(57)【要約】  生物活性複合材料は、１つ以上の有機分子であって各有機分子は金属配位官能基を含む１つ以上の有機分子と、有機分子に結合した無機コアとを含む。無機コアは、１つ以上の金属を含む。金属は、貴金属及び／又は非貴金属であってもよい。非貴金属は、アルカリ、アルカリ土類、遷移、ポスト遷移、半金属材料であってもよい。有機分子と無機コアとは共有結合または非共有結合で結合している。
2021514367.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のセットの特性を有する１つまたは複数の有機分子であって、金属配位官能基を含む１つまたは複数の有機分子と、
前記有機分子に結合した無機コアであって、第２のセットの特性を有し、１つ以上の金属を含む無機コアと、
を含む生物活性複合材料であって、
前記金属は、貴金属および非貴金属からなる群のうちの１つから選択され、前記非貴金属は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、遷移金属、ポスト遷移金属、および半金属のうちの１つ以上を含み、
前記有機分子と無機コアとは、共有結合及び非共有結合のうちの１つを用いて結合し、
前記生物活性複合材料は、単独で、又は他の材料と組み合わせて使用されるか、又は標的表面上に堆積され、
前記第１のセットの特性を保持する前記１つまたは複数の有機分子が、前記結合の加水分解または前記無機コアの溶解を介して、前記生物活性複合材料から制御可能に放出される、
生物活性複合材料。
【請求項２】
前記生物活性複合材料の形成中に添加され、前記無機コアの前記第２のセットの特性を変化させる追加の反応成分をさらに含み、前記追加の反応成分がハロゲン（フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物）塩および遷移／アクチニド／ランタニド塩を含む、請求項１に記載の生物活性複合材料。
【請求項３】
１つ若しくは複数の飽和脂肪酸若しくはそれらの誘導体、１つ若しくは複数の不飽和脂肪酸若しくはそれらの誘導体、および／または飽和脂肪酸若しくはそれらの誘導体と不飽和脂肪酸およびそれらの誘導体との組み合わせに結合した前記無機コアを含む、請求項１に記載の生物活性複合材料。
【請求項４】
ヒトおよび他の哺乳動物細胞における炎症性サイトカインの発現を低下させるために使用される、請求項３に記載の生物活性複合材料。
【請求項５】
ヒトおよび他の哺乳動物細胞において消炎メディエーターの形成を誘導するために使用される、請求項３に記載の生物活性複合材料。
【請求項６】
微生物の増殖を抑制するために使用される、請求項３に記載の生物活性複合材料。
【請求項７】
微生物により形成されるバイオフィルムの形成を抑制するために使用される、請求項３に記載の生物活性複合材料。
【請求項８】
ヒトおよび他の哺乳動物細胞に付着させるために使用される、請求項３に記載の生物活性複合材料。
【請求項９】
ヒトおよび他の哺乳動物幹細胞、多能性細胞、歯髄細胞、および骨芽細胞におけるミネラルの形成および沈着を誘導するために使用される、請求項３に記載の生物活性複合材料。
【請求項１０】
標的表面上で使用するための生物活性組成物であって、
１つ以上の官能基であって１つ以上の金属配位官能基からなる１つ以上の官能基と、カルボン酸またはオルトリン酸またはヒドロキシル基、アミン、アミド、および窒素含有芳香族のうちの１つ以上とからなる１つ以上の有機分子の有機層であって、前記官能基は、アルキルホスフィンオキシド、アルキルホスホン酸、アルキルホスフィン、飽和および不飽和脂肪酸、およびそれらの誘導体のうちの１つ以上を含む、有機層と、
１つ以上の無機分子の無機コアであって、前記無機分子は、金属または金属の混合物を含み、前記金属は、貴金属および非貴金属からなる群から選択される、無機コアと、
前記有機層と前記無機コアとの間の化学結合と、
を含む、生物活性組成物。
【請求項１１】
前記非貴金属が、アルカリ金属、アルカリ土類金属、遷移金属、ポスト遷移金属および半金属からなる群から選択される１つ以上の金属を含む、請求項１０に記載の生物活性組成物。
【請求項１２】
前記金属が、酸化されるか、または、アニオン種と反応して、前記標的表面上に粒子として沈殿するかまたは堆積物を形成するカチオンから生成された、請求項１１に記載の生物活性組成物。
【請求項１３】
前記貴金属が、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕのうちの１つ以上からなる群から選択される１つ以上の金属を含む、請求項１０に記載の生物活性組成物。
【請求項１４】
前記金属が、還元されるか、または、アニオン種と反応して、前記標的表面上に粒子として沈殿するかまたは堆積物を形成する、請求項１３記載の生物活性組成物。
【請求項１５】
前記無機コアが、前記標的表面上の前記有機分子の制御された放出を提供する、請求項１０に記載の生物活性組成物。
【請求項１６】
前記無機コアが、ハロゲン塩および遷移／ランタニド塩からなる群から選択される追加の反応成分をさらに含む、請求項１０に記載の生物活性組成物。
【請求項１７】
１つのセットの生物学的特性を有する１つまたは複数の有機分子であって、金属配位官能基を含む１つまたは複数の有機分子と、
前記有機分子に結合した無機コアであって、１つ以上の金属を含む無機コアと、
を含む生物活性複合材料であって、
前記金属は、貴金属および非貴金属からなる群のうちの１つから選択され、前記非貴金属は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、遷移金属、ポスト遷移金属、および半金属のうちの１つ以上を含み、
前記有機分子及び無機コアは、共有結合及び非共有結合のうちの１つを用いて結合し、
前記生物活性複合材料は、単独で、または他の材料と組み合わせて使用されるか、または標的表面上に堆積されて、前記セットの生物学的特性を有する前記有機分子の制御された放出を提供する、
生物活性複合材料。
【請求項１８】
前記有機分子が、抗炎症剤の制御された放出を提供する、請求項１７に記載の生物活性複合材料。
【請求項１９】
前記有機分子が、抗菌剤の制御された放出を提供する、請求項１７に記載の生物活性複合材料。
【請求項２０】
前記有機分子が、再石灰化剤の制御された放出を提供する、請求項１７に記載の生物活性複合材料。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
現在、生体分子の標的送達（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）は、いくつかの因子によって妨げられている。生体分子は、それらの送達部位に長期間留まることはなく、可能な場合には複数の注射を必要とし、または一つの送達に限定される（手術部位など）。生体分子のカプセル化はそれらの放出を制御することができるが、それらが添加される修復材料の物理化学的特性を妨害することがある。標的表面に吸着した生体分子も同様の問題を示す。
【発明の概要】
【０００２】
有機分子の無機粒子の表面への共有結合／非共有結合が生じ、生物活性複合材料がその有機成分の生体機能性を保持する、新規な生物活性複合材料の同時または段階的プロセスによる配合（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）が開示される。また、この生物活性材料の合成方法および使用も開示される。
【０００３】
さらに、１つ以上の有機分子であって各有機分子は金属配位官能基（ｍｅｔａｌ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ）を含む１つ以上の有機分子と、有機分子に結合した無機コアとを含む生物活性複合材料が開示される。無機コアは、１つ以上の金属を含む。金属は、貴金属及び／又は非貴金属であってよい。非貴金属は、アルカリ、アルカリ土類、遷移、ポスト遷移、半金属材料であってよい。有機分子と無機コアとは、共有結合または非共有結合を用いて結合している。
【０００４】
さらに、標的表面上で使用するための生物活性組成物であって、１つ以上の官能基であって１つ以上の金属配位官能基からなる１つ以上の官能基と、カルボン酸またはオルトリン酸またはヒドロキシル基、アミン、アミド、および窒素含有芳香族のうちの１つ以上とからなる１つ以上の有機分子の有機層であって、前記官能基は、アルキルホスフィンオキシド、アルキルホスホン酸、アルキルホスフィン、飽和および不飽和脂肪酸、およびそれらの誘導体のうちの１つ以上を含む、有機層と；１つ以上の無機分子の無機コアであって、無機分子は、金属または金属の混合物を含み、金属は、貴金属および非貴金属からなる群から選択される、無機コアと；有機層と無機コアとの間の化学結合とを含む生物活性組成物が開示される。
【０００５】
さらに、１つのセットの特性を有する１つまたは複数の有機分子であって、金属配位官能基を含む１つまたは複数の有機分子と、有機分子に結合した無機コアであって、１つ以上の金属を含む無機コアと、を含む生物活性複合材料であって、金属は、貴金属および非貴金属からなる群のうちの１つから選択され、非貴金属は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、遷移金属、ポスト遷移金属、および半金属のうちの１つ以上を含み、有機分子および無機コアは、共有結合および非共有結合のうちの１つを使用して結合し、生物活性複合材料は、単独で、もしくは他の材料と組み合わせて使用されるか、または標的表面上に堆積され、前記セットの特性を保持する有機分子が、生物活性複合材料から、結合の加水分解または無機コアの溶解を介して制御可能に放出される、生物活性複合材料が開示される。生物活性複合材料は、無機分子の１つのセットの特性を変化させるために生物活性材料の形成中に添加される追加の反応成分をさらに含み、付加的な反応特性はハロゲン（フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物）塩および遷移／アクチニド／ランタニド塩を含む。
【０００６】
図面の説明
詳細な説明は、以下の図を参照しており、同一符号は、同一対象物を示す。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｄは、生物活性複合材料の合成計画例を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｄは、生物活性複合材料の合成計画例を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｄは、生物活性複合材料の合成計画例を示す。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｄは、生物活性複合材料の合成計画例を示す。
【０００８】
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、無機コアと結合した有機官能基との間の結合の溶解および加水分解の例を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｃは、無機コアと結合した有機官能基との間の結合の溶解および加水分解の例を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、無機コアと結合した有機官能基との間の結合の溶解および加水分解の例を示す。
【０００９】
【図３】図３は、生物活性複合材料のさらなる合成計画例を示す図である。
【００１０】
【図４】図４〜図１２は、本明細書に開示された生物活性複合材料の合成および組成を確認するための実験シリーズの確認を示す。
【図５】図４〜図１２は、本明細書に開示された生物活性複合材料の合成および組成を確認するための実験シリーズの確認を示す。
【図６】図４〜図１２は、本明細書に開示された生物活性複合材料の合成および組成を確認するための実験シリーズの確認を示す。
【図７】図４〜図１２は、本明細書に開示された生物活性複合材料の合成および組成を確認するための実験シリーズの確認を示す。
【図８】図４〜図１２は、本明細書に開示された生物活性複合材料の合成および組成を確認するための実験シリーズの確認を示す。
【図９】図４〜図１２は、本明細書に開示された生物活性複合材料の合成および組成を確認するための実験シリーズの確認を示す。
【図１０】図４〜図１２は、本明細書に開示された生物活性複合材料の合成および組成を確認するための実験シリーズの確認を示す。
【図１１】図４〜図１２は、本明細書に開示された生物活性複合材料の合成および組成を確認するための実験シリーズの確認を示す。
【図１２】図４〜図１２は、本明細書に開示された生物活性複合材料の合成および組成を確認するための実験シリーズの確認を示す。
【００１１】
【図１３】図１３〜図２１は、本明細書に開示された生物活性複合材料の抗炎症性組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図１４】図１３〜図２１は、本明細書に開示された生物活性複合材料の抗炎症性組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図１５】図１３〜図２１は、本明細書に開示された生物活性複合材料の抗炎症性組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図１６】図１３〜図２１は、本明細書に開示された生物活性複合材料の抗炎症性組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図１７】図１３〜図２１は、本明細書に開示された生物活性複合材料の抗炎症性組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図１８】図１３〜図２１は、本明細書に開示された生物活性複合材料の抗炎症性組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図１９】図１３〜図２１は、本明細書に開示された生物活性複合材料の抗炎症性組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図２０】図１３〜図２１は、本明細書に開示された生物活性複合材料の抗炎症性組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図２１】図１３〜図２１は、本明細書に開示された生物活性複合材料の抗炎症性組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【００１２】
【図２２】図２２〜図３０は、本明細書に開示された生物活性複合材料の抗菌性組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図２３】図２２〜図３０は、本明細書に開示された生物活性複合材料の抗菌性組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図２４】図２２〜図３０は、本明細書に開示された生物活性複合材料の抗菌性組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図２５】図２２〜図３０は、本明細書に開示された生物活性複合材料の抗菌性組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図２６】図２２〜図３０は、本明細書に開示された生物活性複合材料の抗菌性組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図２７】図２２〜図３０は、本明細書に開示された生物活性複合材料の抗菌性組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図２８】図２２〜図３０は、本明細書に開示された生物活性複合材料の抗菌性組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図２９】図２２〜図３０は、本明細書に開示された生物活性複合材料の抗菌性組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図３０】図２２〜図３０は、本明細書に開示された生物活性複合材料の抗菌性組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【００１３】
【図３１Ａ−３１Ｈ】図３１Ａ〜図３８は、本明細書に開示された生物活性複合材料のバイオミネラリゼーション（ｂｉｏｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図３１Ｉ−３１Ｌ】図３１Ａ〜図３８は、本明細書に開示された生物活性複合材料のバイオミネラリゼーション組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図３２Ａ−３２Ｊ】図３１Ａ〜図３８は、本明細書に開示された生物活性複合材料のバイオミネラリゼーション組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図３２Ｋ−３２Ｐ】図３１Ａ〜図３８は、本明細書に開示された生物活性複合材料のバイオミネラリゼーション組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図３３】図３１Ａ〜図３８は、本明細書に開示された生物活性複合材料のバイオミネラリゼーション組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図３４Ａ】図３１Ａ〜図３８は、本明細書に開示された生物活性複合材料の生物石灰化無機化組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図３４Ｂ】図３１Ａ〜図３８は、本明細書に開示された生物活性複合材料のバイオミネラリゼーション組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図３４Ｃ】図３１Ａ〜図３８は、本明細書に開示された生物活性複合材料のバイオミネラリゼーション組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図３５】図３１Ａ〜図３８は、本明細書に開示された生物活性複合材料の生物石灰化無機化組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図３６Ａ−３６Ｈ】図３１Ａ〜図３８は、本明細書に開示された生物活性複合材料のバイオミネラリゼーション組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図３７Ａ−３７Ｈ】図３１Ａ〜図３８は、本明細書に開示された生物活性複合材料のバイオミネラリゼーション組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【図３８】図３１Ａ〜図３８は、本明細書に開示された生物活性複合材料のバイオミネラリゼーション組成物としての有効性を確認するための実験シリーズの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
生体分子（生物活性物質）は、生物分析や疾患治療など、生物学において重要な機能を果たす。ある特定の用途は、癌を治療するために薬物の標的送達（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）を使用することを試みる。しかしながら、生体分子の現在の標的送達は、いくつかの因子によって妨げられる。生体分子は、それらの送達部位に長期間留まることはなく、可能な場合には複数の注射を必要とし、または一つの送達に限定される（手術部位など）。生体分子のカプセル化はそれらの放出を制御することができるが、それらが添加される修復材料の物理化学的特性を妨害することがある。標的表面に吸着した生体分子も同様の問題を示す。
【００１５】
現在の標的送達システムにおける欠陥に対処するために、本明細書において開示されるのは、無機コア（無機粒子）に共有結合／非共有結合で結合していてよく、共有結合の加水分解および／または無機コアの溶解（ｐＨ、存在する反応種および粒子組成／サイズ／表面積のような環境に依存する）を介して生物活性分子の放出を制御することができる１つ以上の生物活性有機分子から構成される生物活性複合材料である。無機コア組成物は、官能基の制御された放出を達成するために、および／またはそれが添加される修復材料と統合するために設計され得、かくして修復材料の物理化学的特性に対するその効果を制御し得る。さらに、一連の生物活性分子（それぞれ特定の目的を目標とするように設計された）の同時導入が可能である。
【００１６】
新規な生物活性複合材料の調製および配合の例も開示される。これらの材料は、有機分子または有機分子の混合物の金属カチオンまたは金属カチオンの混合物との共有および非共有結合によって形成される。有機分子は金属配位官能基を含んでいてもよい。金属配位官能基は、アルキルホスフィンオキシド、アルキルホスホン酸、アルキルホスフィン、飽和および不飽和脂肪酸およびそれらの誘導体、および／または、カルボン酸もしくはオルトリン酸もしくはヒドロキシル基、アミン、アミド、窒素含有芳香族を含有する有機分子であり得る。次に、金属カチオンまたは金属カチオンの混合物は、還元され（貴金属（ｎｏｂｌｅ  ｍｅｔａｌ）カチオンのみの場合：Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ）、酸化され（他のすべての金属カチオンの場合：アルカリ、アルカリ土類、遷移、ポスト遷移、半金属カチオンの場合、酸化性種が存在するとき）、またはＣＯ３２−、ＰＯ４３−などのアニオン種と反応し（カチオン種とアニオン種が存在し、結晶を形成することができるとき、すべての金属カチオンの場合）、標的表面上に、粒子として沈殿するか、または堆積物を形成する。粒子または堆積物は、無機コアおよび無機コアの表面に共有または非共有結合した１つまたは複数の有機層から構成されてもよい。
【００１７】
図１Ａは、生物活性複合材料の一般的な合成計画を示す。示されるように、金属配位官能基を有する有機分子は金属カチオンＭ＋と複合体を形成する。金属カチオンは、生物活性複合材料の無機コアを形成する。次いで、生物活性複合材料を、標的表面上に沈殿または堆積物を形成させてもよい（図示されない）。
【００１８】
図１Ｂ〜１Ｄは、貴金属カチオンの還元、非貴金属カチオンの酸化、および、カチオン種およびアニオン種が存在し、結晶を形成し得る場合の金属カチオンの反応に関する具体的な合成計画をそれぞれ示す。図１Ｂに示す貴金属還元の場合、無機コアは、使用される貴金属（Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ）から構成される。図１Ｃに示す非貴金属（ｎｏｎ−ｎｏｂｌｅ  ｍｅｔａｌ）カチオンの酸化の場合、無機コアは、（金属）ｘＯｙの一般式を有する金属酸化物から構成され、ここでｘおよびｙは化学量論係数である（例えばＣａＯ、ＴｉＯ２など）。図１Ｄに示す金属カチオンとアニオン種との反応の場合、無機コアはそれらの反応生成物（例えば、Ｃａ２＋カチオンとＣＯ３２−アニオンとの反応はＣａＣＯ３コアを生成する；別の例は、Ｃａ２＋カチオンとＰＯ４３−アニオンとの反応であり、この場合、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）コアを生成する。）から構成される。これらのコアは、一般式Ｚ（金属）ｘ（Ｏ）ｙ・Ａ（アニオン）ｂで表されてよく、ここで、ｘ、ｙ、Ｚ、Ａ、ｂは化学量論係数である。
【００１９】
図２Ａ〜２Ｃは、無機コアと結合した有機官能基との間の結合の溶解および加水分解の例を示す。図２Ａを参照すると、有機生物活性成分の放出は、無機コアの溶解および有機分子（１）と無機コア（２）との間の結合の加水分解によって支配される。無機コアの溶解速度および無機コアと有機成分の間の共有結合の加水分解は、周囲環境のｐＨ、存在する反応種および無機コア表面積に依存する。たとえば、図２Ａに示したプロセス１及び２はともに環境のｐＨに強く依存している。中性からわずかに塩基性のｐＨレベルの生理的条件では、複合材料の加水分解と溶解はゆっくり進行する。酸性度が増すと、両方のプロセスが加速する。図２Ｂおよび図２Ｃは、無機コア溶解反応の例および有機分子と無機コアとの間の結合の加水分解の例を示す。無機コア組成は、（１）無機コアが添加される修復材料との最適な一体化（修復材料の物理化学的特性に対するその影響の制御）；（２）生物活性官能基の最適放出；及び、（３）一連の生物活性有機および無機機能性部分（それぞれ特定の目的を目標とするように設計された）の同時導入を達成するように設計され得る。
【００２０】
図３は、合成計画の例をより詳細に示す。図３に示すように、金属塩（たとえば、ＣａＮＯ３、ＣａＣｌ２、ＡｇＮＯ３など）は有機溶媒（例えばアルコール）に溶解する。
【００２１】
ステップ１では、有機生物活性分子（アルキルホスフィンオキシド、アルキルホスホン酸、アルキルホスフィン、飽和および不飽和脂肪酸およびそれらの誘導体などの金属配位基を含む有機分子、カルボン酸またはオルトリン酸またはヒドロキシル基、アミン、アミド、窒素含有芳香族を含む有機分子）を、溶解した１つまたは複数の金属塩を含む有機溶媒に添加する。
【００２２】
ステップ２において、酸化剤（ＨＮＯ３、ＨＣｌなど）または反応剤（Ｎａ３ＰＯ４、Ｎａ２ＣＯ３など）を含有する水溶液が、適切な剤を水に溶解することによって調製される。貴金属塩の場合、水溶液は水または反応剤のみを含む。または、貴金属塩を、有機溶媒に代えて、水性成分に溶解させてもよい。
【００２３】
ステップ３において、無機コア材料の表面／サイズ特性または組成を変更するために、追加の反応成分を添加してもよい。例えば、無機コアへのフッ化物の添加が望まれる場合にはフッ化物塩（ＮａＦ、ＮＨ４Ｆなど）を添加することができ、または、ランタノイド／アクチノイド元素のドーピングが無機コアのアスペクト比を変更するために望まれ得る場合には遷移／ランタニド塩を添加することができる。
【００２４】
ステップ４では、溶液（ステップ３から）を有機相（ステップ２から）に添加して混合する。反応混合物を、大気圧でＮ２またはＡｒなどの不活性ガスでパージした容器内（これは、大気中の酸素または溶媒に溶解した酸素による有機生物活性界面活性剤分子の望ましくない酸化を減少させる；例えば、不飽和脂肪酸またはそれらの誘導体はこのタイプの酸化を受けやすく、不活性ガスによるパージは有機生物活性分子の望ましくない酸化を低減させる）で、または密閉したオートクレーブ反応容器内（ここで、圧力は＞１気圧になる。）で、２０〜３００℃に加熱する。有機生物活性分子の熱および酸化分解を低減するために、フリーラジカルスカベンジャー（ブチル化ヒドロキシトルエン、α−トコフェロールなど）および過酸化物スカベンジャー（ジメチルスルホキシドなど）を反応混合物に添加することができる。経時的に、無機金属カチオン−有機生物活性分子複合体が形成され、次いで、還元され（貴金属カチオンと溶媒を含む）、酸化され（すべての非貴金属カチオン、酸化剤および溶媒を含む）、または反応され（カチオン種とアニオン種が存在し、結晶を形成することができるとき、すべての金属カチオンと溶媒）、有機部分で官能化された無機コアが形成され、沈殿／堆積される。反応時間は数時間から数週間まで様々であり得る。有機生物活性部分の共有結合および非共有結合の程度および無機コアのアスペクト比は、反応条件（温度、反応時間、体積、各成分の濃度／種類、使用する溶媒の量及び種類、圧力等）に依存する。官能化された複合材料は、遠心分離または濾過（大きさによって）によって収集することができ、結合していない有機分子を除去するように設計された有機溶媒（例えばアルコール）を用いて複数回洗浄することができる。複数の洗浄工程の後、官能化された複合材料を乾燥させても（真空下または凍結乾燥下で）、または所望の溶媒（水、アルコール、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒、等）に分散させてもよい。
【００２５】
加熱すると、不飽和結合を含む生体分子が酸化し、構造変化と生体機能の損失をもたらす。これは、慎重な温度／大気制御、フリーラジカルスカベンジャー（一次抗酸化剤）および過酸化物スカベンジャー（二次抗酸化剤）の添加によって克服され得る。本発明者らは、ヒドロキシアパタイト（無機コア）−ドコサヘキサエン酸（有機生物活性成分）合成のために、一次抗酸化剤としてブチル化ヒドロキシトルエンまたはα−トコフェロール、及び、二次抗酸化剤としてジメチルスルホキシドを用いてこの結果を確認した。
【実施例】
【００２６】
実験
【００２７】
実験シリーズ１：生物活性複合材料の合成とキャラクタリゼーション。
【００２８】
すべての化学物質は市販の供給源から購入し、さらに精製することなく使用した。
【００２９】
例１：（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン酸（オレイン酸）（有機生物活性成分）で官能化されたヒドロキシアパタイト（１０ＣａＯ・３Ｐ２Ｏ５・Ｈ２Ｏ＝Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、無機コア）である生物活性複合材料の合成。
【００３０】
オレイン酸（ＯＡ、有機生物活性分子）１グラムを１８ｍＬのエタノール（有機溶媒）と磁気撹拌によって混合した。０．２５Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の水溶液７ｍＬを加え、１０分間混合した。この混合物に０．１５Ｍリン酸三ナトリウムの水溶液（７ｍＬ）を加え、得られた混合物を磁気的に撹拌し、４０ｍＬのオートクレーブに移した。オートクレーブの内容物を密封し、８５℃で８時間熱処理した。オートクレーブを室温に冷却した後、生物活性複合材料を４０００ｒｐｍで遠心分離により回収し、エタノール４０ｍＬで３回洗浄して未反応前駆体を除去した。生物活性複合材料（ＨＡ−ＯＡ）を真空下で一晩乾燥し、キャラクタリゼーションした。
【００３１】
例２：増加させた出発量のオレイン酸を利用した、（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン酸（オレイン酸）（有機生物活性成分）で官能化されたヒドロキシアパタイト（１０ＣａＯ・３Ｐ２Ｏ５・Ｈ２Ｏ＝Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、無機コア）である生物活性複合材料の合成。
【００３２】
オレイン酸（ＯＡ、有機生物活性分子）４グラムを１６ｍＬのエタノール（有機溶媒）と磁気撹拌によって混合した。０．２５Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の水溶液７ｍＬを加え、１０分間混合した。この混合物に０．１５Ｍリン酸三ナトリウムの水溶液（７ｍＬ）を加え、得られた混合物を磁気的に撹拌し、４０ｍＬのオートクレーブに移した。オートクレーブの内容物を密封し、８５℃で８時間熱処理した。オートクレーブを室温に冷却した後、生物活性複合材料を４０００ｒｐｍで遠心分離により回収し、エタノール４０ｍＬで３回洗浄して未反応前駆体を除去した。生物活性複合材料（ＨＡ−ＯＡ）を真空下で一晩乾燥し、キャラクタリゼーションした。
【００３３】
例３：オクタデシルアミン（界面活性剤）の存在下での、（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン酸（オレイン酸）（有機生物活性成分）で官能化されたヒドロキシアパタイト（１０ＣａＯ・３Ｐ２Ｏ５・Ｈ２Ｏ＝Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、無機コア）である生物活性複合材料の合成。
【００３４】
オレイン酸（ＯＡ、有機生物活性分子）１グラムおよびオクタデシルアミン（界面活性剤）０．５グラムを、１８ｍＬのエタノール（有機溶媒）と磁気撹拌によって混合した。０．２５Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の水溶液７ｍＬを加え、１０分間混合した。この混合物に０．１５Ｍリン酸三ナトリウムの水溶液（７ｍＬ）を加え、得られた混合物を磁気的に撹拌し、４０ｍＬのオートクレーブに移した。オートクレーブの内容物を密封し、８５℃で８時間熱処理した。オートクレーブを室温に冷却した後、生物活性複合材料を４０００ｒｐｍで遠心分離により回収し、エタノール４０ｍＬで３回洗浄して未反応前駆体を除去した。生物活性複合材料（ＨＡ−ＯＡ）を真空下で一晩乾燥し、キャラクタリゼーションした。
【００３５】
例４：ポリエチレングリコール（界面活性剤）の存在下での、（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン酸（オレイン酸）（有機生物活性成分）で官能化されたヒドロキシアパタイト（１０ＣａＯ・３Ｐ２Ｏ５・Ｈ２Ｏ＝Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、無機コア）である生物活性複合材料の合成。
【００３６】
オレイン酸（ＯＡ、有機生物活性分子）１グラムおよびポリエチレングリコール（界面活性剤、ＭＷ≒２０，０００Ｄａ）０．５グラムを、１８ｍＬのエタノール（有機溶媒）と磁気撹拌によって混合した。０．２５Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の水溶液７ｍＬを加え、１０分間混合した。この混合物に０．１５Ｍリン酸三ナトリウムの水溶液（７ｍＬ）を加え、得られた混合物を磁気的に撹拌し、４０ｍＬのオートクレーブに移した。オートクレーブの内容物を密封し、８５℃で８時間熱処理した。オートクレーブを室温に冷却した後、４０００ｒｐｍでの遠心分離によって生物活性複合材料を回収し、エタノール４０ｍＬで３回洗浄して未反応前駆体を除去した。生物活性複合材料（ＨＡ−ＯＡ）を真空下で一晩乾燥し、キャラクタリゼーションした。
【００３７】
例５：エタノールアミン（界面活性剤）の存在下での、（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン酸（オレイン酸）（有機生物活性成分）で官能化されたヒドロキシアパタイト（１０ＣａＯ・３Ｐ２Ｏ５・Ｈ２Ｏ＝Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、無機コア）である生物活性複合材料の合成。
【００３８】
オレイン酸（ＯＡ、有機生物活性分子）１グラム及びエタノールアミン（界面活性剤）０．１２ｍＬを、エタノール１８ｍＬ（有機溶媒）と磁気攪拌により混合した。０．２５Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の水溶液７ｍＬを加え、１０分間混合した。この混合物に０．１５Ｍリン酸三ナトリウムの水溶液（７ｍＬ）を加え、得られた混合物を磁気的に撹拌し、４０ｍＬのオートクレーブに移した。オートクレーブの内容物を密封し、８５℃で８時間熱処理した。オートクレーブを室温に冷却した後、生物活性複合材料を４０００ｒｐｍで遠心分離により回収し、エタノール４０ｍＬで３回洗浄して未反応前駆体を除去した。生物活性複合材料（ＨＡ−ＯＡ）を真空下で一晩乾燥し、キャラクタリゼーションした。
【００３９】
例６：４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサエン酸（ドコサヘキサエン酸）（有機生物活性成分）で官能化されたヒドロキシアパタイト（１０ＣａＯ・３Ｐ２Ｏ５・Ｈ２Ｏ＝Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、無機コア）である生物活性複合材料の合成。
【００４０】
ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、有機生物活性分子）１グラムを１８ｍＬのエタノール（有機溶媒）と磁気撹拌によって混合した。０．２５Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の水溶液７ｍＬを加え、１０分間混合した。この混合物に０．１５Ｍリン酸三ナトリウムの水溶液（７ｍＬ）を加え、得られた混合物を磁気的に撹拌し、４０ｍＬのオートクレーブに移した。オートクレーブの内容物を密封し、８５℃で８時間熱処理した。オートクレーブを室温に冷却した後、生物活性複合材料を４０００ｒｐｍで遠心分離により回収し、エタノール４０ｍＬで３回洗浄して未反応前駆体を除去した。生物活性複合材料（ＨＡ−ＤＨＡ）を真空下で一晩乾燥し、キャラクタリゼーションした。
【００４１】
例７：（２Ｒ）−２，５，７，８−テトラメチル−２−［（４Ｒ、８Ｒ）−（４，８，１２−トリメチルトリデシル）］クロマン−６−オール（α−トコフェロール）抗酸化剤の存在下での、４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサエン酸（ドコサヘキサエン酸）（有機生物活性成分）で官能化されたヒドロキシアパタイト（１０ＣａＯ・３Ｐ２Ｏ５・Ｈ２Ｏ＝Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、無機コア）である生物活性複合材料の合成。
【００４２】
抗酸化剤α−トコフェロール１００ｍｇおよびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、有機生物活性分子）１グラムを、１８ｍＬのエタノール（有機溶媒）と磁気撹拌によって混合した。０．２５Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の水溶液７ｍＬを加え、１０分間混合した。この混合物に０．１５Ｍリン酸三ナトリウムの水溶液（７ｍＬ）を加え、得られた混合物を磁気的に撹拌し、４０ｍＬのオートクレーブに移した。オートクレーブの内容物を密封し、８５℃で８時間熱処理した。オートクレーブを室温に冷却した後、生物活性複合材料を４０００ｒｐｍで遠心分離により回収し、エタノール４０ｍＬで３回洗浄して未反応前駆体を除去した。生物活性複合材料（ＨＡ−ＤＨＡ）を真空下で一晩乾燥し、キャラクタリゼーションした。
【００４３】
例８：２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ブチル化ヒドロキシトルエン）及びジメチルスルホキシド抗酸化剤の存在下での、（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン酸（オレイン酸）（有機生物活性成分）で官能化されたヒドロキシアパタイト（１０ＣａＯ・３Ｐ２Ｏ５・Ｈ２Ｏ＝Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、無機コア）である生物活性複合材料の合成。
【００４４】
ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ、一次抗酸化剤）０．８グラムを１８ｍＬのエタノール（有機溶媒）に溶解した。この混合物にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、二次抗酸化剤）０．５ｍＬおよびオレイン酸（ＯＡ、有機生物活性分子）１グラムを加え、磁気的に撹拌した。０．２５Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の水溶液７ｍＬを加え、１０分間混合した。この混合物に０．１５Ｍリン酸三ナトリウムの水溶液（７ｍＬ）を加え、得られた混合物を磁気的に撹拌し、４０ｍＬのオートクレーブに移した。オートクレーブの内容物を密封し、８５℃で８時間熱処理した。オートクレーブを室温に冷却した後、生物活性複合材料を４０００ｒｐｍで遠心分離により回収し、エタノール４０ｍＬで３回洗浄して未反応前駆体を除去した。生物活性複合材料（ＨＡ−ＯＡ）を真空下で一晩乾燥し、キャラクタリゼーションした。
【００４５】
例９：２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ブチル化ヒドロキシトルエン）及びジメチルスルホキシド抗酸化剤の存在下での、４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサエン酸（ドコサヘキサエン酸）（有機生物活性成分）で官能化されたヒドロキシアパタイト（１０ＣａＯ・３Ｐ２Ｏ５・Ｈ２Ｏ＝Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、無機コア）である生物活性複合材料の合成。
【００４６】
ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ、一次抗酸化剤）０．８グラムを１８ｍＬのエタノール（有機溶媒）に溶解した。この混合物にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、二次抗酸化剤）０．５ｍＬおよびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、有機生物活性分子）１グラムを加え、磁気的に撹拌した。０．２５Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の水溶液７ｍＬを加え、１０分間混合した。この混合物に０．１５Ｍリン酸三ナトリウムの水溶液（７ｍＬ）を加え、得られた混合物を磁気的に撹拌し、４０ｍＬのオートクレーブに移した。オートクレーブの内容物を密封し、８５℃で８時間熱処理した。オートクレーブを室温に冷却した後、生物活性複合材料を４０００ｒｐｍで遠心分離により回収し、エタノール４０ｍＬで３回洗浄して未反応前駆体を除去した。生物活性複合材料（ＨＡ−ＤＨＡ）を真空下で一晩乾燥し、キャラクタリゼーションした。
【００４７】
例１０：２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ブチル化ヒドロキシトルエン）及びジメチルスルホキシド抗酸化剤の存在下での、（９Ｚ、１２Ｚ、１５Ｚ）−オクタデカ−９，１２，１５−トリエン酸（α−リノレン酸）（有機生物活性成分）で官能化されたヒドロキシアパタイト（１０ＣａＯ・３Ｐ２Ｏ５・Ｈ２Ｏ＝Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、無機コア）である生物活性複合材料の合成。
【００４８】
ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ、一次抗酸化剤）０．８グラムを１８ｍＬのエタノール（有機溶媒）に溶解した。この混合物にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、二次抗酸化剤）０．５ｍＬおよびα−リノレン酸（ＡＬＡ、有機生物活性分子）１グラムを加え、磁気的に撹拌した。０．２５Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の水溶液７ｍＬを加え、１０分間混合した。この混合物に０．１５Ｍリン酸三ナトリウムの水溶液（７ｍＬ）を加え、得られた混合物を磁気的に撹拌し、４０ｍＬのオートクレーブに移した。オートクレーブの内容物を密封し、８５℃で８時間熱処理した。オートクレーブを室温に冷却した後、生物活性複合材料を４０００ｒｐｍで遠心分離により回収し、エタノール４０ｍＬで３回洗浄して未反応前駆体を除去した。生物活性複合材料（ＨＡ−ＡＬＡ）を真空下で一晩乾燥し、キャラクタリゼーションした。
【００４９】
例１１：２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ブチル化ヒドロキシトルエン）及びジメチルスルホキシド抗酸化剤の存在下での、ａｌｌ−ｃｉｓ−６，９，１２−オクタデカトリエン酸（γ−リノレン酸）（有機生物活性成分）で官能化されたヒドロキシアパタイト（１０ＣａＯ・３Ｐ２Ｏ５・Ｈ２Ｏ＝Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、無機コア）である生物活性複合材料の合成。
【００５０】
ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ、一次抗酸化剤）０．８グラムを１８ｍＬのエタノール（有機溶媒）に溶解した。この混合物にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、二次抗酸化剤）０．５ｍＬ及びγ−リノレン酸（ＧＬＡ、有機生物活性分子）１ｇを加えて磁気的に攪拌した。０．２５Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の水溶液７ｍＬを加え、１０分間混合した。この混合物に０．１５Ｍリン酸三ナトリウムの水溶液（７ｍＬ）を加え、得られた混合物を磁気的に撹拌し、４０ｍＬのオートクレーブに移した。オートクレーブの内容物を密封し、８５℃で８時間熱処理した。オートクレーブを室温に冷却した後、生物活性複合材料を４０００ｒｐｍで遠心分離により回収し、エタノール４０ｍＬで３回洗浄して未反応前駆体を除去した。生物活性複合材料（ＨＡ−ＧＬＡ）を真空下で一晩乾燥し、キャラクタリゼーションした。
【００５１】
例１２：２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ブチル化ヒドロキシトルエン）とジメチルスルホキシド抗酸化剤の存在下での、（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ）−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（エイコサペンタエン酸）（有機生物活性成分）で官能化されたヒドロキシアパタイト（１０ＣａＯ・３Ｐ２Ｏ５・Ｈ２Ｏ＝Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、無機コア）である生物活性複合材料の合成。
【００５２】
ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ、一次抗酸化剤）０．８グラムのを１８ｍＬのエタノール（有機溶媒）に溶解した。この混合物にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、二次抗酸化剤）０．５ｍＬおよびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、有機生物活性分子）１グラムを加え、磁気的に撹拌した。０．２５Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の水溶液７ｍＬを加え、１０分間混合した。この混合物に０．１５Ｍリン酸三ナトリウムの水溶液（７ｍＬ）を加え、得られた混合物を磁気的に撹拌し、４０ｍＬのオートクレーブに移した。オートクレーブの内容物を密封し、８５℃で８時間熱処理した。オートクレーブを室温に冷却した後、生物活性複合材料を４０００ｒｐｍで遠心分離により回収し、エタノール４０ｍＬで３回洗浄して未反応前駆体を除去した。生物活性複合材料（ＨＡ−ＥＰＡ）を真空下で一晩乾燥し、キャラクタリゼーションした。
【００５３】
例１３：Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（有機生物活性成分）で官能化されたリン酸二カルシウム（ｄｉｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＣａＯ・ＨＰＯ３＝ＣａＨＰＯ４、無機コア）である生物活性複合材料の合成。
【００５４】
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ、有機生物活性分子）０．８グラムを１８ｍＬのエタノール（有機溶媒）と磁気撹拌によって混合した。０．２５Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の水溶液７ｍＬを加え、１０分間混合した。この混合物に０．１５Ｍリン酸三ナトリウムの水溶液（７ｍＬ）を加え、得られた混合物を磁気的に撹拌し、４０ｍＬのオートクレーブに移した。オートクレーブの内容物を密封し、８５℃で８時間熱処理した。オートクレーブを室温に冷却した後、生物活性複合材料を４０００ｒｐｍで遠心分離により回収し、エタノール４０ｍＬで３回洗浄して未反応前駆体を除去した。生物活性複合材料（ＤＣＰＡ−ＮＡＣ）を真空下で一晩乾燥し、キャラクタリゼーションした。
【００５５】
生物活性複合材料のキャラクタリゼーションのために用いた方法。
【００５６】
生物活性複合材料の粉末Ｘ線回折パターン（Ｒｉｇａｋｕ  ２２００  Ｄ／ＭＡＸ、４０ｍＡ／４０ｋＶ  Ｃｕ  ＫαＸ線源）を収集し、無機相の組成を決定した。Ｆｏｕｒｉｅｒ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ、ＤＴＧＳ検出器、１ｍｇの複合材料を４００ｍｇのＫＢｒと混合、ペレットにプレス）を用いて、無機コアおよび有機官能基の組成を分析した。熱重量分析（ＴＧＡ、サンプルコンパートメント空気流量６０ｍＬ／ｍｉｎ、２０〜１０００℃、温度勾配（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒａｍｐ）１０℃／ｍｉｎ、サンプルサイズ５〜１０ｍｇ）を行って、無機コアに結合した揮発性有機相の相対量を決定した。生物活性複合材料（ＨＡ−ＯＡ）を１Ｍ  ＨＣｌに溶解し、生物活性成分を酢酸エチルで抽出し、生物活性成分をプロトン核磁気共鳴分析（１Ｈ  ＮＭＲ、６００ＭＨｚ  Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩ、重水素化クロロホルム溶媒中）にかけ、有機相組成を確認した。生物活性複合材料が生理的に適切な条件でそれらの有機相を放出できることを確立するために、生物活性複合材料ＨＡ−ＡＬＡ（１．６６ｍｇ、１０μＬのＤＭＳＯ中）を０．７５ｍＬのｐＨ６．６または７．４のリン酸緩衝液に添加し、１０００ｒｐｍで、３７℃で２４時間撹拌した。メタノール０．７５ｍＬを加え、１４，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００、アイソクラティック法、移動相アセトニトリル（９０％）−メタノール（９．８％）−ギ酸（０．１％）−水（０．１％）、３回実施）のために回収した。ＡＬＡピークを保持時間に基づいて同定し、メタノール中ＡＬＡの標準溶液セットを用いて定量した。
【００５７】
結果。
【００５８】
合成した生物活性複合材料の無機相の純度をＸＲＤ分析を用いて評価した。図４は、合成された複合材料（例１〜１２に開示される）の典型的なＸＲＤパターンを示す。結晶性の相純粋なヒドロキシアパタイト（ＨＡ）は８５℃、８時間後の水熱反応の生成物であった。（０  ０  ２）反射のピーク強度と（２  １  １）反射線のピーク強度との比は、典型的には０．７０〜０．７５であった。これを図５のＮＩＳＴ標準参照物質（ＳＲＭ２９１０ｂ）（比率は０．３０〜０．３５）と比較すると、（０  ０  ２）反射に沿ったＨＡの優先的な配列及び成長が示唆され、これは高いアスペクト比（直径に対する長さ）の粒子を示している。例１３に開示された生物活性複合材料の場合、リン酸二カルシウムは水熱反応の生成物であった（図６）。市販の無水リン酸二カルシウム（ＤＣＰＡ、純度９９％  ＪＴ  Ｂａｋｅｒ製）との比較は、図７に示されるように、強酸性Ｎ−アセチル−Ｌ−システインが、他のリン酸カルシウム相の代わりにＤＣＰＡの優先的形成を駆動することを示す。図８に示す複合材料（例１〜１２に開示される）の典型的なＦＴＩＲスペクトルは、ヒドロキシアパタイトに典型的なＯＨ（３５６８ｃｍ−１）、ＰＯ４（１１９０−９２０および５４５−６２５ｃｍ−１）、ＨＰＯ４／ＣＯ３（８６８ｃｍ−１）バンドを生成し、アパタイト相の形成を裏付ける。Ｃ＝Ｏ伸縮（ｓｔｒｅｔｃｈ）（１５５６ｃｍ−１）、アルカンＣ−Ｈ変角（ｂｅｎｄ）（１４９０−１３６０ｃｍ−１）、ＣＯＯエステル伸縮（１３４０−１２４５ｃｍ−１）の存在は、有機官能基の無機コアへの共有結合および非共有結合による表面結合を確認する。アルケンのＣ−Ｈ  ｓｐ２伸縮バンド（３０１２ｃｍ−１）の強度は、有機官能基の構造、及び各合成に利用される界面活性剤及び抗酸化剤の存在および性質に依存して変化した。しかしながら、界面活性剤および抗酸化剤の存在は、開示された合成に使用される全ての有機分子に存在する不飽和Ｃ＝Ｃ二重結合の残存（ｓｕｒｖｉｖａｌ）を確認する。生物活性複合材料の典型的なサーモグラム（図９）は、１２０℃に達する前に２〜４重量％の吸着水／溶媒損失の可能性を示した。複合材料に官能化された有機分子の熱分解範囲は１００〜６００℃の温度範囲で観察された。観察された重量変化は１３〜５０％の範囲であり、有機官能基および各合成に利用される界面活性剤および抗酸化剤の存在および性質に強く依存する。ＴＧＡ後の材料のＦＴＩＲ分析（図１０）は、結晶性アパタイトの典型的なパターンを示し、以前に検出された有機相の存在を示さなかった。これはさらに、観察された重量減少が、開示された生物活性複合材料の有機官能化を定量的に説明することを確認する。有機相組成のさらなる確認は、上記の材料および方法のセクションに記載されているように、生物活性複合材料（例１に開示されたＨＡ−ＯＡ）を溶解し、生物活性成分を抽出し、生物活性成分をＮＭＲ分析にかけることによって達成された。図１１はこの抽出物のＮＭＲスペクトルである。この抽出物のスペクトルを出発有機前駆体オレイン酸のＮＭＲスペクトル（図１２）と比較して、生物活性物質が意図した有機分子で官能化されていることを確認する。抽出物のＮＭＲで観察された他のピークは、おそらくプロセス中に使用される酢酸エチルおよび他の溶媒の存在による。生物活性複合材料ＨＡ−ＡＬＡ（例１０に開示される）からの生物活性有機分子α−リノレン酸の放出は、上記の材料および方法のセクションに記載されているＨＰＬＣ分析によって確認された。ｐＨ６．６のリン酸緩衝液は、ＨＡ−ＡＬＡ複合材料への２４時間の曝露の後に、０．２８３±０．０１３ｍｇ／ｍＬ（ｎ＝３）のα−リノレン酸を含んでいた。同様に、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液は、ＨＡ−ＡＬＡ複合材料への２４時間の曝露の後に、０．２８４±０．０２６ｍｇ／ｍＬ（ｎ＝３）のα−リノレン酸を含んでいた。
【００５９】
実験シリーズ２：生物活性複合材料の有効性（抗炎症特性）。
【００６０】
材料および方法。
【００６１】
特に明記されていない限り、すべての化学物質はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから調達され、追加の精製なしに使用された。ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）貯蔵溶液、アスピリンの生理的緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）貯蔵溶液を、使用前に調製した。大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）由来リポ多糖類（ＬＰＳ）を１μｇ／ｍＬで再構成し、滅菌濾過し、必要になるまで−８０Ｃで保存した。ＲＡＷ  ２６４．７マウスマクロファージ細胞株をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ, ＶＡ）から得た。細胞を継代５または６で解凍し（ｔｈａｗ）、必要になるまで１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）＋１％  Ｐｅｎｎ／ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ完全増殖培地で維持した。末梢血由来の初代ヒトＣＤ１４＋単球（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ，Ａｌｂａｎｙ，ＮＹ）も、必要になるまでＤＭＥＭ増殖培地中で維持した。実験に先立ち、単球を、培地中２５ｎｇ／ｍＬのマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を用いて、最大三日間、または細胞がコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）近く（約９５％）に達するまでマクロファージに分化させた。ＲＡＷ  ２６４．７細胞を、ウェル当たり約５，０００細胞で９６ウェルプレートに播種し、コンフルエンス近くまで増殖させた。コンフルエンスで、細胞をＬＰＳで２時間前処理した。２時間の時点で、細胞を、ＤＭＳＯ（１％ｗ／ｗ、陰性対照）、アスピリン（陽性対照：１０ｎｍｏｌ／Ｌ）、ＤＨＡ（１００μｍｏｌ／Ｌ）またはこれらの２つの組合せを含有するＤＭＥＭ培地で処理した。生物活性複合材料ヒドロキシアパタイト−ドコサヘキサエン酸（ＨＡ−ＤＨＡ）をＤＭＳＯ中に分散し、ＤＨＡ単独（上述の）と同様の濃度で送達した。細胞は、ＬＰＳ刺激の２、４および６時間後に回収した。ヒトＣＤ１４＋細胞をウェル当たり約３．３×１０４細胞で９６ウェルプレートに播種し、完全なコンフルエンスまでＭＣＳＦで処理した。細胞をＬＰＳで２時間処理し、その時点でＲＡＷ  ２６４．７細胞について上述したのと同じ処理に曝露した。細胞を４および６時間で回収した。全ての試験は３つ組で（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）実施した。
【００６２】
各処理後、マウスまたはヒト細胞用に設計された市販のサンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、試料培地の炎症性腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）発現を試験した。ＴＮＦ−αの減少を示す試料は、レゾルビン（Ｒｅｓｏｌｖｉｎ）Ｄ１およびレゾルビンＤ２  ＥＬＩＳＡキット（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いてさらに分析した。各分析物について平均および標準偏差を計算した。ＥＬＩＳＡの結果は、各ウェルの総タンパク質読み取り値に正規化した。全ての実験は３回行った。
【００６３】
統計解析。少なくとも３の生物学的および技術的レプリケート（ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）のｎから、平均値および標準偏差を得た。試料の一元分散分析（Ｏｎｅ  ｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｎｃｅ）（ＡＮＯＶＡ）をボンフェローニの事後検定（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）後に実施し、各処理を対照とおよび相互に比較して統計的有意性を決定した。有意差は以下により示される：＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００６４】
結果。
【００６５】
炎症に関与し、ＬＰＳで刺激されたミクロファージにより放出される急性相反応の主要な細胞シグナリング蛋白質はＴＮＦ−αである（Tjomme van der Bruggen et al., Lipopolysaccharide-Induced Tumor Necrosis Factor Alpha Production by Human Monocytes Involves the Raf-1/MEK1-MEK2/ERK1-ERK2 Pathway. Infection and Immunity, 1999, p. 3824-3829）。図１３において、ＲＡＷ  ２６４．７マウスミクロファージを１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで６時間処理（Ｔｘ）時間にわたって刺激した。図１３は、累積ＴＮＦ−α発現が、ＤＭＳＯ対照試料中の３０．８（±５．８）ｐｇ／μｇタンパク質から、ＤＨＡ＋アスピリンを用いて２４．７（±４．５）ｐｇ／μｇタンパク質に減少したことを示し、これは、全体の発現におけるほぼ２０％の減少に対応する。より顕著なことに、生物活性複合材料ＨＡ−ＤＨＡおよびアスピリンの共処理（ＨＡ−ＤＨＡ  ＋  アスピリン）は、２０．３（±３．９）ｐｇ／μｇ蛋白質まで発現を減少させ、これはＤＭＳＯ対照と比較してＴＮＦ−α発現の３４．９％の減少に相当した。
【００６６】
２時間ＬＰＳ＋２時間処理時間（Ｔｘ）点（図１４）を見ると、ＤＨＡ−ＨＡ  ＋  アスピリン以外の早期治療処置は、ＤＭＳＯヌル（ｎｕｌｌ）処理対照（４．８ｐｇ／μｇ±０．６）およびＤＨＡ  ＋  アスピリン陽性（抗炎症）対照（４．４ｐｇ／μｇ±０．４）を含む対照と比較して、ＴＮＦ発現の統計的に有意（ｐ＜０．０１）な減少（３．３７ｐｇ／μｇ±０．７）を誘発しなかった。２時間ＬＰＳ＋４時間Ｔｘ（図１５）では、結果は、ＨＡ−ＤＨＡ（４．７ｐｇ／μｇ±０．５）およびＨＡ−ＤＨＡ  ＋  アスピリン（５．９ｐｇ／μｇ±０．２）の両方が、ＤＭＳＯ対照（９．６ｐｇ／μｇ±０．７）、ＤＨＡ  ＋  アスピリン（７．０３ｐｇ／μｇ±０．７）及び他の全ての処理と比較して、ＴＮＦ発現を統計的に減少させたことを示す（それぞれｐ＜０．０１およびｐ＜０．０５）。後の時点２時間ＬＰＳ＋６時間Ｔｘ（図１６）を見ると、結果は、全処理が、ＤＭＳＯ（１６．４ｐｇ／μｇ±０．２）対照と比較して、ＴＮＦを統計的に減少させたことを示す（ｐ＜０．０５）。興味深いことに、ＨＡ−ＤＨＡ  ＋  アスピリンはＴＮＦの発現を最も劇的に１１．２ｐｇ／μｇ±０．０３まで減少させ、これはＤＭＳＯ対照と比較して３２％の減少であった。
【００６７】
まとめると、これらのデータは、マウスマクロファージにおいて、陽性対照のＤＨＡおよびアスピリンと比較して、ＨＡ−ＤＨＡおよびＨＡ−ＤＨＡ  ＋  アスピリン処理が、累積的に、および様々な時点で、ＴＮＦ−α発現を有意に減少させたことを示す。
【００６８】
図１７における結果は、ヒトＣＤ１４＋細胞において、ＤＨＡ＋アスピリン、ＨＡ−ＤＨＡおよびＨＡ−ＤＨＡ  ＋  アスピリンはまた、ＤＭＳＯ、ＤＨＡのみおよびアスピリンの対照と比較して、６時間の処理時間にわたって累積ＴＮＦ発現を有意に減少させたことを示す（２０〜４０％）。個々の時点（２時間ＬＰＳ＋４時間Ｔｘ）を図１８において見ると、データは、ＨＡ−ＤＨＡ（４．６ｐｇ／μｇ±０．６）およびＨＡ−ＤＨＡ  ＋  アスピリン（５．９ｐｇ／μｇ±０．３）のみが、ＤＭＳＯ対照（９．６ｐｇ／μｇ±０．８）と比較して、ＴＮＦ−α発現の統計的に有意な（それぞれｐ＜０．０１およびｐ＜０．０５）減少を示したことを示す。表１は、ＴＮＦ発現に対する２時間＋４時間の処理時間からの全実験群についての平均（ｍｅａｎ）および標準偏差（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ）を示す。
【表１】
2021514367.tif 000003
【００６９】
多くの科学的報告は、局所分解プログラムを活性化することにより炎症反応を制御する多価不飽和脂肪酸（ドコサヘキサエン酸等）に由来する化学的メディエーターの形成を示している。これらの特殊化した消炎（ｐｒｏ−ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ）メディエーター（リポキシン、レゾルビン、プロテクチン、マレジン）は、自己限定的な炎症の分解中に酵素的に生合成される。
【００７０】
参考文献：
【００７１】
Ｓｕｒｈａｎ  ＣＮ．（２０１０）Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７７、Ｎｏ．４．
【００７２】
Ｓｐｉｔｅ  Ｍ，Ｓｅｒｈａｎ  ＣＮ．（２０１０）Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．，１０７（１０）：１１７０−１１８４。
【００７３】
Ｓｕｎｇｗｈａｎ  Ｆ．Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ  １２１  Ｎｕｍｂｅｒ  ２．
【００７４】
Ｒｅｃｃｈｉｕｔｔｉ  Ａ，Ｓｅｒｈａｎ  ＣＮ（２０１２）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ  ３，Ａｒｔｉｃｌｅ  ２９８．
【００７５】
病原性ＬＰＳで攻撃されたヒトおよびマウスマクロファージの両方で観察された抗炎症効果をさらに調査し、生物活性複合材料ＨＡ−ＤＨＡがそれ自体で、およびアスピリンと組み合わせて、消炎（ｐｒｏ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）メディエーターの形成を誘導するかどうかを決定するために、本発明者らは、攻撃されたヒトマクロファージから分泌されるレゾルビン産生を測定した。
【００７６】
図１９に示すように、陽性対照（ＤＨＡ、及びＤＨＡ  ＋  アスピリン）および生物活性複合材料ＨＡ−ＤＨＡのみ、ならびにアスピリンとの共処理（ＨＡ−ＤＨＡ  ＋  アスピリン）は、ＤＭＳＯおよびアスピリンのみの対照と比較して、レゾルビンＤ１（ＲｖＤ１）の発現および放出を統計的（ｐ＜０．００１）に増加させた。この時点におけるこれらの処理の平均および標準偏差を表２に示す。図２０の２時間＋６時間Ｔｘを見ると、同様の誘導が、同じＤＨＡ含有群で、より早い時点と同じ有意水準で測定された。全投与群の値を表３に示す。
【表２】
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【表３】
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【００７７】
次に、別のレゾルビン（レゾルビンＤ２、ＲｖＤ２）を我々の処理に対して検討した。図２１（２時間ＬＰＳ＋４時間Ｔｘ）が示すように、ＲｖＤ１とは異なり、ＨＡ−ＤＨＡおよびＨＡ−ＤＨＡ  ＋  アスピリンのみが、ＲｖＤ２発現を有意に（それぞれｐ＜０．００１およびｐ＜０．０１）上方制御する処理群であった。この時点についての平均および標準偏差を含むすべての値は表４に含まれている。６時間の治療処置および２時間のＬＰＳ刺激後のＲｖＤ２発現を見ると、図２２は、生物活性複合材料ＨＡ−ＤＨＡ処理のみが、他の全ての処理群と比較して、ＲｖＤ２発現および放出の統計学的に有意な（ｐ＜０．０１）増加をもたらしたことを示す。しかしながら、ＨＡ−ＤＨＡ  ＋  アスピリンの共処理が有意になる傾向があることに留意することが重要である。この時点からのすべての値を表５に示す。
【表４】
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【表５】
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【００７８】
結論として、これらの結果は、二つの異なる種からの二つの細胞培養において、生物活性複合材料ＨＡ−ＤＨＡ単独およびアスピリンとの併用は、サイトカイン発現（ＴＮＦ−α）の減少および消炎メディエーター（ＲｖＤ１およびＲｖＤ２）の発現増加を介して抗炎症効果を促進することを示す。また、生物活性複合材料ＨＡ−ＤＨＡは、その生物活性成分ＤＨＡと同様またはそれ以上の効果を示した。
【００７９】
実験シリーズ３：生物活性複合材料の有効性（抗菌性）。
【００８０】
材料および方法。
【００８１】
ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ  １５７（ＡＴＣＣ）を全ての実験に用いた。凍結細胞を１００ｍｍブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天プレート上にまいた。一晩インキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２雰囲気）した後、単一コロニーを３ｍＬのブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）液体培地に接種した。４００μＬ培養物を一晩増殖させ、次いで新鮮なＢＨＩ培地で４０ｍＬに希釈し、細菌培養物３．９６ｍＬを５０ｍＬ組織培養フラスコ（実験条件毎に３つのフラスコ）に入れた。ＤＭＳＯ（４０μＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を、試験管それのみ（対照）またはＨＡ−ＯＡ、ＨＡ−ＤＨＡ、ＨＡ−ＥＰＡ、ＨＡ−ＡＬＡまたはＨＡ−ＧＬＡを含む各試験管に加えた（最終的な生物活性複合材料濃度は１．６６ｍｇ／ｍＬとなる）。細菌培養物を、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターおよび１０ｒｐｍの実験室ロッキングプラットホーム（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｒｏｃｋｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）上に置いた。試料（１０μＬ）を所定の時点（０、２、４、６、および２４時間）で採取し、各試料が３０〜２００コロニー（実用的かつ正確な計数目的のために）となるように段階希釈を行った。希釈した試料をＢＨＩ寒天プレート上にまき、２４時間インキュベートした。ＢＨＩ寒天プレートを実体光学顕微鏡（ｓｔｅｒｅｏｐｔｉｃａｌ  ｌｉｇｈｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（Ｌｅｉｃａ  ＭＺ１６）でデジタル化し、得られた画像を用いてＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）ソフトウェアにより各試料についてのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を定量した。減少させた初期接種実験のために、０．４μＬ一晩培養（４００μＬと比較）を４０ｍＬの新鮮なＢＨＩ液体培地中で使用して、殺菌および静菌効果を確認した。ＤＭＳＯ（対照）、ＨＡ−ＯＡ、ＨＡ−ＤＨＡ、ＨＡ−ＥＰＡ、ＨＡ−ＡＬＡまたはＨＡ−ＧＬＡ（生物活性複合材料の最終濃度１．６６ｍｇ／ｍＬ）の存在下でのバイオフィルム形成を定量するために、標準Ｏ’Ｔｏｏｌ−Ｋｏｌｔｅｒバイオフィルム定量プロトコルを使用した。一晩、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ液体培養物をバイオフィルム形成（ＢＦ）培地（２５％ＴＳＢ  ＋  ５ｍｇ／ｍＬ酵母エキス  ＋  ３０ｍＭスクロース）に接種した。Ｓ．ｍｕｔａｎｓを、試験すべき生物活性複合材料を含む９．６ｃｍ２  ６ウェル組織培養プレートに３時間付着させた。未付着細胞、生物活性複合材料、および培地を除去し、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。新鮮なＢＦ培地を添加し、Ｓ．ｍｕｔａｎｓをさらに３時間増殖させた。６時間の付着／インキュベーションの後、培地を除去し、プレートを脱イオン水で２回洗浄した。クリスタルバイオレット（２ｍＬ、０．１％ｗ／ｗ）溶液を加え、付着した細胞を１５分間染色した。色素を除去し、ペトリ皿を脱イオン水で２回洗浄した。プレートを生物学的に安全なキャビネット内で一晩乾燥させた。酢酸（２ｍＬ、３０％ｖ／ｖ）を加え、室温で１５分間インキュベートした。可溶化クリスタルバイオレット溶液１２５μＬを９６ウェルプレート（Ｏｌｙｍｐｕｓ）に移し、収集した溶液の吸光度を５５０ｎｍで測定した（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）。
【００８２】
結果。
【００８３】
ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）は、糖質を代謝して副生成物として乳酸を生成するグラム陽性菌である。このプロセスは、無機コア（ヒドロキシアパタイト、ＨＡ）を溶解し、無機コア（ＨＡ）と結合した有機生物活性分子（脂肪酸、ＦＡ）との間の共有結合を加水分解することにより、生物活性複合材料（ＨＡ−ＦＡ）と相互作用する酸性環境を作り出す。不飽和脂肪酸であるオレイン酸（ＯＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、α−リノレン酸（ＡＬＡ）およびγ−リノレン酸（ＧＬＡ）で官能化された生物活性複合材料（ＨＡ−ＯＡ、ＨＡ−ＤＨＡ、ＨＡ−ＥＰＡ、ＨＡ−ＡＬＡおよびＨＡ−ＧＬＡ）（例１〜１２に開示される）を試験した。対照群（ＤＭＳＯのみ）対実験群（生物活性複合材料処理）についてのｍＬ当たりの細菌コロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）の定量は、図２３（対照対ＨＡ−ＯＡ）、図２４（対照対ＨＡ−ＤＨＡ）、図２５（対照対ＨＡ−ＥＰＡ）、図２６（対照対ＨＡ−ＡＬＡ）、図２７（対照対ＨＡ−ＧＬＡ）の２時間、４時間、６時間および２４時間の時点で示されている。すべての生物活性複合材料処理は４時間、６時間および２４時間でプランクトンＳ．ｍｕｔａｎｓ成長を阻害したが、有効性は様々であった。ＨＡ−ＯＡ実験からの結果は、ＨＡ−ＯＡがＳ．ｍｕｔａｎｓを最も効果的に阻害するのは６時間時点（対照＝４．６５±１．９１×１０８：ＨＡ−ＯＡ＝１．７１±０．６６×１０８；ｐ＜０．００１）であることを示している。しかし、  Ｓ．ｍｕｔａｎｓはＨＡ−ＯＡ処理で成長し続けた（図２３）。したがって、ＨＡ−ＯＡはＳ．ｍｕｔａｎｓに対して最小限の静菌性である。ＨＡ−ＤＨＡ処理の結果は、この処理がＳ．ｍｕｔａｎｓを２４時間で最も効果的に阻害することを示す（対照＝１．１３±０．４０×１０９；ＨＡ−ＤＨＡ＝２．７２±１．７３×１０７；ｐ＜０．００１）。ＨＡ−ＤＨＡは４および６時間で静菌的であるが、２４時間までには殺菌レベルに達する（図２４）。ＨＡ−ＥＰＡ実験からの結果は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓが４、６、および２４時間で効果的に阻害され、２４時間の期間にわたって有意な成長をもたらさないことを示す（それぞれ１．２３±０．１９×１０７、１．１９±０．２１×１０７、１．０１±０．１２×１０７、１．５９±０．３９×１０７）。したがって、ＨＡ−ＥＰＡは４、６、および２４時間で効果的に静菌的である（ＤＭＳＯ対照と比較してｐ＜０．００１）（図２５）。ＨＡ−ＡＬＡ実験からの結果はまた、この処理が対照と比較してＳ．ｍｕｔａｎｓを阻害することを示す。２、４、６及び２４時間時点におけるＨＡ−ＡＬＡ処理試料のＣＦＵ／ｍＬは、それぞれ９．４０±２．５×１０６、１．７９±０．２９×１０７、３．７４±０．９０×１０７及び６．３６±１．３２×１０７であった（ｐ＞０．０５）（図２６）。したがって、ＨＡ−ＡＬＡは４、６、２４時間で静菌的である。ＨＡ−ＧＬＡは試験した生物活性複合材料の中で最も効果的にＳ．ｍｕｔａｎｓを阻害した（４時間後（ｐ＜０．００１）、６時間後（ｐ＜０．００１）及び２４時間後（ｐ＜０．００１）で殺菌性）（図２７）。減少した初期接種実験の結果は、ＨＡ−ＧＬＡが２４時間で殺菌性であり（図２８）、ＨＡ−ＥＰＡが２４時間で静菌性である（図２９）ことを確認する。２４時間のＨＡ−ＧＬＡ処理は、対照と比較して、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＣＦＵ／ｍＬにおいて７９．１±３２．６％の減少をもたらした（ｐ＝＜０．００１）。２時間のＨＡ−ＧＬＡ処理は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＣＦＵ／ｍＬを対照と比較して２６．８±８．２％減少させた（ｐ＝０．００２）。２４時間ＨＡ−ＥＰＡ処理は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＣＦＵ／ｍＬを対照と比較して３０．５±５．４％減少させた（ｐ＝＜０．００１）。２時間のＨＡ−ＥＰＡ処理は、対照と比較して、２８．７±５．６％のＳ．ｍｕｔａｎｓのＣＦＵ／ｍＬを減少させた（ｐ＜０．００１）。バイオフィルムアッセイ（図３０）の結果は、生物活性複合材料ＨＡ−ＯＡ、ＨＡ−ＤＨＡ、ＨＡ−ＥＰＡ、ＨＡ−ＡＬＡ、ＨＡ−ＧＬＡが６時間のインキュベーション中にバイオフィルム形成を阻害することを示した（ＤＭＳＯ対照群と比較して、それぞれ８３±２％、８５±２％、９１±０．３％、９０±０．８％および８９±１％の減少）（ｐ＜０．００１）。ここではＳ．ｍｕｔａｎｓのみを抗菌活性試験に用いたが、不飽和及び飽和脂肪酸はメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Farrington MN et al. J Med. Microbiol., 36, 56-60 (1992)）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ（Hazel et al. J Clin Microbiol., 28, 1060-1061 (1990)）を含む広範囲の病原性微生物、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ｓｅｇｎｉｓ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙ  ｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、  Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（Jae-Suk Choi et al., Journal of Environmental Biology, vol. 34, 673-676, (2013)）のような口腔疾患関連病原体に対して抗菌特性を有することが示されている。これらの報告は、生物活性有機脂肪酸の放出を介して病原性Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよびそれらのバイオフィルムの成長を阻害する本明細書に開示された生物活性複合材料の有効性の実証と組み合わせて、これらの材料が広範囲の病原性微生物に対して有効であることを示す。
【００８４】
実験シリーズ４：生物活性複合材料の有効性（バイオミネラリゼーション特性）。
【００８５】
材料および方法。
【００８６】
最近抜歯した第三大臼歯からヒト初代歯髄組織を取り出した。歯髄細胞をＴ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で切除組織切片（１ｃｍ×１ｃｍ）から成長させた。細胞を、１０％ウシ胎児血清および５％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、３７℃および５％ＣＯ２にて増殖させた。ヒト胎児骨芽細胞−ｈＦＯＢ１．１９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１１３７２）を、１０％胎児ウシ血清、０．３ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８／Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ）および５％ペニシリン／ストレプトマイシンで補充した２．５ｍＭのＬ−グルタミン（フェノールレッドを含まず）を有するＨａｍのＦ１２培地ダルベッコ改変イーグル培地の１：１混合物中で３４℃および５％ＣＯ２で増殖させた。８０％コンフルエンスに達した時点で、細胞を０．２５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を用いてフラスコの表面から分離し、収集し、トリパンブルー（Ｇｉｂｃｏ）で染色し、計数した。石灰化（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）実験のために、５×１０４細胞をウェル表面に播種した。被覆されていない表面（２Ｄ培養）または細胞外マトリックス基質で被覆され表面（３Ｄ培養用）を使用して、細胞を、８ウェルチャンバーのカバーガラス（Ｌａｂ−Ｔｅｋ（商標））中の増殖培地で培養した。２４時間のインキュベーションの後、増殖培地を、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）に溶解して０．１および０．２５ｍＭの最終濃度に希釈したＨＡ−ＤＨＡまたはＨＡ−ＡＬＡを含有する新鮮な増殖培地と交換した。ＨＡ−ＤＨＡおよびＨＡ−ＡＬＡは、凝集体を除去するために培地に添加する前に、少なくとも１０回ピペッティングした。陽性対照として、細胞を、１０ｍＭのβ−グリセロリン酸、１００μＭのＬ−アスコルビン酸２−リン酸（Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）および１０−８ｍＭのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）を補充した増殖培地である石灰化培地（ｃａｌｃｉｆｙｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）とインキュベートした。陰性対照として、細胞を、生物活性複合材料の添加物または粒子なしで増殖培地で培養した。増殖培地を３日毎に交換し、歯髄細胞を１４日間、およびｈＦＯＢ１．１９細胞を１１日間インキュベートした後、培地を廃棄し、細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０分間室温で固定した。固定した細胞を蒸留水で洗浄し、１，２−ジヒドロキシアントラキノン−アリザリンレッドＳ（Ｓｉｇｍａ）で３０分間染色した後、蒸留水で４回洗浄した。１６．２５メガピクセルＣＭＯＳカラーカメラＤＳ−Ｒｉ２（Ｎｉｋｏｎ）を用い、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ−Ｕ倒立位相差蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）下で染色培養物を分析した。位相差画像はＮＩＳ‐Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアバージョン３．０（Ｎｉｋｏｎ）を用いて撮影し、細胞培養物と石灰化領域の光強度（ｌｉｇｈｔ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）は画像処理プログラムＩｍａｇｅＪ  Ｖ．１．４８（ＮＩＨ）を用いて定量した。アルカリホスファターゼ活性はアルカリホスファターゼ検出キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて測定した。メーカーが推奨するプロトコルに従って、細胞を３分間固定し、次いで、リンス緩衝液ＴＢＳＴ（Ｓｉｇｍａ）で一度洗浄し、次いで、２：１：１の比率のファストレッドバイオレット溶液：ＡＭＰＤ緩衝液中のナプトールＡＳ−ＢＩリン酸塩溶液：蒸留水で３０分間インキュベートした。緩衝液で２回目の洗浄後、細胞を顕微鏡下で分析した。歯髄幹細胞を免疫細胞化学的（ＩＣＣ）にキャラクタリゼーションした。歯髄幹細胞を１０％正常ロバ血清（ＧｅｎｅＴｅｘ）で一時間ブロックし、その後０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｐｒｏｍｅｇａ）で更に一時間インキュベートして透過処理した。処理した細胞を、ラット抗ヒトＯＣＴ４（オクタマー結合転写因子４）、マウス抗ヒトＣＤ１０５およびマウス抗ヒトＳＯＸ２（（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ）−ｂｏｘ  ２）一次抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とともに、４℃で一晩インキュベートした。細胞を２回洗浄し、１：１００希釈のロバ抗ラットまたは抗マウス免疫グロブリンＧノーザリンライト（商標）−ＮＬ５５７複合ポリクローナル二次抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とともに、室温で３時間インキュベートした。洗浄後、細胞を１０ｍＭの４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール−ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と共に室温で３０分間インキュベートし、核を染色した。細胞を再度洗浄し、ＡｘｉｏＣａｍ  ＭＲｍ  ＣＣＤカメラおよびＬＥＤ励起光源（Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  Ａ１倒立蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）の下で分析した。蛍光写真はＺｅｎ２ソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて撮影した。各処理毎に３つのレプリケートを分析し、各レプリケートから１０枚の写真を収集した。光および蛍光強度は、３回以上実施した少なくとも３回の別々の実験の平均値±１標準偏差として表し、比較のために陽性および陰性対照を含めた。統計的比較は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とその後の両側スチューデントｔ検定を用いて行った。ｐ≦０．０５の場合、結果は統計的に有意であると考えられた。
【００８７】
結果。
【００８８】
石灰化実験の前に、初代歯髄細胞を、多能性幹細胞マーカーＯＣＴ４、ＳＯＸ２および間葉系幹細胞マーカーＣＤ１０５蛋白質の定量により、特異的結合抗体との連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）により、免疫細胞化学的（ＩＣＣ）にキャラクタリゼーションした。図３４Ａは、観察されたこれらの細胞マーカーの発現を示す。陽性対照（ＰＯＩＳＩＴＩＶＥ  ＣＯＮＴＲＯＬ）として使用したハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対する抗体で連結した細胞および陰性対照（ＮＥＧＡＴＩＶＥ  ＣＯＮＴＲＯＬ）として使用した非連結細胞と比較して、分析した全てのマーカーの蛍光強度は有意に高かった（＊＊＊はｐ≦０．００１を示す。）。ＯＣＴ４、ＣＤ１０５及びＳＯＸ２抗体で標識した細胞の強度はそれぞれ１２５７．５２±８９．５１、１５２１．７２±１６０．６２及び１６２６．９４±１９６．８４任意単位（ＡＵ）であった（図３４Ｂ）。非連結陰性対照細胞と比較して、これは、１９８．３４±８９．１５（ＯＣＴ４）、４７０．０５±１６０．６２（ＣＤ１０５）および５９８．２８±１９６．８４ＡＵ（図３４Ｃ）の増加を構成する。キャラクタリゼーションされた一次歯髄細胞は、多能性幹細胞マーカーを発現する細胞集団を含むので、本発明者らは、ＨＡ−ＡＬＡおよびＨＡ−ＤＨＡが未分化幹細胞における分化（骨誘導性（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ））およびミネラル形成および沈着（骨伝導性（ｏｓｔｅｏｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ））を誘導する能力を評価した。
【００８９】
低濃度（０．１ｍＭ）の生物活性複合材料ＨＡ−ＡＬＡおよびＨＡ−ＤＨＡでキャラクタリゼーションしたヒト一次歯髄細胞のインキュベーションは、アリザリンレッドＳ試薬で染色した２Ｄ培養物における細胞表面でのミネラル形成および沈着を示した。両方の生物活性複合材料は、石灰化（ｍｉｎｅｒａｌｉｚｉｎｇ）細胞（Ｃｅ）上に付着および蓄積し、それぞれ、図３１Ｅ〜Ｆおよび３１Ｇ〜Ｈにおいて小さな円形の暗い粒子（Ｐ）として現れる。図３１Ｆ及び３１Ｈは、それぞれ図３１Ｅ及び３１Ｇの囲み領域の拡大図である。石灰化（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）（図３１Ａ〜Ｌに薄い灰色の染色領域として示される）は石灰化培地に曝露した細胞でも観察された（図３１Ａ〜Ｂ；図３１Ｂは、図３１Ａの囲み領域の拡大図である。）。生物活性物質または石灰化培地に曝露されなかった細胞は石灰化を伴わない増殖を示した（図３１Ｃ〜Ｄ；図３１Ｄは、図３１Ｃの囲み領域の拡大図である。）。細胞のない培地に曝露された生物活性物質（図３１Ｉ〜Ｌ；図３１Ｌは、図３１Ｉの囲み領域の拡大図である。）は、個々の粒子として任意に拡散した。培養物中に形成されたミネラルによる吸収を示す定量光強度値は、非石灰化細胞で最も高く１３６．９６±６．４２ＡＵであったが、石灰化培地（陽性対照）またはＨＡ−ＡＬＡまたはＨＡ−ＤＨＡに曝露された石灰化細胞は、陰性対照（それぞれ７９．３４±８．４３、８４．６６±７．９０及び７３．８７±５．７６ＡＵ）と比較して測定した光強度で５２ＡＵを超える有意な減少（ｐ≦０．００１）を示した（図３３）。
【００９０】
細胞外マトリックス上でインキュベートした歯髄細胞は微小組織に発達した。アリザリンレッドＳ試薬で染色した３Ｄ培養物におけるミネラル（これらの領域は、図３２Ａ〜Ｐにおいて、微小組織を囲む薄い灰色の染色として示される）の形成、沈着および蓄積を、低濃度（０．１ｍＭ、図３２Ｅ〜Ｆおよび３２Ｋ〜Ｌ；図３２Ｆおよび３２Ｌはそれぞれ、図３２Ｅおよび３２Ｋの囲み領域の拡大図である。）および高濃度（０．２５ｍＭ、図３２Ｇ〜Ｈおよび３２Ｍ〜Ｎ；図３２Ｈ、図３２Ｎはそれぞれ図３２Ｇ、図３２Ｍの囲み領域の拡大図である。）の生物活性複合材料の両方で観察した。ミクロ組織（Ｍｉｃ）上および中での暗色に染色された生物活性複合材料粒子（Ｐ）の実質的な付着および蓄積は明らかである。これは、細胞のないマトリックス（図３２Ｉ〜Ｊおよび３２Ｏ〜Ｐ；図３２Ｊおよび図３２Ｐは、それぞれ図３２Ｉおよび図３２Ｏの囲み領域の拡大図である。）上の個々の粒子としてのＨＡ−ＡＬＡとＨＡ−ＤＨＡの任意の広がりとは対照的であり、凝集と接着効果はマトリックスによって引き起こされないことを示している。石灰化培地で誘導した３Ｄ細胞培養物でも石灰化が観察された（図３２Ａ〜Ｂ；図３２Ｂは、図３２Ａの囲み領域の拡大図である。）。増殖培地のみに曝露された微小組織は染色されず、ミネラル形成がないことを示した（図３２Ｃ〜Ｄ；図３２Ｄは、図３２Ｃの囲み領域の拡大図である。）。石灰化培地（陽性対照）ＨＡ−ＡＬＡおよびＨＡ−ＤＨＡとインキュベートした石灰化微小組織の定量光強度値（それぞれ、６９．６５±１０．２４、６２．４３±９．７７、６８．０３±７．６７ＡＵ）は類似しており、ＨＡ−ＡＬＡおよびＨＡ−ＤＨＡ処理による有意な石灰化を示した。その結果、これらの強度値は、図３５の非石灰化微小組織（１５２．１５±７．０５ＡＵ）と比較して、半分未満に有意に減少した（ｐ≦０．００１）。
【００９１】
ヒト胎児骨芽細胞の初期分化と石灰化過程に対するＨＡ−ＡＬＡとＨＡ−ＤＨＡの誘導効果を分析し、２Ｄ培養におけるアルカリホスファターゼ活性（図３６Ａ〜Ｈ）とミネラル形成と沈着（図３７Ａ〜Ｈ）により実証した。アルカリホスファターゼ活性はＨＡ−ＡＬＡとＨＡ−ＤＨＡに接着した分化骨芽細胞で検出された（図３６Ｅ〜Ｆおよび３６Ｇ〜Ｈ；図３６Ｆおよび図３６Ｈは、それぞれ図３６Ｅおよび図３６Ｇの囲み領域の拡大図である。）。石灰化培地で処理した骨芽細胞（図３６Ａ〜Ｂ；図３６Ｂは、図３６Ａの囲み領域の拡大である。）もアルカリホスファターゼ活性を示した。増殖培地のみで処理した骨芽細胞培養（図３６Ｃ〜Ｄ；図３６Ｄは、図３６Ｃの囲み領域の拡大である。）は低レベルのアルカリホスファターゼ活性を示した。
【００９２】
ＨＡ−ＡＬＡ材料（暗色凝集粒子、Ｐ）で処理した骨芽細胞はアリザリンレッドで染色しなかったことから、１１日目までにミネラル形成は始まっていなかったことが示される（図３７Ｅ〜Ｆ；図３６Ｆは、図３６Ｅの囲み領域の拡大である。）。しかし、この処理のためのアルカリホスファターゼの検出は、石灰化骨芽細胞への細胞分化に対するこの材料の正の効果を示す。ＨＡ−ＤＨＡで処理した骨芽細胞はアリザリンレッドＳで染色し、カルシウム沈着の開始を示した。ＨＡ−ＤＨＡはまた、いずれのＨＡ−ＤＨＡ粒子とも直接接触しない骨芽細胞が染色し、ミネラル形成を示すことから、近傍の骨芽細胞に間接的な影響を及ぼすことが観察された（図３７Ｇ〜Ｈ；図３７Ｈは、図３７Ｇの囲み領域の拡大図である。）。石灰化培地でインキュベートした細胞（図３７Ａ〜Ｂ；図３７Ｂは、図３７Ａの囲み領域の拡大図である。）は染色せず、石灰化過程を開始していないことを示した。この結果は、ＨＡ−ＤＨＡが標準石灰化培地に比べてミネラル形成を誘導するのに必要な時間を短縮する可能性を示唆する。増殖培地のみに曝露した骨芽細胞はミネラル沈着を示さなかった（図３７Ｃ〜Ｄ；図３７Ｄは、図３７Ｃの囲み領域の拡大図である。）。ＨＡ−ＡＬＡとＨＡ−ＤＨＡは、骨芽細胞に接着し凝集することにより、実質性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉｖｉｔｙ）を示した（図３７Ｅ〜Ｆおよび図３７Ｇ〜Ｈ）。ＨＡ−ＤＨＡで処理した骨芽細胞の定量的光強度測定（１３８．９９±１２．１６ＡＵ）は、陰性対照群（１７７．２４±５．３７ＡＵ）と比較して３８ＡＵの有意な減少（ｐ≦０．００１）を示した（図３８）。１１日間のインキュベーション後、ＨＡ−ＡＬＡまたは石灰化培地で培養した骨芽細胞の光強度値に有意差は観察されなかった（１６６．６３±６．５３、１７３．８０±１２．１６ＡＵ）。この結果は、ＨＡ−ＤＨＡが骨芽細胞における初期石灰化過程を誘導することを示す。
【００９３】
本明細書に開示される生物活性複合材料は、生物活性分子を、それらが必要とされる部位に直接送達／堆積するために使用され得る：（１）骨または歯の欠損修復物（移植／修復材料として、または他の移植／修復材料と組み合わせて；無機系セメントや高分子系セメントなどの修復材の添加剤として）；（２）インプラントデバイス（歯科インプラントや骨インプラントなど）のコーティング；（３）歯磨剤（歯磨き粉、ニス、リンスなど）；（４）修復材料の３Ｄプリンティング（例えば骨のインプラントや足場）；（５）抗菌性表面特性／抗菌剤の放出が必要とされる塗料またはワニスへの添加剤（６）官能基のｐＨ制御放出のために経口、静脈内または皮下への送達／注入。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ−３１Ｈ】
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【図３１Ｉ】
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【図３１Ｊ】
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【図３１Ｋ】
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【図３１Ｌ】
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【図３２Ａ−３２Ｊ】
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【図３２Ｋ−３２Ｐ】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
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【図３６Ｅ】
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【図３６Ｆ】
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【図３６Ｇ】
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【図３６Ｈ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３７Ｄ】
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【図３７Ｅ】
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【図３７Ｆ】
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【図３７Ｇ】
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【図３７Ｈ】
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【図３８】
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【国際調査報告】
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