(57)【要約】本発明は、腫瘍を治療するための薬物の製造に有用な単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１からなる群から選択される１つまたは複数の配列からなる重鎖相補性決定領域と、軽鎖相補性決定領域とを含むことを特徴とする単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記重鎖相補性決定領域が、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３であるか、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３であるか、あるいは、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１であることを特徴とする請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記軽鎖相補性決定領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４からなる群から選択される１つまたは複数の配列からなることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記軽鎖相補性決定領域が、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６であるか、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８であるか、あるいは、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４であることを特徴とする請求項３に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含むか、
重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含むか、
重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含むか、
重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含むか、あるいは、
重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４を含むことを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に置換されていることを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
前記軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０に置換されていることを特徴とする請求項６に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
重鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５を含み、軽鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６を含むか、
重鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７を含み、軽鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６を含むか、
重鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５を含み、軽鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８を含むか、
重鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７を含み、軽鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８を含むか、あるいは、
重鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９を含み、軽鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０を含むことを特徴とする請求項６または請求項７に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体である請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
ラクダ化シングルドメイン抗体、二機能性抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓＦｖ２、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓ二機能性抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、または二価ドメイン抗体である請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のタンパク質の定常領域を含む免疫グロブリン定常領域をさらに含む請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
コンジュゲートをさらに含む請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１３に記載の単離されたポリヌクレオチドを発現する条件下で、請求項１５に記載の宿主細胞を培養することを含む請求項１〜請求項１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を発現させる方法。
【請求項１７】
請求項１〜請求項１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含むキット。
【請求項１８】
請求項１〜請求項１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と、１種または複数種の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１９】
ヒトまたはサルＯＸ４０の存在またはレベルの検出における、請求項１〜請求項１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項２０】
ＯＸ４０アゴニストに応答する障害または状態病症または状況を有する個体の検出および同定における、請求項１〜請求項１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項２１】
ＯＸ４０アゴニスト治療の治療応答または疾患進行のモニタリングにおける、請求項１〜請求項１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項２２】
上方制御された免疫応答から利益を得ることができる状態状況を治療するための薬物の製造における、請求項１〜請求項１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項２３】
前記状態が癌または慢性ウイルス感染症である、請求項２２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
「関連出願の相互参照」
本願は、２０１７年１２月２９日に出願された、名称が「単離された抗体またはその抗原結合断片、および腫瘍治療におけるその使用」であり、出願番号が２０１７１１４７６１６０３である中国発明特許出願の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、抗体に関し、特に、単離された抗体またはその抗原結合断片、および腫瘍治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトＯＸ４０は、２７７ａａのタンパク質であるが、Ｎ１４６およびＮ１６０位でのグリコシル化のため、その見かけの分子量が約５０ｋＤ［１、２］である。ＯＸ４０は、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、その細胞外セグメントがその天然リガンドＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）と結合し、細胞内セグメントがＴ細胞活性化の複数のシグナル伝達経路と結合する。
【０００４】
ヒトＯＸ４０は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴｈおよびＴｒｅｇ細胞などを含む活性化Ｔ細胞で主に発現される（ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ［３］）。ＯＸ４０のナイーブＴ細胞（ｎａｉｖｅ（ｉはトレマ付き）Ｔ細胞）での発現は非常に低いが、抗原誘導刺激後に、その発現レベルが上方制御され、１２ｈから５〜６日までにピークに達する。同様に、ＯＸ４０Ｌの発現は、細胞の活性化状態に影響される［３］。ＡＰＣ細胞は、抗原刺激の１〜３日後にＯＸ４０Ｌの発現を検出することができる。興味深いことに、免疫細胞に加えて、筋肉細胞は炎症因子の刺激下でもＯＸ４０Ｌ［４、５］を発現し、ＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０シグナル伝達経路が生体の炎症反応に広く作用する可能性があることを示唆している。
【０００５】
ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌが抗原活性化Ｔ細胞に主に発現するという特徴に基づいて、ＯＸ４０アゴニストは、特異性が強く、副作用が低い免疫療法になると開発することが期待されている。
【０００６】
抗原依存性のＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０共刺激分子の活性化は、Ｔ細胞内の複数のシグナル伝達経路と結合する。結晶構造の研究は、ＯＸ４０ＬとＯＸ４０の結合がＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ複合体の三量体化を誘導することができ［６］、これにより受容体関連分子（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ、ＴＲＡＦ）との結合部位が細胞内に形成されることを示している。後者（ＴＲＡＦ２、５）は、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路をさらに活性化し、Ｔ細胞のアポトーシスを抑制することができる［５、７、８］。一部の研究では、ＯＸ４０活性化は、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬの高発現につながる可能性があることが見出され［９］、ＯＸ４０がＮＦ−κＢシグナル伝達経路を介して抗アポトーシスタンパク質の発現を誘導し、Ｔ細胞のアポトーシスを抑制するその機能を果たす可能性があることを示唆している。
【０００７】
ＰＫＢ／ＰＩ３Ｋは、ＯＸ４０の下流の別の重要なシグナル伝達経路である。研究により、Ｔ細胞上のＯＸ４０の共刺激シグナルがＰＫＢの活性化を維持するための必要条件である一方、構成的に活性化されたＰＫＢは、ＯＸ４０欠損に起因するＴ細胞における抗アポトーシスタンパク質の下方制御に拮抗し得ることが見出された［１０］。ＯＸ４０共刺激シグナルは、ＰＫＢ／ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路を介してＳｕｒｖｉｖｉｎの発現を維持することができる［１１］。
【０００８】
最後に、Ｔ細胞上のＴＣＲおよびＯＸ４０の活性化はまた、カルシウム流れおよびＮＦＡＴシグナル伝達経路の活性化を相乗的に引き起こし、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＦＮ−γを含むサイトカインの発現を調節することができる［１２］。
【０００９】
以上の研究により、ＯＸ４０の活性化がＮＦ−κＢシグナル伝達経路、ＰＫＢ／ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路およびＮＦＡＴシグナル伝達経路を介してＴ細胞の増殖、アポトーシスおよびサイトカイン分泌活性を調節し、これにより免疫系の活力を増強する効果が得られることが示された。
【００１０】
しかし、ＯＸ４０のさらなる研究により、ＣＤ４+細胞におけるＴｒｅｇ細胞亜集団もＯＸ４０を発現することが見出された。ＯＸ４０はマウスＴｒｅｇ細胞で持続的に発現するが、ヒトＴｒｅｇ細胞は活性化後に上方制御された発現を示した［１３、１４］。ＴｒｅｇはエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の抑制に寄与する細胞の一種であるため、Ｔｒｅｇ細胞でのＯＸ４０の機能を調べることは非常に興味深い問題である。既存の証拠は、ＯＸ４０シグナル伝達経路が天然Ｔｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）の発育にあまり影響しないことを示しており、ほとんどの研究は、誘導されたＴｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）の発育に対してより明確な抑制的調節作用を示すことを示している（ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ［３、１５］）。
【００１１】
Ｔｒｅｇ細胞の発育により明確な結論があると違って、Ｔｒｅｇ細胞の機能に対するＯＸ４０シグナル伝達経路の調節作用に関する研究が完全には一致していない。いくつかの研究により、ＯＸ４０シグナル伝達経路はＴｒｅｇ細胞の免疫抑制機能を抑制できることが示された［１４、１６〜２０］。また、Ｔｒｅｇ細胞がその免疫抑制機能を十分に発揮するためにＯＸ４０が必要であることが見出された［２１〜２３］。この不一致は異なる実験室で採用した異なる実験モデルおよび実験条件と相関する可能性があり、ＯＸ４０が生体内でＴｒｅｇ細胞の機能に対して異なる生理学的、病理学的条件の影響を受ける可能性も示唆した。
【００１２】
同様に、Ｔｒｅｇ細胞の増殖およびアポトーシスに対するＯＸ４０活性の影響は、細胞が存在する微小環境によっても異なる。例えば、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４がないと［２４］、またはＦｏｘＰ３発現があると［１７］、ＯＸ４０の活性化は、Ｔｒｅｇ細胞の増幅を著しく促進することができる。一方、他の場合では、このＯＸ４０依存性Ｔｒｅｇの増幅は観察されなかった［１４］。
【００１３】
以上のように、免疫系に対するＯＸ４０の調節制御作用は複雑な過程である。一方では、ＯＸ４０共刺激シグナルは場合によってはエフェクターＴ細胞活性を増強し、Ｔｒｅｇ機能を抑制する二重機序によって免疫活性化の効果を達成することができる。他方では、ＯＸ４０シグナル伝達経路はＴｒｅｇ細胞の増殖を促進し、エフェクターＴ細胞の機能に拮抗することもある。さらに、ＡＤＣＣの作用機序は、Ｔｅｆｆ細胞およびネガティブコントロールされたＴｒｅｇ細胞の両方を除去することができる。
【００１４】
腫瘍浸潤リンパ球（ｔｕｍｏｒ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、ＴＩＬ）は末梢リンパ系が遊走して腫瘍組織内部に留まるリンパ球であり、その数およびタイプは患者の予後と相関する傾向がある［２５、２６］。多くの研究は、ＯＸ４０が腫瘍浸潤リンパ球、特にＴｒｅｇで高発現することを示し［２７〜３２］、これは腫瘍特異的抗原がＴ細胞を活性化する形態の１つである可能性が高いことを示している。リンパ腫では、ＯＸ４０がＴｒｅｇで高度に上方制御されるので、ＯＸ４０は抗原特異的Ｔｒｅｇのバイオマーカーとしてさえ働くことができる［３０］。興味深いことに、ＯＸ４０の発現は、腫瘍患者の臨床予後と関連している。結腸癌では、ＴＩＬ、腸間膜リンパ節または腫瘍辺縁のリンパ集塊におけるＯＸ４０の高発現は、より長い生存期間に関連する［３１］。同様に、黒色腫患者において、ＴＩＬおよび腫瘍周辺リンパ球中のＯＸ４０陽性細胞の数は、腫瘍の転移および患者の生存期間に関連する［３２］。
【００１５】
上記の知見、およびＴ細胞活性化におけるＯＸ４０の重要な役割に基づいて、ＯＸ４０は腫瘍治療の重要な標的となる。ＯＸ４０シグナル伝達経路の活性化は、活性化されたＯＸ４０抗体を使用するか、またはＯＸ４０Ｌ融合タンパク質に結合することなどによって達成することができる。ＯＸ４０アゴニストを用いた腫瘍治療の最初の試みは２０００年に遡ることができ、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ実験室はＯＸ４０Ｌ：Ｉｇ融合タンパク質の腹腔投与が皮下移植腫瘍の腫瘍形成を阻止できることを報告した［３３］。興味深いことに、治療群のマウスは、同じ腫瘍を再接種するのに対しまた良い免疫力を有するが、異なる腫瘍細胞を接種するのに対し同様の免疫力を有しない［３３］。この結果は、ＯＸ４０アゴニストが腫瘍治療中に腫瘍特異的記憶Ｔ細胞応答を増強できることを示唆する。同時に、研究はまた、ＯＸ４０アゴニストの抗腫瘍活性のために、ＣＤ４+およびＣＤ８+細胞の両方が必要であることを示した［３３、３４］。その後の多くの前臨床研究により、動物モデルでのＯＸ４０アゴニストの単独使用または他の腫瘍治療手段との併用は、腫瘍成長の抑制、更には腫瘍再発の予防に有効であることを実証している（ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ［１５、３５］）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｍａｌｌｅｔｔ  Ｓ，Ｆｏｓｓｕｍ  Ｓ，Ｂａｒｃｌａｙ  ＡＮ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＲＣ  ＯＸ４０  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＣＤ４  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ−−ａ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９０；９：１０６３−８．ｄｏｉ：
【非特許文献２】Ｂｙｕｎ  Ｍ，Ｍａ  ＣＳ，Ａｋｃａｙ  Ａ，Ｐｅｄｅｒｇｎａｎａ  Ｖ，Ｐａｌｅｎｄｉｒａ  Ｕ，Ｍｙｏｕｎｇ  Ｊ，Ａｖｅｒｙ  ＤＴ，Ｌｉｕ  Ｙ，Ａｂｈｙａｎｋａｒ  Ａ，Ｌｏｒｅｎｚｏ  Ｌ，Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｍ，Ｌｉｍ  ＨＫ，Ｃａｓｓａｒ  Ｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ＯＸ４０  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｃｌａｓｓｉｃ  Ｋａｐｏｓｉ  ｓａｒｃｏｍａ  ｏｆ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１３；２１０：１７４３−５９．ｄｏｉ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２０１３０５９２．
【非特許文献３】Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ  Ｊ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  Ｊ，Ｔｅｗｓ  Ｉ，Ｃｒａｇｇ  ＭＳ．ＯＸ４０：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ−Ｗｈａｔ  ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ  ｒｅｍａｉｎ？Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７；８３：１３−２２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｉｍｍ．２０１７．０１．００６．
【非特許文献４】Ｂｕｒｇｅｓｓ  ＪＫ，Ｃａｒｌｉｎ  Ｓ，Ｐａｃｋ  ＲＡ，Ａｒｎｄｔ  ＧＭ，Ａｕ  ＷＷ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＰＲ，Ｂｌａｃｋ  ＪＬ，Ｈｕｎｔ  ＮＨ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＯＸ４０  ｌｉｇａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｉｒｗａｙ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ？Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；１１３：６８３−９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｃｉ．２００３．１２．３１１．
【非特許文献５】Ｉｍｕｒａ  Ａ，Ｈｏｒｉ  Ｔ，Ｉｍａｄａ  Ｋ，Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｔ，Ｔａｎａｋａ  Ｙ，Ｍａｅｄａ  Ｍ，Ｉｍａｍｕｒａ  Ｓ，Ｕｃｈｉｙａｍａ  Ｔ．Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＯＸ４０／ｇｐ３４  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９６；１８３：２１８５−９５．  ｄｏｉ：
【非特許文献６】Ｃｏｍｐａａｎ  ＤＭ，Ｈｙｍｏｗｉｔｚ  ＳＧ．Ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２００６；１４：１３２１−３０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｒ．２００６．０６．０１５．
【非特許文献７】Ｓｏｎｇ  Ｊ，Ｓｏ  Ｔ，Ｃｒｏｆｔ  Ｍ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ１  ｂｙ  ＯＸ４０  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｄｒｉｖｅｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１８０：７２４０−８．ｄｏｉ：
【非特許文献８】Ｃｒｏｆｔ  Ｍ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＴＮＦＲ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＯＸ４０（ＣＤ１３４）．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；２８：５７−７８．ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ−ｉｍｍｕｎｏｌ−０３０４０９−１０１２４３．
【非特許文献９】Ｒｏｇｅｒｓ  ＰＲ，Ｓｏｎｇ  Ｊ，Ｇｒａｍａｇｌｉａ  Ｉ，Ｋｉｌｌｅｅｎ  Ｎ，Ｃｒｏｆｔ  Ｍ．ＯＸ４０  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｂｃｌ−ｘＬ  ａｎｄ  Ｂｃｌ−２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ＣＤ４  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００１；１５：４４５−５５．ｄｏｉ：
【非特許文献１０】Ｓｏｎｇ  Ｊ，Ｓａｌｅｋ−Ａｒｄａｋａｎｉ  Ｓ，Ｒｏｇｅｒｓ  ＰＲ，Ｃｈｅｎｇ  Ｍ，Ｖａｎ  Ｐａｒｉｊｓ  Ｌ，Ｃｒｏｆｔ  Ｍ．Ｔｈｅ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｄｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＫＢ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；５：１５０−８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ１０３０．
【非特許文献１１】Ｓｏｎｇ  Ｊ，Ｓｏ  Ｔ，Ｃｈｅｎｇ  Ｍ，Ｔａｎｇ  Ｘ，Ｃｒｏｆｔ  Ｍ．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ＯＸ４０  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｄｒｉｖｅｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００５；２２：６２１−３１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２００５．０３．０１２．
【非特許文献１２】Ｓｏ  Ｔ，Ｓｏｎｇ  Ｊ，Ｓｕｇｉｅ  Ｋ，Ａｌｔｍａｎ  Ａ，Ｃｒｏｆｔ  Ｍ．Ｓｉｇｎａｌｓ  ｆｒｏｍ  ＯＸ４０  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃ１  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐｅｒ  ２  ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００６；１０３：３７４０−５．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０６００２０５１０３．
【非特許文献１３】Ｓｏ  Ｔ，Ｃｒｏｆｔ  Ｍ．Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：ＯＸ４０  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ−ａｎｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｄｒｉｖｅｎ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｉｖｅ  ＣＤ４  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；１７９：１４２７−３０．ｄｏｉ：
【非特許文献１４】Ｖｕ  ＭＤ，Ｘｉａｏ  Ｘ，Ｇａｏ  Ｗ，Ｄｅｇａｕｑｕｅ  Ｎ，Ｃｈｅｎ  Ｍ，Ｋｒｏｅｍｅｒ  Ａ，Ｋｉｌｌｅｅｎ  Ｎ，Ｉｓｈｉｉ  Ｎ，Ｌｉ  ＸＣ．ＯＸ４０  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｔｕｒｎｓ  ｏｆｆ  Ｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇｓ．Ｂｌｏｏｄ．２００７；１１０：２５０１−１０．ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００７−０１−０７０７４８．
【非特許文献１５】Ａｓｐｅｓｌａｇｈ  Ｓ，Ｐｏｓｔｅｌ−Ｖｉｎａｙ  Ｓ，Ｒｕｓａｋｉｅｗｉｃｚ  Ｓ，Ｓｏｒｉａ  ＪＣ，Ｚｉｔｖｏｇｅｌ  Ｌ，Ｍａｒａｂｅｌｌｅ  Ａ．Ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ｆｏｒ  ａｎｔｉ−ＯＸ４０  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１６；５２：５０−６６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｊｃａ．２０１５．０８．０２１．
【非特許文献１６】Ｘｉａｏ  Ｘ，Ｇｏｎｇ  Ｗ，Ｄｅｍｉｒｃｉ  Ｇ，Ｌｉｕ  Ｗ，Ｓｐｏｅｒｌ  Ｓ，Ｃｈｕ  Ｘ，Ｂｉｓｈｏｐ  ＤＫ，Ｔｕｒｋａ  ＬＡ，Ｌｉ  ＸＣ．Ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｏｎ  ＯＸ４０  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；１８８：８９２−９０１．ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１１０１３７３．
【非特許文献１７】Ｋｒｏｅｍｅｒ  Ａ，Ｘｉａｏ  Ｘ，Ｖｕ  ＭＤ，Ｇａｏ  Ｗ，Ｍｉｎａｍｉｍｕｒａ  Ｋ，Ｃｈｅｎ  Ｍ，Ｍａｋｉ  Ｔ，Ｌｉ  ＸＣ．ＯＸ４０  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；１７９：５５８４−９１．ｄｏｉ：
【非特許文献１８】Ｖａｌｚａｓｉｎａ  Ｂ，Ｇｕｉｄｕｃｃｉ  Ｃ，Ｄｉｓｌｉｃｈ  Ｈ，Ｋｉｌｌｅｅｎ  Ｎ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ＡＤ，Ｃｏｌｏｍｂｏ  ＭＰ．Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ＯＸ４０（ＣＤ１３４）ｏｎ  ＣＤ４（＋）ＣＤ２５＋Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｌｏｃｋｓ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＯＸ４０  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ＧＩＴＲ．Ｂｌｏｏｄ．２００５；１０５：２８４５−５１．ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００４−０７−２９５９．
【非特許文献１９】Ｐｉｃｏｎｅｓｅ  Ｓ，Ｖａｌｚａｓｉｎａ  Ｂ，Ｃｏｌｏｍｂｏ  ＭＰ．ＯＸ４０  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｂｌｏｃｋｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００８；２０５：８２５−３９．ｄｏｉ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２００７１３４１．
【非特許文献２０】Ｖｏｏ  ＫＳ，Ｂｏｖｅｒ  Ｌ，Ｈａｒｌｉｎｅ  ＭＬ，Ｖｉｅｎ  ＬＴ，Ｆａｃｃｈｉｎｅｔｔｉ  Ｖ，Ａｒｉｍａ  Ｋ，Ｋｗａｋ  ＬＷ，Ｌｉｕ  ＹＪ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ＯＸ４０  ｅｘｐａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｂｌｏｃｋ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３；１９１：３６４１−５０．ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１２０２７５２．
【非特許文献２１】Ｔａｋｅｄａ  Ｉ，Ｉｎｅ  Ｓ，Ｋｉｌｌｅｅｎ  Ｎ，Ｎｄｈｌｏｖｕ  ＬＣ，Ｍｕｒａｔａ  Ｋ，Ｓａｔｏｍｉ  Ｓ，Ｓｕｇａｍｕｒａ  Ｋ，Ｉｓｈｉｉ  Ｎ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＯＸ４０−ＯＸ４０  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｎｏｎｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；１７２：３５８０−９．ｄｏｉ：
【非特許文献２２】Ｐｉｃｏｎｅｓｅ  Ｓ，Ｐｉｔｔｏｎｉ  Ｐ，Ｂｕｒｏｃｃｈｉ  Ａ，Ｇｏｒｚａｎｅｌｌｉ  Ａ，Ｃａｒｅ  Ａ，Ｔｒｉｐｏｄｏ  Ｃ，Ｃｏｌｏｍｂｏ  ＭＰ．Ａ  ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＯＸ４０  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｆｉｔｎｅｓｓ  ｏｆ  Ｔｒｅｇ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＩＬ−２．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；４０：２９０２−１３．ｄｏｉ：１０．１００２／ｅｊｉ．２０１０４０５０５．
【非特許文献２３】Ｇｒｉｓｅｒｉ  Ｔ，Ａｓｑｕｉｔｈ  Ｍ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｃ，Ｐｏｗｒｉｅ  Ｆ．ＯＸ４０  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃｏｌｉｔｉｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１０；２０７：６９９−７０９．ｄｏｉ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２００９１６１８．
【非特許文献２４】Ｒｕｂｙ  ＣＥ，Ｙａｔｅｓ  ＭＡ，Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ−Ｃｙｍｅｒｍａｎ  Ｄ，Ｃｈｌｅｂｅｃｋ  Ｐ，Ｗｏｌｃｈｏｋ  ＪＤ，Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  ＡＮ，Ｏｆｆｎｅｒ  Ｈ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ＡＤ．Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｅｄｇｅ：ＯＸ４０  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｃａｎ  ｄｒｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｉｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｍｉｌｉｅｕ  ｉｓ  ｒｉｇｈｔ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１８３：４８５３−７．ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．０９０１１１２．
【非特許文献２５】Ｚｈａｎｇ  Ｌ，Ｃｏｎｅｊｏ−Ｇａｒｃｉａ  ＪＲ，Ｋａｔｓａｒｏｓ  Ｄ，Ｇｉｍｏｔｔｙ  ＰＡ，Ｍａｓｓｏｂｒｉｏ  Ｍ，Ｒｅｇｎａｎｉ  Ｇ，Ｍａｋｒｉｇｉａｎｎａｋｉｓ  Ａ，Ｇｒａｙ  Ｈ，Ｓｃｈｌｉｅｎｇｅｒ  Ｋ，Ｌｉｅｂｍａｎ  ＭＮ，Ｒｕｂｉｎ  ＳＣ，Ｃｏｕｋｏｓ  Ｇ．Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ，ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ，ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００３；３４８：２０３−１３．ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ０２０１７７．
【非特許文献２６】Ｇａｌｏｎ  Ｊ，Ｃｏｓｔｅｓ  Ａ，Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｃａｂｏ  Ｆ，Ｋｉｒｉｌｏｖｓｋｙ  Ａ，Ｍｌｅｃｎｉｋ  Ｂ，Ｌａｇｏｒｃｅ−Ｐａｇｅｓ  Ｃ，Ｔｏｓｏｌｉｎｉ  Ｍ，Ｃａｍｕｓ  Ｍ，Ｂｅｒｇｅｒ  Ａ，Ｗｉｎｄ  Ｐ，Ｚｉｎｚｉｎｄｏｈｏｕｅ  Ｆ，Ｂｒｕｎｅｖａｌ  Ｐ，Ｃｕｇｎｅｎｃ  ＰＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｙｐｅ，ｄｅｎｓｉｔｙ，ａｎｄ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｔｕｍｏｒｓ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６；３１３：１９６０−４．ｄｏｉ：  １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１２９１３９．
【非特許文献２７】Ｓａｒｆｆ  Ｍ，Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｄ，Ｄｈｕｎｇｅｌ  Ｂ，Ｗｅｇｍａｎｎ  ＫＷ，Ｃｏｒｌｅｓｓ  Ｃ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ＡＤ，Ｖｅｔｔｏ  ＪＴ．ＯＸ４０（ＣＤ１３４）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｓｅｎｔｉｎｅｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｅｌａｎｏｍａｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ．２００８；１９５：６２１−５；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｍｊｓｕｒｇ．２００７．１２．０３６．
【非特許文献２８】Ｘｉｅ  Ｆ，Ｗａｎｇ  Ｑ，Ｃｈｅｎ  Ｙ，Ｇｕ  Ｙ，Ｍａｏ  Ｈ，Ｚｅｎｇ  Ｗ，Ｚｈａｎｇ  Ｘ．Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｄｕｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｄｕｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ：ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−ｂａｓｅｄ  ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ．Ｐａｔｈｏｌ  Ｒｅｓ  Ｐｒａｃｔ．２０１０；２０６：７３５−９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｐｒｐ．２０１０．０５．０１６．
【非特許文献２９】Ｖｅｔｔｏ  ＪＴ，Ｌｕｍ  Ｓ，Ｍｏｒｒｉｓ  Ａ，Ｓｉｃｏｔｔｅ  Ｍ，Ｄａｖｉｓ  Ｊ，Ｌｅｍｏｎ  Ｍ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ａ．Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ  ＯＸ−４０  ｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｄｒａｉｎｉｎｇ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｄ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ．１９９７；１７４：２５８−６５．ｄｏｉ：
【非特許文献３０】Ｍａｒａｂｅｌｌｅ  Ａ，Ｋｏｈｒｔ  Ｈ，Ｓａｇｉｖ−Ｂａｒｆｉ  Ｉ，Ａｊａｍｉ  Ｂ，Ａｘｔｅｌｌ  ＲＣ，Ｚｈｏｕ  Ｇ，Ｒａｊａｐａｋｓａ  Ｒ，Ｇｒｅｅｎ  ＭＲ，Ｔｏｒｃｈｉａ  Ｊ，Ｂｒｏｄｙ  Ｊ，Ｌｕｏｎｇ  Ｒ，Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ＭＤ，Ｓｔｅｉｎｍａｎ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔｒｅｇｓ  ａｔ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｉｔｅ  ｅｒａｄｉｃａｔｅｓ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１３；１２３：２４４７−６３．ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ６４８５９．
【非特許文献３１】Ｐｅｔｔｙ  ＪＫ，Ｈｅ  Ｋ，Ｃｏｒｌｅｓｓ  ＣＬ，Ｖｅｔｔｏ  ＪＴ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ＡＤ．Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＯＸ−４０（ＣＤ１３４）．Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ．２００２；１８３：５１２−８．ｄｏｉ：
【非特許文献３２】Ｌａｄａｎｙｉ  Ａ，Ｓｏｍｌａｉ  Ｂ，Ｇｉｌｄｅ  Ｋ，Ｆｅｊｏｓ  Ｚ，Ｇａｕｄｉ  Ｉ，Ｔｉｍａｒ  Ｊ．Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｓ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４；１０：５２１−３０．ｄｏｉ：
【非特許文献３３】Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ＡＤ，Ｒｉｖｅｒａ  ＭＭ，Ｐｒｅｌｌ  Ｒ，Ｍｏｒｒｉｓ  Ａ，Ｒａｍｓｔａｄ  Ｔ，Ｖｅｔｔｏ  ＪＴ，Ｕｒｂａ  ＷＪ，Ａｌｖｏｒｄ  Ｇ，Ｂｕｎｃｅ  Ｃ，Ｓｈｉｅｌｄｓ  Ｊ．Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＯＸ−４０  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１６４：２１６０−９．ｄｏｉ：
【非特許文献３４】Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ  Ｊ，Ｔａｎａｋａ  Ｊ，Ｋｉｍ  ＪＡ，Ｒｏｔｈｃｈｉｌｄ  Ｋ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ａ，Ｓｈｕ  Ｓ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ＯＸ−４０  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ａｎａｔｏｍｉｃ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０００；６０：５５１４−２１．ｄｏｉ：
【非特許文献３５】Ｌｉｎｃｈ  ＳＮ，ＭｃＮａｍａｒａ  ＭＪ，Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＷＬ．ＯＸ４０  Ａｇｏｎｉｓｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｕｔｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐｅｄａｌ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｍｅｔａｌ．Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ．２０１５；５：３４．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｏｎｃ．２０１５．０００３４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
従来技術の問題を解消するために、本発明は、新規な抗ヒトＯＸ４０モノクローナル抗体、それをコードするポリヌクレオチド、および腫瘍治療におけるその使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１からなる群から選択される１つまたは複数の配列からなる重鎖相補性決定領域と、軽鎖相補性決定領域とを含む単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１９】
ここで、前記重鎖相補性決定領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３であるか、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３であるか、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１である。
【００２０】
ここで、前記軽鎖相補性決定領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４からなる群から選択される１つまたは複数の配列である。
【００２１】
ここで、前記軽鎖相補性決定領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６であるか、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８であるか、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４である。
【００２２】
ここで、重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含むか、重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含むか、重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含むか、重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含むか、あるいは重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４を含む。
【００２３】
ここで、前記重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に置換されている。
【００２４】
ここで、前記軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０に置換されている。
【００２５】
ここで、重鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５を含み、軽鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６を含むか、重鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７を含み、軽鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６を含むか、重鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５を含み、軽鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８を含むか、重鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７を含み、軽鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８を含むか、あるいは重鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９を含み、軽鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０を含むか、あるいは重鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９を含み、軽鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０を含む。
【００２６】
ここで、前記抗体またはその抗原結合断片がヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００２７】
ここで、前記抗体またはその抗原結合断片がラクダ化シングルドメイン抗体、二機能性抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓＦｖ２、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓ二機能性抗体、ナノボディ、ドメイン抗体または二価ドメイン抗体である。
【００２８】
ここで、さらにヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のタンパク質の定常領域を含む免疫グロブリン定常領域を含む。
【００２９】
本発明で提供される前記抗体またはその抗原結合断片が、さらにコンジュゲートを含む。
【００３０】
本発明は、前記抗体またはその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００３１】
本発明は、前記単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００３２】
本発明は、前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００３３】
本発明は、前記単離されたポリヌクレオチドを発現する条件下で、前記宿主細胞を培養することを含む前記抗体またはその抗原結合断片を発現させる方法を提供する。
【００３４】
本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合断片を含むキットを提供する。
【００３５】
本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合断片と、１種あるいは複数種の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００３６】
本発明は、ヒトまたはサルＯＸ４０の存在またはレベルの検出における、前記抗体またはその抗原結合断片の使用を提供する。
【００３７】
本発明は、ＯＸ４０アゴニストに応答する障害または状態を有する個体の検出および同定における、前記抗体またはその抗原結合断片の使用を提供する。
【００３８】
本発明は、ＯＸ４０アゴニスト治療の治療応答または疾患進行のモニタリングにおける、前記抗体またはその抗原結合断片の使用を提供する。
【００３９】
本発明は、上方制御された免疫応答から利益を得ることができる状態を治療するための薬物の製造における、前記抗体またはその抗原結合断片の使用を提供する。ここで、前記状態が癌または慢性ウイルス感染症である。
【００４０】
本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を使用することを含む、ヒトまたはサルＯＸ４０の存在またはレベルを検出する方法を提供する。
【００４１】
本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を使用することを含む、ＯＸ４０アゴニストに応答する障害または状態を有する個体を検出および同定する方法を提供する。
【００４２】
本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を使用することを含む、ＯＸ４０アゴニスト治療の治療応答または疾患進行をモニタリングする方法を提供する。
【００４３】
本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を使用することを含む、上方制御された免疫応答から利益を得ることができる状態を治療する方法を提供する。ここで、前記状態が癌または慢性ウイルス感染症である。
【００４４】
本発明は、ヒトまたはサルＯＸ４０の存在またはレベルを検出するための抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００４５】
本発明は、ＯＸ４０アゴニストに応答する障害または状態を有する個体を検出および同定する抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００４６】
本発明は、ＯＸ４０アゴニスト治療の治療応答または疾患進行をモニタリングする抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００４７】
本発明は、上方制御された免疫応答から利益を得ることができる状態を治療する抗体またはその抗原結合断片を提供する。ここで、前記状態が癌または慢性ウイルス感染症である。
【発明の効果】
【００４８】
従来技術に比べて、本発明の有益な効果は以下のとおりである。
本発明は自主的に開発したマウス由来抗ＯＸ４０抗体を改造することにより、ヒト−マウスキメラ抗ＯＸ４０モノクローナル抗体を開発し、本発明の抗体は細胞表面ＯＸ４０タンパク質と結合し、かつその下流のシグナル伝達経路を活性化し、Ｔ細胞の機能を活性化して、腫瘍または慢性ウイルス感染症の治療に可能性を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ＥＬＩＳＡ結合実験結果を示す。
【図２】ＦＡＣＳ検出抗体とＣＨＯ−ｈｓＯＸ４０との結合実験結果を示す。
【図３】ＦＡＣＳ検出抗体とＣＨＯ−ｍＯＸ４０との結合実験結果を示す。
【図４】ＯＸ４０抗体によるＪｕｒｋａｔ細胞ＮＦ−ｋＢシグナル伝達経路活性の活性化を示す。
【図５】ＯＸ４０抗体がＯＸ−４０Ｌで誘導したＪｕｒｋａｔ細胞ＮＦ−ｋＢシグナル伝達経路の活性化を競合的に抑制することを示す。
【図６】ＣＨＯ−ＯＸ４０細胞に対するＯＸ４０抗体媒介性ＰＢＭＣのＡＤＣＣ作用を示す。
【図７】ＯＸ４０抗体がＴｈ細胞の増殖を促進することを示す。異なる濃度のＯＸ４０抗体がＯＫＴ３と相乗的に作用し、ＣＤ４＋Ｔｈ細胞の増殖を促進する。
【図８】図８ａは、ＯＸ４０抗体薬物による腫瘍体積抑制の相関図を示す（＊＊Ｐ＜０．０１）。図８ｂは、ＯＸ４０抗体薬物がマウス体重に明らかな影響がないことを示す。
【図９】（ａ）は、ヒトＯＸ４０にヒト化抗体が結合したＥＬＩＳＡデータを示す。（ｂ）は、Ｊｕｒｋａｔ細胞ＮＦ−ｋＢシグナル伝達経路に対するヒト化抗体の活性化活性を示す。（ｃ）は、ＯＸ４０ヒト化トランスジェニックマウスにおけるヒト化抗体の抗腫瘍薬効を示す。
【図１０】図１０ａは、マウスにおけるＯＸ４０抗体薬物の薬物動態学的挙動を示す。図１０ｂは、カニクイザルにおけるＯＸ４０抗体薬物の薬物動態学的挙動を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本願の以下の記述は、本願の様々な実施形態を説明するためのものにすぎない。したがって、本明細書で論じられる特定の修正は、適用範囲の限定として解釈されるべきではない。当業者であれば、本願に記載された範疇内において、各種の均等物、変更例および修正例を考えやすくなり、こんな同等な実施形態は本発明の範囲に属するものと了解される。本願に引用される刊行物、特許および特許出願を含む全ての文献は、参照によりその全体が組み込まれる。
【００５１】
用語の詳細
本発明における「抗体」なる用語は、特定の抗原に結合し得る任意の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体、または二重特異性（二価）抗体を含む。１つの天然の無傷抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。各重鎖は一つの可変領域と第１、第２、第３の定常領域からなり、各軽鎖は一つの可変領域と一つの定常領域からなる。哺乳動物の重鎖はα、δ、ε、γおよびμに分けられ、哺乳動物の軽鎖はλまたはκに分けられる。抗体が「Ｙ」型であり、Ｙ型構造のネックは２つの重鎖の第２および第３の定常領域からなり、これはジスルフィド結合によって結合される。「Ｙ」型構造の各アームは１つの軽鎖の可変領域および定常領域と結合された１つの重鎖の可変領域および第１の定常領域を含む。軽鎖と重鎖の可変領域は抗原の結合を決定する。各鎖の可変領域は相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの超可変領域を含む。軽鎖（Ｌ）のＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、重鎖（Ｈ）のＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む。本発明に開示される抗体および抗原結合断片のＣＤＲ境界はＫａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ命名法によって命名または認識することができる。（ＡＩ−Ｌａｚｉｋａｎｉ，Ｂ．，Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３（４）：９２７（１９９７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８６（３）：６５１−６３（１９８５）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．等，Ｎａｔｕｒｅ，３４２（６２５２）：８７７−８３（１９８９）；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．等，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。ここで、３つのＣＤＲは、ＣＤＲよりも高度に保存され、ステント支持超可変リングを形成するフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる側部連続部によって分離されている。重鎖および軽鎖の定常領域は抗原結合とは無関係であるが、様々なエフェクター機能を有する。抗体は重鎖定常領域のアミノ酸配列によっていくつかのクラスに分類することができる。抗体は、α、δ、ε、γおよびμ重鎖を含むか否かに応じて、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの５つの主要な分類または異性体にそれぞれ分けることができる。いくつかの主要な抗体分類はまた、ＩｇＧ１（γ１重鎖）、ＩｇＧ２（γ２重鎖）、ＩｇＧ３（γ３重鎖）、ＩｇＧ４（γ４重鎖）、ＩｇＡ１（α１重鎖）またはＩｇＡ２（α２重鎖）などのサブクラスに分けることができる。
【００５２】
本願における「抗原結合断片」なる用語は、１つあるいは複数のＣＤＲを含む抗体部分、または抗原に結合するが完全な抗体構造を有さない任意の他の抗体断片から形成される抗体断片を指す。抗原結合断片の例としては、限定されないが、例えば、二機能性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド結合安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド結合安定化二機能性抗体（ｄｓ  ｄｉａｂｏｄｙ）、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（二価の二機能性抗体）、二価一本鎖抗体（ＢｓＦｖ）、多特異性抗体、ラクダ化シングルドメイン抗体（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ナノボディ、ドメイン抗体、および二価ドメイン抗体が挙げられる。抗原結合断片は親抗体と同じ抗原に結合することができる。特定の実施形態では、抗原結合断片は、特定のヒト抗体からの１つあるいは複数のＣＤＲを含み、１つあるいは複数の異なるヒト抗体からのフレームワーク領域に転送することができる。
【００５３】
抗体の「Ｆａｂ」断片は、１つの軽鎖（可変領域および定常領域を含む）、および１つの重鎖の可変領域、および定常領域の一部がジスルフィド結合を介して結合している抗体分子の部分を指す。
【００５４】
「Ｆａｂ’」断片は、ヒンジ領域の一部を含むＦａｂ断片を指す。
【００５５】
「Ｆ（ａｂ’）２」は、Ｆａｂの二量体を指す。
【００５６】
抗体のＦｃセグメントは、ＡＤＣＣおよびＣＤＣなどの様々な異なるエフェクター機能を担うが、抗原結合には関与しない。
【００５７】
抗体の「Ｆｖ」セグメントは、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片を指す。Ｆｖ断片は、１つの軽鎖の可変領域と１つの重鎖の可変領域とからなる。
【００５８】
「一本鎖Ｆｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とが直接または１つのペプチド鎖を介して連結された工学抗体を指す（Ｈｕｓｔｏｎ  ＪＳ等，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８５：５８７９（１９８８））。
【００５９】
「一本鎖抗体Ｆｖ−Ｆｃ」または「ｓｃＦｖ−Ｆｃ」は、ある抗体Ｆｃセグメントに結合したｓｃＦｖからなる工学抗体を指す。
【００６０】
「ラクダ化シングルドメイン抗体（Ｃａｍｅｌｉｚｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、「重鎖抗体」または「ＨＣＡｂ（Ｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎ−ｏｎｌｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＨＣＡｂ）」はいずれも２つのＶＨドメインを含むが、軽鎖を含まない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．およびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２３１（１−２）：２５−３８（１９９９）；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ．，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４（４）：２７７−３０２（２００１）；Ｗ０９４／０４６７８；Ｗ０９４／２５５９１；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，００５，０７９）。重鎖抗体は、最初にパカ科（ラクダ、ヒトコブラクダ、およびアメリカ大陸アルパカ）に由来する。軽鎖の欠失にもかかわらず、ラクダ化抗体（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）は、抗原結合の全機能を確証する（ＨａｍｅｒｓＣａｓｔｅｒｍａｎ  Ｃ．等，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３（６４２８）：４４６−８（１９９３）；Ｎｇｕｙｅｎ  ＶＫ．等，“Ｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃａｍｅｌｉｄａｅ：ａ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．５４（１）：３９−４７（２００２）；Ｎｇｕｙｅｎ  ＶＫ．等，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１０９（１）：９３１０１（２００３））。重鎖抗体の可変領域（ＶＨドメイン）は、既知の最小の獲得免疫による抗原結合単位である（Ｋｏｃｈ−Ｎｏｌｔｅ  Ｆ．等，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２１（１３）：３４９０−８．Ｅｐｕｂ（２００７））。
【００６１】
「ナノボディ」は、重鎖抗体からの１つのＶＨドメインおよび２つの定常領域ＣＨ２およびＣＨ３からなる抗体断片を指す。
【００６２】
「二機能性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）」は、同じポリペプチド鎖に連結されたＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を含む（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．等，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９０（１４）：６４４４−８（１９９３）；ＥＰ４０４０９７；Ｗ０９３／１１１６１を参照されたい）。２つのドメイン間のアダプターは非常に短く、同じ鎖上の２つのドメインを互いにペアにすることができないため、２つのドメインを他の２つの鎖の相補ドメインとペアにさせ、２つの抗体結合部位を形成させる。これらの２つの抗体結合部位は、同じ抗原または異なる抗原（または抗原エピトープ）に標的結合することができる。
【００６３】
「ドメイン抗体」は、１つの重鎖可変領域または１つの軽鎖可変領域のみを含む抗体断片を指す。いくつかの場合において、２つ以上のＶＨドメインは、１つのポリペプチドアダプターによって共有結合され、二価ドメイン抗体を形成する。二価ドメイン抗体の２つのＶＨドメインは、同じ抗原または異なる抗原に標的化することができる。
【００６４】
特定の実施形態では、「（ｄｓＦｖ）２」は、２つのＶＨ遺伝子間が１つのポリペプチドアダプターによって連結され、ジスルフィド結合を介して２つのＶＬ基に結合する３つのペプチド鎖を含む。
【００６５】
特定の実施形態では、「二重特異性ｄｓ二機能性抗体」は、ＶＬ１−ＶＨ２（２つのポリペプチドアダプターによって連結された）およびＶＨ１−ＶＬ２（２つのポリペプチドアダプターによって連結された）を含み、両者はＶＨ１とＶＬｌの間でジスルフィド結合により結合する。
【００６６】
「二重特異性ｄｓＦｖ」または「ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ」は、ＶＨ１−ＶＨ２基では、両方の重鎖がポリペプチドアダプター（例えば、長いエラストマーアダプター）によって連結され、そして、ジスルフィド結合を介してそれぞれＶＬ１およびＶＬ２基に結合し、ジスルフィド結合を介してペアする各重鎖軽鎖が異なる抗原特異性を有する３つのポリペプチド鎖を含む。
【００６７】
特定の実施形態では、「ｓｃＦｖ二量体」は、二量化された２つのＶＨ−ＶＬ（ポリペプチドアダプターによって連結された）基を含む二価二機能性抗体または二価一本鎖抗体（ＢｓＦｖ）であり、２つの基のＶＨは、他方の基のＶＬと協働して、同じ抗原（または抗原エピトープ）または異なる抗原（または抗原エピトープ）に標的結合できる２つの結合部位を形成する。別の実施形態では、「ｓｃＦｖ二量体」は、互いに連結されたＶL1−ＶH2（ポリペプチドアダプターによって連結された）およびＶH1−ＶL2（ポリペプチドアダプターによって連結された）を含む二重特異性二機能性抗体であり、ここで、ＶH1およびＶL1は協働し、ＶH2およびＶL2は協働し、各協働のペアは異なる抗原特異性を有する。
【００６８】
本願で使用される「完全ヒト」なる用語は、抗体または抗原結合断片に使用される場合、前記抗体または抗原結合断片があるアミノ酸配列を有するか、または前記アミノ酸配列からなることを意味し、前記アミノ酸配列は、ヒトまたはヒト免疫細胞から産生された、またはヒト化抗体ライブラリーを利用するトランスジェニック非ヒト動物などの非ヒト由来抗体のアミノ酸配列、またはヒト化抗体をコードする他の配列に対応する。特定の実施形態では、完全ヒト抗体は、非ヒト抗体由来のアミノ酸残基（特に抗原結合残基）を含まない。
【００６９】
本願で使用される「ヒト化」なる用語は、抗体または抗原結合断片に使用される場合、非ヒト動物由来のＣＤＲ、ヒト由来のＦＲ領域、およびヒト由来の定常領域（適用する場合）を含む抗体または抗原結合断片を意味する。ヒト化抗体または抗原結合断片は、免疫原性が低下しているため、特定の実施形態ではヒトの治療剤として使用することができる。いくつかの実施形態では、前記非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、またはハムスターなどの哺乳動物である。いくつかの実施形態では、前記ヒト化抗体または抗原結合断片は、ＣＤＲ配列が非ヒト由来であることを除き、基本的に全てヒト化配列からなる。いくつかの実施形態では、前記ヒト由来のＦＲ領域は、それが由来するヒト化抗体と同じアミノ酸配列を含むことができ、またはいくつかのアミノ酸変化、例えば、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個以下のアミノ酸の変化を含んでもよい。いくつかの実施形態では、該アミノ酸変化は、重鎖ＦＲ領域にのみ存在してもよく、軽鎖ＦＲ領域にのみ存在してもよく、または両方の鎖に存在してもよい。いくつかの好ましい実施形態では、前記ヒト化抗体は、ヒト化ＦＲｌ−３およびヒト化ＪＨおよびＪＫを含む。
【００７０】
本願で使用される「キメラ」なる用語は、１つの種に由来する重鎖および／または軽鎖の一部を有し、前記重鎖および／または軽鎖の残りが異なる種に由来する抗体または抗原結合断片を指す。例示的な例では、キメラ抗体は、ヒト由来の定常領域と、マウスなどの非ヒト動物由来の可変領域とを含むことができる。
【００７１】
「ＯＸ４０」なる用語は、ＯＸ４０Ｌに結合する受容体を指す。それはＴＮＦ受容体ファミリーに属するＩ型膜タンパク質である。その他の名称は、ＡＣＴ−４、ＯＸ４０Ｌ受容体、ＣＤ１３４抗原、ＡＣＴ３５抗原、ＴＮＦＲＳＦ４である。これは、５０ｋＤａの分子量を有し、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔに保存され、登録番号がＰ４３４８９である。
【００７２】
本願で使用される「抗ＯＸ４０抗体」は、診断および／または治療用途を提供するのに十分な親和性でＯＸ４０（例えば、ヒトまたはサルＯＸ４０）に特異的に結合することができる抗体を意味する。
【００７３】
本願における「特異的結合」または「特異的な結合」は、２分子間の非ランダム結合反応、例えば抗体と抗原との間の反応を意味する。特定の実施形態では、本願の抗体またはその抗原結合断片は、ヒトおよび／またはサルＯＸ４０に特異的に結合し、その結合親和性（ＫD）が≦１０-6Ｍである。本願におけるＫDは、解離速度と結合速度との比（ｋoff／ｋon）を意味し、例えばＢｉａｃｏｒｅのような器具を使用して、表面プラズモン共鳴法によって測定することができる。
【００７４】
本願で使用される「ＭＴ０１−Ｌ１」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示す重鎖可変領域、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示す軽鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ１／κアイソタイプ定常領域を有するヒト−マウスキメラモノクローナル抗体である。
【００７５】
本願で使用される「ＭＴ０１−Ｌ１（Ｍ１）」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に示す重鎖可変領域、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示す軽鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ１／κアイソタイプ定常領域を有するヒト−マウスキメラモノクローナル抗体である。
【００７６】
本願で使用される「ＭＴ０１−Ｌ１（Ｍ２）」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示す重鎖可変領域、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に示す軽鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ１／κアイソタイプ定常領域を有するヒト−マウスキメラモノクローナル抗体である。
【００７７】
本願で使用される「ＭＴ０１−Ｌ１（Ｍ１／Ｍ２）」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に示す重鎖可変領域、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に示す軽鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ１／κアイソタイプ定常領域を有するヒト−マウスキメラモノクローナル抗体である。
【００７８】
本願で使用される「ＭＴ０１−Ｌ１（Ｇ２）」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示す重鎖可変領域、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示す軽鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ２／κアイソタイプ定常領域を有するヒト−マウスキメラモノクローナル抗体である。
【００７９】
本願で使用される「ＭＴ０１−Ｌ２」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示す重鎖可変領域、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０に示す軽鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ１／λアイソタイプ定常領域を有するヒト−マウスキメラモノクローナル抗体である。
【００８０】
本願で使用される「ＭＴ０１−Ｌ２（Ｇ２）」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示す重鎖可変領域、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０に示す軽鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ２／λアイソタイプ定常領域を有するヒト−マウスキメラモノクローナル抗体である。
【００８１】
本願で使用される「ＭＴ０１−Ｃ１」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に示す重鎖可変領域、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０に示す軽鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ１／κアイソタイプ定常領域を有するヒト化モノクローナル抗体である。
【００８２】
本願で使用される「ＭＴ０１−Ｃ１（Ｇ２）」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に示す重鎖可変領域、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０に示す軽鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ２／κアイソタイプ定常領域を有するヒト化モノクローナル抗体である。
【００８３】
本願において、「保守的な置換」がアミノ酸配列で使用される場合、１つのアミノ酸残基を、類似の物理化学的性質を有する別の側鎖のアミノ酸残基で置換することを意味する。例えば、疎水性側鎖アミノ酸残基間（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、ＶａＬ、ＬｅｕおよびＩｌｅ）、中性親水性側鎖残基間（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎ）、酸性側鎖残基間（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、塩基性側鎖アミノ酸間（例えば、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇ）、または芳香側鎖残基間（例えば、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）は、保守的に置換される。保守的な置換は、通常、タンパク質の立体構造の有意な変化を引き起こさず、したがってタンパク質の生物学的活性を保持することができることが当該技術分野で知られている。
【００８４】
アミノ酸配列（または核酸配列）に「パーセント配列同一性」を用いる場合には、配列アラインメントを行い、必要に応じて同一アミノ酸（または核酸）の数が最大となるように間隔を導入した後、候補配列において、参照配列と同じアミノ酸（または核酸）残基は、前記候補配列のアミノ酸（または核酸）残基のパーセントを占めることを意味する。前記アミノ酸残基の保守的な置換は、同一の残基と見なされてもされなくてもよい。配列は、アミノ酸（または核酸）配列のパーセント配列同一性を決定するために、当該技術分野で開示されているツールによって配列アラインメントすることができる。当業者は、例えば適切なアルゴリズムを選択することによって、前記ツールのデフォルトパラメータを使用してもよいし、アラインメントの必要に応じてパラメータを適切に調整してもよい。
【００８５】
本願で使用される「Ｔ細胞」には、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔヘルパー１型Ｔ細胞、Ｔヘルパー２型Ｔ細胞、Ｔヘルパー１７型Ｔ細胞および抑制性Ｔ細胞が含まれる。
【００８６】
本願で使用される「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域が、そのエフェクター、例えば、Ｃ１複合体およびＦｃ受容体に結合する生物学的活性を指す。例示的なエフェクター機能は、抗体とＣ１複合体上のＣ１ｑとの相互作用によって誘導される補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体のＦｃ領域とエフェクター細胞上のＦｃ受容体との結合によって誘導される抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および貪食を含む。
【００８７】
本願における「癌」または「癌状態」は、腫瘍または悪性細胞の成長、増殖または転移によって媒介され、固形腫瘍および白血病などの非固形腫瘍を誘発する任意の医学的状態を意味する。本発明における「腫瘍」は、腫瘍および／または悪性細胞の実体物質を意味する。
【００８８】
ある状態に対する「治療」または「療法」は、ある状態を予防または軽減し、ある状態が勃興または進行する速度を低下させ、ある状態に発展するリスクを減少させ、ある状態に関連する症状の進行を予防または遅延させ、ある状態に関連する症状を減少または終息させ、ある状態の完全または部分的な逆転を生じさせ、ある状態を治癒させる、あるいは以上の組み合わせを含む。癌の場合、「治療」または「療法」は、腫瘍または悪性細胞の成長、増殖、または転移、またはこれらのいくつかの組合せを抑制または遅延させることを意味する場合がある。腫瘍の場合、「治療」または「療法」は、腫瘍の全部または一部を除去すること、腫瘍の成長および転移を抑制または遅延させること、腫瘍の進行を予防または遅延させること、またはこれらのいくつかの組み合わせを含む。
【００８９】
「単離された」物質は、人工的に自然状態から変化した。ある「単離された」物質または成分が自然界に存在する場合、それは元の状態から変更または離脱されているか、またはその両方が発生している。例えば、ある生体動物の体内に天然に存在するポリヌクレオチドやポリペプチドは単離されていないが、これらのポリヌクレオチドやポリペプチドが天然状態で共存する物質と十分に単離し、十分に純粋な状態で存在していれば、「単離されている」と考えることができる。特定の実施形態では、抗体および抗原結合断片の純度は、少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であり、電気泳動法（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動）、またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相ＨＰＬＣ）によって決定される。
【００９０】
本発明において「ベクター」は、あるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを操作的に挿入し、そのタンパク質を発現させることができる運送工具を意味する。ベクターは、保有する遺伝物質要素が宿主細胞内で発現されるように、宿主細胞を形質転換、形質導入またはトランスフェクトするために使用することができる。例えば、ベクターは、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などの人工染色体、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）、λファージやＭ１３ファージなどのファージ、および動物ウイルスなどが挙げられる。ベクターとして使用される動物ウイルスの種類は、レトロウイルス（レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）を含む）である。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択要素、およびレポーター遺伝子のような発現を制御する様々な要素を含むことができる。さらに、ベクターは複製開始部位を含んでもよい。ベクターはまた、これらに限定されないが、ウイルス粒子、リポソーム、またはタンパク質外殻のような細胞へのアクセスを助ける成分を含むことができる。
【００９１】
本発明における「宿主細胞」は、外来ポリヌクレオチドおよび／またはベクターが導入された細胞である。
【００９２】
本発明における「ＯＸ４０に関連するかまたは関係する疾患」は、ＯＸ４０の発現または活性の増加または減少に起因する、増悪または他の関連する任意の状態を意味する。
【００９３】
本発明における「治療上有効な量」または「有効な用量」は、ある薬物がヒトＯＸ４０に関連する疾患または状態を治療するのに有効な用量または濃度を意味する。例えば、本発明で開示される抗体またはその抗原結合断片の使用に関して、治療上有効な量は、該用量または濃度で、該抗体または抗原結合体は腫瘍の全部または一部の除去、腫瘍の成長の抑制または遅延、癌状態を媒介する細胞の成長または増殖の抑制、腫瘍細胞転移の抑制、腫瘍または癌状態に関連する任意の症状またはマーカーの軽減、腫瘍または癌状態の進行の予防または遅延、またはこれらの組み合わせの機能を果たすことができる。
【００９４】
「薬学的に許容される」は、一般に化学的および／または物理的に製剤中の他の成分と適合性があり、生理学的に受容者と適合性がある担体、溶媒、希釈剤、賦形剤および／または塩を意味する。
【００９５】
（抗ＯＸ４０抗体について）
特定の実施形態では、本願は、例示的なモノクローナル抗体ＭＴ０１−Ｌ１、ＭＴ０１−Ｌ１（Ｍ１）、ＭＴ０１−Ｌ１（Ｍ２）、ＭＴ０１−Ｌ１（Ｍ１／Ｍ２）、ＭＴ０１−Ｌ１（Ｇ２）、ＭＴ０１−Ｌ２およびＭＴ０１−Ｌ２（Ｇ２）、ＭＴ０１−Ｃ１およびＭＴ０１−Ｃ１（Ｇ２）を提供する。そのＣＤＲ配列を表１に示し、重鎖または軽鎖相補性決定領域配列を以下に示す。
【００９６】
【表１】
2021514198.tif 000002
【００９７】
いくつかの実施形態では、前記抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、７、９、１０および１１からなる群から選択される重鎖相補性決定領域配列を含む。いくつかの実施形態では、前記抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、５、６、８、１２、１３および１４からなる群から選択される軽鎖相補性決定領域配列を含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、前記抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含む重鎖相補性決定領域、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含む重鎖相補性決定領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１を含む重鎖相補性決定領域からなる群から選択される重鎖相補性決定領域を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、前記抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含む軽鎖相補性決定領域、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含む軽鎖相補性決定領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４を含む軽鎖相補性決定領域からなる群から選択される軽鎖相補性決定領域を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、前記抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片は、ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含む重鎖相補性決定領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含む軽鎖相補性決定領域を含むか、ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含む重鎖相補性決定領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含む軽鎖相補性決定領域を含むか、ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含む重鎖相補性決定領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含む軽鎖相補性決定領域を含むか、ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含む重鎖相補性決定領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含む軽鎖相補性決定領域を含むか、あるいは、ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１を含む重鎖相補性決定領域、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４を含む軽鎖相補性決定領域を含む。
【０１０１】
本願で使用される「ＭＴ０１−Ｌ１」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示す重鎖可変領域、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示す軽鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ１／κアイソタイプ定常領域を有するヒト−マウスキメラモノクローナル抗体である。
【０１０２】
本願で使用される「ＭＴ０１−Ｌ１（Ｍ１）」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に示す重鎖可変領域、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示す軽鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ１／κアイソタイプ定常領域を有するヒト−マウスキメラモノクローナル抗体である。
【０１０３】
本願で使用される「ＭＴ０１−Ｌ１（Ｍ２）」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示す重鎖可変領域、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に示す軽鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ１／κアイソタイプ定常領域を有するヒト−マウスキメラモノクローナル抗体である。
【０１０４】
本願で使用される「ＭＴ０１−Ｌ１（Ｍ１／Ｍ２）」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に示す重鎖可変領域、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に示す軽鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ１／κアイソタイプ定常領域を有するヒト−マウスキメラモノクローナル抗体である。
【０１０５】
本願で使用される「ＭＴ０１−Ｌ１（Ｇ２）」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示す重鎖可変領域、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示す軽鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ２／κアイソタイプ定常領域を有するヒト−マウスキメラモノクローナル抗体である。
【０１０６】
本願で使用される「ＭＴ０１−Ｌ２」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示す重鎖可変領域、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０に示す軽鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ１／λアイソタイプ定常領域を有するヒト−マウスキメラモノクローナル抗体である。
【０１０７】
本願で使用される「ＭＴ０１−Ｌ２（Ｇ２）」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示す重鎖可変領域、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０に示す軽鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ２／λアイソタイプ定常領域を有するヒト−マウスキメラモノクローナル抗体である。
【０１０８】
本願で使用される「ＭＴ０１−Ｃ１」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に示す重鎖可変領域、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０に示す軽鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ１／κアイソタイプ定常領域を有するヒト化モノクローナル抗体である。
【０１０９】
本願で使用される「ＭＴ０１−Ｃ１（Ｇ２）」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に示す重鎖可変領域、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０に示す軽鎖可変領域、およびヒトＩｇＧ２／κアイソタイプ定常領域を有するヒト化モノクローナル抗体である。
【０１１０】
当業者は、前述のＣＤＲ配列が、１つまたは複数のアミノ酸の置換を含むように修飾され得、それにより、生物学的活性の向上、例えば、ヒトＯＸ４０との結合親和性の向上がもたらされることを理解できる。例えば、抗体変異体ライブラリー（例えば、ＦａｂまたはＦｃＦｖ変異体）は、ファージディスプレイ技術を用いて作製および発現され、その後、ヒトＯＸ４０と親和性のある抗体がスクリーニングされ得る。別の例では、ヒトＯＸ４０への前記抗体の結合をコンピュータソフトウェアでシミュレートし、抗体上の結合界面を形成するアミノ酸残基を同定することができる。これらの残基の置換は、結合親和性の低下を防ぐために回避され得るか、または、より強力な結合を形成するためにこれらの残基を標的化し得る。特定の実施形態では、ＣＤＲ配列の少なくとも１つ（または全て）の置換は、保守的な置換である。
【０１１１】
特定の実施形態では、前記抗体および抗原結合断片は、表１に列挙された配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を持ち、かつ基本的に同一の配列を有するが、対応するＣＤＲ配列が表１に列挙された配列と１００％の配列同一性を持つその親抗体と同様のまたはそれよりも高いヒトＯＸ４０との結合親和性を保持する１つまたは複数のＣＤＲ配列を含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、本願に記載の抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片は、表面プラズモン共鳴法によって測定することで、≦１０-7Ｍの結合親和性（Ｋｄ）でヒトＯＸ４０に特異的に結合することができることが見出された。結合親和性値は、抗原と抗原結合分子との結合が平衡に達したときの解離速度と結合速度との比（ｋoff／ｋon）から計算されるＫD値で表すことができる。前記抗原結合親和性（例えば、ＫD）は、例えばＢｉａｃｏｒｅのような器具を用いたプラズモン共鳴結合法を含む当該技術分野で公知の適切な方法によって適切に決定することができる。
【０１１３】
特定の実施形態では、本願に記載の抗体およびその抗原結合断片は、１０ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬのＥＣ５０（すなわち、半数結合濃度）でヒトＯＸ４０に結合する。ヒトＯＸ４０への前記抗体の結合は、ＥＬＩＳＡなどのサンドイッチ法、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット、ＦＡＣＳまたは他の結合試験などの当該技術分野で公知の方法によって測定することができる。代表的な例では、固定化されたヒトＯＸ４０またはヒトＯＸ４０を発現する細胞に被測定抗体（すなわち、一次抗体）を結合させた後、未結合抗体を洗い流し、標識された二次抗体を導入し、それは一次抗体と結合することができ、したがって結合した二次抗体を検出することができる。前記検出は、固定化されたＯＸ４０を使用する場合には、エライザプレート上で行うことができ、またはヒトＯＸ４０を発現する細胞を使用する場合には、ＦＡＣＳ分析を使用して行うことができる。
【０１１４】
特定の実施形態では、本願に記載の抗体およびその抗原結合断片は、０．１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ（ＦＡＣＳ分析を用いて測定）のＥＣ５０（すなわち、５０％の有効濃度）でヒトＯＸ４０に結合する。
【０１１５】
特定の実施形態では、本願に記載の抗体およびその抗原結合断片は、ヒトＯＸ４０シグナル伝達経路を活性化することができ、それにより、例えば、活性化Ｔ細胞のサイトカイン産生の誘導（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞）、活性化Ｔ細胞の増殖の誘導（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞）、および調節性Ｔｒｅｇの抑制性機能の逆転を含む生物学的活性を提供する。
【０１１６】
前記抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片は、ヒトＯＸ４０に特異的である。特定の実施形態では、前記抗体およびその抗原結合断片は、マウスＯＸ４０に結合しないが、ヒトＯＸ４０と類似の結合親和性でサルＯＸ４０に結合する。例えば、マウスＯＸ４０への例示的な抗体ＭＴ０１−Ｌ１およびＭＴ０１−Ｌ２の結合は、ＦＡＣＳ分析などの一般的な結合測定法では検出できないが、ＦＡＣＳはこれらの抗体がヒトＯＸ４０と類似の親和性またはＥＣ５０値でサルＯＸ４０に結合することを検出する。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、前記抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片は、低減または排除されたエフェクター機能を有するＩｇＧ２アイソタイプ定常領域を有する。例えば、ＡＤＣＣおよびＣＤＣなどのエフェクター機能は、ＯＸ４０を発現する細胞に対する細胞毒性をもたらすことができる。いくつかの正常な細胞は、ＯＸ４０を発現することができる。これらの正常な細胞に対する潜在的な望ましくない毒性を回避するために、本発明に記載の抗体およびその抗原結合断片の特定の実施形態は、低減またはさらに排除されたエフェクター機能を有する。当業者が容易に選択できるＦｃ受容体結合試験、補体Ｃｌｑ結合実験、および細胞分裂法などのＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性を推定するための多数のアッセイが知られている。理論に束縛されるものではないが、ＡＤＣＣやＣＤＣなどのエフェクター機能を低減または排除する抗体は、ＯＸ４０を発現する細胞（例えば、それらの正常な細胞）に対する細胞毒性を引き起こしたり、最小化したりしないと考えられる。そのために望ましくない副作用を避けることができる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本願に記載の抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片は、副作用を低減する。例えば、前記抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片は、完全ヒトＩｇＧ配列を有することができるので、その免疫原性がヒト化抗体よりも低い。さらに例えば、前記抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを除去するためにＩｇＧ２またはＩｇＧ４の形態を有することができる。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本願に記載の抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片は、腫瘍細胞、精製された腫瘍抗原、および免疫刺激因子をコードするものでトランスフェクトされた細胞、腫瘍ワクチンなどの免疫原性を有する物質との併用が可能であるという利点がある。さらに、前記抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片は、標準化学療法および放射線療法、標的ベースの小分子療法、他の新興免疫チェックポイント調節剤療法を含む併用療法に含まれ得る。いくつかの実施形態では、前記抗体およびその抗原結合断片は、抗体−薬物のコンジュゲート、二重特異性または多価抗体のベース分子として使用することができる。
【０１２０】
本願に記載の抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、二重特異性抗体、標識抗体、二価抗体または抗イディオタイプ抗体であり得る。組換え抗体は、動物の代わりに組換え法を用いてインビトロで作製された抗体である。二重特異性抗体または二価抗体は、２つの異なる抗原に結合できる、２つの異なるモノクローナル抗体の断片を有する人工抗体である。「二価」抗体およびその抗原結合断片は、２つの抗原結合部位を含む。２つの抗原結合部位は、同じ抗原に結合してもよく、またはそれぞれ異なる抗原に結合してもよく、この場合、抗体または抗原結合断片は、「二重特異性」である。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、本願に記載の抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片は、完全ヒト抗体である。いくつかの実施形態では、前記完全ヒト抗体は、組換え法を用いて作製される。例えば、マウスなどのトランスジェニック動物は、ヒト由来免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックまたはトランスジェニック染色体を担持するように作製することができ、したがって、ヒトＯＸ４０などの適切な抗原で免疫した後に、完全ヒト抗体を産生することができる。完全ヒト抗体は、そのようなトランスジェニック動物から単離されてもよく、または加えて、前記トランスジェニック動物の脾臓細胞を不死細胞系と融合させて、前記完全ヒト抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を生成するハイブリドーマ技術によって作製されてもよい。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本願に記載の抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片は、ラクダ化シングルドメイン抗体（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、二機能性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓ二機能性抗体（ｄｓ  ｄｉａｂｏｄｙ）、ナノボディ、ドメイン抗体、または二価ドメイン抗体である。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、本願に記載の抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片は、免疫グロブリン定常領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、重鎖および／または軽鎖定常領域を含む。前記重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ１−ＣＨ２またはＣＨ１−ＣＨ３領域を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、所望の特性を得るための１つまたは複数の修飾をさらに含むことができる。例えば、前記定常領域は、ＦｃＲｎ受容体の結合を増強するか、または１つまたは複数のシステイン残基を導入するために、１つまたは複数のエフェクター機能を低減または排除するように修飾され得る。
【０１２４】
特定の実施形態では、前記抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片は、コンジュゲートをさらに含む。本発明における抗体またはその抗原結合断片は、様々なコンジュゲートに連結できる（例えば、「Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｍ．Ｃｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ、Ｊｒ．（ｅｄｓ．）、Ｃａｒｇｅｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）参照）。これらのコンジュゲートは、共有結合、親和性結合、埋め込み、同等結合（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、錯化、結合、混合、または添加などの他の手段によって、前記抗体または抗原結合体に連結され得る。特定の実施形態では、本発明に開示される抗体および抗原結合断片は、１つまたは複数のコンジュゲートに結合するために使用され得るエピトープ結合部分以外の特定の部位を含むように操作され得る。例えば、そのような部位は、結合体との共有結合を促進するために、システイン残基およびヒスチジン残基などの１つまたは複数の反応性アミノ酸残基を含んでもよい。特定の実施形態では、抗体は、コンジュゲートに間接的に、または別のコンジュゲートを介して連結することができる。例えば、前記抗体またはその抗原結合断片は、ビオチンに結合し、次いで、アビジンに連結された第２のコンジュゲートに間接的に結合することができる。前記コンジュゲートは、検出可能な標識、薬物動態学的修飾部分、精製部分、または細胞毒性部分であってもよい。検出可能な標識の例としては、検出のために、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリスリン、またはテキサスレッド）、酵素基質標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖酸化酵素、またはβ−Ｄガラクトキシラーゼ）、安定同位体または放射性同位体、発色団部分、ジゴキシン、ビオチン／アビジン、ＤＮＡ分子または金が挙げられる。特定の実施形態では、前記コンジュゲートは、抗体の半減期の延長を助けるＰＥＧなどの薬物動態学的修飾部分であってもよい。他の適切なポリマーとしては、例えば、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体などが挙げられる。特定の実施形態では、前記コンジュゲートは、精製部分、例えば磁気ビーズであってもよい。「細胞毒性部分」は、細胞に有害であるか、または細胞を損傷または死滅させる可能性のある任意の薬剤であり得る。細胞毒性部分の例としては、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エリスリン、マイトマイシン、エトプシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、ｌ−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシンおよびそれらの類似体、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプ��ン、６−メルカプトグアニン、シタラビン、５フルオロウラシルダカルバ）、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード、チオテパクロランブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミンプラチナ（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン系抗生物質（例えば、ダウノルビシン（旧ダウノマイシン）およびアドリアマイシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアンピシリン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）を含むが、これらに限定されない。
【０１２５】
ポリヌクレオチドおよび組換え法
当該技術分野で公知の遺伝工学技術を用いて、表１のアミノ酸配列を対応するＤＮＡコード配列に変換することができる。遺伝子コードの縮退性のため、変換されたＤＮＡ配列は完全に一致し得るが、コードされたタンパク質配列は不変のままである。
【０１２６】
当該技術分野で公知の組換え技術を用いて、前記抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片（例えば、表１に示す配列を含む）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、クローニング（ＤＮＡの増幅）または遺伝子発現のために宿主細胞に導入することができる。別の実施形態では、前記抗体は、当該技術分野で公知の相同組換えの方法によって作製することができる。前記モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の方法（例えば、前記抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを使用することができる）によって単離および配列決定することができる。複数のベクターから選択可能である。ベクター成分は、典型的には、限定されないが、シグナル配列、複製開始点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサー配列、プロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ−１ａ）、および転写終結配列の二種類以上を含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、前記ベクター系は、哺乳動物、細菌、酵母系などを含み、かつ限定されないが、プラスミドｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＬｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＬｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ、ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ−Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ４２０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２などの実験室から入手可能なまたは市販されている他のベクターを含む。適切なベクターは、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、複製欠損型レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含むことができる。
【０１２８】
前記抗体およびその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを、クローニングまたは遺伝子発現のために宿主細胞に導入することができる。前記ベクター中のＤＮＡをクローニングまたは発現するために本発明において有用な宿主細胞は、原核細胞、酵母、または上記の高級真核細胞である。本発明での使用に適した原核細胞には、例えば、大腸菌、腸内細菌属、エルビニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、ネズミチフス菌などのサルモネラ属、セラチア・マルセッセンスなどのセラチア属、および赤痢菌属、ならびに枯草菌やバチルスリケニフォルミスなどのバチルス属、緑ペプチドバクテリウムやストレプトマイセスなどのシュードモナスなどの腸内細菌科が挙げられる、グラム陰性菌やグラム陽性菌などの真細菌が含まれる。
【０１２９】
原核細胞以外にも、糸状菌や酵母などの真核微生物も、宿主細胞における抗ＯＸ４０抗体をコードするクローニングまたは発現ベクターとして用いることができる。サッカロミセス酵母、またはパン酵母は、最も一般的に使用される下等真核宿主微生物である。しかし、多くの他の属、種および株はより一般的に使用され、本発明において有用であり、例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロマイセス属乳酵母、クルイベロマイセス・フラジリス（ＡＴＣＣ１２，４２４）、クルイベロマイセス・ブルガリクス（ＡＴＣＣ１６，０４５）、クルイベロマイセス・ウィルソニー（ＡＴＣＣ２４，１７８）、クルイベロマイセス・セレビシエ（ＡＴＣＣ５６，５００）、クルイベロマイセス・ドロソフィラルム（ＡＴＣＣ３６，９０６）、クルイベロマイセス・サーモトレランスおよびクルイベロマイセス・マルシアヌス：ヤロウィア・リポリティカ（ＥＰ４０２，２２６）などのクルイベロマイセス属宿主、ピキア・パストリス（ＥＰ１８３，０７０）、カンジダ：トリコデルマ・レセイ（ＥＰ２４４，２３４）、アカパンカビ、シュワニオミセス・オキシデンタリスなどのシュワニオミセス・オキシデンタリス、およびニューロスポラ、ペニシリウム、クルブラリアおよびアスペルギルス・ニデュランスやアスペルギルス・ニジェールなどのアスペルギルスなどの糸状菌が挙げられる。
【０１３０】
グリコシル化抗体またはその抗原結合断片の発現に適した本発明で提供される宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎細胞の例には、植物細胞および昆虫細胞が含まれる。バキュロウイルス株（ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ  ｓｔｒａｉｎｓ）およびその変異体ならびに対応する許可昆虫宿主細胞（ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ  ｉｎｓｅｃｔ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌｓ）は、例えば、ツマジロクサヨトウ（毛虫）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）、およびカイコなどの宿主に多く見られる。トランスフェクションに使用される種々のウイルス株は、例えば、本発明で使用され、特にツマジロクサヨトウ細胞をトランスフェクションするために使用される、アウトグラファカリフォルニカ核多角体病ウイルスおよびカイコ核多角体病ウイルスのＢｍ−５変異体などが一般的に入手可能である。綿花、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養も宿主として使用することができる。
【０１３１】
しかし、最も興味深いのは脊椎細胞であり、脊椎細胞の培養（組織培養）は一般的な操作となっている。有用な哺乳動物宿主細胞の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎細胞ＣＶ１系（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ヒト胎芽腎細胞系（２９３または懸濁培養でのサブクローニングされた２９３細胞，Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，］．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））、赤ん坊ハムスター腎細胞（Ｂ血，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａ  ｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））、サル腎細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａ  ｔｈｅｒ等，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））、ＭＲＣ  ５細胞、ＦＳ４細胞、およびヒトヘパトーム系（ＨｅｐＧ２）である。ある好ましい実施形態では、前記宿主細胞は２９３Ｆ細胞である。
【０１３２】
上記の抗ＯＸ４０抗体を産生する発現またはクローニングベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、修飾されると、プロモーターの誘導、形質転換細胞の選択、または目的配列をコードする遺伝子の増幅に適した通常の栄養培地で培養する。
【０１３３】
前記抗体またはその抗原結合断片を産生するための本発明の宿主細胞は、当該技術分野で公知の種々の培地で培養することができる。前記培地はまた、当該技術分野で公知の適切な濃度の任意の他の必要な添加剤を含んでもよい。前記培地の条件、例えば、温度、ｐＨなどの類似の条件は、発現に使用される宿主細胞の選択にこれまでに用いられてきた条件であり、当業者には周知である。
【０１３４】
組換え技術を使用する場合、前記抗体は、細胞内、壁膜空間で産生されるか、または培地中に直接分泌され得る。前記抗体が細胞内で産生される場合、例えば、遠心分離または超音波の方法によって、宿主細胞を最初に除去するか、または断片の粒子の残渣を分裂する。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）は、大腸菌壁膜空間に分泌される抗体を単離する方法を記載している。簡潔に言えば、酢酸ウラン（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間以上細胞ペースト（ｃｅｌｌ  ｐａｓｔｅ）を解凍する。遠心分離により細胞破片を除去する。前記抗体が培地中に分泌される場合、一般的にはまず、市販のタンパク質濃度フィルター、例えば、ｌＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｕｎｉｔを使用して、この発現系の上清液を濃縮する。タンパク質分解を抑制するためのＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤、および偶発的な汚染物質の成長を防止するための抗生物質を、上記のいずれの工程においても添加することができる。
【０１３５】
前記細胞から得られた抗体は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、ＤＥＡＥ−セルロースイオン交換カラム、硫酸アンモニウム沈殿、塩析、およびアフィニティークロマトグラフィーなどの精製方法により精製することができ、ここで、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。前記抗体の種類および前記抗体中の任意の免疫グロブリンのＦｃドメインの存在は、アフィニティーリガンドとしてタンパク質Ａが適切であるかどうかを決定する。タンパク質Ａを用いて、ヒトγ１、γ２またはγ４の重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：卜１３（１９８３））。タンパク質Ｇは、全てのマウス由来異性体およびヒトγ３に適している（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７  １５７５（１９８６））。アガロースは最も一般的なアフィニティーリガンド付着基質であるが、他の基質を用いてもよい。機械的に安定な基質、例えば、制御可能な多孔性ガラスまたはポリ（スチレン）ベンゼンは、アガロースと比較して、より速い流速およびより短い処理時間を達成することができる。該抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ．ＴＭ樹脂を用いて精製することができる（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）。他のタンパク質精製技術、例えば、イオン交換カラム中の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカゲルクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂に基づくヘパリンアガロースゲルクロマトグラフィー（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトグラフィーフォーカス、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿も、所望により得られた抗体から決定することができる。
【０１３６】
任意の予備精製工程の後、目的の抗体および不純物を含む混合物は、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーの方法で処理され得、約２．５〜４．５のｐＨの溶出緩衝液で、好ましくは低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩濃度）で行われる。
【０１３７】
キット
本願は、前記抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、前記キットは、生物学的試料中のＯＸ４０の存在またはレベルを検出するために使用される。前記生物学的試料は、細胞または組織を含むことができる。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、前記キットは、検出可能な標識にコンジュゲートされた抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、前記キットは、標識されていない抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片を含み、さらに、標識されていない抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片に結合して標識することができる二次抗体を含む。前記キットは、使用説明書と、キット内の各構成要素を分離するパッケージとをさらに含むことができる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、前記抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片は、サンドイッチアッセイ、例えばＥＬＩＳＡまたは免疫クロマトグラフィーアッセイのために基材または器具に連結される。好適な基材または器具は、例えば、マイクロウェルプレートおよび試験紙であり得る。
【０１４０】
医薬組成物および治療方法
本願はさらに、前記抗ＯＸ４０抗体およびその抗原結合断片を含む医薬組成物および１つまたは複数の薬学的に許容される担体を提供する。
【０１４１】
本願に開示される医薬組成物に使用される薬学的に許容される担体としては、例えば、薬学的に許容される液体、ゲルまたは固体担体、水相媒体、非水相媒体、抗菌物質、等張物質、緩衝液、酸化防止剤、麻酔剤、懸濁剤／分散剤、キレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または非毒性補助物質、他の当該技術分野で公知の成分またはそれ以上の組み合わせを含み得る。
【０１４２】
好適な成分としては、例えば、酸化防止剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、緩衝液、防腐剤、滑沢剤、香味剤、増粘剤、着色剤、乳化剤、または糖およびシクロデキストリンなどの安定剤が挙げられる。好適な酸化防止剤としては、例えば、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、メルカプトグリセロール、チオグリコール酸、メルカプトソルビトール、ブチルメチルアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンおよび／または没食子酸プロピルが挙げられる。本発明に開示されるように、本発明に開示される抗体またはその抗原結合断片を含む組成物中にメチオニンなどの１種または複数種の酸化防止剤を含めることにより、前記抗体またはその抗原結合断片の酸化を低減することができる。酸化効果の減少は、結合親和性の低下を防止または減少させ、それによって抗体の安定性を向上させ、貯蔵寿命を延長させることができる。したがって、特定の実施形態では、本発明は、１つまたは複数の前記抗体またはその抗原結合断片、ならびにメチオニンなどの１種または複数種の酸化防止剤を含む組成物を提供する。本発明は、本発明で提供される抗体またはその抗原結合断片を、メチオニンなどの１種または複数種の酸化防止剤と混合することにより、前記抗体またはその抗原結合断片の酸化を防止し、その貯蔵寿命の延長および／またはその活性の向上を達成できる、様々な方法をさらに提供する。
【０１４３】
さらに、薬学的に許容される担体としては、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、等張ブドウ糖注射液、滅菌水注射液、またはブドウ糖および乳酸リンガー注射液などの水相媒体、植物由来の不揮発性油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、またはピーナッツ油などの非水相媒体、細菌抑制または真菌抑制濃度での抗菌物質、塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの等張剤、リン酸塩またはクエン酸塩緩衝液などの緩衝液、硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤、塩酸プロカインなどの局所麻酔剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリビニルピロリドンなどの懸濁剤および分散剤、ポリソルベート８０（ｔｗｅｅｎ−８０）などの乳化剤、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸）、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸などのキレート剤が挙げられる。担体としての抗菌剤は、フェノール類またはクレゾール、水銀製剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、チオメルサール、クロルフェノキシアンモニウム、およびクロルフェネチルアンモニウムを含む複数回用量容器中の医薬組成物に添加することができる。好適な賦形剤としては、例えば、水、塩、ブドウ糖、グリセロール、またはエタノールが挙げられる。好適な非毒性補助物質としては、例えば、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、可溶化剤、または酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレイン酸エステル、またはシクロデキストリンなどが挙げられる。
【０１４４】
前記医薬組成物は、液剤、懸濁液、乳剤、丸剤、カプセル剤、錠剤、持続放出製剤または粉末であってもよい。経口製剤は、薬物グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準担体を含むことができる。
【０１４５】
特定の実施形態では、前記医薬組成物は、注射可能な組成物として製剤化される。注射可能な医薬組成物は、任意の従来の形態、例えば、液体溶媒、懸濁剤、乳化剤、または液体溶媒、懸濁剤または乳化剤の生成に適した固体形態で製造することができる。注射用製剤には、既製の無菌および／または無発熱物質の溶液、凍結乾燥粉末などの使用前に溶媒と結合する凍結乾燥可溶性物質、皮下錠剤、注射用の既製の無菌懸濁剤、使用前に媒体と結合する無菌乾燥不溶性製品、および無菌および／または無発熱物質のエマルジョンを含んでもよい。溶媒は、水相または非水相であってもよい。
【０１４６】
特定の実施形態では、単位用量の注射用製剤は、アンプル、チューブ、または針を備えたシリンジに包装される。全ての注射投与製剤は、無菌かつ無発熱物質のものであることが当該技術分野で知られている。
【０１４７】
特定の実施形態では、無菌凍結乾燥粉末は、本願に開示される抗体またはその抗原結合断片を適切な溶媒に溶解することによって調製され得る。前記溶媒は、粉末または粉末から製造される組換え溶液の安定性を改善し、または粉末または組換え溶液を改善することができる他の薬理学的成分を含むことができる。好適な賦形剤としては、水、ブドウ糖、トリソルビトール、フルクトース、トウモロコシシロップ、キシリトール、グリセロール、ブドウ糖、黒糖、または他の好適な物質が挙げられるが、これらに限定されない。溶媒は、クエン酸緩衝液、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム緩衝液、または当業者に公知の他の緩衝液などの緩衝液を含むことができ、一実施形態では、緩衝液のｐＨは中性である。当該技術分野で公知の標準条件下で、前記溶液を次の濾過除菌に供し、次いで凍結乾燥して所望の製剤を調製する。一実施形態では、得られた溶媒は、バイアルに分注されて凍結乾燥される。各バイアルは、１回または複数回の用量の前記抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片またはその組成物を収容することができる。各バイアルへの充填量は、サンプリングの正確さおよび投与の正確さを保証するために、１回の用量に必要な量または複数回の用量に必要な量（例えば、１０％過剰量）よりわずかに多くてもよい。凍結乾燥粉末は、適当な条件下、例えば約４℃から室温の範囲で保存することができる。
【０１４８】
凍結乾燥粉末を注射用水で再溶解して、注射投与用製剤が得られる。一実施形態では、凍結乾燥粉末は、無菌かつ無発熱物質の水または他の好適な液体担体に添加して再溶解させることができる。精確な量は選択された療法によって決定され、経験値によって決めることができる。
【０１４９】
また、本願に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片の治療上有効な量を、それを必要とする被験者に投与することにより、ＯＸ４０に関連する状態または障害を治療または予防することを含む治療方法が提供される。別の態様では、本願に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片の治療上有効な量を、それを必要とする被験者に投与することを含む、上方制御された免疫応答から利益を得る被験者の状態を治療する方法も提供される。
【０１５０】
本願において提供される抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片の治療上有効な用量は、当該技術分野で公知の様々な因子、例えば、体重、年齢、過去の病歴、現用治療、対象の健康状態および交差感染の可能性、アレルギー、過敏性および副作用、ならびに投与経路および腫瘍の進行の程度に依存する。当業者（例えば、医師または獣医）は、これらまたは他の条件または要件に応じて、用量を比例的に減少または増加させることができる。
【０１５１】
特定の実施形態では、本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片は、治療上有効な用量の約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの間で投与され得る。特定の実施形態では、前記抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片は、約５０ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与され、特定の実施形態では、投与量は、１０ｍｇ／ｋｇ以下、５ｍｇ／ｋｇ以下、１ｍｇ／ｋｇ以下、０．５ｍｇ／ｋｇ以下、または０．１ｍｇ／ｋｇ以下である。ある特定の用量は、例えば、１日に１回、１日に２回以上、月に２回以上、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、月に１回、または２か月以上に１回の間隔で投与することができる。特定の実施形態では、投与量は、治療の進行に応じて変化し得る。例えば、特定の実施形態では、最初の投与量は、その後の投与量よりも多くてもよい。特定の実施形態では、投与量は、治療の進行中に、投与対象の反応に応じて調節される。
【０１５２】
投与レジメンは、最適な応答（例えば、治療応答）を達成するように調節することができる。例えば、単回投与または２つの期間にわたって複数の分割用量で投与することができる。
【０１５３】
本発明に開示される抗体および抗原結合断片は、当該技術分野で公知の投与手段、例えば、注射投与（例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内点滴、筋肉内注射または皮内注射を含む静脈内注射）、または非注射投与（例えば、経口投与、鼻腔投与、舌下投与、直腸投与または外用投与）により投与することができる。
【０１５４】
ＯＸ４０に関連する状態および障害は、免疫関連疾患または障害であり得る。特定の実施形態では、前記ＯＸ４０に関連する状態および障害は、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、中皮腫、黒色腫、頭頸部癌、甲状腺癌、肉腫、前立腺癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、胸腺癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫、菌状息肉腫（ｍｙｃｏｓｅｓ  ｆｕｎｇｏｉｄｓ）、メルケル細胞癌などの腫瘍および癌、古典的ホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球に富むＢ細胞リンパ腫、ＥＢＶ陽性と陰性ＰＴＬＤとＥＢＶ関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質芽球性リンパ腫、節外ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻咽頭癌とＨＨＶ８関連原発性滲出性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊軸腫瘍、脳幹神経膠腫などの中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍などの他の悪性血液疾患を含む。特定の実施形態では、前記腫瘍および癌は転移性であり、特にＯＸ４０を発現する転移性腫瘍である。特定の実施形態では、前記ＯＸ４０に関連する状態および障害は、慢性ウイルス感染症、例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペスウイルス、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス、エイズウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、単純ヘルペスウイルス２型、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルスのウイルス感染、カポジ肉腫関連のヘルペスウイルス流行病、トルクテノウイルス（Ｔｏｒｑｕｅｔｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ＪＣウイルスやＢＫウイルスなどを含む。
【０１５５】
使用方法
本願はさらに、前記抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片を使用する方法を提供する。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、本願は、本願に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片の治療上有効な量を投与することを含む、ＯＸ４０に関連する状態または障害を個体で治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記個体は、ＯＸ４０アゴニストに応答し得る障害または状態を有すると同定される。
【０１５７】
標的生物組織におけるＯＸ４０の存在およびレベルは、前記生物学的試料源の個体がＯＸ４０アゴニストに応答する可能性があるかどうかを示すことができる。ＯＸ４０の存在またはレベルは、複数の方法を使用して、前記個体からの被測定生物学的試料において決定することができる。例えば、前記被測定生物学的試料は、発現されたＯＸ４０タンパク質に結合し、発現されたＯＸ４０タンパク質を検出する抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片に曝露することができる。いくつかの実施形態では、前記被測定試料は、癌細胞または組織、または腫瘍に入る免疫細胞に由来する。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０の存在またはレベルは、前記被測定生物学的試料中の応答の可能性を上方制御する。本願で使用される「上方制御」なる用語は、同じ抗体を用いて検出された参照試料中のＯＸ４０タンパク質レベルと比較して、本願に記載の抗体またはその抗原結合断片を使用して被測定試料中で検出されるＯＸ４０タンパク質レベルの合計の増加は、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％またはそれ以上であることを意味する。前記参照試料は、健康なまたは疾患のない個体から得られた対照試料であってもよいし、被測定試料源の個体から得られた健康なまたは疾患のない試料であってもよい。例えば、前記参照試料は、被測定試料（例えば、腫瘍）の近くまたは隣接する無疾患試料であってもよい。
【０１５８】
本発明に開示される抗体および抗原結合断片は、単独で、または１つまたは複数の他の治療手段または物質と組み合わせて、投与することができる。例えば、本発明に開示される抗体および抗原結合断片は、化学療法、放射線療法、癌治療手術（例えば、腫瘍切除術）、１つまたは複数の抗嘔吐剤または他の化学療法による合併症に対する治療、または、癌のための任意の他の治療物質、またはＯＸ４０によって媒介される任意の障害のための治療物質と併用することができる。このような特定の実施形態では、本発明に開示される抗体および抗原結合断片は、１つまたは複数の治療物質と併用される場合、前記１つまたは複数の治療物質と同時に投与されてもよく、このような特定の実施形態では、前記抗体および抗原結合断片は、同じ医薬組成物の一部として同時に投与することができる。しかし、他の治療物質と「併用」される抗体および抗原結合体は、同時にまたは当該治療物質と同じ組成物中で投与される必要はない。本発明における「併用」とは、他の治療物質の前または後に投与される抗体および抗原結合体も、当該治療物質と「併用」されると考えられることを意味する。前記抗体またはその抗原結合断片が第２の物質と異なる投与手段で投与されてもよい。可能な場合には、本発明に開示される抗体またはその抗原結合断片と併用される他の治療物質は、当該他の治療物質の製品説明書の方法を参照して投与することができ、または外科医のデスクリファレンス２００３（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５７ｔｈ  Ｅｄ；Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ；ＩＳＢＮ：１５６３６３４４５７；第５７版（２００２年１１月））を参照するか、または当該技術分野で公知の他の方法を参照する。
【０１５９】
特定の実施形態では、前記治療物質は、癌に対する免疫応答を誘導または増強することができる。例えば、腫瘍ワクチンを使用して、特定の腫瘍または癌に対する免疫応答を誘導することができる。サイトカイン治療は、腫瘍抗原の免疫系への提示を高めるために使用することができる。サイトカイン治療の例としては、インターフェロンα、β、およびγなどのインターフェロン、マクロファージＣＳＦ、顆粒球マクロファージＣＳＦ、および顆粒球ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、１Ｌ−Ｌ、１Ｌ−１ａ、１Ｌ−２、１Ｌ−３、１Ｌ−４、１Ｌ−５、１Ｌ−６、１Ｌ−７、１Ｌ−８、１Ｌ−９、１Ｌ−１０、１Ｌ−ｌｌおよび１Ｌ−１２などのインターロイキン、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子を含むが、これらに限定されない。ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１抗体、ＴＧＦ−β抑制剤、ＩＬ−１０抑制剤、およびＦａｓリガンド抑制剤などの免疫抑制標的を不活性化する薬剤を使用することもできる。別の群の薬剤は、腫瘍または癌細胞に対する免疫応答を活性化するもの、例えば、Ｔ細胞活性化を増強するもの（例えば、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳなどのＴ細胞共刺激分子アゴニスト）、ならびに樹状細胞機能と抗原提示を促進するものを含む。
【０１６０】
本願はさらに、本願に記載の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片を用いて、前記個体からの被測定生物学的試料中のＯＸ４０の存在またはレベルを決定することを含む、ＯＸ４０アゴニストで治療された被験者における治療応答または疾患進行をモニタリングする方法を提供する。特定の実施形態では、前記方法は、被測定生物学的試料中のＯＸ４０レベルを、以前に同一の個体から得られた比較可能な試料中のＯＸ４０レベルと比較することをさらに含み、ここで、ＯＸ４０レベルの増加が、被測定生物学的試料において減少または減速または停止する場合、積極的な治療応答または制御された疾患進行を示す。前記比較可能な試料は、被測定試料と同じタイプの試料であってもよいが、治療前または治療の初期段階に同じ個体から得られる。
【実施例】
【０１６１】
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。以下に記載される全ての特定の組成物、材料および方法は、全体的または部分的に、本発明の範囲内である。これらの特定の組成物、材料および方法は、本発明を限定するものではなく、特定の実施形態を説明するために本発明の範囲内である。当業者は、創造性を追加することなく、かつ本発明の範囲から逸脱することなく、同等の組成物、材料および方法を開発することができる。本発明の方法に加えられた様々な変更は、本発明の範囲内に含まれ得ることを理解されたい。本発明者らは、このような変更を本発明の範囲に包含することを意図している。
【０１６２】
実施例１：抗ヒトＯＸ４０活性化モノクローナル抗体の獲得
本願発明者らは、マウスを免疫し、ハイブリドーマ細胞融合を行うために、ＯＸ４０を過剰発現するＣＨＯ細胞株を構築した。抗原抗体結合実験と細胞機能スクリーニングにより、強いＥＬＩＳＡ結合活性とＯＸ４０活性化機能を有する一連のマウス由来抗体が得られた。配列決定により、各抗体の可変領域ＶＨおよびＶＬの配列が得られ、それに基づいてヒト−マウスキメラ抗体を設計、発現し、前記重鎖相補性決定領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１からなる群から選択される１つまたは複数の配列からなる。前記軽鎖相補性決定領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４からなる群から選択される１つまたは複数の配列からなる。
【０１６３】
より好ましくは、前記重鎖相補性決定領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３であるか、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３であるか、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１である。前記軽鎖相補性決定領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６であるか、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８であるか、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４である。
【０１６４】
本発明の好適な実施例では、重鎖相補性決定領域および軽鎖相補性決定領域はそれぞれ表１に示され、
ａ．重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含むか、
ｂ．重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含むか、
ｃ．重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含むか、
ｄ．重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含むか、あるいは、
重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４を含む。
【０１６５】
具体的には、本実施例１の発明者らは、マウスを免疫し、ＳＰ２／０−ＡＧ１４細胞株とハイブリドーマ細胞融合を行うために、ＯＸ４０を過剰発現するＣＨＯ細胞株を構築した。抗原抗体結合実験と細胞機能スクリーニングにより、強いＥＬＩＳＡ結合活性とＯＸ４０活性化機能を有する一連のマウス由来抗体が得られた。配列決定により、各抗体の可変領域ＶＨおよびＶＬの配列が得られ、それに基づいてＭＴ０１−Ｌ１およびＭＴ０１−Ｌ２を含むヒト−マウスキメラ抗体を設計、発現した。
【０１６６】
抗体の安定性を増強し、可能性のある酸化および異性化が抗体の純度および活性に及ぼす影響を低減するために、抗体重鎖および軽鎖Ｖ領域の潜在的な不安定特定部位に対して突然変異を行った。例えば、ＭＴ０１−Ｌ１の重鎖第５７アミノ酸ＧｌｙｃｉｎをＡｌａｎｉｎｅに突然変異させ、ＭＴ０１−Ｌ１の軽鎖第９６位アミノ酸Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎをｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅに突然変異させた。得られた突然変異抗体は、ＭＴ０１−Ｌ１（Ｍ１）、ＭＴ０１−Ｌ１（Ｍ２）、ＭＴ０１−Ｌ１（Ｍ１／Ｍ２）であった。
【０１６７】
抗体のＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性を除去するために、抗体重鎖のサブタイプをヒトＩｇＧ１からヒトＩｇＧ２サブタイプに置換し、得られたキメラ抗体はＭＴ０１−Ｌ１（Ｇ２）であった。
【０１６８】
ＭＴ０１−Ｌ１およびＭＴ０１−Ｌ１（Ｇ２）の重鎖および軽鎖可変領域をヒト化した後、得られたヒト化抗体はＭＴ０１−Ｃ１およびＭＴ０１−Ｃ１（Ｇ２）であった。
【０１６９】
実施例２：抗体の作製
融合タンパク質をコードする重鎖および軽鎖のｃＤＮＡ配列を、哺乳動物細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４にそれぞれクローニングした。重鎖発現プラスミドと軽鎖発現プラスミドを２：１のモル比でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、３７℃、５％二酸化炭素条件下で７日間培養した。培養液上清を採取し、上清中の抗体をＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーで精製した。精製した抗体をＰＢＳ溶液で透析し、凍結乾燥して濃縮した後、−２０℃で保存した。
【０１７０】
実施例３：ＥＬＩＳＡ結合実験
濃度１μｇ／ｍＬのタンパク質溶液を、９６ウェル高親和性プレートで１００μＬ／ｗｅｌｌでコーティングし、４℃で一晩振盪した。翌日、ＰＢＳＴ  ３００μＬ（Ｔｗｅｅｎ２０：０．５％。）で３回洗浄した後、１００μＬ／ｗｅｌｌの５％ＢＳＡ／ＰＢＳで２時間ブロッキングし、室温で振盪した。ＰＢＳＴ  ３００μＬで３回洗浄した。試料の勾配希釈溶液をＰＢＳで調製した。９６ウェルプレートを１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、室温で１時間振盪した。ＰＢＳＴ  ３００μＬで３回洗浄した。二次抗体ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ＨＲＰ溶液を調製し、９６ウェルプレートを１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、室温で１時間振盪した。ＰＢＳＴ  ３００μＬで４回洗浄した。１００μＬ／ｗｅｌｌ  ＴＭＢを加え、２０ｍｉｎ発色させた。１００μＬ／ｗｅｌｌ  ０．６Ｎ  Ｈ2ＳＯ4を加えて発色を停止し、ＯＤ４５０ｎｍを検出した。
【０１７１】
検出したところ、結果を図１に示すように、ヒト−マウスキメラ抗体ＭＴ０１−Ｌ１およびＭＴ０１−Ｌ２のＥＬＩＳＡ結合ＥＣ５０は、それぞれ２９０．７ｎｇ／ｍＬおよび２０８．５ｎｇ／ｍＬであった。
【０１７２】
実施例４：ＣＨＯ−ｈＯＸ４０との結合
ＯＸ４０抗体勾配をＰＢＳで設定し、最終濃度の１０×作動液を調製した。ＣＨＯ−ｈＯＸ４０細胞を収集し、ＰＢＳを１回洗浄した後にカウントし、２＊１０＾６／ｍｌ細胞懸濁液に希釈した。それぞれ１０μｌのＯＸ４０抗体作動液を１００μｌの細胞懸濁液に添加し、４℃で３０ｍｉｎ遮光インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、二次抗体を添加し、４℃で３０ｍｉｎ遮光インキュベートし、ＰＢＳで１回洗浄した後、４００μｌのＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒで懸濁し、機上検出した。図２に示すように、その結果、ＭＴ０１−Ｌ１およびＭＴ０１−Ｌ２はヒトＯＸ４０と結合しており、そのＥＣ５０がそれぞれ１．２２μｇ／ｍＬおよび２．４２μｇ／ｍＬであることが示された。
【０１７３】
同様に、本願発明者らは、マウスＯＸ４０を発現したＣＨＯ細胞への抗体の結合を検出したが、図３の結合実験結果を参照すると、ＭＴ０１−Ｌ１もＭＴ０１−Ｌ２もマウスＯＸ４０に結合していないことが判明した。
【０１７４】
実施例５：ＯＸ４０シグナル伝達経路活性化実験
本願発明者らは、ＯＸ４０活性化抗体の機能を検出する細胞実験系を構築した。具体的には、本願発明者らは、Ｊｕｒｋａｔ−ＯＸ４０−ＮＦκＢ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ安定形質転換細胞株を構築し、ＯＸ４０活性化抗体を、当該安定形質転換細胞株およびＦｃＲを過剰発現したＨＥＫ２９３細胞と混合すると、ＯＸ４０抗体は、ＮＦκＢ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター遺伝子の発現を活性化することができた。
【０１７５】
ＯＸ４０抗体勾配をＰＢＳで設定し、最終濃度の２×作動液を調製し、氷上で操作した。Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ−ＯＸ４０細胞およびＦｃＲを過剰発現したＨＥＫ２９３細胞を収集し、遠心分離後、培地に再懸濁した。３８４ウェルプレートに、ＯＸ４０  Ａｂおよび適量の細胞懸濁液を添加し、５時間インキュベートした後、Ｏｎｅ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）検出試薬を添加し、均一に混合した後、Ｐｈｅｒａｓｔａｒで蛍光シグナルを検出した。
【０１７６】
図４（ａ）に示すように、上記の実験系において、ＭＴ０１−Ｌ１、ＭＴ０１−Ｌ１（Ｇ２）、ＭＴ０１−Ｌ２、ＭＴ０１−Ｌ２（Ｇ２）がＮＦκＢ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター遺伝子を活性化したＥＣ５０が、それぞれ３９．１、１４．９、８４．１および１１７．９ｎｇ／ｍＬであることが検出された。
【０１７７】
図４（ｂ）に示すように、上記の実験系において、ＭＴ０１−Ｌ１、ＭＴ０１−Ｌ１（Ｍ１）、ＭＴ０１−Ｌ１（Ｍ２）、ＭＴ０１−Ｌ１（Ｍ１／Ｍ２）がＮＦκＢ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター遺伝子を活性化するＥＣ５０が、それぞれ５７．３５、６４．５２、５９．９５および１２７．９ｎｇ／ｍＬであることが検出された。
【０１７８】
実施例６：ＯＸ−４０Ｌとの競合実験
ＯＸ４０ＬをＰＢＳで希釈し、最終濃度の１０×作動液を調製し、ＰＢＳでＯＸ４０を配置して抗体勾配を精製し、最終濃度の２×作動液を調製し、氷上で操作した。Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ−ＯＸ４０細胞を収集し、遠心分離後、培地に再懸濁し、細胞懸濁液とした。３８４ウェルプレートに、ＯＸ４０Ａｂ、細胞懸濁液およびＯＸ４０Ｌを加えた。３７℃で、５％ＣＯ2インキュベーター中で５時間インキュベートした後、Ｏｎｅ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬を添加し、均一に混合した後、Ｐｈｅｒａｓｔａｒで蛍光シグナルを検出した。図５で述べたように、結果は、ＯＸ４０Ｌで誘導したＪｕｒｋａｔ細胞ＮＦｋＢシグナル伝達経路活性化に対するＭＴ０１−Ｌ１およびＭＴ０１−Ｌ２の抑制ＩＣ５０がそれぞれ０．６８６μｇ／ｍＬおよび１．５９μｇ／ｍＬであることを示した。
【０１７９】
実施例７：ＡＤＣＣ実験
ＣＨＯ−ＯＸ４０−ｌｕｃを９６ウェルプレーンプレートに敷き、一晩培養した。翌日、ＯＸ４０Ａｂ勾配希釈液を１６４０培地で調製し、９６ウェルプレーンプレートに添加した。ヒトＰＢＭＣを加えてそれと共に４８ｈインキュベートした後、遠心分離により上清を採取し、Ｃｙｔｏ−Ｔｏｘ  Ｇｌｏキットで検出した。図６に示すように、結果は、キメラ抗体ＭＴ０１−Ｌ１およびＭＴ０１−Ｌ２の両方が、１μｇ／ｍＬを超える濃度で有意なＡＤＣＣ作用を有することを示した。
【０１８０】
実施例８：ＯＸ４０抗体による初代Ｔｈ細胞増殖の促進
健常ボランティアの血液からＣＤ４＋細胞を単離し、ＰＨＡ／ＩＬ−２を含有する１６４０完全培地で２日間培養して使用に備える。ＯＫＴ３（０．１μｇ／ウェル）および勾配希釈後のＯＸ４０抗体または対照ＩｇＧを高親和性９６ウェル丸底プレートにコーティングした。翌日、ウェルプレートをＰＢＳで２回洗浄し、前処理したＣＤ４＋細胞を１ウェルあたり５００００で抗体を予めコーティングした９６ウェルプレートに加え、７日間培養を続けた後、ＣＣＫ８キットで細胞増殖状況を検出した。図７に示すように、ＯＫＴ３抗体が存在する場合、ＯＸ４０抗体は、用量依存的にＣＤ４  Ｔｈ細胞の増殖を促進することが実験結果から示された。実験では最高濃度１５００ｎｇ／ｍＬのＯＸ４０抗体のみを加えた場合のＣＤ４＋細胞の生存率を同時に測定し、これを基にデータを標準化処理した。
【０１８１】
実施例９：キメラ抗体動物薬効実験
マウス結腸癌細胞を、ＯＸ４０ヒト化マウス（ＯＸ４０細胞外部分をヒトＯＸ４０細胞外部分配列に置換した）の皮下に、１０6細胞／匹の量で接種した。腫瘍が約１００ｍｍ3に成長した後、ＯＸ４０抗体またはＩｇＧ１対照（１０ｍｇ／ｋｇ）を３日に１回、合計４回静脈内投与した。図８（ａ）および図８（ｂ）に示すように、ＭＴ０１−Ｌ１は、投与開始１３日間後に、対照群と比較して極めて有意な薬効を示した。同じ投与方法では、ＭＴ０１−Ｌ２の薬効は統計学的有意差を達成しなかったが、明らかな薬効傾向を示した。
【０１８２】
実施例１０：ヒト化抗体活性
キメラ抗体に対してＣＤＲ  ｇｒａｆｔｉｎｇおよびアミノ酸復帰突然変異を行うことにより、ヒト化抗体ＭＴ０１−Ｃ１およびＭＴ０１−Ｃ１（Ｇ２）を得た。
【０１８３】
ヒト化抗体とヒトＯＸ抗原タンパク質とのインビトロ結合実験を、実施例３に記載の方法に従って行った。結果は、ヒト化抗体とヒトＯＸ４０タンパク質のＥＬＩＳＡ結合ＥＣ５０がそれぞれ０．３４５μｇ／ｍＬおよび０．３９０μｇ／ｍＬであることを示した。
【０１８４】
ヒト化抗体のインビトロ活性実験を、実施例５に記載の方法に従って行った。結果は、Ｊｕｒｋａｔ−ＯＸ４０−ＮＦκＢ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ安定形質転換細胞株におけるＭＴ０１−Ｃ１およびＭＴ０１−Ｃ１（Ｇ２）の活性化ＥＣ５０がそれぞれ０．０２８および０．０４３４μｇ／ｍＬであることを示した。（図９ｂ）
【０１８５】
ヒト化抗体の動物薬効実験を実施例８の方法に従って行ったが、抗体投与方法は１５ｍｇ／ｋｇに変更し、単回投与した。その結果、投与１７日間後、ＭＴ０１−Ｃ１およびＭＴ０１−Ｃ１（Ｇ２）の腫瘍体積に対する抑制率はそれぞれ７９％および６６％に達した（図９ｃ）。
【０１８６】
実施例１１：ヒト化抗体マウスおよびカニクイザルＰＫの性質
マウスＰＫ実験では、Ｃ５６ＢＬ６マウス、雌、６匹／群に各抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注射した。投与後１ｈ、２ｈ、６ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ、１９２ｈ、３１２ｈ、各時点で１００μＬの血液試料を１群あたり３匹のマウスから採取し、４度で２〜３ｈ静置した後、５０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、血清を採取し、−８０℃で保存し、ＥＬＩＳＡ検出に用いた。
【０１８７】
血清中の抗体濃度を検出するために、高親和性マイクロウェルプレートをヒトＯＸ４０抗原でコーティングした。マウス血清試料を希釈緩衝液１：１００で希釈した後、ウェルに添加し、Ｃ５７ＢＬ６マウス血清中のＭＴ０１−Ｃ１およびＭＴ０１−Ｃ１（Ｇ２）をマイクロウェルプレートでコーティングされたヒトＯＸ４０−６ｈｉｓに結合させた。未結合薬物は、プレート洗浄工程で洗い流された。さらに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を標識したロバ抗ヒトＩｇＧを加えて抗原抗体複合体と結合させ、洗浄後にＨＲＰ酵素の基質（ＴＭＢ）を加えて色反応を起こし、色の濃淡は、被測定抗体の濃度に比例する。１Ｍ  Ｈ2ＳＯ4で反応を停止した後、ＯＤ値を酵素マーカーで読み取り、検出波長が４５０ｎｍで、参照波長が６２０ｎｍであった。生物学的試料中の被測定抗体の濃度を、ＯＤ４５０ｎｍ読み取り値と試料標準曲線とを比較することによって計算した。
【０１８８】
その結果、ＭＴ０１−Ｃ１およびＭＴ０１−Ｃ１（Ｇ２）のＣｍａｘはそれぞれ、１２５．７μｇ／ｍＬおよび１０７．２μｇ／ｍＬであり、ｔ1/2はそれぞれ、２６５ｈｓおよび３２１ｈｓであった。（図１０ａ）
【０１８９】
カニクイザルのＰＫ実験では、各抗体を１．５ｍｇ／ｋｇの用量で、オスのカニクイザル１群に３匹ずつ静脈内注射した。動物群に投与前４８ｈ、投与後１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１、２、６、２４、４８、７２、９６、１６８、２４０、３３６、５０４ｈ、血液試料を各時点で１００μｌずつ採取した。４度で２〜３ｈ静置した後、５０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、血清を採取し、−８０℃で保存し、ＥＬＩＳＡ検出に用いた。
【０１９０】
血清中の抗体濃度を検出するために、高親和性マイクロウェルプレートをヒトＯＸ４０抗原でコーティングした。カニクイザル血清試料を希釈緩衝液１：１００で希釈した後、ウェルに添加し、カニクイザル血清中のＭＴ０１−Ｃ１およびＭＴ０１−Ｃ１（Ｇ２）をマイクロウェルプレートでコーティングされたヒトＯＸ４０−６ｈｉｓと結合させ、未結合薬物は、プレート洗浄工程で洗い流される。さらに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を標識したロバ抗ヒトＩｇＧを加えて抗原抗体複合体と結合させ、洗浄後にＨＲＰ酵素の基質（ＴＭＢ）を加えて色反応を起こし、色の濃淡は、被測定抗体の濃度に比例する。１Ｍ  Ｈ2ＳＯ4で反応を停止した後、ＯＤ値を酵素マーカーで読み取り、検出波長が４５０ｎｍで、参照波長が６２０ｎｍであった。生物学的試料中の被測定抗体の濃度を、ＯＤ４５０ｎｍ読み取り値と試料標準曲線とを比較することによって計算した。
【０１９１】
検出の結果、カニクイザルの１．５ｍｇ／ｋｇ静脈内注射後、末端除去項ｔ１／２が１２１．３０７±６６．８５３ｈｒであり、Ｃｍａｘが４２．６１９±３．４６４μｇ／ｍＬであった。（図１０ｂ）
【０１９２】
上記は、本発明の好適な実施例にすぎず、本発明を限定するものではない。当業者であれば、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲で、本発明の開示する技術的思想および技術的内容を任意の形で均等に置換または変更することが可能であり、いずれも、本発明の特許請求の範囲から逸脱することなく、本発明の範囲内に属するものとする。
【図１】
2021514198.tif 000003
【図２】
2021514198.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年1月27日(2021.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトＯＸ４０との結合親和性を有するアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトＯＸ４０との結合親和性を有するアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１からなる群から選択される１つまたは複数の配列からなる重鎖相補性決定領域と、軽鎖相補性決定領域とを含むことを特徴とする単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記重鎖相補性決定領域が、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３であるか、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトＯＸ４０との結合親和性を有するアミノ酸配列および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列であるか、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３であるか、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトＯＸ４０との結合親和性を有するアミノ酸配列および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列であるか、あるいは、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１であることを特徴とする請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記軽鎖相補性決定領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４からなる群から選択される１つまたは複数の配列からなることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記軽鎖相補性決定領域が、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６であるか、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８であるか、あるいは、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４であることを特徴とする請求項３に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含むか、
重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトＯＸ４０との結合親和性を有するアミノ酸配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列を含むか、
重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含むか、
重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトＯＸ４０との結合親和性を有するアミノ酸配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列を含むか、
重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含むか、
重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトＯＸ４０との結合親和性を有するアミノ酸配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸配列を含むか、
重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含むか、あるいは、
重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトＯＸ４０との結合親和性を有するアミノ酸配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸配列を含むか、
重鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１を含み、軽鎖相補性決定領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４を含むことを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記重鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に置換されていることを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
前記軽鎖可変領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０に置換されていることを特徴とする請求項６に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
重鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５を含み、軽鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６を含むか、
重鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７を含み、軽鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６を含むか、
重鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５を含み、軽鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８を含むか、
重鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７を含み、軽鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８を含むか、あるいは、
重鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９を含み、軽鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０を含むことを特徴とする請求項６または請求項７に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体である請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
ラクダ化シングルドメイン抗体、二機能性抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓＦｖ２、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓ二機能性抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、または二価ドメイン抗体である請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のタンパク質の定常領域を含む免疫グロブリン定常領域をさらに含む請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
コンジュゲートをさらに含む請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１３に記載の単離されたポリヌクレオチドを発現する条件下で、請求項１５に記載の宿主細胞を培養することを含む請求項１〜請求項１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を発現させる方法。
【請求項１７】
請求項１〜請求項１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含むキット。
【請求項１８】
請求項１〜請求項１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と、１種または複数種の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１９】
ヒトまたはサルＯＸ４０の存在またはレベルの検出における、請求項１〜請求項１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項２０】
ＯＸ４０アゴニストに応答する障害または状態病症または状況を有する個体の検出および同定における、請求項１〜請求項１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項２１】
ＯＸ４０アゴニスト治療の治療応答または疾患進行のモニタリングにおける、請求項１〜請求項１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項２２】
上方制御された免疫応答から利益を得ることができる状態状況を治療するための薬物の製造における、請求項１〜請求項１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項２３】
前記状態が癌または慢性ウイルス感染症である、請求項２２に記載の使用。
【国際調査報告】
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