(57)【要約】  遺伝子組換え菌を提供し、該菌は、α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、及び外因性Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、外因性Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ、又はグルコースデヒドロゲナーゼとチロシンフェノールリアーゼの共発現組み合わせからなる群から選ばれる任意の１種を共発現させるとともに、フェノール系化合物分解に関連する遺伝子をノックアウトされている。該組換え菌は、光学的に純粋な３−（３,４−ジヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシプロピオン酸の生産に用いられ得る。また、前記組換え菌を用いたサルビアノリン酸Ａの生産方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、及び
外因性Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、外因性Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、チロシンフェノールリアーゼのうちの任意の１種を同時に発現させ、
チロシンフェノールリアーゼを発現させるとともに、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼを発現させ、
宿主大腸菌からフェノール系化合物分解に関連する遺伝子がノックアウトされている、ことを特徴とする組換え大腸菌。
【請求項２】
前記フェノール類化合物分解遺伝子は、ｈｐａＤ、ｍｈｐＢのうちの任意の１種又は２種の組み合わせである、ことを特徴とする請求項１に記載の組換え大腸菌。
【請求項３】
グルタミン酸トランスポーター遺伝子、乳酸トランスポーター遺伝子、カテコールトランスポーター遺伝子、ＮＡＤ合成遺伝子、ＦＡＤ合成遺伝子のうちの１種又は複数種を増強発現させ、
カテコールトランスポーター遺伝子を発現させるとともに、乳酸トランスポーター遺伝子を発現させ、
グルタミン酸トランスポーター遺伝子と乳酸トランスポーター遺伝子を同時に発現させない、ことを特徴とする請求項１に記載の組換え大腸菌。
【請求項４】
前記増強発現させる遺伝子は、ｇｌｔＳ、ｎａｄＡ、ｒｉｂＦのうちの任意の１種又は複数種であり、
前記増強発現させる遺伝子は、ｌｌｄＰ、ｎａｄＡ、ｒｉｂＦのうちの任意の１種又は複数種であり、
前記増強発現させる遺伝子は、ｌｌｄＰ、ｈｐａＸ、ｍｈｐＴ、ｎａｄＡ、ｐｄｘＪ、ｒｉｂＦのうちの任意の１種又は複数種である、ことを特徴とする請求項１に記載の組換え大腸菌。
【請求項５】
前記増強発現は、宿主大腸菌のゲノム上の増強発現させる遺伝子の前に構成的プロモータを追加することである、ことを特徴とする請求項３又は４に記載の組換え大腸菌。
【請求項６】
前記Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、チロシンフェノールリアーゼ、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ、α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼは、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔを通じて共発現されている、ことを特徴とする請求項１に記載の組換え大腸菌。
【請求項７】
前記宿主大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１である、ことを特徴とする請求項１に記載の組換え大腸菌。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の遺伝子操作菌を用いる、ことを特徴とするサルビアノリン酸Ａの生産方法。
【請求項９】
全細胞変換により生産する、ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換え大腸菌又は請求項８、９のいずれか一項に記載の方法の、化学工業、食品、医薬品調製の分野における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サルビアノリン酸Ａの生産方法に関し、生物工学の技術分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
丹参から抽出されたサルビアノリン酸Ａは、学名がＲ−（＋）−３−（３,４−ジヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシプロピオン酸、Ｄ−（＋）−β−（３,４−ジヒドロキシフェニル）乳酸、英語名が、Ｄａｎｓｈｅｎｓｕ、Ｄ−ＤＳＳ、Ｒ−ＤＳＳ、（Ｒ）−（＋）−３−（３,４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ、（Ｒ）−（＋）−３−（３,４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄであり、Ｄ−フェノール酸系化合物である。現在、天然のＬ−サルビアノリン酸Ａが存在しない。
【０００３】
サルビアノリン酸Ａは、丹参水抽出液中の重要な有効成分であり、中国では、１９８０年に丹参水抽出液から得られ、構造（丹参水溶性有効成分の研究、II．Ｄ（＋）β（３,４−ジヒドロキシフェニル）乳酸の構造、上海第一医学院学報、１９８０,０５（７）,３８４−３８５）が同定され、さまざまな研究から明らかなように、サルビアノリン酸Ａは、重要な薬理・薬効の効果を有し、心臓・脳血管疾患の治療などの分野では独特の治療効果がある。
【０００４】
現在、サルビアノリン酸Ａは、主に丹参から抽出されている（特許ＣＮ２００８１００３８８５３．９）。丹参中のサルビアノリン酸Ａの含有量が低く、そして、丹参の栽培コストが高く、産量が限られるため、現在、サルビアノリン酸Ａは、高価であり、また市場のニーズを満足できない。特許ＣＮ２０１３１０５５９４９８．０は、大腸菌遺伝子組換え菌を構築して、グルコース発酵を利用してサルビアノリン酸Ａを生産する方法を提案しており、アナボリック途径が、代謝プロセスにおける産物を酸化しやすく、サルビアノリン酸Ａの収率に悪影響を与えるヒドロキシラーゼの利用に係り、また、大腸菌の発酵が高酸素消費プロセスであるので、それによってもサルビアノリン酸Ａが酸化され、したがって、現在のところ、該方法は、収率が低く、コストが植物抽出プロセスのコストよりも高い。特許ＣＮ２０１２１０１９０１７１．６は、サルビアノール酸Ｂを加水分解してサルビアノリン酸Ａを生産する方法を提案しており、サルビアノール酸Ｂは、丹参から抽出されるものであり、しかも、化学加水分解プロセスに大量の副反応が生じるため、同じく量産に適用できない。サルビアノリン酸Ａ（特許ＣＮ２０１２１０４２０４８８．４）をキラル合成するための触媒は極めて高価であり、現在、実験室レベルしかない。
【０００５】
１９８８年に、Ｒｏｔｈらにより、まず、化学法でＬ−ドパを処理して、対応する３,４−ジヒドロキシフェニルピルビン酸を得て、次に、酵素法によりＳ−（＋）−３−（３,４−ジヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシプロピオン酸（Ｓ−ＤＳＳ、Ｌ−ＤＳＳ）を合成する方法（Enzymatic Synthesis of (S)-(-)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)lactic Acid, Arch. Pharm. (Weinheim) 321,179-180 (1988))が提案されている。Z. Findrikらは、蛇毒のアミノ酸オキシダーゼを用いてＬ−ドパを３,４−ジヒドロキシフェニルピルビン酸に転化し、次に、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼを用いて還元して、Ｄ−（３,４−ジヒドロキシフェニル）乳酸（Modelling and Optimization of the(R)-(+)-3,4-dihydroxyphenyllactic Acid Production Catalyzed with D-lactateDehydrogenase from Lactobacillus leishmannii Using Genetic Algorithm, Chem. Biochem. Eng. Q. 19 (4) 351-358 (2005)）を生成する。この２種の方法を用いて３,４−ジヒドロキシフェニルピルビン酸中間体を調製すると、コストが高く、しかも、操作が複雑である。
【０００６】
現在の各種の方法の欠陥に対して、本発明は、光学的に純粋なサルビアノリン酸Ａの生産方法を提供し、複数の酵素を共発現させた遺伝子操作菌を構築し、それによって、サルビアノリン酸Ａの効率的な生産を実現する。本発明が解決しようとする課題は、低コストでサルビアノリン酸Ａを生産し得る組換え菌を提供することである。また、本発明は、該菌株の構築及び使用についての技術的課題を解決しようとする。
【０００７】
本発明の第１の目的は、光学的に純粋なサルビアノリン酸Ａを低コストで生産し得る組換え菌を提供することであり、前記組換え菌は、α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼとＬ−アミノ酸オキシダーゼ、及び外因性Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、外因性Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、チロシンフェノールリアーゼのうちの任意の１種を同時に発現させ、チロシンフェノールリアーゼを発現させるとともに、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼを発現させ、宿主大腸菌からフェノール系化合物分解に関連する遺伝子をノックアウトされている。
【０００８】
一実施形態では、前記α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＡＴＣＣ  １４９１７、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ３５０３８又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ  １４９３１に由来するＤ型α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼである。
【０００９】
一実施形態では、前記α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＤＳＭ  １、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｃｏｎｆｕｓａ  ｓｔｒａｉｎ  ＤＳＭ  ２０１９６又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ  １４９３１に由来するＬ型α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼである。
【００１０】
一実施形態では、前記α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼは、Ｄ−α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼであり、そのアミノ酸配列が、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．がＷＰ＿００３６４３２９６．１、ＷＰ＿００２３３５３７４．１、又はＥＥＩ２２１８８．１である配列であり、α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼは、Ｌ−α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼであり、そのアミノ酸配列が、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．がＷＰ＿０１３８５８４８８．１、ＷＰ＿００３６０７６５４．１又はＷＰ＿０３５４３０７７９．１である配列である。
【００１１】
一実施形態では、Ｄ−α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼのヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．がＮＺ＿ＧＬ３７９７６１  ＲＥＧＩＯＮ：  ＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴ（５３３５６２．．５３４５６０）、ＮＺ＿ＫＢ９４４６４１  ＲＥＧＩＯＮ：  １６１８９２．．１６２８３０、ＡＣＧＩ０１００００７８  ＲＥＧＩＯＮ：  ２０７９３．．２１７９１である配列であり、Ｌ−α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼのヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．がＮＺ＿ＡＴＵＭ０１００００１４  ＲＥＧＩＯＮ：  ３９３１６．．４０２５４、ＮＺ＿ＪＱＡＹ０１０００００６  ＲＥＧＩＯＮ：  ６９７０８．．７０６４０、ＮＺ＿ＧＧ６６９９０１  ＲＥＧＩＯＮ：  ４５５１７．４６４７０である配列である。
【００１２】
一実施形態では、前記Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−８０８、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ  ＡＴＣＣ  １４９４０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８に由来する。
【００１３】
一実施形態では、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯがＷＰ＿０００３７３０２１．１、ＷＰ＿０１１３３８２０２．１、ＷＰ＿００３４９７２０２．１、ＷＰ＿０１０８８６５５７．１である配列である。
【００１４】
一実施形態では、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼのヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ：ＮＣ＿０１２８９２  ＲＥＧＩＯＮ：  １７８６７４１．．１７８８０８４、ＮＣ＿００７４９３  ＲＥＧＩＯＮ：  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  （２１２９１３１．．２１３０５５８）、ＮＺ＿ＫＥ９９２９０１  ＲＥＧＩＯＮ：  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  （１７６０３．．１８９５５）、ＮＣ＿０００９６４  ＲＥＧＩＯＮ：  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  （２４０２０６７．．２４０３３５０）の配列である。
【００１５】
一実施形態では、前記Ｌ−アミノ酸オキシダーゼは、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９９０６、Ｃｏｓｅｎｚａｅａ  ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓ  ＡＴＣＣ  １９６９２、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ  ＡＴＣＣ  ４９９９３、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ  ＤＳＭ  １１３１又はＩｇｎａｔｚｓｃｈｉｎｅｒｉａ  ｌａｒｖａｅ  ＤＳＭ  １３２２６に由来する過酸化水素を産生しないＬ−アミノ酸オキシダーゼである。
【００１６】
一実施形態では、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯがＷＰ＿００４２４４２２４．１、ＯＡＴ３０９２５．１、ＥＦＥ５５０２６．１、ＷＰ＿０３６４１４８００．１又はＷＰ＿０２６８７９５０４．１である配列である。
【００１７】
一実施形態では、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼのヌクレオチド配列は、配列表のうち、ＮＺ＿ＧＧ６６８５７６  ＲＥＧＩＯＮ：  １３５０３９０．．１３５１８０５、ＬＸＥＮ０１００００６６  ＲＥＧＩＯＮ：  ２０５６３．．２１９６３、ＡＣＣＩ０２００００３０  ＲＥＧＩＯＮ：  ２１０２５．．２２４４３、ＮＺ＿ＬＡＧＣ０１０００００６  ＲＥＧＩＯＮ：  ３０９５６９．．３１０９９３、ＮＺ＿ＫＩ７８３３３２  ＲＥＧＩＯＮ：  ３５７９９．．３７２１７に示される。
【００１８】
一実施形態では、前記Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼは、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＡＴＣＣ  １９２５７に由来する。
【００１９】
一実施形態では、前記Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯがＷＰ＿００３１３１０７５．１である配列である。
【００２０】
一実施形態では、前記Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼのヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ：ＮＺ＿ＪＸＪＺ０１００００１７  ＲＥＧＩＯＮ：  １８５３２．．１９５０９の配列である。
【００２１】
一実施形態では、前記チロシンフェノールリアーゼは、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ  ＡＴＣＣ  ２１４３４４に由来する。
【００２２】
一実施形態では、前記チロシンフェノールリアーゼのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯがＰ３１０１１．２である。
【００２３】
一実施形態では、前記グルコースデヒドロゲナーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  １３９５２に由来する。
【００２４】
一実施形態では、前記グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯがＷＰ＿０１３３５１０２０．１である配列である。
【００２５】
一実施形態では、前記グルコースデヒドロゲナーゼのヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ：ＮＺ＿ＣＰ００９７４８  ＲＥＧＩＯＮ：  ３８６１５４．．３８６９３である。
【００２６】
一実施形態では、前記組換え菌としては、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼ、及びＬ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をすべてプラスミドに連結し、３つの遺伝子を共発現させた組換えプラスミドを構築し、次に、組換えプラスミドを用いて対応する菌株を形質転換し、遺伝子組換え操作菌を得る。
【００２７】
一実施形態では、前記組換え菌としては、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼ、及びＬ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をすべてプラスミドに連結し、３つの遺伝子を共発現させた組換えプラスミドを構築し、次に、組換えプラスミドを用いて対応する菌株を形質転換し、遺伝子組換え操作菌を得る。
【００２８】
一実施形態では、前記組換え菌としては、チロシンフェノールリアーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼ、及びＬ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を、２つのプラスミドに連結し、次に、組換えプラスミドを用いて宿主大腸菌を形質転換し、遺伝子組換え操作菌を得る。
【００２９】
一実施形態では、前記α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及びＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、プラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−１に連結された後に発現され、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ及びチロシンフェノールリアーゼ遺伝子は、プラスミドｐＡＣＹＣＤｕｅ−１に連結された後に発現される。
【００３０】
一実施形態では、前記組換え菌としては、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼ、及びグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をすべてプラスミド上に連結し、３つの遺伝子を共発現させた組換えプラスミドを構築し、次に、組換えプラスミドを用いて対応する菌株を形質転換し、遺伝子組換え操作菌を得る。
【００３１】
一実施形態では、前記遺伝子操作菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主として構築したものである。
【００３２】
一実施形態では、前記フェノール系化合物分解に関連する遺伝子は、ｈｐａＤ、ｍｈｐＢのうちの任意の１種又は２種の組み合わせである。
【００３３】
一実施形態では、前記フェノール系化合物分解に関連する遺伝子のヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ：ＮＣ＿０１２８９２  ＲＥＧＩＯＮ：  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（４５０５５８５．．４５０６４３６）とＮＣ＿０１２８９２  ＲＥＧＩＯＮ：  ３３９８０６．．３４０７５０である。
【００３４】
一実施形態では、前記組換え大腸菌は、また、グルタミン酸トランスポーター遺伝子、乳酸トランスポーター遺伝子、カテコールトランスポーター遺伝子、ＮＡＤ合成遺伝子、ＦＡＤ合成遺伝子のうちの１種又は複数種を増強発現させ、カテコールトランスポーター遺伝子を発現させるとともに、乳酸トランスポーター遺伝子を発現させ、グルタミン酸トランスポーター遺伝子と乳酸トランスポーター遺伝子は同時に発現させない。
【００３５】
一実施形態では、前記増強発現は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）のゲノムの増強発現させる遺伝子の前に構成的プロモータを追加することである。
【００３６】
一実施形態では、前記増強発現させる遺伝子は、ｇｌｔＳ（グルタミン酸トランスポーター遺伝子）、ｎａｄＡ（ＮＡＤ合成遺伝子）、ｒｉｂＦ（ＦＡＤ合成遺伝子）のうちの任意の１種又は複数種である。
【００３７】
一実施形態では、前記ｇｌｔＳは、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯが、ＮＣ＿０１２８９２  ＲＥＧＩＯＮ：  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（３６９４９３１．．３６９６１３６）；ｎａｄＡがＮＣ＿０１２８９２  ＲＥＧＩＯＮ：  ７４０４８７．．７４１５３０；ｒｉｂＦがＮＣ＿０１２８９２  ＲＥＧＩＯＮ：  ２５４７９．．２６４２０である。
【００３８】
一実施形態では、前記増強発現させる遺伝子は、ｌｌｄＰ（乳酸トランスポーター遺伝子）、ｎａｄＡ（ＮＡＤ合成遺伝子）、ｒｉｂＦ（ＦＡＤ合成遺伝子）のうちの任意の１種又は複数種である。
【００３９】
一実施形態では、前記ｌｌｄＰは、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯが、ＮＣ＿０１２８９２  ＲＥＧＩＯＮ：  ３６４６６３８．．３６４８２９３；ｎａｄＡが、ＮＣ＿０１２８９２  ＲＥＧＩＯＮ：  ７４０４８７．．７４１５３０；ｒｉｂＦが、ＮＣ＿０１２８９２  ＲＥＧＩＯＮ：  ２５４７９．．２６４２０である。
【００４０】
一実施形態では、前記増強発現させる遺伝子は、ｌｌｄＰ（乳酸トランスポーター遺伝子）、ｈｐａＸ（カテコールトランスポーター遺伝子）、ｍｈｐＴ（カテコールトランスポーター遺伝子）、ｎａｄＡ（ＮＡＤ合成遺伝子）、ｐｄｘＪ（リン酸ピリドキサール合成遺伝子）  、ｒｉｂＦ（ＦＡＤ合成遺伝子）のうちの任意の１種又は複数種である。
【００４１】
一実施形態では、前記ｌｌｄＰは、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯが、ＮＣ＿０１２８９２  ＲＥＧＩＯＮ：  ３６４６６３８．．３６４８２９３；ｈｐａＸが、ＮＣ＿０１２８９２  ＲＥＧＩＯＮ：  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（４５０２０２５．．４５０３４０１）；ｍｈｐＴが、ＮＣ＿０１２８９２  ＲＥＧＩＯＮ：  ３４４７８８．．３４５９９９；ｎａｄＡが、ＮＣ＿０１２８９２  ＲＥＧＩＯＮ：  ７４０４８７．．７４１５３０；ｐｄｘＪが、ＮＣ＿０１２８９２  ＲＥＧＩＯＮ：  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  （２５６７５９１．．２５６８３２２）；ｒｉｂＦが、ＮＣ＿０１２８９２  ＲＥＧＩＯＮ：  ２５４７９．．２６４２０である。
【００４２】
一実施形態では、前記組替え菌は、ｈｐａＤとｍｈｐＢをノックアウトした大腸菌宿主を基に、ｌｌｄＰ、ｈｐａＸ、ｍｈｐＴ、ｎａｄＡ、ｐｄｘＪ及びｒｉｂＦを増強発現させ、また、チロシンフェノールリアーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ、及びα−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼを同時に発現させたものである。
【００４３】
本発明の第２の目的は、本発明の組替え菌を用いたサルビアノリン酸Ａの生産方法を提供することである。
【００４４】
一実施形態では、前記サルビアノリン酸Ａの生産は、全細胞変換による生産である。
【００４５】
一実施形態では、前記組換え大腸菌がα−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、及び外因性Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼを同時に発現させた場合、前記全細胞変換による生産系には、細胞（湿重量）１〜２００ｇ／Ｌ、Ｌ−ドパ１−２００ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸１〜２００ｇ／Ｌが含まれ、ｐＨ  ６．０〜９．０これらは、１５〜４０℃で１〜４８時間反応する。
【００４６】
一実施形態では、前記組換え大腸菌が、α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、及び外因性Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼを同時に発現させた場合、前記全細胞変換による生産系には、細胞（湿重量）１〜２００ｇ／Ｌ、Ｌ−ドパ１〜２００ｇ／Ｌ、Ｌ−乳酸１〜２００ｇ／Ｌが含まれ、ｐＨ  ４．０〜９．０、これらは、１５〜４０℃で１〜４８時間反応する。
【００４７】
一実施形態では、前記組換え大腸菌がα−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、チロシンフェノールリアーゼ、及びＬ−乳酸デヒドロゲナーゼを同時に発現させた場合、前記全細胞変換による生産系には、細胞（湿重量）１〜２００ｇ／Ｌ、カテコール１〜２００ｇ／Ｌ、Ｌ−乳酸１〜２００ｇ／Ｌ、ｐＨ  ６．０〜９．０、アンモニウムイオン１〜３０ｇ／Ｌが含まれ、これらは、１５〜４０℃で１〜４８時間反応する。変換終了後、液体クロマトグラフィーによりサルビアノリン酸Ａの産量及び立体配置を測定する。
【００４８】
一実施形態では、前記組換え大腸菌がα−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、及びグルコースデヒドロゲナーゼを同時に発現させた場合、前記全細胞変換による生産系には、細胞（湿重量）１〜２００ｇ／Ｌ、Ｌ−ドパ１〜２００ｇ／Ｌ、グルコース１〜２００ｇ／Ｌが含まれ、ｐＨ  ６．０〜９．０、これらは、１５〜４０℃で１〜４８時間反応する。
【００４９】
本発明の第３の目的は、本発明の組換え菌又は本発明の方法の、化学工業、食品、医薬などの分野における使用を提供することである。
【００５０】
本発明の有益な効果は以下のとおりである。
本発明は、３つの酵素を共発現させた新規の遺伝子組換え菌を構築し、該菌は、光学的に純粋な３−（３,４−ジヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシプロピオン酸の生産に用いられ得る。本発明で選択される（Ｄ／Ｌ）−α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼは、すべて基質特異性が悪く、光学特異性が高いという特徴を有し、光学的に純粋なＤ−サルビアノリン酸Ａ及びＬ−サルビアノリン酸Ａを生産することができる。さらに、大腸菌ゲノムの関連遺伝子をナックアウト又は増強発現することにより、基質の輸送を促進し、産物の分解を減少させ、組換え菌の生産効率を高める。本発明の組換え菌を用いてサルビアノリン酸Ａとα−ケトグルタル酸を変換して生産する方法は、実施されやすく、原料が入手しやすく、このため、工業的応用の将来性が期待できる。
【００５１】
本発明の組換え菌の機能のコアは、複数種の酵素を同時に発現できることにあり、これらの酵素は、それぞれ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼとα−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼ、及び、外因性Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、外因性Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、チロシンフェノールリアーゼ及びＬ−乳酸デヒドロゲナーゼのうちの任意の１種であり、その中でも、チロシンフェノールリアーゼとＬ−乳酸デヒドロゲナーゼを同時に発現させる。その原理は、以下のとおりである。組換え菌の全細胞には、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼのうちの任意の１種は、菌体内のＮＡＤを補酵素として、対応するＬ−グルタミン酸、Ｌ−乳酸、グルコースを脱水素し、対応するα−ケトグルタル酸、ピルビン酸、グルコン酸、及びＮＡＤＨを生成し、チロシンフェノールリアーゼは、ピルビン酸、アンモニウムイオン、カテコールを触媒してＬ−ドパを生成し、Ｌ−ドパは、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼにより脱アミノ化されて３,４−ジヒドロキシフェニルピルビン酸を生成し、α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼは、グルタミン酸脱水素プロセスで生成したＮＡＤＨを利用して、３,４−ジヒドロキシフェニルピルビン酸をサルビアノリン酸Ａに還元し、また、補酵素ＮＡＤも再生される。さらに、大腸菌ゲノムの関連遺伝子をノックアウト又は増強発現することにより、基質の輸送を促進し、産物の分解を減少させ、それによって、目的産物の産量を向上させる。
【００５２】
上記技術的課題を解決するために、本発明で使用される構成は以下のとおりである。
【００５３】
１．本発明に係る菌株及びプラスミド
アメリカンタイプカルチャーコレクションＡＴＣＣから購入されるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＡＴＣＣ  １４９１７、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ３５０３８、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ  １４９３１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  １３９５２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  （ＤＥ３）、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９９０６、Ｃｏｓｅｎｚａｅａ  ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓ  ＡＴＣＣ  １９６９２、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ  ＡＴＣＣ  ４９９９３、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＡＴＣＣ  １９２５７、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ  ＡＴＣＣ  ２１４３４４、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｐｈｅｎｏｌｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ  ７９６６。ドイツカルチャーコレクションＤＳＭＺから購入されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＤＳＭ  １、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｃｏｎｆｕｓａ  ｓｔｒａｉｎ  ＤＳＭ  ２０１９６、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ  ＤＳＭ  １１３１、Ｉｇｎａｔｚｓｃｈｉｎｅｒｉａ  ｌａｒｖａｅ  ＤＳＭ  １３２２６。Ｎｏｖａｇｅｎ社から購入されるｐＥＴＤｕｅｔ−１、ｐＡＣＹＣＤｕｅ−１、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１プラスミド、及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）。ｐＣａｓＲｅｄ、ｐＣＲＩＳＰＲ−ｇＤＮＡは、ａｂｍｇｏｏｄｃｈｉｎａ  ｌｎｃ．から購入される。
【００５４】
２．大腸菌における関連遺伝子のノックアウト及び構成的な増強発現
（１）大腸菌からのフェノール系化合物分解に関連する遺伝子のノックアウト
本発明では、フェノール類物質がすべて大腸菌中の酵素により分解されやすく、文献（Biodegradation of Aromatic Compounds by Escherichia coli、Microbiol Mol Biol Rev. 2001, 65(4): 523-569.）に従って、関連遺伝子をノックアウトすることで、産物や基質の分解を防止する。選択される遺伝子は、ｈｐａＤとｍｈｐＢであり、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ：ＮＣ＿０１２８９２  ＲＥＧＩＯＮ：  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（４５０５５８５．．４５０６４３６）、及びＮＣ＿０１２８９２  ＲＥＧＩＯＮ：  ３３９８０６．．３４０７５０である。
（２）大腸菌でのグルタミン酸トランスポーター遺伝子の構成的な増強発現
全細胞変換プロセスにおいて、基質を細胞内に輸送する必要があり、グルタミン酸トランスポータータンパク質を強化させることは、細胞内基質の高濃度を素早く長期的に維持することに寄与し、反応の進行に有利となる。グルタミン酸の輸送に関連する遺伝子として、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ：ＮＣ＿０１２８９２  ＲＥＧＩＯＮ：  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（３６９４９３１．．３６９６１３６）のｇｌｔＳが選択される。ドバは、芳香族アミノ酸と同様に、細胞培養プロセスにアミノ酸などを吸収する必要があり、したがって、菌体自体が大量のアミノ酸トランスポータータンパク質を発現させるので、さらなる増強発現を必要としない。
（３）大腸菌の補酵素合成関連の重要遺伝子の構成的な増強発現
α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼの還元プロセスには、ＮＡＤＨを補酵素とする必要があり、大腸菌ＮＡＤ合成経路のキー酵素を増強発現させることは、菌体内のＮＡＤレベルを高め、サルビアノリン酸Ａの生成に寄与する。選択される遺伝子には、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ：ＮＣ＿０１２８９２  ＲＥＧＩＯＮ：  ７４０４８７．．７４１５３０のｎａｄＡがある。
ＦＡＤは、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼの補酵素であり、該補酵素経路における重要な遺伝子ｒｉｂＦを過剰発現させることは、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼの活性強化に有利である。ＦＡＤはＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ：ＮＣ＿０１２８９２  ＲＥＧＩＯＮ：  ２５４７９．．２６４２０である。
【００５５】
３．酵素の選択
（１）Ｌ−アミノ酸オキシダーゼの選択
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼは、細菌、真菌、哺乳動物細胞、蛇毒、昆虫毒素や藻類に幅広く存在している（L-amino acid oxidase as biocatalyst: a dream too far. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013,97:9323-41）。Ｌ−アミノ酸オキシダーゼは、αアミノ基とＣα上の水素をＦＡＤに移し、ほとんどは、分子酸素直接レドックスＦＡＤを用いて、酸化型ＦＡＤを再生しながら、過酸化水素を生成する。たとえば、Ｐｏｌｊａｎａｃらは、ヒガシダイヤガラガラヘビの蛇毒Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを用いてドバを酸化し、３,４−ジヒドロキシフェニルピルビン酸を生成し、次に、乳酸デヒドロゲナーゼとギ酸デヒドロゲナーゼを加えて３,４−ジヒドロキシフェニル乳酸を生成し、このプロセスには、過酸化水素の毒性を解消するためにカタラーゼを別に添加する必要がある（Modelling and Optimization of the (R)-(+)-3,4-Dihydroxyphenyllactic Acid Production Catalyzed, Chem. Biochem. Eng. Q.2005,19 (4) 351-358）。また、細胞膜上の電子伝達系に関連するＬ−アミノ酸オキシダーゼもあり、電子が呼吸鎖を通じてチトクロームオキシダーゼに伝達され、分子状酸素を水に還元し、このように、過酸化水素が生成されないようにし、このような酵素類は、主に、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐ．）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｐ．）、モーガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｓｐ．）などの細菌に存在する（Crystal structure of a membrane-bound l-amino acid deaminase from Proteus vulgaris. J. Struct. Biol.2016,195:306-15）。本発明では、過酸化水素を産生しない５種類のＬ−オキシ酸オキシダーゼが選択され、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９９０６、Ｃｏｓｅｎｚａｅａ  ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓ  ＡＴＣＣ  １９６９２、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ  ＤＳＭ  １１３１、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ  ＡＴＣＣ  ４９９９３、Ｉｇｎａｔｚｓｃｈｉｎｅｒｉａ  ｌａｒｖａｅ  ＤＳＭ  １３２２６のそれぞれから、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子ｐｍａａｏ、ｃｍａａｏ、ｐｒａａｏ、ｍｍａａｏ、ｉｌａａｏをクローニングし、これらのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．がＷＰ＿００４２４４２２４．１、ＯＡＴ３０９２５．１、ＥＦＥ５５０２６．１、ＷＰ＿０３６４１４８００．１又はＷＰ＿０２６８７９５０４．１の配列であり、これらの酵素はすべて、基質の種類が多く、活性が高いという特徴を有する。
（２）α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼの選択
最適基質に応じて、α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼには、乳酸デヒドロゲナーゼ、α−ヒドロキシイソカプロン酸デヒドロゲナーゼ、マンデル酸デヒドロゲナーゼ、グリオキシル酸還元酵素などが含まれ、これらの酵素は、複数種の基質に作用してα−ヒドロキシカルボン酸を生成することができ、通常、その最適な作用基質に応じて命名される。本発明では、これらから光学性が強く且つ３,４−ジヒドロキシフェニルピルビン酸に対して高活性がある酵素を、Ｄ又はＬサルビアノリン酸Ａの生産に用いる。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＡＴＣＣ  １４９１７、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ３５０３８、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ  １４９３１のそれぞれから、Ｄ型α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｌｐｌｄｈｄ、ｅｆｍｄｈｄ、ｌｆｌｄｈｄをクローニングし、これらのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．がＷＰ＿００３６４３２９６．１、ＷＰ＿００２３３５３７４．１、ＥＥＩ２２１８８．１の配列である。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＤＳＭ  １、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｃｏｎｆｕｓａ  ｓｔｒａｉｎ  ＤＳＭ  ２０１９６、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ  １４９３１のそれぞれから、Ｌ型α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｂｃｌｄｈｌ、ｗｃｌｄｈｌ、ｌｆｌｄｈｌをクローニングし、これらのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯがＷＰ＿０１３８５８４８８．１、ＷＰ＿００３６０７６５４．１、ＷＰ＿０３５４３０７７９．１の配列である。
（３）Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼの選択
Ｌ−グルタミン酸は、最も低価なアミノ酸であり、脱水素してなるα−ケトグルタル酸が高い付加価値を有し、現在、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼを用いてＬ−グルタミン酸を酸化しα−ケトグルタル酸を生産するのが一般的であるが、このプロセスにおいて、Ｌ−グルタミン酸から離脱した水素が無駄になる。Ｌグルタミン酸デヒドロゲナーゼは、ほぼすべての生物に存在し、Ｌ−グルタミン酸を基質としてＬ−グルタミン酸上で生成した水素を補酵素ＮＡＤ又はＮＡＤＰに伝達し、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成する。ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨは、前述ヒドロキシヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼの水素供与体として機能できる。本発明では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−８０８、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ  ＡＴＣＣ  １４９４０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８のそれぞれから、Ｌ−グルタミン酸遺伝子ｅｃｇｄｈ（アミノ酸配列ＷＰ＿０００３７３０２１．１）、ｒｓｇｄｈ（アミノ酸配列ＷＰ＿０１１３３８２０２．１）、ｃｓｇｄｈ（アミノ酸配列ＷＰ＿００３４９７２０２．１）、ｂｓｇｄｈ（アミノ酸配列ＷＰ＿０１０８８６５５７．１）を得る。
（４）Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼの選択
Ｌ−乳酸は、最も低価な有機酸であり、脱水素してなるピルビン酸が高い付加価値を有する。現在、Ｌ−乳酸オキシダーゼを用いてＬ−乳酸を酸化してピルビン酸を生産するのが一般的であり、このプロセスにおいて、Ｌ−乳酸から離脱した水素が無駄になる。また、酵母発酵によりケト酸を生産する方法もある。Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼは、複数の微生物に幅広く存在し、Ｌ−乳酸を基質としてＬ−乳酸上で生成した水素を補酵素ＮＡＤ又はＮＡＤＰに伝達し、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成する。ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨは、前述α−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼの水素供与体として機能できる。通常、ＮＡＤ（ＮＡＤＰ）を補酵素とする乳酸デヒドロゲナーゼは、ピルビン酸を基質として乳酸を合成する傾向がある、乳酸が過剰である場合、一部の乳酸デヒドロゲナーゼは乳酸の水素を脱離してピルビン酸を生成することもある。
本発明は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＡＴＣＣ  １９２５７からＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｌｌｌｄｈ（アミノ酸配列ＷＰ＿００３１３１０７５．１）を得る。
（５）チロシンフェノールリアーゼの選択
チロシンフェノールリアーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｅｎｏｌ  ｌｙａｓｅ,  ＴＰＬ,  Ｅ．Ｃ．４．１．９９．２）は、β−チロシナーゼとしても知られ、チロシンフェノールリアーゼは、Ｌ−チロシンのβ−消去反応を触媒フェノール、ピルビン酸及びアンモニアの生成してもよく、ドバのβ−消去反応を触媒してカテコール、ピルビン酸及びアンモニアを生成してもよい。該反応は可逆的であり、カテコール、ピルビン酸及びアンモニアは、チロシンフェノールリアーゼの触媒下でＬ−ドバを生成することができる。本発明は、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ  ＡＴＣＣ  ２１４３４４のそれぞれから、アミノ酸の配列がＰ３１０１１．２であるチロシンフェノールリアーゼ遺伝子ｅｈｔｐｌをクローニングする。
（６）グルコースデヒドロゲナーゼの選択
生体内変換反応において、α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨを補酵素とする必要があり、通常、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、亜リン酸デヒドロゲナーゼなどが使用され、これらのうち、グルコースデヒドロゲナーゼは最も高活性であり、したがって、本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  １３９５２からグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子ｂｓｇｄｈ（アミノ酸配列ＷＰ＿０１３３５１０２０．１）を得る。
【００５６】
４．共発現系の構築及び細胞の培養
現在、大腸菌での複数の遺伝子の共発現には、多数の方法があり（大腸菌での複数の遺伝子の共発現の戦略、中国生物工学雑誌、２０１２,３２（４）：１１７−１２２）、本発明では、劉向磊（合成生物学技術により大腸菌を改造してシキミ酸及びレスベラトロールを生産すること、２０１６、上海医薬工業研究院、博士論文）による方法を用いて構築し、各遺伝子の前には、Ｔ７プロモータとＲＢＳ結合サイトが含まれており、理論的には、各遺伝子の前にＴ７とＲＢＳがあるので、並べ替え順序による遺伝子の発現強度への影響が小さい。各プラスミドには３つの遺伝子が含まれており、構築されたプラスミドを大腸菌コンピテント細胞に熱により導入し、抗生物質固体プレートに塗布し、陽性形質転換体をスクリーニングすると、組換え大腸菌を得る。細胞の培養：クラシックな組換え大腸菌の培養及び誘導発現手段に従って、組換え大腸菌を体積比が２％となる量でＬＢ発酵培地（ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ）に播種し、細胞ＯＤ６００が０．６〜０．８になると、最終濃度０．４ｍＭのＩＰＴＧを加え、２０℃で誘導発現培養を８ｈ行う。誘導発現終了後、２０℃、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞を収集する。
【００５７】
５．サンプルの検出分析
サルビアノリン酸Ａの定量的分析：形質転換液について、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２００高速液体クロマトグラフを用いて検出分析を行い、また示差屈折率検出器も装備している。クロマトグラフィー条件：移動相：メタノール−０．１％ギ酸水（４０：６０）、Ｈａｎｂｏｎ社製のＭｅｇｒｅｓ  Ｃ１８クロマトグラフィーカラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ）、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度３０℃、注入量２０μｌ。
キラル分析：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２００高速液体クロマトグラフを用いて検出分析を行い、また示差紫外検出器も装備している。Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＤ−Ｈキラルカラム（４．６×２５０ｍｍ）、移動相：体積比でｎ−ヘキサン：イソプロパノール：トリフルオロ酢酸＝８０：２０：０．１、流速０．５  ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度２５℃、注入量２０μＬ、検出波長２８０ｎｍ。
サルビアノリン酸Ａは、溶解度が低く、変換プロセスに結晶が析出されると、希釈して測定する。
サルビアノリン酸Ａの光学純度は、エナンチオマー過剰率（％ｅ．ｅ）で評価される。
Ｒ−サルビアノリン酸Ａを生産する場合、
エナンチオマー過剰率％ｅ．ｅ＝［（ＳＲ−ＳＳ）／（ＳＲ＋ＳＳ）×１００％］
Ｓ−サルビアノリン酸Ａを生産する場合、
エナンチオマー過剰率％ｅ．ｅ＝［（ＳＳ−ＳＲ）／（ＳＲ＋ＳＳ）×１００％］
式中、ＳＳは変換液中のＳ−サルビアノリン酸Ａのピーク面積、ＳＲは変換液中のＲ−サルビアノリン酸Ａの液体クロマトグラフィーのピーク面積である。
本発明が解決しようとする技術的課題、技術案及び有益な効果をより明確にするために、以下、実施例を参照しながら、本発明を詳しく説明する。なお、ここで説明する特定の実施例は、本発明を解釈するために過ぎず、本発明を限定するものではない。
【００５８】
実施例１
Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼのスクリーニング
各菌株から複数種のＬ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をそれぞれクローニングし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）にて発現させた。
誘導発現方法
組換え大腸菌を体積比が２％となる量でＬＢ発酵培地（ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ）に播種し、細胞ＯＤ６００が０．６〜０．８になると、最終濃度０．４ｍＭのＩＰＴＧを加え、２０℃で誘導発現培養を８ｈ行った。誘導発現終了後、２０℃、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、細胞を収集した。
文献（納豆菌（Bacillus subtilis var. natto）のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング、発現及び酵素活性の測定．上海交通大学学報・農業科学版、２０１０,１：８２−８６．）に従って細胞を破壊し粗酵素液の活性を測定し、前記方法では、ＮＡＤを補酵素とするＬ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼの活性を測定し、結果を表１に示す。したがって、枯草菌由来のＬ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼｂｓｇｄｈをサルビアノリン酸Ａの生産に用いるのが最も好ましい。
2021521801.tif 000002
【００５９】
実施例２
文献Large scale validation of an efficient CRISPR/Cas-based multi gene editing protocol in Escherichia coli. Microbial Cell Factories,2017,16(1):68に記載の方法に従って、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）上のｈｐａＤとｍｈｐＢを一重又は二重ノックアウトした。ここで、本発明では、遺伝子ノックアウト用のプラスミドとして、ｐＣａｓＲｅｄを用いて、ｐＣＲＩＳＰＲ−ｇＤＮＡ（ｈｐａＤ  ｓｇＲＮＡ）及びホモロジーアーム（ｈｐａＤ  ｄｏｎｏｒ）とともにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡで宿主のｈｐａＤ遺伝子部位での二本鎖切断を誘発させ、組換え酵素Ｒｅｄを通じてｈｐａＤ  ｄｏｎｏｒをｈｐａＤ遺伝子に組み込み、それによって、遺伝子をノックアウトし、またシーケンシングして検証した。ｈｐａＤ  ｓｇＲＮＡ、ｈｐａＤ  ｄｏｎｏｒ、ｍｈｐＢ  ｓｇＲＮＡ、ｍｈｐＢ  ｄｏｎｏｒは、それぞれ配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示される。ｍｈｐＢについては、同様にしてノックアウトした。
Ｌ−ドパ又はＤ−サルビアノリン酸Ａ４ｇ／Ｌ、菌体の湿重量２００ｇ／ＬからなるｐＨ７の溶液を調製し、３５℃で１０時間放置後、濃度を測定し、反応系中のＬ−ドパとＤ−サルビアノリン酸Ａの残留量を表２に示す。
2021521801.tif 000003
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ΔｈｐａＤΔｍｈｐＢ,ＤＥ３）は、効果が最も高く、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭと命名された。
【００６０】
実施例３
α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、及び外因性Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼを同時に発現させた組換え大腸菌の構築
まず、チロシンフェノールリアーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼ、及びＬ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を、プラスミドに連結した。３つの遺伝子を共発現させた組換えプラスミドを得て、プラスミドを用いて大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭを形質転換し、抗生物質プレートで陽性形質転換体をスクリーニングすると、組換え大腸菌を得た。
組換え大腸菌の誘導発現が終了した後、菌体を収集し、細胞（湿重量）４０ｇ／Ｌ、Ｌ−ドパ（濃度４０ｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン酸（濃度３０ｇ／ＬからなるｐＨ  ８．０の１００ｍｌ反応系において、３５℃で１２時間反応させた。変換終了後、液体クロマトグラフィーによりサルビアノリン酸Ａの産量及び立体配置を測定し、結果を表３に示す。
2021521801.tif 000004
2021521801.tif 000005
α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、及び外因性Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼを同時に発現させた組換え大腸菌の構築
まず、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼ、及びＬ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を、ｐＥＴＤｕｅｔ−１又はｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１プラスミドに連結した。３つの遺伝子を共発現させた組換えプラスミドを得て、プラスミドを用いて大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭを形質転換し、クロランフェニコールとアンピシリンプレートを用いて陽性形質転換体をスクリーニングすると、組換え大腸菌を得た。
組換え大腸菌誘導発現が終了した後、菌体を収集し、細胞（湿重量）４０ｇ／Ｌ、Ｌ−ドパ（濃度４０ｇ／Ｌ）、Ｌ−乳酸（濃度３０ｇ／Ｌ）からなるｐＨ  ８．０の１００ｍｌ反応系において、３５℃で１２時間反応させた。変換終了後、液体クロマトグラフィーによりサルビアノリン酸Ａの産量及び立体配置を測定し、結果を表４に示す。
2021521801.tif 000006
α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、チロシンフェノールリアーゼ、及びＬ−乳酸デヒドロゲナーゼを同時に発現させた組換え大腸菌の構築
まず、チロシンフェノールリアーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼ、及びＬ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を、それぞれｐＥＴＤｕｅｔ−１又はｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１プラスミドに連結した。２つの遺伝子を共発現させた組換えプラスミドを２種得て、２種のプラスミドを用いて大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭを形質転換し、クロランフェニコールとアンピシリンプレートを用いて陽性形質転換体をスクリーニングすると、組換え大腸菌を得た。
組換え大腸菌誘導発現が終了した後、菌体を収集し、細胞（湿重量）２０ｇ／Ｌ、カテコール（濃度１０ｇ／Ｌ）、Ｌ−乳酸（濃度１０ｇ／Ｌ）、ｐＨ  ８．０、アンモニウムイオン（濃度３０ｇ／Ｌ）からなる１００ｍｌ反応系において、３５℃で１２時間反応させた。変換終了後、液体クロマトグラフィーによりサルビアノリン酸Ａの産量及び立体配置を測定し、結果を表５に示す。
2021521801.tif 000007
α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、及びグルコースデヒドロゲナーゼを同時に発現させた組換え大腸菌の構築
まず、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、α−ヒドロキシカルボン酸デヒドロゲナーゼ、及びグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を、ｐＥＴＤｕｅｔ−１又はｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１プラスミドに連結した。３つの遺伝子を共発現させた組換えプラスミドを得て、プラスミドを用いて大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭを形質転換し、クロランフェニコールとアンピシリンプレートを用いて陽性形質転換体をスクリーニングすると、組換え大腸菌を得た。
誘導発現方法
組換え大腸菌を体積比が２％となる量でＬＢ発酵培地（ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ）に播種し、細胞ＯＤ６００が０．６〜０．８になると、最終濃度０．４ｍＭのＩＰＴＧを加え、２０℃で誘導発現培養を８ｈ行った。誘導発現終了後、２０℃、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、細胞を収集した。
組換え大腸菌誘導発現が終了した後、菌体を収集し、細胞（湿重量）４０ｇ／Ｌ、Ｌ−ドパ（濃度４０ｇ／Ｌ）、グルコース（濃度３０ｇ／Ｌ）からなるｐＨ  ８．０の１００ｍｌ反応系において、３５℃で１２時間反応させた。変換終了後、液体クロマトグラフィーによりサルビアノリン酸Ａの産量及び立体配置を測定し、結果を表６に示す。
2021521801.tif 000008
【００６１】
実施例４
文献Large scale validation of an efficient CRISPR/Cas-based multi gene editing protocol in Escherichia coli. Microbial Cell Factories,2017,16(1):68に記載の方法によって、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭゲノム上の対応する遺伝子の前に、大腸菌のグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｐｄＡ）の前の発現強度が中等である、配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される構成的プロモータ（ＰＧ）を追加した。
遺伝子ｇｌｔＳの発現を強化させる場合は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭゲノムをテンプレートとして、プライマーｇｌｔＳ−ＦＦ／ｇｌｔＳ−ＦＲ、ｇｌｔＳ−ｇｐｄＡ−Ｆ／ｇｌｔＳ−ｇｐｄＡ−Ｒ、ｇｌｔＳ−ＲＦ／ｇｌｔＳ−ＲＲを用いて、上流の配列、プロモータ、下流の配列を増幅し、ｇｌｔＳ−ＦＦとｇｌｔＳ−ＲＲをプライマーとして融合し、ｇｐｄＡプロモータを含有する発現カセットを得た。次に、プラスミドｐＣａｓＲｅｄ、ｐＣＲＩＳＰＲ−ｇＤＮＡ（ｇｌｔＳ  ｓｇＲＮＡ含有）とともにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭに導入した後、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡで宿主のｇｌｔＳ遺伝子部位での二本鎖切断を誘発し、組換え酵素ＲｅｄでｇｐｄＡプロモータをｇｌｔＳ遺伝子の前に組み込み、シーケンシングして検証した。
以下の表７には、プライマー名及び配列表番号に対応するインデックスが示されている。
2021521801.tif 000009
実施例１に記載の方法に従って誘導発現を行い、各細胞を収集して変換して分析し、結果を表８に示す。変換系のうち、全細胞変換系は、細胞（湿重量）５  ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸５０ｇ／Ｌ、Ｌ−ドパ  ２０ｇ／Ｌ、ｐＨ  ８．０、温度４０℃、シェーカーの回転数：２５０回転／分、変換の時間：１２時間であった。
2021521801.tif 000010
効果が最も高いＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭ  （ＰＧ−ｇｌｔＳ）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＬ−１と命名した。
遺伝子ｌｌｄＰの発現を強化させる場合は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭゲノムをテンプレートとし、上流、プロモータ、下流の配列を増幅し、ｇｐｄＡプロモータを含有する発現カセットを得た。次に、プラスミドｐＣａｓＲｅｄ、ｐＣＲＩＳＰＲ−ｇＤＮＡ（ｌｌｄＰ  ｓｇＲＮＡ含有）とともにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭに導入した後、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡで宿主のｌｌｄＰ遺伝子部位での二本鎖切断を誘発し、組換え酵素ＲｅｄでｇｐｄＡプロモータをｌｌｄＰ遺伝子の前に組み込み、シーケンシングして検証した。
実施例２に記載の方法に従って誘導発現を行い、各細胞を収集して変換して分析し、結果を表９に示す。変換系のうち、全細胞変換系は、細胞（湿重量）５ｇ／Ｌ、Ｌ−乳酸５０ｇ／Ｌ、Ｌ−ドパ  ２０ｇ／Ｌ、ｐＨ  ８．０、温度４０℃、シェーカーの回転数：２５０回転／分、変換の時間：１２時間であった。
2021521801.tif 000011
効果が最も高いＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭ  （ＰＧ−ｌｌｄＰ）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＬ−２と命名した。
遺伝子ｈｐａＸの発現を強化させる場合は、遺伝子ｌｌｄＰの発現を強化させる方法と同様に、まず、上流、プロモータ、下流の配列を増幅し、プライマーを設計して融合し、ｇｐｄＡプロモータを含有する発現カセットを得た。次に、プラスミドｐＣａｓＲｅｄ、ｐＣＲＩＳＰＲ−ｇＤＮＡ（ｈｐａＸ  ｓｇＲＮＡ含有）とともにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭに導入した後、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡで宿主のｈｐａＸ遺伝子部位での二本鎖切断を誘発し、組換え酵素ＲｅｄでｇｐｄＡプロモータをｈｐａＸ遺伝子の前に組み込み、シーケンシングして検証した。
遺伝子ｍｈｐＴの発現を強化させる場合は、遺伝子ｌｌｄＰの発現を強化させる方法と同様に、まず、上流、プロモータ、下流の配列を増幅し、プライマーを設計して融合し、ｇｐｄＡプロモータを含有する発現カセットを得た。次に、プラスミドｐＣａｓＲｅｄ、ｐＣＲＩＳＰＲ−ｇＤＮＡ（ｍｈｐＴ  ｓｇＲＮＡ含有）とともにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭに導入した後、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡで宿主のｍｈｐＴ遺伝子部位での二本鎖切断を誘発し、組換え酵素ＲｅｄでｇｐｄＡプロモータをｍｈｐＴの前に組み込み、シーケンシングして検証した。
実施例２に記載の方法に従って誘導発現を行い、各細胞を収集して変換して分析し、結果を表１０に示す。変換系のうち、全細胞変換系は、細胞（湿重量）１０ｇ／Ｌ、Ｌ−乳酸２００ｇ／Ｌ、カテコール１０ｇ／Ｌ、ｐＨ  ８．０、温度４０℃、シェーカーの回転数：２５０回転／分、変換の時間：１２時間であった。
2021521801.tif 000012
効果が最も高いＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭ  （ＰＧ−ｌｌｄＰ,ＰＧ−ｈｐａＸ,ＰＧ−ｍｈｐＴ）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＬＨＭと命名した。
【００６２】
実施例５
実施例４に記載の方法に従って、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＬ中のｎａｄＡ、ｒｉｂＦ遺伝子の前に、大腸菌のグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｐｄＡ）の前の発現強度が中等である、配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される構成的プロモータ（ＰＧ）を追加した。次に、プラスミドを導入した。
遺伝子ｎａｄＡの発現を強化させる場合、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＬゲノムをテンプレートとし、プライマーｎａｄＡ−ＦＦ／ｎａｄＡ−ＦＲ、ｎａｄＡ−ｇｐｄＡ−Ｆ／ｎａｄＡ−ｇｐｄＡ−Ｒ、ｎａｄＡ−ＲＦ／ｎａｄＡ−ＲＲを用いて、上流、プロモータ、下流の配列を増幅し、ｎａｄＡ−ＦＦとｎａｄＡ−ＲＲをプライマーとして融合し、ｇｐｄＡプロモータを含有する発現カセットを得た。次に、プラスミドｐＣａｓＲｅｄ、ｐＣＲＩＳＰＲ−ｇＤＮＡ（ｎａｄＡ  ｓｇＲＮＡ含有）とともにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＬに導入した後、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡで宿主のｎａｄＡ遺伝子部位での二本鎖切断を誘発し、組換え酵素ＲｅｄでｇｐｄＡプロモータをｎａｄＡ遺伝子の前に組み込み、シーケンシングして検証した。
遺伝子ｒｉｂＦの発現を強化させる場合、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＬゲノムをテンプレートとし、プライマーｒｉｂＦ−ＦＦ／ｒｉｂＦ−ＦＲ、ｒｉｂＦ−ｇｐｄＡ−Ｆ／ｒｉｂＦ−ｇｐｄＡ−Ｒ、ｒｉｂＦ−ＲＦ／ｒｉｂＦ−ＲＲを用いて、上流、プロモータ、下流の配列を増幅し、ｒｉｂＦ−ＦＦとｒｉｂＦ−ＲＲをプライマーとして融合し、ｇｐｄＡプロモータを含有する発現カセットを得た。次に、プラスミドｐＣａｓＲｅｄ、ｐＣＲＩＳＰＲ−ｇＤＮＡ（ｒｉｂＦ  ｓｇＲＮＡ含有）とともにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＬに導入した後、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡで宿主のｒｉｂＦ遺伝子部位での二本鎖切断を誘発し、組換え酵素ＲｅｄでｇｐｄＡプロモータをｒｉｂＦ遺伝子の前に組み込み、シーケンシングして検証した。
以下の表１１には、プライマー名及び配列表番号に対応するインデックスが示されている。
2021521801.tif 000013
遺伝子改変終了後、共発現プラスミドを導入した。実施例１に記載の方法に従って誘導発現を行い、各細胞を収集して変換して分析し、結果を表１２に示す。変換系のうち、全細胞変換系は、細胞（湿重量）２０ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸１２０  ｇ／Ｌ、Ｌ−ドパ１２０ｇ／Ｌ、ｐＨ  ９．０、温度３０℃、シェーカーの回転数２５０回転／分、変換の時間：２４時間であり、変換結果の比較を表１２に示す。
2021521801.tif 000014
最適なＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＬ（ＰＧ−ｎａｄＡ,ＰＧ−ｒｉｂＦ）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＮＲ−１と命名した。
遺伝子改変終了後、共発現プラスミドを導入した。実施例１に記載の方法に従って誘導発現を行い、各細胞を収集して変換して分析し、結果を表７に示す。変換系のうち、全細胞変換系は、細胞（湿重量）２０ｇ／Ｌ、Ｌ−乳酸１００  ｇ／Ｌ、Ｌ−ドパ１２０ｇ／Ｌ、ｐＨ  ９．０、温度３０℃、シェーカーの回転数２５０回転／分、変換の時間：２４時間であり、変換結果の比較を表１３に示す。
2021521801.tif 000015
最適なＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＬ（ＰＧ−ｎａｄＡ,ＰＧ−ｒｉｂＦ）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＮＲ−２と命名した。
遺伝子改変終了後、共発現プラスミドを導入した。実施例１に記載の方法に従って変換を行い、各細胞を収集して変換して分析し、結果を表１４に示す。変換系のうち、全細胞変換系は、細胞（湿重量）２０ｇ／Ｌ、Ｌ−乳酸２００  ｇ／Ｌ、カテコール２００ｇ／Ｌ、ｐＨ  ９．０、温度３０℃、シェーカーの回転数２５０回転／分、変換の時間：２４時間であった。
2021521801.tif 000016
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最適なＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＬＨＭ（ＰＧ−ｎａｄＡ,ＰＧ−ｒｉｂＦ,ＰＧ−ｐｄｘＪ）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＰＲと命名した。
遺伝子改変終了後、共発現プラスミドを導入した。実施例１に記載の方法に従って誘導発現を行い、各細胞を収集して変換して分析し、結果を表１５に示す。変換系のうち、全細胞変換系は、細胞（湿重量）２０ｇ／Ｌ、グルコース１００  ｇ／Ｌ、Ｌ−ドパ１２０ｇ／Ｌ、ｐＨ  ９．０、温度３０℃、シェーカーの回転数２５０回転／分、変換の時間：２４時間であった。
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最適なＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭ（ＰＧ−ｎａｄＡ,ＰＧ−ｒｉｂＦ）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＲと命名した。
【００６３】
実施例６
実施例１に記載の誘導発現方法により、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＮＲ／ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１−ｅｆｍｄｈｄ−ｂｓｇｄｈ−ｃｍａａｏの誘導発現を完了した後、菌体を収集し、１００ｍｌ反応系では、細胞（湿重量）１ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸１  ｇ／Ｌ、Ｌ−ドパ１ｇ／Ｌ、ｐＨ  ６．０、温度１５℃、シェーカーの回転数：２５０回転／分、変換の時間：１時間とした。測定の結果、Ｒ−サルビアノリン酸Ａは、濃度が９３  ｍｇ／Ｌであり、ｅ．ｅ％＞９９．９であった。
実施例１に記載の誘導発現方法により、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＮＲ／ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１−ｅｆｍｄｈｄ−ｌｌｌｄｈ−ｃｍａａｏの誘導発現を完了した後、菌体を収集し、１００ｍｌ反応系では、細胞（湿重量）１ｇ／Ｌ、Ｌ−乳酸１  ｇ／Ｌ、Ｌ−ドパ１ｇ／Ｌ、ｐＨ  ６．０、温度１５℃、シェーカーの回転数２５０回転／分、変換の時間：１時間とした。測定の結果、Ｒ−サルビアノリン酸Ａは、濃度が９３  ｍｇ／Ｌであり、ｅ．ｅ％＞９９．９であった。
実施例１に記載の誘導発現方法により、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＰＲ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１−ｗｃｌｄｈｌ−ｌｌｌｄｈ＋ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１−ｃｍａａｏ−ｅｈｔｐｌの誘導発現を完了した後、菌体を収集し、１００ｍｌ反応系では、細胞（湿重量）１ｇ／Ｌ、Ｌ−乳酸１  ｇ／Ｌ、カテコール１ｇ／Ｌ、ｐＨ  ６．０、温度１５℃、シェーカーの回転数２５０回転／分、変換の時間：１時間とした。測定の結果、Ｓ−サルビアノリン酸Ａは、濃度が７８  ｍｇ／Ｌであった。
実施例１に記載の誘導発現方法により、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＲ／ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１−ｅｆｍｄｈｄ−ｂｓｇｄｈ−ｃｍａａｏの誘導発現を完了した後、菌体を収集し、１００ｍｌ反応系では、細胞（湿重量）１ｇ／Ｌ、グルコース１  ｇ／Ｌ、Ｌ−ドパ１ｇ／Ｌ、ｐＨ  ６．０、温度１５℃、シェーカーの回転数２５０回転／分、変換の時間：１時間とした。測定の結果、Ｓ−サルビアノリン酸Ａは、濃度が９３  ｍｇ／Ｌ、ｅ．ｅ％＞９９．９であった。
【００６４】
実施例７
実施例１に記載の誘導発現方法により、表１６中の菌株の誘導発現を完了した後、菌体を収集し、１００ｍｌ反応系では、細胞（湿重量）２００ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸２００ｇ／Ｌ、Ｌ−ドパ２００ｇ／Ｌ、ｐＨ  ８．５、温度４０℃、シェーカーの回転数２５０回転／分、変換の時間：４８時間とした。沈殿をすべて希釈して溶解した後測定し、結果を表１６に示す。
2021521801.tif 000019
実施例１に記載の誘導発現方法により、表１７中の菌株の誘導発現を完了した後、菌体を収集し、１００ｍｌ反応系では、細胞（湿重量）２００ｇ／Ｌ、Ｌ−乳酸２００ｇ／Ｌ、Ｌ−ドパ２００ｇ／Ｌ、ｐＨ  ８．５、温度４０℃、シェーカーの回転数２５０回転／分、変換の時間：４８時間とした。沈殿をすべて希釈して溶解した後測定した。
2021521801.tif 000020
実施例１に記載の誘導発現方法により、表１８中の菌株の誘導発現を完了した後、菌体を収集し、１００ｍｌ反応系では、細胞（湿重量）２００ｇ／Ｌ、Ｌ−乳酸２００ｇ／Ｌ、カテコール２００ｇ／Ｌ、ｐＨ  ８．５、温度４０℃、シェーカーの回転数２５０回転／分、変換の時間：４８時間とした。沈殿をすべて希釈して溶解した後測定した。
2021521801.tif 000021
実施例１に記載の誘導発現方法により、表１９中の菌株の誘導発現を完了した後、菌体を収集し、１００ｍｌ反応系では、細胞（湿重量）２００ｇ／Ｌ、グルコース２００ｇ／Ｌ、Ｌ−ドパ２００ｇ／Ｌ、ｐＨ  ８．５、温度４０℃、シェーカーの回転数２５０回転／分、変換の時間：４８時間とした。沈殿をすべて希釈して溶解した後測定した。
2021521801.tif 000022
【００６５】
以上の酵素及びその共発現遺伝子組換え菌の改変及び構築、菌体の培地の組成及び培養方法、全細胞生物変換は、本発明の好適な実施例に過ぎず、本発明を制限するものではなく、理論的には、ほかの細菌、糸状真菌、放線菌、動物細胞についても、ゲノムの改変、複数の遺伝子を共発現させる全細胞の触媒への使用が可能である。本発明の原則及び思想を逸脱することなく、任意の修正、等価置換を行える。
【配列表】
2021521801000001.app
【国際調査報告】
2021521801.tif 000023
2021521801.tif 000024
2021521801.tif 000025
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