(57)【要約】【課題】    多重核酸検出バイオマーカーに結合する単一塩基配列を用いた多重核酸プローブを提供する。【解決手段】本発明の人工塩基配列設計方法を用いて設計された塩基配列は、全ての類似体に対してより優れたハイブリダイゼーション反応性を示し、これを用いた多重核酸プローブは、一つの診断プローブを用いて有意性を持つ多種の核酸配列と同時多発的に結合可能に設計されて試料内の発現様相全般を診断することによって、一つの診断プローブを用いた核酸バイオマーカーの超−多重診断が可能であり、これによって診断能の向上及び検診費用の画期的な低減ができる効果がある。【選択図】  図２Ａ
2021522868.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）標的核酸と類似性を有する無作為類似体（Ａｎａｌｏｇ）配列セットをそれぞれ準備する段階；
ｂ）前記類似体配列セットのうち、ハイブリダイゼーションプロファイル類似性が最も高い２個の類似体配列を、最近接（ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ）アルゴリズムを用いて選定する段階；
ｃ）前記選ばれた２個の類似体配列及び任意の核酸配列で構成された３本鎖の塩基配列の多重平衡反応を設定し、最高の平衡定数（Ｋ）の和を示す任意の核酸配列を共通補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）として選定する段階；及び
ｄ）前記共通補体と相補的な鎖として、２個の類似体配列を代表する代表配列（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を選定する段階；
を含む、多重核酸バイオマーカーに結合するための人工塩基配列設計方法。
【請求項２】
前記代表配列の平均ピアソン相関係数が、前記ａ）段階の類似体配列セットを構成する全ての類似体に比べて高いことを特徴とする、請求項１に記載の人工塩基配列設計方法。
【請求項３】
前記人工塩基配列は、前記ａ）段階の類似体配列セットを構成する全ての類似体よりも高いハイブリダイゼーション反応性を示すことを特徴とする、請求項１に記載の人工塩基配列設計方法。
【請求項４】
前記類似体配列は、８〜１０個の塩基で構成されていることを特徴とする、請求項１に記載の人工塩基配列設計方法。
【請求項５】
前記ｃ）段階において、２個の類似体配列は、相補的共通配列の個数を近接度（Ｃｌｏｓｅｎｅｓｓ）で示した後、近接度の高い塩基配列からまず計算することを特徴とする、請求項１に記載の人工塩基配列設計方法。
【請求項６】
請求項１によって設計された塩基配列及び蛍光物質を含む、多重核酸バイオマーカー探知用プローブ。
【請求項７】
前記蛍光物質は、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）蛍光分子、ローダミン（Ｒｏｄａｍｉｎｅ）蛍光分子、アレクサ（Ａｌｅｘａ）蛍光分子、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）蛍光分子、ＦＡＭ（５−ｃａｒｂｏｘｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）蛍光分子、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）蛍光分子及びフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）からなる群から選ばれる１以上であることを特徴とする、請求項６に記載の多重核酸バイオマーカー探知用プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多重核酸検出バイオマーカーに結合する単一塩基配列設計及びこれを用いた多重核酸プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子検査は、疾病の症状がある患者に疑われる遺伝疾患を確診又は鑑別できる他、疾患の原因になる遺伝子の突然変異有無の検査によって、疾病の発病可能性と発病危険度が高くなる疾患の予測も可能である。このような遺伝型検査は、疾病の予防、早期診断、治療及び管理に役立ち、疾患の罹患率と死亡率を減少できることが報告されている。
【０００３】
このような遺伝子検査は、人体の全ての細胞が遺伝的に同一に構成されているということを前提に、人体のいかなる組織からも遺伝子検査が可能であるが、最も容易には血液から核酸を抽出して使用することができる。
【０００４】
核酸の診断分野は、単一塩基多形成（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）の区別、病原性細菌又はウイルスの探知及び同定、遺伝病診断などに活用されている。そこで、特定核酸を迅速で正確に検出するための多くの方法が提示されており、現在もそれに関連する多くの研究が行われている（Ｗ．Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｂｉｏｓｅｎ．ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅ．，４２：１６５−１７２．；Ｍ．Ｌ．Ｅｒｍｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｓｅｎ．ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅ．，６１：２８−３７．；Ｋ．Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｂｉｏｓｅｎ．ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅ．，６６：２９７−３０７．）。特定核酸を検出するために最も一般的に使用する方法には、重合酵素連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）を用いる方法、多重重合酵素連鎖反応（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ）方法と、多重重合酵素連鎖反応を使用せずに共通プライマーを用いて多数の核酸を同時に増幅して大量分析を可能にする技術としてＳＮＰｌｅｘ、ゴールデンゲートアッセイ（Ｇｏｌｄｅｎｇａｔｅ  ａｓｓａｙ）、ＭＩＰｓ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ）などがある。
【０００５】
最近では、検出しようとする標的核酸と相補的結合が可能な塩基配列で構成された核酸プローブが開発された。前記核酸プローブは、バイオマーカーを生物学的試料とハイブリダイゼーションさせて測定する方式であり、疾病診断及び予後予測の有意性を高めるために、多重バイオマーカーを同時に診断する方式が必須に用いられており、また、既存方式は、単一核酸バイオマーカーに結合する単一の相補的結合が可能な塩基配列を多数用いて多重診断する方式であった。
【０００６】
ただし、多重診断のための費用が非常に高いため、初期段階での使用が難しく、持続したモニタリング及び予後観察がし難いという限界があった。例えば、代表の乳癌バイオマーカーとされるＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の場合、実の患者群内で突然変異発見確率が約１３．９％程度と低い方であり（大韓放射線腫瘍学会誌）、正確な診断のために用いられている市販の診断キットの場合、平均して１０余種の遺伝因子を同時診断できるが、１回当たり費用が＄３，０００以上もかかり、予防的診断及び持続的モニタリングに大きな限界がある。
【０００７】
一方、ｋ−平均クラスタリングアルゴリズムは、クラスタリング方法のうち分割法に属する。分割法は、与えられたデータを複数のグループに分ける方法である。例えば、ｎ個のデータオブジェクトが入力されたと仮定し、分割法は、該入力データをｎよりも小さい又は等しいｋ個のグループに分けるが、このとき、各群集はクラスターを形成する。すなわち、データを、１個以上のデータオブジェクトで構成されたｋ個のグループに分ける。このとき、グループを分ける過程は、距離ベースのグループ間非類似度（ｄｉｓｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）のような費用関数（ｃｏｓｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を最小化する方式からなり、この過程で同一グループ内のデータオブジェクト間の類似度は増加し、異なるグループにあるデータオブジェクトとの類似度は減少する。ｋ−平均アルゴリズムは、各グループの中心（ｃｅｎｔｒｏｉｄ）とグループ内のデータオブジェクトとの距離の二乗和を費用関数として定め、この関数値を最小化する方向に各データオブジェクトの所属グループをアップデートすることによってクラスタリングを行う。
【０００８】
本発明者らは、上記のような短所を克服しながら患者の生体試料から検出可能な核酸バイオマーカーの全体的様相を安価で迅速に診断できる方法を開発しようと努力した結果、ｋ−平均クラスタリングアルゴリズムを含む熱力学原理とソーシャルネットワーク分析を用いて多重核酸バイオマーカーに対して最適の選択性を有する人工塩基配列をモデリングする方法を開発でき、これによって多くの標的核酸を迅速で正確に検出できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、多重核酸バイオマーカーに結合するための人工塩基配列設計方法を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記人工塩基配列を用いた多重核酸プローブを提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、前記人工塩基配列を用いた多重核酸検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ａ）標的核酸と類似性を有する無作為類似体（Ａｎａｌｏｇ）配列セット（基本配列）をそれぞれ準備する段階；
ｂ）前記類似体配列セットのうち、ハイブリダイゼーションプロファイル類似性が最も高い２個の類似体配列を、最近接（ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ）アルゴリズムを用いて選定する段階；
ｃ）前記選ばれた２個の類似体配列及び任意の核酸配列で構成された３本鎖の塩基配列の多重平衡反応を設定し、下記式１を用いて、最高の平衡定数（Ｋ）の和を示す共通補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を選定する段階であって、
【数１】
2021522868.tif 000003
前記式において、［Ａｎａｌｏｇ］は類似体の濃度を表し、［Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ］は補体の濃度を表し、［Ｃｏｍｐｌｅｘ］は類似体及び補体の複合体濃度を表す。この時、配列の濃度は、２個の類似体配列のハイブリッド化反応性と同等に割り当てられる。また、ΔＧは、標準状態におけるギブス自由エネルギーを表し、Ｒは気体定数、Ｔは絶対温度を表し、ｘは濃度を表す、段階；
ｄ）前記共通補体と相補的な鎖であり、２個の類似体配列を代表する代表配列（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を選定する段階；及び
ｅ）１本鎖が残るまでａ）〜ｅ）過程を反復する段階；を含む、多重核酸バイオマーカーに結合するための人工塩基配列設計方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、前記塩基配列及び蛍光物質を含む、多重核酸バイオマーカー探知用プローブを提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の人工塩基配列設計方法によって設計された塩基配列は、全ての類似体に対してより優れたハイブリダイゼーション反応性を示し、これを用いた多重核酸プローブは、一つの診断プローブを用いて有意性を持つ多種の核酸配列と同時多発的に結合可能に設計され、試料内の発現様相全般を診断することによって、一つの診断プローブを用いた核酸バイオマーカーの超−多重診断が可能であり、結果として、診断能の向上及び検診費用の画期的な低減ができる効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】ＣＡＮＡＤＡ２．０から得た無作為塩基配列（基本配列）とその突然変異配列情報を示す図である。
【図１Ｂ】基本配列とその突然変異配列のソシオグラムを示すものであり、基本配列と突然変異はノード（青丸）で表示され、ギブス自由エネルギーが最も高い上位１００個の相補的配列（白丸）がそれらの補体と連結されている。相補的配列は黄丸で表示された２個以上のリンクを有する。
【図１Ｃ】最高のギブス自由エネルギーを有する１０００個の配列と突然変異の相補的共通配列数（Ｃｌｏｓｅｎｅｓｓ；近接度）プロファイルを示す図である。
【図２Ａ】２個の類似体から代表配列を計算するための順序度であり、検証過程で修正された最近接モデルが用いられている。塩基対内で一致しない隣接媒介変数はギブス自由エネルギーに影響を及ぼさないと仮定し、初期塩基対も計算に考慮されていない。代表配列は最上位共通補体（ｃｏｍｍｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）から得られ、濃度は類似体に対して同等な量のハイブリダイゼーションを生成するように調整している。
【図２Ｂ】多重反応の平衡定数計算から得た双曲線グラフであり、双曲線グラフが反応定数（Ｋ）の増加によって（１，１）座標に接近しており、両双曲線の交差点は反応の平衡状態を表す。
【図３Ａ】代表配列を計算するために用いられた類似体の配列情報を示す。類似体配列には３つの差異点があり、計算された代表配列は、２個の類似体両方に対してヘテロシーケンシングされている。
【図３Ｂ】補体及び反−類似体の多重反応平衡を示す図である。
【図３Ｃ】代表配列が類似体とさらに相補的候補を共有することを示すソシオグラムを示す図である。
【図３Ｄ】類似体と代表配列間の全体相補的配列に対するギブス自由エネルギー値のピアソン相関係数を、類似体同士の相補的配列に対するギブス自由エネルギー値のピアソン相関係数と比較して示す図である。
【図４Ａ】類似体に対する共通補体（２９４３４６及び２８１８０２）のハイブリダイゼーション効率を示す図である。
【図４Ｂ】類似体の濃度変化に従う反−類似体及び共通補体とのハイブリダイゼーション効率を計算した結果を示す図である。
【図４Ｃ】２種の類似体が共に存在するとき、共通補体とのハイブリダイゼーション効率を示す図である。
【図４Ｄ】異なる類似体濃度から計算された最適化された代表配列を示す図である。
【図４Ｅ】類似体に対して最適化された代表配列のピアソン相関係数を示す図である。
【図５Ａ】複数類似体の配列情報と配列間のギブスエネルギーとピアソン相関係数を示す図である。
【図５Ｂ】類似体に対して計算された共通補体のギブスフリーエネルギー及びハイブリダイゼーション収率を示す図である。
【図５Ｃ】５個の類似体及び３個のミスマッチ塩基を有する代表配列を用いて、基本配列及び初期類似体に対する代表配列の平均ピアソン相関係数を示す図である。
【図５Ｄ】様々な突然変異塩基のハイブリダイゼーション収率及びピアソン相関係数の比率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、多重核酸検出バイオマーカーに結合する単一塩基配列を用いた多重核酸プローブ及び多重核酸検出方法に関する。
【００１７】
以下、添付の図面を参照して、本願の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように本願の実施例を詳細に説明する。ただし、本願は様々な異なる形態で具現されてもよく、ここで説明する実施例に限定されない。なお、図面中、本願を明確に説明するために、説明と関係ない部分は省略している。
【００１８】
本願明細書全体を通じて、ある部分がある構成要素を“含む”としたとき、これは、別に断りのない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含んでもよいということを意味する。
【００１９】
本願明細書において使われる用語“約”、“実質的に”などは、言及された意味に固有の製造及び物質許容誤差が提示されるとき、その数値又はその数値に近接した意味で使われ、本願の理解を助けるために正確な又は絶対的な数値が言及された開示内容を非良心的な侵害者が不正に用いることを防止するためにも使われる。本願明細書において使われる用語“〜（する）段階”又は“〜の段階”は、“〜のための段階”を意味しない。
【００２０】
まず、本発明は、下記段階を含む、多重核酸バイオマーカーに結合するための人工塩基配列設計方法を提供する：
ａ）標的核酸と類似性を有する無作為類似体（Ａｎａｌｏｇ）配列セットをそれぞれ準備する段階；
ｂ）前記類似体配列セットのうち、ハイブリダイゼーションプロファイル類似性が最も高い２個の類似体配列を、最近接（ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ）アルゴリズムを用いて選定する段階；
ｃ）前記選ばれた２個の類似体配列及び任意の核酸配列で構成された３本鎖の塩基配列の多重平衡反応を設定し、下記の式１を用いて、最高の平衡定数（Ｋ）の和を示す共通補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を選定する段階であって、
【数２】
2021522868.tif 000004
前記式において、［Ａｎａｌｏｇ］は類似体の濃度を表し、［Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ］は補体の濃度を表し、［Ｃｏｍｐｌｅｘ］は類似体及び補体の複合体濃度を表す。このとき、配列の濃度は、２個の類似体配列のハイブリッド化反応性と同等に割り当てられる。また、ΔＧは、標準状態におけるギブス自由エネルギーを表し、Ｒは気体定数、Ｔは絶対温度を表し、ｘは濃度を表す、段階；
ｄ）前記共通補体と相補的な鎖として、２個の類似体配列を代表する代表配列（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を選定する段階；及び
ｅ）１本鎖が残るまでａ）〜ｄ）過程を反復する段階。
【００２１】
万一、前記類似体配列が３以上の多重鎖である場合、
ｆ）前記ｄ）段階の代表配列とその濃度を用いて、下記の式２によって、最高の平衡定数（Ｋ）の和を示す共通補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を選定する段階であって、
【数３】
2021522868.tif 000005
前記式において、［Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ］は共通補体の相補的鎖の濃度を表し、［ｃｏｍｍｏｎ］は共通補体の濃度を表し、［Ｃｏｍｐｌｅｘ］は共通補体及びその相補的鎖の濃度を表す。また、ΔＧは、標準状態におけるギブス自由エネルギーを表し、Ｒは気体定数、Ｔは絶対温度を表し、ｘは濃度を表す、段階；
ｈ）前記共通補体と相補的な鎖として、２個の類似体配列を代表する代表配列（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を選定する段階；及び
ｉ）１本鎖が残るまでａ）〜ｈ）過程を反復する段階；をさらに含むことができる。
前記多重鎖は、好ましくは、３〜５本の鎖であり得る。
【００２２】
前記“類似体（Ａｎａｌｏｇ）配列セットをそれぞれ準備する段階”の場合、類似体配列セットは、標的配列と相補的な配列セットを、プログラムを用いて無作為的に自動で生成させる段階であり得る。
【００２３】
前記“標的（ｔａｒｇｅｔ）核酸”は、生物学的試料に存在できる任意の関心核酸のことを指すためのもので、“関心核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）”を意味する。
【００２４】
前記“バイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）”は、個人において正常又は異常進行の表示、又は個人において疾病又は他の状態の表示であるか或いはそれを示す標的分子を指すために用いられるものであり、正常又は異常、そして異常なら慢性又は急性の特定生理学的状態又は進行の存在に関連する解剖的、生理学的、生化学的又は分子学的パラメータである。
【００２５】
バイオマーカーが個人における異常進行又は疾病又は他の状態を示すか或いはそれの表示であれば、該バイオマーカーは、通常、個人における正常進行又は疾病又は他の状態の不在を示すか或いはそれの表示であるバイオマーカーの発現レベル又は値と比較して、過大発現（ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）又は過小発現（ｕｎｄｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）のいずれかと表現される。“上向き調節（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）”、“上向き調節された（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）”、“過大発現（ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）”、“過大発現された（ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）”及びこれら表現の変化形は、健康な又は正常な個人の類似の生物学的試料から典型的に検出されるバイオマーカーの値又はレベル（或いは、値又はレベルの範囲）よりも大きい生物学的試料におけるバイオマーカー値又はレベルを表すために同じ意味で使われる。
【００２６】
前記代表配列の検証のためにギブス自由エネルギー値のピアソン相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を用いることができ、好ましくは、平均ピアソン相関係数が、前記ａ）段階の類似体配列セットを構成する全ての類似体に比べて高い。
【００２７】
前記検証から、代表配列が前記２個の類似体の配列及びハイブリダイゼーションプロファイルを代表することが確認できる。
【００２８】
本発明で得た人工塩基配列は、ａ）段階の類似体配列セットを構成するいかなる類似体よりも高いハイブリダイゼーション反応性を示すことができる。
【００２９】
前記ａ）段階において、類似体配列は、好ましくは８〜１０個の塩基で構成され得る。
【００３０】
前記ｃ）段階において、２個の類似体配列は、相補的共通配列の個数を近接度（Ｃｌｏｓｅｎｅｓｓ）と示した後、近接度の高い塩基配列からまず計算され得る。
【００３１】
前記ｃ）段階で適用される最近接（ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ）アルゴリズムは、標的配列と最も類似性の高い配列を計算する。具体的に、最近接アルゴリズムは、ある個体の類似体と全ての個体のそれぞれの類似体間に互いに素な（ｐａｉｒｗｉｓｅ）“距離”を計算する。前記アルゴリズムは、既に公知の文献であるＢｒｅｍｎｅｒ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，（２００５）。“Ｏｕｔｐｕｔ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ”．Ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｏｍｅｔｒｙ  ３３（４）：５９３６０４）を参考できる。
【００３２】
様々な方法を用いて任意の要素のネットワークを識別できるが、最も直観的な方法は、多次元空間で各要素を調整した後、それらの間のユークリッド距離（Ｅｕｃｌｉｄｉａｎ  ｄｉｓｔａｎｃｅ）を測定することである。これをヌクレオチドに適用すれば、２個のヌクレオチドを示す点同士が近く位置する時、高い配列類似性を示すことが分かり、逆に、ヌクレオチドの配列が相互にかなり異なっていれば、２点間の距離はより遠く離れているだろう。したがって、ヌクレオチドを空間配列で調整することは、ネットワーク解析に理想的に利用可能である。
【００３３】
しかし、ヌクレオチドの配列が様々で、相互作用が複雑なため、単一座標系に投影することはほとんど不可能である。したがって、基本的なソーシャルネットワーク方法論が、ヌクレオチドの類似性を示すのに役立ち得る。本発明では、ソシオグラムを図示して類似性を確認した。
【００３４】
また、本発明は、前記方法によって設計された塩基配列及び蛍光物質を含む、多重核酸バイオマーカー探知用プローブを提供する。
【００３５】
前記蛍光物質は、好ましくは、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）蛍光分子、ローダミン（Ｒｏｄａｍｉｎｅ）蛍光分子、アレクサ（Ａｌｅｘａ）蛍光分子、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）蛍光分子、ＦＡＭ（５−ｃａｒｂｏｘｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）蛍光分子、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）蛍光分子及びフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）からなる群から選ばれる１以上であり得、より好ましくはシアニンであり得る。
【００３６】
また、本発明は、下記段階を含む多重核酸検出方法を提供する：
ａ）標的核酸を含む試料を得る段階；
ｂ）前記試料、前記試料と相補的な塩基配列を有するプライマーセット、切断試薬及び請求項８によって製造されたプローブを混合した後、伸張反応によって標的核酸−プローブ複合体を増幅させる段階；及び
ｄ）前記ｃ）段階で増幅された複合体から分離されたプローブ断片の量を測定する段階。
【００３７】
前記試料は、個人から獲得したり或いはその他に導出された物質、生物学的体液、組織又は細胞のことを指し、本願では同じ意味で使われる。これは、（全血（ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ）、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）、末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ）、白血球軟膜（ｂｕｆｆｙ  ｃｏａｔ）、血漿（ｐｌａｓｍａ）及び血清（ｓｅｒｕｍ）を含む）血液、喀痰（ｓｐｕｔｕｍ）、涙（ｔｅａｒｓ）、粘液（ｍｕｃｕｓ）、 鼻腔洗浄液（ｎａｓａｌ  ｗａｓｈｅｓ）、鼻腔吸引物（ｎａｓａｌ  ａｓｐｉｒａｔｅ）、呼吸（ｂｒｅａｔｈ）、小便（ｕｒｉｎｅ）、精液（ｓｅｍｅｎ）、唾液（ｓａｌｉｖａ）、腹腔洗浄液（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｗａｓｈｉｎｇ）、嚢胞液（ｃｙｓｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ）、羊水（ａｍｎｉｏｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ）、腺液（ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｆｌｕｉｄ）、リンパ液（ｌｙｍｐｈ  ｆｌｕｉｄ）、細胞液（ｃｙｔｏｌｏｇｉｃ  ｆｌｕｉｄ）、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）、胸水（ｐｌｅｕｒａｌ  ｆｌｕｉｄ）、乳頭吸引物（ｎｉｐｐｌｅ  ａｓｐｉｒａｔｅ）、気管支吸引物（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ａｓｐｉｒａｔｅ）、気管支擦過物（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｂｒｕｓｈｉｎｇ）、滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｌｕｉｄ）、関節吸引物（ｊｏｉｎｔ  ａｓｐｉｒａｔｅ）、組織分泌物（ｏｒｇａｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ）、細胞（ｃｅｌｌ）、細胞抽出物（ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔ）及び脳脊髓液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）を含む。これはまた、前記列挙したものから実験的に分離された断片（ｆｒａｃｔｉｏｎｓ）を含む。例えば、血液サンプルは血清、血漿又は赤血球細胞又は白血球細胞のような特定形態の血液細胞を含む断片として分離され得る。所望の場合、試料は、組織試料及び体液試料の組合せのように、個人の試料組合せであってもよい。また、例えば、大便サンプル、組織試料又は組織生検からのサンプルのような均質化された固体物質を含む物質を含む。また、組織培養又は細胞培養から由来した物質を含む。生物学的試料を得るための適切な方法を用いることができ；代表的な方法は、例えば、採血、綿棒法（例えば、口腔上皮細胞綿棒法）及び細針吸引組織検査を含む。細針吸引可能な代表的な組織は、リンパ節、肺、肺洗浄液、ＢＡＬ（気管支肺胞洗浄液、ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ）、甲状腺、乳房及び肝（ｌｉｖｅｒ）を含む。試料はまた、例えば、微細切開（例えば、レーザー捕獲微細切開（ｌａｓｅｒ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ；ＬＣＭ）又はレーザー微細切開（ｌａｓｅｒ  ｍｉｃｒｏ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ；ＬＭＤ））、膀胱洗浄、塗抹（例えば、ＰＡＰ塗抹）又は乳汁導管洗浄法によって収集され得る。個人から得られたり或いは由来する生物学的“試料”は、個人から得た後、適切な方法で処理された試料を含む。
【００３８】
また、生物学的試料は、多数の人々から生物学的な試料を得、それらの試料をプール化し、各個人の生物学的試料の部分標本をプール化して導出することができる。プール化した試料は一個人から出た試料として処理され得る。
【００３９】
以下、本発明の理解を助けるために、好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解させるために提供されるものに過ぎず、実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【００４０】
準備例１．実験準備
【００４１】
実験に使用された全てのヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）から購入した。まず、凍結乾燥されたヌクレオチドをＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に１００μＭ濃度に溶解させた。ヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション過程のために、１００ｍＭ  ＮａＣｌと各実験の比率で混合された。アーニル工程は、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ，ＵＳＡ）のＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｐｒｏが提供する熱循環器（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）で行った。９５℃で５分間加熱した後、温度を分当り０．５℃ずつ、９５℃から２５℃に漸次降温させた。蛍光強度は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５を用いて測定した（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）。
【００４２】
準備例２．ギブス自由エネルギー、ピアソン相関係数、多重平衡定数及び近接度計算
【００４３】
ギブス自由エネルギー、ピアソン相関係数、多重平衡定数及び近接度を含む全ての計算は、Ｐｙｔｈｏｎ  ｖ２．７を用いて行われた。ＮｕｍＰｙ  ｖ１．８．０ｒｃ１及びＳｃｉＰｙ  ｖ０．１３．０ｂ１は、アルゴリズム効率性のために用いられた。補充情報には詳細な計算方法と公式が提示されている。
【００４４】
準備例３．ソシオグラム（Ｓｏｃｉｏｇｒａｍ）
【００４５】
Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ  ｖ３．６．０を用いてソシオグラムを図示した。基本配列、類似体及び相補的候補がノードとして用いられた。相補的候補はその関連基本配列又は類似体と連結されている。ノードの位置はｐｒｅｆｕｓｅ  ｆｏｒｃｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｌａｙｏｕｔによって決定された。
【００４６】
実施例１．人工塩基配列合成
【００４７】
１−１．配列類似性によるヌクレオチドマッピング
【００４８】
まず、ＣＡＮＡＤＡ２．０から１０個の無作為塩基（基本）のモデルヌクレオチド配列を得、基本配列の塩基を累積方式で変化させることによって類似体配列（突然変異）を合成した。Ｍｕｔ−１は、基本配列の単一塩基無作為突然変異によって生成し、突然変異された塩基は、次の突然変異Ｍｕｔ−２に移された。したがって、Ｍｕｔ−２は、Ｍｕｔ−１のいずれか一つとそれ自身のいずれか一つの基本塩基から、２個の不一致配列を保有する。この方法で総１０個の突然変異が生成された。突然変異数が高くなると（突然変異の蓄積）、基本配列と突然変異の配列差が大きくなる。
【００４９】
基本塩基配列と突然変異塩基配列情報は図１Ａに示し、基本及び突然変異に対する全ての相補的な鎖のギブス自由エネルギー（Ｇｉｂｂ’ｓ  ｆｒｅｅ  ｅｎｅｒｇｙ）を計算した。
【００５０】
配列は、１０個の塩基で構成されるので、総４１０個の相補的な配列が存在した。また、可能な全ての相補的な鎖のうち、最高のギブス自由エネルギーを持つ１００個のヌクレオチドを選択し（相補的候補）、それぞれの基本又は突然変異に連結して無方向性ソシオグラム（Ｓｏｃｉｏｇｒａｍ）を図示した。これを図１Ｂに示す。
【００５１】
図１Ｂに示すように、モデルヌクレオチド配列において突然変異の蓄積が大きいほど、相補的候補を共有する配列が少ないことを確認した。基本配列は、ただ一つの塩基ミスマッチ突然変異であるＭｕｔ−１と相補的候補の大部分を共有した。また、ミスマッチヌクレオチドは相補的候補の大部分をそれらの最も類似の類似体と共有した。
【００５２】
共有される相補的候補の数は近接度（ｃｌｏｓｅｎｅｓｓ）と示され、近接度の値は、ヌクレオチド間の類似ユークリッド距離を示すために用いられた。上位１０００個の相補的候補を有する基本塩基と突然変異の近接度プロファイルを図１Ｃに示す。
【００５３】
同一の配列に寄与した細胞は黄色で表示し、共通配列数がより多い細胞は赤色で表示した。図１Ｃに示すように、全てのヌクレオチドが、最も類似する塩基と最も近接度が高いということは明らかであった。これは、ヌクレオチド配列をマッピングし、ヌクレオチド中間に位置する配列をマイニングすることによって、多重鎖(ｓｔｒａｎｄ)から代表的な配列を生成できるということを示す。
【００５４】
１−２．２個の類似体から代表配列生成
【００５５】
初期段階で代表配列の存在を証明するためのモデルとして、２個の類似体を使用した。計算過程は、図２Ａに示し、下記の通りである。
【００５６】
１．２個の類似体に対する全ての相補的鎖のギブス自由エネルギーが計算され、ギブス自由エネルギーの和が最も高い相補的鎖（相補的な候補）を選択する。
【００５７】
２．相補的候補とギブス自由エネルギー値の多重反応の平衡が計算され、最大の反応平衡和を有する最良の相補的鎖（共通補体）を選択する。
【００５８】
３．共通補体に対する完璧な逆配列（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）の代表配列が生成され、２個の類似体と共通補体との反応平衡の同等な合計を有する代表配列の濃度が計算される。
【００５９】
まず、ギブス自由エネルギー計算手順において最近接（Ｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ）モデルをやや修正して用いた。通常の使用時に、核酸二重塩基の最近接媒介変数及び末端塩基対媒介変数がハイブリダイゼーションエンタルピー及びエントロピーを計算するために含まれる必要があるが、相補的塩基対において最近接媒介変数だけを考慮した。最近接媒介変数は、以前研究から参照した。計算後に、２個の類似体に対する各相補的な鎖のギブス自由エネルギー値が追加され、最も高い１０００本の鎖が、下記平衡計算段階の相補的候補として選択された。
【００６０】
類似体と相補的候補間のギブス自由エネルギー値は単一反応条件に対して計算されたので、前記ギブス自由エネルギー値を、類似体と相補的候補の両方を含む多重反応の反応定数に変換しなければならない。２個の類似体の反応定数の和は、ハイブリダイゼーションに対する相補的候補の関与を示す。その後、相補的候補から、最高の反応定数の和を有する共通補体を選択した。基本公式及び計算過程は、下記の式１の通りである。
【数４】
2021522868.tif 000006
【００６１】
図２Ｂに示すように、反応定数（Ｋ）の式は、双曲線グラフで示し、合理的な範囲の交差点は、多重反応平衡状態（ｘ）を表す。共通補体から代表配列及びその濃度を計算した。代表配列は、共通補体の配列に対する完璧な逆配列と指定され、代表配列の濃度は、類似体の反応定数の和で標準化された。共通補体と代表配列間のギブス自由エネルギーも計算に用いられた。
【００６２】
２個の塩基不一致を有するヌクレオチドの２個の異なる配列が類似体に対して任意に選択された。最も有利な共通補体及び代表配列は、計算によって決定した。代表配列を計算するために用いられた類似体の配列情報とハイブリダイゼーションギブス自由エネルギーは、図３Ａに示した。類似体配列には３つの差異点があり、計算された代表配列は、２個の類似体の両方に対してヘテロシーケンシングされた。
【００６３】
図３Ａに示すように、代表配列は２個の類似体の混成形態であった。共通補体と類似体に対する類似体の完全な補体のギブス自由エネルギーを比較した結果、共通補体は、極大化されたギブス自由エネルギーを持たないことを確認した。しかし、ハイブリダイゼーション反応の和は、完全な相補的配列よりも高かった。
【００６４】
また、補体及び反−類似体の多重反応平衡を図３Ｂに示す。
【００６５】
図３Ｂに示すように、計算された多重反応平衡座標は、完全な相補的配列の座標よりも（１，１）座標に相対的に近い距離を示した。
【００６６】
また、代表配列と類似体間の共有する相補的候補を、ソシオグラムを用いて図３Ｃに示す。
【００６７】
図３Ｃに示すように、代表配列は２個の類似体よりも相補的候補をさらに共有することを確認した。
【００６８】
また、類似体と代表配列間の全体相補的配列に対するギブス自由エネルギー値のピアソン相関係数を類似体同士の相補的配列に対するギブス自由エネルギー値のピアソン相関係数と比較して図３Ｄに示している。
【００６９】
図３Ｄに示すように、ギブスの自由エネルギーのピアソン相関係数は、ハイブリダイゼーションプロファイルの類似性を示し、予想通り、代表配列と類似体との平均ピアソン相関係数がより高いことを確認した。
【００７０】
前記結果から、代表配列が２個の類似体の配列及びハイブリダイゼーションプロファイルを代表できることを確認した。
【００７１】
１−３．多重配列から代表配列生成
【００７２】
座標系において、ｋ−平均クラスタリングアルゴリズムは、クラスタリングのための直観的で合理的な代表中心を生成できる。ｋ−平均アルゴリズムを用いたクラスタリングの場合、中心からデータ客体までの距離の和が測定され、座標重力の和が最小化されるようにアップデートされる。中心自体は実際のデータではないが、他のデータ個体と同様に座標を有する。したがって、中心はクラスターにおいてデータ客体の属性を示す。これは、類似体配列から代表配列を計算するのと非常に類似している。本発明者らは、ｋ−平均クラスタリングアルゴリズムを、多重配列を有する代表配列の生成に適用しようと試みた。
【００７３】
既存のｋ−平均クラスタリングアルゴリズムにおいて中心の距離はクラスターのデータ客体の中心まで再調整され、距離の和を最小化する。しかし、多数の塩基を用いてヌクレオチドの中心を計算することは殆ど不可能である。最近、多重ヌクレオチド平衡状態を計算するためのいくつかの注目するべき接近法が開発された。例えば、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｄｉｒｔと彼の同僚達は、グラフ理論と分割関数の組合せによって多重鎖相互作用と２次構造の形成のための方法論を開発したことがある。これは、たとえ多くのリソース及び計算時間がかかるが、同時に数千個の反応に対する合理的な結果を提供することができる。したがって、ｋ−平均クラスタリングアルゴリズムを段階的に適用した。
【００７４】
ｋ−平均クラスタリングアルゴリズムの段階別計算において発生する差はデータに質量を割り当てて克服できる。例えば、下記のように２次元空間において３個の点（ａ，ｂ，ｃ）の中心座標（ｘ，ｙ）は、座標の平均である。
【数５】
2021522868.tif 000007
【００７５】
一方、一定質量（α，β，γ）を含むと、中心座標は次のように表現される。
【数６】
2021522868.tif 000008
【００７６】
この場合、中心座標の段階別計算は次の通りであり、座標中心の終わりは単一計算のものと同一である。
【００７７】
実施例２．合成された塩基配列の実験的検証
【００７８】
類似体と共通補体間の多重反応とハイブリダイゼーションを実験的に立証するために、２個の共通補体（コード番号：２９４３４６及び２８１８０２）を選択し、類似体に対する共通補体のハイブリダイゼーション効率を図４Ａに示した。測定のために、類似体を蛍光染料（Ｃｙ３及びＣｙ５）で標識し、共通補体をＩＯＷＡブラック消光体で標識した。類似体と共通補体間のハイブリダイゼーションが発生すると、蛍光強度が弱くなる。
【００７９】
図４Ａに示すように、まず、１μＭの各類似体（類似体１及び類似体２）は、２μＭのそれらの完全な相補的配列（ａｎｔｉ−ａｎａｌｏｇｓ；反−類似体）と別途に反応した。予想通り、反−類似体は自身の類似体と最も高いハイブリダイゼーション効率を示した。しかし、他の類似体とのハイブリダイゼーションは効果的でなかった。反−類似体２の場合、類似体２と完全なハイブリダイゼーションを示した。一方、反−類似体２は５０．４％の効率で類似体１にハイブリダイゼーションされた。共通補体が完全な反−類似体に比べて低い混和効率を示したにもかかわらず、２個の類似体の平均ハイブリダイゼーションにさらに優れていた。さらに、混合類似体溶液において共通補体（コード番号：２９４３４６及び２８１８０２）は全体ハイブリダイゼーションにおいて最高の収率を示した。
【００８０】
このような現象は、類似体の濃度が増加した場合にも観察された。実際の実験前に類似体の様々な濃度において反−類似体と共通補体のハイブリダイゼーション効率を計算し、その結果を図４Ｂに示した。
【００８１】
図４Ｂに示すように、類似体の濃度は、０μＭから２μＭに増加し、濃度の和は２μＭに固定された。類似体１又は類似体２が２μＭにおいて支配的なヌクレオチドを占める終端点及び付近で反−類似体は最高のハイブリダイゼーション効率を示した。しかし、反−類似体のハイブリダイゼーションはそれ自身の補体が減少するにつれて有意に減少した。対照的に、共通補体は全ての濃度で持続したハイブリダイゼーション効率を示した。
【００８２】
また、２個の類似体が共に存在するとき、共通補体とのハイブリダイゼーション効率を図４Ｃに示した。
【００８３】
図４Ｃに示すように、２個の類似体が共に存在するとき、共通補体はより高いハイブリダイゼーション効率を示した。また、類似体の比率と関連して中間領域においてより良いハイブリダイゼーション効率が観察された。図４Ｂにおいて、共通補体がより高いハイブリダイゼーション効率を示す三角形領域は、共通補体及び代表配列の潜在力をよく示しており、これは、図４Ｃでも観察された。反−類似体のハイブリダイゼーション効率は、互換性の低いターゲットの数が増加するほど低くなるが、共通補体は、類似体１／類似体２の比率が０．４／１．６〜１．２／０．８のとき、より良好なハイブリダイゼーションを示し、代表配列の可能性を立証した。
【００８４】
この結果をより信頼できるものとするために、１００個の任意の類似体セットを用いて１００個の代表配列を生成した結果、ハイブリダイゼーション効率値に差異があるにもかかわらず、代表配列と同じ機能の確実な証拠を示した。全ての可能な相補的な配列に対する類似体及び代表配列のギブス自由エネルギープロファイルを、ピアソン相関係数を用いて比較した。２個の塩基対のヌクレオチド間において平均ピアソン相関係数は０．６３６±０．０４９であった。対照的に、代表配列と類似体間の平均ピアソン相関係数は、０．８０５±０．０４２であった。この係数の増加は、代表配列が類似体配列のハイブリダイゼーションプロファイルを代表できるということを示す。
【００８５】
また、様々な濃度の類似体から最適化された代表配列を計算することが可能であり、その結果を図４Ｄに示した。
【００８６】
図４Ｄに示すように、総８個の塩基のうち５個を共有する２個の類似体を用いて、代表配列を様々な濃度で計算した。類似体濃度を０：１００００〜１００００：０にして適用し、最適の代表配列を得た。
【００８７】
また、類似体に対して最適化された代表配列のピアソン相関係数を計算し、その結果を図４Ｅに示した。
【００８８】
図４Ｅに示すように、濃度偏向から、最適化された代表配列はより大きい近接度を有し、支配的な類似体に対するより高いピアソン相関係数を示した。
【００８９】
実施例３．合成された塩基配列の理論的検証
【００９０】
代表配列を検証するために複数類似体の配列情報と配列間のギブスエネルギー及びピアソン相関係数を計算し、図５Ａに示した。
【００９１】
図５Ａに示すように、２個の塩基変異を持つ単一基本塩基から３個の類似体が生成された。２個の類似体の分析から分かるように、類似体２／３のギブス自由エネルギー値は完全な逆配列の配列に比べて低かったが、反−類似体のギブス自由エネルギーよりは高かった。基本配列に対する初期類似体のピアソン相関係数は０．５５０で、相互の平均係数は０．５９７であった。類似体２と類似体３（０．７４６及び０．９３６）に対する類似体２／３の係数は０．６７５であって、類似体２と類似体３間の係数に比べて高かった。この結果は、類似体２／３が類似体２と類似体３を代表するということを示す。
【００９２】
逆に、類似体２／３のギブス自由エネルギーと相関係数は類似体１に比べて増加しなく、基本配列に対するピアソン相関係数の増加はなかった。これは、計算された代表配列が標的類似体に特異的であるということを示す。一方、類似体１と類似体２／３において計算された代表的な配列は、基本配列に対するピアソン相関係数とギブス自由エネルギー値の増加を示し、係数値は、他の類似体の係数値に比べて高い０．６６４であった。平均係数は全ての類似体において増加し、代表配列に対する初期類似体の平均ピアソン相関係数は基本配列に対するそれよりも高かった。この結果は、代表配列を作ることが可能であるということを示すだけでなく、その性能が基本配列の性能よりも良好であり得るということを示す。
【００９３】
代表配列の潜在力はまた、平衡定数計算でも見られ、これを図５Ｂに示した。
【００９４】
図５Ｂに示すように、基本配列の逆配列配列である類似体２／３及び代表配列を用いてハイブリダイゼーション効率を測定した。ハイブリダイゼーションに対する平衡定数は、多重反応平衡計算式によって計算された。逆配列基本配列の平衡定数は、３個の類似体において類似であり、定数の和は２，９８０であった。類似体２及び類似体３において計算された逆配列類似体２／３の場合、類似体２及び類似体３の平衡定数が逆配列基本配列に比べて増加した。しかし、類似体１の定数は有意に減少した。したがって、定数の和は全体的に減少した（２，９６０）。また、逆配列代表配列は、類似体１の回復した定数を示し、定数の和は最高であった（２，９８４）。この結果は、生成された代表配列の潜在力を直接立証する。
【００９５】
また、多重ヌクレオチドの分析のために、５個の類似体及び３個のミスマッチ塩基を持つ同じ手順によって得られた代表配列を用いて、基本配列及び初期類似体に対する代表配列の平均ピアソン相関係数を計算し、図５Ｃに示した。
【００９６】
図５Ｃに示すように、代表配列のピアソン相関係数は、配列依存的方式で基本配列のピアソン相関関係より高い又は低かったが、通常、類似体の係数より高かった。
【００９７】
また、様々な突然変異塩基のハイブリダイゼーション収率及びピアソン相関係数の比率を図５Ｄに示した。
【００９８】
図５Ｄに示すように、配列の差異によってハイブリダイゼーションプロファイルの類似性が少なくなるため、類似体に対する基本配列のピアソン相関係数は、突然変異の数の増加によって減少した。ピアソン相関係数の減少は、代表配列からも観察された。しかし、減少量は基本配列の減少量よりも少なかった。したがって、ピアソン相関係数（代表／基本）の比率は、突然変異の数にしたがって増加した。突然変異の数が４のとき、代表配列の平均係数は基本配列に比べて高かった。これは、本発明の過程が多重ヌクレオチドから代表配列を生成できるということを示すが、基本配列におけるように最適化されてはいないということを示し、これは、ギブス自由エネルギーと平衡定数に対する不正確な計算に起因すると考えられる。特に、二次構造のようなヌクレオチドハイブリダイゼーションにおいて考慮すべきいくつかの要因があるため、簡単な熱力学原理を用いた平衡定数計算は、代表的な配列生成のための最適化に不十分であり得る。このような不正確性を克服するために、ギブス自由エネルギー及び平衡状態計算過程にさらに複雑で同時的な計算を適用してもよい。しかし、代表配列は任意の単一類似体に比べて類似体との相関関係が遥かに高いことを確認した。
【図１Ａ】
2021522868.tif 000009
【図１Ｂ】
2021522868.tif 000010
【図１Ｃ】
2021522868.tif 000011
【図２Ａ】
2021522868.tif 000012
【図２Ｂ】
2021522868.tif 000013
【図３Ａ】
2021522868.tif 000014
【図３Ｂ】
2021522868.tif 000015
【図３Ｃ】
2021522868.tif 000016
【図３Ｄ】
2021522868.tif 000017
【図４Ａ】
2021522868.tif 000018
【図４Ｂ】
2021522868.tif 000019
【図４Ｃ】
2021522868.tif 000020
【図４Ｄ】
2021522868.tif 000021
【図４Ｅ】
2021522868.tif 000022
【図５Ａ】
2021522868.tif 000023
【図５Ｂ】
2021522868.tif 000024
【図５Ｃ】
2021522868.tif 000025
【図５Ｄ】
2021522868.tif 000026
【国際調査報告】
2021522868.tif 000027
2021522868.tif 000028
2021522868.tif 000029
2021522868.tif 000030
2021522868.tif 000031
2021522868.tif 000032