(57)【要約】  少なくとも水、α−グルコース−１−ホスフェート（α−Ｇ１Ｐ）、アクセプター分子、及びβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素を含む反応組成物が、本明細書にて開示される。これらの反応は、β−１，３グリコシド結合を有するオリゴ糖及び多糖を合成し得る。更に、β−１，３−グルカンを単離する方法が開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも水、α−グルコース−１−ホスフェート（α−Ｇ１Ｐ）、アクセプター分子、及び配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素を含む反応組成物であって、前記酵素が、β−１，３−グルカンを合成する反応組成物。
【請求項２】
前記β−１，３−グルカンが、少なくとも約９０％のβ−１，３グリコシド結合を有する、請求項１に記載の反応組成物。
【請求項３】
前記β−１，３−グルカンが、少なくとも約９９％のβ−１，３グリコシド結合を有する、請求項２に記載の反応組成物。
【請求項４】
前記β−１，３−グルカンの重合度（ＤＰ）が、少なくとも３である、請求項１に記載の反応組成物。
【請求項５】
前記β−１，３−グルカンのＤＰが、少なくとも約１５である、請求項４に記載の反応組成物。
【請求項６】
前記アクセプター分子が、単糖、二糖、又はオリゴ糖を含む、請求項１に記載の反応組成物。
【請求項７】
前記アクセプター分子が、ラミナリビオースを含む、請求項６に記載の反応組成物。
【請求項８】
前記アクセプター分子が、多糖を含む、請求項１に記載の反応組成物。
【請求項９】
前記多糖がβ−グルカンを含む、請求項８に記載の反応組成物。
【請求項１０】
前記β−グルカンがラミナリンを含む、請求項９に記載の反応組成物。
【請求項１１】
β−１，３−グルカンを生成するための方法であって、前記方法が：
（ａ）少なくとも水、α−グルコース−１−ホスフェート（α−Ｇ１Ｐ）、アクセプター分子、及び配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素を接触させ、β−１，３−グルカンを生成することと、
（ｂ）任意選択的に、工程（ａ）で生成された前記β−１，３−グルカンを単離することと
を含む方法。
【請求項１２】
前記α−Ｇ１Ｐが、工程（ａ）において第２の反応を行うことによって供給され、前記第２の反応の生成物が、α−Ｇ１Ｐを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の反応が、工程（ａ）が実施される容器と同じ容器で提供され、前記第２の反応が、工程（ａ）の前に及び／又は工程（ａ）に続いて実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２の反応が、（ｉ）水、（ｉｉ）無機ホスフェート、（ｉｉｉ）グルコース−含有二糖、オリゴ糖、又は多糖、及び（ｉｖ）二糖、オリゴ糖、又は多糖を加リン酸分解するホスホリラーゼを接触させることによりα−Ｇ１Ｐを生成する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記アクセプター分子が、工程（ａ）において第３の反応を提供することによって提供され、前記第３の反応の生成物が、前記アクセプター分子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第３の反応によって提供される前記アクセプター分子が、ラミナリビオースである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
β−１，３−グルカンを処理する方法であって、前記方法が：
（ａ）少なくとも１７の重合度（ＤＰ）を有する最大約４０ｗｔ％の不溶性β−１，３−グルカンを含む水性組成物を準備することと；
（ｂ）前記水性組成物を少なくとも約７５℃まで加熱し、それによって、前記β−１，３−グルカンを前記水性組成物に溶解させて、溶液を得ることと；
（ｃ）前記溶解したβ−１，３−グルカン以外の１つ以上の溶質の含有量を減少させる少なくとも１つのプロセスに前記溶液を供し、それによって、前記溶液中の前記溶解したβ−１，３−グルカンの前記含有量を乾燥重量基準で増加させることと；
（ｄ）任意選択的に、前記β−１，３−グルカンが沈殿して不溶性状態に戻る温度まで前記溶液を冷却し、任意選択的に、前記沈殿したβ−１，３−グルカンを単離することと、
を含む方法。
【請求項１８】
前記（ｃ）のプロセスが、ナノ濾過及び／又は限外濾過を含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０８４０３６号（２０１８年４月２３日出願）の利益を主張するものである。
【０００２】
本開示は、酵素反応の分野に属する。例えば、本開示は、β−１，３−グルカンホスホリラーゼを用いた、β−１，３−グルカンの反応及び生成方法に関する。
【０００３】
電子的に提出された配列表の参照
配列表の正式な写しは、約１５６キロバイトのサイズを有して本明細書と同時に提出される、２０１９年４月１０日に作成された２０１９０４１０＿ＮＢ４１４３０ＷＯＰＣＴ２＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔのファイル名を有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。このＡＳＣＩＩフォーマット文献に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
多糖類を様々な用途に使用することが望まれているため、研究者らは、生分解性であり、再生可能に供給される原料から経済的に製造することができる多糖類を探求してきた。このような多糖の１つは、β−１，３−グルカンであり、β−１，３−グリコシド結合を有することを特徴とするグルカンポリマーである。β−１，３−グルカンの異なる形態は、様々な供給源、例えば、藻類、真菌、植物、及び細菌から調製されてきた（Ｓｔｏｎｅ，Ｂ．Ａ．，２００９，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｂｅｔａ  Ｇｌｕｃａｎｓ，Ｉｎ  Ａｎｔｏｎｙ  Ｂａｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  １−３  Ｂｅｔａ  Ｇｌｕｃａｎｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）。酵母及びキノコの細胞壁から単離されたβ−１，３−グルカンは、大きく（１００ｋＤａをはるかに超える）及び／又は分枝構造をとり得る。真菌中で分枝形態のβ−１，３−グルカンは、ペンダントβ−１，６−結合グルコース、及び／又は例えばβ−１，６結合によって互いに繰り返し結合したβ−１，３−グルカンのスパンを含み得る。植物由来β−グルカン、カロースは、ほとんどの場合は、β−１，３グリコシド結合及び少量のβ−１，６グリコシド結合を有する。原生生物のメンバーにより産生されるβ−１，３−グルカンとしては、例えば、ラミナリン及びパラミノンが挙げられ、これらはそれぞれ褐藻及びミドリムシによって産生される。パラミノンは分子量が大きく、直鎖β−１，３−グルカンからなるが、ラミナリンは分子量が小さく、β−１，６−結合した分枝を更に含む。細菌β−１，３−グルカンである、カードランは直鎖であり、高分子量（例えば、１００ｋＤａを上回る）のものである。これら及びその他のβ−１，３−グルカンの天然形態は、ｉｎ  ｖｉｖｏでβ−１，３−グルカンシンターゼ酵素により比較的大きな量で合成することができ、これは、グルカンポリマー合成用の基質としてＵＤＰ−グルコースを利用する（Ｂｒｏｗｎｆｉｅｌｄ、Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ（１，３）−Ｂｅｔａ−Ｇｌｕｃａｎｓ  ｉｎ  Ｅｍｂｒｙｏｐｈｙｔｅｓ，Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔｅｓ；Ｎｏｇａｍｉ、Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ（１−３）−Ｂｅｔａ−Ｇｌｕｃａｎｓ，（１−３；１−６）−Ｂｅｔａ−Ｇｌｕｃａｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｙｅａｓｔｓ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｂｕｌｏｎｅ，Ｖ．，２００９，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ（１，３）−Ｂｅｔａ−Ｇｌｕｃａｎｓ  ａｎｄ（１，３；１，６）−Ｂｅｔａ−Ｇｌｕｃａｎｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｏｚｏａｎｓ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｍｉｓｔａｎｓ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｓｔａｎｉｓｉｃｈ，Ｖ．Ａ．，２００９，Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ（１，３）−Ｂｅｔａ−Ｇｌｕｃａｎｓ：Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ；Ｅａｃｈ  ｉｎ  Ａｎｔｏｎｙ  Ｂａｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  １−３  Ｂｅｔａ  Ｇｌｕｃａｎｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）。
【０００５】
単離されたホスホリラーゼ酵素は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでβ−１，３−グルカンを生成するために使用されてきた（例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７７：１９４９−１９５４；米国特許第８，５３０，２０２号明細書）。単離されたグルカンホスホリラーゼを用いたβ−１，３グリコシド結合を含有するグルカンを生成する更なる方法を本明細書にて開示する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一実施形態では、本開示は、少なくとも水、α−Ｇ１Ｐ、アクセプター分子、及び配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素を含む反応組成物であって、酵素が、β−１，３−グルカンを合成する反応組成物に関する。
【０００７】
別の実施形態では、本開示は、β−１，３−グルカン（本明細書に開示されるような）を生成するための方法であって、方法が：（ａ）少なくとも水、α−Ｇ１Ｐ、アクセプター分子、及び配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素を接触させ、β−１，３−グルカンを生成することと、（ｂ）任意選択的に、工程（ａ）で生成されたβ−１，３−グルカンを単離することと、を含む方法に関する。
【０００８】
別の実施形態では、本開示は、β−１，３−グルカン（本明細書に開示されるような）を処理する方法であって、方法が：（ａ）少なくとも１７の重合度（ＤＰ）を有する最大約４０ｗｔ％の不溶性β−１，３−グルカンを含む水性組成物を準備することと；（ｂ）水性組成物を少なくとも約７５℃まで加熱し、それによって、β−１，３−グルカンを水性組成物に溶解させて、溶液を得ることと；（ｃ）溶解したβ−１，３−グルカン以外の１つ以上の溶質の含有量を減少させる少なくとも１つのプロセスに溶液を供し、それによって、溶液中の溶解したβ−１，３−グルカンの含有量を乾燥重量基準で増加させることと；（ｄ）任意選択的に、β−１，３−グルカンが沈殿して不溶性状態に戻る温度まで溶液を冷却し、任意選択的に、沈殿したβ−１，３−グルカンを単離することと、
を含む方法に関する。
【０００９】
【表１】
2021521815.tif 000002
【発明を実施するための形態】
【００１０】
全ての引用される特許及び非特許文献の開示は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【００１１】
特に開示しない限り、本明細書で用いられるような用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、１つ以上（すなわち少なくとも１つ）の言及される特徴を包含することを意図する。
【００１２】
存在する場合、特に記載しない限り、全ての範囲は、包括的であり、結合可能である。例えば、「１〜５」（すなわち１〜５）の範囲が挙げられる場合、挙げられた範囲は、範囲「１〜４」、「１〜３」、「１〜２」、「１〜２及び４〜５」、「１〜３及び５」などを含むものと解釈されるべきである。
【００１３】
本明細書において、用語「糖」及び他の同様の用語は、別段の記載がない限り、単糖及び／又は二糖／オリゴ糖を指す。本明細書において、「二糖」とは、グリコシド結合によって連結されている２つの単糖を有する炭水化物を指す。本明細書において、「オリゴ糖」は、例えばグリコシド結合によって連結されている３〜１５個の単糖を有する炭水化物を指す。オリゴ糖は、「オリゴマー」と呼ばれる場合もある。二糖／オリゴ糖中に含まれる単糖（例えば、グルコース、及び／又はフルクトース）は、「モノマー単位」、「単糖単位」、又は他の同様の用語を指す場合がある。
【００１４】
用語「β−グルカン」、「β−グルカンポリマー」などは、本明細書では同じ意味で用いられる。β−グルカンは、β−グリコシド結合によって互いに連結されるグルコースモノマー単位を含むポリマーである。本明細書のβ−グルカンは、オリゴ糖又は多糖の形態であり得る。典型的な実施形態では、本明細書のβ−グルカンは、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のβ−グリコシド結合を含む。本明細書のβ−グルカンポリマーの例としては、β−１，３−グルカンが挙げられる。本明細書の糖内に含まれるようなグルコース、β−グルカン、又はその他の炭水化物は、グルコースモノマー単位、グルコースモノマー、グルコース単位、又はその他の同様の用語を指す場合がある。
【００１５】
用語「ポリβ−１，３−グルカン」、「β−１，３−グルカン」、「β−１，３−グルカンポリマー」などは、本明細書では同じ意味で用いられる。β−１，３−グルカンは、少なくともＤＰ３のポリマーであり、グリコシド結合により互いに連結されるグルコースモノマー単位を含み、ここで、少なくとも約９０％のグリコシド結合がβ−１，３である。特定の実施形態におけるβ−１，３−グルカンは、約１００％のβ−１，３グリコシド結合を有するか、又は少なくとも約９０％若しくは９５％のβ−１，３グリコシド結合を含む。本明細書のβ−１，３−グルカンの他の結合（存在する場合）のほとんど又は全ては、典型的には、β−１，６（典型的には分枝を形成する）である。
【００１６】
用語「グリコシド結合（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ  ｌｉｎｋａｇｅ）」、「グリコシド結合（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ  ｂｏｎｄ）」、「結合」などは、本明細書では同じ意味で用いられ、炭水化物（糖）分子を別の炭水化物などの別の基に連結する共有結合を指す。本明細書で使用される、用語「β−１，３−グリコシド結合」は、隣接したβ−Ｄ−グルコース環上の炭素１及び３を介してβ−Ｄ−グルコース分子を互いに連結する共有結合のタイプを指す。本明細書におけるグルカンポリマーのグリコシド結合は、「グリコシド結合」とも呼ぶことができる。本明細書では、別途注記のない限り、「β−Ｄ−グルコース」を「グルコース」と呼ぶ。
【００１７】
本明細書のβ−グルカンのグリコシド結合プロファイルは、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して決定され得る。例えば、結合プロファイルは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法（例えば、１３Ｃ  ＮＭＲ又は１Ｈ  ＮＭＲ）を使用する方法を用いて決定され得る。使用し得るこれらの方法及び他の方法は、例えば、Ｆｏｏｄ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓ．Ｗ．Ｃｕｉ，Ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，Ｓ．Ｗ．Ｃｕｉ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ  ＬＬＣ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００５）に開示されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１８】
本明細書の大きいβ−グルカンポリマーの「分子量」は、重量平均分子量（Ｍｗ）又は数平均分子量（Ｍｎ）として表すことができ、その単位は、ダルトン又はグラム／モルである。或いは、大きいβ−グルカンポリマーの分子量は、ＤＰｗ（重量平均重合度）又はＤＰｎ（数平均重合度）として表すことができる。オリゴ糖などのより小さいβ−グルカンの分子量は、典型的には、「ＤＰ」（重合度）として提供され得、これは、単にβ−グルカン内に含まれるグルコースモノマー単位の数を指す。高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又はゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるなど、これらの様々な分子量の測定値を算出するための様々な手法が当該技術分野で知られている。
【００１９】
特に開示しない限り、本明細書で使用する場合、用語「ホスホリラーゼ」、「ホスホリラーゼ酵素」、及び同様の用語は、ＣＡＺｙ（炭水化物活性酵素）データベース（ｃａｚｙ．ｏｒｇウェブサイト；Ｃａｎｔａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７：Ｄ２３３−２３８（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）によるグリコシルヒドロラーゼ９４（ＧＨ９４）ファミリーに属する特定のクラスの酵素を指す。このようなホスホリラーゼは、特定のタイプの二糖、オリゴ糖、又は多糖（例えば、β−グルカン）の合成（このような可逆性、は典型的には単離された／ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下でのみ）、並びにα−グルコース−１−ホスフェート（α−Ｇ１Ｐ）及び好適なアクセプター（反応基質）からの遊離ホスフェート（反応生成物）を可逆的に触媒することができる。本明細書の「β−１，３−グルカンホスホリラーゼ」（又は「β−１，３−グルカンを合成するホスホリラーゼ酵素」、「１，３−β−Ｄ−グルカンホスホリラーゼ」、及び同様の用語）は、β−１，３グリコシド結合−含有オリゴ糖又は多糖の合成並びにα−Ｇ１Ｐ及び好適なアクセプターからの遊離ホスフェートを触媒する。β−１，３−グルカンホスホリラーゼは、酵素委員会（ＥＣ）番号２．４．１．９７であり、特定の態様では、次の可逆反応を触媒する：α−Ｇ１Ｐ＋（１，３−β−Ｄ−グルコシル）ｎ−１⇔（１，３−β−グルコシル）ｎ＋ホスフェート；「（１，３−β−Ｄ−グルコシル）ｎ−１」は、この反応においてアクセプターとして示されているが、β−１，３−グルカンホスホリラーゼは、本明細書に開示されているような他のアクセプタータイプを使用することができる。特定の態様における、β−１，３−グルカンホスホリラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、又は１２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。本明細書のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応で使用されるアクセプターに応じて、β−１，３グリコシド結合−含有オリゴ糖又は多糖生成物は、（ｉ）完全にグルコースモノマー単位で構成される（アクセプター自体が特定の態様で１つ以上のグルコース単位のみで構成される場合）か、又は（ｉｉ）グルコース単位に加えて非グルコース単糖単位及び／若しくは非糖部分を含む（アクセプター自体がそのような他の単糖単位及び／若しくは部分を含む場合）。これらの生成物タイプのいずれ（ｉ又はｉｉ）も、例えば、任意選択的に、アクセプターから合成される（すなわち、生成物の結合プロファイルにはアクセプターの結合を含まない）β−１，３グリコシド結合−含有オリゴ糖又は多糖に関して特徴付けられ得る。
【００２０】
用語「アクセプター」、「アクセプター分子」、「アクセプター化合物」などは、本明細書では同じ意味で用いられる。本明細書の好適なアクセプターは、少なくとも１つのヒドロキシル部分（−ＯＨ）を含む有機分子であると考えられ、そのヒドロキシル部分は、本明細書のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼの触媒活性を介して、α−Ｇ１Ｐのグルコースの１位とのグリコシド結合（ヒドロキシル部分の酸素原子を含む）の形成を伴い得る（ホスフェート基は、結合形成中に置換される）。好適なアクセプターは、炭水化物又は非炭水化物であり得る。非炭水化物アクセプターの例としては、アルコール、ポリオール、フェノール化合物、及びアミノ酸が挙げられる。炭水化物アクセプターの例としては、二糖、オリゴ糖、及び多糖が挙げられ；いくつかの実施形態における炭水化物アクセプターのモノマー単位の全て又は一部は、グルコース単位であり得る。炭水化物アクセプターの非還元末端は、典型的には、グリコシド結合形成を伴う。用語「初期アクセプター」は、β−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応物を調製する場合に使用されるようなアクセプターとして特徴づけるために、本明細書では、任意選択的に使用され得る。初期アクセプターはまた、β−１，３−グルカンホスホリラーゼによってそれと結合したグルコースを有していない。β−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応の間に、アクセプターは、典型的には、ホスホリラーゼによるその後のグルコース付加のためのアクセプターとして反復的に機能する。
【００２１】
本明細書で使用される「グルコース−１−リン酸」（Ｇ１Ｐ）は、１−炭素にリン酸基を有するグルコース分子を指す。本明細書のＧ１Ｐは、典型的には、α−Ｄ−グルコース−１−ホスフェート（α−Ｇ１Ｐ）であり、これは、アノマー中心にα配置を有するＤ−グルコピラノースである。特に開示しない限り、本明細書のＧ１Ｐは、β−Ｄ−グルコース−１−ホスフェート（β−Ｇ１Ｐ）ではない。
【００２２】
「Ｐｉ」と表記し得る「無機ホスフェート」は、溶液中における遊離ホスフェートオンを指し、Ｇ１Ｐなどのリン酸エステルにおいて結合しているホスフェートとは区別される。
【００２３】
用語「酵素反応物」、「酵素反応組成物」、「グルカンホスホリラーゼ反応物」、「β−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応物」、及び同様の用語は、本明細書では同じ意味で用いられ、特に明記されていなければ、β−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素により実施される反応物を指す。酵素反応物は、一般的に、少なくともα−Ｇ１Ｐ、アクセプター、及び活性β−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素を含む水溶液／調製物を指す。水、α−Ｇ１Ｐ、アクセプター、及びβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素を接触させる工程が実施されるのは、このような反応である。用語「好適な反応条件下」、及び同様の用語は、β−１，３−グルカンホスホリラーゼ活性を介した、基質（α−Ｇ１Ｐ及びアクセプター）のβ−１，３−グルカン（アクセプターから伸長されたもの）及び遊離ホスフェート生成物への変換をサポートする反応条件を指す。特定の実施形態では、β−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応物は、不溶性β−１，３−グルカン生成物を生成するため、このような生成物は溶液外に存在する（反応物は混合物になる）と理解されるであろう。
【００２４】
本明細書で使用される「対照」酵素反応物は、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、又は１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含まないβ−１，３−グルカンホスホリラーゼを用いる反応物を指す。対照反応物の他の全ての特徴（例えば、基質濃度、温度、ｐＨ、時間）は、それと比較される反応物と同じにすることができる。
【００２５】
用語「ラミナリビオース」（「β−１，３−グルコビオース」としても知られている）は、本明細書で使用する場合、二糖である３−β−Ｄ−グルコシル−Ｄ−グルコースを指す。
【００２６】
本明細書の用語「ラミナリン」、「ラミナラン」などは、典型的には、β−１，６−結合した分枝（例えば、β−１，３−結合した主鎖の１０残基ごとに１つの枝）を有する低分子量の水溶性β−１，３−グルカン（例えば、約４０未満のＤＰ）を指す。
【００２７】
本明細書の「α−Ｇ１Ｐ−産生酵素」は、少なくともα−Ｇ１Ｐを含む生成物の合成を触媒することができる酵素を指す。α−Ｇ１Ｐ−産生酵素の例としては、デンプンホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、及びセロデキストリンホスホリラーゼが挙げられる。
【００２８】
本明細書で使用される「デンプンホスホリラーゼ」は、ＥＣ番号２．４．１．１のものであり、デンプン及び無機リン酸からα−Ｇ１Ｐを含む生成物への変換を可逆的に触媒することができる。そのような反応は、以下のように記述することもできる：（１，４−α−Ｄ−グルコシル）ｎ＋ホスフェート⇔（１，４−α−Ｄ−グルコシル）ｎ−１＋α−Ｇ１Ｐ。
【００２９】
本明細書で使用される「デンプン脱分枝酵素」は、デンプンの分枝点でα−１，６結合の加水分解を触媒することができる酵素を指す。本明細書のデンプン脱分枝酵素の例としては、プルラナーゼ及びイソアミラーゼが挙げられる。本明細書で使用される「プルラナーゼ」は、ＥＣ番号３．２．１．４１のものである。本明細書で使用される「イソアミラーゼ」は、ＥＣ番号３．２．１．６８のものである。
【００３０】
本明細書の用語「スクロース」は、α−１，２−グリコシド結合によって連結されたα−Ｄ−グルコース分子及びβ−Ｄ−フルクトース分子から構成される非還元二糖を指す。スクロースは、一般に砂糖として知られている。
【００３１】
本明細書で使用される「スクロースホスホリラーゼ」は、ＥＣ番号２．４．１．７のものであり、スクロース及びホスフェートのフルクトース及びα−Ｇ１Ｐへの変換を可逆的に触媒することができる。そのような反応は、以下のように記述することもできる：スクロース＋ホスフェート⇔フルクトース＋α−Ｇ１Ｐ。
【００３２】
本明細書で使用される「セロデキストリンホスホリラーゼ」は、ＥＣ番号２．４．１．４９のものであり、セロデキストリン及びホスフェートのα−Ｇ１Ｐを含む生成物への変換を可逆的に触媒することができる。そのような反応は、以下のように記述することもできる：（１，４−β−グルコシル）ｎ＋ホスフェート⇔（１，４−β−Ｄ−グルコシル）ｎ−１＋α−Ｇ１Ｐ。
【００３３】
本明細書では、「セルロース系バイオマス」、「セルロース含有バイオマス」などは同義語として使用され、食品成分又は醗酵基質として直接使用することができない、植物の構造部分（例えば、木部、茎）を含む材料を指す。
【００３４】
本明細書では、「エンドグルカナーゼ」及び「ベータ−１，４−エンドグルカナーゼ」は同義語として使用され、セルロース鎖の内部結合を切断し、セルロース鎖をより短くすることができる酵素を指す。このような短鎖は、セロデキストリンホスホリラーゼにとって好適な基質である。
【００３５】
本明細書で使用される「ラミナリビオースホスホリラーゼ」は、ＥＣ番号２．４．１．３１のものであり、下記反応の変換を可逆的に触媒することができる：Ｄ−グルコース＋α−Ｇ１Ｐ⇔３−β−Ｄ−グルコシル−Ｄ−グルコース＋ホスフェート。
【００３６】
本明細書で使用される「第２の反応」は、β−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応（「第１の反応」）に追加され、第１の反応に好適なα−Ｇ１Ｐを提供する反応を指す。本明細書の第２の反応は、任意選択的に、「α−Ｇ１Ｐ−産生反応」として特徴付けることができる。本明細書の少なくとも第１及び第２の反応の組み合わせは、「共役反応」である。本明細書の第２の反応は、典型的には、ホスホリラーゼ及び遊離ホスフェートを使用することにより、α−Ｇ１Ｐを提供し、二糖、オリゴ糖、又は多糖を加リン酸分解し、この加リン酸分解は、少なくともα−Ｇ１Ｐを生成する。
【００３７】
本明細書で使用される「第３の反応」は、β−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応（「第１の反応」）に追加され、第１の反応に好適なアクセプターを提供する反応を指す。本明細書の第３の反応は、任意選択的に、「アクセプター−産生反応」として特徴付けることができる。本明細書の少なくとも第１及び第３の反応の組み合わせは、「共役反応」の別の形態である。本明細書の共役反応の更に別の形態は、第１、第２、及び第３の反応の３つ全てを含む。本明細書の第３の反応は、典型的には、β−１，３−グルカンホスホリラーゼ（例えば、ラミナリビオースホスホリラーゼ）ではないホスホリラーゼ、Ｇ１Ｐ（例えば、α−Ｇ１Ｐ）、及び好適なアクセプター（例えば、グルコース）を使用することにより、アクセプター（例えば、ラミナリビオース）を提供する。
【００３８】
本明細書の用語「ナノ濾過」は、低〜中程度の高圧（典型的には５〜３０ｂａｒ）により溶媒と少量の溶質（例えば、単糖）とが半透過性の膜を通して運ばれ、少量の溶質（例えば、β−１，３−グルカン）が保持される濾過プロセスを指す。本明細書のナノ濾過用の半透過性の膜は、例えば、０．１ｎｍ〜１０ｎｍの孔径及び／又は１００〜５０００ダルトンの分画分子量（ＭＷＣＯ）を有し得る。本明細書の用語「限外濾過」は、大きな溶質（例えば、β−１，３−グルカン）から、溶媒及び小さな溶質を除去するために、典型的には、ナノ濾過よりも大きな孔径を有する半透過性の膜を使用する濾過プロセスを指す。ナノ濾過又は限外濾過ユニットの膜を通過する物質は「透過物」と呼ばれる場合がある一方、膜を透過しない物質は「濃縮物」又は「保持物」と呼ばれる場合がある。
【００３９】
用語「体積によるパーセント」、「体積パーセント」、「体積％」、「ｖ／ｖ％」などは、本明細書では同じ意味で用いられる。溶液中の溶質の体積パーセントは、次式を用いて求めることができる［（溶質の体積）／（溶液の体積）］×１００％。
【００４０】
用語「重量によるパーセント」、「重量パーセント（ｗｔ％）」、「重量−重量パーセント（％ｗ／ｗ）」などは、本明細書では同じ意味で用いられる。重量によるパーセントは、組成物、混合物又は溶液中に物質が含まれる場合に質量基準での物質の百分率を指す。
【００４１】
「乾燥重量基準」（ｄｗｂ）、「乾燥固形分基準」（ｄｓｂ）の用語は、本明細書では同じ意味で用いられる。溶液中の乾燥重量基準での物質（例えば、β−１，３−グルカン）の量は、例えば、溶液中に溶解している全ての物質（例えば、β−１，３−グルカン、フルクトース、スクロース、グルコース、任意選択的に塩及び不純物）中に存在する物質の重量パーセンテージを意味する。例えば、溶液が２０％（ｄｗｂ）の溶解したβ−１，３−グルカンを含む場合、溶液から全ての水を除去して得られる乾燥物質中に２０ｗｔ％のβ−１，３−グルカンが存在するであろう。
【００４２】
本明細書中の溶液の「パーセント乾燥固形分」（パーセントＤＳ）は、溶液中に溶解している全ての物質（すなわち固形物）のｗｔ％を指す。例えば、１０ｗｔ％のＤＳを有する１００ｇの溶液は、１０ｇの溶解した物質を含む。
【００４３】
本明細書で用いられる用語「水性液体」、「水性流体」などは、水又は水溶液を意味し得る。本明細書の「水溶液」は、１種以上の溶解塩を含むことができ、ここで、いくつかの実施形態では、最大全塩濃度は、約３．５ｗｔ％であり得る。本明細書の水性液体は、典型的には、液体中の唯一の溶媒として水を含むが、水性液体は、任意選択的に、水に混和する１種以上の他の溶媒（例えば、極性有機溶媒）を含むことができる。従って、水溶液は、少なくとも約１０ｗｔ％の水を有する溶媒を含むことができる。
【００４４】
本明細書の「水性組成物」は、例えば、少なくとも約１０ｗｔ％の水を含む液体成分を有する。水性組成物の例としては、例えば、混合物、溶液、分散液（例えば、コロイド分散液）、懸濁液及びエマルションが挙げられる。
【００４５】
本明細書で使用する場合、用語「コロイド分散液」は、分散相及び分散媒体を有する不均一系、すなわち微視的に分散した不溶性粒子が別の物質（例えば、水又は水性溶液などの水性組成物）全体に懸濁していることを指す。本明細書のコロイド分散液の例は、親水コロイドである。例えば親水コロイドなどのコロイド状分散液の粒子の全て又は一部は、本開示の不溶性β−グルカンを含むことができる。用語「分散剤（ｄｉｓｐｅｒｓａｎｔ）」及び「分散剤（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）」は、分散液の形成及び／又は安定化を促進する物質を意味するため、本明細書では同じ意味で用いられる。
【００４６】
「不溶性」、「水不溶性（ａｑｕｅｏｕｓ−ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ）」、「水不溶性（ｗａｔｅｒ−ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ）」（及び同様の用語）（例えば、不溶性β−１，３−グルカン）であるグルカンは、水又は他の水性条件で溶解しない（又は認め得るほどに溶解しない）（ここで、水性条件は、任意選択的に、４〜９のｐＨ（例えば、ｐＨ６〜８）（すなわち、非苛性）及び／又は約１〜７４℃（例えば、２０〜４５℃、又は２０〜４０℃）の温度を有することを更に特徴とする）。対照的に、「可溶性」、「水溶性（ａｑｕｅｏｕｓ−ｓｏｌｕｂｌｅ）」、「水溶性（ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ）」などである本明細書のグルカン（例えば、可溶性β−１，３−グルカン）は、これらの条件下でかなり溶解する。本明細書のいくつかの態様では、上記の定義に従って水不溶性であるβ−１，３−グルカンは、少なくとも約７５℃の温度で水溶性になる。
【００４７】
ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に関して本明細書で使用する用語「配列同一性」、「同一性」などは、特定の比較ウィンドウにわたって最高一致のために整列させたときに同一である、２つの配列内の核酸残基又はアミノ酸残基を指す。従って、「配列同一性のパーセンテージ」、「同一性パーセント」などは、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定される数値を指すが、このとき、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのための参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して付加又は欠失（すなわちギャップ）を含む可能性がある。パーセンテージは、両方の配列内で同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が発生する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得、そのマッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列との間の配列相同性を計算するとき、ＤＮＡ配列のＴ残基は、ＲＮＡ配列のＵ残基と合致し、従ってＲＮＡ配列のＵ残基と「同一である」と見なし得ることは理解されるであろう。第１及び第２のポリヌクレオチドの「相補性パーセント」を決定するために、例えば、（ｉ）第１ポリヌクレオチドと第２ポリヌクレオチドの相補配列（又はその逆）間の同一性パーセント、及び／又は（ｉｉ）標準的なワトソン・クリック塩基対を作り出すであろう第１及び第２ポリヌクレオチド間の塩基のパーセンテージを決定することによってそれを得ることができる。
【００４８】
同一性パーセントは、全てが参照により本明細書に組み込まれる：１）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ：ＮＪ（１９９４）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；及び、５）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ  （Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に記載されるものを含むが、これらに限定されない任意の公知の方法によって容易に決定することができる。
【００４９】
同一性パーセントを決定する好ましい方法は、試験する配列同士の最良の一致を付与するように設計される。同一性及び類似性を決定する方法は、例えば、公的に入手可能なコンピュータプログラムにコード化されている。配列アラインメント及び同一性パーセントの算出は、例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイートのＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて実施することができる。配列の多重アラインメントは、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖアラインメント法を含む、様々な種類のアルゴリズムを包含するＣｌｕｓｔａｌアラインメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２）により記載され、また、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイートのＭＥＧＡＬＩＧＮ  ｖ８．０  プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）に見出される）を用いて行うことができる。多重アラインメントの場合、デフォルト値はＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０及びＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応し得る。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用したタンパク質配列のペアワイズアラインメント及び同一性パーセントの計算のためのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５及びＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５であり得る。核酸の場合には、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４及びＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４であり得る。更に、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法を使用することができ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２）：４６７３−４６８０，１９９４によって記載されている）、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイートのＭＥＧＡＬＩＧＮ  ｖ８．０  プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）で見出すことができる。多重アラインメント（タンパク質／核酸）のデフォルトパラメータは：  ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０／１５、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２／６．６６、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０／３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢであり得る。
【００５０】
本明細書には、様々なポリペプチドアミノ酸配列及びポリヌクレオチド配列が特定の実施形態の特徴として開示されている。本明細書に開示した配列と少なくとも約７０〜８５％、８５〜９０％又は９０％〜９５％同一であるこれらの配列のバリアントを使用又は参照することができる。或いは、バリアントアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列は、本明細書に開示した配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の同一性を有し得る。バリアントアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列は、開示した配列と同一の機能／活性又は開示した配列の少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の機能／活性を有する。メチオニンで始まらない、本明細書に開示した任意のポリペプチドアミノ酸配列は、典型的には、アミノ酸配列のＮ末端に少なくとも開始メチオニンを更に含み得る。対照的に、メチオニンで始まる、本明細書に開示した任意のポリペプチドアミノ酸配列は、このようなメチオニン残基を任意選択的に欠失し得る。
【００５１】
用語「単離された」は、本明細書で使用する場合、天然に存在しない形態又は環境にある物質（又は処理物）を特徴付ける。単離された基質の非限定的な例としては、任意の非天然に生じる基質、例えばβ−１，３−グルカン又は本明細書で合成されるような任意のその他のポリマー（並びに本明細書で開示されているβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ及びこれらの酵素を使用した反応物／処理物のいずれか）などが挙げられる。本明細書に開示される実施形態は、合成物／人工物（人間の介入／関与以外には製造できない）であり、且つ／又は天然に存在しない特性を有すると考えられる。
【００５２】
本明細書で使用される「増加した」という用語は、増加した量又は活性が比較される量又は活性より少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、５０％、１００％又は２００％多い量又は活性を指すことができる。用語「増加した」、「上昇した」、「増強された」、「より多い」、「改善された」などの用語は、本明細書では同じ意味で用いられる。
【００５３】
単離されたグルカンホスホリラーゼを用いたβ−１，３グリコシド結合を含有するグルカンを生成するための反応及び方法を本明細書にて開示する。
【００５４】
本開示の特定の実施形態は、少なくとも水、α−グルコース−１−ホスフェート（α−Ｇ１Ｐ）、好適なアクセプター分子、及び配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素を含む反応組成物であって、酵素が、β−１，３−グルカンを合成する反応組成物に関する。有意には、このような酵素反応は、所望する場合、β−１，３−グルカンシンターゼの使用から完全に独立した方法でβ−１，３−グルカンを生成する。
【００５５】
本明細書で開示される酵素反応で使用するのに好適なβ−１，３−グルカンホスホリラーゼは、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、若しくは１２と１００％同一であるか、若しくは少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．５％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなることができる。いくつかの態様では、配列番号２、４、６、８、１０、又は１２と８０〜９９．５％のアミノ酸同一性を有するβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素は、それぞれ、配列番号２、４、６、８、１０、又は１２のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼの酵素活性の一部（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％）、又は全てを有し得る。配列番号２、４、６、８、１０、又は１２を含むβ−１，３−グルカンホスホリラーゼの例としては、それぞれ、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、又は２４が挙げられる。
【００５６】
配列番号２、４、６、８、１０、又は１２をコードする本明細書のポリヌクレオチド配列（又は同一性がそれと８０％以上又は９０％以上の関連アミノ酸配列）は、任意選択的に、それぞれ、配列番号１、３、５、７、９、若しくは１１と１００％同一であるか、又は少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは９９．５％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。本明細書のこのような配列の例は、それぞれ、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、又は２３である。
【００５７】
特定のアミノ酸が互いに類似した構造的特徴及び／又は電荷の特徴を共有する（すなわち、保存されている）場合、本明細書のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ配列（及び／又は本明細書に記載の他のタイプのポリペプチド）の１つ以上のアミノ酸は、任意選択的に、以下のように、保存アミノ酸残基で置換されてもよい（「保存的アミノ酸置換」）：
１．次の小さい脂肪族の非極性又は弱極性の残基は、相互に置換することができる：Ａｌａ（Ａ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）；
２．次の極性の負荷電残基及びそれらのアミドは、相互に置換することができる：Ａｓｐ（Ｄ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；
３．次の極性の正荷電残基は、相互に置換することができる：Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）；
４．次の脂肪族の非極性残基は、相互に置換することができる：Ａｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；及び
５．次の大きい芳香族残基は、相互に置換することができる：Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｒｐ（Ｗ）。
【００５８】
いくつかの態様では、本明細書のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素は、微生物源、例えば、細菌、真菌（例えば、酵母）、又は原生動物から得ることができる（又は得られ得る）。本明細書の細菌の例としては、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ゴリリバクテリウム（Ｇｏｒｉｌｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、カロラマター（Ｃａｌｏｒａｍａｔｏｒ）種、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、及びラクノクロストリジウム（Ｌａｃｈｎｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種が挙げられる。本明細書のパエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種の例としては、Ｐ．ステリファー（Ｐ．ｓｔｅｌｌｉｆｅｒ）、Ｐ．オドリファー（Ｐ．ｏｄｏｒｉｆｅｒ）、Ｐ．エテリ（Ｐ．ｅｔｈｅｒｉ）、Ｐ．ソンチ（Ｐ．ｓｏｎｃｈｉ）、Ｐ．リオグランデンシス（Ｐ．ｒｉｏｇｒａｎｄｅｎｓｉｓ）、Ｐ．ボレアリス（Ｐ．ｂｏｒｅａｌｉｓ）、Ｐ．ジルンリ（Ｐ．ｊｉｌｕｎｌｉｉ）、及びＰ．ティファエ（Ｐ．ｔｙｐｈａｅ）が挙げられる。本明細書のゴリリバクテリウム（Ｇｏｒｉｌｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種の例としては、Ｇ．マッシリエンス（Ｇ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ）、及びＧ．ティモネンス（Ｇ．ｔｉｍｏｎｅｎｓｅ）が挙げられる。本明細書のカロラマター（Ｃａｌｏｒａｍａｔｏｒ）種の例としては、Ｃ．アウストラリクス（Ｃ．ａｕｓｔｒａｌｉｃｕｓ）、Ｃ．フェルビダス（Ｃ．ｆｅｒｖｉｄｕｓ）、及びＣ．ミッシェレンシス（Ｃ．ｍｉｔｃｈｅｌｌｅｎｓｉｓ）が挙げられる。本明細書のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種の例としては、Ｃ．グランティイ（Ｃ．ｇｒａｎｔｉｉ）、Ｃ．ガングウェンス（Ｃ．ｇａｎｇｈｗｅｎｓｅ）、及びＣ．アエスツアリイ（Ｃ．ａｅｓｔｕａｒｉｉ）が挙げられる。本明細書のラクノクロストリジウム（Ｌａｃｈｎｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種の例としては、Ｌ．フィトファーメンタンス（Ｌ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、及びＬ．マッシリオセネガレンス（Ｌ．ｍａｓｓｉｌｉｏｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｅ）が挙げられる。
【００５９】
本明細書に記載β−１，３−グルカンホスホリラーゼ活性を有する酵素の例は、Ｎ末端及び／又はＣ末端に１〜３００（又はその範囲の任意の整数［例えば、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０］）の残基を更に含む本開示のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼアミノ酸配列のいずれかであり得る。そのような付加的残基は、例えば、（Ｎ末端又はＣ末端のいずれかでの）エピトープタグなどの異種配列、又は（Ｎ末端での）異種シグナルペプチドであり得る。異種アミノ酸配列がＮ末端で導入される実施形態では、そのような異種配列は、例えば、β−１，３−グルカンホスホリラーゼの元の開始メチオニンに隣接してもよく、元の開始メチオニンに置き換わってもよい。後者の実施形態では、異種配列のＮ末端に新しい開始メチオニンが存在し得る。
【００６０】
本明細書で開示したβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ活性を有する酵素は、典型的には、Ｎ末端シグナルペプチドを欠く。しかしながら、β−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素を生成するための発現系は、任意選択的に、細胞外分泌を指示するＮ末端シグナルペプチドをコードする配列を更に含む酵素コードポリヌクレオチドを使用することができる。そのような実施形態におけるシグナルペプチドは、分泌プロセス中に酵素から切断される。本明細書に開示されるβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、及び１２）は、シグナルペプチドを伴わないと考えられることから、付加された任意のシグナルペプチドは、酵素とは異種であると考えられ得る。本明細書のシグナルペプチドの例は、細菌種（例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種）又は真菌種由来のシグナルペプチドである。
【００６１】
本明細書のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼは、例えば、適切に遺伝子操作された微生物株の発酵によって調製することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株（例えば、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、並びにアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属（例えば、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ））、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属（例えば、Ｔ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））、及びマイセリオプソラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属（例えば、Ｍ．サーモフィラ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ））（例えば、Ａｄｒｉｏ及びＤｅｍａｉｎ，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ４：１１７−１３９，２０１４を参照されたい（この文献は、参照により本明細書に組み込まれる））などの微生物種を用いる発酵による組換え酵素の生成は、当該技術分野で周知である。β−１，３−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、典型的には、酵素のための発現カセットを形成するために異種プロモーター配列と連結され、及び／又はそれに合うようにコドン最適化される。そのような発現カセットは、当該技術分野で周知の方法を使用して、好適なプラスミドに組み込まれるか、又は微生物宿主染色体中に組み込まれ得る。発現カセットは、アミノ酸をコードする配列に続いて転写ターミネーターヌクレオチド配列を含み得る。発現カセットは、プロモーター配列とホスホリラーゼのアミノ酸コード配列との間に、β−１，３−グルカンホスホリラーゼの直接的な分泌のために設計されたシグナルペプチド（例えば、異種シグナルペプチド）をコードするヌクレオチド配列も含み得る。発酵の終わりに、細胞を適宜破壊してもよく（典型的には、分泌のためのシグナルペプチドが採用されない場合）、ホスホリラーゼは、沈殿、濾過、及び／又は濃縮などの方法を使用して単離することができる。或いは、ホスホリラーゼを含む溶解物又は抽出物を更に単離することなしに使用することができる。β−１，３−グルカンホスホリラーゼが分泌される（すなわち、それが発酵ブロス中に存在する）場合、それは、発酵ブロスから単離されたものとして、又は発酵ブロスに含まれるものとして任意選択的に使用され得る。β−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素の活性は、所望する場合、α−Ｇ１Ｐ及び好適なアクセプターを含有する本明細書の反応物中に酵素を入れた際に、リンの放出を測定するなどの、生化学的アッセイによって確認することができる（例えば、以下の実施例２に記載されたような条件下で）。いくつかの態様では、酵素によるβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ活性１単位を、約１０ｍＭのα−Ｇ１Ｐ、約１ｍＭアクセプター（例えば、セロビオース又はラミナリビオース）、及び約６０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバ��ファ（約ｐＨ  ７．０）を含み、約３７℃で、約３０分間インキュベートした水性反応物中で、１分当たりに無機リン１μｍｏｌを放出する酵素の量と定義することができる。無機ホスフェートの放出は、任意選択的に、ＰｉＢｌｕｅ（商標）ホスフェートアッセイキット（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を用いて測定することができる。本明細書のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素は、例えば、セロビオースホスホリラーゼ活性を有しているものと考えられていない。本明細書のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素は、オリゴ糖／多糖を生成するため、このような酵素はラミナリビオースを生成しないと理解されるであろう（すなわち、このような酵素は、ラミナリビオースホスホリラーゼではない）。
【００６２】
本明細書のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応は、β−１，３−グルカンを生成する。いくつかの態様では、本明細書のβ−グルカンを構成するグリコシド結合の約又は少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％は、β−１，３結合である。従って、いくつかの態様では、β−１，３−グルカンは、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、若しくは０％、又は約それら未満のβ−１，３ではないグリコシド結合を有する。β−１，３−グルカン内に存在するβ−１，３結合のパーセンテージが高くなるほど、ポリマー内で分枝点を形成する特定の結合の発生率は低くなるため、β−１，３−グルカンが直鎖状である確率が高くなることは理解されよう。従って、１００％のβ−１，３結合を有するβ−１，３−グルカンは、完全に直鎖状である。特定の実施形態では、β−１，３−グルカンは、分枝点を有していないか、ポリマー内のグリコシド結合のパーセントとして約５％、４％、３％、２％、又は１％未満の分枝点（典型的には、β−１，６）を有する。いくつかの態様では、所与の結合プロファイルは、アクセプターから合成されるβ−１，３−グルカンの結合プロファイルを特徴付ける（すなわち、結合プロファイルは、アクセプターの結合プロファイルを含まない）。ラミナリビオースが初期アクセプター分子として使用される態様では、前述の結合パーセンテージのいずれも、任意選択的に、生成物全体を特徴付けることができる。
【００６３】
本明細書のβ−１，３−グルカンは、例えば、およそ又は少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３〜１５、３〜２０、３〜２５、３〜３０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１５〜１７、１５〜１８、１５〜１９、１５〜２０、１５〜２１、１５〜２２、１５〜２３、１５〜２４、１５〜２５、１５〜３０、１６〜１７、１６〜１８、１６〜１９、１６〜２０、１６〜２１、１６〜２２、１６〜２３、１６〜２４、１６〜２５、１６〜３０、１７〜１８、１７〜１９、１７〜２０、１７〜２１、１７〜２２、１７〜２３、１７〜２４、１７〜２５、１７〜３０、２０〜２５、２０〜３０、又は２５〜３０のＤＰの分子量を有し得る。いくつかの更なる態様では、ＤＰは、約３０、２５、２４、２３、２２、２１、２０、又は１９未満であり得る。いくつかの他の態様では、ＤＰは、約、少なくとも約、又は最大約４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００であり得る。いくつかの態様では、任意の上述のＤＰ値（例えば、８以上）は、代わりに、ＤＰｗ又はＤＰｎで表すことができる。いくつかの態様では、所与の分子量は、アクセプターから合成されるβ−１，３−グルカンの結合プロファイルを特徴付ける（すなわち、分子量は、アクセプターの分子量を含まない）。ラミナリビオースが初期アクセプター分子として使用される態様では、任意の前述の分子量の開示は、任意選択的に、生成物全体を特徴付ける。
【００６４】
いくつかの態様におけるβ−１，３−グルカンは、水性条件で不溶性である。このような不溶性は、非苛性水性条件、例えば本明細書のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応の条件（下記を参照されたい）などである。ＤＰ１７又は１８の直鎖β−１，３−グルカンは、以下の実施例３において、約３７℃で水不溶性であるが、約８０〜８５℃で水溶性であることが示されている。従って、特定の態様では、約７５、７４、７３、７２、７１、７０、６５、６０、５５、又は５０℃未満の温度での非苛性水性条件において、少なくとも１７又は１８のＤＰを有する直鎖β−１，３−グルカン（典型的には、１００％のβ−１，３結合）は不溶性であり、１６以下、又は１５以下のＤＰを有する直鎖β−１，３−グルカンは可溶性であると考えられる。少なくとも約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５℃又はそれ以上の温度での非苛性水性条件において、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９以下のＤＰを有する本明細書の直鎖β−１，３−グルカンは、水溶性であると考えられる。非苛性水性条件（又は本明細書の水性条件）としては、例えば、水、又は約、若しくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８％、９９％、若しくは１００ｗｔ％の水、及び４〜９のｐＨ（例えば、ｐＨ４〜８又は６〜８）を有する溶媒を含む水溶液を挙げることができる。
【００６５】
本明細書のβ−１，３−グルカンは、典型的には、不活性容器中で（典型的には、無細胞条件下で）（ｉｎ  ｖｉｔｒｏで）酵素的に誘導され、細胞壁（例えば、植物、真菌、原生動物［例えば、藻類］、又は細菌細胞壁）から誘導されない。いくつかの実施形態は、本明細書に開示された酵素反応プロセス／条件のいずれかによって生成されるか、又は生成可能（入手可能）なβ−１，３−グルカンに関する。
【００６６】
好適なアクセプター分子は、本明細書のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応で使用され、典型的には、最初に反応物を調製する際に添加されるため、任意選択的に、「初期アクセプター」として特徴付けることができる。
【００６７】
いくつかの態様では、アクセプター分子は、単糖、二糖、又はオリゴ糖を含む。更にいくつかの態様では、アクセプターは、単糖、二糖、又はオリゴ糖からなる（例えば、糖アクセプターは、化学的に誘導／置換されていない）。二糖又はオリゴ糖アクセプター分子は、典型的には、１つ以上のグルコースモノマー単位を含む（例えば、モノマー単位の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％はグルコースである）か、又はグルコースモノマー単位のみを含む。二糖又はオリゴ糖は、典型的には、１つ以上のグルコースモノマー単位に加えて、１つ以上の非グルコースモノマー単位を任意選択的に含み得る。いくつかの態様では、二糖又はオリゴ糖は、非グルコースモノマー単位のみを含む。二糖又はオリゴ糖の非グルコースモノマー単位（又は非グルコース単糖アクセプター）は、いくつかの態様では、フルクトース、アラビノース、キシロース、又はガラクトースであり得る。更に、いくつかの態様では、単糖アクセプターは、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシド又はメチルβ−Ｄ−グルコピラノシドであり得る。いくつかの態様では、アクセプターは、グルコース、フルクトース、マンノース、又はグルコサミンではない（それらからならない）。アクセプターは、例えば、直鎖（分枝なし）、又は分枝であり得る。
【００６８】
本明細書の二糖又はオリゴ糖アクセプター分子は、β−グリコシド結合及び／又はα−グリコシド結合を含み得る。アクセプターの結合は、例えば、１００％のβ−グリコシド結合、又は少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは９５％のβ−グリコシド結合であり得る。二糖又はオリゴ糖アクセプターのグルコースモノマー間のβ−又はα−グリコシド結合は、以下の結合：１，１；１，２；１，３；１，４；及び／又は１，６のうちの１つのタイプ、若しくは２つ以上のタイプを含み得る。説明のために、結合は、全てβ−１，３グルコシド結合、又は全てβ−１，６グルコシド結合、又はβ−１，３とβ−１，６グルコシド結合の混合であり得る。
【００６９】
本明細書のオリゴ糖アクセプターは、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、若しくは１５モノマー単位を有し得るか、少なくともそれらを有し得るか、又は最大それらを有し得る。本明細書の二糖及びオリゴ糖アクセプター分子の特定例は、ラミナリビオース、セロビオース、ソホロース、ラミナリトリオース、ラミナリテトラオース、ラミナリペンタオース、ラミナリヘキサオース、ラミナリヘプタオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、若しくはゲンチオビオースを含むか、又はそれらからなる。いくつかの態様では、アクセプター分子は、ラミナリビオース又はＤＰ３−１５ラミナリオリゴ糖、例えば、ラミナリトリオース、ラミナリテトラオース、ラミナリペンタオース、ラミナリヘキサオース、若しくはラミナリヘプタオースなどを含むか、又はそれらからなる。いくつかの態様では、アクセプターは、本明細書に開示されるような二糖又はオリゴ糖のｐ−ニトロフェニル又はメチル誘導体であり得る。
【００７０】
いくつかの態様では、アクセプター分子は、多糖を含む。更に、いくつかの態様では、アクセプターは、多糖からなる（例えば、多糖アクセプターは、化学的に誘導／置換されていない）。多糖アクセプター分子は、典型的には、１つ以上のグルコースモノマー単位を含む（例えば、モノマー単位の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％はグルコースである）か、又はグルコースモノマー単位のみを含む（すなわち、グルカン）。多糖は、典型的には、１つ以上のグルコースモノマー単位に加えて、１つ以上の非グルコースモノマー単位を任意選択的に含み得る。多糖の非グルコースモノマー単位は、いくつかの態様では、フルクトース、アラビノース、キシロース、又はガラクトースであり得る。
【００７１】
本明細書の多糖クセプター分子は、β−グリコシド結合及び／又はα−グリコシド結合を含み得る。多糖アクセプターの結合は、例えば、１００％のβ−グリコシド結合（例えば、β−グルカン）、又は少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは９５％のβ−グリコシド結合であり得る。多糖アクセプターのグルコースモノマー間のβ−又はα−グリコシド結合は、以下の結合：１，１；１，２；１，３；１，４；及び／又は１，６のうちの１つのタイプ、若しくは２つ以上のタイプを含み得る。説明のために、結合は、全てβ−１，３グルコシド結合、又はβ−１，３とβ−１，６グルコシド結合の混合であり得る（例えば、ペンダントβ−１，６−結合したグルコース基を有するβ−１，３−グルカン、又はβ−１，６結合によって互いに繰り返し結合したβ−１，３−グルカンのスパン［すなわち、ブランチ−オン−ブランチ（ｂｒａｎｃｈ−ｏｎ−ｂｒａｎｃｈ）］）。
【００７２】
本明細書の多糖アクセプターは、例えば、約、少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、若しくは５００のＤＰ又はＤＰｗを有し得る。このＤＰ／ＤＰｗは、任意選択的に、これらの値の任意の２つの間の範囲として表すことができる。あくまで例として、ＤＰ／ＤＰｗは、約１６〜３０、１６〜４０、１６〜５０、１６〜３０、１６〜４０、２０〜５０、２５〜３０、２５〜４０、２５〜５０、３０〜４０、又は３０〜５０であり得る。
【００７３】
本明細書の多糖アクセプターの例は、ラミナリン、ミコラミナリン（ｍｙｃｏｌａｍｉｎａｒｉｎ）、又はクリソラミナリンを含むか、又はそれらからなることができる。本明細書の多糖アクセプターは、典型的には、水溶性である。
【００７４】
いくつかの態様におけるアクセプターは、参照により本明細書に組み込まれるＳｔｏｎｅ，Ｂ．Ａ．（２００９，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｂｅｔａ−Ｇｌｕｃａｎｓ，Ｉｎ  Ａｎｔｏｎｙ  Ｂａｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  １−３  Ｂｅｔａ  Ｇｌｕｃａｎｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）で開示されるような、β−グルカン、特に可溶性β−グルカンであり得る。
【００７５】
本明細書のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応の温度は、所望する場合、制御することができる。いくつかの態様では、温度は、約５℃〜約５０℃である。いくつかの態様における温度は、約２０℃〜約４２℃である。更にいくつかの態様では、温度は、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、又は４２℃である。
【００７６】
いくつかの態様におけるβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応組成物のｐＨは、約４．０〜９．０、４．０〜８．５、４．０〜８．０、５．０〜８．０、６．０〜８．０、５．５〜７．５、又は５．５〜６．５であり得る。いくつかの態様では、ｐＨは、約４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５又は８．０であり得る。ｐＨは、好適なバッファ、限定はされないが、ホスフェート（例えば、リン酸ナトリウムバッファ、トリス（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン；例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、シトレート、又はこれらの組み合わせを含む好適なバッファを添加又は混入することによって調節又は制御することができる。酵素反応物におけるバッファ濃度は、例えば、０ｍＭ〜約１００ｍＭ、又は約１０、２５、５０若しくは７５ｍＭであり得る。いくつかの態様では、バッファは、トリスを含むか、トリスからなる；この態様及びいくつかの他の態様では、バッファは、任意選択的に、ホスフェートを含まない。
【００７７】
本明細書のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応物におけるα−Ｇ１Ｐの初期濃度は、例えば、約、又は少なくとも約１〜１００ｍＭであり得る。また、例えば、α−Ｇ１Ｐの初期濃度は、約、少なくとも約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００ｍＭ、又は約１０〜５０ｍＭであり得る。本明細書のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ反応物におけるアクセプターの初期濃度は、例えば、約１〜５０ｍＭであり得る。いくつかの態様では、アクセプターの初期濃度は、約、又は少なくとも約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、若しくは５０ｍＭ、又は約１〜１０若しくは５−１０ｍＭであり得る。更に、くつかの態様では、アクセプターの初期濃度は、約、又は少なくとも約０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５、７．５、若しくは１０ｇ／Ｌであり得る。α−Ｇ１Ｐ又はアクセプターなどの基質の「初期濃度」は、全ての反応成分が添加された直後の酵素反応物（少なくとも、水、α−Ｇ１Ｐ、アクセプター、β−１，３−グルカンホスホリラーゼ）における基質濃度を指す。
【００７８】
いくつかの態様における酵素反応物に含まれるβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素（活性酵素）の量は、約０．０１〜６０ｍｇ／ｍＬであり得る。例えば、約又は少なくとも約０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、８、１０、２０、３０、４０、５０、又は６０ｍｇ／ｍＬの酵素を反応物に使用することができる。本明細書の反応物は、例えば、１種、２種又はそれ以上のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素を含み得る。いくつかの態様においては、１種又は２種のみのβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素が反応物に含まれる。本明細書の反応組成物は、細胞を含まないことができ、典型的には細胞を含まない（例えば、全細胞が存在しない）。
【００７９】
反応組成物は、本明細書に開示される１つ以上の反応条件を適用するのに好適な任意の容器（例えば、不活性容器／コンテナ）内に入れることができる。いくつかの態様における不活性容器は、ステンレス鋼製、プラスチック製又はガラス製（又はこれらの構成要素の２つ以上を含む）であり得、且つ特定の反応物を入れるのに好適なサイズであり得る。不活性容器は、任意選択的に、撹拌装置を装備することができる。いくつかの態様における反応組成物は、生成物／用途物内に含まれ得る：そのような態様におけるβ−１，３−グルカンの生成は、任意選択的に、ｉｎ  ｓｉｔｕでの生成として特徴付けることができる。ｉｎ  ｓｉｔｕで生成したβ−１，３−グルカンは、典型的には、任意下流の単離プロセスを行わないが、所望であれば、行うことができる。例えば上記の特徴のいずれかを使用して、本明細書の単離された反応物を特徴付けることができる。
【００８０】
いくつかの態様における、反応の終了は、視覚（例えば、不溶性生成物の蓄積がもはや認められない）及び／又は反応物中に基質（α−Ｇ１Ｐ及び／又はアクセプター）の残存量の測定（例えば、基質濃度が経時的にもはや減少しない）によって決定することができる。本明細書の反応は、例えば、約又は少なくとも約０．５、１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、３６、４８、６０、７２、９６、１２０、１４４、又は１６８時間実施され得る。
【００８１】
本開示の実施形態は、また、β−１，３−グルカンを生成するための方法であって、
（ａ）少なくとも水、α−Ｇ１Ｐ、アクセプター分子、及び配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素を接触させ、β−１，３−グルカンを生成することと、
（ｂ）任意選択的に、工程（ａ）で生成されたβ−１，３−グルカンを単離することと
を含む方法に関する。
【００８２】
本明細書のβ−１，３−グルカンを生成する方法における接触工程は、任意選択的に、本明細書で開示される酵素反応物を準備することと特徴付けることができ、これは、少なくとも水、α−Ｇ１Ｐ、アクセプター分子、及びβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素を含む。従って、本明細書の酵素反応組成物の任意の特徴は、同様に、本明細書で開示されるβ−１，３−グルカン生成方法を特徴付ける。
【００８３】
β−１，３−グルカン生成方法における接触工程は、任意数の方法で行うことができる。例えば、所望量のα−Ｇ１Ｐ及び／又はアクセプターをまず水に溶解し（任意選択的には緩衝成分などの他の成分もこの調製段階で添加してもよい）、次いで、１種以上のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素を添加することができる。反応は、例えば、静置され得るか、又は撹拌（例えば、撹拌器又はオービタルシェーカーによって）され得る。
【００８４】
いくつかの態様では、β−１，３−グルカンの単離は、少なくとも遠心分離、濾過、分留、クロマト分離、透析、蒸発、及び／又は希釈の工程を実施することを含み得る。不溶性β−１，３−グルカンの単離としては、例えば、遠心分離又は濾過工程を少なくとも実施することを含むことができ、任意選択的に、遠心分離及び／又は濾過したβ−１，３−グルカンを、水又はその他の水性液体で、１回、２回、又はそれ以上洗浄することを更に含むことができる。洗浄体積は、任意選択的に、β−１，３−グルカンを生成するのに使用される反応組成物の体積の少なくとも約１０〜１００％であり得る。洗浄は、必要に応じて、置換洗浄又はリスラリー洗浄などの様々な方式で行うことができる。本明細書の単離は、任意選択的に、β−１，３−グルカンを乾燥させること、及び／又は不溶性β−１，３−グルカンを含む水性組成物（例えば、分散体）を調製することを更に含み得る。
【００８５】
乾燥形態で提供される、本発明の単離されたβ−１，３−グルカン生成物は、例えば、２．０、１．５、１．０、０．５、０．２５、０．１０、０．０５、又は０．０１ｗｔ％以下の水を含み得る。いくつかの態様では、β−１，３−グルカン生成物は、少なくとも１グラム（例えば、少なくとも２．５、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、又は１０００ｇ）の量で提供され、このような量は、例えば、乾燥量であり得る。
【００８６】
単離された（任意選択的に「精製された」と特徴付けられた）本明細書のβ−１，３−グルカンは、例えば、約１００％、又は少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．８％、若しくは９９．９％のｗｔ％（乾燥重量基準）で組成物中に存在し得る。このような単離されたβ−１，３−グルカン自体は、所望する場合、生成物／用途物において成分（ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）／成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）として使用され得る。
【００８７】
本明細書のβ−１，３−グルカン生成方法を実施するためのα−Ｇ１Ｐは、例えば、単離されたα−Ｇ１Ｐ（例えば、民間の供給元から入手したα−Ｇ１Ｐ）を添加することにより直接供給され得る。或いは、α−Ｇ１Ｐは、少なくとも第２の反応を提供することによって供給することができ、第２の反応の生成物はα−Ｇ１Ｐを含む（すなわち、第２の反応は生成物としてα−Ｇ１Ｐを生成する）。
【００８８】
いくつかの態様におけるα−Ｇ１Ｐを供給するための第２の反応は、（ｉ）水、（ｉｉ）無機ホスフェート、（ｉｉｉ）二糖、オリゴ糖、又は多糖（その全てが、１つ以上のグルコースモノマー単位を含む）、及び（ｉｖ）二糖、オリゴ糖、又は多糖を加リン酸分解するホスホリラーゼを接触させることによりα−Ｇ１Ｐを生成する。この態様におけるホスホリラーゼは、本明細書のα−Ｇ１Ｐ−産生酵素の例である。第２の反応における二糖、オリゴ糖、又は多糖基質のモノマー単位は、例えば、全てグルコース、又は少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％のグルコースであり得る。モノマー単位間のグリコシド結合は、α−及び／又はβ−結合であり得、以下の結合：１，１；１，２；１，３；１，４；及び／又は１，６のうちの１つのタイプ、若しくは２つ以上のタイプを含み得る。二糖又は三糖は、典型的には、本明細書の第２の反応で用いられる。
【００８９】
本明細書のα−Ｇ１Ｐ−産生酵素として好適なホスホリラーゼの例としては、デンプンホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、及びセロデキストリンホスホリラーゼが挙げられる。少なくとも水及び無機ホスフェートの存在下で、これらの酵素は、それぞれ、デンプン（任意選択的に、プルラナーゼ及び／又はイソアミラーゼなどのデンプン脱分枝酵素で脱分枝化される）、スクロース、及びセロデキストリン（任意選択的に、セルラーゼ及び／又はエンドβ−１，４−グルカナーゼなどの１つ以上のβ−１，４−エンドグルカナーゼで、並びに任意選択的に、更に溶解多糖モノオキシゲナーゼ及び／又はセロビオヒドロラーゼでセルロース処理することにより調製される）を、α−Ｇ１Ｐを含む生成物に変換する。これらの酵素のいずれも、例えば、植物、微生物（例えば、細菌）、又は真菌（例えば、酵母）起源を有し得る。デンプンホスホリラーゼの例は、米国特許出願公開第２００２／０１３３８４９号明細書、及びＴｉｗａｒｉ  ａｎｄ  Ｋｕｍａｒ（２０１２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７：６９−８３）に開示されており、これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。スクロースホスホリラーゼの例は、米国特許第５７１６８３７号明細書、同第７２２９８０１号明細書、及び同第７９６８３０９号明細書（これらは参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。いくつかの態様におけるスクロースホスホリラーゼは、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）種（例えば、Ｌ．メセンテロイデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ））から誘導可能であり得る。セロデキストリンホスホリラーゼの例は、米国特許第８８８９３７９号明細書、並びに米国特許出願公開第２０１４／００８７４３５号明細書、同第２０１４／００５７３２３号明細書、同第２０１３／００５９３４０号明細書、及び同第２０１７／０３２７８５７号明細書に開示されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９０】
本明細書のβ−１，３−グルカン生成方法を実施するためのアクセプター分子は、例えば、単離されたアクセプター（例えば、民間の供給元から入手したアクセプター）を直接添加することにより供給され得る。或いは、アクセプター分子は、少なくとも第３の反応物を提供することによって供給することができ、第３の反応の生成物はアクセプター分子を含む（すなわち、第３の反応物は生成物としてアクセプター分子を生成する）。第３の反応物は、典型的には、少なくともβ−１，３−グルカンホスホリラーゼではないホスホリラーゼ、Ｇ１Ｐ（例えば、α−Ｇ１Ｐ）、及びホスホリラーゼに好適なアクセプターを含む。例えば、第３の反応物は、ラミナリビオースホスホリラーゼ、α−Ｇ１Ｐ、及びグルコースを含むことができ、これはラミナリビオースホスホリラーゼのためのアクセプターとして機能し；このような第３の反応物は、ラミナリビオース（並びにホスフェート）を生成する。次いで、このラミナリビオース生成物は、β−１，３−ホスホリラーゼ及びα−Ｇ１Ｐを含む第１の反応においてアクセプターとして機能し得る。別の例として、第３の反応物は、セロビオースホスホリラーゼ、α−Ｇ１Ｐ、及びグルコースを含み；このような第３の反応物はセロビオース（並びにホスフェート）を生成し、これは、本明細書の第１の反応におけるアクセプターとして機能することができる。前述の開示は、本明細書で開示されるβ−１，３−グルカンホスホリラーゼのためのアクセプターを供給する代替的な方法に関し、アクセプターを供給するこの方法は、同様に、任意のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼを使用する場合に、適用され得る。このような実施形態におけるその他のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼの例としては、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）種（例えば、Ｅ．グラシリス（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、ＧＥＮＢＡＮＫアクセション番号ＡＵＯ３０１９２．１）、オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）種（例えば、Ｏ．ダニカ（Ｏ．ｄａｎｉｃａ）、ＧＥＮＢＡＮＫアクセション番号ＢＡＵ７８２３４．１）、フェルビドバクテリウム（Ｆｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種（例えば、Ｆ．ペニボランス（Ｆ．ｐｅｎｎｉｖｏｒａｎｓ）、ＧＥＮＢＡＮＫアクセション番号ＢＡＵ７８２３６．１）、及びパエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種（例えば、Ｐ．ポリミキサ（Ｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ）、ＧＥＮＢＡＮＫアクセション番号ＢＡＵ７８２３５．１）（その全てのＧＥＮＢＡＮＫアクセション番号は、参照により本明細書に組み込まれる）由来のもの、又はこれらのＧＥＮＢＡＮＫアクセション番号の配列のいずれかと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であり、β−１，３−グルカンホスホリラーゼ活性を有するアミノ酸配列を更に含む。任意の他のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼを用いる反応及び方法は、本明細書で開示される反応／方法の特徴のいずれかを有し得る。
【００９１】
本明細書の第３の反応のためのアクセプター−産生ホスホリラーゼ（例えば、ラミナリビオースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ）は、例えば、植物、微生物（例えば、細菌）又は真菌（例えば、酵母）起源を有し得る。いくつかの態様におけるラミナリビオースホスホリラーゼは、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種から誘導可能であり得る。ラミナリビオースホスホリラーゼの例は、Ｋｉｔａｋｏａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７６：３４３−３４８；１９９３，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０４：５０８−５１４）、及びＮｉｈｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２，Ｃａｒｂ．Ｒｅｓ．３６１：４９−５４）（これらは参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。セロビオースホスホリラーゼの例は、Ｈａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７６：８１２−８１８）、及びＲｅｉｃｈｅｎｂｅｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７：２６２−２６７）（これらは参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００９２】
いくつかの態様における第２の反応及び／又は第３の反応は、β−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素反応（第１の反応）が実施されるのと同じ容器で提供することができ、任意選択的に、「共役反応」として特徴付けることができる（例えば、このような態様は、上記で開示されたｉｎ  ｓｉｔｕでの反応組成物を含む）。或いは、第２の反応及び／又は第３の反応は、第１の反応が行われる容器の外で（別に）実施され得る。第２の反応及び／又は第３の反応は、例えば、第１の反応の前及び／又は連続的に実施することができる。本明細書の第２の反応及び／又は第３の反応の条件（例えば、時間、温度、ｐＨ）は、例えば、第１の反応について開示したとおりであり得る。いくつかの態様では、（ｉ）第１及び第２の反応のみが実施されるか、（ｉｉ）第１及び第３の反応のみが実施されるか、又は（ｉｉｉ）第１、第２、及び第３の反応が実施される。３つ全ての反応（［ｉｉｉ］のような）が共役反応として実施される場合、いくつかの態様では、（Ａ）第１の反応及び／若しくは第３の反応のホスフェート生成物は、第２の反応で有利に使用することができ、並びに／又は（Ｂ）第２の反応のα−Ｇ１Ｐ生成物は、（第１の反応で使用することに加えて）第３の反応で有利に使用することができることが考えられる。
【００９３】
本開示の実施形態は、また、β−１，３−グルカンを処理する方法であって、
（ａ）少なくとも１７のＤＰを有する最大約４０ｗｔ％の不溶性β−１，３−グルカンを含む水性組成物を準備することと；
（ｂ）水性組成物を少なくとも約７５℃まで加熱し、それによって、β−１，３−グルカンを水性組成物に溶解させて、溶液を得ることと；
（ｃ）溶解したβ−１，３−グルカン以外の１つ以上の溶質の含有量（レベル又は濃度）を減少させる少なくとも１つのプロセスに溶液を供し、それによって、溶液中の溶解したβ−１，３−グルカンの含有量（レベル又は濃度）を乾燥重量基準で増加させることと；
（ｄ）任意選択的に、β−１，３−グルカンが沈殿して不溶性状態に戻る温度まで溶液を冷却し、任意選択的に、沈殿したβ−１，３−グルカンを更に単離することと、
を含む方法に関する。
或いは、β−１，３−グルカンを処理する方法は、所望する場合、β−１，３−グルカンを純化する（ｒｅｆｉｎｉｎｇ）、精製する（ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ）、調製する（ｐｒｅｐａｒｉｎｇ）、又は処理する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）方法として特徴付けることができる。
【００９４】
典型的な実施形態では、最大約４０ｗｔ％の不溶性β−１，３−グルカンを含む水性組成物は、本明細書で開示されるβ−１，３−グルカン合成反応／方法を実施することにより供給され得る。或いは、最大約４０ｗｔ％の不溶性β−１，３−グルカンを含む水性組成物は、例えば、生物源（例えば、植物、原生生物、真菌、細菌）からβ−１，３−グルカンを単離すること、（及び、任意選択的に、単離したβ−１，３−グルカンを加水分解してその分子量を減らすこと）、又はβ−１，３−グルカンシンターゼ（シンセターゼ）（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＭｉｙａｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｔａｍａｒｉ，１９７３，Ａｇｒ．ＢｉｏＩ．Ｃｈｅｍ．３７：１２５３−１２６０を参照のこと）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでβ−１，３−グルカンを合成することによって、供給することができる。水性組成物は、非苛性である。本明細書の処理方法に入れられる水性組成物は、例えば、約又は最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ｗｔ％の不溶性β−１，３−グルカンを含み得る。いくつかの態様では、水性組成物は、約５〜４０、５〜３５、５〜３０、２〜２５、５〜２０、１０〜４０、１０〜３５、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０、１５〜２５、１５〜２０、２０〜４０、２０〜３５、２０〜３０、２０〜２５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、３０〜４０、３０〜３５、又は３５〜４０ｗｔ％の不溶性β−１，３−グルカンを含む。本明細書の処理方法に入れられる水性組成物は、例えば、１つ以上の糖（例えば、フルクトース及び／又はグルコースなどの単糖；スクロース、ラミナリビオース、及び／又はセロビオースなどの二糖）、及び／又はその他の分子（例えば、緩衝成分、無機化合物、例えばホスフェートなど）などの溶質を含み得る。本明細書の水性組成物は、例えば、ペースト又はゲルの形態で、色は白であり得る。
【００９５】
本明細書の処理方法は、少なくとも１７のＤＰを有する不溶性β−１，３−グルカンを含む水性組成物を処理することに関する。１７以上のＤＰの例を、本明細書に開示する。いくつかの態様では、ＤＰは、１７又は１８から、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０まで（又は１７〜３０の本明細書で任意のＤＰ）である。処理方法における不溶性β−１，３−グルカンは、典型的には、直鎖である。
【００９６】
本明細書で開示される処理方法は、水性組成物を少なくとも約７５℃まで加熱し、その中で不溶性β−１，３−グルカンを溶解させ、それによって、水性組成物を溶液に変換する工程（ｂ）を含む。加熱は、例えば、約、少なくとも約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００℃未満、又は約それら未満の温度までであり得る。いくつかの態様における加熱は、約７５〜１００、７５〜９５、７５〜９０、７５〜８８、７５〜８６、７８〜１００、７８〜９５、７８〜９０、７８〜８８、７８〜８６、８０〜１００、８０〜９５、８０〜９０、８０〜８８、８０〜８６、８２〜１００、８２〜９５、８２〜９０、８２〜８８、８２〜８６、８４〜１００、８４〜９５、８４〜９０、８４〜８８、又は８４〜８６℃までであり得る。加熱は、任意選択的に、水性組成物のかき混ぜ（例えば、撹拌又は振盪）によって達成され得る。β−１，３−グルカンを溶解させると、水性組成物は、典型的には、感触及び稠度が水に似ている（水と同様に取り扱う）溶液になる。溶液は、典型的には、クリア（ｃｌｅａｒ）／透明（ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ）であるが、β−１，３−グルカン溶解前の水性組成物は、透明ではない（濁っている、不透明、及び／又は白色［例えば、乳白色］）。
【００９７】
いくつかの態様では、工程（ｂ）で水性組成物を加熱することにより、約３〜１２５ｍＰａ（ミリパスカル）の複素粘度を有する水性組成物がもたらされる。加熱した組成物の複素粘度は、例えば、約１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、２、若しくは１ｍＰａ、又は約それら未満であり得る。また、例えば、加熱した組成物の複素粘度は、約２〜２０、２〜１５、２〜１０、５〜２０、５〜１５、５〜１０、７〜２０、７〜１５、７〜１０、９０〜１０５、９０〜１０３、９０〜１００、９５〜１０５、９５〜１０３、９５〜１００、９７〜１０５、９７〜１０３、又は９７〜１００ｍＰａであり得る。いくつかの態様では、約５５〜６５℃（例えば、６０℃）で測定した場合の本明細書の水性組成物の複素粘度は、約８０〜１００、８５〜１００、又は９０〜１００℃の温度（例えば、又は８０℃以上の上記の任意の温度）まで加熱すると、約５５〜６５℃（例えば、６０℃）で測定した場合、約、又は少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、又は９９．９％減少し得る。いくつかの態様における複素粘度は、約３〜７、４〜６、又は５Ｈｚの周波数（任意選択的には、一定の周波数）で、及び／又は回転レオメータ（例えば、Ｋｉｎｅｘｕｓ（登録商標）レオメータ、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、任意選択的に、振動モードでプレートオンプレートジオメトリーで、測定することができる。いくつかの態様における複素粘度は、Ｆｒａｎｃｋ（２００４，Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｒｈｅｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ｆｌｕｉｄｓ，Ｂｏｏｋ  ｏｆ  ＴＡ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ｐｐ．１−１１），Ｆｒａｎｃｋ（２００３，Ａｎｎ．Ｔｒａｎｓ．Ｎｏｒｄｉｃ  Ｒｈｅｏｌ．Ｓｏｃ．１１：９５−１００）、又は米国特許第９９３２５０３号明細書若しくは同第９９１３８７６号明細書（それらは参照により全て本明細書に組み込まれる）に従って測定することができる。
【００９８】
本明細書の処理方法の工程（ｃ）は、溶解したβ−１，３−グルカン以外の１つ以上の溶質の含有量（レベル／濃度）を減少させる少なくとも１つのプロセスに溶液を供し、それによって、溶液中の溶解したβ−１，３−グルカンの含有量（レベル／濃度）を乾燥重量基準で増加させる。この処理がなされる温度は、典型的には、少なくとも７５℃（又は工程［ｂ］で適用される任意の温度）である。この処理工程は、例えば、ナノ濾過及び／又は限外濾過を含み得る。処理されるβ−１，３−グルカンの分子量に基づいて、適切に、濾過アプローチ及び／又は濾過孔径を選択することができる。本明細書で適用可能であると検討される好適なナノ濾過又は限外濾過方法としては、Ｃａｔａｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２：３４−４０）、Ｍａｃｈａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６，Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｅｎｇ．１８０：１２０−１２８）、米国特許出願公開第２０１７／０１６６９３８号明細書、並びに米国特許第６４５４９４６号明細書、同第５２５４１７４号明細書、同第５４０３６０４号明細書、及び同第９９０９１１９号明細書（参照により本明細書全て組み込まれる）により開示されているものが挙げられる。処理工程（ｃ）は、例えば、溶解したβ−１，３−グルカン以外の溶質（例えば、上記参照のこと）のうちの１つ以上を完全に除去する（検出レベル未満まで）か、又は部分的に除去する（例えば、元の溶質の量の少なくとも約８５重量％、９０重量％、９５重量％、９９重量％、又は９９．５重量％が除去される）と考えられる。いくつかの態様では、処理工程（ｃ）は、溶液中に溶解したβ−１，３−グルカンの含有量を、乾燥重量基準で、約又は少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％増加させると考えられる。
【００９９】
本明細書で開示された処理方法は、任意選択的に、β−１，３−グルカンが沈殿して不溶性状態に戻る温度まで溶液（工程［ｃ］において処理に供された）を冷却し、任意選択的に、沈殿したβ−１，３−グルカンを単離する工程（ｄ）を更に含む。冷却により、例えば、温度を、５℃〜５０℃（例えば、２０〜２５℃）の間の、本明細書に開示されている任意の温度まで低下させることができる。冷却は、例えば、冷蔵、冷水浴でのインキュベーション、循環冷水ジャケットの使用、及び／又は溶液への冷水の添加を含む、任意数の方法のいずれかで行うことができる。沈殿したβ−１，３−グルカンは、その酵素合成後の不溶性β−１，３−グルカンを単離するために上記のように任意選択的に単離することができる。
【０１００】
いくつかの代替的な態様では、方法は、代わりに、上記工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｄ）を含むことができ（冷却及び／又は単離する工程［ｄ］が任意選択的である場合）；このような代替的な態様における１つ以上の溶質の除去（工程［ｃ］による）もまた、任意選択的であり、典型的には、実施されない。β−１，３−グルカン純化方法の上記の他の特徴のいずれも、例えば、このような代替的な態様を特徴付けることができる。従って、本明細書のこのような代替的な態様の例は、β−１，３−グルカンを処理、取り扱い（ｈａｎｄｌｉｎｇ）、操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ）、又は制御（ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ）する方法であって：
（ａ）少なくとも１７のＤＰを有する最大約４０ｗｔ％の不溶性β−１，３−グルカンを含む水性組成物を準備することと；
（ｂ）水性組成物を少なくとも約７５℃まで加熱し、それによって、β−１，３−グルカンを水性組成物に溶解させることと；
（ｃ）任意選択的に、β−１，３−グルカンが沈殿して不溶性状態に戻る温度まで水性組成物を冷却することと、
を含む方法である。
【０１０１】
これらの代替的な態様のいくつかでは、冷却工程（ｃ）が実施される；このような方法は、例えば、β−１，３−グルカンが、生成物／用途物に質感及び／又は粘度をもたらす生成物／用途物を調製するために使用することができる。これらの態様の水性組成物中のβ−１，３−グルカンにより示される熱可逆性／熱シフトは、このような生成物／用途物の生成を促進する。従って、この方法により生成される生成物／用途物もまた、開示される。
【０１０２】
いくつかの更なる代替的な態様では、代わりに、加熱工程（ｂ）は、例えば、約、少なくとも約３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、３１〜４０、３１〜３９、３１〜３８、３１〜３７．５、３６〜４０、３６〜３９、３６〜３８、３６〜３７．５、３６．５〜３８、３６．５〜３７．５、３７〜３８、若しくは３７〜３７．５℃（例えば、平熱又は発熱などのヒト／哺乳類の体温）又は約それら以下の温度で実施することができる。加熱は、例えば、外部のヒト／哺乳類の体表面（例えば、皮膚、爪、毛髪）、ヒト／哺乳類の体の開口部（例えば、口腔、鼻腔、耳腔、直腸腔、尿生殖路）、又は内部のヒト／哺乳類の表面／器官（例えば、消化管、呼吸器系）への暴露（接触）によって実施することができる。このような更なる代替的な態様における水性組成物は、例えば、約又は最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、１〜２０、１〜１０、１〜８、１〜５、１〜３、２〜２０、２〜１０、２〜８、２〜５、２〜３、４〜２０、４〜１０、４〜８、４〜５、８〜２０、又は８〜１０ｗｔ％の本明細書の不溶性β−１，３−グルカンを含み得る。このような更なる代替的な態様の他の特徴は、例えば、複素粘度（加熱工程［ｂ］の後）、及び／又はβ−１，３−グルカンＤＰなどの上記で開示したもののいずれかであり得る。このような更なる代替的な態様は、任意選択的に、β−１，３−グルカンの取り扱い、操作、制御、又は触感覚（感触）する方法として特徴付けることができる。様々な水性生成物／用途物は、これらの更なる代替的な態様におけるβ−１，３−グルカンの水性組成物によって示される熱可逆性／熱シフト特性の利点を得ることができ、例えば、ヒト／哺乳類の触覚反応／感度／感覚を生成、誘発、又は刺激する生成物（例えば、触覚反応がβ−１，３−グルカン溶液の状態の変化［非溶解から溶解へ］によって刺激される場合）などである。従って、本明細書のこのような更なる代替的な態様の例は、β−１，３−グルカンの取り扱い、操作、制御、又は触感覚（感触）する方法であって：
（ａ）少なくとも１７のＤＰを有する最大約２０ｗｔ％の不溶性β−１，３−グルカンを含む水性組成物を準備することと；
（ｂ）水性組成物を少なくとも約３１〜４０℃まで加熱し、それによって、β−１，３−グルカンを水性組成物に溶解させることと；
（ｃ）任意選択的に、β−１，３−グルカンが沈殿して不溶性状態に戻る温度まで水性組成物を冷却することと、
を含む方法である。
従って、このような方法（例えば、工程［ａ］及び［ｂ］）を実施するための生成物／用途物もまた、開示されている。
【０１０３】
本明細書に開示される組成物及び方法の非限定的な例としては、以下が挙げられる：
１．少なくとも水、α−Ｇ１Ｐ、アクセプター分子、及び配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素を含む反応組成物であって、酵素が、β−１，３−グルカンを合成する反応組成物。
２．β−１，３−グルカンが、少なくとも約９０％のβ−１，３グリコシド結合を有する、実施形態１に記載の反応組成物。
３．β−１，３−グルカンが、少なくとも約９９％のβ−１，３グリコシド結合を有する、実施形態２に記載の反応組成物。
４．β−１，３−グルカンの重合度（ＤＰ）が、少なくとも３である、実施形態１、２、又は３に記載の反応組成物。
５．β−１，３−グルカンのＤＰが、少なくとも約１５である、実施形態４に記載の反応組成物。
６．アクセプター分子が、単糖、二糖、又はオリゴ糖を含む、実施形態１、２、３、４、又は５に記載の反応組成物。
７．アクセプター分子が、ラミナリビオースを含む、実施形態６に記載の反応組成物。
８．アクセプター分子が、多糖を含む、実施形態１、２、３、４、又は５に記載の反応組成物。
９．多糖がβ−グルカンを含む、実施形態８に記載の反応組成物。
１０．β−グルカンがラミナリンを含む、実施形態９に記載の反応組成物。
１１．β−１，３−グルカンを生成するための方法であって（例えば、実施形態１〜１０のいずれかに記載の反応組成物中で生成されるような）、方法が：（ａ）少なくとも水、α−Ｇ１Ｐ、アクセプター分子、及び配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素を接触させ、β−１，３−グルカンを生成することと、（ｂ）任意選択的に、工程（ａ）で生成されたβ−１，３−グルカンを単離することと、を含む方法。
１２．α−Ｇ１Ｐが、工程（ａ）において第２の反応を行うことによって供給され、第２の反応の生成物は、α−Ｇ１Ｐを含む、実施形態１１に記載の方法。
１３．第２の反応が、工程（ａ）が実施される容器と同じ容器で提供され、第２の反応が、工程（ａ）の前に及び／又は工程（ａ）に続いて実施される、実施形態１２に記載の方法。
１４．第２の反応が、（ｉ）水、（ｉｉ）無機ホスフェート、（ｉｉｉ）グルコース−含有二糖、オリゴ糖、又は多糖、及び（ｉｖ）二糖、オリゴ糖、又は多糖を加リン酸分解するホスホリラーゼを接触させることによりα−Ｇ１Ｐを生成する、実施形態１２又は１３に記載の方法。
１５．アクセプター分子が、工程（ａ）において第３の反応を提供することによって提供され、第３の反応の生成物が、アクセプター分子を含む、実施形態１１、１２、１３又は１４に記載の方法。
１６．第３の反応によって提供されるアクセプター分子が、ラミナリビオースである、実施形態１５に記載の方法。
１７．β−１，３−グルカンを処理する方法であって、方法が：（ａ）少なくとも１７の重合度（ＤＰ）を有する最大約４０ｗｔ％の不溶性β−１，３−グルカンを含む水性組成物を準備することと（任意選択的に、実施形態１〜１０のいずれかに記載の反応組成物、又は実施形態１１〜１６のいずれかに記載の方法を実施することによる）；（ｂ）水性組成物を少なくとも約７５℃まで加熱し、それによって、β−１，３−グルカンを水性組成物に溶解させて、溶液を得ることと；（ｃ）溶解したβ−１，３−グルカン以外の１つ以上の溶質の含有量を減少させる少なくとも１つのプロセスに溶液を供し、それによって、溶液中の溶解したβ−１，３−グルカンの含有量を乾燥重量基準で増加させることと；（ｄ）任意選択的に、β−１，３−グルカンが沈殿して不溶性状態に戻る温度まで溶液を冷却し、任意選択的に、沈殿したβ−１，３−グルカンを単離することと、
を含む方法。
１８．（ｃ）のプロセスが、ナノ濾過及び／又は限外濾過を含む、実施形態１７に記載の方法。
【実施例】
【０１０４】
以下の実施例において、本開示を更に例示する。これらの実施例は、本発明の特定の態様を示しているが、単に説明の目的でのみ示されていることが理解されるべきである。上述の考察及びこれらの実施例から、当業者であれば、本明細書に開示した実施形態の本質的な特徴を確認することができ、本発明の趣旨及び範囲を逸脱しない範囲で、本明細書に開示した実施形態を様々な使用及び条件に適合させるために様々な変更形態及び修飾形態をなし得る。
【０１０５】
実施例１
推定上のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼのクローニング及び発現
本実施例は、様々な推定上のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素のクローニング及び発現を記載する。
【０１０６】
６つの推定上のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列を同定した。これらの酵素を、ＰｓｔＧｐ１（配列番号２）、ＧｍａＧｐ１（配列番号４）、ＰｓｐＧｐ２（配列番号６）、ＣａｕＧｐ１（配列番号８）、ＣｇｒＧｐ１（配列番号１０）、及びＬｐｈＧｐ１（配列番号１２）と表示した。これらの酵素の天然遺伝コード配列のそれぞれの配列番号を表１で示す。これらの酵素の各々のアミノ酸配列のアラインメントは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ウェブサイト上のＢＬＡＳＴ  ｓｅａｒｃｈにより、ＧＥＮＢＡＮＫデータベースに対して行われた。表２（下記）は、それぞれのクエリ配列と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する各アラインメントによって提供されるデータベース配列を列挙する。
【０１０７】
【表２】
2021521815.tif 000003
【０１０８】
【表３】
2021521815.tif 000004
【０１０９】
ＰｓｔＧｐ１（配列番号２）、ＧｍａＧｐ１（配列番号４）、ＰｓｐＧｐ２（配列番号６）、ＣａｕＧｐ１（配列番号８）、ＣｇｒＧｐ１（配列番号１０）、及びＬｐｈＧｐ１（配列番号１２）をコードする核酸配列を、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における発現のために各々最適化した。具体的には、コドン最適化核酸配列を合成し、個別に、Ｇｅｎｅｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）により、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ部位で、発現ベクターｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に挿入し、発現プラスミドを得た。ｐＥＴ３０ａへの各挿入により、（ＬａｃＩ−制御されたＴ７プロモーターの下で）推定上のβ−１，３−ホスホリラーゼ（上記と同じアミノ酸配列）をコードする配列が得られ、その後に２つの追加のアミノ酸（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）（ＸｈｏＩ部位から得られる）及びＣ末端に６ｘ  Ｈｉｓタグが続いた。各ｐＥＴ３０ａ構築物によりコードされるＰｓｔＧｐ１、ＧｍａＧｐ１、ＰｓｐＧｐ２、ＣａｕＧｐ１、ＣｇｒＧｐ１、及びＬｐｈＧｐ１のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、及び２４であった；これらのアミノ酸配列の遺伝コード配列のためのそれぞれの配列番号を表１に示す。
【０１１０】
各発現プラスミドは、個別に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換され、形質転換混合物を、５０ｐｐｍのカナマイシン及び３０ｐｐｍのクロラムフェニコールを補充したルリア（Ｌｕｒｉａ）寒天プレートに広げた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びシーケンス分析によって確認されたとおり、正しい発現プラスミドを保持するコロニーを、５０ｐｐｍのカナマイシン及び３０ｐｐｍのクロラムフェニコールを補充した５ｍＬのルリアブロスに接種し、次いで、約２４時間振盪しながら３７℃でインキュベートした。各形質転換体におけるｐＥＴ３０ａ構築物からの発現を誘導するために、各培養物約１ｍＬを、５０ｐｐｍのカナマイシン及び３０ｐｐｍのクロラムフェニコールを補充した２５ｍＬのＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に接種し、次いで、約２４時間振盪しながら３７℃でインキュベートした。
【０１１１】
タンパク質発現誘導期間後、遠心分離により細胞を回収し、その後、細胞ペレットを、溶解バッファ（５０ｍＭトリス  ｐＨ７．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０）に再懸濁し、１０分間の超音波処理により氷上で溶解した（３５％出力、２０分、２秒オン／２秒オフ）（ＳＣＩＥＮＴ２−ＩＩ  Ｄ、Ｎｉｎｇｂｏ  Ｓｃｉｅｎｔｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）。次いで、溶解物を１３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して不純物を取り除いた（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ，Ａｖａｎｔｉ  Ｊ−Ｅ）。不純物を除去した溶解物を、５０ｍＭトリス  ｐＨ７．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び１０％グリセロールで予め平衡化したＨｉｓ  Ｔｒａｐ（商標）ＨＰ（５ｍＬ）ヒスチジンタグ付きタンパク質精製カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に個別に適用した。標的タンパク質を、平衡化バッファ中０〜２５０ｍＭイミダゾールの直線勾配を用いてカラムから溶出させた。標的タンパク質を含む画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ  ＵＬＴＲＡ限外濾過（１０ｋＤａカットオフ）デバイスを用いて濃縮及び平衡化バッファとのバッファ交換を行い、使用するまで４０％グリセロール中に−２０℃で貯蔵した。次いで、精製した各標的タンパク質を、以下の実施例２及び３で記載されるとおり、β−１，３−グルカンホスホリラーゼ活性及び生成物形成について分析した。
【０１１２】
実施例２
ＰｓｔＧｐ１、ＧｍａＧｐ１、ＰｓｐＧｐ２、ＣａｕＧｐ１、ＣｇｒＧｐ１、及びＬｐｈＧｐ１のホスホリラーゼ活性の分析
本実施例は、実施例１、すなわちＰｓｔＧｐ１、ＧｍａＧｐ１、ＰｓｐＧｐ２、ＣａｕＧｐ１、ＣｇｒＧｐ１、及びＬｐｈＧｐ１で発現される推定上のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼのホスホリラーゼ活性の測定について記載する。
【０１１３】
ＰｓｔＧｐ１（配列番号１４）、ＧｍａＧｐ１（配列番号１６）、ＰｓｐＧｐ２（配列番号１８）、ＣａｕＧｐ１（配列番号２０）、ＣｇｒＧｐ１（配列番号２２）、及びＬｐｈＧｐ１（配列番号２４）の各々のホスホリラーゼ活性を、９６ウェルプレート形式の１００ｍＬ反応物で測定した。各反応物（水系）を、３７℃で３０分間インキュベートし、約４ｐｐｍの前述のタンパク質のうちの１つ、１０ｍＭのα−Ｇ１Ｐ（α−Ｄ−グルコース−１−リン酸二ナトリウム塩水和物、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号Ｇ７０００）、初期アクセプターとしての１ｍＭのセロビオース（Ｄ−［＋］−セロビオース、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号Ｃ７２５２）、及び６０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファ、ｐＨ７．０が含まれた。各反応物からのリン放出は、ＰｉＢｌｕｅ（商標）試薬（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を用いて定量化した。ホスホリラーゼ活性１単位を、上記試験条件下で１分当たりに無機リン１μｍｏｌを放出する酵素の量と定義した。試験したタンパク質の各々はホスホリラーゼ活性を有し、遊離ホスフェートを放出しながら、セロビオースアクセプターにグルコース（α−Ｇ１Ｐから誘導される）を添加できることを示している。伸長された生成物（すなわち、その非還元末端で１つのグルコースモノマーによって伸長されたセロビオース）自体が、進行中のホスホリラーゼ活性のためのアクセプターとして機能した可能性がある。
【０１１４】
また、グルコース、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシド、及びラミナリンを本アッセイを用いて、アクセプター機能について別個に試験した。ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシド（１ｍＭ）及びラミナリン（５ｍｇ／ｍＬ）は、各々アクセプターとして機能し得るが、グルコース（１ｍＭ）はアクセプターとして機能できないことが見出された。
【０１１５】
これらの結果に基づいて、ＰｓｔＧｐ１（配列番号２）、ＧｍａＧｐ１（配列番号４）、ＰｓｐＧｐ２（配列番号６）、ＣａｕＧｐ１（配列番号８）、ＣｇｒＧｐ１（配列番号１０）、及びＬｐｈＧｐ１（配列番号１２）は、ホスホリラーゼ活性を有すると考えられる。これらの結果は、表２から見て、際立っており、これは、ＰｓｔＧｐ１、ＧｍａＧｐ１、ＣａｕＧｐ１、及びＬｐｈＧｐ１が、以前は「仮想タンパク質」としてのみ特徴付けられており、ＰｓｐＧｐ２及びＣｇｒＧｐ１にはセロビオースホスホリラーゼ活性があると考えられている可能性があることを示す。セロビオースホスホリラーゼ酵素は、セロビオースをグルコース及びα−Ｇ１Ｐに可逆的に変換することが知られている。本データは、遊離ホスフェート放出により示されるように、ＰｓｔＧｐ１（配列番号２）、ＧｍａＧｐ１（配列番号４）、ＰｓｐＧｐ２（配列番号６）、ＣａｕＧｐ１（配列番号８）、ＣｇｒＧｐ１（配列番号１０）、及びＬｐｈＧｐ１（配列番号１２）が、特定のアクセプター化合物を認識して、伸長することができることを示唆する。
【０１１６】
実施例３
ＰｓｔＧｐ１、ＧｍａＧｐ１、ＰｓｐＧｐ２、ＣａｕＧｐ１、ＣｇｒＧｐ１、及びＬｐｈＧｐ１ホスホリラーゼによるβ−１，３−グルカンの生成
本実施例は、ＰｓｔＧｐ１、ＧｍａＧｐ１、ＰｓｐＧｐ２、ＣａｕＧｐ１、ＣｇｒＧｐ１、及びＬｐｈＧｐ１ホスホリラーゼを用いて直鎖β−１，３−グルカンを生成する反応について記載しており、それにより、これらのホスホリラーゼの各々がβ−１，３−グルカンホスホリラーゼであることを確認する。
【０１１７】
α−Ｇ１Ｐは、本実施例の反応（下記）において、スクロースに対するスクロースホスホリラーゼの活性により供給された（遊離ホスフェートを用いて、スクロースホスホリラーゼは、スクロースをフルクトース及びα−Ｇ１Ｐに変換する）。ラミナリビオースは、ＰｓｔＧｐ１、ＧｍａＧｐ１、ＰｓｐＧｐ２、ＣａｕＧｐ１、ＣｇｒＧｐ１、又はＬｐｈＧｐ１の各々のための初期アクセプター化合物としての役割を果たした；ラミナリビオースは、これらのホスホリラーゼの各々によって伸長され（その非還元末端で）、３の重合度（ＤＰ）を有するβ−１，３−グルカンを生成した。β−１，３−グルカン（ＤＰ３以上）自体もまた、ＰｓｔＧｐ１、ＧｍａＧｐ１、ＰｓｐＧｐ２、ＣａｕＧｐ１、ＣｇｒＧｐ１、又はＬｐｈＧｐ１の各々によって伸長され（その非還元末端で）、より高いＤＰを有するβ−１，３−グルカンを生成した。ラミナリビオースの初期アクセプターは、これらの反応において、どちらの基質も、ラミナリビオースホスホリラーゼによって使用され、ラミナリビオース及び遊離ホスフェートを生成する、α−Ｇ１Ｐ（スクロースホスホリラーゼによって供給される）、及びグルコース（直接供給される）に対するラミナリビオースホスホリラーゼの活性により供給された。
【０１１８】
ＰｓｔＧｐ１、ＧｍａＧｐ１、ＰｓｐＧｐ２、ＣａｕＧｐ１、ＣｇｒＧｐ１、及びＬｐｈＧｐ１ホスホリラーゼの各々を試験するために、直前に記載したとおりの個々の共役反応を実施した。各１Ｌの反応（水系）は、最初にｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファ、２００ｇ／Ｌのスクロース、１ｇ／Ｌのグルコース、４ｍｇ／Ｌのロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）スクロースホスホリラーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号Ｓ０９３７）、１ｍｇ／Ｌのパエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）のラミナリビオースホスホリラーゼ（Ｋｉｔａｋｏａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７６：３４３−３４８（これは参照により本明細書に組み込まれる））、及びＰｓｔＧｐ１、ＧｍａＧｐ１、ＰｓｐＧｐ２、ＣａｕＧｐ１、ＣｇｒＧｐ１、又はＬｐｈＧｐ１ホスホリラーゼのうちの１つを４ｍｇ／Ｌ含有する溶液中で、３７℃で実施された。１〜２日のインキュベーション後、反応の各々において、不溶性グルカンの沈殿が始まった。各反応をさらに３〜５日間続けて、完全に変換したが、その時点で不溶性グルカンの蓄積はなかった。
【０１１９】
各反応で生成された不溶性グルカンを純化するために、次の工程を実行した。まず、不溶性グルカンを１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって各反応物から収集し、その後、上清を除去し、約７５ｗｔ％の水（約２５ｗｔ％の固形分）を含有する湿ったペレットを残した。ペレットは不透明な白色で、各々がペーストに似ていた。次いで、各ペレット（約４００〜５００ｍＬ）を、水浴にて８５℃まで加熱し、約５〜１０分後、ペレットの液化がもたらされた（すなわち、不溶性β−１，３−グルカンがペレットの水相に溶解）（別の実験では、８０℃での加熱もペレットの液化をもたらすことを示した）。各液化ペレット、むしろ溶液は、水のような感触及び稠度であり、黄色っぽい色相でクリア／透明であった。次いで、冷水を添加して総量を１Ｌにし、その結果、不溶性グルカンが沈殿した。次いで、沈殿した不溶性グルカンを、沈殿工程で使用した水と同じ量を使用して、水で２回洗浄した。不溶性グルカン（水中約２５ｗｔ％固形分）が高温で水のような状態まで溶解しやすいため、溶解したグルカンの特定の液体処理をすぐに適用できると考えられる。例えば、存在する可能性のある糖（単糖及び／又は二糖）を除去するために、ナノ濾過又は限外濾過を適用することができる。
【０１２０】
上記ホスホリラーゼによって合成されたβ−１，３−グルカンの加熱された試料の水のような稠度を調査するために、更なる作業を実施した。Ｋｉｎｅｘｕｓ（登録商標）回転レオメータ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、振動モード（温度の関数として５Ｈｚの一定周波数）にてプレートオンプレートジオメトリーで、試料の粘度遷移を測定した。例えば、ホスホリラーゼＰｓｐＧｐ２によって生成されたβ−１，３−グルカン（水中１７ｗｔ％）について、複素粘度（参照により本明細書に組み込まれるＦｒａｎｃｋ，２００４，Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｒｈｅｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ｆｌｕｉｄｓ，Ｂｏｏｋ  ｏｆ  ＴＡ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ｐｐ．１−１１に従って測定した）は、６０℃にて約１００００ｍＰａから、９５℃にて約１００ｍＰａへ変化したことが見出された。同様に、ホスホリラーゼＣｇｒＧｐ１によって生成されたβ−１，３−グルカン（水中２８ｗｔ％）について、複素粘度は、６０℃にて約１０００００ｍＰａから９５℃にて約１０ｍＰａへ変化した。これらの測定された粘度遷移は非常に劇的であり、非流動ペーストから低粘度流体に変化するこれらの試料の目視観察によく対応していた。
【０１２１】
次いで、各洗浄された不溶性グルカン生成物のグリコシド結合プロファイルを、ＮＭＲ（核磁気共鳴、１Ｈ  ６００−ＭＨｚ  ＮＭＲ、ＤＳＳ／Ｄ２Ｏを添加した３％ＬｉＣｌ／ＤＭＳＯ、８０℃）で分析した。各生成物の結合は、１００％がβ−１，３であることが判明した。従って、開示されたＰｓｔＧｐ１、ＧｍａＧｐ１、ＰｓｐＧｐ２、ＣａｕＧｐ１、ＣｇｒＧｐ１、及びＬｐｈＧｐ１ホスホリラーゼの各々の不溶性グルカン生成物は、直鎖β−１，３−グルカンであった。ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）分析（Ａｍｉｎｅｘ（登録商標）ＨＰＸ−４２Ａカラム、水の溶離液、０．６ｍＬ／分流速、８５℃、ＲＩ検出器を使用）は、これらの直鎖β−１，３−グルカン生成物が、約１７又は１８のＤＰを有することを示した。
【０１２２】
本実施例の結果は、表２から見て、際立っており、これは、ＰｓｔＧｐ１、ＧｍａＧｐ１、ＣａｕＧｐ１、及びＬｐｈＧｐ１は、以前は「仮想タンパク質」としてのみ特徴付けられており、ＰｓｐＧｐ２及びＣｇｒＧｐ１にはセロビオースホスホリラーゼ活性があると考えられている可能性があることを示す。本データは、ＰｓｔＧｐ１（配列番号２）、ＧｍａＧｐ１（配列番号４）、ＰｓｐＧｐ２（配列番号６）、ＣａｕＧｐ１（配列番号８）、ＣｇｒＧｐ１（配列番号１０）、及びＬｐｈＧｐ１（配列番号１２）が、各々、α−Ｇ１Ｐ及びラミナリビオースを用いて、直鎖β−１，３−グルカンを合成することができることを示す。そのため、ＰｓｔＧｐ１、ＧｍａＧｐ１、ＰｓｐＧｐ２、ＣａｕＧｐ１、ＣｇｒＧｐ１、及びＬｐｈＧｐ１ホスホリラーゼは、β−１，３−グルカンホスホリラーゼである。これらのβ−１，３−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列が、以前に開示された唯一のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼアミノ酸配列の代表であると考えられている、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）（ＧＥＮＢＡＮＫアクセション番号ＡＵＯ３０１９２．１）、オクロモナス・ダニカ（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ  ｄａｎｉｃａ）（ＧＥＮＢＡＮＫアクセション番号ＢＡＵ７８２３４．１）、フェルビドバクテリウム・ペニボランス（Ｆｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｎｎｉｖｏｒａｎｓ）（ＧＥＮＢＡＮＫアクセション番号ＢＡＵ７８２３６．１）、及びパエニバチルス・ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）（ＧＥＮＢＡＮＫアクセション番号ＢＡＵ７８２３５．１）由来のβ−１，３−グルカンホスホリラーゼアミノ酸配列とそれぞれ、最大約２５％、４３％、６３％、及び５０％の配列同一性を有するように見えるため、本実施例の結果は、更に際立っている。本開示の反応のβ−１，３−グルカン生成物−１７又は１８のＤＰを有する直鎖−は、水不溶性であることも注目に値する。この観察は、ＤＰが２０未満の直鎖β−１，３−グルカン生成物が水溶性であることを示す他の開示と対照的である（例えば、Ｌｅｇｅｎｔｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０：９７４５−９７６６；Ｍｉｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４：２８６８７−２８６９７；  Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７７：１９４９−１９５４；Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２９：３９７−４０３）。
【０１２３】
従って、β−１，３−グルカンは、少なくとも水、α−Ｇ１Ｐ、ラミナリビオースなどの好適なアクセプター分子、及び配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２を含むβ−１，３−グルカンホスホリラーゼ酵素を含む反応中で合成することができる。不溶性β−１，３−グルカン生成物を含む本実施例の水性組成物は、加熱により、容易に水のような組成物に変換され、これは、例えば、組成物中の非−β−１，３−グルカン成分（例えば、糖）のレベルを低下させる１つ以上の処理工程に影響を受けやすいと考えられる。
【配列表】
2021521815000001.app
【国際調査報告】
2021521815.tif 000005
2021521815.tif 000006
2021521815.tif 000007
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