(57)【要約】本発明は、必要とする患者においてＢＭＰ３遺伝子およびＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化状態およびレベルを決定するために使用され得る定量ＰＣＲを行うためのプライマーおよびプローブの組合せを提供し、これは必要とする患者における大腸がん（ＣＲＣ）および／または進行腺腫（ＡＡ）の有無を診断するための驚くほど高い診断の特異度および感度をもたらす。診断を行うための組成物および方法を提供する。
2021526370.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、必要とする患者において大腸がん（ＣＲＣ）または進行腺腫（ＡＡ）の有無を検出するためのキット：
ａ）患者から得られた生体試料中のＢＭＰ３遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための第１のプライマー対および第１のプローブ、ここで第１のプライマー対および第１のプローブはそれぞれ配列番号１と同一であるか、相補的であるか、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする少なくとも１６ヌクレオチドの連続した配列を含む、
ｂ）患者から得られた生体試料中のＮＤＲＧ４遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための第２のプライマー対および第２のプローブ、ここで第２のプライマー対および第２のプローブはそれぞれ配列番号２と同一であるか、相補的であるか、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする少なくとも１６ヌクレオチドの連続した配列を含む。
【請求項２】
第１のプライマー対および第１のプローブが以下からなる群から選択される、請求項１記載のキット：
ｉ）配列番号３を含む順方向プライマー、配列番号４を含む逆方向プライマー、および配列番号５を含むプローブ；
ｉｉ）配列番号９を含む順方向プライマー、配列番号１０を含む逆方向プライマー、および配列番号１１を含むプローブ；ならびに
ｉｉｉ）配列番号１５を含む順方向プライマー、配列番号１６を含む逆方向プライマー、および配列番号１７を含むプローブ；
ここで、第２のプライマー対および第２のプローブは以下からなる群から選択される：
ｉｖ）配列番号６を含む順方向プライマー、配列番号７を含む逆方向プライマー、および配列番号８を含むプローブ；
ｖ）配列番号１２を含む順方向プライマー、配列番号１３を含む逆方向プライマー、および配列番号１４を含むプローブ；ならびに
ｖｉ）配列番号１８を含む順方向プライマー、配列番号１９を含む逆方向プライマー、および配列番号２０を含むプローブ。
【請求項３】
以下を含む、請求項１記載のキット：
ｉ）患者から得られた生体試料中のＢＭＰ３遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号３を含む順方向プライマー、配列番号４を含む逆方向プライマー、および配列番号５を含むプローブ、ならびに
ｉｉ）患者から得られた生体試料中のＮＤＲＧ４遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号６を含む順方向プライマー、配列番号７を含む逆方向プライマー、および配列番号８を含むプローブ。
【請求項４】
以下を含む、請求項１記載のキット：
ｉ）患者から得られた生体試料中のＢＭＰ３遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号９を含む順方向プライマー、配列番号１０を含む逆方向プライマー、および配列番号１１を含むプローブ、ならびに
ｉｉ）患者から得られた生体試料中のＮＤＲＧ４遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号１２を含む順方向プライマー、配列番号１３を含む逆方向プライマー、および配列番号１４を含むプローブ。
【請求項５】
以下を含む、請求項１記載のキット：
ｉ）患者から得られた生体試料中のＢＭＰ３遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号１５を含む順方向プライマー、配列番号１６を含む逆方向プライマー、および配列番号１７を含むプローブ、ならびに
ｉｉ）患者から得られた生体試料中のＮＤＲＧ４遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号１８を含む順方向プライマー、配列番号１９を含む逆方向プライマー、および配列番号２０を含むプローブ。
【請求項６】
第１のプローブおよび第２のプローブがともに蛍光ドナーおよびアクセプターフルオロフォアを含む、請求項１〜５のいずれかに記載のキット。
【請求項７】
第１のプローブおよび第２のプローブがＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブである、請求項６記載のキット。
【請求項８】
以下をさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載のキット：
（１）患者におけるＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの変異の有無を検出するための手段；および
（２）患者から得られた生体試料中のヘモグロビンの有無を検出するための手段。
【請求項９】
患者におけるＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの変異の有無を検出するための手段が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてＫＲＡＳ遺伝子のエクソン１２および／またはエクソン１３領域を増幅できる少なくとも１つのプライマー対を含む、請求項８記載のキット。
【請求項１０】
生体試料中のヘモグロビンの有無を検出するための手段が抗ヘモグロビン抗体を含む、請求項８記載のキット。
【請求項１１】
プライマーが、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２ＳおよびＧ１３Ｃからなる群から選択される少なくとも１つのＫＲＡＳ変異を含むＫＲＡＳ遺伝子領域を増幅できる、請求項９記載のキット。
【請求項１２】
抗体が金コロイド標識抗体である、請求項１０記載のキット。
【請求項１３】
定量化のための参照遺伝子を増幅する手段をさらに含む、請求項１〜１２のいずれかに記載のキット。
【請求項１４】
キットを用いて得られた検査結果の使用および／または解釈のための説明書をさらに含む、請求項１〜１２のいずれかに記載のキット。
【請求項１５】
生体試料中の抗体およびヘモグロビンによって形成された複合体を検出する手段をさらに含む、請求項１０記載のキット。
【請求項１６】
患者から得られた生体試料が便試料である、請求項１〜１５のいずれかに記載のキット。
【請求項１７】
重亜硫酸試薬、ならびに重亜硫酸試薬および患者の生体試料または生体試料から得られたポリヌクレオチドを混合するのに適した容器をさらに含む、請求項１〜１６のいずれかに記載のキット。
【請求項１８】
メチル化感受性制限酵素試薬をさらに含む、請求項１〜１７のいずれかに記載のキット。
【請求項１９】
以下をさらに含む、請求項１〜１８のいずれかに記載のキット：
（１）生体試料中のＢＭＰ３メチル化を検出するための陽性標準および陰性標準、ならびに
（２）生体試料中のＮＤＲＧ４メチル化を検出するための陽性標準および陰性標準。
【請求項２０】
請求項１９記載のキット、ここでＢＭＰ３メチル化を検出するための陽性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＧＴＴＡＧＴＴＴＧＧＴＣＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧＣＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＧＴＡＴＡＧＡＴＡＧＡＴＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＴＣＧＧＧＴＴＡＴＡＴＡＣＧＴＣＧＣＧＡＴＴＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＣＧＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＣＧＧＣＧＴＴＣＧＴＡＧＣＧＴＴＴＴＧＣＧＣＧＧＧＴＧＡＧＧＴＴＣＧＣＧＴＡＧＴＴＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＧＴＴＧＣＧＴＴＧＧＧＴＴＡＧＣＧＴＡＧＴＡＡＧＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＣＧＴＴＡＴＴＴＣＧＴＴＧＴＡＴＴＣＧＧＴＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧＧＴＴＴＣＧＴＧＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＡＧ（配列番号６７）；
ＢＭＰ３メチル化を検出するための陰性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＧＴＴＡＧＴＴＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧＴＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＧＴＡＴＡＧＡＴＡＧＡＴＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＴＴＧＧＧＴＴＡＴＡＴＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＴＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＧＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＴＧＧＴＧＴＴＴＧＴＡＧＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＧＴＧＴＡＧＴＴＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＧＴＴＧＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＧＴＧＴＡＧＴＡＡＧＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＴＧＴＴＡＴＴＴＴＧＴＴＧＴＡＴＴＴＧＧＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＧＧＴＴＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＡＧ（配列番号６８）；
ＮＤＲＧ４メチル化を検出するための陽性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＴＧＡＧＡＡＧＴＣＧＧＣＧＧＧＧＧＣＧＣＧＧＡＴＣＧＡＴＣＧＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＣＧＣＧＴＣＧＣＧＧＴＴＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＴＴＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＴＡＴＣＧＧＧＴＡＴＴＴＴＡＧＴＣＧＣＧＴＡＧＡＡＧＧＣＧＧＡＡＧＴＴＡＣＧＣＧＣＧＡＧＧＧＡＴＣＧＣＧＧＴＴＣＧＴＴＣＧＧＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＧＧＴＴＣＧＧＴＡＴＣＧＴＴＴＣＧＣＧＧＧＴＣＧＡＧＣＧＴＴＴＡＴＡＴＴＣＧＴＴＡＡＡＴＴＴＡＣＧＣＧＧＧＴＡＣＧＴＴＴＴＣＧＣＧＧＣＧＴＡＴＣＧＴＴＴＴＴＡＧＴＴ（配列番号６９）；および
ＮＤＲＧ４メチル化を検出するための陰性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＴＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＴＴＧＡＴＴＧＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＴＧＴＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＧＧＴＡＴＴＴＴＡＧＴＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＧＴＧＡＧＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＧＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＧＧＴＡＴＴＧＴＴＴＴＧＴＧＧＧＴＴＧＡＧＴＧＴＴＴＡＴＡＴＴＴＧＴＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＴＧＧＧＴＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴＧＧＴＧＴＡＴＴＧＴＴＴＴＴＡＧＴＴ（配列番号７０）。
【請求項２１】
内部標準遺伝子を増幅するための手段が、陽性対照遺伝子および／または陰性対照遺伝子を増幅するためのプライマーを含む、請求項１３記載のキット。
【請求項２２】
以下を含む、必要とする患者における大腸がん（ＣＲＣ）または進行腺腫（ＡＡ）の有無を検出する方法：
ａ）患者の生体試料からゲノムＤＮＡを取得する；
ｂ）ａ）のゲノムＤＮＡまたはその断片を１以上の試薬で処理し、メチル化されていないシトシン塩基をウラシルまたはハイブリダイゼーションの特性に関してシトシンとは検出可能に異なる別の塩基に変換する；
ｃ）処理されたゲノムＤＮＡまたは処理されたその断片を、患者における骨形成タンパク質３（ＢＭＰ３）をコードする遺伝子のメチル化部位の有無を検出するための第１のプライマー対、および患者におけるＮＤＲＧファミリーメンバー４タンパク質（ＮＤＲＧ４）をコードする遺伝子のメチル化部位の有無を検出するための第２のプライマー対と接触させる、ここで第１のプライマー対は配列番号１と同一であるか、相補的であるか、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチドの連続した配列を含み、第２のプライマー対は配列番号２と相補的であるか、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチドの連続した配列を含み、処理されたゲノムＤＮＡまたはその断片は第１のプライマー対または第２のプライマー対によって少なくとも１つの増幅物を生成するように増幅されるか、または増幅されない；および
ｄ）前記増幅物の有無、患者におけるＢＭＰ３遺伝子およびＮＤＲＧ４遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルに基づいて、患者におけるＣＲＣまたはＡＡの有無を判定する。
【請求項２３】
第１のプライマー対および第１のプローブが以下からなる群から選択される、請求項２２記載の方法：
ｉ）配列番号３を含む順方向プライマー、配列番号４を含む逆方向プライマー、および配列番号５を含むプローブ；
ｉｉ）配列番号９を含む順方向プライマー、配列番号１０を含む逆方向プライマー、および配列番号１１を含むプローブ；ならびに
ｉｉｉ）配列番号１５を含む順方向プライマー、配列番号１６を含む逆方向プライマー、および配列番号１７を含むプローブ；
ここで、第２のプライマー対および第２のプローブは以下からなる群から選択される：
ｉｖ）配列番号６を含む順方向プライマー、配列番号７を含む逆方向プライマー、および配列番号８を含むプローブ；
ｖ）配列番号１２を含む順方向プライマー、配列番号１３を含む逆方向プライマー、および配列番号１４を含むプローブ；ならびに
ｖｉ）配列番号１８を含む順方向プライマー、配列番号１９を含む逆方向プライマー、および配列番号２０を含むプローブ。
【請求項２４】
以下を用いることを含む、請求項２２記載の方法：
ｉ）患者から得られた生体試料中のＢＭＰ３遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号３を含む順方向プライマー、配列番号４を含む逆方向プライマー、および配列番号５を含むプローブ、ならびに
ｉｉ）患者から得られた生体試料中のＮＤＲＧ４遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号６を含む順方向プライマー、配列番号７を含む逆方向プライマー、および配列番号８を含むプローブ。
【請求項２５】
以下を用いることを含む、請求項２２記載の方法：
ｉ）患者から得られた生体試料中のＢＭＰ３遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号９を含む順方向プライマー、配列番号１０を含む逆方向プライマー、および配列番号１１を含むプローブ、ならびに
ｉｉ）患者から得られた生体試料中のＮＤＲＧ４遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号１２を含む順方向プライマー、配列番号１３を含む逆方向プライマー、および配列番号１４を含むプローブ。
【請求項２６】
以下を用いることを含む、請求項２２記載の方法：
ｉ）患者から得られた生体試料中のＢＭＰ３遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号１５を含む順方向プライマー、配列番号１６を含む逆方向プライマー、および配列番号１７を含むプローブ、ならびに
ｉｉ）患者から得られた生体試料中のＮＤＲＧ４遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号１８を含む順方向プライマー、配列番号１９を含む逆方向プライマー、および配列番号２０を含むプローブ。
【請求項２７】
第１のプローブおよび第２のプローブがともに蛍光ドナーおよびアクセプターフルオロフォアを含む、請求項２２〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
第１のプローブおよび第２のプローブがＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブである、請求項２２〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
患者から得られた生体試料中のＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの変異の有無を検出する工程、および患者から得られた生体試料中のヘモグロビンの有無を検出する工程をさらに含む、請求項２２〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
患者におけるＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの変異の有無を検出する工程が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてＫＲＡＳ遺伝子のエクソン１２および／またはエクソン１３領域を増幅できる少なくとも１つのプライマー対を用いることを含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
生体試料中のヘモグロビンの有無を検出する工程が、抗ヘモグロビン抗体を用いることを含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
プライマーが、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２ＳおよびＧ１３Ｃからなる群から選択される少なくとも１つのＫＲＡＳ変異を含むＫＲＡＳ遺伝子領域を増幅できる、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
抗体が金コロイド標識抗体である、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
ＢＭＰ３遺伝子の増幅が定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で行われ、方法が第１の参照遺伝子を増幅し、ＢＭＰ３増幅のＣｔ値をΔＣｔ１として決定することをさらに含む、請求項２２〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
ＮＤＲＧ４遺伝子の増幅が定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で行われ、方法が第２の参照遺伝子を増幅し、ＮＤＲＧ４増幅のＣｔ値をΔＣｔ２として決定することをさらに含む、請求項２２〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
変異ＫＲＡＳ遺伝子の増幅が定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で行われ、方法が第３の参照遺伝子を増幅し、変異ＫＲＡＳ増幅のＣｔ値をΔＣｔ３として決定することをさらに含む、請求項３０〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
第１の参照遺伝子と第２の参照遺伝子が同一である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３８】
同一の参照遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
変異ＫＲＡＳ遺伝子が、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２ＡおよびＧ１３Ｒからなる群から選択される変異を含む、請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
変異ＫＲＡＳ遺伝子が以下からなる群から選択される１以上のプライマー対によって増幅される、請求項３９記載の方法：
（１）配列番号３５を含む順方向プライマーＧ１２Ｄ−Ｆ、および配列番号４２を含む逆方向プライマーＫｒａｓ−Ｒ；
（２）配列番号３６を含む順方向プライマーＧ１３Ｄ−Ｆ、および配列番号４２を含む逆方向プライマーＫｒａｓ−Ｒ；
（３）配列番号３７を含む順方向プライマーＧ１２Ｖ−Ｆ、および配列番号４２を含む逆方向プライマーＫｒａｓ−Ｒ；
（４）配列番号３８を含む順方向プライマーＧ１２Ｃ−Ｆ、および配列番号４２を含む逆方向プライマーＫｒａｓ−Ｒ；
（５）配列番号３９を含む順方向プライマーＧ１２Ｓ−Ｆ、および配列番号４２を含む逆方向プライマーＫｒａｓ−Ｒ；
（６）配列番号４０を含む順方向プライマーＧ１２Ａ−Ｆ、および配列番号４２を含む逆方向プライマーＫｒａｓ−Ｒ；ならびに
（７）配列番号４１を含む順方向プライマーＧ１２Ｒ−Ｆ、および配列番号４２を含む逆方向プライマーＫｒａｓ−Ｒ、
ここで、ｑＰＣＲのためのＫＲＡＳプローブは配列番号４６を含む。
【請求項４１】
第３の参照遺伝子がＡＣＴＢ遺伝子である、請求項３６記載の方法。
【請求項４２】
ＡＣＴＢ遺伝子を増幅するためのｑＰＣＲプライマーが配列番号４３および４４を含み、プローブが配列番号４６を含む、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
以下を用いることを含む、請求項２２〜４２のいずれかに記載の方法：
（１）試料中のＢＭＰ３メチル化を検出するための陽性標準および陰性標準、ならびに
（２）試料中のＮＤＲＧ４メチル化を検出するための陽性標準および陰性標準。
【請求項４４】
請求項４３記載の方法、ここでＢＭＰ３メチル化を検出するための陽性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＧＴＴＡＧＴＴＴＧＧＴＣＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧＣＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＧＴＡＴＡＧＡＴＡＧＡＴＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＴＣＧＧＧＴＴＡＴＡＴＡＣＧＴＣＧＣＧＡＴＴＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＣＧＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＣＧＧＣＧＴＴＣＧＴＡＧＣＧＴＴＴＴＧＣＧＣＧＧＧＴＧＡＧＧＴＴＣＧＣＧＴＡＧＴＴＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＧＴＴＧＣＧＴＴＧＧＧＴＴＡＧＣＧＴＡＧＴＡＡＧＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＣＧＴＴＡＴＴＴＣＧＴＴＧＴＡＴＴＣＧＧＴＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧＧＴＴＴＣＧＴＧＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＡＧ（配列番号６７）；
ＢＭＰ３メチル化を検出するための陰性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＧＴＴＡＧＴＴＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧＴＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＧＴＡＴＡＧＡＴＡＧＡＴＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＴＴＧＧＧＴＴＡＴＡＴＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＴＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＧＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＴＧＧＴＧＴＴＴＧＴＡＧＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＧＴＧＴＡＧＴＴＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＧＴＴＧＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＧＴＧＴＡＧＴＡＡＧＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＴＧＴＴＡＴＴＴＴＧＴＴＧＴＡＴＴＴＧＧＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＧＧＴＴＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＡＧ（配列番号６８）；
ＮＤＲＧ４メチル化を検出するための陽性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＴＧＡＧＡＡＧＴＣＧＧＣＧＧＧＧＧＣＧＣＧＧＡＴＣＧＡＴＣＧＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＣＧＣＧＴＣＧＣＧＧＴＴＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＴＴＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＴＡＴＣＧＧＧＴＡＴＴＴＴＡＧＴＣＧＣＧＴＡＧＡＡＧＧＣＧＧＡＡＧＴＴＡＣＧＣＧＣＧＡＧＧＧＡＴＣＧＣＧＧＴＴＣＧＴＴＣＧＧＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＧＧＴＴＣＧＧＴＡＴＣＧＴＴＴＣＧＣＧＧＧＴＣＧＡＧＣＧＴＴＴＡＴＡＴＴＣＧＴＴＡＡＡＴＴＴＡＣＧＣＧＧＧＴＡＣＧＴＴＴＴＣＧＣＧＧＣＧＴＡＴＣＧＴＴＴＴＴＡＧＴＴ（配列番号６９）；および
ＮＤＲＧ４メチル化を検出するための陰性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＴＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＴＴＧＡＴＴＧＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＴＧＴＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＧＧＴＡＴＴＴＴＡＧＴＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＧＴＧＡＧＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＧＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＧＧＴＡＴＴＧＴＴＴＴＧＴＧＧＧＴＴＧＡＧＴＧＴＴＴＡＴＡＴＴＴＧＴＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＴＧＧＧＴＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴＧＧＴＧＴＡＴＴＧＴＴＴＴＴＡＧＴＴ（配列番号７０）。
【請求項４５】
品質管理標準を増幅することを含む、請求項２２〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
請求項１〜２１のいずれかに記載のキットを用いることを含む、必要とする患者における大腸がん（ＣＲＣ）または進行腺腫（ＡＡ）の有無を検出する方法。
【請求項４７】
以下を含む、必要とする患者における大腸がん（ＣＲＣ）または進行腺腫（ＡＡ）の有無を検出する方法：
ａ）患者の便試料から処理されていないゲノムＤＮＡを取得する：
ｂ）ａ）のゲノムＤＮＡまたはその断片を１以上の試薬で処理し、メチル化されていないシトシン塩基をウラシルまたはハイブリダイゼーションの特性に関してシトシンとは検出可能に異なる別の塩基に変換する；
ｃ）ｂ）の処理されたゲノムＤＮＡを鋳型として用いて定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行い、患者におけるＢＭＰ３遺伝子のＣｔ値をΔＣｔ１として決定する；
ｄ）ｂ）の処理されたゲノムＤＮＡを鋳型として用いてｑＰＣＲを行い、患者におけるＮＤＲＧ４遺伝子のＣｔ値をΔＣｔ２として決定する；
ｅ）処理されていないゲノムＤＮＡを鋳型として用いてｑＰＣＲを行い、患者における変異ＫＲＡＳ遺伝子のＣｔ値をΔＣｔ３として決定する；
ｆ）便試料中のヘモグロビンタンパク質の免疫化学的便潜血検査を行い、スコアをＦＩＴとして決定する；
ｇ）Ｋの値を決定する、ここでＫ＝ａ＊ΔＣｔ１＋ｂ＊ΔＣｔ２＋ｃ＊ΔＣｔ３＋ｄ＊ＦＩＴ＋Ｘであり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、Ｘは臨床定数である；および
ｈ）総合指数Ｐの値を決定する、ここでＰ＝ｅＫ／（１＋ｅＫ）であり、ｅは自然定数であり、ここでＰが所定の閾値以上である場合、患者はＣＲＣおよび／またはＡＡを有すると判定され、Ｐが所定の閾値未満である場合、患者は健常であると判定される。
【請求項４８】
ＢＭＰ３遺伝子を増幅するためのｑＰＣＲが第１のプライマー対および第１のプローブを含み、第１のプライマー対および第１のプローブが以下からなる群から選択される、請求項４７記載の方法：
ｉ）配列番号３を含む順方向プライマー、配列番号４を含む逆方向プライマー、および配列番号５を含むプローブ；
ｉｉ）配列番号９を含む順方向プライマー、配列番号１０を含む逆方向プライマー、および配列番号１１を含むプローブ；ならびに
ｉｉｉ）配列番号１５を含む順方向プライマー、配列番号１６を含む逆方向プライマー、および配列番号１７を含むプローブ；
ここで、ＮＤＲＧ４遺伝子を増幅するためのｑＰＣＲは第２のプライマー対および第２のプローブを含み、第２のプライマー対および第２のプローブは以下からなる群から選択される：
ｉｖ）配列番号６を含む順方向プライマー、配列番号７を含む逆方向プライマー、および配列番号８を含むプローブ；
ｖ）配列番号１２を含む順方向プライマー、配列番号１３を含む逆方向プライマー、および配列番号１４を含むプローブ；ならびに
ｖｉ）配列番号１８を含む順方向プライマー、配列番号１９を含む逆方向プライマー、および配列番号２０を含むプローブ。
【請求項４９】
以下を用いることを含む、請求項４７記載の方法：
ｉ）試料中のＢＭＰ３遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号３を含む順方向プライマー、配列番号４を含む逆方向プライマー、および配列番号５を含むプローブ、ならびに
ｉｉ）試料中のＮＤＲＧ４遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号６を含む順方向プライマー、配列番号７を含む逆方向プライマー、および配列番号８を含むプローブ。
【請求項５０】
以下を用いることを含む、請求項４７記載の方法：
ｉ）試料中のＢＭＰ３遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号９を含む順方向プライマー、配列番号１０を含む逆方向プライマー、および配列番号１１を含むプローブ、ならびに
ｉｉ）試料中のＮＤＲＧ４遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号１２を含む順方向プライマー、配列番号１３を含む逆方向プライマー、および配列番号１４を含むプローブ。
【請求項５１】
以下を用いることを含む、請求項４７記載の方法：
ｉ）試料中のＢＭＰ３遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号１５を含む順方向プライマー、配列番号１６を含む逆方向プライマー、および配列番号１７を含むプローブ、ならびに
ｉｉ）試料中のＮＤＲＧ４遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号１８を含む順方向プライマー、配列番号１９を含む逆方向プライマー、および配列番号２０を含むプローブ。
【請求項５２】
第１のプローブおよび第２のプローブがともに蛍光ドナーおよびアクセプターフルオロフォアを含む、請求項４７〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
第１のプローブおよび第２のプローブがＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブである、請求項４７〜５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
変異ＫＲＡＳ遺伝子が、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２ＳおよびＧ１３Ｃからなる群から選択される少なくとも１つのＫＲＡＳ変異を含む、請求項４７〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
免疫化学的便潜血検査が金コロイド標識抗体を含む、請求項４７〜５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
工程ｃ）および工程ｄ）がＢ２Ｍ遺伝子を参照遺伝子として用いることを含む、請求項４７〜５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
変異ＫＲＡＳ遺伝子が以下からなる群から選択される１以上のプライマー対によって増幅される、請求項５４記載の方法：
（１）配列番号３５を含む順方向プライマーＧ１２Ｄ−Ｆ、および配列番号４２を含む逆方向プライマーＫｒａｓ−Ｒ；
（２）配列番号３６を含む順方向プライマーＧ１３Ｄ−Ｆ、および配列番号４２を含む逆方向プライマーＫｒａｓ−Ｒ；
（３）配列番号３７を含む順方向プライマーＧ１２Ｖ−Ｆ、および配列番号４２を含む逆方向プライマーＫｒａｓ−Ｒ；
（４）配列番号３８を含む順方向プライマーＧ１２Ｃ−Ｆ、および配列番号４２を含む逆方向プライマーＫｒａｓ−Ｒ；
（５）配列番号３９を含む順方向プライマーＧ１２Ｓ−Ｆ、および配列番号４２を含む逆方向プライマーＫｒａｓ−Ｒ；
（６）配列番号４０を含む順方向プライマーＧ１２Ａ−Ｆ、および配列番号４２を含む逆方向プライマーＫｒａｓ−Ｒ；ならびに
（７）配列番号４１を含む順方向プライマーＧ１２Ｒ−Ｆ、および配列番号４２を含む逆方向プライマーＫｒａｓ−Ｒ、
ここで、ｑＰＣＲのためのＫＲＡＳプローブは配列番号４６を含む。
【請求項５８】
ＡＣＴＢ遺伝子が変異ＫＲＡＳ遺伝子を増幅するためのｑＰＣＲにおいて参照遺伝子として用いられる、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
ＡＣＴＢ遺伝子を増幅するためのｑＰＣＲプライマーが配列番号４３および４４を含み、ＡＣＴＢ遺伝子のためのｑＰＣＲプローブが配列番号４６を含む、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
以下を用いることを含む、請求項４７〜５９のいずれかに記載の方法：
（１）試料中のＢＭＰ３メチル化を検出するための陽性標準および陰性標準、ならびに
（２）試料中のＮＤＲＧ４メチル化を検出するための陽性標準および陰性標準。
【請求項６１】
請求項６０記載の方法、ここでＢＭＰ３メチル化を検出するための陽性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＧＴＴＡＧＴＴＴＧＧＴＣＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧＣＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＧＴＡＴＡＧＡＴＡＧＡＴＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＴＣＧＧＧＴＴＡＴＡＴＡＣＧＴＣＧＣＧＡＴＴＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＣＧＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＣＧＧＣＧＴＴＣＧＴＡＧＣＧＴＴＴＴＧＣＧＣＧＧＧＴＧＡＧＧＴＴＣＧＣＧＴＡＧＴＴＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＧＴＴＧＣＧＴＴＧＧＧＴＴＡＧＣＧＴＡＧＴＡＡＧＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＣＧＴＴＡＴＴＴＣＧＴＴＧＴＡＴＴＣＧＧＴＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧＧＴＴＴＣＧＴＧＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＡＧ（配列番号６７）；
ＢＭＰ３メチル化を検出するための陰性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＧＴＴＡＧＴＴＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧＴＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＧＴＡＴＡＧＡＴＡＧＡＴＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＴＴＧＧＧＴＴＡＴＡＴＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＴＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＧＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＴＧＧＴＧＴＴＴＧＴＡＧＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＧＴＧＴＡＧＴＴＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＧＴＴＧＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＧＴＧＴＡＧＴＡＡＧＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＴＧＴＴＡＴＴＴＴＧＴＴＧＴＡＴＴＴＧＧＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＧＧＴＴＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＡＧ（配列番号６８）；
ＮＤＲＧ４メチル化を検出するための陽性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＴＧＡＧＡＡＧＴＣＧＧＣＧＧＧＧＧＣＧＣＧＧＡＴＣＧＡＴＣＧＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＣＧＣＧＴＣＧＣＧＧＴＴＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＴＴＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＴＡＴＣＧＧＧＴＡＴＴＴＴＡＧＴＣＧＣＧＴＡＧＡＡＧＧＣＧＧＡＡＧＴＴＡＣＧＣＧＣＧＡＧＧＧＡＴＣＧＣＧＧＴＴＣＧＴＴＣＧＧＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＧＧＴＴＣＧＧＴＡＴＣＧＴＴＴＣＧＣＧＧＧＴＣＧＡＧＣＧＴＴＴＡＴＡＴＴＣＧＴＴＡＡＡＴＴＴＡＣＧＣＧＧＧＴＡＣＧＴＴＴＴＣＧＣＧＧＣＧＴＡＴＣＧＴＴＴＴＴＡＧＴＴ（配列番号６９）；および
ＮＤＲＧ４メチル化を検出するための陰性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＴＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＴＴＧＡＴＴＧＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＴＧＴＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＧＧＴＡＴＴＴＴＡＧＴＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＧＴＧＡＧＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＧＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＧＧＴＡＴＴＧＴＴＴＴＧＴＧＧＧＴＴＧＡＧＴＧＴＴＴＡＴＡＴＴＴＧＴＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＴＧＧＧＴＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴＧＧＴＧＴＡＴＴＧＴＴＴＴＴＡＧＴＴ（配列番号７０）。
【請求項６２】
工程ｃ）および工程ｄ）において品質管理標準を増幅することを含む、請求項４７〜６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
請求項１〜２１のいずれかに記載のキットを用いて患者における大腸がん（ＣＲＣ）および／または進行腺腫（ＡＡ）の有無を決定し、患者におけるＣＲＣおよび／またはＡＡの有無に応じて患者を処置することを含む、必要とする患者におけるＣＲＣおよび／またはＡＡを診断および処置する方法。
【請求項６４】
請求項２２〜６２のいずれかに記載の方法を用いて患者における大腸がん（ＣＲＣ）および／または進行腺腫（ＡＡ）の有無を決定し、患者におけるＣＲＣおよび／またはＡＡの有無に応じて患者を処置することを含む、必要とする患者におけるＣＲＣおよび／またはＡＡを診断および処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2018年5月23日に出願された中国特許出願第201810502359.7号、および2018年5月23日に出願された第201810502387.9号の優先権を主張し、これらはそれぞれ、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、大腸がんおよび進行腺腫をスクリーニングするための組成物および方法、ならびに他の応用に関する。
【０００３】
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータで読み取り可能な形式のコピー（ファイル名：NEWH-017_01WO_SeqList_ST25.txt、記録日：2019年5月22日、ファイルサイズ：22キロバイト）。
【背景技術】
【０００４】
大腸がん（ＣＲＣ）は世界で４番目に多いがんであり、死亡率は肺がん、肝がんおよび胃がんより低い。ＣＲＣによる年間の死亡者は約７０万人である。ＣＲＣは、発展途上国と比較して先進国での発症率が高い「近代化」した疾患である。米国では、大腸がんは未だ２番目に多い死因である（Clinical Interventions in Aging 2016; 11:967-976）。人々の生活水準の向上に伴って、中国では２０００年以降、ＣＲＣの発症率および死亡率が増加している（CA CANCER J CLIN 2016; 66:115-132）。初期の限局性疾患（ステージＩおよびＩＩ）の患者の５年生存率は９０％に近づいているが、後期ＣＲＣの患者の生存率はわずか１３．１％である。後期ＣＲＣ患者の処置費用は莫大な額になることが多く、疾患の症状を軽減することしかできない（Clinical Interventions in Aging 2016; 11:967-976）。
【０００５】
ＣＲＣの発生は、腫瘍が便の通過を妨げ得、筋痙攣、疼痛または目に見える出血をもたらし得る数センチメートルのサイズに成長するまで、一般に無症状で遅いプロセスであり、初期に検出するのは困難である。ＣＲＣの発生は、経時的に蓄積する一連の組織学的、形態学的および遺伝的変化を伴う多段階の（すなわち健常から、過形成、小さなポリープ、大きなポリープ、腺がん、およびがんへの）プロセスを経る。ポリープは、腸管粘膜内で局所的に増殖または蓄積する異常細胞である。ポリープ内の分裂細胞は腸壁を貫通するのに十分な遺伝子変化を蓄積し得、最終的にＣＲＣに進化し得る。しかし、１０年を超える発達の後にＣＲＣに進化するポリープはごく少数である。主要な２種類の潜在的に悪性のポリープは腺腫および無茎性鋸歯状ポリープ（ＳＳＰ）であり、これらはそれぞれ異なるリスクを伴ってＣＲＣに発展する。腺腫がＣＲＣに発展するリスクは、そのサイズに関係する。一般に、腺腫のサイズが大きいほど、ＣＲＣに発展する可能性が高い。進行腺腫（ＡＡ）は、サイズが１ｃｍ以上であるか、または２５％以上の絨毛成分もしくは任意のサイズの高度異形成を有することを指す。ほとんどのＡＡのうち約１０％のみががん化するが、ＣＲＣの６０％〜７０％は腺腫から発症し、残りの２５％〜３５％のＣＲＣはＳＳＰから発症する（Clinical Interventions in Aging 2016; 11:967-976）。したがって、ＣＲＣおよびＡＡの早期発見および病変の除去は、ＣＲＣの進行を効果的に阻止して患者の生命を救い得、患者の５年生存率を著しく改善し得、後期のＣＲＣの高額な処置費用を低減し得、これは家族および社会の経済的負担を大幅に軽減する。
【０００６】
現在、ＣＲＣの検出にはいくつかの検査（主に、大腸内視鏡検査、Ｓ状結腸鏡検査、ＣＴコロノグラフィー、便潜血検査（ＦＯＢＴ）および免疫化学的便潜血検査（ＦＩＴ）を含む）が存在する。
【０００７】
ＣＲＣを検出するための大腸内視鏡検査の感度は＞９５％である。そのスクリーニング間隔は１０年ごとである。大腸内視鏡検査の利点は高い感度であり、結腸全体を検査でき、同時に病変を除去できる。しかし、欠点は侵襲的な検査であり、腸管前処置が不快感をもたらし、患者が落ち着く必要がある。大腸内視鏡検査中において腸穿孔および出血のリスクがある。これらの制限は、大腸内視鏡検査のスクリーニングの低いコンプライアンスに寄与している。
【０００８】
Ｓ状結腸鏡検査が遠位結腸を検出する感度は９５％を超えている。Ｓ状結腸鏡検査によるＣＲＣのスクリーニング間隔はＦＯＢＴと組み合わせて５年ごとである。Ｓ状結腸鏡検査によってＣＲＣをスクリーニングする利点は高い感度であり、全身性の鎮静の必要がなく、検査中に同時に病変を除去できる。欠点は半侵襲的な検査であり、検査中に不快感を与えやすく、検査費用が高いことである。
【０００９】
ＣＴコロノグラフィーは放射線を用いて結腸を可視化し、感度は＞９０％であり、５年ごとに実施される。利点は、結腸全体を観察できる高い感度であり、鎮静の必要がない。欠点は、アッセイが半侵襲的な検査であるため、患者がスクリーニングプロセス中に不快感を生じやすいことである。さらに、病変を同時に除去することはできず、放射線の安全性を考慮する必要がある。
【００１０】
要約すると、イメージングに基づいてＣＲＣを検出する上記検査は高い感度を有するが、高価であり、腸管前処置は不快感および他の副作用を生じやすい。結果として、患者のコンプライアンスは低い。さらに、これらのアッセイは専門的な機器ならびに専門的な技術および豊富な経験を有する医師を必要とし、これらは利用可能でない場合がある。結果として、全体的なスクリーニング率／検出率は低い。さらに、一部の患者はこれらのアッセイに適合しない。例えば、糖尿病患者は腸管前処置の成功率が低く、副作用のリスクがより高い（J Gastrointestin Liver Dis 2010; 19: 369-372, World J Gastrointest Endosc 2013; 5: 39-46）。
【００１１】
ＦＯＢＴおよびＦＩＴはそれぞれ酵素反応および免疫化学的方法によって患者の便中のヘモグロビンを検出し、ＣＲＣの検出感度はそれぞれ３３〜７５％および６０〜８５％であり、検査は１年ごとに行われる。ＦＯＢＴおよびＦＩＴは普及しやすく、非侵襲的で安価であるが、前がん病変の検出率は低い（Clinical Interventions in Aging 2016; 11 967-976）。
【００１２】
ポリープがＣＲＣに発展する間、いくつかの遺伝子（ＡＰＣ、ＫＲＡＳ、ｐ５３、ＢＲＡＦ、ＮＤＲＧ４、ＢＭＰ３など）の変異およびメチル化変化が蓄積する（Clinical Interventions in Aging 2016; 11:967-976）。したがって、これらの変異またはメチル化変化の検出はＣＲＣおよび前がん病変の検出に役立つ。
【００１３】
Zou et al.（Clinical Chemistry 2012; 58: 2375-383）は、メチル化ｑＰＣＲを用いて組織試料中のＢＭＰ３、ＮＤＲＧ４、ＶＩＭおよびＴＦＰＩ２遺伝子のメチル化レベルを検出した。合計３７例のＣＲＣ組織試料において、２５例の腺腫組織試料および２９例の健常なヒト組織試料を検査した。特異度が９５％であった場合、ＣＲＣ検出のＢＭＰ３、ＮＤＲＧ４、ＶＩＭおよびＴＦＰＩ２遺伝子の感度はそれぞれ８４％、９２％、８６％および９２％であり、腺腫検出の感度はそれぞれ６８％、７６％、７６％および８８％であった。結腸がん組織中の遺伝子メチル化の検出は高い感度および特異度を有することが示された。しかし、組織サンプリング法は、サンプリングの過程で患者の身体に一定の損傷を与えるため、広く使用されるのは困難である。したがって、一般の人々のＣＲＣおよび前がん病変のスクリーニングには適していない。
【００１４】
マルチターゲット便ＤＮＡ（ｍｔ−ｓＤＮＡ）検査には、腫瘍剥離細胞(tumor exfoliated cell)のメチル化および変異の検出ならびに便試料中のヘモグロビンの検出が含まれ、これは３年ごとにスクリーニングされ、高感度、非侵襲性および普及しやすいという利点を有する（Clinical Interventions In Aging 2016;11:967-976）。スクリーニング法として、ｍｔ−ｓＤＮＡはＣＲＣおよびＡＡを早期に検出でき、患者の生存率を大幅に向上させる。Imperiale et al.（N Engl J Med 2014; 370:1287-97）は、ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化検出、ＫＲＡＳ遺伝子の点変異検出、ならびに便中ヘモグロビン検出のためのｍｔ−ｓＤＮＡに基づくシステムを確立し、ロジスティック回帰式に従ってＣＲＣおよびＡＡのリスクを評価した。ＣＲＣおよびＡＡの検出感度はそれぞれ９２．３％および４２．４％であり、特異度は８６．６％であった。
【００１５】
Ｍｔ−ｓＤＮＡは散発性ＣＲＣおよびＡＡをスクリーニングするのに適用され、大腸内視鏡検査と比較して非侵襲的であり、ＦＯＢＴおよびＦＩＴと比較して感度が高いという利点があるが、ＡＡの検出感度はＣＲＣよりもはるかに低いままである（Clinical Interventions in Aging 2016; 11:967-976）。
【００１６】
現在、ＣＲＣまたはＡＡを検出するためのｍｔ−ｓＤＮＡに基づく製品（Ｃｏｌｏｇｕａｒｄ（登録商標）など）が、主に欧米人集団のために開発されている。アジア人集団のＣＲＣおよびＡＡの検出のために利用可能な製品は存在しない。特に、米国食品医薬品局が発行したＣｏｌｏｇｕａｒｄ（登録商標）の「Summay of safety and effectiveness data (SSED)」（www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf13/P130017b.pdf）によると、白人集団およびアフリカ系アメリカ人集団におけるＣｏｌｏｇｕａｒｄ（登録商標）を用いたＡＡの検出感度はそれぞれ４２．３％および４２．４％であるが、アジア人集団における同製品を用いたＡＡの検出感度はわずか３０．８％である。したがって、アジア諸国における大腸がんの発症率および死亡率の現在の増加に対処するために、アジア人集団におけるＣＲＣおよび／またはＡＡの検出のための有効なシステムを開発する必要がある。
【００１７】
ＣＲＣおよびＡＡを有する患者由来の便試料中のＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化を検出する方法について多くの研究がなされているが、アジア人集団のＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子中の高メチル化ＣｐＧ部位についての詳細かつ包括的な研究は存在しない（ONCOLOGY LETTERS 2014;8:1751-1756; ONCOLOGY LETTERS 2015;9:1383-1387）。さらに、試料サイズの制限のために、アジア人患者におけるＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化に関する先行研究は、ＣＲＣおよびＡＡに最も関連するメチル化部位を同定するのに有用ではなかった。したがって、アジア人集団におけるＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子の高メチル化ＣｐＧ部位の正確な位置を決定し、これらのメチル化ＣｐＧ部位に基づいてＡＡの検出をより高感度にするキットを設計および最適化する必要がある。
【発明の概要】
【００１８】
本開示は、ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のプロモーター領域における高メチル化ＣｐＧ部位を含むＤＮＡ配列を提供する。
【００１９】
本開示はまた、ＢＭＰ３またはＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化を検出するための好ましいプライマーおよびプローブ、ならびにＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子の両方のメチル化を検出するためのそれらの組合せを提供する。
【００２０】
本開示は、アジア人集団のＣＲＣおよびＡＡを検出するためのキットをさらに提供する。ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のプロモーター領域における高メチル化ＣｐＧ部位を含むＤＮＡ配列は、アジア人集団のＣＲＣおよび／またはＡＡの検出のためのマーカーとして使用され得る。
【００２１】
他のプライマーおよびプローブと比較して、ＢＭＰ３および／またはＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化レベルを検出するための好ましいプライマー対およびプローブは、腫瘍組織（ＣＲＣおよびＡＡなど、特にＡＡ）を検出するための驚くほど高い感度および特異度を有する。さらに、本開示のこれらの好ましいプライマーおよびプローブの組合せはまた、腫瘍組織（ＣＲＣおよびＡＡなど、特にＡＡ）を検出するための驚くほど高い感度および特異度を達成する。
【００２２】
また、上記の好ましいプライマーおよびプローブの組合せに基づくアジア人集団のＣＲＣおよびＡＡを検出するためのキットが提供される。
【００２３】
いくつかの実施態様において、キットは以下を含む：（１）プライマー対およびプローブの好ましい組合せならびに対応するｑＰＣＲ試薬；（２）ＫＲＡＳ遺伝子のコード領域における７つの変異（）を検出するためのプライマーおよびプローブならびに対応するｑＰＣＲ試薬；（３）便中のヘモグロビンを検出するための試薬。
【００２４】
いくつかの実施態様において、キットを用いたアッセイから得られた結果は、ロジスティック回帰式に従って補正および分析される。いくつかの実施態様において、式は、ＣＲＣおよび／またはＡＡの有無を判定するための値を計算するために使用される。いくつかの実施態様において、式は、Ｐ＝ｅＫ／（１＋ｅＫ）であり、ここでＰは総合指数(comprehensive index)であり、Ｋ＝ａ＊ΔＣｔ１＋ｂ＊ΔＣｔ２＋ｃ＊ΔＣｔ３＋ｄ＊ＦＩＴ＋Ｘであり、ｅは自然定数であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、Ｘは臨床定数である。いくつかの実施態様において、Ｐ値が所定の閾値以上である場合、結果は患者におけるＣＲＣおよび／またはＡＡの陽性検出を示す。いくつかの実施態様において、Ｐ値が閾値未満である場合、結果は患者におけるＣＲＣおよび／またはＡＡの陰性検出を示し、患者は健常であると判定される。
【００２５】
本開示は、必要とする患者における大腸がん（ＣＲＣ）または進行腺腫（ＡＡ）の有無を検出するためのキットを提供する。必要とする患者とは、ＣＲＣおよび／またはＡＡを有することが疑われる患者（ＣＲＣおよび／またはＡＡを発症する少なくとも１つの徴候を有する患者、またはＣＲＣおよび／またはＡＡを発症するリスクを有する患者、または定期的な健康診断を受けているが、そうでなければ徴候またはリスクを有さない対象など）である。
【００２６】
いくつかの実施態様において、キットは、ａ）患者から得られた生体試料中のＢＭＰ３遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための第１のプライマー対および第１のプローブを含む。いくつかの実施態様において、第１のプライマー対および第１のプローブはそれぞれ配列番号１と同一であるか、相補的であるか、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする少なくとも１６ヌクレオチドの連続した配列を含む。
【００２７】
いくつかの実施態様において、キットは、ｂ）患者から得られた生体試料中のＮＤＲＧ４遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための第２のプライマー対および第２のプローブを含む。いくつかの実施態様において、第２のプライマー対および第２のプローブはそれぞれ配列番号２と同一であるか、相補的であるか、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする少なくとも１６ヌクレオチドの連続した配列を含む。
【００２８】
いくつかの実施態様において、第１のプライマー対および第１のプローブは、以下からなる群から選択される：
【００２９】
ｉ）配列番号３を含む順方向プライマー、配列番号４を含む逆方向プライマー、および配列番号５を含むプローブ；
【００３０】
ｉｉ）配列番号９を含む順方向プライマー、配列番号１０を含む逆方向プライマー、および配列番号１１を含むプローブ；ならびに
【００３１】
ｉｉｉ）配列番号１５を含む順方向プライマー、配列番号１６を含む逆方向プライマー、および配列番号１７を含むプローブ；
【００３２】
ここで、いくつかの実施態様において、第２のプライマー対および第２のプローブは、以下からなる群から選択される：
【００３３】
ｉｖ）配列番号６を含む順方向プライマー、配列番号７を含む逆方向プライマー、および配列番号８を含むプローブ；
【００３４】
ｖ）配列番号１２を含む順方向プライマー、配列番号１３を含む逆方向プライマー、および配列番号１４を含むプローブ；ならびに
【００３５】
ｖｉ）配列番号１８を含む順方向プライマー、配列番号１９を含む逆方向プライマー、および配列番号２０を含むプローブ；
【００３６】
いくつかの実施態様において、キットは以下を含む：
ｉ）患者から得られた生体試料中のＢＭＰ３遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号３を含む順方向プライマー、配列番号４を含む逆方向プライマー、および配列番号５を含むプローブ、ならびに
ｉｉ）患者から得られた生体試料中のＮＤＲＧ４遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号６を含む順方向プライマー、配列番号７を含む逆方向プライマー、および配列番号８を含むプローブ。
【００３７】
いくつかの実施態様において、キットは以下を含む：
ｉ）患者から得られた生体試料中のＢＭＰ３遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号９を含む順方向プライマー、配列番号１０を含む逆方向プライマー、および配列番号１１を含むプローブ、ならびに
ｉｉ）患者から得られた生体試料中のＮＤＲＧ４遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号１２を含む順方向プライマー、配列番号１３を含む逆方向プライマー、および配列番号１４を含むプローブ。
【００３８】
いくつかの実施態様において、キットは以下を含む：
ｉ）患者から得られた生体試料中のＢＭＰ３遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号１５を含む順方向プライマー、配列番号１６を含む逆方向プライマー、および配列番号１７を含むプローブ、ならびに
ｉｉ）患者から得られた生体試料中のＮＤＲＧ４遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号１８を含む順方向プライマー、配列番号１９を含む逆方向プライマー、および配列番号２０を含むプローブ。
【００３９】
いくつかの実施態様において、第１のプローブおよび第２のプローブはともに蛍光ドナーおよびアクセプターフルオロフォアを含む。
【００４０】
いくつかの実施態様において、第１のプローブおよび第２のプローブは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブである。
【００４１】
いくつかの実施態様において、キットは以下をさらに含む：
（１）患者におけるＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの変異の有無を検出するための手段；および
（２）患者から得られた生体試料中のヘモグロビンの有無を検出するための手段。
【００４２】
いくつかの実施態様において、患者におけるＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの変異の有無を検出するための手段は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてＫＲＡＳ遺伝子のエクソン１２および／またはエクソン１３領域を増幅できる少なくとも１つのプライマー対を含む。
【００４３】
いくつかの実施態様において、生体試料中のヘモグロビンの有無を検出するための手段は、抗ヘモグロビン抗体を含む。
【００４４】
いくつかの実施態様において、プライマーは、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２ＳおよびＧ１３Ｃからなる群から選択される少なくとも１つのＫＲＡＳ変異を含むＫＲＡＳ遺伝子領域を増幅できる。
【００４５】
いくつかの実施態様において、抗体は金コロイド標識抗体である。
いくつかの実施態様において、キットは、内部品質管理遺伝子を増幅する手段をさらに含む。内部標準は、（１）試料または抽出方法からの阻害汚染、（２）装置の異常、（３）化学的な失敗（例えば、キットもしくは成分の期限切れもしくは劣化、または試薬の誤った組合せ）、および（４）ヒューマンエラーを検出し得る。いくつかの実施態様において、内部標準遺伝子は陽性対照（メチル化を有すると判定されている陽性対照試料中の遺伝子など）である。いくつかの実施態様において、内部標準遺伝子は陰性対照（メチル化を有しないと判定されている陰性対照試料中の遺伝子など）である。
【００４６】
いくつかの実施態様において、キットは、キットを用いて得られた検査結果の使用および／または解釈のための説明書をさらに含む。
【００４７】
いくつかの実施態様において、キットは、生体試料中の抗体およびヘモグロビンによって形成された複合体を検出する手段をさらに含む。
【００４８】
いくつかの実施態様において、患者から得られた生体試料は、便試料である。
【００４９】
いくつかの実施態様において、キットは、重亜硫酸試薬、ならびに重亜硫酸試薬および患者の生体試料または生体試料から得られたポリヌクレオチドを混合するのに適した容器をさらに含む。
【００５０】
いくつかの実施態様において、重亜硫酸塩を使用する代わりに、キットはメチル化感受性制限酵素試薬をさらに含む。 
【００５１】
いくつかの実施態様において、キットは以下をさらに含む：（１）生体試料中のＢＭＰ３メチル化を検出するための陽性標準および陰性標準、ならびに（２）生体試料中のＮＤＲＧ４メチル化を検出するための陽性標準および陰性標準。
【００５２】
いくつかの実施態様において、ＢＭＰ３メチル化を検出するための陽性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＧＴＴＡＧＴＴＴＧＧＴＣＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧＣＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＧＴＡＴＡＧＡＴＡＧＡＴＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＴＣＧＧＧＴＴＡＴＡＴＡＣＧＴＣＧＣＧＡＴＴＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＣＧＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＣＧＧＣＧＴＴＣＧＴＡＧＣＧＴＴＴＴＧＣＧＣＧＧＧＴＧＡＧＧＴＴＣＧＣＧＴＡＧＴＴＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＧＴＴＧＣＧＴＴＧＧＧＴＴＡＧＣＧＴＡＧＴＡＡＧＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＣＧＴＴＡＴＴＴＣＧＴＴＧＴＡＴＴＣＧＧＴＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧＧＴＴＴＣＧＴＧＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＡＧ（配列番号６７）；
【００５３】
いくつかの実施態様において、ＢＭＰ３メチル化を検出するための陰性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＧＴＴＡＧＴＴＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧＴＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＧＴＡＴＡＧＡＴＡＧＡＴＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＴＴＧＧＧＴＴＡＴＡＴＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＴＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＧＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＴＧＧＴＧＴＴＴＧＴＡＧＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＧＴＧＴＡＧＴＴＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＧＴＴＧＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＧＴＧＴＡＧＴＡＡＧＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＴＧＴＴＡＴＴＴＴＧＴＴＧＴＡＴＴＴＧＧＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＧＧＴＴＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＡＧ（配列番号６８）；
【００５４】
いくつかの実施態様において、ＮＤＲＧ４メチル化を検出するための陽性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＴＧＡＧＡＡＧＴＣＧＧＣＧＧＧＧＧＣＧＣＧＧＡＴＣＧＡＴＣＧＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＣＧＣＧＴＣＧＣＧＧＴＴＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＴＴＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＴＡＴＣＧＧＧＴＡＴＴＴＴＡＧＴＣＧＣＧＴＡＧＡＡＧＧＣＧＧＡＡＧＴＴＡＣＧＣＧＣＧＡＧＧＧＡＴＣＧＣＧＧＴＴＣＧＴＴＣＧＧＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＧＧＴＴＣＧＧＴＡＴＣＧＴＴＴＣＧＣＧＧＧＴＣＧＡＧＣＧＴＴＴＡＴＡＴＴＣＧＴＴＡＡＡＴＴＴＡＣＧＣＧＧＧＴＡＣＧＴＴＴＴＣＧＣＧＧＣＧＴＡＴＣＧＴＴＴＴＴＡＧＴＴ（配列番号６９）。
【００５５】
いくつかの実施態様において、ＮＤＲＧ４メチル化を検出するための陰性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＴＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＴＴＧＡＴＴＧＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＴＧＴＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＧＧＴＡＴＴＴＴＡＧＴＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＧＴＧＡＧＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＧＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＧＧＴＡＴＴＧＴＴＴＴＧＴＧＧＧＴＴＧＡＧＴＧＴＴＴＡＴＡＴＴＴＧＴＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＴＧＧＧＴＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴＧＧＴＧＴＡＴＴＧＴＴＴＴＴＡＧＴＴ（配列番号７０）。
【００５６】
また、必要とする患者における大腸がん（ＣＲＣ）または進行腺腫（ＡＡ）の有無を検出する方法が提供される。
【００５７】
いくつかの実施態様において、本方法は、ａ）患者の生体試料からゲノムＤＮＡを取得することを含む。
【００５８】
いくつかの実施態様において、本方法はさらに、ｂ）ａ）のゲノムＤＮＡまたはその断片を１以上の試薬で処理し、メチル化されていないシトシン塩基をウラシルまたはハイブリダイゼーションの特性に関してシトシンとは検出可能に異なる別の塩基に変換することを含む。
【００５９】
いくつかの実施態様において、本方法はさらに、ｃ）処理されたゲノムＤＮＡまたは処理されたその断片を、患者における骨形成タンパク質３（ＢＭＰ３）をコードする遺伝子のメチル化部位の有無を検出するための第１のプライマー対と接触させることを含む。いくつかの実施態様において、本方法はさらに、処理されたゲノムＤＮＡまたはその断片を、患者におけるＮＤＲＧファミリーメンバー４タンパク質（ＮＤＲＧ４）をコードする遺伝子のメチル化部位の有無を検出するための第２のプライマー対と接触させることを含む。
【００６０】
いくつかの実施態様において、第１のプライマー対は、配列番号１と同一であるか、相補的であるか、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチドの連続した配列を含む。いくつかの実施態様において、第２のプライマー対は、配列番号２と相補的であるか、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチドの連続した配列を含む。
【００６１】
いくつかの実施態様において、処理されたゲノムＤＮＡまたはその断片は、第１のプライマー対または第２のプライマー対によって少なくとも１つの増幅物を生成するように増幅されるか、または増幅されない。
【００６２】
いくつかの実施態様において、本方法はさらに、ｄ）前記増幅物の有無、患者におけるＢＭＰ３遺伝子およびＮＤＲＧ４遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルに基づいて、患者におけるＣＲＣまたはＡＡの有無を判定することを含む。
【００６３】
いくつかの実施態様において、定量ＰＣＲを用いて試料中のメチル化されたＢＭＰ３遺伝子を増幅する。いくつかの実施態様において、定量ＰＣＲを用いて試料中のメチル化されたＮＤＲＧ４遺伝子を増幅する。
【００６４】
いくつかの実施態様において、本方法はまた、参照遺伝子（ノーマライザー、ハウスキーピング遺伝子または内因性対照としても知られる）を増幅するためのプライマーを用いることを含む。いくつかの実施態様において、定量ＰＣＲを用いて試料中の参照遺伝子を増幅する。
【００６５】
いくつかの実施態様において、第１のプライマー対および第１のプローブは、以下からなる群から選択される：
ｉ）配列番号３を含む順方向プライマー、配列番号４を含む逆方向プライマー、および配列番号５を含むプローブ；
ｉｉ）配列番号９を含む順方向プライマー、配列番号１０を含む逆方向プライマー、および配列番号１１を含むプローブ；ならびに
ｉｉｉ）配列番号１５を含む順方向プライマー、配列番号１６を含む逆方向プライマー、および配列番号１７を含むプローブ。
【００６６】
いくつかの実施態様において、第２のプライマー対および第２のプローブは、以下からなる群から選択される：
ｉｖ）配列番号６を含む順方向プライマー、配列番号７を含む逆方向プライマー、および配列番号８を含むプローブ；
ｖ）配列番号１２を含む順方向プライマー、配列番号１３を含む逆方向プライマー、および配列番号１４を含むプローブ；ならびに
ｖｉ）配列番号１８を含む順方向プライマー、配列番号１９を含む逆方向プライマー、および配列番号２０を含むプローブ。
【００６７】
いくつかの実施態様において、本方法は、以下を用いることを含む：
ｉ）患者から得られた生体試料中のＢＭＰ３遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号３を含む順方向プライマー、配列番号４を含む逆方向プライマー、および配列番号５を含むプローブ、ならびに
ｉｉ）患者から得られた生体試料中のＮＤＲＧ４遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号６を含む順方向プライマー、配列番号７を含む逆方向プライマー、および配列番号８を含むプローブ。
【００６８】
いくつかの実施態様において、本方法は、以下を用いることを含む：
ｉ）患者から得られた生体試料中のＢＭＰ３遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号９を含む順方向プライマー、配列番号１０を含む逆方向プライマー、および配列番号１１を含むプローブ、ならびに
ｉｉ）患者から得られた生体試料中のＮＤＲＧ４遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号１２を含む順方向プライマー、配列番号１３を含む逆方向プライマー、および配列番号１４を含むプローブ。
【００６９】
いくつかの実施態様において、本方法は、以下を用いることを含む：
ｉ）患者から得られた生体試料中のＢＭＰ３遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号１５を含む順方向プライマー、配列番号１６を含む逆方向プライマー、および配列番号１７を含むプローブ、ならびに
ｉｉ）患者から得られた生体試料中のＮＤＲＧ４遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号１８を含む順方向プライマー、配列番号１９を含む逆方向プライマー、および配列番号２０を含むプローブ。
【００７０】
いくつかの実施態様において、第１のプローブおよび第２のプローブはともに蛍光ドナーおよびアクセプターフルオロフォアを含む。いくつかの実施態様において、第１のプローブおよび第２のプローブは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブである。
【００７１】
いくつかの実施態様において、本方法は、患者から得られた生体試料中のＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの変異の有無を検出する工程をさらに含む。
【００７２】
いくつかの実施態様において、本方法は、患者から得られた生体試料中のヘモグロビンの有無を検出する工程をさらに含む。いくつかの実施態様において、生体試料中のヘモグロビンの有無を検出する工程は、抗ヘモグロビン抗体を用いることを含む。いくつかの実施態様において、抗体は金コロイド標識抗体である。
【００７３】
いくつかの実施態様において、患者におけるＫＲＡＳ遺伝子の少なくとも１つの変異の有無を検出する工程は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてＫＲＡＳ遺伝子のエクソン１２および／またはエクソン１３領域を増幅できる少なくとも１つのプライマー対を用いることを含む。いくつかの実施態様において、プライマーは、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２ＳおよびＧ１３Ｃからなる群から選択される少なくとも１つのＫＲＡＳ変異を含むＫＲＡＳ遺伝子領域を増幅できる。
【００７４】
いくつかの実施態様において、変異ＫＲＡＳ遺伝子は、以下からなる群から選択される１以上のプライマー対によって増幅される：
（１）配列番号３５を含む順方向プライマーＧ１２Ｄ−Ｆ、および配列番号４２を含む逆方向プライマーＫｒａｓ−Ｒ；
（２）配列番号３６を含む順方向プライマーＧ１３Ｄ−Ｆ、および配列番号４２を含む逆方向プライマーＫｒａｓ−Ｒ；
（３）配列番号３７を含む順方向プライマーＧ１２Ｖ−Ｆ、および配列番号４２を含む逆方向プライマーＫｒａｓ−Ｒ；
（４）配列番号３８を含む順方向プライマーＧ１２Ｃ−Ｆ、および配列番号４２を含む逆方向プライマーＫｒａｓ−Ｒ；
（５）配列番号３９を含む順方向プライマーＧ１２Ｓ−Ｆ、および配列番号４２を含む逆方向プライマーＫｒａｓ−Ｒ；
（６）配列番号４０を含む順方向プライマーＧ１２Ａ−Ｆ、および配列番号４２を含む逆方向プライマーＫｒａｓ−Ｒ；ならびに
（７）配列番号４１を含む順方向プライマーＧ１２Ｒ−Ｆ、および配列番号４２を含む逆方向プライマーＫｒａｓ−Ｒ。
【００７５】
いくつかの実施態様において、ｑＰＣＲのためのＫＲＡＳプローブは、配列番号４６を含む。
【００７６】
いくつかの実施態様において、ＢＭＰ３遺伝子の増幅は定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で行われ、本方法は第１の参照遺伝子（すなわち、第１の参照遺伝子）を増幅し、ＢＭＰ３増幅のＣｔ値をΔＣｔ１として決定することをさらに含む。
【００７７】
いくつかの実施態様において、ＮＤＲＧ４遺伝子の増幅は定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で行われ、本方法は第２の参照遺伝子（すなわち、第２の参照遺伝子）を増幅し、ＮＤＲＧ４増幅のＣｔ値をΔＣｔ２として決定することをさらに含む。
【００７８】
いくつかの実施態様において、変異ＫＲＡＳ遺伝子の増幅は定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で行われ、本方法は第３の参照遺伝子（すなわち、第３の参照遺伝子）を増幅し、変異ＫＲＡＳ増幅のＣｔ値をΔＣｔ３として決定することをさらに含む。
【００７９】
いくつかの実施態様において、第１の参照遺伝子と第２の参照遺伝子は同一である。いくつかの実施態様において、同一の参照遺伝子はＢ２Ｍ遺伝子である。
【００８０】
いくつかの実施態様において、第３の参照遺伝子はＡＣＴＢ遺伝子である。いくつかの実施態様において、ＡＣＴＢ遺伝子を増幅するためのｑＰＣＲプライマーは配列番号４３および４４を含み、プローブは配列番号４６を含む。
【００８１】
いくつかの実施態様において、本方法は、（１）試料中のＢＭＰ３メチル化を検出するための陽性標準および陰性標準、ならびに（２）試料中のＮＤＲＧ４メチル化を検出するための陽性標準および陰性標準を用いることを含む。
【００８２】
いくつかの実施態様において、ＢＭＰ３メチル化を検出するための陽性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＧＴＴＡＧＴＴＴＧＧＴＣＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧＣＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＧＴＡＴＡＧＡＴＡＧＡＴＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＴＣＧＧＧＴＴＡＴＡＴＡＣＧＴＣＧＣＧＡＴＴＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＣＧＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＣＧＧＣＧＴＴＣＧＴＡＧＣＧＴＴＴＴＧＣＧＣＧＧＧＴＧＡＧＧＴＴＣＧＣＧＴＡＧＴＴＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＧＴＴＧＣＧＴＴＧＧＧＴＴＡＧＣＧＴＡＧＴＡＡＧＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＣＧＴＴＡＴＴＴＣＧＴＴＧＴＡＴＴＣＧＧＴＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧＧＴＴＴＣＧＴＧＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＡＧ（配列番号６７）；
【００８３】
いくつかの実施態様において、ＢＭＰ３メチル化を検出するための陰性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＧＴＴＡＧＴＴＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧＴＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＧＴＡＴＡＧＡＴＡＧＡＴＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＴＴＧＧＧＴＴＡＴＡＴＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＴＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＧＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＴＧＧＴＧＴＴＴＧＴＡＧＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＧＴＧＴＡＧＴＴＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＧＴＴＧＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＧＴＧＴＡＧＴＡＡＧＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＴＧＴＴＡＴＴＴＴＧＴＴＧＴＡＴＴＴＧＧＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＧＧＴＴＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＡＧ（配列番号６８）；
【００８４】
いくつかの実施態様において、ＮＤＲＧ４メチル化を検出するための陽性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＴＧＡＧＡＡＧＴＣＧＧＣＧＧＧＧＧＣＧＣＧＧＡＴＣＧＡＴＣＧＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＣＧＣＧＴＣＧＣＧＧＴＴＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＴＴＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＴＡＴＣＧＧＧＴＡＴＴＴＴＡＧＴＣＧＣＧＴＡＧＡＡＧＧＣＧＧＡＡＧＴＴＡＣＧＣＧＣＧＡＧＧＧＡＴＣＧＣＧＧＴＴＣＧＴＴＣＧＧＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＧＧＴＴＣＧＧＴＡＴＣＧＴＴＴＣＧＣＧＧＧＴＣＧＡＧＣＧＴＴＴＡＴＡＴＴＣＧＴＴＡＡＡＴＴＴＡＣＧＣＧＧＧＴＡＣＧＴＴＴＴＣＧＣＧＧＣＧＴＡＴＣＧＴＴＴＴＴＡＧＴＴ（配列番号６９）。
【００８５】
いくつかの実施態様において、ＮＤＲＧ４メチル化を検出するための陰性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＴＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＴＴＧＡＴＴＧＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＴＧＴＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＧＧＴＡＴＴＴＴＡＧＴＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＧＴＧＡＧＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＧＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＧＧＴＡＴＴＧＴＴＴＴＧＴＧＧＧＴＴＧＡＧＴＧＴＴＴＡＴＡＴＴＴＧＴＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＴＧＧＧＴＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴＧＧＴＧＴＡＴＴＧＴＴＴＴＴＡＧＴＴ（配列番号７０）。
【００８６】
いくつかの実施態様において、本方法は、品質管理標準を増幅することを含む。
【００８７】
いくつかの実施態様において、必要とする患者における大腸がん（ＣＲＣ）または進行腺腫（ＡＡ）の有無を検出する方法は、本開示のキットを用いることを含む。
【００８８】
本開示はさらに、以下を含む必要とする患者における大腸がん（ＣＲＣ）または進行腺腫（ＡＡ）の有無を検出する方法を提供する：
ａ）患者の便試料から処理されていないゲノムＤＮＡを取得する：
ｂ）ａ）のゲノムＤＮＡまたはその断片を１以上の試薬で処理し、メチル化されていないシトシン塩基をウラシルまたはハイブリダイゼーションの特性に関してシトシンとは検出可能に異なる別の塩基に変換する；
ｃ）ｂ）の処理されたゲノムＤＮＡを鋳型として用いて定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行い、患者におけるＢＭＰ３遺伝子のＣｔ値をΔＣｔ１として決定する；
ｄ）ｂ）の処理されたゲノムＤＮＡを鋳型として用いてｑＰＣＲを行い、患者におけるＮＤＲＧ４遺伝子のＣｔ値をΔＣｔ２として決定する；
ｅ）処理されていないゲノムＤＮＡを鋳型として用いてｑＰＣＲを行い、患者における変異ＫＲＡＳ遺伝子のＣｔ値をΔＣｔ３として決定する；
ｆ）便試料中のヘモグロビンタンパク質の免疫化学的便潜血検査を行い、スコアをＦＩＴとして決定する；
ｇ）Ｋの値を決定する、ここでＫ＝ａ＊ΔＣｔ１＋ｂ＊ΔＣｔ２＋ｃ＊ΔＣｔ３＋ｄ＊ＦＩＴ＋Ｘであり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、Ｘは臨床定数である；および
ｈ）総合指数Ｐの値を決定する、ここでＰ＝ｅＫ／（１＋ｅＫ）であり、ｅは自然定数である。
【００８９】
臨床定数ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびＸは、患者集団間の臨床データの分布を分析することによって決定され得る。
【００９０】
いくつかの実施態様において、Ｐが所定の閾値以上である場合、患者はＣＲＣおよび／またはＡＡを有すると判定され、Ｐが所定の閾値未満である場合、患者は健常であると判定される。
【００９１】
いくつかの実施態様において、所定の閾値は、臨床データの分布（ＣＲＣおよび／またはＡＡを有すると判定されている患者およびＣＲＣおよび／またはＡＡを有しないと判定されている患者から得られた臨床データなど）から計算される。
【００９２】
いくつかの実施態様において、ＢＭＰ３遺伝子を増幅するためのｑＰＣＲは、第１のプライマー対および第１のプローブを含み、ここで第１のプライマー対および第１のプローブは以下からなる群から選択される：
ｉ）配列番号３を含む順方向プライマー、配列番号４を含む逆方向プライマー、および配列番号５を含むプローブ；
ｉｉ）配列番号９を含む順方向プライマー、配列番号１０を含む逆方向プライマー、および配列番号１１を含むプローブ；ならびに
ｉｉｉ）配列番号１５を含む順方向プライマー、配列番号１６を含む逆方向プライマー、および配列番号１７を含むプローブ。
【００９３】
いくつかの実施態様において、ＮＤＲＧ４遺伝子を増幅するためのｑＰＣＲは、第２のプライマー対および第２のプローブを含み、ここで第２のプライマー対および第２のプローブは以下からなる群から選択される：
ｉｖ）配列番号６を含む順方向プライマー、配列番号７を含む逆方向プライマー、および配列番号８を含むプローブ；
ｖ）配列番号１２を含む順方向プライマー、配列番号１３を含む逆方向プライマー、および配列番号１４を含むプローブ；ならびに
ｖｉ）配列番号１８を含む順方向プライマー、配列番号１９を含む逆方向プライマー、および配列番号２０を含むプローブ。
【００９４】
いくつかの実施態様において、本方法は、以下を用いることを含む：
ｉ）試料中のＢＭＰ３遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号３を含む順方向プライマー、配列番号４を含む逆方向プライマー、および配列番号５を含むプローブ、ならびに
ｉｉ）試料中のＮＤＲＧ４遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号６を含む順方向プライマー、配列番号７を含む逆方向プライマー、および配列番号８を含むプローブ。
【００９５】
いくつかの実施態様において、本方法は、以下を用いることを含む：
ｉ）試料中のＢＭＰ３遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号９を含む順方向プライマー、配列番号１０を含む逆方向プライマー、および配列番号１１を含むプローブ、ならびに
ｉｉ）試料中のＮＤＲＧ４遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号１２を含む順方向プライマー、配列番号１３を含む逆方向プライマー、および配列番号１４を含むプローブ。
【００９６】
いくつかの実施態様において、本方法は、以下を用いることを含む：
ｉ）試料中のＢＭＰ３遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号１５を含む順方向プライマー、配列番号１６を含む逆方向プライマー、および配列番号１７を含むプローブ、ならびに
ｉｉ）試料中のＮＤＲＧ４遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを検出するための、配列番号１８を含む順方向プライマー、配列番号１９を含む逆方向プライマー、および配列番号２０を含むプローブ。
【００９７】
いくつかの実施態様において、第１のプローブおよび第２のプローブはともに蛍光ドナーおよびアクセプターフルオロフォアを含む。いくつかの実施態様において、第１のプローブおよび第２のプローブは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブである。
【００９８】
いくつかの実施態様において、変異ＫＲＡＳ遺伝子は、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２ＳおよびＧ１３Ｃからなる群から選択される少なくとも１つのＫＲＡＳ変異を含む。
【００９９】
いくつかの実施態様において、免疫化学的便潜血検査は、金コロイド標識抗体を含む。
【０１００】
いくつかの実施態様において、本方法の工程ｃ）および工程ｄ）は、Ｂ２Ｍ遺伝子を参照遺伝子として用いることを含む。
【０１０１】
いくつかの実施態様において、本方法は、以下を用いることを含む：
（１）試料中のＢＭＰ３メチル化を検出するための陽性標準および陰性標準、ならびに
（２）試料中のＮＤＲＧ４メチル化を検出するための陽性標準および陰性標準。
【０１０２】
いくつかの実施態様において、ＢＭＰ３メチル化を検出するための陽性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＧＴＴＡＧＴＴＴＧＧＴＣＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧＣＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＧＴＡＴＡＧＡＴＡＧＡＴＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＴＣＧＧＧＴＴＡＴＡＴＡＣＧＴＣＧＣＧＡＴＴＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＣＧＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＣＧＧＣＧＴＴＣＧＴＡＧＣＧＴＴＴＴＧＣＧＣＧＧＧＴＧＡＧＧＴＴＣＧＣＧＴＡＧＴＴＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＧＴＴＧＣＧＴＴＧＧＧＴＴＡＧＣＧＴＡＧＴＡＡＧＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＣＧＴＴＡＴＴＴＣＧＴＴＧＴＡＴＴＣＧＧＴＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧＧＴＴＴＣＧＴＧＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＡＧ（配列番号６７）。
【０１０３】
いくつかの実施態様において、ＢＭＰ３メチル化を検出するための陰性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＧＴＴＡＧＴＴＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧＴＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＧＴＡＴＡＧＡＴＡＧＡＴＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＴＴＧＧＧＴＴＡＴＡＴＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＴＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＧＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＴＧＧＴＧＴＴＴＧＴＡＧＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＧＴＧＴＡＧＴＴＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＧＴＴＧＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＧＴＧＴＡＧＴＡＡＧＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＴＧＴＴＡＴＴＴＴＧＴＴＧＴＡＴＴＴＧＧＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＧＧＴＴＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＡＧ（配列番号６８）。
【０１０４】
いくつかの実施態様において、ＮＤＲＧ４メチル化を検出するための陽性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＴＧＡＧＡＡＧＴＣＧＧＣＧＧＧＧＧＣＧＣＧＧＡＴＣＧＡＴＣＧＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＣＧＣＧＴＣＧＣＧＧＴＴＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＴＴＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＴＡＴＣＧＧＧＴＡＴＴＴＴＡＧＴＣＧＣＧＴＡＧＡＡＧＧＣＧＧＡＡＧＴＴＡＣＧＣＧＣＧＡＧＧＧＡＴＣＧＣＧＧＴＴＣＧＴＴＣＧＧＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＧＧＴＴＣＧＧＴＡＴＣＧＴＴＴＣＧＣＧＧＧＴＣＧＡＧＣＧＴＴＴＡＴＡＴＴＣＧＴＴＡＡＡＴＴＴＡＣＧＣＧＧＧＴＡＣＧＴＴＴＴＣＧＣＧＧＣＧＴＡＴＣＧＴＴＴＴＴＡＧＴＴ（配列番号６９）。
【０１０５】
いくつかの実施態様において、ＮＤＲＧ４メチル化を検出するための陰性標準は、以下のポリヌクレオチド配列を含む：
ＴＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＡＴＴＧＡＴＴＧＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＴＧＴＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＧＧＴＡＴＴＴＴＡＧＴＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＧＴＧＡＧＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＧＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＧＧＴＡＴＴＧＴＴＴＴＧＴＧＧＧＴＴＧＡＧＴＧＴＴＴＡＴＡＴＴＴＧＴＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＴＧＧＧＴＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴＧＧＴＧＴＡＴＴＧＴＴＴＴＴＡＧＴＴ（配列番号７０）。
いくつかの実施態様において、本方法は、工程ｃ）および工程ｄ）において品質管理標準を増幅することを含む。
【０１０６】
また、以下を含む必要とする患者における大腸がん（ＣＲＣ）および／または進行腺腫（ＡＡ）を診断および処置する方法が提供される：本開示のキットを用いて患者におけるＣＲＣおよび／またはＡＡの有無を決定する、および患者におけるＣＲＣおよび／またはＡＡの有無に応じて患者を処置する。
【０１０７】
また、以下を含む必要とする患者における大腸がん（ＣＲＣ）および／または進行腺腫（ＡＡ）を診断および処置する方法が提供される：本明細書に記載の方法を用いて患者におけるＣＲＣおよび／またはＡＡの有無を決定する、および患者におけるＣＲＣおよび／またはＡＡの有無に応じて患者を処置する。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｄは、２つのＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のＣｐＧアイランド予測の結果および増幅産物の相対的な位置を示す。「Ｙ」、「Ｒ」は縮重塩基である。ＢＭＰ３遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランド予測の結果。
【図１Ｂ】図１Ａ〜図１Ｄは、２つのＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のＣｐＧアイランド予測の結果および増幅産物の相対的な位置を示す。「Ｙ」、「Ｒ」は縮重塩基である。ＢＭＰ３遺伝子の増幅産物の相対的な位置。
【図１Ｃ】図１Ａ〜図１Ｄは、２つのＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のＣｐＧアイランド予測の結果および増幅産物の相対的な位置を示す。「Ｙ」、「Ｒ」は縮重塩基である。ＮＤＲＧ４遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランド予測の結果。
【図１Ｄ】図１Ａ〜図１Ｄは、２つのＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のＣｐＧアイランド予測の結果および増幅産物の相対的な位置を示す。「Ｙ」、「Ｒ」は縮重塩基である。ＮＤＲＧ４遺伝子の増幅産物の相対的な位置。
【０１０９】
【図２Ａ】図２Ａは、白人集団およびアジア人集団におけるＢＭＰのメチル化ＣｐＧ部位の差異を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、白人集団およびアジア人集団におけるＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化ＣｐＧ部位の差異を示す。
【０１１０】
【図３Ａ】図３Ａは、好ましい群１におけるプライマーおよびプローブを用いたＢＭＰ３の分析的感度増幅曲線を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、好ましい群１におけるプライマーおよびプローブを用いたＮＤＲＧ４の分析的感度増幅曲線を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、好ましい群２におけるプライマーおよびプローブを用いたＢＭＰ３の分析的感度増幅曲線を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、好ましい群２におけるプライマーおよびプローブを用いたＮＤＲＧ４の分析的感度増幅曲線を示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、好ましい群３におけるプライマーおよびプローブを用いたＢＭＰ３の分析的感度増幅曲線を示す。
【図３Ｆ】図３Ｆは、好ましい群３におけるプライマーおよびプローブを用いたＮＤＲＧ４の分析的感度増幅曲線を示す。
【図３Ｇ】図３Ｇは、比較群１におけるプライマーおよびプローブを用いたＢＭＰ３の分析的感度増幅曲線を示す。
【図３Ｈ】図３Ｈは、比較群１におけるプライマーおよびプローブを用いたＮＤＲＧ４の分析的感度増幅曲線を示す。
【図３Ｉ】図３Ｉは、比較群２におけるプライマーおよびプローブを用いたＢＭＰ３の分析的感度増幅曲線を示す。
【図３Ｊ】図３Ｊは、比較群２におけるプライマーおよびプローブを用いたＮＤＲＧ４の分析的感度増幅曲線を示す。
【図３Ｋ】図３Ｋは、比較群３におけるプライマーおよびプローブを用いたＢＭＰ３の分析的感度増幅曲線を示す。
【図３Ｌ】図３Ｌは、比較群３におけるプライマーおよびプローブを用いたＮＤＲＧ４の分析的感度増幅曲線を示す。
【０１１１】
【図４Ａ】図４Ａは、好ましい群１におけるプライマーおよびプローブを用いたＢＭＰ３の分析的特異度増幅曲線を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、好ましい群１におけるプライマーおよびプローブを用いたＮＤＲＧ４の分析的特異度増幅曲線を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、好ましい群２におけるプライマーおよびプローブを用いたＢＭＰ３の分析的特異度増幅曲線を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、好ましい群２におけるプライマーおよびプローブを用いたＮＤＲＧ４の分析的特異度増幅曲線を示す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、好ましい群３におけるプライマーおよびプローブを用いたＢＭＰ３の分析的特異度増幅曲線を示す。
【図４Ｆ】図４Ｆは、好ましい群３におけるプライマーおよびプローブを用いたＮＤＲＧ４の分析的特異度増幅曲線を示す。
【図４Ｇ】図４Ｇは、比較群１におけるプライマーおよびプローブを用いたＢＭＰ３の分析的特異度増幅曲線を示す。
【図４Ｈ】図４Ｈは、比較群１におけるプライマーおよびプローブを用いたＮＤＲＧ４の分析的特異度増幅曲線を示す。
【図４Ｉ】図４Ｉは、比較群２におけるプライマーおよびプローブを用いたＢＭＰ３の分析的特異度増幅曲線を示す。
【図４Ｊ】図４Ｊは、比較群２におけるプライマーおよびプローブを用いたＮＤＲＧ４の分析的特異度増幅曲線を示す。
【図４Ｋ】図４Ｋは、比較群３におけるプライマーおよびプローブを用いたＢＭＰ３の分析的特異度増幅曲線を示す。
【図４Ｌ】図４Ｌは、比較群３におけるプライマーおよびプローブを用いたＮＤＲＧ４の分析的特異度増幅曲線を示す。
【０１１２】
【図５Ａ】図５Ａは、臨床試料中のＢＭＰ３メチル化を検出するための好ましい群１におけるプライマーおよびプローブを用いた増幅曲線を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、臨床試料中のＢＭＰ３メチル化を検出するための好ましい群２におけるプライマーおよびプローブを用いた増幅曲線を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、臨床試料中のＢＭＰ３メチル化を検出するための好ましい群３におけるプライマーおよびプローブを用いた増幅曲線を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、同じアッセイにおけるＢＭＰ３メチル化を検出するための比較群１におけるプライマーおよびプローブを用いた増幅曲線を示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、同じアッセイにおけるＢＭＰ３メチル化を検出するための比較群２におけるプライマーおよびプローブを用いた増幅曲線を示す。
【図５Ｆ】図５Ｆは、同じアッセイにおけるＢＭＰ３メチル化を検出するための比較群３におけるプライマーおよびプローブを用いた増幅曲線を示す。
【０１１３】
【図６Ａ】図６Ａは、臨床試料中のＮＤＲＧ４メチル化を検出するための好ましい群１におけるプライマーおよびプローブを用いた増幅曲線を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、臨床試料中のＮＤＲＧ４メチル化を検出するための好ましい群２におけるプライマーおよびプローブを用いた増幅曲線を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、臨床試料中のＮＤＲＧ４メチル化を検出するための好ましい群３におけるプライマーおよびプローブを用いた増幅曲線を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、同じアッセイにおけるＮＤＲＧ４メチル化を検出するための比較群１におけるプライマーおよびプローブを用いた増幅曲線を示す。
【図６Ｅ】図６Ｅは、同じアッセイにおけるＮＤＲＧ４メチル化を検出するための比較群２におけるプライマーおよびプローブを用いた増幅曲線を示す。
【図６Ｆ】図６Ｆは、同じアッセイにおけるＮＤＲＧ４メチル化を検出するための比較群３におけるプライマーおよびプローブを用いた増幅曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１４】
定義
「１つの実施態様」、「ある実施態様」、「１つの例」および「ある例」への言及は、そのように記載された実施態様または例が特定の特徴、構造、特性、性質、要素または制限を含み得るが、すべての実施態様または例が必ずしもその特定の特徴、構造、特性、性質、要素または制限を含むわけではないことを示している。さらに、語句「ある実施態様において」の繰り返しの使用は必ずしも同一の実施態様を指すわけではないが、そうであり得る。
【０１１５】
本明細書における「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、共有結合で互いに連結された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の描写はまた、相補鎖の配列を規定する。したがって、核酸はまた、描写された一本鎖の相補鎖を包含する。核酸の多くのバリアントが、所定の核酸と同じ目的のために使用され得る。したがって、核酸はまた、実質的に同一の核酸およびその相補体を包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズし得るプローブを提供する。したがって、核酸はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブを包含する。核酸は一本鎖または二本鎖であり得、または二本鎖配列および一本鎖配列の両方の一部を含み得る。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得、ここで核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組合せ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む塩基の組合せを含み得る。核酸は、化学合成法または組換え法によって得られ得る。
【０１１６】
本明細書における語句「必要とする対象」は、がんを有することが知られている動物またはヒト対象、がんを有するリスクがある動物またはヒト対象（例えば、遺伝的な素因がある対象、がんの病歴および／または家族歴を有する対象、発がん物質、職業上の危険、環境上の危険性にさらされた対象）、および／またはがんの疑わしい臨床徴候を示す対象（例えば、血便またはメレナ、原因不明の疼痛、発汗、原因不明の発熱、原因不明の（最大で食欲不振までの）体重減少、排便習慣の変化（便秘および／または下痢）、テネスムス（特に直腸がんの場合の不完全な排便の感覚）、貧血および／または全身の脱力感）を指す。追加的または代替的に、必要とする対象は、定期的な健康診断を受けている健康なヒト対象であり得る。
【０１１７】
本明細書における用語「約」は±１０％を指す。
【０１１８】
語句「本質的にからなる」は、追加の成分および／または工程が特許請求の範囲に記載の組成物または方法の基本的かつ新規な特性を実質的に変更しない場合にのみ、組成物または方法が追加の成分および／または工程を含み得ることを意味する。
【０１１９】
本明細書において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈において明確な指示がない限り、複数形の指示対象を含む。例えば、用語「化合物（a compound）」または「少なくとも１つの化合物」は、複数の化合物（それらの混合物を含む）を含み得る。
【０１２０】
本明細書における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、（核酸の混合物などにおいて）第１の核酸配列（例えば、プローブ）が第２の核酸配列（例えば、標的）にハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、種々の状況において異なる。ストリンジェントな条件は、規定されるイオン強度ｐＨにおける特定の配列の熱的融点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低いように選択され得る。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態において標的配列にハイブリダイズする（規定されるイオン強度、ｐＨおよび核濃度における）温度であり得る（標的配列は過剰に存在するため、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態において占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン（ｐＨ７．０〜８．３において約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）など）であり、温度が短いプローブ（例えば約１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば約５０ヌクレオチドより長い）について少なくとも約６０℃である条件であり得る。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化物質の添加により達成され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションのために、陽性のシグナルは、バックグラウンドのハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には以下が含まれる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％ ＳＤＳで４２℃においてインキュベートする、または５×ＳＳＣ、１％ ＳＤＳで６５℃においてインキュベートし、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳで６５℃において洗浄する。
【０１２１】
本明細書における「実質的に相補的」とは、第１の配列が、第２の配列の相補体と８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるか、または２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。
【０１２２】
本明細書における「実質的に同一」とは、第１の配列が第２の配列の相補体と実質的に相補的である場合に、第１の配列および第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域または核酸に関して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であることを意味する。
【０１２３】
本明細書において、用語「診断」は、病理または症状を分類すること、病理の重症度（例えば、グレードまたは段階）を決定すること、病理の進行をモニターすること、病理の結果および／または回復の見込みを予測することを指す。
【０１２４】
語句「本質的にからなる」は、追加の成分および／または工程が特許請求の範囲に記載の組成物または方法の基本的かつ新規な特性を実質的に変更しない場合にのみ、組成物または方法が追加の成分および／または工程を含み得ることを意味する。
【０１２５】
１．ＣＲＣおよびＡＡの中国人集団におけるＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のプロモーター領域の高メチル化ＣｐＧ部位を含むＤＮＡ配列
本発明は、アジア人集団（例えば中国人集団）におけるＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のプロモーター領域の詳細な高メチル化ＣｐＧ部位を含むＤＮＡ配列を提供し、これはＣＲＣおよびＡＡの検出のためのマーカーとして使用され得る。
【０１２６】
いくつかの実施態様において、以下のＢＭＰ３遺伝子の天然配列（５’から３’）が提供され、これは上付き文字「ｍ」によって標識される潜在的にメチル化されている部位を示す：
ＧＣＣＡＧＴＴＴＧＧＣｍＣＧＧＧＴＧＴＴＣＣＣＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧｍＣＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＧＴＡＣＡＧＡＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣｍＣＧＧＧＣＣＡＣＡＣＡｍＣＧＣｍＣＧｍＣＧＡＣＣＴＡＣＡＧＣＴＣＴＴＴＣＴＣＡＧｍＣＧＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡｍＣＧＧｍＣＧＣＣＣＧＣＡＧｍＣＧＣＣＣＴＧｍＣＧｍＣＧＧＧＴＧＡＧＧＴＣｍＣＧｍＣＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＣＣＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＧＣＴＧｍＣＧＣＴＧＧＧＴＣＡＧｍＣＧＣＡＧＣＡＡＧＴＧＧＧＧＣＴＧＧＣｍＣＧＣＴＡＴＣＴｍＣＧＣＴＧＣＡＣＣＣＧＧＣｍＣＧｍＣＧＴＣＣｍＣＧＧＧＣＴＣｍＣＧＴＧｍＣＧＣＣＣＴｍＣＧＣＣＣＣＡＧ（配列番号６５）。
【０１２７】
いくつかの実施態様において、以下のＮＤＲＧ４遺伝子の天然配列（５’から３’）が提供され、これは上付き文字「ｍ」によって標識される潜在的にメチル化されている部位を示す：
ＴＧＡＧＡＡＧＴｍＣＧＧｍＣＧＧＧＧＧｍＣＧｍＣＧＧＡＴｍＣＧＡＣｍＣＧＧＧＧＴＧＴＣＣＣＣＣＡＧＧＣＴＣｍＣＧｍＣＧＴｍＣＧｍＣＧＧＴＣＣＣｍＣＧＣＴｍＣＧＣＣＣＴＣＣｍＣＧＣＣｍＣＧＣＣＣＡＣｍＣＧＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＣｍＣＧｍＣＧＣＡＧＡＡＧＧｍＣＧＧＡＡＧＣＣＡｍＣＧｍＣＧｍＣＧＡＧＧＧＡＣｍＣＧｍＣＧＧＴＣｍＣＧＴＣｍＣＧＧＧＡＣＴＡＧＣＣＣＣＡＧＧＣＣｍＣＧＧＣＡＣｍＣＧＣＣＣｍＣＧｍＣＧＧＧＣｍＣＧＡＧｍＣＧＣＣＣＡＣＡＣＣｍＣＧＣＣＡＡＡＣＣＣＡｍＣＧｍＣＧＧＧＣＡｍＣＧＣＣＣＣｍＣＧｍＣＧＧｍＣＧＣＡＣｍＣＧＣＣＣＣＣＡＧＣＣ（配列番号６６）。
【０１２８】
天然のゲノムＤＮＡまたはその断片を１以上の試薬で処理し、メチル化されていないシトシン塩基を（例えば重亜硫酸塩によって）ウラシルまたはハイブリダイゼーションの特性に関してシトシンとは検出可能に異なる別の塩基に変換した後、変換されたＢＭＰ３遺伝子の配列は以下（５’から３’）であり、これは上付き文字「ｍ」によって標識される潜在的にメチル化されている部位を示す：
ＧＴＴＡＧＴＴＴＧＧＴｍＣＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧｍＣＧＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＧＴＡＴＡＧＡＴＡＧＡＴＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＴｍＣＧＧＧＴＴＡＴＡＴＡｍＣＧＴｍＣＧｍＣＧＡＴＴＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧｍＣＧＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡｍＣＧＧｍＣＧＴＴｍＣＧＴＡＧｍＣＧＴＴＴＴＧｍＣＧｍＣＧＧＧＴＧＡＧＧＴＴｍＣＧｍＣＧＴＡＧＴＴＧＴＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＧＴＴＧｍＣＧＴＴＧＧＧＴＴＡＧｍＣＧＴＡＧＴＡＡＧＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴｍＣＧＴＴＡＴＴＴｍＣＧＴＴＧＴＡＴＴｍＣＧＧＴｍＣＧｍＣＧＴＴＴｍＣＧＧＧＴＴＴｍＣＧＴＧｍＣＧＴＴＴＴｍＣＧＴＴＴＴＡＧ（配列番号１）。
【０１２９】
天然のゲノムＤＮＡまたはその断片を１以上の試薬で処理し、メチル化されていないシトシン塩基を（例えば重亜硫酸塩によって）ウラシルまたはハイブリダイゼーションの特性に関してシトシンとは検出可能に異なる別の塩基に変換した後、変換されたＮＤＲＧ４遺伝子の配列は以下（５’から３’）であり、これは上付き文字「ｍ」によって標識される潜在的にメチル化されている部位を示す：
ＴＧＡＧＡＡＧＴｍＣＧＧｍＣＧＧＧＧＧｍＣＧｍＣＧＧＡＴｍＣＧＡＴｍＣＧＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴｍＣＧｍＣＧＴｍＣＧｍＣＧＧＴＴＴＴｍＣＧＴＴｍＣＧＴＴＴＴＴＴｍＣＧＴＴｍＣＧＴＴＴＡＴｍＣＧＧＧＴＡＴＴＴＴＡＧＴｍＣＧｍＣＧＴＡＧＡＡＧＧｍＣＧＧＡＡＧＴＴＡｍＣＧｍＣＧｍＣＧＡＧＧＧＡＴｍＣＧｍＣＧＧＴＴｍＣＧＴＴｍＣＧＧＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＧＧＴＴｍＣＧＧＴＡＴｍＣＧＴＴＴｍＣＧｍＣＧＧＧＴｍＣＧＡＧｍＣＧＴＴＴＡＴＡＴＴｍＣＧＴＴＡＡＡＴＴＴＡｍＣＧｍＣＧＧＧＴＡｍＣＧＴＴＴＴｍＣＧｍＣＧＧｍＣＧＴＡＴｍＣＧＴＴＴＴＴＡＧＴＴ（配列番号２）。
【０１３０】
本開示のアジア人集団におけるＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のプロモーター領域の詳細な高メチル化ＣｐＧ部位を含むＤＮＡ配列は、アジア人集団においてＣＲＣおよび／またはＡＡを検出するのに特に有用である。例えば、プライマーおよびプローブは、ＢＭＰ３および／またはＮＤＲＧ４のメチル化状態およびレベルを決定し、従って必要とする患者における腫瘍状態を決定するためのツールとして、ＢＭＰ３および／またはＮＤＲＧ４遺伝子における１以上の特定のメチル化部位を標的とするように設計され得る。
【０１３１】
２．ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化を検出するための各３組の好ましいプライマーおよびプローブならびに対応する試薬。
本発明は、ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化レベルを検出するための各３組の好ましいプライマーおよびプローブを提供する。これらのプライマーおよびプローブは、アジア人集団（例えば中国人集団）において高頻度でメチル化されているＣｐＧ部位を標的とするように設計されている。
【０１３２】
これらの好ましいプライマーおよびプローブの特定の組合せは、既存の市販品（Ｃｏｌｏｇｕａｒｄ（登録商標）など）と比較して、ＣＲＣおよびＡＡの検出（特にアジア人集団におけるＡＡの検出）において驚くほど高い感度および特異度を有している。
プライマーおよびプローブの配列は以下である：
【表１】
2021526370.tif 000003
【０１３３】
本開示のオリゴヌクレオチドは、アジア人患者から得られた生体試料中のＢＭＰ３またはＮＤＲＧ４のプロモーター領域における高メチル化ＣｐＧ部位の極めて特異的な増幅を有利に可能にする。
【０１３４】
いくつかの実施態様において、配列番号３〜２０の配列と部分的または完全に相補的なオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１３５】
いくつかの実施態様において、プローブ配列（配列番号５、１１、１７、８、１４および２０など）と比較して１つ以上の修飾を有するオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施態様において、修飾は、配列番号５、１１、１７、８、１４および２０に記載のヌクレオチド配列のうち１つの５’末端および／または３’末端において生じ得る。
【０１３６】
ヌクレオチドをその構造上の任意の位置において修飾するのに使用され得る修飾された塩基部分の例には、限定されないが、以下が挙げられる：特に、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケウオシン、イノシン、Ｎ−６−ソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ−６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、メトキシアミノメチル(methoxyarninomethyl)−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケウオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、ケウオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−Ｓ−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、および２，６−ジアミノプリン。
【０１３７】
ヌクレオチドをその構造上の任意の位置において修飾するのに使用され得る修飾された糖部分の例には、限定されないが、以下が含まれる：アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシロース、およびヘキソース、または修飾されたリン酸骨格成分（ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミダート、ホスホロジアミダート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、またはそれらのホルムアセタールもしくはアナログなど）。
【０１３８】
いくつかの実施態様において、配列番号５、１１、１７、８、１４および２０の配列におけるオリゴヌクレオチドは、非天然ヌクレオチド（人工核酸など）で置換されている。人工核酸には、限定されないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、およびトレオース核酸（ＴＮＡ）が含まれる。これらはそれぞれ、分子骨格の変化によって天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡとは区別される。
【０１３９】
いくつかの実施態様において、本開示のプローブは、５’における標識およびプローブを含む。
【０１４０】
いくつかの実施態様において、プローブの５’における標識には、蛍光色素（フルオロフォアなど）が含まれる。本明細書において、フルオロフォアは、光励起時に光を再放出できる蛍光化合物である。フルオロフォアは通常、いくつかの組み合わされた芳香族基、またはいくつかのπ結合を有する平面状分子もしくは環状分子を含む。非タンパク質有機フルオロフォアには、限定されないが、キサンテン誘導体（例えば、フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシンおよびテキサスレッド）；シアニン誘導体（例えば、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニンおよびメロシアニン）、スクアライン誘導体および環置換スクアライン（例えば、ＳｅＴａ、ＳｅＴａｕおよびＳｑｕａｒｅ色素）、ナフタレン誘導体（例えば、ダンシル誘導体およびプロダン誘導体）、クマリン誘導体；オキサジアゾール誘導体（例えば、ピリジルオキサゾール、ニトロベンンゾオキサジアゾールおよびベンゾオキサジアゾール）；アントラセン誘導体（例えば、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７およびＣｙＴＲＡＫ Ｏｒａｎｇｅを含むアントラキノン類）；ピレン誘導体（カスケードブルーなど）、オキサジン誘導体（例えば、ナイルレッド、ナイルブルー、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０など）；アクリジン誘導体（例えば、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエローなど）；アリールメチン誘導体（例えば、オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン）；テトラピロール誘導体（例えば、ポルフィン、フタロシアニン、ビリルビン）が含まれる。特に例示すると、限定されないが、ＶＩＣ、ＰＥＴ、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、ＨＥＸ（６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン）、ＲＯＸ（５（６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２１，７１−ジメトキシフルオレセイン）、ＴＥＴ（５’−テトラクロロ−フルオレセインホスホロアミダイト）、ＮＥＤ（フルオレセインベンゾキサンテン）、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルローダミン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）が挙げられる。本明細書において開示されるプローブに使用され得る特定のフルオロフォアの例は当業者に公知であり、Nazarenko et alの米国特許第５，８６６，３６６号において提供されるフルオロフォア（特に、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体（アクリジンおよびアクリジンイソチオシアネートなど）、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル］フェニル］ナフタルイミド−３，５−ジスルホン酸塩（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド；ブリリアントイエロー；クマリンおよび誘導体（クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン(couluarin)（クマラン(Coumaran)１５１）など）；シアノシン；４’，６−ジアミニジノ(diaminidino)−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５’’−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体（エオシンおよびエオシンイソチオシアネートなど）；エリスロシンおよび誘導体（エリスロシンＢおよびエリスロシンイソチオシアネートなど）；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体（５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）、−６−カルボキシ−フルオレセイン（ＨＥＸ）およびＴＥＴ（テトラメチルフルオレセイン）など）；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロン；オルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローズアニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリスリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体（ピレン、ピレンブチレートおよびスクシンイミジル１−ピレンブチレートなど）；リアクティブレッド４（ＣＩＢＡＣＲＯＮ（商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）；ローダミンおよび誘導体（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン、およびテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）など）；スルホローダミンＢ；スルホローダミン１０１およびスルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）；リボフラビン；ロゾール酸およびテルビウムキレート誘導体；ライトサイクラーレッド６４０；Ｃｙ５．５；およびＣｙ５６−カルボキシフルオレセイン；ホウ素ジピロメテンジフルオリド（ＢＯＤＩＰＹ）；アクリジン；スチルベン；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）；Ｃｙ３；Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＶＩＣ（登録商標）（Applied Biosystems）；ＬＣ Ｒｅｄ ６４０；ＬＣ Ｒｅｄ ７０５；オレゴングリーン（商標）；ＣＡＬＲｅｄ（商標）；Ｒｅｄ６４０；およびＹａｋｉｍａ ｙｅｌｌｏｗ；ライトサイクラー（登録商標）Ｃｙａｎ５００；ライトサイクラー（登録商標）；Ｒｅｄ６１０；Ａｌｅｘａ６４７；Ａｌｅｘａ５５５；５−（２−アミノエチル）アミノ−１−ナフタレンスルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）；テトラメチルローダミンイソシアネート（ＴＭＲＩＴＣ）、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）、χ−ローダミン、それらの誘導体、またはそれらの任意の組合せなど）を含む。さらなる蛍光色素は、米国特許第５８６６３６６号、第６８１８４３１号、第６０５６８５９号、第９１４０６８８号、第９５８１５８７号、第６１６５７６５号、第６４８５９０９号、第８１５８３５８号、第７６２５７２３号、第７５６０２３６号、第７８６７７０１号、第９１５０９１２号、第７９６０５４３号、第６５５５３８３号、第６８８１５７０号、第８１９８０２６号、第５６２５０８１号、第８４４５２９１号、第９１９４８０１号、第８８３５１１０号、第７８９３２２７号、第９２４３２８９号、第７４２７６７４号、第９５１２４９３号、米国特許出願公開第２０１７０１５２５５２号、第２００３０１７０６７２号、第２０１６０２８１１５１号、第２０１３００８４５５８号、第２００６０２８１１００号、第２０１４０２３４８３３号、第２０１５００７２３４０号、第２００５００８９９１０号、第２００９００８１６７７号、第２０１４００２４０２２２０１８０１７１３９３号、第２００６０１８８８８６号、第２００１００１８１８５号、第２０１１０１５１４４６号、およびＷＯ／２０００／０１７３３０Ａ１、ＷＯ／２００８／０３００７１Ａ１、ＷＯ／２０１３／０４９６３１Ａ１、ＷＯ／２０１６／１７９０９０Ａ１、ＷＯ／２０１６／１２３８９５Ａ１、ＷＯ／２００３／０７９０２２Ａ１に記載されており、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４１】
いくつかの実施態様において、本開示のプローブは、蛍光ドナーおよびアクセプターフルオロフォアを含む。本明細書において、アクセプターフルオロフォア（例えば、「蛍光消光剤」）は、ドナーフルオロフォアからの（例えば約４００〜９００ｎｍの範囲の）エネルギーを吸収するフルオロフォアである。アクセプターフルオロフォアは一般に、ドナーフルオロフォアの最大吸収波長よりも通常少なくとも１０ｎｍ高い（例えば少なくとも２０ｎｍ高い）波長で光を吸収する。ドナーによって放出されたエネルギーが消光剤を励起できるように、アクセプターフルオロフォアはドナーフルオロフォアの発光と重なる励起スペクトルを有する。当分野で公知の任意のアクセプターフルオロフォアが利用され得る。特定の例において、アクセプターフルオロフォアは、ダーククエンチャー（Ｄａｂｃｙｌ、ＱＳＹ７（Molecular Probes）、ＱＳＹ９（Molecular Probes）、ＱＳＹ２１（Molecular Probes）、ＱＳＹ３３（Molecular Probes）、ＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ ＱＵＥＮＣＨＥＲＳ（商標）（Glen Research、例えばＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３）、ＥＣＬＩＰＳＥ（商標）ダーククエンチャー（Epoch Biosciences）、ＤＤＱ−Ｉ、ＤＤＱ−ＩＩ、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、またはＩＯＷＡ ＢＬＡＣＫ（商標）（Integrated DNA Technologies、例えばＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ）など）である。さらなる蛍光消光剤は、米国特許第９９５７５４６号、第ＵＳ９２７４００８号、米国特許出願公開第２０１４０２９５４２２号、第２００９００４２２０５号、第２０１６０２８１１８２号、第２０１８０１４２２８４号、第２０１４０１４７９２９号、およびＷＯ／２００９／００９６１５Ａ１、ＷＯ／２０１６／１６０５７２Ａ１、ＷＯ／２０１６／１７８９５３Ａ１、ＷＯ／２０１８／２２９６６３Ａ１、ＷＯ／２０１０／０５１５４４Ａ２、ＷＯ／２０１３／１５２２２０Ａ２に記載されており、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。消光剤はドナーフルオロフォアの発光を減少または消光させ得る。そのような例において、ドナーフルオロフォアに十分に近接している場合にアクセプターフルオロフォアからの発光シグナルの増加を検出する（またはドナーフルオロフォアから著しく離れている場合にアクセプターフルオロフォアからの発光シグナルの減少を検出する）代わりに、消光剤がドナーフルオロフォアから著しく離れている場合にドナーフルオロフォアからの発光シグナルの増加が検出され得る（または消光剤のアクセプターフルオロフォアに十分に近接している場合にドナーフルオロフォアからの発光シグナルの減少が検出され得る）。
【０１４２】
いくつかの実施態様において、本開示のプライマーおよびプローブは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく。増幅産物を検出するために使用され得るＦＲＥＴを用いるオリゴヌクレオチドの例としては、線状オリゴプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅｓなど）、５’ヌクレアーゼオリゴプローブ（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブなど）、ヘアピンオリゴプローブ（分子ビーコン、ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーおよびＵｎｉＰｒｉｍｅｒなど）、副溝結合プローブ、および自己蛍光性増幅産物（ｓｕｎｒｉｓｅプライマーなど）が挙げられる。
【０１４３】
いくつかの実施態様において、本開示のプライマーおよび／またはプローブは他の機能的実体（ビオチン、ハプテン、抗原、化学基、放射性物質、酵素マーカーなど）によって標識されている。標識された増幅産物の検出は、例えば、蛍光法、化学発光法、濃度測定法、測光法、沈降反応、酵素反応（酵素補強反応(enzymatic reinforcement reaction)を含む）、ＳＰＲ（「表面プラズモン共鳴」）法、偏光解析法、屈折率の測定、反射率の測定、および類似の方法を用いて達成され得る。
【０１４４】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるプライマーおよびプローブは、患者におけるＢＭＰ３および／またはＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化状態およびレベルを決定するために定量ＰＣＲにおいて使用され得る。いくつかの実施態様において、１以上の参照遺伝子を増幅するために追加の反応が含まれ得る。いくつかの実施態様において、参照遺伝子は、活性がＣＲＣおよびＡＡの有無によって影響されず、ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４のメチル化状態およびレベルによって影響されない患者における遺伝子である。いくつかの実施態様において、参照遺伝子には、限定されないが、βグロビン（ＨＢＢ）、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ）、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、アルブミン（ＡＬＢ）、βアクチン（ＡＣＴＢ）、ベータ２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、およびＴ細胞受容体γ（ＴＲＧ）が含まれる。
【０１４５】
いくつかの実施態様において、Ｂ２Ｍ遺伝子は、ＢＭＰ３／ＮＤＲＧ４のメチル化状態およびレベルを検出するための定量ＰＣＲにおいて参照遺伝子として使用される。
【０１４６】
いくつかの実施態様において、１つ以上の他の対照が導入され得、これには限定されないが、（試薬または装置の汚染を検出するため、および陽性結果を確認するための）鋳型を含まない対照、（分解された標識プローブによって生成されるバックグラウンド蛍光を検出するための）増幅されない対照、および（阻害剤または誤動作を検出するため、ならびに試薬および装置が機能していることを確認するための）陽性対照が含まれる。
【０１４７】
いくつかの実施態様において、ｑＰＣＲは、試料中のメチル化されたＢＭＰ３遺伝子またはメチル化されたＮＤＲＧ４遺伝子の増幅があるか否かを決定するために使用される。ＢＭＰ３またはＮＤＲＧ４のプローブから検出されたシグナルは、標準曲線を参照することによって、またはＣｔ値を参照遺伝子と比較することによって定量される。ハウスキーピング遺伝子の分析は、結果を正規化するために使用されることが多い。サイクル閾値（Ｃｔ）は、蛍光シグナルが所定の閾値を超える（例えば、陰性対照試料における増幅のレベルなどのバックグラウンドレベルを超える）のに必要なサイクル数として規定される。いくつかの実施態様において、閾値は、ｑＰＣＲ装置のソフトウェアまたは他の適切な方法によって自動的に決定される。いくつかの実施態様において、閾値は、陰性対照試料中の末端蛍光値より少し高い値（例えば、約０．０１％、０．１％、１％、５％または１０％高い値）に設定される。
【０１４８】
いくつかの実施態様において、検査試料中のＢＭＰ３またはＮＤＲＧ４の増幅に関連するＣｔ値が（≦）約３５、３４、３３、３２、３１、３０またはそれ以下である場合、試料はメチル化ＢＭＰ３またはＮＤＲＧ４を含むと判定され、患者はＣＲＣおよび／またはＡＡを有し（陽性結果）、そうでなければ試料はメチル化ＢＭＰ３またはＮＤＲＧ４を含まないと判定され、患者はＣＲＣまたはＡＡを有しない（陰性結果）。参照遺伝子の増幅について、試料中の対照遺伝子の増幅に関連するＣｔ値が（≦）約３４、３３、３２、３１、３０、２９またはそれ以下である場合、参照遺伝子の増幅は陽性であると判定され、そうでなければ参照遺伝子の増幅は陰性であると判定される。参照遺伝子の増幅が陰性であると判定された場合、検査結果は無効となる。
【０１４９】
いくつかの実施態様において、ＢＭＰ３に関連するＣｔ値の差を参照遺伝子の増幅に関連するＣｔ値と比較し（ΔＣｔ＝Ｃｔ対象の遺伝子−Ｃｔ参照遺伝子）、ΔＣｔ１と呼ぶ。いくつかの実施態様において、ΔＣｔ１が所定の臨界値以下（≦臨界値）である場合、試料はＢＭＰ３メチル化を有すると判定され（陽性結果）、患者はＣＲＣまたはＡＡを有すると判定される。いくつかの実施態様において、ΔＣｔ１が所定の臨界値よりも高い（＞臨界値）場合、試料はＢＭＰ３メチル化を有していないと判定され（陰性結果）、患者は健常であると判定される。いくつかの実施態様において、臨界値は、１％（約８個、９個または１０個など）のメチル化率を有する５ｎｇ／μＬのヌクレオチド配列を含む試料の対応するΔＣｔ値である。
【０１５０】
いくつかの実施態様において、ＮＤＲＧ４に関連するＣｔ値の差を参照遺伝子の増幅に関連するＣｔ値と比較し（ΔＣｔ＝Ｃｔ対象の遺伝子−Ｃｔ参照遺伝子）、ΔＣｔ２と呼ぶ。いくつかの実施態様において、ΔＣｔ２が所定の臨界値以下（≦臨界値）である場合、試料はＮＤＲＧ４メチル化を有すると判定され（陽性結果）、患者はＣＲＣまたはＡＡを有すると判定される。いくつかの実施態様において、ΔＣｔ２が所定の臨界値よりも高い（＞臨界値）場合、試料はＮＤＲＧ４メチル化を有していないと判定され（陰性結果）、患者は健常であると判定される。いくつかの実施態様において、臨界値は、１％（約８個、９個または１０個など）のメチル化率を有する５ｎｇ／μＬのヌクレオチド配列を含む試料の対応するΔＣｔ値である。
【０１５１】
本開示の好ましいプライマーおよびプローブは、アジア人集団におけるＣＲＣおよびＡＡの検出（特にＡＡの検出）において既存の市販品（Ｃｏｌｏｇｕａｒｄ（登録商標）など）と比較して驚くほど高い感度および特異度を有する。
【０１５２】
本明細書において、用語「感度」は、所定の集団において実際にＣＲＣおよび／またはＡＡを有する患者が正確に検出される割合を指す。いくつかの実施態様において、感度は、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくはそれ以上、または１００％である。いくつかの実施態様において、集団の大きさは、少なくとも約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００またはそれ以上である。
【０１５３】
本明細書において、用語「特異度」は、所定の集団において実際にＣＲＣまたはＡＡを有しない患者がその状態を有しないと正確に診断される割合を指す。いくつかの実施態様において、特異度は、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくはそれ以上、または１００％である。いくつかの実施態様において、集団の大きさは、少なくとも約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００またはそれ以上である。
【０１５４】
実施例において示されるように、好ましいプライマーおよびプローブはＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４のメチル化の検出において驚くほど高い感度および特異度を提供し、したがってＣＲＣおよび／またはＡＡの検出において驚くほど高い感度および特異度をもたらす。例えば、ＢＭＰ３遺伝子の３組の好ましいプライマーおよびプローブによるＣＲＣ検出の感度は少なくとも８５％である；ＮＤＲＧ４遺伝子の３組の好ましいプライマーおよびプローブによるＣＲＣ検出の感度は少なくとも９０％である；ＢＭＰ３遺伝子の３組の好ましいプライマーおよびプローブによるＡＡ検出の感度は少なくとも６６％である；ＮＤＲＧ４遺伝子の３組の好ましいプライマーおよびプローブによるＡＡ検出の感度は少なくとも７３％である。また、ＢＭＰ３遺伝子の３組の好ましいプライマーおよびプローブによるＣＲＣおよびＡＡ検出の特異度は約９７％〜１００％（例えば少なくとも約９７．８％）である；ＮＤＲＧ４遺伝子の３組の好ましいプライマーおよびプローブによるＣＲＣおよびＡＡ検出の特異度は約９７％〜１００％（例えば、少なくとも約９７．８％）である。
【０１５５】
３．患者においてＣＲＣおよび／またはＡＡを検出するための３組の好ましいプライマー−プローブの組合せ
本開示はまた、患者におけるＣＲＣまたはＡＡの有無を決定するために、ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化レベルを検出するための３組の好ましいプライマーおよびプローブの組合せを提供する。これらの特定の組合せは、アジア人集団におけるＣＲＣおよびＡＡの検出（特にＡＡの検出）において既存の市販品（Ｃｏｌｏｇｕａｒｄ（登録商標）など）と比較して驚くほど高い感度および特異度を有する。
３組の好ましいプライマーおよびプローブの配列は以下である：
【表２】
2021526370.tif 000004
【０１５６】
実施例において示されるように、ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４プライマー−プローブセットの好ましい組合せは、ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４のメチル化の検出において驚くほど高い感度および特異度を提供し、したがってＣＲＣおよび／またはＡＡの検出において驚くほど高い感度および特異度をもたらす。いくつかの実施態様において、この感度および特異度は、実施例５において説明されるように、同じアッセイがＫＲＡＳ遺伝子解析およびヘモグロビン検査を含む場合に得られる。例えば、ＫＲＡＳ遺伝子解析およびヘモグロビン検査の組合せにおけるＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のプライマーおよびプローブの３つの好ましい組合せによるＣＲＣ検出の全体的な感度は少なくとも９５％である；ＫＲＡＳ遺伝子解析およびヘモグロビン検査の組合せにおけるＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のプライマーおよびプローブの３つの好ましい組合せによるＡＡ検出の感度は少なくとも９３％である；ＫＲＡＳ遺伝子解析およびヘモグロビン検査の組合せにおけるＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のプライマーおよびプローブの３つの好ましい組合せによるＣＲＣ＋ＡＡ検出の感度は少なくとも９７％である；ＫＲＡＳ遺伝子解析およびヘモグロビン検査の組合せにおけるＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のプライマーおよびプローブの３つの好ましい組合せによるＣＲＣ＋ＡＡ検出の特異度は少なくとも９７％である。
【０１５７】
４．ＣＲＣおよびＡＡを検出するためのキット
本開示は、ＢＭＰ３／ＮＤＲＧ４メチル化検出のためのキット、および／またはしたがって必要とされる患者におけるＣＲＣ／ＡＡ検出のためのキットを提供する。いくつかの実施態様において、キットはアジア人の患者（中国人の患者など）に特に適している。
【０１５８】
いくつかの実施態様において、本キットは以下を含む：（１）ＣＲＣおよびＡＡを検出するための３組の好ましいプライマーおよびプローブの組合せ（表２０の組合せ番号４、５および７）のうち少なくとも１つ、および対応するｑＰＣＲ試薬；（２）ＫＲＡＳ遺伝子のコード領域における７つの変異（すなわち、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２ＡおよびＧ１３Ｒ）を検出するための手段（適切なプライマーおよびプローブなど）および対応するｑＰＣＲ試薬；（３）便試料中のヘモグロビンを検出するための手段（ＦＩＴ技術に基づく試薬など、例えば、抗ヘモグロビン抗体、ならびに便試料中の抗体およびヘモグロビンによって形成される複合体を検出するための試薬）。
【０１５９】
いくつかの実施態様において、キットは、以下の好ましいプライマー−プローブの組合せのうち少なくとも１組を含む：
（１）３組の好ましいプライマーおよびプローブの組合せは以下である：
【表３】
2021526370.tif 000005
【０１６０】
（２）ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化レベルを検出するための３重の定量ＰＣＲ試薬。
いくつかの実施態様において、キットは、ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４のメチル化を同時に検出するためのマルチプレックスＰＣＲを行うための試薬を含む。いくつかの実施態様において、マルチプレックスＰＣＲは定量ＰＣＲである。
【０１６１】
いくつかの実施態様において、試薬はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施態様において、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの終濃度は約２Ｕ／反応物である。いくつかの実施態様において、試薬はＭｇＣｌ２を含む。いくつかの実施態様において、反応物中のＭｇＣｌ２の終濃度は２ｍＭである。いくつかの実施態様において、試薬はｄＮＴＰを含む。いくつかの実施態様において、ｄＮＴＰは０．２ｍＭの終濃度を有する。いくつかの実施態様において、試薬は、ＢＭＰ３、ＮＤＲＧ４および参照遺伝子を増幅する約０．５ｍＭ〜０．７５ｍＭのプライマーを含む。いくつかの実施態様において、試薬は、ＢＭＰ３、ＮＤＲＧ４および参照遺伝子のＤＮＡ配列とハイブリダイズされる約０．１ｍＭ〜０．２５ｍＭのプローブを含む。いくつかの実施態様において、試薬は、濃縮（例えば５ｘまたは１０ｘ）ＰＣＲ緩衝液などのＰＣＲ緩衝液をさらに含み、これは１ｘの終濃度に希釈され得る。いくつかの実施態様において、Ｂ２Ｍは参照遺伝子であり、定量ＰＣＲにおいて品質管理のために増幅される。
【０１６２】
（３）ＫＲＡＳ遺伝子のコード領域における７つの変異を検出するためのプライマーおよびプローブ。
いくつかの実施態様において、キットはＫＲＡＳ遺伝子における変異を検出するための手段を含む。いくつかの実施態様において、キットは、ＫＲＡＳ遺伝子のオープンリーディング領域のエクソン１２およびエクソン１３における７つの変異ホットスポットであるＧ１２Ｄ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２ＡおよびＧ１３Ｒを増幅および検出するように設計されたプライマーおよびプローブを含む。いくつかの実施態様において、プライマーおよびプローブの配列は以下である：
【表４】
2021526370.tif 000006
【０１６３】
（４）ＫＲＡＳ遺伝子のコドン変異を検出するためのマルチプレックス定量ＰＣＲ試薬。
ＫＲＡＳ遺伝子の７つ全ての変異を検出するためのマルチプレックス定量ＰＣＲシステムが提供される。いくつかの実施態様において、マルチプレックス定量ＰＣＲ反応物は、終濃度２．５Ｕ／反応物のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、終濃度１ｍＭのＭｇＣｌ２、終濃度０．１ｍＭのｄＮＴＰ、ＫＲＡＳおよびＡＣＴＢ遺伝子を増幅する０．３〜０．９μＭのプライマー、ＫＲＡＳおよびＡＣＴＢ遺伝子のＤＮＡ配列にハイブリダイズされる０．０５〜０．１μＭのプローブ、および１×ＰＣＲ緩衝液を含む。ＡＣＴＢは参照遺伝子であり、定量ＰＣＲにおいて品質管理のために増幅される。
【０１６４】
（５）便中のヘモグロビンを検出するキット
いくつかの実施態様において、キットはヘモグロビンを検出するための試薬を含む。いくつかの実施態様において、ヘモグロビンは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって定性的に検査される。
【０１６５】
５．ロジスティック回帰モデル
いくつかの実施態様において、ＢＭＰ３／ＮＤＲＧ４メチル化検査、ＫＲＡＳ変異検査およびヘモグロビン検査の結果を得た後、患者におけるＣＲＣおよび／またはＡＡの有無を決定するために、すべての結果を収集し、ロジスティック回帰モデルにかける。
【０１６６】
いくつかの実施態様において、本方法はがんの総合指数値Ｐの値を計算することを含み、ここでＰ＝ｅＫ／（１＋ｅＫ）であり、ｅは自然定数である。
【０１６７】
いくつかの実施態様において、Ｋは、Ｋ＝ａ＊ΔＣｔ１＋ｂ＊ΔＣｔ２＋ｃ＊ΔＣｔ３＋ｄ＊ＦＩＴ＋Ｘと規定され、ここでａ、ｂ、ｃ、ｄ、Ｘは臨床定数である。ΔＣｔ１、ΔＣｔ２およびΔＣｔ３は、ＢＭＰ３、ＮＤＲＧ４およびＫＲＡＳのＣｔ値から参照遺伝子のＣｔ値を差し引いた値である。
【０１６８】
いくつかの実施態様において、Ｐ値が所定の閾値以上である場合、検査結果は陽性であり、そうでなければ陰性である。陽性の結果はヒトがＣＲＣまたはＡＡを有する可能性があることを示し、そうでなければ健常であることを示す。
【０１６９】
６．処置方法
いくつかの実施態様における本開示の方法は、患者が大腸がんおよび／または腺腫を有すると分類された後に、必要とする患者を処置することを含む。いくつかの実施態様において、処置には、手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、緩和ケア、運動が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７０】
本明細書において、語句「処置レジメン」は、必要とする対象（例えば、病理学により診断された対象）に提供される処置の種類、投与量、スケジュールおよび／または処置期間を規定する処置計画を指す。選択される処置レジメンは最良の臨床結果（例えば病理の完治）をもたらすと予想される積極的なレジメンであり得、または病理の症状を軽減し得るが病理の不完全な治癒をもたらすより中程度のレジメンであり得る。場合により、処置レジメンは対象への不快感または有害な副作用（例えば、健常細胞または組織への損傷）を伴い得ることが理解される。処置の種類には、外科的介入（例えば、病変、疾患細胞、組織または器官の除去）、細胞補充療法、局所または全身の様式における治療薬（例えば、受容体アゴニスト、アンタゴニスト、ホルモン、化学療法物質）の投与、外部線源（例えば外部ビーム）および／または内部線源（例えば小線源療法）を用いた放射線療法への曝露、および／またはそれらの任意の組合せが含まれ得る。投与量、スケジュールおよび処置期間は病理の重症度および選択された処置の種類に応じて様々であり得、当業者は投与量、スケジュールおよび処置期間により処置の種類を調整できる。
【０１７１】
いくつかの実施態様において、処置には、限定されないが、フルオロウラシル、カペシタビン、オキサリプラチン、イリノテカン、ＵＦＴ、ＦＯＬＦＯＸ、ＦＯＬＦＯＸＩＲＩおよびＦＯＬＦＩＲＩ、抗血管新生薬（ベバシズマブなど）、ならびに上皮増殖因子受容体阻害剤（例えばセツキシマブおよびパニツムマブ）が含まれる。
【０１７２】
７．本発明の利点
特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明は少なくとも以下の利点を有する：
（１）中国人集団におけるＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のプロモーター領域の詳細なメチル化ＣｐＧ部位が提供され、これらはＣＲＣおよび／またはＡＡを検出するためのバイオマーカーであり得る。
（２）従来の製品は白人集団を対象としているのに対し、本発明は中国人集団に特異的なメチル化ＣｐＧ部位を標的としているため、本キットはｍｔ−ｓＤＮＡに基づく他の類似の製品（Ｃｏｌｏｇｕａｒｄ（登録商標）など）よりも中国人集団におけるＣＲＣおよびＡＡの検出に適している。
（３）ＣＲＣ検出の感度および特異度は、ｍｔ−ｓＤＮＡに基づく他の類似の製品と比較して高い。
（４）ＡＡ検出の感度および特異度は、ｍｔ−ｓＤＮＡに基づく他の類似の製品と比較して著しく向上している。
（５）本方法は非侵襲的であり、在宅での試料採取が容易であるため、患者の良好なコンプライアンスをもたらし、ＣＲＣおよびＡＡのスクリーニング方法として広く利用され得る。本方法は、アジア人集団におけるＣＲＣによる発症率および死亡率を減少させる。
【実施例】
【０１７３】
実施例１
中国のＣＲＣおよびＡＡの集団におけるそれぞれＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のプロモーター領域のメチル化ＣｐＧ部位の発見。
（１）試料収集
大腸内視鏡検査によって確認されたＣＲＣおよびＡＡを有する患者から計１９１個の大腸ＦＦＰＥ組織試料を収集し、これは５０個の大腸がん組織および４９個の対となる隣接正常組織、４６個の腺腫がん組織および４６個の対となる補助的な正常組織を含んでいた。
【０１７４】
（２）ＤＮＡ抽出
ゲノムＤＮＡを、ＴａＫａＲａ ＭｉｎｉＢＥＳＴ ＦＦＰＥ ＤＮＡ抽出キット（カタログ番号：９７８２）を用いてＦＦＰＥ試料から抽出した。詳細な操作の段階を以下に記載する：
ｉ．滅菌メスで３０ｍｇのパラフィン切片組織をスクラップ(scrap)し、余分なパラフィンを除去する。
ｉｉ．パラフィン切片組織を１．５ｍＬの遠心管に入れ、５００μＬの緩衝液ＤＰを添加し、８０℃の水中で１分間混合およびインキュベートした後、１０秒間ボルテックスする。１８０μＬの緩衝液ＧＬを添加し、ボルテックスする。
ｉｉｉ．混合物を室温において１２，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した後、溶液が２層（上側の油相、下側の水相）に形成された。下側の水相に２０μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）および１０μＬのＲＮａｓｅ（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、ピペットで上下に穏やかに十分に混合する。層を乱さないように注意する。その後、５６℃で１時間水浴する。
ｉｖ．前の段階の溶液を９０℃で３０分間インキュベートし、室温まで冷却した。次いで、溶液に２００μＬの緩衝液ＧＢおよび２００μＬの１００％エタノールを添加し、１０秒間ボルテックスする。室温において１２，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、溶液が２層（上側の油相、下側の水相）に形成された。
ｖ．スピンカラムを採取管に入れ、前の工程の下側の水相をスピンカラムに添加する。層を乱さないように注意し、室温において１２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した後、廃棄物を捨てる。
ｖｉ．スピンカラムに５００μＬの緩衝液ＷＡを添加し、室温において１２，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した後、廃棄物を捨てる。
ｖｉｉ．スピンカラムに５００μＬの緩衝液ＷＢを添加し、室温において１２，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した後、廃棄物を捨てる。これを１回繰り返す。
ｖｉｉｉ．スピンカラムを採取管に入れ、室温において１２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離する。
ｉｘ．新しい１．５ｍＬの遠心管にスピンカラムを入れ、スピンカラム膜の中心に５０〜１００μＬの滅菌水または溶出緩衝液を添加し、室温で５分間放置する。
ｘ．室温において１２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＤＮＡを溶出させる。
ｘｉ．溶出したＤＮＡをＮａｎｏｄｒｏｐ２０００蛍光光度計で定量し、使用するために−２０℃で保存する。
【０１７５】
（３）ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧアイランドの予測および増幅産物の配列決定のためのプライマー設計。
ｉ．ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧアイランドの予測。
ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のプロモーター配列をダウンロードし、これは転写開始部位（ＴＳＳ）および５’ＵＴＲ領域から約１０００〜１５００ｂｐ上流のＤＮＡ配列を含んでいた。これらの配列のＣｐＧアイランドを、ＭｅｔｈＰｒｉｍｅｒソフトウェア（ｗｗｗ．ｕｒｏｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒ／）を用いて予測した。図１Ａ〜図１Ｄに示されるように、ＢＭＰ３遺伝子の３つのＣｐＧアイランドのうち２つの大きなＣｐＧアイランドは、ＴＳＳおよび５’ＵＴＲ領域全体から約４００ｂｐ上流に位置しており（ｃｈｒ４：８１９５１７５２−８１９５２７６０）、ＮＤＲＧ４遺伝子の唯一のＣｐＧアイランドは、ＴＳＳおよび部分的な５’ＵＴＲ領域から約５００ｂｐ上流に位置していた（ｃｈｒ１６：５８４９７０６１−５８４９７９３８）。ヒト参照ゲノムの構築はＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９である。
【０１７６】
ｉｉ．ＢＭＰ３遺伝子およびＮＤＲＧ４遺伝子の予測されるＣｐＧアイランドの配列を増幅するためのプライマー設計。
増幅する配列の長さおよび配列決定の読み取りの長さに基づいて、ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子についてそれぞれ４組および５組のプライマーを設計した。２つの遺伝子のＣｐＧアイランドを完全に配列決定できるように、隣接する増幅産物間にはできるだけ多くの重複がある。２つの遺伝子のプライマーを表１に示し、２つの遺伝子の増幅産物の相対的な位置を図１Ａ〜図１Ｄに示す。
表１ ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子の増幅産物の配列決定のためのプライマー
【表５】
2021526370.tif 000007
【０１７７】
ＤＮＡ試料を以下に記述するように重亜硫酸処理した。
（４）重亜硫酸処理
ｉ．抽出したＤＮＡを室温で放置して解凍し、ＤＮＡ濃度を２０ｎｇ／μＬに希釈する。４０μＬの希釈したＤＮＡを１．５ｍＬの遠心管に添加し、４μＬの３Ｍ ＮａＯＨ溶液を添加し、４２℃で２０分間インキュベートする。
ｉｉ．４００μＬの変換溶液を添加して混合し、暗所において５０℃で１６時間インキュベートする。
ｉｉｉ．５５０μＬの結合溶液を添加して混合し、溶液をＤＮＡ精製カラムに移す。１３，０００ｒｐｍで９０秒間遠心分離し、廃棄物を捨てる。再度３分間遠心分離し、廃棄物を捨てる。
ｉｖ．６００μＬの９０％エタノールをＤＮＡ精製カラムに添加し、１３，０００ｒｐｍで９０秒間遠心分離し、廃棄物を捨てる。再度１３，０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離する。
ｖ．３００μＬの脱硫化溶液（０．３Ｍ ＮａＯＨの９０％エタノール溶液）をＤＮＡ精製物に添加し、室温で３０分間放置する。１３，０００ｒｐｍで９０秒間遠心分離し、廃棄物を捨てる。
ｖｉ．６００μＬの９０％エタノールを添加し、１３，０００ｒｐｍで９０秒間遠心分離し、廃棄物を捨てる。この手順を１回繰り返し、再度１３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離する。
ｖｉｉ．ＤＮＡ精製カラムを新しい１．５ｍＬの遠心管に入れ、４０μＬの溶出液を添加する。遠心管を５０℃で３０分間インキュベートし、１３，０００ｒｐｍで９０秒間遠心分離する。変換したＤＮＡ溶液を使用のために−２０℃で保存する。
【０１７８】
（５）ライブラリーの調製および増幅産物の配列決定
（ａ）マルチプレックスＰＣＲ増幅
ｉ．ＰＣＲマスター混合物を以下のように調製する：
表２
【表６】
2021526370.tif 000008
ｉｉ．混合物を穏やかにボルテックスし、そのうち４０μＬを各ＰＣＲチューブにピペットし、次いで１０μＬの重亜硫酸処理したＤＮＡを添加する。
ｉｉｉ．穏やかにボルテックスし、ＰＣＲ増幅を以下のように行った：１サイクルの９５℃での１５分間の変性、３５サイクルの９４℃での３０秒間の変性、５５℃での９０秒間のアニールおよび７２℃での９０秒間の伸長、１サイクルの７２℃での１０分間の伸長、ならびに最後の４℃での時間の制限のない放置。
ｉｖ．５μＬのＰＣＲ産物を６Ｘローディングバッファー（TakaRa、カタログ番号：９１５６）と混合し、ＤＬ２０００ ＤＮＡマーカー（TakaRa、カタログ番号：３４２７Ｑ）の対照とともに１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルにロードし、１２０Ｖで４０分間電気泳動した。
ｖ．非特異的な増幅があった場合、キットの説明書（QIAGEN、カタログ番号：２８７０４）に従って電気泳動後に残りの４５μＬのＰＣＲ産物を回収する必要があった。
【０１７９】
（ｂ）ＰＣＲ産物の精製および定量化
ＰＣＲ産物を、キットの説明書（QIAGEN、カタログ番号：２８００４）に従ってＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をＱｕｂｉｔ（商標） ｄｓＤＮＡ ＢＲアッセイキット（カタログ番号：Ｑ３２８５０）を用いて定量した。
【０１８０】
（ｃ）アダプター連結
アダプターをＮＥＢＮｅｘｔ Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（NEB、カタログ番号：Ｅ６０５６Ｌ）を用いて精製したＰＣＲ産物に連結し、反応混合物を以下のように調製した：
表３．アダプター連結のための反応混合物
【表７】
2021526370.tif 000009
３０μＬの混合物を各ＰＣＲチューブに添加し、２０μＬの精製したＰＣＲ産物をそれぞれ添加する。溶液を穏やかに混合し、２０℃で１５分間インキュベートし、４℃で１０分間維持した。
【０１８１】
（ｄ）連結産物の精製
ｉ．Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭｐｕｒｅ ＸＰビーズ（Beckman、カタログ番号：Ａ６３８８２）を使用するために室温に置く。
ｉｉ．ＰＣＲチューブを２０℃において２８０ｇで１分間遠心分離し、５０μＬの連結産物を新しい９６ウェルＰＣＲプレートに移す。
ｉｉｉ．ＡＭｐｕｒｅ ＸＰビーズを３０秒間ボルテックスして均一に分散させ、５６μＬのビーズをＰＣＲプレートの各ウェルに添加する。混合物を穏やかに１０回ピペットして混合し、室温で５分間維持する。
ｉｖ．９６ウェルＰＣＲプレートを９６ウェル磁気プレート上に置き、上清が透明になるまで２分間維持した。９６ウェルＰＣＲプレートを９６ウェル磁気プレート上に維持し、上清を除去し、各ウェルに新たに調製した２００μＬの８０％エタノールを添加し、室温で３０秒間インキュベートし、上清を除去する。
ｖ．９６ウェルＰＣＲプレートを９６ウェル磁気プレート上に維持し、各ウェルに新たに調製した２００μＬの８０％エタノールを添加する。次いで、室温で３０秒間インキュベートする。上清を捨て、残留エタノールを１０μＬピペットで除去する。
ｖｉ．９６ウェルＰＣＲプレートを磁気プレート上に維持し、ビーズを１０分間自然乾燥させる。
ｖｉｉ．９６ウェルＰＣＲプレートを磁気プレートから取り出し、９６ウェルプレートの各ウェルに２７．５μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）を添加する。ビーズが完全に分散するまでビーズおよびＴｒｉｓを穏やかに上下に１０回ピペットして混合する。プレートを室温で２分間維持する。
ｖｉｉｉ．９６ウェルＰＣＲプレートを磁気プレート上に置き、上清が透明になるまで２分間放置する。２５μＬの上清を新たなＰＣＲチューブにピペットし、使用するために−２０℃で保存する。
【０１８２】
（ｅ）ＰＣＲ増幅および産物の精製
ＰＣＲマスター混合物を以下のように調製し、穏やかに混合した。各ＰＣＲチューブに４０μＬの混合物を添加し、５μＬの精製した連結産物を添加する。
表４．ＰＣＲ反応混合物
【表８】
2021526370.tif 000010
ＰＣＲチューブを穏やかにボルテックスし、短時間遠心分離し、以下の条件でＰＣＲ反応を行う：１サイクルの９８℃での３０秒間の変性、８〜１５サイクルの９８℃での１０秒間の変性および６５℃での７５秒間の伸長、１サイクルの６５℃での５分間の変性、ならびに最後の４℃での維持。ＰＣＲ産物を、（ｄ）連結産物の精製に従って精製した。
【０１８３】
（ｆ）ライブラリーの検出および配列決定
精製したＰＣＲ産物の濃度およびサイズ分布を、それぞれＱｕｂｉｔ（商標） ｄｓＤＮＡ ＢＲアッセイキット（カタログ番号：Ｑ３２８５０）およびＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ装置を用いて分析した。ライブラリーを等モル濃度でプールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２５００上でＰＥ１２５の読み取り長さで配列決定した。
【０１８４】
（ｇ）配列データ解析
生データを試料のインデックスに従って逆多重化し、シーケンシングの読み取りをＳＨＲｉＭＰ Ｖ２．０４ソフトウェアを用いてＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４の参照遺伝子配列にマッピングした。マッピングの結果に基づいてメチル化ＣｐＧ部位を同定した。最終的に、ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子の２６個および３９個のＣｐＧ部位が隣接する正常組織と比較してＣＲＣおよびＡＡ組織において高メチル化されている（ｐ＜０．０５）ことが見出され、これにより、これらのメチル化されたＣｐＧ部位がＣＲＣおよびＡＡの早期診断のためのＤＮＡバイオマーカーとなり得ることが示された。
表５ ＣＲＣ組織および隣接する正常組織におけるＢＭＰ３遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化の頻度。
【表９】
2021526370.tif 000011
表６ ＡＡ組織および隣接する正常組織におけるＢＭＰ３遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化の頻度。
【表１０】
2021526370.tif 000012
表７ ＣＲＣ組織および隣接する正常組織におけるＮＤＲＧ４遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化の頻度。
【表１１−１】
2021526370.tif 000013
【表１１−２】
2021526370.tif 000014
表８ ＡＡ組織および隣接する正常組織におけるＮＤＲＧ４遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化の頻度。
【表１２】
2021526370.tif 000015
【０１８５】
実施例２
種々の人種間におけるＣＲＣに関連するＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子の差次的なメチル化ＣｐＧ部位の比較
本発明者らはＴＣＧＡデータベースにおけるＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化マイクロアレイデータ（Ｉｌｌｕｍｉｎａヒトメチル化４５０データ）を分析し、白人集団とアジア人集団との間でＮＤＲＧ４遺伝子のプロモーター領域において有意に異なる５つのメチル化ＣｐＧ部位があることを見出した（図２および表９）。差次的なメチル化ＣｐＧ部位をさらに検証するため、中国における１０６人のＣＲＣおよびＡＡ患者から組織および血液試料を採取した。ＤＮＡを抽出し、重亜硫酸処理した。ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のプロモーター領域を増幅し、配列決定した。本発明者らは配列データを解析し、実際にアジア人集団の高メチル化ＣｐＧ部位はＴＣＧＡデータベースにおける白人集団のものとは異なっており、高メチル化ＣｐＧ部位はＣＲＣ組織試料とＡＡ組織試料との間で異なっていることを見出した。これらの種々のメチル化ＣｐＧ部位に従って、本発明者らはアジア人集団（例えば中国人集団）におけるＣＲＣおよびＡＡのスクリーニングに特異的な検出キットを開発した。
表９ 白人集団とアジア人集団におけるＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化ＣｐＧ部位の差異。
【表１３】
2021526370.tif 000016
【０１８６】
実施例３
ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のためのプライマーおよびプローブのスクリーニング
（１）ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のプライマーおよびプローブの設計および選択
ｑＰＣＲプライマーおよびプローブを、ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化ＣｐＧ部位に基づいて設計した。３組の好ましいプライマーおよびプローブを同定した。好ましいプライマーおよびプローブを、陽性対照および陰性対照を伴ってＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子の他の数種の候補プライマーおよびプローブと比較する。プライマーおよびプローブの情報を表１０に示す。
表１０ 好ましいおよび残りのプライマーおよびプローブの情報
【表１４】
2021526370.tif 000017
【０１８７】
（２）好ましいプライマーおよびプローブのＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子の陽性対照および陰性対照を含む対照との比較。
種々のメチル化の割合を有する標準試料を、ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のそれぞれの陰性対照ＤＮＡに陽性対照ＤＮＡを種々の割合で添加することによって形成した（表１１）。ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のそれぞれの好ましいプライマーおよびプローブならびに対照プライマーおよびプローブを用いて標準試料ＤＮＡを増幅することにより、分析感度を比較した。ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のそれぞれの好ましいプライマーおよびプローブならびに対照プライマーおよびプローブを用いてＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子の陰性対照ＤＮＡを増幅することにより、分析特異度を比較し、反応物当たりの陰性対照ＤＮＡの量は１０４コピー、１０５コピー、１０６コピー、１０７コピーおよび１０８コピーであった。
表１１ ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子の標準試料
【表１５】
2021526370.tif 000018
【０１８８】
マスター混合物を表５のように調製し、定量ＰＣＲ反応条件は、最初の９５℃での１分間の変性、次いで５０サイクルの９５℃での２０秒間の変性および６０℃での１分間の伸長である。
表１２ メチル化ｑＰＣＲの試薬の終濃度
【表１６】
2021526370.tif 000019
【０１８９】
表１３および図３Ａ〜図３Ｌに示されるように、１／１０４メチル化ＤＮＡは、３組の好ましいプライマーおよびプローブを用いて検出できるが、３組の対照では検出できない。
【０１９０】
表１３および図３Ａ〜図３Ｌに示されるように、本発明の好ましい３組のＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４プライマーおよびプローブは１万分の１という低いメチル化レベルを安定に検出できるが、３組の比較プライマーおよびプローブは１万分の１のメチル化レベルを検出できない。
表１３ ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子の好ましいプライマーおよびプローブならびに対照プライマーおよびプローブの分析感度の比較。
【表１７】
2021526370.tif 000020
Y：検出、N：未検出
【０１９１】
ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４の分析感度の増幅曲線を、対照群と比較して好ましい組合せのそれぞれについて図３Ａ〜図３Ｌに示す。
【表１８】
2021526370.tif 000021
【０１９２】
表１４および図４Ａ〜図４Ｌに示されるように、ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子の３組の好ましいプライマーおよびプローブは種々の濃度の非メチル化ＤＮＡに対して増幅シグナルを有しないが、比較プライマーおよびプローブは種々の程度の非特異的な増幅を示す。
表１４ 好ましいプライマーおよびプローブと対照プライマーおよびプローブとの間の分析特異度の比較。
【表１９】
2021526370.tif 000022
Y:増幅なし、N:非特異的な増幅
ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４の分析特異度の増幅曲線
【表２０】
2021526370.tif 000023
【０１９３】
実施例４
好ましいメチル化プライマーおよびプローブならびに比較のメチル化プライマーおよびプローブの検証を、ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子の便試料を用いて実施する。
８１個の便試料中のＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化レベルを、３組の好ましいプライマーおよびプローブならびに比較プライマーおよびプローブを用いて検出した。３つの比較プライマーおよびプローブは以下である：
比較１：ＢＭＰ３順方向プライマー配列番号２１、ＢＭＰ３逆方向プライマー配列番号２２、およびＢＭＰ３プローブ配列番号２３；ＮＤＲＧ４順方向プライマー配列番号２４、ＮＤＲＧ４逆方向プライマー配列番号２５、およびＮＤＲＧ４プローブ配列番号２６；
比較２：ＢＭＰ３順方向プライマー配列番号２７、ＢＭＰ３逆方向プライマー配列番号２８、およびＢＭＰ３プローブ配列番号２９；ＮＤＲＧ４順方向プライマー配列番号２４、ＮＤＲＧ４逆方向プライマー配列番号３０、およびＮＤＲＧ４プローブ配列番号２６；
比較３：ＢＭＰ３順方向プライマー配列番号３１、ＢＭＰ３逆方向プライマー配列番号３２、およびＢＭＰ３プローブ配列番号３３；ＮＤＲＧ４順方向プライマー配列番号２４、ＮＤＲＧ４逆方向プライマー配列番号３４、およびＮＤＲＧ４プローブ配列番号２６。
【０１９４】
便試料の情報を表１５に示す。
表１５ ８１個の便試料の統計
【表２１】
2021526370.tif 000024
【０１９５】
便ＤＮＡを、以下に記載される方法に従って試料から抽出した。
（１）便ＤＮＡの抽出
ｉ．４〜６ｇの便試料に４０ｍＬの可溶化液を添加し、十分にボルテックスした後、５０℃で１６時間インキュベートする。
ｉｉ．次いで、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。遠心分離前の秤量に注意する。遠心分離終了後、遠心管を慎重に取り出し、激しく振らないようにする。
ｉｉｉ．９ｍＬの上清を新たな５０ｍＬの遠心管にピペットし、１ｍＬの抽出アジュバント、６０μＬの磁気ビーズ、および１０ｍＬのイソプロパノールを添加する。１０秒間ボルテックスし、６５℃で２０分間インキュベートする。インキュベート中、５分ごとに１回上下に混合する。
ｉｖ．インキュベーション後、５０ｍＬの遠心管を磁気スタンド上に置き、上清が透明になるまで３分間安定に維持し、上清を捨てる。
ｖ．５０ｍＬの遠心管を磁気スタンドから取り出し、１２ｍＬの洗浄溶液を添加する。磁気ビーズが遠心管のウェルから離れるまでボルテックスし、３分間安定に維持する。５０ｍＬの遠心管を磁気スタンドに戻し、上清が透明になるまで３分間静置し、上清を捨てる。
ｖｉ．１５ｍＬの８０％エタノール溶液を添加し、ビーズが遠心管のウェルから離れるまでボルテックスし、３分間安定に維持する。遠心管を磁気スタンドに戻し、上清が透明になるまで３分間安定に維持し、上清を捨てる。
ｖｉｉ．前の手順を１回繰り返す。
ｖｉｉｉ．底部の残液をピペットし、遠心管を開いたまま６５℃で５分間インキュベートする。ビーズが乾燥するまで遠心管を磁気スタンドから取り出し、１．５ｍＬの予熱した溶離液Ｉを添加する。ビーズをウェルから溶離液Ｉに１０００μＬのピペットでピペットし、混合物を２ｍＬの遠心管に移して蓋を閉め、６５℃で５分間インキュベートする。
ｉｘ．１３０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、６００μＬの上清を新たな１．５ｍＬのチューブにピペットし、６００μＬの結合溶液を添加して十分にボルテックスする。
ｘ．６００μＬの上記混合物をＤＮＡ精製カラムに移し、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、廃棄物を捨てる。
ｘｉ．残りの混合物を前の手順で処理し、１３，０００で２分間遠心分離する。
ｘｉｉ．ＤＮＡ精製カラムに６００μＬの９０％エタノール溶液を添加し、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、廃棄物を捨てる。
ｘｉｉｉ．前の手順を２回繰り返す。
ｘｉｖ．１３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、ＤＮＡ精製カラムを新たな１．５ｍＬの遠心管に入れる。ＤＮＡ精製カラムを開き、６５℃で５分間インキュベートして乾燥させる。
ｘｖ．ＤＮＡ精製カラムの中央に１００μＬの予熱した溶離液ＩＩを滴下し、蓋をして６５℃で５分間インキュベートする。１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離する。溶出したＤＮＡ溶液を取得し、使用するために２〜８℃で保存する。長期保存は−２５℃〜−１５℃で維持すべきである。
【０１９６】
（２）重亜硫酸処理
詳細な操作手順は実施例３に従う。
【０１９７】
（３）ｑＰＣＲ
ＱＰＣＲマスター混合物を以下のように調製した。
表１６
【表２２】
2021526370.tif 000025
ｑＰＣＲ反応条件は、１サイクルの９５℃での２分間の変性、ならびに５０サイクルの９５℃での２０秒間の変性および９５℃での１分間の伸長である。Ｂ２Ｍ遺伝子はｑＰＣＲ反応の品質管理のための参照遺伝子である。
【０１９８】
（４）結果
表１７に示されるように、ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子の３組の好ましいプライマーおよびプローブを用いた８１個の便試料におけるＣＲＣおよびＡＡ検出の感度は、それぞれ最大で８５．０％〜９５．０％（ＢＭＰ３メチル化によるＣＲＣ）、６６．７％〜７３．３％（ＢＭＰ３メチル化によるＡＡ）、９０．０％〜９５．０％（ＮＤＲＧ４メチル化によるＣＲＣ）、および７３．３％〜８６．７％（ＮＤＲＧ４メチル化によるＡＡ）である。さらに、ＢＭＰ３メチル化データまたはＮＤＲＧ４メチル化データのいずれかを用いたＣＲＣおよびＡＡ検出の特異度は、いずれも約９７．８％〜１００．０％である。
【０１９９】
しかしながら、ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子の３組の比較プライマーおよびプローブを用いた８１個の便試料におけるＣＲＣおよびＡＡ検出の感度は、それぞれ８５．０％〜９０．０％（ＢＭＰ３メチル化によるＣＲＣ）、４６．７％〜６０．０％（ＢＭＰ３メチル化によるＡＡ）、９０．０％〜９５．０％（ＮＤＲＧ４メチル化によるＣＲＣ）、および６６．７％〜７３．３％（ＮＤＲＧ４メチル化によるＡＡ）である。また、ＢＭＰ３メチル化データまたはＮＤＲＧ４メチル化データのいずれかを用いたＣＲＣおよびＡＡ検出の全体的な特異度は、それぞれ最大で約９１．３％〜９３．５％および９３．５％〜９５．７％である。
【０２００】
臨床試料の検出（特にＡＡ検出）において、好ましいプライマーおよびプローブが比較プライマーおよびプローブよりも優れていることがわかる。
表１７ 臨床試料の検出結果の統計
【表２３−１】
2021526370.tif 000026
【表２３−２】
2021526370.tif 000027
表１８ ８１個の便試料の検出結果
【表２４−１】
2021526370.tif 000028
【表２４−２】
2021526370.tif 000029
【表２４−３】
2021526370.tif 000030
注釈 U：未検出
【０２０１】
実施例５
ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化プライマーおよびプローブの組合せのスクリーニング
（１）便ＤＮＡの抽出
便ＤＮＡを実施例３のプロトコルに従って抽出する。
【０２０２】
（２）ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化検出
ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のプライマーおよびプローブの組合せを以下に示す。実施例３の手順に従って、９個の組合せをそれぞれ用いてｑＰＣＲを行った。
表１９．プライマーおよびプローブの組合せ
【表２５】
2021526370.tif 000031
ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のプライマーおよびプローブの９個の組合せの配列は以下である：
表２０．組合せにおけるプライマーおよびプローブの配列
【表２６】
2021526370.tif 000032
【０２０３】
反応に用いたＱＰＣＲマスター混合物は以下である：
表２１．ＢＭＰ３／ＮＤＲＧ４のためのＱＰＣＲマスター混合物
【表２７】
2021526370.tif 000033
【０２０４】
ｑＰＣＲ反応条件は、１サイクルの９５℃での２分間の変性、ならびに５０サイクルの９５℃での２０秒間の変性および６０℃での１分間の伸長である。
【０２０５】
（３）ＫＲＡＳ遺伝子のバリアントの検出
ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２および１３において７つの変異ホットスポットが検出された。７つの変異体は、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２ＡおよびＧ１３Ｒであり、これらのプライマーおよびプローブの配列は表２２である。
表２２ ＫＲＡＳ遺伝子の７つの変異を検出するためのプライマーおよびプローブ
【表２８】
2021526370.tif 000034
反応に用いたＱＰＣＲマスター混合物は以下である：
表２３．ＫＲＡＳのためのＱＰＣＲマスター混合物
【表２９】
2021526370.tif 000035
【０２０６】
ＱＰＣＲ反応条件は、１サイクルの９５℃での５分間の変性、ならびに４５サイクルの９５℃での１５秒間の変性、７１℃での６０秒間のアニール、および５５℃での５０秒間の伸長である。
【０２０７】
ｑＰＣＲの反応の品質管理を、ＡＣＴＢを参照遺伝子として用いて行った。
【０２０８】
（４）便中ヘモグロビン検査
便中ヘモグロビンを免疫学的便潜血検査（ＦＩＴ）により検出し、結果は陽性または陰性である。
【０２０９】
（５）式を用いたスコアの生成
ＢＭＰ３、ＮＤＲＧ４およびＫＲＡＳ遺伝子のｑＰＣＲ検出のＣｔ値、ならびに便中ヘモグロビン検査の陽性結果および陰性結果を以下のロジスティック回帰式に入れる：
Ｐ＝ｅＫ／（１＋ｅＫ）
【０２１０】
ここで、Ｐは総合指数、Ｋ＝＝ａ＊ΔＣｔ１＋ｂ＊ΔＣｔ２＋ｃ＊ΔＣｔ３＋ｄ＊ＦＩＴ＋Ｘ、ｅは自然定数、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、Ｘは臨床定数である。ΔＣｔ１、ΔＣｔ２およびΔＣｔ３は、標的遺伝子のＣｔ値から参照遺伝子のＣｔ値を差し引いた値である。
【０２１１】
Ｐ値が所定の閾値以上である場合、検査結果は陽性であり、そうでなければ陰性である。陽性の結果は、対象がＣＲＣまたはＡＡを有する可能性があることを示す。
【０２１２】
（６）検査結果
実施例３の８１個の便試料を検出し、ＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４遺伝子のプライマーおよびプローブの種々の組合せの結果を表２４に示す。
表２４ ８１個の便試料の検出結果
【表３０】
2021526370.tif 000036
【０２１３】
以下のことがわかった：（１）組合せの番号４、５および７は、他の６つの組合せよりも優れている。検査したすべてのプライマーおよびプローブが好ましいものであり、他のプライマーおよびプローブよりも優れていることを考慮すると（実施例３参照）、この３つの特定の組合せはＢＭＰ３およびＮＤＲＧ４プライマー／プローブのあらゆる公知の組合せよりも優れている。（２）ＢＭＰ３、ＮＤＲＧ４、ＫＲＡＳ遺伝子および便中ヘモグロビン検出を含むＣＲＣおよびＡＡ検出のための本キットの感度および特異度は、ＢＭＰ３またはＮＤＲＧ４の単一遺伝子のメチル化検出のためのキットの感度および特異度よりも著しく優れている。（３）アジア人集団（例えば中国人集団）におけるＣＲＣ検出のための本キットの感度および特異度は、既存の類似の製品（Ｃｏｌｏｇｕａｒｄ（登録商標）など）よりも明らかに優れている。（４）アジア人集団（例えば中国人集団）におけるＡＡ検出のための本キットの感度および特異度は、既存の類似の製品（Ｃｏｌｏｇｕａｒｄ（登録商標）など）よりも著しく優れている。
【０２１４】
本明細書において引用されたあらゆる特許、特許出願および刊行物の開示（特許請求の範囲、図および／または図面を含む）は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２１５】
別段の規定がない限り、本明細書におけるあらゆる技術用語および科学用語は、本発明が属する分野における当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および物質と類似または同等である任意の方法および物質が本発明の実施または試験に使用され得るが、好ましい方法および物質が本明細書に記載されている。引用されるあらゆる刊行物、特許および特許出願は、あらゆる目的のためにその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２１６】
本明細書で議論された刊行物は、本願の出願日より前の開示のみを目的として提供される。本明細書のいかなる記述も、本発明が先行発明を理由にそのような刊行物に先行する権利を有していないことを認めるものと解釈されるものではない。
【０２１７】
本発明はその特定の実施態様に関連して記載されているが、さらなる変更が可能であり、本願は一般に本発明の原理に従い、かつ本発明が属する分野における公知または慣例の範囲内であり、先述の本質的な特徴に適用され得、添付の特許請求の範囲に従うような本開示からの逸脱を含む、本発明のあらゆる変形、使用または適合を包含することが意図されることが理解される。
【図１Ａ】
2021526370.tif 000037
【図１Ｂ】
2021526370.tif 000038
【図１Ｃ】
2021526370.tif 000039
【図１Ｄ】
2021526370.tif 000040
【図２Ａ】
2021526370.tif 000041
【図２Ｂ】
2021526370.tif 000042
【図３Ａ】
2021526370.tif 000043
【図３Ｂ】
2021526370.tif 000044
【図３Ｃ】
2021526370.tif 000045
【図３Ｄ】
2021526370.tif 000046
【図３Ｅ】
2021526370.tif 000047
【図３Ｆ】
2021526370.tif 000048
【図３Ｇ】
2021526370.tif 000049
【図３Ｈ】
2021526370.tif 000050
【図３Ｉ】
2021526370.tif 000051
【図３Ｊ】
2021526370.tif 000052
【図３Ｋ】
2021526370.tif 000053
【図３Ｌ】
2021526370.tif 000054
【図４Ａ】
2021526370.tif 000055
【図４Ｂ】
2021526370.tif 000056
【図４Ｃ】
2021526370.tif 000057
【図４Ｄ】
2021526370.tif 000058
【図４Ｅ】
2021526370.tif 000059
【図４Ｆ】
2021526370.tif 000060
【図４Ｇ】
2021526370.tif 000061
【図４Ｈ】
2021526370.tif 000062
【図４Ｉ】
2021526370.tif 000063
【図４Ｊ】
2021526370.tif 000064
【図４Ｋ】
2021526370.tif 000065
【図４Ｌ】
2021526370.tif 000066
【図５Ａ】
2021526370.tif 000067
【図５Ｂ】
2021526370.tif 000068
【図５Ｃ】
2021526370.tif 000069
【図５Ｄ】
2021526370.tif 000070
【図５Ｅ】
2021526370.tif 000071
【図５Ｆ】
2021526370.tif 000072
【図６Ａ】
2021526370.tif 000073
【図６Ｂ】
2021526370.tif 000074
【図６Ｃ】
2021526370.tif 000075
【図６Ｄ】
2021526370.tif 000076
【図６Ｅ】
2021526370.tif 000077
【図６Ｆ】
2021526370.tif 000078
【配列表】
2021526370000001.app
【国際調査報告】
2021526370.tif 000079
2021526370.tif 000080
2021526370.tif 000081