(57)【要約】  単純な技術を使用し、精製工程を最小限化することによる、重量パーセントとして測定される２０〜７０％のエイコサペンタエン酸を有するオイル組成物の製造方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
重量パーセントとして測定される約２０％から約７０％のＮ．Ｏｃｕｌａｔａ藻類のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を含む、オイル組成物を調製するためのプロセスであって、以下の工程：
ａ）Ｎ．Ｏｃｕｌａｔａ藻類由来の微細藻類バイオマスを提供する；
ｂ）細胞壁を破壊し、水相と有機相の混合物または有機相で処理することによって、工程ａの微細藻類バイオマスから脂質を抽出し、ＥＰＡを含む粗油抽出物を提供する；
ｃ）工程ｂの粗油抽出物をエステル交換条件に供し、それによってＥＰＡおよび他の脂肪酸をそれらの対応するエチルエステルにエステル交換し、それによって油相を提供する；
ｄ）重量パーセントとして測定される約２０％から約７０％のＥＰＡを含むオイル組成物を提供するために、漂白土での処理、脱ろう、および尿素での処理から選択される１つ以上の精製方法に供することによって工程ｃの油相を精製する；
あるいは
ｃ’）重量パーセントとして測定される約２０％から約７０％のＥＰＡを含むオイル組成物を提供するために、漂白土での処理、脱ろう、および尿素での処理から選択される１つ以上の精製方法に供することによって、工程ｂの油相を精製する；
ｄ’）工程ｃ’の粗油抽出物をエステル交換条件に供し、それによってＥＰＡおよび他の脂肪酸をそれらの対応するエチルエステルにエステル交換し、油相を提供する；および
ｅ’）任意選択的に、ＥＰＡエチルエステルを他の形態のＥＰＡに変換するために、オイル組成物をさらなる処理に供し、さらなるオイル組成物を提供する
工程を含む、プロセス。
【請求項２】
重量％として測定される約２０％から約７０％のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）が、エステル、塩、酸、モノグリセリド、ジグリセリドまたはトリグリセリド、またはそれらの混合物からなる群から選択される形態にある、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
重量パーセントとして測定される約２０％から約７０％のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）が、低級アルキルアルコールとのエステル、アミノ酸との塩、遊離酸、モノグリセリド、ジグリセリドまたはトリグリセリド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される形態にある、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
エステルがエチルエステルである、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
塩がリジンとの塩である、請求項３に記載のプロセス。
【請求項６】
工程ｂにおける処理が、水相と有機相との混合物を使用することによって行われる、請求項３から５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載のプロセスによって得ることができるオイル組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然形態または合成形態のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を約２０〜７０％含むエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）オイル組成物を提供するための、Ｎ．Ｏｃｕｌａｔａ（ナンノクロロプシス）に由来する藻類調製物の工業的プロセスの分野に関する。このようなオイル組成物は、食品サプリメントまたは化粧品を含む多くの目的に有用である。
【背景技術】
【０００２】
エイコサペンタノイン酸（ＥＰＡ）は、２０個の炭素原子および５個の二重結合を全てシス配置で含有する脂肪酸である。二重結合は５、８、１１、１４および１７位に位置し、正式な化学名はａｌｌ  ｃｉｓ−５、８、１１、１４、１７−エイコサペンタエン酸である。一般的な略語はＥＰＡである。
【０００３】
人体は必須脂肪酸であるα−リノレン酸からそれを合成する。その結果、ＥＰＡレベルを補充することがしばしば必要とされる。これは、油性魚のような食物源から直接ＥＰＡを受け取ることによって、またはＥＰＡを含むオイル組成物を含有する栄養補助食品によって達成することができる。
【０００４】
ＥＰＡは、リン脂質、トリグリセリド、ジグリセリドおよびモノグリセリド、アミド、エステル、または多くの他の異なるタイプ、塩および／または他の化合物の形態で天然源から入手可能である。それぞれの場合において、ＥＰＡ部分は通常、複合体分子から分離されて、遊離酸形態となり、次いで、場合によって、他の複合体分子に再度連結され得る。これは、ＥＰＡの合成形態を提供することを可能にする。
【０００５】
ＥＰＡを含むオイル組成物を含有する栄養補助食品は、魚、オキアミまたは藻類などの天然源から提供されてもよい。
【０００６】
魚およびオキアミは、このようなオイル組成物を得るために使用される。しかし、微細藻類は、脂質産生のための有望な代替供給源として認識されてきている。微細藻類のいくつかの種は、それらの培養培地の物理的および化学的特性の比較的単純な操作によって、特定の脂質および脂肪酸を産生するように誘導され得る。微細藻類はかなりの量の脂質（乾燥重量の約２０〜５０％）を産生し、蓄積することができる。微細藻類における脂質の蓄積は、細胞生成速度よりも速い速度での糖の消費に起因し、過剰な糖の脂質への変換を促進する。
【０００７】
さらに、藻類は、それらの速い成長速度、二酸化炭素消費、農業との非競合性、および海中での成長を含む多くの利点を組み合わせた結果として、バイオマス、オイル、および他の成分の持続可能な供給源であると考えられる。
【０００８】
脂肪酸、特にＥＰＡを得るのに利用される多くの藻類種の中で、Ｎ．Ｏｃｕｌａｔａはより多量のＥＰＡを産生し、特にドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を産生しないので、有利な種と考えられる。特に、Ｎ．Ｏｃｕｌａｔａによって産生される脂肪酸の３分の２以上は、ＥＰＡ、パルミチン酸およびパルミトレイン酸からなる。
【０００９】
上述の形態の１つでＥＰＡを含むオイル組成物を提供するために利用可能な多くの方法がある。これらの方法は、２つの主要な部分、すなわち藻類からのオイル抽出（通常は溶媒の助けによるオイル抽出）、および脱ガム、苛性中和、漂白、脱臭、脱ろうなどの方法の組み合わせによる粗油の精製を含む。魚油とは対照的に、藻油はかなりの量のクロロフィルを含有し、その除去は食品サプリメント、化粧品などでの使用に適したＥＰＡオイル組成物の提供に関連する重要な工程である。強化されたＥＰＡ含有量を有する最終生成物を提供するために、シリカクロマトグラフィーまたは尿素付加物の形成などの他の技術をさらに利用することができる。
【００１０】
国際公開第２０１４１０５５７６号は、高度に生体利用可能なＥＰＡ製剤を提供するための方法を開示する。それらの製剤において、ＥＰＡは、遊離脂肪酸または糖脂質、またはリン脂質コンジュゲートとして利用できる。そこに開示されるように、有機溶媒での抽出に供される藻類ペーストが提供される。非脂質有機物を除去する標準的な手順の後、遊離脂肪酸、ジグリセリドおよびトリグリセリドを含む中性脂質を抽出し、超臨界ＣＯ２を用いて極性脂質から分離する。次いで、この抽出物を加水分解にかけて遊離脂肪酸を得、次いでこれを分画してＥＰＡ遊離脂肪酸の濃縮物を生成する。この濃縮物は、その後の工程において、以前に単離された極性脂質と組み合わされて、特許出願の製剤を提供する。
【００１１】
あるいは、その特許出願が藻類ペーストをエタノールで抽出し、アルカン溶媒で処理し、その後、シリカゲル吸着剤からの溶出によって中性および極性脂質を分離する、上記のものと同様の方法を開示する。上記のように、中性脂質を加水分解し、シリカゲル吸着剤からさらに溶出する。
【００１２】
超臨界二酸化炭素およびシリカゲル吸着剤からの溶出の両方は、洗練された複雑な技術である。一方、ＥＰＡを含むオイル組成物は、重量パーセントとして測定される２０〜７０％でＥＰＡを含む場合、様々な目的に有益であり、有用であることが知られている。
【００１３】
従って、単純な技術を利用しつつも所望のＥＰＡ含量を有する最終生成物を提供する費用効率のよい方法によって、重量パーセントとして測定される２０〜７０％のＥＰＡを有するオイル組成物を製造するニーズがある。
【００１４】
（定義）
本明細書で使用される「ＥＰＡ」という用語は、ＥＰＡの天然形態または合成形態を意味する。これらの形態は、ＥＰＡのエステル、ＥＰＡの塩、モノグリセリド、ジグリセリドまたはトリグリセリドＥＰＡ、またはＥＰＡの遊離酸形態であり得る。ＥＰＡのエステルは、アルコール、特に低級アルキルアルコール、より具体的にはエチルエステルとのエステルであってもよい。ＥＰＡの塩は、アミノ酸、特にリジンとの塩であってもよい。ＥＰＡの塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩であってもよい。モノグリセリド、ジグリセリドまたはトリグリセリドＥＰＡは、場合によっては、１つ以上のＥＰＡ分子において、その３つの利用可能な位置のうちの１つ、２つ、またはすべてがエステル化されたグリセロール分子を意味する。
【００１５】
「ＥＰＡ」の好ましい形態は、ＥＰＡと低級アルキルアルコールとのエステル、アミノ酸との塩、ＥＰＡの遊離酸およびモノグリセリド、ジグリセリドまたはトリグリセリドＥＰＡである。より好ましくは、ＥＰＡとエチルアルコールとのエステルまたはリジンとの塩である。
【００１６】
「酸」とは、水素を含有し、水または溶媒中で解離して正の水素イオンを生成する任意の化合物、ならびにルイス酸（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、トリハロ酢酸（例えば、ＴＦＡ）、臭化水素、マレイン酸、トルエンスルホン酸およびショウノウスルホン酸などのスルホン酸、（Ｒ）−クロロプロピオン酸などのプロピオン酸、Ｎ−［（Ｒ）−１−（Ｌ−ナフチル）エチル］フタルアミン酸などのフタルアミン酸、Ｌ−酒石酸およびジベンジル−Ｌ−酒石酸などの酒石酸、乳酸、ショウノウ酸、アスパラギン酸、シトロネリック酸、ＢＣｌ３、ＢＢｒ３などの酸を含むが、これらに限定されない）を意味する。したがって、この用語は、エタン酸および硫化水素などの弱酸；メタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などの強有機酸などを含む。
【００１７】
「塩基」は本明細書中で使用される場合、水酸化物またはアルコキシド、水素化物、またはアミンおよびその誘導体のような化合物を含み、これらは、水または溶媒中でプロトンを受容する。したがって、例示的な塩基には、アルカリ金属水酸化物およびアルコキシド（すなわち、ＭＯＲ、ここで、Ｍがカリウム、リチウム、またはナトリウムなどのアルカリ金属であり、Ｒが上記で定義される水素またはアルキルであり、より好ましくはＲが直鎖又は分岐鎖Ｃ１−５アルキルであり、したがって、これらに限定されないが、水酸化カリウム、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、カリウムｔｅｒｔ−五酸化物、水酸化ナトリウム、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、水酸化リチウムなどを含む）；水酸化マグネシウム（Ｍｇ（ＯＨ）２）または水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）、水酸化バリウム（Ｂａ（ＯＨ）２）などの他の水酸化物；アルカリ金属水素化物（すなわち、ＭＨ、ここで、Ｍが上記で定義されるものであり、したがって、これらに限定されないが、ナトリウム、カリウム、および水素化リチウムを含む）；カリウムヘキサメチルジシラジド及びリチウムヘキサメチルジシラジドなどのアルキル化ジシラジド；炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）、重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）などの炭酸塩、テトラブチルアンモニウムヒドロキシド（ＴＢＡＨ）などのアルキルアンモニウム水酸化物などが含まれる。水性塩基としては、金属水酸化物、例えば、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどの第１族／第２族金属の水酸化物（例えば、水性ＬｉＯＨ、ＮａＯＨ、ＫＯＨなど）、アルキルアンモニウム水酸化物、および水性炭酸塩が含まれる。非水性塩基としては、アミンおよびそれらの誘導体、例えば、トリアルキルアミン（例えば、Ｅｔ３Ｎ、ジイソプロピルエチルアミンなど）、および芳香族アミン（例えば、Ｐｈ−ＮＨ２、ＰｈＮ（Ｍｅ）Ｈなど）；アルカリ金属アルコキシド；アルカリ金属水素化物；アルキル化ジシラジド；および非水性炭酸塩が含まれるが、これらに限定されない。
【００１８】
「脂質」という用語は、中性または極性脂質を意味する。極性脂質は、主に糖脂質およびリン脂質を含む。中性脂質は、主に脂肪酸、トリグリセリド、ジグリセリドを含む。エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）は、コンジュゲートされてもよく、それらの形態のいずれかの一部であってもよく、または遊離脂肪酸としてであってもよい。
【００１９】
「重量パーセント」という用語は、１００グラムの物質当たりのＥＰＡの量を意味する。それはガスクロマトグラフィーによって測定され、結果は％  ｗ／ｗアッセイ（そのまま）として提供される。
【００２０】
「純度」という用語は、ガスクロマトグラフィーで測定され、クロマトグラフィーで観察されたすべての化合物の総量に対する、クロマトグラフィーで観察された各脂肪酸エチルエステルの量を意味する。これは、試験される化合物の％純度として提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明はＮ．Ｏｃｕｌａｔａの微細藻類バイオマスを最小限の一連の工程で処理し、それによって重量パーセントとして測定される約２０％〜約７０％のＥＰＡを含むオイル組成物を提供するための方法を提供する。
【００２２】
本発明の第１の実施態様によれば、重量パーセントとして測定される約２０％〜約７０％のＮ．Ｏｃｕｌａｔａ藻類のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を含むオイル組成物を調製するためのプロセスであって、以下の工程を含むプロセスが提供される：
ａ）Ｎ．Ｏｃｕｌａｔａ藻類由来の微細藻類バイオマスを提供する；
ｂ）細胞壁を破壊し、水相と有機相の混合物または有機相で処理することによって工程ａの微細藻類バイオマスから脂質を抽出し、ＥＰＡを含む粗油抽出物を提供する；
ｃ）工程ｂの粗油抽出物をエステル交換条件に供し、それによってＥＰＡおよび他の脂肪酸をそれらの対応するエチルエステルにエステル交換し、それによって油相を提供する；
ｄ）重量パーセントとして測定される約２０％〜約７０％のＥＰＡを含むオイル組成物を提供するために、漂白土での処理、脱ろう、および尿素での処理から選択される１つ以上の精製方法に供することによって、工程ｃの油相を精製する；
あるいは
ｃ’）重量パーセントとして測定される約２０％〜約３５％のＥＰＡを含むオイル組成物を提供するために、漂白土での処理、脱ろう、尿素での処理から選択される１つ以上の精製方法に供することによって、工程ｂの油相を精製する；
ｄ’）工程ｃ’の粗油抽出物をエステル交換条件に供し、それによってＥＰＡおよび他の脂肪酸をそれらの対応するエチルエステルにエステル交換し、油相を提供する；
ｅ）任意選択的に、ＥＰＡエチルエステルを他の形態のＥＰＡに変換するために、オイル組成物をさらなる処理に供し、さらなるオイル組成物を提供する。
【００２３】
工程ａで提供されるＮ．Ｏｃｕｌａｔａの微細藻類バイオマスは、当技術分野で知られている標準的な技法に従って、フリーズドライ、凍結乾燥、または加工することができる。微細藻類バイオマスの有用な形態は、乾燥粉末の形態であり得る。
【００２４】
微細藻類バイオマスを乾燥させることは、さらなる加工を容易にするために有利である。乾燥は、主として無処置のバイオマスからの自由表面水分／水の除去、またはバイオマスの（例えば、微粉化による）均質化されたスラリーからの表面水の除去を意味する。場合によっては、バイオマスを乾燥させることにより、より効率的な微細藻類油抽出プロセスを促進することができる。微細藻類バイオマスは、当業者に公知の方法によって乾燥され得る。乾燥方法は、本発明の性能にとって重要ではない。
【００２５】
工程ｂで行われる微細藻類バイオマスからの脂質の抽出は細胞壁を破壊し、細胞残屑を有機相または水相と有機相との混合物で処理することによって達成される。
【００２６】
藻類細胞の細胞破壊のための多くの方法が当業者に周知であり、当技術分野で利用可能である。このような方法の例は、機械的プレス、超音波処理、マイクロ波照射、浸透圧ショック、ビーズビーティング、高圧ホモジナイズ、ブレンド（固体剪断破壊）、レーザー、酵素消化、溶媒の使用、および後者の方法のいずれかの組み合わせである。
【００２７】
細胞壁の破壊は、破壊された細胞を有機相または水相と有機相との混合物で処理することによって脂質の抽出を容易にする。水相は、塩化ナトリウムなどの無機塩の水溶液であってもよい。この目的に適した他の水相は、ＥＤＴＡのようなキレート剤またはキレート剤とＮａＣｌなどの無機塩との混合物を含有するものである。有機相は、１つの有機溶媒または有機溶媒の混合物を含み得る。藻類からの脂質抽出に使用される例示的な溶媒は、ジクロロメタン、クロロホルム、メタノール、イソプロパノール、エトキシエタン、アセトン、２−エトキシエタノール、エタノールである。
【００２８】
工程ｂは典型的には上記のように、細胞壁の破壊を行い、それらを有機相または水相と有機相との混合物と接触させることによって行われる。
【００２９】
工程ｂは、任意選択的に、抽出されたオイルをプロセス中の酸化から保護するための酸化防止剤の使用を含むことができる。この目的に適した酸化防止剤は、トコフェロール、ＢＨＴ（ブチル化ヒドロキシトルエン）、レシチン、オレガノ抽出物、ローズマリー抽出物、クエン酸および／またはアスコルビン酸である。
【００３０】
抽出された脂質画分は、バイオマスのタンパク質、炭水化物、鉱物および繊維の微量成分と共に、主に上記で定義されたような脂質を含む。
【００３１】
微細藻類バイオマスから脂質を抽出した後、混合物を、濾過および／または遠心分離などの標準的な手順にかけ、さらに１つまたは複数の水相で処理して、溶解していない固体および上記の他の微量成分を除去する。有機相の分離および有機溶媒の除去により粗油抽出物が提供される。
【００３２】
工程ｂで得られる粗油抽出物は脂質を含有し、この脂質は、他の化合物もありうるが、ＥＰＡを含むモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロールまたはトリアシルグリセロールの形態の脂肪酸、および遊離酸を含む。この混合物を工程ｃでエステル交換条件に供し、それによって遊離脂肪酸としてまたは上記で定義されたような他の形態で存在する全ての脂肪酸を、対応するエチルエステルに変換する。このような条件下で、ＥＰＡは、同様にその対応するエチルエステルに変換される。当業者に周知のエステル交換条件は、大過剰のエタノールの存在下、高温または室温で、触媒量の強塩基（例えば、水酸化ナトリウムもしくは水酸化カリウム、または任意の他のアルカリ金属水酸化物）での処理を含み得、これは、脂肪酸トリグリセリドの対応するエチルエステルへの変換を導く。エステル交換は、酸性触媒を用いても達成することができる。変換が完了すると、クエンチング、抽出、濾過および溶媒除去により油相が得られる。この工程で、エステル交換反応によって形成されたグリセロールも除去される。
【００３３】
工程ｃで得られた油相からの他の何らかの望ましくないオイル不純物、すなわち、クロロフィルおよび他の色素、リン脂質のような極性脂質、酸化副生成物、および他の望ましくない極性化合物の除去は、工程ｄで達成される。多価不飽和脂肪酸含量および不純物含量に関するオイルのタイプは、この技術の効率および使用される方法の脱色効率に影響する。
【００３４】
したがって、工程ｃで得られた油相は、漂白土での処理、脱ろう、および尿素での処理から選択される１つ以上の精製方法に供される。
【００３５】
漂白は、適切な漂白剤を用いて行われる。一般的な漂白剤は、天然の粘土または土、活性化された粘土または土および炭素である。オイルが容易に漂白可能である場合、天然の粘土が通常使用され；オイルが容易に漂白可能でない場合、酸活性化粘土が使用される。ベントナイト、セピオライト、アタパルジャイト、フラー土、モンモリロナイトは、オイル精製方法に使用される容易に入手可能な漂白剤である。
【００３６】
脱ろうまたは分画は、オイルがゼロ以下の温度にさらされる場合に、制御された結晶化の下で形成された固体の除去に関する技術である。特に各脂肪酸の不飽和度および特定の配置によって誘導される融点および溶解度の差は、多価不飽和脂肪酸中のオイルの精製または富化を可能にする。
【００３７】
尿素結晶化は、アルコール溶液中で尿素と飽和または一不飽和脂肪酸との間に形成される複合体に関する技術である。複合体は結晶化し、濾過によって除去されるが、遊離の非複合体化不飽和脂肪酸は可溶性のままであり、したがって、溶液は富化される。含有分画は、例えば融点、溶解度などの脂肪酸の物理的性質ではなく、脂肪酸の不飽和度に依存する。
【００３８】
あるいは、上記の精製方法のうちの１つ以上が使用される精製工程が、工程ｂの直後に実施され得、したがって工程ｃ’である。この場合、エステル交換工程、すなわちｄ’は、精製工程の直後に行われる。ステップｃまたはｄ’のエステル交換およびステップｄまたはｃ’での精製処理の後に、ガスクロマトグラフィー分析により重量パーセントで測定される約２０％から約７０％のエチルエステル形態のＥＰＡからなるオイル組成が提供される。
【００３９】
工程ｅは任意選択的であり、オイル組成物中に含まれるＥＰＡのエチルエステルを別の形態、例えば、他のエステル、モノグリセリド、ジグリセリドまたはトリグリセリド、塩、または遊離酸に変換するためのさらなる処理を含んでもよい。したがって、このさらなる処理を介してさらなるオイル組成物が提供され得る。これは、当業者に周知の標準的な方法を含み、グリセリドの別のエステルが所望される場合、アルコール、グリセロールまたはアミノ酸などの、カルボン酸基とエステル結合を形成することができる基を含む化合物の存在下での酸または塩基処理を含み得る。あるいは、それはＥＰＡまたはその遊離脂肪酸形態の塩を提供するための塩基での処理を含み得る。
【００４０】
（実験）
アッセイおよび純度は、内部標準としてドコサン酸メチルを使用するガスクロマトグラフィーによって測定した。
【００４１】
実施例１：エイコサペンタエン酸富化トリグリセリドの抽出
メカニカルスターラーを備えた２つ口５Ｌ丸底フラスコに、４００ｇのＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔａ、６５０ｍｇのα−トコフェロール、１．２ＬのＤ．Ｍ．水（脱塩水）、０．４Ｌの塩化ナトリウム２０重量％溶液、１．６Ｌのジクロロメタンおよび０．８Ｌのメタノールを装入する。混合物をアルゴンでフラッシュし、２０〜２５℃で２時間撹拌する。固体を濾過により分離し、濾液を集める。次に、２Ｌのジクロロメタン／メタノール２：１混合物を添加し、混合物を３Ｌの塩化ナトリウム１重量％溶液で洗浄する。形成された２つの層を注意深く分離し、下側の有機層を、３０分間撹拌することによって、１ｇの無水硫酸ナトリウム上で乾燥する。溶媒を減圧下で留去し、オイル状残渣を高真空下で３〜５時間乾燥して、１１０ｇのエイコサペンタエン酸富化トリグリセリドを粘稠性の黒緑色オイルとして得る（脂肪酸メチルエステルとしてのＥＰＡ純度：２８．９％）。
【００４２】
実施例２：エイコサペンタエン酸富化エチルエステル粗混合物
磁石撹拌棒、温度計およびコンデンサーを備えた２つ口１Ｌ丸底フラスコに、エイコサペンタエン酸富化トリグリセリド１００ｇおよび無水エタノール０．３Ｌを不活性雰囲気下で装入する。次に、２０〜２５℃の不活性雰囲気下で１．５ｇの水酸化カリウムをワンポットで添加し、反応塊を同じ温度で２〜３時間撹拌し続ける。３０ｍＬのＤ．Ｍ．水を添加することによって反応塊をクエンチする。過剰の溶媒を減圧下で反応塊から最終体積約０．２Ｌとなるまで除去する。残渣を１Ｌのシクロヘキサンで希釈し、０．４ＬのＤ．Ｍ．水および０．１Ｌの塩化ナトリウム２０重量％溶液と共に３Ｌの分液漏斗に移す。有機層を洗浄し、次いで分離し、別にしておく。水層を２×０．２Ｌのシクロヘキサンで洗浄する。抽出物および洗浄液をプールし、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させる。溶媒をロータリーエバポレーターで留去し、オイル状残渣を高真空下で３〜５時間乾燥させて、８５ｇのエイコサペンタエン酸富化エチルエステル粗混合物を黒緑色オイルとして得る（ＥＰＡ純度：３０．３％；ＥＰＡ  ＧＣアッセイ：２０．８％）。
【００４３】
実施例３：モンモリロナイトＫ１０漂白土で処理することによる粗エチルエステル混合物の精製
メカニカルスターラーを備えた３口３Ｌ丸底フラスコに、８５ｇのエイコサペンタエン酸富化エチルエステル粗混合物、０．８５Ｌのシクロヘキサンおよび４２５ｇのモンモリロナイトＫ１０を装入する。混合物をアルゴンでフラッシュし、不活性雰囲気下、周囲温度で３０分間〜１時間撹拌する。次いで、減圧下で４２５ｇのモンモリロナイトＫ１０フィルターパッドに混合物を通すことによって、固体を濾過する。フィルターパッドを０．８５Ｌのシクロヘキサンで洗浄し、濾液および洗浄液をプールする。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、オイル状残渣を高真空下で乾燥させて、５６ｇのエイコサペンタエン酸富化エチルエステル混合物を淡黄色オイルとして得る（ＥＰＡ純度：２８．９％；ＥＰＡ  ＧＣアッセイ：２５．６％）。
【００４４】
実施例４：エチルエステル混合物の脱ろうによる、ＥＰＡの第１の富化
磁石撹拌棒を備えた１００ｍＬ丸底フラスコに、５０ｇのエイコサペンタエン酸富化エチルエステル粗混合物および２．５ｍＬのヘキサンを装入する。溶液を冷却し、−２０℃で５時間撹拌する。次いで、形成された結晶を冷濾過によって分離する。濾液をロータリーエバポレーター中で減圧下で濃縮し、２３．８ｇのエイコサペンタエン酸富化エチルエステル混合物を黄色オイルとして得る（４８．９％；ＥＰＡＧＣアッセイ：４６．６％）。
【００４５】
実施例５：エチルエステル混合物の尿素処理によるＥＰＡの第２の富化
磁石撹拌棒を備えた２５０ｍＬ丸底フラスコに、６９ｍＬのＥｔＯＨおよび４６ｇの尿素を装入する。透明な溶液が生成するまで、混合物を撹拌下、５０〜５５℃まで加熱する。次いで、エイコサペンタエン酸が富化されたエチルエステル混合物２３ｇを、不活性雰囲気下、５０〜５５℃で撹拌しながらゆっくりと添加する。次に、混合物を加熱から除去し、周囲温度（２０〜２２℃）にゆっくりと到達させる。不活性雰囲気下での撹拌を２０時間維持する。次に、混合物を３×２００ｍＬのヘキサンで抽出する。上部ヘキサン層をプールし、２００ｍＬのＤＭ水で洗浄する。水相を２×５０ｍＬのヘキサンで逆洗浄し、抽出液および洗浄液のヘキサン層をプールし、１ｇの無水硫酸ナトリウム上で乾燥させる。溶媒をロータリーエバポレーター中で減圧下で留去し、オイル状残渣を高真空下で３時間乾燥させて、エイコサペンタエン酸が高度に富化されたエチルエステル混合物７．４ｇを黄色オイルとして得る（ＥＰＡ純度：８３．５％；ＥＰＡ  ＧＣアッセイ：７０．２％）。
【国際調査報告】
2021521882.tif 000002
2021521882.tif 000003
2021521882.tif 000004