(57)【要約】本発明の特定の態様は、単離された生存細胞の特有の細胞呼吸および透過性特性によって生成される時間依存性シグナルを、記録しかつ解釈することによって、細胞を評価し、識別することに向けられる。2021526864.tif 000007
2021526864.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルを評価するための方法であって、以下の工程を含む、方法:
（a）前記サンプルを、対照サブサンプルおよび少なくとも1つの試験サンプルを含む、2つまたはそれ以上のサブサンプルまたはサンプル部分に分割する工程;
（b）各サブサンプルまたはサンプル部分を、1つもしくは複数の試薬、1つもしくは複数の反応体、または1つもしくは複数の試薬および1つもしくは複数の反応体と混合する工程であって、別個のサブサンプルまたはサンプル部分の混合物を形成する、工程;
（c）前記サブサンプルまたはサンプル部分の混合物の各々を、複数の小容量区画に区画化する工程であって、一部の小容量区画が、1つの細胞または1つの細胞凝集体を含む、工程;
（d）前記小容量区画の物理的または化学的特徴を経時的に検出し、各区画に関するデータを生成する工程;および
（e）機械学習を使用して最適化された少なくとも1つの関数への入力として前記データを送信し、分析出力を生成する工程。
【請求項２】
（f）前記データを、（i）少なくとも1つのニューラルネットワークと（ii）ニューラルネットワーク出力および特徴決定器出力を形成する特徴決定器（characterizer）とに、入力として送信する工程;および
（g）前記ニューラルネットワーク出力を分類器（classifier）に送信し、分類器出力を形成する工程と、
（h）前記特徴決定器出力および前記分類器出力を第2のニューラルネットに送信する工程であって、前記第2のニューラルネットが分析出力を形成する、工程
をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが、環境サンプルまたは生体サンプルである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記生体サンプルが、患者のサンプルである、請求項3記載の方法。
【請求項５】
前記患者が、ヒト患者である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
前記生体サンプルが、気管支肺胞洗浄（BAL）物、痰、唾液、尿、血液、脳脊髄液、精液、便、スワブ、擦過物、膿、または組織である、請求項4記載の方法。
【請求項７】
対照サブサンプルが、反応体を含まない、請求項1記載の方法。
【請求項８】
対照サブサンプルが、試薬を含まない、請求項1記載の方法。
【請求項９】
1つまたは複数のサブサンプルが、試薬および反応体と混合されている、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記反応体が、栄養素混合物または薬剤である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
前記試薬が、蛍光発生試薬または発光試薬である、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
前記分析出力が、臨床エンドポイントの決定である、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
前記臨床エンドポイントが、患者の転帰、薬剤の最小発育阻止濃度、感受性もしくは耐性細胞、または予後である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記予後が、入院期間または有害事象の対象リスクであり得る、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
サンプルを評価するための方法であって、以下の工程を含む、方法:
（a）前記サンプルを、対照サブサンプルおよび少なくとも1つの試験サンプルを含む、2つまたはそれ以上のサブサンプルまたはサンプル部分に分割する工程;
（b）各サブサンプルまたはサンプル部分を、1つもしくは複数の試薬、1つもしくは複数の反応体、または1つもしくは複数の試薬および1つもしくは複数の反応体と混合する工程であって、別個のサブサンプルまたはサンプル部分の混合物を形成する、工程;
（c）前記サブサンプルまたはサンプル部分の混合物の各々を、複数の小容量区画に区画化する工程であって、一部の小容量区画が、1つの細胞または1つの細胞凝集体を含む、工程;
（d）前記小容量区画の物理的または化学的特徴を経時的に、および各区画に関するデータを、検出する工程;
（e）収集した前記データを、（i）少なくとも1つのニューラルネットワークと（ii）ニューラルネットワーク出力および特徴決定器出力を形成する特徴決定器とに、入力として送信する工程;
（f）前記ニューラルネットワーク出力を分類器に送信し、分類器出力を形成する工程;および
（g）前記特徴決定器出力、前記分類器出力、コミュニティ情報、および患者情報を第2のニューラルネットに送信する工程であって、前記第2のニューラルネットが分析出力を形成する、工程。
【請求項１６】
対照サブサンプルをさらに含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
1つまたは複数のサブサンプルが、試薬および反応体と混合されている、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
前記反応体が、栄養素混合物または薬剤である、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
前記試薬が、蛍光発生試薬または発光試薬である、請求項15記載の方法。
【請求項２０】
サンプルを評価するための方法であって、以下の工程を含む、方法:
（a）前記サンプルを、2つまたはそれ以上のサブサンプルまたはサンプル部分に分割する工程;
（b）各サブサンプルまたは部分を、1つもしくは複数の試薬および/または1つもしくは複数の反応体と混合する工程であって、別個のサブサンプル  サンプル部分の混合物を形成する、工程;
（c）前記サブサンプルまたはサンプル部分の混合物を複数の小容量区画に区画化する工程であって、一部の小容量区画が、1つの細胞または1つの細胞凝集体を含む工程;
（d）前記小容量区画の特徴を経時的にモニターし、区画データを収集する工程;
（e）収集した前記データを、少なくとも1つのニューラルネットワークに送信する工程。
【請求項２１】
対照サブサンプルをさらに含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
1つまたは複数のサブサンプルが、試薬および反応体と混合されている、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
前記反応体が、栄養素混合物または薬剤である、請求項20記載の方法。
【請求項２４】
前記試薬が、蛍光発生試薬または発光試薬である、請求項20記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2018年6月13日出願の米国特許仮出願第62/684,736号および2018年10月18日出願の米国特許仮出願第62/747,309号に対する優先権を主張する。これらはそれぞれ参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本開示は、概して、細胞生物学および微生物学に関し、より詳細には、細胞の迅速かつ高感度の表現型評価のための、ならびに、化合物および/または処置に対するそれらの表現型応答の迅速かつ高感度の特徴付けのための、組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
様々な例において、疾患を引き起こす細胞（Disease-Causing Cell:DCC）は、従来の分析技術の検出限界を下回る量で見出される。したがって、DCCを識別し、処置に対するそれらの応答を特徴付けるための方法は、通常、標的細胞の増殖、ならびに/または標的細胞の分子含有物および/もしくは産物の標的依存性増幅のいずれかを、用途に応じて必要とする。
【０００４】
他の技術と比較して感受性が高いことに起因して、核酸増幅（例えば、PCRベースの）検査（NAT）は、迅速な病原体の識別に好ましい方法となっている。DNAは、PCRを使用して数時間以内に、1つのコピーから数十億のコピーに増幅され得る。
【０００５】
NATは、通常、細胞溶解と、それに続く、サンプルからPCR阻害物質を除去する核酸濃縮段階とを含む、複雑なサンプルワークフロー段階を必要とする。細胞溶解は、核酸抽出効率の要件に非対称性を作り出す。例えば、マイコバクテリアおよび真菌は、グラム陰性細菌と比較して非常に厚い細胞壁を持っているため、溶解することがはるかに難しく、通常、その細胞壁を効率的に破壊するためには機械的溶解段階が必要である。その結果、単純な化学溶解法を利用するNATは、これらの、より頑丈な病原体に対する感受性がない場合が多い。さらに、細胞溶解試薬はタンパク質を変性させ、PCRはタンパク質を利用して増幅反応を行うため、細胞溶解試薬はPCR反応を抑制する可能性がある。そのため、細胞溶解には、抽出された核酸から溶解試薬を除去するための、非常に効率的な洗浄段階が必要となる。その上、NATは、各標的に対して特異的に設計する必要のある病原体特異的レポーター分子（プライマーおよびプローブ）に依存しているため、高価なアッセイ開発方法を必要とする。そのため、各NATは、プライマー/プローブ設計および各標的のスクリーニングを伴う、高価な分子研究開発プロセスを含む必要がある。
【０００６】
2種またはそれ以上の標的を含む（多重）NATは、それらの標的を、同時に正確かつ的確に定量することができない。これは、レポーター種間の同じ非特異的相互作用がPCRシグナル出力のばらつきを引き起こすこと、および、生成された増幅曲線を初期標的濃度と相関させるために、定量的PCRが、再現性のある反応結果に依存することが理由である。これは、ほとんどの感染が起こる、身体の無菌ではない感染領域の感染について診断するための多重NATの使用を制限するので、重要な制限である。身体の無菌ではない領域では、ヒトは、感染を引き起こし得るものと同じ病原体が生着している場合が多い。感染は、身体の防御を圧倒する微生物によって引き起こされるため、一般に、共生生物よりも多くのコロニー分離菌を生成すると考えられる。そのため、無菌ではない感染部位では、臨床サンプルに存在する病原体の数（病原体負荷量）は、ある細菌種が、感染を引き起こしているのか、またはその部位に「平和的に」生着しているのかを決定する、数である。例えば、下気道呼吸器系からの肺炎感染源（例えば、気管支肺胞洗浄（BAL）物）を決定的に診断するためには、サンプルに存在する細菌を感染源とみなすための病原体負荷量は103CFU/mLを超えていなければならない。同様に、尿検体の場合、閾値は105CFU/mLである。
【０００７】
さらに、NATアッセイが、2以上のレポーター種（プライマーおよび/またはプローブの対）を必要とする、1を超える標的（多重アッセイ）を含む場合、異なる標的および/またはレポーター種は、互いに非特異的に相互作用する可能性があり、レポーターが他の試薬に対して非特異的に増幅する場合には偽陽性を、標的増幅反応が他の種による非特異的相互作用によって抑制される場合には偽陰性を引き起こす。その結果、このことにより、単一のNAT内で標的をいくつ識別できるかが制限される。グラム陰性細菌およびマイコバクテリアの場合は、耐性を示す変異が多数存在する（各突然変異が標的である）ため、これは薬剤耐性問題に特に関連する。NATは、1回の検査でこれらの変異のごく一部しか調べることができない。その上、生物の遺伝子型に存在する遺伝子は、必ずしも表現型に寄与するとは限らない。そのため、遺伝子型情報は、病原体の表現型応答の不正確なまたは不完全な像を表すことが多い。例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）は、耐性を付与するmecA遺伝子を発現しない場合が多い。そのため、感染を引き起こす病原体が特定の薬剤に感受性があるかどうかの臨床的に重要な決定に関して言えば、NATの臨床的妥当性は低い。それは、これらの検査が、抗菌剤耐性を付与することができる遺伝子変異のごく一部しか検査することができず、エピジェネティック耐性機構をまったく説明できないためである。
【０００８】
NATは、よく知られている遺伝的耐性マーカーを調べるように設計される必要もある。しかし、微生物は、抗菌剤によってもたらされた選択圧下で新しい耐性機構を継続的に発達させる。経時的に変化する情報（遺伝子型）に依存することにより、微生物が新しい耐性機構を発達させると、NATは正確でなくなる。抗菌剤耐性の本質的に変化する状況に追いつくために、新しい耐性機構を調査して理解する必要があり、新しいNATを開発し、診療所で使う場合の規制上のハードルをクリアする必要がある。このコストのかかるプロセスは数年を要する可能性がある。
【０００９】
表現型の抗菌剤感受性試験（AST）は依然として、微生物感染を診断するための標準的基準のままである。その理由は、ASTは、治療のために検討されている抗菌剤に対する微生物の表現型応答を測定するものであり、所望の臨床応答に直接変換される機能的エンドポイントに依存しているためである。表現型であるので、ASTはすべての耐性機構を包含し、したがって高い臨床的妥当性を提供する。
【００１０】
ASTは、最小発育阻止濃度（MIC）の決定をもたらし、これは微生物の増殖を著しく阻害するために必要な、抗菌剤の最小濃度に対応する。微生物が異なると、所与の抗菌剤に対する観察された応答に影響を及ぼす固有の特性が異なるため、MICだけでは、病原体が抗生物質に感受性があるか耐性があるかは臨床医にはわからない。例えば、2μg/mLのオキサシリンMICは、病原体が黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）である場合には、オキサシリンに対する感受性を意味し（そのため、オキサシリン処置に応答する）、病原体が表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）である場合には、耐性を意味する（そのため、処置に応答しない）。AST結果を解釈するには、病原体の識別（ID）が必要である。
【００１１】
微生物の増殖が種間で区別可能でなく、種の抗生物質応答が具体的に測定できないため、複数の病原体が同じ検査体に存在する場合には、ASTを正確に実行することはできない。さらに、抗菌剤の選択圧下では、資源に対する競合が強まり、抗菌剤自体の影響が分かりにくくなる可能性がある。ほとんどの細菌感染は、細菌が常在する身体領域で発生するため、これは特に重要である。無菌ではない部位での感染の場合、感染を引き起こしている細菌（病原体）を識別し、感染部位に「平和的に」常在する細菌（共生生物）と分けることが重要である。このことは、使用が簡単で微生物の増殖を促進することが多い、液体ブロス培地での検体の培養を妨げる。その代わりに、定量的または半定量的な培養が必要とされ、この培養は、ある時点でプレート上の微生物が単一の種の分離されたコロニーとして成長するように、サンプルをペトリ皿の全体にわたって様々な濃度で広げることによって達成される。プレートストリーキングによっても、検査技師は、特定の濃度で存在する、視覚的に区別可能なコロニーを計数して、サンプル中の微生物が侵襲性となったかどうかを決定することができる。異なる種によって形成されたコロニーを、互いに視覚的に区別し、計数することができる。検査技師はまた、完全に同じ種で構成されている病原体コロニーを手作業で抽出してさらに検査することもできる。したがって、定量的/半定量的培養プロセスは、その後のASTに必要な多数の細胞を生成するだけでなく、検査されている細菌が均質であり、それが感染を引き起こしている細菌（病原体）であることも保証する。
【００１２】
しかし、定量的/半定量的培養は非常に主観的でエラーが起こりやすく、高度に熟練した技師が、その後の検査にどのコロニーを除外しどのコロニーを含めるか決定する必要がある。多微生物感染は特に困難である。多くの場合、感染病原体のうちあるものは、偏好性生物（複雑な栄養要件を有し、一般に特定条件下でのみ成長する生物）であるかまたは成長の遅い生物であり、他はそうではない。偏好性でない/成長の速い生物は、培養プレート上で偏好性の/成長の遅い生物を圧倒し、検体内でのその存在を隠してしまう場合が多いと考えられる。
【００１３】
ASTは、処置のための薬剤候補に対する評価に必要な多数の細胞を生成する培養増殖段階を事前に必要とするため、微生物集団を、患者のサンプルに存在する数からASTに必要な数に増やすペトリ皿でのインキュベーションに、1日から5日を要する可能性がある。これは、特に重篤な細菌感染症の場合に、抗生物質処置の決定を効果的に誘導するには遅すぎる。
【００１４】
したがって、高速および/または効率的な方法でサンプル中の細胞を識別し、特徴付けるための、さらなる方法および装置がなお必要とされている。
【発明の概要】
【００１５】
概要
本明細書に記載される方法および/または装置/システムの特定の局面は、分析前にサンプル調製を行うための1つまたは複数のキットを利用する必要のない、統合検査を行うことのできる使い捨てカートリッジで自動化および実行することができる、統合されたワークフローおよび分析を使用して実践することができる。本明細書に記載される組成物および方法は、サンプルを評価するための現在の方法およびその結果得られる患者の診断または予後に関連する様々な問題に対処する。特定の態様は、例えば、単離された細胞の特有の細胞代謝、呼吸、成長、および/または透過性特性によって生成される時間依存性シグナルを解釈する、方法および分析に向けられる。本明細書において使用される代謝とは、細胞内の一連の生命を維持する化学変換またはプロセスを指す。代謝の3つの主な目的は、細胞プロセスを実行するために食物/燃料をエネルギーに変換すること、食物/燃料をタンパク質、脂質、核酸、および一部の炭水化物の構成要素に変換すること、そして、窒素性廃棄物を除去することである。本明細書で言及される呼吸は、細胞呼吸、つまり生化学エネルギーを栄養素からアデノシン三リン酸（ATP）に変換し、次に老廃物を放出するために細胞または生物で行われる一連の代謝反応およびプロセスである。
【００１６】
特定の例では、それは、シグナルの存在または不在を生成するために使用されるレポーター分子の特異的結合ではなく、変化するかまたは標的に特有の、経時的な、シグナルの変動、「形状」、または波形である。したがって、それは、個々のレポーター分子または結合部分ではなく、プローブのように働く「システム」である。
【００１７】
本明細書に記載される方法は、サンプルの細胞成分を特徴付けることによってサンプルを評価するために使用することができる、代謝、呼吸、または反応体/試薬の相互作用プロファイルを生成する。具体的には、化合物または効果的な薬剤は、細胞の代謝、呼吸、透過性または他の特徴を変化させると考えられるため、この方法が哺乳類または微生物の細胞の特有の代謝、呼吸、透過性および/または他の特徴を使用して、異なる細胞種や微生物種を区別するのと同様に、これらの同じ特徴を使用して、細胞または微生物が、特定の化合物、細胞傷害性化合物、または抗菌剤に感受性であるかどうかを決定することができる。
【００１８】
特定の局面では、本発明の方法は、1つもしくは複数の化合物または1つもしくは複数の条件と細胞との相互作用を、その細胞が（i）化合物または条件の毒性を決定するための正常細胞であっても、（ii）化合物または条件の治療効力を決定するための病原性または疾患関連細胞であっても、調べることができる。この方法は、特定の細胞に耐性を付与し得るすべての耐性機構を説明できるため、臨床的妥当性の向上をもたらす。
【００１９】
現在記載されている方法は、他の方法よりも大幅に速い所要時間（＜4〜6時間（hr））で評価結果を生成する。速度の増加は、一部、限局された容量で可能になった急速なシグナル濃縮によって達成され、これは、他の方法によって一般に使用されるミリリットルおよびマイクロリットルの容量よりも数桁小さい。
【００２０】
本明細書に記載される方法では、個々の細胞または微生物は、別々の液滴または容量に分離または区画化され、定量を、特定の細胞または微生物の存在を示すシグナルに関連付けられた液滴または容量を計数するという簡単なものにすることができる。経時的なシグナルの形状または変化（例えば、波形）は、識別および特徴付けのために依拠される特徴の一つであり、定量化の方法とは独立している。すなわち一方は他方に影響しない。したがって、正確で的確な多重化された識別と定量化が同時に達成される。
【００２１】
特定の態様は、（a）サンプルを、対照サブサンプルおよび少なくとも1つの試験サンプルを含む、2つまたはそれ以上のサブサンプルまたはサンプル部分に分割する工程、（b）各サブサンプルまたはサンプル部分を、1つもしくはまたは複数の試薬、1つもしくは複数の反応体、または1つもしくは複数の試薬および1つもしくは複数の反応体と混合する工程であって、別個のサブサンプルまたはサンプル部分の混合物を形成する、工程、（c）サブサンプルまたはサンプル部分の混合物の各々を、複数の小容量区画に区画化する工程であって、一部の小容量区画が、1つの細胞または1つの細胞凝集体を含む、工程、（d）小容量区画の物理的または化学的特徴を経時的に検出し、各区画に関するデータを生成する工程、（e）機械学習を使用して最適化された少なくとも1つの関数への入力として前記データを送信する工程、を含む、サンプルを評価するための方法に向けられる。特定の局面では、この方法には、（f）前記データを、（i）少なくとも1つのニューラルネットワークと（ii）ニューラルネットワーク出力および特徴決定器出力を形成する特徴決定器（characterizer）とに、入力として送信する工程、（g）ニューラルネットワーク出力を分類器（classifier）に送信し、分類器出力を形成する工程、ならびに（h）特徴決定器出力および分類器出力を第2のニューラルネットに送信する工程であって、第2のニューラルネットが分析出力を形成する、工程、が含まれる。サンプルは、限定されるものではないが、環境サンプルまたは生体サンプルであり得る。特定の局面では、生体サンプルは患者のサンプルである。特定の例では、患者はヒト患者である。生体サンプルは、気管支肺胞洗浄（BAL）物、痰、唾液、尿、血液、脳脊髄液、精液、便、スワブ、擦過物、膿、または組織であり得る。特定の局面では、対照サブサンプルは、反応体を含まない、かつ/または試薬を含まない。特定の局面では、1つまたは複数のサブサンプルは、試薬と、反応体と、または試薬および反応体と混合される。反応体は、限定されるものではないが、栄養素混合物、薬剤、または生物学的物質であり得る。試薬は、レポーターまたはシグナル生成部分、例えば蛍光発生試薬または発光試薬であり得る。特定の局面では、分析出力は、臨床エンドポイントなどの決定である。臨床エンドポイントは、限定されるものではないが、患者の転帰、薬剤の最小発育阻止濃度、感受性もしくは耐性細胞、または予後であり得る。特定の局面では、予後は、入院期間または有害事象に関する対象のリスクであり得るか、またはそれらを含み得る。
【００２２】
特定の態様は、（a）サンプルを、対照サブサンプルおよび少なくとも1つの試験サンプルを含む、2つまたはそれ以上のサブサンプルまたはサンプル部分に分割する工程、（b）各サブサンプルまたはサンプル部分を、1つもしくは複数の試薬、1つもしくは複数の反応体、または1つもしくは複数の試薬および1つもしくは複数の反応体と混合する工程であって、別個のサブサンプルまたはサンプル部分の混合物を形成する、工程、（c）サブサンプルまたはサンプル部分の混合物の各々を複数の小容量区画に区画化する工程であって、一部の小容量区画が、1つの細胞または1つの細胞凝集体を含む、工程、（d）小容量区画の物理的または化学的特徴を経時的に、および各区画に関するデータを、検出する工程、（e）収集した前記データを、（i）少なくとも1つのニューラルネットワークと（ii）ニューラルネットワーク出力および特徴決定器出力を形成する特徴決定器とに、入力として送信する工程、（f）ニューラルネットワーク出力を分類器に送信し、分類器出力を形成する工程、ならびに（g）特徴決定器出力、分類器出力、コミュニティ情報、および患者情報を第2のニューラルネットに送信する工程であって、第2のニューラルネットが分析出力を形成する、工程、を含む、サンプルを評価するための方法に向けられる。この方法は、対照サブサンプルをさらに含むことができる。特定の局面では、1つまたは複数のサブサンプルは、試薬と、反応体と、または試薬および反応体と混合される。反応体は、限定されるものではないが、栄養素混合物、または薬剤であり得る。試薬は、限定されるものではないが、蛍光発生試薬または発光試薬であり得る。
【００２３】
特定の態様は、（a）サンプルを2つまたはそれ以上のサブサンプルまたはサンプル部分に分割する工程、（b）各サブサンプルまたは部分を、1つもしくは複数の試薬および/または1つもしくは複数の反応体と混合する工程であって、別個のサブサンプル  サンプル部分の混合物を形成する、工程、（c）サブサンプルまたはサンプル部分の混合物を複数の小容量区画に区画化する工程であって、一部の小容量区画が、1つの細胞または1つの細胞凝集体を含む、工程、（d）小容量区画の特徴を経時的にモニターし、区画データを収集する工程、ならびに（e）収集した前記データを少なくとも1つのニューラルネットワークに送信する工程、を含む、サンプルを評価するための方法に向けられる。この方法は、対照サブサンプルをさらに含むことができる。特定の局面では、1つまたは複数のサブサンプルは、反応体、試薬、または試薬および反応体と混合される。反応体は、限定されるものではないが、栄養素混合物、または薬剤であり得る。試薬は、限定されるものではないが、蛍光発生試薬または発光試薬であり得る。
【００２４】
特定の局面では、特徴決定器は、データの特徴の様々な分析、操作、処理、または決定、あるいは、サンプルから、限局された容量から、または、分割部分、サンプル、サブサンプルなどの他の成分から集められたまたは観察された、他の物理的特性の測定、を含み得る。例えば、特定の試験反応体に対する細胞の感受性は、反応体に曝された細胞を含む分割部分と、そうでない細胞を含む分割部分との相違を定量化することによって得ることができる。この相違は、2つの分割部分間のシグナルの相違に反映される。個々の波形の分類に関係のない任意の情報が、特徴決定器に含まれている。特徴決定器（CH）は、限定されるものではないが、各区画の平均強度などの、両方の母集団の統計値全体を含むことができる。特定の例では、N2は、分類器（CL）で分類された波形を使用し、母集団統計値を試験サンプル（TS）と対照サンプル（CS）の両方のCHで使用して、臨床エンドポイントを計算する。特徴決定器への入力および特徴決定器からの出力の限定されない例には、出力として以下が挙げられるが、これらに限定されるものではない:（i）分割部分のすべての波形の平均最大シグナル；（ii）分割部分のすべての波形の曲線下面積；（iii）分割部分のすべての波形の平均最大導関数；（iv）各波形が分割部分のすべての波形の特定の閾値を超える、平均時点；（v）「平均」の代わりに「中央値」を使用することを除いて、上記と同じもの；（vi）正規化された波形を使用することを除いて、上記と同じものであり、ここで、各波形は、同じ分割部分内の陰性区画（細胞を含まない区画）の波形と同じ時点での平均シグナルで除算される。
【００２５】
特定の局面では、分類器（CL）は、そのカテゴリーの帰属関係が分かっている観察値の訓練セットに基づいて、1つの区画からの波形がどのカテゴリーのセットに属するかを識別する。分類器への入力の例には、患者情報、コミュニティ情報、および/または画像データを含む上記入力に加えて、（i）生の波形、および/または（ii）寸法的に縮小された波形が含まれる。本発明の方法は、教師あり学習に基づく任意の統計分類法に適合し、それにはニューラルネットワーク、線形ベクトル量子化、線形分類器、サポートベクターマシン、二次分類器、決定木、カーネル推定、およびメタアルゴリズムアプローチが含まれる。特定の局面では、1つまたは複数のニューラルネットワークが使用される。
【００２６】
疾患を引き起こしている細胞（DCC）は、本明細書において、宿主細胞、例えばサンプルが採取される宿主の悪性または疾患関連細胞（例えば、がん細胞）か、あるいは、疾患または病態に関連している、疾患または病態に関与している、疾患または病態に関係がある、または疾患または病態を示す、任意のミクロフローラを含む、取得細胞（例えば、真菌または細菌の細胞）、のいずれか、と定義される。そのような疾患としては、限定されるものではないが、がんおよび感染症が挙げられる。
【００２７】
本明細書において使用される、「サンプル分割部分」または「分割部分」という用語は、サンプルの一部を指す。サンプルは、いくつかの分割部分、またはサブサンプルの容量に分割することができる。各分割部分は、個別に、かつ異なるかまたは同様の条件下で、ベット処理（bet processed）、処置、操作、および/またはインキュベートすることができる。
【００２８】
本明細書において使用される、「区画」という用語は、バルク容量（例えば、サンプル）の、分けられた部分である、流体（例えば、液体または気体）の容量を指す。バルク容量は、任意の適した数（例えば、102、103、104、105、106、107等）の、より小さい容量または区画に区画化されてよい。区画は、物理的障壁または物理的な力（例えば、表面張力、疎水性反発等）によって分けられてよい。より大きい容量から生成された区画は、実質的に均一なサイズ（単分散）であってもよいし、不均一なサイズ（多分散）であってもよい。区画は、エマルジョン法、マイクロフルイディクス法、およびマイクロスプレー法を含む、任意の適切な方法によって製造されてよい。区画の一例は液滴である。
【００２９】
本明細書において使用される、「液滴」という用語は、その周囲（例えば、気体、液体、表面等）と非混和性である、少量の液体を指す。液滴は、表面上に存在し、それが非混和性である流体、例えばエマルジョン、ガス、またはそれらの組合せの連続相などによって封じ込められる場合がある。液滴は、一般に球形または実質的に球形であるが、球形でなくてもよい。その他の点では球形または実質的に球形の液滴の形状は、表面への付着によって変わる場合がある。液滴は、「単純な液滴」であってもよいし、1つの液滴が、1つまたは複数のさらなるより小さい液滴を封じ込めている「複合の液滴」であってもよい。本明細書において提供される液滴の容量および/または一連の液滴の平均容量は、一般に約1マイクロリットル未満であり、例えば、液滴の容量は、約1μL、0.1μL、10pL、1pL、100nL、10nL、1nL、100fL、10fL、1fLであってよく、それらの間のすべての値および範囲が含まれる。本明細書において提供される液滴の直径および/または一連の液滴の平均径は、一般に約1ミリメートル未満、例えば1mm、100μm、10μmから1μmまでであり、それらの間のすべての値および範囲が含まれる。液滴は、乳化、マイクロフルイディクス等を含む任意の適した技法によって形成されてよく、単分散、実質的に単分散（直径または容量の差が5％未満）、または多分散であってよい。
【００３０】
本発明の他の態様は、本出願を通して考察されている。本発明の一局面に関して考察された任意の態様は、本発明の他の局面にも適用され、逆もまた同様である。本明細書に記載される各態様は、本発明のすべての局面に適用可能な本発明の態様であることが理解される。本明細書において考察される任意の態様は、本発明の任意の方法または組成物に関して実施することができ、逆もまた同様であることが企図される。さらに、本発明の組成物およびキットは、本発明の方法を達成するために使用することができる。
【００３１】
「1つの(a)」または「1つの(an)」という語の使用は、特許請求の範囲および/または明細書中で「含む」という用語と併せて使用される場合には、「1つ」を意味する場合があるが、これは「1つまたは複数」、「少なくとも1つ」および「1つまたは１つより大きい」の意味とも一致する。
【００３２】
この明細書を通して、「約」という用語は、値が、値を決定するために用いられている装置または方法の誤差の標準偏差を含むことを示すために使用される。
【００３３】
特許請求の範囲での「または」という用語の使用は、代替物のみを指すように明示的に示されているかまたは代替物が相互に排他的である場合を除いて、「および/または」を意味するために使用されるが、本開示は代替物と「および/または」のみを指す定義を支持する。
【００３４】
本明細書および特許請求の範囲において使用される、「含む（comprising）」（ならびに「含む（comprise）」および「含む（comprises）」などの、「含む」のあらゆる形態）、「有する（having）」（ならびに「有する（have）」および「有する（has）」などの、「有する」のあらゆる形態）、「含む（including）」（ならびに「含む（includes）」および「含む（include）」などの、「含む」のあらゆる形態）、または「含む（containing）」（ならびに「含む（contains）」および「含む（contain）」などの、「含む」のあらゆる形態）という語は、包括的またはオープンエンドであり、引用されてない追加の要素または方法段階を除外しない。
【００３５】
以下の考察および特許請求の範囲において、「含む（including）」および「含む（comprising）」という用語はオープンエンド方式で使用される。したがって「を含むがこれらに限定されない」を意味すると解釈されるべきである。また、「結合された」、「連結する」または「指向する」という用語およびそれらの形は、間接的または直接的な接続を意味することを意図する。したがって、第1の成分が第2の成分に連結または結合する場合、その接続は、直接接続によるものであるか、または他の成分および接続を介する間接接続によるものであり得る。
【００３６】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の主旨および範囲内の様々な変更および修正は、この詳細な説明から当業者に明らかになると考えられるため、詳細な説明および具体例は、本発明の具体的な態様を示しているが、例示としてのみ記載されていることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
本開示、およびその利点をより完全に理解するために、添付の図面と併せて、以下の説明をここに参照する。
【００３８】
【図１】表現型の迅速な診断およびスクリーニングのための、一般的な概念を示す。区画内の観察可能な変化が、封じ込められた細胞の機能的特徴を表すように、個々の細胞が区画化されている。関数の変動が認識され、封じ込められた細胞を分類するために使用される。
【図２】図1の一般的な概念の、記載される方法への組み込みを示す。生細胞を細胞試薬および細胞反応体で懸濁する。懸濁液を、リアルタイムで観察可能なピコスケールの区画に分割する。各区画について観察された変化は波形に記録され、それは封じ込められた細胞に関する有用情報に分類され得る。
【図３】細胞懸濁液またはサンプルを複数の区画に分類することを概略的に示す。
【図４】図4（左）は、観察可能な区画のシグナルが、経時的にサンプリングされ記録されていることを示す。空の区画は、繰り返し可能なバックグラウンドシグナルを経時的に生成する。細胞を含む区画は、空の液滴から、または異なる細胞表現型を含む区画から生成される変化とは異なる、リアルタイムの変化を生成する。図4（右）は、記録されたシグナルの波形が、サンプリングされた波形に基づいて各区画化された細胞を分類する分類機能、この場合はニューラルネットワーク、に送られることを示す。
【図５】分割部分またはサブサンプル内の個々の区画からの表現型波形をサンプリングおよび記録し、記録した波形を分類のためにディープニューラルネットワークに供給する、基本的な態様を示す。下部は、上記の基本的な態様の概略図である。
【図６】図6Aは、複数の分割部分またはサブサンプルを利用する本発明の態様の概略図であり、各々は、所与サンプルの表現型の変動を増加させるため、または異なる細胞型の栄養素の必要性を説明するための、それ自体の反応体混合物を含む。この態様は、以下により詳細に記載されるように、試薬無しであり得る。図6Bは、図6Aに類似するが、細胞試薬を含む態様の概略図である。図6Cは、同じ細胞反応体を共有するが、異なる細胞試薬を含む分割部分を有する態様の該略図である。
【図７】図7A〜7Cは、1つまたは複数の分割部分の全体にわたって細胞反応体と細胞試薬の組合せを含む方法を説明する概略図である。
【図８】図8Aは、細胞反応体が様々な栄養素混合物であり、単一の細胞試薬が使用される図6Bの態様を概略的に示す。図8Bは、細胞反応体が1つの栄養素混合物であり、細胞試薬が生死判定用色素（viability dyes）、蛍光発生基質、および発光基質の様々な組合せである図7Bの態様を概略的に示す。
【図９】細胞反応体の細胞種への影響を評価するための診断検査の概略図である。試験反応体（TR）は、試験サンプル（TS）にのみ存在し、これはその他の点では対照サンプル（CS）の分割部分と同じである。N1は、全波形をスパース表現に圧縮するエンコーダであり、スパース表現はその後CLによって分類される。特徴決定器（CH）は、例えば各区画の平均強度などの、両方の集団の統計値全体を含む。N2は、CLで分類された波形を使用し、母集団統計値をTSとCSの両方のCHで使用して、臨床エンドポイントを計算する。
【図１０】図9の試験反応体が薬剤である態様の概略図である。ここでN2は、CLで分類された波形を利用し、CHで母集団統計値を利用して、試験されている細胞と相互作用する処方薬に関連する臨床エンドポイントを計算する。機械学習を使用して、ニューラルネットワークN2を任意の臨床エンドポイントに訓練することができる。
【図１１】対照分割部分またはサブサンプルと試験分割部分またはサブサンプルの両方の波形は、同じN1、CH、およびCLに供給することができるが、結果として得られる統計値は、予測器（predictor）のニューラルネットワークの別々の入力ノードに供給されるため、CSおよびTSに存在する変動の詳細な比較が可能になることを示す。
【図１２】複数の薬物について図10に記載される態様の一例の概略図である。
【図１３】他の検査結果、患者情報、およびコミュニティ情報と組合せたサンプル分割部分の統計値を使用する機械学習を使用して診断を最適化して、最も正確で包括的な診断および予後に到達するための方法を示す。
【図１４】カメラによって撮像された液滴単層の図および液滴単層の俯瞰図である。液滴単層は良好な熱伝導率および温度制御をもたらす。
【図１５】液滴生成のための剪断応力の使用、または液滴生成のためのラプラス圧力勾配の使用を例示する。
【図１６】液滴単層中の単離された細菌の視覚化を示す。
【図１７】液滴アレイから得られる複数の波形によって黄色ブドウ球菌（S. aureus）と肺炎桿菌（K. Pneumoniae）の間の、明確な波形の特徴を例示する。これらの波形は、明らかに区別可能である。
【図１８】様々な細菌種を表す波形を例示する。
【図１９】抗生物質を含む場合と含まない場合の、黄色ブドウ球菌の0〜2時間のタイムラプス画像を示す。
【図２０】病原体識別研究から得た結果の例を例示する。
【図２１】最初に単一の肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）細菌を含んでいた80μmの液滴の、40倍の顕微鏡画像である。37℃で12時間以上のインキュベーションの後、液滴中の細菌増殖は、液滴を通過する光の透過をほぼ完全に遮断する。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
詳細な説明
以下の考察は、本発明の様々な態様に向けられる。「発明」という用語は、特定の態様を指すこと、あるいは本開示の範囲を制限することを意図するものではない。これらの態様の1つまたは複数が好ましい場合があるが、開示される態様は、特許請求の範囲を含む本開示の範囲を限定するものとして解釈されたり、使用されるべきではない。その上、当業者は、以下の説明が幅広く適用されること、任意の態様の考察がその態様の一例にすぎないこと、特許請求の範囲を含む本開示の範囲がその態様に限定されることを暗示するものではないことを理解する。
【００４０】
本発明の特定の局面は、概して、単一の細胞分析を使用するサンプルの特徴付けのための方法に関する。サンプルの特徴付けは、状態または病状を診断するため、あるいはサンプル内の細胞の表現型、例として薬剤感受性または耐性を評価し、特徴付けるために使用することができる。以下の項は、サンプルまたはそのサブサンプルの区画化部（すなわち、分割部分）を用いることにより、細胞の表現型を生成し、分析する方法に関する、一般的な考慮事項を記載する。特定の局面では、試薬を含まない、光学的な、発光性の、蛍光発生性の、発光発生性の、または他のシグナルについて、ニューラルネットワークおよびその他のデータ分析方法を使用して分析し、特徴付けることができる。
【００４１】
分析方法には、人工知能（AI）の使用が含まれる。AIを用いて、1つまたは複数のサンプルを分析および/または比較して、サンプル内の1つまたは複数の細胞表現型を決定することができる。特定の局面では、1つまたは複数の細胞表現型は、対象または対象からのサンプルを、識別、診断、予後、または特徴付ける際に使用することができる。この方法は、あらゆる臨床エンドポイント、例えば患者の転帰、最小発育阻止濃度、感受性または耐性、滞在期間や患者のリスク等の予後など、のために最適化することができる。
【００４２】
迅速な表現型の診断および/またはスクリーニングの一般的な概念には、区画内の観察可能な変化が、区画化されたまたは封じ込められた細胞の機能的特徴を表すように、個々の細胞または細胞凝集体を区画化することが含まれる。細胞機能の変動が評価され、かつ/または特徴付けられて、この機能的変動または表現型が細胞を分類するために使用される。
【００４３】
単一細胞の区画化。  拡散環境が制限されているため、ピコスケール（サブナノリットル）の区画内での区画化または封じ込めは、反応容量内の細胞成分および生成物の濃度を大幅に濃縮し、細胞出力は、典型的な反応容量内の場合よりも、はるかに速く検出可能な濃度を達成することができる。例えば、500ピコリットルの反応容量中の1個の細胞は、1ミリリットルの反応容量中の200万個の細胞に相当する。その結果、区画化により、従来の容量で観察する場合よりも、はるかに迅速かつ高感度に細胞出力を観察することが可能になる。
【００４４】
同様に、封じ込められたまたは区画化された細胞は、ピコスケールの区画内の環境条件に急速に影響を及ぼす可能性がある。例えば、区画内のpHまたは酸化還元電位の変化は、封じ込められた細胞または娘細胞（1回または複数回の細胞分裂の結果）によって支配されると考えられる。
【００４５】
一部の単細胞微生物、特に、細胞分裂後に、モノクローナルな細胞の凝集体またはクラスターの状態で存在する場合が多い黄色ブドウ球菌などの細菌は、個々の細胞として単離できるとは限らない。細胞クラスター形成は、実際には、クラスターを形成する生物とクラスターを形成しない生物とを区別するために使用することができる表現型形質である。さらに、凝集した細胞は、一般に、同じ治療法、薬剤、または条件に応答すると考えられるため、治療上区別する必要はない。
【００４６】
リアルタイムの表現型の変動。  ピコスケールの容量では、区画内の観察可能な変化は、メタボローム、トランスクリプトーム、プロテオーム、または環境の変動を含む、細胞表現型によって支配される。例としては以下が挙げられる。
【００４７】
メタボロームの変動。  メタボロームは、生細胞の存在下で化学変換を受ける区画内の分子の完全なセットを含み、それには、酵素基質を含む、細胞とともに区画化される細胞試薬が含まれる。
【００４８】
酵素基質は、区画内のプロテオームまたはトランスクリプトーム（タンパク質またはRNA）内の酵素によって、触媒されるかまたは修飾される物質を含む。基質の変動は、本質的により多次元的であるため、ここではプロテオミクスおよびトランスクリプトームの変動と区別される。
【００４９】
基質の反応速度は、溶液の状態、基質の濃度、および酵素の活性部位への基質のアクセスに依存する。例えば、酵素基質は、細胞内の酵素にアクセスするために細胞壁および/または膜を透過する必要があり得る。細胞の透過性は種間で変動する可能性があるため、プロテオームおよび環境が両方の区画で同一であったとしても、異なる細胞種が封じ込められている2つの区画では、基質濃度は経時的に特徴的に変動する。
【００５０】
最後に、メタボロームの変動には基質の変動が含まれる場合が多いが、基質の変動には、酵素によって触媒される、化学変換を受ける区画に導入される試薬を含む、細胞の代謝経路に関与しない酵素および試薬が含まれることは明らかである。
【００５１】
トランスクリプトームの変動。  トランスクリプトームは、メッセンジャーRNA（mRNA）およびマイクロRNA（miRNA）を含む、区画内のRNA転写物の完全なセットを含む。RNA転写物の濃度は、細胞の表現型に応じて変動すると考えられ、区画化された細胞を分類するために使用することができる。マイクロRNAは分泌される場合が多く、細胞外から探索することができるので、ピコスケールの環境で迅速に濃縮され、細胞透過性に関する検出試薬を不要にする。
【００５２】
プロテオームの変動。  プロテオームは、区画内のタンパク質の完全なセットを含む。区画のプロテオミクス組成は、生細胞の存在下で細胞の表現型に応じて変動すると考えられる。プロテオームには、形質転換、トランスフェクション、および形質導入によって細胞に導入された外来遺伝子または異種遺伝子から発現したタンパク質が含まれてもよい。
【００５３】
環境の変動。  環境の変動は、区画の温度、pH、および酸化還元電位の変化を含む。ピコスケールの容量では、環境の変動は、細胞と、細胞とともに区画化された細胞反応体との相互作用によって支配される。
【００５４】
分類。  単一細胞を区画化することにより、区画内で観察される表現型の変化は、複数の種の平均ではなく単一細胞種の特徴であることが確保される。次に、統計データ分析を使用してこれらの変化を有用な情報に分類することができる。本発明の方法は、教師あり学習と教師なし学習の両方に依拠する統計的手法に適合する。
【００５５】
教師あり学習に基づく表現型診断。  分類は、そのカテゴリーの帰属関係が分かっている観察値の訓練セットに基づいて、表現型の観察がどのカテゴリーのセットに属するかを識別する問題である。分類は、正しく識別された観察値の訓練セットが利用可能である教師あり学習の例とみなされる。一例は、関連条件下の以前の観察値を使用して最適化された関数を使用して、患者のサンプルの観察された特徴に基づいて所与患者に診断を割り当てることである。本発明の方法は、教師あり学習に基づく統計分類法に適合し、それにはニューラルネットワーク、線形ベクトル量子化、線形分類器、サポートベクターマシン、二次分類器、決定木、カーネル推定、およびメタアルゴリズムアプローチが含まれる。特定の局面では、1つまたは複数のニューラルネットワークが使用される。
【００５６】
教師なし学習に基づく表現型診断。  教師なし学習に基づく統計分析は、相対的なカテゴリー化が予測値を持っている例において有用である。例えば、複数の薬剤を単一の細胞種で試験する場合、各薬剤の相対的な影響が1つまたは複数の最良の薬剤候補を予測することがある。
【００５７】
迅速な、表現型の評価。  図2は、迅速な表現型診断のための方法を図示する。生細胞を細胞試薬および/または細胞反応体で懸濁する。懸濁液を、リアルタイムで観察可能なピコスケールの区画に区画化する。各区画について観察された変化は波形に記録され、それは封じ込められた細胞に関する有用情報に分類され得る。「細胞試薬」という用語には、表現型の変動を観察するために使用される物質または物質の混合物が含まれる。細胞試薬は、細胞の代謝または表現型を変更または修飾することなく、区画内の状態の指示薬または検出体として働く。細胞試薬には、生死判定用色素、蛍光発生酵素の基質、および発光酵素の基質が含まれる。「細胞反応体」という用語には、表現型の変動を誘導するために使用される物質、つまり、基本的に、分析中に直接測定されない、細胞と相互作用する物質または物質の混合物が含まれる。細胞反応体は、細胞の代謝または表現型に影響を及ぼすかまたは変更することができる。細胞反応体には、細胞栄養素、抗菌剤、および細胞傷害性薬剤が含まれる。細胞栄養素には、培地、緩衝液、塩、ガス（例えば、O2およびCO2）、ホルモンなどが含まれるが、これらに限定されない。また、細胞栄養素には、任意の炭水化物、糖、およびアルコール、例えばリビトール/アドニトール、グルコース、マルトース、マンノース、パラチノース、スクロース、ガラクトース、リボース、ラフィノース、トレハロース、ゲンチオビオース、ラクトース、メリビオース、ラムノース、ソルボース、ツラノース、キシロース、および/またはメリジトース（melizitose）が含まれる。また、細胞反応体は、酵素阻害剤などを含み得る。薬剤には、限定されるものではないが、小分子、抗菌剤、化学療法薬、細胞傷害性薬剤、バクテリオファージ、ペプチド、ナノ粒子、CRISPR-CAS9に基づく治療法、免疫療法などが含まれる。
【００５８】
様々な局面において、サンプルは分割されるかまたは区画化される（図3）。サンプルまたは細胞懸濁液は複数の区画へと処理されることができる。次に、各区画は特徴付けされる（図4）。図4の左側では、観察可能な区画のシグナルが経時的にサンプリングされ記録されている。空の区画は、繰り返し可能なバックグラウンドシグナルを経時的に生成する。細胞を含む区画は、空の液滴から、または異なる細胞表現型をもつ区画から生成される変化とは異なるリアルタイムの変化を生成すると考えられる。記録されたシグナル波形は、サンプリングされた波形に基づいて各々の区画化された細胞を分類する分類機能、この場合にはニューラルネットワークに供給される。
【００５９】
図5は、本明細書に記載される方法の基本的態様を例示する。図5は、分割部分（サブサンプルまたはサンプルの一部）内の個々の区画からの表現型波形をサンプリングおよび記録し、記録した波形を分類のためにディープニューラルネットワークに供給する一例を例示する。
【００６０】
図6は、1つもしくは複数の試薬および/または1つもしくは複数の反応体を使用して行うことのできる様々なスキームを例示する。図6Aは、所与サンプルの表現型の変動を増加させるため、または異なる細胞型の栄養素の必要性を説明するために、各々がそれ自体の反応体混合物を含む複数の分割部分を利用する方法を例示する。特定の態様では、このスキームは試薬を含まない。図6Bは、細胞試薬と併せて使用される、図6Aと同様の態様の概略図である。図6Cは、同じ細胞反応体を共有するが異なる細胞試薬を含む分割部分を有するスキームの概略図である。試薬を用いない検出が可能な方法は、以下の通りである。
【００６１】
区画の光学密度。  細胞が成長するにつれて、それらは、細胞の成長の特徴に応じて変化すると考えられる、区画の光学密度（OD）に影響を及ぼすと考えられ、ODによって求められるそれらの成長の特徴を用いて細胞を分類することができる（例えば図21参照）。OD法は、単純な明視野顕微鏡を用いる二次元液滴アレイに特によく適している。
【００６２】
区画のスペクトル吸光度。  分光法を達成するには多くの方法がある。基本的な手法では、サンプルを白色ビーム源に曝し、検出器を用いてベースラインを確立した後、エミッター/検出器アセンブリで液滴の二次元アレイを全体にわたってスキャンし、透過スペクトルをベースラインと比較することによって吸収スペクトルが得られる。
【００６３】
酸化還元電位またはpH。  区画をシリコンにエッチングすることを伴う区画化法は、区画の変化する酸化還元電位およびpHを測定するための回路を組み込むことができる。
【００６４】
特定のスキームは、多試薬および多反応体分割部分を使用することができる。図7A〜図7Cは、細胞反応体と細胞試薬の組合せを1つまたは複数の分割部分の全体にわたって含むスキームを説明する概略図である。ある特定のスキームが図8に例示されている。図8Aは、細胞反応体が異なる栄養素混合物であり、単一の細胞試薬が使用されている、図6Bに例示されるスキームの一態様を例示する。図8Bは、細胞反応体が1つの栄養素混合物であり、細胞試薬が、生死判定用色素、蛍光発生基質、および発光基質の様々な組合せである、図7Bに例示されるスキームの一態様を例示する。
【００６５】
特定の局面では、本明細書に記載される方法は、試験物質を細胞への影響について評価するなど、細胞反応体の迅速な表現型検査に使用することができる。図9は、細胞反応体の、細胞種への影響を評価するための診断検査の概略図である。試験反応体（TR）は、試験サンプル（TS）にのみ存在し、試験サンプルはその他の点では対照サンプル（CS）分割部分と同一である。N1は、全波形をスパース表現に圧縮するエンコーダであり、スパース表現はその後CLによって分類される。特徴決定器（CH）は、例えば各区画の平均強度などの両方の集団の統計値全体を含む。N2は、CLで分類された波形を使用し、母集団統計値をTSとCSの両方のCHで使用して、臨床エンドポイントを計算する。
【００６６】
図10は、図9の試験反応体が薬剤であるスキームの概略図である。ここで、N2はCLで分類された波形を利用し、CHで母集団統計値を利用して、試験されている細胞と相互作用する薬剤の処方に関連する臨床エンドポイントを計算する。機械学習を使用して、ニューラルネットワークN2を任意の臨床エンドポイントに訓練することができる。例としては、患者の診断、患者の予後などが挙げられる。
【００６７】
患者の診断。  本明細書に記載される方法の1つの利点は、診断試験を、試験される細胞に関連する任意の臨床エンドポイントに直接最適化することを可能にする点である。
【００６８】
最小発育阻止濃度（MIC）。  微生物学では、最小発育阻止濃度（MIC）は、目視可能な微生物の成長を妨げる化学物質の最小濃度である。MIC情報は、感染部位に応じて、所与抗菌剤の最適な用量を計算するために使用することができる。
【００６９】
感受性（Susceptible）、中間（Intermediate）、または耐性（Resistant）（SIR）。  微生物学では、所与の病原体-抗菌剤の組合せに特異的なカットオフポイントを使用することにより、MIC結果をその組合せに対して感受性（susceptible）（または感受性（sensitive））、中間、または耐性と解釈する。MICカットオフは、CLSIガイドラインによって病原体ごとに確立されている。従来、抗菌剤感受性試験（AST）は、所与抗菌剤のMICを生成し、試験されている病原体を識別（ID）するために別個の試験が使用されている。病原体のIDは、試験されている抗菌剤のSIRカットオフを確立するために使用される。IDが分かって初めて、カットオフを確立することができ、MICが耐性または感受性を示しているのかどうかを理解することができる。
【００７０】
本明細書に記載される方法の利点は、CSサンプルの情報を用いて、CSの波形を分類学的分類に変換する中間ID段階を必要とすることなく、MICおよびSIRカットオフを同時に確立することができる点である。これにより、システム全体を2つの中間段階ではなく臨床エンドポイント（SIR）に最適化することが可能になる。
【００７１】
薬動力学。  抗菌剤のMICは、通常、薬剤の薬動力学を予測する方法である。MICは、抗菌剤の効力の尺度である。特定の種の分離株は、様々なMICを有する。感受性株は比較的低いMICを有し、耐性株は比較的高いMICを有すると考えられる。ブレークポイントMICは、感受性株と耐性株を分けるMICであり、従来、2つの異なる集団を区別する能力に基づいて選択されていた。1つはブレークポイント未満のMICを有する（つまり感受性）集団で、もう1つはブレークポイントより大きいMICを有する（つまり、耐性）集団である。
【００７２】
ブレークポイントMICの別の特性は、標準的な投与量を使用して達成可能な血清薬物レベルへの対応である。投薬戦略を導くために、MICを、抗菌剤が時間依存性であるか濃度依存性であるかなどの固有の抗生物質情報と組み合わせることができる。
【００７３】
患者のアンチバイオグラム。  アンチバイオグラムは、治療が検討されている一連の抗菌薬に対する、各抗生物質のSIRの結果であり、したがって特定の微生物の抗生物質感受性試験結果の全体的なプロファイルを一連の薬剤に提供する。複数の薬剤を使用することができ、薬剤ごとにそれぞれのプロファイルが文書化される。
【００７４】
化学療法感受性試験および哺乳類細胞の診断。  組織/細胞を単離することができかつ薬剤との曝露または接触が細胞の特徴を変更する、がんならびに組織に基づく疾患の化学療法感受性または薬剤感受性に、上記の抗菌剤感受性試験の方法はそのまま適用できる。
【００７５】
患者の予後。  患者の診断に加えて、一般に図9に記載される方法は、患者の予後情報、例えば患者の罹患率、死亡率、および入院期間などを提供するように最適化することができる。図11は、波形シグナルチェーンの概略図を提供する。対照分割部分と試験分割部分の両方の波形は、同じN1、CH、およびCLに供給されるが、結果として得られる統計値は、予測器のニューラルネットワーク（N2）の別々の入力ノードに供給されるため、CSおよびTSに存在する変動の詳細な比較が可能になる。図12は、この一般的なスキームを使用して、複数の薬剤を試験または評価することによって予後を得る一例を例示する。他の局面では、この方法は、様々な他の情報源、例えば画像データ、バイオマーカー、患者情報、コミュニティ情報などを含むことができる（例えば、図13参照）。
【００７６】
本明細書に記載される方法の一つの利点は、他の検査結果、患者情報、およびコミュニティ情報と組み合わせたサンプル分割部分の統計値を使用する機械学習を使用して診断を最適化して、図10に記載のものに加えて、以下を含むがこれらに限定されない、最も正確で包括的な診断および予後に到達することができる点である。
【００７７】
推奨される抗菌剤。  アンチバイオグラムは、感染を引き起こしている微生物に対して効果的である可能性の高い一連の抗生物質を医師に提供することができる。しかし、好ましい抗生物質を選択することはなお臨床医次第である。本明細書に記載される方法の利点は、関連する患者情報、コミュニティ情報、画像データ、および疾患マーカーを組み合わせた感染の表現型細胞プロファイルに基づいて、診断試験を最適化して患者の転帰を改善することができる点である。特定の態様では、診断試験は、行う必要のある最終的な臨床判断、すなわち、どの薬剤をどの用量で投与するかに最適化することができる。
【００７８】
患者情報には、限定されるものではないが、一次もしくは二次診断、年齢、以前の処置履歴、および/または基礎疾患を含む、患者の健康記録および現在の状態の情報が含まれる。患者情報には、ウェアラブルから派生したか、またはパーソナルアプリケーションソフトウェアに記録された生体認証データを含めることもできる。
【００７９】
コミュニティ情報は、限定されるものではないが、遺伝情報、年齢、国籍、民族性、居住地、就業場所、社会経済グループ、行動習慣、生活習慣、環境条件、化学物質への曝露、汚染物質等を含む、患者のコミュニティに関連する集約された医療情報である。患者が微生物感染症を患っている場合、コミュニティの監視および病院のアンチバイオグラム情報は、抗菌剤候補のセットを区別する上で大きな役割を果たす可能性がある。特定の局面では、患者のコミュニティは、疾患、状態またはそれらの組合せのリスクがあるか、あるいは現在または以前に疾患、状態またはそれらの組合せに罹患している患者のグループ;近隣、市、郡、州、国、大陸などの地理的地域;1つまたは複数の共通する人口統計を有する人口統計コミュニティなどに限定することができる。
【００８０】
疾患マーカーには、診断を改善するために表現型細胞データと組み合わせて使用することができる、サイトカイン、マイクロRNA、抗体、セルフリーDNA、ヒトゲノム情報、血液化学等を含む、他の臨床検査から得られる、検査対象の状態に関連するあらゆる情報が含まれる。
【００８１】
画像データには、患者の超音波画像、X線、CATスキャン、PETスキャン、MRIなどが含まれる。この種類のデータは、一般に臨床医によって解釈される。特定の局面では、ニューラルネットワークを使用して生の画像データを符号化してスパース表現を生成し、診断を助けるために予測器ニューラルネット、例えばN1に供給することができる。
【００８２】
患者の抗生物質処置履歴と組み合わせた本明細書に記載される方法から得られた細胞プロファイルは、患者が将来、抗菌剤耐性感染症に罹患するリスクを予測する、すなわち、耐性リスクを識別するために使用することができる。また、コミュニティ情報と組み合わせて用いて大流行リスクを予測することもできる。
【００８３】
I. 機械学習およびディープラーニング
データ科学者は、機械学習技術を利用して、実際のデータから予測を行うモデルを構築する。一般に、機械学習モデルがデータに応用される前に、いくつかの前処理段階が生データに適用される。前処理段階の一部の例には、データ品質プロセス（例えば、インピュテーションおよび外れ値の除去）、および特徴抽出プロセスが含まれる。従来、そのようなプロセスおよびモデルは、ビッグデータサンプル（「ビッグデータ」）（例えば、1台のマシンに収まらないほど大きいため、複数のマシンに保存する必要のある大量のデータサンプル、例えば、テラバイト以上のデータ）かまたはスモールデータサンプル（「スモールデータ」）（例えば、1台のマシンで簡単に保存および処理することができる少数のデータサンプル、例えばキロバイトまたはメガバイトのデータ）が動作するように構築される。訓練セットは、機械学習ユニット、例えばニューラルネットワークまたはサポートベクターマシンなどに提供される。訓練セットを使用して、機械学習ユニットは、波形に基づく成分に従ってサンプルを分類するためのモデルを生成することができる。
【００８４】
人工のニューラルネットワーク（NNet）は、脳の神経構造に基づく「ニューロン」のネットワークを模倣している。これらは、記録を一度に1つずつ、またはバッチモードで処理し、ニューラルネットワークによる記録の分類（最初は大部分が任意である）を既知の実際の記録の分類と比較することにより「学習する」。多層パーセプトロンニューラルネット（MLP-NNets）では、最初の記録の最初の分類の誤りは、ネットワークにフィードバックされ、2回目およびそれ以降の多くの反復でネットワークのアルゴリズムを修正するために使用される。
【００８５】
ある種の態様では、蛍光発生応答または他のシグナルが経時的に測定され、すべての測定値は一連の波形に収集される。特定の局面では、波形は、サンプル中の成分を認識するように事前に訓練されたニューラルネットワークを使用して、特徴的な特色に基づいて既知のクラスにクラスター化することができる。特定の局面は、個々の応答の母集団を取得し、機械学習を用いて、診断、処置、ならびにコミュニティの健康評価およびモニタリングに有用な臨床的に関連する情報を抽出する。
【００８６】
例えば、医療提供者は、培養結果を待つ間、症状のある患者を抗生物質で治療していた。これは、個々の患者と集団全体の両方に悪影響を及ぼし得る、抗生物質の無効な処置、処置ミス、または過剰処置につながる可能性がある。本発明の局面は、2〜6時間で完了することができる抗菌剤感受性を評価するために使用することができるため、効果的な処置をはるかに早く開始することができる。
【００８７】
本発明は、患者のサンプルから臨床的に関連する情報を抽出する機械学習技術を記載しているため、設計者のバイアスなく最良のモデルを決定し、最適化することができる。人間の観察では容易に明らかにならないかもしれないデータ中に隠れている構造が、機械学習によって明らかになる可能性がある。
【００８８】
例えば、方法を用いて、試験するためにアッセイが設計されている、すべての標的病原体および標的抗生物質の抗生物質耐性の様々なレベルで、病原性微生物サンプルを得ることができる。これらのサンプルを、様々な既知耐性レベルで、対照サンプルと抗生物質感受性サンプルに分ける。λをポアソン分布の確率変数とする。各対照サンプルの場合、蛍光発生剤または他の試薬と混合したλ微生物病原体を含む、個別のユニットに、サンプルを区画化する。各抗生物質感受性サンプルの場合および各抗生物質の場合、抗生物質および蛍光発生剤、または他の試薬と混合したλ微生物病原体を含む、個別のユニットに、サンプルを区画化する。各区画化された微生物の蛍光発生応答または他のシグナルを経時的に測定し、シグナルを一連の波形に収集する。どの区画にゼロでない病原体が存在し（陽性）、どの区画が空であるか（陰性）を効果的に決定する光学的メトリックに基づいてシグナルを2つのクラスの正と負の波形に分割する。
【００８９】
特定の態様は、水性エマルジョンに懸濁された油滴内の細菌細胞およびレサズリン色素を区画化する。この態様では、λ＜1は、アッセイのダイナミックレンジ要件に基づいて決定される。液滴をイメージングチャンバーにロードし、一連の画像を2〜6時間にわたって撮影する。各画像の液滴を識別し、ソフトウェアにより一連の画像と相互に関連付けて、ミトコンドリアのレサズリン/レゾルフィン還元の波形を生成する。次に、各波形に光学的メトリックを適用した後に、ソフトウェアが、OTSUセグメンテーション、カーネル密度推定、または固定閾値セグメンテーションを使用して波形を「正」と「負」に分ける。さらに、好ましい態様は、融合液滴、積層液滴、および無相関液滴をフィルタにかける。
【００９０】
波形データを収集した後、データを相互検証のために訓練セットおよび試験セットの2つのセットに分割する。それぞれの正の波形は、それが時間次元にN個のポイントを有し、その蛍光次元が0.0〜1.0の範囲になるように正規化されている。
【００９１】
訓練は、教師なし学習段階から始まり、各波形の次元をN個のポイントから、より小さい数であるM＝4〜10個に減らす。蛍光（またはシグナル）次元を正規化することにより、曲線の相対的な大きさは無視され、曲線の形状が重要となる。オートエンコーダを訓練して、次元を、Nから小さい数のM＝4〜10に減らす。訓練データは、オートエンコーダを訓練するためのサブセットと、オートエンコーダを試験するためのサブセットにさらに分割される。好ましい態様では、オートエンコーダは、1次元の畳み込み層とそれに続くサイズMの完全に接続された層とを備えるニューラルネットワークである。出力の範囲を0.0〜1.0にするtanhなどの活性化関数が適用される。これらのMの活性化の出力は、M次元でのそれぞれの波形の「符号化」となる。主成分分析および固有ベクトル分解などの、存在するデータの次元を縮小する他の方法が存在し、これらは同様に有用であり得る。
【００９２】
次に、波形「クラス」Kの最適な数が決定される。好ましい態様では、最適値Kは、様々な値のKを用いて「Kはクラスタリングを意味する」を繰り返し適用することによって決定される。Kごとに、適合の歪みが計算され、「エルボー法」などの統計的方法、あるいは「ジャンプ法」または「破線法」などのレート歪み法に基づいて最適な値が選択される。最適な値Kが選択された後、曲線は、Kクラスター中心の最近傍分類に従って分類される。これにより、教師なし訓練段階が完了する。
【００９３】
訓練は、標的抗生物質および波形のダイジェストを抗生物質感受性メトリックにマッピングする、回帰関数F（t,d）＝μをモデル化する教師あり段階で継続される。好ましい態様では、抗生物質感受性メトリックは、抗生物質の最小発育阻止濃度であり、波形のダイジェストは、以下のような4（K＋1）要素のベクトルであり、以下を連結したものである。
【００９４】
（1）各要素0＜＝j＜kが、対照サンプル中の陽性の液滴で発生する波形クラス「j」の比であり、j＝kでの要素が、対照サンプルで発生する陰性の比である、K＋1要素のベクトル。
【００９５】
（2）各クラスの液滴波形の平均強度と、対照サンプル中のすべての液滴波形の平均強度との比が異なることを除いて、要素が（1）と同様に定義される、K＋1要素のベクトル。
【００９６】
（3）抗生物質感受性試験サンプルを除いて、要素が（1）と同様に定義される、K＋1要素のベクトル。
【００９７】
（4）抗生物質感受性試験サンプルを除いて、要素が（2）と同様に定義される、K＋1要素のベクトル。
【００９８】
好ましい態様では、モデルは、4（K＋1）の入力ノードと、いくつかの隠れ層と、抗生物質感受性メトリックに対応する1つの出力ノードとを有する、ディープニューラルネットワークである。代替態様では、抗生物質感受性メトリックは、0〜1の範囲の単位のない値であり、ここで、0は、抗生物質耐性がないことを示し、1は、対照と違いがないと定義される完全な抗生物質耐性を示す。回帰関数を訓練した後、テストデータセットに対して保留されたデータを使用することにより、関数の精度を評価する。
【００９９】
好ましい態様では、訓練データは、以下によって増強される。
【０１００】
（1）各データのランダムサンプリングで波形のダイジェストを構築する。
【０１０１】
（2）波形ダイジェストを構築する前に、それぞれの正の波形を分類する際に、M最近傍分類を使用する。それぞれの正の波形wについて、すべてのKの中でwに最も近い波形クラスター中心のセットMを見出す。K＋1要素j＝0〜K＋1のベクトルvは、Mにおける位置jが、各中心jへの近接量wであり、Mにない位置jが0であるような、加重平均である。「近接量」の例は、逆距離加重、または確率分布からの評価であり得る。
【０１０２】
（3）分散の小さい確率変数による波形ダイジェストの摂動と、それに続く繰り込み。
【０１０３】
抗生物質感受性試験を患者のサンプルで行う場合、サンプルは、回路番号Aが抗生物質を含まず対照データであり、かつ各回路番号j＝0〜A-1が特定の抗生物質jを含み抗生物質jの感受性データである、A＋1回路にロードされる。微生物を区画化し、蛍光発生応答（または他のシグナル）を経時的に測定し、波形を抽出して前記のように「正」と「負」に分ける。各回路jについて、波形を正規化し、分類する。各回路j＝0〜A-1について、回路jおよびAからの波形を含むダイジェストd（j）を前記のように構築する。回帰関数F（j,d（j））を評価して抗生物質感受性メトリックを決定する。この抗生物質感受性メトリックを、訓練データによって定義された標準曲線または表に基づいてSIR値またはMIC値などの臨床結果にマッピングする。
【０１０４】
特定の局面では、特徴決定器は、実行されている分析の目的に応じて、多様な入力を受診し、多様な出力を送信することができる。特徴決定器への入力および出力の特定の例では、出力は次のとおりである：（i）分割部分のすべての波形の平均最大シグナル；（ii）分割部分のすべての波形の曲線下面積；（iii）分割部分のすべての波形の平均最大導関数；（iv）各波形が分割部分のすべての波形の特定の閾値を超える平均時点；（v）「平均」の代わりに「中央値」を使用することを除いて上記と同じもの；（vi）正規化された波形を使用することを除いて上記と同じものであり、ここで、各波形は、同じ分割部分内の陰性の区画（細胞を含まない区画）の波形の同じ時点での平均シグナルで除算される。分類器への入力の例には、患者情報、コミュニティ情報、および/または画像データを含む上記入力に加えて、（i）生の波形および/または（ii）寸法的に縮小された波形が含まれる。
【０１０５】
さらに、オートエンコーダを使用して、正の波形（実際に成長を示す波形）に何らかの教師なし学習を行うことにより、本発明者らは、符号化されたベクトル空間におけるデータのクラスターを導出することができる。一部の種の分布が、符号化されたベクトル空間でマルチモーダルである場合、クラスターの数は細菌種の数よりも多いことがある。クラスターKの数を呼び出し、それらに1からKまでのラベルを付ける。対照分割部分のそれぞれの負の波形（成長を示さなかった波形）については、それをクラスター0に属しているとカウントする。対照分割部分のそれぞれの正の波形については、それが属している可能性が最も高いクラスターを決定する。
【０１０６】
特徴決定器へのさらなる入力としては、以下が挙げられる:（i）要素jが、クラスターjに属するすべての波形の最大蛍光値の平均に相当する、K＋1要素j＝0〜Kのベクトル；（ii）要素jが、クラスターjに属するすべての波形の波形蛍光曲線下の平均面積に相当する、K＋1要素j＝0〜Kのベクトル；（iii）要素jが、クラスターjに属するすべての波形の最大導関数蛍光値の平均に相当する、K＋1要素j＝0〜Kのベクトル；（iv）各波形の蛍光曲線が、クラスターjに属するすべての波形の中で最初に特定の閾値に到達する平均時点に、要素jが相当する、K＋1要素j＝0〜Kのベクトル；（v）「平均」ではなく「中央値」についても同様に定義されるもの；（vi）正規化された波形を使用することを除いて上記と同じものであり、ここで、各波形は、他と同様にクラスター0（細胞を含まない区画）の波形の同じ時点での平均シグナルで除算される。
【０１０７】
II. 一般的な方法
特定の局面では、サンプルの処理には、溶解または洗浄は必要ではない。インタクトな細胞を使用するため、核酸分子ではなく細胞全体のみを操作する必要がある。核酸分子はサイズが小さく、様々な物質と電荷に基づく相互作用が起こりやすいため、操作が非常に困難である。さらに、細胞は単一の温度、一般に25〜45℃の範囲の比較的低い温度でインキュベートすることができ、ほとんどのNATに必要とされる熱サイクル装置の必要性をなくし、現在記載されている発明のコストおよびワークフローの複雑さを低減させる。有利には、高温の工程を回避することにより、本発明は、反応の完全性および/または蛍光読み出しを混乱させる可能性のある、流体の蒸発および/または気泡によって生じ得る重大な問題を回避する。
【０１０８】
少なくとも1つの標的細胞を含む試験サンプルまたはサンプル部分は、試薬、例えば生死判定用色素またはレポーターと組み合わせて、または組み合わさずに、統計学的に有意な数の区画または液滴が、2以上の細胞または細胞の凝集体（一部の細胞は凝集して細胞クラスターまたは鎖となる傾向がある）を含まないように、区画または液滴に区画化することができる。試薬は、細胞の存在下でシグナルを生成するように、または生成しないように作用することができる。各液滴は経時的にモニターされ、データは各区画を識別し、特徴付けるために使用される。本発明のプロセスのさらなる詳細を以下に示す。
【０１０９】
サンプル。  サンプル中の細胞は、細菌、真菌、植物細胞、動物細胞、または任意のその他の細胞性生物の細胞を含むことができる。細胞は培養細胞であってもよいし、自然起源から直接得られた細胞であってもよい。細胞は、生物から直接得てもよいし、生物から得た生体サンプル、例えば、痰、唾液、尿、血液、脳脊髄液、精液、便、および組織から得てもよい。一態様では、サンプルには、多様な他の成分、例えば他の細胞（バックグラウンド細胞）、ウイルス、タンパク質、およびセルフリー核酸などを含む、生体サンプルから単離された細胞が含まれる。細胞は、ウイルスまたは別の細胞内病原体が感染していてもよい。その後、単離細胞を得た媒体とは異なる媒体に単離細胞を再懸濁してもよい。一態様では、サンプルは、細胞を複製および/または生存可能に保つことを可能にする栄養培地に懸濁させた細胞を含む。栄養培地は、既知の量またはすべての成分を含む規定培地であってもよいし、栄養素が酵母抽出物またはカゼイン加水分解物などの複雑な成分である規定されていない培地であってもよく、これは、グルコースなどの炭素源、水、様々な塩、アミノ酸および窒素を含む、未知の割合の多くの化学種の混合物を含む。一態様では、試験サンプル中の標的細胞は病原体を含み、栄養培地は病原体を培養するために一般的に使用される栄養ブロス（液体培地）、例えば、溶原性ブロス、ミューラー・ヒントンブロス、ニュートリエントブロスまたはトリプティックソイブロスなどを含む。任意の態様では、選好性生物の成長を促進するために、血清または合成血清を培地に補充してもよい。
【０１１０】
区画化。  本発明の特定の方法は、細胞を含むサンプルまたはサンプル部分またはサンプルの一部を、1つもしくは複数の試薬および/または1つもしくは複数の反応体と組み合わせた後、サンプルまたはサンプル部分を区画化する工程、を含む。サンプルは、区画の統計学的に有意な部分が、2以上の標的細胞または細胞凝集体を含まないように区画化されている。区画の数は、用途に応じて数百から数百万まで様々であり得る。区画の容量も用途に応じて1pL〜100nLで変動し得るが、好ましくは25〜500pLである。本明細書に記載される方法は、どんな区画化方法にも適合する。
【０１１１】
区画化の、1つの限定されない方法は、液滴の使用である。液滴形成の方法は様々であるが、すべての方法は、水性相、この場合には試験サンプルを、連続相とも呼ばれる非混和性相に分散させて、各液滴が非混和性の担体流体に囲まれるようにする。一態様では、非混和性相は油である。特定の局面では、この油は界面活性剤を含み得る。関連する態様では、非混和性相は、フルオロ界面活性剤を含むフッ化炭素油である。フッ化炭素油を使用する重要な利点は、それがガスを比較的よく溶かすことができ、生物学的に不活性である点である。したがって、本明細書に記載される方法で使用されるフッ化炭素油は、細胞の生存に必要な可溶化ガスを含む。
【０１１２】
液滴形成の、1つの限定されない例は、ラプラス圧力勾配を使用することによる（例えば、Dangla et al.,2013,PNAS 110（3）:853-58参照）。ラプラス圧力は、曲面の内側と外側の圧力差、例えば、液滴の内側と外側の圧力差である。細胞または微生物を含む水性相は、適切な装置において水性の「舌」を形成する連続相（すなわち、非混和性流体）のリザーバを有する装置に導入することができる。装置は、高さの変動をマイクロチャネルに組み込むことができ、これは高さの変動に遭遇していない水性相の部分と、高さの変動のある下流の水性相の部分との曲率の差を非混和性界面に与える。水性相が高さの変動部を通って流れる時、高さの変動部の下流の水性相の部分で臨界曲率に達し、それを超えると2つの部分が静的平衡にとどまることができなくなり、水性相を連続相に導入することによって形成された舌から下流部分が離れる時に、水性相は液滴に分けられ、液滴のサイズは装置の幾何学的形状によって決定される。高さの変動は、マイクロチャネルの高さの単一段階の変化（一段階乳化）、多段階の変化（多段階乳化）、および限局部のランプ勾配または同様に段階的な勾配によって実現することができる。
【０１１３】
レポーター。  本明細書に開示されるシステムおよび方法では、多様なレポーターを試薬として使用することができる。例えば、レポーターは、フルオロフォア、フルオロフォアで標識されたタンパク質、光酸化可能な補因子を含むタンパク質、別途挿入されたフルオロフォアを含むタンパク質、ミトコンドリア生体染色物質もしくは色素、酸化還元反応性色素、膜局在性色素、エネルギー伝達特性を有する色素、pH指示色素、および/または、色素と、酵素によって作用することができる部分とから構成される、任意の分子、であり得る。さらなる態様において、レポーターは、レサズリン色素、アクリジン、テトラゾリウム色素、クマリン色素、アントラキノン色素、シアニン色素、アゾ色素、キサンテン色素、アリールメチン色素、ピレン誘導体色素、ルテニウムビピリジル複合色素、またはそれらの誘導体であるか、あるいはこれらを含むことができる。本明細書で使用されるレポーターという用語にも含まれる細胞生死判定用色素は、液滴内に封じ込められた個々の細胞または病原体を識別し特徴付けるための分析試薬として使用される。生死判定用色素は、1950年代から細胞生存率を判定する目的で使用されてきた。しかし、これらの試薬は一般に、容量が1マイクロリットルを大幅に超えるサンプルで用いられ、かつ/または生存細胞の存在を示すエンドポイントアッセイとして使用されている。本発明の局面は、生死判定用色素を1pL〜100nL、より具体的には25〜500pLである液滴で使用する。本明細書に記載される方法では、生死判定用色素によって生成された光シグナルは、小さな液滴容量によって濃縮され、インキュベーション時間にわたって測定され記録される。生存細胞を含む液滴では、これにより、迅速に生成され、液滴内に封じ込められた細胞の特徴に関する情報を有する光学的シグネチャが得られる。環境ストレス要因、例えば抗菌剤または細胞傷害性薬剤などと組合せると、細胞を含む液滴の光シグナルを経時的にモニターすることにより、さらなるシグネチャを生成することができる。環境ストレス要因がある場合とない場合の細胞から得た光学的シグネチャを使用して、細胞の同一性および/または特徴を決定することができる。さらに、薬剤に曝露されていない同じ種の標的細胞の光学的シグネチャと比較した、薬剤に曝露された細胞の種から得た光学的シグネチャの差異を用いて、試験サンプルから得た標的細胞の表現型の薬剤耐性プロファイルを決定することができる。これらのシグネチャは、液滴に封じ込められた個々の細胞から生成されているので、多くの細胞を含むバルクサンプルから生成される細胞集団の平均の特徴とは対照的に、これらは各細胞の個々の特徴についての情報を表す。
【０１１４】
本明細書に記載される方法は、生細胞に対して（細胞溶解を必要とせずに）使用することのできる任意の生死判定用色素またはレポーターまたは蛍光発生酵素基質もしくは発光酵素基質に適合する。好ましい態様では、生死判定用色素は、レゾルフィン系色素またはその誘導体である。一例はレサズリンであり、これはピンク色で高蛍光性のレゾルフィンに不可逆的に還元されると（図6）、蛍光シグナルおよび比色シフト（青色からピンク色への）を生成する。好ましい態様では、蛍光は、比色シグナルの変化に対して、より良好な感度を提供するために使用される。分泌された蛍光分子の、サブナノリットルの容量の中での拡散が制限される限局化は、検出可能なシグナルレベルに急速に濃縮され、その後、以下に記載される方法によって検出される。さらに、酸化還元環境が、特定の酸化還元閾値（通常は-100mV前後）を下回ると、レゾルフィンは可逆的に非蛍光ヒドロレゾルフィンに還元される（図6）。液滴の酸化還元電位に応じた、レサズリンからレゾルフィンへの不可逆的還元、レゾルフィンからヒドロレゾルフィンへの可逆的還元、およびヒドロレゾルフィンがレゾルフィンに戻る酸化の組合せは、単一の細胞または細胞凝集体の存在下で酸化還元変化が迅速に起こるように十分に小さい容量の液滴に特有の蛍光シグネチャを経時的に生成する組合せである。市販のレサズリンに基づく色素の例は、AlamarBlue（商標）（各社）、PrestoBlue（商標）（Thermo Fisher Scientific）、Cell-titer Blue（商標）（Promega）、またはレサズリンナトリウム塩粉末（Sigma-Aldrich）である。レサズリンに構造的に関連し、本方法で使用することもできる色素は、10-アセチル-3、7-ジヒドロキシフェノキサジン（Amplex Red（商標）としても公知）、C12レサズリン、および1,3-ジクロロ-7-ヒドロキシ-9,9-ジメチルアクリジン-2（9H）-オン（DDAO色素）である。代替態様では、レゾルフィンは、蛍光発生基質として働く切断可能部分で修飾されている。市販のレゾルフィンに基づく蛍光発生基質の例は、7-エトキシレゾルフィン、レゾルフィン-β-D-グルクロン酸、レゾルフィン-β-グルクロン酸メチルエステルである。代替態様では、ホルマザン色素などのテトラゾリウム還元に依存する色素を、細胞生存率の指示薬として使用することができる。例としては、INT、MTT、XTT、MTS、TTCまたはテトラゾリウムクロライド、NBT、およびWSTシリーズが挙げられる。代替態様では、レポーターには、4-メチルウンベリフェロン（4-MU）、7-ヒドロキシクマリン-3-カルボン酸エチル（EHC）、7-アミド-4-メチルクマリン（AMC）、フルオレセイン、およびレゾルフィンなどの蛍光発生基質を含めることができる。代替態様では、レポーターは、Aldol（登録商標）指示薬（Biosynth）であり得る。代替態様では、レポーターには、ルミノール、Shaapデオキセタン、ルシフェリン誘導体およびプロト基質、ならびにジオキセタン誘導体などの発光基質を含めることができる。化学発光レポーターは、蛍光レポーターと組み合わせて、類似のDCCを区別する際に役立つ、細胞に特異的な波形の変動を増加させることができる。特定の局面では、レポーターは、特定の酵素に不安定な基を有するジオキセタン誘導体である。単離された細胞によって発現された酵素に曝されると、酵素不安定基は切断され、対応する不安定なフェノラートアニオンを遊離し、分解して、その励起されていない基底状態に戻ることによって発光する高エネルギー中間体を生成する。ジオキセタン誘導体の一例は、AquaSpark（Biosynth）である。ルシフェラーゼプロト基質も、蛍光および/または化学発光レポーターと組み合わせて、細胞特異的な変動を増加させることができる。プロト基質は、単離細胞内でルシフェラーゼ基質に還元された後、ルシフェラーゼにより酸化されて生物発光シグナルを生成する。例には、リアルタイムGlo（Promega）がある。
【０１１５】
本発明は、非発光アッセイ、例えば、蛍光アッセイ、比色アッセイ、および/または発光アッセイの多重化を提供する。本明細書において、「発光アッセイ」には、細胞成分によって一度作用を受けた分子が発光性である反応が含まれる。発光アッセイには、限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、β-ラクタマーゼ、プロテアーゼ、アルカリホスファターゼ、またはペルオキシダーゼと、適した対応する基質、例えば、修飾形態のルシフェリン、セレンテラジン、ルミノール、ペプチドまたはポリペプチド、ジオキセタン、ジオキセタノン、および関連するアクリジニウムエステルとを用いるかまたは検出するアッセイを含む、化学発光アッセイおよび生物発光アッセイが含まれる。本明細書において、「発光アッセイ試薬」には、基質、ならびに発光反応のために基質を切断または修飾する活性化因子または酵素が含まれる。
【０１１６】
特定の局面では、1つまたは複数の単離細胞は、発光反応を生成する際に有用な酵素を有するかまたは発現することができる。特に、本発明で有用な酵素には、酵素活性を示す任意のタンパク質、例えば、リパーゼ、ホスホリパーゼ、スルファターゼ、ウレアーゼ、アリルアミダーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、オキシダーゼ、カタラーゼ、硝酸レダクターゼ、およびエステラーゼが含まれ、それには酸性ホスファターゼ、グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ガラクトシダーゼ、カルボキシルエステラーゼ、およびルシフェラーゼが含まれる。一態様では、酵素の1つは加水分解酵素である。別の態様では、酵素の少なくとも2つは加水分解酵素である。加水分解酵素の例としては、アルカリ性および酸性ホスファターゼ、エステラーゼ、デカルボキシラーゼ、ホスホリパーゼD、P-キシロシダーゼ、β-D-フルコシダーゼ、チオグルコシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、α-D-ガラクトシダーゼ、α-D-グルコシダーゼ、β-D-グルコシダーゼ、β-D-グルクロニダーゼ、α-D-マンノシダーゼ、β-D-マンノシダーゼ、β-D-フルクトフラノシダーゼ、およびβ-D-グルコシドウロナーゼが挙げられる。
【０１１７】
アルカリホスファターゼの場合、基質は、リン酸塩含有ジオキセタン、例えば、3-（2’-スピロアダマンタン）-4-メトキシ-4-（3”-ホスホリルオキシ）フェニル-1,2-ジオキセタン、二ナトリウム塩、または3-（4-メトキシスピロ［1,2-ジオキセタン-3,2’（5’-クロロ）-トリシクロ-［3.3.1.13,7］デカン］-4-イル］フェニルリン酸二ナトリウム、または2-クロロ-5-（4-メトキシスピロ｛1,2-ジオキセタン-3,2’-（5’-クロロ）-トリシクロ｛3.3.1.13,7］デカン｝-4-イル）-1-フェニルリン酸二ナトリウム、または2-クロロ-5-（4-メトキシスピロ｛1,2-ジオキセタン-3,2’-トリシクロ［3.3.1.13,7］デカン｝-4-yl）-1-フェンジル（phenzyl）リン酸二ナトリウム（それぞれ、AMPPD、CSPD、CDP-Star（登録商標）およびADP-Star（商標））を含むことが好ましい。
【０１１８】
β-ガラクトシダーゼの場合、基質は、ガラクトシダーゼで切断可能な基またはガラクトピラノシド基を含むジオキセタンを含むことが好ましい。アッセイでの発光は、ジオキセタン基質から糖部分を酵素で切断することに起因する。そのような基質の例としては、3-（2’-スピロアダマンタン）-4-メトキシ-4-（3”-β-D-ガラクトピラノシル）フェニル-1,2-ジオキセタン（AMPGD）、3-（4-メトキシスピロ［1,2-ジオキセタン-3,2’-（5’-クロロ）トリシクロ［3.3.1.13,7］-デカン］-4-イル-フェニル-β-D-ガラクトピラノシド（Galacton（登録商標））、5-クロロ-3-（メトキシスピロ［1,2-ジオキセタン-3,2’-（5’-クロロ）トリシクロ［3.3.13,7］デカン-4-イル-フェニル-β-D-ガラクトピラノシド（Galacton-Plus（登録商標））、および2-クロロ-5-（4-メトキシスピロ［1,2-ジオキセタン-3,2’（5’-クロロ）-トリシクロ-［3.3.1.13,7］デカン］-4-イル）フェニルβ-D-ガラクトピラノシド（Galacton-Star（登録商標））が挙げられる。
【０１１９】
β-グルクロニダーゼおよびβ-グルコシダーゼのアッセイでは、基質は、グルクロニドなどのβ-グルクロニダーゼで切断可能な基を含有するジオキセタン、例えば、ナトリウム  3-（4-メトキシスピロ｛1,2-ジオキセタン-3,2’-（5’-クロロ）-トリシクロ［3.3.1.13,7］デカン｝-4-イル）フェニル-β-D-グルクロネート（Glucuron（商標））を含む。カルボキシルエステラーゼのアッセイでは、基質は、ジオキセタンに結合した適したエステル基を含む。プロテアーゼおよびホスホリパーゼのアッセイでは、基質は、ジオキセタンに結合した適した酵素切断可能な基を含む。
【０１２０】
好ましくは、アッセイの各酵素の基質は異なる。1つのジオキセタン含有基質を含むアッセイの場合、基質は、必要に応じて、置換または非置換アダマンチル基、置換されていても非置換であってもよいY基、および酵素切断可能な基を含む。好ましいジオキセタンの例としては、上記に言及されるもの、例えば、Galacton（登録商標）、Galacton-Plus（登録商標）、CDP-Star（登録商標）、Glucuron（商標）、AMPPD、Galacton-Star（登録商標）、およびADP-Star（商標）と呼ばれるもの、ならびに3-（4-メトキシスピロ｛1,2-ジオキセタン-3,2’-（5’-クロロ）-トリシクロ［3.3.1.13,7］デカン｝-4-イル）フェニル-β-D-グルコピラノシド（Glucon（商標））、CSPD、3-クロロ-5-（4-メトキシスピロ｛1,2-ジオキセタン-3,2’（5’-クロロ）-トリシクロ-［3.3.1.13,7］デカン）-4-イル）-1-フェニルリン酸二ナトリウム（CDP）が挙げられる。
【０１２１】
細胞（DCC）凝集体。  本発明の好ましい用途は、感染を引き起こしている微生物を識別し、それらが抗菌剤に耐性があるかどうかを識別することによる、微生物感染の診断に向けられている。したがって、本願において、DCCは単一細胞の微生物であり得る。しかし、一部の細菌は、自然に凝集してクラスターまたは鎖になる。これらの場合には、一部の液滴は、単一の微生物ではなく同じ微生物種の細胞の凝集体（均質な凝集体）を含む場合がある。これらの場合には、曲線の形状が凝集体の細胞数に影響を受ける可能性がある。しかし、区画化した細胞を分類するために使用される、保存されたシグネチャの波形および呼び出しロジックは、単一細胞を説明することができるのと同じ方法でそのような凝集を説明することができる。さらに、態様が抗菌剤感受性試験を含む場合、抗菌剤を含む混合物は、抗菌剤を除外した混合物と同じ細胞凝集の特徴を示すと考えられ、比較は依然として正確であると考えられる。そのため、本発明の方法は、概して、各液滴中の単一細胞の単離を含むが、個々の細胞ではなく液滴中で単離された均質な凝集体中の単一細胞種の場合にも必然的に適合する。がん疾患の診断の場合、標的DCCは一般に、血中循環腫瘍細胞である場合は凝集しない。がん細胞が組織から得られる場合、組織は一般に分析の前に個々の細胞に分解される。そのため、各液滴は最大1つの細胞を含む。しかし、一部の例では、記載される方法を使用してがん凝集体も分析されることがある。
【０１２２】
シグナルの検出。  液滴が生成されると、光学システム、センサ、またはセンサアレイによる分析のために液滴を提示する必要がある。好ましい態様では、液滴は、良好な熱制御を維持することができるように二次元アレイで提示され、液滴のシグナルは多数の液滴について同時に（時間内の1回のインスタンスで）測定されることができる。標的細胞を含有する液滴では、レポーターは、細胞を含まないバックグラウンド液滴よりも高くなる、濃縮された蛍光シグナルを生成すると考えられる。液滴の濃縮されたシグナルにより、高速識別の標準的基準である同等の時間標準PCR技術で単一細胞の識別が可能になる。特定の局面では、特定波長の光で、還元されたレポーターを励起し、バンドパスフィルタで処理されたストークスシフト光をカメラで収集することによって、シグナルが検出される。イメージング技術を使用する利点は、これらが、静止したままである液滴アレイを画像化することができる点と、そのため、経時的に容易にモニターされることができる点である。サイトメトリーに基づく方法では、移動する液滴を経時的に追跡することが困難なため、一般にリアルタイム検出ではなくエンドポイント検出が採用されている。アレイを画像化する別の利点は、すべての液滴が分析時に同じ反応条件を経験することである。そのため、液滴のシグナルを同等の時点で比較することができる。シグナルは時間とともに変動するため、これは重要である。サイトメトリーアプローチでは、液滴は異なる時間に検出器を通過する。そのため、一部の液滴は、分析時に他の液滴よりも長くインキュベートされる。最後に、試験サンプルには異なる標的細胞種が存在し得る。それぞれの種ごとに、特定の時点でシグナルを最大化する最適な液滴容量および色素またはレポーター濃度があり得る。エンドポイント方法を使用する場合、時間は最適に及ばない部分を補うことができ、様々な種は単一の色素および液滴濃縮物内で例外なく特徴付けることができるため、液滴容量およびレポーター濃度を同じ程度に制御する必要はない。
【０１２３】
多重化。  本明細書に記載される方法は、単一試験サンプルからの複数の細胞の特異的識別を含む。単一細胞を、それら自体が分けられた液滴に区画化することにより、細胞間の資源の競合が除かれる。そのため、バルク集団に少数派として集合的に存在する個々の細胞は、大多数の細胞集団と比較して、これからは栄養素へのアクセスが等しくなり、その結果、複数の細胞種を有するサンプル中での存在量の少ない細胞に対する感度が高くなる。本発明の多重化の制限は、異なる細胞型間で生存率シグネチャを区別する能力に依存する。多重化のためのほとんどの方法には、複数の色素（フルオロフォア）が必要であり、これには今度は、複数セットのLED、励起フィルタおよび発光フィルタが必要である。本明細書に記載される方法は、スペクトル情報ではなく形状情報を使用するため、この方法を使用して、1つのLED、発光フィルタ、および励起フィルタのみを必要とする単一の色素またはレポーターで多くの標的を多重化することができ、したがって分析を実施するために必要なハードウェアを簡略化することができる。他の態様では、複数のレポーターを組み合わせて、一緒に、または別々に使用することがあり得、この際、レポーターは、複数の独立した代謝経路を関心対象の各液滴について測定できるように、異なるスペクトル波長または発光クラス（例えば、蛍光、化学発光または比色）のセットから選択される。例えば、レサズリンなどの酸化還元感受性蛍光発生色素は、酵素活性のための第2の蛍光発生レポーター、例えばフルオレセインβ-ガラクトピラノシドおよびルシフェリン/ルシフェラーゼなどの生物発光レポーターと組み合わせて使用することができる。各レポーターが特有の細菌特異的情報を提供する場合、任意の数のさらなるレポーターを組合せて使用することができる。
【実施例】
【０１２４】
以下の実施例ならびに図は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれている。実施例または図面に開示された技術は、本発明の実践において十分に機能する、本発明者らによって発見された技術を表す。したがって、その実践のための好ましい様式を構成するとみなされることを当業者は理解するべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の態様において多くの変更を行うことができ、それでも本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
【０１２５】
コアテクノロジー
個々の微生物細胞は、生細胞の存在下で蛍光を発する細胞生死判定用色素とともに、ピコスケールの液滴に封じ込められる。ある種の態様では、レサズリンに基づく色素が使用される。生細胞の存在下、レゾルフィン分子は、ピコスケールの液滴環境の中で急速に濃縮し、容易に検出可能な蛍光シグナルを生成すると考えられる。
【０１２６】
各微生物がレサズリンを還元する速度は、透過性、代謝プロファイル、サイズ、成長速度などの細胞特異的な特徴に依存する。さらに、液滴内部のピコスケールの環境の中で、封じ込められた微生物は、レゾルフィンがヒドロレゾルフィンに還元されるかどうかを決定する条件（例えば、酸化還元電位）を支配すると考えられる。その結果、様々な微生物種が特有の蛍光「シグネチャ」を経時的に生成し、各液滴中の微生物の識別が可能になる。
【０１２７】
さらなる蛍光発生試薬を必要に応じてこれらのアッセイに組み込んで、シグナルの変動を増加させ、それにより必要に応じてシグネチャに特異性を加えてもよい。さらに、抗菌剤を液滴に導入し、抗菌剤を含む液滴と抗菌剤を含まない液滴からの生存率信号を比較することによって、抗菌剤感受性（AST）を測定することができる。
【０１２８】
反応は、数万の液滴を二次元アレイに配置し、LEDによる励起およびCMOSセンサによる検出を備えた広視野イメージングシステムを使用して各液滴からの蛍光を記録することにより、リアルタイムで観察される。
【０１２９】
ディープラーニングを備えたニューラルネット。  機械学習を使用して、微生物をその蛍光シグネチャによって認識し、薬剤感受性を決定することができる。具体的には、独自のディープニューラルネットワークアーキテクチャを使用して、識別（ID）および抗生物質感受性（AST）の結果を解釈することができる。機械学習を活用することにより、単一細胞の解像度で明らかな表現型の違いに基づいて細菌を分類することができ、同じ検出モダリティを使用して病原体の識別と抗生物質の感受性のシームレスな統合が可能になる。この発見により、試験のコストおよび複雑さの削減が独自に可能になる。ニューラルネット入力データは、二次元液滴アレイからの時系列画像に基づく。独自のソフトウェアが、液滴を経時的に識別および追跡し、蛍光強度の液滴ごとの波形を時間に対して生成する。
【０１３０】
細菌IDの目的のためには、抗生物質を含まない「対照」回路のみが使用される。各液滴は分類され、それぞれの種の総液滴が計数される。各抗生物質について、抗生物質が存在しない対照回路が、抗生物質が指定された濃度で存在する試験回路と比較される。ニューラルネットワークは、対照回路と抗生物質試験回路で波形がどのように変化するかを比較することにより、抗生物質の有効性を判断する。
【０１３１】
病原体の識別。  総合すると、IDとASTは、細菌感染症を正確に処置するために必要な決定的な情報を臨床医に提供する。病原体識別の価値は、ASTの結果がいつ利用可能になるかによって異なる。現在のパラダイムでは、IDの結果は数時間で、場合によってはASTの結果が利用可能になる数日前に利用可能である。タイムリーなASTの結果がなければ、臨床医が抗生物質レジメンを調整するのを助けるために種分類を提供するためのIDの負担が増大する。
【０１３２】
例えば、ASTの結果がない場合、アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）は、他のアシネトバクターが耐性ではない特定の抗生物質に耐性である場合が多いため、臨床医は、A. バウマンニ（A. baumannii）と他のアシネトバクターを区別したいであろう。
【０１３３】
しかし、AST結果がID結果と同時に利用できる場合には、完全な耐性プロファイルが明らかになり、CLSIガイドラインに従って、AST結果に導かれる作用がすべてのアシネトバクター（Acinetobacter）種で同一であるため、A. バウマンニと他のアシネトバクターを区別する必要はない。
【０１３４】
ID結果とAST結果が同時に利用できる場合、ID結果を用いてAST結果をCLSIガイドラインに従って解釈し、感染についてのアンチバイオグラムを生成する（アンチバイオグラムは、試験した抗生物質のリストであり、リストされた各抗生物質に対して感染が、感受性（S）、中間（i）、または耐性（R）であるかどうかを示す）。これは、微生物学研究室で最も臨床的に重要な検査結果と広く考えられている。
【０１３５】
A. 結果
感受性統計値および特異性統計値を表1に示す（TPは真陽性を表し、TNは真陰性を表し、FPは偽陽性を表し、FNは偽陰性を表す）。表2は不一致結果の詳細を示す。
【０１３６】
（表１）感受性および特異性
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【０１３７】
（表２）不一致結果
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【０１３８】
表2に示される結果は、1つの液滴あたりの結果である（すなわち、各陽性液滴は独立した培養分離株とみなされた）。この方法は、母集団統計値を呼び出しで利用できないため、性能の推定がより厳しい方に偏るため、ニューラルネットワークに、より効果的に重点が置かれる。
【０１３９】
この研究には、有病率および死亡率に照らして最も重要な病原体の多くが含まれていた。重要なことに、この研究には系統発生的に類似した種、つまり、研究者らが同一条件下で識別できた腸内細菌科の2つの病原体が含まれていた。これらの結果はすべて、Difco LB Broth（Becton Dickinson 244620）において収集された。
【０１４０】
抗生物質感受性試験。  ほとんどのASTプラットフォームは、抗生物質の有効性に相関する細菌の応答の違いを観察するために、同じ抗生物質を複数の濃度で必要とする。例えば、液体微量希釈法では、各抗生物質について7段階の希釈を必要とする。Vitek2は、抗生物質につき少なくとも3つの濃度を必要とする。計画では、試験につき最大25の抗菌剤を含める予定であるが、ほとんどの抗生物質を単一の濃度でテストすることができない限り、これは不可能である。
【０１４１】
IDと同様に、研究者らはASTを行う能力を裏付ける膨大な量の定性的データを持っているが、IDとは異なり、これまで、開発を進めるための定量的証拠が不足していた。ASTニューラルネットアーキテクチャは、IDニューラルネットよりも複雑で、より多くのデータを教師あり学習に必要とする。そのため、ASTデータを生成するために、システムは、IDの実現可能性データが収集された時よりも1日あたり1桁多い液滴データを生成するのに、十分に進んでいなければならなかった。
【０１４２】
この研究では、CLSI手順に従って行われた液体微量希釈法に対して参照された通りに、分類一致率（Categorical Agreement:CA）が測定される。例えば、100％の分類一致率とは、参照が病原体を「感受性」または「耐性」と判定するたびに、試験が同じことを行ったことを意味する。これはID/AST試験で最も臨床的に関連のある結果であり、FDAの認可中に厳しく精査される。
【０１４３】
前述のように、これは液体微量希釈法（標準的基準）に対する本発明者らのAST法の最初の定量的評価である。これは継続的な評価であるため、確固たる結論を出すには時期尚早である。しかし、これまでのところ、結果は有望である。
【０１４４】
（表３）抗生物質によるAST結果
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VME-非常に大きなエラー、RをSとした
ME-大きなエラー、SをRとした
【０１４５】
（表４）病原体によるAST結果
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【０１４６】
B. 材料および方法
病原体の識別。  緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）（ATCC 15442）、肺炎桿菌（ATCC 33495）、および黄色ブドウ球菌（ATCC BAA-977）の複数の継代培養物は、トリプチケース・ソイブロス（Becton Dickinson 211825）中、37℃で一晩インキュベートし、アシネトバクター・バウマンニ（ATCC 19606）、大腸菌（Escherichia coli）（ATCC 25922）、および表皮ブドウ球菌（ATCC 14990）の菌株は、Difcoニュートリエントブロス（Becton Dickinson 234000）中、37℃で一晩インキュベートし、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）の菌株ATCC 19434は、ブレインハートインフュージョン（Sigma 53286-100G）中、37℃で一晩インキュベートした。
【０１４７】
人為的なサンプルは、一晩継代培養物由来のDifco LBブロス（Becton Dickinson 244620）に10％レサズリンベースの色素を供給することによって調製された。液滴の分割部分内で個々の細胞または個々の細胞クラスター（モノクローナル）のポアソン分布を達成するために、希釈液を調製し、試験した。段階的乳化を使用して、サンプルを約30,000個のピコリットル容量の液滴（195ピコリットル）に分割した。液滴を単層に配置し、Leica DMI 6000B蛍光顕微鏡を使用して撮像した。画像は5分間隔でキャプチャされた。各液滴は、各液滴の「波形」（経時的な蛍光強度）を生成する本発明者らの独自の画像処理ソフトウェアを使用して経時的に追跡された。この実験では、形状に基づく特徴が各波形から抽出されたため、研究者らはニューラルネットの最適化時間を最小限に抑え、小さなデータセットで訓練の成績を最大にすることができた。
【０１４８】
抗生物質感受性試験。  菌株は、ATCC、BEI、およびCDCの分離株コレクションから入手した。菌株の同一性は、公開されている生化学方法を用いて確認された。抗生物質は、CLSI手順に従って準備され、検証された。分離株の抗菌剤感受性参照結果は、公開されているCLSI手順に従って陽イオン調整ミューラー・ヒントンブロスを使用する液体微量希釈法によって決定された。
【０１４９】
人為的なサンプルは、10％レサズリンベースの色素を含む継代培養プレート由来のコロニーをブロスに播種することによって調製された。次に、各サンプルを分割した。この際、各マイクロ流体チップは1つの非抗生物質対照と最大7つの異なる抗生物質を含んでいた。最大4つのチップが本発明者らのプロトタイプ計測器にロードされ、所与チップの各回路は液滴アレイを同時に生成し、4時間にわたってインキュベートされ、画像化された。得られる画像を処理して波形にし、対照および特有の抗生物質のペアワイズ分析によってASTの呼び出しを生成した。
【０１５０】
前述の説明および実施例、ならびに図面は、本発明の特定の局面を実証するために含められている。本説明、実施例または図に開示された技術は、本発明の実践において十分に機能する、本発明者らによって発見された技術を表し、したがって、その実践のための特定の様式を構成するとみなされることを当業者は理解するべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の態様において多くの変更を行うことができ、それでも本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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