(57)【要約】  本発明は、低好中球レベル（好中球減少症）及び／又は低血小板レベル（血小板減少症）を特徴とする疾患及び病態の治療のためのペグフィルグラスチム及びロミプロスチムの同時投与を含む方法に関する。本発明は、ペグフィルグラスチム及びロミプロスチムの同時投与によりもたらされる好中球レベル及び血小板レベルに対する増強された効果に関する。本発明はさらに、放射線に被ばくした患者を治療する方法であって、約１μｇ／ｋｇ〜約１０μｇ／ｋｇの用量でロミプロスチムを投与することを含む方法に関する。本発明はさらに、ロミプロスチムの単回用量が患者に投与される方法、及びロミプロスチムが放射線被ばく後、約２４時間以内に投与される方法に関する。本発明はさらに、放射線被ばくのためのロミプロスチム及びペグフィルグラスチムによる治療に関する。このような方法は、急性放射線症候群の治療、及び放射線療法及び他の放射線被ばく源の影響を打ち消すための治療に関する。
2021515780.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロミプロスチム及びペグフィルグラスチムを投与することを含む、患者の血小板減少症を治療する方法。
【請求項２】
ロミプロスチム及びペグフィルグラスチムを投与することを含む、患者の好中球減少症を治療する方法。
【請求項３】
前記患者は放射線に被ばくしている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記患者は急性放射線症候群を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記患者は放射線療法を受けたか又は受けている、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記患者は化学療法を受けたか、又は受けている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記患者は特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記患者は、ウイルス感染、細菌感染、血栓性血小板減少性紫斑病、溶血性尿毒症症候群、及び貧血から選択される病態を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記患者は再生不良性貧血を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者は放射線に被ばくしている、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者は急性放射線症候群を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記患者は放射線療法を受けたか又は受けている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記患者は化学療法を受けたか、又は受けている、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記患者は、慢性特発性好中球減少症、コストマン症候群、白血病、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、骨髄性細胞貯留、ビタミン欠乏症、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ、ライム病、マラリア、骨髄のウイルス感染、サルモネラ感染、敗血症、脾機能亢進症、及び関節リウマチから選択される病態を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
ａ．初回用量１ｍｃｇ／ｋｇで週１回、ロミプロスチムを投与すること、及び
ｂ．血小板数が５０×１０９．Ｋ以上に達し、それが維持されるように１ｍｃｇ／ｋｇずつ週１回のロミプロスチムの用量を調節すること
を含む、請求項１、２、６〜９、１３及び１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
６ｍｇの用量でペグフィルグラスチムを投与することを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
化学療法１サイクル当たり１回、ペグフィルグラスチムを投与することを含む、請求項６又は１３に記載の方法。
【請求項１８】
放射線に被ばくした患者を治療する方法であって、約１μｇ／ｋｇ〜約１０μｇ／ｋｇの用量でロミプロスチムを投与することを含む方法。
【請求項１９】
ロミプロスチムの単回用量が前記患者に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ロミプロスチムは、前記放射線被ばく後、約２４時間以内に投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記患者は急性放射線症候群を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
がん治療に前記放射線被ばくが含まれている、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援の承認
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、アメリカ国立アレルギー・感染症研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、アメリカ合衆国保健福祉省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）により授与されたＨＨＳＮ２７２２０１５０００１３Ｉに基づく政府の支援によりなされた。米国政府は、本発明においていくつかの権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本願は２０１８年９月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／７３４，８９９号、２０１８年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／６５７，５９４号、及び２０１８年３月９日に出願された米国仮特許出願第６２／６４１，２２４号の利益を主張するものであり、これらは全てその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
ロミプロスチム（Ｎｐｌａｔｅ（登録商標））は、血小板及び血小板前駆細胞上のトロンボポエチン受容体（ＴＰＯ−Ｒ）に結合する血小板産生促進ペプチボディである。ロミプロスチムは内因性ＴＰＯと同様の機序でＴＰＯ−Ｒに結合して活性化し、巨核球の増殖及び成熟を促し、循環血小板（ＰＬＴ）を増加させる。初期の発表は、マウス、ヒト以外の霊長類、健常なヒト及び病気のヒトにおけるロミプロスチムのＰＫ及びＰＤを報告した。これにより、２００８年には、持続的な血小板数の減少を特徴とする自己免疫疾患である慢性一次性免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）の治療薬として使用が認められ、後に世界各地で承認されるに至った。ロミプロスチムは、米国では、コルチコステロイド、免疫グロブリン、又は脾臓摘出術に対して応答が不十分な慢性ＩＴＰの治療用として、成人における使用が承認されており、欧州では、脾臓摘出術を受け、他の治療には不応性の人々に向けて、又は手術が禁忌とされ、脾臓摘出をしていない患者の第二選択治療として、承認されている。ロミプロスチムは、開始用量１μｇ／ｋｇ、その後、血小板数が５０×１０９／Ｌ以上４００×１０９／Ｌ以下となり、それが維持されるように、１μｇ／ｋｇずつ調製された用量が毎週投与される。
【０００４】
ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））は、組換え顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）類似体のフィルグラスチム（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標））がモノメトキシポリエチレングリコールに結合した形態である。したがって、ペグフィルグラスチムは、特定の細胞表面受容体に結合して活性化するＧＣＳＦの活性を模倣し、好中球前駆細胞の増殖と分化、及び選択された好中球機能を刺激する。ＧＣＳＦ類似体のポリエチレングリコール分子との結合は、その治療半減期を大きく増加させる。米国では、ペグフィルグラスチムは、発熱性好中球減少症の臨床的に有意な発生率と関連する骨髄抑制抗癌剤を投与されている非骨髄性悪性腫瘍患者において、発熱性好中球減少により発現する感染症の発生率を低下させるために承認されている。ペグフィルグラスチムの推奨投与量は、化学療法１サイクルにつき１回投与される、６ｍｇの単回皮下注射である。ペグフィルグラスチムはまた、骨髄抑制線量の放射線に急性曝露された患者の生存率を上昇させることが示されている。この適応では、１週間隔で皮下に各６ｍｇを２回投与することが推奨される。
【０００５】
医学及び科学文献の検索では、ペグフィルグラスチムとロミプロスチムの同時投与を報告するものは見当たらなかった。しかしながら、文献には、フィルグラスチムとロミプロスチムの同時投与の報告が含まれていた。
【０００６】
Ｖａｎｄｒａｓｓらは、テモゾロミドを投与され、骨髄不全を生じた患者に、このような同時投与を行ったことを報告している。（非特許文献１）。これらの著者らは、顆粒球レベルの一過性の増加のみを認め、１ヵ月後にフィルグラスチムを中止させ、ロミプロスチムの投与量を増加させたにもかかわらず血小板にはほとんど影響がなく、２ヵ月の治療後に中止した。
【０００７】
Ｂｏｓｃｈ−Ｖｉｌａｓｅｃａらは、同種幹細胞移植後の持続性の臨床的に関連する血小板減少症に対するトロンボポエチン（ＴＰＯ）アゴニストのエルトロンボパグ及びロミプロスチムの有用性に関する後ろ向き研究における、このような同時投与について報告している。（非特許文献２）。彼らは、４０歳未満のＴＰＯアゴニストに対するより高い反応、骨髄穿刺液中の巨核球の存在、及び／又は他の造血成長因子に対する事前の反応と関連する可能性のある変数として同定した。彼らは、フィルグラスチムに対する応答（すなわち、白血球レベルの増加）を示した患者１３例中６例で、ＴＰＯアゴニストに対する応答（すなわち、血小板レベルの増加）を示すことを見出した。
【０００８】
Ａｍｉｒｉａｎａらは、ランゲルハンス細胞組織球増殖症に多臓器病変を有する患者の治療において、このような同時投与を報告している。（非特許文献３）。彼らは、患者にフィルグラスチム及びロミプロスチムを投与して白血球及び血小板の骨髄産生を刺激したところ、白血球数は反応したが、血小板数は反応しなかったことを報告している。
【０００９】
Ｋｏｖｔｏｎｙｕｋらは、造血幹細胞（ＨＳＣ）の誘導に関する研究において、フィルグラスチムとロミプロスチムの同時投与を報告している。（非特許文献４）。彼らは、生体内の高解像単一ＨＳＣ分裂追跡に基づいて、臨床的に適用されたＴＰＯ受容体（Ｇ−ＣＳＦ受容体ではない）アゴニストが、それらの生体内連続多系列及び長期再増殖能によって定義されるように、ＨＳＣを自己複製分裂に導き、機能的ＨＳＣの量的拡大をもたらすことを実証したと結論付けている。これらの結果は、トロンボポエチン模倣体が生体内でＨＳＣを拡大し、トロンボポエチン受容体発現ＨＳＣの細胞周期依存性細胞傷害性薬剤に対する感受性を高めるのに適用できる可能性を示唆していると結論している。
【００１０】
ペグフィルグラスチムとプロプラスティムの双方にとって興味のある適応は、急性放射線症候群の急性造血症候群（ＨＳ−ＡＲＳ）である。ＨＳ−ＡＲＳにおいて、白血球、血小板及び網状赤血球が急速に減少すると、感染症、出血及び死に至る。放射線事故やテロ行為の可能性や、放射線被ばくがもたらす疾患の重症度を考慮すると、放射線症候群に対する効果的な医学的対策（ＭＣＭ）の開発と承認が急務である。ＨＳ−ＡＲＳは、好中球減少症、血小板減少症及び貧血を特徴とする。今日まで、ＨＳ−ＡＲＳに付随する血小板レベルに影響を及ぼす薬物療法は示されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｖａｎｄｒａａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６），ＢＭＪ  Ｃａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２０１６；２０１６：ｂｃｒ２０１６２１５７９７
【非特許文献２】Ｂｏｓｃｈ−Ｖｉｌａｓｅｃａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１０１（３）：４０７−１４
【非特許文献３】Ａｍｉｒｉａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃａｓｅｓ  ６（８）：３７６−７
【非特許文献４】Ｋｏｖｔｏｎｙｕｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６），Ｂｌｏｏｄ．１２７（２５）：３１７５−３１７９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、低好中球レベル（好中球減少症）及び／又は低血小板レベル（血小板減少症）を特徴とする疾患及び病態の治療のためのペグフィルグラスチム及びロミプロスチムの同時投与を含む方法に関する。本発明は、ペグフィルグラスチム及びロミプロスチムの同時投与によりもたらされる好中球レベル及び血小板レベルに対する増強された効果に関する。この方法は。本明細書において、ＡＲＳのヒト以外の霊長類を用いた試験で示されているが、このような試験は低レベルの血小板及び／又は好中球を特徴とする他の病態の治療を支持している。このような同時投与における好ましい用量は、ＨＳ−ＡＲＳでは、ロミプロスチム約１〜１０μｇ／ｋｇ及びペグフィルグラスチム約６ｍｇである。好ましい投薬回数は、ペグフィルグラスチム６ｍｇの１週おきの２回投与である。他の適応には、ペグフィルグラスチム及びロミプロスチムについて米国食品医薬品局（ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって承認された用量を含む他の用量が適している。
【００１３】
本発明によれば、ペグフィルグラスチム及びロミプロスチムを投与する方法であって、ロミプロスチムを以下のように投与する方法である：
ａ．初回用量１ｍｃｇ／ｋｇを週１回投与し、
ｂ．血小板数が５０×１０９．Ｋ以上に達し、それが維持されるように、１ｍｃｇ／ｋｇずつの増加により週１回の用量を調節する。
【００１４】
さらに、本発明によれば、ペグフィルグラスチム及びロミプロスチムを投与する方法であって、６ｍｇのペグフィルグラスチムを投与する方法が提供される。血小板レベルが化学療法によって影響を受ける場合、ロミプロスチム及びペグフィルグラスチムを投与し、ペグフィルグラスチムは、好ましくは化学療法１サイクル当たり１回、好ましくは６ｍｇの用量で投与される。
【００１５】
さらに、本発明によれば、血小板レベルの低下、又は血小板の分解の増加を特徴とする病態の治療方法が提供される。したがって、本発明は、哺乳動物にロミプロスチム及びペグフィルグラスチムを投与する方法であって、哺乳動物が放射線に被ばくしている（例えば、急性放射線症候群、癌の放射線療法）；化学療法を受けたか、若しくは受けている；又は特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ウイルス感染、細菌感染、血栓性血小板減少性紫斑病、溶血性尿毒症症候群、若しくは貧血（例えば、再生不良性貧血）などの病態を有する、方法に関する。
【００１６】
さらに、本発明によれば、好中球レベルの低下又は好中球の分解を特徴とする病態を治療する方法が提供される。したがって、本発明は、哺乳動物にロミプロスチム及びペグフィルグラスチムを投与する方法であって、哺乳動物が放射線に被ばくしている（例えば、急性放射線症候群、放射線療法）；化学療法を受けたか；若しくは化学療法を受けている；又は慢性特発性好中球減少症、コストマン症候群、白血病、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、骨髄性細胞貯留、ビタミン欠乏症、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ、ライム病、マラリア、骨髄のウイルス感染、サルモネラ感染、敗血症、脾機能亢進症、若しくは関節リウマチなどの病態を有する、方法に関する。
【００１７】
本発明によれば、ロミプロスチムは、血小板産生を増強するその能力に基づく、ＨＳ−ＡＲＳ及び放射線被ばくの治療に有効な医学的対策（ＭＣＭ）である。本発明によれば、放射線に被ばくした患者を治療する方法であって、ロミプロスチムを投与することを含む方法が提供される。さらに、本発明によれば、そのような方法であって、ロミプロスチムの単回用量を患者に投与する方法が提供される。さらに、本発明によれば、そのような方法であって、そのように治療された患者は急性放射線症候群を有する方法が提供される。さらに、本発明によれば、そのような方法であって、放射線被ばくは、癌治療に含まれるような放射線療法によるものである方法が提供される。他の放射線被ばく源の治療もまた、本発明の範囲内である。
【００１８】
本発明に従って実施された方法では、雄及び雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、３０日生存率を３０％（ＬＤ７０／３０）に低下させる６８０ｃＧｙのＸ線を全身照射（ＴＢＩ）した。ロミプロスチムは、治療の延命効果を評価するために、単回用量として３、３０又は１００μｇ／ｋｇ、又は３０μｇ／ｋｇ（５回投与まで）の用量をＴＢＩの≧２４時間後に皮下（ｓｃ）投与した。薬物動態（ＰＫ）及び血液学的パラメータも評価した。
【００１９】
前述の方法の結果では、ＴＢＩの２４時間後のロミプロスチムの単回投与（３０又は１００μｇ／ｋｇ）では、マウス試験で生存率が約４０％上昇した。１日１回３０μｇ／ｋｇのロミプロスチムをＴＢＩ後に最長３日間又は５日間反復投与した場合も、同等の有効性が認められた。血小板レベルは、ロミプロスチム処置したＴＢＩマウスで急速に低下し、力強い回復前の８日目に最低値となった。逆に、ビヒクル処置したＴＢＩマウスのＰＬＴレベルは、回復開始前の約１０日目に最低値になり遅くなった。他の血液学的パラメータの動態プロファイルは、ＴＢＩロミプロスチム処置マウスとビヒクル対照マウスの間で類似していた。ＴＢＩマウスにおけるロミプロスチムの最高血中濃度は、注射後４〜２４時間（Ｔｍａｘ）に起こり、ｔ１／２は約２４時間であった。Ｃｍａｘ値は３０μｇ／ｋｇ＋／−ＴＢＩ後に約６ｎｇ／ｍｌであり、３００μｇ／ｋｇ後に約２００ｎｇ／ｍｌであった。ロミプロスチムの１０倍の投与は、ＡＵＣｌａｓｔ値を約３５倍増加させた。
【００２０】
以上の結果から、ＴＢＩの２４時間後に投与されたマウスにおけるロミプロスチム注射の単回又は反復投与は、生存率を上昇させＰＬＴの回復を早めるという結論が導き出された。ＰＫ結果＋／−ＴＢＩは、ロミプロスチムがマウスで吸収され、効率的に分散することを示した。
【００２１】
さらに、本発明によれば、ロミプロスチムを約１〜約１０μｇ／ｋｇの用量で投与することを含む、急性放射線症候群の治療方法が提供される。
【００２２】
さらに本発明によれば、ペグフィルグラスチムと一緒にロミプロスチムを投与することを含み、これによりいずれかの薬剤単独よりもより大きな効果が得られる、急性放射線症候群の治療方法が提供される。両薬剤の併用は、ヒト以外の霊長類を対象とした試験において、各薬剤単独のデータと比較して、最も低い血小板及び好中球の最低値と関連した。併用治療はまた、各薬剤単独と比較して、最も早期の血小板及び好中球の回復をもたらした。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】図１Ａ及び図１Ｂはそれぞれ雄のマウス及び雌のマウスにおける、照射２４〜２６時間後に単回皮下投与した後のロミプロスチムの血清濃度を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ及び図１Ｂはそれぞれ雄のマウス及び雌のマウスにおける、照射２４〜２６時間後に単回皮下投与した後のロミプロスチムの血清濃度を示す。
【図２】図２は、照射マウス対非照射マウスにおけるロミプロスチムの薬物動態を示す表である。ロミプロスチムの血清濃度は、６００ｃＧｙとロミプロスチム３μｇ／ｋｇとを受けた第２群の全試料で＜ＬＬＯＱであった（以下、本発明の詳細な説明を参照）。表中の「ＮＣ」は、値を正確に計算するための最終段階のデータポイントが不十分であったことによる「計算されていない」を意味する。表中の値は、ｎ＝３／群／性／時点である。図１Ａ、１Ｂ及び２は、（ａ）ロミプロスチムが皮下注射後に迅速に且つ効率的に吸収され、（ｂ）３０μｇ／ｋｇの投与では、放射線照射の有無にかかわらず、両性において同様の薬物動態（ＰＫ）プロファイルであり、（ｃ）Ｔｍａｘは４〜２４時間、Ｔ１／２は約２４時間であり、（ｄ）Ｃｍａｘ及び曲線下面積（ＡＵＣ）は用量比を超える上昇を示し、（ｅ）１０倍高いロミプロスチム用量が、Ｃｍａｘ及びＡＵＣｌａｓｔの曝露値を約３５倍増加させたことを示している。
【図３Ａ】図３Ａ−３Ｃは、単回投与後の照射マウスと非照射マウスにおけるロミプロスチムの薬力学（ＰＤ）を示している。図３Ａにおいて、血液採取可能な生存照射動物数は、１４日目後にビヒクル対照（黒）及び低用量（青）マウスにおいて劇的に減少した。図３Ｂでは、血小板レベルは４日目の全ての用量群でほぼ同じであった。図３Ｂは、３０及び３００μｇ／ｋｇ用量群では、照射後、生理食塩水群及び３μｇ／ｋｇ群と比較して、より速いものの、より軽度の血小板レベルの低下が見られることを示す（最低値８日目対１０日目）。２２日目対２９日目と、ベースライン付近へのより速い回復が見られる。図３Ｃでは、血小板容積が６〜８日目に中用量群及び高用量群で増加した。この所見は、放射線照射マウスにおいて、ロミプロスチム投与後に、骨髄から新しい血小板がより迅速に放出されていることを示唆している。
【図３Ｂ】図３Ａ−３Ｃは、単回投与後の照射マウスと非照射マウスにおけるロミプロスチムの薬力学（ＰＤ）を示している。図３Ａにおいて、血液採取可能な生存照射動物数は、１４日目後にビヒクル対照（黒）及び低用量（青）マウスにおいて劇的に減少した。図３Ｂでは、血小板レベルは４日目の全ての用量群でほぼ同じであった。図３Ｂは、３０及び３００μｇ／ｋｇ用量群では、照射後、生理食塩水群及び３μｇ／ｋｇ群と比較して、より速いものの、より軽度の血小板レベルの低下が見られることを示す（最低値８日目対１０日目）。２２日目対２９日目と、ベースライン付近へのより速い回復が見られる。図３Ｃでは、血小板容積が６〜８日目に中用量群及び高用量群で増加した。この所見は、放射線照射マウスにおいて、ロミプロスチム投与後に、骨髄から新しい血小板がより迅速に放出されていることを示唆している。
【図３Ｃ】図３Ａ−３Ｃは、単回投与後の照射マウスと非照射マウスにおけるロミプロスチムの薬力学（ＰＤ）を示している。図３Ａにおいて、血液採取可能な生存照射動物数は、１４日目後にビヒクル対照（黒）及び低用量（青）マウスにおいて劇的に減少した。図３Ｂでは、血小板レベルは４日目の全ての用量群でほぼ同じであった。図３Ｂは、３０及び３００μｇ／ｋｇ用量群では、照射後、生理食塩水群及び３μｇ／ｋｇ群と比較して、より速いものの、より軽度の血小板レベルの低下が見られることを示す（最低値８日目対１０日目）。２２日目対２９日目と、ベースライン付近へのより速い回復が見られる。図３Ｃでは、血小板容積が６〜８日目に中用量群及び高用量群で増加した。この所見は、放射線照射マウスにおいて、ロミプロスチム投与後に、骨髄から新しい血小板がより迅速に放出されていることを示唆している。
【図４Ａ】図４Ａ−４Ｄは、放射線に影響されるがロミプロスチムには影響されない他の主要な血液学的パラメータを示す。図に示すパラメータは、白血球数（図４Ａ）、赤血球数（図４Ｂ）、好中球数（図４Ｃ）、及び網状赤血球数（図４Ｄ）である。
【図４Ｂ】図４Ａ−４Ｄは、放射線に影響されるがロミプロスチムには影響されない他の主要な血液学的パラメータを示す。図に示すパラメータは、白血球数（図４Ａ）、赤血球数（図４Ｂ）、好中球数（図４Ｃ）、及び網状赤血球数（図４Ｄ）である。
【図４Ｃ】図４Ａ−４Ｄは、放射線に影響されるがロミプロスチムには影響されない他の主要な血液学的パラメータを示す。図に示すパラメータは、白血球数（図４Ａ）、赤血球数（図４Ｂ）、好中球数（図４Ｃ）、及び網状赤血球数（図４Ｄ）である。
【図４Ｄ】図４Ａ−４Ｄは、放射線に影響されるがロミプロスチムには影響されない他の主要な血液学的パラメータを示す。図に示すパラメータは、白血球数（図４Ａ）、赤血球数（図４Ｂ）、好中球数（図４Ｃ）、及び網状赤血球数（図４Ｄ）である。
【図５Ａ】図５Ａ及び５Ｂは、マウスＨＳ−ＡＲＳ有効性モデルにおけるロミプロスチムの延命効果を示す。図５Ａは、全身照射（ＴＢＩ）の２４時間後にロミプロスチムを３０又は１００μｇ／ｋｇ単回投与することにより、約４０％に統計的に有意な３０日延命効果があったことを示している。図５Ａはさらに、３又は１０μｇ／ｋｇの投与により、約２４％に延命効果が観察されたことを示している（統計的に有意ではない）。図５Ｂは、ＴＢＩの２４時間後からロミプロスチム３０μｇ／ｋｇを１日１回、３回又は５回投与した場合の、統計的に有意な３０日延命効果（約３３％）を示している。ロミプロスチムの３０μｇ／ｋｇの反復投与は、ロミプロスチムの単回投与と比較して、生存の改善は認められなかった。図５Ｃは、ロミプロスチム（３０μｇ／ｋｇ）、ペグフィルグラスチム（３００μｇ／ｋｇ）、及びそれらの併用による生存の統計的に有意な増加を示す。個々の薬剤をそれらの併用と比較した場合、延命効果に差は認められなかった。
【図５Ｂ】図５Ａ及び５Ｂは、マウスＨＳ−ＡＲＳ有効性モデルにおけるロミプロスチムの延命効果を示す。図５Ａは、全身照射（ＴＢＩ）の２４時間後にロミプロスチムを３０又は１００μｇ／ｋｇ単回投与することにより、約４０％に統計的に有意な３０日延命効果があったことを示している。図５Ａはさらに、３又は１０μｇ／ｋｇの投与により、約２４％に延命効果が観察されたことを示している（統計的に有意ではない）。図５Ｂは、ＴＢＩの２４時間後からロミプロスチム３０μｇ／ｋｇを１日１回、３回又は５回投与した場合の、統計的に有意な３０日延命効果（約３３％）を示している。ロミプロスチムの３０μｇ／ｋｇの反復投与は、ロミプロスチムの単回投与と比較して、生存の改善は認められなかった。図５Ｃは、ロミプロスチム（３０μｇ／ｋｇ）、ペグフィルグラスチム（３００μｇ／ｋｇ）、及びそれらの併用による生存の統計的に有意な増加を示す。個々の薬剤をそれらの併用と比較した場合、延命効果に差は認められなかった。
【図５Ｃ】図５Ａ及び５Ｂは、マウスＨＳ−ＡＲＳ有効性モデルにおけるロミプロスチムの延命効果を示す。図５Ａは、全身照射（ＴＢＩ）の２４時間後にロミプロスチムを３０又は１００μｇ／ｋｇ単回投与することにより、約４０％に統計的に有意な３０日延命効果があったことを示している。図５Ａはさらに、３又は１０μｇ／ｋｇの投与により、約２４％に延命効果が観察されたことを示している（統計的に有意ではない）。図５Ｂは、ＴＢＩの２４時間後からロミプロスチム３０μｇ／ｋｇを１日１回、３回又は５回投与した場合の、統計的に有意な３０日延命効果（約３３％）を示している。ロミプロスチムの３０μｇ／ｋｇの反復投与は、ロミプロスチムの単回投与と比較して、生存の改善は認められなかった。図５Ｃは、ロミプロスチム（３０μｇ／ｋｇ）、ペグフィルグラスチム（３００μｇ／ｋｇ）、及びそれらの併用による生存の統計的に有意な増加を示す。個々の薬剤をそれらの併用と比較した場合、延命効果に差は認められなかった。
【図６Ａ】図６Ａ−６Ｃは、以下に詳述する、ヒト以外の霊長類を用いた薬物動態／薬力学試験における（性別、及び雌雄を合わせた）生存曲線を示す。図６Ａは雄のみの生存曲線、６Ｂは雌のみの生存曲線、６Ｃは雌雄を合わせた生存曲線である。（雌雄を合わせた）生存率は、照射対照群で４０％、ロミプロスチム又はペグフィルグラスチム処置群のそれぞれで１００％であった。
【図６Ｂ】図６Ａ−６Ｃは、以下に詳述する、ヒト以外の霊長類を用いた薬物動態／薬力学試験における（性別、及び雌雄を合わせた）生存曲線を示す。図６Ａは雄のみの生存曲線、６Ｂは雌のみの生存曲線、６Ｃは雌雄を合わせた生存曲線である。（雌雄を合わせた）生存率は、照射対照群で４０％、ロミプロスチム又はペグフィルグラスチム処置群のそれぞれで１００％であった。
【図６Ｃ】図６Ａ−６Ｃは、以下に詳述する、ヒト以外の霊長類を用いた薬物動態／薬力学試験における（性別、及び雌雄を合わせた）生存曲線を示す。図６Ａは雄のみの生存曲線、６Ｂは雌のみの生存曲線、６Ｃは雌雄を合わせた生存曲線である。（雌雄を合わせた）生存率は、照射対照群で４０％、ロミプロスチム又はペグフィルグラスチム処置群のそれぞれで１００％であった。
【図７】図７は、以下に詳述するヒト以外の霊長類を用いた薬物動態／薬力学試験における（雌雄を合わせた）好中球絶対数を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、以下に詳述するヒト以外の霊長類を用いた薬物動態／薬力学試験における（雌雄を合わせた）血小板絶対数を示す。図８Ｂは、放射線照射、及びロミプロスチム（ＲＰ）、ペグフィルグラスチム（ＰＦ）又は両者の併用による処置後のアカゲザルの平均血小板容積を経時的に示したものである。エラーバー＋／−標準誤差。明確にするために、下側のエラーバーは省略した。図８Ａの凡例は、図８Ｂと同じである（第１群、ｎ＝４〜１０；第２〜６群、ｎ＝８）。
【図８Ｂ】図８Ａは、以下に詳述するヒト以外の霊長類を用いた薬物動態／薬力学試験における（雌雄を合わせた）血小板絶対数を示す。図８Ｂは、放射線照射、及びロミプロスチム（ＲＰ）、ペグフィルグラスチム（ＰＦ）又は両者の併用による処置後のアカゲザルの平均血小板容積を経時的に示したものである。エラーバー＋／−標準誤差。明確にするために、下側のエラーバーは省略した。図８Ａの凡例は、図８Ｂと同じである（第１群、ｎ＝４〜１０；第２〜６群、ｎ＝８）。
【図９】図９は、雄及び雌の非ヒト霊長類を合わせたロミプロスチムの薬物動態を示す。アカゲザルにおけるロミプロスチムの平均血清濃度の経時変化。ＲＰ：ロミプロスチム；ＰＦ：ペグフィルグラスチム。（第１群、ｎ＝１０；第２〜６群、ｎ＝８）。
【図１０】図１０は、放射線照射及びロミプロスチム（ＲＰ）、ペグフィルグラスチム（ＰＦ）又は両者の併用による処置後のアカゲザルの平均絶対体重を経時的に示したものである。エラーバー＋／−標準誤差。明確にするために、下側のエラーバーを省略した（対照、ｎ＝４〜１０；第２〜６群、ｎ＝８）。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｅは、放射線照射、及びロミプロスチム（ＲＰ）、ペグフィルグラスチム（ＰＦ）又は両者の併用による処置後のアカゲザルにおける選択した血液学的パラメータを経時的に示したものである。平均濃度＋／−標準誤差を示す。明確にするために、下側のエラーバーは省略した。ＲＢＣ：赤血球；ＷＢＣ：白血球；（第１群、ｎ＝４〜１０；第２〜６群、ｎ＝８）。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｅは、放射線照射、及びロミプロスチム（ＲＰ）、ペグフィルグラスチム（ＰＦ）又は両者の併用による処置後のアカゲザルにおける選択した血液学的パラメータを経時的に示したものである。平均濃度＋／−標準誤差を示す。明確にするために、下側のエラーバーは省略した。ＲＢＣ：赤血球；ＷＢＣ：白血球；（第１群、ｎ＝４〜１０；第２〜６群、ｎ＝８）。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｅは、放射線照射、及びロミプロスチム（ＲＰ）、ペグフィルグラスチム（ＰＦ）又は両者の併用による処置後のアカゲザルにおける選択した血液学的パラメータを経時的に示したものである。平均濃度＋／−標準誤差を示す。明確にするために、下側のエラーバーは省略した。ＲＢＣ：赤血球；ＷＢＣ：白血球；（第１群、ｎ＝４〜１０；第２〜６群、ｎ＝８）。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜１１Ｅは、放射線照射、及びロミプロスチム（ＲＰ）、ペグフィルグラスチム（ＰＦ）又は両者の併用による処置後のアカゲザルにおける選択した血液学的パラメータを経時的に示したものである。平均濃度＋／−標準誤差を示す。明確にするために、下側のエラーバーは省略した。ＲＢＣ：赤血球；ＷＢＣ：白血球；（第１群、ｎ＝４〜１０；第２〜６群、ｎ＝８）。
【図１１Ｅ】図１１Ａ〜１１Ｅは、放射線照射、及びロミプロスチム（ＲＰ）、ペグフィルグラスチム（ＰＦ）又は両者の併用による処置後のアカゲザルにおける選択した血液学的パラメータを経時的に示したものである。平均濃度＋／−標準誤差を示す。明確にするために、下側のエラーバーは省略した。ＲＢＣ：赤血球；ＷＢＣ：白血球；（第１群、ｎ＝４〜１０；第２〜６群、ｎ＝８）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書は、ＡＲＳのマウスモデル及びアカゲザルにおける実験の結果を報告する。多くの線源による被ばくの治療にロミプロスチムが有効であることを、それらの結果が実証していることを、当業者であれば理解するであろう。非ヒト霊長類のＨＳ−ＡＲＳ研究においてペグフィルグラスチム及びロミプロスチムで観察された効果の増強は、このような増強が低血小板レベル及び／又は低好中球レベルを特徴とする他の病態においても存在することを実証するものであることを、当業者であればさらに理解するであろう。
【実施例】
【００２５】
実施例１
急性放射線症候群の潜在的対策としてのマウスにおけるロミプロスチム（Ｎｐｌａｔｅ（登録商標））の評価
方法
マウス：０日目に１１〜１２週齢であった雄及び雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。１ケージ当たり≦３匹で飼育。餌及び水を自由に与えた。放射線照射の４日後から、追加した水で軟化させた固形飼料及びヒドロゲルの全マウスに与えた。試験期間≦３１日。
【００２６】
動物は、国際認定施設である米国実験動物管理認定協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）で飼育した。全ての研究プロトコルについて、動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を受けた。
【００２７】
放射線：個々のプラスチックボックスホルダー内の意識のあるマウスに、Ｐａｎｔａｋ（ＨＦ３２０）ユニットを用いて０日目のＸ線曝露を行った。≦６匹のマウスを同時に曝露した。ＬＤ７０／３０（３０日後に７０％が致死する線量）及びＬＤ３０／３０のＴＢＩ曝露量は、それぞれ６８０ｃＧｙ及び６５０ｃＧｙであった。線量の測定は、ＰＴＷ−ＵＮＩＤＯＳマイクロプロセッサが制御するユニバーサルのフィールドクラス線量計で実施した。電力レベル（２３０ｋＶｐ又は２５０ｋＶｐ、５ｍＡ、２ｍｍアルミニウム濾過）、露光ビームからの距離、及び線量率約１Ｇｙ／分を一定に保った。マウスを回転プラットフォーム（約１ｒｐｍ）上で朝に曝露し、線量を確実に均一に分布させた。
【００２８】
生理食塩水（ビヒクル対照）、又は３μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ又は３００μｇ／ｋｇのロミプロスチムの皮下（ｓｃ）注射を、照射の２４時間後に開始（５ｍｌ／ｋｇで、単一部位に）。ロミプロスチム製剤濃度０ｎｇ／μｌ、０．６ｎｇ／μｌ、２ｎｇ／μｌ、６ｎｇ／μｌ、２０ｎｇ／μｌ又は６０ｎｇ／μｌ。反復投与を適用可能な場合、その約２４時間後から１日１回行った。
【００２９】
血液の分析（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ａｄｖｉａ  ２１２０）のために、Ｋ３ＥＤＴＡ抗凝固剤を用いて、イソフルランで麻酔したマウスの眼窩後静脈叢から血液を採取した。所定時間における血液学的検査、雌雄のデータの結合、ｎ＝１〜１１／群／時点（瀕死状態の発生によりｎは変動する）。
【００３０】
血清ロミプロスチムレベルを、ＬＬＯＱが０．２７０〜０．４０１ｎｇ／ｍｌ、ＵＬＯＱが１０．９ｎｇ／ｍｌのＥＬＩＳＡ（ｉｎＶｅｎｔｉｖ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）により定量した；ｎ＝３マウス／性／時点／用量群；時点＝ロミプロスチム投与の１、４、１２、２４、４８、７２及び９６時間後。
【００３１】
ＰＫ解析：Ｐｈｏｅｎｉｘ（登録商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）ｖ６．３による非コンパートメント分析。
【００３２】
カプラン・マイヤー生存分析：ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６及びＳｔｒａｔａＳＥ  １４．１；雌雄両性のデータを結合（２１匹のマウス／性／群）。
【００３３】
予定外の安楽死：有害な臨床徴候の重症度スコアに基づく一貫した基準。安楽死は、３０％の体重減少、瀕死、又は中等度又は重度とスコア付けされた≧２の基準で実施した。有害徴候としては以下のものが挙げられる：
・外観の異常（例えば、毛の皺、目又は鼻の分泌物、睇視、腫れ）
・姿勢調節又は行動の異常（例えば、背中の曲がり、運動失調）
・脱水、低体温、活動性低下
・試験前の体重と比較して体重が減少（２０〜２９％は中等度とみなされ、≧３０％は重度とみなされる）
生理機能の異常（排尿、排便、食事、飲水、呼吸）。
【００３４】
結論
照射後の延命効果：照射の２４時間後に送達された３０μｇ／ｋｇ又は１００μｇ／ｋｇのロミプロスチムの単回投与は、約４０％の延命効果を提供した。ロミプロスチムの３０μｇ／ｋｇの反復投与は、単回投与と比較して、生存の改善は認められなかった。
【００３５】
薬物動態（ＰＫ）：マウスにおいて、放射線はロミプロスチムＰＫに影響を与えなかった。投与量を１０倍に増量した結果、Ｃｍａｘ及びＡＵＣｌａｓｔは約３５倍に増加した。ＰＫは用量比を越えて増加し、ロミプロスチムの非線形ＰＫと一致した。
【００３６】
薬力学（ＰＤ）：ロミプロスチムを投与した放射線照射マウスでは、血小板レベルは対照と比較してより速く低下したが、対照ほど低くはなかった（最低値８日目対１０日目）。血小板レベルは、ロミプロスチム投与後、ベースライン付近までより速やかに回復する（２２日目対２９日目）。ロミプロスチム投与後に血小板容積が増加したことから、骨髄からの血小板のより迅速な放出が示唆された。他の主要な血液学的パラメータは、放射線の影響を受けたが、ロミプロスチムの影響は顕著ではなかった。
【００３７】
実施例２
急性放射線症候群の潜在的対策としてのマウスにおけるロミプロスチム（Ｎｐｌａｔｅ（登録商標））及びペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））の評価
白血球、血小板（ＰＬＴ）、網状赤血球の急速な減少は急性放射線症候群の造血症候群（ＨＳ−ＡＲＳ）の特徴であり、治療せずに放置すると、死を含む健康上の深刻な結果を招くおそれがある。ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））は骨髄抑制線量の放射線に曝露された患者の生存率を高めると認められているが、血小板減少症を治療する対策としては現在のところ利用することはできない。トロンボポエチン受容体アゴニストであるロミプロスチム（Ｎｐｌａｔｅ（登録商標））は、慢性免疫性血小板減少症の成人における低ＰＬＴ数の治療用としてＦＤＡに承認された最初の血小板産生刺激蛋白質である。本出願人らの研究の目的は、マウスにおける急性放射線照射後の生存とＰＬＴ回復を改善するための医学的対策としてロミプロスチムを評価することであった。
【００３８】
ＬＤ７０／３０線量の全身Ｘ線照射（ＴＢＩ）２４時間後に投与した雌及び雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝２１Ｍ／２１Ｆ）におけるロミプロスチムの単回又は反復皮下注射は、生存を増加させ、ＰＬＴ回復を早めた。ロミプロスチムの３０μｇ／ｋｇの単回投与により、生存率が約４０％上昇し、十分な又は最大の効果が得られた。ロミプロスチムのより高用量の（３０又は１００μｇ／ｋｇ）又はより高頻度の投与（３日又は５日間の投与）、ペグフィルグラスチムによる治療（３００μｇ／ｋｇ）、又はペグフィルグラスチムとロミプロスチムとの併用治療で、それ以上の延命効果は認められなかった。結論として、ＴＢＩの２４時間後に投与されたロミプロスチムの単回注射は、ペグフィルグラスチムの有無にかかわらず、マウスの生存率を劇的に増加させ、且つＰＬＴ回復を促進する有望な放射線対策である。
【００３９】
実施例３
非ヒト霊長類の急性放射線誘発性血小板減少症及び好中球減少症に対するロミプロスチム及びペグフィルガスチムの効果
概要：好中球減少症及び血小板減少症は、急性放射線曝露に起因し、死に至る主要な病態として認識されている。本研究では、アカゲザルをＣｏ６０源からの全身照射に曝露し、２４時間後に、対照、２．５ｍｇ／ｋｇ若しくは５ｍｇ／ｋｇのロミプロスチム（トロンボポエチン受容体アゴニスト）、０．３ｍｇ／ｋｇのペグフィルガスチム（好中球産生を刺激する顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）にポリエチレングリコールが結合）、又はロミプロスチム（５ｍｇ／ｋｇ）とペグフィルグラスチム（０．３ｍｇ／ｋｇ）の両方を皮下投与した。結果：照射後４５日間にわたって血液をモニターした。ペグフィルガスチム、又はペグフィルガスチム／ロミプロスチムの投与により、好中球絶対数（ＡＮＣ）最低値がペグフィルガスチム、及びペグフィルガスチム／ロミプロスチムでそれぞれ０．４３×１０９／Ｌ、及び０．５７×１０９／Ｌとなり、０．０９〜０．１３×１０９／Ｌであった対照照射動物のＡＮＣ最低値と比較して、臨床的に有意な改善が認められた。ペグフィルガスチム／ロミプロスチムを投与された動物はまた、ペグフィルガスチム単独群と比較して、より高い好中球数でより早期の回復を示した。対照動物では、照射後に重度の血小板減少症が観察され、照射１４日後に２０．６×１０１２／Ｌの血小板（ＰＬＴ）最低値を示した。ロミプロスチム又はペグフィルガスチムを投与された全群では、比較的軽度の血小板減少症が見られ、１１日目又は１３日目に４７．６３〜６９．１３×１０１２／Ｌの最低値を示した。ロミプロスチム／ペグフィルガスチムを投与された動物は、１１日目に血小板数が他の群と比較して最も軽度の最低値（９２．１３×１０１２／Ｌ）を示し、且つ、その後、より高いＰＬＴ数により速く回復した。ロミプロスチムとペグフィルグラスチムの併用により効果が増強され、両薬剤の併用により血小板及び好中球の最低値は最小となり、また最も早期に回復した。この試験は生存便益を示すようにデザインされたものではなかったが、対照物質を投与した１０匹中４匹が生存したのに対し、投与した全ての動物は４５日まで生存した。
【００４０】
本研究の目的は米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）及び他の規制当局への申請を支援するため、適正な品質と完全性とを備えたデータを提供することであった。したがって、本研究は、米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）が承認したＯＥＣＤ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＥＮＶ／ＭＣ／ＣＨＥＭ（９８）１７）に準拠した。
【００４１】
本試験の目的は、Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標）（ペグフィルグラスチム）の皮下投与の有無にかかわらず、放射線照射された（目標ＬＤ３０／４５）アカゲザル非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に１回又は２回皮下投与した後の、被験物質Ｎｐｌａｔｅ（登録商標）（ロミプロスチム）の薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）プロファイルの特性を評価することであった。動物は、所定の基準に従って、抗生物質、輸液、抗潰瘍薬、制吐薬、鎮痛薬、栄養補給、及び創傷消毒を含む支持療法を受けた。血液製剤は提供されなかった。
【００４２】
４５日間で３０％の目標死亡率（ＬＤ３０／４５）を達成するために、全動物を、Ｃｏ６０源（Ｔｈｅｒａｔｒｏｎ  １０００）からの５５０ｃＧｙ（ＬＤ３０／４５）の単一の均一な全身線量放射線に、線量率約５０ｃＧｙ／分で、１０分４５秒〜１１分１３秒の全曝露時間曝露した。投与日に各動物に、ビヒクル、ロミプロスチム及び／又はペグフィルグラスチムを皮下注射により投与した。ロミプロスチム、ペグフィルグラスチム及び／又はビヒクルの投与は、照射の２４時間±２時間後に開始した。各用量群における照射スキーム及び動物数を示す表を表１に示し、各投与日に各群に投与した容量を表２に示す。
【００４３】
【表１】
2021515780.tif 000003
【００４４】
【表２】
2021515780.tif 000004
【００４５】
動物は、処置の開始時、３〜６歳であり、体重は３．７〜６．４ｋｇであった。
【００４６】
この研究の間の評価には、死亡率チェック、臨床観察、体重及び体温が含まれた。臨床病理学的検査（血液学及び凝固）のために、処置前の期間に２回と、投与１、３、５日目、投与前、８日目（投与前）、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１９、２１、２４、２８、３５、４２及び４５日目に（血液学的検査のため）、また３日目、８日目（投与前）、１０、１４、１７、２１、２４、２８、３５、４２及び４５日目に（凝固検査のため）、血液試料を全動物から採取した。薬物動態評価のための血液試料は、照射前と、投与１日目及び８日目（投与の１、２、４、８、１２、２４、４８及び７２時間後）、並びに１４、２１、２８、３５及び４５日目に採取した。非末期時（発熱性好中球減少症が確認されるか、若しくは感染が疑われた場合）、又は予定外の終了時に、血液培養物を採取した。４５日目の最後の採血を行った後、生存動物を試験から解放した。
【００４７】
試験の実施中に、６匹（雄３匹、雌３匹）が死に至り、それらは全て第１群（ビヒクル）からであった。中止又は死亡に至る臨床徴候には、重度の出血、重度の活動低下及び低体温が含まれた。５、１４、１８日目に３匹（雄２匹、雌１匹）が死んでいるのが認められた。５日目に死んでいるのが発見された雄は、死亡の前日に、中等度の食欲減退、軽度の振戦及び血便を呈していた。残りの３匹は、予定した中止の前、１５及び１７日目に安楽死させた。
【００４８】
対照動物では、５５０ｃＧｙの全身照射後のビヒクルの皮下投与により、６０％の死亡率（ＬＤ６０／４５）となったが、ロミプロスチム群及びペグフィルグラスチム群のいずれにも死亡例は認められなかった。この死亡率は目標のＬＤ３０／４５より高かった。
【００４９】
放射線モデルにおいて予想される臨床徴候、体重変化、及び体温変化は、処置群では、ビヒクル対照群と比較して、重篤度及び／又は発生率がより低いことが観察され、第６群は他の処置群と比較して、より早期の回復、及びより良好な体重回復を示した。予想されたように、照射後の対照群及び処置群において、凝固パラメータに有意な変化はなかった。
【００５０】
血液学的パラメータ（ＲＢＣ、ＨＣＴ、ＷＢＣ、ＬＹＭＰＨ、ＭＯＮＯ）は、照射後に予想される減少を示し、全ての処置群が、対照群と比較して、より早く、且つより良好な回復を示した。一般に、第６群（ロミプロスチム及びペグフィルグラスチムの両方を投与）は、他の処置群と比較して、より早期の回復を示し、放射線で誘発される影響もより穏やかであることが認められた。ＮＥＵＴ（好中球）及びＰＬＴ（血小板）レベルは、照射後、予想どおり減少した。第４群及び第６群（いずれも、ペグフィルグラスチムを投与）は、（ペグフィルグラスチムが好中球産生を刺激するので、予想されるように）残りの処置群と比較して、ＮＥＵＴはより早期に回復したが、第６群（ロミプロスチム及びペグフィルグラスチムの両方を投与）は、第４群（ペグフィルグラスチム単独、０．５１×１０９／Ｌ、１３日目）と比較して、より速い１３日目に、より高いカウント数（１．２５×１０９／Ｌ）で回復することが認められた。ＰＬＴ最低値は治療群でさほど悪くなく、第６群では、細胞数が９２．１×１０９／Ｌ（１１日目に最低値）と最も軽度なＰＬＴ最低値を示し、且つ最も早期の回復（１０５．５×１０９／Ｌ、１２日目）を示した。これらの結果は、第１群及び第４群と有意差があった（ｐ≦０．０１）。第５群の動物にはロミプロスチムを２回投与したが、第３群（ロミプロスチムを１回投与）と比較した場合、最低値又は回復開始時のＮＥＵＴ数又はＰＬＴ数に有意差は認められなかった。これらの結果に基づくと、ロミプロスチム及びペグフィルグラスチムを同時投与した場合、ＮＥＵＴ及びＰＬＴに対し相乗効果があるようである。
【００５１】
いくつかの用量群では、動物間で血清ロミプロスチム濃度にかなりのばらつきが認められ、その結果、ＰＫパラメータにかなりのばらつきが生じた。Ｃｍａｘ及びＡＵＣｌａｓｔの平均値に基づくロミプロスチムの血清曝露量は、第３群の値と比較した場合、第６群の雌では８０％超増加し、雄では約１５％減少した。ロミプロスチムの投与量を２．５ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇへ増加したことによって、ロミプロスチムの血清曝露量が過度に増加した。反復投与によりロミプロスチムが蓄積する傾向が認められ、投与２を投与した雌では、投与１を投与した場合と比べて、平均Ｃｍａｘが約４３％大きく、ＡＵＣ（０〜７２時間）が約３６％大きかったことから、その傾向はまた雌でより明白であった。第３群と比較した場合、ＰＬＴの有意な増加（ｐ≦０．０１）は、１４日目及び１５日目でのみ観察された。
【００５２】
ロミプロスチム及びペグフィルグラスチムの用量レベル設定の根拠
ロミプロスチムについて選択された用量レベルは、以前に実施された、正常で健康なＮＨＰを対象とした単回及び反復投与毒性試験に基づいた。選択された用量の範囲は、臨床的に関連する血小板の増加を達成すると予想された。選択された最高用量は、投与容量及び投与製剤の制約に基づき投与可能な最大用量であった。ペグフィルグラスチムに選択された用量レベルは、急性放射線症候群（ＡＲＳ）に対する本製品の認可を支持する臨床的に関連する好中球の増加を示すこれまでのＮＨＰ研究に基づいた。
【００５３】
照射レベルの妥当性
５５０ｃＧｙの照射線量レベルは、Ｃｉｔｏｘｌａｂ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａで実施された研究からの利用可能なデータ及び病歴データに基づいて、およそＬＤ３０／４５をもたらすように選択された。この線量は、放射線照射下でのＰＫ／ＰＤの評価を提供することを意図したものであるが、さらに有意義なデータセットを提供するのに十分なレベルの生存を提供することを意図したものでもある。
【００５４】
投与経路の選択理由
皮下経路は、ヒトにおける被験物質の意図される投与経路である。
【００５５】
試験系の選択理由
アカゲザル（マカカ・ムラッタ（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ））は、ＰＤ及びＰＫプロファイリングに許容される種であるために選択された。アカゲザルの放射線照射後の病歴データも豊富に入手可能であり、本研究にこの種の使用することを支持している。
【００５６】
選択動物数の妥当性
試験に使用した動物数は、規制要件、統計的検出力及び／又は病歴データの入手可能性に基づき、試験目的を達成するために必要な最小限の数と考えられ、ＩＡＣＵＣ承認ガイドライン内であった。
被験物質、希釈液、ビヒクル／参照物質の特性
被験物質１
識別：ロミプロスチム（バイアル中の凍結乾燥粉末、６００μｇ／バイアル；注射用滅菌水１．２ｍＬで再構成されると０．５ｍｇ／ｍＬ；ロミプロスチム及びＡＭＧ５３１としても知られる）
バッチ番号：００１０２９４９６５
リテスト日：２０１８年１０月３１日
保管条件：冷蔵、２〜８℃、及び遮光
被験物質２
識別：ペグフィルグラスチム（ペグフィルグラスチムとしても知られる）
ロット番号：００１０２３６０９７
有効期限／リテスト日：２０１８年３月
保管条件：冷蔵、２〜８℃、及び遮光
ロミプロスチム用希釈剤
識別：注射用滅菌水、ＵＳＰ
ロット：Ｗ７Ｊ１８Ａ０
有効期限：２０１８年１０月
ロミプロスチム用ビヒクル／参照物質
識別：注射用０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰ
ロット：Ｗ７Ｂ１０Ｃ１
有効期限：２０１８年５月
【００５７】
投与製剤の調製
ロミプロスチム被験物質製剤を、ラミナーフローフード内で滅菌試薬及びクリーン技術を使用して調製した。投与溶液は、遮光し、投与まで濡れた氷上で維持するか又は冷蔵し、調製後２０時間以内に投与した。
【００５８】
使用日に、ロミプロスチムを、注射用滅菌水１．２ｍＬをシリンジにより各バイアルに添加することによって、５００μｇ／ｍＬ（０．５ｍｇ／ｍＬ）の濃度に再構成した。バイアルを穏やかに旋回させ、反転させて再構成し、次いで、溶液が透明で無色であることを確認するために検査し、その後、全ての再構成バイアルの容量を滅菌容器にプールした。次いで、分析化学試料を除去した後、滅菌容器をゴム隔膜でキャップした。
【００５９】
ペグフィルグラスチム被験物質製剤は、投与の少なくとも３０分前に室温に戻し（遮光し）、ゴム隔膜を有する滅菌容器にプールし、そのまま使用した。
【００６０】
製剤化ロミプロスチムの用量分析
この研究のために、再構成した被験物質ロミプロスチムの濃度分析を行った。投与日に、製剤化ロミプロスチム投与液から試料を採取し（１ｍＬを２回）、濃度分析を行った。分析前、試料を冷蔵保存した（目標４℃）。製剤化生成物が水溶液であるため、均質性分析は行わなかった。同等の試料をビヒクル製剤から採取した。投与製剤の濃度は、有効性が認められた方法を用いて±１０％の許容基準内であることを確認した。ペグフィルグラスチムは供給されたまま使用したので、製剤の用量分析は行わなかった。
【００６１】
投与製剤の投与
ロミプロスチム及びビヒクル／参照物質を、上記の研究デザイン表（表１及び表２）に詳述されているように、シリンジに取り付けられた２５ゲージ針を使用して、上背部及び／又は腰部領域に皮下注射により投与した。各動物に投与する実際の容量を、各動物の最新の実際の体重に基づいて計算し、調整した。
【００６２】
注射は、上背部及び／又は腰部の複数部位に行った。ロミプロスチム及び／又はビヒクル／参照物質を分け、１日目及び８日目に６か所にわたって皮下注射により投与した。ペグフィルグラスチムは、１日目及び８日目の両方に、上背部の別個の７番目の部位（１番目及び２番目の部位のレベルより上）に投与した。
【００６３】
投与前に、注射部位を剃毛し、入墨した（１部位当たり約１．５ｃｍ×１．５ｃｍの正方形）。ペグフィルグラスチムを投与する動物のみ、７番目の投与部位に入墨した。投与シリンジに滅菌容器から充填し、各動物に注射する直前に加温した。
【００６４】
投与期間中に時折、個々の動物に投与部位からの少量の投与製剤の漏出が認められるか、又は表３に示すように皮内投与された。
【００６５】
【表３】
2021515780.tif 000005
【００６６】
１日目、動物４６０２（第４群、ペグフィルグラスチム）に、溶媒及びペグフィルグラスチムを、動物の体重に基づいて計算した量よりも多く投与した（ビヒクル３７ｍＬの代わりに５１ｍＬ、及びペグフィルグラスチム０．１１ｍＬの代わりに０．１５ｍＬ、名目用量の＋３６％）。その後の臨床状態の評価及び投与後における動物の血液学的分析では、皮下投与した液量が増加したことによる有害な影響は認められず、動物の好中球数は同群の他の動物と同等であった。動物の状態及び血液学的検査結果は同群の他の動物と同等であり、第４群の動物は参照対照試料として血清を分析したことから、投与量の増加による動物の状態又は試験目的に及ぼす影響は最小限であるか又は全くなかった。これらの投与逸脱は、その容量が投与量と比較して極めて少ないと考えられることから、結果や試験の完全性に影響を及ぼすものではないと考えられた。
【００６７】
試験系
アカゲザル５０匹（雄２５匹、雌２５匹）を、２匹の予備動物／性を含めて、Ｋｕｎｍｉｎｇ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ（Ｃｈｉｎａ）から受領し、２０１８年１月１５日に研究室に移した。投与開始時の動物の年齢は３〜６歳であった。体重は雄及び雌でそれぞれ３．８〜６．４ｋｇ及び３．７〜５．５ｋｇであった
【００６８】
全身照射
第１〜６群の動物を、約５０ｃＧｙ／分の線量率で、Ｃｏ６０源（Ｔｈｅｒａｔｒｏｎ  １０００）からの単一の均一な全身照射線量の放射線に曝露した。照射時間を計算するために、５５０ｃＧｙの名目照射線量を放射線物理学者に提供した。放射線処置計画の精度を保証するために、動物へ照射する前に、２名の異なる検証者が曝露時間と割り当てた放射線量を検証した。線量測定分析は、平均線量測定値が、群全体にわたって、Ｎａｎｏｄｏｔでは５１４〜５６２ｃＧｙ、Ｆａｒｍｅｒイオン化チャンバーでは５４１〜５４６ｃＧｙの範囲で一致することを示した。
【００６９】
照射日の前に、放射線量を、動物照射に使用したのと同じ実験設定に置いたアクリルファントムを使用して較正した。動物にランダムに繰り返し照射した。各動物の曝露時間は、身体寸法に基づいて個々に計算した。
【００７０】
２つの線量計（Ｌａｎｄａｕｅｒ，Ｉｎｃ．Ｍｏｄｅｌ  Ｎａｎｏｄｏｔ）を、全身照射の前に各動物に置き、線量を定量した。照射日、１つの線量計を、ほぼ剣状突起レベルで中央平面上に配置し、第２の線量計を、肩甲骨間領域の下の背側領域の対応するレベルに配置した。線量計を、約５ｍｍ（スーパーフラブ）のゲルボーラス下に置き、包帯で固定した。線量計を、曝露の推定のためにＬａｎｄａｕｅｒに戻した。各動物のファントムを用いた線量測定、線量率、照射期間及び実際の照射時間を記録した。
【００７１】
放射線量を定量化するため、ファーマーイオン化チャンバーを電位計に接続し、各放射線処置場に含めた。電位計によって記録されたエネルギーを放射線量に変換し、研究報告書に含めた。周囲温度及び大気圧を、リアルタイム線量測定の計算のために、各照射後に記録した。
【００７２】
動物を、全身照射の前に一晩絶食させ、照射施設で照射した後、給餌し（すなわち、各動物に照射後、バナナを与えた）、さらに施設に戻ってすぐに給餌した。
【００７３】
照射前に、各動物をケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）で麻酔し、照射処置室に移した。必要に応じて、麻酔薬を追加投与した。動物のストレスを軽減するために、処置室内にソフトミュージックを提供した。動物を全身照射のために水平位置に置いた。動物の位置を、治療室に設置したリニアマーカーで確認した。
【００７４】
均一な線量分布を生成するために、２つの部分に分けて処置した。まず、動物は前後方向の（ＡＰ）照射により線量の半分を受けた。線量の後の半分は後前方向の（ＰＡ）照射により与えた。低血圧の管理に役立つように、各照射動物に照射後に輸液療法（１０ｍＬ／ｋｇ乳酸リンゲル液；ＩＶ）を行った。
【００７５】
生存中の観察
死亡率
試験の全段階の期間、ケージ側の臨床徴候観察と同時に、死亡率のチェックを記録した。回復不能な痛み又は機能不全のある一部の動物は、可能であれば安楽死させた。可能であれば、早期に安楽死させた動物から臨床病理学的血液試料、血液培養及びＰＫ試料を採取した。予定外の安楽死で収集されたデータは、いずれの群平均の概要から除外した。
【００７６】
血液学／薬力学（ＰＤ）及び凝固
臨床病理学的評価（血液学的検査及び凝固検査）を、全ての動物について、以下に示すように実施した。絶食していない動物から大腿静脈（必要であれば、橈側皮静脈又は伏在静脈も使用）から血液試料を採取した。大腿静脈は、個体の血小板数が＞８０×１０９／Ｌの場合を除き、６日目〜２４日目の間は使用しなかった。いずれも血液収集（照射後に開始）の前に、イソプロピルアルコール７０％で拭き取り、続いてグルコン酸クロルヘキシジン４％の拭き取りを、血液収集部位で行った。各血液収集後、少量のイソプロピルアルコール７０％を含ませたガーゼを所定の位置に保持し、収集部位を手で押圧した。完全に止血したなら、出血部位の周囲をイソプロピルアルコール７０％で再び拭った。
【００７７】
試験施設安全衛生標準業務手順書の一部として、予定の収集に加えて、第６群の動物６１０２及び６５０１をそれぞれ１０日目及び１４日目に、技術者がこれらの動物に傷害を受けたため、採血（各５ｍＬ）した。
【００７８】
ａ）血液学／ＰＤ
全生存動物に対して、治療前期間（−１２日目〜−５日目）に２回、放射線に曝露後、１、３，５日目（投与前）に、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１９、２１、２４、２８、３５、４２及び４５日目に血液学的評価を行った。
【００７９】
処置前の試料採取を除き、転帰に影響を及ぼす可能性を回避するため、血液学的検査も凝固検査も再実施は行わなかった。予定外の安楽死のために許可された動物は、その日の採血がまだ行われていない場合に限り、血液学的検査及び凝固検査のための採血を試みた。
【００８０】
抗凝固剤としてＫ３ＥＤＴＡを含有する試験管に採取した血液試料について、以下のパラメータを測定した。各試料について採取する血液の目標容量は０．５ｍＬであった。
ヘマトクリット値  血小板分布幅
ヘモグロビン  血小板数
ヘモグロビン分布幅  血小板クリット／トロンボクリット（ｔｈｒｏｍｂｏｃｒｉｔ）
平均赤血球ヘモグロビン量  赤血球数
平均赤血球ヘモグロビン濃度  赤血球分布幅  網状赤血球数（絶対数及び相対数）
平均赤血球容積  白血球数（ＷＢＣ）
平均血小板容積  白血球分画（絶対値＋相対値）
【００８１】
ｂ）凝固
試料（クエン酸塩チューブ中、１．０ｍＬ）を、処置前期間に１回、３日目（投与前）に、８、１０、１４、１７、２１、２４、２８、３５、４２及び４５日目に採取した。以下のパラメータを記録した：
活性化部分トロンボプラスチン時間
プロトロンビン時間
フィブリノーゲン
試料の外観（異常時）
【００８２】
血液学的分析又は凝固分析後の残りの血液若しくは血漿、又は分析されていない試料（試料の品質による）を、将来あり得る分析のために、試験依頼者に出荷するまで、又は報告書の完成後に廃棄するまで、−７０℃で保管した。
【００８３】
ｃ）血液培養
発熱性好中球減少が確認された時点（好中球絶対数＜０．５×１０９／Ｌ、直腸温≧１０４°Ｆ／４０．０℃）、又は安楽死時に、血液培養用に適切な静脈から血液を採取した（試験中の目標容量１ｍｌ、安楽死時の目標容量１０ｍｌ）が、１週間に３回以上は動物から採取しなかった（安楽死時を除く）。他の日の臨床徴候及び身体所見から臨床獣医が敗血症を疑った場合は、採血及び血液培養も行った。
【００８４】
採取したシリンジから血液試料を直接、血液培養用のバイアルに接種した。シリンジの目盛りから決定された血液試料の容量を記録した。接種した血液バイアルを室温で保存し、採取後、できるだけ早くＩＤＥＸＸへ輸送し、ＩＤＥＸＸは３日以内に受領した。各試料には、動物番号、採取日、検体の種類、保存条件、血液量及び試験番号をラベルした。ＩＤＥＸＸにより好気性及び嫌気性培養が行われた。細菌陽性の血液培養を、抗生物質感受性評価の対象とした。
【００８５】
非終末的に行われる血液培養のために、血液試料（目標容量１ｍＬ）を、橈側皮静脈（又は別の適切な血管）から収集した。終末的に行われる血液培養のために、血液試料（目標容量１０ｍＬ）を、大腿静脈（又は別の適切な血管）から収集した。予定及び予定外の安楽死のために、皮膚を剃毛し、グルコン酸クロルヘキシジン４％及びアルコール７０％で無菌状態に整えた。無菌手順で試料を収集し、ＩＤＥＸＸで培養培地に移した。ＩＤＥＸＸで、彼らの手順に従って、好気性及び嫌気性培養が行われた。
【００８６】
薬物動態（ＰＫ）
ロミプロスチムの血清濃度測定用の血液試料（各々１．０ｍＬの目標値）を全動物から、以下に記載する均一な手順で採取し、各採取時期を正確に記録し、その後の薬物動態分析のためにＳＲＩ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌに提供した。その後、ロミプロスチムを投与された動物から採取した試料について、ロミプロスチムの血清濃度の分析を行った。それぞれ参照物質／ビヒクル及びペグフィルグラスチムのみを投与された第１群及び第４群の動物からの代表的な試料を参照対照として分析した。
【００８７】
照射前（−２日目）
・１日目：全ての群に対し、注射前、並びに注射の１、２、４、８、及び１２時間後
・２日目（１日目の投与の２４±１時間後）
・３日目（１日目の投与の４８±１時間後）
・４日目（１日目の投与の７２±１時間後）
・８日目：全ての群において、注射前、並びに注射の１、２、４、８、及び１２時間後
・９日目（８日目の投与の２４±１時間後）
・１０日目（８日目の投与の４８±１時間後）
・１１日目（８日目の投与の７２±１時間後）
・その後、ほぼ毎週（１４、２１、２８、及び３５日目）
・４５日目
【００８８】
ＰＫのための血液試料を、大腿静脈（６日目〜２４日目を除く）、橈側皮静脈又は伏在静脈により採取した。血清分離用チューブ（ＳＳＴ）に適切な量の血液を入れ、５回穏やかに反転させ、室温で３０〜６０分間凝固させた。次いで、試料を標的１５分間遠心分離した（４℃、１５００ｇに設定）。血清を除去し、２本のクライオバイアルに等分し、ドライアイス上に置き、採血の２時間以内に−７０℃に設定した冷凍庫に移した。血清試料を、分析のために、毎週、ドライアイス上で、Ｓｙｎｅｏｓ  ＨｅａｌｔｈのＲａｑｕｉｃａ  Ｂｕｔｌｅｒに送った。同じ試料からのアリコートは、同じ荷として送らなかった。試料は、−６０℃以下を維持するように設定された冷凍庫で保存した。
【００８９】
血清試料を、Ｓｙｎｅｏｓ  Ｈｅａｌｔｈにより、彼らの有効なサンドイッチイムノアッセイ分析法を使用して、ロミプロスチム濃度について分析した。１日目の注射前試料の分析が、１日目の注射前の各動物にロミプロスチムが存在していないことを示すのに十分であったため、照射前（−２日目）試料の分析は実施しなかった。
【００９０】
第１群及び第４群からの試料は、以下の時点でのみ分析し、代表的な参照対照試料として使用した。
・１日目：注射の４時間後
・２日目：注射の２４時間後
・８日目：注射の４時間後
１日目及び８日目の他の時点（上記に列挙されていない）の第１群の試料を、照射後選択性試験のための生物学的分析法に使用した。
【００９１】
薬物動態試料の一部を、生物学的分析法の再現性の評価のために再分析した（実試料の再分析（ｉｎｃｕｒｒｅｄ  ｓａｍｐｌｅ  ｒｅ−ａｎａｌｙｓｉｓ））。実試料の再分析値は、薬物動態分析には使用しなかった。
【００９２】
血清薬物濃度データを、Ｐｈｏｅｎｉｘ（登録商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）ソフトウェアバージョン６．３を使用して分析して、非コンパートメントモデリングを行った。投与した用量を、ｍｇ／ｋｇとしてプログラムに入力し、その結果、動物の個々の体重についての追加の補正は必要なかった。
【００９３】
非コンパートメント解析を用いて決定されたパラメータ及び定数には、データが許可された場合、最高血清濃度（Ｃｍａｘ）、最高血清濃度到達時間（Ｔｍａｘ）、血清濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）、及び消失半減期（ｔ１／２）が含まれた。
【００９４】
データの取り扱いと報告
データキャプチャ
本試験では、投与開始の少なくとも２週間前からデータを収集した。ベースラインの比較には、投与開始前１週間のデータで十分であると考えられる。この期間の前に収集された可能性のあるデータは、研究ファイルに保持された。
【００９５】
本試験の実施中、以下のデータキャプチャシステムを使用した。
生存中のデータの収集：Ｐｒｏｖａｎｔｉｓ  Ｉｎ−Ｌｉｆｅ  Ｍｏｄｕｌｅ  ９．３．０．０
臨床病理：Ｐｒｏｖａｎｔｉｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｍｏｄｕｌｅ  ９．３．０．０
病理：Ｐｒｏｖａｎｔｉｓ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｍｏｄｕｌｅ  ９．３．０．０
分析：ＥＺＣｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅ  ３．３．１
生物学的分析：Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ  ５．２
薬物動態：Ｐｈｏｅｎｉｘ（登録商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  ６．３
統計解析：ＳＡＳ  ９．２及び９．３
室内環境：Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  ３．１３
【００９６】
データ分析
予定外の場合に記録されたデータは個別に報告したが、以下の分析には含まれていない。
【００９７】
試験の実施中に得られた数値データは、群平均、中央値及び標準偏差の計算に供し、報告した。試験の実施中に得られた非数値データは、個々の結果及び／又は群の発生として報告した。
【００９８】
目的の各対群比較は、有意水準５％で両側検定により行い、有意の結果はｐ≦０．００１、ｐ≦０．０１又はｐ≦０．０５のいずれかとして報告した。ここで、ｐは観測された確率を表す。
【００９９】
生存データ
死亡率データの統計的群間比較を、フィッシャーの正確確率検定を用い、全群を含むプールした性について行った。全体的な群間比較では、死亡率に有意差が認められた（ｐ≦０．０５）。第１群の死亡率をＦｉｓｈｅｒの正確確率検定を用いて他の各群と比較した。第１群以外には死亡率がなかったので、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定は、対象となる他の対群比較では実施できなかった。
【０１００】
数値データ
体重、体重変化、体温、血液学的パラメータ［白血球（ＷＢＣ）、好中球（ＮＥＵＴ）、リンパ球（ＬＹＭＰＨ）、単球（ＭＯＮＯ）、血小板（ＰＬＴ）、ヘマトクリット、赤血球（ＲＢＣ）及び網状赤血球（ＲＥＴＩＣ）］の絶対値の、雄、雌及びプールした性での処置平均値［±標準誤差（ＳＥＭ）］及び経時的な中央値のプロットを示した。
【０１０１】
統計的群比較のために提出された数値データセット：
・体重及び体重変化
・体温
・臨床病理（血液学的検査；ＷＢＣ、ＮＥＵＴ、ＬＹＭＰＨ、ＰＬＴ、ＲＢＣ、ＲＥＴＩＣを含む全てのパラメータ、凝固検査；活性化部分トロンボプラスチン時間、プロトロンビン時間、フィブリノーゲン）
【０１０２】
以下の統計的群比較を、上に列挙した数値データセットについて、場合により２つのフェーズで行った。第１フェーズでは、ロミプロスチムの処置効果のみを評価した。第２フェーズでは、ロミプロスチム、ペグフィルグラスチム、及びそれらの可能性のある相互作用の処置効果を評価した。
【０１０３】
フェーズ１比較
以下の統計的比較を用いてロミプロスチムも処置効果を評価した。比較には、第１群、第２群、第３群及び第５群の結果のみが含まれた。
【０１０４】
各場合について、一変量二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った。モデルは、固定効果として、群、性、及び相互作用群×性を含んだ。
【０１０５】
考慮した固定効果のレベル間の分散不均一性の有意性を評価するために、３つの不均一分散ＡＮＯＶＡモデルを、それぞれ、１−群、２−性、及び３−群及び性の組み合わせの各レベルについて異なる共分散行列をモデル化することによって適合させた。最終的なヘシアンがモデルに対して正の確定でなかった場合、又はモデルをフィッティングする際に計算上の制限／収束問題に遭遇した場合、モデル結果は以下のステップで考慮されなかった。うまくフィットした不均一分散モデルの中から、最も低い補正赤池情報量基準（ＡＩＣＣ）を有するものを選択し、縮小等分散ＡＮＯＶＡモデル（群及び性の全てのレベルについて共通の共分散行列を有するモデル）と比較した。
【０１０６】
選択された不均一分散モデル（フルモデル）が等分散モデル（縮小モデル）よりも有意に良好な適合を提供することを試験するために、ＲＥＭＬ推定結果に基づく尤度比検定を使用した。尤度比検定が有意でなかった場合（ｐ＞０．０５）、縮小モデルからの結果を保持した。それ以外はフルモデルの結果を保持した。ケンワード−ロジャー法を用いて、固定効果を含む検定の分母自由度を計算した。代替のサタスウェイト法は、ケンワード−ロジャー法が適用できなかった場合に用いた。
【０１０７】
保持されたモデルが、固定効果相互作用が保持されたＡＮＯＶＡモデルから有意ではないことを示した場合（ｐ＞０．１０）、群効果を、ＡＮＯＶＡ  Ｆ検定を用いて、性間でプールされた最小二乗平均で評価した。相互作用が有意であった場合（ｐ≦０．１０）、群効果はＡＮＯＶＡ  Ｆ検定を用いて、最小二乗平均で、各性について評価した。
【０１０８】
群効果が有意であった（ｐ≦０．０５）場合、ｔ検定を用いて、最小二乗平均で、目的の対比較を行った。目的の対比較は、ビヒクル対照の第１群と他の各群、及び第３群と第５群であった。
【０１０９】
フェーズ２比較
以下の統計的比較を用いて、ロミプロスチム、ペグフィルグラスチム、及びそれらの可能性のある相互作用の処置効果を評価し、したがって、第１群、第３群、第４群及び第６群の結果のみを含めて実施された。
【０１１０】
三元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った。このモデルには、固定効果として、ロミプロスチム（２レベル：０及び５ｍｇ／ｋｇ  １日目）、ペグフィルグラスチム（２レベル：０及び０．３ｍｇ／ｋｇ  １日目及び８日目）、性、及びそれらの双方向及び三方向相互作用が含まれた。
【０１１１】
考慮した固定効果のレベル間の分散不均一性の有意性を評価するために、不均一分散ＡＮＯＶＡモデルを適合させ、各固定効果の各レベル及び固定効果の組み合わせの各レベルについて異なる共分散行列をモデル化した。最終的なヘシアンがモデルに対して正の確定でなかった場合、又はモデルをフィッティングする際に計算上の制限／収束問題に遭遇した場合、モデル結果は以下のステップで考慮された。考慮された不均一分散モデルの中から、最も低い補正赤池情報量基準（ＡＩＣＣ）を有するものを選択し、縮小等分散ＡＮＯＶＡモデル（画固定効果の全てのレベルについて共通の共分散行列を有するモデル）と比較した。
【０１１２】
選択された不均一分散モデル（フルモデル）が等分散モデル（縮小モデル）よりも有意に良好な適合を提供することを試験するために、ＲＥＭＬ推定結果に基づく尤度比検定を使用した。尤度比検定が有意でなかった場合（ｐ＞０．０５）、縮小モデルからの結果を保持した。それ以外はフルモデルの結果を保持した。ケンワード−ロジャー法を用いて、固定効果を含む検定の分母自由度を計算した。代替のサタスウェイト法は、ケンワード−ロジャー法が適用できなかった場合に用いた。
【０１１３】
保持された三元配置ＡＮＯＶＡの結果、三重相互作用が有意であることが示された場合（ｐ≦０．１０）、ロミプロスチム効果はペグフィルグラスチムと性の各組み合わせ内で、またペグフィルグラスチム効果はロミプロスチムと性別の各組み合わせ内で、ｔ検定を用いて、最小二乗平均で評価した。
【０１１４】
有意な三重相互作用が認められなかった場合（ｐ＞０．１０）、下表（表４）に、どの相互作用が有意であった（ｐ≦０．１０）かに応じてロミプロスチムとペグフィルグラスチムの効果をどのように評価したかを詳述した。
【０１１５】
【表４】
2021515780.tif 000006
【０１１６】
上記の表に記載したように、ロミプロスチム及びペグフィルグラスチムの効果の評価を、ｔ検定を用い、ＡＮＯＶＡモデルからのそれぞれの最小二乗平均で行った。ロミプロスチム及びペグフィルグラスチム効果の有意性を５％αレベルで評価した。
【０１１７】
結果
被験物質濃度の分析
ビヒクル試料（第１群、第２群、第４群）における被験物質濃度（ロミプロスチム）の非存在が実証された。被験物質の名目濃度との一致は、以下の表に詳述するように、名目濃度から±１０％（名目濃度から−７．４％〜−０．２％）の範囲内であった。
【０１１８】
【表５】
2021515780.tif 000007
【０１１９】
死亡率
試験の実施中に、６匹（雄３匹及び雌３匹）が死に、それらは全て第１群（ビヒクル）からであった。図６Ａ〜６Ｃは生存曲線（性別、及び雌雄合計）を示しており、この試験では照射レベルが約ＬＤ６０／４５であることを示している。
【０１２０】
食欲減退、背中の曲がり、出血（点状出血）の兆候、及び下痢が、照射後の群（両性）で見られた。
【０１２１】
食欲減退は全群で認められ、発生率や重症度については全般的に群間差はなかった。照射誘発性下痢が予想された期間中の２日目〜１７日目に下痢（液状便）が認められた。背中の曲がりは全群で見られ、発生率が最も高かったのは第１群であった。雄は雌よりも影響が少ないようであった（１日目に行ったこの観察で、第３群の１匹の雄のみ）。点状出血が全群で認められ、第６群の動物で発生率がわずかに低かった。
【０１２２】
発熱性好中球減少症（好中球絶対数＜０．５×１０９／Ｌ；≧４０℃）の疑いがあったため血液培養を行っていた３匹の動物は、結果は陰性であった。
【０１２３】
その他の臨床徴候（分泌物の有無を問わない皮膚創傷、薄い被毛、赤い液状物質、外陰部からの赤色の分泌物が挙げられるが、これらに限定されない）は、実験手順（膿瘍及び創傷を生じる可能性のある製剤の予防的皮下注射、線量計の設置部位又は採血部位の剃毛による薄い被毛）に関連し、又は発情期にある実験室で飼育されたメンバーに見られ、且つ／又は発生率若しくは重症度において用量レベルに関係しないと考えられた。
【０１２４】
血液学（薬力学）
ＲＢＣ（赤血球）値及びＨＣＴ（ヘマトクリット）値は照射後に低下し、１７日目までに全処置群で回復が始まった。他の処置群と比較して、第６群はわずかに高いままで、第４群はわずかに低いままであった。
【０１２５】
ＲＥＴＩＣ（網状赤血球）レベルは全て照射後に減少し、対照群を含め、群間に差はなかった。ＲＥＴＩＣ数の回復は、対照群と比較した場合、処置群（すなわち、ロミプロスチム及び／又はペグフィルグラスチム）で改善されたが、処置間で有意差はなかった。
【０１２６】
ＷＢＣ（白血球）値、ＬＹＭＰＨ（リンパ球）値及びＭＯＮＯ（単球）値は照射後減少し、１７日目頃から徐々に回復が始まった。ＬＹＭＰＨは、全ての処置群（すなわち、第２群〜第６群）で、第１群と比較してより高いカウントを示し、全般的に互いに同等であった。ＷＢＣ及びＭＯＮＯについては、第１群と比較して、全ての処置群がより早期の回復を示し（第６群が最も早期の回復を示した）、より高いカウントを有した。
【０１２７】
ＮＥＵＴ（好中球）レベルは照射後に低下し、第１群は１４日目に最低値（０．１３×１０９／Ｌ）を示し、１５日目に回復が始まった（０．１５×１０９／Ｌ）が、第４群及び第６群は、他の群の０．０９〜０．１３×１０９／Ｌの範囲の最低値と比較して、それぞれ０．４３×１０９／Ｌ及び０．５６×１０９／Ｌと、より軽度の最低値を示すことが認められた。第４群及び第６群の最低値は、第１群及び第３群に対してのみ有意差が認められた（ｐ≦０．０５）。第６群（ペグフィルグラスチム及びロミプロスチム）では、１３日目に、より多い細胞数（１．２５×１０９／Ｌ）で、最も早い回復が認められ、それに続いて、第４群（ペグフィルグラスチム）が１３日目に０．５１×１０９／Ｌを示した。興味深いことに、第４群及び第６群はまた、最下点の前の８日目〜９日目に、ＮＥＵＴの一過性の上昇を示すことが認められた。第５群の動物にはロミプロスチムを２回投与したが、第３群（ロミプロスチムを１回投与）と比較した場合、好中球数の最低値及び回復の開始のいずれにも有意差は認められなかった。各群（雌雄を合わせた）における、好中球数の中央値を図７に示し、好中球の最低値及び回復日を表７に示す。
【０１２８】
【表６】
2021515780.tif 000008
【０１２９】
Ａ：第１群と統計的有意差。Ｂ：第３群と統計的有意差。Ｃ：第４群と統計的有意差。
【０１３０】
第１群において、照射後に重度の血小板減少が観察され、照射１４日後にＰＬＴ最低値２０．６×１０９／Ｌであった。ロミプロスチム及びペグフィルグラスチムのいずれかを投与された群（すなわち、第２群〜第５群）は血小板減少が比較的少なく、１３日目に４７．６〜７１．０×１０９／Ｌの範囲の最低値を示し、一方、ロミプロスチム及びペグフィルグラスチムの両方を投与された群（すなわち、第６群）は１１日目に最も軽度な血小板数の最低値（９２．１×１０９／Ｌ）を示し、第１群及び第４群と比較して有意差があった（ｐ≦０．０１）。第６群はまた、その後、他の群と比較して、より高いＰＬＴ数（１０５．５×１０９／Ｌ、１２日目）で、より早い回復を示した。最低値に関しては、第３群（ロミプロスチムを１回投与）及び第５群（ロミプロスチムを２回投与）で観察された細胞数が非常に類似しており（それぞれ７１×１０９／Ｌ及び６９．１×１０９／Ｌ）、第１群のみと有意差があった（ｐ≦０．０５）。同様のプロファイルが、第３群及び第５群の回復開始時に認められた（それぞれ、８１．８×１０９／Ｌ及び７４．１×１０９／Ｌ）。第３群と第５群との間に有意差は観察されなかった。血小板数の中央値（雌雄合計）を図８に示し、血小板の最低値と回復（雌雄合計）を表８に示す。
【０１３１】
【表７】
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【０１３２】
Ａ：第１群と統計的有意差。Ｂ：第３群と統計的有意差。Ｃ：第４群と統計的有意差。
【０１３３】
観察期間の残りの期間中、若干の変動が認められたが、４５日目までに全群がベースライン値と同程度となった。ロミプロスチム及びペグフィルグラスチムの両方を投与した場合、好中球及び血小板の回復に対し、相乗効果があるようであった。試験期間中にＰＴ及びａＰＴＴに変化は見られなかった。時折、個々の結果にいくらかの増加が認められたが、他の凝固パラメータに相関する変化はなく、この増加は生物学的変化ではなく、むしろ試料の採取及び取り扱いに起因したものである可能性がある。
【０１３４】
凝固
プロトロンビン時間（ＰＴ）及び活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）については、対照群と比較して投与群で統計学的に有意な投与に関連した差は認められなかったことから、ロミプロスチムの投与もペグフィルグラスチムの投与もそれらの併用も副次的な凝固エンドポイントに影響を及ぼさなかった。フィブリノーゲン濃度は全ての群（対照を含む）でわずかに上昇し、３日目において、ペグフィルグラスチムを投与された群（すなわち、第４群及び第６群）が対照群（ｐ＜０．０５）よりも有意に高かった。値は８日目までにベースラインに戻り、その後、２回目の上昇があり、１４日目から１７日目の間にピークに達した。ビヒクル処置動物（第１群）はフィブリノーゲン濃度が最も高く、１７日目にピーク値を示したことから、この群では炎症がより大きいことが示唆された。
【０１３５】
薬物動態
表９は、アカゲザルにおけるロミプロスチムの薬物動態を示す。選択薬物動態パラメータの平均（＋／−標準誤差）を示す。Ｃｍａｘ：最高血中濃度；Ｔｍａｘ：最高血中濃度到達時間；ＡＵＣ：曲線／曝露下面積；Ｔ１／２：消失半減期。ＲＰ：ロミプロスチム；ＰＦ：ペグフィルグラスチム。（第１群、ｎ＝１０；第２〜６群、ｎ＝８）。
【０１３６】
【表８】
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【０１３７】
いくつかの処置群の動物間で血清ロミプロスチム濃度にかなりのばらつきがあり、その結果、得られるＰＫパラメータにかなりのばらつきが生じた。
【０１３８】
ロミプロスチムは、第２群、第３群及び第６群において、単回投与後の平均Ｔｍａｘが約５〜１２時間で吸収された。第２群、第３群、第６群では単回投与後、約３７〜７４時間、また第５群では２回目投与後、約５２〜６３時間の、平均終末相ｔ１／２でロミプロスチムが消失した。
【０１３９】
血清ロミプロスチム曝露量は、２．５ｍｇ／ｋｇ（第２群）から５ｍｇ／ｋｇ（第３群）へ用量が増加したことに伴って不釣り合いな増加を示した。５ｍｇ／ｋｇ投与時の平均Ｃｍａｘ及びＡＵＣｌａｓｔ（第３群）は、２．５ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇへの２倍の用量増加で、２．５ｍｇ／ｋｇ投与（第２群）で測定された値よりも、雄でそれぞれ約２．３倍及び２．５倍、雌でそれぞれ１．３倍及び１．４倍大きかった。平均Ｃｍａｘは、２．５ｍｇ／ｋｇ（第２群）で９９０±４０２ｎｇ／ｍｌ（雄）及び１，４２５±１，００１ｎｇ／ｍｌ（雌）、５ｍｇ／ｋｇ（第３群）で２，２６３±１，７９０ｎｇ／ｍｌ（雄）及び１，７８２±１，４２１ｎｇ／ｍｌ（雌）であった。対応する平均ＡＵＣｌａｓｔは、２．５ｍｇ／ｋｇ（第２群）で３０，１４７±１１，１６４ｈｒ・ｎｇ／ｍｌ（雄）及び３３，５０１±２１，２３２ｈｒ・ｎｇ／ｍｌ（雌）、５．０ｍｇ／ｋｇ（第３群）で７４，９５７±４４，３９６ｈｒ・ｎｇ／ｍｌ（雄）及び４５，２６０±２８，６５２ｈｒ・ｎｇ／ｍｌ（雌）であった。
【０１４０】
血清ロミプロスチム曝露量を、ロミプロスチムを５ｍｇ／ｋｇ投与しペグフィルグラスチムを同時投与した群とロミプロスチムを５ｍｇ／ｋｇ投与しペグフィルグラスチムを同時投与しなかった群（それぞれ、第３群及び第６群）の間で血清ロミプロスチム曝露量を比較した。平均Ｃｍａｘ及びＡＵＣｌａｓｔは、第３群のペグフィルグラスチムを添加しなかった場合のこれらのパラメータと比較して、第６群のペグフィルグラスチムを添加した雄では約１５％減少し、雌では８０％超増加した。ペグフィルグラスチムを用いた第６群では、ロミプロスチムの平均Ｃｍａｘは１，９２１±９８１ｎｇ／ｍｌ（雄）及び３，２５５±８５０ｎｇ／ｍｌ（雌）であり、平均ＡＵＣｌａｓｔは６４，１５０±２２，７１９ｈｒ・ｎｇ／ｍｌ（雄）及び８５，２３３±１８，３８７ｈｒ・ｎｇ／ｍｌ（雌）であった。このことは、雌にペグフィルグラスチムを同時投与した場合、ロミプロスチムの曝露量が大きくなる（＞８０％）ことを示唆している。また、第３群の雌では、ロミプロスチムの血清中曝露量が雄よりも約２１％（Ｃｍａｘ）及び約４０％（ＡＵＣｌａｓｔ）低く、したがって、これが、用法にペグフィルグラスチムを加えた場合と加えなかった場合の血清中曝露量に雌で大きな差が認められた一因になったのであろう（すなわち第６群対第３群）。
【０１４１】
ロミプロスチムの２回投与（１日目及び８日目、第５群）に関して、全体の平均Ｔｍａｘは、雄の２匹で８．０時間、雄の他の２匹で１８０．０及び１７６．０時間、そして雌で１７６．０±３．３時間であった。両用量投与後の全体の平均Ｃｍａｘは３，８００±１，６１６ｎｇ／ｍｌ（雄）及び４，７７８±４６７ｎｇ／ｍｌ（雌）であり、全体の平均ＡＵＣｌａｓｔは１５３，１０３±５３，３７５ｈｒ・ｎｇ／ｍｌ（雄）及び１８０，３９４±３３，９３６ｈｒ・ｎｇ／ｍｌ（雌）であった。個々の投与量では、平均Ｃｍａｘ（投与１）は３，１８６±１，９５１ｎｇ／ｍｌ（雄）及び３，３４５±２９１ｎｇ／ｍｌ（雌）、平均Ｃｍａｘ（投与２）は３，５４８±１，４４８ｎｇ／ｍｌ（雄）及び４，７７８±４６７ｎｇ／ｍｌ（雌）であった。平均ＡＵＣ（０〜７２時間、投与１）は７１，７８９±４１，８９８ｈｒ・ｎｇ／ｍｌ（雄）及び６６，０６５±８，７３２ｈｒ・ｎｇ／ｍｌ（雌）であり、平均ＡＵＣ（０〜７２時間、投与２）は５５，５９３±３６，２３７ｈｒ・ｎｇ／ｍｌ（雄）及び９０，１１３±２４，６０４ｈｒ・ｎｇ／ｍｌ（雌）であった。反復投与によるロミプロスチムの蓄積傾向があり、それは女性においてより明白であった。Ｃｍａｘ及びＡＵＣ（０〜７２時間））の平均値は、投与１と比較した場合、投与２の投与後に雌でそれぞれ約４３％及び約３６％大きかった。雄では、投与１と比較した場合、投与２の投与後のＣｍａｘ及びＡＵＣ（０〜７２時間）はそれぞれ約１１％大きく、約２３％低かった。しかし、第５群の血清ロミプロスチム濃度のばらつきは、雌よりも雄で顕著であった。ロミプロスチムの測定可能な血清濃度は、第５群のほとんどの動物で投与２の前に認められ、特に雌では、この群の投与２の後に血清曝露量が大きくなった一因となった可能性がある。
【０１４２】
考察
ロミプロスチム（様々な用量レベル又は時点で）、ペグフィルグラスチム、又はロミプロスチムとペグフィルグラスチムの併用を、５５０ｃＧｙの全身照射後に皮下投与したところ、対照動物では死亡率６０％となったが、ロミプロスチム群及びペグフィルグラスチム群のいずれの群でも死亡は観察されなかった。
【０１４３】
放射線モデルで予想された臨床徴候、体重変化、体温変化は、処置群では重症度及び／又は発生率が低く、第６群は他の処置群と比較して早期の回復及びより大きい体重を示した。凝固パラメータに変化はなかった。
【０１４４】
血液学的パラメータ（ＲＢＣ、ＨＣＴ、ＷＢＣ、ＬＹＭＰＨ、ＭＯＮＯ）は、照射後に予想された減少を示し、全ての処置群で、対照群と比較して、より早く且つ良好な回復を示した（図１１Ａ〜１１Ｅ）。一般に、第６群（ロミプロスチム及びペグフィルグラスチムの両方を投与）は、他の処置群と比較して、より高い結果でより早期の回復を示すと認められた。ＮＥＵＴ及びＰＬＴレベルは、照射後、予想どおり低下した。第４群及び第６群（いずれも、ペグフィルグラスチムを投与）は、（ペグフィルグラスチムが骨髄細胞系列を刺激するので、予想どおり）残りの処置群と比較して、より早期に回復を示したが、第６群（ロミプロスチム及びペグフィルグラスチムの両方を投与）は、ＮＥＵＴが０．５１×１０９／Ｌの第４群（ペグフィルグラスチム単独）と比較して、１３日目に、より高い細胞数（１．２５×１０９／Ｌ）でより早期に回復することが認められた。ＰＬＴ最低値は処置群で重症度が低かったが、ＰＬＴ最低値が最も軽度で、回復が最も早かった群は第６群（ロミプロスチムとペグフィルグラスチムの両方を投与）であり、細胞数は９２．１×１０９／Ｌ（１１日目に最低値）及び１０５．５×１０９／Ｌ（１２日目に回復開始）であり、第１群及び第４群と有意差があった（ｐ≦０．０１）。第５群の動物にはロミプロスチムを２回投与したが、第３群（ロミプロスチムを１回投与）と比較した場合、最低値及び回復開始時の好中球数にも血小板数にも有意差は認められなかった。
【０１４５】
ロミプロスチムとペグフィルグラスチムの両方を投与した場合、どちらか一方を単独投与した場合よりも、好中球及び血小板の回復に大きな効果があるようであった。
【０１４６】
処置群では、動物間で血清ロミプロスチム濃度にかなりのばらつきが認められ、その結果、ＰＫパラメータにかなりのばらつきが生じた。平均Ｃｍａｘ値及びＡＵＣｌａｓｔ値に基づくロミプロスチムの血清中曝露量は、ペグフィルグラスチムを同時投与した場合、雌で８０％超増加し、雄で約１５％減少し、これにより、ペグフィルグラスチムがロミプロスチムの薬物動態に影響を及ぼし、この影響は雌でより顕著であることが示唆された。２．５ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇへの用量増加は、単独で投与された場合、ロミプロスチムの血清曝露量の不釣り合いな変化をもたらした。反復投与によりロミプロスチムが蓄積する傾向が認められ、投与２を投与した雌では、投与１を投与した場合と比べて、平均Ｃｍａｘが約４３％大きく、ＡＵＣ（０〜７２時間）が約３６％大きかったことから、その傾向はまた雌でより明白であった。
【０１４７】
本明細書中に提示されるロミプロスチムのＮＨＰ効果は、本明細書で報告される照射マウスに投与されたロミプロスチムの研究と一致し、トロンボポエチン（ＴＰＯ）投与が照射ＮＨＰにおける血小板レベル及び生存を改善することを実証した以前の研究（Ｎｅｅｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｂｌｏｏｄ９０（７）：２５６５−２５７３、Ｎｅｅｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２５（１０）：１０８４−１０９３）にも一致する。本明細書中に報告されるＮＨＰ研究と同様に、ＴＰＯの単回投与は、血小板減少症を軽減するための反復投与と同じくらい有効であった。しかしながら、中和抗体はＴＰＯ投与後に発現し、その使用に関する研究は、大部分が放棄されている。ロミプロスチムはＴＰＯ受容体アゴニストとして作用するが、ＴＰＯとの配列相同性はなく、したがって中和抗体が発現する危険性はかなり低い。
【０１４８】
好中球数に対する予想される効果に加えて、ペグフィルグラスチムはまた血小板数を改善するようであり、これまでに報告されている所見である（Ｈａｎｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５），Ｒａｄｉａｔ  Ｒｅｓ．１８３（６）：６４３−６５５）。しかしながら、本明細書で報告する結果は、ロミプロスチムがペグフィルグラスチム単独よりも放射線誘発性血小板減少症の治療により有効であることを示している。
【０１４９】
ロミプロスチムとペグフィルグラスチムの併用は、血小板数及び好中球数を、いずれかの薬剤の単独投与で観察されるレベルを上回るレベルまで改善した。これらの結果は、これら２つの薬剤がおそらく異なる造血経路及び系統に作用するが、好中球及び血小板生成の両方に有益な効果を有することを示唆している。重度の血小板減少症及び好中球減少症の日数と生存との間の逆相関が照射アカゲザルで報告されている（Ｓｔｉｃｋｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．７（４）：５００−５０５）ことから、この所見は重要である。照射アカゲザル（Ｎｅｅｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｂｌｏｏｄ９０（７）：２５６５−２５７３、Ｎｅｅｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２５（１０）：１０８４−１０９３）及びマウス（Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｌｏｏｄ，８８（９）：３３６３−３３７０）にＴＰＯ及びＧ−ＣＳＦを投与すると、ＡＲＳにおける有効性が増すことが観察されている。これらの研究では、Ｇ−ＣＳＦに対する好中球応答の明らかな増加は、顆粒球／単球コロニー形成単位（ＧＭ−ＣＦＵ）を含むＴＰＯを介した骨髄前駆細胞の拡大に起因していた（Ｆａｒｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．９７（９）：２１４５−２１５１、Ｋｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｂｌｏｏｄ，８７（１１）：４５４４−４５５１、Ｓｉｔｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｂｌｏｏｄ，８７（１２）：４９９８−５００５）。さらに、ロミプロスチム及びペグフィルグラスチムの効果は、巨核球及び好中球に対する作用とともにＴＰＯとＧ−ＣＳＦとの複雑な相互作用によるものと考えられる。マウスでは、Ｇ−ＣＳＦを注射すると、骨髄におけるＴＰＯ濃度が上昇し、巨核球から好中球を誘引するサイトカインが放出され、好中球が動員される（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１），Ｂｌｏｏｄ，１１７（１６）：４３４９−４３５７）。したがって、ペグフィルグラスチムの投与はまた、ＴＰＯ産生を刺激して血小板産生を増加させ、さらにロミプロスチム（及びＴＰＯ）が次に、好中球の動員を刺激する可能性がある。
【０１５０】
血小板レベルの改善に加えて、本発明者らはロミプロスチム及びペグフィルグラスチムが放射線照射後の平均血小板容積（ＭＰＶ）を対照レベルよりも高く維持することに寄与することを初めて報告し（図８Ｂ）、これは古くから血小板活性及び代謝回転のマーカーとして認識されている（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４），Ｂｌｏｏｄ，６３（６）：１３７２−１３７５）。このことは、これらの薬剤の両方、特に併用が血小板産生を刺激し、出血の発生率に潜在的な影響を及ぼし、最終的に生存転帰を改善することを示す別の指標である。ＭＰＶの減少は、非小肺癌患者の生存期間の短縮と関連している（Ｉｎａｇａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４），Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，８３（１）：９７−１０１、Ｋｕｍａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５），Ｍｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．３（１）：１９７−２０１）。
【０１５１】
本明細書に引用された各参考文献は、その全体が、参照により援用される。開示した本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル及び材料に限定されず、これらは変化し得ることが理解される。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲を限定することを意図されていないことも理解される。
【０１５２】
当業者は、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を、単なる日常的な実験を使用して、認識し、又は確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
2021515780.tif 000027
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
2021515780.tif 000031
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【国際調査報告】
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