(57)【要約】  ある実施態様において、本発明は、尿、脳脊髄液、血漿、血液、胸水または体液などの液体サンプルから濃縮され、単離され、次いで、ＰＣＲを用いず遺伝子変異について分析されて、超高感度で小型サイズのｃｆＤＮＡが検出される技術に関する。特に、正荷電ナノ構造体が使用されるとき、本技術はｃｆＤＮＡの捕捉率および検出率を増加させ得る。本発明の実施態様による検出方法はＰＣＲ増幅反応を必要とせず、故に結果を得るまでの時間を大幅に短縮させる。さらに、本発明方法は特別な装置を必要とせず現場での即席の分析を可能とするため、短時間内に複数遺伝子の同時探索を可能とする臨床現場即時検査(ＰＯＣＴ)に使用されることが期待される。
2021526029.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルから不安定二重螺旋構造を有するセルフリーＤＮＡ(ｃｆＤＮＡ)を増幅せずに検出する方法であって：
ａ)ｃｆＤＮＡを含むサンプルと正荷電物質との混合；
ｂ)該ｃｆＤＮＡが結合している正荷電物質の分離；
ｃ)該混合物とプローブおよびマーカーとの混合；
ｄ)該ｃｆＤＮＡと結合していないプローブおよびマーカーの除去；および
ｅ)マーカーの検出
を含む、方法。
【請求項２】
不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡが：
ｉ)安定な二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡより低いＴｍ値を有する；または
ii)安定な二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡが変性されない条件下で変性される、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡが、ｃｆＤＮＡと相補的に結合できる１５量体〜３０量体プローブと、次の
ｉ)１〜１２０分間、室温に静置させる条件；
ii)９０℃〜９５℃で１秒間〜３分間加熱する条件；
iii)７５℃〜９０℃で１秒間〜５分間加熱する条件；
iv)６０℃〜７５℃で３０秒間〜３０分間加熱する条件；
ｖ)２５℃〜４０℃で１０〜１２０分間加熱する条件；
vi)プロテアーゼで１〜３０分間処理する条件；および
vii)ＤＮａｓｅで１〜３０分間処理する条件、
の何れかの条件下で結合できる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡが循環腫瘍ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡが正常細胞に存在しない損傷された核酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
正常細胞に存在しない損傷された核酸配列が欠失、重複、反転、転座、ミスマッチおよび一塩基変異(ＳＮＶ)からなる群から選択される何れかの構造異常を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程ｃ)の前に、サンプルまたは正荷電物質に結合したｃｆＤＮＡを次の条件
ｉ)１〜１０分間、室温に静置させる条件；
ii)９０℃〜９５℃で１秒間〜１分間加熱する条件；
iii)７５℃〜９０℃で１０秒間〜３分間加熱する条件；
iv)６０℃〜７５℃で１〜３０分間加熱する条件；
ｖ)２５℃〜４０℃で５〜６０分間加熱する条件；
vi)プロテアーゼで１〜１０分間処理する条件；および
vii)ＤＮａｓｅで１〜１０分間処理する条件
から選択される何れかの条件下で変性させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
プローブが１５量体〜３０量体ヌクレオチドからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
プローブが、ビオチンがそれに結合している形態である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
マーカーがホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)または蛍光タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
マーカーがさらにアビジン、ストレプトアビジンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される何れかを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
マーカーが導電性ポリマー；ヒアルロン酸；アビジンまたはストレプトアビジン；およびホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)または蛍光タンパク質を含むナノ粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
正荷電物質が正荷電ナノワイヤーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ナノワイヤーが導電性ポリマーを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ナノワイヤーがさらにビオチンを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
導電性ポリマーがポリ(アセチレン)、ポリ(ピロール)、ポリ(チオフェン)、ポリ(パラ−フェニレン)、ポリ(３,４−エチレンジオキシチオフェン)、ポリ(フェニレンスルフィド)、ポリ(パラ−フェニレンビニレン)およびポリアニリンからなる群から選択される何れかである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
サンプルが尿、脳脊髄液、血漿、血液、胸水、腹水、唾液、痰および体液からなる群から選択される何れかである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
損傷された核酸配列がＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＡＲ、ＢＲＣＡ、ＫＩＴ、ＦＧＦＲ、ＩＤＨ、ＥＳＲ１、ＨＥＲ２、ＡＬＫ−ＥＭＬ４およびＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の変異配列である、請求項５に記載の方法。
【請求項１９】
工程ｅ)において、マーカーが色調変化、ＵＶ吸光度変化、蛍光応答変化または電気化学的変化により検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
サンプルから不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡを増幅せずに検出することにより、癌または感染性疾患の診断または予測に関する情報を提供する方法であって、
ａ)ｃｆＤＮＡを含むサンプルとの正荷電物質の混合；
ｂ)該ｃｆＤＮＡが結合している正荷電物質の分離；
ｃ)該混合物とプローブおよびマーカーの混合；
ｄ)該ｃｆＤＮＡと結合していないプローブおよびマーカーの除去；
ｅ)マーカーの検出；および
ｆ)マーカーが検出されたとき、不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡに対応する遺伝子と関連する癌または感染性疾患があることを決定する
ことを含む、方法。
【請求項２１】
サンプルから室温で不安定である二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡの存在または非存在を増幅せずに検出するデバイスであって、
ａ)ｃｆＤＮＡを含むサンプルと正荷電ナノワイヤーとを混合するための混合セクション；
ｂ)ｃｆＤＮＡが結合したナノワイヤー以外のサンプルを除去する取得セクション；
ｃ)ｃｆＤＮＡが結合したナノワイヤーに、該ｃｆＤＮＡが相補的に結合し得るビオチンを結合させたプローブならびにストレプトアビジンおよびマーカーを含むナノ粒子を加えるための、反応セクション；
ｄ)該マーカーの検出のための検出セクション；および
ｅ)マーカーの検出により、該サンプルが、該プローブと相補的配列を有し、室温で不安定である二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡを含むことを決定するための情報処理セクション
を含む、デバイス。
【請求項２２】
サンプルから不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡを増幅せずに検出することにより、癌または感染性疾患の診断または予測のための情報を提供するデバイスであって、
ａ)ｃｆＤＮＡを含むサンプルと正荷電ナノワイヤーとを混合のための混合セクション；
ｂ)ｃｆＤＮＡが結合したナノワイヤー以外のサンプルを除去する取得セクション；
ｃ)ｃｆＤＮＡが結合したナノワイヤーに、該ｃｆＤＮＡが相補的に結合できるビオチンを結合させたプローブならびにストレプトアビジンおよびマーカーを含むナノ粒子を加えるための、反応セクション；
ｄ)該マーカーの検出のための検出セクション；および
ｅ)マーカーの検出により、該サンプルが、該プローブと相補的配列を有し、室温で不安定である二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡを含むことを決定するための情報処理セクション
を含む、デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、遺伝子増幅過程なく、不安定二重螺旋構造を有するセルフリーＤＮＡを検出するための方法およびデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
近年、癌疾患の早期診断の重要性が、世界中でますます顕著になってきている。それ故に、癌の早期診断方法についての研究も増えている。しかしながら、今日まで、癌を診断する方法は、組織サンプル取得および内視鏡検査などの侵襲的方法で実施されている。特に、組織学的試験は、疾患が疑われる部位の一部を摘出し、顕微鏡下に観察するような方法で実施される。それ故に、組織サンプルを針、穿孔器、内視鏡または腹腔鏡を使用して採取するために、体を切開する必要があるとの事実により、患者が相当不快に感じるだけでなく、瘢痕も残り、回復に長時間かかる。
【０００３】
液体細胞診を使用する分子診断方法は、侵襲的診断および試験方法の代替として、興味が惹かれている。液体細胞診は非侵襲的方法を使用するため、その結果を直ぐに特定することが可能である。さらに、疾患の一部しか分析できない組織サンプルとは異なり、液体細胞診は、疾患の多角的分析を可能とする。特に、液体細胞診は、癌診断に優れた有効性を発揮することが期待される。特に、血液および尿などの体液の試験からだけで、血液中に存在する体の各部分の癌細胞由来ＤＮＡを分析することが可能となり、よって、癌進展および転移などの詳細な観察がなされ得ると予測される。
【０００４】
分子診断方法は、血液および尿などの遺伝情報を含むサンプルから、多くの数値または像を用いて、ＤＮＡまたはＲＮＡの変化を検出および診断する、エクスビボ診断の代表的技術である。精度の高さおよび組織学的試験が不要であるとの利点により、ゲノム分析技術の迅速な開発と共に、その経費削限利点に基づいて、癌診断技術に、分子診断方法を応用する試みがなされている。
【０００５】
一方で、セルフリーＤＮＡ(以後ｃｆＤＮＡと称する)は、血漿に存在し、細胞由来であるＤＮＡをいう。ｃｆＤＮＡは通常二重螺旋構造を有する。さらに、多くの場合、ｃｆＤＮＡはコイルドコイル構造を有する。ｃｆＤＮＡは腫瘍細胞に由来し得る。さらに、腫瘍細胞由来のｃｆＤＮＡは、癌患者から得た血液、血漿または尿などの生物学的サンプルに見られ得る。
【０００６】
癌患者で見られるｃｆＤＮＡは壊死性細胞、正常細胞および／または癌細胞に由来し得る。このようなｃｆＤＮＡは、種々の過程を経て尿、血液などに放出される。故に、血液、血漿または尿などの生物学的サンプルにおけるｃｆＤＮＡを単離および検出する技術の開発が、液体細胞診を、癌のリスクのある患者のモニタリングのための、より有効かつ信頼できるツールとし得る。特に、尿、血漿、血液または体液は容易に入手可能なサンプルであるため、非侵襲的方法で大量の検体を集めることが可能である。
【０００７】
しかしながら、現在の技術レベルを考慮すると、癌の早期診断方法には、血液および尿などの液体サンプル中のｃｆＤＮＡおよび遺伝子に存在する変異の発見を含む、多くの困難がある。それ故に、ｃｆＤＮＡを容易に検出する方法ならびに検出感受性の改善および正確な癌早期診断の技術の開発が必要である。
【０００８】
同時に、韓国特許１０−１７５１９６２は、ｃｆＤＮＡが検出されるようにプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を実施することによる、ｃｆＤＮＡの定量が可能な技術を開示する。しかしながら、ポリメラーゼ連鎖反応の実施には別々のポリメラーゼおよび実験装置が必要であるとの問題があり、増幅のために正確なプライマー産生が必要であり、現場での診断が容易にできないとの問題がある。
【０００９】
さらに、韓国特許１０−１７０１６１８は、ｃｆＤＮＡを効率的に単離するために、電場の変化により表面性質を変えることができる、ナノ構造体を記載する。ナノ構造体は電場の変化によりｃｆＤＮＡと結合したり、解離したりでき、故に、サンプルからｃｆＤＮＡを容易に単離できる。しかしながら、どのｃｆＤＮＡが存在するかを同定するためにポリメラーゼ連鎖反応を使用しなければならないとの限界がある。
【００１０】
ポリメラーゼ連鎖反応の実施によりｃｆＤＮＡを増幅するために、種々のタイプのプライマーセットが必要であり、複雑な工程を実施する時間もかかる。それ故に、ＰＣＲを行わなければならない限界を克服し、ｃｆＤＮＡを高精度で分析する方法を開発する研究が継続してなされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明の記載
技術的課題
慣習的に、ｃｆＤＮＡを検出するために、ｃｆＤＮＡを変性させ、該ｃｆＤＮＡと相補的なプライマーを使用して増幅する過程を実施することが必須であった。しかしながら、本願発明者らは、血液中の不安定ｃｆＤＮＡの存在を同定した。さらに、本願発明者らは、安定ｃｆＤＮＡと異なり、不安定ｃｆＤＮＡが一本鎖プローブと異常な反応を示すことを同定した。特に、本願発明者らは、このような不安定ｃｆＤＮＡが癌または感染性疾患を有する個体の細胞に由来することを同定した。これらの発見に基づき、本願発明者らは本発明を完成させた。
【００１２】
従って、本発明の目的は、不安定ｃｆＤＮＡの存在または非存在を同定する方法の提供およびこのような不安定ｃｆＤＮＡの同定により癌または種々の疾患の診断のための情報を提供する方法の提供である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
課題の解決
上記目的を達成するために、サンプルからの不安定ｃｆＤＮＡを増幅せずに検出する方法が提供される。さらに、サンプルからの不安定ｃｆＤＮＡを増幅せずに検出することにより、癌および感染性疾患の診断または予測のための情報を提供する方法が提供される。さらに、サンプルからの不安定ｃｆＤＮＡを増幅せずに検出するためのデバイスが提供される。
【発明の効果】
【００１４】
発明の有利な効果
本実施態様による不安定ｃｆＤＮＡを検出する方法が使用されたとき、不安定ｃｆＤＮＡを増幅する工程が不要となるだけでなく、ｃｆＤＮＡを分析する時間を短縮することも可能である。特に、遺伝子変異部分を含む不安定二本鎖ｃｆＤＮＡを効率的に検出可能であり、それにより遺伝子変異と関連する癌または疾患を効率的に診断または予測することが可能である。さらに、本発明の実施態様による方法が使用されたとき、迅速かつ正確な方法で、尿、脳脊髄液、胸水、腹水、血漿、血液または体液などの小量の生物学的サンプルから、不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡの存在または非存在を同定することが可能である。さらに、このように検出された不安定ｃｆＤＮＡが種々の癌または疾患と関連することが確認されているため、本発明の実施態様による方法は、癌の診断または処置後の予後の同定のために有効に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】正荷電ナノワイヤー(ＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＷ)の走査型電子顕微鏡(ＳＥＭ)画像を示す。
【００１６】
【図２】正荷電ナノワイヤー(ＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＷ)の透過型電子顕微鏡(ＴＥＭ)画像を示す。
【００１７】
【図３】カチオン性ポリマーとしてポリリシン(ＰＬＬ)が結合した、ナノ構造体(ＰＬＬ／Ｐｐｙ  ＮＷ)表面の、走査型電子顕微鏡画像を示す。
【００１８】
【図４】ＨＲＰ／ストレプトアビジン結合ナノ粒子の走査型電子顕微鏡画像を示す。
【００１９】
【図５】５０nmの直径を有するＰＥＩ結合ナノ粒子(ＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＰ)の走査型電子顕微鏡(ＳＥＭ)画像を示す。
【００２０】
【図６】ポリエチレンイミン(ＰＥＩ)が結合した表面を有するナノワイヤー(ＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＷ)を使用して、患者の体液からｃｆＤＮＡを得て、次いで、遺伝子変異をプローブおよびＨＲＰ／ストレプトアビジンタグ付ナノ粒子(ＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰ)との反応により６０分以内に分析する、方法の模式図を示す。
【００２１】
【図７】ナノワイヤー、プローブおよびＨＲＰ／ストレプトアビジンタグ付ナノ粒子を使用して、不安定ｃｆＤＮＡを検出する方法を図説する。
【００２２】
【図８】血液、脳脊髄液または胸水などのサンプルにおける不安定ｃｆＤＮＡを検出する方法を、時系列フローで示す。
【００２３】
【図９】尿などのサンプルにおける不安定ｃｆＤＮＡを検出する方法を、時系列フローで示す。
【００２４】
【図１０】血液から得たｃｆＤＮＡの状態による変性条件の差異を模式的に示す。
【００２５】
【図１１】尿、唾液および痰から得たｃｆＤＮＡの状態による変性条件の差異を模式的に示す。
【００２６】
【図１２】子宮頸癌患者の尿サンプルおよび正常対象の尿サンプルからｃｆＤＮＡを得て、次いで、ＨＰＶ  １８またはＨＰＶ  １６プローブを使用してｃｆＤＮＡにおける遺伝子変異の存在または非存在を検出した結果を示す。
【００２７】
【図１３】ＨＰＶ陽性子宮頸癌患者(ＨＰＶ１６(＋)およびＨＰＶ１８(＋))およびＨＰＶ陰性健常対照(ＨＰＶ−)の尿に存在するｃｆＤＮＡと、ＨＰＶ  １８またはＨＰＶ  １６に特異的なプローブの間の結合を、吸光度により同定することにより得た結果を示す。
【００２８】
【図１４】子宮頸癌患者の尿から単離したｃｆＤＮＡを、ＨＰＶ  １６、ＥＧＦＲ１９欠失、ＨＰＶ  １８およびＥＧＦＲ  ２１  Ｌ８５８Ｒに特異的なプローブと連続的に反応させ、次いで、ｃｆＤＮＡと各プローブの間の結合を同定することにより得た結果を示す。
【００２９】
【図１５】正常対象血漿に、低範囲(１０bp〜１００bp)、中範囲(１００bp〜２kb)および高範囲(３.５kb〜２１kb)ＤＮＡラダーを加え、次いで、ＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＷを使用してＤＮＡラダーを捕捉するときの捕捉効率を評価して得た結果を示す。
【００３０】
【図１６】超音波処理せずに得たＡ５４９細胞株(レーン１および２)、ＨＣＣ２２７９細胞株(レーン３および４)およびＨ１９７５細胞株(レーン５および６)の細胞株ゲノムＤＮＡ(以後ｇＤＮＡと称する)ならびに各細胞株のｇＤＮＡの超音波処理により得た断片化ＤＮＡ(以後ｆＤＮＡと称する)のサイズの同定により得た結果を示す。
【００３１】
【図１７】Ａ５４９細胞株、ＨＣＣ２２７９細胞株およびＨ１９７５細胞株から超音波処理せずに得たｇＤＮＡおよび各細胞株の超音波処理により得たｆＤＮＡの、ＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＷを使用する捕捉、次いで捕捉効率の評価により得た結果を示す。
【００３２】
【図１８】Ａ５４９細胞株、ＨＣＣ２２７９細胞株およびＨ１９７５細胞株から超音波処理せずに得たｇＤＮＡおよび各細胞株の超音波処理により得たｆＤＮＡの、ＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＷを使用する捕捉、次いでＥＧＦＲ  １９(１９Ｄｅｌ)、ＥＧＦＲ  ２０(Ｔ７９０Ｍ)およびＥＧＦＲ  ２１(Ｌ８５８Ｒ)に特異的なプローブの付加による色調変化の同定により得た結果を示す。ｆＤＮＡのみが標的プローブに選択的に結合することが同定された。
【００３３】
【図１９】Ａ５４９細胞株、ＨＣＣ２２７９細胞株およびＨ１９７５細胞株から超音波処理せずに得たｇＤＮＡおよび各細胞株の超音波処理により得たｆＤＮＡの、ＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＷを使用する捕捉、次いでＥＧＦＲ  １９(１９Ｄｅｌ)、ＥＧＦＲ  ２０(Ｔ７９０Ｍ)およびＥＧＦＲ  ２１(Ｌ８５８Ｒ)に特異的なプローブの付加によるＵＶ−Ｖｉｓスペクトル変化の同定により得た結果を示す。ｆＤＮＡのみが標的プローブに選択的に結合することが同定された。
【００３４】
【図２０】Ｈ１９７５細胞株、ＨＣＣ２２７９細胞株およびＡ５４９細胞株のｆＤＮＡをＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＷを使用して得て、次いで、蛍光色素が結合したＤＮＡプローブを使用して遺伝子変異を分析して得た結果を示す。
【００３５】
【図２１】ＨＣＣ２２７９(ＥＧＦＲエクソン１９欠失遺伝子変異)細胞のｆＤＮＡおよびＥＧＦＲエクソン１９欠失に特異的なプローブを使用し、ｆＤＮＡの濃度に応じた該プローブの該ｆＤＮＡへの結合をＵＶ吸光度を使用して得た結果を示す。これにより、ｃｆＤＮＡの検出可能濃度が同定された。
【００３６】
【図２２】Ｈ１９７５(ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍおよびエクソン２１  Ｌ８５８Ｒ遺伝子変異)のｆＤＮＡおよびＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍに特異的なプローブを使用し、ｆＤＮＡの濃度に応じた該プローブの該ｆＤＮＡへの結合をＵＶ吸光度を使用して得た結果を示す。これにより、ｃｆＤＮＡの検出可能濃度が同定された。
【００３７】
【図２３】ＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＷを使用して、肺癌患者の２００μLの血漿から得たｃｆＤＮＡのバイオアナライザでの分析により得た結果を示す。文献によると、癌関連ｃｆＤＮＡは、１６６bpの平均サイズを有することが知られる。バイオアナライザデータに示されるとおり、ＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＷを使用して肺癌患者の血漿から得たｃｆＤＮＡは、１６９bpにピークを有する。
【００３８】
【図２４】ＥＧＦＲ遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿から単離したｃｆＤＮＡを、ＥＧＦＲエクソン１９欠失(Ｄｅｌ)またはＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８Ｒに特異的に結合するプローブと反応させたとき、組織の遺伝子型と同じ色調変化およびＵＶ吸光度が示されることを同定することにより得た結果を示す。
【００３９】
【図２５】ＥＧＦＲエクソン１９欠失(Ｄｅｌ)、ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０ＭおよびＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８Ｒ遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿から単離したｃｆＤＮＡを、ＥＧＦＲエクソン１９Ｄｅｌ、ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０ＭまたはＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８Ｒに特異的なプローブと反応させたとき、組織の遺伝子型と同じ色調変化およびＵＶ吸光度が示されることを同定することにより得た結果を示す。
【００４０】
【図２６】ＫＲＡＳエクソン２遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿から、ＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＷを使用して、単離したｃｆＤＮＡを、ＫＲＡＳエクソン２に特異的なプローブと反応させたとき、組織の遺伝子型と同じ色調変化およびＵＶ吸光度が示されることを同定することにより得た結果を示す。
【００４１】
【図２７】ＫＲＡＳエクソン２遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿から、ＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＷを使用して、単離したｃｆＤＮＡを、ＫＲＡＳエクソン２に特異的なプローブと反応させたとき、組織の遺伝子型と同じ色調変化およびＵＶ吸光度が示されることを同定することにより得た結果を示す。
【００４２】
【図２８】ＡＬＫ−ＥＭＬ４融合遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿から単離したｃｆＤＮＡを、ＡＬＫ−ＥＭＬ４に特異的に結合するプローブと反応させたとき、組織の遺伝子型と同じ色調変化およびＵＶ吸光度が示されることを同定することにより得た結果を示す。
【００４３】
【図２９】ＥＧＦＲエクソン１９欠失およびＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍ遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿から単離したｃｆＤＮＡを、ＥＧＦＲエクソン１９欠失またはＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍに特異的に結合する種々のプローブと反応させたとき、組織に一致した色調変化およびＵＶ吸光度が示されることを同定することにより得た結果を示す。しかしながら、この結果によると、３タイプのプローブを使用したにも関わらず、ＥＧＦＲ  ２１  Ｌ８５８Ｒ変異では色調変化が観察されないことが同定された。その結果、遺伝子とプローブの反応は特異的プローブに限定されず、あらゆるプローブが、該プローブが該遺伝子に特異的に結合する限り、変異を有する遺伝子に結合できることが解る。
【００４４】
【図３０】ＥＧＦＲ遺伝子変異がない肺癌患者(野生型、ＷＴ)の血漿から単離したｃｆＤＮＡを、それぞれ９５℃で１分間および１０分間変性させ、次いで、ＥＧＦＲエクソン１９欠失、ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０ＭまたはＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８Ｒに対するプローブと反応させて得た結果を示す。ＥＧＦＲ  ＷＴ患者の血漿から抽出したｃｆＤＮＡは、９５℃で１分間変性させたときどのプローブとも反応を示さず、そして他方で、ｃｆＤＮＡは、９５℃で１０分間変性させた後全プローブと非特異的に反応することが同定された。
【００４５】
【図３１】ＥＧＦＲエクソン１９欠失およびＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍ遺伝子変異を有する肺癌患者および正常対象の血漿から、ナノワイヤーによりｃｆＤＮＡを補足し、該ｃｆＤＮＡを９５℃で０分間変性させ、次いで、ＥＧＦＲ  １９欠失、２０  Ｔ７９０Ｍまたは２１  Ｌ８５８Ｒに対するプローブとの反応を同定することにより得た結果を示す。
【００４６】
【図３２】ＥＧＦＲエクソン１９欠失およびＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍ遺伝子変異を有する肺癌患者および正常対象の血漿から、ナノワイヤーによりｃｆＤＮＡを補足し、該ｃｆＤＮＡを９５℃で１分間変性させ、次いで、ＥＧＦＲ  １９欠失、２０  Ｔ７９０Ｍまたは２１  Ｌ８５８Ｒに対するプローブとの反応を同定することにより得た結果を示す。
【００４７】
【図３３】ＥＧＦＲエクソン１９欠失およびＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍ遺伝子変異を有する肺癌患者および正常対象の血漿から、ナノワイヤーによりｃｆＤＮＡを補足し、該ｃｆＤＮＡを９５℃で１０分間変性させ、次いで、ＥＧＦＲ  １９欠失、２０  Ｔ７９０Ｍまたは２１  Ｌ８５８Ｒに対するプローブとの反応を同定することにより得た結果を示す。
【００４８】
【図３４】１５１名の肺癌患者の血漿からｃｆＤＮＡを得て、該肺癌患者における遺伝子変異を分析することにより得た表を示す。
【００４９】
【図３５】ＥＧＦＲ変異がない(野生型)肺癌患者、ＥＧＦＲエクソン１９欠失を有する肺癌患者およびＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８Ｒを有する肺癌患者の血漿ｃｆＤＮＡを得て、該ｃｆＤＮＡをＥＧＦＲエクソン１９  Ｄｅｌに特異的なプローブと混合し、次いでＵＶ分光吸光度(ΔＯＤ、５００nm〜６５０nm)値の分析により該肺癌患者における遺伝子変異を同定することにより得た結果を示す。
【００５０】
【図３６】ＥＧＦＲエクソン１９欠失を有する肺癌患者の血漿からのｃｆＤＮＡを得て、該ｃｆＤＮＡをＥＧＦＲエクソン１９  Ｄｅｌに特異的なプローブと混合し、次いで、遺伝子変異の特異性および感受性を分析することにより得た結果を示す。
【００５１】
【図３７】ＥＧＦＲ変異がない(野生型)肺癌患者、ＥＧＦＲエクソン１９欠失を有する肺癌患者およびＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８Ｒを有する肺癌患者の血漿からｃｆＤＮＡを得て、それにＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８Ｒに特異的なプローブを加え、次いで、ＵＶ分光吸光度(ΔＯＤ、５００nm〜６５０nm)値の分析により患者における遺伝子変異を同定することにより得た結果を示す。
【００５２】
【図３８】ＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８Ｒを有する肺癌患者の血漿からｃｆＤＮＡを得て、それにＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８Ｒに特異的なプローブを加え、次いで、患者における遺伝子変異の特異性および感受性を分析することにより得た結果を示す。
【００５３】
【図３９】ＥＧＦＲエクソン１９欠失遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿から、ＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＰを使用して、単離したｃｆＤＮＡを、ＥＧＦＲエクソン１９  Ｄｅｌ(Ｅ１９)、ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍ(Ｅ２０)またはＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８Ｒ(Ｅ２１)に特異的なプローブと反応させることにより得た結果を示し、その結果、組織に一致するＵＶ吸光度が観察されることが同定される。
【００５４】
【図４０】ポリリシンで修飾したＰＬＬ／Ｐｐｙ  ＮＷを使用して、ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０ＭおよびＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８Ｒ遺伝子変異を有するＨ１９７５細胞株のｆＤＮＡを得て、該ｆＤＮＡをＥＧＦＲエクソン１９  Ｄｅｌ、ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０ＭまたはＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８Ｒに特異的なプローブと反応させ、次いで遺伝子変異を分析することにより得た結果を示す。
【００５５】
【図４１】ＥＧＦＲエクソン１９欠失についてＣＰおよびＤＰの配列を示す。この試験において、肺癌患者におけるｃｆＤＮＡ遺伝子変異をＣＰ＿１およびＤＰを使用して分析した。ここで、ＣＰは変異部分を含むまたはそれに隣接した配列に特異的に結合するよう設計されたプローブをいい、ＤＰは、変異配列から空間的に離れた部分に特異的に結合するよう設計されたプローブをいう。
【００５６】
【図４２】ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０ＭのＣＰおよびＤＰの配列を示す。この試験において、肺癌患者におけるｃｆＤＮＡ遺伝子変異を、ＣＰ２およびＤＰを使用して分析した。
【００５７】
【図４３】ＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８ＲのＣＰおよびＤＰの配列を示す。この試験において、肺癌患者におけるｃｆＤＮＡ遺伝子変異を、ＣＰ２およびＤＰを使用して分析した。
【００５８】
【図４４】ＥＧＦＲエクソン１９欠失遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿からｃｆＤＮＡを得て、次いで、ＤＰを用いず、図４１〜４３のＥＧＦＲエクソン１９  ＣＰ＿１、エクソン２０  ＣＰ２およびエクソン２１  ＣＰ２を使用して遺伝子変異を分析して得た結果を示す。
【００５９】
【図４５】ＥＧＦＲエクソン１９欠失を有する肺癌患者の血漿をＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅ処理に付し、ＰＥＩ／ＰｐｙナノワイヤーによりｃｆＤＮＡを得て、ＥＧＦＲエクソン１９欠失に特異的なプローブを使用して不安定ｃｆＤＮＡを検出することにより得た結果を示す。
【００６０】
【図４６】ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍ有する肺癌患者の血漿をＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅ処理に付し、ＰＥＩ／ＰｐｙナノワイヤーによりｃｆＤＮＡを得て、ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍに特異的なプローブを使用して不安定ｃｆＤＮＡを検出することにより得た結果を示す。
【００６１】
【図４７】ＥＧＦＲエクソン１９欠失およびＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍ遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿から得たｃｆＤＮＡをＥＧＦＲエクソン１９欠失(Ｄｅｌ１９)、ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０ＭおよびＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８Ｒに特異的なプローブと反応させ、ＨＲＰ／ストレプトアビジンナノ粒子(大量のＨＲＰを含む)をそれに加えて、色調変化およびＵＶ吸光度により検出したｃｆＤＮＡを同定することにより得た結果を示す。
【００６２】
【図４８】図４７と同じＥＧＦＲエクソン１９欠失およびＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍ遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿から得たｃｆＤＮＡを、ＥＧＦＲエクソン１９欠失(Ｄｅｌ１９)、ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０ＭおよびＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８Ｒに特異的なプローブと反応させ、次いでＨＲＰ／ストレプトアビジン複合体(ＨＲＰとストレプトアビジンの１：１での結合により得た複合体)をそれに加え、色調変化およびＵＶ吸光度により検出したｃｆＤＮＡを同定することにより得た結果を示す。この結果から、ＨＲＰ／ストレプトアビジンナノ粒子と比較して、ＨＲＰ／ストレプトアビジン複合体の場合ノイズが生じることが同定される。
【００６３】
【図４９】５ＥＧＦＲエクソン１９欠失およびエクソン２０  Ｔ７９０Ｍ遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿からｃｆＤＮＡを抽出し、次いで、該ｃｆＤＮＡをＥＧＦＲエクソン１９  Ｄｅｌ、ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０ＭおよびＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８Ｒに特異的なプローブおよびＨＲＰ／ストレプトアビジンタグ付ナノ粒子(ＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰ)と反応させ、および、ＥＧＦＲエクソン１９  Ｄｅｌ、ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０ＭおよびＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８Ｒに特異的なプローブおよびＨＲＰ／ストレプトアビジン複合体(ＨＲＰとストレプトアビジンは互いに１：１で結合している)と反応させることにより得た二つの結果の分析により、癌組織の遺伝子型を同定し、一致を比較することにより得たグラフを示す。
【００６４】
【図５０】ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍおよび２１  Ｌ８５８Ｒ遺伝子変異を有する肺癌患者の胸水から得たｃｆＤＮＡを、ＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰが既に結合しているＥＧＦＲエクソン１９欠失(１９  Ｄｅｌ)、ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０ＭおよびＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８Ｒに対するプローブと反応させ、次いで、ＵＶ吸光度で遺伝子変異を検出することにより同定することにより得た結果を示す。
【００６５】
【図５１】ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０ＭおよびＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８６１Ｑ遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿から得たｃｆＤＮＡを、ｃｆＤＮＡにおける遺伝子変異検出のために、ＥＧＦＲエクソン１９欠失に特異的なプローブ(１９  Ｄｅｌ)、ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍ、ＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８ＲおよびＥＧＦＲエクソンＬ８６１ＱおよびＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰと一斉に混合することにより得た結果を示し、その結果、遺伝子変異が癌組織におけると同様ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０ＭおよびＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８６１Ｑにのみ観察されることが、ＵＶ吸光度で同定される。
【００６６】
【図５２】ＡＬＫ−ＥＭＬ４融合およびＡＬＫ点変異(Ｉ１１７１Ｎ／Ｔ)遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿から得たｃｆＤＮＡを、ｃｆＤＮＡにおける遺伝子変異検出のために、ＡＬＫ−ＥＭＬ４融合およびＡＬＫ点変異(Ｔ１１５１、Ｌ１１５２Ｐ、Ｌ１１５２Ｒ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｉ１１７１Ｎ／Ｔ)に特異的なプローブおよびＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰと一斉に混合することにより得た結果を示し、その結果、癌組織におけると同様ＡＬＫ−ＥＭＬ４融合およびＡＬＫ点変異(Ｉ１１７１Ｎ／Ｔ)遺伝子型が検出されることが同定される。
【００６７】
【図５３】ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ遺伝子変異を有する甲状腺癌患者の血漿から得たｃｆＤＮＡを、ｆＤＮＡにおける遺伝子変異検出のために、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅに特異的なプローブおよびＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰと一斉に混合することにより得た結果を示し、その結果、患者の遺伝子型と同じＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ遺伝子変異が検出されることが同定される。
【００６８】
【図５４】正常対象の血液から集めたサンプルを種々の温度条件下の変性に付し、次いで、各処理条件の不安定ｃｆＤＮＡを検出することにより得た結果を示す。
【００６９】
【図５５】患者の血液から集めたサンプルを種々の温度条件下の変性に付し、次いで、各処理条件の不安定ｃｆＤＮＡを検出することにより得た結果を示す。
【００７０】
【図５６】変異体細胞株から得たｆＤＮＡを種々の温度条件下の変性に付し、次いで、各処理条件の不安定ｃｆＤＮＡを検出することにより得た結果を示す。
【００７１】
【図５７】変異体細胞株から得たｆＤＮＡを３７℃で３０分間ＤＮａｓｅで処理し、次いで、処理条件の不安定ｃｆＤＮＡを検出することにより得た結果を示す。
【００７２】
【図５８】変異体細胞株から得たｆＤＮＡを３７℃で６０分間ＤＮａｓｅで処理し、次いで、処理条件の不安定ｃｆＤＮＡを検出することにより得た結果を示す。
【００７３】
【図５９】変異体細胞株から得たｆＤＮＡを３７℃で１２０分間ＤＮａｓｅで処理し、次いで、処理条件の不安定ｃｆＤＮＡを検出することにより得た結果を示す。
【００７４】
【図６０】ＤＮａｓｅ活性による不安定ｃｆＤＮＡと安定ｃｆＤＮＡの差異を同定するために、不安定ｃｆＤＮＡおよび安定ｃｆＤＮＡを１μlまたは２μlのＤＮａｓｅで２４℃で１２０分間処理して得た結果を示す。
【００７５】
【図６１】ＤＮａｓｅ活性による不安定ｃｆＤＮＡと安定ｃｆＤＮＡの差異を同定するために、不安定ｃｆＤＮＡおよび安定ｃｆＤＮＡを１μlまたは２μlのＤＮａｓｅで３℃で１２０分間処理して得た結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
発明を実施するための最良の形態
＜用語の定義＞
ここで使用する用語「セルフリーＤＮＡ」はｃｆＤＮＡとも称する。さらに、ｃｆＤＮＡは、癌患者由来の尿、脳脊髄液、血漿、血液または体液などの生物学的サンプルにみられる癌細胞由来ＤＮＡである循環腫瘍ＤＮＡ(ｃｔＤＮＡ)でもあり得る。さらに、ｃｆＤＮＡは、尿、脳脊髄液、胸水、腹水、血漿、血液、唾液、痰または体液などの生物学的サンプルに存在し得る。ここで、ｃｆＤＮＡは、８０bp〜１０kbｐ、１００bp〜１kbｐまたは１２０bp〜５００bpのサイズを有し得る。さらに、ｃｆＤＮＡは１５０bp〜２００bpのサイズを有し得て、通常１６５bp〜１７０bpのサイズを有し得る。
【００７７】
ここで使用する用語「不安定ｃｆＤＮＡ」は、「安定ｃｆＤＮＡ」と比較して熱力学的に不安定であるｃｆＤＮＡをいう。換言すると、不安定ｃｆＤＮＡは、安定ｃｆＤＮＡが変性されるより過酷ではない条件下で変性され得る。不安定ｃｆＤＮＡが産生される理由は、不安定ｃｆＤＮＡが不安定二重螺旋構造を有するからである。
【００７８】
ここで使用する用語「不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡ」は、安定な二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡより低いＴｍ値を有するまたは安定な二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡが変性しない条件下で変性することにより特徴づけられる。Ｔｍは、二本鎖ＤＮＡの５０％が一本鎖ＤＮＡに変換される融解温度をいう。Ｔｍ値は、ＤＮＡの長さに比例し、ヌクレオチド配列により異なり得る。ゲノムＤＮＡでは多数のヌクレオチドが互いに水素結合されているため、ゲノムＤＮＡは、９２℃〜９５℃で５分間以上または９８℃で２分間以上加熱しなければならない。さらに、ゲノムＤＮＡは、９０℃より低温では容易に変性を受けない。安定な二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡが平均１７０bpヌクレオチドを有するため、ゲノムＤＮＡに類似するＴｍ値を有し得る。
【００７９】
しかしながら、「不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡ」は、安定な二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡより低いＴｍ値を有する。それ故に、安定な二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡが、ｉ)１〜１２０分間、室温に静置させる条件；ii)９０℃〜９５℃で１秒間〜３分間加熱する条件；iii)７５℃〜９０℃で１秒間〜５分間加熱する条件；iv)６０℃〜７５℃で３０秒間〜６０分間加熱する条件；ｖ)２５℃〜４０℃で１０〜１２０分間加熱する条件；vi)プロテアーゼで１０秒間〜３０分間処理する条件；およびvii)ＤＮａｓｅで１０秒間〜３０分間処理する条件からなる群から選択される何れかの条件下で変性され、次いで１５量体〜３０量体プローブと結合反応させたとき、安定な二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡはプローブに結合しない。ここで、「室温」は環境温度をいい、１８℃〜２５℃であり得る。さらに、上記条件に加えて、４０℃〜６５℃で５〜８０分間加熱する条件がさらに含まれ得る。
【００８０】
しかしながら、不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡを上記ｉ)〜vii)の条件の何れかの下での処理に付し、次いで１５量体〜３０量体プローブと結合反応させたとき、該不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡがプローブと結合することが確認されている。ここで、プローブは１５量体〜３０量体または２０量体〜２５量体であってよく、２１量体、２２量体、２３量体または２４量体プローブであってよい。
【００８１】
ここで、不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡは、循環腫瘍ＤＮＡ(以後ｃｔＤＮＡと称する)であり得る。さらに、不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡは、正常細胞に存在しない損傷された核酸配列由来のｃｆＤＮＡであり得る。ここで、正常細胞に存在しない該損傷された核酸配列は、遺伝子の一部の欠失、重複、反転または転座による構造異常を含み得る。さらに、該損傷された核酸配列は、核酸の一部のミスマッチが原因の構造異常を含み得て、核酸の部分配列の変異が原因の一塩基変異(ＳＮＶ)を有し得る。損傷された核酸配列は、ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＡＲ、ＢＲＣＡ、ＫＩＴ、ＦＧＦＲ、ＩＤＨ、ＥＳＲ１、ＨＥＲ２、ＡＬＫ−ＥＭＬ４およびＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の変異配列を有し得る。
【００８２】
具体的には、正常細胞に存在しない損傷された核酸配列は、１)一本鎖の開裂、２)二本鎖の開裂、３)複製フォーク進行阻害、４)ミスマッチ核酸、５)染色体異常、６)鎖内架橋、７)鎖間架橋、８)外来遺伝子挿入、９)遺伝子の一部の欠失、１０)核酸の一部の置換、１１)核酸反転、１２)チミジン二量体形成、１３)脱アミノ化、１４)遺伝子重複、１５)染色体転座または１６)塩基欠乏(ＡＰ部位)の何れかにより引き起こされ得る。特に、腫瘍細胞において、二本鎖ＤＮＡ(ｄｓＤＮＡ)はしばしば損傷され、該損傷されたｄｓＤＮＡは腫瘍細胞に見られる特異的構造を含み得る。特に、損傷された核酸配列は、核酸のミスマッチによるゆらぎ塩基対を含み得る。
【００８３】
ここで使用する用語「プローブ」は、標的ｃｆＤＮＡを検出するためのＤＮＡまたはＲＮＡをいう。プローブは、不安定ｃｆＤＮＡに相補的に結合できるように設計された配列を有し得る。ここで使用する用語「ｃｆＤＮＡと相補的配列を有するプローブ」は、標的二重螺旋構造を有し、血漿に存在する、検出するｃｆＤＮＡと特異的に結合できる核酸配列を有するプローブをいう。
【００８４】
ここで、プローブは、２つの方法で産生され得る。一つは、損傷が生じた遺伝子の部分に結合できるように設計された第一プローブ(以後ＣＰと称する)であり、他方は損傷された部分周辺に結合できるように設計された第二プローブ(以後ＤＰと称する)である。ＤＰは、損傷が起きている標的ＤＮＡ配列または領域から１０bp〜１００bpまたは２０bp〜５０bp離れた位置の配列に特異的に結合するよう設計され得る。
【００８５】
本発明において、損傷されたｃｆＤＮＡが、第一プローブおよび第二プローブを同時に使用したときだけでなく、第一プローブまたは第二プローブを個々に使用したときも効率的に検出され得ることが確認された。さらに、プローブは、マーカーに結合するように、ビオチンなどの物質が結合した形態であり得る。あるいは、プローブは、マーカーに直接またはリンカーを介して、結合し得る。ここで、マーカーはナノ粒子、蛍光色素、蛍光タンパク質または酵素であり得る。さらに、プローブおよびマーカーを同時に加えてよくまたは連続的方法で加えてよい。
【００８６】
本発明のある実施態様において、標的ｃｆＤＮＡと相補的に結合できるプローブは、下記癌細胞の各タイプに特異的な配列を含む領域に特異的に結合し得る。例えば、卵巣癌または乳癌に特異的な配列は、ＢＲＣＡ１エクソン７、ＢＲＣＡ１エクソン１０、ＢＲＣＡ１エクソン１１またはＢＲＣＡ１エクソン１５に存在するＳＮＰであり得る。さらに、胃癌に特異的な配列は、ＴＰ５３に存在するＳＮＰであり得て、結腸直腸癌に特異的な配列は、ＭＳＨ２に存在するＳＮＰであり得る。肺癌に特異的な配列は、ＥＧＦＲに存在するＳＮＰであり得る。さらに、肝臓癌に特異的な配列は、ＦＧＦＲ３に存在するＳＮＰから選択され得る。
【００８７】
【表１】
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【００８８】
ここで使用する用語「単離生物学的サンプル」は、人体から単離されている、尿、唾液、脳脊髄液、胸水、腹水、血漿、血液、痰または体液のサンプルをいう。単離生物学的サンプルは、人体から単離された液体サンプルをいう。ここで、血漿は、血液から得られ得る。
【００８９】
ここで使用する用語「正荷電物質」は、ナノ粒子、ナノワイヤー、網構造またはフィルターの形で使用し得る、物質をいう。しかしながら、正荷電物質の形はそれに限定されない。「正荷電物質」の実施態様は、正荷電ナノワイヤーまたは正荷電膜であり得る。ナノワイヤーは、導電性ポリマーを使用して製造され得る。導電性ポリマーは、ポリ(アセチレン)、ポリ(ピロール)、ポリ(チオフェン)、ポリ(パラ−フェニレン)、ポリ(３,４−エチレンジオキシチオフェン)、ポリ(フェニレンスルフィド)、ポリ(パラ−フェニレンビニレン)およびポリアニリンからなる群から選択される何れかであり得る。製造方法によって、ナノワイヤーの長さおよび直径を適当に調節し得る。ある実施態様において、ナノワイヤーは、２００nmの直径および１８μmの長さを有し得る。さらに、ナノワイヤーを、製造中ビオチンを含むようにし得る。
【００９０】
ナノワイヤーの表面を、カチオン性ポリマーで修飾し得る。カチオン性ポリマーのタイプは限定されない。カチオン性ポリマーの実施態様はポリエチレンイミン(ＰＥＩ)またはポリリシン(ＰＬＬ)であり得る。さらに、カチオン性ポリマーは、カチオン性分岐ポリマーポリエチレンイミンであり得る。このようなカチオン性ポリマーで修飾されたナノワイヤーは、正荷電表面を有し得る。
【００９１】
ある実施態様において、正荷電ナノワイヤーは、低濃度でもｃｆＤＮＡを上手くかつ効率的に捕捉し得る。特に、正荷電ナノワイヤーは、ＤＮＡを含む標的分子に結合するための大きな表面積およびＤＮＡとの相互作用を促進するための移動性の改善など、その特徴によりｃｆＤＮＡを効率的に捕捉できる。
【００９２】
ここで使用する用語「マーカー」は、不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡを効率的に検出するための物質をいい、特に量子ドット、ある基質を分解し、発色反応を引き起こす物質および特定波長光で照射したとき発光を引き起こす物質を含み得る。具体的には、マーカーは蛍光タンパク質であり、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)、黄色蛍光タンパク質(ＹＦＰ)、赤色蛍光タンパク質(ＲＦＰ)または青緑色蛍光タンパク質(ＣＦＰ)であり得る。あるいは、マーカーは、ＡＢＴＳ、ＯＰＤ、ＡｍｐｌｅｘＲｅｄ、ＤＡＢ、ＡＥＣ、ＴＭＢ、ホモバニリン酸およびルミノールからなる群から選択される何れかの基質を着色物質に変換できる、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)などの物質であり得る。
【００９３】
マーカーは、さらに、プローブに結合できる物質を含み得る。具体的には、ビオチンがプローブに結合しているとき、マーカーは、さらに、アビジン、ストレプトアビジンまたはこれらの組み合わせからなる群から選択される何れかを含み得る。ある実施態様において、このようなマーカーを、ストレプトアビジンおよびＨＲＰが結合したナノ粒子の形で使用でき、ナノ粒子は導電性ポリマーおよびヒアルロン酸からなる。ここで、導電性ポリマーは上記のとおりであり、好ましくはポリピロールであり得る。他の実施態様において、マーカーを、ストレプトアビジンおよび蛍光タンパク質が結合したナノ粒子の形で使用でき、ナノ粒子は導電性ポリマーおよびヒアルロン酸からなる。
【００９４】
＜不安定ｃｆＤＮＡを検出する方法＞
本発明のある態様において、不安定ｃｆＤＮＡとマーカーが結合しているプローブを混合する工程を含む、サンプルから不安定セルフリーＤＮＡを増幅せずに検出する方法が提供される。
【００９５】
このような不安定ｃｆＤＮＡは腫瘍由来の循環腫瘍ＤＮＡ(ｃｔＤＮＡ)であり得る。ここで、ｃｔＤＮＡは、上記のとおり損傷遺伝子配列を有し得る。さらに、ｃｔＤＮＡは、発現が高度に活性な遺伝子から単離され得る。ここで、サンプルは生物学的サンプルであってよく、人体から単離されたサンプルであり得る。具体的には、サンプルは尿、脳脊髄液、血漿、血液、胸水、腹水、唾液、痰または体液であり得る。
【００９６】
それ故に、不安定ｃｆＤＮＡは、次の条件の何れかの下でサンプルを処理する工程を介して、プローブとの反応性の点で安定と区別され得る。具体的には、処理は、ｉ)１〜１２０分間、室温に静置させる条件；ii)９０℃〜９５℃で１秒間〜３分間加熱する条件；iii)７５℃〜９０℃で１秒間〜５分間加熱する条件；iv)６０℃〜７５℃で３０秒間〜３０分間加熱する条件；ｖ)２５℃〜４０℃で１０〜１２０分間加熱する条件；vi)プロテアーゼで１〜３０分間処理する条件；およびvii)ＤＮａｓｅで１〜３０分間処理する条件から選択される何れかの条件下で実施され得る。プローブは１５量体〜３０量体ヌクレオチドまたは２０量体〜２５量体ヌクレオチドを含み得る。ここで、プローブは、不安定ｃｆＤＮＡの遺伝子配列と相補的に結合できるように設計され得る。
【００９７】
安定ｃｆＤＮＡを上記条件の何れかの下で処理したとき、安定ｃｆＤＮＡは、その中で形成された強い二本鎖により変性せず、プローブと相補的に結合しない。しかしながら、不安定ｃｆＤＮＡは、上記条件の何れかの下で処理したとき、プローブに結合し得る。このような不安定性は、ｃｆＤＮＡの一部ヌクレオチドが相補的結合を形成せきず、故に、ｃｆＤＮＡの二重螺旋構造が変わっているとの事実による。
【００９８】
本発明の他の態様において、サンプルから不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡを増幅せずに検出する方法が提供される。ここで、方法は、ａ)ｃｆＤＮＡを含むサンプルと正荷電物質を混合する工程；ｂ)該ｃｆＤＮＡが結合している正荷電物質を単離する工程；ｃ)該混合物とプローブおよびマーカーを混合する工程；ｄ)該ｃｆＤＮＡと結合していないプローブおよびマーカーの除去；およびｅ)マーカーの検出を含む。
【００９９】
具体的には、方法は、ｃｆＤＮＡを含むサンプルと正荷電物質を混合する工程を含み得る。
【０１００】
サンプルは上記のとおり生物学的サンプルであり得る。その実施態様は血漿または尿であり得る。血漿または尿において、正常二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡおよび不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡが共に存在し得る。さらに、正荷電物質は、特に正荷電ナノワイヤーであり得る。正荷電ナノワイヤーは上記のとおりである。
【０１０１】
上記工程は、特に下記順番でかつ下記条件下で実施し得る。まず、患者の血漿、尿、唾液、痰などを受領した直後、４℃で１０分間、３,０００×ｇで遠心分離を実施する。その後、患者の血漿、尿、唾液、痰などを、ＤＰＢＳで一定比率まで希釈する。次いで、血漿の場合、３０μlの血漿を１２０μlの蒸留水(ＤＷ)と混合し、スピンカラム(タイプＧまたはタイプＱ)に入れる。ポリエチレンイミンで表面修飾したポリピロール(ＰＥＩ／Ｐｐｙ)ナノワイヤー(２０μl)をそれに加え、サーモミキサーを使用して、室温で２０分間、１,２００rpmの速度で混合を実施する。
【０１０２】
次に、方法は、該ｃｆＤＮＡが結合している正荷電物質を単離する工程を含み得る。
【０１０３】
正荷電物質を単離する方法は、遠心分離または真空など陰圧の適用により実施し得る。ｃｆＤＮＡは正荷電物質に結合する。故に、正荷電物質と混合したサンプルをスピンカラムまたは真空カラムに入れ、遠心分離を実施するかまたは陰圧を適用したとき、ナノワイヤーなどの正荷電物質はカラムのフィルターを通過せず、一方、生物学的サンプルの他の成分はフィルターを通過する。それ故に、ｃｆＤＮＡが結合している正荷電物質を、遠心分離または減圧などの方法により単離し得る。さらに、こうして単離したナノワイヤーから不純物を除去するために、洗浄工程を１〜３回さらに実施してよい。洗浄について、慣用法が適切に使用され得る。
【０１０４】
上記工程は、特に下記順番でかつ下記条件下で実施し得る。スピンカラムを、減圧を適用するデバイスにマウントし、次いで５５０mBarで吸引を実施する。洗浄について、４００μlの１×ＤＰＢＳをそれに加え、再び吸引を実施する。同じ過程をさらに１回繰り返してよい。
【０１０５】
ある実施態様において、温度処理を実施するとき、吸引が完了したスピンカラムを、９５℃に予熱したヒートブロックに入れ、９５℃で１分間インキュベートし、次いで直ぐにそこから取り出す。温度変性工程を必要としない条件下のサンプルは、このような過程を経なくてよい。
【０１０６】
次に、方法は該混合物とプローブおよびマーカーを混合する工程を含み得る。
【０１０７】
プローブは、上記のとおり、１５量体〜３０量体ヌクレオチドまたは２０量体〜２５量体ヌクレオチドからなり得る。プローブの配列を、不安定二重螺旋構造を有する検出すべきｃｆＤＮＡと相補的に結合できるように設計し得る。特に、不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡは腫瘍由来ｃｔＤＮＡであり得る。さらに、不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡは、癌バイオマーカーとして知られる遺伝子と相補的に結合できるように設計し得る。
【０１０８】
さらに、マーカーは、特異的条件下で検出できる蛍光タンパク質またはＨＲＰなどの物質であり得る。ここで、マーカーは、プローブに結合できる物質を含み得る。具体的には、ビオチンがマーカーに結合したとき、アビジンまたはストレプトアビジンが該マーカーに結合し得る。ある実施態様において、検出感度を上げるために、マーカーは、数ＨＲＰ分子と数ストレプトアビジン分子が凝集したナノ粒子を有し得る。
【０１０９】
上記工程は、特に下記順番でかつ下記条件下で実施し得る。各実験に適するプローブ(２００μl)およびＨＲＰ／ＳＴＲナノ粒子の溶液(２００μl)をそれぞれスピンカラムに入れる。室温で３０分間、８５０rpm〜１,０００rpmの速度で混合を実施する。
【０１１０】
次に、方法は、該ｃｆＤＮＡと結合していないプローブおよびマーカーを除去する工程を含み得る。
【０１１１】
これは、ｃｆＤＮＡに結合していないプローブを除去する工程である。１５量体〜３０量体プローブも負に帯電しており、正荷電ナノワイヤーに結合し得る。それ故に、混合反応完了後、残存プローブおよびマーカーを反応溶液から除かなければならない。ここで、プローブおよびマーカーを遠心分離または陰圧の使用により除去し得る。ここで、ｃｆＤＮＡは、短鎖プローブより強く正荷電物質、具体的には正荷電ナノワイヤーに結合していなければならない。プローブおよびマーカーを除去する工程において、ｃｆＤＮＡは正荷電物質に結合し、故に、除去されない。
【０１１２】
上記工程の実施態様は、特に下記順番で実施し得る。上記工程実施後、スピンカラムに陰圧を適用し、吸引を実施する。次いで、４００μlの１×ＤＰＢＳをそれに加え、再び吸引を実施する。同じ過程をさらに１回繰り返してよい。
【０１１３】
最後に、方法はマーカーを検出する工程を含み得る。
【０１１４】
マーカーを検出する方法は、使用するマーカーにより種々に実施され得る。マーカーの検出は、色調変化、ＵＶ吸光度変化、蛍光応答変化または電気化学的変化により測定され得る。例えば、ＨＲＰがマーカーとして使用されるとき、発色反応の観察によりマーカーが検出され得る。さらに、マーカーがＧＦＰなどの蛍光タンパク質であるとき、マーカーの存在または非存在を、特定波長の光でマーカーを照射し、次いで検出された光を観察することにより検出し得る。
【０１１５】
上記工程の実施態様は、特に下記順番で実施し得る。スピンカラムに２００μlの酢酸ナトリウム緩衝液(０.２Ｍ、ｐＨ７.０)、５０μlのＴＭＢ(１０mM)および５０μlのＨ２Ｏ２(０.１Ｍ)を逐次的に加える。次いで、３分間インキュベーションを実施する。その後、３,５００rpm〜５,０００rpmの速度で３０秒間の遠心分離を実施する。コレクションチューブに集めた溶液を、ウェルあたり２００μlで９６ウェルに移し、次いで５００nm〜８５０nm波長範囲の吸光度をＵＶ／ＶＩＳ分光光度計を使用して測定する。
【０１１６】
さらに、方法は、正常二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡと不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡのプローブとの反応性の差異を増強するためのさらなる処理過程をさらに含み得る。さらなる処理過程は、サンプルを得た後に行っても、ｃｆＤＮＡを単離した後に行ってもよい。
【０１１７】
さらに、工程ｃ)の前に、方法は、サンプルまたは正荷電物質に結合したｃｆＤＮＡを、ｉ)１〜１０分間、室温に静置させる条件；ii)９０℃〜９５℃で１秒間〜１分間加熱する条件；iii)７５℃〜９０℃で１０秒間〜３分間加熱する条件；iv)６０℃〜７５℃で１〜３０分間加熱する条件；ｖ)２５℃〜４０℃で５〜６０分間加熱する条件；vi)プロテアーゼで１〜１０分間処理する条件；およびvii)ＤＮａｓｅ  Ｉで１〜１０分間処理する条件からなる群から選択される何れかの条件下、変性させることをさらに含み得る。このような変性過程は、安定ｃｆＤＮＡを変性させず、不安定ｃｆＤＮＡをより不安定に変性させ、よって、不安定ｃｆＤＮＡがプローブにより容易に結合し得る。上記条件下での変性を、サンプルを得た後実施し得る。さらに、該変性を、正荷電物質に結合したｃｆＤＮＡを得た後実施し得る。さらに、温度、プロテアーゼおよびＤＮａｓｅでの処理時間は、安定ｃｆＤＮＡが変性しない限り、適切に調節され得る。
【０１１８】
本発明のある実施態様において、検出すべき不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡが、別の変性工程を必要とせず、標的プローブを使用して検出され得ることが同定されている(図３１)。さらに、安定な二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡおよび不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡが、このようなｃｆＤＮＡを温度処理過程に付したときでも、同じプローブになお異なる結合反応を示すことが同定されている(図３２および３３)。
【０１１９】
＜不安定ｃｆＤＮＡの検出を用いる診断のための情報を提供する方法＞
本発明のさらに他の態様において、サンプルから不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡを増幅せずに検出することにより癌および感染性疾患の診断または予測のための情報を提供する方法が提供される。ここで、方法は、ａ)ｃｆＤＮＡを含むサンプルと正荷電物質の混合；ｂ)該ｃｆＤＮＡが結合している正荷電物質の単離；ｃ)該混合物とプローブおよびマーカーの混合；ｄ)該ｃｆＤＮＡと結合していないプローブおよびマーカーの除去；ｅ)該マーカーの検出；およびｆ)該マーカーが検出されたとき、不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡに対応する遺伝子と関連する癌または感染性疾患があることを決定する工程を含む。具体的には、不安定ｃｆＤＮＡを検出する方法は上記のとおりである。
【０１２０】
本発明において使用する癌の実施態様は、膀胱癌、骨癌、血液癌、乳癌、黒色腫、甲状腺癌、副甲状腺癌、骨髄癌、直腸癌、咽頭癌、喉頭癌、肺癌、食道癌、膵臓癌、結腸直腸癌、胃癌、舌癌、皮膚癌、脳腫瘍、子宮癌、頭頸部癌、胆嚢癌、口腔癌、直腸癌、肛門周囲癌、中枢神経系腫瘍、肝臓癌および結腸直腸癌からなる群から選択される何れかであり得る。特に、癌は胃癌、結腸直腸癌、肝臓癌、肺癌または乳癌であり得る。
【０１２１】
ある実施態様において、上記癌細胞に特異的に存在する配列は、癌細胞に存在するＳＮＰであり得る。胃癌の場合、該癌に特異的に存在する配列の態様は、腫瘍抑制遺伝子として知られるｐ５３およびＰＴＥＮにおける変異であり得る。さらに、結腸直腸癌の場合、その態様は、ＡＰＣおよびＭＳＨ２遺伝子における変異であり得る。さらに、肝臓癌の場合、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)またはＣ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)の感染がその主因であるため、ＨＢＶまたはＨＣＶ核酸が標的であり得る。さらに、肺癌の場合、上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)遺伝子の変異が標的であり得る；および乳癌の場合、ＢＲＣＡ１／２遺伝子における変異が腫瘍な標的であり得る。さらに、子宮頸癌の場合、ヒトパピローマウイルスＤＮＡ(ＨＰＶ  ＤＮＡ)由来ｃｆＤＮＡが標的であり得る。
【０１２２】
不安定ｄｓＤＮＡの他の例示的態様は、ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＡＲ、ＢＲＣＡ、ＫＩＴ、ＦＧＦＲ、ＩＤＨ、ＥＳＲ１、ＨＥＲ２、ＡＬＫ−ＥＭＬ４およびＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子変異であり得る。
【０１２３】
＜不安定ｃｆＤＮＡを検出するためのデバイス＞
本発明のなおさらに他の態様において、ａ)ｃｆＤＮＡを含むサンプルと正荷電ナノワイヤーの混合のための混合セクション；ｂ)ｃｆＤＮＡが結合したナノワイヤー以外のサンプルを除去する取得セクション；ｃ)ｃｆＤＮＡが結合したナノワイヤーに、該ｃｆＤＮＡが相補的に結合できるビオチンが結合されたプローブならびにストレプトアビジンおよびマーカーを含むナノ粒子を加えるための、反応セクション；ｄ)該マーカーの検出のための検出セクション；およびｅ)マーカーの検出により、該サンプルが、検出プローブと相補的配列を有し、室温で不安定である二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡを含むことを決定するための情報処理セクションを含む、室温で不安定である二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡを検出するためのデバイスが提供される。
【０１２４】
＜不安定ｃｆＤＮＡの検出を使用する診断デバイス＞
本発明のなおさらに他の態様において、サンプルから不安定二重螺旋構造を有するセルフリーＤＮＡを増幅せずに検出することによる癌または感染性疾患を診断または予測する情報を提供するためのデバイスが提供される。ここで、デバイスは、ａ)ｃｆＤＮＡを含むサンプルと正荷電ナノワイヤーの混合のための混合セクション；ｂ)ｃｆＤＮＡが結合したナノワイヤー以外のサンプルを除去する取得セクション；ｃ)ｃｆＤＮＡが結合したナノワイヤーに、該ｃｆＤＮＡが相補的に結合できるビオチンが結合されたプローブならびにストレプトアビジンおよびマーカーを含むナノ粒子を加えるための、反応セクション；ｄ)該マーカーの検出のための検出セクション；およびｅ)マーカーの検出により、該サンプルが、検出プローブと相補的配列を有し、室温で不安定である二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡを含むことを決定するための情報処理セクションを含む。
【０１２５】
本発明は、安定ｃｆＤＮＡと不安定ｃｆＤＮＡの、その熱力学的安定性の差異によるプローブとの反応性の差異に基づく。ここで、正荷電ナノワイヤーはゲノムＤＮＡおよびｃｆＤＮＡに結合し得る。しかしながら、ゲノムＤＮＡは、結合力およびサイズの差異により、洗浄によって正荷電ナノワイヤーから分離される。さらに、ある実施態様において、ナノワイヤーは、修飾されるときビオチンを含むように製造され得る。しかしながら、カチオン性ポリマーであるポリエチレンイミンでナノワイヤーの表面を修飾する過程において、ナノワイヤーに含まれ、ナノワイヤーの表面に露出されるビオチンはカチオン性ポリマーと結合する。さらに、ナノワイヤーはカチオン性ポリマーで被覆され、故に、ストレプトアビジンを含むマーカーはナノワイヤーに結合しない。さらに、プローブもまた負に帯電しているため、正に荷電されたナノワイヤーに結合し得る。しかしながら、プローブはｃｆＤＮＡより結合力が弱いため、洗浄過程中に除去されることが判明した。
【０１２６】
さらに、安定ｃｆＤＮＡおよび不安定ｃｆＤＮＡを、損傷されたＤＮＡ配列を含む領域に特異的に結合できるプローブ(ＣＰ)および損傷されたＤＮＡ配列を含まない周辺領域に特異的に結合できるプローブ(ＤＰ)で処理した。その結果、不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡと安定な二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡの間の、プローブへの結合反応の差を同定することができた。これらの結果から、不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡが損傷されたＤＮＡ配列に特異的なプローブだけでなく、その周辺ＤＮＡ配列に特異的に結合できるプローブとも結合できることが判明した。さらに、不安定ｃｆＤＮＡがこれらプローブの一つのみで検出できることが確認された。
【０１２７】
次に、本発明は、以下の実施例により、より詳細に説明される。しかしながら、以下の実施例は単に本発明を説明することを意図し、本発明の範囲はそれのみによって制限されるものではない。
【実施例】
【０１２８】
Ｉ. 実施方法ならびにナノワイヤー、マーカーおよびプローブを製造する方法
実施方法１. 不安定ｃｆＤＮＡを検出する方法
工程１：サンプルの調製およびナノワイヤーの付加
患者の血漿、尿、唾液、痰などを受領直後、４℃で１０分間、３,０００×ｇでの遠心分離を実施した。患者の血漿、尿、唾液、痰などを、ＤＰＢＳで一定比に希釈した。血漿の場合、３０μlの血漿を１２０μlのＤＷと混合し、スピンカラム(タイプＧまたはタイプＱ)に入れた。ＰＥＩ／Ｐｐｙナノワイヤー(２０μl)をそれに加え、室温で２０分間、１,２００rpmの速度でサーモミキサーを使用して、混合を実施した。
【０１２９】
工程２：真空／洗浄／温度変性
スピンカラムを真空吸引デバイスにマウントし、次いで５５０mBarで吸引を実施した。４００μlの１×ＤＰＢＳをそれに加え、吸引を再び実施した。同じ過程をもう１回繰り返した。本２工程過程により獲得されたナノワイヤー−ＤＮＡ複合体のみをスピンカラムにトラップした。温度変性が必要であるならば、吸引が完了しているスピンカラムを９５℃に予熱した加熱ブロックに入れ、９５℃で１分間インキュベートし、次いで直ぐにそこから取り出した。温度変性工程を必要としないサンプルは、本過程を経なかった。
【０１３０】
工程３：プローブおよびＨＲＰ／ＳＴＲ  ＮＰの付加
各実験に適するプローブ(２００μl)およびＨＲＰ／ＳＴＲ  ＮＰの溶液(２００μl)を、それぞれスピンカラムに入れた。室温で３０分間、８５０rpm〜１,０００rpmの速度でサーモミキサーを使用して、混合を実施した。スピンカラムを真空デバイスにマウントし、次いで吸引を実施した。４００μlの１×ＤＰＢＳをそれに加え、吸引を再び実施した。同じ過程をもう１回繰り返した。
【０１３１】
工程４：遺伝子変異を検出するためのＴＭＢ応答
コレクションチューブを新しいものに代えた後、２００μlの酢酸ナトリウム緩衝液(０.２Ｍ、ｐＨ７.０)および５０μlのＨ２Ｏ２(０.１Ｍ)を、シリンジポンプを使用してスピンカラムに連続的に加えた。次いで、３分間インキュベーションを実施した。インキュベーションの最後に、スピンカラムを、３,５００rpm〜５,０００rpmの速度で３０秒間遠心分離した。コレクションチューブに集めた溶液をウェルあたり２００μlで９６ウェルに移し、次いで５００nm〜８５０nm波長範囲の吸光度をＵＶ／ＶＩＳ分光光度計を使用して測定した。
【０１３２】
製造例１. 正荷電ナノワイヤーの製造
図１に示すとおり、カチオン性ポリマーとしてポリエチレンイミン(ＰＥＩ)がコンジュゲートした表面を有するナノワイヤーを製造した。陽極酸化アルミニウム(ＡＡＯ)の片側を金(Ａｕ)層(約１５０nmの厚さを有する)で、５×１０−３mbarおよび５０mAで６００秒間、Ｑ１５０Ｔモジュールコーティングシステム(Quorum Technologies, UK)を使用して被覆した。全電気化学的操作において、白金ワイヤ対電極およびＡｇ／ＡｇＣｌ(３.０Ｍ  ＮａＣｌタイプ)基準電極を備えたポテンショスタット／ガルバノスタット(BioLogic SP-150)を使用して、金(Ａｕ)被覆ＡＡＯ鋳型で測定を実施した。
表面がカチオン性ポリマーで処理されたナノワイヤー(ＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＷ)の製造のために、電気化学的沈着を、ＡＡＯ鋳型の孔にクロノアンペロメトリーを７分間、１.０Ｖ(対Ａｇ／ＡｇＣｌ)で、０.０１Ｍ  ポリ(４−スチレンスルホン酸)および１mg／mlのビオチンを含む０.０１Ｍ  ピロール溶液と共に適用することにより実施した。
得られたＡＡＯ鋳型を蒸留水で数回洗浄し、２Ｍ  水酸化ナトリウム(ＮａＯＨ)溶液に３時間浸し、次いで超音波処理のためにBioruptor UCD-200(Diagenode)に入れ、ビオチン分子をドープした自立型Ｐｐｙ  ＮＷを得た。次いで、得られたナノワイヤーに、３０mM  Ｎ−(３−ジメチルアミノプロピル)−Ｎ−エチルカルボジイミドヒドロクロライド(ＥＤＣ)および６mM  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)を加え、カルボン酸(−ＣＯＯＨ)基を活性化した。続いて、ＰＥＩ溶液を加えた後、室温で１時間反応させ、水での洗浄を実施した。ポリエチレンイミンがコンジュゲートした表面を有するナノ構造体(ＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＷ)を脱イオン水に分散させ、使用するまで室温に維持した。
この製造方法で、ＡＡＯ鋳型の選択的溶解後、各ポリピロール(Ｐｐｙ)ナノワイヤーはＡＡＯ鋳型から遊離され、カチオン性分岐ポリエチレンイミン(ＰＥＩ)(２５kDa)をビオチン−ストレプトアビジン相互作用によりナノワイヤーにさらにコンジュゲートさせた。
【０１３３】
製造例２. 表面がカチオン性ポリマーで処理されたナノ粒子(ＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＰ)の製造
ポリエチレンイミンがコンジュゲートした表面を有するナノ粒子(ＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＰ)を製造するために、０.２ｇのポリビニルピロリドン(ＰＶＰ)を、１２.５mlの３回蒸留の蒸留水に加え、３０分間撹拌した。次いで、６５μlのピロールをそれに加え、次いで得られた溶液を１０分間さらに撹拌した。次いで、０.７５ｇ／ml濃度の０.５mlのＦｅＣｌ３溶液をそれに加え、１０分間反応させた。その後、２０mlの水性ヒアルロン酸溶液(４００mg／２０ml)をそれに加え、得られた溶液を３時間撹拌した。
５０,０００ＭＷＣＯ孔径を有する膜を使用する透析を、３回蒸留の蒸留水に対して２日間実施した。１,２００rpmで３分間遠心分離を実施して、大型粒子凝集物を除き、次いで残存液を凍結乾燥した。２００μgのＰｐｙ−ＨＡ−ＮＰを、１mlの３回蒸留の蒸留水に加えた。次いで、１００mM  ＥＤＣ／５０mM  ＮＨＳ溶液をそれに加え、４５分間反応させて、ヒアルロン酸のカルボキシル基を活性化させた。１５,０００rpmで１０分間遠心分離を実施して上清を除去し、その間、洗浄を２回実施した。
続いて、１００mg／mlのＰＥＩ溶液(溶媒：０.２Ｍ  重炭酸ナトリウム)をそれに加え、一夜、４℃で反応させた。次いで、１５,０００rpmで１０分間遠心分離を実施して上清を除去し、次いで沈殿物を３回蒸留の蒸留水に維持した。ポリエチレンイミンがコンジュゲートした表面を有するナノ粒子(ＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＰ)の形を、走査型電子顕微鏡を使用して観察した。図６Ａに示すとおり、ＰＥＩがコンジュゲートした平均５０nmのナノ粒子(ＮＰ)の形状を、走査型電子顕微鏡画像(２００μmのスケールバー)で確認した。
【０１３４】
製造例３. ＨＲＰおよびストレプトアビジンで標識したポリピロールナノ粒子の製造
ＨＲＰおよびストレプトアビジンを含むナノ粒子の製造のために、０.５ｇのポリビニルピロリドン(ＰＶＰ)を１２.５mlの３回蒸留の蒸留水に加え、３０分間撹拌した。次いで、６５μlのピロールをそれに加え、それを１０分間さらに撹拌した。その後、０.７５ｇ／ml濃度の０.５mlのＦｅＣｌ３溶液をそれに加え、３時間反応させた。次いで、２０mlの水性ヒアルロン酸溶液(４００mg／２０ml)をそれに加え、それを３時間撹拌した。
５０,０００ＭＷＣＯ孔径を有する膜を使用する透析を、３回蒸留の蒸留水に対して２日間実施した。１,２００rpmで３分間遠心分離を実施して、大型粒子凝集物を除き、次いでそれを凍結乾燥した。ポリピロールおよびヒアルロン酸を含む２００μgのＰｐｙ−ＨＡ−ＮＰを１mlの３回蒸留の蒸留水に加えた。次いで、１００mM  ＥＤＣ／５０mM  ＮＨＳ溶液をそれに加え、４５分間反応させて、ヒアルロン酸のカルボキシル基を活性化した。１５,０００rpmで１０分間遠心分離を実施して上清を除去し、その間洗浄を２回実施した。１mgのＨＲＰおよび１mgのストレプトアビジンをＰｐｙ−ＨＡ−ＮＰに加え、４℃の温度で混合した。続いて、１５,０００rpmで１０分間遠心分離を実施して上清を除去し、次いでそれを３回蒸留の蒸留水に維持した。ＨＲＰおよびストレプトアビジンがコンジュゲートした表面を有するナノ粒子(ＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰ)の形を、走査型電子顕微鏡を使用して観察した(図４)。
【０１３５】
製造例４. プローブの製造
不安定二重螺旋構造を有するｃｆＤＮＡを検出するためにプローブを製造した。プローブを、検出するｃｆＤＮＡに応じて種々に製造した。ここで、プローブを、ビオチンが結合した形で製造した。プローブを２種類、すなわち、不安定二重螺旋構造を引き起こす損傷されたＤＮＡを含む領域と相補的に結合する第一プローブ(以後ＣＰと称する)および損傷されたＤＮＡの周辺領域と相補的に結合する第二プローブ(以後ＤＰと称する)を製造した。
【０１３６】
II. ２つのプローブを使用するｃｆＤＮＡの検出
実施例１. 尿に存在するＨＰＶ由来ｃｆＤＮＡの分析
セルフリーＨＰＶ  ＤＮＡを尿サンプルから単離するために、製造例１で製造した表面がカチオン性ポリマーで処理されたナノワイヤー(ＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＷ)１０μg／mlを、ＨＰＶ陽性患者からの尿２００μlに加え、室温で３０分間混合を実施した。単離ｃｆＤＮＡを９５℃で１分間変性させた。次いで、ビオチンが末端に結合した第一プローブ(ＣＰ)および第二プローブ(ＤＰ)を、１pMでそれに加え、３７℃で１時間反応させた。次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)およびストレプトアビジンタグ付ポリピロールナノ粒子(以後ＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰと称する)をサンプルに加え、３７℃で３０分間インキュベーションを実施した。
続いて、ＨＰＶ由来ｃｆＤＮＡに、２５μlの１０mM  ３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)、２５μlの０.１Ｍ  Ｈ２Ｏ２および２００μlの０.２Ｍ  酢酸ナトリウム三水和物緩衝液(ｐＨ５.０)を加えた。ＤＮＡサンプルと共に、暗所で室温で３分間反応させた。ＨＰＶ  ＤＮＡ濃度と吸光度の相関を同定するために、ＵＶ−Ｖｉｓ検出をＤＵ  ７３０  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計(Beckman Coulter, USA)を使用して、６５２nm波長で実施した。
その結果、比色シグナルが目視できるような程度に比色シグナルを増幅することにより、結果を同定することが可能であった。ＨＰＶ検出用プローブ配列を下表２に示す。
【表２】
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【０１３７】
さらに、ＨＰＶ陽性子宮頸癌患者(ＨＰＶ１６(＋)およびＨＰＶ１８(＋))およびＨＰＶ陰性健常対照(ＨＰＶ−)の尿サンプルを評価するため、無ＰＣＲ比色アッセイを実施した。陰性対照として、ＰＢＳを使用した。その結果、図１２に示すとおり、ナノワイヤーを使用して単離した標的ＨＰＶ  ＤＮＡをＣＰおよびＤＰと混合し、ＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰをそれに加えた。次いで、色調の変化を観察した。単離ｃｆＤＮＡの分析のために、変性を９５℃で１分間実施した。
計２４のＨＰＶ陽性およびＨＰＶ陰性尿サンプルを採取し、試験した。その結果、ＨＰＶ陽性子宮頸癌患者(ＨＰＶ１６(＋)およびＨＰＶ１８(＋))およびＨＰＶ陰性健常対照(ＨＰＶ−)の尿から単離したｃｆＤＮＡの間で、吸光度値が異なることが確認された(図１３)。ここで、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８に特異的に結合するプローブを使用し、単離ｃｆＤＮＡの分析のために、変性を９５℃で１分間実施した。
さらに、ＥＧＦＲ  １９およびＥＧＦＲ  ２１などの非ＨＰＶプローブを使用したとき反応は観察されず、色調変化およびＵＶ吸光度変化が標的ＨＰＶとその相補的プローブの間のタイプ特異的結合の結果として生じることが判明した(図１４)。ここで、単離ｃｆＤＮＡの分析のために、変性を９５℃で１分間実施した。
【０１３８】
実施例２. 肺癌細胞株のＤＮＡ分析によるＥＧＦＲ遺伝子変異の確認
実施例２.１. ナノワイヤーを用いて得ることができるｃｆＤＮＡのサイズの確認
低範囲(１０bp〜１００bp)、中範囲(１００bp〜２kb)および高範囲(３.５kb〜２１kb)ＤＮＡラダーを正常対象の血漿に加え、次いで捕捉効率をナノワイヤー(ＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＷ)を使用して確認した。ナノ構造体が小型ＤＮＡ捕捉に効率的であることが確認された(図１５)。
ナノワイヤーを使用して、Ｈ１９７５(ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍ、２１  Ｌ８５８Ｒ遺伝子変異を有する細胞株)、ＨＣＣ２２７９(ＥＧＦＲエクソン１９欠失遺伝子変異を有する細胞株)およびＡ５４９細胞株(ＥＧＦＲエクソン遺伝子変異がない細胞株)から遺伝子を得た。次いで、超音波処理に付されていないゲノムＤＮＡ(ｇＤＮＡ)および超音波処理に付された断片化ＤＮＡ(ｆＤＮＡ)を使用して、ナノ構造体捕捉効率を比較した。その結果、ナノ構造体を使用したとき、ｇＤＮＡよりｆＤＮＡで高い捕捉効率が観察されることが確認された(図１６および１７)。
【０１３９】
実施例２.２. 不安定ｃｆＤＮＡの分析を用いるＥＧＦＲ変異の検出
無ＰＣＲ比色アッセイを実施して、ＥＧＦＲエクソン２０、２１陽性Ｈ１９７５細胞株、ＥＧＦＲエクソン１９陽性ＨＣＣ２２７９細胞株およびＥＧＦＲ遺伝子変異がないＡ５４９細胞株からナノ構造体を使用してｇＤＮＡおよびｆＤＮＡを単離した。その後、ＥＧＦＲエクソン１９、２０および２１に対するプローブをそれに加え、混合を実施した。次いで、ＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰをそれに加え、色調変化を観察した。その結果、ｇＤＮＡと比較して、ナノ構造体、すなわち、ｆＤＮＡが小型ＤＮＡ捕捉にはるかに有効であり、明確な色調変化およびＵＶ−Ｖｉｓスペクトル変化があることを確認することが可能であった(図１８および１９)。
【０１４０】
実施例２.３. 蛍光色素を使用するｃｆＦＮＡの検出
遺伝子変異が標的プローブを使用して肺癌患者の血漿サンプルから検出され得るかを調べるるために、このような可能性を蛍光色素を使用して試験した。Ｈ１９７５(ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍ、２１  Ｌ８５８Ｒ遺伝子変異を有する細胞株)、ＨＣＣ２２７９(ＥＧＦＲエクソン１９欠失遺伝子変異を有する細胞株)およびＡ５４９細胞株(ＥＧＦＲエクソン遺伝子変異を有しない細胞株)を超音波処理に付し、次いで獲得したＤＮＡ(ｆＤＮＡ)をナノワイヤーを用いて捕捉した。次いで、ｆＤＮＡを９５℃で１分間変性させ、次いでＥＧＦＲ１９、２０および２１に特異的なプローブと混合した。細胞株の遺伝子変異を、該プローブに結合する蛍光色素(Alexa488)を使用して確認した。
その結果、Ａ５４９細胞株で、ＥＧＦＲ  １９および２１に対するプローブと反応させたとき、蛍光は観察されなかった。しかしながら、Ｈ１９７５およびＨＣＣ２２７９において、ＥＧＦＲ  １９および２０に対するプローブに関して蛍光が検出可能であった(図２０)。
【０１４１】
実施例２.４. インビトロでのｃｆＤＮＡの分析を用いるＥＧＦＲ遺伝子変異の検出限界(ＬＯＤ)の同定
Ｈ１９７５(ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍ、２１  Ｌ８５８Ｒ遺伝子変異を有する細胞株)およびＨＣＣ２２７９(ＥＧＦＲエクソン１９欠失遺伝子変異を有する細胞株)を超音波処理に付し、次いで種々の濃度(ｆＤＮＡ；１ag／ml〜１００ng／ml)の獲得した断片化ＤＮＡを健常ヒト血漿(２００μl)に加えた。次いで、ｆＤＮＡをナノワイヤーを用いて捕捉した。その後、変性を９５℃で１分間実施し、次いで検出限界(ＬＯＤ)をＥＧＦＲエクソン１９  ＤｅｌおよびＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０ＭおよびＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰに特異的なプローブを使用して確認した。その結果、３倍のシグナル対ノイズ比を適用したとき、ＨＣＣ２２７９細胞株のｆＤＮＡは１０ag／mlまで検出可能であり、Ｈ１９７５細胞株のｆＤＮＡは１００ag／mlまで検出可能であった(図２１および２２)。
【０１４２】
実施例３. 血漿または脳脊髄液サンプルに存在するｃｆＤＮＡの分析を用いるＥＧＦＲ、ＫＲＡＳおよびＡＬＫ−ＥＭＬ４遺伝子の変異の確認：肺癌患者
実施例３.１. 不安定ｃｆＤＮＡの分析を用いるＥＧＦＲ遺伝子の変異の確認
ある態様において、ナノ構造体を使用して癌患者の体液サンプルからｃｆＤＮＡを単離し、プローブへのハイブリダイゼーションおよびその後のＨＲＰ／ｓｔタグ付ナノ粒子への結合を用いて遺伝子変異を検出するのに、計６０分かかった(図６)。
血漿または脳脊髄液サンプルからｃｆＤＮＡを単離するために、ＥＧＦＲ陽性患者の血漿２００μlと５μg／mlのＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＷを室温で３０分間混合して、患者の血漿からｃｆＤＮＡを抽出した。２００μlの肺癌患者の血漿からＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＷを使用して抽出したｃｆＤＮＡのサイズをバイオアナライザーにより分析した(図２３)。一般に、癌関連ｃｆＤＮＡが１ー実験でＰＥＩ／Ｐｐｙ  ＮＷを使用して肺癌患者の血漿からｃｆＤＮＡを抽出した結果、１６９bpでピークが観察されることが確認された。
続いて、ナノ構造体に捕捉されたＤＮＡを９５℃で１分間変性させ、ビオチン結合ＣＰおよびビオチン結合ＤＰを１pMでそれに加え、３７℃で１時間反応させた。次いで、ＨＲＰおよびストレプトアビジンタグ付ポリピロールナノ粒子(ＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰ)をサンプルに加え、３７℃で３０分間反応させた。
その後、反応溶液に２５μlの１０mM  ＴＭＢ、２５μlの０.１Ｍ  Ｈ２Ｏ２および２００μlの０.２Ｍ  酢酸ナトリウム三水和物緩衝液(ｐＨ５.０)を加えた。次いで、光を遮断し、室温で３分間反応させた。その後、ＵＶ−Ｖｉｓ検出を、DU 730 UV-Vis分光光度計(Beckman Coulter, USA)を使用する６５２nmの波長で実施した。
【０１４３】
ＴＭＢの酸化反応による色調の差異が目視により観察された。ＥＧＦＲエクソン１９欠失、２０  Ｔ７９０Ｍおよび２１  Ｌ８５８Ｒを有する変異ｃｆＤＮＡの捕捉および検出のためのプローブの配列を下表３に示す。
【表３】
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【０１４４】
この試験において、特に断らない限り、ＥＧＦＲエクソン１９欠失−プローブ１(標的特異的)、ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍ−プローブ２(標的特異的)およびＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８Ｒ−プローブ２(標的特異的)をＣＰおよびＤＰとして使用した。その結果、単離したＥＧＦＲ変異ｃｆＤＮＡが検出プローブに依存して特異的に検出されたことが判明した(図２４および２５)。ＥＧＦＲエクソン１９欠失、２０  Ｔ７９０Ｍまたは２１  Ｌ８５８Ｒ遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿から捕捉したｃｆＤＮＡをそれぞれＥＧＦＲエクソン１９欠失、２０  Ｔ７９０Ｍまたは２１  Ｌ８５８ＲおよびＨＲＰ／ストレプトアビジン結合ナノ粒子(ＮＰ)を標的とするプローブと反応させたとき、患者の組織と同じ遺伝子変異を標的とするプローブを使用したとき、色調変化およびＵＶ−Ｖｉｓスペクトル変化が示されたことが判明した(図２４)。
さらに、他のＥＧＦＲ変異を有する肺癌患者から捕捉したｃｆＤＮＡをＥＧＦＲ  １９、２０および２１を標的とする同じプローブと反応させた。その結果、患者の組織同じ遺伝子変異を標的とするプローブを使用したとき、色調変化およびＵＶ−Ｖｉｓスペクトル変化が示されたことが判明した(図２５)。
【０１４５】
実施例３.２. ｃｆＤＮＡの分析を用いるＫＲＡＳおよびＡＬＫ−ＥＭＬ４遺伝子における変異の確認
さらに、ＥＧＦＲに類似して、ＫＲＡＳおよびＡＬＫ−ＥＭＬ４遺伝子における変異を分析するために、ｃｆＤＮＡを血漿または脳脊髄液サンプルから単離し、次いで捕捉ＤＮＡを９５℃で１分間変性させた。ビオチン結合ＣＰおよびビオチン結合ＤＰを１pMでそれに加え、３７℃で１時間反応させた。次いで、ＨＲＰおよびストレプトアビジンタグ付きポリピロールナノ粒子をサンプルに加え、３７℃で３０分間反応させた。
その結果、ＫＲＡＳエクソン２遺伝子変異およびＡＬＫ−ＥＭＬ４融合遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿から単離したｃｆＤＮＡは、ＫＲＡＳエクソン２に対するプローブおよびＡＬＫ−ＥＭＬ４に対するプローブに応答し、故に、患者の組織と一致した色調変化およびＵＶ吸光度を示すことが確認できた(図２６〜２８)。ＫＲＡＳエクソン２変異(図２６および２７)およびＡＬＫ−ＥＭＬ４変異１および３(図２８)を有するｃｆＤＮＡ検出のためのプローブ(ＣＰおよびＤＰ)の配列を下表４に示す。
【表４】
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【０１４６】
実施例３.３. 温度変性による非特異的反応の確認
表３における３種類のプローブ(すなわち、標的特異的または標的非特異的プローブを含む)の各々をＥＧＦＲエクソン１９欠失および２０  Ｔ７９０Ｍ遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿に加え、混合した。その結果、９５℃で１分間ＤＮＡ変性後、使用した全プローブ(すなわち、プローブが標的特異的であるか標的非特異的であるかにかかわらず)が、組織に類似したＥＧＦＲエクソン１９欠失および２０  Ｔ７９０Ｍに対してのみ色調およびＵＶ吸光度の変化を示し、これにより、特異的遺伝子変異の同定が可能であった(図２９)。しかしながら、ＥＧＦＲエクソン２１について、色調およびＵＶ吸光度の変化は、プローブのタイプにかかわらず観察されなかった。これは、不安定ｃｆＤＮＡが、ＥＧＦＲエクソン１９およびＥＧＦＲエクソン２０における変異に特異的なプローブに応答することを示唆し、これにより遺伝子変異分析が可能となる。
さらに、ｃｆＤＮＡを、ＥＧＦＲ遺伝子に変異がない肺癌患者の血漿から得た。それぞれ９５℃で１分間および１０分間変性後、ＥＧＦＲ  １９、２０および２１の変異に特異的なプローブと不安定ｃｆＤＮＡの結合を確認した。その結果、９５℃で１分間変性させたとき、色調変化およびＵＶ吸光度変化はＥＧＦＲ遺伝子に変異がない肺癌患者で観察されなかった。しかしながら、９５℃で１０分間変性させたとき、非特異的ハイブリダイゼーションによる色調変化およびＵＶ吸光度変化が全てのＥＧＦＲエクソン１９、２０および２１に対するプローブで観察可能であった(図３０)。
さらに、ｃｆＤＮＡを他のＥＧＦＲ  １９欠失および２０  Ｔ７９０Ｍ遺伝子変異を有する肺癌患者および正常対象の血漿から、ナノワイヤーを用いて捕捉した。次いで、それぞれ９５℃で０分間、１分間および１０分間の変性により、ＥＧＦＲ  １９、２０および２１に対するプローブとのそのハイブリダイゼーション反応性を確認した。その結果、図３１〜３３に示すとおり、ＥＧＦＲ遺伝子に変異がない正常対象の場合、色調変化およびＵＶ吸光度変化は９５℃で０分間(図３１)および１分間(図３２)の変性で観察されなかった。しかしながら、９５℃で１０分間の変性を用いて(図３３)、非特異的ハイブリダイゼーションを用いる色調変化およびＵＶ吸光度変化が全てのＥＧＦＲエクソン１９、２０および２１に対するプローブで観察された。それ故に、ｃｆＤＮＡにおける遺伝子変異は変性させずに分析できることが確認された。
【０１４７】
実施例４. 肺癌患者のサンプルの分析を用いる不安定ｃｆＤＮＡを検出する方法の精度の同定
本発明のある実施態様において、１５１名の肺癌患者の血漿から得たｃｆＤＮＡにおける遺伝子変異の特異性および感受性の分析により得られた結果が、患者の癌組織における遺伝子変異結果と一致することが確認された(図３４)。ＥＧＦＲエクソン１９  Ｄｅｌに特異的なプローブをＥＧＦＲに変異がない肺癌患者(ＥＧＦＲ野生型)、ＥＧＦＲエクソン１９欠失を有する肺癌患者(Ｄｅｌ)およびＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８Ｒを有する肺癌患者のｃｆＤＮＡに加え、生じた遺伝子変異をＵＶスペクトルの吸光度値(ΔＯＤ、５００nm〜６５０nm)の分析を用いて確認した。その結果、得られた結果が、患者の癌組織の遺伝子変異結果と、９８.４％一致を示したことが確認された(図３５および３６)。
さらに、ＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８Ｒのプローブを、ＥＧＦＲに変異がない肺癌患者、ＥＧＦＲエクソン１９欠失を有する肺癌患者(Ｄｅｌ)およびＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８Ｒを有する肺癌患者のｃｆＤＮＡに加え、生じた遺伝子変異をＵＶスペクトルの吸光度値(ΔＯＤ、５００nm〜６５０nm)の分析を用いて確認した。その結果、得られた結果が、患者の癌組織における遺伝子変異結果と９８.０％一致を示したことが確認された(図３７および３８)。
【０１４８】
実施例５. 正荷電ナノ粒子を使用するｃｆＤＮＡの検出
上記ＥＧＦＲ実験に類似して、ＥＧＦＲ  １９欠失(Ｄｅｌ)遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿サンプルからｃｆＤＮＡを単離するために、製造例において産生したＰＥＩ結合ナノ粒子(ＰＥＩ−Ｐｐｙ  ＮＰ、５μg／ml)をＥＧＦＲ陽性患者の２００μlの血漿に加え、室温で３０分間混合した。その後、捕捉されたＤＮＡを変性させないかまたは９５℃で１分間変性させた。次いで、ビオチンが結合しているビオチン結合ＣＰおよびＤＰをそれに１pMで加え、３７℃で３０分間インキュベーションを実施した。その後、ＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰをサンプルに加え、３７℃で１５分間反応させた。ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルでの吸光度変化がＥＧＦＲ  １９に特異的なプローブでのみＴＭＢの酸化反応を用いて観察されることが確認された(図３９)。
【０１４９】
実施例６. 血漿に存在するｃｆＤＮＡの分析を用いるＥＧＦＲ遺伝子における変異の同定
Ｈ１９７５細胞株(ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍおよび２１  Ｌ８５８Ｒ遺伝子変異を有する)を使用して、超音波処理によりｆＤＮＡを調製した。その後、製造例における方法により製造したポリリシンがコンジュゲートした表面を有するナノ構造体(ＰＬＬ／Ｐｐｙ  ＮＷ)をそれに加え、次いで無ＰＣＲ比色アッセイを実施した(図４０)。ＥＧＦＲエクソン２０、２１陽性Ｈ１９７５細胞株のｆＤＮＡをナノワイヤーを使用して単離した。次いで、ＥＧＦＲエクソン１９、２０および２１に対するプローブをそれに加え、反応させた。その後、ＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰをそれに加え、次いで色調変化を観察した。図４０に示すとおり、ＥＧＦＲ  ２０およびＥＧＦＲ  ２１においてのみ明確な色調変化およびＵＶ−Ｖｉｓスペクトル変化の化認ができた。
【０１５０】
III. 単一プローブを使用する不安定ｃｆＤＮＡの検出
実施例７. 損傷された部分のみに結合できるプローブのみを使用した不安定ｃｆＤＮＡの検出
ｃｆＤＮＡを肺癌患者の血漿サンプルから単離した。次いで、遺伝子変異を検出するために、２タイプのプローブ、すなわち、ＣＰおよびＤＰを混合物で使用した。図４１〜４３に示すとおり、ＥＧＦＲエクソン１９欠失、エクソン２０  Ｔ７９０Ｍおよびエクソン２１  Ｌ８５８Ｒ遺伝子変異を検出するために、ＣＰ＿１(ＥＧＦＲエクソン１９欠失)、ＣＰ２(ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍ)およびＣＰ２(ＥＧＦＲエクソン２１  Ｌ８５８Ｒ)を、これらは上記領域を含むｃｆＤＮＡに特異的なプローブであるが、ＤＰとの混合物で使用した。
しかしながら、図４４に示すとおり、患者の癌組織での結果(ＥＧＦＲエクソン１９欠失)と同じＥＧＦＲエクソン１９欠失遺伝子変異結果を、ＤＰを用いずにＣＰのみ加えて、確認することができた。
【０１５１】
IV. サンプル処理方法による不安定ｃｆＤＮＡの検出能の同定
実施例８. ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅでの処理による不安定ｃｆＤＮＡの検出能の同定
肺癌患者の血漿サンプルをまずＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅで処理し、次いでｃｆＤＮＡをナノ構造体を使用してそこから単離して、遺伝子変異を同定した。図４５に示すとおり、ＥＧＦＲエクソン１９欠失遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿をＲＮａｓｅ  Ａで前処理した後、ｃｆＤＮＡをそこからナノワイヤーにより得て、次いでＥＧＦＲエクソン１９  ｄｅｌに対するプローブと反応させた。その結果、患者の癌組織と同じＥＧＦＲエクソン１９欠失遺伝子変異に対するＵＶ−ｖｉｓピークが対照(対照ｃｆＤＮＡ)と同様に得られた。しかしながら、ＤＮａｓｅ  Ｉで前処理後、おそらくｃｆＤＮＡが分解したため、ＵＶ吸光度が観察されなかった(図４５)。
同様に、図４６に示すとおり、ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍ遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿をＲＮａｓｅ  Ａで前処理した後、ｃｆＤＮＡをナノワイヤーを用いてそこから得て、次いでＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍに対するプローブと反応させた。その結果、患者の癌組織における結果と同じＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍ遺伝子変異に対するＵＶ吸光度が確認された。しかしながら、ＤＮａｓｅ  Ｉでの処理後、ＵＶ吸光度が観察されないことを確認することができた(図４６)；そして、これは、おそらく患者の血漿にＤＮａｓｅ  Ｉを加えたことにより、ｃｆＤＮＡが分解された可能性によるものとされた。
【０１５２】
Ｖ. マーカーによるｃｆＤＮＡの検出能の同定
実施例９. ＨＲＰ／ストレプトアビジン複合体を使用するｃｆＤＮＡの検出能の同定
図４７に示すとおり、ｃｆＤＮＡをＥＧＦＲエクソン１９欠失およびエクソン２０  Ｔ７９０Ｍ遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿から抽出し、ＥＧＦＲエクソン１９  Ｄｅｌ、２０  Ｔ７９０Ｍおよび２１  Ｌ８５８ＲおよびＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰに対するプローブと反応させ、次いで患者の癌組織における結果と同じＥＧＦＲエクソン１９欠失およびエクソン２０  Ｔ７９０Ｍ遺伝子変異結果がＵＶ吸光度および色調の変化により確認された。
しかしながら、図４８に示すとおり、ｃｆＤＮＡを同じ患者の血漿から抽出しＥＧＦＲエクソン１９  Ｄｅｌ、２０  Ｔ７９０Ｍ、２１  Ｌ８５８Ｒおよび、次いでＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰの代わりにＨＲＰ−ストレプトアビジン複合体(ＨＲＰとストレプトアビジンは互いに１：１で結合している)に対するプローブと反応させたとき、患者の癌組織結果と完全に異なる遺伝子変異結果が観察された。ＨＲＰ／ストレプトアビジン複合体をＨＲＰ／ストレプトアビジンタグ付ナノ粒子(ＮＰ)の代わりに使用したとき、非特異的結合の増加により、不正確な遺伝子変異結果が観察されたことが判明した。
図４９に示すとおり、５ＥＧＦＲエクソン１９欠失およびエクソン２０  Ｔ７９０Ｍ遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿からｃｆＤＮＡを抽出し、次いで該ｃｆＤＮＡをＥＧＦＲエクソン１９  Ｄｅｌ、２０  Ｔ７９０Ｍおよび２１  Ｌ８５８ＲおよびＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰに対するプローブならびにＥＧＦＲエクソン１９  Ｄｅｌ、２０  Ｔ７９０Ｍおよび２１  Ｌ８５８ＲおよびＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰの代わりにＨＲＰ／ストレプトアビジン複合体(ＨＲＰとストレプトアビジンは互いに１：１で結合している)に対するプローブと反応させることにより得た結果の分析を実施した。その結果、ナノワイヤーを用いて得たｃｆＤＮＡは、プローブおよびそれに対するＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰの結合によりもたらされる反応特異性増加により、癌組織に一致するＵＶ吸光度を示したことが確認された。さらに、５ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍおよび２１  Ｌ８５８Ｒ遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿においても、ＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰが遺伝子変異決定に重要な役割を有することが確認された。
【０１５３】
VI. プローブおよびマーカーが互いに結合した複合体を使用するｃｆＤＮＡの検出
実施例１０. ＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰが結合したプローブを使用する遺伝子変異の検出
図５０に示すとおり、ｃｆＤＮＡをそれぞれプローブおよびＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰとの連続反応に付す代わりに、ＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰをまずＥＧＦＲエクソン１９  Ｄｅｌ、２０  Ｔ７９０Ｍおよび２１  Ｌ８５８Ｒに特異的なプローブと結合させ、プローブ−ＨＲＰマーカーの形の結産物を産生し、ｃｆＤＮＡをこのような結合物と反応させた；そしてその結果、癌組織と同じ遺伝子型が、ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍおよび２１  Ｌ８５８Ｒ遺伝子変異を有する肺癌患者の胸水で検出されたことが確認された。
【０１５４】
VII. 配列混合によるｃｆＤＮＡの検出
実施例１１. プローブおよびマーカーの同時混合を用いる不安定ｃｆＤＮＡの検出の同定
図５１に示すとおり、ｃｆＤＮＡをそれぞれＣＰおよびＤＰプローブおよびＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰとの連続反応に付す代わりに、ｃｆＤＮＡを、一斉に、プローブおよびＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰと混合し、反応させた；そしてその結果、ＥＧＦＲエクソン２０  Ｔ７９０Ｍおよび２１  Ｌ８５８Ｒ遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿において癌組織と同じ遺伝子型が検出されたことが確認された。さらに、図５２に示すとおり、ｃｆＤＮＡを、一斉に、ＣＰおよびＤＰプローブおよびＨＲＰ／ｓｔタグ付ＮＰと混合し、反応させた；そしてその結果、ＡＬＫ−ＥＭＬ４融合およびＡＬＫ点変異(Ｉ１１７１Ｎ／Ｔ)遺伝子変異を有する肺癌患者の血漿において癌組織と同じ遺伝子型が検出されたことが確認された。
【０１５５】
VIII. サンプル変性条件による不安定ｃｆＤＮＡの検出
実施例１２. 温度条件によるサンプル変性後のｃｆＤＮＡの検出
不安定ｃｆＤＮＡおよび安定ｃｆＤＮＡを、サンプル変性条件によって互い区別できるか否かを確認するために実験を行った。具体的には、ＥＧＦＲ  １９欠失の検出が可能なプローブを使用して、正常対象および肺癌患者(０２０８−３４３、２０１９０３１１＿ＬＣ＃１、由来組織：Ｅ１９ｄｅｌ)から集めた血漿を種々の変性条件に付し、次いで不安定ｃｆＤＮＡおよび安定ｃｆＤＮＡを互いに区別できるか否かを試験した。
プローブについては、ＥＧＦＲエクソン１９欠失の検出が可能であるプローブであるggaattaaga gaagcaacat ctcc(配列番号９)を使用した。ここで、ビオチン結合プローブを使用した。ＰＥＩ／Ｐｐｙナノワイヤーを使用し、ＨＲＰ／ストレプトアビジンが凝集したナノ粒子をマーカーとして使用した。
具体的には、ナノワイヤーでｃｆＤＮＡを単離する前に、サンプルを下記の種々の条件下処理した。サンプルをそれぞれ３０℃で１５分間および０分間加熱した。さらに、サンプルをそれぞれ６０℃で５分間および０分間加熱した。さらに、サンプルを９５℃で１分間および０分間加熱した。他の工程は、図８に模式化した方法で実施した。
その結果、ＥＧＦＲ  １９欠失変異がない正常対象において、不安定ｃｆＤＮＡはどの変性条件下でも検出されなかった(図５４)。しかしながら、Ｅ１９ｄｅｌ患者において、不安定ｃｆＤＮＡが全ての異なる変性条件下で検出されたことが同定された(図５５)。これらの結果から、不安定ｃｆＤＮＡの存在または非存在によって、肺癌患者がＥ１９ｄｅｌ変異を有するとの情報を提供することが可能であった。
【０１５６】
実施例１３. 温度条件による細胞株由来不安定ｃｆＤＮＡの検出
人体から得たサンプルにおけると同様、細胞株に存在する変異位置を確認するための実験を実施した。具体的には、ｃｆＤＮＡに類するサイズを有するｆＤＮＡを、ＨＣＣ２２７９(エクソン１９Ｄｅｌ)、ＨＣＣ８２７(エクソン１９Ｄｅｌ)、Ｈ１９７５(Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ)およびＡ５４９(ＥＧＦＲ野生型)の各々から得た。具体的には、ｆＤＮＡを実施例２の方法で得た。
その結果、それぞれ９５℃で１分間および０分間加熱する変性条件下で、不安定ｃｆＤＮＡのみがプローブに特異的に結合し、マーカーに結合した状態で検出されたことが確認された(図５６)。これらの結果から、不安定ｃｆＤＮＡの存在または非存在を細胞株から得たサンプルでも確認できた。
【０１５７】
実施例１４. ＤＮａｓｅでの処理による不安定ｃｆＤＮＡの検出
不安定ｃｆＤＮＡおよび安定ｃｆＤＮＡが、温度条件だけでなく、ＤＮＡ分解酵素によっても異なるかを同定するために、不安定ｃｆＤＮＡおよび安定ｃｆＤＮＡをＤＮａｓｅでの処理に付し、次いでそのプローブとの反応性を確認した。ここで、サンプルは高温での変性はさせなかった。
具体的には、ＨＣＣ２２７９(エクソン１９Ｄｅｌ)、ＨＣＣ８２７(エクソン１９Ｄｅｌ)、Ｈ１９７５(Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ)およびＡ５４９(ＥＧＦＲ野生型)の各々からＰＥＩ／Ｐｐｙナノワイヤーを使用して得たｆＤＮＡをＰＢＳに懸濁し、次いで１μlのＤＮａｓｅで処理した。３７℃で３０分間の処理の結果、不安定ｃｆＤＮＡおよび安定ｃｆＤＮＡがプローブとの反応性の観点で異なったことが確認された(図５７)。さらに、ＤＮａｓｅでの処理を３７℃で６０分間実施したとき同じ効果が示されたことが確認された(図５８)。これらの結果に基づき、安定ｃｆＤＮＡがＤＮａｓｅ酵素により容易に分解されないことを確認することができた。
しかしながら、３７℃で１２０分間の１μlまたは２μlのＤＮａｓｅでの処理の結果、安定ｃｆＤＮＡも、ＤＮａｓｅでの処理時間が長くなるかまたは使用するＤＮａｓｅ量を増やしたとき、プローブと応答することが確認された(図５９)。これらの結果から、不安定ｃｆＤＮＡと安定ｃｆＤＮＡの安定性の差異を確認することができた。
さらに、ＤＮａｓｅの活性により、不安定ｃｆＤＮＡと安定ｃｆＤＮＡの差を確認するために、１μlまたは２μlのＤＮａｓｅで２４℃で１２０分間処理により得た結果を図６０に示す。その結果、酵素の活性が２４℃で減少したが、不安定ｃｆＤＮＡと安定ｃｆＤＮＡが、プローブとの反応性で異なることが確認された(図６０)。
さらに、ＤＮａｓｅの活性により不安定ｃｆＤＮＡと安定ｃｆＤＮＡの差異を確認するために、１μlまたは２μlのＤＮａｓｅで３℃で１２０分間処理により得た結果を図５８に示す。その結果、酵素の活性が３℃で減少したが、不安定ｃｆＤＮＡと安定ｃｆＤＮＡが、プローブとの反応性で異なることが確認された(図６１)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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