(57)【要約】  本発明は、変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質（またはそのバリアント）、それをコードする配列、それを調製する方法、およびそれを含むウイルス様粒子に関し、ここで、当該タンパク質（またはそのバリアント）および当該ウイルス様粒子は少なくとも２つのＨＰＶ型（たとえば、ＨＰＶ３９およびＨＰＶ６８、またはＨＰＶ３９、ＨＰＶ６８、およびＨＰＶ７０）に対する中和抗体の発生を誘発でき、したがって、上記少なくとも２つのＨＰＶ型による感染および当該感染により引き起こされる疾患（子宮頚がんおよび尖圭コンジローマなど）を予防するために使用できる。本発明はさらに、上記少なくとも２つのＨＰＶ型による感染および当該感染により引き起こされる疾患（子宮頚がんおよび尖圭コンジローマなど）を予防するための医薬組成物またはワクチンの製造における上記タンパク質および上記ウイルス様粒子の使用にも関する。
2021526851.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントであって、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質との比較において、前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質は、以下の変異：
（１）Ｎ末端における１〜２５個のアミノ酸、たとえば１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、５〜１５、１０〜１５、１０〜２０、または１５〜２０個のアミノ酸の切断；および
（２）前記野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の２６９〜２８８位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換；
を有し、
前記バリアントは、１個以上（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個）のアミノ酸が置換（好ましくは保存的置換）、付加、または欠失されているという点でのみ、前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質と異なり、かつ、前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の機能、すなわち少なくとも２つのＨＰＶ型（たとえば、ＨＰＶ３９およびＨＰＶ６８、またはＨＰＶ３９、ＨＰＶ６８、およびＨＰＶ７０）に対する中和抗体の発生を誘発する能力を保持し；
好ましくは、前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質は、任意に、さらに以下の変異：
（３）（ａ）前記野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の１１７〜１４０位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換；または
（ｂ）前記野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の１６９〜１８１位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換；または
（ｃ）前記野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５８位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換；
を有し、
好ましくは、前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質は、前記野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質との比較において、Ｎ末端の３、５、８、１０、１２、１５、１８、２０、または２２個のアミノ酸が切断されており；
好ましくは、前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質は、前記野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質との比較において、Ｎ末端の１５個のアミノ酸が切断されており；
好ましくは、前記第２の型の野生型ＨＰＶは、ＨＰＶ６８であり；好ましくは、前記（２）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質の２７０〜２８９位のアミノ酸残基であり；
好ましくは、前記第３の型の野生型ＨＰＶは、ＨＰＶ７０であり；好ましくは、前記（３）（ａ）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質の１１７〜１４１位のアミノ酸残基であり；好ましくは、前記（３）（ｂ）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８２位のアミノ酸残基であり；好ましくは、前記（３）（ｃ）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質の３４８〜３５９位のアミノ酸残基であり；
好ましくは、前記野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有し；
好ましくは、前記野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有し；
好ましくは、前記野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を有し；
好ましくは、前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質は、配列番号７、１０、１１、および１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、
変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアント。
【請求項２】
単離された核酸であって、請求項１に記載の変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントをコードし、
好ましくは、前記単離された核酸は、配列番号１９、２２、２３、および２４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、単離された核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項４】
請求項２に記載の単離された核酸および／または請求項３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
請求項１に記載の変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質もしくはそのバリアントを含む、またはこれからなる、ＨＰＶウイルス様粒子。
【請求項６】
請求項１に記載の変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質もしくはそのバリアント、または請求項２に記載の単離された核酸、または請求項３に記載のベクター、または請求項４に記載の宿主細胞、または請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子を含む、組成物。
【請求項７】
医薬組成物またはワクチンであって、請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子と、任意に、製薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含み、
好ましくは、前記ＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を予防するのに有効な量で存在し；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型による感染（たとえば、ＨＰＶ３９感染、ＨＰＶ６８感染、および／またはＨＰＶ７０感染）であり；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患は、子宮頚がんおよび尖圭コンジローマからなる群より選択される、医薬組成物またはワクチン。
【請求項８】
請求項１に記載の変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントの調製方法であって、前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを宿主細胞において発現させる工程と、次いで、前記宿主細胞の培養物から前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを回収する工程とを含み；
好ましくは、前記宿主細胞は、大腸菌であり；
好ましくは、前記方法は、前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを大腸菌において発現させる工程と、次いで、前記大腸菌の溶解物上清を精製することによって前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを得る工程；好ましくは、クロマトグラフィー（たとえば、陽イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、および／または疎水性相互作用クロマトグラフィー）によって前記大腸菌の溶解物上清から前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを回収する工程とを含む、方法。
【請求項９】
ワクチンの調製方法であって、請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子と、製薬学的に許容される担体および／または賦形剤と、を組み合わせる工程を含む、方法。
【請求項１０】
ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染により引き起こされる疾患の予防方法であって、請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子または請求項７に記載の医薬組成物もしくはワクチンの予防的有効量を対象に投与する工程を含み、
好ましくは、前記ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型による感染（たとえば、ＨＰＶ３９感染、ＨＰＶ６８感染、および／またはＨＰＶ７０感染）であり；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患は、子宮頚がんおよび尖圭コンジローマからなる群より選択される、方法。
【請求項１１】
ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を予防するための医薬組成物またはワクチンの製造における、請求項１に記載の変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質もしくはそのバリアント、または請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子の使用であって、
好ましくは、前記ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型による感染（たとえば、ＨＰＶ３９感染、ＨＰＶ６８感染、および／またはＨＰＶ７０感染）であり；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患は、子宮頚がんおよび尖圭コンジローマからなる群より選択される、使用。
【請求項１２】
ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を予防するための、請求項１に記載の変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質もしくはそのバリアント、または請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子であって、
好ましくは、前記ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型による感染（たとえば、ＨＰＶ３９感染、ＨＰＶ６８感染、および／またはＨＰＶ７０感染）であり；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患は、子宮頚がんおよび尖圭コンジローマからなる群より選択される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１８年６月４日付で提出された中国出願第２０１８１０５６３３７８．０号に基づき、かつ、同出願の優先権の利益を主張する。当該出願の開示内容の全体を引用により本明細書に援用する。
【０００２】
技術分野
本発明は、分子ウイルス学および免疫学の分野に関する。特に、本発明は、変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質（またはそのバリアント）、それをコードする配列、それを調製する方法、およびそれを含むウイルス様粒子に関し、ここで、当該タンパク質（またはそのバリアント）および当該ウイルス様粒子は、少なくとも２つのＨＰＶ型（たとえば、ＨＰＶ３９およびＨＰＶ６８、またはＨＰＶ３９、ＨＰＶ６８、およびＨＰＶ７０）に対する中和抗体の発生を誘発でき、したがって、上記少なくとも２つのＨＰＶ型による感染および当該感染により引き起こされる疾患（子宮頚がんおよび尖圭コンジローマなど）を予防するために使用できるものである。本発明はさらに、上記少なくとも２つのＨＰＶ型による感染および当該感染により引き起こされる疾患（子宮頚がんおよび尖圭コンジローマなど）を予防するための医薬組成物またはワクチンの製造における上記タンパク質および上記ウイルス様粒子の使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、主として、皮膚および粘膜にいぼを生じさせる。ＨＰＶの型は、腫瘍形成との関連に依存してハイリスク型とローリスク型とに分けられる。そのうちハイリスク型ＨＰＶによる感染は女性の子宮頚がんを含む生殖器がんの主因であることが示されており、ローリスク型ＨＰＶは主として尖圭コンジローマを引き起こす。ＨＰＶ感染を予防および制御するための最も有効な方法は、ＨＰＶワクチン、特に子宮頚がんを引き起こすハイリスク型ＨＰＶに対するワクチンの接種である。
【０００４】
ＨＰＶの主要カプシドタンパク質Ｌ１は、自己集合して中空状のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成するという特徴がある。ＨＰＶ  ＶＬＰは、主要カプシドタンパク質Ｌ１の五量体が７２個集まって構成される対称二十面体構造を有する（Doorbar, J. and P.H. Gallimore. 1987. J Virol, 61(9): 2793-9）。ＨＰＶ  ＶＬＰは構造の点で天然ＨＰＶと非常によく似ており、天然のウイルスの中和エピトープの大部分を保持していて、力価の高い中和抗体の発生を誘発できる（Kirnbauer, R., F. Booy, et al. 1992 Proc Natl Acad Sci U S A 89(24): 12180-4）。
【０００５】
しかしながら、これまでの研究によると、ＨＰＶ  ＶＬＰは主に同じ型のＨＰＶに対する中和抗体の発生を誘発し、同じ型のＨＰＶに対する防御免疫をもたらし、相同性の高い少数のＨＰＶ型に対して低い交差防御効果を有するのみであることが示されている（Sara L. Bissett, Giada Mattiuzzo, et al. 2014 Vaccine. 32:6548-6555）。したがって、既存のＨＰＶワクチンの防御範囲は非常に限定されている。一般的に、１つの型のＨＰＶのＶＬＰは同じ型のＨＰＶによる感染の予防にのみ使用できる。この場合、ＨＰＶワクチンの防御範囲を広くすることが必要であれば、より多くの型のＨＰＶのＶＬＰをワクチンに添加するしかない。現在のところ、メルクのＧａｒｄａｓｉｌ（登録商標）（ＨＰＶ１６、１８、６、および１１に対する４価のワクチン）、ＧＳＫのＣｅｒｖａｒｉｘ（登録商標）（ＨＰＶ１６および１８に対する２価のワクチン）、およびメルクのＧａｒｄａｓｉｌ（登録商標）９（ＨＰＶ６、１１、１６、１８、３１、３３、４５、５２、および５８に対する９価のワクチン）を含む市販ＨＰＶワクチンは、複数のＨＰＶ型のＶＬＰを組み合わせることによって調製されている。しかしながら、このような解決策では、ＨＰＶワクチンの製造コストが大幅に増大すると考えられ、免疫量の増大による安全性の問題も生じ得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、当技術分野において、複数のＨＰＶ型による感染およびこの感染により引き起こされる疾患（子宮頚がんおよび尖圭コンジローマなど）をより経済的かつ効果的に予防するために、複数のＨＰＶ型に対する防御中和抗体の発生を誘発できるＨＰＶウイルス様粒子を開発することが急務である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の内容
本発明は、本発明者らによる以下の驚くべき発見に少なくとも一部基づく。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）３９型のＬ１タンパク質の特定セグメントを第２の型のＨＰＶ（ＨＰＶ６８など）のＬ１タンパク質の対応セグメントで置換した後、こうして得られる変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質は、生物においてＨＰＶ３９および第２の型のＨＰＶ（ＨＰＶ６８など）に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果はＨＰＶ３９  ＶＬＰと第２の型のＨＰＶのＶＬＰとの混合物の場合と同等であり、ＨＰＶ６８に対するその防御効果はＨＰＶ６８  ＶＬＰ単独の場合と同等であり、第２の型のＨＰＶ（ＨＰＶ６８など）に対するその防御効果は第２の型のＨＰＶのＶＬＰ単独の場合と同等である。
【０００８】
加えて、上述される置換をベースとし、ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の他の特定セグメントを第３の型のＨＰＶ（ＨＰＶ７０など）のＬ１タンパク質の対応セグメントでさらに置換することができ、こうして得られる二重置換を有する変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質は、ＨＰＶ３９、第２の型のＨＰＶ（ＨＰＶ６８など）、および第３の型のＨＰＶ（ＨＰＶ７０など）に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果はＨＰＶ３９  ＶＬＰ、第２の型のＨＰＶのＶＬＰ、および第３の型のＨＰＶのＶＬＰの混合物の場合と同等であり、ＨＰＶ３９に対するその防御効果はＨＰＶ３９  ＶＬＰ単独の場合と同等であり、第２の型のＨＰＶ（ＨＰＶ６８など）に対するその防御効果は第２の型のＨＰＶのＶＬＰ単独の場合と同等であり、第３の型のＨＰＶ（ＨＰＶ７０など）に対するその防御効果は第３の型のＨＰＶのＶＬＰ単独の場合と同等である。
【０００９】
したがって、一態様において、本発明は、変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを提供し、ここで、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質との比較において、変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質は、以下の変異：
（１）Ｎ末端における１〜２５個のアミノ酸、たとえば１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、５〜１５、１０〜１５、１０〜２０、または１５〜２０個のアミノ酸の切断；および
（２）野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の２６９〜２８８位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換；
を有し、
バリアントは、１個以上（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個）のアミノ酸が置換（好ましくは保存的置換）、付加、または欠失されているという点でのみ、変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質と異なり、かつ、変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の機能、すなわち少なくとも２つのＨＰＶ型（たとえば、ＨＰＶ３９およびＨＰＶ６８、またはＨＰＶ３９、ＨＰＶ６８、およびＨＰＶ７０）に対する中和抗体の発生を誘発する能力を保持する。
【００１０】
いくつかの好ましい実施形態において、変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質は、任意に、さらに以下の変異：
（３）（ａ）野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の１１７〜１４０位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換；または
（ｂ）野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の１６９〜１８１位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換；または
（ｃ）野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５８位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換
を有する。
【００１１】
いくつかの好ましい実施形態において、変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質との比較において、Ｎ末端の３、５、８、１０、１２、１５、１８、２０、または２２個のアミノ酸が切断されている。いくつかの好ましい実施形態において、変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質との比較において、Ｎ末端の１５個のアミノ酸が切断されている。
【００１２】
いくつかの好ましい実施形態において、第２の型の野生型ＨＰＶは、ＨＰＶ６８である。いくつかの好ましい実施形態において、（２）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質の２７０〜２８９位のアミノ酸残基である。いくつかの好ましい実施形態において、第３の型の野生型ＨＰＶは、ＨＰＶ７０である。いくつかの好ましい実施形態において、（３）（ａ）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質の１１７〜１４１位のアミノ酸残基である。いくつかの好ましい実施形態において、（３）（ｂ）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８２位のアミノ酸残基である。いくつかの好ましい実施形態において、（３）（ｃ）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質の３４８〜３５９位のアミノ酸残基である。
【００１３】
いくつかの好ましい実施形態において、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【００１４】
いくつかの好ましい実施形態において、野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【００１５】
いくつかの好ましい実施形態において、野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を有する。
【００１６】
いくつかの好ましい実施形態において、野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質の２７０〜２８９位のアミノ酸残基は、配列番号２５の配列を有する。
【００１７】
いくつかの好ましい実施形態において、野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質の１１７〜１４１位のアミノ酸残基は、配列番号２６の配列を有する。
【００１８】
いくつかの好ましい実施形態において、野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８２位のアミノ酸残基は、配列番号２７の配列を有する。
【００１９】
いくつかの好ましい実施形態において、野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質の３４８〜３５９位のアミノ酸残基は、配列番号２８の配列を有する。
【００２０】
いくつかの好ましい実施形態において、変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質は、配列番号７、１０、１１、および１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００２１】
別の一態様において、本発明は、上述される変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントをコードする単離された核酸を提供する。別の一態様において、本発明は、上記単離された核酸を含むベクターを提供する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明に係る単離された核酸は、配列番号１９、２２、２３、および２４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する。
【００２２】
目的のポリヌクレオチドを挿入するのに有用なベクターは当技術分野において公知であり、これにはクローニングベクターおよび発現ベクターが含まれるが、それらに限定されない。一実施形態において、ベクターは、たとえば、プラスミド、コスミド、ファージなどである。
【００２３】
別の一態様において、本発明はさらに、上記単離された核酸またはベクターを含む宿主細胞にも関する。宿主細胞は、大腸菌細胞などの原核細胞、ならびに酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、および動物細胞（哺乳類細胞など、たとえばマウス細胞、ヒト細胞など）などの真核細胞を含むが、これらに限定されない。本発明に係る宿主細胞は、２９３Ｔ細胞および２９３ＴＴ細胞などの細胞株であってもよい。
【００２４】
別の一態様において、本発明は、本発明に係る変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質もしくはそのバリアントを含む、またはこれからなる、ＨＰＶウイルス様粒子に関する。
【００２５】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質との比較においてＮ末端における１〜２５個のアミノ酸、たとえば１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、５〜１５、１０〜１５、１０〜２０、または１５〜２０個のアミノ酸、たとえば３、５、８、１１、１３、１５、１８、２０、または２２個のアミノ酸が切断され、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の２６９〜２８８位のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質の２７０〜２８９位のアミノ酸残基で置換されている、変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質を含む。
【００２６】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質との比較においてＮ末端における１〜２５個のアミノ酸、たとえば１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、５〜１５、１０〜１５、１０〜２０、または１５〜２０個のアミノ酸、たとえば３、５、８、１１、１３、１５、１８、２０、または２２個のアミノ酸が切断され、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の２６９〜２８８位のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質の２７０〜２８９位のアミノ酸残基で置換され、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の１１７〜１４０位のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質の１１７〜１４１位のアミノ酸残基で置換されている、変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質を含む。
【００２７】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質との比較においてＮ末端における１〜２５個のアミノ酸、たとえば１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、５〜１５、１０〜１５、１０〜２０、または１５〜２０個のアミノ酸、たとえば３、５、８、１１、１３、１５、１８、２０、または２２個のアミノ酸が切断され、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の２６９〜２８８位のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質の２７０〜２８９位のアミノ酸残基で置換され、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の１６９〜１８１位のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８２位のアミノ酸残基で置換されている、変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質を含む。
【００２８】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質との比較においてＮ末端における１〜２５個のアミノ酸、たとえば１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、５〜１５、１０〜１５、１０〜２０、または１５〜２０個のアミノ酸、たとえば３、５、８、１１、１３、１５、１８、２０、または２２個のアミノ酸が切断され、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の２６９〜２８８位のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質の２７０〜２８９位のアミノ酸残基で置換され、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５８位のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質の３４８〜３５９位のアミノ酸残基で置換されている、変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質を含む。
【００２９】
特に好ましい一実施形態において、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、配列番号７、１０、１１、または１２の配列を有する変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質を含む。
【００３０】
別の一態様において、本発明はさらに、上記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質もしくはそのバリアント、上記単離された核酸、上記ベクター、上記宿主細胞、または上記ＨＰＶウイルス様粒子を含む組成物にも関する。いくつかの好ましい実施形態において、組成物は、本発明に係る変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを含む。いくつかの好ましい実施形態において、組成物は、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子を含む。
【００３１】
別の一態様において、本発明はさらに、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子と、任意に、製薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む、医薬組成物またはワクチンにも関する。本発明に係る医薬組成物またはワクチンは、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染により引き起こされる疾患（子宮頚がんおよび尖圭コンジローマなど）を予防するために使用できる。
【００３２】
いくつかの好ましい実施形態において、ＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を予防するのに有効な量で存在する。いくつかの好ましい実施形態において、ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型による感染（たとえば、ＨＰＶ３９感染、ＨＰＶ６８感染、および／またはＨＰＶ７０感染）である。いくつかの好ましい実施形態において、ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患は、子宮頚がんおよび尖圭コンジローマからなる群より選択される。
【００３３】
本発明に係る医薬組成物またはワクチンは、たとえば経口または注射（これらに限定されない）などの当技術分野において公知の方法によって投与されてよい。本発明において、特に好ましい投与経路は、注射である。
【００３４】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明に係る医薬組成物またはワクチンは、単位投薬量の形態で投与される。発明を限定することを意図しないが、たとえば、各単位投薬量は、ＨＰＶウイルス様粒子を５μｇ〜８０μｇ、好ましくは２０μｇ〜４０μｇ含有する。
【００３５】
別の一態様において、本発明は、上述される変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントの調製方法であって、変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを宿主細胞において発現させる工程と、次いで、宿主細胞の培養物から変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを回収する工程とを含む方法に関する。
【００３６】
いくつかの好ましい実施形態において、宿主細胞は、大腸菌である。
いくつかの好ましい実施形態において、当該方法は、変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを大腸菌において発現させる工程と、次いで、大腸菌の溶解物上清を精製することによって変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを得る工程とを含む。いくつかの好ましい実施形態において、変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントは、クロマトグラフィー（たとえば、陽イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、および／または疎水性相互作用クロマトグラフィー）によって大腸菌の溶解物上清から回収される。
【００３７】
別の一態様において、本発明は、ワクチンの調製方法であって、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子と、製薬学的に許容される担体および／または賦形剤と、を組み合わせる工程を含む方法に関する。
【００３８】
別の一態様において、本発明は、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染により引き起こされる疾患の予防方法であって、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子または医薬組成物またはワクチンの予防的有効量を対象に投与する工程を含む方法に関する。好ましい一実施形態において、ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型による感染（たとえば、ＨＰＶ３９感染、ＨＰＶ６８感染、および／またはＨＰＶ７０感染）である。別の好ましい一実施形態において、ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患は、子宮頚がんおよび尖圭コンジローマを含むが、これらに限定されない。別の好ましい一実施形態において、対象は、ヒトなどの哺乳類である。
【００３９】
別の一態様において、本発明はさらに、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を予防するための医薬組成物またはワクチンの製造における、本発明に係る変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質もしくはそのバリアントまたはＨＰＶウイルス様粒子の使用にも関する。好ましい一実施形態において、ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型による感染（たとえば、ＨＰＶ３９感染、ＨＰＶ６８感染、および／またはＨＰＶ７０感染）である。別の好ましい一実施形態において、ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患は、子宮頚がんおよび尖圭コンジローマを含むがこれらに限定されない。
【００４０】
別の一態様において、本発明はさらに、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を予防するための、本発明に係る変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質もしくはそのバリアントまたはＨＰＶウイルス様粒子にも関する。好ましい一実施形態において、ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型による感染（たとえば、ＨＰＶ３９感染、ＨＰＶ６８感染、および／またはＨＰＶ７０感染）である。別の好ましい一実施形態において、ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患は、子宮頚がんおよび尖圭コンジローマを含むがこれらに限定されない。
【００４１】
本発明中の用語の定義
本発明において、特記しない限り、本明細書中において使用される科学技術用語は、当業者が一般的に理解する意味を有する。また、本明細書中において使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、および免疫学の実験における操作は、対応分野において広く使用される通例的な操作である。ここで、本発明のよりよい理解を目的として、関連用語の定義および説明が以下に示される。
【００４２】
本発明において、「第２の型の野生型ＨＰＶ」という用語は、ＨＰＶ３９以外の野生型ＨＰＶ型を指す。本発明において、第２の型の野生型ＨＰＶは、好ましくは野生型ＨＰＶ６８である。
【００４３】
本発明において、「第３の型の野生型ＨＰＶ」という用語は、ＨＰＶ３９および第２の型の野生型ＨＰＶ以外の野生型ＨＰＶ型を指す。本発明において、第３の型の野生型ＨＰＶは、好ましくは野生型ＨＰＶ７０である。
【００４４】
本発明において、「対応位置」という表現は、比較対象配列を最適に並べた際、すなわち比較対象配列を同一率が最大となるように並べた際の、比較対象配列上の同等の位置を指す。
【００４５】
本発明において、「野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質」という用語は、ヒトパピローマウイルス３９型（ＨＰＶ３９）の天然の主要カプシドタンパク質Ｌ１を指す。野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の配列は当技術分野において公知であり、公開データベース中に見つかる（ＮＣＢＩデータベース中、受入番号Ｐ２４８３８．１、ＡＲＱ８２６１７．１、ＡＧＵ９０５４９．１、およびＡＥＰ２３０８４．１など）。
【００４６】
本発明において、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列に言及される場合、配列番号１の配列を参照して説明される。たとえば、「野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の５３〜６１位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号１のポリペプチドの５３〜６１位のアミノ酸残基を指す。しかしながら、野生型ＨＰＶ３９は多様な分離株を含み得ること、多様な分離株の間でＬ１タンパク質のアミノ酸配列が異なり得ることが、当業者には理解される。さらに、Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列は異なり得るが、異なるＨＰＶ３９分離株の間の同一性は非常に高く（一般的に、９５％よりも高い、たとえば、９６％よりも高い、９７％よりも高い、９８％よりも高い、または９９％よりも高い）、実質的に同じ生物学的機能を有することが、当業者には理解される。したがって、本発明において、「野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質」という用語は、配列番号１のタンパク質だけでなく、多様なＨＰＶ３９分離株のＬ１タンパク質（番号Ｐ２４８３８．１、ＡＲＱ８２６１７．１、ＡＧＵ９０５４９．１、およびＡＥＰ２３０８４．１のＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質など）をも含む。また、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の配列断片が記載される場合、これは、配列番号１の配列断片だけでなく、多様なＨＰＶ３９分離株のＬ１タンパク質の対応配列断片をも含む。たとえば、「野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の５３〜６１位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号１の５３〜６１位のアミノ酸残基、および多様なＨＰＶ３９分離株のＬ１タンパク質の対応断片を含む。
【００４７】
本発明において、「野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質」という用語は、ヒトパピローマウイルス６８型（ＨＰＶ６８）の天然の主要カプシドタンパク質Ｌ１を指す。野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質の配列は当技術分野において公知であり、公開データベース中に見つかる（ＮＣＢＩデータベース中、受入番号ＡＡＺ３９４９８．１、ＡＧＵ９０７１７．１、Ｐ４６６９．１、およびＡＧＵ９０７０３．１など）。
【００４８】
本発明において、野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列に言及される場合、配列番号２の配列を参照して説明される。たとえば、「野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質の５３〜６１位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号２のポリペプチドの５３〜６１位のアミノ酸残基を指す。しかしながら、野生型ＨＰＶ６８は多様な分離株を含み得ること、多様な分離株の間でＬ１タンパク質のアミノ酸配列が異なり得ることが、当業者には理解される。さらに、Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列は異なり得るが、異なるＨＰＶ６８分離株の間の同一性は非常に高く（一般的に、９５％よりも高い、たとえば、９６％よりも高い、９７％よりも高い、９８％よりも高い、または９９％よりも高い）、実質的に同じ生物学的機能を有することが、当業者には理解される。したがって、本発明において、「野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質」という用語は、配列番号２のタンパク質だけでなく、多様なＨＰＶ６８分離株のＬ１タンパク質（ＡＡＺ３９４９８．１、ＡＧＵ９０７１７．１、Ｐ４６６９．１、およびＡＧＵ９０７０３．１のＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質など）をも含む。また、野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質の配列断片が記載される場合、これは、配列番号２の配列断片だけでなく、多様なＨＰＶ６８分離株のＬ１タンパク質の対応配列断片をも含む。たとえば、「野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質の５３〜６１位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号２の５３〜６１位のアミノ酸残基、および多様なＨＰＶ６８分離株のＬ１タンパク質の対応断片を含む。
【００４９】
本発明において、「野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質」という用語は、ヒトパピローマウイルス７０型（ＨＰＶ７０）の天然の主要カプシドタンパク質Ｌ１を指す。野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質の配列は当技術分野において公知であり、公開データベース中に見つかる（ＮＣＢＩデータベース中、受入番号ＡＧＵ９０８４６．１、ＡＧＵ９０８５４．１、ＡＡＣ５４８７９．１、およびＰ５０７９３．１など）。
【００５０】
本発明において、野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列に言及される場合、配列番号３の配列を参照して説明される。たとえば、「野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質の１１７〜１４１位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号３のポリペプチドの１１７〜１４１位のアミノ酸残基を指す。しかしながら、野生型ＨＰＶ７０は多様な分離株を含み得ること、多様な分離株の間でＬ１タンパク質のアミノ酸配列が異なり得ることが、当業者には理解される。さらに、Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列は異なり得るが、異なるＨＰＶ７０分離株の間の同一性は非常に高く（一般的に、９５％よりも高い、たとえば、９６％よりも高い、９７％よりも高い、９８％よりも高い、または９９％よりも高い）、実質的に同じ生物学的機能を有することが、当業者には理解される。したがって、本発明において、「野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質」という用語は、配列番号３のタンパク質だけでなく、多様なＨＰＶ７０分離株のＬ１タンパク質（ＡＧＵ９０８４６．１、ＡＧＵ９０８５４．１、ＡＡＣ５４８７９．１、およびＰ５０７９３．１のＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質など）をも含む。また、野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質の配列断片が記載される、これは、配列番号３の配列断片だけでなく、多様なＨＰＶ７０分離株のＬ１タンパク質の対応配列断片をも含む。たとえば、「野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質の１１７〜１４１位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号３の１１７〜１４１位のアミノ酸残基、および多様なＨＰＶ７０分離株のＬ１タンパク質の対応断片を含む。
【００５１】
本発明において、「対応配列断片」または「対応断片」という表現は、比較対象配列を最適に並べた際、すなわち比較対象配列を同一率が最大となるように並べた際の、比較対象配列上の同等の位置にある断片を指す。
【００５２】
本発明において、「Ｎ末端におけるＸ個のアミノ酸の切断」または「Ｎ末端のＸ個のアミノ酸が切断されている」という表現は、タンパク質のＮ末端における１〜Ｘ位のアミノ酸残基が、開始コドンによりコードされるメチオニン残基で置換されている（タンパク質翻訳を開始させるために）ことを指す。たとえば、Ｎ末端の１５個のアミノ酸が切断されているＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質とは、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質のＮ末端における１〜１５位のアミノ酸残基が、開始コドンによりコードされるメチオニン残基で置換されているタンパク質を指す。
【００５３】
本発明において、「バリアント」という用語は、本発明に係る変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質（たとえば、配列番号７、１０、１１、または１２のタンパク質）との比較において、アミノ酸配列が、１個以上（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個）のアミノ酸の置換（好ましくは保存的置換）、付加、もしくは欠失を有し、または少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有し、かつ、本発明に係る変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の機能を保持するような、タンパク質を指す。本発明において、「変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の機能」という用語は、少なくとも２つのＨＰＶ型（たとえば、ＨＰＶ３９およびＨＰＶ６８、またはＨＰＶ３９、ＨＰＶ６８、およびＨＰＶ７０）に対する中和抗体の発生を誘発する能力を指す。「同一性」という用語は、ヌクレオチド配列同士またはアミノ酸配列同士の間の類似度についての尺度を指す。概して、マッチングが最大となるように配列を並べた。「同一性」は、当技術分野において知られる意味を有し、公開されているアルゴリズム（ＢＬＡＳＴなど）によって計算できる。
【００５４】
本発明において、「同一性」という用語は、２つのポリペプチドの間または２つの核酸の間のマッチ度を指す。比較される２つの配列が特定部位に同一の塩基またはアミノ酸のモノマーサブユニットを有する場合（たとえば、２つのＤＮＡ分子の各々が特定部位にアデニンを有する場合、または２つのポリペプチドの各々が特定部位にリシンを有する場合）、これら２つの分子は当該部位において同一である。２つの配列の間の同一率は、比較対象部位の総数に対する当該２つの配列に共通の同一部位の数（×１００）と相関する。たとえば、２つの配列において１０個の部位のうち６個が一致している場合、当該２つの配列は同一性が６０％である。たとえば、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴとは同一性が５０％である（６個中３個の部位が一致している）。一般的に、２つの配列の比較は、同一性が最大となるような手法で行なう。このような配列比較は、たとえばNeedlemanら（J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970）の方法に基づくＡｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ社）などのコンピュータプログラムを使用して実施できる。また、２つのアミノ酸配列の間の同一率は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたE.MeyersおよびW.Miller（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)）のアルゴリズムを用い、PAM120 weight residue tableを使用し、gap length penaltyを１２とし、gap penaltyを４とすることによって、求めることができる。加えて、２つのアミノ酸配列の間の同一率は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comにて入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれたNeedlemanおよびWunsch（J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)）のアルゴリズムにより、Blossum 62 matrixまたはPAM250 matrixのいずれかを用い、gap weightを１６、１４、１２、１０、８、６、または４とし、length weightを１、２、３、４、５、または６とすることによって、求めることができる。
【００５５】
本明細書中において使用される場合、「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの本質的特性に不利な影響または変化を及ぼすことのないアミノ酸置換を指す。たとえば、保存的置換は、当技術分野において知られる標準的な技術（部位特異的変異誘発、およびＰＣＲを用いた変異誘発など）によって導入されてよい。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基を、類似する側鎖を有する別のアミノ酸残基で置換すること、たとえば、当該アミノ酸残基と物理的または機能的に類似する（たとえば、サイズ、形状、電荷、共有結合または水素結合形成能力を含む化学的特性などが類似する）残基で置換することを含む。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定められている。こうしたファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、リシン、アルギニン、およびヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、およびトリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、およびメチオニン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（トレオニン、バリン、およびイソロイシンなど）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびヒスチジン）を含む。したがって、一般的に、保存的置換は、対応するアミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換することを指す。アミノ酸の保存的置換を特定する方法は、当技術分野において公知である（たとえば、Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); and Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)を参照；これらを引用により本明細書に援用する）。
【００５６】
本発明において、「大腸菌発現系」という用語は、大腸菌（株）とベクターとからなる発現系であって、当該大腸菌（株）がＥＲ２５６６、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、およびＢＬＲ（ＤＥ３）を含むがこれらに限定されない市販株に由来するものを指す。
【００５７】
本発明において、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドを挿入できる核酸担持手段を指す。ベクターが、挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を発現させることができる場合、このベクターは発現ベクターとよばれる。このベクターは、担持している遺伝物質要素を、宿主細胞中への形質転換、形質導入、またはトランスフェクションによって宿主細胞において発現させることができる。ベクターは当業者に知られており、プラスミド、ファージ、コスミドなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
本発明において、「製薬学的に許容される担体および／または賦形剤」という用語は、対象および活性成分と薬理学的および／または生理学的に適合している担体および／または賦形剤を指し、これらは当技術分野において公知であり（たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995を参照）、ｐＨ調製剤、界面活性剤、アジュバント、およびイオン強度エンハンサーを含むが、これらに限定されない。たとえば、ｐＨ調製剤はリン酸バッファーを含むがこれに限定されず、界面活性剤はカチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、またはたとえばＴｗｅｅｎ−８０などの非イオン性界面活性剤を含むがこれらに限定されず、アジュバントはアルミニウムアジュバント（たとえば、水酸化アルミニウム）およびフロイントアジュバント（たとえば、フロイント完全アジュバント）を含むがこれらに限定されず、イオン強度エンハンサーはＮａＣｌを含むがこれらに限定されない。
【００５９】
本発明において、「有効量」という用語は、意図される目的を効果的に達成できる量を指す。たとえば、疾患（ＨＰＶ感染など）を予防するのに有効な量とは、疾患（ＨＰＶ感染など）の発生を予防、抑制、または遅延させるのに有効な量を指す。このような有効量を決定することは、当業者の能力の範囲内である。
【００６０】
本発明において、「クロマトグラフィー」という用語は、イオン交換クロマトグラフィー（陽イオン交換クロマトグラフィーなど）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなど）、ゲルろ過クロマトグラフィー（ゲル排除クロマトグラフィー）、およびアフィニティクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない。
【００６１】
本発明において、「溶解物上清」という用語は、以下の工程によって得られる溶液を指す：宿主細胞（大腸菌など）を溶解バッファー中で破壊し、次いで、破壊された宿主細胞を含有する溶解物溶液から不溶性物質を除去する。様々な溶解バッファーが当技術分野において公知であり、トリスバッファー、リン酸バッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＯＰＳバッファーなどが含まれるが、これらに限定されない。加えて、宿主細胞の破壊は、ホモジナイザーによる破壊、超音波処理、粉砕、高圧押出し、リゾチーム処理などを含むがこれらに限定されない当業者に知られる方法によって行うことができる。不溶性物質の除去方法も当業者に知られており、ろ過および遠心分離を含むが、これらに限定されない。
【発明の効果】
【００６２】
発明の有益な効果
研究によれば、ＨＰＶ３９と他のＨＰＶ型（ＨＰＶ６８およびＨＰＶ７０など）との間にはいくらか交差防御があるが、このような交差防御は非常に小さく、一般的には１パーセント未満であり、同じ型のＨＰＶのＶＬＰの防御レベルと比べて千分の一であることが示されている。したがって、ＨＰＶ３９ワクチンの接種を受けた対象は、依然として、他のＨＰＶ型（ＨＰＶ６８およびＨＰＶ７０など）に感染するリスクが高い。
【００６３】
本発明は、変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質およびこれによって形成されるＨＰＶウイルス様粒子を提供する。本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ３９および他のＨＰＶ型（ＨＰＶ６８およびＨＰＶ７０など）に対して著しい交差防御を提供する。特に、免疫量が同じである場合に、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、生物において少なくとも２つのＨＰＶ型（たとえば、ＨＰＶ３９およびＨＰＶ６８、またはＨＰＶ３９、ＨＰＶ６８、およびＨＰＶ７０）に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その効果は、複数のＨＰＶ型のＶＬＰの混合物（たとえば、ＨＰＶ３９  ＶＬＰおよびＨＰＶ６８  ＶＬＰの混合物、またはＨＰＶ３９  ＶＬＰ、ＨＰＶ６８  ＶＬＰ、およびＨＰＶ７０  ＶＬＰの混合物）の場合と同等である。したがって、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、少なくとも２つのＨＰＶ型（たとえば、ＨＰＶ３９およびＨＰＶ６８、またはＨＰＶ３９、ＨＰＶ６８、およびＨＰＶ７０）による感染と同時に当該感染に関連する疾患をも予防するために使用でき、非常に有益な技術的効果を有する。このことは、ＨＰＶワクチンの防御範囲を拡大してＨＰＶワクチンの製造コストを低減するという観点において特に著しい利点を有する。
【００６４】
本発明の実施形態がさらに、図面および実施例を参照して詳細に記載される。しかしながら、当業者には、以下の図面および実施例が本発明を例証することのみを意図したものであり、本発明の範囲を規定するものではないことが理解される。以下の図面および好ましい実施形態の詳細な説明から、当業者には、本発明の様々な目的および利点が明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】実施例１における精製した変異タンパク質についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。レーン１、タンパク質分子量マーカー；レーン２、ＨＰＶ３９Ｎ１５（Ｎ末端の１５個のアミノ酸が切断されたＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質）；レーン３、ＨＰＶ６８Ｎ０（Ｎ末端の０個のアミノ酸が切断されたＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質、すなわち、全長野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質）；レーン４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１；レーン５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２；レーン６、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３；レーン７、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４；レーン８、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５；レーン９、タンパク質分子量マーカー；レーン１０、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４；レーン１１、ＨＰＶ７０Ｎ１０（Ｎ末端の１０個のアミノ酸が切断されたＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質）；レーン１２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１；レーン１３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２；レーン１４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３；レーン１５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５。結果は、クロマトグラフィーによる精製後、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５タンパク質の純度が９０％を超えたことを示した。
【図２】実施例１において調製した変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５についてのウェスタンブロットの結果を示す（広域スペクトル抗体４Ｂ３を使用して行なった）。レーン１、ＨＰＶ３９Ｎ１５；レーン２、ＨＰＶ６８Ｎ０；レーン３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１；レーン４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２；レーン５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３；レーン６、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４；レーン７、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５；レーン８、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４；レーン９、ＨＰＶ７０Ｎ１０；レーン１０、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１；レーン１１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２；レーン１２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３；レーン１３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５。結果は、変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５が広域スペクトル抗体４Ｂ３によって特異的に認識され得たことを示した。
【図３】タンパク質ＨＰＶ３９Ｎ１５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ５を含む試料について、モレキュラーシーブクロマトグラフィーによって分析した結果を示す。結果は、タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、またはＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ５を含む試料の第１のタンパク質ピークが、ＨＰＶ３９Ｎ１５の場合と同等の約１３〜１４分に現れたことを示した。このことから、これらのタンパク質はいずれも集合してＶＬＰを形成できたことが示された。
【図４】タンパク質ＨＰＶ３９Ｎ１５、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０、ＨＰＶ７０Ｎ１０、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５を含む試料について、モレキュラーシーブクロマトグラフィーによって分析した結果を示す。結果は、タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、またはＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５を含む試料の第１のタンパク質ピークが、ＨＰＶ３９Ｎ１５、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０、ＨＰＶ７０Ｎ１０、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰの場合と同等の約１３〜１４分に現れたことを示した。このことから、これらのタンパク質はいずれも集合してＶＬＰを形成できたことが示された。
【図５Ａ】ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降速度分析の結果を示す。図５Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ；図５Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ；図５Ｃ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ；図５Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ；図５Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ；図５Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ；図５Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ；図５Ｈ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ；図５Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ；図５Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ；図５Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ；図５Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降係数がそれぞれ１３６Ｓ、１５１Ｓ、１３８Ｓ、１４５Ｓ、１３５Ｓ、１２４Ｓ、１０８Ｓ、９９Ｓ、および１２７Ｓであったことを示した。このことから、変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５は、集合して、サイズおよび形態の観点において野生型ＶＬＰ（ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、１１５Ｓ；ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ、１５３Ｓ；ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、１４４Ｓ）に類似するウイルス様粒子を形成できたことが示された。
【図５Ｂ】ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降速度分析の結果を示す。図５Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ；図５Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ；図５Ｃ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ；図５Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ；図５Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ；図５Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ；図５Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ；図５Ｈ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ；図５Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ；図５Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ；図５Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ；図５Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降係数がそれぞれ１３６Ｓ、１５１Ｓ、１３８Ｓ、１４５Ｓ、１３５Ｓ、１２４Ｓ、１０８Ｓ、９９Ｓ、および１２７Ｓであったことを示した。このことから、変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５は、集合して、サイズおよび形態の観点において野生型ＶＬＰ（ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、１１５Ｓ；ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ、１５３Ｓ；ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、１４４Ｓ）に類似するウイルス様粒子を形成できたことが示された。
【図５Ｃ】ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降速度分析の結果を示す。図５Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ；図５Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ；図５Ｃ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ；図５Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ；図５Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ；図５Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ；図５Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ；図５Ｈ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ；図５Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ；図５Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ；図５Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ；図５Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降係数がそれぞれ１３６Ｓ、１５１Ｓ、１３８Ｓ、１４５Ｓ、１３５Ｓ、１２４Ｓ、１０８Ｓ、９９Ｓ、および１２７Ｓであったことを示した。このことから、変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５は、集合して、サイズおよび形態の観点において野生型ＶＬＰ（ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、１１５Ｓ；ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ、１５３Ｓ；ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、１４４Ｓ）に類似するウイルス様粒子を形成できたことが示された。
【図５Ｄ】ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降速度分析の結果を示す。図５Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ；図５Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ；図５Ｃ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ；図５Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ；図５Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ；図５Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ；図５Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ；図５Ｈ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ；図５Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ；図５Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ；図５Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ；図５Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降係数がそれぞれ１３６Ｓ、１５１Ｓ、１３８Ｓ、１４５Ｓ、１３５Ｓ、１２４Ｓ、１０８Ｓ、９９Ｓ、および１２７Ｓであったことを示した。このことから、変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５は、集合して、サイズおよび形態の観点において野生型ＶＬＰ（ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、１１５Ｓ；ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ、１５３Ｓ；ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、１４４Ｓ）に類似するウイルス様粒子を形成できたことが示された。
【図５Ｅ】ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降速度分析の結果を示す。図５Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ；図５Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ；図５Ｃ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ；図５Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ；図５Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ；図５Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ；図５Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ；図５Ｈ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ；図５Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ；図５Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ；図５Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ；図５Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降係数がそれぞれ１３６Ｓ、１５１Ｓ、１３８Ｓ、１４５Ｓ、１３５Ｓ、１２４Ｓ、１０８Ｓ、９９Ｓ、および１２７Ｓであったことを示した。このことから、変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５は、集合して、サイズおよび形態の観点において野生型ＶＬＰ（ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、１１５Ｓ；ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ、１５３Ｓ；ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、１４４Ｓ）に類似するウイルス様粒子を形成できたことが示された。
【図５Ｆ】ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降速度分析の結果を示す。図５Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ；図５Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ；図５Ｃ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ；図５Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ；図５Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ；図５Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ；図５Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ；図５Ｈ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ；図５Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ；図５Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ；図５Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ；図５Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降係数がそれぞれ１３６Ｓ、１５１Ｓ、１３８Ｓ、１４５Ｓ、１３５Ｓ、１２４Ｓ、１０８Ｓ、９９Ｓ、および１２７Ｓであったことを示した。このことから、変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５は、集合して、サイズおよび形態の観点において野生型ＶＬＰ（ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、１１５Ｓ；ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ、１５３Ｓ；ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、１４４Ｓ）に類似するウイルス様粒子を形成できたことが示された。
【図５Ｇ】ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降速度分析の結果を示す。図５Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ；図５Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ；図５Ｃ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ；図５Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ；図５Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ；図５Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ；図５Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ；図５Ｈ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ；図５Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ；図５Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ；図５Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ；図５Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降係数がそれぞれ１３６Ｓ、１５１Ｓ、１３８Ｓ、１４５Ｓ、１３５Ｓ、１２４Ｓ、１０８Ｓ、９９Ｓ、および１２７Ｓであったことを示した。このことから、変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５は、集合して、サイズおよび形態の観点において野生型ＶＬＰ（ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、１１５Ｓ；ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ、１５３Ｓ；ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、１４４Ｓ）に類似するウイルス様粒子を形成できたことが示された。
【図５Ｈ】ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降速度分析の結果を示す。図５Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ；図５Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ；図５Ｃ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ；図５Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ；図５Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ；図５Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ；図５Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ；図５Ｈ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ；図５Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ；図５Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ；図５Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ；図５Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降係数がそれぞれ１３６Ｓ、１５１Ｓ、１３８Ｓ、１４５Ｓ、１３５Ｓ、１２４Ｓ、１０８Ｓ、９９Ｓ、および１２７Ｓであったことを示した。このことから、変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５は、集合して、サイズおよび形態の観点において野生型ＶＬＰ（ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、１１５Ｓ；ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ、１５３Ｓ；ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、１４４Ｓ）に類似するウイルス様粒子を形成できたことが示された。
【図５Ｉ】ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降速度分析の結果を示す。図５Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ；図５Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ；図５Ｃ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ；図５Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ；図５Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ；図５Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ；図５Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ；図５Ｈ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ；図５Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ；図５Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ；図５Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ；図５Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降係数がそれぞれ１３６Ｓ、１５１Ｓ、１３８Ｓ、１４５Ｓ、１３５Ｓ、１２４Ｓ、１０８Ｓ、９９Ｓ、および１２７Ｓであったことを示した。このことから、変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５は、集合して、サイズおよび形態の観点において野生型ＶＬＰ（ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、１１５Ｓ；ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ、１５３Ｓ；ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、１４４Ｓ）に類似するウイルス様粒子を形成できたことが示された。
【図５Ｊ】ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降速度分析の結果を示す。図５Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ；図５Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ；図５Ｃ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ；図５Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ；図５Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ；図５Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ；図５Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ；図５Ｈ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ；図５Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ；図５Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ；図５Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ；図５Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降係数がそれぞれ１３６Ｓ、１５１Ｓ、１３８Ｓ、１４５Ｓ、１３５Ｓ、１２４Ｓ、１０８Ｓ、９９Ｓ、および１２７Ｓであったことを示した。このことから、変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５は、集合して、サイズおよび形態の観点において野生型ＶＬＰ（ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、１１５Ｓ；ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ、１５３Ｓ；ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、１４４Ｓ）に類似するウイルス様粒子を形成できたことが示された。
【図５Ｋ】ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降速度分析の結果を示す。図５Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ；図５Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ；図５Ｃ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ；図５Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ；図５Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ；図５Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ；図５Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ；図５Ｈ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ；図５Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ；図５Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ；図５Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ；図５Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降係数がそれぞれ１３６Ｓ、１５１Ｓ、１３８Ｓ、１４５Ｓ、１３５Ｓ、１２４Ｓ、１０８Ｓ、９９Ｓ、および１２７Ｓであったことを示した。このことから、変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５は、集合して、サイズおよび形態の観点において野生型ＶＬＰ（ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、１１５Ｓ；ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ、１５３Ｓ；ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、１４４Ｓ）に類似するウイルス様粒子を形成できたことが示された。
【図５Ｌ】ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降速度分析の結果を示す。図５Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ；図５Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰ；図５Ｃ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ；図５Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ；図５Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ；図５Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ；図５Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ；図５Ｈ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ；図５Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ；図５Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ；図５Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ；図５Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降係数がそれぞれ１３６Ｓ、１５１Ｓ、１３８Ｓ、１４５Ｓ、１３５Ｓ、１２４Ｓ、１０８Ｓ、９９Ｓ、および１２７Ｓであったことを示した。このことから、変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５は、集合して、サイズおよび形態の観点において野生型ＶＬＰ（ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、１１５Ｓ；ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ、１５３Ｓ；ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、１４４Ｓ）に類似するウイルス様粒子を形成できたことが示された。
【図６Ａ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図６Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５の集合によるＶＬＰ；図６Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図６Ｃ、ＨＰＶ７０Ｎ１０の集合によるＶＬＰ；図６Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図６Ｈ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図６Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５がＨＰＶ３９Ｎ１５、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０、およびＨＰＶ７０Ｎ１０に類似し、集合して半径約２５〜３０ｎｍのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図６Ｂ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図６Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５の集合によるＶＬＰ；図６Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図６Ｃ、ＨＰＶ７０Ｎ１０の集合によるＶＬＰ；図６Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図６Ｈ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図６Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５がＨＰＶ３９Ｎ１５、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０、およびＨＰＶ７０Ｎ１０に類似し、集合して半径約２５〜３０ｎｍのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図６Ｃ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図６Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５の集合によるＶＬＰ；図６Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図６Ｃ、ＨＰＶ７０Ｎ１０の集合によるＶＬＰ；図６Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図６Ｈ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図６Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５がＨＰＶ３９Ｎ１５、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０、およびＨＰＶ７０Ｎ１０に類似し、集合して半径約２５〜３０ｎｍのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図６Ｄ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図６Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５の集合によるＶＬＰ；図６Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図６Ｃ、ＨＰＶ７０Ｎ１０の集合によるＶＬＰ；図６Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図６Ｈ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図６Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５がＨＰＶ３９Ｎ１５、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０、およびＨＰＶ７０Ｎ１０に類似し、集合して半径約２５〜３０ｎｍのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図６Ｅ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図６Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５の集合によるＶＬＰ；図６Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図６Ｃ、ＨＰＶ７０Ｎ１０の集合によるＶＬＰ；図６Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図６Ｈ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図６Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５がＨＰＶ３９Ｎ１５、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０、およびＨＰＶ７０Ｎ１０に類似し、集合して半径約２５〜３０ｎｍのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図６Ｆ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図６Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５の集合によるＶＬＰ；図６Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図６Ｃ、ＨＰＶ７０Ｎ１０の集合によるＶＬＰ；図６Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図６Ｈ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図６Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５がＨＰＶ３９Ｎ１５、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０、およびＨＰＶ７０Ｎ１０に類似し、集合して半径約２５〜３０ｎｍのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図６Ｇ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図６Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５の集合によるＶＬＰ；図６Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図６Ｃ、ＨＰＶ７０Ｎ１０の集合によるＶＬＰ；図６Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図６Ｈ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図６Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５がＨＰＶ３９Ｎ１５、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０、およびＨＰＶ７０Ｎ１０に類似し、集合して半径約２５〜３０ｎｍのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図６Ｈ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図６Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５の集合によるＶＬＰ；図６Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図６Ｃ、ＨＰＶ７０Ｎ１０の集合によるＶＬＰ；図６Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図６Ｈ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図６Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５がＨＰＶ３９Ｎ１５、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０、およびＨＰＶ７０Ｎ１０に類似し、集合して半径約２５〜３０ｎｍのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図６Ｉ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図６Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５の集合によるＶＬＰ；図６Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図６Ｃ、ＨＰＶ７０Ｎ１０の集合によるＶＬＰ；図６Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図６Ｈ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図６Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５がＨＰＶ３９Ｎ１５、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０、およびＨＰＶ７０Ｎ１０に類似し、集合して半径約２５〜３０ｎｍのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図６Ｊ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図６Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５の集合によるＶＬＰ；図６Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図６Ｃ、ＨＰＶ７０Ｎ１０の集合によるＶＬＰ；図６Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図６Ｈ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図６Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５がＨＰＶ３９Ｎ１５、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０、およびＨＰＶ７０Ｎ１０に類似し、集合して半径約２５〜３０ｎｍのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図６Ｋ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図６Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５の集合によるＶＬＰ；図６Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図６Ｃ、ＨＰＶ７０Ｎ１０の集合によるＶＬＰ；図６Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図６Ｈ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図６Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５がＨＰＶ３９Ｎ１５、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０、およびＨＰＶ７０Ｎ１０に類似し、集合して半径約２５〜３０ｎｍのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図６Ｌ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図６Ａ、ＨＰＶ３９Ｎ１５の集合によるＶＬＰ；図６Ｂ、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図６Ｃ、ＨＰＶ７０Ｎ１０の集合によるＶＬＰ；図６Ｄ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｅ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｆ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｇ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図６Ｈ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図６Ｉ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１の集合によるＶＬＰ；図６Ｊ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図６Ｋ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３の集合によるＶＬＰ；図６Ｌ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５がＨＰＶ３９Ｎ１５、ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０、およびＨＰＶ７０Ｎ１０に類似し、集合して半径約２５〜３０ｎｍのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図７Ａ】マウスにＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、またはＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰを接種した後におけるマウス血清中の中和抗体力価の結果を示す。図７Ａ、アルミニウムアジュバント群１（免疫量５μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）；図７Ｂ、アルミニウムアジュバント群２（免疫量１μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）；図７Ｃ、アルミニウムアジュバント群３（免疫量０．２μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰは、マウスにおいてＨＰＶ３９に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合よりもわずかに弱かったが、同一投与量のＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れており；マウスにおいてＨＰＶ６８に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合よりもわずかに弱かったが、同一投与量のＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れていたことを示した。このことから、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰがＨＰＶ３９およびＨＰＶ６８に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有していたことが示された。
【図７Ｂ】マウスにＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、またはＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰを接種した後におけるマウス血清中の中和抗体力価の結果を示す。図７Ａ、アルミニウムアジュバント群１（免疫量５μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）；図７Ｂ、アルミニウムアジュバント群２（免疫量１μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）；図７Ｃ、アルミニウムアジュバント群３（免疫量０．２μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰは、マウスにおいてＨＰＶ３９に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合よりもわずかに弱かったが、同一投与量のＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れており；マウスにおいてＨＰＶ６８に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合よりもわずかに弱かったが、同一投与量のＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れていたことを示した。このことから、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰがＨＰＶ３９およびＨＰＶ６８に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有していたことが示された。
【図７Ｃ】マウスにＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、またはＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰを接種した後におけるマウス血清中の中和抗体力価の結果を示す。図７Ａ、アルミニウムアジュバント群１（免疫量５μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）；図７Ｂ、アルミニウムアジュバント群２（免疫量１μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）；図７Ｃ、アルミニウムアジュバント群３（免疫量０．２μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰは、マウスにおいてＨＰＶ３９に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合よりもわずかに弱かったが、同一投与量のＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れており；マウスにおいてＨＰＶ６８に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合よりもわずかに弱かったが、同一投与量のＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れていたことを示した。このことから、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰがＨＰＶ３９およびＨＰＶ６８に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有していたことが示された。
【図８Ａ】マウスにＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰを接種した後におけるマウス血清中の中和抗体力価の結果を示す。図８Ａ、アルミニウムアジュバント群１（免疫量５μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）；図８Ｂ、アルミニウムアジュバント群２（免疫量１μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）；図８Ｃ、アルミニウムアジュバント群３（免疫量０．２μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰは、マウスにおいてＨＰＶ３９に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ３９／ＨＰＶ６８／ＨＰＶ７０  ＶＬＰの場合よりもわずかに弱かったが、同一投与量のＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合およびＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れており；マウスにおいてＨＰＶ６８に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ３９／ＨＰＶ６８／ＨＰＶ７０  ＶＬＰの場合と同等であり、同一投与量のＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合およびＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れており；マウスにおいてＨＰＶ７０に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ３９／ＨＰＶ６８／ＨＰＶ７０  ＶＬＰの場合と同等であり、同一投与量のＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合およびＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れていたことを示した。このことから、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰがＨＰＶ３９、ＨＰＶ６８、およびＨＰＶ７０に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有していたことが示された。
【図８Ｂ】マウスにＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰを接種した後におけるマウス血清中の中和抗体力価の結果を示す。図８Ａ、アルミニウムアジュバント群１（免疫量５μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）；図８Ｂ、アルミニウムアジュバント群２（免疫量１μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）；図８Ｃ、アルミニウムアジュバント群３（免疫量０．２μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰは、マウスにおいてＨＰＶ３９に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ３９／ＨＰＶ６８／ＨＰＶ７０  ＶＬＰの場合よりもわずかに弱かったが、同一投与量のＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合およびＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れており；マウスにおいてＨＰＶ６８に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ３９／ＨＰＶ６８／ＨＰＶ７０  ＶＬＰの場合と同等であり、同一投与量のＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合およびＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れており；マウスにおいてＨＰＶ７０に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ３９／ＨＰＶ６８／ＨＰＶ７０  ＶＬＰの場合と同等であり、同一投与量のＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合およびＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れていたことを示した。このことから、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰがＨＰＶ３９、ＨＰＶ６８、およびＨＰＶ７０に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有していたことが示された。
【図８Ｃ】マウスにＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰを接種した後におけるマウス血清中の中和抗体力価の結果を示す。図８Ａ、アルミニウムアジュバント群１（免疫量５μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）；図８Ｂ、アルミニウムアジュバント群２（免疫量１μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）；図８Ｃ、アルミニウムアジュバント群３（免疫量０．２μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰは、マウスにおいてＨＰＶ３９に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ３９／ＨＰＶ６８／ＨＰＶ７０  ＶＬＰの場合よりもわずかに弱かったが、同一投与量のＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合およびＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れており；マウスにおいてＨＰＶ６８に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ３９／ＨＰＶ６８／ＨＰＶ７０  ＶＬＰの場合と同等であり、同一投与量のＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合およびＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れており；マウスにおいてＨＰＶ７０に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ３９／ＨＰＶ６８／ＨＰＶ７０  ＶＬＰの場合と同等であり、同一投与量のＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合およびＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れていたことを示した。このことから、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰがＨＰＶ３９、ＨＰＶ６８、およびＨＰＶ７０に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有していたことが示された。
【図９】ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの熱安定性の検出結果を示すものであり、ＡはＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰの熱安定性の検出結果を示し、ＢはＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０  ＶＬＰの熱安定性の検出結果を示し、ＣはＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰの熱安定性の検出結果を示し、ＤはＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ  ＶＬＰの熱安定性の検出結果を示し、ＥはＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰの熱安定性の検出結果を示し、ＦはＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの熱安定性の検出結果を示す。結果は、これらのタンパク質によって形成されるＶＬＰがいずれも非常に高い熱安定性を有していたことを示した。
【図１０】Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰおよびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰのクライオ電子顕微鏡（ｃｒｙｏ−ＥＭ）写真と、それらの三次元構造を再構築したものを示すものであり、ＡはＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰのクライオ電子顕微鏡（ｃｒｙｏ−ＥＭ）写真を示し、ＢはＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰの三次元構造を再構築したものを示し、ＣはＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰのクライオ電子顕微鏡（ｃｒｙｏ−ＥＭ）写真を示し、ＤはＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの三次元構造を再構築したものを示す。最構築した三次元構造は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰおよびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰがいずれも７２個のカプソメア（形態学的サブユニット、五量体）からなるＴ＝７の二十面体構造（ｈ＝１、ｋ＝２）を有していたことを示した。準等価原理（quasi-equivalence principle）に合致する従来の二十面体のウイルスカプシドとは異なり、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰおよびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの構造におけるすべての構成サブユニットは五量体であり、六量体はなかった。また、これらの２種のＶＬＰは外径が約５５ｎｍであった。これらは、以前に報告された天然ＨＰＶウイルス粒子および真核生物発現系（たとえば、ポックスウイルス発現系）（Baker TS, Newcomb WW, Olson NH. et al. Biophys J. (1991), 60(6): 1445-1456. Hagensee ME, Olson NH, Baker TS, et al. J Virol. (1994), 68(7):4503-4505. Buck CB, Cheng N, Thompson CD. et al. J Virol. (2008), 82(11): 5190-7）により調製されたＨＰＶ  ＶＬＰの三次元構造に類似していた。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
配列情報
本発明における関連する配列のいくつかが、以下の表１中に示される。
【００６７】
【表１】
2021526851.tif 000003
【００６８】
配列１（配列番号１）：
MALWRSSDSMVYLPPPSVAKVVNTDDYVTRTGIYYYAGSSRLLTVGHPYFKVGMNGGRKQDIPKVSAYQYRVFRVTLPDPNKFSIPDASLYNPETQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGHPLYNRQDDTENSPFSSTTNKDSRDNVSVDYKQTQLCIIGCVPAIGEHWGKGKACKPNNVSTGDCPPLELVNTPIEDGDMIDTGYGAMDFGALQETKSEVPLDICQSICKYPDYLQMSADVYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRGGMVGDAIPAQLYIKGTDIRANPGSSVYCPSPSGSMVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGICWHNQLFLTVVDTTRSTNFTLSTSIESSIPSTYDPSKFKEYTRHVEEYDLQFIFQLCTVTLTTDVMSYIHTMNSSILDNWNFAVAPPPSASLVDTYRYLQSAAITCQKDAPAPEKKDPYDGLKFWNVDLREKFSLELDQFPLGRKFLLQARVRRRPTIGPRKRPAASTSSSSATKHKRKRVSK
配列２（配列番号２）：
MALWRASDNMVYLPPPSVAKVVNTDDYVTRTGMYYYAGTSRLLTVGHPYFKVPMSGGRKQGIPKVSAYQYRVFRVTLPDPNKFSVPESTLYNPDTQRMVWACVGVEIGRGQPLGVGLSGHPLYNRLDDTENSPFSSNKNPKDSRDNVAVDCKQTQLCIIGCVPAIGEHWAKGKSCKPTNVQQGDCPPLELVNTPIEDGDMIDTGYGAMDFGTLQETKSEVPLDICQSVCKYPDYLQMSADVYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRGGMVGDTIPTDMYIKGTDIRETPSSYVYAPSPSGSMVSSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGICWHNQLFLTVVDTTRSTNFTLSTTTDSTVPAVYDSNKFKEYVRHVEEYDLQFIFQLCTITLSTDVMSYIHTMNPAILDDWNFGVAPPPSASLVDTYRYLQSAAITCQKDAPAPVKKDPYDGLNFWNVDLKEKFSSELDQFPLGRKFLLQAGVRRRPTIGPRKRTATAATTSTSKHKRKRVSK
配列３（配列番号３）：
MALWRSSDNTVYLPPPSVAKVVNTDDYVTRTGIYYYAGSSRLLTVGHPYFKVPVNGGRKQEIPKVSAYQYRVFRVSLPDPNKFGLPDPSLYNPDTQRLVWACIGVEIGRGQPLGVGVSGHPLYNRLDDTENSHFSSAVNTQDSRDNVSVDYKQTQLCIIGCVPAMGEHWAKGKACKSTTVQQGDCPPLELVNTAIEDGDMIDTGYGAMDFRTLQETKSEVPLDICQSVCKYPDYLQMSADVYGDSMFFCLRKEQLFARHFWNRGGMVGDTIPSELYIKGTDIRDRPGTHVYSPSPSGSMVSSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGICWHNQLFITVVDTTRSTNFTLSACTETAIPAVYSPTKFKEYTRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMAYIHTMNPAILDNWNIGVTPPPSASLVDTYRYLQSAAIACQKDAPAPEKKDPYDDLKFWNVDLKEKFSTELDQFPLGRKFLLQVGARRRPTIGPRKRPASAKSSSSASKHKRKRVSK
配列４（配列番号４）：
MPSVAKVVNTDDYVTRTGIYYYAGSSRLLTVGHPYFKVPMSGGRKQGIPKVSAYQYRVFRVTLPDPNKFSIPDASLYNPETQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGHPLYNRQDDTENSPFSSTTNKDSRDNVSVDYKQTQLCIIGCVPAIGEHWGKGKACKPNNVSTGDCPPLELVNTPIEDGDMIDTGYGAMDFGALQETKSEVPLDICQSICKYPDYLQMSADVYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRGGMVGDAIPAQLYIKGTDIRANPGSSVYCPSPSGSMVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGICWHNQLFLTVVDTTRSTNFTLSTSIESSIPSTYDPSKFKEYTRHVEEYDLQFIFQLCTVTLTTDVMSYIHTMNSSILDNWNFAVAPPPSASLVDTYRYLQSAAITCQKDAPAPEKKDPYDGLKFWNVDLREKFSLELDQFPLGRKFLLQARVRRRPTIGPRKRPAASTSSSSATKHKRKRVSK
配列５（配列番号５）：
MPSVAKVVNTDDYVTRTGIYYYAGSSRLLTVGHPYFKVGMNGGRKQDIPKVSAYQYRVFRVTLPDPNKFSIPDASLYNPETQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLYNRLDDTENSPFSSNKNPKDSRDNVAVDCKQTQLCIIGCVPAIGEHWGKGKACKPNNVSTGDCPPLELVNTPIEDGDMIDTGYGAMDFGALQETKSEVPLDICQSICKYPDYLQMSADVYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRGGMVGDAIPAQLYIKGTDIRANPGSSVYCPSPSGSMVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGICWHNQLFLTVVDTTRSTNFTLSTSIESSIPSTYDPSKFKEYTRHVEEYDLQFIFQLCTVTLTTDVMSYIHTMNSSILDNWNFAVAPPPSASLVDTYRYLQSAAITCQKDAPAPEKKDPYDGLKFWNVDLREKFSLELDQFPLGRKFLLQARVRRRPTIGPRKRPAASTSSSSATKHKRKRVSK
配列６（配列番号６）：
MPSVAKVVNTDDYVTRTGIYYYAGSSRLLTVGHPYFKVGMNGGRKQDIPKVSAYQYRVFRVTLPDPNKFSIPDASLYNPETQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGHPLYNRQDDTENSPFSSTTNKDSRDNVSVDYKQTQLCIIGCVPAIGEHWAKGKSCKPTNVQQGDCPPLELVNTPIEDGDMIDTGYGAMDFGALQETKSEVPLDICQSICKYPDYLQMSADVYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRGGMVGDAIPAQLYIKGTDIRANPGSSVYCPSPSGSMVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGICWHNQLFLTVVDTTRSTNFTLSTSIESSIPSTYDPSKFKEYTRHVEEYDLQFIFQLCTVTLTTDVMSYIHTMNSSILDNWNFAVAPPPSASLVDTYRYLQSAAITCQKDAPAPEKKDPYDGLKFWNVDLREKFSLELDQFPLGRKFLLQARVRRRPTIGPRKRPAASTSSSSATKHKRKRVSK
配列７（配列番号７）：
MPSVAKVVNTDDYVTRTGIYYYAGSSRLLTVGHPYFKVGMNGGRKQDIPKVSAYQYRVFRVTLPDPNKFSIPDASLYNPETQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGHPLYNRQDDTENSPFSSTTNKDSRDNVSVDYKQTQLCIIGCVPAIGEHWGKGKACKPNNVSTGDCPPLELVNTPIEDGDMIDTGYGAMDFGALQETKSEVPLDICQSICKYPDYLQMSADVYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRGGMVGDTIPTDMYIKGTDIRETPSSYVYCPSPSGSMVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGICWHNQLFLTVVDTTRSTNFTLSTSIESSIPSTYDPSKFKEYTRHVEEYDLQFIFQLCTVTLTTDVMSYIHTMNSSILDNWNFAVAPPPSASLVDTYRYLQSAAITCQKDAPAPEKKDPYDGLKFWNVDLREKFSLELDQFPLGRKFLLQARVRRRPTIGPRKRPAASTSSSSATKHKRKRVSK
配列８（配列番号８）：
MPSVAKVVNTDDYVTRTGIYYYAGSSRLLTVGHPYFKVGMNGGRKQDIPKVSAYQYRVFRVTLPDPNKFSIPDASLYNPETQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGHPLYNRQDDTENSPFSSTTNKDSRDNVSVDYKQTQLCIIGCVPAIGEHWGKGKACKPNNVSTGDCPPLELVNTPIEDGDMIDTGYGAMDFGALQETKSEVPLDICQSICKYPDYLQMSADVYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRGGMVGDAIPAQLYIKGTDIRANPGSSVYCPSPSGSMVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGICWHNQLFLTVVDTTRSTNFTLSTSTDSTVPAVYDSNKFKEYTRHVEEYDLQFIFQLCTVTLTTDVMSYIHTMNSSILDNWNFAVAPPPSASLVDTYRYLQSAAITCQKDAPAPEKKDPYDGLKFWNVDLREKFSLELDQFPLGRKFLLQARVRRRPTIGPRKRPAASTSSSSATKHKRKRVSK
配列９（配列番号９）：
MPSVAKVVNTDDYVTRTGIYYYAGSSRLLTVGHPYFKVPVNGGRKQEIPKVSAYQYRVFRVTLPDPNKFSIPDASLYNPETQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGHPLYNRQDDTENSPFSSTTNKDSRDNVSVDYKQTQLCIIGCVPAIGEHWGKGKACKPNNVSTGDCPPLELVNTPIEDGDMIDTGYGAMDFGALQETKSEVPLDICQSICKYPDYLQMSADVYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRGGMVGDTIPTDMYIKGTDIRETPSSYVYCPSPSGSMVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGICWHNQLFLTVVDTTRSTNFTLSTSIESSIPSTYDPSKFKEYTRHVEEYDLQFIFQLCTVTLTTDVMSYIHTMNSSILDNWNFAVAPPPSASLVDTYRYLQSAAITCQKDAPAPEKKDPYDGLKFWNVDLREKFSLELDQFPLGRKFLLQARVRRRPTIGPRKRPAASTSSSSATKHKRKRVSK
配列１０（配列番号１０）：
MPSVAKVVNTDDYVTRTGIYYYAGSSRLLTVGHPYFKVGMNGGRKQDIPKVSAYQYRVFRVTLPDPNKFSIPDASLYNPETQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGVSGHPLYNRLDDTENSHFSSAVNTQDSRDNVSVDYKQTQLCIIGCVPAIGEHWGKGKACKPNNVSTGDCPPLELVNTPIEDGDMIDTGYGAMDFGALQETKSEVPLDICQSICKYPDYLQMSADVYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRGGMVGDTIPTDMYIKGTDIRETPSSYVYCPSPSGSMVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGICWHNQLFLTVVDTTRSTNFTLSTSIESSIPSTYDPSKFKEYTRHVEEYDLQFIFQLCTVTLTTDVMSYIHTMNSSILDNWNFAVAPPPSASLVDTYRYLQSAAITCQKDAPAPEKKDPYDGLKFWNVDLREKFSLELDQFPLGRKFLLQARVRRRPTIGPRKRPAASTSSSSATKHKRKRVSK
配列１１（配列番号１１）：
MPSVAKVVNTDDYVTRTGIYYYAGSSRLLTVGHPYFKVGMNGGRKQDIPKVSAYQYRVFRVTLPDPNKFSIPDASLYNPETQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGHPLYNRQDDTENSPFSSTTNKDSRDNVSVDYKQTQLCIIGCVPAIGEHWAKGKACKSTTVQQGDCPPLELVNTPIEDGDMIDTGYGAMDFGALQETKSEVPLDICQSICKYPDYLQMSADVYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRGGMVGDTIPTDMYIKGTDIRETPSSYVYCPSPSGSMVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGICWHNQLFLTVVDTTRSTNFTLSTSIESSIPSTYDPSKFKEYTRHVEEYDLQFIFQLCTVTLTTDVMSYIHTMNSSILDNWNFAVAPPPSASLVDTYRYLQSAAITCQKDAPAPEKKDPYDGLKFWNVDLREKFSLELDQFPLGRKFLLQARVRRRPTIGPRKRPAASTSSSSATKHKRKRVSK
配列１２（配列番号１２）：
MPSVAKVVNTDDYVTRTGIYYYAGSSRLLTVGHPYFKVGMNGGRKQDIPKVSAYQYRVFRVTLPDPNKFSIPDASLYNPETQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGHPLYNRQDDTENSPFSSTTNKDSRDNVSVDYKQTQLCIIGCVPAIGEHWGKGKACKPNNVSTGDCPPLELVNTPIEDGDMIDTGYGAMDFGALQETKSEVPLDICQSICKYPDYLQMSADVYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRGGMVGDTIPTDMYIKGTDIRETPSSYVYCPSPSGSMVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGICWHNQLFLTVVDTTRSTNFTLSTSTETAIPAVYSPTKFKEYTRHVEEYDLQFIFQLCTVTLTTDVMSYIHTMNSSILDNWNFAVAPPPSASLVDTYRYLQSAAITCQKDAPAPEKKDPYDGLKFWNVDLREKFSLELDQFPLGRKFLLQARVRRRPTIGPRKRPAASTSSSSATKHKRKRVSK
配列１３（配列番号１３）：
ATGGCCCTCTGGCGCAGCTCCGATTCCATGGTCTACCTCCCCCCCCCCAGCGTCGCCAAGGTCGTGAACACCGACGACTACGTCACCCGCACCGGGATCTACTACTACGCCGGGTCCAGCCGCCTGCTGACCGTGGGCCACCCCTACTTCAAGGTCGGCATGAACGGCGGGCGCAAGCAGGATATCCCCAAGGTCAGCGCCTACCAGTACCGCGTGTTCCGCGTCACCCTCCCAGACCCCAACAAGTTCTCCATCCCCGACGCCAGCCTGTACAACCCCGAGACCCAGCGCCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCGTCGAAGTCGGGCGCGGGCAGCCCCTCGGCGTCGGCATCTCCGGCCACCCCCTGTACAACCGCCAGGACGACACCGAGAATAGCCCCTTCAGCAGCACAACAAACAAGGATTCCCGCGACAACGTCAGCGTCGACTACAAGCAGACCCAGCTCTGTATCATCGGGTGCGTCCCAGCAATCGGCGAACACTGGGGCAAGGGCAAGGCCTGTAAGCCAAACAACGTGAGCACCGGCGATTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAATACACCCATCGAAGACGGCGACATGATCGACACCGGGTACGGCGCCATGGATTTCGGCGCCCTCCAGGAGACAAAGTCCGAAGTCCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTCCAGATGAGCGCCGACGTCTACGGCGATTCCATGTTCTTCTGCCTGCGCCGCGAGCAGCTCTTCGCCCGCCACTTCTGGAACCGCGGCGGCATGGTCGGCGATGCAATCCCCGCACAGCTCTACATCAAGGGGACCGACATCCGCGCCAATCCAGGCTCCAGCGTGTATTGTCCAAGCCCATCCGGCAGCATGGTGACAAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCACAGGGGCATAATAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCCTGACCGTCGTCGATACCACACGCTCCACAAATTTCACCCTGAGCACAAGCATCGAAAGCAGCATCCCCAGCACCTACGACCCCAGCAAGTTCAAGGAGTACACACGCCACGTCGAAGAATACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTCTGCACCGTGACCCTGACCACCGACGTCATGAGCTACATCCACACCATGAACAGCAGCATCCTCGATAACTGGAACTTCGCCGTGGCCCCCCCCCCCAGCGCATCCCTCGTGGATACCTATCGCTATCTGCAGAGCGCCGCAATCACCTGCCAGAAGGACGCCCCCGCCCCCGAGAAGAAGGACCCCTACGATGGCCTGAAGTTCTGGAACGTCGATCTGCGCGAGAAGTTCTCCCTGGAGCTGGACCAGTTCCCCCTCGGCCGCAAGTTCCTCCTCCAGGCACGCGTGCGCCGCCGCCCCACCATCGGCCCACGCAAGCGCCCCGCCGCCAGCACCAGCAGCAGCAGCGCCACCAAGCACAAGCGCAAGCGCGTCAGCAAGTGA
配列１４（配列番号１４）：
ATGGCACTGTGGAGAGCCAGCGACAACATGGTGTACCTGCCCCCTCCCAGCGTGGCCAAGGTGGTCAACACCGACGACTACGTGACCCGGACCGGCATGTACTACTACGCCGGCACCTCTCGGCTCCTGACCGTGGGCCACCCCTACTTCAAGGTGCCCATGAGCGGCGGCAGAAAGCAGGGCATCCCCAAGGTGTCCGCCTACCAGTACCGGGTGTTCAGAGTGACCCTGCCCGACCCCAACAAGTTCAGCGTGCCCGAGAGCACCCTGTACAACCCCGACACCCAGCGGATGGTCTGGGCCTGCGTGGGCGTGGAGATCGGCAGAGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTACAATCGGCTGGACGACACCGAGAACAGCCCCTTCAGCAGCAACAAGAACCCCAAGGACAGCCGGGACAACGTGGCCGTGGACTGCAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGTGCCTGCCATTGGCGAGCACTGGGCCAAGGGCAAGAGCTGCAAGCCCACCAACGTGCAGCAGGGCGACTGCCCCCCTCTGGAACTGGTCAACACACCCATCGAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTACGGCGCCATGGACTTCGGCACCCTGCAGGAAACCAAGAGCGAGGTCCCCCTGGACATCTGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGCAGATGAGCGCCGACGTGTACGGCGACAGCATGTTCTTTTGCCTGCGGCGGGAGCAGCTGTTCGCCCGGCACTTCTGGAACAGAGGCGGCATGGTCGGCGACACCATCCCCACCGACATGTACATCAAGGGCACCGACATCAGAGAGACACCCAGCAGCTACGTGTACGCCCCCAGCCCCAGCGGCAGCATGGTGTCCAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTTCTGACCGTGGTGGACACCACCAGAAGCACCAACTTCACCCTGAGCACCACCACCGACAGCACCGTGCCCGCCGTGTACGACAGCAATAAGTTCAAAGAATACGTGCGGCACGTGGAGGAATACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGTACCATCACCCTGTCCACCGACGTGATGAGCTACATCCACACCATGAACCCCGCCATCCTGGACGACTGGAACTTCGGCGTGGCCCCTCCCCCTAGCGCCAGCCTGGTGGATACCTACAGATACCTGCAGAGCGCCGCCATCACCTGCCAGAAGGACGCCCCTGCCCCCGTGAAGAAGGACCCCTACGACGGCCTGAACTTCTGGAATGTGGACCTGAAAGAGAAGTTCAGCAGCGAGCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCCGGAAGTTCCTGCTGCAAGCCGGCGTGCGGAGAAGGCCCACCATCGGCCCCAGAAAGCGGACCGCCACCGCAGCCACAACCTCCACCTCCAAGCACAAGCGGAAGCGGGTGTCCAAGTGA
配列１５（配列番号１５）： 
ATGGCTTTGTGGCGGTCTAGTGACAACACGGTGTATTTGCCACCCCCTTCTGTGGCGAAGGTTGTCAATACAGATGATTATGTAACACGTACAGGCATATATTATTATGCTGGAAGCTCTCGCTTATTAACAGTAGGGCATCCTTATTTTAAGGTACCTGTAAATGGTGGCCGCAAGCAGGAAATACCTAAGGTGTCTGCATATCAGTATAGGGTATTTAGGGTATCCCTACCTGATCCTAATAAGTTTGGCCTTCCGGATCCTTCCCTTTATAATCCTGACACACAACGCCTGGTATGGGCCTGTATAGGTGTGGAAATTGGTAGAGGCCAGCCATTGGGCGTTGGTGTTAGTGGACATCCTTTATATAATAGATTGGATGATACTGAAAATTCACATTTTTCCTCTGCTGTTAATACACAGGACAGTAGGGACAATGTGTCTGTGGACTATAAGCAGACACAGTTATGTATTATAGGCTGTGTTCCTGCTATGGGAGAGCACTGGGCAAAGGGCAAGGCCTGTAAGTCCACTACTGTACAACAGGGCGATTGTCCACCATTAGAATTAGTTAATACTGCAATTGAGGATGGCGATATGATAGATACAGGCTATGGAGCCATGGACTTTCGTACATTGCAGGAAACCAAAAGTGAGGTACCACTAGATATTTGCCAATCCGTGTGTAAATATCCTGATTATTTGCAGATGTCTGCTGATGTATATGGGGACAGTATGTTTTTTTGTTTGCGCAAGGAACAGTTATTTGCCAGACACTTTTGGAATAGAGGTGGCATGGTGGGCGACACAATACCTTCAGAGTTATATATTAAAGGCACGGATATACGTGATCGTCCTGGTACTCATGTATATTCCCCTTCCCCAAGTGGCTCTATGGTTTCTTCTGATTCCCAGTTGTTTAATAAGCCCTATTGGTTGCATAAGGCCCAGGGACACAATAATGGCATTTGTTGGCATAACCAGTTGTTTATTACTGTGGTGGACACTACACGTAGTACTAATTTTACATTGTCTGCCTGCACCGAAACAGCCATACCTGCTGTATATAGCCCTACAAAGTTTAAGGAATATACTAGGCATGTGGAGGAATATGATTTACAATTTATATTTCAGTTGTGTACTATCACATTAACTGCAGACGTTATGGCCTACATCCATACTATGAATCCTGCAATTTTGGACAATTGGAATATAGGCGTTACCCCTCCACCATCTGCAAGCTTGGTGGACACGTATAGGTATTTACAATCAGCAGCTATAGCATGTCAGAAGGATGCTCCTGCACCTGAAAAAAAGGATCCCTATGACGATTTAAAATTTTGGAATGTTGATTTAAAGGAAAAGTTTAGTACAGAACTAGATCAGTTTCCTTTGGGGCGCAAATTTTTACTACAGGTAGGGGCTCGCAGACGTCCTACTATAGGCCCTCGCAAACGCCCTGCATCAGCTAAATCGTCTTCCTCAGCCTCTAAACACAAACGGAAACGTGTGTCCAAGTAA
配列１６（配列番号１６）：
ATGCCCAGCGTCGCCAAGGTCGTGAACACCGACGACTACGTCACCCGCACCGGGATCTACTACTACGCCGGGTCCAGCCGCCTGCTGACCGTGGGCCACCCCTACTTCAAGGTGCCCATGAGCGGCGGCAGAAAGCAGGGCATCCCCAAGGTGTCCGCCTACCAGTACCGCGTGTTCCGCGTCACCCTCCCAGACCCCAACAAGTTCTCCATCCCCGACGCCAGCCTGTACAACCCCGAGACCCAGCGCCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCGTCGAAGTCGGGCGCGGGCAGCCCCTCGGCGTCGGCATCTCCGGCCACCCCCTGTACAACCGCCAGGACGACACCGAGAATAGCCCCTTCAGCAGCACAACAAACAAGGATTCCCGCGACAACGTCAGCGTCGACTACAAGCAGACCCAGCTCTGTATCATCGGGTGCGTCCCAGCAATCGGCGAACACTGGGGCAAGGGCAAGGCCTGTAAGCCAAACAACGTGAGCACCGGCGATTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAATACACCCATCGAAGACGGCGACATGATCGACACCGGGTACGGCGCCATGGATTTCGGCGCCCTCCAGGAGACAAAGTCCGAAGTCCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTCCAGATGAGCGCCGACGTCTACGGCGATTCCATGTTCTTCTGCCTGCGCCGCGAGCAGCTCTTCGCCCGCCACTTCTGGAACCGCGGCGGCATGGTCGGCGATGCAATCCCCGCACAGCTCTACATCAAGGGGACCGACATCCGCGCCAATCCAGGCTCCAGCGTGTATTGTCCAAGCCCATCCGGCAGCATGGTGACAAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCACAGGGGCATAATAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCCTGACCGTCGTCGATACCACACGCTCCACAAATTTCACCCTGAGCACAAGCATCGAAAGCAGCATCCCCAGCACCTACGACCCCAGCAAGTTCAAGGAGTACACACGCCACGTCGAAGAATACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTCTGCACCGTGACCCTGACCACCGACGTCATGAGCTACATCCACACCATGAACAGCAGCATCCTCGATAACTGGAACTTCGCCGTGGCCCCCCCCCCCAGCGCATCCCTCGTGGATACCTATCGCTATCTGCAGAGCGCCGCAATCACCTGCCAGAAGGACGCCCCCGCCCCCGAGAAGAAGGACCCCTACGATGGCCTGAAGTTCTGGAACGTCGATCTGCGCGAGAAGTTCTCCCTGGAGCTGGACCAGTTCCCCCTCGGCCGCAAGTTCCTCCTCCAGGCACGCGTGCGCCGCCGCCCCACCATCGGCCCACGCAAGCGCCCCGCCGCCAGCACCAGCAGCAGCAGCGCCACCAAGCACAAGCGCAAGCGCGTCAGCAAGTGA
配列１７（配列番号１７）：
ATGCCCAGCGTCGCCAAGGTCGTGAACACCGACGACTACGTCACCCGCACCGGGATCTACTACTACGCCGGGTCCAGCCGCCTGCTGACCGTGGGCCACCCCTACTTCAAGGTCGGCATGAACGGCGGGCGCAAGCAGGATATCCCCAAGGTCAGCGCCTACCAGTACCGCGTGTTCCGCGTCACCCTCCCAGACCCCAACAAGTTCTCCATCCCCGACGCCAGCCTGTACAACCCCGAGACCCAGCGCCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCGTCGAAGTCGGCAGAGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTACAATCGGCTGGACGACACCGAGAACAGCCCCTTCAGCAGCAACAAGAACCCCAAGGACAGCCGGGACAACGTGGCCGTGGACTGCAAGCAGACCCAGCTCTGTATCATCGGGTGCGTCCCAGCAATCGGCGAACACTGGGGCAAGGGCAAGGCCTGTAAGCCAAACAACGTGAGCACCGGCGATTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAATACACCCATCGAAGACGGCGACATGATCGACACCGGGTACGGCGCCATGGATTTCGGCGCCCTCCAGGAGACAAAGTCCGAAGTCCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTCCAGATGAGCGCCGACGTCTACGGCGATTCCATGTTCTTCTGCCTGCGCCGCGAGCAGCTCTTCGCCCGCCACTTCTGGAACCGCGGCGGCATGGTCGGCGATGCAATCCCCGCACAGCTCTACATCAAGGGGACCGACATCCGCGCCAATCCAGGCTCCAGCGTGTATTGTCCAAGCCCATCCGGCAGCATGGTGACAAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCACAGGGGCATAATAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCCTGACCGTCGTCGATACCACACGCTCCACAAATTTCACCCTGAGCACAAGCATCGAAAGCAGCATCCCCAGCACCTACGACCCCAGCAAGTTCAAGGAGTACACACGCCACGTCGAAGAATACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTCTGCACCGTGACCCTGACCACCGACGTCATGAGCTACATCCACACCATGAACAGCAGCATCCTCGATAACTGGAACTTCGCCGTGGCCCCCCCCCCCAGCGCATCCCTCGTGGATACCTATCGCTATCTGCAGAGCGCCGCAATCACCTGCCAGAAGGACGCCCCCGCCCCCGAGAAGAAGGACCCCTACGATGGCCTGAAGTTCTGGAACGTCGATCTGCGCGAGAAGTTCTCCCTGGAGCTGGACCAGTTCCCCCTCGGCCGCAAGTTCCTCCTCCAGGCACGCGTGCGCCGCCGCCCCACCATCGGCCCACGCAAGCGCCCCGCCGCCAGCACCAGCAGCAGCAGCGCCACCAAGCACAAGCGCAAGCGCGTCAGCAAGTGA
配列１８（配列番号１８）：
ATGCCCAGCGTCGCCAAGGTCGTGAACACCGACGACTACGTCACCCGCACCGGGATCTACTACTACGCCGGGTCCAGCCGCCTGCTGACCGTGGGCCACCCCTACTTCAAGGTCGGCATGAACGGCGGGCGCAAGCAGGATATCCCCAAGGTCAGCGCCTACCAGTACCGCGTGTTCCGCGTCACCCTCCCAGACCCCAACAAGTTCTCCATCCCCGACGCCAGCCTGTACAACCCCGAGACCCAGCGCCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCGTCGAAGTCGGGCGCGGGCAGCCCCTCGGCGTCGGCATCTCCGGCCACCCCCTGTACAACCGCCAGGACGACACCGAGAATAGCCCCTTCAGCAGCACAACAAACAAGGATTCCCGCGACAACGTCAGCGTCGACTACAAGCAGACCCAGCTCTGTATCATCGGGTGCGTCCCAGCAATCGGCGAACACTGGGCCAAGGGCAAGAGCTGCAAGCCCACCAACGTGCAGCAGGGCGACTGCCCCCCTCTGGAGCTGGTGAATACACCCATCGAAGACGGCGACATGATCGACACCGGGTACGGCGCCATGGATTTCGGCGCCCTCCAGGAGACAAAGTCCGAAGTCCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTCCAGATGAGCGCCGACGTCTACGGCGATTCCATGTTCTTCTGCCTGCGCCGCGAGCAGCTCTTCGCCCGCCACTTCTGGAACCGCGGCGGCATGGTCGGCGATGCAATCCCCGCACAGCTCTACATCAAGGGGACCGACATCCGCGCCAATCCAGGCTCCAGCGTGTATTGTCCAAGCCCATCCGGCAGCATGGTGACAAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCACAGGGGCATAATAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCCTGACCGTCGTCGATACCACACGCTCCACAAATTTCACCCTGAGCACAAGCATCGAAAGCAGCATCCCCAGCACCTACGACCCCAGCAAGTTCAAGGAGTACACACGCCACGTCGAAGAATACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTCTGCACCGTGACCCTGACCACCGACGTCATGAGCTACATCCACACCATGAACAGCAGCATCCTCGATAACTGGAACTTCGCCGTGGCCCCCCCCCCCAGCGCATCCCTCGTGGATACCTATCGCTATCTGCAGAGCGCCGCAATCACCTGCCAGAAGGACGCCCCCGCCCCCGAGAAGAAGGACCCCTACGATGGCCTGAAGTTCTGGAACGTCGATCTGCGCGAGAAGTTCTCCCTGGAGCTGGACCAGTTCCCCCTCGGCCGCAAGTTCCTCCTCCAGGCACGCGTGCGCCGCCGCCCCACCATCGGCCCACGCAAGCGCCCCGCCGCCAGCACCAGCAGCAGCAGCGCCACCAAGCACAAGCGCAAGCGCGTCAGCAAGTGA
配列１９（配列番号１９）：
ATGCCCAGCGTCGCCAAGGTCGTGAACACCGACGACTACGTCACCCGCACCGGGATCTACTACTACGCCGGGTCCAGCCGCCTGCTGACCGTGGGCCACCCCTACTTCAAGGTCGGCATGAACGGCGGGCGCAAGCAGGATATCCCCAAGGTCAGCGCCTACCAGTACCGCGTGTTCCGCGTCACCCTCCCAGACCCCAACAAGTTCTCCATCCCCGACGCCAGCCTGTACAACCCCGAGACCCAGCGCCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCGTCGAAGTCGGGCGCGGGCAGCCCCTCGGCGTCGGCATCTCCGGCCACCCCCTGTACAACCGCCAGGACGACACCGAGAATAGCCCCTTCAGCAGCACAACAAACAAGGATTCCCGCGACAACGTCAGCGTCGACTACAAGCAGACCCAGCTCTGTATCATCGGGTGCGTCCCAGCAATCGGCGAACACTGGGGCAAGGGCAAGGCCTGTAAGCCAAACAACGTGAGCACCGGCGATTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAATACACCCATCGAAGACGGCGACATGATCGACACCGGGTACGGCGCCATGGATTTCGGCGCCCTCCAGGAGACAAAGTCCGAAGTCCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTCCAGATGAGCGCCGACGTCTACGGCGATTCCATGTTCTTCTGCCTGCGCCGCGAGCAGCTCTTCGCCCGCCACTTCTGGAACAGAGGCGGCATGGTCGGCGACACCATCCCCACCGACATGTACATCAAGGGCACCGACATCAGAGAGACACCCAGCAGCTACGTGTACTGTCCAAGCCCATCCGGCAGCATGGTGACAAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCACAGGGGCATAATAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCCTGACCGTCGTCGATACCACACGCTCCACAAATTTCACCCTGAGCACAAGCATCGAAAGCAGCATCCCCAGCACCTACGACCCCAGCAAGTTCAAGGAGTACACACGCCACGTCGAAGAATACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTCTGCACCGTGACCCTGACCACCGACGTCATGAGCTACATCCACACCATGAACAGCAGCATCCTCGATAACTGGAACTTCGCCGTGGCCCCCCCCCCCAGCGCATCCCTCGTGGATACCTATCGCTATCTGCAGAGCGCCGCAATCACCTGCCAGAAGGACGCCCCCGCCCCCGAGAAGAAGGACCCCTACGATGGCCTGAAGTTCTGGAACGTCGATCTGCGCGAGAAGTTCTCCCTGGAGCTGGACCAGTTCCCCCTCGGCCGCAAGTTCCTCCTCCAGGCACGCGTGCGCCGCCGCCCCACCATCGGCCCACGCAAGCGCCCCGCCGCCAGCACCAGCAGCAGCAGCGCCACCAAGCACAAGCGCAAGCGCGTCAGCAAGTGA
配列２０（配列番号２０）：
ATGCCCAGCGTCGCCAAGGTCGTGAACACCGACGACTACGTCACCCGCACCGGGATCTACTACTACGCCGGGTCCAGCCGCCTGCTGACCGTGGGCCACCCCTACTTCAAGGTCGGCATGAACGGCGGGCGCAAGCAGGATATCCCCAAGGTCAGCGCCTACCAGTACCGCGTGTTCCGCGTCACCCTCCCAGACCCCAACAAGTTCTCCATCCCCGACGCCAGCCTGTACAACCCCGAGACCCAGCGCCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCGTCGAAGTCGGGCGCGGGCAGCCCCTCGGCGTCGGCATCTCCGGCCACCCCCTGTACAACCGCCAGGACGACACCGAGAATAGCCCCTTCAGCAGCACAACAAACAAGGATTCCCGCGACAACGTCAGCGTCGACTACAAGCAGACCCAGCTCTGTATCATCGGGTGCGTCCCAGCAATCGGCGAACACTGGGGCAAGGGCAAGGCCTGTAAGCCAAACAACGTGAGCACCGGCGATTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAATACACCCATCGAAGACGGCGACATGATCGACACCGGGTACGGCGCCATGGATTTCGGCGCCCTCCAGGAGACAAAGTCCGAAGTCCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTCCAGATGAGCGCCGACGTCTACGGCGATTCCATGTTCTTCTGCCTGCGCCGCGAGCAGCTCTTCGCCCGCCACTTCTGGAACCGCGGCGGCATGGTCGGCGATGCAATCCCCGCACAGCTCTACATCAAGGGGACCGACATCCGCGCCAATCCAGGCTCCAGCGTGTATTGTCCAAGCCCATCCGGCAGCATGGTGACAAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCACAGGGGCATAATAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCCTGACCGTCGTCGATACCACACGCTCCACAAATTTCACCCTGAGCACAAGCACCGACAGCACCGTGCCCGCCGTGTACGACAGCAATAAGTTCAAGGAGTACACACGCCACGTCGAAGAATACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTCTGCACCGTGACCCTGACCACCGACGTCATGAGCTACATCCACACCATGAACAGCAGCATCCTCGATAACTGGAACTTCGCCGTGGCCCCCCCCCCCAGCGCATCCCTCGTGGATACCTATCGCTATCTGCAGAGCGCCGCAATCACCTGCCAGAAGGACGCCCCCGCCCCCGAGAAGAAGGACCCCTACGATGGCCTGAAGTTCTGGAACGTCGATCTGCGCGAGAAGTTCTCCCTGGAGCTGGACCAGTTCCCCCTCGGCCGCAAGTTCCTCCTCCAGGCACGCGTGCGCCGCCGCCCCACCATCGGCCCACGCAAGCGCCCCGCCGCCAGCACCAGCAGCAGCAGCGCCACCAAGCACAAGCGCAAGCGCGTCAGCAAGTGA
配列２１（配列番号２１）：
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配列２２（配列番号２２）：
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配列２３（配列番号２３）：
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配列２４（配列番号２４）：
ATGCCCAGCGTCGCCAAGGTCGTGAACACCGACGACTACGTCACCCGCACCGGGATCTACTACTACGCCGGGTCCAGCCGCCTGCTGACCGTGGGCCACCCCTACTTCAAGGTCGGCATGAACGGCGGGCGCAAGCAGGATATCCCCAAGGTCAGCGCCTACCAGTACCGCGTGTTCCGCGTCACCCTCCCAGACCCCAACAAGTTCTCCATCCCCGACGCCAGCCTGTACAACCCCGAGACCCAGCGCCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCGTCGAAGTCGGGCGCGGGCAGCCCCTCGGCGTCGGCATCTCCGGCCACCCCCTGTACAACCGCCAGGACGACACCGAGAATAGCCCCTTCAGCAGCACAACAAACAAGGATTCCCGCGACAACGTCAGCGTCGACTACAAGCAGACCCAGCTCTGTATCATCGGGTGCGTCCCAGCAATCGGCGAACACTGGGGCAAGGGCAAGGCCTGTAAGCCAAACAACGTGAGCACCGGCGATTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAATACACCCATCGAAGACGGCGACATGATCGACACCGGGTACGGCGCCATGGATTTCGGCGCCCTCCAGGAGACAAAGTCCGAAGTCCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTCCAGATGAGCGCCGACGTCTACGGCGATTCCATGTTCTTCTGCCTGCGCCGCGAGCAGCTCTTCGCCCGCCACTTCTGGAACAGAGGCGGCATGGTCGGCGACACCATCCCCACCGACATGTACATCAAGGGCACCGACATCAGAGAGACACCCAGCAGCTACGTGTACTGTCCAAGCCCATCCGGCAGCATGGTGACAAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCACAGGGGCATAATAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCCTGACCGTCGTCGATACCACACGCTCCACAAATTTCACCCTGAGCACAAGCACCGAAACAGCCATACCTGCTGTATATAGCCCTACAAAGTTCAAGGAGTACACACGCCACGTCGAAGAATACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTCTGCACCGTGACCCTGACCACCGACGTCATGAGCTACATCCACACCATGAACAGCAGCATCCTCGATAACTGGAACTTCGCCGTGGCCCCCCCCCCCAGCGCATCCCTCGTGGATACCTATCGCTATCTGCAGAGCGCCGCAATCACCTGCCAGAAGGACGCCCCCGCCCCCGAGAAGAAGGACCCCTACGATGGCCTGAAGTTCTGGAACGTCGATCTGCGCGAGAAGTTCTCCCTGGAGCTGGACCAGTTCCCCCTCGGCCGCAAGTTCCTCCTCCAGGCACGCGTGCGCCGCCGCCCCACCATCGGCCCACGCAAGCGCCCCGCCGCCAGCACCAGCAGCAGCAGCGCCACCAAGCACAAGCGCAAGCGCGTCAGCAAGTGA
配列２５（配列番号２５）：
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配列２６（配列番号２６）：
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配列２７（配列番号２７）：
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配列２８（配列番号２８）：
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配列２９（配列番号２９）：
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配列３０（配列番号３０）：
ATGCCCAGCGTCGCCAAGGTCGTGAACACCGACGACTACGTCACCCGCACCGGGATCTACTACTACGCCGGGTCCAGCCGCCTGCTGACCGTGGGCCACCCCTACTTCAAGGTCGGCATGAACGGCGGGCGCAAGCAGGATATCCCCAAGGTCAGCGCCTACCAGTACCGCGTGTTCCGCGTCACCCTCCCAGACCCCAACAAGTTCTCCATCCCCGACGCCAGCCTGTACAACCCCGAGACCCAGCGCCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCGTCGAAGTCGGGCGCGGGCAGCCCCTCGGCGTCGGCATCTCCGGCCACCCCCTGTACAACCGCCAGGACGACACCGAGAATAGCCCCTTCAGCAGCACAACAAACAAGGATTCCCGCGACAACGTCAGCGTCGACTACAAGCAGACCCAGCTCTGTATCATCGGGTGCGTCCCAGCAATCGGCGAACACTGGGGCAAGGGCAAGGCCTGTAAGCCAAACAACGTGAGCACCGGCGATTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAATACACCCATCGAAGACGGCGACATGATCGACACCGGGTACGGCGCCATGGATTTCGGCGCCCTCCAGGAGACAAAGTCCGAAGTCCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTCCAGATGAGCGCCGACGTCTACGGCGATTCCATGTTCTTCTGCCTGCGCCGCGAGCAGCTCTTCGCCCGCCACTTCTGGAACCGCGGCGGCATGGTCGGCGATGCAATCCCCGCACAGCTCTACATCAAGGGGACCGACATCCGCGCCAATCCAGGCTCCAGCGTGTATTGTCCAAGCCCATCCGGCAGCATGGTGACAAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCACAGGGGCATAATAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCCTGACCGTCGTCGATACCACACGCTCCACAAATTTCACCCTGAGCACAAGCATCGAAAGCAGCATCCCCAGCACCTACGACCCCAGCAAGTTCAAGGAGTACACACGCCACGTCGAAGAATACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTCTGCACCGTGACCCTGACCACCGACGTCATGAGCTACATCCACACCATGAACAGCAGCATCCTCGATAACTGGAACTTCGCCGTGGCCCCCCCCCCCAGCGCATCCCTCGTGGATACCTATCGCTATCTGCAGAGCGCCGCAATCACCTGCCAGAAGGACGCCCCCGCCCCCGAGAAGAAGGACCCCTACGATGGCCTGAAGTTCTGGAACGTCGATCTGCGCGAGAAGTTCTCCCTGGAGCTGGACCAGTTCCCCCTCGGCCGCAAGTTCCTCCTCCAGGCACGCGTGCGCCGCCGCCCCACCATCGGCCCACGCAAGCGCCCCGCCGCCAGCACCAGCAGCAGCAGCGCCACCAAGCACAAGCGCAAGCGCGTCAGCAAGTGA
配列３１（配列番号３１）：
MVYLPPPSVAKVVNTDDYVTRTGIYYYAGSSRLLTVGHPYFKVPVNGGRKQEIPKVSAYQYRVFRVSLPDPNKFGLPDPSLYNPDTQRLVWACIGVEIGRGQPLGVGVSGHPLYNRLDDTENSHFSSAVNTQDSRDNVSVDYKQTQLCIIGCVPAMGEHWAKGKACKSTTVQQGDCPPLELVNTAIEDGDMIDTGYGAMDFRTLQETKSEVPLDICQSVCKYPDYLQMSADVYGDSMFFCLRKEQLFARHFWNRGGMVGDTIPSELYIKGTDIRDRPGTHVYSPSPSGSMVSSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGICWHNQLFITVVDTTRSTNFTLSACTETAIPAVYSPTKFKEYTRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMAYIHTMNPAILDNWNIGVTPPPSASLVDTYRYLQSAAIACQKDAPAPEKKDPYDDLKFWNVDLKEKFSTELDQFPLGRKFLLQVGARRRPTIGPRKRPASAKSSSSASKHKRKRVSK
配列３２（配列番号３２）：
ATGGTGTATTTGCCACCCCCTTCTGTGGCGAAGGTTGTCAATACAGATGATTATGTAACACGTACAGGCATATATTATTATGCTGGAAGCTCTCGCTTATTAACAGTAGGGCATCCTTATTTTAAGGTACCTGTAAATGGTGGCCGCAAGCAGGAAATACCTAAGGTGTCTGCATATCAGTATAGGGTATTTAGGGTATCCCTACCTGATCCTAATAAGTTTGGCCTTCCGGATCCTTCCCTTTATAATCCTGACACACAACGCCTGGTATGGGCCTGTATAGGTGTGGAAATTGGTAGAGGCCAGCCATTGGGCGTTGGTGTTAGTGGACATCCTTTATATAATAGATTGGATGATACTGAAAATTCACATTTTTCCTCTGCTGTTAATACACAGGACAGTAGGGACAATGTGTCTGTGGACTATAAGCAGACACAGTTATGTATTATAGGCTGTGTTCCTGCTATGGGAGAGCACTGGGCAAAGGGCAAGGCCTGTAAGTCCACTACTGTACAACAGGGCGATTGTCCACCATTAGAATTAGTTAATACTGCAATTGAGGATGGCGATATGATAGATACAGGCTATGGAGCCATGGACTTTCGTACATTGCAGGAAACCAAAAGTGAGGTACCACTAGATATTTGCCAATCCGTGTGTAAATATCCTGATTATTTGCAGATGTCTGCTGATGTATATGGGGACAGTATGTTTTTTTGTTTGCGCAAGGAACAGTTATTTGCCAGACACTTTTGGAATAGAGGTGGCATGGTGGGCGACACAATACCTTCAGAGTTATATATTAAAGGCACGGATATACGTGATCGTCCTGGTACTCATGTATATTCCCCTTCCCCAAGTGGCTCTATGGTTTCTTCTGATTCCCAGTTGTTTAATAAGCCCTATTGGTTGCATAAGGCCCAGGGACACAATAATGGCATTTGTTGGCATAACCAGTTGTTTATTACTGTGGTGGACACTACACGTAGTACTAATTTTACATTGTCTGCCTGCACCGAAACAGCCATACCTGCTGTATATAGCCCTACAAAGTTTAAGGAATATACTAGGCATGTGGAGGAATATGATTTACAATTTATATTTCAGTTGTGTACTATCACATTAACTGCAGACGTTATGGCCTACATCCATACTATGAATCCTGCAATTTTGGACAATTGGAATATAGGCGTTACCCCTCCACCATCTGCAAGCTTGGTGGACACGTATAGGTATTTACAATCAGCAGCTATAGCATGTCAGAAGGATGCTCCTGCACCTGAAAAAAAGGATCCCTATGACGATTTAAAATTTTGGAATGTTGATTTAAAGGAAAAGTTTAGTACAGAACTAGATCAGTTTCCTTTGGGGCGCAAATTTTTACTACAGGTAGGGGCTCGCAGACGTCCTACTATAGGCCCTCGCAAACGCCCTGCATCAGCTAAATCGTCTTCCTCAGCCTCTAAACACAAACGGAAACGTGTGTCCAAGTAA
配列３３（配列番号３３）：
PMSGGRKQG
配列３４（配列番号３４）：
LSGHPLYNRLDDTENSPFSSNKNPKDSRDNVAVDC
配列３５（配列番号３５）：
AKGKSCKPTNVQQ
配列３６（配列番号３６）：
TDSTVPAVYDSN
配列３７（配列番号３７）：
PVNGGRKQE
【実施例】
【００６９】
発明を実施するための具体的な様式
実施例を参照して本発明が以下にさらに記載されるが、当該実施例は、本発明を例証するためにのみ使用されるものであり、本発明を限定するものではない。
【００７０】
特記しない限り、本発明において使用する分子生物学的実験方法および免疫学的アッセイは、実質的に、Sambrook J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989、およびF. M. Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995中に記載される方法に従って行ない、制限酵素は製造元推奨の条件下において使用する。当業者には、当該実施例が本発明を例証するために使用されるものであり、本発明の保護範囲の限定を意図するものではないことが理解される。
【００７１】
実施例１．変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の発現および精製
発現ベクターの構築
多部位変異誘発を目的として、ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質由来のセグメントを含む変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質をコードする発現ベクターをＰＣＲによって構築し、最初に使用した鋳型は、プラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ３９Ｎ１５Ｃであった（Ｎ末端の１５個のアミノ酸が切断されたＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質をコードする；表２中では３９Ｌ１Ｎ１５と略記される）。各ＰＣＲにおける鋳型およびプライマーは表２中に示される通りであり、ＰＣＲの増幅条件は以下の通りとした：変性を９４℃において１０分間；２５サイクル（変性を９４℃において５０秒間、アニーリングを所与の温度において特定時間、伸長を７２℃において７．５分間）；最終の伸長を７２℃において１０分間。アニーリングの温度および時間が表２中に示される。使用したＰＣＲプライマーの配列が表３中に示される。
【００７２】
増幅産物（５０μＬ）に、制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（ＭＢＩ）、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＦＤ１７０４、２５００Ｕ／チューブ）２μＬを添加し、得られた混合物を３７℃において６０分間インキュベートした。消化産物１０μＬを使用して、塩化カルシウム法で調製されたコンピテント大腸菌ＥＲ２５６６（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入）４０μＬを形質転換した。形質転換した大腸菌を、カナマイシン含有（最終濃度２５μｇ／ｍＬ、以降でも同様）の固体ＬＢ培地（ＬＢ培地の成分：ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、以降でも同様）上に広げ、単一コロニーが明瞭に観察されるまで、３７℃において１０〜１２時間静置培養した。単一コロニーを選んで、液体ＬＢ培地（カナマイシン含有）４ｍＬを入れたチューブ中に播種し、２２０ｒｐｍで３７℃において１０時間振とう培養した後、細菌溶液１ｍｌを取り、−７０℃において保存した。大腸菌からプラスミドを抽出し、プラスミド中に挿入された目的断片のヌクレオチド配列をＴ７プライマーを使用してシーケンシングした。シーケンシング結果から、構築したプラスミド（発現ベクター）中に挿入された目的断片のヌクレオチド配列は配列番号１６であり、これによってコードされるアミノ酸配列は配列番号４であることが示された（対応するタンパク質をＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ１と命名した）。変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１は、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の５３〜６１位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質の５３〜６１位由来のアミノ酸残基で置換されている点で、ＨＰＶ３９Ｎ１５と異なる。
【００７３】
Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ（Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 2009;6:343-5. doi: 10.1038/nmeth.1318）を使用して、他の変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質をコードする発現ベクターを構築した（ここで、この変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質は、ＨＰＶ６８  Ｌ１由来の特定セグメントおよびＨＰＶ７０Ｌ１由来の特定セグメントを含む）。簡潔には、変異を含む短い断片と変異を含まない長い断片とをＰＣＲによって得て、次いでＧｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙシステムを使用してこれら２つの断片をライゲーションし、環を形成した。使用した最初の鋳型は、プラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ３９Ｎ１５（Ｎ末端の１５個のアミノ酸が切断されたＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質をコードする；表２中では３９Ｌ１Ｎ１５と略記される）、プラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ６８Ｌ１（ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質をコードする；表２中では６８Ｌ１Ｎ０と略記される）、プラスミドｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４（変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４をコードする；表２中ではＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４と略記される）、およびプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ７０Ｎ１０（Ｎ末端の１０個のアミノ酸が切断されたＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質をコードする；表２中では７０Ｌ１Ｎ１０と略記される）を含むものであった。各ＰＣＲにおける鋳型およびプライマーは表２中に示される通りであり、短い断片を増幅するためのＰＣＲの増幅条件は以下の通りとした：変性を９４℃において１０分間；２５サイクル（変性を９４℃において５０秒間、アニーリングを所与の温度において特定時間、伸長を７２℃において１分間）；最終の伸長を７２℃において１０分間。長い断片を増幅するためのＰＣＲの増幅条件は以下の通りとした：変性を９４℃において１０分間；２５サイクル（変性を９４℃において５０秒間、アニーリングを所与の温度において特定時間、伸長を７２℃において７．５分間）；最終の伸長を７２℃において１０分間。使用したＰＣＲプライマーの配列が表３中に示される。増幅産物を電気泳動に供し、次いで、ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＥＹＯＴＩＭＥ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ００３３）を使用して目的断片を回収し、その濃度を求めた。増幅によって得た短い断片と長い断片とをモル比２：１で混合し（総体積３μＬ）、次いで３μＬの２  Ｘ  Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢから購入；Ｔ５  エキソヌクレアーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ含有）を添加して、５０℃において１時間反応させた。
【００７４】
繋ぎ合わせた産物（６μＬ）を使用して、塩化カルシウム法で調製されたコンピテント大腸菌ＥＲ２５６６（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入）４０μＬを形質転換した。形質転換した大腸菌をカナマイシン含有固体ＬＢ培地上に広げ、単一コロニーが明瞭に観察されるまで３７℃で１０〜１２時間にわたって静置培養した。単一コロニーを選んで、液体ＬＢ培地（カナマイシン含有）４ｍＬを入れたチューブ中に播種し、２２０ｒｐｍで３７℃において１０時間振とう培養し、次いで細菌溶液１ｍｌを取って−７０℃において保存した。大腸菌からプラスミドを抽出し、プラスミド中に挿入された目的断片のヌクレオチド配列をＴ７プライマーを使用してシーケンシングした。シーケンシング結果から、構築したプラスミド（発現ベクター）中に挿入された目的断片のヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４であり、これらによってコードされるアミノ酸配列はそれぞれ配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、および１２であることが示された（これらに対応するタンパク質をそれぞれＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５と命名した）。
【００７５】
変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２は、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の１１７〜１５０位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質の１１７〜１５１位由来のアミノ酸残基で置換されている点で、ＨＰＶ３９Ｎ１５と異なる。変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３は、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の１６９〜１８１位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８２位由来のアミノ酸残基で置換されている点で、ＨＰＶ３９Ｎ１５と異なる。変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４は、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の２６９〜２８８位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質の２７０〜２８９位由来のアミノ酸残基で置換されている点で、ＨＰＶ３９Ｎ１５と異なる。変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５は、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５８位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質の３４８〜３５９位由来のアミノ酸残基で置換されている点で、ＨＰＶ３９Ｎ１５と異なる。
【００７６】
変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１は、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の２６９〜２８８位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質の２７０〜２８９位由来のアミノ酸残基で置換されており、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の５３〜６１位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質の５３〜６１位由来のアミノ酸残基で置換されている点で、ＨＰＶ３９Ｎ１５と異なる。変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２は、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の２６９〜２８８位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質の２７０〜２８９位由来のアミノ酸残基で置換されており、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の１１７〜１４０位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質の１１７〜１４１位由来のアミノ酸残基で置換されている点で、ＨＰＶ３９Ｎ１５と異なる。変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３は、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の２６９〜２８８位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質の２７０〜２８９位由来のアミノ酸残基で置換されており、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の１６９〜１８１位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８２位由来のアミノ酸残基で置換されている点で、ＨＰＶ３９Ｎ１５と異なる。変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５は、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の２６９〜２８８位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質の２７０〜２８９位由来のアミノ酸残基で置換されており、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５８位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質の３４８〜３５９位由来のアミノ酸残基で置換されている点で、ＨＰＶ３９Ｎ１５と異なる。
【００７７】
【表２】
2021526851.tif 000004
【００７８】
【表３】
2021526851.tif 000005
【００７９】
大スケールでの変異タンパク質の発現
組換えプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５をそれぞれ含む大腸菌溶液を−７０℃の冷蔵庫から取り出し、１００ｍＬのカナマイシン含有ＬＢ液体培地中に接種して、２００ｒｐｍにおいて３７℃で約８時間インキュベートした。次いで、培養物を５００ｍＬのカナマイシン含有ＬＢ培地に移し（細菌溶液１ｍｌを移し）、さらにインキュベートした。細菌濃度がＯＤ６００約０．６に達したら、培養温度を下げて２５℃とし、５００μＬのＩＰＴＧを各培養ボトルに添加した。インキュベーションをさらに８時間行なった。インキュベーション終了後、遠心分離によって細菌を集めた。Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５タンパク質をそれぞれ発現している細菌が得られた。
【００８０】
変異タンパク質を発現している細菌の破壊
得られた細菌を、細菌１ｇに対して溶解バッファー（２０ｍＭトリスバッファー、ｐＨ７．２、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）１０ｍＬの比率で再懸濁した。超音波装置を使用して３０分間かけて細菌を破壊した。破壊された細菌を含有する溶解溶液を１３５００ｒｐｍ（３００００ｇ）で１５分間遠心分離して、上清（すなわち、破壊された細菌の上清）を得た。
【００８１】
クロマトグラフィーによる変異タンパク質の精製
機器：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（すなわち、元のＡｍｅｒｓｈａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）製のＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００  分取液体クロマトグラフィーシステム
クロマトグラフィー媒体：ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、ＣＨＴ−ＩＩ（Ｂｉｏ−ＲＡＤから購入）、およびＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）
バッファー：バッファーＡ（２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ８．０、２０ｍＭ  ＤＴＴ）；およびバッファーＢ（２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ８．０、２０ｍＭ  ＤＴＴ、２Ｍ  ＮａＣｌ）。以下の溶出プロトコールにおいて使用した異なる濃度のＮａＣｌを含有するバッファーは、バッファーＡとバッファーＢとを特定の比率で混合することによって調製した。
【００８２】
試料：上述されるとおりに得られた、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５をそれぞれ含有する破壊された細菌の上清。
【００８３】
溶出プロトコール：
（１）破壊された細菌の上清のＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗによる陽イオン交換精製：試料をカラムに載せ、次いで、４００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファー（８０％バッファーＡ＋２０％バッファーＢ）を用いて望ましくないタンパク質を溶出させ、続いて８００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファー（６０％バッファーＡ＋４０％バッファーＢ）を用いて目的のタンパク質を溶出させ、８００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファーを用いて、溶出させた画分を集めた。
【００８４】
（２）工程（１）で得られた溶出画分のＣＨＴＩＩ（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）によるクロマトグラフィー精製：工程（１）で得られた溶出画分を希釈してＮａＣｌ濃度を０．５Ｍに下げ、試料をカラムに載せ、次いで、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファー（７５％バッファーＡ＋２５％バッファーＢ）を用いて望ましくないタンパク質を溶出させ、続いて１０００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファー（５０％バッファーＡ＋５０％バッファーＢ）を用いて目的のタンパク質を溶出させ、１０００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファーを用いて、溶出させた画分を集めた。
【００８５】
（３）工程（２）で得られた溶出画分のＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）によるクロマトグラフィー精製：試料をカラムに載せ、次いで、１０００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファーを用いて望ましくないタンパク質を溶出させ、続いて２００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファー（９０％バッファーＡ＋１０％バッファーＢ）を用いて目的のタンパク質を溶出させ、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファーを用いて、溶出させた画分を集めた。
【００８６】
工程（３）で得られた溶出画分１５０μＬを３０μＬの６×ローディングバッファー（その１Ｌは、３００ｍｌの１Ｍ  ＴＢ  ６．８、６００ｍｌの１００％グリセリン、１２０ｇのＳＤＳ、６ｇのブロモフェノールブルー、および５０ｍｌのβ−メルカプトエタノールを含有）に添加した。得られた溶液を十分に混合して、８０℃の水浴中で１０分間、十分にインキュベートした。次いで、得られた試料の１０μｌを、１２０Ｖにて１２０分間、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブリリアントブルーによって電気泳動バンドを染色した。電気泳動の結果が図１中に示される。結果は、上述される精製工程の後、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５の純度が９０％を超えたことを示した。
【００８７】
同様の方法により、大腸菌およびプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ３９Ｎ１５を使用してＨＰＶ３９Ｎ１５タンパク質を調製および精製し、大腸菌およびプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ６８Ｌ１Ｎ０を使用してＨＰＶ６８Ｎ０タンパク質を調製および精製し、大腸菌およびプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ７０Ｎ１０を使用してＨＰＶ７０Ｎ１０タンパク質を調製および精製した。
【００８８】
変異タンパク質のウェスタンブロットアッセイ
上述される方法によって精製したＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５タンパク質を、電気泳動に供した。電気泳動後、ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質に対する広域スペクトル抗体４Ｂ３を使用してウェスタンブロットアッセイを行ない、結果を図２中に示す。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５が広域スペクトル抗体４Ｂ３によって特異的に認識され得たことを示した。
【００８９】
実施例２：ＨＰＶウイルス様粒子の集合と粒子の形態学的検出
ＨＰＶウイルス様粒子の集合
所与の体積（約２ｍｌ）のタンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、またはＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５を、（１）２Ｌの保存バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）中、（２）２Ｌの再生バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）中、および（３）２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ中に、連続的に透析した。透析は、３種のバッファーそれぞれについて１２時間行なった。
【００９０】
同様の方法により、ＨＰＶ３９Ｎ１５、ＨＰＶ６８Ｎ０、およびＨＰＶ７０Ｎ１０タンパク質を集合させて、それぞれＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ、およびＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰとした。
【００９１】
モレキュラーシーブクロマトグラフィーによる分析
透析した試料を、１１２０  Ｃｏｍｐａｃｔ  ＬＣ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたモレキュラーシーブクロマトグラフィーによる分析に供した（使用した分析カラムはＴＳＫ  Ｇｅｌ  ＰＷ５０００×ｌ  ７．８×３００ｍｍ）。分析結果が図３および図４中に示される。結果は、タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、またはＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５を含む試料の第１のタンパク質ピークが、ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ、およびＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰの場合と同等の約１３〜１４分に現れたことを示した。このことから、これらのタンパク質はいずれも集合してＶＬＰを形成できたことが示された。
【００９２】
沈降速度分析
沈降速度分析に用いた装置は、光学式検査システムとＡｎ−５０ＴｉおよびＡｎ−６０Ｔｉローターとを備えるＢｅｃｋｍａｎ  ＸＬ−Ａ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅであった。ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降係数を沈降速度法によって分析した。結果が図５Ａ〜図５Ｌ中に示される。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの沈降係数がそれぞれ１３６Ｓ、１５１Ｓ、１３８Ｓ、１４５Ｓ、１３５Ｓ、１２４Ｓ、１０８Ｓ、９９Ｓ、および１２７Ｓであったことを示した。このことから、上記で調製した変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５は、集合して、サイズおよび形態の観点において野生型ＶＬＰ（ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、１１５Ｓ；ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ、１５３Ｓ；ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ、１４４Ｓ）に類似するウイルス様粒子を形成できたことが示された。
【００９３】
ウイルス様粒子の形態学的試験
ＶＬＰを含む試料１００μＬを透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した。使用した装置はＪＥＯＬ社提供の１００ｋＶ透過電子顕微鏡（倍率１００，０００倍）であった。簡潔には、試料１３．５μＬを２％リンタングステン酸（ｐＨ７．０）でネガティブ染色し、炭素被覆銅グリッドに固定した後、ＴＥＭで観察した。結果が図６Ａ〜図６Ｌ中に示される。結果は、変異タンパク質Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ５、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５は集合してウイルス様粒子を形成でき、これらの変異タンパク質の集合によるウイルス様粒子はサイズが均一で半径が約２５〜３０ｎｍであったことを示した。野生型ＨＰＶ３９Ｎ１５、ＨＰＶ６８Ｎ０、およびＨＰＶ７０Ｎ１０の集合によるウイルス様粒子も半径が約２５〜３０ｎｍでサイズが均一であった。このことから、これらの変異タンパク質は野生型ＨＰＶ３９、ＨＰＶ６８、およびＨＰＶ７０のＬ１タンパク質と類似しており、集合して均一なサイズのＶＬＰを形成できたことが示された。
【００９４】
実施例３：ウイルス様粒子を接種したマウスの血清中における中和抗体力価の評価１
この実験において、使用したウイルス様粒子はＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰであった。
【００９５】
この実験における接種スケジュールが表４中に示される。すべてのマウス（６週齢ＢａｌＢ／ｃ雌マウス）を３つの群に分けた：アルミニウムアジュバント群１（免疫量５μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）、アルミニウムアジュバント群２（免疫量１μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）、およびアルミニウムアジュバント群３（免疫量０．２μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）。各群をさらに８つの小群に分けた。コントロール小群１および２にＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独およびＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独をそれぞれ接種し、コントロール小群３に混合ＨＰＶ３９／ＨＰＶ６８  ＶＬＰ（すなわち、ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰおよびＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰの混合物、各ＶＬＰは所与の免疫量にて）を接種した。実験小群１、２、３、４、および５にＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ５  ＶＬＰをそれぞれ接種した。
【００９６】
アルミニウムアジュバント群１〜３において、１つの小群あたり５匹のマウスに、免疫量それぞれ５μｇ、１μｇ、および０．２μｇ、注射体積１ｍＬにて、腹腔内注射により接種した。すべてのマウスに対して、０週目に１回目の接種を行ない、次いで２週目および４週目の各々において追加免疫接種を行なった。８週目に血液試料を眼窩採血（orbital bleeding）によって集め、血清中のＨＰＶ３９およびＨＰＶ６８に対する抗体の力価を分析した。分析結果が図７Ａ〜図７Ｃ中に示される。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰは、マウスにおいてＨＰＶ３９に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合よりもわずかに弱かったが、同一投与量のＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れており；マウスにおいてＨＰＶ６８に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合よりもわずかに弱かったが、同一投与量のＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れていたことを示した。このことから、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰがＨＰＶ３９およびＨＰＶ６８に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有していたことが示された。
【００９７】
【表４】
2021526851.tif 000006
【００９８】
実施例４：抗体陽転を誘発するウイルス様粒子のＥＤ５０の評価１
この実験において、使用したウイルス様粒子はＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰであった。
【００９９】
６週齢ＢａｌＢ／ｃ雌マウス（マウス８匹）に単回の腹腔内注射によってアルミニウムアジュバントを接種し、ここで、実験群にはＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰ（免疫量０．９００μｇ、０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、または０．０１１μｇ）を使用し、ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独（免疫量０．９００μｇ、０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、または０．０１１μｇ）、ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独（免疫量０．９００μｇ、０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、または０．０１１μｇ）、または混合ＨＰＶ３９／ＨＰＶ６８  ＶＬＰ（すなわち、ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰおよびＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰの混合物、各ＶＬＰは免疫量０．９００μｇ、０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、または０．０１１μｇにて）；免疫化体積は１ｍＬとした。加えて、ワクチンの希釈に使用した希釈剤をブランクコントロールとして用いた。各群のマウス８匹に接種し、接種後５週目に眼球から静脈血を集めた。血清中のＨＰＶに対する抗体を検出し、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法（Reed LJ MH. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg. 1938; 27:493-7）によって、抗体陽転を誘発する（すなわち、マウスにおいて抗体の発生を誘発する）ＥＤ５０を各試料について計算した。結果が表５〜８中に示される。
【０１００】
【表５】
2021526851.tif 000007
【０１０１】
【表６】
2021526851.tif 000008
【０１０２】
【表７】
2021526851.tif 000009
【０１０３】
【表８】
2021526851.tif 000010
【０１０４】
結果は、マウスに接種した後５週間で、マウスにおいてＨＰＶ３９に対する抗体の発生を誘発するＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰのＥＤ５０はＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合と同等となり、ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れており、ＨＰＶ６８に対する抗体の発生を誘発するＥＤ５０はＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合よりもわずかに弱かったが、ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れていたことを示した。このことから、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４  ＶＬＰがＨＰＶ６８およびＨＰＶ３９に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有していたことが示された。
【０１０５】
実施例５：ウイルス様粒子を接種したマウスの血清中における中和抗体力価の評価２
この実験において、使用したウイルス様粒子はＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰであった。
【０１０６】
この実験における接種スケジュールが表９中に示される。すべてのマウス（６週齢ＢａｌＢ／ｃ雌マウス）を３つの群に分けた：アルミニウムアジュバント群１（免疫量５μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）、アルミニウムアジュバント群２（免疫量１μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）、およびアルミニウムアジュバント群３（免疫量０．２μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）。各群をさらに８つの小群に分けた。コントロール小群１、２、および３にＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独、ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独、およびＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ単独をそれぞれ接種し、コントロール小群４に混合ＨＰＶ３９／ＨＰＶ６８／ＨＰＶ７０  ＶＬＰ（すなわち、ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ、およびＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰの混合物、各ＶＬＰは所与の免疫量にて）を接種した。実験小群１、２、３、および４にＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰをそれぞれ接種した。
【０１０７】
アルミニウムアジュバント群１〜３において、１つの小群あたり５匹のマウスに、免疫量それぞれ５μｇ、１μｇ、および０．２μｇ、注射体積１ｍＬにて、腹腔内注射により接種した。すべてのマウスに対して、０週目に１回目の接種を行ない、次いで２週目および４週目の各々において追加免疫接種を行なった。８週目に血液試料を眼窩採血によって集め、血清中のＨＰＶ３９、およびＨＰＶ６８、およびＨＰＶ７０に対する抗体の力価を分析した。分析結果が図８Ａ〜図８Ｃ中に示される。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰは、マウスにおいてＨＰＶ３９に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ３９／ＨＰＶ６８／ＨＰＶ７０  ＶＬＰの場合よりもわずかに弱かったが、同一投与量のＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合およびＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れており；マウスにおいてＨＰＶ６８に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ３９／ＨＰＶ６８／ＨＰＶ７０  ＶＬＰの場合と同等であり、同一投与量のＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合およびＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れており；マウスにおいてＨＰＶ７０に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ３９／ＨＰＶ６８／ＨＰＶ７０  ＶＬＰの場合と同等であり、同一投与量のＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合およびＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れていたことを示した。このことから、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰがＨＰＶ３９、ＨＰＶ６８、およびＨＰＶ７０に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有していたことが示された。
【０１０８】
【表９】
2021526851.tif 000011
【０１０９】
実施例６：抗体陽転を誘発するウイルス様粒子のＥＤ５０の評価２
この実験において、使用したウイルス様粒子はＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰであった。
【０１１０】
６週齢ＢａｌＢ／ｃ雌マウス（マウス８匹）に単回の腹腔内注射によってアルミニウムアジュバントを接種し、ここで、実験群にはＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰ（免疫量０．９００μｇ、０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、または０．０１１μｇ）を使用し、ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独、ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独、ＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ単独（免疫量０．９００μｇ、０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、または０．０１１μｇ）または混合ＨＰＶ３９／ＨＰＶ６８／ＨＰＶ７０  ＶＬＰ（すなわち、ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ、ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ、およびＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰの混合物、各ＶＬＰは免疫量０．９００μｇ、０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、または０．０１１μｇにて）；免疫化体積は１ｍＬとした。加えて、ワクチンの希釈に使用した希釈剤をブランクコントロールとして用いた。各群のマウス８匹に接種し、接種後５週目に眼球から静脈血を集めた。血清中のＨＰＶに対する抗体を検出し、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法（Reed LJ MH. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg. 1938; 27:493-7）によって、抗体陽転を誘発する（すなわち、マウスにおいて抗体の発生を誘発する）ＥＤ５０を各試料について計算した。結果が表１０〜１６中に示される。
【０１１１】
【表１０】
2021526851.tif 000012
【０１１２】
【表１１】
2021526851.tif 000013
【０１１３】
【表１２】
2021526851.tif 000014
【０１１４】
【表１３】
2021526851.tif 000015
【０１１５】
【表１４】
2021526851.tif 000016
【０１１６】
【表１５】
2021526851.tif 000017
【０１１７】
【表１６】
2021526851.tif 000018
【０１１８】
結果は、マウスに接種した後５週間で、マウスにおいてＨＰＶ３９に対する抗体の発生を誘発するＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰおよびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰのＥＤ５０はＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ３９／ＨＰＶ６８／ＨＰＶ７０  ＶＬＰの場合と同等であり、ＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合およびＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れており；マウスにおいてＨＰＶ６８に対する抗体の発生を誘発するＥＤ５０はＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ３９／ＨＰＶ６８／ＨＰＶ７０  ＶＬＰの場合と同等であり、ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合およびＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れており；マウスにおいてＨＰＶ７０に対する抗体の発生を誘発するＥＤ５０はＨＰＶ７０Ｎ１０  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ３９／ＨＰＶ６８／ＨＰＶ７０  ＶＬＰの場合と同等であり、ＨＰＶ３９Ｎ１５  ＶＬＰ単独の場合およびＨＰＶ６８Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れていたことを示した。このことから、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰおよびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰがＨＰＶ３９、ＨＰＶ６８、およびＨＰＶ７０に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有していたことが示された。
【０１１９】
実施例７：ウイルス様粒子の熱安定性の評価
ＨＰＶ３９Ｎ１５タンパク質、ＨＰＶ６８Ｎ０タンパク質、ＨＰＶ７０Ｎ１０タンパク質、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４タンパク質、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２タンパク質、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５タンパク質によって形成されるＶＬＰについて、その熱安定性を、ＧＥ  Ｃｏｍｐａｎｙ（すなわち、元のＭｉｃｒｏＣａｌ社）から購入した示差走査熱量計ＶＰ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣを使用して評価し、この際、タンパク質の保存バッファーをコントロールとして使用し、加熱速度１．５℃／分および温度範囲１０℃〜９０℃にてタンパク質の走査を行なった。検出結果が図９中に示される。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４タンパク質、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２タンパク質、およびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５によって形成される上記ＶＬＰがいずれも非常に高い熱安定性を有していたことを示した。
【０１２０】
実施例８：Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰおよびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの三次元構造の再構築
Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰおよびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの三次元構造を、クライオ電子顕微鏡法（ｃｒｙｏ−ＥＭ）（Wolf M, Garcea RL, Grigorieff N. et al. Proc Natl Acad Sci U S A. (2010), 107(14): 6298-303）を使用する三次元構造再構築実験によって再構築した。簡潔には、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰのクライオ電子顕微鏡（ｃｒｙｏ−ＥＭ）写真（図１０のＡ）中で、サイズが均一で直径が５０ｎｍよりも大きい粒子を６４１０個選択し、コンピュータによるオーバーラップおよび構造再構築（computer overlapping and structural reconstruction）を行なうことによって、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰの三次元構造を得た。得られた三次元構造が図１０のＢに示される（解像度は１４．５１Å）。加えて、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰのクライオ電子顕微鏡（ｃｒｙｏ−ＥＭ）写真（図１０のＣ）中で、サイズが均一で直径が５０ｎｍよりも大きい粒子を６１７個選択し、コンピュータによるオーバーラップおよび構造再構築を行なうことによって、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの三次元構造を得た。得られた三次元構造が図１０のＤに示される（解像度は１７．６４Å）。結果は、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰおよびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰがいずれも７２個のカプソメア（形態学的サブユニット、五量体）からなるＴ＝７の二十面体構造（ｈ＝１、ｋ＝２）を有していたことを示した。準等価原理に合致する従来の二十面体のウイルスカプシドとは異なり、Ｈ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ２  ＶＬＰおよびＨ３９Ｎ１５−６８Ｔ４−７０Ｓ５  ＶＬＰの構造におけるすべての構成サブユニットは五量体であり、六量体はなかった。また、これらの２種のＶＬＰは外径が約６０ｎｍであった。これらは、以前に報告された天然ＨＰＶウイルス粒子および真核生物発現系（たとえば、ポックスウイルス発現系）（Baker TS, Newcomb WW, Olson NH. et al. Biophys J. (1991), 60(6): 1445-1456. Hagensee ME, Olson NH, Baker TS, et al. J Virol. (1994), 68(7):4503-4505. Buck CB, Cheng N, Thompson CD. et al. J Virol. (2008), 82(11): 5190-7）により調製されたＨＰＶ  ＶＬＰの三次元構造に類似していた。
【０１２１】
以上に、本発明の具体的な実施形態が詳細に記載されているが、当業者には、本明細書中に開示される教示内容に従えば様々な改変および変更を加えることが可能であること、このような改変および変更も本発明の範囲に含まれることが理解される。本発明の範囲は付属の請求項およびこれの同等物によってもたらされる。
【図１】
2021526851.tif 000019
【図２】
2021526851.tif 000020
【図３】
2021526851.tif 000021
【図４】
2021526851.tif 000022
【図５Ａ】
2021526851.tif 000023
【図５Ｂ】
2021526851.tif 000024
【図５Ｃ】
2021526851.tif 000025
【図５Ｄ】
2021526851.tif 000026
【図５Ｅ】
2021526851.tif 000027
【図５Ｆ】
2021526851.tif 000028
【図５Ｇ】
2021526851.tif 000029
【図５Ｈ】
2021526851.tif 000030
【図５Ｉ】
2021526851.tif 000031
【図５Ｊ】
2021526851.tif 000032
【図５Ｋ】
2021526851.tif 000033
【図５Ｌ】
2021526851.tif 000034
【図６Ａ】
2021526851.tif 000035
【図６Ｂ】
2021526851.tif 000036
【図６Ｃ】
2021526851.tif 000037
【図６Ｄ】
2021526851.tif 000038
【図６Ｅ】
2021526851.tif 000039
【図６Ｆ】
2021526851.tif 000040
【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
2021526851.tif 000043
【図６Ｊ】
2021526851.tif 000044
【図６Ｋ】
2021526851.tif 000045
【図６Ｌ】
2021526851.tif 000046
【図７Ａ】
2021526851.tif 000047
【図７Ｂ】
2021526851.tif 000048
【図７Ｃ】
2021526851.tif 000049
【図８Ａ】
2021526851.tif 000050
【図８Ｂ】
2021526851.tif 000051
【図８Ｃ】
2021526851.tif 000052
【図９】
2021526851.tif 000053
【図１０Ａ】
2021526851.tif 000054
【図１０Ｂ】
2021526851.tif 000055
【図１０Ｃ】
2021526851.tif 000056
【図１０Ｄ】
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【配列表】
2021526851000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年2月5日(2021.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントであって、野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質との比較において、
（Ｉ）前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質は、以下の変異：
（１）Ｎ末端における１〜２５個のアミノ酸の切断；および
（２）前記野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の２６９〜２８８位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換；
を有する、または、
（ＩＩ）前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質は、前記（１）および（２）中に定義される変異を有し、さらに以下の変異：
（３）（ａ）前記野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の１１７〜１４０位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換；もしくは
（ｂ）前記野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の１６９〜１８１位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換；もしくは
（ｃ）前記野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５８位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換
を有し、
前記バリアントは、たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のアミノ酸が置換、付加、または欠失されているという点でのみ、前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質と異なり、かつ、前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質の機能、すなわち少なくとも２つのＨＰＶ型に対する中和抗体の発生を誘発する能力を保持する、
変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアント。
【請求項２】
前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質は、前記野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質との比較において、Ｎ末端の３、５、８、１０、１２、１５、１８、２０、または２２個のアミノ酸が切断されている、請求項１に記載の変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアント。
【請求項３】
前記第２の型の野生型ＨＰＶは、ＨＰＶ６８であり；
好ましくは、前記（２）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質の２７０〜２８９位のアミノ酸残基である、
請求項１または２に記載の変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアント。
【請求項４】
前記第３の型の野生型ＨＰＶは、ＨＰＶ７０であり；
好ましくは、前記（３）（ａ）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質の１１７〜１４１位のアミノ酸残基であり；
好ましくは、前記（３）（ｂ）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質の１７０〜１８２位のアミノ酸残基であり；
好ましくは、前記（３）（ｃ）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質の３４８〜３５９位のアミノ酸残基である、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアント。
【請求項５】
前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質は、下記項目：
（ｉ）前記野生型ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有する；
（ｉｉ）前記野生型ＨＰＶ６８  Ｌ１タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有する；
（ｉｉｉ）前記野生型ＨＰＶ７０  Ｌ１タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を有する
のうちの１つ以上によって特徴づけられる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアント。
【請求項６】
前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質は、配列番号７、１０、１１、および１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアント。
【請求項７】
単離された核酸であって、請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントをコードし、
好ましくは、前記単離された核酸は、配列番号１９、２２、２３、および２４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、単離された核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項９】
請求項７に記載の単離された核酸および／または請求項８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質もしくはそのバリアントを含む、またはこれからなる、ＨＰＶウイルス様粒子。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質もしくはそのバリアント、または請求項７に記載の単離された核酸、または請求項３に記載のベクター、または請求項９に記載の宿主細胞、または請求項１０に記載のＨＰＶウイルス様粒子を含む、組成物。
【請求項１２】
医薬組成物またはワクチンであって、請求項１０に記載のＨＰＶウイルス様粒子と、任意に、製薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含み、
好ましくは、前記ＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を予防するのに有効な量で存在し；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型による感染であり；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染は、ＨＰＶ３９感染、ＨＰＶ６８感染、ＨＰＶ７０感染、およびこれらの任意の組み合わせから選択され；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患は、子宮頚がんおよび尖圭コンジローマからなる群より選択される、医薬組成物またはワクチン。
【請求項１３】
請求項１に記載の変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントの調製方法であって、前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを宿主細胞において発現させる工程と、次いで、前記宿主細胞の培養物から前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを回収する工程とを含み；
好ましくは、前記宿主細胞は、大腸菌であり；
好ましくは、前記方法は、前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを大腸菌において発現させる工程と、次いで、前記大腸菌の溶解物上清を精製することによって前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを得る工程；
好ましくは、クロマトグラフィーによって前記大腸菌の溶解物上清から前記変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを回収する工程とを含み；
好ましくは、前記クロマトグラフィーは、陽イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびこれらの任意の組み合わせから選択される、方法。
【請求項１４】
ワクチンの調製方法であって、請求項１０に記載のＨＰＶウイルス様粒子と、製薬学的に許容される担体および／または賦形剤と、を組み合わせる工程を含む、方法。
【請求項１５】
ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を予防するための組成物またはワクチンであって、請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質もしくはそのバリアントまたは請求項１０に記載のＨＰＶウイルス様粒子を含み、
好ましくは、前記ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型による感染であり；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染は、ＨＰＶ３９感染、ＨＰＶ６８感染、ＨＰＶ７０感染、およびこれらの任意の組み合わせのうち１種以上から選択され；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患は、子宮頚がんおよび尖圭コンジローマからなる群より選択される、組成物またはワクチン。
【国際調査報告】
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2021526851.tif 000059
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