(57)【要約】本明細書では、トリプタミンおよびトリプタミン誘導体を生合成するように遺伝子改変された、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを始めとする原核および真核微生物が開示される。本開示の微生物は、アントラニレートまたはインドールをトリプタミンに変換するのに十分な遺伝情報を含むプラスミドおよび安定した遺伝子組込みを含有するように操作されている場合もある。全細胞生体触媒における置換トリプタミンの発酵産生は、治療に使用されるこうした化合物の費用効果の高い生産に有用となりうる。
2021514682.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリプタミンを産生する微生物細胞であって、アントラニレートをトリプタミンに変換する生合成経路に関与する１種または複数の酵素をコードする１種または複数の異種核酸配列をその中に含有している微生物細胞。
【請求項２】
トリプタミンを産生する微生物細胞であって、インドールをトリプタミンに変換する生合成経路に関与する１種または複数の酵素をコードする１種または複数の異種核酸配列をその中に含有している微生物細胞。
【請求項３】
トリプタミンを産生する微生物細胞であって、トリプトファンをトリプタミンに変換する生合成経路に関与する１種または複数の酵素をコードする１種または複数の異種核酸配列をその中に含有している微生物細胞。
【請求項４】
前記アントラニレートが置換アントラニレートである、請求項１に記載の微生物細胞。
【請求項５】
前記アントラニレートが、
【化１５】
2021514682.tif 000035
［式中、
−  各Ｒは、独立に、水素、ハロゲン、−ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、ＮＯ２、ＮＨ、ＣＯＯＨ、ＣＮ、硫黄、ＳＯ３、ＳＯ４、またはＰＯ４である］
である、請求項１または４に記載の微生物細胞。
【請求項６】
前記インドールが置換インドールである、請求項２に記載の微生物細胞。
【請求項７】
前記インドールが、
【化１６】
2021514682.tif 000036
［式中、
−  各Ｒは、独立に、ハロゲン、−ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、ＮＯ２、ＮＨ、ＣＯＯＨ、ＣＮ、硫黄、ＳＯ３、ＳＯ４、またはＰＯ４である］
である、請求項２または６に記載の微生物細胞。
【請求項８】
前記トリプタミンが置換トリプタミンである、請求項１から７のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項９】
前記トリプタミンが、
【化１７】
2021514682.tif 000037
［式中、
−  各Ｒは、独立に、水素、ハロゲン、−ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、ＮＯ２、ＮＨ、ＣＯＯＨ、ＣＮ、硫黄、ＳＯ３、ＳＯ４、またはＰＯ４である］
である、請求項１から８のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項１０】
前記１種または複数の酵素が、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、およびｔｒｐＡの１つまたは複数を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項１１】
前記１種または複数の異種核酸配列が、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、およびｔｒｐＡの少なくとも２つをコードする多シストロン性オペロンを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項１２】
前記多シストロン性オペロンが、配列番号１〜４のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を有する、請求項１１に記載の微生物細胞。
【請求項１３】
前記ｔｒｐＤが、配列番号５〜７のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項１４】
前記ｔｒｐＣが、配列番号８および９のいずれか一方に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項１５】
前記ｔｒｐＢが、配列番号１０および１１のいずれか一方に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項１６】
前記ｔｒｐＡが、配列番号１２および１３のいずれか一方に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項１７】
前記１種または複数の酵素がデカルボキシラーゼを含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項１８】
前記デカルボキシラーゼがトリプトファンデカルボキシラーゼである、請求項１７に記載の微生物細胞。
【請求項１９】
前記トリプトファンデカルボキシラーゼが、配列番号１４〜２０のいずれか１つに対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の微生物細胞。
【請求項２０】
前記１種または複数の酵素がトランスフェラーゼを含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項２１】
前記トランスフェラーゼが、トリプタミンＮ−メチルトランスフェラーゼ、トリプタミンベンゾイルトランスフェラーゼ、セロトニンＮ−アセチルトランスフェラーゼ、ドーパミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ、アリールアルキルアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ、およびトリプタミンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項２０に記載の微生物細胞。
【請求項２２】
前記トランスフェラーゼが、配列番号２１〜３１または４６のいずれか１つに対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の微生物細胞。
【請求項２３】
前記１種または複数の酵素がトリプタミン４−ヒドロキシラーゼを含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項２４】
前記トリプタミン４−ヒドロキシラーゼが、配列番号３２〜３５のいずれか１つに対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の微生物細胞。
【請求項２５】
前記１種または複数の酵素がＰ４５０レダクターゼを含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項２６】
前記Ｐ４５０レダクターゼが、配列番号３６〜４０のいずれか１つに対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の微生物細胞。
【請求項２７】
前記１種または複数の酵素がキナーゼを含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項２８】
前記キナーゼが、配列番号４１〜４４のいずれか１つに対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の微生物細胞。
【請求項２９】
前記アントラニレートが、前記微生物細胞によって生合成により産生される、請求項１、４、５、または８から２８のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項３０】
前記アントラニレートが、操作された前記微生物細胞に供給される、請求項１、４、５、または８から２８のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項３１】
前記アントラニレートが、５−ブロモアントラニレート、６−ヒドロキシアントラニレート、５−ヒドロキシアントラニレート、６−クロロアントラニレート、または５−クロロアントラニレートである、請求項１、４、５、または８から３０のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項３２】
前記インドールが、前記微生物細胞によって生合成により産生される、請求項２、６、７、または８から２８のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項３３】
前記インドールが、操作された前記微生物細胞に供給される、請求項２、６、７、または８から２８のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項３４】
前記インドールが、５−ヒドロキシインドール、４−ヒドロキシインドール、７−ヒドロキシインドール、および４−クロロインドール、５−ブロモインドール、または４−フルオロインドールからなる群より選択される、請求項２、６、７、８〜２８、３２、または３３のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項３５】
培養ブロスにおいて前記トリプタミンを分泌する、請求項１から３４のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項３６】
前記トリプタミンが、図４、図６、または図８に記載されるいずれかのトリプタミンから選択される、請求項１から３５のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項３７】
前記トリプタミンが、トリプタミン、５−ヒドロキシトリプタミン、５−ヒドロキシメチルトリプタミン、５−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、５−ホスホリルオキシメチルトリプタミン、５−ホスホリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、４−ヒドロキシトリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、４−ホスホリルオキシトリプタミン、４−ホスホリルオキシ−Ｎ，Ｎ−トリプタミン、７−ヒドロキシトリプタミン、７−ホスホリルオキシメチルトリプタミン、７−ホスホリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、４−クロロ−トリプタミン、４−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、５−ブロモトリプタミン、５−ブロモ−メチルトリプタミン、５−ブロモ−Ｎ−メチルトリプタミン、５−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、Ｎ−アセチル−トリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ−アセチル−トリプタミンからなる群より選択される、請求項１から３６のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項３８】
真核細胞である、請求項１から３７のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項３９】
酵母細胞である、請求項１から３８のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項４０】
前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種のものである、請求項３９に記載の微生物細胞。
【請求項４１】
前記酵母細胞が、芳香族アミノトランスフェラーゼＩ（ａｒｏ８）およびフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ａｒｏ１０）の１つまたは複数を発現しない、請求項３９または４０に記載の微生物細胞。
【請求項４２】
前記酵母細胞が、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ＴＲＰ１）、アントラニル酸シンターゼ（ＴＲＰ２）、インドール−３−グリセロリン酸シンターゼ（ＴＲＰ３）、アントラニル酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＴＲＰ４）、およびトリプトファンシンターゼ（ＴＲＰ５）の１つまたは複数を過剰発現する、請求項３９から４１のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項４３】
前記酵母細胞が、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ＴＲＰ１）、アントラニル酸シンターゼ（ＴＲＰ２）、インドール−３−グリセロリン酸シンターゼ（ＴＲＰ３）、アントラニル酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＴＲＰ４）、およびトリプトファンシンターゼ（ＴＲＰ５）の１つまたは複数の変異体を過剰発現する、請求項３９から４１のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項４４】
前記酵母細胞が、前記１種または複数の異種核酸配列の２つまたはそれよりも多くのコピーを有し、それらが相乗的に働く、請求項３９から４３のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項４５】
原核生物である、請求項１から４４のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項４６】
細菌細胞である、請求項１から４５のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項４７】
前記細菌細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ種のものである、請求項４６に記載の微生物細胞。
【請求項４８】
前記細菌細胞が、トリプトファナーゼ（ｔｎａ）、トリプトファン抑制エレメント（ｔｒｐＲ）、またはアントラニル酸シンターゼ（ｔｒｐＥ）遺伝子の１つまたは複数を発現しない、請求項４６または４７に記載の微生物細胞。
【請求項４９】
前記１種または複数の異種核酸配列の少なくとも１つのコピーが、前記微生物細胞のゲノムに安定して組み込まれている、請求項１から４８のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項５０】
前記１種または複数の異種核酸配列の２つまたはそれよりも多くのコピーが、前記微生物細胞のゲノムに安定して組み込まれている、請求項４９に記載の微生物細胞。
【請求項５１】
前記１種または複数の異種核酸配列の前記２つまたはそれよりも多くのコピーが、同じ配列からのものである、請求項５０に記載の微生物細胞。
【請求項５２】
前記１種または複数の異種核酸配列の前記２つまたはそれよりも多くのコピーが、別個の配列からのものである、請求項５０に記載の微生物細胞。
【請求項５３】
トリプタミンを合成するための方法であって、請求項１、３、４、または７から５２のいずれか一項に記載の微生物細胞を、アントラニレートの存在下で培養し、それによって、前記トリプタミンを合成することを含む、方法。
【請求項５４】
前記微生物細胞に前記アントラニレートを供給することをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記アントラニレートが、前記微生物細胞によって生合成により産生される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記アントラニレートが置換アントラニレートである、請求項５３から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
トリプタミンを合成するための方法であって、請求項２または５から５２のいずれか一項に記載の微生物細胞を、インドールの存在下で培養し、それによって、前記トリプタミンを合成することを含む、方法。
【請求項５８】
前記微生物細胞に前記インドールを供給することをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記インドールが、前記微生物細胞によって生合成により産生される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記インドールが置換インドールである、請求項５７から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
トリプタミンを合成するための方法であって、請求項３または７から５２のいずれか一項に記載の微生物細胞を、トリプトファンの存在下で培養し、それによって、前記トリプタミンを合成することを含む、方法。
【請求項６２】
前記微生物細胞に前記トリプトファンを供給することをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記トリプトファンが、前記微生物細胞によって生合成により産生される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
培養物から前記トリプタミンを精製することをさらに含む、請求項５３から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
トリプタミンをトリプタミン誘導体に変換する生合成経路に関与する１種または複数の酵素をコードする１種または複数の異種核酸配列をその中に含有している微生物細胞。
【請求項６６】
前記１種または複数の酵素がトリプタミン４−ヒドロキシラーゼを含む、請求項６５に記載の微生物細胞。
【請求項６７】
前記トリプタミン４−ヒドロキシラーゼが、配列番号３２〜３５のいずれか１つに対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６６に記載の微生物細胞。
【請求項６８】
前記１種または複数の酵素がトリプタミン５−ヒドロキシラーゼを含む、請求項６５から６７のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項６９】
前記トリプタミン５−ヒドロキシラーゼが、配列番号４７に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６８に記載の微生物細胞。
【請求項７０】
前記１種または複数の酵素が４−ヒドロキシトリプタミンキナーゼを含む、請求項６５から６９のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項７１】
前記４−ヒドロキシトリプタミンキナーゼが、配列番号４１〜４４のいずれか１つに対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７０に記載の微生物細胞。
【請求項７２】
前記トリプタミンが置換トリプタミンである、請求項６５から７１のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項７３】
前記トリプタミンが、５−メトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−トリプタミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−トリプタミン、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルトリプタミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、Ｎ，Ｎ−テトラメチレントリプタミン、Ｎ，Ｎ−ジプロピルトリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、トリプタミン、４−ヒドロキシトリプタミン、５−ヒドロキシトリプタミン、イボガミン、４−ヒドロキシイボガミン、および５−ヒドロキシイボガミンからなる群より選択される、請求項６５から７２のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項７４】
前記トリプタミン誘導体が、図１６に記載に記載されるいずれかのトリプタミン誘導体である、請求項６５から７３のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項７５】
前記トリプタミン誘導体が、５−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−トリプタミン、５−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルトリプタミン、５−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、５−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−テトラメチレントリプタミン、５−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジプロピルトリプタミン、４，５−メトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−トリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−トリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルトリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−テトラメチレントリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジプロピルトリプタミン、４−ホスホリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジプロピルトリプタミン、４−ヒドロキシトリプタミン、５−ヒドロキシトリプタミン、４−メトキシトリプタミン、５−メトキシトリプタミン、４−ホスホリルオキシトリプタミン、５−ホスホリルオキシトリプタミン、４−ヒドロキシイボガミン、５−ヒドロキシイボガミン、４−ホスホリルオキシイボガミン、および５−ホスホリルオキシイボガミンからなる群より選択される、請求項６５から７３のいずれか一項に記載の微生物細胞。
【請求項７６】
トリプタミンからトリプタミン誘導体を合成する方法であって、請求項６５から７５のいずれか一項に記載の微生物細胞を、トリプタミンの存在下で培養し、それによって、前記トリプタミン誘導体を合成することを含む、方法。
【請求項７７】
培養物から前記トリプタミン誘導体を精製することをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
配列番号５〜４９のいずれか１つに対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む１種または複数の酵素をコードする１種または複数の異種核酸配列を含むベクター。
【請求項７９】
配列番号５〜４９のいずれか１つに対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むトリプタミン合成経路からの酵素またはその機能性断片をコードする１種もしくは複数の異種核酸配列をその中に含有している微生物細胞。
【請求項８０】
請求項７９に記載の微生物細胞内の４−ヒドロキシトリプタミンのレベルについてスクリーニングする方法であって、前記微生物細胞内の前記４−ヒドロキシトリプタミンの色または蛍光産物を検出することを含む、方法。
【請求項８１】
前記４−ヒドロキシトリプタミンが、前記微生物細胞内で酸化され、それによって、酸化された４−ヒドロキシトリプタミンを生じる、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記酸化された４−ヒドロキシトリプタミンが、前記微生物細胞内で合成された４−ヒドロキシトリプタミンのレベルに正比例する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記酸化された４−ヒドロキシトリプタミンの酸化が、硫酸鉄によって触媒される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記酸化された４−ヒドロキシトリプタミンの酸化が、前記微生物細胞によって発現される酵素によって触媒される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
前記酵素が、配列番号４５に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８６】
アントラニレートをトリプタミンに変換する方法であって、アントラニレートをトリプタミンに変換する生合成経路に関与する１種または複数の酵素の存在下で前記アントラニレートをインキュベートすることを含む、方法。
【請求項８７】
インドールをトリプタミンに変換する方法であって、インドールをトリプタミンに変換する生合成経路に関与する１種または複数の酵素の存在下で前記インドールをインキュベートすることを含む、方法。
【請求項８８】
トリプトファンをトリプタミンに変換する方法であって、トリプトファンをトリプタミンに変換する生合成経路に関与する１種または複数の酵素の存在下で前記トリプトファンをインキュベートすることを含む、方法。
【請求項８９】
トリプタミンを誘導体化トリプタミンに変換する方法であって、トリプタミンを誘導体化トリプタミンに変換する生合成経路に関与する１種または複数の酵素の存在下で前記トリプタミンをインキュベートすることを含む、方法。
【請求項９０】
生物学的細胞なしで実施される、請求項８６から８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で実施される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
無細胞条件下で実施される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
細胞溶解物中で実施される、請求項９０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、全体として参照により本明細書に援用される、２０１８年３月８日に出願された米国仮出願第６２／６４０，４４３号の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、配列表を含むが、配列表は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出しており、全体として参照により本明細書により援用される。２０１９年３月８日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーは、５４０３３−７０１＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名前であり、サイズが２０１，１１４バイトである。
【背景技術】
【０００３】
トリプタミンは、モノアミンアルカロイドである。それは、インドール環構造を含有しており、アミノ酸のトリプトファンと構造が似通っており、これが名前の由来である。トリプタミンは、哺乳動物の脳において極微量で見出され、神経調節物質または神経伝達物質として役割を果たすという仮説が立てられている。トリプタミンは、ひとまとめにして置換トリプタミンと呼ばれる一式の化合物における共通の官能基である。この一式は、神経伝達物質および向精神薬を始めとする多くの生物活性化合物を包含する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様では、トリプタミンを産生する微生物細胞であって、アントラニレートをトリプタミンに変換する生合成経路に関与する１種または複数の酵素をコードする１種または複数の異種核酸配列をその中に含有している微生物細胞が提供される。
【０００５】
別の態様では、トリプタミンを産生する微生物細胞であって、インドールをトリプタミンに変換する生合成経路に関与する１種または複数の酵素をコードする１種または複数の異種核酸配列をその中に含有している微生物細胞が提供される。
【０００６】
別の態様では、トリプタミンを産生する微生物細胞であって、トリプトファンをトリプタミンに変換する生合成経路に関与する１種または複数の酵素をコードする１種または複数の異種核酸配列をその中に含有している微生物細胞が提供される。
【０００７】
一部の場合では、アントラニレートは、置換アントラニレートである。一部の場合では、アントラニレートは、
【化１】
2021514682.tif 000003
［式中、
−  各Ｒは、独立に、水素、ハロゲン、−ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、ＮＯ２、ＮＨ、ＣＯＯＨ、ＣＮ、硫黄、ＳＯ３、ＳＯ４、またはＰＯ４である］
である。
【０００８】
一部の場合では、インドールは、置換インドールである。一部の場合では、インドールは、
【化２】
2021514682.tif 000004
［式中、
−  各Ｒは、独立に、ハロゲン、−ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、ＮＯ２、ＮＨ、ＣＯＯＨ、ＣＮ、硫黄、ＳＯ３、ＳＯ４、またはＰＯ４である］
である。
【０００９】
一部の場合では、トリプタミンは、置換トリプタミンである。一部の場合では、トリプタミンは、
【化３】
2021514682.tif 000005
［式中、
−  各Ｒは、独立に、水素、ハロゲン、−ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、ＮＯ２、ＮＨ、ＣＯＯＨ、ＣＮ、硫黄、ＳＯ３、ＳＯ４、またはＰＯ４である］
である。
【００１０】
一部の場合では、１種または複数の酵素は、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、およびｔｒｐＡの１つまたは複数を含む。一部の場合では、１種または複数の異種核酸配列は、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、およびｔｒｐＡの少なくとも２つをコードする多シストロン性オペロンを含む。一部の場合では、多シストロン性オペロンは、配列番号１〜４のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を有する。一部の場合では、ｔｒｐＤは、配列番号５〜７のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合では、ｔｒｐＣは、配列番号８および９のいずれか一方に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合では、ｔｒｐＢは、配列番号１０および１１のいずれか一方に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合では、ｔｒｐＡは、配列番号１２および１３のいずれか一方に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合では、１種または複数の酵素は、デカルボキシラーゼを含む。一部の場合では、デカルボキシラーゼは、トリプトファンデカルボキシラーゼである。一部の場合では、トリプトファンデカルボキシラーゼは、配列番号１４〜２０のいずれか１つに対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合では、１種または複数の酵素は、トランスフェラーゼを含む。一部の場合では、トランスフェラーゼは、トリプタミンＮ−メチルトランスフェラーゼ、トリプタミンベンゾイルトランスフェラーゼ、セロトニンＮ−アセチルトランスフェラーゼ、ドーパミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ、アリールアルキルアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ、およびトリプタミンヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼからなる群より選択される。一部の場合では、トランスフェラーゼは、配列番号２１〜３１または４６のいずれか１つに対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合では、１種または複数の酵素は、トリプタミン４−ヒドロキシラーゼを含む。一部の場合では、トリプタミン４−ヒドロキシラーゼは、配列番号３２〜３５のいずれか１つに対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合では、１種または複数の酵素は、Ｐ４５０レダクターゼを含む。一部の場合では、Ｐ４５０レダクターゼは、配列番号３６〜４０のいずれか１つに対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合では、１種または複数の酵素は、キナーゼを含む。一部の場合では、キナーゼは、配列番号４１〜４４のいずれか１つに対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合では、アントラニレートは、微生物細胞によって生合成により産生される。一部の場合では、アントラニレートは、操作された微生物細胞に供給される。一部の場合では、アントラニレートは、５−ブロモアントラニレート、６−ヒドロキシアントラニレート、５−ヒドロキシアントラニレート、６−クロロアントラニレート、または５−クロロアントラニレートである。一部の場合では、インドールは、微生物細胞によって生合成により産生される。一部の場合では、インドールは、操作された微生物細胞に供給される。一部の場合では、インドールは、５−ヒドロキシインドール、４−ヒドロキシインドール、７−ヒドロキシインドール、および４−クロロインドール、５−ブロモインドール、または４−フルオロインドールからなる群より選択される。一部の場合では、微生物細胞は、培養ブロスにおいてトリプタミンを分泌する。一部の場合では、トリプタミンは、図４、図６、または図８に記載されるいずれかのトリプタミンから選択される。一部の場合では、トリプタミンは、トリプタミン、５−ヒドロキシトリプタミン、５−ヒドロキシメチルトリプタミン、５−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、５−ホスホリルオキシメチルトリプタミン、５−ホスホリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、４−ヒドロキシトリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、４−ホスホリルオキシトリプタミン、４−ホスホリルオキシ−Ｎ，Ｎ−トリプタミン、７−ヒドロキシトリプタミン、７−ホスホリルオキシメチルトリプタミン、７−ホスホリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、４−クロロ−トリプタミン、４−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、５−ブロモトリプタミン、５−ブロモ−メチルトリプタミン、５−ブロモ−Ｎ−メチルトリプタミン、５−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、Ｎ−アセチル−トリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ−アセチル−トリプタミンからなる群より選択される。一部の場合では、微生物細胞は、真核細胞である。一部の場合では、微生物細胞は、酵母細胞である。一部の場合では、酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種のものである。一部の場合では、酵母細胞は、芳香族アミノトランスフェラーゼＩ（ａｒｏ８）およびフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ａｒｏ１０）の１つまたは複数を発現しない。一部の場合では、酵母細胞は、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ＴＲＰ１）、アントラニル酸シンターゼ（ＴＲＰ２）、インドール−３−グリセロリン酸シンターゼ（ＴＲＰ３）、アントラニル酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＴＲＰ４）、およびトリプトファンシンターゼ（ＴＲＰ５）の１つまたは複数を過剰発現する。一部の場合では、酵母細胞は、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ＴＲＰ１）、アントラニル酸シンターゼ（ＴＲＰ２）、インドール−３−グリセロリン酸シンターゼ（ＴＲＰ３）、アントラニル酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＴＲＰ４）、およびトリプトファンシンターゼ（ＴＲＰ５）の１つまたは複数の変異体を過剰発現する。一部の場合では、酵母細胞は、１種または複数の異種核酸配列の２つまたはそれ���りも多くのコピーを有し、それらが相乗的に働く。一部の場合では、微生物細胞は、原核生物である。一部の場合では、微生物細胞は、細菌細胞である。一部の場合では、細菌細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ種のものである。一部の場合では、細菌細胞は、トリプトファナーゼ（ｔｎａ）、トリプトファン抑制エレメント（ｔｒｐＲ）、またはアントラニル酸シンターゼ（ｔｒｐＥ）遺伝子の１つまたは複数を発現しない。一部の場合では、１種または複数の異種核酸配列の少なくとも１つのコピーが、微生物細胞のゲノムに安定して組み込まれている。一部の場合では、１種または複数の異種核酸配列の２つまたはそれよりも多くのコピーが、微生物細胞のゲノムに安定して組み込まれている。一部の場合では、１種または複数の異種核酸配列の２つまたはそれよりも多くのコピーは、同じ配列からのものである。一部の場合では、１種または複数の異種核酸配列の２つまたはそれよりも多くのコピーは、別個の配列からのものである。
【００１１】
別の態様では、トリプタミンを合成するための方法であって、前述のいずれかに従う微生物細胞をアントラニレートの存在下で培養し、それによって、トリプタミンを合成することを含む方法が提供される。一部の場合では、方法は、微生物細胞にアントラニレートを供給することをさらに含む。一部の場合では、アントラニレートは、微生物細胞によって生合成により産生される。一部の場合では、アントラニレートは、置換アントラニレートである。
【００１２】
別の態様では、トリプタミンを合成するための方法であって、前述のいずれかに従う微生物細胞をインドールの存在下で培養し、それによって、トリプタミンを合成することを含む方法が提供される。一部の場合では、方法は、微生物細胞にインドールを供給することをさらに含む。一部の場合では、インドールは、微生物細胞によって生合成により産生される。一部の場合では、インドールは、置換インドールである。
【００１３】
別の態様では、トリプタミンを合成するための方法であって、前述のいずれかの微生物細胞をトリプトファンの存在下で培養し、それによって、トリプタミンを合成することを含む方法が提供される。一部の場合では、方法は、微生物細胞にトリプトファンを供給することをさらに含む。一部の場合では、トリプトファンは、微生物細胞によって生合成により産生される。
【００１４】
一部の場合では、前述のいずれかの方法が、培養物からトリプタミンを精製することをさらに含む。
【００１５】
別の態様では、トリプタミンをトリプタミン誘導体に変換する生合成経路に関与する１種または複数の酵素をコードする１種または複数の異種核酸配列をその中に含有している微生物細胞が提供される。一部の場合では、１種または複数の酵素は、トリプタミン４−ヒドロキシラーゼを含む。一部の場合では、トリプタミン４−ヒドロキシラーゼは、配列番号３２〜３５のいずれか１つに対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合では、１種または複数の酵素は、トリプタミン５−ヒドロキシラーゼを含む。一部の場合では、トリプタミン５−ヒドロキシラーゼは、配列番号４７に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合では、１種または複数の酵素は、４−ヒドロキシトリプタミンキナーゼを含む。一部の場合では、４−ヒドロキシトリプタミンキナーゼは、配列番号４１〜４４のいずれか１つに対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合では、トリプタミンは、置換トリプタミンである。一部の場合では、トリプタミンは、５−メトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−トリプタミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−トリプタミン、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルトリプタミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、Ｎ，Ｎ−テトラメチレントリプタミン、Ｎ，Ｎ−ジプロピルトリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、トリプタミン、４−ヒドロキシトリプタミン、５−ヒドロキシトリプタミン、イボガミン、４−ヒドロキシイボガミン、および５−ヒドロキシイボガミンからなる群より選択される。一部の場合では、トリプタミン誘導体は、図１６に記載されるいずれかのトリプタミン誘導体である。一部の場合では、トリプタミン誘導体は、５−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−トリプタミン、５−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルトリプタミン、５−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、５−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−テトラメチレントリプタミン、５−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジプロピルトリプタミン、４，５−メトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−トリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−トリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルトリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−テトラメチレントリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジプロピルトリプタミン、４−ホスホリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジプロピルトリプタミン、４−ヒドロキシトリプタミン、５−ヒドロキシトリプタミン、４−メトキシトリプタミン、５−メトキシトリプタミン、４−ホスホリルオキシトリプタミン、５−ホスホリルオキシトリプタミン、４−ヒドロキシイボガミン、５−ヒドロキシイボガミン、４−ホスホリルオキシイボガミン、および５−ホスホリルオキシイボガミンからなる群より選択される。
【００１６】
別の態様では、トリプタミンからトリプタミン誘導体を合成する方法であって、前述のいずれかに従う微生物細胞をトリプタミンの存在下で培養し、それによって、トリプタミン誘導体を合成することを含む方法が提供される。一部の場合では、方法は、培養物からトリプタミン誘導体を精製することをさらに含む。
【００１７】
さらに別の態様では、配列番号５〜４９のいずれか１つに対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む１種または複数の酵素をコードする１種または複数の異種核酸配列を含むベクターが提供される。
【００１８】
さらに別の態様では、配列番号５〜４９のいずれか１つに対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むトリプタミン合成経路からの酵素またはその機能性断片をコードする１種もしくは複数の異種核酸配列を含有している微生物細胞が提供される。
【００１９】
別の態様では、前述のいずれかの微生物細胞内の４−ヒドロキシトリプタミンのレベルについてスクリーニングするための方法であって、微生物細胞内の４−ヒドロキシトリプタミンの色または蛍光産物を検出することを含む方法が提供される。一部の場合では、４−ヒドロキシトリプタミンは、微生物細胞内で酸化され、それによって、酸化された４−ヒドロキシトリプタミンを生じる。一部の場合では、酸化された４−ヒドロキシトリプタミンは、微生物細胞内で合成された４−ヒドロキシトリプタミンのレベルに正比例する。一部の場合では、酸化された４−ヒドロキシトリプタミンの酸化は、硫酸鉄によって触媒される。一部の場合では、酸化された４−ヒドロキシトリプタミンの酸化は、微生物細胞によって発現される酵素によって触媒される。一部の場合では、酵素は、配列番号４５に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２０】
別の態様では、アントラニレートをトリプタミンに変換する方法であって、アントラニレートをトリプタミンに変換する生合成経路に関与する１種または複数の酵素の存在下でアントラニレートをインキュベートすることを含む方法が提供される。
【００２１】
さらに別の態様では、インドールをトリプタミンに変換する方法であって、インドールをトリプタミンに変換する生合成経路に関与する１種または複数の酵素の存在下でインドールをインキュベートすることを含む方法が提供される。
【００２２】
さらに別の態様では、トリプトファンをトリプタミンに変換する方法であって、トリプトファンをトリプタミンに変換する生合成経路に関与する１種または複数の酵素の存在下でトリプトファンをインキュベートすることを含む方法が提供される。
【００２３】
さらに別の態様では、トリプタミンを誘導体化トリプタミンに変換する方法であって、トリプタミンを誘導体化トリプタミンに変換する生合成経路に関与する１種または複数の酵素の存在下でトリプタミンをインキュベートすることを含む方法が提供される。
【００２４】
一部の場合では、前述の方法は、生物学的細胞なしで実施される。一部の場合では、前述の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で実施される。一部の場合では、前述の方法は、無細胞条件下で実施される。一部の場合では、前述の方法は、細胞溶解物中で実施される。
【００２５】
参照による援用
本明細書において言及するすべての公表文献、特許、および特許出願は、個々の各公表文献、特許、または特許出願について参照により援用されることが詳細かつ個別に示されたかの如く、参照により本明細書に援用される。
【００２６】
本発明のいくつかの新規の特色は、添付の特許請求の範囲において示される。本発明の特色および利点のより深い理解は、本発明の原理が利用される実例となる実施形態を示す以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することで得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、本開示の実施形態に従う、細菌トリプトファンオペロンの細菌における過剰発現に適するプラスミドマップの非限定的な例を示す。プラスミドは、中コピー（ｐ１５ａ）であり、アンピシリン耐性を含有している。多シストロン性オペロンにおいて、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢ、およびｔｒｐＡが発現される（たとえば、配列番号１）。
【００２８】
【図２】図２は、本開示の実施形態に従う、シロシビンシンターゼ（たとえば、配列番号２１）、トリプトファンデカルボキシラーゼ（たとえば、配列番号１４）、および４−ヒドロキシトリプタミンキナーゼ（たとえば、配列番号４１）の細菌における過剰発現に適するプラスミドマップの非限定的な例を示す。
【００２９】
【図３】図３は、本開示の実施形態に従う、トリプトファンデカルボキシラーゼ（たとえば、配列番号１９）およびエタノールアミンメチルトランスフェラーゼ（たとえば、配列番号２５）の過剰発現による、細菌におけるＮ−メチル誘導体の産生に適するプラスミドマップの非限定的な例を示す。
【００３０】
【図４】図４は、本開示の実施形態に従って置換アントラニレートまたはインドール化合物が供給された操作された細菌細胞によって産生される置換トリプタミンの非限定的な例を示す。
【００３１】
【図５】図５は、本開示の実施形態に従う、トリプトファンデカルボキシラーゼ（たとえば、配列番号１９）、４−ヒドロキシトリプタミンキナーゼ（たとえば、配列番号４１）、シロシビンシンターゼ（たとえば、配列番号２１）、およびトリプタミン４−ヒドロキシラーゼ（たとえば、配列番号３３）の過剰発現による、酵母におけるＮ−メチルトリプタミン誘導体の産生に適するプラスミドマップの非限定的な例を示す。
【００３２】
【図６】図６は、本開示の実施形態に従って、酵母代謝中に存在するアントラニル酸を、ｐＲＪＰ１６０８においてコードされる酵素によってトリプタミンに変換する生合成経路の非限定的な例を示す。
【００３３】
【図７】図７は、本開示の実施形態に従う、トリプトファンデカルボキシラーゼ（たとえば、配列番号１９）、トリプタミン４−ヒドロキシラーゼ（たとえば、配列番号３３）、およびＮ−アセチルトランスフェラーゼ（たとえば、配列番号２８）の過剰発現による、酵母におけるＮ−アセチルトリプタミン誘導体の産生に適するプラスミドマップの非限定的な例を示す。
【００３４】
【図８】図８は、本開示の実施形態に従って、酵母代謝中に存在するアントラニル酸を、ｐＲＪＰ１６１８においてコードされる酵素によってトリプタミンに変換する生合成経路の非限定的な例を示す。
【００３５】
【図９】図９は、本開示の実施形態に従って、操作された酵母細胞から得られた４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−トリプタミンのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）の非限定的な例を示す。
【００３６】
【図１０】図１０は、本開示の実施形態に従って、操作された酵母細胞から得られたシロシビンのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）の非限定的な例を示す。
【００３７】
【図１１】図１１は、本開示の実施形態に従って、操作された酵母細胞から得られたＮ−アセチルトリプタミンのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）の非限定的な例を示す。
【００３８】
【図１２】図１２は、本開示の実施形態に従って、操作された酵母細胞から得られた４−ヒドロキシ−Ｎ−アセチルトリプタミンのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）の非限定的な例を示す。
【００３９】
【図１３】図１３は、本開示の実施形態に従う、トリプタミン４−ヒドロキシラーゼ（たとえば、配列番号３３）の酵母における過剰発現のためのプラスミドマップの非限定的な例を示す。
【００４０】
【図１４】図１４は、本開示の実施形態に従う、トリプタミン５−ヒドロキシラーゼ（たとえば、配列番号４７）の酵母における過剰発現のためのプラスミドマップの非限定的な例を示す。
【００４１】
【図１５】図１５は、本開示の実施形態に従う、４−ヒドロキシトリプタミンキナーゼ（たとえば、配列番号４１）の酵母における過剰発現のためのプラスミドマップの非限定的な例を示す。
【００４２】
【図１６】図１６は、本開示の実施形態に従って、操作された酵母を使用して、供給されたトリプタミンから置換トリプタミンを生産する非限定的な例を示す。
【００４３】
【図１７】図１７は、本開示の実施形態に従う、酵母におけるヒドロキシラーゼ活性の指標としての比色スクリーニングアッセイの非限定的な例を示す。
【００４４】
【図１８Ａ】図１８Ａは、トリプタミンをトリプタミン誘導体に変換する生合成経路の非限定的な例を示す。
【００４５】
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、イボガミンをイボガミンの誘導体に変換する生合成経路の非限定的な例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本開示は、４−、５−、６−、もしくは７−インドール置換、および／またはＲ１もしくはＲ２アミン置換を有するトリプタミンの生産において有用な異種ＤＮＡを含有している微生物に関する。さらに、本開示は、生産を最適化する、生産を実行する、およびそうした置換トリプタミンを回収するためのプロセスに関する。本明細書で提供される開示によって、トリプタミンなどの種々の化合物の生産のためのプロセスが提供される。本開示はさらに、トリプタミンおよび／または置換トリプタミンをｉｎ  ｖｉｖｏで合成するための生合成経路を提供しうる生体分子をコードする異種配列を含有するように遺伝子改変されていてもよい、細菌（たとえば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）および酵母（たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を始めとする原核および真核微生物を提供する。一部の態様では、本開示は、アントラニレートもしくは置換アントラニレートおよび／またはインドールもしくは置換インドールを、それぞれのトリプタミンまたは置換トリプタミンに変換するのに十分な遺伝情報を含むプラスミドおよび安定した遺伝子組込みを含有するように操作されていることもある微生物を提供する。全細胞生体触媒における置換トリプタミンの発酵産生は、治療に使用されるこうした化合物の費用効果の高い生産に有用となりうる。
【００４７】
トリプタミンは、名前の由来であるトリプトファンから導かれる、自然に存在するモノアミンアルカロイドである。トリプタミンファミリー内の類似体は、インドール環構造およびアミン基の箇所に置換を含有している。このファミリーの化合物は、Ｎ，−Ｎ−ジメチルトリプトファン（ＤＭＴ）、５−メトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン（５−ＭｅＯ−ＤＭＴ）、４−ヒドロキシジメチル−トリプトファン（シロシン）およびその４−Ｏ−リン酸エステルであるシロシビンを始めとする、向精神活性のあるメンバーを含有する（Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９５９）。シロシンは、５ＨＴ１ａ、５ＨＴ２ａ、および５ＨＴ２ｃ受容体において部分アゴニストとして働きうる（Ｈａｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４）。Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ属および他の属のいくつかの担子菌真菌は、シロシビン、シロシン、ノルシロシン、ベオシスチン、ノルベオシスチン、およびアエルギナシン（ａｅｒｕｇｉｎａｓｃｉｎ）を始めとする置換トリプタミンを生合成によって産生する（Ｌｅｎｚ，  Ｗｉｃｋ，  ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ  ２０１７）。Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン化合物は、自然界に遍在し、多くの動植物によって産生される（Ｃａｒｂｏｎａｒｏ  ａｎｄ  Ｇａｔｃｈ  ２０１６）。トリプタン類（たとえば、ゾルミトリプタンやスマトリプタン）を含む置換トリプタミンは、合成によって得ることもでき、トリプタン類は、化学的に合成され、片頭痛および群発頭痛の処置に使用される医薬として使用されている（Ｄｅｒｒｙ，  Ｄｅｒｒｙ，  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ２０１４）。
【００４８】
シロシンなどのトリプタミンは、ヒト被験体において知覚および気分の著しい変化を引き起こす場合がある。高用量のシロシビンを投与すると、生活の質の有意かつ長続きする改善につながる不可思議な経験が確実に引き起こされることがわかっている（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６）。シロシビン投与は、９人の重症抗療性強迫性障害の患者に関して、安全であり、十分に許容されると結論付けられており、中核症状の「急性の力強い軽減」と関連付けることができる（Ｍｏｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６）。
【００４９】
トリプタミンおよびそのそれぞれの置換類似体は、その複雑な構造ゆえに、仮に大規模であったとしても、経済的に実現可能な価格で商業的に得ることは難しい。シロシビンを含む置換トリプタミンの生産については、いくつかの有機化学的方法が存在する。Ａｌｂｅｒｔ  Ｈｏｆｆｍａｎｎ博士が、当初、１９５８年にシロシビンの有機合成について発表している（Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９５８）。しかし、インドール環の４位においてリン酸をリン酸化するのに危険な試薬が使用され、後に、合成について改良が行われた（Ｈｏｆｍａｎｎ，  Ａ．  ＆  Ｔｒｏｘｌｅｒ，  Ｆ．  １９６３．  Ｅｓｔｅｒｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｏｌｅｓ（米国特許３，０７５，９９２）．，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ：  Ｓａｎｄｏｚ  Ｌｔｄ．）。この生産方法は、Ｄａｖｉｄ  Ｅ  Ｎｉｃｈｏｌｓ博士によって早期の臨床試験に採用されたが、生産コストが高くついた（Ｎｉｃｈｏｌｓ  ２０１４）。
【００５０】
化合物を自然に産生する担子菌真菌組織からのトリプタミンの抽出は、大規模生産に適していない。報告されている、Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ  ｃｕｂｅｎｓｉｓというキノコ中のシロシビンの濃度は、乾燥細胞重量の１％未満であり（Ｊ．  Ｇａｒｔｚ  １９９４）、抽出および精製の課題を突きつけている。さらに、そうした真菌組織の培養には、１か月の時間スケールが必要となり、供給の課題に直面することになる（Ｊｏｃｈｅｎ  Ｇａｒｔｚ，  Ａｌｌｅｎ，  ａｎｄ  Ｍｅｒｌｉｎ  １９９４）。さらに、天然組織の使用では、治療特性を有する新規および非天然トリプタミン化合物を生産することはできなくなる。
【００５１】
本開示は、置換トリプタミンを、高価でない媒質成分から高い収率で生産するための方法および材料を提供する。本開示の方法によって、自然界で自然に見出されないトリプタミン誘導体、または合成化学によって到達できないトリプタミン誘導体の生産が提供される。一部の例では、開示するトリプタミン誘導体は、好都合な薬理学的効果（たとえば、半減期、適応症など）を有する場合がある。本明細書に記載の方法の付加的な利点には、いくつかの置換トリプタミン類似体を産生するための単一の生体触媒、および、発酵において丈夫であり、それ自体で再生しうる全細胞触媒が使用されて、生産実施の際に使用し易いことが含まれる。
【００５２】
したがって、本発明の目的は、４−、５−、６−、もしくは７−インドール置換および／またはＲ１もしくはＲ２アミン置換トリプタミンを生合成によって生産するための新規のプロセスを提供することである。
【００５３】
本開示の一部の場合では、４−、５−、６−、もしくは７−インドール置換および／またはＲ１もしくはＲ２アミン置換トリプタミンは、操作された微生物細胞によって、対応する置換アントラニレートおよびインドールから生合成により産生される場合がある。置換アントラニレートおよびインドールは、広く入手可能であり、変種が膨大であり、そのそれぞれの置換トリプタミンに比べて高価でない。
【００５４】
本開示の他の態様では、アントラニレートをトリプタミンに変換する方法であって、アントラニレートをトリプタミンに変換する生合成経路に関与する１種または複数の酵素の存在下でアントラニレートをインキュベートすることを含む方法が提供される。本開示の他の態様では、インドールをトリプタミンに変換する方法であって、インドールをトリプタミンに変換する生合成経路に関与する１種または複数の酵素の存在下でインドールをインキュベートすることを含む方法が提供される。本開示の他の態様では、トリプトファンをトリプタミンに変換する方法であって、トリプトファンをトリプタミンに変換する生合成経路に関与する１種または複数の酵素の存在下でトリプトファンをインキュベートすることを含む方法が提供される。本開示の他の態様では、トリプタミンを誘導体化トリプタミンに変換する方法であって、トリプタミンを誘導体化トリプタミンに変換する生合成経路に関与する１種または複数の酵素の存在下でトリプタミンをインキュベートすることを含む方法が提供される。一部の場合では、方法は、生物学的細胞内で（たとえば、本明細書に記載するとおりの操作された微生物細胞によって）実施されることがある。他の場合では、方法は、生物学的細胞なしで実施されることがある。一部の場合では、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で実施されることがある。一部の場合では、方法は、無細胞条件下で実施されることがある。一部の場合では、方法は、細胞溶解物中で実施されることがある。
【００５５】
操作された微生物細胞における置換アントラニレートからの置換トリプタミンの合成
【００５６】
本開示の一態様では、本明細書に記載のプロセスによって、アミンにおいてＲ１またはＲ２置換を有する４−、５−、６−、または７−インドール置換トリプタミンの生産が提供される。一部の場合では、アントラニレート、または３−、４−、５−、もしくは６−置換されているアントラニレートを使用して、Ｒ１またはＲ２置換を有する４−、５−、６−、または７−インドール置換トリプタミンを生成することができる。一部の場合では、プロセスは、全細胞微生物発酵において実施されることがある。一部の場合では、操作された微生物細胞を、アントラニレートまたは置換アントラニレートの存在下で培養することができる（たとえば、アントラニレートまたは置換アントラニレートが、微生物細胞に供給されるか、または微生物細胞と共に別の方法でインキュベートされる場合がある）。他の場合では、アントラニレートまたは置換アントラニレートは、微生物細胞によって生合成により産生されることがある。たとえば、微生物細胞が、アントラニレートまたは置換アントラニレートを（たとえば、中心炭素代謝の一部として）自然に産生する場合がある。他の場合では、微生物細胞は、アントラニレートまたは置換アントラニレートを（たとえば、置換アントラニレートを産生するための酵素を過剰発現することによって）産生するように操作されることがある。
【００５７】
以下のスキーム１は、操作された微生物細胞においてアントラニレートまたは置換アントラニレートから置換トリプタミンを合成する非限定的な例を示す。
スキーム１：
【化４】
2021514682.tif 000006
【００５８】
一部の態様では、本開示は、操作された微生物を、アントラニレートまたは置換アントラニレート
【化５】
2021514682.tif 000007
【００５９】
［式中、−Ｒは、限定はしないが、ハロゲン（−Ｂｒ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｉなど）、−ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、ＮＯ２、ＮＨ、ＣＯＯＨ、ＣＮ、硫黄、ＳＯ３、ＳＯ４、またはＰＯ４である］の存在下で培養することによって置換トリプタミンを生産するための方法を提供する。得られる置換トリプタミン
【化６】
2021514682.tif 000008
【００６０】
は、培養ブロスから回収してもよい。一部の場合では、得られるトリプタミンを、発酵生合成プロセスの間にトリプタミン骨格に組み込まれた化学的脱離基または保護基を活用しながら、さらに下流の化学において使用してもよい。
【００６１】
本開示の別の態様では、インドール、または４−、５−、６−、もしくは７−置換されているインドールを使用して、Ｒ１またはＲ２置換を有する４−、５−、６−、または７−インドール置換トリプタミンを生成することができる。一部の場合では、プロセスは、全細胞微生物発酵において実施されることがある。一部の場合では、操作された微生物細胞を、インドールまたは置換インドールの存在下で培養することができる（たとえば、インドールまたは置換インドールが、微生物細胞に供給されるか、または微生物細胞と共に別の方法でインキュベートされる場合がある）。他の場合では、インドールまたは置換インドールは、微生物細胞によって生合成により産生されることがある。たとえば、微生物細胞が、インドールまたは置換インドールを自然に産生する場合がある。他の場合では、微生物細胞は、インドールまたは置換インドールを（たとえば、置換インドールを産生するための酵素を過剰発現することによって）産生するように操作されることがある。
【００６２】
操作された微生物細胞におけるインドールまたは置換インドールからの置換トリプタミンの合成
【００６３】
スキーム２は、操作された微生物細胞においてインドールまたは置換インドールから置換トリプタミンを合成する非限定的な例を示す。
スキーム２
【化７】
2021514682.tif 000009
【００６４】
一部の態様では、本開示は、操作された微生物を、インドールまたは置換インドール
【化８】
2021514682.tif 000010
【００６５】
［式中、−Ｒは、限定はしないが、ハロゲン（−Ｂｒ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｉなど）、−ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、ＮＯ２、ＮＨ、ＣＯＯＨ、ＣＮ、硫黄、ＳＯ３、ＳＯ４、またはＰＯ４である］の存在下で培養することによって置換トリプタミンを生産するための方法を提供する。得られる置換トリプタミン
【化９】
2021514682.tif 000011
【００６６】
は、培養ブロスから回収してもよい。一部の場合では、得られるトリプタミンを、発酵生合成プロセスの間にトリプタミン骨格に組み込まれた化学的脱離基または保護基を活用しながら、さらに下流の化学において使用してもよい。
【００６７】
操作された微生物細胞におけるアントラニレートまたは置換アントラニレートからの置換トリプタミンの合成
スキーム３
【化１０】
2021514682.tif 000012
【００６８】
一部の態様では、本明細書に記載のプロセスは、アントラニレートまたは置換アントラニレートから置換トリプタミンを生産するために、操作された微生物を使用するものでよい。スキーム３は、操作された微生物細胞において置換アントラニレートから置換トリプタミンを生産する非限定的な例を示す。一部の場合では、操作された微生物細胞は、細菌細胞でよい。一部の場合では、細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍでよい。一部の場合では、細菌は、ｔｎａ（トリプトファナーゼ）、ｔｒｐＲ（トリプトファン抑制エレメント）、およびｔｒｐＥ（アントラニル酸シンターゼ）のノックアウトを始めとする、宿主の遺伝的性質の改変を含むことがある。一部の場合では、操作された微生物細胞は、酵母細胞でよい。一部の場合では、酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種のものでよい。一部の場合では、微生物細胞は、１種または複数の遺伝子を発現または過剰発現するようにさらに改変されていてもよい。一部の場合では、微生物細胞は、内因性または異種ｔｒｐＤＣＢＡオペロンのプラスミドまたはゲノム組込みによって、余分なＤＮＡコピーを含有するように操作されていてもよい。一部の場合では、ｔｒｐＤＣＢＡオペロンは、配列番号１〜４のいずれか１つを含むことがある。一部の場合では、ｔｒｐＤＣＢＡオペロンは、配列番号１〜４のいずれか１つに対して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含むことがある。一部の場合では、操作された微生物細胞は、配列番号５〜１３のいずれか１つに従うアミノ酸配列、または配列番号５〜１３のいずれか１つに対して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する１種または複数の酵素を産生しうる。一部の場合では、操作された微生物細胞によって、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＣ、またはｔｒｐＡの１つまたは複数が産生されることがあり、酵素は、より高いレベルの活性を示すように修飾され、または変異している。
【００６９】
一部の場合では、微生物細胞は、１種または複数の追加の遺伝子を発現または過剰発現するようにさらに操作されていてもよい。一部の態様では、そのような微生物細胞は、トリプタミンデカルボキシラーゼ（スキーム３、「デカルボキシラーゼ」を参照されたい）をさらに発現する場合がある。一部の場合では、トリプタミンデカルボキシラーゼは、微生物細胞におけるＤＮＡのゲノム組込みまたはプラスミドの発現によって発現させることができる。トリプタミンデカルボキシラーゼは、リン酸ピリドキサール（ＰＬＰ）非依存的でもよいし、またはＰＬＰ依存的でもよい。一部の場合では、トリプタミンデカルボキシラーゼは、配列番号１４〜２０（表２を参照されたい）に従うアミノ酸配列のいずれか１つ、または配列番号１４〜２０のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことがある。一部の場合では、より高い活性レベルを示すように修飾され、または変異しているトリプタミンデカルボキシラーゼが、操作された微生物細胞によって発現されることもある。
【００７０】
一部の場合では、発酵から得られたトリプタミンまたは置換トリプタミンのＲ１およびＲ２アミノ位置を、非限定的な例によればＮ−メチル、Ｎ，Ｎ−ジメチル、Ｎ−アセチル、またはＮ−ヒドロキシシンナモイル官能基が得られるように、トランスフェラーゼによって修飾することができる。したがって、一部の場合では、操作された微生物細胞が、トランスフェラーゼをさらに発現または過剰発現することもある（スキーム３を参照されたい）。一部の場合では、トランスフェラーゼは、配列番号２１〜３１（表２を参照されたい）で示されるアミノ酸配列のいずれか１つ、または配列番号２１〜３１のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことがある。一部の場合では、より高い活性レベルを示すように修飾され、または変異しているトランスフェラーゼが、操作された微生物細胞によって発現されることもある。
【００７１】
一部の場合では、トリプタミンのインドール環上のヒドロキシルがさらに修飾されるように、限定はしないが、ホスホトランスフェラーゼ（キナーゼ）、アセチルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、またはスルホトランスフェラーゼなどの追加のトランスフェラーゼを発現させてもよい。たとえば、操作された細胞を６−ヒドロキシアントラニレートまたは４−ヒドロキシインドールの存在下で培養して、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミンが得られるときなどに、キナーゼを発現させ、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミンのリン酸エステル、すなわちシロシビンを得ることができる。適切なキナーゼには、限定はしないが、配列番号４１〜４４（表２を参照されたい）のいずれか１つで示されるアミノ酸配列、または配列番号４１〜４４のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列が含まれうる。
【００７２】
一部の場合では、置換アントラニレートは、５−ブロモアントラニレート、６−ヒドロキシアントラニレート、５−ヒドロキシアントラニレート、６−クロロアントラニレート、および５−クロロアントラニレートのいずれか１つでよい。一部の場合では、トリプタミンは、トリプタミン、５−ヒドロキシトリプタミン、５−ヒドロキシメチルトリプタミン、５−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、５−ホスホリルオキシメチルトリプタミン、５−ホスホリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、４−ヒドロキシトリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、４−ホスホリルオキシトリプタミン、４−ホスホリルオキシ−Ｎ，Ｎ−トリプタミン、７−ヒドロキシトリプタミン、７−ホスホリルオキシメチルトリプタミン、７−ホスホリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、４−クロロ−トリプタミン、４−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、５−ブロモトリプタミン、５−ブロモ−メチルトリプタミン、５−ブロモ−Ｎ−メチルトリプタミン、５−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、Ｎ−アセチル−トリプタミン、および４−ヒドロキシ−Ｎ−アセチル−トリプタミンのいずれか１つでよい。
【００７３】
操作された微生物細胞におけるインドールまたは置換インドールからの置換トリプタミンの合成
スキーム４
【化１１】
2021514682.tif 000013
【００７４】
一部の態様では、本明細書に記載のプロセスは、インドールまたは置換インドールから置換トリプタミンを生産するために、操作された微生物を使用するものでよい。スキーム４は、操作された微生物細胞において置換インドールから置換トリプタミンを生産する非限定的な例を示す。一部の場合では、操作された微生物は、細菌細胞でよい。一部の場合では、細菌細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ種のものでよい。一部の場合では、細菌細胞は、ｔｎａ（トリプトファナーゼ）、ｔｒｐＲ（トリプトファン抑制エレメント）、およびｔｒｐＥ（アントラニル酸シンターゼ）のノックアウトを始めとする、宿主の遺伝的性質の改変を含むことがある。一部の場合では、微生物細胞は、酵母細胞でよい。一部の場合では、酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種のものでよい。
【００７５】
一部の場合では、微生物細胞は、１種または複数の遺伝子を発現または過剰発現するようにさらに改変されていてもよい。一部の場合では、微生物細胞は、内因性または異種ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡのプラスミドまたはゲノム組込みによって、余分なＤＮＡコピーを含有するように操作されていてもよい（たとえば、スキーム４を参照されたい）。一部の場合では、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡは、配列番号５〜１３（表２を参照されたい）のいずれか１つに従うアミノ酸配列、または配列番号５〜１３で示されるいずれかのアミノ酸配列に対して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことがある。一部の場合では、より高い活性レベルを示すように修飾され、または変異しているｔｒｐＢおよび／またはｔｒｐＡが、操作された微生物細胞によって発現されることもある。
【００７６】
一部の場合では、微生物細胞は、１種または複数の追加の遺伝子を発現または過剰発現するようにさらに操作されていてもよい。一部の態様では、そのような微生物細胞は、トリプタミンデカルボキシラーゼ（たとえば、スキーム４、「デカルボキシラーゼ」を参照されたい）をさらに発現する場合がある。一部の場合では、トリプタミンデカルボキシラーゼは、微生物細胞におけるＤＮＡのゲノム組込みまたはプラスミドの発現によって発現させることができる。トリプタミンデカルボキシラーゼは、リン酸ピリドキサール（ＰＬＰ）非依存的でもよいし、またはＰＬＰ依存的でもよい。一部の場合では、トリプタミンデカルボキシラーゼは、配列番号１４〜２０（表２を参照されたい）に従うアミノ酸配列のいずれか１つ、または配列番号１４〜２０のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことがある。一部の場合では、より高い活性レベルを示すように修飾され、または変異しているトリプタミンデカルボキシラーゼが、操作された微生物細胞によって発現されることもある。
【００７７】
一部の場合では、発酵から得られたトリプタミンまたは置換トリプタミンのＲ１およびＲ２アミノ位置を、非限定的な例によればＮ−メチル、Ｎ，Ｎ−ジメチル、Ｎ−アセチル、またはＮ−ヒドロキシシンナモイル官能基が得られるように、トランスフェラーゼによって修飾することができる。したがって、一部の場合では、操作された微生物細胞が、トランスフェラーゼをさらに発現または過剰発現することもある（たとえば、スキーム４を参照されたい）。一部の場合では、トランスフェラーゼは、配列番号２１〜３１（表２を参照されたい）で示されるアミノ酸配列のいずれか１つ、または配列番号２１〜３１のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことがある。一部の場合では、より高い活性レベルを示すように修飾され、または変異しているトランスフェラーゼが、操作された微生物細胞によって発現されることもある。一部の場合では、トリプタミンのインドール環上のヒドロキシルがさらに修飾されるように、限定はしないが、ホスホトランスフェラーゼ（キナーゼ）、アセチルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、またはスルホトランスフェラーゼなどの追加のトランスフェラーゼを発現させてもよい。たとえば、操作された細胞を６−ヒドロキシアントラニレートまたは４−ヒドロキシインドールの存在下で培養して、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミンが得られるときなどに、キナーゼを発現させ、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミンのリン酸エステル、すなわちシロシビンを得ることができる。適切なキナーゼには、限定はしないが、配列番号４１〜４４（表２を参照されたい）のいずれか１つで示されるアミノ酸配列、または配列番号４１〜４４のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列が含まれうる。
【００７８】
一部の場合では、置換インドールは、５−ヒドロキシインドール、４−ヒドロキシインドール、７−ヒドロキシインドール、および４−クロロインドール、５−ブロモインドール、および４−フルオロインドールのいずれか１つでよい。一部の場合では、トリプタミンは、トリプタミン、５−ヒドロキシトリプタミン、５−ヒドロキシメチルトリプタミン、５−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、５−ホスホリルオキシメチルトリプタミン、５−ホスホリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、４−ヒドロキシトリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、４−ホスホリルオキシトリプタミン、４−ホスホリルオキシ−Ｎ，Ｎ−トリプタミン、７−ヒドロキシトリプタミン、７−ホスホリルオキシメチルトリプタミン、７−ホスホリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、４−クロロ−トリプタミン、４−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、５−ブロモトリプタミン、５−ブロモ−メチルトリプタミン、５−ブロモ−Ｎ−メチルトリプタミン、５−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、Ｎ−アセチル−トリプタミン、および４−ヒドロキシ−Ｎ−アセチル−トリプタミンのいずれか１つでよい。
【００７９】
操作された微生物細胞による、トリプトファンからの４−ヒドロキシル置換および／またはＲ１もしくはＲ２アミン置換トリプタミンの合成
スキーム５
【化１２】
2021514682.tif 000014
【００８０】
別の態様では、４−ヒドロキシル置換および／またはＲ１もしくはＲ２アミン置換トリプタミンを、スキーム５に従って、操作された微生物細胞によってトリプトファンから生合成により生産することができる。
【００８１】
一部の場合では、微生物細胞が、プラスミド上に、またはゲノムへの組込みによって、Ｌ−トリプトファンをトリプタミンに変換する酵素（たとえば、デカルボキシラーゼ）および／またはトリプタミンを４−ヒドロキシトリプタミンに変換する酵素（たとえば、トリプトファン４−ヒドロキシラーゼ）を発現する異種ＤＮＡを含有していてもよい。デカルボキシラーゼは、リン酸ピリドキサール（ＰＬＰ）非依存的またはＰＬＰ依存的である場合がある。
【００８２】
一部の場合では、微生物細胞は、デカルボキシラーゼを発現または過剰発現するように操作されていてよい。一部の場合では、デカルボキシラーゼは、配列番号１４〜２０（表２を参照されたい）のいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号１４〜２０のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することがある。一部の場合では、より高い活性レベルを示すように修飾され、または変異しているデカルボキシラーゼが、操作された微生物細胞によって発現されることもある。
【００８３】
一部の場合では、微生物細胞は、トリプタミン４−ヒドロキシラーゼを発現または過剰発現するように操作されていてよい。トリプタミン４−ヒドロキシラーゼは、Ｐ４５０レダクターゼ対によってＮＡＤＰＨからの電子伝達により還元力が提供されることを必要とするＰ４５０酵素である。一部の場合では、トリプタミン４−ヒドロキシラーゼは、配列番号３２〜３５（表２を参照されたい）のいずれか１つに従うアミノ酸配列、または配列番号３２〜３５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することがある。一部の場合では、より高い活性レベルを示すように修飾され、または変異しているトリプタミン４−ヒドロキシラーゼが、操作された微生物細胞によって発現されることもある。
【００８４】
一部の場合では、微生物細胞は、Ｐ４５０レダクターゼを発現または過剰発現するように操作されていてよい。一部の場合では、Ｐ４５０レダクターゼは、配列番号３６〜４０（表２を参照されたい）のいずれか１つに従うアミノ酸配列、または配列番号３６〜４０のいずれか１つに対して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することがある。一部の場合では、より高い活性レベルを示すように修飾され、または変異しているＰ４５０レダクターゼが、操作された微生物細胞によって発現されることもある。
【００８５】
一部の場合では、トリプタミンのインドール環上のヒドロキシルがさらに修飾されるように、限定はしないが、ホスホトランスフェラーゼ（キナーゼ）、アセチルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、またはスルホトランスフェラーゼなどの追加のトランスフェラーゼを発現させてもよい。目的の産生化合物が４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミンであるとき、キナーゼを発現させ、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミンのリン酸エステル、すなわちシロシビンを得ることができる。一部の場合では、微生物細胞は、キナーゼを発現または過剰発現するようにさらに操作されていてもよい。一部の場合では、キナーゼは、配列番号４１〜４４（表２を参照されたい）のいずれか１つに従うアミノ酸配列、または配列番号４１〜４４のいずれか１つに対して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することがある。一部の場合では、より高い活性レベルを示すように修飾され、または変異しているキナーゼが、操作された微生物細胞によって発現されることもある。
【００８６】
操作された微生物細胞における置換トリプタミンからのトリプタミン誘導体の合成
【００８７】
別の態様では、トリプタミンの誘導体を、操作された微生物細胞によって置換トリプタミンから生合成により生産することができる。
【００８８】
一部の場合では、微生物細胞が、プラスミド上に、またはゲノムへの組込みによって、置換トリプタミンをトリプタミン誘導体に変換する酵素を発現する異種ＤＮＡを含有していてもよい。一部の場合では、微生物細胞は、トリプタミン４−ヒドロキシラーゼを発現または過剰発現するように操作されていてよい。一部の場合では、トリプタミン４−ヒドロキシラーゼは、配列番号３２〜３５（表２を参照されたい）のいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号３２〜３５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することがある。一部の場合では、より高い活性レベルを示すように修飾され、または変異しているトリプタミン４−ヒドロキシラーゼが、操作された微生物細胞によって発現されることもある。一部の場合では、微生物細胞は、トリプタミン５−ヒドロキシラーゼを発現または過剰発現するように操作されていてよい。一部の場合では、トリプタミン５−ヒドロキシラーゼは、配列番号４７（表２を参照されたい）に従うアミノ酸配列、または配列番号４７に従うアミノ酸配列に対して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することがある。一部の場合では、より高い活性レベルを示すように修飾され、または変異しているトリプタミン５−ヒドロキシラーゼが、操作された微生物細胞によって発現されることもある。一部の場合では、微生物細胞は、４−ヒドロキシトリプタミンキナーゼを発現または過剰発現するように操作されていてよい。一部の場合では、４−ヒドロキシトリプタミンキナーゼは、配列番号４１〜４４（表２を参照されたい）のいずれか１つに従うアミノ酸配列、または配列番号４１〜４４のいずれか１つに従うアミノ酸配列に対して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することがある。一部の場合では、より高い活性レベルを示すように修飾され、または変異している４−ヒドロキシトリプタミンキナーゼが、操作された微生物細胞によって発現されることもある。
【００８９】
図１８Ａは、トリプタミンをトリプタミン誘導体に変換するための生合成経路の非限定的な例を示す。たとえば、トリプタミンを、４−ヒドロキシラーゼ（たとえば、配列番号３２〜３５）によって４−ヒドロキシトリプタミンに変換することができる。４−ヒドロキシトリプタミンを、メチルトランスフェラーゼ（たとえば、配列番号４８または４９）によって４−メトキシトリプタミンに、またはキナーゼ（たとえば、配列番号４１〜４４）によって４−ホスホリルオキシトリプタミンに変換することができる。別の例では、トリプタミンを、５−ヒドロキシラーゼ（たとえば、配列番号４７）によって５−ヒドロキシトリプタミンに変換することができる。５−ヒドロキシトリプタミンを、メチルトランスフェラーゼ（たとえば、配列番号４８または４９）によって５−メトキシトリプタミンに、またはキナーゼ（たとえば、配列番号４１〜４４）によって５−ホスホリルオキシトリプタミンに変換することができる。
【００９０】
図１８Ｂは、イボガミンをイボガミンの誘導体に変換する生合成経路の非限定的な例を示す。たとえば、イボガミンを、４−ヒドロキシラーゼ（たとえば、配列番号３２〜３５）によって４−ヒドロキシイボガミンに変換することができる。４−ヒドロキシイボガミンを、メチルトランスフェラーゼ（たとえば、配列番号４８または４９）によって４−メトキシイボガミンに、またはキナーゼ（たとえば、配列番号４１〜４４）によって４−ホスホリルオキシイボガミンに変換することができる。別の例では、イボガミンを、５−ヒドロキシラーゼ（たとえば、配列番号４７）によって５−ヒドロキシイボガミンに変換することができる。５−ヒドロキシイボガミンを、メチルトランスフェラーゼ（たとえば、配列番号４８または４９）によって５−メトキシイボガミンに、またはキナーゼ（たとえば、配列番号４１〜４４）によって５−ホスホリルオキシイボガミンに変換することができる。
【００９１】
一部の場合では、操作された微生物細胞は、１種または複数のトリプタミンの存在下で培養されることがある。一部の場合では、トリプタミンは、５−メトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−トリプタミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−トリプタミン、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルトリプタミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、Ｎ，Ｎ−テトラメチレントリプタミン、Ｎ，Ｎ−ジプロピルトリプタミン、イボガミン、および１２−メトキシイボガミン、トリプタミン、４−ヒドロキシトリプタミン、５−ヒドロキシトリプタミン、イボガミン、４−ヒドロキシイボガミン、および５−ヒドロキシイボガミンからなる群より選択される。
【００９２】
一部の場合では、操作された微生物細胞は、トリプタミンをトリプタミン誘導体に変換しうる。一部の場合では、トリプタミン誘導体は、図１６に記載されるいずれかのトリプタミン誘導体である。一部の場合では、トリプタミン誘導体は、５−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−トリプタミン、５−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルトリプタミン、５−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、５−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−テトラメチレントリプタミン、５−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジプロピルトリプタミン、４，５−メトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−トリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−トリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルトリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−テトラメチレントリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジプロピルトリプタミン、４−ホスホリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジプロピルトリプタミン、イボガミン、１２−メトキシイボガミン、４−ヒドロキシトリプタミン、５−ヒドロキシトリプタミン、４−メトキシトリプタミン、５−メトキシトリプタミン、４−ホスホリルオキシトリプタミン、５−ホスホリルオキシトリプタミン、４−ヒドロキシイボガミン、５−ヒドロキシイボガミン、４−ホスホリルオキシイボガミン、および５−ホスホリルオキシイボガミンからなる群より選択される。
【００９３】
宿主細胞中の４−ヒドロキシトリプタミンのレベルを検出するためのアッセイ
スキーム６
【化１３】
2021514682.tif 000015
【００９４】
別の態様では、本開示は、宿主細胞中の４−ヒドロキシトリプタミンのレベルを検出するための方法を提供する。一部の場合では、方法は、４−ヒドロキシトリプタミンを産生するように遺伝子改変された宿主細胞において、４−ヒドロキシトリプタミンの有色または蛍光産物を検出することを含む。一部の場合では、４−ヒドロキシトリプタミンの有色または蛍光産物は、細胞において生じる酸化機序の作用によって産生されることがある。一部の場合では、細胞において産生された４−ヒドロキシトリプタミンのレベルは、細胞において産生された４−ヒドロキシトリプタミンまたは４−ヒドロキシトリプタミンの有色産物のレベルに正比例しうる（たとえば、スキーム６を参照されたい）。このようなｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング方法を使用すると、操作された産生宿主細胞において高い活性を有するトリプタミン４−ヒドロキシラーゼ変異体について、迅速にスクリーニングすることができる（ＤｅＬｏａｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５）。
【００９５】
酸化機序は、硫酸鉄、または、限定はしないが、マルチ銅オキシダーゼ酵素を始めとする、宿主細胞によって発現される酵素によって触媒される場合がある（Ｂｌａｓｃｈｋｏ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｅ  １９６０）。適切なオキシダーゼの非限定的な例を配列番号４５で示す（表２を参照されたい）。一部の場合では、改変体トリプトファン４−ヒドロキシラーゼをコードする核酸配列を含む遺伝子改変細胞によって、改変体トリプタミン４−ヒドロキシラーゼをコードする核酸配列を含まない対照細胞における４−ヒドロキシトリプタミンまたはその有色もしくは蛍光産物のレベルより高いレベルの４−ヒドロキシトリプタミンまたはその有色もしくは蛍光産物が産生されることがある。これは、改変体酵素によって、生合成経路を通るフラックスが増大し、その結果、より高い力価および速度の４−ヒドロキシトリプタミン産生が生じることを示し得る。より高度な４−ヒドロキシトリプタミン産生を包含する遺伝子改変宿主細胞は、本明細書に記載するとおりの、４−ヒドロキシインドール位置またはアミノ位置に対するメチル、スルホノ、グルコシル、および／またはホスホトランスフェラーゼなどの酵素を含有している場合がある。
【００９６】
一部の場合では、改変宿主細胞は、トリプトファンを通るフラックスを増大させ、トリプトファン産生を増加させるように改変されることがある。これは、ａｒｏ８およびａｒｏ１０のノックアウト、ならびにＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＴＲＰ３、ＴＲＰ４、およびＴＲＰ５の過剰発現によって実現することができる。加えて、ＴＲＰ２フィードバック抵抗性変異対立遺伝子の含有を用いることができる。
【００９７】
非限定的な例（実施例１を参照されたい）では、ｌ−トリプトファンが、デカルボキシラーゼ、ヒドロキシラーゼ、Ｐ４５０レダクターゼ、メチルトランスフェラーゼ、およびキナーゼを発現する改変された微生物宿主細胞において、Ｏ−ホスホリル−４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミンに変換される場合がある。
【００９８】
培養条件および産物生産
【００９９】
一部の場合では、遺伝子改変宿主細胞は、好気性条件下で培養されることがある。一部の場合では、遺伝子改変宿主細胞は、嫌気性条件下で培養されることがある。
【０１００】
一部の場合では、培養培地は、限定はしないが、Ｍ９、ＭＯＰＳ、ＹＮＢ、アンモニア塩を始めとする最少培地、または、たとえば、酵母抽出物、カザミノ酸、ペプトン、もしくはトリプトンを含有する複合培地でよい。一部の場合では、培養培地は、たとえば、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、またはＴｒｉｓによって緩衝化されていてもよい。一部の場合では、培養培地は、還元剤、たとえば、Ｌ−アスコルビン酸、ジチオトレイトール、またはメルカプトエタノールを含有することもある。一部の場合では、培養培地は、Ｌ−メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、アラニン、イソロイシン、システイン、アスパラギン酸、ロイシン、グルタミン、アスパラギン、リシン、グリシン、グルタミン酸、プロリン、セリン、フェニルアラニン、チロシン、セレノシステイン、トレオニン、ピロリシン、トリプトファン、またはバリンなどの追加のアミノ酸で補充されることがある。一部の場合では、追加のビタミンおよび補因子、たとえば、Ｌ−アスコルビン酸、チアミン、リン酸ピリドキサール、ナイアシン、ピリドキシン、ビオチン、葉酸、テトラヒドロ葉酸、リボフラビン、パントテン酸、銅塩、マグネシウム塩、マンガン塩、モリブデン塩、鉄塩、亜鉛塩、ニッケル塩、グルタチオン、ヘム、またはＤ−アミノレブリン酸が加えられることもある。
【０１０１】
一部の場合では、遺伝子改変宿主細胞には、１回の添加、バッチ供給、または培地への一定希釈によって、置換アントラニレートが供給されることがある。一部の場合では、遺伝子改変宿主細胞には、１回の添加、バッチ供給、または培地への一定希釈によって、置換インドールが供給されることがある。
【０１０２】
一部の場合では、下流産物が産生されることがある。一部の場合では、下流産物は、精製される、たとえば、培養培地、細胞溶解物、またはそれらの両方から単離および精製されることがある。一部の場合では、下流産物は、少なくともまたは約２５重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、または９９重量％純粋であり得る。精製は、公知のいずれかの方法または方法の組合せによって行うことができ、そうした方法には、たとえば、カラムクロマトグラフィー、相分離、沈殿、結晶化、デカンテーション、ガスストリッピング、膜強化分離、分画、吸着／脱着、パーベーパレーション、固相からの熱または真空脱着、固相に固定または吸収されている産物の溶媒抽出などが含まれる。純度は、適切ないずれかの方法、たとえば、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析、またはガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）分析によって評価することができる。
【０１０３】
一部の場合では、培養中の細胞によって、細胞培養培地中の供給された前駆体の約０．００１５、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、５．０、６．０、７．０、もしくは８．０％、またはそれらより多くが所望の産物に変換されることがある。一部の場合では、培養中の細胞によって、液体培養培地中に少なくとも２ｇ／Ｌ、少なくとも３ｇ／Ｌ、少なくとも４ｇ／Ｌ、少なくとも５ｇ／Ｌ、少なくとも７ｇ／Ｌ、少なくとも１０ｇ／Ｌ、または５０ｇ／Ｌより多量の所望の産物が産生されることがある。
【０１０４】
一部の場合では、培養中の細胞によって、細胞培養培地中の炭素の約０．００１５、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、５．０、６．０、７．０、もしくは８．０％、またはそれらより多くが所望の産物に変換されることがある。一部の場合では、培養中の細胞によって、液体培養培地中に少なくとも２ｇ／Ｌ、少なくとも３ｇ／Ｌ、少なくとも４ｇ／Ｌ、少なくとも５ｇ／Ｌ、少なくとも７ｇ／Ｌ、少なくとも１０ｇ／Ｌ、または５０ｇ／Ｌより多量の所望の産物が産生されることがある。
【０１０５】
宿主細胞
【０１０６】
適切な宿主細胞には、培地において、たとえば単細胞生物として培養することのできる細胞が含まれる。適切な宿主細胞には、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、藻類細胞、および細菌細胞が含まれる。適切な宿主細胞には、糸状菌細胞をさらに含めてもよく、適切な糸状菌細胞には、たとえば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａなどが含まれる。
【０１０７】
宿主細胞は、原核細胞になる場合がある。適切な原核細胞には、限定はしないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒなどの様々な実験室株のいずれもが含まれる。たとえば、Ｃａｒｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：１１７６−１１８１、米国特許第６，４４７，７８４号、およびＳｉｚｅｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：２９９−３０２を参照されたい。本発明において用いることのできるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の例として、限定はしないが、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉおよびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが挙げられる。適切なＳｈｉｇｅｌｌａ株には、限定はしないが、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、およびＳｈｉｇｅｌｌａ  ｄｉｓｅｎｔｅｒｉａｅが含まれる。通常、実験室株は、病原性でないものである。適切な他の細菌の非限定的な例としては、限定はしないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｄｉｔａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．などが挙げられる。一部の場合では、宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。
【０１０８】
適切な酵母宿主細胞の非限定的な例は、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、およびＹａｒｒｏｗｉａの種の細胞から選択される株である。一部の場合では、酵母宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｃａｏｉ、およびＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓからなる群より選択されることがある。有用な他の酵母宿主細胞は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｕｓｔｉｌｇｏ  ｍａｙｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ、およびＰｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｏｌである。適切な酵母宿主細胞には、限定はしないが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａなどが含まれうる。一部の場合では、酵母宿主細胞をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとすることがあり、たとえば、本開示の遺伝子改変細胞を、遺伝子改変Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞にする場合がある。
【０１０９】
糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖で構成された菌糸壁によって特徴付けられてもよい。栄養生長が菌糸伸長によるものでよく、炭素異化が偏性好気性であるものでよい。適切な糸状菌株には、限定はしないが、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｇａｒｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ、Ｍｕｃｏｒ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａの株が含まれる。適切な糸状菌細胞の非限定的な例として、たとえば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅが挙げられる。適切な真菌細胞の別の例は、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ細胞である。
【０１１０】
改変宿主細胞における異種タンパク質発現
【０１１１】
一部の場合では、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、転写調節エレメントに作動可能に連結していることがある。
【０１１２】
細菌における発現に適するプロモーターには、限定はしないが、ｐＴ７、ｐｔａｃ、ｐＬａｃ、ｐＬａｃＵＶ５、ｐＴｅｔ、ｐＢＡＤ、およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｌｉｂｒａｒｙの構成的なＢＢａシリーズのプロモーター（Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ，  ”Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＢｉｏＢｒｉｃｋ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ”  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２００９  ３：４）が含まれうる。酵母における発現に適するプロモーターには、限定はしないが、ＴＤＨ３、ＣＣＷ１２、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、およびＴＰ１、ならびに（たとえば、Ｐｉｃｈｉａにおいて使用するための）ＡＯＸ１が含まれうる。
【０１１３】
発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写ターミネーターも含有している場合がある。発現ベクターは、発現の増幅に適切な配列も含む場合がある。
【０１１４】
一部の場合では、アミノ酸配列の発現には、ｉｎ  ｖｉｖｏでタンパク質の発現が増加するように、コドン最適化がなされる、またはバイアスがかけられることがある。これは、いくつかのアルゴリズムによって達成することができる（Ｈａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １９，  ｐａｇｅｓ  ２０−３０  （２０１８））、（Ｑｕａｘ，  ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｖｏｌｕｍｅ  ５９，  Ｊｕｌｙ  １６，  ２０１５）。一部の場合では、ｉｎ  ｖｉｖｏでのアミノ酸配列のコーディングに、ネイティブのアミノ酸配列が使用されることがある。
【０１１５】
一部の場合では、本開示の遺伝子改変微生物細胞は、配列番号１〜４（表１を参照されたい）のいずれか１つに従う１種もしくは複数の核酸配列、または配列番号１〜４のいずれか１つに対して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含むことがある。
【０１１６】
一部の場合では、本開示の遺伝子改変微生物細胞は、配列番号５〜４９のいずれか１つに従うアミノ酸配列、または配列番号５〜４９のいずれか１つに対して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する１種または複数の酵素を発現または過剰発現することがある。
【０１１７】
【表１−１】
2021514682.tif 000016
【表１−２】
2021514682.tif 000017
【表１−３】
2021514682.tif 000018
【表１−４】
2021514682.tif 000019
【表１−５】
2021514682.tif 000020
【表１−６】
2021514682.tif 000021
【表１−７】
2021514682.tif 000022
【０１１８】
【表２−１】
2021514682.tif 000023
【表２−２】
2021514682.tif 000024
【表２−３】
2021514682.tif 000025
【表２−４】
2021514682.tif 000026
【表２−５】
2021514682.tif 000027
【表２−６】
2021514682.tif 000028
【表２−７】
2021514682.tif 000029
【表２−８】
2021514682.tif 000030
【表２−９】
2021514682.tif 000031
【表２−１０】
2021514682.tif 000032
【表２−１１】
2021514682.tif 000033
【実施例】
【０１１９】
これら実施例は、説明の目的のためだけに示され、本明細書で提供する特許請求の範囲を限定するものでない。
【０１２０】
（実施例１  操作された細胞における４−ヒドロキシトリプタミンの検出）
【化１４】
2021514682.tif 000034
【０１２１】
４−ヒドロキシトリプタミンを青色の産物へと酸化させると、上流経路を通る高度な生合成フラックスについてスクリーニングすることができる（青色の枠）。別法として、メチルトランスフェラーゼまたはキナーゼを発現させることにより、４−ヒドロキシトリプタミンを、Ｏ−ホスホリル−４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、すなわちシロシビンへの変換に用いることもできる。
【０１２２】
（実施例２  酵母および細菌株ならびに増殖条件）
【０１２３】
単一遺伝子発現プラスミドを化学的にコンピテントなＴＧ１  Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換させ、多重遺伝子プラスミドをＴｒａｎｓｆｏｒＭａｘ（商標）ＥＰＩ３００（商標）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉに形質転換させた。化学的または電気的適格性を使用して菌株を構築した。アンピシリン（２５ｍｇ／Ｌ）およびカナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を含有するＬＢにおいて表示の通りに選別を行った。ラムダＤＥ３（ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するファージ構築物）を有するバックグラウンド株ＭＧ１６５５を宿主株として使用し、３７℃で増殖させた。この研究における実験にはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＢＹ４７４１（ＭＡＴａ  ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０  ｍｅｔ１５Δ０  ｕｒａ３Δ０）を使用し、３０℃で増殖させた。
【０１２４】
Ｅ．ｃｏｌｉ培養物は、ＬＢブロス（１リットルの培地が、１０グラムのトリプトン、５グラムの酵母抽出物、および１０グラムの塩化ナトリウムを含有した）において増殖させた。酵母培養物は、ＹＰＤ（１０ｇ／ＬのＢａｃｔｏ酵母抽出物、２０ｇ／ＬのＢａｃｔｏペプトン、２０ｇ／ＬのＤ−グルコース）において増殖させた。酢酸リチウム形質転換方法を使用して、酵母を、それぞれの栄養要求性マーカーを含有しているプラスミドで形質転換した。合成ドロップアウト培地（６．７ｇ／Ｌのアミノ酸非含有Ｄｉｆｃｏ酵母窒素ベース；２ｇ／Ｌの合成規定アミノ酸ミックスからそれぞれの独立栄養性を差し引いたもの、酵母窒素ベースなし（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）；２０ｇ／ＬのＤ−グルコースまたはそれぞれの炭素源；２０ｇ／ＬのＢＤ  Ｄｉｆｃｏ寒天をプレートに使用した）において選別を行った。適切な場合、ＮａＯＨまたはＨＣｌでｐＨを調整した。
【０１２５】
プラスミドおよびクローニング
【０１２６】
コード配列部プラスミド、酵母タンパク質発現カセット、および多重遺伝子プラスミドの組立てに、階層型のＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニングスキームを使用した。すべてのタンパク質コード配列を、ｇｏｌｄｅｎ  ｇａｔｅクローニングにおいて使用される内部のＢｓａＩおよびＢｓｍＢＩ部位が省かれるように合成またはＰＣＲ増幅した。真菌経路酵素用のタンパク質コード配列は、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ用にコドン最適化し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって合成した。
【０１２７】
（実施例３  供給された置換インドールおよびアントラニレートによる置換トリプタミンの生産）
【０１２８】
ラムダＤＥ３を有するバックグラウンド株ＭＧ１６５５は、ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するファージ構築物であり、宿主株として使用した。この株を、トリプトファン生合成経路（たとえば、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢ、およびｔｒｐＡ）およびトリプトファンデアミナーゼ（ｔｎａＡ）がノックアウトされるように改変した。この遺伝物質は、Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ  （２０００）が記載しているような改良型λレッドシステムによって取り除いた。得られる株をｂＮＡＢ００１と名付けた。
【０１２９】
トリプトファン生合成経路であるｔｒｐＤＣＢＡ（配列番号１）を、ｐ１５ａ起点を有するアンピシリン耐性プラスミドに、ＬａｃＩオペロン制御下でクローニングし、ｐＲＪＰ１３７６と名付けた（図１）。このプラスミドをｂＮＡＢ００１に導入し、株ｂＮＡＢ００２を得た。したがって、ｂＮＡＢ００２株では、置換アントラニレートおよび置換インドールが加えられると、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導の際に、置換トリプトファン生合成のためのｔｒｐＤＣＢＡオペロンの発現が可能になる。得られる置換トリプトファン化合物を下流のトリプタミンにさらに変換するために、２種のプラスミドをクローニングした。置換トリプトファンをトリプタミンに変換するためのＰ．ｃｕｂｅｎｓｉｓからのトリプトファンデカルボキシラーゼ（ｐｓｉＤ、配列番号１４）、Ｐ．ｃｕｂｅｎｓｉｓからの４−ヒドロキシトリプタミンキナーゼ（ｐｓｉＫ、配列番号４１）、およびＰ．ｃｕｂｅｎｓｉｓからのトリプタミンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ｐｓｉＭ、配列番号２１）のコード配列を、カナマイシン耐性遺伝子およびＢＲ３２２複製起点を含有しているプラスミドにクローニングし、ｐＲＪＰ１４６０と名付けた（図２）。コード配列を、Ｔ７プロモーター配列の下流の多シストロン性オペロンにおいて配向させた。このプラスミドをｂＮＡＢ００２に形質転換させ、得られる株をｂＮＡＢ００３と名付けた。Ｂ．ａｔｒｏｐｈａｅｕｓからのトリプトファンデカルボキシラーゼ（配列番号１９）およびＨ．ｓａｐｉｅｎｓからの芳香族エタノールアミンメチルトランスフェラーゼ（配列番号２５）のコード配列を、プロモーターおよびリボソーム結合配列の下流に、カナマイシン耐性遺伝子およびＢＲ３２２複製起点配列と共にクローニングして、プラスミドｐＲＪＰ１６２５を生成した（図３）。ｐＲＪＰ１６２５プラスミドをｂＮＡＢ００２に形質転換させ、得られる株をｂＮＡＢ００４と名付けた。
【０１３０】
ｂＮＡＢ００３終夜培養物を使用して、１ＬのＬＢ（カナマイシンおよびアンピシリンを添加）培養物に０．１ＯＤ６００で接種した。培養物を０．５のＯＤ６００まで増殖させ、氷上で１８℃に冷却した後、０．５ｍＭのＩＰＴＧによって、ｔｒｐＤＣＢＡ経路タンパク質およびｐｓｉＭＤＫ経路タンパク質の発現を誘導した。培養物を１８℃で振盪機に移し、２００ＲＰＭで１６時間振盪した。細胞を収穫し、滅菌水で洗浄し、Ｍ９培地（０．２％のグルコース、４０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．５ｍＭのＩＰＴＧに、１００ｍｇ／ＬのＬ−セリン、２ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム、および２ｇ／Ｌの酵母抽出物を加えたもの）に再懸濁した。培養物を、滅菌培養管中１０ｍＬの培養物に分割した。４ｍＭの５−ヒドロキシインドール、４−ヒドロキシインドール、７−ヒドロキシインドール、および４−クロロインドールを別々の管に加えた。３０℃で３日間インキュベートした後、１ｍＬの培養物を１８０００ｒｐｍで遠心分離し、清澄になった培地を試料バイアルに移すことにより、培養物から培地を試料採取した。６１２０四重極質量分析計に接続した１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたクロマトグラフィー／質量分析（ＬＣＭＳ）によって分析を行った。２０℃で、０．５ｍＬ／分の流量を使用し、Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８ガードカラム（４．６ｃｍ×１２．５ｃｍ、５μｍ充填、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×１００ｍｍ、３．５μｍ充填、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に接続した。水およびアセトニトリル移動相は、ｐＨ調整剤として０．１％のギ酸を含有した。溶離勾配（水：アセトニトリル体積比）は、次のとおりとした。９８：２（０〜２分）、９８：２から５：９５への線形傾斜（２〜１７分）、５：９５（１７〜２２分）、５：９５から９８：２への線形傾斜（２２〜２３分）、および９８：２（２３〜２８分）。ＵＶ−Ｖｉｓ分析用のダイオードアレイ検出器を使用して、吸光度を測定した。大気圧イオン化−ポジティブエレクトロスプレー（ＡＰＩ−ＥＳポジティブ）モードにおいて、１００Ｖのフラグメンター電圧で、イオン検出を両完全走査モード（５０〜１２００ｍ／ｚ）に設定して、ＭＳを行った。供給のない対照試料において見出されなかった対応するトリプタミンのイオン質量を抽出することにより、トリプタミンの検出を行った。５−ヒドロキシインドールが供給された培養物では、５−ヒドロキシトリプタミンが検出された。４−ヒドロキシインドール培養物では、４−ヒドロキシトリプタミン、４−ホスホリルオキシトリプタミン、および４−ホスホリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミンが検出された。７−ヒドロキシインドールが供給された培養物では、７−ヒドロキシトリプタミン、７−ホスホリルオキシトリプタミン、および７−ホスホリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミンが検出された。４−クロロインドールが供給された培養物では、４−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミンが検出された（図４を参照されたい）。
【０１３１】
ｂＮＡＢ００４終夜培養物を使用して、１ＬのＬＢ（カナマイシンおよびアンピシリンを添加）培養物に０．１ＯＤ６００で接種した。培養物を０．５のＯＤ６００まで増殖させ、氷上で１８℃に冷却した後、０．５ｍＭのＩＰＴＧによって、ｔｒｐＤＣＢＡ経路タンパク質およびｐｓｉＭＤＫ経路タンパク質の発現を誘導した。培養物を１８℃で振盪機に移し、２００ＲＰＭで１６時間振盪した。細胞を収穫し、滅菌水で洗浄し、Ｍ９培地（０．２％のグルコース、４０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．５ｍＭのＩＰＴＧに、１００ｍｇ／ＬのＬ−セリン、２ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム、および２ｇ／Ｌの酵母抽出物を加えたもの）に再懸濁した。培養物を、滅菌培養管中１０ｍＬの培養物に分割した。４ｍＭの５−ヒドロキシインドール、４−クロロインドール、および５−ブロモアントラニレートを別々の管に加えた。３０℃で３日間インキュベートした後、１ｍＬの培養物を１８０００ｒｐｍで遠心分離し、清澄になった培地を試料バイアルに移すことにより、培養物から培地を試料採取した。６１２０四重極質量分析計に接続した１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたクロマトグラフィー／質量分析（ＬＣＭＳ）によって分析を行った。２０℃で、０．５ｍＬ／分の流量を使用し、Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８ガードカラム（４．６ｃｍ×１２．５ｃｍ、５μｍ充填、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×１００ｍｍ、３．５μｍ充填、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に接続した。水およびアセトニトリル移動相は、ｐＨ調整剤として０．１％のギ酸を含有した。溶離勾配（水：アセトニトリル体積比）は、次のとおりとした。９８：２（０〜２分）、９８：２から５：９５への線形傾斜（２〜１７分）、５：９５（１７〜２２分）、５：９５から９８：２への線形傾斜（２２〜２３分）、および９８：２（２３〜２８分）。ＵＶ−Ｖｉｓ分析用のダイオードアレイ検出器を使用して、吸光度を測定した。大気圧イオン化−ポジティブエレクトロスプレー（ＡＰＩ−ＥＳポジティブ）モードにおいて、１００Ｖのフラグメンター電圧で、イオン検出を両完全走査モード（５０〜１２００ｍ／ｚ）に設定して、ＭＳを行った。供給のない対照試料において見出されなかった対応するトリプタミンのイオン質量を抽出することにより、トリプタミンの検出を行った。５−ヒドロキシインドールが供給された培養物では、５−ヒドロキシトリプタミン、５−ヒドロキシメチルトリプタミン、および５−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミンが検出された。４−クロロインドールが供給された培養物では、４−クロロトリプタミンおよび４−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミンが検出された。５−ブロモアントラニレートが供給された培養物では、５−ブロモトリプタミン、５−ブロモ−Ｎ−メチルトリプタミン、および５−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミンが検出された（図４を参照されたい）。
【０１３２】
（実施例４  操作された酵母による置換トリプタミンの産生）
【０１３３】
遺伝子改変を用いると、中心炭素代謝から生合成により産生されたアントラニレート（すなわち、水素置換されたアントラニレート）が代謝されて、置換トリプタミンを生成することがある。トリプタミンのアミン位置およびインドール環の置換を調査した。ＣＥＮ６／ＡＲＳ４複製配列、ＵＲＡ３発現カセット、およびカナマイシン耐性を有する多重遺伝子プラスミドを、Ｂ．ａｔｒｏｐｈａｅｕｓからのトリプトファンデカルボキシラーゼ（配列番号１９）、Ｐ．ｃｙａｎｅｓｃｅｎｓからのトリプトファン４−ヒドロキシラーゼ（配列番号３３）、Ｐ．ｃｕｂｅｎｓｉｓからの４−ヒドロキシトリプタミンキナーゼ（ｐｓｉＫ、配列番号４１）、およびＰ．ｃｕｂｅｎｓｉｓからのトリプタミンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ｐｓｉＭ、配列番号２１）のコード配列が、高活性酵母プロモーターおよびターミネーター対（たとえば、プロモーターｐＣＣＷ１２、ｐＴＤＨ３、およびｐＰＧＫ１、またはターミネーターｔＡＤＨ１、ｔＰＧＫ１、およびｔＥＮＯ１）の制御下で含有されるようにクローニングし、プラスミドｐＲＪＰ１６０８と名付けた（図５）。酵母代謝中に存在するアントラニル酸を、ｐＲＪＰ１６０８においてコードされる酵素によってトリプタミンに変換する生合成経路については、図６に概略を示している。ＣＥＮ６／ＡＲＳ４複製配列、ＵＲＡ３発現カセット、およびカナマイシン耐性を有する第２の多重遺伝子プラスミドを、Ｂ．ａｔｒｏｐｈａｅｕｓからのトリプトファンデカルボキシラーゼ（配列番号１９）、Ｐ．ｃｙａｎｅｓｃｅｎｓからのトリプトファン４−ヒドロキシラーゼ（配列番号３３）、およびＢ．ｔａｕｒｕｓからのアラルキルアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（配列番号４６）のコード配列が、高活性酵母プロモーターおよびターミネーター対（たとえば、プロモーターｐＣＣＷ１２、ｐＴＤＨ３、およびｐＰＧＫ１、またはターミネーターｔＡＤＨ１、ｔＰＧＫ１、およびｔＥＮＯ１）の制御下で含有されるようにクローニングし、プラスミドｐＲＪＰ１６１８と名付けた（図７）。酵母代謝中に存在するアントラニル酸を、ｐＲＪＰ１６１８においてコードされる酵素によってトリプタミンに変換する生合成経路については、図８に概略を示している。
【０１３４】
この研究における実験にはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＢＹ４７４１（ＭＡＴａ  ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０  ｍｅｔ１５Δ０  ｕｒａ３Δ０）を使用し、３０℃で増殖させた。ｐＲＪＰ１６０８プラスミドを、酢酸リチウムプロトコールによってＢＹ４７４１に形質転換させ、ウラシルを含まない合成完全培地において選別にかけた。得られる株、すなわちｙＮＡＢ００１を単離し、遺伝子型を同定した。ｐＲＪＰ１６１８プラスミドを、酢酸リチウムプロトコールによってＢＹ４７４１に形質転換させ、ウラシルを含まない合成完全培地において選別にかけた。得られる株、すなわちｙＮＡＢ００２を単離し、遺伝子型を同定した。
【０１３５】
ｙＮＡＢ００１およびｙＮＡＢ００２のコロニーを使用して、５ｍＬの合成完全培地培養物に接種し、２２５ｒｐｍの回転式振盪機において３０℃で増殖させた。１ｍＬの培養物を１８０００ｒｐｍで遠心分離し、清澄になった培地を試料バイアルに移すことにより、培養物から培地を試料採取した。６１２０四重極質量分析計に接続した１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたクロマトグラフィー／質量分析（ＬＣＭＳ）によって分析を行った。２０℃で、０．５ｍＬ／分の流量を使用し、Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８ガードカラム（４．６ｃｍ×１２．５ｃｍ、５μｍ充填、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×１００ｍｍ、３．５μｍ充填、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に接続した。水およびアセトニトリル移動相は、ｐＨ調整剤として０．１％のギ酸を含有した。溶離勾配（水：アセトニトリル体積比）は、次のとおりとした。９８：２（０〜２分）、９８：２から５：９５への線形傾斜（２〜１７分）、５：９５（１７〜２２分）、５：９５から９８：２への線形傾斜（２２〜２３分）、および９８：２（２３〜２８分）。ＵＶ−Ｖｉｓ分析用のダイオードアレイ検出器を使用して、吸光度を測定した。大気圧イオン化−ポジティブエレクトロスプレー（ＡＰＩ−ＥＳポジティブ）モードにおいて、１００Ｖのフラグメンター電圧で、イオン検出を両完全走査モード（５０〜１２００ｍ／ｚ）に設定して、ＭＳを行った。
【０１３６】
供給のない対照試料において見出されなかった対応するトリプタミンのイオン質量を抽出することにより、トリプタミンの検出を行った。加えて、タンデムＭＳ／ＭＳを行った。ｙＮＡＢ００１の培養物では、トリプタミン、４−ヒドロキシトリプタミン、４−ホスホリルオキシトリプタミン、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、および４−ホスホリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミンのイオン質量が検出された（図６）。２０５．１３３５ｍ／ｚの陽イオン質量の箇所の４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン（図９）および２８５．０９９９ｍ／ｚの陽イオン質量の箇所の４−ホスホリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン（図１０）について、タンデムＭＳ／ＭＳフラグメント化データを収集した。ｙＮＡＢ００２の培養物では、トリプタミン、４−ヒドロキシトリプタミン、Ｎ−アセチル−トリプタミン、および４−ヒドロキシ−Ｎ−アセチル−トリプタミンのイオン質量が検出された（図８）。２０３．１１７９ｍ／ｚの陽イオン質量の箇所のＮ−アセチル−トリプタミン（図１１）および２１９．１１２８の陽イオン質量の箇所の４−ヒドロキシ−Ｎ−アセチル−トリプタミン（図１２）について、タンデムＭＳ／ＭＳフラグメント化データを収集した。形質転換していないＢＹ４７４１株からの培地では、極微レベルのトリプタミンしか検出されず、ｙＮＡＢ００１およびｙＮＡＢ００２培地からの前述の他のトリプタミンは検出されなかった。
【０１３７】
（実施例５  操作された細胞を使用する、供給されたトリプタミンからのトリプタミン誘導体の生産）
【０１３８】
微生物を遺伝子改変して、トリプタミンを誘導体化することのできる代謝酵素を発現させることができる。酵母において異種酵素を発現させ、種々のアミン置換を有するトリプタミンを供給することにより、トリプタミンのインドール位置に対するヒドロキシルおよびホスホリルオキシ置換を調査した。ＣＥＮ６／ＡＲＳ４複製配列、ＵＲＡ３発現カセット、およびカナマイシン耐性を有する単一遺伝子発現プラスミドを、Ｐ．ｃｙａｎｅｓｃｅｎｓからのトリプタミン４−ヒドロキシラーゼ（配列番号３３）のコード配列を含有するようにクローニングし、ｐＲＪＰ１６３９と名付けた（図１３）。ＣＥＮ６／ＡＲＳ４複製配列、ＵＲＡ３発現カセット、およびカナマイシン耐性を有する単一遺伝子発現プラスミドを、Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉからのトリプタミン５−ヒドロキシラーゼ（配列番号４７）のコード配列を含有するようにクローニングし、ｐＲＪＰ１６４０と名付けた（図１４）。ＣＥＮ６／ＡＲＳ４複製配列、ＬＥＵ２発現カセット、およびカナマイシン耐性を有する単一遺伝子発現プラスミドを、Ｐ．ｃｕｂｅｎｓｉｓからの４−ヒドロキシトリプタミンキナーゼ（配列番号４１）のコード配列を含有するようにクローニングし、ｐＲＪＰ１６４１と名付けた（図１５）。
【０１３９】
この研究における実験にはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＢＹ４７４１（ＭＡＴａ  ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０  ｍｅｔ１５Δ０  ｕｒａ３Δ０）を使用し、３０℃で増殖させた。ｐＲＪＰ１６３９プラスミドを、酢酸リチウムプロトコールによってＢＹ４７４１に形質転換させ、ウラシルを含まない合成完全培地において選別にかけた。得られる株、すなわちｙＮＡＢ００３を単離し、遺伝子型を同定した。ｐＲＪＰ１６４０プラスミドを、酢酸リチウムプロトコールによってＢＹ４７４１に形質転換させ、ウラシルを含まない合成完全培地において選別にかけた。得られる株、すなわちｙＮＡＢ００４を単離し、遺伝子型を同定した。プラスミドｐＲＪＰ１６４１を、ＮｏｔＩ消化によって線状にし、酢酸リチウムプロトコールによって株ｙＮＡＢ００３に形質転換させ、ロイシンを含まない合成完全培地において選別にかけた。得られる株、すなわちｙＮＡＢ００５を単離し、遺伝子型を同定した。
【０１４０】
終夜増殖させたｙＮＡＢ００３、ｙＮＡＢ００４、およびｙＮＡＢ００５の培養物を使用して、２５０ｍＬの合成完全培地培養物に接種し、２２５ｒｐｍの回転式振盪機において３０℃で増殖させた。培養物を濃縮して、ウラシルを含まない２５ｍＬの合成完全培地に入れ、５ｍＬの培養管に移した。５ｍＭの種々のトリプタミン（５−メトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−トリプタミン、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルトリプタミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミン、Ｎ，Ｎ−テトラメチレントリプタミン、およびＮ，Ｎ−ジプロピルトリプタミンが含まれる）を、別々の管に加えた（図１６）。３０℃で３日間インキュベートした後、１ｍＬの培養物を１８０００ｒｐｍで遠心分離し、清澄になった培地を試料バイアルに移すことにより、培養物から培地を試料採取した。６１２０四重極質量分析計に接続した１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたクロマトグラフィー／質量分析（ＬＣＭＳ）によって分析を行った。２０℃で、０．５ｍＬ／分の流量を使用し、Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８ガードカラム（４．６ｃｍ×１２．５ｃｍ、５μｍ充填、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×１００ｍｍ、３．５μｍ充填、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に接続した。水およびアセトニトリル移動相は、ｐＨ調整剤として０．１％のギ酸を含有した。溶離勾配（水：アセトニトリル体積比）は、次のとおりとした。９８：２（０〜２分）、９８：２から５：９５への線形傾斜（２〜１７分）、５：９５（１７〜２２分）、５：９５から９８：２への線形傾斜（２２〜２３分）、および９８：２（２３〜２８分）。ＵＶ−Ｖｉｓ分析用のダイオードアレイ検出器を使用して、吸光度を測定した。大気圧イオン化−ポジティブエレクトロスプレー（ＡＰＩ−ＥＳポジティブ）モードにおいて、１００Ｖのフラグメンター電圧で、イオン検出を両完全走査モード（５０〜１２００ｍ／ｚ）に設定して、ＭＳを行った。供給のない対照試料または元のトリプタミン化学ストックにおいて見出されなかった対応するトリプタミンのイオン質量を抽出することにより、トリプタミンの検出を行った。ｙＮＡＢ００３培養物については、供給されたトリプタミンの４−ヒドロキシ誘導体が確認された。ｙＮＡＢ００４培養物については、供給されたトリプタミンの５−ヒドロキシ誘導体が確認された。Ｎ，Ｎ−ジプロピルトリプタミンが供給されたｙＮＡＢ００５培養培地では、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジプロピルトリプタミンおよび４−ホスホリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジプロピルトリプタミンのイオン質量が確認された（図１６を参照されたい）。
【０１４１】
（実施例６  高ヒドロキシル化活性についての比色スクリーニング）
【０１４２】
４−ヒドロキシ−トリプタミンおよび４−ヒドロキシトリプトファンのヒドロキシル位置における保護基の付加がなければ、化合物は、有色化合物へと酸化される。したがって、トリプタミンおよびトリプトファンにおけるその後のヒドロキシラーゼおよび酸化活性を、ヒドロキシラーゼ活性の指標として使用することができる。この活性を実証するために、Ｐ．ｃｙａｎｅｓｃｅｎｓからのトリプタミン４−ヒドロキシラーゼ（配列番号３３）を高度に有する株ｙＮＡＢ００３の色生成を、ＷＴ  ＢＹ４７４１の活性と比較した。ＷＴ  ＢＹ４７４１およびｙＮＡＢ００３について、４つの別々の３ｍＬ培養を、４ｍＭのトリプタミンが加えられた合成完全培地において、３０℃で３日間、７５０ｒｐｍの高頻度振盪で開始した。培養後、色素生成を観察するために、これらの培養物を遠心分離して細胞をペレット化した。ｙＮＡＢ００３培養物では、トリプタミン４−ヒドロキシラーゼ活性の指標として青色の産物の生成が観察され、ＷＴ  ＢＹ４７４１培養物では観察されなかった（図１７）。
【０１４３】
本発明の好ましい実施形態を本明細書において示し、説明してきたが、そのような実施形態が例として提供されるにすぎないことは当業者には言うまでもない。本発明は、本明細書内で提供する詳細な実施例によって限定されるものではない。本発明について前述の明細書に関連して述べてきたが、本明細書における記述および例証は、限定する意味に解釈されないものとする。当業者は、本発明から逸脱することなく、数多くの変形形態、変更形態、および代用形態をすぐにでも発想するところとなる。さらに、本発明のすべての態様が、様々な条件および可変要素に左右される、本明細書で明示する詳細な図画、配置、または相対的割合に限定されないことを理解すべきである。本発明を実践する際、本明細書に記載する本発明の実施形態の種々の代替形態を用いてもよいと理解すべきである。したがって、本発明は、そうしたいかなる代替形態、改変形態、変形形態、または均等物もカバーするものと企図される。本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって規定されるものとし、そうした特許請求の範囲内の方法および構造ならびにその均等物がそれによってカバーされるものとする。
【図１】
2021514682.tif 000038
【図２】
2021514682.tif 000039
【図３】
2021514682.tif 000040
【図４】
2021514682.tif 000041
【図５】
2021514682.tif 000042
【図６】
2021514682.tif 000043
【図７】
2021514682.tif 000044
【図８】
2021514682.tif 000045
【図９】
2021514682.tif 000046
【図１０】
2021514682.tif 000047
【図１１】
2021514682.tif 000048
【図１２】
2021514682.tif 000049
【図１３】
2021514682.tif 000050
【図１４】
2021514682.tif 000051
【図１５】
2021514682.tif 000052
【図１６】
2021514682.tif 000053
【図１７】
2021514682.tif 000054
【図１８Ａ】
2021514682.tif 000055
【図１８Ｂ】
2021514682.tif 000056
【配列表】
2021514682000001.app
【国際調査報告】
2021514682.tif 000057
2021514682.tif 000058
2021514682.tif 000059
2021514682.tif 000060
2021514682.tif 000061
2021514682.tif 000062
2021514682.tif 000063
2021514682.tif 000064