(57)【要約】  本発明は、粘度の低下を示す高濃度タンパク質製剤の組成物に関する。調製された製剤に含まれるタンパク質は、凝集および変性に対して安定化されており、よって、患者に投与するまで十分に貯蔵安定である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に活性なタンパク質を少なくとも５０ｍｇ／ｍｌから３００ｍｇ／ｍｌまでの範囲の濃度で含む液体製剤の粘度を低下させる方法であって、タンパク質溶液と、粘度を低下させる濃度のメグルミン、オルニチン、カルニチン、ベンゼンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム、グルコン酸、グルクロン酸、アミノカプロン酸およびコハク酸塩またはそれらの混合物からなる群から選択される賦形剤とを組み合わせる工程を含む、前記方法。
【請求項２】
治療用タンパク質が、抗体、抗体フラグメント、ミニボディ、修飾抗体、抗体様分子および融合タンパク質の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
メグルミンと対イオンとしてのベンゼンスルホン酸またはメグルミンと対イオンとしてのｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムが、粘度低下賦形剤として添加される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
オルニチンと対イオンとしてのベンゼンスルホン酸またはオルニチンと対イオンとしてのｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムが、粘度低下賦形剤として添加される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
メグルミンおよびオルニチンが粘度低下賦形剤として添加される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
メグルミンまたはオルニチンまたはカルニチンと、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム、グルコン酸、グルクロン酸、アミノカプロン酸、およびコハク酸塩の群から選択される対イオンとが、粘度低下賦形剤として添加される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
粘度低下賦形剤が等モル量で添加される、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
製剤の粘度が少なくとも１２％低下する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
製剤の粘度が少なくとも５０％低下する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
製剤の粘度が少なくとも７５％低下する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法によって製造された、低下した粘度を有する医薬製剤。
【請求項１２】
少なくとも５０ｍｇ／ｍｌから３００ｍｇ／ｍｌまでの濃度の治療用タンパク質と、メグルミン、オルニチン、カルニチン、ベンゼンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム、グルコン酸、グルクロン酸、アミノカプロン酸およびコハク酸塩またはそれらの混合物からなる群から選択される賦形剤とを含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
メグルミンと、対イオンとしてのベンゼンスルホン酸とが粘度低下賦形剤として含まれる、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
メグルミンと、対イオンとしてのｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムとが粘度低下賦形剤として添加される、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
オルニチンと、対イオンとしてのベンゼンスルホン酸とが粘度低下賦形剤として添加される、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
オルニチンと、対イオンとしてのｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムとが粘度低下賦形剤として添加される、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
粘度低下賦形剤が等モル量で添加される、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
賦形剤の濃度が約５００ｍＭ未満、とりわけ２００ｍＭ未満である、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
約４．５から約８．０の範囲のｐＨを有する、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
約５．４から約７．９の範囲のｐＨを有する、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
約４．６から約５．４のｐＨを有する、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物を凍結乾燥する工程を含む、凍結乾燥粉末を調製する方法。
【請求項２３】
治療用タンパク質と、メグルミン、オルニチン、カルニチン、ベンゼンスル
ホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム、グルコン酸、グルクロン酸、アミノカプロン酸およびコハク酸塩またはそれらの混合物からなる群から選択される賦形剤とを含み、賦形剤が、希釈剤で再構成したときに粘度を下げるのに有効な重量：重量濃度で存在する、請求項２２に記載の凍結乾燥粉末。
【請求項２４】
賦形剤が、治療用タンパク質１ｍｇあたり約１００μｇから治療用タンパク質１ｍｇあたり約１ｍｇの間の濃度で存在する、請求項２２または２３に記載の凍結乾燥粉末。
【請求項２５】
賦形剤が、治療用タンパク質１ｍｇあたり約２００μｇから約５００μｇの間から治療用タンパク質１ｍｇあたり約１ｍｇまでの濃度で存在する、請求項２２、２３または２４に記載の凍結乾燥粉末。
【請求項２６】
無菌の水性希釈剤を添加する工程を含む、請求項２２に記載の凍結乾燥粉末を再構成する方法。
【請求項２７】
治療用タンパク質が、抗体、抗体フラグメント、ミニボディ、修飾抗体、抗体様分子および融合タンパク質の群から選択される、請求項１または２、２２または２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
治療用タンパク質が、抗体、抗体フラグメント、ミニボディ、修飾抗体、抗体様分子および融合タンパク質の群から選択される、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の医薬製剤または医薬組成物。
【請求項２９】
治療用タンパク質が、抗体、抗体フラグメント、ミニボディ、修飾抗体、抗体様分子および融合タンパク質の群から選択される、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の凍結乾燥粉末。
【請求項３０】
請求項２８に記載の医薬製剤または請求項２９に記載の凍結乾燥粉末を含むキット。
【請求項３１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法によって得られる医薬組成物の凍結乾燥または噴霧乾燥調製物を含み、使用前に溶液調製物にすることができる、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
９６ウェルプレートに置かれた、すぐに使用できる凍結乾燥製剤または噴霧乾燥製剤を含む、請求項３０に記載のキット。
【請求項３３】
容器、注射器および／または針の有無にかかわらず他の投与装置、注入ポンプ、ジェット注射器、ペン装置、経皮注射器、または他の無針注射器ならびに指示書を含む、患者への投与のための請求項３１または３１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粘度の低下を示す高濃度タンパク質製剤の組成物に関する。調製された製剤に含まれるタンパク質は、凝集および変性に対して安定化されており、よって、患者に投与するまで十分に貯蔵安定である。
【背景技術】
【０００２】
技術水準
開発中のほとんどのバイオセラピューティックタンパク質製品は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）あるいは二重特異性抗体または抗体フラグメントなどの関連するフォーマットである。臨床的に重要な適応症の広い範囲にわたるかかる製品の治療用量はしばしば多い。
【０００３】
しかし、ペプチドおよびタンパク質は、従来の有機および無機薬よりも大きく、より複雑であり（すなわち、複雑な３次元構造に加えて複数の官能基を持っている）、かかるタンパク質の製剤は特別な問題をもたらす。これらの問題の1つは、とりわけ高濃度での、タンパク質製剤の粘度の上昇である。
【０００４】
しかしながら、後者は特に問題であり、なぜなら患者の利便性、コンプライアンス、および全体的な医療費の観点から、得られる製品が少量の皮下注射によって送達されることが非常に望ましいからである。
【０００５】
しかし、多い治療用量と非常に望ましい少ない注射量との組み合わせは、しばしば、有効成分の極めて高濃度の製剤の必要性につながる。高濃度で、バイオセラピューティックの安定した水性製剤を達成することは並外れて困難になることがあり、しばしば凝集率、粒子形成、および粘度のかなりの増加につながることがあることはよく知られている。高粘度は、製品の注入性を有意に制限するため、許容できない。
【０００６】
抗体および他のタンパク質治療薬は、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）または皮下（ＳＣ）ルートなどによって非経口的に投与することができる。皮下注射は、患者への投与を簡素化する可能性（高速、少量の注射）および治療費の削減（より短い医療支援）により、タンパク質治療薬の送達についてますます注目を集めている。患者のコンプライアンスを確保するために、皮下注射剤形は等張であり、少ない注射量（注射部位あたり＜２．０ｍｌ）を含有することが望ましい。注射量を減らすために、タンパク質はしばしば１ｍｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内で投与される。
【０００７】
よって、皮下投与のためのタンパク質製剤の主な開発は、しばしば粘度の課題に関連している。容量制限（＜２ｍｌ）および用量要件（通常＞１００ｍｇ投与）は、しばしば高濃度のタンパク質製剤を要求する。しかし、すでに述べたように、高濃度では、タンパク質は高粘度の溶液を形成する傾向があり、可溶性および不溶性のタンパク質−タンパク質凝集体の形成により、安定性が問題になり得る。かかる粘度は、
a）製造工程および
b）患者への投与
に対して厳しい課題である。
【０００８】
製造工程において、高粘度である高濃度タンパク質製剤は、処理において、特に限外濾過および滅菌濾過において、困難である。
【０００９】
ｍＡｂベースの治療法は通常、長期間にわたって繰り返し投与され、数ｍｇ／ｋｇの投与が必要である。抗体溶液または懸濁液は、静脈内（ＩＶ）注入、および皮下（ＳＣ）または筋肉内（ＩＭ）注射などの非経口ルートで投与できる。ここで、注射溶液において、高粘度が問題である。この問題を解決し、溶液の安定性を向上させるために、通常、高濃度の添加剤および賦形剤も添加される。筋肉内または皮下投与を目的とした製剤に望ましいタンパク質濃度では、長期のタンパク質安定性を達成するために、スクロースおよび塩化ナトリウムなどの高濃度の安定剤が必要である。得られる溶液は、高い射出力（high injection forces）による組織損傷のためにしばしば注射の痛みを引き起こす。したがって、高タンパク質濃度製剤の安定性と浸透圧のために必要な量の安定剤のバランスをとることが重要である。
【００１０】
結果として、粘度に起因する技術的ハードルは、大抵、皮下送達のためのタンパク質製剤の開発の失敗につながる。
【００１１】
皮下製剤の開発における成功率を高めるために、化学的方法による粘度の低下および制御が、近年かなりの注目を集めている。
多数の出版物および特許出願は、塩のファミリー（主にＮａＣｌ）および特別なアミノ酸のファミリー、好ましくはアルギニン、ヒスチジンおよびプロリン、からの賦形剤に言及しており、ある特定の高濃度タンパク質治療薬の粘度を低減させるのに効率的であることが示されている。
【００１２】
残念ながら、粘度を低減させるためのこれらのよく知られたアプローチは、おそらくタンパク質製剤の粘度が様々な分子間力の結果であるという事実のために、普遍的に適用できるわけではない。タンパク質分子およびその配合条件に応じて、分子クラウディング、あるいは双極子相互作用あるいは疎水性基または荷電基間の相互作用などの異なる相互作用が粘度に影響を与え得る。その結果、製薬業界は、とりわけ上記のＮａＣｌおよびアミノ酸に基づく標準溶液が失敗したときの代替オプションとして、粘度を低下させる賦形剤を強く必要としている。
【００１３】
過去に、多数の粘度低減添加剤および賦形剤が研究されてきた。今日、最も有名なものの1つは、ヒスチジン、リジン、およびカンファー−１０−スルホン酸に加えて、アルギニンである。Zheng Guo et al(「Structure-Activity Relationship for Hydrophobic Salts as Viscosity-Lowering Excipients for Concentrated Solutions of Monoclonal Antibodies」、 Pharmaceutical Research, vol. 29, no. 11, June 13, 2012, p. 3182-3189)からの研究論文において、粘度低減特性を呈するさらに多くのユニークな分子が記載されている。現在でも、高濃度で粘度問題を呈する全ての治療用タンパク質溶液が、既知の粘度低減賦形剤によって適切に対処できるわけではない。
【発明の概要】
【００１４】
本発明の目的
製薬用途を目的としたタンパク質製剤（例えばモノクローナル抗体、融合タンパク質など）は通常、望ましくない凝集に対する安定剤を必要とし、物理的または化学的分解を防ぐ。これらの問題は、このクラスの分子の治療的投与にしばしば望ましい高タンパク質濃度で悪化する。
【００１５】
高濃度では、タンパク質は自己会合する傾向があり、高粘度の製剤をもたらし、例えば、注射によるこれらのタンパク質溶液の投与だけでなく、タンジェンシャルフローろ過がバッファー交換およびタンパク質濃度の増加のためにしばしば使用される製造工程も複雑にする。注射およびろ過中に背圧とせん断応力を増加させることにより、治療用タンパク質が潜在的に不安定になるか、または処理時間が長くなる。したがって、バイオ医薬品業界では、粘度低減機能を備えた製剤添加剤および賦形剤、またはそれらの組み合わせに対する高いニーズがある。しかしながら、モノクローナル抗体のようなタンパク質を製剤化するには、タンパク質の変性および生物活性の喪失を回避するために、製剤添加剤および／または賦形剤の慎重な選択を必要とする。
【００１６】
しかし、依然として多数の新しい抗体および抗体フォーマットは、適切で革新的な粘度低減添加剤および／または賦形剤、あるいは特定の添加剤／賦形剤の組み合わせ、あるいは標的製剤戦略の開発を必要としている。これらの添加剤／賦形剤は、タンパク質製剤が非経口的、これは静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内または皮下ルートを包含する、に投与されるため、薬学的に安全でなければならない。したがって、これらの製剤に使用できる添加剤は、生理学的に適合性があり、望ましくない副作用有してはならず、いかなる状況においてもアレルギー反応につながってはならず、特に、アナフィラキシー様の副作用を引き起こしてはならない。
【００１７】
本発明の主題
本発明の主題は、タンパク質溶液と、粘度を低下させる濃度のメグルミン、オルニチン、カルニチン、ベンゼンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム、グルコン酸、グルクロン酸、アミノカプロン酸およびコハク酸塩またはそれらの混合物からなる群から選択される賦形剤とを組み合わせる工程を含む、薬学的に活性なタンパク質の液体高濃度製剤の粘度を低下させる方法である。特に、本発明は、タンパク質の濃度が少なくとも５０ｍｇ／ｍｌから３００ｍｇ／ｍｌまでの範囲にある製剤であって、治療用タンパク質が抗体、抗体フラグメント、ミニボディ、修飾抗体、抗体様分子および融合タンパク質の群から選択される、前記製剤に関する。
【００１８】
メグルミンを、ベンゼンスルホン酸を対イオンとしてまたはｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムを対イオンとして一緒に添加したときだけでなく、オルニチンと対イオンとしてのベンゼンスルホン酸とを添加した場合、あるいはオルニチンまたは対イオンとしてのｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム、あるいは効果的であるさらなる好適な組み合わせを添加した場合もまた、請求項１または請求項２〜１０のいずれか一項の方法で特に良好な粘度低減効果が達成される。この効果は、特にこれらの組み合わせが等モル量で添加された場合に達成される。とりわけ言及した前記賦形剤を添加することにより、少なくとも１２％の、最適条件下で８０％までの粘度の低下が達成され得る。
【００１９】
請求項１１から２１に記載のその特定の態様を備える薬学的に活性なタンパク質またはペプチドの濃縮医薬製剤もまた本発明の目的である。治療用タンパク質は、抗体、抗体フラグメント、ミニボディ、修飾抗体、抗体様分子および融合タンパク質の群から選択してもよい。さらに、請求項１１〜２１の組成物から凍結乾燥粉末を製造するための請求項２２から２９の方法は本発明の目的である。しかしながら、請求された組成物を含むキットならびに請求項３０〜３４の請求された組成物を含むキットもまた本発明の範囲内であり、その用途もまた本発明の範囲内である。
【００２０】
発明の詳細な記載
上で概説したように、高タンパク質濃度は、タンパク質の物理的および化学的安定性に関連する課題、ならびにタンパク質製剤の製造、貯蔵、および投与に困難をもたらす。重大な問題は、処理および／または貯蔵中にタンパク質が凝集して粒子を形成する傾向であり、これがさらなる処理および／または投与中の操作を困難にする。濃度依存性の分解および/または凝集は、より高濃度のタンパク質製剤を開発する上での重大な課題である。非天然タンパク質凝集および粒子形成の可能性に加えて、水溶液中で可逆的自己会合が起こることがあり、これは、何よりも、注射による送達を複雑にする粘度の増加に寄与する。
【００２１】
定義
本明細書で一般に使用される用語「タンパク質」は、ペプチド結合によって互いに連結されて、鎖長が少なくとも検出可能な三次構造を生成するのに十分である、ポリペプチドを形成するアミノ酸のポリマーを指す。約１００ｋＤａを超える分子量（ｋＤａで表され、「Ｄａ」は「ダルトン」を意味し、１ｋＤａ＝１，０００Ｄａ）を有するタンパク質は、「高分子量タンパク質」と規定されることがあり、一方分子量が約１００ｋＤａ未満のタンパク質は「低分子量タンパク質」と規定されることがある。用語「低分子量タンパク質」は、タンパク質と見なされるために必要な少なくとも三次構造の必要条件を欠いている小さなペプチドを除外する。タンパク質の分子量は、当業者に知られている標準的な方法を使用して決定することができ、質量分析（例えば、ＥＳＩ、ＭＡＬＤＩ）または既知のアミノ酸配列およびグリコシル化からの計算が挙げられるがこれらに限定されない。タンパク質は、天然または非天然、合成、あるいは半合成であり得る。
【００２２】
「本質的に純粋なタンパク質」および「実質的に純粋なタンパク質」は、本明細書で交換可能に使用され、少なくとも約９０重量％の純粋なタンパク質、好ましくは少なくとも約９５重量％の純粋なタンパク質を含む組成物を指す。「本質的に均質」および「実質的に均質」は、本明細書で交換可能に使用され、少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約９５％の存在するタンパク質が、モノマーおよび可逆的ジ−およびオリゴマー会合体（不可逆的凝集体ではない）の組み合わせである組成物を指す。
【００２３】
本明細書で一般に使用される用語「抗体」は、ｍＡｂｓ（免疫グロブリンＦｃ領域を有する完全長抗体を包含する）、ポリエピトープ特異性を備えた抗体組成物、二重特異性抗体、ダイアボディ、および一本鎖抗体分子、ならびに抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）、単一ドメイン抗体、多価単一ドメイン抗体、Ｆａｂ融合タンパク質、ならびにそれらの融合を広くカバーする。
【００２４】
本明細書で一般に使用される用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、天然に生じる可能性のある少量で存在し得る突然変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一のエピトープに対して向けられる。例えば、これらは典型的にはKohler et al.(Nature 256: 495, 1975)によって記載されているように、ハイブリドーマ細胞を培養することによって合成され、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）によって作製することができ、またはClackson et al.(Nature 352: 624-628, 1991)およびMarks et al.(J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991)に記載された技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離することができる。本明細書に使用されるとき、「ｍＡｂ」は、具体的には、誘導体化抗体、抗体薬物複合体、および重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来する抗体に対応する配列と同一または相同である一方、鎖の残りの部分は、別の種に由来するあるいは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、ならびに所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体のフラグメントを包含する（米国特許４，８１６，５６７号；Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984）。
【００２５】
「抗体フラグメント」はインタクト抗体の一部を含み、インタクト抗体の抗原結合領域および／または可変領域を包含する。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号；Zapata et al., Protein Eng. 8:1057-1062, 1995を参照）；一本鎖抗体分子；多価単一ドメイン抗体；および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を包含する。
【００２６】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む、主にヒト配列のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合サブ配列など）である（例えば、Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Reichmann et al., Nature 332:323-329, 1988；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992参照）。
【００２７】
これに関連して、用語「治療的に活性なタンパク質」は、簡単に言えば、抗体、抗体フラグメント、ミニボディ、修飾抗体、抗体様分子、および融合タンパク質の群から選択され、および上述のように定義される、タンパク質またはペプチドであることを意味すると理解される。
【００２８】
「レオロジー」は物の変形および流れの研究を指し、および「粘度」は物質（典型的には液体）の流れに対する抵抗を指す。粘度はせん断力の概念に関連している；それは流体の異なる層が互いに反対方向に移動するときに、互いにまたは他の表面にせん断力を及ぼす効果として理解できる。粘度にはいくつかの尺度がある。粘度の単位はＮｓ／ｍ２で、パスカル秒（Ｐａ−ｓ）として知られている。粘度は「動（kinematic）」または「絶対（absolute)」であり得る。動粘度は運動量が流体を介して伝達される速度の尺度である。それはストークス（Ｓｔ）で測定される。動粘度は重力の影響下にある流体の抵抗流の尺度である。体積が等しく粘度が異なる２つの流体を同一のキャピラリー粘度計に設置し、重力によって流動させたとき、粘度の高い流体が粘度の低い流体よりもキャピラリーを流れるのに時間がかかる。例えば、ある流体がその流れを完了するのに２００秒（ｓ）かかり、別の流体が４００秒かかる場合、２番目の流体は動粘度スケールで最初の流体の２倍の粘度と呼ばれる。動粘度の寸法は長さ２／時間である。一般的に、動粘度はセンチストークス（ｃＳｔ）で表される。動粘度のＳＩ単位はｍｍ２／ｓであり、これは１ｃＳｔに等しい。「力学的粘度（dynamic viscosity）」または「単純粘度」と呼ばれることもある「絶対粘度」は、動粘度と流体密度の積である。絶対粘度はセンチポアズ（ｃＰ）の単位で表される。絶対粘度のＳＩ単位は、ミリパスカル秒（ｍＰａ−ｓ）である、１ｃＰ＝１ｍＰａ−ｓ。
【００２９】
粘度は、例えば、所与の剪断速度または複数の剪断速度で粘度計を使用することによって測定してもよい。「外挿されたゼロせん断」粘度は、絶対粘度対せん断速度のプロット上に４つの最高せん断点の最良適合線を作成し、粘度を外挿してゼロせん断に戻すことによって決定できる。あるいは、ニュートン流体に対して、粘度は、複数のせん断速度で粘度値を平均することによって決定できる。粘度は、マイクロ流体粘度計を使用して、単一または複数のせん断速度（流量とも呼ばれる）で測定することもでき、ここで絶対粘度は、液体がチャネルを流れるときの圧力の変化から導き出される。粘度はせん断速度に対するせん断応力に等しくなる。マイクロ流体粘度計で測定された粘度は、いくつかの態様において、外挿されたゼロ剪断粘度、例えば、コーンおよびプレート粘度計を使用して複数の剪断速度で測定された粘度から外挿された粘度と直接比較することができる。
【００３０】
「せん断速度」は、流体の１つの層が隣接する層を通過する速度の変化率を指す。速度勾配は、プレートからの距離に伴う速度の変化率である。この単純なケースは、（ｃｍ／秒）／（ｃｍ）＝１／秒の単位でせん断速度（ｖ１−ｖ２）／ｈの均一な速度勾配を示す。これゆえに、せん断速度の単位は秒の逆数、または一般に時間の逆数である。マイクロ流体粘度計については、圧力と流量の変化はせん断速度に関連している。「せん断速度」とは、物質が変形する速度のことである。タンパク質および粘度低下剤を含む製剤は、対象のサンプルの粘度範囲において粘度を正確に測定するために当業者によって適切に選択されたコーンおよびプレート粘度計およびスピンドルを使用して測定されるとき（すなわち、２０ｃＰのサンプルは、ＤＶ２Ｔ粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ）に取り付けられたＣＰＥ４０スピンドルで最も正確に測定される）、典型的には約０．５ｓ−１から約２００ｓ−１の範囲の剪断速度で測定される；マイクロ流体粘度計を使用して測定したときは約２０ｓ−１より大きく約３，０００ｓ−１まで。
【００３１】
本明細書で一般に使用される古典的な「ニュートン」流体の場合、粘度は本質的に剪断速度に依存しない。しかしながら「非ニュートン流体」については、粘度はせん断速度の増加とともに減少または増加する、例えば、流体はそれぞれ「剪断減粘性」または「剪断増粘性」である。濃縮された（すなわち、高濃度の）タンパク質溶液についていえば、これは、擬塑性剪断減粘性挙動、すなわち、剪断速度に伴う粘度の低下として現れ得る。
【００３２】
本明細書で一般に使用される用語「化学的安定性」は、酸化、脱アミド化、または加水分解などの化学的経路を経る分解に抵抗する製剤中のタンパク質成分の能力を指す。典型的には、４°Ｃで２４か月後に分解される成分が約５％未満の場合、タンパク質製剤は化学的に安定であると見なされる。
【００３３】
本明細書で一般に使用される用語「物理的安定性」は、凝集などの物理的劣化に抵抗するタンパク質製剤の能力を指す。物理的に安定である製剤は、許容可能なパーセンテージの生物活性タンパク質剤の不可逆的な凝集体（例えば、二量体、三量体、または他の凝集体）のみを形成する。凝集体の存在は、動的光散乱によって製剤中のタンパク質の平均粒子サイズを測定することを包含する、いくつかの方法で評価し得る。４°Ｃで２４ヶ月後に形成される不可逆的な凝集体が約５％未満の場合、製剤は物理的に安定である見なされる。凝集不純物の許容レベルは、理想的には約２％未満であろう。およそ１％がより典型的であるが、約０．２％という低いレベルが達成可能である。
【００３４】
本明細書で一般に使用される用語「安定な製剤」は、製剤が化学的に安定および物理的に安定の両方であることを意味する。安定な製剤は、約９５％以上の生物活性タンパク質分子が、４°Ｃで２４ヶ月の保存後、または高温での同等の溶液条件（４０°Ｃで１ヶ月の保管など）後に製剤中に生物活性を保持するものであり得る。タンパク質の安定性を測定するための様々な分析技術が当技術分野で利用可能であり、レビューされている、例えば、Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee, Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y. (1991)およびJones, A., Adv. Drug Delivery Revs. 10:29-90, 1993。安定性は、ある特定の期間、選択した温度で測定し得る。迅速なスクリーニングのために、例えば、製剤は、４０°Ｃで２週間から１ヶ月間維持してもよく、その時点で、残留生物活性が測定され、安定性を評価するために初期条件と比較される。製剤を２°Ｃ〜８°Ｃで保存すべきとき、一般に、製剤は、３０℃または４０℃で少なくとも１ヶ月間安定および／または２°Ｃ〜８°Ｃで少なくとも２年間安定でなければならない。製剤を室温、約２５°Ｃで保存すべきとき、一般に、製剤は、約２５℃で少なくとも２年間安定および／または４０°Ｃで少なくとも約６ヶ月間安定でなければならない。凍結乾燥および保存後の凝集の程度は、タンパク質の安定性の指標として使用できる。いくつかの態様において、安定性は、製剤中のタンパク質の粒子サイズを測定することによって評価される。いくつかの態様において、安定性は、標準的な生物学的活性または結合アッセイウェルを使用して、当業者の能力の範囲内で製剤の活性を測定することによって評価され得る。
【００３５】
本明細書で一般に使用される用語「粒子サイズ」は、周知の粒子サイズ測定機器、例えば動的光散乱、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）、または当業者に知られている他の方法を使用することによって決定されるような、製剤中の生物活性分子粒子の主要な集団の平均直径、またはその粒子サイズ分布を意味する。
【００３６】
本明細書で一般に使用される用語「濃縮」または「高濃度」は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、とりわけ約１０ｍｇ／ｍＬより大きい、好ましくは約５０ｍｇより大きい、より好ましくは約１００ｍｇ／ｍＬより大きい、さらにより好ましくは約２００ｍｇ／ｍＬより大きい、または最も好ましくは約２５０ｍｇ／ｍＬより大きいタンパク質の最終濃度を有する液体タンパク質製剤を表す。
【００３７】
本明細書で一般に使用される用語「再構成製剤」は、投与のためにタンパク質を水溶液に溶解または分散するように、乾燥粉末、凍結乾燥、噴霧乾燥または溶媒沈殿されたタンパク質を希釈剤に溶解することによって調製された製剤を指す。
【００３８】
「凍結保護剤」は、タンパク質と組み合わされると、凍結乾燥および／またはその後の貯蔵時にタンパク質の化学的および／または物理的不安定性を有意に低下させる物質である。凍結保護剤は、一般に、「凍結保護量」で予備凍結乾燥製剤に添加される。これは、凍結保護量の凍結保護剤の存在下でタンパク質を凍結乾燥した後、タンパク質が本質的にその物理的および化学的安定性および完全性を保持することを意味する。
【００３９】
本明細書で一般に使用される「希釈剤」または「担体」は、薬学的に許容され（すなわち、ヒトまたは別の哺乳動物への投与に対して安全および非毒性）、凍結乾燥後に再構成された水性製剤などの液体製剤の調製に有用な成分である。例示的な希釈剤は、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液、およびそれらの組み合わせを包含する。
【００４０】
「防腐剤」は、細菌、真菌、または他の感染性病原体による汚染および／またはそれらの作用を低下させるために、本明細書の製剤に添加することができる化合物である。防腐剤の添加は、例えば、多目的（複数回投与）製剤の製造を容易にし得る。
【００４１】
本明細書で一般に使用される「増量剤」は、凍結乾燥混合物に質量を加え、凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する化合物である（例えば、開孔構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケーキの製造を容易にする）。
【００４２】
「治療有効量」は、任意の症状または特有の状態または障害の測定可能な改善または予防をもたらすため、平均余命の測定可能な延長をもたらすため、または一般に患者の生活の質を改善するために必要な最小濃度である。治療有効量は、特定の生物学的に活性な分子および治療される特定の状態または障害に依存する。本明細書に記載のｍＡｂなどの多くのタンパク質の治療有効量は、当技術分野で周知である。まだ確立されていないタンパク質の治療有効量、または追加の障害を治療するために臨床的に適用されるmAbなどの既知のタンパク質で特定の障害を治療するための治療有効量は、医師などの当業者の技術の十分な範囲内にある標準的な技術によって決定し得る。
【００４３】
本明細書で一般に使用される用語「注入性（injectability）」または「注射針通過性（syringeability）」は、１８〜３２ゲージの針、任意に薄壁を具備した注射器を介した医薬製剤の注入性能を指す。注入性は、注射に必要な圧力または力、流れの均一性、吸引品質、および目詰まりのないことなどの要因に依存する。液体医薬製剤の注入性は、減粘度製剤の射出力を、粘度低減剤を添加していない標準製剤と比較することによって評価し得る。粘度低減剤を含む製剤の射出力の低下は、その製剤の改善された注入性を反映している。粘度低減剤をほぼ同じ濃度の適切な緩衝液で置き換えることを除いて、他の点では同じ条件下で同じ濃度のタンパク質を有する標準配合物と比較して、射出力が少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％低下したとき、減粘度製剤は改善された注入性を有する。あるいは、液体医薬製剤の注入性は、注射器が同じ力で押し下げられたときに、０．５ｍＬ、またはより好ましくは約１ｍＬなどの同じ容量の異なる液体タンパク質製剤を注射するのに必要な時間を比較することによって評価され得る。
【００４４】
本明細書で一般に使用される用語「射出力」は、所与の注射速度で所与の針ゲージを具備した所与の注射器を介して所与の液体製剤を押すのに必要な力を指す。射出力は典型的にはニュートンで報告される。例えば、射出力は、２５０ｍｍ／分の注射速度で０．５０−インチ２７−ゲージ針を具備した内径０．２５インチを有する１ｍＬプラスチック注射器を介して液体製剤を押すのに必要な力として測定し得る。試験装置を使用して、射出力を測定できる。同じ条件下で測定したとき、一般に粘度の低い製剤は全体的に低い射出力を必要とする。
【００４５】
本明細書で一般に使用される用語「減粘度製剤」は、粘度低減添加剤または薬剤を含まない対応する製剤と比較して、粘度を低下させるための１以上の添加剤の存在によって修飾された、高濃度のｍＡｂなどの高分子量タンパク質または低分子量タンパク質を有する液体製剤を指す。
【００４６】
本明細書で使用される用語「粘度低減剤」は、粘度低減剤が存在しない溶液の粘度と比較して、溶液の粘度を低下させるように作用する化合物を指す。粘度低減剤は、単一の化合物であってもよく、または１以上の化合物の混合物であってもよい。粘度低減剤が２以上の化合物の混合物であるとき、列挙されている濃度は、特に明記しない限り、それぞれ個々の薬剤を指す。例として、粘度低減剤として約０．２５Ｍのベンゼンスルホン酸メグルミンを含む製剤は、０．２５Ｍの濃度のベンゼンスルホン酸と、０．２５Ｍの濃度のメグルミンとを有する溶液である。
【００４７】
ある特定の粘度低減剤は、酸性または塩基性官能基を含み、親水性および疎水性領域を示すことがあり、これらは一緒になって、溶液のタンパク質を含むこととの相互作用特性に影響を与える。官能基が完全にまたは部分的にイオン化されているかどうかは、それらが入っている製剤のｐＨに依存する。特に明記しない限り、イオン化可能な官能基を有する粘度低減剤を含む配合物への言及は、親化合物および任意の可能なイオン化状態の両方を包含する。
【００４８】
本明細書で使用される用語「液体製剤」は、許容可能な医薬希釈剤中で供給されるタンパク質であるか、または患者に投与する前に許容可能な医薬希釈剤で再構成されるタンパク質である。
【００４９】
バイオシミラーは、微生物細胞（原核生物、真核生物）、ヒトまたは動物起源の細胞株（例えば、哺乳類、鳥類、昆虫）、または動物または植物に由来する組織によって産生することができる。提案されたバイオシミラー製品の発現コンストラクトは、一般に、その参照製品と同じ一次アミノ酸配列をコードする。安全性、純度、または効力に影響を及ぼさないＮ−またはＣ−末端の切断などのマイナーな変更は存在し得る。
【００５０】
バイオシミラーｍＡｂは、安全性および有効性の両方の点で、物理化学的または生物学的に参照ｍＡｂと類似している。バイオシミラーｍＡｂは、標的抗原への結合；Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩ）、ＦｃＲｎ、および補体（Ｃ１ｑ）のアイソフォームへの結合；Ｆａｂ関連機能（例えば、可溶性リガンドの中和、受容体の活性化または遮断）；またはＦｃ関連機能（例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、補体依存性細胞傷害、補体活性化）を詳細に調べるアッセイを含む１以上のインビトロ試験を使用して、参照ｍＡｂに対して評価できる。インビトロ比較は、薬物動態、薬力学、および／または安全性の類似性を実証するインビボデータと組み合わせることができる。参照ｍＡｂに対するバイオシミラーｍＡｂの臨床評価は、薬物動態特性の比較を（例えば、ＡＵＣ０−ｉｎｆ、ＡＵＣ０−ｔ、Ｃｍａｘ、ｔｍａｘ、Ｃｔｒｏｕｇｈ）；薬力学的エンドポイント；または臨床効果の類似性（例えば：ランダム化並行群間比較臨床試験を使用）を包含することができる。バイオシミラーｍＡｂと参照ｍＡｂ間の品質比較は確立された手順を使用して評価でき、「Guideline on similar biological medicinal products containing biotechnology-derived proteins as active substance: Quality issues」（EMEA / CHMP / BWP / 49348/2005）、および「Guideline on development, production, characterization and specifications for monoclonal antibodies and related substances」（EMEA / CHMP / BWP / 157653/2007）に記載のものを包含する。
【００５１】
バイオシミラーｍＡｂとリファレンスｍＡｂとの違いは、リン酸塩、様々な脂質および炭水化物などの他の生化学的グループをｍＡｂに付着させることによる；アミノ酸の化学的性質を変えることによる（例えば、ホルミル化）;または他の多くのメカニズムによる、翻訳後修飾を包含し得る。その他の翻訳後修飾は、製造プロセス操作の結果であり得る−例えば、生成物が還元糖にさらされると糖化が発生することがある。他の場合において、これらの生成物関連の変異体はすべてバイオシミラーｍＡｂに包含される可能性があるため、貯蔵条件は、酸化、脱アミド化、または凝集などのある特定の分解経路を許容し得る。
【００５２】
本明細書に使用されるとき、用語「薬学的に許容される塩」は、薬学的に許容される非毒性の酸および塩基から調製される塩を指し、無機酸および塩基、ならびに有機酸および塩基を包含する。
【００５３】
本明細書に使用されるとき、用語「アルキル基」は、直鎖、分枝鎖、および環状炭化水素基を指す。特に明記しない限り、用語アルキル基は、1以上の二重結合または三重結合を含む炭化水素基を包含する。少なくとも１つの環系を含むアルキル基は「シクロアルキル」基である。少なくとも１つの二重結合を含むアルキル基は「アルケニル基」であり、少なくとも１つの三重結合を含むアルキル基は「アルキニル基」である。
【００５４】
本明細書に使用される用語「アリール」は、縮合環系を包含する芳香族炭素環系を指す。「アリール」基において、環を形成する各原子は炭素原子である。
【００５５】
本明細書に使用されるとき、「ヘテロアリール」は、環を形成する原子の少なくとも１つがヘテロ原子である、縮合環系を包含する芳香族環系を指す。さらに、本明細書で使用される用語「複素環」は、縮合環系を包含し、芳香族ではなく、環を形成する原子の少なくとも１つがヘテロ原子である環系を指す。
【００５６】
本明細書で使用される用語「ヘテロ原子」は、任意の非炭素または非水素原子である。好ましいヘテロ原子は、酸素、硫黄、および窒素を包含する。
【００５７】
製剤
生体適合性のある低粘度のタンパク質溶液、ｍＡｂのものなどは、皮下（ＳＣ）および筋肉内（ＩＭ）注射に有用な量の治療有効量のタンパク質を送達できる、典型的にはＳＣに対して約２ｍｌ以下およびＩＭに対して約５ｍｌ以下、より好ましくはＳＣに対して約１ｍｌ以下およびＩＭに対して約３ｍｌ以下。いくつかの態様においては高分子量タンパク質が好ましいが、タンパク質は一般に任意の分子量を有することができる。他の態様において、タンパク質は低分子量タンパク質である。
【００５８】
ここで、本発明は、治療用タンパク質と、粘度を低下させる量の、メグルミン、オルニチン、カルニチン、ベンゼンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム、グルコン酸、グルクロン酸、アミノカプロン酸およびコハク酸塩またはそれらの混合物から選択される賦形剤とをタンパク質溶液と等モル量で組み合わせることにより、治療用タンパク質の液体医薬製剤の粘度を低下させる、および／または安定性を改善する方法を提供する。溶液のｐＨ値、タンパク質溶液の濃度、タンパク質の性質、添加された賦形剤の結果として生じる濃度、およびその（それらの）化学的性質に応じて、粘度低下効果は変化する。
【００５９】
特に、トルエンスルホン酸およびベンゼンスルホン酸から選択される対イオンの１つと一緒のメグルミン混合物およびオルニチンの混合物が、例えば（ｍＡｂＡおよびｍＡｂＢ）の溶液に、等モル量で濃縮タンパク質溶液に添加される場合、特に良好な粘度低下が達成された。
【００６０】
予期せぬことに、アミノ酸オルニチン、ならびにｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムおよびベンゼンスルホン酸から選択される負に帯電した対イオンと組み合わせたカチオン性アミノ−糖メグルミンの混合物が、特定の等モル混合物として、モノクローナル抗体または融合タンパク質の高濃度タンパク質液体製剤の粘度を有意に低下させることが実験によって見出された。
【００６１】
例示的な態様において、治療用タンパク質は、上述のとおり高タンパク質濃度である。いくつかの態様において、粘度の低下は、粘度低下剤溶液の代わりに緩衝液をタンパク質溶液に同量で添加した対照製剤と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％または７０％である。
【００６２】
例示的な態様において、治療用タンパク質は、上述のとおり少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは７５ｍｇ／ｍｌより大きい、より好ましくは１００ｍｇ／ｍｌより大きい高タンパク質濃度である。本明細書で試験され、開示された製剤のタンパク質濃度は、１５０〜２８０ｍｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの態様において、粘度の低下は対照製剤と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％である。
【００６３】
別の側面において、本発明は、治療用タンパク質と、メグルミン、オルニチン、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム、およびベンゼンスルホン酸またはそれらの混合物からなる群から選択される賦形剤とを含む液体溶液を提供し、ここで該製剤は対照製剤と比較して低下した粘度を表す。例示的な態様において、治療用タンパク質は、上述のとおり高タンパク質濃度であり、本明細書に記載の賦形剤は、粘度を低下させる（重量：体積）濃度で存在する。これらの賦形剤はいずれも、溶解限度までの濃度で使用できる。かかる溶液は、粘度を有意に増加させることなく、安定性をさらに改善し、凝集を低減し、および／または配合物を等張にするのに有効な量の他の添加剤をさらに含んでもよい。
【００６４】
さらなる態様において、メグルミン、オルニチン、カルニチン、ベンゼンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム、グルコン酸、グルクロン酸、アミノカプロン酸およびコハク酸塩またはそれらの混合物からなる群から選択される賦形剤の濃度は、少なくとも約５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、または少なくとも約１００ｍＭ〜約２５０ｍＭ、または少なくとも約１４０ｍＭ〜約２００ｍＭである。例示的な態様において、賦形剤の濃度は、少なくとも約５０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２５０または３００ｍＭ以上である。他の例示的な態様は、粘度を有意に増加させることなく、製剤を等張にするのに有効な賦形剤の濃度を包含する。例示的な濃度は、少なくとも約１５０ｍＭ以上の濃度を包含し、さらなる態様においては、量は少なくとも約１７０ｍＭ以上である。
【００６５】
別の側面において、本発明は、治療用タンパク質と、メグルミン、オルニチン、カルニチン、ベンゼンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム、グルコン酸、グルクロン酸、アミノカプロン酸およびコハク酸塩またはそれらの混合物からなる群から選択される賦形剤とを含む凍結乾燥タンパク質製剤を提供し、ここで該製剤は、推奨量の希釈剤で再構成すると、対照製剤と比較して低下した粘度を示す。例示的な態様において、治療用タンパク質は、上述のとおり高タンパク質濃度である。いくつかの態様において、賦形剤は、希釈剤で再構成したときに粘度を低下させるのに有効な量で存在する（重量：重量濃度）。かかる製剤は、粘度を有意に増加させることなく、安定性をさらに改善し、凝集を低減し、および／または配合物を等張にするのに有効な量の他の添加剤をさらに含んでもよい。
【００６６】
例示的な態様において、メグルミン、オルニチン、カルニチン、ベンゼンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム、グルコン酸、グルクロン酸、アミノカプロン酸およびコハク酸塩またはそれらの混合物からなる群から選択される賦形剤の濃度は、治療用タンパク質１ｍｇあたり少なくとも約１μｇ、治療用タンパク質１ｍｇあたり約１．０ｍｇまでである。いくつかの態様において、賦形剤の濃度は、治療用タンパク質１ｍｇあたり少なくとも約１、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００または５５０μｇである。他の例示的な態様において、賦形剤の濃度は、治療用タンパク質１ｍｇあたり約６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００μｇまでである。
【００６７】
さらに別の態様において、本発明は、メグルミン、オルニチン、カルニチン、ベンゼンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム、グルコン酸、グルクロン酸、アミノカプロン酸およびコハク酸塩またはそれらの混合物を、本明細書に記載のいずれかの量または濃度の賦形剤として使用することにより、液体製剤中のタンパク質の自己会合を防止する方法を提供する。安定性および貯蔵寿命が改善された（例えば、凝集が減少した）製剤も提供される。
【００６８】
本発明はまた、本発明の液体タンパク質製剤と、その投与のための指示書とを、任意に容器、注射器および／または他の投与装置と一緒に含むキットを提供する。本発明はさらに、本発明の凍結乾燥タンパク質製剤と（任意に容器中）、その再構成および投与のための指示書とを、任意に滅菌希釈剤のバイアル、および任意に注射器または他の投与装置と一緒に含むキットを提供する。例示的な容器は、バイアル、チューブ、ボトル、シングルまたはマルチチャンバーのプレフィルドシリンジ、またはカートリッジを包含するが、ウェル内に置かれたすぐに使用できる凍結乾燥製剤または噴霧乾燥製剤を含む９６ウェルプレートも包含する。例示的な投与装置は、針の有無にかかわらず注射器、注入ポンプ、ジェット注射器、ペン装置、経皮注射器、または他の無針注射器を包含する。
【００６９】
本発明の別の側面は、以下の工程：（１）第１の濃度のメグルミン、オルニチン、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム、ベンゼンスルホン酸、グルコン酸、グルコロン酸、アミノカプロン酸、カルニチン、およびコハク酸塩またはそれらの混合物からなる群から選択される賦形剤を含む第１の溶液の粘度を評価する工程、（２）異なる第２の濃度の賦形剤および治療用タンパク質を含む第２の溶液の粘度を評価する工程、および（３）第１の溶液の粘度が低い場合、第１の濃度の賦形剤は、第２の濃度の賦形剤よりも粘度が低下していると決定する工程、を含む、賦形剤の粘度低下濃度をスクリーニングするための方法を提供することである。粘度は、例えば、m-VROC（商標）テクノロジーレオメーター（RheoSense、サンラモン、カリフォルニア、米国）またはAriesARG2cまたはBrookfieldRV-DVIIIレオメーターを使用して決定することができる。
【００７０】
凝集を減少させるまたは安定化する賦形剤の濃度をスクリーニングするために、同様の方法が提供される。
【００７１】
安定性は多くの方法で評価でき、温度範囲にわたって（熱安定性）および／または期間（貯蔵寿命）および／またはストレスの多い取り扱い状況（物理的な揺れなど）にさらされた後、構造変化をモニタリングすることを包含する。さまざまな濃度の製剤成分を含む製剤の安定性は、さまざまな方法を使用して測定できる。例えば、タンパク質凝集の量は、濁度の視覚的観察、特定の波長での吸光度の測定、サイズ排除クロマトグラフィー（タンパク質の凝集体が本来の活性状態のタンパク質と比較して異なる画分に溶出する）、ＨＰＬＣ、またはその他のクロマトグラフィー法によって測定できる。構造変化を測定する他の方法を使用することができ、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、例えば変性の温度を決定するために、またはタンパク質のモル楕円率を測定する円二色性（ＣＤ）を使用することを包含する。蛍光もまた組成を分析するために使用することができる。蛍光は、光または熱の形でのエネルギーの放出または吸収、および光の極性特性の変化を包含する。蛍光発光はタンパク質に固有であることもあれば、蛍光レポーター分子に起因することもあり、例えば、部分的に折りたたまれていないタンパク質の疎水性ポケットに結合する。レポーター分子の結合の増加は、タンパク質サンプルの蛍光シグナルを検出することでモニターできる。安定性を測定するための他の手段を使用することができ、当業者によく知られている。
【００７２】
実施した実験において、まず、メグルミン、オルニチン、カルニチン、ベンゼンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム、グルコン酸、グルクロン酸、アミノカプロン酸およびコハク酸塩のみの粘度低減能を６種類の抗体（ｍＡｂＡ、ｍＡｂＢ、ｍＡｂＣ（ＩｇＧ２）、ｍＡｂＤ、ｍＡｂＥ、ｍＡｂＦ）と１つの融合タンパク質（ＦｕｓｉｏｎＡ）とを組み合わせて試験する。タンパク質の濃度は、９８ｍｇ／ｍｌまたは９９ｍｇ／ｍｌまたは１７３ｍｇ／ｍｌまたは１７７ｍｇ／ｍｌまたは２００ｍｇ／ｍｌまたは２２０ｍｇ／ｍｌまたは２６０ｍｇ／ｍｌまたは２７０ｍｇ／ｍｌのいずれかに調整されて、高粘度レベルを作りだす。
【００７３】
すでに上で述べたとおり、これらの製剤のｐＨ値は、それらの有効性およびそれぞれの薬学的に活性なタンパク質の有用性にとって特に重要である。したがって、調査されるタンパク質製剤のｐＨは、約４．５〜約８．０の間の範囲に調整されることが望ましい。含まれるタンパク質またはペプチドの性質に応じて、ｐＨ値は、好ましくは、約４．６〜約５．４の間の範囲、または約５．４〜約７．９の間の範囲に調整される。ｐＨを調整するために使用される緩衝液は、好ましくは、ｐＨ５の酢酸緩衝液（２５ｍＭ）およびｐＨ７のリン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭ）である。しかしながら、必要ならば、含まれる薬学的に活性なタンパク質と適合性があり、および生理学的に許容される、別の緩衝液を使用することができる。
【００７４】
粘度低減剤の濃度は、５０ｍＭから５００ｍＭの間の範囲で調整される（例１Ａ〜Ｅ）。チップベースの（微小電気機械システム）キャピラリーレオメーター、m-VROC（商標）（RheoSence、サンラモン、カリフォルニア）を用いて、力学的粘度を測定した。一般に、絶対粘度（絶対粘度係数）とも呼ばれる力学的粘度は、高濃度溶液内のタンパク質分子の自己会合によって決定できる内部抵抗の尺度である。
【００７５】
決定された粘度は、メグルミン、オルニチン、カルニチン、ベンゼンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム、グルコン酸、グルクロン酸、アミノカプロン酸およびコハク酸塩のみを、ある特定の濃度で、特定の抗体または融合タンパク質と一緒に適用すると、高濃度タンパク質溶液の粘度の測定可能な有意な低下をもたらすことを明確に示している。
【００７６】
しかしながら、特に予期せぬことに、実験は、メグルミン、オルニチン、またはカルニチンと、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、グルコン酸、グルクロン酸、アミノカプロン酸、コハク酸塩から選択される対イオンとを組み合わせて添加すると、有意により大きい粘度の低下につながることを示している。
【００７７】
すでに指摘したように、とりわけトルエンスルホン酸およびベンゼンスルホン酸、グルコン酸、グルクロン酸、アミノカプロン酸およびコハク酸塩から選択される対イオンの１つと一緒のメグルミンの混合物またはオルニチンの混合物を、等モル量で濃縮タンパク質溶液、例えば（ｍＡｂＡおよびｍＡｂＢ）の溶液、に添加する場合、特に良好な粘度低下が達成される。
【００７８】
さらなる実験において、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム、ベンゼンスルホン酸、グルコン酸、グルクロン酸、アミノカプロン酸またはコハク酸を負の対イオンとして組み合わせた、カチオン性アミノ糖メグルミンまたはアミノ酸オルニチンまたはカルニチンのいずれかの混合物の、高濃度抗体溶液（ｍＡｂＡおよびｍＡｂＢ）の粘度を低下させる可能性を調査した。
【００７９】
さらなる実験において、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムまたはベンゼンスルホン酸を負に帯電した対イオンとして組み合わせた、カチオン性アミノ糖メグルミンまたはアミノ酸オルニチンのいずれかの混合物の、高濃度抗体溶液（ｍＡｂＡおよびｍＡｂＢ）の粘度を低下させる可能性を調査した。これらの各研究について、等モル量のこれらの賦形剤の混合物を加えた。ここでは、１５０ｍＭの濃度で特に良好な結果が見られた（例２Ａ〜Ｃ）。
【００８０】
すべてのモデル抗体は、ｐＨ７の１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水中、約１００ｍｇ／ｍｌ、一部は約１５０ｍｇ／ｍｌ、とりわけ２００ｍｇ／ｍｌより大きい、および特に２２０ｍｇ／ｍｌ（ｍＡｂＢ）および２７０ｍｇ／ｍＬ（ｍＡｂＡ）のかなり高い濃度で配合した。チップベースの（微小電気機械システム）キャピラリーレオメーター、m-VROC（商標）（RheoSence、サンラモン、ァリフォルニア）を用いて粘度を測定した。
【００８１】
すべての場合において、カチオン性アミノ糖メグルミンまたはアミノ酸オルニチンと、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムまたはベンゼンスルホン酸のような負に帯電した対イオンとの１５０ｍＭの濃度の、特定の等モル混合物が、高濃度の抗体溶液で測定された粘度の有意な低下を示す。
【００８２】
メグルミンおよびＬ−オルニチン塩酸塩の粘度低減能を、３つの異なるタイプの抗体（キメラＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒト化ＩｇＧ４）を含む濃縮溶液で試験する。これらの溶液の平均濃度は、９９ｍｇ／ｍｌ、１７３ｍｇ／ｍｌ、または１７７ｍｇ／ｍｌであった。
【００８３】
実験において、両方の賦形剤が、それぞれ１５０ｍＭの濃度でタンパク質溶液に添加されたときに、抗体製剤の粘度を有意に低下できることがわかった。
【００８４】
また、ｍＡｂＤがタンパク質として含まれている溶液において、各１５０ｍＭのｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムおよびベンゼンスルホン酸の添加は、粘度の有意な低下を引き起こす。
【００８５】
さらにまた、ｍＡｂＤ−含有溶液への１５０ｍＭＤ−グルコン酸ナトリウム塩の添加は粘度の低減につながる。Ｌ−オルニチン塩酸塩またはメグルミンとｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムまたはベンゼンスルホン酸との等モルの組み合わせの使用は、高濃度抗体溶液（ｍＡｂＤおよびｍＡｂＥ）の粘度を著しく減らした。加えて、実施された実験によって示されるように、本明細書で言及された助剤の他の様々な組み合わせは、高濃度抗体溶液の粘度を低下させる。  したがって、ここで言及されている賦形剤の組み合わせは網羅的ではなく、対応する結果につながる他の可能な組み合わせがある。
【００８６】
実験はまた、ここで言及された賦形剤の添加からもたらされるさらなる有利な効果を示した。通常、数週間の貯蔵期間後でも確実な効果を得るために薬剤製剤で使用されているため、適切な貯蔵実験を実施し、タンパク質の安定性を確認した。
【００８７】
例えば、モノマーの量で示されるｍＡｂＤの安定性は、１５０ｍＭメグルミン、１５０ｍＭＬ−オルニチン塩酸塩、または各７５ｍＭのＬ−オルニチン塩酸塩とｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムの等モルの組み合わせの添加により、加速安定性試験中に改善することができる。
【００８８】
この点に関して、様々なタンパク質溶液の粘度を低減させる試みは、特定の溶液に含まれるタンパク質に応じて、異なる添加剤が最良の安定化および粘度の低下をもたらすことを示した。
【００８９】
これに関連して、タンパク質ｍＡｂＤに対する最良の製剤は５ｍＭリン酸緩衝液、１４６ｍＭスクロース、０．０５ｇ／Ｌポリソルベート８０、７５ｍＭＬ−オルニチン塩酸塩、および７５ｍＭｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム−を含み、ミリＱ水に溶解して、ｐＨ７．２に調整した組成物である。
【００９０】
次にＭＡｂＥに対する最良の製剤は、２０ｍＭ酢酸緩衝液、０．１ｇ／Ｌポリソルベート８０、１５０ｍＭメグルミンを含み、ミリＱ水に溶解してｐＨ５．０に調整した組成物、およびＭＡｂＦに対する最良の製剤は２０ｍＭ酢酸緩衝液、２０５ｍＭスクロース、７５ｍＭメグルミン、７５ｍＭＤ−グルコン酸ナトリウム塩を含み、ミリＱ水に溶解し、ｐＨ５．５に調整した組成物である。
【００９１】
好ましい態様：
本発明の特に好ましい態様は、メグルミン、オルニチン、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム、ベンゼンスルホン酸、グルコン酸、グルコロン酸、アミノカプロン酸、カルニチン、およびコハク酸塩からなる群から選択される賦形剤を、上述の高濃度タンパク質溶液に、粘度低下のために、単独でまたは組み合わせて添加することにある。特に好ましくは、対イオンとしてベンゼンスルホン酸またはｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムのどちらかと組み合わせたメグルミンの添加が、良好な粘度低下につながる。本発明の別の好ましい態様において、対イオンとしてベンゼンスルホン酸またはｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムと組み合わせたオルニチンもまた、良好な粘度低下につながる。したがって、濃縮タンパク質溶液の粘度低下は、メグ＞メグ−ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム＞ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム＞ベンゼンスルホン酸＞オルニチン＞これらの賦形剤の他のすべての組み合わせが好ましい。
【００９２】
溶液調製物の配合および凍結乾燥は、上述の方法および以下の例に開示される方法によって実施することができる。
【００９３】
本記載は、当業者が本発明を包括的に実施することを可能にする。したがって、さらなるコメントがなくても、当業者は、上の記載を最も広い範囲で利用することができると想定される。
【００９４】
本発明は好ましい態様に関連して記載されてきたが、添付される請求項に定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者によって本発明に様々な修正、追加および変更を行うことができることが理解されるべきである。
【００９５】
不明な点がある場合は、引用され、および当業者に知られている出版物および特許文献を参考にすべきであることが理解される。したがって、引用された文書は、本説明の開示内容の一部と見なされ、参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】例１Ａ）２５ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０中に配合した高濃度ｍＡｂＡ溶液（２６０ｍｇ／ｍｌ）における、メグルミン、Ｌ−オルニチン塩酸塩およびｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムの粘度低下効果
【図２】例１Ｂ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．０中に配合した高濃度ｍＡｂＡ溶液（２６０ｍｇ／ｍＬ）における、メグルミン、Ｌ−オルニチン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムおよびベンゼンスルホン酸の粘度低下効果
【図３】例１Ｃ）ＰＢＳｐＨ７．０中に配合した高濃度ｍＡｂＢ溶液（２００ｍｇ／ｍＬ）における、メグルミン、Ｌ−オルニチン塩酸塩およびｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムの粘度低下効果。
【図４】例１Ｄ）リン酸緩衝液ｐＨ７中に２６０ｍｇ／ｍＬ（＋／−２．７％）で配合した高濃度ｍＡｂＣ溶液に対するメグルミン、Ｌ−オルニチン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムおよびベンゼンスルホン酸の粘度低下効果
【図５】例１Ｅ）リン酸緩衝液ｐＨ７中に２００ｍｇ／ｍＬ（＋／−５．０％）で配合した融合Ａに対するメグルミン、Ｌ−オルニチン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムおよびベンゼンスルホン酸の粘度低下効果
【図６】例２Ａ）ＰＢＳｐＨ７．０中に配合した高濃度ｍＡｂＡ溶液（２７０ｍｇ／ｍｌ）における、累積濃度１５０ｍＭの賦形剤メグルミンとベンゼンスルホン酸（１：１）、メグルミンとｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム（１：１）の組み合わせの粘度低下効果
【図７】例２Ｂ）ＰＢＳｐＨ７．０中に配合した高濃度ｍＡｂＡ溶液（２７０ｍｇ／ｍｌ）における、累積濃度１５０ｍＭの賦形剤Ｌ−オルニチン塩酸塩とベンゼンスルホン酸（１：１）、Ｌ−オルニチン塩酸塩とｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム（１：１）の組み合わせの粘度低下効果
【図８】例２Ｃ）ＰＢＳｐＨ７．０中に配合した高濃度ｍＡｂＢ溶液（２２０ｍｇ／ｍＬ）における、賦形剤Ｌ−オルニチン塩酸塩とベンゼンスルホン酸（１：１）、Ｌ−オルニチン塩酸塩とｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム（１：１）、メグルミンとベンゼンスルホン酸（１：１）、メグルミンとｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム（１：１）の組み合わせの粘度低下効果
【図９】例３）リン酸緩衝液ｐＨ７．２中に配合した高濃度ｍＡｂＤ溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）における、賦形剤メグルミンとグルコン酸（１：１）、メグルミングルクロシン酸（１：１）、オルニチンとグルコン酸（１：１）、オルニチングルコルシン酸（１：１）の組み合わせの粘度低下効果
【図１０】例４に記載されているとおりの、ポリソルベート８０を含む酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中の各賦形剤について７５ｍＭの等モル濃度の２つの賦形剤の組み合わせを含む溶液での１７０ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈されたｍＡｂＥの濃縮タンパク質溶液の粘度低下効果。
【図１１】例３に記載されているとおりの、スクロースおよびポリソルベート８０を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）中の各賦形剤について７５ｍＭの等モル濃度の２つの賦形剤の組み合わせを含む溶液での１００ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈されたｍＡｂＤの濃縮タンパク質溶液の粘度低下効果。
【図１２】例４に記載されているとおりの、ポリソルベート８０を含む酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中の各賦形剤について７５ｍＭの等モル濃度の２つの賦形剤の組み合わせを含む溶液での１７０ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈されたｍＡｂＥの濃縮タンパク質溶液の粘度低下効果
【図１３】例５に記載されているとおりの、スクロースを含む酢酸緩衝溶液（ｐＨ５．５）中の各賦形剤について７５ｍＭの等モル濃度の２つの賦形剤の組み合わせを含む溶液での約１８０ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈されたｍＡｂＦの濃縮タンパク質溶液の粘度低下効果
【図１４】さまざまな添加剤の存在下での２５°Ｃおよび６０％ＲＨでのｍＡｂＤの１２週間にわたる安定性試験。（略語：ＭＧ＝メグルミン；ＯＭ＝Ｌ−オルニチン一塩酸塩；ＮＴＳ＝ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム；ｗ／ｏ＝なし、これは賦形剤なしの市場配合物を意味する）
【００９７】
よりよく理解するために、および本発明を説明するために、本発明の保護の範囲内にある例を下に提示する。これらの例は、可能なバリアントを説明するのにも役立つ。
【００９８】
さらにまた、当業者には言うまでもなく、所与の例および記載の残りの部分の両方において、組成物中に存在する成分量は、全体としての組成に基づいて、常に合計１００重量％またはモル％まで添加され、表示されたパーセント範囲からより高い値が発生する場合でも、このパーセンテージを超えることはできない。したがって、別様に明記しない限り、％データは、体積データに示されている比率を除いて、重量％またはモル％である。
【００９９】
例
例１：  高濃度タンパク質溶液中のメグルミン、Ｌ−オルニチン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムおよびベンゼンスルホン酸の粘度低下効果
−例１Ａ）  ２６０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度でのｍＡｂＡの粘度は、メグルミン、Ｌ−オルニチン塩酸塩、およびｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムによって有意に低減されるが、５０ｍＭのベンゼンスルホン酸では低下しない。
−例１Ｂ）  緩衝液およびｐＨの環境変化のため、ｍＡｂＡの粘度もまた、賦形剤としてのベンゼンスルホン酸（１５０ｍＭ）によって有意に低下する。
−例１Ｃ）  ２００ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度でのｍＡｂＢの粘度は、５００ｍＭのメグルミン、Ｌ−オルニチン塩酸塩、およびｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムによって有意に低下した粘度を示している。
−例１Ｄ）  ｍＡｂＣについて、賦形剤ベンゼンスルホン酸は１５０ｍＭで明確な粘度低下効果を表す。調査した他の賦形剤についても、低下効果が見られた。
−例１Ｅ）  融合タンパク質「融合Ａ」について、すべての賦形剤に対してわずかな粘度低下効果しか見られなかった。ベンゼンスルホン酸だけが５０ｍＭの濃度でより強力な低下を示す。
【０１００】
例１Ａ）  図１に示される、２５ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０中に配合した高濃度ｍＡｂＡ溶液（２６０ｍｇ／ｍｌ）における、メグルミン、Ｌ−オルニチン塩酸塩およびｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムの粘度低下効果。
緩衝液調製：
−２５ｍＭ酢酸ナトリウム三水和物および２５ｍＭ氷酸をミリＱ水に溶解し、必要ならば、ＨＣｌまたはＮａＯＨを使用してｐＨを５．０（±０．１）に調整した。
【０１０１】
試料調製：
−５０ｍＭのメグルミン、Ｌ−オルニチン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム、およびベンゼンスルホン酸の賦形剤溶液を、２５ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０中に調製した。必要ならば、ＨＣｌまたはＮａＯＨを使用してｐＨを調整した。
−関連する賦形剤を含む濃縮ｍＡｂＡ溶液は、超遠心フィルター（３０ｋＤａＭＷＣＯ）で緩衝液と上記の関連する賦形剤溶液とを交換すること、および溶液の量を低下させてタンパク質を濃縮することにより調製した。その後、濃縮タンパク質溶液を、上記の適切な賦形剤溶液を使用して２６０ｍｇ／ｍｌに希釈した。
【０１０２】
粘度測定：
−粘度測定には、m-VROCTM(商標)Technology（RheoSense、サンラモン、カリフォルニア、米国）を使用した。
測定は、５００μｌシリンジおよび５０００ｓ−１のせん断速度を使用して行った。必要なサンプル量は２００μｌであり、試料は３回試験した。
【０１０３】
例１Ｂ）  図２に示される、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．０中に配合した高濃度ｍＡｂＡ溶液（２６０ｍｇ／ｍＬ）における、メグルミン、Ｌ−オルニチン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムおよびベンゼンスルホン酸の粘度低下効果。
緩衝液調製：
−緩衝液は、ミリＱ水に溶解した０．０１Ｍリン酸緩衝液、０．００２７Ｍ塩化カリウム、および０．１３７Ｍ塩化ナトリウムを含んでいた。必要ならば、ＨＣｌまたはＮａＯＨを使用してｐＨを７．０（±０．１）に調整した。
【０１０４】
試料調製：
−１５０ｍＭのメグルミン、Ｌ−オルニチン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムおよびベンゼンスルホン酸の賦形剤溶液をＰＢＳｐＨ７．０中に調製した。必要ならば、ＨＣｌまたはＮａＯＨを使用してｐＨを調整した。
−関連する賦形剤を含む濃縮ｍＡｂＡ溶液は、超遠心フィルター（３０ｋＤａＭＷＣＯ）で緩衝液と上記の関連する賦形剤溶液とを交換すること、および溶液の量を低下させてタンパク質を濃縮することにより調製した。その後、濃縮タンパク質溶液を、上記の適切な賦形剤溶液を使用して２６０ｍｇ／ｍｌに希釈した。
粘度測定は、例１Ａ）に記載されているとおりに行った。
【０１０５】
例１Ｃ）  図３に示される、ＰＢＳｐＨ７．０中に配合した高濃度ｍＡｂＢ溶液（２００ｍｇ／ｍＬ）における、メグルミン、Ｌ−オルニチン塩酸塩およびｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムの粘度低下効果。
緩衝液調製：
−緩衝液の調製は、例１Ｂ）に記載されているとおりに行った。
試料調製：
−５００ｍＭのメグルミン、Ｌ−オルニチン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムおよびベンゼンスルホン酸の賦形剤溶液をＰＢＳｐＨ７．０中に調製した。必要ならば、ＨＣｌまたはＮａＯＨを使用してｐＨを調整した。
−関連する賦形剤を含む濃縮ｍＡｂＢ溶液は、超遠心フィルター（３０ｋＤａＭＷＣＯ）で緩衝液と上記の関連する賦形剤溶液とを交換すること、および溶液の量を低下させてタンパク質を濃縮することにより調製した。その後、濃縮タンパク質溶液を、上記の適切な賦形剤溶液を使用して２００ｍｇ／ｍｌに希釈した。
粘度測定は、例１Ａ）に記載されているとおりに行った。
【０１０６】
例１Ｄ）  図４に示される、リン酸緩衝液ｐＨ７中に２６０ｍｇ／ｍＬ（＋／−２．７％）で配合した高濃度ｍＡｂＣ溶液に対するメグルミン、Ｌ−オルニチン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムおよびベンゼンスルホン酸の粘度低下効果。
緩衝液調製：
−１００ｍＭリン酸ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウムおよび１３７ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液を調製した。
試料調製：
−１５０ｍＭのメグルミン、Ｌ−オルニチン、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムおよびベンゼンスルホン酸の賦形剤溶液をリン酸緩衝液中に調製した。ｐＨ値を確認し、必要ならば、塩酸または水酸化ナトリウムを使用して７．０（±０．１）に調整した。
−７１ｍｇ／ｍｌのｍＡｂＣ（約１４７ｋＤａ）のタンパク質溶液を洗浄し、１５０ｍＭの対応する賦形剤を含むリン酸緩衝液ｐＨ７で濃縮した。
−洗浄およびｍＡｂＣの２６０ｍｇ／ｍｌまでの濃縮は、３０ｋＤａＭＷＣＯを備えた超遠心フィルターユニットを使用して行った。
ｍＶＲＯＣ法は、例１Ａ）に記載されているとおりに行った。
【０１０７】
例１Ｅ）  図５に示される、リン酸緩衝液ｐＨ７中に２００ｍｇ／ｍＬ（＋／−５．０％）で配合した融合Ａに対するメグルミン、Ｌ−オルニチン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムおよびベンゼンスルホン酸の粘度低下効果。
緩衝液調製：
−１００ｍＭリン酸ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウムおよび１３７ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液を調製した。
試料調製：
−５０ｍＭのメグルミン、Ｌ−オルニチン、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムおよびベンゼンスルホン酸の賦形剤溶液をリン酸緩衝液中に調製した。ｐＨ値を確認し、必要ならば、塩酸または水酸化ナトリウムを使用して７．０（±０．１）に調整した。
−５０ｍｇ／ｍｌの融合Ａ（約５１ｋＤａ）のタンパク質溶液を洗浄し、３００ｍＭの対応する賦形剤を含むリン酸緩衝液ｐＨ７で濃縮した。
−洗浄およびｍＡｂＤの２００ｍｇ／ｍｌまでの濃縮は、２，０００×ｇで３０ｋＤａＭＷＣＯを備えた超遠心フィルターユニットを使用して行った。
ｍＶＲＯＣ法は、例１Ａ）に記載されているとおりに行った。
【０１０８】
例２  高濃度タンパク質溶液中の２つの賦形剤（メグルミン、Ｌ−オルニチン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムおよびベンゼンスルホン酸）の組み合わせの粘度低下効果
−例２Ａ）は、メグルミンとベンゼンスルホン酸またはメグルミンとｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム（それぞれがＰＢＳｐＨ７中に７５ｍＭで存在する）の組み合わせを使用した、２７０ｍｇ／ｍｌ（＋／−２．６％）の濃度のｍＡｂＡの粘度低下を示す。
−例２Ｂ）は、Ｌ−オルニチン塩酸塩とベンゼンスルホン酸（両方とも緩衝液中に７５ｍＭで存在する）の賦形剤の組み合わせを使用した、ｍＡｂＡに対するより強力な粘度低下効果を表す。Ｌ−オルニチン塩酸塩とｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムの組み合わせも低下効果を有する。
−例２Ｃ）は、調査された賦形剤のすべての組み合わせについて、ｐＨ７でＰＢＳ緩衝液中、２２０ｍｇ／ｍｌの濃度のｍＡｂＢの粘度の明らかな低下を示す。最も大きな影響は、メグルミンとｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム（両方とも７５ｍＭ）の組み合わせにより引き起こされ、ＰＢＳ中、純粋なｍＡｂＢの粘度が１２５ｍＰａ＊ｓから３７．７ｍＰａ＊ｓに低下した。
【０１０９】
例２Ａ）  図６に示される、ＰＢＳｐＨ７．０中に配合した高濃度ｍＡｂＡ溶液（２７０ｍｇ／ｍｌ）における、累積濃度１５０ｍＭの賦形剤メグルミンとベンゼンスルホン酸（１：１）、メグルミンとｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム（１：１）の組み合わせの粘度低下効果。
緩衝液調製：
−緩衝液の調製は、例１Ｂ）に記載されているとおりに行った。
試料調製：
−７５ｍＭメグルミンと７５ｍＭベンゼンスルホン酸または７５ｍＭｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムとを含む賦形剤溶液をＰＢＳｐＨ７．０中に調製した。必要ならば、塩酸または水酸化ナトリウムを使用してｐＨを調整した。
−関連する賦形剤の組み合わせを含む濃縮ｍＡｂＡ溶液は、超遠心フィルター（３０ｋＤａＭＷＣＯ）で緩衝液と上記の賦形剤の組み合わせとを交換すること、および溶液の量を低下させてタンパク質を濃縮することにより調製した。その後、濃縮タンパク質溶液を、上記の適切な賦形剤の組み合わせ溶液を使用して２７０ｍｇ／ｍｌに希釈した。
粘度測定は例１Ａ）に記載されているとおりに行った。
【０１１０】
例２Ｂ）  図７に示される、ＰＢＳｐＨ７．０中に配合した高濃度ｍＡｂＡ溶液（２７０ｍｇ／ｍｌ）における、累積濃度１５０ｍＭ賦形剤Ｌ−オルニチン塩酸塩とベンゼンスルホン酸（１：１）、Ｌ−オルニチン塩酸塩とｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム（１：１）の組み合わせの粘度低下効果。
緩衝液調製：
−緩衝液の調製は、例１Ｂ）に記載されているとおりに行った。
試料調製：
−７５ｍＭＬ−オルニチン塩酸塩と７５ｍＭベンゼンスルホン酸または７５ｍＭｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムとを含む賦形剤溶液をＰＢＳｐＨ７．０中に調製した。必要ならば、塩酸または水酸化ナトリウムを使用してｐＨを調整した。
−残りの試料調製備は例２Ａ）に記載されているとおりに行った。
粘度測定は例１Ａ）に記載されているとおりに行った。
【０１１１】
例２Ｃ）  図８〜１０に示される、ＰＢＳｐＨ７．０中に配合した高濃度ｍＡｂＢ溶液（２２０ｍｇ／ｍＬ）における、賦形剤Ｌ−オルニチン塩酸塩とベンゼンスルホン酸（１：１）、Ｌ−オルニチン塩酸塩とｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム（１：１）、メグルミンとベンゼンスルホン酸（１：１）、メグルミンとｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム（１：１）の組み合わせの粘度低下効果。
緩衝液調製：
−緩衝液の調製は、例１Ｂ）に記載されているとおりに行った。
試料調製：
−７５ｍＭＬ−オルニチン塩酸塩と７５ｍＭベンゼンスルホン酸、７５ｍＭＬ−オルニチン塩酸塩と７５ｍＭｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム、７５ｍＭメグルミンと７５ｍＭベンゼンスルホン酸、７５ｍＭメグルミンと７５ｍＭｐ−トルエンスルホン酸ナトリウムの賦形剤溶液をＰＢＳｐＨ７．０中に調製した。必要ならば、塩酸または水酸化ナトリウムを使用してｐＨを調整した。
−関連する賦形剤の組み合わせを含む濃縮ｍＡｂＢ溶液は、超遠心フィルター（３０ｋＤａＭＷＣＯ）で緩衝液と上記の賦形剤の組み合わせとを交換すること、および溶液の量を低下させてタンパク質を濃縮することにより調製した。その後、濃縮タンパク質溶液を、上記の適切な賦形剤の組み合わせ溶液を使用して２２０ｍｇ／ｍＬに希釈した。
粘度測定は例１Ａ）に記載されているとおりに行った。
【０１１２】
例３
緩衝液調製：
緩衝液はミリＱ水に溶解した５ｍＭリン酸緩衝液、１４６ｍＭスクロース、０．０５ｇ／Ｌポリソルベート８０を含む。必要ならば、ＨＣｌまたはＮａＯＨを使用してｐＨをｐＨ７．２（±０．０５）に調整する。
試料調製：
賦形剤溶液は、上述したリン酸緩衝液中で１５０ｍＭの濃度で調製する。
２つの賦形剤の組み合わせは、リン酸緩衝液中に各賦形剤に対して７５ｍＭの等モル濃度で調製する。
濃縮ＭＡｂＤ溶液は、超遠心フィルター（３０ｋＤａＭＷＣＯ）を使用して、それぞれの賦形剤溶液とのバッファー交換によって調製する。
濃縮タンパク質溶液は、上記の対応する賦形剤溶液で１００ｍｇ／ｍＬに希釈する。
粘度測定は例１Ａ）に記載されているとおりに行った。
【０１１３】
例４
緩衝液調製：
２０ｍＭ酢酸緩衝液、０．１ｇ／Ｌポリソルベート８０を含む緩衝溶液は、ミリＱ水に溶解して調製する。必要ならば、ＨＣｌまたはＮａＯＨを使用してｐＨをｐＨ５．０（±０．０５）に調整する。
試料調製：
賦形剤溶液は、上述した酢酸緩衝液中、１５０ｍＭの濃度で調製する。
２つの賦形剤の組み合わせは、酢酸緩衝液中に各賦形剤に対して７５ｍＭの等モル濃度で調製する。
濃縮ＭＡｂＥ溶液は、超遠心フィルター（３０ｋＤａＭＷＣＯ）を使用して、それぞれの賦形剤溶液とのバッファー交換によって調製する。
濃縮タンパク質溶液は、上述した対応する賦形剤溶液で１７０ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈する。
粘度測定は例１Ａ）に記載されているとおりに行った。
【０１１４】
例５
緩衝液調製：
緩衝液はミリＱ水に溶解した２０ｍＭ酢酸緩衝液、２０５ｍＭスクロースを含んでいた。必要ならば、ＨＣｌまたはＮａＯＨを使用してｐＨをｐＨ５．５（±０．０５）に調整した。
試料調製：
賦形剤溶液は、上述した酢酸緩衝液中、１５０ｍＭの濃度で調製する。
２つの賦形剤の組み合わせは、リン酸緩衝液中に各賦形剤に対して７５ｍＭの等モル濃度で調製した。
濃縮ＭＡｂＦ溶液は、超遠心フィルター（３０ｋＤａＭＷＣＯ）を使用してそれぞれの賦形剤溶液とのバッファー交換によって調製する。
濃縮タンパク質溶液は、上記の対応する賦形剤溶液で１８０ｍｇ／ｍＬに希釈する。
粘度測定は例１Ａ）に記載されているとおりに行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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2021521226.tif 000017
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