(57)【要約】  本開示は、クロマトグラフィカラムを操作する方法を目的とする。この方法は、カラム充填を含むクロマトグラフィカラムの操作中に、カラム出口信号及び累積流量パラメータを、少なくとも１つの移動相遷移フロントの２つ以上の間隔で収集することを含む。モデルガンマ累積分布曲線は、少なくとも１つの移動相遷移フロントについての収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータに基づいて決定される。モデルガンマ累積分布曲線のパラメータを使用して、少なくとも１つの移動相遷移フロントについての理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値を計算し、計算されたＨＥＴＰ値に基づいてクロマトグラフィカラム充填の品質を評価する。ルーチンのカラムモニタリング中に、ＨＥＴＰの有害な傾向が観察されるか、又は管理限界を超えた場合、溶出液の製品品質、カラムプロセス性能、及び／又は不純物除去データを評価して、特定されたバッチの製品品質を確保する必要がある。製品品質又はカラム性能のいずれかが設定された基準に適合しない場合は、カラムのコンディショニング、再充填又は交換などの適切な是正処置を行い、更なる使用のためにリリースする前に品質評価を行う必要がある。
2021522477.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィカラムを操作する方法であって、前記方法が、
カラム充填を含む前記クロマトグラフィカラムの第１の操作中に、カラム出口信号及び累積流量パラメータを、少なくとも１つの移動相遷移フロントの２つ以上の間隔で収集する工程と、
前記少なくとも１つの移動相遷移フロントについての収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータに基づいて、上昇遷移フロントについては式Ｉａ又は下降遷移フロントについては式Ｉｂを使用して、モデルガンマ累積分布曲線を決定する工程であって、式Ｉａ又は式Ｉｂは、
【数１】
2021522477.tif 000027
であり、各式中、Ｃは所与のＶのカラム出口信号であり、Ｖはカラム体積で除算された累積流量であり、ｋ、θ、及びＶｉは曲線を画定するために使用される形状、スケール、及びオフセットパラメータである、モデルガンマ累積分布曲線を決定する工程と、
式ＩＩ及びモデルガンマ累積分布曲線のパラメータｋ、θ、及びＶｉを使用して、少なくとも１つの移動相遷移フロントについての理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値を計算する工程であって、式ＩＩは、
【数２】
2021522477.tif 000028
式中、
μ＝ｋθ＋Ｖｉ
【数３】
2021522477.tif 000029
Ｌ＝カラム長さである、理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値を計算する工程と、
前記計算されたＨＥＴＰ値に基づいて、クロマトグラフィカラム充填の品質を評価する工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記評価に基づいて、クロマトグラフィカラムのコンディショニング、交換、又は再充填を行うことを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記クロマトグラフィカラム充填の１つ又は複数の後続の使用中に、対応する移動相遷移フロントの２つ以上の間隔でカラム出口信号及び累積流量パラメータを収集する工程と、
前記クロマトグラフィカラム充填の前記１つ又は複数の後続の各使用中に、前記収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータを使用して、前記決定及び前記計算を実行する工程と、
前記実行に基づいて、前記１つ又は複数の後続の各使用中に、前記クロマトグラフィカラム充填のＨＥＴＰ値を決定する工程と、
前記２つ以上の後続の使用の前記クロマトグラフィカラム充填の前記決定されたＨＥＴＰ値の傾向を収集する工程と、
前記収集された傾向に基づいて、前記クロマトグラフィカラム充填の品質の変化を特定する工程とを更に含み、前記クロマトグラフィカラムのコンディショニング、交換又は再充填は、前記特定に基づくものとなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記カラム充填の前記１つ又は複数の後続の使用における前記クロマトグラフィカラム充填の前記ＨＥＴＰ値の増加が、前記カラム充填の１つ又は複数の以前の使用における前記クロマトグラフィカラム充填の前記ＨＥＴＰ値と比較して、前記クロマトグラフィカラム充填の品質の低下を特定する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記カラム充填の前記第１の操作中に、２つ以上の異なる移動相遷移フロントのカラム出口信号及び累積流量パラメータを収集し、前記方法が、
前記２つ以上の異なる移動相遷移フロントのそれぞれについて収集された前記カラム出口信号及び累積流量パラメータを使用して、前記決定及び計算を実行する工程であって、前記２つ以上の異なる移動相遷移フロントのそれぞれについてＨＥＴＰ値を独立して計算する、前記決定及び計算を実行する工程と、
前記２つ以上の計算されたＨＥＴＰ値に基づいて、前記クロマトグラフィカラム充填の品質を評価する工程とを更に含み、それにより、前記クロマトグラフィカラムの前記コンディショニング、交換又は再充填は、前記評価に基づくものとなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記移動相遷移フロントが、変性剤を含む移動相から非変性剤を含む移動相への変化によって生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記移動相遷移フロントが、非変性剤を含む移動相から変性剤を含む移動相への変化によって生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記移動相遷移フロントが、アルカリ性移動相状態からより酸性の移動相状態への変化によって生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記移動相遷移フロントが、酸性移動相状態からよりアルカリ性の移動相状態への変化によって生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記移動相遷移フロントが、有機溶媒を含む移動相から水性移動相への変化によって生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記移動相遷移フロントが、水性移動相から有機溶媒を含む移動相への変化によって生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記カラム出口信号が、導電性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記決定が、
最小信号値を０に設定し、最大導電率値を１に設定することによって、前記移動相遷移フロントの前記収集されたカラム出口信号を正規化する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記収集が、
前記カラム充填を含む前記クロマトグラフィカラムに、第１の移動相を加える工程と、
前記カラム充填を含むクロマトグラフィカラムに、第２の移動相を添加する工程であって、前記第１及び第２の移動相は、異なる検出可能なカラム出口信号を有する、第２の移動相を添加する工程と、
前記第１の移動相と第２の移動相との間で、移動相遷移の２つ以上の間隔で前記カラム出口信号及び累積流量パラメータを収集する工程とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１及び第２の移動相の前記カラム出口信号が、信号ノイズを超える量で信号が異なる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記カラム出口信号及び累積流量パラメータが、移動相遷移フロント全体を通してそれぞれ異なる間隔で収集される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記クロマトグラフィカラム充填が、親和性クロマトグラフィ充填材料、イオン交換クロマトグラフィ充填材料、吸着クロマトグラフィ充填材料、疎水性相互作用クロマトグラフィ充填材料、金属キレート親和性クロマトグラフィ充填材料、サイズ排除クロマトグラフィ充填材料、又は分子排除クロマトグラフィ充填材料からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１８年４月２０日に出願された米国特許仮出願第６２／６６０，３４０号に対する優先権を主張するものであり、特許仮出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、クロマトグラフィカラムの品質評価の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
カラムクロマトグラフィは、治療用タンパク質を産生するための精製プロセスにおいて使用される重要な技術である。カラムの性能は、プロセスがベンチトップから製造プラントまでスケールアップされるまで、及びカラム寿命にわたって維持されなければならない。プロセスをスケールアップするために、カラム径、装置、及びバッファ消費量が増加すると、カラム評価手順の困難さ、充填されたベッドの完全性に対する潜在的な変化、及びロジスティックスが発生する可能性がある。
【０００４】
クロマトグラフィカラムの品質評価のための現在の方法は、ピークの最大値から平均値を推定し、半分の高さにおけるピークの幅からの標準偏差を推定することによって、パルス注入後の分散の測定値である理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）を計算する。この方法の主な制限は、ピーク形状がガウス分布から逸脱している場合、分散（すなわち、ＨＥＴＰ）の正確な測定値を提供しないことである。感度の不足を補うために、第２の測定値である非対称性を利用して、ピーク歪度を評価する。この測定値は、最大ピーク高さの１０％でのリーディングピーク幅とテーリングピーク幅とを比較している。この手法の限界は、カラム性能の変化に対する感度の欠如をもたらし、カラム性能は実際には許容可能であるが、カラムの再充填又はコンディショニングをもたらすことが多い。カラムの品質評価のための他の方策が報告されている。これらの方策としては、プロセス遷移をモデル化するためにガウス分布又は非ガウス分布を使用することが含まれる（例えば、Ｌａｒｓｏｎら、「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄａｔａ  ｔｏ  Ａｓｓｅｓｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ−Ｓｃａｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１９：４８５−４９２（２００３年）及びＢｅｌｏｕｓｏｖらの米国特許第９，０４７，４３８号及びＧａｎｇｕｌｙの米国特許第８，４１０，９２８号を参照）。ガウス法は、注入方法に関して上述したように感度に同じ制限を有し、報告された非ガウス法は複雑な計算を必要とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
繰り返し操作中のクロマトグラフィカラム性能の変化を監視し、カラムがその寿命にわたって実行する有効性を評価するために、より感度が高く、より合理的に定義された限界を有する改善された品質評価手順が必要とされる。本発明は、技術分野におけるこの欠点を克服することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
簡単にするために、参照により本明細書に組み込まれる、本明細書に添付の独立及び従属請求項によって、本発明の実施形態がそれぞれ定義される。本発明の様々な態様の他の実施形態、特徴、及び長所は、添付の図面に関連付けられる以下の発明を実施するための形態から明らかになる。
【０００７】
特定の実施形態では、本発明は、クロマトグラフィカラムを操作する方法を提供する。この方法は、カラム充填を含むクロマトグラフィカラムの第１の操作中に、カラム出口信号及び累積流量パラメータを、少なくとも１つの移動相遷移フロントの２つ以上の間隔で収集する工程を含む。この方法は、少なくとも１つの移動相遷移フロントについての収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータに基づいて、上昇遷移フロントについては式Ｉａ又は下降遷移フロントについては式Ｉｂを使用して、モデルガンマ累積分布曲線を決定する工程を更に含み、式Ｉａ又は式Ｉｂは、
【０００８】
【数１】
2021522477.tif 000003
であり、各式中、Ｃは所与のＶのカラム出口信号であり、Ｖはカラム体積で除算された累積流量であり、ｋ、θ、及びＶｉは曲線を画定するために使用される形状、スケール、及びオフセットパラメータである。理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値は、式ＩＩ及びモデルガンマ累積分布曲線のパラメータｋ、θ、及びＶｉを使用して、少なくとも１つの移動相遷移フロントについて計算され、式ＩＩは、
【０００９】
【数２】
2021522477.tif 000004
式中
μ＝ｋθ＋Ｖｉ
【００１０】
【数３】
2021522477.tif 000005
Ｌ＝カラム長さである。
【００１１】
クロマトグラフィカラム充填の品質は、計算されたＨＥＴＰ値に基づいて評価される。この評価に基づいて、クロマトグラフィカラムは再利用、コンディショニング、交換、又は再充填される。
【００１２】
本明細書でガンマ分布遷移分析（ＧＤＴＡ）と称される、カラム完全性を評価するための新たな方法が開発された。新しい方法は、カラム操作の規則的なプロセス工程の間に生成される移動相遷移フロントデータを介して曲線に適合するための数学的モデルを使用する。次いで、モデル曲線パラメータを利用して、カラム品質の尺度としてカラムベッド全体の分散を計算する。移動相遷移フロントは、導電率、ｐＨ、及び／又はバッファ成分などの異なる特性を有するプロセスバッファ／洗浄液が使用されるクロマトグラフィ精製プロセス内の別個の工程から生じる。方法は、一般に、通常のカラム処理中に生成される任意の１つ又は複数の移動相遷移フロントに適用することができる。
【００１３】
ＧＤＴＡ法の主要な利点は、ガウスＨＥＴＰ推定法よりもカラムベッド全体の分散をより敏感に測定できることである。ＧＤＴＡを使用することにより、ＧＤＴＡモデルが曲線適合からの分散を正確に測定するため、非対称性を測定する必要はない。加えて、ガンマ分布関数を使用することで、以前に報告された代替の非ガウス法と比較して、フロント遷移の解析が容易になる。クロマトグラフィプロセス中に既に存在する移動相遷移を使用することで、余分なオフラインプロセス工程の必要性を回避する。更に、多くの場合、過去のデータにより、実施前にカラム効率の過去の範囲を確立することができる。最後に、ＧＤＴＡ法を自動化して、一貫した適用を確実にすることができる。
【００１４】
特定の実施形態では、本発明は、クロマトグラフィカラムを操作する方法を提供し、当該方法は、
カラム充填を含むクロマトグラフィカラムの第１の操作中に、カラム出口信号及び累積流量パラメータを、少なくとも１つの移動相遷移フロントの２つ以上の間隔で収集する工程と、
少なくとも１つの移動相遷移フロントについての収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータに基づいて、上昇遷移フロントについては式Ｉａ又は下降遷移フロントについては式Ｉｂを使用して、モデルガンマ累積分布曲線を決定する工程であって、式Ｉａ又は式Ｉｂは、
【００１５】
【数４】
2021522477.tif 000006
であり、各式中、Ｃは所与のＶのカラム出口信号であり、Ｖはカラム体積で除算された累積流量であり、ｋ、θ、及びＶｉは曲線を画定するために使用される形状、スケール、及びオフセットパラメータである、モデルガンマ累積分布曲線を決定する工程と、
式ＩＩ及びモデルガンマ累積分布曲線のパラメータｋ、θ、及びＶｉを使用して、少なくとも１つの移動相遷移フロントについての理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値を計算する工程であって、式ＩＩは、
【００１６】
【数５】
2021522477.tif 000007
式中、
μ＝ｋθ＋Ｖｉ
【００１７】
【数６】
2021522477.tif 000008
Ｌ＝カラム長さである、理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値を計算する工程と、
当該計算されたＨＥＴＰ値に基づいて、クロマトグラフィカラム充填の品質を評価する工程と、を含む方法。
【００１８】
特定の実施形態では、本発明は、以下の工程を更に含む方法を提供する：
当該評価に基づいてクロマトグラフィカラムをコンディショニング、交換、又は再充填する工程。
【００１９】
特定の実施形態では、本発明は、以下の工程を更に含む方法を提供する：
クロマトグラフィカラム充填の１つ又は複数の後続の使用中に、対応する移動相遷移フロントの２つ以上の間隔でカラム出口信号及び累積流量パラメータを収集する工程と、
クロマトグラフィカラム充填の１つ又は複数の後続の各使用中に、収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータを使用して、当該決定及び当該計算を実行する工程と、
当該実行に基づいて、当該１つ又は複数の後続の各使用中に、クロマトグラフィカラム充填のＨＥＴＰ値を決定する工程と、
２つ以上の後続の使用のクロマトグラフィカラム充填の決定されたＨＥＴＰ値の傾向を収集する工程と、
当該収集された傾向に基づいて、当該クロマトグラフィカラム充填の品質の変化を特定する工程であり、当該クロマトグラフィカラムのコンディショニング、交換又は再充填は、当該特定に基づくものとなる。
【００２０】
特定の実施形態では、本発明は、当該カラム充填の１つ又は複数の後続の使用におけるクロマトグラフィカラム充填のＨＥＴＰ値の増加が、当該カラム充填の１つ又は複数の以前の使用におけるクロマトグラフィカラム充填のＨＥＴＰ値と比較して、クロマトグラフィカラム充填の品質の低下を特定する方法を提供する。
【００２１】
特定の実施形態では、本発明は、カラム充填の当該第１の操作中に、２つ以上の異なる移動相遷移フロントのカラム出口信号及び累積流量パラメータを収集する方法を提供し、当該方法は、以下の工程を含む：
２つ以上の異なる移動相遷移フロントのそれぞれについて収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータを使用して、当該決定及び計算を実行し、２つ以上の異なる移動相遷移フロントのそれぞれについてＨＥＴＰ値を独立して計算する工程と、
２つ以上の計算されたＨＥＴＰ値に基づいて、クロマトグラフィカラム充填の品質を評価する工程、それにより、クロマトグラフィカラムの当該コンディショニング、交換又は再充填は、当該評価に基づくものとなる。
【００２２】
特定の実施形態では、本発明は、移動相遷移フロントが、変性剤を含む移動相から非変性剤を含む移動相への変化によって生成される方法を提供する。
【００２３】
特定の実施形態では、本発明は、移動相遷移フロントが、非変性剤を含む移動相から変性剤を含む移動相への変化によって生成される方法を提供する。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明は、移動相遷移フロントが、アルカリ性移動相状態からより酸性の移動相状態への変化によって生成される方法を提供する。
【００２５】
特定の実施形態では、本発明は、移動相遷移フロントが、酸性移動相状態からよりアルカリ性の移動相状態への変化によって生成される方法を提供する。
【００２６】
特定の実施形態では、本発明は、移動相遷移フロントが、有機溶媒を含む移動相から水性移動相への変化によって生成される方法を提供する。
【００２７】
特定の実施形態では、本発明は、移動相遷移フロントが、水性移動相から有機溶媒を含む移動相への変化によって生成される方法を提供する。
【００２８】
特定の実施形態では、本発明は、カラム出口信号が導電性である方法を提供する。
【００２９】
特定の実施形態では、本発明は、当該決定が、
最小信号値を０に設定し、最大導電率値を１に設定することによって、移動相遷移フロントの当該収集されたカラム出口信号を正規化する工程を含む方法を提供する。
【００３０】
特定の実施形態では、本発明は、当該収集が、
当該カラム充填を含むクロマトグラフィカラムに、第１の移動相を添加する工程と、
当該カラム充填を含むクロマトグラフィカラムに、第２の移動相を添加する工程であって、当該第１及び第２の移動相は、異なる検出可能なカラム出口信号を有する、第２の移動相を添加する工程と、
第１の移動相と第２の移動相との間で、移動相遷移の２つ以上の間隔で当該カラム出口信号及び累積流量パラメータを収集する工程とを含む方法を提供する。
【００３１】
特定の実施形態では、本発明は、第１及び第２の移動相のカラム出口信号が、信号ノイズを超える量で信号が異なる方法を提供する。
【００３２】
特定の実施形態では、本発明は、カラム出口信号及び累積流量パラメータが、移動相遷移フロントの全体にわたってそれぞれ異なる間隔で収集される方法を提供する。
【００３３】
特定の実施形態では、本発明は、クロマトグラフィカラム充填が、親和性クロマトグラフィ充填材料、イオン交換クロマトグラフィ充填材料、吸着クロマトグラフィ充填材料、疎水性相互作用クロマトグラフィ充填材料、金属キレート親和性クロマトグラフィ充填材料、サイズ排除クロマトグラフィ充填材料、又は分子排除クロマトグラフィ充填材料からなる群から選択される方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】例示的なガンマ分布遷移分析曲線適合のグラフを示す。図１Ａは、移動相遷移データへの例示的なガンマ分布遷移分析曲線適合を示すグラフである。
【図１Ｂ】例示的なガンマ分布遷移分析曲線適合のグラフを示す。図１Ｂは、カラム効率の尺度としての理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）を計算するために使用される、その曲線からのパラメータを有する、移動相転移データへの例示的なガンマ分布遷移分析曲線適合を示すグラフである。
【図２】本明細書に記載されるクロマトグラフィカラムの品質評価システムを示す図である。
【図３】プロテインＡカラム平衡化フロントの変換なしのＨＥＴＰの確率プロットである。
【図４】プロテインＡカラム平衡化フロントの変換なしの平方和（ＳＳ）の確率プロットである。
【図５】プロテインＡカラム洗浄フロントの変換なしのＨＥＴＰの確率プロットである。
【図６】プロテインＡカラム洗浄フロントの変換なしのＳＳの確率プロットである。
【図７】プロテインＡカラム平衡化フロントの自然対数（λ＝０）変換を伴うＨＥＴＰの確率プロットである。
【図８】プロテインＡカラム平衡化フロントの自然対数（λ＝０）変換を伴うＳＳの確率プロットである。
【図９】プロテインＡカラム洗浄フロントの自然対数（λ＝０）変換を伴うＨＥＴＰの確率プロットである。
【図１０】プロテインＡカラム洗浄フロントの自然対数（λ＝０）変換を伴うＳＳの確率プロットである。
【図１１】プロテインＡカラム平衡化の平均値（Ｖｍ）の確率プロットである。
【図１２】プロテインＡカラム洗浄フロントの平均値（Ｖｍ）の確率プロットである。
【図１３】プロテインＡカラム平衡化のフロントの自然対数（λ＝０）変換を伴うＨＥＴＰの管理図である。ＵＣＬ＝上方管理限界；ＬＣＬ＝下方管理限界である。チャート上の番号付けされた点は、シューハートルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果において明らかな孤立値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。
【図１４】プロテインＡカラム平衡化フロントのＨＥＴＰの時系列プロットである。ＵＣＬは、図１３の変換データから導出される。
【図１５】プロテインＡカラム洗浄フロントの自然対数（λ＝０）変換を伴うＳＳの管理図である。チャート上の番号付けされた点は、シューハートルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果において明らかな孤立値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。
【図１６】プロテインＡカラム平衡化フロントのＳＳの時系列プロットである。ＵＣＬは、図１５の変換データから導出される。
【図１７】プロテインＡカラム平衡化の平均値（Ｖｍ）の管理図である。チャート上の番号付けされた点は、シューハートルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果において明らかな孤立値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。
【図１８】プロテインＡカラム洗浄フロントの自然対数（λ＝０）変換を伴うＨＥＴＰの管理図である。チャート上の番号付けされた点は、シューハートルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果において明らかな孤立値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。
【図１９】プロテインＡカラム洗浄フロントのＨＥＴＰの時系列プロットである。ＵＣＬは、図１８の変換データから導出される。
【図２０】プロテインＡカラム洗浄フロントの自然対数（λ＝０）変換を伴うＳＳの管理図である。チャート上の番号付けされた点は、シューハートルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果において明らかな孤立値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。
【図２１】プロテインＡカラム洗浄フロントのＳＳの時系列プロットである。ＵＣＬは、図２０の変換データから導出される。
【図２２】プロテインＡカラム洗浄フロントの平均値（Ｖｍ）の管理図である。チャート上の番号付けされた点は、シューハートルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果において明らかな孤立値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。
【図２３】カラム充填によってグループ化された直接生成物捕獲（ＤＰＣ）プロテインＡカラム平衡化フロントのＨＥＴＰ結果の時系列プロットである。
【図２４】カラム充填によってグループ化されたＤＰＣプロテインＡカラム洗浄フロントのＨＥＴＰ結果の時系列プロットである。
【図２５】スキッドによってグループ化されたＤＰＣプロテインＡカラム平衡化フロントのＨＥＴＰ結果の時系列プロットである。
【図２６】スキッドによってグループ化されたＤＰＣプロテインＡカラム洗浄フロントのＨＥＴＰ結果の時系列プロットである。
【図２７】ＤＰＣプロテインＡカラム平衡化の平均流量を示すチャートである。チャート上の番号付けされた点は、シューハートルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果において明らかな孤立値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。
【図２８】平衡化中の平均プレカラム圧力のチャートである。チャート上の番号付けされた点は、シューハートルール則１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果において明らかな孤立値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。
【図２９】ＤＰＣプロテインＡカラム洗浄フロントの平均洗浄流量のチャートである。チャート上の番号付けされた点は、シューハートルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果において明らかな孤立値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。
【図３０】ＤＰＣプロテインＡカラム洗浄フロントの平均洗浄圧力のチャートである。チャート上の番号付けされた点は、シューハートルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果において明らかな孤立値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。
【図３１】洗浄流量を変更する前及び後のＨＥＴＰを示すチャートである。チャート上の番号付けされた点は、シューハートルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果において明らかな孤立値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。
【図３２】４５バッチのＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）（インフリキシマブ）の平衡化フロントで評価した２つの異なるプロテインＡカラム充填のＨＥＴＰの時系列プロットである。
【図３３】ＳＰ−セファロース高性能（ＳＰＨＰ）カラム平衡化フロントのＨＥＴＰの時系列プロットである。管理限界は、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換データから導出される。
【図３４】ＳＰＨＰカラムＷＦＩフラッシュフロントのＨＥＴＰの時系列プロットである。管理限界は、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換データから導出される。
【図３５】ＳＰＨＰカラムストレージフロントのＨＥＴＰの時系列プロットである。管理限界は、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換データから導出される。
【図３６】Ｑ２カラム平衡化フロントのＨＥＴＰの時系列プロットである。管理限界は、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換データから導出される。
【図３７】Ｑ２カラムストリップ平衡化フロントのＨＥＴＰの時系列プロットである。管理限界は、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換データから導出される。
【図３８】Ｑ２カラムストレージフロントのＨＥＴＰの時系列プロットである。管理限界は、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換データから導出される。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本開示は、カラムの繰り返し操作中の充填されたクロマトグラフィカラムベッドの変化をモニタリングするための改善された品質評価に関する。この方法は、スケールとは無関係に、カラムの寿命を通してカラムが性能を発揮する有効性を評価する実用的な手段を提供する。
【００３６】
クロマトグラフィカラム分離効率は、クロマトグラフィの理論プレートモデルを使用して特徴付けられることが多い。この手法を使用して、クロマトグラフィカラムは、多数の段階又は理論プレートからなるものとして認識される。各プレートは、試料成分が移動相と固定相との間の平衡を達成する距離である（Ｖａｎ  Ｄｅｅｍｔｅｒ、Ｚｕｉｄｅｒｗｅｇ及びＫｌｉｎｋｅｎｂｅｒｇ、「Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｍａｓｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｓ  Ｃａｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｎｏｎｉｄｅａｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」、Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇｎｇ．Ｓｃｉ．５：２７１〜２８９（１９５６年）を参照し、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）。カラム効率は、カラム内の理論プレート数Ｎｐで測定され、カラム内のプレート数が多いほど平衡化が進み、クロマトグラフィバンドの分散が少なくなり、ピークが狭くなり、分離の質が向上することを意味する。所与のカラムのプレートの数が多いほど、プレートの高さは低くなる。したがって、カラム効率は、プレートの高さを計算することによっても測定することができ、これは、「理論段相当高さ」又はＨＥＴＰと呼ばれる。この手法を使用して、ＨＥＴＰ値が小さいほど、カラム分離の効率が高くなる。
【００３７】
ＨＥＴＰは、クロマトグラフィカラムの長さＬを、理論的なプレートの数Ｎｐで割ることによって計算される。
ＨＥＴＰ＝Ｌ／Ｎｐ
カラムが保有する理論プレートの数は、過去にはパルス注入後のクロマトグラフのピークを以下の式で調査することによって決定されてきた：
【００３８】
【数７】
2021522477.tif 000009
式中、ｔＲは保持時間であり、ｗ１／２は半分の高さにおけるピーク幅である。しかし、この手法は、Ｎｐを計算するために使用されるピーク形状がガウス分布から逸脱している場合、カラム効率の正確な測定値を提供しない。この感度の不足を補うために、第２の測定値である非対称性を利用して、ピーク歪度を評価する。この測定値は、最大ピーク高さの１０％でのリーディングピーク幅とテーリングピーク幅とを比較している。上述のように、このモデルは、カラム性能の変化を検出する感度を欠いている。
【００３９】
本明細書に記載される方法は、ルーチンのクロマトグラフィカラム操作中に生じる１つ又は複数の移動相遷移フロント上のガンマ分布に基づく、代替的でより正確なＨＥＴＰの測定を提供する。したがって、本開示は、クロマトグラフィカラムを操作する方法を目的とする。この方法は、カラム充填を含むクロマトグラフィカラムの第１の操作中に、カラム出口信号及び累積流量パラメータを、少なくとも１つの移動相遷移フロントの２つ以上の間隔で収集することを含む。この方法は、少なくとも１つの移動相遷移フロントについての収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータに基づいて、上昇遷移フロントについては式Ｉａ又は下降遷移フロントについては式Ｉｂを使用して、モデルガンマ累積分布曲線を決定することを更に含む。
【００４０】
【数８】
2021522477.tif 000010
式Ｉａ及び式Ｉｂを参照すると、Ｃは所与のＶのカラム出口信号であり、Ｖはカラム体積で除算された累積流量であり、ｋ、θ、及びＶｉは曲線を画定するために使用される形状、スケール、及びオフセットパラメータである。理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値は、式ＩＩ及びモデルガンマ累積分布曲線のパラメータｋ、θ、及びＶｉを使用して、少なくとも１つの移動相遷移フロントについて計算され、式ＩＩは、
【００４１】
【数９】
2021522477.tif 000011
式中、
μ＝ｋθ＋Ｖｉ
【００４２】
【数１０】
2021522477.tif 000012
Ｌ＝カラム長さである。
【００４３】
クロマトグラフィカラム充填の品質は、計算されたＨＥＴＰ値に基づいて評価される。カラム品質の評価に基づいて、クロマトグラフィカラムは、後続の使用が許容可能であると判定されるか、そうでなければ、コンディショニング、交換、又は再充填されなければならない。
【００４４】
本明細書に開示されるカラムの品質評価の方法は、任意のクロマトグラフィカラムに適用することができる。例示的なクロマトグラフィカラムとしては、液体クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、分子排除、超臨界流体クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、二次元クロマトグラフィ、高速タンパク質（ＦＰＬＣ）クロマトグラフィ、向流クロマトグラフィ、キラルクロマトグラフィ、水性順相（ＡＮＰ）、混合モードクロマトグラフィ、及び偽親和性クロマトグラフィに使用されるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例示的なカラム充填剤は、親和性クロマトグラフィ充填剤（例えば、プロテインＡ又はプロテインＧ親和性クロマトグラフィ充填剤）、イオン交換クロマトグラフィ充填剤（例えば、陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）、及び混合モード交換クロマトグラフィ充填剤）、吸着クロマトグラフィ充填剤（例えば、シリカゲル又はアルミナ充填剤）、疎水性相互作用クロマトグラフィ充填剤（例えば、フェニル−セファロース、アザ−アレノフィリン樹脂、又はｍ−アミノフェニルボロン酸充填剤）、金属キレート親和性クロマトグラフィ充填剤（例えば、Ｎｉ（ＩＩ）−及びＣｕ（ＩＩ）−親和性クロマトグラフィ充填剤）、サイズ排除クロマトグラフィ充填剤（例えば、ゲル電気泳動又はキャピラリ電気泳動充填剤）、又は分子排除クロマトグラフィ充填剤（例えば、ポリスチレン）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
本明細書に記載される方法は、ルーチンのクロマトグラフィカラム操作中、例えば、試料中の化学物質又は生物学的物質の単離、精製、又は特定の間に適用することができる。このような化合物としては、例えば、タンパク質（例えば、抗体及びそのフラグメント）、核酸、炭水化物、脂質、有機低分子、無機低分子、ウイルス、リポソーム、及び任意のそのような化合物のハイブリッド又は変異型を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００４６】
試験のためにカラムをオフラインにする必要がある、以前のクロマトグラフィカラムの品質評価方法、例えば、パルス注入法とは対照的に、本明細書に記載される法は、ルーチンのカラム操作中に実施される。本方法は、ルーチンのカラム精製プロセス中に生じる、プロセスバッファ及び異なる特性を有する溶液を含む移動相プロセス遷移の利点を有する。
【００４７】
本発明の方法によれば、「移動相」とは、カラムクロマトグラフィにおける液相であって、クロマトグラフィカラム充填の固定クロマトグラフィ材料を取り囲み、移動するものである。クロマトグラフィカラム操作中、移動相の組成及び特性は、各プロセス工程、例えば、平衡化、洗浄などで変化することが多い。移動相の特性の変化は、溶出液、すなわち、固定相を通過した後にカラムから溶出する移動相で検出及び測定することができる。本明細書で使用するとき、「カラム出口信号」は、溶出液がカラムから溶出する際に検出される移動相からの溶出液の物理的又は化学的特性の信号である。カラム出口信号を提供する物理的又は化学的特性は、任意の典型的なクロマトグラフィ検出器を使用して測定することができる、ｐＨ、導電率、光吸収、蛍光、電荷、塩濃度、偏光測定、屈折率、電気化学反応、質量電荷比などの任意の特性であり得る。カラム出口信号を測定するのに好適なクロマトグラフィ検出器としては、質量分析計、赤外分光計、可視分光計、紫外分光計、フーリエ変換赤外分光計、炎イオン化検出器、低角度レーザ光散乱検出器、ダイオードアレイ検出器、蛍光分光計、ｐＨ検出器、導電率検出器、電気化学検出器、及び屈折率検出器などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
カラム出口信号は、溶出液から収集される。更に、カラム出口信号を収集するために、「累積流量」も収集される。「累積流量」は、カラムから経時的に溶出される流体の総体積である。この値をカラム体積で割った値を、カラム体積単位で表す。
【００４９】
遷移フロントは、累積流量に対するカラム出口信号の変化によって生成される。遷移フロントは、１つ又は複数の異なる特性（例えば、導電率、ｐＨなど）を有する異なる移動相の、カラムへの連続的な適用から生じる。本明細書に記載される方法によれば、遷移フロントに対するカラム出口信号は、最大値１及び最小値０を有するように正規化され得る。本明細書で言及されるように、「下降遷移フロント」とは、開始移動相が、順次導入された移動相のカラム出口信号よりも高いカラム出口信号、例えば、導電率を有する移動相遷移のことである。
【００５０】
本明細書で使用されるように、「上昇遷移フロント」とは、開始移動相が、順次導入される移動相のカラム出口信号よりも低いカラム出口信号、例えば、導電率を有する移動相遷移のことである。
【００５１】
遷移フロントは、カラム操作の過程で認定されるカラム充填を含むクロマトグラフィカラムに第１の移動相を添加することによって作成される。第１の移動相の添加の一部の時点で、例えば、第１の移動相が溶出を開始すると、第１の移動相とは異なる検出可能なカラム出口信号を有する第２の移動相が、カラム充填を含むクロマトグラフィカラムに添加される。第１の移動相と第２の移動相との間で遷移する際に、移動相の２つ以上の間隔でカラム出口信号及び累積流量パラメータを収集することにより、遷移フロントを検出する。
【００５２】
一実施形態では、第１及び第２の移動相のカラム出口信号は、信号ノイズを超える量で信号が異なる。一実施形態では、第１の移動相と第２の移動相との間のカラム出口信号の差は、バックグラウンド信号ノイズの５％以上である。別の実施形態では、第１の移動相と第２の移動相との間のカラム出口信号の差は、バックグラウンド信号ノイズの少なくとも１０％以上である。別の実施形態では、別の実施形態では、第１の移動相と第２の移動相との間のカラム出口信号の差は、バックグラウンド信号ノイズの少なくとも１５％以上である。
【００５３】
一実施形態では、遷移フロント上で検出されるカラム出口信号は導電率である。この実施形態では、第１の移動相と第２の移動相との間のカラム出口信号は、好ましくは、少なくとも１μＳ／ｃｍ、少なくとも１０μＳ／ｃｍ、少なくとも１００μＳ／ｃｍ、少なくとも１ｍＳ／ｃｍ、又は１ｍＳ／ｃｍ超異なる。
【００５４】
別の実施形態では、遷移フロント上で検出されるカラム出口信号は、ｐＨである。この実施形態では、第１の移動相と第２の移動相との間のカラム出口信号は、好ましくは、少なくとも０．０５のｐＨ単位、少なくとも０．１のｐＨ単位、少なくとも１のｐＨ単位、少なくとも２のｐＨ単位、又は２を超えるｐＨ単位で異なる。
【００５５】
別の実施形態では、遷移フロント上で検出されるカラム出口信号は、ＵＶ−Ｖｉｓ吸光度である。この実施形態では、第１の移動相と第２の移動相との間のカラム出口信号は、好ましくは少なくとも０．０１の吸光度単位、少なくとも０．１の吸光度単位、少なくとも０．５の吸光度単位、少なくとも０．８の吸光度単位、又は０．８を超える吸光度単位で異なる。
【００５６】
別の実施形態では、遷移フロント上で検出されるカラム出口信号は、赤外吸光度である。この実施形態では、第１の移動相と第２の移動相との間のカラム出口信号は、好ましくは、少なくとも１パーセントの透過率、少なくとも１０パーセントの透過率、少なくとも２０パーセントの透過率、少なくとも３０パーセントの透過率、又は３０パーセントを超える透過率で異なる。
【００５７】
一実施形態では、移動相遷移フロントは、変性剤を含む移動相から非変性剤を含む移動相への変化によって生成される。別の実施形態では、移動相遷移フロントは、非変性剤を含む移動相から変性剤を含む移動相への変化によって生成される。
【００５８】
別の実施形態では、移動相遷移フロントは、アルカリ性移動相状態から中性又はより酸性の移動相状態への変化によって生成される。あるいは、移動相遷移フロントは、酸性移動相状態から中性又はよりアルカリ性の移動相状態への変化によって生成される。
【００５９】
別の実施形態では、移動相遷移フロントは、有機溶媒を含む移動相から水性移動相への変化によって生成される。あるいは、移動相遷移フロントは、水性移動相から有機溶媒を含む移動相への変化によって生成される。
【００６０】
カラム出口信号及び累積流量パラメータは、移動遷移フロントの過程でそれぞれ異なる間隔で収集される。好ましくは、カラム出口信号及び累積流量パラメータは、最小カラム出口信号から最大カラム出口信号まで、又はその逆に、移動遷移フロントの全体の過程で収集される。一実施形態では、カラム出口信号及び累積流量パラメータは、不規則な間隔で収集され、例えば、カラム出口信号の変化が検出されると収集される。別の実施形態では、カラム出口信号及び累積流量パラメータは、移動遷移フロントの全体の過程で一定の時間間隔で収集される。例えば、一実施形態では、カラム出口信号及び累積流量パラメータは、移動遷移フロントの全体の過程で１秒間隔で収集される。別の実施形態では、カラム出口信号及び累積流量パラメータは、移動遷移フェーズの過程で５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０秒間隔で収集される。
【００６１】
一実施形態では、カラム出口信号データは、分析期間にわたって最大値を１に設定し、最小値を０に設定することによって、上述のように正規化される。流量はまた、カラム体積に変換され、異なるカラム充填間のデータの比較のために標準化される。このデータを使用して、ガンマ累積分布関数（「ＣＤＦ」を使用して、収集されたデータポイントに最も適合する曲線を生成する。ガンマＣＤＦは、３つの値：形状パラメータｋ；スケールパラメータθ（シータ）；及びオフセットパラメータＶｉにより決定され、以下の式Ｉを使用する：
Ｃ＝ｆ（Ｖ，ｋ，θ，Ｖｉ）式Ｉ
【００６２】
式Ｉを参照すると、Ｃは、所与のＶのカラム出口信号であり、Ｖは、累積流量をカラム体積で除算したものである。式Ｉａは、式Ｉに由来し、上昇遷移フロントに沿ってガンマ分布関数値を決定するために使用される。
【００６３】
【数１１】
2021522477.tif 000013
式中、
Γは、第２種不完全ガンマ関数であり、
γは、第１種不完全ガンマ関数である。
あるいは、式Ｉｂはまた、式Ｉに由来し、下降遷移フロントに沿ってガンマ分布関数値を決定するために使用される。
【００６４】
【数１２】
2021522477.tif 000014
【００６５】
図１Ａは、カラム遷移フロントにわたって収集された例示的な正規化カラム出口信号及びカラム体積データをプロットするグラフである。式Ｉａを使用して、データに対する曲線適合を生成した。
【００６６】
最良適合ガンマＣＤＦパラメータは、ｋ、θ、及びＶｉの値を操作して、データからの平方和の偏差が最小となるモデル曲線を生成するパラメータを見出すことによって決定される。この曲線は、最適な適合モデルを生成するために、遷移フロント全体からのデータポイントを介して適合される。この曲線からのｋ、θ、及びＶｉパラメータを利用して、カラム効率の指標として、カラム内のプレート数Ｎｐ又はプレートの高さ、すなわち、ＨＥＴＰを計算する。
【００６７】
プレートの数Ｎｐは、モデル曲線の平均μ及び分散σ２に基づいて計算される。平均及び分散は、以下のように曲線から導出される：
平均、μ＝ｋθ＋Ｖｉ
分散、σ２＝ｋθ２
プレートの数は、以下の平均及び分散に基づいて計算される：
プレートの数、Ｎｐ＝μ２／σ２
ＨＥＴＰは、以下のように、センチメートルのカラムの長さＬをプレートの数Ｎｐで割ったものに基づいて、上述のように計算される。
【００６８】
【数１３】
2021522477.tif 000015
【００６９】
図１Ｂは、定義された平均μ及び分散σ２パラメータを有する、図１Ａに示されるものと同じグラフを示す。
【００７０】
本明細書に記載されるように計算されたデータに対するモデル適合を評価するために、平均（Ｖｍ）、平方和（ＳＳ）、及びモードも決定することができる。ＳＳは、導出されるプロセスデータからのモデル曲線の偏差の直接測定である。Ｖｍ値は、カラム体積単位における遷移の中心点の尺度である。バッファ遷移には典型的には１カラム体積が必要なため、この値は１に近い値にする必要がある。平均は、典型的には、フロントの形状によって影響されない。平均値を使用して、誤差の自動計算をチェックする。例えば、値が低い場合は、データ収集エラーを示している可能性があり、結果を確認するために更なる調査を必要とする可能性がある。モードは、変化率が最大である体積に対応する。これは、遷移曲線が対称である場合に平均と等しい。典型的には、遷移に歪みがあり、モードは平均よりも低い。
【００７１】
ＨＥＴＰに加えて、ｋ（形状）パラメータから計算することができる他の要因としては、非対称性に関連する尺度である歪度（γ１）、及びピーク鮮鋭度の尺度である尖度（γ２）が挙げられる。これらの要因を使用して、カラム性能の変化を特定することができる。
【００７２】
【数１４】
2021522477.tif 000016
【００７３】
本明細書に記載される方法によれば、カラム出口信号及び累積流量パラメータは、ガンマＣＤＦからＨＥＴＰを計算するために、カラムプロセスがカラム上で実行されるたびに、同じ移動遷移相について収集される。同じプロセス工程及び同じスケールで使用されるカラムにより生成される過去のデータはまた、ＨＥＴＰを計算するために取得し、利用することができる。ＨＥＴＰデータを収集して、過去又は現在の操作中に対応する遷移のＨＥＴＰ値の傾向を特定し、ＨＥＴＰ値の上限及び下限の管理限界を特定する。管理限界は、許容可能なＨＥＴＰ値の範囲、すなわち、許容可能なカラム効率に対応するＨＥＴＰ値を定義するＨＥＴＰの高値及び低値である。これらの上限及び下限の管理限界は、統計的評価に基づいて設定することができる。例えば、一実施形態では、上限及び下限の管理限界は、平均＋／−２、３、又は４標準偏差を計算することによって設定される。一実施形態では、上限及び下限の管理限界は、本明細書の実施例に記載される平均＋／−３標準偏差を計算することによって設定される。別の実施形態では、上限及び下限の管理限界は、過去のデータから信頼区間を計算することによって設定することができる。一実施形態では、上限及び下限の管理限界は、過去のデータから９５％、９６％、９７％、又は９８％信頼区間を計算することによって設定される。別の実施形態では、上限及び下限の管理限界は、過去のデータから９９％信頼区間を計算することによって設定される。
【００７４】
上限及び下限の管理限界を利用して、カラムの時間及び使用に対するカラム効率の変化を特定する。典型的には、上限管理限界を超えるＨＥＴＰの任意の増加は、カラム効率の低下を示し得る。ルーチンのカラムモニタリング中に、ＨＥＴＰの有害な傾向が観察されるか、又は管理限界を超えた場合、溶出液の製品品質、カラムプロセス性能、及び／又は不純物除去データを評価して、特定されたバッチの製品品質を確保する必要がある。製品品質又はカラム性能のいずれかが設定された基準に適合しない場合は、カラムのコンディショニング、再充填又は交換などの適切な是正処置を行い、更なる使用のためにリリースする前に品質評価を行う必要がある。充填されたベッドを再分配するためにクロマトグラフィカラムをコンディショニングする方法は、使用されるカラムに応じて異なるが、当業者にはよく理解される。
【００７５】
カラム操作中のカラム性能のモニタリングは、精製プロトコルにルーチンに含まれる１つ又は２つ以上の遷移相に基づくことができる。好ましくは、モニタリングは、精製プロトコル中の２つ又は３つ以上の遷移相についてガンマＣＤＦに基づいて計算されたＨＥＴＰ値に基づく。
【００７６】
以下に記載されるように、カラム性能を決定するために本明細書に記載されるＧＤＴＡ法を使用してＨＥＴＰを計算することは、同じプロセス工程及び同じスケールで使用されるカラムから収集された過去のデータに基づくことができる。プロセス工程の適格縮尺モデルモデルから生成されるデータを評価に使用することもできる。これにより、品質評価データと比較して、カラムの性能の品質を評価することができる。
【００７７】
流量（Ｖａｎ  Ｄｅｅｍｔｅｒ効果）、潜在的なバッファ相互作用、及び余分なカラム体積などの要因は、本明細書に記載されるＧＤＴＡ法の結果に影響を与える可能性があり、ＧＤＴＡの管理限界を設定する際に評価する必要がある。ＧＤＴＡに含まれる遷移フロントは、両方の移動相カラム出口信号測定値がスケール上にあり、移動相間のカラム出口信号測定値の差がバックグラウンド信号ノイズを上回っており、移動相と樹脂との間の相互作用が一貫しており、再現性があるなどの特定の基準を満たすことが好ましい。
【００７８】
使用中のリリース及びモニタリングに使用される一般的なカラム評価基準は、装置及び樹脂の種類に固有の過去のデータを評価することによって決定されるものとする。カラムの品質評価結果と性能との間の関係を評価するために使用することができる、ルーチンの製品品質及びプロセス性能の測定の例を表１に列挙する。評価に使用されるルーチンの品質及びプロセス性能の測定は、表１に列挙されるものに限定されるものではなく、リストはガイドラインであることを意味し、評価されるプロジェクト及びプロセス工程の特定の要件に基づいている必要がある。製品品質及びプロセス性能に関する仕様及び許容基準は、プロジェクト固有であり、プロセス要件に基づいて決定される。
【００７９】
【表１】
2021522477.tif 000017
【００８０】
本明細書に記載されるガンマ分布遷移分析法は、カラム操作中にリアルタイムで実行することができる。この方法は、クロマトグラフィカラムの品質評価のコンピューティングデバイスによって、カラム充填を含むクロマトグラフィカラムの第１の操作中に、カラム出口信号及び累積流量パラメータを、少なくとも１つの移動相遷移フロントの２つ以上の間隔で収集することと、クロマトグラフィカラムの品質評価のコンピューティングデバイスによって、少なくとも１つの移動相遷移フロントについての収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータに基づいて、上昇遷移フロントについては式Ｉａ又は下降遷移フロントについては式Ｉｂを使用して、モデルガンマ累積分布曲線を決定することとを含む。
【００８１】
【数１５】
2021522477.tif 000018
【００８２】
式Ｉａ及び式Ｉｂを参照すると、Ｃは所与のＶのカラム出口信号であり、Ｖは、カラム体積で除算された累積流量であり、ｋ、θ、及びＶｉは、曲線を画定するために使用される形状、スケール及びオフセットパラメータである。この方法は、クロマトグラフィカラムの品質評価のコンピューティングデバイスによって、式ＩＩ及びモデルガンマ累積分布曲線のパラメータｋ、θ、及びＶｉを使用して、少なくとも１つの移動相遷移フロントについての理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値を計算することを更に含む。式ＩＩは、
【００８３】
【数１６】
2021522477.tif 000019
式中、
μ＝ｋθ＋Ｖｉ
【００８４】
【数１７】
2021522477.tif 000020
Ｌ＝カラム長さである。
【００８５】
本方法は、クロマトグラフィカラムの品質評価のコンピューティングデバイスを使用して、当該計算されたＨＥＴＰ値に基づいて、クロマトグラフィカラム充填の品質を評価することを更に含む。この評価に基づいて、クロマトグラフィカラムの操作者は、クロマトグラフィカラムを再使用できるか、又は次のカラム操作の前に交換、再充填、又はコンディショニングする必要があるかを判断することができる。
【００８６】
図２は、クロマトグラフィカラムを操作し、本明細書に記載されるようなカラム効率をリアルタイムで評価する方法及びシステムの概要を提供する図である。図２及び上述のように、システム１０は、複雑な混合物としてカラムに導入された生体分子を分離するために使用されるクロマトグラフィカラム１２、すなわち、溶出液１４、クロマトグラフィカラムから溶出する際に溶出液中のカラム出力信号を検出する検出器２０、検出器２０からの信号／データを送信する通信インタフェース２２、カラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４、及びサーバ２６を含む。
【００８７】
クロマトグラフィカラム１２は、透過性、半透過性、又は不透過性の固相カラム充填材料で充填される。好適なクロマトグラフィカラム及びカラム充填材料は、上述のように記載されている。対象となる生体分子を含む溶出液１４をクロマトグラフィカラム１２に導入する。移動相１６もまた、クロマトグラフィカラム１２に導入する。移動相１６は、クロマトグラフィカラム１２の固定相を通じた生体分子の分離、及びクロマトグラフィカラムの出力１８を通じた溶出液中の生体分子の溶出を促進する。本明細書に記載される方法によって、移動相１６は、以下に記載されるように、１つ又は複数の物理的又は化学的特性、例えば、ｐＨ、導電率、塩濃度が互いに異なる、連続的に導入されたカラムバッファ及び／又は洗浄試薬を含む。１つ又は複数の物理的又は化学的特性におけるこれらの差違は、検出器２０によって溶出液中で検出される。
【００８８】
検出器２０は、クロマトグラフィカラム１２の出力１８に結合される。したがって、検出器２０は、クロマトグラフィカラム１２の溶出液を介してカラム出力信号をモニタリング及び収集する。好適な検出器及び溶出液の特性、すなわち、検出されるカラム出力信号は、上述のように記載されている。検出器は、検出器２０によって収集されたデータ（例えば、カラム出力信号及び累積流量パラメータ）を、データ処理用のカラムの品質評価コンピューティングデバイス２４及び／又はストレージのためのサーバ２６に送信する通信インタフェースユニット２２に結合されている。
【００８９】
本明細書に記載されるシステムのカラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４は、バス３６又は他のリンクによって一緒に結合される、中央処理ユニット（ＣＰＵ）又はプロセッサ３２、メモリ３０、ネットワークインタフェース２８、及びユーザインタフェース３４を含む、任意のコンピューティングデバイス、例えばコンピュータ、パーソナルコンピューティング装置、スマートフォンなどであってもよい。カラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４は、他のタイプ及び／又は数の他の構成の構成要素及び要素を含んでもよい。
【００９０】
カラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４内のプロセッサ３２は、本明細書の実施例によって説明及び例示されるガンマ分布遷移分析の１つ又は複数の態様の記憶された命令のプログラムを実行するが、他のタイプ及び／又は数の処理装置を使用することができ、プロセッサ３２は、他のタイプ及び／又は数のプログラムされた命令を実行することができる。一実施形態では、プロセッサ３２は、カラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４にのみ配置される。別の実施形態では、プロセッサは、検出器２０とカラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４との間に分散される。例えば、一実施形態では、カラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４のプロセッサ３２は、検出器に連結されたマイクロコントローラを含む。この実施形態では、マイクロコントローラは、検出器２０によって収集されたデータを、カラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４に送信されるデジタル信号にマッピング又は変換することができるオンボードプロセッサとして機能する。１つ又は複数の検出器に連結されたマイクロコントローラは、カラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４の１つ又は複数の処理機能を実行することができる。
【００９１】
カラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４内のメモリ３０は、本明細書に記載されるように、ＧＤＴＡの１つ又は複数の態様のためのこれらのプログラムされた命令を記憶している。メモリ３０には、タイミングプロセッサ装置内のランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）及び／又はリードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、又はカラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４内のプロセッサ３２に結合された磁気的、光学的、又は他の読み書きシステムによって読み書きされるフロッピーディスク、ハードディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、又は他のコンピュータ読み取り可能な媒体など、様々な種類のメモリ記憶装置を使用することができる。
【００９２】
カラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４のネットワークインタフェース２８は、カラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４と検出器２０との間の通信を操作的に結合し、通信を容易にするが、他のタイプ及び／又は数の接続及び構成を有する他のタイプ及び／又は数の通信ネットワーク又はシステムを使用することができる。
【００９３】
カラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４は、例えば、グラフィカルユーザインタフェース、タッチユーザインタフェース、又はウェブベースのユーザインタフェースなどのユーザインタフェース３４を更に含んでもよい。ユーザインタフェースは、クロマトグラフィカラムの品質評価パラメータに関する情報をユーザに表示するように構成される。ユーザインタフェースはまた、クロマトグラフィカラムパラメータに関するユーザからの入力を受信するように構成される。
【００９４】
図２に示すサーバ２６は、それぞれがＣＰＵ又はプロセッサ、メモリ、及びネットワークインタフェースを含む１つ又は複数のコンピューティングデバイスであってもよく、これらは、カラムの品質評価のコンピューティング装置２４に関して記載されたものと同様のバス又は他のリンクによって一緒に結合される。サーバ２６は、他のタイプ及び／又は数の他の構成の構成要素及び要素を含んでもよい。
【００９５】
本明細書に記載されるシステムの通信インタフェース２２は、１つ又は複数のローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）及び／又はワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）を含むことができる。例示としてのみ、通信インタフェース２２は、ハイパーテキスト転送プロトコル（ＨＴＴＰ）及び／又はセキュアＨＴＴＰ（ＨＴＴＰＳ）を含む、イーサネット上のＴＣＰ／ＩＰ及び業界標準プロトコルを使用することができるが、他のタイプ及び／又は数の通信ネットワークが利用されてもよい。
【００９６】
本開示の別の態様は、ガンマ分布遷移分析を使用してクロマトグラフィカラムの品質評価のための命令を記憶している、一過性のコンピュータ読み取り可能な媒体に関する。これらの命令は、プロセッサによって実行されると、カラム充填を含むクロマトグラフィカラムの第１の操作中に、カラム出口信号及び累積流量パラメータを、少なくとも１つの移動相遷移フロントの２つ以上の間隔で収集する工程と、少なくとも１つの移動相遷移フロントについての収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータに基づいて、上昇遷移フロントについては上述のような式Ｉａ又は下降遷移フロントについては上述のような式Ｉｂを使用して、モデルガンマ累積分布曲線を決定する工程と、上述のように式ＩＩ及び本明細書に記載されるモデルガンマ累積分布曲線のパラメータｋ、θ、及びＶｉを使用して、少なくとも１つの移動相遷移フロントについての理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値を計算し、当該計算されたＨＥＴＰ値に基づいてクロマトグラフィカラム充填の品質を評価する工程とを含む工程をプロセッサに実行させる、実行可能なコードを含む。
【００９７】
本開示の別の態様は、クロマトグラフィカラムの品質評価の装置に関する。この装置は、プロセッサ及びプロセッサに連結されたメモリを含む。メモリは、メモリに記憶されたプログラム命令を実行するように構成される。これらの命令は以下を含む：カラム充填を含むクロマトグラフィカラムの第１の操作中に、カラム出口信号及び累積流量パラメータを、少なくとも１つの移動相遷移フロントの２つ以上の間隔で収集する工程と、上述のように、少なくとも１つの移動相遷移フロントについての収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータに基づいて、上昇遷移フロントについては式Ｉａ又は下降遷移フロントについては式Ｉｂを使用して、モデルガンマ累積分布曲線を決定する工程と、上述のように式ＩＩ及び本明細書に記載されるモデルガンマ累積分布曲線のパラメータｋ、θ、及びＶｉを使用して、少なくとも１つの移動相遷移フロントについての理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値を計算し、当該計算されたＨＥＴＰ値に基づいてクロマトグラフィカラム充填の品質を評価する工程。
【実施例】
【００９８】
実施例１−レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造に使用される、プロテインＡクロマトグラフィカラムのカラムの品質評価へのガンマ分布遷移分析の適用
概論：
治療抗体レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造プロセスは、いくつかの段階を含み、そのうちの４つはクロマトグラフィ精製を含む。カラムの品質評価のためのガンマ分布遷移分析（ＧＤＴＡ）を、これらのカラム工程のそれぞれの間に２つ又は３つの遷移に適用した。この実施例は、レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造中に使用されるプロテインＡカラム精製工程にＧＤＴＡ法を適用することを記載している。精製プロセスは、本明細書に記載されるように、ＧＤＴＡに適した２つの遷移フロント、すなわち、平衡化及び中間洗浄を含む。
【００９９】
６９バッチのレミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の連続精製から、６０の平衡化及び６９の洗浄フロントを含む１２９のフロントについてＧＤＴＡを実行した。ガンマフロント分布分析は、製造と並行して行われ、製造プロセスに影響を与えなかった。全ての製造、モニタリング及び制御は、現在の有効な手順を使用して行われた。レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）のカラムクロマトグラフィ精製中、導電率（すなわち、カラム出口信号）及び溶出液の流量（すなわち、累積流量）を記録した。
【０１００】
ＧＤＴＡをリアルタイムでカラム操作に適用したことに加えて、過去４年間に処理された２８５バッチの過去のデータもまた、本明細書に記載されるように収集及び分析した。データセットには、２５３の平衡化のフロント及び２８５の洗浄フロントを含み、合計５３８の過去のフロントが含まれていた。使用前消毒が行われた３２バッチについては、平衡化のフロントは生成されなかった。このデータセットは、カラムの寿命を通じて均等な分布を提供するために選択され、１１のカラム充填を表す。
【０１０１】
ＧＤＴＡプロトコル：
プロテインＡカラム精製の各遷移フロント、すなわち、洗浄及び平衡化について、導電率及び累積流量を記録した。カラムがインラインに置かれた時点を特定するために、プレカラム導電率及び圧力の傾向を評価することによって、開始点の決定を行った。フロントの持続時間について、スプレッドシートを作成し、計算された１０秒の間隔を使用して、サーバから流量及び導電率のデータを取得するように設定した。
【０１０２】
導電率データは、最大値を１及び最小値を０とし、他の点を比例的にスケーリングすることで正規化した。加えて、流量をカラム体積に変換した。
【０１０３】
開始ガンマＣＤＦを、ＰＩモジュールと同じ開始ｋ、θ、Ｖｉパラメータを使用して計算した。Ｖｉは、ガンマ分布関数のｘ項の各体積値から減算した。精製中に増加していた導電率を正規化するために、Ｖｉ未満の体積では導電率の値を０に設定し、最大値を１に設定した。
【０１０４】
各導電率値と各体積点に対するモデル適合との差（誤差）を計算した。加えて、０．５〜１．８ＣＶの誤差に対する平方和を計算した。次の式を使用して平方和の最小値を有するモデル曲線を生成するｋ、θ、及びＶｉパラメータを見つけるために、Ｅｘｃｅｌソルバーを使用して最良適合ガンマＣＤＦパラメータを計算した
【０１０５】
【数１８】
2021522477.tif 000021
ソルバーは、最も近い適合に達することを確実にするために、ｋ≧０．０００１及びＶｉ≧０の制約を有するＧＲＧ非線形法を使用して、１０，０００回の反復を行った。
ｋ、θ、及びＶｉの最終値から以下のパラメータを計算した：
平均（Ｖｍ）、μ＝ｋθ＋Ｖｉ、
分散、σ２（シグマ二乗）＝ｋθ２
モード＝（ｋ−１）θ＋Ｖｉ
【０１０６】
【数１９】
2021522477.tif 000022
平均流量及びプレカラム圧力を、各フロントについて０．５〜１．８ＣＶの期間にわたって計算した。
【０１０７】
受入基準の分析及び評価：
正規性
平衡化及び洗浄フロントの両方についてのＨＥＴＰ及びＳＳの結果を、確率プロットを作成することによって正規性について評価した。確率プロット（図３〜図１２）では、データポイント（ＨＥＴＰ又はＳＳの結果）は、試料で観察された実際の累積分布を表している。線は、試料から推定されるパラメータを使用した正規分布に基づいて、適合された累積分布並びに信頼区間の上限値及び下限値を表している。パーセンタイルスケールを変換することにより、適合された分布が直線を形成する。ＨＥＴＰ及びＳＳデータセットはそれぞれ、下端で０に拘束されているが、正規分布モデルは負の値を示唆している。得られた確率プロットは、曲線形状を示す。図３〜図６を参照されたい。したがって、結果は、自然対数変換を用いて良好に適合する。自然対数変換データの確率プロットについては、図７〜図１０を参照されたい。
【０１０８】
平均（Ｖｍ）のデータもまた、正規性について評価した。図１１及び図１２は、データが正規分布に適合することを示し、わずかな孤立値のみを示す。したがって、変換は必要なかった。このパラメータは、プロトコルにおいて指定されなかったが、曲線適合が有効であることを保証した。このパラメータの管理限界もまた、この分析から生成される。
【０１０９】
孤立値の特定及び変動の原因。
孤立値を特定し、結果の変動性を評価するために、各パラメータについての管理図を作成した。図１３〜図２２を参照されたい。管理図は、ＨＥＴＰ及びＳＳの変換されたデータを使用し、自然対数変換が適用された。データはまた、これらのパラメータのそれぞれについて、変換された上限の管理限界を有する時系列プロットでプロットされる。
【０１１０】
ＨＥＴＰ：平衡化及び洗浄フロントの両方について、多くの孤立値及び傾向が、ＨＥＴＰ結果において明らかである。加えて、図１３及び図１８は、図中の四角で表され、以下に番号を付したシューハートルール１、２及び３に基づくデータの傾向を示している。
【０１１１】
【表２】
2021522477.tif 000023
【０１１２】
これらの変位に関連するバッチは、許容可能なプロセスを代表するので、分析から除外されなかった。
【０１１３】
管理図（図１３及び図１８）の両方は、管理限界を更に超える、多くのシューハートルール１の違反の数を示しており、これも管理限界を超えている。各場合において、問題は、カラムを再コンディショニングすることによって特定及び修正された。
【０１１４】
予想されるように、カラム充填の変動に起因して、いくつかの実行は、ルール２及び３の基準を満たしていた。傾向を更に評価するために、カラム充填（図２３〜図２４）及びスキッド（図２５〜図２６）によりグループ化されたデータを使用して時系列プロットを作成した。これらのチャートは、特別な原因による変動の多くが、カラムの劣化及びいくつかの孤立した変位に起因することを示している。平衡化フロントの各カラムについて、ＨＥＴＰの増加傾向が明らかである（図２３）。洗浄フロントで観察された変位は、異なる時間で一方のスキッド又は他方のスキッドに分離されているように見え（図２６）、これは、スキッドにおけるカラム性能の変動の原因がある可能性を示唆している。
【０１１５】
平方和（ＳＳ）：平方和は、ガンマ分布がプロセスデータにどのくらい良好に適合するかの尺度である。この測定は、ＨＥＴＰ結果が有効であることを確認にするためのチェックを提供する。変換されたデータの管理図は、それぞれ平衡化及び洗浄について図１５及び図２０に示される。この測定値は、上限の管理限界のみを有する。図１５は、上限の管理限界を超えた６点を示す。これらのうちの４つは、より高いＨＥＴＰと関連付けられる。バッチ８８０５７２Ｍは、フロントの間に流れが乱れてＳＳが高くなったが、ＨＥＴＰには影響しなかった。
【０１１６】
流量及び圧力の評価。
データセットの平均流量及びプレカラム圧力を評価して、任意の孤立値を特定した。特定された差違と結果との間の関係を評価した。
【０１１７】
流量及びプレカラム圧力は、図２７〜図３０の傾向がある。チャートは、各工程の流量制御に優れていることを示している。この評価の間、洗浄流量を変化させた。プレカラム圧力は、スキッド及びカラムに関連する変動を示しているが、一般的には、範囲内で安定である。図３１は、ＨＥＴＰ値が洗浄流量変化によって有意な影響を受けていないことを示している。
【０１１８】
プロテインＡカラムの管理限界
ＨＥＴＰ：
ＨＥＴＰは、カラム性能に直接関連し、分散を増加させる可能性があるシステム内の他の要因によっても影響を受ける。結果は、＞０でなければならない。ＨＥＴＰの管理限界は、平衡化についての図１３及び洗浄フロントについての図１８に示すように、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換（λ＝０）を使用することによって最適に決定される。管理図は、平均＋／−３標準偏差を使用してＭｉｎｉｔａｂにより計算された変換されたデータの管理限界を示す（以下の表２も参照されたい）。標準偏差は、平均移動範囲に基づいて決定される。カラム寿命にわたるカラム性能の変動を考慮するために、１００の移動範囲を選択した。上限及び下限の管理限界を逆変換（ｅｘ）して、変換されていないデータの管理限界を決定する。
【０１１９】
各フロントのＨＥＴＰ結果及び管理限界の時系列プロットを図１４及び図１９に示す。これらの限界内での動作は、この過去のレビューに基づいて、許容可能なクロマトグラフ性能が得られると期待されている。上限の管理限界を超える値は、カラム流量の問題を示している可能性があり、更に評価する必要がある。下限の管理限界を下回る値は、計算エラーを示している可能性がある。
【０１２０】
平方和（ＳＳ）：
ＳＳは、ガンマ分布モデルがどのくらい良好にデータに適合するかを示す尺度である。この尺度を使用して、ＧＤＴＡ法で計算されたＨＥＴＰ値がプロセスデータを表すことを確認する。下限は存在せず、結果は＞０でなければならない。ＳＳの上限の管理限界は、平衡化についての図１５及び洗浄フロントについての図２０に示すように、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換（λ＝０）を使用することによって最適に決定される。管理図は、平均＋／−３標準偏差を使用してＭｉｎｉｔａｂにより計算された変換されたデータの管理限界を示す。標準偏差は、平均移動範囲に基づいて決定される。カラム寿命にわたるカラム性能の変動を考慮するために、１００の移動範囲を選択した。管理図は、平衡化及び洗浄フロントについてそれぞれ０．０５０及び０．９８９を与えるように逆変換した、変換されたデータの上限の管理限界を示している（表２を参照されたい）。各フロントのＳＳ結果及び管理限界の時系列プロットを図１６及び図２０に示す。限界内の結果は、モデルがデータ及び過去の結果に適合することを確実にする。結果がこの範囲外である場合、特別な原因が考えられる。
【０１２１】
平均値：
平均値を、ガンマ分布モデルの精度の第２の尺度として加えた。平均値は、フロントの理論的な質量中心を表し、大きな余分なカラム体積や移動相と樹脂との間の相互作用など、システム内でそれをシフトさせる他の要因がない限り、常に１カラム体積に近い値であるべきである。平衡化及び洗浄フロントの両方の平均値は、ほぼ正規分布しており、変換を必要とせず、図１１及び図１２を参照されたい。平衡化フロントの平均は、１．０７ＣＶ付近に密に分布しており、いくつかの孤立値がいずれかの側に存在し、高い側では１．２に接近しており、図１７を参照されたい。洗浄フロントは、わずかに多くの変動を示し、０．８に接近したいくつかの低い孤立値が存在する０．９９ＣＶの中心にあり、図２２を参照されたい。両フロントの平均値については、０．８０〜１．２０ＣＶの管理限界を適用することが推奨される（表２を参照されたい）。平均値はカラム性能の尺度ではなく、分析が適切であったかどうかを確認するためのチェックとして用いられるものであるため、これは適切である。より厳しい管理限界は、このチェックのために不必要な感度になってしまう。
【０１２２】
【表３】
2021522477.tif 000024
【０１２３】
実施例２−レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造に使用される、プロテインＡクロマトグラフィカラムの最適以下の性能の検出のためのガンマ分布遷移分析の適用
治療抗体レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造プロセスは、いくつかの段階を含み、そのうちの４つはクロマトグラフィ精製を含む。カラムの品質評価のためのガンマ分布遷移分析（ＧＤＴＡ）を、これらのカラム工程のそれぞれの間に２つ又は３つの遷移に適用した。この実施例は、レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）製造に使用されるプロテインＡカラム精製工程にＧＤＴＡ法を適用することを記載している。精製プロセスは、本明細書に記載されるように、ＧＤＴＡに適した２つの遷移フロント、すなわち、平衡化及び中間洗浄を含む。
【０１２４】
カラム充填８８３３３３Ｍ００１で処理された２３バッチ及びカラム充填８８５４７３Ｍ００１で処理された２２バッチを含む、レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の４５バッチの連続した精製から、４５の平衡化フロントについてＧＤＴＡを実行した。ガンマフロント分布分析は、製造と並行して行われ、製造プロセスに影響を与えなかった。全ての製造、モニタリング及び制御は、現在の有効な手順を使用して行われた。レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）のカラムクロマトグラフィ精製中、導電率（すなわち、カラム出口信号）及び溶出液の流量（すなわち、累積流量）を記録した。
【０１２５】
４５バッチの平衡化ＨＥＴＰ結果の傾向は、図３２を参照して、カラム充填間の有意差を示した。カラム評価のための現在の対照では、２つのカラム充填間の差は確認されなかった。バッチ収率の評価は、２つのカラム充填で処理されたバッチ間の有意な差（ｐ＝０．００１）を示し、より高いＨＥＴＰ値を有するカラム充填の方が４．３％低いと推定された。他の潜在的要因を評価し、収率差に対する相関は示さなかった。したがって、この分析からの結論は、カラム性能差がより低い収率を引き起こしたことである。この発見に基づいて、より低い収率のカラムをコンディショニングして、使用を連続する前にカラム充填を改善した。この実施例は、クロマトグラフィカラム品質を評価する際のＧＤＴＡ法の感度を示す。
【０１２６】
実施例３−レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造に使用される、ＳＰ−セファロース高性能クロマトグラフィカラムのカラムの品質評価へのガンマ分布遷移分析の適用
概論：
上述のように、レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造プロセスは、いくつかの段階を含み、そのうちの４つはクロマトグラフィ精製を含む。本実施例は、レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）製造に使用されるＳＰ−セファロース高性能（ＳＰＨＰ）カラム精製工程にＧＤＴＡ法を適用することを記載している。ＳＰＨＰカラムは陽イオン交換クロマトグラフィカラムである。精製プロセスは、本明細書に記載されるように、ＧＤＴＡに適した３つの遷移フロント、すなわち、平衡化、ＷＦＩフラッシュ、及びストレージフロントを含む。
【０１２７】
２３バッチのレミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の精製から、２３の平衡化、ＷＦＩフラッシュ、及びストレージフロントを含む６９のフロントについてＧＤＴＡを実行した。ガンマフロント分布分析は、製造と並行して行われ、製造プロセスに影響を与えなかった。全ての製造、モニタリング及び制御は、現在の有効な手順を使用して行われた。レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）のカラムクロマトグラフィ精製中、導電率（すなわち、カラム出口信号）及び溶出液の流量（すなわち、累積流量）を記録した。
【０１２８】
ＧＤＴＡをリアルタイムでカラム操作に適用したことに加えて、過去４年間に処理された１８９の遷移フロントの過去のデータもまた、本明細書に記載されるように収集及び分析した。データセットには、６４の平衡化フロント、６３のＷＦＩフラッシュフロント、及び６２のストレージフロントが含まれた。このデータセットは、カラムの寿命を通じて均等な分布を提供するために選択され、６のカラム充填を表す。
【０１２９】
ＳＰＨＰカラムフロントのＧＤＴＡは、上記実施例１に記載されるように行われた。この分析は、ＨＥＴＰ、ＳＳの測定値、及び各フロントの平均値を生成した。統計的評価に基づいてこれら３つのパラメータのそれぞれに導出された管理限界を以下の表３に列挙する。
【０１３０】
ＳＰＨＰカラムの管理限界：
ＨＥＴＰ：
ＨＥＴＰは、カラム性能に直接関連し、分散を増加させる可能性があるシステム内の他の要因によっても影響を受ける。結果は、＞０でなければならない。ＨＥＴＰの管理限界は、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換（λ＝０）を使用することによって最良に決定される。変換されたデータの管理限界は、平均＋／−３標準偏差を使用してＭｉｎｉｔａｂにより計算した。標準偏差は、平均移動範囲に基づいて決定される。カラム寿命にわたるカラム性能の変動を考慮するために、２５の移動範囲を選択した。上限及び下限の管理限界を逆変換（ｅｘ）して、変換されていないデータの管理限界を決定する。各フロントのＨＥＴＰ結果及び管理限界の時系列プロットを図３３（平衡化フロント）、図３４（ＷＦＩフラッシュフロント）、及び図３５（ストレージフロント）に示す。これらの限界内での動作は、この過去のレビューに基づいて、許容可能なクロマトグラフ性能が得られると期待されている。上限の管理限界を超える値は、カラム流量の問題を示している可能性があり、更に評価する必要がある。下限の管理限界を下回る値は、計算エラーを示している可能性がある。
【０１３１】
平方和（ＳＳ）：
ＳＳは、ガンマ分布モデルがどのくらい良好にデータに適合するかを示す尺度である。この尺度を使用して、ＧＤＴＡ法で計算されたＨＥＴＰ値が、プロセスデータを表すことを確認する。下限は存在せず、結果は＞０でなければならない。ＳＳの上限の管理限界は、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換（λ＝０）を使用することによって最良に決定される。変換されたデータの管理限界は、平均＋／−３標準偏差を使用してＭｉｎｉｔａｂにより計算した。標準偏差は、平均移動範囲に基づいて決定される。カラム寿命にわたるカラム性能の変動を考慮するために、１００の移動範囲を選択した。変換されたデータの上限の管理限界を逆変換して、平衡化フロントについて０．１１０、ＷＦＩフラッシュフロントについて０．０２７、及びストレージフロントについて０．０７３を得た（表３を参照されたい）。限界内の結果は、モデルがデータ及び過去の結果に適合することを確実にする。結果がこの範囲外である場合、特別な原因が考えられる。
【０１３２】
平均値：
平均値を、ガンマ分布モデルの精度の第２の尺度として加えた。平均値は、フロントの理論的な質量中心を表し、大きな余分なカラム体積や移動相と樹脂との間の相互作用など、システム内でそれをシフトさせる他の要因がない限り、常に１カラム体積に近い値であるべきである。平衡化、ＷＦＩフラッシュ及びストレージフロントの平均値は、不規則な分布を有し、変換から恩恵を受けていない。フロントのそれぞれの平均については、０．８０〜１．２０ＣＶの管理限界を適用することが推奨される（表３を参照されたい）。平均値はカラム性能の尺度ではなく、分析が適切であったかどうかを確認するためのチェックとして用いられるものであるため、これは適切である。これらの限界は、予想される計算結果からの有意な逸脱を特定するために十分であると予想される。より厳しい管理限界は、このチェックのための不必要な感度になってしまい、これは各カラム充填で変化すると見られる。
【０１３３】
【表４】
2021522477.tif 000025
【０１３４】
実施例４−レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造に使用される、Ｑ２クロマトグラフィカラムのカラムの品質評価へのガンマ分布遷移分析の適用
概論：
この実施例は、レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）製造に使用される二次陰イオン交換（Ｑ２）カラム精製工程にＧＤＴＡ法を適用することを記載している。Ｑ２カラムは、陰イオン交換クロマトグラフィカラムである。精製プロセスは、本明細書に記載されるように、ＧＤＴＡに適した３つの遷移フロント、すなわち、平衡化、ストリップ、及びストレージフロントを含む。
【０１３５】
２３の平衡化及びストリップフロント、及び２２のストレージフロントを含む６８のフロントについてＧＤＴＡを実行した。ガンマフロント分布分析は、製造と並行して行われ、製造プロセスに影響を与えなかった。全ての製造、モニタリング及び制御は、現在の有効な手順を使用して行われた。レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）のカラムクロマトグラフィ精製中、導電率（すなわち、カラム出口信号）及び溶出液の流量（すなわち、累積流量）を記録した。
【０１３６】
ＧＤＴＡをリアルタイムでカラム操作に適用したことに加えて、過去４年間に処理された３２４の遷移フロントの過去のデータもまた、本明細書に記載されるように収集及び分析した。データセットには、１２１の平衡化フロント、１２４のストリップフロント、及び７９のストレージフロントが含まれた。このデータセットは、カラムの寿命を通じて均等な分布を提供するために選択され、１０のカラム充填を表す。
【０１３７】
Ｑ２カラムフロントのＧＤＴＡは、上記実施例１に記載されるように行われた。この分析は、ＨＥＴＰ、ＳＳの測定値、及び各フロントの平均値を生成した。統計的評価に基づいてこれら３つのパラメータのそれぞれに導出された管理限界を以下の表４に列挙する。
【０１３８】
Ｑ２カラムの管理限界：
ＨＥＴＰ：
ＨＥＴＰは、カラム性能に直接関連し、分散を増加させる可能性があるシステム内の他の要因によっても影響を受ける。結果は、＞０でなければならない。ＨＥＴＰの管理限界は、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換（λ＝０）を使用することによって最良に決定される。変換されたデータの管理限界は、平均＋／−３標準偏差を使用してＭｉｎｉｔａｂにより計算した。標準偏差は、平均移動範囲に基づいて決定される。カラム寿命にわたるカラム性能の変動を考慮するために、１００の移動範囲を選択した。上限及び下限の管理限界を逆変換（ｅｘ）して、変換されていないデータの管理限界を決定する。
【０１３９】
各フロントのＨＥＴＰ結果及び管理限界の時系列プロットを図３６（平衡化フロント）、図３７（ストリップフロント）、及び図３８（ストレージフロント）に示す。これらの限界内での動作は、この過去のレビューに基づいて、許容可能なクロマトグラフ性能が得られると期待されている。上限の管理限界を超える値は、カラム流量の問題を示している可能性があり、更に評価する必要がある。下限の管理限界を下回る値は、計算エラーを示している可能性がある。
【０１４０】
平方和（ＳＳ）：
ＳＳは、ガンマ分布モデルがどのくらい良好にデータに適合するかを示す尺度である。この尺度を使用して、ＧＤＴＡ法で計算されたＨＥＴＰ値が、プロセスデータを表すことを確認する。下限は存在せず、結果は＞０でなければならない。ＳＳの上限の管理限界は、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換（λ＝０）を使用することによって最良に決定される。変換されたデータの管理限界は、平均＋／−３標準偏差を使用してＭｉｎｉｔａｂにより計算した。標準偏差は、平均移動範囲に基づいて決定される。カラム寿命にわたるカラム性能の変動を考慮するために、１００の移動範囲を選択した。移動範囲法ではより高い標準偏差を出していたため、ストレージフロントの集計データから標準偏差を決定した。管理限界を下の表４に報告する。限界内の結果は、モデルがデータ及び過去の結果に適合することを確実にする。結果がこの範囲外である場合、特別な原因が考えられる。
【０１４１】
平均値：
平均値を、ガンマ分布モデルの精度の第２の尺度として加えた。平均値は、フロントの理論的な質量中心を表し、大きな余分なカラム体積や移動相と樹脂との間の相互作用など、システム内でそれをシフトさせる他の要因がない限り、常に１カラム体積に近い値であるべきである。平衡化、ストリップ、及びストレージフロントの平均値は、不規則な分布を有し、変換から恩恵を受けていない。フロントのそれぞれの平均については、０．８０〜１．２０ＣＶの管理限界を適用することが推奨される（表４を参照されたい）。平均値はカラム性能の尺度ではなく、分析が適切であったかどうかを確認するためのチェックとして用いられるものであるため、これは適切である。これらの限界は、予想される計算結果からの有意な逸脱を特定するために十分であると予想される。より厳しい管理限界は、このチェックのための不必要な感度になってしまい、これは各カラム充填で変化すると見られる。
【０１４２】
【表５】
2021522477.tif 000026
【０１４３】
好ましい実施形態を本明細書で詳細に描写及び説明するが、本発明の趣旨から逸脱することなく様々な修正、追加、置換などを行うことができ、したがって、これらは以下の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることは、当業者には明らかであろう。
【図１Ａ】
2021522477.tif 000030
【図１Ｂ】
2021522477.tif 000031
【図２】
2021522477.tif 000032
【図３】
2021522477.tif 000033
【図４】
2021522477.tif 000034
【図５】
2021522477.tif 000035
【図６】
2021522477.tif 000036
【図７】
2021522477.tif 000037
【図８】
2021522477.tif 000038
【図９】
2021522477.tif 000039
【図１０】
2021522477.tif 000040
【図１１】
2021522477.tif 000041
【図１２】
2021522477.tif 000042
【図１３】
2021522477.tif 000043
【図１４】
2021522477.tif 000044
【図１５】
2021522477.tif 000045
【図１６】
2021522477.tif 000046
【図１７】
2021522477.tif 000047
【図１８】
2021522477.tif 000048
【図１９】
2021522477.tif 000049
【図２０】
2021522477.tif 000050
【図２１】
2021522477.tif 000051
【図２２】
2021522477.tif 000052
【図２３】
2021522477.tif 000053
【図２４】
2021522477.tif 000054
【図２５】
2021522477.tif 000055
【図２６】
2021522477.tif 000056
【図２７】
2021522477.tif 000057
【図２８】
2021522477.tif 000058
【図２９】
2021522477.tif 000059
【図３０】
2021522477.tif 000060
【図３１】
2021522477.tif 000061
【図３２】
2021522477.tif 000062
【図３３】
2021522477.tif 000063
【図３４】
2021522477.tif 000064
【図３５】
2021522477.tif 000065
【図３６】
2021522477.tif 000066
【図３７】
2021522477.tif 000067
【図３８】
2021522477.tif 000068
【国際調査報告】
2021522477.tif 000069
2021522477.tif 000070
2021522477.tif 000071