(57)【要約】  本発明の主題は、細胞支持体として適切であり、特に、繊維の直径が０．１〜１．５μｍの間であり、前記繊維間の間隙のサイズが０．１〜５０μｍ２の間であり、ネットワークの剛性が０．０１〜１００００ｋＰａの間、好ましくは０．１〜１００００ｋＰａの間、好ましくは０．１〜１０００ｋＰａの間、より好ましくは０．１〜３００ｋＰａの間の弾性率を特徴とすることを特徴とする、架橋ポリマー繊維の不融性三次元ネットワークである。本発明の主題はまた、架橋ポリマー繊維の三次元ネットワークを調製する方法であって、剛化剤が場合により添加されたアクリル型ポリマー、さらに特にＰＡＮの溶液の電界紡糸によって前記ネットワークを合成するステップと、引き続いて酸化雰囲気下および４０℃〜４００℃の間、好ましくは２００℃〜３００℃の間の温度で熱処理するステップとを含む方法である。最後に、本発明の主題は、特に細胞生存および移動を研究するために使用することができる、細胞支持体としての架橋ポリマー繊維の不融性三次元ネットワークである。
2021514203.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維の直径が０．１〜１．５μｍの間、好ましくは０．３〜１μｍの間、より好ましくは０．６〜０．８μｍの間に含まれ、
前記繊維間の間隙のサイズが０．１〜５０μｍ２の間、好ましくは０．５〜１０μｍ２の間、より好ましくは１〜２μｍ２の間に含まれ、
ネットワークの剛性が０．０１〜１００００ｋＰａの間、好ましくは０．１〜１００００ｋＰａの間、好ましくは０．１〜１０００ｋＰａの間、より好ましくは０．１〜３００ｋＰａの間に含まれる弾性率を特徴とする
ことを特徴とする、架橋ポリマー繊維の不融性三次元ネットワーク。
【請求項２】
前記ポリマーがポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）の熱架橋によって得られ、
ネットワークの剛性が０．０１〜１００００ｋＰａの間、好ましくは０．１〜１００００ｋＰａの間、好ましくは０．１〜１０００ｋＰａの間、より好ましくは０．１〜３００ｋＰａの間に含まれる弾性率を特徴とし、
場合により、前記繊維の表面が、好ましくはラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヒアルロン酸およびコラーゲンから選択される、細胞外マトリックスの少なくとも１つのタンパク質でコーティングされている
ことを特徴とする、請求項１に記載の三次元ネットワーク。
【請求項３】
前記ポリマーがＰＡＮの熱架橋によって得られ、
前記架橋ポリマーが０．００００１〜５％の間、好ましくは０．００００１〜１％の間、好ましくは０．０００１〜０．１％の間、好ましくは０．０００２〜０．０８％の間、好ましくは０．０００７５〜０．０５％の間に含まれる濃度で、ナノフィラー、好ましくはカーボンナノチューブを含み、前記百分率が架橋前の前記ポリマー溶液の重量％で表され、
ネットワークの剛性が０．１〜１０００ｋＰａの間、好ましくは０．１〜３００ｋＰａの間に含まれる弾性率を特徴とし、
前記繊維の表面がラミニンでコーティングされている
ことを特徴とする、請求項２に記載の三次元ネットワーク。
【請求項４】
請求項３に記載の架橋ポリマー繊維の三次元ネットワークを調製する方法であって、以下の連続ステップ：
ａ）その濃度が、ＰＡＮ溶液の重量％で表される、８〜１２％の間、好ましくは１０％に含まれるＰＡＮ溶液の電界紡糸によって前記ネットワークを合成して、繊維の三次元ネットワークを得るステップと、
ｂ）ステップａ）の間に得られた繊維の前記三次元ネットワークを、酸化雰囲気下および４０℃〜４００℃の間、好ましくは２００℃〜３００℃の間に含まれる温度で熱処理するステップと
を含み、
電界紡糸による前記合成のステップは、
前記ＰＡＮ溶液を針から押し出し、その変位振幅は３０〜５０ｍｍの間、好ましくは４０ｍｍに含まれ、その変位速度は２〜１０ｍｍ／秒の間、好ましくは５ｍｍ／秒に含まれ、
ポリマー源と集電極との間の距離は１〜５０ｃｍの間、好ましくは１０〜３０ｃｍの間、より好ましくは１５ｃｍに含まれ、押出場に印加される電界は１６〜２４ｋＶの間、好ましくは２０ｋＶに含まれ、
シリンジに供給する間のポリマー溶液の流量は０．５〜８．６ｍＬ／時間の間に含まれる
ことを特徴とする方法。
【請求項５】
前記ＰＡＮ溶液を、１２〜１８ｃｍの間、好ましくは１５ｃｍに含まれる直径を有する回転集電極、好ましくはドラム上に押し出し、前記電極の回転速度が１〜１０００００ｇの間、好ましくは１〜１０００ｇの間、より好ましくは３３５ｇに含まれることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリマー溶液が、架橋前の前記ポリマー溶液の重量％で表される、０．００００１〜５％の間、好ましくは０．００００１〜１％の間、好ましくは０．０００１〜０．１％の間、好ましくは０．０００２〜０．０８％の間、好ましくは０．０００７５〜０．０５％の間に含まれる濃度でカーボンナノチューブを含むことを特徴とする、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記熱処理ステップに、前記ネットワークを前記細胞外マトリックスの少なくとも１つのタンパク質の溶液の存在下に持ち込むことを含む、前記繊維の表面を処理するステップが続き、前記タンパク質が、好ましくはラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヒアルロン酸およびコラーゲンから選択され、前記ネットワークを存在下に持ち込むことに、場合により前記ネットワークの繊維の表面の前処理が先行することを特徴とする、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の少なくとも１つのネットワーク、または請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるネットワークを含む、細胞支持のためのデバイス。
【請求項９】
細胞支持体としての、請求項１〜３のいずれか一項に記載の三次元ネットワーク、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法によって得られる三次元ネットワーク、または請求項８に記載のデバイスの使用。
【請求項１０】
以下の連続ステップ：
細胞を、請求項１〜３のいずれか一項に記載の三次元ネットワーク、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法によって得られる三次元ネットワーク、または請求項８に記載のデバイスと接触させるステップと、
前記細胞および／または前記細胞の生化学的分析を特徴付ける少なくとも１つのパラメータを観察し、場合により決定するステップと
を含むことを特徴とする、請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体適合性三次元デバイスの分野に関する。
【０００２】
本発明の主題は、生体適合性繊維の三次元（３Ｄ）ネットワーク、およびデバイスに組み込まれた場合のその形態であり、別の主題は、このような繊維のネットワークを製造する方法である。本発明の別の主題は、３Ｄ環境内の細胞挙動、特に細胞の生存、増殖、移動および侵入性を研究するための細胞支持体としての前記ネットワークの使用である。
【先行技術】
【０００３】
二次元でのインビボ細胞移動条件の物理的特性をシミュレートするネットワークおよびデバイスが頻繁に使用され、販売されている。いくつかのタイプの３Ｄネットワークまたはデバイスが開発されており、現在知られているネットワークは、脱細胞化組織、細胞層、ヒドロゲル、電界紡糸繊維およびスポンジなどの材料によって構成されており、使用される材料の性質によって種々の欠点がある。
【０００４】
Ｓｈｏｇｏｌｕら（“Ｒｅｃｒｅａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｗｉｔｈ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ”，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．９，ｐ．１５２１−３１，２０１６）は、腫瘍のインビトロ微小環境を模倣する様々な３Ｄデバイスを記載しており、それらの欠点に言及している：インタクトな脱細胞化組織は入手が困難で、十分な標準化および再現性を許さない、細胞単層、ヒドロゲルは有意な細胞毒性を有するおそれがある、電界紡糸繊維は良好な細胞浸潤を許さない、スポンジは剛性の制御を許さない、ネットワークの分解または空隙率。
【０００５】
Ｂｕｉら（“Ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｙｉｅｌｄｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｉｎ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｃｉ．Ｒｅｐｏｒｔｓ  ６：２６１３４，２０１６）は、３つの異なる程度の物理的閉じ込め：狭い閉じ込め（５×５μｍ）、広い閉じ込め（１５×１５μｍ）および２Ｄ閉じ込め（高さ１５０μｍ）を生成するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）マイクロ流体デバイスを記載している。このデバイスは、使用前にラミニンでコーティングされる。このシステムは硬く、２Ｄのように、細胞と支持体の面の相互作用が平坦である。
【０００６】
Ａｋｈｍａｎｏｖａら（“Ｐｈｙｓｉｃａｌ，ｓｐａｔｉａｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｎｉｃｈｅｓ  ａｎｄ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｔｏ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｖｏｌ．２０１５，ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ１６７０２５，２０１５）は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリエチレングリコールジメタクリレート（ＰＥＧｄｍａ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）によって構成された電界紡糸繊維を含むデバイスを記載している。
【０００７】
Ｌｅｅら（“Ｐｌａｓｍａ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ａｍｉｎｏｃｌａｙ−ｄｅｃｏｒａｔｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ  ｎａｎｏｆｉｂｒｅｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ”，Ｊ．Ｎａｎｏｓｃｉ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｆｅｂ  １６（２）：１３９２−５，２０１６）は、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）の電界紡糸によって得られ、マグネシウムまたは鉄アミノクレイ（ａｍｉｎｏｃｌａｙ）を含むナノファイバーを記載している。
【０００８】
Ｌｉｕら（“Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ−ｂａｓｅｄ  ｎａｎｏｆｉｂｒｅｓ  ｍａｉｎｔａｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍｎｅｓｓ  ｖｉａ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ”Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｒ；１２（４）：７３２−４２，２０１６）は、電界紡糸によって処理された生体適合性ＰＡＮ繊維によって構成された細胞培養デバイスを記載している。
【０００９】
Ｍａｈｍｏｕｄｉｆａｒｄ  Ｍ．ら（“Ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｆａｔｅ  ｏｆ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ  ｎａｎｏｆｉｂｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｇｒａｐｈｅｎｅ  ａｎｄ  ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ  ｎａｎｏｓｈｅｅｔｓ”，Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ．Ｍａｒ  １０；１１（２）２０１６）は、グラフェンまたはグラフェンオキシドのナノシートを補足した、ポリアニリン（ＰＡＮＩ）およびＰＡＮ繊維のネットワークを記載している。
【００１０】
Ｊａｉｎら（“Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”Ｈｅｐａｔｏｌ  Ｉｎｔ．Ａｐｒ；８（２）：１８５−９７，２０１４）は、カーボンナノファイバーまたは薄膜の形態の、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）のインビトロ細胞適合性を研究している。
【００１１】
米国特許出願公開第２０１６／０３７７６００号明細書は、ポリマーおよびタンパク質を含む生体機能性組成物を電界紡糸することによって合成された３Ｄネットワークを記載している。電界紡糸後、ネットワークは真空チャンバーに直接入れられ、使用前に乾燥雰囲気下で保管される。
【００１２】
米国特許出願公開第２０１６／０３５５７８０号明細書は、少なくとも１つの天然または合成ポリマーとインテグリン活性化ペプチドモチーフを組み合わせることによって調製される、細胞培養に適した３Ｄ微小環境を記載している。前記３Ｄネットワークは、生体機能性組成物の電界紡糸によって得られる。電界紡糸後、ネットワークは真空チャンバーに直接入れられ、使用前に乾燥雰囲気下で保管される。
【００１３】
米国特許出願公開第２０１２／００４０５８１号明細書の主題は、予め定義された型の使用を含むナノファイバーネットワークを製造する特定の方法である。
【００１４】
電界紡糸繊維によって構成される現在知られているネットワークは、低浸潤および低細胞増殖、不均一な細胞分布、ならびに細胞がそこに独立してのみ移動するという事実を特徴とする。さらに、これらの材料は、細胞に関して一定の毒性を有するおそれがあり、特にプロテオミクスおよび機能レベルでの、移動する細胞の完全な分析を許さない。実際、ネットワークがコラーゲンによって構成されている場合、細胞タンパク質分析は、これらのネットワークに由来するタンパク質のタンパク質抽出中の塩析によって中断される。ポリカプロラクトンなどの物質の不透明性は、細胞を特徴付けるために二光子顕微鏡の特定の使用を必要とする。最後に、先行技術の３Ｄネットワークの機械的特性の任意の調整を、このネットワークの化学的調整と独立に実行することはできず、その逆も同様であり、これにより、様々な細胞型への適応の可能性が制限される。
【００１５】
本発明者らは、繊維の芳香化および架橋をもたらす４０℃超４００℃未満の温度で行われる熱処理が適用される、アクリル型ポリマー、特にポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）の溶液の電界紡糸によって得られる繊維によって構成される３Ｄネットワークを設計および製造した。驚くべきことに、前記ネットワークは、細胞のインビボ環境に非常に近い機械的特性、ならびに前記細胞に対する生体適合性、非毒性および接着支持特性を有する。さらに、前記ネットワークは、不融性の性質、蛍光光学特性およびその後の任意の官能化を可能にする残留表面化学官能を有する。繊維の前記ネットワークの自己蛍光特性が、特に、免疫蛍光法、または多光子顕微鏡、落射蛍光顕微鏡もしくは共焦点顕微鏡によって測定可能な細胞カルシウムの流出を、当業者に周知の、マークされた指示薬および適切な分析ソフトウェアを使用して測定することによって、ネットワーク内の細胞を可視化することを容易にする。ネットワークのその後の官能化の可能性により、３Ｄ環境内の細胞挙動、特に細胞の生存、増殖、移動および侵入性を研究し、再現性よく特徴付けることが可能になる。
【００１６】
本発明による３Ｄネットワークは、その機械的特性および／またはその化学的特性の調節を独立に受けることができるという利点を有する。ネットワークの機械的特性は、例えば、剛性を増加させるカーボンナノチューブを添加することによって修正することができる。化学的特性は、繊維の表面を官能化し、基質／細胞界面の模倣を最適化することによって調節することができる。
【００１７】
さらに、本発明によるネットワークは、その非細胞毒性、その安定性（ネットワーク内に存在する細胞からのタンパク質の抽出中に化合物が塩析しない）、ならびに生理学的および病理学的条件下の組織のものに近い弾性（“Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ  Ｄｉｃｔａｔｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ，ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ”Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．１１（１）：１−１５，２０１５）を特徴とし、カーボンナノチューブの添加後に少なくとも１２６０ｋＰａに達するようにこの弾性を調節することもできる。よって、本発明によるネットワークは、細胞の生物学的環境を可能な限り厳密に模倣することを可能にする。
【００１８】
繊維の任意の官能化およびこの官能化の性質に応じて、本発明による３Ｄネットワークは、様々な細胞型の移動を研究することを可能にする。繊維の表面上にポリ−Ｄ−リジンおよびラミニンを堆積させることで、例えば、コーティングされていない繊維の上を集合的に移動する際の神経膠芽腫幹細胞（ＧＳＣ）の個別的な移動を研究することが可能になる。
【００１９】
本発明者らは、細胞が、本発明による３Ｄネットワークと接触されると、記載されるインビボ移動挙動と同様の移動挙動を有し、これらがネットワーク内に均一な分布で浸潤することを示した。
【００２０】
最後に、本発明によるこのネットワークにより、顕微鏡を使用して細胞挙動、特に移動挙動を可視化し、再現性よく測定することが可能になる。このネットワークにより、ウエスタンブロットによって分析することができるタンパク質、ならびにトランスクリプトーム、プロテオームおよびメタボローム研究等を含む完全な分析の可能性を抽出することが可能になる。繊維は非常に使用しやすく、迅速に大量に製造することができ、その製造は安価である。
【００２１】
本発明による３Ｄネットワークは、選択されるデバイスの性質に従って、分析研究またはスクリーニング研究のための「マルチウェルプレート」型のデバイスに容易に組み込むことができる。
【００２２】
よって、本発明の第１の主題は、繊維の直径が０．１〜１．５μｍの間に含まれ、繊維間の間隙のサイズが０．１〜５０μｍ２の間に含まれ、ネットワークの剛性が０．０１〜１００００ｋＰａの間に含まれる弾性率を特徴とすることを特徴とする、架橋ポリマー繊維の不融性三次元ネットワークである。このネットワークは、デバイス内に組み込むことができる。
【００２３】
本発明の第２の主題は、本発明による架橋ポリマー繊維の三次元ネットワークを調製する方法であって、電界紡糸によって繊維の３Ｄネットワークを合成するステップと、引き続いて合成された３Ｄネットワークを、４０℃超４００℃未満の温度、好ましくは２００℃超３００℃未満の温度で熱処理するステップとを含む方法である。
【００２４】
本発明の第３の主題は、細胞支持体としての本発明による架橋ポリマー繊維の３Ｄネットワークの使用であって、この細胞支持体が、細胞の培養ならびに細胞挙動、特にそれらの生存、それらの増殖、それらの移動およびそれらの侵入性の研究のためにインビトロで使用される使用である。研究された細胞は特に神経膠芽腫細胞である。
【００２５】
この使用は、特に、例えば顕微鏡および当業者に知られている任意の方法による細胞の生化学分析による、本発明によるネットワーク上の培養細胞の挙動の可視化を含む。
【００２６】
最後に、本発明の第４の主題は、本発明による繊維の３Ｄネットワークが挿入され、必要な寸法に切断され、試験デバイスに含められている、例えばマルチウェルプレートまたはペトリ皿などの試験デバイス、および分析用途でのその使用である。
【００２７】
本発明の主題の他の特徴、利点および実施形態は、例として、非限定的に与えられる、以下の説明で詳述される。
【００２８】
本文の残りの部分では、「．．．〜．．．の間に含まれる」という表現は包括的である。
【詳細な説明】
【００２９】
本発明の第１の主題は、
繊維の直径が０．１〜１．５μｍの間、好ましくは０．３〜１μｍの間、より好ましくは０．６〜０．８μｍの間に含まれ、
前記繊維間の間隙のサイズが０．１〜５０μｍ２の間、好ましくは０．５〜１０μｍ２の間、より好ましくは１〜２μｍ２の間に含まれ、
ネットワークの剛性が０．０１〜１００００ｋＰａの間、好ましくは０．１〜１００００ｋＰａの間、好ましくは０．１〜１０００ｋＰａの間、より好ましくは０．１〜３００ｋＰａの間に含まれる弾性率を特徴とする
ことを特徴とする、架橋ポリマー繊維の三次元ネットワークである。
【００３０】
「架橋ポリマー繊維」とは、架橋ポリマーを含む繊維状材料を意味し、前記架橋ポリマーは、前に繊維の形態に組織化されたポリマーに適切な熱または光処理を施すことによって得られる。前記熱または光処理の影響下で、ポリマーは、その繊維状形態を失うことなく架橋ポリマーをもたらすために、特定の３Ｄ構造組織を採用する。架橋は、ポリマー鎖の架橋による三次元ネットワークの形成として定義される。ネットワークの性質は、熱的または光学的ストレスに依存する。
【００３１】
ポリマー繊維を合成する方法は、当業者に周知であり、その中でも電界紡糸が言及され得る。熱または光処理によってプラスチックポリマーを架橋する方法もまた、当業者に周知である。熱架橋法のうち、４０〜４００℃の間に含まれる温度で少なくとも１０分間の処理を施すと、ポリマー繊維の芳香化およびそれらの架橋がもたらされることが知られている。光架橋法の中でも、特にＵＶ光架橋が言及され得る。
【００３２】
本発明による架橋ポリマー繊維の３Ｄネットワークは、生体適合性であり、不融性であり、好ましくは、特に水、アルコールまたはＤＭＳＯなどの生物学で使用される通常の溶媒に不溶性である。
【００３３】
「生体適合性」とは、接触している細胞に関して細胞増殖抑制および／または細胞毒性効果を誘導しない支持体を意味する。本発明による３Ｄネットワークはまた、好ましくは、前記細胞との接触時に非生分解性である。
本発明による３Ｄネットワークでは、前記架橋ポリマーが、
【００３４】
−少なくとも１０％のポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）もしくはポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）などのアクリル；または少なくとも１０％のポリアミド、例えばポリヘキサメチレンアジパミド（ＰＡ６．６もしくはナイロン）、または少なくとも１０％の別の架橋性モチーフを含むポリマー溶液、あるいは
−少なくとも１０％のスチレン−アクリロニトリルコポリマー（ＳＡＮ）、または少なくとも１０％のアクリロニトリル−ブタジエン−スチレン（ＡＢＳ）、ブタジエン−アクリロニトリル（ＮＢＲ）などのコポリマーもしくは混合物、または少なくとも１０％の別の架橋性モチーフを含むコポリマー溶液または混合溶液
から得られる。
【００３５】
「架橋ポリマー繊維の３Ｄネットワーク」とは、その少なくともシェル、すなわち表面部分が少なくとも１０％の架橋ポリマーを含む材料によって構成される繊維によって構成されるネットワークを意味し、この百分率は前記材料の重量％で表される。前記繊維のコアは、繊維のシェルを構成する材料と同一のまたは異なる任意の適切な材料によって構成され得る。この態様によると、前記繊維の少なくともシェルは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の架橋ポリマーを含む材料によって構成され、この百分率は前記繊維の表面を構成する材料の重量％で表される。繊維のコアおよびシェルが異なる材料によって構成される本発明による３Ｄネットワークは、特に、前記繊維のシェルおよびコアを構成するポリマーが同時に押し出される、同軸電界紡糸法によって得ることができる。
【００３６】
特定の実施形態によると、本発明による３Ｄネットワークの繊維のシェルおよびコアは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の架橋ポリマーによって構成され、この百分率は前記繊維の表面を構成する材料の重量％で表される。
【００３７】
特定の実施形態によると、前記架橋ポリマーは、少なくとも１０％の特にポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）などのアクリル型ポリマーおよびポリアミド型ポリマーから選択されるポリマーを含むポリマーから得られ、前記ポリマーはポリマーまたはコポリマーの形態で存在する。より具体的には、本発明による３Ｄネットワークは、架橋ポリマーがアクリル型ポリマーの溶液、好ましくは少なくとも１０％のアクリル型ポリマーを含む溶液から得られることを特徴とする。「アクリル型ポリマー」とは、アクリル酸およびその誘導体、例えば、アクリレート、メチルアクリレートおよびアクリロニトリルなどのエステルから誘導される任意のポリマーを意味する。
【００３８】
よって、特定の実施形態によると、本発明の主題は、
繊維の直径が０．１〜１．５μｍの間、好ましくは０．３〜１μｍの間、より好ましくは０．６〜０．８μｍの間に含まれ、
前記繊維間の間隙のサイズが０．１〜５０μｍ２の間、好ましくは０．５〜１０μｍ２の間、より好ましくは１〜２μｍ２の間に含まれ、
ネットワークの剛性が０．０１〜１００００ｋＰａの間、好ましくは０．１〜１００００ｋＰａの間、好ましくは０．１〜１０００ｋＰａの間、より好ましくは０．１〜３００ｋＰａの間に含まれる弾性率を特徴とする
ことを特徴とする、架橋アクリル型ポリマー繊維の三次元ネットワークである。
【００３９】
特定の例によると、前記プラスチックポリマーは、少なくとも５０％のＰＡＮを含み、ＰＡＮの百分率は様々なポリマーの総重量の百分率として表される。
【００４０】
この特定の態様によると、前記３Ｄネットワークは、そのコアが、特にポリマーまたはゲルなどの任意の適切な材料によって構成される繊維によって構成される。
【００４１】
本発明による３Ｄネットワークのより特定の態様によると、前記繊維は架橋ポリマーによって完全に構成される。この態様によると、本発明による３Ｄネットワークは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の架橋ポリマーを含む繊維によって構成され、この百分率は前記繊維の重量％で表される。
【００４２】
別の特定の実施形態によると、本発明による３Ｄネットワークは、架橋ポリマー繊維によって構成され、前記架橋ポリマーは、少なくとも１つの剛化化合物を含み、前記剛化化合物は、好ましくはナノフィラー、より好ましくはナノ粒子、ナノチューブ、ナノファイバーおよびナノシートから選択される。
【００４３】
特定の実施形態によると、本発明によるネットワークは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のＰＡＮ由来架橋ポリマーを含む繊維によって構成され、この百分率はその架橋前のＰＡＮ溶液の重量％で表される。
【００４４】
特定の態様によると、本発明による３Ｄネットワークの繊維の直径は、０．１〜１．５μｍの間、好ましくは０．２〜１．２μｍの間、好ましくは０．３〜１．１μｍの間、好ましくは０．４〜１μｍの間、好ましくは０．５〜０．９μｍの間、より好ましくは０．６〜０．８μｍの間に含まれ、この値は前記ネットワーク内で測定される繊維の直径の平均を表す。前記直径は、当業者に知られている任意の手段によって、特に走査型電子顕微鏡によって測定される。
【００４５】
「前記繊維間の間隙」とは、少なくとも１つの細胞が前記ネットワークと接触すると、配置され得る、ネットワークの少なくとも２つの繊維の間に位置する自由空間、または「細孔」または「メッシュ」を意味する。本発明による３Ｄネットワークでは、繊維の表面の任意の官能化の前に、間隙のサイズは、前記間隙の表面の平均寸法であり、このサイズは０．１〜５０μｍ２の間、好ましくは１〜１０μｍ２の間、より好ましくは１〜２μｍ２の間に含まれる。この寸法は、特に電子顕微鏡または共焦点光学顕微鏡によって測定される。別の定義によると、本発明によるネットワークの空隙率は、０．１〜５０μｍの間、好ましくは１〜１０μｍの間、より好ましくは１〜２μｍの間に含まれる濾過閾値によって定義される。この寸法は、例えば細胞外マトリックスのタンパク質でコーティングされているような繊維の表面の任意の官能化の前に定義され、前記官能化は繊維間の間隙のサイズを実質的に修正しない。
【００４６】
「剛性」とは、弾性率によって定義される特徴を意味する。本発明によるネットワークの剛性は、０．０１〜１００００ｋＰａの間、好ましくは０．１〜１００００ｋＰａの間、好ましくは０．１〜１０００ｋＰａの間、好ましくは０．１ｋＰａ〜３００ｋＰａの間に含まれる弾性率を特徴とする。弾性率は、当業者に知られている任意の手段によって、特にピコニュートンからナノニュートンまで変化する力の印加を利用する原子間力顕微鏡によって測定される。好ましくは、特に指示しない限り、剛性は、記録された画像全体の平均値として測定される。あるいは、剛性は、繊維間の間隙を除いて、繊維自体に関して測定することができる。
【００４７】
特定の態様によると、本発明による３Ｄネットワークは、互いに整列している、または一般的な配向であるが必ずしも厳密に平行ではない繊維を特徴とする。別の特定の態様によると、本発明による３Ｄネットワークは、ランダムに組織化された繊維を特徴とする。
【００４８】
より特定の態様によると、本発明の主題は、アクリル型ポリマーの溶液の熱架橋によって得られる架橋ポリマー繊維の３Ｄネットワークである。本発明のより特定の態様によると、前記溶液は、任意の他のポリマーを除外してアクリル型ポリマーを含む。別のより特定の態様によると、前記溶液は、アクリル型ポリマーおよび第２のポリマーを含む。本発明のさらにより特定の態様によると、前記溶液は、第１のアクリル型ポリマーおよび第２のアクリル型ポリマーを含む。
【００４９】
より特定の態様によると、本発明の主題は、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）溶液の熱架橋によって得られる架橋ポリマー繊維の３Ｄネットワークである。本発明のより特定の態様によると、前記溶液は、任意の他のポリマーを除外してＰＡＮを含み、別のより特定の態様によると、前記溶液は、コポリマーの形態のＰＡＮを含む。
【００５０】
「ポリアクリロニトリル」とは、以下の式（Ｉ）の式（Ｃ３Ｈ３Ｎ）ｎの化合物を意味する：
【化１】
2021514203.tif 000003
【００５１】
より特定の態様によると、本発明による３Ｄネットワークは、その表面が少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の、ＰＡＮの熱架橋によって得られる架橋ポリマーを含む繊維によって構成され、前記百分率は前記繊維の表面の重量パーセントで表される。
【００５２】
さらにより特定の態様によると、本発明による３Ｄネットワークは、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の、ＰＡＮの熱架橋によって得られる架橋ポリマーを含む繊維によって構成され、この百分率は前記繊維の重量パーセントで表される。
【００５３】
別の特定の態様によると、本発明による３Ｄネットワークは、特に以下の波長：緑（４８８ｎｍ）および赤（５９４ｎｍ）、ならびにより少ない程度に青（３５０ｎｍ）および赤外線（６４７ｎｍ）で蛍光特性を有する。これらの特性は、特に蛍光顕微鏡により、４８８、５９４、３５０および／または６４７ｎｍでの励起によって測定可能である。これらの特性は、例えば、励起波長４０５、４５８、４８８、５２４、５６１および／または６３３ｎｍで材料に励起を印加し、次いで、発せられたシグナルの波長および強度を決定することによって、ラムダスキャン法と呼ばれる手法でも測定可能である。
【００５４】
特定の態様によると、本発明の主題は、
架橋ポリマーがポリアクリロニトリル溶液の熱架橋によって得られ、
繊維の直径が０．１〜１．５μｍの間、好ましくは０．３〜１μｍの間、より好ましくは０．６〜０．８μｍの間に含まれ、
前記繊維間の間隙のサイズが０．１〜５０μｍ２の間、好ましくは０．５〜１０μｍ２の間、より好ましくは１〜２μｍ２の間に含まれ、
ネットワークの剛性が０．１〜１００００ｋＰａの間、好ましくは０．１〜３００ｋＰａの間に含まれる弾性率を特徴とし、
場合により、繊維の表面が細胞外マトリックスの少なくとも１つのタンパク質でコーティングされている、
ことを特徴とする、架橋ポリマーの３Ｄネットワークである。これらのタンパク質の中でも、特にラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヒアルロン酸およびコラーゲンが言及され得る。
【００５５】
さらにより特定の態様によると、本発明の主題は、
架橋ポリマーがポリアクリロニトリル溶液の熱架橋によって得られ、
繊維の直径が０．６〜０．８μｍの間に含まれ、
前記繊維間の間隙のサイズが１〜２μｍ２の間に含まれ、
ネットワークの剛性が０．１〜１００００ｋＰａの間、好ましくは０．１〜３００ｋＰａの間に含まれる弾性率を特徴とし、
場合により、繊維の表面が細胞外マトリックスの少なくとも１つのタンパク質、特にラミニンでコーティングされている、
ことを特徴とする、架橋ポリマーの３Ｄネットワークである。
【００５６】
このさらにより特定の態様によると、繊維の前記３Ｄネットワークは、神経膠芽腫細胞の支持体として適している。
【００５７】
さらにより特定の態様によると、本発明の主題は、ポリマーが剛化化合物を含むことを特徴とする、架橋ポリマー繊維の３Ｄネットワークである。このような剛化化合物は、好ましくは、この目的のために当業者に周知の化合物から選択される。これは特に、ナノフィラー、好ましくはナノ粒子、ナノチューブ、ナノファイバーおよびナノシートから選択することができる。より好ましくは、前記剛化化合物は、カーボンナノチューブ、特に当業者がポリマーに適した溶媒に容易に分散させることができる多層カーボンナノチューブ（ＭＷＣＴ）から選択され、前記ナノチューブは、それらの分散を促進するために、−ＣＯＯＨまたは−ＮＨ２官能によって表面官能化され得る。この態様によると、前記剛化化合物は前記架橋ポリマー内に存在し、したがって、その合成後に３Ｄネットワークに添加されないが、全く反対に、これはポリマーに組み込まれる。
【００５８】
特定の態様によると、ネットワークの前記繊維の少なくともシェルは、架橋前の前記ポリマーの溶液の重量％で表される、０．００００１〜５％の間、好ましくは０．００００１〜１％の間、好ましくは０．０００１〜０．１％の間、好ましくは０．０００２〜０．０８％の間、好ましくは０．０００７５〜０．０５％の間に含まれる剛化化合物の濃度で剛化化合物を組み込んだ前記架橋ポリマーを含む。
【００５９】
より特定の態様によると、前記剛化化合物は、前記繊維のシェルおよびコアを構成する材料内に存在する。
【００６０】
さらにより特定の態様によると、本発明の主題は、繊維の表面が細胞外マトリックスの少なくとも１つのタンパク質でコーティングされていることを特徴とする、架橋ポリマー繊維の３Ｄネットワークである。細胞外マトリックスのタンパク質の中でも、特にラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヒアルロン酸およびコラーゲンが言及され得る。
【００６１】
「少なくとも１つのタンパク質でコーティングされた繊維」とは、その表面上にタンパク質が１０μｇ／ｃｍ２以上のタンパク質密度で存在する繊維を意味する。顕微鏡を使用して観察すると、前記タンパク質は、前記繊維の表面に不連続に存在し得る。
【００６２】
特定の態様によると、本発明による架橋ポリマー繊維の３Ｄネットワークは、ネットワークの繊維の表面が、細胞外媒体の少なくとも１つのタンパク質、好ましくはラミニンでコーティングされていることを特徴とする。
【００６３】
特定の態様によると、本発明による架橋ポリマー繊維の３Ｄネットワークは、
前記架橋ポリマーがＰＡＮの熱架橋によって得られ、
繊維の直径が０．１〜１．５μｍの間、好ましくは０．３〜１μｍの間、より好ましくは０．６〜０．８μｍの間に含まれ、
繊維間の間隙の平均サイズが０．１〜５０μｍ２の間、好ましくは０．５〜１０μｍ２の間、より好ましくは１〜２μｍ２の間に含まれ、
前記ネットワークの剛性が０．０１〜１００００ｋＰａの間、好ましくは０．１〜１００００ｋＰａの間、好ましくは０．０１ｋＰａ〜１０００ｋＰａの間、好ましくは０．１ｋＰａ〜３００ｋＰａの間に含まれる弾性率を特徴とし、
繊維間の間隙のサイズが０．１〜５０μｍ２の間、好ましくは０．５〜１０μｍ２の間、より好ましくは１〜２μｍ２の間に含まれ、
架橋ポリマーが、前記繊維の重量％で表される、０．００００１〜５％の間、好ましくは０．０００１〜１％の間、好ましくは０．０００１〜０．１％の間、好ましくは０．０００２〜０．０８％の間、好ましくは０．０００７５〜０．０５％の間に含まれる濃度で、好ましくはカーボンナノチューブから選択される剛化化合物を含み、
ネットワークが、光エネルギーに供されると、蛍光を発し、
ネットワークの繊維の表面が、細胞外媒体の少なくとも１つのタンパク質、好ましくはラミニンでコーティングされている
ことを特徴とする。
【００６４】
さらにより特定の態様によると、本発明の主題は、
繊維の直径が０．３〜１μｍの間に含まれ、
繊維が、前記繊維の重量％で表される０．０００２〜０．０８％の間に含まれ、好ましくは０．０００７５〜０．０５％の間に含まれる濃度でカーボンナノチューブを含み、
ネットワークの剛性が０．１〜１０００ｋＰａの間、好ましくは０．１〜３００ｋＰａの間に含まれる弾性率を特徴とし、
繊維の表面がラミニンでコーティングされている
ことを特徴とする、ＰＡＮ繊維の３Ｄネットワークである。
【００６５】
本発明の第２の主題は、本発明による繊維の３Ｄネットワークを調製する方法であって、以下のステップ：
ａ）その濃度が、アクリル型ポリマーの溶液の重量％で表される、５〜２５％の間、好ましくは８〜１２％の間、好ましくは１０％に含まれるアクリル型ポリマーの溶液の電界紡糸によって前記ネットワークを合成して、繊維の３Ｄネットワークを得るステップと、
ｂ）ステップａ）の間に得られた繊維の３Ｄネットワークを、酸化雰囲気下および４０℃〜４００℃の間、好ましくは２００℃〜３００℃の間、好ましくは１００℃〜３００℃の間に含まれる温度で熱処理するステップと
を含み、
電界紡糸による合成の前記ステップａ）は、
ポリマー溶液を針から押し出し、その変位振幅は３０〜５０ｍｍの間、好ましくは４０ｍｍに含まれ、その変位速度は２〜１０ｍｍ／秒の間、好ましくは５ｍｍ／秒に含まれ、
ポリマー源と集電極との間の距離は１〜５０ｃｍの間、好ましくは１０〜３０ｃｍの間、より好ましくは１５ｃｍに含まれ、押出場に印加される電界は１６〜２４ｋＶの間、好ましくは２０ｋＶに含まれ、
シリンジに供給するためのポリマー溶液の流量は０．５〜８．６ｍＬ／時間の間に含まれる
ことを特徴とする方法である。
【００６６】
より具体的には、本発明による繊維の３Ｄネットワークを調製する方法では、アクリル型ポリマーの前記溶液はポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）および別のアクリル型ポリマーを含み、ポリマーの総濃度は８〜１２％の間、好ましくは１０％に含まれる。
【００６７】
より具体的には、本発明の第２の主題は、本発明による繊維の３Ｄネットワークを調製する方法であって、以下のステップ：
ａ）その濃度が、ＰＡＮ溶液の重量％で表される、８〜１２％の間、好ましくは１０％に含まれるＰＡＮ溶液の電界紡糸によって前記ネットワークを合成して、繊維の３Ｄネットワークを得るステップと、
ｂ）ステップａ）の間に得られた繊維の３Ｄネットワークを、酸化雰囲気下および４０℃〜４００℃の間、好ましくは２００℃〜３００℃の間に含まれる温度で熱処理するステップと
を含み、
電界紡糸による合成の前記ステップａ）は、
ＰＡＮ溶液を針から押し出し、その変位振幅は３０〜５０ｍｍの間、好ましくは４０ｍｍに含まれ、
その変位速度は２〜１０ｍｍ／秒の間、好ましくは５ｍｍ／秒に含まれ、
ポリマー源と集電極との間の距離は１〜５０ｃｍの間、好ましくは１０〜３０ｃｍの間、より好ましくは１５ｃｍに含まれ、押出場に印加される電界は１６〜２４ｋＶの間、好ましくは２０ｋＶに含まれ、
シリンジに供給するためのポリマー溶液の流量は０．５〜８．６ｍＬ／時間の間に含まれる
ことを特徴とする方法である。
【００６８】
この態様によると、前記溶液は、その純度が９０％以上、好ましくは９２％以上、好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上であるＰＡＮから調製される。別の態様によると、前記ＰＡＮは１５００００の平均分子量（ＭＷ）を特徴とする。ＰＡＮは、様々な既知の供給業者によって販売されている。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）によって販売されているＰＡＮが、本発明のこの態様に特に適している。
【００６９】
第１の特定の態様によると、本発明による方法は、ＰＡＮ溶液を、１２〜１８ｃｍの間、好ましくは１５ｃｍに含まれる直径を有する回転集電極、好ましくはドラム上に押し出し、前記電極の回転速度は１〜１０００００ｇの間、好ましくは１〜１０００ｇの間、より好ましくは３３５ｇに含まれることを特徴とする。このような方法の実施により、整列した繊維を含むネットワークが得られ、前記整列した繊維のネットワークは、厳密に平行な繊維ではなくむしろ一般的な配向を有する。別の特定の態様によると、本発明による方法では、ＰＡＮ溶液を非回転平板式コレクター上に押し出し、方法のこの他の態様の実施により、絡み合った繊維を含む３Ｄネットワークが合成され、繊維は一般的な配向を有さない。
【００７０】
別の特定の態様によると、本発明による方法は、ＰＡＮ溶液が、ナノ粒子、ナノチューブ、ナノファイバーまたはナノシートなどの剛化化合物を含まないことを特徴とする。より具体的には、本発明による方法は、カーボンナノチューブ、特に多層カーボンナノチューブ（ＭＷＣＴ）を含むＰＡＮ溶液を利用する。この特定の態様によると、電界紡糸による合成のステップは、
押出場に印加される電場が１６〜２４ｋＶの間、好ましくは２０ｋＶに含まれ、
シリンジに供給するためのポリマー溶液の流量が０．５〜８．６ｍＬ／時間の間、好ましくは２．１〜２．７ｍＬ／時間の間、好ましくは２．４ｍＬ／時間に含まれる
ことを特徴とする。
【００７１】
別の特定の態様によると、本発明による方法は、ＰＡＮ溶液が、好ましくはナノフィラー、より好ましくはナノ粒子、ナノチューブ、ナノファイバーおよびナノシートから選択される剛化化合物を含むことを特徴とする。より具体的には、本発明による方法は、カーボンナノチューブ、特に多層カーボンナノチューブ（ＭＷＣＴ）を含むＰＡＮ溶液を利用する。
【００７２】
より特定の態様によると、前記ネットワークの繊維は、架橋前のポリマー溶液の重量％で表される、０．００００１〜５％の間、好ましくは０．００００１〜１％の間、好ましくは０．０００１〜０．１％の間、好ましくは０．００２〜０．０８％の間、好ましくは０．００７５〜０．０５％の間に含まれる濃度で剛化化合物を含む。
【００７３】
別の特定の態様によると、本発明による方法は、好ましくはカーボンナノチューブによって構成される剛化化合物、および分散剤、好ましくは界面活性剤、より好ましくは非イオン性界面活性剤を含むポリマー溶液を電界紡糸するステップを含む。前記分散剤の存在により、前記剛化剤の良好な可溶化が確保される。
【００７４】
この特定の態様によると、本発明による方法は、ＰＡＮ溶液が、ナノ粒子、ナノチューブ、ナノファイバーおよびナノシート、好ましくはカーボンナノチューブ、特に多層カーボンナノチューブ（ＭＷＣＴ）から選択される剛化化合物を含むことを特徴とし、電界紡糸による合成のステップは、
押出場に印加される電場が１６〜２４ｋＶの間、好ましくは２０ｋＶに含まれ、
シリンジに供給するためのポリマー溶液の流量が０．５〜８．６ｍＬ／時間の間、好ましくは０．５〜１．９ｍＬ／時間の間、好ましくは０．８〜１．５ｍＬ／時間の間に含まれる
ことを特徴とする。
【００７５】
より具体的には、本発明による方法は、３Ｄネットワークに施される熱処理のステップｂ）が、前記ネットワークを、４０〜４００℃の間、好ましくは１００〜３００℃の間に含まれる温度、より好ましくは２５０℃の温度で、少なくとも１０分間、好ましくは１０〜３００分間の間、好ましくは２０〜１８０分間の間、６０〜１５０分間の間、より好ましくは１２０分間、酸化雰囲気下に保つことを含むことを特徴とする。酸化雰囲気下での熱処理の前記ステップに、前記熱処理を施すために使用されるデバイスの特徴に従って、温度の上昇が先行し、温度の低下が続く。
【００７６】
前記熱処理の間、ネットワークの色は、繊維の芳香化およびポリマーの架橋を反映して、白色から茶色に変化する。
【００７７】
より具体的には、この第２の態様によると、本発明の主題は、以下のステップ：
ａ）０．０５％  ＭＷＣＴカーボンナノチューブを含む１０％ＰＡＮ溶液の電界紡糸によって前記ネットワークを合成するステップであって、
ＰＡＮ溶液を針から押し出し、その変位振幅は３０〜５０ｍｍの間含まれ、その変位速度は２〜１０ｍｍ／秒の間に含まれ、
ポリマー源と集電極との間の距離は１〜５０ｃｍの間に含まれ、押出場に印加される電界は２０ｋＶであり、
シリンジに供給するためのポリマー溶液の流量は２．４ｍＬ／時間である
ことを特徴とするステップと、
ｂ）ステップａ）の間に得られた繊維の３Ｄネットワークを、酸化雰囲気下および２００℃〜３００℃の間に含まれる温度で１２０分間熱処理するステップと
を含む方法である。
【００７８】
別の特定の態様によると、本発明による方法は、前記熱処理ステップに、前記繊維を官能化すること、特に本発明による３Ｄネットワークと接触している細胞の細胞外環境の模倣に寄与することを意図した、ネットワークの繊維の表面の処理が続く。本発明による方法の特定の態様によると、表面処理ステップは、ネットワークを、特に、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヒアルロン酸およびコラーゲンから選択される、細胞外マトリックスの少なくとも１つのタンパク質の溶液の存在に持ち込むことを含む。細胞外マトリックスの少なくとも１つのタンパク質のこの溶液は、適切な緩衝液中および適切な濃度条件下で調製される。例えば、ラミニンを１〜２ｍｇ／ｍｌの間に含まれる濃度でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で調製し、次いで、ネットワークを５〜２０μｇ／ｍｌの間に含まれる濃度のラミニン溶液と接触させる。
【００７９】
本発明による方法では、ネットワークを細胞外マトリックスの少なくとも１つのタンパク質の溶液の存在下に持ち込むことに、場合により前記ネットワークの官能化の質を改善することを意図した、前記ネットワークの繊維の表面の前処理が先行する。前記前処理は、当業者に知られている任意の適切な方法によって、特に液相または気相で実施される化学堆積によって実施される。好ましい態様によると、このような化学堆積は、特に浸漬によって、これを５〜５０μｇ／ｍｌの間に含まれる濃度でポリ−Ｄ−リジン溶液の存在下に持ち込むことを含む。
【００８０】
この特定の態様によると、本発明による方法は、以下の連続ステップ：
繊維の表面の前処理、
フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヒアルロン酸およびコラーゲン、好ましくはラミニンから選択される細胞外マトリックスの少なくとも１つのタンパク質による繊維の官能化をもたらす表面の処理
によって、３Ｄネットワークの繊維の表面を処理することを含む。
【００８１】
より特定の態様によると、本発明による方法は、以下の連続ステップ：
ポリ−Ｄ−リジン溶液による前処理、
ラミニン溶液による表面の処理
によって、３Ｄネットワークの繊維の表面を処理することを含む。
【００８２】
本発明の第３の主題は、本発明による架橋ポリマー繊維の不融性３Ｄネットワークまたは本発明による方法によって得られるネットワークを含む、細胞支持のためのデバイスである。
【００８３】
本発明による細胞を支持するためのデバイスは、本発明による架橋ポリマー繊維の不融性３Ｄネットワーク、より具体的には本発明による架橋アクリル型ポリマー繊維の不融性３Ｄネットワークまたは他の要素と組み合わせて、本発明による方法によって得られるネットワークを含む。
【００８４】
このようなデバイスは、特に、前記ネットワークによってそのまま、または例えば培養皿などの任意の適切な支持体に配置もしくは挿入された前記ネットワークによって構成することができる。例として、本発明によるデバイスは、少なくとも１つのウェルが本発明による繊維の３Ｄネットワークを含むマルチウェルプレート型のプレートによって構成することができる。特定の態様によると、本発明の主題は、「マルチウェルプレート」型の任意の適切な支持体内に配置または挿入された、同一のまたは異なる、本発明による１つまたは複数の３Ｄネットワークを含むデバイスである。
【００８５】
本発明の第４の主題は、細胞支持体としての、本発明による３Ｄネットワーク、本発明による方法によって得られる３Ｄネットワーク、またはこのような３Ｄネットワークを含むデバイスの使用である。このような使用は、
目的の細胞を、本発明による３Ｄネットワーク、本発明による方法によって得られる３Ｄネットワーク、またはこのような３Ｄネットワークを含むデバイスと、適切な条件下および適切な期間、接触させること、および
前記細胞および／または前記細胞の生化学的分析を特徴付ける少なくとも１つのパラメータを観察し、場合により決定すること
を連続的に含む。
【００８６】
前記適切な条件および期間は、細胞培養を専門とする当業者に周知であり、特に、細胞を懸濁する培地、それらの濃度およびそれらのインキュベーション温度に関連する。
【００８７】
細胞を特徴付けるパラメータは、特に、細胞の生死の状態、細胞数、前記ネットワークの表面でのおよび／または前記ネットワーク内での細胞の位置、単離および／またはグループ化された細胞の存在、細胞のサイズおよび形状、核およびオルガネラの特徴から選択される。前記細胞を観察するための手段は、特に、但し排他的ではなく、例えば、走査型電子顕微鏡、従来の蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、多光子顕微鏡、落射蛍光顕微鏡、ビデオ顕微鏡および三次元イメージングなどの任意のタイプの顕微鏡である。
【００８８】
細胞の生化学分析は、特に、但し排他的ではなく、当業者に知られている任意の適切な手段による、ＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞タンパク質および代謝産物の定性的および／または定量的分析を含む。このような手段には、特にトランスクリプトームおよびプロテオミクス研究が含まれる。
【００８９】
より特定の態様によると、本発明の主題は、増殖細胞またはがん性細胞用の支持体としての、本発明による３Ｄネットワーク、本発明による方法によって得られる３Ｄネットワーク、またはこのような３Ｄネットワークを含むデバイスの使用である。さらにより特定の態様によると、本発明の主題は、神経膠芽腫細胞、さらに特に浸潤性神経膠芽腫細胞用の支持体としての、本発明による３Ｄネットワーク、本発明による方法によって得られる３Ｄネットワーク、またはこのような３Ｄネットワークを含むデバイスの使用である。
【００９０】
別のより特定の態様によると、本発明の主題は、細胞の生存、増殖、分化および／または移動を研究し、特徴付けるための、本発明による３Ｄネットワーク、本発明による方法によって得られる３Ｄネットワーク、またはこのような３Ｄネットワークを含むデバイスの使用である。この態様によると、前記細胞は、特にがん細胞、さらに特に神経膠芽腫細胞である。
【００９１】
以下の実施例１〜４および図１〜１０は本発明を例示するものである。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】実施例１による、本発明による繊維の３Ｄネットワークの物理的特徴を示す図である：図１Ａ：整列した（左側の画像）または整列していない（右側の画像）ＰＡＮ繊維の走査型電子顕微鏡像（スケールバー：５０μｍ）；図１Ｂ：繊維上のラミニン堆積を示す免疫染色像（スケールバー：２０μｍ）、図１Ｃ：図１Ｂの画像の取得に対応する「ｚスタック」からの３Ｄ再構築、繊維上のラミニンの不連続堆積は矢印で示される（スケールバー：２０μｍ）。
【図２】実施例２による、繊維のネットワーク内のニューロスフェア（ＮＳ）の接着および浸透を示す図である：図２Ａ：５０００個の細胞を含有するニューロスフェアの堆積時の、３Ｄネットワーク中のニューロスフェアの接着および浸透を示す画像（スケールバー：５００μｍ）；図２Ｂ：繊維のネットワーク上の堆積５時間後のＧｌｉ４細胞のニューロスフェアを示す画像（スケールバー：２００μｍ）；図２Ｃ：繊維のネットワーク上の堆積６日後のＧｌｉ４細胞のニューロスフェアを示す画像（スケールバー：２００μｍ）、図２Ｄ：ニューロスフェアから離れた、繊維のネットワークの深さの、移動性Ｇｌｉ４細胞の分布の側面図（スケールバー：２０μｍ）、図２Ｅ：繊維へのＧｌｉ４の接着を示す免疫染色像（スケールバー：１０μｍ）、矢印はＧｌｉ４細胞を示す；図２Ｆ：繊維上のＧｌｉ４細胞の画像（図２Ｅ）の取得に対応する「ｚスタック」からの３Ｄ再構築。
【図３】ラミニンの非存在下（図３Ａおよび図３Ｂ）または存在下（図３Ｃおよび図３Ｄ）での、分化条件下での６日間の培養後の、実施例２による、繊維の３Ｄネットワーク上に堆積した細胞の個別のまたは集合的な移動を示す図である；図３Ａおよび図３Ｃ：走査型電子顕微鏡によるＧｌｉ４細胞の可視化（スケールバー：５００μｍ）、図３Ｂおよび図３Ｄ：ファロイジングリーンでアクチン細胞骨格をマーキングした後のＧｌｉ４細胞の可視化（スケールバー：２０μｍ）。図３Ａおよび３Ｂ中、矢印は、繊維上のラミニンの非存在下で集合的に移動する細胞群の中心に位置する末梢細胞および円形細胞の葉状仮足伸長を示す。図３Ｃおよび３Ｄ中、矢印は、繊維上のラミニンの存在下で個別に移動する細胞を示す。
【図４】整列した繊維上のラミニンの存在下（左側のヒストグラム）または非存在下（右側のヒストグラム）で定量化された集団的移動の数（ｙ軸）を示し、少なくとも２個の細胞によって形成され、ニューロスフェアから物理的に分離されたクラスターを集団的移動と見なし、結果は少なくとも３つの異なる実験を表す図である、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（スチューデントのｔ検定）。
【図５】繊維の３Ｄネットワーク上、分化条件下で６日間の培養後の、実施例２による、整列したまたは整列していない繊維上の細胞の移動の方向を示す図である：アクチン骨格をファロイジンで染色し、核をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３４２染料で染色し（スケールバー２００μｍ）、繊維の方向を矢印で示す。図５Ａおよび図５Ｃ：ラミニンの非存在下、図５Ｂおよび図５Ｄ：ラミニンの存在下、図５Ａおよび図５Ｂ：整列していない繊維、図５Ｃおよび図５Ｄ：整列した繊維。
【図６】ラミニンの非存在下（バーＡおよびＢ）または存在下（バーＣおよびＤ）で、整列した繊維の平行（バーＡおよびＣ）または垂直（バーＢおよびＤ）方向に移動するＧｌｉ４細胞の総数の定量化（ｙ軸）を表す図である。細胞数は、ニューロスフェアの外縁から２００μｍ〜２０００μｍの間に含まれる距離でカウントする。このフィールドは、ニューロスフェアに近い細胞の膨張性増殖による移動を排除するために選択した。バーＡとバーＢとの間：＊ｐ＜０．１、バーＣとバーＤとの間：＊＊ｐ＜０．０１（スチューデントのｔ検定）。全ての結果は、２つの独立した実験を表す。
【図７】架橋ポリマー繊維の走査型電子顕微鏡像（スケールバー：２００μｍ）を表す図である。前記ポリマーは、５％ＰＭＭＡ＋５％ＰＡＮ（図７Ａ）、５％ＰＭＭＡ＋１０％ＰＡＮ（図７Ｂ）または２０％ＰＭＭＡ（図７Ｃ）溶液の架橋によって得られる。
【図８】（ＭＴＴアッセイ）ｙ軸に、ポリマー繊維上の生きている代謝的に活性な細胞によるＭＴＴテトラゾリウム塩（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）の還元によって生成されるホルマザンの吸光度、ならびにｘ軸に、左から右に、１０％ＰＡＮ；５％ＰＭＭＡ＋５％ＰＡＮ；５％ＰＭＭＡ＋１０％ＰＡＮおよび２０％ＰＭＭＡを示すヒストグラムである。
【図９】繊維の３Ｄネットワーク上、分化条件下で５日間の培養後の、１０％ＰＡＮ（図９Ａ）、５％ＰＭＭＡ＋５％ＰＡＮ（図９Ｂ）または２０％ＰＭＭＡ（図９Ｃ）繊維上のＧｌｉ４細胞の移動の方向を示す図である：アクチン骨格をファロイジンで染色し、核をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３４２染料で染色した。
【図１０】ｙ軸に、ポリマー繊維上に堆積したＧｌｉ４細胞の移動領域の表面積（μｍ２）、およびｘ軸に、左から右に、１０％ＰＡＮ、５％ＰＡＮ＋５％ＰＭＭＡまたは２０％ＰＭＭＡを示すヒストグラムである。
【実施例】
【００９３】
実施例１：ポリアクリロニトリル繊維の３Ｄネットワークの合成および物理的特徴付け
１．１．材料および方法
ＰＡＮ繊維の３Ｄネットワークの合成
ポリアクリロニトリル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の１０重量％溶液をジメチルホルムアミド中で調製する。１０％ＰＡＮ溶液１０ｇの場合：ＤＭＦ９ｇに対してＰＡＮ１ｇの値を秤量し、引き続いてＰＡＮがＤＭＦに完全に溶解するまで、攪拌下で７５℃に加熱する。
【００９４】
この溶液を電界紡糸によって形成する。コレクターは、直径１５ｃｍの回転式コレクターである。ポリマーを分配する針とコレクターとの間に２０ｋＶの電界を印加する。
繊維が整列した３Ｄネットワーク：針は回転式コレクターから１５ｃｍの距離に位置する。繊維が巻き付けられているコレクターは回転速度が２０００ｒｐｍで、これにより繊維が整列したネットワークを得ることが可能になる。
「絡み合った」繊維と呼ばれる繊維による３Ｄネットワーク：針は平板式非回転コレクターから１５ｃｍの距離に位置する。
【００９５】
いずれの場合も、この場合、２．４ｍｌ／時間の押力で「シリンジポンプ」によってポリマーを針に運搬する。電界紡糸中、針は５ｍｍ／秒の変位速度で振幅４０ｍｍの変位を実行する。電界紡糸は少なくとも２０分間続く。次いで、繊維の組織が、滅菌される前に熱処理を受ける。
【００９６】
３Ｄネットワークの熱処理
電界紡糸によって得られたネットワークを、空気下、２５０℃の温度で、１２０℃／時間の加熱速度、２５０℃で２時間のプラトーで熱処理し、冷却速度は３００℃／時間とする。処理の間、ネットワークの色は、繊維の芳香化を反映して、白色から茶色に変化する。
【００９７】
使用前に、ネットワークは７０度エタノールまたはオートクレーブで滅菌を受ける。
【００９８】
ＰＡＮ繊維およびカーボンナノチューブの３Ｄネットワークの合成
多層カーボンナノチューブ（Ｎａｎｏｃｙｌ（商標）、純度９５％、製品整理番号ＮＣ３１０１またはＮＣ３１５１）を含有する繊維の製造中に、ＰＡＮ溶液中のＭＷＣＴの分散を増加させるために、界面活性剤ｔｒｉｔｏｎ  １００Ｘを、０．０５％ＷＴのＭＷＣＴの場合、最終溶液の２．５％で添加する。
【００９９】
０．０５％ＷＴ  ＰＡＮ溶液の調製の場合、以下のステップを行う：
ａ）１０％ＰＡＮ中ＭＷＣＴの０．０５％溶液（重量％）１０ｇの調製
−ＰＡＮ１ｇ、ＭＷＣＴ０．０５ｇおよびＤＭＦ８．９５ｇの値を秤量する、
−ＰＡＮがＤＭＦに完全に溶解するまで、攪拌下で７５℃に加熱する
−溶液を超音波処理する
ｂ）第１．１．１．節に従って１０％ＰＡＮ溶液を製造する
ｃ）Ｔｒｉｔｏｎ  １００Ｘ  ０．７５ｇおよび１０％ＰＡＮ溶液８．２５ｇについて、１０％ＰＡＮ＋０．０５％ＷＴ（重量％）ＭＷＣＴ溶液１ｇを混合する
ｄ）混合溶液を超音波処理する。
【０１００】
次いで、ポリマー溶液を電界紡糸によって処理し、次いで、得られたネットワークを上に示されるように熱処理する。
【０１０１】
１０％ＰＡＮで希釈することにより、ＰＡＮ繊維および０．００１６％（重量％）ＭＷＣＴによって構成されるネットワークを合成する。
【０１０２】
繊維の表面をラミニンでコーティングする
ラミニンによる官能化のために、培養皿および生体適合性電界紡糸繊維の３Ｄネットワークを、３７％のホウ酸緩衝液中２５μｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リジンと一晩インキュベートし、次いで、滅菌水で２回洗浄し、滅菌水中５．２μｇ／ｍｌのラミニンと３７℃で４時間インキュベートする。これを水で２回洗浄する。
【０１０３】
ウェルへの繊維のネットワークの包含
この包含は、繊維を収容することを意図したウェルのサイズに対応するサイズのパンチを使用して繊維を切り抜くことによって実行することができる。次いで、切り抜いた繊維をウェルの底に堆積させると、使用準備ができる。
【０１０４】
ウェルのサイズに対応するサイズの挿入物に切り抜いた繊維を配置することも可能であり、これにより繊維をウェルに侵入させ、除去することが容易になる、または繊維の両側に濃度勾配を生成することが可能になる。
【０１０５】
１．２．結果
ＰＡＮ繊維の３Ｄネットワークの特徴付け
０．６８＋／−０．２８μｍと推定される繊維の直径は、０．６４＋／−０．４２μｍと推定される脳梁に存在する軸索の直径に類似である（Ｌｉｅｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｌ．Ｃｙｂｅｒｎ．１０８，５４１−５５７）。実施した電界紡糸法に応じて、生成された繊維のネットワークは、ランダムに整列または組織化した繊維を含む（図１Ａ）。整列した繊維のネットワークは、厳密に平行な繊維ではなくむしろ一般的な配向を有する。
【０１０６】
機械的特性の評価は、原子間力顕微鏡によって行う。カーボンナノチューブを添加していないＰＡＮ繊維によって構成されるネットワークの弾性は、０．１６ｋＰａの弾性率を特徴とする。実験は、窒化ケイ素三角カンチレバーシステム（ＭＬＣＴＡＵＨＷ、Ｖｅｅｃｏ）を使用し、Ｏｌｙｍｐｕｓブランドの倒立顕微鏡に取り付けられたＡｓｙｌｕｍ  ＭＦＰ−３Ｄデバイス（Ａｓｙｌｕｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国カリフォルニア州サンタバーバラ）の接触モードで、１０ｐＮ／ｎｍの剛性定数で行う。測定は、最大力１ｎＮを印加することによって行う。剛性は、記録された画像の全ての平均値として測定する。
【０１０７】
ＰＡＮ繊維および０．００１６％（重量％）ＭＷＣＴによって構成されるネットワークの場合、弾性は６２ｋＰａの弾性率を特徴とする。
【０１０８】
ＰＡＮ繊維および０．０５％（重量％）ＭＷＣＴによって構成されるネットワークの場合、弾性は２５０ｋＰａの弾性率を特徴とする。
【０１０９】
間隙は、繊維のメッシュが許容されるが、それにもかかわらず、細胞をマトリックスに入るように変形させるようなものである。間隙は０．５μｍ２〜９μｍ２の間に含まれ、これは細胞の閉じ込め位置に対応する。
【０１１０】
蛍光特性：
ネットワークが光エネルギーに供されると、繊維は蛍光として現れる（図１Ｂ）。繊維は、緑（４８８ｎｍ）および赤（５９４ｎｍ）、ならびにより少ない程度に青（３５０ｎｍ）および赤外線（６４７ｎｍ）で自家蛍光性である。ラミニンによる繊維の官能化は、微小環境を修正することを可能にする。
【０１１１】
ラミニンでコーティングされたネットワークの特徴付け
ラミニン堆積物は、繊維上に不連続に分布している（図１Ｃ）。
【０１１２】
結論
このようにして得られた３Ｄネットワークは非細胞毒性であり、それらの増殖、移動および分化を可能にする細胞のための３Ｄ支持体を構成することができる。
【０１１３】
実施例２：神経膠芽腫細胞の移動の特徴付け
２．１．材料および方法
神経膠芽腫細胞の培養
神経膠芽腫細胞（ＧＢＭ）ならびに培養物の取得および単離は、非接着ニューロスフェアについてＤｒｏｍａｒｄら（Ｄｒｏｍａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．８６，１９１６−１９２６）に従って、Ｇｕｉｃｈｅｔら（Ｇｕｉｃｈｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｇｌｉａ，６１，２２５−２３９）によって作成されたプロトコルを使用して行う。Ｇｌｉ４およびＧｌｉＴ細胞は、２人の異なる患者に由来する初代神経膠芽腫培養物である。これらのＧＢＭ細胞を、グルコース、グルタミン、インスリン、Ｎ２およびシプロフラキシン（ｃｉｐｒｏｆｌａｘｉｎ）を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、２つの異なる条件下で培養する。
【０１１４】
「増殖」条件と呼ばれる非接着条件下で、培養皿をポリ−２ヒドロキシエチルメタクリレート（ポリＨＥＭＡ、ＳＩＧＭＡ）で前処理し、培地に上皮成長因子（ＥＧＦ）および線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ゲンタマイシン、ヘパリン、ファンギゾン、ファンギンおよびＢ２７も補足する。これらの条件下で、ＧＢＭ細胞は、インビトロ神経幹細胞（ＮＳＣ）を思い出させるニューロスフェア（ＮＳ）を形成し、神経前駆細胞および幹細胞マーカー（ネスチン、ｏｌｉｇ２、ｓｏｘ２等）を発現し、自己再生し、免疫不全動物で腫瘍を増殖させる。コンフルエント後、ＨＢＳＳ（カルシウムもマグネシウムも含まない）を使用してＮＳを機械的に解離し、再播種する。
【０１１５】
「分化」条件と呼ばれる条件下で、ＤＭＥＭ／Ｆ１２は、成長因子もヘパリンも含まないウシ胎児血清（０．５％）を含有する。この場合、ＧＢＭ細胞を、ポリＨＥＭＡなしで、実施例１に従って調製した平坦な（２Ｄ）表面または３Ｄネットワークに接着して培養する。
【０１１６】
３Ｄネットワーク上での細胞の培養
細胞を堆積させる前に、実施例１に記載されるように調製した生体適合性電界紡糸繊維（「繊維」と示される）の３Ｄネットワークを７０％アルコールで滅菌し、オートクレーブし、実施例１に記載されるように、ポリ−Ｄ−リジン／ラミニンで官能化するまたはしない。官能化のために、２Ｄ培養皿および繊維を、３７％のホウ酸緩衝液中２５μｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リジンと一晩インキュベートし、次いで、滅菌水で２回洗浄し、滅菌水中５．２μｇ／ｍｌのラミニンと３７℃で４時間インキュベートする。皿および繊維を滅菌水で２回洗浄し、Ｇｌｉ４およびＧｌｉＴのニューロスフェアまたは解離細胞をその上に播種する。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で６日間、培養条件下に維持する。
【０１１７】
ニューロスフェアを得るために、９６ウェルのＣｏｒｎｉｎｇマイクロプレートを使用する（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ７００７）。解離したＧＢＭニューロスフェアを増殖条件下で培養し、５０００個細胞／ウェルで播種する。細胞が沈降し、ＮＳを播種の２４時間後に採取する。
【０１１８】
ＧＢＭの同所性異種移植
Ｇｌｉ４およびＧｌｉＴ細胞を、０．２５％トリプシンを使用して酵素的に解離し、０．５×１０５個細胞／マイクロリットルでＰＢＳに再懸濁する。３マイクロリットル（１．５×１０５個細胞）を、イソフルラン麻酔下で６週齢の雌ＮＭＲＩヌードマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ研究所）の線条体（頭側１ｍｍ、外側２ｍｍ、深さ２．５ｍｍ）に注入する。ポンプに接続されたＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して、０．３ｍｌ／分の流量で細胞懸濁液を注入する。手術の最後に、残りの細胞を播種して細胞生存率を確認する。３ヶ月後、動物をペントバルビタール麻酔下で屠殺し、ＰＦＡの心臓内灌流で固定する。脳を回収し、４％ＰＦＡで一晩後固定し、次いで、７％、１５％および３０％スクラーゼに連続的に浸漬する。次いで、これらの脳をＯＣＴ（最適切断温度）に含め、液体窒素で凍結し、−２０℃で保存する。１４μｍ厚さの脳の冠状断面を、クライオスタットで生成する。
【０１１９】
３Ｄネットワークのクライオセレクション（Ｃｒｙｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）
繊維の３Ｄネットワークを、ＯＣＴコンパウンドに含める。横断面の厚さは１４μｍである。
【０１２０】
免疫蛍光および３Ｄ再構成
６日間の培養後、ＮＦまたは皿で培養したＧＳＣを４％ＰＦＡで固定する。３Ｄネットワーク、皿および脳の切片を、０．５％ＰＢＳ−トリトン−５％ウマ血清を使用してブロッキングおよび透過処理する。一次抗体を４℃で一晩インキュベートする。蛍光色素に結合した二次抗体を、１／５００の希釈で、周囲温度で２時間インキュベートする。これらの抗体は、Ｎ−カドヘリン（Ａｂｃａｍ  ａｂ１２２２１）、カルパイン−２（Ａｂｃａｍ  ａｂ１５５６６６）およびヒト核（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＢ  １２８１）である。切片をＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔでマウントし、観察前に乾燥させる。アクチン細胞骨格を（緑色）ファロイジンで強調し、核をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で強調する。Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ２  Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５  Ｌｉｖｅ  ＤＵＯおよびＷｉｄｅｆｉｅｌｄ  １−Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｚ１／Ｚｅｎ（Ａｐｏｔｏｍｅを搭載）顕微鏡を使用して、Ｚスタック取得で画像を撮影する。Ｉｍａｒｉｓ  Ｘ６４  ８．１．２ソフトウェアを３Ｄ画像の再構築に使用する。定量化はＺＥＮ  ２０１２ソフトウェアで実行する。
【０１２１】
繊維上で培養されたＧｌｉ４細胞を、周囲温度で１時間、次いで４℃で一晩、ＰＨＥＭ緩衝液中２．５％グルタルアルデヒドで固定する。次いで、細胞を７０％、９６％および１００％のアルコールで連続的に脱水し、次いで、乾燥のためにＨＭＤＳ中でインキュベートする。
【０１２２】
ウエスタンブロット
タンパク質を、ＲＩＰＡ緩衝液（ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を補足）中繊維上の培養物から抽出する。タンパク質ライセート２０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、その後、ＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−５％脱脂乳でブロッキングする。使用される一次抗体は、ガレクチン−３（ａｂｃａｍ  ａｂ２７８５）、インテグリンβ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡＢ  １９５２）、インテグリンα６（ａｂｃａｍ  ａｂ７５７３７）、ＦＡＫ（ａｂｃａｍ  ａｂ４０７９４）、ホスホ−ＦＡＫ  Ｙ３９７（ａｂｃａｍ  ａｂ  ８０２９８）、タリン１／２（ａｂｃａｍ  ａｂ１１１８８）、カルパイン−２（ａｂｃａｍ  ａｂ１５５６６６）、および対照としてのＧＡＰＤＨ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＢ３７４）である。二次抗体と結合した西洋ワサビペルオキシダーゼを周囲温度で２時間インキュベートする。ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ＋イメージャを、化学発光の検出に使用する。ピクセルの定量化はＩｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェアで実行する。
【０１２３】
細胞移動の特徴付け
Ｇｌｉ４細胞の移動の方向および距離を、ラミニンでコーティングされた、またはコーティングされていない、整列したまたは整列していない繊維で分析する。Ｔ＝０で、５０００個の細胞を有するニューロスフェアを播種する。移動距離当たりの細胞数を、ＡＸＩＯ−ＩＭＡＪＥＵＲソフトウェアで定量化する。基本的に、同心円弧は球の中心から一定の間隔で定義され、２つの連続する弧の間に存在する細胞の数をカウントするので、移動距離間隔当たりの細胞の数を定義する。移動弧は、ニューロスフェアの縁から２００〜２０００μｍの間に含まれる。この空間は、ＮＳ増殖の拡大に関連する移動を排除するよう選択される。この試験を２Ｄおよび３Ｄで行う。
【０１２４】
統計分析
実験ごとに少なくとも３つの複製を作成する。値は平均＋／−ＳＤとして表される。統計検定は、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して実行する。
【０１２５】
２．２．結果
整列した繊維は、神経膠腫細胞の接着および移動のための３Ｄ環境を構成する。
繊維のネットワークにより、脳梁を移動する細胞をよりよく理解、特徴付けおよび標的化することが可能になる。細胞が２Ｄ表面上に堆積し、成長因子の非存在下および血清（分化培地）の存在下で培養されると、ニューロスフェア（ＮＳ）が支持体に接着し、Ｇｌｉ４細胞が分化し、ＮＳから離れて移動する（Ｇｕｉｃｈｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ”，Ｇｌｉａ．Ｆｅｂ；６１（２）：２２５−３９，２０１３）。繊維の３Ｄネットワーク上に播種し、分化培地で培養すると、Ｇｌｉ４  ＮＳは表面に接着し、繊維のネットワークに浸透する（図２Ａ）。Ｇｌｉ４細胞は、ＮＳから離れることによって増殖および移動する（図２Ａ〜図２Ｃ）。繊維のネットワーク内でのＧｌｉ４細胞の分布の分析は、細胞がネットワークの内部に深く移動することを示している（図２Ｄ）。この環境では、Ｇｌｉ４細胞は、いくつかの繊維に三次元的に接着するために、様々な方向に細胞伸長を形成する（図２Ｅおよび図２Ｆ）。Ｇｌｉ４細胞は、繊維の直径のおよそ４０倍の直径を有し（およそ０．５μｍに対して２０μｍ）、繊維を取り囲んで接着および移動する（図２Ｅおよび図２Ｆ、矢印）。この環境により、Ｇｌｉ４細胞がネットワーク内で腹側、外側および背側に相互作用することが可能になる。さらに、繊維間の不均質な間隙は０．１〜１０μｍ２の間で分布し、最大分布は１〜２μｍ２の間である。これらの空間は、細胞を繊維のネットワークに侵入するために変形させ（図２Ｄ）、これはインビボで観察される自然な細胞閉じ込めを思い出させる（Ｆｒｉｅｄｌ  ａｎｄ  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  “Ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ：ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｃｉｐｒｏｃｉｔｙ”，Ｃｅｌｌ，１４７，９９２−１００９，２０１１）。これらの結果は、ＰＡＮ繊維が３Ｄ微小環境で神経膠芽腫細胞の接着および移動を許容することを示している。
【０１２６】
細胞外マトリックスのタンパク質への細胞接着の動力学ならびに平坦な（２Ｄ）従来の表面および整列した（３Ｄ）繊維に関するＧｌｉ４細胞の接着斑
Ｇｌｉ４細胞と細胞外媒体（ＥＣＭ）との間の相互作用、および平坦な表面上とラミニンで官能化したまたはしていない（＋または−ＬＮ）繊維の３Ｄネットワーク中での接着斑（ＡＦ）を比較するため、インテグリンβ１、インテグリンａ６およびガレクチン−３の発現を分析した。ラミニンでコーティングされた皿（ＰＳ＋ＬＮ）とラミニンでコーティングされた繊維（ＮＦ＋ＬＮ）との間で、ガレクチン−３およびインテグリンβ１の発現レベルはそれぞれ６倍および２．６倍増加し、インテグリンα６のレベルは２．５倍減少した。平坦な表面とラミニンでコーティングされていないネットワークとの間では、インテグリンβ１およびα６の発現レベルに違いは見られない。免疫蛍光法により、インテグリンβ１は、ラミニンでコーティングされた平坦な表面上に堆積したＧｌｉ４細胞の細胞質中および核の周りに分布する場合、ラミニンでコーティングされた３Ｄネットワーク上を移動するＧｌｉ４細胞の膜上に位置する。さらに、ラミニンでコーティングされた繊維のネットワーク上では、インテグリンβ１の染色は繊維との結合点に位置する。さらに、平坦な表面または３Ｄネットワークがラミニンでコーティングされている場合、インテグリン媒介シグナルの伝達における主要な動作主である接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）のリン酸化が増加する。
【０１２７】
ＰＳ＋ＬＮおよびＮＦ＋ＬＮ支持体上のＧｌｉ４細胞におけるタリン１／２、ビンキュリンおよびカルパイン−２の発現を測定した。ラミニンの有無にかかわらず、平坦な表面上のＧｌｉ４細胞でインタクトおよび切断型が検出され、ＰＳ＋ＬＮ支持体上でタリンの切断率が最も高かった。逆に、タリン１／２は、ラミニンの有無にかかわらず、繊維上のＧｌｉ４細胞では切断されない。ビンキュリンの発現レベルは、様々な条件下で変化しない。カルパイン−２の発現は、ラミニンでコーティングされた平坦な表面と比較して、ラミニンでコーティングされた繊維上に堆積したＧｌｉ４細胞では２分の１に減少する。
【０１２８】
これらの結果は、ＥＣＭへのインテグリンβ１およびガレクチン−３によって媒介される接着が、電界紡糸繊維上で増加することを示している。接着斑の動力学は、カルパイン−２の発現によって制御され、タリンの切断は、平坦な表面と３Ｄネットワークで異なる。
【０１２９】
ＧｌｉＴ細胞の接着およびその細胞外マトリックスの細胞との相互作用は繊維上では改善されない。
ＧｌｉＴ細胞は神経芽腫細胞の別の主要な系統であり、インビボではＧｌｉ４よりも侵入性が低い。ＧｌｉＴとＧｌｉ４は、試験した様々な系（平坦な表面または神経線維、ラミニンありまたはなし）において、細胞外マトリックスに関連する多数のタンパク質の発現が異なり、特にガレクチン−３、インテグリンβ１およびインテグリンα６の発現が異なる。ガレクチン−３、インテグリンβ１およびインテグリンα６を介したＧｌｉＴ細胞の接着は、繊維のネットワークの存在下では改善されない。
【０１３０】
インテグリンβ１およびガレクチン３は脳梁のＧｌｉ４細胞で過剰発現しているが、カルパイン−２はインビボの侵入性Ｇｌｉ４およびＧｌｉＴ細胞で過少発現している。
得られた結果は、Ｇｌｉ４細胞がＧｌｉＴ細胞よりも侵入性が高く、Ｇｌｉ４細胞におけるインテグリンβ１およびガレクチン−３の発現が脳の微小環境に依存し、カルパイン−２の発現がインビボでの浸潤性神経膠芽腫細胞（ＧＩＣ）の浸入能と逆相関していると思われることを示している。
【０１３１】
Ｇｌｉ４細胞は、整列したＰＡＮ繊維上、ラミニンの存在下または非存在下で、個別にまたは集合的に移動する。
蛍光顕微鏡および電子顕微鏡による３Ｄ画像再構成を使用して観察すると（図３Ａ〜図３Ｄ）、ラミニンでコーティングされていない繊維の３Ｄネットワークに播種すると、Ｇｌｉ４細胞は集合的に移動して、互いに強く結合した細胞で構成されたクラスターを形成する。逆に、ラミニンでコーティングされた繊維のネットワークの存在下では、Ｇｌｉ４細胞が互いに分離し、個別に移動する。よって、細胞は、繊維の官能化に応じて、２つの異なる移動様式、集合的様式または個別的様式を採用する。さらに、「ラミニンなし」の繊維では、ファロイジンによる細胞骨格のアクチンの染色は、細胞の大部分が丸く、クラスター内では、アクチン細胞骨格が細胞間で連続的であり、細胞塊の中心では、細胞が丸いが、クラスターの外側では、これらが双極性で、葉状仮足を有することを示す。逆に、ラミニンでコーティングされた繊維のネットワークでは、Ｇｌｉ４細胞が個別的、双極性、非対称であり、それぞれ前面に葉状仮足を有する。さらに、細胞が膜上でＮ−カドヘリンを発現する。
【０１３２】
さらに、ニューロスフェアによる集合的移動イベントの数を、ラミニンで官能化されたまたはされていない３Ｄネットワーク上で定量化した。この目的のために、同じサイズで、同じ数の細胞を含有するニューロスフェアを２つのネットワークに播種した。ラミニンによる繊維の官能化後に、ニューロスフェアによる集合的移動の数の有意な減少（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）が観察される。ニューロスフェア当たりの集合的移動の単位数は、繊維が官能化されると８０から２０に減少する。
【０１３３】
Ｇｌｉ４細胞は、生体適合性電界紡糸繊維の配向および組織化から生じるトポインダクション（ｔｏｐｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）シグナルに応答する。
ラミニンによって官能化されたまたはされていない、整列した繊維（ＡＦ）または整列していない繊維（Ｎ−ＡＦ）上のＧｌｉ４細胞の移動の方向を比較する。結果は、ラミニンの存在が、整列した繊維および整列していない繊維上で、ＮＳの外側に移動する細胞の数を増加させることを示している。整列していない繊維では、Ｇｌｉ４細胞が、ラミニンの非存在下または存在下で、ニューロスフェアから全ての方向に離れることによって移動する。整列した繊維では、Ｇｌｉ４細胞が、垂直方向ではなく主に繊維の方向に移動し、この効果が主にラミニンの存在下で観察される。繊維上の移動距離の関数としての移動性細胞の数を定量化した。移動領域の長さを、ニューロスフェアの縁と移動の方向に２ｍｍの距離との間で区切った。結果は、ラミニンのない整列していない繊維（左側のヒストグラム）と比較して、ラミニンの存在下での整列していない繊維（右側のヒストグラム）での移動性細胞の数の有意な増加を示している（図４）。ラミニンを添加すると、整列した繊維と平行な方向および垂直方向に移動するＧｌｉ４細胞の数が増加する。繊維に平行な方向およびラミニンの存在下で、Ｇｌｉ４細胞の数は、非官能化繊維と比較して、ＮＳの縁から２００〜８００μｍの間の距離で有意に増加する。整列した繊維に垂直な方向でも同じ結果が観察され、細胞の数が同様にラミニンの存在下でＮＳの縁から２００〜６００μｍの間の距離で有意に増加する。逆に、ラミニンの存在下および非存在下、繊維と平行および垂直で、ＮＳの縁の近く（０〜２００μｍ）の移動性細胞の数に有意差は観察されない。ＮＳに隣接する細胞の存在は、移動よりも増殖の結果として生じる。ラミニンの非存在下および存在下で、垂直方向と比較して、整列した繊維に平行な方向に移動する細胞の数の有意な増加が観察される。したがって、記載されるモデルでは、細胞浸潤を許容する間質性空間を作成するために、繊維を整列させる必要はない。
【０１３４】
合わせて、これらの結果は、ラミニンの存在が、整列した繊維および整列していない繊維上のＧｌｉ４細胞の移動を増加させることを示している。さらに、繊維の配向がＧｌｉ４細胞の移動の方向を指定する。非配向繊維では、Ｇｌｉ４細胞が全ての方向に移動するが、整列した繊維では、垂直方向よりも繊維に平行な方向に移動する。
【０１３５】
結論として、電界紡糸繊維の３Ｄマトリックスは、神経膠芽腫細胞の接着および３Ｄ微小環境でのその移動を可能にする。このモデルは、集合的移動プロセスにおけるＮ−カドヘリンを介した細胞間接着の重要性および神経膠芽腫細胞の加速した移動におけるラミニンの役割を示している。この繊維のマトリックスは、特に神経膠芽腫細胞の移動における細胞外マトリックスの役割を研究するための重要なツールとなる。
【０１３６】
実施例３：アクリル型ポリマー繊維の３Ｄネットワークの合成および物理的特徴付け
３．１．材料および方法
３．１．１．５％ＰＭＭＡ、５％ＰＡＮポリマーの整列した繊維の３Ｄネットワーク
ポリアクリロニトリル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）および５％ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の５重量％溶液をジメチルホルムアミド中で調製する。ポリマー溶液１０ｇの場合：ＤＭＦ９ｇに対してＰＡＮ０．５ｇおよびＰＭＭＡ０．５ｇの値を秤量し、引き続いてポリマーがＤＭＦに完全に溶解するまで、攪拌下で７５℃に加熱する。
【０１３７】
この溶液を電界紡糸によって形成する。コレクターは、直径１５ｃｍの回転式コレクターである。ポリマーを分配する針とコレクターとの間に２０ｋＶの電界を印加する。針は回転式コレクターから１５ｃｍの距離に位置する。繊維が巻き付けられているコレクターは回転速度が２０００ｒｐｍで、これにより繊維が整列したネットワークを得ることが可能になる。この場合、３．４ｍｌ／時間の押力で「シリンジポンプ」によってポリマーを針に運搬する。電界紡糸中、針は５ｍｍ／秒の変位速度で振幅４０ｍｍの変位を実行する。電界紡糸は少なくとも２０分間続く。次いで、繊維の組織が、滅菌される前に熱処理を受ける。
【０１３８】
電界紡糸によって得られたネットワークを、空気下、１１０℃の温度で、１２０℃／時間の加熱速度、１１０℃で１時間のプラトーで熱処理し、冷却速度は３００℃／時間とする。処理の間、ネットワークの色は、繊維の芳香化を反映して、白色から茶色に変化する。
【０１３９】
使用前に、ネットワークは７０度エタノールまたはオートクレーブで滅菌を受ける。
【０１４０】
３．１．２．５％ＰＭＭＡ、１０％ＰＡＮポリマーの繊維の３Ｄネットワーク
ポリアクリロニトリル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）および５％ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の１０重量％溶液をジメチルホルムアミド中で調製する。ポリマー溶液１０ｇの場合：ＤＭＦ８．５ｇに対してＰＡＮ１．０ｇおよびＰＭＭＡ０．５ｇの値を秤量し、引き続いてポリマーがＤＭＦに完全に溶解するまで、攪拌下で７５℃に加熱する。
【０１４１】
この溶液を電界紡糸によって形成する。コレクターは、直径１５ｃｍの回転式コレクターである。ポリマーを分配する針とコレクターとの間に２０ｋＶの電界を印加する。針は回転式コレクターから１５ｃｍの距離に位置する。繊維が巻き付けられているコレクターは回転速度が２０００ｒｐｍで、これにより繊維が整列したネットワークを得ることが可能になる。この場合、２．４ｍｌ／時間の押力で「シリンジポンプ」によってポリマーを針に運搬する。電界紡糸中、針は５ｍｍ／秒の変位速度で振幅４０ｍｍの変位を実行する。電界紡糸は少なくとも２０分間続く。次いで、繊維の組織が、滅菌される前に熱処理を受ける。
【０１４２】
電界紡糸によって得られたネットワークを、空気下、１１０℃の温度で、１２０℃／時間の加熱速度、１１０℃で１時間のプラトーで熱処理し、冷却速度は３００℃／時間とする。処理の間、ネットワークの色は、繊維の芳香化を反映して、白色から茶色に変化する。
【０１４３】
使用前に、ネットワークは７０度エタノールまたはオートクレーブで滅菌を受ける。
【０１４４】
３．１．３．２０％ＰＭＭＡポリマー繊維、＋ＤＭＦ＋ＴＨＦの３Ｄネットワーク
ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の２０重量％溶液をジメチルホルムアミドとテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の混合物中で調製する。ポリマー溶液１０ｇの場合：ＤＭＦ４ｇおよびＴＨＦ４ｇに対してＰＭＭＡ２．０ｇの値を秤量し、引き続いてポリマーが溶媒に完全に溶解するまで、攪拌する。
【０１４５】
この溶液を電界紡糸によって形成する。コレクターは、直径１５ｃｍの回転式コレクターである。ポリマーを分配する針とコレクターとの間に２０ｋＶの電界を印加する。針は回転式コレクターから１５ｃｍの距離に位置する。繊維が巻き付けられているコレクターは回転速度が２０００ｒｐｍで、これにより繊維が整列したネットワークを得ることが可能になる。この場合、３．８ｍｌ／時間の押力で「シリンジポンプ」によってポリマーを針に運搬する。電界紡糸中、針は５ｍｍ／秒の変位速度で振幅４０ｍｍの変位を実行する。電界紡糸は少なくとも２０分間続く。次いで、繊維の組織が、滅菌される前に熱処理を受ける。
【０１４６】
電界紡糸によって得られたネットワークを、空気下、１１０℃の温度で、１２０℃／時間の加熱速度、１１０℃で１時間のプラトーで熱処理し、冷却速度は３００℃／時間とする。処理の間、ネットワークの色は、繊維の芳香化を反映して、白色から茶色に変化する。
【０１４７】
使用前に、ネットワークは７０度エタノールまたはオートクレーブで滅菌を受ける。
【０１４８】
３．２．結果
ポリマー繊維の３Ｄネットワークの特徴付け
図７Ａ〜図７Ｃは、それぞれ
−ＤＭＦ中５％ＰＭＭＡ、５％ＰＡＮ：図７Ａ
−ＤＭＦ中５％ＰＭＭＡ、１０％ＰＡＮ：図７Ｂ
−ＤＭＦ＋ＴＨＦ中２０％ＰＭＭＡ：図７Ｃ
を含むポリマー溶液の架橋によって得られた本発明による３Ｄネットワークを表す。
【０１４９】
走査型電子顕微鏡像は、繊維の平均直径が、「５％ＰＭＭＡ、５％ＰＡＮ」混合物の場合は３００ｎｍ、「５％ＰＭＭＡ、１０％ＰＡＮ」混合物の場合は６００ｎｍ、「２０％ＰＭＭＡ」の場合は１．２μｍであることを示している。
【０１５０】
実施例４：神経膠芽腫細胞の生存率の特徴付け
４．１．材料および方法
Ｇｌｉ４神経膠芽腫細胞の培養
３Ｄネットワーク上での細胞の培養
細胞を堆積させる前に、実施例３に記載されるように調製した生体適合性電界紡糸繊維（「繊維」と示される）の３Ｄネットワークをオートクレーブした７０％アルコール中で滅菌する。皿および繊維を滅菌水で２回洗浄する。
【０１５１】
ニューロスフェアを得るために、９６ウェルのＣｏｒｎｉｎｇマイクロプレートを使用する（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ７００７）。解離したＧｌｉ４ニューロスフェアを増殖条件下で培養し、５０００個細胞／ウェルで播種する。細胞が沈降し、ＮＳを播種の２４時間後に採取する。
【０１５２】
４．２．結果
図８（ＭＴＴアッセイ）は、ｙ軸に、ポリマー繊維上の生きている代謝的に活性な細胞によるＭＴＴテトラゾリウム塩（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）の還元によって生成されるホルマザンの吸光度、ならびにｘ軸に、左から右に、１０％ＰＡＮ；５％ＰＭＭＡ＋５％ＰＡＮ；５％ＰＭＭＡ＋１０％ＰＡＮおよび２０％ＰＭＭＡを示すヒストグラムである。当業者に周知のこのＭＴＴアッセイは、アクリルから誘導された、またはアクリル型ポリマーの混合物から得られた繊維によって構成される３Ｄネットワークが細胞毒性を示さないことを示している。この試験を、繊維の各ネットワーク上に堆積した３００００個の解離したＧｌｉ４細胞で実行した。インキュベーション時間は、分化培地中で５日間とする。
【０１５３】
実施例５：神経膠芽腫細胞の移動の特徴付け
５．１．材料および方法
細胞を堆積させる前に、実施例３に記載されるように調製した生体適合性電界紡糸繊維（「繊維」と示される）の３Ｄネットワークをオートクレーブした７０％アルコール中で滅菌する。皿および繊維を滅菌水で２回洗浄する。
【０１５４】
ニューロスフェアを得るために、９６ウェルのＣｏｒｎｉｎｇマイクロプレートを使用する（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ７００７）。同じサイズのＧｌｉ４ニューロスフェアを形成するために、７５００個のＧｌｉ４細胞を各ウェルに堆積させ、増殖条件下で培養する。ＮＳを播種の４８時間後に採取し、様々な繊維に堆積させる。ニューロスフェアを、実施例１に記載されるように、固定および染色の前に、分化培地中で５日間移動させる。
【０１５５】
５．２．結果
アクリルから誘導されたまたはアクリル型ポリマーの混合物から得られた繊維上に播種された同じサイズ（７５００個細胞）のニューロスフェアのＧｌｉ４の蛍光顕微鏡像は、細胞移動ならびに細胞の接着に関する前記ネットワークの許容性を示している。Ｇｌｉ４は、繊維のネットワークの好ましい配向と平行に移動する。Ｇｌｉ４のアクチン細胞骨格をファロイジンでマークし、核をＨｏｅｃｈｓｔでマークする。
【０１５６】
次いで、ニューロスフェアの初期面積を差し引くことによって、Ｚｅｎソフトウェアを使用して移動面積を計算して、繊維上の移動の広さを評価することが可能になる。結果（図９Ａ〜図９Ｃ、図１０）は、繊維の物理的および化学的特徴の移動速度論に対する影響を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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