(57)【要約】子宮内膜症の検出方法および診断方法を本明細書に開示する。より具体的には、子宮内膜細胞から得られた細胞集団における特定の遺伝子発現パターンを検出するための高感度な単一細胞発現解析方法が提供される。2021521803.tif 000006
2021521803.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮内膜症の診断および治療を必要とする対象において子宮内膜症を診断および治療する方法であって、
該対象から得られた子宮内膜間質細胞を濃縮または増殖させることと、
増幅ｃＤＮＡを産生するために、該濃縮または増殖された子宮内膜間質細胞をマイクロ流体チャンバー内の単一細胞処理に供することと、
ＤＢＮ１、ＣＡＶ１、ＣＤＨ、ＣＤＫ１、ＣＤ４５、ＣＫ１９、ＣＳＮＫ、ＣＴＮＮＢ１、Ｃｘ４３、ＥｐＣＡＭ、ＧＡＰＤＨ、ＧＪＡ１、ＧＪＡ３、ＧＪＡ５、ＧＪＡ８、ＧＪＡ９、ＧＪＢ１、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ４、ＧＪＢ５、ＧＪＢ６、ＧＪＢ７、ＧＪＣ２、ＧＵＳＢ、ＫＲＴ１８、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＭＭＥ、Ｎｏｔｃｈ１、ＮＯＶ１、ＰＥＣＡＭ、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＲＫＡＣＧ、ＰＲＫＣＡ、ＳＮＡＩ１、ＳＲＣ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＪＡＰ１、ＴＪＰ１、ＴＪＰ２、Ｔｗｉｓｔ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＩＭ、Ｚｅｂ２、ＺＯ１、ＺＯ２、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の遺伝子のＲＮＡ遺伝子発現を検出するために、該増幅ｃＤＮＡをマイクロ流体ＰＣＲに供することと、
該１つ以上の遺伝子の発現が、子宮内膜症のない対象からの子宮内膜間質細胞における該１つ以上の遺伝子の発現と比較して低下している場合に、該対象を子宮内膜症と診断することと、
子宮内膜症と診断された該対象に子宮内膜症の治療を施すことと
を含む、方法。
【請求項２】
子宮内膜症の診断および治療を必要とする対象において子宮内膜症を診断および治療する方法であって、
該対象から得られた子宮内膜上皮細胞を濃縮または増殖させることと、
増幅ｃＤＮＡを産生するために、該濃縮または増殖された子宮内膜上皮細胞をマイクロ流体チャンバー内の単一細胞処理に供することと、
ＤＢＮ１、ＣＡＶ１、ＣＤＨ、ＣＤＫ１、ＣＤ４５、ＣＫ１９、ＣＳＮＫ、ＣＴＮＮＢ１、Ｃｘ４３、ＥｐＣＡＭ、ＧＡＰＤＨ、ＧＪＡ１、ＧＪＡ３、ＧＪＡ５、ＧＪＡ８、ＧＪＡ９、ＧＪＢ１、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ４、ＧＪＢ５、ＧＪＢ６、ＧＪＢ７、ＧＪＣ２、ＧＵＳＢ、ＫＲＴ１８、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＭＭＥ、Ｎｏｔｃｈ１、ＮＯＶ１、ＰＥＣＡＭ、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＲＫＡＣＧ、ＰＲＫＣＡ、ＳＮＡＩ１、ＳＲＣ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＪＡＰ１、ＴＪＰ１、ＴＪＰ２、Ｔｗｉｓｔ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＩＭ、Ｚｅｂ２、ＺＯ１、ＺＯ２、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の遺伝子のＲＮＡ遺伝子発現を検出するために、該増幅ｃＤＮＡをマイクロ流体ＰＣＲに供することと、
該１つ以上の遺伝子の発現が、子宮内膜症のない対象からの子宮内膜上皮細胞における該１つ以上の遺伝子の発現と比較して上昇している場合に、該対象を子宮内膜症と診断することと、
子宮内膜症と診断された該対象に子宮内膜症の治療を施すことと
を含む、方法。
【請求項３】
子宮内膜症の診断および治療を必要とする対象において子宮内膜症を診断および治療する方法であって、
該対象から得られた子宮内膜間質細胞および子宮内膜上皮細胞を濃縮または増殖させることと、
増幅ｃＤＮＡを産生するために、該濃縮または増殖された子宮内膜間質細胞および子宮内膜上皮細胞をマイクロ流体チャンバー内の単一細胞処理に供することと、
ＤＢＮ１、ＣＡＶ１、ＣＤＨ、ＣＤＫ１、ＣＤ４５、ＣＫ１９、ＣＳＮＫ、ＣＴＮＮＢ１、Ｃｘ４３、ＥｐＣＡＭ、ＧＡＰＤＨ、ＧＪＡ１、ＧＪＡ３、ＧＪＡ５、ＧＪＡ８、ＧＪＡ９、ＧＪＢ１、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ４、ＧＪＢ５、ＧＪＢ６、ＧＪＢ７、ＧＪＣ２、ＧＵＳＢ、ＫＲＴ１８、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＭＭＥ、Ｎｏｔｃｈ１、ＮＯＶ１、ＰＥＣＡＭ、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＲＫＡＣＧ、ＰＲＫＣＡ、ＳＮＡＩ１、ＳＲＣ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＪＡＰ１、ＴＪＰ１、ＴＪＰ２、Ｔｗｉｓｔ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＩＭ、Ｚｅｂ２、ＺＯ１、ＺＯ２、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の遺伝子のＲＮＡ遺伝子発現を検出するために、該増幅ｃＤＮＡをマイクロ流体ＰＣＲに供することと、
該１つ以上の遺伝子の発現が、子宮内膜症のない対象からの子宮内膜間質細胞における該１つ以上の遺伝子の発現と比較して低下しており、子宮内膜症のない対象からの子宮内膜上皮細胞における該１つ以上の遺伝子の発現と比較して上昇している場合に、該対象を子宮内膜症と診断することと、
子宮内膜症と診断された該対象に子宮内膜症の治療を施すことと
を含む、方法。
【請求項４】
前記子宮内膜細胞が、月経血から得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記子宮内膜細胞が、子宮内膜生検材料から得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記子宮内膜症の治療が、抗炎症薬、ホルモン療法、または患部組織の外科的除去を含む群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記対象を子宮内膜症と診断することが、該子宮内膜症を病期分類することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記子宮内膜症が、表在性子宮内膜症（ステージＩ／ＩＩ）または深部浸潤性子宮内膜症（ステージＩＩＩ／ＩＶ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記対象が、子宮内膜症の症状を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象が、子宮内膜症と以前に診断されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記子宮内膜症が、表在性子宮内膜症（ステージＩ／ＩＩ）または深部浸潤性子宮内膜症（ステージＩＩＩ／ＩＶ）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記子宮内膜間質細胞が、子宮内膜間質細胞マーカーＣＤ１０、ＣＤ１４６、およびＣＤ１３を使用して該細胞を選別することによって単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記子宮内膜上皮細胞が、内皮上皮細胞マーカーＥｐＣａｍ＋、ＣＤ４５、およびＣＤ９を使用して該細胞を選別することによって単離される、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
子宮内膜症のない対象からの子宮内膜間質細胞における前記１つ以上の遺伝子の発現と比較して発現が低下している該１つ以上の遺伝子には、Ｃｘ４３、ＭＡＰＫ、ＴＧＦＢＲ２、ＺＯ２、およびＺＯ１が含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
子宮内膜症のない対象からの子宮内膜間質細胞における前記１つ以上の遺伝子の発現と比較して発現が低下している該１つ以上の遺伝子には、ＳＮＡＩ１、Ｔｗｉｓｔ１、Ｚｅｂ２、Ｎｏｔｃｈ１、ＶＥＧＦＲ１、およびＣＤ４５が含まれる、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が組み込まれる、２０１８年４月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／６６０，６４１号の恩典および優先権を主張する。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、概して、子宮内膜症を検出および診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
子宮内膜症は、米国で最も一般的な婦人科疾患の一つである。これは、疼痛を伴い、往々にして衰弱性の疾患であり、アメリカにおける６５０万人超の１５〜４４歳の女性が罹患している（Ｂｕｃｋ  Ｌｏｕｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ，９６：３６０〜３６５（２０１１）（非特許文献１））。子宮内膜症は、子宮の内膜が異所性に、最も一般的には卵巣、卵管、子宮を所定の位置に保持する組織、および子宮の外表面に成長するときに起こる。あまり一般的ではないが、子宮内膜の成長は、膣、子宮頸部、外陰部、腸、膀胱、または直腸にも見られる。子宮内膜症の最も一般的な症状としては、疼痛、出血もしくは点状出血、不妊症、および下痢、便秘、腹部膨満、または吐き気などの消化器疾患が挙げられる。
【０００４】
子宮内膜症の原因は不明である。考えられる原因には、逆行性月経出血、遺伝要因、免疫系の問題、ホルモンバランスの乱れ、および外科的合併症が挙げられる。子宮内膜症の原因は不明であるため、現在の子宮内膜症の治療は、疾患自体ではなく症状のみを治療している。さらに、子宮内膜症病変を除去するための手術以外に子宮内膜症の治療法は存在しない。子宮内膜症病変の除去は、疾患の永久的な治療ではなく、単なる一時的な治療選択肢である。
【０００５】
子宮内膜症は、その症状が腹部および腸に影響を及ぼす他の多くの疾患と重複するため、診断が困難である。現在、子宮内膜症の診断は、臨床歴と侵襲性および非侵襲性の両方の検査との組み合わせに依存している。婦人科内診、超音波検査、およびＭＲＩはすべて、潜在的な子宮内膜症病変を可視化するために使用される技術である。しかし、子宮内膜症の確定診断は、現在、腹腔鏡検査と呼ばれる種類の手術によってのみ得ることができ、医師は骨盤領域内から子宮内膜組織を直接見ることができる。腹腔鏡検査の間に、医師はまた、発見される子宮内膜症病変を切除することができる。腹腔鏡検査は侵襲的な方法であり、費用が高いため、子宮内膜症のスクリーニングは実用的ではない。その結果、多くの子宮内膜症の女性は診断されないままになり、または誤って診断され、未治療のままである。子宮内膜症を診断するための、侵襲性の低い、早期検出方法が必要とされている。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、子宮内膜症を診断するためのより効果的な方法を提供することである。
【０００７】
子宮内膜症を診断するための侵襲性の低い方法を提供することも、本発明の目的である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｕｃｋ  Ｌｏｕｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ，９６：３６０〜３６５（２０１１）
【発明の概要】
【０００９】
患者の子宮内膜症を診断および治療する方法が本明細書に開示される。現在の子宮内膜症の診断方法は、効率が低いかまたは侵襲性が高いかのいずれかである。子宮内膜症を診断する効率的で非侵襲的な方法が提供される。
【００１０】
一実施形態は、対象から得られた子宮内膜間質細胞を濃縮または増殖させること、増幅ｃＤＮＡを産生するために、濃縮または増殖された子宮内膜間質細胞をマイクロ流体チャンバー内の単一細胞処理に供すること、ＤＢＮ１、ＣＡＶ１、ＣＤＨ、ＣＤＫ１、ＣＤ４５、ＣＫ１９、ＣＳＮＫ、ＣＴＮＮＢ１、Ｃｘ４３、ＥｐＣＡＭ、ＧＡＰＤＨ、ＧＪＡ１、ＧＪＡ３、ＧＪＡ５、ＧＪＡ８、ＧＪＡ９、ＧＪＢ１、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ４、ＧＪＢ５、ＧＪＢ６、ＧＪＢ７、ＧＪＣ２、ＧＵＳＢ、ＫＲＴ１８、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＭＭＥ、Ｎｏｔｃｈ１、ＮＯＶ１、ＰＥＣＡＭ、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＲＫＡＣＧ、ＰＲＫＣＡ、ＳＮＡＩ１、ＳＲＣ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＪＡＰ１、ＴＪＰ１、ＴＪＰ２、Ｔｗｉｓｔ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＩＭ、Ｚｅｂ２、ＺＯ１、ＺＯ２、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の遺伝子のＲＮＡ遺伝子発現を検出するために、増幅ｃＤＮＡをマイクロ流体ＰＣＲに供すること、該１つ以上の遺伝子の発現が、子宮内膜症のない対象からの子宮内膜間質細胞における該１つ以上の遺伝子の発現と比較して低下している場合、対象を子宮内膜症と診断すること、および子宮内膜症と診断された対象に子宮内膜症の治療を施すことにより、それを必要とする対象において子宮内膜症の診断および治療をする方法を提供する。
【００１１】
別の実施形態は、対象から得られた子宮内膜上皮細胞を濃縮または増殖させること、増幅ｃＤＮＡを産生するために、濃縮または増殖された子宮内膜上皮細胞をマイクロ流体チャンバー内の単一細胞処理に供すること、ＤＢＮ１、ＣＡＶ１、ＣＤＨ、ＣＤＫ１、ＣＤ４５、ＣＫ１９、ＣＳＮＫ、ＣＴＮＮＢ１、Ｃｘ４３、ＥｐＣＡＭ、ＧＡＰＤＨ、ＧＪＡ１、ＧＪＡ３、ＧＪＡ５、ＧＪＡ８、ＧＪＡ９、ＧＪＢ１、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ４、ＧＪＢ５、ＧＪＢ６、ＧＪＢ７、ＧＪＣ２、ＧＵＳＢ、ＫＲＴ１８、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＭＭＥ、Ｎｏｔｃｈ１、ＮＯＶ１、ＰＥＣＡＭ、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＲＫＡＣＧ、ＰＲＫＣＡ、ＳＮＡＩ１、ＳＲＣ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＪＡＰ１、ＴＪＰ１、ＴＪＰ２、Ｔｗｉｓｔ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＩＭ、Ｚｅｂ２、ＺＯ１、ＺＯ２、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の遺伝子のＲＮＡ遺伝子発現を検出するために、増幅ｃＤＮＡをマイクロ流体ＰＣＲに供すること、該１つ以上の遺伝子の発現が、子宮内膜症のない対象からの子宮内膜上皮細胞における該１つ以上の遺伝子の発現と比較して上昇している場合、対象を子宮内膜症と診断すること、および子宮内膜症と診断された対象に子宮内膜症の治療を施すことにより、それを必要とする対象において子宮内膜症の診断および治療をする方法を提供する。
【００１２】
さらに別の実施形態は、対象から得られた子宮内膜間質細胞および子宮内膜上皮細胞を濃縮または増殖させること、増幅ｃＤＮＡを産生するために、濃縮または増殖された子宮内膜間質細胞および子宮内膜上皮細胞をマイクロ流体チャンバー内の単一細胞処理に供すること、ＤＢＮ１、ＣＡＶ１、ＣＤＨ、ＣＤＫ１、ＣＤ４５、ＣＫ１９、ＣＳＮＫ、ＣＴＮＮＢ１、Ｃｘ４３、ＥｐＣＡＭ、ＧＡＰＤＨ、ＧＪＡ１、ＧＪＡ３、ＧＪＡ５、ＧＪＡ８、ＧＪＡ９、ＧＪＢ１、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ４、ＧＪＢ５、ＧＪＢ６、ＧＪＢ７、ＧＪＣ２、ＧＵＳＢ、ＫＲＴ１８、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＭＭＥ、Ｎｏｔｃｈ１、ＮＯＶ１、ＰＥＣＡＭ、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＲＫＡＣＧ、ＰＲＫＣＡ、ＳＮＡＩ１、ＳＲＣ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＪＡＰ１、ＴＪＰ１、ＴＪＰ２、Ｔｗｉｓｔ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＩＭ、Ｚｅｂ２、ＺＯ１、ＺＯ２、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の遺伝子のＲＮＡ遺伝子発現を検出するために、増幅ｃＤＮＡをマイクロ流体ＰＣＲに供すること、該１つ以上の遺伝子の発現が、子宮内膜症のない対象からの子宮内膜間質細胞における該１つ以上の遺伝子の発現と比較して低下しており、子宮内膜症のない対象からの子宮内膜上皮細胞における該１つ以上の遺伝子の発現と比較して上昇している場合、対象を子宮内膜症と診断すること、および子宮内膜症と診断された対象に子宮内膜症の治療を施すことにより、それを必要とする対象において子宮内膜症の診断および治療をする方法を提供する。
【００１３】
子宮内膜細胞は、月経血または子宮内膜生検から得ることができる。一実施形態において、間質細胞は、子宮内膜間質細胞マーカーＣＤ１０、ＣＤ１４６、およびＣＤ１３を使用して細胞を選別することによって単離される。別の実施形態において、子宮内膜上皮細胞は、内皮上皮細胞マーカーＥｐＣａｍ＋、ＣＤ４５、およびＣＤ９を使用して細胞を選別することによって単離される。
【００１４】
子宮内膜症の治療は、抗炎症薬、ホルモン療法、または患部組織の外科的除去を含む群から選択することができる。
【００１５】
一実施形態において、対象は子宮内膜症の症状を有する。別の実施形態において、対象は子宮内膜症と以前に診断されている。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｉは、ギャップ結合遺伝子（コネキシン）、ならびに細胞−細胞相互作用に関与する他のタンパク質（密着結合および接着結合）、およびそれらを調節する種々のキナーゼの遺伝子発現レベルを反映するヒートマップを示す。モノクロマップにおいて、最も高い発現は灰色、中間発現は黒色、最も低い発現は白色である。各ドットは、特定の細胞（列で配列）における特定の遺伝子（行で配列）の発現に対応する。図１Ａ〜１Ｅは、子宮内膜症がない（正常；図１Ａ）、初期子宮内膜症（ステージＩ／ＩＩ；図１Ｂ）、および骨盤腔内により広範な子宮内膜症病変（ステージＩＩＩ／ＩＶ；図１Ｃ〜１Ｅ）の女性由来の子宮内膜生検試料から濃縮された間質細胞の遺伝子発現プロファイルである。これらの試料は、以下の月経周期の異なる段階で得られた：ＥＳ、初期分泌期（図１Ａ〜１Ｃ）、ＭＳ、中間分泌期（図１Ｄ）、およびＰ、増殖期（図１Ｅ）。図１Ｆ〜１Ｉは、子宮内膜症がない（正常；図１Ｆ〜Ｇ）、初期子宮内膜症（ステージＩ／ＩＩ；図１Ｈ）、および広範な子宮内膜症（ステージＩＩＩ／ＩＶ；図１Ｉ）の女性由来の子宮内膜生検試料から濃縮された上皮細胞の遺伝子発現プロファイルである。これらの試料は、以下の月経周期の異なる段階で得られた：ＥＳ、初期分泌期（図１Ｆ〜Ｈ）、およびＰ、増殖期（図１Ｉ）。
【図１−２】図１Ａ〜１Ｉは、ギャップ結合遺伝子（コネキシン）、ならびに細胞−細胞相互作用に関与する他のタンパク質（密着結合および接着結合）、およびそれらを調節する種々のキナーゼの遺伝子発現レベルを反映するヒートマップを示す。モノクロマップにおいて、最も高い発現は灰色、中間発現は黒色、最も低い発現は白色である。各ドットは、特定の細胞（列で配列）における特定の遺伝子（行で配列）の発現に対応する。図１Ａ〜１Ｅは、子宮内膜症がない（正常；図１Ａ）、初期子宮内膜症（ステージＩ／ＩＩ；図１Ｂ）、および骨盤腔内により広範な子宮内膜症病変（ステージＩＩＩ／ＩＶ；図１Ｃ〜１Ｅ）の女性由来の子宮内膜生検試料から濃縮された間質細胞の遺伝子発現プロファイルである。これらの試料は、以下の月経周期の異なる段階で得られた：ＥＳ、初期分泌期（図１Ａ〜１Ｃ）、ＭＳ、中間分泌期（図１Ｄ）、およびＰ、増殖期（図１Ｅ）。図１Ｆ〜１Ｉは、子宮内膜症がない（正常；図１Ｆ〜Ｇ）、初期子宮内膜症（ステージＩ／ＩＩ；図１Ｈ）、および広範な子宮内膜症（ステージＩＩＩ／ＩＶ；図１Ｉ）の女性由来の子宮内膜生検試料から濃縮された上皮細胞の遺伝子発現プロファイルである。これらの試料は、以下の月経周期の異なる段階で得られた：ＥＳ、初期分泌期（図１Ｆ〜Ｈ）、およびＰ、増殖期（図１Ｉ）。
【図２−１】図２Ａ〜２ＢＢは、子宮のブラシ生検由来の濃縮間質細胞（図２Ａ〜２Ｎ）および上皮細胞（図２Ｏ〜２ＢＢ）におけるほとんどのギャップ結合遺伝子（各プロット上にＧＪによって示されている）の単一細胞マイクロ流体ＰＣＲ発現データの箱ひげ図である。患者は、各プロットのＸ軸に沿った番号によって識別され、実施例の表３に示されるように、正常な対象、初期および後期の子宮内膜症対象を表す。Ｙ軸はＬｏｇ１０発現を表す。ＧＪＡ１（Ｃｘ４３タンパク質をコードする）は、両細胞型において最も豊富に発現されるコネキシンである。しかし、実質的にすべてのコネキシンは、間質細胞において疾患進行に伴う発現の一貫した有意な減少（アスタリスクで示す）を示す（図２Ａ〜２Ｎ）が、上皮細胞においては疾患進行に伴う増加を示す（図２Ｏ〜２ＢＢ）。
【図２−２】図２Ａ〜２ＢＢは、子宮のブラシ生検由来の濃縮間質細胞（図２Ａ〜２Ｎ）および上皮細胞（図２Ｏ〜２ＢＢ）におけるほとんどのギャップ結合遺伝子（各プロット上にＧＪによって示されている）の単一細胞マイクロ流体ＰＣＲ発現データの箱ひげ図である。患者は、各プロットのＸ軸に沿った番号によって識別され、実施例の表３に示されるように、正常な対象、初期および後期の子宮内膜症対象を表す。Ｙ軸はＬｏｇ１０発現を表す。ＧＪＡ１（Ｃｘ４３タンパク質をコードする）は、両細胞型において最も豊富に発現されるコネキシンである。しかし、実質的にすべてのコネキシンは、間質細胞において疾患進行に伴う発現の一貫した有意な減少（アスタリスクで示す）を示す（図２Ａ〜２Ｎ）が、上皮細胞においては疾患進行に伴う増加を示す（図２Ｏ〜２ＢＢ）。
【図２−３】図２Ａ〜２ＢＢは、子宮のブラシ生検由来の濃縮間質細胞（図２Ａ〜２Ｎ）および上皮細胞（図２Ｏ〜２ＢＢ）におけるほとんどのギャップ結合遺伝子（各プロット上にＧＪによって示されている）の単一細胞マイクロ流体ＰＣＲ発現データの箱ひげ図である。患者は、各プロットのＸ軸に沿った番号によって識別され、実施例の表３に示されるように、正常な対象、初期および後期の子宮内膜症対象を表す。Ｙ軸はＬｏｇ１０発現を表す。ＧＪＡ１（Ｃｘ４３タンパク質をコードする）は、両細胞型において最も豊富に発現されるコネキシンである。しかし、実質的にすべてのコネキシンは、間質細胞において疾患進行に伴う発現の一貫した有意な減少（アスタリスクで示す）を示す（図２Ａ〜２Ｎ）が、上皮細胞においては疾患進行に伴う増加を示す（図２Ｏ〜２ＢＢ）。
【図２−４】図２Ａ〜２ＢＢは、子宮のブラシ生検由来の濃縮間質細胞（図２Ａ〜２Ｎ）および上皮細胞（図２Ｏ〜２ＢＢ）におけるほとんどのギャップ結合遺伝子（各プロット上にＧＪによって示されている）の単一細胞マイクロ流体ＰＣＲ発現データの箱ひげ図である。患者は、各プロットのＸ軸に沿った番号によって識別され、実施例の表３に示されるように、正常な対象、初期および後期の子宮内膜症対象を表す。Ｙ軸はＬｏｇ１０発現を表す。ＧＪＡ１（Ｃｘ４３タンパク質をコードする）は、両細胞型において最も豊富に発現されるコネキシンである。しかし、実質的にすべてのコネキシンは、間質細胞において疾患進行に伴う発現の一貫した有意な減少（アスタリスクで示す）を示す（図２Ａ〜２Ｎ）が、上皮細胞においては疾患進行に伴う増加を示す（図２Ｏ〜２ＢＢ）。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｎは、子宮のブラシ生検からの濃縮子宮内膜間質細胞（図３Ａ〜３Ｇ）および子宮内膜上皮細胞（図３Ｈ〜３Ｎ）における、各プロットの上部に示されるような（ＴＪＰ１＝ＺＯ１；Ｃａｖ＝カベオリン；ＣＤＨ２＝Ｎ−カドヘリン；Ｖｉｍ＝ビメンチン；ＣＴＮＮＢ＝カテニンβ；ＰＲＨＡＣＡ＝タンパク質キナーゼＡ；ＰＲＫＣＢ＝タンパク質キナーゼＣ）ギャップ結合およびそれらの調節因子以外の細胞間相互作用に関与するいくつかの他の遺伝子に関する単一細胞マイクロ流体ＰＣＲ発現データを示すボックスプロットである。グラフのラベリングは、図２Ａ〜２ＢＢに示す通りである。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｎは、子宮のブラシ生検からの濃縮子宮内膜間質細胞（図３Ａ〜３Ｇ）および子宮内膜上皮細胞（図３Ｈ〜３Ｎ）における、各プロットの上部に示されるような（ＴＪＰ１＝ＺＯ１；Ｃａｖ＝カベオリン；ＣＤＨ２＝Ｎ−カドヘリン；Ｖｉｍ＝ビメンチン；ＣＴＮＮＢ＝カテニンβ；ＰＲＨＡＣＡ＝タンパク質キナーゼＡ；ＰＲＫＣＢ＝タンパク質キナーゼＣ）ギャップ結合およびそれらの調節因子以外の細胞間相互作用に関与するいくつかの他の遺伝子に関する単一細胞マイクロ流体ＰＣＲ発現データを示すボックスプロットである。グラフのラベリングは、図２Ａ〜２ＢＢに示す通りである。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｈは、正常な対象および子宮内膜症対象からの初代子宮内膜間質細胞および子宮内膜上皮細胞におけるギャップ結合細胞間カップリングの機能評価を示す。図４Ａは、「ドナー」細胞にギャップ結合浸透性色素を充填し、それらをレシピエント細胞の単層上に滴下し、色素の単層への拡散を追跡することによって、アッセイがどのように行われるかを示す模式図である。図４Ｂ〜４Ｅは、正常な対象および進行性子宮内膜症患者からの間質細胞を使用したアッセイの例を示す代表的な画像である。図４Ｆは、ドナー細胞とレシピエント細胞との間の経時的なカルセインの移動速度を示す線グラフである（上のグラフ−正常；下のグラフ−子宮内膜症）。Ｘ軸は時間を表し、Ｙ軸はドナー細胞あたりの標識されたレシピエント細胞の数を表す。勾配は、細胞間カップリング効率（「カップリング」と称される）の尺度として使用される。
【図４−２】図４Ａ〜４Ｈは、正常な対象および子宮内膜症対象からの初代子宮内膜間質細胞および子宮内膜上皮細胞におけるギャップ結合細胞間カップリングの機能評価を示す。図４Ｇ〜４Ｈは、上皮子宮内膜細胞（図４Ｇ）および間質子宮内膜細胞（図４Ｈ）の互いへのカップリングレベル（ホモタイプカップリング−黒色の棒）またはＬＰ９腹膜中皮細胞の単層へのカップリングレベル（ヘテロタイプカップリング−灰色の棒）を示す棒グラフである。まず、発現プロファイルから予想されるように、間質細胞は、上皮細胞よりも互いにうまく結合されていない。しかし、中皮細胞に曝されると（通常はそれを介して子宮内膜症に侵襲する）、カップリングの劇的な増加が見られるが、子宮内膜症患者からの間質細胞でのみ見られる（有意性は対応のあるｔ検定から示される）。
【図５】図５Ａ〜５Ｆは、子宮内膜症のない女性由来の子宮内膜症生検試料（１６７正常；図５Ａ、図５Ｄ）、表在性子宮内膜症の女性由来の子宮内膜症生検試料（１６４子宮内膜症Ｉ〜ＩＩ；図５Ｂ、図５Ｅ）、および深部浸潤性子宮内膜症の女性由来の子宮内膜症生検試料（１６９子宮内膜症ＩＩＩ〜ＩＶ；図５Ｃ、図５Ｆ）からの、間質細胞単独（図５Ａ〜図５Ｃ）、または中皮細胞に曝された間質細胞（図５Ｄ〜５Ｆ）における、Ｃｘ４３の発現を示す蛍光顕微鏡画像である。矢印は、中皮細胞に曝された子宮内膜症細胞におけるＣｘ４３の細胞表面への再分布を示し、図４Ａ〜４Ｈに見られるカップリングの急速な誘発を潜在的に説明する。
【図６】未処理試料（黒色の棒）、細胞カップリングを減少するようＣｘ４３ｓｉＲＮＡで処理した試料（灰色の棒）、またはグルタルアルデヒドデヒドロゲナーゼに対する対照ｓｉＲＮＡで処理した試料（ＧＡＰＤＨ−斜線入り棒）中の、中皮細胞単層を介して侵襲した子宮内膜上皮細胞および子宮内膜間質細胞の数を示す棒グラフである。両細胞型は侵襲性であり、Ｃｘ４３発現が抑制されると、この侵襲性はほとんど排除される。しかし、間質細胞は、疾患進行とともに侵襲性の有意な増加を示し、これは、子宮内膜症試料においてのみＣｘ４３発現に依存する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明確に矛盾しない限り、（特に特許請求の範囲の文脈において）現在請求されている発明を説明する文脈における用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、および同様の言及の使用は、単数および複数の両方を網羅すると解釈されるべきである。
【００１８】
本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書に別段の指示がない限り、範囲内に含まれる各別々の値を個別に参照する簡単な方法としての役割を果たすことが意図されるに過ぎず、各別々の値は、本明細書に個別に列挙されるかのように本明細書に組み込まれる。
【００１９】
「約」という用語の使用は、約＋／−１０％の範囲で記載値以上または以下のいずれかの値を記述することを意図しており、他の実施形態では、値は、約＋／−５％の範囲で記載値以上または以下のいずれかの値にわたってもよく、他の実施形態では、値は、約＋／−２％の範囲で記載値以上または以下のいずれかの値にわたってもよく、他の実施形態では、値は、約＋／−１％の範囲で記載値以上または以下のいずれかの値にわたってもよい。前述の範囲は、文脈によって明確にされることが意図され、さらなる限定は示唆されない。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明確に矛盾しない限り、任意の好適な順序で実行され得る。本明細書に提供される任意およびすべての実施例、または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をより良く明らかにすることを意図しており、特に主張されない限り、本発明の範囲に限定を課さない。本明細書におけるいかなる記載も、本発明の実施に不可欠である任意の請求されていない要素を示すものとして解釈されてはならない。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「子宮」とは、胎内としても知られている女性生殖器系の器官を指す。子宮の主な機能は、胎児が生まれる準備ができるまで、胎児を収容し、栄養を与えることである。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「子宮内膜」とは、子宮内の粘膜を指す。子宮内膜は月経周期を通して変化する。月経とは、ホルモンの変動に反応する子宮内膜の周期的な脱落である。月経周期は、卵胞期すなわち増殖期、および黄体期すなわち分泌期の２つの期に分けられる。増殖期は、卵胞の発達を特徴とする。分泌期は、一般的には１４日間であり、排卵後に開始する。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「子宮内膜細胞」とは、子宮内膜由来の細胞を指す。子宮内膜細胞は、間質細胞および上皮細胞に細分することができる。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「間質細胞」とは、任意の臓器の結合組織細胞を指す。間質細胞は、その臓器の実質細胞の機能を支持する。子宮内膜間質細胞は、妊娠の開始および維持において重要である。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「上皮細胞」とは、上皮と呼ばれる細胞の粘着性の薄膜を形成する細胞を指す。上皮細胞は、体表面の外皮または内層として、および分泌腺の機能単位として機能する。上皮細胞は、吸収、分泌、またはバリアとして機能するよう特化し得る。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「子宮内膜症」とは、子宮からの組織が子宮の外側の腹腔内で増殖する婦人科疾患を指す。子宮内膜症の２つの主な症状としては、疼痛と不妊が挙げられる。疼痛と不妊の主な原因は、子宮内膜の移植物と接着である。本明細書で使用される場合、「子宮内膜移植物」とは、異所性部位に見られる子宮内膜組織を指す。移植物は、骨盤領域の腹膜表面の小さくて、平らなパッチに似ている。これらの移植物は、周囲の組織に刺激および炎症を引き起こし、接着の形成につながり得る。本明細書で使用される場合、「接着」とは、通常移動性の組織および臓器に結合することができる内部瘢痕組織の帯を指す。
【００２６】
子宮内膜症は、疾患の重症度、疾患の広がりの程度、骨盤構造の関与、骨盤癒着の程度、卵管の閉塞に基づいて「ステージ」に分類される。子宮内膜症の病期分類は、患者が経験する症状の重症度を必ずしも反映するものではない。
【００２７】
子宮内膜症の４つのステージは、最軽度、軽度、中等度、および重度に相当する。ほとんどの患者は、最軽度および軽度の範囲に入る。ステージＩと呼ばれる最軽度の子宮内膜症は、移植物が単離され、有意な接着がないことを特徴とする。軽度の子宮内膜症、ステージＩＩは、有意な接着がなく、凝集塊中の５ｃｍ未満の表在性移植物を特徴とする。ステージＩおよびＩＩの子宮内膜症は、多くの場合、「表在性子宮内膜症」と呼ばれる同じカテゴリーに統合される。中等度（ステージＩＩＩ）の子宮内膜症は、子宮内膜組織が卵巣で成長すると形成される嚢胞の一種である、子宮内膜腫の出現を特徴とする。重度の子宮内膜症（ステージＩＶ）は、複数の移植物、嚢胞、および卵管と卵巣の周囲に瘢痕をもたらす重度の癒着を特徴とする。ステージＩＶの子宮内膜症を有する女性は、不妊の問題を抱える可能性が最も高い。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「ギャップ結合」とは、隣接する細胞間をイオンおよび小分子が通過することができる細胞膜中のタンパク質チャネルの組織化された凝集塊を指す。
【００２９】
ＩＩ．子宮内膜症の診断および治療方法
子宮内膜症の診断および治療方法が本明細書に提供される。子宮内膜細胞から得られた細胞集団における特定の遺伝子発現パターンを検出するための高感度単一細胞発現解析方法が本明細書に開示される。例示的な方法は、対象から得られた子宮内膜細胞を濃縮または増殖させるステップと、増幅ｃＤＮＡを産生するために、細胞をマイクロ流体チャンバー内の単一細胞処理に供するステップと、ＤＢＮ１、ＣＡＶ１、ＣＤＨ、ＣＤＫ１、ＣＤ４５、ＣＫ１９、ＣＳＮＫ、ＣＴＮＮＢ１、Ｃｘ４３、ＥｐＣＡＭ、ＧＡＰＤＨ、ＧＪＡ１、ＧＪＡ３、ＧＪＡ５、ＧＪＡ８、ＧＪＡ９、ＧＪＢ１、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ４、ＧＪＢ５、ＧＪＢ６、ＧＪＢ７、ＧＪＣ２、ＧＵＳＢ、ＫＲＴ１８、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＭＭＥ、Ｎｏｔｃｈ１、ＮＯＶ１、ＰＥＣＡＭ、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＲＫＡＣＧ、ＰＲＫＣＡ、ＳＮＡＩ１、ＳＲＣ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＪＡＰ１、ＴＪＰ１、ＴＪＰ２、Ｔｗｉｓｔ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＩＭ、Ｚｅｂ２、ＺＯ１、ＺＯ２、およびそれらの組み合わせを含有する群から選択される１つ以上の遺伝子のＲＮＡ遺伝子発現を検出するために、増幅ｃＤＮＡをマイクロ流体ＰＣＲに供するステップと、１つ以上の遺伝子の発現が、子宮内膜症のない対象からの子宮内膜上皮細胞における該１つ以上の遺伝子の発現と比較して上昇している場合、対象を子宮内膜症と診断するステップと、子宮内膜症と診断された対象に子宮内膜症の治療を施すステップとを含む。
【００３０】
Ａ．子宮内膜細胞の濃縮および増殖
１．子宮内膜試料
一実施形態において、子宮細胞の試料は、定期健康診断中に女性から収集される。いくつかの実施形態において、女性は子宮内膜症の疑いがある。別の実施形態において、女性は子宮内膜症と以前に診断されており、開示される方法は、疾患の再発を観察するために使用される。
【００３１】
一実施形態において、子宮内膜細胞は、対象から非侵襲的な方法で、例えば、ステリカップで収集された月経液中に得られる。別の実施形態において、子宮内膜細胞は、子宮内膜ブラシ生検装置または子宮内膜吸引カテーテルなどの微侵襲的方法で対象から得られる。
【００３２】
子宮内膜症を有する女性は、表在性子宮内膜症（ステージＩ／ＩＩ）または深部浸潤性子宮内膜症（ステージＩＩＩ／ＩＶ）を有し得る。生検標本は、早期分泌期、中間分泌期、または増殖期を含む月経周期の異なる時期で得ることができるが、これらに限定されない。
【００３３】
いくつかの実施形態は、子宮細胞を単一細胞処理およびマイクロ流体ＰＣＲに供する方法を提供する。子宮細胞は、間質細胞または上皮細胞であり得る。
【００３４】
子宮内膜生検材料は、組織から細胞を単離することによって、濃縮、増殖、および単一細胞処理のために調製することができる。子宮内膜生検材料から細胞を単離するための方法は、当該技術分野において既知である。例示的な方法としては、これらに限定されないが、全生検材料からの表面上皮のコラゲナーゼ消化、トリプシン消化、および手動スクレーピングが挙げられる（Ｋｒｊｕｔｓｋｏｖ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，３１：８４４〜８５３（２０１６）、Ｊｉｖｉｄｅｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ，８７：ｅ５１５１３）。
【００３５】
月経液から赤血球を除去し、子宮内膜細胞を単離することによって、濃縮、増殖、および単一細胞処理のために月経液が調製される。
【００３６】
２．細胞濃縮
一実施形態において、生検材料からの子宮内膜細胞集団は、間質細胞または上皮細胞が濃縮されている。間質細胞または上皮細胞の子宮内膜細胞集団を濃縮する方法は、当該技術分野で既知である。例示的な方法としては、濾過装置、フローサイトメトリー、磁気ビーズまたは特定の抗体でコーティングされたマイクロビーズ、およびマイクロフルイディクスを使用した物理的分離が挙げられるが、これらに限定されない。濃縮した試料は、単一細胞処理の前に培養液中で増殖させることができる。
【００３７】
ｉ．濾過
一実施形態において、間質細胞は、消化された細胞懸濁液を細胞培養フィルターに通すことによって子宮内膜細胞集団から単離される。間質細胞はフィルターを通過するが、上皮細胞はフィルターを通過しない組織内に凝集した状態で残存する。上皮組織は、さらに単一細胞懸濁液へと消化させることができる。濃縮細胞懸濁液は、増殖のために培養するか、または単一細胞処理のために直接使用することができる。
【００３８】
ｉｉ．ＦＡＣＳ
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、単一細胞を単離することができる選別能力を有するフローサイトメトリーの特化型である。分離前に、細胞懸濁液を作製し、標的細胞を蛍光プローブで標識する。フルオロフォアコンジュゲートモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、標的細胞上の特定の表面マーカーを認識する最も広く使用されている蛍光プローブである。細胞懸濁液が装置を通過すると、各細胞がレーザーに曝露され、これにより、蛍光検出器は、選択された特性、特にどの抗体が結合しているかに基づいて細胞を識別することができる。この機器は、対象となる細胞を含む液滴に電荷（正または負）を印加し、静電偏向システムにより、後に分析するために、帯電液滴を適切な収集チューブに収集することが容易になる。ＦＡＣＳは、単一細胞を選別するために使用することもできる。
【００３９】
一実施形態において、子宮内膜生検材料からの細胞はＦＡＣＳを使用して選別される。子宮内膜生検材料由来の細胞懸濁液は、ＣＤ１０、ＣＤ１４６、およびＣＤ１３などの間質細胞マーカーを認識する蛍光プローブとともにインキュベートされ得る。細胞懸濁液を、フローサイトメーターを通して流し、間質細胞を別々の容器に収集する。別の実施形態において、細胞懸濁液は、ＥｐＣａｍ＋およびＣＤ９などの上皮マーカーを認識する蛍光プローブとともにインキュベートされる。細胞懸濁液を、フローサイトメーターを通して流し、上皮細胞を別々の容器に収集する。一実施形態において、子宮内膜細胞培養物は、ＦＡＣＳを使用して間質細胞または上皮細胞が濃縮される。
【００４０】
ｉｉｉ．磁気ビーズ
磁気ビーズ細胞単離は、細胞の混合集団から特定の細胞型を濃縮するために使用される技術である。標的細胞上の細胞表面マーカーに対する抗体とコンジュゲートされた磁気ビーズまたはナノ粒子は、細胞集団と混合される。細胞を保持する容器を磁気カラムに曝露し、対象となる細胞（磁気ビーズとコンジュゲートされている）は細胞の残りの部分から分離される。一実施形態において、磁気ビーズは、ＣＤ１０、ＣＤ１４６、およびＣＤ１３などの間質細胞マーカーに対する抗体とコンジュゲートされ、間質細胞を子宮内膜細胞懸濁液から分離するために使用される。
【００４１】
ｉｖ．マイクロフルイディクス
別の実施形態において、子宮内膜生検材料からの細胞は、マイクロフルイディクスを使用して濃縮される。マイクロ流体チップによる細胞選別は、細胞親和性クロマトグラフィーに基づくマイクロ流体分離、細胞に基づくマイクロ流体分離の物理的特性、免疫磁気ビーズに基づくマイクロ流体分離、および種々の細胞型間の誘電特性の差に基づく分離方法の４つのカテゴリーに分類され得る。
【００４２】
細胞親和性クロマトグラフィーに基づくマイクロフルイディクスは、マイクロ流体チップ分析のために最も一般的に使用されている方法である。これは、抗原と抗体、リガンドと受容体との間の高度に特異的な相互作用に基づく。処理の開始時に、チップ内のマイクロチャネルは、細胞表面抗原またはアプタマーに結合することができる特異的抗体で修飾される。試料がマイクロチャネルを通って流れると、その細胞表面抗原は、チップ上の細胞を固定化する特定の抗体またはアプタマーに結合することができるが、残りの細胞は緩衝液によってチップから流れ出る。最終的に、異なる緩衝液を使用して、固定化細胞を下流分析のために溶出することができる。一実施形態において、子宮内膜細胞集団は、マイクロフルイディクスを使用して間質細胞について濃縮される。別の実施形態において、上皮細胞が濃縮される。
【００４３】
３．細胞増殖
他の実施形態において、細胞は、細胞の特定のサブタイプが濃縮されることなく培養中で増殖される。子宮内膜生検材料は、組織から細胞を単離することによって、細胞培養での増殖のために調製することができる。子宮内膜生検材料から細胞を単離するための方法は、当該技術分野において既知である。例示的な方法としては、全生検材料からの表面上皮のコラゲナーゼ消化、トリプシン消化、および手動スクレーピングが挙げられるが、これらに限定されない（Ｋｒｊｕｔｓｋｏｖ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，３１：８４４〜８５３（２０１６）；Ｊｉｖｉｄｅｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ，８７：ｅ５１５１３）。子宮内膜細胞を培養するための方法は当該技術分野において既知である。例えば、Ｏｓｔｅｅｎ，Ｋ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  ，５２：９６６〜９７２（１９８９）；Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ，１０８：３２３〜３３１（１９９５）を参照されたい。いくつかの実施形態において、単一細胞ＰＣＲの高い感度は、分析の前に培養物中の細胞を増殖させる必要性を克服する。
【００４４】
Ｂ．単一細胞処理
一実施形態において、濃縮もしくは増殖した間質細胞または子宮細胞は、単一細胞処理に供される。単一細胞処理は、単一細胞を細胞集団から単離し、細胞集団全体ではなく単一細胞についての分析を行う方法である。一実施形態において、子宮内膜試料由来の単一細胞をマイクロ流体ＰＣＲに供する。
【００４５】
１．単一細胞単離
一実施形態において、間質細胞は子宮内膜細胞培養物から単離される。例示的な子宮内膜間質細胞マーカーとして、ＣＤ１０、ＣＤ１４６、およびＣＤ１３が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、上皮細胞は子宮内膜細胞培養物から単離される。例示的な上皮マーカーとして、ＥｐＣａｍ＋、ＣＤ４５、およびＣＤ９が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
全細胞培養物から単一細胞を単離するための方法は、当該技術分野において既知である。細胞の大集団から単一細胞を単離するための例示的な方法としては、手動細胞採集、フローサイトメトリー、磁気活性化細胞選別、およびマイクロフルイディクスが挙げられる。
【００４７】
集団から希少細胞を単離する、または小試料から単一細胞を単離するための方法も当該技術分野で既知である。誘電泳動（ＤＥＰ）マイクロ流体システムは、蛍光マーカーで同定した後、誘電泳動ケージを備えたマイクロ流体チップを使用して、電荷によって個別の細胞をナビゲートする。これらのシステムの利点は、すべての細胞が保存され、１０万個のプール内の単一細胞でさえ効率的に単離され得ることである。例示的なＤＥＰシステムは、ＤＥＰ−Ａｒｒａｙ（商標）システム（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。一実施形態において、子宮内膜細胞はＤＥＰシステムを使用して単一細胞試料に分離される。細胞を間質マーカーまたは上皮マーカーで標識して、２つの細胞集団を分離することができる。ＤＥＰシステムは、さらなる処理のために、それぞれ単一細胞をマイクロプレートのそれぞれの個別のウェルに分配することができる。
【００４８】
２．マイクロ流体ＰＣＲ
一実施形態において、処理された単一細胞由来のｃＤＮＡは、マイクロ流体ＰＣＲに使用される。マイクロフルイディクスは、ナノリットルまたはピコリットルのオーダーで大量の流体を含む試料を処理することができる超小型化デバイスである。マイクロ流体ＰＣＲシステムは、ナノリットルサイズの試料から核酸発現を正常に検出することができる。一実施形態において、マイクロ流体ＰＣＲ装置は単一細胞マイクロ流体ＰＣＲ装置である。市販されているマイクロ流体ＰＣＲ装置の一例としては、ＢｉｏＭａｒｋ（商標）ＨＤ単一細胞システム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）またはＣ１（商標）システム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）がある。
【００４９】
ｉ．ギャップ結合
ギャップ結合は、細胞と細胞との特別な細胞間接続である。これらの接続またはチャネルは、２つの細胞の細胞質間の直接細胞間コミュニケーションを提供し、最大約１ｋＤのサイズのイオンおよび代謝産物の迅速な交換を可能にする。ギャップ結合は、コネキシンタンパク質のクラスターから形成される。例示的なギャップ結合遺伝子としては、ＧＪＡ１、ＧＪＡ３、ＧＪＡ５、ＧＪＡ８、ＧＪＡ９、ＧＪＢ１、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ４、ＧＪＢ５、ＧＪＢ６、ＧＪＢ７、およびＧＪＣ２が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、ギャップ結合遺伝子の発現は、子宮内膜症を有する女性からの子宮内膜上皮細胞において上昇するが、子宮内膜間質細胞において低下する。
【００５０】
子宮内膜細胞と子宮内膜症の侵襲標的である中皮との間の細胞間コミュニケーションのモードとして、細胞間ギャップ結合のコミュニケーションが検討されている。従来の細胞アッセイならびに単一細胞分析を使用して、子宮内膜症病変の発生につながる子宮内膜細胞侵襲性に関与し得る特異的なギャップ結合タンパク質（チャネル形成コネキシン）を同定した。ギャップ結合遺伝子に加えて、他の調節遺伝子およびキナーゼが、ギャップ結合におけるコミュニケーションに関与する。ギャップ結合を調節する例示的なキナーゼとしては、チロシンキナーゼ、タンパク質キナーゼＣ、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ、ＭＡＰキナーゼ、ｃｄｃ２／サイクリンＢ、およびカゼインキナーゼＩ（Ｗａｒｎ−Ｃｒａｍｅｒ，Ｂ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌａｕ，Ａ．Ｆ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１６６２：８１〜９５（２００４）；Ｌａｍｐｅ，Ｐ．Ｄ．ａｎｄ  Ｌａｕ  Ａ．Ｆ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，３６：１１７１〜１１８６（２００４））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
一実施形態において、単一細胞試料由来のｃＤＮＡ中のＤＢＮ１、ＣＡＶ１、ＣＤＨ、ＣＤＫ１、ＣＤ４５、ＣＫ１９、ＣＳＮＫ、ＣＴＮＮＢ１、Ｃｘ４３、ＥｐＣＡＭ、ＧＡＰＤＨ、ＧＪＡ１、ＧＪＡ３、ＧＪＡ５、ＧＪＡ８、ＧＪＡ９、ＧＪＢ１、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ４、ＧＪＢ５、ＧＪＢ６、ＧＪＢ７、ＧＪＣ２、ＧＵＳＢ、ＫＲＴ１８、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＭＭＥ、Ｎｏｔｃｈ１、ＮＯＶ１、ＰＥＣＡＭ、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＲＫＡＣＧ、ＰＲＫＣＡ、ＳＮＡＩ１、ＳＲＣ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＪＡＰ１、ＴＪＰ１、ＴＪＰ２、Ｔｗｉｓｔ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＩＭ、Ｚｅｂ２、ＺＯ１、およびＺＯ２のＲＮＡ遺伝子発現は、マイクロ流体ＰＣＲによって測定される。
【００５２】
別の実施形態において、試料中の開示される遺伝子のうちの１つの発現レベルが、子宮内膜症のない健常な個体由来の試料中の同じ遺伝子の発現レベルと比較される。
【００５３】
Ｃ．子宮内膜症の診断
開示される方法において、ＤＢＮ１、ＣＡＶ１、ＣＤＨ、ＣＤＫ１、ＣＤ４５、ＣＫ１９、ＣＳＮＫ、ＣＴＮＮＢ１、Ｃｘ４３、ＥｐＣＡＭ、ＧＡＰＤＨ、ＧＪＡ１、ＧＪＡ３、ＧＪＡ５、ＧＪＡ８、ＧＪＡ９、ＧＪＢ１、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ４、ＧＪＢ５、ＧＪＢ６、ＧＪＢ７、ＧＪＣ２、ＧＵＳＢ、ＫＲＴ１８、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＭＭＥ、Ｎｏｔｃｈ１、ＮＯＶ１、ＰＥＣＡＭ、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＲＫＡＣＧ、ＰＲＫＣＡ、ＳＮＡＩ１、ＳＲＣ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＪＡＰ１、ＴＪＰ１、ＴＪＰ２、Ｔｗｉｓｔ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＩＭ、Ｚｅｂ２、ＺＯ１、およびＺＯ２を含有する群からの１つ以上の遺伝子の発現が、子宮内膜症のない対象からの子宮内膜上皮細胞における１つ以上の該遺伝子の発現と比較して上昇している、または子宮内膜症のない対象からの子宮内膜間質細胞における１つ以上の該遺伝子と比較して低下している場合、対象は、子宮内膜症と診断される。
【００５４】
上記遺伝子の発現レベルは、疾患の重症度とともに漸進的に増加または減少する。したがって、一実施形態において、遺伝子の発現レベルを用いて、子宮内膜症のステージを決定することができる。子宮内膜症上皮細胞試料と正常な子宮内膜上皮細胞試料との間で最も差のある発現を有する遺伝子には、実施例（以下の表１）における、ＣＤＨ２、ビメンチン、およびＣＴＮＮＢがある。
【００５５】
（表１）子宮内膜上皮細胞における種々の遺伝子の発現
Ｌｏｇ  １０発現＊：
2021521803.tif 000003
１７２：正常
１６４：子宮内膜症ステージＩ／ＩＩ
１７２：子宮内膜症ステージＩＩＩ／ＩＶ
＊発現は２−ΔＣｔによって定義され、Ｃｔは各遺伝子のＰＣＲサイクル閾値であり、Δ（ギリシャ語、デルタ）は標的遺伝子と正規化ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）との差である。
【００５６】
一実施形態において、子宮内膜症に対する検査をされる女性は、子宮内膜症の症状を有するか、またはこの疾患の家族歴を有する。子宮内膜症に対する検査をされる女性は、不妊治療を受けているか、または不妊症にかかっている可能性がある。一実施形態において、子宮内膜症に対する検査をされる女性は生殖年齢である。女性は１５歳から４５歳の間であり得る。
【００５７】
Ｄ．子宮内膜症治療薬
一実施形態において、対象は、開示される遺伝子の発現レベルに基づいて子宮内膜症と診断され、その後、子宮内膜症の治療を受ける。子宮内膜症の治療法は、疾患の症状の緩和に向けられている。この疾患の最も一般的な症状には、疼痛、出血、および不妊症が挙げられる。
【００５８】
ｉ．鎮痛剤
一実施形態は、子宮内膜症誘発性疼痛の治療法を提供する。鎮痛薬は、子宮内膜症の軽度の疼痛および炎症症状に使用することができる。最も一般的な鎮痛剤は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）である。非ステロイド性抗炎症剤の代表的な例としては、ピロキシカム、イソキシカム、テノキシカム、スドキシカムなどのオキシカム；アスピリン、ジサルシド、ベノリラート、トリリサート、サファプリン、ソルプリン、ジフルニサール、およびフェンドサルなどのサリチル酸塩；ジクロフェナク、フェンクロフェナク、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、イソキセパク、フロフェナク、チオピナク、ジドメタシン、アセマタシン、フェンチアザク、ゾメピラク、クリンダナク、オキセピナク、フェルビナク、およびケトロラクなどの酢酸誘導体；メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、ニフルル酸、およびトルフェナム酸などのフェナム酸；イブプロフェン、ナプロキセン、ベノキサプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、フェノプロフェン、フェンブフェン、インドプロフェン、ピルプロフェン、カルプロフェン、オキサプロジン、プラノプロフェン、ミロプロフェン、チオキサプロフェン、スプロフェン、アルミノプロフェン、およびチアプロフェニクなどのプロピオン酸誘導体；フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン、フェプラゾン、アザプロパゾン、およびトリメタゾンなどのピラゾールが挙げられるが、これらに限定されない。これらの非ステロイド性抗炎症剤の混合物も使用され得る。
【００５９】
ステロイド性抗炎症剤を、疼痛を治療するために使用することもできる。ステロイド性抗炎症薬の代表的な例としては、ヒドロコルチゾン、ヒドロキシル−トリアムシノロン、α−メチルデキサメタゾン、リン酸デキサメタゾン、ベクロメタゾンジプロピオネート、吉草酸クロベタゾール、デソニド、デスオキシメタゾン、酢酸デオキシコルチコステロン、デキサメタゾン、ジクロリゾン、二酢酸ジフロラゾン、吉草酸ジフルコルトロン、フルアドレノロン、フルクロロロンアセトニド、フルドロコルチゾン、ピバル酸フルメタゾン、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルコルチンブチルステル、フルオコルトロン、酢酸フルプレドニデン（フルプレドニリデン）、フルランドレノロン、ハルシノニド、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルテキソロン、フルセトニド、フルドロコルチゾン、フルラドレノロン、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフロラゾン、フルラドレノロンアセトニド、メドリゾン、アムシンフェル、アムシナフィド、ベタメタゾンおよびその残りのエステル、クロロプレドニゾン、酢酸クロロプレドニゾロン、クロコルトロン、クレスシノロン、ジクロリゾン、ジフルプレドナート、フルクロロニド、フルニソリド、フルオロメタロン、フルペロロン、フルプレドニゾロン、吉草酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンシクロペンチルプロピオネート、ヒドロコルタメート、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、トリアムシノロン、およびこれらの混合物などのコルチコステロイドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
抗炎症薬の効果がないほど疼痛が激しい場合、モルヒネ、フェンタニル、オキシコドン、トラマドール、ヒドロモルフォン、およびコデインなどの麻酔性鎮痛薬を女性に処方することができるが、これらに限定されない。
【００６１】
ｉｉ．ホルモン治療薬
子宮内膜症関連の疼痛および出血の別の治療法は、ホルモン治療薬である。異所性子宮内膜組織は月経と同様の周期を経るため、ホルモンは疾患に関連する疼痛を治療するのに有効である場合がある。ホルモンは、丸薬、注射もしくは注射剤、またはスプレー式点鼻薬の形態で送達することができる。経口避妊薬を用いて、ホルモンを送達することができる。通常、経口避妊薬にはエストロゲンとプロゲスチンの２種のホルモンが含まれている。例示的な組み合わせの経口避妊薬としては、デソゲストレル／エチニルエストラジオール、ジエノゲスト／吉草酸エストラジオール、ドロスピレノン／エチニルエストラジオール、ドロスピレノン／エチニルエストラジオール／レボメフォレート、エチノジオール／エチニルエストラジオール、レボノルゲストレル／エチニルエストラジオール、メストラノール／ノルエチンドロン、ノルエチンドロン／エチニルエストラジオール、ノルゲスチメート／エチニルエストラジオール、およびノルゲストレル／エチニルエストラジオールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
プロゲスチンは、女性ホルモンのプロゲステロンと同様に作用する薬物のグループである。プロゲスチンは、丸薬として、注射によって、または子宮内器具（ＩＵＤ）を通して摂取することができる。最も一般的に処方される経口避妊薬は、エストロゲンとプロゲスチンの複合製剤であるが、プロゲスチンのみの避妊薬も処方される。経口避妊薬は、女性の月経を減らすか、または完全に止めることによって子宮内膜症の症状を改善することが示されている。
【００６３】
ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニストは、一般に、子宮内膜症の女性に処方される。ＧｎＲＨアゴニストは、３ヶ月に１回の注射、１ヶ月に１回の注射、１日１回の注射、およびスプレー式点鼻薬を含む様々な形態がある。例示的なＧｎＲＨアゴニストとしては、ブセレリン、ゴセレリン、リュープロレリン、リュープロリド、ナファレリン、およびトリプトレリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
ダナゾールは、子宮内膜症に関連する骨盤痛の治療に効果的であることが示されているアンドロゲンである。
【００６５】
一実施形態において、開示される方法を使用して子宮内膜症と診断される女性は、ホルモン治療薬で治療される。
【００６６】
ｉｉｉ．外科的治療
手術は、子宮内膜症からの著しい鎮痛をもたらすことが示されている。腹腔鏡検査は、外科医が腹部に小さな切開を行い、腹腔鏡と呼ばれる小さな視認器具を腹部に挿入する手術の一種である。これにより、外科医は子宮内膜症病変を直接目視することができる。外科医は、病変を除去または破壊するために、腹部にレーザーまたは他の器具を挿入するための二次的な切開を行い得る。一実施形態において、本明細書に開示される方法で子宮内膜症と診断される患者は、腹腔鏡検査によって治療される。
【００６７】
開腹術は、子宮内膜病変を除去するために用いることもできる主要な腹部手術である。この術式では、外科医は腹腔と子宮を目視するために腹部を横切って切開する。外科医は、開腹中に子宮内膜症病変を除去することができる。一実施形態において、本明細書に開示される方法で子宮内膜症と診断される患者は、開腹術によって治療される。外科医は、開腹術中に、子宮全体が摘出される子宮摘出を行うこともできる。極度の疼痛または進行性もしくは再発性の子宮内膜症を有する患者は、子宮内膜症を根絶するために子宮摘出を行うことを選択することができる。一実施形態において、本明細書に開示される方法で子宮内膜症と診断される患者は、子宮摘出術によって治療される。
【００６８】
腹部の中心部に疼痛を有する女性は、疼痛を軽減するために骨盤の神経を切断し得る。これは、腹腔鏡検査または開腹術によって行うことができる。異なる神経経路を切断する術式が２つある。仙骨前神経切除術は子宮につながっている神経を切断する。一実施形態において、本明細書に開示される方法によって子宮内膜症と診断される患者は、仙骨前神経切除によって治療される。腹腔鏡子宮神経アブレーションと呼ばれる第２の術式は、子宮を固定する靭帯の神経を切断することを伴う。一実施形態において、本明細書に開示される方法を使用して子宮内膜症と診断される患者は、腹腔鏡子宮神経アブレーションによって治療される。
【実施例】
【００６９】
実施例１．ギャップ結合遺伝子は、子宮内膜症由来の子宮上皮細胞において上昇し、子宮内膜症由来の間質細胞において低下する
方法
子宮内膜症を有するまたは有しない女性からの正所性（子宮から）子宮内膜組織の獲得
子宮内膜症の有無は、腹腔鏡検査により確認した。すべての正所性子宮内膜試料は、ホルモン剤の投与を受けていない通常の周期の生殖年齢の女性（年齢範囲３０〜４５歳）から、月経周期の増殖期に得られた。子宮内膜症試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ分類に基づいてステージＩ〜ＩＶに分類された患者から得た。正常対象の場合、子宮内膜組織は、経口避妊薬を服用しておらず、腹腔鏡検査によって子宮内膜症がないことが示され、粘膜下筋腫または子宮内膜ポリープの所見がない、卵管不妊手術を受けている女性から単離した。生検材料からの初代子宮内膜上皮細胞（ＥＥＣ）および間質細胞（ＥＳＣ）の単離を、以前の研究によって確認された約９７％の純度を達成することが示されたＫｉｒｋおよびＩｒｗｉｎによって開発された方法を用いて行った。さらに、ＥＥＣの上皮性の性質は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）およびサイトケラチン１８の発現に対する染色を使用して、本試験において確認した。ＥＳＣはビメンチン染色によって確認した。表２は、試験で使用した正常対象および患者のリストを示す。単一細胞上で行なった広範な分析、および分析の前に初代細胞を大量に継代させない必要性のために、数は限定された。
【００７０】
（表２）患者のベース
2021521803.tif 000004
【００７１】
細胞培養
初代子宮内膜ＥＥＣおよびＥＳＣを、前述のように、抗生物質および抗真菌薬、５μｇ／ｍＬインスリン（Ｓｉｇｍａ）、および１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ，ＵＳＡ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２（１：１）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）中で培養した。実験は、低継代（≦４）を使用して行った。確立されたＬＰ９細胞（Ｃｏｒｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）を、腹膜中皮細胞のモデルとして使用した。コネキシン４３（Ｃｘ４３）タンパク質発現を調べるために、一般的な免疫蛍光染色法を、緑色蛍光コンジュゲート抗Ｃｘ４３抗体を用いて培養中のＥＳＣに使用した。ＥＳＣにおけるＣｘ４３発現を実験的に抑制するために、Ｃｘ４３に特異的なｓｉＲＮＡを細胞にトランスフェクトした。
【００７２】
マイクロ流体ＰＣＲによるコネキシン遺伝子パネル発現の単一細胞ＲＮＡスクリーニング
初代ＥＥＣおよびＥＳＣ培養物をＣ１（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃｏｒｐ）単一細胞単離および処理に供して、各細胞から増幅ｃＤＮＡを作製した。次いで、ｃＤＮＡを、Ｂｉｏｍａｒｋプラットフォーム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃｏｒｐ）を使用して、マイクロ流体ＰＣＲ遺伝子発現解析に供した。対応するＰＣＲプライマー配列コネキシンおよびギャップ結合調節パネルを、これらの遺伝子の発現の検出のために使用した。各マイクロ流体ＰＣＲチップアッセイにおいて、ヒト正常組織（カタログ番号４２３４５６５、ＢｉｏＣｈａｉｎ、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）由来のユニバーサルＲＮＡ（２００ｐｇ）およびテンプレートなしの対照（ＮＴＣ）をそれぞれ陽性対照および陰性対照として用いた。有効なＰＣＲ産物を、各遺伝子アンプリコンについてのアンプリコン融解温度曲線によって決定した。
【００７３】
結果
健康な対象からのものと比較した場合、子宮内膜症患者からの子宮内膜間質細胞において、特にステージＩＩＩ／ＩＶ子宮内膜症疾患において、ギャップ結合遺伝子発現の減少パターン（図１Ａ〜１Ｉの各プロットの上部）が観察された（図１Ａ〜１Ｅ）。重要なことに、これは、細胞が採取された月経期には無関係であった。
【００７４】
対照的に、子宮内膜症の濃縮上皮細胞において、正常由来試料と比較して多くのギャップ結合遺伝子の発現が増加したパターンが観察された（図１Ｆ〜１Ｉ）。遺伝子発現の漸進的な増加は、疾患段階でも観察されるが、いくつかの遺伝子については、この増加は子宮内膜症の最初期段階でも著しかった。
【００７５】
接着型および密封型の細胞間接触に関与する他の遺伝子、ならびにそれらを調節するキナーゼにおいても変化が見られた（図１Ａ〜１Ｉの各プロットの下部）が、これらは、先に述べたコネキシンパターンと比較してはるかに一貫性がなかった。
【００７６】
図２Ａ〜２ＢＢは、正常対象、ならびに間質細胞（図２Ａ〜２Ｎ）および上皮細胞（図２Ｏ〜２ＢＢ）の分離後の初期および後期の子宮内膜症患者からの単一細胞レベルでのすべてのコネキシン発現の定量ＰＣＲ分析を示す。試料識別子は、表３に記載する。実質的にすべてのコネキシン遺伝子は、間質細胞において疾患進行に伴う漸進的な発現減少を示した。上皮細胞は反対のパターンを示したが、主要なコネキシン（ＧＪＡ１）は患者間でほとんど差を示さなかった。
【００７７】
（表３）図２Ａ〜２ＢＢおよび３Ａ〜３Ｎの試料識別子
2021521803.tif 000005
【００７８】
図３Ａ〜３Ｎは、ギャップ結合活性の調節に関与する遺伝子（ＰＲＫＡＣ、ＰＲＫＣＢ、Ｃａｖ）、または細胞骨格アンカータンパク質をコードする遺伝子（Ｖｉｍ）、または接着結合（ＣＤＨ２、ＣＴＮＮＢ）および密着結合（ＴＪＰ１）のような他の種類の細胞−細胞相互作用について類似の分析を示す。いくつかの遺伝子は疾患とともに変化を示さなかったが（上皮細胞におけるＴＪＰ１、Ｃａｖ、および不図示の他のもの）、他の遺伝子はコネキシンを模倣した発現パターンを示した（間質細胞において疾患とともに減少するが、上皮細胞では増加する）。
【００７９】
実施例２．子宮内膜上皮細胞（Ｅ）および間質細胞（Ｓ）と中皮細胞（Ｍ）とのカップリングおよび侵襲性
方法
ホモタイプおよびヘテロタイプのギャップ結合細胞間コミュニケーション（ＧＪＩＣ）アッセイ（カップリングアッセイとしても記載）
ＧＪＩＣを、ギャップ結合を介して浸透できる蛍光色素カルセインの細胞間移動を使用して測定した。アッセイは、活性炭処理済みＦＢＳ（１０％）を補充した培養培地で行った。ドナー細胞をカルセインＡＭとともに２０分間、室温でインキュベートした。細胞内で、カルセインＡＭは、非特異的エステラーゼによってカルセインに切断され、細胞膜を通って拡散することが不可能になる。レシピエント細胞をコンフルエンスまで増殖させる。次いで、カルセイン標識ドナー細胞をレシピエント細胞層上に滴下（「パラシュート」）させ、ドナー細胞とレシピエント細胞との間のカルセイン移動を蛍光顕微鏡イメージングで観察した。ホモタイプの相互作用のために、子宮内膜上皮細胞（ＥＥＣ）、子宮内膜間質細胞（ＥＳＣ）、および中皮（ＬＰ９）のドナー細胞をそれぞれ同一タイプのレシピエント細胞にパラシュートさせた。ヘテロタイプのＧＪＩＣアッセイについては、ＥＥＣ（またはＥＳＣ）をＬＰ９レシピエント細胞上にパラシュートさせ、逆もまた同様に行った。初期最適化アッセイは、パラシュートから１．５〜２時間後、ＥＥＣ、ＥＳＣ、およびＬＰ９細胞における色素移動が最適に観察されたことを示した。Ｏｐｅｒｅｔｔａ自動顕微鏡（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上で、１ウェルあたり１０〜１５フィールドの蛍光画像を捕捉した。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒによって書かれたプログラムにより、プレート上のすべての細胞（位相コントラスト画像から）、ならびに元のドナー（１ウェルあたり１００±５０）、および経時的なカルセイン移動による色素充填レシピエントの同定が可能であった。データを、各条件の蛍光レシピエント細胞の数／ドナー細胞の数として表す。
【００８０】
経中皮侵襲アッセイ
経中皮侵襲をモデリングする３Ｄ侵襲アッセイは既出である。簡潔に述べると、ＬＰ９腹膜中皮細胞（ＰＭＣ）を、８μｍの細孔膜（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）上にコーティングした成長因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含有する２４ウェルインベージョンチャンバーインサート中でコンフルエンスまで増殖させた。次いで、２０，０００個の子宮内膜上皮細胞（ＥＥＣ）または子宮内膜間質細胞（ＥＳＣ）を、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で標識した後、調製したインサート中のＬＰ９ＰＭＣの融合層上に播種し、適切なｓｉＲＮＡで処理した。２０時間のインキュベーション後、インサート膜の上面に侵襲しなかった細胞を機械的に除去した。コーティングされた膜の底部の侵襲細胞をＤＡＰＩで染色し、２０倍の対物レンズを有する蛍光顕微鏡を使用して可視化した。各細胞型の侵襲アッセイを三つ組で行った。
【００８１】
結果
細胞のカップリングは、レシピエント細胞の単層上に滴下されたドナー細胞間のカルセイン移動を経時的に測定するパラシュートアッセイを使用して測定した（図４Ａ〜４Ｆ）。この移動速度を、正常（Ｎ）、初期（Ｉ〜ＩＩ）および後期（ＩＩＩ〜ＩＶ）の子宮内膜症患者における上皮細胞（ＥＥＣ−図４Ｇ）または間質細胞（ＥＳＣ−図４Ｈ）のいずれかの間のホモタイプカップリング［黒色の棒］、ならびにこれらの細胞のＬＰ９腹膜中皮細胞とのヘテロタイプカップリング［灰色の棒］について決定した。中皮細胞は、患者由来の間質細胞においてカップリングを誘発したが、正常な対象由来では誘発せず（図４Ｈ）、患者または正常な対象由来の上皮細胞においては誘発しなかった（図４Ｇ）。
【００８２】
Ｃｘ４３の免疫蛍光染色は、すべての対象からの間質細胞におけるＣｘ４３の内部分布を明らかにする（染色は、細胞の縁の周辺および細胞−細胞界面では濃縮されないことに注意−図５Ａ〜Ｃ）。これは、子宮内膜症が進行するにつれてより顕著であるが、意外なことに発現の顕著な減少は見られない（図５Ａ〜５Ｃ）。しかし、中皮細胞への間質細胞の曝露は、子宮内膜症試料中の細胞表面（矢印）へのＣｘ４３の再分布を引き起こす（図５Ｅおよび５Ｆ）が、正常な対象からの細胞においてはその程度はかなり低い（図５Ｄ）。中皮細胞への曝露時の細胞内貯蔵Ｃｘ４３のこの活性化は、図４Ｂ〜４Ｅに見られるヘテロタイプカップリングの劇的かつ急速な増加を説明することができる。
【００８３】
中皮細胞単層を介した子宮内膜上皮細胞（Ｅ）および間質細胞（Ｓ）の侵襲も、子宮内膜症の侵襲プロセスの特徴を模倣するために、ボイデンチャンバー内で測定した（図６）。子宮内膜細胞は、未処理のまま［黒色の棒］、またはＣｘ４３を標的とするｓｉＲＮＡ［灰色の棒］、もしくは対照タンパク質ＧＡＰＤＨ［斜線入り棒］での処理のいずれかに供した。上皮細胞は、Ｃｘ４３依存的様式で侵襲性であったが、これは患者間で変化し、疾患状態と相関しなかった（図６）。対照的に、間質細胞は、疾患進行とともに侵襲性の増加を示したが、これは、疾患状態においてＣｘ４３にのみ依存していた。
【００８４】
上記の明細書では、本発明はその特定の実施形態に関連して記載されており、多くの詳細は例示目的で提示されているが、本発明はさらなる実施形態の影響を受けやすく、本明細書に記載される特定の詳細は、本発明の基本原理から逸脱することなく大きく変化し得ることは当業者には明白であろう。
【００８５】
本明細書に引用されているすべての参照文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。本発明は、その趣旨または本質的な特性から逸脱することなく他の特定の形態で具体化されることが可能であり、したがって、本発明の範囲を示している上記の明細書よりはむしろ添付の特許請求の範囲を参照する必要がある。
【図１−１】
2021521803.tif 000007
【図１−２】
2021521803.tif 000008
【図２−１】
2021521803.tif 000009
【図２−２】
2021521803.tif 000010
【図２−３】
2021521803.tif 000011
【図２−４】
2021521803.tif 000012
【図３−１】
2021521803.tif 000013
【図３−２】
2021521803.tif 000014
【図４−１】
2021521803.tif 000015
【図４−２】
2021521803.tif 000016
【図５】
2021521803.tif 000017
【図６】
2021521803.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】令和3年2月26日(2021.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮内膜症の検出を必要とする対象において子宮内膜症を検出する方法であって、
該対象から得られた子宮内膜間質細胞を濃縮または増殖させることと、
増幅ｃＤＮＡを産生するために、該濃縮または増殖された子宮内膜間質細胞をマイクロ流体チャンバー内の単一細胞処理に供することと、
ＤＢＮ１、ＣＡＶ１、ＣＤＨ、ＣＤＫ１、ＣＤ４５、ＣＫ１９、ＣＳＮＫ、ＣＴＮＮＢ１、Ｃｘ４３、ＥｐＣＡＭ、ＧＡＰＤＨ、ＧＪＡ１、ＧＪＡ３、ＧＪＡ５、ＧＪＡ８、ＧＪＡ９、ＧＪＢ１、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ４、ＧＪＢ５、ＧＪＢ６、ＧＪＢ７、ＧＪＣ２、ＧＵＳＢ、ＫＲＴ１８、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＭＭＥ、Ｎｏｔｃｈ１、ＮＯＶ１、ＰＥＣＡＭ、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＲＫＡＣＧ、ＰＲＫＣＡ、ＳＮＡＩ１、ＳＲＣ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＪＡＰ１、ＴＪＰ１、ＴＪＰ２、Ｔｗｉｓｔ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＩＭ、Ｚｅｂ２、ＺＯ１、ＺＯ２、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の遺伝子のＲＮＡ遺伝子発現を検出するために、該増幅ｃＤＮＡをマイクロ流体ＰＣＲに供することと、
該１つ以上の遺伝子の発現が、子宮内膜症のない対象からの子宮内膜間質細胞における該１つ以上の遺伝子の発現と比較して低下している場合に、子宮内膜症を検出することと
を含む、方法。
【請求項２】
子宮内膜症の検出を必要とする対象において子宮内膜症を検出する方法であって、
該対象から得られた子宮内膜上皮細胞を濃縮または増殖させることと、
増幅ｃＤＮＡを産生するために、該濃縮または増殖された子宮内膜上皮細胞をマイクロ流体チャンバー内の単一細胞処理に供することと、
ＤＢＮ１、ＣＡＶ１、ＣＤＨ、ＣＤＫ１、ＣＤ４５、ＣＫ１９、ＣＳＮＫ、ＣＴＮＮＢ１、Ｃｘ４３、ＥｐＣＡＭ、ＧＡＰＤＨ、ＧＪＡ１、ＧＪＡ３、ＧＪＡ５、ＧＪＡ８、ＧＪＡ９、ＧＪＢ１、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ４、ＧＪＢ５、ＧＪＢ６、ＧＪＢ７、ＧＪＣ２、ＧＵＳＢ、ＫＲＴ１８、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＭＭＥ、Ｎｏｔｃｈ１、ＮＯＶ１、ＰＥＣＡＭ、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＲＫＡＣＧ、ＰＲＫＣＡ、ＳＮＡＩ１、ＳＲＣ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＪＡＰ１、ＴＪＰ１、ＴＪＰ２、Ｔｗｉｓｔ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＩＭ、Ｚｅｂ２、ＺＯ１、ＺＯ２、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の遺伝子のＲＮＡ遺伝子発現を検出するために、該増幅ｃＤＮＡをマイクロ流体ＰＣＲに供することと、
該１つ以上の遺伝子の発現が、子宮内膜症のない対象からの子宮内膜上皮細胞における該１つ以上の遺伝子の発現と比較して上昇している場合に、子宮内膜症を検出すること
を含む、方法。
【請求項３】
子宮内膜症の検出を必要とする対象において子宮内膜症を検出する方法であって、
該対象から得られた子宮内膜間質細胞および子宮内膜上皮細胞を濃縮または増殖させることと、
増幅ｃＤＮＡを産生するために、該濃縮または増殖された子宮内膜間質細胞および子宮内膜上皮細胞をマイクロ流体チャンバー内の単一細胞処理に供することと、
ＤＢＮ１、ＣＡＶ１、ＣＤＨ、ＣＤＫ１、ＣＤ４５、ＣＫ１９、ＣＳＮＫ、ＣＴＮＮＢ１、Ｃｘ４３、ＥｐＣＡＭ、ＧＡＰＤＨ、ＧＪＡ１、ＧＪＡ３、ＧＪＡ５、ＧＪＡ８、ＧＪＡ９、ＧＪＢ１、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ４、ＧＪＢ５、ＧＪＢ６、ＧＪＢ７、ＧＪＣ２、ＧＵＳＢ、ＫＲＴ１８、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＭＭＥ、Ｎｏｔｃｈ１、ＮＯＶ１、ＰＥＣＡＭ、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＲＫＡＣＧ、ＰＲＫＣＡ、ＳＮＡＩ１、ＳＲＣ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＪＡＰ１、ＴＪＰ１、ＴＪＰ２、Ｔｗｉｓｔ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＩＭ、Ｚｅｂ２、ＺＯ１、ＺＯ２、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の遺伝子のＲＮＡ遺伝子発現を検出するために、該増幅ｃＤＮＡをマイクロ流体ＰＣＲに供することと、
該１つ以上の遺伝子の発現が、子宮内膜症のない対象からの子宮内膜間質細胞における該１つ以上の遺伝子の発現と比較して低下しており、子宮内膜症のない対象からの子宮内膜上皮細胞における該１つ以上の遺伝子の発現と比較して上昇している場合に、子宮内膜症を検出することと
を含む、方法。
【請求項４】
前記子宮内膜細胞が、月経血から得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記子宮内膜細胞が、子宮内膜生検材料から得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記対象を子宮内膜症を検出することが、該子宮内膜症を病期分類することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記子宮内膜症が、表在性子宮内膜症（ステージＩ／ＩＩ）または深部浸潤性子宮内膜症（ステージＩＩＩ／ＩＶ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記対象が、子宮内膜症の症状を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記対象が、子宮内膜症と以前に診断されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記子宮内膜症が、表在性子宮内膜症（ステージＩ／ＩＩ）または深部浸潤性子宮内膜症（ステージＩＩＩ／ＩＶ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記子宮内膜間質細胞が、子宮内膜間質細胞マーカーＣＤ１０、ＣＤ１４６、およびＣＤ１３を使用して該細胞を選別することによって単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記子宮内膜上皮細胞が、子宮内膜上皮細胞マーカーＥｐＣａｍ＋、ＣＤ４５、およびＣＤ９を使用して該細胞を選別することによって単離される、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
子宮内膜症のない対象からの子宮内膜間質細胞における前記１つ以上の遺伝子の発現と比較して発現が低下している該１つ以上の遺伝子には、Ｃｘ４３、ＭＡＰＫ、ＴＧＦＢＲ２、ＺＯ２、およびＺＯ１が含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
子宮内膜症のない対象からの子宮内膜間質細胞における前記１つ以上の遺伝子の発現と比較して発現が低下している該１つ以上の遺伝子には、ＳＮＡＩ１、Ｔｗｉｓｔ１、Ｚｅｂ２、Ｎｏｔｃｈ１、ＶＥＧＦＲ１、およびＣＤ４５が含まれる、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
一実施形態において、対象は子宮内膜症の症状を有する。別の実施形態において、対象は子宮内膜症と以前に診断されている。
[本発明1001]
子宮内膜症の診断および治療を必要とする対象において子宮内膜症を診断および治療する方法であって、
該対象から得られた子宮内膜間質細胞を濃縮または増殖させることと、
増幅ｃＤＮＡを産生するために、該濃縮または増殖された子宮内膜間質細胞をマイクロ流体チャンバー内の単一細胞処理に供することと、
ＤＢＮ１、ＣＡＶ１、ＣＤＨ、ＣＤＫ１、ＣＤ４５、ＣＫ１９、ＣＳＮＫ、ＣＴＮＮＢ１、Ｃｘ４３、ＥｐＣＡＭ、ＧＡＰＤＨ、ＧＪＡ１、ＧＪＡ３、ＧＪＡ５、ＧＪＡ８、ＧＪＡ９、ＧＪＢ１、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ４、ＧＪＢ５、ＧＪＢ６、ＧＪＢ７、ＧＪＣ２、ＧＵＳＢ、ＫＲＴ１８、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＭＭＥ、Ｎｏｔｃｈ１、ＮＯＶ１、ＰＥＣＡＭ、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＲＫＡＣＧ、ＰＲＫＣＡ、ＳＮＡＩ１、ＳＲＣ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＪＡＰ１、ＴＪＰ１、ＴＪＰ２、Ｔｗｉｓｔ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＩＭ、Ｚｅｂ２、ＺＯ１、ＺＯ２、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の遺伝子のＲＮＡ遺伝子発現を検出するために、該増幅ｃＤＮＡをマイクロ流体ＰＣＲに供することと、
該１つ以上の遺伝子の発現が、子宮内膜症のない対象からの子宮内膜間質細胞における該１つ以上の遺伝子の発現と比較して低下している場合に、該対象を子宮内膜症と診断することと、
子宮内膜症と診断された該対象に子宮内膜症の治療を施すことと
を含む、方法。
[本発明1002]
子宮内膜症の診断および治療を必要とする対象において子宮内膜症を診断および治療する方法であって、
該対象から得られた子宮内膜上皮細胞を濃縮または増殖させることと、
増幅ｃＤＮＡを産生するために、該濃縮または増殖された子宮内膜上皮細胞をマイクロ流体チャンバー内の単一細胞処理に供することと、
ＤＢＮ１、ＣＡＶ１、ＣＤＨ、ＣＤＫ１、ＣＤ４５、ＣＫ１９、ＣＳＮＫ、ＣＴＮＮＢ１、Ｃｘ４３、ＥｐＣＡＭ、ＧＡＰＤＨ、ＧＪＡ１、ＧＪＡ３、ＧＪＡ５、ＧＪＡ８、ＧＪＡ９、ＧＪＢ１、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ４、ＧＪＢ５、ＧＪＢ６、ＧＪＢ７、ＧＪＣ２、ＧＵＳＢ、ＫＲＴ１８、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＭＭＥ、Ｎｏｔｃｈ１、ＮＯＶ１、ＰＥＣＡＭ、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＲＫＡＣＧ、ＰＲＫＣＡ、ＳＮＡＩ１、ＳＲＣ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＪＡＰ１、ＴＪＰ１、ＴＪＰ２、Ｔｗｉｓｔ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＩＭ、Ｚｅｂ２、ＺＯ１、ＺＯ２、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の遺伝子のＲＮＡ遺伝子発現を検出するために、該増幅ｃＤＮＡをマイクロ流体ＰＣＲに供することと、
該１つ以上の遺伝子の発現が、子宮内膜症のない対象からの子宮内膜上皮細胞における該１つ以上の遺伝子の発現と比較して上昇している場合に、該対象を子宮内膜症と診断することと、
子宮内膜症と診断された該対象に子宮内膜症の治療を施すことと
を含む、方法。
[本発明1003]
子宮内膜症の診断および治療を必要とする対象において子宮内膜症を診断および治療する方法であって、
該対象から得られた子宮内膜間質細胞および子宮内膜上皮細胞を濃縮または増殖させることと、
増幅ｃＤＮＡを産生するために、該濃縮または増殖された子宮内膜間質細胞および子宮内膜上皮細胞をマイクロ流体チャンバー内の単一細胞処理に供することと、
ＤＢＮ１、ＣＡＶ１、ＣＤＨ、ＣＤＫ１、ＣＤ４５、ＣＫ１９、ＣＳＮＫ、ＣＴＮＮＢ１、Ｃｘ４３、ＥｐＣＡＭ、ＧＡＰＤＨ、ＧＪＡ１、ＧＪＡ３、ＧＪＡ５、ＧＪＡ８、ＧＪＡ９、ＧＪＢ１、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ４、ＧＪＢ５、ＧＪＢ６、ＧＪＢ７、ＧＪＣ２、ＧＵＳＢ、ＫＲＴ１８、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＭＭＥ、Ｎｏｔｃｈ１、ＮＯＶ１、ＰＥＣＡＭ、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＲＫＡＣＧ、ＰＲＫＣＡ、ＳＮＡＩ１、ＳＲＣ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＪＡＰ１、ＴＪＰ１、ＴＪＰ２、Ｔｗｉｓｔ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＩＭ、Ｚｅｂ２、ＺＯ１、ＺＯ２、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の遺伝子のＲＮＡ遺伝子発現を検出するために、該増幅ｃＤＮＡをマイクロ流体ＰＣＲに供することと、
該１つ以上の遺伝子の発現が、子宮内膜症のない対象からの子宮内膜間質細胞における該１つ以上の遺伝子の発現と比較して低下しており、子宮内膜症のない対象からの子宮内膜上皮細胞における該１つ以上の遺伝子の発現と比較して上昇している場合に、該対象を子宮内膜症と診断することと、
子宮内膜症と診断された該対象に子宮内膜症の治療を施すことと
を含む、方法。
[本発明1004]
前記子宮内膜細胞が、月経血から得られる、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記子宮内膜細胞が、子宮内膜生検材料から得られる、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記子宮内膜症の治療が、抗炎症薬、ホルモン療法、または患部組織の外科的除去を含む群から選択される、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記対象を子宮内膜症と診断することが、該子宮内膜症を病期分類することをさらに含む、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記子宮内膜症が、表在性子宮内膜症（ステージＩ／ＩＩ）または深部浸潤性子宮内膜症（ステージＩＩＩ／ＩＶ）である、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記対象が、子宮内膜症の症状を有する、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記対象が、子宮内膜症と以前に診断されている、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記子宮内膜症が、表在性子宮内膜症（ステージＩ／ＩＩ）または深部浸潤性子宮内膜症（ステージＩＩＩ／ＩＶ）である、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記子宮内膜間質細胞が、子宮内膜間質細胞マーカーＣＤ１０、ＣＤ１４６、およびＣＤ１３を使用して該細胞を選別することによって単離される、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記子宮内膜上皮細胞が、内皮上皮細胞マーカーＥｐＣａｍ＋、ＣＤ４５、およびＣＤ９を使用して該細胞を選別することによって単離される、本発明1002の方法。
[本発明1014]
子宮内膜症のない対象からの子宮内膜間質細胞における前記１つ以上の遺伝子の発現と比較して発現が低下している該１つ以上の遺伝子には、Ｃｘ４３、ＭＡＰＫ、ＴＧＦＢＲ２、ＺＯ２、およびＺＯ１が含まれる、本発明1001の方法。
[本発明1015]
子宮内膜症のない対象からの子宮内膜間質細胞における前記１つ以上の遺伝子の発現と比較して発現が低下している該１つ以上の遺伝子には、ＳＮＡＩ１、Ｔｗｉｓｔ１、Ｚｅｂ２、Ｎｏｔｃｈ１、ＶＥＧＦＲ１、およびＣＤ４５が含まれる、本発明1001の方法。
【国際調査報告】
2021521803.tif 000019
2021521803.tif 000020
2021521803.tif 000021
2021521803.tif 000022
2021521803.tif 000023