(57)【要約】  本発明はエキソソームまたは微小胞の単離または抽出のための方法および組成物を提供する。方法および組成物は、基質表面上に配置されるアニオン基または電子豊富な基の形態のエキソソーム結合リガンドを含むデバイスを提供することを包含し得る。方法および組成物は、表面を有する基質、基質に付着した複数のポリマー、および複数のポリマー上に配置されるアニオン基または電子豊富な基の形態のエキソソーム結合リガンドを含むデバイス提供することを包含し得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エキソソームまたは微小胞を含む液体を提供することと；
エキソソームまたは微小胞への結合のためのデバイスを提供することであって、前記デバイスが
表面を有する基質；
前記基質に付着した複数のポリマー；
前記ポリマー上に配置されるアニオン基または電子豊富な基の形態のエキソソーム結合リガンド；
を含み；
前記ポリマーが前記基質表面から拡張してエキソソームまたは微小胞への結合のために前記基質表面から離れた間隔で置かれた場所にエキソソーム結合リガンドを位置し、それによってエキソソームまたは微小胞が前記デバイスへ結合することを可能にする；
デバイスを提供することと；
エキソソームまたは微小胞が前記エキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件において前記デバイスと前記液体を接触させることと；
前記液体から前記デバイスを分離すること；
を包含し、それによってエキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得るエキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得るための方法。
【請求項２】
前記ポリマーが、前記基質表面から拡張して前記基質表面から離れた間隔で置かれた場所にエキソソーム結合リガンドの直線アレイを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エキソソーム結合リガンドが一般的に、前記ポリマー１ｎｍあたり１〜５個のリガンドの範囲で、好ましくは１ｎｍあたり約２個のリガンドで提供される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
エキソソームまたは微小胞を含む液体を提供することと；
エキソソームまたは微小胞への結合のためのデバイスを提供することであって、前記デバイスが
表面を有する基質；
前記基質に付着した複数のポリマー；
前記複数のポリマー上に配置されるアニオン基または電子豊富な基の形態のエキソソーム結合リガンド；
を含み；
前記複数のポリマーが、前記基質と異なる化学を有する；
デバイスを提供することと；
エキソソームまたは微小胞が前記エキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件において前記デバイスと前記液体を接触させることと；
前記液体から前記デバイスを分離すること；
を包含し、それによってエキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得るエキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得るための方法。
【請求項５】
前記エキソソーム結合リガンドが、前記複数のポリマー上に配置されてエキソソーム結合リガンドの平面アレイを形成する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記平面アレイが好ましくは、１ｎｍ２あたり約１〜１０のリガンドの密度を有するエキソソーム結合リガンドの領域を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記１つまたは複数のポリマーが、１つまたは複数のエキソソーム結合リガンドを有するモノマー種を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記１つまたは複数のポリマーのうちの前記モノマーの少なくとも２５％が、エキソソーム結合リガンドを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記１つまたは複数のポリマーのすべてのモノマーが、エキソソーム結合リガンドを有する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記アレイの各々のリガンドが、前記アレイの別のリガンドから多くとも約１０Å離れた間隔で置かれる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記アレイの前記リガンドが、約２Åを超えて離れた間隔で置かれる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
２つ以上のモノマー種が、エキソソーム結合リガンドを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記基質表面の一部が、前記アレイを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリマーが、多糖またはペプチドである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリマーが、合成ポリマーである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つまたは複数のポリマーが、前記基質を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つまたは複数のポリマーが、前記基質へカップリングされる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つまたは複数のポリマーが、前記液体に可溶である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記基質が前記液体から分離された後に前記基質からエキソソームまたは微小胞を放出するために前記エキソソーム結合リガンドから前記エキソソームまたは微小胞を溶出するさらなるステップを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記基質から放出された前記エキソソームまたは微小胞を分離するさらなるステップを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
エキソソームまたは微小胞が以下の組成物へ結合することを可能にする条件において、
Ｃａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒＳまたはＣａｐｔｏＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）；
Ｅｓｈｍｕｎｏ  Ｓ（Ｍｅｒｃｋ、ＫＧａＡ）；
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３−（Ｍｅｒｃｋ、ＫＧａＡ）；
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＣＯＯ−（Ｍｅｒｃｋ、ＫＧａＡ）；
Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｓ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．）；
ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）；
ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）；
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；
ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ  ＳＯ３（ＢＩＡ））；
Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ）；および
Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＣ（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ）；
からなる組成物の群から選択される組成物と前記液体を接触させることと；
前記液体から前記生成物を分離すること；
を包含し、それによってエキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得る、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
先行請求項のいずれか一項に記載の基質を含みかつ先行請求項のいずれか一項に記載の方法の実行を可能にする装置またはデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞性微小胞（特にエキソソーム）、分子モデリング、ならびに分子の分離および単離のためのクロマトグラフィー法（イオン交換クロマトグラフィーを含む）に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書中の任意の先行技術への参照は、オーストラリアまたは他の法域においてこの先行技術が共通の一般的知識の一部を形成するという認識または任意の形態の示唆ではなく、そしてそのように見なされるべきではない。
【０００３】
微小胞は、膜によって結合される生物学的構造の不均一な集合である。これらの構造は脂質二重層を有し、それらは細胞内にまたは細胞外環境中に存在し得る。微小胞は約２０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲のサイズである。
【０００４】
エキソソームは小さな脂質二重層小胞であり、複数の細胞タイプによって分泌され、直径で２０〜約１５０ｎｍの範囲である（電子顕微鏡（ＥＭ）によって決定されるように）。他の細胞由来の微小胞とは異なり、エキソソームは細胞内空間内で形成され、次いで細胞によって分泌される（Ｒａｐｏｓｏ  ａｎｄ  Ｓｔｏｏｒｖｏｇｅｌ，２０１３）。
【０００５】
エキソソームの脂質組成は起源の細胞のものとは異なるが、依然としてそれらが生じる細胞タイプの特徴が多少はある。加えて、エキソソームはそれらの起源とは無関係ないくつかの共通の脂質特色を示す（Ｕｒｂａｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０００６】
それらの起源に依存して、エキソソームは様々な「積載物」（ペプチド、タンパク質、脂質、転写調節因子、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含むがこれらに限定されない）を含有し得る。
【０００７】
エキソソームは、それにより起源の細胞（すなわちそれからエキソソームが生じる細胞）が、神経シナプス、免疫調節、血管新生、組織再生およびエピジェネティック修飾等の状況において、標的細胞とコミュニケーションできる手段として、現在考えられている。かかるコミュニケーションは局所または遠隔であり得る。実際、母乳からのエキソソームは、新生仔における免疫および他の機能を調節し得る。かかるコミュニケーションは種間でさえあり得、例えばウシ乳汁エキソソームはヒトにおける免疫および他の機能を調節するがこれらに限定されない。
【０００８】
エキソソームは、様々な生物流体（唾液、尿、血液、血漿、（乳房）乳汁、関節液、腹水、樹液および果実抽出物を含む）を起源とし得る。上記を要約すると、エキソソームのユニークな特徴はそれらのサイズ、エンドサイトーシスによる細胞取込み、それらの「積載物」によって推進され、それらは標的細胞において生物学的に活性になる「メッセージ」を送達すると思われる。
【０００９】
エキソソームは様々な疾患の開始および永続における役割を果たし得るという証拠が増大している。生物学的サンプルから収集されたエキソソームは、疾患の状態についての診断情報を提供できる。エキソソーム中のＲＮＡの濃度は、体液（血液等）から直接抽出されるものより最大６０倍高く、診断におけるそれらの有用性についての可能性を推進する。例えば、ヒト流体から単離されたエキソソーム内の発癌性ＲＮＡシグネチャーの同定は、浸潤癌が発症するずっと前に、異常な状態の診断をもたらす可能性がある。
【００１０】
最近、治療用の間充織タイプの細胞の機能は細胞それ自体に依存しないが、むしろ細胞によって産生されるパラクライン因子（エキソソームを包含する）に依存することが示され、エキソソームが、無細胞様式でのいくつかの細胞療法において観察される効果を媒介できる、循環する細胞分泌因子の一部であることを立証する（Ｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【００１１】
インビトロ培養を行っている細胞の馴化培地から収集される治療的に有用なエキソソームも、無細胞治療物質として使用できるが、それらの供給源の流体からの単離の着実で柔軟な方法についての必要性がある（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。加えて、エキソソームは、細胞ベースの発現系が特異的にテーラーメイドされる場合に、治療用のタンパク質およびＲＮＡが詰められた天然の送達ベヒクルを提供できる。エキソソームは通常の光学顕微鏡下で見えない。
【００１２】
エキソソームおよび微小胞のようなこれらの限外顕微鏡的粒子の検出のために使用される技術としては、電子顕微鏡（ＥＭ）、フローサイトメトリー、動的光散乱（ＤＬＳ）、およびナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）が挙げられる。使用される方法に依存して、１リットルの血液中の細胞外小胞の報告される絶対数は、５桁ほど変動し得ることが報告された（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００１３】
エキソソームは豊富であり、診断または治療的な意味で有用であると予想されるが、エキソソームを単離および精製する手段がそれらの臨床適用を今日まで限定している。
【００１４】
一般に、エキソソーム単離のための既存の方法は２つの群によって特徴づけられる。
（ｉ）小胞のいくつかの（恐らくユニークな）選択的な外部特色（例えば糖タンパク質マーカー、テトラスパニン（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ８２）ならびにＭＨＣクラスＩおよびＩＩのような膜貫通タンパク質、ならびに熱ショックタンパク質（ＨＳＰ−７０およびＨＳＰ−９０）のような細胞質タンパク質）による親和性捕捉
（ｉｉ）エキソソームのいくつかの生物物理学的特性（例えばサイズ、密度、ζ電位、脂質のパッキングの隙間を含有する高度に湾曲した表面、膜湾曲センサー）に基づく単離または精製
【００１５】
これらの技法の限界は、以下の表中で説明される。
【表１】
2021526843.tif 000002
【００１６】
ＵＳ２０１３／０２７３５４４（Ｖｌａｓｓｏｖ）およびＵＳ２０１５／０１９２５７１（Ｇｈｏｓｈ）の両方は、溶液からの微小胞の沈殿のための体積排除ポリマーとしてポリエチレングリコールおよびある特定の多糖を含むポリマーの使用を開示する。ＵＳ２０１６０２１６２５３は、細胞外小胞の単離のためのヘパリンの使用を開示する。
【００１７】
エキソソームの単離のための改善された方法（特にエキソソームの改善された収率を提供し、エキソソームの医薬グレードの製造または産生のためのスケールアップが可能であり、上で論じられた先行技術の他の限界を回避する、方法）についての必要性がある。
【発明の概要】
【００１８】
本発明は、上で言及した必要性または限界の１つまたは複数に取り組もうとし、一実施形態においてエキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得るための方法を提供する。方法は、以下のステップ：
エキソソームまたは微小胞を含む液体を提供することと；
エキソソームまたは微小胞への結合のためのデバイスを提供することであって、デバイスが
表面を有する基質；
基質に付着した複数のポリマー；
エキソソームへの結合のために複数のポリマー上に配置され、それによってエキソソームまたは微小胞がデバイスへ結合することを可能にする、アニオン基または電子豊富な基の形態のエキソソーム結合リガンド；
を含み；
基質がアガロースであり、ポリマーがデキストランであり、エキソソーム結合リガンドがサルフェートであるか（例えば、Ｃａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒＳまたはＣａｐｔｏＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ)）；または
基質がポリビニルエーテルであり、ポリマーがポリアクリルアミドであり、エキソソーム結合リガンドがスルホイソブチル（ＳＯ３−）であるか（例えば、Ｅｓｈｍｕｎｏ  Ｓ（Ｍｅｒｃｋ、ＫＧａＡ））；または
基質がポリメタクリレートであり、ポリマーがポリアクリルアミドであり、エキソソーム結合リガンドがスルホイソブチル（ＳＯ３−）であるか（例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３−（Ｍｅｒｃｋ、ＫＧａＡ））；または
基質がポリメタクリレートであり、ポリマーがポリアクリルアミドであり、エキソソーム結合リガンドがカルボキシエチルであるか（例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＣＯＯ−（Ｍｅｒｃｋ、ＫＧａＡ））；または
基質が変性親水性ポリエーテルスルホンであり、ポリマーが架橋ポリマーコーティングであり、エキソソーム結合リガンドがＳＯ３スルホニルである（例えば、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｓ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．））；
デバイスを提供することと；
エキソソームまたは微小胞がエキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件においてデバイスと液体を接触させることと；
液体からデバイスを分離すること；
を包含し、それによってエキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得る。
【００１９】
別の実施形態において、エキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得るための方法が提供される。方法は、以下のステップ：
エキソソームまたは微小胞を含む液体を提供することと；
エキソソームまたは微小胞への結合のためのデバイスを提供することであって、デバイスが
表面を有する基質；
エキソソームへの結合のために基質表面上に配置され、それによってエキソソームまたは微小胞がデバイスへ結合することを可能にする、アニオン基または電子豊富な基の形態のエキソソーム結合リガンド；
を含み；
デバイスが、
基質がアガロースであり、リガンドがスルホプロピル（サルフェート）である（例えば、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ））；
基質がアガロースであり、リガンドがカルボキシルである（例えば、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ））；
基質がポリメタクリレートであり、リガンドがサルフェートである（例えば、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））；
基質がポリ（グリシジルメタクリレート−コ−エチレンジメタクリレート）であり、リガンドがＳＯ３（スルホニル）である（例えば、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ  ＳＯ３（ＢＩＡ））；
基質がセルロースであり、リガンドがスルホン酸（Ｒ−ＣＨ２−ＳＯ３−）である（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ））；
基質がセルロースであり、リガンドがサルフェートである（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＣ（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ））；
生成物の群から選択される；
デバイスを提供することと；
エキソソームまたは微小胞がエキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件においてデバイスと液体を接触させることと；
液体からデバイスを分離すること；
を包含し、それによってエキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得る。
【００２０】
別の実施形態において、エキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得るための方法が提供される。方法は、以下のステップ：
エキソソームまたは微小胞を含む液体を提供することと；
エキソソームまたは微小胞への結合のためのデバイスを提供することであって、デバイスが
表面を有する基質；
基質に付着した複数のポリマー；
複数のポリマー上に配置されるアニオン基または電子豊富な基の形態のエキソソーム結合リガンド；
を含み；
複数のポリマーが基質表面から拡張して、エキソソームまたは微小胞への結合のために基質表面から離れた間隔で置かれた場所にエキソソーム結合リガンドを位置し、それによってエキソソームまたは微小胞がデバイスへ結合することを可能にする、
デバイスを提供することと；
エキソソームまたは微小胞がエキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件においてデバイスと液体を接触させることと；
液体からデバイスを分離すること；
を包含し、それによってエキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得る。
【００２１】
別の実施形態において、エキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得るための方法が提供される。方法は、以下のステップ：
エキソソームまたは微小胞を含む液体を提供することと；
エキソソームまたは微小胞への結合のためのデバイスを提供することであって、デバイスが
表面を有する基質；
基質に付着した複数のポリマー；
複数のポリマー上に配置されるアニオン基または電子豊富な基の形態のエキソソーム結合リガンド；
を含み；
複数のポリマーが基質と異なる化学を有する；
デバイスを提供することと；
エキソソームまたは微小胞がエキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件においてデバイスと液体を接触させることと；
液体からデバイスを分離すること；
を包含し、それによってエキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得る。
【００２２】
本発明は、上記の方法の実行を可能にする上記のような基質を含む、装置またはデバイスも提供する。
【００２３】
先の一般的な記述および以下の詳細な記述の両方は、例示的および説明的なものに過ぎず、特許請求される本発明の説明をさらに提供するものであることが意図される。添付の図面は、本発明のさらなる理解を提供するために包含および援用され、本明細書の一部を構成し、本発明の複数の実施形態を図示し、記述と一緒に本発明の原理について説明する役目を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】セルロースサルフェート／セルファインサルフェートの予測される構造。（Ａ）投影された端部からの概観図、および（Ｂ）側面からの概観図。セルロースホスフェート／セルファインホスフェートの予測される構造。（Ｃ）投影された端部からの概観図、および（Ｄ）側面からの概観図。
【図２】キトサンの予測される構造。（Ａ）投影された端部からの概観図、および（Ｂ）側面からの概観図。
【図３】ポリ（メチルビニルエーテル−マレイン酸無水物）の予測される構造。
【図４】ヘパリンの予測される構造。
【図５】３−ＡＰＢＡについての予測された構造。
【図６】ヒアルロン酸の予測される構造。
【図７】コンドロイチンサルフェートの予測される構造。
【図８】ポリビニルサルフェートの予測される構造。
【図９】ポリグルタミン酸の予測される構造。
【図１０】ポリアスパラギン酸の予測される構造。
【図１１】ポリセリンの予測される構造。
【図１１Ａ】ビオチン−Ｃ３−ポリ−４−ヒドロキシブチル−β−アスパラギンの予測される構造。
【図１１Ｂ】ビオチン−Ｃ３−ポリ−４−ヒドロキシベンジル−β−アスパラギンの予測される構造。
【図１２】ポリＤＬセリンサルフェートの予測される構造。
【図１３】一般的な構造モデル。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、生物源（馴化細胞培地、インビボの流体、組織および生検、ならびにその抽出物または画分または単離物を含む）からの、細胞外小胞（特にエキソソーム）の単離における改善のための試薬および方法のデザインを考慮する。特に、本発明は、源からの細胞外小胞の捕捉の改善および放出の改善を提供し、細胞外小胞の再現性良くより高い収率をもたらす、試薬および方法を考慮する。本明細書において記載されるように、本発明者は、生物源からの細胞外小胞（特にエキソソーム）の収率の改善を得るために物質中で要求される、従来は知られていない特徴を決定した。本研究は、微小胞およびエキソソームを単離する方法における使用のための物質の選択および／またはデザインを可能にする。
【００２６】
「細胞外小胞（ＥＶ）または微小胞（ＭＶ）」は一般的に、約２０〜１０００ｎｍの直径を有する膜結合性の生物学的構造の不均一なインビボの集合を指す。
【００２７】
「エキソソーム」は一般的に、脂質二重層およびＥＭによって測定される約２０〜２００ｎｍの直径を有する小胞を指す。
【００２８】
「結合効率」は一般的に、基質に結合されるエキソソームの比率の測定値を指す。それは、本発明の方法の適用後のサンプル中の残りのエキソソームの量と本発明の方法の適用前のサンプル中のエキソソームの量の差異である。
【００２９】
「溶出効率」は一般的に、基質から溶出されたエキソソームの比率の測定値を指す。それは、本発明の方法に従う溶出後の溶出物中のエキソソームの量と基質へ結合されるエキソソームの理論量の差異である。
【００３０】
「収率」は一般的に、本発明の方法の適用前のエキソソームの全数に対する割合として、溶出物から放出されたエキソソームの数を指す。
【００３１】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびこの用語の変化形（「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」等）は、さらなる添加物、構成要素、整数またはステップを除外することを意図しない。
【００３２】
第１の実施形態において、本発明は、エキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得るための方法を提供する。方法は、以下のステップ：
エキソソームまたは微小胞を含む液体を提供することと；
エキソソームまたは微小胞への結合のためのデバイスを提供することであって、デバイスが
表面を有する基質；
基質に付着した複数のポリマー；
複数のポリマー上に配置されるアニオン基または電子豊富な基の形態のエキソソーム結合リガンド；
を含み；
複数のポリマーが基質と異なる化学を有する；
デバイスを提供することと；
エキソソームまたは微小胞がエキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件においてデバイスと液体を接触させることと；
液体からデバイスを分離すること；
を包含し、それによってエキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得る。
【００３３】
語句「複数のポリマーが基質と異なる化学を有する」は一般的に、ポリマーおよび基質の各成分に関して基質がポリマーと異なることを指す。例えば、基質はペプチドであり得、ポリマーは炭水化物であり得る。基質およびポリマーが炭水化物である場合、基質は例えば、セルロースであり得、ポリマーはデキストランであり得る。
【００３４】
上記の実施形態によれば、基質は表面を有して提供される。エキソソーム結合リガンドは、液体がデバイスと接触される場合に微小胞の外側表面または膜とのエキソソーム結合リガンドの接触を可能にするように、他の場合には「アレイ」として公知の、多かれ少なかれ秩序立った配置にて基質表面で提供される。典型的には、アレイは、少なくとも基質表面の一部または領域を横切って位置する複数のエキソソーム結合リガンドの形態をとる。
【００３５】
アレイは、平面アレイまたは直線アレイの形態であり得る。
【００３６】
平面アレイは一般的に、領域を画成するように２次元で広がる。平面アレイは一般的に、１ｎｍ２あたり約１〜１０のリガンド、好ましくは１ｎｍ２あたり約５のリガンドの密度を有するエキソソーム結合リガンドの領域を含み得る。この間隔は、例えば原子間力顕微鏡によって決定され得る。アレイの他の領域は、より高いかまたはより低い密度のエキソソーム結合リガンドを有し得る。したがって、一実施形態において、エキソソームまたは微小胞の組成物または単離物を得るための方法が提供される。方法は、以下のステップ：
エキソソームまたは微小胞を含む液体を提供することと；
エキソソームまたは微小胞への結合のためのデバイスを提供することであって、デバイスが
表面を有する基質；
基質に付着した複数のポリマー；
複数のポリマー上に配置されて、基質表面上でエキソソーム結合リガンドの平面アレイを形成する、アニオン基または電子豊富な基の形態のエキソソーム結合リガンド；
を含み；
複数のポリマーが基質と異なる化学を有し；
平面アレイが好ましくは、１ｎｍ２あたり約１〜１０のリガンド、より好ましくは１ｎｍ２あたり約５のリガンドの密度を有するエキソソーム結合リガンドの領域を含む；
デバイスを提供することと；
エキソソームまたは微小胞がエキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件においてデバイスと液体を接触させることと；
液体からデバイスを分離すること；
を包含し、それによってエキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得る。
【００３７】
直線アレイは一般的に１次元で広がる。一実施形態において、直線アレイは、基質表面上で一般的に直線状の配置を有するポリマー上で、または溶媒の中へ基質表面から外方に拡張する場合にポリマー上でエキソソーム結合リガンドが提供される場合に、形成され得る。
【００３８】
直線アレイにおいて、エキソソーム結合リガンドは一般的に、１ｎｍあたり１〜５のリガンドの範囲で、好ましくは１ｎｍあたり約２のリガンドで提供される。この間隔は、例えば原子間力顕微鏡または質量分析によって決定され得る。したがって、別の実施形態において、エキソソームまたは微小胞の組成物または単離物を得るための方法が提供される。方法は、以下のステップ：
エキソソームまたは微小胞を含む液体を提供することと；
エキソソームまたは微小胞への結合のためのデバイスを提供することであって、デバイスが
表面を有する基質；
基質に付着した複数のポリマー；
複数のポリマー上に配置されるアニオン基または電子豊富な基の形態のエキソソーム結合リガンド；
を含み、
ポリマーが基質表面から拡張して、エキソソームまたは微小胞への結合のために基質表面から離れた間隔で置かれた場所にエキソソーム結合リガンドの直線アレイを形成し、それによってエキソソームまたは微小胞がデバイスへ結合することを可能にし；
エキソソーム結合リガンドが一般的に、１ｎｍあたり１〜５個のリガンドの範囲、好ましくは１ｎｍあたり約２個のリガンドで提供される；
デバイスを提供することと；
エキソソームまたは微小胞がエキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件においてデバイスと液体を接触させることと；
液体からデバイスを分離すること；
を包含し、それによってエキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得る。
【００３９】
別の実施形態において、エキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得るための方法が提供される。方法は、以下のステップ：
エキソソームまたは微小胞を含む液体を提供することと；
エキソソームまたは微小胞への結合のためのデバイスを提供することであって、デバイスが
表面を有する基質；
基質に付着した複数のポリマー；
複数のポリマー上に配置されて、基質表面上でエキソソーム結合リガンドの平面アレイを形成する、アニオン基または電子豊富な基の形態のエキソソーム結合リガンド；
を含み；
複数のポリマーが基質と異なる化学を有し；
エキソソーム結合リガンドが一般的に、１ｎｍあたり１〜５個のリガンドの範囲、好ましくは１ｎｍあたり約２個のリガンドで提供される；
デバイスを提供することと；
エキソソームまたは微小胞がエキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件においてデバイスと液体を接触させることと；
液体からデバイスを分離すること；
を包含し、それによってエキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得る。
【００４０】
さらなる実施形態において、エキソソーム結合リガンドのアレイ（微小胞外膜表面とインターフェースする）を提示するデバイス（その中で、エキソソーム結合リガンドは、別のエキソソーム結合リガンドから多くとも約３．５〜１０Å離れた間隔で置かれる）は、高度に効率的なエキソソーム結合表面を形成することが見出された。以下でさらに説明されるように、アレイが、エキソソーム結合リガンドを含む１つまたは複数のポリマーによって提供される場合に、エキソソーム結合リガンドの間隔に関して、３．５〜１０Å、好ましくは２Åを超える、特に約４〜６Åの測定値は、本明細書において例示される方法によって決定されるようなポリマーの低エネルギー状態において観察される間隔を指す。
【００４１】
本明細書においてさらに記載されるように、本発明は、高度に効率的なエキソソーム結合物質であるデバイスを予測する、エキソソーム結合リガンドの配置の構造モデルを提供する。このモデルに従って、高度に効率的なエキソソーム結合物質は、一般的に構造モデルが基づく方法論に従って測定されるように、約４〜６Å離れた間隔で置かれるアニオン基または電子豊富な基を有するデバイスである。本発明は、アニオン基または電子の豊富な基の同定を介して、および本明細書における構造モデルの導出のための方法論を利用するデバイスのポリマー成分の構造のモデリングによって、エキソソームまたは微小胞のためのデバイスの結合効率を予測することを可能にする。
【００４２】
好ましくは、エキソソーム結合リガンドは、別のエキソソーム結合リガンドから２Åを超えて離れた間隔で置かれる。より好ましくは、エキソソーム結合リガンドは、アレイ中の別のエキソソーム結合リガンドから３．５〜６または４〜６Å、より好ましくは３．５、４、５または６Å離れた間隔で置かれる。
【００４３】
典型的には、大多数のリガンド、好ましくは６０％または７０％または８０％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のリガンドは、アレイ中の別のリガンドから２Åを超えて、かつ多くとも約１０Å以下の、好ましくは３．５〜６または４〜６Å離れた間隔で置かれる。
【００４４】
本発明によれば、アレイ中のエキソソーム結合リガンドの配置は様々なレベルの秩序を有し得る。一実施形態において、アレイ内でエキソソーム結合リガンドの配置の非常に高い秩序があり得る。例えば、各々のリガンドは、アレイ中の他のリガンドから４Åの正確な距離で離れた間隔で置かれ得る。さらに、各々のリガンドの位置および／またはリガンド間の間隔は、特定のパターンを定義し得る。かかるより高い秩序の配置において、一般的にリガンドのすべては、アレイ中で均一に離れた間隔で置かれる。本明細書において記載されるように、より高い秩序の配置によるエキソソーム結合リガンドのアレイを有するデバイスは一般的に、再現性良くエキソソームまたは微小胞のより高い結合効率を有することが見出された。
【００４５】
他の実施形態において、アレイ内でエキソソーム結合リガンドのより低い秩序の配置があり得る。例えば、すべてではないが大多数のリガンドは、アレイ中の別のリガンドから２Åを超える、かつ多くとも約１０Åの、好ましくは３．５〜６または４〜６Åの互いから１６離れた間隔で置かれ得る。さらに、この大多数のリガンドのうちで、アレイ中のこれらのリガンドの間隔の間で変動があり得る。例えば、いくつかのリガンドは、他のものから３．５Å、他のものは４Å、他のものは５Å、他のものは６Å離れた間隔で置かれ得る。かかる配置において、各々のリガンドの位置および／またはリガンド間の間隔は、識別可能なパターンを定義しなくてもよい。しかしながら、かかるより低い秩序のアレイはエキソソームを結合するために有用な結合効率を有することが見出された。
【００４６】
認識されるように、エキソソーム結合リガンド中の秩序の程度は、局所秩序およびメタ秩序として見なされ得る。このことは、エキソソーム結合リガンドのアレイを離れて見ると、リガンドの所在位置にランダム性があるように見える（すなわちそれらは明瞭な直交アレイでない）（メタ秩序）にもかかわらず、リガンド間の平均距離は比較的厳密に平均値の付近に分布し得る（局所秩序）ことを意味する。本発明において、より高い秩序の局所秩序が好ましいが、メタ秩序の程度はそれほど重要でないことが見出される。したがって、ある特定の実施形態において、アレイが少なくとも１つの局所秩序の領域を含有するならば、アレイはメタ秩序の領域を含み得る。
【００４７】
アレイは多様な方法によって形成され得る。アレイが基質表面上で形成される場合、より高い秩序のアレイは基質表面上の正確な位置でのエキソソーム結合リガンドの堆積によって形成され得る。例としては、結晶シリコン、リソグラフィーを使用するセラミックまたはポリマーの表面、プラズマイオン注入堆積法（ＰＩＩＩ＆Ｄ）、原子間力顕微鏡、レーザー、電気エッチング、低密度プラズマ反応性イオンエッチング、ウェットエッチング、電子顕微鏡、またはエキソソーム結合リガンドを含有する官能化表面を産生することが公知の他の手段が挙げられる。また、アレイは基質表面上にプリントされ得る。例としては、ケミカルパッドにより基質表面を官能化すること、および次いでかかるパッドを、かかるパッドへ今度は化学的に結合されるエキソソーム結合リガンド部分によりさらに誘導体化することが挙げられる。これらの技法は、エキソソーム結合リガンドを含む基質およびポリマーが同じ化学を有する場合に適用可能であり得る。
【００４８】
別の実施形態において、アレイは、エキソソーム結合リガンドを含む１つまたは複数のポリマーによって提供される。この実施形態において、基質はポリマーから一体化して形成され、それによって基質表面を形成し得る。基質がポリマーから形成される実施形態において、基質表面は、ポリマー上でのエキソソーム結合リガンドの形成のために、そのポリマーを活性化するように処理され得る。
【００４９】
一実施形態において、ポリマーは基質へカップリングされるかまたは他の場合には結合され、それによって、例えばビオチン／ストレプトアビジン結合を介して、基質表面を形成する。この実施形態において、エキソソーム結合リガンドを含むポリマーは基質の上へコーティングされ、それによって、基質表面上でエキソソーム結合リガンドを形成する。好ましくは、ポリマーは、基質の化学と比較して異なる化学を有する。例えば、ポリマーはデキストランであり得るが、基質はセルロースであり得る。
【００５０】
上述したように、およびさらに詳細に本明細書において記載されるように、エキソソーム結合リガンドが１つまたは複数のポリマーによってアレイ中に提供される場合に、それらのポリマーは、最低エネルギーで、それらが提示するリガンドが、２Åを超える、かつ多くとも約１０Åの、好ましくは３．５〜６Åまたは４〜６Åの互いから離れた間隔で置かれることがインシリコで観察されるかどうかに従って選択される。簡潔には、インシリコの観察は、ポリマー（アニオン基または電子豊富な基を備えた）のサブ構造単位（典型的には六量体〜十二量体であるがより大きいかもしれない）を、最も安定な（最低エネルギー）三次元構造を表示するように、したがってこの構造がエキソソーム結合に関与する可能性が高いように、幾何学的構造最小化計算（ＭＭ＋アルゴリズム）に供することから導き出される。リガンド間の距離を次いでインシリコで測定して、エキソソームへの結合の可能性を決定できる。モデル化されたオリゴマーのエネルギー最小化構造がリガンドペアの好適な数を持ち、電子豊富なリガンドまたはアニオンリガンドのペアの分離が２〜１０Åの距離である場合、その結果このモデル化されたオリゴマーが表わすポリマーは、本発明に記載のエキソソームまたは微小胞を結合するために好適である。
【００５１】
したがって、別の実施形態において、エキソソームまたは微小胞の組成物または単離物を得るための方法が提供される。方法は、以下のステップ：
エキソソームまたは微小胞を含む液体を提供することと；
エキソソームまたは微小胞への結合のためのデバイスを提供することであって、デバイスが
表面を有する基質；
基質に付着した複数のポリマー；
複数のポリマー上に配置されるアニオン基または電子豊富な基の形態のエキソソーム結合リガンド；
を含み；
ポリマーが基質表面から拡張して、エキソソームまたは微小胞への結合のために基質表面から離れた間隔で置かれた場所にエキソソーム結合リガンドを位置し、それによってエキソソームまたは微小胞がデバイスへ結合することを可能にする；
デバイスを提供することと；
エキソソームまたは微小胞がエキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件においてデバイスと液体を接触させることと；
液体からデバイスを分離すること；
を包含し、それによってエキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得；
エキソソーム結合リガンドが、本明細書において記載されるエネルギー最小化モデルにおいて、２Åを超える、かつ多くとも約１０Åの、好ましくは３．５〜６Å、好ましくは４〜６Åの互いから離れた間隔で置かれることがインシリコで観察される。
【００５２】
別の実施形態において、エキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得るための方法が提供される。方法は、以下のステップ：
エキソソームまたは微小胞を含む液体を提供することと；
エキソソームまたは微小胞への結合のためのデバイスを提供することであって、デバイスが
表面を有する基質；
基質に付着した複数のポリマー；
複数のポリマー上に配置されるアニオン基または電子豊富な基の形態のエキソソーム結合リガンド；
を含み、
複数のポリマーが基質と異なる化学を有する；
デバイスを提供することと；
エキソソームまたは微小胞がエキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件においてデバイスと液体を接触させることと；
液体からデバイスを分離すること；
を包含し、それによってエキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得；
エキソソーム結合リガンドが、本明細書において記載されるエネルギー最小化モデルにおいて、２Åを超える、かつ多くとも約１０Åの、好ましくは３．５〜６Å、好ましくは４〜６Åの互いから離れた間隔で置かれることがインシリコで観察される。
【００５３】
１つまたは複数のポリマー上で提供されるエキソソーム結合リガンドから形成されるアレイの秩序は、各々のポリマー内のモノマーの秩序および各々のポリマーの長さに関して、ポリマーの不均一性に一般的に依存する。好ましくは、本発明における使用のためのポリマーは、ほとんど不均一性を有していないか、または他の場合には、多かれ少なかれ、モノマー秩序およびポリマー長さに関し均一性を有する。好ましくは、ポリマーは直線状である。
【００５４】
この点に関して、天然源または生物源に由来するポリマーではなく、合成ポリマーが好ましい。これは、生物源（特定の多糖等）からのポリマーが、ポリマー長、分岐モノマー秩序およびさらにモノマー官能基のいずれかに関して、顕著な不均一性を有するからである。本明細書において記載されるように、この不均一性は一般的に、エキソソームまたは微小胞の結合のより低い効率およびエキソソームまたは微小胞のより低い収率に寄与する。したがって、一実施形態において、ポリマーは、分画されないまたは不均一な天然源または生物源（特にヘパリン）ではない。
【００５５】
より好ましくは、モノマー含有量に関して、ポリマーは、特にポリマーが異なるモノマー種を含む場合に、モノマーの一様な秩序を有し、そこで、モノマー種のうちのいくつかのみがエキソソーム結合リガンドを含有する。モノマー秩序の均一性が、エキソソームまたは微小胞の外膜表面へ提示されるエキソソーム結合リガンドの間隔における均一性を生成することが特に重要である。これは一般的に、エキソソームまたは微小胞との相互作用のために、エキソソーム結合リガンドの一様なステレオ化学が存在することを要求する。
【００５６】
ポリマーを形成するモノマーの少なくとも２５％（好ましくはポリマーを形成するモノマーの５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％）が、エキソソームまたは微小胞の外膜への結合を可能にするように基質表面上で配置されるエキソソーム結合リガンドを有することが、好ましい。
【００５７】
ポリマーを形成するモノマーのすべてが、約３．５〜６Å、好ましくは４〜６Å、３．５、４、５または６Åの互いからの間隔で置かれるエキソソーム結合リガンドを、エキソソームまたは微小胞の外膜表面へ提示することが、特に好ましい。
【００５８】
ポリマーが２つ以上のモノマー種からなる特定の実施形態において、１つの種は１つのタイプのエキソソーム結合リガンドを提供し、別のモノマーの種は別のタイプのエキソソーム結合リガンドを提供し得る。
【００５９】
さらに、モノマー種の長さに依存して、１つのモノマー種は２つ以上のエキソソーム結合リガンド（それは同じであるか異なり得る）を提供し得る。但し、モノマー種上で提供されるリガンドは、エキソソームまたは微小胞の外側表面へのそれらの提示において、約３．５〜６Åまたは４〜６Å、好ましくは３．５、４、５または６Åの互いからの間隔で置かれる。
【００６０】
本発明の意外な所見は、エキソソームおよび微小胞を、電荷（特にエキソソームまたは微小胞上の正電荷）に基づいて、インビボまたはインビトロで形成された生物流体の他の構成要素から分離できるということである。
【００６１】
大部分の細胞膜および脂質二重層は正味の負電荷を有する（生理的ｐＨで一般的に負に荷電される脂質極性頭部基、膜の糖およびタンパク質から特に生じる）と一般的に理解されているので、これは意外なことである。
【００６２】
複数のポリマーが基質と異なる化学を有する場合、またはポリマーが基質表面から拡張して、基質表面から離れてエキソソーム結合リガンドを位置する場合、上記の実施形態において利用されるエキソソーム結合リガンドは、アニオンまたは電子の豊富な基の形態であるか、またはそれらからなる。エキソソームは、７．４±１〜１．５．の生理的ｐＨで一般的に安定である。したがって、エキソソーム結合リガンドは、約４〜８または５〜８のｐＨで一般的にアニオンまたは他の場合には電子豊富な基である。エキソソーム結合リガンドは、無機アニオンもしくは有機アニオンまたは電子豊富な基であり得る。無機アニオンの例としては、硫黄、セレン、ホウ素、窒素またはリン原子を含有するアニオンが挙げられ、サルフェート、セレナート、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネートが挙げられる。好ましくは、リガンドは、有機アニオンまたは電子豊富な基である。例としては、硫酸化アルコールおよびアミン、アミド、スルホンアミド、カルボキシレート基、アルコール、エーテル、無水物類、セレナート、イミド、アシルスルホンアミド、ホスホネート、ホスフィネート、ホスフェートなどが挙げられる。一実施形態において、本発明に記載のエキソソーム結合リガンドのアレイは、有機アニオンおよび無機アニオンまたは電子豊富な基の組み合わせであり得る。
【００６３】
本明細書において記載される本発明の重要な所見は、ポリマーがエキソソーム結合リガンドのアレイを提供するために利用される場合に、ポリマーは、一様な間隔で置かれた複数のエキソソーム結合リガンドを微小胞外膜表面へ提示または表示するその能力に基づいて（ポリマー主鎖のいくつかの他の特徴に基づいてではなく）、選択されることである。この点に関して、本発明は、以前に記載された、溶液から微小胞を沈殿させるためにポリマーを利用した他のアプローチとは区別される。それらのアプローチは典型的には、水溶解度および体積排除特徴に基づいてポリマーを選択していた。これらのアプローチにおいて利用された例示的なポリマーは、ポリエチレングリコール［ＵＳ２０１３／０２７３５５４およびＵＳ２０１３／０３３７４４０］および多糖［ＵＳ２０１５０１９２５７１］である。
【００６４】
上記実施形態によれば、複数のポリマーが基質と異なる化学を有する場合、またはポリマーが基質表面から拡張して、基質表面から離れてエキソソーム結合リガンドを位置する場合、ポリマーは、多糖、ポリエチレンテレフタレート、またはアニオン基もしくは電子豊富な基による誘導体化のために好適な側鎖を備えたペプチド（ポリアスパラギン酸、ポリセリン、ポリスレオニン、ポリアスパラギン等）、核酸、または他の有機分子（ポリエーテル、（ＰＥＧＳ）、硫酸化ポリビニルアルコール、ポリフェノール、ポリフェニルボロン酸等）、または他のポリ芳香族化合物もしくはポリヘテロ芳香族化合物（好ましくは合成の）であり得る。ポリマーが天然源または生物源に由来し、かつポリマーが、特にポリマー長、モノマー含有量および秩序に関して、有意な源依存性不均一性を有することが知られている、複数の実施形態において、ポリマーの所望される長さ、モノマー含有量または秩序についての不均一性を減少させ均一性を増加させるように、天然源または生物源を分画することは特に好ましい。典型的には、ポリマーは、ある特定の多糖（ヘパリン等）について１０ｋＤａ〜９００ｋＤａ、好ましくは２０〜５０ｋＤａ、またはある特定の他の分子（例としてはキトサン）について１００〜２００ｋＤａの分子量を有する。特に好ましいポリマーは、ピラノース類の群から選択される多糖の合成源または均一の天然源もしくは生物源であり、モノマーとしては、デキストロース、グルコース、ガラクトース、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、および同種のもののアミノ糖類が挙げられる（がこれらに限定されない）。ポリマーは、ペプチドの形態で提供され得る。特に好ましいペプチドはポリアスパラギン酸である。本明細書において記載されるように、アニオン性側鎖の間隔が４〜６Åの本発明の好ましい範囲を超過することを考慮すると、ポリグルタミン酸はあまり好ましくはないかもしれない。他の好ましいペプチドとしては、ポリセリン、ポリスレオニン、ポリアスパラギン、ポリシステイン酸、ポリセレノシステイン酸、およびＤ型の同じアミノ酸が挙げられる。ポリマー主鎖は、水溶性または非水溶性であり得る。特に好ましい実施形態において、ポリマーは、グルコースモノマーの長さに近似する長さ（約１．５ｎｍ）を有する単一モノマー種を含有するか、またはグルコースモノマーもしくは約１．５ｎｍの長さを有するその誘導体であり、各々のモノマーは、各々の基が約４〜５Åで離れた間隔で置かれるように配置されるアニオン基または電子豊富な基を含み、ポリマーは、約１００〜４００のモノマー、好ましくは約２５０〜３００のモノマーを含有し、および／または約４０〜６０ｋＤａ、好ましくは約４５〜５５ｋＤａの分子量を有する。好ましい実施形態において、ポリマーは直鎖セルロース分子であり、エキソソーム外膜表面への提示のための各々モノマーは、陰イオン基または電子豊富な基（好ましくはサルフェート基）により官能化される。
【００６５】
アレイが、基質表面上で形成される場合、基質表面の全体がエキソソーム結合リガンドのアレイで被覆される必要はないか、またはエキソソーム結合リガンドのアレイを含有する必要はない。一実施形態において、基質は、エキソソームまたは微小胞が結合領域へ結合することを可能にするように、領域上にエキソソーム結合リガンドのアレイを有するエキソソームまたは微小胞の結合領域からなる。基質の他の表面は、エキソソームの結合を除外するように操作され得る。例えば、これらの「非結合」領域は、使用時に、それらがエキソソームまたは微小胞へエキソソーム結合リガンドを提示しないように構築され得る。エキソソームの結合領域および非結合領域のかかる配置は、エキソソームの産生、検出またはモニタリングのためのデバイスの形成において有用であり得る。かかるデバイスとしては、マイクロ流体デバイス、または細胞培養のための大型デバイスもしくは臨床用途のための医療デバイスが挙げられ得る。
【００６６】
好ましい実施形態において、エキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得るための方法が提供される。方法は、以下のステップ：
エキソソームまたは微小胞を含む液体を提供することと；
エキソソームまたは微小胞への結合のためのデバイスを提供することであって、デバイスが
表面を有する基質；
基質に付着した複数のポリマー；
エキソソームへの結合のためにポリマー上に配置され、それによってエキソソームまたは微小胞がデバイスへ結合することを可能にするアニオン基または電子豊富な基の形態のエキソソーム結合リガンド；
を含み；
基質がアガロースであり、ポリマーがデキストランであり、エキソソーム結合リガンドがサルフェートであるか（例えば、Ｃａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒＳまたはＣａｐｔｏＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ)）；または
基質がポリビニルエーテルであり、ポリマーがポリアクリルアミドであり、エキソソーム結合リガンドがスルホイソブチル（ＳＯ３−）であるか（例えば、Ｅｓｈｍｕｎｏ  Ｓ（Ｍｅｒｃｋ、ＫＧａＡ））；または
基質がポリメタクリレートであり、ポリマーがポリアクリルアミドであり、エキソソーム結合リガンドがスルホイソブチル（ＳＯ３−）であるか（例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３−（Ｍｅｒｃｋ、ＫＧａＡ））；または
基質がポリメタクリレートであり、ポリマーがポリアクリルアミドであり、エキソソーム結合リガンドがカルボキシエチルであるか（例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＣＯＯ−（Ｍｅｒｃｋ、ＫＧａＡ））；または
基質が変性親水性ポリエーテルスルホンであり、ポリマーが架橋ポリマーコーティングであり、エキソソーム結合リガンドがＳＯ３スルホニルである（例えば、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｓ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．））；
デバイスを提供することと；
エキソソームまたは微小胞がエキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件においてデバイスと液体を接触させることと；
液体からデバイスを分離すること；
を包含し、それによってエキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得る。特定の好ましい実施形態において、基質はセルロースであり、ポリマーはデキストランであり、エキソソーム結合リガンドはサルフェートである。１つの例は、アガロースビーズでのみグラフトするデキストラン上のサルフェートを包含する構造の国際公開第２００８／０３９１３６号の表４に示されるデバイスである。
【００６７】
別の実施形態において、エキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得るための方法が提供される。方法は、以下のステップ：
エキソソームまたは微小胞を含む液体を提供することと；
エキソソームまたは微小胞への結合のためのデバイスを提供することであって、デバイスが
表面を有する基質；
エキソソームへの結合のために基質表面上に配置され、それによってエキソソームまたは微小胞がデバイスへ結合することを可能にするアニオン基または電子豊富な基の形態のエキソソーム結合リガンド；
を含み；
デバイスが、
基質がアガロースであり、リガンドがスルホプロピル（サルフェート）である（例えば、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ））；
基質がアガロースであり、リガンドがカルボキシルである（例えば、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ））；
基質がポリメタクリレートであり、リガンドがサルフェートである（例えば、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））；
基質がポリ（グリシジルメタクリレート−コ−エチレンジメタクリレート）であり、リガンドがＳＯ３（スルホニル）である（例えば、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ  ＳＯ３（ＢＩＡ））；
基質がセルロースであり、リガンドがスルホン酸（Ｒ−ＣＨ２−ＳＯ３−）である（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ））；
基質がセルロースであり、リガンドがサルフェートである（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＣ（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ））；
生成物の群から選択される；
デバイスを提供することと；
エキソソームまたは微小胞がエキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件においてデバイスと液体を接触させることと；
液体からデバイスを分離すること；
を包含し、それによってエキソソームまたは微小胞の単離物または組成物を得る。
デバイスは、様々な形状または立体配置の形態をとり得る。デバイスの基質の表面は、平坦であるか、湾曲しているか、へこみがあるか、または多孔性であり得る。表面は、チューブもしくはウェル内で、またはビーズもしくは膜上で形成され得る。したがって、デバイスは、膜、ビーズ、チューブまたはウェルなどであり得る。
【００６８】
一実施形態において、デバイス表面は、好適なナノテクノロジー分析技法（原子間力顕微鏡、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）、オージェ発光分析（ＡＥＳ）、レーザー質量分析、Ｘ線光子分光分析等）を使用して、かかるデバイスへ結合されたエキソソームまたは微小胞の存在、その特性、またはそのサイズを感知するために、１つまたは複数のセンサーとのコミュニケーションへと導かれる。
【００６９】
別の実施形態において、デバイスの基質表面は測定手段とコミュニケーションして、エキソソーム−基質（または微小胞−基質）の組み合わせの有用なパラメーターを決定する。それらは、（ａ）電気プローブ、（ｂ）組込型レーザー、（ｃ）電気力顕微鏡、（ｄ）磁気力顕微鏡、（ｅ）走査ゲート顕微鏡または他の好適な技法の１つまたは複数などの手段を介する（ｉ）エキソソームの存在または非存在（およびそれによりエキソソームの数および密度）、（ｉｉ）エキソソームのサイズ、（ｉｉｉ）エキソソームの伝導率、（ｉｖ）エキソソームの表面マーカー、（ｖ）エキソソームの剛性、（ｖｉ）エキソソームの電荷、または（ｖｉｉ）いくつかの他の有用なパラメーターの１つまたは複数などである。デバイスは測定手段を形成し得る。
【００７０】
本発明の方法は、上で定義したエキソソーム結合リガンドを含むデバイスを利用して、電荷に基づき生物源から微小胞、特にエキソソームを単離する。上記のように、電荷に基づき、および特にエキソソームまたは微小胞の正電荷に基づき、生物流体の他の構成要素からエキソソームおよび微小胞を分離できることは、本発明者の意外な所見である。この所見に基づいて、本発明者は、エキソソームおよび微小胞の単離にイオン交換クロマトグラフィーアプローチを利用した。
【００７１】
本発明によれば、エキソソームまたは微小胞を含有する液体は、液体中のエキソソームまたは微小胞のエキソソーム結合リガンドへの結合を可能にする条件においてデバイスと接触される。これは次いでエキソソームまたは微小胞をデバイスに結合させ、これが、液体からのデバイスの分離から生じる、液体からのエキソソームまたは微小胞の後の分離についての根拠である。
【００７２】
エキソソームまたは微小胞がエキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にするための条件は一般的に、エキソソームまたは微小胞を含有する液体の塩含有量およびｐＨの考慮を要求する。一般的に、液体のｐＨはエキソソームまたは微小胞のｐＨ安定性によって定義され、このｐＨ安定域は約４〜８である。
【００７３】
いくつかの実施形態において、エキソソームまたは微小胞を含有する液体は、デバイスとの接触の前に前処理され得る。かかる処理は例えば、エキソソーム結合リガンドとの結合相互作用を至適化するためのｐＨ調整を含み得る。例えば、溶液のｐＨを７．２〜７．４の生理的ｐＨレベルへ調整することが必要であり得る。これは、エキソソーム結合リガンドに結合されるエキソソームまたは微小胞上の部分が陽イオン性であり、かつエキソソーム結合リガンドのアニオンまたは他の場合には電子豊富な基へ結合可能であることを保証する。
【００７４】
処理は、デバイスと液体を接触させる前の、塩調整（例えば透析ステップによる、液体の潜在的な塩の最小化）も包含し得る。
【００７５】
典型的には、エキソソームまたは微小胞を含有する液体は、基質と接触される前に、７．２〜７．４の範囲のｐＨ、および０．１〜０．５Ｍ、好ましくは０．１５Ｍの塩含有量、および０．０１Ｍのホスフェート含有量を有するだろう。
【００７６】
さらなる処理が、エキソソームまたは微小胞がエキソソーム結合リガンドへ結合することを妨害し得る細胞残屑または混入を除去するために要求され得る。この処理は、約０．２２ミクロンまでの濾過有りまたは無しで、５００ｇでの遠心分離を包含し得る。
【００７７】
一実施形態において、液体は生物流体の形態であり得、それは遠心分離されて上清および微小胞含有ペレットを形成し、上清は廃棄され、ペレットはデバイスとの接触のためのイオン交換結合バッファー中で再懸濁される。かかるバッファーは、７．２〜７．４の範囲のｐＨおよび０．１Ｍ〜０．２Ｍの範囲の塩含有量を一般的に有する。
【００７８】
濾過もまた用いて、デバイスとの液体の接触の前に液体から特定のサイズの微小胞を枯渇させることができる。例えば、液体を分画して、デバイスとの液体の接触の前に１００ｎｍを超える直径を備えるエキソソームを除去できる。あるいは、このステップを、エキソソーム結合リガンドからの微小胞の溶出の完了時に遂行できる（さらに以下で記載されるように）。
【００７９】
液体およびデバイスは、エキソソームがエキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にするのに十分な期間で、接触へと導かれる。一般的に、これは１分間〜１６時間であり、約１５分間であり得る。これは１分間未満、例えば３０秒未満であり得る。
【００８０】
デバイスとの液体の接触は多様なフォーマットで確立され得る。例えば、液体は固体樹脂またはビーズを介して浸透され、捕捉され、かつ浸透および捕捉サイクルは前もって決定されたサイクル数で反復され得る。
【００８１】
上で論じられるように、本発明の特定の利点は、エキソソームまたは微小胞へ結合する能力に関して、荷電ポリマー（特に固有の不均一性を有する天然源に由来するもの）中に不均衡があり、かつ本発明に記載の基質またはポリマーの慎重な選択によって結合効率における有意な改善を得ることが可能であるという意外な新事実にある。特に、本明細書において記載される研究において、本発明者は、エキソソームまたは微小胞の結合について他の場合には同等に効率的であると恐らくみなされるであろうポリマー（一般的にそれらは、生理的ｐＨですべて負に荷電するので）が、変動するレベルの効率を有すること、およびこの様々なレベルの結合効率はエキソソームまたは微小胞の外膜表面へ提示された負電荷の配置により説明できることを示した。
【００８２】
特に、本明細書において記載されるように、本発明者は、全体的な単離収率（それは主に理論上の結合効率における差から生じる）は、約４．３％（ヒアルロン酸について観察されるように）から最大で９８％（セルファインサルフェートについて観察されるように）の範囲であると決定した。さらに、結合効率について試験されたポリマーについて構造モデルおよび結合モデルを決定することによって、結合効率における差が、エキソソーム外膜表面へ提示されたアニオンおよび電子豊富な基の配置に関して説明され、エキソソーム結合のための至適の基質またはポリマー、および特により高い結合効率を提供するであろうものの選択を可能にする。
【００８３】
エキソソームまたは微小胞の単離手順においてこの研究を実装することによって、本発明は、エキソソームまたは微小胞の許容可能な収率を得るために他の場合に適用できるものよりも広範囲の結合選択肢を可能にする。これは、結合バッファーにおいて適用できるｐＨまたは塩の条件に関して限定がある場合、特に有用である。
【００８４】
さらに、本発明はより効率的な結合手順を可能にし、より短い結合期間、または他の場合に複数の結合サイクルが要求される場合により少数の結合サイクルを潜在的に可能にする。これらの改善は、エキソソームまたは微小胞の単離へのイオン交換アプローチを、ハイスループット処理（エキソソームの医薬スケール産生を可能にするために最終的に要求される製造実践）へ確実に平行移動することを可能にする。
【００８５】
方法の結合相における最終ステップは、上で示されるように、液体からデバイスを分離し、それによって液体からエキソソーム（それはデバイス上のエキソソーム結合リガンドへ結合される）を分離することである。この分離は、液体からデバイスを除去することによって（例えばビーズの形態でのデバイスを遠心分離することによって）能動的に、またはデバイスにわたって液体を通過させることによって（それにより液体がデバイスから分離するにつれて液体からエキソソームを枯渇させる）受動的に、達成され得る。
【００８６】
本発明の特に重要な利点は、主としてエキソソームおよび／または微小胞ならびに溶出バッファーからなる溶出物を産生するように、生物源からのエキソソームおよび／または微小胞の溶出を可能にすることである。これは、最終産物の品質制御の調節のために特に重要である。比較において、エキソソームの単離のための今日までの他のアプローチは、例えばポリエチレングリコールの形態、または多糖の分解のための酵素と共に、多糖もしくはその断片の形態での沈澱剤により精製されるエキソソームをもたらす。これらのアプローチは、これらの混入物を除去するための最終産物のさらなる操作を要求し、このさらなる操作（遠心分離または濾過等）はエキソソームに有害に影響し得る。
【００８７】
より高い親和性またはより高い結合活性相互作用を介して本発明のデバイスに結合したエキソソームおよび微小胞が、エキソソーム結合リガンドから一様に溶出され、リガンドからのエキソソームの放出を可能にすることは、本発明の意外な所見である。具体的には、本明細書において記載されるように、選択された（しかし関連しない）基質（すなわちセルファインサルフェート、キトサンおよびポリ（メチルビニルエーテル−マレイン酸無水物））は、改善されたエキソソーム結合効率を有し、それへ結合されたエキソソームは一般的に、エキソソームが安定なままである範囲の塩濃度またはｐＨ範囲を有する溶出バッファーの利用によって溶出され得ることが見出された。
【００８８】
したがって、一実施形態において、方法は、デバイスが液体から分離された後に基質からエキソソームまたは微小胞を放出するために、エキソソーム結合リガンドからエキソソームまたは微小胞を溶出する、さらなるステップを含む。
【００８９】
本発明によれば、エキソソームまたは微小胞は、溶出バッファーとのデバイスの接触によって溶出され得る。典型的には、溶出バッファーは、バッファー系のｐＨに依存して、約０．５〜４Ｍまたは０．５〜２Ｍの塩含有量を有する。この塩含有量は、溶出バッファー中の陰イオン種と溶出をもたらすエキソソームまたは微小胞の外膜の間の優先的結合を確立する。
【００９０】
さらなる実施形態において、溶出バッファーの塩含有量は結合バッファーと同じであり得、溶出バッファーは結合バッファーよりも高いｐＨを有し得る。これは、バッファー系のｐＨが、エキソソーム結合リガンドへ結合するエキソソームまたは微小胞上の部分の等電点に接近するにつれて、エキソソーム結合リガンドからのエキソソームまたは微小胞の溶出をもたらす。したがって、一実施形態において、溶出バッファーは約０．５〜２Ｍの塩含有量およびｐＨ約７．２〜７．４のｐＨ単位を有する。
【００９１】
別の実施形態において、溶出バッファーは基質表面を形成するポリマーのオリゴマーを含み、上記オリゴマーは、ポリマー上のエキソソーム結合リガンドよりも高いアニオン電荷またはより高い電極電位を有し、それによりエキソソームまたは微小胞の溶出をもたらす。例えば、エキソソーム結合リガンドがセルロースサルフェート多糖の形態で基質表面上で提供される場合に、溶出バッファーは、より多量の硫酸化を有する、より短鎖のセルロースオリゴマーを含み得る。
【００９２】
別の実施形態において、溶出バッファーは、エキソソームまたは微小胞に対する基質上のエキソソーム結合リガンドよりも高い親和性を有する競合リガンドを含み得る。例えば、エキソソームは、糖、好ましくはフルクトース（それはエキソソームに対しボロン酸よりも高い親和性があり、したがって基質からエキソソームを溶出する）の過剰量を含有する溶出バッファーを使用して、ボロン酸ポリマーから溶出され得る。
【００９３】
一実施形態において、溶出バッファーは、一回のみ基質へ適用される。他の実施形態において、溶出バッファーは、前もって決定された数のサイクルで継続的に繰り返され得る。
【００９４】
一実施形態において、方法は、デバイスから放出されたエキソソームまたは微小胞を分離する、さらなるステップを含み得る。エキソソームまたは微小胞が、溶出の完了時にデバイスと共に溶液中に残存する場合に、このステップは特に要求される。１つの例は、ビーズの形態でデバイス上で配置されるエキソソーム結合リガンドからエキソソームまたは微小胞が溶出され、ビーズが放出されたエキソソームまたは微小胞から除去される場合である。他の実施形態において、物理的分離は、エキソソームがデバイスから溶出されることから単純に生じ、例えばカラムクロマトグラフィーにおいて起こり得る。
【００９５】
本明細書において開示および定義される本発明は、テキストまたは図面から言及されるかまたは明らかである個別の特色の２つ以上のすべての代替の組み合わせへ拡張されることが理解されるだろう。これらの異なる組み合わせのすべては、本発明の様々な代替態様を構成する。
【００９６】
実施例
実施例１  −  ポリマーベースの基質を使用するエキソソーム単離
１．１  試験材料
使用した試験材料は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ完全培養培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）血清低減培地＋１０％エキソソーム枯渇ウシ胎仔血清＋ペニシリン−ストレプトマイシン＋ＧｌｕｔａＭＡＸ）中で４８〜７２時間培養した、マウス視床下部神経細胞株ＧＴ  １−７に由来する細胞培養馴化培地であった。
【００９７】
１．２  試験方法
新鮮に収集された細胞培養馴化培地を遠心分離して（５分間で５００×ｇ）細胞および大きな残骸を除去し、次いで上清を０．２２μｍのシリンジフィルターを使用して濾過して大きな小胞およびアポトーシス小体を除去した。濾過した馴化培地を、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００上でナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）を使用して、粒子濃度について定量した。
【００９８】
表１は、結合効率および溶出効率ならびに全体的な単離収率を決定した、ポリマーベースの基質のパネルを記載する。
【００９９】
キトサンは、２００ｋＤａ（ビオチン−）キトサンであった（カスタムメイド）。Ｖｉｒｏａｄｅｍ  ｂｅａｄｓは、Ａｄｅｍｔｅｃｈ  Ｖｉｒｏ−Ａｄｅｍｂｅａｄｓであった。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）７５は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ＃Ｓ６６５７からであった。ＢＡ−Ｍａｇｂｅａｄｓは、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  １５０４−５  ＳｉＭＡＧ−ボロン酸磁性粒子からであった。ＰＥＧ−対照：ビオチン−ＰＥＧ２４（厳密に言えばビオチン−ＰＥＧ２４−３ＡＰＢＡおよびビオチン−ＰＥＧ２４−４ＡＰＢＡである３−ＡＰＢＡ／４−ＡＰＢＡについての対照として（カスタムメイド））。Ｍａｇビーズ対照は、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ  ＳＶＭ−４０−１０アビジンコーティング磁性粒子からであった。Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ細胞培養培地エキソソーム精製キット（＃６０６００）を使用した。キトサン、ヘパリン、３−ＡＰＢＡ、４−ＡＰＢＡ、ＰＥＧ対照およびヒアルロン酸を、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ  ＳＶＭ−４０−１０アビジンコーティング磁性粒子へビオチン−Ｘによりカップリングした。
【０１００】
至適化された濃度で基質上に固定化したリガンドを、チューブ回転機（１００ｒｐｍ）上で４℃で５時間１ｍｌの定量した試験材料とインキュベーションして、エキソソームを親和性捕捉する能力を試験した。リガンド固定化固体基質をインキュベーション後に分離し、粒子の濃度を、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００上でＮＴＡを使用して、捕捉後の溶液中で決定した（未結合のエキソソーム）。エキソソームへ結合した分離されたリガンド固定化固体基質を、チューブ回転機（１００ｒｐｍ）上で４℃で一晩溶出溶液中でインキュベーションして、結合したエキソソームを溶出した。リガンド固定化固体基質を溶出インキュベーション後に分離し、粒子の濃度をＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００上でＮＴＡを使用して溶液中で決定した。
【０１０１】
１．３  データ捕捉
粒子濃度を、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００上でＮＴＡを使用して決定した。用いられたデータ捕捉ストラテジーは、静的モード操作において５×３０秒間ビデオを取得することであった。ＮａｎｏＳｉｇｈｔソフトウェアは次いで５つの独立した３０秒間のビデオ捕捉を分析して、平均（±標準誤差）粒子濃度データによる実験的な報告を作成した。
【０１０２】
１．４  試験リードアウト
３つの実験ステージで粒子濃度を測定した。
（ｉ）親和性分離の前（すなわち捕捉前の試験材料中の粒子濃度）
（ｉｉ）溶液中の親和性捕捉の後（すなわち未結合のエキソソームを表わす捕捉後の試験材料中の粒子濃度）
（ｉｉｉ）溶出の後（すなわちリガンド捕捉粒子の溶出後の溶液中の粒子濃度）
【０１０３】
１．５  データ分析方法論
得られた試験リードアウトデータを使用して、４つのパラメーターを決定した。
・リガンド結合効率（すなわちリガンド固定化固体基質への曝露によって捕捉された試験材料中の粒子の数）
・リガンド溶出効率（すなわち溶出されたそのリガンド捕捉粒子の比率）
・全体のプロセス収率
【０１０４】
１．６  結果
至適化された結合条件において、セルロースサルフェートリガンド（セルファインサルフェートの形態で）は、理論上の結合粒子の数が１．３１×１０１０で、７７．９０％の理論上の結合効率を示した（表１）。セルファインサルフェートビーズからの溶出後に回収された粒子の数は、１．６４×１０１０であり、器機によって定量された溶出効率は１２５％であった（表１）。セルファインサルフェートリガンドについての全体のプロセス収率は９８％であった（表１）。注、１２５％の溶出効率は、操作上の因子および他の因子に起因する多様な定量データ分散の影響を受けた。１００％未満に向かう傾向の実際の溶出効率が予想されるだろう。
【０１０５】
Ｖｉｒｏａｄｅｍｂｅａｄｓは、理論上の結合粒子の数が１．１１×１０１０で、６６．１３％の理論上の結合効率を示した（表１）。試験された溶出条件において、２３２．４ｎｍの平均サイズを備えたＶｉｒｏａｄｅｍｂｅａｄｓによって捕捉された粒子の４１％を溶出できた（表１）。Ｖｉｒｏａｄｅｍｂｅａｄｓについての全体のプロセス収率は２７％であった（表１）。
【０１０６】
予想外に、超遠心分離法ベースのエキソソーム単離についての全体的な粒子単離収率は、７．５％であった（表１）。本発明中で報告されたリガンドにより観察された全体的な単離収率に比較して、この収率は大幅に低かった。Ｎｏｒｄｉｎ  ｅｔ  ａｌは、超遠心分離法によるエキソソーム収率が１０％であると報告した（Ｎｏｒｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。さらに、４Ｌの脂肪幹細胞由来ＣＭは超遠心分離法による０．９ｍｇのエキソソームをもたらし、恐らく５ｍｇの単回ヒト用量を生成するには、２３ＬのＣＭおよび２７６〜２８０時間の処理を必要とする。比較において、８０％のエキソソーム収率で本発明において記載されるリガンドは、クロマトグラフィーモードで処理された場合より短い処理時間で４Ｌ未満の脂肪の幹細胞由来ＣＭから５ｍｇの単精度のヒト用量を生成できた。これは、超遠心分離法の最新のゴールドスタンダードの単離方法に比較して、エキソソームを単離するための本発明において記載されるリガンドの優越性をさらに強調する。
【０１０７】
実施例２  −  ＥＭＩＴ構造的および機能的モデルの決定
官能化ポリマーの中で至適のエキソソーム結合の可能性を決定するために、インシリコのエネルギー最小化プロトコールを続いて行った。ポリマーのサブセクションを表わすオリゴマー（それは六量体〜十二量体の範囲のサイズであり得る）を、リガンドの正確なステレオ化学的立体配置（キトサンまたはセルファインサルフェートの事例において等の、既知のもの、またはポリアスパラギン酸の事例において等の、定義されたもの）を使用して描写した。立体配置がランダムまたは未知である（ポリ（メチルビニルエーテル−マレイン酸無水物）の事例において等の）場合に、次いでランダムなオリゴマー構造を同じやり方で使用した。構造を次いで、Ｐｏｌａｋ−Ｒｉｂｉｅｒｅ降下関数を使用する、エネルギー最小化計算（ＭＭ＋またはＡＭＢＥＲ分子力学モデル、ＨｙｐｅｒＣｈｅｍバージョン７．５）に供した。エネルギー最小値の決定に必要とされるコンピュータによる反復の数は、典型的には１０００〜２０００であったが、エネルギー最小値に到達しなかったならば、かかる最小値が達成されるまで計算を継続した。この時点で、複数の角度から配置を調べ、リガンドのポジショニングを相互の距離（例えば、硫酸化多糖の事例において硫黄原子間、またはポリ（メチルビニルエーテル−マレイン酸無水物）の事例において無水物のカルボニル酸素間）に関して査定した。これらの事例におけるポリマーの二次構造は、主鎖（それは６〜１２のモノマー単位からなる）が、ヘリックス形状（その上で結合部分が外部へ突出する）へと配置されることを示す。これらのエネルギー最小化計算は、ソフトウェア／処理の限界、およびさらに全体的なポリマーサイズにおける任意の変動の両方に起因して、全体としてのポリマーではなく、ポリマーの分画したサブセクションを表わすことを理解するべきである。さらに、ＭＭ＋／ＡＭＢＥＲタイプの計算は、溶媒和分子（水、またはインビボでもしくは実践的な意味で恐らく遭遇する他の構成要素等）の非存在下において遂行される。これらの計算はリガンド官能化オリゴマー自体の意味においてのみ実際は遂行されるので、この方法は、より複雑な培地中に存在する不一致および予測不能の構成要素を除外し、したがって内的に一貫するとみなされ得る。さらに、得られた結果は、最小限の構造内のリガンド間隔を有し、エキソソーム結合効率の観察と一致するパターンを示す。
【０１０８】
実施例３  −  セルファインサルフェートおよびセルファインホスフェートの予測される構造
セルファインサルフェートは、合成由来のセルロースサルフェート粒子であり、セルファインサルフェート（ＪＮＣ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、日本）として商業的に入手可能である。セルファインサルフェート調製物の合成方法は、ヨーロッパ特許ＥＰ０１７１０８６  Ａ２の一部である。簡潔には、非架橋セルロース粒子を、未加工のポリマーとして２５０〜３００グルコース単位から作製されるグルコースポリマーから開発した。セルロース粒子を次いで、硫酸化試薬を使用して、誘導されたセルロースサルフェートビーズ（セルファインサルフェート）へと硫酸化した。粒子上の硫黄含有量の合計は９００μｇ／ｇ乾燥重量である。
【０１０９】
セルファインサルフェート七量体モデルを、隣接するサルフェートの酸素種間のサンプル原子間測定により、投影の端部からおよび側面から示されるように（図１（Ａ）および１（Ｂ））、最小化する。サルフェート部分（硫黄から隣接する硫黄へ測定された）はおよそ６．７〜７．９Å離れ、荷電した酸素は４．５Å内で動くことが可能である（側面からの投影図中で指摘されるように）。本モデルは、エキソソームを結合するために、十分な間隙（ヘリックスからの外向きの突出）および水素結合形成性能力（アルコール部分とアニオン性または中性の電子豊富な酸素の間で等）の両方がなくてはならないことを示唆する。それに対しリガンドが水素結合を形成するエキソソーム表面分子は、したがって水素結合ドナー（リン脂質または細胞膜の他の主要な構成要素内のグリコール等のアルコール等）である可能性が高い。この事例において、第一級アルコール基（ＣＨ２ＯＨ）は、２つの陰イオン基（サルフェート等）の間に突出し、ピンサー型水素結合ネットワークを形成し、そこで、アルコールの水素は同時に２つの酸素原子と相互作用できる。サルフェートの酸素の縮退性質は、相互作用の確率がより高いことを意味し（１つのサルフェートあたり３、１ペアのサルフェートについて合計で６）、したがって結合のための水素結合ネットワークの強度を増加させる。図１（Ａ）および（Ｂ）を参照されたい。
【０１１０】
セルファインホスフェートは、同様に、合成由来のセルロースホスフェート粒子である。それはセルファインホスフェート（ＪＮＣ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、日本）として商業的に入手可能でもある。例示の目的のために十二量体として表わし、図１（Ｃ）および（Ｄ）は、モデルにおけるヘリックス構造の端部からおよび側面の描写を示す。モデルは、モノアニオンとしてのホスフェート基（ＣＨ２ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２）（実質的にＣＨ２ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）Ｏ−）の部分的に荷電した性質を示し、予想される結合のｐＨ範囲と一致する。セルファインサルフェートについてと同様にこの事例において、第一級アルコール基（ＣＨ２ＯＨ）はアニオン性ホスフェートの間に突出して、ピンサー型水素結合ネットワークを形成する。アルコールの水素は同時に２つの酸素原子と相互作用できる。ホスフェートの酸素の縮退性質はサルフェートのものに類似するが、ホスフェートのプロトン化程度のｐＨ依存性が相互作用の確率を決定する。図１（Ｃ）および１（Ｄ）中で示されるように、酸素のうちの２つは縮退し、結合のためのネットワーク水素結合の強度を増加させる。
【０１１１】
実施例４  −  ポリ（メチルビニルエーテル−マレイン酸無水物）の予測される構造
陰イオン性ポリマー［ポリ（メチルビニルエーテル−マレイン酸無水物）（ポリ（ＭＶＥ−ＭＡ））］は、Ｖｉｒｏａｄｅｍｂｅａｄｓ（Ａｄｅｍｔｅｃｈ、フランス）として市販で入手可能である。Ｖｉｒｏａｄｅｍｂｅａｄｓのために簡略な合成方法を下で記載する（Ｓａｋｕｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９ｂ）。高フェライト量（磁界下での表面分離を可能にする）を備えた小さな（直径３００ｎｍ）モノザイド（ｍｏｎｏｚｉｄｅ）磁性粒子（沈降を低減し、広い表面を提供する）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／ホスフェートバッファー５／９５溶液中のポリ（ＭＶＥ−ＭＡ）を３７℃で３時間グラフトすることによって調製した。
【０１１２】
ポリ（メチルビニルエーテル−マレイン酸無水物）（ＰＭＶＥＭＡ）の事例において、フランジオンおよび主鎖のメトキシ置換の両方の上での置換のステレオ化学は、ランダムかつ定義されていない。エネルギー最小化構造を得る目的のために、一様かつ一貫したステレオ化学的立体配置を使用し、主鎖から離れたフランジオン部分の点が交互に起こるシート構造をもたらした。隣接するカルボニル（それはリン脂質との相互作用のための水素結合アクセプターとして一緒に作用できる）の間の分離は、およそ４．４Åである。図３を参照されたい。
【０１１３】
実施例５  −  キトサンの予測される構造
キトサン（キチンのＮ−脱アセチル化からもたらされる天然多糖類）は、６０〜１００％のＮ−脱アセチル化単糖単位を含有する。キトサンのエネルギー最小化構造は、端部から、以下に示すように、内面に向かって所在するアミノ基を備えたヘリックスを形成し、ヘリックスから外に向かって突出されるアルコール部分を置く。側面からの投影図は、エキソソームのリン脂質と相互作用できる結合部分として本明細書において提案される、隣接する第一級アルコール基の位置を図示する。これらは、ヘリックスの周辺部のあたりにおよそ４．６〜５．０Å離れて配置される。図２Ａおよび２Ｂを参照されたい。
【０１１４】
実施例６  −  ヘパリンの予測される構造
ヘパリン（それはヘパランほど硫酸化されない）は、グルクロン酸部分、ガラクトサミン部分、およびイズロン酸部分からなる。ヘパリンはヘパラン（それはより多くのグルクロン酸単糖を担持する）よりも多くのイズロン酸を含有する。したがって、結合部分の幾何学的構造の予測がポリマー構造の全体にわたって一貫すると予想できないので、ヘパリンのエネルギー最小化モデルは任意のものである。想定はしたがって単糖単位の任意の配置に基づくが、それにもかかわらずこのエネルギー最小化構造も、そこからサルフェート基が外に向かって突出するヘリックス超構造を形成する。隣接する硫黄原子間の距離は、図示されるように５〜６Åの間である。ヘパリンが描写されるものよりも少数のサルフェートを含有すると仮定すれば、これは、例えばセルファインサルフェート（それは単糖単位のより一貫した配列を含有する）よりも低下した結合効率をもたらす可能性がある。図４を参照されたい。
【０１１５】
実施例７  −  ３−ＡＰＢＡおよび４−ＡＰＢＡについて予測される構造
化合物３−ＡＰＢＡは、ビオチン化（ＰＥＧ−２４）−３−アミノフェニルボロン酸を指し、表１によれば、それはエキソソームにあまり結合しない。その４−アミノフェニルボロン酸に基づくアナログ（上記の表中の４−ＡＰＢＡ）も、効果がなかった。両方の化合物は使用の前に超音波処理を必要とし、それらが培地中でそれ自体で折り畳まれる傾向があり、エキソソームへの結合に不利なコロイドまたは他の懸濁物を形成することを示唆する。ＰＥＧ対照（単純なポリエチレングリコール）は、溶液中で異なる物理的特徴を有し、類似する様式で会合しないだろう。
【０１１６】
ボロン酸（ポリ−（３−アクリルアミドフェニルボロン酸）等）を含む、陰イオン基の同等の間隔で置かれたアレイを持つ有機ポリマーは、かなり接近して配置されるアニオン性付加物により、隣接するアリール基をπ−スタックさせるエネルギー最小化幾何学的構造を占める。本実施例は、コアのポリアクリルアミド主鎖から離れたランダムなステレオ化学を有し、４Å未満離れて隣接するボロン原子の両方の特色を示す。図５を参照されたい。
【０１１７】
実施例８  −  ヒアルロン酸の予測される構造
ヒアルロン酸（それは３位および４位を介して接続される交互に起こる糖単位からなる）は、緊密なヘリックス構造を容易に形成できず、そこで、負に荷電したカルボキシレートは、例えばセルファインサルフェートまたはヘパリン中に存在するそれらの陰イオン基に類似する立体配座を形成する。交互に起こる二糖は秩序のない非ヘリックスアレイへと最小化され、カルボキシレートを比較的ランダムな位置に置く。この秩序の欠如は、化合物がエキソソームを効率的に結合できないことに寄与し得る。ここで、カルボキシレートを空間充填モデル上で緑で図示して、互いの近傍でのそれらの欠如を図示する。図６を参照されたい。
【０１１８】
実施例９  −  コンドロイチンサルフェートの予測される構造
コンドロイチンサルフェートは、グルクロン酸単位およびＮ−アセチルガラクトサミン単位が交互に起こる１００以上の様々な形態で存在し、そこで、交互に起こる単糖単位は、様々な位置で連結される。この理由のために、エキソソームを結合するその能力を予測できる特異的モデルを生成することは不可能である。しかしながら、八量体のＭＭ２＋最小化モデルは、コア主鎖から外に向かって突出する隣接するサルフェート基およびカルボキシレート基が十分に露出して、リン脂質との相互作用を促進できることを示す。図７を参照されたい。
【０１１９】
実施例１０  −  ポリアミノ酸の予測される構造
ポリアミノ酸（別の可能なエキソソーム結合リガンドタイプ）としては、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリセリンおよび同種のものが挙げられる。
【０１２０】
γ−ポリグルタミン酸は、主鎖に対し垂直におよそ１２Å離れて位置するカルボキシレート基によるシート形態を採択することが予測され、潜在的な結合部分間のこの距離は、リン脂質との効率的な相互作用を許容するのには十分ではないかもしれない。したがって、このポリマーは低効率のエキソソーム結合物質であることが予測される。
【０１２１】
ポリアスパラギン酸は、様々な合成方法論によりすべてＬ型、すべてＤ型、または立体配置の混合物として調製できる。例示の目的のために、ポリ−Ｌ−Ａｓｐの八量体が、Ｎ−アセチル−Ａｓｐ７ＮＨ２として示される。この事例において、エネルギー最小化分子は、交互に起こるループのシリーズであると思われ、その上で、カルボキシレートは外に向かって突出し、隣接するＣＯ２−基は４．５〜５．０Åの間で離れて（炭素間の距離）いる。構造モデルに従って、ポリアスパラギン酸は効率的なエキソソーム結合物質であると予測される。
【０１２２】
ポリ−β−アスパラギン誘導体は、実施例１１において記載されるように様々な合成方法論により、すべてＬ型、すべてＤ型、または立体配置の混合物として調製できる。
【０１２３】
このモデルに基づいて、天然に存在するタンパク質のマルチセリン領域中の二次構造の観察に加えて、合成ポリセリンは交互に起こるループのシリーズで存在することが予想されるだろう。この事例において、提案されるエキソソームを結合部分（キトサンのものに類似する電子豊富なアルコール部分）は、他のエキソソーム結合ポリマーに類似する隣接する距離を占める。
【０１２４】
アセチル硫酸塩を用いた、ポリセリンサルフェートを形成するためのセリンおよび他のヒドロキシル基を持つアミノ酸（例えばチロシン、スレオニン）の硫酸化は、Ｓａｌｋ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＲｉｖｉｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｎｋｅによる米国特許４４４４６８２Ａ（１９８４）中で記載される。ポリセリンサルフェートの調製は、したがって高度に硫酸化された多糖のペプチド様アナログ（セルファインサルフェート等）を提供するだろう。この分子の幾何学的構造は、その不斉性のおかげで、非硫酸化ポリペプチドよりも、よりヘリックス形状を採択する。ランダム化側鎖形態において描写されるように（ポリ−Ｄ，Ｌ−Ｓｅｒ−サルフェートにおいて参照されるように）、隣接するサルフェート部分は、多糖によって示されるものに類似する様式でそれ自体を外に向かって配置する。硫黄間の原子距離は類似の範囲内（４．５〜６．５Å）である。図９〜１２を参照されたい。
【０１２５】
実施例１１（ａ）ビオチン−Ｃ３−ポリ−４−ヒドロキシブチル−β−アスパラギンおよび実施例１１（ｂ）ビオチン−Ｃ３−ポリ−４−ヒドロキシベンジル−β−アスパラギン。
合成は、示されるように、１−ヒドロキシブチルアミンまたは４−フェノキシエチルアミンでポリマー無水物ビオチンＣ３−ＡｓｐＡｎ（ビオチンＣ３−ポリスクシンイミド）を処理することによって達成され、開環ポリマーβ−アスパラギン誘導体をもたらす。例示の目的のために、ポリ−β−１−ヒドロキシブチルアスパラギンの八量体（図１１（Ａ））を使用して、実施例１１（ａ）のエネルギー最小化立体配座を示し、図１１（Ｂ）は実施例１１（ｂ）のエネルギー最小化立体配座を示す。両方の実施例はエキソソームを結合し、有効なリガンド分離の範囲を例証する。
【化１】
2021526843.tif 000003
【０１２６】
実施例１２  −  一般的な構造モデル
エキソソームへのポリマー結合について一般的なモデルは、したがって、外に向かって伸長する好適な間隔で置かれた突出するアニオン基または水素結合可能基を備えたヘリックスまたはシートとして表わすことができ、そこで、主鎖が反復テンプレートからなり、陰イオン基が、Ｒ＝ＣＯ２Ｈ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＳＯ３Ｈ、Ｂ（ＯＨ）２およびＣＨ２ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、またはそれらの妥当なｐＫａによって指示されるようなイオン化形態でのそれらの基、それにならびにエキソソームが結合できる同種のものと、表すことができる。このモデルは、エキソソームについて高い結合効率を備えたポリマーが、アニオン基または電子豊富な基（そこでそれらの相互の分離は４〜５Åの間である）を持つことを説明する。図１３を参照されたい。
【０１２７】
実施例１３  −  ポリビニルサルフェートの予測される構造
ポリビニルサルフェート中の硫黄原子は、それら自体（九量体モデルにおいて）を約４．２〜４．５Å離して最小化する。図８を参照されたい。
【０１２８】
実施例１４  −  構造モデルに基づくエキソソーム結合リガンドの結合効率の予測
実施例１１での一般的な構造モデルを利用して、以前の実施例において試験されたものを含むエキソソーム結合リガンドの結合効率を予測した。結果を表２中で示す。
【０１２９】
参照文献
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【０１３０】
【表２】
2021526843.tif 000004
【表３】
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【図１−１】
2021526843.tif 000006
【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2021526843.tif 000012
【図６】
2021526843.tif 000013
【図７】
2021526843.tif 000014
【図８】
2021526843.tif 000015
【図９】
2021526843.tif 000016
【図１０】
2021526843.tif 000017
【図１１−１】
2021526843.tif 000018
【図１１−２】
2021526843.tif 000019
【図１２】
2021526843.tif 000020
【図１３】
2021526843.tif 000021
【国際調査報告】
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2021526843.tif 000023
2021526843.tif 000024