(57)【要約】  養子細胞療法は、様々な疾患を治療するために自己細胞または同種異系細胞を患者に移植することに関わる。免疫療法の分野において、腫瘍特異的Ｔ細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖され得るか、または再注入前に遺伝子工学的手法によって腫瘍特異性を持たせて移植され得る。Ｔ細胞注入は、持続性および移植を増強するためのプレコンディショニング治療が必要であり、また多くの場合、ＩＬ−２の注入後治療が必要である。ここでは、本発明者らは、臨床的に利用可能な薬物であるエルトロンボパグを投与する際に、Ｔ細胞の選択的生存および／または増殖を可能にするキメラ組換え増殖因子受容体（ＣｒＧＦＲ）を発現するようにＴ細胞を操作することができることを明らかにしている。
2021527425.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）細胞外（ＥＣ）ドメイン；
（ｉｉ）トロンボポエチン膜貫通（ＴＭ）ドメイン；および
（ｉｉｉ）第１の細胞内（ＩＣ）ドメイン；および任意に、
（ｉｖ）第２の細胞内ドメイン
を含むキメラ組換え増殖因子受容体（ＣｒＧＦＲ）を含むＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項２】
リガンドのＣｒＧＦＲへの結合がＴ細胞またはＮＫ細胞の増殖を誘導する、請求項１に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項３】
リガンドがヒトトロンボポエチン、トロンボポエチン受容体アゴニスト、または腫瘍関連抗原である、請求項２に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項４】
トロンボポエチン受容体アゴニストがＴＭドメインに結合する、請求項３に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項５】
トロンボポエチン受容体アゴニストがエルトロンボパグおよびロミプロスチムから選択される、請求項３または請求項４に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項６】
ＥＣドメインがヒトｃ−ｍｐｌ（トロンボポエチン）ＥＣドメインを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項７】
ＥＣドメインが、ｉ）切断型ＥＣドメイン、ｉｉ）切断型ｃ−ｍｐｌ  ＥＣドメイン、ｉｉｉ）腫瘍関連抗原に結合するドメイン、ｉｖ）腫瘍関連抗原に結合する抗体もしくは抗体フラグメント；およびｖ）選択マーカーのうちの１つまたは複数を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項８】
第１のＩＣドメインがヒト成長ホルモン受容体、ヒトプロラクチン受容体、ヒトトロンボポエチン受容体（ｃ−ｍｐｌ）、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、ＬＭＰ、ＩＬ２、ＣＤ２８またはＣＤ１３７から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項９】
第１のＩＣドメインがヒトトロンボポエチン受容体（ｃ−ｍｐｌ）由来のＩＣドメイン、またはヒトトロンボポエチン受容体（ｃ−ｍｐｌ）由来の切断型ＩＣドメインを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項１０】
第２のＩＣドメインが、ヒト成長ホルモン受容体、ヒトプロラクチン受容体、ヒトトロンボポエチン受容体（ｃ−ｍｐｌ）、Ｇ−ＣＳＦ受容体もしくはＧＭ−ＣＳＦ受容体、共刺激受容体、サイトカイン受容体または共シグナル伝達受容体由来である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項１１】
第２のＩＣドメインがヒトトロンボポエチン受容体（ｃ−ｍｐｌ）、またはヒトトロンボポエチン受容体（ｃ−ｍｐｌ）由来の切断型ＩＣドメイン、好ましくはＴｐｏＲΔ６０、ＣＤ４０、ＩＬ２ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＴＡＭ１またはＬＭＰ１から選択される、請求項８または請求項９に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項１２】
ＣｒＧＦＲが配列番号１に示すＴＭ配列、またはヒトトロンボポエチンまたはトロンボポエチン受容体アゴニストに結合する少なくとも８０％の配列同一性を有するそれらのバリアントを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項１３】
配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４として示した配列、またはヒトトロンボポエチンもしくはトロンボポエチン受容体アゴニストに結合する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％もしくは９９％の配列同一性を有するそれらのバリアントを含むキメラ組換え増殖因子受容体（ＣｒＧＦＲ）を含むＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項１４】
トロンボポエチンまたはヒトトロンボポエチン受容体アゴニストによる結合が細胞増殖および／または生存を誘導する、請求項１３に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項１５】
エルトロンボパグに結合する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項１６】
Ｔ細胞が腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）または一次Ｔ細胞から選択される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項１７】
組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に定義されているキメラ組換え増殖因子受容体（ＣｒＧＦＲ）。
【請求項１９】
請求項１８に記載のキメラ組換え増殖因子受容体（ＣｒＧＦＲ）を含む細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に定義されているＣｒＧＦＲをコードする核酸配列。
【請求項２１】
配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８として示した配列を含む、請求項２０に記載の核酸配列。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項２３】
請求項２０もしくは２１に記載の核酸、または請求項２２に記載のベクターをＴ細胞またはＮＫ細胞に導入するステップを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞を作製する方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載のベクター、または請求項１〜１７に記載のＴ細胞もしくはＮＫ細胞を、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と共に含む医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１〜１７の細胞、または請求項２４に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、ｉｎ−ｖｉｖｏで細胞増殖させる方法。
【請求項２６】
トロンボポエチン、またはトロンボポエチン受容体アゴニスト、例えばエルトロンボパグもしくはロミプロスチムを対象に投与することを含む、請求項２５に記載のｉｎ−ｖｉｖｏで細胞を増殖させる方法。
【請求項２７】
養子細胞療法において使用するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＴ細胞もしくはＮＫ細胞、または請求項２２に記載のベクター。
【請求項２８】
がんを治療する方法において使用するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＴ細胞もしくはＮＫ細胞、または請求項２２に記載のベクター。
【請求項２９】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞を対象に投与するステップを含む、がんを治療する方法。
【請求項３０】
がんを治療するための医薬の製造における、請求項２２に記載のベクター、または請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＴ細胞もしくはＮＫ細胞の使用。
【請求項３１】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞のｉｎ−ｖｉｔｒｏ増殖またはｉｎ−ｖｉｖｏ増殖において使用するためのエルトロンボパグ。
【請求項３２】
がんの治療においてトロンボポエチンまたはトロンボポエチン受容体アゴニストと組み合わせて使用するための、請求項１〜１７に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
がん退縮の媒介に自己Ｔ細胞を使用する養子細胞療法（ＡＣＴ）は、初期の臨床試験において非常に有望であることが明らかになっている。いくつかの一般的なアプローチ、例えば、天然に存在する腫瘍反応性の、またはｅｘ  ｖｉｖｏで増殖された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の使用などが取られてきた。さらに、Ｔ細胞は、所定の腫瘍抗原に向けてそれらを再標的化するために遺伝的に改変され得る。これは、ペプチド（ｐ）−主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の遺伝子導入、または腫瘍特異的単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）とＴ細胞シグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ζ）の間の合成融合によって実施することができるが、後者はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼ばれている。ＴＩＬおよびＴＣＲの導入は、メラノーマを標的とする場合に特に良好であることが分かっており（Rosenberg et al. 2011；Morgan 2006）、一方、ＣＡＲ療法は特定のＢ細胞悪性腫瘍の治療において非常に有望であることが明らかになっている（Grupp et al. 2013）。
【０００２】
ＡＣＴに関する現在の一般的な治療プロトコルは、ｅｘ  ｖｉｖｏ増殖細胞を再注入する前に患者の循環リンパ球の大部分を除去する、シクロホスファミドおよび／またはフルダラビンを使用した初期非骨髄破壊的プレコンディショニング治療を行うことが必要である。これによって新しい細胞が増殖するための余地を得ることができ、正常細胞が新たに注入された細胞と増殖および生存シグナルを競合する「サイトカインシンク（ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｉｎｋ）」が一掃される。細胞と一緒に、患者は、新しい細胞の移植および増殖を促進する高用量のインターロイキン（ＩＬ）−２の注入を介してサイトカインサポートを受ける。
現在、Ｔ細胞ＡＣＴの技術を制限している要因が多数存在する。上記の現在のプレコンディショニング療法には入院が必要であり、患者を免疫無防備状態のままにする可能性がある。さらに、多くの患者は、この治療レジメンの過酷さに耐えることができるほど十分な健康な状態ではない。プレコンディショニングを経てもさらに、支持療法としてのＩＬ−２の使用が、重度の毒性および集中治療処置の可能性と関わっている。実際、ＴＩＬ療法それ自体は、ＴＣＲおよびＣＡＲ療法と異なり、いかなる重大なオンまたはオフターゲット毒性とは関係しておらず、大部分の毒性事象は付随するＩＬ−２注入に関係している。
プレコンディショニングとＩＬ−２支持療法を最小限にするか、低減することができる方法には、次のような点で大きな利点がある：（ｉ）患者の入院を短縮する、（ｉｉ）ＡＣＴによって治療することができる可能性のある患者の割合を増やす、（ｉｉｉ）大がかりな入院に伴う臨床コストを削減することにより、多くの患者に対してＡＣＴの可能性をより開く。
したがって、プレコンディショニング治療および／またはＩＬ−２支持療法の必要性を最小限にする新しいＡＣＴ療法が求められている。
【０００３】
本発明は、臨床的に検証された薬物であり得るＣｒＧＦＲのリガンドを投与することによってオンまたはオフにすることができる組換えキメラ増殖因子受容体を発現する細胞を使用する。これにより、他の細胞に対する毒性は最小限にしてｉｎ−ｖｉｖｏで標的細胞を増殖させることが可能となる。
多くの報告書は、細胞のある特定の集団を増殖させる手段として、または抗体操作方策のための選択方法の開発のために増殖因子受容体操作のアイデアを使用している。例えば、多数の報告では、抗体−ＴｐｏＲまたはＥｐｏＲ融合が多くのバイオテクノロジー方策、例えば単鎖抗体選択などに使用され得ることが証明されており（Ueda et al. 2000、Kawahara et. Al. 2004）、また多くの報告では、増殖因子受容体融合が巨核球細胞株Ｂａ／Ｆ３および／または造血幹細胞を良好に増殖させることができることを証明している（Jin et al. 2000；Richard et al. 2000；Nagashima et al. 2003；Kawahara et al 2011；Saka et al. 2013）。
【０００４】
トロンボポエチン（Ｔｐｏ）受容体（ＴｐｏＲ；ＣＤ１１０、ｃ−ｍｐｌ）は、通常、巨核球系統の細胞において発現される。その通常の状態において、ＴｐｏＲはトロンボポエチンに応答してスイッチがオンになり、血小板の巨核球産生を引き起こす。ＴｐｏＲの血小板発現をシンクとして使用してＴｐｏの循環レベルを低下させることができる活性のネガティブフィードバックループ（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｌｏｏｐ）もある。重要なことには、ＴｐｏＲは、他のいずれの正常組織またはがん細胞でも発現されない（Columbyova 1995）。
【０００５】
最近の報告で、Ｔ細胞を野生型ＴｐｏＲで操作し、Ｔｐｏまたはエルトロンボパグ（Ｅｌｔｒｏｍｂｏｐａｇ）の投与を介してＴ細胞の生存および増殖を制御することができることが証明された（Nishimura et al. 2018）。しかし、トロンボポエチン融合受容体などのキメラ増殖因子受容体を発現するように操作されているＴ細胞および他のリンパ球の報告はなく、またＡＣＴにおけるこれらの細胞の使用の報告はない。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】増殖因子ドメインを含むキメラ組換え増殖因子受容体の概略図である。これらの受容体は、ＴｐｏＲ細胞外ドメインと原形質膜にまたがる膜貫通ドメインからなる。細胞内ドメインは、受容体の全体的な活性を増大し、図の凡例で詳述されているように増殖因子ドメイン、共シグナル伝達ドメイン、または共刺激ドメインの選択に由来し得る１つまたは複数の追加ドメインに融合されたＴｐｏＲ細胞質ドメインからなる。Δ６０＝６０アミノ酸のＣ末端が欠失したＴｐｏＲ、ＩＬ２ｒβｃｙｔ＝ＩＬ２受容体ベータ鎖の細胞質ドメイン、ＳＬＡＭ＝ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０、ＴＩＡＦ１＝ＴＧＦβ１誘導性抗アポトーシス因子１、ＴＬＲ１＝Ｔｏｌｌ様受容体１、ＣＤ４０＝ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＩＬ２ｒγ＝ＩＬ−２受容体共通ガンマ鎖、ＩＴＡＭ１＝ＣＤ３ζ由来の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ、ＬＭＰ１＝エプスタインバーウイルス潜在膜タンパク質１。
【図２】共刺激ドメインを含むキメラ組換え増殖因子受容体の概略図である。これらの受容体は、ＴｐｏＲ細胞外ドメインと原形質膜にまたがる膜貫通ドメインからなる。細胞内ドメインは、定義した共刺激受容体、例えば、限定するものではないがＣＤ２８またはＣＤ１３７などから得られる共刺激ドメインからなる。
【図３】レンチウイルス導入遺伝子の遺伝子構成の概略図である。ＴｐｏＲ導入遺伝子はコドン最適化され、ｐＳＦ．ＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターのＸｂａＩおよびＮｈｅＩ制限消化対によってＥＦ１αプロモーターの下流にクローニングされた。
【図４】ＪｕｒｋａｔＥ６．１細胞における非形質導入の野生型（ＷＴ）およびバリアントのキメラ組換え増殖因子受容体のフロー分析を示す図である。Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１  Ｔ細胞に、示した導入遺伝子を有するレンチウイルス粒子を形質導入した。発現は、抗ＣＤ１１０−ＰＥ抗体を使用して感染の７２時間後に評価した。
【図５】Ｂａ／Ｆ３細胞におけるキメラ組換え増殖因子受容体活性の分析を示す図である。サイトカイン依存性マウスＢ細胞株Ｂａ／Ｆ３に示したＣｒＧＦＲを形質導入し、ＩＬ−３またはエルトロンボパグのいずれかと１０日間インキュベートした。ＣｒＧＦＲの発現は、ＣＤ１１０抗体を使用し、示した時点でフローサイトメトリーにより評価した。
【図６】ドナー１由来の一次ヒトＴ細胞に対するエルトロンボパグおよびＩＬ−２の分析を示す図である。ドナー１由来の一次ヒトＴ細胞にＷＴ  ＴｐｏＲまたはバリアントＣｒＧＦＲを形質導入し、ＩＬ２またはエルトロンボパグの存在下でインキュベートした。細胞を２１日までの時点で取り出し、受容体を発現する細胞の割合を、ＰＥ結合型抗ＣＤ１１０抗体およびＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザーを使用して評価した。
【図７】ドナー２由来の一次ヒトＴ細胞に対するエルトロンボパグおよびＩＬ−２の分析を示す図である。ドナー２由来の一次ヒトＴ細胞にＷＴ  ＴｐｏＲまたはバリアントＣｒＧＦＲを形質導入し、ＩＬ２またはエルトロンボパグの存在下でインキュベートした。細胞を２１日までの時点で取り出し、受容体を発現する細胞の割合を、ＰＥ結合型抗ＣＤ１１０抗体およびＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザーを使用して評価した。
【図８】ドナー３由来の一次ヒトＴ細胞に対するエルトロンボパグおよびＩＬ−２の分析を示す図である。ドナー３由来の一次ヒトＴ細胞にＷＴ  ＴｐｏＲまたはバリアントＣｒＧＦＲを形質導入し、ＩＬ２またはエルトロンボパグの存在下でインキュベートした。細胞を２１日までの時点で取り出し、受容体を発現する細胞の割合を、ＰＥ結合型抗ＣＤ１１０抗体およびＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザーを使用して評価した。
【図９】次の分析ラウンドに最適なＣｒＧＦＲの選択を示す図である。エルトロンボパグで２１日間インキュベーションした後の３名のドナーの一次ヒトＴ細胞におけるＣｒＧＦＲの発現を示すフローサイトメトリープロット。受容体のＴｐｏＲ．ＣＤ４０、ＴｐｏＲ．ＩＬ２ｒγ、ＴｐｏＲ．ＩＴＡＭ１、ＴｐｏＲ．Δ６０、ＴｐｏＲ．ＬＭＰ１−ｃｙｔｏおよびＴｐｏＲ．ＴｐｏＲ−ｃｙｔｏ．ＬＭＰ１−ｃｙｔｏを、今後のｗｔ  ＴｐｏＲとの比較のために選択した。
【図１０】ドナー４由来のＣｒＧＦＲ選別一次ヒトＴ細胞に対するエルトロンボパグおよびＩＬ−２の分析を示す図である。ドナー４由来の一次ヒトＴ細胞にＷＴ  ＴｐｏＲまたはバリアントＣｒＧＦＲを形質導入し、ＩＬ２またはエルトロンボパグについて選択され、ＩＬ２またはエルトロンボパグの存在下でインキュベートされるＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳ技術により発現を濃縮した。細胞を７日までの時点で取り出し、受容体を発現する細胞の数を、ＰＥ結合型抗ＣＤ１１０抗体、ＤＲＡＱ７生存率用色素、およびＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザーを使用して評価した。
【図１１】ドナー５由来のＣｒＧＦＲ選別一次ヒトＴ細胞に対するエルトロンボパグおよびＩＬ−２の分析を示す図である。ドナー５由来の一次ヒトＴ細胞にＷＴ  ＴｐｏＲまたはバリアントＣｒＧＦＲを形質導入し、ＩＬ２またはエルトロンボパグについて選択され、ＩＬ２またはエルトロンボパグの存在下でインキュベートされるＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳ技術により発現を濃縮した。細胞を７日までの時点で取り出し、受容体を発現する細胞の数を、ＰＥ結合型抗ＣＤ１１０抗体、ＤＲＡＱ７生存率用色素、およびＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザーを使用して評価した。
【図１２】ドナー６由来のＣｒＧＦＲ選別一次ヒトＴ細胞におけるエルトロンボパグおよびＩＬ−２の分析を示す図である。ドナー６由来の一次ヒトＴ細胞にＷＴ  ＴｐｏＲまたはバリアントＣｒＧＦＲを形質導入し、ＩＬ２またはエルトロンボパグについて選択され、ＩＬ２またはエルトロンボパグの存在下でインキュベートされるＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳ技術により発現を濃縮した。細胞を７日までの時点で取り出し、受容体を発現する細胞の数を、ＰＥ結合型抗ＣＤ１１０抗体、ＤＲＡＱ７生存率用色素、およびＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザーを使用して評価した。
【図１３】ＴＩＬ０４２のキメラ組換え増殖因子受容体の分析を示す図である。ＴＩＬ０４２由来の腫瘍浸潤リンパ球にＷＴ  ＴｐｏＲまたは示したバリアントＣｒＧＦＲを形質導入し、患者に適合した腫瘍株の存在下で、ＩＬ２、エルトロンボパグ、ＩＬ−２＋エルトロンボパグを添加して、または増殖因子を添加しないでインキュベートした。細胞を４日目および７日目に分析およびカウントし、受容体を発現する細胞の数を、ＰＥ結合型抗ＣＤ１１０抗体、ＤＲＡＱ７生存率用色素、およびＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザーを使用して評価した。グラフは、ＴＩＬの回復が、腫瘍調節因子および／または活性化誘導細胞死によって引き起こされる数の最初の減少後に起こる場合の４日目〜７日目のカウントを示す。
【図１４】卵巣ＴＩＬにおけるキメラ組換え増殖因子受容体の分析を示す図である。３つの卵巣ＴＩＬ由来の腫瘍浸潤リンパ球にＷＴ  ＴｐｏＲまたは示したバリアントＣｒＧＦＲを形質導入し、患者に適合した腫瘍細胞の存在下で、エルトロンボパグと共に、または増殖因子なしでインキュベートした。細胞を４日目および７日目に分析およびカウントし、受容体を発現する細胞の数を、ＰＥ結合型抗ＣＤ１１０抗体、ＤＲＡＱ７生存率用色素、およびＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザーを使用して評価した。グラフは、ＴＩＬの回復が、腫瘍調節因子および／または活性化誘導細胞死によって引き起こされる数の最初の減少後に起こる場合の４日目〜７日目のカウントを示す。
【図１５】キメラ組換え増殖因子受容体によるｐＳＴＡＴの誘導を示す図である。一次ヒトＴ細胞を単離し、示したＣｒＧＦＲを形質導入した。細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳ技術を使用してＣｒＧＦＲ発現について濃縮し、ポリクローナル刺激によって増殖させた。濃縮した細胞を、培地単独（ＲＰＭＩ）、ＩＬ２、ＩＬ１２、Ｔｐｏ、またはエルトロンボパグ（Ｅｌｔ）のいずれかで４時間刺激し、その後、メタノール固定およびホスホ−ＳＴＡＴ５に向けての抗体による細胞内染色を行った。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、増殖スイッチとして機能し得るＣｒＧＦＲを含むＴ細胞およびＮＫ細胞を含むリンパ球を操作により作製することができることを明らかにした。これによって、ＣｒＧＦＲリガンドを患者に投与することによりリンパ球をｉｎ−ｖｉｖｏで増殖させることができるようになる。本発明者らは、例えば、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）受容体（ＴｐｏＲ；ＣＤ１１０、ｃ−ｍｐｌ）をベースとしたＣｒＧＦＲが、受容体へのＣｒＧＦＲリガンドの結合後に、操作されたリンパ球の増殖を誘導することを明らかにした。したがって、リガンドは、ＣｒＧＦＲを発現する細胞の増殖または活性化誘導性細胞死からの保護をもたらすが、患者における他の細胞における受容体の欠如または低発現に起因して、毒性は低いと予想される。ＴｐｏＲまたは他の関連する増殖因子受容体をベースとしたＣｒＧＦＲは、養子細胞療法において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでリンパ球増殖を増大させる有益なツールとなり得る。
【０００８】
したがって、第１の態様では、本発明は、
（ｉ）細胞外（ＥＣ）ドメイン；
（ｉｉ）トロンボポエチン膜貫通（ＴＭ）ドメイン；および
（ｉｉｉ）第１の細胞内（ＩＣ）ドメイン、および任意に、
（ｉｖ）第２の細胞内ドメイン
を含むキメラ組換え増殖因子受容体（ＣｒＧＦＲ）を含むＴ細胞またはＮＫ細胞を含むリンパ球を提供する。
【０００９】
ＣｒＧＦＲは、受容体リガンドがＣｒＧＦＲに結合することにより、受容体の活性化および細胞への増殖シグナル伝達が生じ、増殖および／または生存が誘導されるように設計されている。
リガンドは、ヒトトロンボポエチン、またはトロンボポエチン受容体アゴニスト、例えば、エルトロンボパグ、ルストロンボパグ（Ｌｕｓｏｔｒｏｍｂｏｐａｇ）、アバトロンボパグ（Ａｖａｔｒｏｍｂｏｐａｇ）またはロミプロスチム（Ｒｏｍｉｐｌａｓｔｉｍ）であり得る。
【００１０】
ＥＣドメインは、ヒトｃ−ｍｐｌ  ＥＣドメイン（ヒトＴｐｏに結合する）であり得るか、またはｉ）切断型ＥＣドメイン、ｉｉ）切断型ｃ−ｍｐｌ  ＥＣドメイン、ｉｉｉ）選択マーカー、例えばＣＤ３４のうちの１つもしくは複数であり得る。
ＣｒＧＦＲのＩＣドメインは、ＪＡＫ結合ドメインを含み得る。ＩＣドメインは、２つ以上の増殖因子受容体または他のシグナル伝達ドメインからなり、１つはヒト成長ホルモン受容体、ヒトプロラクチン受容体またはヒトトロンボポエチン受容体（ｃ−ｍｐｌ）のリストからのものであり得、追加の増殖因子または他のシグナル伝達ドメインはサイトカイン受容体シグナル伝達ドメイン（例えばＩＬ２受容体）、共シグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ４０）、ウイルス発がん性タンパク質（例えばＬＭＰ１）、共刺激ドメイン（例えばＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１５０など）または他のマイトジェンドメイン（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ、ＣＤ３シグナル伝達ドメインなど）のリストからのもの（ただし限定するものではない）であり得るとからなる。
【００１１】
リンパ球は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）もしくは一次Ｔ細胞を含むＴ細胞、またはＮＫ細胞、または樹状細胞であり得る。
ＣｒＧＦＲに加えて、リンパ球、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含んでいてもよい。
【００１２】
第２の態様では、本発明は、ＣｒＧＦＲをコードする核酸配列を提供する。
第３の態様では、本発明は、第２の態様に記載の核酸配列を含み、存在する場合、ＴＣＲおよび／またはＣＡＲ核酸配列を含むベクターを提供する。
第４の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に記載のリンパ球、またはＴ細胞もしくはＮＫ細胞を作製する方法であって、ＣｒＧＦＲをコードする核酸、またはベクターをリンパ球に導入するステップを含む方法を提供する。
第５の態様では、本発明は、第３の態様に記載のベクター、または第１の態様に記載のリンパ球（Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞を含む）を、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含む医薬組成物を提供する。
第６の態様では、本発明は、第１の態様のリンパ球、またはＴ細胞もしくはＮＫ細胞、あるいは第５の態様の医薬組成物を対象に投与することを含む、ｉｎ−ｖｉｖｏ細胞増殖の方法を提供する。細胞は、トロンボポエチン、またはトロンボポエチンアゴニスト、例えばエルトロンボパグを対象に投与することによりｉｎ−ｖｉｖｏで増殖され得る。
第７の態様では、本発明は、養子細胞療法において使用するための、第１の態様に記載のＴ細胞もしくはＮＫ細胞を含むリンパ球、または第３の態様に記載のベクターを提供する。
第８の態様では、本発明は、がんを治療する方法において使用するための、第１の態様に記載のＴ細胞もしくはＮＫ細胞を含むリンパ球、または第３の態様に記載のベクターを提供する。
第９の態様では、本発明は、がんを治療するための医薬の製造における第１の態様に記載のリンパ球の使用、または第３の態様に記載のベクターの使用を提供する。
第１０の態様では、本発明は、養子細胞療法において使用するためのエルトロンボパグまたはＴｐｏを提供する。
第１１の態様では、本発明は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を含むリンパ球のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖において使用するためのエルトロンボパグまたはＴｐｏを提供する。
第１２の態様では、本発明は、がんの治療において、トロンボポエチンまたはトロンボポエチン受容体アゴニスト、例えばエルトロンボパグと組み合わせて使用するための第１の態様のリンパ球を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
キメラ組換え増殖因子受容体（ＣｒＧＦＲ）
本明細書では、（ｉ）細胞外（ＥＣ）ドメイン；（ｉｉ）トロンボポエチン膜貫通（ＴＭ）ドメイン；および（ｉｉｉ）キメラ増殖因子受容体細胞内（ＩＣ）ドメイン含む、組換え増殖因子受容体（ＣｒＧＦＲ）を提供する。シンプル形態では、ＣｒＧＦＲは、完全長ヒトＴｐｏ受容体（本明細書の図１に示したもの）またはリガンド結合に応答してシグナル伝達および細胞増殖を維持するその誘導体もしくはバリアント（例えば、これはシグナル伝達能力を維持することが示された切断型トロンボポエチンシグナル伝達ドメインを含んでいてもよい）を含み得る。ＣｒＧＦＲは、異なる受容体に由来するＥＣドメイン、ＴＭドメインおよびＩＣドメインを有するモジュラー形態であってもよい。しかし、ＣｒＧＦＲは、リガンド結合の際に増殖シグナルを細胞に伝達するその能力を維持する必要がある。ＣｒＧＦＲは、ＴＭドメインにリガンドが結合した際に、活性化され、増殖シグナルを細胞に伝達し得る。シグナル伝達ドメインは、１つまたは複数の追加のシグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。
【００１４】
適切なＣｒＧＦＲは、正常なヒト組織で発現が制限されているＧＦＲ、例えば、小さな細胞集団のみで発現されるか、または特定の細胞タイプに制限されるＧＦＲ、例えばｃ−ｋｉｔに基づいて選択することができる。あるいは、増殖因子受容体の天然リガンド結合ドメインは、除去され、例えば、マーカーまたは他のＥＣドメインで置き換えられ得る。
ＣｒＧＦＲは、増殖因子結合機能を有さないＥＣドメイン（例えば、ＴｐｏＲ  ＥＣドメインの切断型）および／またはマーカー（例えばＣＤ３４）、ならびにＴｐｏＲ由来のＴＭドメインおよびＩＣドメインを含むことができる。このタイプの受容体を有する細胞の増殖は、その後、ＴＭドメインへのエルトロンボパグの結合によって刺激され得る。
ＣｒＧＦＲは、治療活性を有する細胞の治療性集団、例えば腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）においてプロモーターの制御下で単独で発現され得る。
【００１５】
あるいは、ＣｒＧＦＲは、例えば図１４で説明されているように、治療用導入遺伝子、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と共に発現され得る。適切なＴＣＲおよびＣＡＲは、文献、例えば、ＨＬＡ−Ａ*０２−ＮＹＥＳＯ−１特異的ＴＣＲ（Rapoport et al. Nat Med 2015）または抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ．ＣＤ３ζ融合体ＣＡＲ（Kochenderfer et al. J Clin Oncol 2015）で周知であり、それぞれ、骨髄腫またはＢ細胞悪性腫瘍を治療するために良好に使用されている。本明細書に記載されているＣｒＧＦＲは、任意の公知のＣＡＲまたはＴＣＲと共に発現させることができ、したがって、ｉｎ−ｖｉｔｒｏまたはｉｎ−ｖｉｖｏでの細胞の増殖／生存を可能にする制御可能な増殖スイッチ、および抗がん活性に関するＴＣＲまたはＣＡＲの形態での従来の活性化メカニズムを有する細胞を提供する。したがって、本発明は、本明細書に記載されているＣｒＧＦＲと、腫瘍関連抗原に特異的に結合するＴＣＲおよび／またはＣＡＲとを含む、養子細胞療法において使用するための細胞を提供する。
【００１６】
ＣｒＧＦＲは、ヒトＴｐｏ受容体のＴＭドメインおよび第１のＩＣドメインと、野生型または切断型のＴｐｏ受容体ＥＣドメイン（天然のリガンド結合機能なし）とを有し得る。
ＣｒＧＦＲの特定の実施形態は、図１および図２に示すものを含む。
いくつかの実施形態では、増殖因子受容体（ＣｒＧＦＲ）は、ＴｐｏＲ受容体をベースとし、少なくともＴＭ領域およびＩＣ領域（ＴｐｏＲ  ＴＭドメインおよび５１４〜６３５およびＴｐｏＲ細胞質ドメインを示す配列番号１を参照）が保持されており、また追加の（第２の）ＩＣドメインがＴｐｏまたはＴｐｏアゴニスト結合に応答してシグナル伝達を増強するように構築物に付加されているように構築されている。したがって、いくつかの実施形態では、ＣｒＧＦＲは、（ｉ）ＴｐｏＲ細胞外（ＥＣ）ドメイン、または切断型ＴｐｏＲ  ＥＣドメイン；（ｉｉ）トロンボポエチン膜貫通（ＴＭ）ドメイン；（ｉｉｉ）ヒトトロンボポエチンＩＣドメイン（またはその切断型バージョン、例えばデルタ６０）を含む第１の細胞内（ＩＣ）ドメイン；および（ｉｖ）共刺激受容体、サイトカイン受容体、共シグナル伝達受容体またはヒトトロンボポエチン受容体（ｃ−ｍｐｌ）由来のＩＣドメインから選択される、第２の細胞内ドメインを含む。例えば、第２のＩＣドメインは、ＣＤ４０、ＩＬ２Ｒ（ＩＬ２ｒβ、ＩＬ２Ｒγ）、ＩＴＡＭ１またはＬＭＰ１由来のＩＣドメインであり得る。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＣｒＧＦＲは、ｉ）ＥＣドメインと；配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４に示したＴＭドメインおよびＩＣドメイン、または少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％９７％もしくは９９％の配列同一性を有するそれらのバリアントを含む。適切なＥＣドメインは、本明細書に記載されているもの、例えば、切断型ＴｐｏＲ  ＥＣドメインを含む。これらの受容体は、ヒトトロンボポエチンまたはトロンボポエチン受容体アゴニストに結合する能力を保持する。
他の実施形態では、ｗｔ  ＴｐｏのＩＣドメインは、適切な受容体、例えば、ＬＭＰ１、ＩＬ２Ｒ、ＣＤ２８、ＣＤ１３７由来のＩＣドメインで置き換えられる；そのような構築物の例は、図１に「ＴｐｏＲ．ＬＭＰ１」「ＴｐｏＲ．ＩＬ２ｒβ−ｃｙｔ．ＴｐｏＲ−ｃｙｔ」として示し、図２に「ＴｐｏＲｅｃ．ＴｐｏＲｔｍ  ＣＤ２８ｃｙｔｏ」および「ＴｐｏＲｅｃ．ＴｐｏＲｔｍ  ＣＤ１３７ｃｙｔｏ」として示している。
【００１８】
ＥＣドメイン
ＥＣドメインは、ＴｐｏＲ（配列番号１）由来のＥＣドメイン、または受容体へのリガンド結合に応答してシグナル伝達および細胞増殖を維持するその誘導体もしくはバリアントであり得る。
例えば、リガンド結合時に受容体活性化を引き起こし得るＴＭドメイン、例えばＴｐｏＲ  ＴＭドメインが使用される場合、ＥＣドメインはＣｒＧＦＲシグナル伝達に必要ではない場合がある。ＥＣドメインは、次に、切断型または変異型の天然ドメイン（例えば、リガンド結合機能なし）、例えば切断型ＴｐｏＲ  ＥＣドメインであってもよい。天然ＥＣドメインは、選択および／またはｉｎ  ｖｉｖｏモニタリングのためのマーカー、例えば切断型ＣＤ３４に置き換えることができる。
【００１９】
ＴＭドメイン
Ｔｐｏ受容体（ＴｐｏＲ）由来のＴＭドメイン（図１に示す）を、受容体へのリガンド結合に応答してシグナル伝達および細胞増殖を維持するその誘導体またはバリアントを含めて、使用することができる。ＴｐｏＲは正常なヒト組織で発現が制限されていることが知られており、またエルトロンボパグ、ルストロンボパグおよびアバトロンボパグに結合することも知られているので、これは有用である可能性があり、したがって、Ｔｐｏ受容体由来のＴＭドメインを含むＣｒＧＦＲは、公知の毒性プロファイルを有する臨床検証された化合物に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでこの細胞を暴露させることにより活性化させることができる。
【００２０】
ＩＣドメイン
Ｔｐｏ受容体由来の増殖因子受容体細胞内（ＩＣ）ドメイン（配列番号１に示す）は、受容体へのリガンド結合に応答してシグナル伝達および細胞増殖を維持するその誘導体またはバリアント（例えば、配列番号２に示したような切断型ＴｐｏＲシグナル伝達ドメイン）を含めて、使用することができる。これをＴｐｏ受容体由来のＴＭドメインと組み合わせて、リガンド結合に応答して良好なレベルの細胞増殖を達成することができる。
増殖因子受容体様の他のＩＣドメインは、これらの受容体がＴｐｏ受容体と同じ細胞シグナル伝達経路を活性化することが知られていることから、本発明のＣｒＧＦＲの構築における使用に適し得る。例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、プロラクチンまたはヒト成長ホルモン由来のＩＣドメインを使用して、ＴｐｏＲ  ＴＭドメインと組み合わせた場合にＣｒＧＦＲを構築することができる。次いで、受容体アゴニスト、例えばエルトロンボパグに応答して細胞増殖を誘導するこれらのＩＣドメインを含むＣｒＧＦＲの能力は、本明細書の実施例で説明されている方法を使用して決定することができる。ＴｐｏＲのＩＣドメインは、Ｃ末端で最大７９アミノ酸まで切断され得る。これを上回る切断は、ＴｐｏＲ活性を完全にノックアウトすることが明らかにされている（Gurney et al. PNAS 1995）。
さらに、ＩＣドメインはまた、（限定するものではないが）以下のうちの１つに由来する第２のドメインを含むことができる：サイトカイン受容体シグナル伝達ドメイン（例えばＩＬ２受容体）、共シグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ４０）、ウイルス発がん性タンパク質（例えばＬＭＰ１）、共刺激ドメイン（例えばＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１５０など）または他のマイトジェンドメイン（例えばＴｏｌｌ様受容体、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ、ＣＤ３シグナル伝達ドメインなど）。
【００２１】
サイトカイン受容体は、多くの細胞タイプで発現される受容体の広範囲の群であり、可溶性サイトカインに結合することによって細胞外環境の合図を感知することに関与している。この結合の事象は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を介してシグナル伝達カスケードを誘発し、生存および増殖に関与する遺伝子のアップレギュレーションをもたらす。そのような受容体としては、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体およびトロンボポエチン受容体が挙げられる（Liongue et al. 2016）。共刺激受容体は、細胞がＴ細胞受容体によって一次シグナルを受ける場合に、Ｔ細胞の活性を増強することに関与するタンパク質である。これは、シグナル１およびシグナル２の概念に基づいており、それによって、シグナル１はＴ細胞受容体とペプチド−ＭＨＣとの結合を介して送達され、シグナル２はＴ細胞の共刺激受容体と標的細胞（例えば樹状細胞）の共刺激リガンドとの結合を介して送達される。共刺激ドメインを介して送達されるシグナル２は、Ｔ細胞に重要な生存シグナルを提供する。一般的な共刺激受容体としては、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ１５０が挙げられる（Leitner et al. 2010）。用語の共シグナル伝達とは、共刺激受容体について説明したものと同様の支持シグナルを提供する細胞膜タンパク質のグループを定義するが、ある特定の状況下では、Ｔ細胞でそれらが発現されない可能性があるため、通常は共刺激性であるとは考えられない場合があり、そのような受容体には抗原提示細胞で通常発現されるＣＤ４０が含まれ、Ｔ細胞で発現されるＣＤ４０−リガンドの結合の際に生存率を増強する（He et al. 2012；Kumar et al. 2018）。
【００２２】
この第２のＩＣドメインは、第１のＩＣドメイン（例えば、膜貫通Ｔｐｏドメインの隣に配置されるＴｐｏＲ  ＩＣドメイン）のＣ末端に直接融合され得るか、またはリンカードメインを介して融合され得る。したがって、キメラ増殖因子受容体は、ＴｐｏＲ膜貫通ドメインおよびＴｐｏＲ  ＩＣドメイン（第１のＩＣドメイン）、およびＴｐｏＲに由来し得るか、または前の段落で説明したようなサイトカイン受容体シグナル伝達ドメイン、共シグナル伝達ドメイン、ウイルス発がん性タンパク質（例えばＬＭＰ１）もしくは共刺激ドメインであってもよい、第２のＩＣドメインを含み得る。
さらに、共刺激ドメイン、共抑制ドメイン、または共シグナル伝達ドメインをＴｐｏＲ膜貫通ドメインに直接融合させて、図２ならびに配列番号１３および１４に示したような受容体を作製することができる。これらの受容体は、さらなる（第２の）ＩＣドメイン、例えばＴｐｏＲドメインを含んでいてもよい。
【００２３】
細胞
本発明で使用される細胞は、養子細胞療法において有用な任意のリンパ球であってよく、例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、ガンマ／デルタＴ細胞または制御性Ｔ細胞などであり得る。細胞は、同種異系細胞であってもよく、または自己細胞であってもよい。
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞性免疫において中心的な役割を有するリンパ球の一種である。それらは、細胞表面のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって、他のリンパ球、例えばＢ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などと識別され得る。以下に要約しているように、様々なタイプのＴ細胞がある。
【００２４】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また移植片拒絶反応にも関係している。ＣＴＬは、それらの表面でＣＤ８分子を発現する。これらの細胞は、すべての有核細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩに関連した抗原に結合することによってそれらの標的を認識する。制御性Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−１０、アデノシンおよび他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞はアネルギー状態に不活化され得るが、これにより自己免疫疾患、例えば実験的自己免疫性脳脊髄炎などが阻止される。
メモリーＴ細胞は、感染が解消した後も長期間持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、同族の抗原への再曝露の際に多数のエフェクターＴ細胞を速やかに増殖することにより、過去の感染に対する「記憶」を免疫系に提供する。メモリーＴ細胞は、次の３つのサブタイプ：セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）および２つのタイプのエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。メモリーＴ細胞は、典型的には、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
以前はサプレッサーＴ細胞として知られていた制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持にとって重要である。それらの主要な役割は、免疫反応の終了に向けてＴ細胞性免疫をシャットダウンすること、また胸腺でのネガティブ選択のプロセスを回避した自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【００２５】
ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞の２つの主要なクラスである、天然に存在するＴｒｅｇ細胞と適応性Ｔｒｅｇ細胞が開示されている。
天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋  Ｔｒｅｇ細胞としても知られている）は胸腺において発生し、ＴＳＬＰで活性化された骨髄性（ＣＤ１１ｃ＋）樹状細胞と形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方と発達中のＴ細胞との間の相互作用に関連していた。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在によって、他のＴ細胞と識別され得る。
適応性Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても知られている）は、正常な免疫応答中に発生し得る。
【００２６】
ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）は、自然免疫系の一部を形成する細胞傷害性の細胞の一種である。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ非依存的方法でウイルス感染細胞からの自然シグナルに対して速やかな応答を提供する。
ＮＫ細胞（自然リンパ球の群に属する）は、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を産生する一般的なリンパ球前駆体から分化した第３の種類の細胞を構成する。
【００２７】
核酸
本発明の一態様は、本明細書に記載されているＣｒＧＦＲ、ポリペプチド、またはタンパク質（それらの機能的部分および機能的バリアントを含む）のいずれかをコードする、本発明の核酸配列を提供する。
本明細書で使用される場合、用語の「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」とは、相互に同義であるものとする。
遺伝コードの縮重の結果、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が同じポリペプチドをコードし得ることは、当業者には理解されよう。さらに、日常的な技術を使用して、ポリペプチドを発現させようとする任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映するように、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を作製することが当業者はできることを理解されたい。
【００２８】
本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。それらは一本鎖であってもよく、または二本鎖であってもよい。それらはまた、合成ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドをそれらの中に含むポリヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドに対する多くの異なるタイプの修飾が当技術分野において公知である。これらには、メチルホスホネート骨格およびホスホロチオエート骨格、分子の３’末端および／または５’末端でのアクリジン鎖またはポリリジン鎖の付加が含まれる。本発明の目的において、ポリヌクレオチドは当技術分野で利用可能な任意の方法によって修飾され得ることを理解されたい。そのような修飾は、目的のポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性または寿命を増強するために実施することができる。
ヌクレオチド配列に関連する用語の「バリアント」、「相同体」または「誘導体」とは、配列からの、または配列への１つ（または複数）の核酸の任意の置換、変更、修飾、置き換え、欠失、または付加を含む。
【００２９】
核酸配列は、配列番号２に示したようなＴｐｏ受容体の切断型をコードするかまたはそれを含む核酸配列を含む、配列番号３〜１４に示したタンパク質配列またはそれらのバリアントをコードし得る。
ヌクレオチド配列は、配列番号１７〜２８に示したＴｐｏＲのヌクレオチド配列、またはそれらのバリアントを含み得る。
また本発明は、ＣｒＧＦＲをコードする核酸配列と、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするさらなる核酸配列とを含む核酸配列を提供する。
核酸配列は、２つ以上の核酸配列を共発現させることが可能な配列によって連結され得る。例えば、構築物は、内部プロモーター、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）、または切断部位をコードする配列を含むことができる。ポリペプチドが産生された場合に、いかなる外部切断活性も必要とすることなく直ちに個別のタンパク質に切断されるように、切断部位は自己切断され得る。
口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）および２ａ自己切断ペプチドを含む様々な自己切断部位が知られている。
共発現配列は、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）であってもよい。共発現配列は、内部プロモーターであってもよい。
【００３０】
ベクター
一態様では、本発明は、本発明の核酸配列または核酸構築物を含むベクターを提供する。
そのようなベクターを使用して、核酸配列または核酸構築物を宿主細胞に導入することができ、その結果、これは本発明の第１の態様に記載の１つまたは複数のＣｒＧＦＲを発現し、任意に１つまたは複数の他の目的のタンパク質（ＰＯＩ）、例えばＴＣＲまたはＣＡＲを発現する。
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクター、またはトランスポゾンベースのベクターもしくは合成ｍＲＮＡであり得る。レトロウイルス、例えばレンチウイルス由来のベクターは、１つまたは複数の導入遺伝子の長期的で安定した組み込みと娘細胞におけるその増殖を可能にするので、長期的な遺伝子導入を達成する適切なツールである。
ベクターは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を含むリンパ球をトランスフェクトするか、または形質導入することができる。
本発明はまた、本発明の核酸が挿入されているベクターを提供する。
ＣｒＧＦＲおよび任意にＴＣＲまたはＣＡＲをコードしている天然または合成の核酸の発現は、典型的には、ＣｒＧＦＲおよびＴＣＲ／ＣＡＲポリペプチドまたはその一部をコードする核酸を１つまたは複数のプロモーターに作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことにより達成される。ベクターは、真核細胞における複製および組み込みに適し得る。典型的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の調節に有用な転写および翻訳のターミネーター、開始配列、およびプロモーターを含む。
ウイルスベクター技術は当技術分野においては周知であり、例えば、Sambrook et al.（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）、ならびに他のウイルス学および分子生物学のマニュアルに記載されているが、またWO 01/96584；WO 01/29058；および米国特許第６，３２６，１９３号も参照されたい。
【００３１】
いくつかの実施形態では、核酸構築物は、本明細書の図面に示した通りである。いくつかの実施形態では、核酸は、単一プロモーターの制御下で、複数の導入遺伝子（例えばＣｒＧＦＲならびにＴＣＲおよび／またはＣＡＲなど）の発現を可能にするマルチシストロン性構築物である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子（例えば、ＣｒＧＦＲならびにＴＣＲおよび／またはＣＡＲなど）は、自己切断２Ａペプチドによって分離される。本発明の核酸構築物において有用な２Ａペプチドの例としては、Ｆ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｔ２ＡおよびＥ２Ａが挙げられる。本発明の他の実施形態において、本発明の核酸構築物は、２つのプロモーター；ＣｒＧＦＲの発現を駆動する１つのプロモーターと、ＴＣＲまたはＣＡＲの発現を駆動する別のプロモーターとを含むマルチシストロン性構築物である。いくつかの実施形態では、本発明の二重プロモーター構築物は一方向性である。他の実施形態では、本発明の二重プロモーター構築物は双方向性である。
ＣｒＧＦＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、選択可能なマーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれかまたはその両方を含み、ウイルスベクターを介してトランスフェクトされるか、または形質導入されることが求められる細胞の集団からの発現細胞の同定および選択を容易にすることもできる。ＣｒＧＦＲポリペプチドは、マーカー、例えばＣＤ３４などをＥＣドメインの一部として組み込むことができる。
【００３２】
医薬組成物
本発明はまた、本発明のベクターまたはＣｒＧＦＲ発現細胞を、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤、任意に１つまたは複数のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を共に含む、医薬組成物に関する。そのような製剤は、例えば、静脈内注入に適した剤形であり得る。
【００３３】
治療方法
本発明の方法において使用するためのＣｒＧＦＲを発現する、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む細胞は、患者自身の末梢血（自己）からｅｘ  ｖｉｖｏで作製され得るか、またはドナー末梢血もしくは無関係のドナー（同種異系）由来の末梢血からの造血幹細胞移植の設定においてｅｘ  ｖｉｖｏで作製され得る。あるいは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のＴ細胞またはＮＫ細胞へのｅｘ  ｖｉｖｏ分化に由来していてもよい。これらの事例において、ＣｒＧＦＲならびに任意にＣＡＲおよび／またはＴＣＲを発現するＴ細胞は、ＣｒＧＦＲならびに任意にＣＡＲおよび／またはＴＣＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを、ウイルスベクターによる形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡによるトランスフェクションを含む多数の手段の１つによって導入することによって生成される。
本発明のＣｒＧＦＲならびに任意にＴＣＲおよび／またはＣＡＲを発現するＴ細胞またはＮＫ細胞は、血液のがんまたは固形腫瘍の治療において使用することができる。
【００３４】
疾患を治療する方法は、本発明のベクターまたはＴ細胞もしくはＮＫ細胞を含む細胞の治療的使用に関する。この点において、ベクター、またはＴ細胞もしくはＮＫ細胞は、疾患に関連する少なくとも１つの症状を緩和、軽減もしくは改善するため、および／または疾患の進行を減速、軽減もしくは阻止するために、既存の疾患または状態を有する対象に投与することができる。本発明の方法は、Ｔ細胞媒介性のがん細胞の死滅を引き起こすか、または促進することができる。
本発明によるベクター、またはＴ細胞もしくはＮＫ細胞は、１つまたは複数の追加の治療薬と共に患者に投与することができる。１つまたは複数の追加の治療薬を患者に同時投与することができる。「同時投与する」とは、１つまたは複数の追加の治療薬と、本発明のベクター、またはＴ細胞もしくはＮＫ細胞を、時間的に十分に接近して投与することによりベクター、またはＴ細胞もしくはＮＫ細胞が１つまたは複数の追加の治療薬の効果を増強できるようにすること、またはその逆を意味する。この点に関して、ベクターまたは細胞を最初に投与することができ、次に１つまたは複数の追加の治療薬を投与することができるか、またはその逆で投与することができる。あるいは、ベクターまたは細胞と１つまたは複数の追加の治療薬とを同時に投与することができる。本発明のベクターまたは細胞と同時投与することができる適切な治療薬としては、ＣｒＧＦＲを活性化する任意の増殖因子受容体アゴニスト、例えば、エルトロンボパグ（ｒＩＮＮ、コード名称ＳＢ−４９７１１５−ＧＲ）、ルストロンボパグおよびアバトロンボパグまたはロミプロスチムが挙げられる。
【００３５】
エルトロンボパグは、その傷害性プロファイルが知られているので、本発明の方法において特に有用であり得る。前臨床試験においては、この化合物がトロンボポエチン受容体と選択的に相互作用し、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の活性化ならびに巨核球の増殖および分化の増加に結びつくことが明らかになった。動物実験では、投与によって血小板の数が増加し得ることが確認された。７３名の健康なボランティアにおいて、高用量のエルトロンボパグは、循環血小板の数を顕著に増加させ、許容性に問題はなかった。例えば、Jenkins JM, Williams D, Deng Y, Uhl J, Kitchen V, Collins D, Erickson-Miller CL (Jun 2007). "Phase 1 clinical study of eltrombopag, an oral, nonpeptide thrombopoietin receptor agonist". Blood 109 (11): 4739-41を参照されたい。したがって、本発明の方法において、適切な用量のエルトロンボパグは、既に開示されている臨床研究および本明細書に記載のｉｎ−ｖｉｔｒｏアッセイに基づいて決定することができる。
【００３６】
有用な可能性のある別の薬剤はＩＬ−２であるが、現在、これが既存の細胞療法で使用されており、投与された細胞の活性を増大させていることによる。しかし、前述のように、ＩＬ−２治療は傷害性および許容性の問題と関係している。したがって、本発明の目的は、ＣｒＧＦＲに結合するアゴニストを使用して細胞増殖を刺激することで、投与する必要のあるＩＬ−２の量を（例えば、低い毒性レベルまで）低減すること、またはＩＬ−２投与の必要性を排除することである。
細胞が患者に投与される本発明の方法の目的において、細胞は、患者に対して同種異型または自己の細胞であり得る。
【００３７】
本発明の様々なさらなる態様および実施形態は、本開示を考慮すれば当業者には明らかであろう。
本明細書に言及されているすべての文書は、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合の「および／または」とは、他方の有無にかかわらず、２つの明示された特徴または構成要素のそれぞれの特定の開示として理解されるものである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、あたかもそれぞれが個別に本明細書に記載されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれの特定の開示として理解されるものとする。
文脈が別段の指示をしない限り、上記の特徴の説明および定義は、本発明の任意の特定の態様または実施形態に限定的でなく、記載されているすべての態様および実施形態に等しく適用される。
本発明のある特定の態様および実施形態を、ここで、例として、また上記の図面および下記の表を参照することにより説明する。
【実施例】
【００３８】
（実施例１）
ＣｒＧＦＲを発現するＴ細胞の産生および評価
材料および方法
プラスミド
ｐＳＦ．Ｌｅｎｔｉ．ＥＦ１αプラスミドは、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓにより、ｐＳＦ．Ｌｅｎｔｉ．ＣＭＶ．ＰＧＫ．ｐｕｒｏ内の既存のＣＭＶプロモーターを伸長因子（ＥＦ）１αプロモーターで置き換えてｐＳＦ．Ｌｅｎｔｉ．ＥＦ１α．ＰＧＫ．ｐｕｒｏを生成することによって生成された。次いで、ＰＧＫ．Ｐｕｒｏセグメントを除去し、ピューロマイシン耐性遺伝子の下流にあるＮｈｅＩ部位でＸｂａＩ／ＮｈｅＩ消化することによりＴｐｏＲ構築物をクローニングした。パッケージングプラスミドｐＶＳＶｇ、ｐＣｇｐＶおよびｐＲＳＶ．Ｒｅｖ（ＶｉｒａＳａｆｅレンチウイルスパッケージングシステム−Ｐａｎｔｒｏｐｉｃ）は、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＶＰＫ−２０６）から入手した。
【００３９】
試薬
以下の試薬は、以下の製造業者から供給された：−
Ａｂｃａｍ  −  ＤＲＡＱ７（ＡＢ１０９２０２−１ｍｌ）
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  −  抗メラノーマ（ＭＣＳＰ）−ＰＥ（１３０−０９９−４１３）；抗ＣＤ３４−ＡＰＣ（１３０−０９０−９５４）、抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣ（１３０−０８０−２０２）、抗ＣＤ７１−ＡＰＣ（１３０−０９９−２３９）、抗ＣＤ１１０−ＰＥ
ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  −  抗ＣＤ３４−ＰＥ  （５５５８２２）；
Ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  −  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ色素ｅＦｌｏｒ  ４５０（６５−０８６３−１８）、Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ色素ｅＦｌｏｒ  ７８０（６５−０８６５−１８）。
【００４０】
細胞株
Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１細胞株およびＢａ／Ｆ３細胞株は、１０％のＦＣＳ（Ｆ９６６５−５００ｍｌ：Ｓｉｇｍａ）、１％の１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（Ｈ０８８７−１００ｍｌ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ０７８１−１００ｍｌ）を補充したＲＰＭＩ（Ｔ細胞培地：ＴＣＭ）で培養した。細胞株２９３Ｔは、１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ０７８１−１００ｍｌ）（Ｄ１０）を補充したＤＭＥＭで通常通り培養した。
【００４１】
Ｔ細胞の単離
Ｔ細胞は、バフィーコートからのＰＢＭＣから単離した。簡単に説明すると、バフィーコートをＮＨＳＢＴから入手し、ＰＢＭＣはフィコールによる密度遠心分離によって単離した。アンタッチドＴ細胞は常磁性ビーズを使用して単離した（以下を参照）。Ｔ細胞は、１０％ＦＣＳ（Ｆ９６６５−５００ｍｌ：Ｓｉｇｍａ）、１％の１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（Ｈ０８８７−１００ｍｌ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ０７８１−１００ｍｌ）を補充したＲＰＭＩ（Ｔ細胞培地：ＴＣＭ）で培養した。
【００４２】
レンチウイルスの産生
６×１０6個の２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの前日に、ポリ−ｄ−リジンをコーティングしたＴ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に入れた１０ｍｌのＤ１０に播種した。トランスフェクション当日、０．０２５ＭのＨＥＰＥＳ緩衝無血清ＤＭＥＭ（ｐＨ７．１）および０．０２５ＭのＨＥＰＥＳ緩衝Ｄ１０（ｐＨ７．９）を調製した。１．５ｍｌのトランスフェクションミックスは、フラスコ１個につき１０μｇのレンチウイルストランスファープラスミド（ｐＳＦ．Ｌｅｎｔｉ）および各１０μｇのｐＶＳＶｇ、ｐＣｇｐＶおよびｐＲＳＶ．ＲｅｖならびにＣａＣｌ2を使用し、ｐＨ７．１培地で最終濃度を０．０５Ｍに調整した。トランスフェクション複合体を３０分間形成させた後、６ｍｌのｐＨ７．９培地を入れたフラスコに滴下添加した。２４時間後に、培地を１０ｍｌの新しいＤ１０と交換した。２４時間後および４８時間後に培地を回収して合わせ、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ濃縮機（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ−Ｔａｋａｒａ：６３１２３２）を使用して濃縮した。濃縮したレンチウイルス粒子を元の上清容量の１０倍に再懸濁し、使用するまで−８０℃で保存した。
【００４３】
Ｔ細胞形質導入
１×１０5個のＴ細胞を平底９６ウェルプレートのウェルごとに加えた。プレートを遠心分離にかけ、上清を吸引した後、４μｇ／ｍｌのポリブレン（臭化ヘキサジメトリン−Ｓｉｇｍａ：Ｈ９２６８−５Ｇ）および示した濃度のＩＬ−２を補充したレンチウイルス上清５０〜１００μｌを添加した。場合によっては、次の活性化試薬を加えた：製造業者の推奨する濃度のＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ヒトＴ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ：１１１３１  Ｄ）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ヒトＴ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ１３７（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  １１１６２Ｄ）。
【００４４】
常磁性ビーズによる選別
常磁性ビーズによる選別は、製造業者の指示に従って、抗ＰＥマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ｏｒ  ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＴ細胞単離ビーズ（１７９５１：ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかを使用して実施した。
【００４５】
急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）
Ｔ細胞は、照射したバフィーコートフィーダーを使用して増殖させた。簡単に説明すると、１０個の照射済みバフィーコートをＮＨＳＢＴから入手し、ＰＢＭＣをフィコールによる密度遠心分離によって単離し、合わせてから凍結保存した。解凍したバフィーコートフィーダーを、１：２０〜１：１００の比率のＴ細胞と混合し、細胞の最終濃度はＴ２５培養液フラスコに入れたＴＣＭ＋２００ｌＵ／ｍｌのＩＬ−２および１μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン中１×１０6個／ｍｌとした。直立フラスコを、最初の５日間４５°の角度で配置した後、フラスコを直立に戻し、培地を半量培地交換により交換した。培地交換は、１４日間２〜３日ごとに新しいＩＬ−２を最終濃度２００ｌＵ／ｍｌになるよう実施し、その後、細胞を凍結保存するか、または直接アッセイにかけた。
【００４６】
構築物の設計
既に、本発明者らは、ＴｐｏＲが一次ヒトＴ細胞で活性を有し得ることを検証している。しかし、受容体を改変する試みは、必ずしも簡単ではなかった。例えば、ＴｐｏＲ  ＥｃドメインとＧＣＳＦ  ＩＣドメインとの間の融合では、細胞表面での発現が失敗した。さらに、プロラクチン受容体融合体は、表面安定性が完全であるように思われなかった。さらに、本発明者らは、ＩＬ−２シグナル伝達には関与するがＴｐｏＲシグナル伝達には関与しないシグナル伝達分子のＪＡＫ３を活性化することで、操作した細胞においてＩＬ−２様のシグナルを駆動する可能性が高いシグナル伝達成分を含めることにより、Ｔ細胞におけるＴｐｏＲベース受容体のシグナル伝達能力を改善することができると考えた。
したがって、本発明者らは、追加のドメインがＴｐｏＲ  ＩＣドメインのＣ末端に直接融合された融合受容体を生成することを目的とした。本発明者らは、まず、ＴｐｏＲとＩＬ２ｒβシグナル伝達ドメインの間の融合体を生成した。ＴｐｏＲ細胞内ドメインを完全に除去することによりＴｐｏＲとＩＬ２ｒβの間の融合体を生成する以前の試みでは、良好な発現が十分ではない受容体が得られた。したがって、本発明者らは、ハイブリッドＴｐｏＲ−ＩＬ２ｒβシグナル伝達ドメインを作製することによって、Ｉｌ２ｒβシグナル伝達領域をＴｐｏＲシグナル伝達ドメインのＮ末端またはＣ末端に融合させる代替手法をとった。次いで、ＣＤ３ζ由来のＴＩＡＦ１、ＴＬＲ１、ＣＤ１５０、ＩＬ２ｒγ、ＣＤ４０、ＬＭＰ１およびＩＴＡＭ１の細胞質ドメインがＣ末端でＴｐｏＲシグナル伝達ドメインに融合された受容体を生成した。これらの受容体の選択理由は以下の通りであった：ＴＩＡＦ１  −  ＴＩＡＦ１がＪＡＫ３に結合するという証拠がある（Ji et al. 2000）；ＴＬＲ１／ＣＤ４０  −  ＴＬＲとＣＤ４０の間の相乗効果によってＴ細胞の増殖が誘導されることが明らかになっており（Ahonen et al. 2004）、さらに、ＣＤ４０はＪＡＫ３に結合し、Ｂ細胞におけるシグナル伝達にＪＡＫ３を必要とすることが明らかになっている（Hanissian & Geha 1997）；ＣＤ１５０  −  ＣＤ１５０がＴ細胞をＩＬ−２枯渇から保護し得るという証拠がある（Aversa et al. 1997）；ＩＴＡＭ１  −  本発明者らは、マイトジェン応答を誘導するために、ＣＤ３ζ由来の単一ＩＴＡＭをＴｐｏＲのＣ末端に融合させることに決定した；ＬＭＰ１  −  ＥＢＶウイルス由来のＬＭＰ１は、ＪＡＫ３と相互作用することが明らかにされており（Gires et al. 1999）、さらに、本発明者らはまた、ＴｐｏＲ細胞質ドメイン融合体が非常に大きく、十分良好に発現がされない可能性があると考えたので、ＬＭＰ１をＴｐｏＲ膜貫通ドメインに直接融合した。本発明者らはまた、エルトロンボパグを投与した際に共刺激増殖シグナルが提供され得ると思われたので、ＣＤ２８およびＣＤ１３７の細胞質ドメインに融合されたＴｐｏＲ細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインからなるＣｒＧＦＲを生成した。これらの構築物の配列は以下に示している。
【００４７】
構築物は、ＸｂａＩ部位およびＮｈｅＩ部位を介してｐＳＦ．Ｌｅｎｔｉ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）にクローニングした。すべてのフラグメントおよび構築物は、Ｇｅｎｅｗｉｚによって、コドン最適化および遺伝子合成され、クローニングされた。
【００４８】
レンチウイルスの産生  −  レンチウイルスの産生は、３種プラスミドパッケージングシステム（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ、サンディエゴ、米国）を使用し、１０μｇの各プラスミドと１０μｇの導入遺伝子含有ｐＳＦ．レンチウイルスプラスミドを、５０ｍＭのＣａＣｌ２を含有する無血清ＲＰＭＩ中で一緒に混合することにより実施した。この混合物を、７５ｃｍ２フラスコ中の２９３Ｔ細胞の５０％コンフルエントな単層に滴下添加した。ウイルス上清をトランスフェクションの４８時間後および７２時間後に収集し、プールし、ＬｅｎｔｉＰａｃレンチウイルス上清濃度（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ、ロックビル、メリーランド、米国）溶液を製造業者の指示に従って使用して濃縮した。レンチウイルス上清を１０倍に濃縮し、４μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ドーセット、英国）の存在下で、一次ヒトＴ細胞に直接感染させるために使用した。
【００４９】
末梢血単核細胞を正常な健康なドナーから単離し、製造業者の指示に従ってＴ細胞活性化増殖ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２４時間活性化した後、レンチウイルス上清を添加した。
増殖後、細胞を過剰洗浄して外因性ＩＬ２を除去し、９６ウェルのＵ底プレートに播種した。細胞には、ＩＬ２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）またはエルトロンボパグ（Ｓｔｒａｔｅｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、サフォーク、英国）を補充した。それ以降の様々な時点で、細胞を１：４００希釈のｅＦｌｏｒ−４５０固定可能な生存率用色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、英国）で染色し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ血球計数計を使用してウェルから直接カウントするか、またはＤＲＡＱ７生存率用色素およびフィコエリトリン結合型抗ＣＤ１１０抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、英国）で染色し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ血球計数計を使用して分析した。次いで、細胞生存率および／または形質導入レベルを、ＭＡＣＳＱｕａｎｔｉｆｙソフトウェア（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、英国）を使用して分析した。
【００５０】
結果
本発明者らは、最初に、ＣｒＧＦＲの機能性および発現のプロファイルを、それぞれ、ヒトＴ細胞リンパ腫およびＩＬ−３依存性マウスＢ細胞株であるＪｕｒｋａｔＥ６．１細胞およびＢａ／Ｆ３細胞のｗｔ受容体との比較で試験した。Ｂａ／Ｆ３はヒト細胞でもＴ細胞でもないが、それらは受容体が適切に折り畳まれて発現できるかどうか、またそれらがシグナルを伝達できるかどうかを少なくとも示す。レンチウイルス粒子を作製し、ＪｕｒｋａｔＥ６．１細胞およびＢａ／Ｆ３細胞の直接感染に使用した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＰＥ結合型抗ＣＤ１１０抗体を使用することにより、発現について４８時間後に分析した。Ｂａ／Ｆ３細胞をエルトロンボパグまたはマウスＩＬ−３とインキュベートし、ＣｒＧＦＲの発現をフローサイトメトリーによるＣＤ１１０発現の分析によって数日間にわたって評価した。図４に示すように、すべての受容体がＪｕｒｋａｔＥ６．１細胞において良好に検出できたが、３つの受容体（ＴｐｏＲ．ＳＬＡＭ、ＴｐｏＲ．ＴＩＡＦ１、およびＴｐｏＲ．ＩＬ２ｒβ−ｃｙｔ．ＴｐｏＲ−ｃｙｔ）は、表面で特に十分に発現しないことを示唆する低発現プロファイルを有していた。Ｂａ／Ｆ３細胞では、すべての受容体が発現し、エルトロンボパグを添加することにより集団内で濃縮することができたが、ＩＬ−３は予測したように濃縮できなかった（図５）。しかし、２つのＩＬ２ｒβ融合受容体については、集団内で濃縮することはできるが、Ｂａ／Ｆ３での生存プロファイルは不十分であり生細胞が不足していることから、アッセイをこれらの受容体では切り上げる必要があった。
【００５１】
次に、本発明者らはこれらの受容体を取り、一次ヒトＴ細胞でそれらを発現させ、これらの細胞をＩＬ−２またはエルトロンボパグに曝露した。ドナー３名の一次ヒトＴ細胞集団をバフィーコートから単離し、ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズの存在下、示したレンチウイルス構築物を形質導入した。増殖後、細胞をＩＬ−２またはエルトロンボパグとインキュベートした。結果を図６、７、８（ドナー３名）に示す。本発明者らは、一部のドナーの一部の受容体でＴ細胞の増殖／生存の増加を確認した。本発明者らは、２１日後に、ＣＤ１１０＋細胞の別個の集団で良好な割合の生存細胞を示す細胞割合を調査することにより、このデータセット全体を分析した。これによって、さらに分析するための本発明者らの受容体パネルが次のようにさらに絞り込まれた：ＴｐｏＲ．ＣＤ４０、ＴｐＯＲ．ＩＬ２ｒγ、ＴｐｏＲ．ＩＴＡＭ１、ＴｐＯＲ．ＬＭＰ１−ｃｙｔ、およびＴｐｏＲ．ＴｐｏＲ−ｃｙｔ−ＬＭＰ１−ｃｙｔ。またＴｐｏＲ．Ａ６０も良好であるように思われたが、これは後の世代の融合受容体に後で組み込むことが可能であるという考えから最初はこれを探求しなかった。
【００５２】
次に、本発明者らは実験を繰り返し、選択の最初のラウンドで特定された受容体を使用し、常磁性ビーズ選択によるＣＤ１１０＋選択を使用してＣｒＧＦＲ＋細胞を選別した（図１０、１１および１２）。本発明者らは、３名のドナーすべてにおいて多数のＣｒＧＦＲが移植されたＴ細胞の生存の増強を観察した。特に、本発明者らは、第２のドナー（図１２）におけるＷＴ−ＴｐｏＲ、ＴｐＯＲ．ＣＤ４０、ＴｐＯＲ．ＩＬ２ｒγおよびＴｐｏＲ．ＬＭＰ１−ｃｙｔｏの細胞の増殖が、培地単独の場合を上回ることを確認した。
【００５３】
次に、本発明者らは、これらの受容体が養子細胞療法のモデルにおいて生存／増殖を促進する能力を、腫瘍浸潤リンパ球を操作することにより評価した。患者ＴＩＬ０４２（ブドウ膜黒メラノーマ）由来のＴＩＬをバリアントまたはｗｔ  ＣｒＧＦＲで操作し、患者に適合した腫瘍細胞（ＣＴＵＭ４２．１）と混合した。４日目および７日目に、全細胞ならびにＣＤ１１０＋細胞をカウントした。本発明者らは、おそらくＡＩＣＤまたは内因性抑制因子によって引き起こされる細胞数の初期の減少を確認した。しかし、４日目〜７日目の間に、本発明者らは、エルトロンボパグまたはエルトロンボパグ＋低用量ＩＬ−２で試験したすべての受容体でＣＤ１１０＋細胞の数の増加を観察した。特に、ＴｐｏＲ．ＣＤ４０の効果については、ＩＬ２単独で非特異的濃縮はなく、試験した他の受容体においてこの効果が示されたため有望であった。
【００５４】
本発明者らは、卵巣ＴＩＬにおけるＣｒＧＦＲの効果をさらに評価した。３つの卵巣ＴＩＬ集団を、ＷＴ、またはＴｐｏＲ．ＣＤ４０、ＴｐｏＲ．ＩＬ２ｒγもしくはＴｐｏＲ．ＬＭＰ１−Ｃｙｔバリアント受容体のいずれかを発現するように操作し、エルトロンボパグの存在下または非存在下で、患者に適合した腫瘍細胞と混合した。全細胞およびＣＤ１１０＋細胞を４日後および７日後にカウントした。本発明者らは、ＣｒＧＦＲ＋細胞の特異的増殖を、ＴｐＯＲ．ＬＭＰ１．ｃｙｔを除いたすべての受容体で、ドナー２およびドナー３において４日目〜７日目に、腫瘍の存在下で観察した。ドナー１においては、ＣｒＧＦＲ＋細胞の非特異的増殖はなかったが、エルトロンボパグの添加によって細胞がＡＩＣＤ（活性化誘導細胞死）から保護されるように見えることを本発明者らは確認した。重要なことには、本発明者らは、３名のすべてのドナーにおいて、ＴｐｏＲ．ＩＬ２ｒγバリアントおよびＴｐｏＲ．ＣＤ４０バリアントの活性がＷＴ受容体の活性よりも優れていることを確認した（図１３）。
【００５５】
最後に、本発明者らは、ＣｒＧＦＲ発現Ｔ細胞を培地、サイトカイン、または薬物で処理した際にホスホＳＴＡＴ分析を行うことによって、新規ＣｒＧＦＲのシグナル伝達の可能性を検証した。この目的のため、４名のドナー由来のＴ細胞にｗｔ  ＴｐｏＲ、ＴｐｏＲ．ＣＤ４０またはＴｐｏＲ．ＩＬ２ｒγのいずれかを形質導入し、常磁性ビーズ選択プロトコルを使用してＣｒＧＦＲ発現を濃縮し、次いでポリクローナル刺激を使用して増殖させた。細胞を培地単独（ＲＰＭＩ）、ＩＬ−２、Ｔｐｏまたはエルトロンボパグ（Ｅｌｔ）で４時間処理した後、メタノール固定、透過処理、およびｐＳＴＡＴ特異的抗体を使用する分析を実施した。ＳＴＡＴ分子は、細胞のサイトカイン活性化の際の細胞シグナル伝達の重要なドライバーであり、ｐＳＴＡＴ５は特にＩＬ−２活性にとって重要である。実際、本発明者らは、ＩＬ−２のインキュベーションでｐＳＴＡＴ５の誘導を確認したが、培地のインキュベーションでは誘導は確認されなかった。対照としてのＩＬ−１２は、この実験で観察されたように、ＳＴＡＴ５の活性化を誘導することはできない。Ｔｐｏおよびエルトロンボパグは、特にＳＴＡＴ５活性の誘導を示した。このことは、ＴｐｏＲ．ＩＬ２ｒγ  ＣｒＧＦＲで極めて明確であり、エルトロンボパグで刺激された場合に的確なＳＴＡＴ５活性化経路の明らかな活性化があることを証明している。
【００５６】
結論
臨床的に利用可能な薬物に応答する増殖因子受容体は、遺伝子導入技術によってＴ細胞に導入され、Ｔ細胞において細胞増殖／生存のシグナルを送達する機能的能力を維持する。重要なことには、本発明者らは、例として、ＴｐｏＲベースＣｒＧＦＲを移植した一次ヒトＴ細胞が臨床的に利用可能な薬物エルトロンボパグに応答し、最適なＴ細胞増殖に通常必要とされるＩＬ−２の非存在下で、増殖および生存することを明らかにしている。
【００５７】
ここでは、本発明者らは、多くの共刺激分子もしくは共シグナル伝達分子または他の増殖因子受容体からのシグナル伝達ドメインに融合されたＴｐｏＲに基づいて、多くの機能性バリアントを試験した。本発明者らは、これらの受容体が、ＴｐｏＲアゴニストであるエルトロンボパグの存在下で、一次ヒトＴ細胞および腫瘍浸潤リンパ球においてＩＬ−２非依存性の増殖および生存を付与することを示した。特に、本発明者らは、ＴｐｏＲ．ＣＤ４０融合体ＣｒＧＦＲが、非常に特異的なエルトロンボパグ媒介性のＴＩＬの生存／増殖を付与し、一次ヒトＴ細胞において最適な活性を示すことを見出した。
本発明の態様および実施形態はまた、以下の項目にも記載されている。
【００５８】
１．  （ｉ）細胞外（ＥＣ）ドメイン；
（ｉｉ）トロンボポエチン膜貫通（ＴＭ）ドメイン；および
（ｉｉｉ）キメラ増殖因子受容体細胞内（ＩＣ）ドメイン
を含むキメラ組換え増殖因子受容体（ＣｒＧＦＲ）を含むＴ細胞またはＮＫ細胞。
２．  リガンドのＣｒＧＦＲへの結合がＴ細胞またはＮＫ細胞の増殖を誘導する、項目１に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
３．  リガンドがヒトトロンボポエチン、トロンボポエチン受容体アゴニスト、または腫瘍関連抗原である、項目２に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
４．  トロンボポエチン受容体アゴニストがＴＭドメインに結合する、項目３に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
５．  トロンボポエチン受容体アゴニストがエルトロンボパグおよびロミプロスチムから選択される、項目３または項目４に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【００５９】
６．  ＥＣドメインがヒトｃ−ｍｐｌ  ＥＣドメインを含む、項目１〜５に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
７．  ＥＣドメインが、ｉ）切断型ＥＣドメイン、ｉｉ）切断型ｃ−ｍｐｌ  ＥＣドメイン、ｉｉｉ）腫瘍関連抗原に結合するドメイン、ｉｖ）腫瘍関連抗原に結合する抗体もしくは抗体フラグメント；およびｖ）選択マーカーのうちの１つまたは複数を含む、項目１〜６に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
８．  ＩＣドメインが任意の共刺激分子、共抑制分子または共シグナル伝達分子に由来する共刺激ドメイン、共抑制ドメインまたは共シグナル伝達ドメイン、例えば、限定するものではないが、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５０、ＰＤ１などを含む、項目１〜７に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
９．  第１のＩＣドメインがヒト成長ホルモン受容体、ヒトプロラクチン受容体、ヒトトロンボポエチン受容体（ｃ−ｍｐｌ）、Ｇ−ＣＳＦ受容体またはＧＭ−ＣＳＦ受容体から選択される、項目１〜８に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
１０．  追加のＩＣドメインがヒト成長ホルモン受容体、ヒトプロラクチン受容体、ヒトトロンボポエチン受容体（ｃ−ｍｐｌ）、Ｇ−ＣＳＦ受容体もしくはＧＭ−ＣＳＦ受容体、または共刺激受容体または共シグナル受容体から選択される、項目１〜９に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。さらに、ＩＣドメインはまた、（限定するものではないが）以下のいずれかに由来する第２のドメインを含む：サイトカイン受容体シグナル伝達ドメイン（例えばＩＬ２受容体）、共シグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ４０）、ウイルス発がん性タンパク質（例えばＬＭＰ１）、共刺激ドメイン（例えばＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１５０など）、または他のマイトジェンドメイン（例えばＴｏｌｌ様受容体、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ、ＣＤ３シグナル伝達ドメインなど）。この第２のドメインは、ＴｐｏＲ  ＩＣドメインのＣ末端またはＮ末端に直接融合されているか、またはリンカードメインを介して融合されている。
【００６０】
１０．  ヒトトロンボポエチン受容体ＴＭドメイン、またはヒトトロンボポエチンもしくはトロンボポエチン受容体アゴニストに結合する少なくとも８０％の配列同一性を有するそれらのバリアントを有する、項目１〜９に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
１１．  ＣｒＧＦＲが、配列番号３として示した配列を含むか、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するか、もしくはＣ末端で最大７９アミノ酸まで切断されたＴｐｏＲ  ＩＣドメインを含むか、もしくは合成アゴニスト薬、例えばエルトロンボパグに応答する能力を維持する代替ＥＣドメインを含む、それらのバリアントを含む、請求項１〜１０に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
１２．  ＣｒＧＦＲが、配列番号４として示した配列を含むか、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するか、もしくは最大７９アミノ酸まで切断されたＴｐｏＲ  ＩＣドメインを含むか、もしくは合成アゴニスト薬、例えばエルトロンボパグに応答する能力を維持する代替ＥＣドメインを含む、それらのバリアントを含む、請求項１〜１１に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
１３．  ＣｒＧＦＲが、配列番号５として示した配列を含むか、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するか、もしくはＣ末端で最大７９アミノ酸まで切断されたＴｐｏＲ  ＩＣドメインを含むか、もしくは合成アゴニスト薬、例えばエルトロンボパグに応答する能力を維持する代替ＥＣドメインを含む、それらのバリアントを含む、請求項１〜１２に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【００６１】
１４．  ＣｒＧＦＲが、配列番号６として示した配列を含むか、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するか、もしくはＣ末端で最大７９アミノ酸まで切断されたＴｐｏＲ  ＩＣドメインを含むか、もしくは合成アゴニスト薬、例えばエルトロンボパグに応答する能力を維持する代替ＥＣドメインを含む、それらのバリアントを含む、請求項１〜１３に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
１５．  ＣｒＧＦＲが、配列番号７として示した配列を含むか、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するか、もしくはＣ末端で最大７９アミノ酸まで切断されたＴｐｏＲ  ＩＣドメインを含むか、もしくは合成アゴニスト薬、例えばエルトロンボパグに応答する能力を維持する代替ＥＣドメインを含む、それらのバリアントを含む、請求項１〜１４に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
１６．  ＣｒＧＦＲが、配列番号８として示した配列を含むか、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するか、もしくはＣ末端で最大７９アミノ酸まで切断されたＴｐｏＲ  ＩＣドメインを含むか、もしくは合成アゴニスト薬、例えばエルトロンボパグに応答する能力を維持する代替ＥＣドメインを含む、それらのバリアントを含む、請求項１〜１５に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
１７．  ＣｒＧＦＲが、配列番号９として示した配列を含むか、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するか、もしくはＣ末端で最大７９アミノ酸まで切断されたＴｐｏＲ  ＩＣドメインを含むか、もしくは合成アゴニスト薬、例えばエルトロンボパグに応答する能力を維持する代替ＥＣドメインを含む、それらのバリアントを含む、請求項１〜１６に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【００６２】
１８．  ＣｒＧＦＲが、配列番号１０として示した配列を含むか、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するか、もしくはＣ末端で最大７９アミノ酸まで切断されたＴｐｏＲ  ＩＣドメインを含むか、もしくは合成アゴニスト薬、例えばエルトロンボパグに応答する能力を維持する代替ＥＣドメインを含む、それらのバリアントを含む、請求項１〜１７に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
１９．  ＣｒＧＦＲが、配列番号１１として示した配列を含むか、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するか、もしくはＣ末端で最大７９アミノ酸まで切断されたＴｐｏＲ  ＩＣドメインを含むか、もしくは合成アゴニスト薬、例えばエルトロンボパグに応答する能力を維持する代替ＥＣドメインを含む、それらのバリアントを含む、請求項１〜１８に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
２０．  ＣｒＧＦＲが、配列番号１２として示した配列を含むか、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するか、もしくはＣ末端で最大７９アミノ酸まで切断されたＴｐｏＲ  ＩＣドメインを含むか、もしくは合成アゴニスト薬、例えばエルトロンボパグに応答する能力を維持する代替ＥＣドメインを含む、それらのバリアントを含む、請求項１〜１９に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
２１．  ＣｒＧＦＲが、配列番号１３として示した配列を含むか、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するか、もしくは合成アゴニスト薬、例えばエルトロンボパグに応答する能力を維持する代替ＥＣドメインを含む、それらのバリアントを含む、請求項１〜２０に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【００６３】
２２．  ＣｒＧＦＲが、配列番号１４として示した配列を含むか、またはタンパク質レベルで少なくとも８０％の配列同一性を有するか、もしくは合成アゴニスト薬、例えばエルトロンボパグに応答する能力を維持する代替ＥＣドメインを含む、それらのバリアントを含む、請求項１〜２１に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
２３．  ＣｒＧＦＲが、配列番号３〜１４のいずれかに示した配列か、または少なくとも８０％の配列同一性を有するが、ｉ）ヒトトロンボポエチンもしくはヒトトロンボポエチン受容体アゴニストに結合する能力を保持し；ｉｉ）細胞の増殖または生存を誘導する、それらのバリアントを含む、請求項１〜２２に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
２４．  エルトロンボパグに結合する１〜２３のいずれかの項目に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
２５．  Ｔ細胞が腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）または一次Ｔ細胞から選択される、１〜２４のいずれかの項目に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【００６４】
２６．  組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む、１〜２５のいずかの項目に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
２７．  １〜２６のいずれかの請求項に定義されているＣｒＧＦＲをコードする核酸配列。
２８．  配列番号１７〜２８として示した配列、または翻訳されたタンパク質配列を変化させないそれらのバリアントを含む、項目２７に記載の核酸配列。
２９．  配列番号３〜１２に示した配列を含むが、配列番号２に示したＩＣドメインを含む、項目２７に記載の核酸配列。
３０．  項目２７〜２９に記載の核酸配列、または翻訳されたタンパク質配列を変化させないその任意のバリアントを含むベクター。
【００６５】
３１．  項目２７〜２９に記載の核酸配列、または項目１９〜２８に記載のベクターをＴ細胞またはＮＫ細胞に導入するステップを含む、項目１〜２６のいずれかに記載のＴ細胞またはＮＫ細胞を作製する方法。
３２．  項目３０に記載のベクター、または項目１〜２６に記載のＴ細胞もしくはＮＫ細胞を、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含む医薬組成物。
３３．  項目１〜２６の細胞、または項目３２の医薬組成物を対象に投与することを含むｉｎ−ｖｉｖｏで細胞増殖させる方法。
３４．  トロンボポエチン、またはトロンボポエチン受容体アゴニスト、例えばエルトロンボパグもしくはロミプロスチムを対象に投与することを含む、項目３３に記載のｉｎ−ｖｉｖｏで細胞増殖させる方法。
３５．  養子細胞療法において使用するための、項目１〜２６のいずれかに記載のＴ細胞もしくはＮＫ細胞、または項目３０に記載のベクター。
【００６６】
３６．  がんを治療する方法において使用するための、項目１〜２６のいずれかに記載のＴ細胞もしくはＮＫ細胞、または項目３０に記載のベクター。
３７．  項目１〜２６のいずれかに記載のＴ細胞またはＮＫ細胞を対象に投与するステップを含む、がんを治療する方法。
３８．  がんを治療するための医薬の製造における、項目３０に記載のベクター、または項目１〜２６のいずれかに記載のＴ細胞もしくはＮＫ細胞の使用。
３９．  養子細胞療法において使用するためのエルトロンボパグ。
４０．  項目１〜２６のいずれかに記載のＴ細胞またはＮＫ細胞のｉｎ−ｖｉｔｒｏ増殖またはｉｎ−ｖｉｖｏ増殖において使用するためのエルトロンボパグ。
４１．  がんの治療においてトロンボポエチンまたはトロンボポエチン受容体アゴニストと組み合わせて使用するための、項目１〜２６に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞を含む組成物。
【００６７】
2021527425.tif 000003
2021527425.tif 000004
2021527425.tif 000005
配列
以下のアミノ酸配列において、太字はＴｐｏＲ由来の配列を示す。
【表１】
2021527425.tif 000006
＊＊は終止コドンを示す
膜貫通ドメインには下線を付けた（配列番号１〜１５中）
【００６８】
配列番号１：野生型ＴｐｏＲ
６３５アミノ酸をＮ末端からＣ末端の方向に示した。そのうち、１〜４９１（太字）：ＴｐｏＲ細胞外ドメイン、４９２〜５１３（太字、下線付き）：ＴｐｏＲ  ＴＭドメイン、５１４〜６３５（太字、斜体）：ＴｐｏＲ細胞質ドメイン。
【００６９】
【化１】
2021527425.tif 000007
配列番号１５：野生型ＴｐｏＲ
【化２】
2021527425.tif 000008
配列番号２：ＴｐｏＲ．Δ６０
５８０アミノ酸をＮ末端からＣ末端の方向に示した。そのうち、１〜４９１（太字）：ＴｐｏＲ細胞外ドメイン、４９２〜５１３（太字、下線付き）：ＴｐｏＲ  ＴＭドメイン、５１４〜５８０（太字、斜体）：Ｃ末端が切断されたＴｐｏＲ細胞質ドメイン。
【化３】
2021527425.tif 000009
配列番号１６：ＴｐｏＲ．Δ６０
【化４】
2021527425.tif 000010
配列番号３：ＴｐｏＲ．ＴｐｏＲ−ｃｙｔ．ＩＬ２ｒβ−ｃｙｔ
６２６アミノ酸をＮ末端からＣ末端の方向に示した。そのうち、１〜４９１（太字）：ＴｐｏＲ細胞外ドメイン、４９２〜５１３（太字、下線付き）：ＴｐｏＲ  ＴＭドメイン、５１４〜５３８（太字、斜体）：Ｃ末端が切断されたＴｐｏＲ細胞質ドメイン、５３９〜６２６（書式なし）：ＩＬ２ｒβ細胞質ドメイン。
【００７０】
【化５】
2021527425.tif 000011
配列番号１７：ＴｐｏＲ．ＴｐｏＲ−ｃｙｔ．ＩＬ２ｒβ−ｃｙｔ
【化６】
2021527425.tif 000012
配列番号４：ＴｐｏＲ．ＩＬ２ｒＢ−ｃｙｔ．ＴｐｏＲ−ｃｙｔ
８０８アミノ酸をＮ末端からＣ末端の方向に示した。そのうち、１〜４９１（太字）：ＴｐｏＲ細胞外ドメイン、４９２〜５１３（太字、下線付き）：ＴｐｏＲ  ＴＭドメイン、５１４〜７０９（書式なし）：ＩＬ２ｒＢ細胞質ドメイン、７１０〜８０８（太字、斜体）：Ｎ末端が切断されたＴｐｏＲ細胞質ドメイン。
【００７１】
【化７】
2021527425.tif 000013
配列番号１８：ＴｐｏＲ．ＩＬ２ｒＢ−ｃｙｔ．ＴｐｏＲ−ｃｙｔ
【化８】
2021527425.tif 000014
配列番号５：ＴｐｏＲ．ＳＬＡＭ
７１０アミノ酸をＮ末端からＣ末端の方向に示した。そのうち、１〜４９１（太字）：ＴｐｏＲ細胞外ドメイン、４９２〜５１３（太字、下線付き）：ＴｐｏＲ  ＴＭドメイン、５１４〜６３５（太字、斜体）：ＴｐｏＲ細胞質ドメイン、６３６〜７１０（書式なし）：ＳＬＡＭ細胞質ドメイン。
【００７２】
【化９】
2021527425.tif 000015
配列番号１９：ＴｐｏＲ．ＳＬＡＭ
【化１０】
2021527425.tif 000016
配列番号６：ＴｐｏＲ．ＩＬ２ｒγ
７２１アミノ酸をＮ末端からＣ末端の方向に示した。そのうち、１〜４９１（太字）：ＴｐｏＲ細胞外ドメイン、４９２〜５１３（太字、下線付き）：ＴｐｏＲ  ＴＭドメイン、５１４〜６３５（太字、斜体）：ＴｐｏＲ細胞質ドメイン、６３６〜７２１（書式なし）：ＩＬ２ｒγ細胞質ドメイン。
【化１１】
2021527425.tif 000017
配列番号２０：ＴｐｏＲ．ＩＬ２ｒγ
【００７３】
【化１２】
2021527425.tif 000018
配列番号７：ＴｐｏＲ−ＴＬＲ１
８１７アミノ酸をＮ末端からＣ末端の方向に示した。そのうち、１〜４９１（太字）：ＴｐｏＲ細胞外ドメイン、４９２〜５１３（太字、下線付き）：ＴｐｏＲ  ＴＭドメイン、５１４〜６３５（太字、斜体）：ＴｐｏＲ細胞質ドメイン、６３６〜８１７（書式なし）：ＴＬＲ１細胞質ドメイン。
【化１３】
2021527425.tif 000019
配列番号２１：ＴｐｏＲ−ＴＬＲ１
【化１４】
2021527425.tif 000020
配列番号８：ＴｐｏＲ−ＴＩＡＦ１
７５０アミノ酸をＮ末端からＣ末端の方向に示した。そのうち、１〜４９１（太字）：ＴｐｏＲ細胞外ドメイン、４９２〜５１３（太字、下線付き）：ＴｐｏＲ  ＴＭドメイン、５１４〜６３５（太字、斜体）：ＴｐｏＲ細胞質ドメイン、６３６〜７５０（書式なし）：ＴＩＡＦ１細胞質ドメイン。
【００７４】
【化１５】
2021527425.tif 000021
配列番号２２：ＴｐｏＲ−ＴＩＡＦ１
【化１６】
2021527425.tif 000022
配列番号９：ＴｐｏＲ−ＣＤ４０
６９７アミノ酸をＮ末端からＣ末端の方向に示した。そのうち、１〜４９１（太字）：ＴｐｏＲ細胞外ドメイン、４９２〜５１３（太字、下線付き）：ＴｐｏＲ  ＴＭドメイン、５１４〜６３５（太字、斜体）：ＴｐｏＲ細胞質ドメイン、６３６〜６９７（書式なし）：ＣＤ４０細胞質ドメイン。
【化１７】
2021527425.tif 000023
配列番号２３：ＴｐｏＲ−ＣＤ４０
【００７５】
【化１８】
2021527425.tif 000024
配列番号１０：ＴｐｏＲ−ＩＴＡＭ１
６７６アミノ酸をＮ末端からＣ末端の方向に示した。そのうち、１〜４９１（太字）：ＴｐｏＲ細胞外ドメイン、４９２〜５１３（太字、下線付き）：ＴｐｏＲ  ＴＭドメイン、５１４〜６３５（太字、斜体）：ＴｐｏＲ細胞質ドメイン、６３６〜６７６（書式なし）：ＩＴＡＭ１細胞質ドメイン。
【化１９】
2021527425.tif 000025
配列番号２４：ＴｐｏＲ−ＩＴＡＭ１
【００７６】
【化２０】
2021527425.tif 000026
配列番号１１：ＴｐｏＲ．ＴｐｏＲ−ｃｙｔ．ＬＭＰ１−ｃｙｔ
８３６アミノ酸をＮ末端からＣ末端の方向に示した。そのうち、１〜４９１（太字）：ＴｐｏＲ細胞外ドメイン、４９２〜５１３（太字、下線付き）：ＴｐｏＲ  ＴＭドメイン、５１４〜６３５（太字、斜体）：ＴｐｏＲ細胞質ドメイン、６３６〜８３６（書式なし）：ＬＭＰ−１細胞質ドメイン。
【化２１】
2021527425.tif 000027
配列番号２５：ＴｐｏＲ．ＴｐｏＲ−ｃｙｔ．ＬＭＰ１−ｃｙｔ
【００７７】
【化２２】
2021527425.tif 000028
配列番号１２：ＴｐｏＲ．ＬＭＰ１−ｃｙｔ
７１４アミノ酸をＮ末端からＣ末端の方向に示した。そのうち、１〜４９１（太字）：ＴｐｏＲ細胞外ドメイン、４９２〜５１３（太字、下線付き）：ＴｐｏＲ  ＴＭドメイン、５１４〜７１４（書式なし）：ＬＭＰ−１細胞質ドメイン。
【化２３】
2021527425.tif 000029
配列番号２６：ＴｐｏＲ．ＬＭＰ１−ｃｙｔ
【００７８】
【化２４】
2021527425.tif 000030
配列番号１３：ＴｐｏＲｅｃ．ＴｐｏＲｔｍ．ＣＤ１３７ｃｙｔｏ
５５５アミノ酸をＮ末端からＣ末端の方向に示した。そのうち、１〜４９１（太字）：ＴｐｏＲ細胞外ドメイン、４９２〜５１３（太字、下線付き）：ＴｐｏＲ  ＴＭドメイン、５１４〜５５５（書式なし）：ＣＤ１３７細胞質ドメイン。
【化２５】
2021527425.tif 000031
配列番号２７：ＴｐｏＲｅｃ．ＴｐｏＲｔｍ．ＣＤ１３７ｃｙｔｏ
【００７９】
【化２６】
2021527425.tif 000032
配列番号１４：ＴｐｏＲｅｃ．ＴｐｏＲｔｍ．ＣＤ２８ｃｙｔｏ
５５４アミノ酸をＮ末端からＣ末端の方向に示した。そのうち、１〜４９１（太字）：ＴｐｏＲ細胞外ドメイン、４９２〜５１３（太字、下線付き）：ＴｐｏＲ  ＴＭドメイン、５１４〜５５４（書式なし）：ＣＤ２８細胞質ドメイン。
【化２７】
2021527425.tif 000033
配列番号２８：ＴｐｏＲｅｃ．ＴｐｏＲｔｍ．ＣＤ２８ｃｙｔｏ
【化２８】
2021527425.tif 000034
【図１】
2021527425.tif 000035
【図２】
2021527425.tif 000036
【図３】
2021527425.tif 000037
【図４】
2021527425.tif 000038
【図５Ａ】
2021527425.tif 000039
【図５Ｂ】
2021527425.tif 000040
【図６Ａ】
2021527425.tif 000041
【図６Ｂ】
2021527425.tif 000042
【図７Ａ】
2021527425.tif 000043
【図７Ｂ】
2021527425.tif 000044
【図８Ａ】
2021527425.tif 000045
【図８Ｂ】
2021527425.tif 000046
【図９Ａ】
2021527425.tif 000047
【図９Ｂ】
2021527425.tif 000048
【図１０】
2021527425.tif 000049
【図１１】
2021527425.tif 000050
【図１２】
2021527425.tif 000051
【図１３】
2021527425.tif 000052
【図１４】
2021527425.tif 000053
【図１５】
2021527425.tif 000054
【配列表】
2021527425000001.app
【国際調査報告】
2021527425.tif 000055
2021527425.tif 000056
2021527425.tif 000057