(57)【要約】  本開示は、デュルバルマブなどのヒト抗ＰＤ−Ｌ１を対象とする抗体の製剤及び組成物に関する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）４０ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体；
（ｂ）１５ｍＭ〜３５ｍＭの緩衝液；
（ｃ）２５５ｍＭ〜２７５ｍＭの二糖類；及び、
（ｄ）０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．０５％（ｗ／ｖ）の界面活性剤、
を含む、抗体製剤であって、
ここで、前記製剤のｐＨは、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．２である、抗体製剤。
【請求項２】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体は：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；又は、
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；
配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；及び
配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３、
を含む、請求項１に記載の抗体製剤。
【請求項３】
前記緩衝液は、ヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液である、請求項１に記載の抗体製剤。
【請求項４】
前記二糖類は、トレハロース二水和物である、請求項１に記載の抗体製剤。
【請求項５】
前記二糖類は、スクロースである、請求項１に記載の抗体製剤。
【請求項６】
前記界面活性剤は、ポリソルベート８０である、請求項１に記載の抗体製剤。
【請求項７】
前記製剤は、液体製剤、凍結製剤、凍結乾燥製剤、又は再構成製剤である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体製剤。
【請求項８】
高圧サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＰＥＣ）により測定して、約１％未満の前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、４０℃で約１ヶ月間保管した際に凝集体を形成する、請求項１に記載の抗体製剤。
【請求項９】
高圧サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）により測定して少なくとも９７％の前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、約４０℃で約１ヶ月間保管した後にモノマーとして存在する、請求項１に記載の抗体製剤。
【請求項１０】
高圧サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）により測定して少なくとも９９％の前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、約４０℃で約１ヶ月間保管した後にモノマーとして存在する、請求項１に記載の抗体製剤。
【請求項１１】
高圧サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）により測定して少なくとも９８％の前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、約５℃で約１ヶ月間保管した後にモノマーとして存在する、請求項１に記載の抗体製剤。
【請求項１２】
前記抗体製剤は、少なくとも３回の凍結／解凍サイクルの後に安定性を維持する、請求項１に記載の抗体製剤。
【請求項１３】
（ａ）５０ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体；
（ｂ）２６ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液；
（ｃ）２７５ｍＭのトレハロース二水和物；及び、
（ｄ）０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０；
を含む、抗体製剤であって、
ここで、前記製剤のｐＨは、ｐＨ６．０である、抗体製剤。
【請求項１４】
（ａ）５０ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体；
（ｂ）２５ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液；
（ｃ）２６５ｍＭのトレハロース二水和物；及び、
（ｄ）０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０；
を含む、抗体製剤であって、
ここで、前記製剤のｐＨは、ｐＨ５．５である、抗体製剤。
【請求項１５】
（ａ）５０ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体；
（ｂ）２５ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液；
（ｃ）２６５ｍＭのトレハロース二水和物；及び、
（ｄ）０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０；
を含む、抗体製剤であって、
ここで、前記製剤のｐＨは、ｐＨ６．５である、抗体製剤。
【請求項１６】
（ａ）５０ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体；
（ｂ）２５ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液；
（ｃ）２６５ｍＭのトレハロース二水和物；及び、
（ｄ）０．０４％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０；
を含む、抗体製剤であって、
ここで、前記製剤のｐＨは、ｐＨ６．０である、抗体製剤。
【請求項１７】
（ａ）５０ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体；
（ｂ）２５ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液；
（ｃ）２６５ｍＭのスクロース；及び、
（ｄ）０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０；
を含む、抗体製剤であって、
ここで、前記製剤のｐＨは、ｐＨ６．０である、抗体製剤。
【請求項１８】
前記ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖を含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の抗体製剤。
【請求項１９】
前記ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体は：
配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；及び
配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；及び
配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；及び
配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；及び
配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；及び
配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３、
を含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の抗体製剤。
【請求項２０】
前記製剤は、液体製剤、凍結製剤、凍結乾燥製剤、又は再構成製剤である、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の抗体製剤。
【請求項２１】
高圧サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＰＥＣ）により決定して約１％未満の前記ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、４０℃で約１ヶ月間保管した際に凝集体を形成する、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の抗体製剤。
【請求項２２】
高圧サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）により測定して少なくとも９７％の前記ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、約４０℃で約１ヶ月間保管した後にモノマーとして存在する、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の抗体製剤。
【請求項２３】
高圧サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）により測定して少なくとも９９％の前記ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、約４０℃で約１ヶ月間保管した後にモノマーとして存在する、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の抗体製剤。
【請求項２４】
高圧サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）により測定して少なくとも９８％の前記ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、約５℃で約１ヶ月間保管した後にモノマーとして存在する、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の抗体製剤。
【請求項２５】
前記抗体製剤は、少なくとも３回の凍結／解凍サイクルの後に安定性を維持する、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の抗体製剤。
【請求項２６】
組成物であって：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体；並びに、
（ｂ）前記組成物のキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）を使用し測定して前記組成物中の４５％以上のタンパク質を含む前記抗体の主要形態、
を含む、組成物。
【請求項２７】
組成物であって：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体；
（ｂ）前記組成物のｃＩＥＦを使用し測定して前記組成物中の４５％以上のタンパク質を含む前記抗体の主要形態；並びに
（ｃ）前記組成物のｃＩＥＦを使用し測定して前記組成物中の４５％〜５０％のタンパク質を含む抗体の酸性形態、
を含む、組成物。
【請求項２８】
組成物であって：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体；
（ｂ）前記組成物のｃＩＥＦを使用し測定して前記組成物中の４５％以上のタンパク質を含む前記抗体の主要形態；並びに、
（ｃ）前記組成物のｃＩＥＦを使用し測定して前記組成物中の１８％〜２３％のタンパク質を含む前記抗体の塩基形態、
を含む、組成物。
【請求項２９】
組成物であって：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体；
（ｂ）前記組成物のｃＩＥＦを使用し測定して前記組成物中の４５％以上のタンパク質を含む前記抗体の主要形態；
（ｃ）前記組成物のｃＩＥＦを使用し測定して前記組成物中の４５％〜５０％のタンパク質を含む前記抗体の酸性形態；並びに、
（ｄ）前記組成物のｃＩＥＦを使用し測定して前記組成物中の１８％〜２３％のタンパク質を含む前記抗体の塩基形態、
を含む、組成物。
【請求項３０】
組成物であって：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含み；並びに、
（ｂ）前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体のグリカン構造は、Ｇ０ｆ、Ｇ１ｆ、Ｇ２ｆ、及びＧ０グリコフォームを含む、組成物。
【請求項３１】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体のグリカン構造は、前記Ｇ０ｆ、Ｇ１ｆ、Ｇ２ｆ、及びＧ０グリコフォームに関して９０％よりも高い含有量を有する、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、７１．９％のＧ０ｆ含有量、１８．４％のＧ１ｆ含有量、１．５％のＧ２ｆ含有量、及び１．９％のＧ０含有量を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
組成物であって：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体；を含み、
（ｂ）高圧サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＰＥＣ）により決定して１．５％〜２．５％の前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、凝集体を形成し；並びに、
（ｃ）ＨＰ−ＳＥＣにより測定して、９７％〜９８％の前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、モノマーとして存在する、組成物。
【請求項３４】
前記ＰＤ−Ｌ１抗体は：
配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；及び
配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；及び
配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；及び
配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；及び
配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；及び
配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３、
を含む、請求項２６〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
（ａ）５０ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体；
（ｂ）２６ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液；
（ｃ）２７５ｍＭのトレハロース二水和物；並びに、
（ｄ）０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０；
を含む、抗体製剤であって、
ここで、前記製剤のｐＨは、ｐＨ６．０であり、ここで、前記ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖を含む、抗体製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、デュルバルマブなどのヒト抗ＰＤ−Ｌ１を対象とする抗体の製剤及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ７Ｈ１としても公知のプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）は、抗癌免疫に大きな障害をもたらす４０ｋＤａの膜貫通タンパク質である。プログラム死受容体（ＰＤ−１）に結合するＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞を不活性化し、腫瘍細胞を保護し、免疫系の検出を抑制し、癌細胞の未確認の増殖を可能とする。ＰＤ−Ｌ１はまた、共刺激分子であるＣＤ８０に結合する。
【０００３】
抗原提示細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び非造血細胞を含む、広範囲な腫瘍原性及び活性化免疫細胞型は、ＰＤ−Ｌ１を自然に発現する。加えて、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）などの炎症性サイトカインは、ＰＤ−Ｌ１の発現を誘導する可能性がある。例えば、活性化Ｔ細胞は、ＩＦＮγを生産し、これが、ＰＤ−Ｌ１の最も有力な誘導因子である。ＩＦＮγにより誘導されるＰＤ−Ｌ１の発現が腫瘍保護を促進し、これが、適応性のある免疫耐性として公知の機構である。
【０００４】
適応性のある免疫耐性及びＰＤ−Ｌ１の致死性を抑制するための１つの戦略は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いる。このアプローチと一貫して、ＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１に結合するのを妨害する、親和性最適化抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナルＩｇＧ１三重変異体（ＴＭ）である１４９ｋＤａの抗ＰＤ−Ｌ１抗体デュルバルマブは、細胞傷害性Ｔ細胞に対するＰＤ−Ｌ１の免疫抑制効果を失わせるために採用できる。その結果が、腫瘍増殖を促進する負の阻害信号の軽減、抗腫瘍免疫の増強、免疫系による腫瘍細胞の殺傷を増強する反応である。
【０００５】
重要なことに、液状原薬及び凍結乾燥された薬物製品の安定性を保つ抗ＰＤ−Ｌ１抗体の緩衝液製剤が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の有効性に不可欠である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、本開示は、４０ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体、１５ｍＭ〜３５ｍＭの緩衝液、２５５ｍＭ〜２７５ｍＭの二糖類、０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．０５％（ｗ／ｖ）の界面活性剤を含む抗体製剤を提供し、ここで、製剤のｐＨは、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ７．２である。
【０００７】
一態様では、本開示は、５０ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体、２６ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液、２７５ｍＭのトレハロース無水物、０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む抗体製剤を提供し、ここで、製剤のｐＨは、ｐＨ６．０である。
【０００８】
一態様では、本開示は、５０ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体、２５ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液、２６５ｍＭのトレハロース無水物、０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む抗体製剤を提供し、ここで、製剤のｐＨは、約ｐＨ５．５である。
【０００９】
一態様では、本開示は、５０ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体、２５ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液、２６５ｍＭのトレハロース無水物、０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む抗体製剤を提供し、ここで、製剤のｐＨは、約ｐＨ６．５である。
【００１０】
一態様では、本開示は、５０ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体、２５ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液、２６５ｍＭのトレハロース無水物、０．０４％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む抗体製剤を提供し、ここで、製剤のｐＨは、約ｐＨ６．０である。
【００１１】
一態様では、本開示は、５０ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体、２５ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液、２６５ｍＭのスクロース、０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む抗体製剤を提供し、ここで、製剤のｐＨは、約ｐＨ６．０である。
【００１２】
一態様では、本開示は、配列番号１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体、並びに組成物のキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）を使用し測定して４５％以上の組成物中のタンパク質を含む抗体の主要形態を含む組成物を提供する。
【００１３】
一態様では、本開示は、配列番号１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体、組成物のｃＩＥＦを使用し測定して４５％以上の組成物中のタンパク質を含む抗体の主要形態、並びに組成物のｃＩＥＦを使用し測定して４５％〜５０％の組成物中のタンパク質を含む抗体の酸性形態を含む組成物を提供する。
【００１４】
一態様では、本開示は、配列番号１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体、組成物のｃＩＥＦを使用し測定して４５％以上の組成物中のタンパク質を含む抗体の主要形態、並びに組成物のｃＩＥＦを使用し測定して１８％〜２３％の組成物中のタンパク質を含む抗体の塩基形態を含む組成物を提供する。
【００１５】
一態様では、本開示は、配列番号１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体、組成物のｃＩＥＦを使用し測定して４５％以上の組成物中のタンパク質を含む抗体の主要形態、組成物のｃＩＥＦを使用し測定して４５％〜５０％の組成物中のタンパク質を含む抗体の酸性形態、並びに組成物のｃＩＥＦを使用し測定して１８％〜２３％の組成物中のタンパク質を含む抗体の塩基形態を含む組成物を提供する。
【００１６】
一態様では、本開示は、配列番号１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む組成物を提供し、抗ＰＤ−Ｌ１抗体のグリカン構造は、Ｇ０ｆ、Ｇ１ｆ、Ｇ２ｆ、及びＧ０グリコフォームを含む。
【００１７】
一態様では、本開示は、配列番号１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む組成物を提供し、高圧サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＰＥＣ）により決定して１．５％〜２．５％の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、凝集体を形成し、並びにＨＰ−ＳＥＣにより測定して９７％〜９８％の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、モノマーとして存在する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】デュルバルマブ製剤開発活動の概要を示す。
【図２】製剤緩衝液（２６ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ、２７５ｍＭのトレハロース無水物、０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ｐＨ６．０）中の、３ｍｇ／ｍＬでのデュルバルマブの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）プロファイルを示し、ここで、Ｔｍ１は、６４．５℃と実証され、Ｔｍ２は、７３．０４℃であると実証された。
【図３】製剤緩衝液（２６ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ、２７５ｍＭのトレハロース無水物、０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ｐＨ６．０）中のデュルバルマブの、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）プロファイルである。４つのピークは、８．３〜８．８のｐＩ範囲を示した。主要なピークは、８．６のｐＩを有した。
【図４】製剤緩衝液（２６ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ、２７５ｍＭのトレハロース無水物、０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ｐＨ６．０）中で、５℃又は４０℃で、１ヶ月間インキュベーションした後の、デュルバルマブのクローン１又はクローン２の液体安定性を実証する。
【図５Ａ−Ｂ】５℃（図５Ａ）、２５℃（図５Ｂ）、及び４０℃（図５Ｃ）で３ヶ月保管した後のデュルバルマブの電気泳動図を図示する。２５℃及び４０℃で３ヶ月保管した後に、追加のピログルタミン酸ピークが存在した。
【図５Ｃ】５℃（図５Ａ）、２５℃（図５Ｂ）、及び４０℃（図５Ｃ）で３ヶ月保管した後のデュルバルマブの電気泳動図を図示する。２５℃及び４０℃で３ヶ月保管した後に、追加のピログルタミン酸ピークが存在した。
【図６】製剤緩衝液（２６ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ、２７５ｍＭのトレハロース無水物、０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ｐＨ６．０）中のデュルバルマブの、崩壊の開始及び完全な崩壊の温度を示す、凍結乾燥顕微鏡法を実証する。
【図７】製剤緩衝液（２６ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ、２７５ｍＭのトレハロース無水物、０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ｐＨ６．０）中のデュルバルマブのガラス転移（Ｔｇ’）温度を示す、ＤＳＣサーモグラムを図示する。
【図８】設計空間生成プロセスモデルである。実験計画は、変更された一次乾燥温度、圧力、一次乾燥時間、及び最大製品温度で実施される。チャンバー圧でのサイクル中点（点）及びプロセスの頑健性（白色の三角形の領域）、並びに棚温度が表される。
【図９】ピラニゲージ（Δ１０μｂａｒ）の収束がおおよそ１０３時間〜１１５時間の乾燥工程で生じる、デュルバルマブＮＭＦ凍結乾燥の実施データを実証する。これは、１０％の安全域に相当する。
【図１０】Ａｍｓｃｏ凍結乾燥機中で実施された大規模なＮＭＦ凍結乾燥を実証する。結果は、割り当てられた一次時間内での製品熱電対の収束を示した。
【図１１】デュルバルマブ震盪研究のマイクロフローイメージング（ＭＦＩ）の結果を実証する。
【図１２−１】デュルバルマブに対する２−ＡＢ標識オリゴ糖の超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）のピーク同定を実証する。
【図１２−２】図１２−１の続き。
【図１２−３】図１２−２の続き。
【図１２−４】図１２−３の続き。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示は、デュルバルマブなどの抗ＰＤ−Ｌ１を対象とする抗体の製剤及び組成物に関する。
【００２０】
本開示に従い使用されるように、下記の用語は、別に指示されない限り、以下の意味を有すると理解される。特に文脈上必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。
【００２１】
用語「抗体」は、本明細書で使用されるとき、抗原を認識する、特に抗原に結合する能力があるタンパク質を指す。通常又は慣例の哺乳動物抗体は、四量体を含み、それは、典型的には、ポリペプチド鎖の２つの相同対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（典型的には、約２５ｋＤａの分子量を有する）及び１つの「重」鎖（典型的には、約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）からなる。用語「重鎖」及び「軽鎖」は、本明細書で使用されるとき、標的抗原用特異性を付与するように十分な可変ドメイン配列を有する、あらゆる免疫グロブリンポリペプチドを指す。各軽鎖及び重鎖のアミノ末端部分は、典型的には抗原認識の役割を果たす約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変ドメインを、典型的に含む。各鎖のカルボキシル末端部分は、典型的には、エフェクター機能の役割を果たす定常ドメインを画定する。従って、自然発生の抗体では、完全長の重鎖免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）、並びにＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジ領域を含み、ここで、ＶＨドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨ３ドメインは、カルボキシル末端にあり、並びに完全長の軽鎖免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）を含み、ここで、ＶＬドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＬドメインは、カルボキシル末端にある。
【００２２】
完全長の軽鎖及び重鎖内では、可変及び定常ドメインは、典型的には、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により連結され、重鎖はまた、約１０個を超えるアミノ酸の「Ｄ」領域をさらに含む。各軽質／重鎖対の可変領域は、典型的には、抗原結合部位を形成する。自然発生の抗体の可変ドメインは、典型的には相補性決定領域又はＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域により連結される、比較的保管性の高いフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各対の２つの鎖のＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域により整列し、特定のエピトープに結合することを可能とすることもある。アミノ末端からカルボキシル末端まで、軽鎖及び重鎖の両方の可変ドメインは、典型的には、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。
【００２３】
本明細書に開示される抗体製剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む。特定の実施形態では、製剤は、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬ、又は６０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む。他の実施形態では、製剤は、４０ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む。他の実施形態では、製剤は、５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む。特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒト型である。
【００２４】
本明細書に開示される抗体製剤は、１又は複数の緩衝液を含む。本明細書で使用されるとき、「緩衝液」は、製剤のｐＨを維持するための賦形剤を指す。特定の実施形態では、緩衝液は、ヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液である。緩衝液は、約１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、又は３０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、緩衝液の濃度は、２６ｍＭである。
【００２５】
特定の実施形態では、抗体製剤は、二糖類を含む。特定の実施形態では、二糖類は、トレハロース二水和物又はスクロースである。二糖類は、約２５０ｍＭ、２５５ｍＭ、２６０ｍＭ、２６５ｍＭ、２７０ｍＭ、２７５ｍＭ、又は２８０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、二糖類の濃度は、２６５ｍＭである。他の実施形態では、二糖類の濃度は、２７５ｍＭである。
【００２６】
特定の実施形態では、抗体製剤は、界面活性剤を含む。用語「界面活性剤」は、本明細書で使用されるとき、両親媒性構造を有する有機物質を指し；すなわち、そのような物質は、相反する溶解性傾向の基、典型的には、油溶性の炭化水素鎖及び水溶性のイオン基から構成される。界面活性剤は、表面活性部分の電荷に応じて、陰イオン、陽イオン、及び非イオン界面活性剤に分類できる。界面活性剤は、生体物質の様々な医薬製剤及び調製物のための、湿潤、乳化、可溶化、及び分散剤として頻繁に使用される。特定の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート８０である。界面活性剤は、約０．００１％〜約０．５％（体積）の濃度で存在する。
【００２７】
特定の実施形態では、４０ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体、１５ｍＭ〜３５ｍＭの緩衝液、２５５ｍＭ〜２７５ｍＭの二糖類、０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．０５％（ｗ／ｖ）の界面活性剤を含む抗体製剤が本明細書で開示され、製剤のｐＨは、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ７．２である。特定の実施形態では、抗体製剤は、５０ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体、２６ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液、２７５ｍＭのトレハロース無水物、０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ここで、製剤のｐＨは、約６．０である。他の実施形態では、抗体製剤は、５０ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体、２５ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液、２６５ｍＭのトレハロース無水物、０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ここで、製剤のｐＨは、約５．５である。他の実施形態では、抗体製剤は、５０ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体、２５ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液、２６５ｍＭのトレハロース無水物、０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ここで、製剤のｐＨは、約６．５である。他の実施形態では、抗体製剤は、５０ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体、２５ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液、２６５ｍＭのトレハロース無水物、０．０４％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ここで、製剤のｐＨは、約６．０である。他の実施形態では、抗体製剤は、５０ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体、２５ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液、２６５ｍＭのスクロース、０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ここで、製剤のｐＨは、約６．０である。他の実施形態では、抗体製剤は、５０ｍｇ／ｍＬのヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体、２５ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液、２６５ｍＭのスクロース、０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ここで、製剤のｐＨは、約６．０である。
【００２８】
特定の実施形態では、ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。他の実施形態では、ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【００２９】
特定の実施形態では、ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号１のアミノ酸配列との同一性が１００％未満のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び配列番号２のアミノ酸配列との同一性が１００％未満のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。他の実施形態では、ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号１のアミノ酸配列に対する９０％の配列同一性、９１％の配列同一性、９２％の配列同一性、９３％の配列同一性、９４％の配列同一性、９５％の配列同一性、９６％の配列同一性、９７％の配列同一性、９８％の配列同一性、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び配列番号２のアミノ酸配列に対する９０％の配列同一性、９１％の配列同一性、９２％の配列同一性、９３％の配列同一性、９４％の配列同一性、９５％の配列同一性、９６％の配列同一性、９７％の配列同一性、９８％の配列同一性、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
【００３０】
用語「ＭＥＤＩ４７３６」及び「デュルバルマブ」は、本明細書で使用されるとき、米国特許第８，７７９，１０８号明細書及び同第９，４９３，５６５号明細書に開示されているように、ヒト抗ＰＤ−Ｌ１に選択的に結合し、ＰＤ−Ｌ１の、ＰＤ−１及びＣＤ８０受容体への結合を妨害する抗体を指し、各文献は、それら全体を、本明細書において参照することにより組み込まれる。デュルバルマブの断片結晶性（Ｆｃ）ドメインは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の媒介に関与する補体成分Ｃ１ｑ及びＦｃγ受容体への結合を低下させるＩｇＧ１重鎖の定常領域中の三重変異を含む。デュルバルマブは、インビトロでヒトＴ細胞活性化のＰＤ−Ｌ１媒介性抑制を軽減することができ、Ｔ細胞依存性機構を介して異種移植片モデルでの腫瘍成長を阻害する。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、句「医薬製剤」、「製剤」、並びに「抗体製剤」は、交換可能に使用され、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、並びに１つ又は複数の適正な緩衝液及び／又は賦形剤を含む組成物を指す。適切に、本明細書に記載される医薬製剤は、「薬学的に許容可能」であり、従って、連邦若しくは州の政府の規制当局により要求されているか、又は動物及びとりわけヒトにおいて使用するための、米国薬局方、欧州薬局方、又は他の一般的に認識されている薬局方に表記されている必要な認可要件を満たすであろう。
【００３２】
本明細書に開示される抗体製剤は、液体製剤、凍結製剤、凍結乾燥製剤、又は再構成製剤として製剤化できる。
【００３３】
凍結乾燥は、オーブン、真空遠心分離、又は当業者により公知の他の手段で乾燥することにより発生させることができる。凍結乾燥されたデュルバルマブは、再構成された場合に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の活性を保つ。
【００３４】
用語「安定性」及び「安定している」は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む製剤の文脈において本明細書で使用されるとき、与えられた製造、調製、輸送、及び保管条件下での、凝集、分解、又は断片化に対する製剤中の抗体の耐性を指す。「安定している」製剤は、与えられた製造、調製、輸送、及び保管条件下で、生物活性を保つ。抗体の安定性は、参照製剤と比較して、高圧サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）、静的光散乱（ＳＬＳ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、円二色性（ＣＤ）、尿素アンフォールディング技術、内因性トリプトファン蛍光、示差走査熱量測定、及び／又はＡＮＳ結合技術により測定されるような、凝集、分解、又は断片化の程度により評価できる。ヒトＰＤ−Ｌ１抗体を含む製剤の全体的な安定性は、例えば、単離した抗原分子を使用するＥＬＩＳＡ及びラジオイムノアッセイを含む様々な免疫学的アッセイにより評価できる。
【００３５】
特定の実施形態では、ＨＰ−ＳＥＣにより決定して約１％未満の抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、４０℃で、約１ヶ月間の保管時に凝集体を形成する。他の実施形態では、ＨＰ−ＳＰＥＣにより測定して少なくとも９７％のヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、約４０℃で約１ヶ月間保管した後に、モノマーとして存在する。他の実施形態では、ＨＰ−ＳＰＥＣにより測定して少なくとも９９％のヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、約４０℃で約１ヶ月間保管した後に、モノマーとして存在する。他の実施形態では、ＨＰ−ＳＰＥＣにより測定して少なくとも９８％のヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、約５℃で約１ヶ月間保管した後に、モノマーとして存在する。特定の実施形態では、抗体製剤は、少なくとも３回の凍結／解凍サイクルの後に、安定性を維持する。
【００３６】
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、配列番号１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含み；ここで、抗体の主要形態は、組成物のキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）を使用し測定して４５％以上の組成物中のタンパク質を含む。他の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、配列番号１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含み；ここで、抗体の主要形態は、組成物のｃＩＥＦを使用し測定して４５％以上の組成物中のタンパク質を含み；ここで、抗体の酸性形態は、組成物のｃＩＥＦを使用し測定して４５％〜５０％の組成物中のタンパク質を含む。他の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、配列番号１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含み；ここで、抗体の主要形態は、組成物のｃＩＥＦを使用し測定して４５％以上の組成物中のタンパク質を含み；ここで、抗体の塩基形態は、組成物のｃＩＥＦを使用し測定して１８％〜２３％の組成物中のタンパク質を含む。他の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、配列番号１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含み；ここで、抗体の主要形態は、組成物のｃＩＥＦを使用し測定して４５％以上の組成物中のタンパク質を含み；ここで、抗体の酸性形態は、組成物のｃＩＥＦを使用し測定して４５％〜５０％の組成物中のタンパク質を含み；ここで、抗体の塩基形態は、組成物のｃＩＥＦを使用し測定して１８％〜２３％の組成物中のタンパク質を含む。
【００３７】
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、配列番号１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含み；ここで、抗ＰＤ−Ｌ１抗体のグリカン構造は、Ｇ０ｆ、Ｇ１ｆ、Ｇ２ｆ、及びＧ０グリコフォームを含む。他の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体のグリカン構造は、Ｇ０ｆ、Ｇ１ｆ、Ｇ２ｆ、及びＧ０形態に関して約９０％よりも高い含有量を有する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組成物は、約６５〜７５％のＧ０ｆ含有量、１３〜２３％のＧ１ｆ含有量、０〜３％の含有量Ｇ２ｆ、及び０〜４％のＧ０含有量を含む。他の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組成物は、約７１．９％のＧ０ｆ含有量、１８．４％のＧ１ｆ含有量、１．５％の含有量Ｇ２ｆ、及び１．９％のＧ０含有量を含む。
【００３８】
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、配列番号１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含み；ここで、高圧サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＰＥＣ）により決定して１．５％〜２．５％の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、凝集体を形成し、ここで、ＨＰ−ＳＥＣにより測定して、９７％〜９８％の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、モノマーとして存在する。
【００３９】
本開示を限定することなく、本開示の多数の実施形態が、例示の目的のために以下に記載される。続く実施例は、本発明の特定の実施形態及びそれらの様々な使用を例証する。それらは、説明の目的のためだけに記載され、本発明を限定するものとしてはみなされない。
【実施例】
【００４０】
実施例１
材料及び方法
１．タンパク質濃度の決定
デュルバルマブタンパク質濃度を、Ａｌｉｇｅｎｔ  ＵＶ−Ｖ分光光度計で、２８０ｎｍの吸収度を測定することにより決定した。希釈物を、製剤緩衝液中で作製した。タンパク質濃度を、１．５５（ｍｇ／ｍＬ）−１ｃｍ−１の理論上の吸光係数を使用することにより計算した。決定の一部では、１．５２（ｍｇ／ｍＬ）−１ｃｍ−１の実験的な係数を、計算で使用した。
【００４１】
２．高圧サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）分析
ＨＰ−ＳＥＣ分析のための試料を、最初に、０．１Ｍの硫酸ナトリウムを含む０．１Ｍの２ナトリウムリン酸塩ｐＨ６．８を用いて、１．０ｍＬ／分の流量で、均一濃度で溶離した。溶離したタンパク質を、２８０ｎｍの吸収度で検出した。結果を、すべての他のピークと比較した、製品モノマーのピークの領域パーセントとして報告した。おおよそ１２分で観察された緩衝液関連ピークを、報告した結果から除外した。モノマーピークよりも早く溶離したあらゆるピークを、凝集パーセントとして記録した。モノマーピークの後に溶離したピークを、断片パーセントとして記録した。
【００４２】
３．視覚分析
試料の目視検査を、明るい背景及び暗い背景の両方を備えるライトボックスを使用して、ガラスバイアルを、色、清澄性、並びに微粒子及び繊維状物の存在に関して試験することにより実施した。可視粒子及び清澄性を評価した。
【００４３】
４．高精度（ＨＩＡＣ）液体粒子計数器による可視粒子分析
試料を、濾過した製剤緩衝液を用いて５ｍｇ／ｍＬに希釈し、その後、分析前に３０分間静置させた。試料を、超純水で３回すすいだファルコンチューブ中で調製した。タンパク質濃度が＜５ｍｇ／ｍＬである試料を、そのまま分析した。各試料につき６つの読み取り値を、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＨＩＡＣ  Ｒｏｙｃｏ  ３０００Ａ、及び８チャネル粒子計数器８０００Ａを使用して得た。最終的な３つの読み取り値の平均を、最終的なサブ可視粒子数として記録した。＞１０〜２５μｍの累積的な粒子数を記録した。
【００４４】
５．浸透圧及びｐＨ
浸透圧を、Ｇｏｎｏｔｅｃ  Ｏｓｍｏｍａｔ  ０３０−Ｄ浸透圧計を使用し測定した。溶液のｐＨを、ＰＨＭ２２０  Ｌａｂ  ｐＨメーターを使用し測定した。
【００４５】
６．カールフィッシャー分析
凍結乾燥製剤中の残留水分の存在を、カールフィッシャー滴定（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ）を使用し測定した。凍結乾燥材料を、乾燥メタノールを使用して再構成した。残留水分を、乾燥メタノール中の水の量、及び全固形分の重量に基づいて決定した。
【００４６】
７．キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）
試料を、ＨＰＬＣグレード水を用いて０．２５ｍｇ／ｍＬに調節した。試料を、カルボキシペプチダーゼＢ（ＣＢＰ）を用いて、１０分間、３７℃で消化し、その後、１％のメチルセルロース溶液、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ  ｐＨ３〜１０、ｐＩマーカー９．４６、及びｐＩマーカー５．８５で希釈した。試料を、ｉＣＥ２８０  Ａｎａｌｙｚｅｒ上へと載せ、１５００Ｖで１分間集束させた後、３０００Ｖで７分間集束させた。生じた電気泳動図を、ＥＺＣｈｒｏｍソフトウェアを使用して分析し、参照標準と比較した。
【００４７】
８．還元及び非還元ゲル電気泳動
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２３０  ＬａｂＣｈｉｐ技術（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いるＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを、還元及び非還元ゲル電気泳動により、デュルバルマブを分析するために使用した。ＬａｂＣｈｉｐの流路が、分離、染色、脱染、及び検出を可能とした。試料及び標準を、ＰＢＳ中で４ｍｇ／ｍＬに調節し、６０ｍＭのＮ−エチルマレイミド（非還元）又は６０ｍＭのジチオスレイトール（還元）の存在下で、試料緩衝液を変性するＳＤＳと、１：１で混合させた。その後、試料を、加熱し、遠心分離し、水で希釈し、ＬａｂＣｈｉｐ上のウェルへと充填した。第１の次元では、タンパク質を、４〜２０％の勾配ゲルに匹敵する分解能で分離した。タンパク質を、分子量により第２の次元で分離した。試料緩衝液中に存在する蛍光染料を、６３３ｎｍで励起させた。
【００４８】
９．示差走査熱量測定
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を、溶融温度（Ｔｍ１）を決定するために使用した。
【００４９】
１０．粘度
試料及び緩衝液の粘度を、Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  ＡＭＶｎ  Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒを使用し測定した。測定を、標的濃度で行った。
【００５０】
１１．ホットスポットに対するアミノ酸配列分析
デュルバルマブのアミノ酸配列を、ＢＬＡＺＥソフトウェアを使用して分析して、ホットスポットに対するアミノ酸残基、又は潜在的修飾部位を同定した。ホットスポットの反応性を、他のモノクローナル抗体を用いる経験に基づく配列ライアビリティー基準に合致する、高、中、又は低のリスクスコアを割り当てた。
【００５１】
１２．デュルバルマブ中のＮ結合オリゴ糖の同定
超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）中の有意なピークとして検出される、デュルバルマブ中のＮ結合オリゴ糖を、ＦＬＲ検出器を用いるＷａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣシステムを使用して同定した。２６ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ、２７５ｍＭのトレハロース二水和物、０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ｐＨ６．０中で製剤化した、デュルバルマブ参照標準（１０．２ｍｇ／ｍＬ；１００μｇ）を、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）中で、０．５ｍｇ／ｍＬまで再構成した。試料を、２μＬのＰＮＧａｓｅ  Ｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化し、蛍光タグ２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識し、ＨＩＬＩＣ  ＳＰＥカートリッジで洗浄し、ＵＰＬＣプロファイリングのために水へと溶離させた。２−ＡＢ標識オリゴ糖をさらに、ピーク同定のために、フコシダーゼ、シアリダーゼＡ、マンノシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを含む様々なｅｘｏ−グリコシドで消化した。
【００５２】
試料を、移動相Ａとして５０ｍＭのギ酸アンモニウム、ｐＨ４．４、及び移動相Ｂとして１００％のアセトニトリルを使用して、Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣシステム上でＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ  Ｇｌｙｃａｎカラム（１．７μＭ、２．１×１５０ｍｍ）に注入した。データを収集し、グリコシダーゼ消化された試料のプロファイルを、消化されていない試料と入念に比較して、グリカン及びそれらのオリゴ糖の結合を同定した。
【００５３】
実施例２
開発性の研究
デュルバルマブ製剤を、ホットスポット分析、溶融温度、等電点（ｐＩ）、及び安定性の決定を含む開発性の研究後に決定した（図１）。
【００５４】
１．ホットスポット分析
保管中のデュルバルマブの安定性は、モノクローナル抗体の有効性には不可欠である。抗体保管のリスクは、凝集を介する一次分解経路による活性の損失である。加えて、長期保管のアミノ酸残基の改変は、抗体の安定性及び活性に影響を及ぼす可能性がある。
【００５５】
デュルバルマブの活性の損失を、ホモジニアス時間分解蛍光測定法（ＨＴＲＦ）により評価した。活性の損失は、高い及び低いｐＨの緩衝液の両方において、１ヶ月間の４０℃でのインキュベーション後には観察されなかった。Ｄ５４（Ｇ）での微量なレベルのＡｓｐ異性化のみが、４０℃のｐＨ６．０緩衝液中で１ヶ月後にペプチドマッピングすることにより検出された。
【００５６】
２．溶融温度、等電点（ｐＩ）、及び安定性の決定
抗体の融点を、製剤緩衝液中で、３ｍｇ／ｍＬのデュルバルマブの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して決定した。デュルバルマブのｐＩ及び安定性を、それぞれキャピラリー等電点電気泳動及び高圧サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）を使用して決定した。
【００５７】
デュルバルマブのＤＳＣプロファイルは、６４．５℃のＴｍ１、及び７３．０４℃のＴｍ２として示された（図２）。８．３〜８．８の範囲の４つのピークは、デュルバルマブのキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）プロファイル中に検出された。主要なピークは、８．６の等電点を有していた（図３）。液体安定性の研究は、クローン１及びクローン２が、５℃又は４０℃のいずれかでの１ヶ月のインキュベーション後にデフォルト製剤中で安定していたことを示した（図４）。開発性研究の結果を、表１に要約する。
【００５８】
【表１】
2021522209.tif 000003
【００５９】
実施例３
凍結乾燥製剤
５つの製剤をスクリーニングして、液状原薬及び凍結乾燥薬物製品の安定性を評価した。スクリーニングした製剤を、表２に示す。
【００６０】
初期レベルのＰ８０（すなわち、０．０２％ｗ／ｖ）を使用した。凍結乾燥製剤に対する後続の製剤スクリーニングの間、０．０２％（ｗ／ｖ）のＰ８０を含有する製剤を再構成する際に粒子が観察された場合には、０．０４％（ｗ／ｖ）のＰ８０（製剤４）も含まれていた。この研究のデータに基づいて、０．０２％（ｗ／ｖ）のＰ８０が、デュルバルマブの最適な界面活性剤レベルであることが見出された。
【００６１】
【表２】
2021522209.tif 000004
【００６２】
製剤を、製剤スクリーニング研究のために凍結乾燥した。製剤は、Ｖｉｒｔｉｓ  Ｇｅｎｅｓｉｓ  ２５ＥＬ  Ｆｒｅｅｚｅ−Ｄｒｙｅｒ中で、凍結、アニール、一次乾燥、及び二次乾燥を受けた。凍結乾燥サイクルのパラメーターを、表３に提供する。
【００６３】
【表３】
2021522209.tif 000005
【００６４】
１．安定性
４０℃で１ヶ月後、凍結乾燥製剤のすべてのモノマー損失率は、１ヶ月当たり＜０．３％であった（表４Ａ）。５℃では、すべての製剤に対する１ヶ月当たりのモノマー損失の割合は、１ヶ月当たり＜０．１％であった。すべての製剤は、４０℃で４週間後、凝集の観点から同等であった（表４Ｂ）。凝集は、４０℃で４週間後、製剤のいずれの場合でも存在しなかった（表４Ｃ）。
【００６５】
凍結−融解研究を、５つの製剤すべてに対して実施した。製剤は、−７０℃での凍結及び周囲温度での融解からなる、０、１、及び３回の凍結−融解サイクルを受けた。試料を、視覚的に検査し、サイクルの終了時にＨＰ−ＳＥＣにより分析した。ＨＰ−ＳＥＣの結果は、いかなる試料においても、ＨＰ−ＳＥＣによる純度の有意な変化を示さなかった。すべての試料は、３回のサイクル後に可視粒子を実質的に含まなかった。
【００６６】
【表４】
2021522209.tif 000006
【００６７】
【表５】
2021522209.tif 000007
【００６８】
【表６】
2021522209.tif 000008
【００６９】
２．再構成後の安定性
５つの凍結乾燥製剤のすべてを、５℃及び２５℃で、最大２４時間保存して再構成した後に、安定性に関して試験した。５つの製剤のいずれも、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより評価された際に、可視粒子の数の変化、又はモノマー純度の有意な減少を示さなかった。Ｔ０での結果は表５Ａに、５℃で２４時間の結果は表５Ｂに、２５℃で２４時間の結果は表５Ｃに示される。
【００７０】
【表７】
2021522209.tif 000009
【００７１】
【表８】
2021522209.tif 000010
【００７２】
【表９】
2021522209.tif 000011
【００７３】
３．２６ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ、２７５ｍＭのトレハロース無水物、０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ｐＨ６．０の製剤中の、デュルバルマブに対する凍結−融解研究
繰り返される凍結／融解サイクルに関する抗体構造の分解を評価して、デュルバルマブの安定性を調査した。これに一貫して、デュルバルマブの安定性を、凍結−融解研究を使用して試験した。
【００７４】
デュルバルマブの製剤化されていない製剤原料（ＵＤＳ）の凍結−融解研究を、製剤（２６ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ、２７５ｍＭのトレハロース無水物、０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ｐＨ６．０）に対して実施した。デュルバルマブは、５．６ｍＬで充填された８ｍＬのＮａｌｇｅｎｅボトル中、又は２０ｍＬで充填された３０ｍＬのＣｅｌｓｉｕｓ  Ｐａｋバッグ中で、０、１、及び３回の制御されていない凍結−融解サイクルを受けた。Ｎａｌｇｅｎｅボトルは−８０℃で、Ｃｅｌｓｉｕｓ  Ｐａｋバッグは−４０℃で凍結し、両方を周囲温度で融解した。その後、試料を、高圧サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）分析による純度、Ａ２８０により決定されるタンパク質濃度、及び、各凍結−融解サイクル後に評価される外観に関して分析した。
【００７５】
デュルバルマブは、以下の表６Ａ（Ｎａｌｇｅｎｅボトル）及び６Ｂ（Ｃｅｌｓｉｕｓ  Ｐａｋ）に示されるように、３回の凍結−融解サイクル後に安定していることが見出された。
【００７６】
【表１０】
2021522209.tif 000012
【００７７】
【表１１】
2021522209.tif 000013
【００７８】
これらの結果は、Ｎａｌｇｅｎｅボトル及びＣｅｌｓｉｕｓ  Ｐａｋの両方において繰り返される凍結／融解サイクル後に、デュルバルマブが安定していたことを示す。
【００７９】
実施例４：
ピログルタミン酸の形成及び検出
デュルバルマブは、重鎖及び軽鎖上にＮ末端グルタミン酸を有する。経時的に、グルタミン酸は、ピログルタミン酸へと環化する。この変換を、２５℃及び４０℃で３ヶ月保管した後に、ｐＩ８．８のピークとして、ｃＩＥＦアッセイにおいて検出した。ピークは、同様に、２〜８℃で２４ヶ月後に発生した（図４）。環化は、凍結乾燥及び液体の両方の形態で発生した。環化が抗体の効力に影響を及ぼさなかったことを示す変異型デュルバルマブが作り出された。
【００８０】
実施例５：
最終的な凍結乾燥製剤のパラメーター及び安定性
２６ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ、２７５ｍＭのトレハロース無水物、０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ｐＨ６．０の凍結乾燥製剤は、５０ｍｇ／ｍＬのデュルバルマブを含有していた。２６ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ、２７５ｍＭのトレハロース無水物、０．０２％のポリソルベート８０、ｐＨ６．０の製剤のパラメーターは、表７に示され、最終的な製剤中の凍結乾燥された薬物製品の安定性は、表８に提供される。ポリプロピレン管における最終的な製剤中の凍結乾燥された製剤原料の溶解性プロファイルは、表９に示される。
【００８１】
【表１２】
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【００８２】
【表１３】
2021522209.tif 000015
【００８３】
【表１４】
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【００８４】
実施例６
凍結乾燥サイクルの開発
凍結乾燥サイクルの開発により、表１０に示されるパラメーターがもたらされた。
【００８５】
【表１５】
2021522209.tif 000017
【００８６】
凍結乾燥顕微鏡法を使用して、崩壊開始（−３３℃）及び完全な崩壊（−２７．３℃；図６）の凍結乾燥サイクル温度を評価した。ガラス転移温度（Ｔｇ’）を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ；図７）により−２７．１４℃と決定した。
【００８７】
凍結乾燥プロセスの設計空間モデルを、実験計画法（ＤｏＥ）のアプローチを用いるＤｅｓｉｇｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  ７を使用して生成した。ＤｏＥアプローチを使用して、＜７日の頑健な保守的サイクルを達成する。中点（おおよそＴｇ’）及び実験的な空間の４つの「角」を示す選択した実施条件は、表１１に記載される。
【００８８】
【表１６】
2021522209.tif 000018
【００８９】
すべての実験的なサイクルは、最終的なサイクルに記載されるものと同じランプ速度、凍結温度、及び二次乾燥条件であった。最終的なデュルバルマブ凍結乾燥サイクル条件は表１２に示される。
【００９０】
【表１７】
2021522209.tif 000019
【００９１】
凍結乾燥サイクルの開発における主要な基準は：（１）崩壊温度（Ｔｇ’とほぼ同等）を超える製品温度を維持すること；（２）６日未満のサイクル時間を保つために、一次乾燥時間が１１５時間を超えていないことを確かめること；（３）スケールアップのために十分な頑健性（２〜３℃の棚温度、及び４０ｍＴｏｒｒのチャンバー圧）を提供することである。
【００９２】
表１１の実験的実施は、凍結乾燥プロセスの設計空間をもたらした。５つの実験的実施から生成された設計空間は、図８に図示される。簡潔に言えば、チャンバーでのサイクル中点及びプロセスの頑健性、並びに棚温度を決定した。ＮＭＦ  Ｅｄｗａｒｄｓ凍結乾燥器のデータは、おおよそ１０３時間〜１１５時間の一次乾燥工程でピラニゲージの収束（Δ１０ｕｂａｒ）を示した。これは、おおよそ１０％の安全域と同等である（図９）。このことは、以前の大規模での実施と一貫しており、Ａｍｓｃｏ凍結乾燥器は、割り当てられた一次時間内で製品熱電対の収束を示した（図１０）。
【００９３】
実施例７
液体製剤の開発
１．界面活性剤レベルを最適化するための震盪研究
ポリソルベート８０の液体製剤の適切性を、バイアルにおける震盪研究を介して評価した。０、０．００５％、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、及び０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含有する試料を管中に入れ、最悪の場合、空気対液体の体積比は６．５ｍＬであった。管を、６００ｒｐｍで、４時間、周囲温度で勢いよく撹拌した。その後、試料を、視覚分析、Ａ２８０、ＢｉｏＡ、ＨＰ−ＳＥＣ、及びマイクロフローイメージング（ＭＦＩ）により検査した。２〜８℃に配した対照の未浸透管も分析した。
【００９４】
観察可能な変化は、ＢｉｏＡ及びＨＰ−ＳＥＣにより分析されるような純度パーセントでは気付かなかった。Ａ２８０タンパク質濃度の変化は、震盪によりもたらされなかった。ＭＦＩ分析は、試料のすべてが、低レベルの＞１０μｍ及び＞２５μｍのサブ可視粒子（ｓｕｂ−ｖｉｓｉｂｌｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を有することを示した（図１１）。サブ可視粒子レベルは、全体的に、すべての管中で低く、０．０２％のポリソルベート８０は、液体製剤に対して最適な界面活性剤レベルとして選択された。
【００９５】
２．制御された凍結−融解研究
２６ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ、２７５ｍＭのトレハロース無水物、０．０２％のポリソルベート８０、ｐＨ６．０の製剤は、５回の制御された凍結−融解サイクル、５℃での融解、及び−４０℃での凍結を受けた。５回目の凍結／融解サイクルの終了時に、純度、外観、サブ可視粒子、及びタンパク質濃度を決定した。５回目の凍結−融解サイクル後の生成物の品質の有意な変化は、観察されなかった（表１３）。
【００９６】
【表１８】
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【００９７】
３．製剤安定性の概要
最終的な製剤中の凍結乾燥された薬物製品の安定性プロファイルは、表１４に提供される。結果は、最終的な製剤中の凍結乾燥されたデュルバルマブが、長期保管後に安定したままであることを実証する。
【００９８】
【表１９】
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【００９９】
実施例８
Ｎ結合オリゴ糖の同定
デュルバルマブのＦｃ領域は、Ａｓｎ−３０１で重鎖上の単一部位に結び付いたＮ結合オリゴ糖鎖を含む。デュルバルマブ上のオリゴ糖の構造特性分析は、製品の構造的な微小不均一性の理解に不可欠である。プロセスが変わる場合の品質管理にとっても重要である。
【０１００】
２−ＡＢ標識Ｎ結合オリゴ糖プロファイルにおいて存在したデュルバルマブから開裂したオリゴ糖は、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）により特性決定され、少量のグリコフォームを含んでいた。表１５に記載されるようにｅｘｏ−グリコシダーゼを用いる２−ＡＢ標識オリゴ糖の消化を実施して、非還元末端単糖残基を立証した。オリゴ糖プロファイリングを、表１６に示されるように完了した。ＬＣ／ＭＳ分析を使用して、分子量を立証した。
【０１０１】
【表２０】
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【０１０２】
【表２１】
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【０１０３】
ＵＰＬＣにおける有意なピークとして検出されたデュルバルマブ中のＮ結合オリゴ糖を同定し、結果は、図１２に示される。デュルバルマブの主要素をなすグリコフォームは、端末ガラクトース残基（Ｇ０ｆ）、又はモノ−ガラクトシル化（Ｇ１ｆ）及びジ−ガラクトシル化（Ｇ２ｆ）形態を持たない、フコシル化された二分岐（ｂｉａｔｅｎｎａｒｙ）の複合型オリゴ糖である。少量の複合グリコフォームは、アフコシル化されたＧ０及びＧ１、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含まないトランケート型Ｇ０ｆ及びＧ０形態、シアル化されたＧ１ｆ及びＧ２ｆ形態（Ｇ１ｆ＋ＮＡｃ、Ｇ２ｆ＋ＮＡｃ、又はＧ２ｆ＋２ＮＡｃ）、並びにバイセクト構造のＧ０ｆｂ及びＧ１ｆｂであった。ＩｇＧが採取されるときのチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞の成熟に応じて、高マンノースグリコフォーム（Ｍａｎ４、Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、及びＭａｎ８）も存在した。
【０１０４】
前述の開示が、本発明のある特定の実施形態を強調し、それと同等の変形形態又は代替物のすべてが、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の趣旨及び範囲内にあることを理解するべきである。
【０１０５】
【表２２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｂ】
2021522209.tif 000029
【図５Ｃ】
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【図６】
2021522209.tif 000031
【図７】
2021522209.tif 000032
【図８】
2021522209.tif 000033
【図９】
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【図１０】
2021522209.tif 000035
【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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