(57)【要約】  本開示は、乳がんを有する対象において免疫応答を誘導するための乳管内送達方法及び組成物に関する。乳管内投与された組成物は、抗原提示細胞のインサイツ成熟及び成熟抗原提示細胞のリンパ節への遊走を誘導することができる1つ又は複数の生物活性剤を含む。乳管内送達方法及び組成物は、エフェクター免疫細胞の活性化を誘導し、腫瘍細胞死を増強する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の母乳管に、1つ又は複数の生物活性剤を含む有効量の組成物を乳管内投与することを含む、対象において免疫応答を誘導する方法であって、組成物が抗原提示細胞のインサイツ成熟を誘導する、方法。
【請求項２】
組成物に含まれる1つ又は複数の生物活性剤が、TLRアゴニスト(例えば、TLR3アゴニスト(例えばポリ(I:C)、ポリアデノシン-ポリウリジル酸(ポリAU)アンプリゲン(ポリI:ポリC(12)U)及びポリ-L-リジン及びカルボキシメチルセルロースで安定化されたポリイノシン酸-ポリシチジル酸(ポリICLC));TLR4アゴニスト(グルカノピノシルリポイドA(G100)、GSK1795091、モノホスホリル脂質A(MPL)及びMPLベースのアゴニスト、例えばアミノアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)、リポ多糖(LPS)、及びオピオイド、例えばメタドン、モルフィン-3-グルクロニド等);TLR7及びTLR8アゴニスト、例えばイミダゾキノリン(イミキモド及びレシキモド(R848));(PF-3512676等のCpG-ODN)等のTLR9アゴニスト、HMGB1等のDAMP、サイトカイン(TNFα、IFNγ等、IFNα又はIFNβ等のI型IFN、IL-1β、IL-2、IL-12等)、ケモカイン(IL-1β、CCL2、又はCCL19等のCCR7リガンド、CCL21等)、並びに成長因子、miR-155等のmi-RNA、共刺激分子アゴニスト(CD-40アゴニスト等(例えば、RO7009789、APX005M、CP-870,893、ABBV-927等の抗CD40抗体)、OX-40アゴニスト(例えば、抗OX-40抗体MOXR0916、PF-04518600、MEDI0562、MEDI6469、及びMEDI6383)、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン等のシクロデキストリン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるタイプ1分極化剤である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
組成物が、対象における抗原提示細胞のリンパ節への遊走を誘導する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
免疫応答が、エフェクターT細胞、エフェクターNK細胞、エフェクターB細胞、又はそれらの組み合わせの活性化を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
免疫応答が、抗腫瘍T細胞エフェクター応答、NK細胞エフェクター応答、又はB細胞抗腫瘍エフェクター応答、又はそれらの組み合わせを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
エフェクターT細胞が、細胞傷害性CD8+ T細胞、CD4+ Th1細胞、メモリーT細胞、Tfh細胞、又はそれらの組み合わせを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
免疫応答が免疫抑制の減少を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
対象の腫瘍サイズが減少する、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
組成物が、サイトカイン及びケモカイン、(例えばIL-1β、MCP-1、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、C1q、CCL1(CCR1リガンド)、CCL2(CCR2リガンド)、CCL5(CCR5リガンド)、CCL20(CCR6リガンド)、CXCL3(CXCR3リガンド)、CXCL4(CXCR4リガンド)及びCXCL1(CXCR1リガンド))、HMGB1等のDAMP、及びTLRアゴニスト(例えばTLR3アゴニスト(ポリ(I:C)、ポリアデノシン-ポリウリジル酸(ポリAU)アンプリゲン(ポリI:ポリC(12)U及びポリ-L-リジン及びカルボキシメチルセルロースで安定化されたポリイノシン酸-ポリシチジル酸(ポリICLC)等)、TLR4アゴニスト、例えばグルカノピノシルリポイドA(G100)、GSK1795091、モノホスホリル脂質A(MPL)及びMPLベースのアゴニスト、例えばアミノアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)、リポ多糖(LPS)、及びオピオイド、例えばメタドン、モルフィン-3-グルクロニド)、TLR7アゴニスト及びTLR8アゴニスト、例えばイミダゾキノリン(イミキモド及びレシキモド(R848));(CpG-ODN、例えばPF-3512676等)等のTLR9アゴニストからなる群から選択される対象の乳管又は乳房組織へのインバウンド抗原提示細胞の動員を誘導することができる有効量の生物活性剤を更に含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
インバウンド抗原提示細胞の動員を誘導することができるタイプ1分極化剤又は生物活性剤又はその両方が、TLR3アゴニスト、TLR4アゴニスト、TLR7アゴニスト、TLR8アゴニスト又はTLR9アゴニストである、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
組成物が、フェンレチニド(4-ヒドロキシ(フェニル)レチナミド、4-HPR);IL-12; IFNγ、miR127、miR155、及びmiR223、フェルモキシトール、以下の阻害剤:CSF-1、CSF-1R、IL-10、IL-10R、TGFβ、アルギナーゼ1(Arg1)、M2マクロファージスカベンジャー受容体(A、B、MARCO等)、ヒストンデアセチラーゼ(HDACi)、DICER、IRF4/STAT4/STAT6シグナル伝達経路;IL-4、IL-13、IL-17、PPARγ、KLF4、KLF6、miRNA-146ファミリーメンバー(miRNA-146a)等、let7ファミリーメンバー(let-7c等)、miRNA-9、miRNA-21、miRNA-47、miRNA-187、CCR-CCl2軸シグナル伝達、CCL2/MCP-1、胎盤成長因子(PlGF)(HRG)及びC/EBPβ(PI3Kγ欠失)、AMPKα1(メトホルミン)、p50-p50 NFκB、NADPHオキシダーゼ(NOX)(NOX 1及びNOX 2)例えばGKT137831、Rbpj、Notchシグナル伝達経路;CD40及びCD40Lの活性化因子/アゴニスト、IRF1、IRF5、STAT1(IFNγ、バジメザン(DMXAA)等)及びSTAT3、核因子カッパB活性化因子、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8及びTLR9のトール様受容体(TLR)アゴニスト例えばイミキモド、合成非メチル化シトシン-グアニン(CpG)オリゴデオキシヌクレオチド(CpG-ODN)、(ポリI:C)、C792、レフィトリモド(MGN1703)、SD-101 (Dynavax社)、SD-101、IMO-2125; p65-p50 NFκB、MyD88、miR127、miR155、及びmiR223、又はそれらの組み合わせからなる群から選択されるM2-DCをタイプ-1分極化DC(DC1)に再分極化させることができる有効量の再分極化剤を更に含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
組成物が、DCからマクロファージへのシフトを低減又は阻害することができる有効量の遮断薬を更に含み、遮断薬が、CSF-1阻害剤、CSF-1R阻害剤、MCP-1阻害剤、IL-4阻害剤(パスコリズマブ、ピタキンラ及びデュピルマブ等)、IL-10阻害剤、IL-13阻害剤(アンルキンズマブ、レブリキズナブ及びトラロキヌマブ等)、デュピルマブ等のIL-4/IL-13二重阻害剤、プロスタノイド阻害剤(PGE3の阻害剤等)、STAT3阻害剤(ソラフェニブ、スニチニブ、WP1066及びレスベラトロール等)、並びにSTAT6阻害剤(フェンレチニド(4-HPR)、レフルノミド、TMX264及びAS1217499等)、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
抗ホルモン剤(例えば、抗エストロゲン又は抗エストロゲン受容体、例えばタモキシフェン、シス-タモキシフェン、エンドキシフェン、デスメチルタモキシフェン、ラソフォキシフェン、ラロキシフェン、ベンゾチオフェン、バゼドフォキシフェン、アルゾキシフェン、ミプロキシフェン、レボルメロキシフェン、ドロロキシフェン、クロミフェン、イドキシフェン、トレミフェン、EM652及びERA-923、フルベストラント、ARN-810、又はCH498、アナストロゾール、エクセメスタン及びレトロゾール)、ステロイド剤、アントラサイクリン系薬剤、甲状腺ホルモン補充剤、細胞傷害性薬、例えばアルキル化剤(テモゾロミド及びシクロホスファミド等)、アントラサイクリン系薬剤(ドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン等)、ミトキサントロン等のアントラセンジオン類、プラチナ系薬剤(シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、オルマプラチン、エンロプラチン等)、タキサン系薬剤(パクリタキセル等)、抗有糸分裂薬、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、パツピロン、カルレティキュリン、広範囲の細胞死剤、例えばグロッシポール、茶フェノール類、例えばエピガロカテキン-3-ガレート、7-ブロモインジルビン-3'-オキシム(7BIO)-、発がん性RAS、マクロリド類、ベルベリン(植物由来のイソキノリンアルカロイド)、UMI-77、トリプトリド及びセリネキソール、細胞外ヌクレオチダーゼの広範囲の阻害剤、例えばARL67156、テモゾロミドシクロホスファミド、マフォスファミド、ドキソルビシン、エピルビンシン、イダルビシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、腫瘍退縮ウイルス、パツピロン、チルフォスチンAG 490、ヤヌス活性化キナーゼ2/シグナル伝達物質及び転写活性化因子-3(JAK2/STAT3)阻害剤、DNA低メチル化剤(アザシチジン又はデシタビン等)、チミジル酸標的薬(ドセタキセル、ゲムシタビン等)、トラスツズマブ、アド-トラスツズマブエムタンシン、ペルツズマブ、アベマシクリブ、パルボシクリブ、抗IL-10阻害剤、抗TGF-β阻害剤、チェックポイント阻害剤(抗PD-1抗体(例えば、ニボルマブ)等のPD-1阻害剤等)、抗PD-1L(例えば、アテゾリズマ
ブ(MPDL3280)、アベルマブ(MSB0010718C)、デュルバルマブ、MDX-1105)等のPD-1L阻害剤、抗CTLA4抗体等のCTLA-4阻害剤(例えば、イピリムマブ)、抗LAG-3抗体等のLAG-3阻害剤(例えば、IMP321、BMS-986016及びGSK2831781)、MOXR0916、PF-04518600、MEDI0562、MEDI6469、及びMEDI6383等のOX-40アゴニスト、TIM阻害剤、IDO阻害剤)、CCR4阻害剤、FoxP3阻害剤、キメラ抗原受容体/T細胞(CAR-T)療法等の細胞療法、及び他の養子細胞療法、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される有効量の追加の治療薬を対象に投与することを更に含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
追加の治療薬が、請求項1から13に規定の組成物のいずれかに含まれる、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
細胞傷害性剤が腫瘍細胞死を誘導する、請求項14又は15に記載の方法。
【請求項１７】
対象が、TLR9アゴニスト及びOX-40アゴニストを含む有効量の組成物を乳管内投与される、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
TLR9アゴニストが、単位用量あたり0.01μg/mLから20mg/mL、0.1μg/mLから15mg/mL、1μg/mLから10mg/mL、10μg/mLから5mg/mL、又は50μg/mLから1mg/mLの範囲のCPG-ODNであり、OX-40アゴニスト抗体は、単位用量あたり0.01mg/mLから50mg/mL、0.1mg/mLから40mg/mL、0.5mg/mLから30mg/mL、又は1mg/mLから25mg/mLの範囲である、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
対象が、TLR3アゴニスト及びIFNαを含む有効量の組成物を乳管内投与される、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
TLR3アゴニストが、単位用量あたり0.01μg/mLから50μg/mL、0.1μg/mLから40μg/mL、0.5μg/mLから25μg/mL又は1μg/mLから20μg/mLの範囲のポリ(I:C)であり、IFNαの範囲は、単位用量あたり1μg/mLから300μg/mL、10μg/mLから250μg/mL、25μg/mLから200μg/mL、又は50μg/mLから150μg/mLである、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
対象が、TNFα、IL-1β、IFNγ、IFNα-2b、及びポリ(I:C)を含む有効量の組成物を投与される、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
TNFαが、単位用量あたり0.05μg/mLから150μg/mL、0.1μg/mLから100μg/mL、又は0.5μg/mLから50μg/mLの範囲であり;IL-1βが、単位用量あたり0.01μg/mLから20μg/mL、0.1μg/mLから15μg/mL、0.5μg/mLから10μg/mL、又は1μg/mLから10μg/mLの範囲であり;IFNγが、単位用量あたり1μg/mLから100μg/mL、10μg/mLから80μg/mL、25μg/mLから75μg/mL、又は50μg/mLから75μg/mLの範囲であり;IFNαが、単位用量あたり1μg/mLから300μg/mL、10μg/mLから250μg/mL、25μg/mLから200μg/mL、又は50μg/mLから150μg/mLの範囲であり;及びポリ(I:C)が、単位用量あたり0.01μg/mLから50μg/mL、0.1μg/mLから40μg/mL、0.5μg/mLから25μg/mL、又は1μg/mLから20μg/mLの範囲である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
対象の母乳管に1つ又は複数の生物活性剤を含む有効量の組成物を乳管内投与することを含む、対象における抗原提示細胞の遊走を誘導する方法であって、組成物の中に含まれる少なくとも1つの生物活性剤が、対象のリンパ節への抗原提示細胞の遊走を誘導することができる、方法。
【請求項２４】
1つ又は複数の生物活性剤は、TLRアゴニスト(例えば、TLR3アゴニスト(ポリ(I:C)、ポリアデノシン-ポリウリジル酸(ポリAU)アンプリゲン(ポリI:ポリC(12)U)及びポリ-L-リジン及びカルボキシメチルセルロースで安定化されたポリイノシン酸-ポリシチジル酸(ポリICLC)等);TLR4アゴニスト(グルカノピノシルリポイドA(G100)、GSK1795091、モノホスホリル脂質A(MPL)及びMPLベースのアゴニスト、例えばアミノアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)、リポ多糖(LPS)、及びオピオイド、例えばメタドン、モルフィン-3-グルクロニド等);TLR7アゴニスト及びTLR8アゴニスト、例えばイミダゾキノリン(イミキモド及びレシキモド(R848);(PF-3512676等のCpG-ODN等)等のTLR9アゴニスト、HMBG1等のDAMP、サイトカイン(TNFα、IFNγ等、IFNα又はIFNβ等のI型IFN、IL-1β、IL-2、IL-12p70)、HMBG1等のDAMP、ケモカイン(IL-1β、MIP-3β、CCL2、CCL19、CCL21又は任意のCCR7リガンド等)、並びに成長因子、miR-155等のmi-RNA、共刺激分子アゴニスト(CD-40アゴニスト等(例えば、RO7009789、APX005M、CP-870,893、ABBV-927等の抗CD40抗体)、OX-40アゴニスト(例えば、抗OX-40抗体MOXR0916、PF-04518600、MEDI0562、MEDI6469、及びMEDI6383)、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン等のシクロデキストリン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるタイプ1分極化剤である、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
対象において抗原提示細胞のリンパ節への遊走を誘導することができる少なくとも1つの生物活性剤が、IL-1β、MIP-3β、CCL2、CCL19及びCCL21等のCCR7リガンド、LMP1、LMP1-CD40、LMP1-OX40アゴニスト、CD40L、MMP9、HMBG1等のDAMP、又はそれらの組み合わせである、請求項23又は24に記載の方法。
【請求項２６】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項23から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
リンパ節に遊走する抗原提示細胞が、細胞傷害性CD8+ T細胞、CD4+ Th1細胞、メモリーT細胞、メモリーB細胞、Thf細胞、NK細胞、B細胞又はそれらの任意の組み合わせを活性化する、請求項23から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
対象において抗腫瘍免疫応答を誘導する、請求項23から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
抗腫瘍免疫応答が、活性化された細胞傷害性CD8+ T細胞、CD4+ Th1細胞、NK細胞、B細胞、又はそれらの組み合わせによる乳房腫瘍浸潤を含む、請求項23から28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
対象の乳房腫瘍のサイズが減少する、請求項23から29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
対象の乳房腫瘍細胞における免疫学的細胞死を誘導又は増強するための方法であって、有効量の細胞傷害性剤を対象に投与すること、及び有効量の1つ又は複数の生物活性剤を含む組成物を乳管内投与することを含む方法。
【請求項３２】
細胞傷害性剤が、テモゾロミド、シクロホスファミド(低用量又はメトロノミックシクロホスファミドを含む)、マフォスファミド、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、腫瘍退縮ウイルス、パツピロン、チルフォスチンAG 490(JAK2/STAT3阻害剤)又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
1つ又は複数の生物活性剤が、TLRアゴニスト(例えば、TLR3アゴニスト(ポリ(I:C)、ポリアデノシン-ポリウリジル酸(ポリAU)アンプリゲン(ポリI:ポリC(12)U)及びポリ-L-リジン及びカルボキシメチルセルロースで安定化されたポリイノシン酸-ポリシチジル酸(ポリICLC));TLR4アゴニスト(グルカノピノシルリポイドA(G100)、GSK1795091、モノホスホリル脂質A(MPL)及びMPLベースのアゴニスト、例えばアミノアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)、リポ多糖(LPS)、及びオピオイド、例えばメタドン、モルフィン-3-グルクロニド等);TLR7アゴニスト及びTLR8アゴニスト、例えばイミダゾキノリン(イミキモド及びレシキモド(R848));(PF-3512676等のCpG-ODN等)等のTLR9アゴニスト、HMGB1等のDAMP、サイトカイン(TNFα、IFNγ等、IFNα又はIFNβ等のI型IFN、IL-1β、IL-2、IL-12)、ケモカイン(IL-1β、CCL2、CCL19、CCL21又は任意のCCR7リガンド等)、並びに成長因子、miR-155等のmi-RNA、共刺激分子アゴニスト(CD-40アゴニスト等(例えば、RO7009789、APX005M、CP-870,893、ABBV-927等の抗CD40抗体)、OX-40アゴニスト(例えば、抗OX-40抗体MOXR0916、PF-04518600、MEDI0562、MEDI6469、及びMEDI6383)、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン等のシクロデキストリン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるタイプ1分極化剤である、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
サイトカイン及びケモカイン、例えばIL-1β、MCP-1、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、C1Q、CCL1(CCR1リガンド)、CCL2(CCR2リガンド)、CCL5(CCR5リガンド)、CCL20(CCR6リガンド)、CXCL3(CXCR3リガンド)、CXCL4(CXCR4リガンド)及びCXCL1(CXCR1リガンド)、HMGB1等のDAMP、及びTLRアゴニスト(例えばTLR3アゴニスト(ポリ(I:C)、ポリアデノシン-ポリウリジル酸(ポリAU)アンプリゲン(ポリI:ポリC(12)U及びポリ-L-リジン及びカルボキシメチルセルロースで安定化されたポリイノシン酸-ポリシチジル酸(ポリICLC)等)、TLR4アゴニスト、例えばグルカノピノシルリポイドA(G100)、GSK1795091、モノホスホリル脂質A(MPL)及びMPLベースのアゴニスト、例えばアミノアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)、リポ多糖(LPS)、及びオピオイド、例えばメタドン、モルフィン-3-グルクロニド、TLR7アゴニスト及びTLR8アゴニスト、例えばイミダゾキノリン(イミキモド及びレシキモド(R848));(CpG-ODN、例えばPF-3512676、(ポリI:C)、C792、レフィトリモド(MGN1703)、SD-101、IMO-2125等)等のTLR9アゴニスト、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される対象の乳管又は乳房組織へのインバウンド抗原提示細胞の動員を誘導することができる有効量の生物活性剤の乳管内投与を更に含む、請求項31から33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
細胞傷害性剤がオキサリプラチンを含み、1つ又は複数の生物活性剤を含む組成物が、(i)TLR3アゴニスト  ポリ(I:C)及びIFNα;(ii)TLR9アゴニスト(CpG-ODN)及びOX-40アゴニスト抗体;又は(iii)TNFα、IL-1β、IFNγ、IFNα-2b、及びポリ(I:C)を含む、請求項31から34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
細胞傷害性剤が、静脈内又は乳管内により対象に投与される、請求項31から35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
対象の腫瘍サイズが減少する、請求項31から36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
組成物が単回用量又は複数回用量で乳管内投与される、請求項1から37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
組成物が、毎日、1日数回(2回、3回、4回等)、隔日、2日毎、3日毎、5日毎、7日毎、14日毎、15日毎、3週間毎、28日毎、毎月、3ヶ月毎、6ヶ月毎、及び毎年投与される、請求項1から38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ガドリニウムキレート、超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)、19Fパーフルオロカーボンナノ粒子、メタロタンパク質ベースのMRIプローブ等の他の磁気レポーター遺伝子からなる群から選択される造影剤、色素又はコントラスト剤を更に含む、請求項1から39のいずれか一項に規定の組成物。
【請求項４１】
薬学的に許容される担体を更に含む、請求項1から40のいずれか一項に規定の組成物。
【請求項４２】
リポソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、又はミセルとして製剤化される、請求項1から41のいずれか一項に規定の組成物。
【請求項４３】
1つ又は複数の生物活性剤が、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、又はミセル中に含まれる、請求項1から42のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
1つ又は複数の生物活性剤が、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、又はミセル上に含まれる、請求項1から43のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
ナノ粒子が脂質ナノ粒子である、請求項1から44のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
ナノ粒子が細胞標的化剤で更にコーティングされている、請求項1から45のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４７】
細胞標的化剤が、DEC-205、Clec9A(DNGR-1)、DC-SIGN、C1q、BDCA1、BDCA2、BDCA3、及びBDCA4からなる群から選択される、請求項46に記載の組成物。
【請求項４８】
請求項1から47のいずれか一項に記載の組成物、1つ又は複数の容器、包装材料、ラベル又は添付文書、及び任意選択でデバイスを含む製品。
【請求項４９】
デバイスが、針及び注射器、カニューレ、カテーテル、マイクロカテーテル、浸透圧ポンプ、又はカプセル化デバイスである、請求項48に記載の製品。
【請求項５０】
チェックポイント阻害剤、抗ホルモン剤(例えば、抗エストロゲン又は抗エストロゲン受容体、例えばタモキシフェン、シス-タモキシフェン、エンドキシフェン、デスメチルタモキシフェン、ラソフォキシフェン、ラロキシフェン、ベンゾチオフェン、バゼドフォキシフェン、アルゾキシフェン、ミプロキシフェン、レボルメロキシフェン、ドロロキシフェン、クロミフェン、イドキシフェン、トレミフェン、EM652及びERA-923、フルベストラント、ARN-810、又はCH498、アナストロゾール、エクセメスタン及びレトロゾール)、ステロイド剤、アントラサイクリン系薬剤、甲状腺ホルモン補充剤、細胞傷害性薬、例えばアルキル化剤(テモゾロミド及びシクロホスファミド等)、アントラサイクリン系薬剤(ドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン等)、ミトキサントロン等のアントラセンジオン類、プラチナ系薬剤(シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、オルマプラチン、エンロプラチン等)、タキサン系薬剤(パクリタキセル等)、抗有糸分裂薬、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、パツピロン、カルレティキュリン、広範囲の細胞死剤、例えばグロッシポール、茶フェノール類、例えばエピガロカテキン-3-ガレート、7-ブロモインジルビン-3'-オキシム(7BIO)-、発がん性RAS、マクロリド類、ベルベリン(植物由来のイソキノリンアルカロイド)、UMI-77、トリプトリド及びセリネキソール、細胞外ヌクレオチダーゼの広範囲の阻害剤、例えばARL67156、テモゾロミドシクロホスファミド、マフォスファミド、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、腫瘍退縮ウイルス、パツピロン、チルフォスチンAG 490、(JAK2/STAT3阻害剤)、DNA低メチル化剤(アザシチジン又はデシタビン等)、チミジル酸標的薬(ドセタキセル、ゲムシタビン等)、トラスツズマブ、アド-トラスツズマブエムタンシン、ペルツズマブ、アベマシクリブ、パルボシクリブ、抗IL-10阻害剤、抗TGF-β阻害剤、チェックポイント阻害剤(抗PD-1抗体、抗PD-1L抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体等)、抗CCR4阻害剤、抗FoxP3阻害剤、キメラ抗原受容体/T細胞(CAR-T)療法等の細胞療法、及び他の養子縁組細胞療法、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される追加の治療薬を更に含む、請求項48又は請求項49に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出題への相互参照
本出願は、2018年3月15日に出願された仮出願第62/643618号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞(DC)、マクロファージ、ナチュラルキラー(NK)細胞等の自然免疫細胞は、「非自己」腫瘍関連抗原(TAA)を認識することにより、がんの免疫監視に関与している。これらの細胞は、TAAに対して適応免疫細胞(T細胞やB細胞等)を刺激する。これは、直接的及び間接的な抗がんエフェクター機能、抗TAA抗体の産生、がん細胞の死滅、及び対応するTAAを所有する腫瘍細胞を拒絶することができるその後の免疫をもたらす。したがって、TAAに対する自然免疫細胞による適応免疫細胞の刺激は、自然免疫細胞の抗原提示及び抗原感知能力に完全に依存する重要なマイルストーンである。「非自己」TAAを適切に提示して適応免疫細胞を刺激並びに活性化する抗原提示細胞(APC)の能力は、強力な抗がん免疫を活性化するための絶対的な前提条件である。APCには、樹状細胞(DC)、マクロファージ、Bリンパ球(B細胞)が含まれ、DCは「プロフェッショナル」APCである。
【０００３】
環境感知及び迅速な先天性免疫関連機能の実行を支援するために、DCは、CD91、インテグリン、CD36、表面パターン認識受容体(PRR)、トール様受容体(TLR)、及び細胞内PRR様NOD様受容体(NLR)のようなさまざまなスカベンジング又は食作用受容体等の細胞表面受容体及び細胞内受容体の多様なレパートリーを持つ。DCベースのPRRは、病原体関連分子パターン(PAMP)やダメージ関連分子パターン(DAMP)のような危険信号の検出(及びその後のDC刺激)を助ける。
【０００４】
DCは抗原プロセシング機構も備えている。古典的に、細胞内抗原は、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスI提示システムによって提示されるが、細胞外抗原(食作用又は飲作用によって捕捉される)は、MHCクラスII提示について優先的にプロセシングされる。しかしながら、DCは、抗原を「交差提示」することができる。つまり、DCでは、細胞外抗原もまた、MHCクラスI提示システムにアクセスすることができ、細胞内抗原フラグメントもまた、MHCクラスII分子(オートファジーによって媒介される)において見出される。
【０００５】
一般に、DCには2つの主要状態、すなわち定常状態の未成熟樹状細胞(iDC)と完全に成熟したDCが存在し、これらの分類は、表現型レベル及び機能レベルで発生する変化に部分的に基づく。表現型の成熟は、DCが、MHCクラスII分子及びCD40とともに、CD54、CD80、CD83、CD86及びICOS-L等の表面共刺激分子を上方制御する際に達成される。機能レベルで刺激されたDCはサイトカインを分泌し、炎症性又は免疫刺激性サイトカイン(例えば、IL-12、IL-6、IL-1β)と免疫抑制性サイトカイン(例えば、IL-10、TGF-β)の間のバランスは、「自己」抗原又はTAA若しくは病原体等、異常な「非自己」若しくは「外来」抗原の存在の環境的状況によって決定される。
【０００６】
普通の健康状態では、DCは、未成熟又は定常状態(iDC)で存在し、「自己」抗原を持つ宿主細胞を攻撃することから適応免疫細胞を妨げることによって免疫寛容を維持する。iDCは、継続的な食作用(エンドサイトーシス)活性を示し、エフェクター状態に向けて分極化する代わりに寛容又は免疫抑制を促進するために分極化されたT細胞に「自己」抗原を継続的に提示する。このようなiDCは、典型的には、低レベルのCD40を構成的に発現する(Ma等、Semin Immunol. 2009年10月; 21(5):265〜272頁)。
【０００７】
そのような免疫寛容は、免疫チェックポイント経路と、例えば、OX-40L、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA4)及びプログラムされた細胞死タンパク質1(PD1)のようなリガンドのDCベースの提示等の、DCによって提供される共刺激シグナルの完全な欠如の混合によって、T細胞アネルギー又は免疫抑制性T細胞又は調節性T細胞(Treg)の分化を引き起こすT細胞に、活発に誘導し、維持する。
【０００８】
一方、DCが、腫瘍抗原、病原体、又はPAMPを持つ実体(部分的にPRRを介して検出される)に遭遇すると、貪食スカベンジングの機能を離れ、MHCクラスI及びII分子にロードされる適切な抗原ペプチドを産生するために「非自己」の実体由来のタンパク質を分解して、共刺激分子を上方制御し、T細胞及びB細胞への抗原提示のためにリンパ節に遊走する抗原提示機能を引き受けて成熟DCになる。
【０００９】
活性化され成熟したDCは、したがって、3セットのT細胞刺激シグナル(適切な抗原-MHC複合体(シグナル1、T細胞受容体/TCR-CD3の複合体を介してT細胞によって検出される)、表現型成熟リガンドを同時に提供する。すなわち、共刺激分子(シグナル2、CD28、CD40LのようなT細胞受容体によって検出される)、並びに免疫刺激及びエフェクターT細胞表現型を誘発する適切なサイトカイン又は因子(シグナル3、それぞれのサイトカインコグネイト受容体によって検出される)は、T細胞と相互作用し、そのことにより「非自己」実体の抗原特異的排除のためにそれらを分極化するエフェクタープロファイルを活性化させるのに役立つ。DCは、エフェクター機能を誘発する際に他の機能的免疫刺激因子も使用し得る。DCのこの成熟と活性化は、ナイーブT細胞の活性化と分化及び免疫応答の開始に重要である。
【００１０】
腫瘍微小環境(TME)では、がん細胞は定常状態のDC(腫瘍浸潤DC又は腫瘍浸潤樹状細胞「TIDC」とも呼ばれる)を積極的に抑制し、腫瘍に有利な未成熟状態に保つ。TIDCの状態は、通常、(1)よくプロセシングされたがん抗原の完全な欠如又は無視できる量の存在(シグナル1の生成の障害)、(2)表現型成熟リガンド又は共刺激分子の欠如又はわずかな量(シグナル2の消失)、及び/又は(3)IL-12p70のような機能的刺激/免疫刺激性サイトカインの完全な欠如又はわずかな存在(消失したシグナル3)のどちらか、によって特徴付けられる。
【００１１】
抗原の下方制御又は喪失(シグナル1)は、がん細胞が用いる免疫回避戦略のうちの1つである。もう1つは、共刺激分子の低発現である(シグナル2)。より低いがん細胞関連抗原レベル又は低い共刺激分子の発現は、不安定なDC-T細胞の相互作用と、T細胞免疫の障害をもたらす。抗原及び共刺激分子の下方制御とは別に、がん細胞は、IL-10、VEGF、TGF-β及びPGE2等の免疫抑制因子の分泌を介して未成熟なTIDC状態も直接誘導し、それによって安定したDC-T細胞相互作用を更に損なう(シグナル4)。
【００１２】
過去数年、DCベースのワクチンはがん患者の臨床治療にますます適用されてきている。しかしながら、樹状細胞ベースのワクチンを含むほとんどの抗がん療法は、非免疫原性又は非常に低い免疫原性がん細胞死を誘導し、十分なDC刺激を許さず、DCを未成熟状態に保つ傾向がある。例えば、シスプラチンのような特定の化学療法薬や凍結融解のような特定の抗腫瘍ワクチン調製方法は、実際に、最適未満のDC活性化を招き、それにより共刺激シグナル(例えば、CD40、CD86)又は適切な免疫刺激性サイトカイン(例えば、IL-12p70)を欠く「半成熟」DCと呼ぶこともできる、幾分「リンボー(limbo)な」状態を引き起こす可能性がある。したがって、半成熟DCは、T細胞の活性化の成功/最適化に必要な3つのシグナルの完全なセットは示さず、それによりT細胞との不安定なインターフェースを示し、抗がん免疫の能動的消失及びクローンT細胞アネルギーをもたらす。表現型の成熟に差がある半成熟DCは、IL-10、IL-6、IL-1β及び腫瘍壊死因子(TNF)のような数少ないサイトカインの1つ又は複数を分泌することが可能である(シグナル4)。iDCと半成熟DCを合わせると、T細胞アネルギー又はT細胞の枯渇、がん細胞に対する寛容原性、更には活発な腫瘍形成促進活性を進めさせる傾向がある。
【００１３】
リポ多糖のような成熟剤やGM-CSFのようなサイトカインの全身送達によるDCのインビボ成熟の試みがいくつかある一方で(Smedt等、j. Exp. Med. 9、184巻、1413〜1424頁、1996年; Bobanga等、Vaccines (Basel). 2013年12月; 1(4): 444〜462頁)、対象の血液及びDCの分離を含むさまざまなインビトロ及びエクスビボの方法を使用した完全に成熟したDCの生成が多く試みられている(米国特許第5,851,756号、第5,994,126号及び第5,475,483号、米国特許第5,866,115号、米国特許第6,228,640号、米国特許第6,251,665号、米国特許第6,121,044号、米国特許第8,932,575号、米国特許第7,972,847号及び米国特許第8691570号)。乳がんの治療に関する研究は、がん抗原の自己DCへのインビトロ又はエクスビボローディングによって調製されたこれらの樹状細胞ベースのワクチンを使用して行われてきている(Park等、Cancer Res Treat. 2011年3月; 43(1): 56〜66頁; Maillard等、Cancer Research 64、5934〜5937頁、2004年)。DCベースのワクチンのそのようなインビトロ又はエクスビボ製剤は、大量生産、効果的な保存、貯蔵寿命、及び分配に関連するロジスティカル及び規制上の課題に直面している(Kalinski等、Immunol Res. 2011年8月; 50(0): 235〜247頁)。更に、抗原を交差提示する能力は、異なるDCサブセット、DCの発達及び成熟の段階間で異なり、DCの活性化及び成熟の条件によって影響を受ける。DC成熟の初期段階は、一般に、抗原の取り込み及びその交差提示に最適であると考えられているが、腫瘍細胞の交差提示の有効性は、DCの成熟に使用される因子の選択により顕著な影響を受ける可能性がある。同上。
【００１４】
更に、これらの抗がん療法は、しばしば血管内又は皮下に送達される。しかしながら、投与経路は治療の有効性に影響を与える可能性がある(Bouvier等、Front Immunol. 2011年; 2:71)。本開示は、抗原提示のために、DC等の対象の内因性免疫細胞を可動化し、対象の血液を収集し、APCを単離する必要性を排除する乳がんと戦うための免疫応答を誘導するための、並びにDCのエクスビボ教育、抗原提示細胞及び樹状細胞ベースのワクチンのインビトロ大量生産、保存、貯蔵寿命、及び分配に関連する課題に対しての新規のインサイツ方法を提供する。本開示は、有利には、腫瘍に存在するiDC及び半成熟DCを活性化し、完全に成熟するまで分化させ、T細胞、NK細胞及びB細胞への腫瘍抗原の効果的な提示を可能にし、免疫応答及び抗腫瘍免疫を誘導させる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第5,851,756号
【特許文献２】米国特許第5,994,126号
【特許文献３】米国特許第5,475,483号
【特許文献４】米国特許第5,866,115号
【特許文献５】米国特許第6,228,640号
【特許文献６】米国特許第6,251,665号
【特許文献７】米国特許第6,121,044号
【特許文献８】米国特許第8,932,575号
【特許文献９】米国特許第7,972,847号
【特許文献１０】米国特許第8691570号
【特許文献１１】米国特許第6,413,228号
【特許文献１２】米国特許第5,531,736号
【特許文献１３】米国特許第5,279,608号
【特許文献１４】米国特許第5,562,654号
【特許文献１５】米国特許第5,827,538号
【特許文献１６】米国特許第5,798,119号
【特許文献１７】米国特許第5,795,591号
【特許文献１８】米国特許第4,552,561号
【特許文献１９】米国特許第5,492,534号
【非特許文献】
【００１６】
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【非特許文献３】Bobanga等、Vaccines (Basel). 2013年12月; 1(4): 444〜462頁
【非特許文献４】Park等、Cancer Res Treat. 2011年3月; 43(1): 56〜66頁
【非特許文献５】Maillard等、Cancer Research 64、5934〜5937頁、2004年
【非特許文献６】Kalinski等、Immunol Res. 2011年8月; 50(0): 235〜247頁
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本概要は、以下の詳細な説明で更に記載される簡略形式で概念の選択を紹介するために提供されている。本概要は、特許請求された主題の重要な特徴を特定することを意図しておらず、特許請求された主題の範囲を決定する際の支援として使用されることも意図されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
対象の母乳管に有効量の1つ又は複数の生物活性剤を含む組成物を乳管内投与することを含む、対象において免疫応答を誘導する方法が本明細書で提供され、組成物は、乳房内の抗原提示細胞のインサイツ成熟を誘導する。いくつかの実施形態では、組成物に含まれる1つ又は複数の生物活性剤は、TLRアゴニスト(例えば、TLR3アゴニスト(ポリ(I:C)、ポリアデノシン-ポリウリジル酸(ポリAU)アンプリゲン(ポリI:ポリC(12)U; Hemispherx Biopharma社)及びポリ-L-リジン及びカルボキシメチルセルロースで安定化されたポリイノシン酸-ポリシチジル酸(ポリICLC、Hiltonol(登録商標)));TLR4アゴニスト(グルカノピノシルリポイドA(G100)、GSK1795091、モノホスホリル脂質A(MPL)及びアミノアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)、リポ多糖(LPS)、メタドン、モルフィン-3-グルクロニド等のオピオイド等のMPLベースのアゴニスト;イミダゾキノリン等のTLR7-及びTLR8アゴニスト(イミキモド(Imiquimod)(3M)及びレシキモド(Resiquimod)(R848;3M));(PF-3512676等のCpG-ODN)等のTLR9アゴニスト、高移動度グループボックス-1タンパク質(HMGB1)等のDAMP、サイトカイン(TNFα、IFNγ、IFNα又はIFNβ等のI型IFN、IL-1β、IL-2、IL-12)、ケモカイン(IL-1β、CCL2、又はCCL19、CCL21等のCCR7リガンド等)、及び成長因子、miR-155等のmi-RNA、共刺激分子アゴニスト(CD-40アゴニスト(例えば、RO7009789、APX005M、CP-870,893、ABBV-927等の抗CD40抗体)、OX-40アゴニスト(例えば、抗OX-40抗体MOXR0916、PF-04518600、MEDI0562、MEDI6469、及びMEDI6383等)、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン等のシクロデキストリン、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択されるタイプ1分極化剤である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は樹状細胞である。
【００２０】
一態様では、本開示は、本明細書に開示される1つ又は複数の生物活性剤を含む組成物が、抗原提示細胞の対象のリンパ節への遊走を誘導することを提供する。いくつかの実施形態では、免疫応答は、エフェクターT細胞、エフェクターNK細胞、エフェクターB細胞、又はそれらの組み合わせの活性化を含む。特定の実施形態では、免疫応答は、抗腫瘍T細胞エフェクター応答、NK細胞エフェクター応答、又はB細胞抗腫瘍エフェクター応答、又はそれらの組み合わせを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、エフェクターT細胞は、細胞傷害性CD8+ T細胞、CD4+ Th1細胞、メモリーT細胞、T濾胞性ヘルパー(Tfh)細胞、又はそれらの組み合わせを含む。他の実施形態では、免疫応答は、免疫抑制の減少を含む。少なくとも1つの実施形態では、対象の腫瘍サイズが減少する。
【００２２】
一態様では、本開示は、組成物が、サイトカイン及びケモカイン(IL-1β、MCP-1、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、C1q、CCL1(CCR1リガンド)、CCL2(CCR2リガンド)、CCL5(CCR5リガンド)、CCL20(CCR6リガンド)、CXCL3(CXCR3リガンド)、CXCL4(CXCR4リガンド)及びCXCL1(CXCR1リガンド)等)、HMGB1等のDAMP、及びTLRアゴニスト(TLR3アゴニスト(ポリ(I:C)、ポリアデノシン-ポリウリジル酸(ポリAU)アンプリゲン(ポリI:  ポリC(12)U; Hemispherx Biopharma)及びポリ-L-リジン及びカルボキシメチルセルロースで安定化されたポリイノシン酸-ポリシチジル酸(Poly-ICLC、Hiltonol(登録商標))等)、グルカノピノシルリポイドA(G100)、GSK1795091等のTLR4アゴニスト、モノホスホリル脂質A(MPL)及びアミノアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)等のMPLベースのアゴニスト、リポ多糖(LPS)及びメタドン、モルヒネ-3-グルクロニド等のオピオイド、イミダゾキノリン(イミキモド(3M)及びレシキモド(R848;3M))等のTLR7/8アゴニスト、(PF-3512676等のCpG-ODN)等のTLR9アゴニストからなる群から選択される対象の乳管又は乳房組織へのインバウンド(inbound)抗原提示細胞の動員を誘導することができる有効量の生物活性剤を更に含むことを提供する。
【００２３】
特定の実施形態では、タイプ1分極化剤若しくはインバウンド抗原提示細胞の動員を誘導することができる生物活性剤又はその両方は、TLR3アゴニスト、TLR4アゴニスト、TLR7アゴニスト、TLR8アゴニスト又はTLR9アゴニストである。
【００２４】
別の態様では、本開示は、組成物が、フェンレチニド(4-ヒドロキシ(フェニル)レチナミド、4-HPR);IL-12; IFNγ、miR127、miR155、及びmiR223、フェルモキシトール(ferumoxytol)、以下の阻害剤:CSF-1、CSF-1R、IL-10、IL-10R、TGFβ、アルギナーゼ1(Arg1)、M2マクロファージスカベンジャー受容体(A、B、MARCO等)、ヒストンデアセチラーゼ(HDACi)、DICER、IRF4/STAT4/STAT6シグナル伝達経路;IL-4、IL-13、IL-17、PPARγ、KLF4、KLF6、miRNA-146ファミリーメンバー(miRNA-146a)等、let7ファミリーメンバー(let-7c等)、miRNA-9、miRNA-21、miRNA-47、miRNA-187、CCR-CCl2軸シグナル伝達、CCL2/MCP-1、胎盤成長因子(PlGF)(HRG)及びC/EBPβ(PI3Kγ欠失)、AMPKα1(メトホルミン)、p50-p50 NFκB、NADPHオキシダーゼ(NOX)(NOX 1及びNOX 2)例えばGKT137831、Rbpj、Notchシグナル伝達経路;CD40及びCD40Lの活性化因子/アゴニスト、IRF1、IRF5、STAT1(IFNγ、バジメザン(vadimezan)(DMXAA)等)及びSTAT3、核因子カッパB活性化因子、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8及びTLR9のトール様受容体(TLR)アゴニスト例えばイミキモド(Imiquimod)、合成非メチル化シトシン-グアニン(CpG)オリゴデオキシヌクレオチド(CpG-ODN)、(ポリI:C)、C792、レフィトリモド(lefitolimod)(MGN1703)、SD-101(Dynavax社)、SD-101(Dynavax社)、IMO-2125(Idera社); p65-p50 NFκB、MyD88、miR127、miR155、及びmiR223、又はそれらの組み合わせからなる群から選択されるM2分極化マクロファージ様DC(「M2-DC」)をタイプ1分極化DC(「DC1」)に再分極化させることができる有効量の再分極化剤を更に含むことを提供する。
【００２５】
別の態様では、本開示は、組成物が、抗原提示細胞がDCからマクロファージへのシフトを受けることから低減又は阻害させることができる有効量の遮断薬を更に含むことを提供し、遮断薬は、CSF-1阻害剤、CSF-1R阻害剤、MCP-1阻害剤、IL-4阻害剤(パスコリズマブ(pascolizumab)、ピタキンラ(pitakinra)及びデュピルマブ(dupilumab)等)、IL-10阻害剤、IL-13阻害剤(アンルキンズマブ(anrukinzumab)、レブリキズナブ(lebrikizunab)及びトラロキヌマブ(tralokinumab)等)、デュピルマブ等のIL-4/IL-13二重阻害剤、プロスタノイド阻害剤(PGE3の阻害剤等)、STAT3阻害剤(ソラフェニブ(sorafenib)、スニチニブ(sunitinib)、WP1066及びレスベラトロール(resveratrol)等)並びにSTAT6阻害剤(フェンレチニド(fenretinide)(4-HPR)、レフルノミド(leflunomid)、TMX264及びAS1217499等)、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２６】
更に別の態様では、本方法は、抗ホルモン剤(例えば、抗エストロゲン又は抗エストロゲン受容体、例えばタモキシフェン(tamoxifen)、シス-タモキシフェン、エンドキシフェン(endoxifen)、デスメチルタモキシフェン、ラソフォキシフェン(lasofoxifene)、ラロキシフェン(raloxifene)、ベンゾチオフェン、バゼドフォキシフェン(bazedofoxifene)、アルゾキシフェン(arzoxifene)、ミプロキシフェン(miproxifene)、レボルメロキシフェン(levormeloxifene)、ドロロキシフェン(droloxifene)、クロミフェン(clomifene)、イドキシフェン(idoxifene)、トレミフェン(toremifene)、EM652及びERA-923、フルベストラント(fulvestrant)、ARN-810、又はCH498、アナストロゾール(anastrozole)、エクセメスタン(exemestane)及びレトロゾール(letrozole))、ステロイド剤、アントラサイクリン系薬剤、甲状腺ホルモン補充剤、細胞傷害性薬、例えばアルキル化剤(テモゾロミド(temozolomide)及びシクロホスファミド等)、アントラサイクリン系薬剤(ドキソルビシン(doxorubicin)、ペグ化リポソームドキソルビシン、エピルビシン(epirubicin)、イダルビシン(idarubicin)等)、ミトキサントロン(mitoxantrone)等のアントラセンジオン類、プラチナ系薬剤(シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン(oxaliplatin)、オルマプラチン(ormaplatin)、エンロプラチン(enloplatin)等)、タキサン系薬剤(パクリタキセル(paclitaxel)等)、抗有糸分裂薬、ブレオマイシン、ボルテゾミブ(bortezomib)、パツピロン(patupilone)、カルレティキュリン(calreticulin)、広範囲の細胞死剤、例えばグロッシポール(glossypol)、茶フェノール類、例えばエピガロカテキン-3-ガレート、7-ブロモインジルビン-3'-オキシム(7BIO)-、発がん性RAS、マクロリド類、ベルベリン(Berberine)(植物由来のイソキノリンアルカロイド)、UMI-77、トリプトリド(triptolide)及びセリネキソール(selinexor)、細胞外ヌクレオチダーゼの広範囲の阻害剤、例えばARL67156、テモゾロミドシクロホスファミド(temozolomide cyclophosphamide)、マフォスファミド(mafosfamide)、ドキソルビシン(doxorubicin)、エピルビンシン(epirubincin)、イダルビシン(idarubicin)、ミトキサントロン(mitoxantrone)、オキサリプラチン、パクリタキセル、ブレオマイシン、ボルテゾミブ(bortezomib)、腫瘍退縮ウイルス、パツピロン(patupilone)、チルフォスチン(Tyrphostin)AG 490、ヤヌス活性化キナーゼ2 /シグナル伝達物質及び転写活性化因子-3(JAK2 / STAT3)阻害剤、DNA低メチル化剤(アザシチジン(azacitidine)又はデシタビン(decitabine)等)、チミジル酸標的薬(ドセタキセル、ゲムシタビン(gemcitabine)等)、トラスツズマブ(trastuzumab)、アド-トラスツズマブエムタンシン(ado-trastuzumab emtansine)、ペルツズマブ(pertuzumab)、アベマシクリブ(abemaciclib)、パルボシクリブ(palbociclib)、抗IL-10阻害剤、抗TGF-β阻害剤、チェックポイント阻害剤(抗PD-1抗体(例えば、ニボルマブ(Nivolumab))等のPD-1阻害剤等)、抗PD-1L(例えば、アテゾリズマブ(atezolizumab)(MPDL3280)、アベルマブ(Avelumab)(MSB0010718C)、デュルバルマブ(Durvalumab)、MDX-1105)等のPD-1L阻害剤、抗CTLA4抗体等のCTLA-4阻害剤(例えば、イピリムマブ(Ipilimumab))、抗LAG-3抗体等のLAG-3阻害剤(例えば、IMP321、BMS-986016及びGSK2831781)、MOXR0916、PF-04518600、MEDI0562、MEDI6469、及びMEDI6383等のOX-40アゴニスト、TIM阻害剤、及びIDO阻害剤)、CCR4阻害剤、FoxP3阻害剤、キメラ抗原受容体/T細胞(CAR-T)療法等の細胞療法、及び他の養子細胞療法、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される有効量の追加の治療薬を対象に投与することを含む。
【００２７】
追加の治療薬は、別個の組成物であり得る。いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、1つ又は複数の生物活性剤、APCの動員を誘導することができる生物活性剤、再分極化剤、又は遮断剤、又はそれらの任意の組み合わせを含む組成物のいずれかに含まれる。
【００２８】
特定の実施形態では、対象は、TLR9アゴニスト及びOX-40アゴニストを含む有効量の組成物を乳管内投与される。いくつかの実施形態では、TLR9アゴニストは、単位用量あたり0.01μg/mLから20mg/mL、0.1μg/mLから15mg/mL、1μg/mLから10mg/mL、10μg/mLから5mg/mL、50μg/mLから1mg/mLの範囲のCPG-ODNであり、OX-40アゴニスト抗体は、単位用量あたり0.01mg/mLから50mg/mL、0.1mg/mLから40mg/mL、0.5mg/mLから30mg/mL、及び1mg/mLから25mg/mLの範囲である。
【００２９】
特定の実施形態では、対象は、TLR3アゴニスト及びIFNαを含む有効量の組成物を乳管内投与される。いくつかの実施形態では、TLR3アゴニストは、0.01μg/mLから50μg/mL、0.1μg/mLから40μg/mL、0.5μg/mLから25μg/mL及び1μg/mLから20μg/mLの範囲のポリ(I:C)であり、IFNαの範囲は、単位用量あたり1μg/mLから300μg/mL、10μg/mLから250μg/mL、25μg/mLから200μg/mL、及び50μg/mLから150μg/mLである。
【００３０】
特定の実施形態では、対象は、αDCカクテルTNFα、IL-1β、IFNγ、IFNα-2b、及びポリ(I:C)を含む有効量の組成物を投与される。いくつかの実施形態では、TNFαは、単位用量あたり0.05μg/mLから150μg/mL、0.1μg/mLから100μg/mL、及び0.5μg/mLから50μg/mLの範囲である;IL-1βは、単位用量あたり0.01μg/mLから20μg/mL、0.1μg/mLから15μg/mL、0.5μg/mLから10μg/mL及び1μg/mLから10μg/mLの範囲である;IFNγは、1μg/mLから100μg/mL、10μg/mLから80μg/mL、25μg/mLから75μg/mL、及び50μg/mLから75μg/mLの範囲である;IFNαは、単位用量あたり1μg/mLから300μg/mL、10μg/mLから250μg/mL、25μg/mLから200μg/mL、及び50μg/mLから150μg/mLである;並びにポリ(I:C)は、単位用量あたり0.01μg/mLから50μg/mL、0.1μg/mLから40μg/mL、0.5μg/mLから25μg/mL及び1μg/mLから20μg/mLの範囲である。
【００３１】
別の態様では、本開示は、対象の母乳管に1つ又は複数の生物活性剤を含む有効量の組成物を乳管内投与することを含む、対象における抗原提示細胞の遊走を誘導する方法を提供し、組成物中に含まれる少なくとも1つの生物活性剤は、対象のリンパ節への抗原提示細胞の遊走を誘導することができる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、1つ又は複数の生物活性剤は、TLRアゴニスト(例えば、TLR3アゴニスト(ポリ(I:C)、ポリアデノシン-ポリウリジル酸(ポリAU)アンプリゲン(ポリI:ポリC(12)U;Hemispherx Biopharma社)及びポリ-L-リジン及びカルボキシメチルセルロースで安定化されたポリイノシン酸-ポリシチジル酸(ポリICLC、Hiltonol(登録商標))等);TLR4アゴニスト(グルカノピノシルリポイドA(G100)、GSK1795091、モノホスホリル脂質A(MPL)及びMPLベースのアゴニスト、例えばアミノアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)、リポ多糖(LPS)、及びオピオイド、例えばメタドン、モルフィン-3-グルクロニド等);TLR7アゴニスト及びTLR8アゴニスト、例えばイミダゾキノリン(イミキモド(3M)及びレシキモド(R848;3M));(PF-3512676等のCpG-ODN)等のTLR9アゴニスト、HMGB1等のDAMP、サイトカイン(TNFα、IFNγ等、IFNα又はIFNβ等のI型IFN、IL-1β、IL-2、IL-12p70)、ケモカイン(IL-1β、MIP-3β、CCL2、CCL19、CCL21又は任意のCCR7リガンド等)、並びに成長因子、miR-155等のmi-RNA、共刺激分子アゴニスト(CD-40アゴニスト等(例えば、RO7009789、APX005M、CP-870,893、ABBV-927等の抗CD40抗体)、OX-40アゴニスト(例えば、抗OX-40抗体MOXR0916、PF-04518600、MEDI0562、MEDI6469、及びMEDI6383)、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン等のシクロデキストリン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるタイプ1分極化剤である。
【００３３】
特定の実施形態では、抗原提示細胞の対象のリンパ節への遊走を誘導することができる少なくとも1つの生物活性剤は、IL-1β、MIP-3β、CCL2、CCL19及びCCL21等のCCR7リガンド、LMP1、LMP1-CD40、LMP1-OX40アゴニスト、CD40L、MMP9、HMGB1等のDAMP、又はそれらの組み合わせである。特定の実施形態では、抗原提示細胞は樹状細胞である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、リンパ節に遊走する抗原提示細胞は、細胞傷害性CD8+T細胞、CD4+Th1細胞、メモリーT細胞、メモリーB細胞、Thf細胞、NK細胞、又はそれらの任意の組み合わせを活性化する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物は、対象において抗腫瘍免疫応答を誘導する。抗腫瘍免疫応答は、活性化された細胞傷害性CD8+ T細胞、CD4+ Th1細胞、NK細胞、B細胞、又はそれらの組み合わせによる乳房腫瘍浸潤を含む。いくつかの実施形態では、対象の乳房腫瘍のサイズが減少する。
【００３５】
別の態様では、本開示は、対象に有効量の細胞傷害性剤を投与すること、及び1つ又は複数の生物活性剤を含む有効量の組成物を乳管内投与することを含む、対象の乳房腫瘍細胞における免疫学的細胞死を誘導又は増強するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤は、テモゾロミド、シクロホスファミド(低用量又はメトロノミックシクロホスファミドを含む)、マフォスファミド、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、腫瘍退縮ウイルス、パツピロン、チルフォスチンAG 490(JAK2/STAT3阻害剤)又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００３６】
特定の実施形態では、1つ又は複数の生物活性剤は、TLRアゴニスト(例えば、TLR3アゴニスト(ポリ(I:C)、ポリアデノシン-ポリウリジル酸(ポリAU)アンプリゲン(ポリI:ポリC(12)U;Hemispherx Biopharma社)及びポリ-L-リジン及びカルボキシメチルセルロースで安定化されたポリイノシン酸-ポリシチジル酸(ポリICLC、Hiltonol(登録商標))等);TLR4アゴニスト(グルカノピノシルリポイドA(G100)、GSK1795091、モノホスホリル脂質A(MPL)及びMPLベースのアゴニスト、例えばアミノアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)、リポ多糖(LPS)、及びオピオイド、例えばメタドン、モルフィン-3-グルクロニド等);TLR7アゴニスト及びTLR8アゴニスト、例えばイミダゾキノリン(イミキモド(3M)及びレシキモド(R848;3M));(PF-3512676等のCpG-ODN)等のTLR9アゴニスト、サイトカイン(TNFα、IFNγ等、IFNα又はIFNβ等のI型IFN、IL-1β、IL-2、IL-12)、ケモカイン(IL-1β、CCL2、CCL19、CCL21又は任意のCCR7リガンド等)、並びに成長因子、miR-155等のmi-RNA、共刺激分子アゴニスト(CD-40アゴニスト等(例えば、RO7009789、APX005M、CP-870,893、ABBV-927等の抗CD40抗体)、OX-40アゴニスト(例えば、抗OX-40抗体MOXR0916、PF-04518600、MEDI0562、MEDI6469、及びMEDI6383)、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン等のシクロデキストリン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるタイプ1分極化剤である。
【００３７】
特定の状況下では、腫瘍抗原を効果的に提示するために、ナイーブAPC(「インバウンドAPC」)を乳管及び乳房組織に新たに動員することが望ましいことがあり得る。特定の実施形態において、本方法は、サイトカイン及びケモカイン、例えばIL-1β、MCP-1、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、C1Q、CCL1(CCR1リガンド)、CCL2(CCR2リガンド)、CCL5(CCR5リガンド)、CCL20(CCR6リガンド)、CXCL3(CXCR3リガンド)、CXCL4(CXCR4リガンド)及びCXCL1(CXCR1リガンド)、HMGB1等のDAMP、及びTLRアゴニスト(例えばTLR3アゴニスト(ポリ(I:C)、ポリアデノシン-ポリウリジル酸(ポリAU)アンプリゲン(ポリI:ポリC(12)U;Hemispherx Biopharma社)及びポリ-L-リジン及びカルボキシメチルセルロースで安定化されたポリイノシン酸-ポリシチジル酸(ポリICLC、Hiltonol(登録商標))等)、TLR4アゴニスト、例えばグルカノピノシルリポイドA(G100)、GSK1795091、モノホスホリル脂質A(MPL)及びMPLベースのアゴニスト、例えばアミノアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)、リポ多糖(LPS)、及びオピオイド、例えばメタドン、モルフィン-3-グルクロニド、TLR7アゴニスト及びTLR8アゴニスト、例えばイミダゾキノリン(イミキモド(3M)及びレシキモド(R848;3M));(CpG-ODN、例えばPF-3512676、(ポリI:C)、C792、レフィトリモド(MGN1703)、SD-101(Dynavax社)、IMO-2125(Idera社)等)等のTLR9アゴニスト、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される対象の乳管又は乳房組織へのインバウンド抗原提示細胞の動員を誘導することができる有効量の生物活性剤の乳管内投与を更に含む。
【００３８】
特定の実施形態では、細胞傷害性剤は、オキサリプラチンを含み、1つ又は複数の生物活性剤を含む組成物は、(i)TLR3アゴニストポリ(I:C)及びIFNα;(ii)TLR9アゴニスト(CpG-ODN)及びOX-40アゴニスト抗体;又は(iii)TNFα、IL-1β、IFNγ、IFNα-2b、及びポリ(I:C)を含む。いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤は、静脈内又は乳管内により対象に投与される。本開示は、対象の腫瘍サイズが、細胞傷害性剤及び1つ又は複数の生物活性剤を含む組成物の乳管内投与に際して減少することを提供する。
【００３９】
一態様では、本開示は、組成物が単回用量又は複数回用量で乳管内投与されることを提供する。組成物は、毎日、1日数回(2回、3回、4回等)、隔日、2日毎、3日毎、5日毎、7日毎、14日毎、15日毎、3週間毎、28日毎、毎月、3ヶ月毎、6ヶ月毎、及び毎年投与することができる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、組成物は、ガドリニウムキレート、超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)、19Fパーフルオロカーボンナノ粒子、他の磁気レポーター遺伝子、例えばメタロタンパク質ベースのMRIプローブからなる群から選択される造影剤、色素又はコントラスト剤を更に含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される乳管内投与された組成物は、薬学的に許容される担体を含む。
【００４２】
特定の実施形態では、組成物は、リポソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、又はミセルとして製剤化される。いくつかの実施形態では、1つ又は複数の生物活性剤は、(カプセル化された)リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、又はミセルに含まれる。他の実施形態では、1つ又は複数の生物活性剤は、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、又はミセル上に含まれる。少なくとも1つの実施形態では、ナノ粒子は脂質ナノ粒子である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、細胞標的化剤で更にコーティングされる。いくつかの実施形態では、細胞標的化剤は、DEC-205、Clec9A(DNGR-1)、DC-SIGN、C1q、BDCA1、BDCA2、BDCA3及びBDCA4からなる群から選択される。
【００４４】
一態様では、本開示は、本明細書に開示される組成物、1つ又は複数の容器、包装材料、ラベル又は添付文書、及び任意選択でデバイスを含む製品を提供する。いくつかの実施形態では、デバイスは、針及び注射器、カニューレ、カテーテル、マイクロカテーテル、浸透圧ポンプ、又はカプセル化デバイスである。
【００４５】
いくつかの実施形態では、製品は、チェックポイント阻害剤、抗ホルモン剤(例えば、抗エストロゲン又は抗エストロゲン受容体、例えばタモキシフェン、シス-タモキシフェン、エンドキシフェン、デスメチルタモキシフェン、ラソフォキシフェン、ラロキシフェン、ベンゾチオフェン、バゼドフォキシフェン、アルゾキシフェン、ミプロキシフェン、レボルメロキシフェン、ドロロキシフェン、クロミフェン、イドキシフェン、トレミフェン、EM652及びERA-923、フルベストラント、ARN-810、又はCH498、アナストロゾール、エクセメスタン及びレトロゾール)、ステロイド剤、アントラサイクリン系薬剤、甲状腺ホルモン補充剤、細胞傷害性薬、例えばアルキル化剤(テモゾロミド及びシクロホスファミド等)、アントラサイクリン系薬剤(ドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン等)、ミトキサントロン等のアントラセンジオン類、プラチナ系薬剤(シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、オルマプラチン、エンロプラチン等)、タキサン系薬剤(パクリタキセル等)、抗有糸分裂薬、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、パツピロン、カルレティキュリン、広範囲の細胞死剤、例えばグロッシポール、茶フェノール類、例えばエピガロカテキン-3-ガレート、7-ブロモインジルビン-3'-オキシム(7BIO)-、発がん性RAS、マクロリド類、ベルベリン(植物由来のイソキノリンアルカロイド)、UMI-77、トリプトリド及びセリネキソール、細胞外ヌクレオチダーゼの広範囲の阻害剤、例えばARL67156、テモゾロミドシクロホスファミド、マフォスファミド、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、腫瘍退縮ウイルス、パツピロン、チルフォスチンAG 490、(JAK2/STAT3阻害剤)、DNA低メチル化剤(アザシチジン又はデシタビン等)、チミジル酸標的薬(ドセタキセル、ゲムシタビン等)、トラスツズマブ、アド-トラスツズマブエムタンシン、ペルツズマブ、アベマシクリブ、パルボシクリブ、抗IL-10阻害剤、抗TGF-β阻害剤、チェックポイント阻害剤(抗PD-1抗体、抗PD-1L抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体等)、抗CCR4阻害剤、抗FoxP3阻害剤、キメラ抗原受容体/T細胞(CAR-T)療法等の細胞療法、及び他の養子縁組細胞療法、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される追加の治療薬を更に含む。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本開示は、1つ又は複数の生物活性剤を含む組成物を、それを必要とする対象の母乳管(breast/milk duct)に乳管内投与することによって、乳がんを有する対象において免疫応答を誘導するための新規な方法を提供する。生物活性剤は、乳がんと戦うために対象の内因性免疫細胞をインサイツで可動化する。対象における免疫細胞の可動化が、インビトロ若しくはエクスビボ成熟抗原提示細胞又はキメラ抗原及び共刺激抗原を発現するエクスビボ調製されたCAR-T細胞のDCベースのワクチン投与を必要とする現在の方法論とは対照的に、本開示は、乳房における対象の未成熟及び/又は半成熟DCの乳管内に送達される1つ又は複数の生物活性剤及び対象特異的腫瘍抗原への同時インサイツ局所曝露を提供し、DC等の成熟APCが、IL-12p70を産生し、抗原を提示し、Th1支配の応答、より具体的には、対象のがん特異的CTL応答を誘導するその後の能力の強力な増強をもたらす (Vieira等、J Immunol、164:4507〜12頁、2000年、Maillard等、Cancer Research、64、5934〜5937頁、2004年)。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「乳管内」及び「乳管内に」という用語は、本明細書に開示される組成物が、乳房内の奥深くに到達するように、乳腺乳頭の乳首の乳管開口部を介して対象の少なくとも1つの母乳管に送達される治療の方法を指す。本明細書に開示される乳管内送達方法は、本明細書に開示される組成物の対象の乳房の母乳管の自然な開口部を介した送達を含むことが、当技術分野の当業者によって理解されるであろう。本開示の有利な態様では、乳管内送達は、典型的には、非侵襲的又は低侵襲的に行われ、対象の皮膚又は組織又は細胞層の意図的な破壊を伴わず、組成物は、発症した乳房組織に近い対象の乳腺乳頭の乳首の対象自身の自然な乳管口(乳管開口部)を介して送達されることである。
【００４８】
一態様では、乳管内投与は、本開示の組成物を乳腺乳頭の乳首に適用することを指し、そこから、組成物は、乳首の乳管開口部を介して少なくとも1つの母乳管に送達される。乳房乳首及び乳管開口部は、1つ又は複数の生物活性剤、再分極化剤、分極化遮断剤、細胞傷害性剤、若しくは治療剤、又はそれらの組み合わせを含むような、本明細書に開示される組成物を乳管内に受けるために、ユニークに適している。別の態様では、乳管内投与は、乳腺乳頭の乳首の乳管開口部を介して母乳管の内腔に直接組成物を乳管内送達することを指す。
【００４９】
乳がん等の乳房障害は、典型的には、個体の乳管に起因する(Wellings SR. Pathol. Res. Prac. 1980年;166:515〜535頁;Love及びBarsky. Cancer. 2004年、101(9)巻:1947〜1957頁)。したがって、本明細書に開示される組成物(非限定的な例として、1つ又は複数の生物活性剤を含む組成物)を用いる治療の、乳管(乳房乳管)内の発症部位の近くへの、局所送達が非常に望ましい。そのような組成物の乳管内投与は、本明細書に開示される組成物への全身的な曝露を低減することにより全身治療の副作用を未然に防ぐ、局所的で効果的で投与が容易な治療を提供する。これには、オン標的オフ腫瘍効果の可能性/リスクを低減するという追加の利点がある。乳管内投与による乳管への局所送達は、組成物の輸送時間を短縮し、組成物及び近隣腫瘍細胞への、DC、M1マクロファージ及びB細胞等のAPCのより速い曝露を提供し、それにより細胞傷害性活性及び有効性を改善させ、また、より短縮された輸送により、薬物の不活性化及び/又は分解の可能性を低減する。
【００５０】
本明細書に開示される乳管内送達法の特定の利点は、T細胞、NK細胞及びB細胞等のエフェクター免疫細胞への抗原提示のための、対象特異的腫瘍抗原への曝露時のAPCのインサイツ活性化及び成熟、並びに成熟抗原をロードしたAPCの流入領域リンパ節への(存在する場合は異所性及び三次リンパ節への)の遊走に付随する乳管内送達される1つ又は複数の生物活性剤である。本明細書に開示される組成物の乳管内投与は、対象における抗原提示及び免疫応答の増加を誘導する。さまざまな態様では、本開示は、それを必要とする対象の母乳管への本明細書に開示される組成物の乳管内投与が、以下のいずれか1つ又は複数の出現をもたらすことを提供する:T細胞(例えば、細胞傷害性CD8+T細胞及びヘルパーT細胞(CD4+ Th1細胞))、NK細胞、B細胞等の腫瘍特異的エフェクター免疫細胞の活性化及び対象の乳管又は乳房組織への遊走又は可動化、腫瘍細胞死の増加、記憶T細胞及びB細胞の形成の増加、Tregの減少、免疫抑制の減少、抗血管新生反応等CD4+ Tヘルパー細胞、細胞傷害性CD8+ T細胞、Tfh細胞、NK細胞等のT細胞のエフェクター機能の増加。
【００５１】
乳がんを有する対象において免疫応答を誘導するために適した生物活性剤には、TLRアゴニスト(例えば、TLR3アゴニスト(ポリ(I:C)、ポリアデノシン-ポリウリジル酸(ポリAU)アンプリゲン(ポリI:ポリC(12)U;Hemispherx Biopharma)及びポリ-L-リジン及びカルボキシメチルセルロースで安定化されたポリイノシン酸-ポリシチジル酸(ポリICLC、Hiltonol(登録商標))等);TLR4アゴニスト(グルカノピノシルリポイドA(G100)、GSK1795091、モノホスホリル脂質A(MPL)及びMPLベースのアゴニスト、例えばアミノアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)、リポ多糖(LPS)、及びオピオイド、例えばメタドン、モルフィン-3-グルクロニド等);TLR7アゴニスト及びTLR8アゴニスト、例えばイミダゾキノリン(イミキモド(3M)及びレシキモド(R848;3M));(PF-3512676等のCpG-ODN)等のTLR9アゴニスト、HMGB1等のDAMP、サイトカイン(TNFα、IFNγ等、IFNα又はIFNβ等のI型IFN、IL-1β、IL-2、IL-12)、ケモカイン、及び成長因子、mi-RNA、共刺激分子アゴニスト(CD28アゴニスト、CD-40アゴニスト等(例えば、RO7009789、APX005M、CP-870,893、ABBV-927等の抗CD40抗体)、OX-40アゴニスト(例えば、抗OX-40抗体MOXR0916、PF-04518600、MEDI0562、MEDI6469、及びMEDI6383)、2-ヒドロキシプロピル-β  -シクロデキストリン等のT細胞(「DC1」)を活性化する免疫刺激性APCを形成するタイプI分極化剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
特定の実施形態では、組成物は、IFNα又はIFNβ等のI型IFN及びTLR3アゴニストを含む。少なくとも1つの実施形態では、組成物は、IFNα-2b及びポリイノシン-ポリシチジン(ポリI:C)等のTLR3アゴニストを含む。別の実施形態では、組成物は、生物活性剤として、TNFα、IL-1β、及びIFNγを含む。
【００５３】
特定の実施形態では、1つ又は複数のタイプ1分極化剤を含む組成物は、IFNα及び/又はポリ(I:C)を更に含む。
【００５４】
特定の実施形態では、組成物は、IL-1、TNF-α、IFN-α、IFN-γ、及びポリ(I:C)を含むタイプ1分極化剤のカクテル(「αDCカクテル」又は「αタイプ1分極化剤」)を含む。少なくとも1つの実施形態では、αDCカクテルは、TNFα/Il-1β/IFNγ/IFNα-2b/ポリI:Cを含む。α-タイプI分極化剤又はαDCカクテルは、DCの完全な成熟を誘導して、タイプ1分極化DC(「DC1」)を形成し:これは、細胞傷害性Tリンパ球(CD8+ T細胞;「CTL」)及びCD4+ Th1ヘルパーT細胞(「CD4+ Th1細胞」)等のエフェクター細胞を活性化し、二次リンパ器官ケモカインに応答し、高いインターロイキン-12p70(IL-12p70)産生能を生産する。αDCカクテルは、成熟したDC1によるIL-12p70の生成の上昇に基づき、CD40リガンド(CD40L)シグナル伝達に高い応答性のDC1を形成するように、DCの成熟を誘導する。CD4+ Tヘルパー1細胞(CD4+ Th1細胞)及びCD8+ T細胞はCD40Lを発現し、DC1上のCD40とのこの相互作用は、インビボでTh1に偏った免疫を増幅及び維持するために重要であるようである。
【００５５】
いくつかの実施形態では、組成物は、生物活性剤として、CpG-ODN等のTLR9リガンド及びアゴニスト抗OX-40抗体等のCD134(OX-40)アゴニスト(例えば、MOXR0916、PF-04518600、MEDI0562、MEDI6469、及びMEDI6383)又はOX-40Lの誘導物質を含む。OX-40は共刺激分子であり、長期にわたる免疫応答及び免疫T細胞メモリーの生成に必要な共刺激シグナルを提供する。OX40シグナルは、T細胞活性化の増強、T細胞生存の延長、記憶反応の生成、T細胞寛容の阻害、及び調節性T細胞の免疫抑制活性の低下をもたらす(Croft等、Immunol Rev. 2009年5月; 229(1): 173〜191頁; Sagiv-Barfi等、Science Translational Medicine 2018年1月31日:10巻、426号、eaan4488)。
【００５６】
少なくとも1つの実施形態では、組成物は、TLR9リガンドCpG-ODN、IL-12(IL-12p70等)、及びOX-40のアゴニストを含む。
【００５７】
CpG-ODNは、クラスA、B、及び/又はCであってもよい(Krieg等、J Clin Invest. 2007年5月1日; 117(5): 1184〜1194頁)。クラスA(タイプD)CpG ODN(CpG-A ODN)には、中央パリンドローム非メチル化ホスホジエステル(PO)CpG配列及び1.5μMのEC50を有するPS修飾3 'ポリGテールを含めることができる。クラスA CpG-ODNは、pDC等のAPCを刺激し、IFN-α産生を誘導する。例示的なクラスA CpG-ODNには、ODN 2216(5'-ggGGGACGA:TCGTCgggggg-3'(20mer))が含まれる。クラスB CpG-ODNは、ODN 7909(CpG2006; 5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3'(24mer))等の0.4μMのEC50を有する1つ又は複数のCpGジヌクレオチドを持つ完全非メチル化ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート(PS)バックボーンを含むことができる。クラスB CpG-ODNはB細胞を強力に活性化するが、pDCのIFN-α分泌を弱く刺激する。クラスC CpG-ODNは、完全非メチル化ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート(PS)バックボーン及びパリンドロームモチーフ(CpG-ODN)を含むことができ、pDC等のAPC並びに0.8μMのEC50を有するB細胞を可動化することができる。このようなTLR9 CpG-ODNは、pDC及びB細胞の刺激及びIFNαを介したT細胞の活性化からIFNα産生を誘導することができる。例示的なクラスC CpG-ODNには、M362(5'-tcgtcgtcgttc:gaacgacgttgat-3'(25mer))又はCpG 2395(5'-tcgtcgttttcggcgc:gcgccg-3'(22mer))が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
いくつかの実施形態では、TLRアゴニストは、dSLIMファミリー、例えば、MGN 1703からのオリゴヌクレオチドであり得る(Witting等、Critical Reviews in Oncology/Hematology. 94巻、1号、2015年4月、31〜44頁)。
【００５９】
他の実施形態では、乳管内送達組成物は、IFN-α及びモノホスホリルリピドA(MPL)等の1つ又は複数の生物活性剤を含む。
【００６０】
本明細書に開示される生物活性剤は、対象の未成熟及び半成熟APCをインサイツで完全成熟に誘導する。したがって、一態様では、本開示は、本明細書に開示される方法及び組成物が、未成熟及び/又は半成熟から完全成熟である対象自身のAPCをインサイツで完全成熟に誘導し、本明細書に開示される1つ又は複数の生物活性剤及び対象の乳房腫瘍における腫瘍抗原を含む乳管内投与された組成物に接触すると免疫刺激性抗原をロードしたAPC(DC1)を形成することを有利に提供する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、可動化される免疫細胞はAPCである。
【００６２】
いくつかの実施形態では、APCは、乳房組織に存在するAPCであるか、若しくは乳房腫瘍関連APCであるか、又はその両方である。本開示の目的のために、APCは、DC、M1分極化マクロファージ等のマクロファージ、及びB細胞等の当技術分野で知られている任意のAPCであり得る。いくつかの実施形態では、APCは、DC又はその前駆体である。DCは、任意の未成熟又は定常状態DC(iDC)であってもよい。DCは、骨髄由来、脾臓由来、又は単球由来DCであってもよい。いくつかの実施形態では、APCは、乳房組織に存在するDC、又はTIDC等の腫瘍関連DCである。DCサブセットは当該技術分野で既知であり、さまざまなマーカー及び方法によって識別可能である(Collins等、Immunology. 2013年9月; 140(1): 22〜30頁; Worah等、2016年、Cell Reports 16、2953〜2966頁)。DCには、骨髄性又は従来のDC(mDC; BDCA-3+(CD141 +)DC、BDCA1+(CD1c+)DC等)、形質細胞様DC(pDC; BDCA-2+ DC等)、CD14+ DC、ランゲルハンス細胞(LC)等が含まれるが、これらに限定されない。腫瘍関連DCの例には、腫瘍関連mDC、腫瘍関連単球由来DC、腫瘍関連pDC、腫瘍関連iDC、又は腫瘍関連半成熟DC等のTIDCが含まれるが、これらに限定されない。当業者は、DCの命名法が進化してきており、今後も進化し続けること、しかしながら、本開示が識別される全てのDCを含むことを理解するであろう。
【００６３】
腫瘍におけるAPCは機能的に欠損があり、乏しい抗腫瘍免疫反応に寄与することが、研究により示されている(Palucka等、Cancer J. 2013年 ; 19(6))。腫瘍は骨髄性可塑性を乱用して、DC分化をT細胞刺激性DCサブセット(DC1)から抗腫瘍免疫に干渉する可能性のある免疫抑制性DCサブセット(調節性DC)にリダイレクトさせる(Gabrilovich等、Nat Rev Immunol (2012) 12:253〜68頁; Janco等、J Immunol. 2015年4月1日; 194(7): 2985〜2991頁)。研究によると、腫瘍細胞は、iNOS、IL-6、IL-10、VEGF、TGF-β、プロスタグランジンE2(PGE2)等の免疫抑制因子の分泌を介して、未成熟なTIDC状態を直接誘導し、それにより、安定なDC-T細胞相互作用を更に損なう可能性もあることも、示されている。例えば、アルギナーゼ、PGE2及びIL-10等の腫瘍由来抑制因子は、単球由来DCと同じく、皮膚DCの発達と活性化の阻害に関与する原発性ヒト腫瘍の培養における因子として同定されている(Sombroek等、J Immunol (2002)168:4333〜43頁)。
【００６４】
更に、IL-10は、「DCからマクロファージへ」のシフトを誘導できる点、すなわち、完全に発達したDCを、未成熟なCD14+BDCA3+DC-SIGN+CD16+表現型及びマクロファージ様形態、免疫抑制性IL-10(高)vs免疫刺激性IL-12p70(低)の放出の乱れたバランス、高発現レベルのT細胞阻害分子B7-H1/PDL-1、及び同種異系Th細胞及びCD8+(細胞傷害性)T細胞のプライミング効率の低下、結合エピトープ/ MHC複合体の低結合活性を有する機能的なM2特性を持つ未成熟なマクロファージ様細胞に変換できる点で、免疫抑制性である(De Gruijl等、J Immunol (2006) 176:7232〜42頁、Fortsch D等、J Immunol 2000、165:978〜987頁; Gerlini G等、Am J Pathol (2004) 165:1853〜63; van de Ven等、Front. Immunol.、2013年11月25日)。したがって、これらの未成熟及び半成熟TIDCは、腫瘍関連M2分極化マクロファージと同様の免疫抑制機能を持つM2マクロファージ様分極化状態(「M2マクロファージ様DC」又は「M2-DC」)を取り、T細胞活性化の低下(例えば、細胞傷害性CD8+ T細胞エフェクター機能の低減)及び腫瘍細胞死の低減をもたらす。
【００６５】
M2-DC等のTIDCは、抗原提示能力の機能不全、食細胞及びエンドサイトーシス活性の抑制、異常な運動性、及びその他のさまざまな未成熟な特性を示す傾向がある。更に、腫瘍細胞は、免疫抑制調節DC、例えばCCR6 DC及びマウスCD11b+CD11c+MHC-II+CD24+CD64lowF4/80low DCのヒト等価物)が腫瘍に動員されるようにTMEを変化させる(Kenkel等、Cancer Res. 2017年8月1日;77(15):4158〜4170頁)。
【００６６】
いかなる理論又は機構に拘束されることを望むことなく、一態様では、本開示は、腫瘍関連M2-DC及び調節DCを免疫刺激性DC(DC1)に変換するための乳管内送達方法及び組成物を提供する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような1つ又は複数の生物活性剤を含む組成物は、再分極化剤を含む。適切な再分極化剤は、フェンレチニド(4-ヒドロキシ(フェニル)レチナミド、4-HPR);IL-12; IFNγ、miR127、miR155、及びmiR223、フェルモキシトール、以下の阻害剤:CSF-1、CSF-1R、IL-10、IL-10R、TGFβ、アルギナーゼ1(Arg1)、M2マクロファージスカベンジャー受容体(A、B、MARCO等);ヒストンデアセチラーゼ(HDACi)、DICER、IRF4/STAT4/STAT6シグナル伝達経路;IL-4、IL-13、IL-17、PPARγ、KLF4、KLF6;miRNA-146ファミリーメンバー(miRNA-146a)等、let7ファミリーメンバー(let-7c等)、miRNA-9、miRNA-21、miRNA-47、miRNA-187;CCR-CCl2軸シグナル伝達:CCL2/MCP-1合成;胎盤成長因子(PlGF)(HRG)及びC/EBPβ(PI3Kγ欠失);AMPKα1(メトホルミン)、p50-p50 NFκB、NADPHオキシダーゼ(NOX)(NOX 1及びNOX 2)、Rbpj、Notchシグナル伝達経路;CD40及びCD40Lの活性化因子;IRF1、IRF5、STAT1(IFNγ、バジメザン(DMXAA)等)及びSTAT3;核因子カッパB活性化因子、TLR3、TLR4及びTLR9のトール様受容体(TLR)アゴニスト例えばイミキモド(Imiquimod)、合成非メチル化シトシン-グアニン(CpG)オリゴデオキシヌクレオチド(CpG-ODN)、(ポリI:C)、C792、レフィトリモド(lefitolimod)(MGN1703)、SD-101(Dynavax)、SD-101(Dynavax)、IMO-2125(Idera); p65-p50 NFκB、MyD88、miR127、miR155、及びmiR223、又はそれらの組み合わせを含むことができるが、それらに限定されない。当業者は、1つ又は複数の生物活性剤もまた再分極化剤として機能し得ることを理解するであろう。
【００６８】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される乳管内送達方法及び組成物が、DCからマクロファージへのシフト(「M2シフト」)を低減又は阻害することを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような1つ又は複数の生物活性剤を含む組成物は、遮断剤を含む。DCからマクロファージへのM2シフトを予防又は低減するための適切な遮断薬には、CSF-1阻害剤、CSF-1R阻害剤、MCP-1阻害剤、IL-4阻害剤(パスコリズマブ、ピタキンラ及びデュピルマブ等)、IL-10阻害剤、IL-13阻害剤(アンルキンズマブ、レブリキズナブ及びトラロキヌマブ等)、デュピルマブ等のIL-4/IL-13二重阻害剤、プロスタノイド阻害剤(PGE3の阻害剤等)、STAT3阻害剤(ソラフェニブ、スニチニブ、WP1066、及びレスベラトロール等)、及びSTAT6阻害剤(フェンレチニド(4-HPR)、レフルノミド、TMX264、及びAS1217499等)、又はそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
M2-DCのDC1への再分極化又はM2シフトの低減若しくは阻害は、本明細書に開示される1つ又は複数の生物活性剤を、再分極化剤又は遮断剤又はその両方と一緒に、それを必要とする対象の母乳管内に同時送達することによって達成され得る。1つ又は複数の生物活性剤並びに再分極化剤及び/又は遮断剤は、単一の組成物又は別個の組成物内に含むことができる。そのような別個の組成物は、任意の順序で対象の乳管に同時送達され得る。例えば、再分極化剤又は遮断剤、或いはその両方を含む組成物は、本明細書に開示される1つ又は複数の生物活性剤を含む組成物の乳管内送達後、1分から30分以内、30分から6時間以内、6時間から12時間以内、及び24時間以内に送達され得る。別の例として、対象への送達のために、別個の組成物の各々を組み合わせてもよい。
【００７０】
当業者は、本明細書に開示される乳管内送達方法及び組成物が、免疫抑制調節DC又はM2-DCと比較して免疫刺激DC1の比率を増加させることができることを認識するであろう。
【００７１】
特定の状況下では、腫瘍抗原を効果的に提示するために、ナイーブAPC(「インバウンドAPC」)を乳管及び乳房組織に新しく動員することが望ましいことがあり得る。そのようなインバウンドAPCは、循環APC、骨髄由来APC、脾臓由来APC等の末梢APCであり得る。したがって、いくつかの実施形態では、APCは、APCの対象の乳管への遊走を動員又は誘導することができる1つ又は複数の生物活性剤を含む組成物の乳管内投与時に、対象の乳管又は乳房組織に新しく又は新たに動員されるインバウンドAPCであることが、本開示により提供される。そのような新たに動員されたAPCは、対象特異的腫瘍抗原に曝露され、効果的な抗原提示と免疫応答の増加のために、乳管及び/又は乳房組織においてインサイツで完全成熟した抗原がロードされたAPCに分化するように誘導される。そのような乳管内送達法により、発症部位近くのインサイツでの最適な抗原取り込み及び腫瘍抗原交差提示が可能となる。更に、本明細書に開示されるインサイツ方法は、対象の血液を収集し、APCを単離する必要性、非対象特異的腫瘍抗原を選択する必要性、並びにAPCの大量生産、保存、貯蔵寿命及び分配に関連する課題を取り除く。
【００７２】
いくつかの実施形態では、APCはインバウンドDCである。インバウンドDCサブセットの例には、循環ナイーブmDC(BDCA-1+(CD1c+)、BDCA-3+(CD141+)及びBDCA-4+ DC等)、pDC(BDCA-2+ DC等)、及びそれらの前駆体が含まれる。そのようなインバウンドAPCは、インサイツで対象の特定の腫瘍抗原に曝露され、食作用、飲作用等によって腫瘍抗原を取り込むようになる。新しく動員されたインバウンドAPCは、上記のようにM2シフトを受けたり調節性DCになったりすることを防ぐことができる。
【００７３】
インバウンドAPCの新しい動員に適した生物活性剤の非限定的な例には、IL-1β、MCP-1、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。少なくとも1つの実施形態では、組成物は、MIP3α、MIP1α及びRANTESを含む。別の実施形態では、組成物は、HMGB1、TLRアゴニスト、例えばTLR3アゴニスト(ポリ(I:C)、ポリアデノシン-ポリウリジル酸(ポリAU)アンプリゲン(ポリI:ポリC(12)U;Hemispherx Biopharma)及びポリ-L-リジン及びカルボキシメチルセルロースで安定化されたポリイノシン酸-ポリシチジル酸(ポリICLC、Hiltonol(登録商標))等)、TLR4アゴニスト、例えばグルカノピノシルリポイドA(G100)、GSK1795091、モノホスホリル脂質A(MPL)及びMPLベースのアゴニスト、例えばアミノアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)、リポ多糖(LPS)、及びオピオイド、例えばメタドン、モルフィン-3-グルクロニド)、TLR7/8アゴニスト、例えばイミダゾキノリン(イミキモド(3M)及びレシキモド(R848;3M));(CpG-ODN、例えばPF-3512676等の)TLR9アゴニスト、循環iDC及び末梢組織iDCの走化性を母乳管及び乳房組織に誘導するための生物活性剤を含む。HMGB1はDAMP、すなわち、死にかけている細胞や壊死細胞によって放出されるか、ヒト単球由来のiDCの走化性物質として作用する活性化マクロファージにより分泌される「危険信号」である。iDCを動員するための生物活性剤には、C1q、CCL1(CCR1リガンド)、CCL2(CCR2リガンド)、CCL5(CCR5リガンド)、CCL20(CCR6リガンド)、CXCL3(CXCR3リガンド)、CXCL4(CXCR4リガンド)、及びCXCL1(CXCR1リガンド)もまた含まれる。CXCL3は、pDC上のCXCR3に結合できるが、CXCR3を発現しないMoDC又は血液DCには結合できない(Villablanca等、Histol Histopathol(2008)23:897〜910頁)。
【００７４】
インバウンドAPCを動員する生物活性剤もまた、APCを完全成熟させることができることは、当業者により理解されるであろう。いくつかの実施形態では、インバウンドAPCは、対象の乳管に到達した時に、APCを特異的に完全成熟させる本明細書に開示される組成物に更に曝露されてもよい。
【００７５】
完全成熟に誘導されたAPCは、3セットのT細胞刺激シグナル(適切な抗原-MHC複合体(シグナル1、T細胞受容体/TCR-CD3の複合体を介してT細胞によって検出される)、表現型成熟リガンド、すなわち、共刺激分子(シグナル2、CD28、CD40L、OX-40(CD134、TNFRSF4)等のT細胞受容体によって検出される)、並びに免疫刺激及びエフェクターT細胞表現型を誘発するIL-12p70、IL-18、IL-23等の適切なサイトカイン又は因子(シグナル3、IL-12受容体等のそれぞれのサイトカインコグネイト受容体によって検出される)を同時に提供し、T細胞と相互作用し、それにより、腫瘍細胞の対象腫瘍抗原特異的排除のためにそれらを極性化することにおいてエフェクタープロファイルを活性化することを助ける。DCは、B細胞及びNK細胞を介してエフェクター機能を誘発する際に他の機能的免疫刺激因子も使用し得る。
【００７６】
いくつかの実施形態では、成熟DCは、CCR7+DC、CD80+DC、CD86+DC、CD40+DC、OX-40+DC、又はそれらの任意の組み合わせである。他の実施形態では、成熟DCは、表現型マーカーCD11c+HLA-DR+、CD11c+MHCIIhigh、又はCD11b+CD11c+CD86highMHC-IIhighを示す。
【００７７】
本明細書に開示される組成物と共に乳管内投与された対象から得られたDC1は、IL-10、TGF-β、IL-4、及びIL-13等の免疫抑制性サイトカインをほとんど又は全く放出しない可能性がある。DC1は、例えば、ELISAによってインビトロで試験される場合、IL-18及び/又はIL-23及び/又はIL-27等の炎症性サイトカインを放出する可能性がある。いくつかの実施形態では、活性化された成熟DCは、IL-12p70を放出する。他の実施形態では、活性化された成熟DCは、IFNαを放出する。
【００７８】
DC1等の免疫刺激性APCへの成熟及び/又は再分極化は、対象から得られたサンプルからの(i)CD40、CD80、CD83、CD86、OX-40、及びCCR7、又はそれらの組み合わせ等の1つ又は複数の成熟のマーカーの増加、並びに(ii)IL-6、IL-12p70、IL-18、IL-23、IL-27、TNFα、又はそれらの組み合わせのレベルの増加等のサイトカインの放出の増加(シグナル3)を決定することによって測定できる。対象のサンプルは、任意のサンプルであってもよく、例えば、サンプルは、血液、血清、血漿、組織、乳頭吸引液、管内洗浄液、リンパ液等であってもよい。APC放出サイトカインIL-6、IL-8、IL-12p-70及びTNFαのレベルは、例えば、ELISA、ELISPOT等によって、当該技術分野で既知の方法のいずれかを使用して、組織サンプル中で決定することができる。少なくとも1つの実施形態では、測定されるサイトカインはIL-12p70である。
【００７９】
腫瘍微小環境は、DC等の内因性APCのリンパ節への遊走に悪影響を与える可能性がある(N. Seyfizadeh等、Critical Reviews in Oncology/Hematology 107(2016)100〜110頁)。一態様では、本開示は、本明細書に開示される乳管内送達方法及び組成物が、T細胞、NK細胞及びB細胞の抗原提示及びプライミングのために、DC1等の成熟抗原にロードされた免疫刺激APCを、乳房組織又は乳がんから流入領域リンパ節に(及び存在する場合、異所性リンパ節及び三次リンパ節に)遊走するように誘導することを有利に提供する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物の乳管内投与時に、DCの二次リンパ器官(流入領域リンパ節等)、異所性及び/又は三次リンパ節への遊走が増加する。いくつかの実施形態では、乳房組織から流入領域リンパ節に遊走するAPCは、CCR7+DC、CD80+APC、CD86+APC、CD40+APLC、OX-40L+APC、又はそれらの任意の組み合わせのいずれかである。APCの遊走は、リンパ節のケモカイン勾配に従い得る。活性化APCのリンパ節へのそのような遊走を誘導するのに適したケモカインは、IL-1β、MIP-3β、CCL2、CCR7リガンド、例えば、CCL19、CCL21、CD40L、ペプチドグリカン、MMP9、HMGB1等のDAMP、又はそれらの組み合わせであり得る。
【００８０】
いくつかの実施形態では、活性化されたAPCのリンパ節への遊走を誘導する組成物は、生物活性剤としてIL-1β、IL-6、MIP-3βのカクテルを含む。
【００８１】
他の実施形態では、活性化APCのリンパ節への遊走を誘導する組成物は、CpG-ODN及びイキモド等のTLRアゴニスト、CCL2、CCL19、CCL21又は他のCCR7リガンド等のケモカインを含む。更に他の実施形態では、活性化されたAPCのリンパ節への遊走を誘導する組成物は、生物活性剤としてCpG-ODN及びペプチドグリカンを含む。更に他の実施形態では、活性化されたAPCのリンパ節への遊走を誘導する組成物は、生物活性剤として、CpG-ODN及びMMP9等のマトリックスメタロプロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、CpG-ODNは、エプスタインバール(Epstein Barr)ウイルスLMP1タンパク質又はペプチド、CD40タンパク質又はペプチド、OX-40ペプチド等の他の分子に融合され得る。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物は、RNAワクチンによるAPCのインサイツトランスフェクションにより、APC(乳房組織及び腫瘍に存在するAPC、並びに本明細書に開示される方法によって完全成熟するように誘導された新たに動員されたインバウンドAPC)の遊走を誘導し、野生型エプスタインバールウイルスLMP1タンパク質又はペプチド配列を含むタンパク質の発現をもたらす。そのようなLMP1タンパク質は、抗腫瘍エフェクターT細胞に結合する共刺激分子とのLMP1の融合タンパク質(例えば、LMP1-CD40融合タンパク質、LMP1-OX-40L融合タンパク質)等の融合タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、RNAワクチンは、緑色又は黄色の蛍光タンパク質等の蛍光タンパク質をコードするもの等のレポーターRNAを含む。
【００８３】
APCの遊走は、コンピューター断層撮影(CT)、蛍光(例えば、緑色蛍光及び黄色蛍光タンパク質)を使用した光学イメージング技術、生体発光、磁気共鳴画像法(MRI)、セルラーMRI等を組み合わせて、ポジトロン放出断層撮影(PET)及び単一光子放射断層撮影(SPECT)を使用して、インビボでモニターできる。
【００８４】
一態様では、本開示は、本明細書に開示される乳管内送達方法及び組成物が、APCによるT細胞、B細胞及びNK細胞等のエフェクター免疫細胞への抗原提示の増加を誘導することを提供する。いくつかの実施形態では、抗原提示は、ナイーブAPCの新たな動員、並びに乳房組織に存在するAPC及び腫瘍組織に存在するAPCの再分極化によって増加され得る。
【００８５】
他の実施形態では、インバウンドAPC、乳房組織に存在するAPC、及び腫瘍関連APCによる抗原提示は、腫瘍細胞死を誘導する細胞傷害性剤で対象を前処理することによって増強され得る。腫瘍細胞死の増加は、例えば、アポトーシス(カスパーゼ依存性)、ネクロトーシス(カスパーゼの化学的抑制に続くTNF受容体によって開始される、すなわちカスパーゼ非依存性)、ネクローシス及び免疫学的細胞死(「ICD」)等の任意の細胞死様式によるものであってもよい。アポトーシス、ネクロトーシス及びネクローシスの細胞死様式は、Belizario等  in Mediators Inflamm. 2015年: 128076; Vanden Berge等、Mol Cell Oncol. 2015年10〜12月; 2(4): e975093)により記載されている。
【００８６】
化学療法薬は一般に、オートファジーを伴うか、後の段階で細胞のネクローシスを伴う可能性のあるアポトーシスを誘発することにより腫瘍細胞を殺すことがよくある。ICDの免疫原性は、マクロファージ、NK細胞及びDC等の免疫系の多様な構成要素を活性化することができるいくつかの分子の死にかけている細胞の曝露又は放出によって決定される(Cirone M等、Oncoimmunology. 2012年10月1日; 1(7):1218〜1219頁; Bezu等、Front Immunol. 2015年; 6: 187頁)。
【００８７】
細胞死の増加は、APCによる抗原提示を支援する腫瘍関連抗原及び分子をより大量に生成する。死にかけている腫瘍細胞は、特定の骨髄性免疫エフェクターの動員と活性化を指示する一連の危険信号、DAMPを放出し、故に第一線の生得的応答を引き起こすことがある(Krysko等、Nat Rev Cancer. 2012年12月; 12(12):860〜75頁)。このようなDAMPには、代謝変化(ATPの細胞外空間への押し出し)、細胞表面の変化(原形質膜へのカルレティキュリンの曝露等、細胞周囲微小環境の変化(最終的に抗がん免疫応答を引き起こすクロマチン結合タンパク質HMGB1の核及び細胞の流出等が含まれる。(Bezu等、Front Immunol. 2015年; 6: 187頁)。これらのDAMPは、抗原提示細胞(APC)を活性ICDの部位に動員し、死細胞関連抗原の取り込み、プロセシング、及び提示を促進し、最終的に適応免疫応答のプライミングをもたらす。このような免疫応答には、インターロイキン-1βを産生する単球由来樹状細胞(DC)等のDC、インターロイキン-17を産生するγ/δT細胞及びインターフェロン-γ(IFN-γ)を産生する従来のCD8+α/βT細胞を含む免疫エフェクターの複雑な階層が含まれる、Ma Y等; J. Exp. Med. 2011年。死にかけている細胞から放出される内因性の危険信号は、Toll様受容体(TLR)を結合して、そのような自然免疫反応を誘導する。例えば、DCの表面に存在するTLR3、TLR4、TLR9は、死にかけている腫瘍細胞から放出される、その内因性リガンドHMGB1を認識し(Tian等、Nature Immunology 8巻、487〜496頁(2007))、このことがICDの認知に不可欠なMyD88(骨髄分化一次応答遺伝子)依存性シグナル伝達経路に火をつける。HMGB1によって誘発されるTLR4/MyD88経路は、ファゴソーム及びリソソームの間の融合を阻害し、それにより、がん細胞に対する細胞免疫応答の再刺激又は可動化の誘導に必要な腫瘍抗原プロセシング及び抗原提示を促進する。
【００８８】
細胞傷害性剤は、経口、非経口、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内等を含む任意の送達経路を介して送達されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤は、静脈内又は乳管内に投与されてもよい。細胞傷害性剤の乳管内投与の後には、本明細書に開示される組成物の乳管内投与が続いた。他の実施形態では、対象は、1つ又は複数の生物活性剤を含む組成物での治療中又は治療後に、本明細書に開示される細胞傷害性剤が投与され得る。本明細書に開示される細胞傷害性剤及び組成物は、1つ又は複数のサイクルで投与され得る。本明細書に開示されるそのような組成物への曝露は、腫瘍細胞をその後送達される細胞傷害性剤に対して有利に感作する。細胞傷害性剤及び本明細書に開示される組成物による治療は、APCによる抗原提示及び免疫応答を増加させる。乳管内投与された細胞傷害性剤は、細胞傷害性剤のより低い全身曝露のため、バイスタンダー効果を低減する。
【００８９】
細胞傷害性剤は、単独で、又はIFN産生、HMGB1放出を誘導し、DC上のTLR3、TLR4、TLR7、TLR8、及びTLR9経路の任意の1つ又は複数を活性化する1つ又は複数の他の生物活性剤と組み合わせて送達できる。使用できるTLR9アゴニストの例には、抗TLR-9アゴニスト抗体及びScFv等の抗体フラグメント、合成DNA及びTTAGGGマルチマー等のCpGモチーフ(CpG ODN)を含むオリゴヌクレオチド、レフィトリモド(MGN1703)、SD-101(Dynavax社)、IMO-2125(Idera社)等が含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
腫瘍細胞死を増加させるのに適した細胞傷害性剤には、アルキル化剤(テモゾロミド及びシクロホスファミド等)、アントラサイクリン(ドキソルビシン、エピルビンシン、イダルビシン等)、ミトキサントロン等のアントラセンジオン、プラチナ系薬剤(シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、オルマプラチン、エンロプラチン等)、タキサン(パクリタキセル等)、抗有糸分裂薬、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、パツピロン、カルレティキュリン、広範囲の細胞死剤、例えばグロッシポール、茶フェノール類、例えばエピガロカテキン-3-ガレート、7-ブロモインジルビン-3'-オキシム(7BIO)-、発がん性RAS、マクロリド類、ベルベリン(植物由来のイソキノリンアルカロイド)、UMI-77、トリプトリド及びセリネキソール、細胞外ヌクレオチダーゼの広範囲の阻害剤、例えばARL67156、又はそれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００９１】
免疫学的細胞死を誘導するために有用な細胞傷害性剤には、テモゾロミド、シクロホスファミド(低用量又はメトロノミックシクロホスファミド(例えば、50mg/dの用量で)を含む、マフォスファミド、ドキソルビシン、エピルビンシン、イダルビシン。ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、腫瘍退縮ウイルス、パツピロン、チルフォスチンAG 490、ヤヌス活性化キナーゼ2/シグナル伝達因子及び転写活性化因子-3(JAK2/STAT3)阻害剤、又はそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】
細胞死は、例えば組織生検のTUNNEL技術によるアポトーシスアッセイ等の当該技術分野で既知の方法によって測定されてもよい。腫瘍サイズの減少は、マンモグラフィ、CT-SCAN及びMRIによって決定できる。
【００９３】
一態様では、本開示は、本明細書に開示される乳管内送達方法及び組成物が更にアジュバントを含むことを提供する。適切なアジュバントは、無機塩、エマルション、及びリポソーム、例えば、PLGAリポソーム、サポニン、熱ショックタンパク質、例えばHSP70、VSSP、BCG、及びDETOXであってもよい。
【００９４】
一態様では、本開示は、本明細書に開示される方法及び組成物が、対象における免疫応答を誘導することを提供する。免疫応答は、T細胞エフェクター機能(例えば、CD4+ヘルパー-1 T細胞及び細胞傷害性CD8+ T細胞の活性化、T細胞媒介細胞傷害性を介した)、腫瘍抗原標的抗体形成等のB細胞エフェクター機能、NK細胞エフェクター機能、記憶T及びB細胞の形成、Tregの減少、免疫抑制の減少(例えば、CTLA4、PD-1、PD1-L1、TIM、LAG3又は活性化OX-40/OX-40L経路等のチェックポイント経路分子の阻害を介して)、血管新生抑制反応(血管新生の阻害)、及び腫瘍細胞死の誘導又は増強等の任意の1つ又は複数の抗体及び免疫細胞媒介応答でありうる。(Park等、Cancer Res Treat. 2011年3月; 43(1): 56〜66頁)。
【００９５】
したがって、本明細書に開示される方法は、T細胞及びB細胞への抗原提示のための、不適切又は不十分な抗原提示及び/又はリンパ節等の二次リンパ器官への、及び存在する場合は異所性及び三次リンパ節への遊走の問題を解決する。M2シフトを行うこと又はM2-DCになることから阻害される新たに動員されたiDC、乳房組織に存在するDC、及び腫瘍関連DC等のインバウンドAPCSは、腫瘍抗原をプロセシングし、活性となり、より効率的に腫瘍抗原を提示することができる。したがって、本明細書に開示される乳管内投与された組成物への曝露はまた、腫瘍細胞を、細胞傷害性剤を用いたその後の治療に対して感作するであろう。
【００９６】
一態様では、本開示は、本明細書に開示される組成物及び方法がエフェクター免疫細胞を可動化することを提供する。いくつかの実施形態では、可動化される免疫細胞は、T細胞、B細胞及びNK細胞等のエフェクター細胞である。腫瘍抗原特異的T細胞、B細胞及びNK細胞は、本明細書に開示される組成物の乳管内送達時に、抗原提示のために流入領域リンパ節、異所性リンパ節及び三次リンパ節に遊走する成熟抗原にロードされたAPCによって可動化される。
【００９７】
別の態様では、本開示は、T細胞の遊走を誘導又は増強することができる1つ又は複数の生物活性剤を含む組成物の乳管内投与に際して、浸潤性抗腫瘍T細胞の対象の乳管又は乳房組織への遊走を誘導又は増強する方法及び組成物を提供する。このようなT細胞遊走は、求心性リンパ系に沿って、及び/又は血液中にあり得る。理論又は機構に拘束されることを望むことなく、いくつかの実施形態では、そのような1つ又は複数の生物活性剤を含む組成物には、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL27、CXCL1、及びCX3CL1又はそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。少なくとも1つの実施形態では、1つ又は複数の生物活性剤を含む組成物において、少なくとも1つの生物活性剤は、T細胞の遊走を誘導する。このようなT細胞は乳房腫瘍に浸潤し、腫瘍の殺傷を支援することができる。
【００９８】
別の態様では、本開示は、NK細胞遊走を誘導又は増強することができる1つ又は複数の生物活性剤を含む組成物の乳管内投与に際して、対象の乳管又は乳房組織へのNK細胞の遊走を誘導又は増強する方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、そのような1つ又は複数の生物活性剤を含む組成物には、IL-12、IL-15、IL-18、低用量IL-2、又はそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、1つ又は複数の生物活性剤を含む組成物には、miR-30c-1、miR-27a、miR-548q、miR362-5p、miR628-5p及びmiR152、又はそれらの任意の組み合わせが更に含まれる。このようなmiRNAを含むことで、NK細胞を介した細胞傷害性が支援される。
【００９９】
活性化された抗腫瘍エフェクター免疫細胞による腫瘍組織の浸潤は、乳がんの陽性転帰と相関している。
【０１００】
一態様では、本開示は、本明細書に開示される1つ又は複数の生物活性剤を含む組成物が、Table 1(表1)に記載されるような単位用量での乳管内送達のために製剤化されることを提供する。
【０１０１】
【表１】
2021515797.tif 000002
【０１０２】
乳管内組成物中のTNFαの単位用量は、0.05μg/mLから150μg/mL、0.1μg/mLから100μg/mL、及び0.5μg/mLから50μg/mLの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、組成物は、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL及び200μg/mLの単位用量でTNFαを含む。
【０１０３】
乳管内組成物中のIL-1βの単位用量は、0.01μg/mLから20μg/mL、0.1μg/mLから15μg/mL、0.5μg/mLから10μg/mL、及び1μg/mLから10μg/mLの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、組成物は、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、及び20μg/mLの単位用量でIL-1βを含む。
【０１０４】
乳管内組成物中のIFNγの単位用量は、1μg/mLから100μg/mL、10μg/mLから80μg/mL、25μg/mLから75μg/mL、及び50μg/mLから75μg/mLの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、1μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL及び100μg/mLの単位用量のIFNγを含む。
【０１０５】
乳管内組成物中のIFNαの単位用量は、1μg/mLから300μg/mL、10μg/mLから250μg/mL、25μg/mLから200μg/mL、及び50μg/mLから150μg/mLの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、1μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL及び300μg/mLの単位用量でIFNαを含む。
【０１０６】
乳管内組成物中のポリ(I:C)等のTLR3アゴニストの単位用量は、0.01μg/mLから50μg/mL、0.1μg/mLから40μg/mL、0.5μg/mLから25μg/mL、及び1μg/mLから20μg/mLの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、組成物は、0.01μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、及び50μg/mLの単位用量のポリ(I:C)を含む。
【０１０７】
乳管内組成物中のCpG-ODN等のTLR9アゴニストの単位用量は、0.01μg/mLから20mg/mL、0.1μg/mLから15mg/mL、1μg/mLから10mg/mL、10μg/mLから5mg/mL、50μg/mLから1mg/mLの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、組成物は、0.01μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、及び20mg/mLの単位用量のCpG-ODNを含む。
【０１０８】
乳管内組成物中の抗OX-40抗体等のOX-40アゴニストの単位用量は、0.01mg/mLから50mg/mL、0.1mg/mLから40mg/mL、0.5mg/mLから30mg/mL、及び1mg/mLから25mg/mLの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、組成物は、0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、及び50mg/mLの単位用量のOX-40アゴニストを含む。
【０１０９】
別の態様では、本開示は、1つ又は複数の生物活性剤を含む組成物が、追加の治療剤を更に含むことを提供する。そのような追加の治療薬は、乳房障害の治療のために有用な任意の薬剤であり得る。
【０１１０】
例示的な追加の治療薬には、チェックポイント阻害剤、乳がんを有する対象におけるエストロゲンの減少を目的とする抗ホルモン剤(例えば、抗エストロゲン又は抗エストロゲン受容体、例えばタモキシフェン、シス-タモキシフェン、エンドキシフェン、デスメチルタモキシフェン、ラソフォキシフェン、ラロキシフェン、ベンゾチオフェン、バゼドフォキシフェン、アルゾキシフェン、ミプロキシフェン、レボルメロキシフェン、ドロロキシフェン、クロミフェン、イドキシフェン、トレミフェン、EM652及びERA-923、フルベストラント、ARN-810、又はCH498、アナストロゾール、エクセメスタン及びレトロゾール)、ステロイド剤、アントラサイクリン系薬剤、甲状腺ホルモン補充剤、細胞傷害性薬、例えばアルキル化剤(テモゾロミド及びシクロホスファミド等)、アントラサイクリン系薬剤(ドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、エピルビンシン、イダルビシン等)、ミトキサントロン等のアントラセンジオン類、プラチナ系薬剤(シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、オルマプラチン、エンロプラチン等)、タキサン系薬剤(パクリタキセル等)、抗有糸分裂薬、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、パツピロン、カルレティキュリン、広範囲の細胞死剤、例えばグロッシポール、茶フェノール類、例えばエピガロカテキン-3-ガレート、7-ブロモインジルビン-3'-オキシム(7BIO)-、発がん性RAS、マクロリド類、ベルベリン(植物由来のイソキノリンアルカロイド)、UMI-77、トリプトリド及びセリネキソール、細胞外ヌクレオチダーゼの広範囲の阻害剤、例えばARL67156、テモゾロミドシクロホスファミド、マフォスファミド、ドキソルビシン、エピルビンシン、イダルビシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、腫瘍退縮ウイルス、パツピロン、チルフォスチンAG 490、ヤヌス活性化キナーゼ2/シグナル伝達因子及び転写活性化因子-3(JAK2/STAT3)阻害剤、DNA低メチル化剤(アザシチジン又はデシタビン等)、チミジル酸標的薬(ドセタキセル、ゲムシタビン等)、トラスツズマブ、アド-トラスツズマブエムタンシン、ペルツズマブ、アベマシクリブ、パルボシクリブ、抗IL-10阻害剤、抗TGF-β阻害剤、チェックポ
イント阻害剤(抗PD-1抗体、抗PD-1L抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体等)、抗CCR4抗体、抗FoxP3阻害剤、キメラ抗原受容体/T細胞(CAR-T)療法等の細胞療法、及び他の養子縁組細胞療法、又はそれらの組み合わせが限定されることなく含まれる。
【０１１１】
腫瘍浸潤調節性T細胞(T-reg;CD4+/CD25+/Foxp3+ T細胞)は、乳がんの最悪の転帰と関連している(Shou等、BMC Cancer. 2016年;16(1):687頁)。エストロゲンはT-regコンパートメントを拡張することによって免疫寛容を促進することが、研究により示されている(Prieto及びRosenstein. Immunology. 2006年5月;118(1):58〜65頁; Polanczyk等、International Immunology、19巻、3号、337〜343頁)。本開示は、乳がん対象においてT-regを減少させるための乳管内送達方法及び組成物を有利に提供する。したがって、いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、乳がんを有する対象におけるエストロゲンを減少させることを目的とする1つ又は複数の抗ホルモン(例えば、抗エストロゲン又は抗エストロゲン受容体)であり、タモキシフェン、シス-タモキシフェン、エンドキシフェン、デスメチルタモキシフェン、ラソフォキシフェン、ラロキシフェン、ベンゾチオフェン、バゼドフォキシフェン、アルゾキシフェン、ミプロキシフェン、レボルメロキシフェン、ドロロキシフェン、クロミフェン、イドキシフェン、トレミフェン、EM652及びERA-923、フルベストラント、ARN-810又はCH498、アナストロゾール、エクセメスタン並びにレトロゾールからなる群から選択される。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、抗PD-1(ニボルマブ等)、抗PD-1L(アテゾリズマブ(MPDL3280)、アベルマブ(MSB0010718C)、デュルバルマブ、MDX-1105等)、抗CTLA4(例えば、イピリムマブ)、抗LAG-3(IMP321、BMS-986016及びGSK2831781等)、OX-40アゴニスト、TIM阻害剤、IDO阻害剤、又はそれらの組み合わせからなる群から選択されるチェックポイント阻害剤を含む1つ又は複数のチェックポイント阻害剤である。
【０１１３】
本開示は、本開示を実施するために使用される1つ又は複数の生物活性剤、再分極化剤、DCからマクロファージへの遮断剤、及び追加の治療剤が、非限定的な例として、小分子阻害剤、小分子活性化剤、遺伝子、DNA、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド(ODN)、アプタマー、デンドリマー、コピーDNA(cDNA)、ネイキッドRNA、メッセンジャーRNA(mRNA)、マイクロRNA(miRNA)、アンチセンスRNA(ASR)、サイレンサーRNA(siRNA)、長鎖非コードRNA(lncRNA)、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣体、おとり配列、DNAワクチン、RNAワクチン、自己増幅型mRNAレプリコン、抗体(ヒト、ヒト化、キメラ、モノクローナル、ポリクローナル、単一特異性、二重特異性等)及び抗体フラグメント、糖類、多糖類、遺伝子療法(CRISPR/Cas9介在遺伝子編集等)等であり得ることを提供する。特許請求の範囲を含む本開示が抗体に言及する場合、本開示を実践するために使用することができる抗体フラグメントを含むことが抗体の範囲についての出願人の意図であることが、当業者により理解される。
【０１１４】
本発明を実施するために使用されるタンパク質、ポリペプチド及びペプチドは、天然の供給源から単離されるか、合成されるか、又は組換え生成されたポリペプチドであり得る。ペプチド及びタンパク質は、インビトロ又はインビボで組換え発現させることができる。本発明を実施するために使用されるタンパク質、ペプチド及びポリペプチドは、当技術分野で既知の任意の方法を使用して作製及び単離することができる。本発明を実施するために使用されるタンパク質、ポリペプチド及びペプチドはまた、当該分野で周知の化学的方法を使用して、全体的又は部分的に合成され得る。例えば、Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser.、215-223頁;Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser.、225-232頁; Banga、A.K、Therapeutic Peptides and Proteins、Formulation、Processing and Delivery Systems (1995) Technomic出版社、Lancaster、Pa.を参照のこと。例えば、ペプチド合成は、さまざまな固相技術を使用して実行でき(例えば、Roberge (1995) Science、269:202頁; Merrifield (1997) Methods Enzymol.、289:3-13頁を参照)、自動合成は、例えば、製造業者により提供された取扱説明書に従い、ABI 431Aペプチドシンセサイザー(Perkin Elmer社)を使用して達成されてもよい。
【０１１５】
生物活性剤、再分極化剤、及びDCからマクロファージへのシフト遮断剤の配列(例えば、タンパク質、ポリペプチド、遺伝子、DNA、ヌクレオチド配列)は、必要に応じて、公的及び商業的に入手可能なリソースから、又は当該技術分野で既知のNCBI Genbank及びシーケンスビューア等から決定することができる。
【０１１６】
タンパク質、ペプチド、及びポリペプチドは、ポリエチレングリコール(PEG)等の他の部分に結合させることができる。例えば、IFNαはPEG化されているか、アスパラギン(asprigine)-グリシン-アルギニンと結合している可能性がある。
【０１１７】
ポリヌクレオチドは、さまざまな形態で送達されてもよい。いくつかの実施形態では、裸のポリヌクレオチドを、線状形態で、又は発現プラスミド等のプラスミドに挿入して使用してもよい。他の実施形態では、ウイルス又は細菌ベクター等の生ベクターを使用してもよい。DNAのRNAへの転写及び/又はRNAのポリペプチドへの翻訳を支援する1つ又は複数の調節配列が存在し得る。メッセンジャーRNA(mRNA)分子であるポリヌクレオチドの場合等、場合によっては、転写プロセスに関連する調節配列(例えば、プロモーター)は必要ではなく、タンパク質発現はプロモーターの非存在下で行われてもよい。当業者は、状況に応じて適切な調節配列を含めることができる。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、本発明の組成物が投与される対象においてポリヌクレオチドが発現されることが可能となる調節配列に作動可能に連結される発現カセット中に存在する。発現カセットの選択は、組成物が投与される対象、並びに発現されたポリペプチドに望まれる特徴に依存する。
【０１１９】
典型的には、発現カセットには、対象において機能的であり、構成的又は誘導的であり得るプロモーター;リボソーム結合部位;必要に応じて開始コドン(ATG);目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;終止コドン;及び任意選択で3'末端領域(翻訳及び/又は転写ターミネーター)が含まれる。シグナルペプチドをコードする領域等の追加配列が含まれていてもよい。目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現カセット内の他の調節配列のいずれかと相同又は異種であってよい。シグナルペプチドコード領域等の目的のポリペプチドとともに発現される配列は、典型的には、発現されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに隣接されるように位置し、適切なリーディングフレームに配置される。発現されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドによって構成されるオープンリーディングフレームは、単独で、又は発現される任意の他の配列(例えばシグナルペプチド)と一緒に、組成物が投与される対象において転写及び翻訳が起こるようにプロモーターの制御下に配置される。
【０１２０】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される組成物が、薬学的に許容される担体を更に含み得ることを提供する。
【０１２１】
選択される担体は、特定の生物活性剤によって、及び乳管内投与のために部分的に決定され得る。キャリアは、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences  第16版、Osol、A.編  (1980)により記載されている。薬学的に許容される担体は、使用される用量及び濃度でレシピエントに対して一般に無毒であり、以下が含まれるが、これらに限定されない:リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝液;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド;ヘキサメトニウムクロライド;ベンザルコニウムクロライド;ベンゼトニウムクロライド;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;メチル若しくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、デキストリンを含む単糖、二糖、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;ショ糖、マンニトール、トレハロース、ソルビトール等の糖類;ナトリウム等の塩を形成する対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);並びに/又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤。
【０１２２】
適切な防腐剤には、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、及び塩化ベンザルコニウムが含まれてもよい。いくつかの態様では、2つ以上の保存剤の混合物が使用される。保存料又はその混合物は、典型的には、全組成物の約0.0001重量%〜約2重量%の量で存在する。
【０１２３】
いくつかの態様における緩衝剤は、組成物に含まれる。適切な緩衝剤には、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、並びに他のさまざまな酸及び塩が含まれる。いくつかの態様では、2つ以上の緩衝剤の混合物が使用される。緩衝剤又はそれらの混合物は、典型的には、全組成物の約0.001重量%〜約4重量%の量で存在する。投与可能な医薬組成物を調製する方法は既知である。例示的な方法は、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy、Lippincott Williams&Wilkins;第21版(2005年5月1日)において詳細に記載されている。
【０１２４】
製剤は、水溶液、アルコール溶液、又は水性アルコール溶液を含むことができる。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、組成物の担体は、液体疎水性物質等の疎水性物質の連続相を含んでもよい。連続相は、本質的に純粋な疎水性物質又は疎水性物質の混合物であってもよい。更に、担体は、疎水性物質が連続相を構成するという条件で、疎水性物質中の水のエマルション又は疎水性物質の混合物中の水のエマルションであってもよい。
【０１２６】
本明細書に記載される組成物において有用な疎水性物質は、薬学的に許容されるものである。担体は好ましくは液体であるが、常温で液体ではない特定の疎水性物質は、例えば加温によって液化されてもよく、本発明において有用でもある。一実施形態では、疎水性担体は、リン酸緩衝生理食塩水であってもよい。
【０１２７】
油又は油中水型エマルションは、本開示での使用に特に適した担体である。油は薬学的に許容されるべきである。適切な油には、例えば、鉱油(特に、ドラケオール(Drakeol)(登録商標)6VR等の軽質又は低粘度鉱油)、植物油(例えば、大豆油)、ナッツ油(例えば、ピーナッツ油)、又はそれらの混合物が含まれる。一実施形態では、油はモンタニド(Montanide)(登録商標)ISA 51として市販されている鉱油溶液中のオレイン酸マンニドである。動物脂肪及び人工疎水性ポリマー材料、特に、常温で液体であるか、比較的容易に液化できるものもまた、使用されてもよい。
【０１２８】
組成物が水を含まないリポソーム懸濁液(「水を含まない」(ウォーターフリー))であると記載される本明細書の実施形態では、これらの「水を含まない」組成物の疎水性担体は、水が担体の非連続相に存在することを条件として、依然として少量の水を含んでいる可能性がある。例えば、組成物の個々の成分は、凍結乾燥又は蒸発等のプロセスによって完全に除去されない可能性がある結合水を有することがあり、特定の疎水性担体は、その中に溶解した少量の水を含む可能性がある。一般に、「水を含まない」と記載されている本発明の組成物は、組成物の担体成分の総重量の重量/重量ベースで、例えば、約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%又は0.01%未満の水を含む。
【０１２９】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される組成物が、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びミセルとして製剤化されることを提供する。したがって、いくつかの実施形態では、1つ又は複数の生物活性剤、再分極化剤、遮断剤、追加の治療剤、又はそれらの任意の組み合わせが、(カプセル化された)リポソーム、微粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞及びミセル中に含まれる。他の実施形態では、1つ又は複数の生物活性剤、再分極化剤、遮断剤、追加の治療剤、又はそれらの任意の組み合わせは、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びミセルの表面上に含まれる。更に他の実施形態では、1つ又は複数の生物活性剤、再分極化剤、遮断剤、追加の治療剤、又はそれらの任意の組み合わせは、リポソーム、微粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びミセルの中及び表面上に含まれ得る。
【０１３０】
リポソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びミセルを作製する方法は、当技術分野で周知である。
【０１３１】
リポソームは、閉じ込められた水性容量を含む完全に閉じた脂質膜である。リポソームは、単層小胞(単一の二重層膜を有する)又は多層膜二重層に特徴付けられる多層小胞であってよく、各二重層は、水層によってその次と分離されていても、されていなくてもよい。本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「リポソーム」という用語は、「ニオソーム」、「トランスファーソーム」及び「ウイロソーム」として当技術分野で記載されるものを含むが、これらに限定されない、上記のすべての小胞構造を包含するものと意図される。リポソーム粒子の両親媒性構造は、親水性及び疎水性両方の医薬品のカプセル化を可能にする。
【０１３２】
リポソームの一般的な議論は、Akbarzadeh等、Nanoscale Research Letters 2013年、8:102頁;Gregoriadis G. Immunol. Today、11:89〜97頁, 1990年;及び、Frezard, F.、Braz. J. Med. Bio. Res.、32:181〜189頁、1999年に見出すことができる。リポソームを作製するための任意の適切な方法が、本発明の実施において使用され得るか、又はリポソームは、商業的供給源から取得され得る。リポソームは、典型的には、脂質二重層を形成するリポソーム成分(例えば、リン脂質及びコレステロール)を、純水又は水に溶解した1つ又は複数の成分の溶液であり得る水溶液で、例えば、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、リン酸を含まない生理食塩水、又はその他の生理学的に適合する水溶液で水和することにより調製される。
【０１３３】
リポソーム組成物は、例えば、天然脂質、合成脂質、スフィンゴ脂質、エーテル脂質、ステロール、カルジオリピン、カチオン性脂質、及びポリ(エチレングリコール)及び他のポリマーで修飾された脂質を使用することにより、取得され得る。合成脂質には、次の脂肪酸成分を含んでもよい;ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、アラキドイル、オレオイル、リノレオイル、エルコイル、又はこれらの脂肪酸の組み合わせ。リポソームの製造に特に適した脂質には、リン脂質、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、トリオレイン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、水素化大豆ホスファチジルコリン(HSPC)、ジステアロイルホスファチジルグリセロール(DSPG)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPG)、コレステロール、トリカプリリン、トリオレイン、N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-エタノールアミンナトリウム塩(MPEG-DSPE)、レシチン、セファリン、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン(EPC)、コハク酸二ナトリウム六水和物(DSH)、(1,2-ビス(オレオイルオキシ)-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン)(DOTAP)、1-[2-(オレオイルオキシ)エチル]-2-オレイル-3-(2-ヒドロキシエチル)イミダゾリニウムクロリド(DOTIM)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、及びジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)が含まれるが、それらに限定されない。
【０１３４】
DOTAPやDOTIM等のカチオン性合成脂質は、腫瘍の血管系及び乳管に親和性を有するカチオン性リポソームの調製に有用である。いくつかの実施形態において、リポソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、ミセルを作製することは、カチオン性合成脂質を使用して調製される。
【０１３５】
古細菌脂質から作製されたリポソームを含めて、任意のリポソームを本発明で使用することができるが、少なくとも1つの実施形態では、リン脂質及び非エステル化コレステロールがリポソーム製剤に使用される。コレステロールは、リポソームを安定化させるために使用され、リポソームを安定化する任意の他の化合物がコレステロールを置き換えてもよい。他のリポソーム安定化化合物は、当業者に知られている。例えば、飽和リン脂質は、安定性の増加を示す高い転移温度を有するリポソームを生成する。
【０１３６】
リポソームの調製に好ましく使用されるリン脂質は、ホスホグリセロール、ホスホエタノールアミン、ホスホセリン、ホスホコリン及びホスホイノシトールからなる群から選択される少なくとも1つの頭部基を有するものである。いくつかの実施形態では、リポソームは、94〜100%ホスファチジルコリンである脂質を含む。このような脂質は、レシチンホスホリポン(lecithin Phospholipon)(登録商標)90Gにおいて市販されている。非エステル化コレステロールもリポソーム製剤で使用される場合、コレステロールはリン脂質の重量の約10%に相当する量で使用される。コレステロール以外の化合物を使用してリポソームを安定化させる場合、当業者は、組成物に必要な量を容易に決定することができる。
【０１３７】
他の実施形態において、リン脂質(例えば、ホスホリポン(登録商標)90G)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、トリオレイン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、水素化大豆ホスファチジルコリン(HSPC)、ジステアロイルホスファジルグリセロール(DSPG)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPG)、コレステロール、トリカプリリン、トリオレイン、N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-エタノールアミンナトリウム塩(MPEG-DSPE)、レシチン、セファリン、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン(EPC)、コハク酸二ナトリウム六水和物(DSH)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)等のリポソーム成分又はリポソーム成分の混合物は、クロロホルム及びメタノールの混合物等の有機溶媒に可溶化させた後、ろ過(例えば、PTFE 0.2μmフィルター)し、例えばロータリーエバポレーションにより乾燥させて、溶媒を除去する。
【０１３８】
得られた脂質混合物の水和は、例えば、脂質混合物を水溶液に注入することによって、又は脂質混合物及び水溶液を超音波処理することによって達成され得る。リポソームの形成中、リポソーム成分は、リポソーム成分が水和される水溶液の容積を囲む単一の二重層(単層)又は複数の二重層(多層)を形成する。
【０１３９】
他の実施形態では、リポソームは、連続的な疎水性相を含む担体と組み合わせてもよい。
【０１４０】
担体が疎水性物質又は疎水性物質の混合物のみで構成されている場合(例えば、100%鉱油担体の使用)、リポソームは単に疎水性物質と混合させるか、又は複数の疎水性物質がある場合は、任意の1つ又はそれらの組み合わせと混合させてもよい。代わりに、疎水性物質の連続相を含む担体が不連続な水相を含む場合、担体は典型的には、油中水型エマルション等の疎水相中の水相のエマルションの形態をとる。そのような組成物は、エマルションを安定化し、リポソームの均一な分布を促進するために乳化剤を含んでもよい。乳化剤は、担体中のリポソームの均一な分布を促進する目的で、水を含まない担体が使用されている場合であっても有用であり得る。典型的な乳化剤には、オレイン酸マンニド(アーラセル(Arlacel)(商標)A)、レシチン(例えば、S100レシチン)、リン脂質、Tween(商標)80、及びSpans(商標)20、80、83及び85が含まれる。いくつかの実施形態では、疎水性物質の乳化剤に対する体積比(v/v)は、約5:1〜約15:1の範囲である。少なくとも1つの実施形態では、比率は約10:1である。
【０１４１】
リポソームは、最終のエマルションに加えてもよいし、乳化前に水相又は疎水相のいずれかに存在してもよい。いくつかの実施形態では、リポソームはその後、例えば、フリーズドライ又は凍結乾燥によって脱水されてもよい。
【０１４２】
1つ又は複数の生物活性剤は、製剤プロセスのさまざまな異なる段階で導入することができる。複数のタイプの生物活性剤(及び/又は再分極化剤又は遮断剤)を組成物に取り込むことができる(例えば、抗体及び小分子阻害剤又はsiRNA及びmRNA、ポリペプチド及びRNAワクチン等)。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、1つ又は複数の生物活性剤(及び/又は再分極化剤又は遮断剤)は、リポソームの脂質二重層(例えば、リン脂質及びコレステロール)を形成するために使用される成分を水和するために使用される水溶液中に存在する。この場合、1つ又は複数の生物活性剤(及び/又は再分極化剤又は遮断剤)は、その水性内部に存在するリポソームに封入される。得られたリポソームが洗浄又は乾燥されず、最終的に疎水性物質の連続相を含む担体と混合される残留水溶液が存在する場合、追加の分極化剤又は遮断剤が最終産物のリポソーム外に存在する可能性がある。
【０１４４】
関連する技術では、水溶液で水和する前に、1つ又は複数の生物活性剤(及び/又は再分極化剤若しくは遮断剤)を、リポソームの脂質二重層を形成するために使用される成分と混合することができる。1つ又は複数の生物活性剤を予め形成されたリポソームに添加することもでき、その場合、1つ又は複数の生物活性剤はリポソームに能動的にロードされる(すなわち、封入される)か、又はリポソームの表面にロードされる(例えば、結合する)か、又は抗原はリポソームの外部に留まり得る。そのような実施形態では、1つ又は複数の生物活性剤の添加前に、事前に形成されたリポソームは、空のリポソーム(例えば、封入された1つ若しくは複数の生物活性剤及び/又は再分極化剤若しくは遮断剤を含まない)であるか、事前に形成されたリポソームは、リポソームに取り込まれたか、会合した1つ又は複数の生物活性剤を含み得る。これらの工程は、疎水性物質の連続相を含む担体と混合する前に行ってもよい。
【０１４５】
別のアプローチでは、1つ又は複数の生物活性剤(及び/又は再分極化剤若しくは遮断剤)は、代わりに、担体がリポソームと組み合わされる前、途中又は後に、疎水性物質の連続相を含む担体と混合されてもよい。担体がエマルションである場合、1つ又は複数の生物活性剤(及び/又は再分極化剤若しくは遮断剤)を、乳化剤の前に、水相又は疎水性相のいずれか又は両方と混合してもよい。或いは、1つ又は複数の生物活性剤(及び/又は再分極化剤若しくは遮断剤)を、乳化後に担体と混合してもよい。いくつかの実施形態では、1つ又は複数の生物活性剤(及び/又は再分極化剤若しくは遮断剤)は、リポソーム内に存在してもよく、疎水性物質の連続相を含む担体中にも存在してよい。
【０１４６】
1つ又は複数の生物活性剤を含む組成物が追加の治療剤を更に含む場合、追加の治療剤は、上記のように組み合わせてもよい。
【０１４７】
スクロース等の糖等の安定剤、アルファ-トコフェロール等の抗酸化剤、又は生物活性を維持するか、化学的安定性を改善して1つ又は複数の生物活性剤の保存期間を延長する保存剤をそのような組成物に加えてもよい。他の賦形剤には、塩化ナトリウム(NaCl)及び塩化カルシウム、無水リン酸二ナトリウム、リン酸二水素カリウム等の塩が含まれ得る。
【０１４８】
一実施形態では、本発明の組成物を製剤化するために、S100レシチンとコレステロールの均質な混合物(例えば、10:1 w:w)を、1つ又は複数の生物活性剤(αDCカクテル、TLR3アゴニスト  ポリ(I:C)及びIFNα、及びTLR9アゴニスト  CpG-ODNS及びOX-40アゴニスト等)の存在下で、任意選択でリン酸緩衝液中で水和し、1つ又は複数の生物活性剤がカプセル化されたリポソームを形成させる。その後、リポソーム調製物を、任意選択で手動ミニ押し出し機を通して押し出してもよく、任意選択で追加の治療剤又は造影剤と混合してもよい。その後、この懸濁液を凍結乾燥し、疎水性物質の連続相を含む担体中に復元させ、水を含まないリポソーム懸濁液を形成してもよい。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、組成物は、トリオレイン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、水素化大豆ホスファチジルコリン(HSPC)、ジステアロイルホスファジルグリセロール(DSPG)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPG)、コレステロール、トリカプリリン、トリオレイン、N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-エタノールアミンナトリウム塩(MPEG-DSPE)、レシチン(0.01mg/ml〜0.2mg/ml)、セファリン(0.005mg/ml〜0.05mg/ml)、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン(EPC)、コハク酸二ナトリウム六水和物(DSH)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)(例えば、10:1 w:w)からなる群から選択される少なくとも1つの脂質成分と1つ又は複数の生物活性剤との均質混合物を、水和させて、再分極化剤、遮断剤又はその両方で封入されたリポソームを形成することにより製剤化してもよい。
【０１５０】
他の実施形態では、組成物は、トリオレイン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、水素化大豆ホスファチジルコリン(HSPC)、ジステアロイルホスファジルグリセロール(DSPG)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPG)、コレステロール、トリカプリリン、トリオレイン、N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-エタノールアミンナトリウム塩(MPEG-DSPE)、レシチン(0.01mg/ml〜0.2mg/ml)、セファリン(0.005mg/ml〜0.05mg/ml)、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン(EPC)、コハク酸二ナトリウム六水和物(DSH)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)(例えば、10:1 w:w)からなる群から選択される少なくとも2つの脂質成分の均質混合物を、1つ又は複数の生物活性剤の存在下で、任意選択でリン酸緩衝液中で、水和させて、1つ又は複数の生物活性剤で封入されたリポソームを形成することにより製剤化してもよい。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、組成物は、ジオレオイル-ホスファチジルコリン(DOPC)及びコレステロールの均質混合物(例えば、10:1 w:w)を、1つ又は複数の生物活性剤の存在下で、任意選択でリン酸緩衝液中で、水和させ、1つ又は複数の生物活性剤で封入されたリポソームを形成することにより製剤化してもよい。
【０１５２】
一態様では、本開示は、1つ又は複数の生物活性剤(及び/又は再分極化剤若しくは遮断剤)を含む組成物がナノ粒子として製剤化されることを提供する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子等は、脂質ナノ粒子(修飾されたリポソーム等)であってもよい。ナノスケールで修飾されたリポソームは、DNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、タンパク質、及び化学療法剤の送達のための優れた薬物動態プロファイルを持つことが示されている。したがって、いくつかの実施形態では、1つ又は複数の生物活性剤(及び/又は再分極化剤若しくは遮断剤)が脂質ナノ粒子に含まれる。他の実施形態では、1つ又は複数の生物活性剤は、ナノ粒子(例えば、実施例1に示されるような脂質被覆ナノ粒子等の脂質粒子)又はリポソームの表面にロードされる。
【０１５３】
他の適したナノ粒子には、ポリマーナノ粒子(例えば、ポリラクチド-ポリグリコリドコポリマー、ポリアクリレート及びポリカプロラクトン等の生分解性合成ポリマー、又はアルブミン、ゼラチン、アルギン酸塩、コラーゲン及びキトサン等の天然ポリマーを使用して製造される)、ポリマーミセル、ヒドロゲルナノ粒子、デンドリマー、貴金属ナノ粒子(金ナノ粒子等)等が含まれる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、組成物は、約900、800、700、600、500、400、300、200、及び100nmのいずれか以下等、約1000ナノメートル(nm)以下の平均径又は平均直径を有するナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均径又は平均直径は、約200nm以下である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均径又は平均直径は、約150nm以下である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均径又は平均直径は、約100nm以下である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均径又は平均直径は、約20〜約400nmである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の平均径又は平均直径は、約40〜約200nmである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は無菌濾過可能である。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子-及びリポソーム-応答性ポリマー、又はヒドロゲルからの1つ又は複数の生物活性剤の放出は、pH、温度、高周波又は磁場の変化により誘発され得る。
【０１５６】
一態様では、本開示は、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びミセルが、標的特異的薬物送達のために製剤化されることを提供する。このような標的特異性は、ナノ粒子及びリポソームを、DC、M1マクロファージ、及びB細胞等のAPCを標的とする1つ又は複数の細胞標的剤と結合させることによってもたらされる。本発明の目的に適した細胞標的化剤は、任意のAPC特異的細胞表面分子であり得る。M2-DCの免疫原性DC1への再分極化が望まれる場合、細胞標的剤は、任意のM2-DC選択的細胞表面分子であり得る。本開示は、ナノ粒子及びリポソームが、1つ又は複数のM2-DC選択的細胞表面分子でコーティングされることを提供する。当業者は、M2-DC選択的細胞表面分子がM2-DCに独占的に存在し得るが、他のDCにも存在し得ることを認識するであろう。しかしながら、適切なM2-DC選択的細胞表面分子は、M2-DC上で独占的に発現されるか、又は非M2-DCよりもM2-DC上でより高いレベルで発現されるものである。本発明の目的に適したM2-DC選択的細胞表面分子には、C1qタンパク質が、限定されることなく含まれる。本開示に適した他の細胞標的化剤には、DEC-205、Clec9A(DNGR-1)、DC-SIGN、BDCA1、BDCA2、BDCA3及びBDCA4等のAPC上の細胞表面分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５７】
本明細書に記載されるナノ粒子は、(凍結乾燥組成物等の)乾燥製剤中に存在してもよく、又は生体適合性媒体中に懸濁されてもよい。適した生体適合性媒体には、水、緩衝水性媒体、生理食塩水、緩衝生理食塩水、任意選択でアミノ酸の緩衝液、任意選択でタンパク質の緩衝液、任意選択で糖の緩衝液、任意選択でビタミンの緩衝液、任意選択で合成ポリマーの緩衝液、脂質含有エマルション等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５８】
ナノ粒子は、当技術分野で知られている任意の方法で調製することができる(Pal等、Journal of Applied Pharmaceutical Science 01(06); 2011年:228〜234頁; Hu Y等、Nanoparticles. Nano Letters、2007年; 7巻:3056〜3064頁; Hu YH等、Biomacromolecules、2009年;10巻:756〜765頁; Lynn DM、Langer R.、Journal of the American Chemical Society、2000年;122巻:10761〜10768頁を参照のこと)。
【０１５９】
1つ又は複数の生物活性剤、分極化剤、遮断剤、及び追加の治療剤の添加は、既知の任意の適切な手段によって達成することができる。非限定的な例として、線状又はプラスミド及びカセットとしてのDNA配列は、Goncalves等、Su等によって記載されるように、リポソーム、微粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びミセルに添加されてもよい。
【０１６０】
本開示は、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びミセルの脂質対核酸比(LNR)が30:1〜2.5:1の範囲であることを提供する。いくつかの実施形態では、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びミセルのLNRは、25:1〜5:1の範囲である。少なくとも1つの実施形態では、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びミセルのLNRは、20:1〜10:1の範囲である。
【０１６１】
本開示は、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びミセルの脂質対タンパク質比(LPR)が30:1〜1:1の範囲であることを提供する。いくつかの実施形態では、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びミセルのLNRは、25:1〜5:1の範囲である。少なくとも1つの実施形態では、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びミセルのLNRは、20:1〜10:1の範囲である。
【０１６２】
本開示は、本開示のリポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、小胞、及びミセルの小分子薬物対脂質(D/L)比が、典型的には、脂質mgあたり少なくとも0.05、0.1、0.2、0.35、0.5、又は少なくとも0.65mgの薬物であることを提供する。モル比に関して、本開示によるD/L比は、脂質モルあたり少なくとも約0.02から約5、少なくとも0.1から約2、及び約0.15から約1.5モルの薬物である。
【０１６３】
一態様では、本開示は、1つ又は複数の生物活性剤を含む組成物が、造影剤、色素又はコントラスト剤を更に含むことを提供する。適した造影剤は、ガドリニウムキレート、超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)、19Fパーフルオロカーボンナノ粒子、及び金属タンパク質ベースのMRIプローブ等の他の磁気レポーター遺伝子である。本明細書に開示される造影剤、色素及びコントラスト剤の添加は、本明細書に開示される組成物の乳管内送達及びこれらの組成物を貪食、飲作用又は他の機構によって取り込むAPCの遊走を追跡するという追加の利点を提供する。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、組成物は、デポー製剤、徐放性製剤、制御放出製剤として製剤化される。
【０１６５】
本明細書に開示される組成物は、対象の乳管への乳管内投与に適している。
【０１６６】
一態様では、本開示は、本明細書で開示される組成物が、当技術分野で既知の方法のいずれかによって対象の1つ又は複数の乳管に乳管内送達され得ることを提供する。これらには、注射器/針を使用した注射(Krause等、J. Vis. Exp. 2013年; (80): 50692頁)、マイクロニードル(例えば、固体、薬物コート、中空、及び溶解マイクロニードル)、カニューレ、マイクロカニューレ、カテーテル、マイクロカテーテル、及びプローブが含まれるが、それらに限定されない。
【０１６７】
薬物の経皮投与に適したマイクロニードルは、本開示の実践に使用することができる(Kim等、Adv Drug Deliv Rev. 2012年11月; 64(14): 1547〜1568頁、その全体が組み込まれる)。
【０１６８】
非限定的な例として、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、対象の母乳管に乳管内投与されてもよく、デバイスの治療チャンバー内に含まれる本明細書に開示される組成物を乳房の乳首と接触させることを含み、正圧をかけることにより、組成物が乳管開口乳管を介して母乳内に押し進むように、組成物に圧力をかけることを含む。好ましくは、組成物は1つ又は複数の乳管に押し込まれる。他の実施形態では、組成物は、2〜5個の乳管、4〜8個の乳管、又は7〜11個の乳管に押し込まれる。
【０１６９】
例えば、米国特許第6,413,228号は、管液を収集し、管に洗浄液を注入することができる管アクセスデバイスを開示している。このようなデバイスは、本開示の組成物の乳管内送達のためのこの開示の目的のために、適切に適合又は構成され得る。
【０１７０】
乳管内投与の別の方法として、管領域への組成物のゆっくりとした連続投与のために、管にアクセスするように、小さなポンプを管の内又は乳首の表面に設置してもよい。例えば、ポンプは、組成物をそこに投与するために乳管洞に設置され、残りの管への組成物の拡散を引き起こさせてもよいし、又はポンプは、管へアクセスするように乳首の表面に設置されてもよい。乳首表面に設置されたポンプは、例えば、タック(又は上部又はタック部分を有する指ぬき形状の部分及び乳首表面の残りが治療を必要とするか治療を必要とするリスクがある管に伸びている部分のような形状にすることができる。ポンプ機構は、例えば、Johnson&Johnson社により買収されたAlza社により製造されたDuros(商標)浸透圧(マイクロ)ポンプ(Viadur)、IntelliDrug、Alzet(登録商標)(Durect社)、Ivomec SR(登録商標)ボーラス等(Herrlich等、Advanced Drug Delivery Reviews、2012年、1617〜1626頁)を含むことができる。
【０１７１】
浸透圧ポンプはまた、本質的に米国特許第5,531,736号、米国特許第5,279,608号、米国特許第5,562,654号、米国特許第5,827,538号、米国特許第5,798,119号、米国特許第5,795,591号、米国特許第4,552,561号、又は米国特許第5,492,534号に記載されるポンプと実質的に同様に、乳房の管への投与、例えば、管への配置(例えば、乳管洞)のため、又は乳首表面への配置のためのサイズ及び容量の適切な変更を伴って、組み立てられるか、又は構成することもできる。(管にアクセスする)チップは、乳首表面のさまざまな位置の管に対応するために回転することが可能であってもよい。単一のタックヘッドポンプは、特定の管にアクセスするために、タックヘッドの下に、例えば、乳房の2つ以上の管にアクセスする必要がある場所に、1つ又は複数のチップを配置できる。このように構成され、乳管内投与のための本明細書に開示される適切に製剤化された組成物をロードしたポンプは、記載の組成物を投与することができるが、乳管における前がん又はがん状態の治療のための適切な治療目的のために本明細書に開示された組成物以外の薬剤も含有及び投与することができる。おそらく、ポンプは、サイズ及び容量の変更とともに、乳房にあるすべての管に投与されるように構成されてもよい。
【０１７２】
別の態様では、本明細書に開示される組成物の乳管内送達は、乳房の管への及び/又は管の内部での細胞の移動を助ける乳房への電流の印加を含むイオン導入法で支援されてもよい。
【０１７３】
本明細書に開示される組成物の投与のタイミング及び規模は、一般的に、リスクを低減し、又は毒性結果を最小化し、及び/又は効力を改善するように、例えば、経時的等、より速くかつ増加した対象の組成物への曝露を提供するように設計される。投与の量及び頻度は、患者の状態、年齢、体重、腫瘍サイズ及び病期、表面積、並びに対象の疾患の重症度等の要因によって決定されるが、適切な投与量は主治医によって決定されてもよい。
【０１７４】
最適な投与量及び投薬計画は、疾患の兆候について患者をモニターし、それに応じて治療を調整することで、医学分野の当業者により容易に決定することができる。組成物はこれらの投与量で複数回投与することができる。したがって、本方法は、一定期間にわたる単回用量又は複数回用量、又は例えば、注入による連続用量を包含することができる。いくつかの実施形態では、用量は、単一の単位用量であり得る。他の実施形態では、単回用量は分割単位用量であり得る。本明細書で使用される場合、「分割単位用量」という用語は、1日間に複数回にわたって投与されるように分割される単位用量を指し、1日を超えるものを含む。本発明の目的のための分割単位用量としては、単一の、すなわち1単位用量と見なされる。用量を分割する例示的な方法には、初日に用量の25%を投与し、残りを翌日に投与することが含まれる。別の実施形態において、単位用量は2つに分割されてもよく、それぞれ50%が2連続日に送達され得る。さらなる他の実施形態では、分割単位用量は、隔日で与えられてもよい。なお他の実施形態では、単位用量を3つに分割して、3連続日に等しく投与することができる。
【０１７５】
一態様では、本開示は、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、及び小胞のいずれかを含む組成物が、単位用量あたり1×104〜1×108のリポソーム  マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、又は小胞の濃度で乳管内投与されることを提供する。
【０１７６】
一態様では、本発明は、対象が本明細書に開示される組成物を投与され、ここで、1つ又は複数の生物活性剤がTable 2(表2)に提供される用量範囲で乳管内投与されることを提供する。
【０１７７】
【表２】
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【０１７８】
いくつかの実施形態では、本開示は、対象が0.05μg/mLから150μg/mL、0.1μg/mLから100μg/mL、及び0.5μg/mLから50μg/mLの範囲の単位用量でTNFαを含む組成物を乳管内投与されることを提供する。いくつかの実施形態では、TNFαを含む組成物は、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL及び200μg/mLの単位用量で投与される。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、本開示は、対象が、単位用量あたり0.01μg/mLから20μg/mL、0.1μg/mLから15μg/mL、0.5μg/mLから10μg/mL、及び1μg/mLから10μg/mLの範囲の単位用量でIL-1βを含む組成物を乳管内投与されることを提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、及び20μg/mLの単位用量でIL-1βを含む。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、本開示は、対象が、1μg/mLから100μg/mL、10μg/mLから80μg/mL、25μg/mLから75μg/mL、及び50μg/mLから75μg/mLの範囲の単位用量でIFNγを含む組成物を乳管内投与されることを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、1μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL及び100μg/mLの単位用量でIFNγを含む。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、本開示は、対象が、1μg/mLから300μg/mL、10μg/mLから250μg/mL、25μg/mLから200μg/mL、及び50μg/mLから150μg/mLの範囲の単位用量でIFNαを含む組成物を乳管内投与されることを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、1μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL及び300μg/mLの単位用量でIFNαを含む。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、本開示は、対象が、0.01μg/mLから50μg/mL、0.1μg/mLから40μg/mL、0.5μg/mLから25μg/mL、及び1μg/mLから20μg/mLの範囲の単位用量でポリ(I:C)等のTLR3アゴニストを含む組成物を乳管内投与されることを提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、0.01μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、及び50μg/mLの単位用量のポリ(I:C)を含む。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、本開示は、対象が、0.01μg/mLから20mg/mL、0.1μg/mLから15mg/mL、1μg/mLから10mg/mL、10μg/mLから5mg/mL、50μg/mLから1mg/mLの範囲の単位用量でCpG-ODN等のTLR9アゴニストを含む組成物を乳管内投与されることを提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、0.01μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、及び20mg/mLの単位用量のCpG-ODNを含む。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、本開示は、対象が、0.01mg/mLから50mg/mL、0.1mg/mLから40mg/mL、0.5mg/mLから30mg/mL、及び1mg/mLから25mg/mLの範囲の単位用量で、抗OX-40抗体等のOX-40アゴニストを含む有効量の組成物を乳管内投与されることを提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、及び50mg/mLの単位用量のOX-40アゴニストを含む。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、本開示は、対象が、αDCカクテル(TNFα、IL-1β、IFNγ、IFNα、及びポリ(I:C))を含む有効量の組成物を乳管内投与されることを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象がαDCカクテルを含む組成物を乳管内投与され、組成物の単位用量が:0.05μg/mLから150μg/mL、0.1μg/mLから100μg/mL、及び0.5μg/mLから50μg/mLの範囲のTNFα;0.01μg/mLから20μg/mL、0.1μg/mLから15μg/mL、0.5μg/mLから10μg/mL、及び1μg/mLから10μg/mLの範囲のIL-1β;1μg/mLから100μg/mL、10μg/mLから80μg/mL、25μg/mLから75μg/mL、及び50μg/mLから75μg/mLの範囲のIFNγ;1μg/mLから300μg/mL、10μg/mLから250μg/mL、25μg/mLから200μg/mL、及び50μg/mLから150μg/mL;及び0.01μg/mLから50μg/mL、0.1μg/mLから40μg/mL、0.5μg/mLから25μg/mL、及び1μg/mLから20μg/mLの範囲のポリ(I:C)を含むことを提供する。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、本開示は、対象が、TLR9アゴニストCpG-ODN及びOX-40アゴニスト抗体を含む組成物を乳管内投与され、ここで組成物の単位用量が、0.01μg/mLから20mg/mL、0.1μg/mLから15mg/mL、1μg/mLから10mg/mL、10μg/mLから5mg/mL、50μg/mLから1mg/mLの範囲のCPG-ODN、及び0.01mg/mLから50mg/mL、0.1mg/mLから40mg/mL、0.5mg/mLから30mg/mL、及び1mg/mLから25mg/mLの範囲のOX-40アゴニスト抗体を含むことを提供する。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、本開示は、対象が、TLR3アゴニスト  ポリ(I:C)及びIFNαを含む組成物を乳管内投与され、ここで組成物の単位用量が、0.01μg/mLから50μg/mL、0.1μg/mLから40μg/mL、0.5μg/mLから25μg/mL、1μg/mLから20μg/mLの範囲のポリ(I:C)、及び1μg/mLから300μg/mL、10μg/mLから250μg/mL、25μg/mLから200μg/mL、及び50μg/mLから150μg/mLの範囲のIFNαを含むことを提供する。
【０１８８】
本明細書に開示される方法は、初回用量を受けた可能性のある対象の乳管に組成物の1つ又は複数の連続用量を投与すること、及び/又は初回及び1つ又は複数の後続用量を投与することを包含する。用量は、特定の量で、特定のタイミングスケジュール及びパラメーターに従って投与される。
【０１８９】
別の態様では、初回用量は乳管内投与され、任意の後続用量は、乳管内投与、注射及び注入、例えば、静脈内又は皮下注射、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、トランス中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、サブコンジェクトバル(subconjectval)注射、結膜下注射、テノン嚢下注射、眼球後注射、眼球周囲注射、又はポステリアジャクスタスクレラル(posterior juxtascleral)送達を含む、任意の適した手段により投与される。いくつかの実施形態では、それらは、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療が望ましい場合は、病変内投与によって投与される。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、胸腔内、頭蓋内、又は皮下投与が含まれる。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、本方法は一般に、本明細書に開示される組成物の初回用量を乳管内投与することを包含し、それにより疾患の負担を軽減する。この後に、初回用量に対して特定時間帯に投与される組成物の後続用量、又は初回用量を受けた対象への後続用量の投与が続いてもよい。いくつかの実施形態での最初の用量は比較的低い。投与される組成物の量及び組成物の用量のタイミングは、APC(乳房組織に存在する、腫瘍組織に存在する、又はインバウンドAPC)の成熟、完全に成熟した抗原をロードしたAPCの流入領域リンパ節への(及び存在する場合、異所性及び/又は三次リンパ節への)遊走の増加、T細胞、B細胞、及び/又はNK細胞のいずれかのエフェクター細胞機能の活性化、T細胞、B細胞及び/又はNK細胞のいずれかによる乳房腫瘍浸潤の増加、T-regの減少、免疫抑制の減少、腫瘍サイズの減少及び炎症促進性サイトカイン、ケモカインの増加、M2-DCの再分極化、M2-シフトの減少又は阻害、細胞傷害性Tリンパ球の動員、及び他の免疫応答等の1つ又は複数の転帰を改善するように設計される。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、初回/最初の用量よりも数が増加した、したがってより高い用量での組成物の後続用量の投与を包含する方法である。
【０１９２】
投薬計画が複数回用量を包含する場合、各用量は、毎日、1日数回(2回、3回、4回等)、隔日、2日ごと、3日、5日、7日、14日、15日、3週間ごと、28日、毎月、四半期、6月、及び毎年投与されてもよい。
【０１９３】
いくつかの態様では、最初の用量後の用量のタイミングは、最初の(初回)用量の開始から次の用量の開始まで測定される。他の実施形態では、最初の用量後の用量のタイミングは、最初の(初回)用量の完了から測定される。
【０１９４】
本開示は、最初の用量が分割単位用量であり、その後に投与される第2用量が続いてもよいことを包含する。いくつかの実施形態では、第2又は後続用量は分割単位用量であってもよい。非限定的な例として、分割単位用量は、3日間にわたって投与してもよく、第2の単位用量をその翌日に投与するか、又は1年後に投与してもよい。最初の用量は、対象が細胞療法の用量を受けたことがないこと、又はなお、対象が以前に同じ組換え受容体を発現する、又は同じ抗原を標的とする同じ細胞の用量を受けたことがないことを暗示することによって、そのような用量を必要とする対象に関して、何らかの制限を生じさせることを意図している。
【０１９５】
一般に、本明細書に記載の組成物は、単位用量あたり1×104〜1×108のリポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、又は小胞のいずれかで乳管内投与することができる。
【０１９６】
併用療法
本開示は、本明細書に開示される乳管内送達方法が更に併用療法を含むことを企図する。一態様では、乳管内送達方法は、対象に1つ又は複数の追加の治療剤又は療法を投与することを更に含む。追加の治療薬は、乳管内、局所、経口、経鼻、注射又は注入による非経口、皮下等を限定無く含む、当技術分野で既知の任意の適した手段によって対象に投与することができる。追加の治療薬は、本明細書に開示される組成物に含まれても、独立して製剤化されてもよい。治療剤及び/又は療法の投与の順序は、任意の投与の順序であってもよい。例えば、本明細書に開示される組成物は、追加の治療剤と同時投与されてもよいし、又は追加の治療剤は、最初に投与されてもよいし、又は追加の治療剤は、本開示の組成物が投与された後に投与されてもよい。
【０１９７】
追加の治療薬は、本発明の目的に有用な任意のものであり得る。
【０１９８】
例示的な追加の治療薬には、チェックポイント阻害剤、乳がんを有する対象におけるエストロゲンの減少を目的とする抗ホルモン剤(例えば、抗エストロゲン又は抗エストロゲン受容体、例えばタモキシフェン、シス-タモキシフェン、エンドキシフェン、デスメチルタモキシフェン、ラソフォキシフェン、ラロキシフェン、ベンゾチオフェン、バゼドフォキシフェン、アルゾキシフェン、ミプロキシフェン、レボルメロキシフェン、ドロロキシフェン、クロミフェン、イドキシフェン、トレミフェン、EM652及びERA-923、フルベストラント、ARN-810、又はCH498、アナストロゾール、エクセメスタン及びレトロゾール)、ステロイド剤、アントラサイクリン系薬剤、甲状腺ホルモン補充剤、細胞傷害性薬、例えばアルキル化剤(テモゾロミド及びシクロホスファミド等)、アントラサイクリン系薬剤(ドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、エピルビンシン、イダルビシン等)、ミトキサントロン等のアントラセンジオン類、プラチナ系薬剤(シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、オルマプラチン、エンロプラチン等)、タキサン系薬剤(パクリタキセル等)、抗有糸分裂薬、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、パツピロン、カルレティキュリン、広範囲の細胞死剤、例えばグロッシポール、茶フェノール類、例えばエピガロカテキン-3-ガレート、7-ブロモインジルビン-3'-オキシム(7BIO)-、発がん性RAS、マクロリド類、ベルベリン(植物由来のイソキノリンアルカロイド)、UMI-77、トリプトリド及びセリネキソール、細胞外ヌクレオチダーゼの広範囲の阻害剤、例えばARL67156、テモゾロミドシクロホスファミド、マフォスファミド、ドキソルビシン、エピルビンシン、イダルビシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、腫瘍退縮ウイルス、パツピロン、チルフォスチンAG 490、(JAK2/STAT3阻害剤)、DNA低メチル化剤(アザシチジン又はデシタビン等)、チミジル酸標的薬(ドセタキセル、ゲムシタビン等)、トラスツズマブ、アド-トラスツズマブエムタンシン、ペルツズマブ、アベマシクリブ、パルボシクリブ、抗IL-10阻害剤、抗TGF-β阻害剤、チェックポイント阻害剤(PD-1抗体、抗PD-1L抗体、抗PD-L2抗体
、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体等)、抗CCR4阻害剤、抗FoxP3阻害剤、キメラ抗原受容体/T細胞(CAR-T)療法等の細胞療法、及び他の養子縁組細胞療法、又はそれらの組み合わせが限定されることなく、含まれる。
【０１９９】
追加の療法には、手術、放射線、化学療法、鍼治療、養子細胞療法等が含まれる。本明細書に開示される方法は、一次療法、ネオアジュバント療法(例えば、手術(乳房切除術や乳腺腫瘤摘出術等)又は化学療法の前)、又はアジュバント療法(例示目的のみ、化学療法又は養子細胞療法の他の方法での治療の後)として使用してもよい。
【０２００】
製品
養子細胞療法のための本明細書に開示される細胞及び組成物の投与のための、並びに細胞及び組成物の貯蔵及び投与のための、キット及びデバイス等の製品も本明細書に提供される。
【０２０１】
製品には、本明細書に開示される組成物、1つ又は複数の容器、包装材料、及びラベル又は対象への細胞の投与についての指示を一般に含む添付文書が含まれる。
【０２０２】
容器は、投与される組成物の1つ又は複数の単位用量を含む。いくつかの実施形態では、製品は、各々が組成物の単一の単位用量を含む、1つ又は複数の容器を含む。単位用量は、初回用量に対象に投与されるリポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、及び小胞のいずれかの量又は数であってもよく、又はナノ粒子、リポソーム等の初回又は後続用量に投与される数の2倍(又はそれ以上)であってもよい。投与方法に関連して対象に投与されるのは、ナノ粒子、リポソーム等の最低用量又は最低可能用量であってもよい。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、各容器は、同じか又は実質的に同じ数のリポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、及び小胞のいずれかを含む組成物の単位用量を個別に含む。したがって、いくつかの実施形態では、各容器は、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、及び小胞のいずれかと同じか、又はおよそか、又は実質的に同じ数を含む。いくつかの実施形態では、単位用量は、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、及び小胞のいずれかを1×104以上含む。いくつかの実施形態では、単位用量は、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ナノカプセル、ナノ粒子、ナノスフェア、脂質粒子、及び小胞のいずれかの1×104〜1×108を含む。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、製品は、チェックポイント阻害剤、乳がんを有する対象におけるエストロゲンの減少を目的とする抗ホルモン剤(例えば、抗エストロゲン又は抗エストロゲン受容体、例えばタモキシフェン、シス-タモキシフェン、エンドキシフェン、デスメチルタモキシフェン、ラソフォキシフェン、ラロキシフェン、ベンゾチオフェン、バゼドフォキシフェン、アルゾキシフェン、ミプロキシフェン、レボルメロキシフェン、ドロロキシフェン、クロミフェン、イドキシフェン、トレミフェン、EM652及びERA-923、フルベストラント、ARN-810、又はCH498、アナストロゾール、エクセメスタン及びレトロゾール)、ステロイド剤、アントラサイクリン系薬剤、甲状腺ホルモン補充剤、チミジル酸標的薬(ドセタキセル、ゲムシタビン、パクリタキセル又はカルボプラチン及びペグ化リポソームドキソルビシン等)、細胞傷害性薬、例えばアルキル化剤(テモゾロミド及びシクロホスファミド等)、アントラサイクリン系薬剤(ドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、エピルビンシン、イダルビシン等)、ミトキサントロン等のアントラセンジオン類、プラチナ系薬剤(シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、オルマプラチン、エンロプラチン等)、タキサン系薬剤(パクリタキセル等)、抗有糸分裂薬、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、パツピロン、カルレティキュリン、広範囲の細胞死剤、例えばグロッシポール、茶フェノール類、例えばエピガロカテキン-3-ガレート、7-ブロモインジルビン-3'-オキシム(7BIO)-、発がん性RAS、マクロリド類、ベルベリン(植物由来のイソキノリンアルカロイド)、UMI-77、トリプトリド及びセリネキソール、細胞外ヌクレオチダーゼの広範囲の阻害剤、例えばARL67156、テモゾロミドシクロホスファミド、マフォスファミド、ドキソルビシン、エピルビンシン、イダルビシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、腫瘍退縮ウイルス、パツピロン、チルフォスチンAG 490、ヤヌス活性化キナーゼ2/シグナル伝達物質及び転写活性化因子-3(JAK2/STAT3)阻害剤、DNA低メチル化剤(アザシチジン又はデシタビン等)、チミジル酸標的薬(ドセタキセル、ゲムシタビン等)、トラスツズマブ、アド-
トラスツズマブエムタンシン、ペルツズマブ、アベマシクリブ、パルボシクリブ、抗IL-10阻害剤、抗TGF-β阻害剤、トラスツズマブ、アドトラスツズマブエムタンシン、ペルツズマブ、アベマシクリブ、パルボシクリブ、キメラ抗原受容体/T細胞(CAR-T)療法等の細胞療法、及び他の養子縁組細胞療法等の追加の治療薬を更に含む。抗ホルモン剤は、タモキシフェン、シス-タモキシフェン、エンドキシフェン、デスメチルタモキシフェン、ラソフォキシフェン、ラロキシフェン、ベンゾチオフェン、バゼドフォキシフェン、アルゾキシフェン、ミプロキシフェン、レボルメロキシフェン、ドロロキシフェン、クロミフェン、イドキシフェン、トレミフェン、EM652からなる群から選択することができる。抗チェックポイント阻害剤は、抗PD-1、抗PD-1L、抗PD-L2、抗CTLA-4、抗LAG-3、抗TIM-3、抗OX40等からなる群から選択することができる。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、製品は、ガドリニウムキレート、超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)、19Fパーフルオロカーボンナノ粒子からなる群から選択される造影剤、色素又はコントラスト剤を更に含む。
【０２０６】
適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、及び輸液バッグ等の可撓性バッグが含まれるが、これらに限定されない。容器は、ガラス又はプラスチック等のさまざまな材料から形成されてもよい。いくつかの実施形態では、容器は、例えば、経乳頭送達のために並びに/又は細胞培養及び/若しくは貯蔵バッグ又は他の容器等の他の容器への又は他の容器からの輸送目的の接続のために、例えば、チューブ挿入又はカニューレ挿入を1つ又は複数のチューブに接続するための、1つ又は複数のポート、例えば、無菌アクセスポートを有する。
【０２０７】
製品は更に、1つ又は複数の識別情報及び/又は使用指示を有する添付文書又はラベルを含んでもよい。いくつかの実施形態では、情報又は指示は、内容物が乳房障害を治療するために使用できるか又は使用すべきであること、及び/又はそのための指示を提供することを示す。ラベル又は添付文書は、製品の内容物が乳房障害の治療に使用されることを示していてもよい。いくつかの実施形態では、ラベル又は添付文書は、例えば、提供される方法の実施形態のいずれかに従って、細胞の初回及び1回以上の後続用量の乳管内投与を含む方法を介して、対象、例えば乳房障害を有する対象を治療するための指示を提供する。いくつかの実施形態では、取扱説明書は、初回用量での1回の単位用量、例えば、製品中の単一の個々の容器の内容物の投与を指定し、その後、指定された時点又は指定された時間範囲内及び/又は対象の1つ又は複数の要因又は結果の有無又は量又は程度の検出後に1回以上の後続用量が続く。
【０２０８】
本明細書で使用される場合、「a」、「an」、及び「the」という用語は、文脈が他を指示しない限り、複数の参照を含む。
【０２０９】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、量、時間的期間等の測定可能な値を指し、指定された値から±20%、いくつかの例では±10%、又はいくつかの例では±5%、いくつかの例では±1%、及びいくつかの例では±0.1%の変動を包含することを意味する。それは、そのような変動は開示された方法を実行するために適切であるからである。
【０２１０】
本明細書で使用される場合、「活性化」という用語は、検出可能な細胞増殖を誘導するために十分に刺激されている細胞の状態を指す。活性化は、誘導されたサイトカイン産生、及び検出可能なエフェクター機能とも関連している可能性がある。「活性化T細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂を受けているT細胞を指す。
【０２１１】
本明細書で使用される場合、「アジュバント療法」という用語は、一次療法に続く、再発のリスクがある対象に投与される療法を指す。これらは、乳房障害の病歴を有し、別のモードの療法で治療された対象である。乳がんの場合のアジュバント全身療法は通常、再発を遅らせ、生存期間を延ばし、又は対象を治癒させるために、一次療法の直後に始められる。本明細書で使用される場合、「一次療法」は、対象における乳房障害の最初の診断時の治療の第一線を指す。非限定的な例示的一次療法は、手術、広い範囲の化学療法、及び放射線療法を含み得る。
【０２１２】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル、多鎖又は単鎖、又はインタクトな免疫グロブリンであってよく、天然の供給源又は組換え供給源に由来してもよい。IgG等の抗体は、典型的には、免疫グロブリン分子の四量体である。
【０２１３】
本明細書で使用される場合、「抗体フラグメント」という用語は、インタクトな抗体又はその組換え変異体の少なくとも一部を指し、抗原結合ドメイン、例えば、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を指し、これは、抗原等の標的に対する抗体フラグメントの認識及び特異的結合を付与するのに十分である。抗体フラグメントの例には、Fab、Fab'、F(ab')2、及びFvフラグメント、scFv、線状抗体、sdAb(VL又はVHのいずれか)等の単一ドメイン抗体、キャメリドVHHドメイン、並びに抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。「scFv」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも1つの抗体フラグメント及び重鎖の可変領域を含む少なくとも1つの抗体フラグメントを含み、軽鎖及び重鎖の可変領域が短い柔軟なポリペプチドリンカーを介して隣接して連結されている融合タンパク質を指し、一本鎖ポリペプチドとして発現することが可能であり、ここでscFvはそれが由来するインタクトな抗体の特異性を保持している。特に指定されない限り、本明細書で使用する場合、scFvは、VL及びVH可変領域をいずれかの順序で有してもよく、例えば、ポリペプチドのN末端及びC末端に関して、scFvは、VL-リンカー-VHを含んでもよいし、VH-リンカー-VLを含んでもよい。
【０２１４】
本明細書で使用される場合、「対象」、「患者」、及び「個体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ヒト等の哺乳動物を指す。哺乳動物には、イヌ、ネコ等のペット動物、ラット、マウス等の実験動物、及びウシやウマ等の家畜も含まれる。他に指定しない限り、哺乳類は任意のジェンダー又は性別であってよい。
【０２１５】
本明細書で使用される場合、「投与経路」又は「送達経路」は、組成物を対象に送達するための経路を指し、典型的には、組成物が投与される場所(例えば、経口、静脈内等)又は投与の標的(例えば、局所、経腸、非経口等)を指す。本開示において「投与経路」又は「送達経路」は交換可能に使用され得る。
【実施例】
【０２１６】
(実施例1)
脂質コーティングCpG-ODN及びCpG-ODN+OX-40アゴニスト抗体ナノ粒子の合成
脂質被覆ナノ粒子の調製。poly-1コアを含む脂質被覆ナノ粒子は、Su等によって記載されるように合成される(Molecular Pharmaceutics 8巻、3号(2011年6月6日):774〜787頁)。簡潔に述べると、poly-1コアを含む脂質被覆ナノ粒子は、2つの異なるプロセス:二重エマルション/溶媒蒸発アプローチ又は溶媒拡散/ナノ沈殿ストラテジーを介して合成される。二重エマルション合成については、30mgのpoly-1(又はpH非感受性対照粒子の場合はPLGA)及び7:2:1のモル比のリン脂質DOPC、DOTAP、及びDSPE-PEGの2mgが1mlのジクロロメタン(DCM)中に共溶解される。次に、200μlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を、プローブチップソニケーター(Misonix XL2000、Farmingdale、NY)を使用して7Wで1分間超音波処理段階の間に、氷上で混合物に追加して、最初のエマルションを形成する。次に、一次エマルションを、6mlの蒸留脱イオン化ヌクレアーゼフリー水に12Wで5分間の超音波処理とともに分散させた後、シェーカーに25℃で18時間置いて、有機溶媒を蒸発させる。ナノ沈殿合成については、同じ量のDOPC、DOTAP、及びポリマーを4mlのエタノールに共溶解し、40mlの蒸留脱イオン化ヌクレアーゼフリー水に滴下して加え、その後、5時間穏やかに攪拌して、エタノールを蒸発させる。DSPEは、挿入後プロセスを介して脂質コーティングに導入される:DSPE脂質は、蒸留脱イオン化ヌクレアーゼフリー水中に1mMで0.5mg/mlの粒子に添加され、懸濁液は25℃で16時間攪拌される。粒子は回収され、遠心分離により1回洗浄され、新鮮な水に再懸濁され、使用するまで4℃で保存される。無脂質PVA安定化粒子は、有機エマルション又はポリマーのみを含む溶液が2% w/vol PVA水溶液に分散されることを除いて、同様のプロセスにより調製される。
【０２１７】
各粒子バッチの分画を真空オーブンで乾燥させ、乾燥質量を測定して粒子濃度(mg/ml)を決定する。動的光散乱(DLS)及びゼータ電位の測定は、ZetaPALS動的光散乱検出器(Brookhaven Instruments社)を使用して粒径及び表面電荷を決定するために使用される。取り込まれた脂質の割合及び脂質表面コーティングに存在する脂質の得られたモル%を見積もるために、脂質被覆粒子は、カルボキシフルオレセイン標識DSPE脂質(DSPE-CF)の挿入後の前に、粒子に取り込まれた脂質の総量を測定するために、上記のナノ沈殿に1モル%のDOPE-ローダミンをトレーサーとして添加して調製される。次に、2%トリトンX-100で15分間処理することにより、脂質を粒子表面から取り除き、上澄みを、ローダミン及びフルオレセインの両方のシグナルについて測定して、取り込まれた脂質の量を定量する。
【０２１８】
脂質被覆ナノ粒子の表面構造を極低温電子顕微鏡法(cryoEM)で調べるために、粒子懸濁液(3uL)を1.2/1.3μmの穴あき炭素被覆銅グリッド(電子顕微鏡科学)上にブロットし、Leicaプランジ冷凍機を使用して、液体エタン中で試料をすぐに冷凍し、粒子を氷中に埋め込む。試料を極低温ホルダーに移し、JEOL 2200FS透過型電子顕微鏡を使用して、放出電流185μA、倍率40000倍で画像化する。
【０２１９】
CpG-ODNのローディング。米国Invivogen社から入手できるCpG-ODN(1.5mL、200μg/mL、pH=5.7)をナノ粒子にコーティングする。1から3層を沈着させる。アセンブリ後、遠心分離(15000rpm、25分)によって上清を収集する。上清中のCpGの量は、UV-Vis分光法によって特徴付けられる。262nm及び278nmでの吸光度を使用して、CpGを特徴付ける。粒子にロードされたCpGの量は、上清中のCpGの量を、加えた元の材料と比較して差し引くことによって計算される。
【０２２０】
OX-40アゴニスト抗体のローディング。OXアゴニスト抗体をロードしたCpG-ODNナノ粒子についても、OX-40アゴニスト抗体をナノ粒子の表面に沈着させ(2mL、200mg/mL)、ナノ粒子へのコーティングに使用される。1から3層を沈着させる。抗体の量は、上清中の抗体の量を、加えた元の材料と比較して、差し引くことによって決定される。
【０２２１】
(実施例2)
α-タイプ1分極化ナノ粒子の合成
α-タイプ1分極化生物活性剤(αDCカクテル)をカプセル化するナノ粒子は、Kocbek等、J. Control. Release、120、18〜26頁  (2007)によって記載された方法に従って調製される。臨床グレードのポリ(I:C)は、Hemispherx Pharmaceuticals社からリンタトリモド(Rintatolimod)又はアンプリゲン(Ampligen)(登録商標)として市販されている。
【０２２２】
簡単に説明すると、400μLのαDCカクテル(TNFα(500μg/mL)、IL-1β(2.5μg)、IFNγ(1250μg/mL)、PEG-IFNα-2b(1250μg/mL)、及びポリ(I:C)(100μg/mL))を200mgのポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA、Sigma-Aldrich社)を含む酢酸エチルに添加する。次に、混合物を20,000rpmで撹拌しながら(ホモジナイザー、IKA社)同時に超音波処理(超音波浴:500W、30kHz、BRANSON社)する。乳化の3分後、8mLのポリビニルアルコール水溶液(PVA、5%)を水/油エマルションに加えて水/油/水二重エマルションを形成し、これを5分間撹拌する。ナノ粒子を固化するために、二重エマルションを200mLの0.1%PVAの水溶液とともに500rpmで2時間撹拌することによって、有機溶媒を蒸発させる。酢酸エチルを完全に除去するために、ナノ粒子の分散液を、ロータリーエバポレーターを40℃で使用して体積の約半分に濃縮する。得られたナノ粒子を3,000rpmで20分間遠心分離し、リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄する(PBS)。粒子の平均サイズは、粒子サイズアナライザー(ELS-Z、Otsuka社)を使用して測定される。
【０２２３】
一部のバッチでは、この実施例に記載する方法を使用して生物活性剤IFNα-2b、ポリ(I:C)、TNFα、IL-1β、IFNγ、PEG-IFNα、及びポリI:Cを含むナノ粒子を個々に調製する。個々の生物活性剤を含むナノ粒子を組み合わせて、生物活性剤のカクテルを作製する。
【０２２４】
生物活性剤の濃度は、0.1%SDS及び0.1N NaOHを含む溶解バッファーでナノ粒子を溶解した後に決定される。TNFα、IL-1β、IFNγ、PEG-IFNα-2b、及びポリI:Cの量は、260°nmで測定される。
【０２２５】
(実施例3)
生物活性剤の乳管内投与TLR9アゴニストCpG-ODN及びOX-40アゴニスト
治療プロトコル。本研究の主な目的は、TLR9アゴニストCpG-ODN及びOX-40アゴニスト(例えば、MOXR0916)(総称して「薬剤」)の乳管内投与の安全性及び忍容性を、プラセボと比較して評価することである。本研究の第2の目的は、(i)免疫細胞の可動化、対象における抗原提示、及び(ii)治療後の全奏効率及び無増悪生存期間を評価することにより、予備的有効性を評価することである。
【０２２６】
乳がんを有する88人の対象が無作為化され、プラセボ又は薬物による治療を受ける。全ての対象は1〜2日目に放射線療法を受ける。2、9、16、及び23日目に、対象はプラセボ(コホート1;n=8)又は1mg(コホート2;n=20)、5mg(コホート3;n=20)、及び10mg(コホート4;n=20)及び20mg(コホート5;n=20)mgのTLR9アゴニストCpG-ODNを乳管内投与(以下に記載のように)される。3、10、30、60、90、120、及び160日目に、コホート2、3、4、及び5の対象は、プラセボ(n=5)又は10mg/mL(n=5)、100mg/mL(n=5)及び200mgs/mL(n=5)の抗OX-40抗体を乳管内投与され、コホート1の対象はプラセボを受ける。
【０２２７】
TLR9アゴニストは、臨床グレードのクラスC CpG-ODN M362(5'-tcgtcgtcgttc:gaacgacgttgat-3'(25mer))又はCpG-ODN 2395(5'-tcgtcgttttcggcgc:gcgccg-3'(22mer))である。OX-40抗体は、T細胞を活性化することができるOX-40リガンドを模倣するアゴニストである。
【０２２８】
乳首の準備。対象が脱衣した後、臨床医は研究する乳房の乳首をクリーニングする。これには、わずかな粒状のゲル又は軟膏で乳首をきれいに拭いて、死んだ皮膚細胞及び蓄積した油を緩めて除去することが含まれる。これは病院で医療前によく使われるクレンザーのことである。その後、乳首に何らかの麻酔クリームを塗布する。
【０２２９】
乳首麻酔。0.1〜0.2mLの青色色素と混合した1mLのリドカインを非常に小さな針で乳首の根本に注入する。
【０２３０】
管識別。色素の注射後、カテーテル配置の前に、管開口部を更に識別して拡張するために、小さな柔軟なワイヤーを開口部に約1/2インチ挿入する。管が識別されたら、結び目を付けた縫合糸の小片を管に挿入して、それをマークする。これは、少なくとも3つの管開口部に行われ、5つほど行われる。臨床医が少なくとも3つの管開口部を見つけることができない場合は、対象は研究を続けることができず、中断される。これらの対象は新しく登録された対象に置き換えられる。
【０２３１】
カテーテル配置、CpG-ODN及び抗OX-40抗体、並びにX線検査。すべての乳頭管開口部がマークされると、臨床医は、各マークされるようマークされた乳管に、管口からカテーテルを挿入して配置させる。カテーテルが設置されたなら、臨床医は任意選択でゆっくりと(30秒以上)1mL未満の放射線不透過性色素を管に滴下注入し、管を画像化させてもよい。
【０２３２】
色素の滴下注入後、同定された乳管の数に依存して、クラスC CpG-ODN TLR9アゴニストを含む第1の組成物の2mLまで(一般に0.5mLから2mLの範囲)、2、9、16及び23日目に対象の各乳管にゆっくりと(1分以上)乳管内送達される。免疫刺激活性を有する可能性のあるOX-40アゴニスト抗体を含む第2の組成物を、3、10、30、60、90、120、及び160日目に、対象の各乳管に乳管内投与する。OX-40抗体は、OX-40リガンドを模倣してT細胞を活性化する。がんを含む乳房のみが治療される。組成物は、治療すべき管の数に応じて、バッチ又はセットで最大10mLまでの容量で、乳管に乳管内投与される。
【０２３３】
同定された発症した管又は小葉の数に基づいて、管ごとに用量を均等に分配する試みがなされる。
【０２３４】
カテーテルは通常、各管の内におよそ1〜5分間留める。処置中、対象は視覚的アナログスケールを使用して痛みを評価するよう問われる。色素及びナノ粒子が滴下注入された後、管内への改変細胞の適切な注入を示すために画像が撮られる。発症した管の数が2管より多い場合、乳管内療法の手順はセットで行われてもよい。カテーテルは、最初の管のセット、例えば隣接する2つの管から取り除かれ、これらの管は各々、結んだ縫合材料の小片でマークされる。この時点で、痛み評価用の痛みスケールを使用して対象の痛みを評価する。
【０２３５】
その後、マークされた残りの管に新しいカテーテルが挿入される。次の半分の乳首管にカニューレを挿入し、色素と細胞を注入した後、フルオロスコープで別の画像を撮影して、管を記録する。対象は再び痛みを評価するよう問われる。カテーテルが取り除かれ、管は結んだ縫合材料の小片で個別にマークされる。ベンゾイン軟膏と透明なプラスチックドレッシング(生体閉塞性)を乳首に付けて、手術までマーカーを固定する。全体の手順は0.5〜1.5時間かかる。手順の写真が撮られる。
【０２３６】
痛みの評価中に対象が乳房のグレード3又は4の痛みを報告し、組成物の注入後10分以内にそれが解消しない場合、その対象についての研究関連手順は中止される。本明細書に記載される採血及び追跡評価並びに病理学的評価は、プロトコルに従って行われる。この場合、統計上の目的で、研究グループの対象は置き換えられる。
【０２３７】
最初のX線検査の穿孔が認められない場合は、副作用が直ちに評価される。対象が有害な影響を報告しなければ、残りの管にカニューレが挿入され、ナノ粒子が投与される。研究に関連する採血と評価、及び以下で記載する病理学的評価は、プロトコルごとに実行される。
【０２３８】
本研究投与の2日目、プラセボ又は薬物のいずれかを投与する前、バイタルサイン(収縮期/拡張期血圧、脈拍、体温、呼吸数)及び顔面紅潮の発生を投与前及び次の時点:用量投与後1、2、4、8、及び12時間にチェックする。投与前及び初回投与4時間後に12リードECGを行う。バイオマーカー及び薬物動態(PK)分析用の血液サンプルは、ベースラインを確立するために、投与の10±1分前に収集される。
【０２３９】
9、16、23、30、60、90、120、160日目及び本研究の終了時に、バイタルサイン(収縮期/拡張期血圧、脈拍、体温、呼吸数)及び顔面紅潮の発生をチェックする。投与前60分以内にECGもまた行われ、血液学、血清化学、凝固及び尿検査、PK分析用の血液サンプルが研究薬剤投与の10±1分前に収集される。
【０２４０】
腫瘍の生検は、治療前及び治療中又は治療後に取られる。腫瘍流入領域リンパ節の連続生検も、治療前、治療中、及び治療後に取られる。腫瘍反応は、RECIST v1.1を使用して評価される。組織生検は、組織に存在する免疫細胞とサイトカインの免疫表現型検査に使用される。
【０２４１】
各用量群の安全性プロファイルと忍容性は、臨床評価、対象報告、及び研究期間中の積極的なフォローアップによって決定される。全ての有害事象が、重大度に関係なく記録され及び評価される。
【０２４２】
APCの成熟及び免疫反応。対象におけるpDC等のAPCの成熟及び免疫応答は、IL-12p70、IFNα及びIL6等のサイトカインの放出、CCR7の発現等のAPC上の成熟マーカーの上昇、及びOX-40L、CD40等のAPC上の共刺激分子、及びT細胞、B細胞、及びNK細胞等のエフェクター免疫細胞の活性化をもたらす抗原提示の増加を測定することによって決定される。統計分析は、Microsoft Excel(Microsoft社、Redmond、WA)及びSPSS v18.0(SPSS社、Chicago、IL)を使用して実行される。CD11c+HLA-DR+DC及びCD123+HLA-DR+DC(pDC)の存在が決定され、それらの比率が計算される。免疫細胞及びサイトカイン放出からのデータは、対応t検定で分析される。異なる群を使用した免疫細胞変化からのデータは、両側t検定で試験される。免疫細胞変化は、ピアソンの相関係数を使用して分析される。0.05未満のP値は統計的に有意であると見なされた。
【０２４３】
インビトロアッセイ-サイトカイン放出。対象の血清サイトカインレベルを測定して、対象の免疫細胞の刺激の変化を決定する。IL6、IL8、MIP-1α、MIP1β、IL10、IL12p70、IL17A、IFNα、IFNγ、TNFα、Il-23、IL-27及びGM-CSFの血清サイトカインレベルは、Qiagen社、Germantown、MDからのヒト炎症性サイトカインマルチ分析ELISArrayキットMEH-004A等の市販のELISAキットを使用して、2日目の第1の組成物CpG-ODNの乳管内送達の前及び組成物CpG-ODNの乳管内投与後4時間、8時間、12時間、24時間、36時間、48時間、及び72時間にアッセイされる。IL-13分泌の変化は、Miltenyi Biotec社及びThermo Fischer社からのもの又はR&D Biosystems社のヒトIL-13 Luminexパフォーマンスアッセイ等の市販のIL-13分泌ELISAアッセイを使用して決定される。サイトカイン分泌は、アッセイの線形範囲内となるように希釈されたサンプルにおいて測定される。IL12p70、IL-23、IL-27、IFNα及びIL6のような炎症促進性サイトカイン及びケモカインの時間依存的な増加レベルは、対象におけるpDCのようなAPCの活性化及び成熟を示す。
【０２４４】
免疫細胞の可動化。
APC。DC、M1マクロファージ及びB細胞等の成熟抗原にロードされたAPCは、対照と比較して薬物治療を受けた対象の乳房組織に、より高レベルで存在すると予測され、エフェクター細胞への抗原提示のために流入領域リンパ節に遊走すると予測される。したがって、薬物治療を受けた対象の流入領域リンパ節における成熟APCは、プラセボ対象よりも高レベルで検出されると予測される。腫瘍生検サンプルは、免疫組織化学(IHC)又はフローサイトメトリー(例えば、Bio-Rad社、AbCam社等の製造業者の取扱説明書に従って)によって成熟APCの存在について試験される。腫瘍生検サンプルは、走化性指向及び遊走速度調節分子CCR7、CD40、CD83、CD86、OX-40L、CD209及び他に対するFITC又はPE標識抗体等を使用して、APC成熟メーカーで免疫表現型決定又は染色される(Bio-RAD社、Invitrogen社、Biolegend社、R&D Systems社、AbCam社、及びBD Biosciences社から入手可能)。
【０２４５】
連続リンパ節生検は、APCの遊走を決定するために使用される。CCR7、CD40、CD83、及びOX-40Lを発現するDCは、生検組織の免疫組織化学又はフローサイトメトリーによって検出できる。単細胞懸濁液(SSC)は、生検リンパ節サンプルから調製される。細胞数と生存率は、改良型ノイバウアー血球計算盤とトリパンブルー染色を使用して測定される。サンプルは、CCR7、CD40、CD83、CD86、OX-40L(Bio-RAD社、Invitrogen社、Biolegend社、R&D Systems社、AbCam社、及びBD Biosciences社から入手可能)に対するFITC又はPE標識抗体等のAPC成熟メーカーで免疫表現型決定又は染色される。
【０２４６】
T細胞。流入領域リンパ節に存在するT細胞は、成熟抗原にロードされたAPCによる腫瘍抗原提示及びサイトカインシグナル伝達によって活性化されると予測される。流入領域リンパ節のT細胞の活性化は、対象のリンパ節のCD4+Th1細胞CD8+細胞傷害性T細胞、Tfh細胞のレベルを測定することによって決定される。単細胞懸濁液(SSC)は、生検リンパ節サンプルから調製される。細胞数と生存率は、改良型ノイバウアー血球計算盤とトリパンブルー染色を使用して測定される。サンプルは、CD3、CD4、CD8、CD56、CD19、CD-28、CD69、CD40L、OX-40、CD134、及びCD137(Invitrogen社)に対するPE又はFITC標識抗体で免疫表現型決定又は染色され、1%パラホルムアルデヒドで固定した後で、LSR IIフローサイトメーター(BD Biosciences社、San Jose、Ca)で分析され、WinList(Verity Software House社、Topsham、ME)を使用してデータ処理する。
【０２４７】
活性化T細胞による乳房腫瘍組織の浸潤は、IHCによる腫瘍生検組織又は上記のようなCD4+Th1細胞及びCD8+CTLのT細胞マーカーでの免疫表現型決定又は染色によるフローサイトメトリーを使用して決定される。
【０２４８】
B細胞、形質細胞、形質芽細胞。活性化B細胞による乳房腫瘍組織の浸潤は、腫瘍生検組織を使用して決定され、対象の末梢血単核細胞(PBMC)は、上記のようにIHC又はフローサイトメトリーによって(フライバーグ分類に基づいた)B細胞マーカー、CD19アロフィコシアニン-Cy7、CD20-PE、IgD FITC、IgM PE-Cy5、CD38 PE-Cy7、Igκアロフィコシアニン、IgλPE、IgG PE-Cy5、CD27 PE、CD21アロフィコシアニン、CD40 FITC、CD86 PE-Cy5、初期活性化マーカーCD69 FITC(Becton Dickinson社)、及びIgA FITC(Miltenyi Biotec社)に対するPE-又はFITC標識抗体による免疫表現型決定又は染色によって、B細胞について免疫表現型決定される。
【０２４９】
薬物治療を受けた対象の乳房腫瘍組織は、B細胞の浸潤がより多く、活性化及び記憶B細胞マーカーを発現する形質細胞と形質芽細胞の数がより多く、例えば、C80+ B細胞、CD86+ B細胞、CD40L活性化B細胞、及び/又はCD20+ B細胞(記憶細胞)が上昇していると予測される。浸潤性B細胞の存在は、乳がんを有する対象の陽性転帰と相関している(Tsou等、Cancer Research. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-16-0431; Mehmoud等、Breast Cancer Res Treat 2012年;132:545〜53頁)。
【０２５０】
NK細胞。流入領域リンパ節に存在するNK細胞は、成熟抗原をロードしたAPCによって活性化され、プラセボ治療を受けた対象と比較して、薬物治療を受けた対象においてより多くの数で活性化T細胞と免疫シナプスを形成すると予測される。ほとんどのリンパ節に存在するNK細胞は、CD56brightCD16dim/-NK細胞であると言われている(Sta Maria等、Magn Reson Insights. 2014年; 7巻: 15-2頁)。活性化NK細胞は、プラセボ治療を受けた対象と比較して、薬物治療を受けた対象においてより多くの数で乳房腫瘍組織に浸潤すると予測される。活性化NK細胞による乳房腫瘍組織の浸潤は、腫瘍生検組織を使用して決定され、対象の末梢血細胞は、によりれるか、CD27、CD56、CD57、CD62L、CD94、並びにNKG2D、CD16等の成熟マーカーに対するPE又はFITC標識抗体による免疫表現型決定又は染色によるIHC又はフローサイトメトリーによって、NK細胞について免疫表現型決定される。
【０２５１】
薬物治療を受けた対象の乳房腫瘍は、浸潤性細胞溶解性NK細胞の1つ又は複数のサブセット、例えばCD57+、CD27high、及びCD56dimCD16+ NK細胞の数がより多いと予測される。
【０２５２】
本研究では、対象の末梢血サンプルを、CD56dimCD16+(細胞溶解性)、CD56brightCD16-(未成熟)、及びCD56-CD16+、CD56brightCD16+及びCD56dimCD16-(未成熟)NK細胞サブセットのレベルをMamessier等(J Immunol 2013年3月1日、190 (5) 2424〜2436頁)に記載されるように分析する。簡単に説明すると、NK細胞は、製造業者の取扱説明書に従って、対象の末梢血単核細胞(PBMC)からNK細胞StemSepシステム(StemCell Technology社)を用いてネガティブに分離される。選別された細胞の純度と生存率は94%超であることが確立される。NK細胞は、供給細胞として使用される照射PBMC上でIL-2(1000U/ml; Proleukin; Chiron社)及びPHA(1/1000; Life Technologies社)で補充されたRPMI 1640/10%FCS中で15日間インキュベートされる。6日目と10日目に、培地の3分の1を、IL-2で補充された新しいRPMI 1640/10%FCSと交換した。
【０２５３】
対象の乳房組織、末梢血、及び骨髄から分離された200μLの新たな全血又は1×106の細胞を、ロッキングプラットフォーム上で適切なPE又はFITC標識抗体とともに30分間インキュベートする。RBCはOptiLyse B(Beckman Coulter社)で溶解される。サンプルはBD FACSCanto(BD Biosciences社)で分析される。サンプルの分析の前後に、FACSCantoからの蛍光強度を、光電子増倍管の7色セットアップビーズ(BD Biosciences社)を用いて時間経過で標準化し、外部又は内因性の要因に関連する蛍光強度の変動を防ぐ。ゲーティング戦略は、前方散乱領域/前方散乱高パラメーターに基づいてダブレットを排除し、次に死細胞(7-アミノアクチノマイシンD+)を排除し、次にCD45+CD3-CD33-HLA-DR-CD56+/-細胞を選択することで構成された。
【０２５４】
薬物治療を受けた対象から得られたPBMCは、プラセボ治療を受けた対象から得られたPBMCと比較して、細胞溶解性NK細胞のより高いレベルで存在すると予測される(例えば、CD56dimCD16+細胞溶解性NK細胞、より高い数のCD57+ NK細胞及び/又はCD27high NK細胞)。末梢血及び脾臓のNK細胞の約90%は、CD56dim CD16+ NK細胞であるが、研究では、NK細胞の未成熟CD56brightCD16-及びCD56dimCD16-サブセットが末梢血から動員され、乳腺腫瘍で増加し、未成熟NK細胞が乳房腫瘍に優先的に動員されることが示されている(Mamessier等)。本開示の方法は、リンパ節に存在するNK細胞を活性化し、自己細胞溶解性NK細胞をリンパ節及び末梢血から乳房腫瘍組織に可動化し、血管漏出及びサイトカインを使用したエクスビボでの自己NK細胞の活性化及び増殖に伴う論理的問題を含む、がん患者における重篤な副作用とともに観察される不良な臨床転帰を回避することが期待される。
【０２５５】
(実施例4)
APCの流入領域リンパ節へのインビボ遊走
DC、M1マクロファージ、及びB細胞等のAPCの流入領域リンパ節へのインビボ遊走は、HBCx22及びHBCx34患者由来異種移植(PDX)マウスモデルで測定できる。
【０２５６】
HBCx22及びHBCx34 PDXモデルは、以前に記載されるように、未処理の初期段階のLBCから確立されている(Cottu等、Breast Cancer Res Treat 2012年;133:595〜606頁)。両方の腫瘍モデルは内分泌療法(ET)に反応した。管腔B状態は、患者の腫瘍及び由来した異種移植片の両方で確立されており、低PR/高Ki67発現に基づいて評価されている。これらの異種移植片からホルモン耐性モデルを確立するために、タモキシフェンを含むさまざまなETで6〜8か月間、担がんマウスを治療する。腫瘍エスケープ時に、抵抗性腫瘍をスイスのヌードマウスに3回連続継代で再移植し、抵抗性が現れる治療法で治療する。腫瘍がこれらの3回の継代に成功したときに抵抗性異種移植片が確立され、対照群と治療群の間で類似した腫瘍増殖パターンによって定義される抵抗性表現型を示した。
【０２５７】
これらのマウスにおいて、FITC標識CpG-ODN 2395 Vaccigrade(商標)又はODN 2395-FITC((5'-tcgtcgttttcggcgc:gcgccg-3')及びOX-40アゴニスト抗体(Bio-Cell社から入手可能なInvivoMabクローンOX-86)を針と注射器でマウスの母乳管に乳管内注入することにより、APCの流入領域リンパ節へのインビボ遊走を測定する。24時間後、脇の下のリンパ節(腋窩リンパ節)を解剖して、実施例4に記載の免疫組織化学又はフローサイトメトリーによりAPCを測定する。ODN処置マウスからのリンパ節は、対照マウスのリンパ節と比較してより高いレベルの完全成熟APC(例えば、1つ又は複数のCCR7+、CD40+ CDOX40L+、CD80+、CD86+及び他の成熟APC)を示すと予測される。
【０２５８】
(実施例5)
α-タイプ1分極化性生物活性剤の乳管内投与
治療プロトコル。本研究の主要な目的は、乳がんを有する対象におけるICD化学療法と組み合わせたα-タイプ1分極化性生物活性剤(TNFα/Il-1β/IFNγ/IFNα-2b/ポリI:C)の「αDCカクテル」の乳管内投与の安全性と忍容性を評価することである。
【０２５９】
本研究のために乳がんの女性80人を募集し、無作為化されてプラセボ又はαDCカクテルを含む組成物(「薬物」)のいずれかを乳管内に投与する。本研究の第2の目的は、(i)免疫細胞の可動化、対象における抗原提示、及び(ii)治療後の全奏効率及び無増悪生存期間を評価することによる予備的有効性を評価することである。
【０２６０】
乳がんを有する対象は、プラセボ又は薬物による治療を受けるように無作為化される。全ての対象は、1日目に2時間にわたって注入されたICD誘導細胞傷害性剤オキサリプラチン(85mg/m2IV)による化学療法を受ける。
【０２６１】
細胞傷害性剤によるこの事前治療後の1日目に、対象はTable 3(表3)の用量でプラセボ又は薬物のいずれかを受ける。
【０２６２】
【表３】
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【０２６３】
8日目に、対象は、オキサリプラチンによる事前治療なしで、記載されているようにプラセボ又は薬物を再び受ける。プラセボ及び薬物は、上記のように乳管内投与される。この投与計画は、2週間ごとに少なくとも4回繰り返される。研究期間の終了時に、対象は更に6〜18ヶ月間監視される。
【０２６４】
研究投与の1日目、プラセボ又は薬物のいずれかを投与する前に、バイタルサイン(収縮期/拡張期血圧、脈拍、体温、呼吸数)が、投与前及び次の時点:投与後1、2、4、8、及び12時間にチェックされる。投与前及び初回用量の4時間後に12リードECGが行われる。ベースラインを確立するため、投与の10±1分前にバイオマーカー及び薬物動態(PK)分析用の血液サンプルが収集される。
【０２６５】
8日目から、バイタルサイン(収縮期/拡張期血圧、脈拍、体温、呼吸数)が、研究期間中の各投与日(投与前)に定期的にチェックされる。用量投与前60分以内にECGも行われ、血液学、血清化学、凝固及び尿検査、及びPK分析用の血液サンプルが研究薬剤投与の10±1分前に収集される。
【０２６６】
各用量群の安全性プロファイル及び忍容性が、臨床評価、対象報告、及び研究期間中の積極的フォローアップによって決定される。重大さに関わらず、全ての有害事象が記録及び評価される。
【０２６７】
DC等のAPCの成熟及びT細胞、B細胞、及びNK細胞等の免疫細胞の可動化は、実施例4に記載されるように決定される。リンパ節へのAPCの遊走は、実施例5に記載されるように決定される。対象の腫瘍サイズは、マンモグラフィ、CTスキャン及び/又はMRIによって決定される。
【０２６８】
(実施例6)
APCの流入領域リンパ節へのインビボ遊走
休止DCにおいては、TLR3及びTLR9は初期エンドソーム及び他の細胞内コンパートメント内に位置するが、リガンドでの刺激の際にはLAMP1+エンドソームに遊走する。TLR3は二本鎖RNA、例えばポリI:C(例えばリンタタロミド)等のTLR3リガンドに結合し、TLR9は非メチル化CpG DNAに結合する。DC等のAPCの流入領域リンパ節へのインビボ遊走は、C57/Bl6マウスにおいて、例えば注射により、TLR3リガンド(Invivogen社から入手可能なポリI:C HMWフルオレセイン)又はTLR9リガンドCpG-ODN(Invivogen社から入手可能な5'-tcgtcgttttcggcgc:gcgccg-3'(22mer)、及びCCR7リガンド、CCL19及びCCL21(R&D biosystems社から入手可能)を針と注射器を用いてマウスの母乳管に乳管内送達することにより、測定することができる。インビボにおけるAPCの遊走を追跡するために、CCR7リガンドはEGFP-又はFITC標識される。24時間後、脇の下のリンパ節(腋窩リンパ節)を解剖し、免疫組織化学又はフローサイトメトリーによってCCR7+ APCを測定する。
【０２６９】
(実施例7)
APCの流入領域リンパ節へのインビボ遊走
DC等のAPCの流入領域リンパ節へのインビボ遊走は、上記のようにHBCx22及びHBCx34患者由来異種移植(PDX)マウスモデルにおいて測定できる。PDXマウスの1つ又は複数の母乳管に、TLR9アゴニストFITC標識CpG-ODN 2395 Vaccigrade(商標)又はODN 2395-FITC((5'-tcgtcgttttcggcgc:gcgccg-3')、及びOX-40アゴニスト抗体(Bio-Cell社から入手可能なインビボMabクローンOX-86)を針と注射器を用いて乳管内注射する。24時間後、脇の下のリンパ節(腋窩リンパ節)を解剖し、CCR7+ APCを測定する。
【０２７０】
本発明の前述の議論は、例示及び説明の目的で提示されたものである。上記は、本発明を本明細書に開示された形態に限定することを意図するものではない。本発明の記載は、1つ又は複数の実施形態及び特定の変形及び変更の記載を含むものであるが、他の変形及び変更は、例えば、本開示を理解した後の、当業者の技術及び知識の範囲内であり得るように、本発明の範囲内であり得る。代替、交換、及び/又は同等の構造、機能、範囲、又は工程は、そのような代替、交換、及び/又は同等の構造、機能、範囲、又は工程が本明細書に開示されているか否かにかかわらず、請求されるものについて許される範囲で代替の実施形態を含む権利を取得することを意図しており、特許性のある主題を公に捧げることを意図していない。
【０２７１】
本明細書で参照されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、又は特許出願の各々が、参照によりその全体が取り込まれることが具体的及び個別に示されている場合と同じ程度に、その全体が参照により取り込まれる。
【０２７２】
例示的な実施形態が例示及び記載されてきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、さまざまな変更がそこで行われ得ることが理解されよう。
【０２７３】
排他的所有権又は特権が請求される本発明の実施形態は、以下に規定される。
【国際調査報告】
2021515797.tif 000005
2021515797.tif 000006