(57)【要約】化合物を医薬品有効成分（ＡＰＩ）として使用可能とするのに十分な純度の量のネオサキシトキシンを調製する方法が記載されている。同方法は、ｐＨが７．４〜７．６の範囲にある溶液中でジチオール（ＤＴＴまたはＤＴＢＡのような）を用いることによる、ゴニオトキシン１（ＧＴＸ１）およびゴニオトキシン４（ＧＴＸ４）の未確定混合物の還元的脱スルホン化を含む。反応生成物は、ネオサキシトキシンをジチオールから分離するために、シリカ系弱カチオン交換収着剤を用いて精製される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一定量のｎｅｏＳＴＸを調製する方法であって、前記方法は、
（ａ）反応溶媒中の溶液中で、９７．５％（ｗ／ｗ）を超えるＧＴＸ１，４がｎｅｏＳＴＸに変換された反応生成物を提供するのに十分な時間および温度にて、一定量の精製したＧＴＸ１，４および一定量のジチオールを接触させるステップと；その後、
（ｂ）前記反応生成物をシリカ系弱カチオン交換収着剤に適用し、水性弱有機酸で溶離して、ｎｅｏＳＴＸをジチオールから分離して、一定量のｎｅｏＳＴＸを得るステップと、
を含み、前記溶液のｐＨは７．４〜７．６の範囲である、方法。
【請求項２】
前記反応溶媒は、緩衝酢酸水溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ジチオールは、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）およびジチオブチルアミン（ＤＴＢＡ）からなる群より選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ジチオールは、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法によって調製される一定量のｎｅｏＳＴＸであって、９９．５％（ｗ／ｗ）より大きい純度を有し、前記一定量は１００ｍｇより大きい、ｎｅｏＳＴＸ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゴニオトキシン１（ＧＴＸ１）およびゴニオトキシン４（ＧＴＸ４）の混合物のネオサキシトキシン（ｎｅｏＳＴＸ）への分取スケールでの変換、ならびに医薬品有効成分（ＡＰＩ）として使用するためのｎｅｏＳＴＸの精製に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇａｒｃｉａ−Ａｌｔａｒｅｓの刊行物（２０１７）（非特許文献１）に記載されているように、海洋微小藻類毒素は天然物の最も多様で洗練されたグループの一つを構成する。その例はサキシトキシン（ＳＴＸ）、その類似体および誘導体などの麻痺性貝毒（ＰＳＴ）である。ゴニオトキシン（ＧＴＸ）はＳＴＸの硫酸化類似体であり、海洋細菌は還元的脱離を介してＧＴＸをＳＴＸに変換できる。海洋環境におけるＳＴＸの主要な生産者は真核生物の渦鞭毛藻類である。
【０００３】
ＳＴＸはモノテルペノイドインドールアルカロイドであり、還元プリンのＣ２およびＣ８の位置においてＮＨ２基により形成される２つのグアニジニウム部分を有する三環式３，４−プロピノペルヒドロプリン系を含有する：
【０００４】
【化１】
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【０００５】
ＳＴＸは電位依存性ナトリウムチャネル（ＶＧＳＣ）を遮断するが、また、カルシウムおよびカリウムチャネルに結合する。置換基の性質はサキシトキシン類似体の全体的な毒性に大きく影響する。例えばネオサキシトキシン（ｎｅｏＳＴＸ）におけるようなＮ１のヒドロキシル化は結合親和性において主要な役割を果たさないが、効力を増加させるようである。
【０００６】
先行技術は、局所麻酔薬および鎮痛薬としてのそれらの使用を含めて、ＰＳＴの美容的および治療的用途の開示に満ちている。Ｍｅｚｈｅｒの刊行物（２０１８）（非特許文献２）は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が、特定の状況における全身性経口オピオイドの必要性に代わる徐放性局所麻酔薬の開発を奨励するためのガイダンス文書の開発を計画していることを明らかにしている。米国ＦＤＡが期待していることは、鎮痛薬の長期使用を必要とする患者に安全な代替薬を提供できる、慢性疼痛を治療する新しい非オピオイド薬の開発である。Ｋｏｈａｎｅら（２０００）、Ｒｏｇｒｉｇｕｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏら（２０１１）、Ｔｅｍｐｌｉｎら（２０１５）およびＷｙｌｉｅら（２０１２）の刊行物（非特許文献３〜６）は、これらの用途におけるｎｅｏＳＴＸの使用を開示している。これらの用途の開発および広範な採用を制限するものは、医薬製剤の製造においてＰＳＴの使用を商業的に実行可能にするのに十分な量および十分な純度でのＰＳＴの利用可能性である。
【０００７】
以下の刊行物は、ゴニオトキシン１（ＧＴＸ１）、ゴニオトキシン４（ＧＴＸ４）またはネオサキシトキシン（ｎｅｏＳＴＸ）の調製を開示する。多くの場合、調製は分析スケールであるか、医薬品有効成分（ＡＰＩ）としての調製の使用に必要な量および純度を提供するものではない。
【０００８】
Ｈａｌｌらの刊行物（１９８４）（非特許文献７）は、Ｘ線結晶学による３つの置換基の位置および同一性の確認を開示しており、これらの置換基は、親化合物と共に、原始爪甲に見出される１２のサキシトキシンのアレイを形成する。
【０００９】
Ｄａｉｇｏらの刊行物（１９８５）（非特許文献８）は、カニの標本からのネオサキシトキシン（ｎｅｏＳＴＸ）の抽出および単離を開示している。単離したｎｅｏＳＴＸの用量−死亡時間曲線はサキシトキシン（ＳＴＸ）の曲線と明確に区別できるものであった。
【００１０】
Ｌａｙｃｏｃｋらの刊行物（１９９４）（非特許文献９）は、分析用標準物質として使用するのに十分な量の一般的な麻痺性貝毒（ＰＳＰ）毒素のいくつかを精製する方法を開示している。ＰＳＰ毒素を渦鞭毛藻類Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｅｘｃａｖａｔｕｍ、巨大ホタテガイ（Ｐｌａｇｏｐｅｃｔｅｎ  ｍａｇｅｌｌａｎｉｃｕｓ）肝膵臓およびシアノバクテリアＡｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ  ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅから精製した。
【００１１】
Ｒａｖｎらの刊行物（１９９５）（非特許文献１０）は、Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅのクローンから麻痺性貝毒を抽出するための最適条件であると主張されているものを開示している。麻痺性貝毒は０．０１〜１．０Ｎの濃度範囲の酢酸と塩酸で抽出した。０．０３〜１．０Ｎの範囲の塩酸濃度は、Ｃ１とＣ２毒素の量を急激に減少させ、同時にゴニオトキシン２（ＧＴＸ２）と３（ＧＴＸ３）の量を増加させた。
【００１２】
Ｔｓａｉらの刊行物（１９９７）（非特許文献１１）は、カニの標本におけるテトロドトキシンバイオアッセイによる麻痺毒性の検出を開示している。毒素の部分精製と特性評価により、主な毒素が少量のゴニオトキシン（ＧＴＸ）とネオサキシトキシン（ｎｅｏＳＴＸ）を含むテトロドトキシンであることが実証された。
【００１３】
Ｓｉｕらの刊行物（１９９７）（非特許文献１２）は、Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａにおける個体群動態および毒素産生に対する環境および栄養因子の影響の検討を開示している。この渦鞭毛藻種の成長のための最適条件が、これらの条件下で成長した種の毒素プロファイルと共に開示されている。ＨＰＬＣで検出した毒素プロファイルは、降順に、ＧＴＸ４、ＧＴＸ３、ＧＴＸ１、Ｂ２、ネオサキシトキシン（ｎｅｏＳＴＸ）及びサキシトキシン（ＳＴＸ）を含むことが判明した。
【００１４】
Ｓａｔｏらの刊行物（２０００）（非特許文献１３）は、ＧＴＸ１およびＧＴＸ４のＯ−硫酸基のメチレンへの変換によるネオサキシトキシンの生成を開示している。変換はグルタチオンのようなチオールを用いて達成され、変換の中間体が単離された。
【００１５】
Ｐａｒｋｅｒらの刊行物（２００２）（非特許文献１４）は、３つの異なる高バイオマス培養系における有毒渦鞭毛藻Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍの独立栄養増殖の研究を開示し、増殖、生産性および毒素産生を評価している。この生物を、２リットルの三角フラスコ、０．５リットルのガラス通気管、および４リットルの実験室規模の肺胞パネル光バイオリアクターで、曝気および非曝気で増殖させた。曝気に応答してバイオマスおよび生産性の顕著な増加が観察された。週１回の採取で、最大細胞濃度は３．３×１０５細胞／ｍＬ、平均産生量は０．４×１０４細胞／ｍＬ／日、毒素産生量は約２０μｇ／Ｌ／日と報告されている。
【００１６】
Ｂａｋｅｒらの刊行物（２００３）（非特許文献１５）は、サキシトキシン生産性渦鞭毛藻から単離された細菌株による、ゴニオトキシン４（ＧＴＸ４）と容易に誤認され得る化合物の産生を開示している。
【００１７】
Ｍｉａｏらの刊行物（２００４）（非特許文献１６）はＡｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ  Ｈａｌｉｍの２つの系統からのゴニオトキシン（ＧＴＸ１、ＧＴＸ２、ＧＴＸ３およびＧＴＸ４）の単離を開示している。Ａｍｔｋ４と命名されたＡｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ  Ｈａｌｉｍ株は、ゴニオトキシンの調製に適していると主張されている。
【００１８】
ＪｉａｎｇおよびＪｉａｎｇの刊行物（２００８）（非特許文献１７）はＣｈｌａｍｙｓ  ｎｏｂｉｌｉｓの生殖腺から麻痺性貝毒毒素を抽出するための最適条件の確立を開示している。抽出には０．０４〜１．０ｍｏｌ／Ｌの濃度範囲の酢酸および塩酸を使用している。０．２５〜１．０ｍｏｌ／Ｌの濃度範囲の塩酸の使用は、毒素Ｃ１、Ｃ２およびＧＴＸ５の有意な減少とそれに伴う毒素ＧＴＸ２、３の増加を引き起こすことが示された。３種の不安定な毒素の量は抽出に酢酸を用いても変わらなかった。
【００１９】
Ｌｉｕらの刊行物（２０１０）（非特許文献１８）は、実験室でＡｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａを産生する毒素の培養を開示している。培養８日以内に０．４×１０４細胞／ｍＬの最大細胞密度が得られた。粗抽出物を高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）で分析した結果、主な毒性成分はＣ１／２、ＧＴＸ４、ＧＴＸ５およびｎｅｏＳＴＸで、それぞれ約０．０４５５０、０．２５２６、０．３３９２、０．８２７５および０．１２６６μｍｏｌ／Ｌの濃度であった。
【００２０】
Ｆｏｓｓらの刊行物（２０１２）（非特許文献１９）は、繊維状シアノバクテリアＬｙｎｇｂｙａ  ｗｏｌｌｅｉからの麻痺性貝毒（ＰＳＴｓ）の抽出方法の比較を開示している。このシアノバクテリアによって産生される特有の毒素の市販の標準物質は存在しないので、抽出された毒素を定量することはできなかった。
【００２１】
Ｌｉらの刊行物（２０１３）（非特許文献２０）は、赤潮藻類における麻痺性貝毒（ＰＳＰ）毒素の迅速なスクリーニングおよび同定のための方法を開示している。この方法は、正確な質量データベースと組み合わせた親水性相互作用クロマトグラフィー−高分解能質量分析（ＨＩＬＩＣ−ＨＲ−ＭＳ）を利用している。１０種の一般的なＰＳＰ化合物の検出限界（ＬＯＤ）は１０〜８０ｎｍｏｌ／Ｌの範囲であった。開発した方法は有害藻類における一般的なＰＳＰ毒素の迅速スクリーニングと定性的同定のための有用なツールであると主張されていた。
【００２２】
Ｂｅｒｎａｒｄｉ  Ｂｉｆらの刊行物（２０１３）（非特許文献２１）は、サキシトキシンを含有する有毒細胞抽出物に対するウニの感受性を開示している。
Ｐｏｙｅｒらの刊行物（２０１５）（非特許文献２２）は、硫酸化（ゴニオトキシン）および非硫酸化類似体を含むサキシトキシン類似体を特性化および区別するための分析方法の開発を開示している。親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を用いて硫酸化類似体を分離した。イオン移動度質量分析（ＩＭ−ＭＳ）をイオン気相確認に基づく新しい次元の分離法として用い、サキシトキシン類似体を区別した。ゴニオトキシンには正および負のイオン化モードを用いた。正イオン化モードを非硫酸化類似体に用いた。３つの相補的技術、ＨＩＬＩＣ−ＩＭ−ＭＳを組み合わせることによりサキシトキシン類似体の分離と同定が可能になり、異性体の識別はＨＩＬＩＣ次元で達成され、ＩＭ−ＭＳ次元では非硫酸化類似体が分離された。
【００２３】
Ｒｕｂｉｏらの刊行物（２０１５）（非特許文献２３）は、イオン対に基づく液体クロマトグラフィー方法を用いてサキシトキシンを精製する方法を開示している。サキシトキシンは塩酸を用いて抽出し、トリクロロ酢酸およびヘキサン／ジエチルエーテル（９７／３）で処理した後、硫酸アンモニウムで処理する。サキシトキシンの純粋画分を収集するためにサンプルを半分取ＨＰＬＣで分析し、これらの画分を固相カチオン交換ＳＴＸ抽出カラムで溶出した。精製されたサキシトキシンは安定で均一であることが報告されており、ＬＣ−ＭＳ−ＭＳによりその同一性が確認された。デカルバモイルサキシトキシンのネオサキシトキシンなどの類似体は、精製されたサキシトキシンには存在しないことが報告された。
【００２４】
Ｃｈｅｎらの刊行物（２０１６）（非特許文献２４）は、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）および親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）のシリアルカップリングを高分解能質量分析（ＨＲ−ＭＳ）と組み合わせて、有害藻類ブルーム（ＨＡＢｓ）の藻類における既知の親油性及び親水性毒素の同時スクリーニング及び同定に適用することを開示している。超音波支援抽出（ＵＡＥ）を用いて親油性及び親水性毒素を同時に抽出した。この刊行物は、既知の海洋藻類毒素の正確な質量リストと組み合わせたＨＰＬＣ／ＨＩＬＩＣ−ＨＲ−ＭＳが、海洋有害藻類における既知の毒素の異なるクラスのスクリーニングのための強力なツールとして使用できることを示した。
【００２５】
Ｃｈｏらの刊行物（２０１６）（非特許文献２５）は、質量分析と組み合わせた親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を用いた、カラムスイッチングおよび二段階勾配溶出による毒素産生性渦鞭毛藻の粗抽出物の分析を開示している。得られたデータは、サキシトキシン生合成とシャント経路の初期段階が渦鞭毛藻類とシアノバクテリアで同じであるという仮説を支持するものであると、同刊行物は述べている。
【００２６】
Ｂｅａｃｈらの刊行物（２０１８）（非特許文献２６）には、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）−タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）法を用いた魚介類中の麻痺性貝毒、テトロドトキシンおよびドーモイ酸の高感度なマルチクラス分析が開示されている。５Ｍギ酸を含む新規の強酸性バックグラウンド電解質を用いて分析物のプロトン化を最大化し、ｐＫａ値が異なる他のクラスの小極性分子の同時分析に一般的に適用できると主張されている。
【００２７】
ＫｅｌｌｍａｎｎおよびＮｅｉｌａｎの刊行物（２００７）（特許文献１）は、組換え大腸菌株におけるネオサキシトキシンおよびその類似体の発酵生産を開示している。
Ｌａｇｏｓ  Ｇｏｎｚａｌｅｓの刊行物（２０１０、２０１５ａ、２０１５ｂ、および２０１６）（特許文献２〜６）は、連続培養で生産されたシアノバクテリアからのフィコトキシンの精製を開示している。フィコトキシンは主に細菌から分離されるが、培地からも分離できる。開示されたプロセスの一実施形態において、ネオサキシトキシン（ｎｅｏＳＴＸ）およびサキシトキシン（ＳＴＸ）のみが生成されている。開示されたプロセスの別の実施形態において、ゴニオトキシン２（ＧＴＸ２）およびゴニオトキシン３（ＧＴＸ３）のみが生成されている。
【００２８】
Ｗａｎｇらの刊行物（２０１０）（特許文献７）は、麻痺性貝毒（ＰＳＰ）標準溶液の調製を開示している。貝類原料から不純物を除去し、貝肉を採取し、蒸留水と０．１〜０．３ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液を加え、ｐＨを１．５〜５．０に調整し、ホモジナイズしてホモジネートを得、−２０℃で３０分〜２４時間予冷し、凍結乾燥してコアサンプルを取得し、粉砕し、ふるいにかけ、−２０℃で１０分〜６時間予冷し、凍結乾燥して標準サンプルを得ることにより、標準溶液は調製されている。調製方法は、原材料コストが低く、調製プロセスが簡単であるという利点があると主張されている。
【００２９】
ＸｉｏｎｇおよびＱｉｕの刊行物（２００９）（特許文献８）は、治療効果を改善し、抗腫瘍剤の副作用を低減するためのビグアニドプリン誘導体、それらの塩およびエステルの適用を開示している。ビグアニドプリン誘導体はサキシトキシン類似体である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３０】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２０１７／１３７６０６号
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２０１０／１０９３８６号
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２０１０／１０９３８７号
【特許文献４】米国特許第８９５７２０７号明細書
【特許文献５】米国特許第８９５２１５２号明細書
【特許文献６】米国特許第９２４９１５０号明細書
【特許文献７】中国特許出願公開第１０１８５８８３３号明細書
【特許文献８】中国特許出願公開第１０１５１３４０８号明細書
【非特許文献】
【００３１】
【非特許文献１】Ｇａｒｃｉａ−Ａｌｔａｒｅｓ（２０１７）、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ  ｍａｒｉｎｅ  ｔｏｘｉｎｓ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７８、３５−７５
【非特許文献２】Ｍｅｚｈｅｒ（２０１８）、ＦＤＡ  ｔｏ  ｒｅｐｌａｃｅ  ａｎａｌｇｅｓｉｃ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｎｅｗ  ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｆｏｃｕｓ  Ｎｅｗｓ  Ａｒｔｉｃｌｅ（ｗｗｗ．ｒａｐｓ．ｏｒｇ／ｎｅｗｓ−ａｎｄ−ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｎｅｗｓ−ａｒｔｉｃｌｅｓ／２０１８／８／ｆｄａ−２−ｒｅｐｌａｃｅ−ａｎａｌｇｅｓｉｃ−ｄｒｕｇ−ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ−ｇｕｉｄａｎｃｅ）
【非特許文献３】Ｋｏｈａｎｅら（２０００）、Ｔｈｅ  ｌｏｃａｌ  ａｎｅｓｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓａｘｉｔｏｘｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ｒａｔ  ｓｃｉａｔｉｃ  ｎｅｒｖｅ  ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ｖｉｖｏ、Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ  ａｎｄ  Ｐａｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２５、１、５２−５９
【非特許文献４】Ｒｏｇｒｉｇｕｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏら（２０１１）、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｎｅｏｓａｘｉｔｏｘｉｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ  ｖｉａ  ｐｏｒｔ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｇｅｓｉａ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｌａｐａｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｅｃｔｏｍｙ，ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ  ｔｒｉａｌ、Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ  ａｎｄ  Ｐａｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３６、２、１０３
【非特許文献５】Ｔｅｍｐｌｉｎら（２０１５）、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｄｅｘ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ，ｗｉｔｈ  ａｎｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ、１２３、４、８８６
【非特許文献６】Ｗｙｌｉｅら（２０１２）、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ，ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ，ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｎｅｏｓａｘｉｔｏｘｉｎ  ｉｎ  ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ−ａｎｅｓｔｈｅｔｉｚｅｄ  ｓｈｅｅｐ、Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ  ａｎｄ  Ｐａｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３７、２、１０３
【非特許文献７】Ｈａｌｌら（１９８４）、Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｓａｘｉｔｏｘｉｎ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｏｘｉｎｓ  Ｃ３  ａｎｄ  Ｃ４，ａｎｄ  ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｎｅｏｓａｘｉｔｏｘｉｎ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２５（３３）、３５３７−８
【非特許文献８】Ｄａｉｇｏら（１９８５）、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｏｍｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｎｅｏｓａｘｉｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  ａ  ｘａｎｔｈｉｄ  ｃｒａｂ  Ｚｏｓｉｍｕｓ  ａｅｎｅｕｓ、日本水産学会誌、５１（２）、３０９−１３
【非特許文献９】Ｌａｙｃｏｃｋら（１９９４）、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ  ｔｏｘｉｎ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ、２（４）、１７５−８３
【非特許文献１０】Ｒａｖｎら（１９９５）、Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ、７（６）、５８９−９４
【非特許文献１１】Ｔｓａｉら（１９９７）、Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｘａｎｔｈｉｄ  ｃｒａｂｓ，Ａｔｅｒｇａｔｉｓ  ｆｌｏｒｉｄｕｓ  ａｎｄ  Ｄｅｍａｎｉａ  ｒｅｙｎａｕｄｉ，ｏｆ  Ｔａｉｗａｎ、Ｔｏｘｉｃｏｎ、３５（８）、１３２７−１３３５
【非特許文献１２】Ｓｉｕら（１９９７）、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｗｈｉｃｈ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ、Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ、３５２、１１７−１４０
【非特許文献１３】Ｓａｔｏら（２０００）、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｏｎｙａｕｔｏｘｉｎｓ  ｉｎｔｏ  ｓａｘｉｔｏｘｉｎｓ  ｂｙ  ｔｈｉｏｌｓ、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０，１７８７−１７８９
【非特許文献１４】Ｐａｒｋｅｒら（２００２）、Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｃ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）ｕｓｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｂｉｏｍａｓｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ、１４（５）、３１３−３２４
【非特許文献１５】Ｂａｋｅｒ（２００３）、ＧＴＸ４  ｉｍｐｏｓｔｅｒｓ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｂｙ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ  ＳＦ／ＰＳ  ａｎｄ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ／Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ＰＴＢ−１，ｓｙｍｂｉｏｎｔｓ  ｏｆ  ｓａｘｉｔｏｘｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｔｏｘｉｃｏｎ、４１（３）、３３９−３４７
【非特許文献１６】Ｍｉａｏら（２００４）、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｏｎｙａｕｔｏｘｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ  Ｈａｌｉｍ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１３（２）、１０３−１０５
【非特許文献１７】ＪｉａｎｇおよびＪｉａｎｇ（２００８）、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ  ｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ、Ｆｅｎｘｉ  Ｈｕａｘｕｅ、３６（１１）、１４６０−１４６４
【非特許文献１８】Ｌｉｕら（２０１０）、Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ  ｔｏｘｉｎｓ、Ｓｈｕｉｃｈａｎ  Ｘｕｅｂａｏ、３４（１１）、１７８３−１７８８
【非特許文献１９】Ｆｏｓｓら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｌｙｎｇｂｙａ  ｗｏｌｌｅｉ  ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｐａｒａｌｙｔｉｃ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｔｏｘｉｎｓ、Ｔｏｘｉｃｏｎ、６０（６）、１１４８−１１５８
【非特許文献２０】Ｌｉら（２０１３）、Ｒａｐｉｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ  ｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  ｒｅｄ  ｔｉｄｅ  ａｌｇａｅ  ｕｓｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｃｃｕｒａｔｅ−ｍａｓｓ  ｄａｔａｂａｓｅ、Ｆｅｎｘｉ  Ｈｕａｘｕｅ、４１（７）、９７９−９８５
【非特許文献２１】Ｂｅｒｎａｒｄｉ  Ｂｉｆら（２０１３）、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｓｉｄｓ  ａｎｄ  ｓｅａ  ｕｒｃｈｉｎｓ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ  ｓａｘｉｔｏｘｉｎｓ、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、３６（３）、８１９−８２５
【非特許文献２２】Ｐｏｙｅｒら（２０１５）、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓａｘｉｔｏｘｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ  ｔｒａｖｅｌｉｎｇ  ｗａｖｅ  ｉｏｎ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、５０（１）、１７５−１８１
【非特許文献２３】Ｒｕｂｉｏら（２０１５）、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓａｘｉｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｃｈｉｌｅｎｓｉｓ  ｏｆ  ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃｈｉｌｅ、Ｔｏｘｉｃｏｎ、１０８、１４７−１５３
【非特許文献２４】Ｃｈｅｎら（２０１６）、Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｒｉｎｅ  ｈａｒｍｆｕｌ  ａｌｇａｅ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｅｒｉａｌｌｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、９１４、１１７−１２６
【非特許文献２５】Ｃｈｏら（２０１６）、Ｃｏｌｕｍｎ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓａｘｉｔｏｘｉｎ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ、１４７４、１０９−１２０
【非特許文献２６】Ｂｅａｃｈら（２０１８）、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ−ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｃｌａｓｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌａｒ  ｍａｒｉｎｅ  ｔｏｘｉｎｓ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１０（２２）、５４０５−５４２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３２】
本発明の目的は、医薬製剤の製造に使用するのに十分な量および十分な純度のネオサキシトキシンを調製する方法を提供することである。この目的は、少なくとも有用な選択肢を提供するために、目的の代替において読み取られる。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
第１の態様において、本発明は、以下のステップ：
１．反応溶媒中の溶液中で、一定量の（ａ  ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｆ）ＧＴＸ１，４および一定量のジチオールを、９７．５％（ｗ／ｗ）を超えるＧＴＸ１，４がｎｅｏＳＴＸに変換された反応生成物を提供するのに十分な時間および温度で接触させるステップと；その後、
２．反応生成物をシリカ系弱カチオン交換収着剤（ｓｏｒｂｅｎｔ）に適用し、水性弱有機酸で溶離して、ｎｅｏＳＴＸをジチオールから分離し、一定量のｎｅｏＳＴＸを得るステップと、
を含み、ここで、溶液のｐＨは７．４〜７．６の範囲である、一定量のｎｅｏＳＴＸを調製する方法を提供する。
【００３４】
好ましくは、反応溶媒は、緩衝酢酸水溶液（ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ａｑｕｅｏｕｓ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）である。
好ましくは、ジチオールは、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）およびジチオブチルアミン（ＤＴＢＡ）からなる群から選択される。より好ましくは、ジチオールはジチオトレイトール（ＤＴＴ）である。
【００３５】
好ましくは、ｎｅｏＳＴＸの量は１００ｍｇより大きく、純度は９９．５％（ｗ／ｗ）より大きい。
好ましくは、一定量のＧＴＸ１，４は、少なくとも９７．５％（ｗ／ｗ）の純度である。より好ましくは、一定量のＧＴＸ１，４は、少なくとも９８．７５％（ｗ／ｗ）の純度である。より好ましくは、一定量のＧＴＸ１，４は、少なくとも９９％（ｗ／ｗ）の純度である。
【００３６】
好ましくは、一定量のｎｅｏＳＴＸを調製する方法は、ほぼ定量的な方法である。
本発明の方法は、以前には得られなかった量および純度（Ｌａｇｏｓ  Ｇｏｎｚａｌｅｓ（２０１０、２０１５ａ、２０１５ｂ、および２０１６）（特許文献２〜６）を参照）のｎｅｏＳＴＸのバッチ調製を提供する。
【００３７】
本明細書の説明及び特許請求の範囲において、以下の略語、頭字語、語句及び用語は、提供された意味を有する：「バッチ調製（ｂａｔｃｈ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」とは、不連続に調製されたことを意味する；「生合成」とは、生物又は細胞内で調製されたものを意味する；「ＣＡＳ  ＲＮ」とは、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＣＡＳ、オハイオ州コロンバス）登録番号を意味する；「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「〜を特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」を意味し、いかなる追加の要素、成分または工程も排除するものではない；「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」とは、不純物及びその他の付随的なものを除き、特定されていない元素、成分又は工程を除くことを意味する；「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、物質的限定である元素、成分又は工程を除くことを意味する；「ＧＴＸ」とは、ゴニオトキシンを意味し；「ＧＴＸ１」とは、ゴニオトキシン１［ＣＡＳ  ＲＮ６０７４８−３９−２］を意味し；「ＧＴＸ４」とは、ゴニオトキシン４［ＣＡＳ  ＲＮ６４２９６−２６−０］を意味し；「ＧＴＸ１，４」とは、ゴニオトキシン１およびゴニオトキシン４を含む未確定の混合物（ｕｎｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｍｉｘｔｕｒｅ）（固体として、または溶液中に）を意味し；「ＧＴＸ２，３」とは、ゴニオトキシン２およびゴニオトキシン３を含む未確定の混合物（固体として、または溶液中に）を意味し；「ほぼ定量的な（ｎｅａｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）」は、９７．５％（ｗ／ｗ）を超える基質（例えばＧＴＸ１，４）が、生成物（例えばｎｅｏＳＴＸ）に変換されることを意味し；「ｎｅｏＳＴＸ」は、（３ａＳ，４Ｒ，１０ａＳ）−２−アミノ−４−［［（アミノカルボニル）オキシ］メチル］−３ａ，４，５，６，８，９−ヘキサヒドロ−５−ヒドロキシ−６−イミノ−１Ｈ，１０Ｈ−ピロロ［１、２−ｃ］プリン−１０，１０−ジオール［ＣＡＳ  ＲＮ６４２９６−２０−４］を意味し；「分取スケール（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｃａｌｅ）」とは、１００ｍｇを超える、バッチで調製されたものを意味し；そして「半合成」とは、少なくとも部分的に精製された生合成前駆体の化学的変換によって調製されることを意味する。定義された用語のいずれかの同源語（ｐａｒｏｎｙｍ）は、対応する意味を有する。
【００３８】
「第１の」、「第２の」、「第３の」等の用語は、発明の概要及び特許請求の範囲に定義された事項の要素、特徴もしくは整数に関して、または本発明の代替的な実施形態に関して使用されるが、優先順位を意味することを意図するものではない。試薬の濃度または比が規定される場合、規定される濃度または比は、試薬の初期濃度または比である。値が小数第１位又はそれ以下まで表される場合、標準的な丸め方が適用される。例えば、１．７には１．６５０００・・・から１．７４９９９・・・までの範囲が含まれる。単離されたｎｅｏＳＴＸの純度は、方法３［Ｆ．分析］に従って決定される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ゴニオトキシン（ＧＴＸ１（◆）およびＧＴＸ４（■））の濃度の時間に対するプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下の実施例および添付の図面ページを参照して本発明を以下に説明する。
Ｌａｙｃｏｃｋらの刊行物（１９９４）（非特許文献９）は、ホタテガイ（Ｐｌａｃｏｐｅｃｔｅｎ  ｍａｇａｌｌａｎｉｃｕｓ）の肝膵臓からのＧＴＸ１およびＧＴＸ４の抽出および精製を開示している。
【００４１】
組織（１キログラム）を、１Ｌの０．１Ｍ  ＨＣｌ中で、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）組織ホモジナイザー（モデルＰＴ１０／３５、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃａｎａｄａ  Ｌｔｄ、オンタリオ州レックスデール）を用いてホモジナイズした。スラリーを３０分間で８０℃に加熱し、次いで冷却し、遠心分離（５，０００ｇ、２０分）して沈殿したタンパク質を除去した。上澄み液をジクロロメタン（各５００ｃｃ）で２回抽出した。水層を回転蒸発によって２００ｍｌに濃縮し、次いで活性炭（Ｎｏｒｉｔｅ，Ａ、５００ｇ、ＢＤＨ  Ｌｔｄ．）およびセライト（５００ｇ、Ｊｏｈｎｓ−Ｍａｎｖｉｌｌｅ）の混合物のカラム（内径１０ｃｍ×１５ｃｍ）に注いだ。カラムを２０％エタノールおよび１％酢酸の溶液で洗浄した。１リットルの画分を複数個集め、ＨＰＬＣ−ＦＤによって毒素濃度をモニターした。毒素含有画分を回転蒸発によって濃縮し、凍結乾燥した。
【００４２】
この刊行物はさらに、いずれのゴニオトキシンについてもＢｉｏ−Ｒｅｘ（登録商標）−７０の分離が完全ではなかったことを開示している。しかしながら、ＧＴＸ２を繰り返し除去し、混合物を再平衡化することにより、ＧＴＸ１およびＧＴＸ４の画分を不純にする（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ）ＧＴＸ２およびＧＴＸ３の割合は徐々に減少した。
【００４３】
Ｌａｙｃｏｃｋらの刊行物（１９９５）は、水溶液中に１００ｍＭの濃度のジチオトレイトールが、ｐＨ８．５でＧＴＸ１，４をＮｅｏＳＴＸおよび少量（１０％未満）のネオサキシトキシノール（キャピラリー電気泳動によって測定される）に迅速に変換することを開示している。対照的に、分析的スケールとは対照的に、分取スケールで変換を行う場合、還元剤としてジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いると、最適ｐＨはより低く、７．２〜７．８の範囲、より具体的には７．４〜７．６であることが以下に決定されている。
【００４４】
溶液中では、ＧＴＸ１およびＧＴＸ４は、一対のエピマーとして存在すると考えられており、そのうちのＧＴＸ１が熱力学的に最も有利である。エピマー化はＣ−１２でのケト−エノール平衡を介してほとんどの条件下で起こると考えられている。スキームＩに従う想定した２段階反応機構の第１段階では、ジチオール（Ｒ−ＳＨ）のチオール基がケト型（Ｉ）の求電子性Ｃ−１２を攻撃してチオヘミケタール（ＩＩ）を生成する。チオエーテル（ＩＶ）への変換は、脱離基（Ｏ−スルフェート）が硫黄原子に対してアンチ配向しているとき、エピスルホニウムイオン中間体（ＩＩＩ）を経て起こる（反応性エピマーＧＴＸ１のように）。提唱した反応機構の第２段階において、ジチオールのチオール基は、チオエーテル（ＩＶ）の硫黄と反応してジスルフィドを形成し、それによって、ｎｅｏＳＴＸ（Ｖ）に容易に水和するエノラートを生成する。
【００４５】
【化２】
2021526539.tif 000003
【００４６】
以下の実施例に記載されるＧＴＸ１，４のｎｅｏＳＴＸへの変換のための最適ｐＨは、約７．５であると決定されており、理論に束縛されることを望まないが、このｐＨは、（ｉ）ゴニオトキシンエピマー間のエピマー化の最適速度、および（ｉｉ）Ｃ−１２における求電子性および還元剤として使用されるジチオールの脱プロトン化の最適度、の両方を確実にすると考えられる。ジチオトレイトール（ＤＴＴ）およびジチオブチルアミン（ＤＴＢＡ）のようなジチオールの使用は、グルタチオン（ＧＳＨ）およびメルカプトエタノール（ＭＥ）のようなモノチオールの使用よりも好ましい（Ｓａｋａｍｏｔｏら（２０００）、Ｓａｔｏら（２０００）参照）。ジチオールを使用すると、より高い変換率が得られ、分取スケールでのｎｅｏＳＴＸの製造における使用により適したものとなった。
【００４７】
過剰のジチオール、リン酸ナトリウム緩衝液および未反応のＧＴＸ１，４は、カチオン交換クロマトグラフィーの使用により、ｎｅｏＳＴＸ含有変換生成物から最も便利に除去されることが見出された。シリカ系弱カチオン交換収着剤Ｓｅｐｒａ（商標）ＷＣＸは、ＤＴＴを保持しないことが明らかとなっているので、適切な収着剤であると決定された。高分子系弱カチオン交換収着剤Ｓｔｒａｔａ−Ｘ（商標）ＣＷ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）の試験により、この収着剤は分取スケールでの変換生成物からのｎｅｏＳＴＸの精製には不適切であることが判明した。この収着剤を用いると、過剰のジチオールはイオン交換と逆相機構の両方によって保持される。過剰のＤＴＴの一部はアセトニトリル／水のような有機溶媒で溶出されるが、さらなる部分は、この収着剤を用いる場合、ｎｅｏＳＴＸの精製を妨げる１Ｍ酢酸で溶出される。
【００４８】
Ａ．分析
ＧＴＸ１，４またはｎｅｏＳＴＸのサンプルを２００μｇ／ｍＬの濃度に１０ｍＭ酢酸で希釈する。次いで、希釈したサンプルを８％アセトニトリル／０．２５％酢酸でさらに１００倍に希釈して、定量分析のために２０ｍｇ／ｍＬの濃度で生成物の溶液を得る。多数の参照用麻痺性貝毒（ＰＳＴｓ）を含む混合標準物質も同じ溶媒中で調製した。希釈した生成物の２μＬの溶液（２０ｎｇ／ｍＬ）を、温度を４０℃に維持したオートサンプラーを用いて、０．６ｍＬ／分の流速で溶出する１．７μｍのウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）のＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨアミドのカラム（２．１×１００ｍｍ）上に、温度を６０℃に維持しながら注入する。カラムは、注入後６分間、８０％移動相Ｂ／２０％移動相Ｃで段階的に溶出し、その後０．５０分間、５５％移動相Ｂ／４５％移動相Ｃで溶出し、その後８０％移動相Ｂ／２０％移動相Ｃに戻す。溶出液は、ＥＳＩ−イオン化モードおよびＥＳＩ＋イオン化モードで質量分析モニタリングによってモニターする。
【００４９】
Ｂ．変換
１８３ｍｇの量（遊離塩基として）のＧＴＸ１，４を全容量（ｔｏｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅ）５ｍＬの希酢酸に溶解し、容量４５ｍＬの０．２Ｍリン酸緩衝液とｐＨ７．５で１００ｍＬの丸底フラスコ中で混合する。混合物を氷上に置き、固体炭酸ナトリウムを撹拌しながら添加してｐＨを６．８〜７．５に調整する。ｐＨ調整した混合物に１．５ｇの量のジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加え、反応混合物を含有する丸底フラスコを超音波浴に入れてその溶解を促進した後、５０℃の温度に維持された水浴に移す。１０μＬの量のアリコートを反応混合物から取り出して水浴に移し（Ｔ＝０）、その後定期的に（１５分ごと）に移す。反応混合物から取り出した直後に、アリコートを４９０μＬの容量の８０％アセトニトリル０．２５％酢酸を添加して５０倍に希釈し、（Ａ．分析）に記載のようにＬＣ−ＭＳにより分析して、ほぼリアルタイムで反応の進行をモニターする（図１）。４５分間５０℃でインキュベートした後、丸底フラスコを氷スラリーに移して反応混合物を冷却する。これらの条件下で、ＧＴＸ１，４のｎｅｏＳＴＸへのほぼ定量的な変換が１００％近い収率で観察された。
【００５０】
Ｃ．単離
変換生成物を、空のフラッシュカートリッジ（Ｇｒａｃｅ）に充填した３９ｇの量のＳｅｐｒａ（商標）ＷＣＸ上に装填し、２５０ｍＬの容量の５０％（ｗ／ｗ）アセトニトリル、次いで２５０ｍＬの容量の脱イオン水で前処理する（ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）。変換生成物は、排出液（約２００ｍＬ）を収集しながら、脱イオン水ですすいで充填されたカートリッジに装填される。変換生成物を４℃で保存する間に形成された結晶の溶解は、最少量の脱イオン水を加えることによって達成される。次いで、装填された充填カートリッジを５０ｍＬ／分の速度で、合計容量１．５Ｌで溶出し、次いで、１Ｍ酢酸への連続勾配を用いて２０分かけて溶出し、２０５ｎｍおよび２５４ｎｍでのＵＶ吸光度をモニターしながら、１０ｍＬの容量の溶出液を画分として順次収集する。
【００５１】
２０５ｎｍにおけるＵＶ吸収を示す５μＬの量の画分を８０％アセトニトリル０．２５％酢酸中で１０万倍に希釈し、ＬＣ−ＭＳにより分析した。ｎｅｏＳＴＸを含むことが確認された画分を合わせ、−７０℃で凍結し、凍結乾燥する。乾燥したｎｅｏＳＴＸを少量の１０ｍＭに溶解し、予め秤量した１０ｍＬガラスバイアルに移し、１０μＬの容量を分析する。上記方法に従って調製したｎｅｏＳＴＸのバッチ（ＣＮＣ０００６３）の純度および量を表１に示す。
【００５２】
【表１】
2021526539.tif 000004
【００５３】
表１：上記した半合成法に従って調製したｎｅｏＳＴＸのバッチ（ＣＮＣ０００６３）の仕様。
本発明を実施形態または実施例を参照して説明したが、本発明の範囲から逸脱することなく、これらの実施形態または実施例に変形および修正を加えることができることを理解されたい。特定の要素、特徴、または整数に既知の均等物が存在する場合、そのような均等物は、本明細書で具体的に言及されているかのように組み込まれる。参照された刊行物に開示され、参照された刊行物から選択された要素、特徴、または整数を含む実施形態または実施例に対する変形および修正は、特に権利放棄されない限り、本発明の範囲内である。本発明によって提供され、詳細な説明で論じられる利点は、本発明のこれらの異なる実施形態において、代替として、または組み合わせて提供され得る。
【００５４】
参考文献
ベイカー（Ｂａｋｅｒ）（２００３）、「ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｂｙ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ  ＳＦ／ＰＳ  ａｎｄ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ／Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ＰＴＢ−１，ｓｙｍｂｉｏｎｔｓ  ｏｆ  ｓａｘｉｔｏｘｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｓｐｐ．（ＧＴＸ４インポスタ：サキシトキシン産生Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｓｐｐ．の共生体であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ  ＳＦ／ＰＳおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ／Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ＰＴＢ−１によって合成された蛍光化合物の特性化）」、Ｔｏｘｉｃｏｎ、４１（３）、３３９−３４７。
【００５５】
ビーチ（Ｂｅａｃｈ）ら（２０１８）、「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ−ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｃｌａｓｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌａｒ  ｍａｒｉｎｅ  ｔｏｘｉｎｓ（極性海洋毒素のマルチクラス分析のためのキャピラリー電気泳動−タンデム質量分析）」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１０（２２）、５４０５−５４２０。
【００５６】
ベルナルディ・ビフ（Ｂｅｒｎａｒｄｉ  Ｂｉｆ）ら（２０１３）、「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｓｉｄｓ  ａｎｄ  ｓｅａ  ｕｒｃｈｉｎｓ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ  ｓａｘｉｔｏｘｉｎｓ（サキシトキシンに曝露されたアミ目およびウニの評価）」、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、３６（３）、８１９−８２５。
【００５７】
チェン（Ｃｈｅｎ）ら（２０１６）、「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｒｉｎｅ  ｈａｒｍｆｕｌ  ａｌｇａｅ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｅｒｉａｌｌｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（高分解能質量分析を備えた直列結合逆相および親水性相互作用液体クロマトグラフィー分離システムを使用した海洋有害藻類の親油性および親水性毒素の同時スクリーニング）」、Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、９１４、１１７−１２６。
【００５８】
チョ（Ｃｈｏ）ら（２０１６）、「Ｃｏｌｕｍｎ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓａｘｉｔｏｘｉｎ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ（渦鞭毛藻中のサキシトキシン類似体およびそれらの生合成中間体の分析のための親水性相互作用クロマトグラフィー−タンデム質量分析と組み合わせたカラムスイッチング）」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ、１４７４、１０９−１２０。
【００５９】
ダイゴ（Ｄａｉｇｏ）ら（１９８５）、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｏｍｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｎｅｏｓａｘｉｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  ａ  ｘａｎｔｈｉｄ  ｃｒａｂ  Ｚｏｓｉｍｕｓ  ａｅｎｅｕｓ（ウモレオウギガニＺｏｓｉｍｕｓ  ａｅｎｅｕｓからのネオサキシトキシンの分離といくつかの特性）」、日本水産学会誌、５１（２）、３０９−１３。
【００６０】
フォス（Ｆｏｓｓ）ら、「Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｌｙｎｇｂｙａ  ｗｏｌｌｅｉ  ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｐａｒａｌｙｔｉｃ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｔｏｘｉｎｓ（Ｌｙｎｇｂｙａ  ｗｏｌｌｅｉ由来の麻ひ性貝毒の抽出および分析技術の調査）」、Ｔｏｘｉｃｏｎ、６０（６）、１１４８−１１５８。
【００６１】
ガルシア−アルタレス（Ｇａｒｃｉａ−Ａｌｔａｒｅｓ）（２０１７）、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ  ｍａｒｉｎｅ  ｔｏｘｉｎｓ（微細藻類の海洋毒素の構造的多様性）」、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７８、３５−７５。
【００６２】
ホール（Ｈａｌｌ）ら（１９８４）、「Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｓａｘｉｔｏｘｉｎ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｏｘｉｎｓ  Ｃ３  ａｎｄ  Ｃ４，ａｎｄ  ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｎｅｏｓａｘｉｔｏｘｉｎ（サキシトキシンに関連する渦鞭毛藻神経毒：毒素Ｃ３およびＣ４の構造、およびネオサキシトキシンの構造の確認）」、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２５（３３）、３５３７−８。
【００６３】
ジャン（Ｊｉａｎｇ）およびジャン（Ｊｉａｎｇ）（２００８）、「Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ  ｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ（甲殻類の麻ひ性貝中毒毒素の抽出方法の調査）」、Ｆｅｎｘｉ  Ｈｕａｘｕｅ、３６（１１）、１４６０−１４６４。
【００６４】
ケルマン（Ｋｅｌｌｍａｎｎ）およびネイラン（Ｎｅｉｌａｎ）（２００７）、「Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｏｓａｘｉｔｏｘｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｎａｌｏｇｓ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎｓ（組換え大腸菌株におけるネオサキシトキシンおよびその類似体の発酵生産）」、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５３０７７号（国際公開第ＷＯ２０１７／１３７６０６Ａ１号）
コハネ（Ｋｏｈａｎｅ）ら（２０００）、「Ｔｈｅ  ｌｏｃａｌ  ａｎｅｓｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓａｘｉｔｏｘｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ｒａｔ  ｓｃｉａｔｉｃ  ｎｅｒｖｅ  ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ｖｉｖｏ（インビボにおけるラットの坐骨神経ブロックに対するサキシトキシン同族体の局所麻酔特性および毒性）」、Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ  ａｎｄ  Ｐａｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２５、１、５２−５９。
【００６５】
ラゴズ・ゴンザレス（Ｌａｇｏｓ  Ｇｏｎｚａｌｅｓ）（２０１０）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ  ｐｈｙｃｏｔｏｘｉｎｓ，ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｐｈｙｃｏｔｏｘｉｎｓ，ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｅ  ｔｈｅｒｅｏｆ（フィコトキシンを精製するための方法、精製されたフィコトキシンを含む医薬組成物、およびそれらの使用方法）」、国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５１１８７号（国際公開第ＷＯ２０１０／１０９３８６Ａ１号）および国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５１１８８号（国際公開第ＷＯ２０１０／１０９３８７Ａ１号）。
【００６６】
ラゴズ・ゴンザレス（２０１５ａ）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｐｈｙｃｏｔｏｘｉｎｓ（フィコトキシンの製造方法）」、米国特許第８９５７２０７Ｂ２号明細書。
【００６７】
ラゴズ・ゴンザレス（２０１５ｂ）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ  ｐｈｙｃｏｔｏｘｉｎｓ，ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｐｈｙｃｏｔｏｘｉｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｅ  ｔｈｅｒｅｏｆ（フィコトキシンを精製するための方法、精製されたフィコトキシンを含む医薬組成物、およびそれらの使用方法）」、米国特許第８９５２１５２Ｂ２号明細書。
【００６８】
ラゴズ・ゴンザレス（２０１６）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ  ｐｈｙｃｏｔｏｘｉｎｓ，ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｐｈｙｃｏｔｏｘｉｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｅ  ｔｈｅｒｅｏｆ（フィコトキシンを精製するための方法、精製されたフィコトキシンを含む医薬組成物、およびそれらの使用方法）」、米国特許第９２４９１５０Ｂ２号明細書。
【００６９】
レイコック（Ｌａｙｃｏｃｋ）ら（１９９４）、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ  ｔｏｘｉｎ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ（麻ひ性貝中毒毒素標準物質の調製のための単離および精製手順）」、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ、２（４）、１７５−８３。
【００７０】
レイコック（Ｌａｙｃｏｃｋ）ら（１９９５）、「Ｓｏｍｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ  （ＰＳＰ）  ｔｏｘｉｎｓ  ｕｓｅｆｕｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ（分析標準物質の調製に有用な麻ひ性貝毒（ＰＳＰ）毒素のいくつかのインビトロ化学的相互変換）」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｉｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、１９９４）、３（１−３）、１２１−１２５。
【００７１】
リ（Ｌｉ）ら（２０１３）、「Ｒａｐｉｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ  ｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  ｒｅｄ  ｔｉｄｅ  ａｌｇａｅ  ｕｓｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｃｃｕｒａｔｅ−ｍａｓｓ  ｄａｔａｂａｓｅ（正確な質量データベースによる親水性相互作用クロマトグラフィー−高分解能質量分析を用いた赤潮藻類における麻ひ性貝毒（ＰＳＰ）毒素の迅速なスクリーニング、同定）」、Ｆｅｎｘｉ  Ｈｕａｘｕｅ、４１（７）、９７９−９８５。
【００７２】
リュー（Ｌｉｕ）ら（２０１０）、「Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ  ｔｏｘｉｎｓ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａの養殖、麻ひ性貝毒毒素の抽出と検出）」、Ｓｈｕｉｃｈａｎ  Ｘｕｅｂａｏ、３４（１１）、１７８３−１７８８。
【００７３】
マザハル（Ｍｅｚｈｅｒ）（２０１８）、「ＦＤＡ  ｔｏ  ｒｅｐｌａｃｅ  ａｎａｌｇｅｓｉｃ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｎｅｗ  ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ（ＦＤＡは鎮痛薬開発ガイダンスを新しい文書に置き換える）」、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｆｏｃｕｓ  Ｎｅｗｓ  Ａｒｔｉｃｌｅ（ｗｗｗ．ｒａｐｓ．ｏｒｇ／ｎｅｗｓ−ａｎｄ−ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｎｅｗｓ−ａｒｔｉｃｌｅｓ／２０１８／８／ｆｄａ−２−ｒｅｐｌａｃｅ−ａｎａｌｇｅｓｉｃ−ｄｒｕｇ−ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ−ｇｕｉｄａｎｃｅ）。
【００７４】
ミャオ（Ｍｉａｏ）ら（２００４）、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｏｎｙａｕｔｏｘｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ  Ｈａｌｉｍ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ  Ｈａｌｉｍの２つの系統からのゴニオトキシンの単離および精製）」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１３（２）、１０３−１０５。
【００７５】
パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）ら（２００２）、「Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｃ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）ｕｓｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｂｉｏｍａｓｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ（高バイオマス培養系を用いた有毒渦鞭毛藻Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ（渦鞭毛藻）の増殖）」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ、１４（５）、３１３−３２４。
【００７６】
ポイヤー（Ｐｏｙｅｒ）ら（２０１５）、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓａｘｉｔｏｘｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ  ｔｒａｖｅｌｉｎｇ  ｗａｖｅ  ｉｏｎ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（進行波イオン移動度−質量分析と組み合わせた親水性相互作用液体クロマトグラフィーを使用したサキシトキシンの同定と分離）」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、５０（１）、１７５−１８１。
【００７７】
ラビン（Ｒａｖｎ）ら（１９９５）、「Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ（植物プランクトンにおける麻ひ性貝毒の標準化された抽出方法）」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ、７（６）、５８９−９４。
【００７８】
ログリゲス−ナバロ（Ｒｏｇｒｉｇｕｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏ）ら（２０１１）、「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｎｅｏｓａｘｉｔｏｘｉｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ  ｖｉａ  ｐｏｒｔ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｇｅｓｉａ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｌａｐａｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｅｃｔｏｍｙ，ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ  ｔｒｉａｌ（腹腔鏡下胆嚢摘出術後の術後鎮痛のためのポート浸潤によるネオサキシトキシンとブピバカインの比較、無作為化二重盲検試験）」、Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ  ａｎｄ  Ｐａｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３６、２、１０３。
【００７９】
ルビオ（Ｒｕｂｉｏ）ら（２０１５）、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓａｘｉｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｃｈｉｌｅｎｓｉｓ  ｏｆ  ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃｈｉｌｅ（チリ南部のＭｙｔｉｌｕｓ  ｃｈｉｌｅｎｓｉｓからのサキシトキシンの精製と特性）」、Ｔｏｘｉｃｏｎ、１０８、１４７−１５３。
【００８０】
ラットマン（Ｒｕｔｍａｎ）ら（２０１１）、「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｓｅｎｓｅ  ｏｆ  ｔｏｕｃｈ  ｗｉｔｈ  ｓａｘｉｔｏｘｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ（サキシトキシン誘導体による触覚喪失の治療）」、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５１９９２号（国際公開第ＷＯ２０１１／０９８５３９Ａ１号）。
【００８１】
ラットマン（Ｒｕｔｍａｎ）ら（２０１３）、「Ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｐｏｉｓｏｎ（麻ひ性貝毒）」、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０５５４４８号（国際公開第ＷＯ２０１３／１３５８８４Ａ１号）。
【００８２】
サカモト（Ｓａｋａｍｏｔｏ）ら（２０００）、「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｏｎｙａｕｔｏｘｉｎｓ  ｔｏ  ｓａｘｉｔｏｘｉｎｓ  ｂｙ  ｔｈｉｏｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（チオール化合物によるゴニオトキシンのサキシトキシンへの還元的変換における中間体コンジュゲートの形成）」、Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、６６、１３６−１４１。
【００８３】
サトウ（Ｓａｔｏ）ら（２０００）、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｏｎｙａｕｔｏｘｉｎｓ  ｉｎｔｏ  ｓａｘｉｔｏｘｉｎｓ  ｂｙ  ｔｈｉｏｌｓ（チオールによるゴニオトキシン類のサキシトキシン類への還元的変換におけるチオエーテル中間体の同定）」、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０，１７８７−１７８９。
【００８４】
シウ（Ｓｉｕ）ら（１９９７）、「Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｗｈｉｃｈ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ（渦鞭毛藻類、Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａにおける個体群動態および毒素産生を調節する環境および栄養因子）」、Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ、３５２、１１７−１４０。
【００８５】
テンプリン（Ｔｅｍｐｌｉｎ）ら（２０１５）、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｄｅｘ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ，ｗｉｔｈ  ａｎｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ（エピネフリン麻酔の有無にかかわらず、ブピバカインとの併用による治療指数の改善）」、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ、１２３、４、８８６。
【００８６】
ツァイ（Ｔｓａｉ）ら（１９９７）、「Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｘａｎｔｈｉｄ  ｃｒａｂｓ，Ａｔｅｒｇａｔｉｓ  ｆｌｏｒｉｄｕｓ  ａｎｄ  Ｄｅｍａｎｉａ  ｒｅｙｎａｕｄｉ，ｏｆ  Ｔａｉｗａｎ（台湾のＡｔｅｒｇａｔｉｓ  ｆｌｏｒｉｄｕｓおよびＤｅｍａｎｉａ  ｒｅｙｎａｕｄｉの２種のベニズワイガニの毒性および毒性成分）」、Ｔｏｘｉｃｏｎ、３５（８）、１３２７−１３３５。
【００８７】
ワン（Ｗａｎｇ）ら（２０１０）、「Ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｐｏｉｓｏｎ  ｏｒ  ＰＳＰ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｓｅａ  ｆｏｏｄ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（麻ひ性貝毒またはＰＳＰ標準物質および海産物産業を監視するための調製物）」、中国特許出願第２０１０−１０１７９５３４号（中国特許出願公開第１０１８５８８３３Ａ号明細書）。
【００８８】
ワイリー（Ｗｙｌｉｅ）ら（２０１２）、「Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ，ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ，ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｎｅｏｓａｘｉｔｏｘｉｎ  ｉｎ  ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ−ａｎｅｓｔｈｅｔｉｚｅｄ  ｓｈｅｅｐ（イソフルランで麻酔したヒツジにおけるネオサキシトキシンの呼吸、神経筋、および心血管への影響）」、Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ  ａｎｄ  Ｐａｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３７、２、１０３。
【００８９】
ション（Ｘｉｏｎｇ）およびクィ（Ｑｉｕ）（２００９）、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｇｕａｎｉｄｏ  ｐｕｒｉｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｓｉｄｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｇｅｎｔｓ（治療効果を改善し、抗腫瘍剤の副作用を低減するためのビグアニドプリン誘導体の適用）」、中国特許出願第２００８−１０００７２１５号（中国特許出願公開第１０１５１３４０８号明細書）。
【図１】
2021526539.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】令和2年12月4日(2020.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一定量のｎｅｏＳＴＸを調製する方法であって、前記方法は、
緩衝反応溶媒中の溶液中で、９７．５％（ｗ／ｗ）を超える一定量のＧＴＸ１，４がｎｅｏＳＴＸに変換された変換生成物を提供するのに十分な温度および時間にて、一定量のＧＴＸ１，４および一定量のジチオトレイトールを接触させるステップであって、前記溶液のｐＨは７．２〜７．８の範囲である前記ステップを含む、方法。
【請求項２】
前記変換生成物をシリカ系弱カチオン交換収着剤に適用し、水性の弱酸で溶離して、ｎｅｏＳＴＸをジチオトレイトールから分離するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記水性の弱酸は、水性の有機酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記有機酸は酢酸である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記反応溶媒は、水性の酢酸である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記溶液のｐＨは、７．４〜７．６の範囲である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記一定量のｎｅｏＳＴＸは、９９．５％（ｗ／ｗ）より大きい純度を有する、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記一定量のｎｅｏＳＴＸは、１００ｍｇより大きい、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
2021526539.tif 000006
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2021526539.tif 000008
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