(57)【要約】【課題】がんの治療および／または予防の分野に関する。【解決手段】悪性腫瘍を有し、かつタキサン粒子を含む組成物の悪性腫瘍への局所投与を受けている対象から腫瘍特異的免疫細胞を単離するための方法、ならびに養子細胞療法およびがんワクチンのためのかかる単離された免疫細胞の組成物中での使用が開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性腫瘍を有する対象から腫瘍特異的免疫細胞を単離する方法であって、
（ａ）タキサン粒子を含む組成物を前記腫瘍に１回以上の別個の投与で局所投与して、インビボでの腫瘍特異的免疫細胞の産生を誘導することと、
（ｂ）前記対象の血液からおよび／または前記対象の腫瘍部位での組織もしくはその周辺の組織から前記腫瘍特異的免疫細胞を単離し、それにより、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団を提供することと、を含み、
前記腫瘍特異的免疫細胞が、前記悪性腫瘍に対する特異性を有する、方法。
【請求項２】
前記単離ステップ１（ｂ）が、前記投与ステップ１（ａ）の少なくとも１０日後または少なくとも２８日後に起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単離ステップ１（ｂ）が、投与ステップ１（ａ）後６０日以内に起こる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記単離された腫瘍特異的免疫細胞集団が、樹状細胞、ＣＤ４５＋細胞、リンパ球、白血球、マクロファージ、Ｍ１マクロファージ、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記悪性腫瘍が、肉腫、癌腫、リンパ腫、固形腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、頭頸部腫瘍、腹腔内臓器腫瘍、脳腫瘍、膠芽細胞腫、膀胱腫瘍、膵臓腫瘍、肝腫腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍、皮膚腫瘍、皮膚転移、リンパ系、胃腸腫瘍、肺腫瘍、骨腫瘍、黒色腫、網膜芽細胞腫、もしくは腎臓腫瘍、またはそれらの転移性腫瘍を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記単離された腫瘍特異的免疫細胞集団が、前記対象の血液から単離される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記単離された腫瘍特異的免疫細胞集団が、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって血液から単離される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記単離された腫瘍特異的免疫細胞集団が、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項６または７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、前記単離された腫瘍特異的免疫細胞集団の約４％〜約１５％を構成する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が、前記単離された腫瘍特異的免疫細胞集団の約３％〜約１０％を構成する、請求項８または９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記単離された腫瘍特異的免疫細胞集団が、対照免疫細胞集団よりも多いＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞集団、ならびにそれよりも少ない骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の細胞集団を含む、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記対照免疫細胞集団が、前記悪性腫瘍型に特異的ではない免疫細胞集団を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対照免疫細胞集団が、前記投与ステップ１（ａ）の前に前記対象の血液から単離された免疫細胞集団を含む、請求項１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記対照免疫細胞集団が、前記悪性腫瘍型を有し、かつタキサン組成物の静脈内（ＩＶ）投与を受けている対象の血液から単離された免疫細胞集団を含む、請求項１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記対照免疫細胞集団が、前記悪性腫瘍型を有しない対象の血液から単離された免疫細胞集団を含む、請求項１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ１（ａ）における前記組成物の前記局所投与が、２回以上の別個の投与を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ１（ａ）における前記組成物の前記局所投与が、少なくとも２週間にわたる週１回の２回以上の別個の投与を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ１（ａ）における前記組成物の前記局所投与が、少なくとも１週間にわたる週２回の２回以上の別個の投与を含み、前記２回以上の別個の投与が少なくとも１日間隔である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記単離ステップ１（ｂ）がステップ１（ａ）における各々の別個の投与後に繰り返され、各々の繰り返された単離ステップから得られた前記単離された腫瘍特異的免疫細胞集団がプールされる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記単離された腫瘍特異的免疫細胞集団がエクスビボで濃縮されて、濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団を産生し、かつ／またはエクスビボで増殖されて、増殖された腫瘍特異的免疫細胞集団を産生し、かつ／または増殖され濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団を産生する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記単離された腫瘍特異的免疫細胞集団、前記濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団、前記増殖された腫瘍特異的免疫細胞集団、および／または前記増殖され濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団が凍結される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記単離された腫瘍特異的免疫細胞集団、前記濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団、前記増殖された腫瘍特異的免疫細胞集団、および／または前記増殖され濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団が保管される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記単離された腫瘍特異的免疫細胞集団が濃縮され、前記濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団の前記細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４５＋細胞、およびＭ１マクロファージ、ならびにそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記単離された腫瘍特異的免疫細胞集団、前記濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団、前記増殖された腫瘍特異的免疫細胞集団、および／または前記増殖され濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団がエクスビボで修飾される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記単離された腫瘍特異的免疫細胞集団、前記濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団、前記増殖された腫瘍特異的免疫細胞集団、および／または前記増殖され濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団が修飾されて、修飾された腫瘍特異的免疫細胞集団を産生し、前記修飾が、前記細胞を抗体に曝露すること、前記細胞をペプチドに曝露すること、前記細胞を生物学的応答修飾因子に曝露すること、前記細胞をサイトカインもしくはその類似体に曝露すること、前記細胞を成長因子もしくはその類似体に曝露すること、前記細胞を抗原に曝露すること、前記細胞をＲＮＡもしくは低分子干渉ＲＮＡに曝露すること、前記細胞を全細胞溶解物と共培養すること、前記細胞を人工抗原提示細胞と共培養すること、前記細胞を他の細胞型と共培養すること、前記細胞を遺伝子操作すること、前記細胞の遺伝子転写を上方制御すること、前記細胞の遺伝子転写を下方制御すること、レンチウイルスベクターを前記細胞にトランスフェクトすること、プラスミドＤＮＡを前記細胞にトランスフェクトすること、ｍＲＮＡを前記細胞にヌクレオフェクトすること、前記細胞を、レトロウイルスベクターを介して操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする遺伝子で形質導入すること、および／または遺伝子ノックアウトもしくはＣＲＩＳＰＲ法によって前記細胞の遺伝子を遺伝的に不活性化することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記修飾された腫瘍特異的免疫細胞集団が凍結される、請求項２４または２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記修飾された腫瘍特異的免疫細胞集団が保管される、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記タキサン粒子が、０．１ミクロン〜５ミクロン、または０．１ミクロン〜１．５ミクロン、または０．４ミクロン〜１．２ミクロンの平均粒径（数）を有する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記タキサン粒子が、前記タキサンの少なくとも９５％を構成する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記タキサン粒子が、少なくとも１８ｍ２／ｇ、２０ｍ２／ｇ、２５ｍ２／ｇ、３０ｍ２／ｇ、３２ｍ２／ｇ、３４ｍ２／ｇ、もしくは３５ｍ２／ｇ、または約１８ｍ２／ｇ〜約６０ｍ２／ｇ、もしくは約１８ｍ２／ｇ〜約５０ｍ２／ｇの比表面積（ＳＳＡ）を有する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記タキサン粒子が、０．０５ｇ／ｃｍ３〜０．１５ｇ／ｃｍ３のかさ密度（タップなし）を有する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記タキサン粒子が、モノマー、ポリマー（もしくは生体適合性ポリマー）、タンパク質、界面活性剤、またはアルブミンのうちの１つ以上に結合していない、それらの中にカプセル化されていない、またはそれらでコーティングされていない、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記タキサン粒子が結晶形態である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記タキサン粒子が、パクリタキセル粒子、ドセタキセル粒子、カバジタキセル粒子、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記タキサン粒子が、パクリタキセル粒子を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記タキサン粒子が、ドセタキセル粒子を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物の前記局所投与が、局所的投与、肺投与、腫瘍内注射投与、腹腔内注射投与、膀胱内注入投与（膀胱）、もしくは前記腫瘍の周辺組織への直接注射、またはそれらの組み合わせによるものである、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物の前記局所投与が局所的投与であり、それにより、前記組成物が前記対象の患部に局所的に適用され、前記腫瘍が皮膚悪性腫瘍である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記皮膚悪性腫瘍が、皮膚癌を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記皮膚癌が、黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、またはカポジ肉腫である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記皮膚悪性腫瘍が、皮膚転移を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記皮膚転移が、肺癌、乳癌、結腸癌、口腔癌、卵巣癌、腎臓癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、および／またはカポジ肉腫由来である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記組成物が液体または半固体担体をさらに含み、前記タキサン粒子が前記担体中に分散している、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記組成物が無水および疎水性である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記組成物が炭化水素を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記炭化水素が、ワセリン、鉱油、もしくはパラフィンワックス、またはそれらの混合物である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記組成物が１つ以上の揮発性シリコーン流体をさらに含む、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記１つ以上の揮発性シリコーン流体の濃度が、前記組成物の５〜２４ｗ／ｗ％である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記揮発性シリコーン流体が、シクロメチコンである、請求項４または４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記シクロメチコンが、シクロペンタシロキサンである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記組成物が、揮発性Ｃ１〜Ｃ４脂肪族アルコールを含有せず、追加の浸透促進剤を含有せず、追加の揮発性溶媒を含有せず、界面活性剤を含有せず、タンパク質を含有せず、かつ／またはアルブミンを含有しない、請求項４３〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記組成物中の前記タキサン粒子の濃度が、約０．１〜約５ｗ／ｗ％である、請求項３８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記局所投与が肺投与によるものであり、それにより、前記組成物が吸入され、前記腫瘍が肺腫瘍である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５４】
前記肺投与が噴霧を含み、前記噴霧により、前記組成物のエアロゾル液滴の肺送達がもたらされる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記エアロゾル液滴が、直径約０．５μｍ〜約６μｍ、または直径約１μｍ〜約３μｍ、または直径約２μｍ〜約３μｍの空気動力学的質量中央径（ＭＭＡＤ）を有する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記局所投与が腫瘍内注射投与によるものであり、それにより、前記組成物が前記腫瘍に直接注射される、請求項３７に記載の方法。
【請求項５７】
前記腫瘍が、肉腫、癌腫、リンパ腫、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、頭頸部腫瘍、脳腫瘍、膠芽細胞腫、膀胱腫瘍、膵臓腫瘍、肝腫腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍、皮膚腫瘍、皮膚転移、リンパ系、胃腸腫瘍、および／または腎臓腫瘍である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記局所投与が腹腔内注射投与によるものであり、それにより、前記組成物が腹膜腔に注射され、前記腫瘍が腹腔内臓器腫瘍である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５９】
前記腹腔内臓器腫瘍が卵巣腫瘍である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記局所投与が膀胱内注入投与（膀胱）によるものであり、それにより、前記組成物が膀胱に注入される、請求項３７に記載の方法。
【請求項６１】
前記組成物が液体担体をさらに含み、前記タキサン粒子が前記担体中に分散している、請求項５３〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記液体担体が水性担体である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記水性担体が０．９％生理食塩水溶液を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記水性担体が界面活性剤を含む、請求項６２または６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記界面活性剤がポリソルベートである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ポリソルベートがポリソルベート８０であり、前記ポリソルベート８０が、約０．０１ｖ／ｖ％〜約１ｖ／ｖ％の濃度で前記水性担体中に存在する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記組成物中の前記タキサン粒子の濃度が、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、または約６ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬである、請求項５３〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
担体と、請求項１〜６７のいずれか一項に記載の方法によって得られた前記単離された腫瘍特異的免疫細胞集団、前記濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団、前記増殖された腫瘍特異的免疫細胞集団、前記増殖され濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団、および／または前記修飾された腫瘍特異的免疫細胞集団と、を含む、細胞組成物。
【請求項６９】
悪性腫瘍を有し、かつタキサン粒子を含む組成物の前記悪性腫瘍への局所投与を受けている対象から単離された腫瘍特異的免疫細胞集団を含む細胞組成物であって、前記対象から得られた前記単離された腫瘍特異的免疫細胞集団が前記悪性腫瘍型に特異的である、細胞組成物。
【請求項７０】
前記単離された腫瘍特異的免疫細胞集団が、対照免疫細胞集団と比較してＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の濃度が増強されている、請求項６９に記載の細胞組成物。
【請求項７１】
前記対照免疫細胞集団が、前記悪性腫瘍型に特異的ではない免疫細胞集団を含む、請求項７０に記載の細胞組成物。
【請求項７２】
前記対照免疫細胞集団が、タキサン粒子を含む組成物の前記腫瘍への前記局所投与前に前記対象から単離された免疫細胞集団を含む、請求項７０または７１のいずれか一項に記載の細胞組成物。
【請求項７３】
前記対照免疫細胞集団が、前記悪性腫瘍型を有し、かつタキサン組成物の静脈内（ＩＶ）投与を受けている対象から単離された免疫細胞集団を含む、請求項７０または７１のいずれか一項に記載の細胞組成物。
【請求項７４】
前記対照免疫細胞集団が、前記悪性腫瘍型を有しない対象から単離された免疫細胞集団を含む、請求項７０または７１のいずれか一項に記載の細胞組成物。
【請求項７５】
前記腫瘍特異的免疫細胞集団が、約４％〜約１５％のＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、請求項６９〜７４のいずれか一項に記載の細胞組成物。
【請求項７６】
前記腫瘍特異的免疫細胞集団が、約３％〜約１０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項６９〜７５のいずれか一項に記載の細胞組成物。
【請求項７７】
担体をさらに含む、請求項６９〜７６のいずれか一項に記載の細胞組成物。
【請求項７８】
１つ以上の治療薬をさらに含む、請求項６９〜７７のいずれか一項に記載の細胞組成物。
【請求項７９】
前記治療薬が免疫治療薬またはチェックポイント阻害剤である、請求項７８に記載の細胞組成物。
【請求項８０】
前記細胞組成物が凍結される、請求項６９〜７９のいずれか一項に記載の細胞組成物。
【請求項８１】
がんまたは転移性がんを有する対象におけるがんまたは転移性がんを治療する方法であって、前記対象に、請求項６８〜８０のいずれか一項に記載の細胞組成物を投与することを含む、方法。
【請求項８２】
前記治療が自家治療である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記治療が同種治療である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記細胞組成物の前記投与が、静脈内投与、静脈内注射、静脈内注入／灌流／ボーラス、動脈内注射、動脈内注入／灌流、ボーラス、リンパ内注入、結節内注入、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、膀胱内注入、腫瘍内注射、腫瘍周辺注射、肺投与、局所的投与、またはそれらの組み合わせによるものである、請求項８１〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記がんまたは転移性がんが、前記タキサン粒子を含む組成物が局所投与された前記悪性腫瘍と同じ悪性腫瘍型である、請求項８１〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
請求項６８〜８０のいずれか一項に記載の細胞組成物を含む、がんを予防するか、またはがんの再発を予防するためのワクチン。
【請求項８７】
対象におけるがんを予防するか、またはがんの再発を予防する方法であって、前記対象に、請求項８６に記載のワクチンを投与することを含む、方法。
【請求項８８】
前記ワクチンが自家ワクチンである、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記ワクチンが同種ワクチンである、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記ワクチンの前記投与が、静脈内投与、静脈内注射、静脈内注入／灌流／ボーラス、動脈内注射、動脈内注入／灌流／ボーラス、リンパ内注入、結節内注入、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、膀胱内注入、腫瘍内注射、腫瘍周辺注射、肺投与、局所的投与、またはそれらの組み合わせによるものである、請求項８６〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記がんが、前記タキサン粒子を含む組成物が局所投与された前記悪性腫瘍と同じ悪性腫瘍型である、請求項８７〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１９年３月２２日出願の米国仮特許出願第６２／８２２５０６号、２０１８年５月３１日出願の同第６２／６７８４７０号、２０１８年１０月３日出願の同第６２／７４０４８９号、および２０１８年１２月１３日出願の同第６２／７７９３２７号に対する優先権を主張し、各々参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、概して、がんの治療および／または予防の分野に関する。具体的には、本開示は、インビボでの腫瘍特異的免疫細胞の産生を誘導するためのタキサン粒子組成物の悪性腫瘍への局所投与、ならびに養子細胞療法およびがんワクチンのための当該細胞の単離に関する。
【背景技術】
【０００３】
世界中で毎年何百万人もの患者ががんを有すると診断されており、毎年さらに何百万人もの患者ががんまたはがん関連合併症で死亡している。がんのリスクは年齢とともに著しく増加し、多くのがんは先進国でより一般的に発症し、がん発症率は、先進国世界において平均寿命の増加につれて増加している。現在の療法には、抗腫瘍薬の静脈内（ＩＶ）注入注射等の全身治療が含まれる。しかしながら、これらの療法は、全身毒性のため、一般に患者に重大な望ましくない副作用をもたらし、抗腫瘍薬は、体内での半減期が短いため、一般に腫瘍部位にあまり長く留まらない。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の一態様では、悪性腫瘍を有する対象から腫瘍特異的免疫細胞を単離するための方法であって、（ａ）タキサン粒子を含む組成物を腫瘍に１回以上の別個の投与で局所投与して、インビボでの腫瘍特異的免疫細胞の産生を誘導することと、（ｂ）対象の血液からおよび／または対象の腫瘍部位での組織もしくはその周辺の組織から腫瘍特異的免疫細胞を単離し、それにより、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団を提供することと、を含み、腫瘍特異的免疫細胞が悪性腫瘍に対する特異性を有する、方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、単離ステップ（ｂ）は、投与ステップ（ａ）の少なくとも１０日後または少なくとも２８日後に起こる。いくつかの実施形態では、単離ステップ（ｂ）は、投与ステップ（ａ）後６０日以内に起こる。いくつかの実施形態では、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団は、樹状細胞、ＣＤ４５＋細胞、リンパ球、白血球、マクロファージ、Ｍ１マクロファージ、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、悪性腫瘍は、肉腫、癌腫、リンパ腫、固形腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、頭頸部腫瘍、腹腔内臓器腫瘍、脳腫瘍、膠芽細胞腫、膀胱腫瘍、膵臓腫瘍、肝腫腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍、皮膚腫瘍、皮膚転移、リンパ系、胃腸腫瘍、肺腫瘍、骨腫瘍、黒色腫、網膜芽細胞腫、もしくは腎臓腫瘍、またはそれらの転移性腫瘍を含む。
【０００５】
いくつかの実施形態では、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団は、対象の血液から単離される。いくつかの実施形態では、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団は、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって血液から単離される。いくつかの実施形態では、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団の約４％〜約１５％を構成する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団の約３％〜約１０％を構成する。いくつかの実施形態では、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団は、対照免疫細胞集団よりも多いＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞集団、ならびにそれよりも少ない骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、対照免疫細胞集団は、悪性腫瘍型に特異的ではない免疫細胞集団を含む。他の実施形態では、対照免疫細胞集団は、投与ステップ（ａ）の前に対象の血液から単離された免疫細胞集団を含む。他の実施形態では、対照免疫細胞集団は、悪性腫瘍型を有し、かつタキサン組成物の静脈内（ＩＶ）投与を受けている対象の血液から単離された免疫細胞集団を含む。他の実施形態では、対照免疫細胞集団は、悪性腫瘍型を有しない対象の血液から単離された免疫細胞集団を含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）における組成物の局所投与は、２回以上の別個の投与を含む。いくつかの実施形態では、ステップ１（ａ）における組成物の局所投与は、少なくとも２週間にわたる週１回の２回以上の別個の投与を含む。いくつかの実施形態では、ステップ１（ａ）における組成物の局所投与は、少なくとも１週間にわたる週２回の２回以上の別個の投与を含み、２回以上の別個の投与は、少なくとも１日間隔である。いくつかの実施形態では、単離ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）における各々の別個の投与後に繰り返され、各々の繰り返された単離ステップから得られた単離された腫瘍特異的免疫細胞集団はプールされる。
【０００７】
いくつかの実施形態では、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団は、エクスビボで濃縮されて、濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団を産生し、かつ／またはエクスビボで増殖されて、増殖された腫瘍特異的免疫細胞集団を産生し、かつ／または増殖され濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団を産生する。他の実施形態では、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団、濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団、増殖された腫瘍特異的免疫細胞集団、および／または増殖され濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団は、凍結および／または保管される。いくつかの実施形態では、濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団の細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４５＋細胞、およびＭ１マクロファージ、ならびにそれらの混合物からなる群から選択される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団、濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団、増殖された腫瘍特異的免疫細胞集団、および／または増殖され濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団は、エクスビボで修飾される。いくつかの実施形態では、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団、濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団、増殖された腫瘍特異的免疫細胞集団、および／または増殖され濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団は修飾されて、修飾された腫瘍特異的免疫細胞集団を産生し、修飾は、細胞を抗体に曝露すること、細胞をペプチドに曝露すること、細胞を生物学的応答修飾因子に曝露すること、細胞をサイトカインもしくはその類似体に曝露すること、細胞を成長因子もしくはその類似体に曝露すること、細胞を抗原に曝露すること、細胞をＲＮＡもしくは低分子干渉ＲＮＡに曝露すること、細胞を全細胞溶解物と共培養すること、細胞を人工抗原提示細胞と共培養すること、細胞を他の細胞型と共培養すること、細胞を遺伝子操作すること、細胞の遺伝子転写を上方制御すること、細胞の遺伝子転写を下方制御すること、レンチウイルスベクターを細胞にトランスフェクトすること、プラスミドＤＮＡを細胞にトランスフェクトすること、ｍＲＮＡを細胞にヌクレオフェクトすること、細胞を、レトロウイルスベクターを介して操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする遺伝子で形質導入すること、および／または遺伝子ノックアウトもしくはＣＲＩＳＰＲ法によって細胞の遺伝子を遺伝的に不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、修飾された腫瘍特異的免疫細胞集団は、凍結および／または保管される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、局所投与された組成物のタキサン粒子は、０．１ミクロン〜５ミクロン、または０．１ミクロン〜１．５ミクロン、または０．４ミクロン〜１．２ミクロンの平均粒径（数）を有する。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、０．１ミクロン〜５ミクロン、または０．１ミクロン〜１．５ミクロン、または０．４ミクロン〜１．２ミクロンの平均粒径（数）を有する。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、少なくとも１８ｍ２／ｇ、２０ｍ２／ｇ、２５ｍ２／ｇ、３０ｍ２／ｇ、３２ｍ２／ｇ、３４ｍ２／ｇ、もしくは３５ｍ２／ｇ、または約１８ｍ２／ｇ〜約６０ｍ２／ｇ、もしくは約１８ｍ２／ｇ〜約５０ｍ２／ｇの比表面積（ＳＳＡ）を有する。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、０．０５ｇ／ｃｍ３〜０．１５ｇ／ｃｍ３のかさ密度（タップなし）を有する。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、モノマー、ポリマー（もしくは生体適合性ポリマー）、タンパク質、界面活性剤、またはアルブミンのうちの１つ以上に結合していない、それらの中にカプセル化されていない、またはそれらでコーティングされていない。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、モノマー、ポリマー（もしくは生体適合性ポリマー）、タンパク質、界面活性剤、またはアルブミンのうちの１つ以上に結合していない、それらの中にカプセル化されていない、またはそれらでコーティングされていない。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、パクリタキセル粒子、ドセタキセル粒子、カバジタキセル粒子、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、組成物の局所投与は、局所的投与、肺投与、腫瘍内注射投与、腹腔内注射投与、膀胱内注入投与（膀胱）、もしくは腫瘍の周辺組織への直接注射、またはそれらの組み合わせによるものである。
【００１０】
本開示の別の態様では、担体と、上記の方法によって得られた単離された腫瘍特異的免疫細胞集団、濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団、増殖された腫瘍特異的免疫細胞集団、増殖され濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団、および／または修飾された腫瘍特異的免疫細胞集団と、を含む、細胞組成物が本明細書に開示される。
【００１１】
本開示の別の態様では、悪性腫瘍を有し、かつタキサン粒子を含む組成物の悪性腫瘍への局所投与を受けている対象から単離された腫瘍特異的免疫細胞集団を含む細胞組成物であって、対象から得られた単離された腫瘍特異的免疫細胞集団が悪性腫瘍型に特異的である、細胞組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団は、対照免疫細胞集団と比較してＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の濃度が増強されている。いくつかの実施形態では、対照免疫細胞集団は、悪性腫瘍型に特異的ではない免疫細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、対照免疫細胞集団は、タキサン粒子を含む組成物の腫瘍への局所投与前に対象から単離された免疫細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、対照免疫細胞集団は、悪性腫瘍型を有し、かつタキサン組成物の静脈内（ＩＶ）投与を受けている対象から単離された免疫細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、対照免疫細胞集団は、悪性腫瘍型を有しない対象から単離された免疫細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍特異的免疫細胞集団は、約４％〜約１５％のＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍特異的免疫細胞集団は、約３％〜約１０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞組成物は、担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞組成物は、免疫治療薬またはチェックポイント阻害剤等の１つ以上の治療薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞組成物は凍結される。
【００１２】
本開示の別の態様では、がんまたは転移性がんを有する対象におけるがんまたは転移性がんを治療する方法であって、対象に、本明細書に記載の細胞組成物を投与することを含む、方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、治療は、自家治療である。他の実施形態では、治療は、同種治療である。いくつかの実施形態では、細胞組成物の投与は、静脈内投与、静脈内注射、静脈内注入／灌流／ボーラス、動脈内注射、動脈内注入／灌流、ボーラス、リンパ内注入、結節内注入、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、膀胱内注入、腫瘍内注射、腫瘍周辺注射、肺投与、局所的投与、またはそれらの組み合わせによるものである。いくつかの実施形態では、がんまたは転移性がんは、タキサン粒子を含む組成物が局所投与された悪性腫瘍と同じ悪性腫瘍型である。
【００１３】
本開示の別の態様では、本明細書に開示される細胞組成物を含む、がんを予防するか、またはがんの再発を予防するためのワクチンが本明細書に開示される。
【００１４】
本開示の別の態様では、対象におけるがんを予防するか、またはがんの再発を予防する方法であって、対象に、本明細書に開示されるワクチンを投与することを含む、方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、自家ワクチンである。他の実施形態では、ワクチンは、同種ワクチンである。いくつかの実施形態では、ワクチンの投与は、静脈内投与、静脈内注射、静脈内注入／灌流／ボーラス、動脈内注射、動脈内注入／灌流／ボーラス、リンパ内注入、結節内注入、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、膀胱内注入、腫瘍内注射、腫瘍周辺注射、肺投与、局所的投与、またはそれらの組み合わせによるものである。いくつかの実施形態では、がんは、タキサン粒子を含む組成物が局所投与された悪性腫瘍と同じ悪性腫瘍型である。
【００１５】
以下の実施形態１〜９１が本明細書に開示される。
実施形態１は、悪性腫瘍を有する対象から腫瘍特異的免疫細胞を単離するための方法であって、（ａ）タキサン粒子を含む組成物を腫瘍に１回以上の別個の投与で局所投与して、インビボでの腫瘍特異的免疫細胞の産生を誘導することと、（ｂ）対象の血液からおよび／または対象の腫瘍部位での組織もしくはその周辺の組織から腫瘍特異的免疫細胞を単離し、それにより、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団を提供することと、を含み、腫瘍特異的免疫細胞が悪性腫瘍に対する特異性を有する、方法である。
実施形態２は、単離ステップ１（ｂ）が、投与ステップ１（ａ）の少なくとも１０日後または少なくとも２８日後に起こる、実施形態１に記載の方法である。
実施形態３は、単離ステップ１（ｂ）が投与ステップ１（ａ）後６０日以内に起こる、実施形態２に記載の方法である。
実施形態４は、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団が、樹状細胞、ＣＤ４５＋細胞、リンパ球、白血球、マクロファージ、Ｍ１マクロファージ、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のうちの少なくとも１つを含む、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態５は、悪性腫瘍が、肉腫、癌腫、リンパ腫、固形腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、頭頸部腫瘍、腹腔内臓器腫瘍、脳腫瘍、膠芽細胞腫、膀胱腫瘍、膵臓腫瘍、肝腫腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍、皮膚腫瘍、皮膚転移、リンパ系、胃腸腫瘍、肺腫瘍、骨腫瘍、黒色腫、網膜芽細胞腫、もしくは腎臓腫瘍、またはそれらの転移性腫瘍を含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態６は、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団が、対象の血液から単離される、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態７は、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団が、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって血液から単離される、実施形態６に記載の方法である。
実施形態８は、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団が、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、実施形態６または７のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態９は、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団の約４％〜約１５％を構成する、実施形態８に記載の方法である。
実施形態１０は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団の約３％〜約１０％を構成する、実施形態８または９のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１１は、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団が、対照免疫細胞集団よりも多いＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞集団、ならびにそれよりも少ない骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の細胞集団を含む、実施形態６〜１０のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１２は、対照免疫細胞集団が、悪性腫瘍型に特異的ではない免疫細胞集団を含む、実施形態１１に記載の方法である。
実施形態１３は、対照免疫細胞集団が、投与ステップ１（ａ）の前に対象の血液から単離された免疫細胞集団を含む、実施形態１１または１２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１４は、対照免疫細胞集団が、悪性腫瘍型を有し、タキサン組成物の静脈内（ＩＶ）投与を受けている対象の血液から単離された免疫細胞集団を含む、実施形態１１または１２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１５は、対照免疫細胞集団が、悪性腫瘍型を有しない対象の血液から単離された免疫細胞集団を含む、実施形態１１または１２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１６は、ステップ１（ａ）における組成物の局所投与が、２回以上の別個の投与を含む、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１７は、ステップ１（ａ）における組成物の局所投与が、少なくとも２週間にわたる週１回の２回以上の別個の投与を含む、実施形態１６に記載の方法である。
実施形態１８は、ステップ１（ａ）における組成物の局所投与が、少なくとも１週間にわたる週２回の２回以上の別個の投与を含み、２回以上の別個の投与が少なくとも１日間隔である、実施形態１６に記載の方法である。
実施形態１９は、単離ステップ１（ｂ）がステップ１（ａ）にける各々の別個の投与後に繰り返され、各々の繰り返された単離ステップから得られた単離された腫瘍特異的免疫細胞集団がプールされる、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２０は、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団がエクスビボで濃縮されて、濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団を産生し、かつ／またはエクスビボで増殖されて、増殖された腫瘍特異的免疫細胞集団を産生し、かつ／または増殖され濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団を産生する、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２１は、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団、濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団、増殖された腫瘍特異的免疫細胞集団、および／または増殖され濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団が凍結される、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２２は、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団、濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団、増殖された腫瘍特異的免疫細胞集団、および／または増殖され濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団が保管される、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２３は、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団が濃縮され、濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団の細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４５＋細胞、およびＭ１マクロファージ、ならびにそれらの混合物からなる群から選択される、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２４は、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団、濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団、増殖された腫瘍特異的免疫細胞集団、および／または増殖され濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団がエクスビボで修飾される、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２５は、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団、濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団、増殖された腫瘍特異的免疫細胞集団、および／または増殖され濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団が修飾されて、修飾された腫瘍特異的免疫細胞集団を産生し、修飾が、細胞を抗体に曝露すること、細胞をペプチドに曝露すること、細胞を生物学的応答修飾因子に曝露すること、細胞をサイトカインもしくはその類似体に曝露すること、細胞を成長因子もしくはその類似体に曝露すること、細胞を抗原に曝露すること、細胞をＲＮＡもしくは低分子干渉ＲＮＡに曝露すること、細胞を全細胞溶解物と共培養すること、細胞を人工抗原提示細胞と共培養すること、細胞を他の細胞型と共培養すること、細胞を遺伝子操作すること、細胞の遺伝子転写を上方制御すること、細胞の遺伝子転写を下方制御すること、レンチウイルスベクターを細胞にトランスフェクトすること、プラスミドＤＮＡを細胞にトランスフェクトすること、ｍＲＮＡを細胞にヌクレオフェクトすること、細胞を、レトロウイルスベクターを介して操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする遺伝子で形質導入すること、および／または遺伝子ノックアウトまたはＣＲＩＳＰＲ法によって細胞の遺伝子を遺伝的に不活性化することを含む、実施形態２４に記載の方法である。
実施形態２６は、修飾された腫瘍特異的免疫細胞集団が凍結される、実施形態２４または２５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２７は、修飾された腫瘍特異的免疫細胞集団が保管される、実施形態２４〜２６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２８は、タキサン粒子が、０．１ミクロン〜５ミクロン、または０．１ミクロン〜１．５ミクロン、または０．４ミクロン〜１．２ミクロンの平均粒径（数）を有する、実施形態１〜２７のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２９は、タキサン粒子が、タキサンの少なくとも９５％を構成する、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３０は、タキサン粒子が、少なくとも１８ｍ２／ｇ、２０ｍ２／ｇ、２５ｍ２／ｇ、３０ｍ２／ｇ、３２ｍ２／ｇ、３４ｍ２／ｇ、もしくは３５ｍ２／ｇ、または約１８ｍ２／ｇ〜約６０ｍ２／ｇ、もしくは約１８ｍ２／ｇ〜約５０ｍ２／ｇの比表面積（ＳＳＡ）を有する、実施形態１〜２９のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３１は、タキサン粒子が、０．０５ｇ／ｃｍ３〜０．１５ｇ／ｃｍ３のかさ密度（タップなし）を有する、実施形態１〜３０のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３２は、タキサン粒子が、モノマー、ポリマー（もしくは生体適合性ポリマー）、タンパク質、界面活性剤、またはアルブミンのうちの１つ以上に結合していない、それらの中にカプセル化されていない、またはそれらでコーティングされていない、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３３は、タキサン粒子が結晶形態である、実施形態１〜３２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３４は、タキサン粒子が、パクリタキセル粒子、ドセタキセル粒子、カバジタキセル粒子、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１〜３３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３５は、タキサン粒子が、パクリタキセル粒子を含む、実施形態３４に記載の方法である。
実施形態３６は、タキサン粒子が、ドセタキセル粒子を含む、実施形態３４に記載の方法である。
実施形態３７は、組成物の局所投与が、局所的投与、肺投与、腫瘍内注射投与、腹腔内注射投与、膀胱内注入投与（膀胱）、または腫瘍の周辺組織への直接注射、またはそれらの組み合わせによるものである、実施形態１〜３６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３８は、組成物の局所投与が局所的投与であり、それにより、組成物が対象の患部に局所的に適用され、腫瘍が皮膚悪性腫瘍である、実施形態３７に記載の方法である。
実施形態３９は、皮膚悪性腫瘍が、皮膚癌を含む、実施形態３８に記載の方法である。
実施形態４０は、皮膚癌が、黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、またはカポジ肉腫である、実施形態３９に記載の方法である。
実施形態４１は、皮膚悪性腫瘍が、皮膚転移を含む、実施形態３９に記載の方法である。
実施形態４２は、皮膚転移が、肺癌、乳癌、結腸癌、口腔癌、卵巣癌、腎臓癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、および／またはカポジ肉腫に由来する、実施形態４１に記載の方法である。
実施形態４３は、組成物が液体または半固体担体をさらに含み、タキサン粒子が担体中に分散している、実施形態３８〜４２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態４４は、組成物が無水および疎水性である、４３に記載の方法である。
実施形態４５は、組成物が炭化水素を含む、実施形態４４に記載の方法である。
実施形態４６は、炭化水素が、ワセリン、鉱油、もしくはパラフィンワックス、またはそれらの混合物である、実施形態４５に記載の方法である。
実施形態４７は、組成物が１つ以上の揮発性シリコーン流体をさらに含む、実施形態４４〜４６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態４８は、１つ以上の揮発性シリコーン流体の濃度が、組成物の５〜２４ｗ／ｗ％である、実施形態４７に記載の方法である。
実施形態４９は、揮発性シリコーン流体が、シクロメチコンである、実施形態４または４８のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態５０は、シクロメチコンが、シクロペンタシロキサンである、実施形態４９に記載の方法である。
実施形態５１は、組成物が揮発性Ｃ１〜Ｃ４脂肪族アルコールを含有せず、追加の浸透促進剤を含有せず、追加の揮発性溶媒を含有せず、界面活性剤を含有せず、タンパク質を含有せず、かつ／またはアルブミンを含有しない、実施形態４３〜５０のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態５２は、組成物中のタキサン粒子の濃度が、約０．１〜約５ｗ／ｗ％である、実施形態３８〜５１のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態５３は、局所投与が肺投与によるものであり、それにより、組成物が吸入され、腫瘍が肺腫瘍である、実施形態３７に記載の方法である。
実施形態５４は、肺投与が噴霧を含み、噴霧により、組成物のエアロゾル液滴の肺送達がもたらされる、実施形態５３に記載の方法である。
実施形態５５は、エアロゾル液滴が、直径約０．５μｍ〜約６μｍ、または直径約１μｍ〜約３μｍ、または直径約２μｍ〜約３μｍの空気動力学的質量中央径（ＭＭＡＤ）を有する、実施形態５４に記載の方法である。
実施形態５６は、局所投与が腫瘍内注射投与によるものであり、それにより、組成物が腫瘍に直接注射される、実施形態３７に記載の方法である。
実施形態５７は、腫瘍が、肉腫、癌腫、リンパ腫、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、頭頸部腫瘍、脳腫瘍、膠芽細胞腫、膀胱腫瘍、膵臓腫瘍、肝腫腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍、皮膚腫瘍、皮膚転移、リンパ系、胃腸腫瘍、および／または腎臓腫瘍である、実施形態５６に記載の方法である。
実施形態５８は、局所投与が腹腔内注射投与によるものであり、それにより、組成物が腹膜腔に注射され、腫瘍が腹腔内臓器腫瘍である、実施形態３７に記載の方法である。
実施形態５９は、腹腔内臓器腫瘍が卵巣腫瘍である、実施形態５８に記載の方法である。
実施形態６０は、局所投与が膀胱内注入投与（膀胱）によるものであり、それにより、組成物が膀胱に注入される、実施形態３７に記載の方法である。
実施形態６１は、組成物が液体担体をさらに含み、タキサン粒子が担体中に分散している、実施形態５３〜６０のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態６２は、液体担体が水性担体である、実施形態６１に記載の方法である。
実施形態６３は、水性担体が０．９％生理食塩水溶液を含む、実施形態６２に記載の方法である。
実施形態６４は、水性担体が界面活性剤を含む、実施形態６２または６３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態６５は、界面活性剤がポリソルベートである、実施形態６４に記載の方法である。
実施形態６６は、ポリソルベートがポリソルベート８０であり、ポリソルベート８０が、約０．０１ｖ／ｖ％〜約１ｖ／ｖ％の濃度で水性担体中に存在する、実施形態６５に記載の方法である。
実施形態６７は、組成物中のタキサン粒子の濃度が、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、または約６ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬである、実施形態５３〜６６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態６８は、担体と、実施形態１〜６７のいずれか１つに記載の方法によって得られた単離された腫瘍特異的免疫細胞集団、濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団、増殖された腫瘍特異的免疫細胞集団、増殖され濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団、および／または修飾された腫瘍特異的免疫細胞集団と、を含む、細胞組成物である。
実施形態６９は、悪性腫瘍を有し、かつタキサン粒子を含む組成物の悪性腫瘍への局所投与を受けている対象から単離された腫瘍特異的免疫細胞集団を含む細胞組成物であって、対象から得られた単離された腫瘍特異的免疫細胞集団が悪性腫瘍型に特異的である、細胞組成物である。
実施形態７０は、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団が、対照免疫細胞集団と比較してＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の濃度が増強されている、実施形態６９に記載の細胞組成物である。
実施形態７１は、対照免疫細胞集団が、悪性腫瘍型に特異的ではない免疫細胞集団を含む、実施形態７０に記載の細胞組成物である。
実施形態７２は、対照免疫細胞集団が、タキサン粒子を含む組成物の腫瘍への局所投与前に対象から単離された免疫細胞集団を含む、実施形態７０または７１のいずれか１つに記載の細胞組成物である。
実施形態７３は、対照免疫細胞集団が、悪性腫瘍型を有し、かつタキサン組成物の静脈内（ＩＶ）投与を受けている対象から単離された免疫細胞集団を含む、実施形態７０または７１のいずれか１つに記載の細胞組成物である。
実施形態７４は、対照免疫細胞集団が、悪性腫瘍型を有しない対象から単離された免疫細胞集団を含む、実施形態７０または７１のいずれか１つに記載の細胞組成物である。
実施形態７５は、腫瘍特異的免疫細胞集団が、約４％〜約１５％のＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、実施形態６９〜７４のいずれか１つに記載の細胞組成物である。
実施形態７６は、腫瘍特異的免疫細胞集団が、約３％〜約１０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、実施形態６９〜７５のいずれか１つに記載の細胞組成物である。
実施形態７７は、担体をさらに含む、実施形態６９〜７６のいずれか１つに記載の細胞組成物である。
実施形態７８は、１つ以上の治療薬をさらに含む、実施形態６９〜７７のいずれか１つに記載の細胞組成物である。
実施形態７９は、治療薬が免疫治療薬またはチェックポイント阻害剤である、実施形態７８に記載の細胞組成物である。
実施形態８０は、細胞組成物が凍結される、実施形態６９〜７９のいずれか１つに記載の細胞組成物である。
実施形態８１は、がんまたは転移性がんを有する対象におけるがんまたは転移性がんを治療する方法であって、対象に、実施形態６８〜８０のいずれか１つに記載の細胞組成物を投与することを含む、方法である。
実施形態８２は、治療が自家治療である、実施形態８１に記載の方法である。
実施形態８３は、治療が同種治療である、実施形態８１に記載の方法である。
実施形態８４は、細胞組成物の投与が、静脈内投与、静脈内注射、静脈内注入／灌流／ボーラス、動脈内注射、動脈内注入／灌流、ボーラス、リンパ内注入、結節内注入、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、膀胱内注入、腫瘍内注射、腫瘍周辺注射、肺投与、局所的投与、またはそれらの組み合わせによるものである、実施形態８１〜８３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態８５は、がんまたは転移性がんが、タキサン粒子を含む組成物が局所投与された悪性腫瘍と同じ悪性腫瘍型である、実施形態８１〜８４のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態８６は、実施形態６８〜８０のいずれか１つに記載の細胞組成物を含む、がんを予防するか、またはがんの再発を予防するためのワクチンである。
実施形態８７は、対象におけるがんを予防するか、またはがんの再発を予防する方法であって、対象に、実施形態８６に記載のワクチンを投与することを含む、方法である。
実施形態８８は、ワクチンが自家ワクチンである、実施形態８７に記載の方法である。
実施形態８９は、ワクチンが同種ワクチンである、実施形態８７に記載の方法である。
実施形態９０は、ワクチンの投与が、静脈内投与、静脈内注射、静脈内注入／灌流／ボーラス、動脈内注射、動脈内注入／灌流／ボーラス、リンパ内注入、結節内注入、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、膀胱内注入、腫瘍内注射、腫瘍周辺注射、肺投与、局所的投与、またはそれらの組み合わせによるものである、実施形態８６〜８９のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態９１は、がんが、タキサン粒子を含む組成物が局所投与された悪性腫瘍と同じ悪性腫瘍型である、実施形態８７〜９０のいずれか１つに記載の方法である。
【００１６】
本明細書で使用される「悪性腫瘍」という用語は、通常嚢胞または液体領域を含まず、かつ細胞が分裂すべきよりも多く分裂するか、または死滅すべきときに死滅しないときに結果的に生じる組織の１つ以上の異常な塊を意味する。
【００１７】
免疫細胞に関して本明細書で使用される「腫瘍特異的」という用語は、１つ以上の特異的悪性腫瘍抗原を特定する免疫細胞を意味する。腫瘍特異的免疫細胞とは、特定の悪性腫瘍の環境と直接または間接的に接触した後に変化を受けており、これにより、免疫細胞が物質を作製もしくは産生するか、または別様には受けないであろう構造変化を受けることが可能になった免疫細胞である。腫瘍特異的免疫細胞は、活性化されて特定の腫瘍細胞を攻撃するようになり、それ故に、腫瘍特異的活性を有する。例えば、腎腫瘍の環境と接触した免疫細胞は、活性化されて腎腫瘍細胞を攻撃するようになり、膀胱腫瘍の環境と接触した免疫細胞は、活性化されて膀胱腫瘍細胞を攻撃するようになるであろう。
【００１８】
本明細書で使用される「疎水性」という用語は、室温で１０ｍｇ／ｍＬ以下の水中溶解度を有する化合物、組成物、または担体を表す。
【００１９】
本明細書で使用される「揮発性」という用語は、室温で１０Ｐａ以上の蒸気圧を有する化合物、組成物、または担体を表す。
【００２０】
本明細書で使用される「不揮発性」という用語は、室温で１０Ｐａ未満の蒸気圧を有する化合物、組成物、または担体を表す。
【００２１】
本開示の組成物または担体に関して本明細書で使用される「無水」という用語は、３ｗ／ｗ％未満、２ｗ／ｗ％未満、１ｗ／ｗ％未満、または０ｗ／ｗ％の水が組成物または担体中に存在することを意味する。これは、存在している少量の水（例えば、組成物または担体の成分のうちのいずれかに本質的に含有される水、大気から収縮された水等）を説明することができる。
【００２２】
本明細書で使用される「皮膚（ｓｋｉｎ）」または「皮膚（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ）」という用語は、表皮および／または真皮を意味する。
【００２３】
本明細書で使用される「皮膚腫瘍」という用語は、良性皮膚腫瘍および悪性皮膚腫瘍を含む固形腫瘍を意味する。
【００２４】
本明細書で使用される「皮膚悪性腫瘍」または「悪性皮膚腫瘍」という用語は、皮膚癌および皮膚転移を含むがん性皮膚腫瘍を含む固形腫瘍を意味する。
【００２５】
本明細書で使用される皮膚腫瘍または皮膚悪性腫瘍の「患部」とは、皮膚腫瘍または皮膚悪性腫瘍が皮膚の最外表面上または皮膚表面の真下（上皮／皮膚被覆）に目に見えて存在する皮膚の少なくとも一部を意味し、目に見えて検出不能な前臨床病変を含む可能性が高い皮膚腫瘍または皮膚悪性腫瘍の近くの皮膚の領域を含む。
【００２６】
本明細書で使用される「皮膚（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（皮膚（ｓｋｉｎ））転移」または「皮膚（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（皮膚（ｓｋｉｎ））転移（複数）」という用語は、身体の別の場所における、癌腫瘍の原発性増殖から生じる二次増殖（悪性腫瘍）としての皮膚の悪性腫瘍の発現を意味する。原発腫瘍からの広がりは、リンパ系もしくは血液循環系を介して、または他の手段による可能性がある。
【００２７】
がんの治療および／または腫瘍の治療に関して本明細書で使用される「治療する」、「治療すること」、または「治療」という用語は、（ａ）腫瘍サイズの低減、（ｂ）腫瘍成長の低減、（ｃ）腫瘍の除去、（ｄ）転移の発症および／または広がりの低減または制限、（ｅ）がんの部分または完全寛解を得ることのうちの１つ以上を達成することを意味する。
【００２８】
本明細書で使用される「対象」または「患者」という用語は、脊椎動物を意味する。いくつかの実施形態では、脊椎動物は、哺乳動物であり得る。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトを含む霊長類であり得る。
【００２９】
本明細書で使用される「室温」（ＲＴ）という用語は、１５〜３０℃または２０〜２５℃を意味する。
【００３０】
本明細書で使用される「浸透促進剤」または「皮膚浸透促進剤」という用語は、皮膚（表皮および真皮）への薬物吸収を促進する化合物または材料または物質を意味する。
【００３１】
本明細書で使用される「界面活性剤」または「表面活性剤」という用語は、水の表面張力を低下させる能力、または２つの非混和性物質間の界面張力を低減する能力を呈する化合物または材料または物質を意味する。
【００３２】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。本明細書で使用される「および」は、特に明記しない限り、「または」と互換的に使用される。
【００３３】
本明細書で使用される「約」または「およそ」という用語は、列挙された測定単位の＋／−５パーセント（５％）を意味する。
【００３４】
本出願について、１桁以上の小数位を有する数値は、標準の四捨五入ガイドラインを使用して、小数第１位で四捨五入して整数にされ得、すなわち、四捨五入される数値が５、６、７、８、または９である場合は切り上げられ、四捨五入される数値が０、１、２、３、または４の場合は切り捨てられ得る。例えば、３．７は、４に四捨五入され得る。
【００３５】
文脈上明白に他の意味に解すべき場合を除き、本明細書および特許請求の範囲全体を通して、「備える、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「備えること、含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の単語は、排他的または網羅的な意味とは対照的に包括的または非限定的（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）な意味で、すなわち、「〜を含むが、これらに限定されない）」という意味で解釈されるものとする。単数または複数を使用する単語は、それぞれ、複数および単数も含む。さらに、「本明細書における（ｈｅｒｅｉｎ）」、「上に（ａｂｏｖｅ）」、および「以下に（ｂｅｌｏｗ）」という単語、ならびに類似の趣旨の単語は、本出願で使用される場合、全体としての本出願を指すものであり、本出願のいずれの特定の部分を指すものではない。組成物およびそれらを使用するための方法は、本明細書全体を通して開示される成分またはステップのうちのいずれかを「含む」、「から本質的になる」、または「からなる」ことができる。
【００３６】
本明細書で論じられるいずれの実施形態も本開示のいずれの方法または組成物に関して実行され得、逆もまた同様であることが企図される。さらに、本開示の組成物は、本開示の方法を達成するために使用され得る。
【００３７】
本開示の実施形態の説明は、網羅的であるようにも、本開示を、開示された正確な形態に限定するようにも意図されていない。本開示の特定の実施形態および実施例が例証目的で本明細書に記載されているが、当業者であれば認識するであろうように、様々な同等の修正が本開示の範囲内で可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】フォーミュラＦ１〜Ｆ７について表皮にインビトロ送達されたパクリタキセルの濃度（μｇ／ｃｍ２）のグラフである。
【図２】フォーミュラＦ６＊（反復分析）およびＦ８〜Ｆ１３について表皮にインビトロ送達されたパクリタキセルの濃度（μｇ／ｃｍ２）のグラフである。
【図３】フォーミュラＦ１〜Ｆ７について真皮にインビトロ送達されたパクリタキセルの濃度（μｇ／ｃｍ２）のグラフである。
【図４】フォーミュラＦ６＊（反復分析）およびＦ８〜Ｆ１３について真皮にインビトロ送達されたパクリタキセルの濃度（μｇ／ｃｍ２）のグラフである。
【図５】皮膚転移研究におけるベースライン（１日目）のステージ４乳癌を有する女性の胸部上の皮膚転移病変の写真である。
【図６】皮膚転移研究における局所的処理中の８日目のステージ４乳癌を有する女性の胸部上の皮膚転移病変の写真である。
【図７】皮膚転移研究における局所的処理中の１５日目のステージ４乳癌を有する女性の胸部上の皮膚転移病変の写真である。
【図８ａ】皮膚転移研究における研究終了時の局所的処理中の２９日目のステージ４乳癌を有する女性の胸部上の皮膚転移病変の写真である。
【図８ｂ】皮膚転移研究における局所的処理終了の２週間後の４３日目のステージ４乳癌を有する女性の胸部上の皮膚転移病変の写真である。
【図９】吸入研究からの６．０ｍｇ／ｍＬのナノ粒子パクリタキセル（ｎＰａｃ）製剤の空気動力学的直径のプロットである。
【図１０】吸入研究からの２０．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃ製剤の空気動力学的直径のプロットである。
【図１１】吸入研究からの経時的な血漿中パクリタキセルレベルのグラフである。
【図１２】吸入研究からの経時的な肺組織中パクリタキセルレベルのグラフである。
【図１３】吸入研究からの経時的な動物体重のグラフである。
【図１４】吸入研究からの経時的な動物体重変化のグラフである。
【図１５】吸入研究からの経時的な血漿中パクリタキセルレベルのグラフである。
【図１６】吸入研究からの経時的な肺組織中パクリタキセルレベルのグラフである。
【図１７】同所性肺癌研究からの経時的な動物体重のグラフである。
【図１８】同所性肺癌研究からの経時的な動物体重変化のグラフである。
【図１９】同所性肺癌研究からの動物肺重量のプロットである。
【図２０】同所性肺癌研究からの動物の体重に対する肺重量の比率のプロットである。
【図２１】同所性肺癌研究からの動物の脳重量に対する肺重量の比率のプロットである。
【図２２】同所性肺癌研究からの平均腫瘍面積のグラフである。
【図２３】同所性肺癌研究からの平均腫瘍面積のプロットである。
【図２４】同所性肺癌研究からの腫瘍退縮のプロットである。
【図２５】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（１００６（対照）腺癌−３、原始−１、退縮−０）。肺腫瘍塊の主な特徴。（２倍）。
【図２６】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（１００６対照、腺癌−３、原始−１、退縮−０）。肺腫瘍塊内の未分化細胞の主な特徴。
【図２７】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（１００６（対照）腺癌−３、原始−１、退縮−０）。肺腫瘍塊内の未分化細胞の主な特徴。
【図２８】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（１００６（対照）腺癌−３、原始−１、退縮−０）。肺胞腔内の塊を示す肺腫瘍塊内の未分化細胞の主な特徴。ａ（２０倍）。
【図２９】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（１００６（対照）腺癌−３、原始−１、退縮−０）。肺腫瘍塊内の原始細胞の主な特徴。ｂ（１０倍）。
【図３０】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（１００６（対照）腺癌−３、原始−１、退縮−０）。肺腫瘍塊内の原始細胞の主な特徴。ｂ２０倍。
【図３１】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（１００６（対照）腺癌−３、原始−１、退縮−０）。肺腫瘍塊内の原始細胞の主な特徴。ｂ（４０倍）。
【図３２】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（１００６（対照）腺癌−３、原始−１、退縮−０）。肺腫瘍塊内の原始細胞の主な特徴。ｂ（４０倍）。
【図３３】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（１００６（対照）腺癌−３、原始−１、退縮−０、細気管支）。細気管支内を示す未分化細胞の主な特徴。ｃ（２０倍）。
【図３４】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（１００６（対照）腺癌−３、原始−１、退縮−０、腺）。肺腫瘍塊内の腺房腺分化の主な特徴。ｄ（１０倍）。
【図３５】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（１００６（対照）腺癌−３、原始−１、退縮−０、腺）。肺腫瘍塊内の腺房腺分化の主な特徴。ｄ（２０倍）。
【図３６】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（２００１（ＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））腺癌−２、原始−１、退縮−０）。細気管支下を押圧し、かつ血管内浸潤の兆候を示さない肺腫瘍塊の主な特徴。（２倍）。
【図３７】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（２００１（ＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））腺癌−２、原始−１、退縮−０）。細気管支下を押圧し、かつ血管内浸潤の兆候を示さない肺腫瘍塊の主な特徴。（４倍）。
【図３８】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（２００１（ＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））腺癌−２、原始−１、退縮−０）。細気管支下を押圧する肺腫瘍塊の主な特徴。（１０倍）。
【図３９】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（２００３（ＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））腺癌−１、原始−１、退縮−１）。退縮中の肺腫瘍塊の特徴。（４倍）。
【図４０】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（２００３（ＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））腺癌−１、原始−１、退縮−１）。退縮中の肺腫瘍塊の特徴。（１０倍）。
【図４１】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（２００３（ＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））腺癌−１、原始−１、退縮−１）。退縮中の肺腫瘍塊の特徴。（２０倍）。
【図４２】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（２００３（ＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））腺癌−１、原始−１、退縮−１）。退縮中の肺腫瘍塊の特徴。縁部に沿ったリンパ球およびマクロファージに留意されたい。１（４０倍）。
【図４３】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（２００３（ＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））腺癌−１、原始−１、退縮−１）。退縮中の肺腫瘍塊の特徴。縁部に沿ったリンパ球およびマクロファージに留意されたい。２（４０倍）。
【図４４】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（２００３（ＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））腺癌−１、原始−１、退縮−１）。退縮中の肺腫瘍塊の特徴。より大きい泡沫状の色素性マクロファージに留意されたい。２、２×（４０倍）。
【図４５】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（２０１０（ＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））腺癌−３、原始−１、退縮−０）。肺腫瘍塊の主な特徴。（２倍）。
【図４６】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（２０１０（ＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））腺癌−３、原始−１、退縮−０）。肺腫瘍塊の主な特徴。（２０倍）。
【図４７】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（２０１０（ＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））腺癌−３、原始−１、退縮−０）。肺腫瘍塊の主な特徴。縁部に沿ったマクロファージのわずかな兆候に留意されたい。（４０倍）。
【図４８】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（４００９（ＩＨ  ｎＰａｃ  １×高）腺癌−０、原始−０、退縮−４）。完全に退縮した肺腫瘍塊の特徴。（２倍）。
【図４９】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（４００９（ＩＨ  ｎＰａｃ  １×高）腺癌−０、原始−０、退縮−４）。完全に退縮した肺腫瘍塊の特徴。間質性線維症に留意されたい。（１０倍）。
【図５０】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（４００９（ＩＨ  ｎＰａｃ  １×高）腺癌−０、原始−０、退縮−４）。完全に退縮した肺腫瘍塊の特徴。間質性線維症、ならびに縁部に沿ったリンパ球およびマクロファージに留意されたい。（４０倍）。
【図５１】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（５０１０（ＩＨ  ｎＰａｃ  ２×低）腺癌−１、原始−０、退縮−３）。退縮中の肺腫瘍塊の特徴。（２倍）。
【図５２】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（５０１０（ＩＨ  ｎＰａｃ  ２×低）腺癌−１、原始−０、退縮−３）。退縮中の肺腫瘍塊の特徴。（１０倍）。
【図５３】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（５０１０（ＩＨ  ｎＰａｃ  ２×低）腺癌−１、原始−０、退縮−３）。退縮中の肺腫瘍塊の特徴。（２０倍）。
【図５４】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（５０１０（ＩＨ  ｎＰａｃ  ２×低）腺癌−１、原始−０、退縮−３）。退縮中の肺腫瘍塊の特徴。（４０倍）。
【図５５】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（６００５（ＩＨ  ｎＰａｃ  ２×高）腺癌−１、原始−０、退縮−４）。退縮中の肺腫瘍塊の特徴。（２倍）。
【図５６】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（６００５（ＩＨ  ｎＰａｃ  ２×高）腺癌−１、原始−０、退縮−４）。退縮中の肺腫瘍塊の特徴。間質性線維症、ならびに縁部に沿ったリンパ球およびマクロファージに留意されたい。（１０倍）。
【図５７】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（６００５（ＩＨ  ｎＰａｃ  ２×高）腺癌−１、原始−０、退縮−４）。退縮中の肺腫瘍塊の特徴。縁部に沿ったリンパ球およびマクロファージに留意されたい。（２０倍）。
【図５８】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（６００５（ＩＨ  ｎＰａｃ  ２×高）腺癌−１、原始−０、退縮−４）。縁部に沿ったリンパ球およびマクロファージに留意されたい。（４０倍）。
【図５９】Ｈ＆Ｅで染色した同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である（６００５（ＩＨ  ｎＰａｃ  ２×高）腺癌−１、原始−０、退縮−４）。肺胞内の残留腫瘍細胞の焦点領域の存在に留意されたい。２（４０倍）。
【図６０】同所性肺癌組織スライド（対照）の様々な顕微鏡写真である。上の行：Ｈ／Ｅで染色した切片。下の行：ケラチンまたはＣＤ１１ｂでの免疫組織化学的染色。
【図６１】同所性肺癌組織スライド（ＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））の様々な顕微鏡写真である。上の行：Ｈ／Ｅで染色した切片。下の行：ケラチンまたはＣＤ１１ｂでの免疫組織化学的染色。
【図６２】同所性肺癌組織スライド（吸入されたｎＰａｃ）の様々な顕微鏡写真である。Ｈ／Ｅ染色、トリクローム、ケラチン、およびＣＤ１１ｂでの様々な染色。
【図６３】ＴＬＳの存在を示す同所性肺癌組織スライドの顕微鏡写真である。
【図６４】膀胱癌異種移植片研究からの経時的な平均腫瘍体積のグラフである。ｘ軸上の矢印は、投与時点を表す。
【図６５】膀胱癌異種移植片研究からのビヒクル  ３サイクルの場合の経時的な個別の腫瘍体積のグラフである。ｘ軸上の三角形は、投与時点を表す。
【図６６】膀胱癌異種移植片研究からのドセタキセルＩＶ  ３サイクルの場合の経時的な個別の腫瘍体積のグラフである。ｘ軸上の三角形は、投与時点を表す。
【図６７】膀胱癌異種移植片研究からのナノ粒子ドセタキセル（ｎＤｏｃｅ）ＩＴ  １サイクルの場合の経時的な個別の腫瘍体積のグラフである。ｘ軸上の三角形は、単回投与時点を表す。
【図６８】膀胱癌異種移植片研究からのｎＤｏｃｅ  ＩＴ  ２サイクルの場合の経時的な個別の腫瘍体積のグラフである。ｘ軸上の三角形は、投与時点を表す。
【図６９】膀胱癌異種移植片研究からのｎＤｏｃｅ  ３サイクルの場合の経時的な個別の腫瘍体積のグラフである。ｘ軸上の三角形は、投与時点を表す。
【図７０】膀胱癌異種移植片研究からの１日目の処理時点での腫瘍体積に対する研究終了時の腫瘍体積の散布図である。
【図７１】膀胱癌異種移植片研究からの経時的な平均体重のグラフである。ｘ軸上の矢印は、投与時点を表す。
【図７２】膀胱癌異種移植片研究からの各投与群の６１日目の平均腫瘍体積のグラフである。
【図７３】膀胱癌異種移植片研究からの腫瘍移植後２７日目、４０日目、および６１日目の各投与群からの動物の写真である。
【図７４】膀胱癌異種移植片研究からのｎＤｏｃｅ  １サイクル、２サイクル、および３サイクルの場合の腫瘍組織中のドセタキセル濃度のグラフである。
【図７５】膀胱癌異種移植片組織スライド（ＩＴビヒクル対照）の顕微鏡写真である。Ｈ＆Ｅ。倍率２．５２倍。
【図７６】膀胱癌異種移植片組織スライドの顕微鏡写真である（ＩＴビヒクル対照）。Ｈ＆Ｅ。倍率６．３倍。
【図７７】膀胱癌異種移植片組織スライドの顕微鏡写真である（ＩＴビヒクル対照）。Ｈ＆Ｅ。倍率２５．２倍。
【図７８】膀胱癌異種移植片組織スライドの顕微鏡写真である（ＩＶドセタキセル３サイクル）。Ｈ＆Ｅ。倍率２．５２倍。
【図７９】膀胱癌異種移植片組織スライドの顕微鏡写真である（ＩＶドセタキセル３サイクル）。Ｈ＆Ｅ。倍率６．３倍。
【図８０】膀胱癌異種移植片組織スライドの顕微鏡写真である（ＩＶドセタキセル３サイクル）。Ｈ＆Ｅ。倍率２５．２倍。
【図８１】膀胱癌異種移植片組織スライドの顕微鏡写真である（ＩＴ  ｎＤｏｃｅ  ２サイクル）。Ｈ＆Ｅ。倍率２．５２倍。
【図８２】膀胱癌異種移植片組織スライドの顕微鏡写真である（ＩＴ  ｎＤｏｃｅ  ２サイクル）。Ｈ＆Ｅ。倍率６．３倍。
【図８３】膀胱癌異種移植片組織スライドの顕微鏡写真である（ＩＴ  ｎＤｏｃｅ  ３サイクル）。Ｈ＆Ｅ。倍率２．５２倍。
【図８４】膀胱癌異種移植片組織スライドの顕微鏡写真である（ＩＴ  ｎＤｏｃｅ  ３サイクル）。Ｈ＆Ｅ。倍率２．５２倍。
【図８５】膀胱癌異種移植片組織スライドの顕微鏡写真である（ＩＴ  ｎＤｏｃｅ  ３サイクル）。Ｈ＆Ｅ。倍率２５．２倍。
【図８６】膀胱癌異種移植片組織スライドの顕微鏡写真である（ＩＴビヒクル対照３サイクル、Ｆ４／８０染色）。倍率２．５２倍。
【図８７】膀胱癌異種移植片組織スライドの顕微鏡写真である（ＩＶドセタキセル３サイクル、Ｆ４／８０染色）。倍率２．５２倍。
【図８８】膀胱癌異種移植片組織スライドの顕微鏡写真である（ＩＴ  ｎＤｏｃｅ  ３サイクル、Ｆ４／８０染色）。倍率２．５２倍。
【図８９】膀胱癌異種移植片組織スライドの対照症例様々な顕微鏡写真である。Ｈ＆Ｅ染色およびＣＤ６８染色。
【図９０】膀胱癌異種移植片組織スライドのＩＴ  ｎＤｏｃｅ症例の様々な顕微鏡写真である。１行目：ｎＤｏｃｅを１サイクル（１×）。２行目：ｎＤｏｃｅ処理を２サイクル（２×）。３行目：ｎＤｏｃｅ処理を２サイクル（２×）。４行目：ｎＤｏｃｅ処理を３サイクル（３×）。
【図９１】雌ラット由来の腎細胞腺癌異種移植片組織スライドの顕微鏡写真である（未処理）。Ｈ＆Ｅ。倍率６．３倍。
【図９２】雌ラット由来の腎細胞腺癌異種移植片組織スライドの顕微鏡写真である（ビヒクル対照（ＩＴ）３サイクル）。Ｈ＆Ｅ。倍率６．３倍。
【図９３】雌ラット由来の腎細胞腺癌異種移植片組織スライドの顕微鏡写真である（ドセタキセル溶液（ＩＶ）３サイクル）。Ｈ＆Ｅ。倍率６．３倍。
【図９４】雌ラット由来の腎細胞腺癌異種移植片組織スライドの顕微鏡写真である（ｎＤｏｃｅ（ＩＴ）３サイクル）。Ｈ＆Ｅ。倍率６．３倍。
【図９５】腎細胞腺癌異種移植片組織スライドの対照症例の様々な顕微鏡写真である。上の行：Ｈ＆Ｅで染色した切片。下の行：免疫組織化学的染色。
【図９６】腎細胞腺癌異種移植片組織スライドのＩＴ  ｎＤｏｃｅ症例の様々な顕微鏡写真である。１行目：ｎＤｏｃｅを１サイクル（１×）。２行目：ｎＤｏｃｅを１サイクル（１×）。３行目：ｎＤｏｃｅを２サイクル（２×）。４行目：ｎＤｏｃｅを２サイクル（２×）。５行目：ｎＤｏｃｅを３サイクル（３×）。
【図９７】腎細胞腺癌異種移植片研究からのｎＰａｃ群のラットの経時的な平均腫瘍体積のグラフである。ｘ軸上の三角形は、投与時点を表す。
【図９８】腎細胞腺癌異種移植片研究からのｎＤｏｃｅ群のラットの経時的な平均腫瘍体積のグラフである。ｘ軸上の三角形は、投与時点を表す。
【図９９】３６ｍｇ／ｋｇのｎＰａｃをＩＰ投与したマウス由来の腹水および血漿中の経時的なパクリタキセル濃度のグラフである。
【図１００】３６ｍｇ／ｋｇのｎＤｏｃｅをＩＰ投与したマウス由来の腹水および血漿中の経時的なドセタキセル濃度のグラフである。
【図１０１】３６ｍｇ／ｋｇのＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）およびＴａｘｏｌ（登録商標）をＩＰ投与したマウス由来の血漿中の経時的なパクリタキセル濃度のグラフである。
【図１０２】３６ｍｇ／ｋｇのＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）およびＴａｘｏｌ（登録商標）をＩＰ投与したマウス由来の腹水中の経時的なパクリタキセル濃度のグラフである。
【図１０３】Ｒｅｎｃａ同系異種移植片研究からの群１〜７の腫瘍体積中央値結果のグラフである。
【図１０４】Ｒｅｎｃａ同系異種移植片研究からの群１〜７の３４日目の平均腫瘍体積のグラフである。
【図１０５】Ｒｅｎｃａ同系異種移植片研究からの移植後１２〜２０（＋／−１）日目の群８〜１０の平均腫瘍体積のグラフである。
【図１０６】Ｒｅｎｃａ同系異種移植片研究におけるフローサイトメトリーによって決定される総生細胞数のパーセントとして表される各動物および各フォーミュラ投与に対する血液中のＣＤ４５＋細胞のパーセンテージのグラフである。
【図１０７】Ｒｅｎｃａ同系異種移植片研究におけるフローサイトメトリーによって決定されるＣＤ４５＋細胞のパーセントとして表される各動物および各フォーミュラ投与に対する血液中のＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージのグラフである。
【図１０８】Ｒｅｎｃａ同系異種移植片研究におけるフローサイトメトリーによって決定されるＣＤ４５＋細胞のパーセントとして表される各動物および各フォーミュラ投与に対する血液中のＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージのグラフである。
【図１０９】Ｒｅｎｃａ同系異種移植片研究におけるフローサイトメトリーによって決定されるＣＤ４５＋細胞のパーセントとして表される各動物および各フォーミュラ投与に対する血液中のＭＤＳＣのパーセンテージのグラフである。
【図１１０】Ｒｅｎｃａ同系異種移植片研究におけるフローサイトメトリーによって決定されるＣＤ４５＋細胞のパーセントとして表される各動物および各フォーミュラ投与に対する血液中のＴｒｅｇ細胞のパーセンテージのグラフである。
【図１１１】Ｒｅｎｃａ同系異種移植片研究におけるフローサイトメトリーによって決定されるＣＤ４５＋細胞のパーセントとして表される各動物および各フォーミュラ投与に対する血液中のＭ１マクロファージのパーセンテージのグラフである。
【図１１２】Ｒｅｎｃａ同系異種移植片研究におけるフローサイトメトリーによって決定されるＣＤ４５＋細胞のパーセントとして表される各動物および各フォーミュラ投与に対する血液中のＭ２マクロファージのパーセンテージのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
悪性腫瘍を有する対象から腫瘍特異的免疫細胞を単離するための方法が本明細書に開示される。本方法は、（ａ）タキサン粒子を含む組成物を腫瘍に１回以上の別個の投与で局所投与して、インビボでの対象における腫瘍特異的免疫細胞の産生を誘導することと、（ｂ）対象の血液からおよび／または対象の腫瘍部位での組織もしくはその周辺の組織から腫瘍特異的免疫細胞を単離し、それにより、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団を提供することと、を含み、腫瘍特異的免疫細胞が悪性腫瘍に対する特異性を有する。
【００４０】
本発明者らは、対象における悪性腫瘍へのタキサン粒子を含む組成物の局所投与（例えば、局所的投与、肺投与、腫瘍内注射投与、腹腔内注射投与、膀胱内注入投与）により、対象の内因性免疫系が刺激され、（１）インビボでの免疫細胞の産生、および（２）これらの免疫細胞の血液系中ならびに腫瘍部位中およびその周辺への浸潤がもたらされることを発見した。以下の実施例１０に開示される研究は、これらの免疫細胞が対象の悪性腫瘍型に腫瘍特異的であることを示している。したがって、対象の血液および／または腫瘍組織からこれらの腫瘍特異的免疫細胞を単離することにより、それらは、それらを対象または同じ悪性腫瘍型を有する他の患者に戻し投与することによる養子細胞療法として特定の悪性腫瘍型の治療に有用になる。加えて、これらの腫瘍特異的免疫細胞は、特定の悪性腫瘍型の発症または再発を予防するワクチンに有用である。腫瘍特異的免疫細胞には、樹状細胞、ＣＤ４５＋細胞、マクロファージ、Ｍ１マクロファージ、リンパ球、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団は、対照免疫細胞集団と比較してＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の濃度が増強されている。
【００４１】
いずれの特定の機構にも限定されることなく、かかる効果は、例えば、リンパ球が悪性腫瘍に対するそれらの生得的免疫学的応答のみならず適応的免疫学的応答も活性化するのに十分な時間を提供することを含み得、全て、ＩＶ化学療法の追加の関連毒性を伴わない。例えば、いずれの特定の機構にも限定されることなく、タキサン粒子の局所投与による局所腫瘍細胞死滅により、抗原提示細胞によって特定される腫瘍細胞抗原が放出される。その後、活性化された抗原提示細胞は、患者の血管系中を循環するＴ細胞、Ｂ細胞、および他の殺腫瘍細胞に腫瘍特異的抗原を提示し、腫瘍を含有する組織に進入し得る。したがって、タキサン粒子は、対象の免疫応答を刺激し、かつインビボでの腫瘍特異的免疫細胞の産生の増強をもたらすためのアジュバントとして作用する。タキサンの局所濃度は長期間（例えば、少なくとも１０日間または少なくとも２８日間）にわたって腫瘍部位で上昇したままであり、これにより、局所腫瘍細胞の死滅および免疫応答の刺激のために腫瘍がタキサンに曝露されるのに十分な時間が提供される。タキサン粒子の局所投与による免疫系のこの刺激は、患者の循環血液中に付随する高レベルのタキサンを産生することなく生じる。したがって、タキサン粒子組成物の局所投与は、リンパ球等の白血球数の減少を伴う骨髄中での造血を低減しない。骨髄抑制は、高濃度の循環タキサンによるＩＶ投与時のタキサンの一般的な副作用である。
【００４２】
いずれの特定の機構にも限定されることなく、本明細書に開示される方法は、抗原提示細胞の一種である樹状細胞の活性化により局所免疫学的応答を刺激するのに十分な濃度のタキサンを長期間にわたって産生し得る。樹状細胞の活性化は、それらが豊富に見られる皮膚または肺で最も顕著に生じ得る。例えば、タキサン粒子の皮膚腫瘍への局所的投与は、タキサンの腫瘍細胞への進入を引き起こし、それらの分裂周期中にそれらを死滅させ、それらを免疫認識により到達し易くする。その領域内の樹状細胞は、腫瘍抗原への到達の増加によって活性化されるようになり、その後、抗原をリンパ球に提示する。次いで、リンパ球は、患者の体全体を循環し、腫瘍細胞の細胞表面抗原に特異的である液性メディエーターを産生する。
【００４３】
悪性腫瘍を有し、かつタキサン粒子を含む組成物の悪性腫瘍への局所投与を受けている対象から単離された腫瘍特異的免疫細胞集団を含む養子細胞療法およびワクチンのための細胞組成物であって、対象から得られた単離された腫瘍特異的免疫細胞集団が悪性腫瘍型に特異的である、細胞組成物も本明細書に開示される。これらの細胞組成物およびワクチンを使用する方法も本明細書に開示される。
【００４４】
Ｉ．対象から腫瘍特異的免疫細胞を単離するための方法
悪性腫瘍を有する対象から腫瘍特異的免疫細胞を単離するための方法が本明細書に開示される。本方法は、（ａ）タキサン粒子を含む組成物を腫瘍に１回以上の別個の投与で局所投与して、インビボでの対象における腫瘍特異的免疫細胞の産生を誘導することと、（ｂ）対象の血液からおよび／または対象の腫瘍部位での組織もしくはその周辺の組織から腫瘍特異的免疫細胞を単離し、それにより、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団を提供することと、を含み、腫瘍特異的免疫細胞が悪性腫瘍に対する特異性を有する。
【００４５】
ステップ（ａ）における組成物の局所投与は、１回以上または２回以上の別個の投与であり得る。いくつかの実施形態では、２回以上の別個の投与は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、もしくは１４日間間隔でまたは少なくともそれらの間隔で投与される。いくつかの実施形態では、２回以上の別個の投与は、２〜１２、２〜１１、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜１２、３〜１１、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜１２、４〜１１、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜１２、５〜１１、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、５〜６、６〜１２、６〜１１、６〜１０、６〜９、６〜８、６〜７、７〜１２、７〜１１、７〜１０、７〜９、７〜８、８〜１２、８〜１１、８〜１０、８〜９、９〜１２、９〜１１、９〜１０、１０〜１２、１０〜１１、１１〜１２、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間間隔で投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、２〜５、２〜４、２〜３、３〜５、３〜４、２、３、４、５回、またはそれ以上の別個の投与で投与される。いくつかの実施形態では、２回以上の別個の投与は、少なくとも２週間にわたって週１回投与される。他の実施形態では、２回以上の別個の投与は、少なくとも１週間にわたって週２回投与され、２回以上の別個の投与は、少なくとも１日間隔である。いくつかの実施形態では、本方法により、腫瘍の除去（根絶）がもたらされる。いくつかの実施形態では、組成物は、１、２、３、４、５、６回、またはそれ以上の別個の投与で投与される。他の実施形態では、組成物は、７回またはそれ以上の別個の投与で投与される。
【００４６】
単離ステップ（ｂ）は、投与ステップ（ａ）後の、腫瘍特異的細胞が対象においてインビボで産生されるのに十分な時点で起こり得、投与ステップの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６日後、またはそれ以上であり得る。１つより多くの投与ステップが行われる場合、単離ステップは、投与ステップのうちのいずれか１つの後に起こり得るか、または最終投与ステップ後に起こり得る。いくつかの実施形態では、単離ステップは、投与ステップまたは最終投与ステップ後３０日、３５日、４０日、４５日、５０日、５５日、６０日、６５日、７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、１００日、１０５日、１１０日、１１５日以内に、または１２０日以内に起こる。いくつかの実施形態では、単離ステップは、各々の別個の投与ステップ後に繰り返され、各々の繰り返された単離ステップから得られた単離された腫瘍特異的免疫細胞集団はプールされ得る。
【００４７】
悪性腫瘍は、肉腫、癌腫、リンパ腫、固形腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、頭頸部腫瘍、腹腔内臓器腫瘍、脳腫瘍、膠芽細胞腫、膀胱腫瘍、膵臓腫瘍、肝腫腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍、皮膚腫瘍、皮膚転移、リンパ系、胃腸腫瘍、肺腫瘍、骨腫瘍、黒色腫、網膜芽細胞腫、もしくは腎臓腫瘍、またはそれらの転移性腫瘍であり得るが、これらに限定されない。
【００４８】
単離された腫瘍特異的免疫細胞集団は、樹状細胞、ＣＤ４５＋細胞、リンパ球、白血球、マクロファージ、Ｍ１マクロファージ、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のうちの少なくとも１つを含み得るが、これらに限定されない。
【００４９】
いくつかの実施形態では、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団は、対象の血液から単離される。免疫細胞は、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスを含むが、これらに限定されない方法および技法によって血液から単離され得る。いくつかの実施形態では、血液から単離された腫瘍特異的免疫細胞集団は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団の約４％〜約１５％を構成する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、約１％〜約５０％、または約１％〜約４０％、または約１％〜約３０％、または約１％〜約２５％、または約１％〜約２０％、または約１％〜約１５％、または約４％〜約５０％、または約４％〜約４０％、または約４％〜約３０％、または約４％〜約２５％、または約４％〜約２０％、または約１０％〜約５０％、または約１０％〜約４０％、または約１０％〜約３０％、または約１０％〜約２５％、または約１０％〜約２０％、または約１０％〜約１５％を構成する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団の約３％〜約１０％を構成する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、約１％〜約５０％、または約１％〜約４０％、または約１％〜約３０％、または約１％〜約２５％、または約１％〜約２０％、または約１％〜約１５％、または約１％〜約１０％、または約３％〜約５０％、または約３％〜約４０％、または約３％〜約３０％、または約３％〜約２５％、または約３％〜約２０％、または約３％〜約１５％、または約１０％〜約５０％、または約１０％〜約４０％、または約１０％〜約３０％、または約１０％〜約２５％、または約１０％〜約２０％、または約１０％〜約１５％を構成する。いくつかの実施形態では、血液から単離された腫瘍特異的免疫細胞集団は、対照免疫細胞集団よりも多いＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞集団、ならびにそれよりも少ない骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の細胞集団を含む。以下の実施例１０に開示される研究は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な増加、ならびにフローサイトメトリーによって示される、対照免疫細胞集団と比較した血液から採取された単離された腫瘍特異的免疫細胞集団中のＭＤＳＣの減少への傾向を示す。対照免疫細胞集団は、投与ステップの前に対象の血液から単離され得るか、または悪性腫瘍型を有し、かつタキサン組成物の静脈内（ＩＶ）投与を受けている対象の血液から単離され得るか、または悪性腫瘍型を有しない対象の血液から単離され得る。いくつかの実施形態では、対照免疫細胞集団は、悪性腫瘍型に特異的ではない免疫細胞を含むか、またはそれからなる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団は、対象の腫瘍部位の組織またはその周辺の組織から単離される。免疫細胞は、組織を外科的に除去し、細胞を除去された組織から分離することを含むが、これらに限定されない方法および技法によって組織から単離され得る。外科的技法には、生検が含まれ得る。細胞は、当業者に既知の方法および技法によって外科的に除去された組織から分離され得、その例には、細胞懸濁技法が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、対象の腫瘍部位の組織またはその周辺の組織から単離された単離された腫瘍特異的免疫細胞集団は、Ｍ１マクロファージを含む。いくつかの実施形態では、Ｍ１マクロファージは、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団の約２０％〜約４０％を構成する。
【００５１】
単離された腫瘍特異的免疫細胞集団は、エクスビボで濃縮されて、濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団を産生し得、かつ／またはエクスビボで増殖されて、増殖された腫瘍特異的免疫細胞集団を産生し得、かつ／または増殖され濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団を産生し得る。単離された腫瘍特異的免疫細胞集団、濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団、増殖された腫瘍特異的免疫細胞集団、および／または増殖され濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団は、凍結および／または保管され得る。単離された腫瘍特異的免疫細胞集団が濃縮され得、濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団の細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４５＋細胞、およびＭ１マクロファージ、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００５２】
単離された腫瘍特異的免疫細胞集団、濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団、増殖された腫瘍特異的免疫細胞集団、および／または増殖され濃縮された腫瘍特異的免疫細胞集団は、エクスビボで修飾され得る。修飾する方法には、細胞を抗体に曝露すること、細胞をペプチドに曝露すること、細胞を生物学的応答修飾因子に曝露すること、細胞をサイトカインもしくはその類似体に曝露すること、細胞を成長因子もしくはその類似体に曝露すること、細胞を抗原に曝露すること、細胞をＲＮＡもしくは低分子干渉ＲＮＡに曝露すること、細胞を全細胞溶解物と共培養すること、細胞を人工抗原提示細胞と共培養すること、細胞を他の細胞型と共培養すること、細胞を遺伝子操作すること、細胞の遺伝子転写を上方制御すること細胞、細胞の遺伝子転写を下方制御すること、レンチウイルスベクターを細胞にトランスフェクトすること、プラスミドＤＮＡを細胞にトランスフェクトすること、ｍＲＮＡを細胞にヌクレオフェクトすること、細胞を、レトロウイルスベクターを介して操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする遺伝子で形質導入すること、および／または遺伝子ノックアウトもしくはＣＲＩＳＰＲ法によって細胞の遺伝子を遺伝的に不活性化することが含まれ得るが、これらに限定されない。修飾された腫瘍特異的免疫細胞集団は、凍結および／または保管され得る。
【００５３】
ＩＩ．細胞組成物、がんワクチン、およびそれらを使用する方法
本明細書に開示される悪性腫瘍を有する対象から腫瘍特異的免疫細胞を単離するための方法のうちのいずれかによって得られた単離された腫瘍特異的免疫細胞、濃縮された腫瘍特異的免疫細胞、増殖された腫瘍特異的免疫細胞、増殖され濃縮された腫瘍特異的免疫細胞、および／または修飾された腫瘍特異的免疫細胞集団を含む細胞組成物が本明細書に開示される。
【００５４】
悪性腫瘍を有し、かつタキサン粒子を含む組成物の悪性腫瘍への局所投与を受けている対象から単離された腫瘍特異的免疫細胞集団を含む細胞組成物であって、対象から得られた単離された腫瘍特異的免疫細胞集団が悪性腫瘍型に特異的である、細胞組成物も本明細書に開示される。
【００５５】
細胞組成物は、担体をさらに含み得る。細胞組成物は、細胞懸濁液であり得る。担体は、水性担体等の液体（流体）担体であり得る。好適な水性担体の非限定的な例には、注射用滅菌水ＵＳＰ、注射用０．９％塩化ナトリウムＵＳＰ等の０．９％食塩水溶液（生理食塩水）、注射用５％デキストロースＵＳＰ等のデキストロース溶液、および注射用乳酸リンゲル液ＵＳＰが挙げられる。非水性系液体担体および他の水性系液体担体が使用され得る。担体は、薬学的に許容される担体、すなわち、注射、注入、または他の投与経路による対象への投与に好適な担体であり得る。担体は、エマルションまたは流動性半固体等の他のタイプの液体であり得る。流動性半固体の非限定的な例には、ゲルおよび熱硬化性ゲルが挙げられる。担体を含む細胞組成物は、注入投与等のために希釈剤でさらに希釈され得る。好適な希釈剤は、水性流体等の流体であり得る。好適な水性希釈剤の非限定的な例には、注射用滅菌水ＵＳＰ、注射用０．９％塩化ナトリウムＵＳＰ等の０．９％食塩水溶液（生理食塩水）、注射用５％デキストロースＵＳＰ等のデキストロース溶液、および注射用乳酸リンゲル液ＵＳＰが挙げられる。注射、注入、または他の投与経路による投与に好適な他の液体および水性系希釈剤が使用され得、任意に、塩、緩衝剤、および／または他の賦形剤を含み得る。いくつかの実施形態では、希釈剤は、滅菌である。いくつかの実施形態では、細胞組成物は、滅菌である。いくつかの実施形態では、担体は、自然界に見られる物質のみからなるのではない。いくつかの実施形態では、担体は、血液ではない。
【００５６】
細胞組成物は、悪性腫瘍を有し、かつタキサン粒子を含む組成物の悪性腫瘍への局所投与を受けている対象から単離された腫瘍特異的免疫細胞集団を含み得、単離された腫瘍特異的免疫細胞集団は、対照免疫細胞集団と比較してＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の濃度が増強されている。いくつかの実施形態では、対照免疫細胞集団は、悪性腫瘍型に特異的ではない免疫細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、対照免疫細胞集団は、タキサン粒子を含む組成物の腫瘍への局所投与前に対象から単離された免疫細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、対照免疫細胞集団は、悪性腫瘍型を有し、かつタキサン組成物の静脈内（ＩＶ）投与を受けている対象から単離された免疫細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、対照免疫細胞集団は、悪性腫瘍型を有しない対象から単離された免疫細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍特異的免疫細胞集団は、約４％〜約１５％のＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍特異的免疫細胞集団は、約３％〜約１０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。
【００５７】
細胞組成物は、免疫治療薬またはチェックポイント阻害剤を含むが、これらに限定されない１つ以上の治療薬をさらに含み得る。
【００５８】
本明細書に開示される細胞組成物は、がんおよび転移性がんの治療のための養子細胞療法に使用され得る。がんまたは転移性がんを有する対象におけるがんまたは転移性がんを治療する方法であって、対象に、本明細書に開示される細胞組成物を投与することを含む、方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、治療は、自家治療である。他の実施形態では、治療は、同種治療である。細胞組成物は、静脈内投与、静脈内注射、静脈内注入／灌流／ボーラス、動脈内注射、動脈内注入／灌流、ボーラス、リンパ内注入、結節内注入、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、膀胱内注入、腫瘍内注射、腫瘍周辺注射、肺投与、局所的投与、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない方法によって投与され得る。いくつかの実施形態では、がんまたは転移性がんは、タキサン粒子を含む組成物が局所投与された悪性腫瘍と同じ悪性腫瘍型である。
【００５９】
本明細書に開示される細胞組成物のうちのいずれか１つを含む、がんを予防するか、またはがんの再発を予防するためのワクチンが本明細書に開示される。
【００６０】
対象におけるがんを予防するか、またはがんの再発を予防する方法であって、対象に、本明細書に開示されるワクチンを投与することを含む、方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、自家ワクチンである。他の実施形態では、ワクチンは、同種ワクチンである。ワクチンは、静脈内投与、静脈内注射、静脈内注入／灌流／ボーラス、動脈内注射、動脈内注入／灌流、ボーラス、リンパ内注入、結節内注入、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、膀胱内注入、腫瘍内注射、腫瘍周辺注射、肺投与、局所的投与、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、当業者に既知の方法によって投与され得る。いくつかの実施形態では、がんまたは転移性がんは、タキサン粒子を含む組成物が局所投与された悪性腫瘍と同じ悪性腫瘍型である。いくつかの実施形態では、がんは、タキサン粒子を含む組成物が局所投与された悪性腫瘍と同じ悪性腫瘍型である。
【００６１】
ＩＩＩ．タキサン粒子
タキサンは、一般に室温で１０ｍｇ／ｍＬ以下の水中溶解度を有する難水溶性化合物である。タキサンは、抗腫瘍薬および化学療法薬として広く使用されている。本明細書で使用される「タキサン」という用語には、パクリタキセル（Ｉ）、ドセタキセル（ＩＩ）、カバジタキセル（ＩＩＩ）、および任意の他のタキサンもしくはタキサン誘導体が含まれ、その非限定的な例は、タキソールＢ（セファロマニン）、タキソールＣ、タキソールＤ、タキソールＥ、タキソールＦ、タキソールＧ、タキサジエン、バッカチンＩＩＩ、１０−デアセチルバッカチン、タクスキニンＡ、ブレビホリオール、およびタクススピンＤであり、タキサンの薬学的に許容される塩も含まれる。
【化１】
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【００６２】
パクリタキセルおよびドセタキセル医薬品有効成分（ＡＰＩ）は、Ｐｈｙｔｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＬＬＣ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａから市販されている。ドセタキセルＡＰＩは、無水の無溶媒ベースで計算される、９０％以上、または９５％以上、または９７．５％以上のドセタキセルを含有する。パクリタキセルＡＰＩは、無水の無溶媒ベースで計算される、９０％以上、または９５％以上、または９７％以上のパクリタキセルを含有する。いくつかの実施形態では、パクリタキセルＡＰＩおよびドセタキセルＡＰＩは、ＵＳＰおよび／またはＥＰグレードである。パクリタキセルＡＰＩは、半合成化学プロセスから、または植物細胞の発酵または抽出等の天然源から調製され得る。パクリタキセルはまた、商標名ＴＡＸＯＬ（登録商標）によって呼ばれることもあるが、ＴＡＸＯＬ（登録商標）が、静脈内注入前に好適な非経口液で希釈することを目的とした、ポリオキシエチル化ヒマシ油およびエタノール中のパクリタキセルの溶液の商標名であるため、これは誤称である。タキサンＡＰＩは、タキサン粒子を作製するために使用され得る。タキサン粒子は、パクリタキセル粒子、ドセタキセル粒子、もしくはカバジタキセル粒子、またはタキサンの薬学的に許容される塩の粒子を含む他のタキサン誘導体の粒子であり得る。
【００６３】
タキサン粒子は、直径約０．１ミクロン〜約５ミクロン（約１００ｎｍ〜約５０００ｎｍ）の平均粒径（数）を有する。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、固体のコーティングされていない（ニート）個別粒子である。タキサン粒子は、全身循環によって腫瘍から運び出される可能性が低いサイズ範囲内であり、それにもかかわらず高い比表面積の恩恵を受けて、強化された薬物の可溶化および放出を提供する。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、いずれの物質にも結合していない。いくつかの実施形態では、いかなる物質もタキサン粒子の表面に吸収または吸着されていない。いくつかの実施形態では、タキサンまたはタキサン粒子は、いずれの物質中にもカプセル化、含有、封入、または埋め込みされていない。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、いずれの物質でもコーティングされていない。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、タキサンを含有するマイクロエマルション、ナノエマルション、ミクロスフェア、またはリポソームではない。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、モノマー、ポリマー（もしくは生体適合性ポリマー）、タンパク質、界面活性剤、またはアルブミンのうちの１つ以上に結合していない、それらの中にカプセル化されていない、またはそれらでコーティングされていない。いくつかの実施形態では、モノマー、ポリマー（もしくは生体適合性ポリマー）、タンパク質、界面活性剤、またはアルブミンは、タキサン粒子の表面に吸収または吸着されていない。いくつかの実施形態では、組成物およびタキサン粒子は、アルブミンを除外する。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、結晶形態である。他の実施形態では、タキサン粒子は、非晶質形態、または結晶形態と非晶質形態の両方の組み合わせである。いくつかの実施形態では、本開示のタキサン粒子は、タキサンの調製中に典型的に見られる微量の不純物および副生成物を含有する。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のタキサンを含み、タキサン粒子が、実質的に純粋なタキサンからなるか、またはそれから本質的になることを意味する。
【００６４】
いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、タンパク質（例えば、アルブミン）、モノマー、ポリマー、生体適合性ポリマー、および／または界面活性剤等の物質でコーティングされているか、またはそれらに結合している。いくつかの実施形態では、タンパク質（例えば、アルブミン）、モノマー、ポリマー、生体適合性ポリマー、または界面活性剤等の物質は、タキサン粒子の表面に吸着または吸収されている。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、タンパク質（例えば、アルブミン）、モノマー、ポリマー、生体適合性ポリマー、または界面活性剤等の物質中にカプセル化、含有、封入、または埋め込みされている。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、タキサンを含有するマイクロエマルション、ナノエマルション、ミクロスフェア、またはリポソームである。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、非凝集個別粒子であり、非共有結合相互作用、ファンデルワールス力、親水性もしくは疎水性相互作用、静電相互作用、クーロン力、分散材料との相互作用、または官能基を介した相互作用等の相互作用によって一緒に結合される複数のタキサン粒子のクラスターではない。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、より小さい粒子の凝集によって形成される個別のタキサン粒子であり、これらは、一緒に融合してより大きい個別のタキサン粒子を形成し、これらは全てタキサン粒子の処理中に生じる。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、非共有結合相互作用、ファンデルワールス力、親水性もしくは疎水性相互作用、静電相互作用、クーロン力、分散材料との相互作用、または官能基を介した相互作用等の相互作用によって一緒に結合されるタキサン粒子のクラスターまたは凝集体である。
【００６５】
タキサン粒子（パクリタキセル粒子、ドセタキセル粒子、またはカバジタキセル粒子を含むが、これらに限定されない）は、０．１ミクロン〜５ミクロン、０．１ミクロン〜２ミクロン、０．１ミクロン〜１．５ミクロン、０．１ミクロン〜１．２ミクロン、０．１ミクロン〜１ミクロン、または０．１ミクロン〜１ミクロン未満、または０．１ミクロン〜０．９ミクロン、０．１ミクロン〜０．８ミクロン、０．１ミクロン〜０．７ミクロン、０．２ミクロン〜５ミクロン、０．２ミクロン〜２ミクロン、０．２ミクロン〜１．５ミクロン、０．２ミクロン〜１．２ミクロン、０．２ミクロン〜１ミクロン、または０．２ミクロン〜１ミクロン未満、または０．２ミクロン〜０．９ミクロン、０．２ミクロン〜０．８ミクロン、０．２ミクロン〜０．７ミクロン、０．３ミクロン〜５ミクロン、０．３ミクロン〜２ミクロン、０．３ミクロン〜１．５ミクロン、０．３ミクロン〜１．２ミクロン、０．３ミクロン〜１ミクロン、または０．３ミクロン〜１ミクロン未満、または０．３ミクロン〜０．９ミクロン、０．３ミクロン〜０．８ミクロン、０．３ミクロン〜０．７ミクロン、０．４ミクロン〜５ミクロン、０．４ミクロン〜２ミクロン、０．４ミクロン〜１．５ミクロン、０．４ミクロン〜１．２ミクロン、０．４ミクロン〜１ミクロン、または０．４ミクロン〜１ミクロン未満、または０．４ミクロン〜０．９ミクロン、０．４ミクロン〜０．８ミクロン、０．４ミクロン〜０．７ミクロン、０．５ミクロン〜５ミクロン、０．５ミクロン〜２ミクロン、０．５ミクロン〜１．５ミクロン、０．５ミクロン〜１．２ミクロン、０．５ミクロン〜１ミクロン、または０．５ミクロン〜１ミクロン未満、または０．５ミクロン〜０．９ミクロン、０．５ミクロン〜０．８ミクロン、０．５ミクロン〜０．７ミクロン、０．６ミクロン〜５ミクロン、０．６ミクロン〜２ミクロン、０．６ミクロン〜１．５ミクロン、０．６ミクロン〜１．２ミクロン、０．６ミクロン〜１ミクロン、または０．６ミクロン〜１ミクロン未満、または０．６ミクロン〜０．９ミクロン、０．６ミクロン〜０．８ミクロン、０．６ミクロン〜０．７ミクロンの平均粒径（数）を有し得る。タキサン粒子は、全身循環によって腫瘍から運び出される可能性が低いサイズ範囲内であり、それにもかかわらず高い比表面積の恩恵を受けて、強化された薬物の可溶化および放出を提供する。
【００６６】
タキサン粒子の粒径は、粒径アナライザー計器によって決定され得、測定値は、数分布（数）に基づく平均直径として表される。好適な粒径アナライザー計器は、フォトゾーンまたは単一粒子光学検知法（ＳＰＯＳ）とも称される光遮蔽の分析技法を用いるものである。好適な光遮蔽粒径アナライザー計器は、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｏｒｔ  Ｒｉｃｈｅｙ，Ｆｌｏｒｉｄａから入手可能なＡＣＣＵＳＩＺＥＲ  ７８０  ＳＩＳ等のＡＣＣＵＳＩＺＥＲである。別の好適な粒径アナライザー計器は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＳＡＬＤ−７１０１等のレーザー回折を用いるものである。
【００６７】
タキサン粒子は、当該技術分野で既知の様々な粒径低減方法および装置を使用して製造され得る。かかる方法には、湿式または乾式粉砕、微粉化、崩壊、および微粉砕等の従来の粒径低減方法が含まれるが、これらに限定されない。他の方法には、超臨界二酸化炭素等の「圧縮抗溶媒を用いた沈殿」（ＰＣＡ）が含まれる。様々な実施形態では、抗腫瘍薬粒子および／またはタキサン粒子は、全て参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５８７４０２９号、同第５８３３８９１号、同第６１１３７９５号、同第７７４４９２３号、同第８７７８１８１号、同第９２３３３４８号、米国公開第２０１５／０３７５１５３号、同第２０１６／０３５４３３６号、同第２０１６／０３７４９５３号、ならびに国際特許出願公開第２０１６／１９７０９１号、同第２０１６／１９７１００号、および同第２０１６／１９７１０１号に開示されるＰＣＡ方法によって作製される。
【００６８】
超臨界二酸化炭素を使用したＰＣＡ粒径低減方法では、十分に特徴付けられた粒径分布内で０．１〜５ミクロン程度の小さいコーティングされていないタキサン粒子を生成するために、超臨界二酸化炭素（抗溶媒）および溶媒、例えば、アセトンまたはエタノールが用いられる。二酸化炭素および溶媒が処理中に除去され（最大０．５％の残留溶媒が残る場合がある）、タキサン粒子を粉末として残す。安定性研究は、パクリタキセル粒子粉末が、室温で最大５９ヶ月間および加速条件下（４０℃／７５％相対湿度）で最大６ヶ月間保管された場合、バイアル投与形態で安定していることを示す。
【００６９】
様々な超臨界二酸化炭素粒径低減方法によって生成されたタキサン粒子は、物理的衝撃または研削、例えば、湿式または乾式粉砕（ｍｉｌｌｉｎｇ）、微粉化、崩壊、粉砕（ｃｏｍｍｉｎｕｔｉｎｇ）、微小流動化、または微粉砕を使用した従来の粒径低減方法によって生成されたタキサン粒子と比較して、特有の物理的特性を有し得る。参照により本明細書に組み込まれる米国公開第２０１６／０３７４９５３号に開示されるように、かかる特有の特性は、０．０５ｇ／ｃｍ３〜０．１５ｇ／ｃｍ３のかさ密度（タップなし）および少なくとも１８ｍ２／ｇの比表面積（ＳＳＡ）のタキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）粒子を含み、これらは、米国公開第２０１６／０３７４９５３号に記載され、かつ以下に記載される超臨界二酸化炭素粒径低減方法によって生成される。このかさ密度範囲は、一般に、従来の手段によって生成されたタキサン粒子のかさ密度よりも低く、ＳＳＡは、一般に、従来の手段によって生成されたタキサン粒子のＳＳＡよりも高い。これらの特有の特性により、従来の手段によって生成されたタキサンと比較して、水／メタノール媒体中の溶解速度が大幅に高まる。本明細書で使用される場合、「比表面積」（ＳＳＡ）とは、以下の方法によるブルナウアー・エメット・テラー（「ＢＥＴ」）等温線によって測定されるタキサン質量単位あたりのタキサン粒子の総表面積である：２００〜３００ｍｇの既知の質量の検体が３０ｍＬ試料管に添加される。次いで、装填された管は、Ｐｏｒｏｕｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｉｎｃ．ＳＯＲＰＴＯＭＥＴＥＲ（登録商標）、モデルＢＥＴ−２０２Ａに載置される。次いで、自動試験が、ＢＥＴＷＩＮ（登録商標）ソフトウェアパッケージを使用して行われ、その後に各試料の表面積が計算される。当業者であれば理解するであろうように、「タキサン粒子」は、凝集タキサン粒子および非凝集タキサン粒子の両方を含み得、ＳＳＡがグラム単位で決定されるため、組成物中の凝集タキサン粒子および非凝集タキサン粒子の両方が考慮される。凝集タキサン粒子は、より小さい粒子の凝集によって形成される個別のタキサン粒子として本明細書で定義され、これらは、一緒に融合してより大きい個別のタキサン粒子を形成し、これらは全てタキサン粒子の処理中に生じる。ＢＥＴ比表面積試験手順は、米国薬局方および欧州薬局方の両方に含まれる公定法である。かさ密度の測定は、室温でのタッピングなしでタキサン粒子をメスシリンダーに注ぎ、質量および体積を測定し、かさ密度を計算することによって行われ得る。
【００７０】
米国公開第２０１６／０３７４９５３号に開示されるように、研究は、室温で６０分間にわたって６００ＲＰＭで、５ｍｍボールサイズを使用したＤｅｃｏ−ＰＢＭ−Ｖ−０．４１ボールミル内でパクリタキセルを粉砕することによって生成されたパクリタキセル粒子について、１５．０ｍ２／ｇのＳＳＡおよび０．３１ｇ／ｃｍ３のかさ密度を示した。また、米国公開第２０１６／０３７４９５３号に開示されるように、１ロットのパクリタキセル粒子は、以下の方法を使用した超臨界二酸化炭素法によって生成された場合、３７．７ｍ２／ｇのＳＳＡおよび０．０８５ｇ／ｃｍ３のかさ密度を有した：６５ｍｇ／ｍＬのパクリタキセルの溶液をアセトン中で調製した。ＢＥＴＥ  ＭｉｃｒｏＷｈｉｒｌ（登録商標）噴霧ノズル（ＢＥＴＥ  Ｆｏｇ  Ｎｏｚｚｌｅ，Ｉｎｃ．）および音波プローブ（Ｑｓｏｎｉｃａ、型番Ｑ７００）を、およそ８ｍｍ離して結晶化チャンバ内に位置付けた。およそ１００ｎｍの穴を有するステンレス鋼メッシュフィルターを結晶化チャンバに取り付けて、沈殿したパクリタキセル粒子を収集した。超臨界二酸化炭素を製造装置の結晶化チャンバ内に配置し、約３８℃および２４ｋｇ／時間の流量でおよそ１２００ｐｓｉにした。音波プローブを、２０ｋＨｚの周波数で６０％の総出力に調整した。パクリタキセルを含有するアセトン溶液を、４．５ｍＬ／分の流量でおよそ３６時間にわたってノズルを通して送り出した。上記の超臨界二酸化炭素法によって生成されたパクリタキセル粒子の追加のロットは、２２．２７ｍ２／ｇ、２３．９０ｍ２／ｇ、２６．１９ｍ２／ｇ、３０．０２ｍ２／ｇ、３１．１６ｍ２／ｇ、３１．７０ｍ２／ｇ、３２．５９ｍ２／ｇ、３３．８２ｍ２／ｇ、３５．９０ｍ２／ｇ、３８．２２ｍ２／ｇ、および３８．５２ｍ２／ｇのＳＳＡ値を有した。
【００７１】
米国公開第２０１６／０３７４９５３号に開示されるように、研究は、室温で６０分間にわたって６００ＲＰＭで、５ｍｍボールサイズを使用したＤｅｃｏ−ＰＢＭ−Ｖ−０．４１ボールミル内でドセタキセルを粉砕することによって生成されたドセタキセル粒子について、１５．２ｍ２／ｇのＳＳＡおよび０．４４ｇ／ｃｍ３のかさ密度を示した。また、米国公開２０１６／０３７４９５３に開示されているように、ドセタキセル粒子は、以下の方法を使用した超臨界二酸化炭素法によって生成された場合、４４．２ｍ２／ｇのＳＳＡおよび０．０７９ｇ／ｃｍ３のかさ密度を有した：７９．３２ｍｇ／ｍＬのドセタキセルの溶液をエタノール中で調製した。ノズルおよび音波プローブを、およそ９ｍｍ離して加圧可能なチャンバ内に位置付けた。およそ１００ｎｍの穴を有するステンレス鋼メッシュフィルターを加圧可能なチャンバに取り付けて、沈殿したドセタキセル粒子を収集した。超臨界二酸化炭素を製造装置の加圧可能なチャンバ内に配置し、約３８℃および６８ｓｌｐｍの流量でおよそ１２００ｐｓｉにした。音波プローブを、２０ｋＨｚの周波数で６０％の総出力に調整した。ドセタキセルを含有するエタノール溶液を、２ｍＬ／分の流量でおよそ９５分間にわたってノズルを通して送り出した。次いで、沈殿したドセタキセル凝集粒子およびより小さいドセタキセル粒子を、混合物がステンレス鋼メッシュフィルターを通して送り出されるときに超臨界二酸化炭素から収集した。ドセタキセルの粒子を含むフィルターを開き、結果として生じた生成物をフィルターから収集した。
【００７２】
米国公開第２０１６／０３７４９５３号に開示されるように、溶解研究は、室温で６０分間にわたって６００ＲＰＭで、５ｍｍボールサイズを使用したＤｅｃｏ−ＰＢＭ−Ｖ−０．４１ボールミルを使用してパクリタキセルおよびドセタキセルを粉砕することによって作製されたパクリタキセルおよびドセタキセル粒子と比較して、米国公開第２０１６／０３７４９５３号に記載される超臨界二酸化炭素法によって作製されたパクリタキセルおよびドセタキセル粒子のメタノール／水媒体中の溶解速度の増加を示した。溶解速度を決定するために使用される手順は、以下のとおりである。パクリタキセルの場合、およそ５０ｍｇの材料を、約１時間バイアル内で材料とビーズを転動させることによって、約１．５ｇの１ｍｍガラスビーズ上にコーティングした。ビーズをステンレス鋼メッシュ容器に移し、３７℃、ｐＨ７のメタノール／水５０／５０（ｖ／ｖ）媒体および７５ｒｐｍで動作するＵＳＰ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ＩＩ（Ｐａｄｄｌｅ）を含む溶解浴内に配置した。１０、２０、３０、６０、および９０分で、５ｍＬのアリコートを除去し、０．２２μｍのフィルターを通して濾過し、ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計で、２２７ｎｍで分析した。試料の吸光度値を、溶解媒体中で調製した標準溶液の吸光度値と比較して、溶解した材料の量を決定した。ドセタキセルの場合、およそ５０ｍｇの材料を、３７℃、ｐＨ７のメタノール／水１５／８５（ｖ／ｖ）媒体および７５ｒｐｍで動作するＵＳＰ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ＩＩ（Ｐａｄｄｌｅ）を含む溶解浴内に直接配置した。５、１５、３０、６０、１２０、および２２５分で、５ｍＬのアリコートを除去し、０．２２μｍのフィルターを通して濾過し、ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計で、２３２ｎｍで分析した。試料の吸光度値を、溶解媒体中で調製した標準溶液の吸光度値と比較して、溶解した材料の量を決定した。パクリタキセルの場合、溶解速度は、粉砕によって作製された粒子についての３０分で３２％溶解と対比して、超臨界二酸化炭素法によって作製された粒子については３０分で４７％溶解した。ドセタキセルの場合、溶解速度は、粉砕によって作製された粒子についての３０分で９％溶解と対比して、超臨界二酸化炭素法によって作製された粒子については３０分で２７％溶解した。
【００７３】
いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、または少なくとも３５ｍ２／ｇのＳＳＡを有する。一実施形態では、タキサン粒子は、約１０ｍ２／ｇ〜約５０ｍ２／ｇのＳＳＡを有する。いくつかの実施形態では、抗腫瘍粒子は、約０．０５０ｇ／ｃｍ３〜約０．２０ｇ／ｃｍ３のかさ密度を有する。
【００７４】
さらなる実施形態では、タキサン粒子は、以下のＳＳＡを有する。
（ａ）１６ｍ２／ｇ〜３１ｍ２／ｇ、もしくは３２ｍ２／ｇ〜４０ｍ２／ｇ、
（ｂ）１６ｍ２／ｇ〜３０ｍ２／ｇ、もしくは３２ｍ２／ｇ〜４０ｍ２／ｇ、
（ｃ）１６ｍ２／ｇ〜２９ｍ２／ｇ、もしくは３２ｍ２／ｇ〜４０ｍ２／ｇ、
（ｄ）１７ｍ２／ｇ〜３１ｍ２／ｇ、もしくは３２ｍ２／ｇ〜４０ｍ２／ｇ、
（ｅ）１７ｍ２／ｇ〜３０ｍ２／ｇ、もしくは３２ｍ２／ｇ〜４０ｍ２／ｇ、
（ｆ）１７ｍ２／ｇ〜２９ｍ２／ｇ、もしくは３２ｍ２／ｇ〜４０ｍ２／ｇ、
（ｇ）１６ｍ２／ｇ〜３１ｍ２／ｇ、もしくは３３ｍ２／ｇ〜４０ｍ２／ｇ、
（ｈ）１６ｍ２／ｇ〜３０ｍ２／ｇ、もしくは３３ｍ２／ｇ〜４０ｍ２／ｇ、
（ｉ）１６ｍ２／ｇ〜２９ｍ２／ｇ、もしくは３３ｍ２／ｇ〜４０ｍ２／ｇ、
（ｊ）１７ｍ２／ｇ〜３１ｍ２／ｇ、もしくは３３ｍ２／ｇ〜４０ｍ２／ｇ、
（ｋ）１７ｍ２／ｇ〜３０ｍ２／ｇ、もしくは３３ｍ２／ｇ〜４０ｍ２／ｇ、
（ｌ）１７ｍ２／ｇ〜２９ｍ２／ｇ、もしくは３３ｍ２／ｇ〜４０ｍ２／ｇ、
（ｍ）１６ｍ２／ｇ〜３１ｍ２／ｇ、もしくは≧３２ｍ２／ｇ、
（ｈ）１７ｍ２／ｇ〜３１ｍ２／ｇ、もしくは≧３２ｍ２／ｇ、
（ｉ）１６ｍ２／ｇ〜３０ｍ２／ｇ、もしくは≧３２ｍ２／ｇ、
（ｊ）１７ｍ２／ｇ〜３０ｍ２／ｇ、もしくは≧３２ｍ２／ｇ、
（ｋ）１６ｍ２／ｇ〜２９ｍ２／ｇ、もしくは≧３２ｍ２／ｇ、
（ｌ）１７ｍ２／ｇ〜２９ｍ２／ｇ、もしくは≧３２ｍ２／ｇ、
（ｍ）１６ｍ２／ｇ〜３１ｍ２／ｇ、もしくは≧３３ｍ２／ｇ、
（ｎ）１７ｍ２／ｇ〜３１ｍ２／ｇ、もしくは≧３３ｍ２／ｇ、
（ｏ）１６ｍ２／ｇ〜３０ｍ２／ｇ、もしくは≧３３ｍ２／ｇ、
（ｐ）１７ｍ２／ｇ〜３０ｍ２／ｇ、もしくは≧３３ｍ２／ｇ、
（ｑ）１６ｍ２／ｇ〜２９ｍ２／ｇ、もしくは≧３３ｍ２／ｇ、または
（ｒ）１７ｍ２／ｇ〜２９ｍ２／ｇ、もしくは≧３３ｍ２／ｇ。
【００７５】
いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、より小さい粒子の凝集によって形成される凝集粒子であり、これらは、一緒に融合してより大きい個別のタキサン粒子を形成し、これらは全て粒子の処理中に生じる。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、より小さい粒子凝集によって形成され、これらは、一緒に融合してより大きい個別のタキサン粒子を形成し、これらは全て粒子の処理中に生じる。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、非凝集個別粒子であり、非共有結合相互作用、ファンデルワールス力、親水性もしくは疎水性相互作用、静電相互作用、クーロン力、分散材料との相互作用、または官能基を介した相互作用等の相互作用によって一緒に結合される複数のタキサン粒子のクラスターではない。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、凝集粒子および非凝集粒子の両方を含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、パクリタキセル粒子であり、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、または少なくとも３５ｍ２／ｇのＳＳＡを有する。他の実施形態では、パクリタキセル粒子は、１８ｍ２／ｇ〜５０ｍ２／ｇ、または２０ｍ２／ｇ〜５０ｍ２／ｇ、または２２ｍ２／ｇ〜５０ｍ２／ｇ、または２５ｍ２／ｇ〜５０ｍ２／ｇ、または２６ｍ２／ｇ〜５０ｍ２／ｇ、または３０ｍ２／ｇ〜５０ｍ２／ｇ、または３５ｍ２／ｇ〜５０ｍ２／ｇ、または１８ｍ２／ｇ〜４５ｍ２／ｇ、または２０ｍ２／ｇ〜４５ｍ２／ｇ、または２２ｍ２／ｇ〜４５ｍ２／ｇ、または２５ｍ２／ｇ〜４５ｍ２／ｇ、または２６ｍ２／ｇ〜４５ｍ２／ｇ、または３０ｍ２／ｇ〜４５ｍ２／ｇ、または３５ｍ２／ｇ〜４５ｍ２／ｇ、または１８ｍ２／ｇ〜４０ｍ２／ｇ、または２０ｍ２／ｇ〜４０ｍ２／ｇ、または２２ｍ２／ｇ〜４０ｍ２／ｇ、または２５ｍ２／ｇ〜４０ｍ２／ｇ、または２６ｍ２／ｇ〜４０ｍ２／ｇ、または３０ｍ２／ｇ〜４０ｍ２／ｇ、または３５ｍ２／ｇ〜４０ｍ２／ｇのＳＳＡを有する。
【００７７】
いくつかの実施形態では、パクリタキセル粒子は、０．０５ｇ／ｃｍ３〜０．１５ｇ／ｃｍ３、または０．０５ｇ／ｃｍ３〜０．２０ｇ／ｃｍ３のかさ密度（タップなし）を有する。
【００７８】
いくつかの実施形態では、パクリタキセル粒子は、３７℃および７のｐＨで、７５ＲＰＭで動作するＵＳＰ  ＩＩパドル装置中で５０％メタノール／５０％水（ｖ／ｖ）の溶液中に３０分未満で少なくとも４０ｗ／ｗ％溶解する溶解速度を有する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、ドセタキセル粒子であり、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、または少なくとも４２ｍ２／ｇのＳＳＡを有する。他の実施形態では、ドセタキセル粒子は、１８ｍ２／ｇ〜６０ｍ２／ｇ、または２２ｍ２／ｇ〜６０ｍ２／ｇ、または２５ｍ２／ｇ〜６０ｍ２／ｇ、または３０ｍ２／ｇ〜６０ｍ２／ｇ、または４０ｍ２／ｇ〜６０ｍ２／ｇ、または１８ｍ２／ｇ〜５０ｍ２／ｇ、または２２ｍ２／ｇ〜５０ｍ２／ｇ、または２５ｍ２／ｇ〜５０ｍ２／ｇ、または２６ｍ２／ｇ〜５０ｍ２／ｇ、または３０ｍ２／ｇ〜５０ｍ２／ｇ、または３５ｍ２／ｇ〜５０ｍ２／ｇ、または４０ｍ２／ｇ〜５０ｍ２／ｇのＳＳＡを有する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、ドセタキセルの粒子は、０．０５ｇ／ｃｍ３〜０．１５ｇ／ｃｍ３のかさ密度（タップなし）を有する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ドセタキセル粒子は、３７℃および７のｐＨで、７５ＲＰＭで動作するＵＳＰ  ＩＩパドル装置で、１５％メタノール／８５％水（ｖ／ｖ）の溶液中に３０分未満で少なくとも２０ｗ／ｗ％溶解する溶解速度を有する。
【００８２】
ＩＶ．局所投与のためのタキサン粒子組成物および方法
局所投与に有用な組成物は、本明細書および本開示全体に記載のタキサン粒子を含む組成物であり、様々なタイプの局所投与、すなわち、局所的適用、肺投与、腫瘍内（ＩＴ）注射、膀胱内注入（膀胱）、腹腔内（ＩＰ）注射、もしくは腫瘍の周辺組織への直接注射、またはそれらの組み合わせに好適な組成物である。組成物は、懸濁液であり得る。例えば、組成物は、担体が連続相であり、タキサン粒子が分散（懸濁）相であるように、タキサン粒子が担体中に分散している担体を含み得る。懸濁液中で、タキサン粒子は組成物および／または担体中に完全に分散していても、部分的に分散および部分的に溶解していてもよいが、タキサン粒子は組成物および／または担体中に完全に溶解することはできない。
【００８３】
組成物は、２回以上の別個の投与で投与され得る。いくつかの実施形態では、２回以上の別個の投与は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、もしくは１４日間間隔でまたは少なくともそれらの間隔で投与される。いくつかの実施形態では、２回以上の別個の投与は、２〜１２、２〜１１、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜１２、３〜１１、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜１２、４〜１１、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜１２、５〜１１、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、５〜６、６〜１２、６〜１１、６〜１０、６〜９、６〜８、６〜７、７〜１２、７〜１１、７〜１０、７〜９、７〜８、８〜１２、８〜１１、８〜１０、８〜９、９〜１２、９〜１１、９〜１０、１０〜１２、１０〜１１、１１〜１２、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間間隔で投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、２〜５、２〜４、２〜３、３〜５、３〜４、２、３、４、５回、またはそれ以上の別個の投与で投与される。いくつかの実施形態では、２回以上の別個の投与は、少なくとも２週間にわたって週１回投与される。他の実施形態では、２回以上の別個の投与は、少なくとも１週間にわたって週２回投与され、２回以上の別個の投与は、少なくとも１日間隔である。いくつかの実施形態では、本方法により、腫瘍の除去（根絶）がもたらされる。いくつかの実施形態では、組成物は、１、２、３、４、５、６回、またはそれ以上の別個の投与で投与される。他の実施形態では、組成物は、７回またはそれ以上の別個の投与で投与される。
【００８４】
Ａ．局所的適用のためのタキサン粒子組成物
局所的適用のための組成物は、タキサン粒子を含む。タキサン粒子は、局所用組成物中に分散し（懸濁され）得る。局所用組成物は、局所的送達に好適な任意の組成物であり得る。局所用組成物は、疎水性組成物であり得る。局所用組成物は、無水親水性組成物または無水疎水性組成物を含み得る、無水組成物であり得る。無水親水性組成物の非限定的な例には、ポリオール、グリコール（例えば、プロピレングリコール、ＰＥＧ）、および／またはポロキサマーベースの組成物が挙げられる。局所用組成物は、水性系組成物等の非無水であり得る。局所用組成物は、滅菌であり得るか、自己保存性であり得るか、または防腐剤を含み得る。
【００８５】
局所用組成物は、局所的送達に好適な様々な形態で製剤化され得る。非限定的な例には、半固体組成物、ローション、液体懸濁液、エマルション、クリーム、ゲル、軟膏、ペースト、エアロゾルスプレー、エアロゾルフォーム、非エアロゾルスプレー、非エアロゾルフォーム、フィルム、およびシートが挙げられる。半固体組成物には、軟膏、ペースト、およびクリームが含まれる。局所用組成物は、ガーゼ、包帯、または他の皮膚被覆材に含浸され得る。いくつかの実施形態では、局所用組成物は、半固体組成物である。いくつかの実施形態では、局所用組成物は、軟膏である。他の実施形態では、局所用組成物は、ゲルである。さらに他の実施形態では、局所用組成物は、液体懸濁液である。いくつかの実施形態では、局所用組成物は、スプレーではなく、スプレー可能ではない。
【００８６】
いくつかの実施形態では、局所用組成物は、ポリマー／コポリマーまたは生体適合性ポリマー／コポリマーを含んでいない／含まないまたは含有しない。いくつかの実施形態では、組成物は、タンパク質を含んでいない／含まないまたは含有しない。本開示のいくつかの態様では、組成物は、アルブミンを含んでいない／含まないまたは含有しない。本開示のいくつかの態様では、組成物は、ヒアルロン酸を含んでいない／含まないまたは含有しない。本開示のいくつかの態様では、組成物は、ヒアルロン酸とタキサンとのコンジュゲートを含んでいない／含まないまたは含有しない。本開示のいくつかの態様では、組成物は、ヒアルロン酸とパクリタキセルとのコンジュゲートを含んでいない／含まないまたは含有しない。本開示のいくつかの態様において、組成物は、ポロキサマー、ポリアニオン、ポリカチオン、修飾ポリアニオン、修飾ポリカチオン、キトサン、キトサン誘導体、金属イオン、ナノベクター、ポリ−ガンマ−グルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、アルギン酸（ＡＬＧ）、ビタミンＥ−ＴＰＧＳ、ジメチルイソソルビド（ＤＭＩ）、メトキシＰＥＧ  ３５０、クエン酸、抗ＶＥＧＦ抗体、エチルセルロース、ポリスチレン、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリホスファゼン、ポリオルトエステル、ポリエステル、ポリアミド、ポリサッカライド、ポリタンパク質、スチレン−イソブチレン−スチレン（ＳＩＢＳ）、ポリ無水物コポリマー、ポリカプロラクトン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビス（Ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン−セバシン酸、ポリ（ｄ，ｌ−乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（ｄ，ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＡＧＡ）、および／またはポリ（Ｄ，Ｌ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）を含んでいない／含まないまたは含有しない。
【００８７】
局所用組成物は、局所用製品に好適な任意のパッケージ構成でパッケージングされ得る。非限定的な例には、ボトル、ポンプ付きボトル、トトル、チューブ（アルミニウム、プラスチック、またはラミネート）、ジャー、非エアロゾルポンプ噴霧器、エアロゾル容器、パウチ、およびパケットが挙げられる。パッケージは、単回用量投与または複数回用量投与用に構成され得る。
【００８８】
好適な局所用組成物の非限定的な例は、参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第２０１７／０４９０８３号に開示されている。
【００８９】
１．疎水性局所用組成物
いくつかの実施形態では、局所用組成物は、疎水性組成物である。本開示の目的のために、疎水性組成物は、組成物中の疎水性構成成分の総量が組成物中の非疎水性構成成分の総量よりも多い組成物である。いくつかの実施形態では、疎水性組成物は、無水である。いくつかの実施形態では、疎水性組成物は、疎水性担体を含む。
【００９０】
疎水性担体は、植物、動物、パラフィン、および／または合成的に誘導された源由来の物質を含み得る。疎水性物質は、一般に、水に対する親和性を欠き、水をはじく物質として知られている。疎水性担体は、局所用組成物の連続相であり得、タキサン粒子は、分散相であり得る。様々な実施形態では、疎水性担体は、非極性および／または不揮発性である。疎水性担体の非限定的な例には、脂肪、バター、グリース、ワックス、溶媒、および油；鉱油；植物油；ワセリン；非水溶性有機エステルおよびトリグリセリド；ならびにフッ素化合物が挙げられる。疎水性担体は、シリコーン材料も含み得る。シリコーン材料は、ポリジアルキルシロキサンベースの化合物として定義され、ポリマー、エラストマー（架橋シリコーン）、および接着剤（分岐状シリコーン）を含む。シリコーン材料の非限定的な例には、ジメチコン（ポリジメチルシロキサン）、ジメチコンコポリオール、シクロメチコン、シメチコン、ＳＴ−ｅｌａｓｔｏｍｅｒ  １０（ＤＯＷ  ＣＯＲＮＩＮＧ）等のシリコーンエラストマー、シリコーン油、シリコーンポリマー、揮発性シリコーン流体、およびシリコーンワックスが挙げられる。いくつかの実施形態では、疎水性担体は、シリコーン材料を含まない。植物由来の材料には、ラッカセイ（ピーナッツ）油、バルサムペルー油、カルナバワックス、キャンデリラワックス、ヒマシ油、水添ヒマシ油、ココアバター、ココナッツ油、トウモロコシ油、綿実油、ホホバ油、マカダミア種子油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジワックス、パーム核油、菜種油、ベニバナ油、ゴマ油、シアバター、大豆油、ヒマワリ種子油、ティーツリー油、植物油、および水添植物油が含まれるが、これらに限定されない。動物由来の材料の非限定的な例には、蜜蝋（黄蝋および白蝋）、タラ肝油、エミュー油、ラード、ミンク油、サメ肝油、スクアラン、スクアレン、および獣脂が挙げられる。パラフィン系材料の非限定的な例には、イソパラフィン、微結晶ワックス、重鉱油、軽鉱油、オゾケライト、ワセリン、白色ワセリン、およびパラフィンワックスが挙げられる。有機エステルおよびトリグリセリドの非限定的な例には、Ｃ１２〜１５安息香酸アルキル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、中鎖トリグリセリド、モノおよびジグリセリド、トリラウリン、ならびにトリヒドロキシステアリンが挙げられる。フッ素化化合物の非限定的な例は、Ｓｏｌｖａｙ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓから市販されているＦＯＭＢＬＩＮ（登録商標）ＨＣ０４等のペルフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）である。疎水性担体は、医薬品グレードの疎水性物質を含み得る。
【００９１】
様々な実施形態では、疎水性担体は、ワセリン、鉱油、パラフィン、またはそれらの混合物を含む。ワセリンは、石油から得られる半固体飽和炭化水素の精製された混合物であり、濃琥珀色から明るい黄色まで色が異なる。白色ワセリンは、完全にまたはほぼ脱色され、クリーム色から雪白色まで色が異なる。異なる融点、粘度、および稠度特性を有するワセリンが利用可能である。ワセリンは、酸化防止剤等の安定剤も含有し得る。医薬品グレードのワセリンには、ワセリンＵＳＰおよび白色ワセリンＵＳＰが含まれる。鉱油は、石油から得られる液体炭化水素の混合物である。軽鉱油、重鉱油、および超重鉱油等の様々な粘度グレードの鉱油が入手可能である。軽鉱油は、４０℃で３３．５センチストーク以下の動粘度を有する。重鉱油は、４０℃で３４．５センチストーク以上の動粘度を有する。医薬品グレードの鉱油には、重鉱油である鉱油ＵＳＰおよび軽鉱油である軽鉱油ＮＦが含まれる。いくつかの実施形態では、鉱油は、重鉱油である。パラフィンワックスは、石油から得られる固体炭化水素の精製された混合物である。それはまた、フィッシャー・トロプシュ法によって、パラフィン炭化水素の混合物に触媒的に変換される一酸化炭素および水素から合成的に誘導され得る。パラフィンワックスは、酸化防止剤を含有し得る。医薬品グレードのパラフィンワックスには、パラフィンＮＦおよび合成パラフィンＮＦが含まれる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、疎水性組成物中の疎水性担体の濃度は、全組成物重量の１０ｗ／ｗ％超である。他の実施形態では、疎水性組成物中の疎水性担体の濃度は、全組成物重量の１５％超、または２０％超、または２５％超、または３０％超、または３５％超、または４０％超、または４５％超、または５０％超、または５５％超、または６０％超、または６５％超、または７０％超、または７５％超、または８０％超、または８２％超、８５％超、８７％超、または９０ｗ／ｗ％超である。他の実施形態では、疎水性組成物中の疎水性担体の濃度は、全組成物重量の１０ｗ／ｗ％超〜９５ｗ／ｗ％である。他の実施形態では、疎水性組成物中の疎水性担体の濃度は、全組成物重量の１１ｗ／ｗ％〜９５ｗ／ｗ％、または１２ｗ／ｗ％〜９５ｗ／ｗ％、または１３ｗ／ｗ％〜９５ｗ／ｗ％、または１４ｗ／ｗ％〜９５ｗ／ｗ％、または１５ｗ／ｗ％〜９５ｗ／ｗ％、または１６ｗ／ｗ％〜９５ｗ／ｗ％、または１７ｗ／ｗ％〜９５ｗ／ｗ％、または１８ｗ／ｗ％〜９５ｗ／ｗ％、または１９ｗ／ｗ％〜９５ｗ／ｗ％、または２０ｗ／ｗ％〜９５ｗ／ｗ％である。いくつかの実施形態では、疎水性組成物中の疎水性担体は、疎水性組成物の５０％超である。
【００９３】
疎水性組成物は、疎水性担体を含み得、１つ以上の揮発性シリコーン流体をさらに含み得る。揮発性シリコーンオイルとしても既知の揮発性シリコーン流体は、環状または直鎖状であり得る揮発性液体ポリシロキサンである。これらは、室温で液体である。揮発性シリコーン流体は、疎水性材料である。直鎖状揮発性シリコーン流体には、ポリジメチルシロキサン、ヘキサメチルジシロキサン、およびオクタメチルトリシロキサンが含まれ、それぞれ、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇから商標名ＤＯＷ  ＣＯＲＮＩＮＧ  Ｑ７−９１８０  Ｓｉｌｉｃｏｎｅ  Ｆｌｕｉｄ  ０．６５ｃＳｔおよびＤＯＷ  ＣＯＲＮＩＮＧ  Ｑ７−９１８０  Ｓｉｌｉｃｏｎｅ  Ｆｌｕｉｄ  １．０ｃＳｔで市販されている。環状揮発性シリコーン流体は、一般にシクロメチコンとして既知である。シクロメチコンは、式（ＩＶ）：
（ＩＶ）          ［−（ＣＨ３）２ＳｉＯ−］ｎ
（式中、ｎは、３、４、５、６、もしくは７である）の繰り返し単位を含む完全にメチル化された環状シロキサン、またはそれらの混合物である。シクロメチコンは、透明な無色の揮発性液体シリコーン流体である。シクロメチコンは、皮膚軟化特性を有し、皮膚のべたつき感を低減することによって、油性製品の触感を改善するのに役立つ。医薬品グレードのシクロメチコンには、シクロメチコンＮＦが含まれる。シクロメチコンＮＦは、式（ＩＶ）（式中、ｎは、４（シクロテトラシロキサン）、５（シクロペンタシロキサン）、もしくは６（シクロヘキサシロキサン）である）、またはそれらの混合物によって表される。デカメチルシクロペンタシロキサン、シクロメチコンＤ５、またはシクロメチコン５としても既知のシクロペンタシロキサンは、式（ＩＶ）（式中、ｎは、５（五量体）である）によって表されるシクロメチコンであるが、これは、少量（一般に１％未満）の他の環状鎖長シクロメチコンのうちの１つ以上を含有することができる。シクロペンタシロキサンは、シクロメチコンＮＦとして医薬品グレードで入手可能である。シクロメチコンは、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇから商標名ＤＯＷ  ＣＯＲＮＩＮＧ  ＳＴ−Ｃｙｃｌｏｍｅｔｈｉｃｏｎｅ  ５−ＮＦ、ＤＯＷ  ＣＯＲＮＩＮＧ  ＳＴ−Ｃｙｃｌｏｍｅｔｈｉｃｏｎｅ  ５６−ＮＦ、およびＸＩＡＭＥＴＥＲ  ＰＭＸ−０２４５で市販されている。これは、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｆｇ．Ｃｏｒｐ．からも市販されている。シクロペンタシロキサンは、２５℃で約２０〜約２７Ｐａの蒸気圧を有する。
【００９４】
一実施形態では、疎水性組成物中のシクロメチコンの濃度は、２５ｗ／ｗ％未満である。別の実施形態では、疎水性組成物中のシクロメチコンは、５〜２４ｗ／ｗ％の濃度である。別の実施形態では、シクロメチコンの濃度は、５〜２０ｗ／ｗ％である。別の実施形態では、シクロメチコンは、５〜１８ｗ／ｗ％の濃度である。別の実施形態では、シクロメチコンの濃度は、１３ｗ／ｗ％である。様々な実施形態では、シクロメチコンの濃度は、全組成物重量の５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、もしくは２４ｗ／ｗ％、またはそれらの中から導き出される任意のパーセンテージであり得る。いくつかの実施形態では、揮発性シリコーン流体は、シクロメチコンである。いくつかの実施形態では、シクロメチコンは、シクロペンタシロキサンである。
【００９５】
疎水性組成物は、疎水性担体と揮発性シリコーン流体との混合物中のタキサン粒子の懸濁液であり得る。タキサン粒子は疎水性組成物中に完全に分散していても、部分的に分散および部分的に溶解していてもよいが、タキサン粒子は疎水性組成物中に完全に溶解することはできない。疎水性担体は、疎水性組成物の連続相であり得、タキサン粒子は、分散相であり得る。したがって、疎水性組成物は、少なくとも２つの相、連続疎水性担体相および分散（懸濁）タキサン粒子相を含み得る。揮発性シリコーン流体は、連続相中で可溶化され得、かつ／または分散し得る。
【００９６】
いくつかの実施形態では、疎水性組成物は、追加の浸透促進剤を含んでいない／含まないまたは含有しない。いくつかの実施形態では、疎水性組成物は、ラウロカプラムを含んでいない／含まないまたは含有しない。いくつかの実施形態では、疎水性組成物は、ジエチレングリコールモノエチルエーテル（ＤＧＭＥ）を含んでいない／含まない。いくつかの実施形態では、疎水性組成物は、ミリスチン酸イソプロピルを含んでいない／含まない。他の実施形態では、疎水性組成物は、アルファトコフェロールを含んでいない／含まない。他の実施形態では、疎水性組成物は、追加の揮発性溶媒または化合物を含んでいない／含まないまたは含有しない。いくつかの実施形態では、疎水性組成物は、いかなるアルコールまたはＣ１〜Ｃ４脂肪族アルコールを含んでいない／含まないまたは含有しない。いくつかの実施形態では、疎水性組成物は、Ｃ１〜Ｃ５脂肪族アルコールを含んでいない／含まないまたは含有しない。他の実施形態では、疎水性組成物は、界面活性剤を含んでいない／含まないまたは含有しない。他の実施形態では、疎水性組成物は、ポリマー／コポリマー（または生分解性ポリマー／コポリマー）を含んでいない／含まない。他の実施形態では、疎水性組成物は、ポロキサマー、スチレン−イソブチレン−スチレン（ＳＩＢＳ）、ポリ無水物コポリマー、ポリカプロラクトン、ポリエチレングリコール、ポリ（ビス（Ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン−セバシン酸、および／またはポリ（Ｄ，Ｌ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）を含んでいない／含まない。
【００９７】
いくつかの実施形態では、疎水性組成物は、半固体組成物である。いくつかの実施形態では、疎水性組成物は、軟膏である。いくつかの実施形態では、疎水性組成物は、軟膏を含む半固体組成物であり、２分間の平衡時間にわたって５ｒｐｍでＳＣ４−１４スピンドルおよび６Ｒチャンバを備えた小さい試料アダプターを使用したＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ＲＶ粘度計によって室温で測定される、１２，５００ｃｐｓ〜２４７，５００ｃｐｓ、または２５，０００ｃｐｓ〜１５０，０００ｃｐｓの粘度を有する。疎水性半固体組成物の粘度測定を行うための代替の方法は、室温で４５秒間にわたってＴ−Ｅスピンドルを１０ＲＰＭで用いた、ヘリパスがオンのヘリパススタンド上のＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ＲＶ粘度計を使用することである。いくつかの実施形態では、疎水性組成物は、軟膏を含む半固体組成物であり、室温で４５秒間にわたってＴ−Ｅスピンドルを１０ＲＰＭで用いた、ヘリパスがオンのヘリパススタンド上のＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ＲＶ粘度計を使用して、２５，０００ｃｐｓ〜５００，０００ｃｐｓ、または２５，０００ｃｐｓ〜４００，０００ｃｐｓ、または２５，０００ｃｐｓ〜３５０，０００ｃｐｓ、または２５，０００ｃｐｓ〜３００，０００ｃｐｓ、または５０，０００ｃｐｓ〜５００，０００ｃｐｓ、または５０，０００ｃｐｓ〜４００，０００ｃｐｓ、または５０，０００ｃｐｓ〜３５０，０００ｃｐｓ、または５０，０００ｃｐｓ〜３００，０００ｃｐｓ、または７５，０００ｃｐｓ〜５００，０００ｃｐｓ、または７５，０００ｃｐｓ〜４００，０００ｃｐｓ、または７５，０００ｃｐｓ〜３５０，０００ｃｐｓ、または７５，０００ｃｐｓ〜３００，０００ｃｐｓ、または１００，０００ｃｐｓ〜５００，０００ｃｐｓ、または１００，０００ｃｐｓ〜４００，０００ｃｐｓ、または１００，０００ｃｐｓ〜３５０，０００ｃｐｓ、または１００，０００ｃｐｓ〜３００，０００ｃｐｓの粘度を有する。
【００９８】
２．水性系局所用組成物
水性系局所用組成物は、タキサン粒子および水性担体を含む。水性組成物は、水性担体中のタキサン粒子の分散液（懸濁液）である。タキサン粒子は水性担体中に完全に分散していても、部分的に分散および部分的に溶解していてもよいが、完全に溶解することはできない。水性系組成物は、水が主な構成成分（５０％超）である組成物である。水性担体には、単相水溶液、ならびに水中油および油中水エマルション等の多相水性系エマルションが含まれ得る。水性担体の非限定的な例には、水および緩衝液が挙げられる。
【００９９】
水性系局所用組成物の非限定的な例は、国際特許公開第２０１７／０４９０８３号に開示される、ポロキサマー４０７、四級アンモニウム化合物、および／または架橋アクリル酸ポリマーを含む水性担体（例えば、水）を含む。四級アンモニウム化合物の非限定的な例には、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムが挙げられる。架橋アクリル酸ポリマーの非限定的な例には、カルボマー（ＩＮＣＩ名）、アクリレートコポリマー（ＩＮＣＩ名）、アクリレート／Ｃ１０〜３０アルキルアクリレートクロスポリマー（ＩＮＣＩ名）、アクリレートクロスポリマー−４（ＩＮＣＩ名）、およびポリアクリレート−１クロスポリマー（ＩＮＣＩ名）が挙げられる。
【０１００】
３．局所用組成物の追加の成分および賦形剤
局所用組成物は、局所用組成物における使用に好適な機能性成分をさらに含み得る。非限定的な例には、吸収剤、酸性化剤、抗菌剤、酸化防止剤、結合剤、殺生物剤、緩衝剤、増量剤、結晶成長抑制剤、キレート剤、着色剤、消臭剤、エマルション安定剤、皮膜形成剤、香料、保湿剤、溶解剤、酵素剤、乳白剤、酸化剤、ｐＨ調整剤、可塑剤、防腐剤、還元剤、エモリエントスキンコンディショニング剤、保湿スキンコンディショニング剤、保湿剤、界面活性剤、乳化剤、洗浄剤、起泡剤、ヒドロトープ（ｈｙｄｒｏｔｏｐｅ）、溶媒、懸濁剤、粘度制御剤（レオロジー調整剤）、粘度増加剤（増粘剤）、および噴射剤が挙げられる。本明細書に記載の機能性成分の例のリストおよび研究論文は、参照により本明細書に組み込まれるＴｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ＩＮＣＩ），１２ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００８に開示されている。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、局所用組成物は、浸透促進剤を含む。他の実施形態では、局所用組成物は、追加の浸透促進剤を含んでいない／含まない。「浸透促進剤」という用語は、皮膚を通した薬物吸収を促進する化合物または材料または物質を説明するために使用されている。これらの化合物もしくは材料もしくは物質は、皮膚の透過性に直接影響を及ぼすことができるか、またはそれらは、浸透剤の熱力学的活性を高めることによって経皮吸収を増強し、それにより、拡散種の効果的な逃散傾向および濃度勾配を高めることができる。これらの促進剤の主な効果は、角質層の水和度を高めるか、またはそのリポタンパク質基質を破壊することのいずれかであり、いずれの場合の最終結果も、薬物（浸透剤）拡散に対する耐性の低下である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ  ｅｄ．，２０１３）。皮膚浸透促進剤の非限定的な例には、オレイルアルコール、ミリスチン酸イソプロピル、商標名ＡＲＬＡＳＯＬＶＥ  ＤＭＩで入手可能なジメチルイソソルビド（ＤＭＩ）、および商標名ＴＲＡＮＳＣＵＴＯＬ  Ｐで入手可能なジエチレングリコールモノエチルエーテル（ＤＧＭＥ）が挙げられる。皮膚浸透促進剤の他の例は、参照により本明細書に組み込まれる“Ｓｋｉｎ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  Ｃｉｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ”，Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｄａｖｉｄ  Ｗ．，ａｎｄ  Ｈｅｎｋｅ，Ｊｉｌｌ  Ｊ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ  ５８−６６，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９９７で見つけることができる。かかる例には、脂肪アルコール、例えば、脂肪族アルコール、デカノール、ラウリルアルコール（ドデカノール）、リノレニルアルコール、ネロリドール、１−ノナノール、ｎ−オクタノール、オレイルアルコール、脂肪酸エステル、酢酸ブチル、乳酸セチル、デシルＮ，Ｎ−ジメチルアミノアセテート、デシルＮ，Ｎ−ジメチルアミノイソプロピオネート、ジエチルグリコールオレエート、セバシン酸ジエチル、コハク酸ジエチル、セバシン酸ジイソプロピル、ドデシルＮ，Ｎ−ジメチルアミノアセテート、ドデシル（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−ブチレート、ドデシルＮ，Ｎ−ジメチルアミノイソプロピオネート、ドデシル２−（ジメチルアミノ）プロピオネート、ＥＯ−５−オレイルエステル、酢酸エチル、アセト酢酸エチル、プロピオン酸エチル、グリセリンモノエーテル、モノラウリン酸グリセロール、モノオレイン酸グリセロール、モノリノール酸グリセロール、イソステアリン酸イソプロピル、リノール酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル／脂肪酸モノグリセリドの組み合わせ、ミリスチン酸イソプロピル／エタノール／Ｌ−乳酸（８７：１０：３）の組み合わせ、パルミチン酸イソプロピル、酢酸メチル、カプリン酸メチル、ラウリン酸メチル、プロピオン酸メチル、吉草酸メチル、１−モノカプロイルグリセロール、モノグリセリド（中鎖長）、ニコチン酸エステル（ベンジル）、酢酸オクチル、オクチルＮ，Ｎ−ジメチルアミノアセテート、オレイン酸オレイル、ｎ−ペンチルＮ−アセチルプロリネート、モノラウリン酸プロピレングリコール、ジラウリン酸ソルビタン、ジオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、トリラウリン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、スクロースココナッツ脂肪エステル混合物、モノラウリン酸スクロース、モノオレイン酸スクロース、およびテトラデシルＮ，Ｎ−ジメチルアミノアセテート；脂肪酸、例えば、アルカン酸、カプリン酸、二酸、エチルオクタデカン酸、ヘキサン酸、乳酸、ラウリン酸、リノエライジン酸、リノール酸、リノレン酸、ネオデカン酸、オレイン酸、パルミチン酸、ペラルゴン酸、プロピオン酸、およびバクセン；脂肪アルコールエーテル、例えば、α−モノグリセリルエーテル、ＥＯ−２−オレイルエーテル、ＥＯ−５−オレイルエーテル、ＥＯ−１０−オレイルエーテル、およびポリグリセリンとアルコールのエーテル誘導体（１−Ｏ−ドデシル−３−Ｏ−メチル−２−Ｏ−（２’，３’−ジヒドロキシプロピル）グリセロール）；生物製剤、例えば、Ｌ−α−アミノ酸、レシチン、リン脂質、サポニン／リン脂質、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、およびタウログリココール酸ナトリウム；酵素、例えば、酸性ホスファターゼ、カロナーゼ、オルゲラーゼ、パパイン、ホスホリパーゼＡ−２、ホスホリパーゼＣ、およびトリアシルグリセロールヒドロラーゼ；アミンおよびアミド、例えば、アセトアミド誘導体、非環式アミド、Ｎ−アダマンチルｎ−アルカンアミド、クロフィブリン酸アミド、Ｎ，Ｎ−ジドデシルアセトアミド、ジ−２−エチルヘキシルアミン、ジエチルメチルベンズアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルアミド、Ｅｔｈｏｍｅｅｎ  Ｓ１２［ビス−（２−ヒドロキシエチル）オレイルアミン］、ヘキサメチレンラウラミド、ラウリル−アミン（ドデシルアミン）、オクチルアミド、オレイルアミン、不飽和環状尿素、および尿素；錯化剤、例えば、β−およびγ−シクロデキストリン複合体、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、リポソーム、ナフタレンジアミドジイミド、およびナフタレンジエステルジイミド；大環状化合物、例えば、大環状ラクトン、ケトン、および無水物（最適な環−１６）、ならびに不飽和環状尿素；典型的な界面活性剤、例えば、Ｂｒｉｊ  ３０、Ｂｒｉｊ  ３５、Ｂｒｉｊ  ３６Ｔ、Ｂｒｉｊ  ５２、Ｂｒｉｊ  ５６、Ｂｒｉｊ  ５８、Ｂｒｉｊ  ７２、Ｂｒｉｊ  ７６、Ｂｒｉｊ  ７８、Ｂｒｉｊ  ９２、Ｂｒｉｊ  ９６、Ｂｒｉｊ  ９８、セチルトリメチルアンモニウム臭化物、Ｅｍｐｉｃｏｌ  ＭＬ２６／Ｆ、ＨＣＯ−６０界面活性剤、ヒドロキシポリエトキシドデカン、イオン性界面活性剤（ＲＯＯＮａ、ＲＯＳＯ３Ｎａ、ＲＮＨ３Ｃｌ、Ｒ＝８〜１６）、ラウロイルサルコシン、非イオン性表面活性剤、ノノキシノール、オクトキシノール、Ｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆｏｎａｔｅ  ＣＡ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ  １２７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ６２、ポリオレイン酸塩（非イオン性界面活性剤）、Ｒｅｗｏｐａｌ  ＨＶ  １０、ラウリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム（ドデシル硫酸ナトリウム）、オレイン酸ナトリウム、ジラウリン���ソルビタン、ジオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、トリラウリン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、Ｓｐａｎ  ２０、Ｓｐａｎ  ４０、Ｓｐａｎ  ８５、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  ＮＰ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ４０、Ｔｗｅｅｎ  ６０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、およびＴｗｅｅｎ  ８５；Ｎ−メチルピロリドンおよび関連化合物、例えば、Ｎ−シクロヘキシル−２−ピロリドン、１−ブチル−３−ドデシル−２−ピロリドン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリキノン、１，５ジメチル−２−ピロリドン、４，４−ジメチル−２−ウンデシル−２−オキサゾリン、１−エチル−２−ピロリドン、１−ヘキシル−４−メチルオキシカルボニル−２−ピロリドン、１−ヘキシル−２−ピロリドン、１−（２−ヒドロキシエチル）ピロリジノン、３−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、１−イソプロピル−２−ウンデシル−２−イミダゾリン、１−ラウリル−４−メチルオキシカルボニル−２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ピログルタミン酸エステル、および２−ピロリドン（２−ピロリジノン）；イオン化合物、例えば、アスコルビン酸塩、両性カチオンおよびアニオン、チオグリコール酸カルシウム、セチルトリメチルアンモニウム臭化物、３，５−ジヨードサリチル酸ナトリウム、ヨウ化ラウロイルコリン、５−メトキシサリチル酸ナトリウム、リン酸モノアルキル、２−ＰＡＭクロリド、４−ＰＡＭクロリド（Ｎ−メチルピコリニウムクロリドの誘導体）、カルボン酸ナトリウム、およびヒアルロン酸ナトリウム；ジメチルスルホキシドおよび化合物、例えば、環状スルホキシド、デシルメチルスルホキシド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および２−ヒドロキシウンデシルメチルスルホキシド；溶媒および関連化合物、例えば、アセトン、ｎ−アルカン（７〜１６の鎖長）、シクロヘキシル−１，１−ジメチルエタノール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、エタノール、エタノール／ｄ−リモネンの組み合わせ、２−エチル−１，３−ヘキサンジオール、エトキシジグリコール（ＴＲＡＮＳＣＵＴＯＬ）、グリセロール、グリコール、塩化ラウリル、リモネン、Ｎ−メチルホルムアミド、２−フェニルエタノール、３−フェニル−１−プロパノール、３−フェニル−２−プロペン−１−オール、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエステル、ポリプロピレングリコール、第一級アルコール（トリデカノール）、プロピレングリコール、スクアレン、トリアセチン、トリクロロエタノール、トリフルオロエタノール、トリメチレングリコール、およびキシレン；アゾンおよび関連化合物、例えば、Ｎ−アシル−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−アゼピン、Ｎ−アルキル−ジヒドロ−１，４−オキサゼピン−５，７−ジオン、Ｎ−アルキルモルホリン−２，３−ジオン、Ｎ−アルキルモルホリン−３，５−ジオン、アザシクロアルカン誘導体（−ケトン、−チオン）、アザシクロアルケノン誘導体、１−［２−（デシルチオ）エチル］アザシクロペンタン−２−オン（ＨＰＥ−１０１）、Ｎ−（２，２−ジヒドロキシエチル）ドデシルアミン、１−ドデカノイルヘキサ��ドロ−１−Ｈ−アゼピン、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン（ＡＺＯＮＥまたはラウロカプラム）、Ｎ−ドデシルジエタノールアミン、Ｎ−ドデシル−ヘキサヒドロ−２−チオ−１Ｈ−アゼピン、Ｎ−ドデシル−Ｎ−（２−メトキシエチル）アセトアミド、Ｎ−ドデシル−Ｎ−（２−メトキシエチル）イソブチルアミド、Ｎ−ドデシル−ピペリジン−２−チオン、Ｎ−ドデシル−２−ピペリジノン、Ｎ−ドデシルピロリジン−３，５−ジオン、Ｎ−ドデシル１ピロリジン−２−チオン、Ｎ−ドデシル−２−ピロリドン、１−ファメシルアザシクロヘプタン−２−オン、１−ファメシルアザシクロペンタン−２−オン、１−ゲラニルアザシクロヘプタン−２−オン、１−ゲラニルアザシクロペンタン−２−オン、ヘキサヒドロ−２−オキソ−アゼピン−１−酢酸エステル、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−２−ピロリドン、１−ラウリルアザシクロヘプタン、２−（１−ノニル）−１，３−ジオキソラン、１−Ｎ−オクチルアザシクロペンタン−２−オン、Ｎ−（１−オキソドデシル）−ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピン、Ｎ−（１−オキソドデシル）−モルホリン、１−オキソヒドロカルビル置換アザシクロヘキサン、Ｎ−（１−オキソテトラデシル）−ヘキサヒドロ−２−オキソ−ｌＨ−アゼピン、およびＮ−（ｌ−チオドデシル）−モルホリン；ならびにその他、例えば、脂肪族チオール、アルキルＮ，Ｎ−ジアルキル置換アミノアセテート、アニス油、抗コリン薬前処理、アスカリドール、二相性基誘導体、ビサボロール、カルダモン油、１−カルボン、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ（７０％アスカリドール）、ヘノポジ油、１，８シネオール（ユーカリプトール）、タラ肝油（脂肪酸抽出物）、４−デシルオキサゾリジン−２−オン、ジシクロヘキシルメチルアミンオキシド、ジエチルヘキサデシルホスホネート、ジエチルヘキサデシルホスホルアミデート、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミン−Ｎ−オキシド、４，４−ジメチル−２−ウンデシル−２−オキサゾリン、Ｎ−ドデカノイル−Ｌ−アミノ酸メチルエステル、１，３−ジオキサシクロアルカン（ＳＥＰＡ）、ジチオトレイトール、ユーカリプトール（シネオール）、ユーカリ油、オイゲノール、ハーブ抽出物、ラクタムＮ−酢酸エステル、Ｎ−ヒドロキシエタラセアミド、Ｎ−ヒドロキシエチルアセトアミド、２−ヒドロキシ−３−オレオイルオキシ
−１−ピログルタミルオキシプロパン、メントール、メントン、モルホリン誘導体、Ｎ−オキシド、ネロリドール、オクチル−β−Ｄ−（チオ）グルコピラノシド、オキサゾリジノン、ピペラジン誘導体、極性脂質、ポリジメチルシロキサン、ポリ［２−（メチルスルフィニル）エチルアクリレート］、ポリロタキサン、ポリビニルベンジルジメチルアルキルアンモニウムクロリド、ポリ（Ｎ−ビニル−Ｎ−メチルアセトアミド）、ピログルタミン酸ナトリウム、テルペンおよびアザシクロ環化合物、ビタミンＥ（α−トコフェロール）、ビタミンＥ  ＴＰＧＳおよびイランイラン油が挙げられる。上に列記されていない浸透促進剤のさらなる例は、“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ”，Ｆｉｆｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，２００６で見つけることができ、これらには、グリコフロール、ラノリン、軽鉱油、ミリスチン酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、およびチモールが挙げられる。浸透促進剤の他の例には、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジエチレングリコール、モノエチルエーテル、クエン酸、コハク酸、ルリヂサ油、テトラヒドロピペリン（ＴＨＰ）、メタノール、エタノール、プロパノール、オクタノール、ベンジルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、およびポリエチレングリコールモノラウレートが挙げられる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、局所用組成物は、アルコール、Ｃ１〜Ｃ４脂肪族アルコール、および／またはＣ１〜Ｃ５脂肪族アルコールを含む。他の実施形態では、局所用組成物は、Ｃ１〜Ｃ４脂肪族アルコール、および／またはＣ１〜Ｃ５脂肪族アルコールを含んでいない／含まないまたは含有しない。いくつかの実施形態では、局所用組成物は、揮発性溶媒を含む。他の実施形態では、局所用組成物は、揮発性溶媒を含んでいない／含まない。揮発性溶媒は、「逃散性」溶媒としても既知である。揮発性溶媒の非限定的な例には、揮発性アルコール、例えば、Ｃ１〜Ｃ４脂肪族アルコール、Ｃ１〜Ｃ５アルコール、および揮発性Ｃ１〜Ｃ４脂肪族ケトン、例えば、アセトンが挙げられる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、局所用組成物は、界面活性剤を含む。他の実施形態では、局所用組成物は、界面活性剤を含んでいない／含まない。「界面活性剤」または「表面活性剤」という用語は、水の表面張力を低下させる能力、または２つの非混和性物質間の界面張力を低減する能力を示す化合物または材料または物質を意味し、アニオン性、カチオン性、非イオン性、両性、および／またはリン脂質界面活性剤を含む。界面活性剤の非限定的な例は、参照により本明細書に組み込まれるＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ＆  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，２００１  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｈｅ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｃｏｎｆｅｃｔｉｏｎｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．で見つけることができ、参照により本明細書に組み込まれるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  ＤｉｃｔｉｏｎａｒｙおよびＨａｎｄｂｏｏｋ（ＩＮＣＩ），１２ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００８でも見つけることができる。かかる例には、ブロックポリマー、例えば、ポロキサマー１２４；エトキシ化アルコール、例えば、セテス−２、セテアレス−２０、ラウレス−３；エトキシ化脂肪エステルおよび油、例えば、ＰＥＧ−４０水添ヒマシ油、ＰＥＧ−３６ヒマシ油、ＰＥＧ−１５０ジステアレート；グリセロールエステル、例えば、ポリグリセリル−３ジイソステアレート、グリセリルステアレート；グリコールエステル、ＰＥＧ−１２ジオレエート、ＬＥＸＥＭＵＬ  Ｐ；リン酸エステル、例えば、リン酸セチル；高分子界面活性剤、例えば、ＰＶＭ／ＭＡコポリマー、アクリレート／Ｃ１０〜３０アルキルアクリレートクロスポリマー；四級界面活性剤、例えば、セトリモニウムクロリド；シリコーン系界面活性剤、例えば、ＰＥＧ／ＰＰＧ−２０／６ジメチコン；ソルビタン誘導体、例えば、ステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート８０；スクロースおよびグルコースエステルおよび誘導体、例えば、ＰＥＧ−２０メチルグルコースセスキステアレート；ならびにアルコールの硫酸塩、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。より一般的には、界面活性剤は、アニオン性、カチオン性、非イオン性、または両性等のそれらのイオン型によって分類され得る。それらは、ブロックポリマー、エトキシ化アルコール、エトキシ化脂肪エステルおよび油、グリセロールエステル、グリコールエステル、リン酸エステル、高分子界面活性剤、四級界面活性剤、シリコーン系界面活性剤、ソルビタン誘導体、スクロースおよびグルコースエステルおよび誘導体、ならびにアルコールの硫酸塩等のそれらの化学構造によっても分類され得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、局所用組成物は、アルブミン等のタンパク質を含む。他の実施形態では、局所用組成物は、アルブミン等のタンパク質を含んでいない／含まない。
【０１０５】
一実施形態では、局所用組成物は、疎水性担体、１つ以上の揮発性シリコーン流体、およびタキサン粒子を含む疎水性組成物であり、タキサン粒子の平均粒径（数）は、０．１ミクロン〜１．５ミクロンである。さらなる実施形態では、疎水性担体は、ワセリン、鉱油、パラフィンワックス、またはそれらの混合物を含む。さらなる実施形態では、１つ以上の揮発性シリコーン流体は、組成物の５〜２５ｗ／ｗ％の濃度のシクロメチコンである。さらなる実施形態では、タキサン粒子は、パクリタキセル粒子である。
【０１０６】
４．タキサン粒子局所用組成物中のタキサン粒子の濃度
局所用組成物中のタキサン粒子の濃度または量は、組成物が悪性腫瘍に局所的に投与されたときにインビボで対象における免疫学的応答を刺激するのに「有効な量」である。タキサン粒子の濃度は、全組成物重量の０．０５〜１０ｗ／ｗ％であり得るか、またはタキサン粒子の濃度は、０．０５〜５ｗ／ｗ％であり得るか、またはタキサン粒子の濃度は、０．１〜５ｗ／ｗ％であり得るか、またはタキサン粒子の濃度は、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．２５、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．７５、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．２５、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．７５、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．２５、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．７５、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．２５、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．７５、４．８、４．９、５、６、７、８、９、もしくは１０ｗ／ｗ％、またはそれらの中から導き出される任意のパーセンテージであり得る。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、パクリタキセルナノ粒子、ドセタキセルナノ粒子、またはカバジタキセルナノ粒子である。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、パクリタキセル粒子である。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、組成物中約０．０５〜３ｗ／ｗ％未満、または約０．０５〜約２ｗ／ｗ％、または約０．０５〜約１ｗ／ｗ％、または約０．０５〜約０．３ｗ／ｗ％、または約０．０５〜約０．２ｗ／ｗ％、または約０．０５〜約０．１５ｗ／ｗ％、または約０．１〜約５ｗ／ｗ％、または約０．１〜約４ｗ／ｗ％、または約０．１〜約３ｗ／ｗ％、または約０．１〜約２ｗ／ｗ％、または約０．１〜約１ｗ／ｗ％、または約０．１〜約０．３ｗ／ｗ％、または約０．１〜約０．２ｗ／ｗ％、または約０．１５〜約５ｗ／ｗ％、または約０．１５〜約４ｗ／ｗ％、または約０．１５〜約３ｗ／ｗ％、または約０．１５〜約２ｗ／ｗ％、または約０．１５〜約１ｗ／ｗ％、または約０．１５〜約０．３ｗ／ｗ％、または約０．３〜約５ｗ／ｗ％、または約０．３〜約４ｗ／ｗ％、または約０．３〜約３ｗ／ｗ％、または約０．３〜約２ｗ／ｗ％、または約０．３〜約１ｗ／ｗ％、または約１〜約５ｗ／ｗ％、または約１〜約４ｗ／ｗ％、または約１〜約３ｗ／ｗ％または約１〜約２ｗ／ｗ％、または約０．２〜約０．４ｗ／ｗ％、または約０．５〜約１．５ｗ／ｗ％、または約１．５〜約２．５ｗ／ｗ％、または約２〜約５ｗ／ｗ％、または約２〜約４ｗ／ｗ％、または約２〜約３ｗ／ｗ％、または約０．２〜約０．４ｗ／ｗ％、または約０．５〜約１．５ｗ／ｗ％、または約１．５〜約２．５ｗ／ｗ％の濃度である。他の実施形態では、タキサン粒子の濃度は、１ｗ／ｗ％の８０〜１２０％（すなわち、０．８〜１．２ｗ／ｗ％）、または０．０５ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または０．１ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または０．１５ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または０．２ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または０．２５ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または０．３ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または０．３５ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または０．４ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または０．４５ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または０．５ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または０．５５ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または０．６ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または０．６５ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または０．７ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または０．７５ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または０．８ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または０．８５ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または０．９ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または０．９５ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または１．５ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または２ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または２．５ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または３ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または４ｗ／ｗ％の８０〜１２０％、または５ｗ／ｗ％の８０〜１２０％である。
【０１０７】
Ｂ．肺投与、腫瘍内（ＩＴ）注射、腹腔内（ＩＰ）注射、膀胱内注入（膀胱）、および／または組織への直接注射用のタキサン粒子組成物
肺投与、腫瘍内（ＩＴ）注射、腹腔内（ＩＰ）注射、膀胱内注入（膀胱）、および／または腫瘍の周辺組織（前立腺組織、膀胱組織、および腎臓組織等）への直接注射に好適な組成物は、タキサン粒子を含み、以下に記載されている。組成物は、担体をさらに含み得る。組成物は、無水であり得、無水担体を含み得る。担体は、水性担体等の液体（流体）担体であり得る。好適な水性担体の非限定的な例には、注射用滅菌水ＵＳＰ、注射用０．９％塩化ナトリウムＵＳＰ等の０．９％食塩水溶液（生理食塩水）、注射用５％デキストロースＵＳＰ等のデキストロース溶液、および注射用乳酸リンゲル液ＵＳＰが挙げられる。非水性系液体担体および他の水性系液体担体が使用され得る。担体は、薬学的に許容される担体、すなわち、注射、肺経路、または他の投与経路による対象への投与に好適な担体であり得る。担体は、エマルションまたは流動性半固体等の他のタイプの液体であり得る。流動性半固体の非限定的な例には、ゲルおよび熱硬化性ゲルが挙げられる。組成物は、懸濁液、すなわち、タキサン粒子が連続担体／および／または希釈剤中に分散（懸濁）している懸濁液剤形組成物であり得る。懸濁液中で、タキサン粒子は完全に分散していても、部分的に分散および部分的に溶解していてもよいが、担体中で完全に溶解することはできない。いくつかの実施形態では、組成物は、タキサン粒子が連続担体中に分散した懸濁液である。一実施形態では、担体は、薬学的に許容される担体である。他の実施形態では、組成物は、滅菌である。様々な実施形態では、組成物は、タキサン粒子および液体担体を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、組成物は、タキサン粒子が液体担体中に分散した懸濁液である。いくつかの実施形態では、組成物は、タキサン粒子および担体から本質的になるか、またはそれらからなり、担体は、水性担体であり、組成物は、懸濁液である。
【０１０８】
タキサン粒子および担体の組成物は、そのままで投与され得る。任意に、タキサン粒子および担体の組成物は、所望の濃度（用量）のタキサン粒子を達成するために、組成物の希釈に好適な希釈剤をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、担体は、希釈剤として機能することができ、別の言い方をすれば、組成物中の担体の量は、組成物中の所望の濃度のタキサン粒子を提供し、さらなる希釈は必要とされない。好適な希釈剤は、水性流体等の流体であり得る。好適な水性希釈剤の非限定的な例には、注射用滅菌水ＵＳＰ、注射用０．９％塩化ナトリウムＵＳＰ等の０．９％食塩水溶液（生理食塩水）、注射用５％デキストロースＵＳＰ等のデキストロース溶液、および注射用乳酸リンゲル液ＵＳＰが挙げられる。注射による投与に好適な他の液体および水性系希釈剤が使用され得、任意に、塩、緩衝剤、および／または他の賦形剤を含み得る。いくつかの実施形態では、希釈剤は、滅菌である。組成物は、所望の濃度投与量のタキサン粒子を提供する比率で、希釈剤で希釈され得る。例えば、希釈剤に対する組成物の体積比は、１：１〜１：１００ｖ／ｖの範囲または他の好適な比率であり得る。いくつかの実施形態では、組成物は、タキサン粒子、担体、および希釈剤を含み、担体および希釈剤は、混合物を形成し、組成物は、タキサン粒子が担体／希釈剤混合物中に分散した懸濁液である。いくつかの実施形態では、担体／希釈剤混合物は、連続相であり、タキサン粒子は、分散相である。
【０１０９】
組成物、担体、および／または希釈剤は、機能性成分、例えば、緩衝剤、塩、浸透圧剤、界面活性剤、粘度調整剤、レオロジー調整剤、懸濁化剤、アルカリ化剤もしくは酸性化剤等のｐＨ調整剤、張度調整剤、防腐剤、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウム等の四級アンモニウム化合物を含む抗菌剤、粘滑剤、酸化防止剤、消泡剤、キレート剤、ならびに／または着色剤をさらに含み得る。例えば、組成物は、タキサン粒子と、水、塩、界面活性剤、および任意に緩衝液を含む担体とを含み得る。一実施形態では、担体は、水性担体であり、界面活性剤を含み、界面活性剤の濃度は、ｗ／ｗまたはｗ／ｖ基準で１％以下である。他の実施形態では、界面活性剤は、０．５％未満、０．２５％未満、０．１％未満、または約０．１％である。他の実施形態では、水性担体は、界面活性剤ＧＥＬＵＣＩＲＥ（登録商標）（モノ、ジ、およびトリグリセリドならびにポリエチレングリコールのモノおよびジエステルから成るポリエチレングリコールグリセリド）および／またはＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）（ポリエトキシ化ヒマシ油）を除外する。いくつかの実施形態では、組成物または担体は、ポリマー、タンパク質（アルブミン等）、ポリエトキシ化ヒマシ油、ならびに／またはモノ、ジ、およびトリグリセリドおよびポリエチレングリコールのモノおよびジエステルから成るポリエチレングリコールグリセリドを除外する。
【０１１０】
組成物、担体、および／または希釈剤は、１つ以上の界面活性剤を含み得る。好適な界面活性剤の例には、ポリソルベート、ラウリル硫酸塩、アセチル化モノグリセリド、ジアセチル化モノグリセリド、およびポロキサマー４０７等のポロキサマーが挙げられるが、これらに限定されない。ポリソルベートは、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、これは、ソルビトールおよびその無水物の一連の部分脂肪酸エステルであり、ソルビトールおよびその無水物のモル毎におよそ２０、５、または４モルのエチレンオキシドと共重合している。ポリソルベートの非限定的な例は、ポリソルベート２０、ポリソルベート２１、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６１、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリソルベート８１、ポリソルベート８５、およびポリソルベート１２０である。およそ２０モルのエチレンオキシドを含有するポリソルベートは、親水性非イオン性界面活性剤である。およそ２０モルのエチレンオキシドを含有するポリソルベートの例には、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリソルベート８５、およびポリソルベート１２０が挙げられる。ポリソルベートは、商標名ＴＷＥＥＮ（商標）でＣｒｏｄａから市販されている。ポリソルベートの番号指定は、ＴＷＥＥＮの番号指定に対応し、例えば、ポリソルベート２０は、ＴＷＥＥＮ  ２０であり、ポリソルベート４０は、ＴＷＥＥＮ  ４０であり、ポリソルベート６０は、ＴＷＥＥＮ  ６０であり、ポリソルベート８０は、ＴＷＥＥＮ  ８０であるといった具合である。ＵＳＰ／ＮＦグレードのポリソルベートには、ポリソルベート２０  ＮＦ、ポリソルベート４０  ＮＦ、ポリソルベート６０  ＮＦ、およびポリソルベート８０  ＮＦが含まれる。ポリソルベートは、ＰｈＥｕｒグレード（欧州薬局方）、ＢＰグレード、およびＪＰグレードでも入手可能である。「ポリソルベート」という用語は、一般的名称である。ポリソルベート２０の化学名は、ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノラウレートである。ポリソルベート４０の化学名は、ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノパルミテートである。ポリソルベート６０の化学名は、ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノステアレートである。ポリソルベート８０の化学名は、ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノオレエートである。いくつかの実施形態では、組成物、担体、および／または希釈剤は、ポリソルベートの混合物を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物、担体、および／または希釈剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリソルベート８５、および／またはポリソルベート１２０を含む。いくつかの実施形態では、組成物、担体、および／または希釈剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、および／またはポリソルベート８０を含む。一実施形態では、組成物、担体、および／または希釈剤は、ポリソルベート８０を含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、組成物は、タキサン粒子、担体、および任意に希釈剤を含み、担体および／または希釈剤は、水およびポリソルベートを含む。一実施形態では、組成物は、タキサン粒子の懸濁液であり、ポリソルベートは、ポリソルベート８０である。他の実施形態では、ポリソルベートまたはポリソルベート８０は、約０．０１ｖ／ｖ％〜約１．５ｖ／ｖ％の濃度で、組成物、担体、および／または希釈剤中に存在する。驚くべきことに、本発明者らは、列挙される非常に少量のポリソルベート８０が、タキサン粒子と水性担体（生理食塩水溶液等）との界面における表面張力を低減することを発見した。これらの実施形態は、典型的には、組成物の使用間近に製剤化される。いくつかの実施形態では、粒子は、ポリソルベートまたはポリソルベート８０でコーティングされていてもよい。他の実施形態では、粒子は、ポリソルベートまたはポリソルベート８０でコーティングされていない。様々な他の実施形態では、ポリソルベートまたはポリソルベート８０は、組成物、担体、および／または希釈剤中に、約０．０１ｖ／ｖ％〜約１ｖ／ｖ％、約０．０１ｖ／ｖ％〜約０．５ｖ／ｖ％、約０．０１ｖ／ｖ％〜約０．４ｖ／ｖ％、約０．０１ｖ／ｖ％〜約０．３５ｖ／ｖ％、約０．０１ｖ／ｖ％〜約０．３ｖ／ｖ％、約０．０１ｖ／ｖ％〜約０．２５ｖ／ｖ％、約０．０１ｖ／ｖ％〜約０．２ｖ／ｖ％、約０．０１ｖ／ｖ％〜約０．１５ｖ／ｖ％、約０．０１ｖ／ｖ％〜約０．１ｖ／ｖ％、約０．０５ｖ／ｖ％〜約１ｖ／ｖ％、約０．０５ｖ／ｖ％〜約０．５ｖ／ｖ％、約０．０５ｖ／ｖ％〜約０．４ｖ／ｖ％、約０．０５ｖ／ｖ％〜約０．３５ｖ／ｖ％、約０．０５ｖ／ｖ％〜約０．３ｖ／ｖ％、約０．０５ｖ／ｖ％〜約０．２５ｖ／ｖ％、約０．０５ｖ／ｖ％〜約０．２ｖ／ｖ％、約０．０５ｖ／ｖ％〜約０．１５ｖ／ｖ％、約０．０５ｖ／ｖ％〜約０．１ｖ／ｖ％、約０．１ｖ／ｖ％〜約１ｖ／ｖ％、約０．１ｖ／ｖ％〜約０．５ｖ／ｖ％、約０．１ｖ／ｖ％〜約０．４ｖ／ｖ％、約０．１ｖ／ｖ％〜約０．３５ｖ／ｖ％、約０．１ｖ／ｖ％〜約０．３ｖ／ｖ％、約０．１ｖ／ｖ％〜約０．２５ｖ／ｖ％、約０．１ｖ／ｖ％〜約０．２ｖ／ｖ％、約０．１ｖ／ｖ％〜約０．１５ｖ／ｖ％、約０．２ｖ／ｖ％〜約１ｖ／ｖ％、約０．２ｖ／ｖ％〜約０．５ｖ／ｖ％、約０．２ｖ／ｖ％〜約０．４ｖ／ｖ％、約０．２ｖ／ｖ％〜約０．３５ｖ／ｖ％、約０．２ｖ／ｖ％〜約０．３ｖ／ｖ％、約０．２ｖ／ｖ％〜約０．２５ｖ／ｖ％、約０．３ｖ／ｖ％〜約１ｖ／ｖ％、約０．３ｖ／ｖ％〜約０．５ｖ／ｖ％、約０．３ｖ／ｖ％〜約０．４ｖ／ｖ％、もしくは約０．３ｖ／ｖ％〜約０．３５ｖ／ｖ％、または約０．０１％、約０．０５％、約０．１ｖ／ｖ％、約０．１５ｖ／ｖ％、約０．１６ｖ／ｖ％、約０．２ｖ／ｖ％、約０．２５ｖ／ｖ％、約０．３ｖ／ｖ％、約０．３５ｖ／ｖ％、約０．４ｖ／ｖ％、約０．４５ｖ／ｖ％、約０．５ｖ／ｖ％、もしくは約１ｖ／ｖ％の濃度で存在する。
【０１１２】
組成物、担体、および／または希釈剤は、１つ以上の張度調整剤を含み得る。好適な張度調整剤の例には、１つ以上の無機塩、電解質、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ナトリウム、硫酸カリウム、重炭酸ナトリウムおよびカリウム、ならびにアルカリ土類金属塩、例えば、アルカリ土類金属無機塩、例えば、カルシウム塩、およびマグネシウム塩、マンニトール、デキストロース、グリセリン、プロピレングリコール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
組成物、担体、および／または希釈剤は、１つ以上の緩衝剤を含み得る。好適な緩衝剤の例には、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン、および炭酸水素ナトリウム、ならびに当業者に既知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＨを腹腔内使用に望ましい範囲に調整するために、緩衝液が一般に使用される。通常、約５〜９、５〜８、６〜７．４、６．５〜７．５、または６．９〜７．４のｐＨが望ましい。
【０１１４】
組成物、担体、および／または希釈剤は、１つ以上の粘滑剤を含み得る。粘滑剤は、腹膜およびその中の臓器を覆う膜等の粘膜の上に滑らかな薄膜を形成する薬剤である。粘滑剤は、軽度の痛みおよび炎症を軽減する場合があり、粘膜保護剤と称されることもある。好適な粘滑剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびメチルセルロース等の約０．２〜約２．５％の範囲のセルロース誘導体；約０．０１％のゼラチン；グリセリン、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、およびプロピレングリコール等の約０．０５〜約１％も含む、約０．０５〜約１％のポリオール；約０．１〜約４％のポリビニルアルコール；約０．１〜約２％のポビドン；ならびに本明細書に記載の別の高分子粘滑剤とともに使用される場合に約０．１％のデキストラン７０が含まれる。
【０１１５】
組成物、担体、および／または希釈剤は、ｐＨを調整するために１つ以上のアルカリ化剤を含み得る。本明細書で使用される場合、「アルカリ化剤」という用語は、アルカリ性媒体を提供するために使用される化合物を意味するよう意図されている。かかる化合物の例には、アンモニア溶液、炭酸アンモニウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、および水酸化ナトリウム、ならびに当業者に既知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
組成物、担体、および／または希釈剤は、ｐＨを調整するために１つ以上の酸性化剤を含み得る。本明細書で使用される場合、「酸性化剤」という用語は、酸性媒体を提供するために使用される化合物を意味するよう意図されている。かかる化合物の例には、酢酸、アミノ酸、クエン酸、硝酸、フマル酸、および他のアルファヒドロキシ酸、塩酸、アスコルビン酸、および硝酸、ならびに当業者に既知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
組成物、担体、および／または希釈剤は、１つ以上の消泡剤を含み得る。本明細書で使用される場合、「消泡剤」という用語は、充填組成物の表面上に形成される起泡を防止するか、またはその量を低減する化合物（複数可）を意味するよう意図されている。好適な消泡剤の例には、ジメチコン、ＳＩＭＥＴＨＩＣＯＮＥ、オクトキシノール、および当業者に既知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
組成物、担体、および／または希釈剤は、懸濁液の粘度を増加または減少させる１つ以上の粘度調整剤を含み得る。好適な粘度調整剤には、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マンニトール、ポリビニルピロリドン、カルボマー等の架橋アクリル酸ポリマー、および当業者に既知の他のものが含まれる。組成物、担体、および／または希釈剤は、組成物の流動特性を調整して、それが注射針または管等のデバイスを通して適切に流動することを可能にするレオロジー調整剤をさらに含み得る。粘度調整剤およびレオロジー調整剤の非限定的な例は、“Ｒｈｅｏｌｏｇｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ−Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”Ｂｒａｕｎ，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ａｎｄｒｅｗ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００で見つけることができる。
【０１１９】
肺投与、腫瘍内注射、腹腔内注射、膀胱内注入、または組織への直接注射用の組成物中のタキサン粒子の濃度および量は、組成物が局所投与されたときにインビボで対象における免疫学的応答を刺激するのに「有効な量」である。一実施形態では、組成物中のタキサン粒子の濃度は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬである。様々なさらなる実施形態では、組成物中のタキサン粒子の濃度は、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約０．５ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ〜約８ｍｇ／ｍＬ、もしくは約４ｍｇ／ｍＬ〜約６ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６１、６５、７０、７５、もしくは１００ｍｇ／ｍＬ、または約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６１、６５、７０、７５、もしくは１００ｍｇ／ｍＬである。タキサン粒子は、投与される唯一の治療薬であってもよく、または他の治療薬とともに投与されてもよい。
【０１２０】
様々な実施形態では、組成物は、タキサン粒子（パクリタキセル粒子またはドセタキセル粒子）、担体、および希釈剤を含み、組成物（担体および希釈剤を含む）中のタキサン粒子の濃度は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、もしくは約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、または約６ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、もしくは約１５ｍｇ／ｍＬである。さらなる実施形態では、担体は、約０．９％塩化ナトリウム溶液等の食塩水溶液であり得る水性担体であり、希釈剤は、約０．９％塩化ナトリウム溶液等の食塩水溶液であり得る水性希釈剤である。さらなる実施形態では、水性担体は、ポリソルベート８０等のポリソルベートを含む。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、組成物は、ポリマー／コポリマーまたは生体適合性ポリマー／コポリマーを含んでいない／含まないまたは含有しない。いくつかの実施形態では、組成物は、タンパク質を含んでいない／含まないまたは含有しない。本開示のいくつかの態様では、組成物は、アルブミンを含んでいない／含まないまたは含有しない。本開示のいくつかの態様では、組成物は、ヒアルロン酸を含んでいない／含まないまたは含有しない。本開示のいくつかの態様では、組成物は、ヒアルロン酸とタキサンとのコンジュゲートを含んでいない／含まないまたは含有しない。本開示のいくつかの態様では、組成物は、ヒアルロン酸とパクリタキセルとのコンジュゲートを含んでいない／含まないまたは含有しない。本開示のいくつかの態様において、組成物は、ポロキサマー、ポリアニオン、ポリカチオン、修飾ポリアニオン、修飾ポリカチオン、キトサン、キトサン誘導体、金属イオン、ナノベクター、ポリ−ガンマ−グルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、アルギン酸（ＡＬＧ）、ビタミンＥ−ＴＰＧＳ、ジメチルイソソルビド（ＤＭＩ）、メトキシＰＥＧ  ３５０、クエン酸、抗ＶＥＧＦ抗体、エチルセルロース、ポリスチレン、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリホスファゼン、ポリオルトエステル、ポリエステル、ポリアミド、ポリサッカライド、ポリタンパク質、スチレン−イソブチレン−スチレン（ＳＩＢＳ）、ポリ無水物コポリマー、ポリカプロラクトン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビス（Ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン−セバシン酸、ポリ（ｄ，ｌ−乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（ｄ，ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＡＧＡ）、および／またはポリ（Ｄ，Ｌ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）を含んでいない／含まないまたは含有しない。
【０１２２】
一実施形態では、肺投与、腫瘍内注射、および／または腹腔内注射に好適な組成物は、タキサン粒子および液体担体を含み、タキサン粒子は、０．１ミクロン〜１．５ミクロンの平均粒径（数）を有する。さらなる実施形態では、タキサン粒子は、パクリタキセル粒子である。さらなる実施形態では、液体担体は、水性担体である。
【０１２３】
Ｃ．タキサン粒子組成物の局所投与方法
タキサン粒子組成物の対象への投与は、局所投与によるものである。タキサン粒子を含む組成物の腫瘍への直接局所投与には、局所的適用、肺投与、腫瘍内注射、腫瘍周辺注射、膀胱内注入（膀胱）、および腹腔内注射が含まれるが、これらに限定されない。本明細書および本開示全体に記載の局所投与用の組成物は、様々なタイプの局所投与、例えば、局所的適用、肺投与、腫瘍内注射、および腹腔内注射における使用に好適な組成物である。
【０１２４】
組成物は、単回用量の単回投与（サイクル）で、または単回用量の２回以上の別個の投与（２サイクル以上）で投与され得る。いくつかの実施形態では、２回以上の別個の投与は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、もしくは１４日間間隔でまたは少なくともそれらの間隔で投与される。いくつかの実施形態では、２回以上の別個の投与は、２〜１２、２〜１１、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜１２、３〜１１、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜１２、４〜１１、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜１２、５〜１１、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、５〜６、６〜１２、６〜１１、６〜１０、６〜９、６〜８、６〜７、７〜１２、７〜１１、７〜１０、７〜９、７〜８、８〜１２、８〜１１、８〜１０、８〜９、９〜１２、９〜１１、９〜１０、１０〜１２、１０〜１１、１１〜１２、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間間隔で投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、２〜５、２〜４、２〜３、３〜５、３〜４、２、３、４、５回、またはそれ以上の別個の投与で投与される。いくつかの実施形態では、２回以上の別個の投与は、少なくとも２週間にわたって週１回投与される。他の実施形態では、２回以上の別個の投与は、少なくとも１週間にわたって週２回投与され、２回以上の別個の投与は、少なくとも１日間隔である。いくつかの実施形態では、組成物は、１、２、３、４、５、６回、またはそれ以上の別個の投与で投与される。他の実施形態では、組成物は、７回またはそれ以上の別個の投与で投与される。いくつかの実施形態では、本方法により、腫瘍の除去（根絶）がもたらされる。
【０１２５】
１．タキサン粒子組成物局所的適用方法
いくつかの実施形態では、タキサン粒子組成物の局所投与は、局所的投与であり、それにより、組成物が対象の患部に局所的に適用され、固形腫瘍は、皮膚悪性腫瘍である。皮膚悪性腫瘍は、皮膚癌または皮膚転移であり得る。いくつかの実施形態では、腫瘍は、対象の体内の唯一のがんである。他の実施形態では、対象は、体内の他の場所にもがんを有する。皮膚悪性腫瘍の「患部」には、皮膚悪性腫瘍が皮膚の最外表面上または皮膚表面の真下（上皮／皮膚被覆）に目に見えて存在する皮膚の少なくとも一部が含まれ得、目に見えて検出不能な前臨床病変を含む可能性が高い皮膚悪性腫瘍の近くの皮膚の領域が含まれ得る。皮膚悪性腫瘍は、皮膚癌または皮膚転移であり得る。いくつかの実施形態では、皮膚悪性腫瘍は、皮膚転移である。他の実施形態では、皮膚悪性腫瘍は、皮膚癌である。皮膚転移は、以下の原発性がん：乳癌、肺癌、鼻腔癌、副鼻腔癌、喉頭癌、口腔癌、結腸（大腸）癌、直腸癌、胃癌、卵巣癌、精巣癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頸部癌、膣癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、腎臓癌、食道癌、膵臓癌、肝臓癌、黒色腫、およびカポジ肉腫（エイズ関連カポジ肉腫を含む）の非限定的な例等の様々な原発性がん由来のものであり得る。いくつかの実施形態では、皮膚転移は、肺癌、乳癌、結腸癌、口腔癌、卵巣癌、腎臓癌、食道癌、胃癌、または肝臓癌由来のものである。いくつかの実施形態では、皮膚転移は、乳癌由来のものである。皮膚癌の非限定的な例には、黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、およびカポジ肉腫が挙げられる。いくつかの実施形態では、本方法は、電気化学療法（ＥＣＴ）、光線力学療法（ＰＤＴ）、放射線療法（ＲＴ）、または病変内局注療法（ＩＬＴ）等の追加の皮膚指向療法を含まない。
【０１２６】
皮膚悪性腫瘍の患部に局所的に適用される組成物の量は、患部のサイズおよび組成物中のタキサンの濃度によって異なり得るが、一般に、患部を完全に覆うためにおよそ１０セント硬貨の厚さで適用され得る。適用する組成物の量を決定するのに好適な別の方法は、「フィンガーチップユニット」（ＦＴＵ）アプローチである。１ＦＴＵは、成人の指先に沿って標準のチューブから絞り出される局所用組成物の量である（これは、チューブが標準の５ｍｍノズルを有すると仮定する）。指先は、指の一番端から指の第１の線までである。組成物は、手袋をはめた手、またはスパチュラ、または他の局所的投与手段で適用され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、無傷の皮膚被覆（上皮／真皮被覆）を有する皮膚悪性腫瘍に適用される。いくつかの実施形態では、組成物は、皮膚悪性腫瘍病変が皮膚の表面上にあるか、または皮膚被覆が劣化して皮膚悪性腫瘍病変が露出している潰瘍形成領域に適用される。適用前に、患部を水（および必要に応じて低刺激性石鹸）で優しく洗浄し、乾燥させてもよい。組成物が適用されると、適用部位は、ＴＥＧＡＤＥＲＭ（登録商標）またはＳＯＬＯＳＩＴＥ（登録商標）等の密封包帯で被覆され得る。組成物の投与は異なり得るが、一般に、状態が改善または排除されるまで、毎日ほぼ同じ時間に１日１回、２回、または３回の適用を含み得る。
【０１２７】
２．タキサン粒子組成物の肺投与方法
いくつかの実施形態では、局所投与は肺投与であり、それにより、タキサン粒子組成物が吸入され、固形腫瘍は、肺腫瘍である。いくつかの実施形態では、対象は、身体の他の領域にがんを有する。いくつかの実施形態では、肺腫瘍は、中皮腫である。悪性肺腫瘍は、肺内に存在する任意の腫瘍であり、原発性または転移性肺腫瘍であり得る。悪性肺腫瘍の非限定的な例には、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）が挙げられる。一実施形態では、悪性肺腫瘍は、ＳＣＬＣである。別の実施形態では、悪性肺腫瘍は、ＮＳＣＬＣである。本開示の方法によるタキサン粒子の肺投与により、任意の他のタキサン製剤を使用して以前に可能であったよりもはるかに長い肺内でのタキサンの滞留時間がもたらされることが示されている。以下の例に示されるように、タキサンは、投与後少なくとも９６時間（４日間）または少なくとも３３６時間（１４日間）にわたって対象の肺組織中で検出可能なままである。様々なさらなる実施形態では、タキサンは、投与後少なくとも１０８、１２０、１３２、１４４、１５６、１６８、１８０、１９２、２０４、２１６、２２８、２４０、２５２、２６４、２７６、２８８、３００、３１２、３２４、または３３６時間にわたって対象の肺組織中で検出可能なままである。いくつかの実施形態では、がん性肺疾患は、体内の唯一の癌である。いくつかの実施形態では、対象は、がん性肺疾患および身体の他の領域に癌を有する。
【０１２８】
本開示の１つの特定の実施形態では、肺投与は、経鼻吸入、経口吸入、またはそれらの両方等による、タキサン粒子を含む組成物の吸入を含む。この実施形態では、タキサン粒子を含む組成物は、エアロゾル（すなわち、ガス状媒体中のタキサン粒子の安定した分散液または懸濁液の液滴）として製剤化され得る。エアロゾル組成物として送達されたタキサン粒子は、重力沈降、慣性衝突、および／または拡散によって気道中に沈着し得る。加圧定量噴霧式吸入器（ｐＭＤＩ）、ネブライザー、およびソフトミスト吸入器が含まれるが、これらに限定されない、エアロゾルを生成するための任意の好適なデバイスが使用され得る。いくつかの実施形態では、タキサン粒子は、乾燥粉末形態であり得、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）で使用され得る。これらの薬物粒子は、典型的には、ＤＰＩデバイスのカプセル内に配置される。作動すると、カプセルは破裂され、乾燥粉末の煙が放出される。薬物粉末は、所望の空気動力学的質量中央径（ＭＭＡＤ）に調整され得るが、最も一般的な方法は、小さい薬物粉末を肺送達用のラクトース等の担体とブレンドすることである。薬物粒子は、静的付着によってラクトース粒子に付着する。肺送達用のラクトースは、約２．５ミクロン等の所望のＭＭＡＤにサイズ決定され得る。マンニトール等の他の糖も使用され得る。
【０１２９】
１つの特定の実施形態では、本方法は、噴霧によりエアロゾル化されたタキサン粒子を含む組成物の吸入を含む。ネブライザーは、一般に、圧縮空気または超音波出力を使用して、エアロゾル粒子を含む組成物の吸入可能なエアロゾル液滴を作り出す。この実施形態では、噴霧により、タキサン粒子を含む組成物のエアロゾル液滴の対象への肺送達がもたらされる。一実施形態では、タキサン粒子は、パクリタキセル粒子である。好適なネブライザーは、Ｈｏｓｐｉｔａｋ圧縮空気ジェットネブライザーである。
【０１３０】
別の実施形態では、本方法は、ｐＭＤＩによりエアロゾル化されたタキサン粒子を含む組成物の吸入を含み、タキサン粒子を含む組成物は、好適な推進剤系（計量弁で密封された加圧容器内に少なくとも１つの液化ガスを含有するヒドロフルオロアルカン（ＨＦＡ）を含むが、これに限定されない）中に懸濁される。弁の作動により、タキサン粒子を含む組成物のエアロゾルスプレーの計量された用量の送達がもたらされる。一実施形態では、タキサン粒子は、パクリタキセル粒子である。
【０１３１】
タキサン粒子を含む組成物が投与のためにエアロゾル化される実施形態では、タキサン粒子を含む組成物のエアロゾル液滴の空気動力学的質量中央径（ＭＭＡＤ）は、本明細書に開示される方法での使用に好適な任意の粒径であり得る。一実施形態では、エアロゾル液滴は、直径約０．５μｍ〜約６μｍのＭＭＡＤを有する。様々なさらなる実施形態では、エアロゾル液滴は、直径約０．５μｍ〜約５．５μｍ、直径約０．５μｍ〜約５μｍ、直径約０．５μｍ〜約４．５μｍ、直径約０．５μｍ〜約４μｍ、直径約０．５μｍ〜約３．５μｍ、直径約０．５μｍ〜約３μｍ、直径約０．５μｍ〜約２．５μｍ、直径約０．５μｍ〜約２μｍ、直径約１μｍ〜約５．５μｍ、直径約１μｍ〜約５μｍ、直径約１μｍ〜約４．５μｍ、直径約１μｍ〜約４μｍ、直径約１μｍ〜約３．５μｍ、直径約１μｍ〜約３μｍ、直径約１μｍ〜約２．５μｍ、直径約１μｍ〜約２μｍ、直径約１．５μｍ〜約５．５μｍ、直径約１．５μｍ〜約５μｍ、直径約１．５μｍ〜約４．５μｍ、直径約１．５μｍ〜約４μｍ、直径約１．５μｍ〜約３．５μｍ、直径約１．５μｍ〜約３μｍ、直径約１．５μｍ〜約２．５μｍ、直径約１．５μｍ〜約２μｍ、直径約２μｍ〜約５．５μｍ、直径約２μｍ〜約５μｍ、直径約２μｍ〜約４．５μｍ、直径約２μｍ〜約４μｍ、直径約２μｍ〜約３．５μｍ、直径約２μｍ〜約３μｍ、および直径約２μｍ〜約２．５μｍのＭＭＡＤを有する。いくつかの実施形態では、エアロゾル液滴は、直径約０．５μｍ〜約６μｍ、または直径約１μｍ〜約３μｍ、または直径約２μｍ〜約３μｍの空気動力学的質量中央径（ＭＭＡＤ）を有する。エアロゾル液滴の空気動力学的質量中央径（ＭＭＡＤ）および幾何標準偏差（ＧＳＤ）の測定に好適な計器は、Ｍｅｒｃｅｒ−Ｓｔｙｌｅ  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｉｍｐａｃｔｏｒ等の７段階エアロゾルサンプラーである。
【０１３２】
３．タキサン粒子組成物の腫瘍内（ＩＴ）注射方法
いくつかの実施形態では、タキサン粒子組成物の局所投与は腫瘍内注射投与であり、それにより、組成物が固形腫瘍に直接注射される。本明細書で使用される場合、「固形腫瘍」とは、通常嚢胞または液体領域を含まない組織の異常な塊である。固形腫瘍は、良性（がんではない）または悪性（がんである）であり得る。異なるタイプの固形腫瘍は、それらを形成する細胞型に応じて命名される。固形悪性腫瘍の例は、肉腫、癌腫、およびリンパ腫である。１つの特定の実施形態では、固形腫瘍は、悪性固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、悪性固形腫瘍は、対象の体内の唯一の癌である。他の実施形態では、対象は、悪性固形腫瘍および身体の他の領域に癌を有する。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「腫瘍に直接注射される」または「腫瘍内注射（ＩＴ）」とは、懸濁液等の組成物の一部または全てが腫瘍塊に注射されることを意味する。当業者であれば理解するであろうように、かかる直接注射は、例えば、組成物またはその懸濁液の量が多すぎて、全てを固形腫瘍塊に直接注射することができない場合に、懸濁液等の組成物、例えば、固形腫瘍の周辺（「腫瘍周辺」）への薬剤の一部の注射を含み得る。一実施形態では、組成物またはその懸濁液は、その全体が固形腫瘍塊に注射される。別の実施形態では、組成物またはその懸濁液は、腫瘍の周辺組織（腫瘍周辺）に注射される。本明細書で使用される場合、腫瘍は、腫瘍塊および腫瘍転移（骨転移および軟部組織転移を含むが、これらに限定されない）の両方を含む。
【０１３４】
タキサン粒子の組成物の腫瘍への腫瘍内注射は、当業者に既知の任意の好適な手段によって達成され得る。非限定的な実施形態では、注射は、磁気共鳴映像法−経直腸的超音波融合（ＭＲ−ＴＲＵＳ）ガイダンス（前立腺腫瘍の注射等のため）を介して、または内視鏡超音波ガイド下細針注射（ＥＵＳ−ＦＮＩ）を介して行われ得る。好適な腫瘍内注射方法および組成物は、参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１７／２５７１８号に開示されている。
【０１３５】
様々な実施形態では、固形腫瘍は、肉腫、癌腫、およびリンパ腫、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、頭頸部腫瘍、膠芽細胞腫、膀胱腫瘍、膵臓腫瘍、肝腫腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、リンパ系腫瘍、胃腸腫瘍、または腎臓腫瘍から選択される。特定の実施形態では、固形腫瘍は、前立腺腫瘍であり、化学療法粒子は、パクリタキセル粒子またはドセタキセル粒子である。別の特定の実施形態では、固形腫瘍は、卵巣腫瘍であり、化学療法粒子は、パクリタキセル粒子またはドセタキセル粒子である。別の特定の実施形態では、固形腫瘍は、乳房腫瘍であり、化学療法粒子は、ドセタキセル粒子である。別の特定の実施形態では、固形腫瘍は、膵臓腫瘍であり、化学療法粒子は、パクリタキセル粒子またはドセタキセル粒子である。これらの実施形態のいずれでも、腫瘍は、例えば、腺癌であり得る。
【０１３６】
４．タキサン粒子組成物の腹腔内（ＩＰ）注射方法
いくつかの実施形態では、タキサン粒子組成物の局所投与は腹腔内注射投与であり、それにより、組成物が腹膜腔に注射され、腫瘍は、腹腔内臓器腫瘍である。腹腔内臓器には、胃、回腸、空腸、横行結腸、虫垂、Ｓ状結腸、脾臓、肝臓、膵尾部、十二指腸の最初の５センチメートル、および直腸の上部３分の１が含まれる。女性では、腹腔が開いて生殖器と連通するため（卵管がこの連通を容易にする）、子宮、卵巣、卵管、および性腺血管は全て腹腔内にあり、本開示の目的のために腹腔内臓器として含まれる。
【０１３７】
タキサン粒子の組成物の腫瘍への腹腔内注射は、当業者に既知の任意の好適な手段によって達成され得る。好適な腹腔内注射方法および組成物は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８２２１７７９号に開示されている。腹腔内注射に好適な方法には、シリンジを介した注射、ポートを介した注入、および外科的投与が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、悪性固形腫瘍は、卵巣癌、子宮癌、胃癌、結腸癌、脾臓癌、肝臓癌、直腸癌、および／または膵臓癌である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、卵巣癌腫瘍である。
【実施例】
【０１３９】
本開示は、特定の実施例によってさらに詳細に説明される。以下の実施例は、例証目的のために提供されており、いかなる方法でも本開示を限定するようには意図されていない。当業者であれば、本質的に同じ結果をもたらすように変更または修正され得る様々な重要ではないパラメータを容易に認識するであろう。
【０１４０】
実施例１−パクリタキセル粒子の粒径、ＳＳＡ、およびかさ密度分析
表１（実施例２）および表７（実施例３）に列記されるフォーミュラで使用されるパクリタキセル粒子ロットの粒径を、ＡＣＣＵＳＩＺＥＲ  ７８０を使用した以下の粒径法によって分析した。
【０１４１】
計器パラメータ：最大濃度：９０００粒子／ｍＬ、容器数：１、センサ範囲：総和、検出下限：０．５μｍ、流量：３０ｍＬ／分、分析プル数：４、プル間隔：１秒、プル体積：１０ｍＬ、風袋体積：１ｍＬ、プライム体積：１ｍＬ、第１のプルを含む：選択されず。
【０１４２】
試料の調製：ひとすくいのパクリタキセル粒子ＡＰＩをきれいな２０ｍＬバイアルに入れ、濾過した（０．２２μｍ）０．１ｗ／ｗ％のＳＤＳ溶液をおよそ３ｍＬ添加してＡＰＩを湿潤させ、次いでバイアルの残りにＳＤＳ溶液を充填した。５〜１０分間ボルテックスし、水バッチで１分間超音波処理した。
【０１４３】
方法：濾過した（０．２２μｍ）０．１ｗ／ｗ％のＳＤＳ溶液でプラスチックボトルを充填し、バックグラウンドを分析した。少量（１００μＬ未満）のパクリタキセル粒子試料懸濁液を、撹拌しながら０．１ｗ／ｗ％のＳＤＳ溶液のボトルにピペットで移し、ＡＣＣＵＳＩＺＥＲ注入チューブをボトルに入れ、試料を計器に通した。必要に応じて、ＳＤＳ溶液またはパクリタキセル試料懸濁液をさらに添加して、６０００〜８０００粒子数の所望の実行濃度を達成した。
【０１４４】
粒径の結果（数加重微分分布に基づく）：表１に列記されるフォーミュラで使用されるパクリタキセル粒子ロット：平均：０．８６１μｍ。表７に列記されるフォーミュラで使用されるパクリタキセル粒子ロット：平均：０．８３μｍ。
【０１４５】
表１および表７に列記されるフォーミュラで使用されるパクリタキセル粒子ロットの比表面積（ＳＳＡ）を、上記のブルナウアー・エメット・テラー（「ＢＥＴ」）等温法によって分析した。表１に列記されるフォーミュラで使用されるパクリタキセル粒子ロットは、４１．２４ｍ２／ｇのＳＳＡを有した。表７に列記されるフォーミュラで使用されるパクリタキセル粒子ロットは、２６．７２ｍ２／ｇのＳＳＡを有した。
【０１４６】
表１に列記されるフォーミュラで使用されるパクリタキセル粒子ロットのかさ密度（タップなし）は、０．０５ｇ／ｃｍ３であった。表７に列記されるフォーミュラで使用されるパクリタキセル粒子ロットのかさ密度（タップなし）は、０．０９ｇ／ｃｍ３であった。
【０１４７】
実施例２−疎水性担体を有するパクリタキセル粒子の無水疎水性局所用組成物
疎水性担体を含むパクリタキセル粒子の無水疎水性局所用組成物を表１に列記する。
【表１】
2021526354.tif 000003
【０１４８】
Ｆ４〜Ｆ１３を調製するための手順：シクロメチコン（または鉱油（Ｆ４）もしくはＦＯＭＢＬＩＮ（Ｆ７））の一部を有するパクリタキセル粒子のスラリーを調製した。ワセリンを５２±３℃に加熱し、残りの成分を添加し、融解して均質になるまで混合した。パクリタキセルスラリーを添加し、均質になるまで混合した。混合し、バッチを３５℃以下に冷却した。軟膏が形成された。
【０１４９】
無水疎水性局所用組成物中の粒子の粒径分析
計器：ＡＣＣＵＳＩＺＥＲ  Ｍｏｄｅｌ  ７７０／７７０Ａ：
計器パラメータ：センサ：ＬＥ０．５μｍ〜４００μｍ、センサ範囲：総和、検出下限：０．５μｍ、収集時間：６０秒、チャネル数：１２８、槽流体体積：１００ｍＬ、流量：６０ｍＬ／分、最大一致：８０００粒子／ｍＬ、試料槽：Ａｃｃｕｓｉｚｅｒ  Ｖｅｓｓｅｌ、試料計算：なし、電圧検出器：１０Ｖ以上、粒子濃度計算：なし、濃度範囲：５０００〜８０００粒子／ｍＬ、自動データ保存：選択、バックグラウンド減算：あり、自動サイクル数：１。
【０１５０】
試料の調製：試料製剤のアリコートをシンチレーションバイアルに添加した。スパチュラを使用して、試料をバイアルの内壁に沿って塗りつけた。ＩＳＯＰＡＲ−Ｇ（商標）（Ｃ１０〜１１イソパラフィン）溶液中約２０ｍＬの２％レシチンをバイアルに添加した。バイアルを１分間超音波処理した。試料が溶液中に十分に分散していることを確認した。
【０１５１】
方法：ＩＳＯＰＡＲ−Ｇ溶液中の濾過した（０．２２μｍ）２％レシチンで試料槽を充填し、バックグラウンドを分析した。ピペットを使用して、調製した試料の一部を撹拌しながら槽に移した。５０００〜８０００粒子／ｍＬの一致レベルを提供するために、必要に応じて試料を希釈するか、または槽に添加した。計器を通して分析を開始し、この分析では一致レベルが５０００〜８０００粒子／ｍＬであったことを検証した。
【０１５２】
粒径分析の結果を以下の表２および表３に示す。
【表２】
2021526354.tif 000004
【表３】
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【０１５３】
インビトロ皮膚浸透拡散研究
フランツ拡散セルシステムを使用して無傷のヒト死体皮膚内およびそれを通したフォーミュラＦ１〜Ｆ１３のインビトロ皮膚浸透の速度および程度を決定するための研究を行った。パクリタキセルの濃度を、異なる時点で拡散セルのレセプターチャンバ内で測定した。拡散研究が終了した時点で、皮膚をテープ剥離し、表皮層および真皮層に分割した。表皮組織および真皮組織中のパクリタキセルを、抽出溶媒を使用して抽出し、分析も行った。
【０１５４】
分析方法：質量分析（ＭＳ）法を、パクリタキセルを分析するために開発した。ＭＳ条件は、以下の表４のとおりであった。
【表４】
2021526354.tif 000006
【０１５５】
フランツ拡散セル（ＦＤＣ）研究−方法論
皮膚の調製：無傷のヒト死体皮膚を、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｆｉｒｅｆｉｇｈｔｅｒｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋ（ＮＦＦＴＢ）から購入した。皮膚を上背から収集し、組織バンクにより約５００μｍの厚さに採皮刀切除された。皮膚を組織バンクから受け取った時点で、皮膚を実験の朝まで−２０℃で冷凍保存した。使用前に、皮膚を冷凍庫から取り出し、室温で完全に解凍させた。次いで、皮膚をＰＢＳ浴に短時間浸して、いかなる残留抗凍結剤および防腐剤も除去した。視覚的に無傷の皮膚の領域のみを実験中に使用した。各研究では、２つの別個のドナーを使用し、各ドナーは対応する３つの複製物を有した。
【０１５６】
レセプター液の調製：予備溶解度データの結果に基づいて、ｐＨ７．４の９６重量％のリン酸塩緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）および４重量％のヒドロキシルプロピルベータシクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）のレセプター液を選択した。レセプター液中の活性物質の溶解度（約０．４μｇ／ｍＬ）が研究中にシンク条件を維持するのに十分であることが示された。真空を引きながら、ＺａｐＣａｐ  ＣＲ  ０．２μｍ膜を通してレセプター液を濾過することによって、レセプター液を脱気した。真空を維持しながら、濾過したレセプター液をさらに２０分間撹拌して、完全な脱気を確実にした。
【０１５７】
拡散セルの組み立て：死体皮膚を冷凍庫から取り出し、バイオセーフティフードで３０分間解凍した。パッケージを開ける前に、皮膚を完全に解凍した。死体皮膚をパッケージから取り出し、角質層側を上にしてバイオセーフティフードカウンター上に置いた。皮膚をキムワイプで軽くたたいて乾燥させ、次いで、新鮮なＰＢＳを噴霧し、再び軽くたたいて乾燥させた。このプロセスをさらに３回繰り返して、皮膚上に存在するいかなる残留物も除去した。次いで、レセプターウェルに脱気した受容体流体を充填した。テフロンコーティングされた撹拌棒を各レセプターウェルに加えた。解凍された死体皮膚を試験し、厚さが均一であり、かつ表面に目に見える損傷がない領域のみを使用した。皮膚を約２ｃｍ×２ｃｍの正方形に切断した。皮膚片は、角質層（ＳＣ）側を上にしてドナーウェルの中央に配置した。皮膚を中央に配置し、縁部を平らにした。次いで、ドナーウェルとレセプターウェルを整列させ、クランプで一緒に固定した。必要に応じて、追加のレセプター液を追加した。セルを傾けて存在するいかなる気泡も除去し、試料ポートに沿って空気を逃がした。次いで、拡散セルを撹拌ドライブロックヒーターに入れ、レセプター液から２０分間再水和させた。ブロックヒーターを連続撹拌しながら、実験全体を通して３２℃に維持した。皮膚を２０分間水和させ、各皮膚切片のバリア完全性を試験した。膜完全性チェック研究が完了した時点で、全レセプターチャンバ体積をレセプター液と交換した。
【０１５８】
製剤の適用手順：製剤を皮膚の角質層に適用した。１回投与レジメンをこの研究に使用した。容積式Ｎｉｃｈｉｒｙｏピペッターを使用して、試験物品を１０μＬの用量で皮膚に適用した。次いで、ガラス棒を使用して、製剤を皮膚の表面全体に広げた。実験中、セルをキャップなしで放置した。１セルあたりのパクリタキセルの理論用量を以下の表５に示す。
【表５】
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【０１５９】
レセプター液のサンプリング：３、６、１２、および２４時間時点で、目盛り付きハミルトン型インジェクターシリンジを使用して、３００μＬの試料アリコートをレセプターウェルから取り出した。新鮮なレセプター培地を添加して、３００μＬの試料アリコートを交換した。
【０１６０】
テープ剥離および熱分割：２４時間時点で、ＰＢＳ／エタノールに浸したキムワイプを使用して、皮膚をきれいに拭き取った。残留製剤を拭き取り、皮膚をキムワイプで乾燥させた後、角質層を３回テープ剥離し、各テープ剥離は、均一な圧力でセロハンテープを皮膚に適用することおよびテープを剥がすことからなる。テープ剥離物を収集し、今後の分析のために冷凍した。最初の３つのテープ剥離物は、角質層の最上層を除去し、追加の皮膚洗浄ステップとして機能する。活性物質は、典型的には、この領域に完全に吸収されるとはみなされない。これらのテープ剥離物は、通常、質量平衡アッセイのためのみに分析される。皮膚をテープ剥離した後、ピンセットまたはスパチュラを使用して各片の表皮を下層真皮組織から分離した。表皮組織および真皮組織を収集し、４ｍＬホウケイ酸ガラスバイアルに入れた。全ての皮膚片を分離した後、抽出溶媒のアリコートをガラスバイアルに添加した。このプロセスは、２ｍＬのＤＭＳＯをバイアルに添加することおよび３２℃で２４時間インキュベートすることからなった。抽出時間が経過した後、抽出流体の３００μＬの試料アリコートを収集および濾過した。
【０１６１】
試料の分析：上述の分析法を使用して、試料アリコートをパクリタキセルについて分析した。
【０１６２】
結果：
以下の表６の結果は、製剤Ｆ１〜Ｆ１３についての、様々な時点でのレセプター液中のパクリタキセルの送達用量（μｇ／ｃｍ２）、ならびに２４時間経過後の表皮および真皮に送達されたパクリタキセルの濃度（μｇ／ｃｍ２）（浸透）を示す。図１は、フォーミュラＦ１〜Ｆ７について、表皮内に送達されたパクリタキセルの濃度（μｇ／ｃｍ２）をグラフで示す。図２は、フォーミュラＦ６＊（反復分析）およびＦ８〜Ｆ１３について、表皮内に送達されたパクリタキセルの濃度（μｇ／ｃｍ２）をグラフで示す。図３は、フォーミュラＦ１〜Ｆ７について、真皮内に送達されたパクリタキセルの濃度（μｇ／ｃｍ２）をグラフで示す。図４は、フォーミュラＦ６＊（反復分析）およびＦ８〜Ｆ１３について、真皮内に送達されたパクリタキセルの濃度（μｇ／ｃｍ２）をグラフで示す。
【０１６３】
注：フォーミュラＦ１〜Ｆ６を１つのインビトロ研究で試験し、フォーミュラＦ６＊およびＦ８〜Ｆ１３を、異なる死体皮膚ロットを用いて、第２の別個のインビトロ研究で試験した。フォーミュラＦ６の分析を第２の研究で繰り返し（Ｆ６＊と表記される）、これにより、それを第２の研究で評価し、他のフォーミュラと比較することができた。
【表６】
2021526354.tif 000008
【０１６４】
表６の結果から分かるように、皮膚（表皮および真皮）を通るパクリタキセルの経皮フラックスは、ゼロまたはごくわずかな量、すなわち、０．０１μｇ／ｃｍ２未満であった。表６、ならびに図１、２、３、および４の結果から分かるように、皮膚（表皮および真皮）内へのパクリタキセルの浸透は、水性製剤（Ｆ１〜Ｆ３）が皮膚浸透促進剤ＤＧＭＥ（ＴＲＡＮＳＣＵＴＯＬ  Ｐ）を含有していたにもかかわらず、水性製剤よりも無水疎水性製剤（Ｆ４〜Ｆ１３）を用いた場合にはるかに高かった。これらの結果は、シクロメチコンを有する無水疎水性製剤がシクロメチコンを有しない無水疎水性製剤よりも高い皮膚浸透（表皮および真皮）を呈したことも示す。加えて、これらの結果は、シクロメチコンを含有する無水疎水性製剤への他の皮膚浸透促進剤の添加が、これらの組成物の皮膚浸透（表皮および真皮）にほとんどまたは全く影響を及ぼさなかったことを示す。
【０１６５】
実施例３−皮膚転移についてのフェーズ１／２用量増加、安全性、忍容性、および有効性研究
以下の表７に示される軟膏製剤を皮膚転移研究で使用するために調製した。
【表７】
2021526354.tif 000009
【０１６６】
パクリタキセル粒子を含有する表７に列記されるフォーミュラを各々６ｋｇのバッチサイズで製造した。次いで、フォーミュラを１５ｇｍのラミネートチューブにパッケージングした。
【０１６７】
ロットＦ１４、Ｆ１５、およびＦ１６の製造プロセスは、以下のとおりであった。ワセリン、鉱油、パラフィンワックス、およびシクロメチコンの一部を槽に添加し、融解して均質になるまで、プロペラミキサーで混合しながら５２±３℃に加熱した。パクリタキセルナノ粒子を、シクロメチコンの別の一部を含む槽に添加し、最初にスパチュラで混合してナノ粒子を湿潤させ、次いで、槽を氷／水浴内に保持しながら、均質なスラリーが得られるまで、Ｓ２５−２５Ｇ分散ツールを備えたＩＫＡ  Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘホモジナイザーで混合した。次いで、プロペラミキサーで混合しながらスラリーをワセリン／パラフィンワックス容器に添加し、続いて、シクロメチコンの残りの一部ですすぎ、５２±３℃で、バッチが視覚的に均質になるまで混合した。次いで、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎホモジナイザーを使用してバッチを均質化した。その後、均質な軟膏が形成されるまでバッチをプロペラミキサーで混合し、バッチを３５℃以下に冷却した。
【０１６８】
ロットＦ１７の製造プロセスは、以下のとおりであった。ワセリンおよびパラフィンワックスを槽に添加し、融解して均質になるまで、プロペラミキサーで混合しながら５２±３℃に加熱した。パクリタキセルナノ粒子を、シクロメチコンおよび鉱油の一部を含む槽に添加し、最初にスパチュラで混合してナノ粒子を湿潤させ、次いで、槽を氷／水バッチ内に保持しながら、均質なスラリーが得られるまで、Ｓ２５−２５Ｇ分散ツールを備えたＩＫＡ  Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘホモジナイザーで混合した。次いで、プロペラミキサーで混合しながらワセリン／パラフィンワックス容器にスラリーを添加し、続いて、鉱油の残りの一部ですすぎ、５２±３℃で、バッチが視覚的に均質になるまで混合した。次いで、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎホモジナイザーを使用してバッチを均質化した。その後、均質な軟膏が形成されるまでバッチをプロペラミキサーで混合し、バッチを３５℃以下に冷却した。
【０１６９】
表７の各フォーミュラの化学的および物理的分析結果を、２５℃でＴ＝０、１ヶ月、および３ヶ月について、表８〜１１に示す。
【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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表７の製剤のうちの３つ、上記のＦ１４（０．１５％）、Ｆ１６（１．０％）、およびＦ１７（２．０％）を、ヒトにおける皮膚転移について、ＦＤＡ承認のフェーズ１／２の用量増加、安全性、忍容性、および有効性研究で使用した。研究は、現在進行中である。これは、非黒色腫皮膚転移に２８日間にわたって１日２回局所的に適用された、表７の製剤のうちの３つ、Ｆ１４（０．１５％）、Ｆ１６（１．０％）、およびＦ１７（２．０％）の安全性、忍容性、および予備有効性研究を評価する、フェーズ１／２、非盲検、用量増加研究であった。
【０１７０】
少なくとも１つの適格な病変を含む胴体または四肢の５０ｃｍ２の処置面積を、測定可能な腫瘍（その最長径で１０ｍｍ以上）のＲＥＣＩＳＴ（バージョン１．１）定義によってベースラインで決定した。処置面積内の全ての病変をキャリパーによって測定して、適格性を確認した。手袋をはめた手を使用して、対象は、フィンガーチップユニット（ＦＴＵ）の製剤を２８日間にわたって毎日ほぼ同じ時間に１日２回、５０ｃｍ２の処置面積に適用した。ＦＴＵは、直径５ｍｍのノズルを備えたチューブから搾り出される、大人の人さし指の遠位の皮膚線から先端まで適用される、軟膏製剤の量として定義される。対象は、１日目に、用量適用のトレーニングおよび最初の処置適用の観察のためのクリニックに参加した。追加の来診は、８、１５、２９、および４３日目であった。最後の来診は最後の治験薬投与の３０日後に完了し、有害事象をレビューした。研究への参加は、用量漸増段階および用量拡大段階に分類される。
【０１７１】
用量漸増段階：用量漸増段階中、本研究は、標準の３＋３用量上昇設計に従い、３名の対象の第１のコホートに製剤Ｆ１４（０．１５％）での処置を開始した。安全性監視委員会は、３名の対象の各コホートの最後の対象が１５日間の処置を完了した後に利用可能な全てのデータをレビューして、用量漸増を続けるかを決定した。
【０１７２】
用量拡大段階：用量拡大段階では、追加の対象を登録して、用量漸増段階で決定した用量レベルで最大１２名の合計対象に達した。用量拡大段階の対象は、同じ来診日にクリニックに出席し、上記の用量漸増段階と同じ評価を受けた。
【０１７３】
目的：この研究の第一目的は、製剤の予備的安全性および忍容性を決定することであった。第二目的は、製剤の予備的有効性を決定し、処置面積における疼痛の潜在的な軽減を研究し、かつ転移病変に適用された製剤の薬物動態を説明することであった。
【０１７４】
集団：非黒色腫皮膚転移を有する、１８歳以上の最少２名〜最大２４名の男性および女性ヒト対象。
【０１７５】
主要エンドポイント：有害事象、臨床検査評価の変化、身体検査の所見、およびバイタルサインによって実証される安全性および忍容性。
【０１７６】
副次的エンドポイント：有効性に関する以下の副次的エンドポイントの目的のために、適格病変を、測定可能な腫瘍（その最長径で１０ｍｍ以上）のＲＥＣＩＳＴ（バージョン１．１）定義によってベースラインで決定した（ＥＩＳＥＮＨＡＵＥＲ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ：ｒｅｖｉｓｅｄ  ＲＥＣＩＳＴ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１）．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．２００９；４５；２２８−２４７）。
ベースラインと４３日目（すなわち、投与レジメンに応じて、用量漸増段階および用量拡大段階の最終投与の１４日後）との間の処置面積内の適格腫瘍径（複数可）の合計の差として定義される、客観的腫瘍応答。全ての来診時に腫瘍表面積および応答を評価した。表面積の変化を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）によって提供される較正済みグリッド測定システム（ＩｍａｇｅＪフリーウェア）を使用して評価した。ＩｍａｇｅＪを使用して病変を測定および分析した。
客観的臨床応答は、完全臨床応答（ＣＲ）＋部分応答（ＰＲ）を有する対象として定義され、さらに、最終処置の１４日後の処置面積内の適格標的病変（複数可）の最長径（複数可）の合計の変化として測定される、製剤での最終処置の１４日後に完全臨床応答または部分応答を達成する患者のパーセンテージとして定義される。処置に対する応答を、処置後の全直径を処置前の全直径で割った関数として評価した。
最良の全体応答は、研究処置の開始から処置の終了、すなわち、４３日目までに記録された最良の応答として定義される。
完全臨床応答（ＣＲ）は、処置面積内の適格病変（複数可）においていかなる検出可能な残存病変も存在しないものとして定義され、部分応答（ＰＲ）は、ベースラインと比較して、処置面積内の適格病変（複数可）の直径の合計の少なくとも３０％の減少であり、進行性疾患（ＰＤ）は、研究の最小合計を基準として、処置面積内の適格病変（複数可）の直径の合計の少なくとも２０％の増加である。加えて、合計は、少なくとも５ｍｍの絶対的増加も示さなければならない。安定疾患（ＳＤ）は、ＰＲまたはＰＤとして定義された病変径間の適格病変径（複数可）の合計として定義される。
この研究への参加中の新たな非標的病変の出現は、進行性疾患に相当しない。
処置面積での疼痛を、数値評価スケール（ＮＲＳ−１１）によって測定する。ベースラインから４３日目までの疼痛の変化を分析する。
Ｔｍａｘ、Ｃｍａｘ、ＡＵＣによって決定される全身曝露。
【０１７７】
予備的結果：進行中の研究の予備的結果は、ステージ４の乳癌を有する女性の胸部の皮膚転移病変の写真を含む。対象を、乳癌のためのｎａｂ−パクリタキセルでのＩＶ療法を完了した後に研究に登録した。１ヶ月後、製剤Ｆ１４（０．１５％）の局所的適用により処置を開始した。図５は、ベースライン（１日目）に撮影した写真であり、潰瘍性病変からの凝固滲出液で覆われた指標病変（矢印）を示す。図６は、同じ処置部位上に１日２回適用した製剤Ｆ１４（０．１５％）の局所的処置後の８日目に撮影した写真である。病変の表面は、表皮が失われ、真皮に限定された推定潰瘍形成の領域を含んでいる。図７は、同じ処置部位上に１日２回適用した製剤Ｆ１４（０．１５％）の局所的処置後の１５日目の写真である。病変の内側部分には少量の古い滲出液が見られ、明らかな表皮潰瘍形成は見られない。図８ａは、同じ処置部位上に１日２回適用した製剤Ｆ１４（０．１５％）の局所的処置後の２９日目の写真である。２８日間の処置中、対象の皮膚病変が紅斑に囲まれ、潰瘍形成することなく拡大し、局所免疫応答を示す（図８ａ）。処置終了の１１日後、対象を再び全身性パクリタキセルで処置した。全身性パクリタキセルでの処置の３日後、研究処置が終了した２週間後、図８ｂに示されるように、対象の病変のサイズおよび体積が著しく減少した。局所的製剤Ｆ１４（０．１５％）での局所処置は、ＩＶパクリタキセルに対するその後の応答に対して皮膚病変を感作した。病変は、潰瘍形成の兆候なく上皮化されたように見える。対照的に、潰瘍性皮膚乳癌転移の自然歴は、表皮表面が腫瘍によって破られると急速に拡大し、真皮をさらに貫通し、典型的には潰瘍形成をもたらすことである。したがって、皮膚転移性疾患への処置製剤の局所的適用は、患者に利益をもたらす。
【０１７８】
実施例４−ラットにおけるｎＰａｃ（すなわち、本明細書に開示されるパクリタキセル粒子、およそ９８％パクリタキセル（実施例４、５、および６で使用される、０．８３ミクロンの平均粒径（数）、２７．９ｍ２／ｇのＳＳＡ、および０．０８０５ｇ／ｃｍ３のかさ密度（タップなし）を有するもの））吸入研究−低用量および高用量
要旨
本研究の全体的な目的は、６．０ｍｇ／ｍＬおよび２０．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃ懸濁製剤を用いて雄のラットに鼻のみの吸入曝露を行うことであった。ラット吸入曝露を、各々６５分間行った。
【０１７９】
６．０ｍｇ／ｍＬおよび２０．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃ懸濁製剤をスポンサーによって提供される指示に従って調製した。齧歯類吸入曝露チャンバへのｎＰａｃ製剤のエアロゾル化のために、２つＨｏｓｐｉｔａｋ圧縮空気ジェットネブライザーを２０ｐｓｉで同時に使用した。各曝露中に、１．０±０．５Ｌ／分の流量で４７ｍｍのＧＦ／Ａフィルターにサンプリングすることによって、エアロゾル濃度を動物呼吸ゾーンから測定した。２．０±０．１Ｌ／分の流量でＭｅｒｃｅｒスタイルカスケードインパクターを使用して動物呼吸ゾーンからエアロゾルをサンプリングすることによって、粒径を決定した。フィルターを重量測定的に分析して、総ｎＰａｃエアロゾル濃度を決定し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析して、曝露毎のパクリタキセルエアロゾル濃度を決定した。吸入曝露中にわたって、酸素および温度を監視および記録した。
【０１８０】
平均総ｎＰａｃエアロゾル濃度およびパクリタキセルエアロゾル濃度は、吸入曝露を６．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃ製剤で行った場合、それぞれ、０．２５ｍｇ／Ｌ（残差標準偏差７．４３％）および８５．６４μｇ／Ｌ（残差標準偏差１０．２３％）であると決定した。カスケードインパクターを使用して測定された平均空気動力学的質量中央径（幾何標準偏差）は、６．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃ製剤エアロゾルの場合、１．８（２．０）μｍであった。平均総ｎＰａｃエアロゾル濃度およびパクリタキセルエアロゾル濃度は、吸入曝露を２０．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃ製剤で行った場合、それぞれ、０．４６ｍｇ／Ｌ（残差標準偏差１０．９５％）および２６２．２７μｇ／Ｌ（残差標準偏差１１．９９％ＲＳＤ）であると決定した。カスケードインパクターを使用して測定された平均空気動力学的質量中央径（幾何標準偏差）は、２０．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃ製剤エアロゾルの場合、２．３（１．９）μｍであった。
【０１８１】
０．３８ｍｇ／ｋｇおよび１．１８ｍｇ／ｋｇの平均パクリタキセル沈着用量を、それぞれ、６．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃ製剤および２０．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃ製剤６５分間曝露について、等式１を使用して計算した。
製剤および吸入曝露
製剤の調製
材料
試験物品：吸入曝露に使用した試験物品を以下に示す。
ｎＰａｃ：
正体：ｎＰａｃ（滅菌ナノ粒子パクリタキセル）
説明：３０６ｍｇ／バイアルとして送達されるパクリタキセルの新規乾燥粉末製剤
ビヒクル
ｎＰａｃ製剤の調製に使用したビヒクルを以下に示す。
１％ポリソルベート８０溶液
正体：注射用０．９％塩化ナトリウム中滅菌１％ポリソルベート８０
説明：透明な液体
生理食塩水希釈剤
正体：注射用滅菌０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰ
説明：透明な液体
【０１８２】
製剤および吸入曝露
製剤の調製
６．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃ製剤を以下のように調製した。簡潔には、５．０ｍＬの１％ポリソルベート８０を、ｎＰａｃ（３０６ｍｇ、粒子を含むバイアルに添加した。ｎＰａｃバイアルを激しく振盪し、反転させて、ｎＰａｃバイアル内に存在する全ての粒子の湿潤を確実にした。振盪直後、４６ｍＬの０．９％塩化ナトリウム溶液をｎＰａｃバイアルに添加し、バイアルを少なくとも１分間振盪して、懸濁液十分な混合および適切な分散を確認した。
【０１８３】
６．０ｍｇ／ｍＬの製剤に使用した４６ｍＬの代わりに１０．３ｍＬの０．９％塩化ナトリウム溶液をｎＰａｃバイアルに添加することを除いて、６．０ｍｇ／ｍＬの製剤についての上述のｎＰａｃ製剤化手順を使用して、２０．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃ製剤を調製した。
【０１８４】
結果として得られた製剤を少なくとも５分間そのまま放置し、エアロゾル化作業のためにバイアル内のいかなる空気／泡も減少させた後にネブライザーに入れた。６．０ｍｇ／ｍＬの最終製剤を室温で保ち、再構成後２時間以内に噴霧化した。２０．０ｍｇ／ｍＬの最終製剤を室温で保ち、再構成後３０分以内に噴霧化した。
【０１８５】
実験デザイン
３０匹のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを単回「臨床基準」用量の静脈内Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（パクリタキセル、標的用量５．０ｍｇ／ｋｇ）に曝露し、３０匹のＳｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットをｎＰａｃ（パクリタキセル、標的用量０．３７ｍｇ／ｋｇ）に曝露し、３０匹のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを単回での鼻のみの吸入によりｎＰａｃ（パクリタキセル、標的用量１．０ｍｇ／ｋｇ）に曝露した。３匹の動物（ｎ＝３）を、血液（血漿）および肺組織収集のために曝露後０．５（±１０分）、６（±１０分）、１２（±１０分）、２４（±３０分）、４８（±３０分）、７２（±３０分）、１２０（±３０分）、１６８（±３０分）、２４０（±３０分）、および３３６（±３０分）時間時点で安楽死させた。血漿および肺組織で非コンパートメント分析を行い、各用量群の曝露後のパクリタキセルの検出可能な量の持続時間を特定した。
【０１８６】
曝露システム
吸入曝露システムは、２つの圧縮空気ジェットネブライザー（Ｈｏｓｐｉｔａｋ）および齧歯類の鼻のみの吸入曝露チャンバからなった。曝露酸素レベル（％）を曝露中にわたって監視した。ｎＰａｃ懸濁エアロゾルを、２０ｐｓｉの入口圧力で、一組の２つの圧縮空気ジェットネブライザー（最大４０（±１）分間使用し、その後、残りの曝露持続時間では第２の組の２つの圧縮空気ジェットネブライザーと交換した）を用いて生成した。エアロゾルを、２４インチのステンレス鋼エアロゾル送達ライン（直径１．５３ｃｍ）を通して鼻のみの曝露チャンバに方向付けた。
【０１８７】
濃度の監視
エアロゾル濃度の監視を、エアロゾルを予め秤量したＧＦ／Ａ  ４７ｍｍフィルターに収集することによって行った。フィルターを、齧歯類曝露中にわたって、鼻のみの曝露チャンバの齧歯類呼吸ゾーンからサンプリングした。ＧＦ／Ａフィルターを通過するエアロゾルサンプリング流量を、１．０±０．５Ｌ／分で維持した。１３分後に収集した最後のフィルターを除いて、合計６つのＧＦ／Ａフィルターを曝露持続時間中にわたって１０分毎に１つ収集した。試料収集後、フィルターを秤量して、曝露システム内の総エアロゾル濃度を決定した。フィルターを抽出し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析して、各フィルター上で収集されたパクリタキセルの量を定量化した。収集されたエアロゾルおよびパクリタキセルエアロゾルの総量を、フィルターを通った全空気流量で割ることによって、各フィルターの総エアロゾル濃度およびパクリタキセルエアロゾル濃度を計算した。平均パクリタキセルエアロゾル濃度を使用して、以下に示される等式１を使用して、齧歯類の肺へのパクリタキセルの達成された平均沈着用量を計算した。
【０１８８】
エアロゾル粒子（液滴）サイズの測定
エアロゾルの粒径分布を、Ｍｅｒｃｅｒスタイル７段階カスケードインパクター（Ｉｎｔｏｘ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ，ＮＭ）によって、鼻のみの曝露チャンバの齧歯類呼吸ゾーンから測定した。粒径分布を、空気動力学的質量中央径（ＭＭＡＤ）および幾何標準偏差（ＧＳＤ）の観点から決定した。カスケードインパクター試料を、２．０±０．１Ｌ／分の流量で収集した。
【０１８９】
用量の決定
等式１を使用して、沈着用量を計算した。この計算では、曝露から測定した平均エアロゾル濃度をラットの平均群体重とともに使用した。このようにして、ラットの肺内に沈着したパクリタキセルの推定量を、測定したパクリタキセルエアロゾル濃度を使用して計算した。
【数１】
2021526354.tif 000014
式中、
沈着用量＝（ＤＤ）μｇ／ｋｇ
２呼吸分時量（ＲＭＶ）＝０．６０８×ＢＷ０．８５２
エアロゾル曝露濃度（ＡＣ）＝パクリタキセルエアロゾル濃度（μｇ／Ｌ）
沈着分率（ＤＦ）＝想定沈着分率１０％
ＢＷ＝研究時の動物の平均体重（無作為化時、−１日目）（ｋｇ）
【０１９０】
結果
曝露の結果
エアロゾルの濃度および粒径
エアロゾル濃度を、鼻のみの曝露チャンバの動物の呼吸ゾーンからの４７ｍｍのＧＦ／Ａフィルターを使用して、各ｎＰａｃ製剤エアロゾル曝露中にわたって監視した。７つの４７ｍｍのＧＦ／Ａフィルターを各曝露中にサンプリングした。低用量群および高用量群毎に、フィルターＦＳ−１〜ＦＳ−６を各々１０分間サンプリングし、フィルターＦＳ−７を５分間サンプリングした。粒径を、曝露チャンバの動物呼吸ゾーンからのＭｅｒｃｅｒスタイルカスケードインパクターを使用して測定した。表１２および表１３は、それぞれ、低用量曝露および高用量曝露中にＧＦ／Ａフィルターをサンプリングすることによって測定された総エアロゾル濃度およびパクリタキセルエアロゾル濃度を示す。
【表１２】
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【表１３】
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【０１９１】
粒径（エアロゾル液滴サイズ）分布を、カスケードインパクターを使用して、ｎＰａｃ製剤エアロゾル毎のＭＭＡＤ（空気動力学径に対する空中浮遊粒子質量の分布の中央値）（ＧＳＤ、粒径分布の変動を特徴付けるＭＭＡＤ測定を伴う）の観点から決定した。６．０ｍｇ／ｍＬおよび２０．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃエアロゾルについて、ＭＭＡＤ（ＧＳＤ）は、それぞれ、１．８（２．０）μｍおよび２．３（１．９）μｍであると決定した。図９および図１０は、それぞれ、６．０ｍｇ／ｍＬおよび２０．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃ製剤エアロゾルの粒径分布を示す。
【０１９２】
沈着用量
パクリタキセル沈着用量を、等式１を使用して、平均パクリタキセルエアロゾル濃度、ラットの平均体重、想定沈着分率１０％、ならびに低用量および高用量ｎＰａｃ製剤曝露毎の曝露持続時間６５分間に基づいて計算した。表１４は、平均パクリタキセルエアロゾル濃度、ラットの平均体重、曝露時間、および曝露毎の沈着用量を示す。達成された齧歯類の平均沈着用量は、６．０ｍｇ／ｋｇおよび２０．０ｍｇ／ｋｇのｎＰａｃ製剤曝露の場合、それぞれ、０．３８ｍｇ／ｋｇおよび１．１８ｍｇ／ｋｇであると決定した。
【表１４】
2021526354.tif 000017
【０１９３】
酸素および温度
酸素および温度を、ｎＰａｃ製剤エアロゾル曝露中にわたって監視した。記録された酸素および温度範囲は、６．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃ曝露の場合、それぞれ、１９．８％〜２０．９％および２０．７℃〜２０．８℃であった。２０．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃ製剤曝露の場合、記録された酸素値は、曝露中にわたって１９．８％であり、温度範囲は、２０．７℃〜２０．８℃であった。
予備データ：図１１および図１２を参照されたい。
【０１９４】
実施例５−ｎＰａｃの薬物動態学的研究
要旨
９０匹の雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを、静脈内（ＩＶ）ボーラス注射により「臨床基準」用量のパクリタキセルＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（注射用懸濁液用のパクリタキセルタンパク質結合粒子、別名、ｎａｂ−パクリタキセル）に、または単回での鼻のみの吸入によりｎＰａｃ（パクリタキセル、標的用量０．３７ｍｇ／ｋｇまたは１．０ｍｇ／ｋｇ）に曝露した。３匹の動物（ｎ＝３）を、血液（血漿）および肺組織収集のために、曝露後０．５〜３３６時間の１０時点で安楽死させた。血漿および肺組織で非コンパートメント分析（ＮＣＡ）を行い、各用量群の曝露後のパクリタキセルの検出可能な量の持続時間を特定した。全ての群からの３３６時間時点に指定された動物の右肺を液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）分析のために収集し、潜在的な組織病理学のために左肺を１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）で灌流固定した。比較組織病理学を可能にするために、３匹の予備の動物（未処理対照）を３３６時間時点で安楽死させ、肺の収集を同じ様式で行なった。全ての他の時点に指定された動物の全ての肺を、ＬＣＭＳ分析のために個別に凍結した。
【０１９５】
低用量ｎＰａｃ群および高用量ｎＰａｃ群の吸入曝露平均パクリタキセルエアロゾル濃度は、それぞれ、８５．６４μｇ／Ｌおよび２６２．２７μｇ／Ｌであった。平均曝露エアロゾル濃度は、噴霧化吸入曝露について予想された目標エアロゾル濃度の±１５％以内であった。粒径分布を、カスケードインパクターを使用して各ｎＰａｃ製剤エアロゾルのＭＭＡＤ（ＧＳＤ）の観点から決定した。６．０ｍｇ／ｍＬおよび２０．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃエアロゾルについて、ＭＭＡＤ（ＧＳＤ）は、それぞれ、１．８（２．０）μｍおよび２．３（１．９）μｍであると決定した。
【０１９６】
パクリタキセル沈着低用量を、パクリタキセル平均エアロゾル濃度８５．６４μｇ／Ｌ、０日目の群平均体重４２０．４ｇ、想定沈着分率１０％、および曝露持続時間６５分間に基づいて計算し、達成された齧歯類の平均沈着用量が低用量ｎＰａｃ群の場合に０．３８ｍｇ／ｋｇであると決定した。高用量ｎＰａｃ群の場合、パクリタキセル平均エアロゾル濃度２６２．２７μｇ／Ｌ、０日目の群平均体重４２０．５ｇ、想定沈着分率１０％および、曝露持続時間６５分間であり、達成された齧歯類の平均沈着用量が１．１８ｍｇ／ｋｇであると決定した。記録された酸素および温度範囲は、６．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃ曝露の場合、それぞれ、１９．８％〜２０．９％および２０．７℃〜２０．８℃であった。２０．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃ製剤曝露の場合、記録された酸素値は、曝露中にわたって１９．８％であり、温度範囲は、２０．７℃〜２０．８℃であった。
【０１９７】
Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）のＩＶ注射を受けた群の場合、１日目の体重は３８６．１〜４７２．８ｇの範囲であり、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）用量が２．６〜３．２ｍｇ／ｋｇになり、群平均用量が２．９ｍｇ／ｋｇであった。
【０１９８】
本研究中にわたって全ての群の体重が増加した。本研究の継続期間中にわたって、異常な臨床的観察は認められなかった。全ての動物がそれらの指定された剖検時点まで生存した。全ての動物を、各時点を対象とした時間枠内で安楽死させた。
【０１９９】
剖検時、各群からの動物のおよそ半数が肺に最小限から軽度の褐色変色を有した。かかる観察は、多くの場合、吸入曝露に関連する。他の一時的観察には、肥大した心臓（動物番号２０１６）および肥大した気管気管支リンパ節が含まれた。剖検時に他の異常な巨視的観察は認められなかった。組織病理学は、試験物品および参照物品で処理したラット由来の肺および気管が正常範囲内であり、本研究の条件下で未処理ラットのものと区別不能であったことを示した。投与屠殺後３３６時間時点で、肺内に沈着した外因性物質に対する生理学的に正常な応答として吸入研究で一般的であるマクロファージ集積は、この研究で試験した処理動物の肺切片内で明らかではなかった。
【０２００】
ＮＣＡを、曝露（濃縮対時間曲線下面積［ＡＵＣ］）、最大濃度までの時間（Ｔｍａｘ）、最大濃度（Ｃｍａｘ）、および可能な場合は見かけの最終半減期（Ｔ１／２）を定量化するように設計した。
【０２０１】
新規ｎＰａｃ製剤の仮説は、その製剤が肺組織中でのパクリタキセルの滞留を増加させ、全身曝露を減少させるというものであった。全身血漿中での半減期は試験した製剤／用量で不変であり、肺組織中での半減期は吸入により送達したｎＰａｃ製剤で増加した。
【０２０２】
吸入によりｎＰａｃ製剤として送達した場合、肺組織への曝露（用量正規化ＡＵＣ）が増加した。
【０２０３】
まとめると、このデータは、ＩＶ「臨床基準」と比較した吸入により送達された場合の肺組織中でのｎＰａｃの有意な滞留を示す。
【０２０４】
目的
本研究の目的は、パクリタキセルの臨床基準用量と比較したｎＰａｃ製剤の薬物動態を決定することであった。ｎＰａｃを吸入により投与したＬｏｖｅｌａｃｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌの研究ＦＹ１７−００８Ａ（上記の実施例１）からのパイロット薬物動態（ＰＫ）データは、肺組織中での１６８時間を超える滞留時間を示した。この研究では、単回低用量もしくは高用量の鼻のみの吸入によるｎＰａｃ製剤または単回臨床基準用量の尾静脈内（ＩＶ）注射によるパクリタキセルのいずれかを投与した動物の血漿および肺組織を０．５〜３３６時間時点で評価した。
【０２０５】
材料および方法
試験システム
種／系統：Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット
研究開始時の動物の年齢：８〜１０週齢
研究開始時の体重範囲：３４５〜４４７ｇ
研究中の数／性別：９５匹の雄（９０匹の研究動物および５匹の予備）
供給源：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，ＮＹ）
識別：油性マーカーによる尾マーキング
【０２０６】
Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）製剤
ＩＶ製剤に使用した臨床基準材料は、医薬品Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（製造業者：Ｃｅｌｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｍｍｉｔ，ＮＪ、ロット：６１１１８８０）であった。この医薬品を投与日に生理食塩水（製造業者：Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ｌｌ．．、ロット：Ｐ３５７８８９）で５．０ｍｇ／ｍＬに再構成し、製造業者の指示に従って保管した。
【０２０７】
ｎＰａｃ製剤
低用量群曝露の場合に６．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃ製剤および高用量群曝露の場合に２０．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃ製剤をスポンサーの推奨に従って調製した。具体的には、ｎＰａｃを１％ポリソルベート８０で再構成した。全ての粒子が湿潤するまでバイアルを手で振盪した。注射用の追加の０．９％塩化ナトリウムを（所望の濃度目標まで）添加し、バイアルをさらに１分間手で振盪した。大きい塊が見えなくなり、懸濁液が適切に分散するまで振盪を続けた。結果として得られた製剤を少なくとも５分間そのまま放置して、バイアル内のいかなる空気／泡を減少させた後に、エアロゾル化作業のためにネブライザーに入れた。６．０ｍｇ／ｍＬの最終製剤を室温で保ち、再構成後２時間以内に噴霧化した。２０．０ｍｇ／ｍＬの最終製剤を室温で保ち、再構成後３０分以内に噴霧化した。
【０２０８】
実験デザイン
表１５に示される群１の動物は、ＩＶ尾静脈注射により単回「臨床基準」用量（製剤濃度：５ｍｇ／ｍＬ、目標用量：体重に基づいて５．０ｍｇ／ｋｇ、目標用量体積：２５０μＬ未満）のＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（注射用懸濁液用のパクリタキセルタンパク質結合粒子）を受けた。表１５における群２および群３の動物を、以下の研究デザインに従って鼻のみの吸入（ＩＮＨ）によりｎＰａｃエアロゾル（目標用量０．３７または１．０ｍｇ／ｋｇ）に単回曝露した。３匹の動物（ｎ＝３）を、血液（血漿）および肺組織収集のために曝露後０．５（±１０分）、６（±１０分）、１２（±１０分）、２４（±３０分）、４８（±３０分）、７２（±３０分）、１２０（±３０分）、１６８（±３０分）、２４０（±３０分）、および３３６（±３０分）時間時点で安楽死させた。血漿および肺組織で非コンパートメント分析を行い、各用量群の曝露後のパクリタキセルの検出可能な量の持続時間を特定した。全ての群からの３３６時間時点に指定された動物の右肺をＬＣＭＳ分析のために個別に凍結させ、潜在的な組織病理学のために左肺を１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）で灌流固定した。比較組織病理学を可能にするために、３匹の予備の動物（未処理対照）も３３６時間時点で安楽死させ、肺を同じ様式で収集した。
【表１５】
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【０２０９】
畜産、隔離、および研究への割り当て
雄のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（６〜８週齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，ＮＹ）から入手し、１４日間隔離した。隔離の終わりに動物を秤量し、その後、研究への割り当てのために体重によって無作為化した。動物を尾マーキングおよびケージカードによって識別した。水、照明、湿度、および温度制御を適切なＳＯＰに従って維持および監視した。非曝露時間中、ラットに標準の齧歯類飼料を自由に摂食させた。
【０２１０】
体重および毎日の観察
体重を、無作為化時、研究期間全体を通して毎日、および安楽死時に収集した。研究中の各動物に異常、瀕死状態、または死亡の臨床的徴候がないか、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＣＭＡＲ）担当者が１日２回観察した。
【０２１１】
Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）ＩＶ投与−尾静脈注射
Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（濃度：５ｍｇ／ｍＬ、目標用量：体重に基づいて５．０ｍｇ／ｋｇ、用量体積：２５０μＬ未満）を、齧歯類およびモルモットにおける注射、皮膚投与、および採血のためのＳＯＰ  ＡＣＳ  １２７８手順に従って、ＩＶ尾静脈注射により群１の動物に１回投与した。
【０２１２】
ｎＰａｃ投与−鼻のみのエアロゾル曝露
条件付け
動物を、鼻のみの吸入曝露のための小動物ハンドリングのＳＯＰ  ＴＸＰ  １２１０に従って、最大７０分間にわたって鼻のみの曝露チューブに条件付けた。曝露前の３日間にわたって３つの条件付けセッションを行い、第１のセッションは３０分間、第２のセッションは６０分間、第３のセッションは７０分間であった。動物を、条件付け期間全体を通して、かつ曝露中に綿密に監視して、動物が一時的な苦痛以上を経験しないことを確実にした。
【０２１３】
曝露システム
エアロゾルを、２つの圧縮空気ジェットＨｏｓｐｉｔａｋ噴霧器を用いて２０ｐｓｉの噴霧器圧で生成した。６．０ｍｇ／ｍＬおよび２０．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃ懸濁製剤を、それぞれ、低用量曝露および高用量曝露に使用した。両方の製剤を別個にエアロゾル化し、エアロゾルを、送達ラインを通して３２ポートの鼻のみの曝露チャンバ内に方向付けた。齧歯類吸入曝露を各々６５分間行った。ｎＰａｃ懸濁エアロゾルを、一組の２つのＨｏｓｐｉｔａｋ圧縮空気ジェット噴霧器（最大４０（±１）分間使用）を用いて生成し、その後、残りの曝露持続時間では第２の組の２つのＨｏｓｐｉｔａｋ噴霧器と交換した。各吸入曝露中にわたって、酸素および温度を監視および記録した。
【０２１４】
濃度の監視
実施例４と同じ。
【０２１５】
粒径の決定
実施例４と同じ。
【０２１６】
用量の決定
実施例４と同じ。
【０２１７】
安楽死および剖検
動物を、上記の研究デザインにおける時点で（小動物の安楽死のＳＯＰ  ＡＣＳ−０３３４に従って）安楽死溶液の腹腔内（ＩＰ）注射により安楽死させた。
【０２１８】
３３６時間時点（および予備の動物、ｎ＝３）の場合：剖検中、血液（血漿用）を心穿刺によりＫ２ＥＤＴＡ管内に収集した。全肺重量を収集し、左肺を結紮し、中性緩衝ホルマリンを充填し、潜在的な組織病理学のために保存した。右肺葉を個別に秤量し、液体窒素中で急速凍結し、生体分析的分析のために−７０〜−９０℃で保管した。加えて、資格のある剖検担当者による完全肉眼検査を行った。身体の外側表面、開口部、ならびに頭蓋、胸部、および腹腔の内容物を試験した。形態、量、形状、色、稠度、および重症度についての一組の用語集用語を使用して、病変を記述および記録した。
【０２１９】
全ての他の時点の場合：剖検中、血液（血漿用）を心穿刺によりＫ２ＥＤＴＡ管内に収集した。全肺重量を収集し、肺葉を個別に秤量し、液体窒素中で急速凍結し、生体分析的分析のために−７０〜−９０℃で保管した。加えて、資格のある剖検担当者による完全肉眼検査を行った。身体の外側表面、開口部、ならびに頭蓋、胸部、および腹腔の内容物を試験した。形態、量、形状、色、稠度、および重症度についての一組の用語集用語を使用して、病変を記述および記録した。
【０２２０】
組織病理学
利用可能な固定組織をトリミングした。固定された左肺葉をトリミングして、気道を備えた典型的な毒物学的病理スタイル切片を得た。顕微鏡検査のために組織を通例に従って処理し、パラフィン包埋し、約４μｍで切片化し、載置し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。毒物学的病理学の経験がある１人の病理学者により、所見を１〜５段階（１＝最小限、２＝軽度、３＝中程度、４＝顕著、５＝重度）で主観的かつ半定量的に段階分けした。組織病理学データ取得、報告、および分析のためにＰｒｏｖａｎｔｉｓ（商標）（Ｉｎｓｔｅｍ  ＬＳＳ  Ｌｔｄ．，Ｓｔａｆｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）コンピュータソフトウェア／データベースを使用した。
【０２２１】
血液の収集および処理
剖検時に収集した血液を、最低１３００ｇで４℃での１０分間にわたる遠心分離により血漿に処理した。血漿試料を分析まで−７０〜−９０℃で保管した。
【０２２２】
生体分析的分析
全身血液（Ｋ２ＥＤＴＡからの血漿の形態）および肺組織を液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）アッセイによりアッセイして、パクリタキセルの量を時間の関数として定量化した。簡潔には、このアッセイは、超高性能液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）アッセイを利用して、パクリタキセルを定量化する。
【０２２３】
試料をタンパク質沈殿法によって抽出し、分離を逆相クロマトグラフィーにより達成する。マトリックスベースの較正曲線を用いて定量化を行った。
【０２２４】
血漿および肺組織濃度からのデータを用いて非コンパートメント分析を行った。少なくとも、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、ＡＵＣ、および見かけの最終的な半減期を決定した。このデータに基づいて他のパラメータを決定することができる。
【０２２５】
結果
臨床的観察、生存期間、および体重
全ての動物がそれらの指定された剖検時点まで生存した。全ての動物を、各時点を対象とした時間枠内で安楽死させた。本研究の継続期間中にわたって、異常な臨床的観察は認められなかった。
【０２２６】
図１３および図１４は、研究持続期間中にわたる平均体重および１日目からのパーセント変化を示す。研究期間中にわたって、全ての群の体重がほぼ同じ速度で増加した。
【０２２７】
Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）ＩＶ尾静脈注射
Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）ＩＶ注射を受けた群の場合、１日目の体重は３８６．１〜４７２．８ｇの範囲であり、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）用量が２．６〜３．２ｍｇ／ｋｇになった。平均用量（標準偏差）は２．９（０．１６）ｍｇ／ｋｇであった。個別のＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）用量を表１６に示す。
【表１６】
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【０２２８】
ｎＰａｃ曝露
エアロゾルの濃度および粒径
実施例４における結果−エアロゾルの濃度および粒径を参照されたい。
【０２２９】
酸素および温度
実施例４における結果−酸素および温度を参照されたい。
【０２３０】
沈着用量
実施例４における結果−沈着用量を参照されたい。
【０２３１】
剖検
全ての動物がそれらの指定された剖検時点まで生存した。剖検時、各群からの動物が肺に最小限から軽度の褐色変色を有した（表１７）。かかる観察は、多くの場合、吸入曝露に関連する。他の散発的観察には、肥大した心臓（動物番号２０１６）および肥大した気管気管支リンパ節が含まれた。剖検時に他の異常な巨視的観察は認められなかった。
【表１７】
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【０２３２】
組織病理学
この研究のために試験した投与後３３６時間（約１４日）時点で屠殺した動物の気管および左肺に有意な異常は認められなかった。組織は、対照としての役割を果たす「予備の」動物とは顕微鏡では区別不能であった。
【０２３３】
この研究のために試験した処理動物の肺切片に明らかなマクロファージ集積は認められなかった。肺胞マクロファージのある程度の増加は、肺内に沈着した外因性物質に対する生理学的に正常な応答として吸入研究では非常に一般的である（軽微なレベルも未処理動物における比較的一般的な観察結果であり得る）。この研究における吸入投与した動物における明らかな不在は、組織学的に試験した比較的遅い（３３６時間または約１４日）投与後時点に部分的に関連している可能性がある。
【０２３４】
生体分析的およびＰＫモデリング
結果を以下の表１８、１９、および２０、ならびに図１５および図１６に要約する。時間に対する平均パクリタキセル血漿濃度データおよび時間に対する平均パクリタキセル肺組織濃度データを上に示されるようにモデリングし、結果をそれぞれ表２１および表２２に示す。
【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【０２３５】
ＷｉｎＮｏｎｌｉｎを用いて各時点での平均血漿または肺組織濃度に基づいてモデリングを行った。ＮＣＡを、曝露（濃縮対時間曲線下面積［ＡＵＣ］）、最大濃度までの時間（Ｔｍａｘ）、最大濃度（Ｃｍａｘ）、および可能な場合は見かけの最終半減期（Ｔ１／２）を定量化するように設計した。
【０２３６】
全身血漿中での半減期は試験した製剤／用量で不変であり、肺組織中での半減期は吸入により送達したｎＰａｃ製剤で増加した。吸入によりｎＰａｃ製剤として送達した場合、肺組織への曝露（用量正規化ＡＵＣ）が増加した。
【０２３７】
まとめると、このデータは、吸入により送達された場合の肺組織中での有意な滞留を示す。
【０２３８】
結論
９０匹の雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを、静脈内（ＩＶ）ボーラス注射により「臨床基準」用量のパクリタキセルＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（注射用懸濁液用のパクリタキセルタンパク質結合粒子）に、または鼻のみの吸入によりｎＰａｃ（パクリタキセル、目標用量０．３７または１．０ｍｇ／ｋｇ）に単回曝露した。３匹の動物（ｎ＝３）を、血液（血漿）および肺組織収集のために、曝露後０．５〜３３６時間の１０時点で安楽死させた。血漿および肺組織で非コンパートメント分析を行い、各用量群の曝露後のパクリタキセルの検出可能な量の持続時間を特定した。全ての群からの３３６時間時点に指定された動物の右肺を液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）分析のために収集し、潜在的な組織病理学のために左肺を１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）で灌流固定した。比較組織病理学を可能にするために、３匹の予備の動物（未処理対照）も３３６時間時点で安楽死させ、肺収集を同じ様式で行った。全ての他の時点に指定された動物の全ての肺を、ＬＣＭＳ分析のために個別に凍結した。
【０２３９】
低用量ｎＰａｃ群および高用量ｎＰａｃ群の吸入曝露平均パクリタキセルエアロゾル濃度は、それぞれ、８５．６４μｇ／Ｌおよび２６２．２７μｇ／Ｌであった。平均曝露エアロゾル濃度は、噴霧化吸入曝露について予想された目標エアロゾル濃度の±１５％以内であった。粒径分布を、カスケードインパクターを使用して各ｎＰａｃ製剤エアロゾルのＭＭＡＤ（ＧＳＤ）の観点から決定した。６．０ｍｇ／ｍＬおよび２０．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃエアロゾルについて、ＭＭＡＤ（ＧＳＤ）は、それぞれ、１．８（２．０）μｍおよび２．３（１．９）μｍであると決定した。
【０２４０】
パクリタキセル沈着用量を、パクリタキセル平均エアロゾル濃度８５．６４μｇ／Ｌ、０日目の群平均体重４２０．４ｇ、想定沈着分率１０％、および曝露持続時間６５分間に基づいて計算し、達成された平均齧歯類沈着用量が低用量ｎＰａｃ群の場合に０．３８ｍｇ／ｋｇであると決定した。高用量ｎＰａｃ群の場合、パクリタキセル平均エアロゾル濃度２６２．２７μｇ／Ｌ、０日目の群平均体重４２０．５ｇ、想定沈着分率１０％および、曝露持続時間６５分間であり、達成された齧歯類の平均沈着用量が１．１８ｍｇ／ｋｇであると決定した。記録された酸素および温度範囲は、６．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃ曝露の場合、それぞれ、１９．８％〜２０．９％および２０．７℃〜２０．８℃であった。２０．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃ製剤曝露の場合、記録された酸素値は、曝露中にわたって１９．８％であり、温度範囲は、２０．７℃〜２０．８℃であった。Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）ＩＶ注射を受けた群の場合、１日目の体重は３８６．１〜４７２．８ｇの範囲であり、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）用量が２．６〜３．２ｍｇ／ｋｇになり、平均群用量が２．９ｍｇ／ｋｇになった。
【０２４１】
本研究中にわたって全ての群の体重が増加した。本研究の継続期間中にわたって、異常な臨床的観察は認められなかった。全ての動物がそれらの指定された剖検時点まで生存した。全ての動物を、各時点を対象とした時間枠内で安楽死させた。
【０２４２】
剖検時、各群からの動物のおよそ半数が肺に最小限から軽度の褐色変色を有した。かかる観察は、多くの場合、吸入曝露に関連する。他の一時的観察には、肥大した心臓（動物番号２０１６）および肥大した気管気管支リンパ節が含まれた。剖検時に他の異常な巨視的観察は認められなかった。組織病理学は、試験物品および参照物品で処理したラット由来の肺および気管が正常範囲内であり、この研究の条件下で未処理ラットのものと区別不能であったことを示した。
【０２４３】
ＮＣＡを、曝露（濃縮対時間曲線下面積［ＡＵＣ］）、最大濃度までの時間（Ｔｍａｘ）、最大濃度（Ｃｍａｘ）、および可能な場合は見かけの最終半減期（Ｔ１／２）を定量化するように設計した。
【０２４４】
新規ｎＰａｃ製剤の仮説は、その製剤が肺組織中でのパクリタキセルの滞留を増加させ、全身曝露を減少させるというものであった。全身血漿中での半減期は試験した製剤／用量で不変であり、肺組織中での半減期は吸入により送達したｎＰａｃ製剤で増加した。吸入によりｎＰａｃ製剤として送達した場合、肺組織への曝露（用量正規化ＡＵＣ）が増加した。まとめると、このデータは、ＩＶ「臨床基準」と比較した吸入により送達された場合の肺組織中でのｎＰａｃの有意な滞留を示す。
【０２４５】
実施例６−ヌードラット同所性肺癌モデルにおける吸入ナノ粒子パクリタキセル（ｎＰａｃ）の有効性の評価−ＦＹ１７−０９５研究
要旨
−１日目に１２７匹のＮＩＨ−ｒｎｕヌードラットにＸ線照射して、免疫抑制を誘発した。０日目に、気管内（ＩＴ）点滴注入により動物にＣａｌｕ３腫瘍細胞を投与した。動物を３週間成長させた。３週目に、動物を体重層別化によって５つの研究群に無作為化した。４週目から、群２の動物に、２２、２９、および３６日目に静脈内（ＩＶ）投与（５ｍｇ／ｋｇ）により週１回用量のＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）を投与した。群３および群４の動物に、それぞれ、低目標用量（０．５ｍｇ／ｋｇ）および高目標用量（１．０ｍｇ／ｋｇ）で週１回（月曜日）吸入（ＩＮＨ）用量のｎＰａｃを投与した。群５および群６の動物に、それぞれ、低用量（０．５０ｍｇ／ｋｇ）および高用量（最大１．０ｍｇ／ｋｇ）で週２回（月曜日および木曜日）目標吸入用量のｎＰａｃを投与した。群１の動物は、正常な腫瘍細胞成長の対照として未処理のままにした。全ての動物を８週目に剖検した。
【０２４６】
全ての動物がそれらの指定された剖検時点まで生存した。このモデルに関連した臨床的観察には、皮膚発疹および呼吸困難が含まれた。研究期間全体を通して、全ての群の体重がほぼ同じ速度で増加した。
【０２４７】
週１回低用量ｎＰａｃ群および週２回低用量ｎＰａｃ群の吸入曝露平均パクリタキセルエアロゾル濃度は、それぞれ、２７０．５１μｇ／Ｌおよび２６３．５６μｇ／Ｌであった。週１回高用量ｎＰａｃ群および週２回高用量ｎＰａｃ群の吸入曝露平均パクリタキセルエアロゾル濃度は、それぞれ、２４４．８２μｇ／Ｌおよび２４５．７６μｇ／Ｌであった。
【０２４８】
用量は、平均エアロゾルパクリタキセル濃度、最新の平均群体重、想定沈着分率１０％、および曝露持続時間３３分間（低用量）または６５分間（高用量）に基づいた。４週間の処理中、週１回低用量ｎＰａｃ群および週２回低用量ｎＰａｃ群の達成された平均齧歯類沈着用量は、それぞれ、０．６５５ｍｇ／ｋｇおよび０．６４０ｍｇ／ｋｇ（１．２８ｍｇ／ｋｇ／週）であった。週１回高用量ｎＰａｃ群および週２回高用量ｎＰａｃ群の達成された平均齧歯類沈着用量は、それぞれ、１．１６６ｍｇ／ｋｇおよび１．１７６ｍｇ／ｋｇ（２．３５２ｍｇ／ｋｇ／週）であった。Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）ＩＶ注射を受けた群の場合、２２、２９、および３６日目の平均用量は、それぞれ、４．９４、４．６４、および４．４６ｍｇ／ｋｇであった。
【０２４９】
予定された剖検時に、各群からの動物の大半が、肺に褐色の結節および／または肺に赤色もしくは褐色の斑点状変色を有した。他の散発的観察には、１匹の動物における腹部ヘルニアおよび別の動物における心膜の結節が含まれた。剖検時に他の異常な巨視的観察は認められなかった。
【０２５０】
Ａｂｒａｘａｎｅ処理動物の肺重量では、肺対体重比および肺対脳重量比は、未処理対照と比較して有意に低かった。週１回ｎＰａｃ高用量群は、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）群と同様の重量を有し、未処理対照と比較して有意に低い肺重量および肺対脳比を有した。
【０２５１】
組織学的に、全ての群の動物の大半の肺は、腫瘍形成のいくらかの兆候を含んでいた。腫瘍形成は、肺実質内にランダムに散在している拡大性の可変サイズの小さい塊、ならびに肺実質、より小さい気道、および血管の最大７５％を消失させたより大きい拡大して合体した塊の存在を特徴とした。より大きい塊は、主に肺門領域に分布しているか、または軸方向気道に並列しており、より小さい塊は、概ね末梢に位置していた。
【０２５２】
肺腫瘍塊の主要な形態学的細胞特徴は、肺腺癌の未分化パターンから非常に高分化パターンの存在まで異なった。主な腫瘍細胞型は、未分化腺癌の形態を示し、細胞は多形性、大型、退生、淡両染性染色であり、粘液小胞に似た微細な細胞質内液胞を有し、中程度から顕著な核大小不同を呈し、個別化されているか、またはシート状に成長しており、腺癌への分化に対する明確な特徴を欠いていることが観察された。しかしながら、他の塊内で観察された、または上述の未分化塊内で成長している細胞形態学的特徴は、より組織化されており、明確な腺房腺分化を示す高分化肺腺癌と一致していた。これらの両染性染色腫瘍細胞は、主に巣または腺パターンで配置され、これは、肺胞中隔によって結合されていることが観察された。この腫瘍細胞集団では、有糸分裂像はめったに観察されなかった。少量から中程度の量の淡好塩基性細胞質、卵形および可変小胞核、ならびに中程度の核大小不同を伴う、原始様の比較的小さい原始腫瘍細胞の局所領域は、これらの塊内では低頻度でしか観察されなかった。これらの原始腫瘍細胞は、ランダムかつシート状に成長していることが観察された。この好塩基性原始腫瘍細胞集団では、有糸分裂像およびアポトーシス小体の数の増加が最も頻繁に認められた。間質性線維症を伴う混合炎症細胞（主に好酸球、リンパ球、泡沫状マクロファージ、および偶発的な巨細胞）浸潤を特徴とする炎症が共通して観察された。有意な実質壊死は、稀であったか、存在しなかった。
【０２５３】
病理学者は、腫瘍細胞の漸進的な損失から、肺実質の残存線維形成結合組織足場を伴い、かつ泡沫状マクロファージの浸潤を伴う腫瘍細胞の完全な損失を特徴とする、個々の腫瘍塊の縁部の浸食像の存在を、腫瘍退縮の兆候とみなした。
【０２５４】
陽性対照群１およびＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）で処理した比較群２と比較して、腺癌腫瘍塊および原始腫瘍細胞集団の重症度の減少、ならびに腫瘍退縮の兆候を特徴とするｎＰａｃ処理群（群３〜６）における全肺腫瘍量の減少が見られた。他の処理関連病変または所見は観察されなかった。広範囲に及ぶ単核細胞浸潤が、吸入によりｎＰａｃを受けた動物の肺に観察された。使用したモデルがＴ細胞欠損であるため、これらの細胞がＢ細胞またはＮＫ細胞である可能性が高い。腫瘍のｎＰａｃへの局所的で恐らくより高い濃度の曝露が腫瘍に影響を及ぼし、結果として環境に変化をもたらし、単核細胞浸潤物を肺に引き込むと仮定される。
【０２５５】
目的
本研究の目的は、肺癌の同所性モデルにおける腫瘍量の減少において、静脈内投与Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の臨床基準用量と比較した吸入ｎＰａｃ製剤の有効性を評価することであった。
材料および方法
試験システム
【表２３】
2021526354.tif 000026
【０２５６】
Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）製剤
ＩＶ製剤に使用される臨床基準材料は、医薬品Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）であった。この医薬品を投与日に生理食塩水で５．０ｍｇ／ｍＬに再構成し、製造業者の指示書に従って保管した。
【０２５７】
ｎＰａｃ製剤
２０．０ｍｇ／ｍＬの曝露用ｎＰａｃ製剤をスポンサーの推奨に従って調製した。具体的には、ｎＰａｃを１％ポリソルベート８０で再構成した。全ての粒子が湿潤するまでバイアルを手で振盪した。注射用の追加の０．９％塩化ナトリウムを（所望の濃度目標まで）添加し、バイアルをさらに１分間手で振盪した。大きい塊が見えなくなり、懸濁液が適切に分散するまで振盪を続けた。
【０２５８】
結果として得られた製剤を少なくとも５分間そのまま放置して、バイアル内のいかなる空気／泡を減少させた後に、エアロゾル化作業のためにネブライザーに入れた。最終製剤を室温で保ち、再構成後２時間以内に噴霧化した。最終２０．０ｍｇ／ｍＬを室温で保ち、再構成後３０（＋５）分以内に噴霧化した。
【０２５９】
実験デザイン
１２７匹の動物を研究に使用した。Ｘ線照射および腫瘍細胞の投与前に、７匹の動物を予備として指定した（予備の動物には照射も細胞株点滴注入も行わなかった）。−１日目に全ての研究動物にＸ線照射して免疫抑制を誘発した。０日目に、気管内（ＩＴ）点滴注入により動物にＣａｌｕ３腫瘍細胞を投与した。動物を３週間成長させた。３週目に、動物を体重層別化によって以下の表２３に概説される群に無作為化した。４週目から、群２の動物に、静脈内（ＩＶ）投与（５ｍｇ／ｋｇ）により週１回目標用量のＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）を投与した。群３および群４の動物に、それぞれ、低用量（０．５ｍｇ／ｋｇ）および高用量（１．０ｍｇ／ｋｇ）で週１回（月曜日）吸入（ＩＮＨ）目標用量のｎＰａｃを投与した。群５および群６の動物に、それぞれ、低用量（０．５０ｍｇ／ｋｇ）および高用量（１．０ｍｇ／ｋｇ）で週２回（月曜日および木曜日）吸入目標用量のｎＰａｃを投与した。群１の動物は、正常な腫瘍細胞成長の対照として未処理のままにした。全ての動物を８週目に剖検した。
【表２４】
2021526354.tif 000027
【０２６０】
畜産、隔離、および研究への割り当て
隔離後、全ての動物を秤量し、体重に基づいて無作為化して７匹の予備を排除した。１週目から３週目まで、動物をケージカード（ＬＣ番号）および尾マーキングによって識別した。
【０２６１】
３週目に、処理を開始する前、動物を秤量し、体重層別化によって上に列記した群に無作為化し、研究ＩＤを割り当てた。この時点以降は、動物をケージカードおよびシャーピーによる尾マーキングによって識別した。
【０２６２】
免疫抑制および照射
−１日目に、動物は、２５０ｋＶｐ、１５ｍＡ、および線源と対象物の距離１００ｃｍで設定された約５００ラド（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＲＴ  ２５０  Ｘ−ｒａｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｕｎｉｔ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｈｅｌｔｏｎ，ＣＴ）で全身Ｘ線曝露を受けた。動物を、パイスライスあたり２〜３匹、パイチャンバユニットに入れた。照射プロセスは、１０〜１５分かかった。
【０２６３】
腫瘍細胞移植
０日目に、動物に腫瘍細胞（Ｃａｌｕ３）をＩＴにより投与した。簡潔には、誘発チャンバ内で３〜５％イソフルランで麻酔した後、傾斜した吊り下げ式点滴注入プラットフォームに上顎切歯を引っ掛けて、動物を配置した。スタイレットを、喉頭を過ぎて気管内に挿入する間、動物の舌を優しく固定した。ＥＤＴＡ懸濁液中の細胞の体積（目標用量体積：５００μＬ、濃度：０．５ｍＬあたりおよそ２０×１０６）を気管内点滴注入により肺に送達した。点滴注入後、動物の呼吸および運動を注意深く監視した。腫瘍細胞移植後、動物は、処理前におよそ３週間の腫瘍成長期間を経て、腫瘍細胞の生着および肺癌の発生を可能にした。
【０２６４】
Ｃａｌｕ３の成長および調製
Ｃａｌｕ３細胞を、細胞培養フラスコ内で５％ＣＯ２／３７℃で成長させた。これらを、８０％コンフルエンスになるまで、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を有するＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地で成長させた。細胞を点滴注入日まで維持した。点滴注入前に、細胞をＰＢＳで洗浄することによって収集し、その後、トリプシンを添加して、細胞をフラスコから除去した。１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ  １６４０培地で細胞を中和した。その後、細胞を１００×ｇで５分間遠心分離し、培地を除去し、細胞を再懸濁して、４５０μＬの無血清ＲＰＭＩ中２，０００万細胞の濃度にした。点滴注入前に、１ラットあたり５００μＬの総ＩＴ用量体積に対して、７０μＭのＥＤＴＡの５０μＬを細胞懸濁液に添加した。
【０２６５】
体重および毎日の観察
無作為化のために、３週目まで毎週、４週目から研究の終わりまで週２回、および剖検時に体重を収集した。
【０２６６】
研究中の各動物を、異常、罹患率、または死亡の臨床的徴候がないか１日２回観察した。技術者は、投与および体重セッション中に動物を観察した。
【０２６７】
Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）ＩＶ尾静脈注射
Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（５ｍｇ／ｍＬ、最大用量体積２５０μＬ）を、２２、２９、および３６日目にＩＶ尾静脈注射により群２の動物に投与した。
【０２６８】
ｎＰａｃ投与−鼻のみのエアロゾル曝露
条件付け
動物を、最大７０分間にわたって鼻のみの曝露チューブに条件付けた。曝露前の３日間にわたって３つの条件付けセッションを行い、第１のセッションは３０分間、第２のセッションは６０分間、第３のセッションは７０分間であった。動物を、条件付け期間全体を通して、かつ曝露中に綿密に監視して、動物が一時的な苦痛以上を経験しないことを確実にした。
【０２６９】
曝露システム
エアロゾルを、２つの圧縮空気ジェットＨｏｓｐｉｔａｋを用いて２０ｐｓｉの噴霧器圧で生成した。２０．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃ懸濁製剤を低用量曝露および高用量曝露に使用した。エアロゾルを、送達ラインを通して３２ポートの鼻のみの曝露チャンバ内に方向付けた。齧歯類吸入曝露を３３分間または６５分間行った。ｎＰａｃ懸濁エアロゾルを、一組の２つのＨｏｓｐｉｔａｋ圧縮空気ジェット噴霧器（最大４０（±１）分間使用）を用いて生成し、その後、残りの曝露持続時間では第２の組の２つのＨｏｓｐｉｔａｋ噴霧器と交換した。各吸入曝露中にわたって、酸素および温度を監視および記録した。
【０２７０】
濃度の監視
エアロゾル濃度の監視を、エアロゾルを予め秤量したＧＦ／Ａ  ４７ｍｍフィルターに収集することによって行った。フィルターを、各吸入曝露中にわたって、鼻のみの曝露チャンバの動物呼吸ゾーンからサンプリングした。ＧＦ／Ａフィルターを通過するエアロゾルサンプリング流量を、１．０±０．５Ｌ／分で維持した。最後のフィルターを除いて、フィルターを各曝露持続時間中にわたって１０分毎に収集した。３３分間の低用量曝露（群３および群５）では、最後のフィルターを１３分後に収集し、６５分の高用量曝露（群４および群６）では、最後のフィルターを１５分後に収集した。試料収集後、フィルターを秤量して、曝露システム中の総エアロゾル濃度を決定した。
【０２７１】
秤量後、各フィルターを７ｍＬガラスバイアルに入れた。ガラスバイアル内のフィルターを抽出し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析して、フィルター上に収集されたパクリタキセルの量を定量化した。収集されたエアロゾルおよびパクリタキセルエアロゾルの総量を、フィルターを通った全空気流量で割ることによって、各フィルターの総エアロゾル濃度およびパクリタキセルエアロゾル濃度を計算した。平均パクリタキセルエアロゾル濃度を使用して、以下の用量の決定の節に示されるように、等式１を使用して、齧歯類の肺へのパクリタキセルの達成された平均沈着用量を計算した。
【０２７２】
用量の決定
実施例４と同じように等式１を使用して沈着用量を計算した。
【０２７３】
安楽死および剖検
予定された剖検で、過量のバルビツレート系鎮静剤の腹腔内注射により動物を安楽死させた。
【０２７４】
血液および組織の収集
全ての剖検について、最終体重および脳重量を収集した。予定された安楽死のために、血液（血漿用）を心穿刺によりＫ２ＥＤＴＡ管内に収集した。肺を取り除き、秤量した。腫瘍を含む肺組織の切片である気管気管支リンパ節を、潜在的な将来の分析のために液体窒素中で凍結させた。残りの肺を、潜在的な組織病理学のために固定した。
【０２７５】
組織病理学
固定した左肺葉を「ブレッドローフ」様式でトリミングし、切片を２つのカセットに交互に入れて、各々左肺の３つの代表的な切片を有する２つのスライドを得た。顕微鏡検査のために組織を通例に従って処理し、パラフィン包埋し、約４μｍで切片化し、載置し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。所見を主観的かつ半定量的に等級付けした。
【０２７６】
長手方向にトリミングした研究中の１２０匹の処理ヌードマウス中６０匹から得た肺の切片（１動物あたり１〜４つ）を、光学顕微鏡評価のためにＨ＆Ｅ染色スライドガラスに処理した。
【０２７７】
このレビュー中に、顕微鏡所見を記録し、その後、電子病理報告システム（ＰＤＳ−Ａｓｃｅｎｔｏｓ−１．２．０，Ｖ．１．２）に転送し、肺負荷特性データの発生率および重症度を要約し、これらの結果を表にし、個別の動物データを生成した。６０匹のヌードラット由来の肺を組織学的に検査した：群１［１００１〜１０１０］、群２［２００１〜２０１０］、群３［３００１〜３０１０］、群４［４００１〜４０１０］、群５［５００１〜５０１０］、および群６［６００１〜６０１０］）。これらの肺の腫瘍量レベルを評価するために、肺を組織病理学的検査中に評価およびスコアリングした。各累積肺負荷特性診断：１）腺癌（未分化および分化）、２）原始腫瘍細胞（低分化多形性細胞）、ならびに３）腫瘍退縮について、以下のように提供される肺組織全体の関与パーセントを示す４ポイント等級スケールを使用して肺を半定量的に等級付けした：０＝兆候なし、１＝最低限（関与する肺切片の合計面積の約１〜２５％）、２＝軽度（関与する肺切片の合計面積の約２５〜５０％）、３＝中程度（関与する肺切片の合計面積の約５０〜７５％）、４＝顕著（関与する肺切片の合計面積の約７５〜１００％）。
【０２７８】
組織形態計測
各群からの最初の１０匹の動物の固定した左肺葉を使用して、組織形態計測分析を行った。形態計測（「ブレッドスライス」）スタイルのトリミングを使用して、組織をトリミングした。簡潔には、トリミングを肺の頭部末端から２〜４ｍｍのランダムな点で開始した。各肺切片をおよそ４ｍｍの厚さに切断した。奇数番号の切片を、尾側を下にしてカセット１に入れ、偶数番号の切片をカセット２に入れた。その後、組織切片を処理し、パラフィン包埋し、４μｍで切片化し、検査のためにヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）で染色した。両方のスライド（奇数スライスおよび偶数スライス）を使用して、１動物あたりの平均腫瘍分率を決定した。
【０２７９】
形態学的分析を、Ｌｏｖｅｌａｃｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌによる指定動物由来のヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）で染色した肺組織で行った。スライド全体（左肺全体の横断方向切片を含む、１動物あたり２つ）を、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒ（商標）を使用してスキャンした。スキャンをＶｉｓｉｏｐｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア（ＶＩＳ、バージョン２０１７．２．５．３８５７）で分析した。腫瘍面積分率の統計分析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５（バージョン５．０４）で行った。
【０２８０】
各スライド上に存在する腫瘍面積の量を定量化するように設計されたコンピュータ化画像定量化を、スライド全体のスキャンを使用して全ての左肺組織に行った。肺転移の面積を定量化するためのＶｉｓｉｏｐｈａｒｍ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎを使用して、細胞密度、染色強度、ならびにサイズおよび染色強度に基づいて腫瘍細胞を正常肺組織と区別した。単純なＨ＆Ｅ染色に基づいたこの定量化は完全ではないことに留意されたい（すなわち、腫瘍組織タイプ、壊死腫瘍組織と生存腫瘍組織を完全に区別することはできず、いくつかの正常構造が腫瘍として含まれる場合がある）。このプロセスをＨ＆Ｅ切片に適用する価値は、それが腫瘍定量化に対する不偏アプローチであるということである。肺全体の面積を決定し、その後、転移として特定された構造が占める面積を総面積のパーセンテージとして表す。肺外構造が除外され、肺全体が含まれることを確実にするために分析される面積の微調整を手動で行うことができる。全ての群にわたる一貫性を確実にし、偏向が導入される可能性を排除するために、他の手動操作を避ける。可能な場合、腫瘍組織のみを特定するための特定の免疫組織化学的染色の開発により、この分析の特異性が高まるであろう。
【０２８１】
血液の収集および処理
剖検時に収集した血液を、最低１３００ｇで４℃での１０分間にわたる遠心分離により血漿に処理した。血漿試料を、分析またはスポンサーへの発送まで−７０〜−９０℃で保管した。
【０２８２】
追加の形態学的および免疫組織化学的（ＩＨＣ）研究
ヘマトキシリンおよびエオシン、マッソントリクローム、ＡＥ１／ＡＥ３（パン−ケラチン）、ならびにＣＤ１１ｂ（樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、およびマクロファージ）で調製したスライドを使用して、１７匹の動物のサブセットを選択して、形態学的および免疫組織化学的（ＩＨＣ）特徴をレビューした。このサブセットは、対照動物（ｎ＝２）および各処理群からの処理動物（１群あたりｎ＝３）を含んだ。ラット肺ブロックを４μｍの厚さで切片化し、正に帯電したスライド上に収集した。
【０２８３】
方法
Ｈ＆Ｅ染色およびマッソントリクローム染色を標準のプロトコルに従って行った。抗パンサイトケラチン抗体［ＡＥ１／ＡＥ３］について、ラット子宮を対照として組織バンクから切片化した。Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ自動免疫染色機、ならびに４つの異なる希釈でのマウス抗パンサイトケラチン［ＡＥ１／ＡＥ３］（Ａｂｃａｍ、番号ａｂ２７９８８、ロット番号ＧＲ３２０９９７８−１）抗体に加えて、陰性対照：一次抗体なし、１：５０、１：１００、１：２００、および１：４００を使用して、最適化を組織バンクからのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ラット子宮組織に対して行った。Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄエピトープ賦活化緩衝液１（クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０）を２０分間（ＥＲ１（２０））、およびＬｅｉｃａ  Ｂｏｎｄエピトープ賦活化緩衝液２（ＥＤＴＡ溶液、ｐＨ９．０）を２０分間（ＥＲ２（２０））使用して、熱誘発抗原賦活化を行った。非特異的バックグラウンドを、Ｒｏｄｅｎｔ  Ｂｌｏｃｋ  Ｍ（Ｂｉｏｃａｒｅ、番号ＲＢＭ９６１Ｈ、ロット番号０６２１１７）でブロックした。
【０２８４】
抗パンサイトケラチン抗体［ＡＥ１／ＡＥ３］抗体を、Ｍｏｕｓｅ−ｏｎ−Ｍｏｕｓｅ  ＨＲＰＰｏｌｙｍｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ、番号ＭＭ６２０Ｈ、ロット番号０６２０１６）を使用して検出し、３’３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、茶色）で可視化した。ヘマトキシリン核対比染色（青色）を適用した。最適化スライドを試験し、試料スライドの最適な染色条件を、ＥＲ２（２０）との１：５０希釈で抗パンサイトケラチン抗体［ＡＥ１／ＡＥ３］を用いて決定した。
【０２８５】
抗ＣＤ−１１ｂ抗体の場合、Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ自動免疫染色機、ならびに４つの異なる希釈でのウサギ抗ＣＤ１１ｂ抗体、および陰性対照：一次抗体なし、１：２５０、１：５００、１：１０００、および１：２０００を使用して、最適化を組織バンクからのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ラットリンパ節組織に対して行った。
【０２８６】
Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄエピトープ賦活化緩衝液１（クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０）を２０分間（ＥＲ１（２０））、またはＬｅｉｃａ  Ｂｏｎｄエピトープ賦活化緩衝液２（ＥＤＴＡ溶液、ｐＨ９．０）を２０分間（ＥＲ２（２０））使用して、熱誘発抗原賦活化を行った。
【０２８７】
抗ＣＤ１１ｂ抗体を、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ  Ｂｏｎｄ  Ｒｅｆｉｎｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎを使用して検出し、３’３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、茶色）で可視化した。ヘマトキシリン核対比染色（青色）を適用した。最適化スライドを試験し、ＦＦＰＥ組織の最適な染色条件を、ＥＲ２（２０）との１：２０００の希釈で抗ＣＤ１１ｂを用いて決定した。ラットリンパ節対照を、ラット肺試料と並行して使用した。
【０２８８】
研究結果
臨床的観察、生存期間、および体重
全ての動物がそれらの指定された剖検時点まで生存した。このモデルに関連した臨床的観察には、皮膚発疹および呼吸困難が含まれた。１匹の動物は、上腹部ヘルニアを有することが観察された。獣医の推奨に従って、動物を、吸入曝露を受けない、したがって曝露チューブの拘束が必要ではない群１（未処理対照）と交換した。
【０２８９】
図１７は、研究の全継続期間中にわたる平均体重を示す。図１８は、０日目からの平均体重のパーセント変化を示す。研究期間中にわたって、全ての群の体重がほぼ同じ速度で増加した。
【０２９０】
Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）ＩＶ尾静脈注射
Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）ＩＶ注射を受けた群の場合、２２、２９、および３６日目の平均用量は、それぞれ、４．９４、４．６４、および４．４６ｍｇ／ｋｇであった。
【０２９１】
ｎＰａｃ曝露
エアロゾルの濃度および沈着用量
総エアロゾル濃度およびパクリタキセルエアロゾル濃度を、各曝露中にＧＦ／Ａフィルターのサンプリングによって測定した。週１回低用量ｎＰａｃ群および週２回低用量ｎＰａｃ群の吸入曝露平均パクリタキセルエアロゾル濃度は、それぞれ、２７０．５１μｇ／Ｌおよび２６３．５６μｇ／Ｌであった。週１回高用量ｎＰａｃ群および週２回高用量ｎＰａｃ群の吸入曝露平均パクリタキセルエアロゾル濃度は、それぞれ、２４４．８２μｇ／Ｌおよび２４５．７６μｇ／Ｌであった。酸素および温度レベルを、各曝露中にわたって監視した。
【０２９２】
用量は、平均エアロゾルパクリタキセル濃度、最新の平均群体重、想定沈着分率１０％、および曝露持続時間３３分間または６５分間に基づいた。４週間の処理中、週１回低用量ｎＰａｃ群および週２回低用量ｎＰａｃ群の達成された平均齧歯類沈着用量は、それぞれ、０．６５５ｍｇ／ｋｇおよび０．６４０ｍｇ／ｋｇ（１．２８ｍｇ／ｋｇ／週）であった。
【０２９３】
週１回高用量ｎＰａｃ群および週２回高用量ｎＰａｃ群の達成された平均齧歯類沈着用量は、それぞれ、１．１６６ｍｇ／ｋｇおよび１．１７６ｍｇ／ｋｇ（２．３５２ｍｇ／ｋｇ／週）であった。
【０２９４】
粒径（ＭＭＡＤおよびＧＳＤ）
粒径分布を、カスケードインパクターを使用して、各ｎＰａｃ製剤エアロゾルの空気動力学的質量中央径（ＭＭＡＤ）および幾何標準偏差（ＧＳＤ）の観点から決定した。２０．０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃエアロゾルの場合、平均ＭＭＡＤが２．０１μｍであり、ＧＳＤが１．８７であると決定した。
【０２９５】
剖検観察および臓器重量
全ての動物がそれらの指定された剖検時点まで生存した。剖検時に、各群からの動物が、肺に褐色の結節および／または肺に赤色もしくは褐色の斑点状変色を有した。他の散発的観察には、１匹の動物における腹部ヘルニアおよび別の動物における心膜の結節が含まれた。剖検時に他の異常な巨視的観察は認められなかった。１匹の動物が、剖検時にいかなる目に見える腫瘍（結節）も有しなかった。
【０２９６】
個々の動物の臓器重量データを、図１９、図２０、および図２１にグラフで示す。Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）処理動物の肺重量では、肺対体重比および肺対脳重量比は、未処理対照と比較して有意に低かった。週１回ｎＰａｃ高用量群は、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）群と同様の重量を有し、未処理対照と比較して有意に低い肺重量および肺対脳比を有した。週１回低用量ｎＰａｃ群、週２回低用量ｎＰａｃ群、および週２回高用量ｎＰａｃ群は、概して、同様の平均肺重量および比率を有した。
【０２９７】
形態計測
全ての処理群が対照群と比較して平均肺腫瘍分率の減少を示したが、群間に統計的に有意な差はなかった。断面肺スライド上で検査した腫瘍面積分率に関して、ＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）処理とｎＰａｃ処理レジメンのうちのいずれかとの間にも統計的有意な差はなかった。このモデルの典型であるように、全ての群内の動物間に腫瘍分率の大きいばらつきがある。これらのデータは、最終的な解釈のための肺対脳重量比および標準組織病理学を含む、このモデルにおける肺腫瘍量の他の指標と組み合わせて考慮されるべきである。形態計測分析および組織病理学的検査を左肺葉由来の固定した肺組織に行う一方で、肺組織に対する他の分析を右肺葉由来の凍結組織に行うことができることに留意することが重要である。平均腫瘍面積を図２２および図２３に示す。
【０２９８】
病理学結果
腫瘍性細胞の特定された集団のスライド試験の結果として、病理学者は以下のことを決定した：（１）未処理対照群１（２．１）と比較して、全ての処理群（群２（１．７）、群３（１．８）、群４（１．７）、群５（１．６）、および群６（１．６）に腺癌（未分化および分化細胞）の全肺腫瘍量の重症度のわずかな減少があった。（２）対応する対照郡１（０．９）および群２（１．０）、および３）と比較して、群３（０．３）、群４（０．３）、群５（０．２）、および群６（０．２）に重症度の減少による明らかな原始腫瘍細胞集団の減少があった。対応する対照群１（０．０）および群２（０．１）と比較して、群３（０．６）、群４（１．０）、群５（０．８）、および群６（１．０）に腫瘍退縮が存在した。肺負荷特性データの発生率および重症度を表２４および図２４に要約する。スライドの顕微鏡写真を図２５〜５９に示す。
【表２５】
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【０２９９】
図２５〜５９におけるＨ＆Ｅで染色した肺癌組織のスライド顕微鏡写真の組織学的概要
一般的な観察結果：
対照：増殖細胞を有し、免疫細胞浸潤がほとんどまたは全くない広範なレベルの生存腫瘍。
【０３００】
Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）ＩＶ：ある程度の腫瘍退縮を伴うある程度のリンパ球応答を有する多くの生存しているように見える腫瘍塊。
【０３０１】
ｎＰａｃ週１回、高：生存腫瘍細胞がほとんど残っていない肺からの腫瘍のクリアランス。残っている塊は、免疫細胞浸潤物および線維形成のように見える。
【０３０２】
ｎＰａｃ週２回、低：マクロファージおよび単核細胞を含む免疫細胞浸潤物に囲まれた腫瘍結節がいくつか残っている。
【０３０３】
ｎＰａｃ週２回、高：腫瘍に代わる免疫浸潤物および間質性線維症を伴う腫瘍結節はほとんどない。
【０３０４】
広範な単核殺腫瘍細胞浸潤が、吸入によりｎＰａｃを受けた動物の肺に観察された。使用したモデルがＴ細胞欠損であるため、これらの細胞がＢ細胞もしくはＮＫ細胞であるか、またはそれらの両方である可能性が高い。Ｂ細胞は、抗体の産生に寄与し、抗体依存性細胞介在性細胞傷害による腫瘍細胞の死滅に関与し得る（抗体は、Ｆｃ受容体を発現する細胞に結合し、これらの細胞の死滅能力を高める）。ＮＫ細胞は、腫瘍細胞の死滅に重要な先天性リンパ系細胞である。腫瘍を有する患者では、ＮＫ細胞活性が低減され、腫瘍の成長を可能にする。Ｔ細胞に加えて、ＮＫ細胞は、それらの活性を高めるためのいくつかのチェックポイント阻害剤の標的である。
【０３０５】
トリガーシグナルまたは阻害シグナルのいずれかを送達することができる幅広い表面受容体を使用することによって、ＮＫ細胞は、それらの環境内の細胞を監視して、細胞が異常（腫瘍またはウイルス感染）であり、細胞毒性によって排除されるべきかを確認することができる。
【０３０６】
ＮＫ細胞の細胞毒性および走化性は、腫瘍細胞およびそれらの副産物を含む多くの病理学的プロセスによって修正され得る。ある特定のシグナルに応じて、それらの機能が強化または増強される。異なるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を使用することによっていくつかの病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）に応答して、ＮＫ細胞は、サイトカイン産生および／または細胞溶解活性を高めることができる。ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、およびＩＦＮ  α／βを含むサイトカインも、ＮＫ細胞の活性を修正することができる。ＮＫ細胞は、異なる腫瘍細胞標的を死滅させることができる細胞溶解性エフェクターのみの単純な細胞ではなく、むしろ、それらは、多様な環境状況でそれらの活性を微調整することができる不均一集団を表す。
【０３０７】
ｎＰａｃで処理した動物の肺では腫瘍量が著しく減少しているようであり、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）ＩＶの場合よりも低い。したがって、ｎＰａｃの形態でのパクリタキセルの局所投与は、追加の効力を提供する。これは、長期にわたる化学療法へのより長い曝露および腫瘍部位への活発な細胞浸潤の両方に起因する可能性が高い。この後者の応答は、用量密度（実際の用量および投与頻度）に依存しているように見えた。
【０３０８】
特定の顕微鏡写真の観察結果：
図２５：対象１００６（対照）腺癌−３、原始−１、退縮−０。肺胞腔内または肺胞中隔を覆う未分化、多形性、大型、退生腫瘍細胞の一般的な分布を示す、低倍率（２倍）。細胞の大半は、腺癌の特徴を有さず、隣接する腫瘍のシート状に見られる。多くの細胞は、好塩基性細胞質を有するが、他の細胞は、大型、退生であり、淡両染性染色を含む。肺胞マクロファージの既存の常在集団の存在および腫瘍退縮の欠如に留意されたい。
【０３０９】
図３９：対象２００３（ＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））腺癌−１、原始−１、退縮−１。主に辺縁における腫瘍塊の一般的な分布、ならびに肺胞腔を満たす複数のより小さい拡大性腫瘍塊を示す、低倍率（４倍）。腫瘍細胞は、多形性、大型、退生であり、淡両染性染色を有し、腺癌の未分化から分化のパターンまで異なる。腫瘍退縮の兆候は、塊の辺縁の周囲に存在し、主にマクロファージの浸潤を特徴とする。
【０３１０】
図４５：対象２０１０（ＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））腺癌−３、原始−１、退縮−０。大部分の肺胞腔を満たす大型の拡大性腫瘍塊の一般的な分布、ならびに辺縁の腫瘍性細胞を示す、低倍率（２倍）。大部分の腫瘍細胞は、主に淡両染性染色を有し、未分化、多形性、大型、退生である。原始細胞は、より小型、卵形であり、可変性の小胞核を伴うより好塩基性の染色細胞質、および中等度から顕著の核大小不同を有する。炎症性細胞浸潤は、主に好中球およびマクロファージである。この画像は、腫瘍退縮がないことを実証する。
【０３１１】
図４８：対象４００９（ＩＨ  ｎＰａｃ週１回、高）腺癌−０、原始−０、退縮−４。以前に存在していた腫瘍塊の一般的な分布、線維性結合組織、中央の膠原性間質、および線維細胞の複数の小さい領域の存在が周辺の肺胞腔に見られること、ならびに肥厚した肺胞中隔が腫瘍退縮の兆候を裏付けることを示す、低倍率（２倍）。加えて、肺胞腔は、一般的に、腫瘍退縮のさらなる兆候とともに、マクロファージおよびリンパ球の浸潤物で満たされる。
【０３１２】
図５１：対象５０１０（ＩＨ  ｎＰａｃ週２回、低）腺癌−１、原始−０、退縮−３。以前に存在していた腫瘍塊の一般的な分布を示す、低倍率（２倍）。退縮している塊は、可変的に小さく、ランダムに分布している。線維性結合組織が肺胞腔を満たす／に置き換わるのが見られ、退行性腺癌の病巣を示唆する。急性壊死、線維性結合足場、上皮ならびに間質周囲のマクロファージ、巨細胞、およびリンパ球の混合細胞浸潤が、腫瘍退縮の兆候である。
【０３１３】
図５５：対象６００５（ＩＨ  ｎＰａｃ週２回、高）腺癌−１、原始−０、退縮−４。腺癌細胞の以前の浸潤物の病巣を示唆する、肺胞腔を満たす／に置き換わる線維性結合組織の複数の小さい領域における、以前に存在していた腫瘍塊の一般的な分布を示す、低倍率（２倍）。腫瘍退縮は、以前に存在していた腫瘍塊の線維形成、肺胞腔を満たす／に置き換わる中央の膠原性間質核および辺縁の線維性結合組織、中隔の肥厚、ならびにリンパ球およびマクロファージによって浸潤した肺胞腔を満たす線維細胞の存在によって証明される。
【０３１４】
追加の形態学的および（ＩＨＣ）研究の結果
この研究の１２０匹全ての動物のＨ＆Ｅスライドをレビューした後、免疫応答の可能性が処理群で見られたことに留意した。この所見をさらに調査するために、動物のサブセットをさらなる免疫組織化学的評価のために各群から選択した。
【０３１５】
最初に、１２０匹全ての動物をレビューする病理学者によって評価された腫瘍退縮の傾向を、試料サイズ間の同様の傾向を示すために、１７匹の動物のサブセットをレビューする異なる病理学者と比較した。
【０３１６】
１２０匹全ての動物の腫瘍退縮の程度の初期評価を、肺組織全体の関与パーセントを示す５点スケールを使用して半定量的に等級付けする病理学者によって行った。等級付けシステムは、０＝兆候なし、１＝肺切片の総面積の１〜２５％、２＝肺切片の総面積の２５〜５０％、３＝肺切片の総面積の５０〜７５％、４＝肺切片の総面積の７５〜１００％の等級付けスケールに基づく。この評価は、以下のようにスコアリングされた腫瘍退縮を呈する動物の発生率を示した：未処理対照０％、ＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）１０％、ＩＨ  ｎＰａｃ低用量、週１回５５％、ＩＨ  ｎＰａｃ低用量、週２回５５％、ＩＨ  ｎＰａｃ高用量、週１回５５％、およびＩＨ  ｎＰａｃ高用量、週２回６５％。
【０３１７】
同様の半定量的等級付けスケール（０＝兆候なし、１＝肺切片の総面積の１〜１９％、２＝肺切片の総面積の１１〜５０％、３＝肺切片の総面積の５０％超、４＝完全退縮）として使用して、腫瘍退縮を評価する別の病理学者によって行われた１７匹の動物のサブセットのレビュー。この評価は、この評価は、以下のようにスコアリングされた腫瘍退縮を呈する動物の発生率を示した：未処理対照０％、ＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）６５〜６９％、ＩＨ  ｎＰａｃ低用量、週１回１００％、ＩＨ  ｎＰａｃ低用量、週２回１００％、ＩＨ  ｎＰａｃ高用量、週１回１００％、およびＩＨ  ｎＰａｃ高用量、週２回１００％。このレビュー（１７匹の動物）は、以前のレビュー（１２０匹の動物）と同様のパターンを示し、吸入群は、腫瘍退縮を伴う動物の割合が最も高かった。
【０３１８】
この研究からの１７匹の動物のサブセットの組織学的レビュー時に、腫瘍退縮および免疫応答に関する興味深いパターンが見られた。様々な群間で２つの主な特徴、特に腫瘍退縮の存在および程度、ならびに付随する免疫反応の存在および強度が異なっていた。以下は、組織学的レビューの観察結果および所見である。
【０３１９】
未処理群
観察結果：図６０：対照症例。上の行：Ｈ／Ｅで染色した切片。下の行：免疫組織化学的染色。
列１：（Ａ）多形性核、有糸分裂の増加、および腺分化の欠如を伴う、大型細胞のシートから成る腺癌の低分化領域。腫瘍細胞の密集したコンパクトな配置、右下角の周囲の正常肺からの鋭い境界、および腫瘍を囲む線維性被膜の欠如に留意されたい。（Ｄ）Ａに示される同じ領域からの対応するケラチン免疫染色。これは、パンサイトケラチンによる癌腫細胞の高感度かつ特異的な標識化を示す（実線矢印）。
列２：（Ｂ）局所原基痕跡管形成（右上の破線矢印）を伴う腺癌。小リンパ球および局所マクロファージからなる中央の局所、限局性免疫細胞成分に留意されたい（中央の実線矢印）。（Ｅ）腫瘍細胞結節の辺縁の最小数のＮＫ細胞およびマクロファージを示すＣＤ１１ｂ染色（実線矢印）。
列３：（Ｃ）高密度に密集した小さい成熟リンパ球からなる気管支関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）の病巣に隣接して成長する腺癌（実線矢印で印付け）。ＢＡＬＴと隣接する正常な気管支内層との密接な関連に留意されたい（左上角の破線矢印）。（Ｆ）癌腫細胞の陽性染色およびリンパ系細胞の染色の欠如を示す、ケラチンで染色したＣに見られる病巣に対応する病巣。
【０３２０】
所見：両方の動物は、腺癌の固形の高密度に密集した集団の均一な成長を示した。腫瘍は、周囲の正常な肺実質に隣接する比較的良好に境界が定められた縁を有し、腫瘍退縮および衰えない腫瘍細胞成長の兆候はなかった。これらの動物のリンパ浸潤物は軽度であり、三次リンパ構造はわずかであった。
【０３２１】
静脈内（ＩＶ）Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）陽性処理対照群
観察結果：図６１：関連する免疫細胞浸潤物の増加を伴い、漸進的に小さくなる腫瘍細胞クラスターおよび単一腫瘍細胞へと結節の辺縁に向かう腫瘍の分離からなる腫瘍退縮を伴う腺癌の結節を示す、ＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（２００３）。
列１：（Ａ）浸潤性腺癌の結節の低倍率画像（破線矢印で強調）。片縁での腫瘍細胞の進行性分離および免疫細胞応答の増加による、結節の不規則な辺縁境界に留意されたい（実線矢印）。（Ｄ）Ａに示される同じ領域からの対応するケラチン免疫染色。これは、辺縁に向かう腫瘍細胞結節の漸進的に小さくなるサイズ（破線矢印）、およびそれらの間に介在する間質の増加（実線矢印）を明確に実証する。
列２：（Ｂ）画像Ａの領域の高倍率画像。腫瘍細胞の漸進的に小さくなるクラスターを示す（破線矢印）。（Ｅ）分離したより小さい腫瘍細胞結節を強調する、Ｄに示されるケラチン染色領域の高倍率画像。右上から、腫瘍が個々の単一腫瘍細胞として存在する左下角に向かって移動する腫瘍細胞クラスターサイズの漸進的な減少に留意されたい（破線矢印）。実線矢印は、免疫細胞とともに介在する間質が増加することを強調する。
列３：（Ｃ）腫瘍結節の中心内に見られる免疫細胞（実線矢印で強調）（破線矢印は、腫瘍細胞を強調する）。（Ｆ）画像Ａに見られる同じ領域を強調するＣＤ１１ｂ染色切片の低倍率画像。これは、結節の辺縁における、かつ腫瘍結節内の免疫細胞の密度の増加（実線矢印）を示す。破線矢印は、ＣＤ１１ｂ抗体で標識されていない残存癌腫細胞を強調する。
【０３２２】
所見：３匹全ての動物は、腺癌の高密度に密集した集団での腫瘍成長を示したが、これらの動物のうちの２匹は、腫瘍退縮と適合するいくつかの特徴を示した。この退縮は、周囲の正常な肺実質に隣接する境界が不鮮明な腫瘍結節の辺縁での腫瘍細胞クラスターの進行性分離および消失の存在を特徴とした。腫瘍消失を示す領域のリンパ浸潤物は、間質のリンパ浸潤物の増加を示した。
【０３２３】
吸入ｎＰａｃ処理群
観察結果：図６２：吸入ｎＰａｃ症例。
１行目：低用量、週１回（ＬＤ１×）（症例３００６）。（Ａ）辺縁の腫瘍細胞の顕著な分離および消失を伴う結節内の腫瘍退縮を示すＨ／Ｅ染色（破線矢印は、残存腫瘍を示し、実線矢印は、炎症を伴う介在する間質を示す）。（Ｂ）ケラチン染色は、リンパ球およびマクロファージを有する背景間質から成る大きい腫瘍消失介在領域（実線矢印）を伴う、残存癌腫（破線矢印）を強調する。（Ｃ）ＣＤ１１ｂ免疫染色は、腫瘍細胞脱落がある領域内の顕著なリンパ組織球性免疫細胞浸潤物を強調する（実線矢印）。残存未染色癌腫は、破線矢印で強調される。
２行目：低用量、週２回（ＬＤ２×）（症例４００９）。（Ｄ）Ｈ／Ｅ染色は、残存生存腺癌がないことを示した。この症例は、背景間質内の小リンパ球およびマクロファージの集団から成るもの等の散在性病巣を含んだ。これらの結節または肺切片の他の場所には診断的に生存可能な腫瘍細胞は見られなかった。（Ｅ）染色の欠如を示し、したがって、残存生存癌腫がないことおよび完全退縮の解釈のための免疫組織化学的裏付けを加える、Ｄと同じ領域のケラチン染色。（Ｆ）ＣＤ１１ｂ染色は、この病巣が、軽度から中程度の免疫細胞浸潤物を有することを示す。
３行目：高用量、週１回（ＨＤ１×）（症例５００８）。（Ｇ）辺縁の腫瘍細胞の顕著な分離および消失を伴う結節内の腫瘍退縮を示すＨ／Ｅ染色（破線矢印は、残存腫瘍を示し、実線矢印は、炎症を伴う介在する間質を示す）。（Ｈ）ケラチン染色は、残存癌腫（破線矢印）、ならびにリンパ球およびマクロファージを有する背景間質から成る腫瘍消失の大きい非染色領域（実線矢印）を強調する。（Ｉ）ＣＤ１１ｂ免疫染色は、腫瘍細胞脱落がある領域内の顕著な免疫細胞浸潤物を強調する（実線矢印）。未染色癌腫の残存ポケットを破線矢印で強調する。
４行目：高用量、週２回（ＨＤ２×）（症例６００５）。（Ｊ）Ｈ／Ｅ染色は、好酸球性および泡沫状細胞質を伴う細胞を含むこの集団等の多数の集団を示した（低倍率）。（Ｋ）同じ領域のより高い倍率は、紡錘形の核（実線矢印）およびほとんど可能性がない管様構造または再生小血管（破線矢印）を伴う細胞を示す。（Ｌ）マッソントリクローム染色は、初期膠原線維形成および組織化と一致する間質の青色染色を示す。
５行目：高用量、週２回（ＨＤ２×）（症例６００５続き）。（Ｍ）ケラチン染色は、局所の単一細胞および管様構造の標識化を示す（破線矢印）。介在細胞は、ケラチンに対して陰性である（実線矢印）。（Ｎ）ＣＤ１１ｂ免疫染色は、腫瘍細胞脱落がある領域内の免疫細胞浸潤物を強調する（実線矢印）。この画像の倍率は、Ｊの倍率と一致する。
【０３２４】
所見：１２匹の動物のうち、１匹の動物は、残存腺癌を示さず、完全レスポンダーと解釈された（非生着に対して）。１匹の動物は、腫瘍として、または再生小血管および／もしくは再生／萎縮性非腫瘍性肺実質として区別することが困難であった腫瘍陽性染色の稀な症例を含んだため、分類が困難なものであることを示した。したがって、この第２の症例も、広範でほぼ完全なレスポンダーと解釈された。これら２つの症例では、以前に腺癌の固体クラスターを含んでいたと推定される領域に、免疫細胞の散在性病巣があった。１つの症例は、マッソントリクローム染色によって認められた線維性コラーゲンの沈着を伴う組織化の兆候を示した。残りの１０匹全ての動物は、異なる程度の明らかな腫瘍退縮を伴う腫瘍結節を示し、１０匹のうちの８匹の動物は、腫瘍結節の５０％を超える腫瘍退縮を示した。吸入ｎＰａｃ群は、明確に定義されたリンパ濾胞、および胚中心、および毛包間領域、および傍皮質領域を伴う、高密度に密集した成熟リンパ系細胞の明確に定義された組織化した集団とは異なるリンパ浸潤物を示した。同様に、腫瘍結節の辺縁における、かつ局所的に中心内のリンパ系組織のより小さい高密度の集団。
【０３２５】
三次リンパ構造（ＴＬＳ）の観察
二次リンパ器官は、胚形成中に遺伝的に予めプログラムされたプロセスの一部として発達し、主に適応免疫応答を開始し、稀な抗原特異的ナイーブリンパ球と局所組織から排出する抗原提示細胞との間の相互作用の場所を提供する働きをする。二次リンパ組織の器官形成は、三次リンパ構造（ＴＬＳ）の新たなリンパ新生中、成人期に繰り返され、癌を含む様々な病的状態を患う炎症組織に形成され得る。気管支関連リンパ組織等の粘膜関連リンパ組織の臓器形成は、かかる例の１つである。ＴＬＳという用語は、リンパ球の単純なクラスターから、二次リンパ器官に非常によく似た高度な分離構造まで、異なる組織の構造を指し得る。リンパ節とＴＬＳとの間の顕著な違いは、リンパ節が被包型である場合、ＴＬＳは、臓器または組織中に閉じ込められた免疫細胞および間質細胞の集合を表すことである。
【０３２６】
観察結果：図６３：処理症例および未処理症例のリンパ構造。
１行目：濾胞過形成を伴う三次リンパ構造（ＴＬＳ）を実証する、吸入ｎＰａｃ症例。高用量、週２回（ＨＤ２×）（症例６００７）。（Ａ）２つの隣接するＴＬＳを示すＨ／Ｅ染色（実線矢印で強調）。肺において、これらは、気管支関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）と称される。これらのＴＬＳが、顕著な胚中心、毛包間領域、および傍皮質領域を伴うリンパ濾胞を含む明確なトポロジーを有する高密度のリンパ組織の境界が明瞭な集団から成るという点で、これらのＴＬＳのオルガノイド出現に留意されたい。破線矢印は、腫瘍退縮と一致する不規則な辺縁境界を有する腫瘍の隣接病巣を強調する。（Ｂ）Ａの領域からのより高倍率の画像。より小さいＴＬＳは、顕著な胚中心（矢印の先端におけるより淡い領域）を伴うリンパ濾胞を含む。リンパ濾胞における胚中心形成のこのプロセスは、リンパ濾胞過形成と称され、活性化され、かつ異物および腫瘍破片を含む様々な抗原に対する免疫応答を開始するプロセスにあるリンパ組織を示している。胚中心は、リンパ系細胞の明るい領域および暗い領域を有する偏光を特徴的に示す。この画像では、胚中心の淡い領域は、隣接する腫瘍結節に向いている。（Ｃ）不規則な辺縁境界を有する隣接する癌腫結節を示す、ケラチン染色。実線矢印は、ＴＬＳを示す。ＡおよびＢに示されるＨ／Ｅ染色切片と比較して、この組織切片がパラフィン包埋組織のより深い部分に由来するため、このＴＬＳは、この切片ではより小さく見える。
２行目：異なる群における腫瘍結節に関連するより小さいリンパ球集団の数および密度の差を例示するための、対照（Ｄ）、ＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（Ｅ）、およびｎＰａｃ（Ｆ）症例間の比較。これらの３つの画像は、全て同じ低倍率（４倍対物レンズ）である。（Ｄ）対照症例（１００３）は、いかなる個別のリンパ球集団も伴わない、高密度に密集した腺癌（破線矢印）を示す。（Ｅ）腺癌の結節（破線矢印）および右下の１つのみの稀な小さいリンパ球集団（実線矢印）を示す、ＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）症例（２００９）。（Ｆ）小リンパ系細胞の多数の関連する小型および中型集団を伴う、腺癌結節（破線矢印）を示す、ｎＰａｃ症例、高用量週２回（ＨＤ２Ｘ）。これらは、腫瘍の辺縁に、かつ局所的に腫瘍内に配置される（実線矢印）。
【０３２７】
所見：吸入ｎＰａｃ群は、対照およびＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）群（低倍率視野あたり１）と比較して増加したＴＬＳの数および密度（低倍率視野あたり２）を示し、これらＴＬＳのうちのより多くが、顕著な胚中心を含むリンパ濾胞過形成を伴い、サイズおよび活性化の増加を示した。
【０３２８】
要約すると、１７匹の動物のサブレビューは、腫瘍退縮および免疫応答に関していくつかの興味深いパターンを示した。具体的には、ｎＰａｃで処理した動物の全てが、完全および／またはほぼ完全な退縮を示す２匹の動物を含む、腫瘍退縮と適合する少なくともくつかの特徴を示した一方で、この群の残りの１０匹の動物のうちの８匹は、腫瘍結節の５０％超において腫瘍退縮と適合するいくつかの特徴を示した。これは、動物が応答を示さなかった対照群および３匹のうちの２匹の動物が腫瘍結節の１〜１０％において腫瘍退縮を示したＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）群と比較して、応答が増加した。
【０３２９】
ｎＰａｃ群を互いに評価すると、より高い用量およびより頻繁な投与量（週２回対週１回）の両方が腫瘍応答に対するより高い効果と関連していた。このデータは、腫瘍退縮との免疫ベースの関連付けを裏付け、ｎＰａｃ群もまた、対照およびＩＶ  Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）群（低倍率視野あたり１）と比較して増加したＴＬＳの数および密度（低倍率視野あたり２）を示し、これらＴＬＳのうちのより多くが、顕著な胚中心を含むリンパ濾胞過形成を伴い、サイズおよび活性化の増加を示した。また、ｎＰａｃ群では、腫瘍結節の辺縁において、かつ腫瘍結節内に、より高い密度の免疫細胞があった。
【０３３０】
結論
−１日目に１２７匹のＮＩＨ−ｒｎｕヌードラットにＸ線照射して、免疫抑制を誘発した。０日目に、気管内（ＩＴ）点滴注入により動物にＣａｌｕ３腫瘍細胞を投与した。動物を３週間成長させた。３週目に、動物を体重層別化によって群に無作為化した。４週目から、群２の動物に、２２、２９、および３６日目に静脈内（ＩＶ）投与（５ｍｇ／ｋｇ）により週１回用量のＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）を投与した。群３および群４の動物に、それぞれ、低目標用量（０．５ｍｇ／ｋｇ）および高目標用量（１．０ｍｇ／ｋｇ）で週１回（月曜日）吸入（ＩＮＨ）用量のｎＰａｃを投与した。群５および群６の動物に、それぞれ、低用量（０．５０ｍｇ／ｋｇ）および高用量（１．０ｍｇ／ｋｇ）用量で週２回（月曜日および木曜日）目標吸入用量のｎＰａｃを投与した。群１の動物は、正常な腫瘍細胞成長の対照として未処理のままにした。全ての動物を８週目に剖検した。
【０３３１】
全ての動物がそれらの指定された剖検時点まで生存した。このモデルに関連する臨床的観察結果は、皮膚発疹、呼吸困難を含んだ。研究期間中にわたって、全ての群の体重がほぼ同じ速度で増加した。
【０３３２】
週１回低用量ｎＰａｃ群および週２回低用量ｎＰａｃ群の吸入曝露平均パクリタキセルエアロゾル濃度は、それぞれ、２７０．５１μｇ／Ｌおよび２６３．５６μｇ／Ｌであった。週１回高用量ｎＰａｃ群および週２回高用量ｎＰａｃ群の吸入曝露平均パクリタキセルエアロゾル濃度は、それぞれ、２４４．８２μｇ／Ｌおよび２４５．７６μｇ／Ｌであった。
【０３３３】
用量は、平均エアロゾルパクリタキセル濃度、最新の平均群体重、想定沈着分率１０％、および曝露持続時間３３分間または６５分間に基づいた。４週間の処理中、週１回低用量ｎＰａｃ群および週２回低用量ｎＰａｃ群の達成された平均齧歯類沈着用量は、それぞれ、０．６５５ｍｇ／ｋｇおよび０．６４０ｍｇ／ｋｇ（１．２８ｍｇ／ｋｇ／週）であった。週１回高用量ｎＰａｃ群および週２回高用量ｎＰａｃ群の達成された平均齧歯類沈着用量は、それぞれ、１．１６６ｍｇ／ｋｇおよび１．１７６ｍｇ／ｋｇ（２．３５２ｍｇ／ｋｇ／週）であった。Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）ＩＶ注射を受けた群の場合、２２、２９、および３６日目の平均用量は、それぞれ、４．９４、４．６４、および４．４６ｍｇ／ｋｇであった。
【０３３４】
予定された剖検において、各群からの動物の大多数が、肺に褐色の結節および／または肺に赤色もしくは褐色の斑点状変色を有した。他の散発的観察には、１匹の動物における腹部ヘルニアおよび別の動物における心膜の結節が含まれた。剖検時に他の異常な巨視的観察は認められなかった。
【０３３５】
Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）処理動物の肺重量では、肺対体重比および肺対脳重量比は、未処理対照と比較して有意に低かった。週１回ｎＰａｃ高用量群は、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）群と同様の重量を有し、未処理対照と比較して有意に低い肺重量および肺対脳比を有した。
【０３３６】
陽性対照群１およびＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）処理比較群２と比較して、明らかな有害事象なしで、肺／脳重量比の低下および全体的な肺腫瘍量の低下によって測定される治療効果があった。吸入ｎＰａｃで処理した肺腫瘍量の組織学的分析は、腫瘍塊の減少、原始腫瘍細胞集団の減少、および腫瘍退縮の増加を示した。広範囲に及ぶ単核細胞浸潤が、吸入によりｎＰａｃを受けた動物の肺に観察された。使用されるモデルがＴ細胞欠損であるため、これらの細胞がＢ細胞またはＮＫ細胞である可能性が高い。ｎＰａｃへの腫瘍の局在的なより高い濃度の可能性がある曝露は、肺に影響を及ぼし、肺に単核細胞浸潤物を引き込む環境の変化をもたらしたと仮定される。
【０３３７】
実施例７．ヒト膀胱癌（ＵＭ−ＵＣ−３）マウス異種移植片研究
免疫不全（Ｈｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕヌード）マウスにおける皮下（ＳＣ）ＵＭ−ＵＣ−３膀胱癌細胞株（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１７４９）腫瘍の成長に対する、ｎＤｏｃｅ（本明細書に開示されるナノ粒子ドセタキセル、本実施例で使用される１．０７８ミクロンの平均粒径（数）、３７．２ｍ２／ｇのＳＳＡ、および０．０７２３ｇ／ｃｍ３のかさ密度（タップなし）を有するおよそ９９％のドセタキセル）懸濁液の１、２、および３回の毎週の腫瘍内注射（ＩＴ）投与（投与サイクル）の効果を評価するための研究を行った。ビヒクルの腫瘍内注射投与およびドセタキセル溶液の静脈内（ＩＶ）投与も、対照群として研究に組み込んだ。
【０３３８】
腫瘍を、右脇腹に１×１０７細胞（１００μＬ体積）で移植した（マトリゲル：ＢＤ３５６２３４を含むＰＢＳ  １：１）。腫瘍体積をキャリパーで決定した。式：Ｖ＝ｒ長さ×ｒ幅×ｒ高さ）×π×４／３。動物を週２回秤量した。腫瘍体積を、腫瘍移植後３〜４日毎に（合計約２０回の測定）および安楽死の日に決定した。腫瘍の写真画像を、移植後２、３、および４週間時点で、かつ安楽死の日に得た。腫瘍が３，０００ｍｍ３のサイズまたは有意な腫瘍の潰瘍形成時点まで達すると、動物を安楽死させた。安楽死の時点で、腫瘍を分離し、半分にした。腫瘍の半分をＬＮ２中で急速凍結し、−８０℃で保管し、その後に分析される。腫瘍のもう半分をホルマリンで固定した。２つのＨ＆Ｅ染色スライド／腫瘍を調製した（最大４つの腫瘍／群を処理した）。
【０３３９】
腫瘍移植後１８日目に、平均腫瘍サイズは、５０〜３２５ｍｍ３であり、動物を等しい平均腫瘍サイズの５つの群に分類し、以下の表２５に示されるように処理した。
【表２６】
2021526354.tif 000029
【０３４０】
ＩＴ投与（ビヒクル／ｎＤｏｃｅ）のために、注射（２７Ｇ、１／２インチ針を使用）を、腫瘍内の３つの部位で投与して（４０ｍｇ／ｍＬのｎＤｏｃｅ原液および２５ｇのマウス＝６３μＬに基づいて計算した総注射体積。３つの注射部位に均一に分割）、腫瘍全体にわたる試験製剤の分布を最大化した。第２の処理（第２のサイクル）を第１の処理（第１のサイクル）の７日後に行い、第３の処理（第３のサイクル）を第１の処理の１４日後に行った。ドセタキセル溶液ＩＶを、尾静脈を介して投与した。
【０３４１】
試験製剤を以下のように調製した。
ビヒクル（対照）：生理食塩水（注射用０．９％塩化ナトリウム）再構成溶液中１ｍＬの１％ポリソルベート８０／８％エタノール１ｍＬを、１．５ｍＬの生理食塩水（０．９％注射用塩化ナトリウム、ＵＳＰ）で希釈した。ビヒクル中、ポリソルベート８０の最終濃度は０．４％であり、エタノールの最終濃度は３．２％であった。
ｎＤｏｃｅ懸濁液：生理食塩水（注射用０．９％塩化ナトリウム）再構成溶液中１ｍＬの１％ポリソルベート８０／８％エタノールを、ｎＤｏｃｅ粒子粉末のバイアル（１００ｍｇ／６０ｃｃのバイアル）に添加した。ｎＤｏｃｅ粒子粉末の平均粒径（数）は、１．０ミクロンであった。バイアルを反転させて１分間手で激しく振盪した。振盪直後、１．５ｍＬの生理食塩水溶液（０．９％注射用塩化ナトリウムＵＳＰ）をバイアルに添加し、バイアルをさらに１分間手で振盪して、４０ｍｇ／ｍＬの懸濁液を作製した。懸濁液を少なくとも５分間静置させて、閉じ込められた空気および泡を減少させた。
ドセタキセル溶液：５０％エタノール／５０％ポリソルベート８０中２０ｍｇ／ｍＬのドセタキセル原液を調製した。生理食塩水溶液（０．９％注射用塩化ナトリウム）を原液に添加して、３ｍｇ／ｍＬの最終ドセタキセル溶液を作製した。ボルテックスして混合した。
【０３４２】
結果：
腫瘍体積を、研究継続期間（６１日間）にわたって週２回決定した。この研究の結果を、図６４、図６５、図６６、図６７、図６８、図６９、図７０、図７１、図７２、および図７３に示す。図６４に見られるように、ｎＤｏｃｅ  ＩＴ  ２サイクルおよびｎＤｏｃｅ  ＩＴ  ３サイクルの投与量の場合、腫瘍体積が減少し、腫瘍を効果的に排除した。腫瘍体積は、ｎＤｏｃｅ  ＩＴ  １サイクルおよびドセタキセルＩＶ  ３サイクルの投与量の場合、最初に減少したが、その後に増加した。これらの観察結果は、図６５、図６６、図６７、図６８、図６９、図７２、および図７３にも反映されている。
【０３４３】
図７０の散布図は、処理１日目対研究終了時（屠殺日）の１動物あたりの腫瘍体積を示す。図７０から分かるように、本質的に、全ての腫瘍が効果的に排除されたため、研究終了時の所与の動物における腫瘍の体積は、ｎＤｏｃｅ  ＩＴ  ２サイクルおよびｎＤｏｃｅ  ＩＴ  ３サイクルで処理した動物の場合、同じ動物の初期の腫瘍サイズに依存しなかった。しかしながら、ドセタキセルＩＶ  ３サイクルで処理した動物の場合、研究終了時の腫瘍の体積は、一般に、所与の動物の初期腫瘍体積に依存し、すなわち、初期腫瘍体積が大きいほど、研究終了時の腫瘍体積はより大きかった。ドセタキセルＩＶ  ３サイクルでの処理は、小さい腫瘍の治療にはある程度効果的であったが、大きい腫瘍の治療にはあまり効果的ではなかった。初期腫瘍サイズにかかわらず、ｎＤｏｃｅ  ＩＴ（腫瘍内）２サイクルまたは３サイクルの投与は、腫瘍を効果的に治療した。
【０３４４】
図７１から分かるように、ドセタキセルＩＶ  ３サイクルで処理した動物の初期の動物体重減少は、概して、ｎＤｏｃｅ  ＩＴ  １サイクル、ｎＤｏｃｅ  ＩＴ  ２サイクル、およびｎＤｏｃｅ  ＩＴ  ３サイクルで処理した動物よりも大きかった。体重は、最終的に、全ての処理においてある程度回復した。これは、初期食欲喪失の副作用が、ｎＤｏｃｅ  ＩＴ投与よりもドセタキセルＩＶ投与で大きいことを示唆し得る。また、ドセタキセルＩＶ  ３サイクルで処理した動物が、ｎＤｏｃｅ  ＩＴ  ３サイクルで処理した動物よりも強い末梢神経障害の兆候を有したことが観察され、末梢神経障害の兆候は、ｎＤｏｃｅ  ＩＴ  １サイクルまたは２サイクルで処理した動物では観察されなかった。
【０３４５】
死亡または安楽死の日に、腫瘍組織試料を収集し、ドセタキセル分析、組織学、および免疫組織化学（ＩＨＣ）観察のためにＬＮ２中に凍結させた。ＩＶドセタキセル対照群では、１つの腫瘍のみ（測定した７つのうち）が、アッセイの定量限界（１ｎｇ／ｇ）を超えるドセタキセルレベルを有した。ドセタキセルの測定可能なレベルは、ＩＴ  ｎＤｏｃｅ群からの全ての腫瘍で見られ、ｎＤｏｃｅ  ３サイクル群は、腫瘍内に残っているドセタキセルの最高濃度を有する傾向があった（図７４を参照のこと）。組織学スライド、Ｈ＆Ｅ染色の顕微鏡写真を、図７５〜８５に示す。Ｆ４／８０抗体染色で染色したＩＨＣスライドの顕微鏡写真を、図８６、図８７、および図８８に示す。
【０３４６】
追加のＨ＆Ｅおよび免疫組織化学的（ＩＨＣ）評価を、ホルマリン固定組織に行い、図８９および９０に示す。
【０３４７】
図７５〜８５の顕微鏡写真の組織学的概要
一般的な観察結果：
対照：増殖細胞を有し、単核免疫細胞浸潤がほとんどまたは全くなく、時折マクロファージが見られる、広範なレベルの生存腫瘍。
【０３４８】
ドセタキセル溶液：ある程度の腫瘍壊死を伴う、ある程度のマクロファージおよび時折のリンパ球応答応を有する、多くの生存しているように見える腫瘍塊。
【０３４９】
ｎＤｏｃｅ  ２サイクル：単離された腫瘍細胞がいくつか残っており、皮膚損傷の小さい領域、瘢痕／線維症が見られ、マクロファージおよび単核細胞を含む免疫細胞浸潤物。
【０３５０】
ｎＤｏｃｅ  ３サイクル：単離された腫瘍細胞がいくつか残っており、皮膚損傷の小さい領域、瘢痕／線維症が見られ、マクロファージおよび単核細胞を含む免疫細胞浸潤物。
【０３５１】
広範囲の単核細胞浸潤が、ｎＤｏｃｅの腫瘍内注射を受けた動物の皮下空間の腫瘍移植部位において観察された。サイクル数が増えると、腫瘍応答が増加するが、恐らくヌードマウスの脇腹に注射するための小さい空間および浅い領域により、ある程度の皮膚損傷がある（例えば、腫瘍上できつく引っ張られている皮膚に対してすぐの腫瘍）。使用されるモデルがＴ細胞欠損であるため、これらのリンパ系細胞がＢ細胞またはＮＫ細胞である可能性が高い。Ｂ細胞は、細胞傷害の生成に寄与する（抗体は、Ｆｃ受容体を発現する細胞に結合し、これらの細胞の死滅能力を高める。ＮＫ細胞は、腫瘍細胞の死滅に重要な先天性リンパ系細胞である。腫瘍を有する患者では、ＮＫ細胞活性が低減され、腫瘍の成長を可能にする。Ｔ細胞に加えて、ＮＫ細胞は、それらの活性を高めるためのいくつかのチェックポイント阻害剤の標的である。提供された全ての組織学的試料において、マクロファージが腫瘍内に存在していたが、その数は、大幅に増加するようには見えなかった。
【０３５２】
トリガーシグナルまたは阻害シグナルのいずれかを送達することができる幅広い表面受容体を使用することによって、ＮＫ細胞は、それらの環境内の細胞を監視して、細胞が異常（腫瘍またはウイルス感染）であり、細胞毒性によって排除されるべきかを確認することができる。ＮＫ細胞の細胞毒性および走化性は、腫瘍細胞およびそれらの副産物を含む多くの病理学的プロセスによって修正され得る。ある特定のシグナルに応じて、それらの機能が強化または増強される。異なるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を使用することによっていくつかの病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）に応答して、ＮＫ細胞は、サイトカイン産生および／または細胞溶解活性を高めることができる。ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、およびＩＦＮ  α／βを含むサイトカインも、ＮＫ細胞の活性を修正することができる。ＮＫ細胞は、異なる腫瘍細胞標的を死滅させることができる細胞溶解性エフェクターのみの単純な細胞ではなく、むしろ、それらは、多様な環境状況でそれらの活性を微調整することができる不均一集団を表す。
【０３５３】
腫瘍負荷は、ｎＤｏｃｅで処理した動物の異種移植片注射部位において大幅に低減され、腫瘍内注射は、静脈内ドセタキセルよりも効果的である。したがって、ｎＤｏｃｅの形態のドセタキセルの局所投与は、追加の効力を提供する。これは、長期にわたる化学療法へのより長い曝露および腫瘍部位への活発な細胞浸潤の両方に起因する可能性が高い。この後者の応答は、用量密度（実際の用量および投与頻度）に依存しているように見えた。解剖学的に、マクロファージは、腫瘍の縁に多数存在し、腫瘍内でより深く移動する間質全体にわたって頻度が減少する。
【０３５４】
図８６、図８７、および図８８の免疫組織化学の概要
図８６：生存腫瘍細胞の巨大なシートであり、単核免疫細胞は存在しない（茶色の染色なし）。
【０３５５】
図８７：膨大な数の生存腫瘍細胞の中で、腫瘍細胞破壊は非常に少なく、散在性単核免疫細胞はほとんど存在しない。
【０３５６】
図８８：実質的に腫瘍細胞が残っておらず、膨大な数の単核免疫細胞が明確なパターン（恐らく大部分はマクロファージ）に組織化されている。
【０３５７】
さらなるＨ＆Ｅおよび免疫組織化学的（ＩＨＣ）評価（図８９および図９０を参照のこと）
Ｈ＆ＥおよびＩＨＣ染色の前に腫瘍組織を固定した。膀胱組織切片を脱パラフィンし、標準のＨ＆ＥおよびＩＨＣ染色により処理した。１処理群あたり少なくとも４つの腫瘍を処理した。
【０３５８】
観察結果：図８９の対照症例：
上の行：Ｈ＆Ｅ染色切片（Ａ〜Ｃ）：（Ａ）近接に密集した大きい多形性腫瘍細胞のシートから成る膀胱癌腫。（Ｂ）顕著な核小体（実線矢印）および有糸分裂像の著しい増加（破線矢印）を伴う大きい腫瘍細胞を示す高倍率像。（Ｃ）混合した変性腫瘍細胞（点線矢印）および画像の下部と上部に隣接する生存癌腫（実線矢印）を伴う地理的な腫瘍細胞壊死の焦点を示す低倍率像。
下の行：ＩＴビヒクル（Ｄ）およびＩＶドセタキセル（ＥおよびＦ）：（Ｄ）ＩＴビヒクル症例（症例Ａ３）。Ｈ＆Ｅ染色切片は、画像の下半分に広範な壊死（破線矢印）および左上に生存癌腫（実線矢印）を示す。（Ｅ）ＩＶドセタキセル（症例Ｂ１）。Ｈ＆Ｅ染色切片は、画像の右上部分に、対照およびＩＴビヒクルの場合における癌腫と類似しているように見える生存癌腫を示す（実線矢印）。腫瘍を囲むカプセルのない左下の非腫瘍性脂肪組織との境界がはっきりしていることに留意されたい（破線矢印）。脂肪はまばらな免疫細胞の浸潤を含んでいた。（Ｆ）ＩＶドセタキセル（症例Ｂ１）。ＣＤ６８染色は、画像の下半分の周囲の間質に浸潤する穏やかなマクロファージを強調している（破線の矢印）。生存癌腫は、画像の上部にある（実線矢印）。
【０３５９】
観察結果：図９０．腫瘍内ｎＤｏｃｅ症例（全ての群からの代表的な画像は１サイクル、２サイクル、および３サイクルを含んだ）。
１行目：ｎＤｏｃｅ  １サイクル（１×）（症例Ｃ４）。（Ａ）非生存壊死物質の均質な好酸球染色からなる広範囲の地理的腫瘍細胞壊死を示す低倍率Ｈ／Ｅ染色（破線矢印）。壊死は、画像の右上にあるマウスの被覆皮膚表面（２つの実線の矢印）から、左下隅にある限局性の生存癌腫（単一の実線の矢印）に及ぶ。（Ｂ）左の生存癌腫（実線矢印）および右の壊死（破線矢印）の高倍率像。（Ｃ）周囲の非腫瘍性脂肪組織における軽度のマクロファージ浸潤（実線矢印）を示すＣＤ６８免疫組織化学染色。
２行目：ｎＤｏｃｅ処理  ２サイクル（２×）（症例Ｄ２）。（Ｄ）最大寸法２ｍｍ（実線矢印）と測定された三次元リンパ構造（ＴＬＳ）を示す低倍率像。ＴＬＳと免疫細胞が浸潤している周囲組織との明瞭な境界に留意されたい。潰瘍を形成している被覆皮膚（破線の矢印）に留意されたい。（Ｅ）ＴＬＳのリンパ球の大部分がＢ細胞であることを確認する、ＴＬＳ全体で広範な染色を示すＣＤ４５Ｒ免疫染色（Ｂ細胞マーカー）。Ｂ細胞のリンパ濾胞（実線の矢印）および毛包間の「Ｔ細胞」のゾーン（破線の矢印）を表す非染色焦点領域への構成に留意されたい。（Ｆ）同じＴＬＳの高倍率像。髄洞（破線の矢印）およびリンパ濾胞の１つに形成される胚中心（実線の矢印）を含む肺門領域を持つＴＬＳの構成に留意されたい。
３行目：ｎＤｏｃｅ処理  ２サイクル（２×）（症例Ｄ２）、続き。（Ｇ）胚中心の高倍率像。小さい成熟したリンパ球、中間サイズのセントロサイト、および時折より大きいセントロブラスト（実線矢印）の混合集団からなる胚中心の多形性リンパ球集団に留意されたい。これを小さい成熟リンパ球の隣接する均質な集団と比較する（破線の矢印）。（Ｇ）同じ症例、左側に潰瘍のある皮膚（破線の矢印）、および右側に壊死組織（実線の矢印）を伴う、別個の領域を示している。生存癌腫は存在しない。（Ｈ）診断可能な生存癌腫を有しない均質な好酸球性無定形壊死物質を示す、壊死領域の高倍率像。
４行目：ｎＤｏｃｅ処理  ３サイクル（３×）（症例Ｄ２）。（Ｊ）上部に潰瘍のある皮膚表面および根底にある壊死（破線矢印）を示す、低倍率像。画像の右下部分にある隣接するＴＬＳに留意されたい（実線矢印）。（Ｊ）ＴＬＳのＢ細胞の密集した集団を示すＣＤ４５Ｒ免疫染色切片の低倍率像（実線矢印）。（Ｌ）診断可能な生存癌腫細胞を有しない無定形壊死物質を示す、皮膚潰瘍の下の壊死領域の高倍率像。
【０３６０】
病理組織学：
未処理対照：剖検日に、未処理対照動物の腫瘍体積を測定し、その後、腫瘍部位の組織を解剖し、腫瘍のおよそ半分をドセタキセル含有量のために処理し、半分を組織学的分析のために保存した。未処理対照腫瘍は、スライド上で最大１５ｍｍと測定され、密接に詰め込まれた腫瘍細胞のシートからなる、浸潤性癌腫の広範なびまん性増殖を含んだ（図８９−スライドＡ）。腫瘍細胞は大きく、小胞クロマチンを有する多形性核、および顕著な好酸球性核小体を伴った。腫瘍細胞は、適量の軽度に好酸球性な細胞質を有し、それらは、有糸分裂活性の増加を顕著に示した（１０の高倍率視野あたり１２２の有糸分裂［４００×ｈｐｆ］）（図８９−スライドＢ）。個別に壊死性およびアポトーシス性腫瘍細胞が腫瘍内に存在し、凝固性腫瘍細胞壊死の散在した領域もあり、全体として腫瘍領域の５〜１０％を占めていた。壊死中心は均質な好酸球性壊死破片からなり、これは混合した変性腫瘍細胞の領域を含んでいた（図８９−スライドＣ）。腫瘍内に有意なリンパ球浸潤物はなく、特に、腫瘍組織または周囲の非腫瘍性間質組織には、別個の小リンパ球集団または三次リンパ組織（ＴＬＳ）はなかった。周囲の間質は、斑点状の穏やかな免疫細胞浸潤物を含んでいた。ＣＤ６８の免疫組織化学的染色（マクロファージのマーカー）は、腫瘍内および周囲の軽度のマクロファージ浸潤物を強調し、腫瘍壊死の病巣内の染色密度の増加は、細胞破片の増加を含む領域のマクロファージの増加濃度と一致した。
【０３６１】
未処理腫瘍内ビヒクル対照：剖検日に、これらのＩＴビヒクル動物の腫瘍体積を測定し、その後、腫瘍部位の組織を解剖し、腫瘍のおよそ半分をドセタキセル含有量のために処理し、半分を組織学的分析のために保存した。２つの腫瘍内ビヒクル症例は、形態学的および免疫組織化学的レベルで同様の所見を示し、これらはいずれも、上述の対照症例において見られるものと同一の形態学的および免疫組織化学的外観を有した。具体的には、これらの両方の症例には、対照の症例で見られたものと同一の外観を持つ大きい癌腫細胞の広範なシートが含まれていた。生存腫瘍は、これらの２つの症例のスライドで、それぞれ、最大寸法１２ｍｍおよび２４ｍｍと測定された。これらの両方の症例は壊死の地理的領域も含み、これは腫瘍領域の５０％超を占める１つの症例（症例Ａ３）でかなり広範であった（図８９スライドＤ）。これらの両方の症例では評価するには非常に限られた非腫瘍性組織しか存在しなかったが、存在する場合、これは穏やかな免疫細胞浸潤物を含んでいた。ＴＬＳは存在しなかった。
【０３６２】
静脈内ドセタキセル：剖検日に、ＩＶドセタキセル動物の腫瘍体積を測定し、その後、腫瘍部位の組織を解剖し、腫瘍のおよそ半分をドセタキセル含有量のために処理し、半分を組織学的分析のために保存した。２つのＩＶドセタキセル症例は、形態学的および免疫組織化学的レベルで同様の所見を示し、これらはいずれも、上述の対照症例および２つのＩＴビヒクル症例で見られるものと同様の形態学的および免疫組織化学的外観を有した。具体的には、これらの両方の症例には、２つの症例においてそれぞれ腫瘍領域の１１〜５０％（症例Ｂ１）および５０〜９０％（症例Ｂ３）を占める、大きい生存癌腫細胞のシートおよび地理的腫瘍細胞壊死の散在領域が含まれていた（以下の表２９、図８９−スライドＥおよび図８９−スライドＦを参照のこと）。これらはいずれも、スライド上で最大寸法１０ｍｍを超える腫瘤（１１ｍｍおよび１５ｍｍ）を有した（以下の表２６を参照のこと）。周囲の間質組織は、穏やかな免疫細胞浸潤を含んでいた。ＴＬＳは存在しなかった。
【０３６３】
腫瘍内ｎＤｏｃｅ  １サイクル：この群の３匹全ての動物には、対照群、ＩＴビヒクル群、およびＩＶドセタキセル群で見られるものと同様の多形性細胞から成る残存癌腫が含まれていた。しかしながら、残存癌腫の量はこの群内で劇的に異なった。具体的には、３つの症例のうちの２つ（症例Ｃ１およびＣ６）に、スライド上で最大寸法１６ｍｍおよび１９ｍｍと測定された広範囲の残存生存癌腫が含まれていた。これらの２つの症例は、腫瘍領域の１１〜５０％を占める地理的壊死も有していた。これら２つの症例の一方（症例Ｃ１）には、軽度の免疫細胞浸潤を伴う少量の非腫瘍性組織が含まれていた。他方の症例には、周囲の免疫細胞浸潤を評価するための非腫瘍性組織は存在しなかった（症例Ｃ６）。対照的に、第３の症例（症例Ｃ４）は、腫瘍の５０〜９０％の壊死を示し、この場合、スライド上の最大断面寸法が２．５ｍｍと測定された、残存生存癌腫の小さい焦点のみが存在した（図９０−スライドＡおよび図９０スライドＢ）。この症例では、周囲の非腫瘍性間質は、軽度の免疫細胞浸潤物を含んでいた（図９０−スライドＣ）。さらに、より深い免疫組織化学染色切片では、隣接する非腫瘍性脂肪組織にＴＬＳが認められた。ＴＬＳは最大寸法およそ１ｍｍと測定され、リンパ濾胞および門部領域への組織化を示す密集した境界が明瞭な小さい成熟したリンパ球集団からなった。ＣＤ４５Ｒの染色により、ＴＬＳのリンパ球の大部分がＢ細胞であり、これらがＴＬＳ内のＢ細胞の濾胞に組織化されたことが確認された。未処理腫瘍内ビヒクル対照と同様に、剖検日に、これらの動物の腫瘍体積を測定し、その後、腫瘍部位の組織を解剖し、腫瘍のおよそ半分をドセタキセル含有量のために処理し、半分を組織学的分析のために保存した。
【０３６４】
腫瘍内ｎＤｏｃｅ  ２サイクル：この群の５匹の動物のうちの４匹の腫瘍部位組織全体を組織学的分析のために保存した。この群の５匹の動物のうちの２匹（症例Ｄ２およびＤ８）には生存癌腫が含まれておらず、これらの動物は広範囲の地理的腫瘍壊死も示した（１００％の腫瘍壊死、図９０−スライドＨおよび図９０−スライドＩ）。残りの３匹の動物のうちの２匹（症例Ｄ４およびＤ６）にも、広範な壊死（腫瘍の９０％超）が存在し、いずれの症例にも、剥離した腫瘍細胞の稀な小さい集団しか存在せず、その最大のものは各症例で最大０．１ｍｍと測定された。これらの稀な小さい剥離した腫瘍細胞クラスターの有意性は明確ではなく、それらの外観と組織の縁部および壊死の縁部に隣接する剥離した局在を考慮すると、切片化の人為的結果を除外することができなかった。これらの４つの症例の各々に、単一のＴＬＳがあった。ＴＬＳのうちの３つは１ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍと測定されたが、４つ目は０．１ｍｍと測定された（症例Ｄ８）。ＴＬＳは、非腫瘍性組織中に離散的に配置され、概して、壊死性物質に近接して、または直接隣接していた（図９０−スライドＤ）。ＴＬＳの境界は明瞭であったが、それらは繊維膜を欠いていた。ＴＬＳの内部トポロジーはさまざまな成熟度を示したが、より成熟した外観のＴＬＳには、二次リンパ器官に明確な類似点があり、これらのいくつかは、目に見える核小体のない均質な小さい成熟リンパ球から成る末梢に配置されたリンパ濾胞に向かって延在する髄洞を持つ門部領域を有していた（図９０−スライドＦおよび図９０−スライドＧ）。濾胞間領域には、免疫芽細胞と一致するより大きいリンパ系細胞が時折存在する、同様に見える小さい成熟リンパ球も含まれていた。局所的に、いくつかのリンパ濾胞は、小さい成熟リンパ球、中型のセントロサイト、およびセントロブラストと一致するより大きい細胞を含む多形性リンパ球集団から成る胚中心を含んでいた（図９０−スライドＧ）。時折、可染体（ｔａｎｇｉｂｌｅ−ｂｏｄｙ）マクロファージも胚中心で認められた。ＣＤ４５Ｒのための免疫組織化学染色は、ＴＬＳのＢ細胞の強い染色を示した。具体的には、この結果は、胚中心を含むリンパ濾胞におけるＢ細胞を強調し、濾胞性リンパ系細胞（Ｔ細胞領域）で染色がないことを示した（図９０−スライドＥ）。この群の第５の症例（症例Ｄ９）は、最大寸法８ｍｍと測定された生存癌腫の残存巣を含み、腫瘍領域の５〜１０％の壊死も示した。この動物では、腫瘍部位組織のおよそ５０％を組織学的分析のために保存し、５０％をドセタキセル含有量について分析した。ＣＤ６８の染色では、この群の５つの症例のうちの１つの症例（症例Ｄ２）で中程度のマクロファージ浸潤が見られ、残りの４つの症例（症例Ｄ４、Ｄ６、Ｄ８、およびＤ９）で軽度のマクロファージ浸潤が見られた。
【０３６５】
腫瘍内ｎＤｏｃｅ  ３サイクル：この群の３匹の動物（Ｅ１、Ｅ７、Ｅ９）のいずれも診断可能な残存生存浸潤性癌腫結節を含まず、３つの症例全てが広範囲の壊死を示した（図９０−スライドＬ）。この群の３匹全ての動物の腫瘍部位組織全体を組織学的分析のために保存した。これらの動物のうちの２匹（Ｅ１およびＥ７）には、大きい皮膚潰瘍形成領域があり、その下には、周囲の非腫瘍性線維脂肪組織と筋肉組織に広がる壊死領域があった。これは、筋細胞の変性変化だけでなく、偽上皮腫性過形成の領域を含む周囲の表皮内層の再生変化に関連していた。同様に、壊死内および壊死に隣接して、線維芽細胞および内皮細胞を含む再生性のより大きい間質細胞が存在した。核が変性している壊死には、稀な混合した単一のより大きい細胞も存在した。これらの稀な細胞は壊死の過程にあるか、または完全に壊死したように見え、これらが稀に死にかけている腫瘍細胞を表す可能性があることを明確に除外することは困難であったが、切片の別の場所にある最終的な筋細胞が退化した核の特徴を示すように、これらはまた反応性／再生性の間質細胞または退化した筋細胞を表すこともできた。そのため、これらの稀な細胞の正確な意味は明確ではなかったが、それらは凝集性の小結節を形成せず、死につつあるか壊死性であるように見えた。これらの細胞をさらに評価するために、パンサイトケラチン（ＡＥ１／ＡＥ３）免疫染色を実施した。しかしながら、これはこれらのより大きい細胞のいくつかの標識の欠如を示した一方で、決定的な評価を一部の領域で困難にする過剰なバックグラウンド染色があった。さらに、この研究で実施されたパンサイトケラチンは全体的に信頼性がなく、対照症例では感度を欠いていた。そのため、現在のケラチン染色によるこれらの切片の決定的な評価は信頼できず、これは、現在保留中の別のケラチン免疫染色（ケラチン７）で染色されたスライドのレビューまで延期される。３つの症例は全て、単一の十分に形成されたＴＬＳも含んでおり、これらの３匹の動物において、最大寸法０．８ｍｍ、１．５ｍｍ、２ｍｍと測定された。この群のＴＬＳ（図９０−スライドＪおよび図９０−スライドＫ）は、上記のｎＤｏｃｅ  ２サイクル群で説明したものと同様の範囲の成熟およびＣＤ４５Ｒ染色パターンを示した。具体的には、ＴＬＳの境界は明瞭であり、壊死と潰瘍に近接して局在した。この群のＴＬＳは、ＣＤ４５Ｒを強く発現するＢ細胞から成るリンパ濾胞の内部組織を示し、これらのリンパ濾胞のいくつかは胚中心を含んでいた。ＣＤ６８染色により、３匹全ての動物における中程度のマクロファージ浸潤が強調された。
【０３６６】
以下の表２６および表２７は、スライド上でミリメートル単位で測定された生存癌腫の最大断面寸法を反映している。
【表２７】
2021526354.tif 000030
【表２８】
2021526354.tif 000031
【０３６７】
表２６は、６つの群の残存腫瘍のサイズの範囲を示す。表２７は、３つのｎＤｏｃｅ群（合計１１匹の動物）における残存癌腫結節のサイズを３つの非ｎＤｏｃｅ処理群（合計５匹の動物）と直接比較するために、このデータを要約している。５匹の非ｎＤｏｃｅ処理動物は全て、１０ｍｍ超と測定された残存生存癌腫結節を有していた。対照的に、ＩＴ  ｎＤｏｃｅで処理した動物の半分足らず（５／１１）は、スライド上に測定すべき診断可能な残存生存癌腫を有しなかった（完全退縮）。残存生存癌腫を有したＩＴ  ｎＤｏｃｅ群の残りの５匹の動物のうちの２匹では、これは、腫瘍が最大寸法最大０．１ｍｍと測定された稀な小さい腫瘍細胞集団からなった。これらの症例における少量の腫瘍の有意性は、分離した局在および小さいサイズも切片化の人為的結果の可能性を高めたため、確実ではなかった。第３の症例では、残存腫瘍は２．５ｍｍと測定され、残りの３つの症例では、スライド上で最大寸法８ｍｍ、１６ｍｍ、１９ｍｍと測定された。
【０３６８】
残存浸潤癌腫を有しない症例のパーセンテージおよびスライド上の残存生存癌腫結節のサイズに関する３つのＩＴ  ｎＤｏｃｅ群の比較を表２８に示す。
【表２９】
2021526354.tif 000032
【０３６９】
ＩＴ  ｎＤｏｃｅのサイクル数が１サイクルから３サイクルに次第に増加すると、残存癌腫を有しない症例のパーセンテージが増加した。具体的には、ＩＴ  ｎＤｏｃｅ  １サイクル群では、完全退縮を伴う症例が０％（０／３）であったが、これらの症例のうちの１つはわずか２．５ｍｍと測定され、他の２つはスライド上で１６ｍｍおよび１９ｍｍと測定された。対照的に、ｎＤｏｃｅを２サイクル投与した群では、症例の４０％（２／５）で完全に退縮した。しかしながら、残存生存癌腫を有したこの群の残りの３つの症例のうち、これは非常に最小限であり、人為的結果を表す可能性のある最大０．１ｍｍと測定されたクラスターを伴った。最後に、３サイクル投与された群は、動物の１００％（３／３）で完全退縮を有し、ＩＴ  ｎＤｏｃｅ  ３サイクル群の３つの症例のうちのいずれも測定すべき残存生存癌腫を有しなかった。
【０３７０】
壊死を示す組織のパーセンテージを表２９に示す。
【表３０】
2021526354.tif 000033
【０３７１】
この研究の１６匹の動物は全て、地理的な腫瘍細胞壊死を含み、非ｎＤｏｃｅ処理症例では、これには、５０〜９０％の腫瘍壊死を伴う２つの症例が含まれていた。しかしながら、全体として、腫瘍細胞壊死の程度は、非ｎＤｏｃｅ処理群よりもｎＤｏｃｅ処理群で有意に大きかった。具体的には、１１匹のｎＤｏｃｅ処理動物のうちの５匹が１００％の腫瘍細胞壊死（完全退縮）を示し、残りの６匹のうちの２匹が９０％超の腫瘍細胞退縮を示した。対照的に、５匹の非ｎＤｏｃｅ処理動物のいずれも、９０％超の腫瘍細胞壊死を示さなかった。
【０３７２】
半定量的に等級付けした、Ｈ＆Ｅの評価およびＣＤ６８による免疫組織化学的染色に基づいた周囲の非腫瘍性組織におけるマクロファージ浸潤物密度を表３０に示す。
【表３１】
2021526354.tif 000034
【０３７３】
全ての動物における周囲の非腫瘍性組織中のマクロファージ浸潤の強度は顕著でなかったが、非ｎＤｏｃｅ処理群をｎＤｏｃｅ処理群と比較した場合、非ｎＤｏｃｅ処理群には見られなかったが、後者には中程度のマクロファージ浸潤が認められた症例が含まれていることが認められた。＊ＩＴ  ｎＤｏｃｅ処理１サイクル群の１つの症例は、評価のための周囲の非腫瘍性組織を含まなかった。
【０３７４】
少なくとも１つのＴＬＳを含む各群の症例の数を表３１に示す。
【表３２】
2021526354.tif 000035
【０３７５】
非ｎＤｏｃｅ処理群の５つの症例のいずれもＴＬＳを含まなかった。しかしながら、ｎＤｏｃｅ処理群の１１匹の動物のうちの８匹はＴＬＳを含み、これらの８つの症例のうちの１つを除く全てにおいて、ＴＬＳは最大寸法少なくとも１ｍｍと測定された。特に重要なのは、ＴＬＳの有無が残存癌腫の有無と密接に関連していたことである。具体的には、診断可能な残存癌腫を有しない（５症例）か、または２．５ｍｍ以下と測定された残存癌腫（３症例）を有するかのいずれかの全ての症例もＴＬＳを含み、これらはＴＬＳを含む唯一の症例であった。対照的に、残りの症例はいずれも、スライド上に少なくとも８ｍｍの残存癌腫を有したが、ＴＬＳを含まなかった。
【０３７６】
スライド上で測定された剖検体積と最大腫瘍サイズとの比較を表３２に示す。
【表３３】
2021526354.tif 000036
【０３７７】
剖検時の腫瘍部位の体積をスライド上の最大癌腫の長さと比較すると、異なる処理群間でのスライド上の腫瘍長さに見られる傾向は、剖検腫瘍体積にも見られ、これは、スライド上の腫瘍測定値が、異なる動物における処理に対する異なる応答の代表的な評価であったことを裏付けている（表３２を参照のこと）。剖検時にわずかな体積の腫瘍部位が記録され、顕微鏡検査で癌腫が全くないか、ごくわずかな癌腫が観察された動物では、剖検時に認められた少量の体積は、主にまたは完全に、壊死または線維性組織に起因した可能性がある。あるいは、剖検時に１〜２ｍｍのＴＬＳが腫瘍部位で検出された可能性もあり、その測定が記録された腫瘍部位の体積の一部に寄与した可能性がある。
【０３７８】
考察：
膀胱癌腫研究からの１６匹のマウスのサブセットの形態学的および免疫組織化学的特徴は、腫瘍内ｎＤｏｃｅの一般的安全性および有効性を評価することを目的とした。１６匹の動物のこのサブセットは、１匹の未処理対照動物、腫瘍内ビヒクルを投与した２匹の動物、静脈内ドセタキセル（３サイクル）で処理した２匹の動物、および腫瘍内ｎＤｏｃｅで処理した１１匹の動物を含んだ。ｎＤｏｃｅ群を、投与サイクルの数に基づいて、３つの群：群１（１サイクル、３匹の動物）、群２（２サイクル、５匹の動物）、および群３（３サイクル、３匹の動物）に分けた。
【０３７９】
様々な群間で２つの主な特徴、腫瘍退縮の存在および程度、ならびに三次リンパ球凝集の存在が異なっていた。具体的には、腫瘍内ｎＤｏｃｅ群の大半の動物に顕著な腫瘍退縮が存在したが、他の群のいずれの動物にも明白な腫瘍退縮は存在しなかった。この所見を反映して、有意な退縮を伴うｎＤｏｃｅ群の全ての動物にＴＬＳが含まれていたが、明白な退縮を伴わずに腫瘍が持続する動物にはＴＬＳが含まれていなかった。
【０３８０】
この顕微鏡的レビューでは、スライド上の残存生存癌腫の最大寸法を使用して、異なる群の応答の程度を比較した。剖検時の対応する最大腫瘍長は比較に利用不能であったが、剖検時の腫瘍体積は利用可能であった。剖検時の腫瘍体積をスライド上の最大腫瘍の長さと比較すると、異なる処理群間でのスライド上の腫瘍長さに見られる傾向は、剖検腫瘍体積にも見られ、これは、スライド上の腫瘍測定値が、異なる動物における処理に対する異なる応答を比較するために使用するための典型的な標準尺度であったことを裏付けている（表３２）。非ｎＤｏｃｅ群では、５匹の動物の全てが、スライド上で最大寸法少なくとも１１ｍｍ（範囲：１１ｍｍ〜２４ｍｍ）と測定された広範囲の残存生存癌腫を含んでいた。対照的に、ＩＴ  ｎＤｏｃｅで処理した動物の半分足らず（５／１１）は、スライド上に測定すべき診断可能な残存生存癌腫を有しなかった（完全退縮）。残存生存癌腫を有したＩＴ  ｎＤｏｃｅ群の残りの５匹の動物のうちの２匹では、これは、腫瘍が最大寸法最大０．１ｍｍと測定された稀な小さい腫瘍細胞集団からなった。これらの症例の両方における少量の腫瘍の有意性は、これらの症例における偽陽性知見をもたらす、分離した局在および小さいサイズも切片化の人為的結果の可能性を高めたため、確実ではなかった。第３の症例では、残存腫瘍は２．５ｍｍと測定され、残りの３つの症例では、スライド上で最大寸法８ｍｍ、１６ｍｍ、１９ｍｍと測定された（表２６および表２７）。
【０３８１】
この研究の１６匹全ての動物には、腫瘍領域の少なくとも５％を占める地理的腫瘍細胞壊死の領域が含まれていた。しかしながら、これらの両方の群における全ての症例をまとめると、腫瘍細胞の壊死の程度は、非ｎＤｏｃｅ群よりもｎＤｏｃｅ群において有意に大きかった。具体的には、１１匹のｎＤｏｃｅ動物のうちの５匹が１００％の腫瘍細胞壊死（完全退縮）を示し、残りの６匹のうちの２匹が９０％超の腫瘍細胞退縮を示した。対照的に、５匹の非ｎＤｏｃｅ動物のいずれも、９０％超の腫瘍細胞壊死を示さなかった。具体的には、非ｎＤｏｃｅ群では、５つの症例のうちの３つが５０％未満の壊死を示し、非ｎＤｏｃｅ症例の５つのうちの２つが５０〜９０％の腫瘍壊死を示した（表２９）。
【０３８２】
３つのｎＤｏｃｅ群（１サイクル、２サイクル、３サイクル）を一緒に比較すると、ＩＴ  ｎＤｏｃｅのサイクル数の１サイクルから３サイクルへの漸進的増加が、残存癌腫を有しなかった症例のパーセンテージの増加と関連したことが認められた。具体的には、ＩＴ  ｎＤｏｃｅ  １サイクル群では、完全退縮を伴う症例が０％（０／３）であったが、これらの症例のうちの１つでは、スライド上で残存生存癌腫結節がわずか２．５ｍｍと測定された一方で、他の２つの症例では、スライド上で１６ｍｍおよび１９ｍｍと測定された残存生存癌腫を有した。対照的に、２サイクル投与した群は、５つの症例のうちの２つの症例（４０％）で完全な退縮があった。さらに、残存生存癌腫を有したこの群の残りの３つの症例のうちの２つでは、残存癌腫のサイズは非常に小さく、クラスターは最大寸法最大０．１ｍｍと測定された。これらの２匹の動物における小さいクラスターの末梢および分離した局在を考慮すると、これらは恐らくこれらの２匹の動物で偽陽性をもたらす切片化の人為的結果を表している可能性があり、その場合、実際の完全退縮率は、２サイクル投与した群において４／５（８０％）となる。２サイクル群の最後の動物は、８ｍｍと測定された残存癌腫を有した。最後に、ｎＤｏｃｅの３サイクル投与群は、動物の１００％（３／３）で完全退縮を有し、ＩＴ  ｎＤｏｃｅ  ３サイクル群の３つの症例のいずれも測定に利用可能な残存生存癌腫を有さなかった（表２８）。
【０３８３】
この研究におけるもう１つの印象的な所見は、処理に対する有意な応答を示した全てのｎＤｏｃｅ動物における三次リンパ球構造（ＴＬＳ）の存在であった。具体的には、ＴＬＳは８匹の動物に見つかり、これらは全てｎＤｏｃｅ群に属していた。ＴＬＳを含むこれらの８匹の動物には、残存生存癌腫を有しない５匹の動物、最大０．１ｍｍと測定された稀な剥離した癌腫クラスターを有する２匹の動物、および２．５ｍｍと測定された残存癌腫巣を有する動物が含まれた。少なくとも８ｍｍと測定された残存癌腫結節を有した残りの動物のいずれもＴＬＳを有しなかった。この所見は、ＴＬＳの存在と処理に対する有意な腫瘍応答との間に非常に強い相関があることを実証した。さらに、ＴＬＳはＩＴ  ｎＤｏｃｅを受けた動物でのみ見られ、その群内では、ｎＤｏｃｅ  ３サイクルを投与した３匹全ての動物を含む１１匹の動物のうちの８匹にＴＬＳが存在した。
【０３８４】
この研究におけるＴＬＳのサイズは０．１〜最大２ｍｍの範囲であったが、８つのＴＬＳのうちの７つが最大寸法少なくとも１ｍｍであり、２つが最大２ｍｍと測定された。これらのサイズを考慮すると、これらの大半の動物におけるＴＬＳは、染色されたスライドの肉眼検査で個別の小結節として容易に評価され、これらはインビボ状態で触知できた可能性がある。ＴＬＳの全ての境界は明瞭であったが、それらは十分に形成された繊維膜を欠いていた。それらは、成熟のさまざまな段階を示し、最も成熟したＴＬＳは、ＣＤ４５Ｒで強く標識された成熟Ｂ細胞と介在する濾胞間「Ｔ細胞領域」および副鼻腔を伴う髄質領域から成る十分に形成された末梢リンパ濾胞を有していた。これらのＴＬＳのうちのいくつかは、胚中心を含むリンパ濾胞による活性化の兆候を示した。
【０３８５】
最後に、非腫瘍性組織に関連するマクロファージ浸潤が存在し、これは、概して、処理に対する腫瘍応答の程度と相関していた。具体的には、非ｎＤｏｃｅ群の全ての動物には軽度のマクロファージ浸潤があり、ｎＤｏｃｅ群には軽度および中程度の免疫細胞浸潤の症例が含まれていた。中程度の免疫細胞浸潤を伴う４症例全てで腫瘍が完全に退縮し、これには、ＩＴ  ｎＤｏｃｅ  ３サイクルを投与した群の３匹全ての動物が含まれた。
【０３８６】
結果：
結論として、膀胱癌腫コホートの１６匹のマウスのサブセットで行ったこの研究は、ＩＴ  ｎＤｏｃｅ処理と腫瘍退縮との間の強い関連性を明らかに示し、ＩＴ  ｎＤｏｃｅで処理した１１匹の動物のうちの５匹は完全な腫瘍退縮を示し、この群のさらに３匹の動物は、０．１ｍｍ、０．１ｍｍ、２．５ｍｍと測定された最大範囲の最小残存腫瘍があった。さらに、ＩＴ  ｎＤｏｃｅのサイクルの増加（１サイクルから３サイクルへの移動）により、腫瘍退縮の程度が大きくなり、３サイクル群の３匹全ての動物が完全な腫瘍退縮を示した。さらに、有意な腫瘍応答を示した全ての８匹の動物で三次リンパ構造（ＴＬＳ）が見られたが、有意な腫瘍応答を示さなかった動物のいずれにもＴＬＳは見られなかった。これらの所見は、ＩＴ  ｎＤｏｃｅを投与した動物において、腫瘍に対する局所薬物効果と宿主動物の免疫系との間に有意な相互作用があり、腫瘍に隣接する強力な局所ＴＬＳの形成をもたらし、次いで、有意な腫瘍退縮にさらに寄与する適応免疫および体液性免疫の急速なフィードバックループをセットアップすることを示唆している。
【０３８７】
実施例８−ヒト腎細胞腺癌のラット異種移植片モデルにおける薬物有効性研究
ヒト腎細胞腺癌のラット異種移植片モデルにおける腫瘍内注射によって投与したｎＰａｃ（ナノ粒子パクリタキセル）懸濁液およびｎＤｏｃｅ（ナノ粒子ドセタキセル）懸濁液の薬物有効性を決定するための非ＧＬＰ研究を行った。
【０３８８】
目的
本研究の目的は、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  Ｒａｇ２；ヒト腎細胞腺癌のＩｌ２ｒｇヌル（ＳＲＧ（登録商標））ラット異種移植片モデル（７８６−Ｏ細胞株）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１９３２（商標））における長期にわたる腫瘍内（ＩＴ）注射によって投与したｎＰａｃ（ナノ粒子パクリタキセル）およびｎＤｏｃｅ（ナノ粒子ドセタキセル）の潜在的有効性を調査することであった。５〜７週齢のＳＲＧラットにＣｕｌｔｒｅｘ（登録商標）中で５００万個の７８６−Ｏ細胞を皮下接種して、腫瘍異種移植片を成長させた。腫瘍体積が１５０〜３００ｍｍ３に達した時点で、ラットを試験物品（ＩＴ投与）、陽性対照（パクリタキセルおよびドセタキセル、静脈内（ＩＶ）投与）、およびビヒクル対照（ＩＴ投与）からなる処理群に回転方式で登録し、その後、腫瘍の成長または退縮について監視した。
【０３８９】
細胞培養
細胞株：７８６−Ｏ細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１９３２（商標））。細胞を液体窒素中で保管した。解凍後、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で培養した。細胞を移植用に調製した後、それらを注射まで氷上で維持した。
【０３９０】
細胞培養条件：細胞を３７℃／５％ＣＯ２で、組織培養処理したフラスコ上のＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ番号４１０４９１−０１）および１０％ＦＢＳ中で培養した。接種前に細胞を２〜３週間増殖させた。細胞の解凍、培養、および継代はＡＴＣＣによって行われた（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ａｌｌ／ＣＲＬ−１９３２．ａｓｐｘ）。
【０３９１】
細胞接種：１ラットあたり５×１０６細胞。皮下の左後側腹、背側。
【０３９２】
接種ビヒクル：５０％Ｃｕｌｔｒｅｘ  ＢＭＥタイプ３（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ番号３６３２−００１−０２、インビボ腫瘍成長用に製剤化されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）等の基底膜マトリックスタイプ）０．５ｍＬの総体積中培地５０％。５ｍｇ／ｍＬのＣｕｌｔｒｅｘ最終濃度のために、１０ｍｇ／ｍＬのＣｕｌｔｒｅｘと１：１で混合した細胞懸濁液。最終接種体積は、５００ｕＬである。
【０３９３】
試験物品（ｎＰａｃおよびｎＤｏｃｅ懸濁液）の調製
薬物：６０ｍＬバイアル中３０６ｍｇのｎＰａｃ（およそ９８％パクリタキセルであり、０．８７８ミクロンの平均粒径（数）、２６．７ｍ２／ｇのＳＳＡ、および０．０７６３ｇ／ｃｍ３のかさ密度（タップなし）を有するナノ粒子パクリタキセル粉末を本実施例で使用した）、および６０ｍＬバイアル中１００ｍｇのｎＤｏｃｅ（およそ９９％ドセタキセルであり、１．０７８ミクロンの平均粒径（数）、３７．２ｍ２／ｇのＳＳＡ、および０．０７２３ｇ／ｃｍ３のかさ密度（タップなし）を有するナノ粒子ドセタキセル粉末を本実施例で使用した）。
【０３９４】
ｎＰａｃ懸濁液の場合（最終濃度：生理食塩水溶液中２０ｍｇ／ｍＬのｎＰａｃおよび０．３２％ポリソルベート８０、最終体積：１バイアルあたり１５．３ｍＬ）：
１８ゲージ以上の滅菌針を有する滅菌シリンジを使用して、５．０ｍＬの滅菌１％ポリソルベート８０再構成溶液を６０ｍＬのｎＰａｃ粉末バイアル（３０６ｍｇのｎＰａｃ粉末を含む）に添加した。
【０３９５】
バイアルを反転させて手で激しく振盪して、バイアルの内部および栓に接着している全ての粒子が湿潤していることを確認した。
【０３９６】
１分間振盪を続け、大きい粒子の塊がないか懸濁液を検査した。
【０３９７】
振盪直後、１８ゲージ以上の滅菌針を有する滅菌シリンジを使用して、１０．３ｍＬの生理食塩水溶液（０．９％注射用塩化ナトリウム溶液）をバイアルに添加し、バイアルをさらに１分間手で振盪した。大きい目に見える塊がないか懸濁液を定期的に検査した。存在する場合、懸濁液が適切に分散するまで手で混合し続けた。
【０３９８】
混合後、懸濁液を少なくとも５分間静置させて、閉じ込められた空気および泡を減少させた。
【０３９９】
ｎＤｏｃｅ懸濁液の場合（最終濃度：生理食塩水溶液中２０ｍｇ／ｍＬのｎＤｏｃｅ、０．２０％ポリソルベート８０、および１．６％エタノール、最終体積：１バイアルあたり５ｍＬ）：
１８ゲージ以上の滅菌針を有する滅菌シリンジを使用して、１ｍＬの滅菌１％ポリソルベート８０／８％エタノール再構成溶液を６０ｍＬのｎＤｏｃｅ粉末バイアル（１００ｍｇのｎＤｏｃｅ粉末を含む）に添加した。
【０４００】
バイアルを反転させて手で激しく振盪して、バイアルの内部および栓に接着している全ての粒子が湿潤していることを確認した。
【０４０１】
１分間振盪を続け、大きい粒子の塊がないか懸濁液を検査した。
【０４０２】
振盪直後、１８ゲージ以上の滅菌針を有する滅菌シリンジを使用して、４ｍＬの生理食塩水溶液（０．９％注射用塩化ナトリウム）をバイアルに添加し、バイアルをさらに１分間手で振盪した。大きい目に見える塊がないか懸濁液を定期的に検査した。存在する場合、懸濁液が適切に分散するまで手で混合し続けた。
【０４０３】
混合後、懸濁液を少なくとも５分間静置させて、閉じ込められた空気および泡を減少させた。
【０４０４】
腫瘍内（ＩＴ）ビヒクル（最終濃度：生理食塩水溶液中０．２％ポリソルベート８０および１．６％エタノール）：各１ｍＬの１％ポリソルベート／８％エタノール再構成溶液を、４ｍＬの生理食塩水溶液（０．９％注射用塩化ナトリウム溶液）で希釈した。
【０４０５】
陽性対照製剤の調製
薬物：ドセタキセル：ＣＡＳ  １１４９７７−２８−５、およびパクリタキセル：ＣＡＳ  ３３０６９−６２−４。純度９７％超。
【０４０６】
ドセタキセル溶液の場合：５０％エタノール：５０％ポリソルベート８０中２０ｍｇ／ｍＬのドセタキセル溶液を作製した。ボルテックスして混合した。生理食塩水溶液を添加して、３ｍｇ／ｍＬのドセタキセル溶液に希釈した。
【０４０７】
パクリタキセル溶液の場合：バルクパクリタキセルを使用して、
５０％エタノール：５０％クレモフォールＥＬ中６ｍｇ／ｍＬの製剤を作製した。必要に応じてボルテックスして混合した。生理食塩水溶液を添加して、３ｍｇ／ｍＬのパクリタキセル溶液に希釈した。ボルテックスして混合する。
【０４０８】
試験システム
種／系統：ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）／Ｒａｇ２−ｉ−、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙバックグラウンドの１１２ｒｇ−ｉ−（ＳＲＧ（登録商標））。
【０４０９】
動物数／およその年齢および体重：６０匹の健常ラット（３０匹の雄および３０匹の雌）をこの研究のために割り当て、異種移植片の成長に使用した。合計少なくとも５４匹の腫瘍を有する動物（２７匹の雄および２７匹の雌）が必要な腫瘍体積に達したため、処理に登録した。これらの動物に、動物が利用可能になるまで、同日にスタガードバッチで７８６−０細胞を接種した。動物は、研究の開始時におよそ５〜７週齢であった。およその重量は、１５０〜２７５ｇであった。腫瘍サイズが１５０〜３００ｍｍ３に達したときに、動物を回転方式で処理群に登録した。
【０４１０】
処理群の組織化、投与量レベル、処理レジメン
以下の表３３は、研究群の取り決めを示す。
【表３４】
2021526354.tif 000037
【０４１１】
処理レジメン：
体積が１５０〜３００ｍｍ３に達した腫瘍を発症した全てのラットを処理に登録した。全ての処理を、腫瘍が１５０ｍｍ３を超える接種７日後に開始する。
【０４１２】
群３、４、および５のラットはｎＰａｃを受け、群７、８、および９のラットはｎＤｏｃｅを受けた。群３および７は、病期分類日（処理の初日）にのみＩＴ注射を受け、群４および８は、病期分類日および処理開始の７日後にＩＴ注射を受け、群５および９は、病期分類日、処理開始の７日後および１４日後にＩＴ注射を受けた。陽性対照試験物品（パクリタキセルおよびドセタキセル）を、病期分類日、群２（パクリタキセル）ラットおよび群６（ドセタキセル）ラットの処理開始の７日後および１４日後に、尾静脈注射により静脈内投与した。ビヒクル対照を、病期分類日、群１の動物の処理開始の７日後および１４日後に、ＩＴ注射により投与した。
【０４１３】
投与方法：
試験物品およびビヒクルを、滅菌針およびシリンジを用いて、投与群に応じてＩＴ注射またはＩＶ注射により投与した。全てのＩＶ注射を、２７Ｇ針を使用して投与した。
【０４１４】
ＩＴ注射を、腫瘍が無傷の場合は６回の注射、潰瘍性腫瘍の場合は３回の注射で腫瘍全体に分布させた。全ての投与日にわたる１腫瘍あたりのＩＴ注射の回数を生データに記録した。
【０４１５】
用量体積は、ビヒクル、ｎＰａｃ、およびｎＤｏｃｅの場合には１ｍＬ／ｋｇであり、パクリタキセルおよびドセタキセルの場合には１．６７ｍＬ／ｋｇであった。群６の場合、ドセタキセルの投与量を２．５ｍＬ／ｋｇに変更し、用量体積を０．８３５ｍＬ／ｋｇに減少させた。用量投与の時点で、用量除去の直前にｎＰａｃおよびｎＤｏｃｅバイアルを優しく５〜１０回反転させて、懸濁液の均一性を確実にした。
【０４１６】
滅菌１８ゲージ＊針またはより大きい穴を有する滅菌シリンジを使用して、バイアルを反転させ、反転させたバイアルのセプタムに針を挿入した。必要な懸濁液を少し超える量を引き出し、バイアルから針を取り外し、所望の体積に調整した。針に再び蓋をした。＊注：ＩＴ注射の場合、投与には２７Ｇ針を使用した。
【０４１７】
ＩＴ注射を腫瘍全体にＺパターンで（上部にわたって、対角線を通って、その後、下部にわたって）投与し、その後の投与機会（複数可）毎に反転させた。注射を、注射後のＴＡの漏れを最小限に抑えるために、針の斜面を下向きにして投与した。また、注射後のＴＡの漏れを最小限に抑えるために、針を入れる前および注射中に皮膚をわずかに引っ張った。ＩＴ注射の投与パターンが全ての動物および投与日で一貫していることを確実にするよう努力した。
【０４１８】
ｎＰａｃを再構成の１時間以内に使用し、ｎＤｏｃｅを再構成の２４時間以内に使用した。陽性対照およびドセタキセルを室温で維持し、製剤化の８時間以内に使用した一方で、パクリタキセルを再構成後に温水中で保持し、２０分以内に使用した。
【０４１９】
観察結果：
個々の体重：接種時から開始して週３回（月曜日、水曜日、金曜日）。
【０４２０】
個々の腫瘍体積：動物を腫瘍接種の翌日から開始して毎日触診した。腫瘍の長さおよび幅をデジタルキャリパーで測定し、腫瘍体積が５０ｍｍ３に達した時点から記録を開始し、この時点で腫瘍を週３回（月曜日、水曜日、金曜日）に測定し、剖検時にも測定した。腫瘍体積（ｍｍ３）を、＝（Ｌ×Ｗ２）／２として計算し、式中、「Ｌ」は、最大直径である。
【０４２１】
腫瘍画像化：全ての腫瘍の写真を、処理開始前の病期分類日、ならびに処理開始の７、１４、２１、２８、３５、および４２日後に撮影した。研究終了前にエンドポイントに達した動物を含む全てのラットの剖検時に、追加の腫瘍写真も撮影した。全ての写真は、動物ＩＤ、研究日、および日付を示す写真タグを付けて、動物を前方から後方の方向に撮影した。
【０４２２】
分析のための血液試料の収集：研究終了時、すなわち、処理開始の５０日後に、２００〜２５０ｕＬの血液を全ての処理動物の尾静脈または頸静脈から収集した。
【０４２３】
予定された剖検：全ての動物は、処理開始の５０日後に剖検が予定されていた。０日目は、腫瘍接種日であった。
【０４２４】
解剖病理学：
肉眼検査：自然死したか、切迫安楽死させたか、または処理開始の５０日後の予定された剖検時に安楽死させた全ての動物に剖検を行った。切迫安楽死させたか、または研究終了時に安楽死させた動物を、ＣＯ２吸入により安楽死させた。剖検は、外側表面、全ての開口部、ならびに内臓を含む胸腔、腹腔、および骨盤腔の検査を含んだ。剖検時に、最終体重および身体状態スコアを収集した。
【０４２５】
組織の収集：原発腫瘍（接種部位）−切除前に最終腫瘍測定を行った。切除後に腫瘍を秤量した。各腫瘍のおよそ１／２（視覚的評価に基づく）をドライアイス上の２−メチルブタンで瞬間凍結させ、可能な場合、腫瘍片が瞬間凍結する前に秤量した。残りを１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。登録体積に達していない動物からも腫瘍を収集した。二次腫瘍−目に見える腫瘍を有するいかなる臓器も収集し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。ホルマリン固定組織を室温で保管した。凍結組織を−８０℃で保管した。全ての組織を最大３ヶ月間保管した。全ての腫瘍、存在する場合、原発腫瘍および二次腫瘍の写真を撮影した。
【０４２６】
顕微鏡検査：１０％ＮＢＦで固定した組織をパラフィン包埋した。各腫瘍を２〜３片に切り分け、包埋し、一緒に切片化した。各腫瘍について、３枚のスライドを調製し、Ｈ＆Ｅで染色した。未処理、ビヒクル対照（ＩＴ）３サイクル、ドセタキセル（ＩＶ）３サイクル、およびｎＤｏｃｅ（ＩＴ）３サイクルに対する雌ラット由来の予備的組織学スライドの顕微鏡写真を、それぞれ、図９１、図９２、図９３、および図９４に示す。
【０４２７】
追加のＨ＆Ｅおよび免疫組織化学的（ＩＨＣ）評価を、ドセタキセル群からの動物由来のホルマリン固定組織で行い、図９５および図９６に示す。
【０４２８】
図９２、図９３、および図９４の顕微鏡写真の組織学の概要。
ビヒクル対照（ＩＴ）３サイクル、図９２：顕微鏡写真は、細胞外マトリックスに囲まれた多核／二核腫瘍細胞の「パケット」を示す。
【０４２９】
ドセタキセル（ＩＶ）３サイクル、図９３：顕微鏡写真は、ビヒクル対照に見られる生存腎細胞癌の形態学的に類似した「パケット」を示す：差異なし。
【０４３０】
ｎＤｏｃｅ（ＩＴ）３サイクル、図９４：顕微鏡写真は、腫瘍細胞に対する強い免疫応答を示す単核細胞の帯を示す。いくつかの死滅腫瘍または死にかけている腫瘍が存在し、細胞「ゴースト」（単核免疫細胞の帯の左側に示される）を特徴とする。単核細胞の帯の右側には、単核免疫細胞の「点在」によって覆われた「ゴースト」がある。
【０４３１】
ドセタキセル群の追加のＨ＆Ｅおよび免疫組織化学的（ＩＨＣ）評価
観察結果：図９５の対照症例。上の行：Ｈ＆Ｅで染色した切片。下の行：免疫組織化学的染色。
列１：（Ａ）多形性核および目に見える核小体を有する大きい腫瘍細胞の、近接して置かれた凝集クラスターおよび索から成る腎細胞癌。散在している小血管を含む最小限の介在間質に留意されたい（左下の破線矢印）。画像の上部にある多核癌細胞に留意されたい（実線矢印）。（Ｄ）Ａに示される同じ腫瘍に行ったケラチン（ＡＥ１／ＡＥ３）免疫染色。これは、パンサイトケラチンによる癌腫細胞の高感度かつ特異的な標識化を示す（実線矢印）。
列２：（Ｂ）均一に均質な不定形好酸球性物質から成る腫瘍細胞壊死の局所領域（破線矢印）。周囲の生存癌細胞からの明確な境界を有するこの病巣の分離の性質に留意されたい（実線矢印）。これは、対照群の壊死の典型的な外観であった。これは、腫瘍の中心領域に存在し、腫瘍面積の５％未満を占めた。（Ｅ）画像Ｂに示される同じ領域を強調するＣＤ６８染色（マクロファージマーカー）。これは、生存癌腫の限られた数のマクロファージ（実線矢印）および壊死の病巣で著しく増加したマクロファージ（破線矢印）を示す。後者の発見は、壊死破片の食作用の特徴的なマクロファージ機能を示す。
列３：（Ｃ）腫瘍周辺の周囲の非腫瘍性間質の限られた数の小リンパ球（破線矢印）。右上角の癌腫に留意されたい（実線矢印）。対照群では、典型的には、腫瘍自体にはリンパ球はほとんど存在せず、腫瘍周辺の軟組織は、概して、軽度のリンパ球浸潤物を含んだ。（Ｆ）リンパ系細胞で陽性の染色を示す、ＣＤ１１ｂで染色したＣで見られるものに対応する病巣（破線矢印）。右上角の癌腫に留意されたい（実線矢印）。
【０４３２】
所見：２つの対照症例は、形態学的および免疫組織化学的レベルで同様の所見を示した。これらのいずれも、別個の十分に形成された線維性被膜なしに、周囲の正常間質組織からの境界が非常に明瞭であった浸潤癌の高密度の結節を含んだ。腫瘍結節内で、癌細胞は、腫瘍細胞の小さい組織化されたクラスターおよび索に配置され、これらは、圧縮された小血管を含む最小量の介在ストーマとともに近接して密集していた（図９５−スライドＡ）。腫瘍細胞は大きく、小胞クロマチンを有する多形性核、ならびに１００倍の倍率（１０倍の接眼レンズおよび１０倍の対物レンズ）ではっきりと見える顕著な好酸球性核小体を有した。核は、円形および紡錘形の形態を含み、散在性多核巨大腫瘍細胞が存在した（図９５−スライドＡ）。腫瘍細胞は、豊富な量の軽度に好酸球性で透明な細胞質を有し、それらは、有糸分裂活性の増加を示した（１０の高倍率視野あたり１３の有糸分裂［４００×ｈｐｆ］）。凝固性腫瘍細胞壊死の散在性離散病巣が存在し、これらは、腫瘍結節の中央部内でより頻繁に見られた（図９５−スライドＢ）。壊死の病巣は、周囲の生存腫瘍細胞からの境界が比較的明瞭であった均質な好酸球性壊死破片からなった。壊死の病巣は、腫瘍細胞面積の５％未満を占めた。パンサイトケラチンの免疫組織化学的染色（ＡＥ１／ＡＥ３）は、腫瘍細胞を強調し、細胞質および膜の局在化を示した（図９５−スライドＤ）。ケラチン標識化は強く、高感度で、かつ特異的であり、陽性に染色された腫瘍細胞と陰性に染色された周囲の非がん性組織との間に非常に明瞭な境界を有した。２匹の対照群動物のうちのいずれにも、明らかな腫瘍退縮は認められなかった。腫瘍内に有意なリンパ球浸潤物はなく、特に、腫瘍組織または周囲の非腫瘍性間質組織には、別個の小リンパ球集団または三次リンパ組織（ＴＬＳ）はなかった。周囲の間質は、主に単一細胞として配置された散在性小リンパ球から成る斑点状の軽度のリンパ球浸潤物を含んだ（図９５−スライドＣ）。ＣＤ１１ｂの免疫組織化学的染色（ＮＫ細胞および組織球のマーカー）は、周囲の非腫瘍性間質内の軽度の免疫細胞浸潤物を強調した（図９５−スライドＦ）が、腫瘍内に有意なリンパ系成分はなかった。ＣＤ６８の免疫組織化学的染色（マクロファージのマーカー）は、腫瘍内および周囲の軽度のマクロファージ浸潤物を強調し、腫瘍壊死の病巣内の染色密度の増加は、細胞破片の増加を含む領域のマクロファージの増加と一致した（図９５−スライドＥ）。
【０４３３】
観察結果：図９６。腫瘍内ｎＤｏｃｅ症例（全ての群からの代表的な画像は１サイクル、２サイクル、および３サイクルを含んだ）。
１行目：ｎＤｏｃｅ  １サイクル（１×）（症例７５０−２５８）。（Ａ）非生存壊死物質の均質な好酸球染色からなる広範囲の地理的腫瘍細胞壊死を示す低倍率Ｈ＆Ｅ染色（実線矢印）。壊死破片および混合免疫細胞の密集帯からなる境界の中央の垂直線に留意されたい（破線矢印）（Ｂ）境界線の高倍率画像。高密度の免疫細胞集団および混合破片に留意されたい（右側の破線矢印）。画像の左側には、生存腫瘍細胞がない広範囲の壊死物質がある（実線矢印）（Ｃ）画像Ａの左半分に対応する壊死の中央部分の高倍率画像。実線矢印は、壊死腫瘍細胞のゴースト輪郭を指す。破線矢印は、変性した小血管を強調する。
２行目：ｎＤｏｃｅ  １サイクル（１×）（症例７５０−２５８）。各画像は、その上のＨ＆Ｅ画像に対応する。（Ｄ）画像Ａに見られる領域のＣＤ１１ｂ免疫染色。これは、壊死破片および免疫細胞浸潤物の中央の帯にある高密度の免疫細胞集団を強調する。この染色はまた、右側の周囲組織における免疫細胞応答を強調するが、左側の腫瘍壊死の中央領域の炎症の程度はより低い。（Ｅ）Ｂに見られる同じ領域を示すケラチン染色。これは、染色の完全な欠如を示し、したがって、この領域に残存する生存可能な癌腫がないという解釈のための強力な免疫組織化学的裏付けを加える。（Ｆ）画像Ｃに示される壊死の中央領域からのケラチン染色。これは、壊死ゴースト細胞の輪郭（実線矢印）の変性ケラチンフィラメントのケラチン標識化を示し、これは、生存癌腫が後に完全退縮および壊死を経験したという仮説を裏付けるが、この領域に生存腫瘍細胞は残っていない（上記のＨ＆Ｅ画像で最もよく分かる生存可能な核の欠如）。
３行目：ｎＤｏｃｅ  ２サイクル（２×）（症例７４８−８２７）。（Ｇ）広範囲の壊死物質（破線矢印）に囲まれた生存癌腫（実線矢印）の０．９ｍｍの残存病巣を示すＨ＆Ｅ染色。（Ｈ）核が保持された生存腫瘍細胞を示す、より高い倍率での癌腫の同じ病巣（実線矢印）。左下角に向かう生存腫瘍細胞の進行性消失に留意されたい（破線矢印）（Ｉ）生存腫瘍の前縁部（実線矢印）および腫瘍細胞死の隣接領域を示す同じ病巣のより高い倍率。ここで、細胞死の進行段階にある腫瘍細胞の残存物は、核の進行性消失および別個の細胞質膜の輪郭の消失（破線矢印）によって証明される。
４行目：ｎＤｏｃｅ  ２サイクル（２×）（症例７４８−８２７）。各画像は、その上のＨ＆Ｅ画像に対応する。（Ｊ）画像の左上に残存生存癌腫の病巣（実線矢印）が存在するケラチン染色の低倍率画像。この病巣を囲んでいるのは、ケラチン染色の欠如（破線矢印）であり、壊死物質の程度を示す。（Ｋ）ケラチン抗体で強く標識された生存有核癌細胞（実線矢印）およびケラチン染色に対して陰性である周囲の壊死組織（破線矢印）を示す、同じケラチン染色腫瘍のより高い倍率の画像。（Ｌ）右上の生存有核ケラチン陽性癌細胞（実線矢印）から左下角に向かう壊死の様々な段階の腫瘍細胞（破線矢印）への進行性移行を示す、同じ領域のケラチン染色。後者は、残存する変性腫瘍細胞ケラチン中間体フィラメントのケラチン標識化を示す腫瘍細胞の無核ゴースト輪郭を含むが、これらの細胞は、生存不能である。これは、生存癌腫を囲む壊死物質が、その後の療法後に死滅した生存癌腫を前に含んでいたという印象を裏付ける。
５行目：ｎＤｏｃｅ  ３サイクル（３×）（症例７４８−８２２）。（Ｍ）壊死破片および混合免疫細胞の帯（破線矢印）によって、左側の変性線維性脂肪組織の周囲領域から区別された右側の高密度の不定形壊死（実線矢印）を示す、低倍率Ｈ＆Ｅ染色切片。（Ｎ）生存有核癌細胞を示さない壊死領域（実線矢印）の高倍率画像。（Ｏ）染色の完全な欠如（実線矢印）を示し、したがって、療法後にこの領域において残存する癌腫がないことをさらに裏付ける、画像Ｎの同じ領域のケラチン染色切片。
【０４３４】
所見：
腫瘍内ｎＤｏｃｅ  １サイクル：
この群の３匹の動物のうち２匹は、残存する生存浸潤癌を含んだ。Ｈ／Ｅ染色スライド上で測定した場合、これは、対照群、ＩＴビヒクル群、およびＩＶドセタキセル群（９〜１５ｍｍの範囲であり、これらの大半は、スライド上の最大断面寸法が１５ｍｍに近い）と比較して、サイズが有意に小さかった（スライド上の最大断面寸法が最大５ｍｍ）。存在する場合、これらの２つのＩＴ  ｎＤｏｃｅ症例における腫瘍細胞の形態は、上記の非ＩＴドセタキセル群で見られたものと本質的に同一であった。両方のＩＴ  ｎＤｏｃｅ症例は、周囲の壊死の評価に十分な非生存腫瘍または非腫瘍性間質を有しなかったが、これらのうちの一方は、提出された組織の５％未満を占めた壊死の病巣辺縁を有した。対照群と同様に、周囲の非腫瘍性間質組織中のこれらの腫瘍に関連する軽度の免疫細胞浸潤のみがあり（評価可能な場合）、これは、ＣＤ１１ｂ免疫染色によって強調された。検査した切片では、三次リンパ構造（ＴＬＳ）は認められなかった。この群の第３の動物は、生存残存浸潤癌および広範囲の地理的腫瘍細胞凝固壊死を示さなかった。壊死の広範囲の領域は、周囲の間質線維、脂肪、および骨格筋組織と混合していた。領域では、不定形壊死と隣接する変性線維脂肪組織との間に境界線があり、これは、壊死破片および混合免疫細胞の密集帯からなった（図９６−スライドＡおよびＢ）。Ｈ／Ｅ染色切片検査では、診断上の生存腫瘍細胞は認められなかった（図９６−スライドＢ）。しかしながら、不定形壊死物質の中央部分には、核壊死性腫瘍細胞のゴースト輪郭が認められる小さい領域があった（図９６−スライドＣ）。これは、ケラチン抗体が壊死細胞の輪郭内の変性ケラチンフィラメントを標識したケラチン染色切片上でも強調された（図９６−スライドＦ）。加えて、変性および壊死性線維脂肪組織中で非常に局所的に、この動物のケラチン染色切片は、変性ケラチン中間体フィラメントの組織球貪食と一致するように見えた局所細胞質標識化を示した。重要なことには、ケラチン染色は、生存癌細胞の別個の細胞質膜標識化を示さず、ケラチン標識された診断上の生存腫瘍細胞のいかなる凝集性集団も示さなかった。いくつかの領域では、異栄養性石灰化を示唆した小さい均質な構造に合体した豊富な顆粒状の青色物質があった。この顆粒状物質を明確に識別することは困難であり、鑑別診断は、顆粒状壊死破片およびカルシウム、変性骨格筋線維およびナノ粒子を含んだ。完全な腫瘍退縮を伴う動物のＣＤ１１ｂの免疫組織化学的染色は、非腫瘍性組織の中程度のマクロファージ浸潤物を強調し、ＣＤ１１ｂ染色は、破片および混合炎症の領域も強調した（図９６−スライドＤ）。ＣＤ６８の免疫組織化学的染色（マルクロファージのマーカー）は、中程度のマクロファージ浸潤物を強調した。３匹の動物のうちのいずれにもＴＬＳは認められなかった。
腫瘍内ｎＤｏｃｅ  ２サイクル：
この群の３匹の動物のうちの２匹（７５０−２５４および７４８−８２７）は、残存生存浸潤癌を含んだ。Ｈ＆Ｅ染色スライド上で測定した場合、これは、対照群、ＩＴビヒクル群、およびＩＶドセタキセル群（９〜１５ｍｍの範囲であり、これらの大半は、スライド上の最大断面寸法が１５ｍｍに近い）と比較して、サイズが有意に小さかった（スライド上の最大断面寸法は、それぞれ、３ｍｍおよび０．９ｍｍであった）。残存癌腫を有する両方のＩＴ  ｎＤｏｃｅ症例において、残存生存浸潤癌の小さい病巣の周囲の広範囲の地理的腫瘍細胞壊死があった（図９６−スライドＧ、Ｈ、およびＩ）。これらの残存腫瘍のうち小さい方からのＨ＆Ｅ染色およびケラチン染色切片のより高倍率の検査は、生存癌細胞から壊死性癌細胞への進行性移行を示し、後者は、パンサイトケラチン免疫染色による残存変性ケラチン中間体フィラメントの標識化によって識別された（図９６−スライドＩおよびＬ）。残存癌腫を有する両方の動物において、ＣＤ１１ｂの免疫組織化学低染色は、壊死組織中の中程度の免疫細胞浸潤物を強調した。ＣＤ６８の免疫組織化学的染色（マクロファージのマーカー）は、両方の症例で壊死領域内の中程度のマクロファージ浸潤物を強調した。この群の第３の症例（７４８−８２６）は、Ｈ＆Ｅまたはケラチン染色切片上に残存生存浸潤癌が存在しない広範囲の地理的腫瘍細胞凝固壊死を示した。ＣＤ１１ｂの免疫組織化学的染色は、斑点状の中程度の免疫細胞浸潤物を強調した。ＣＤ６８の免疫組織化学的染色（マクロファージのマーカー）は、斑点状の中程度のマクロファージ浸潤物を強調した。３匹の動物のうちのいずれにもＴＬＳは認められなかった。
腫瘍内ｎＤｏｃｅ  ３サイクル：
この群の両方の症例（７４８−７９７および７４８−８２２）は、Ｈ＆Ｅまたはケラチン染色切片上に残存生存浸潤癌が存在しない広範囲の地理的腫瘍細胞凝固壊死を示した（図９６−スライドＭ〜Ｏ）。ＣＤ１１ｂの免疫組織化学的染色は、それぞれ、２匹の動物の壊死組織中の中程度のおよび顕著な免疫細胞浸潤物を強調した。ＣＤ６８の免疫組織化学的染色（マクロファージのマーカー）は、それぞれ、これら２つの症例の壊死領域内の軽度のおよび顕著なマクロファージ浸潤物を強調した。これら２匹の動物のうちのいずれにもＴＬＳは認められなかった。
注：ｎＤｏｃｅ処理群の動物は、恐らく腫瘍内に残ったナノ粒子堆積物に起因する白色の「石灰化」領域を伴う腫瘍を有した。
【０４３５】
追加の観察結果：（図面なし）
ＩＴ  ｎＤｏｃｅビヒクル群：２つの腫瘍内ビヒクル症例は、形態学的および免疫組織化学的レベルで同様の所見を示し、これらはいずれも本質的に、対照群で見られるものと同一の形態学的および免疫組織化学的外観を有した。
ＩＶドセタキセル：２つの腫瘍内ＩＶドセタキセル症例は、形態学的および免疫組織化学的レベルで同様の所見を示し、これらはいずれも本質的に、対照およびＩＴビヒクル群で見られるものと同一の形態学的および免疫組織化学的外観を有した。
【０４３６】
パクリタキセル群およびドセタキセル群の腫瘍体積結果：
動物を秤量し、腫瘍の長さよび幅をデジタルキャリパーで５８日間にわたって週３回および剖検時に測定した。腫瘍体積（Ｖ）を以下のように計算した：Ｖ（ｍｍ３）＝（（Ｌ×Ｗ２））／２
式中、Ｌは、最大直径であり、Ｗは、腫瘍の幅（ｍｍ）である。Ｓｔｕｄｙ  Ｌｏｇ（登録商標）を腫瘍体積および体重の統計分析に用いた。
【０４３７】
パクリタキセル群の平均腫瘍体積結果を図９７に示す。ドセタキセル群の平均腫瘍体積結果を図９８に示す。これらの図から分かるように、ＩＴ  ｎＰａｃもＩＴ  ｎＤｏｃｅもいずれも、腫瘍を効果的に処理した。
【０４３８】
ドセタキセル群の腫瘍体積の結果に関して、雄および雌の両方の最初の測定可能な腫瘍が接種の２日後に観察された。
【０４３９】
未処理腫瘍およびビヒクル対照処理腫瘍は、処理中にわたって成長し続け、雌ラットの最終体積は、５６５６ｍｍ３〜１０，０００ｍｍ３未満の範囲であった。ＩＶドセタキセル処理は、ビヒクル対照と比較して部分的な腫瘍成長阻害をもたらした。
【０４４０】
ＩＴ送達したｎＤｏｃｅは、ビヒクルおよび全ての他の処理と比較して最も有効な処理であった。大半の動物において、ＩＴ  ｎＤｏｃｅ  １、２、または３サイクルで処理した腫瘍は、完全に退縮したように見え、壊死組織のみが元の腫瘍部位に残っていた。
【０４４１】
剖検時に、ｎＤｏｃｅ処理群の動物は、恐らく腫瘍内に残ったナノ粒子堆積物に起因する白色の「石灰化」領域を伴う腫瘍を有した。
【０４４２】
ドセタキセル群の結果：
組織中のドセタキセル濃度：内部標準としてその重水素化類似体ドセタキセル−ｄ９を使用したＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によって、ドセタキセルの腫瘍組織濃度を決定した。Ｆｒｏｎｔａｇｅによって以前に開発された方法を使用して、１／×２の重み付けの線形回帰を使用して、ピーク面積比（内部標準に対する分析物）対分析物濃度をプロットすることによって作成された較正曲線からドセタキセルの濃度を得た。腫瘍組織中のドセタキセルについて、公称濃度範囲は、１．００〜２，０００ｎｇ／ｇであった。ラット対照腫瘍組織ホモジネートで作成した較正曲線を、各分析ランの開始時および終了時に分析した。二組の品質管理（ＱＣ）試料を４つの濃度レベル（低、中−１、中−２、および高）で調製し、これらを使用してアッセイの信頼性を確実にした。
【０４４３】
ＩＶドセタキセル（５〜２．５ｍｇ／ｋｇ）の週３回サイクルの最終サイクルの３８日後、評価した４匹の動物のうちの１匹が、２１．８ｎｇ／ｇの検出可能な（ＬＯＱ＝１．００ｎｇ／ｇ）ドセタキセルレベルを有した。ｎＤｏｃｅ  ＱＷＸ１群の３匹全ての動物が、処理の５１日後に６５９ｎｇ／ｇ〜１．４ｘ１０５ｎｇ／ｇの範囲の検出可能なドセタキセルレベルを有した。ｎＤｏｃｅ  ＱＷＸ２群の２匹の動物を評価し、処理の４４日後に２．４９μｇ／ｇおよび５．２６μｇ／ｇのレベルを有した。分析に利用可能な腫瘍がｎＤｏｃｅ  ＱＷＸ３群には存在しなかったため、分析を行わなかった。
【０４４４】
動物：処理期間中にわたって、全ての群の動物は、いくつかの例外を除いて、未処理動物およびビヒクル対照と比較して比較的正常な体重増加を示した。ｎＤｏｃｅ  ＱＷＸ１を受けた１匹の動物の体重が処理９日目に減少した。補給にもかかわらず、この動物の体重は減少し続け、その後、体重減少のエンドポイントに達したため、処理１６日目に安楽死させた。ｎＤｏｃｅ  ＱＷＸ３を受けた１匹の動物の体重が著しく減少し、補給にもかかわらず処理３９日目にエンドポイントに達した。
【０４４５】
他の観察結果は、潰瘍形成および明らかな末梢神経障害を含んだ。ｎＤｏｃｅを受けた全ての動物が、腫瘍表面に潰瘍形成または病変を呈した。これらの病変を、乾燥した硬い組織の領域である「かさぶた」と称した。多くの場合、創傷は無傷のままであった。ｎＤｏｃｅ  ＱＷＸ３を受けた１匹の動物は、処理後３５日目に後肢虚弱および運動制限を示した。介入により、虚弱は、動物が研究に留まるのに十分に安定した。しかしながら、腫瘍表面の５０％超を覆った潰瘍形成のため、その動物を４９日目に安楽死させた。
【０４４６】
６つの群の残存腫瘍のサイズ範囲（スライド上のミリメートルで測定した生存癌腫の最大断面寸法）を表３４に示す。
【表３５】
2021526354.tif 000038
【０４４７】
３つの非ｎＤｏｃｅ群（合計６匹の動物）の残存癌腫結節のサイズを３つのｎＤｏｃｅ群（合計８匹の動物）と直接比較する表３４におけるデータの要約を表３５に示す。
【表３６】
2021526354.tif 000039
【０４４８】
両方のＩＶドセタキセル動物を含む６匹の非ｎＤｏｃｅ動物のうちの５匹が、１０ｍｍ超と測定された残存生存癌腫結節を有し、これらの大半が１５ｍｍ近かった。残りの非ｎＤｏｃｅ動物は、最大寸法９ｍｍと測定された生存癌腫を有した。対照的に、ＩＴ  ｎＤｏｃｅで処理した動物の半分（４／８）は、スライド上に測定すべき残存生存癌腫を有しなかった。残存生存癌腫を有したＩＴ  ｎＤｏｃｅ群の全ての残りの４匹の動物は、スライド上で最大寸法５ｍｍ以下と測定された生存癌腫結節を有した。これは、腫瘍が０．９ｍｍと測定された１つの症例を含み、これは、顕微鏡検査前に腫瘍を肉眼で測定したときに明らかではなかった。
【０４４９】
残存留浸潤癌腫を有しない症例のパーセンテージおよび残存生存癌腫結節のサイズに関する３つのＩＴ  ｎＤｏｃｅ群の比較を表３６に示す。
【表３７】
2021526354.tif 000040
【０４５０】
ｎＤｏｃｅ  １サイクル群およびｎＤｏｃｅ  ２サイクル群の両方が残存生存癌腫を有しない症例を１／３有した一方で、ＩＴ  ｎＤｏｃｅ  ３サイクル群は、残存生存浸潤癌腫を有しない症例を２／２有した。残存生存癌腫を有する症例の中で、ＩＴ  ｎＤｏｃｅのサイクル数の漸進的増加は、残存生存癌腫結節のサイズの減少に関連していた。具体的には、ＩＴ  ｎＤｏｃｅ  １サイクル群およびＩＴ  ｎＤｏｃｅ  ２サイクル群において、残存生存癌腫結節が４ｍｍおよび５ｍｍと測定され、結節が０．９ｍｍおよび３ｍｍと測定された。ＩＴ  ｎＤｏｃｅ  ３サイクル群では、２つの症例には測定すべき残存生存癌腫は存在しなかった。
【０４５１】
壊死を示す組織のパーセンテージを表３７に示す。
【表３８】
2021526354.tif 000041
【０４５２】
非ｎＤｏｃｅ群の６匹全ての動物が５％未満の壊死を示した。これは、腫瘍領域の５％未満を占める小さい腫瘍内の壊死の局所的な小さい個別の病巣からなり、それらは、腫瘍結節の中央部分内にあり、これらが、腫瘍がその血液供給より大きくなることによる低酸素血症に続発する可能性があることを示唆する。８匹のｎＤｏｃｅ動物のうちの４匹が、腫瘍の完全壊死を示した。残存癌腫を有する４匹のｎＤｏｃｅ動物のうちの２匹が、周辺組織で広範囲の壊死（組織の５０％超）を示した。＊残存癌腫を有する２匹の残りのｎＤｏｃｅ動物は、壊死の決定的な評価に十分な周囲組織を有しなかったが、これらのうちの１匹は、提出された組織領域の５％超を表す壊死の病巣縁を含んだ。
【０４５３】
半定量的に等級付けした、Ｈ／Ｅの評価およびＣＤ１１ｂによる免疫組織化学的染色に基づいたリンパ組織球性浸潤物密度を表３８に示す。
【表３９】
2021526354.tif 000042
【０４５４】
非ｎＤｏｃｅ群の６匹全ての動物が軽度の免疫細胞浸潤物を含み、これは、腫瘍内にいかなる有意な免疫細胞浸潤物もない腫瘍周辺の非腫瘍性間質に存在していた。対照的に、ｎＤｏｃｅ群の８匹の動物のうちの７匹が、中程度の免疫細胞浸潤物を含んだ一方で、残りの動物は、顕著な免疫細胞浸潤物を有した。これは、ＩＴ  ｎＤｏｃｅ処理動物における壊死量の増加と相関した。
【０４５５】
ドセタキセル群の結果の考察：
腫瘍内ｎＤｏｃｅの有効性の評価を目的とした腎細胞癌研究からの１４匹の雌ラットのサブセットの形態学的および免疫組織化学的特徴についてのレビューを行った（研究全体は、３０匹の動物を含んだ）。１４匹の動物のこのサブセットは、２匹の対照動物、腫瘍内ビヒクルを投与した２匹の動物、静脈内ドセタキセル（３サイクル）で処理した２匹の動物、および腫瘍内ｎＤｏｃｅで処理した８匹の動物を含んだ。ｎＤｏｃｅ群を、投与したサイクル数に基づいて３つの群：群１（１サイクル、３匹の動物）、群２（２サイクル、３匹の動物）、および群３（３サイクル、２匹の動物）に分けた。
【０４５６】
様々な群間で異なった主な特徴は、腫瘍退縮の存在および程度であった。腫瘍内ｎＤｏｃｅ群の全ての動物において、腫瘍退縮が顕著であったが、他の群の全ての動物において、腫瘍退縮はなかった。
【０４５７】
非ｎＤｏｃｅ群（すなわち、対照群、ＩＴビヒクル群、およびＩＶドセタキセル群）の６匹全ての動物が残存生存腫瘍を有した。これは、周囲の正常間質組織からの境界が非常に明瞭であった浸潤癌の高密度の結節からなった。癌細胞は、高密度に密集しており、凝固性腫瘍細胞壊死の散在する別個の病巣が存在していたが、これらはサイズが小さく、全体で、６匹の動物の各々の腫瘍面積の５％未満を占め、腫瘍結節の中央部分内にあった。これらの観察結果は、これらの壊死領域が、腫瘍がその血液供給より大きくなることによる低酸素血症に続発する可能性があることを示唆する（表３７）。ケラチン染色は、腫瘍細胞の強く、高感度で、かつ特異的な染色を示した。染色スライド上で測定した生存腫瘍結節の最大寸法は、これら６匹の動物において９〜１５ｍｍの範囲であり、多くの場合、これは１５ｍｍに近かった（表２７および表２８）。スライド上のこの腫瘍のサイズは、肉眼解剖時に取った腫瘍測定値に対応した。
【０４５８】
対照的に、腫瘍内ｎＤｏｃｅで処理した８匹の動物のうちの４匹は、Ｈ＆Ｅおよびケラチン染色切片の評価によって決定される残存生存癌腫を有しなかった（完全応答）。残りの４匹の動物のうち、染色スライド上で測定した残存生存腫瘍は、非ｎＤｏｃｅ群に見られるものよりも著しく小さかった（表３４および表３５）。具体的には、ＩＴ  ｎＤｏｃｅで処理したこれらの４匹の動物の残存生存腫瘍結節のサイズは、最大寸法が０．９ｍｍ〜５ｍｍの範囲であった（表３６）。これらの動物のうちの３匹では、スライド上で測定した腫瘍サイズは、肉眼解剖時に取った腫瘍サイズ測定値と相関した。浸潤癌の０．９ｍｍの病巣を有する残りの動物では、これは、広範囲の壊死の間で存在し、肉眼解剖時には明らかではなかった。
【０４５９】
８匹のｎＤｏｃｅ動物のうちの６匹では、いくつかの動物において隣接する壊死骨格筋および線維組織に広がる広範囲の腫瘍細胞凝固壊死があった。加えて、壊死領域内に局所的に、死滅腫瘍細胞からの変性ケラチン中間体フィラメントの標識化と一致した、壊死性非生存ゴースト腫瘍細胞の輪郭のケラチン染色があった。これは、これらの領域が、療法に完全に応答していた生存癌腫を以前に含んでいたことをさらに裏付けた。残りの２匹の動物からスライドでは、壊死の評価のための周囲組織が非常に限られていたが、これらのうちの１つは、１つの領域内に壊死の病巣辺縁を含んでいた。
【０４６０】
非ｎＤｏｃｅ群では、均一に軽度の免疫細胞浸潤物があり、これは、主に腫瘍の周囲の非腫瘍性組織で見られた。有意な腫瘍内免疫細胞浸潤物はなかった。対照的に、腫瘍内ｎＤｏｃｅ群は、軽度の免疫細胞浸潤物を有する２つの症例、中程度の免疫細胞浸潤物を有する５つの症例、および壊死領域内に顕著な免疫細胞浸潤物を有する単一の症例を含んだ（表３８）。非ｎＤｏｃｅ群と同様に、有意な腫瘍内リンパ系浸潤はなかった。この研究群の１４匹の動物のうちのいずれにも、診断上の三次リンパ構造（ＴＬＳ）は見られなかった。
【０４６１】
要約すると、このレビューは、３０匹の雌の動物を含んだ研究のうちの１４匹の雌の動物に限定されたが、腫瘍内ｎＤｏｃｅ群を非ｎＤｏｃｅ群と比較したときに、療法に対する腫瘍応答のタイプおよび程度に顕著な差が認められた。６匹の非ｎＤｏｃｅ群動物のいずれも、腫瘍退縮の明らかな兆候を示さず、全て、スライド上で測定したときに９〜１５ｍｍのサイズの範囲の残存生存癌結節を有した。しかしながら、腫瘍内ｎＤｏｃｅ群の８匹全ての動物が腫瘍応答の兆候を示し、評価するのに十分な周囲組織を有した動物のうちの６匹全てに広範囲の壊死が認められた。腫瘍応答が、Ｈ＆Ｅおよびケラチン染色切片の検査で決定的な残存生存癌腫の欠如によって示される、この群の半分（４／８）に完全退縮を含んだ一方で、残りの４匹の動物は、局所的な小さい残存生存癌結節を含み、その最大は５ｍｍあり、その最小は０．９ｍｍあった。残存癌腫を有するこれらの４匹の動物のうちの２匹において、スライド上に評価するのに十分な周囲組織が存在し、これは、広範囲の壊死を示した。同様に、非ｎＤｏｃｅ群における免疫細胞浸潤物の程度が軽度であった一方で、ｎＤｏｃｅ群では軽度から顕著の範囲であり、腫瘍応答および結果として得られた壊死破片の程度との関連を示唆する。
【０４６２】
３つのＩＴ  ｎＤｏｃｅ群を互いに比較したときに、動物が増加するサイクル数の腫瘍内ｎＤｏｃｅ療法を受けた場合、より大きい程度の腫瘍応答を示したことが認められた。具体的には、ＩＴ  ｎＤｏｃｅ  １サイクルを受けた群の３匹のうち、３匹の動物のうちの１匹が完全応答を示した一方で、残りの２匹の動物は、４ｍｍおよび５ｍｍと測定された残存結節を有した。ＩＴ  ｎＤｏｃｅ  ２サイクルを受けた群の３匹のうち、１匹が完全応答を示した一方で、残りの２匹の動物は、０．９ｍｍおよび３ｍｍと測定された残存結節を有した。最後に、ＩＴ  ｎＤｏｃｅ  ３サイクルを受けた群の両方の動物が、療法に対する完全応答を示した（評価した２匹のうちの２匹）（表３６）。
【０４６３】
結論として、腫瘍内ｎＤｏｃｅで処処理したこの研究の腎細胞癌を有する８匹全ての動物が、完全腫瘍退縮の５０％の割合、ならびに残りの４匹の動物における残存腫瘍サイズの著しい減少を含む顕著な組織学的応答を示した。関連する広範囲の壊死および免疫応答の増加が、ｎＤｏｃｅ群において顕著であり、壊死領域における無核の非生存ゴースト腫瘍細胞の輪郭のケラチン標識化の病変領域は、これらの領域が、療法に完全に応答していた生存癌腫を以前に含んでいたことをさらに裏付けた。対照的に、非ｎＤｏｃｅ処理群では、かかる腫瘍退縮はなかった。さらに、１サイクルから３サイクルへの腫瘍内ｎＤｏｃｅの増加するサイクル数は、ＩＴ  ｎＤｏｃｅコホート内の漸進的に大きくなる腫瘍退縮の程度、および漸進的に高くなる完全退縮の割合をもたらした。
【０４６４】
実施例９−マウスにおけるｎＰａｃ、ｎＤｏｃｅ、およびＴａｘｏｌ（登録商標）の薬物動態比較研究
マウスにおける薬物動態研究を行い、これらの粒子の懸濁液の腹膜腔内への注射後のパクリタキセルまたはドセタキセルの持続放出を提供するよう意図された特有のサブミクロン粒子からのパクリタキセルおよびドセタキセルの放出速度を評価した。腹水に放出された薬物の量を、市販のパクリタキセル溶液製剤（ジェネリックＴａｘｏｌ（登録商標））と比較した。
【０４６５】
ｎＰａｃ（およそ９８％パクリタキセルであり、０．８７８ミクロンの平均粒径（数）、２６．７ｍ２／ｇのＳＳＡ、および０．０７６３ｇ／ｃｍ３のかさ密度（タップなし）を有するパクリタキセル粒子を本実施例で使用した）およびｎＤｏｃｅ（およそ９９％ドセタキセルであり、０．９２１ミクロンの平均粒径（数）、２３．９ｍ２／ｇのＳＳＡ、および０．０９９１ｇ／ｃｍ３のかさ密度（タップなし）を有するドセタキセル粒子を本実施例で使用した）を、これらの溶液を超臨界二酸化炭素に注入したときにアセトン中に溶解したパクリタキセルまたはエタノール中に溶解したドセタキセルからの超臨界沈殿によって調製した。音響エネルギーを使用した激しい混合により、有機溶媒が非常に迅速に除去され、非常に高い比表面積を有した純粋パクリタキセルまたは純粋ドセタキセルの特有のサブミクロン粒子のフラッシュ沈殿がもたらされた。これらの粒子の増強された比表面積および特有の特性を使用して、それらを腹水に注入するときにこれらの粒子からの薬物放出の速度を調整した。
【０４６６】
パクリタキセル粒子またはドセタキセル粒子の投与懸濁液を２ｍｇ／ｍＬで調製し、雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射により３６ｍｇ／Ｋｇで投与した。同様に、２ｍｇ／ｍＬのパクリタキセル溶液（ジェネリックＴａｘｏｌ（登録商標））を雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射により３６ｍｇ／Ｋｇで投与した。パクリタキセル粒子またはドセタキセル粒子を投与したマウスについて、腹水および血液試料を１８の収集時点の各々で３匹のマウスから収集した。血液試料を心穿刺によるイソフルラン麻酔下で収集した。腹水試料を、マウスの腹腔を開いて腹膜腔を露出させることによって収集した。収集時点は、ゼロ時点、３時間、６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日、４２日、４９日、５６日、７０日、および８４日であった。
【０４６７】
ジェネリックＴａｘｏｌ（登録商標）を投与した雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、試料収集時間を短縮したことを除いて全く同じ方法で処理した。ジェネリックＴａｘｏｌ（登録商標）で処理したマウスの血液および腹水試料を、ゼロ、３時間、６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、７日、および１４日時点で収集した。
【０４６８】
血漿および腹水試料の全てを、検証されたＬＣＭＳＭＳ試験方法を使用してアッセイした。これらの研究の結果は、図９９、図１００、図１０１、および図１０２に含まれている。注：図１０１および図１０２は、３６ｍｇ／ｋｇのＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）ＩＰ投与も含む。
【０４６９】
実施例１０−マウスにおけるＲｅｎｃａ−ｅ２３７同系異種移植片研究
本研究の目的は、完全に無傷の免疫系を有する雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して、一次および二次腫瘍接種を伴うＲｅｎｃａ同系腎臓癌モデルにおけるｎＤｏｃｅ（ナノ粒子ドセタキセル）の腫瘍内用量投与を評価することであった。追加のマウス群を使用して、原発腫瘍の部位から遠く離れて移植した二次腫瘍に影響を及ぼすｎＤｏｃｅの能力を、ビヒクルまたはＩＶドセタキセルでの処理と比較した。表３９のスケジュールに従った。
【表４０】
2021526354.tif 000043
【０４７０】
Ｒｅｎｃａは、腎皮質腺癌として自然発生したマウス腫瘍に由来する細胞株である。Ｒｅｎｃａ腫瘍の成長パターンは、ヒト成人腎細胞癌腫の成長パターンを正確に模倣する。
【０４７１】
本研究は以下の群からなった。
群１：処理なし
群２：ＩＴ  ビヒクル（対照群）
群３：ＩＶ  ドセタキセル
群４：ＩＴ／ＰＴ  ｎＤｏｃｅ（ｎＤｏｃｅ−１）３０ｍｇ／ｋｇ（半用量を腫瘍内（ＩＴ）／半用量を腫瘍周辺（ＰＴ））
群５：ＩＴ  ｎＤｏｃｅ（ｎＤｏｃｅ−１）３０ｍｇ／ｋｇ（全用量を腫瘍内）
群６：ＩＴ／ＰＴ  ｎＤｏｃｅ（ｎＤｏｃｅ−２）６０ｍｇ／ｋｇ（半用量を腫瘍内／半用量を腫瘍周辺）
群７：ＩＴ  ｎＤｏｃｅ（ｎ−Ｄｏｃｅ−２）６０ｍｇ／ｋｇ（全用量を腫瘍内）
群８：ＩＴ  ビヒクル／５×１０５  Ｒｅｎｃａ細胞、１５日目
群９：ＩＶ  ドセタキセル／５×１０５  Ｒｅｎｃａ細胞、１５日目
群１０：ＩＴ  ｎＤｏｃｅ（ｎＤｏｃｅ−１）３０ｍｇ／ｋｇ／５×１０５  Ｒｅｎｃａ細胞、１５日目
【０４７２】
全ての処理を同じ日に開始した。ＩＴビヒクルおよびｎＤｏｃｅを３週サイクルで投与した。ＩＶドセタキセルを１日目（１０ｍｇ／ｋｇ）および１１日目（５ｍｇ／ｋｇ）に投与した（全身毒性のため投与スケジュールを修正した）。
【０４７３】
材料および投与：
「ドセタキセル」＝７．５％エタノール中ドセタキセル：生理食塩水溶液中７．５％ポリソルベート８０（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）注射）
ｎＤｏｃｅ粉末＝ナノ粒子ドセタキセル粉末（およそ９９％ドセタキセル、１．０７８ミクロンの平均粒径（数）、３７．２ｍ２／ｇのＳＳＡ、および０．０７２３ｇ／ｃｍ３のかさ密度（タップなし））。
ｎＤｏｃｅ−１＝０．１１％ポリソルベート８０中１１ｍｇ／ｍＬのｎＤｏｃｅ粉末：生理食塩水溶液中０．８８％エタノールの懸濁液
ｎＤｏｃｅ−２＝０．２２％ポリソルベート８０中２２ｍｇ／ｍＬのｎＤｏｃｅ粉末：生理食塩水溶液中１．７６％エタノールの懸濁液
ビヒクル＝０．２２％ポリソルベート８０、生理食塩水溶液中１．７６％エタノール
ドセタキセルの投与＝１０ｍＬ／ｋｇ（０．２００ｍＬ／２０ｇマウス）、体重に応じて体積を調整する。
ビヒクルの投与＝０．０５ｍＬ／マウス、体重に応じて体積を調整しない。
ｎＤｏｃｅ−１の投与＝０．０５ｍＬ／マウス、体重に応じて体積を調整し、１８ｇの動物に基づいて３０ｍｇ／ｋｇとする。
ｎＤｏｃｅ−２の投与＝０．０５ｍＬ／マウス、体重に応じて体積を調整せず、１８ｇの動物に基づいて６０ｍｇ／ｋｇとする。
手順：２２２匹のＣＲ雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの側腹部に０％マトリゲル中５×１０５  Ｒｅｎｃａ腫瘍細胞を皮下（ＳＣ）注射した。細胞注射体積：０．１ｍＬ／マウス。開始時の年齢：８〜１２週齢。腫瘍が平均サイズ４０〜６０ｍｍ３に達したときにペアマッチを行い。処理を開始した。群８〜１０では、反対側（左）の側腹部への第２の細胞注射を処理開始後１５日目に行った。体重：５／２、その後、終了まで週２回。キャリパー測定：終了まで週２回。二重キャリパー測定を群８〜１０に行った。３０％超の体重減少が１回観察されたか、または２５％超の体重減少が３回連続測定された個々の動物を安楽死させた。２０％超の平均体重減少または１０％超の死亡率を有する群への投与を中止した。この群は安楽死させず、回復させた。２０％超の体重減少を有する群内で、個々の体重減少エンドポイントに達した個体を安楽死させた。群処理関連体重減少が元の体重の１０％以内に回復した場合、投与をより低い容量またはより少ない頻度の投与スケジュールで再開した。未処理体重％回復の例外をケースバイケースで許可した。
【０４７４】
エンドポイント：群１〜７：エンドポイントＴＧＩ。動物を１つの群として監視した。本実験のエンドポイントは、対照群の平均腫瘍重量２０００ｍｍ３、または４５日、または動物が安楽死基準（体重、腫瘍サイズ、または潰瘍形成）に達した時点のいずれかが先に起こったときであった。エンドポイントに達したときに、全ての動物を安楽死させた。腫瘍体積および重量を３４日目まで収集し、この時点で、未処理群、ビヒクル対照群、およびＩＶドセタキセル群の平均腫瘍体積は２０００ｍｍ３超であった。群１、２、３、４、および６の全ての動物を３４日目に屠殺し、末梢血および腫瘍組織をフローサイトメトリーおよび組織病理学のために収集した。群５および７の動物を４６日目まで研究に残し、ＩＴ  ｎＤｏｃｅ処理における腫瘍進行を追跡した。
エンドポイント：群８〜１０：本実験のエンドポイントは、総腫瘍重量２０００ｍｍ３、または処理開始の４５日後、または動物が安楽死基準（体重、腫瘍サイズ、または潰瘍形成）に達した時点のいずれかが先に起こったときであった。エンドポイントに達したときに、全ての動物を安楽死させた。注：腫瘍体積が２０００ｍｍ３超に達したため、ビヒクル動物およびＩＶドセタキセル動物を３４〜３６日目に屠殺した。
【０４７５】
サンプリング指示：時点：エンドポイント時点。
【０４７６】
動物：群２〜７：全ての動物（対照群の腫瘍重量が２０００ｍｍ３に達したとき）。群８〜１０：全ての動物（対照群８の総腫瘍重量が２０００ｍｍ３に達したとき）。
【０４７７】
血液収集：イソフルラン麻酔下で末端心穿刺により全体積の血液を収集した。血液を全血に処理、抗凝血剤：Ｋ２ＥＤＴＡ、保存：４℃で冷却、出荷条件：４℃（湿潤氷）。フローサイトメトリーのためにＣＲＬ−ＮＣで保持した。以下の表４０のフローパネルを参照されたい。
【０４７８】
臓器収集：腫瘍（２つのパートに分ける）。パート１：保存：２４時間ホルマリン、その後、７０％ＥｔＯＨに移す、出荷条件：室温。ＩＨＣ染色のために実験室に送った。パート２：保存：単一細胞懸濁液に処理、出荷条件：４℃（湿潤氷）。フローサイトメトリーのためにＣＲＬ−ＮＣで保持した。以下の表４０のフローパネルを参照されたい。群２〜１０の早期安楽死のための腫瘍保存：腫瘍および乳房脂肪体領域（頭側）から腫瘍（尾側）直後までの周囲領域を切除した。この領域には鼠径リンパ節が含まれていた。この試料を頭側端から尾側端まで４ｍｍ毎に切片化し、順にラベル付けした別個のカセットに入れた。
【０４７９】
末梢血および腫瘍組織をフローサイトメトリーによる分析のために収集した。分析した細胞型には、Ｔ細胞：ＣＤ４＋、ＣＤ８＋（腫瘍抑制）；Ｔｒｅｇ（腫瘍促進）；Ｍ１マクロファージ（腫瘍抑制）；Ｍ２マクロファージ（腫瘍促進）；およびＭ２マクロファージ（腫瘍促進）が含まれた。フローパネルを以下の表４０に示す。
【表４１】
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【０４８０】
結果：
群１〜７の腫瘍体積結果を図１０３および図１０４に示す。ビヒクルと比較してＩＶドセタキセルでの腫瘍体積の差は見られなかった。ＩＴ  ｎＤｏｃｅ処理は、ビヒクルおよびＩＶドセタキセルと比較して有意に低い腫瘍体積をもたらした。ｎＤｏｃｅ用量間（３０ｍｇ／ｋｇ対６０ｍｇ／ｋｇ）または投与間（腫瘍内対腫瘍内／腫瘍周辺）の差は見られなかった。ｎＤｏｃｅでは、腫瘍体積減少は研究終了時（４６日目）まで維持され、これは、ｎＤｏｃｅデポーが最終投与後２０日を超えて腫瘍体積の減少を持続させたことを示す。
【０４８１】
移植後１２〜２０日（＋／−１）日目の群８〜１０の平均腫瘍体積結果を図１０５に示す。この図から分かるように、未処理二次腫瘍は、ビヒクルまたはＩＶドセタキセルで処理した原発腫瘍よりも低い初期成長速度を有し、ＩＴ  ｎＤｏｃｅで処理した原発腫瘍と同様の速度を有する。したがって、原発腫瘍へのＩＴ  ｎＤｏｃｅ投与は、未処理二次腫瘍の成長速度を低下させる。
【０４８２】
様々な群および個々の動物の血液のフローサイトメトリー結果を以下の表４１に要約する。様々な群および個々の動物の腫瘍組織のフローサイトメトリー結果を以下の表４２に要約する。
【表４２−１】
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【表４２−２】
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【表４２−３】
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【表４２−４】
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【表４２−５】
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【表４２−６】
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【表４２−７】
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【表４３−１】
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【表４３−２】
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【表４３−３】
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【表４３−４】
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【表４３−５】
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【表４３−６】
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【表４３−７】
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【０４８３】
表４１（血液のフローサイトメトリー結果）から、ＣＤ４５＋細胞は、全生細胞集団の約９０％〜約９９％を構成する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、全免疫細胞集団の約４％〜約１５％を構成する。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、全免疫細胞集団の約３％〜約１０％を構成する。
【０４８４】
表４２（腫瘍組織のフローサイトメトリー結果）から、ＣＤ４５＋細胞は、全生細胞集団の約６０％〜約９０％を構成する。Ｍ１マクロファージは、全免疫細胞集団の約２０％〜約４０％を構成する。
【０４８５】
血液中の免疫細胞集団の分析を図１０６〜１１２に示す。これらの図から分かるように、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な増加、ならびにＭＤＳＣの減少傾向が、ＩＴ  ｎＤｏｃｅ処理で示される。
【０４８６】
結論として、これらのデータは、図１０５に示されるように未処理二次Ｒｅｎｃａ腫瘍の成長速度が低下したため、原発Ｒｅｎｃａ腫瘍へのＩＴ  ｎＤｏｃｅの投与後にインビボで産生された免疫細胞が、Ｒｅｎｃａ腫瘍に特異的な腫瘍特異的免疫細胞であることを示す。逆に、図１０５に示されるように、対照用量およびＩＶドセタキセル用量が二次Ｒｅｎｃａ腫瘍の成長速度を低下させなかったため、以前に存在していた可能性があるか、または対照用量およびＩＶドセタキセル用量の投与後にインビボで産生されたいずれの免疫細胞もＲｅｎｃａ腫瘍に腫瘍特異的ではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2021526354.tif 000073
【図１５】
2021526354.tif 000074
【図１６】
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【図１７】
2021526354.tif 000076
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2021526354.tif 000079
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１２】
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【国際調査報告】
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