(57)【要約】  本発明は、ＤＮＡ分子における標的部位を改変するための方法及び組成物に関する。本開示は、ｃｒＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖と、標的ＤＮＡの改変のためのこれらの分子の使用方法とを提供する。改変は、標的化された導入遺伝子挿入、標的化された対立遺伝子置換、及び標的化された変異誘発を含む。
2021522829.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃｒＲＮＡ分子及びその対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖であって、前記ｃｒＲＮＡ分子及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、各々、配列番号５５及び５６、配列番号５７及び５８、配列番号５９及び６０、配列番号６１及び６２、配列番号６３及び６４、配列番号６５及び６６、配列番号６７及び６８、配列番号６９及び７０、配列番号７１及び７２、配列番号７３及び７４、配列番号７５及び７６、配列番号７７及び７８、配列番号７９及び８０、配列番号８１及び８２、又は配列番号８３及び８４の核酸配列を含み、前記ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡ分子における配列に相補的な核酸配列を含むＤＮＡ標的化セグメントを更に含み、それにより前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖は、標的ＤＮＡ配列を標的化及び標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズする、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖。
【請求項２】
前記ｃｒＲＮＡ分子の前記ＤＮＡ標的化セグメントが、少なくとも１２ヌクレオチド長であり、かつ標的ＤＮＡ分子における配列に対して少なくとも８０％相補性を有する核酸配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖。
【請求項３】
前記ｃｒＲＮＡ分子及びその対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子の二重鎖形成セグメントが、各々、配列番号５５及び９６、配列番号５７及び９７、配列番号５９及び９８、配列番号６１及び９９、配列番号６３及び１００、配列番号６５及び１０１、配列番号６７及び１０２、配列番号６９及び１０３、配列番号７１及び１０４、配列番号７３及び１０５、配列番号７５及び１０６、配列番号７７及び１０７、配列番号７９及び１０８、配列番号８１及び１０９、又は配列番号８３及び１１０の核酸配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖。
【請求項４】
請求項１に記載の前記ｃｒＲＮＡ又は前記ｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子。
【請求項５】
請求項１に記載の前記ｃｒＲＮＡ分子及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡ分子の両方をコードするＤＮＡ分子。
【請求項６】
前記ｃｒＲＮＡ分子及びその対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子が、各々、配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号７及び８、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２、配列番号１３及び１４、配列番号１５及び１６、配列番号１７及び１８、配列番号１９及び２０、配列番号２１及び２２、配列番号２３及び２４、配列番号２８及び２９、配列番号３０及び３１、配列番号３２及び３３、又は配列番号３４及び３５を含む核酸配列、又はその相補体によってコードされ、前記ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡ分子における配列に相補的な核酸配列を含むＤＮＡ標的化セグメントを更に含み、それにより前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖は、標的ＤＮＡ配列を標的化及び標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズする、請求項４又は５に記載のＤＮＡ分子。
【請求項７】
少なくとも１つのｃｒＲＮＡセグメント及びその対応するｔｒａｃｒＲＮＡセグメントを含むＲＮＡ分子であって、前記セグメントが、５’及び／又は３’末端においてｔＲＮＡ切断配列に作動可能に連結され、それによりｔＲＮＡ切断後に、前記ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡセグメントは、分離し、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖を形成することが可能な別個の分子となる、ＲＮＡ分子。
【請求項８】
タンデムアライメントにあるｔＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ又はｔＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｃｒＲＮＡを含む、請求項７に記載のＲＮＡ分子
【請求項９】
少なくとも２つのｃｒＲＮＡセグメント及びそれらの対応するｔｒａｃｒＲＮＡセグメントを含み、前記セグメントが、５’及び／又は３’末端においてｔＲＮＡ切断配列に作動可能に連結されている、請求項７に記載のＲＮＡ分子
【請求項１０】
前記２つのｃｒＲＮＡセグメントが、異なる標的ＤＮＡ分子における異なる配列に相補的な核酸配列であるＤＮＡ標的化セグメントを含む、請求項９に記載のＲＮＡ分子
【請求項１１】
前記ｃｒＲＮＡセグメント及びその対応するｔｒａｃｒＲＮＡセグメントの少なくとも１つが、各々、配列番号５５及び５６、配列番号５７及び５８、配列番号５９及び６０、配列番号６１及び６２、配列番号６３及び６４、配列番号６５及び６６、配列番号６７及び６８、配列番号６９及び７０、配列番号７１及び７２、配列番号７３及び７４、配列番号７５及び７６、配列番号７７及び７８、配列番号７９及び８０、配列番号８１及び８２、又は配列番号８３及び８４の核酸配列を含み、前記ｃｒＲＮＡが、標的ＤＮＡ配列における配列に相補的な核酸配列を含むＤＮＡ標的化セグメントを更に含む、請求項７に記載のＲＮＡ分子
【請求項１２】
前記ｔＲＮＡ切断部位の核酸配列が、配列番号１１２に対して少なくとも９０％同一である、請求項７〜１１のいずれかに記載のＲＮＡ分子。
【請求項１３】
少なくとも１つの請求項７に記載のＲＮＡ分子をコードする核酸分子。
【請求項１４】
前記ＲＮＡ分子の発現が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより駆動されるプロモーターにより駆動される、請求項１３に記載の核酸分子
【請求項１５】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより駆動される前記プロモーターの核酸配列が、配列番号８５に対して少なくとも９０％同一である、請求項１４に記載の核酸分子
【請求項１６】
前記ＲＮＡ分子の発現が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより駆動されるプロモーターにより駆動される、請求項１３に記載の核酸分子
【請求項１７】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより駆動される前記プロモーターの核酸配列が、配列番号８６に対して少なくとも９０％同一である、請求項１６に記載の核酸分子
【請求項１８】
１つのＲＮＡ分子の発現が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより駆動されるプロモーターにより駆動され、第２のＲＮＡ分子の発現が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより駆動されるプロモーターにより駆動される、請求項１３に記載の核酸分子
【請求項１９】
各々、前記ｃｒＲＮＡ及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする、２つの発現カセットが存在する、請求項１３〜１８のいずれかに記載の核酸分子
【請求項２０】
少なくとも１つの発現カセットが、配列番号８７〜９５のいずれかの配列を含む、請求項１３〜１９のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項２１】
請求項１に記載のＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖、及び更に部位特異的改変ポリペプチドを含み、それにより前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖が前記部位特異的改変ポリペプチドと相互作用して複合体を形成し、前記複合体は、標的ＤＮＡ分子を標的化及び標的ＤＮＡ分子とハイブリダイズし、前記部位特異的改変ポリペプチドが標的ＤＮＡ配列を改変する、標的化変異誘発のための、人工的な、天然に存在しないシステム。
【請求項２２】
少なくとも１つのｃｒＲＮＡ分子、少なくとも１つのｔｒａｃｒＲＮＡ分子、及び前記部位特異的改変ポリペプチドが、少なくとも１つの核酸分子内でコードされ、少なくとも１つのｃｒＲＮＡ分子及びその対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子が、各々、配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号７及び８、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２、配列番号１３及び１４、配列番号１５及び１６、配列番号１７及び１８、配列番号１９及び２０、配列番号２１及び２２、配列番号２３及び２４、配列番号２８及び２９、配列番号３０及び３１、配列番号３２及び３３、又は配列番号３４及び３５を含む核酸配列、又はその相補体によってコードされ、前記ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列における配列に相補的な核酸配列を含むＤＮＡ標的化セグメントを更に含み、それにより前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖は、前記部位特異的改変ポリペプチドと相互作用して複合体を形成し、前記複合体は、前記標的ＤＮＡ分子を標的化及び前記標的ＤＮＡ分子とハイブリダイズし、前記部位特異的改変ポリペプチドは、前記標的ＤＮＡ配列を改変する、請求項２１に記載の標的化変異誘発のためのシステム。
【請求項２３】
少なくとも１つのｃｒＲＮＡ分子及び少なくとも１つのｔｒａｃｒＲＮＡ分子が、同じ発現カセット内でコードされ、前記発現カセットは、２つ以上のｔＲＮＡ切断配列を含み、それによりｔＲＮＡ切断後、前記ｃｒＲＮＡ及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は分離し、別個の分子である、請求項２２に記載の核酸分子
【請求項２４】
標的ＤＮＡの部位特異的改変の方法であって、前記方法が：
前記標的ＤＮＡを：
（ｉ）請求項１に記載のＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖、又はそれをコードするＤＮＡ分子；及び
（ｉｉ）前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分と、部位特異的酵素活性を示す活性部分とを含む部位特異的改変ポリペプチド、又はそれをコードするＤＮＡ分子；
と接触させることを含み、
前記酵素活性は、前記標的ＤＮＡを改変する、方法。
【請求項２５】
前記標的ＤＮＡが染色体外である、請求項２４に記載の方法
【請求項２６】
前記標的ＤＮＡが染色体の一部である、請求項２４に記載の方法
【請求項２７】
前記標的ＤＮＡが、細胞内の染色体の一部である、請求項２６に記載の方法
【請求項２８】
前記標的ＤＮＡが、エピソーム又はミニ染色体の一部であり、又はミトコンドリア又は葉緑体内に存在する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が真核生物細胞である、請求項２７に記載の方法
【請求項３０】
前記酵素活性が、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、又はグリコシラーゼ活性である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＤＮＡ改変酵素活性がヌクレアーゼ活性である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ヌクレアーゼが、前記標的ＤＮＡにおいて二本鎖切断を導入する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記接触が、非相同末端結合又は相同組換え修復が許容される条件下で起こる、請求項２４〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記標的ＤＮＡ分子をドナーポリヌクレオチドと接触させることを更に含み、前記ドナーポリヌクレオチド、前記ドナーポリヌクレオチドの部分、前記ドナーポリヌクレオチドのコピー、又は前記ドナーポリヌクレオチドのコピーの部分が、前記標的ＤＮＡ分子に統合される、請求項２４〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記部位特異的改変ポリペプチドがＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼである、請求項２４〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記部位特異的改変ポリペプチドが、改変されていてもよいＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、配列番号３９のアミノ酸配列を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
抗サイレンシングポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む追加の核酸分子を前記細胞内に導入することを更に含む、請求項２４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞に抗サイレンシングポリペプチドを提供することを更に含む、請求項２４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞が、植物細胞、菌細胞、又は藻類細胞である、請求項２４〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記植物細胞が単子葉植物細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記植物細胞が、トウモロコシ、イネ、モロコシ、サトウキビ、大麦、小麦、カラス麦、芝草、又は観賞用草細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記植物細胞が、双子葉植物細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記植物細胞が、タバコ、トマト、コショウ、ナス、ヒマワリ、アブラナ科、アマ、ジャガイモ、綿、大豆、テンサイ、又はアブラナ細胞である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖及び／又は部位特異的改変ポリペプチドを含む分子が、前記細胞に送達される、請求項２４〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖及び／又は部位特異的改変ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子が、前記細胞内に導入される、請求項２４〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＤＮＡ分子が、微粒子銃照射によって前記細胞内に導入される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＤＮＡ分子が、アグロバクテリウム媒介形質転換によって前記細胞内に導入される、請求項４６に記載の方法
【請求項４９】
標的ＤＮＡの部位特異的改変を含む植物、植物部分、又はその子孫の生成方法であって、前記方法は、請求項４０〜４８のいずれか一項に記載の方法によって生成された植物細胞から植物を再生することを含む、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法によって生成された標的ＤＮＡの部位特異的改変を含む植物、植物部分、又はその子孫。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本願は、その全体が参照により組み込まれる、２０１８年５月１０日出願の米国仮特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０８６３６５号明細書による利益を主張する。
【０００２】
配列表
２０１８年４月２４日に生成された、「８１５５５＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題される、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§  １．８２１の下で提出された、８２キロバイトのサイズのＡＳＣＩＩテキスト形式の配列表は、紙コピーの代わりに提供される。この配列表は、その開示について参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、細胞のゲノムにおける標的化された導入遺伝子挿入、標的化された対立遺伝子置換、又は標的化された変異誘発のための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
標的化されたゲノム改変の分野での最近の進歩により、日常的な標的化改変が間もなく可能となり得る。部位特異的ヌクレアーゼ、例えば亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮＳ）及びクラスター化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）／ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）（これは、人工的な（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖又は単一ガイドＲＮＡとの複合体で作用する）によってゲノムＤＮＡを標的化及び切断する方法及び組成物に向けて、過去数年間で重要な進歩があった。これらの部位特異的ヌクレアーゼは、標的化変異誘発を誘導し、ＤＮＡ配列の標的化削除を誘導し、また標的化ＤＮＡ配列内の外来性ドナーＤＮＡポリヌクレオチド、例えば導入遺伝子の標的化組換えを容易にし得る。
【０００５】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムでは、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を含むデュアルガイドシステムにより誘導されるＣａｓ９ヌクレアーゼは、標的ＤＮＡを切断するのに十分である（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ：３３７：８１６−８２１）。部位特異的切断は、ｃｒＲＮＡ及び標的ＤＮＡ、並びに、標的ＤＮＡにおける相補的な領域に並置される、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される短いモチーフの間の塩基対合相補性により決定される位置で起こる。ｃｒＲＮＡ単独ではＣａｓ９を標的ＤＮＡに指向させることができず；ｃｒＲＮＡの配列と対合するｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖とＣａｓ９酵素との複合体形成を可能にするタンパク質結合セグメントを形成することが要求される。しかしながら、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの相互作用が、Ｃａｓ９標的化及び／又は変異誘発効率を増加することを最適化できるか否かは知られていない。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ｃｒＲＮＡ分子及びその対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖を提供し、ｃｒＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、各々、配列番号５５及び５６、配列番号５７及び５８、配列番号５９及び６０、配列番号６１及び６２、配列番号６３及び６４、配列番号６５及び６６、配列番号６７及び６８、配列番号６９及び７０、配列番号７１及び７２、配列番号７３及び７４、配列番号７５及び７６、配列番号７７及び７８、配列番号７９及び８０、配列番号８１及び８２、又は配列番号８３及び８４の核酸配列を含み、ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡ分子における配列に相補的な核酸配列を含むＤＮＡ標的化セグメントを更に含み、それによりＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖は、標的ＤＮＡ配列を標的化及びハイブリダイズする。本発明のｃｒＲＮＡ及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、操作されており、これはそれらが人の手により作製され、天然に存在しないことを意味する。
【０００７】
本発明はまた、本発明の少なくとも１つのｃｒＲＮＡ及び／又は少なくとも１つのｔｒａｃｒＲＮＡをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。核酸分子は、２つ以上のｃｒＲＮＡ分子をコードしてもよく、複数のｃｒＲＮＡ分子は、異なるプロトスペーサー配列を有する。或いは、核酸分子は、同じプロトスペーサー配列を有する複数のｃｒＲＮＡ分子をコードしてもよい。核酸分子はまた、複数のｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードしてもよく、又は単一のｔｒａｃｒＲＮＡ分子を複数回コードしてもよい。核酸分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であってもよい。いくつかの実施形態では、核酸分子は環状化されている。他の実施形態では、核酸分子は線状である。いくつかの実施形態では、核酸分子は、一本鎖、部分的に二本鎖、又は二本鎖である。
【０００８】
本発明はまた、人工的な、天然に存在しない、標的化変異誘発のためのシステムを提供し、当該システムは、本発明のＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖と、部位特異的改変ポリペプチドとを含み、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖は、ｃｒＲＮＡ分子及びその対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子を含み、ｃｒＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、各々、配列番号５５及び５６、配列番号５７及び５８、配列番号５９及び６０、配列番号６１及び６２、配列番号６３及び６４、配列番号６５及び６６、配列番号６７及び６８、配列番号６９及び７０、配列番号７１及び７２、配列番号７３及び７４、配列番号７５及び７６、配列番号７７及び７８、配列番号７９及び８０、配列番号８１及び８２、又は配列番号８３及び８４の核酸配列を含み、ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡ分子における配列に相補的な核酸配列を更に含み、それによりｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡデュアルガイド複合体は、標的ＤＮＡ配列を標的化及びハイブリダイズし、部位特異的改変ポリペプチドは、ＤＮＡ分子を切断する。本発明のｃｒＲＮＡ分子は、本発明のｃｒＲＮＡ分子のＤＮＡ標的化セグメントであり、且つ標的ＤＮＡ分子における配列に相補的なプロトスペーサー配列を更に含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ分子、その対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子、及び部位特異的改変ポリペプチドは、少なくとも１つの核酸分子内でコードされ、ｃｒＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、各々、配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号７及び８、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２、配列番号１３及び１４、配列番号１５及び１６、配列番号１７及び１８、配列番号１９及び２０、配列番号２１及び２２、配列番号２３及び２４、配列番号２８及び２９、配列番号３０及び３１、配列番号３２及び３３、又は配列番号３４及び３５を含む核酸配列、又はその相補体によりコードされ、ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡ分子における配列に相補的な核酸配列を含むＤＮＡ標的化セグメントを更に含み、それによりｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡデュアルガイド複合体は、標的ＤＮＡ配列を標的化及びハイブリダイズし、部位特異的改変ポリペプチドは、ＤＮＡ分子を切断する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡがコードされている核酸分子は、ベクターである。更なる実施形態では、核酸分子は、形質転換、例えば微粒子銃形質転換、アグロバクテリウム媒介形質転換、又はＰＥＧ／エレクトロポレーションが可能なベクターである。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子がコードされている同じ核酸分子上にコードされる。他の実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子がコードされているものとは異なる核酸分子上にコードされる。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、異なる発現カセットにコードされる。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、同じ発現カセットにコードされる。
【００１１】
本発明はまた、少なくとも１つのｃｒＲＮＡセグメント及びその対応するｔｒａｃｒＲＮＡセグメントの少なくとも１つを含むＲＮＡ分子を提供し、これらのセグメントは、５’及び／又は３’末端においてｔＲＮＡ切断配列に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、ｔＲＮＡ切断が可能な細胞内に存在し得る。ｔＲＮＡ切断後、ｃｒＲＮＡセグメントは本発明のｃｒＲＮＡ分子となり、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントは本発明のｔｒａｃｒＲＮＡ分子となるため、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は分離し、別個の分子であり、これらはＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖を形成することが可能である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、タンデムアライメントにあるｔＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ又はｔＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、得られたｃｒＲＮＡ分子及びその対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子の少なくとも１つは、各々、配列番号５５及び５６、配列番号５７及び５８、配列番号５９及び６０、配列番号６１及び６２、配列番号６３及び６４、配列番号６５及び６６、配列番号６７及び６８、配列番号６９及び７０、配列番号７１及び７２、配列番号７３及び７４、配列番号７５及び７６、配列番号７７及び７８、配列番号７９及び８０、配列番号８１及び８２、又は配列番号８３及び８４の核酸配列を含み、ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列における配列に相補的な核酸配列を更に含む。
【００１２】
本発明はまた、本明細書に記載されるｔＲＮＡ切断部位を含むＲＮＡ分子を発現する、少なくとも１つの発現カセットを含む核酸分子を提供する。この核酸分子は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子を細胞及び標的ＤＮＡ分子に送達するための改善された構築物である。核酸分子は、ｔＲＮＡ切断が可能な細胞内に存在してもよい。いくつかの実施形態では、本発明のｃｒＲＮＡ分子、本発明の対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子、及び少なくとも２つのｔＲＮＡ切断配列は、同じ発現カセット内でコードされ、それによりｔＲＮＡ切断後、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は分離し、別個の分子である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｔＲＮＡ切断部位を含むＲＮＡ分子を発現する核酸分子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより駆動されるプロモーターを含む少なくとも１つの発現カセットを含む。更なる実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより駆動されるプロモーターは、配列番号８５に対して少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより駆動されるプロモーターを含む少なくとも１つの発現カセットを含む。更なる実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより駆動されるプロモーターは、配列番号８６に対して少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、少なくとも２つの発現カセットを含み、一方は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより駆動されるプロモーターを含み、他方は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより駆動されるプロモーターを含む。更なる実施形態では、第１の発現カセットは、配列番号８５に対して少なくとも９０％同一のプロモーターを含み、第２の発現カセットは、配列番号８６に対して少なくとも９０％同一のプロモーターを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、直上に記載された核酸分子は、少なくとも１つの発現カセットを含み、発現カセットの核酸配列は、配列番号８７〜９４のいずれかである。配列番号８７〜９４内の２０個のＮ’は、発現カセット内でコードされるｃｒＲＮＡ分子のプロトスペーサーを表す。本明細書に記載されるように、プロトスペーサー配列は、少なくとも１２ヌクレオチド長であり、標的ＤＮＡ分子の標的配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％相補性を有し得る。
【００１５】
本発明はまた、標的ＤＮＡの部位特異的改変の方法を提供し、当該方法は、標的ＤＮＡを以下と接触させることを含む：（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖、又はそれをコードするＤＮＡ分子、ここでＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖は、本明細書に記載されるような本発明のＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖である、及び（ｉｉ）部位特異的改変ポリペプチド、又はそれをコードするＤＮＡ分子、ここで部位特異的改変ポリペプチドは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、及び部位特異的酵素活性を示す活性部分を含む。
【００１６】
本発明の方法は、標的ＤＮＡの部位特異的改変を含み、ＤＮＡ改変酵素活性は、ヌクレアーゼ活性である。ヌクレアーゼは、標的ＤＮＡにおいて一本鎖又は二本鎖切断を導入することができる。ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖及び／又は部位特異的改変ポリペプチドは、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）又は相同組換え修復が許容される条件下で、標的ＤＮＡと接触することができる。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、修復プロセスの結果として改変されてもよく、部位特異的ヌクレアーゼとしてのみ作用し得る部位特異的改変ポリペプチドの酵素活性の直接的な結果としてではない。
【００１７】
本発明はまた、部位特異的改変の方法を提供し、標的部位は、核酸配列の挿入により改変される。この配列は、ドナー分子により提供される。この方法において、標的ＤＮＡは、以下と接触する：（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖、又はそれをコードするＤＮＡ分子、ここでＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖は、本明細書に記載されるような本発明のＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖である；（ｉｉ）部位特異的改変ポリペプチド、又はそれをコードするＤＮＡ分子、ここで部位特異的改変ポリペプチドは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、及び部位特異的酵素活性を示す活性部分を含む；並びに（ｉｉｉ）ドナーポリヌクレオチド、ここでドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、又はドナーポリヌクレオチドのコピーの一部は、標的ＤＮＡ内に統合される。
【００１８】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖及び／又は部位特異的改変ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子は、標的ＤＮＡを含む細胞内に導入又は送達される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖及び部位特異的改変ポリペプチドは、同じＤＮＡ分子上にコードされる。他の実施形態では、それらは別々のＤＮＡ分子上にコードされる。更なる実施形態では、ＤＮＡ分子は、微粒子銃照射、アグロバクテリウム媒介形質転換、又は当技術分野で既知の任意の他の方法によって、細胞内に導入される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子は、一過性に発現され、細胞のゲノムに組み込まれない。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子は、安定的に形質転換され、細胞のゲノムに組み込まれる。
【００１９】
本発明はまた、標的ＤＮＡの部位特異的改変を含む植物、植物部分、又はその子孫の生成方法を提供し、前記方法は、そのＤＮＡが、上述した本発明の方法のいずれかにより改変されている植物細胞から植物を再生することを含む。本発明は更に、これらの方法によって生成された、そのＤＮＡの改変を含む植物、植物部分、又はその子孫を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を図示し、本発明の変異ｄ２〜ｄ９及びｄ１１を示す。ｃｒＲＮＡの配列は、配列番号１１３である。ｔｒａｃｒＲＮＡの配列は、配列番号１１４である。ｄ２〜ｄ７及びｄ１１は、ｃｒＲＮＡに対する点変異の位置、及び塩基対合を保つための対応するｔｒａｃｒＲＮＡ内の位置を示す。プロトスペーサーがない場合、ｄ２のｃｒＲＮＡ及びその対応するｔｒａｃｒＲＮＡの配列は、配列番号５７〜５８；ｄ３の場合、配列番号５９〜６０、ｄ４の場合、配列番号６１〜６２、ｄ５の場合、配列番号６３〜６４、ｄ６の場合、配列番号６５〜６６、ｄ７の場合、配列番号６７〜６８、及びｄ１１の場合、配列番号７５〜７６である。ｄ８は、３’末端においてｃｒＲＮＡを伸長して、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端と相補的な塩基対合を提供する９ｎｔ追加であり、変異型ｃｒＲＮＡ（プロトスペーサーなし）及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡの配列は、配列番号６９〜７０である。ｄ９は、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’オーバーハングを排除するためのｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端の８ｎｔ削除であり、ｄ９（プロトスペーサーなし）のｃｒＲＮＡ及び変異型ｔｒａｃｒＲＮＡの配列は、配列番号７１〜７２である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
配列表における配列の簡単な説明
配列番号１〜２は、ｃｒＲＮＡ及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子の一部をコードするＤＮＡ配列である。このｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントを含まない。
【００２２】
配列番号３〜２４は、人工的なｃｒＲＮＡ及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子の一部をコードするＤＮＡ配列である。このｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントを含まない。これらの対は、図１及び表１において変異ｄ１〜ｄ１１として特定される。
【００２３】
配列番号２５は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより駆動されるｐｒＯｓＵ３プロモーターにより駆動され、その３’末端が合成ポリＴターミネーターで終結する、ｔＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする発現カセットのＤＮＡ配列である。この発現カセットは、実施例２及び表１に記載されるようにベクター２３９９９内に存在する。
【００２４】
配列番号２６は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより駆動されるｐｒＯｓＵ３プロモーターにより駆動され、その３’末端が合成ポリＴターミネーターで終結する、ｔＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ分子をコードする発現カセットのＤＮＡ配列である。この発現カセットは、実施例２及び表１に記載されるようにベクター２４０００内に存在する。
【００２５】
配列番号２７は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより駆動されるｐｒＯｓＵ３プロモーターにより駆動され、その３’末端が合成ポリＴターミネーターで終結する、単一ガイドＲＮＡ分子をコードする発現カセットのＤＮＡ配列である。この発現カセットは、ベクター２３１２７内に存在する。このｓｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、実施例２及び表１に記載されるように、人工的なｃｒＲＮＡ分子内と同じＤＮＡ標的化セグメントである。
【００２６】
配列番号２８〜３５は、実施例３〜４及び表２に記載される、人工的なｃｒＲＮＡ及びその対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子の一部をコードするＤＮＡ配列である。このｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントを含まない。
【００２７】
配列番号３６は、小麦矮小ウイルス（ＷＤＶ）ＤＮＡレプリコンを含むＤＮＡ配列であり、従って人工的なｄ９＋ｄ１１  ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、ＷＤＶレプリコンから発現される。
【００２８】
配列番号３７は、実施例３に記載のように、ｔＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｃｒＲＮＡを含むＲＮＡ分子をコードする、ｐｒＯｓＵ３プロモーターにより駆動され、合成ポリＴターミネーターにより終結される発現カセットのＤＮＡ配列である。
【００２９】
配列番号３８は、ｐｒＯｓＵ３プロモーターにより駆動され、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ターミネーターにより終結される、実施例３に記載のように、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡがｄ９変異を含む、ｔＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｃｒＲＮＡを含むＲＮＡ分子をコードする発現カセットのＤＮＡ配列である。
【００３０】
配列番号３９は、実施例で使用されるＣａｓ９バリアントのアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号４０は、実施例３に記載のように、ｔＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡを含むＲＮＡ分子をコードする、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより駆動されるｐｒＳｏＵｂｉプロモーターにより駆動され、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ターミネーターにより終結される発現カセットのＤＮＡ配列である。
【００３２】
配列番号４１は、実施例３に記載のように、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡがｄ９変異を含む、ｔＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｃｒＲＮＡを含むＲＮＡ分子をコードする、ｐｒＯｓＵ３プロモーターにより駆動され、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ターミネーターにより終結される発現カセットのＤＮＡ配列である。
【００３３】
配列番号４２は、実施例３に記載のように、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡがｄ９変異を含む、ｔＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡを含むＲＮＡ分子コードする、ｐｒＳｏＵｂｉプロモーターにより駆動され、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ターミネーターにより終結される発現カセットのＤＮＡ配列である。
【００３４】
配列番号４３は、実施例３に記載のように、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡがｄ９及びｄ１１（ｄ９＋ｄ１１）変異を含む、ｔＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｃｒＲＮＡを含むＲＮＡ分子をコードする、ｐｒＯｓＵ３プロモーターにより駆動され、合成ポリＴターミネーターにより終結される発現カセットのＤＮＡ配列である。
【００３５】
配列番号４４は、実施例３に記載のように、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡがｄ９＋ｄ１１変異を含む、ｔＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡを含むＲＮＡ分子をコードする、ｐｒＳｏＵｂｉプロモーターにより駆動され、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ターミネーターにより終結される発現カセットのＤＮＡ配列である。
【００３６】
配列番号４５は、実施例に記載されている、全ての人工的なｃｒＲＮＡ分子の５’末端に作動可能に連結され、その一部である、プロトスペーサー（及びＤＮＡ標的化セグメント）であるＤＥＰ１プロトスペーサー標的のＤＮＡ配列である。
【００３７】
配列番号４６〜４８は、ＰＭＩ遺伝子の検出に有用なＰＭＩプライマーセット及びプローブである。
【００３８】
配列番号４９〜５１は、Ｃａｓ９遺伝子の検出に有用なＣａｓ９プライマーセット及びプローブである。
【００３９】
配列番号５２〜５４は、ＯｓＤＥＰ１遺伝子における標的化変異の検出に有用なＯｓＤｅｐ１−２６７８プライマーセット及びプローブである。
【００４０】
配列番号５５〜７６は、配列番号３〜２４のＤＮＡ配列に対応する、ＤＮＡ標的化セグメント及びその対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子を含まない、人工的なｃｒＲＮＡの一部のＲＮＡ配列である。
【００４１】
配列番号７７〜８４は、配列番号２８〜３５のＤＮＡ配列に対応する、ＤＮＡ標的化セグメント及びその対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子を含まない、人工的なｃｒＲＮＡの一部のＲＮＡ配列である。
【００４２】
配列番号８５は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより駆動されるｐｒＳｏＵｂｉ４プロモーターのＤＮＡ配列である。
【００４３】
配列番号８６は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより駆動されるｐｒＯｓＵ３プロモーターのＤＮＡ配列である。
【００４４】
配列番号８７〜９５は、２０個のＮ’が、人工的なｃｒＲＮＡのプロトスペーサーのコード配列を示す以外は、配列番号２５、２６、３７、３８、及び４０〜４４と同様の発現カセットのＤＮＡ配列である。これらのＮ’は、任意のヌクレオチド、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣであり得る。これらのＮ’は、ヌクレオチドがないことを示す場合もあり、従ってプロトスペーサーは２０ヌクレオチド長未満であり得る。
【００４５】
配列番号９６〜１１０は、本発明のｔｒａｃｒＲＮＡ分子の二重鎖形成セグメントのＲＮＡ配列である。
【００４６】
配列番号１１１は、実施例で使用されるＣａｓ９バリアントのＤＮＡ配列である。
【００４７】
配列番号１１２は、実施例に記載される発現カセットのｔＲＮＡ配列として使用されるプレｔＲＮＡ（ｇｌｙ）をコードするＤＮＡ配列である。
【００４８】
発明の詳細な説明
この説明は、本発明を実施することができる全ての異なる方法、又は本発明に追加することができる全ての特徴の詳細なカタログであることを意図するものではない。例えば、一実施形態に関連して示される特徴は、他の実施形態に組み込まれてもよく、特定の実施形態に関連して示される特徴は、その実施形態から削除されてもよい。加えて、本明細書で示唆される様々な実施形態に対する多数のバリエーション及び追加は、本開示に照らして当業者には明らかであり、本発明から逸脱するものではない。従って、以下の説明は、本発明のいくつかの特定の実施形態を例示することを意図しており、その全ての置換、組合せ、及びバリエーションを網羅的に特定することを意図していない。
【００４９】
別途定義されないかぎり、本明細書に用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書における本発明の説明において使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書に言及されている全ての出版物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。
【００５０】
以下の定義及び方法は、本発明をより良く定義し、本発明の実施において当業者を導くために提供される。特に断らない限り、本明細書で使用される用語は、関連技術における当業者による従来の使用に従って理解されるべきである。分子生物学における一般的用語の定義は、Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，５th  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４にも見出すことができる。
【００５１】
本発明の実施形態及び添付の特許請求の範囲の記載で使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別段の明確な指示をしない限り、複数形も含むことが意図される。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、関連する列挙された項目のうちの１つ以上の任意の及び全ての可能な組合せを指し、包含する。
【００５３】
「約」という用語は、本明細書で使用される場合、化合物の量、用量、時間、温度等の測定可能な値を指す場合、特定の量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、又は更には０．１％の変動を包含することを意味する。
【００５４】
「含む」及び／又は「含んでいる」という用語は、本明細書で使用される場合、述べられた特徴、整数、工程、操作、エレメント、及び／又は成分の存在を指定するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、操作、エレメント、成分、及び／又はそれらの群の存在又は追加を排除しない。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という移行句は、請求項の範囲が請求項に記載された特定の材料又は工程、並びに請求項に記載された発明の基本的且つ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものを包含すると解釈されることを意味する。従って、用語「から本質的になる」は、本発明の請求項で使用される場合、「を含む」と同等であると解釈されることを意図しない。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「増幅された」という用語は、核酸分子の少なくとも１つを鋳型として使用する、核酸分子の複数のコピー又は核酸分子に相補的な複数のコピーの構築を意味する。例えば、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｄ．Ｈ．Ｐｅｒｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９３）を参照されたい。増幅の産物は、アンプリコンと呼ばれる。
【００５７】
「コード配列」は、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、センスＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ等のＲＮＡに転写される核酸配列である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、次いで、生物において翻訳されて、タンパク質を産生する。
【００５８】
本明細書で使用される「発現カセット」は、適切な宿主細胞における特定のヌクレオチド配列の発現を指示することができる核酸分子を意味し、目的のヌクレオチド配列（典型的には、コード領域）に作動可能に連結されたプロモーターを含み、これは終結シグナルに作動可能に連結されている。発現カセットはまた、典型的には、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列を含む。コード領域は、通常、目的のタンパク質をコードするが、目的の機能性ＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡ、又はｔＲＮＡのような翻訳されないＲＮＡも、センス又はアンチセンス方向にコードしてもよい。発現カセットはまた、目的のヌクレオチド配列の直接発現に必要ではないが、発現ベクターからカセットを除去するための便利な制限部位のために存在する配列を含んでもよい。目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであり得、これは、その成分の少なくとも１つが、その他の成分の少なくとも１つに関して異種であることを意味する。発現カセットはまた、天然に存在するが、異種発現に有用な組換え形態で得られたものであってもよい。しかしながら、典型的には、発現カセットは、宿主に対して異種であり、即ち、発現カセットの特定の核酸配列は、宿主細胞内に天然には存在せず、当技術方法で既知の形質転換プロセスによって宿主細胞又は宿主細胞の祖先に導入されていなければならない。発現カセット内のヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターの制御下にあってもよいし、又は宿主細胞が何らかの特定の外部刺激にさらされたときにのみ転写を開始する誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。植物等の多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織、又は器官、又は発生段階に特異的であり得る。発現カセット又はその断片はまた、植物に形質転換される場合、「挿入された配列」又は「挿入配列」と称され得る。
【００５９】
「遺伝子」は、ゲノム内に位置し、前述のコード核酸配列に加えて、コード部分の発現、即ち転写及び翻訳の制御に関与する他の主に調節性の核酸配列を含む、規定された領域である。遺伝子は、コード領域及び非コード領域（例えば、イントロン、調節エレメント、プロモーター、エンハンサー、終結配列、並びに５’及び３’非翻訳領域）の両方を含み得る。遺伝子は、典型的には、ｍＲＮＡ、機能性ＲＮＡ、又は調節配列を含む特定のタンパク質を発現する。遺伝子は、機能的タンパク質を産生するために使用され得るか、又はされ得ない。いくつかの実施形態では、遺伝子は、コード領域のみを指す。「天然遺伝子」という用語は、天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」という用語は、１）天然では、共存して見出されない調節配列及びコード配列を含むＤＮＡ配列、又は２）天然には隣接していないタンパク質の一部をコードする配列、又は３）天然には隣接していないプロモーターの一部を含む任意の遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列を含むか、又は同じ供給源に由来するが、天然に見出されるものとは異なる様式で配置される調節配列及びコード配列を含み得る。遺伝子は、「単離」されてもよく、これは天然の状態で核酸分子と関連して通常見出される成分を実質的に又は本質的に含まない核酸分子を意味する。このような成分としては、他の細胞材料、組換え産生由来の培養培地、及び／又は核酸分子を化学的に合成する際に使用される種々の化学物質が挙げられる。
【００６０】
ポリヌクレオチドコード配列の「発現する」又は「発現」という用語は、配列が転写され、場合により翻訳されることを意味する。
【００６１】
「目的の遺伝子」又は「目的のヌクレオチド配列」は、植物に移入された場合に、抗生物質耐性、ウイルス耐性、昆虫耐性、疾病耐性、又は他の害虫に対する耐性、除草剤耐性、栄養価の改善、工業プロセスにおける性能の改善、又は生殖能力の変化等の所望の特徴を植物に付与する任意の遺伝子を指す。「目的の遺伝子」はまた、植物において商業的に価値のある酵素又は代謝産物を産生するために植物に移入されるものであってもよい。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「異種」は、それが導入される宿主細胞と天然に関連しない核酸分子又はヌクレオチド配列を指し、これは、別の種に由来するか、又は同じ種若しくは生物に由来するが、その元の形態又は細胞内で主に発現される形態から改変されている（天然に存在する核酸配列の天然に存在しない複数のコピーを含む）。従って、ヌクレオチド配列が導入される細胞のものとは異なる生物又は種に由来するヌクレオチド配列は、その細胞及び細胞の子孫に関して異種である。加えて、異種ヌクレオチド配列は、同じ天然の元の細胞型に由来し、挿入されるが、非天然の状態で存在する（例えば、異なるコピー数で存在する）、及び／又は核酸分子の天然の状態で見出されるものとは異なる調節配列の制御下に存在する、ヌクレオチド配列を含む。核酸配列はまた、例えば、発現ベクターのような核酸構築物において、それが関連し得る他の核酸配列に対して異種であり得る。非限定的な一例として、プロモーターは、その特定のプロモーターと関連して天然には存在しない、即ち、プロモーターに対して異種の１つ以上の調節エレメント及び／又はコード配列と組み合わせて、核酸構築物中に存在し得る。
【００６３】
「相同」核酸配列は、それが導入される宿主細胞に天然に関連する核酸配列である。相同核酸配列はまた、例えば核酸構築物中に存在し得る他の核酸配列と天然に関連する核酸配列であり得る。非限定的な一例として、プロモーターは、その特定のプロモーターと関連して天然に存在する、即ち、プロモーターと相同の１つ以上の調節エレメント及び／又はコード配列と組み合わせて、核酸構築物中に存在し得る。
【００６４】
「作動可能に連結された」は、一方の機能が他方の機能に影響を及ぼすような、単一の核酸配列上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、コード配列又は機能性ＲＮＡの発現に影響を及ぼすことができる場合（即ち、コード配列又は機能性ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある場合）、そのコード配列又は機能性ＲＮＡと作動可能に連結されている。センス又はアンチセンス配向におけるコード配列は、調節配列に作動可能に連結され得る。従って、ヌクレオチド配列と作動可能に関連する調節配列又は制御配列（例えば、プロモーター）は、ヌクレオチド配列の発現に影響を及ぼすことができる。例えば、ＧＦＰをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターは、そのＧＦＰヌクレオチド配列の発現に影響を及ぼすことができる。制御配列は、それらがその発現を指示するように機能する限り、目的のヌクレオチド配列と連続している必要はない。従って、例えば、介在する非翻訳であるが転写された配列は、プロモーターとコード配列との間に存在することができ、プロモーター配列は、依然としてコード配列に「作動可能に連結されている」と考えることができる。
【００６５】
本明細書で使用される「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的標的ＤＮＡ鎖にアニールされて、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間にハイブリッドを形成し、次いで、ＤＮＡポリメラーゼのようなポリメラーゼによって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長される単離された核酸である。プライマー対又はセットは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は他の核酸増幅方法による核酸分子の増幅のために使用され得る。
【００６６】
「プローブ」は、標的核酸分子の一部に相補的であり、典型的には、標的核酸分子を検出及び／又は定量するために使用される、単離された核酸分子である。従って、いくつかの実施形態では、プローブは、検出可能な部分又はレポーター分子（例えば、放射性同位体、リガンド、化学発光剤、蛍光剤又は酵素）が結合している単離された核酸分子であり得る。本発明によるプローブは、デオキシリボ核酸又はリボ核酸だけでなく、標的核酸配列に特異的に結合し、その標的核酸配列の存在を検出し及び／又はその量を定量するために使用することができるポリアミド及び他のプローブ材料も含むことができる。
【００６７】
ＴａｑＭａｎプローブは、特定のプライマーセットによって増幅されたＤＮＡ領域内でアニールするように設計される。Ｔａｑポリメラーゼがプライマーを伸長し、新生鎖を一本鎖鋳型から相補鎖の３’から５’を合成すると、ポリメラーゼの５’から３’のエキソヌクレアーゼは、プローブを介して新生鎖を伸長し、その結果、鋳型にアニールしたプローブを分解する。プローブの分解は、それからフルオロフォアを放出し、クエンチャーへの近接を破壊し、従って、クエンチング効果を軽減し、フルオロフォアの蛍光を可能にする。従って、定量的ＰＣＲサーマルサイクラーで検出される蛍光は、放出されるフルオロフォア及びＰＣＲに存在するＤＮＡ鋳型の量に正比例する。
【００６８】
プライマー及びプローブは、一般に、５〜１００ヌクレオチド又はそれを超える長さである。いくつかの実施形態では、プライマー及びプローブは、少なくとも２０ヌクレオチド以上の長さ、又は少なくとも２５ヌクレオチド以上、又は少なくとも３０ヌクレオチド以上の長さであり得る。このようなプライマー及びプローブは、当技術分野で既知の最適なハイブリダイゼーション条件下で標的配列に特異的にハイブリダイズする。本発明によるプライマー及びプローブは、標的配列と完全な配列相補性を有し得るが、標的配列とは異なり、標的配列にハイブリダイズする能力を保持するプローブは、本発明による従来の方法によって設計され得る。
【００６９】
プローブ及びプライマーを調製及び使用する方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９に記載されている。ＰＣＲ−プライマー対は、例えば、その目的のために意図されるコンピュータープログラムを使用することによって、既知の配列から誘導され得る。
【００７０】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡの特定の断片を「増幅」するための技術である。ＰＣＲを行うためには、複製されるＤＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部が既知でなければならない。一般に、増幅されるＤＮＡ（既知の配列）の各鎖の３’末端のヌクレオチド配列に相補的（例えば、実質的に相補的又は完全に相補的）なプライマー又は短いオリゴヌクレオチドが使用される。ＤＮＡサンプルを加熱してその鎖を分離し、プライマーと混合する。プライマーは、ＤＮＡサンプル中のそれらの相補的配列にハイブリダイズする。元のＤＮＡ鎖を鋳型として使用して合成が開始する（５’から３’方向）。反応混合物は、４つ全てのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼを含有しなければならない。重合は、新たに合成された各鎖が他のプライマーによって認識される配列を含むのに十分に進行するまで続く。これが起こると、元の分子と同一である２つのＤＮＡ分子が生成される。これらの２つの分子は、それらの鎖を分離するために加熱され、このプロセスが繰り返される。各サイクルでＤＮＡ分子の数が２倍になる。自動化された装置を用いて、複製の各サイクルを５分未満で完了することができる。３０サイクル後、ＤＮＡの単一分子として開始したものは、１０億を超えるコピーに増幅されている（２30＝１．０２×１０9）。
【００７１】
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応とも称される定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）は、ＰＣＲ反応からのＤＮＡ産物の蓄積をリアルタイムでモニターする。ｑＰＣＲは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく分子生物学の実験室技術であり、標的ＤＮＡ分子を増幅し、同時に定量するために使用される。ＴａｑＭａｎは、ｑＰＣＲのためのシステムである。特異的配列の１コピーでさえ、ＰＣＲにおいて増幅及び検出することができる。ＰＣＲ反応は、ＤＮＡ鋳型のコピーを指数関数的に生成する。これは、出発標的配列の量と任意の特定のサイクルで蓄積されたＰＣＲ産物の量との間の定量的関係を生じる。鋳型、試薬制限又はピロリン酸分子の蓄積で見出されるポリメラーゼ反応の阻害剤のために、ＰＣＲ反応は、最終的に、指数関数的速度（即ち、プラトー相）で鋳型を生成するのを停止し、ＰＣＲ産物の終点定量を信頼できないものにする。従って、重複反応は、可変量のＰＣＲ産物を生成し得る。ＰＣＲ反応の指数関数相の間のみ、鋳型配列の開始量を決定するために外挿し戻すことが可能である。ＰＣＲ産物が蓄積するときのＰＣＲ産物の測定（即ち、リアルタイム定量ＰＣＲ）は、反応の指数関数相における定量を可能にし、従って、従来のＰＣＲに関連する変動性を除去する。リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、陽性反応は、蛍光シグナルの蓄積によって検出される。ＤＮＡサンプル中の１つ以上の特異的配列について、定量的ＰＣＲは、検出及び定量の両方を可能にする。この量は、コピーの絶対数、又はＤＮＡインプットに対して正規化された場合の相対量、又は更なる正規化遺伝子のいずれかであり得る。リアルタイムＰＣＲの最初の記録以来、それは、ｍＲＮＡ発現研究、ゲノム又はウイルスＤＮＡにおけるＤＮＡコピー数測定、対立遺伝子識別アッセイ、遺伝子の特異的スプライスバリアントの発現分析、並びにパラフィン包埋組織及びレーザー捕獲顕微解剖細胞における遺伝子発現を含む、増大する及び多様な数の応用に使用されてきた。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、任意の生細胞を指す。細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。細胞は、単離することができる。細胞は、生物に再生することができてもできなくてもよい。細胞は、組織、カルス、培養物、器官、又は部分の状態であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、植物細胞であってもよい。本発明の植物細胞は、単離された単一細胞の形態であり得るか、又は培養された細胞であり得るか、又は例えば植物組織若しくは植物器官のようなより高度に組織化された単位の一部であり得る。植物細胞は、被子植物若しくは裸子植物に由来し得るか、又はその一部であり得る。更なる実施形態では、植物細胞は、単子葉植物細胞、双子葉植物細胞であってもよい。単子葉植物細胞は、例えば、トウモロコシ、イネ、モロコシ、サトウキビ、大麦、小麦、カラス麦、芝草、又は観賞用草細胞であり得る。双子葉植物細胞は、例えば、タバコ、コショウ、ナス、ヒマワリ、アブラナ科、アマ、ジャガイモ、綿、大豆、テンサイ、又はアブラナ細胞であってもよい。
【００７３】
「植物部分」という用語は、本明細書で使用される場合、胚、花粉、胚珠、種子、葉、茎、苗条、花、枝、果実、穀粒、穂（ｅａｒ）、穂軸（ｃｏｂ）、殻、柄、根、根端、葯を含むがこれらに限定されない。植物部分は、植物細胞を含む。「植物細胞」は、植物及び／又は植物の一部、植物プロトプラスト、植物組織、植物細胞組織培養物、植物カルス、植物塊等において無傷である植物細胞を含む。本明細書で使用される場合、「苗条」は、葉及び茎を含む地上部分を指す。更に、本明細書で使用される場合、「植物細胞」は、細胞壁を含み、プロトプラストとも称され得る、植物の構造的及び生理的単位を指す。
【００７４】
細胞、原核細胞、細菌細胞、真核細胞、植物細胞、植物及び／又は植物部分の状況における「導入している」又は「導入する」という用語は、核酸分子が細胞、真核細胞、植物細胞、並びに／又は植物及び／若しくは植物部分の細胞の内部に接近するように、核酸分子を細胞、真核細胞、植物、植物部分及び／又は植物細胞と接触させることを意味する。２つ以上の核酸分子が導入される場合、これらの核酸分子は、単一のポリヌクレオチド若しくは核酸構築物の一部として、又は別個のポリヌクレオチド若しくは核酸構築物として組み立てられ得、同じ又は異なる核酸構築物上に位置し得る。従って、これらのポリヌクレオチドは、単一の形質転換事象において、別々の形質転換事象において、又は例えば繁殖プロトコルの一部として、植物細胞に導入され得る。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「形質転換された」及び「遺伝子導入」という用語は、少なくとも１つの組換え（例えば、異種）ポリヌクレオチドの全部又は一部を含有する任意の細胞、原核細胞、真核細胞、植物、植物細胞、カルス、植物組織、又は植物部分を指す。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドの全部又は一部は、染色体又は安定な染色体外エレメントに安定的に統合され、その結果、連続した世代に渡される。本発明の目的のために、「組換えポリヌクレオチド」という用語は、遺伝子工学によって変更され、再配置され、又は改変されたポリヌクレオチドを指す。例としては、異種配列に結合又は連結された任意のクローン化ポリヌクレオチド、又はポリヌクレオチドが挙げられる。「組換え」という用語は、自然発生的変異のような天然に存在する事象から、又は非自然発生的変異誘発に続く選択的繁殖から生じるポリヌクレオチドの変化を指すものではない。
【００７６】
本明細書で使用される「形質転換」という用語は、異種核酸の細胞への導入を指す。細胞の形質転換は、安定的であっても一過性であってもよい。従って、本発明の遺伝子導入細胞、植物細胞、植物及び／又は植物部分は、安定的に形質転換され得るか、又は一過性に形質転換され得る。形質転換は、宿主細胞のゲノムへの核酸分子の転移を指し得、遺伝的に安定な継承をもたらす。いくつかの実施形態では、植物、植物部分及び／又は植物細胞への導入は、細菌媒介形質転換、粒子衝撃形質転換、リン酸カルシウム媒介形質転換、シクロデキストリン媒介形質転換、エレクトロポレーション、リポソーム媒介形質転換、ナノ粒子媒介形質転換、ポリマー媒介形質転換、ウイルス媒介核酸送達、ウィスカー媒介核酸送達、マイクロインジェクション、超音波処理、浸潤、ポリエチレングリコール媒介形質転換、プロトプラスト形質転換、又は植物、植物部分及び／若しくはその細胞への核酸の導入をもたらす任意の他の電気的、化学的、物理的及び／若しくは生物学的メカニズム、又はそれらの任意の組合せを介する。
【００７７】
植物を形質転換するための手順は、当技術分野で周知且つ日常的であり、文献を通して記載される。植物の形質転換のための方法の非限定的な例としては、細菌媒介核酸送達（例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属からの細菌を介する）、ウイルス媒介核酸送達、炭化ケイ素又は核酸ウィスカー媒介核酸送達、リポソーム媒介核酸送達、マイクロインジェクション、マイクロ粒子衝撃、リン酸カルシウム媒介形質転換、シクロデキストリン媒介形質転換、エレクトロポレーション、ナノ粒子媒介形質転換、超音波処理、浸潤、ＰＥＧ媒介核酸取り込み、並びに植物細胞への核酸の導入をもたらす任意の他の電気的、化学的、物理的（機械的）及び／又は生物学的メカニズム（これらの任意の組み合わせを含む）を介する形質転換が挙げられる。当技術分野で既知の種々の植物形質転換法への一般的なガイドとしては、Ｍｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（“Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｅｄｓ．（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３），ｐａｇｅｓ  ６７−８８）及びＲａｋｏｗｏｃｚｙ−Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋａ（Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  ７：８４９−８５８（２００２））が挙げられる。
【００７８】
アグロバクテリウム媒介形質転換は、形質転換の高い効率のため、及び多くの異なる種とのその広範な有用性のために、植物を形質転換するために一般に使用される方法である。アグロバクテリウム媒介形質転換は、典型的には、目的の外来ＤＮＡを担持するバイナリーベクターを、共存するＴｉプラスミド上又は染色体上のいずれかで宿主アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株によって担持されるｖｉｒ遺伝子の補体に依存し得る適切なアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株に導入することを含む（Ｕｋｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１５９−１６９）。組換えバイナリーベクターのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）への導入は、組換えバイナリーベクターを担持する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、組換えバイナリーベクターを標的アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株に動員することができるプラスミドを担持するヘルパー大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を用いる三親交配手順によって達成することができる。或いは、組換えバイナリーベクターは、核酸形質転換によってアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に導入され得る（Ｈｏｅｆｇｅｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ  １９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １６：９８７７）。
【００７９】
組換えアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による植物の形質転換は、通常、植物からの外植片とのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の共培養を含み、当技術分野で周知の方法に従う。形質転換された組織は、典型的には、バイナリープラスミドＴ−ＤＮＡ境界の間に抗生物質又は除草剤耐性マーカーを保有する選択培地上で再生される。
【００８０】
植物、植物部分及び植物細胞を形質転換するための別の方法は、植物組織及び細胞において不活性又は生物学的に活性な粒子を推進することを含む。例えば、米国特許第４，９４５，０５０号明細書、同第５，０３６，００６号明細書及び同第５，１００，７９２号明細書を参照されたい。一般に、この方法は、細胞の外表面に浸透し、その内部に組み込むのに有効な条件下で、植物細胞において不活性又は生物学的に活性な粒子を推進することを含む。不活性粒子が利用される場合、ベクターは、目的の核酸を含むベクターで粒子をコーティングすることによって、細胞に導入され得る。或いは、１つ以上の細胞をベクターによって取り囲むことができ、その結果、ベクターは、粒子の伴流によって細胞内に運ばれる。生物学的に活性な粒子（例えば、各々が導入されることが求められる１つ以上の核酸を含む、乾燥酵母細胞、乾燥細菌又はバクテリオファージ）もまた、植物組織中に推進され得る。
【００８１】
ポリヌクレオチドの状況における「一過性形質転換」は、ポリヌクレオチドが細胞に導入され、細胞のゲノムに統合されないことを意味する。一過性の形質転換は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又はウェスタンブロットによって検出され得、これは、生物に導入された１つ以上の核酸分子によってコードされるペプチド又はポリペプチドの存在を検出し得る。
【００８２】
本明細書で使用される場合、細胞に導入されるポリヌクレオチドの状況において、「安定的に導入する」、「安定的に導入される」、「安定な形質転換」、又は「安定的に形質転換される」は、導入されたポリヌクレオチドが細胞のゲノムに安定的に統合され、従って、細胞がポリヌクレオチドで安定的に形質転換されていることを意味する。従って、統合されたポリヌクレオチドは、その子孫によって、より詳細には、複数の連続した世代の子孫によって遺伝され得る。本明細書で使用される「ゲノム」は、核及び／又は色素体ゲノムを含み、従って、例えば、葉緑体ゲノムへのポリヌクレオチドの統合を含む。本明細書で使用される安定な形質転換はまた、染色体外に維持されるポリヌクレオチド（例えば、ミニ染色体）を指す。
【００８３】
細胞の安定な形質転換は、例えば、生物（例えば、植物）に導入された核酸分子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を用いた細胞のゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって検出され得る。細胞の安定な形質転換は、例えば、植物又は他の生物に導入された核酸分子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を用いた細胞のＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって検出することができる。細胞の安定な形質転換はまた、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は当技術分野で周知の他の増幅反応によって検出することができ、核酸分子の標的配列とハイブリダイズする特異的プライマー配列を使用し、標的配列の増幅をもたらし、これは、標準的な方法に従って検出され得る。形質転換はまた、当技術分野で周知の直接配列決定及び／又はハイブリダイゼーションプロトコルによって検出することができる。
【００８４】
従って、本発明の特定の実施形態において、植物細胞は、当技術分野で既知の任意の方法によって、また本明細書に記載されるように、形質転換され得、無傷の植物は、種々の既知の技術のいずれかを使用して、これらの形質転換細胞から再生され得る。植物細胞、植物組織培養物及び／又は培養プロトプラストからの植物再生は、例えば、Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｖｏｌ．１，ＭａｃＭｉｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３））；及びＶａｓｉｌ  Ｉ．Ｒ．（ｅｄ．）（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｖｏｌ．Ｉ（１９８４），ａｎｄ  Ｖｏｌ．ＩＩ（１９８６））に記載されている。形質転換された遺伝子導入植物、植物細胞、及び／又は植物組織培養物を選択する方法は、当技術分野で慣用的であり、本明細書に提供される本発明の方法において使用され得る。
【００８５】
「形質転換及び再生プロセス」は、植物細胞に導入遺伝子を安定的に導入し、遺伝子導入植物細胞から植物を再生するプロセスを指す。本明細書で使用される場合、形質転換及び再生は、形質転換された細胞が選択剤の存在下で生存し、発達的に繁殖するように、導入遺伝子が選択マーカーを含み、形質転換された細胞が導入遺伝子を組み込んで発現する選択プロセスを含む。「再生」は、植物細胞、植物細胞の群、又は植物片、例えばプロトプラスト、カルス、又は組織部分から植物全体を成長させることを指す。
【００８６】
「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸配列」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において、ヌクレオチドのヘテロポリマーを指すために互換的に使用され、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、合成（例えば、化学的に合成された）ＤＮＡ又はＲＮＡ、並びにＲＮＡ及びＤＮＡのキメラを含むＲＮＡ及びＤＮＡの両方を包含する。核酸分子という用語は、鎖の長さに関係なくヌクレオチドの鎖を指す。ヌクレオチドは、糖、リン酸、及びプリン又はピリミジンのいずれかである塩基を含む。核酸分子は、二本鎖又は一本鎖であり得る。一本鎖の場合、核酸分子は、センス鎖又はアンチセンス鎖であり得る。核酸分子は、オリゴヌクレオチド類似体又は誘導体（例えば、イノシン又はホスホロチオエートヌクレオチド）を用いて合成することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、変化した塩基対合能力又はヌクレアーゼに対する増大した耐性を有する核酸分子を調製するために使用され得る。本明細書に提供される核酸配列は、左から右への５’から３’方向に提示され、米国配列規則、３７  ＣＦＲ§§１．８２１−１．８２５及び世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）規格ＳＴ．２５に記載されているヌクレオチド文字を表すための標準コードを使用して表される。
【００８７】
「核酸断片」は、所与の核酸分子の断片である。「ＲＮＡ断片」は、所与のＲＮＡ分子の断片である。「ＤＮＡ断片」は、所与のＤＮＡ分子の断片である。「核酸断片」は、所与の核酸分子の断片であり、分子から単離されていない。「ＲＮＡ断片」は、所与のＲＮＡ分子の断片であり、分子から単離されていない。「ＤＮＡ断片」は、所与のＤＮＡ分子の断片であり、分子から単離されていない。ポリヌクレオチドのセグメントは、任意の長さ、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００又は５００以上のヌクレオチド長であり得る。ガイド配列のセグメント又は部分は、ガイド配列の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、例えば、ガイド配列の３分の１以下、例えば、７、６、５、４、３、又は２ヌクレオチド長であり得る。
【００８８】
分子の状況における「に由来する」という用語は、親分子又はその親分子からの情報を使用して単離又は作製された分子を指す。例えば、Ｃａｓ９単一変異体ニッカーゼ及びＣａｓ９二重変異体ヌル−ヌクレアーゼは、各々、野生型Ｃａｓ９タンパク質に由来する。
【００８９】
高等植物において、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は遺伝物質であり、一方、リボ核酸（ＲＮＡ）は、ＤＮＡ内に含まれる情報のタンパク質への転移に関与する。「ゲノム」は、生物の各細胞に含まれる遺伝物質の全体である。他に示されない限り、本発明の特定の核酸配列はまた、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）及び相補的配列並びに明示的に示される配列を暗黙に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換される配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。核酸分子という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと互換的に使用される。
【００９０】
本明細書で使用される「配列同一性」は、成分（例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸）のアライメントのウィンドウ全体にわたって、２つの最適に整列されたポリヌクレオチド又はペプチド配列が不変である程度を指す。「同一性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されているものを含むがこれらに限定されない、既知の方法によって容易に計算することができる。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「配列同一性パーセント」又は「同一性パーセント」という用語は、２つの配列が最適に整列される場合の試験（「対象」）ポリヌクレオチド分子（又はその相補鎖）と比較した、参照（「問い合わせ」）ポリヌクレオチド分子（又はその相補鎖）の線状ポリヌクレオチド配列中の同一ヌクレオチドの百分率を指す。いくつかの実施形態では、「同一性パーセント」は、アミノ酸配列中の同一アミノ酸の百分率を指すことができる。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「実質的に同一」という表現は、２つの核酸分子、ヌクレオチド配列又はタンパク質配列の状況において、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、又は目視検査によって測定して、最大対応について比較及び整列された場合に、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％のヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一性を有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。本発明のいくつかの実施形態では、実質的な同一性は、長さが少なくとも約１５残基〜約１５０残基である配列の領域にわたって存在する。従って、本発明のいくつかの実施形態では、実質的な同一性は、長さが少なくとも約１０、約２０、約３０、約４０、５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、又はそれを超える残基である配列の領域にわたって存在する。いくつかの特定の実施形態では、配列は、少なくとも約８０残基にわたって実質的に同一である。更なる実施形態では、配列は、コード領域の全長にわたって、例えばｔｒａｃｒＲＮＡ分子の全長にわたって実質的に同一である。更に、代表的な実施形態では、実質的に同一のヌクレオチド又はタンパク質配列は、実質的に同じ機能を行う（例えば、特定のゲノム標的への誘導、特定のゲノム標的部位のエンドヌクレアーゼ切断）。
【００９３】
配列比較のために、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【００９４】
比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアライメントは、当業者に周知であり、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性方法の検索等のツールによって、及び場合により、ＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の一部として入手可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ等のこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって、実施することができる。試験配列及び参照配列の整列されたセグメントについての「同一性分数」は、２つの整列された配列によって共有される同一の成分の数を、参照配列セグメント（即ち、参照配列全体又は参照配列のより小さい規定された部分）中の成分の総数で割ったものである。配列同一性パーセントは、同一性分数に１００を掛けたものとして表される。１つ以上のポリヌクレオチド配列の比較は、全長ポリヌクレオチド配列若しくはその一部、又はより長いポリヌクレオチド配列に対するものであり得る。本発明の目的のために、「同一性パーセント」はまた、翻訳されたヌクレオチド配列については、ＢＬＡＳＴＸバージョン２．０を使用し、ポリヌクレオチド配列については、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を使用して決定され得る。
【００９５】
ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含み、これは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列された場合に、いくつかの正の値の閾値スコアＴと一致するか、又は満たす。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０）。これらの最初の近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するための種として作用する。次いで、ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（１対のマッチング残基に対する報酬スコア；常に＞０）及びＮ（ミスマッチング残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を用いて算出される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの延長は、累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下し、累積スコアが１つ以上の負のスコアリング残基アライメントの累積のためにゼロ以下になるか、又はいずれかの配列の末端に到達した場合に、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照されたい）。
【００９６】
配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸配列は、試験ヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列との比較における最小合計確率が約０．１未満〜約０．００１未満である場合、参照配列に類似すると考えられる。従って、本発明のいくつかの実施形態では、試験ヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列との比較における最小合計確率は、約０．００１未満である。
【００９７】
２つのヌクレオチド配列はまた、２つの配列がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする場合、実質的に同一であると考えられ得る。いくつかの代表的な実施形態では、実質的に同一であると考えられる２つのヌクレオチド配列は、高度にストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする。
【００９８】
核酸ハイブリダイゼーション実験、例えばサザン及びノーザンハイブリダイゼーションの状況における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、異なる環境パラメーターの下で異なっている。核酸のハイブリダイゼーションの広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）に見出される。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、規定されたイオン強度及びｐＨにおける特異的配列についての熱融点（Ｔm）よりも約５℃低くなるように選択される。
【００９９】
Ｔmとは、標的配列の５０％が完全に一致するプローブとハイブリダイズする（規定のイオン強度及びｐＨの下での）温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブについてのＴmに等しくなるように選択される。サザン又はノーザンブロットにおいてフィルター上に１００を超える相補的残基を有する相補的ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃での５０％ホルムアミドと１ｍｇのヘパリンであり、ハイブリダイゼーションは、一晩行われる。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、７２℃で約１５分間、０．１  ５Ｍ  ＮａＣｌである。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃で１５分間の０．２ｘ  ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の記載については、下記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照されたい）。しばしば、バックグラウンドプローブシグナルを除去するために、高ストリンジェンシー洗浄の前に、低ストリンジェンシー洗浄が行われる。例えば、１００ヌクレオチドを超える二重鎖についての中程度のストリンジェンシー洗浄の例は、４５℃で１５分間の１ｘ  ＳＳＣである。例えば、１００ヌクレオチドを超える二重鎖についての低ストリンジェンシー洗浄の例は、４０℃で１５分間の４〜６ｘ  ＳＳＣである。短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）の場合、ストリンジェントな条件は、典型的には、約１．０Ｍ未満のＮａイオンの塩濃度、典型的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（又は他の塩）を含み、温度は、典型的には、少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミド等の不安定化剤の添加によっても達成することができる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係なプローブについて観察されるものよりも２倍（又はそれよりも高い）のシグナル対ノイズ比は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしないヌクレオチド配列は、それらがコードするタンパク質が実質的に同一である場合、なお実質的に同一である。これは、例えば、ヌクレオチド配列のコピーが遺伝暗号によって許容される最大コドン縮重を用いて作製される場合に起こり得る。
【０１００】
以下は、本発明の参照ヌクレオチド配列と実質的に同一である相同ヌクレオチド配列をクローニングするために使用され得るハイブリダイゼーション／洗浄条件のセットの例である。一実施形態では、参照ヌクレオチド配列は、５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中の「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、５０℃で２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で洗浄する。別の実施形態では、参照ヌクレオチド配列は、５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中の「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、５０℃で１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で洗浄し、又は５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中の「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、５０℃で０．５Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で洗浄する。なお更なる実施形態では、参照ヌクレオチド配列は、５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中の「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、５０℃で０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で洗浄し、又は５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中の「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、６５℃で０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で洗浄する。
【０１０１】
「単離された」核酸分子若しくはヌクレオチド配列又は「単離された」ポリペプチドは、ヒトの手によって、その天然の環境とは別に存在し、及び／又はその天然の環境におけるその機能と比較して異なる、改変された、調節された、及び／又は変更された機能を有し、従って天然の産物ではない、核酸分子、ヌクレオチド配列又はポリペプチドである。単離された核酸分子又は単離されたポリペプチドは、精製された形態で存在し得るか、又は非天然環境（例えば、組換え宿主細胞）において存在し得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドに関して、単離されるという用語は、それが天然に存在する染色体及び／又は細胞から分離されることを意味する。ポリヌクレオチドはまた、それが天然に存在する染色体及び／又は細胞から分離され、次いで遺伝的状況、染色体、染色体位置、及び／又はそれが天然に存在しない細胞に挿入される場合、単離される。本発明の組換え核酸分子及びヌクレオチド配列は、上記で定義したように「単離された」と考えることができる。
【０１０２】
「野生型」ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列は、天然に存在する（「天然」）又は内因性のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を指す。従って、例えば、「野生型ｍＲＮＡ」は、生物内に天然に存在する、又は生物に内因性のｍＲＮＡである。「相同」ヌクレオチド配列は、それが導入される宿主細胞に天然に関連するヌクレオチド配列である。
【０１０３】
「オープンリーディングフレーム」及び「ＯＲＦ」という用語は、コード配列の翻訳開始コドンと終結コドンとの間にコードされるアミノ酸配列を指す。「開始コドン」及び「終結コドン」という用語は、各々、タンパク質合成（ｍＲＮＡ翻訳）の開始及び連鎖終結を指定するコード配列中の３つの隣接するヌクレオチド（「コドン」）の単位を指す。
【０１０４】
「プロモーター」は、通常そのコード配列の上流（５’）にあるヌクレオチド配列を指し、これはＲＮＡポリメラーゼ及び適切な転写に必要な他の因子に対する認識を提供することによってコード配列の発現を制御する。「プロモーター調節配列」は、近位及びより遠位の上流エレメントから成る。プロモーター調節配列は、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング又は安定性、又は翻訳に影響を及ぼす。調節配列には、エンハンサー、プロモーター、非翻訳リーダー配列、イントロン、及びポリアデニル化シグナル配列が含まれる。これらには、天然及び合成配列、並びに天然及び合成配列の組み合わせであり得る配列が含まれる。「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激し得るＤＮＡ配列であり、プロモーターの生得的エレメント、又はプロモーターのレベル若しくは組織特異性を高めるために挿入された異種エレメントであり得る。エンハンサーは、両方の配向（通常又は反転）で作動することができ、プロモーターから上流又は下流のいずれかに移動させても機能することができる。「プロモーター」という用語の意味は、「プロモーター調節配列」を含む。
【０１０５】
「一次形質転換体」及び「Ｔ０世代」は、最初に形質転換された（即ち、形質転換から減数分裂及び受精を経ていない）組織と同じ遺伝的世代である遺伝子導入植物を指す。「二次形質転換体」及び「Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３等の世代」は、１つ以上の減数分裂及び受精サイクルを経て一次形質転換体に由来する遺伝子導入植物を指す。これらは、一次若しくは二次形質転換体の自家受精、又は一次若しくは二次形質転換体と他の形質転換された若しくは形質転換されていない植物との交配によって誘導され得る。
【０１０６】
「導入遺伝子」は、形質転換によってゲノムに導入され、安定的に維持されている核酸分子を指す。導入遺伝子は、少なくとも１つの発現カセットを含んでもよく、典型的には、少なくとも２つの発現カセットを含み、１０以上の発現カセットを含んでもよい。導入遺伝子には、例えば、形質転換される特定の植物の遺伝子と異種又は同種の遺伝子が含まれ得る。更に、導入遺伝子には、非天然生物に挿入された天然遺伝子、又はキメラ遺伝子が含まれ得る。「内因性遺伝子」という用語は、生物のゲノム中の天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物には通常見られないが、遺伝子導入によって生物に導入される遺伝子を指す。
【０１０７】
「イントロン」は、ほとんど真核生物の遺伝子内にのみ存在するが、遺伝子産物中のアミノ酸配列には翻訳されないＤＮＡの介在区分を指す。イントロンは、スプライシングと呼ばれるプロセスを経て未熟なｍＲＮＡから除去され、スプライシングは、エキソンをそのままに残してｍＲＮＡを形成する。本発明の目的のために、「イントロン」という用語の定義は、標的遺伝子に由来するイントロンのヌクレオチド配列に対する改変を含むが、但し、改変されたイントロンは、その関連する５’調節配列の活性を有意に低下させないことを条件とする。
【０１０８】
「エキソン」は、タンパク質又はその一部のコード配列を有するＤＮＡの部分を指す。エキソンは、介在する非コード配列（イントロン）によって分離されている。本発明の目的のために、「エキソン」という用語の定義は、標的遺伝子に由来するエキソンのヌクレオチド配列に対する改変を含むが、但し、改変されたエキソンは、その関連する５’調節配列の活性を有意に低下させないことを条件とする。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、「標的部位」、「標的配列」、又は「標的プロトスペーサーＤＮＡ」は、結合のための十分な条件が存在することを条件として、対象ＤＮＡ標的化ＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡ中に存在する核酸配列を指すために、本明細書で互換的に使用される。適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件には、細胞内に通常存在する生理学的条件が含まれる。他の適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は、当技術分野で既知である；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出を参照されたい。ＤＮＡ標的化ＲＮＡに相補的であり、ハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補鎖」と称され、「相補鎖」に相補的である（従って、ＤＮＡ標的化ＲＮＡに相補的でない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補鎖」と称される。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、本発明の１つ以上のヌクレオチド配列に関連した用語「近位」又は「の近位」は、すぐ隣（例えば、介在配列を有さない）又は約１塩基〜約１０，０００塩基（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、又は１０，０００塩基）（本明細書に明示的には言及されていない、この範囲内に含まれる任意の値を含む）分離されていることを意味する。
【０１１１】
「切断」又は「切断している」という用語は、ポリヌクレオチドのリボシルホスホジエステルバックボーンにおける共有結合ホスホジエステル結合の切断を意味する。「切断」又は「切断している」という用語は、一本鎖切断及び二本鎖切断の両方を包含する。二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断事象の結果として起こり得る。切断は、平滑末端又は互い違いの末端のいずれかの生成をもたらすことができる。「ヌクレアーゼ切断部位」又は「ゲノムヌクレアーゼ切断部位」は、特定のヌクレアーゼによって認識されるヌクレアーゼ切断配列を含むヌクレオチドの領域であり、これは、一方又は両方の鎖においてゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を切断するように作用する。ヌクレアーゼ酵素によるこのような切断は、細胞内でＤＮＡ修復機構を開始させ、それが相同組換え又は非相同末端連結を起こすための環境を確立する。
【０１１２】
「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質」、「Ｃａｓタンパク質」、「ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ」又は「Ｃａｓヌクレアーゼ」という用語は、野生型Ｃａｓタンパク質、その断片、又はその変異体若しくはバリアントを指す。「Ｃａｓ変異体」又は「Ｃａｓバリアント」という用語は、野生型Ｃａｓタンパク質のタンパク質又はポリペプチド誘導体、例えば、１つ以上の点変異、挿入、欠失、切断、融合タンパク質、又はそれらの組み合わせを有するタンパク質を指す。特定の実施形態では、Ｃａｓ変異体又はＣａｓバリアントは、植物由来の核局在化シグナル（ＮＬＳ）に作動可能に連結された本明細書に記載のＣａｓ９バリアント等のＣａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性を実質的に保持する。特定の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、例えば、ｄＣａｓ９と称される触媒的に死んだＣａｓ９等、１つ又は両方のヌクレアーゼドメインが不活性であるように変異され、これは依然として特定のゲノム位置に標的化することができるが、エンドヌクレアーゼ活性を有さない（Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｃｅｌｌ，１５２：１１７３−１１８３、本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、その野生型対応物のヌクレアーゼ活性の一部又は全部を欠くように変異される。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ，１６３：７５９−７７１、本明細書に組み込まれる）又は別のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼであり得る。
【０１１３】
「ドナー分子」、「ドナーポリヌクレオチド」、又は「ドナー配列」は、標的ポリヌクレオチド、典型的には標的ゲノム部位での挿入を意図したヌクレオチドポリマー又はオリゴマーである。ドナー配列は、１つ以上の導入遺伝子、発現カセット、又は目的のヌクレオチド配列であってよい。ドナー分子は、一本鎖、部分的二本鎖、又は二本鎖のいずれかのドナーＤＮＡ分子であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、天然又は改変ポリヌクレオチド、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ、又はＤＮＡ断片（一本鎖又は少なくとも部分的に二本鎖、又は完全に二本鎖のＤＮＡ分子のいずれか）、又はＰＧＲ増幅ｓｓＤＮＡ又は少なくとも部分的にｄｓＤＮＡ断片であり得る。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は、環状化ＤＮＡ分子の一部である。ｄｓＤＮＡ断片は一般にｓｓＤＮＡよりもヌクレアーゼ分解に対して耐性があるので、完全二本鎖ドナーＤＮＡは、安定性の増加をもたらし得るため有利である。ドナー分子は、少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むことができ、核酸分子は、ゲノムヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一であり、その結果、これらの連続したヌクレオチドは、部位特異的改変ポリペプチド（この場合、部位特異的ヌクレアーゼ）による切断後に、標的ゲノムＤＮＡ配列における細胞のゲノムへのドナーＤＮＡ分子の相同組換えに十分である。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は、少なくとも約１０、２０、３０、５０、７０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、２５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、７５００、１００００、１５，０００又は２０，０００ヌクレオチドを含むことができ（本明細書に明示的に列挙されていないこの範囲内の任意の値を含む）、ドナーＤＮＡ分子は、ゲノム核酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は、ゲノム核酸配列に実質的に相補的であり得る。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は、異種核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は、少なくとも１つの発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は、少なくとも１つの発現カセットを含む導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は、標的ゲノムに対して天然である遺伝子の対立遺伝子改変を含む。対立遺伝子改変は、少なくとも１つのヌクレオチド挿入、少なくとも１つのヌクレオチド欠失、及び／又は少なくとも１つのヌクレオチド置換を含み得る。いくつかの実施形態では、対立遺伝子改変は、ＩＮＤＥＬを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は、標的ゲノム部位に対する相同アームを含む。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は、ゲノム核酸配列と少なくとも９０％同一である少なくとも１００個の連続したヌクレオチドを含み、場合により導入遺伝子等の異種核酸配列を更に含み得る。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「部位特異的改変ポリペプチド」又は「ＲＮＡ結合部位特異的ポリペプチド」又は「ＲＮＡ結合部位特異的改変ポリペプチド」は、ＲＮＡに結合し、特定のＤＮＡ配列に標的化されるポリペプチドを指す。部位特異的改変ポリペプチドの例は、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９又はそのバリアントである。本明細書に記載の部位特異的改変ポリペプチドは、それが結合するＲＮＡ分子によって特定のＤＮＡ配列を標的とする。ＲＮＡ分子、又は２つのＲＮＡ分子である場合にはＲＮＡ二重鎖は、標的ＤＮＡ内の標的配列に相補的な配列を含み、従って、結合したポリペプチドを標的ＤＮＡ内の特定の位置（標的配列）に標的化する。
【０１１５】
部位特異的改変ポリペプチドに結合し、標的ＤＮＡ内の特定の位置にポリペプチドを標的とするＲＮＡ二重鎖は、本明細書において「ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖」と称される。本発明のＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖は、一緒になって「ＤＮＡ標的化セグメント」及び「タンパク質結合セグメント」を提供する２つの分子を含む。この２つの分子は、当技術分野でｃｒＲＮＡ（「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（「トランス作用ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」）として既知である（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ｃｒＲＮＡ分子は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖のＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）及びＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖のタンパク質結合セグメントのＲＮＡ二重鎖の半分を形成するヌクレオチドのストレッチ（「二重鎖形成セグメント」）の両方を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖のタンパク質結合セグメントのＲＮＡ二重鎖の他の半分を形成するヌクレオチドのストレッチ（二重鎖形成セグメント）を含む。換言すれば、ｃｒＲＮＡ分子のヌクレオチドのストレッチは、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子のヌクレオチドのストレッチと相補的であり、ハイブリダイズして、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合ドメインのＲＮＡ二重鎖を形成する。従って、各ｃｒＲＮＡ分子は、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子を有すると言うことができる。ｃｒＲＮＡ分子は、更に、一本鎖ＤＮＡ標的化セグメントを提供する。従って、ｃｒＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、対応する対として、ハイブリダイズして、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖を形成する。ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖は、任意の対応するｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ対を含むことができる。
【０１１６】
「二重鎖形成セグメント」という用語は、本明細書では、対応するｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子のヌクレオチドのストレッチにハイブリダイズすることによってＲＮＡ二重鎖の形成に寄与するｃｒＲＮＡ分子又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子のヌクレオチドのストレッチを意味するために使用される。換言すれば、ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメントに相補的な二重鎖形成セグメントを含む。このように、ｔｒａｃｒＲＮＡは二重鎖形成セグメントを含み、一方、ｃｒＲＮＡは、二重鎖形成セグメント及びＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖のＤＮＡ標的化セグメントの両方を含む。
【０１１７】
「セグメント」は、分子のセグメント／区分／領域（例えば、ＲＮＡ中のヌクレオチドの連続ストレッチ）を意味する。セグメントはまた、セグメントが２つ以上の分子の領域を含み得るような複合体の領域／区分を意味し得る。例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖のタンパク質結合セグメントは、相補性の領域に沿ってハイブリダイズする２つの別個のＲＮＡ分子を含む。例示的な非限定的な例として、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖のタンパク質結合セグメントは、（ｉ）１００塩基対の長さである第１のＲＮＡ分子の塩基対４０〜７５；及び（ｉｉ）５０塩基対の長さである第２のＲＮＡ分子の塩基対１０〜２５を含み得る。「セグメント」の定義は、特定の状況において特に定義されない限り、特定の数の総塩基対に限定されず、所与のＲＮＡ分子からの特定の数の塩基対に限定されず、複合体内の特定の数の別個の分子に限定されず、任意の全長であり、他の分子と相補性を有する領域を含んでも含まなくてもよいＲＮＡ分子の領域を含んでもよい。本発明のＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖のＤＮＡ標的化セグメント（又は「ＤＮＡ標的化配列」）は、標的ＤＮＡ（標的ＤＮＡの相補鎖）内の特定の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。タンパク質結合セグメント（又は「タンパク質結合配列」）は、部位特異的改変ポリペプチドと相互作用する。
【０１１８】
部位特異的改変ポリペプチドが、Ｃａｓ９又はＣａｓ９バリアントポリペプチドである場合、標的ＤＮＡの部位特異的切断は、（ｉ）ｃｒＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡとの間の塩基対合相補性；及び（ｉｉ）標的ＤＮＡにおける短いモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される）の両方によって決定される位置において起こる。ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖のタンパク質結合セグメントは、互いにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成する、ヌクレオチドの２つ相補的なストレッチを含む。例示的なＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖は、ｃｒＲＮＡ分子及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子を含む。ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子は、単一ガイドＲＮＡ分子の反対側の末端のハイブリダイゼーションによって形成されるタンパク質結合セグメントを含む、二次構造を形成することが可能な、単一の分子、例えばいわゆる単一ガイドＲＮＡも含み得る（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０１１９】
本開示は、関連した部位特異的改変ポリペプチドの活性を、標的ＤＮＡ内の特異的標的配列に誘導するＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖を提供する。本発明のＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖は、２つのＲＮＡ分子、即ちｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子を含む。ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡにおける配列に相補的な核酸配列であるＤＮＡ標的化セグメントを含む。このＤＮＡ標的化セグメントは、「プロトスペーサー」とも称される。換言すれば、本発明のｃｒＲＮＡ分子のＤＮＡ標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション（即ち、塩基対合）を介して配列特異的方法で標的ＤＮＡと相互作用する。従って、ｃｒＲＮＡ分子のＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は、様々であり、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖と標的ＤＮＡが相互作用するであろう標的ＤＮＡ内の位置を決定し得る。
【０１２０】
本発明のｃｒＲＮＡ分子のＤＮＡ標的化セグメントは、改変されて（例えば、遺伝子操作により）、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイズすることができる。本発明のｃｒＲＮＡ分子のＤＮＡ標的化セグメントは、約１２ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、本発明のｃｒＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２０ｎｔ、又は約１２ｎｔ〜約１９ｎｔの長さを有し得る。例えば、本発明のｃｒＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、約１７ｎｔ〜約２７ｎｔの長さを有し得る。例えば、本発明のｃｒＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、約１９ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約７０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約９０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約１００ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約９０ｎｔ、又は約２０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有し得る。本発明のｃｒＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は、少なくとも約１２ｎｔの長さを有し得る。いくつかの実施形態では、本発明のｃｒＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、本発明のｃｒＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、１９ヌクレオチド長である。
【０１２１】
少なくとも１つのｃｒＲＮＡ及び少なくとも１つのｔｒａｃｒＲＮＡの発現のための発現カセットをコードするＤＮＡ配列を含む配列番号８７〜９５において、ｃｒＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、２０個の「Ｎ’」で示される。この２０個のＮ’は、本発明のｃｒＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントを表し、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイズするように改変され得ると理解される。この２０個のＮ’はまた、上述したように及び当業者に周知なように、ＤＮＡ標的化セグメントに適した長さを表すと理解され、長さは少なくとも約１２ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ、少なくとも約４０ｎｔ、少なくとも約５０ｎｔ、少なくとも約６０ｎｔ、少なくとも約７０ｎｔ、少なくとも約８０ｎｔ、少なくとも約９０ｎｔ、又は少なくとも約１００ｎｔである。
【０１２２】
ＤＮＡ標的化セグメントと、標的ＤＮＡの標的配列との間のパーセント相補性は、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）であり得る。いくつかの場合、本発明のｃｒＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと、標的ＤＮＡの標的配列との間のパーセント相補性は、標的ＤＮＡの相補的な鎖の標的配列の７個の連続する最も５’のヌクレオチドにわたって１００％である。いくつかの場合、ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列と、標的ＤＮＡの標的配列との間のパーセント相補性は、約２０連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％である。いくつかの場合、ｃｒＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと、標的ＤＮＡの標的配列との間のパーセント相補性は、標的ＤＮＡの相補的な鎖の標的配列の１４個の連続する最も５’のヌクレオチドにわたって１００％であり、その他の部分にわたって０％と低い。そのような場合、ＤＮＡ標的化配列は、１４ヌクレオチド長と見なされ得る。いくつかの場合、ｃｒＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと、標的ＤＮＡの標的配列との間のパーセント相補性は、標的ＤＮＡの相補的な鎖の標的配列の７個の連続する最も５’のヌクレオチドにわたって１００％であり、その他の部分にわたって０％と低い。そのような場合、ＤＮＡ標的化配列は、７ヌクレオチド長と見なされ得る。
【０１２３】
本発明のＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖のタンパク質結合セグメントは、部位特異的改変ポリペプチドと相互作用する。ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖は、上述したｃｒＲＮＡ分子のＤＮＡ標的化セグメントを介して、結合したポリペプチドを標的ＤＮＡ内の特異的ヌクレオチド配列に誘導する。本発明のＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖のタンパク質結合セグメントは、互いに相補的なヌクレオチドの２つのストレッチを含む。これらのストレッチの一方は、ｃｒＲＮＡ分子上にあり、他方はｔｒａｃｒＲＮＡ分子上にある。ヌクレオチドのこれらのストレッチの各々は、２つのＲＮＡ分子の相補的なヌクレオチドがハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントの二本鎖ＲＮＡ二重鎖を形成するように、互いに相補的である。タンパク質結合セグメントは、ｃｒＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子の二重鎖形成セグメントを含み、それらはハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡセグメントを形成し、これは次いで、結合のために、部位特異的改変ポリペプチドにより認識される。二重鎖形成セグメントは、一次ＲＮＡ配列内に、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子及び／又は５’オーバーハング（ｔｒａｃｒＲＮＡ分子の場合）及び／又は３’オーバーハング（ｃｒＲＮＡ分子の場合）の間のミスマッチとして表される二次ＲＮＡ構造を含むことができる。
【０１２４】
ｃｒＲＮＡは、二重鎖形成セグメント及びプロトスペーサーから構成される。いくつかの実施形態では、本発明のｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメントは、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、又は２２連続ヌクレオチドのストレッチにわたって、配列番号５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、又はその相補体に対して少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一である。
【０１２５】
対応するｔｒａｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメントは、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子の５’末端に存在する。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子の二重鎖形成セグメントは、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、又は２２連続ヌクレオチドのストレッチにわたって、配列番号９６〜１１０、又はその相補体に対して、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一である。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント（又はｔｒａｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメントをコードするＤＮＡ）は、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、又は少なくとも２２連続ヌクレオチドのストレッチにわたって、配列番号９６〜１１０に示されるｔｒａｃｒＲＮＡ配列の二重鎖形成セグメントの１つ、又はその相補体に対して、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一又は１００％同一である。
【０１２６】
ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子の２つの二重鎖形成セグメントは、ハイブリダイズし、タンパク質結合セグメントを形成する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ分子の二重鎖形成セグメントは、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、又は少なくとも２２連続ヌクレオチドのストレッチにわたって、対応する本発明のｔｒａｃｒＲＮＡ分子に対して、少なくとも６０％同一の、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメントは、各々、配列番号５５及び９６である。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメントは、各々、配列番号５７及び９７である。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメントは、各々、配列番号５９及び９８である。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメントは、各々、配列番号６１及び９９である。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメントは、各々、配列番号６３及び１００である。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメントは、各々、配列番号６５及び１０１である。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメントは、各々、配列番号６７及び１０２である。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメントは、各々、配列番号６９及び１０３である。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメントは、各々、配列番号７１及び１０４である。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメントは、各々、配列番号７３及び１０５である。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメントは、各々、配列番号７５及び１０６である。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメントは、各々、配列番号７７及び１０７である。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメントは、各々、配列番号７９及び１０８である。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメントは、各々、配列番号８１及び１０９である。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメントは、各々、配列番号８３及び１１０である。
【０１２８】
本発明のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子を含むデュアルガイドＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの制御された（即ち、条件的な）結合を可能にするように設計され得ることが認識されるであろう。ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方が、機能的複合体において、Ｃａｓ９等の部位特異的改変ポリペプチドと結合しない限り機能しないため、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの結合を誘導可能にすることによって、誘導可能（例えば、薬物誘導可能）であり得る。非限定的な一例として、ＲＮＡアプタマーは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの結合を調節（即ち、制御）するのに使用することができる。従って、ｃｒＲＮＡ及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡは、ＲＮＡアプタマー配列を含むことができる。
【０１２９】
ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖の一部であり、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子の二重鎖形成セグメントを含むタンパク質結合セグメントは、約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、タンパク質結合セグメントは、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２５ｎｔ、又は約１２〜約２０ｎｔの長さを有し得る。タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖は、約６塩基対（ｂｐ）〜約５０ｂｐの長さを有し得る。例えば、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖は、約６ｂｐ〜約４０ｂｐ、約６ｂｐ〜約３０ｂｐ、約６ｂｐ〜約２５ｂｐ、約６ｂｐ〜約２０ｂｐ、約６ｂｐ〜約１５ｂｐ、約８ｂｐ〜約４０ｂｐ、約８ｂｐ〜約３０ｂｐ、約８ｂｐ〜約２５ｂｐ、約８ｂｐ〜約２０ｂｐ又は約８ｂｐ〜約１５ｂｐの長さを有し得る。例えば、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖は、約８ｂｐ〜約１０ｂｐ、約１０ｂｐ〜約１５ｂｐ、約１５ｂｐ〜約１８ｂｐ、約１８ｂｐ〜約２０ｂｐ、約２０ｂｐ〜約２５ｂｐ、約２５ｂｐ〜約３０ｂｐ、約３０ｂｐ〜約３５ｂｐ、約３５ｂｐ〜約４０ｂｐ、又は約４０ｂｐ〜約５０ｂｐの長さを有し得る。いくつかの実施形態では、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖は、１７塩基対の長さを有する。
【０１３０】
ハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する、ヌクレオチド配列の間のパーセント相補性は、少なくとも約６０％であり得る。例えば、ハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する、ヌクレオチド配列の間のパーセント相補性は、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％であり得る。いくつかの場合、ハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する、ヌクレオチド配列の間のパーセント相補性は、１００％であり得る。
【０１３１】
ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子の二重鎖形成セグメント間の塩基対合は、形成される少なくとも１つの小ループが存在するため、天然ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖においては１００％ではない（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｂｒｉｎｅｒ  ｅｔ  ａ．，２０１４．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ５６：３３３−３３９）。同様に、本発明のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子の二重鎖形成セグメント間の塩基対合は、１００％ではない可能性がある。いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖のタンパク質結合セグメントは、少なくとも８塩基対合を含む。他の実施形態では、本発明のＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖のタンパク質結合セグメントは、少なくとも９塩基対合、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、又は少なくとも３０塩基対合を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、本発明のＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖と、部位特異的改変ポリペプチドとは、複合体を形成する。ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖は、標的ＤＮＡの配列に相補的なｃｒＲＮＡ分子上のヌクレオチド配列を含むことによって、複合体に標的特異性を提供する（上記したように）。複合体の部位特異的改変ポリペプチドは、部位特異的活性を提供する。換言すれば、部位特異的改変ポリペプチドは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖の少なくともタンパク質結合セグメントとのその関連によって、ＤＮＡ配列（例えば染色体配列又は染色体外配列、例えばエピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、葉緑体配列等）に誘導される。部位特異的改変ポリペプチドは、標的ＤＮＡ（例えば、標的ＤＮＡの切断又はメチル化）及び／又は標的ＤＮＡに関連したポリペプチド（例えば、ヒストンテールのメチル化又はアセチル化）を改変する。部位特異的改変ポリペプチドは、本明細書で「部位特異的ポリペプチド」又は「ＲＮＡ結合部位特異的改変ポリペプチド」とも称される。
【０１３３】
いくつかの場合、部位特異的改変ポリペプチドは、天然に存在する改変ポリペプチドである。他の場合、部位特異的改変ポリペプチドは、天然に存在しないポリペプチド（例えば、キメラポリペプチド又は改変された、例えば、変異、削除、挿入された天然に存在するポリペプチド）である。例示的な天然に存在する部位特異的改変ポリペプチドは、当技術分野で既知である（例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｃｅｌｌ  １６８：３２８−３２８．ｅ１，及びＳｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １５（３）：１６９−１８２参照、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）。これらの天然に存在するポリペプチドは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡに結合し、それにより標的ＤＮＡ内の特異的配列に誘導され、標的ＤＮＡを切断して二本鎖切断を生成する。
【０１３４】
部位特異的改変ポリペプチドは、２つの部分、ＲＮＡ結合部分及び活性部分を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、以下を含む：（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、ここでＤＮＡ標的化ＲＮＡは、標的ＤＮＡにおける配列に相補的なヌクレオチド配列を含む；及び（ｉｉ）部位特異的酵素活性（例えば、ＤＮＡメチル化についての活性、ＤＮＡ切断についての活性、ヒストンアセチル化についての活性、ヒストンメチル化についての活性等）を示す活性部分、ここで酵素活性の部位は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される。他の実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、以下を含む：（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、ここでＤＮＡ標的化ＲＮＡは、標的ＤＮＡにおける配列に相補的なヌクレオチド配列を含む；及び（ｉｉ）標的ＤＮＡ内の転写を調節する（例えば、転写を増加又は低下させるために）活性部分、ここで標的ＤＮＡ内の調節される転写の部位は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって決定される。
【０１３５】
いくつかの場合、部位特異的改変ポリペプチドは、標的ＤＮＡを改変する酵素活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性又はグリコシラーゼ活性）を有する。他の場合、部位特異的改変ポリペプチドは、標的ＤＮＡに関連したポリペプチド（例えば、ヒストン）を改変する酵素活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性又は脱ミリストイル化活性）を有する。
【０１３６】
いくつかの場合、異なる部位特異的改変ポリペプチド、例えば異なるＣａｓ９タンパク質（即ち、様々な種からのＣａｓ９タンパク質）は、本発明の様々な提供される方法において使用して、異なるＣａｓ９タンパク質の様々な酵素特性を利用する（例えば、異なるＰＡＭ配列優先（傾向）のために；増加又は低下した酵素活性のために；増加又は低下した細胞毒性レベルのために；ＮＨＥＪ、相同組換え修復、一本鎖切断、二本鎖切断の間のバランスの変更のために等）のに有利であり得る。様々な種からのＣａｓ９タンパク質（例えば、Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７に開示されているもの、又はそれに由来するポリペプチド）は、標的ＤＮＡにおける異なるＰＡＭ配列を必要とし得る。従って、選択される特定のＣａｓ９酵素について、ＰＡＭ配列の要件は、Ｃａｓ９活性に必要であるとして既知の５’−Ｎ  ＧＧ−３’配列（ここでＮは、Ａ、Ｔ、Ｃ、又はＧのいずれかである）とは異なり得る。非常に様々な種からの多数のＣａｓ９オルソログが本明細書で特定されており、タンパク質は、僅かな同一のアミノ酸を共有する。特定された全Ｃａｓ９オルソログは同じドメイン構造（ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）を有し、中央ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメイン及び分割ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨドメインを有する。Ｃａｓ９タンパク質は、保存された構造を有する４つの重要なモチーフを共有する；モチーフ１、２、及び４は、ＲｕｖＣ様モチーフである一方、モチーフ３はＨＮＨ−モチーフである。
【０１３７】
部位特異的改変ポリペプチドはまた、キメラ及び改変Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり得る。例えば、部位特異的改変ポリペプチドは、改変されたＣａｓ９「塩基エディタ」であり得る。塩基の編集により、ＤＮＡ切断又はドナーＤＮＡ分子を必要とすることなく、プログラム可能な方法で、１つの標的ＤＮＡ塩基を別の塩基に直接且つ不可逆的に変換することが可能となる。例えば、Ｋｏｍｏｒ  ｅｔ  ａｌ（２０１６，Ｎａｔｕｒｅ，５３３：４２０−４２４）は、Ｃａｓ９−シチジンデアミナーゼ融合を教示し、ここでＣａｓ９も、不活性であり、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導しないように操作されている。加えて、Ｇａｕｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１７，Ｎａｔｕｒｅ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２４６４４）は、ｔＲＮＡアデノシンデアミナーゼに融合した触媒的に障害されたＣａｓ９を教示し、これは標的ＤＮＡ配列におけるＡ／ＴからＧ／Ｃへの変換を媒介し得る。本発明の方法及び組成物において部位特異的改変ポリペプチドとして作用し得る人工的なＣａｓ９ヌクレアーゼの別のクラスは、ＮＧ、ＧＡＡ及びＧＡＴを含む幅広いＰＡＭ配列を認識できるバリアントである（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｎａｔｕｒｅ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２６１５５）。
【０１３８】
天然に存在するもの、及び／又は天然に存在するＣａｓ９タンパク質から変異し若しくは改変されたものを含む任意のＣａｓ９タンパク質は、本発明の方法及び組成物において部位特異的改変ポリペプチドとして使用することができる。触媒的に活性なＣａｓ９ヌクレアーゼは、標的ＤＮＡを切断して二本鎖切断を生じる。これらの切断は、次いで、２つの方法：非相同末端連結及び相同組換え修復の１つで、細胞により修復される。
【０１３９】
非相同末端連結（ＮＨＥＪ）では、二本鎖切断は、切断された末端を互いに直接連結することによって修復される。従って、新たな核酸材料は部位に挿入されないが、いくつかの核酸材料は損失し、欠失がもたらされる場合がある。相同組換え修復では、切断された標的ＤＮＡ配列に対する相同性を有するドナーＤＮＡ分子が、切断された標的ＤＮＡ配列の修復のための鋳型として使用され、ドナーポリヌクレオチドから標的ＤＮＡへの遺伝情報の移動がもたらされる。従って、新たな核酸材料が部位内に挿入／コピーされ得る。いくつかの場合、標的ＤＮＡは、ドナー分子、例えばドナーＤＮＡ分子と接触する。いくつかの場合、ドナーＤＮＡ分子は、細胞内に導入される。いくつかの場合、少なくともドナーＤＮＡ分子のセグメントが、細胞のゲノムに統合される。
【０１４０】
ＮＨＥＪ及び／又は相同組換え修復による標的ＤＮＡの改変は、例えば、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子タグ付け、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、遺伝子変異等をもたらす。従って、部位特異的改変ポリペプチドによるＤＮＡの切断を用いて、標的ＤＮＡ配列を切断し、外因的に提供されるドナーポリヌクレオチドの非存在下で、細胞が配列を修復することを可能にすることによって、標的ＤＮＡ配列から核酸材料を削除することができる（例えば、細胞を感染に感受性にする遺伝子（例えば、Ｔ細胞をＨＩＶ感染に感受性にするＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４遺伝子）を破壊するため、ニューロンにおける疾病の原因となるトリヌクレオチドリピート配列を除去するため、研究において疾病モデルとして遺伝子ノックアウト及び変異を作製するため、等）。従って、主題の方法を用いて、標的ＤＮＡにおける遺伝子をノックアウトし（転写又は変更された転写の完全な欠如をもたらす）又は遺伝子材料を選択された遺伝子座にノックインすることができる。或いは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖及び部位特異的改変ポリペプチドが、標的ＤＮＡ配列に対する相同性を有する少なくとも１つのセグメントを含むドナー分子を有する細胞に共投与された場合、主題の方法を用いて、核酸材料を標的ＤＮＡ配列に追加、即ち挿入又は置き換え（例えば、タンパク質をコードする核酸、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等を「ノックイン」するために）、タグ（例えば、６ｘＨｉｓ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質；黄色蛍光タンパク質等）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＦＬＡＧ等）を追加し、制御配列を遺伝子（例えばプロモーター、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）、２Ａペプチド、開始コドン、終結コドン、スプライスシグナル、局在化シグナル等）に追加し、核酸配列を改変（例えば、変異を導入）、等することができる。従って、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖及び部位特異的改変ポリペプチドを含む複合体は、例えば、例えば疾病を処置するための遺伝子治療において使用される、又は抗ウイルス、抗病原、若しくは抗癌治療として使用される、農業における遺伝子改変された生物の生成、治療的、診断若しくは研究目的のための細胞によるタンパク質の大規模生産、ｉＰＳ細胞の誘導、生物学的研究、削除又は置換のための病原体の遺伝子の標的化等において使用される、部位特異的な方法、即ち「標的化された」方法、例えば遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、遺伝子編集、遺伝子タグ付け等においてＤＮＡを改変することが望ましい、任意のインビトロ又はインビボ適用に有用である。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本発明のｃｒＲＮＡ及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡは、１つ以上の改変、例えば、塩基改変、バックボーン改変等を含んで、新たな又は向上した特徴（例えば、改善された安定性）を核酸に提供する。当技術分野で既知のように、ヌクレオシドは、塩基−糖組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環式塩基である。そのような複素環式塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリン及びピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基を更に含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基は、糖の２’、３’、又は５’ヒドロキシル部分に結合し得る。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は、隣接するヌクレオシドに互いに共有結合して、線状高分子化合物を形成する。次に、この線状高分子化合物の各末端が更に連結して環状化合物を形成し得るが、線状化合物が一般に適切である。加えて、線状化合物は、内部ヌクレオチド塩基相補性を有する場合があり、従って完全又は部分的に二本鎖の化合物を生成するように折り畳まれ得る。オリゴヌクレオチド内では、リン酸基は、通常、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成すると言われる。ＲＮＡ及びＤＮＡの通常の結合又はバックボーンは、３’から５’へのホスホジエステル結合である。
【０１４２】
改変を含む適切な核酸の例は、改変バックボーン又は非天然ヌクレオシド間結合を含む核酸を含む。改変バックボーンを有する核酸には、バックボーンにおいてリン原子を保持するもの、及びバックボーンにおいてリン原子を有さないものが含まれる。本発明のｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、核酸模倣物であり得る。ポリヌクレオチドに適用される場合の用語「模倣物」は、フラノース環のみ、又はフラノース環及びヌクレオチド間結合の両方が、非フラノース基で置き換えられたポリヌクレオチドを含むことが意図され、フラノース環のみの置き換えはまた、当技術分野で糖代替（ｓｕｇａｒ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）と称される。複素環式塩基部分又は改変複素環式塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。卓越したハイブリダイゼーション特性を有すると報告されている１つのポリヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ化合物のバックボーンは、ＰＮＡにアミド含有バックボーンを与える、２つ以上の結合アミノエチルグリシン単位である。複素環式塩基部分は、バックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を記載している代表的な米国特許には：米国特許第５，５３９，０８２号明細書；同第５，７１４，３３１号明細書；及び同第５，７１９，２６２号明細書が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４３】
本発明のｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、１つ以上の置換された糖部分を含むことができる。本発明のｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡは、核酸塩基（多くの場合、当技術分野で単に「塩基」と称される）改変又は置換も含むことができる。本発明のｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子の別の可能な改変は、ポリヌクレオチドに１つ以上の部分又はコンジュゲートを化学的に結合することを含み、これはオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布又は細胞取り込みを向上させる。コンジュゲートは、「タンパク質形質導入ドメイン」又はＰＴＤ（ＣＰＰ−細胞膜透過性ペプチドとしても既知）を含むことができ、これは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜又はベシクル膜の横断を促進するポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、又は有機若しくは無機化合物を指し得る。
【０１４４】
本発明のいくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、２つ以上のｔＲＮＡ切断配列を含む、天然に存在しない異種ＲＮＡ分子である、より長いＲＮＡ分子の成分又はセグメントである。これらのｔＲＮＡ切断配列は、例えばプレｔＲＮＡスプライシングにおけるＲＮＡ−核酸分解活性、３’末端プレｍＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性、プレｔＲＮＡ切断活性、及び／又はプレリボソームＲＮＡ切断活性のためである。このＲＮＡ分子が細胞内に存在すると、天然ｔＲＮＡプロセシングシステムは、ｔＲＮＡ配列においてＲＮＡ分子を切断する。次いで、この切断によりｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子が個々の分子に解放され、これらは次いで相互作用してＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖を形成することができる。いくつかの実施形態では、より長いＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡの複数のコピーを含む。ｃｒＲＮＡのこれらの複数のコピーは、同じプロトスペーサー配列を含むことができる。他の実施形態では、より長いＲＮＡ分子は、異なるｃｒＲＮＡ分子の複数のコピーを含み、これらは、異なるＤＮＡ標的に対する異なるプロトスペーサー配列を含む。異なるＤＮＡ標的は、同じ遺伝子の異なる領域に対する、又は異なる遺伝子に対するものであり得る。いくつかの実施形態では、複数のｃｒＲＮＡ分子は、異なるプロトスペーサー配列を含み得るが、各々は同じ対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有し得る。換言すれば、各ｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメントは同じであり、従って対応するｔｒａｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメントは同じである。他の実施形態では、より長いＲＮＡ分子は、ｃｒＲＮＡ及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子の異なるバリアント、例えばｄ９  ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｄ９＋ｄ１１  ｔｒａｃｒＲＮＡを含むことができる（図１及び実施例に記載されるように）。
【０１４５】
ｔＲＮＡ切断配列は、細胞の内因性ｔＲＮＡシステム、例えばＲＮａｓｅ  Ｐ、ＲＮａｓｅ  Ｚ及びＲＮａｓｅ  Ｅ（細菌）と能動的に相互作用し、それらにより切断される任意の配列及び／又は構造モチーフを含む。これは、構造認識エレメント、例えばアクセプターステム、Ｄ−ループアーム、Ｔ  Ｐｓｉ  Ｃループ、及び特異的配列モチーフを含むことができる。ワールドワイドウェブｌｏｗｅｌａｂ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｔＲＮＡｓｃａｎ−ＳＥ、又はワールドワイドウェブｔｒｎａ．ｂｉｏｉｎｆ．ｕｎｉ−ｌｅｉｐｚｉｇ．ｄｅ／ＤａｔａＯｕｔｐｕｔ／Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ（全生物の場合）、又はｐｌａｎｔｒｎａ．ｉｂｍｐ．ｃｎｒｓ．ｆｒ／ｐｌａｎｔｒｎａのワールドワイドウェブ（植物の場合）で入手可能なｔＲＮＡ−ＳＥプログラム等の供給源を通じて当業者が既知及び入手可能な多数のｔＲＮＡ活性配列及びモチーフが存在する。多数の論文及びジェンバンクリソースも入手可能である。
【０１４６】
ｔＲＮＡの一般的な特性は、当業者に周知である。好ましくは、ｔＲＮＡは、折り畳まれて特徴的な「クローバー葉」二次構造をとることができる単一のリボヌクレオチド分子から形成される。この特徴的な二次構造は：（ｉ）リボヌクレオチド鎖の５’末端の最初の７リボヌクレオチドと、リボヌクレオチド鎖の３’末端の最後の４リボヌクレオチドに先行する７リボヌクレオチドとから構成され、それにより６又は７対のリボヌクレオチドを含む二本鎖構造を形成するアクセプターステム、ここでリボヌクレオチド鎖の５’末端の最初のリボヌクレオチドと、リボヌクレオチド鎖の３’末端の最後の４リボヌクレオチドに先行するリボヌクレオチドとによって構成されるリボヌクレオチドは、対合しないことが可能である；ｉｉ）４対のリボヌクレオチドによって構成されるＤアーム、及び、８リボヌクレオチドによって構成されるＤループ（リボヌクレオチド鎖の５’末端の最初の７リボヌクレオチドに続くリボヌクレオチド鎖の一部の折り畳みによって形成される）；（ｉｉｉ）５対のリボヌクレオチドによって構成されるアンチコドンのステム、及び７リボヌクレオチドによって構成されるアンチコドンのループ（アンチコドンのステムループ）（Ｄアーム及びＤループに続くリボヌクレオチド鎖の一部の折り畳みによって形成される）；（ｉｖ）４〜２１リボヌクレオチドから構成され、アンチコドンのステム及びアンチコドンのループに続くリボヌクレオチド鎖の一部によって形成される可変のループ；（ｖ）アクセプターステムの構成に関与する、可変のループに続き、且つリボヌクレオチド鎖の３’末端のリボヌクレオチドに先行するリボヌクレオチド鎖の一部の折り畳みによって形成される、５対のリボヌクレオチドから構成されるＴアーム、及び８リボヌクレオチドから構成されるＴループ。
【０１４７】
場合によっては、好ましくは、５’末端から３’末端に向かう方向において、リボヌクレオチド鎖の５’末端の最初の７リボヌクレオチドと、Ｄアーム及びループとの間に２リボヌクレオチドが存在し、１リボヌクレオチドが、一方ではＤアーム及びループと、他方ではアンチコドンのステム及びループとの間に存在し、１リボヌクレオチドが、一方ではアンチコドンのステム及びループと、他方では可変のループとの間に存在する。なお好ましくは、当業者に周知であり、及びＳｐｒｉｎｚｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：１４８−１５３）に定義される番号付けによれば、ｔＲＮＡは、ｔＲＮＡの三次元構造及び細胞酵素による認識を確実にする１７リボヌクレオチド、即ち：Ｕ．ｓｕｂ．８、Ａ．ｓｕｂ．１４、（Ａ又はＧ）．ｓｕｂ．１５、Ｇ．ｓｕｂ．１８、Ｇ．ｓｕｂ．１９，Ａ．ｓｕｂ．２１、Ｇ．ｓｕｂ．５３、Ｕ．ｓｕｂ．５４、Ｕ．ｓｕｂ．５５、Ｃ．ｓｕｂ．５６、（Ａ又はＧ）．ｓｕｂ．５７、Ａ．ｓｕｂ．５８、（Ｃ又はＵ）．ｓｕｂ．６０、Ｃ．ｓｕｂ．６１、Ｃ．ｓｕｂ．７４、Ｃ．ｓｕｂ．７５、Ａ．ｓｕｂ．７６を含む。示されたリボヌクレオチドは、細胞内機構による特定のリボヌクレオチドの任意の転写後修飾の前の転写されたｔＲＮＡの配列に対応する。
【０１４８】
特に、上記に定義したｔＲＮＡは、始生代、細菌、ウイルス、原生動物、真菌、藻類、植物又は動物ｔＲＮＡから構成される群から選択されてもよい。本発明に従って使用され得るｔＲＮＡは、Ｓｐｒｉｎｚｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）により記載された全ｔＲＮＡ、又は、例えばｕｎｉ−ｂａｙｒｅｕｔｈ．ｄｅ／ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｓ／ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ／ｔｍａ／においてワールドワイドウェブで入手可能なものも含む。本発明の状況において、「ｔＲＮＡ」という用語は、上記に定義したｔＲＮＡの改変により得られる構造、又は上記に定義したｔＲＮＡの天然バリアントも含むが、但し、それらの改変された構造又はそれらのバリアントが、非改変ｔＲＮＡの機能性、即ち特にＥＦ−Ｔｕ’因子（例えば、Ｒｏｄｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ，．（２００５）ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．５７９：９３８−９４２参照）又はＣＣＡｓｅ（例えば、Ａｕｇｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２８：９８５−９９４参照）等のタンパク質との相互作用を保持することを条件とする。例えばｔＲＮＡ−ＳＥプログラム等の供給源を介して、又はｐｌａｎｔｒｎａ．ｉｂｍｐ．ｃｎｒｓ．ｆｒ／ｐｌａｎｔｒｎａ（植物の場合）におけるワールドワイドウェブから、当業者に既知であり及び当業者が入手可能な多数のｔＲＮＡ活性配列及びモチーフが存在する。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、「３’末端プレｍＲＮＡエンドヌクレアーゼに対する基質」という表現は、３’末端プレｍＲＮＡエンドヌクレアーゼにより認識及び切除される任意のヌクレオチド配列を指す。例えば、切断部位の上流の配列ＡＡＣＡＡＡを有するヘキサヌクレオチドと、下流のＧ／Ｕリッチ配列エレメントとを含むヌクレオチド配列は、３’末端プレｍＲＮＡエンドヌクレアーゼに対する基質として利用され得る。３’末端プレｍＲＮＡエンドヌクレアーゼにより認識及び切除されるヌクレオチド配列は、１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１２５ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、又はそれを超えるヌクレオチドを含むことができる。
【０１５０】
本発明は、ｃｒＲＮＡ分子及びその対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖を提供し、ｃｒＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、各々、配列番号５５及び５６、配列番号５７及び５８、配列番号５９及び６０、配列番号６１及び６２、配列番号６３及び６４、配列番号６５及び６６、配列番号６７及び６８、配列番号６９及び７０、配列番号７１及び７２、配列番号７３及び７４、配列番号７５及び７６、配列番号７７及び７８、配列番号７９及び８０、配列番号８１及び８２、又は配列番号８３及び８４の核酸配列を含み、ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡ分子における配列に相補的な核酸配列を更に含み、それによりＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖は、標的ＤＮＡ配列を標的化及びハイブリダイズする。本発明のｃｒＲＮＡ及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、操作されており、これは人の手により作製され、天然に存在しないことを意味する。
【０１５１】
本発明のｃｒＲＮＡ分子は、本発明のｃｒＲＮＡ分子のＤＮＡ標的化セグメントであり、且つ標的ＤＮＡ分子における配列に相補的なプロトスペーサー配列を含む。上述したように、プロトスペーサー配列は、少なくとも１２ヌクレオチド長であり、標的ＤＮＡ分子の標的配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％相補性を有し得る。プロトスペーサー配列は、膨大な数の標的配列のいずれかとなるように操作され得ることが当業者により認識されるであろう。ｃｒＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントの配列は、ｃｒＲＮＡのタンパク質結合セグメントがその対応するｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズする能力に影響を与えないことも当業者により認識されるであろう。本発明のｃｒＲＮＡ分子は、プロトスペーサー配列が完全に機能的であることを必要とするが、本発明は、上述したように、プロトスペーサー配列の配列又は長さを、標的化される適切なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに既に必要とされるものを超えて制限しない。
【０１５２】
他の実施形態では、本発明は、ｃｒＲＮＡ分子及びその対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子の二重鎖形成セグメントが、各々、配列番号５５及び９６、配列番号５７及び９７、配列番号５９及び９８、配列番号６１及び９９、配列番号６３及び１００、配列番号６５及び１０１、配列番号６７及び１０２、配列番号６９及び１０３、配列番号７１及び１０４、配列番号７３及び１０５、配列番号７５及び１０６、配列番号７７及び１０７、配列番号７９及び１０８、配列番号８１及び１０９、又は配列番号８３及び１１０の核酸配列を含む、上述したＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖を提供する。
【０１５３】
本発明はまた、本発明の少なくとも１つのｃｒＲＮＡ及び／又は少なくとも１つのｔｒａｃｒＲＮＡをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。核酸分子は、２つ以上のｃｒＲＮＡ分子をコードしてもよく、ここで複数のｃｒＲＮＡ分子は、異なるプロトスペーサー配列を有する。或いは、核酸分子は、同じプロトスペーサー配列を有する複数のｃｒＲＮＡ分子をコードしてもよい。核酸分子はまた、複数のｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードしてもよく、又は単一のｔｒａｃｒＲＮＡ分子を複数回コードしてもよい。核酸分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であってもよい。いくつかの実施形態では、核酸分子は環状化される。他の実施形態では、核酸分子は線状である。いくつかの実施形態では、核酸分子は、一本鎖、部分的に二本鎖、又は二本鎖である。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、少なくとも１つのポリペプチドと複合体化される。ポリペプチドは、核酸認識又は核酸結合ドメインを有してもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、例えば、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び／又はＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖、及びまた部位特異的改変ポリペプチド、及び場合によりドナー分子の送達を媒介するためのシャトルである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドシャトルは、Ｆｅｌｄａｎ  Ｓｈｕｔｔｌｅ（米国特許出願公開第２０１６０２９８０７８号明細書、参照により本明細書に組み込まれる）である。
【０１５５】
本発明の核酸分子は、少なくとも１つのｃｒＲＮＡ及び／又は少なくとも１つのｔｒａｃｒＲＮＡの発現を駆動することが可能な発現カセットを含むことができる。核酸分子は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの一部を含むキメラ酵素、又は改変Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（これらの全ては、上述）等のヌクレアーゼを発現することが可能な、追加の発現カセットを更に含んでもよい。
【０１５６】
本発明はまた、人工的な、天然に存在しない、標的化変異誘発のためのシステムを提供し、当該システムは、本発明のＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖と、部位特異的改変ポリペプチドとを含み、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖は、ｃｒＲＮＡ分子及びその対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子を含み、ｃｒＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、各々、配列番号５５及び５６、配列番号５７及び５８、配列番号５９及び６０、配列番号６１及び６２、配列番号６３及び６４、配列番号６５及び６６、配列番号６７及び６８、配列番号６９及び７０、配列番号７１及び７２、配列番号７３及び７４、配列番号７５及び７６、配列番号７７及び７８、配列番号７９及び８０、配列番号８１及び８２、又は配列番号８３及び８４の核酸配列を含み、ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡ分子における配列に相補的な核酸配列を更に含み、それによりｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡデュアルガイド複合体は、標的ＤＮＡ配列を標的化及びハイブリダイズし、部位特異的改変ポリペプチドは、ＤＮＡ分子を切断する。上述したように、本発明のｃｒＲＮＡ分子は、本発明のｃｒＲＮＡ分子のＤＮＡ標的化セグメントであり、且つ標的ＤＮＡ分子における配列に相補的なプロトスペーサー配列を含む。上述したように、プロトスペーサー配列は、少なくとも１２ヌクレオチド長であり、標的ＤＮＡ分子の標的配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％相補性を有し得る。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ分子、その対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子、及び部位特異的改変ポリペプチドは、少なくとも１つの核酸分子内でコードされ、ｃｒＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、各々、配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号７及び８、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２、配列番号１３及び１４、配列番号１５及び１６、配列番号１７及び１８、配列番号１９及び２０、配列番号２１及び２２、配列番号２３及び２４、配列番号２８及び２９、配列番号３０及び３１、配列番号３２及び３３、若しくは配列番号３４及び３５を含む核酸配列、若しくはその相補体によりコードされ、又はｃｒＲＮＡ分子は、配列番号３６の核酸配列若しくはその相補体を含み、ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡ分子における配列に相補的な核酸配列を更に含み、それによりｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡデュアルガイド複合体は、標的ＤＮＡ配列を標的化及びハイブリダイズし、部位特異的改変ポリペプチドは、ＤＮＡ分子を切断する。上述したように、プロトスペーサー配列は、少なくとも１２ヌクレオチド長であり、標的ＤＮＡ分子の標的配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％相補性を有し得る。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより駆動されるプロモーターを含む少なくとも１つの発現カセットを含む。更なる実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより駆動されるプロモーターの核酸配列は、配列番号８５に対して少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより駆動されるプロモーターを含む少なくとも１つの発現カセットを含む。更なる実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより駆動されるプロモーターの核酸配列は、配列番号８６に対して少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、少なくとも２つの発現カセットを含み、その一方は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより駆動されるプロモーターを含み、他方は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより駆動されるプロモーターを含む。更なる実施形態では、第１の発現カセットは、配列番号８５に対して少なくとも９０％同一のプロモーターを含み、第２の発現カセットは、配列番号８６に対して少なくとも９０％同一のプロモーターを含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、上述した本発明の核酸分子は、２つ以上の発現カセットを含み、それらの各々は、同じｃｒＲＮＡ及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする。他の実施形態では、上述した核酸分子は、２つ以上の発現カセットを含み、それらの各々は、異なるプロトスペーサー配列を有する本発明のｃｒＲＮＡ分子をコードする。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、核酸分子はベクターである。更なる実施形態では、核酸分子は、形質転換、例えば微粒子銃形質転換又はアグロバクテリウム媒介形質転換が可能なベクターである。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子がコードされている同じ核酸分子上にコードされる。他の実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子がコードされているものとは異なる核酸分子上にコードされる。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、異なる発現カセットにコードされる。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、同じ発現カセットにコードされる。
【０１６１】
本発明はまた、少なくとも１つのｃｒＲＮＡセグメント及びその対応するｔｒａｃｒＲＮＡセグメントの少なくとも１つを含むＲＮＡ分子を提供し、セグメントは、５’及び／又は３’末端においてｔＲＮＡ切断配列に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、ｔＲＮＡ切断が可能な細胞内に存在し得る。ｔＲＮＡ切断後、ｃｒＲＮＡセグメントは本発明のｃｒＲＮＡ分子となり、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントは本発明のｔｒａｃｒＲＮＡ分子となるため、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は分離し、別個の分子であり、これらはＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖を形成することが可能である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、タンデムアライメントにあるｔＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、得られたｃｒＲＮＡ分子及びその対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子の少なくとも１つは、各々、配列番号５５及び５６、配列番号５７及び５８、配列番号５９及び６０、配列番号６１及び６２、配列番号６３及び６４、配列番号６５及び６６、配列番号６７及び６８、配列番号６９及び７０、配列番号７１及び７２、配列番号７３及び７４、配列番号７５及び７６、配列番号７７及び７８、配列番号７９及び８０、配列番号８１及び８２、又は配列番号８３及び８４の核酸配列を含み、ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列における配列に相補的な核酸配列を更に含む。前述したように、本発明のｃｒＲＮＡ分子は、本発明のｃｒＲＮＡ分子のＤＮＡ標的化セグメントであり、且つ標的ＤＮＡ分子における配列に相補的なプロトスペーサー配列を含む。上述したように、プロトスペーサー配列は、少なくとも１２ヌクレオチド長であり、標的ＤＮＡ分子の標的配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％相補性を有し得る。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｃｒＲＮＡ、少なくとも１つのｔｒａｃｒＲＮＡ、及び少なくとも１つのｔＲＮＡ切断配列を含む上述したＲＮＡ分子は、配列番号１１２に対して少なくとも９０％同一のｔＲＮＡ切断部位の核酸配列を含む。
【０１６３】
本発明はまた、上述したｔＲＮＡ切断部位を含むＲＮＡ分子を発現する少なくとも１つの発現カセットを含む核酸分子を提供する。核酸分子は、ｔＲＮＡ切断が可能な細胞内に存在し得る。いくつかの実施形態では、本発明のｃｒＲＮＡ分子、対応する本発明のｔｒａｃｒＲＮＡ分子、及び少なくとも２つのｔＲＮＡ切断配列は、同じ発現カセット内でコードされ、それによりｔＲＮＡ切断後、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は分離し、別個の分子である。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｔＲＮＡ切断部位を含むＲＮＡ分子を発現する核酸分子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより駆動されるプロモーターを含む少なくとも１つの発現カセットを含む。更なる実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより駆動されるプロモーターは、配列番号８５に対して少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより駆動されるプロモーターを含む少なくとも１つの発現カセットを含む。更なる実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより駆動されるプロモーターは、配列番号８６に対して少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、少なくとも２つの発現カセットを含み、一方は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより駆動されるプロモーターを含み、他方は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより駆動されるプロモーターを含む。更なる実施形態では、第１の発現カセットは、配列番号８５に対して少なくとも９０％同一のプロモーターを含み、第２の発現カセットは、配列番号８６に対して少なくとも９０％同一のプロモーターを含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、直上に記載された本発明の核酸分子は、各々が、同じｃｒＲＮＡ及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードしてもよい２つ以上の発現カセットを含む。他の実施形態では、上述した核酸分子は、各々が、異なるプロトスペーサー配列を有する本発明のｃｒＲＮＡ分子をコードしてもよい２つ以上の発現カセットを含む。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、直上に記載された核酸分子は、ベクターである。更なる実施形態では、核酸分子は、形質転換、例えば微粒子銃形質転換又はアグロバクテリウム媒介形質転換が可能なベクターである。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子がコードされている同じ核酸分子上にコードされる。他の実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子がコードされているものとは異なる核酸分子上にコードされる。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、２つ以上の発現カセットにコードされる。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、同じ発現カセットにコードされる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、直上に記載された核酸分子は、発現カセットの核酸配列が、配列番号８７〜９４のいずれかである、少なくとも１つの発現カセットを含む。配列番号８７〜９４内の２０個のＮ’は、発現カセット内でコードされるｃｒＲＮＡ分子のプロトスペーサーを表す。上述したように、プロトスペーサー配列は、少なくとも１２ヌクレオチド長であり、標的ＤＮＡ分子の標的配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％相補性を有し得る。
【０１６８】
本発明はまた、標的ＤＮＡの部位特異的改変の方法を提供し、当該方法は、標的ＤＮＡを以下と接触させることを含む：（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖、又はそれをコードするＤＮＡ分子、ここでＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖は、上述したような本発明によるＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖である、及び（ｉｉ）部位特異的改変ポリペプチド、又はそれをコードするＤＮＡ分子、ここで部位特異的改変ポリペプチドは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、及び部位特異的酵素活性を示す活性部分を含む。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、本方法の標的ＤＮＡは、染色体外である。更なる実施形態では、本方法はインビトロで実践され、標的ＤＮＡは、ＤＮＡベクター又はプラスミド等の染色体外である。他の実施形態では、標的ＤＮＡは、細胞内である。いくつかの実施形態では、細胞は、真核生物細胞である。更なる実施形態では、細胞は、植物、藻類、又は真菌細胞である。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、エピソーム、ミトコンドリア又は葉緑体内に存在する。他の実施形態では、標的ＤＮＡは、染色体の一部である。更なる実施形態では、標的ＤＮＡは、細胞内の染色体の一部である。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、部位特異的改変の方法は、部位特異的改変ポリペプチドが、標的ＤＮＡを改変する酵素活性を有することを必要とする。酵素活性は、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、又はグリコシラーゼ活性、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。前述したように、部位特異的改変ポリペプチドは、人工的な及び／又はキメラ酵素であり得る。
【０１７１】
本発明の方法は、標的ＤＮＡの部位特異的改変を含み、ＤＮＡ改変酵素活性は、ヌクレアーゼ活性である。ヌクレアーゼは、標的ＤＮＡにおいて一本鎖又は二本鎖切断を導入することができる。ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖及び／又は部位特異的改変ポリペプチドは、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）又は相同組換え修復が許容される条件下で、標的ＤＮＡと接触することができる。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、修復プロセスの結果として改変されてもよく、部位特異的ヌクレアーゼとしてのみ作用し得る部位特異的改変ポリペプチドの酵素活性の直接的な結果としてではない。
【０１７２】
本発明はまた、部位特異的改変の方法を提供し、標的部位は、核酸配列の挿入により改変される。この配列は、ドナー分子により提供される。この方法において、標的ＤＮＡは、以下と接触する：（ｉ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖、又はそれをコードするＤＮＡ分子、ここでＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖は、上述したような本発明のＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖である；（ｉｉ）部位特異的改変ポリペプチド、又はそれをコードするＤＮＡ分子、ここで部位特異的改変ポリペプチドは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、及び部位特異的酵素活性を示す活性部分を含む；並びに（ｉｉｉ）ドナーポリヌクレオチド、ここでドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの部分、ドナーポリヌクレオチドのコピー、又はドナーポリヌクレオチドのコピーの部分は、標的ＤＮＡに統合される。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、本発明の方法の部位特異的改変ポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼである。更なる実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、改変されていてもよいＣａｓ９ヌクレアーゼである。改変されたＣａｓ９ヌクレアーゼは、上述したように、キメラであってもよく、変更された酵素活性を有してもよく、及び／又はヌクレアーゼ活性を有さなくてもよい。ヌクレアーゼ活性が不活化された改変Ｃａｓ９は、ｄＣａｓ９と称され得る。
【０１７４】
本発明の方法は、標的ＤＮＡの部位特異的改変の方法である。いくつかの実施形態では、改変は、ゲノム内の遺伝子を標的とする、改変された遺伝子配列の挿入であり、これは対立遺伝子交換とも称される。理論に束縛されるものではないが、改変された遺伝子配列は、標的化ゲノム部位と高く相同であり、それによって、改変された遺伝子配列は、ＲＮＡ媒介標的化ゲノム切断後の相同依存性修復を介して、相同組換えによって標的化ゲノム部位のヌクレオチドの少なくとも一部を置き換えることができる。対立遺伝子交換は、外来遺伝子配列を導入しない。対立遺伝子交換は、典型的には、遺伝子機能、例えば酵素活性又は調節機能を改変するための、少なくとも１つのヌクレオチドの正確な置き換えを含む。いくつかの実施形態では、対立遺伝子交換は、遺伝子のコード領域の数個のヌクレオチドを置き換えて、１つ又は数個の新たなアミノ酸変化を含む新たな機能性タンパク質又は酵素バリアントを生成するのに使用することができる。例えば、グリホサート感受性ＥＰＳＰＳ遺伝子の対立遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介ゲノム編集を用いて、２アミノ酸の変化、Ｔ１７８Ｉ及びＰ１８２Ａ変異によって、グリホサート耐性バリアントに変換することができる（Ｓａｕｅｒ  ＮＪ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．ＤＯＩ：１０．１１０４／ｐｐ．１５．０１６９６）。対立遺伝子交換頻度は、典型的には、背景の相同組換え頻度と比較して、数千倍まで、その頻度を増大させる部位特異的ヌクレアーゼを使用した場合であっても、作物において非常に低く、従って作物改善におけるその用途は限定される。
【０１７５】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、抗サイレンシングタンパク質、又は抗サイレンシングタンパク質自体をコードする核酸分子も、標的ＤＮＡを含む細胞に導入される。いくつかの実施形態では、抗サイレンシングタンパク質は、ウイルスサイレンシング抑制因子（ＶＳＲ）であり又はそれに由来する。更なる実施形態では、抗サイレンシングタンパク質は、植物ウイルスに由来するＶＳＲである。更なる実施形態では、抗サイレンシングタンパク質は、Ｔｏｍｂｕｓウイルス、例えばＣｙｍＲＳＶ、ＣＩＲＶ又はＴＢＳＶに由来するウイルスサイレンシング抑制因子ｐ１９タンパク質である。Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌは、最近、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼ（ｎｕｃｌｅｅａｓｅ）と共発現したトマトブッシースタントウイルスに由来するｐ１９  ＶＳＲが、植物において遺伝子標的化の効率及び／又はガイドＲＮＡ安定性を改善することを示した（米国特許出願公開第２０１６／０２６４９８２号明細書）。いくつかの実施形態では、ＶＳＲは、ＨＣ−Ｐｒｏ、ｐ１４、ｐ３８、ＮＳ、ＮＳ３、ＣａＭＶ  Ｐ６、ＰＮＳ１０、Ｐ１２２、２ｂ、Ｐｏｔｅｘ  ｐ２５、ＴｏＲＳＶ  ＣＰ、Ｐ０、及びＳＰＭＭＶ  Ｐ１を含む植物ウイルスタンパク質の群から選択される（Ｃｓｏｒｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４７９−４８０  ｐ．８５−１０３参照、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１７６】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、標的ＤＮＡを含む細胞は、単子葉植物細胞である。更なる実施形態では、植物細胞は、トウモロコシ、イネ、モロコシ、サトウキビ、大麦、小麦、カラス麦、芝草、又は観賞用草細胞である。他の実施形態では、細胞は、双子葉植物細胞である。更なる実施形態では、植物細胞は、タバコ、トマト、コショウ、ナス、ヒマワリ、アブラナ科、アマ、ジャガイモ、綿、大豆、テンサイ、又はアブラナ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、針葉樹細胞である。
【０１７７】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖及び／又は部位特異的改変ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子は、標的ＤＮＡを含む細胞内に導入又は送達される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖及び部位特異的改変ポリペプチドは、同じＤＮＡ分子上にコードされる。他の実施形態では、それらは、別々のＤＮＡ分子上にコードされる。更なる実施形態では、ＤＮＡ分子は、微粒子銃照射、アグロバクテリウム媒介形質転換、又は当技術分野で既知の任意の他の方法によって細胞内に導入される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子は、一過性に発現され、細胞のゲノムに組み込まれない。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子は、安定的に形質転換され、細胞のゲノムに組み込まれる。
【０１７８】
本発明はまた、標的ＤＮＡの部位特異的改変を含む、植物、植物部分、又はその子孫を生成する方法を提供し、前記方法は、そのＤＮＡが上述した本発明の方法のいずれかによって改変されている植物細胞から、植物を再生することを含む。本発明は、これらの方法によって生成された、そのＤＮＡの改変を含む植物、植物部分、又はその子孫を更に提供する。
【０１７９】
ここで本発明を、以下の実施例を参照して記載する。これらの実施例は、本発明の特許請求の範囲を限定することを意図するものではなく、特定の実施形態の例示を意図することを認識するべきである。当業者が見出す、例示した方法における任意のバリエーションは、本発明の範囲内に含まれる。
【実施例】
【０１８０】
実施例１：ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの変異によるゲノム編集効率の改善
この実施例は、ゲノム編集効率を改善するためのｃｒＲＮＡ及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡへの変異を記載する。これらの変異は、一般に４つの領域に分類される。最初の変異は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの一時停止シグナルを標的とする。これらの変異は、一般に、デュアルガイドＲＮＡ複合体の２つの領域を標的としている。これらの領域は、いずれもＲＮＡ中に「ＵＵＵＵ」モチーフを含む。ＤＮＡ鋳型中のＴの連続配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの一時停止シグナルである。第１のポリＵモチーフは、ｃｒＲＮＡのプロトスペーサーの下流に位置する。この一時停止シグナルを破壊するために点変異を作った。図１に示すように、この第１のモチーフを破壊する効果がゲノム編集効率にどのような影響を与えるかを決定するために変異体ｄ２からｄ７が産生された。「ｄ１」は、図１に示すように、プロトスペーサー（配列番号１１３）とその対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号１１４）の特定の配列を有さないｃｒＲＮＡの配列である。ｄ２からｄ７の変異は、ｃｒＲＮＡ分子の変異と、それに対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子の変異の両方を含んでおり、その結果、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、依然として変異残基で塩基対を形成する。例えば、ｄ２は、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡにおけるＵ／Ａからｄ２変異体のｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡにおけるＧ／Ｃへの変異である。ｄ１１変異体は、ｃｒＲＮＡの３’末端とｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端にある第２のＵＵＵＵモチーフを標的とする。これらの変異は、図１に例示され、そして配列番号５７〜６８として提供される。
【０１８１】
第２の変異誘発領域は、点変異及び追加のＲＮＡエレメントの挿入によるｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖構造の最適化に焦点を当てた。ＲＮＡ：ＲＮＡ相互作用を増加させるために二重鎖の塩基対の数を伸長又は短縮することが変異誘発効率を改善するか否かを試験するために、ｄ８変異体を作製した。ｄ８変異は、ｃｒＲＮＡの３’末端に付加された「ＡＡＵＧＧＵＵＣＣ」モチーフを含んで、天然のｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号６９）と相補的な塩基対合を提供する。或いは、ｄ９変異体は、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子の５’末端に８ヌクレオチド配列「ＧＡＡＣＣＡＵＵ」の欠失を含んで、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’オーバーハングを排除する（配列番号７２）。変異体ｄ１０では、ＢＹＤＶ（大麦黄萎ウイルス）３’−ＵＴＲの３０ヌクレオチドがｃｒＲＮＡの３’末端に導入され（配列番号７３）、ＢＹＤＶ  ５’−ＵＴＲの３７ヌクレオチドがｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端に導入される（配列番号７４）。ＢＹＤＶ由来のこれらの配列は、植物宿主因子によって認識されるＢＹＤＶ翻訳エレメントをコードするＲＮＡ−ＲＮＡループ相互作用構造を含み、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖に更なるＲＮＡ：ＲＮＡエレメントを提供する。これらの変異の全てを図１に示す。
【０１８２】
第３の変異誘発領域は、デュアルガイドＲＮＡの転写産物プロセシングに焦点を当てた。複数の部位を標的とするように設計された単一ガイドＲＮＡにｔＲＮＡを導入することは、細胞におけるＲＮＡのプロセシングを可能にする有効な方法であるという報告がある（Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，ＰＮＡＳ  １１２（１１）：３５７０−３５７５；Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＤＯＩ  １０．１１８６／ｓ１２８９６−０１６−０２８９−２）。しかしながら、デュアルガイドＲＮＡシステムにおける効率を高めるｔＲＮＡの能力は、実証されていない。構築物２３９９９を作製し、これは、その３’末端がｔＲＮＡに作動可能に連結されたＰｏｌＩＩＩプロモーター、即ちｐｒＯｓＵ３を含む発現カセット（配列番号２５）を含み、ＰｏｌＩＩＩプロモーターはその３’末端がｃｒＲＮＡに作動可能に連結され、ｃｒＲＮＡは、その３’末端が第２のｔＲＮＡに作動可能に連結され、第２のｔＲＮＡは、その３’末端がｔｒａｃｒＲＮＡに作動可能に連結され、ｔｒａｃｒＲＮＡは、その３’末端がポリＴに作動可能に連結された。これにより、タンデムアライメントにあるｔＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡを有するＲＮＡ分子が作製される。構築物２３９９９と同じエレメントを含むが、ｔｒａｃｒＲＮＡがｃｒＲＮＡの上流にある発現カセットを含む構築物２４０００も作製した。換言すれば、構築物２４０００は、ｐｒＯｓＵ３プロモーターを含む発現カセット（配列番号２６）を含み、ｐｒＯｓＵ３プロモーターは、その３’末端がｔＲＮＡに作動可能に連結され、ｔＲＮＡは、その３’末端がｔｒａｃｒＲＮＡに作動可能に連結され、ｔｒａｃｒＲＮＡは、その３’末端がｔＲＮＡに作動可能に連結され、ｔＲＮＡは、その３’末端がｃｒＲＮＡに作動可能に連結され、ｃｒＲＮＡは、その３’末端がポリＴに作動可能に連結された。これにより、タンデムアライメントにあるｔＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ−ｃｒＲＮＡを有するＲＮＡ分子が作製される。
【０１８３】
実施例２：イネの標的化変異誘発
上述したデュアルガイド構築物のゲノム編集効力を試験するために、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）のゲノムにおいて標的を同定した。標的遺伝子は、ＤＥＮＳＥ  ＡＮＤ  ＥＲＥＣＴ  ＰＡＮＩＣＬＥ  １（ＤＥＰ１）である。ジャポニカ米ｄｅｐ１変異体は、ＤＥＰ１の３’末端近くに６２５ｂｐの欠失を含む。変異体は、野生型よりも高い穀粒数及び低い植物高さを有する密で直立した穂（ｐａｎｉｃｌｅ）を有する（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４１：４９４−４９７。インディカ米は、ＤＥＰ１遺伝子の野生型コピーを有する。本明細書に記載の実施例では、ＤＥＰ１を変異の標的とし、本明細書に記載の全てのｃｒＲＮＡ構築物は、本明細書に記載のｃｒＲＮＡ分子のためのプロトスペーサーをコードする５’−ＡＣＴＧＣＡＧＴＧＣＧＴＧＣＴＧＣＧＣ−３’（配列番号４５）を含む。本発明は、プロトスペーサー又はその対応するＤＮＡ標的の配列に限定されず、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子に対する変異、並びにそれらが産生される発現カセットは、任意のプロトスペーサー配列に適合され得ることが、当業者により認識されるであろう。
【０１８４】
本明細書に記載される全てのバイナリーベクターは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを発現するための発現カセット（国際公開第１６１０６１２１号、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）及び形質転換のための選択マーカーを発現するための第２の発現カセットを含む。選択マーカー、ホスホマンノースイソメラーゼをコードし、マンノースを代謝する能力を提供するＰＭＩ遺伝子（ｍａｎＡ遺伝子とも称される）（米国特許第５，７６７，３７８号明細書及び同第５，９９４，６２９号明細書、参照により本明細書に組み込まれる）を、遺伝子導入イネ植物の形質転換及び再生のための選択マーカーとして使用した。２３９９９及び２４０００を除く全てのバイナリーベクターについて、各バイナリーベクターは、更に、ｃｒＲＮＡの野生型若しくはｄ１−ｄ１１変異体を産生する発現カセット、及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子の野生型若しくはｄ１−ｄ１１変異体を産生する追加の発現カセットを含んでいた。２３９９９及び２４０００について、単一の発現カセットは、上述したように、ｔＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むＲＮＡ分子を産生した。対照として、野生型ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子を産生するための発現カセットを含むバイナリーベクター（構築物２３８４４）、並びに単一ガイドＲＮＡ分子を産生する発現カセットを含むバイナリーベクター（構築物２３１２７）も試験した。各バイナリーベクター中の全ての発現カセットは、単一の導入遺伝子の一部である。
【０１８５】
イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）近交系ＩＲ５８０２５Ｂを、Ｇｕｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１４（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ３３：１０８１−１０９０、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、形質転換、選択、及び再生のためのプロトコルに本質的に従うアグロバクテリウム媒介形質転換実験のために使用した。遺伝子導入イネラインを、１６時間明／３０℃及び８時間暗／２２℃の温室内で成長させた。
【０１８６】
Ｔ０遺伝子導入事象からの葉組織をサンプリングし、ゲノムＤＮＡ抽出、続いてＴａｑＭａｎ分析に使用した。ＴａｑＭａｎ分析は、本質的に、Ｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３１（１）：１３２−４，１３６−４０，２００１）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように実施された。ＴａｑＭａｎを実施して、ＰＭＩ遺伝子（配列番号４６〜４７はプライマー；配列番号４８はプローブ）、Ｃａｓ９遺伝子（配列番号４９〜５０はプライマー；配列番号５１はプローブ）、及びＤＥＰ１における標的化変異（配列番号５２〜５３はプライマー；配列番号５４はプローブ）の存在を検出した。ＤＥＰ１における変異を検出するために、フォワードプライマー（配列番号５２）及びリバースプライマー（配列番号５３）は、プロトスペーサー標的配列（配列番号４５）に隣接し、そしてプローブ（配列番号５４）は、Ｃａｓ９切断部位及びＰＡＭを含むプロトスペーサーの領域にハイブリダイズする。変異（典型的には、ｉｎｄｅｌ）がＣａｓ９切断部位に導入される場合、プローブは、標的配列に結合せず、従って蛍光を生成しないであろう。変異率は、ＤＥＰ１のＴａｑＭａｎ分析に基づいて計算される。
【０１８７】
表１は、本発明のＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖による標的化変異誘発を示す。配列番号は、変異ｃｒＲＮＡ（プロトスペーサーを含まない）及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列、又は構築物２３９９９及び２４０００のＲＮＡ分子をコードする発現カセットである。「外植片の数」は、最初に形質転換されたイネ外植片の数であり、「形質転換体の数」は、形質転換に成功した外植片の数である。変異率は、上述したＴａｑＭａｎアッセイによって決定された、ＤＥＰ１に標的変異を含有した形質転換体の百分率である。「変異体のコピー数」は、ＤＥＰ１遺伝子の変異に成功した形質転換体における導入遺伝子挿入の数を示す。「低コピー」は、１つの挿入を示唆する。「２コピー」は、２つの挿入を示唆し、「高コピー」は、３つ以上の挿入を示唆する。
【０１８８】
【表１】
2021522829.tif 000003
【０１８９】
表１でわかるように、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖に対するいくつかの変異は、驚くべきことに、野生型ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖よりも数倍良好な変異率をもたらした。特に、ｄ９及びｄ１１変異、並びに２３９９９及び２４０００構築物によって産生されたＲＮＡ分子は、野生型ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖と比較して高い変異率を与えた。
【０１９０】
実施例３：デュアルガイドＲＮＡ分子の更なる最適化
更なる変異構築物を作製して、ｃｒＲＮＡ及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡの変異誘発、特にそれらが相互作用して二重鎖を形成する領域において、又は更なるＲＮＡエレメントを挿入することによって、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖構造を更に最適化することができるか否かを決定した。これらの構築物の多くは、表１に示される結果に基づいて構築される。
【０１９１】
構築物２４１２７は、ｄ１１変異を含むｃｒＲＮＡ分子（配列番号２８）と、上記及び図１に記載のｄ９  ５’末端欠失変異及びｄ１１変異の両方を含むｔｒａｃｒＲＮＡ分子（配列番号２９）をコードする。構築物２４１２８も、ｄ９欠失変異を有するｔｒａｃｒＲＮＡをコードする。更に、構築物２４１２８のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端（配列番号３０を参照）及びｔｒａｃｒ  ＲＮＡの５’末端（配列番号３１を参照）において、二重鎖の１０ヌクレオチドにおけるＧＣ含量を増加させるために変異されている。
【０１９２】
構築物２４１４１は、上記及び図１に記載されるｄ９  ５’末端欠失変異を有するｔｒａｃｒＲＮＡを含む。更に、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を３０ヌクレオチド伸長させるために、ｃｒＲＮＡの３’末端（配列番号３２を参照）及びｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端（配列番号３３を参照）に、３０ヌクレオチド長のパリンドローム構造が導入されている。構築物２４１２９は、２４１４１についての変異を含むが、４ヌクレオチド長のモチーフ（ｃｒＲＮＡについては配列番号３４、及びｔｒａｃｒＲＮＡについては配列番号３５を参照）がパリンドローム構造内に挿入されて、パリンドローム内のｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖構造中にループを作製する。
【０１９３】
構築物２４１２７と同様に、構築物２４１５４は、ｄ１１変異を含むｃｒＲＮＡ分子、及びｄ９  ５’末端欠失変異とｄ１１変異の両方を含むｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする。構築物２４１５４は、更に、小麦矮小ウイルスＤＮＡレプリコンを含み、その結果、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、ＷＤＶ  ＤＮＡレプリコン（配列番号３６）から発現される。構築物２４１５４はまた、ＲｅｐＡのための発現カセット、ＷＤＶレプリカーゼを含む。ＷＤＶレプリカーゼによるｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードする更なるＤＮＡ分子の産生は、細胞内のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子を増加させ得、それによって変異誘発効率を増加させる（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ  １０：１００７−１０１０；Ｂａｌｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２６：１５１−１６３）。
【０１９４】
変異誘発のための第４の領域は、標的細胞内に存在するデュアルガイドＲＮＡ分子のレベルを増加させることに焦点を当てた。ＲＮＡポリメラーゼＩＩは、ｍＲＮＡの転写に関わることが知られており、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩは、ｔＲＮＡ及び他の小ＲＮＡ分子を含む非コードＲＮＡの転写に関わることが知られている。異なるＲＮＡポリメラーゼによる転写がデュアルガイドＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムにおけるゲノム編集効率を上昇させる可能性があるか否かを決定するため、ＲＮＡ  ＰｏｌＩＩＩプロモーターではなくＲＮＡ  ＰｏｌＩＩプロモーターを用いた。これらの構築物はまた、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの各々を２コピーずつ有して、細胞内に存在するｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子の数も増やしている。
【０１９５】
構築物２４１４０は、ｐｒＯｓＵ３プロモーターを含む発現カセットを含み、ｐｒＯｓＵ３プロモーターは、その３’末端がｔＲＮＡに作動可能に連結され、ｔＲＮＡは、その３’末端がｔｒａｃｒＲＮＡに作動可能に連結され、ｔｒａｃｒＲＮＡは、その３’末端がｔＲＮＡに作動可能に連結され、ｔＲＮＡは、その３’末端がｃｒＲＮＡに作動可能に連結され、ｃｒＲＮＡは、その３’末端がｔｒａｃｒＲＮＡの第２のコピーに作動可能に連結され、第２のコピーは、その３’末端がｔＲＮＡに作動可能に連結され、ｔＲＮＡは、その３’末端がｃｒＲＮＡの第２のコピーに作動可能に連結され、第２のコピーは、その３’末端がポリＴに作動可能に連結されていた（配列番号３７）。構築物２４１５５は、ｐｒＯｓＵ３プロモーターを含む発現カセットを含み、ｐｒＯｓＵ３プロモーターは、その３’末端がｔＲＮＡと作動可能に連結され、ｔＲＮＡは、その３’末端がｄ９  ｔｒａｃｒＲＮＡと作動可能に連結され、ｄ９  ｔｒａｃｒＲＮＡは、その３’末端がｔＲＮＡと作動可能に連結され、ｔＲＮＡは、その３’末端がｄ９  ｃｒＲＮＡと作動可能に連結され、ｄ９  ｃｒＲＮＡは、その３’末端がｄ９  ｔｒａｃｒＲＮＡの第２のコピーと作動可能に連結され、第２コピーは、その３’末端がｔＲＮＡと作動可能に連結され、ｔＲＮＡは、ｄ９  ｃｒＲＮＡの第２のコピーと作動可能に連結され、第２のコピーはその３’末端がポリＴに作動可能に連結されていた（配列番号３８）。構築物２４１５５は、構築物２４１５５が「ｄ９」変異を有するデュアルガイドＲＮＡ分子を含むのに対し、構築物２４１４０は、野性型デュアルガイドＲＮＡ分子を含むため、構築物２４１４０とは異なる。
【０１９６】
構築物２４１６４は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモーターであるｐｒＳｏＵｂｉ４プロモーターを含む発現カセットを含み、ｐｒＳｏＵｂｉ４プロモーターは、その３’末端がｔＲＮＡに作動可能に連結され、ｔＲＮＡは、その３’末端がｄ９  ｔｒａｃｒＲＮＡに作動可能に連結され、ｄ９  ｔｒａｃｒＲＮＡは、その３’末端がｔＲＮＡに作動可能に連結され、ｔＲＮＡは、その３’末端がｄ９  ｃｒＲＮＡに作動可能に連結され、ｄ９  ｃｒＲＮＡは、その３’末端がｄ９  ｔｒａｃｒＲＮＡの第２のコピーと作動可能に連結され、第２のコピーは、その３’末端がｔＲＮＡに作動可能に連結され、ｔＲＮＡは、その３’末端がｄ９  ｃｒＲＮＡの第２のコピーに作動可能に連結され、第２のコピーは、その３’末端がポリＴに作動可能に連結されていた（配列番号４０）。
【０１９７】
構築物２４１６５は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子の発現のための２つの発現カセットを含み、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、ｄ９変異を含むように変異される。第１の発現カセットは、その３’末端がｔＲＮＡに作動可能に連結されたｐｒＯｓＵ３プロモーターを含み、ｔＲＮＡは、その３’末端がｄ９  ｔｒａｃｒＲＮＡに作動可能に連結され、ｄ９  ｔｒａｃｒＲＮＡは、その３’末端がｔＲＮＡに作動可能に連結され、ｔＲＮＡは、その３’末端がｄ９  ｃｒＲＮＡに作動可能に連結され、ｄ９  ｃｒＲＮＡは、その３’末端がｄ９  ｔｒａｃｒＲＮＡの第２のコピーに作動可能に連結され、第２のコピーは、その３’末端がｔＲＮＡに作動可能に連結され、ｔＲＮＡは、その３’末端がｄ９  ｃｒＲＮＡの第２のコピーに作動可能に連結され、第２のコピーは、その３’末端がポリＴに作動可能に連結されていた（配列番号４１）。第２の発現カセットは、ｐｒＳｏＵｂｉ４プロモーターを含み、ｐｒＳｏＵｂｉ４プロモーターは、その３’末端がｔＲＮＡに作動可能に連結され、ｔＲＮＡは、その３’末端がｄ９  ｔｒａｃｒＲＮＡに作動可能に連結され、ｄ９  ｔｒａｃｒＲＮＡは、その３’末端がｔＲＮＡに作動可能に連結され、ｔＲＮＡは、その３’末端がｄ９  ｃｒＲＮＡに作動可能に連結され、ｄ９  ｃｒＲＮＡは、その３’末端がｄ９  ｔｒａｃｒＲＮＡの第２のコピーに作動可能に連結され、第２のコピーは、その３’末端がｔＲＮＡに作動可能に連結され、ｔＲＮＡは、その３’末端がｄ９  ｃｒＲＮＡの第２のコピーに作動可能に連結され、第２のコピーは、その３’末端がポリＴに作動可能に連結されていた（配列番号４２）。
【０１９８】
構築物２４１６９も、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子の発現のための２つの発現カセットを含んでいたが、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、ｄ９及びｄ１１変異の両方を含むように変異されている。第１の発現カセットは、ｐｒＯｓＵ３プロモーターを含み、ｐｒＯｓＵ３プロモーターは、その３’末端がｔＲＮＡに作動可能に連結され、ｔＲＮＡは、その３’末端がｄ９＋ｄ１１  ｔｒａｃｒＲＮＡに作動可能に連結され、ｄ９＋ｄ１１  ｔｒａｃｒＲＮＡは、その３’末端がｔＲＮＡに作動可能に連結され、ｔＲＮＡは、その３’末端がｄ９＋ｄ１１  ｃｒＲＮＡに作動可能に連結され、ｄ９＋ｄ１１  ｃｒＲＮＡは、その３’末端がｄ９＋ｄ１１  ｔｒａｃｒＲＮＡの第２のコピーに作動可能に連結され、第２のコピーは、その３’末端がｔＲＮＡに作動可能に連結され、ｔＲＮＡは、その３’末端がｄ９＋ｄ１１  ｃｒＲＮＡの第２のコピーに作動可能に連結され、第２のコピーは、その３’末端がポリＴに作動可能に連結されていた（配列番号４３）。第２の発現カセットは、ｐｒＳｏＵｂｉ４プロモーターを含み、ｐｒＳｏＵｂｉ４プロモーターは、その３’末端がｔＲＮＡに作動可能に連結され、ｔＲＮＡは、その３’末端がｄ９＋ｄ１１  ｔｒａｃｒＲＮＡに作動可能に連結され、ｄ９＋ｄ１１  ｔｒａｃｒＲＮＡは、その３’末端がｔＲＮＡに作動可能に連結され、ｔＲＮＡは、その３’末端がｄ９＋ｄ１１  ｃｒＲＮＡに作動可能に連結され、ｄ９＋ｄ１１  ｃｒＲＮＡは、その３’末端がｄ９＋ｄ１１  ｔｒａｃｒＲＮＡの第２のコピーに作動可能に連結され、第２のコピーは、その３’末端がｔＲＮＡに作動可能に連結され、ｔＲＮＡは、その３’末端がｄ９＋ｄ１１  ｃｒＲＮＡの第２のコピーに作動可能に連結され、第２のコピーは、その３’末端がポリＴに作動可能に連結されていた（配列番号４４）。
【０１９９】
上述した構築物は、表１において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖とも称されるｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖の変異誘発効率を改善することが経験的に示された変異及び構造を組み込むことに留意することが重要である。これらの構築物のいずれの成功も予測できなかった。最適な配列／構築物は、経験的にのみ決定することができた。
【０２００】
実施例４：イネの標的化変異誘発
実施例３に記載された構築物を試験するために、ｃｒＲＮＡ構築物は、実施例２に記載のＤＥＰ１を標的とする。この実施例に記載されるバイナリ構築物は、実施例２のものと同様であり、ＰＭＩ遺伝子及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子を含む。イネ品種ＩＲ５８０２５Ｂの形質転換及び形質転換体のＴａｑＭａｎ分析を、実施例２に記載のように行った。
【０２０１】
表２は、本発明のＤＮＡ標的化ＲＮＡ二重鎖による標的化変異誘発を示す。構築物２４１２７、２４１２８、２４１４１、及び２４１２９について、配列番号は、変異ｃｒＲＮＡ（プロトスペーサーを含まない）及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列である。構築物２４１５４について、配列番号３６は、ｃｒＲＮＡのｄ１１変異体及びｔｒａｃｒＲＮＡのｄ９＋ｄ１１変異体を含む、ＷＤＶ  ＤＮＡレプリコンのＤＮＡ配列である。構築物２４１４０、２４１５５、２４１６４、２４１６５、及び２４１６９について、配列番号は、プロモーターを含む発現カセットのＤＮＡ配列である。「外植片の数」は、最初に形質転換されたイネ外植片の数であり、「形質転換体の数」は、形質転換に成功した外植片の数である。変異率は、上述したＴａｑＭａｎアッセイによって決定された、ＤＥＰ１に標的化変異を含有した形質転換体の百分率である。「変異体のコピー数」は、ＤＥＰ１遺伝子の変異に成功した形質転換体における導入遺伝子挿入の数を示す。「低コピー」は、１つの挿入を示唆する。「２コピー」は、２つの挿入を示唆し、「高コピー」は、３つ以上の挿入を示唆する。
【０２０２】
【表２】
2021522829.tif 000004
【０２０３】
表２に示すように、これらの構築物の多くの変異率は非常に高い。変異ｄ９及びｄ１１（２４１２７及び２４１６９）の両方を含むｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ分子を産生する構築物は、非常によく機能する。興味深いことに、構築物２４１６９を使用して得られた変異率は、構築物２４１６５を使用して得られたものの１５０％を超えるが、それらは、構築物２４１６９６における変異ｄ９及びｄ１１の両方の存在によってのみ異なる（構築物２４１６５は、ｄ９変異のみを含む）。ｄ１１変異は、各々ｃｒＲＮＡと対応するｔｒａｃｒＲＮＡのタンパク質結合ＲＮＡ二重鎖領域においてＵＵ／ＡＡをＧＧ／ＣＣに変える。２つの塩基対合により強い結合を導入するが、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の塩基対合の総数を変化させないこのような変異は、デュアルガイドＲＮＡ変異効率を有意に増加させることができることは、驚くべきことであり、予想外である。
【０２０４】
プロトスペーサー配列は、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖形成（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ若しくはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる転写、又はｔＲＮＡプロセシングにとって重要ではないので、本明細書に記載される例は、任意のゲノム標的／プロトスペーサー配列に拡張され得ることが、当業者により認識されるであろう。
【０２０５】
前述の発明は、理解を明確にする目的で、例示及び実施例によっていくらか詳細に記載されているが、本発明の範囲で特定の変更及び修正が実施され得ることは、明らかである。
【図１】
2021522829.tif 000005
【配列表】
2021522829000001.app
【国際調査報告】
2021522829.tif 000006
2021522829.tif 000007
2021522829.tif 000008
2021522829.tif 000009