(57)【要約】  本発明は、組換え産生デノスマブ分子、及びデノスマブ分子のグリカンプロファイルを改変する方法に関する。
2021521854.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デノスマブ分子上に存在する高マンノースのレベルを増加させる方法であって、前記デノスマブ分子は哺乳動物宿主細胞によって組換え発現されたものであり、
（ａ）細胞密度が少なくとも１×１０６生細胞／ｍＬになるまで、増殖期の間、第１の培養培地中で前記哺乳動物宿主細胞をインキュベートする工程と、ここで、前記第１の培養培地は、１ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌのグルコースを含み、その後、
（ｂ）産生期の間、第２の培養培地中で前記工程（ａ）からの宿主細胞をインキュベートして、前記デノスマブ分子を発現させる工程と、ここで、前記第２の培養培地は、０ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌのグルコース及び５ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌのガラクトースを含む、
を含み、
前記デノスマブ分子の２％〜１４％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースグリカンを含む、方法。
【請求項２】
前記増殖期の間、前記グルコース濃度は、ボーラス供給又は灌流によって４ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌに維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記宿主細胞が、前記産生期の間、前記第２の培養培地中でインキュベートされるとき、ボーラス供給又は灌流によって、前記グルコース濃度は、０ｇ／Ｌ〜８ｇ／Ｌに維持され、前記ガラクトース濃度は、７ｇ／Ｌ〜１５ｇ／Ｌに維持される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記産生期の間、前記宿主細胞は最初に、約３〜約１５日間、前記第１の培養培地中に維持され、その後、灌流又はボーラス供給によって、前記第２の培養培地中に移される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）において、前記細胞密度は、５×１０６生細胞／ｍＬ〜１２×１０６生細胞／ｍＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記デノスマブ分子の約４％〜約１１％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物宿主細胞は、ＣＳ−９細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の培養培地は、メトトレキサート（ＭＴＸ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）増殖期の間、第１の培養培地中で前記哺乳動物宿主細胞をインキュベートし、１回以上のボーラス供給により培養物を補充する工程と、ここで、前記増殖期の間、前記グルコース濃度は、約４ｇ／Ｌ〜約１８ｇ／Ｌに維持される
（ｂ）工程（ａ）からの宿主細胞を増殖期から産生期へ移行させ、約３日〜約１５日間、前記グルコース濃度を約４ｇ／Ｌ〜約１８ｇ／Ｌに維持する工程と、その後、
（ｃ）前記（ｂ）の宿主細胞を第２の培養培地に移す工程と、ここで、前記第２の培養培地は、約１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌのグルコース及び約１０ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌのガラクトースを含む、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
組換え産生デノスマブ分子を含む組成物であって、前記デノスマブ分子の少なくとも１５％は１つ以上の糖化リジン残基を含む、組成物。
【請求項１２】
前記デノスマブ分子の２％〜１４％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記デノスマブ分子の４％〜１１％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記デノスマブは、約２５ｐＭ以下の結合親和性（ＫＤ）値でヒトＲＡＮＫＬに結合する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
組換え産生デノスマブ分子を含む組成物であって、前記デノスマブ分子の少なくとも５％は、ガラクトース部分を含む１つ以上の糖化リジン残基を含む組成物。
【請求項１６】
前記デノスマブ分子の２％〜１４％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記デノスマブ分子の４％〜１１％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記デノスマブは、約２５ｐＭ以下の結合親和性（ＫＤ）値でヒトＲＡＮＫＬに結合する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
組換え産生デノスマブ分子を含み、前記デノスマブ分子の０．２％〜１．８％はＮ−２９８部位に高マンノースグリカンを含む組成物。
【請求項２０】
前記デノスマブ分子の約０．５％〜約１％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースグリカンを含む、請求項１９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０１８年５月１日に出願された米国仮特許出願第６２／６６５，０４５号明細書に基づく利益を主張するものであり、その出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、組換え発現抗体、及びこのような抗体のグリカンプロファイルを調節する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
糖タンパク質のグリカン部分の構造及び組成は、治療用タンパク質の安全性及び有効性、例えば、その免疫原性、溶解性及び半減期に影響し得る。哺乳動物細胞の培養で産生されるタンパク質は、マンノース５（Ｍａｎ−５）、マンノース６（Ｍａｎ−６）、マンノース７（Ｍａｎ−７）、マンノース８（Ｍａｎ−８）及びマンノース９（Ｍａｎ−９）などの高マンノースグリコフォームを様々なレベルで含有し得る。マンノース含量の高い抗体は、Ｍａｎ−５グリカン及びＭａｎ−７、８又は９グリカンを有する抗体によって示される治療活性及びクリアランス速度に差があるために興味深いものになっている。例えば、キフネンシン処理で生成された高マンノース抗体は、高いＡＤＣＣ活性、及びＦＣγＲＩＩＩＡに対する高い親和性を示した（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ９９（３）：６５２−６６５）。同様に、Ｙｕらは、Ｍａｎ−５及びＭａｎ−８／９グリコフォームがＡＤＣＣ活性を増加させ、ＣＤＣ活性を減少させ、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合親和性を増加させ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＩＩＢへの結合親和性を減少させたようにみえると報告している（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ．  ２０１２  Ｊｕｌ  １；４（４）：４７５−４８７．ｄｏｉ：１０．４１６１／ｍａｂｓ．２０７３７）。したがって、高マンノースグリカン（例えば、Ｍａｎ−５）を増加させた抗体組成物は、いくつかの治療上の利益を提供することができる。
【０００４】
一方、Ｍａｎ−５及びＭａｎ−６グリコフォームはまた、複合体フコシル化グリコフォームよりも速いクリアランス速度を示すことも報告されている（Ｙｕら、上記）。したがって、高レベルのＭａｎ−５グリカンは、抗体の半減期の減少及び迅速なクリアランスをもたらし得る。したがって、ＰＫ特性と治療活性（例えば、ＡＤＣＣ）との間の望ましいバランスを達成するために、抗体の高マンノース含量を制御し調節する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ９９（３）：６５２−６６５
【非特許文献２】Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ．２０１２  Ｊｕｌ  １；４（４）：４７５−４８７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書中に開示され、且つ例示されるように、デノスマブ上の高マンノースグリカンのレベルを調節するための方法が開発された。特に、産生期の間、培養培地中のグルコースの量を減少させ、且つガラクトースの量を増加させることによって、高マンノースグリカンのレベルを増加させた。種々のグリカンプロファイルを含む、組換え産生デノスマブもまた、本明細書中に開示され、例示される。
【０００７】
本明細書の記載に基づき、当業者であれば、単なる日常的な実験により、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識又は確認することができるであろう。このような均等物は、以下の実施形態（Ｅ）に包含されるものとする。
【０００８】
Ｅ１．デノスマブ分子上に存在する高マンノースのレベルを増加させる方法（ここで、前記デノスマブ分子は哺乳動物宿主細胞によって組換え発現されたものである）であって、
（ａ）増殖期の間、第１の培養培地中で前記哺乳動物宿主細胞を、細胞密度が少なくとも１×１０６生細胞／ｍＬになるまでインキュベートする工程（ここで、前記第１の培養培地は、約１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌのグルコースを含む）と、その後の、
（ｂ）産生期の間、第２の培養培地中で工程（ａ）からの宿主細胞をインキュベートして、前記デノスマブ分子を発現させる工程（ここで、前記第２の培養培地は、約０ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌのグルコース及び約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌのガラクトースを含む）と
を含み、
デノスマブ分子の約２％〜約１４％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースグリカンを含む、方法。
Ｅ２．デノスマブ分子上に存在する高マンノースのレベルを増加させる方法（ここで、前記デノスマブ分子は哺乳動物宿主細胞によって組換え発現されたものである）であって、
（ａ）増殖期の間、第１の培養培地中で前記哺乳動物宿主細胞を、細胞密度が少なくとも１×１０６生細胞／ｍＬになるまでインキュベートする工程（ここで、前記第１の培養培地は、約１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌのグルコースを含む）と、その後の、
（ｂ）産生期の間、第２の培養培地中で工程（ａ）からの宿主細胞をインキュベートして、前記デノスマブ分子を発現させる工程（ここで、前記第２の培養培地は、約０ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌのグルコース及び約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌのガラクトースを含む）とを含み、
Ｎ−２９８部位に高マンノースを含むデノスマブ分子の割合は、対照と比較して増加している、方法。
Ｅ３．デノスマブ分子の約２％〜約１４％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースグリカンを含む、Ｅ２に記載の方法。
Ｅ４．増殖期の間、グルコース濃度は、ボーラス供給又は灌流によって約１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌに維持される、Ｅ１〜Ｅ３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ５．増殖期の間、グルコース濃度は、ボーラス供給又は灌流によって約４ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌに維持される、Ｅ１〜Ｅ３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ６．産生期の間、宿主細胞は最初に、約３〜約１５日間、第１の培養培地中に保持され、その後、灌流又はボーラス供給によって、第２の培養培地中に移される、Ｅ１〜Ｅ５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ７．宿主細胞が、産生期の間、第２の培養培地中でインキュベートされる場合、グルコース濃度は、ボーラス供給又は灌流によって、約０ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、又は約０ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌに維持される、Ｅ１〜Ｅ６のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ８．宿主細胞が、産生期の間、第２の培養培地中でインキュベートされる場合、ガラクトース濃度は、ボーラス供給又は灌流によって、約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、又は約７ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌに維持される、Ｅ１〜Ｅ７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ９．宿主細胞が、産生期の間、第２の培養培地中でインキュベートされる場合、ボーラス供給又は灌流によって、グルコース濃度は約０ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌに維持され、且つガラクトース濃度は約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌに維持される、Ｅ１〜Ｅ８のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１０．宿主細胞が、産生期の間、第２の培養培地中でインキュベートされる場合、ボーラス供給又は灌流によって、グルコース濃度は約０ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌに維持され、且つガラクトース濃度は約７ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌに維持される、Ｅ１〜Ｅ９のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１１．
（ａ）増殖期の間、第１の培養培地中で前記哺乳動物宿主細胞をインキュベートし、１回以上のボーラス供給により培養物を補充する工程（ここで、増殖期の間、グルコース濃度は、約１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌに維持される）と；
（ｂ）工程（ａ）からの宿主細胞を増殖期から産生期へ移行させ、約３日〜約１５日間、グルコース濃度を約１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌに維持する工程と、その後の、
（ｃ）（ｂ）の宿主細胞を第２の培養培地に移す工程（ここで、前記第２の培養培地は、約０ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌのグルコース及び約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌのガラクトースを含む）と
を含む、Ｅ１〜Ｅ１０のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１２．工程（ａ）及び（ｂ）において、グルコース濃度は、ボーラス供給又は灌流によって、約１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌに維持される、Ｅ１１に記載の方法。
Ｅ１３．工程（ａ）及び（ｂ）において、グルコース濃度は、ボーラス供給又は灌流によって、約４ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌに維持される、Ｅ１１又は１２に記載の方法。
Ｅ１４．工程（ｃ）において、グルコース濃度は、ボーラス供給又は灌流によって、約０ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、又は約０ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌに維持される、Ｅ１１〜Ｅ１３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１５．工程（ｃ）において、ガラクトース濃度は、ボーラス供給又は灌流によって、約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、又は約７ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌに維持される、Ｅ１１〜Ｅ１４のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１６．工程（ｃ）において、ボーラス供給又は灌流によって、グルコース濃度は、約０ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌに維持され、ガラクトース濃度は、約７ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌに維持される、Ｅ１１〜Ｅ１５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１７．前記第１及び第２の培養培地は合成培養培地である、Ｅ１〜Ｅ１６のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１８．前記第１の培養培地は、約４ｇ／Ｌ〜約１８ｇ／Ｌのグルコースを含む、Ｅ１〜Ｅ１７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ１９．前記第２の培養培地は、約１ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約５／Ｌのグルコースを含む、Ｅ１〜Ｅ１８のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２０．前記第２の培養培地は、約１ｇ／Ｌ〜約５／Ｌのグルコースを含む、Ｅ１〜Ｅ１９のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２１．前記第２の培養培地は、約８ｇ／Ｌ〜約１４ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ〜約１３ｇ／Ｌ、又は約１０ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌのガラクトースを含む、Ｅ１〜Ｅ２０のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２２．前記第２の培養培地は、約１０ｇ／ｍＬ〜約１２ｇ／ｍＬのガラクトースを含む、Ｅ１〜Ｅ２１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２３．前記第２の培養培地は、約１ｇ／Ｌ〜約５／Ｌのグルコース、及び約１０ｇ／ｍＬ〜約１２ｇ／ｍＬのガラクトースを含む、Ｅ１〜Ｅ２１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２４．工程（ａ）において、前記細胞密度は、少なくとも約２×１０６生細胞／ｍＬ、少なくとも約５×１０６生細胞／ｍＬ、又は少なくとも約１０×１０６生細胞／ｍＬである、Ｅ１〜Ｅ２３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２５．デノスマブ分子の約４％〜約１１％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ１〜Ｅ２４のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２５ｂ．デノスマブ分子の約４％〜約１４％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ１〜Ｅ２４のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２５ｃ．デノスマブ分子の約５％〜約１４％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ１〜Ｅ２４のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２５ｄ．デノスマブ分子の約５％〜約１１％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ１〜Ｅ２４のいずれか１つに記載の方法。Ｅ２６．デノスマブ分子の２％〜６．５％、又は８．５％〜１４％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ１〜Ｅ２５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２７．デノスマブ分子の４％〜６．５％、又は８．５％〜１１％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ１〜Ｅ２６のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２７ｂ．デノスマブ分子の４％〜６．５％、又は８．５％〜１４％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ１〜Ｅ２５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２７ｃ．デノスマブ分子の５％〜６．５％、又は８．５％〜１４％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ１〜Ｅ２５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２７ｄ．デノスマブ分子の５％〜６．５％、又は８．５％〜１１％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ１〜Ｅ２５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２８．Ｎ−２９８部位に高マンノースを含むデノスマブ分子の割合が６．５％〜７．５％ではないことを条件とする、Ｅ１〜Ｅ２７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ２９．Ｎ−２９８部位に高マンノースを含むデノスマブ分子の割合が６．５％〜８．５％ではないことを条件とする、Ｅ１〜Ｅ２７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ３０．Ｎ−２９８部位に高マンノースを含むデノスマブ分子の割合が７．５％〜８．５％ではないことを条件とする、Ｅ１〜Ｅ２７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ３１．前記宿主細胞は、灌流によって第１の培養培地から第２の培養培地に移される、Ｅ１〜Ｅ３０のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ３２．前記宿主細胞は、ボーラス供給によって第１の培養培地から第２の培養培地に移される、Ｅ１〜Ｅ３０のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ３３．デノスマブ分子上に存在する高マンノースのレベルを増加させる方法（ここで、前記デノスマブ分子は哺乳動物宿主細胞によって組換え発現されたものである）であって、
（ａ）最初の細胞培養を確立する工程（前記哺乳動物宿主細胞の密度は少なくとも１×１０６生細胞／ｍｌである）と、その後の、
（ｂ）産生期の間、培養培地中で工程（ａ）からの宿主細胞をインキュベートして、前記デノスマブ分子を発現させる工程（ここで、前記培養培地は、約０ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌのグルコース及び約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌのガラクトースを含む）と
を含み、
デノスマブ分子の約２％〜約１４％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースグリカンを含む、方法。
Ｅ３４．デノスマブ分子上に存在する高マンノースのレベルを増加させる方法（ここで、前記デノスマブ分子は哺乳動物宿主細胞によって組換え発現されたものである）であって、
（ａ）最初の細胞培養を確立する工程（前記哺乳動物宿主細胞の密度は少なくとも１×１０６生細胞／ｍｌである）と、その後の、
（ｂ）産生期の間、培養培地中で工程（ａ）からの宿主細胞をインキュベートして、前記デノスマブ分子を発現させる工程（ここで、前記培養培地は、約０ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌのグルコース及び約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌのガラクトースを含む）と
を含み、
Ｎ−２９８部位に高マンノースを含むデノスマブ分子の割合は、対照と比較して増加している、方法。
Ｅ３５．デノスマブ分子の約２％〜約１４％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースグリカンを含む、Ｅ３４に記載の方法。
Ｅ３６．工程（ｂ）において、グルコース濃度は、ボーラス供給又は灌流によって約０ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌに維持される、Ｅ３３〜Ｅ３５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ３７．工程（ｂ）において、ガラクトース濃度は、ボーラス供給又は灌流によって約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌに維持される、Ｅ３３〜Ｅ３６のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ３８．前記培養培地は合成培養培地である、Ｅ３３〜Ｅ３７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ３９．前記培養培地は、約１ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約５／Ｌのグルコースを含む、Ｅ３３〜Ｅ３８のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ４０．前記培養培地は、約１ｇ／Ｌ〜約５／Ｌのグルコースを含む、Ｅ３３〜Ｅ３９のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ４１．前記培養培地は、約８ｇ／Ｌ〜約１４ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ〜約１３ｇ／Ｌ、又は約１０ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌのガラクトースを含む、Ｅ３３〜Ｅ４０のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ４２．前記第２の培養培地は、約１０ｇ／ｍＬ〜約１２ｇ／ｍＬのガラクトースを含む、Ｅ３３〜Ｅ４１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ４３．工程（ａ）において、前記細胞密度は、少なくとも約２×１０６生細胞／ｍＬ、少なくとも約５×１０６生細胞／ｍＬ、又は少なくとも約１０×１０６生細胞／ｍＬである、Ｅ３３〜Ｅ４２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ４４．デノスマブ分子の約４％〜約１１％がＮ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ３３〜Ｅ４３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ４４ｂ．デノスマブ分子の約４％〜約１４％がＮ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ３３〜Ｅ４３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ４４ｃ．デノスマブ分子の約５％〜約１４％がＮ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ３３〜Ｅ４３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ４４ｄ．デノスマブ分子の約５％〜約１１％がＮ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ３３〜Ｅ４３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ４５．デノスマブ分子の２％〜６．５％、又は８．５％〜１４％が、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ３３〜Ｅ４４のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ４６．デノスマブ分子の４％〜６．５％、又は８．５％〜１１％が、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ３３〜Ｅ４５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ４６ｂ．デノスマブ分子の４％〜６．５％、又は８．５％〜１４％が、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ３３〜Ｅ４５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ４６ｃ．デノスマブ分子の５％〜６．５％、又は８．５％〜１４％が、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ３３〜Ｅ４５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ４６ｄ．デノスマブ分子の５％〜６．５％、又は８．５％〜１１％が、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ３３〜Ｅ４５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ４７．Ｎ−２９８部位に高マンノースを含むデノスマブ分子の割合が６．５％〜７．５％ではないことを条件とする、Ｅ３３〜Ｅ４６のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ４８．Ｎ−２９８部位に高マンノースを含むデノスマブ分子の割合が６．５％〜８．５％ではないことを条件とする、Ｅ３３〜Ｅ４６のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ４９．Ｎ−２９８部位に高マンノースを含むデノスマブ分子の割合が７．５％〜８．５％ではないことを条件とする、Ｅ３３〜Ｅ４６のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ５０．前記培養物は、回収時に少なくとも約１０ｇ／Ｌのデノスマブを産生する、Ｅ１〜Ｅ４９のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ５１．Ｎ−２９８部位に高マンノースを含むデノスマブ分子の割合は、対照と比較して増加している、Ｅ１又はＥ３３に記載の方法。
Ｅ５２．前記対照は、参照バッチが約５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌのグルコースを含み、ガラクトースを含まない培養培地中で産生される場合の、前記参照バッチからのＮ−２９８部位における高マンノースの割合である、Ｅ２〜Ｅ３２及びＥ３４〜Ｅ５１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ５３．前記対照は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含むデノスマブ分子の約１．５％以下である、Ｅ２〜Ｅ３２及びＥ３４〜Ｅ５２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ５４．前記哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞である、Ｅ１〜Ｅ５３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ５５．前記ＣＨＯ細胞は、ＣＳ−９細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞又はＣＨＯ−Ｓ細胞である、Ｅ５４に記載の方法。
Ｅ５６．前記ＣＨＯ細胞はＣＳ−９細胞である、Ｅ５４に記載の方法。
Ｅ５７．前記ＣＨＯ細胞はＡＭ１／Ｄ細胞である、Ｅ５４に記載の方法。
Ｅ５７ｂ．前記ＣＨＯ細胞はＣＨＯ  ＤＵＸ−Ｂ１１細胞である、Ｅ５４に記載の方法。
Ｅ５７ｃ．前記ＣＨＯ細胞はＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞である、Ｅ５４に記載の方法。
Ｅ５７ｄ．前記ＣＨＯ細胞はＣＨＯ−Ｋ１細胞である、Ｅ５４に記載の方法。
Ｅ５８．前記ＣＨＯ細胞は、メトトレキサート（ＭＴＸ）選択によって増幅されている、Ｅ５４〜Ｅ５７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ５９．前記第１の培養培地はメトトレキサート（ＭＴＸ）を含む、Ｅ１〜Ｅ３２及びＥ５０〜Ｅ５７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ６０．工程（ａ）における前記哺乳動物宿主細胞は、メトトレキサート（ＭＴＸ）選択によって増幅されている、Ｅ３３〜Ｅ５７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６１．前記哺乳動物宿主細胞は、デノスマブをコードする核酸配列を約５００コピー以上含む、Ｅ１〜Ｅ６０のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ６２．前記哺乳動物宿主細胞は、配列番号３を含む核酸配列を約５００コピー以上含む、Ｅ１〜Ｅ６１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ６３．前記哺乳動物宿主細胞は、配列番号４を含む核酸配列を約５００コピー以上含む、Ｅ１〜Ｅ６２のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ６４．デノスマブ分子の約７％〜約１０％がＮ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ１〜Ｅ６３のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ６５．前記高マンノースは、Ｍａｎ−５であるＥ１〜Ｅ６４のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ６６．デノスマブ分子の約７％〜約１０％は、Ｎ−２９８部位にＭａｎ−５を含む、Ｅ１〜Ｅ６５のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ６７．デノスマブ分子の約４８％〜約７０％は、Ｎ−２９８部位にＡ２Ｆ−Ｇ０を含む、Ｅ１〜Ｅ６６のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ６８．デノスマブ分子の約９％〜約２６％は、Ｎ−２９８部位にＡ２Ｆ−Ｇ１を含む、Ｅ１〜Ｅ６７のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ６９．デノスマブ分子の約４％〜約８％は、Ｎ−２９８部位にＡ２−Ｇ０を含む、Ｅ１〜Ｅ６８のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ７０．デノスマブ分子の約０．３％〜約５％は、Ｎ−２９８部位にＡ２Ｆ〜Ｇ２を含む、Ｅ１〜Ｅ６９のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ７１．デノスマブ分子の約０．５％〜約３％は、Ｎ−２９８部位にＡ２−Ｇ１を含む、Ｅ１〜Ｅ７０のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ７２．デノスマブ分子の約０．５％〜約３％は、Ｎ−２９８部位にＡ１−Ｇ０を含む、Ｅ１−Ｅ７１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７３．デノスマブ分子の約１％〜約５％は、Ｎ−２９８部位にＡ１Ｆ−Ｇ０を含む、Ｅ１〜Ｅ７２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７４．組換え産生デノスマブ分子を含む組成物であって、デノスマブ分子の少なくとも１５％は１つ以上の糖化リジン残基を含む組成物。
Ｅ７５．前記糖化リジン残基は、グルコース部分又はガラクトース部分を含む、Ｅ７４に記載の組成物。
Ｅ７６．組換え産生デノスマブ分子を含む組成物であって、デノスマブ分子の少なくとも５％は、ガラクトース部分を含む１つ以上の糖化リジン残基を含む組成物。
Ｅ７７．デノスマブ分子の約７％〜約２０％は、ガラクトース部分を含む１つ以上の糖化リジン残基を含む、Ｅ７６に記載の組成物。
Ｅ７８．デノスマブ分子の７０％以下は、１つ以上の糖化リジン残基を含む、Ｅ７４〜Ｅ７７のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ７９．デノスマブ分子の約２０％〜約３０％は、１つ以上の糖化リジン残基を含む、Ｅ７４〜Ｅ７８のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ８０．ガラクトース−糖化リジン対グルコース−糖化リジンの比は、約１：１０〜約１０：１である、Ｅ７４〜Ｅ７９のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ８１．ガラクトース−糖化リジン対グルコース−糖化リジンの比は、約１：１である、Ｅ７４〜Ｅ８０のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ８２．デノスマブ分子の約２％〜約１４％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ７４〜Ｅ８１のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ８３．デノスマブ分子の２％〜１４％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ７４〜Ｅ８２のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ８３ｂ．デノスマブ分子の約４％〜約１４％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ７４〜Ｅ８２のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ８３ｃ．デノスマブ分子の４％〜１４％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ７４〜Ｅ８２のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ８３ｄ．デノスマブ分子の約５％〜約１４％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ７４〜Ｅ８２のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ８３ｅ．デノスマブ分子の５％〜１４％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ７４〜Ｅ８２のいずれか一つに記載の組成物。Ｅ８４．デノスマブ分子の約４％〜約１１％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ７４〜Ｅ８３のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ８５．デノスマブ分子の４％〜１１％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ７４〜Ｅ８４のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ８５ｂ．デノスマブ分子の約５％〜約１１％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ７４〜Ｅ８４のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ８５ｃ．デノスマブ分子の５％〜１１％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ７４〜Ｅ８４のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ８６．デノスマブ分子の２％〜６．５％、又は８．５％〜１４％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ７４〜Ｅ８５のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ８７．デノスマブ分子の４％〜６．５％、又は８．５％〜１１％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ７４〜Ｅ８６のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ８７ｂ．デノスマブ分子の４％〜６．５％、又は８．５％〜１４％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ７４〜Ｅ８６のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ８７ｃ．デノスマブ分子の５％〜６．５％、又は８．５％〜１４％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ７４〜Ｅ８６のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ８７ｄ．デノスマブ分子の５％〜６．５％、又は８．５％〜１１％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ７４〜Ｅ８６のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ８８．Ｎ−２９８部位に高マンノースを含むデノスマブ分子の割合が６．５％〜７．５％ではないことを条件とする、Ｅ７４〜Ｅ８７のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ８９．Ｎ−２９８部位に高マンノースを含むデノスマブ分子の割合が６．５％〜８．５％ではないことを条件とする、Ｅ７４〜Ｅ８８のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ９０．Ｎ−２９８部位に高マンノースを含むデノスマブ分子の割合が７．５％〜８．５％ではないことを条件とする、Ｅ７４〜Ｅ８９のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ９１．デノスマブ分子の約７％〜約１０％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含む、Ｅ７４〜Ｅ９０のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ９２．前記高マンノースは、Ｍａｎ−５である、Ｅ７４〜Ｅ９１のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ９３．デノスマブ分子の約７％〜約１０％は、Ｎ−２９８部位にＭａｎ−５を含む、Ｅ７４〜Ｅ９２のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ９４．デノスマブ分子の約４８％〜約７０％は、Ｎ−２９８部位にＡ２Ｆ−Ｇ０を含む、Ｅ７４〜Ｅ９３のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ９５．デノスマブ分子の約９％〜約２６％は、Ｎ−２９８部位にＡ２Ｆ−Ｇ１を含む、Ｅ７４〜Ｅ９４のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ９６．デノスマブ分子の約０．５％〜約３％は、Ｎ−２９８部位にＡ１−Ｇ０を含む、Ｅ７４〜Ｅ９５のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ９７．デノスマブ分子の約１％〜約５％は、Ｎ−２９８部位にＡ１Ｆ−Ｇ０を含む、Ｅ７４〜Ｅ９６のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ９８．デノスマブ分子の約４％〜約８％は、Ｎ−２９８部位にＡ２−Ｇ０を含む、Ｅ７４〜Ｅ９７のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ９９．デノスマブ分子の約０．５％〜約４％は、Ｎ−２９８部位にＡ２−Ｇ１を含む、Ｅ７４〜Ｅ９８のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ１００．デノスマブ分子の約０．３％〜約５％は、Ｎ−２９８部位にＡ２Ｆ−Ｇ２を含む、Ｅ７４〜Ｅ９９のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ１０１．前記糖化リジンは、（ｉ）重鎖Ｋ７６、Ｋ９８、Ｋ２１８、Ｋ２４９、Ｋ３１８、Ｋ３２７、及びＫ３３５（配列番号１による番号付け）；並びに（ｉｉ）軽鎖Ｋ１０４、Ｋ１０８、Ｋ１５０、Ｋ１８４、及びＫ１９１（配列番号２による番号付け）からなる群から選択される、Ｅ７４〜Ｅ１００のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ１０２．組換え産生デノスマブ分子を含み、デノスマブ分子の約０．２％〜約１．８％はＮ−２９８部位に高マンノースグリカンを含む組成物。
Ｅ１０３．デノスマブ分子の０．２％〜１．８％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースグリカンを含む、Ｅ１０２に記載の組成物。
Ｅ１０４．デノスマブ分子の約０．５％〜約１％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースグリカンを含む、Ｅ１０２又はＥ１０３に記載の組成物。
Ｅ１０５．デノスマブ分子の０．５％〜１％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースグリカンを含む、Ｅ１０２〜Ｅ１０４のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ１０６．前記高マンノースグリカンは、Ｍａｎ−５である、Ｅ１０２〜Ｅ１０５のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ１０７．デノスマブ分子の０．２％〜１．８％は、Ｎ−２９８部位にＭａｎ−５を含む、Ｅ１０２〜Ｅ１０６のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ１０８．デノスマブ分子の約０．５％〜約１％は、Ｎ−２９８部位にＭａｎ−５を含む、Ｅ１０２〜Ｅ１０７のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ１０９．デノスマブ分子の０．５％〜１％は、Ｎ−２９８部位にＭａｎ−５を含む、Ｅ１０２〜Ｅ１０８のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ１１０．デノスマブ分子の約３０％〜約６０％は、Ｎ−２９８部位にＡ２Ｆ−Ｇ０を含む、Ｅ１０２〜Ｅ１０９のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ１１１．デノスマブ分子の約２０％〜約５０％は、Ｎ−２９８部位にＡ２Ｆ−Ｇ１を含む、Ｅ１０２〜Ｅ１１０のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ１１２．デノスマブ分子の約０．１％〜約３％は、Ｎ−２９８部位にＡ１−Ｇ０を含む、Ｅ１０２〜Ｅ１１１のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ１１３．デノスマブ分子の約０．１％〜約４％は、Ｎ−２９８部位にＡ１Ｆ−Ｇ０を含む、Ｅ１０２〜Ｅ１１２のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ１１４．デノスマブ分子の約４％〜約１０％は、Ｎ−２９８部位にＡ２−Ｇ０を含む、Ｅ１０２〜Ｅ１１３のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ１１５．デノスマブ分子の約１％〜約７％は、Ｎ−２９８部位にＡ２−Ｇ１を含む、Ｅ１０２〜Ｅ１１４のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ１１６．デノスマブ分子の約３％〜約１０％は、Ｎ−２９８部位にＡ２Ｆ−Ｇ２を含む、Ｅ１０２〜Ｅ１１５のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ１１７．前記デノスマブは、約２５ｐＭ以下の結合親和性（ＫＤ）値でヒトＲＡＮＫＬに結合する、Ｅ７４〜Ｅ１１６のいずれか一つに記載の組成物。
Ｅ１１８．前記デノスマブは、約１ｐＭ〜約２５ｐＭの結合親和性（ＫＤ）値でヒトＲＡＮＫＬに結合する、Ｅ７４〜Ｅ１１７のいずれか一つに記載の組成物。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＣＰ２プロセスからの試料のＮ−グリカンプロファイルを示すグラフである。
【図２】図２は、糖化の分析のためのＣＰ２プロセスからのデノスマブ試料のＣＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示すグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、ＣＰ２プロセス及びＣＰ３プロセスからの試料、並びに参照標準のＮ−グリカンプロファイルを示すグラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＣＰ２プロセス及びＣＰ３プロセスからの試料のＮ−グリカンプロファイルを要約した表である。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｅは、ＣＰ２プロセス及びＣＰ３プロセスによって産生されたデノスマブのＰＫ／ＰＤプロファイルを要約している。図４Ａ〜４Ｂは、それぞれ、均等目盛り（図４Ａ）及び片対数目盛り（図４Ｂ）で表示した、健常志願者へ６０ｍｇのデノスマブＣＰ３又はＣＰ２をＳＣ投与した後の平均（±ＳＤ）血清デノスマブ濃度−時間プロファイル（ｎｇ／ｍＬ）を示す。図４Ｃは、健常志願者に６０ｍｇのデノスマブＣＰ３又はＣＰ２を皮下（ＳＣ）投与した後の血清ｃ−テロペプチド（ＣＴＸ１）のベースラインからの平均（±ＳＤ）変化率を示す。図４Ｄ〜４Ｅは、デノスマブのＭａｎ−５レベルが経時的に減少する一方、Ｇａｌ−種はほぼ一定であったことを示している。４人の総ＣＰ２患者から経時変化を分析した。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｅは、ＣＰ２プロセス及びＣＰ３プロセスによって産生されたデノスマブのＰＫ／ＰＤプロファイルを要約している。図４Ａ〜４Ｂは、それぞれ、均等目盛り（図４Ａ）及び片対数目盛り（図４Ｂ）で表示した、健常志願者へ６０ｍｇのデノスマブＣＰ３又はＣＰ２をＳＣ投与した後の平均（±ＳＤ）血清デノスマブ濃度−時間プロファイル（ｎｇ／ｍＬ）を示す。図４Ｃは、健常志願者に６０ｍｇのデノスマブＣＰ３又はＣＰ２を皮下（ＳＣ）投与した後の血清ｃ−テロペプチド（ＣＴＸ１）のベースラインからの平均（±ＳＤ）変化率を示す。図４Ｄ〜４Ｅは、デノスマブのＭａｎ−５レベルが経時的に減少する一方、Ｇａｌ−種はほぼ一定であったことを示している。４人の総ＣＰ２患者から経時変化を分析した。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｅは、ＣＰ２プロセス及びＣＰ３プロセスによって産生されたデノスマブのＰＫ／ＰＤプロファイルを要約している。図４Ａ〜４Ｂは、それぞれ、均等目盛り（図４Ａ）及び片対数目盛り（図４Ｂ）で表示した、健常志願者へ６０ｍｇのデノスマブＣＰ３又はＣＰ２をＳＣ投与した後の平均（±ＳＤ）血清デノスマブ濃度−時間プロファイル（ｎｇ／ｍＬ）を示す。図４Ｃは、健常志願者に６０ｍｇのデノスマブＣＰ３又はＣＰ２を皮下（ＳＣ）投与した後の血清ｃ−テロペプチド（ＣＴＸ１）のベースラインからの平均（±ＳＤ）変化率を示す。図４Ｄ〜４Ｅは、デノスマブのＭａｎ−５レベルが経時的に減少する一方、Ｇａｌ−種はほぼ一定であったことを示している。４人の総ＣＰ２患者から経時変化を分析した。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｅは、ＣＰ２プロセス及びＣＰ３プロセスによって産生されたデノスマブのＰＫ／ＰＤプロファイルを要約している。図４Ａ〜４Ｂは、それぞれ、均等目盛り（図４Ａ）及び片対数目盛り（図４Ｂ）で表示した、健常志願者へ６０ｍｇのデノスマブＣＰ３又はＣＰ２をＳＣ投与した後の平均（±ＳＤ）血清デノスマブ濃度−時間プロファイル（ｎｇ／ｍＬ）を示す。図４Ｃは、健常志願者に６０ｍｇのデノスマブＣＰ３又はＣＰ２を皮下（ＳＣ）投与した後の血清ｃ−テロペプチド（ＣＴＸ１）のベースラインからの平均（±ＳＤ）変化率を示す。図４Ｄ〜４Ｅは、デノスマブのＭａｎ−５レベルが経時的に減少する一方、Ｇａｌ−種はほぼ一定であったことを示している。４人の総ＣＰ２患者から経時変化を分析した。
【図４Ｅ】図４Ａ〜４Ｅは、ＣＰ２プロセス及びＣＰ３プロセスによって産生されたデノスマブのＰＫ／ＰＤプロファイルを要約している。図４Ａ〜４Ｂは、それぞれ、均等目盛り（図４Ａ）及び片対数目盛り（図４Ｂ）で表示した、健常志願者へ６０ｍｇのデノスマブＣＰ３又はＣＰ２をＳＣ投与した後の平均（±ＳＤ）血清デノスマブ濃度−時間プロファイル（ｎｇ／ｍＬ）を示す。図４Ｃは、健常志願者に６０ｍｇのデノスマブＣＰ３又はＣＰ２を皮下（ＳＣ）投与した後の血清ｃ−テロペプチド（ＣＴＸ１）のベースラインからの平均（±ＳＤ）変化率を示す。図４Ｄ〜４Ｅは、デノスマブのＭａｎ−５レベルが経時的に減少する一方、Ｇａｌ−種はほぼ一定であったことを示している。４人の総ＣＰ２患者から経時変化を分析した。
【図５】図５は、グリカンマップ（ＨＰ−ＡＥＸ）オーバーレイを示す。ＣＰ２−デノスマブとＣＰ４−デノスマブは同様のＮ−グリカンプロファイルを示した。
【図６Ａ−１】図６Ａは、デノスマブ重鎖のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号３）を示す。ヌクレオチド１〜５７はシグナルペプチドをコードし、これがタンパク質合成の間に切断されて成熟重鎖を生成する。成熟重鎖の最初のアミノ酸（Ｅ）を太字で且つ拡大して示す。
【図６Ａ−２】図６Ａは、デノスマブ重鎖のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号３）を示す。ヌクレオチド１〜５７はシグナルペプチドをコードし、これがタンパク質合成の間に切断されて成熟重鎖を生成する。成熟重鎖の最初のアミノ酸（Ｅ）を太字で且つ拡大して示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、デノスマブ軽鎖のヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列番号４）を示す。ヌクレオチド１〜６０はシグナルペプチドをコードし、これがタンパク質合成の間に切断されて成熟軽鎖を生成する。成熟軽鎖の最初のアミノ酸（Ｅ）を太字で且つ拡大して示す。
【図７Ａ】図７Ａは、デノスマブ高マンノース含量に対するグルコース及びガラクトース濃度の効果を示す。図７Ａは、１７日目のＭａｎ−５のフルモデル解析を示し、実験中心点での予測プロファイルを含む。
【図７Ｂ】図７Ｂは、デノスマブ高マンノース含量に対するグルコース及びガラクトース濃度の効果を示す。図７Ｂは、グルコースレベルを２．５ｇ／Ｌに設定したＭａｎ−５の１７日目の予測を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、デノスマブ高マンノース含量に対するグルコース及びガラクトース濃度の効果を示す。図７Ｃは、１１日目から１７日目までのＭａｎ−５の経時変化を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、１７日目のＭａｎ−５のフルモデル分析を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＨＩＬＩＣによって評価されたＭａｎ−５レベルを示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＣＰ２参照と比較した、Ｍａｎ−５及び全高マンノース種を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、１０日流加培養スキームを示す図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、１０日流加培養の間、高い生存率を維持した細胞培養物を示す。全ての試料は、全ての試験条件で＞８０％の生存率を示した。黒塗りの丸、矩形、及び菱形は、供給期間中、バイオリアクター中で１０〜１２ｇ／Ｌレベルを維持するようにグルコースを補充し、ガラクトースは添加しなかった対照条件を表す。白抜きの丸、矩形及び菱形は、供給期間中、バイオリアクター中で１０〜１２ｇ／Ｌレベルを維持するように、１０ｇ／Ｌのガラクトースをグルコースと共に補充した条件を表す。斜線入りバーは、供給期間中、１０ｇ／Ｌのガラクトースを補充する一方、バイオリアクター中のグルコースレベルが消費によって１〜５ｇ／Ｌレベルまで低下するのを許容した条件を表す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、供給日及び回収日におけるバイオリアクター中のグルコースレベルを示す。グルコースの測定は、２つの培養条件に必要なグルコース供給量を導くために行った。３、６及び８日目に、対照及びｇａｌ／ｇｌｕｃ培養物（それぞれ黒色バー及び白色バー）に約５〜６ｇ／Ｌのグルコースを補充したが、ｇａｌのみの培養物（斜線入りバー）にはグルコースを添加しなかった。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、細胞増殖、力価及び比生産性に対する糖源修飾効果を示す。図１０Ａは、全ての試料の生細胞密度（ＶＣＤ）を示す折れ線グラフである。図１０Ｂは、力価を示す棒グラフであり、図１０Ｃは、１０日流加培養の比生産性を示す。黒色のバーは、供給期間中、バイオリアクター中で１０〜１２ｇ／Ｌレベルを維持するようにグルコースを補充した対照条件を表す。白色のバーは、供給期間中、バイオリアクター中で１０〜１２ｇ／Ｌレベルを維持するように、１０ｇ／Ｌのガラクトースをグルコースと共に補充した条件を表す。斜線入りバーは、供給期間中、１０ｇ／Ｌのガラクトースを補充する一方、バイオリアクター中のグルコースレベルが消費によって１〜５ｇ／Ｌレベルまで低下するのを許容した条件を表す。
【図１１】図１１は、ガラクトースが添加され、グルコースレベルが低かった場合に、高マンノースレベルが増加したことを示す。棒グラフは、１０日流加培養の終わりにおける各プール中のＭａｎ−５の報告された領域％を示す。黒色のバーは、供給期間中、バイオリアクター中で１０〜１２ｇ／Ｌレベルを維持するようにグルコースを補充した対照条件を表す。白色のバーは、供給期間中、バイオリアクター中で１０〜１２ｇ／Ｌレベルを維持するように、１０ｇ／Ｌのガラクトースをグルコースと共に補充した条件を表す。斜線入りバーは、供給期間中、１０ｇ／Ｌのガラクトースを補充する一方、バイオリアクター中のグルコースレベルが消費によって１〜５ｇ／Ｌレベルまで低下するのを許容した条件を表す。
【図１２】図１２は、Ｄ−ガラクトースの添加がモノ−及びビ−ガラクトグリカン残基を増加させたが、アガラクト残基は増加させなかったことを示す。棒グラフは、１０日流加培養の終わりにおける各プール中のグリカンの報告された領域％を示す。黒色のバーは、供給期間中、バイオリアクター中で１０〜１２ｇ／Ｌレベルを維持するようにグルコースを補充した対照条件を表す。白色のバーは、供給期間中、バイオリアクター中で１０〜１２ｇ／Ｌレベルを維持するように、１０ｇ／Ｌのガラクトースをグルコースと共に補充した条件を表す。斜線入りバーは、供給期間中、１０ｇ／Ｌのガラクトースを補充する一方、バイオリアクター中のグルコースレベルが消費によって１〜５ｇ／Ｌレベルまで低下するのを許容した条件を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．概要
デノスマブは、ヒトＲＡＮＫＬ（核因子カッパＢリガンドの受容体活性化因子）に対する親和性及び特異性を有するヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体である。デノスマブはおおよその分子量が１４７ｋＤであり、現在、遺伝子操作された哺乳動物（チャイニーズハムスター卵巣）細胞で生産されている。組換え産生プロセスの過程で、グリカン部分が、翻訳後修飾、例えば、酵素媒介プロセス（グリコシル化）又は非酵素媒介プロセス（糖化）によって、デノスマブに結合される。グリカンは抗体の治療効果及びインビボ半減期に重要な役割を有するので、規制当局の要求を満たすために、治療用糖タンパク質のグリコフォームプロファイルを特徴付ける必要がある。
【００１１】
本明細書に開示し、例示されているように、デノスマブのグリカンプロファイルを改変する様々な培養プロセスが開発されている。デノスマブは、各重鎖の第２定常ドメインに位置する２つのＮ−グリコシル化部位を有する（残基Ｎ−２９８）。さらに、糖部分がリジン残基を介して抗体に結合する場合、抗体はまた糖化（ときに「非酵素的グリコシル化」とも呼ばれる）によって修飾され得る。
【００１２】
第１の例示的な培養プロセス（本明細書では「ＣＰ２」と呼ぶ）では、ＡＭ−１／Ｄに由来するＣＨＯ細胞株を使用した。細胞を改変ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養し、２回のボーラス供給を３日目と９日目に行い、その後、１４日目に培養物を回収した。得られた重要なグリコフォームは、以下のものを含んだ：Ａ２Ｆ−Ｇ０  約５５％〜６５％、Ａ２Ｆ−Ｇ１  約１５％〜２５％、及びＭａｎ−５  約４％〜９％。
【００１３】
第２の例示的な培養プロセス（本明細書では「ＣＰ３」と呼ぶ）では、わずかに異なるプロセスを使用することによって、全体としてより高い生成物収率が達成された。ＣＳ−９  ＣＨＯ細胞に基づく細胞株を、増殖期に、メトトレキサート（ＭＴＸ）選択により増幅した。ＭＴＸ選択により、デノスマブをコードする核酸のコピー数は、ＣＰ２プロセスで使用した宿主細胞と比較して大きく増加した。一般に、ＭＴＸ選択に伴い、宿主細胞は約７００〜１０００コピーの組換え配列を含み、それによって組換えタンパク質産生の全体的な収率を増加させると推定される。特に、ＣＰ３によって産生された組換えデノスマブはまた、１％未満の低いＭａｎ−５含量を示した。ＣＰ３プロセスにより産生されたデノスマブは、患者においてより高い血清半減期とより遅いクリアランスを示した。
【００１４】
第３の例示的な培養プロセスは、本明細書では「ＣＰ４」と呼ばれる。ＣＰ３と同様に、ＣＳ−９  ＣＨＯ細胞に基づく細胞株は、増殖期に、ＭＴＸ選択により増幅し、それによりデノスマブ産生の全体的な収量が増加した。さらに、産生期の間、１１日目に灌流培地の変換があった。培地の変換には、グルコース濃度を低下させること、及び代替炭水化物源としてガラクトースを添加することが含まれた。ＣＰ４プロセスにより産生されたデノスマブは、ＣＰ２−デノスマブと比較して、Ａ２Ｆ−Ｇ０（約５５％〜６５％）、Ａ２Ｆ−Ｇ１（約１０％〜１９％）、及びＭａｎ−５（約４％〜９％）のレベルが同程度であり、ＣＰ３−デノスマブと比較して、Ｍａｎ−５のレベルが高かった。ＣＰ４プロセスによって産生されたデノスマブでは、糖化レベルの上昇が観察された。さらに、ＣＰ４では代替炭素源としてガラクトースを使用したため、ＣＰ４−デノスマブは新しい種であるガラクトース−糖化リジンを含んだ。
【００１５】
驚くべきことに、ＣＰ４−デノスマブはＣＰ２−デノスマブと比較してはるかに高い糖化レベルを示したが、ＲＡＮＫＬリガンドへの結合、及び生物学的活性は影響を受けなかった。リジン残基は荷電しており、しばしばタンパク質−タンパク質相互作用に関与しているので、糖化の大きな上昇が生物学的活性に影響しなかったことは驚くべきことであった。別の驚くべき発見は、ガラクトース−糖化リジンがデノスマブの免疫原性に影響しなかったことである。ガラクトースは、天然では、ヒト血清中に約０．３ｍｇ／ｄＬ存在する。このような低い血清ガラクトースレベルでは、ガラクトース血症患者を除いて、健常な人が測定可能なレベルのガラクトース糖化を含む血中蛋白質を有する可能性は低い。したがって、ガラクトース糖化の臨床的安全性はこれまで不明であった。デノスマブの場合、高レベルのガラクトース−糖化デノスマブは免疫原性に影響を与えないことがわかった。
【００１６】
２．定義
「デノスマブ」（商品名Ｐｒｏｌｉａ（登録商標）及びＸｇｅｖａ（登録商標））は、配列番号１を含む重鎖及び配列番号２を含む軽鎖を含むヒトモノクローナル抗体を指す。デノスマブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を表１に示す。配列番号１及び２をコードする核酸配列を図６Ａ〜６Ｂに示す。実施例に示すように、デノスマブのグリカンプロファイルは変化し得る。
【００１７】
【表１】
2021521854.tif 000003
【００１８】
抗体は糖タンパク質であり、グリコシル化の多様性が予想される。モノクローナル抗体は各ＨＣのＣＨ２  Ｆｃドメイン中に単一のコンセンサスＮ結合グリコシル化部位を含むが、ＬＣはコンセンサスＮ結合グリコシル化部位を欠く。Ｆｃグリカンは主に次の３つのグリカンクラスからなる：（１）末端ガラクトース含量が異なる非シアル化二分枝型コアフコシル化構造（Ａ２ＧｘＦ（ここで、ｘ＝０、１又は２））；（２）ガラクトース含量が異なる非シアル化一分枝型コアフコシル化ハイブリッド構造（Ａ１ＧｘＭｙＦ（ここで、ｘ＝０又は１、及びｙ＝３、４又は５））；及び（３）高マンノース構造（Ｍｘ（ｘ＝５、６、７、又は８））。デノスマブは、コンセンサス配列の存在、及び哺乳動物細胞培養物から産生したＩｇＧ２モノクローナル抗体の歴史的特徴付けに基づいて、各重鎖上のＮ−２９８に単一のＮグリコシル化部位を含むと予想される。
【００１９】
文献では、Ｎ−グリコシル化部位は、Ｋａｂａｔ  ＥＵ番号付けにより、一般に残基Ｎ−２９７と呼ばれている。実際の残基番号は、配列番号１の残基２９８である。この違いは、番号付けシステムによるものであり、両方とも同じＮ残基を指す。
【００２０】
炭水化物部分は、オリゴ糖に一般に使用されている命名法を参照して本明細書に記載される。この命名法を使用する炭水化物化学の概説は、例えば、Ｈｕｂｂａｒｄ  ａｎｄ  Ｉｖａｔｔ，Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：５５５−５８３（１９８１）に見出すことができる。この命名法には、例えば、マンノースを表すＭａｎ、ガラクトースを表すＧａｌ、及びグルコースを表すＧｌｃが含まれる。一般に知られているグリカンを表２に示す。
【００２１】
【表２】
2021521854.tif 000004
【００２２】
【表３】
2021521854.tif 000005
【００２３】
「高マンノース」グリカンは、高マンノース５（Ｍａｎ−５）グリカン、高マンノース６（Ｍａｎ−６）グリカン、高マンノース７（Ｍａｎ−７）グリカン、高マンノース８（Ｍａｎ−８）グリカン、及び高マンノース９（Ｍａｎ−９）グリカンなどの５〜９個のマンノース単位を含むグリカン部分である。
【００２４】
抗体の高マンノース含量は、当該技術分野で知られた方法により評価することができる。一般に、アッセイは、酵素（ＰＮＧアーゼ−Ｆ又はＥｎｄｏ−Ｈ）処理又は化学的処理（すなわち、ヒドラジン分解）によるｍＡｂからのグリカンの放出を含む。次いで、放出されたグリカンを精製し、その後、さらに誘導体化することなく、又は異なる発色団／蛍光団で標識した後に分析する。例えば、酵素的又は化学的に処理された試料を、通常、クロマトグラフィー、電気泳動又は質量分析によって分析し、ｍＡｂの高マンノース含有グリコフォームを同定する。高マンノースアッセイの例は、本明細書に提示される。
【００２５】
デノスマブのグリカン含量は、通常、特定のパーセンテージ（例えば、２％〜１４％の高マンノース）として表される。特に明記しない限り、グリカンのパーセンテージは、試料中の全デノスマブ分子のうち、そのようなグリカンを含むデノスマブ分子の数として理論的に計算される。例えば、２％の高マンノースは、１００個のデノスマブ分子のうちの２個のデノスマブ分子が高マンノースを含むことを意味する。この理論的計算は、Ｎ−２９８部位のアスパラギンの１００％がグリコシル化されていると仮定している。しかし、実際には、ごくわずかな割合の抗体分子は非グリコシル化又は脱グリコシル化され得る（例えば、以下の実施例３．１を参照されたい。約０．３％以下の抗体分子がＮ−２９８部位で非グリコシル化又は脱グリコシル化され得る）。さらに、個々の分子レベルでグリカン種を計数することは、非実用的／不可能である。したがって、本明細書に記載されるグリカン含量の割合は一般に、汎用されている分析方法による相対的割合に基づいて計算される。例えば、実施例３．２に例示するように、酵素を使用して、タンパク質から全てのＮ−グリカンを放出させ、次いで、グリカンを、高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）によって分離する。ＨＰＡＥＣは種々のピークをもたらし、各ピークはグリカン種を表す。ピーク番号８は、Ｍａｎ−５を表す。したがって、Ｍａｎ−５の割合（この場合、８．４％）は全てのピークの合計面積のうち、ピーク８の面積に基づいて計算される。別の例は実施例７．１であり、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を用いてＮ−グリカンの割合を評価する。したがって、特に明記しない限り、グリカンの割合は、汎用の分析法（ＨＰＡＥＣ、ＣＥ−ＳＤＳ、ＨＩＬＩＣなど）のいずれかを用いて、Ｎ−２９８部位における全Ｎ−グリカンのうち、その特定のグリカン種の相対的割合によって計算される。割合は、個々の分子レベルのグリカン含量を指すものとして文字通りに解釈されるべきではない。
【００２６】
組換えタンパク質産生プロセスは、一般的には、２つの段階に分けられる。一般的に「増殖期」と呼ばれる第１段階では、細胞増殖が起こる。一般的に「産生期」と呼ばれる第２段階では、組換えタンパク質の発現は、一般に、誘導物質（ＩＰＴＧなど）を添加することによって、又は培養条件（温度の変化など）を変えることによって、宿主細胞内で開始される。
【００２７】
なお、本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかに他の意味であると解釈すべき場合を除いて、複数の指示対象を含んでいる。用語「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」）、並びに用語「１つ以上」及び「少なくとも１つ」は、本明細書においては、互換的に使用することができる。
【００２８】
３．組換え産生デノスマブの高マンノース含量
３．１  デノスマブの高マンノース含量を増加させる方法
高マンノースグリコフォームは、治療用モノクローナル抗体の重要な品質属性として認識が高まっている。本明細書に記載するように、組換え産生デノスマブ上に存在する高マンノースは、細胞培養培地中のグルコース及びガラクトースの濃度を操作することによって制御し得る。
【００２９】
本発明は、低濃度又は限られた濃度のグルコースを、代替炭素源、特にガラクトース又はスクロースと組み合わせて使用することによって、組換え産生デノスマブ、特にＭａｎ−５の高マンノース含量を増加させる方法を提供する。本明細書に記載するように、代替炭素源（例えば、ガラクトース）と組み合わせて、細胞培養培地中のグルコースの濃度を低下させることによってグルコースが制限された細胞培養培地中で細胞を培養することにより、細胞増殖、生存率及び力価を許容可能なレベルに維持しながら、高マンノース含量の濃度が増加したデノスマブ組成物が得られた。
【００３０】
一態様において、本発明は、デノスマブ分子上に存在する高マンノースのレベルを増加させる方法（ここで、前記デノスマブ分子は哺乳動物宿主細胞によって組換え発現されたものである）であって、（ａ）増殖期の間、第１の培養培地中で前記哺乳動物宿主細胞を、細胞密度が少なくとも１×１０６生細胞／ｍＬになるまでインキュベートする工程（ここで、前記第１の培養培地は、約１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌのグルコースを含む）と、その後の、（ｂ）産生期の間、第２の培養培地中で工程（ａ）からの宿主細胞をインキュベートして、前記デノスマブ分子を発現させる工程（ここで、前記第２の培養培地は、約０ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌのグルコース及び約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌのガラクトースを含む）とを含み、デノスマブ分子の約２％〜約１４％は、Ｎ−２９８部位に高マンノースグリカンを含む、方法を提供する。
【００３１】
一般に、糖源（グルコース、スクロース、又はガラクトースなど）及び他の栄養素の濃度を議論する場合、数（例えば、２０ｇ／Ｌ）は一般に、バイオリアクターに供給している濃度を指す。培地がバイオリアクターの内部に到達した後、濃度は細胞代謝、消費、及び希釈のためにしばしば変化する。バイオリアクター内の実際の濃度は、細胞密度及び代謝速度に大きく依存するので、時間の経過とともに著しく変化し得、常にモニターされるとは限らない場合がある。したがって、容易さ及び一貫性のために、数字は一般に、バイオリアクター内の消費又は希釈を考慮せず、培地がバイオリアクターに供給される前に測定された濃度を指す。一方、バイオリアクター内部の濃度は一般に、「使用済み培地」の濃度、又は「バイオリアクター内部」の濃度と呼ばれる。
【００３２】
一般に、増殖期の間、グルコース濃度は、宿主細胞を確実に効率良く増殖させるために、ボーラス供給及び灌流のいずれかによって、約１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌに維持される。
特定の実施形態では、グルコース濃度は、ボーラス供給又は灌流によって、約２ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約１９ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約１９ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約１９ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約１８ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約１８ｇ／Ｌ、又は約４ｇ／Ｌ〜約１８ｇ／Ｌに維持される。
【００３３】
特定の実施形態では、増殖期の間、使用済み培地のグルコース濃度は、宿主細胞を確実に効率良く増殖させるために、ボーラス供給及び灌流のいずれかによって、約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌに維持される。特定の実施形態では、使用済み培地のグルコース濃度は、ボーラス供給又は灌流によって、約２ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、又は約４ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌに維持される。
【００３４】
特定の実施形態では、増殖期の間、使用済み培地のグルコース濃度は、細胞を少なくとも１×１０６生細胞／ｍＬまで増殖させるレベルに維持される（ここで、グルコース濃度はボーラス供給又は灌流によって維持され、ボーラス供給又は灌流培地中のグルコース濃度は約４ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約１９ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約１８ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１９ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１８ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ〜約１９ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ〜約１８ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約１９ｇ／Ｌ、又は約７ｇ／Ｌ〜約１８ｇ／Ｌである）。ボーラス供給の時機選択／頻度、又は灌流の流量は、細胞培養物の消費／代謝速度に依存し、当業者の知識の範囲内である。
【００３５】
特定の実施形態では、細胞密度は、増殖期の間、約１×１０６生細胞／ｍＬ〜約８０×１０６生細胞／ｍＬ、例えば、少なくとも約１×１０６生細胞／ｍＬ、少なくとも約２×１０６生細胞／ｍＬ、少なくとも約３×１０６生細胞／ｍＬ、少なくとも約４×１０６生細胞／ｍＬ、少なくとも約５×１０６生細胞／ｍＬ、少なくとも約６×１０６生細胞／ｍＬ、少なくとも約７×１０６生細胞／ｍＬ、少なくとも約８×１０６生細胞／ｍＬ、少なくとも約９×１０６生細胞／ｍＬ、少なくとも約１０×１０６生細胞／ｍＬ、少なくとも約２０×１０６生細胞／ｍＬ、少なくとも約３０×１０６生細胞／ｍＬ、少なくとも約４０×１０６生細胞／ｍＬ、少なくとも約５０×１０６生細胞／ｍＬ、少なくとも約６０×１０６生細胞／ｍＬ、少なくとも約７０×１０６生細胞／ｍＬ、少なくとも約８０×１０６生細胞／ｍＬ、約２×１０６生細胞／ｍＬ〜約２０×１０６生細胞／ｍＬ、約２×１０６生細胞／ｍＬ〜約１５×１０６生細胞／ｍＬ、約２×１０６生細胞／ｍＬ〜約１０×１０６生細胞／ｍＬ、又は約２×１０６生細胞／ｍＬ〜約１０×１０６生細胞／ｍＬに達する。
【００３６】
宿主細胞を増殖期から産生期に移行させて、高マンノース（例えば、Ｍａｎ−５）含量を増加させる場合、細胞に、ガラクトース又はスクロース、好ましくはガラクトースなどの代替炭素源と組み合わせて、グルコース濃度を減少させた（例えば、０〜８ｇ／Ｌ）第２の培養培地を供給することができる。
【００３７】
低グルコース培養培地への切り替えは、産生期の開始時に行う必要はない。多くの場合、産生期の間、低グルコース培地に切り替える前に、十分なグルコース（例えば、約４ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、又はそれ以上）を含有する培地中に３〜１５日間（例えば、３〜１１日間）宿主細胞を維持することが望ましい。これは、望ましい培養パラメータ（生細胞密度、又は細胞生存率など）を確立し、これらのパラメーターを維持するのに役立ち得る。産生期に入って３〜１５日（例えば、３〜１１日）後、組換え産生デノスマブの高マンノース含量を増加させることが望ましい場合、次に、細胞培養物に、グルコース濃度が低く、代替炭素源が提供される細胞培養培地を供給し、所望の高マンノース含量に増加させることができる。
【００３８】
グルコース濃度をどの程度低下させる必要があるかを決定する因子としては、代替炭素源として何が使用され、またどのくらいの量が使用されるか；細胞培養産生プロセス；細胞の種類及び質量、並びにグルコース消費量が挙げられる。バイオリアクター中の細胞質量が大きいほど、細胞培養物によるグルコース消費量が多くなり、したがって、所望の高マンノース含量を生じる低グルコース状態をなお維持しながら、供給することができるグルコース量が多くなる。グルコースを細胞培養物に供給する方法もまた、所望の高いマンノース含量を産生する低グルコース状態を維持するのに必要なグルコースの量に影響を及ぼし得る。例えば、流加細胞培養において、グルコースは、細胞培養培地に配合し、ボーラス供給によって補充することができる。灌流細胞培養プロセスでは、グルコース濃度は、灌流培地の供給速度（ｇ／Ｌ／日）に依存する。さらに、産生中の培養培地中のグルコースの量は、灌流培養のための使用済み培地分析などによって測定することができる。さらに、産生中の培養培地中のグルコースの量は、灌流培養のための使用済み培地分析などによって測定することができる。使用済み培地中のグルコースの量が０ｇ／Ｌ又はほぼ０ｇ／Ｌである場合に、Ｍａｎ−５レベルが増加することが観察された。このような状況では、タンパク質の収量がグルコースの減少によってさほど影響されないように、ほぼ全部が消費されるだけのグルコースが細胞に供給される。
【００３９】
バイオリアクター内のグルコース濃度の低下は、例えば、灌流によって第１の培養培地を第２の培養培地で置換することによって達成することができる。或いは、最初の培養培地中のグルコースが細胞によって消費されるのを待ち、次いで、バイオリアクター内部のグルコース濃度が低下するように、ボーラス供給計画及び／又は濃度を調節することによって達成することができる。
【００４０】
特定の実施形態では、第２の培養培地中のグルコースの量が、例えば、灌流培地供給物において、使用済み培地中で測定されるグルコースの量が適宜０ｇ／Ｌ以上であるように、制限量まで低下される。グルコース消費速度は、グルコース添加速度及び／又は細胞培養物の質量によって決定することができる。グルコースは、約０ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの濃度で供給することができる。
【００４１】
特定の実施形態では、第２の培養培地中のグルコース濃度は、約０ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約０ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約０ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約０ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約０ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、又は約０ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌに維持される。
【００４２】
低下したグルコース濃度と組み合わせて、第２の培養培地は、ガラクトース又はスクロースなどの代替炭素源を含有、又は補充されるべきである。特定の実施形態では、第２の培養培地は最大２０ｇ／Ｌの濃度のガラクトースを含む。例えば、第２の培養培地中のガラクトース濃度は、約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１９ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１８ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１７ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１６ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１４ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１３ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約１９ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約１８ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約１７ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約１６ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約１４ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約１３ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約１９ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約１８ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約１７ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約１６ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約１４ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約１３ｇ／Ｌ、又は約１０ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌに維持することができる。
【００４３】
特定の実施形態では、デノスマブの高マンノース含量を増加させるために、産生期に入って３〜１５日後に、グルコース濃度を低下させ、ガラクトースを代替糖源として使用する。例えば、（ｉ）約０ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約０ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約０ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約０ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、約０ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約７ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌ、又は約１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌのグルコース、及び（ｉｉ）約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１９ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１８ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１７ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１６ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１４ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１３ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約１９ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約１８ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約１７ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約１６ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約１４ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約１３ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約１９ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約１８ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約１７ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約１６ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約１４ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約１３ｇ／Ｌ、又は約１０ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌのガラクトースを含むボーラス供給培地又は灌流培地を使用することによって、グルコース濃度を低下させることができる。
【００４４】
例示的な一実施形態において、グルコース濃度は、（ｉ）約１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌのグルコース、及び（ｉｉ）約１０ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌのガラクトースを含むボーラス供給培地又は灌流培地を使用することによって低下される。ボーラス供給の時機選択／頻度、又は灌流の流量は、細胞培養物の消費／代謝速度に依存し、当業者の知識の範囲内である。
【００４５】
低グルコース培地の総糖含量を最初の増殖培地のグルコース含量に一致させることが望ましい場合がある。例えば、増殖培地が１５ｇ／Ｌのグルコースを含み、産生期の間、低グルコース培地が３ｇ／Ｌのグルコースのみを含む場合、総糖含量が１５ｍｇ／Ｌになるように、１２ｇ／Ｌのガラクトースをそれに補充することが好ましい場合がある。
【００４６】
特定の実施形態では、産生期の間、低グルコース培地に切り替えた後、使用済み培地のグルコース濃度を、ボーラス供給又は灌流によって、約０〜約５ｇ／Ｌ、約０ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌ、又は約０ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌに維持し、使用済み培地のガラクトース濃度を、ボーラス供給又は灌流によって、約２ｇ／Ｌ〜約１２．５ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約１２．５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約１２．５ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ〜約９ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌ、又は約４ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌに維持することができる。
【００４７】
特定の実施形態では、低下したグルコース濃度と組み合わせて、細胞培養培地は、最大で約４８ｇ／Ｌ、例えば、約１６ｇ／Ｌ〜約２４ｇ／Ｌの濃度のスクロースを含有するか、又は補充される。
【００４８】
哺乳動物細胞培養物は、通常、バイオリアクター、例えば、５００Ｌ〜２００００Ｌバイオリアクターで増殖される。特定の実施形態では、１０００Ｌ〜２０００Ｌバイオリアクターが使用される。バイオリアクターの血清を含まない培養培地に、少なくとも０．５×１０６以下且つ３．０×１０６生細胞／ｍＬ超を接種する。特定の実施形態では、接種は、約１．０×１０６生細胞／ｍＬである。産生バイオリアクターに接種されると、哺乳動物細胞は、指数増殖期に入る。増殖期は、約１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌのグルコースを含む無血清供給培地のボーラス供給による流加法により維持することができる。これらの補充ボーラス供給は、通常、細胞がバイオリアクターに接種された後まもなく、細胞培養物が供給を必要とすると予想されるか又は決定される時点で、開始する。例えば、補充供給は、培養の３日目若しくは４日目頃、又はその１日若しくは２日前若しくは後に開始することができる。培養物は、増殖期の間、２回、３回又はそれ以上のボーラス供給を受け得る。基礎細胞培養培地もボーラス供給培地も、ガラクトースを含有せず、スクロースも含有しない。
【００４９】
細胞が定常期若しくは産生期に入るか、又は細胞培養物が所望の生細胞密度及び／若しくは細胞力価を達成したとき、流加ボーラス供給を中断し、灌流を開始することができる。灌流培養は、細胞培養物が新鮮な灌流供給培地を受け、同時に使用済み培地を除去するものである。灌流は、連続的であっても、段階的であっても、断続的であっても、これらのいずれか又は全ての組み合わせであってもよい。灌流速度は、１日当たりの作動容積未満から数作動容積とすることができる。細胞が培養物中に保持され、除去される使用済み培地には細胞が実質的に含まれないか、又は培養物に比べて非常に少ないことが好ましい。灌流は、遠心分離、沈降、又は濾過を含む多くの手段によって達成することができる。例えば、Ｖｏｉｓａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ８２：７５１−６５を参照されたい。好ましい濾過方法は、交互タンデンシャルフローフィルトレーションである。交互タンデンシャルフローは、中空ファイバフィルタモジュールを通して培地をポンプ注入することにより維持される。例えば、米国特許第６，５４４，４２４号明細書を参照されたい。中空糸モジュールは、精密濾過器又は限外濾過器であり得る。
【００５０】
流加培養物が、所望の細胞生存率、細胞密度、圧縮細胞量率、力価、圧縮細胞量調整力価、年齢などの所定のトリガーポイントに達すると、流加培養と灌流との間の切り替えを行うことができる。例えば、この切り替えは培養の７日目前後に行うことができるが、その１日又は２日前又は後であってもよい。灌流供給処方には、２０ｇ／Ｌ以下又はそれ以上の濃度のグルコースが含まれるが、ガラクトースもスクロースも含まれない。一実施形態では、灌流培地は、約４ｇ／Ｌ〜約１８ｇ／Ｌのグルコースを含有する。
【００５１】
灌流培養物が、所望の細胞生存率、細胞密度、圧縮細胞量率、力価、圧縮細胞量調整力価、年齢などの所定のトリガーポイントに達すると、細胞培養培地中のグルコース濃度が低下する。例えば、このシフトは培養の１１日目に開始され得るが、その１日又は２日前又は後に起こり得る。この時点で、低濃度のグルコースを含む細胞培養培地で細胞培養物を灌流する。
【００５２】
細胞培養物中の低グルコース状態は、使用済み培地中のグルコース濃度を測定し、灌流培地処方中のグルコース濃度を所望のレベルに維持するように調整するなど、細胞培養物中のグルコース濃度をモニターすることによって維持することができる。
【００５３】
細胞培養物は、ガラクトース又はスクロースを補充した低グルコース状態で連続して維持することができる。細胞培養物は、回収まで、ガラクトース又はスクロースを補充した低グルコース状態で維持することができる。細胞培養物は、ガラクトースもスクロースも補充しない標準のグルコースレベルに戻し、全プロセスを再び開始することができる。
【００５４】
細胞培養物はまた、増殖期及び産生期の両方のための灌流培養系で維持することができる。産生バイオリアクターに接種されるとすぐに、哺乳動物細胞は指数増殖期に入り、その間、細胞培養物は、無血清で、且つ／又は合成の細胞培養培地で灌流される。
【００５５】
１つの例示的な実施形態は、以下に詳細に説明するように、ＣＰ４プロセスである。
【００５６】
一態様において、本発明は、デノスマブ分子上に存在する高マンノースのレベルを増加させる方法（ここで、前記デノスマブ分子は哺乳動物宿主細胞によって組換え発現されたものである）であって、（ａ）増殖期の間、第１の培養培地中で前記哺乳動物宿主細胞を、細胞密度が少なくとも１×１０６生細胞／ｍＬになるまでインキュベートする工程（ここで、前記第１の培養培地は、約１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌのグルコースを含む）と、その後の、（ｂ）産生期の間、第２の培養培地中で工程（ａ）からの宿主細胞をインキュベートして、前記デノスマブ分子を発現させる工程（ここで、前記第２の培養培地は、約０ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌのグルコース及び約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌのガラクトースを含む）とを含む、方法を提供する。開示した方法の結果として、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含むデノスマブ分子の割合が、対照と比較して増加する。
【００５７】
対照は、所定の範囲又は閾値、当該技術分野で一般に許容されている範囲、又はデノスマブ産生からの歴史的範囲であり得る。或いは、対照は、宿主細胞が、グルコース濃度が低下されないか、又は代替の炭素源を補充されない培養培地中で培養される参照バッチであり得る。例えば、宿主細胞は、約０ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ（例えば、約１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ）のグルコース及び約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ（例えば、約１０ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌ）のガラクトースを含む第２の培養培地に移行されず、全産生期の間、約１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ（例えば、約４ｇ／Ｌ〜約１８ｇ／Ｌ）のグルコースを含む第１の培地中で培養され得る。
【００５８】
特定の実施形態では、対照は所定の閾値である。例えば、対照は、約１．８％以下、約１．７％以下、約１．６％以下、約１．５％以下、約１．４％以下、約１．３％以下、約１．２％以下、約１．１％以下、約１．０％以下、約０．９％、約０．８％、約０．７％、約０．６％、約０．５％、約０．４％、約０．３％、約０．２％、又は約０．１％以下の高マンノースレベルであり得る。
【００５９】
別の態様において、本発明は、約２％〜約１４％のデノスマブ分子がＮ−２９８部位に高マンノースを含む組換え産生デノスマブを提供する。例えば、約２％〜約１４％、約３％〜約１４％、約４％〜約１４％、約５％〜約１４％、約２％〜約１３％、約２％〜約１２％、約２％〜約１１％、約３％〜約１３％、約３％〜約１２％、約３％〜約１１％、約４％〜約１３％、約４％〜約１２％、約４％〜約１１％、約２％〜約６．５％、約３％〜約６．５％、約４％〜約６．５％、約８．５％〜約１４％、約８．５％〜約１３％、約８．５％〜約１２％、約８．５％〜約１１％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％、約１０％、約１０．５％、約１１％、約１１．５％、約１２％、約１２．５％、約１３％、約１３．５％、又は約１４％のデノスマブ分子がＮ−２９８部位に高マンノースを含む。
【００６０】
特定の実施形態では、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含むデノスマブ分子の割合は、約５％〜約１４％である。特定の実施形態では、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含むデノスマブ分子の割合は、約５％〜約１２％である。特定の実施形態では、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含むデノスマブ分子の割合は、約５％〜約１１％である。
【００６１】
特定の実施形態では、Ｎ−２９８部位に高マンノースを含むデノスマブ分子の割合は、６．５％〜７．５％ではなく、６．５％〜８．５％ではなく、又は７．５％〜８．５％ではない。
【００６２】
上述のように、ここで割合として表される高マンノースレベルは、文字通り個々の分子レベルでの高マンノース含量を計数することを意味すると解釈されるべきではない。それよりむしろ、割合は、一般に使用されている分析方法のいずれかを使用して、抗体組成物の全体的なＮ−グリカン含量に基づく高マンノース種の相対的な割合を反映するものである。例えば（例えば、実施例３．２、実施例７．１を参照）、割合は、クロマトグラフィーのピークの面積に基づいて計算され得る。
【００６３】
本明細書で提示されるデノスマブの高マンノース含量の範囲は、主にＰＫ／ＰＤ評価（市販のＰｒｏｌｉａ（登録商標）及びＸｇｅｖａ（登録商標）と比較して実質的に類似のＰＫ）に基づいている。最も広い範囲（例えば、２％〜１４％）は、ＦＤＡによる生物学的類似性評価のための決定基準として単に解釈されるべきものではない。生物学的類似性の評価に関して、ＦＤＡは、提案されたバイオシミラー製品と革新的な（参照）生物学的製品との間の生物学的類似性を実証するエビデンスの統合を得るための段階的アプローチを推奨している。段階的アプローチは、提案されたバイオシミラー製品の製造プロセスの様々な段階での機能的及び構造的特徴付けのための分析研究から始まる。分析的類似性評価には、臨床転帰に関連する重要品質特性（ＣＱＡ）の特定が含まれる。したがって、生物学的類似性を実証するために、異なる又はより狭い範囲の高マンノース含量が必要とされ得る。生物学的類似性はまた、他の特性（例えば、他の型のグリカン）に一致するバイオシミラー製品を必要とし得る。
【００６４】
３．２  高マンノースレベルが減少したデノスマブ
高マンノースレベルが減少したデノスマブもまた、本明細書において提供される。１つの例示的な実施形態（以下に詳細に記載するＣＰ３プロセスを参照）においては、Ｎ−２９８部位にＭａｎ−５を有する組換え産生デノスマブは１％未満である。
【００６５】
一態様において、本発明は、組換え産生デノスマブ分子を含む組成物であって、約０．２％〜約１．８％のデノスマブ分子がＮ−２９８部位に高マンノースグリカンを含む組成物を提供する。特定の実施形態では、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約０．２％〜約１．８％、約０．２％〜約１．７％、約０．２％〜約１．６％、約０．２％〜約１．５％、約０．２％〜約１．４％、約０．２％〜約１．３％、約０．２％〜約１．２％、約０．２％〜約１．１％、約０．２％〜約１．０％、約０．３％〜約１．８％、約０．４％〜約１．８％、約０．５％〜約１．８％、約０．３％〜約１．５％、約０．４％〜約１．５％、約０．５％〜約１．５％、約０．３％〜約１．２％、約０．４％〜約１．２％、約０．５％〜約１．２％、約０．３％〜約１．０％、約０．４％〜約１．０％、又は約０．５％〜約１．０％のデノスマブ分子がＮ−２９８部位に高マンノースグリカンを含む。
【００６６】
治療用抗体の有効性は、血清クリアランス速度、すなわち抗体の血清中半減期によって影響を受ける。ＩｇＧ抗体の血清中半減期は、高マンノース含有病原体及び内因性タンパク質の両方に結合するマンノース受容体を含む多くの受容体によって調節される。一般に、高マンノースグリカンを含むＩｇＧは、ヒトにおいて、他のグリカン形態よりも急速に除かれる（Ｇｏｅｔｚｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．２１  ｎｏ．７  ｐｐ．９４９−９５９，２０１１）。したがって、高マンノース含有グリコフォームの減少は、望ましい品質特性である抗体組成物の半減期を改善する。
【００６７】
特に、Ｇｏｅｔｚｅは、モノクローナル抗体（Ｍａｂ１）とＭ５含有Ｍａｂ１集団との間の消失半減期の差が、用量の減少と共に増加し（表ＶＩＩ）、Ｍ５含有ＩｇＧがより低い静脈内用量で比較的速く除去されることを示した。著者らは、マンノース受容体がＭ５  ＩｇＧ集団のより速いクリアランスに寄与し、より高用量でのより遅い相対的クリアランスがこの受容体の飽和を反映している可能性があることを示唆した。血清ＩｇＧの半減期は一般にＦｃＲｎによって媒介され、治療用ＩｇＧの半減期はさらに標的に基づくクリアランスによって調節される可能性があるが、マンノース受容体は治療的ＩｇＧの非天然（高マンノース）グリカン変異体のより迅速なクリアランスに明らかに寄与する。これは、外因性病原体及び望ましくない内因性分子のクリアランスにおけるマンノース受容体が果たす役割と一致しており、マウスにおけるＭ５含有ＩｇＧ１のより速いクリアランスを示した初期の研究により支持されている。
【００６８】
臨床試験では、健常志願者にＣＰ２−デノスマブ又はＣＰ３−デノスマブを投与した。ＰＫ／ＰＤ分析の結果、ＣＰ３−デノスマブはＣＰ２−デノスマブと比較して平均して半減期が１０％長いことが示された。したがって、ＣＰ３−デノスマブは、その良好なＰＫ／ＰＤプロファイルのため、治療効果がより長い潜在的有益性を有する。この有益な効果は、必要とされる投与頻度を減少させ、患者のコンプライアンスを高めるであろう。
【００６９】
３．３  高マンノース含量を評価するための分析方法
組換え産生されたデノスマブ上の高マンノース構造を分析するために、様々な方法を使用することができる。このような方法を用いて、以下の１つ以上を測定することができる：グリカン又は糖タンパク質調製物中の高マンノースの存在及び／又は量（例えば、総グリカン質量に対する）、高マンノース構造の相対比（例えば、高マンノース種相互の相対比（例えば、Ｍａｎ−５、Ｍａｎ−６、Ｍａｎ−７、Ｍａｎ−８、及び／又はＭａｎ−９、並びにそれらの異性体の相対存在量又は相対比）、高マンノース構造とハイブリッド構造との相対比、高マンノース構造と複合型構造との相対比、高マンノース構造とフコシル化構造との相対比）；修飾高マンノース構造の存在又は量（例えば、フコシル化高マンノース構造の存在又は量）。
【００７０】
高マンノース含量は、例えば、Ｗｕｈｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ  Ｖｏｌ．８２５：１２４−１３３，２００５）及びＤｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．２９１：２３５１−２３５６）に記載されているような当該技術分野でよく知られている１つ以上の方法、並びに、例えば、糖タンパク質のＮ−グリカンマッピングのための分析方法を含む、本明細書中に記載されている方法によって測定することができる。簡潔に記載すると、組換えモノクローナル抗体などの組換え糖タンパク質からＮ−グリカンを酵素により除去し、還元末端に蛍光タグ（２−アミノベンズアミド）で標識する。蛍光Ｎ−グリカンを、高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）によって分離し、蛍光検出によって検出する。一般に、中性Ｎ−グリカンの分離は、Ｎ−グリカン構造の複雑さの増加に基づく。荷電Ｎ−グリカンの分離は、シアル酸、硫酸塩、又は電荷数を導き出すことができる存在する他の修飾の数及びタイプに基づく。試験試料のこれらのグリカンプロファイルを、適切な標準と視覚的に比較する。
【００７１】
高マンノース含量はまた、糖タンパク質の高マンノース含量を検出及び／又は定量するためのハイスループット方法である、国際公開第２００７／０８７３８４号パンフレットに開示される方法を使用して測定することができる。簡潔に記載すると、糖タンパク質をエンドグリコシダーゼで消化し、続いて、（必要であれば）還元剤を用いて消化された糖タンパク質を還元し、そして変性電気泳動によって消化された糖タンパク質を分離する。高マンノース／ハイブリッド型グリカンの比率は、非グリコシル化重鎖の画分（エンドグリコシダーゼ処理なしのピーク画分）を、脱グリコシル化重鎖の画分（エンドグリコシダーゼ消化後のピーク）から差し引くことによって決定される。エンドグリコシダーゼ処理なしの非グリコシル化重鎖画分又はピーク画分は、エンドグリコシダーゼがその中に含まれない以外は、同じ試料又は組成物を同じ消化条件に供することによって生成される。この工程はエンドグリコシダーゼ消化工程と同時に、又は別々に実施することができる。
【００７２】
コアグリカン上のＧｌｃＮＡｃ１とＧｌｃＮＡｃ２との間の高マンノース及びハイブリッドグリカンを選択的に切断する（又は、タンパク質上に短いグリカンを生成する）一方、複合型Ｎ結合グリカンを無傷のまま残す任意のエンドグリコシダーゼを使用することができる。酵素の濃度、インキュベーション温度及び消化時間を含む、エンドグリコシダーゼ消化を実施するための特定の条件は、使用するエンドグリコシダーゼの種類に依存する。本発明に関連するエンドグリコシダーゼの例としては、エンドグリコシダーゼＨ及びエンドグリコシダーゼＦ１が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一実施形態では、糖タンパク質を含む試料は、３７℃で約２時間、エンドグリコシダーゼＨで処理され、β−メルカプトエタノールで還元され、ＣＥ−ＳＤＳ分析に供される。
【００７３】
グリコシル化糖タンパク質、例えば、グリコシル化抗体から、脱グリコシル化糖タンパク質、例えば、脱グリコシル化抗体を分離するための方法の例としては、以下の２つの方法が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００７４】
１）還元条件下でのＣＥ−ＳＤＳ。グリコシル化糖タンパク質、例えば抗体を、ＳＤＳ及び還元剤で変性し、グリカンを有するその重鎖（ＨＣ）を、キャピラリー電気泳動−ＳＤＳ（ＣＥ−ＳＤＳ）によって、切断されたＨＣ（脱グリコシル化ＨＣ）から分離する。ＵＶ信号の電気泳動図を生成する。ピーク下の面積は相対量に比例する。したがって、高マンノース／ハイブリッド型の量は、より早い脱グリコシル化ＨＣ位置で溶出する画分から決定される。ＧｌｃＮＡｃ−ＨＣは脱グリコシル化ＨＣと共移動するので、未消化試料からの脱グリコシル化ＨＣ％を消化試料のプレピークから差し引いて、高マンノース％値を得る。分離には、構成に依存して、１５〜３０分を要する。
【００７５】
２）マイクロ流体ベースのＣＥ−ＳＤＳ。糖タンパク質は、１）と同様に変性させるが、ＣａｌｉｐｅｒによるＬＣ９０などの「ラボオンチップ」機器を使用して分離する。タンパク質を検出するために蛍光色素を使用するが、アッセイ及び分離には同じ原理を使用する。分離時間は１アッセイ当たり約３０秒に短縮され、それはマイクロタイタープレートからサンプリングされ得る。
【００７６】
実施例７．１は、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を使用する。簡潔に記載すると、グリカン種は、以下の工程に基づいて分析することができる：（ｉ）Ｎ−グリカンの放出（例えば、ＰＮＧアーゼＦなどの酵素による）、（ｉｉ）標識（例えば、２−アミノ安息香酸又は２−アミノベンズアミドによる）、（ｉｉｉ）遊離標識の除去（例えば、ゲル濾過又は固相抽出による）、（ｉｖ）ＨＩＬＩＣによるグリカン種の分離、及び（ｖ）検出（例えば、蛍光分光法による）。ＨＩＬＩＣのさらなる詳細は、Ｍｅｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１０、Ｖｏｌｕｍｅ  ３９８、Ｉｓｓｕｅ  ２、ｐｐ９０５−９１４によって提供される。
【００７７】
一般的に使用されている別の方法は、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ）である。Ｎ−グリカンの放出、標識化、及び遊離標識の除去の後、試料は、液体クロマトグラフィー（又はＨＰＬＣ）の物理的な分離機能を質量分析（ＭＳ）の質量分析機能と組み合わせる技術によって分析され得る。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｍｅｔｈｏｄ、１７  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１８、ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｂｉｏｔ．２０１７００１８５を参照されたい。
【００７８】
さらに他の好適な方法としては、陽イオンＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析、陰イオンＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析、ＨＰＬＣ，弱陰イオン交換（ＷＡＸ）クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー（ＮＰ−ＨＰＬＣ）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−４クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、及び一次元ＮＭＲ分光法、並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｐａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，２０１６，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．５  ｐａｇｅｓ  １１８１−１１９２、Ｓｈａｈ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．（２０１４）２５：９９９、Ｍａｔｔｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ  ２７３：２２６０−２２７２（１９９８）、Ｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２９９（Ｐｔ  １）：２６１−２７５（１９９４）、Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ  ２（３）：３２０−３３４（２０１０）Ｗｕｈｒｅｒ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，２００５，Ｖｏｌ．８２５，Ｉｓｓｕｅ  ２，ｐａｇｅｓ  １２４−１３３、Ｒｕｈａａｋ  Ｌ．Ｒ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，２０１０，Ｖｏｌ．３９７：３４５７−３４８１、Ｋｕｒｏｇｏｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ  １０（７）：ｅ０１３２８４８；ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１３２８４８、Ｔｈｏｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ１０（８）：ｅ０１３４９４９．  Ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１３４９４９、Ｐａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．３２（５）：１１８１−１１９２（２０１６）、及びＧｅｏｆｆｒｅｙ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ．ａｌ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９６，Ｖｏｌ．２４０，２１０−２２６頁を参照されたい。
【００７９】
高マンノース含量を評価する場合、対照は、上記のように、比較目的のために使用され得る。
【００８０】
４．組換え産生デノスマブの糖化
糖化（非酵素的グリコシル化と呼ばれることもある）は、グルコース又はフルクトースなどの糖分子のタンパク質又は脂質分子への共有結合の結果であり、酵素の制御作用を受けない。糖化は、一般にタンパク質分子の表面に位置する正に荷電した第一級アミンで起こる。潜在的な糖化部位が特定されたことを示す特異的配列は確認されていない。しかし、塩基性残基（アルギニン及び他のリジン）は、既知の構造を有するいくつかのタンパク質における糖化の発生と相関することが観察されている。糖化はＮ−２９８部位のＮ−グリコシル化とは異なる。
【００８１】
治療用ｍＡｂでは、生物学的機能部位の遮断又は凝集を誘発するさらなる分解などの糖化の潜在的効果が、糖化を潜在的な重要品質特性（ＣＱＡ）にする。抗体活性に及ぼす糖化の影響は、影響なし（Ｑｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００８；３７３（２）：１７９−９１、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ２０１１；１００（７）：２５４３−５０）から活性喪失（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９４；９８（２）：２４５−５１、Ｄｏｌｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ  １９８５；３６６（４）：３６１−６）まで幅があった。
【００８２】
リジン残基は荷電しており、しばしばタンパク質−タンパク質相互作用に関与しているので、糖化の有意な増加がＣＰ４デノスマブの生物学的活性に影響しなかったことは驚くべきことであった。したがって、一態様においては、本発明は、組換え産生デノスマブ分子を含む組成物であって、少なくとも１５％のデノスマブ分子が１つ以上の糖化リジン残基を含む組成物を提供する。実施例に示すように、ＣＰ４−デノスマブは、ＣＰ２−デノスマブと比較してより高レベルの糖化を示す。驚くべきことに、糖化レベルがより高いにもかかわらず、デノスマブのそのリガンドへの結合、及び生物学的活性は影響されない。実際、強制糖化した１つの実験では、最大７０％のデノスマブ分子が１つ以上の糖化リジン残基を含むが、その生物学的活性は維持された。したがって、特定の実施形態では、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約１５％〜約７０％、約１５％〜約６５％、約１５％〜約６０％、約１５％〜約５５％、約１５％〜約５０％、約１５％〜約４５％、約１５％〜約４０％、約１５％〜約３５％、約１５％〜約３０％、約２０％〜約７０％、約２０％〜約６５％、約２０％〜約６０％、約２０％〜約５５％、約２０％〜約５０％、約２０％〜約４５％、約２０％〜約４０％、約２０％〜約３５％、約２０％〜約３０％、又は約２４％のデノスマブ分子は１つ以上の糖化リジン残基を含む。
【００８３】
別の驚くべき発見は、ガラクトース−糖化リジンがデノスマブの生物学的活性にも免疫原性にも影響しなかったことである。ガラクトースは、天然には、ヒト血清中に約０．３ｍｇ／ｄＬ存在する。このような低い血清ガラクトースレベルでは、ガラクトース血症患者を除いて、健常な人が測定可能なレベルのガラクトース糖化を含む血中蛋白質を有する可能性は低い。したがって、ガラクトース糖化の臨床的安全性はこれまで不明であった。デノスマブの場合、高レベルのガラクトース−糖化デノスマブは免疫原性に影響を与えないことがわかった。したがって、別の態様において、本発明は、組換え産生デノスマブ分子を含む組成物であって、少なくとも５％のデノスマブ分子が、ガラクトース部分を含む１つ以上の糖化リジン残基を含む組成物を提供する。例えば、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約５％〜約３５％、約５％〜約３０％、約５％〜約２５％、約５％〜約２０％、約５％〜約１５％、約１０％〜約３５％、約１０％〜約３０％、約１０％〜約２５％、約１０％〜約２０％、又は約１０％〜約１５％のデノスマブ分子が、ガラクトース部分を含む１つ以上の糖化リジン残基を含む。
【００８４】
上記のＮ−２９８グリカンレベルと同様に、割合として表される糖化レベルは、文字通り個々の分子レベルで糖化リジンを有する分子を計数することを意味するものと解釈されるべきではない。それよりむしろ、割合は、一般に使用されている分析方法のいずれかを使用して、抗体組成物の全リジン含量に基づく糖化リジン種の相対的な割合を反映するものである。例えば、実施例７．２を参照されたい。そこでは、Ｋ−９８における糖化リジンの割合は、ＣＥ−ＨＰＬＣピークに基づいて計算されている。
【００８５】
特定の実施形態では、ガラクトース糖化リジンとグルコース糖化リジンの比は、約１：１０〜約１０：１、例えば、約１：１０、約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約７：１〜約１：７、約６：１〜約１：６、約５：１〜約１：５、約４：１〜約１：４、約３：１〜約１：３、又は約２：１〜約１：２である。
【００８６】
特定の実施形態では、糖化リジンは、（ｉ）重鎖Ｋ７６、Ｋ９８、Ｋ２１８、Ｋ２４９、Ｋ３１８、Ｋ３２７及びＫ３３５、並びに（ｉｉ）軽鎖Ｋ１０４、Ｋ１０８、Ｋ１５０、Ｋ１８４及びＫ１９１からなる群から選択される。
【００８７】
特定の実施形態では、本発明のデノスマブ分子は、ヒトＲＡＮＫＬに高い親和性で結合するが、マウスＲＡＮＫＬには結合しない。抗体の結合親和性は、特定の抗原−抗体相互作用の解離速度を指すＫＤ値として表すことができる。ＫＤは、「オフレート（ｋｏｆｆ）」とも呼ばれる解離速度と、結合速度、すなわち「オンレート（ｋｏｎ）」との比である。したがって、ＫＤはｋｏｆｆ／ｋｏｎ（解離／結合）に等しく、モル濃度（Ｍ）として表され、ＫＤが小さいほど結合親和性が強い。抗体のＫＤ値は、当該技術分野で十分に確立された方法を使用して決定され得る。特に明記しない限り、「結合親和性」は一価の相互作用（固有活性；例えば、一価の相互作用による抗体の抗原に対する結合）を指す。
【００８８】
ＫＤ値はよく知られた方法によって直接決定することができ、複雑な混合物についても、例えばＣａｃｅｃｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４，Ｂｙｔｅ  ９：３４０−３６２）に記載されているような方法によって計算することができる。（１９８４，Ｂｙｔｅ  ９：３４０−３６２）。例えば、ＫＤは、Ｗｏｎｇ  ＆  Ｌｏｈｍａｎ（１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５４２８−５４３２）によって開示されているような二重フィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイを用いて確立することができる。標的抗原に対する抗体のようなリガンドの結合能力を評価するための他の標準的なアッセイは当該技術分野で知られており、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＲＩＡ、及びフローサイトメトリー分析、並びに、本明細書の他の箇所に例示される他のアッセイが挙げられる。
【００８９】
結合親和性（ＫＤ）値を測定するための１つの例示的な方法は、一般的にはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムなどのバイオセンサシステムを使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。ＳＰＲは、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムを使用して、バイオセンサマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによって、リアルタイムの生体特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。ＢＩＡｃｏｒｅ動態分析は、チップからの抗原の、その表面上の固定化分子（例えば、抗原結合ドメインを含む分子）との結合及び解離、又は固定化抗原を有するチップからの抗体若しくはその抗原結合フラグメントの解離を分析することを含む。
【００９０】
特定の実施形態では、結合親和性（ＫＤ）値は、溶液ベースの結合平衡除外法（ＫｉｎＥｘＡ（商標））を使用して測定される。特定の実施形態では、ＫｉｎＥｘＡ測定がＫｉｎＥｘＡ（商標）３２００機器（Ｓａｐｉｄｙｎｅ）を使用して行われる。結合平衡除外法（ＫｉｎＥｘＡ（商標））は、抗原／抗体相互作用の平衡解離定数、並びに結合及び解離速度定数を測定することができる汎用免疫アッセイプラットフォーム（基本的には、フロー蛍光分光光度計）である。ＫｉｎＥｘＡ（商標）は、平衡が得られた後に実施されるので、相互作用のオフレートが非常に遅い可能性がある高親和性相互作用のＫＤの測定に使用することが有利な技術である。ＫｉｎＥｘＡ（商標）方法は一般に、Ｄｒａｋｅ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２８，３５−４３に記載されているように実施することができる。
【００９１】
抗体のＫＤを決定するための別の方法は、一般的にはＯｃｔｅｔ（登録商標）技術（Ｏｃｔｅｔ  ＱＫｅシステム、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用する、バイオレイヤー干渉法の使用による。
【００９２】
デノスマブに対する結合親和性は、一般に１００ｐＭ未満である。特定の実施形態では、デノスマブはヒトＲＡＮＫＬに約１００ｐＭ以下、約７５ｐＭ以下、約５０ｐＭ以下、約２５ｐＭ以下、約２０ｐＭ以下、約１０ｐＭ以下、約５ｐＭ以下、約０．１ｐＭ〜約５０ｐＭ、約０．５ｐＭ〜約５０ｐＭ、約１ｐＭ〜約５０ｐＭ、約０．１ｐＭ〜約２５ｐＭ、約０．５ｐＭ〜約２５ｐＭ、又は約１ｐＭ〜約２５ｐＭの親和性で結合する。特定の実施形態では、結合親和性は、ＫｉｎＥｘＡ  ３０００システム（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用する溶液平衡結合分析により、Ｋｏｓｔｅｎｕｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ  ２４，１８２−１９５（２００９）に開示されている方法に従って測定される。簡潔に記載すると、Ｒｅａｃｔｉ−Ｇｅｌ  ６３ビーズを２０ｍｇ／ｍｌのヒトＲＡＮＫＬにより、４℃で一晩プレコートし、１ｍｇ／ｍｌのＢｋＳＡで２時間ブロックし、ＰＢＳで３回洗浄した。デノスマブ（５０ｐＭ）を、種々の濃度の可溶性ヒトＲＡＮＫＬ（０〜５ｎＭ）と共に室温で＞６時間インキュベートして、ＲＡＮＫＬ被覆ビーズを通過させる前に平衡結合を可能にした。遊離デノスマブのビーズへの結合を、蛍光標識した（シアニンＣｙ５色素）ヤギ抗ヒト抗体によって定量した。
【００９３】
糖化レベルの評価に多くのアッセイを用いることができる。１つの例示的な方法は、ボロン酸アフィニティークロマトグラフィーである。ボロン酸アフィニティークロマトグラフィー（ＢＡＣ）は、シス−ジオール化合物の単離及び濃縮のための技術である。固定相上のボロン酸官能基は、アルカリ性ｐＨ条件下で四面体アニオンを形成し、これは、糖分子のｃｉｓ−１，２−ジオールアレイと相互作用し（Ｑｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００８；３７３（２）：１７９−９１）、非糖化種から糖化種を分離することができる。糖化種を溶出するために、ｐＨを低下させるか、又はソルビトールなどの水酸基の競合源を添加することによって、相互作用を破壊する。ＢＡＣは、炭水化物及び無傷のタンパク質の分析に使用されている。
【００９４】
抗体糖化分析では、ＢＡＣは、必要とする試料調製は最小限でよく、自然の動作条件を使用するので、糖化抗体の同定、定量及び単離の一般的な方法である。遮蔽剤、ｐＨ及び緩衝塩組成物の濃度の最適化は、原薬物質の糖化レベルの定量を可能にする。
【００９５】
糖化レベルを評価する別の方法は、電荷に基づく方法である。キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）又はイメージキャピラリー電気泳動（ｉｃＩＥＦ）は、糖化部位上の正電荷の損失による糖化を検出することができる、電荷に基づく分離方法である。完全に糖化され保持されたボロン酸画分は、糖化されず保持されていないボロン酸画分と比較して、酸性領域へのシフトが存在する。ｉｃＩＥＦは０．０５−ｐＩの差異を有する種を分離することが知られており、ブロックされたリジン残基に起因する０．０９−ｐＩ単位の差異を理論的に有する糖化抗体を分離することができる。この電荷差分離は、共混合糖化及び非糖化ボロン酸画分においても観察可能である。
【００９６】
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）はまた、表面電荷差を有する糖化タンパク質及び非糖化タンパク質を分離し得る。糖化ボロン酸画分の分析は、線形勾配条件下で主ピークへの明確な酸性シフトを示す。これに対応して、ＩＥＣから分画された酸性変異体もまた、糖化のわずかな富化を示す。
【００９７】
Ｑｕａｎら（上記）は、元の未分画抗体と比較して、完全に糖化したボロン酸保持抗体の酸性領域へのシフトを報告した。シフトの量は、線形勾配における約０．５ｍＭ塩化ナトリウムに等しかった。ボロン酸保持画分のＩＥＣピークも顕著に広がったが、ボロン酸非保持画分（非糖化）のＩＥＣピークは未分画出発物質よりもシャープであった。しかし、ＩＥＣは出発物質内の糖化種を十分に分離するだけの分解能を有していないことがあり、これは分子における低レベルの糖化の複数の部位からの複合電荷効果を示す。対照的に、カルボキシル末端に０、１、又は２個のリジン残基を有する分子は、明らかに樹脂との特異的且つ特有の位置的相互作用のために、互いに完全に分離される。
【００９８】
糖化レベルを評価する別の方法は、液体クロマトグラフィー−質量分析である。無傷の抗体又は酵素切断ｍＡｂ断片のトップダウン質量分析もまた、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）（例えば、Ｋｉｓｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２００５；１０４３：２４９−５９を参照）、又はエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ２０１１；１００（７）：２５４３−５０を参照）によって、糖化レベルを決定するために使用することができる。各糖化部位は＋１６２Ｄａの質量シフトを示すので、トップダウンアプローチを、抗体の糖化レベルの迅速な推定として使用し得る。脱グリコシル化及びＣ末端リジンの除去後、質量分析による糖化の定量は、１．０％の検出限界及び３．０％の定量限界を有し、ＢＡＣと質量分析結果との間に相関があることが報告されている。
【００９９】
糖化部位を見つけるために、ボトムアップペプチドマッピングアプローチが一般に使用される。トリプシンはリジン残基の糖化によって阻害されるので、＋１６２Ｄａの質量付加を伴うトリプシン切断の失敗は、糖化リジンを示す。収集されたＢＡＣ保持画分又は強制糖化試料のトリプシンペプチドマッピングは、抗体の糖化感受性の部位を明らかにする。
【０１００】
質量分析における断片化の別の方法は、電子移動解離（ＥＴＤ）である。断片化方法の比較に関する研究は、ＥＴＤがいかなる中性損失もなしに完全な配列断片化を提供することを示す。
【０１０１】
感度を改善し、糖化ペプチドの中性損失を減少させる１つの方法は、水素化ホウ素ナトリウム又はシアノ水素化ホウ素ナトリウム還元、続いてトリプシン切断及びＭＳ／ＭＳ検出によるペプチドマップ分析を使用することによる（例えば、Ｂｒａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ２００７；７９（２４）：９４０３−１３を参照）。このアプローチにおいて、炭水化物とペプチドとの間の結合は、還元した糖化糖部分のために安定化され、これはより高品質のＭＳ／ＭＳスペクトルが得られる。
【０１０２】
液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）もまた、タンパク質糖化のレベルを調べるために一般的に使用される方法である。
【０１０３】
比色アッセイもまた使用することができる。抗体糖化から形成されたケトアミンは、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）還元アッセイによって定量することができる。ＮＢＴは糖化タンパク質のケトアミン形態によって還元され、これは５２５ｎｍにおける吸光度の変化をもたらす。この方法は、ポリリジン及び糖化アルブミンの測定に使用されてきた。
【０１０４】
さらに、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）フォーマットが、試料と、特定の種類の糖化最終産物を標的とするビオチン結合一次抗体との間の結合を利用して、糖化抗体を調べるために適用されてきた。
【０１０５】
５．他のグリカン種
一般に知られているグリカンを表２に示す。一態様において、本発明は、組換え産生デノスマブ分子を含む組成物であって、約４８％〜約７０％のデノスマブ分子がＡ２Ｆ−Ｇ０を含む組成物を提供する。例えば、約４８％〜約５５％、約５０％〜約６５％、約５０％〜約６０％、又は約５５％〜約６５％のデノスマブ分子がＡ２Ｆ−Ｇ０を含む。
【０１０６】
別の態様において、本発明は、組換え産生デノスマブ分子を含む組成物であって、約３０％〜約６０％（例えば、約３０％〜約５５％、約３０％〜約５０％、約３０％〜約４５％、約３５％〜約５５％、約３５％〜約５０％、又は約３５％〜約４５％）のデノスマブ分子が、Ｎ−２９８部位にＡ２Ｆ−Ｇ０を含む組成物を提供する。
【０１０７】
一態様において、本発明は、組換え産生デノスマブ分子を含む組成物であって、約９％〜約２６％（例えば、約１０％〜約２６％、約１１％〜約２６％、約１２％〜約２６％、約１３％〜約２６％、約１０％〜約２０％、又は約１５％〜約２５％）のデノスマブ分子がＡ２Ｆ−Ｇ１を含む組成物を提供する。
【０１０８】
別の態様において、本発明は、組換え産生デノスマブ分子を含む組成物であって、約２０％〜約５０％のデノスマブ分子がＮ−２９８部位にＡ２Ｆ−Ｇ１を含む組成物を提供する。例えば、約２５％〜約４５％、約２５％〜約４０％、約３０％〜約４５％、又は約３０％〜約４０％のデノスマブ分子がＡ２Ｆ−Ｇ１を含む。
【０１０９】
一態様において、本発明は、組換え産生デノスマブ分子を含む組成物であって、約０．１％〜約３％のデノスマブ分子がＮ−２９８部位にＡ１−Ｇ０を含む組成物を提供する。別の態様において、本発明は、組換え産生デノスマブ分子を含む組成物であって、約０．５％〜約３％のデノスマブ分子がＮ−２９８部位にＡ１−Ｇ０を含む組成物を提供する。
【０１１０】
一態様において、本発明は、組換え産生デノスマブ分子を含む組成物であって、約０．１％〜約４％のデノスマブ分子がＮ−２９８部位にＡ１Ｆ−Ｇ０を含む組成物を提供する。別の態様において、本発明は、組換え産生デノスマブ分子を含む組成物であって、約１％〜約５％のデノスマブ分子がＮ−２９８部位にＡ１Ｆ−Ｇ０を含む組成物を提供する。
【０１１１】
一態様において、本発明は、組換え産生デノスマブ分子を含む組成物であって、約４％〜約１０％のデノスマブ分子がＮ−２９８部位にＡ２−Ｇ０を含む組成物を提供する。別の態様において、本発明は、組換え産生デノスマブ分子を含む組成物であって、約４％〜約８％のデノスマブ分子がＮ−２９８部位にＡ２−Ｇ０を含む組成物を提供する。
【０１１２】
一態様において、本発明は、組換え産生デノスマブ分子を含む組成物であって、約１％〜約７％のデノスマブ分子がＮ−２９８部位にＡ２−Ｇ１を含む組成物を提供する。一態様において、本発明は、組換え産生デノスマブ分子を含む組成物であって、約０．５％〜約４％のデノスマブ分子がＮ−２９８部位にＡ２−Ｇ１を含む組成物を提供する。
【０１１３】
一態様において、本発明は、組換え産生デノスマブ分子を含む組成物であって、約３％〜約１０％のデノスマブ分子がＮ−２９８部位にＡ２Ｆ−Ｇ２を含む組成物を提供する。一態様において、本発明は、組換え産生デノスマブ分子を含む組成物であって、約０．３％〜約５％のデノスマブ分子がＮ−２９８部位にＡ２Ｆ−Ｇ２を含む組成物を提供する。
【０１１４】
一態様において、本発明は、組換え産生デノスマブ分子を含む組成物であって、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約０．１％〜約５％、約０．１％〜約４％、約０．１％〜約３％、約０．１％〜約２．５％、約０．１％〜約２％のデノスマブ分子がＮ−２９８部位にシアル化Ｎ−グリカンを含む組成物を提供する。一態様において、本発明は、組換え産生デノスマブを含む組成物であって、約０．３％〜約１％のデノスマブ分子がＮ−２９８部位にシアル化Ｎ−グリカンを含む組成物を提供する。一態様において、本発明は、組換え産生デノスマブを含む組成物であって、約０．３％〜約２％のデノスマブ分子がＮ−２９８部位にシアル化Ｎ−グリカンを含む組成物を提供する。一態様において、本発明は、組換え産生デノスマブを含む組成物であって、約１％〜約３％のデノスマブ分子がＮ−２９８部位にシアル化Ｎ−グリカンを含む組成物を提供する。
【０１１５】
上述したように、ここで割合として表される種々のグリカン種のレベルは、文字通り個々の分子レベルでのＮ−グリカン含量を計数することを意味すると解釈されるべきではない。割合は、一般に使用されている分析方法のいずれかを使用して、抗体組成物の全体的なＮ−グリカン含量に基づくグリカン種の相対的な割合を反映するものである。例えば（例えば、実施例３．２、実施例７．１を参照）、割合は、クロマトグラフィーのピークの面積に基づいて計算され得る。
【０１１６】
例示されたプロセスによって産生されたデノスマブ分子は、高マンノースとは異なった、上記した種の種々のグリカン含量を示したが、デノスマブの生物学的活性及びＰＫ／ＰＤプロファイルはこれらのグリカン種の変動によって影響されない。したがって、グリカンプロファイルは、有意な変動を潜在的に許容し得るであろう。特定の実施形態では、約４８％〜約７０％がＡ２Ｆ−Ｇ０を有し、約１３％〜約２６％がＡ２Ｆ−Ｇ１を有するか、又は約４８％〜約７０％がＡ２Ｆ−Ｇ０を有し、約１０％〜約２０％がＡ２Ｆ−Ｇ１を有することが望ましい場合がある。
【０１１７】
さらに、生物学的類似性評価が網羅的検証に基づいているので、最も広い範囲（例えば、デノスマブ分子の約４８％〜約７０％がＡ２Ｆ−Ｇ０を含む）は、生物学的類似性評価の決定基準として決して解釈されるべきではない。例えば、Ｆｃグリカン上の糖残基（例えば、フコース、シアル酸、末端β−ガラクトース）の存在又は非存在はＦｃの構造に影響を及ぼし、それによって、Ｆｃ媒介エフェクター機能に潜在的に影響を及ぼす。Ｇ０グリカンは（ｉ）補体を活性化し、且つ（ｉｉ）血清クリアランスを促進するために、マンノース結合タンパク質と相互作用することが知られている（例えば、Ｄｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３（１９９９），ｐｐ．５４２７−５４３４、Ｍａｌｈｏｔｒａ，ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１（１９９５），ｐｐ．２３７−２４３を参照）。Ｇ２グリコフォームは、妊婦及び臍帯において増加することが知られている（Ｋｉｂｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｎｕｔｒ．，２１（１９９６），ｐｐ．５７−６３）。静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の脱シアル化は、ＫＮマウスにおける抗炎症特性を喪失させることが知られている（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４４８（２０１４），ｐｐ．８２−９１）。ＩｇＧ上のコアα（１，６）フコースの喪失は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の活性を増強することが知られている（例えば、Ｆｅｒｒａｒａ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０８（２０１１），ｐｐ．１２６６９−１２６７４、Ｓｈｉｅｌｄｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（２００２），ｐｐ．２６７３３−２６７４０を参照）。最後に、Ｎ結合複合型グリカンの末端単糖は、シアル酸によって占められることがある。このシアル酸の存在は吸収、血清中半減期、及び血清からのクリアランス、並びにそれぞれの糖タンパク質の物理的特性、化学的特性、及び免疫特性に影響を及ぼす（例えば、Ｂｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．２００９  Ｏｃｔ；９８（１０）：３４９９−５０８．ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｐｓ．２１６８４を参照）。したがって、生物学的類似性を実証する目的のために、種々の、又はより狭い範囲のグリカン含量が必要とされ得る。
【０１１８】
６．細胞株
本発明において使用される細胞株（「宿主細胞」とも呼ばれる）は、デノスマブを発現するように遺伝子操作される。細胞株は、一般的には時間が制限されずに培養で維持され得る初代培養から生じる系統に由来する。細胞株の遺伝子操作には、宿主細胞に所望の組換えポリペプチドを発現させるように、細胞を組換えポリヌクレオチド分子でトランスフェクト、形質転換若しくは形質導入すること、及び／又は別の方法で改変すること（例えば、相同組換え及び遺伝子活性化、又は組換え細胞と非組換え細胞との融合によって）を含む。目的のポリペプチドを発現するように細胞及び／又は細胞株を遺伝子操作するための方法及びベクターは当業者によく知られており、例えば、種々の技術が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８、及び四半期ごとにアップデート）中のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９９０，ｐｐ．１５−６９に説明されている。
【０１１９】
動物細胞株は、その前駆細胞が多細胞動物に由来する細胞に由来する。動物細胞株の一種は哺乳動物細胞株である。培養での増殖に適した多種多様な哺乳動物細胞株が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）及び商業的ベンダーから入手可能である。産業で一般的に使用されている細胞株の例としては、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＶ１（Ｃｏｓを含む）、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄腫細胞株（例えば、ＮＳＯ、ＮＳ１）、ＰＣ１２、ＷＩ３８細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。
【０１２０】
特定の実施形態では、哺乳動物宿主細胞は齧歯動物細胞である。齧歯動物細胞株の例としては、例えば、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）（例えば、ＢＨＫ２１、ＢＨ  ＴＫ）、マウスセルトリ（ＴＭ４）、バッファローラット肝臓（ＢＲＬ３Ａ）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ）、ラット肝癌（ＨＴＣ）、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）、マウスハイブリドーマ（Ｓｐ２／０）、マウス胸腺腫（ＥＬ４）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＨＯ細胞誘導体、マウス胚性（ＮＩＨ／３Ｔ３、３Ｔ３  Ｌｉ）、ラット心筋（Ｈ９ｃ２）、マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）及びマウス腎臓（ｍｉＭＣＤ−３）が挙げられる。
【０１２１】
特定の実施形態では、哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞である。本明細書で使用される場合、「ＣＨＯ細胞」にはまた、ＣＨＯ細胞にさらなる遺伝子修飾が導入されているＣＨＯ誘導体が含まれる。ＣＨＯ細胞は、複雑な組換えタンパク質、例えば、サイトカイン、凝固因子、及び抗体の産生のために広く使用されている（Ｂｒａｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｂｌｏｏｄ  ８８：２００４−２０１２、Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３：６３５２−６３６２、ＭｃＫｉｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ６：２３１−２３９，Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５；３０１  １−３０１６）。
【０１２２】
好適なＣＨＯ細胞としては、例えば、ＤＵＸＢ１１及びＤＧ４４株が挙げられる。これらの２つの細胞株はジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）活性が欠損しており、したがって、増殖はヌクレオチド前駆体の外因性供給源に依存する。ＤＨＦＲ欠損は、ゲノム組み込み及び外因性ＤＮＡの安定な発現を選択するのに適した、容易に操作される表現型である。ゲノム組み込みは、目的遺伝子及びＤＨＦＲ遺伝子のための発現カセットで細胞をトランスフェクトすることによって達成される。トランスフェクション後、細胞を、ヌクレオチド前駆体を欠く選択培地中に置く。さらに、これらの細胞は接着性又は懸濁培養物として操作しやすく、比較的良好な遺伝的安定性を示す。ＣＨＯ細胞及びそれらで組換え発現したタンパク質は広範に特徴付けられており、規制当局による臨床商業生産での使用が認められている。
【０１２３】
ＤＨＦＲ欠損細胞株における組換えタンパク質発現は、メトトレキサート（ＭＴＸ）を培養物に添加することによってさらに増強され得、その結果、高コピー数の導入発現ベクターを選択することができる。ＭＴＸはＤＨＦＲ酵素の競合阻害剤である。ヌクレオチド前駆体が存在しないことに加えて、この追加の選択圧を適用することにより、ＤＨＦＲ選択マーカーを含む組み込み発現ベクター、及び、ほとんどの場合、目的遺伝子の自発的増幅を受けた少数の細胞集団の選択及び単離が可能になる。複数の遺伝子コピーの存在は、外因性タンパク質の高レベルの発現を達成するのに役立つ。或いは、ＭＴＸ選択は、ＤＨＦＲ欠損とは無関係に行うことができる（すなわち、ＭＴＸを使用して、元々ＤＨＦＲコンピテントである宿主細胞を選択する）。
【０１２４】
別の好適なＣＨＯ細胞株は野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞株（例えば、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−６１）、及びその誘導体ＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶである。ＣＨＯ−Ｋ１細胞株のため一般的に使用されている一選択方法は、グルタミン合成酵素（ＧＳ）選択である。グルタミンの外因性供給源がない場合、細胞生存は、グルタミンを産生するＧＳ酵素に依存する。比較的低い内因性ＧＳ酵素活性を有するマウス骨髄腫由来ＮＳ／０細胞及びＣＨＯ細胞などの宿主細胞株を用いて、この方法は、ＧＳ選択マーカーを発現ベクター中及びグルタミンを含まない選択培地において使用する場合、単純な選択スキームを可能にする。ＤＨＦＲ／ＭＴＸ系と同様に、ＧＳ競合阻害剤メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を培地に添加して、さらなる圧力を加え、組み込みベクターから高レベルの発現を駆動するＣＨＯ細胞を選択することができる。
【０１２５】
ＤＨＦＲ欠損の有無にかかわらず、ＭＴＸに基づいて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、又は他の一般的に使用されている任意のＣＨＯ細胞を選択することもできる。一般に、ＤＦＨＲ欠損細胞株を用いた場合、外因性配列のコピー数は、一般に非常に多く、数百コピーに及ぶこともある。
【０１２６】
本明細書に記載の本発明に好適な他のＣＨＯ細胞株としては、例えば、ＣＨＯ−ＩＣＡＭ−１細胞、及びＣＨＯ−ｈｌＦＮ細胞γが挙げられる。これらの遺伝子改変細胞は、細胞の特定の遺伝子又は発現領域への組換えＤＮＡの安定した挿入、挿入されたＤＮＡの増幅、及び組換えタンパク質の高レベル発現を示す細胞の選択を可能にする。
【０１２７】
産業研究所で一般的に使用されているＣＨＯ細胞株のさらなる例としては、ＣＳ−９細胞及びＡＭ−１／Ｄ細胞（米国特許第６，２１０，９２４号明細書に記載）が挙げられる。ＣＳ−９及びＡＭ１／Ｄはいずれも、無血清培地への適応及びサブクローニングによってＤＵＸ  Ｂ１１から誘導される。他の例示的なＣＨＯ細胞株としては、ＥＭ９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１８６１）、ＵＶ２０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１８６２）、ＣＨＯ  ｄｆｈｒ−（ＥＣＡＣＣ  ９４０６０６０７）、ＲＲ  ＣＨＯ  ＫＩ（ＥＣＡＣＣ  ９２０５２１２９）、ｈＣＢＥ１１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３３５７）、Ｅ７７．４（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３７６５）、ｈＬＴ−Ｂ：Ｒ−ｈＧ１  ＣＨＯ＃１４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  １９６５）、ＭＯＲ−ＣＨＯ−ＭＯＲＡｂ−００３−ＲＣＢ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７５５２）、ＡＱ．Ｃ２クローン１１Ｂ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３２７４）、ＡＱ．Ｃ２クローン１１Ｂ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３２７４）、ＣＨＯ−ＤＧ４４のｈｓＡＱＣ２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３３５６）、ｘｒｓ５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２３４８）、Ｌｅｄ［元の名称はＰｒｏ−５ＷｇａＲＩ３Ｃ］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７３５）、Ｐｒｏ−５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７８１）、ＡＣＹ１−Ｅ（ＡＴＣＣ  ６５４２１）、ＡＣＹ１−Ｅ（ＡＴＣＣ  ６５４２０）、ｐｇｓＥ−６０６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２４６）、ＣＨＯ−ＣＤ３６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２０９２）、ｐｇｓＣ−６０５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２４５）、ＭＣ２／３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１４３）、ＣＨＯ−ＩＣＡＭ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２０９３）、及びｐｇｓＢ−６１８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２４１）が挙げられる。細胞株は、どの細胞株が組換えデノスマブの高発現レベルを有するかを決定することによって選択され得る。
【０１２８】
本明細書に例示されるように、ＣＰ３及びＣＰ４プロセスにおいては、ＣＨＯ細胞は、増殖期の間、ＭＴＸ選択を使用して増幅された。一般に、ＭＴＸ選択に伴い、宿主細胞は約７００〜１０００コピーの組換え配列を含み、それによって組換えタンパク質産生の全体的な収率を増加させると推定される。したがって、特定の実施形態では、本発明の哺乳動物宿主細胞は、メトトレキサート（ＭＴＸ）選択によって増幅されている。特定の実施形態では、哺乳動物宿主細胞が約５００コピー以上、約６００コピー以上、又は約７００コピー以上など、約５００コピー以上のデノスマブをコードする核酸配列を含む。
【０１２９】
特定の実施形態では、本発明の哺乳動物宿主細胞は、約５００コピー以上の配列番号３を含む核酸配列、及び／又は約５００コピー以上の配列番号４を含む核酸配列を含む。
【０１３０】
特定の実施形態では、本発明の哺乳動物宿主細胞は、配列番号１をコードする核酸配列、及び／又は配列番号２をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明の哺乳動物宿主細胞は、抗体をコードする核酸配列を含み、前記抗体は配列番号１を含む重鎖、及び配列番号２を含む軽鎖を含む。特定の実施形態では、本発明の哺乳動物宿主細胞は、配列番号３を含む核酸配列、及び／又は配列番号４を含む核酸配列を含む。
【０１３１】
特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞株は、十分なグルコースを提供する培地中で培養された場合に、Ｎ−２９８部位に低レベルの高マンノースを提供する細胞株である。このような宿主細胞には、１ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌのグルコース（例えば、４ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌのグルコース）を含む培養培地中で培養した場合に、Ｎ−２９８部位における高マンノースレベルが約１．８％以下であるデノスマブ組成物を産生するＣＨＯ細胞が含まれる。例えば、宿主細胞が（低グルコース培地に移行することなく）全産生期の間に約１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ（例えば、約４ｇ／Ｌ〜約１８ｇ／Ｌ）のグルコースを含む培地中で培養された場合に、Ｎ−２９８部位における高マンノースレベルは、約１．８％以下、約１．７％以下、約１．６％以下、約１．５％以下、約１．４％以下、約１．３％以下、約１．２％以下、約１．１％以下、約１．０％以下、約０．９％、約０．８％、約０．７％、約０．６％、約０．５％、約０．４％、約０．３％、約０．２％、又は約０．１％以下である。このようなＣＨＯ細胞は通常のグルコースに富む培地中で培養された場合、Ｎ−２９８部位に所望の高マンノース含量を提供しないので、これらのＣＨＯ細胞宿主によって産生されるデノスマブ分子の高マンノースレベルを増加させるために、本明細書に記載される方法を使用することに特に利点がある。
【実施例】
【０１３２】
実施例１：ＣＰ２及びＣＰ３培養プロセスの比較
ＣＰ２培養増殖プロセスは、７０Ｓワーキングセルバンクからのバイアルを解凍することによって開始した。解凍したバイアルの内容物を、振盪フラスコ中のＣＰ２細胞培養増殖培地に移した。培養物を、２０Ｌバイオリアクターの接種のためにプールされるのに十分な細胞集団が利用可能になるまで、連続的により大きな振盪フラスコ中で継代した。その後、培養物を６０Ｌバイオリアクターで増殖させ、３日後に３００Ｌバイオリアクターで増殖させた。３００Ｌバイオリアクター中で３〜４日培養した後、２，０００Ｌの産生バイオリアクターに接種した。
【０１３３】
ＣＰ３培養増殖プロセスは、ＷＣＢからの２５Ｂ１２細胞株のバイアルを解凍することによって開始した。解凍したバイアルの内容物を、振盪フラスコ中のメトトレキサート（ＭＴＸ）を含有するＣＰ３細胞培養増殖培地に移した。培養物を、１０Ｌの培養バッグバイオリアクターの接種のためにプールされるのに十分な細胞集団が利用可能になるまで、連続的により大きな振盪フラスコ中で継代した。１０Ｌ培養バッグバイオリアクター中で３日後、細胞集団を５０Ｌバイオリアクターに接種し、この段階でＭＴＸを増殖培地から除去した。この後、３日ごとに、１００Ｌ、次いで５００Ｌのバイオリアクターへと増殖を続けた。５００Ｌバイオリアクター中で３日培養した後、２，０００Ｌの産生バイオリアクターに接種した。
【０１３４】
ＣＰ２及びＣＰ３細胞培養増殖及び産生プロセスを比較するプロセスフロー図を表３に示す。両方のプロセスが、産生バイオリアクターに接種するのに十分なバイオマスが生成される前、３接種バイオリアクター段階を使用した。接種バイオリアクターの操作の間、ｐＨ、温度、圧力、撹拌及び溶存酸素を、各プロセスに特異的な設定値で制御した。ＣＰ２プロセスは接種バイオリアクター間の全容量移行を含み、一方、ＣＰ３プロセスは、初期生細胞密度（ＶＣＤ）を目標とした。これは、操作の優先度によるものであった。
【０１３５】
ＣＰ２からＣＰ３への細胞株の変化により、より高い収率がもたらされた。ＣＰ３細胞株（２５Ｂ１２）は、ＣＳ−９親ＣＨＯ細胞に基づく。
【０１３６】
もう一つの変化は、培養増殖プロセスへの培養バッグユニット操作の導入であった。これは、Ｎ−３バイオリアクターの接種に必要な振盪フラスコの数を減らすために導入した使い捨てバイオリアクター技術である。
【０１３７】
産生バイオリアクタープロセスは両方ともに、２，０００Ｌの産生容器中、同じ温度設定値で操作した。産生バイオリアクターの操作の間、温度、初期ＶＣＤ、ｐＨ及び溶存酸素を、異なる細胞株のために最適化した、各プロセスに特異的な設定値で制御した。
【０１３８】
両方のプロセスで、接種は、前のシードバイオリアクター（Ｎ−１）培養物を産生バイオリアクターバッチ培地に希釈することによって行った。ＣＰ２プロセスは、１０×１０５細胞／ｍＬの産生バイオリアクターにおける最大初期ＶＣＤまで、接種バイオリアクター間の全容量移行を含んだ。ＣＰ３プロセスは、５×１０５細胞／ｍＬの初期ＶＣＤを目標とした。この差異は、操作の優先度によるものであった。
【０１３９】
ＣＰ２産生プロセスは、改変ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に基づき、そして培養物が１４日目に回収される前の３日目及び９日目に２回のボーラス供給があった。ＣＰ２供給媒体はＡＣＯ  ４．４をベースとし、大豆加水分解物を含有した。ＣＰ３産生プロセスは、ＩＭＸ  ７．０培地に基づき、そして培養物が１０日目に回収される前の４日目、７日目及び９日目に３回のボーラス供給があった。ＣＰ３供給培地はＡＦＭ００４及びＡＦＭ０２０培地に基づき、酵母エキス（酵母抽出物）を含有した。両方のプロセスからの培地は全て、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に基づいており、異なる細胞株のために最適化された。
【０１４０】
【表４】
2021521854.tif 000006
【０１４１】
実施例２：ＣＰ２及びＣＰ３の回収及び精製プロセスの比較
産生期が完了した後、バイオリアクター内容物を冷却し、収穫した。ＣＰ２プロセスは１８±３℃に冷却し、ＣＰ３プロセスは１０〜１５℃に冷却した。回収物の清澄化は、ディスクスタック遠心分離、深層濾過（段階１）及び膜濾過（段階２）を包含した。
【０１４２】
ディスクスタック遠心分離は、培養培地からの産生細胞及び細胞残屑の一次分離を達成した。遠心分離に続いて、段階１（深層）濾過を行い、段階２（膜）濾過及びその後の精製操作を著しい汚染なしに行うことができるように、回収遠心分離液をさらに清澄化した。段階１の濾過器に続き、段階２の膜濾過器により、清澄度が高く生物汚染度が減少した回収濾液プールが提供された。
【０１４３】
ＣＰ２精製プロセスとＣＰ３精製プロセスとを比較したプロセスフロー図を表４に示す。両方のプロセスが同じ基本的な種類の単位操作を含んだが、各単位操作にための操作パラメーター、及びこれらの単位操作の順序は各プロセスで最適化された。これは、上流性能パラメーターにおける細胞株の相異によるものであった。
【０１４４】
両方のプロセスにおいて、最初の単位操作は、清澄化された収穫物に対して行われたプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程であった。プロテインＡクロマトグラフィー工程は、固定化プロテインＡリガンドとデノスマブのＦｃ領域との間の特異的な高親和性相互作用を用いてデノスマブを捕捉する主要な精製段階であった。両方のプロセスにおいて、第２の単位操作は、エンベロープウイルスを不活化するように設計された低ｐＨウイルス不活化段階であった。
【０１４５】
次に、ＣＰ２プロセスは、２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）及びトリス溶液を使用して、産生物プールをｐＨ６．５に中和した後、２段階濾過を行った。ＣＰ３プロセスは、クエン酸三ナトリウム溶液を使用して、産生物プールをｐＨ５．２に中和した後、２段階濾過を行った。この段階で、ＣＰ２プロセスは、さらなる処理のために必要とされるまで、長期貯蔵のために２〜８℃で保持することができた。ＣＰ３プロセスは、室温で５日間保持することができた。
【０１４６】
両方のプロセスにおいて、第２のクロマトグラフィー工程及び第３の単位操作は、陽イオン交換（ＣＥＸ）であった。各プロセスの操作条件は同様であった。プロセスの次の２つの単位操作は、ウイルス濾過及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）段階であった。両方のプロセスの最終単位操作は、精製デノスマブを製剤緩衝液に交換するための限外濾過及び透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）であった。ＣＰ２では、最終原薬濃度は７０ｍｇ／ｍＬであった。ＣＰ３では、最終原薬濃度は１２０ｍｇ／ｍＬである。
【０１４７】
表４に要約するように、ＣＰ３プロセスは、デノスマブ産生の収率を改善した。
【０１４８】
【表５】
2021521854.tif 000007
【０１４９】
実施例３：ＣＰ２プロセスにより産生されるデノスマブのグリカンマッピング
デノスマブのグリコシル化は、重鎖上のアスパラギン２９８における単一のＮ結合部位を占めるオリゴ糖構造を含む。
【０１５０】
３．１  グリカン占有率
Ａｓｎ−２９８におけるＮ−グリコシル化部位の占有率を、ＰＮＧアーゼＦとのインキュベーション後のデノスマブのＬｙｓ−Ｃペプチドマップから決定した。質量分析は、ＰＮＧアーゼＦ処理後のグリコシル化ペプチドに対応するイオンの不在を実証し、Ｎ−グリカンの完全な除去を確認した。Ａｓｎ−２９８のグリコシル化を欠くペプチドは非グリコシル化ペプチドとして分解され、ＰＮＧアーゼＦによって除去されたＡｓｎ−２９８にグリカンを有するペプチドは脱グリコシル化ペプチドとして分解された。マップ中の非グリコシル化及び脱グリコシル化ペプチドの同定及び定量を、両方のペプチドについての＋２〜＋５電荷状態の抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）の再構築によって確立した。ＥＩＣを再構築するために、２つのペプチドの各電荷状態のモノアイソトピックピークのみを使用した。
【０１５１】
非グリコシル化及び脱グリコシル化ペプチドのＥＩＣトレースの絶対ピーク面積から、Ｎ−グリコシル化部位の占有率を決定した。占有率は、以下の式を用いて計算した：
【数１】
2021521854.tif 000008
計算は非グリコシル化種と脱グリコシル化種のイオン化効率が同等であると仮定した。実際には、非グリコシル化ペプチドがＡｓｎ残基を含有するのに対して、脱グリコシル化ペプチドが２９８位に負に荷電したＡｓｐ残基を含有するとすれば、非グリコシル化種のイオン化効率は脱グリコシル化種よりもわずかに高いようである。したがって、非グリコシル化ペプチドの割合は、おそらく過大に報告されている。Ａｓｎ−２９８におけるグリコシル化の部位占有率は約９９．７％であった。Ａｓｎ−２９８での非グリコシル化フォームのレベルは、質量分析と組み合わせたＬｙｓ−Ｃペプチドマップによって約０．３％であると決定された。
【０１５２】
全配列にわたるペプチドマッピング研究からの質量データに基づくと、検出可能なレベルのさらなるＮ−結合グリコシル化、又はＯ−結合グリコシル化の証拠はない。
【０１５３】
３．２  Ｎ−結合型グリカンとＯ−結合型グリカンの質量分析
オリゴ糖マッピング、質量分析、及びエキソグリコシダーゼシーケンシングにより、Ｎ−結合型グリカンを特徴付けた。オリゴ糖マッピングは、エンドグリコシダーゼＰＮＧアーゼ−Ｆを用いた加水分解によるタンパク質からのＮ−グリカンの遊離を含んだ。次いで、遊離したグリカンの還元末端を、蛍光タグ（２−アミノベンズアミド、２−ＡＢ）による還元アミノ化によって標識し、この標識グリカンを、蛍光検出を伴う高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）によって分離した。
【０１５４】
半分取ＨＰＡＥＣプロファイル中の各グリカン種を質量分析のために収集した。各ピークを分析カラムに再注入して、画分の純度を確認した（ほとんどの画分で９０％を超える）。次いで、精製した画分を、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）により分析し、観測質量に基づいてグリカン構造を解明した。
【０１５５】
各画分に割り当てられたグリカン構造（図１を参照）、及び実験式に基づく理論質量対観測質量を表５に示す。観測質量は全て理論質量の１，０００ｐｐｍ以内であり、これは実験精度の範囲内である。微量種の正確な構造（ピーク１、１５、１６、１７、及び１８）は、分析条件下でのそれらの低い存在量及び不十分なイオン化特性のために同定されなかった。
【０１５６】
【表６】
2021521854.tif 000009
【０１５７】
Ｎ−グリカンプロファイルに存在する主要な種は、ＣＨＯ由来抗体について予想されるように、様々な程度の末端ガラクトシル化を有する二分枝型構造であった（約８５％）。次に多い種は高マンノース種（約１０％）で、このサブセットの大部分はマンノース５（８．１％）であった。Ｎ−グリカンプロファイルにおいて、一分枝型構造も見出された（ピーク２及び４、３．７％）。フコシル化二分枝型形態対非フコシル化二分枝型形態の比は約９：１であった。
【０１５８】
優勢なＮ−結合オリゴ糖（表５のピーク２〜９）の構造を、エキソグリコシダーゼ；α−（２−３，６，８，９）シアリダーゼ、β−（１−４）ガラクトシダーゼ、β−（１−２，３，４，６）グルコサミニダーゼ、及びα−（１−２，３，４，６）フコシダーゼを用いた酵素遊離によってさらに確認した。
【０１５９】
対照試料及び試料中のグリカンプロファイルを、シアル酸の切断のためにα−（２−３，６，８，９）シアリダーゼで処理した。８種の優勢種はいずれもシアリダーゼ処理の影響を受けず、これらの優勢種はシアリル化グリカンではないことが示された。
【０１６０】
β−（１−４）結合末端ガラクトース残基を特異的に切断するα−シアリダーゼ及びβ−（１−４）ガラクトシダーゼの組み合わせによる消化からのプロファイルも分析した。表５に列挙した３つのピーク（Ａ２Ｆ−Ｇ１、Ａ２Ｆ−Ｇ２、Ａ２−Ｇ１）は、末端ガラクトースを含有する推定構造を有した。β−（１−４）ガラクトシダーゼによる処理後、これらのピークはなくなり、これらの３つのピークにおける末端β−（１−４）結合ガラクトース残基の存在を確認した。
【０１６１】
先に記載したα−シアリダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼの組み合わせに加えて、末端ＧｌｃＮＡｃ残基の切断に特異的な酵素であるβ−（１−２，３，４，６）グルコサミニダーゼによる消化からのプロファイルも分析した。シアリダーゼ及びガラクトシダーゼによる連続消化の後、末端ＧｌｃＮＡｃを含む推定構造を有する表５に列挙した４つの優勢グリカン種のＡ１Ｆ−Ｇ０、Ａ２Ｇ−Ｇ０、Ａ１−Ｇ０、及びＡ２−Ｇ０が存在した。β−（１−２，３，４，６）グルコサミニダーゼによる処理後は、これらのピークは存在せず、これらの４つのピークにおける末端ＧｌｃＮＡｃの存在を確認した。
【０１６２】
α−シアリダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びβ−グルコサミニダーゼの混合物による消化後は、プロファイルに３つのピークが残っていた。１０分で溶出するピークを集め、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより分析した。観測質量は１，１９８．７Ｄａであり、２−ＡＢ標識フコシル化マンノース３（１，１９８．１Ｄａ）、上記の酵素処理によるフコシル化二分枝型構造からのガラクトース及びＮ−アセチルガラクトサミンの除去から生じたフコシル化マンノース−３構造の予想質量と一致した。
【０１６３】
先に記載したα−シアリダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びβ−グルコサミニダーゼの混合物に加えて、トリマンノシルコアに結合したフコース残基の切断に特異的な酵素であるα−（１−２，３，４，６）フコシダーゼによる消化からのプロファイルも分析した。α−（１−２，３，４，６）フコシダーゼによる消化後、１０分で溶出するピークはもはやプロファイル中に存在せず、１６分で溶出するピークの強度が有意な増加があった。この結果により、１０分で溶出するピークがフコシル化マンノース３であり、１６分で溶出するピークが非フコシル化マンノース３であることが確認された。
【０１６４】
上記のエキソグリコシダーゼ処理に加えて、グリカンプールをα−（１−３，４，６）ガラクトシダーゼで消化して、デノスマブグリカン部分中の任意の潜在的に免疫原性の末端α−（１−３）ガラクトース残基を同定した。α−ガラクトシダーゼによる消化後、デノスマブのＨＰＡＥＣグリカンプロファイルを対照試料と比較した。プロファイルにおける微妙な変動を説明するために、対照及び消化試料の注入を３回行った。３回の注入からのクロマトグラムのオーバーレイは、グリカンプロファイルの変化を示さず、検出可能な量の末端α−（１〜３）ガラクトース残基がないことを示した。
【０１６５】
上記のエキソグリコシダーゼによる処理の研究に基づいて、ＨＰＡＥＣ／ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（表５）による８つの優勢なＮ結合オリゴ糖（表５）の同定が確認された。
【０１６６】
デノスマブの一次構造を特徴付けるために、包括的な質量分析に基づき配列を調べた。その結果、デノスマブにＯ−結合型グリコシル化のエビデンスがないことが確認された。
【０１６７】
３．３  糖化
可変領域に隣接する重鎖のＬｙｓ−９８に、非酵素的糖化が観察された。修飾は重鎖に特異的であった。糖化は正電荷（Ｌｙｓ）の損失を引き起こすので、電荷不均一性に寄与し、酸性変異体及び１６２Ｄａの質量増加をもたらす。
【０１６８】
デノスマブの電荷不均一性をＣＥ−ＨＰＬＣによって評価した。デノスマブのＣＥ−ＨＰＬＣプロファイルは、４つの明確なピーク：プレピーク１（ＰＰ−１）、主ピーク（ＭＰ）、塩基性ピーク１（Ｂ−１）及び塩基性ピーク２（Ｂ−２）を含んだ（図２Ａ）。精製されたピークは、電荷修飾の性質及び位置を解明するために、直交電荷に基づく技術及び一次構造技術を含む種々の分析技術によって特徴付けられた。ＰＰ−１はＬｙｓ−９８に糖化重鎖を含んだ。精製したＰＰ−１をＬｙｓ−Ｃペプチドマッピングで分析した。Ｌｙｓ−９８での糖化修飾と一致するペプチド質量は、８７分の保持時間で溶出するピークで観察された。
【０１６９】
糖化修飾としてのピーク同一性をさらに確認するために、強制糖化試料を調製し、Ｌｙｓ−Ｃペプチドマッピングにより実行した。強制糖化はデノスマブを緩衝グルコース溶液と混合し、３７℃で一晩インキュベートすることによって達成した。グルコースは調製物から省いた対照試料も並行して調製した。８７分で溶出するペプチドのレベルの上昇が、精製ＰＰ−１試料及び強制糖化試料で見出された。これは精製ＰＰ−１試料における糖化変異体の存在をさらに確認するものである。
【０１７０】
推定糖化ペプチドピーク及び天然ペプチドピークを、ペプチドマップの溶出の間のインサイチューでのエレクトロスプレーＭＳ分析によって特徴付けた。８８分で溶出するペプチドの測定されたモノアイソトピック質量は、３＋イオンのズームスキャンから５，５７２．４８Ｄａであった。８７．０２分で溶出する糖化ペプチドの３＋イオンから測定されたモノアイソトピック質量は５，７３４．５４Ｄａ（５，５７２．４８＋１６２．０６Ｄａ）であり、糖化のための＋１６２質量の予想される増加と一致した。ＰＰ−１のサイズプロファイルを、ＳＥ−ＨＰＬＣ及びｒＣＥ−ＳＤＳによって調べた。ＰＰ−１は、ＳＥ−ＨＰＬＣによって天然モノマーを含むと決定された。ＣＥ−ＳＤＳの減少により、ポスト−重鎖領域における重鎖よりわずかに大きい分子量種の存在が明らかになった。
【０１７１】
ＣＰ２プロセスによって産生されるデノスマブは、おそらく産生細胞培養液中に存在するグルコースによる修飾で、約１０％の糖化（脱グリコシル化された無傷の集団による分析）を有する。
【０１７２】
ＰＰ−１における電荷変異体の生物学的影響を調べるために、この画分を、ＨＴＲＦ受容体−リガンド結合、レポーター遺伝子、及びＴＲＡＰ活性アッセイを用いて、効力について分析した（表６）。分析に強制糖化試料を含めた。ＰＰ−１及び強制糖化原薬はともに十分な効力を示した。
【０１７３】
【表７】
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【０１７４】
実施例３：ＣＰ２及びＣＰ３プロセスにより産生されるデノスマブのＮ−グリカンプロファイルの比較
グリカンをＮ−グリカナーゼで処理して除去し、続いて蛍光化合物の２−アミノベンズアミドで標識した。高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてグリカン種を分離し、蛍光検出（励起λ＝３３０ｎｍ及び発光λ＝４２０ｎｍ）を用いて定量した。次いで、グリカンピークを定量した。全ての試験試料及び参照標準のＮ−グリカンプロファイルのオーバーレイを図３Ａに示す。ＣＰ３ロット及びＣＰ２ロットからのデノスマブ中のＮ−グリカンの相対分布を図３Ｂに示す。
【０１７５】
図３Ａのグリカンマッププロファイルに示すように、ＣＰ３ロット及びＣＰ２ロットはいずれも８つの名前が付されたグリカン種及び２つの名前が付されたグループを含有した。したがって、全てのグリカンマッププロファイルは、ＣＰ３ロット及びＣＰ２ロットの両方が同様のグリカンパターンを含むことを示している。ＣＰ３ロットのプロファイルに、新たなグリコフォームは観察されなかった。しかし、ＣＰ３ロットとＣＰ２ロットの間でグリカンの分布に違いがあった。具体的には、ＣＰ３ロットはよりガラクトシル化され、それに対応してシアリル化の程度が増加した。さらに、ＣＰ３ロットは、Ｍａｎ−５及び一分枝型構造の含量が少なかった（図３Ｂ）。表７にグリカンマップ履歴データを要約する。
【０１７６】
ＣＰ２及びＣＰ３について表７（最後の列）に示す「好ましい」範囲は、臨床範囲（一般的には、臨床試験中の患者曝露に基づく）と考えられることに留意されたい。臨床的範囲は、一般に、商業的範囲（商業的ロットから得られる）よりも広く、且つ厳しくない。また、これらの好ましい範囲は生物学的類似性評価の決定基準であると単に解釈されるべきではない。生物学的類似性の目的のために、異なる又はより狭い範囲の様々なグリカン含量が必要とされ得る。
【０１７７】
【表８】
2021521854.tif 000011
【０１７８】
ＣＰ３プロセスを用いて製造されたデノスマブには、ＣＰ２プロセスと比較して新しい炭水化物種は存在しなかったが、種の分布はわずかに異なっていた。デノスマブを用いて実施された研究により、グリコシル化の差がＲＡＮＫリガンドへのデノスマブの結合に影響しないことが示された。脱グリコシル化デノスマブはまた、３つのバイオアッセイの全てで十分な効力を有している。
【０１７９】
実施例４：ＣＰ３工程で製造されたデノスマブのＰＫ／ＰＤ試験
４．１  試験計画
健常志願者を対象とした非盲検、無作為化、単回投与、並行群間比較試験を実施した。対象者を、ＣＰ３プロセスを利用して製造されたデノスマブ６０ｍｇを単回ＳＣ投与（治療Ａ）又はＣＰ２プロセスを利用して製造されたデノスマブ６０ｍｇを単回ＳＣ投与（治療Ｂ）のいずれかに無作為に割り付けた（割付け比１：１）。デノスマブ投与前から試験終了までの特定の時点で、ＰＫ及びＰＤ分析のために血液試料を採取した。全ての試験手順を実施した後、１１３日目に、対象者は試験を完了した
【０１８０】
合計１１５人の対象者が本試験に登録された。合計１１２人の対象者（９７％）が本試験を完了した。３人の対象者（３％）が本試験を完了しなかった。５７人の対象者にＣＰ３−デノスマブが投与され（５５人が試験を完了）、５８人の対象者にＣＰ２−デノスマブが投与された（５７人が試験を完了）。
【０１８１】
デノスマブの血清中濃度を、検証済みの酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。アッセイの定量下限（ＬＬＯＱ）は２０ｎｇ／ｍＬであった。簡潔に記載すると、ＮＦ−κＢリガンドの組換えヒト受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）をポリスチレン９６ウェルプレート上にコーティングし、キャプチャー試薬として使用した。デノスマブを１００％ヒト血清にスパイクすることによって、標準（ＳＴＤ）及び品質管理（ＱＣ）を調製した。アッセイ希釈剤（１％ＢＳＡ、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む１×ＰＢＳ）で１：１０前処理した後、標準、品質管理、試験試料、及びブランクをウェルにロードした。ＳＴＤ、ＱＣ、及び試験試料中のデノスマブを、固定化組換えヒトＲＡＮＫＬによって捕捉した。洗浄工程の後、ビオチン化ウサギ抗デノスマブ検出抗体を添加した。新たな洗浄工程の後、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンを加えて複合体に結合させた。最終洗浄工程の後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）−ペルオキシダーゼ基質をプレートに添加した。発色を停止し、６５０ｎｍを基準として４５０ｎｍで色の強度（光学濃度、ＯＤ）を測定した。品質管理及び試験試料のＯＤ単位の濃度への変換は、同じランにおける標準曲線とのコンピューターソフトウェア媒介比較によって達成され、これをＷａｔｓｏｎ  ＬＩＭＳ  バージョン７．０．０．０１データ削減パッケージを使用して、１／Ｙの重み係数を有するロジスティック自己推定回帰モデルに従って回帰した。
【０１８２】
血清Ｃ−テロペプチド（ＣＴＸ１）の濃度を、検証済みＳｅｒｕｍ  ＣｒｏｓｓＬａｐｓ（登録商標）ＥＬＩＳＡにより測定した。ＬＬＯＱは０．０４９ｎｇ／ｍＬであった。簡潔に記載すると、Ｓｅｒｕｍ  ＣｒｏｓｓＬａｐ（登録商標）ＥＬＩＳＡは、アスパラギン酸残基（Ｄ）がβ−異性化されているＥＫＡＨＤ−β−ＧＧＲのアミノ酸配列に対する２つの高度に特異的なモノクローナル抗体に基づいている。Ｓｅｒｕｍ  ＣｒｏｓｓＬａｐｓ（登録商標）ＥＬＩＳＡで特異的なシグナルを得るために、ＥＫＡＨＤ−β−ＧＧＲの２本の鎖は架橋されていなければならない。標準（ＳＴＤ）、品質管理（ＱＣ）、試料対照（ＳＣ）、ブランク、及び試験試料を、ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタープレートに加え、続いて、ビオチン化抗体とホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体の混合物を添加した。ＳＴＤ、ＱＣ、ＳＣ、又は試料中に存在するＣＴＸ１は、ビオチン化抗体及びＨＲＰ結合抗体と複合体を形成する。この複合体は、ビオチン化抗体を介してストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートに結合した。周囲室温でインキュベートした後、プレートを洗浄した。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液をプレートに添加した。発色を停止し、６５０ｎｍを基準として４５０ｎｍで色の強度（光学濃度、ＯＤ）を測定した。ＯＤ単位の濃度への変換は、同じプレート上でアッセイした標準曲線とのコンピューターソフトウェア媒介比較によって達成され、Ｗａｔｓｏｎ  バージョン７．０．０．０１データ削減パッケージを使用して、１／Ｙ２の重み係数を有する４−パラメーターロジスティック（自己推定）回帰モデルに従って回帰した
【０１８３】
４．２  薬物動態分析
血清デノスマブ濃度−時間データを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  ｖ  ５．１．１（ＰＫＳ  ｖ３．１ａ，ｂｕｉｌｄ２００６１０２４０９１２）（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて、ノンコンパートメント法により分析した。図は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ  ｖ  １０  ｂｕｉｌｄ１０．０．１．２（ＳＰＳＳ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を用いて作成した。実際の時間のずれが１０％以上でない限り、公称サンプリング時間を分析に使用し、この場合、実際の時間を使用した。定量下限（ＬＬＯＱ）２０ｎｇ／ｍＬ未満のデノスマブ血清中濃度を、ノンコンパートメント解析及び要約統計量の算出のためにゼロに設定した。要約統計量は、四捨五入をしていない値を用いて計算した。
【０１８４】
投与後の観測最高血清中デノスマブ濃度（Ｃｍａｘ）を、データを調べて確認した。対応するＣｍａｘの時間（ｔｍａｘ）も記録した。時間０〜１６週の濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ０−１６週）を、Ｃｍａｘまでの線形台形則を適用し、次いで曲線の残りについて対数台形則を適用する線形対数台形法によって計算した。
【０１８５】
デノスマブＣＰ３及びＣＰ２の平均血清中デノスマブ濃度−時間プロファイルを、線形スケール及び片対数スケールで、それぞれ図４Ａ〜４Ｂに示す。線形スケールでのプロファイルの評価（図４Ａ）は、１６週（１１２日）までのサンプリングが両方の処置で曝露の大部分を捕捉したことを示している。ＣＰ３プロセスにより産生されたデノスマブは示した。ＣＰ２プロセスで産生されたデノスマブと比較して、ＣＰ３−デノスマブは、ｇａｌ種をより多く有し、高マンノース種はより少なかった。
【０１８６】
図４Ａ及び４Ｂに示すように、ＣＰ３プロセスにより産生されたデノスマブは患者でより高い血清半減期（平均で１０％長い半減期）を示し、クリアランス速度がより遅いことを示唆した。ＣＰ２産生デノスマブの平均半減期は、約２５．８（６．５）日（中央値＝２５．０）、ＣＰ２産生デノスマブの平均半減期は約２８．３（６．５）日（中央値＝２７．４）である。ＣＰ３のＡＵＣ０〜１６週及びＣｍａｘの幾何平均値は、ＣＰ２の値よりもそれぞれ約１６％及び１４％大きかった（表８．１及び８．２）。
【０１８７】
図４Ｄ及び４Ｅに示すように、ＣＰ３−デノスマブの半減期の増加は、Ｍａｎ−５種のクリアランスが速いためであった。Ｍａｎ−５を含むデノスマブ分子は、優先的に除去され、経時的にＭａｎ−５レベル全般が減少した。対照的に、ｇａｌ種のレベルは、同じ期間中、ほぼ一定であった。これは、Ｍａｎ−５を有するデノスマブ分子が、Ｍａｎ−５を有さないデノスマブと比較して、血清中で優先的に除去され、その結果、Ｍａｎ−５レベルが全体的に減少したことを示している。試験の開始時には、デノスマブ分子の約８％がＭａｎ−５を含み、約６０日目には、Ｍａｎ−５を含んだデノスマブ分子は４％未満となった。
【０１８８】
【表９】
2021521854.tif 000012
【０１８９】
【表１０】
2021521854.tif 000013
【０１９０】
４．３  薬力学分析
ベースライン血清ＣＴＸ１濃度を、デノスマブの投与前に得られた３試料において決定された濃度の中央値として計算した。ベースラインからの変化率は、投与後の測定値からベースラインの測定値を差し引いた値をベースラインの測定値で除し、その値に１００％を乗じて算出した。分析方法のＬＬＯＱ未満のベースライン後のＣＴＸ１濃度に、ベースラインからの変化率の計算のために、ＬＬＯＱの値（０．０４９ｎｇ／ｍＬ）を割り当てた。全ての計算は、四捨五入をしていない値を用いて行った。実際の時間のずれが１０％以上でない限り、公称サンプリング時間を分析に使用し、この場合、実際の時間を使用した。図は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ  ｖ  １０  ｂｕｉｌｄ  １０．０．１．２（ＳＰＳＳ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を用いて作成した。
【０１９１】
投与後のＣＴＸ１の阻害％は、ベースラインからの変化％に−１を乗じて算出した。ＣＴＸ１の個々の阻害％対時間データを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  ｖ  ５．１．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて、ノンコンパートメント法により分析した。ＣＴＸ１の最大観測阻害％（Ｉｍａｘ）とそれが起こった時間（ｔｍａｘ、ＣＴＸ１）を記録した。時間ゼロ〜１６週の効果（ＣＴＸ１の阻害％対時間）曲線下面積（ＡＵＥＣ０−１６週）を、Ｉｍａｘまで線形台形則を適用し、次いで曲線の残りについて対数台形則を適用する線形対数台形法によって計算した。
【０１９２】
ベースラインでは、ＣＴＸ１の平均（±ＳＤ）血清中濃度は、ＣＰ３群で０．５５５（±０．２８８）ｎｇ／ｍＬ、ＣＰ２群で０．４８８（±０．２５１）ｎｇ／ｍＬであった。２つの処置についてのＣＴＸ１のベースラインからの平均（±ＳＤ）変化％対時間プロファイルを図４Ｃに示す。２つの処置についてのＣＴＸ１のベースラインからの平均変化率のプロファイルは、実質的に重ね合わせ可能であった。ＡＵＥＣ０−１６週及びＩｍａｘの幾何平均値は、処置間で≦３％異なった（表８．１及び８．３）。ＡＵＥＣ０−１６週の幾何平均値とＩｍａｘの比の９０％ＣＩは、０．８０〜１．２５の範囲内であった。ｔｍａｘ、ＣＴＸ１平均値はＣＰ３とＣＰ２の間で異なっていたが（２５日対１２日）、ベースラインプロファイルからの平均ＣＴＸ１変化率プロファイル（図１０−３）から、阻害の全体的な程度は両処置とも７日目から１１２日目まで比較的一定であったことは明らかである。
【０１９３】
【表１１】
2021521854.tif 000014
【０１９４】
実施例５：ＣＰ２及びＣＰ４培養プロセスの比較
ＣＰ２プロセス対ＣＰ４プロセスの細胞培養及び回収操作を比較するプロセスフロー図を表９に示す。ＣＰ４細胞培養増殖及び産生プロセスは、ＣＳ−９  ＣＨＯ（２５Ｂ１２）親細胞株に基づいた。ＣＰ４プロセスは、灌流モードで操作される、より小型の産生バイオリアクターを利用し、シングルユース（使い捨て）細胞培養増殖及び産生容器のみを利用する。ＣＰ２及びＣＰ４産生培養プロセスを、各細胞株について最適化されたプロセス特異的設定値で制御した。栄養供給のための培地処方及び時機選択は、最適な細胞の健康及び産生のために設計された。ＣＰ４産生バイオリアクターは合成培地処方を使用し、メトトレキサート（ＭＴＸ）で増幅した。両方のプロセスで、細胞集団の解凍及び最初の増殖は、振盪フラスコで行った。いずれのプロセスもダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２ベースの培地を使用したが、処方は異なり、異なる細胞株用に最適化された。
【０１９５】
【表１２】
2021521854.tif 000015
【０１９６】
両方のプロセスで、増殖バイオリアクター段階は、流加モードで操作したＣＰ４  Ｎ−１を除いて、バッチモードで操作した。増殖バイオリアクター期の間、ＣＰ２プロセスは４つのステンレス鋼バイオリアクターを使用し、ＣＰ４プロセスは２つの段階でそれぞれ２つのシングルユースバッグ（ＳＵＢ）システムを使用した。ＣＰ４増殖プロセスにおける第１のシングルユースシステムは、プロセス固有の設定値に制御された温度、ｐＣＯ２、及びオーバーレイガス流量を有する２段階５０Ｌ培養バッグであった。ＣＰ４増殖プロセスにおける第２のシングルユースシステムは、第２段階（Ｎ−１）の２日目に栄養供給物を有する２段階５００ＬのＳＵＢであった。全ての増殖バイオリアクターの操作の間（ＣＰ２及びＣＰ４  ＳＵＢ段階）、ｐＨ、温度、圧力、撹拌及び溶存酸素をプロセスに特異的な設定値に制御した。
【０１９７】
産生バイオリアクターは、異なるモードで操作した。ＣＰ２プロセスは、１６ｋＬステンレス鋼の流加バイオリアクターを使用し、３日目及び９日目に供給を行い、培養物を１４日目に回収した。ＣＰ４プロセスは２ｋＬのＳＵＢを使用し、３日目及び６日目に２回のボーラス供給を行い、灌流を７日目に開始し、１１日目に培地を交換し、培養物を１８日目に回収した。１１日目の培地交換は、グルコース濃度を低下させ、代替炭水化物源としてガラクトースを添加した。モノクローナル抗体の高マンノースグリカンプロファイルはインビボでのクリアランスに影響を及ぼす可能性があるので、この変更は、ＣＰ４プロセスからの高マンノースグリカンプロファイルがＣＰ２プロセスのものに匹敵するように行われた。灌流分離技術は３０ｋＤａの公称細孔サイズを有する膜を使用し、そのサイズよりもほぼ大きい、細胞及び産物を含む全ての成分が、バイオリアクター中に保持された。全ての設定値を細胞株及び産生モードごとに最適化した。
【０１９８】
ＣＰ２産生及び供給培地は改変ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に基づいており、大豆加水分解物を含有した。ＣＰ４産生、供給、及び灌流培地は合成処方であり、加水分解物を含有しなかった。
【０１９９】
実施例６：ＣＰ２及びＣＰ４の回収及び精製プロセスの比較
両方のプロセスで、産生期の完了後、バイオリアクター内容物を、ＣＰ２は１０±３℃の目標温度に、ＣＰ４は≦１２℃の目標温度に冷却した。ＣＰ２プロセスでは、ディスクスタック遠心分離により、産生細胞及び細胞破片の培養培地からの一次分離を達成した。ＣＰ４プロセスでは、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド（ＰＤＡＤＭＡＣ）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でのフロキュレーション、続く沈降により、一次分離を達成した。両プロセスは、深層濾過及び膜濾過による一次分離後に、深層濾過及び膜濾過を続けた。さらに、ＣＰ４プロセスは、回収処理中に空気又は酸素スパージを利用した。
【０２００】
ＣＰ２プロセス及びＣＰ４プロセスの精製操作を比較したプロセスフロー図を表１０に示す。
【０２０１】
【表１３】
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【０２０２】
両精製プロセスは、次の同じ基本単位操作を使用した：２回の専用ウイルス除去／不活化操作（低ｐＨウイルス不活化及び２００ｎｍウイルス濾過）、３回のクロマトグラフィー操作（プロテインＡアフィニティー、陽イオン交換、及び疎水性相互作用）、及び限外濾過（ＵＦ）／透析濾過（ＤＦ）操作により、デノスマブを濃縮し、緩衝液交換して最終ＤＳ製剤にする。各単位操作のための操作パラメーター及びこれらの単位操作の順序は、各プロセスで最適化した。さらなる違いには、クロマトグラフィー樹脂、緩衝液、フィルターの種類、並びに操作の面積及び順序の変化が含まれた。これらの差異は、細胞株の変化、及びＣＰ４プロセス産生バイオリアクターにおいて灌流モードを使用することから生じるより高い細胞濃度によるものであった。
【０２０３】
最初の単位操作はカラム１のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程であり、回収濾液に対して行われた。カラム１はデノスマブを捕捉するために、固定化プロテインＡとＩｇＧ型抗体のＦｃ領域との間の特異的な高親和性相互作用を利用する、一次精製段階であった。ＣＰ４プロセスはＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ樹脂を利用し、ＣＰ２プロセスはＭａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂を利用した。両プロセスにおける第２の単位操作は、低ｐＨウイルス不活化工程であり、この工程は、ウイルスを不活化及び除去するための２つの専用操作のうちの最初のものであった。ウイルス不活化は、ＣＰ４プロセスでは、６０〜９０分間、ｐＨ３．５±０．１で達成され、ＣＰ２プロセスでは、６０〜１２０分間、ｐＨ３．３１〜３．６０で達成され、宿主細胞株及びプロセスの変化による差異があった。
【０２０４】
ＣＰ４プロセスにおける低ｐＨインキュベーション期間の終わりに、ウイルス不活化プールのｐＨを、トリス塩基で５．０に調整し、次いで、プールを、０．２μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルターにより濾過した。ＣＰ２プロセスでは、プールのｐＨを、１−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸ナトリウム（ＭＥＳ）及びトリス塩基で３．３１〜３．６０に調整し、次いで、プールを２段階濾過トレインによって清澄化した。ｐＨの差異は、カラム２の操作の差異によるものであった。
【０２０５】
両方のプロセスにおいて、第３の単位操作は、カラム２、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）工程であった。この工程は、ＣＥＸ樹脂を用いて、生成物流から、濾過したウイルス不活化プール中に存在する不純物を除去した。ＣＰ４プロセスはＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＣＯＯ−（Ｍ）樹脂を使用し、ＣＰ２プロセスはＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＯ３−（Ｍ）樹脂を使用した。
【０２０６】
両方のプロセスで、次の２単位操作は、ウイルス濾過及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）段階であったが、この順序は逆であった。
【０２０７】
両方のプロセスの次の単位操作は、精製デノスマブを製剤緩衝液に交換するためのＵＦ／ＤＦであった。ＣＰ４及びＣＰ２生成物流の両方を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、５％ソルビトール（ｐＨ  ４．８０）で透析濾過し、７０ｍｇ／ｍＬの最終デノスマブ濃度とした。ＤＳの貯蔵容器も貯蔵条件も変わらなかった。
【０２０８】
実施例７：ＣＰ４プロセスによって産生されたデノスマブのグリカンマッピング
７．１  ＣＰ４プロセスによって産生されたデノスマブのＮ−グリカンマッピング
グリコシル化を、Ｎ結合オリゴ糖構造のマッピングによって評価した。この手順には、ＰＮＧアーゼＦ処理によりデノスマブからＮ−結合型グリカンを遊離させることが含まれた。遊離したグリカンを２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）で標識し、続いて、蛍光検出を伴う親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を行った。溶出したピークを蛍光検出器でモニターした。デノスマブＮグリカンマップピークの特徴付けは、質量分析によるオリゴ糖マッピングによって行った。各グリカンに割り当てられたグリカン構造、及び実験式に基づく理論質量対観測質量を表２及び５に示す。観測質量は全て予想された実験精度の範囲内であった。
【０２０９】
【表１４】
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【０２１０】
大部分の種は、０又は１個の末端ガラクトースを有するコアフコシル化複合二分枝型構造であり、非フコシル化二分枝型構造は比較的低いレベルであった。グリカン集団は、非常に低レベルのシアル化種及びハイブリッド型グリカン、並びに約８％の高マンノースグリカン（主に、マンノース５構造として）を含有した。デノスマブＮ−結合型グリカンの割合は、全てのグリカンピークの積分によって決定した。
このようなピークの例を図５に示す。
【０２１１】
コンセンサス部位モチーフ（Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）内に存在しないＡｓｎ上のＮ−グリコシル化は、ヒト抗体上で低レベルで生じることが知られている。この種は、一般的にはｒＣＥ  ＳＤＳによってポスト重鎖ピークとして分離される。総重鎖ピーク面積に対するこのポスト重鎖ピーク面積の相対比率の決定により、約１．５％のデノスマブにおける非コンセンサスグリコシル化のレベルを得た。
【０２１２】
デノスマブの一次構造を特徴付けるために、質量分析に基づき配列を調べた。その結果、デノスマブにＯ−結合型グリコシル化のエビデンスがないことが確認された。
【０２１３】
７．２  非酵素的糖化特性
７．２．１  糖化特性
非酵素的糖化は、還元糖（グルコース又はガラクトース）が糖のアルデヒド基とタンパク質の第一級アミンとの間でシッフ塩基を形成することによってタンパク質と反応するプロセスである。ＣＰ２産生デノスマブでは、ＣＥ−ＨＰＬＣプレピークに富む種である非酵素的糖化がデノスマブの１つのリジン残基（Ｌｙｓ−９８）上に位置する。
【０２１４】
特性化技術及び高分解能質量分析器の進歩により、デノスマブの非酵素的糖化のさらなる特性化が可能になった。デノスマブを水素化ホウ素ナトリウムで処理し、続いて還元し、アルキル化し、トリプシンで消化して、質量分析検出によるペプチドマップ分析を行った。水素化ホウ素ナトリウムによる処理は、Ｂｒａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．  （Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，２００７，７９（２４），ｐｐ９４０３−９４１３）に記載されているように、糖とタンパク質との間の結合を安定化し、ＭＳ／ＭＳによる部位の特定を可能にする。この技術を用いて、ＣＰ４産生デノスマブにおける複数の糖化部位を特定した。２つのプロセスからのデノスマブの非酵素的糖化が確認された部位を表１２に示すが、糖化の同じ部位が存在することを示している。この予想された結果は、糖化がランダムな事象ではなく、溶媒露出度及びタンパク質の局在化した化学的環境に大きく依存するという事実による（Ｇａｄｇｉｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．  ２００７  Ｏｃｔ；９６（１０）：２６０７−２１．）。
【０２１５】
【表１５】
2021521854.tif 000018
【０２１６】
ＣＰ４プロセスは、細胞培養中にグルコース及びガラクトースの両方を利用し、グルコース及びガラクトースの両糖で糖化された抗体を生じる。ＣＰ４に存在する糖化は約２４％であり、ガラクトース糖化により１２％が推定された。
【０２１７】
グルコースはヒト血清中に約７０〜１００ｍｇ／ｄＬ（Ｐｅｓｃｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｏｕｒｉａｎ  １９８２）存在し、血中蛋白質の非酵素的糖化をもたらす。ガラクトースは、天然には、ヒト血清中に約０．３ｍｇ／ｄＬ存在する。このような低い血清ガラクトースレベルでは、ガラクトース血症患者を除いて、健常な人が測定可能なレベルのガラクトース糖化を含む血中蛋白質を有する可能性は低い。ガラクトース糖化の臨床的安全性は不明であったため、新しい分子種と考えられ、安全性の懸念の可能性がある。この潜在的な安全性の懸念に対処するため、この翻訳後修飾の糖化レベル、臨床的安全性及び有効性への影響を評価する試験を実施した。
【０２１８】
ＣＰ４−デノスマブは約２４％の糖化を有するが、ＣＰ２は約１０％の糖化を有する。１２の糖化部位をＣＰ２上に確認した。同じ１２の部位がＣＰ４上に検出され、新たな糖化部位は確認されなかった。ＣＰ４、ＣＰ２及び糖化に富むＣＰ４試料（７０％）は、２つの機能的バイオアッセイにおいて同等の効力を有し、糖化レベル及びガラクトース糖化が産生機能に影響を与えないことを示した。さらに、トリプシン分解ペプチドマッピング実験は、糖化の原薬部位がＣＰ２プロセスとＣＰ４プロセスとの間で同一であり、合計１２個の糖化部位が特定され、そのいずれもがデノスマブのＣＤＲ領域には存在しないことを確認した。
【０２１９】
ＣＰ４プロセスは、細胞培養の１〜１０日目の間、グルコース含有培地を利用し、続く１１〜１８日目に低グルコース及び高ガラクトース含有灌流培地を利用した。培地の単糖分析は、細胞培養の１２日目のグルコースレベルが検出可能なレベル未満であることを決定した。したがって、培地交換後の糖化の大部分がガラクトースによるようであった。このデータに基づいて、理論的計算を行って、ＣＰ４−デノスマブ上に存在するグルコース対ガラクトース糖化のレベルを推定した。この計算により、ＣＰ４糖化（２４％）の約５０％がガラクトースによるものであることがわかった。これは、８抗体中の１つがガラクトースで糖化され、８抗体中の１つがグルコースで糖化されていることに相当する。
【０２２０】
７．２．２  糖化の生物学的特性
治療用抗体の修飾は、臨床効力の減少をもたらす、又は患者の安全性に影響する可能性がある。したがって、糖化に特に重点を置いたＣＰ４−デノスマブの徹底的な特徴付けを行った。ＨＴＲＦによる効力分析及びレポーター遺伝子結合アッセイを用いて、ＣＰ４−デノスマブの生物学的機能をＣＰ−デノスマブと比較して評価した。
【０２２１】
ＣＰ２−デノスマブの開発中、強制糖化試験を実施し、糖化及び効力への影響を評価した。デノスマブＣＰ２は、出発物質の約６８倍のレベルまで強制的に糖化された。この試料をＨＴＲＦ及びレポーター遺伝子アッセイによって分析したところ、全ての効力を保持していた。
【０２２２】
１つのアッセイにおいて、精製されたＣＰ４  ＣＥＸプレピーク種は、主ピーク及び塩基性画分における２４％と比較して、約７０％の糖化を有した。３つの精製画分の全てがＨＴＲＦ及びレポーター遺伝子アッセイによってそれらの効力を保持しており、糖化のレベルの上昇が産物の機能に影響を与えないことを示した。さらに、ＣＰ２とＣＰ４の相対的な効力は、ＨＴＲＦ及びレポーター遺伝子アッセイで同等であり、ＣＰ４の糖化が産物の効力に影響しないことをさらに実証した。
【０２２３】
７．２．３  糖化及びＦｃ機能への潜在的影響
ＩｇＧ抗体のクリアランス又は血清中半減期は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）によって調節される。ＩｇＧ１及びＩｇＧ２抗体について行われた以前の強制糖化研究（Ｇｏｅｔｚｅら、２０１２）は、ＦｃＲｎ結合に対する影響がないことを決定し、糖化修飾がタンパク質機能にほとんど影響を及ぼさないことを示唆した。しかし、ＦｃＲｎをＣＰ２及びＣＰ４試料で実施し、これらのデータは同様のＦｃＲｎを示す。強制糖化研究結果に基づき、ＣＰ２とＣＰ４が同じ糖化部位を有することを考慮すると、ＣＰ４糖化のレベルの上昇はＦｃＲｎ結合に影響しなかった。
【０２２４】
７．２．４  ガラクトース糖化の免疫原性評価
ガラクトース糖化を有するデノスマブは、これまでの製剤提示では存在しなかった新しい種であり、したがって、免疫原性のリスク評価を実施した。成熟体液性免疫応答には、Ｂ細胞エピトープとＴ細胞エピトープの両方が必要である。Ｂ細胞エピトープは抗体結合部位であり、通常、タンパク質の構造に依存する。Ｔ細胞エピトープは抗原提示細胞表面の主要組織適合クラスＩＩ蛋白質に結合し、抗体成熟を誘発するＴ細胞からのサイトカイン分泌を誘発する直鎖アミノ酸配列である。免疫原性リスク評価では、以下の事項を考慮した：
【０２２５】
Ｂ細胞エピトープのリスク。ＣＰ４は、グルコース糖化のみを有するＣＰ２と比較して、ガラクトースで糖化された新しい種を含む。これらの新しい種に曝露された患者はおらず、免疫応答に関しては若干の不確実性があった。糖化は最大１１個の異なるリジンにわたって分布し、デノスマブ分子の約１２％は１個のガラクトースを有した。したがって、ガラクトースで修飾された特定のアミノ酸を有する任意の１つの分子の濃度は低かった。
【０２２６】
完全ヒト型モノクローナルに対する抗体は、通常、非寛容配列のためにＣＤＲ領域に結合する。デノスマブ中のＣＤＲは、ガラクトースで糖化される可能性を有する１つのリジンを含み、６個を隣接フレームワーク中に含有する。しかしながら、ＣＤＲにおける糖化は検出されなかった。
【０２２７】
Ｔ細胞エピトープのリスク。イン・シリコ解析では、わずか１個のマイナーＴ細胞「アグレトープ」のみが予測された。糖化はＴ細胞の助けを誘発するような配列変異を引き起こさない。ガラクトースは抗原プロセシングを増強し得るが、ガラクトース濃縮分子による増加した取り込みはより高次のオリゴ糖によるものであり得る。
【０２２８】
全体として、デノスマブの免疫原性を変化させるガラクトースによる糖化のリスクは最小限である。
【０２２９】
７．３  非コンセンサスＮ−グリカン（ＮＣＧ）
非コンセンサスＮ−グリカン（ＮＣＧ）は、Ｖａｌｌｉｅｒｅ−Ｄｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００９  Ｎｏｖ  ２０；２８４（４７）：３２４９３−３２５０６）に記載されているように、一般的には抗体ＣＨ２ドメインにおける、コンセンサスモチーフの一部ではないＡｓｎ残基へのオリゴ糖の結合を表す。この種は、一般的にはＣＥ−ＨＰＬＣプレピークに富み、ｒＣＥ−ＳＤＳによってポスト重鎖ピークとして分離される。
【０２３０】
ｒＣＥ−ＳＤＳによるＣＥ−ＨＰＬＣ画分の分析は、ＣＥ−ＨＰＬＣプレピークが非グリコシル化重鎖（ＮＧＨＣ）ピークでわずかに富んでいることを示した。さらに、ｒＣＥ−ＳＤＳデータにより、ＣＥ−ＨＰＬＣプレピーク画分がポスト重鎖ピークでわずかに富んでいることが示され（表１３）、Ｖａｌｌｉｅｒｅ−Ｄｏｕｇｌａｓら（２００９）の所見と一致する結果が得られた。
【０２３１】
【表１６】
2021521854.tif 000019
【０２３２】
実施例８：ＣＰ２及びＣＰ４プロセスにより産生されたデノスマブのグリカンプロファイルの比較
ＣＰ２ロットとＣＰ４ロットからの高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰ−ＡＥＸ）によって作成されたオリゴ糖マップを比較した。ＣＰ４ロット及びＣＰ２ロットの全てが、４％〜１１％のマンノース−５の同等性／同質性判定基準を満たした（表１４）。ＣＰ４原薬ロットはマンノース−５〜ＣＰ２歴史的データに匹敵するレベルを有し、歴史的な最小値及び最大値（５％〜９％のマンノース−５）の範囲内であった。グリカンマップ（ＨＰ−ＡＥＸ）オーバーレイを図５に示す。オーバーレイは、予想されたＣＰ２ロットと比較して、ＣＰ４原薬中のＡ２Ｆ−Ｇ１のレベルが低いことを示している。
【０２３３】
【表１７】
2021521854.tif 000020
【０２３４】
Ｍａｎ−５レベルを制御するためにＣＰ４細胞培養プロセスを改変した結果、ＣＰ４−デノスマブはＣＰ２−デノスマブよりオリゴ糖種Ａ２Ｆ−Ｇ１％が少なく、オリゴ糖種Ａ２Ｆ−Ｇ０％が多いと予想された。これらの種はヒト血清中に天然に存在するグリコフォームであり、したがって、安全性又は有効性の懸念はないと考えられる。
【０２３５】
グリカンプロファイルの潜在的変化を評価するために、グリカンマップ分析を用いて、デノスマブのＮ−結合型グリカンを評価した。図５は、２つのプロセスによって産生されたデノスマブ間の一貫したＮ−グリカンプロファイルを示す。ＣＰ４ロットのプロファイルに、新たなグリコフォームは観察されなかった。オリゴ糖種のＡ２Ｆ−Ｇ０％、Ａ２Ｆ−Ｇ１％、及びＭａｎ５％の要約を表１４に示す。ＣＰ４データは算出許容差（ＴＩ）範囲内であり、Ａ２Ｆ−Ｇ１％結果は、算出ＣＰ２  ＴＩ範囲の下限であった。ＣＰ２ロット対ＣＰ４ロットの末端ガラクトシル化のわずかなシフトは、製品の安全性又は有効性に影響を及ぼさないと予想される。
【０２３６】
これらのデータが示すように、ＣＰ２プロセスと比較して、ＣＰ４プロセスを用いて製造されたデノスマブ中には、新たな炭水化物種は存在しなかった。ＣＰ４及びＣＰ２ロットは、ＨＰ−ＡＥＸの同等性／同質性基準を満たしている。ＨＰ−ＡＥＸ分析中に記録された全てのＮ−グリカン種の要約を表１５．１及び１５．２に要約する。この要約表に示すように、ＣＰ４ロットで得られた値は、ＣＰ２プロセスから得られた値と類似している。シアル化種のレベルは、ＣＰ４ロットとＣＰ２ロットとの間で類似している。ＣＰ４ロットとＣＰ２ロットの間でＡ１Ｆ−Ｇ０％レベルにわずかな差が認められるが、これらの差は本製品の有効性に影響を及ぼすことはないと予想される。
【０２３７】
【表１８】
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【０２３８】
【表１９】
2021521854.tif 000022
【０２３９】
ＣＰ２原薬と比較してデノスマブＣＰ４原薬で観察された糖化レベルの増加は、ＣＰ４プロセスでなされた変化、すなわち、細胞培養プロセス期間の増加と、細胞培養培地におけるグルコース及びガラクトースの両方の使用の組み合わせと一致した。ガラクトースはＣＰ２産生供給物には使用されず、培養培地中のガラクトースはグルコースよりも非酵素的糖化レベルを高めることが示されている（Ｑｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ２００８；３７３（２）：１７９−９１）。ＣＰ４原薬の総糖化率は約２４％であり、これに対し、ＣＰ２原薬の総糖化率は約１０％である。ＣＰ４原薬に存在する糖化レベルの上昇は、グルコースとガラクトースの両方の組み合わせであると予想される。
【０２４０】
以前の研究では、糖化が約６８倍（強制糖化により）増加した場合でも、ＣＰ２原薬はＨＴＲＦ及びレポーター遺伝子アッセイにより十分な効力を保持した。ＣＰ４原薬とＣＰ２原薬の効力は、ＨＴＲＦ及びレポーター遺伝子アッセイにより同等であり、デノスマブＣＰ４原薬の約２倍の高レベルの糖化は効力に影響を及ぼさないことがさらに示された（表１６．１及び表１６．２）。さらに、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２抗体の強制糖化は、ＦｃＲｎ結合に測定可能な影響を及ぼさず、糖化がデノスマブの生物学的機能にほとんど影響しないことをさらに示唆した。総合すると、これらのデータは、ＣＰ４で観察された糖化の増加が製品の安全性や有効性に影響を及ぼさないであろうことを示唆している。
【０２４１】
【表２０】
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【０２４２】
【表２１】
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【０２４３】
実施例９：高マンノース含量に及ぼすグルコース、スクロース、及びガラクトース濃度の効果
この実施例では、種々の濃度のグルコース、スクロース、及びガラクトースを用いて、デノスマブの高マンノース含量に及ぼすそれらの効果を評価した。
【０２４４】
グルコースに代わる２つの炭素源、二糖スクロース及び単糖ガラクトースを選択して、高マンノースを含むデノスマブ分子の割合に対するそれらの効果を評価した。上で詳細に記載したように、培養培地の交換を灌流によって１１〜１７日目に行った。
【０２４５】
１つの試験では、Ｍａｎ−５含量に対するグルコース及びガラクトース濃度の効果を評価した。実験計画を表１７に示す。
【０２４６】
【表２２】
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【０２４７】
図７Ａは、１７日目のＭａｎ−５のフルモデル解析を示し、実験中心点での予測プロファイルを含む。データは、グルコースとガラクトースとの間の相互作用がＭａｎ−５レベルにとって重要である可能性が高いことを示唆している。図７Ｂは、グルコースレベルを２．５ｇ／Ｌに設定したＭａｎ−５の１７日目の予測を示す。Ｍａｎ−５の結果は、ＨＥＬＩＣ分析法によって得た。図７Ｃは、１１日目から１７日目までのＭａｎ−５の経時変化を示す。グラフは、経時的なＭａｎ−５の増加を示す。
【０２４８】
表１８は、この試験のグリカンプロファイルを示す。これらのグリカン種のバリエーションはいずれも統計的に有意ではなかった。
【０２４９】
【表２３】
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【０２５０】
この試験に基き、約１０％のＭａｎ−５では、培養培地は、約２．５ｇ／Ｌのグルコースと約１１．５ｇ／Ｌのガラクトースを含むべきであることがわかった。これらの濃度は、Ｍａｎ−５目標を達成するという主な目標を達成しつつ、増殖、生存率及び力価をバランスさせた。分析はまた、グルコース濃度と増殖及び力価との間の相関を示し、グルコースが高くなるほど、より高い増殖及び力価をもたらす。より高いガラクトースがより高いＭａｎ−５レベルをもたらす場合があるにもかかわらず、２．５ｇ／Ｌガラクトースの濃度を選択したが、より高いガラクトースは培養生存率に対して潜在的な負の効果を有し得た。
【０２５１】
第２の試験では、Ｍａｎ−５含量に対するグルコース及びスクロース濃度の効果を評価した。実験計画を表１９に示す。目標Ｍａｎ−５は少なくとも７％〜９％である。
【０２５２】
【表２４】
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【０２５３】
試験した因子のうち、全てが１７日目に８％を超えるＭａｎ−５レベルを達成し、多くは１５日目までに１０％を超えるレベルを達成した。Ｍａｎ−５の１７日目の値は９％から１６％未満までの範囲であった。ＣＰ２レベルに最も近い２つの条件は、１６又は２４ｇ／Ｌのスクロースと共に２ｇ／Ｌのグルコースを含む条件であった。ＨＩＬＩＣアッセイによるＭａｎ−５のグラフを図８Ｂに示す。図８Ｃは、ＣＰ２参照と比較した、Ｍａｎ−５及び全高マンノース種を示す。
【０２５４】
実施例１０：ＳＲ３  ＧＳ−ＫＯ宿主細胞に対する低グルコース及びガラクトース補充の効果
この実施例では、別のＣＨＯ宿主細胞株を使用して、代替炭素源（ガラクトース）を補充した低グルコース培養培地の効果を評価した。細胞株ＳＲ３  ＧＳ−ＫＯは、ＧＳノックアウトを有するＣＨＯ−Ｋ１細胞株に由来する。
【０２５５】
１０日間の流加培養（ＦＢ）プラットフォームを使用して、以下の工程による生産条件下でのデノスマブ分子の増殖、発現及び製品品質（ＰＱ）プロファイルを評価した（図９Ａ）：
１．Ｎ−１接種。プールを、１０日間のＦＢの前に＞８５％の生存率まで回復させた。デノスマブをトランスフェクトしたＳＲ３−Ｅ１  ＧＳ−ＫＯ細胞の４日間のシードトレイン培養物を、培養培地中に５×１０５細胞／ｍｌで播種した。
２．Ｎ接種。産生培養物をＮ−１シードトレインから準備し、細胞を５０ｍＬスピンチューブに播種した。流加培養物に、０日目に高生存率の細胞（＞９８％）を１×１０６細胞／ｍｌで播種した。産生期の間、培養容器を２２５ｒｐｍで振盪しながら、３６℃＋５％ＣＯ２で維持した。
３．工程内監視。生細胞密度及び生存率を、Ｖｉｃｅｌｌを用いて、３、６、８及び１０日目に測定した。グルコース消費レベルを、Ｎｏｖａｆｌｅｘを用いて同じ日に測定した。
４．供給及び補充。３日目、６日目、及び８日目に産生培養物に、最初の培養開始容量の５％で供給培地を供給し、且つ１×チロシン−システイン補充物を供給用量の０．４％で供給した。１０ｇ／Ｌガラクトースの補充物を、供給日にボーラスとして添加する一方、グルコースレベルを消費によって低下させ、産生の間、１〜５ｇ／Ｌレベルを維持するためにのみ供給した。
５．力価及び製品品質評価。１０日目に回収する前に、生細胞密度、生存率及びグルコースレベルを測定した。馴化培地（ＣＭ）を回収するために、培養物を２００ｇで１５分間遠心分離した。力価測定及びＡＴＯＬＬ  ｃｅｎｔｒｉｃｏｌｕｍｎ精製のためにＣＭを回収した。ＨＩＬＩＣ、ＣＥＸ−ＨＰＬＣ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ｎｒＣＥ−ＳＤＳ及びｒＣＥ−ＳＤＳアッセイを含む製品品質評価に、精製材料を使用した。
【０２５６】
１０．１  １０日間の流加培養中のＤ−ガラクトース添加は培養生存率に影響しなかった。
デノスマブをトランスフェクトしたＳＲ３−Ｅ１  ＧＳＫＯ細胞の３つのプールを、次の３つの培養条件で繰り返し試験した：１）Ｃｔｒｌ又は対照、培養中１０〜１２ｇ／Ｌレベルを維持するように供給日にグルコースを補充、２）Ｇａｌ／Ｇｌｕｃ、１０〜１２ｇ／Ｌレベルを維持するようにグルコースと共にボーラスとして１０ｇ／Ｌのガラクトースを補充、及び３）Ｇａｌのみ、培養中１〜５ｇ／Ｌグルコースレベルを維持するようにグルコース供給なしでボーラスとして１０ｇ／Ｌのガラクトースを補充。１０日間の流加培養中の細胞の生存率を、供給及び回収前の３、６、８及び１０日目にＶｉｃｅｌｌを用いて測定した。培養物は全てのプール及び条件で、１０日間の流加培養を通して高い生存率（＞８０％）を示し（図９Ｂ）、産生培養物中の糖レベル及び供給源の改変が生存率に最小限の影響しか及ぼさないことを示唆した。
【０２５７】
１０．２  細胞増殖及び比生産性に及ぼす低グルコースレベルの影響。
グルコースが各条件で適切なレベルに確実に維持されるように、バイオリアクター中のグルコースレベルの測定を、供給前の３、６、８、及び１０日目にＮｏｖａｆｌｅｘを使用して行った。ｇａｌのみの培養条件では、６日目までにグルコースレベルを消費によって約２ｇ／Ｌまで低下させた。この条件では、グルコースは、１０日間の流加培養の残り期間を通してそのレベルが維持された（図９Ｃ）。この観察は、糖源としてのグルコースの非存在下では、デノスマブ発現ＳＲ３−Ｅ１  ＧＳＫＯ細胞がその増殖及び他の細胞活性を維持するためにガラクトースを使用することに切り替え得ることを示唆している。
【０２５８】
低レベルのグルコースは生存率に影響しなかったが、細胞の増殖は、ガラクトースを添加した培養物ではわずかに遅かった。最も遅い増殖は、ガラクトース及びグルコースの両方が補充された培養物において観察された（図１０Ａ）。この培養条件では力価は低下したようであったが、比生産性は対照培養（図１０Ｂ〜１０Ｃ）と比較して有意差を示さなかった。低グルコース条件でのガラクトースの添加は、力価のわずかな低下及び比生産性の減少に相関した。
【０２５９】
１０．３  低グルコースと組み合わせたＤ−ガラクトースの添加は、デノスマブの高マンノースレベルを増加させた。
１０日間流加培養からの馴化培地をＡＴＯＬＬ精製及び製品品質特性アッセイに供した。精製製品をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を用いて分析し、純度が約９９％、高分子量及び低分子量の不純物が＜１％（データは示さず）であることがわかった。
【０２６０】
続いて、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を実施して、生成物のグリカンレベルを測定した。結果は、高グルコースレベルの存在下でのガラクトースの添加がデノスマブの高マンノース（Ｍ５）レベルに影響しないことを示す。一方、低グルコースレベルでの１０ｇ／Ｌのガラクトースの補充は、高マンノースレベルを約１．５倍以上増加させた（図１１）。このデータは、小規模生産中に糖源をグルコースからガラクトースに変化させることが、産生物の高マンノースレベルに直接的な影響を及ぼしたことを示唆している。
【０２６１】
１０．４  ガラクトースの添加は、モノ−及びビ−ガラクトシル化グリカン残基を増加させた。
グリカンプロファイルの分析はさらに、１０日間の流加培養中にガラクトース補充物を添加すると、非ガラクト残基の減少が最小限となるが、非シアロモノガラクト及びビガラクト残基が増加することを示した。これらの残基の増加は培養物中に存在するグルコースのレベルに反比例し、低グルコース条件は約２〜４倍の増加を示した（図１２）。
【０２６２】
本明細書は、本明細書内で引用される参考文献の教示に照らせば、最もよく理解される。明細書内の実施形態は本発明の実施形態の例示を提供するものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者であれば、多くの他の実施形態が本発明に包含されることを容易に認識する。本開示において引用される全ての刊行物、特許、及びＧｅｎＢａｎｋ配列は、その全体が参照により組み込まれる。参照によって組み込まれる材料が本明細書と矛盾するか又は整合性がない限り、いかなるそのような材料にも本明細書が優先するものとする。本明細書中のいかなる参考文献の引用も、そのような参考文献が本発明の先行技術であることを容認するものではない。
【０２６３】
上記の個々のセクションで言及された本発明の様々な特徴及び実施形態は、必要に応じて他のセクションに準用される。その結果、１つの項で特定された特徴は、必要に応じて、他のセクションで特定された特徴と組み合わせることができる。
【０２６４】
当業者であれば、単に日常的な実験により、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識又は確認することができるであろう。このような均等物は、以下の実施形態に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６Ａ−１】
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【図６Ａ−２】
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【図６Ｂ】
2021521854.tif 000040
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
2021521854.tif 000043
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2021521854.tif 000045
【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
2021521854.tif 000049
【図１０】
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【図１１】
2021521854.tif 000051
【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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