(57)【要約】  モノクローナル抗タウ抗体及びその抗原結合断片が記載される。抗体をコードしている核酸、抗体を含む組成物、並びに抗体の製造方法、及びタウ異常症などの状態を治療又は予防するための、抗体の使用方法についてもまた、記載されている。本発明の抗体はまた、生体サンプル中のタウを定量するために使用することもできる。
2021515556.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
相補的決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、相補的決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、ＰＨＦ−タウに結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、
（ａ）前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３、並びに配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むか；
（ｂ）前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号７のＨＣＤＲ１、配列番号８のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３、並びに配列番号９のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むか；
（ｃ）前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号７のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３、並びに配列番号１１のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むか；
（ｄ）前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号７のＨＣＤＲ１、配列番号１２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３、並びに配列番号１１のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むか；
（ｅ）配列番号７のＨＣＤＲ１、配列番号１３のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３、並びに配列番号１１のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３；あるいは
（ｆ）前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号７のＨＣＤＲ１、配列番号１４のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３、並びに配列番号１１のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む、
前記単離抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
（ａ）配列番号１５と少なくとも９５％同一である配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６と少なくとも９５％同一である配列を含む軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号１７と少なくとも９５％同一である配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１８と少なくとも９５％同一である配列を含む軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１９と少なくとも９５％同一である配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２０と少なくとも９５％同一である配列を含む軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号２１と少なくとも９５％同一である配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２２と少なくとも９５％同一である配列を含む軽鎖可変領域；
（ｅ）配列番号２３と少なくとも９５％同一である配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２０と少なくとも９５％同一である配列を含む軽鎖可変領域；又は
（ｆ）配列番号２４と少なくとも９５％同一である配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２５と少なくとも９５％同一である配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の単離抗体又は抗原結合断片。
【請求項３】
（ａ）配列番号１５の重鎖可変領域及び配列番号１６を含む軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号１７を含む重鎖可変領域及び配列番号１８を含む軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１９を含む重鎖可変領域及び配列番号２０を含む軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号２１を含む重鎖可変領域及び配列番号２２を含む軽鎖可変領域；
（ｅ）配列番号２３を含む重鎖可変領域及び配列番号２０を含む軽鎖可変領域；又は
（ｆ）配列番号２４を含む重鎖可変領域及び配列番号２５を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１又は２に記載の単離抗体又は抗原結合断片。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の抗体又は抗原結合断片をコードしている、単離核酸。
【請求項５】
請求項４に記載の単離核酸を含む、ベクター。
【請求項６】
請求項４に記載の核酸又は請求項５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離抗体又は抗原結合断片と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項８】
病理学的タウ凝集又はタウ異常症の拡散の低減を必要とする対象における、病理学的タウ凝集又はタウ異常症の拡散を低減する方法であって、請求項７に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項９】
タウ異常症の治療を必要とする対象における、タウ異常症を治療する方法であって、請求項７に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１０】
タウ異常症の治療を必要とする対象における、タウ異常症を治療する方法であって、請求項７に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、前記タウ異常症が、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病及び散発性アルツハイマー病を含む）、染色体１７に関連したパーキンソン症候群による前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性皮質下神経膠症、神経原線維型認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン認知症複合、ダウン症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーフォルデン−シュパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、多系統萎縮症、Ｃ型ニーマン・ピック病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管障害、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソン症候群、慢性外傷性脳症、及び拳闘家認知症（ボクサー病）からなる群から選択される、前記方法。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を生成する方法であって、前記抗体又は抗原結合断片を生成する条件下で前記抗体又は抗原結合断片をコードしている核酸を含む細胞を培養することと、前記細胞又は細胞培養物から前記抗体又は抗原結合断片を回収することとを含む、前記方法。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒト化抗体又は抗原結合断片を含む医薬組成物を生成する方法であって、前記抗体又は抗原結合断片を医薬的に許容される担体と組み合わせて前記医薬組成物を得ることを含む、前記方法。
【請求項１３】
対象由来の生体サンプルにおけるＰＨＦ−タウの存在を検出する方法であって、前記生体サンプルを請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片と接触させることと、前記対象由来の前記サンプル中のＰＨＦ−タウへの前記抗体又は抗原結合断片の結合を検出することとを含む、前記方法。
【請求項１４】
前記生体サンプルが、血液、尿、又は脳脊髄液のサンプルである、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＰＨＵ−タウ抗体、並びにその製造方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、徐々に激しい精神機能低下を導き、最終的には死に至らしめる、記憶、認知、論理的思考、判断力、及び情動安定性の進行性喪失を臨床的特徴とする、退行性脳障害である。ＡＤは、高齢者の進行性精神機能不全（認知症）の非常に一般的な原因であり、米国では４番目に多い医学的死亡原因を表すと考えられている。ＡＤは、世界中の民族で観察され、現在及び未来の、主たる公衆の健康上の問題を提示する。
【０００３】
ＡＤ個体の脳は、老人性（又はアミロイド）斑、アミロイド血管症（血管におけるアミロイド沈着）及び神経原線維変化と呼ばれる特徴的な病変を呈する。これら病変の大多数、特にアミロイド斑及び対らせん状細線維の神経原線維変化は、一般にＡＤ患者の記憶及び認知機能に重要なヒトの脳のいくつかの領域で見られる。
【０００４】
ＡＤ及びいくつかの他の神経変性疾患における神経原線維変性の主なタンパク質成分は、高リン酸化形態の微小管結合タンパク質タウである。タウの凝集を予防又は排除する治療法の開発は、長年にわたる関心事であるが、抗凝集化合物及びキナーゼ阻害剤を含む候補薬物は、臨床試験に入ったばかりである（Ｂｒｕｎｄｅｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ８：７８３−９３，２００９）。
【０００５】
最近、トランスジェニックタウマウスモデルにおいて、タウについての能動及び受動免疫が治療可能性を有している可能性があるという前臨床的エビデンスが得られた（Ｃｈａｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８６：３４４５７−６７，２０１１、Ｂｏｕｔａｊａｎｇｏｕｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  １１８：６５８−６７，２０１１、Ｂｏｕｔａｊａｎｇｏｕｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３０：１６５５９−６６，２０１０、Ａｓｕｎｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２７：９１１５−２９，２００７）。最近、タウ異常症の伝播及び拡散仮説が報告されたが、これは、ヒト脳におけるタウ異常症進行のＢｒａａｋステージと前臨床的タウモデルにおけるタウ凝集体を注入した後のタウ異常症の拡散に基づいている（Ｆｒｏｓｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８４：１２８４５−５２，２００９、Ｃｌａｖａｇｕｅｒａ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１：９０９−１３，２００９）。したがって、ＡＤ及び他の神経変性疾患を治療するためにタウ凝集体及びタウ異常症進行を防ぐ治療法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一般的な一態様では、本発明は、単離抗体、好ましくは単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片であって、ＰＨＦ−タウ、好ましくはヒトＰＨＦ−タウに結合する、抗体又はその抗原結合断片に関する。
【０００７】
一実施形態では、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１又は７のＨＣＤＲ１；配列番号２、８、１０、１２、１３、又は１４のＨＣＤＲ２；及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖を有する。別の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、配列番号４、９又は１１のＬＣＤＲ１；配列番号５のＬＣＤＲ２；及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖を有する。他の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、及び１４のいずれかのＣＤＲと少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、又は少なくとも９９％同一であるＣＤＲを含む。
【０００８】
別の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、及び２４のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１６、１８、２０、２２、及び２５のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０００９】
別の実施形態では、本発明の単離抗体又はその抗原結合断片は、定常領域、例えばヒト又はマウス重鎖ＩｇＧ定常領域、及びヒト又はマウス抗体軽鎖カッパ若しくはラムダ定常領域を更に含む。
【００１０】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片をコードしている単離核酸に関する。
【００１１】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片をコードしている単離核酸を含むベクターに関する。
【００１２】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片をコードしている単離核酸を含む宿主細胞に関する。
【００１３】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明の単離抗体又はその抗原結合断片と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【００１４】
別の一般的な態様では、本発明は、病理学的タウ凝集又はタウ異常症の拡散の低減を必要とする対象における、病理学的タウ凝集又はタウ異常症の拡散を低減する方法であって、本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法に関する。タウ異常症としては、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病及び散発性アルツハイマー病を含む）、染色体１７に関連したパーキンソン症候群による前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性皮質下神経膠症、神経原線維型認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン認知症複合、ダウン症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーフォルデン−シュパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、多系統萎縮症、Ｃ型ニーマン・ピック病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管障害、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソン症候群、慢性外傷性脳症、及び拳闘家認知症（ボクサー病）からなる群から選択される１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
好ましくは、タウ異常症は、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病及び散発性アルツハイマー病を含む）、ＦＴＤＰ−１７、又は進行性核上麻痺である。
【００１６】
最も好ましくは、タウ異常症は、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病及び散発性アルツハイマー病を含む）である。
【００１７】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片を生成する方法であって、当該抗体又はその抗原結合断片を生成する条件下で当該抗体又はその抗原結合断片をコードしている核酸を含む細胞を培養することと、当該細胞又は細胞培養物から当該抗体又はその抗原結合断片を回収することとを含む、方法に関する。
【００１８】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物を生成する方法であって、当該抗体又はその抗原結合断片を医薬的に許容される担体と組み合わせて医薬組成物を得ることを含む、方法に関する。
【００１９】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片を用いて、対象におけるＰＨＦ−タウの存在を検出する方法、又は対象におけるＰＨＦ−タウの存在を検出することによって当該対象におけるタウ異常症を診断する方法に関する。
【００２０】
本発明の他の態様、特徴、及び利点は、発明の詳細な説明、並びにその好ましい実施形態及び添付の特許請求の範囲を含む以下の開示より明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
上述の「課題を解決するための手段」及び以降の「発明を実施するための形態」は、添付の図面と併せて読むことでより良好に理解されるであろう。本発明は、図面に示される実施形態そのものに限定されない点は理解されるべきである。
【図１Ａ】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって分析した、組換え的に発現させたＰＴ８２ｍＡｂ又はそのＦａｂ断片のＰＨＦ−タウ及び可溶性タウへの結合を示し、抗体又はＦａｂの濃度を、それぞれのセンサーグラムの隣りに示す（７５ｎＭ、１５ｎＭ、３ｎＭ、０．６ｎＭ）。（Ａ）ｍＡｂのＰＨＦへの結合を示す。
【図１Ｂ】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって分析した、組換え的に発現させたＰＴ８２ｍＡｂ又はそのＦａｂ断片のＰＨＦ−タウ及び可溶性タウへの結合を示し、抗体又はＦａｂの濃度を、それぞれのセンサーグラムの隣りに示す（７５ｎＭ、１５ｎＭ、３ｎＭ、０．６ｎＭ）。（Ｂ）ＦａｂのＰＨＦへの結合を示す。
【図１Ｃ】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって分析した、組換え的に発現させたＰＴ８２ｍＡｂ又はそのＦａｂ断片のＰＨＦ−タウ及び可溶性タウへの結合を示し、抗体又はＦａｂの濃度を、それぞれのセンサーグラムの隣りに示す（７５ｎＭ、１５ｎＭ、３ｎＭ、０．６ｎＭ）。（Ｃ）Ｆａｂの２Ｎ４Ｒタウへの結合を示す。
【図２】１０ｎｇ／ｍＬ又は１ｎｇ／ｍＬにおける２Ｎ４Ｒタウの２つのコーティング濃度を用いてＥＬＩＳＡによって分析された、ハイブリドーマ上清由来のＰＴ８２及び組換え的に発現させたＰＴ８２の組換え２Ｎ４Ｒタウへの結合を示す。
【図３Ａ】ＦＲＥＴアッセイにおいてタウ凝集体の形成をブロックするＰＴ８２ｍＡｂの能力を示す。（Ａ）使用した細胞モデルにおけるＦＲＥＴアッセイの図を示す。
【図３Ｂ】ＦＲＥＴアッセイにおいてタウ凝集体の形成をブロックするＰＴ８２ｍＡｂの能力を示す。（Ｂ）陰性対照ｍＡｂ（ＣＮＴＯ１０３７／Ｃ１８Ａ抗体）と比較したＦＲＥＴアッセイにおけるＰＴ８２の有効性を示す。
【図４Ａ】免疫枯渇アッセイにおいてタウ凝集体の形成をブロックするＰＴ８２ｍＡｂの能力を示す。（Ａ）ＰＴ８２ｍＡｂを使用してヒトＡＤ脳又はＰ３０１Ｓマウス脊髄抽出物由来のホモジネートのいずれかを免疫枯渇させた、免疫枯渇アッセイの図を示す。
【図４Ｂ】免疫枯渇アッセイにおいてタウ凝集体の形成をブロックするＰＴ８２ｍＡｂの能力を示す。ＰＴ８２ｍＡｂは、（Ｂ）ＦＲＥＴアッセイによってアッセイしたとき、ＡＤ脳及びＰ３０１Ｓ脊髄抽出物の両方においてタウ種を減少させることができた。
【図４Ｃ】免疫枯渇アッセイにおいてタウ凝集体の形成をブロックするＰＴ８２ｍＡｂの能力を示す。ＰＴ８２ｍＡｂは、（Ｃ）タウ凝集選択性ＭＳＤアッセイによってアッセイしたとき、ＡＤ脳及びＰ３０１Ｓ脊髄抽出物の両方においてタウ種を減少させることができた。
【図５Ａ】（Ａ）全ホモジネートを分析したときの、インビボｅＰＨＦ注射モデルにおけるＡＴ１８０及びＰＴ３抗体と比較したＰＴ８２の有効性を示す。
【図５Ｂ】（Ｂ）不溶性画分を分析したときの、インビボｅＰＨＦ注射モデルにおけるＡＴ１８０及びＰＴ３抗体と比較したＰＴ８２の有効性を示す。
【図６Ａ】（Ｂ）抗体及びＰＨＦの頭蓋内への同時注射と比較した、（Ａ）抗体を末梢投与（ＩＰ注射）した際のＰＴ８２及びＰＴ３の有効性を示す。（Ｃ）全ホモジネート及び（Ｄ）不溶性画分で有効性を分析した。
【図６Ｂ】（Ｂ）抗体及びＰＨＦの頭蓋内への同時注射と比較した、（Ａ）抗体を末梢投与（ＩＰ注射）した際のＰＴ８２及びＰＴ３の有効性を示す。（Ｃ）全ホモジネート及び（Ｄ）不溶性画分で有効性を分析した。
【図６Ｃ】（Ｂ）抗体及びＰＨＦの頭蓋内への同時注射と比較した、（Ａ）抗体を末梢投与（ＩＰ注射）した際のＰＴ８２及びＰＴ３の有効性を示す。（Ｃ）全ホモジネート及び（Ｄ）不溶性画分で有効性を分析した。
【図６Ｄ】（Ｂ）抗体及びＰＨＦの頭蓋内への同時注射と比較した、（Ａ）抗体を末梢投与（ＩＰ注射）した際のＰＴ８２及びＰＴ３の有効性を示す。（Ｃ）全ホモジネート及び（Ｄ）不溶性画分で有効性を分析した。
【図７】ＰＴ８２の線形ペプチドマッピングを使用したエピトープマッピングデータを示す。
【図８】ＥＬＩＳＡによって測定したときの、可溶性タウへのヒト化ＰＴ８２ｍＡｂの結合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、広義に用いられ、ポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒト適合化、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、並びに抗体フラグメントを含む、免疫グロブリン又は抗体分子を含む。
【００２３】
一般に抗体とは、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質又はペプチド鎖である。抗体の構造は、公知である。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて５つの主なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。いずれの脊椎動物種の抗体軽鎖も、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて２つの明確に異なるタイプ、すなわちカッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの一方に割り当てられ得る。
【００２４】
用語「抗体断片」は、インタクトな抗体の部分を意味する。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、ＣＤＲ、抗原結合部位、重鎖又は軽鎖可変領域、ダイアボディ、単鎖抗体分子、並びに少なくとも２つのインタクトな抗体又はその断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００２５】
免疫グロブリン軽鎖又は重鎖可変領域は、「抗原結合部位」が割り込んだ「フレームワーク」領域からなる。抗原結合部位は、以下のとおり様々な用語を使用して定義される：（ｉ）相補的決定領域（ＣＤＲ）は、配列多様性に基づいている（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １３２：２１１−５０，１９７０）。一般に、抗原結合部位は、各可変領域に３つのＣＤＲ（重鎖可変領域（ＶＨ）にＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに軽鎖可変領域（ＶＬ）にＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を有する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」は、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１−１７，１９８７）によって定義されているように、構造中の超可変性である抗体可変ドメインの領域を指す。一般的に、抗原結合部位は、各ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの超可変領域を有する。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋは、構造的に保持されているＨＶを「カノニカル構造」と呼ぶ。付番システム、並びにＣＤＲ及びＨＶのアノテーションは、Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ及びＭａｒｔｉｎ（Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：３８３２−９，２００８）により最近改訂された。（ｉｉｉ）抗原結合部位を形成する領域の別の定義が、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体由来のＶドメインの比較に基づいて、Ｌｅｆｒａｎｃ（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５−７７，２００３）によって提案されている。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベースが、標準化したこれらの領域の付番及び定義を提供している。ＣＤＲ、ＨＶ、及びＩＭＧＴの記述間の対応については、Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，同上に記載されている。（ｉｖ）抗原結合部位は、「特異性決定残基の使用」（Specificity Determining Residue Usage、ＳＤＲＵ）（Ａｌｍａｇｒｏ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２−４３，２００４）に基づいて記述することもでき、この場合、特異性決定残基（Specificity Determining Residues、ＳＤＲ）は、抗原接触に直接関与する免疫グロブリンのアミノ酸残基を指す。
【００２６】
「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」は、抗原結合部位の配列であると定義されるもの以外の、抗体の可変領域内の残りの配列である。抗原結合部位の正確な定義は、上述したような様々な描写により決定され得るため、正確なフレームワーク配列は、抗原結合部位の定義に依存する。
【００２７】
本明細書で使用するとき、用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）とは、ほぼ均質な抗体の集団から得られる抗体（又は抗体フラグメント）を意味する。モノクローナル抗体は極めて特異性が高く、通常、単一の抗原決定基を標的とする。
【００２８】
本明細書で使用するとき、用語「エピトープ」とは、抗体が特異的に結合する抗原の部分を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸、リン酸化アミノ酸、又は多糖類側鎖などの部分の化学的に活性な（例えば、極性、非極性、又は疎水性の）表面基からなり、特定の３次元構造特性及び特定の帯電特性を有し得る。エピトープは、事実上線状であってもよく、又は線状の一連のアミノ酸ではなく、抗原の隣接していないアミノ酸間の空間的関係によって形成される不連続エピトープ、例えば、立体構造エピトープであってもよい。立体構造エピトープには、抗原の線状配列の異なる部分のアミノ酸同士が３次元空間で近接するような抗原の折畳みによって生じるエピトープが含まれる。
【００２９】
タウは、多数の周知のアイソフォームを有する豊富な中枢及び末梢神経系タンパク質である。ヒトのＣＮＳでは、オルタナティブスプライシングによって３５２〜４４１のサイズの６つの主なタウアイソフォームが存在する（Ｈａｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １５：１１２−９，２００９）。これらアイソフォームは、０〜２個のＮ末端挿入、及び３又は４個のタンデムに配置された微小管結合反復配列が制御されて含まれることにより互いに異なっており、０Ｎ３Ｒ（配列番号２６）、１Ｎ３Ｒ（配列番号２７）、２Ｎ３Ｒ（配列番号２８）、０Ｎ４Ｒ（配列番号２９）、１Ｎ４Ｒ（配列番号３０）、及び２Ｎ４Ｒ（配列番号３１）と称される。用語「対照タウ」及び「可溶性タウ」とは、本明細書で互換的に使用されるとき、リン酸化及び他の翻訳後修飾されていない、配列番号３１のタウアイソフォームを指す。
【００３０】
タウは、微小管に結合しており、タウのリン酸化によって調節され得るプロセスである、細胞を通じたカーゴの輸送を制御する。ＡＤ及び関連する疾患においては、タウの異常リン酸化が広く生じ、これは、タウの対らせん状細線維（ＰＨＦ）と呼ばれる原線維への凝集の前に生じるか又はその凝集を誘発すると考えられる。ＰＨＦの主な成分は、高リン酸化タウである。用語「対らせん状細線維−タウ」又は「ＰＨＦ−タウ」は、本明細書で使用するとき、対らせん状細線維における周知のタウ凝集体を指す。ＰＨＦ構造における２つの主要な領域は、電子顕微鏡、ファジーコート、及びコア細線維により明らかであり、ファジーコートはタンパク質分解に対して感受性であり、フィラメントの外側に位置し、当該フィラメントのプロテアーゼ耐性コアが、ＰＨＦの主鎖を形成する（Ｗｉｓｃｈｉｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８５：４８８４−８，１９８８）。
【００３１】
本明細書で使用するとき、「ＰＨＦ−タウに結合する抗体」は、ウエスタンブロットで評価したときにＰＨＦ−タウに結合する抗体を指す。典型的に、ＰＨＦ−タウに結合する抗体は、５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）ＴＢＳ−Ｔ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で１時間ブロッキングした後、約５００ｎｇのＰＨＦ−タウをクマシー染色した後に評価することができる。対照タウ及びＰＨＦ−タウの両方がＰＨＦ−タウエピトープに対する選択性を有しないタウ抗体（例えば、抗体ＨＴ７（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））によって等しく検出される抗原負荷条件下で試験した場合、ウエスタンブロットによって測定したとき、ＰＨＦ−タウに結合する抗体は、対照タウ（配列番号３１）には結合しない場合がある（Ｍｅｒｃｋｅｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ５８：５４８−５３，１９９２）。このような例示的な抗原ローディング条件は、５００ｎｇのＰＨＦ−タウ及び２００ｎｇの対照タウである。
【００３２】
本明細書では、従来周知のアミノ酸の１文字表記及び３文字表記を用いる。
【００３３】
物質の組成
本発明は、抗ＰＨＦ−タウ抗体及びこのような抗体の使用に関する。このような抗ＰＨＦ−タウ抗体は、ＰＨＦ−タウにてリン酸化エピトープを結合させる特性、又はＰＨＦ−タウにて非リン酸化エピトープを結合させる特性を有することができる。抗ＰＨＦ−タウ抗体は治療薬として有用であり得、また、生体サンプル、例えば組織又は細胞中のＰＨＦ−タウを検出するための研究又は診断試薬としても有用であり得る。
【００３４】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、表１に示す配列を有する。ＰＴ８２は、マウスモノクローナル抗体であり、ＰＴ１Ｂ７７８、ＰＴ１Ｂ７７９、ＰＴ１Ｂ７８０、ＰＴ１Ｂ７８１、及びＰＴ１Ｂ７８２は、ＰＴ８２のヒト化バージョンである。可変領域配列におけるＣＤＲには下線を付している。ヒト化モノクローナル抗体のＣＤＲにおける太字のアミノ酸は、ＰＴ８２  ＣＤＲ配列と比較したときの置換を示す。
【００３５】
【表１−１】
2021515556.tif 000003
【００３６】
【表１−２】
2021515556.tif 000004
【００３７】
一実施形態では、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１又は７のＨＣＤＲ１；配列番号２、８、１０、１２、１３、又は１４のＨＣＤＲ２；及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖を有する。別の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、配列番号４、９又は１１のＬＣＤＲ１；配列番号５のＬＣＤＲ２；及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖を有する。
【００３８】
好ましい実施形態では、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１のＨＣＤＲ１；配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３、並びに配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２；及び配列番号６のＬＣＤＲ３；
配列番号７のＨＣＤＲ１；配列番号８のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３、並びに配列番号９のＬＣＤＲ１；配列番号５のＬＣＤＲ２；及び配列番号６のＬＣＤＲ３；
配列番号７のＨＣＤＲ１；配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３、並びに配列番号１１のＬＣＤＲ１；配列番号５のＬＣＤＲ２；及び配列番号６のＬＣＤＲ３；
配列番号７のＨＣＤＲ１；配列番号１２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３、並びに配列番号１１のＬＣＤＲ１；配列番号５のＬＣＤＲ２；及び配列番号６のＬＣＤＲ３；
配列番号７のＨＣＤＲ１；配列番号１３のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３、並びに配列番号１１のＬＣＤＲ１；配列番号５のＬＣＤＲ２；及び配列番号６のＬＣＤＲ３；又は
配列番号７のＨＣＤＲ１；配列番号１４のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３、並びに配列番号１１のＬＣＤＲ１；配列番号５のＬＣＤＲ２；及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む。
【００３９】
他の実施形態では、ＰＨＦ−タウに結合する本発明のモノクローナル抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、及び１４のいずれかのＣＤＲと少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、又は少なくとも９９％同一である１つ以上のＣＤＲを含む。
【００４０】
別の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、及び２４のいずれかを含む重鎖可変領域と、配列番号１６、１８、２０、２２及び２５のいずれかを含む軽鎖可変領域とを含む。
【００４１】
別の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１５を含む重鎖可変領域及び配列番号１６を含む軽鎖可変領域；
配列番号１７を含む重鎖可変領域及び配列番号１８を含む軽鎖可変領域；
配列番号１９を含む重鎖可変領域及び配列番号２０を含む軽鎖可変領域；
配列番号２１を含む重鎖可変領域及び配列番号２２を含む軽鎖可変領域；
配列番号２３を含む重鎖可変領域及び配列番号２０を含む軽鎖可変領域；又は
配列番号２４を含む重鎖可変領域及び配列番号２５を含む軽鎖可変領域を含む。
【００４２】
別の実施形態では、ＰＨＦ−タウに結合する本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、及び２４のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号１６、１８、２０、２２及び２５のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、ＣＤＲ領域は、アミノ酸変化が可変領域の非ＣＤＲ領域に存在するように、表１に記載のとおりである。
【００４３】
別の実施形態では、本発明の単離抗体又はその抗原結合断片は、ヒトタウタンパク質の１１９〜１２６を含むエピトープに結合し、アミノ酸の付番は、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を参照する。
【００４４】
実施例で説明する実施形態は、一方が重鎖に由来し、一方が軽鎖に由来する可変領域の対を含むが、当業者であれば、別の実施形態が、単一の重鎖又は軽鎖の可変領域を含んでいてもよいことを理解するであろう。１つの可変領域を用いて、例えばＰＨＦ−タウに結合することが可能な２ドメイン特異的抗原結合断片を形成することが可能な可変ドメインについてスクリーニングすることができる。スクリーニングは、例えば、国際公開第９２／０１０４７号に開示されている階層的デュアルコンビナトリアルアプローチを用いたファージディスプレイスクリーニング法によって実現することができる。このアプローチでは、Ｈ鎖又はＬ鎖のいずれかのクローンを含む個別のコロニーを用いて他方の鎖（Ｌ又はＨ）をコードしているクローンの完全なライブラリを感染させ、得られた二本鎖特異的抗原結合ドメインを記載されるようなファージディスプレイ法に従って選択する。
【００４５】
本発明の別の実施形態は、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、及び２４のいずれかの重鎖可変領域（ＶＨ）並びに／又は配列番号１６、１８、２０、２２及び２５のいずれかのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗原結合部位を含む、ＰＨＦ−タウに結合する単離抗体である。一実施形態では、本発明の単離抗体又はその抗原結合断片は、ＩＧＨＶ６−３＊０１のＩＭＧＴ生殖系列識別子（Ｂａｒｂｉｅ  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ，１９９８、Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ，１５：１７１−１８３）を有するＶＨと、ＩＧＫＶ６−１３＊０１のＩＭＧＴ生殖系列識別子を有するＶＬとを含む。
【００４６】
前述の実施形態のいずれかでは、ＰＨＦ−タウに結合する単離抗体は、ヒト化され得る。
【００４７】
本発明の抗体は、様々な技術により、例えばハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ．２５６：４９５−７，１９７５）により生成することができる。アクセプター抗体（典型的にはヒトなどの別の哺乳類種）に由来する軽鎖及び重鎖定常領域と会合しているドナー抗体（典型的にはマウス）に由来する軽鎖及び重鎖可変領域を含有するキメラｍＡｂは、米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている方法により調製することができる。非ヒトドナー免疫グロブリン（典型的にはマウス）に由来するＣＤＲと１つ以上のヒト免疫グロブリンに由来する分子の残りの免疫グロブリン由来部分とを有するＣＤＲグラフトｍＡｂは、米国特許第５，２２５，５３９号に開示されているような当業者に公知の技術によって調製することができる。
【００４８】
非ヒト配列を全く有しない完全ヒトｍＡｂは、（Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−９，１９９４、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：８４５−５１，１９９６、Ｍｅｎｄｅｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １５：１４６−５６，１９９７）において言及されている技術によって、ヒト免疫グロブリントランスジェニックマウスから調製することができる。また、ヒトｍＡｂは、ファージディスプレイライブラリから調製及び最適化することもできる（Ｋｎａｐｐｉｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６：５７−８６，２０００、Ｋｒｅｂｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５４：６７−８４，２００１、Ｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７：３８５−９６，２０１０）。
【００４９】
抗体のヒト化は、特異性決定残基リサーフェシング（ＳＤＲＲ）（米国特許出願公開第２０１０／０２６１６２０号）、リサーフェシング（Ｐａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−９８，１９９１）、超ヒト化（国際公開第０４／００６９５５号）、及びヒトストリング含有量の最適化（米国特許第７，６５７，３８０号）などの周知の方法を使用して達成することができる。グラフト化／ヒト化に有用なヒトフレームワーク配列は、当業者であれば関連するデータベースから選択することができる。選択されたフレームワークは、Ｑｕｅｅｎら（Ｑｕｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８６：１００２９−３３，１９８９）又は米国特許出願公開第２０１１／００９２３７２号に開示されているものなどの技術によって、結合親和性を保持又は増強するために更に修飾されてもよい。
【００５０】
免疫用抗原又は単離抗体として用いるためのＰＨＦ−タウのファージディスプレイライブラリからの調製は、任意の好適な技術を用いて行うことができる。例示的な方法では、ＰＨＦ−タウは、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ及びＤａｖｉｅｓ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｅｓ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８７：５８２７−３１，１９９０）に記載されているような周知のプロトコールを用いて、ＡＤを有する患者の脳から単離される。ＰＨＦ−タウは、アルツハイマー患者の死後皮質から単離してもよい。単離ＰＨＦ−タウは、その純度及びＰＨＦ−タウと反応することが知られている抗体による過剰リン酸化状態を特徴とする。典型的なＰＨＦ−タウの調製では、ウエスタンブロットにおいて約６０、６４、６８、及び７２ｋＤａで移動する高リン酸化バンド（Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ  ａｎｄ  Ｇｏｅｄｅｒｔ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２１：４２８−３３，１９９８）は、高リン酸化ＰＨＦ−タウに特異的に結合するが、脱リン酸化ＰＨＦ−タウには結合しないＡＴ８抗体によって検出される。
【００５１】
本発明の抗体は、配列番号３１の対照タウには結合しないという特徴を有し得る。このような抗体は、上記方法、及びウエスタンブロットにおいて対照タウに結合しないことについて抗体を試験し、次いで、上記のとおりクマシー染色することを用いて生成することができる。対照タウは、組換え的に発現させ、標準的な方法を用いて精製することができる。
【００５２】
本発明の抗体又はその抗原結合断片は、例えば、対照及びＡＤの脳切片に対する免疫組織化学的検査を用いて、その特異性について更に評価してもよい。
【００５３】
本発明の抗体は、ＰＨＦ−タウに対する親和性を有し得、解離定数（ＫＤ）は、約１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、又は１０−１２Ｍ以下である。ＰＨＦ−タウに対する所与の分子の親和性は、任意の好適な方法を用いて実験的に判定することができる。このような方法は、当業者に公知のＢｉａｃｏｒｅ、ＰｒｏｔｅＯｎ若しくはＫｉｎＥｘＡ装置、ＥＬＩＳＡ、又は競合的結合アッセイを利用し得る。
【００５４】
本発明の別の態様は、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、及び２４のいずれかの重鎖可変領域と、配列番号１６、１８、２０、２２及び２５のいずれかのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを有する抗原結合部位を含む、ＰＨＦ−タウ結合についてモノクローナル抗体と競合する単離抗体又はその抗原結合断片である。
【００５５】
本発明の別の態様は、配列番号１５の重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；配列番号１７の重鎖可変領域及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；配列番号１９の重鎖可変領域及び配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；配列番号２１の重鎖可変領域及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；配列番号２３の重鎖可変領域及び配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は配列番号２４の重鎖可変領域及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗原結合部位を含む、ＰＨＦ−タウ結合についてモノクローナル抗体と競合する単離抗体又はその抗原結合断片である。
【００５６】
ＰＨＦ−タウに対する結合間の競合は、周知の方法を用いてインビトロでアッセイすることができる。例えば、未標識抗体の存在下におけるＭＳＤ  Ｓｕｌｆｏ−タグ（商標）ＮＨＳ−エステル標識抗体のＰＨＦ−タウに対する結合は、イムノアッセイ、続いて、電気化学発光検出を用いて評価することができる。
【００５７】
競合的結合に加えて、いくつかの周知の方法を用いて、本発明の抗体の結合エピトープを決定することができる。例えば、両方の個々の構成要素の構造が知られている場合、インシリコでタンパク質−タンパク質ドッキングを行って、適合する相互作用部位を特定することができる。抗原抗体複合体を用いて水素−重水素（Ｈ／Ｄ）交換を行って、抗体が結合し得る抗原の領域をマッピングすることができる。抗原のセグメント及び点変異誘導を用いることにより、抗体の結合に重要なアミノ酸の位置を特定することができる。抗体−抗原複合体の共結晶構造を使用して、エピトープ及びパラトープに寄与する残基を特定することができる。
【００５８】
本発明の抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、又はＩｇＭアイソタイプのモノクローナル抗体であってよい。本発明の抗体は、二重特異的又は多重特異的であってよい。例示的な二重特異性抗体は、ＰＨＦ−タウ上の２つの異なるエピトープに結合することができるか、又はＰＨＦ−タウ及びアミロイドベータ（Ａβに結合することができる。別の例示的な二重特異性抗体は、ＰＨＦ−タウ及び内因性血液脳関門トランスサイトーシス受容体、例えば、インスリン受容体、トランスフェリング受容体（transferring receptor）、インスリン様増殖因子−１受容体、及びリポタンパク質受容体に結合することができる。例示的な抗体は、ＩｇＧ１タイプである。
【００５９】
本発明の抗体の免疫エフェクターの特性は、当業者には既知の技術により、Ｆｃ修飾によって強化又はサイレンシングすることが可能である。例えば、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貧食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ））の下方制御などのＦｃエフェクター機能は、これらの活性を担うＦｃの残基を修飾することによって提供及び／又は制御され得る。例えば、Ｆｃ領域は、エフェクター機能を排除する置換を有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含有し得る。したがって、単離抗体は、以下の置換のうちの１つ以上を含有する修飾されたヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域を有するＦｃ領域を更に含む：残基２３３におけるグルタミン酸のプロリンでの置換、残基２３４におけるフェニルアラニンのアラニン又はバリンでの置換、及びに残基２３５におけるロイシンのアラニン又はグルタミン酸での置換（ＥＵ付番、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２）。残基２９７（ＥＵ番号付け）においてＡｓｎの代わりにＡｌａを使用することによって、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域におけるＮ連結グリコシル化部位を除去することは、残留エフェクター活性が排除されることを確実にする別の方法である。また、抗体の半減期を延長するＦｃドメインの残基を変異させることによって、薬物動態特性を増強することができる（Ｓｔｒｏｈｌ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：６８５−９１，２００９）。
【００６０】
更に、本発明の抗体は、グリコシル化、異性化、脱グリコシル化、又はポリエチレングリコール部分の付加（ペグ化）及び脂質化などの自然界では生じない共有結合修飾などのプロセスによって、翻訳後修飾してもよい。このような修飾はインビボ又はインビトロで行われ得る。例えば、本発明の抗体はポリエチレングリコールとコンジュゲート（ＰＥＧ化）することによって薬物動態的なプロファイルを向上させることができる。コンジュゲーションは、当業者に既知の方法によって行うことができる。治療用抗体とＰＥＧとのコンジュゲーションは、薬効を増強するが、機能には干渉しないことが示されている（Ｋｎｉｇｈｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  １５：４０９−１８，２００４、Ｌｅｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６：１０６−１９，２００１、Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １６：７６１−７０，２００３）。
【００６１】
本発明の別の実施形態は、本発明の抗体をコードしている単離ポリヌクレオチド、又はその補体、又はその断片である。例示的な単離ポリヌクレオチドは、配列番号１又は７のＨＣＤＲ１；配列番号２、８、１０、１２、１３、又は１４のＨＣＤＲ２；及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、配列番号４、９、又は１１のＬＣＤＲ１；配列番号５のＬＣＤＲ２；及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖を有する。更なる例示的な単離ポリヌクレオチドは、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、及び２４のいずれかの重鎖可変領域と配列番号１６、１８、２０、２２、及び２５のいずれかのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである。
【００６２】
遺伝コードの縮重又は所与の発現系におけるコドンの選好性を考慮すると、本発明の抗体をコードする他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。本発明の単離核酸は、公知の組換え又は合成技術を用いて作製することができる。モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、当該技術分野において公知の方法を用いて容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマが生成される場合、そのような細胞はそれらのＤＮＡの供給源として機能することができる。あるいは、例えばファージ又はリボソームディスプレイライブラリなどのコード配列と翻訳産物とが連結しているディスプレイ技術を用いると、結合剤及び核酸の選択が簡略化される。ファージの選択後、ファージからの抗体コード領域が単離され、ヒト抗体、又は任意の他の所望の抗原結合断片を含む抗体全体の生成に使用され、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌を含む任意の所望の宿主内で発現され得る。
【００６３】
本発明の別の実施形態は、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。このようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾンに基づくベクター、又は任意の手段によって所与の生物若しくは遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するのに好適な任意の他のベクターであってよい。
【００６４】
本発明の別の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含む宿主細胞である。このような宿主細胞は、真核細胞、細菌細胞、植物細胞、又は古細菌細胞であってよい。例示的な真核細胞は、哺乳動物、昆虫、鳥類、又は他の動物由来のものであってもよい。哺乳類真核細胞としては、不死化細胞株（例えばハイブリドーマ）又は骨髄腫細胞株（例えばＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ、ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８０）マウス細胞株）が挙げられる。例示的なヒト骨髄腫細胞株は、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ  ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６１、Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）のようなチャイニーズハムスターに由来する卵巣（ＣＨＯ）細胞又はＤＧ４４が挙げられる。
【００６５】
本発明の別の実施形態は、本発明の宿主細胞を培養し、当該宿主細胞によって産生された抗体を回収することを含む、ＰＨＦ−タウと結合する抗体を作製する方法である。抗体を作製し、それを精製する方法は、当該技術分野において周知である。
【００６６】
治療方法
Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、ｓｃＦｖ断片を含む本発明の抗ＰＨＦ−タウ抗体又はその抗原結合断片、又は本発明の抗体の抗原結合部位を含む抗体を用いて、脳内にタウの病理学的凝集を伴う神経変性疾患を有する患者における症状を治療、低減、又は予防することができる。
【００６７】
本発明の方法によって治療される疾患（タウ異常症）としては、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病及び散発性アルツハイマー病を含む）、染色体１７に関連したパーキンソン症候群による前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性皮質下神経膠症、神経原線維型認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン認知症複合、ダウン症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーフォルデン−シュパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、多系統萎縮症、Ｃ型ニーマン・ピック病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管障害、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソン症候群、慢性外傷性脳症、及び拳闘家認知症（ボクサー病）からなる群から選択される１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
好ましくは、疾患（タウ異常症）は、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病及び散発性アルツハイマー病を含む）、ＦＴＤＰ−１７、又は進行性核上麻痺である。
【００６９】
最も好ましくは、疾患（タウ異常症）は、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病及び散発性アルツハイマー病を含む）である。
【００７０】
任意の特定の理論に束縛されるものではないが、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、病理学的タウ凝集を低減し（例えば、凝集を予防及び／又は既に生じている凝集を減少させ）、ひいては、脳内のＰＨＦ−タウの量を低減することによって、その有益な効果を発揮することができる。本発明の抗体又はその抗原結合断片を用いて、任意の分類に属する動物患者を治療することができる。このような動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。例えば、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ＡＤを治療するための医薬の調製において有用であり、当該医薬は、本明細書において規定される投薬量で投与するために調製される。
【００７１】
本発明の別の実施形態は、タウの凝集を低減するのに十分な時間、治療的に有効な量の本発明の単離抗体又はその抗原結合断片を患者に投与することを含む、タウの凝集の低減を必要としている患者における、タウの凝集を低減する方法である。
【００７２】
本発明の別の実施形態は、タウの凝集を伴う神経変性疾患の症状を治療又は低減するのに十分な時間、治療的に有効な量の本発明の単離抗体又はその抗原結合断片を患者に投与することを含む、患者における当該神経変性疾患の症状を治療又は低減する方法である。
【００７３】
上記実施形態のいずれかでは、タウの凝集体を伴う神経変性疾患は、タウ異常症である。
【００７４】
本明細書で使用するとき、「タウ異常症」は、脳内のタウの病理学的凝集を伴う任意の神経変性疾患を包含する。家族性及び散発性ＡＤに加えて、他の例示的なタウ異常症は、染色体１７に関連したパーキンソン症候群による前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性皮質下神経膠症、神経原線維型認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン認知症複合、ダウン症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーフォルデン−シュパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、多系統萎縮症、Ｃ型ニーマン・ピック病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管障害、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソン症候群、慢性外傷性脳症、及び拳闘家認知症（ボクサー病）である。（Ｍｏｒｒｉｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ  ７０：４１０−２６，２０１１）。
【００７５】
タウ異常症に関連する行動的表現型としては、認知障害、初期人格変化及び脱抑制、感情鈍麻、無為症、無言症、失行症、反復症、常同運動／挙動、口愛過度、混乱、連続タスクを予定又は計画する能力の欠如、利己的行動／無神経、反社会的特徴、共感の欠如、言葉のつかえ、錯誤的誤りは頻繁にあるが比較的理解力は保たれている失文症的な話し方、理解障害及び換語欠陥、緩徐進行性歩行不安定性、後方突進、すくみ、頻繁な転倒、非レボドパ反応性軸剛性、核上性注視麻痺、方形波痙攣、緩徐な垂直断続性運動、仮性球麻痺、四肢失行症、筋緊張異常、皮質性感覚消失、及び振戦が挙げられる。
【００７６】
治療の影響を受けやすい患者としては、現在症状を示している患者に加えて、ＡＤ又は他のタウ異常症のリスクを有する無症候性個体が挙げられる。治療の影響を受けやすい患者としては、ＡＤの家族歴又はゲノムにおける遺伝的リスク因子の存在など、ＡＤの公知の遺伝的リスクを有する個体が挙げられる。例示的なリスク因子は、特に、位置７１７、並びに位置６７０及び６７１におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の変異（それぞれ、Ｈａｒｄｙ及びＳｗｅｄｉｓｈ変異）である。他のリスク因子は、プレセニリン遺伝子、ＰＳ１及びＰＳ２、並びにＡｐｏＥ４における突然変異、高コレステロール血症又は粥状硬化症の家族歴である。現在ＡＤに罹患している個体は、上記リスク因子の存在によって特徴的な認知症から認識することができる。更に、ＡＤを有する個体を同定するために利用可能な多数の診断試験が存在する。これらとしては、脳脊髄液のタウ及びＡβ４２レベルの測定が挙げられる。タウレベルの上昇及びＡβ４２レベルの低下が、ＡＤの存在を表す。また、ＡＤに罹患している個体は、アルツハイマー病及び関連障害協会の基準によって診断することもできる。
【００７７】
投与／医薬組成物
本発明の抗ＰＨＦ−タウ抗体又はその抗原結合断片は、ＡＤ又は他のタウ異常症など、タウの病理学的凝集を伴う神経変性疾患を治療又は予防するための治療剤及び予防剤の両方として好適である。無症候性患者では、治療は何歳から開始してもよい（例えば、約１０、１５、２０、２５、３０歳）。しかし、通常、患者が約４０、５０、６０、又は７０歳に達するまで治療を始める必要はない。治療は、典型的には、ある期間にわたる複数回投与を伴う。治療は、経時的に治療剤に対する抗体、又は活性化Ｔ細胞若しくはＢ細胞の応答を評価することによってモニタリングしてもよい。反応が低下した場合、追加投与が指示される。
【００７８】
予防用途では、医薬組成物又は薬剤は、疾患の生化学的、組織学的、及び／又は挙動的症状、その合併症、並びに疾患の発現中に現れる中間病理学的表現型を含む、疾患のリスクをなくす若しくは低減する、重症度を低下させる、又は発症を遅らせるのに十分な量で、ＡＤ又は他のタウ異常症に罹患しやすいか又はそうでなければリスクを有する患者に投与される。治療用途では、組成物又は薬剤は、疾患の症状（生化学的、組織学的、及び／又は挙動的）のいずれかを低減、阻止、又は遅延させるのに十分な量で、かかる疾患が疑われるか又は既に罹患している患者に投与される。治療薬の投与により、障害の特徴的な病状を未だ発現していない患者における軽度認知障害を低減又はなくすことができる。治療又は予防的処置を達成するのに適切な量は、治療的に又は予防的に有効な用量として定義される。予防的及び治療的レジメンの両方において、組成物又は薬剤は、通常、十分な免疫反応が得られるまで何回か投与される。
【００７９】
本発明の抗ＰＨＦ−タウ抗体又はその断片は、関連する神経変性疾患の治療に有効な他の剤と併用投与してもよい。
【００８０】
本発明の方法では、タウ異常症の治療又は症状の改善における抗体の「治療的に有効な量」は、標準的な研究技術によって決定することができる。例えば、抗体の用量は、当該技術分野において周知の関連する動物モデルに薬剤を投与することによって決定することができる。
【００８１】
更に、最適な用量範囲を特定するのに役立てるために、場合によりインビトロアッセイを用いてもよい。特定の有効量の選択は、当業者であればいくつかの因子の考慮に基づいて（例えば臨床試験によって）決定することができる。このような要因としては、治療又は予防しようとする疾患、疾患症状、患者の体重、患者の免疫状態、及び当業者に公知のその他の要因が挙げられる。また、製剤に用いられる正確な用量は、投与経路及び疾患の重篤度に応じて決まり、医師の判断及び各患者の状況に従って決定されなければならない。有効量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導かれる用量応答曲線から推定することができる。
【００８２】
本発明の抗体を治療的に使用するための投与様式は、薬剤を宿主に送達する任意の好適な経路であってもよい。これら抗体の医薬組成物は、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、又は頭蓋内等非経口投与に有用であるか、あるいは脳又は脊髄の脳脊髄液に投与してもよい。
【００８３】
本発明の抗体又はその抗原結合断片は、医薬的に許容される担体における活性成分として有効な量の抗体又は断片を含有する医薬組成物として調製することができる。「担体」という用語は、抗体と一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又は溶媒を指す。このような医薬用溶媒は、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの、石油、動物、植物又は合成物由来の水及び油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いることができる。これらの溶液は滅菌され、一般には粒子状物質を含まない。これらは、従来の周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされる医薬的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、滑沢及び着色剤等を含有していてよい。このような医薬製剤中の本発明の抗体の濃度は、幅広く、すなわち、約０．５重量％未満、通常は約１重量％又は少なくとも約１重量％から最大で１５又は２０重量％まで変化し得、そして、選択される具体的な投与様式に従って、主に、必要とされる用量、流体の体積、粘度等に基づいて選択される。
【００８４】
治療は、単回投与スケジュール、又は複数回投与スケジュールで行ってもよく、複数回投与計画では、一次治療過程が１〜１０回の別個の投与と、続いて、応答を維持しかつ／又は強化するのに必要な後続の時間間隔で他の投与とを行い、例えば第２の投与を、１〜４ヶ月で行い、また必要であれば、次の投与を数ヶ月後に行う。好適な治療スケジュールの例としては、（ｉ）０、１ヶ月及び６ヶ月、（ｉｉ）０、７日及び１ヶ月、（ｉｉｉ）０及び１ヶ月、（ｉｖ）０及び６ヶ月、又は疾病の症候を軽減し、若しくは疾病の重症度を低下させることが期待される、所望の応答を誘発するのに十分な他のスケジュールが挙げられる。
【００８５】
このように、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの無菌緩衝水、及び約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、又は約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明の抗体を含有するように調製してよい。同様に、静脈内注射用の本発明の医薬組成物は、約２５０ｍＬの滅菌リンガー液、及び約１ｍｇ〜約３０ｍｇ又は約５ｍｇ〜約約２５ｍｇの本発明の抗体を含有するように構成してよい。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法が周知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに、より詳細に記載されている。
【００８６】
本発明の抗体及びその断片は、保存のために凍結乾燥させ、使用前に好適な担体で再構成することができる。この技術は、抗体及び他のタンパク質調製物に効果的であることが示されており、当該技術分野において公知の凍結乾燥及び溶解技術を用いることができる。
【００８７】
診断方法及びキット
本発明の抗体は、対象におけるＡＤ又は他のタウ異常症を診断する方法において使用することができる。この方法は、本発明の抗体又はその断片などの診断試薬を用いてＰＨＦ−タウの存在を対象において検出することを含む。
【００８８】
対象由来の生体サンプルを診断抗体試薬と接触させ、対象由来のサンプルにおける当該診断抗体試薬のＰＨＦ−タウに対する結合を検出することによって、当該生体サンプル（例えば、血液、尿、脳脊髄液）中のＰＨＦ−タウを検出することができる。検出を実施するためのアッセイとしては、周知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的方法、ウエスタンブロット、又はインビトロイメージングが挙げられる。
【００８９】
診断抗体又は類似の試薬は、患者の体内に静脈内注射により投与することができるか、あるいは、上に例示したとおり薬剤を宿主に送達する任意の好適な経路によって脳内に直接投与することができる。抗体の用量は、治療方法と同じ範囲内であるべきである。典型的に、抗体は標識されるが、同じ方法において、ＰＨＦ−タウに対して親和性を有する一次抗体は未標識であり、二次標識剤は、一次抗体に結合させるために用いられる。標識の選択は、検出手段に依存する。例えば、蛍光標識は、光学検出に好適である。常磁性標識の使用は、外科的介入のないトモグラフィー検出に好適である。また、放射標識は、ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴを用いて検出され得る。
【００９０】
診断は、対象由来のサンプル又は対象における、標識ＰＨＦ−タウ、タウ凝集体、及び／又は神経原線維変化の数、大きさ、及び／又は強度を、対応するベースライン値と比較することによって行われる。ベースライン値は、非罹患個体の集団における平均レベルを表し得る。また、ベースライン値は、同じ対象において決定された以前の値を表す。
【００９１】
また、上記診断方法は、治療前、治療中、又は治療後の対象におけるＰＨＦ−タウの存在を検出することによって、治療に対する対象の応答をモニタリングするために用いることもできる。ベースラインに対する値の減少は、治療に対する陽性応答を示す。また、値は、病理学的タウが脳からクリアランスされたとき、生物学的流体において一時的に増加する場合がある。
【００９２】
本発明は、更に、上記診断及びモニタリング方法を実施するためのキットに関する。典型的には、このようなキットには、本発明の抗体などの診断試薬と、任意選択的に検出可能な標識とが入っている。診断抗体自体は、直接検出可能であるか又は二次反応（例えば、ストレプトアビジンとの反応）を介して検出可能である、検出可能な標識（例えば、蛍光標識、ビオチン等）を含有してもよい。あるいは、検出可能な標識を含有する第２の試薬を利用してもよく、この場合、当該第２の試薬は、一次抗体に対する結合特異性を有する。生体サンプルにおけるＰＨＦ−タウを測定するのに好適な診断キットでは、キットの抗体は、マイクロタイターディッシュのウェルなどの固相に予め結合した状態で供給され得る。
【００９３】
本出願全体で引用した全ての引用参考文献（論文参考文献、交付済み特許、公開された特許出願、及び同時係属の特許出願を含む）の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【実施例１】
【００９４】
対らせん状細線維−タウ（ＰＨＦ−タウ）の精製
Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ及びＤａｖｉｅｓ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｅｓ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８７：５８２７−３１，１９９０）の変法によって、ＰＨＦ−タウを部分的に精製した。簡潔に述べると、組織学的に確認されたアルツハイマー患者から得られた皮質の死後組織を部分的に精製した。典型的に、１０００ｒｐｍでガラス／テフロンポッター組織ホモジナイザー（ＩＫＡ  Ｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ；Ｓｔａｕｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、前頭皮質５ｍｇを１０体積の冷バッファＢｕｆｆｅｒ  Ｈ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、８００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、及び１０％スクロース／ｐＨ７．４）中でホモジナイズした。ホモジナイズされた材料を、ＳｏｒｖａｌｌローターＳＳ３４において２７０００ｇで２０分間遠心分離した。ペレットを廃棄し、上清を１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシン及び１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノールの最終濃度に調整し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、上清を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ６０Ｔｉローターにおいて２０℃で３５分間１０８０００ｇで遠心分離した。ペレットを慎重にＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに懸濁させた。上記のとおり上清を２回目の遠心分離にかけ、最後のペレットを溶解させ、分注し、−８０℃で冷凍した。ＰＨＦ−タウ調製物の量を、１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、抗タウ抗体ＡＴ８及びＨＴ７（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いたウエスタンブロットとで評価した。優れた品質のＰＨＦ−タウ調製物は、ＡＴ８などの過剰リン酸化ＰＨＦ−タウと反応する抗体で検出された、ウエスタンブロット上の約６０、６４、６６、及び７２ｋＤａの分子量を有する４本のバンドからなる。同等の量及び純度を有する２つの別々のＰＨＦ−タウ調製物を同じ脳サンプルから作製した。調製物１を免疫に用いた。
【実施例２】
【００９５】
ＰＨＦ−タウに対するモノクローナル抗体の作製
正常Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて標準的なハイブリドーマ技術を用いて抗ＰＨＦ−タウ抗体を作製した（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−７，１９７５）。得られたハイブリドーマを９６ウェルプレートに播種し、１０日後に、下記のとおり２５ｎｇ／ウェルでコーティングされたＰＨＦ−タウにおいて直接ＥＬＩＳＡでスクリーニングした。陽性細胞を、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＢＬ２１細胞で発現させた対照タウ（配列番号３１）でコーティングされたウェルあたり１０ｎｇで交差反応性について試験し、熱処理及び硫酸アンモニウム沈殿によって精製した。ＰＴ８２は、ＰＨＦタウ及び対照タウ（配列番号３１）の両方に結合することが見出された。
【００９６】
陽性細胞を直ちにサブクローニングし、陽性クローンを液体窒素中で凍結させた。１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｅｕｒｏｐｅ）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（２％）（Ｒｏｃｈｅ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、２％ＨＴ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ−グルタミン及びペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、並びにストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地において、全てのハイブリドーマを増殖させた。
【００９７】
抗体可変領域を、選択したハイブリドーマ細胞からマウスＩｇＧ１／ＩｇＧ２／κバックグラウンドにクローニングし、発現させ、常法を用いて精製した。簡潔に述べると、ＰＴ／８２ハイブリドーマ細胞をＲＬＴバッファ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７９２１６）で溶解させ、−７０℃で凍結した。溶解物を３７℃で解凍し、ＲＮｅａｓｙ９６キット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７４１８２）を使用してＲＮＡを単離した。
【００９８】
ＲＮＡのアリコートを使用して、マウスＩｇＧ重鎖、マウスカッパ軽鎖、及びマウスラムダ軽鎖の定常領域にアニーリングするように設計されたプライマーを使用して、遺伝子特異的リバースプライマーミックスを使用してｃＤＮＡを合成した。
【００９９】
ＩｇＧ重鎖可変領域、カッパ軽鎖可変領域、又はラムダ軽鎖可変領域のいずれかを増幅するように設計されたマウスプライマーセットを用いたＰＣＲ反応において、ｃＤＮＡのアリコートを使用した。フォワードプライマーは、フレームワーク１にアニーリングするように設計された複数のプライマーからなっており、リバースプライマーは、定常領域にアニーリングするように設計されていた。ＰＣＲ産物のアリコートを２％アガロースゲルで泳動したところ、重及びカッパＰＣＲ産物は、正確なサイズの可視バンドを示した。
【０１００】
それぞれの定常領域にアニーリングするように設計された重鎖又はカッパ軽鎖リバースプライマーを使用して、重鎖及びカッパ軽鎖のＰＣＲ産物の配列を決定した（サンガー法）。配列を分析し、アラインメントして、最も一致するマウス生殖系列を同定した。重鎖及びカッパ鎖フレームワーク１配列の最初の１０個のアミノ酸を、一致する生殖系列配列を用いて置換した。ＩｇＧ重鎖及びカッパ可変領域のアミノ酸配列を、コドン最適化及び合成した。コドン最適化されたＩｇＧ重鎖及びカッパ軽鎖可変領域を合成し、断片をマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ重鎖及びカッパ軽鎖アイソタイプ発現ベクターにクローニングした。
【０１０１】
抗体の可変領域を、選択されたハイブリドーマ細胞からクローニングし、標準的な方法を用いて配列を決定し、ｍＡｂ及びＦａｂ用の発現ベクターにサブクローニングした。ＭａｂをマウスＩｇＧ２ａ／κバックグラウンドで生成し、発現させ、親和性クロマトグラフィー（プロテインＡ）によって精製した。ヒトＩｇＧ１／κ定常ドメインに融合したマウス可変ドメイン及び重鎖のＣ末端におけるＨｉｓタグを有するキメラバージョンとして、Ｆａｂを生成した。ＦａｂをＨＥＫ２９３Ｆ細胞で一過的に発現させ、親和性クロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ）によって精製した。
【実施例３】
【０１０２】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による結合評価
ＰＨＦ及び可溶性（２Ｎ４Ｒ）タウとＰＴ８２及びそのＦａｂ断片について、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）又はＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）機器においてＳＰＲによってＰＨＦ−タウ及び組み換えタウとの相互作用を評価した。表２は、ＰＴ８２及びそのＦａｂとＰＨＦ−タウ及び可溶性タウとの親和性評価の代表的な結果を示す。
【０１０３】
【表２】
2021515556.tif 000005
【０１０４】
ＰＴ８２及びそのＦａｂの両方がＰＨＦ−タウに結合した。一方、ＰＴ８２のＦａｂ断片は、可溶性タウにも結合した（図１も参照）。この研究の結果は、ＰＴ８２がＰＨＦ−タウ及び可溶性タウに結合することを実証した。
【実施例４】
【０１０５】
抗体選択のための直接ＥＬＩＳＡ
２５ｎｇ／ウェルのＰＨＦ−タウを、ＮＵＮＣ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）平底高結合９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて４℃で一晩、５０μＬ／ウェルのコーティングバッファ（１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＮａＣｌ、及び１０ｍＭのＮａＮ３、ｐＨ８．５）でコーティングした。次の日、室温で６０分間７５μＬ／ウェルのＰＢＳ中０．１％カゼインでプレートをブロッキングした。次に、５０μＬのハイブリドーマ上清を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、結合しているモノクローナル抗体を、３７℃で１時間、５０μＬ／ウェルのセイヨウワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしているヒツジ抗マウスＩｇＧで検出した（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）。両試薬を０．１％カゼイン／ＰＢＳで希釈した。プレートを洗浄し、０．４２ｍＭの３，５，３’，５’−テトラメチル−ベンジジン、１００ｍＭのクエン酸中０．００３％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２、及び１００ｍＭのリン酸水素二ナトリウム（ｐＨ４．３）溶液５０μＬを基質として添加した。室温でプレートシェーカー上において最長１５分間反応を進行させることができ、その後、５０μＬ／ウェルの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で発色を停止させ、マイクロタイタープレートリーダーで４５０ｎｍにてプレートを読み取った（Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）。
【実施例５】
【０１０６】
完全長タウタンパク質（１ｎｇ／ｍＬ又は１０ｎｇ／ｍＬ）をプレートに直接コーティングし、異なる濃度の組換え的に又はハイブリドーマで生成されたＰＴ８２抗体と共にインキュベートしたＥＬＩＳＡによって、組換え野生型（２Ｎ４Ｒ、配列番号３１）タウへの結合を分析した（図２）。抗体と共にインキュベーションした後、プレートを再度洗浄し、５０μＬ／ウェルのＨＲＰＯで標識された抗マウス抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（ブロッキングバッファで１：１００００希釈）を添加した。別の洗浄ステップの後、メーカーの取扱説明書に従い、「ワンステップ」ＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、検出を実施した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）２１０２  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）でプレートを分析した。結合曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７．０ソフトウェアを使用して生成した。予想どおり、より低いコーティング濃度のタウからは、より低い最大値が得られた（例えば、赤色の曲線を、組換え抗体のそれぞれ１ｎｇ／ｍＬ又は１０ｎｇ／ｍＬへの結合が示された緑色の曲線と比較）。組換え的に及びハイブリドーマで生成された抗体の結合プロファイル間には、実質的な差は観察されなかった。
【実施例６】
【０１０７】
脊髄同時培養アッセイ（ＦＲＥＴアッセイ）
コインキュベーションするためのタウ種を含有するホモジネートは、凝集したトランスジェニックヒトタウを含有する２２〜２３週齢のＰ３０１Ｓトランスジェニック動物の脊髄組織に由来していた（図３Ａ）。アッセイで使用したレシピエント細胞は、Ｋ１８／Ｐ３０１Ｌ−ＹＦＰ及びＫ１８／Ｐ３０１Ｌ−ＣＦＰを安定的に発現しているＨＥＫ細胞であった（Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１１１（４１）：Ｅ４３７６−８５，２０１４）。タウ種を含有するホモジネートを陰性対照又はＰＴ８２抗体とコインキュベートし、この混合物を添加して、７２時間、発色団−Ｋ１８含有ＨＥＫ細胞を受容させた。ＦＡＣＳによりＦＲＥＴ陽性細胞を計数することによって、Ｋ１８凝集体形成を測定した。
【０１０８】
ＰＴ８２は、わずか３ｎＭの濃度でタウ凝集体誘導をブロックした（図３Ｂ）。
【実施例７】
【０１０９】
免疫枯渇細胞アッセイ
最大阻害率（％）の値が、当該種におけるエピトープの密度、又はＰＴ８２エピトープを含有する種の数に関係しているかどうかを調べるために、免疫枯渇アッセイを実施した（図４Ａ）。免疫枯渇アッセイにおいて、タウ種を陰性対照又はＰＴ８２抗体と共にインキュベートし、プロテインＧビーズを用いて溶液から除去した。枯渇した上清を、発色団−Ｋ１８含有ＨＥＫ細胞内における残存播種能（residual seeding capacity）について試験し、上記のとおりＦＡＣＳによって分析した（Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１１１（４１）：Ｅ４３７６−８５，２０１４）、又は凝集選択的タウアッセイを使用して凝集タウのレベルについて試験した。
【０１１０】
免疫枯渇のためのタウ種を含有するホモジネートは、２２〜２３週齢のＰ３０１Ｓトランスジェニック動物の脊髄、又は冷凍保存したヒトＡＤ脳組織から生成した。ヒトＡＤ脳免疫枯渇アッセイにおいて、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００の存在下において、枯渇後に上清を試験し、許容されるアッセイウィンドウを得た。
【０１１１】
タウ播種能（ＦＲＥＴアッセイで測定、図４Ｂ）及びタウ凝集レベル（凝集タウ選択性ＭＳＤアッセイによって測定、図４Ｃ）を、脊髄抽出物中のＰＴ８２及びヒトＡＤ脳由来の全ホモジネートで枯渇させることができた。ＰＴ８２は、ヒトＡＤ脳及びＴｇＰ３０１Ｓ脊髄溶解物の両方に由来するタウ種を阻害した。タウ播種は、脊髄抽出物中のＰＴ８２でほぼ完全に枯渇させることができた。
【実施例８】
【０１１２】
ｅＰＨＦ注射モデルにおけるマウスＰＴ８２のインビボ有効性
合成Ｋ１８原線維（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４５（５１）：１５６９２−７０１，２００６）又はヒトＡＤ脳由来のＰＦＨ−タウ種などのタウの凝集促進断片を、細胞自律的凝集が始まっていない年齢でＰ３０１Ｌトランスジェニックマウスモデルの皮質又は海馬領域に注射する、トランスジェニックＰ３０１Ｌマウス注射モデルが確立されている。注射モデルは、タウ拡散の決定的な細胞外播種構成成分を再現することを目的としている。注射されるＫ１８又はＰＨＦ−タウ種は、注入部位にてタウ異常症を誘発し、また、接続した反対側の領域において、より軽度に、タウ異常症を誘発する（Ｐｅｅｒａｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ．７３：８３−９５，２０１５）。このモデルにより、ＡＤ脳由来のＰＨＦ−タウ種又はＫ１８原線維と同時注射したときに、本発明の抗タウ抗体などの抗体の、抗播種能の試験が可能となる（Ｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３３（３）：１０２４−３７，２０１３；Ｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１３０（３）：３４９−６２）。
【０１１３】
死後のＡＤ脳のサルコシル不溶性画分の皮質注射により、タウ凝集の緩徐に進行する増加が誘発される。注射された半球では、注射の１ヶ月後に最初のシグナルが測定され、注射の更に３ヶ月後まで進行する。注射の５ヶ月後に、いくつかの動物では、Ｐ３０１Ｌ変異により引き起こされる濃縮の形成が開始される（Ｔｅｒｗｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｉｄ．）。ＡＴ８の染色レベルは、１ヶ月と３ヶ月との間で増加する（ＰＴ３親を参照）ため、抗体の有効性実験を、同時注射の２ヶ月後に分析する。更に、死後のＡＤ脳のサルコシル不溶性画分の海馬注射により、注射された半球由来のサルコシル不溶性画分をＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ（ＭＳＤ）分析することによって測定される、用量依存的に進行するタウ凝集の増加が誘発される。
【０１１４】
動物治療及び頭蓋内注射
注射の検討のために、Ｐ３０１Ｌ変異を有する最長のヒトタウアイソフォーム（タウ−４Ｒ／２Ｎ−Ｐ３０１Ｌ）（Ｔｅｒｗｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｉｄ．）を発現するトランスジェニックタウ−Ｐ３０１Ｌマウスを、月齢３ヶ月にて手術に使用した。現地の倫理委員会が認可した手順を遵守して、全ての実験を実施した。定位脳手術については、モノクローナル抗体の存在下又は不存在下において、死後ＡＤ組織（富化した対らせん状細線維、ｅＰＨＦ）由来のサルコシル不溶性ｐｒｅｐ３μＬ（速度：０．２５μＬ／分）を、マウスの海馬（ＡＰ−２．０、ＭＬ＋２．０（ブレグマから）、ＤＶ１．８ｍｍ（硬膜から））に片側（右半球）注射した。マウスを切開するために屠殺した（頭蓋内注射の２ヶ月後）。
【０１１５】
抽出手順
注射された半球由来のマウス組織を計量し、６体積のホモジナイゼーションバッファ（１０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．８ＭのＮａＣｌ、１０％ｗ／ｖのスクロース、１ｍＭのＥＧＴＡ、ＰｈｏｓＳｔｏｐホスファターゼ阻害剤カクテル、完全ＥＤＴＡ不含ミニプロテアーゼ阻害剤）中でホモジナイズした。２８０００×ｇにて２０分間、ホモジネートを遠心分離し、得られた上清（全ホモジネート）からアリコートを取り出した後、１％のＮ−ラウロイルサルコシンを添加した。９０分後（９００ｒｐｍ、３７℃）、溶液を再び、１８４０００×ｇにて１時間遠心分離にかけた。上清はサルコシル可溶性画分として保持したが、サルコシル不溶性材料を含有するペレットは、均質化緩衝液中に懸濁させた。
【０１１６】
生化学的分析
コーティング抗体（ＡＴ８）をＰＢＳ（１μｇ／ｍＬ）で希釈し、ＭＳＤプレート（３０μＬ／ウェル）（Ｌ１５ＸＡ、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ）に分注し、これを４℃で一晩インキュベートした。５×２００μＬのＰＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ−２０で洗浄した後、プレートをＰＢＳ中の０．１％のカゼインでブロックし、５×２００μＬのＰＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ−２０で再び洗浄した。サンプル及び標準（共に、ＰＢＳ中の０．１％のカゼインに希釈）を添加した後、プレートを４℃で一晩インキュベーションした。その後、プレートを５×２００μＬのＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、ＰＢＳ中の０．１％カゼイン中ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）コンジュゲート検出抗体（ＡＴ８）を添加し、６００ｒｐｍで振盪しながら室温で２時間インキュベーションした。最後の洗浄（５×２００μＬのＰＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ−２０）の後、１５０μＬの２×緩衝液Ｔを添加し、プレートをＭＳＤイメージャで読み取った。死後のＡＤ脳（ｅＰＨＦ）のサルコシル不溶性ｐｒｅｐの１６個の希釈物からなる検量線に対してそのままのシグナルを正規化し、任意の単位（ＡＵ）ｅＰＨＦとして表した。ＧｒａｐｈＰａｄプリズムソフトウェア及び自動分析のために「インハウス」で開発したアプリケーションを用いて、統計分析（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を伴うＡＮＯＶＡ）を実施した。
【０１１７】
結果
海馬同時注射モデル下のマウスＰＴ８２（ＩｇＧ２ａとして組換え的に発現）の活性を、１つの研究においてＡＴ１８０及びＰＴ３の活性と比較した（図５、表３）。抗体（４．５ピコモル）をｅＰＨＦタウ（０．６ピコモル）と共に皮質に同時注射した。各群で１５頭の動物を使用した。したがって、ＰＴ８２の同時注射は、Ｐ３０１ＬマウスにおけるｅＰＨＦ誘導性タウ凝集を減弱した（図５Ａ及び５Ｂ）。全ホモジネート（図５Ａ）及びサルコシル不溶性ホモジネート（図５Ｂ）において効果が観察された。
【０１１８】
【表３】
2021515556.tif 000006
＊多重比較のためにボンフェローニ補正を用いて一元配置分散分析により統計分析を行った。
【０１１９】
追跡調査では、ＰＨＦの頭蓋内注射（図６Ａ）及び抗体＋ＰＨＦの頭蓋内同時注射（図６Ｂ）後に抗体を末梢投与（２０ｍｇ／ｋｇ、２×／週）した際のＰＴ３及びＰＴ８２による有効性を比較した。末梢投与は、ＰＨＦの頭蓋内注射の２週間前に開始し、実験の生活相（life phase）の間継続した。表４は、実験で使用した抗体の量を示す。最初の研究と一致して、ＰＴ３及びＰＴ８２の両方の同時投与によって、サルコシル不溶性画分（図６Ｃ及び表５）及び全脳ホモジネート（図６Ｄ及び表５）中のｅＰＨＦ誘導性凝集シグナルが低減された。これに加えて、抗体の末梢投与は、ｅＰＨＦによって誘導された播種を有意に阻害した。
【０１２０】
【表４】
2021515556.tif 000007
【０１２１】
【表５】
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＊多重比較のためにボンフェローニ補正を用いて一元配置分散分析により統計分析を行った。
【実施例９】
【０１２２】
アレイペプチドの合成
標的分子のエピトープを再構築するために、タウ４４１配列を網羅するペプチド（１８アミノ酸が重複している２０ｍｅｒ）のライブラリを合成した。独自の親水性ポリマー製剤でグラフト化し、続いて、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）と共にジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いてｔ−ブチルオキシカルボニル−ヘキサメチレンジアミン（ＢｏｃＨＭＤＡ）と反応させ、その後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いてＢｏｃ基を切断することにより、アミノ官能化ポリプロピレン担体を得た。標準的なＦｍｏｃペプチド合成を使用して、カスタム変性ＪＡＮＵＳ液体ハンドリングステーション（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によってアミノ官能化固体担体上でペプチドを合成した。Ｐｅｐｓｃａｎ独自のスカフォールド上で化学的に結合したペプチド（Chemically Linked Peptides on Scaffolds、ＣＬＩＰＳ）技術を用いて構造ミミックの合成を行った（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  Ｐ，Ｐｕｉｊｋ  ＷＣ，Ｍｅｌｏｅｎ  ＲＨ（２００７）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｉｍｉｃｒｙ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｕｓｉｎｇ  ＣＬＩＰＳ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  ２０：２８３−２９９．１０．１００２／ｊｍｒ．８４６［ｄｏｉ］）。ＣＬＩＰＳ技術により、ペプチドを単ループ、二重ループ、三重ループ、シート状折畳み、らせん状折畳み、及びこれらの組み合わせにペプチドを構造化することが可能になる。ＣＬＩＰＳテンプレートは、システイン残基に結合する。ペプチド中の複数のシステインの側鎖が、１つ又は２つのＣＬＩＰＳテンプレートに結合する。例えば、Ｐ２  ＣＬＩＰＳ（２，６−ビス（ブロモメチル）ピリジン）の０．５ｍＭ溶液を重炭酸アンモニウム（２０ｍＭ、ｐＨ７．８）／アセトニトリル（１：３（ｖ／ｖ））に溶解させる。この溶液をペプチドアレイに添加する。ＣＬＩＰＳテンプレートは、ペプチドアレイの固相結合ペプチド（３μＬのウェルを有する４５５ウェルプレート）中に存在するとき、２つのシステインの側鎖に結合する。ペプチドアレイを、溶液中で完全に被覆しながら、溶液中で３０〜６０分間穏やかに振盪する。最後に、ペプチドアレイを過剰のＨ２Ｏで広範に洗浄し、７０℃で３０分間ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中１％ＳＤＳ／０．１％β−メルカプトエタノールを含有する破壊バッファ中で超音波処理し、続いて、更に４５分間Ｈ２Ｏ中で超音波処理する。Ｔ３  ＣＬＩＰＳ担持ペプチドを同様の方法で作製したが、ここでは３つのシステインを用いて作製した。
【０１２３】
Ｅｌｉｓａスクリーニング
各合成ペプチドに対する抗体の結合（ＩｇＧ２ａとして組換え的に発現）を、ペプスキャン系ＥＬＩＳＡにおいて試験した。ペプチドアレイを、一次抗体溶液と共にインキュベートした（４℃で一晩）。洗浄後、ペプチドアレイを、適切な抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート（ＳＢＡ）の１／１０００希釈物と共に２５℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）及び２０μＬ／ｍＬの３％Ｈ２Ｏ２を添加した。１時間後、発色を測定した。発色を電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ及び画像処理システムを用いて定量した。
【０１２４】
結果
図７のデータは、タウ４４１配列中の残基１０３から出発して残基１４０までの一連のペプチドに対するＰＴ８２の結合を示す。これらの抗体については、他のタウペプチドに対する結合は観察されなかった。詳細なマッピングは、ＰＴ８２が、共通モチーフ１１９ＡＧＨＶＴＱ１２４（配列番号３２）でペプチドに結合することを実証した。
【実施例１０】
【０１２５】
ＰＴ８２のヒト化
ヒト化重鎖及び軽鎖の最良の組み合わせを見つけるために、いくつかのヒトＶ領域配列を試験のために選択した。ヒト生殖細胞系及びＪ領域の選択は、フレームワーク（ＦＲ）領域におけるマウス抗体との全体的な配列類似性にのみ基づくものであった。ＣＤＲ配列も、その長さ又は標準構造も、この選択には考慮しなかった。
【０１２６】
ＨＦＡで使用したＣＤＲの定義は、（Ｆｒａｎｓｓｏｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１０；３９８：２１４−２３１）に記載されており、Ｍａｒｔｉｎの定義（Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ  ＫＲ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ  ＡＣ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；４５：３８３２−３８３９）に対応する。ＣＤＲは、以下のように定義される（Ｃｈｏｔｈｉａ付番スキーム［Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ，ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ａ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７；１９６：９０１−９１７］を使用。ＶＬ／ＶＨの対形成及びＣＤＲの立体構造にとって重要であることが知られているフレームワーク位置では、ヒトからマウスへの復帰突然変異を組み込んで、ヒト化Ｖ領域の結合親和性を維持するために、二残基ライブラリでアミノ酸を変化させた。ＰＴ８２については、ＣＤＲをヒトＨＶ３−７２＊０１ａ生殖系列遺伝子にグラフトした。ＶＨ：ヒト／マウスバイナリコンビナトリアルライブラリは、位置３７：Ｉ、Ｖ；７８：Ｖ、Ｌ；９３：Ｔ、Ａ；９４：Ｒ、Ｇを含んでいた。軽鎖については、位置４：Ｌ、Ｍ及び７８：Ｌ、ＭにおけるＶＬ：ヒト／マウスバイナリコンビナトリアルライブラリを用いて、ＣＤＲをヒトＫＶ１−９＊０１ａ遺伝子にグラフト化した。
【０１２７】
更に、ヒト化ＰＴ８２の親和性を改善するのに役立てるためにファージディスプレイライブラリにおいて、ＶＨ及びＶＬにおけるいくつかの位置をランダム化した（表６）。
【０１２８】
【表６】
2021515556.tif 000009
【０１２９】
重複ＰＣＲにおいて縮重オリゴヌクレオチドを使用して、ヒト化／成熟ライブラリを作製した。次いで、相補性マウスＶ領域と組み合わせて、ＶＨ又はＶＬライブラリＤＮＡ断片を、ｐＣＮＴＯファージミド（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９７：３８５−３９６，２０１０；国際公開第２００９／０８５４６２号；米国特許出願公開第２０１０／００２１４７７号；同第２０１２／０１０８７９５号）にクローニングした。ライブラリライゲーションを精製し、ＭＣ１０６１Ｆ’細胞に形質転換した。対数増殖期成長（ＯＤ６００ｎｍ≒０．６）が達成されるまで、細胞を２ｘＹＴ（Ｃａｒｂ）中で成長させた。ヘルパーファージを添加し、培養物を３７℃で３０分間インキュベートした。それぞれ３５ｕｇ／ｍＬ及び１ｍＭの最終濃度になるようにカナマイシン及びＩＰＴＧを各培養物に添加し、振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。ＰＥＧ／ＮａＣｌを用いて細菌培地からファージを沈殿させ、ＰＢＳに再懸濁した。
【０１３０】
親和性成熟パニングにあたって、Ｂｔ−タウペプチドを５０μＬのＳＡコーティングされた磁気ビーズ上に捕捉した。抗原の濃度は、１回目は１０ｎＭ、２回目は０．１ｎＭ、そして３回目は０．１ｎＭであった。ビーズを、ＰＢＳＴで６回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄し、続いて上述の大腸菌に感染させた。ファージディスプレイ選択後、感染したＭＣ１０６１Ｆ’細胞からファージミドＤＮＡを単離し、制限酵素で消化してｐＩＸをコードしている配列を除去し、線状化したプラスミドＤＮＡを切除し、アガロースゲルから精製した。次に、このＤＮＡをＴ４  ＤＮＡリガーゼで自己連結した。連結したＤＮＡをＭＣ１０６１Ｆ’細胞内に電気穿孔し、ＬＢ（Ｃａｒｂ／グルコース）寒天プレート上で平板培養した。
【０１３１】
この電気穿孔からのコロニーをＥＬＩＳＡスクリーニング及びＦａｂ発現の評価のために選んだ。簡潔に言えば、Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレートを可溶性タウタンパク質でコーティングした。Ｆａｂコロニーを２ｘＹＴ培地で増殖させ、Ｆａｂ発現をＩＰＴＧにより誘導した。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、大腸菌培地に分泌されたＦａｂを各ＥＬＩＳＡプレートに添加した。プレートを洗浄し、抗Ｆａｂ’２：ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をＥＬＩＳＡプレートに添加した。プレートを洗浄し、化学発光検出試薬を添加し、発光についてＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーでプレートを読み取った。
【０１３２】
ＶＨ及びＶＬの両方で陽性クローンの配列を決定した。ＶＨ及びＶＬ配列を表１に列挙する。固有の配列を、完全長ＩｇＧ１分子として発現及び精製するためのＩｇＧ遺伝子発現コンストラクトにクローニングした。ＩｇＧコンストラクトをＣＨＯ−Ｅｘｐｉ細胞にトランスフェクトし、ＩｇＧタンパク質をＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ樹脂を用いて精製した。次いで、ＩｇＧ結合を検出するために、抗ヒトＦｃ：ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、可溶性タウへの結合について抗体をＥＬＩＳＡで試験した。このデータを図８に示す。ヒト化は、可溶性タウに対するＰＴ８２の結合と比較して、可溶性タウに対する結合に実質的に影響を及ぼさなかった。
【０１３３】
ＥＬＩＳＡは、ＰＧＳ中５μｇ／ｍＬで開始した５つの５倍希釈物で抗体を試験し、抗ヒトＦｃ：ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用してＩｇＧ結合を検出したことを除いて、Ｆａｂについて記載したとおり行った。
【０１３４】
以上、本発明を詳細に、かつその具体的な実施形態を参照して説明したが、当業者には、発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更及び改変を行い得る点は明らかであろう。
【図１Ａ】
2021515556.tif 000010
【図１Ｂ】
2021515556.tif 000011
【図１Ｃ】
2021515556.tif 000012
【図２】
2021515556.tif 000013
【図３Ａ】
2021515556.tif 000014
【図３Ｂ】
2021515556.tif 000015
【図４Ａ】
2021515556.tif 000016
【図４Ｂ】
2021515556.tif 000017
【図４Ｃ】
2021515556.tif 000018
【図５Ａ】
2021515556.tif 000019
【図５Ｂ】
2021515556.tif 000020
【図６Ａ】
2021515556.tif 000021
【図６Ｂ】
2021515556.tif 000022
【図６Ｃ】
2021515556.tif 000023
【図６Ｄ】
2021515556.tif 000024
【図７】
2021515556.tif 000025
【図８】
2021515556.tif 000026
【配列表】
2021515556000001.app
【国際調査報告】
2021515556.tif 000027
2021515556.tif 000028