応を刺激し、例えば感染中及び外傷後に、特に火傷その他の組織損傷が炎症を引き起こす。ＩＬ−６は感染と戦う役割を果たす。さらに、骨芽細胞はＩＬ−６を分泌して破骨細胞の形成を刺激する。多くの血管の中膜における平滑筋細胞も、炎症誘発性サイトカインとしてＩＬ−６を産生する。抗炎症性サイトカインとしてのＩＬ−６の役割は、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１に及ぼす阻害効果、及びＩＬ−１ｒａ及びＩＬ−１０の活性化によって仲介される。
【０１２９】
ＴＮＦ、ＩＦＮβ及びＩＬ−６は共に、極めて新規であるがバランスの取れた免疫調節プラットフォームを提供し、それによって炎症誘発性因子と抗炎症性因子との自己バランスが可能になる。免疫学的濃縮物中のオプソニン、レクチン、及びコレクチン（ただしこれらのものは関連のあるペプチドである）の存在の可能性を組み合わせるという新規性によって、Ｂ細胞がＴＮＦ、ＩＦＮβ及びＩＬ−６の発現を一緒に誘導する能力が得られた。バランスの取れた免疫調節プラットフォームが存在すれば、体重減少、筋萎縮、倦怠感、脱力感、食欲不振、骨量減少、さらには神経変性などの症状が緩和されると考えられる。健康でバランスの取れた免疫系の結果として、癌が発生する可能性も低くなると考えられる。
【０１３０】
説明したアッセイ及び結果から分かるように、燕の巣抽出物１〜７は、様々な免疫細胞を誘導して、炎症誘発性サイトカイン及び抗炎症性サイトカインの両方のサイトカインの産生を増加させることができる。これは、両方のタイプのサイトカインが体内に存在するサイトカインのバランスを取ってブーストされるため、免疫系を調節する。これにより、特定のサイトカインの過剰産生が防止される。
【０１３１】
燕の巣抽出物は、プロセス又は製品自体によって定義されているかどうかにかかわらず、栄養補助食品又は健康補助食品としての消費に好適である。このものは、所定の組成物における薬剤として使用できる可能性がある。
【０１３２】
本明細書に記載されたプロセスは、貴重な生物活性分子をＥＢＮから抽出することを可能にし、費用効果が高くかつ重要な免疫ブースター源を提供する。
【０１３３】
上記の説明において本発明の好ましい実施形態を記載してきたが、関連する技術分野における当業者であれば、本発明から逸脱することなく、上記詳細な説明において多くの設計変更や構造の変更を行うことができることが分かるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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