(57)【要約】  現代の酵素的プロセスに必要とされるよりも少ない酵素及びより複雑でない条件を用いる、マルトデキストリン及び特殊シロップを生成するための簡素化プロセスに関する組成物及び方法が開示される。【選択図】図１
2021522799.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルトジェニックアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１３３）、β−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２）、プルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）、グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるマルトジェニック酵素の実質的非存在下で、デンプン基質を、マルトジェニック酵素を含む従来の多酵素、酸前処理条件により生成されたＤＥプロファイルと同等のＤＥプロファイルを有するシロップを生成することができるα−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）と接触させることを含む、マルトデキストリン及び／又は特殊シロップを生成するための方法であって、前記方法が、異なる従来の液化α−アミラーゼを利用すること以外は同一のプロセスにおいて、少なくとも１つのｐＨ調節又は温度調節工程を実質的に排除する、方法。
【請求項２】
マルトジェニックアミラーゼ活性を有し得る前記α−アミラーゼを除く、マルトジェニック酵素の非存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
マルトジェニックアミラーゼ活性を有し得る前記α−アミラーゼを除く、任意のマルトジェニック酵素の非存在下で実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記プロセス工程が、異なる従来の液化α−アミラーゼを不活性化させるために液化物のｐＨを低下させること、マルトジェニック酵素の最適化性能を促進するために前記液化物を冷却すること、前記マルトジェニック酵素を不活性化させるために糖化液を加熱すること、及び前記生成物を濃縮するために前記糖化液を冷却することからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記α−アミラーゼが、サイトファーガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐ．）由来である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記α−アミラーゼが、配列番号１又はそのバリアントのアミノ酸配列を有するサイトファーガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐ．）由来のα−アミラーゼである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記従来の液化α−アミラーゼが、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本組成物及び方法は、現在の酵素的プロセスに必要とされるよりも少ない酵素及びより複雑でない条件を用いる、マルトデキストリン及び特殊シロップを生成するための簡素化プロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
コーンシロップ、グルコースシロップ、マルトデキストリン、及び高フルクトースシロップなどのデンプン系甘味剤は、従来、デンプンを酸又は酵素処理を使用して液化し、その後、所望のＤＥが達成されるまで酵素的糖化をすることによって生成される。コーンシロップの物理的性質は、それらの組成に著しく依存して変動する。コーンシロップは、デキストロース当量（ＤＥ）に基づいて、４つの型に分類される。１型コーンシロップは、２０〜３８のＤＥを有する。２型コーンシロップは、３８〜５８のＤＥを有する。３型コーンシロップは、５８〜７３のＤＥを有する。４型コーンシロップは、７３超のＤＥを有する。図１の表は、従来のプロセスで生成される様々なシロップのＤＥをより詳細に示している。
【０００３】
酸処理プロセスよりも酵素的処理の方が好まれるようになり、３４〜４３の範囲のＤＥを有する特殊シロップは、現在、α−アミラーゼ並びにマルトジェニックアミラーゼ、β−アミラーゼ、プルラナーゼ、及びグルコアミラーゼなどのマルトジェニック酵素によって支援される液化及び部分的糖化の組み合わせにより生成されている。これらのマルトジェニック酵素は、所望の糖プロファイルに応じて、組み合わせて、又は個別のいずれかで使用される。
【０００４】
一連の酵素に加えて、液化後のデキストリン化デンプンの変換には、１６〜１８時間を必要とし、且つ厳密に従う必要のある一連の工程が求められる。これらの工程には、（ｉ）液化α−アミラーゼを不活性化させるために、ＨＣｌを使用して９０℃でｐＨを４．５０未満（好ましくはｐＨ４．２０〜４．３０）まで低下させること、（ｉｉ）グルコアミラーゼ又は他のマルトジェニック酵素の最適化性能のために液化物を６０℃まで冷却すること、（ｉｉｉ）グルコアミラーゼ又は他のマルトジェニック酵素を不活性化させるために、糖化液を８５〜９０℃まで加熱すること、及び（ｉｖ）生成物を所望水準のＤＳまで濃縮するために糖化液を６０℃まで冷却することが含まれる。このプロセスは煩雑で、エネルギー、時間、及び人的資源を大量に消費する。
【０００５】
マルトデキストリン粉末及び特殊シロップを生成するための改善されたプロセスに対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明を解決するための手段】
【０００６】
本組成物及び方法は、マルトデキストリン及び特殊シロップを生成するための簡素化プロセスに関する。本組成物及び方法の態様及び実施形態は、以下の個別にナンバリングした段落で要約する。
１．  一態様では、マルトジェニックアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１３３）、β−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２）、プルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）、グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるマルトジェニック酵素の実質的非存在下で、デンプン基質を、マルトジェニック酵素を含む従来の多酵素、酸前処理条件により生成されたＤＥプロファイルと同等のＤＥプロファイルを有するシロップを生成することができるα−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）と接触させることを含む、マルトデキストリン及び／又は特殊シロップを生成するための方法であって、方法が、異なる従来の液化α−アミラーゼを利用すること以外は同一のプロセスにおいて、少なくとも１つのｐＨ調節又は温度調節工程を実質的に排除する、方法が提供される。
２．  いくつかの実施形態では、段落１の方法は、マルトジェニックアミラーゼ活性を有し得るα−アミラーゼを除く、マルトジェニック酵素の非存在下で実施される。
３．  いくつかの実施形態では、段落２の方法は、マルトジェニックアミラーゼ活性を有し得るα−アミラーゼを除く、任意のマルトジェニック酵素の非存在下で実施される。
４．  段落１〜３のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、プロセス工程は、異なる従来の液化α−アミラーゼを不活性化させるために液化物のｐＨを低下させること、マルトジェニック酵素の最適化性能を促進するために液化物を冷却すること、マルトジェニック酵素を不活性化させるために糖化液を加熱すること、及び生成物を濃縮するために前記糖化液を冷却することからなる群から選択される。
５．  段落１〜４のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、α−アミラーゼは、サイトファーガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐ．）由来である。
６．  段落１〜５のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、α−アミラーゼは、配列番号１又はそのバリアントのアミノ酸配列を有するサイトファーガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐ．）由来のα−アミラーゼである。
７．  段落１〜５のいずれかの方法のいくつかの実施形態では、従来の液化α−アミラーゼは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来である。
【０００７】
本組成物及び方法のこれらや他の態様及び実施形態は、本明細書の説明及び図面から明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、現在の酵素的プロセスによって生成されている様々なシロップのＤＥの詳細の表を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．概要
現在の酵素的プロセスに必要とされるよりも少ない酵素及びより複雑でない条件を用いる、マルトデキストリン及び特殊シロップを生成するための簡素化プロセスに関する組成物及び方法が記載されている。特定のα−アミラーゼは、マルトデキストリン並びに３０〜４６の範囲のＤＥを有する１型及び２型の特殊シロップを生成する能力を有し（図１）、これは、より在来式の酸−酵素プロセス（例えば、Ｓｈｕｋｌａ，Ｐ．ａｎｄ  Ｐｌｅｔｓｃｈｋｅ，Ｂ．Ｉ．（ｅｄｓ．）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ，２０１３を参照）を使用して生成される商業用シロップのプロファイルに適合することが発見された。改善されたプロセスは、追加のマルトジェニック酵素を必要とせず、はるかに単純なプロセス条件を必要とする。本組成物及び方法の利点としては、（ｉ）より少ない冷却及び加熱工程の結果としての省エネ、（ｉｉ）工場のスループットの向上及び円滑な運用、並びに（ｉｉｉ）冷却及び加熱工程の排除に起因する時間の節約が挙げられる。
【００１０】
本組成物及び方法の様々な態様及び実施形態について説明する前に、以下の定義及び略語について説明する。
【００１１】
２．定義及び略語
この詳細な説明によると、以下の略語及び定義が適用される。文脈が明白に他のことを指示していない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、複数の対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「酵素」という言及は、複数のそのような酵素を含み、「用量」という言及は、１つ以上の用量及び当業者であれば公知であるその同等物を含む。
【００１２】
本明細書は、読み易くするために多くのセクションで編成されている。しかしながら、読者は、１つのセクションでなされた記載を他のセクションに適用できることを理解できるであろう。このように、本開示の異なるセクションで使用された見出しを限定的であると解釈すべきではない。
【００１３】
他に特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって通常理解される意味と同一の意味を有する。明確にするために次の用語が以下に定義される。
【００１４】
２．１．略語及び頭字語
以下の略語／頭字語は、他に特に規定しない限り、以下の意味を有する。
ＥＣ  酵素委員会
ＤＥ  デキストロース当量
ＤＰ  重合度
ＧＡ  グルコアミラーゼ
ｐｐｍ  百万分の１、例えば乾燥固体１ｇ当たりのタンパク質（μｇ）
ｓｐ．  種
ｗ／ｖ  重量／体積
ｗ／ｗ  重量／重量
ｖ／ｖ  体積／体積
（ｗｔ％）重量パーセント
℃  摂氏度
ｄＨ２Ｏ又はＤＩ  脱イオン水
ｄＩＨ２Ｏ  脱イオン水、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ濾過
ｇ又はｇｍ  グラム
μｇ  マイクログラム
ｍｇ  ミリグラム
ｋｇ  キログラム
μＬ及びμｌ  マイクロリットル
ｍＬ及びｍｌ  ミリリットル
ｍｍ  ミリメートル
μｍ  マイクロメートル
Ｍ  モル濃度
ｍＭ  ミリモル濃度
μＭ  マイクロモル濃度
Ｕ  単位
ｍｉｎ  分
ｈｒ  時間
Ｎ  規定
Ｔ  メートルトン
【００１５】
２．２．定義
本明細書で使用する場合、用語「デンプン」は、式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）Ｘ［式中、Ｘは任意の数であり得る］を有するアミロース及びアミロペクチンから構成される植物の複合多糖炭水化物から構成される、任意の物質を指す。この用語には、植物系物質、例えば穀物、穀草類、草類、塊茎及び根、並びにより具体的には、小麦、大麦、トウモロコシ、ライ麦、米、ソルガム、フスマ、キャッサバ、キビ、ミロ、ジャガイモ、サツマイモ及びタピオカから得られた物質が含まれる。用語「デンプン」には、粒状デンプンが含まれる。用語「粒状デンプン」は、生の、すなわち未調理デンプン、例えば糊化を受けていないデンプンを指す。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「α−アミラーゼ」（ＥＣ３．２．１．１）は、３つ以上の（１−＞４）−α−結合したＤ−グルコース単位を含有する多糖類中の（１−＞４）−α−Ｄ−グルコシド結合のエンド加水分解を触媒する酵素である。
【００１７】
本明細書で使用する場合、「β−アミラーゼ」（ＥＣ３．２．１．２）は、鎖の非還元末端から連続するマルトース単位を除去するために、多糖類中の（１−＞４）−α−Ｄ−グルコシド結合の加水分解を触媒する酵素である。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「プルラナーゼ」（ＥＣ３．２．１．４１）は、プルラン、アミロペクチン、及びグリコーゲン、並びにアミロペクチン及びグリコーゲンのα−及びα−限界デキストリン中の（１−＞６）−α−Ｄ−グルコシド結合の加水分解を触媒する酵素である。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「グルコアミラーゼ」（ＥＣ３．２．１．３）は、鎖の非還元末端から連続してβ−Ｄ−グルコースを放出する、末端（１−＞４）−結合したα−Ｄ−グルコース残基の加水分解を触媒する酵素である。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「マルトジェニックアミラーゼ」（ＥＣ３．２．１．１３３）は、鎖の非還元末端から連続するα−マルトース残基を除去するために、多糖類中の（１−＞４）−α−Ｄ−グルコシド結合の加水分解を触媒する酵素である。
【００２１】
【００２２】
本明細書で使用する場合、用語「液化」又は「液化する」は、それによってデンプンが低粘性及びより短鎖のデキストリンに変換されるプロセスを意味する。
【００２３】
本明細書で使用する場合、ポリペプチドに関する用語「野生型」、「親」又は「参照」は、１つ以上のアミノ酸の位置での人為的な置換、挿入又は欠失を含まない天然型ポリペプチドを指す。
【００２４】
本明細書で使用する場合、ポリペプチドに関する用語「バリアント」は、アミノ酸の１つ以上の天然型又は人為的置換、挿入又は欠失を含むという点で特定の野生型、親又は参照ポリペプチドと異なるポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関する用語「バリアント」は、ヌクレオチド配列において特定の野生型、親又は参照ポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドを指す。野生型、親又は参照ポリペプチド又はポリヌクレオチドの同一性は、文脈から明らかになるであろう。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「組み合わせバリアント」は、２つ以上の突然変異、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０又はそれを超える置換、欠失及び／又は挿入を含むバリアントである。
【００２６】
本明細書で使用する場合、用語「組み換え」は、対象細胞、核酸、タンパク質又はベクターに関して使用した場合、対象がその自然状態から修飾されていることを示す。したがって、例えば、組み換え細胞は、細胞の天然（非組み換え）形内で見出されない遺伝子を発現するか、又は異なるレベル若しくは自然で見出される条件と異なる条件下で天然遺伝子を発現する。組み換え核酸は、天然配列と１つ以上のヌクレオチドが相違する、及び／又は、例えば発現ベクター内の異種プロモーターなどの異種配列と機能的に連結している。組み換えタンパク質は、天然配列とは１つ以上のアミノ酸が異なることがある、及び／又は異種配列と融合している。アミラーゼをコードする核酸を含むベクターは、組み換えベクターである。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「回収（された）」、「単離（された）」及び「分離（された）」は、自然に見出されるようにそれが自然に結び付いている少なくとも１つの他の物質又は構成成分から除去されている化合物、タンパク質（ポリペプチド）、細胞、核酸、アミノ酸又は他の特定の物質又は構成成分を指す。それらの「単離（された）」ポリペプチドとしては、異種宿主細胞内で発現した分泌ポリペプチドを含有する細胞培養ブロスが挙げられるが、それに限定されない。
【００２８】
本明細書で使用する場合、酵素に関する用語「熱安定性の」及び「熱安定性」は、酵素が高温への曝露後に活性を保持する能力を指す。酵素、例えばアミラーゼ酵素の熱安定性は、その時間中に規定条件下で酵素活性の半分が失われる、分、時間又は日数で与えられるその半減期（ｔ１／２）によって測定される。半減期は、高温への曝露（すなわち、高温によるチャレンジ）後の残留α−アミラーゼ活性を測定することによって計算され得る。
【００２９】
本明細書で使用する場合、酵素に関する「ｐＨ範囲」は、酵素が触媒活性を示すｐＨ値の範囲を指す。
【００３０】
本明細書で使用する場合、酵素に関する用語「ｐＨ安定性の」及び「ｐＨ安定性」は、酵素が規定の時間（例えば、１５分間、３０分間、１時間）にわたって広範囲のｐＨ範囲にわたり活性を保持する能力に関する。
【００３１】
本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」と同義語であり、互換的に使用される。そのようなアミノ酸配列が活性を示す場合、それらは「酵素」と呼ぶことができる。アミノ酸残基に対しては従来型の１文字コード又は３文字コードが使用され、アミノ酸配列は、標準のアミノからカルボキシ末端方向（すなわち、Ｎ→Ｃ）で表示される。
【００３２】
本明細書で使用する場合、用語「核酸」は、ポリペプチドをコードできるＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ二本鎖及び合成分子を含む。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「ハイブリダイゼーション」は、ブロットハイブリダイゼーション技術及びＰＣＲ技術で起こるような、核酸の一本鎖が、相補鎖と二本鎖、すなわち塩基対を形成するプロセスを指す。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下の条件下のハイブリダイゼーションによって例示される：６５℃及び０．１×ＳＳＣ（ここで、１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）。ハイブリダイズした二本鎖核酸は、ハイブリダイズした核酸の２分の１が相補鎖と対にならない融解温度（Ｔｍ）を特徴とする。二本鎖内のミスマッチヌクレオチドは、Ｔｍを低下させる。バリアントα−アミラーゼをコードする核酸は、配列番号２のヌクレオチドとその同一相補体との間で形成された二本鎖と比較して１℃〜３℃以上低いＴｍを有する可能性がある。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「生物活性」は、例えば酵素活性などの特定の生物活性を有する配列を指す。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「比活性」は、特定条件下で単位時間当たりの酵素又は酵素調製物によって生成物に変化させることのできる基質のモル数を指す。比活性は、一般に単位（Ｕ）／ｍｇ（タンパク質）として表示される。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「水の硬度」は、水中に存在する無機質（例えば、カルシウム及びマグネシウム）の尺度である。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「配列同一性パーセント」は、特定の配列を、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムをデフォルトパラメーターで使用して整列させた場合、特定の参照配列内のものと同一のアミノ酸残基を少なくとも一定のパーセンテージで有することを意味する。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０を参照されたい。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムのためのデフォルトパラメーターは、次のとおりである：
ギャップ開始ペナルティ：１０．０
ギャップ伸長ペナルティ：０．０５
タンパク質重量マトリックス：ＢＬＯＳＵＭシリーズ
ＤＮＡ重量マトリックス：ＩＵＢ
ディレイ発散配列（％）：４０
ギャップ分離距離：８
ＤＮＡ遷移重量：０．５０
親水性残基のリスト：ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ
負のマトリックスの使用：オフ
トグル残基特異的ペナルティ：オン
トグル親水性ペナルティ：オン
トグル末端ギャップ分離ペナルティ：オフ。
【００３８】
欠失は、参照配列と比較して非同一の残基として計数される。
【００３９】
本明細書で使用する場合、用語「乾燥固体含量」（ｄｓ又はＤＳ）は、乾燥重量％ベースでのスラリーの総固体に関する。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「スラリー」は、不溶性固体を含有する水性混合物を指す。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「約」は、参照値の±１５％を指す。
【００４２】
３．好適なα−アミラーゼ
本組成物及び方法の１つの態様は、マルトジェニックアミラーゼ活性を有する追加の酵素の実質的又は完全な非存在下で使用することができるα−アミラーゼ酵素である。例示的なα−アミラーゼは、Ｊｅａｎｇ，Ｃ−Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（（２００２）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６８：３６５１−５４）によって前述されたサイトファーガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐ．）由来の野生型α−アミラーゼ（本明細書では「ＣｓｐＡｍｙ２アミラーゼ」と呼ばれる）である。ＣｓｐＡｍｙ２α−アミラーゼポリペプチドの成熟形態のアミノ酸配列は、下記に配列番号１として示した。
【化１】
2021522799.tif 000003
【００４３】
ＣｓｐＡｍｙ２α−アミラーゼは、低ｐＨ活性及び熱安定性を必要とする穀物処理用途、並びに中〜高ｐＨ活性及び界面活性剤安定性を必要とする洗浄用途の両方に好適な非常に多機能な分子によって証明された。どちらかの用途で改善された性質を有するＣｓｐＡｍｙ２α−アミラーゼのバリアントが作製される；ただし、このような酵素は、所与の用途に合わせて調整されているにもかかわらず、多機能のままである。
【００４４】
上記配列番号１では、Ｒ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０、及びＧ１８１に下線を付した。いくつかの実施形態では、バリアントα−アミラーゼは、カルシウム結合ループに隣接するこのＸ１Ｇ／Ｓ１Ｘ２Ｇ２モチーフ内に、欠失を更に含む。いくつかの実施形態では、バリアントα−アミラーゼは、Ｒ１７８及びＧ１７９又はＴ１８０及びＧ１８１に対応するアミノ酸残基の隣接するペアワイズ欠失を含む。Ｒ１７８及びＧ１７９の両方の欠失を有するサイトファーガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐ．）α−アミラーゼのバリアント（本明細書では「ＣｓｐＡｍｙ２−ｖ１」）についても記載されている（Ｓｈｉａｕ，Ｒ−Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６９：２３８３−８５）。成熟ＣｓｐＡｍｙ２−ｖ１  α−アミラーゼポリペプチドのアミノ酸配列は、下記に配列番号２として示した。
【化２】
2021522799.tif 000004
【００４５】
出発点としての配列番号２を使用して、多数の組み合わせＣｓｐＡｍｙ２バリアントが以前に作成され、試験された（国際公開第２０１４／１６４７７７号パンフレットに記載されるとおり）。最高に機能するバリアントは、望ましい特性を改良した追加の突然変異と一緒に、一般に、Ｅ１８７又はＳ２４１のいずれかに対応するアミノ酸位置で安定化突然変異を含んでいた。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本組成物及び方法には、任意選択的にＲ３７７、Ｓ３６２、及び／又はＹ３０３に対応するアミノ酸残基での突然変異と組み合わせた、Ｅ１８７、Ｓ２４１、Ｎ１２６、Ｆ１５３、Ｔ１８０、Ｅ１８７、及びＩ２０３に対応する位置のうちの１つ以上での突然変異を有するバリアントＣｓｐＡｍｙ２α−アミラーゼが含まれる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、バリアントに含まれる特定の突然変異は、Ｅ１８７Ｐ、Ｓ２４１Ｑ、Ｎ１２６Ｙ、Ｆ１５３Ｗ、Ｔ１８０Ｈ、Ｔ１８０Ｄ、Ｅ１８７Ｐ、Ｉ２０３Ｙ、Ｙ３０３Ａ、Ｒ３７７Ｙ、及びＳ３６２Ａ、Ｒ３７７Ｙ、Ｓ３６２Ａ  及び／又はＹ３０３Ａである。いくつかの実施形態では、バリアントα−アミラーゼは、Ｇ４７６、Ｇ４７７、Ｅ１３２、Ｑ１６７、Ａ２７７、Ｒ４５８、Ｔ４５９、及び／又はＤ４６０に対応するアミノ酸残基での１つ以上の以前に記載された突然変異を更に含む。特定の組み合わせバリアントとしては、残基Ｒ１７８及びＧ１７９の欠失並びにＮ１２６Ｙ、Ｆ１５３Ｗ、Ｔ１８０Ｈ、Ｅ１８７Ｐ、及びＩ２０３Ｙの置換を有するＣｓｐＡｍｙ２−Ｃ１６Ｅ、更にＳ３６２Ａ及びＲ３７７Ｙの置換を有するＣ１６Ｅ−ＡＹ、並びに更にＹ３０３Ａの置換を有するＣ１６Ｅ−ＡＹ−Ｙ３０３Ａが挙げられるがこれらに限定されない。これらの組み合わせバリアントは、国際公開第２０１７／１００７２０号パンフレットに記載されている。
【００４８】
読者は、α−アミラーゼが、上記に列挙した突然変異を自然に有する場合（すなわち、野生型α−アミラーゼが、既に突然変異であると同定された残基を含む場合）、特定の突然変異がそのα−アミラーゼに当てはまらないことを理解するであろう。しかし、他の記載された突然変異は、その位置での天然型残基と組み合わせて機能することができる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本α−アミラーゼバリアントは、突然変異の指示された組み合わせ及び配列番号１又は配列番号２との規定の程度のアミノ酸配列相同性／同一性、例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性／同一性を有する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本α−アミラーゼバリアントは、突然変異の指示された組み合わせを有し、配列番号１又は配列番号２との規定の程度のアミノ酸配列相同性／同一性、例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性／同一性を有する親アミラーゼに由来する。
【００５１】
更に、本α−アミラーゼは、任意の数の保存的アミノ酸置換を含み得る。例示的な保存的アミノ酸置換は、数え切れないほどの刊行物に記載されている。
【００５２】
本α−アミラーゼはまた、アミノ酸配列内の１個若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加、例えば１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満又は更には２個未満の置換、欠失若しくは付加による上記に記載したアミラーゼバリアントのいずれかに由来してもよい。そのようなバリアントは、それからそれらが由来したα−アミラーゼと同一の活性を有しなければならない。
【００５３】
本アミラーゼは、その場合にはシグナル配列を含む「前駆体」、「未成熟」若しくは「全長」、又はその場合にはシグナル配列を欠如している「成熟」であり得る。ポリペプチドの成熟形態が、一般に、最も有用である。他に特に規定されていない限り、本明細書で使用するアミノ酸残基のナンバリングは、それぞれのアミラーゼポリペプチドの成熟形態を指す。本アミラーゼポリペプチドは、得られたポリペプチドがアミラーゼ活性を保持する限り、Ｎ末端又はＣ末端を除去するために先端が切断されてもよい。
【００５４】
本アミラーゼは、それが第１α−アミラーゼポリペプチドの少なくとも一部分及び第２α−アミラーゼポリペプチドの少なくとも一部分を含むという点で、「キメラ」、「ハイブリッド」、又は「ドメイン−スワップ」ポリペプチドであり得る。本アミラーゼは、異種シグナル配列、トラッキング又は精製を可能にするエピトープなどを更に含んでもよい。
【００５５】
別の態様では、α−アミラーゼは、α−アミラーゼをコードするポリヌクレオチドと規定の程度の配列同一性を有する核酸によってコードされる。例示的な核酸は、以下に示される配列番号３として提供される（下線が付された配列は、ＬＡＴシグナルペプチドをコードする）。
【化３】
2021522799.tif 000005
【００５６】
いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号３との少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％の核酸配列同一性を有する。
【００５７】
いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号３との少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％の核酸配列同一性を有するα−アミラーゼをコードする（又はコードする核酸に相補的である）核酸にとってストリンジェント又は極めてストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００５８】
いくつかの実施形態では、組成物及び方法にて使用するためのα−アミラーゼは、ＣｓｐＡｍｙ２及びそのバリアントと同様の性質を有し、その性質は、本明細書で記載される条件下でスクリーニングできる。特殊シロップの生成におけるＣｓｐＡｍｙ２の特有の性質はこれまで知られていなかったため、そのような性質についてα−アミラーゼをスクリーニングする動機は認識されていなかった。
【００５９】
４  他の酵素に対する必要性の排除
マルトデキストリン粉末及び特殊シロップを生成するために使用される現代の酵素的プロセス条件で使用される酵素は、本明細書に概して記載されている。酵素としては、マルトジェニックアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１３３）、β−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２）、プルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）、及びグルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）が挙げられる。本組成物及び方法は、これらの酵素のうちの１つ以上の必要性を低減又は排除する。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本組成物及び方法は、任意の又は全てのマルトジェニック酵素に対する必要性を、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％低減する。いくつかの実施形態では、本組成物及び方法は、マルトデキストリン粉末及び特殊シロップの生成における任意の又は全てのマルトジェニック酵素に対する必要性を完全に排除する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本組成物及び方法に関して有意な利益をもたらさないわずかな量又は取るに足らない量のマルトジェニック酵素を含むことは、本発明を無効にしない。
【００６２】
５  簡素化プロセス条件
マルトデキストリン粉末及び特殊シロップを生成するために使用される現代のプロセス条件で使用される酵素は、本明細書に概して記載されている。本組成物及び方法は、特殊シロップの酵素的調製に現在必要とされている１つ以上のプロセス工程の必要性を排除する。例えば、様々な実施形態では、本組成物及び方法は、特殊シロップの生成プロセス中、従来の液化α−アミラーゼ（これは、存在するα−アミラーゼとは異なるα−アミラーゼである）を不活性化するために、液化物のｐＨを９０℃で４．５０未満、４．４０未満、４．３０未満、又は更には４．２０未満まで下げる必要性を排除する。他の実施形態では、本組成物及び方法は、液化を実行するために従来のα−アミラーゼを使用した後、グルコアミラーゼ又は他のマルトジェニック酵素の最適化性能のために液化物を５５〜６５℃まで冷却する必要性を排除する。他の実施形態では、本組成物及び方法は、グルコアミラーゼ又は他のマルトジェニック酵素を不活性化させるために、糖化液を８５〜９０℃、例えば、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、又は９０℃まで加熱する必要性を排除する。他の実施形態では、本組成物及び方法は、生成物を所望水準のＤＳまで濃縮するために糖化液を５５〜６０℃まで冷却する必要性を排除する。
【００６３】
排除される工程の各々は、別々に又は組み合わせて排除することができ、既存の特殊シロップの生成に小さな又は大きな改善をもたらす。
【００６４】
本明細書中で引用した全ての参考文献は、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本組成物及び方法並びにそれらの利点について詳細に説明するために、下記の特定の実施例は、それらが限定的ではなくむしろ例示的であるとの理解の下で提供される。
【実施例】
【００６５】
本明細書で開示される方法を以下の実施例で例証する。上の議論及びこれらの実施例から、当業者であれば本開示の様々な実施形態を突き止めることができ、またその趣旨及び範囲から逸脱することなしに本明細書で開示された方法及び組成物の様々な変更及び変形を行って様々な用途及び条件に適応させることができる。
【００６６】
実施例１
単一の酵素的プロセスを使用した特殊シロップ
デンプンスラリーは、６０ｇのコーンスターチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｓ４１２６）を計量し、続いて５００ｍＬの三角フラスコに１３２ｇの水を添加することによって調製した。スラリーのｐＨは、１ＮのＨＣｌを使用して、５．６０±０．１０に調節し、続いて、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＨＴ  ＴＧ（Ｎ１２６Ｙ、Ｆ１５３Ｗ、Ｔ１８０Ｈ、Ｅ１８７Ｐ、Ｉ２０３Ｙ、Ｙ３０３Ａ、Ｓ３６２Ａ、Ｒ３７７Ｙの置換、並びにＲ１７８及びＧ１７９の欠失を有するサイトファーガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐ．）からのα−アミラーゼのバリアント）を、デンプンの０．４５、０．７５、１．００、１．５０、２．００、及び２．５０ｋｇ／Ｔの量で添加した。最終スラリー容量は、水で２００ｍＬまで調節した。液化は、水浴中で、３５０ｒｐｍにて４時間混合を続けて、９２℃で実施した。フラスコを４時間でサンプリングし、ＨＰＬＣを用いてＤＰプロファイル決定し、還元力（ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｐｏｗｅｒ）に関するＬａｎｅ−Ｅｙｎｏｎ法を用いてＤＥを決定した（この方法では、混合フェーリング溶液をメチレンブルーを指示薬として使用して、サンプルで滴定する）。フェーリング溶液は、１ｗ／ｖ％のグルコース溶液を用いて標準化した。結果を表１に示す。
【表１】
2021522799.tif 000006
【００６７】
デンプン液化物にＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＨＴ  ＴＧを添加することにより、３２〜４０％の範囲のＤＥ値を有する特殊シロップが得られた。ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＨＴ  ＴＧを用いた単一酵素的プロセスにより得られた特殊シロップのＤＰプロファイルは、マルトジェニック酵素の有無にかかわらず、酸加水分解法を使用して生成されたシロップに類似している。
【００６８】
実施例２
様々なＤＰプロファイルを有する特殊シロップの生成にかかる時間及び用量の影響
デンプンスラリーは、６０ｇのコーンスターチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｓ４１２６）を計量し、続いて５００ｍＬの三角フラスコに１３２ｇの水を添加することによって調製した。スラリーのｐＨは、１ＮのＨＣｌを使用して、５．６０±０．１０に調節し、続いて、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＨＴ  ＴＧを、デンプンの２．４０及び２．９０ｋｇ／Ｔの量で添加した。最終スラリー容量は、水で２００ｍＬまで調節した。液化は、水浴中で、３５０ｒｐｍにて２４時間混合を続けながら、９２℃で実施した。フラスコを６、８、１０、及び２４時間でサンプリングし、ＨＰＬＣを用いてＤＰプロファイル決定し、Ｌａｎｅ−Ｅｙｎｏｎ法を用いてＤＥを決定した。結果を表２に示す。
【表２】
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【００６９】
ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＨＴ  ＴＧによるデンプンの液化の延長により、ＤＰ１及びＤＰ２の含有量の増加によってもたらされたＤＥが高いシロップが生成される。酵素の用量の増大により、特殊シロップのＤＰ１及びＤＰ２含有量が更に高められる。所望のＤＰプロファイルを有する特殊シロップは、ＳＰＥＺＹＭＥ  ＨＴ  ＴＧの用量及び液化時間を調節することにより得ることができる。
【００７０】
実施例３
特殊シロップ生成におけるＤＰプロファイルの進行に対する高固形分の影響
デンプンスラリーは、８０ｇのコーンスターチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｓ４１２６）を計量し、続いて５００ｍＬの三角フラスコに１３２ｇの水を添加することによって調製した。スラリーのｐＨは、１ＮのＨＣｌを使用して、５．６０±０．１０に調節し、続いて、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＨＴ  ＴＧを、デンプンの１．００、１．５０、２．００、２．５０、及び２．９０ｋｇ／Ｔの量で添加した。最終スラリー容量は、水で２００ｍＬまで調節した。液化は、水浴中で、３５０ｒｐｍにて２４時間混合を続けながら、９２℃で実施した。フラスコを６、８、１０、及び２４時間でサンプリングし、ＨＰＬＣを用いてＤＰプロファイル決定した。結果を表４に示す。
【表４】
2021522799.tif 000008
【００７１】
３０ｗ／ｖ％のデンプンを使用して実施例２で得られた結果は、４０ｗ／ｖ％デンプンを使用して、概して、複製された。
【００７２】
実施例４
特殊シロップ生成における異なるα−アミラーゼの影響
デンプンスラリーは、８０ｇのコーンスターチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｓ４１２６）を計量し、続いて５００ｍＬの三角フラスコに１３２ｇの水を添加することによって調製した。スラリーのｐＨは、１ＮのＨＣｌを使用して、５．６０±０．１０に調節し、続いて、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＨＴ  ＴＧ、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ΑＬＰＨＡ、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＲＳＬ、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＦＲＥＤを、デンプンの１．００ｋｇ／Ｔの量で添加した。最終スラリー容量は、水で２００ｍＬまで調節した。液化は、水浴中で、３５０ｒｐｍにて２４時間混合を続けながら、９２℃で実施した。フラスコを６及び２４時間でサンプリングし、ＨＰＬＣを用いてＤＰプロファイル決定した。結果を表５に示す。
【表５】
2021522799.tif 000009
【００７３】
注目すべきことに、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＨＴ  ＴＧは、マルトジェニック酵素の有無にかかわらず、酸加水分解法を使用して生成されたシロップに類似しているＤＰプロファイルを有する特殊シロップを生成できる唯一の酵素であった。
【００７４】
実施例６
特殊シロップ生成におけるＤＰプロファイルの進行に対するｐＨ４．５０の影響
デンプンスラリーは、８０ｇのコーンスターチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｓ４１２６）を計量し、続いて５００ｍＬの三角フラスコに１３２ｇの水を添加することによって調製した。スラリーのｐＨは、１ＮのＨＣｌを使用して、４．５０±０．１０に調節し、続いて、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＨＴ  ＴＧを、デンプンの２．００ｋｇ／Ｔで添加した。最終スラリー容量は、水で２００ｍＬまで調節した。液化は、水浴中で、３５０ｒｐｍにて２４時間混合を続けながら、９２℃で実施した。フラスコを６及び２４時間でサンプリングし、ＨＰＬＣを用いてＤＰプロファイル決定した。結果を表６に示す。
【表６】
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【００７５】
デンプンの液化時間が長くなり、液化ｐＨが低くなると、液化ｐＨが高くなるのに比べて、ＤＰ１、ＤＰ２、及びＤＰ３の含有量が少なくなる。低ｐＨ（すなわち、４．５０）でのＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＨＴ  ＴＧによるＤＰプロファイルは、高ｐＨ（即ち、５．５０）でのＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）Ａ、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＲＳＬ、及びＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＦＲＥＤにより得られたＤＰプロファイルよりも良好であった。
【００７６】
本明細書で言及した全ての刊行物、特許及び特許出願は、あらゆる目的のために、及び個別の各刊行物、特許又は特許出願が参照により組み込まれると特に且つ個別に指示されている場合と同程度までこれにより参照して全体として本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【国際調査報告】
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