(57)【要約】  １以上の標的蛋白質をコーディングする１以上のポリヌクレオチドを含む組み換え微生物由来の細胞外小嚢（ＥＶ）、該組み換え微生物から分離された細胞外小嚢、及びその用途に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の標的蛋白質をコーディングする１以上のポリヌクレオチドを含む組み換え微生物に由来する細胞外小嚢であって、前記微生物は、乳酸菌または酵母である細胞外小嚢。
【請求項２】
前記標的蛋白質は、信号ペプチドが連結されているものであり、それにより、前記標的タンパク質が、前記信号配列に連結されていないものに比べ、前記微生物は、前記標的蛋白質を増加させた量で、前記細胞外小嚢に搭載させるものである、請求項１に記載の細胞外小嚢。
【請求項３】
前記乳酸菌は、Lactobacillus、Lactococcus及びBifidobacteriumからなる群から選択された属に属するものである、請求項１に記載の細胞外小嚢。
【請求項４】
前記酵母は、Saccharomyces、Pichia及びHansenulaからなる群から選択された属に属するものである、請求項１に記載の細胞外小嚢。
【請求項５】
前記標的蛋白質は、成長因子、シトキン、抗体、酵素、阻害蛋白質、及びそれらの断片からなる群れから選択された以上である、請求項１に記載の細胞外小嚢。
【請求項６】
前記標的タンパク質は、ＥＧＦ、ＦＧＦ１及びＦＧＦ２からなる群から選択された１以上である、請求項５に記載の細胞外小嚢。
【請求項７】
前記信号ペプチドは、配列番号４のヌクレオチド配列によってコーディングされるか、あるいは配列番号２１ないし６０からならなる群から選択されたアミノ酸配列を有するものである、請求項１に記載の細胞外小嚢。
【請求項８】
前記細胞外小嚢は、前記組み換え微生物の培養液から分離されたものである、請求項１に記載の細胞外小嚢。
【請求項９】
前記細胞外小嚢は、前記微生物培養液を１００，０００ｘｇ以上の超遠心分離下で、沈降によって分離させたものである、請求項８に記載の細胞外小嚢。
【請求項１０】
約２０ｎｍないし約５００ｎｍの直径を有するものである、請求項１に記載の細胞外小嚢。
【請求項１１】
活性成分として、請求項１ないし１０のうちいずれか１項に記載の細胞外小嚢、及び担体を含む、個体に標的タンパク質を伝達するための組成物。
【請求項１２】
標的タンパク質を、経皮、皮膚内、経口、経粘膜または粘膜内に伝達するためである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
薬剤学的または化粧学的に使用するためである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
皮膚しわ軽減、皮膚ホワイトニング、紫外線遮断または炎症軽減のためのものである、請求項１１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に係わる交差参照（cross−reference）
本出願は、２０１８年５月４日に韓国特許庁に出願され、その開示が、全体として援用により、本明細書に統合される、韓国特許出願番号１０−２０１８−００５２１５７の優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、標的蛋白質をコーディングするポリヌクレオチドを含む組み換え微生物由来の細胞外小嚢及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
ほとんどの動物細胞は、多様な大きさと成分とを有する細胞内起源の細胞外小嚢を分泌する。原核生物及び真核生物は、いずれも細胞外小嚢を分泌すると知られている。
細胞外小嚢は、小さくは、直径約２０ｎｍから、大きくは、直径約５μｍを有する膜構造小嚢体である。該細胞外小嚢は、その大きさと構成とにおいて異質性があり、エクソソーム（exosome；約３０ないし約１００ｎｍ）、エクトソーム（ectosome）、マイクロ小嚢（microvesicle；約１００ないし約１，０００ｎｍ）、マイクロ粒子（microparticle）、外膜小嚢（outer membrane vesicle）のような多数の異なる種を含む。該細胞外小嚢の特性は、その起源になる細胞の特性に影響を受ける。
一方、細胞内物質（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質など）は、細胞外小嚢に自然に搭載され、細胞外に分泌されうる。該細胞外小嚢は、生体膜成分と同一であり、生体互換性（biocompatibility）が高く、その大きさがナノサイズほどに小さく、物質伝達効率にすぐれる。従って、既存のリポソームなどの伝達システムの代わりに、細胞外小嚢を利用した薬物を伝達する研究が進められている。しかし、標的蛋白質が該細胞外小嚢に搭載されるとき、標的蛋白質の細胞外小嚢への搭載効率が低かった。従って、細胞外小嚢に標的蛋白質を優秀な効率で安定して搭載させることができる技術への要求が存在した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の１以上の具現例は、１以上の標的蛋白質をコーディングする１以上のポリヌクレオチドを含む組み換え微生物由来の細胞外小嚢として、前記微生物は、乳酸菌または酵母である細胞外小嚢を含むことである。
本発明の１以上の具現例は、前述の組み換え微生物から分離された細胞外小嚢を含むことである。
本発明の１以上の具現例は、有効成分として、前述の組み換え微生物由来の細胞外小嚢及び担体を含む１以上の標的蛋白質を個体に伝達するための組成物を含むことである。
本発明の１以上の具現例は、前記組成物を個体に投与する段階を含む個体の疾病を治療する方法を含むことである。
本発明の１以上の具現例は、前記組成物を個体に投与する段階を含む個体に化粧料を適用する方法を含むことである。
本発明の１以上の具現例は、前述の微生物を培養して培養物を得る段階と、前記培養物から細胞外小嚢を分離する段階と、を含む、細胞外小嚢を生産する方法を含むことである。
追加の様相は、一部は、以下で説明する説明書に開示され、一部は、上前説明書から明白であったり、提供された具現例の実施によって知るようになったりするであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
その例が添付図面に例示されている具体例に参照が詳細になされ、図面全体において、類似参照番号は、類似要素を示す。従って、本具体例は、他の形態を有することができ、本明細書に開示された前記説明書に限定されるものであると解釈されるものではない。それにより、前記具体例は、本説明の様相を説明するために、図面を参照することにより、以下において単純に記述される。
【０００６】
具現例の１様相は、１以上の標的蛋白質をコーディングする１以上のポリヌクレオチドを含む組み換え微生物に由来する細胞外小嚢として、前記組み換え微生物は、乳酸菌または酵母である細胞外小嚢を提供する。
【０００７】
前記標的蛋白質は、信号ペプチドに連結されうる。すなわち、前記標的蛋白質は、信号ペプチドと標的蛋白質との融合蛋白質でもある。前記微生物は、前記標的蛋白質を増加させた量で、細胞外小嚢（ＥＶ：extracellular vesicle）に搭載することができる。その場合、前記組み換え微生物は、信号ペプチドがない１以上の標的蛋白質をコーディングする１以上のポリヌクレオチドを含む組み換え微生物に比べ、増大された細胞外小嚢搭載能を有するものでもある。該細胞外小嚢搭載能とは、標的蛋白質がＥＶ内に含まれる程度、または標的蛋白質が、ＥＶ内に発現される程度を示す。該細胞外小嚢搭載能は、標的蛋白質をコーディングするポリヌクレオチドを含まない両親微生物に対する搭載能を示すものでもある。
【０００８】
前記信号ペプチドは、配列番号４のヌクレオチド配列によってコーディングされるか、あるいは配列番号２１ないし６０のアミノ酸配列のうちいずれか一つであるか、それを含む配列であるか、あるいはそれと類似した配列でもある。
【０００９】
前記組み換え微生物において、前記乳酸菌は、Lactobacillus属、Lactococcus属及びBifidobacteriumからなる群から選択された属に属しうる。前記乳酸菌は、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus brevisまたはLactobacillus plantarumでもある。
【００１０】
前記組み換え微生物において、前記酵母は、Saccharomyces、Pichia及びHansenulaからなる群から選択された属に属しうる。Saccharomycesは、Ｓ．cerevisiaeでもある。Pichiaは、Pichia pastorisでもあり、Hansenulaは、Hansenula polymorphaでもある。
【００１１】
前記組み換え微生物において、前記標的蛋白質は、成長因子、シトキン、抗体、酵素、阻害蛋白質、またはそれらの断片でもある。前記成長因子は、線維芽細胞成長因子でもある。前記標的蛋白質は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ：fibroblast growth factor）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ：epidermal growth factor）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ：hepatocyte growth factor）、インシュリン類似成長因子（ＩＧＦ：insulin-like growth factor）、胎盤成長因子（ＰＧＦ：placenta growth factor：ＰＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ：platelet-derived growth factor）、形質転換成長因子（ＴＧＦ：transforming growth factor）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ：vascular endothelial growth factor）、チオレドキシン（ＴＲＸ：thioredoxin）、インターロイキン−１（ＩＬ−１：interleukin−１）、インターロイキン−１０、インターロイキン−２２、インターロイキン−１３及び腫瘍懐死因子（ＴＮＦ：tumor necrosis factor）からなる群から選択されたものでもある。前記標的蛋白質は、例えば、ＩＬ−２２、ＥＧＦ、ＩＧＦ１、ＦＧＦ１（以下、ａＦＧＦ（acidic fibroblast growth factor）ともいう）、ＦＧＦ２（以下、ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）ともいう）、ＦＧＦ７（以下、ＫＧＦ（keratinocyte growth factor）ともいう）、ＴＧＦａ及びＴＲＸからなる群から選択されたものでもある。
【００１２】
前記組み換え微生物において、前記信号ペプチドは、配列番号４のヌクレオチド配列によってコーディングされるもの、または配列番号２１ないし６０のアミノ酸配列のうちいずれか一つでもある。前記信号ペプチドをコーディングする遺伝子は、信号ペプチドが、前記標的蛋白質のＮ末端に連結されるように連結されたものでもある。前記信号ペプチドは、前記蛋白質に対し、自然なものまたは外来的（heterologous）なものでもある。前記標的蛋白質は、前記微生物に対し、外来蛋白質（heterologous protein）でもある。前記組み換え微生物は、前記標的蛋白質を発現するものでもある。前記標的蛋白質は、信号ペプチドが切られた状態でＥＶに搭載されるものでもある。前記標的蛋白質は、ＥＶの膜またはその内部に搭載されるものでもある。
【００１３】
前記組み換え微生物において、前記標的蛋白質をコーディングするポリヌクレオチドは、発現可能なものでもある。前記ポリヌクレオチドは、転写調節配列と作動可能に連結されたものでもある。前記転写調節配列は、プローモーター、オペレーター、エンハンサーまたはターミネーターでもある。前記ポリヌクレオチドは、翻訳調節配列と作動可能に連結されたものでもある。前記翻訳調節配列は、リボソーム結合サイト配列（ribosome binding site sequence）またはリボソーム進入サイト配列（ribosome entry site sequence）でもある。前記ポリヌクレオチドは、前記微生物のゲノムに統合されているか、あるいは独立して存在するものでもある。前記ポリヌクレオチドは、ベクターに含まれたものでもある。前記ベクターは、発現ベクターでもある。前記ベクターは、プラスミドまたはウイルス性ベクターでもある。
【００１４】
具現例の他の様相は、前述の組み換え微生物から分離された細胞外小嚢を提供する。
具現例の他の様相は、活性成分として、前述の組み換え微生物由来の細胞外小嚢及び担体を有効成分として含む１以上の標的蛋白質を個体に伝達するための組成物を提供する。
前記組み換え微生物及び前記組成物に係わる具体例において、前記細胞外小嚢は、前記微生物の培養液から分離されたものでもある。すなわち、前記細胞外小嚢は、細胞外に分泌されるものでもある。前記細胞外小嚢は、約２０nmないし約５００ｎｍ、例えば、約２０nmないし約２００ｎｍ、約１００nmないし約２００ｎｍの平均径を有するものでもある。前記細胞外小嚢は、前述の標的蛋白質を含むものでもある。前記標的蛋白質は、前記細胞外小嚢の膜またはその内部に位置するものでもある。
【００１５】
前記細胞外小嚢は、培養液からそれを分離することができる任意の方法によって分離されたものでもある。例えば、前記細胞外小嚢は、遠心分離、超遠心分離（ultracentrifugation）、フィルターによる濾過、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、沈澱、免疫沈降、プリフロー電気泳動、毛細管電気泳動、またはそれらの組み合わせによっても分離される。前記分離方法は、不純物除去のための洗浄、及び濃縮などの過程を含んでもよい。前記細胞外小嚢は、下記の前記細胞外小嚢を分離する方法によって生産されたものでもある。前記細胞外小嚢は、前記微生物培養液を、カットオフ１０ｋＤ以上、例えば、５０ｋＤ以上、１００ｋＤ以上、３００ｋＤ以上または５００ｋＤ以上の超微細フィルターを使用して限外濾過する方法によって生産されたものでもある。前記細胞外小嚢は、前記微生物培養液を、１００，０００ｘｇ以上の超遠心分離で沈降するものでもある。前記分離は、下記の第７様相による細胞外小嚢を生産する方法によって生産されたものでもある。
【００１６】
前記組成物に係わる具体例において、前記担体は、生理的に許容可能なもの、例えば、薬剤学的または化粧品製造学的に許容可能なものでもある。前記担体は、一般的に使用される食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝液、シクロデキストリン、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソーム、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。また、前記担体は、抗酸化剤、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
【００１７】
前記組成物は、経口投与用または非経口投与用の剤形を有するものでもある。前記非経口投与剤形は、局所投与剤形でもある。該局所投与剤形は、皮膚投与または粘膜投与の剤形でもある。前記非経口投与剤形は、溶液、懸濁液、乳濁液、皮膚外用剤、スプレーまたはパフの剤形を有するものでもある。
【００１８】
前記組成物は、皮膚適用、粘膜適用または鼻腔投与などにより、個体に投与されうる。
該投与量は、患者の体重・年齢・性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率、及び疾患の重症度などによっても異なる。一日投与量は、治療を必要とする個体に投与されることにより、軽減された疾病状態に対する治療に十分な有効成分の量を意味する。該投与量は、体重７０ｋｇである成人個体を基準にするとき、約０．０１ないし１，０００ｍｇ／日、または約０．０１ないし約５００ｍｇ／日であり、一定時間間隔で、１日に１回ないし数回に分割投与されうる。
【００１９】
前記組成物は、化粧用組成物でもある。前記化粧用組成物は、化粧組成物に一般的に利用される成分が含まれてもよい。前記化粧用組成物は、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、香料のような一般的な補助剤及び担体を含んでもよい。
前記化粧用組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、オイル、粉末ファウンデーション、乳濁液ファウンデーション、ワックスファウンデーションまたはスプレーでもある。前記化粧用組成物は、栄養クリーム、収斂化粧水、柔軟化粧水、ローション、エッセンス、栄養剤剤をまたはマッサージクリームの剤形を有するものでもある。
【００２０】
前記組成物は、個体において、線維芽細胞または角質形成細胞の成長またはコラーゲン合成を促進させるためのものでもある。前記組成物は、皮膚老化防止またはしわ改善のために使用するためのものでもある。その場合、前記標的蛋白質は、成長因子でもある。
前記組成物は、前記個体に局所的に標的蛋白質を伝達するためのものでもある。前記組成物は、経皮(transdermally)、皮膚内(intradermally)、経口、経粘膜(transmucosally)または粘膜を介して伝達するためのものでもある。
前記組成物において、前記個体は、哺乳動物でもある。前記哺乳動物は、ヒト、犬、猫、馬または豚でもある。
具体的な他の様相は、前記組成物を個体に投与する段階を含む個体の疾病を治療する方法を提供する。前記個体は、哺乳動物でもある。前記哺乳動物は、ヒト、犬、猫、馬または豚でもある。前記疾病は、炎症性疾患、創傷、アトピー皮膚炎、乾癬またはにきびでもある。
【００２１】
具体的な他の様相は、前記組成物を個体に投与する段階を含む個体に化粧料を適用する方法を提供する。前記投与は、個体の皮膚に塗布するものでもある。前記投与は、老化された皮膚、またはしわの寄った皮膚の部位に塗布するものでもある。前記化粧料を適用する方法は、老化された皮膚またはしわの寄った皮膚を改善させるためのものでもある。具体的な他のは、前述組み換え微生物を培養し、培養物を得る段階と、前記培養物から細胞外小嚢を分離する段階と、を含む、細胞外小嚢を生産する方法を提供する。
【００２２】
前記培養は、前記微生物の成長に有用な培地内においてインキュベーションするものでもある。前記培養は、乳酸菌または酵母に適すると知られた条件、例えば、温度条件及び撹拌条件によっても行われる。
前記培養物から細胞外小嚢を分離する段階は、培養物から細胞外小嚢を分離するものであるならば、いずれも含まれる。
【００２３】
前記分離する段階は、前記培養物を遠心分離して上澄み液を得る段階と、前記上澄み液を濾過する段階と、前記濾過物を超遠心分離して沈殿物を得る段階と、を含むものでもある。
前記分離段階において、上澄み液を得る段階において、該遠心分離は、約１，０００ｘｇないし約２０，０００ｘｇで行われるものでもある。前記上澄み液を濾過する段階において、前記濾過は、超微細フィルターを使用した濾過でもある。前記濾過は、前記上澄み液をカットオフ１０ｋＤ以上、例えば、５０ｋＤ以上、１００ｋＤ以上、３００ｋＤ以上または５００ｋＤ以上の超微細フィルターを使用して限外濾過するものでもある。前記濾過物を超遠心分離して沈殿物を得る段階において、前記超遠心分離は、１００，０００ｘｇ以上、例えば、約１００，０００ｘｇないし約２００，０００ｘｇで行われるものでもある。
前記方法は、沈殿物を懸濁する段階をさらに含んでもよい。
【発明の効果】
【００２４】
一具現例による組み換え微生物は、細胞外小嚢、またはそれから標的蛋白質を効率的に分離するところにも使用される。
他の具現例による前述の細胞外小嚢及び標的蛋白質を個体に伝達するための組成物は、標的蛋白質を個体に効率的に伝達するところにも使用される。
他の具現例による個体の疾病を治療する方法は、前記疾病を効率的に治療するところにも使用される。
他の具現例による個体に化粧料を適用する方法は、個体に効率的に化粧料を適用するところにも使用される。
他の具現例による細胞外小嚢を生産する方法は、細胞外小嚢を効率的に生産するところにも使用される。
【００２５】
本明細書において記述された具体例は、記述的意味にのみ考慮されなければならず、限定する目的に使用されてはならない。それぞれの具体例内において、特徴(features)または様相(aspects)の記述は、他の具体例において、他の類似した特徴または様相について利用することができると、一般的に考慮されなければならない。
１以上の具体例が、図面に参照されて記述されているが、形態及び細部事項において、多様な変化が、下記における請求項によって定義されているような開示の精神(spirit)と範囲とを外れることなく、その中においてなされうるということは、当業界の通常の技術者によって理解されるところである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
それらの様相及び／または他の様相は、添付された図面と共にとりなされた、具体例の下記説明から明白になるか、あるいはさらに容易に理解されるであろう。
【図１】標的蛋白質を酵母細胞で発現するための発現ベクターを示す図である。
【図２】ｐ４１６Ｇ−ＭＦ−ｈＥＧＦ１（ＩＧＦ１、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＴＧＦ alpha及びＴＲＸ）で形質転換されたＳ．Cerevisiaeに由来する、上澄み液及び細胞外小嚢に標的蛋白質が発現された程度を示す図である。
【図３】ｐ４１６Ｇ−ｈＦＧＦ１、ｐ４１６Ｇ−ＭＦ−ｈＦＧＦ１、ｐ４１６Ｇ−ｈＴＲＸ及びｐ４１６Ｇ−ＭＦ−ｈＴＲＸで形質転換されたＳ．Cerevisiaeに由来する、上澄み液及び細胞外小嚢に標的蛋白質が発現された程度を示す図である。
【図４】酵母に由来する成長因子含有細胞外小嚢の細胞増殖に及ぼす効果を示す図である。
【図５】Ｓ．Cerevisiae由来のＩＬ−２２を含む細胞外小嚢、及びＩＬ−２２を含んでいない細胞外小嚢でそれぞれ処理された細胞において、ＩＬ−１０生産量を示す図である。
【図６】Ｓ．CerevisiaeのＥＶであって、ＣＦＳＥで標識された細胞外小嚢が細胞と融合する程度を、細胞フロー分析を介して観察した結果を示す図である。
【図７】酵母由来細胞外小嚢の皮膚に対する毒性を測定した図である。
【図８】形質転換された乳酸菌に由来するＥＶの大きさ及び濃度分布を示す図である。
【図９】ＥＶ溶液に対してウェスタンブロットを行った結果を示す図である。
【図１０】信号ペプチド遺伝子と融合されているか、あるいは融合されていないＦＧＦ１をコーディングする遺伝子を含むｐＭＴ１７２組み換えで形質転換されたＬＭＴ１−２１に由来するＥＶに対してウェスタンブロットを行った結果を示す図である。
【図１１】乳酸菌に由来する成長因子含有細胞外小嚢の細胞増殖に及ぼす効果を示す図である。
【図１２】ＬＭＴ１−２１由来ＩＬ−２２含有ＥＶ、またはＩＬ−２２を含んでいないＥＶで処理された細胞において、ＩＬ−１０の生産を示す図である。
【図１３】ＣＦＳＥで標識された細胞外小嚢が細胞と融合する程度を、細胞フロー分析を介して観察した結果を示す図である。
【図１４】酵母由来細胞外小嚢の皮膚に対する毒性を測定した図である。
【図１５】ＥＶに含まれた成長因子、またはＥＶに含まれていない成長因子の上皮細胞増殖、またはコラーゲン生成に対する影響を観察した結果を示す図である。
【図１６】ＥＶに含まれているＥＧＦ、またはＥＶに含まれていないＥＧＦの安定性を観察した結果を示す図である。
【図１７】ＥＶに含まれているＦＧＦ２、またはＥＶに含まれていないＦＧＦ２の安定性を観察した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２８】
実施例１：酵母細胞由来の細胞外小嚢
標的蛋白質を発現する組み換え酵母を作製し、その酵母から細胞外小嚢を分離した。具体的な過程は、次の通りである。該酵母細胞は、Saccharomyces cerevisiaeを使用した。
【００２９】
１．発現ベクターの作製
図１は、標的蛋白質を酵母細胞で発現するための発現ベクターを示す。該ベクターは、プラスミドｐＲＳ４１６ ＧＰＤ（配列番号１）の配列を利用して作製され、標的蛋白質は、ｈＥＧＦ１、ｈＩＧＦ１、ｈＦＧＦ１、ｈＦＧＦ２、ｈＴＧＦ alpha及びｈＴＲＸである。前述のｈＥＧＦ１、ｈＩＧＦ１、ｈＦＧＦ１、ｈＦＧＦ２、ｈＴＧＦ alpha及びｈＴＲＸは、それぞれ配列番号１４，１５，１２，１３，１７または１８のアミノ酸配列を有し、それらは、配列番号５，６，７，８，１０及び１１のヌクレオシド配列によってもコーディングされる。ＦＧＦ７は、配列番号９のヌクレオシド配列を有することができ、そのアミノ酸配列は、配列番号９のヌクレオシド配列によってコーディングされるアミノ酸配列でもある。
図１のベクターは、標的蛋白質により、ｐ４１６Ｇ−ＭＦ−ｈＥＧＦ１（ＩＧＦ１、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＴＧＦ alpha及びＴＲＸ）と命名した。
まず、Ｓ．cerevisiaeのコドン使用頻度により、コドン最適化された標的蛋白質遺伝子、すなわち、ヒトＥＧＦ１遺伝子、ヒトＩＧＦ１遺伝子、ヒトＦＧＦ１遺伝子、ヒトＦＧＦ２遺伝子、ヒトＴＧＦ alpha遺伝子及びヒトＴＲＸ遺伝子を、Microgen社に依頼して合成した。それら遺伝子を、ｐ４１６ＧＰＤベクター（ＡＴＣＣ８７３６０）（配列番号１）を使用し、図１の発現ベクターを作製した。図１の発現ベクターは、Ｓ．cerevisiaeのmating factor alpha−１信号ペプチド（ＭＦ）をコーディングするポリヌクレオチド（配列番号４）を、標的蛋白質遺伝子の上流に連結された配列を含む。対照群として、信号ペプチド（ＭＦ）をコーディングするポリヌクレオチド（配列番号４）が連結されていない遺伝子を使用した。また、ｐ４１６ＧＰＤ（ＡＴＣＣ８７３６０）ベクターの代わりに、ｐ４２６ＧＰＤベクター（ＡＴＣＣ８７３６１）（配列番号２）を使用し、同一にベクターを作製した。ｐ４１６ＧＰＤベクターは、低いコピー（low copy）で細胞内に存在するベクターであり、ｐ４２６ＧＰＤは、高いコピー（high copy）で細胞内に存在するベクターである。ｐ４１６ＧＰＤ及びｐ４２６ＧＰＤにおいて、ＧＰＤは、プローモーターＧＰＤのヌクレオシド配列（配列番号３）を示す。
図１において、前記ベクターは、Ｓ．cerevisiaeの複製原点であるＣＥＮ／Ａｒｓ配列、アンピシリン抵抗性遺伝子Ａｍｐｒ配列、大腸菌複製原点配列であるＣｏｌＥ１ ｏｒｉ配列、Ｓ．cerevisiaeのプローモーター配列であるプローモーターＧＰＤ配列、Ｓ．cerevisiaeのＣＹＣ terminator配列であるＳｃＣＹＣ ｔｅｒｍ配列、バクテリオファージの複製原点であるＦ１ ｏｒｉ配列、Ｓ．cerevisiaeのプローモーター、ＯＲＦ、ターミネーター配列（ＳｃＵＲＡ３ｐ−ＵＲＡ３）を含んでいる。
【００３０】
２．酵母における標的蛋白質の発現
ｐ４１６Ｇ−ＭＦ−ｈＥＧＦ１（ＩＧＦ１、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＴＧＦ alpha及びＴＲＸ）ベクターを、それぞれＳ．cerevisiae ＣＥＮ．ＰＫ２−１菌株に、ＬｉＣｌ方法によって形質転換させた。得られた形質転換菌株を、２ｍＬのminimal ura−drop out培地（Yeast nitrogen base without amino acids（Sigma−Aldrich：Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｙ０６２６）６．７ｇ／Ｌ及びYeast synthetic drop-out without uracil（Sigma−Aldrich：Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｙ１５０１）１．９２ｇ／Ｌ、ブドウ糖２（ｗ／ｖ）％）で一日の間、一次培養し、培養された菌株を、カザミノ酸（casamino acids）が１％含まれた１５ｍＬのminimal ura-drop out培地に、開始ＯＤ６００が０．５になるように接種し、本培養を行った。本培養は、３０℃で２日間、２２０ｒｐｍで撹拌培養し、菌体を除去した上澄み液を直接使用した試料群を準備した。また、前記上澄み液を、１００ｋＤａカットオフ膜（Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane（１００Ｋ）、Millipore：Ｃａｔ．Ｎｏ．ＵＦＣ９１００２４）を使用して濾過し、濃縮された濾過液を得て、それを、１５０，０００ｇで２時間超遠心分離し、細胞外小嚢（ＥＶ）を分離させ、１ｍｌ ＰＢＳに懸濁した。ここで、上澄み液、及び得られた細胞外小嚢試料に対し、ウェスタンブロットを行い、蛋白質の発現程度を確認した。
図２は、ｐ４１６Ｇ−ＭＦ−ｈＥＧＦ１（ＩＧＦ１、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＴＧＦ alpha及びＴＲＸ）で形質転換されたＳ．cerevisiaeから、上澄み液及び細胞外小嚢に、標的蛋白質が発現された程度を示す図面である。レーン１及び２は、各標的蛋白質が、信号ペプチド（ＭＦ）に連結された融合蛋白質の発現程度を示すウェスタンブロット写真である。該レーン１は、酵母細胞内で発現され、培養液に分離された全ての蛋白質、すなわち、細胞外小嚢に搭載された蛋白質と、搭載されていない標的蛋白質とのいずれも含む。該レーン２は、細胞外小嚢に搭載された標的蛋白質のみを示す。図２に示されているように、６個実験群いずれにおいても、細胞外小嚢に標的蛋白質が顕著に増加した量に搭載されている。
図３は、ｐ４１６Ｇ−ｈＦＧＦ１、ｐ４１６Ｇ−ＭＦ−ｈＦＧＦ１、ｐ４１６Ｇ−ｈＴＲＸ及びｐ４１６Ｇ−ＭＦ−ｈＴＲＸで形質転換されたＳ．cerevisiaeから、上澄み液及び細胞外小嚢に標的蛋白質が発現された程度をそれぞれ示す図面である。すなわち、信号ペプチドの有無による細胞外小嚢に捕獲される程度を示す。
レーン１は、信号ペプチドなしに発現させた菌株の培養液から獲得された細胞外小嚢私の標的蛋白質を示し、レーン２は、信号ペプチド配列と共に発現させて分泌させた菌株の培養液から獲得された細胞外小嚢内標的蛋白質が発現されたところを示す。図３に示されているように、標的蛋白質を細胞内で発現させたもの、すなわち、１億個ＥＶ当たり、ＦＧＦ１：０．６６７ｎｇ、ＴＲＸ：０．０４７ｎｇより、発現させて細胞外に分泌発現させたとき、細胞外小嚢に発現される標的蛋白質の量、すなわち、１億個ＥＶ当たり、ＦＧＦ１：２．６４８ｎｇ、ＴＲＸ：３５．５１８ｎｇと顕著に多かった。
【００３１】
３．成長因子含有細胞外小嚢が細胞増殖に及ぼす効能確認
２．に記載された方法によって分離された細胞外小嚢内標的蛋白質の濃度を測定した後、それを２０μＬ使用したものを開始濃度にし、順次に１０倍ずつ蛋白質濃度を、ＰＢＳで４段階希釈した。各希釈液２０μＬを、ＮＩＨ３Ｔ３細胞株またはＨａＣａｔ細胞を、各ウェル当たり５，０００細胞ずつ含む９６ウェルプレートに添加した後、３７℃で４８時間培養した。その後、Cell Counting Kit−８（Dojindo）溶液１０μＬを、各ウェルに添加した。２時間後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。ＦＧＦ１、ＦＧＦ２及びＩＧＦの場合、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用し、ＴＧＦａ及びＥＧＦの場合、ＨａＣａｔ細胞を使用した。
図４は、酵母から分離された成長因子含有細胞外小嚢の細胞増殖に及ぼす効果を示す図面である。図４において、ＳＣは、Saccharomyces cerevisiaeを示す。
その結果、前記標的蛋白質含有細胞外小嚢は、用量依存的に細胞数を増加させた。図４において、PichiaＥＶ−ＦＧＦ１及びHansenula ＥＶ−ＦＧＦ１は、ＦＧＦ１で形質転換されたPichia pastorisまたはHansenula polymorphaを使用したことを除いては、Ｓ．cerevisiaeを使用したところと同一過程を経たものである。図４において、横軸は、培地内細胞外小嚢内標的蛋白質含有濃度（ｗ／ｖ、ｎｇ／ｍｌ）を示す。縦軸は、使用された細胞外小嚢含有溶液が、細胞増殖程度を対照群（１００％）と比較し、それを百分率で示したものである。
【００３２】
４．ＩＬ−２２発現の確認
標的蛋白質をＩＬ−２２にし、１．に記載されたところにより、発現ベクターｐ４２６Ｇ−ＭＦ−ＩＬ−２２を作製し、２．に記載されたところにより、Ｓ．cerevisiae ＣＥＮ．ＰＫ２−１菌株で形質転換した。対照群としては、ＩＬ−２２を含まないものを除いては、同一ｐ４２６Ｇ−ＭＦベクターを使用した。
具体的には、Ｃｏｌｏ２０５細胞株を、９６ウェルプレートにおいて、ＲＰＭＩ培地内で３７℃で４８時間培養した後、ｐ４２６Ｇ−ＭＦ−ＩＬ２２ベクターまたはｐ４２６Ｇ−ＭＦベクターで形質転換され、それぞれＩＬ−２２を発現する酵母由来、及びそれを発現しない酵母由来の細胞外小嚢を精製した。前記細胞外小嚢を、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で、ＰＢＳ内で懸濁し、それらを２０μＬずつ、９６ウェルプレートのウェルに添加し、３７℃で６時間さらに培養した。その後、細胞株から蛋白質を抽出し、間接的にＩＬ−１０の発現レベルを介し、ＩＬ−２２の発現レベルを比較した。該ＩＬ−２２は、配列番号１９のアミノ酸配列を有する。該ＩＬ−２２は、細胞においてＩＬ−１０生産を促進すると知られている。
図５は、ＩＬ−２２を含む細胞外小嚢、及びＩＬ−２２を含んでいない細胞外小嚢でそれぞれ処理されたＣｏｌｏ２０５細胞株から蛋白質を抽出して確認したＩＬ−１０蛋白質生産量を示す図面である。図５に示されているように、ＩＬ−２２を含んでいない細胞外小嚢に比べ、ＩＬ−２２を含む細胞外小嚢を細胞と接触させて培養した場合、ＩＬ−１０の蛋白質生産量が顕著に増加した。図５において、レーン１は、ＩＬ−２２を含まない細胞外小嚢を処理したＣｏｌｏ２０５細胞株のＩＬ−１０蛋白質生産程度を示したものであり、レーン２は、ＩＬ−２２を含む細胞外小嚢を処理したＣｏｌｏ２０５細胞株のＩＬ−１０蛋白質生産程度を示したものである。
【００３３】
５．酵母由来細胞外小嚢と細胞との融合
形質転換されていないＳ．cerevisiae ＣＥＮ．ＰＫ２−１菌株から、前述のように、細胞外小嚢を分離させた。分離された細胞外小嚢（０．５ｍｇ／ｍｌ ＰＢＳ）１ｍｌを、ＣＦＳＥ（５−carboxyfluorescein Ｎ−hydroxysuccinimidyl ester）（５μＭ）溶液内に常温で３０分間置いた。その後、溶液に対し、ＰＤ−１０脱塩カラム（desalting column）（ＧＥ）を利用し、残っているＣＦＳＥを除去し、ＣＦＳＥで標識された細胞外小嚢を得た。ＮＩＨ３Ｔ３細胞株を、９６ウェルプレートのウェルにおいて、ＲＰＭＩ培地０．２ｍＬ内で３７℃で４８時間培養した後、ＰＢＳ内で、ＣＦＳＥで標識された細胞外小嚢の１０μＬ（赤色）または２０μＬ（緑色）を添加し、３７℃で２４時間さらに培養した。その後、ＰＢＳで細胞を洗浄した。残っている細胞を、フロー分析機（flow cytometer）を介して通過させ、それに係わる蛍光度を測定した。対照群としては、ＢＳＡ ０．５μｇ／ｍｌを同じＣＦＳＥで標識させ、２０μｌ使用した。
図６は、ＣＦＳＥで標識された細胞外小嚢が細胞と融合する程度を、細胞フロー分析を介して観察した結果を示す。図６において、対照群（negative control）（左側図面）は、ＣＦＳＥで標識させたＢＳＡと細胞とを接触させたものであり、実験群（右側）は、ＣＦＳＥで標識された細胞外小嚢の１０μＬ（赤色）及び２０μＬ（緑色）と細胞とを接触させた後、観察された結果を示す。その結果、図６の右側に示されているように、細胞がＣＦＳＥで染色されるところから見て、細胞外小嚢が細胞と融合し、細胞外小嚢の成分が細胞に導入されることを確認した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、標準線維芽細胞（fibroblast）細胞株である。
【００３４】
６．酵母由来細胞外小嚢の皮膚毒性確認
酵母由来細胞外小嚢の皮膚に対する毒性を、ＯＥＣＤガイドラインにより、人工皮膚に対する毒性実験を介して測定した。該人工皮膚は、NeodermTM−ＥＤ（Tegoサイエンス社製）を使用した。
Ｓ．cerevisiae、Pichia pastorisまたはHansenula polymorphaに由来する細胞外小嚢を分離させた。Ｓ．cerevisiae由来細胞外小嚢は、２．に記載されたところによって分離させた。Pichia pastorisまたはHansenula polymorphaに由来する細胞外小嚢は、Pichia pastoris及びHansenula polymorphaを使用したことを除いては、２．に記載されたところによって分離させた。
分離された細胞外小嚢のそれぞれ、陰性対照群としてのＰＢＳ、及び陽性対照群としての５％ ＳＤＳのそれぞれ３０μＬを、NeodermTM−ＥＤ人工皮膚に塗布し、３７℃で１５分間インキュベーションした。その後、前記人工皮膚をＰＢＳで洗浄した後、１２ウェルプレートにある２ｍｌ分析媒質（assay medium）（Tegoサイエンス社）に浸漬させ、３７℃で４２時間さらにインキュベーションした。
インキュベーションされた人工皮膚を取り出し、０．３％ ＭＴＴ溶液（０．３ｍｇ／ｍｌ）に移した後、３７℃で３時間インキュベーションした。その後、さらに人工皮膚を取り出し、８ｍｍ生検（biopsy punch）を利用して組織を分離させ、０．０４Ｎ ＨＣｌ・イソプロパノール５００μｌに入れ、４時間脱色させた。５７０ｎｍで吸光度を測った後、対照群吸光度と比較し、生存度（％）を求めた。その結果、測定された生存度が、陽性対照群値と陰性対照群値との中間以上であるならば、毒性がないと決定した。該生存度は、下記数式によって計算した。
生存度＝試験物質吸光度／陰性対照群吸光度Ｘ１００
図７は、酵母由来細胞外小嚢の皮膚に対する毒性を測定した図面である。図７において、１：陰性対照群（ＰＢＳ）、２：陽性対照群（５％ ＳＤＳ）、３：Ｓ．cerevisiaeに由来する細胞外小嚢、４：Ｐ．pastorisに由来する細胞外小嚢、５：Ｈ．Polymorphaに由来する細胞外小嚢を示す。
【００３５】
実施例２：乳酸菌（ＬＡＢ：lactic acid bacteria）細胞由来の細胞外小嚢
標的蛋白質を発現する組み換え乳酸菌を作製し、その乳酸菌から細胞外小嚢を分離した。具体的な過程は、次の通りである。該乳酸菌細胞は、Lactobacillus paracasei ＬＭＴ１−２１（ＫＣＴＣ１３４２２ＢＰ）、Lactobacillus brevis ＬＭＴ１−４６（ＫＣＴＣ１３４２３ＢＰ）及び／またはLactobacillus plantarum ＬＭＴ１−９（ＫＣＴＣ１３４２１ＢＰ）を使用した。
【００３６】
１．遺伝子発現ベクターの作製
標的遺伝子は、蛋白質のアミノ酸配列から、Codo noptimization tool（http://sq.idtdna.com/CodonOpt）を使用し、使用される乳酸菌に最適化されたコドンを有するヌクレオシド配列を導き出し、該配列の両端に、ＢａｍＨＩ制限酵素及びＸｈｏＩ制限酵素の認知配列を有する配列を考案し、該配列を有するＤＮＡを合成した（Microgen社、韓国）。合成された遺伝子は、ＢａｍＨＩ制限酵素及びＸｈｏＩ制限酵素を使用して切断した。また、親ベクターｐＭＴ１８２−ＰＲ４（配列番号２０）も、同一制限酵素を使用して切断し、Gel purification kitを使用して精製した後、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）を使用し、脱リン酸化させた。該親ベクターは、標的蛋白質を発現させるためのプローモーターＰＲ４、及び細胞外に分泌させるための信号ぺプチドＳＰ４（配列番号２１）を含んでいる。
そのように準備したベクターＤＮＡ １μＬ、挿入体（insert）ＤＮＡ ３μＬ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Takara社、日本）０．５μＬ及び緩衝溶液１μＬを、蒸溜水５．５μＬに添加し、総体積を１０μＬにした。該反応溶液を、１６℃で１２時間インキュベーションさせて結合反応を行わせ、得られた結合体を、Sambrookらの方法（Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd ed. 1989）により、大腸菌top１０菌株を形質転換した。各コロニーから得られたプラスミドの配列を分析して確認した。標的蛋白質は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ＫＧＦ、ＴＧＦａ、ＴＲＸ及びＩＬ−２２を使用した。それらは、それぞれ配列番号１，２，３，４，５，６，７及び８のアミノ酸配列を有する。
【００３７】
２．乳酸菌形質転換
前記得られたクローニングされたＤＮＡを、３種の乳酸菌で形質転換させた。各菌株を、５０ｍＬのＭＲＳで、ＯＤ６００が０．５になるまで培養した後、４℃、７，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、２５ｍＬ ice-cold ＥＰＳ（１ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＭｇＣｌ２及び０．５Ｍサッカロース含有）で２回洗浄した。該細胞を、１ｍＬ ice-cold ＥＰＳに懸濁し、電気穿孔法（electroporation）に使用されるコンピテント細胞（competent cell）を製造し、−８０℃冷蔵庫（deep freezer）に保管した。該コンピテント細胞４０μＬとベクター１μｇ／ｕＬ ＤＮＡとをキュベットに移し、５分間氷に放置した。２５μＦ、８ｋＶ／ｃｍ及び４００ｏｈｍｓの条件でパルスを与えた後、直ちに１ｍＬ ＭＲＳ液体培地を添加し、３７℃で１時間ほど培養した。該細胞を、１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールが含まれたＭＲＳ培地に塗抹した後、４９時間３７℃で培養し、形質転換された細胞を得た。
【００３８】
３．細胞外小嚢（ＥＶ）分離
得られたそれぞれ形質転換された前記乳酸菌菌株のうちＫＣＴＣ１３４２２ＢＰ菌株を、ＭＲＳ液体培地で３７℃で１６時間静置培養した後、さらにＭＲＳ液体培地に、その２％体積を接種した後、１６時間静置培養した。得られた培養物を５，０００ｘｇで１５分間遠心分離し、乳酸菌を除去した上澄み液を得た後、それに対し、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）１００ｋＤａ超微細濾過膜を利用して限外濾過し、２０倍濃縮した。該濃縮液を、１５０，０００ｘｇで３時間超遠心分離し、沈んだペレットを得た後、該ペレットをＰＢＳに再懸濁し、ＥＶ溶液を得た。NanoSight ＮＳ３００（Malvern）を利用して得られたＥＶの大きさと個数とを測定した。その結果を図８に示した。
図８は、形質転換された乳酸菌から分離されたＥＶの大きさ及び濃度分布を示した図面である。図８において、横軸は、直径であり、縦軸は、濃度（粒子／ｍｌ）である。図８において、使用された乳酸菌は、ＫＣＴＣ１３４２２ＢＰ菌株であり、標的蛋白質は、ＦＧＦ１である。
図８に示されているように、ＥＶは、８０ないし２５０ｎｍの粒子サイズにおいて、９０％の粒子が分布した。
【００３９】
４．ＥＶに標的蛋白質が存在するか否かということの確認
３．で得られたＥＶ溶液に対してウェスタンブロットを行い、標的蛋白質がＥＶに存在するか否かということを確認した。前記ＥＶは、ｐＭＴ１８２−ＰＲ４に、ＦＧＦ１またはＴＲＸをコーディングする遺伝子をクローニングしたベクターで形質転換されたＫＣＴＣ１３４２２ＢＰ菌株（以下、ＬＭＴ１−２１ともする）から分離されたものである。このとき、前記遺伝子は、信号ペプチド、すなわち、ＳＰ４配列と融合されたり、融合されなかったりする配列を使用した。
ウェスタンブロットは、次のように行った。ＥＶ溶液５μＬに、４ｘローディングバッファ（thermo）、１０ｘ還元剤（reducing agent）（thermo）を添加した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）用ゲルに電気泳動した。該ゲルの蛋白質をニトロセルロース膜に移した後、該膜を、遮断溶液５％脱脂乳含有ＴＢＳＴ（tris-buffered saline with Tween２０）で２時間インキュベーションして遮断した。その後、ＴＢＳＴを使用し、５分間３回洗浄した後、遮断溶液に、該膜と一次抗体とを添加し、２時間インキュベーションし、抗原・抗体結合を誘導した。ＴＢＳＴ洗浄後、二次抗体を添加した。１時間放置した後、ＥＣＬ（enhanced electrochemical）システムを使用し、標的蛋白質の量及び位置を確認した。
図９は、ＥＶ溶液に対してウェスタンブロットを行った結果を示す。図９に示されているように、信号ペプチドと融合されたＦＧＦ１及びＴＲＸを、ｐＭＴ１８２−ＰＲ４にクローニングして得られたベクターで形質転換されたＬＭＴ１−２１から分離されたＥＶには、ＦＧＦ１及びＴＲＸが発現されており、それらがＥＶに存在するということが分かる。
図１０は、信号ペプチド遺伝子と融合するか、あるいは融合していないＦＧＦ１をコーディングする遺伝子を含む組み換えベクター、すなわち、ｐＭＴ１８２−ＰＲ４−ＦＧＦ１ベクターまたはｐＭＴ１８２−ＰＲ４−ＳＰ４−ＦＧＦ１ベクターで形質転換されたＬＭＴ１−２１から分離されたＥＶに対し、ウェスタンブロットを行った結果を示す。図１０において、レーン１は、信号配列なしにＦＧＦ１遺伝子を発現させた場合のＥＶを示し、レーン２は、信号配列がＦＧＦ１と融合された蛋白質をコーディングする遺伝子を発現させた場合のＥＶを示す。
【００４０】
５．乳酸菌由来成長因子含有細胞外小嚢が細胞増殖に及ぼす効能の確認
３．に記載された方法により、１Ｌ乳酸菌培養液から分離された細胞外小嚢をＰＢＳ１ｍｌに懸濁した。ＤＭＥＭ培地におけるＮＩＨ３Ｔ３細胞株（または、ＨａＣａｔ細胞）を９６ウェルプレートの各ウェルに、５，０００細胞ずつ接種（seeding）した後、３７℃で４８時間培養した。その後、前記成長因子を発現する細胞外小嚢含有溶液または対照群ＰＢＳを２０μＬずつ添加した。同一条件で４８時間培養した後、Cell Counting Kit−８（Dojindo）溶液１０μＬを各ウェルに添加した。２時間後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。ＦＧＦ１、ＦＧＦ２及びＩＧＦの場合、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用し、ＫＧＦ、ＴＧＦａ及びＥＧＦの場合、ＨａＣａｔ細胞を使用した。
図１１は、乳酸菌から分離された成長因子含有細胞外小嚢の細胞増殖に及ぼす効果を示す図面である。図１１において、ＬＡＢは、lactic acid bacterium（ＫＣＴＣ１３４２２ＢＰ菌株）を示す。その結果、前記標的蛋白質含有細胞外小嚢は、用量依存的に細胞濃度を上昇させた。図１１において、横軸は、細胞外小嚢に含まれた標的蛋白質の濃度（ｗ／ｖ）を示す。縦軸は、使用された細胞外小嚢含有溶液の細胞増殖の程度を、対照群に対比させ、それを百分率で示したものである。
【００４１】
６．成長因子を含むＥＶの効能：ＩＬ−１０発現の確認
１．及び２．により、ＩＬ−２２を発現するベクターを作製し、該ベクターをＬＭＴ１−２１で形質転換した。３．により、ＩＬ−２２を発現するベクターで形質転換されたＬＭＴ１−２１からＥＶが分離された。該ＥＶが、細胞において、ＩＬ−１０発現を促進するか否かということを確認し、間接的にＩＬ−２２の存在いかんを推定した。
具体的には、Ｃｏｌｏ２０５細胞株を、９６ウェルプレートで、ＲＰＭＩ培地中に３７℃で４８時間培養した後、ここに、ＩＬ−２２を発現する乳酸菌、及びそれを発現しない乳酸菌に由来する細胞外小嚢を分離し、該細胞外小嚢を、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で、ＰＢＳ内に懸濁し、それらを２０μＬずつウェルに添加し、３７℃で６時間さらに培養した。その後、細胞株から蛋白質を抽出、すなわち、細胞破砕（lysis）した後、破砕物（lysate）を得て、そこにおいて、ＩＬ−１０の発現量を比較した。
図１２は、ＬＭＴ１−２１由来ＥＶと接触された細胞由来蛋白質をウェスタンブロットした写真である。図１２において、レーン１は、ＰＢＳであり、レーン２は、ＬＭＴ１−２１由来ＥＶであり、レーン３は、ＩＬ−２２を発現するＬＭＴ１−２１由来ＥＶを処理したものを示す。
【００４２】
７．乳酸菌由来細胞外小嚢と細胞との融合
形質転換されていない乳酸菌菌株（ＫＣＴＣ１３４２２ＢＰ）から、前述のように、細胞外小嚢を分離させた。分離された細胞外小嚢（０．５ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを、ＣＦＳＥ（５μＭ）溶液内に常温で３０分間置いた。その後、溶液に対し、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ）を利用し、残っているＣＦＳＥを除去し、ＣＦＳＥで標識された細胞外小嚢を得た。ＮＩＨ３Ｔ３細胞株を、９６ウェルプレートのウェルで、ＲＰＭＩ培地０．２ｍＬにおいて４８時間培養した後、ＰＢＳにおいて、ＣＦＳＥで標識された細胞外小嚢の１０μＬ（赤色）または２０μＬ（緑色）を添加し、２４時間さらに培養した。その後、ＰＢＳで細胞を洗浄した。残っている細胞をフロー分析機を介して通過させ、それに係わる蛍光度を測定した。対照群としては、ＢＳＡ ０．５μｇ／ｍｌを同じＣＦＳＥで標識させ、２０μｌ使用した。
図１３は、ＣＦＳＥで標識された細胞外小嚢が細胞と融合する程度を、細胞フロー分析を介して観察した結果を示す。図１３において、対照群（negative control）（左側図面）は、ＣＦＳＥで標識させたＢＳＡと細胞とを接触させたものであり、実験群（右側）は、ＣＦＳＥで標識された細胞外小嚢の１０μＬ（赤色）と２０μＬ（緑色）と、細胞とを接触させた後、観察された結果を示す。その結果、図１３の右側に示されているように、細胞がＣＦＳＥに染色されることから見て、細胞外小嚢が細胞と融合し、細胞外小嚢の成分が細胞に導入されることを確認した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、標準線維芽細胞細胞株である。
【００４３】
８．乳酸菌由来細胞外小嚢の皮膚毒性確認
乳酸菌由来細胞外小嚢の皮膚に対する毒性を、ＯＥＣＤガイドラインにより、人工皮膚に対する毒性実験を介して測定した。該人工皮膚は、NeodermTM−ＥＤ（Tegoサイエンス社製）を使用した。
ＬＭＴ１−２１、ＬＭＴ１−９またはＬＭＴ１−４６に由来する細胞外小嚢を分離させた。それら細胞外小嚢は、２．に記載されたところによって分離させた。分離された細胞外小嚢のそれぞれ、陰性対照群としてのＰＢＳ、及び陽性対照群としての５％ ＳＤＳそれぞれ３０μＬをNeodermTM−ＥＤ人工皮膚に塗布し、３７℃で１５分間インキュベーションした。その後、前記人工皮膚をＰＢＳで洗浄した後、１２ウェルプレートにある２ｍｌ分析媒質（Tegoサイエンス）に浸漬させ、３７℃で４２時間さらにインキュベーションした。
インキュベーションされた人工皮膚を取り出し、０．３％ ＭＴＴ溶液（０．３ｍｇ／ｍｌ）に移した後、３時間インキュベーションした。その後、さらに人工皮膚を取り出し、８ｍｍ生検を利用して組織を分離させ、０．０４Ｎ ＨＣｌ・イソプロパノール５００μｌに入れて４時間脱色させた。５７０ｎｍで吸光度を測った後、対照群吸光度と比較し、生存度（％）を求めた。その結果、測定された生存度が、陽性対照群値と陰性対照群値との中間以上であるならば、毒性がないと決定した。該生存度は、下記数式によって計算した。
生存度＝試験物質吸光度／陰性対照群吸光度Ｘ１００
図１４は、乳酸菌由来細胞外小嚢の皮膚に対する毒性を測定した図面である。図１４において、１：陰性対照群（ＰＢＳ）、２：陽性対照群（５％ＳＤＳ）、３：ＬＭＴ１−４６、４：ＬＭＴ１−９、５：ＬＭＴ１−２１に由来する細胞外小嚢を示す。
【００４４】
実施例３：成長因子含有ＥＶの細胞増殖効果と、ネイキド成長因子の細胞増殖効果との比較
１．成長因子含有ＥＶの製造
成長因子含有ＥＶは、実施例１の３．と同一方式により、それぞれｐ４１６Ｇ−ＭＦ−ＥＧＦ、ｐ４１６Ｇ−ＭＦ−ＦＧＦ１及びｐ４１６Ｇ−ＭＦ−ＦＧＦ２で形質転換されたPichia pastorisから分離された。成長因子含有ＥＶそれぞれは、ＰＢＳに懸濁させ、ＥＧＦの濃度を１０μｇ／ｍｌ、及びＦＧＦ１またはＦＧＦ２の濃度を１μｇ／ｍｌに調整した。対照群として、ネイキドＥＧＦ蛋白質、ネイキドＦＧＦ１蛋白質及びネイキドＦＧＦ２蛋白質をＡｂＣａｍから購入し、前記濃度と同一濃度でＰＢＳ内に懸濁させた。
【００４５】
２．成長因子含有ＥＶの細胞増殖効果と、ネイキド成長因子の細胞増殖効果との比較
人工皮膚、NeodermTM−ＥＤをTaigo Science Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。前記人工皮膚をＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ ２ｍＬ、前述のところで準備されたＥＶ−成長因子含有溶液２ｍＬ、及び前述のところで製造されたネイキドＥＧＦ蛋白質、ネイキドＦＧＦ１蛋白質及びネイキドＦＧＦ２蛋白質含有の対照群溶液２ｍＬを、１２ウェルプレートのウェルに添加し、３７℃で２４時間、さらにインキュベーションした。ＰＢＳで３回洗浄した後、該人工皮膚を、３７℃で１８時間、４％パラホルムアルデヒド溶液（Sigma、米国）中に固定し、Leica Biosystemsを使用し、冷凍切片を作った。ＥＧＦ−ＥＶ及び対照群蛋白質に対する抗Ｋｉ−６７抗体（ＡｂＣａｍ）、並びにＦＧＦ１−ＥＶ、ＦＧＦ２−ＥＶ及び対照群蛋白質に対する抗コラーゲン抗体（ＡｂＣＡｍ）を使用し、免疫組織化学（ＩＨＣ）を遂行した後、ＤＡＢ（３，
３，３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を添加した。その結果について、顕微鏡下で写真を撮った。一般的には、Ｋｉ−６７またはコラーゲンの豊富は、茶色に観察される。Ｋｉ−６７は、上皮細胞増殖のバイオマーカーとして知られている。
図１５に示されているように、ＰＢＳ及び対照群蛋白質処理に比べ、ＥＧＦ−ＥＶ処理した場合、さらに良好な上皮細胞増殖が観察された（Ａ列）。また、ＰＢＳまたは対照群蛋白質を使用した場合に比べ、ＦＧＦ１−ＥＶ及びＦＧＦ２−ＥＶを使用した場合、さらに良好なコラーゲン合成が観察された（Ｂ列及びＣ列）。３つの結果によれば、成長因子タイプに係わらず、ＥＶに含まれた成長因子は、ネイキド成長因子に比べ、細胞増殖に対してさらに効果的であり、そのうち、ＦＧＦ２−ＥＶが、ＥＶに含まれた他の成長因子、またはＥＶに含まれていない他の成長因子に比べ、さらに効果的であった。
【００４６】
実施例４：成長因子の安定性比較
１．ＥＧＦ−ＥＶ安定性とネイキドＥＧＦ安定性との比較
Pichia pastoris由来ＥＧＦ−ＥＶ及び対照群蛋白質、すなわち、ＥＶに含まれていないＥＧＦ蛋白質を、実施例１の２．に記述されたところと同一方式で準備した。簡単には、前記ＥＧＦ−ＥＶまたはＥＧＦ蛋白質をＰＢＳ １ｍＬに懸濁させ、濃度を１０μｇ／ｍｌにした後、４０℃で８週間インキュベーションした。２週ごとに試料を分注し、細胞増殖活性分析（cell proliferation activity assay）のために、ＰＢＳを使用して希釈し、１００ｎｇ／ｍｌ濃度にした。
ＤＭＥＭ中のＨａＣａｔ細胞を、５，０００細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレートの各ウェルに接種し、３７℃で４８時間培養した。次に、前記ＥＧＦ−ＥＶ、前記対照群蛋白質及び前記ＰＢＳの各サンプル２０μＬを、そこに添加した。細胞を４８時間、同一条件で培養した後、cell counting kit−８（Dojindo）溶液１０μＬを各ウェルに添加した。２時間後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
図１６に示されているように、ＥＶに含まれたＥＧＦは、ネイキドＥＧＦに比べ、さらに安定している。
【００４７】
２．ＦＧＦ２−ＥＶ安定性とネイキドＦＧＦ２安定性との比較
Pichia pastoris由来ＦＧＦ２−ＥＶ及び対照群蛋白質、すなわち、ＥＶに含まれていないＦＧＦ２蛋白質を、実施例１の２．に記述されたところと同一方式で準備した。簡単には、前記ＦＧＦ２−ＥＶ蛋白質または前記ＦＧＦ２蛋白質をＰＢＳ １ｍＬに懸濁させ、濃度を１０μｇ／ｍｌになるようにした後、室温で４週間インキュベーションした。規則的に（on regular basis）各試料を分注し、細胞増殖活性分析のためにＰＢＳを使用して希釈し、１００ｎｇ／ｍｌ濃度にした。
ＤＭＥＭ培地中のＮＩＨ３Ｔ３細胞を、５，０００細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレートの各ウェルに接種し、３７℃で４８時間培養した。次に、前記ＦＧＦ２−ＥＶ、前記対照群蛋白質及び前記ＰＢＳの各サンプル２０μＬをそこに添加した。細胞を４８時間、同一条件で培養した後、cell counting kit−８（Dojindo）溶液１０μＬを各ウェルに添加した。２時間後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
図１７に示されているように、ＥＶに含まれたＦＧＦ２は、ネイキドＦＧＦ２に比べ、さらに安定している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年2月4日(2021.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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