(57)【要約】  本発明はヒト及びマウスｃ−Ｍｅｔに交差結合する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体及びその用途に関し、より詳細には、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片を含む二重特異性抗体又は抗体−薬物複合体、これを含む癌の予防又は治療用医薬組成物、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸、前記核酸を含むベクター及び宿主細胞、これを用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片の製造方法及び前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片及び他の癌治療剤を含む癌治療用併用投与組成物に関する。本発明に係るｃ−Ｍｅｔに結合する抗体又はその抗原結合断片は、ヒト及びマウスｃ−Ｍｅｔに高い親和力で結合でき、マウス腫瘍モデルを用いた効能評価においてより正確な前臨床結果を確認することができる。本発明に係るｃ−Ｍｅｔに結合する抗体又はその抗原結合断片は、目的とする癌の予防又は治療に有用に用いることができる。【選択図】図６
2021521872.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は２７のアミノ酸配列を含む重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）ＣＤＲ１；配列番号２及び２８〜３１からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；配列番号３、３２及び３３からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び、
配列番号４、３４及び３５からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）ＣＤＲ１；配列番号５、３６及び３７からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；配列番号６、３８及び３９からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
配列番号４０及び４２〜４８からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４１及び４９〜５４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
単クローン抗体であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗原結合断片は、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
前記抗体又はその抗原結合断片は、ヒトｃ−Ｍｅｔ及びマウスｃ−Ｍｅｔに交差結合することを特徴とする、請求項１に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
請求項１に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片を含む、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）又は抗体−薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）。
【請求項７】
請求項１に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む、癌の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項８】
請求項６に記載の二重特異性抗体又は抗体−薬物複合体を有効成分として含む、癌の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項９】
前記癌は、乳癌、大腸癌、肺癌、胃癌、肝癌、血液癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、脳癌、子宮癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、結腸癌、卵巣癌、直腸癌、大腸癌、膣癌、小腸癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、尿管癌、尿道癌、前立腺癌、気管支癌、膀胱癌、腎臓癌又は骨髄癌であることを特徴とする、請求項７又は８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
放射線を用いた併用治療に使用されることを特徴とする、請求項７又は８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１４】
動物細胞、植物細胞、酵母、大腸菌及び昆虫細胞からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
サル腎臓細胞７（ＣＯＳ７：ｍｏｎｋｅｙ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ）細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞、Ｗ１３８、仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ：ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ＭＤＣＫ、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ７８細胞及びＨＥＫ２９３細胞、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）又はスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養する段階を含む、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片の製造方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片及び他の癌治療剤を含む癌治療用併用投与組成物。
【請求項１８】
前記他の癌治療剤は、免疫チェックポイント阻害剤であることを特徴とする、請求項１７に記載の併用投与組成物。
【請求項１９】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗−ＣＴＬＡ−４抗体、抗−ＰＤ−１抗体又は抗−ＰＤ−Ｌ１抗体であることを特徴とする、請求項１８に記載の併用投与組成物。
【請求項２０】
前記癌は、乳癌、大腸癌、肺癌、胃癌、肝癌、血液癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、脳癌、子宮癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、結腸癌、卵巣癌、直腸癌、大腸癌、膣癌、小腸癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、尿管癌、尿道癌、前立腺癌、気管支癌、膀胱癌、腎臓癌又は骨髄癌であることを特徴とする、請求項１７に記載の併用投与組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト及びマウスｃ−Ｍｅｔに交差結合する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体及びその用途に関し、より詳細には、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片を含む二重特異性抗体又は抗体−薬物複合体、これを含む癌の予防又は治療用医薬組成物、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸、前記核酸を含むベクター及び宿主細胞、これを用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片の製造方法、及び前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片及び他の癌治療剤を含む癌治療用併用投与組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）、表皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＦＧＦ）のような様々な成長因子は、細胞表面の受容体チロシンキナーゼ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ；ＲＴＫ）と相互作用して、発生段階の他、細胞成長、分化、血管新生、組織再生などにおいても重要な細胞生理的調節を誘導する。このような成長因子と受容体が変異、過発現、自体活性促進などのように生理的な側面で脱調節される場合、非正常の細胞成長又は分化を引き起こし、癌の発達を開始、促進させる（Ｌｅｍｍｏｎ  ＭＡ  ＆  Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ  Ｊ，Ｃｅｌｌ．１４１：１１１７−１１３４，２０１０）。
【０００３】
ＭＥＴ（ｍｅｔ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ；ｃ−Ｍｅｔ）タンパク質は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）／散乱因子（ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ；ＳＦ）受容体を発現させる原腫瘍遺伝子と知られており（Ｄｅａｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３１８：３８５−３８８，１９８５，Ｇｈｅｒａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ．１２：８９−１０３，２０１２）、唯一に知られたリガンドであるＨＧＦと相互作用して間葉−上皮移行（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ；ＭＥＴ）を誘導し、癌細胞の成長、侵入、転移の機能を促進する。ｃ−Ｍｅｔの場合、様々な腫瘍の発達過程においてリガンドであるＨＧＦに関係なく発生、転移、侵襲、新生血管誘導などの機序にも関与することから、効果的な抗癌標的とされており、この背景下で、化学薬物、単クローン抗体などのようなｃ−Ｍｅｔ阻害剤関連研究が活発である（Ｃｏｍｏｇｌｉｏ  ＰＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．７：５０４−５１６，２００８）。
【０００４】
抗癌標的ｃ−Ｍｅｔに対する拮抗抗体（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の開発は、代表的なｃ−Ｍｅｔ阻害による抗癌治療戦略である。抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の場合、リガンドであるＨＧＦとｃ−Ｍｅｔの相互作用を阻害したり、或いはｃ−Ｍｅｔを分解して不活性化させるものとして報告されている。例えば、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体として開発された‘ＯＡ−５Ｄ５’一本腕拮抗抗体（ｏｎｅ−ａｒｍｅｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）であり、ｃ−Ｍｅｔ二量化（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を誘導する副作用を持たないように変形された抗体として開発されており（Ｍａｒｔｅｎｓ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：６１４４−６１５２，２００６）、‘ＤＮ３０’の場合、ｃ−Ｍｅｔ自体の不活性化を誘導して機能を喪失させることによって腫瘍形成抑制を誘導するように開発されている（Ｐｅｔｒｅｌｌｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ．１０３：５０９０−５０９５，２００６）。しかし、一本腕拮抗抗体は、抗体単独処理による腫瘍抑制効果はわずかであるが、化学療法と共に処理されるときに有意の治療効果を示し、ｃ−Ｍｅｔ不活性化抗体は、リガンドと競合する様相が低く、アゴニストとしての効果を部分的に示す短所があることが確認された。このため、ヒトｃ−Ｍｅｔの機能を抑制する治療用抗体の開発への要求は続いている。
【０００５】
抗癌標的抗体の開発において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ効能評価の他、マウス腫瘍モデルを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ前臨床効能評価も必要である。特に、マウス腫瘍モデルを用いた効能評価時に、確認可能な腫瘍サイズ減少能力、生存日数増加のような前臨床実験結果から、当該抗体の治療効能を主に判断する。この時に用いられるマウス腫瘍モデルは、抗癌標的を過発現させるヒト由来の癌細胞を注入して作られるが、実際にマウス内腫瘍微小環境（ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）は、注入されたヒト腫瘍細胞だけでなく混在しいるマウス由来細胞の干渉によって、抗体の治療効果の確認時に、前臨床結果と臨床結果との相関関係が低い確率が高い（Ｔａｌｍａｄｇｅ  ＪＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７０：７９３−８０４，２００７）。したがって、ヒト由来抗癌標的だけを抑制する抗体だけでなく、マウス由来抗癌標的又はリガンドを抑制する抗体との組合せ処置（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）又はヒト／マウス異種抗癌標的に特異的な抗体が、腫瘍モデルにおいてより正確な前臨床治療結果を示すことができる。例えば、腫瘍内血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を抑制する抗Ｄｌｌ４（ｄｅｌｔａ  ｌｉｋｅ  ｌｉｇａｎｄ  ４）抗体の場合、ヒトＤｌｌ４に対する抗体に加え、マウスＤｌｌ４に対する抗体をマウス腫瘍モデルに組合処置したとき、有意に腫瘍のサイズが減る結果が報告された（Ｈｏｅｙ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．５：１６８−１７７，２００９）。また、血管内皮細胞成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ−２）又は血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）を標的する抗体も、ヒト／マウス異種抗癌標的に交差反応（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ）する抗体がマウス腫瘍モデルにおいて高い腫瘍抑制効果を示し、交差反応抗体開発の必要性を示唆した（Ｈｕａｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．６２：６１−７１，２０１０；Ｌｉａｎｇ  Ｗ−Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：９５１−９６１，２００６）。
【０００６】
このように、ｃ−Ｍｅｔの機能だけを抑制する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の場合、ヒト又はマウス由来肝細胞成長因子のオートクリン（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）／パラクリン（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）作用に対するマウスｃ−Ｍｅｔ受容体抑制作用がないため、マウス腫瘍モデルにおける前臨床効能評価時にその効果が評価し難い。ヒトｃ−Ｍｅｔ（Ｐ０８５８１，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）は１，３９０個、マウスｃ−Ｍｅｔ（Ｐ１６０５６，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）は１，３７９個のアミノ酸で構成されており、互いに８９％以上の高い配列類似性を有する（Ｃｈａｎ  ＡＭＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２：５９３−５９９，１９８８）。リガンドである肝細胞成長因子も同様、ヒトとマウス間において９０％以上の非常に高い配列類似性があり（Ｔａｓｈｉｒｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ．８７：３２００−３２０４，１９９０）、リガンドと受容体が作用する代表的な位置も同様にセマ部位（Ｓｅｍａ  ｄｏｍａｉｎ）であるので、交差反応抗体の開発及び適用の可能性が高いといえる。したがって、ヒト／マウスｃ−Ｍｅｔに対する抗体腫瘍微小環境内癌特異リガンド−受容体作用を抑制することによって、マウス腫瘍モデルにおいて効果的な前臨床研究結果が確認できる、ヒト／マウスｃ−Ｍｅｔに交差反応する抗体の開発が必要である。
【０００７】
このような技術的背景下で、本発明者らは、ヒト及びマウスｃ−Ｍｅｔに交差結合能を有し、親和度成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）過程を用いてｃ−Ｍｅｔとの結合能が改善された改良抗体を開発し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本背景技術部分に記載された前記情報は、単に本発明の背景に対する理解を向上させるためのものであり、よって、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者にとって既に知られた先行技術を形成する情報を含まなくてもよい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む二重特異性抗体又は抗体−薬物複合体を提供することにある。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片及び／又は前記二重特異性抗体又は抗体−薬物複合体を含む癌の予防又は治療用医薬組成物及び治療方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸、該核酸を含むベクター及び宿主細胞、これを用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供することにある。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片及び他の癌治療剤を含む癌治療用併用投与組成物及び治療方法を提供することにある。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、癌の治療のための前記抗体若しくはその抗原結合断片又は前記二重特異性抗体若しくは前記抗体−薬物複合体の用途を提供することにある。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、癌治療用薬剤の製造のための前記抗体若しくはその抗原結合断片又は前記二重特異性抗体若しくは前記抗体−薬物複合体の使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１又は２７のアミノ酸配列を含む重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）ＣＤＲ１；配列番号２及び２８〜３１からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；配列番号３、３２及び３３からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号４、３４及び３５からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）ＣＤＲ１；配列番号５、３６及び３７からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；配列番号６、３８及び３９からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００１７】
本発明はまた、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片を含む二重特異性抗体又は抗体−薬物複合体を提供する。
【００１８】
本発明はまた、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片及び／又は前記二重特異性抗体又は抗体−薬物複合体を含む癌の予防又は治療用医薬組成物及び治療方法を提供する。
【００１９】
本発明はまた、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸、前記核酸を含むベクター及び宿主細胞、これを用いた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供する。
【００２０】
本発明はまた、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片及び他の癌治療剤を含む癌治療用併用投与組成物及び治療方法を提供する。
【００２１】
本発明はまた、前記抗体若しくはその抗原結合断片又は前記二重特異性抗体若しくは前記抗体−薬物複合体を投与することを特徴とする癌の治療方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、癌の治療のための前記抗体若しくはその抗原結合断片又は前記二重特異性抗体若しくは前記抗体−薬物複合体の用途及び癌治療用薬剤の製造のための前記抗体若しくはその抗原結合断片又は前記二重特異性抗体若しくは前記抗体−薬物複合体の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】親抗体（１Ｆ１２）の重鎖可変領域配列及びＣＤＲ／フレームワーク分類を示す図である。
【図２】親抗体（１Ｆ１２）の軽鎖可変領域配列及びＣＤＲ／フレームワーク分類を示す図である。
【図３】抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の突然変異ライブラリー（ｍｕｔａｎｔ  ｌｉｂｒａｒｙ）デザインである。
【図４】抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の突然変異ライブラリー構築のためのプライマー配列を示す図である。
【図５】抗ｃ−Ｍｅｔ抗体親和性変異体（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｎｔｓ）のＣＤＲ配列を示す図である。
【図６】抗ｃ−Ｍｅｔ抗体親和性変異体１６種のアゴニスト活性（ａｇｏｎｉｓｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）分析結果を示す図である。
【図７】抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）結果を示す図である。
【図８】胃癌細胞株成長抑制様相の分析結果を示す図である。
【図９】大腸癌細胞株において抗ｃ−Ｍｅｔ抗体単独及び免疫治療剤との併用効能分析結果を示す図である。
【図１０】大腸癌細胞株において抗ｃ−Ｍｅｔ抗体と放射線治療との併用効能を分析した結果を示す図である。
【図１１】大腸癌皮下移植動物モデルにおいて免疫細胞分布に対する分析結果を示す図である。
【図１２】大腸癌皮下移植動物モデルにおいて、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体投与後の腫瘍細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
特に定義しない限り、本明細書で使われる技術的及び科学的用語はいずれも、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家に通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野においてよく知られており、通常用いられるものである。
【００２５】
抗体効能の向上のためには抗体工学技術の応用が要求される。中でも、抗原に対する抗体の親和度を成熟させる親和度成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）方法がある。親和度成熟は、無作為突然変異を抗体遺伝子に導入し、抗原に対する抗体の結合親和性を増加させる技術であり、効果的な治療及び診断用抗体新薬開発に非常に有用である。試験管内親和度成熟のために、通常、３つの接近方法が用いられる。誤りがちなＰＣＲ、退化したオリゴヌクレオチドを使用する標的残基のランダム化及び鎖シャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）を含む。標的残基として選択可能な部分は相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ，ＣＤＲ）であり、特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が抗体−抗原相互作用を支配する傾向があることから、無作為化のための論理的標的となる。標的となる抗体遺伝子ＣＤＲ部位にあるアミノ酸を変化させることによって抗体の結合親和性を高めるわけである。この方法によってＡＫＡ（腫瘍関連糖タンパク質（ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）７２に結合するヒト化抗体）のＣＤＲ−Ｈ３にあるアミノ酸を変化させて、結合親和性を２２倍も増加させた報告（Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００６，２８１，６９８５−６９９２）があり、B型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）抗原に対して開発した抗体も結合親和性を６倍まで増加させた報告（Ｈｏｎｇ  ｅｌ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７，４５，５２８−５３３）がある。
【００２６】
本発明は、一観点において、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片に関する。好ましくは、配列番号１又は２７のアミノ酸配列を含む重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）ＣＤＲ１；配列番号２及び２８〜３１からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；配列番号３、３２及び３３からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号４、３４及び３５からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）ＣＤＲ１；配列番号５、３６及び３７からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；配列番号６、３８及び３９からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００２７】
本発明において、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１又は２７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；配列番号２及び２８〜３１からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；配列番号３、３２及び３３からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３とそれぞれ８０％以上の配列相同性、好ましくは９０％以上の配列相同性、より好ましくは９９％の配列相同性を有する配列を含む重鎖可変領域を含み、本発明に係るｃ−Ｍｅｔと同じ特性を有する抗体又はその抗原結合断片も、本発明に係る抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片の権利範囲に含まれる。
【００２８】
また、配列番号４、３４及び３５からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５、３６及び３７からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；配列番号６、３８及び３９からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３とそれぞれ８０％以上の配列相同性、好ましくは９０％以上の配列相同性、より好ましくは９９％の配列相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含み、本発明に係るｃ−Ｍｅｔと同じ特性を有する抗体又はその抗原結合断片も、本発明に係る抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片の権利範囲に含まれる。
【００２９】
本発明において、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４０及び４２〜４８からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４１及び４９〜５４からなる群から選ばれる軽鎖可変領域を含むことを特徴とし得る。
【００３０】
一方、配列番号４０及び４２〜４８からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と８０％以上の配列相同性、好ましくは９０％以上の配列相同性、より好ましくは９９％の配列相同性を有する配列を含み、本発明に係るｃ−Ｍｅｔと同じ特性を有する抗体又はその抗原結合断片も、本発明に係る抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片の権利範囲に含まれ、
【００３１】
配列番号４１及び４９〜５４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と８０％以上の配列相同性、好ましくは９０％以上の配列相同性、より好ましくは９９％の配列相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含み、本発明に係るｃ−Ｍｅｔと同じ特性を有する抗体又はその抗原結合断片も、本発明に係る抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片の権利範囲に含まれる。
【００３２】
また、本発明に係る抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片には、本発明に係る抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片において、保存的置換によってアミノ酸配列の一部が置換された抗体又はその抗原結合断片も含まれる。
【００３３】
本明細書において“保存的置換”とは、１個以上のアミノ酸を、当該ポリペプチドの生物学的又は生化学的機能の損失を引き起こさない、類似の生化学的特性を有するアミノ酸に置換することを含む、ポリペプチドの変形を意味する。“保存的アミノ酸置換”は、アミノ酸残基を、類似の側鎖を持つアミノ酸残基に置き換える置換である。類似の側鎖を持つアミノ酸残基部類は、当該技術分野に規定されており、よく知られている。それらの部類は、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えば、リジン（ｌｙｓｉｎｅ）、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、帯電されていない極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐した側鎖を持つアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。本発明の抗体が保存的アミノ酸置換を有し、相変らず活性を保有できることが予想される。
【００３４】
本明細書において用語“ｃ−Ｍｅｔ特異的抗体”とは、ｃ−Ｍｅｔに結合してｃ−Ｍｅｔの生物学的活性の抑制を招く抗体を意味し、“抗ｃ−Ｍｅｔ抗体”と同じ意味で使われる。
【００３５】
本発明において、“抗ｃ−Ｍｅｔ抗体”とは、多クローン抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）及び単クローン抗体（単一クローン抗体、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）のいずれをも含む概念であり、好ましくは単クローン抗体であり、正常な全抗体（ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の形態を有することができる。全抗体は２本の全長の軽鎖及び２本の全長の重鎖を有し、定常領域を含む構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。
【００３６】
本発明に係る抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の全抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＧの形態を含む概念であり、ＩｇＧは亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）としてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。
【００３７】
本発明に係る抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ヒト抗体ライブラリー（ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｙ）から選別された完全ヒト抗体（ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３８】
本発明に係る抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の“抗原結合断片”は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の抗原、すなわち、ｃ−Ｍｅｔと結合できる機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、及びＦｖなどを含む概念であり、本明細書では“抗体断片”と同じ意味で使われる。
【００３９】
前記Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の定常領域、及び重鎖の一番目の定常領域（ＣＨ１ドメイン）を有する構造であり、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合して生成される。
【００４０】
前記Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）は、重鎖可変部位及び軽鎖可変部位だけを有する最小の抗体断片を意味する。二本鎖Ｆｖ（ｄｓＦｖ）は、ジスルフィド結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は一般に、ペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連結されている。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全抗体をパパインで制限切断すればＦａｂが得られ、ペブシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片が得られる。）、遺伝子組換え技術（例えば、抗体の重鎖又はその可変領域をコードするＤＮＡ及び軽鎖又はその可変領域をコードするＤＮＡを鋳型とし、プライマー対を用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によって増幅させ、ペプチドリンカーをコードするＤＮＡと両末端がそれぞれ重鎖又はその可変領域及び軽鎖又はその可変領域に連結されるようにするプライマー対を組み合わせて増幅）によって作製することができる。
【００４１】
本明細書において、用語“重鎖”とは、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ及び３個の定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長重鎖及びその断片を全て意味する。また、本明細書において用語“軽鎖”とは、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び定常領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖及びその断片を全て意味する。
【００４２】
本明細書において、用語“相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ，ＣＤＲ）”は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））。重鎖（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）及び軽鎖（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）にはそれぞれ３個のＣＤＲが含まれている。ＣＤＲは、抗体が抗原又はエピトープに結合する上で主要な接触残基を提供する。
【００４３】
本発明において、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片は、ヒトｃ−Ｍｅｔに対して特異的結合能を有することを特徴とし得る。好ましくは、ヒトｃ−Ｍｅｔ及びマウスｃ−Ｍｅｔに対して交差結合能を有することを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【００４４】
本発明は、他の観点において、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片に薬物が接合された抗体−薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ＡＤＣ）に関する。
【００４５】
抗体−薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ＡＤＣ）は、ターゲット癌細胞に抗癌薬物を伝達するまで抗癌薬物が抗体に安定的に結合している必要がある。ターゲットに伝達された薬物は抗体から遊離し、ターゲット細胞の死滅を誘導しなければならない。そのためには、薬物が抗体に安定的に結合すると同時に、ターゲット細胞から遊離する時はターゲット細胞の死滅を誘導するに十分な細胞毒性を有する必要がある。
【００４６】
本発明において、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片と抗癌剤などの薬物を含む細胞毒性物質とが相互結合（例えば、共有結合、ペプチド結合などによる）して、複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）又は融合タンパク質（細胞毒性物質及び／又は標識物質がタンパク質である場合）の形態で用いられ得る。前記細胞毒性物質は、癌細胞、特に、固形癌細胞に対して毒性を有する全ての物質であり、放射線同位元素、細胞毒素化合物（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、細胞毒性タンパク質、抗癌剤などからなる群から選ばれる１種以上であり得るが、これに制限されるものではない。前記細胞毒素タンパク質は、リシン（ｒｉｃｉｎ）、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、デボガニン（ｄｅｂｏｕｇａｎｉｎ）、ジフテリア毒素、緑膿菌（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｏｘｉｎ）などからなる群から選ばれる１種以上であり得るが、これに制限されるものではない。前記放射線同位元素は１３１Ｉ、１８８Ｒｈ、９０Ｙなどからなる群から選ばれる１種以上であり得るが、これに制限されるものではない。前記細胞毒素化合物は、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、モノメチルオーリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ  ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  Ｅ；ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ  ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  Ｆ；ＭＭＡＦ）、Ｎ２’−ジアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）メイタンシン（Ｎ２’−ｄｅａｃｅｔｙｌ−Ｎ２’−（３−ｍｅｒｃａｐｔｏ−１−ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ；ＤＭ１）、ＰＢＤ（Ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）二量体などからなる群から選ばれる１種以上であり得るが、これに制限されるものではない。
【００４７】
本発明において、前記抗体−薬物複合体は、本発明の属する技術分野によく知られた技術によるものであり得る。
【００４８】
本発明において、前記抗体−薬物複合体は、前記抗体又はその抗原結合断片がリンカーを介して薬物と結合することを特徴とし得る。
【００４９】
本発明において、前記リンカーは、切断性リンカー又は非切断性リンカーであることを特徴とし得る。
【００５０】
前記リンカーは、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体と薬物とを連結する部位であり、例えば、前記リンカーは、細胞内条件において切断可能な形態、すなわち、細胞内環境においてリンカーの切断によって抗体から薬物が放出され得るようにする。
【００５１】
前記リンカーは、細胞内環境、例えば、リソソーム又はエンドソームに存在する切断剤で切断可能であり、細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素、例えば、リソソーム又はエンドソームプロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーであり得る。一般に、ペプチドリンカーは、少なくとも２個以上のアミノ酸長を有する。前記切断剤は、カテプシンＢ及びカテプシンＤ、プラスミンを含むことができ、ペプチドを加水分解して薬物を標的細胞内に放出可能にする。前記ペプチドリンカーは、チオール依存性プロテアーゼカテプシン−Ｂによって切断可能であり、これは、癌組織で高発現し、例えば、Ｐｈｅ−Ｌｅｕ又はＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙリンカーが使用可能である。また、前記ペプチドリンカーは、例えば、細胞内プロテアーゼによって切断され得るもので、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカー又はＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーであり得る。
【００５２】
本発明において、前記切断性リンカーはｐＨ敏感性であり、特定ｐＨ値で加水分解に敏感であり得る。一般に、ｐＨ敏感性リンカーは、酸性条件で加水分解され得るものを指す。例えば、リソソームで加水分解され得る酸性不安定リンカー、例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス−アコニット酸アミド（ｃｉｓ−ａｃｏｎｉｔｉｃ  ａｍｉｄｅ）、オルトエステル、アセタール、ケタールなどであってもよい。
【００５３】
前記リンカーは還元条件で切断されてもよく、例えば、二硫化リンカーがこれに該当し得る。ＳＡＴＡ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ）、ＳＰＤＰ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ＳＰＤＢ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｂｕｔｙｒａｔｅ）及びＳＭＰＴ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−ｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−ａｌｐｈａ−ｍｅｔｈｙｌ−ａｌｐｈａ−（２−ｐｙｒｉｄｙｌ−ｄｉｔｈｉｏ）ｔｏｌｕｅｎｅ）を用いて様々な二硫化結合を形成することができる。
【００５４】
本発明において、前記薬物及び／又は薬物−リンカーは、抗体のリジンによって無作為に接合されたり、或いは二硫化結合鎖を還元した時に露出されるシステインによって接合され得る。場合によって、遺伝工学的に作製されたタグ、例えば、ペプチド又はタンパク質に存在するシステインによってリンカー−薬物が結合できる。前記遺伝工学的に作製されたタグ、例えば、ペプチド又はタンパク質は、例えば、イソプレノイドトランスフェラーゼによって認識可能なアミノ酸モチーフを含むことができる。前記ペプチド又はタンパク質は、ペプチド又はタンパク質のカルボキシ末端で欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を有したり、或いはペプチド又はタンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端にスぺーサユニットの共有結合による付加を有する。前記ペプチド又はタンパク質は、アミノ酸モチーフと直接共有結合したり、或いはスぺーサユニットと共有結合してアミノ酸モチーフと連結され得る。前記アミノ酸スぺーサユニットは１〜２０個のアミノ酸で構成され、特に、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）ユニットが好ましい。
【００５５】
前記リンカーはリソソームにおいて多数存在したり、或いはいくつかの腫瘍細胞において過発現するベータ−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）によって認識されて加水分解されるベータ−グルクロニドリンカーを含むことができる。ペプチドリンカーとは違い、親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）が大きいので、疎水性の性質が高い薬物と結合時に抗体−薬物複合体の溶解度を増加させることができるという長所がある。
【００５６】
これに関して、本発明では、大韓民国特許公開公報第２０１５−０１３７０１５号に開示のベータ−グルクロニドリンカー、例えば、自壊基（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐ）を含むベータ−グルクロニドリンカーを使用することができる。
【００５７】
また、前記リンカーは、例えば、非切断性リンカーであってもよく、抗体加水分解の単一段階によって薬物が放出され、例えばアミノ酸−リンカー−薬物複合体を生産する。このような類型のリンカーは、チオエーテル基又はマレイミドカプロイル（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）基であり得、血液内安定性が維持できる。
【００５８】
本発明において、前記薬物は、化学療法剤、毒素、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は放射性同位元素であることを特徴とし得る。前記薬物は、薬理学的効果を示す製剤として抗体に結合可能である。
【００５９】
前記化学療法剤は、細胞毒性製剤又は免疫抑制剤であり得る。具体的に、マイクロチューブリン抑制剤、有糸分裂抑制剤、トポイソメラーゼ抑制剤、又はＤＮＡインターカレータとして働き得る化学療法剤を含むことができる。また、免疫調節化合物、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗バクテリア剤、抗真菌剤、駆虫剤又はこれらの組合せを含むことができる。
【００６０】
前記薬物には、例えば、メイタンシノイド、オーリスタチン、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、サリドマイド、カンプトテシン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、１−（２クロロエチル）−１，２−ジメチルスルホニルヒドラジド、エスペラマイシン、エトポシド、６−メルカプトプリン、ドラスタチン、トリコテセン、カリケアミシン、タキソール（ｔａｘｏｌ）、タキサン、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、メトトレキサート、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、メルファラン、クロランブシル、ズオカルマイシン、Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ；マイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、窒素マスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｍｕｓｔａｒｄ）、シトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ＣＮＵ（ｂｉｓｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕＬｆａｎ）、トレオスルファン（ｔｒｅｏｓｕｌｆａｎ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、９−アミノカンプトテシン（９−ａｍｉｎｏｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、クリスナトール（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ）、トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、チアゾフリン（ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）、リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）、ＥＩＣＡＲ（５−ｅｔｈｙｎｙｌ−１−ｂｅｔａ−Ｄｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ−４−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、デフェロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ（ａｒａ  Ｃ））、シトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ）、ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、酢酸リュープロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ  ａｃｅｔａｔｅ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ＥＢ１０８９、ＣＢ１０９３、ＫＨ１０６０、ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）、フタロシアニン（ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）、光感作剤Ｐｅ４（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ  Ｐｅ４）、デメトキシ−ヒポクレリンＡ（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙ−ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ  Ａ）、インターフェロン−α（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α）、インターフェロン−γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ベルケイド（ｖｅｌｃａｄｅ）、レブリミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウムイオン（１−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍｉｏｎ）、スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシンＡ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  Ａ２）、ブレオマイシンＢ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎＢ２）、ペプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）及びタプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）、核酸分解酵素及び細菌や動植物由来の毒素からなる群から選ばれる一つ以上であるが、これに限定されない。
【００６１】
本発明において、前記薬物は、リンカー及びリンカー試薬上の親電子性基と共有結合を形成するために反応可能なアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジド基から構成された群から選ばれる一つ以上の親核基を含むことができる。
【００６２】
本発明は、さらに他の観点において、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片を含む二重特異性抗体（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）に関する。
【００６３】
本発明において、前記二重特異性抗体は、抗体の２本の腕（ａｒｍ）のうち、一つの腕（ａｒｍ）は、本発明に係る抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片を含み、他の腕は（ａｒｍ）は、ｃ−Ｍｅｔ以外の抗原、好ましくは、癌関連抗原又は免疫関門タンパク質抗原に特異的な抗体、又は免疫効能細胞関連抗原に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む形態を意味する。
【００６４】
前記二重抗体に含まれる抗ｃ−Ｍｅｔ抗体以外の抗体が結合する抗原は、好ましくは癌関連抗原又は免疫関門タンパク質抗原としてＨＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、Ａｎｇ２、Ｄｌｌ４、ＮＲＰ１、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ｃ−Ｋｉｔ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＤＤＬ３、Ｆｏｌａｔｅ  Ｒ１、Ｎｅｃｔｉｎ４、Ｔｒｏｐ２、ｇｐＮＭＢ、Ａｘｌ、ＢＣＭＡ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＫＩＲ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ７−Ｈ７、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＢ２、Ｅ−セルＬＥＫＴＩＮ（ｓｅｌｅｃｔｉｎ）、ＥｐＣａｍ、ＣＥＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ｃ−ＭＥＴなどから選択でき、免疫効能細胞関連抗原としてはＴＣＲ／ＣＤ３、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ）ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、ＣＤ８９、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８（ＣＲ３）などを選択できるが、これに限定されるものではない。
【００６５】
本発明は、さらに他の観点において、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片を含む癌の予防及び／又は治療用医薬組成物に関する。
【００６６】
本発明は、さらに他の観点において、前記二重特異性抗体又は抗体−薬物複合体を含む癌の予防及び／又は治療用医薬組成物に関する。
【００６７】
本発明において、前記癌は、ｃ−Ｍｅｔの発現又は過発現に関連するものであり得る。
【００６８】
本発明において、“癌”と“腫瘍”は同じ意味で使われ、典型的に、調節されていない細胞成長／増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を表したり意味する。
【００６９】
本発明において、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、高い抗ｃ−Ｍｅｔ結合及びそれによるｃ−Ｍｅｔ機能抑制によって様々な癌腫由来の癌細胞の成長を抑制し、ｃ−Ｍｅｔ及び下部信号伝達物質のリン酸化を抑制することによってｃ−Ｍｅｔ信号伝達を抑制し、新生血管形成を抑制する。したがって、本発明の抗体は、癌の予防及び治療に非常に有効である。
【００７０】
本発明の組成物で治療できる癌又は癌腫は特に制限されず、固形癌及び血液癌のいずれをも含む。このような癌の例には、乳癌、大腸癌、肺癌、胃癌、肝癌、血液癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、脳癌、子宮癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、結腸癌、卵巣癌、直腸癌、大腸癌、膣癌、小腸癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、尿管癌、尿道癌、前立腺癌、気管支癌、膀胱癌、腎臓癌及び骨髄癌を含むことができるが、これに限定されるものではない。前記癌は、原発生癌又は転移性癌であり得る。より好ましくは、前記医薬組成物によって予防又は治療可能な癌は、ｃ−Ｍｅｔ発現癌であることを特徴とし得る。
【００７１】
本発明において、前記医薬組成物は、放射線を用いた併用治療に使用されることを特徴とし得る。
【００７２】
本発明は、さらに他の観点において、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片及び／又は前記二重特異性抗体又は抗体−薬物複合体の治療的有効量を、ｃ−Ｍｅｔ関連疾病の予防及び／又は治療を必要とする患者に投与する段階を含む、ｃ−Ｍｅｔ関連疾病の予防及び／又は治療方法に関する。前記予防及び／又は治療方法は、前記投与段階前に、前記疾病の予防及び／又は治療を必要とする患者を確認する段階をさらに含むことができる。
【００７３】
本発明において、前記治療方法は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物を投与する段階；及び放射線を照射する段階；を含むことを特徴とし得る。
【００７４】
前記放射線は、照射（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）量が２Ｇｙ〜１０Ｇｙであることを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【００７５】
本発明の方法は、放射線治療回数及び放射線治療と医薬組成物投与との間の時間量は本発明の方法によって様々であり得るが、好ましくは、放射線照射と同時に医薬組成物を投与したり、或いは医薬組成物を投与して１０日〜２０日後に放射線を照射することを特徴とし得るが、これに制限されない。
【００７６】
本発明は、さらに他の観点において、癌の治療のための前記抗体若しくはその抗原結合断片又は前記二重特異性抗体若しくは抗体−薬物複合体の用途に関する。
【００７７】
本発明は、さらに他の観点において、癌治療用薬剤の製造のための前記抗体若しくはその抗原結合断片又は前記二重特異性抗体若しくは抗体−薬物複合体の使用に関する。
【００７８】
本発明に係る前記医薬組成物、治療方法及び用途において、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片は、単独有効成分として提供されたり、抗癌剤などの細胞毒性物質と併用投与されたり、或いは抗癌剤などの細胞毒性物質と接合された複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ；ＡＤＣ）形態で提供され得る。
【００７９】
本発明に係る抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片、及びこれを含む医薬組成物は、従来の治療剤と併用して使用する用途に用いることができる。すなわち、本発明に係る抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片、及びこれを含む医薬組成物は、既存の抗癌剤などの治療剤と同時に投与されたり、或いは順次に投与される用途に使用可能である。
【００８０】
本発明において、前記医薬組成物は、治療有効量の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片、及び薬剤学的に許容される担体を含むことを特徴とし得る。
【００８１】
前記“薬剤学的に（製薬上）許容される担体”とは、製剤を製剤化したり又は安定化させることを助けるために活性成分に追加され得る物質であり、患者に有意な有害毒性効果を招かない。薬剤学的に許容される担体は製剤時に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。
【００８２】
前記医薬組成物は、前記成分の他、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適切な薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
【００８３】
本発明の医薬組成物は、非経口で投与でき、例えば、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入などで投与できる。
【００８４】
本発明の医薬組成物の適度の投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応成性のような要因によって様々であり、通常の熟練した医師にとっては、所望する治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方できる。本発明の好ましい具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇである。本明細書において用語“薬剤学的有効量”とは、癌の予防又は治療に十分な量を意味する。
【００８５】
本発明の医薬組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態に製造したり又は多用量容器内に内入させて製造することができる。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
【００８６】
本発明は、さらに他の観点において、本発明に係る抗ｃ−Ｍｅｔ抗体をコードする核酸に関する。本明細書で用いられる核酸は、細胞、細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅ）中に存在してもよく、或いは部分的に精製された形態又は実質的に純粋な形態で存在してもよい。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド化（ｂａｎｄｉｎｇ）、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当該技術分野によく知られたその他のものを含む標準技術によって他の細胞成分又はその他汚染物質、例えば他の細胞の核酸又はタンパク質から精製されて出る場合、“単離された”或いは“実質的に純粋になった”ものである。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。
【００８７】
本発明において、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体をコードする核酸は、配列番号５５〜６９からなる群から選ばれる配列を含むことを特徴とし得る。具体的に、本発明に係る抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号５５又は５７〜６３であり、及び／又は本発明に係る抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号５６又は６４〜６９である。
【００８８】
本発明は、さらに他の観点において、前記核酸を含む組換え発現ベクターに関する。本発明に係る抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片の発現のために、部分的であるか或いは全長である軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを、標準分子生物学技術（例えば、ＰＣＲ増幅又は目的抗体を発現するハイブリドーマを用いたｃＤＮＡクローニング）によって得ることができ、ＤＮＡが転写及び翻訳制御配列に“作動されるように結合”して発現ベクター内に挿入され得る。
【００８９】
本明細書で用いられる用語“作動されるように結合”とは、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節する意図的な機能をするように、抗体をコードする遺伝子がベクター内にライゲーションされることを意味できる。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現用宿主細胞と相容性を持つように選択される。抗体の軽鎖遺伝子及び抗体の重鎖遺伝子は別個のベクター内に挿入されたり、或いは両遺伝子とも同じ発現ベクター内に挿入される。抗体は、標準方法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクター上の相補性制限酵素部位のライゲーション、又は制限酵素部位が全く存在しない場合、ブラント（ｂｌｕｎｔ）末端ライゲーション）によって発現ベクター内に挿入される。場合によって、前記組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を容易にする信号ペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、信号ペプチドがフレームに合うように抗体鎖遺伝子のアミノ末端に結合するようにベクター内にクローニングされ得る。信号ペプチドは、免疫グロブリン信号ペプチド又は異種性信号ペプチド（すなわち、免疫グロブリン以外のタンパク質由来の信号ペプチド）であり得る。また、前記組換え発現ベクターは、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。“調節配列”は、抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及びその他発現制御要素（例えば、ポリアデニル化信号）を含むことができる。通常の技術者には、形質転換させる宿主細胞の選択、タンパク質の発現レベルなどのような因子によって調節配列を個別に選択し、発現ベクターのデザインが変わり得ることが認識できる。
【００９０】
本発明は、さらに他の観点において、前記核酸又は前記ベクターを含む宿主細胞に関する。本発明に係る宿主細胞は、動物細胞、植物細胞、酵母、大腸菌及び昆虫細胞からなる群から選択されることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００９１】
具体的には、本発明に係る宿主細胞は、大腸菌、バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）又はスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）のような原核細胞であり得る。また、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）のような真菌、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）及びニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）のような酵母、その他下等真核細胞、及び昆虫からの細胞のような高等真核生物の細胞のような真核細胞であり得る。
【００９２】
また、植物や哺乳動物から由来してもよい。好ましくは、サル腎臓細胞７（ＣＯＳ７：ｍｏｎｋｅｙ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ）細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞、Ｗ１３８、仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ：ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ＭＤＣＫ、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ７８細胞及びＨＥＫ２９３細胞などが利用可能であるが、これに限定されない。特に好ましくは、ＣＨＯ細胞が使用できる。
【００９３】
前記核酸又は前記ベクターは、宿主細胞に形質注入又はトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）される。“形質注入”又は“トランスフェクション”させるために原核又は真核宿主細胞内に外因性核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を導入する時に通常利用できる様々な技術、例えば、電気泳動法、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション又はリポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）などを用いることができる。本発明に係る抗グリピカン３抗体を発現させるために様々な発現宿主／ベクター組合せを用いることができる。真核宿主に適した発現ベクターとしては、これらに限定されるものではないが、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、アデノ−関連ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルス及びレトロウイルスから由来した発現調節配列が含まれる。細菌宿主に使用可能な発現ベクターには、ｐＥＴ、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＵＣベクター、ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びこれらの誘導体のよう大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から得られる細菌性プラスミド、ＲＰ４のようにより広い宿主範囲を有するプラスミド、λｇｔ１０とλｇｔ１１、ＮＭ９８９のような非常に様々なファージラムダ（ｐｈａｇｅ  ｌａｍｂｄａ）誘導体のようなファージＤＮＡ、及びＭ１３及びフィラメント性一本鎖ＤＮＡファージのようなその他ＤＮＡファージが含まれる。酵母細胞に有用な発現ベクターは、２μプラスミド及びその誘導体である。昆虫細胞に有用なベクターはｐＶＬ９４１である。
【００９４】
本発明は、さらに他の観点において、前記宿主細胞を培養して本発明に係る抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片を発現させる段階を含む抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片の製造方法に関する。
【００９５】
前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片を発現できる組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞内に導入される場合、抗体は、宿主細胞において抗体が発現するのに十分な期間、又はより好ましくは宿主細胞が培養される培養培地内に抗体が分泌されるのに十分な期間に宿主細胞を培養することによって製造することができる。
【００９６】
場合によって、発現した抗体は、宿主細胞から分離して均一に精製できる。前記抗体の分離又は精製は、通常のタンパク質において用いられている分離、精製方法、例えばクロマトグラフィーによって行うことができる。前記クロマトグラフィーは例えば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムを含む親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性クロマトグラフィーを含むことができる。前記クロマトグラフィーに加えて、濾過、超濾過、塩析、透析などを組み合わせることによって抗体を分離、精製することもできる。
【００９７】
本発明に係る抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片及びこれを含む医薬組成物は、従来の治療剤と併用する用途に用いることができる。
【００９８】
したがって、本発明は、さらに他の観点において、前記抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片及び他の癌治療剤を含む癌治療用併用投与組成物及び治療方法に関する。
【００９９】
前記他の癌治療剤は、本発明に係る抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片以外に、癌治療のために使用可能な全ての治療剤を意味する。本発明において、前記癌治療剤は免疫チェックポイント阻害剤であることを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【０１００】
人体の免疫システムは、Ｔ−細胞の過多症式による過剰免疫反応を抑制するための免疫検問体系を持っている。このような免疫検問体系を免疫関門（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）といい、免疫関門に関与するタンパク質を免疫関門タンパク質（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）という。本質的に、免疫関門は、Ｔ−細胞の過活性化及び／又は過多症式による過剰免疫反応を抑制する機能を行うが、癌細胞はこのような免疫関門を悪用してＴ−細胞が自身を攻撃できないようにすることによって免疫システムによる攻撃から逃れ、究極として癌が進行する結果を招く。
【０１０１】
このような免疫関門の抑制剤を用いて癌などの疾患を治療できることは既に当該技術分野に周知であり、現在免疫関門タンパク質を標的とする抗体医薬品が市販されており、様々な免疫チェックポイント阻害剤が開発中である。
【０１０２】
最初に開発された免疫チェックポイント阻害剤形態の治療剤は、免疫関門受容体ＣＴＬＡ−４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−４）特異的な単クローン抗体であるイピリムマブであり、転移性悪性黒色腫においてその効果を示した。続いて、ＰＤ−１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ−１）とＰＤ−１に対するリガンドであるＰＤ−Ｌ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ  ｌｉｇａｎｄ−１）に特異的な単クローン抗体が開発中であり、代表としては、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）及びデュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）などがある。ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１抑制剤は、悪性黒色腫の他にも様々な腫瘍に効果を示す。
【０１０３】
本発明において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイント阻害剤（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）又はチェックポイント阻害剤（ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を意味し、抗−ＣＴＬＡ−４抗体、抗−ＰＤ−１抗体又は抗−ＰＤ−Ｌ１抗体であることを特徴とし得るが、これに限定されず、具体的には、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）又はデュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）などが使用可能であるが、これに限定されるものではない。
【０１０４】
本発明において、前記癌は、乳癌、大腸癌、肺癌、胃癌、肝癌、血液癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、脳癌、子宮癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、結腸癌、卵巣癌、直腸癌、大腸癌、膣癌、小腸癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、尿管癌、尿道癌、前立腺癌、気管支癌、膀胱癌、腎臓癌又は骨髄癌であることを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【０１０５】
“併用”とは、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片と、他の癌治療剤のそれぞれを同時に、順次に、又は逆順に投与できることを意味し、通常の技術者にとっては、範囲内における適切な有効量の組合せで投与可能である。
【０１０６】
本発明の一実施例において、抗−ＰＤ−Ｌ１抗体と本発明に係る抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を併用投与した場合、腫瘍の成長をさらに抑制することを確認した。
【０１０７】
前記併用投与組成物は抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を含み、これに関連した構成は、前述した癌の予防又は治療用組成物に含まれた構成と同一であるので、各構成に対する説明は併用投与用組成物においても同一に適用される。
【０１０８】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【０１０９】
実施例１：親和度成熟のための突然変異ライブラリー構築
【０１１０】
ｃ−Ｍｅｔ標的抗体１Ｆ１２は、ファージディスプレイ技術を用いて選別されたが、この抗体の親和度改良のために指向性進化法（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を用いた。抗体の可変領域は、相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ，ＣＤＲ）とフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）とに区分され、抗原−抗体間の結合にはＣＤＲが大きく寄与する。親抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、図１及び図２に示す通りである。ＫＡＢＡＴナンバリング法を基準に抗体のＣＤＲとフレームワーク領域を区分した（表１）。
【０１１１】
【表１】
2021521872.tif 000003
【０１１２】
親抗体（１Ｆ１２）重鎖及び軽鎖の可変領域に存在する総６個のＣＤＲにＮＮＫ縮重コードン（ＮＮＫ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｃｏｄｏｎ）を用いた１０種の突然変異ライブラリー（Ｍｕｔａｎｔ  ｌｉｂｒａｒｙ）（１Ｆ１２−Ｈ１ｍｕｔ、１Ｆ１２−Ｈ２−１ｍｕｔ、１Ｆ１２−Ｈ２−２ｍｕｔ、１Ｆ１２−Ｈ３−１ｍｕｔ、１Ｆ１２−Ｈ３−２ｍｕｔ、１Ｆ１２−Ｌ１−１ｍｕｔ、１Ｆ１２−Ｌ１−２ｍｕｔ、１Ｆ１２−Ｌ２ｍｕｔ、１Ｆ１２−Ｌ３−１ｍｕｔ、１Ｆ１２−Ｌ３−２ｍｕｔ）を作製した（図３）。突然変異ライブラリー構築に用いられるＣＤＲの配列が任意化した１Ｆ１２突然変異一本鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）（ｓｆｉＩ−ＶＨ−ｌｉｎｋｅｒ−ＶＬ−ｓｆｉＩ）のＤＮＡ配列は、下記表２に示すプライマーを用いた重複伸長ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ）法で確保した。
【０１１３】
【表２】
2021521872.tif 000004
【０１１４】
このとき、重鎖ＣＤＲ−Ｈ３のＶＨ９９とＶＨ１００ｄにシステインが存在し（図１）、これら両位置は鎖間ジスルフィド結合（ｉｎｔｅｒｃｈａｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ）を形成してＣＤＲ−Ｈ３構造を安定化させるので、この両部位にはＮＮＫコドンを使用せずにシステイン残基を維持させるためにＴＧＴコドンを使用した。ｐＣｏｍｂ３Ｘ  ｓｃＦｖ発現ベクター（ＯｍｐＡ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｆｉＩ−ＶＨ−ｌｉｎｋｅｒ−ＶＬ−ｓｆｉＩ−Ｈｉｓ−ＨＡ−Ａｍｂｅｒ  ｃｏｄｏｎ−ｐＩＩＩ）を、ｓｆｉＩ（ＮＥＢ）制限酵素を用いてインサート配列を除去し、ベクターを線形化させた。この線形化したベクターに、ＣＤＲのそれぞれの位置がＮＮＫ縮重コードンによって２０個のアミノ酸に任意化されたｓｆｉＩ−ＶＨ−ｌｉｎｋｅｒ−ＶＬ−ｓｆｉＩをＴ４リガーゼ（ＮＥＢ）を用いて挿入することによって、突然変異ライブラリー構築を完了した。
【０１１５】
実施例２：親和度改良抗体選別
【０１１６】
構築された突然変異ライブラリーは、宿主細胞としてＴＧ１大腸菌を使用しており、約３．１０×１０１０の形質転換体を有する。この突然変異ライブラリーは、ファージ形態で回収し、ファージディスプレイ技術を適用して、ｃ−Ｍｅｔにさらに高い結合能を示す抗体プール（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｏｏｌ）をエンリッチメント（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）させ、ＥＬＩＳＡを用いたスクリーニングによって親和性変異体が選別された。最初に１３種の親和度の向上したクローンを選別したが、それらのクローンは、１Ｆ１２＿Ｈ３５Ｈ、１Ｆ１２＿Ｈ５３Ｄ、１Ｆ１２＿Ｈ５７Ｋ、１Ｆ１２＿Ｈ５８Ｄ、１Ｆ１２＿Ｈ６０Ｎ、１Ｆ１２＿Ｈ１００ｅＨ、１Ｆ１２＿Ｈ１００ｈＲ１Ｆ１２＿Ｌ２６Ｄ、１Ｆ１２＿Ｌ２７ｂＤ、１Ｆ１２＿Ｌ５０Ｅ、１Ｆ１２＿Ｌ５１Ｄ、１Ｆ１２＿Ｌ９５ａＲ、１Ｆ１２＿Ｌ９６Ｄである。１Ｆ１２−Ｈ３５Ｈは、ＫＡＢＡＴナンバリング基準に、１Ｆ１２重鎖の３５番位置のアミノ酸がヒスチジン（Ｈ）に置換され、１Ｆ１２＿Ｌ２６Ｄは、１Ｆ１２軽鎖の２６番位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換された突然変異を意味する。この１３種の親和度改良突然変異抗体は、哺乳細胞において全長ヒトＩｇＧ１として製造するための生産ベクターを構築し、Ｅｘｐｉ２９３発現システム（Ｇｉｂｃｏ）を用いてメーカーのマニュアル通りに行った。その結果、１Ｆ１２＿Ｈ１００ｈＲ（親抗体において重鎖１００ｈ位置のアミノ酸がアルギニンに置換されたクローン）は、反復した製造においていずれも抗体発現しなかった。６種の１Ｆ１２の重鎖ＣＤＲ残基置換抗体と６種の軽鎖ＣＤＲ残基置換抗体が確保され、これを組み合わせた抗体４種をさらに製造した（１Ｆ１２＿Ｈ２Ｌ３、１Ｆ１２＿Ｈ２Ｌ６、１Ｆ１２＿Ｈ３Ｌ５、１Ｆ１２＿Ｈ６Ｌ５）。１Ｆ１２＿Ｈ２Ｌ３は、重鎖可変領域５３番位置がアスパラギン酸に置換された重鎖発現ベクターと軽鎖可変領域５０番位置がグルタミン酸に置換された軽鎖発現ベクターとを組み合わせて製造した抗体である（７種の重鎖突然変異発現ベクターと６種の軽鎖突然変異発現ベクターのうち、それぞれ、２番目と３番目の発現ベクターで製造したことを意味する）。結論的に、図５において、１Ｆ１２＿Ｈ１００ｈＲ以外の抗体が哺乳細胞において発現及び精製されて後続実験に用いられた。
【０１１７】
総１７種の改良抗体のＣＤＲ配列を表３に示し、重鎖及び軽鎖可変領域配列を表４に示した。また、各改良抗体をコードするポリヌクレオチド配列を表５に示した。
【０１１８】
【表３】
2021521872.tif 000005
2021521872.tif 000006
2021521872.tif 000007
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【０１１９】
【表４】
2021521872.tif 000009
2021521872.tif 000010
2021521872.tif 000011
【０１２０】
【表５】
2021521872.tif 000012
2021521872.tif 000013
2021521872.tif 000014
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【０１２１】
実施例３：アゴニスト活性（Ａｇｏｎｉｓｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）分析
【０１２２】
ｃ−Ｍｅｔ抗体の開発においてアゴニスト活性分析は必須である。一般の抗体はＹ−形態で標的を認知するパラトープ２個を有する二価の構造を有する。これによって、１個のｃ−Ｍｅｔ抗体は、標的抗原である２個のｃ−Ｍｅｔに結合し、これはむしろｃ−Ｍｅｔ二量化を誘導して、下部信号伝達経路を活性化させるアゴニスト活性を招く。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈはハイブリドーマ技術を用いて５Ｄ５抗体を開発したが、この抗体はｃ−Ｍｅｔに結合して、ｃ−ＭｅｔのリガンドであるＨＧＦ／ＳＦと類似の効果を示し、信号伝達経路をむしろ強化するアゴニスト活性を招いた。この現象を最小化するために、５Ｄ５抗体は一本腕（ｏｎｅ−ａｒｍ）形態であるＯＡ−５Ｄ５に改良され、アゴニスト活性は最小化した。
【０１２３】
親抗体である１Ｆ１２と１６種の親和性変異体のアゴニスト活性を定量するために、Ａｋｔリン酸化の程度を測定した。詳細には、９６ウェル細胞培養プレートにＣａｋｉ−１腎細胞癌（ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株がＲＰＭＩ１６４０完全培地（＋１０％  ＦＢＳ）においてウェル当たり約７０％の密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に到達した時、血清飢餓（Ｓｅｒｕｍ  ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）が２４時間進行された。親抗体と親和性変異体（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｖａｒｉａｎｔ）１６種が処理され、対照群として、ｃ−Ｍｅｔアゴニスト抗体である５Ｄ５と最小限のアゴニスト活性を示すＯＡ−５Ｄ５、ｃ−ＭｅｔのリガンドであるＨＧＦ／ＳＦ（Ｒ＆Ｄシステム）が用いられた。ＰＢＳは、試料の溶媒（ｖｅｈｉｃｌｅ）で処理された試料と同一体積（ｖｏｌｕｍｅ）で処理し、抗体は１０μｇ／ｍＬで処理され、ＨＧＦ／ＳＦは５０ｎｇ／Ｌで処理された。抗体とリガンドの処理時間は３０分であり、３回反復で実験が進行された。各試料処理３０分後、直ちに１Ｘ  ＰＢＳで１回洗浄を行い、溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いて細胞溶解（ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ）を行った。その後、Ａｋｔリン酸化測定は、ＰａｔｈＳｃａｎ(R)  Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡｋｔサンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、メーカーのマニュアル通りに行い、また、各ウェルに対する発光信号（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌ）を測定してＰＢＳ処理グループは０％に、ＨＧＦ／ＳＦ処理グループは１００％に変換し、各抗体のアゴニスト活性を数値化した。５Ｄ５ｃ−Ｍｅｔアゴニスト抗体は、８６．０１％のＡｋｔリン酸化を誘導し、ＨＧＦに類似する程度のアゴニスト活性を示した。アゴニスト活性を最小化するために改良されたＯＡ−５Ｄ５一本腕一価抗体（ｏｎｅ−ａｒｍｅｄ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の場合、３０．４６％の減少したアゴニスト活性を示した。これに比べて、１Ｆ１２親抗体のアゴニスト活性は１８．２３％と確認された。１６種の親和性変異体のアゴニスト活性は、下記表６に示す（図６）。
【０１２４】
【表６】
2021521872.tif 000018
【０１２５】
実施例４：親和度分析
【０１２６】
ＥＬＩＳＡベース親和度分析は、３回反復で行った。９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に組換えヒトｃ−Ｍｅｔ（Ｓｉｎｏ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）が５０ｎｇ／ウェルで４℃で一晩コーティングした。翌日、３％スキムミルク溶液で１時間ブロッキングを進行後、１Ｘ  ＰＢＳＴ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて３回洗浄した。ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）にそれぞれの抗体を２００ｎＭから１／２ずつ希釈して１００μＬ体積で各ウェルに処理し、常温で１時間静置した。１Ｘ  ＰＢＳＴ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて３回洗浄後、１：１００００に３％スキムミルク溶液に希釈された抗ヒトＦａｂ−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）２次抗体を各ウェルに１００μＬで１時間常温で静置した。それぞれのウェルを１Ｘ  ＰＢＳＴ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて５回洗浄後、ＴＭＢ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各ウェルに１００μＬ処理し、発色が始まって適切に青色に変わった時、停止（ｓｔｏｐ）溶液（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を１００μＬ処理し、反応を終了させた。ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を用いてＯＤ４５０を測定し、この数値を正規化した結果、親抗体（１Ｆ１２）対比１Ｆ１２＿Ｈ２Ｌ３、１Ｆ１２＿Ｈ２Ｌ６、１Ｆ１２＿Ｈ３Ｌ５及び１Ｆ１２＿Ｈ６Ｌ５クローンの親和度が上昇しており、特に、１Ｆ１２＿Ｈ３Ｌ５クローンが最高の親和度を示すことを確認した（図７）。
【０１２７】
実施例５：癌細胞成長抑制能分析
【０１２８】
ＭＫＮ４５はｃ−Ｍｅｔ増幅胃癌細胞株であり、ＪＣＲＢ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（Ｊａｐａｎ）から得、ＲＰＭＩ１６４０に１０％  ＦＢＳが添加された培地で培養して細胞を維持した。対照抗体としてオナルツズマブ（Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）（ＯＡ−５Ｄ５；一価ｃ−Ｍｅｔ抗体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を使用し、公開された抗体配列に基づいて抗体発現ベクターを作製した。Ｅｘｐｉ２９３発現システム（Ｇｉｂｃｏ）を用いた一時的発現（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）をし、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  ｓｕｒｅ（ＧＥ）をＡＫＴＡ  ａｖａｎｔ（ＧＥ）に装着した親和クロマトグラフィー（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）法で精製を行い、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析を通じて９８％以上の純度を確認し、また、ＥＬＩＳＡとＳＰＲ分析を通じて文献と類似性を確認した。細胞成長抑制能分析のために９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３６１０）にＲＰＭＮ１６４０＋１０％  ＦＢＳの組成を持つ完全培養培地に３０００セル／ウェルで分注し、一晩培養して細胞を付着させた後、培地を除去し、最高１００ｎＭから１／５ずつ抗体を完全培養培地に希釈して培地を１００μＬずつ処理した。７２時間後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに１００μＬ処理後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  Ｐｒｏ（ＴＥＣＡＮ）で細胞生存性（Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を分析した。その結果、改良前抗体（１Ｆ１２）と対照抗体オナルツズマブ対比１Ｆ１２＿Ｈ２Ｌ３、１Ｆ１２＿Ｈ２Ｌ６、１Ｆ１２＿Ｈ３Ｌ５及び１Ｆ１２＿Ｈ６Ｌ５抗体の効能が高いことを確認し、１Ｆ１２＿Ｈ３Ｌ５抗体の効能が最高であることを確認した（図８）。
【０１２９】
実施例６：動物モデルにおいて腫瘍成長抑制能評価
【０１３０】
腫瘍細胞が移植されている動物モデルにおいて腫瘍成長抑制能を評価するために、マウス大腸癌腫瘍細胞であるＭＣ３８細胞をマウスに移植して腫瘍動物モデルを作製し、１Ｆ１２＿Ｈ３Ｌ５投与による腫瘍成長抑制能を評価した。
【０１３１】
ＭＣ３８を１００μＬ当たり２０００００セルが存在するように準備し、このとき、ハンクス塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  Ｓａｌｔ（ＨＢＳＳ）  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｇｉｂｃｏ）とＢａｓａｌ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ(R)）を１：１に混ぜた溶液を用いた。準備した細胞は７〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスの右側腰背部に１００μＬずつ１ｃｃ注射器（２６Ｇ）を用いて移植した。
【０１３２】
ＭＣ３８細胞株をそれぞれマウスに移植した後、５日目から１Ｆ１２＿Ｈ３Ｌ５（２０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）（５ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）投与を開始し、週２回投与を行った。併用投与による反応性を評価するために腫瘍移植後５日目の時点に単独投与群と共に１Ｆ１２＿Ｈ３Ｌ５（２０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）、アテゾリズマブ（５ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）併用投与を行ったが、併用投与時に１Ｆ１２＿Ｈ３Ｌ５（２０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）をまず投与後、続いてアテゾリズマブ（５ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）を投与した。腫瘍サイズはキャリパーを用いて長軸及び短軸をミリメートル（ｍｍ）単位で測定し、［（長軸）×（短軸）２×０．５］の計算式で算出して測定した。
【０１３３】
評価の結果、ＭＣ３８腫瘍動物モデルにおいては１Ｆ１２＿Ｈ３Ｌ５（２０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）投与による有意味な腫瘍抑制能が観察されず、アテゾリズマブ（５ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）投与群では約４０〜５０％の腫瘍が抑制されたことが観察できた。同一モデルにおける併用投与群（１Ｆ１２＿Ｈ３Ｌ５＋アテゾリズマブ）では対照群に比べて腫瘍が発生しないことを確認し（腫瘍移植後２２日目）、実験を終了した４３日頃には当該併用投与群において１個体でのみ腫瘍が形成され、残り４個体は持続的に腫瘍が形成されないことを観察した。
【０１３４】
ＭＣ３８腫瘍動物モデルにおいて進行された動物試験結果は、１Ｆ１２＿Ｈ３Ｌ５と代表的な免疫チェックポイント阻害剤として知られているアテゾリズマブ（ＰＤ−Ｌ１抑制剤）との併用投与によって１Ｆ１２＿Ｈ３Ｌ５の治療効能が増大できることを示唆する（図９）。
【０１３５】
実施例７：動物モデルにおいて放射線治療との併用治療反応性評価
【０１３６】
腫瘍細胞が移植されている動物モデルにおいて腫瘍成長抑制能を評価するために、マウス大腸癌腫瘍細胞であるＭＣ３８細胞をマウスに移植して腫瘍動物モデルを作製し、１Ｆ１２＿Ｈ３Ｌ５投与による腫瘍成長抑制能を評価した。
【０１３７】
ＭＣ３８を１００μＬ当たり２０００００セルが存在するように準備し、このとき、ハンクス塩（ＨＢＳＳ）溶液（Ｇｉｂｃｏ）とＢａｓａｌ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を１：１に混ぜた溶液を用いた。準備した細胞は、７〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスの右側腰背部に１００μＬずつ１ｃｃ注射器（２６Ｇ）を用いて移植した。腫瘍サイズはキャリパーを用いて長軸と短軸をミリメートル（ｍｍ）単位で測定し、［（長軸）×（短軸）２×０．５］の計算式で算出して測定した。放射線治療のために、腫瘍移植後２０日になる時点でマウスを麻酔し、放射線照射機を用いて、皮下移植された腫瘍に放射線を２Ｇｙ単回照射した。
【０１３８】
試験の結果、試験終了時点基準に、放射線照射群において約８０％に近い腫瘍成長抑制が観察され、放射線照射と共に１Ｆ１２＿Ｈ３Ｌ５又はアテゾリズマブをそれぞれ投与した場合、約９０％に近い腫瘍成長抑制能が確認された（図１０）。
【０１３９】
実施例８：ＭＣ３８動物モデル腫瘍における免疫細胞発現分析
【０１４０】
免疫チェックポイント阻害剤（Ｉｍｍｕｎｅ−ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）などとの併用投与戦略などのメカニズム分析のために、ＭＣ３８動物モデルを作製し、腫瘍組織における免疫細胞発現分析を行った。
【０１４１】
ＭＣ３８を１００μＬ当たり２０００００セルが存在するように準備し、このとき、ハンクス塩（ＨＢＳＳ）溶液（Ｇｉｂｃｏ）とＢａｓａｌ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を１：１に混ぜた溶液を用いた。準備した細胞は７〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスの右側腰背部に１００μＬずつ１ｃｃ注射器（２６Ｇ）を用いて移植した。腫瘍サイズが約８００〜１０００ｍｍ３になる時点で剖検して腫瘍組織を確保し、分離された腫瘍組織を用いてＲＮＡシーケンシングを行って分析した。分析のために、既存に論文で報告された主要免疫細胞別の遺伝子発現シグネチャー（ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を用いて分析した。
【０１４２】
ＭＣ３８腫瘍組織において主要免疫細胞発現を確認した結果、免疫細胞浸潤が多い腫瘍として確認された（図１１）。したがって、ＭＣ３８腫瘍モデルにおいて免疫チェックポイント阻害剤治療及び腫瘍免疫関連治療反応性が現れる可能性が高いことを示唆し、今後、試験において腫瘍の免疫細胞発現傾向によって治療反応性が予測できると予想される。
【０１４３】
実施例９：腫瘍における免疫チェックポイントＰＤ−Ｌ１分析
【０１４４】
ＭＣ３８モデルにおいて１Ｆ１２＿Ｈ３Ｌ５を投与したマウスと非投与したマウスの腫瘍細胞において免疫チェックポイントであるＰＤ−Ｌ１の発現変化を確認するために、腫瘍組織は、単一細胞に分離する過程を行った。単一細胞において免疫細胞マーカーであるＣＤ４５とＰＤ−Ｌ１の染色を通じて腫瘍細胞におけるＰＤ−Ｌ１に対する分析を行った。腫瘍細胞に侵襲した免疫細胞を排除するために、ＣＤ４５の発現がない細胞においてＰＤ−Ｌ１の発現を確認した。
【０１４５】
その結果、１Ｆ１２＿Ｈ３Ｌ５を投与したマウス個体においてＰＤ−Ｌ１の発現する細胞が２倍以上増加することを確認した（図１２）。これは、１Ｆ１２＿Ｈ３Ｌ５とＰＤ−Ｌ１阻害剤に対する敏感度を増加させることができることを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明に係るｃ−Ｍｅｔに結合する抗体又はその抗原結合断片は、ヒト及びマウスｃ−Ｍｅｔに高い親和力で結合できるので、マウス腫瘍モデルを用いた効能評価においてより正確な前臨床結果を確認することができる。本発明に係るｃ−Ｍｅｔに結合する抗体又はその抗原結合断片は、目的とする癌の予防又は治療に有用に用いることができる。
【０１４７】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は好ましい実施様態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるわけではない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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