(57)【要約】本発明は新規の高分子核酸を構成することのできる核酸ユニット及び目的遺伝子の発現を干渉することのできる高分子核酸を開示する。本発明によると、新規の核酸ユニット及びその自己組織化した高分子核酸を設計して構築することで、マルチ標的の干渉を実現し、疾患が発生または進行する信号通路における複数の遺伝子の発現を抑制し、または複数の疾患の標的遺伝子の発現を同時に抑制して、生物学、化学等の多くの学科分野で幅広い応用の見込みがある。該高分子核酸によると、一つの遺伝子に位置するかまたは複数の遺伝子に位置する複数の配列を同時に標的とすることができる。本発明によると、１）ＲＮＡｉ効果が高く、２）安定性が優れ、３）オフターゲット率を低下させ、４）細胞への導入能力が強化され、５）モジュール化設計が可能であるメリットを有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の発現を干渉するための高分子核酸分子であて、
ｎ本のＸ型核酸分子からなり、
前記Ｘ型核酸分子それぞれは、５’末端から順に標的断片１、標的断片２、リンカー断片３からなり、
前記Ｘ型核酸分子それぞれは、標的断片１がその隣り合うＸ型核酸分子のリンカー断片３に相補的にペアリングし、
前記高分子核酸分子それぞれは、標的断片１と標的断片２がいずれも標的遺伝子と相補的にペアリングし、
前記Ｘ型核酸分子それぞれは、長さが同様であり、
前記ｎが３以上の整数であることを特徴とする高分子核酸分子。
【請求項２】
Ｈ１型核酸分子とＨｎ型核酸分子からなるＨ型核酸分子をさらに含み、
ｎ本のＸ型核酸分子をそれぞれ、Ｘ１ユニット、Ｘ２ユニット、Ｘ３ユニット、…、Ｘｎ−１ユニット、Ｘｎユニットと称し、
前記Ｘ１ユニットのリンカー断片３が前記Ｘ２ユニットの標的断片１と相補的にペアリングし、前記Ｘ２ユニットのリンカー断片３が前記Ｘ３ユニットの標的断片１と相補的にペアリングし、…、前記Ｘｎ−１ユニットのリンカー断片３が前記Ｘｎユニットの標的断片１と相補的にペアリングし、
前記Ｈ１型核酸分子が前記Ｘ１ユニットの標的断片１と相補的にペアリングし、前記Ｈｎ型核酸分子が前記Ｘｎユニットのリンカー断片３と相補的にペアリングすることを特徴とする請求項１に記載の高分子核酸分子。
【請求項３】
前記Ｈ型核酸分子は５’末端または３’末端にＨｙ断片をさらに含み、前記Ｈ型核酸分子はＨｘ断片とＨｙ断片からなり、
前記Ｈ１型核酸分子のＨｘ断片が前記Ｘ１ユニットの標的断片１と相補的にペアリングし、前記Ｈｎ型核酸分子のＨｘ断片が前記Ｘｎユニットのリンカー断片３と相補的にペアリングし、
前記Ｈｙ断片が、前記Ｘ１ユニットまたは前記Ｘｎユニットの標的断片２における５’末端または３’末端からの一つ、二つまたは複数の連続する核酸分子と相補的にペアリングすることを特徴とする請求項２に記載の高分子核酸分子。
【請求項４】
それぞれｎ本の前記Ｘ型核酸分子における標的断片２の逆相補配列であるｎ個の断片が順に接続されてなるＣ型核酸分子をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の高分子核酸分子。
【請求項５】
前記Ｘ型核酸分子、前記Ｈ型核酸分子、前記Ｃ型核酸分子がいずれも一本鎖ＲＮＡ分子であることを特徴とする請求項１乃至４の中のいずれか一項に記載の高分子核酸分子。
【請求項６】
前記Ｘ型核酸分子は、長さが１５〜５０ｎｔであり、
前記標的断片１は、長さが５〜２４ｎｔであり、
前記標的断片２は、長さが１〜２０ｎｔであり、
前記リンカー断片３は、長さが５〜２４ｎｔであり、
前記標的断片１と前記標的断片２の長さの合計は少なくとも１４〜１６ｎｔであることを特徴とする請求項１または３に記載の高分子核酸分子。
【請求項７】
前記Ｘ型核酸分子は、長さが２４〜３６ｎｔであることを特徴とする請求項６に記載の高分子核酸分子。
【請求項８】
少なくとも一つの修飾されたヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１に記載の高分子核酸分子。
【請求項９】
前記修飾が、リン酸骨格修飾、塩基修飾及び／またはリボース修飾であることを特徴とする請求項８に記載の高分子核酸分子。
【請求項１０】
前記リボース修飾が、リボース２位水酸基がハロゲン基またはＯ−アルキル基によって置換されることであることを特徴とする請求項９に記載の高分子核酸分子。
【請求項１１】
前記アルキル基が、メチル基、エチル基、プロピル基またはメチルエチル基であることを特徴とする請求項１０に記載の高分子核酸分子。
【請求項１２】
前記Ｘ型核酸分子のリンカー断片３の３’末端の第１位ヌクレオチドから連続する５〜９個のヌクレオチドのリボース２位水酸基が、ハロゲン基またはＯ−アルキル基によって置換され、
または、前記Ｈ型核酸分子のＨｘ断片の３’末端の第１位ヌクレオチドから連続する５〜９個のヌクレオチドのリボース２位水酸基が、ハロゲン基またはＯ−アルキル基によって置換され、
または、前記Ｈ型核酸分子の３’末端の第１位ヌクレオチドから連続する８〜３０個のヌクレオチドのリボース２位水酸基が、ハロゲン基またはＯ−アルキル基によって置換され、
または、前記Ｃ型核酸分子におけるＸ型核酸分子の標的断片２と相補的にペアリングする各断片の５’末端の第１位ヌクレオチドから連続する２〜６個のヌクレオチドのリボース２位水酸基が、ハロゲン基またはＯ−アルキル基によって置換されることを特徴とする請求項１０に記載の高分子核酸分子。
【請求項１３】
前記Ｈ型核酸分子の３’末端の第１位ヌクレオチドから連続する１４〜１８個のヌクレオチドのリボース２位水酸基が、ハロゲン基またはＯ−アルキル基によって置換されることを特徴とする請求項１２に記載の高分子核酸分子。
【請求項１４】
前記ｎが、３または４または５または６または７または８であることを特徴とする請求項１に記載の高分子核酸分子。
【請求項１５】
前記ｎが、４または５または６であることを特徴とする請求項１４に記載の高分子核酸分子。
【請求項１６】
前記標的遺伝子の数量は、一つまたは二つまたは複数であり且つｎ個以下であり、
または、前記標的遺伝子の数量は、一つまたは４個または６個であることを特徴とする請求項１に記載の高分子核酸分子。
【請求項１７】
前記標的遺伝子が、ＰＰＩＢ遺伝子、ｐ６５遺伝子、ＢＩＲＣ５遺伝子、ＣＴＮＮＢ遺伝子、ＣＯＰＳ５遺伝子、ＣＬＵ遺伝子、ＥＩＦ４Ｅ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＴＰ５３遺伝子、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＳＯＤ１遺伝子の中の少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載の高分子核酸分子。
【請求項１８】
標的遺伝子ＰＰＩＢの発現を干渉するための高分子核酸分子が、下記のａ１）〜ａ５）であり、
ａ１）配列１、配列２、配列３及び配列４により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ａ２）配列１、配列２、配列３、配列４、配列２０及び配列２１により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ａ３）配列１、配列２、配列３、配列４及び配列８により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ａ４）配列２、配列３、配列９、配列１０、配列１１及び配列１２により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ａ５）配列２、配列３、配列６、配列９、配列１０、配列１１、配列１３及び配列１４により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
または、標的遺伝子Ｐ６５の発現を干渉するための高分子核酸分子が、下記のｂ１）〜ｂ５）であり、
ｂ１）配列１５、配列１６、配列１７及び配列１８により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｂ２）配列６、配列７、配列１５、配列１６、配列１７及び配列１９により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｂ３）配列１５、配列１６、配列１７、配列１８及び配列２２により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｂ４）配列１５、配列１６、配列１７、配列２３、配列２４及び配列２５により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｂ５）配列１５、配列１６、配列１７、配列２０、配列２３、配列２４、配列２６及び配列２７により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
または、標的遺伝子ＢＩＲＣ５、ＣＴＮＮＢ、ＣＯＰＳ５、ＣＬＵの発現を同時に干渉するための高分子核酸分子が、配列２８、配列２９、配列３０及び配列３１により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなり、
または、標的遺伝子ＢＩＲＣ５、ＣＴＮＮＢ、ＣＯＰＳ５、ＣＬＵ、ＥＩＦ４Ｅ、ＨＩＦ１Ａの発現を干渉するための高分子核酸分子が、配列２８、配列２９、配列３０、配列３２、配列３３及び配列３４により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなり、
または、標的遺伝子ＳＯＤ１、ＰＰＩＢ、Ｐ６５、ＶＥＧＦＡの発現を同時に干渉するための高分子核酸分子が、下記のｃ１）〜ｃ３）であり、
ｃ１）配列３５、配列３６、配列３７及び配列３８により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｃ２）配列３５、配列３６、配列３７、配列３８、配列３９及び配列４０により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｃ３）配列３５、配列３６、配列３７、配列３８及び配列４１により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
または、標的遺伝子ＶＥＧＦＡの発現を干渉するための高分子核酸分子が、下記のｄ１）〜ｄ１１）であり、
ｄ１）配列４２、配列４３、配列４４、配列４５、配列４６及び配列４７により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｄ２）配列４８、配列４９、配列５０、配列５１、配列５２及び配列５３により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｄ３）配列５４、配列５５、配列５６、配列５７、配列５８及び配列５９により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｄ４）配列４２、配列４３、配列４５、配列４６及び配列４７により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｄ５）配列４８、配列４９、配列５１、配列５２及び配列５３により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｄ６）配列５４、配列５５、配列５７、配列５８及び配列５９により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｄ７）配列４２、配列４５、配列４６及び配列４７により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｄ８）配列４８、配列５１、配列５２及び配列５３により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｄ９）配列５４、配列５７、配列５８及び配列５９により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｄ１０）配列６０、配列６１、配列６２、配列６３、配列６４及び配列６５により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｄ１１）配列６６、配列６７、配列６８、配列６９、配列７０及び配列７１により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
または、標的遺伝子ＴＰ５３の発現を干渉するための高分子核酸分子が、下記のｅ１）〜ｅ１１）であり、
ｅ１）配列７２、配列７３、配列７４、配列７５、配列７６及び配列７７により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｅ２）配列７８、配列７９、配列８０、配列８１、配列８２及び配列８３により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｅ３）配列８４、配列８５、配列８６、配列８７、配列８８及び配列８９により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｅ４）配列７３、配列７４、配列７５、配列７６及び配列７７により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｅ５）配列７９、配列８０、配列８１、配列８２及び配列８３により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｅ６）配列５４、配列５５、配列５７、配列５８及び配列５９により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｅ７）配列７４、配列７５、配列７６及び配列７７により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｅ８）配列８０、配列８１、配列８２及び配列８３により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｅ９）配列配列８６、配列８７、配列８８及び配列８９により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｅ１０）配列９０、配列９１、配列９２、配列９３、配列９４及び配列９５により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｅ１１）配列９６、配列９７、配列９８、配列９９、配列１００及び配列１０１により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるものであることを特徴とする請求項１７に記載の高分子核酸分子。
【請求項１９】
請求項１乃至１８の中のいずれか一項に記載の高分子核酸分子の誘導体であって、
（ｍ１）請求項１乃至１８の中のいずれか一項に記載の高分子核酸分子に一つまたは複数のヌクレオチドを削除または増加して得た誘導体であって、前記高分子核酸分子と同様な機能を有する高分子核酸分子の誘導体、
（ｍ２）請求項１乃至１８の中のいずれか一項に記載の高分子核酸分子にヌクレオチドの置換または修飾を行って得た誘導体であって、前記高分子核酸分子と同様な機能を有する高分子核酸分子の誘導体、
（ｍ３）請求項１乃至１８の中のいずれか一項に記載の高分子核酸分子の骨格をチオリン酸エステル骨格に改善して得た誘導体であって、前記高分子核酸分子と同様な機能を有する高分子核酸分子の誘導体、
（ｍ４）請求項１乃至１８の中のいずれか一項に記載の高分子核酸分子によってペプチド核酸、ロックド核酸またはアンロックド核酸をコードして得た誘導体であって、前記高分子核酸分子と同様な機能を有する高分子核酸分子の誘導体、
（ｍ５）請求項１乃至１８の中のいずれか一項に記載の高分子核酸分子の一つの末端または途中に信号分子及び／または活性分子及び／または官能基を接続して得た誘導体であって、前記高分子核酸分子と同様な機能を有する高分子核酸分子の誘導体の中のいずれか１種であることを特徴とする高分子核酸分子の誘導体。
【請求項２０】
請求項１乃至１８の中のいずれか一項に記載の高分子核酸分子の調製方法であって
Ｍ１）請求項１乃至１８の中のいずれか一項に記載のＸ型核酸分子及び／またはＨ型核酸分子及び／またはＣ型核酸分子を合成する工程と、
Ｍ２）前記Ｘ型核酸分子及び／または前記Ｈ型核酸分子及び／または前記Ｃ型核酸分子をアニーリングさせて、前記高分子核酸を得る工程と、を含むことを特徴とする高分子核酸分子の調製方法。
【請求項２１】
下記のＡ１）又はＡ２）における請求項１乃至１８の中のいずれか一項に記載の高分子核酸分子または請求項１９に記載の誘導体の応用。
Ａ１）標的遺伝子の細胞での発現レベルの調節、
Ａ２）標的遺伝子の発現による病気を予防及び／または和らげる及び／または治療するための製品の調製
【請求項２２】
前記調節が、抑制または低下または干渉であることを特徴とする請求項２１に記載の応用。
【請求項２３】
前記細胞が腫瘍細胞であることを特徴とする請求項２１に記載の応用。
【請求項２４】
前記標的遺伝子が疾患関連遺伝子であり、
または、前記疾患関連遺伝子が腫瘍関連遺伝子であり、
または、前記腫瘍関連遺伝子が、ＰＰＩＢ遺伝子、ｐ６５遺伝子、ＢＩＲＣ５遺伝子、ＣＴＮＮＢ遺伝子、ＣＯＰＳ５遺伝子、ＣＬＵ遺伝子、ＥＩＦ４Ｅ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＴＰ５３遺伝子、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＳＯＤ１遺伝子の中の少なくとも１種であることを特徴とする請求項２１に記載の応用。
【請求項２５】
請求項１乃至１８の中のいずれか一項に記載の高分子核酸分子または請求項１９に記載の誘導体を含むことを特徴とする標的遺伝子の細胞での発現レベルを抑制または低下または干渉するための試薬または試薬キットまたは薬物。
【請求項２６】
請求項１乃至１８の中のいずれか一項に記載の高分子核酸分子または請求項１９に記載の誘導体を細胞に導入して標的遺伝子の細胞での発現レベルを抑制または低下させることを含むことを特徴とする標的遺伝子の細胞での発現レベルを抑制または低下または干渉する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸技術分野に関し、特に、新型構造の核酸ユニットとそれの自己組織化した一つまたは複数の目的遺伝子の発現を干渉することのできる高分子核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＯＮ（相補的オリゴヌクレオチド）技術によって、人工合成されたオリゴヌクレオチド分子が配列の相補性によって標的分子と結合し標的分子の生物特性を変更することができるようになった。ＣＯＮ技術は、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）技術と、ＡＳＯ（アンチセンスオリゴヌクレオチド）技術との２種類を含み、現在、すでに機能ゲノム学研究に汎用されていて、小分子化合物及び生物学的製剤以外の第３の治療手段になる可能性がある。例えば、ホモ接合型家族性高コレステロール血症（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ、ＦｏＦＨ）を治療するためのｍｉｐｏｍｅｒｓｅｎは、Ｇｅｎｚｙｍｅにより研究開発された合成されたチオリン酸オリゴヌクレオチドであり、Ａｐｏ  Ｂ−１００タンパクｍＲＮＡのコード領域と相補的にペアリングすることで、Ａｐｏ  Ｂ−１００タンパク（ＬＤＬとＶＬＤＬの主なアポリポ蛋白）の翻訳合成を抑制して、ＦｏＦＨ患者のＬＤＬ−Ｃ、ＴＣ、Ｎｏｎ−ＨＤＬ−Ｃレベルを有効に下げる。ＣＯＮ技術がある程度の成功を取得したが、該技術にはいまだに改善すべきものがある。例えば、伝統的なＲＮＡｉ試薬には、１）合成工程が複雑で、生産コストが比較的に高く、２）エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼに対して非常に敏感であり、安定性が高くなく、３）抑制の有効率が高くなく、単一の分子によっても標的遺伝子の発現を抑制できることを保証できず、４）主にセンス鎖からの非特異的な活性による副作用があり、５）細胞、特に動物の体内に導入しにくい問題がある。
【０００３】
ナノ技術は直径が１〜１００ｎｍナノ範囲内である物質の性質及び応用を研究する。ナノ構造の物質が有する小サイズ効果、表面効果、高拡散性等の特性は、科学研究や技術応用のために新領域を開いた。オリゴヌクレオチド構造は柔軟性を有し、例えばＲＮＡ構造の場合、自己組織化してナノ構造を形成することができる。ＤＮＡとＲＮＡを代表とする核酸ナノ技術は、ナノ技術分野が発展すべき新しい方向である。
【発明の概要】
【０００４】
本発明が解決しようとする技術課題は、如何に標的遺伝子の発現を抑制または低下または干渉するかである。
【０００５】
上記技術課題を解決するため、本発明はまず、標的遺伝子の発現を抑制または低下または干渉するための高分子核酸分子を提供する。
【０００６】
本発明による標的遺伝子の発現を抑制または低下または干渉するための高分子核酸分子は、ｎ本のＸ型核酸分子からなる。
【０００７】
前記Ｘ型核酸分子それぞれは、５’末端から順に標的断片１、標的断片２、リンカー断片３からなる。前記Ｘ型核酸分子それぞれは、標的断片１がその隣り合うＸ型核酸分子のリンカー断片３と相補的にペアリングする。具体的には、ｎ本のＸ型核酸分子をそれぞれ、Ｘ１ユニット、Ｘ２ユニット、Ｘ３ユニット、…、Ｘｎ−１ユニット、Ｘｎユニットと称す。前記Ｘ１ユニットのリンカー断片３が前記Ｘ２ユニットの標的断片１と相補的にペアリングし（完全相補）、前記Ｘ２ユニットのリンカー断片３が前記Ｘ３ユニットの標的断片１と相補的にペアリングし（完全相補）、類似に、前記Ｘｎ−１ユニットのリンカー断片３が前記Ｘｎユニットの標的断片１と相補的にペアリングし（完全相補）、前記Ｘｎユニットのリンカー断片３が前記Ｘ１ユニットの標的断片１と相補的にペアリングする（完全相補）。各前記Ｘ型核酸分子の標的断片１は他のＸ型核酸分子の配列といずれも相補しない。
【０００８】
前記高分子核酸分子それぞれは、標的断片１と標的断片２がいずれも標的遺伝子と相補的にペアリングし、前記高分子核酸分子それぞれは標的断片１と標的断片２によって標的遺伝子の特定の配列と結合して、標的遺伝子の発現に対する抑制または低下または干渉を実現する。ある特定の状況で、標的遺伝子の配列と相補する領域はリンカー断片３の配列の一部までに延長することができる。同一のＸ型核酸分子における標的断片１と標的断片２は、同一であることができれば、異なることもできる。２本の異なるＸ型核酸分子における標的断片１または標的断片２は同一であることができれば、異なることもできる。
【０００９】
前記Ｘ型核酸分子それぞれは、長さが同じである（構造も同じである）。
【００１０】
前記ｎは、３以上の整数である。
【００１１】
本発明の具体的な実施例において、前記ｎ本のＸ型核酸分子は、順に末端がつながり（前のＸ型核酸分子のリンカー断片３が次の隣り合うＸ型核酸分子の標的断片１と相補することで実現される）、最終的に環状の二次構造を有する高分子核酸分子を形成する。
【００１２】
上記高分子核酸分子において、前記ｎ本のＸ型核酸分子はさらに、線形構造を有する高分子核酸分子を形成することができ、前記線形構造を有する高分子核酸分子はＨ１型核酸分子とＨｎ型核酸分子からなるＨ型核酸分子をさらに含む。
【００１３】
ｎ本のＸ型核酸分子をそれぞれ、Ｘ１ユニット、Ｘ２ユニット、Ｘ３ユニットと、…、Ｘｎ−１ユニット、Ｘｎユニットと称する。前記Ｘ１ユニットのリンカー断片３が前記Ｘ２ユニットの標的断片１と相補的にペアリングし、前記Ｘ２ユニットのリンカー断片３が前記Ｘ３ユニットの標的断片１と相補的にペアリングし、類似に、前記Ｘｎ−１ユニットのリンカー断片３が前記Ｘｎユニットの標的断片１と相補的にペアリングする。そして前記Ｈ１型核酸分子が前記Ｘ１ユニットの標的断片１と相補的にペアリングし、前記Ｈｎ型核酸分子が前記Ｘｎユニットのリンカー断片３と相補的にペアリングする。
【００１４】
さらに、前記Ｈ型核酸分子は５’末端または３’末端にＨｙ断片をさらに含み、前記Ｈ型核酸分子はＨｘ断片とＨｙ断片からなる。
【００１５】
前記Ｈ１型核酸分子と前記Ｘ１ユニットとの相補領域は前記Ｘ１ユニットの標的断片２の配列の一部または全部までに延長することができ、前記Ｈｎ型核酸分子と前記Ｘｎユニットとの相補領域は前記Ｘｎユニットの標的断片２の配列の一部分または全部までに延長することができる。
【００１６】
前記Ｈ１型核酸分子のＨｘ断片は前記Ｘ１ユニットの標的断片１と相補的にペアリングし、前記Ｈｎ型核酸分子のＨｘ断片は前記Ｘｎユニットのリンカー断片３と相補的にペアリングし、前記Ｈｙ断片は前記Ｘ１ユニットまたは前記Ｘｎユニットの標的断片２における５’末端または３’末端からの一つ、二つまたは複数の連続する核酸分子と相補的にペアリングする。
【００１７】
上記高分子核酸分子において、環状構造を有する高分子核酸分子は、ｎ本の前記Ｘ型核酸分子における標的断片２の逆相補配列であるｎ個の断片が順に接続されてなるＣ型核酸分子をさらに含む。具体的には、前記Ｃ型核酸分子は３’末端から、順に帽端（キャッピングされた端）断片１、帽端断片２、帽端断片３、…、帽端断片Ｃｎ−１、帽端断片ｎからなる。なお、ｎ本のＸ型核酸分子をそれぞれＸ１ユニット、Ｘ２ユニット、Ｘ３ユニット、…、Ｘｎ−１ユニット、Ｘｎユニットと称す。
【００１８】
前記Ｘ１ユニットのリンカー断片３は前記Ｘ２ユニットの標的断片１と相補的にペアリングし、前記Ｘ２ユニットのリンカー断片３は前記Ｘ３ユニットの標的断片１と相補的にペアリングし、類似に、前記Ｘｎ−１ユニットのリンカー断片３が前記Ｘｎユニットの標的断片１と相補的にペアリングし、前記Ｘｎユニットのリンカー断片３が前記Ｘ１ユニットの標的断片１と相補的にペアリングし、前記帽端断片１が前記Ｘ１ユニットの標的断片２と相補的にペアリングし、前記帽端断片２が前記Ｘ２ユニットの標的断片２と相補的にペアリングし、類似に、前記帽端断片Ｃｎ−１が前記Ｘｎ−１ユニットの標的断片２と相補的にペアリングし、前記帽端断片ｎが前記Ｘｎユニットの標的断片２と相補的にペアリングする。
【００１９】
上記高分子核酸分子において、前記核酸分子（Ｘ型核酸分子、Ｈ型核酸分子またはＣ型核酸分子）は、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはＤＮＡとＲＮＡからなるオリゴヌクレオチドであることができる。
【００２０】
さらに、前記核酸分子（Ｘ型核酸分子、Ｈ型核酸分子またはＣ型核酸分子）は、一本鎖ＲＮＡ分子である。
【００２１】
上記高分子核酸分子において、前記Ｘ型核酸分子は長さが１５〜５０ｎｔであり、好ましは２４〜３６ｎｔである。
【００２２】
前記標的断片１は長さが５〜２４ｎｔである。
【００２３】
前記標的断片２は長さが１〜２０ｎｔである。
【００２４】
前記リンカー断片３は長さが５〜２４ｎｔである。
【００２５】
前記標的断片１と前記標的断片２の長さの合計は少なくとも１４〜１６ｎｔである。
【００２６】
前記Ｈｙ断片は長さが２〜６ｎｔであるかまたはさらに長い。
【００２７】
さらに、前記Ｘ型核酸分子は長さが２４〜３６ｎｔである。
【００２８】
上記高分子核酸分子において、前記高分子核酸分子は少なくとも一つの修飾されたヌクレオチドを含む。
【００２９】
さらに、前記修飾は、リン酸骨格修飾、塩基修飾及び／またはリボース修飾である。前記リボース修飾は、リボース２位水酸基がハロゲン基またはＯ−アルキル基によって置換されることである。前記アルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基またはメチルエチル基である。
【００３０】
さらに、前記Ｘ型核酸分子のリンカー断片３は、３’末端の第１位ヌクレオチドから連続する５〜９個のヌクレオチドのリボース２位水酸基がハロゲン基またはＯ−アルキル基によって置換される。
【００３１】
前記Ｈ型核酸分子のＨｘ断片は、３’末端の第１位ヌクレオチドから連続する５〜９個のヌクレオチドのリボース２位水酸基がハロゲン基またはＯ−アルキル基によって置換される。
【００３２】
前記Ｈ型核酸分子は、３’末端の第１位ヌクレオチドから連続する８〜３０個のヌクレオチドのリボース２位水酸基がハロゲン基またはＯ−アルキル基によって置換され、好ましくは、前記Ｈ型核酸分子は、３’末端の第１位ヌクレオチドから連続する１４〜１８個のヌクレオチドのリボース２位水酸基がハロゲン基またはＯ−アルキル基によって置換される。
【００３３】
前記Ｃ型核酸分子中の各帽端断片は、５’末端の第１位ヌクレオチドから連続する２〜６個のヌクレオチドのリボース２位水酸基がハロゲン基またはＯ−アルキル基によって置換される。
【００３４】
上記高分子核酸分子において、前記ｎは３または４または５または６または７または８である。
【００３５】
さらに、前記ｎは４または５または６である。
【００３６】
上記高分子核酸分子において、前記標的遺伝子の数量は一つまたは二つまたは複数であり、且つ前記標的遺伝子の数量はｎ個以下である。Ｘ型核酸分子それぞれは一つの標的遺伝子に対応し、または複数本のＸ型核酸分子が同一の標的遺伝子の異なる領域に対応する。
【００３７】
さらに、前記標的遺伝子の数量は一つまたは４個または６個である。
【００３８】
前記標的遺伝子は、ＰＰＩＢ遺伝子、ｐ６５遺伝子、ＢＩＲＣ５遺伝子、ＣＴＮＮＢ遺伝子、ＣＯＰＳ５遺伝子、ＣＬＵ遺伝子、ＥＩＦ４Ｅ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＴＰ５３遺伝子、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＳＯＤ１遺伝子の中の少なくとも１種である。
【００３９】
またさらに、標的遺伝子ＰＰＩＢの発現を干渉するための高分子核酸分子は、下記のａ１）〜ａ５）であり、
ａ１）配列１、配列２、配列３及び配列４により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ａ２）配列１、配列２、配列３、配列４、配列２０及び配列２１により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ａ３）配列１、配列２、配列３、配列４及び配列８により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ａ４）配列２、配列３、配列９、配列１０、配列１１及び配列１２により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ａ５）配列２、配列３、配列６、配列９、配列１０、配列１１、配列１３及び配列１４により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
標的遺伝子Ｐ６５の発現を干渉するための高分子核酸分子は、下記のｂ１）〜ｂ５）であり、
ｂ１）配列１５、配列１６、配列１７及び配列１８により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｂ２）配列６、配列７、配列１５、配列１６、配列１７及び配列１９により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｂ３）配列１５、配列１６、配列１７、配列１８及び配列２２により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｂ４）配列１５、配列１６、配列１７、配列２３、配列２４及び配列２５により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｂ５）配列１５、配列１６、配列１７、配列２０、配列２３、配列２４、配列２６及び配列２７により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
標的遺伝子ＢＩＲＣ５、ＣＴＮＮＢ、ＣＯＰＳ５、ＣＬＵの発現を同時に干渉するための高分子核酸分子は、配列２８、配列２９、配列３０及び配列３１により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなり、
標的遺伝子ＢＩＲＣ５、ＣＴＮＮＢ、ＣＯＰＳ５、ＣＬＵ、ＥＩＦ４Ｅ、ＨＩＦ１Ａの発現を同時に干渉するための高分子核酸分子は、配列２８、配列２９、配列３０、配列３２、配列３３及び配列３４により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなり、
標的遺伝子ＳＯＤ１、ＰＰＩＢ、Ｐ６５、ＶＥＧＦＡの発現を同時に干渉するための高分子核酸分子は、下記のｃ１）〜ｃ３）であり、
ｃ１）配列３５、配列３６、配列３７及び配列３８により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｃ２）配列３５、配列３６、配列３７、配列３８、配列３９及び配列４０により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｃ３）配列３５、配列３６、配列３７、配列３８及び配列４１により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるものであり、
標的遺伝子ＶＥＧＦＡの発現を干渉するための高分子核酸分子は、下記のｄ１）〜ｄ１１）であり、
ｄ１）配列４２、配列４３、配列４４、配列４５、配列４６及び配列４７により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｄ２）配列４８、配列４９、配列５０、配列５１、配列５２及び配列５３により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｄ３）配列５４、配列５５、配列５６、配列５７、配列５８及び配列５９により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｄ４）配列４２、配列４３、配列４５、配列４６及び配列４７により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｄ５）配列４８、配列４９、配列５１、配列５２及び配列５３により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｄ６）配列５４、配列５５、配列５７、配列５８及び配列５９により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｄ７）配列４２、配列４５、配列４６及び配列４７により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｄ８）配列４８、配列５１、配列５２及び配列５３により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｄ９）配列５４、配列５７、配列５８及び配列５９により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｄ１０）配列６０、配列６１、配列６２、配列６３、配列６４及び配列６５により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｄ１１）配列６６、配列６７、配列６８、配列６９、配列７０及び配列７１により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
標的遺伝子ＴＰ５３の発現を干渉するための高分子核酸分子は、下記のｅ１）〜ｅ１１）であり、
ｅ１）配列７２、配列７３、配列７４、配列７５、配列７６及び配列７７により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｅ２）配列７８、配列７９、配列８０、配列８１、配列８２及び配列８３により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｅ３）配列８４、配列８５、配列８６、配列８７、配列８８及び配列８９により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｅ４）配列７３、配列７４、配列７５、配列７６及び配列７７により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｅ５）配列７９、配列８０、配列８１、配列８２及び配列８３により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｅ６）配列５４、配列５５、配列５７、配列５８及び配列５９により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｅ７）配列７４、配列７５、配列７６及び配列７７により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｅ８）配列８０、配列８１、配列８２及び配列８３により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｅ９）配列配列８６、配列８７、配列８８及び配列８９により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｅ１０）配列９０、配列９１、配列９２、配列９３、配列９４及び配列９５により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるもの、
ｅ１１）配列９６、配列９７、配列９８、配列９９、配列１００及び配列１０１により示される一本鎖ＲＮＡ分子からなるものである。
【００４０】
上記技術課題を解決するため、本発明においてさらに上記高分子核酸分子の誘導体を提供する。
【００４１】
本発明による上記高分子核酸分子の誘導体は、
（ｍ１）上記高分子核酸分子に一つまたは複数のヌクレオチドを削除または増加して得た誘導体であって、前記高分子核酸分子と同様な機能を有する高分子核酸分子の誘導体、
（ｍ２）上記高分子核酸分子にヌクレオチドの置換または修飾を行って得た誘導体であって、前記高分子核酸分子と同様な機能を有する高分子核酸分子の誘導体、
（ｍ３）上記高分子核酸分子の骨格をチオリン酸エステル骨格に改善して得た誘導体であって、前記高分子核酸分子と同様な機能を有する高分子核酸分子の誘導体、
（ｍ４）上記高分子核酸分子によってペプチド核酸、ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）またはアンロックド核酸（ｕｎｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）をコードして得た誘導体であって、前記高分子核酸分子と同様な機能を有する高分子核酸分子の誘導体、
（ｍ５）上記高分子核酸分子の一つの末端または途中に信号分子及び／または活性分子及び／または官能基を接続して得た誘導体であって、前記高分子核酸分子と同様な機能を有する高分子核酸分子の誘導体の中のいずれか１種である。
【００４２】
上記技術課題を解決するため、本発明において上記高分子核酸分子の調製方法を提供する。
【００４３】
本発明による上記高分子核酸分子の調製方法は、
Ｍ１）上記Ｘ型核酸分子及び／またはＨ型核酸分子及び／またはＣ型核酸分子を合成する工程と、
Ｍ２）前記Ｘ型核酸分子及び／または前記Ｈ型核酸分子及び／または前記Ｃ型核酸分子をアニーリングさせて、前記高分子核酸を得る工程と、を含む。
【００４４】
上記方法において、前記アニーリングの反応系は、同モル量の各一本鎖ＲＮＡ分子、ＲＮＡアニーリングｂｕｆｆｅｒと水を均一に混合して体系を得た。前記アニーリングの反応条件は、ＰＣＲ機器において９０℃、２ｍｉｎで充分に変性させ、その後、ＰＣＲ機器において温度を２５℃まで下げてアニーリングさせる。
【００４５】
ｎが４である場合、アニーリング体系（総体積は１００μＬである）において、各一本鎖ＲＮＡ分子溶液（濃度は１００μＭである）２０μＬ、ＲＮＡアニーリングｂｕｆｆｅｒ（５Ｘ）１５μＬ、ＤＥＰＣ水５μＬである。
【００４６】
ｎが５である場合、アニーリング体系（総体積は１５０μＬである）において、各一本鎖ＲＮＡ分子溶液（濃度は１５０μＭである）２０μＬ、ＲＮＡアニーリングｂｕｆｆｅｒ（５Ｘ）３０μＬ、ＤＥＰＣ水２０μＬである。
【００４７】
ｎが６である場合、アニーリング体系（総体積は２００μＬである）において、各一本鎖ＲＮＡ分子溶液（濃度は２００μＭである）２０μＬ、ＲＮＡアニーリングｂｕｆｆｅｒ（５Ｘ）４０μＬ、ＤＥＰＣ水４０μＬである。
【００４８】
上記技術課題を解決するため、本発明において上記高分子核酸分子または誘導体の新しい応用をさらに提供する。
【００４９】
本発明において、Ａ１）又はＡ２）における上記高分子核酸分子または誘導体の応用を提供する。
【００５０】
Ａ１）標的遺伝子の細胞での発現レベルの調節、
Ａ２）標的遺伝子の発現による病気を予防及び／または和らげる及び／または治療するための製品の調製
上記応用において、前記調節は、抑制または低下または干渉である。
【００５１】
上記応用において、前記細胞は腫瘍細胞である。
【００５２】
上記応用において、前記標的遺伝子は疾患関連遺伝子であり、前記疾患関連遺伝子は具体的に腫瘍関連遺伝子であり、前記腫瘍関連遺伝子は具体的に、ＰＰＩＢ遺伝子、ｐ６５遺伝子、ＢＩＲＣ５遺伝子、ＣＴＮＮＢ遺伝子、ＣＯＰＳ５遺伝子、ＣＬＵ遺伝子、ＥＩＦ４Ｅ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＴＰ５３遺伝子、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＳＯＤ１遺伝子の中の少なくとも１種である。
【００５３】
上記技術課題を解決するため、本発明において細胞での標的遺伝子の発現レベルを抑制または低下または干渉するための試薬または試薬キットまたは薬物をさらに提供する。
【００５４】
本発明による細胞での標的遺伝子の発現レベルを抑制または低下または干渉するための試薬または試薬キットまたは薬物は、上記高分子核酸分子または上記誘導体を含む。
【００５５】
上記技術課題を解決するため、最後に本発明において細胞での標的遺伝子の発現レベルを抑制または低下または干渉するための方法をさらに提供する。
【００５６】
本発明による細胞での標的遺伝子の発現レベルを抑制または低下または干渉するための方法は、上記高分子核酸分子または誘導体を前記細胞に導入して前記細胞での標的遺伝子の発現レベルの抑制または低下を実現する工程を含む。
【００５７】
上記方法において、前記導入する方法は、前記高分子核酸分子、トランスフェクション試薬と緩衝液を均一に混合して細胞培養培地に投入して反応系を得て、前記高分子核酸分子の前記反応系での終濃度は１〜３００ｎＭである。
【００５８】
上記方法において、前記細胞は腫瘍細胞である。
【００５９】
上記方法において、前記標的遺伝子は疾患関連遺伝子であり、前記疾患関連遺伝子は具体的に腫瘍関連遺伝子であり、前記腫瘍関連遺伝子は具体的に、ＰＰＩＢ遺伝子、ｐ６５遺伝子、ＢＩＲＣ５遺伝子、ＣＴＮＮＢ遺伝子、ＣＯＰＳ５遺伝子、ＣＬＵ遺伝子、ＥＩＦ４Ｅ遺伝子、ＨＩＦ１Ａ遺伝子、ＴＰ５３遺伝子、ＶＥＧＦＡ遺伝子、ＳＯＤ１遺伝子の中の少なくとも１種である。
【００６０】
本発明によると、以下のメリットを有する：
１）ＲＮＡｉ効果を向上させる。
【００６１】
２）構造がさらに安定的で、化学安定性が良好で、ヌクレアーゼ分解に対する耐性が強化され、特に、血液での安定性が強化され、半減期が延長される。
【００６２】
３）オフターゲット率を低下する。
【００６３】
４）ナノ粒子構造を形成して、細胞への導入能力が強化される。
【００６４】
５）核酸分子をモジュール化設計することができる。
【００６５】
６）一部の構造の高分子核酸はＲＮＡｉ作用を果たす時にＤｉｃｅｒ酵素の参与を必要としないため、化学修飾に対する耐性がより高く、一部修飾または完全修飾を行うことができる。
【００６６】
本発明によると、ＣＯＮ技術をナノ技術と結合して、精確に設計可能であり、且つ自己組織化能力を有する核酸構造を構築することで、マルチ標的の干渉作用を実現し、疾患が発生または進行する信号通路における複数の遺伝子の発現を抑制し、または複数の疾患の標的遺伝子の発現を同時に抑制するに用いられ、生物学、化学等の多くの学科分野で幅広い応用の見込みがある。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】標的核酸ユニット−Ｘ型を示す図である。
【図２】フランキング核酸ユニット−Ｈ型を示す図である。
【図３】帽端核酸ユニット−Ｃ型を示す図である。
【図４】Ｒ構造の高分子核酸の平面と環状図を示す図である。上方の図はＲ構造の高分子核酸の平面を示す図である。下方の図はＲ構造の高分子核酸の環状を示す図である（左：Ｒ＝（Ｘｉ）４；右：Ｒ＝（Ｘｉ）６）。
【図５】Ｌ構造の高分子核酸の平面を示す図である。
【図６】Ｃｒ構造の高分子核酸の平面を示す図である。
【図７】単一遺伝子の相対的な発現レベルを示す。
【図８】マルチ遺伝子の相対的な発現レベルを示す。
【図９】マルチ遺伝子の相対的な発現レベル（ｎ＝４）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
以下の実施例に用いられる実験方法は、特別な説明がない限り、いずれも通常の方法である。
【００６９】
以下の実施例に用いられる材料、試薬等は、特別な説明がない限り、いずれも市販品から入手可能なものである。
【００７０】
実施例１、核酸ユニット、高分子核酸の設計及び合成
一、核酸ユニットの設計
本発明において３種類の形態の核酸ユニットを設計し、それぞれＸ型標的核酸ユニット、Ｈ型フランキング核酸ユニット、Ｃ型帽端核酸ユニットと称す。これらの核酸ユニットは、複種類の構造の高分子核酸に自由に組み合わせられることができる。
【００７１】
１、標的核酸ユニット：Ｘ型
Ｘ型標的核酸ユニットの構造は、５’−Ｔ１−Ｔ２−Ａ３−３’である。ここで、Ｔ１は標的断片１で、Ｔ２は標的断片２で、Ａ３はリンカー断片３であり、Ｔ１とＴ２によって、標的遺伝子配列に相補的なひと区切りの配列を構成する。ある特定の状況で、標的遺伝子配列に相補的なの領域はＡ３の一部の配列までに延長することができる。Ｘ型標的核酸ユニットの長さは１５〜５０ｎｔであり、好ましくは２４〜３６ｎｔである。ここで、Ｔ１の長さは５〜２４ｎｔで、Ｔ２の長さは１〜２０ｎｔで、Ａ３の長さは５〜２４ｎｔである。図１にＸ型標的核酸ユニットを示す。
【００７２】
２、フランキング核酸ユニット：Ｈ型
Ｈ型フランキング核酸ユニットの構造は、３’−Ｈｘ−Ｈｙ−５’または３’−Ｈｙ−Ｈｘ−５’である。ここで、Ｈｘはフランキング主体断片で、Ｈｙはフランキング延長断片（Ｈｙは存在しなくてもよい）である。ＨｘとＨｙは、ホスホジエステル結合を介して接続される。ＨｙはＨｘの５’末端または３’末端に位置する。ＨｘがＸユニットのＴ１断片またはＡ３断片と相補的にペアリングし、ＨｙはＸユニットのＴ２断片の５’末端または３’末端からの一つ、二つまたは複数の連続するヌクレオチドと相補的にペアリングする。Ｈｙの長さは２〜６ｎｔまたはさらに長いことができる。図２にＨ型フランキング核酸ユニットを示す。
【００７３】
３、帽端核酸ユニット：Ｃ型
Ｃ型帽端核酸ユニットの構造は、３’−Ｃ１−Ｃ２−……Ｃｎ−５’である。ここで、Ｃ１は帽端断片１で、Ｘ１ユニットのＴ２断片と逆相補し、Ｃ２は帽端断片２で、Ｘ２ユニットのＴ２断片と逆相補し、類似に、Ｃｎは帽端断片ｎで、ＸｎユニットのＴ２断片と逆相補する。図３にＣ型帽端核酸ユニットを示す。
【００７４】
二、高分子核酸分子の設計
本発明において、工程１の３種類の核酸ユニットに従って、３種類の構造の高分子核酸を設計し、それぞれＲ構造の高分子核酸、Ｌ構造の高分子核酸、Ｃｒ構造の高分子核酸と称す。これらの構造は、同時に同一の遺伝子の異なる部位を標的とすることができ、同時に異なる遺伝子の異なる部位を標的とすることもでき、標的遺伝子の発現の干渉を実現する。
【００７５】
１、高分子核酸の構造１：Ｒ構造
Ｒ構造の高分子核酸の構造は、（Ｘｉ）ｎである。ここで、Ｘｉは標的核酸ユニットである。ｎは３以上の整数であり、３〜８の整数であることが好ましく、４、５、６であることがさらに好ましい。
【００７６】
ｎ個のＸ型標的核酸ユニットを、それぞれＸ１ユニット、Ｘ２ユニット、Ｘ３ユニット、…、Ｘｎ−１ユニット、Ｘｎユニットと称す。
【００７７】
本発明のＲ構造の高分子核酸において、標的核酸ユニットそれぞれは、いずれも配列の相補的作用によって、高分子核酸における、自体以外の他の二つの標的核酸ユニットと二本鎖領域を形成し、すなわち、隣り合うＸユニットがＴ１断片とＡ３断片との相補的なペアリングによって接続される。具体的には、Ｘ１ユニットのＡ３断片がＸ２ユニットのＴ１断片と相補的にペアリングし、Ｘ２ユニットのＡ３断片がＸ３ユニットのＴ１断片と相補的にペアリングし、類似に、ＸｎユニットのＡ３断片がＸ１ユニットのＴ１断片と相補的にペアリングして（各標的核酸ユニットのＴ１断片が隣り合う標的核酸ユニットのＡ３断片と相補的にペアリングし、且つ各標的核酸ユニットのＴ１断片は他の標的核酸ユニットの配列といずれも相補的にペアリングしない）、環状の二次構造を形成する。当該環状構造において、各標的核酸ユニットの構造や長さは同じである。
【００７８】
各標的核酸ユニットは、そのＴ１及びＴ２によって標的遺伝子の特定の配列に結合して、標的遺伝子の発現を調節する。
【００７９】
図４にＲ構造の高分子核酸の平面と環状図を示す。
【００８０】
２、高分子核酸構造２：Ｌ構造
Ｌ構造の高分子核酸の構造は、Ｈ１−（Ｘｉ）ｎ−Ｈｎである。ここで、Ｈ１、Ｈｎはいずれもフランキング核酸ユニットであり、Ｘｉは標的核酸ユニットである。ｎは３以上の整数であり、３〜８の整数であることが好ましく、４、５、６であることがさらに好ましい。
【００８１】
ｎ個のＸ型標的核酸ユニットをそれぞれ、Ｘ１ユニット、Ｘ２ユニット、Ｘ３ユニット、…、Ｘｎ−１ユニット、Ｘｎユニットと称す。
【００８２】
本発明のＬ構造の高分子核酸において、Ｘ１ユニットのＡ３断片がＸ２ユニットのＴ１断片と相補的にペアリングし、Ｘ２ユニットのＡ３断片がＸ３ユニットのＴ１断片と相補的にペアリングし、類似に、Ｘｎ−１ユニットのＡ３断片がＸｎユニットのＴ１断片と相補的にペアリングし。そして、Ｈ１ユニットがＸ１ユニットのＴ１断片と相補的にペアリングする。Ｈ１ユニットとＸ１ユニットとの相補領域は、Ｘ１ユニットのＴ２断片の一部または全部までに延長することができる。ＨｎユニットがＸｎユニットのＡ３断片と相補的にペアリングし、ＨｎユニットとＸｎユニットとの相補領域は、ＸｎユニットのＴ２断片の一部または全部までに延長することができる。Ｈ１ユニットの５’末端またはＨｎユニットの３’末端はＨｙ断片をさらに含み、Ｈｙ断片は、前記Ｘ１ユニットまたは前記Ｘｎユニットの標的断片２における５’末端または３’末端からの一つ、二つまたは複数の連続する核酸分子と相補的にペアリングする。
【００８３】
図５にＬ構造の高分子核酸の平面を示す。
【００８４】
３、高分子核酸構造３：Ｃｒ構造
Ｃｒ構造の高分子核酸の構造は、（Ｘｉ）ｎ−Ｃである。ここで、Ｘｉは標的核酸ユニットで、Ｃは帽端核酸ユニットである。ｎは３以上の整数であり、３〜８の整数であることが好ましく、４、５、６であることがさらに好ましい。
【００８５】
ｎ個のＸ型標的核酸ユニットをそれぞれ、Ｘ１ユニット、Ｘ２ユニット、Ｘ３ユニット、…、Ｘｎ−１ユニット、Ｘｎユニットと称す。
【００８６】
本発明のＣｒ構造の高分子核酸において、Ｘ１ユニットのＡ３断片がＸ２ユニットのＴ１断片と相補的にペアリングし、Ｘ２ユニットのＡ３断片がＸ３ユニットのＴ１断片と相補的にペアリングし、類似に、Ｘｎ−１ユニットのＡ３断片がＸｎユニットのＴ１断片と相補的にペアリングする。そして帽端核酸ユニットＣは、帽端断片１、帽端断片２、…、帽端断片ｎからなり、帽端断片１がＸ１ユニットのＴ２断片と相補的にペアリングし、帽端断片２がＸ２ユニットのＴ２断片と相補的にペアリングし、類似に、帽端断片ｎがＸｎユニットのＴ２断片と相補的にペアリングする。帽端断片１、帽端断片２、…、帽端断片ｎはいずれもホスホジエステル結合を介して接続されて一本鎖核酸を形成する。
【００８７】
図６にＣｒ構造の高分子核酸の平面を示す。
【００８８】
三、高分子核酸の合成方法及び核酸ユニットの修飾方法
１、高分子核酸の合成方法
本発明の核酸ユニットは、配列特異的な形態で互いにアニーリングし、その相補性によって該高分子核酸の自己組織化が促進されて、二次構造を有する高分子核酸分子を形成する。具体的な合成方法は以下のとおりである。
【００８９】
１）高分子核酸構造に必要な核酸ユニットを合成する。
【００９０】
２）核酸ユニットをアニーリング条件に置いて、互いにアニーリングして自己組織化して二次構造体を形成する。
【００９１】
アニーリング反応系は、同モル量の各核酸ユニット、ＲＮＡアニーリングｂｕｆｆｅｒ（５Ｘ）（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ製Ａｎｎｅａｌｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  ｏｌｉｇｏｓ（５Ｘ）、Ｒ００５１）と水（ＤＥＰＣ水）を均一に混合して得た体系である。
【００９２】
アニーリング反応条件は、ＰＣＲ機器において９０℃、２ｍｉｎで充分に変性させ、その後、ＰＣＲ機器において温度を２５℃まで下げてアニーリングさせる。
【００９３】
２、核酸ユニットの修飾方法
ヌクレアーゼの安定性と生物学活性を増やすために、核酸に、例えば２’リボース水酸基をハロゲン基またはＯ−アルキル基で置換する等のリボースに対する化学修飾を含む適切なリボース、塩基、リン酸部分の修飾を導入することができる。ここで、アルキル基はメチル基、エチル基、プロピル基またはメチルエチル基等を含む。このような核酸修飾によって高分子核酸の干渉活性が低下することはない。本発明において設計された核酸ユニットは以下の修飾を含む：
１）標的核酸ユニットにおけるＡ３リンカー断片の３’末端の第１位ヌクレオチドから連続する５〜９個のヌクレオチドのリボース２位水酸基が、ハロゲン基またはＯ−アルキル基によって置換される。
【００９４】
２）フランキング核酸ユニットのフランキング主体断片の３’末端の第１位ヌクレオチドから連続する５〜９個のヌクレオチドのリボース２位水酸基が、ハロゲン基またはＯ−アルキル基によって置換され、またはフランキング核酸ユニットの３’末端の第１位ヌクレオチドから連続する８〜３０個のヌクレオチドのリボース２位水酸基が、ハロゲン基またはＯ−アルキル基によって置換される。好ましくは、フランキング核酸ユニットの３’末端の第１位ヌクレオチドから連続する１４〜１８個のヌクレオチドのリボース２位水酸基がハロゲン基またはＯ−アルキル基によって置換される。
【００９５】
３）帽端核酸ユニットの各帽端核酸断片の５’末端から３’末端までの２〜６個のヌクレオチドのリボース２位水酸基が、ハロゲン基またはＯ−アルキル基によって置換される。
【００９６】
実施例２、高分子核酸の調製及び標的遺伝子の発現の干渉での応用
（一）Ｒ構造の高分子核酸：同一遺伝子の異なる領域を標的とする抑制実験
１、高分子核酸
以下の構造の高分子核酸を調製し、各構造の標的核酸ユニットはそれぞれＶＥＧＦＡ、ＴＰ５３遺伝子の４個、５個または６個の異なる領域を標的とする。
【００９７】
Ａは、標的核酸ユニットのＴ１とＡ３断片は１２ｎｔで、Ｔ２断片は６ｎｔであることを表す。
【００９８】
Ｂは、標的核酸ユニットのＴ１とＡ３断片は１２ｎｔで、Ｔ２断片は５ｎｔであることを表す。
【００９９】
Ｃは、標的核酸ユニットのＴ１とＡ３断片は１２ｎｔで、Ｔ２断片は３ｎｔであることを表す。
【０１００】
Ｄは、標的核酸ユニットのＴ１とＡ３断片は１１ｎｔで、Ｔ２断片は６ｎｔであることを表す。
【０１０１】
Ｅは、標的核酸ユニットのＴ１とＡ３断片は１０ｎｔで、Ｔ２断片は６ｎｔであることを表す。
【０１０２】
ｎが４である場合、アニーリング体系（総体積は１００μＬである）において、各核酸ユニット溶液（濃度は１００μＭである）２０μＬ、ＲＮＡアニーリングｂｕｆｆｅｒ（５Ｘ）１５μＬ、ＤＥＰＣ水５μＬである。
【０１０３】
ｎが５である場合、アニーリング体系（総体積は１５０μＬである）において、各核酸ユニット溶液（濃度は１５０μＭである）２０μＬ、ＲＮＡアニーリングｂｕｆｆｅｒ（５Ｘ）３０μＬ、ＤＥＰＣ水２０μＬである。
【０１０４】
ｎが６である場合、アニーリング体系（総体積は２００μＬである）において、各核酸ユニット溶液（濃度は２００μＭである）２０μＬ、ＲＮＡアニーリングｂｕｆｆｅｒ（５Ｘ）４０μＬ、ＤＥＰＣ水４０μＬである。
【０１０５】
標的遺伝子がＶＥＧＦＡである高分子核酸は、以下の１）〜１１）である。
【０１０６】
１）ＶＥＧＦＡ−Ｒ６−Ａ（Ｒ構造、ｎ＝６）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ６は順に表１の配列４２〜４７である。
【０１０７】
２）ＶＥＧＦＡ−Ｒ６−Ｂ（Ｒ構造、ｎ＝６）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ６は順に表１の配列４８〜５３である。
【０１０８】
３）ＶＥＧＦＡ−Ｒ６−Ｃ（Ｒ構造、ｎ＝６）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ６は順に表１の配列５４〜５９である。
【０１０９】
４）ＶＥＧＦＡ−Ｒ５−Ａ（Ｒ構造、ｎ＝５）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ５は順に表１の配列４２、４３、４５、４６、４７である。
【０１１０】
５）ＶＥＧＦＡ−Ｒ５−Ｂ（Ｒ構造、ｎ＝５）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ５は順に表１の配列４８、４９、５１、５２、５３である。
【０１１１】
６）ＶＥＧＦＡ−Ｒ５−Ｃ（Ｒ構造、ｎ＝５）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ５は順に表１の配列５４、５５、５７、５８、５９である。
【０１１２】
７）ＶＥＧＦＡ−Ｒ４−Ａ（Ｒ構造、ｎ＝４）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ４は順に表１の配列４２、４５、４６、４７である。
【０１１３】
８）ＶＥＧＦＡ−Ｒ４−Ｂ（Ｒ構造、ｎ＝４）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ４は順に表１の配列４８、５１、５２、５３である。
【０１１４】
９）ＶＥＧＦＡ−Ｒ４−Ｃ（Ｒ構造、ｎ＝５）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ４は順に表１の配列５４、５７、５８、５９である。
【０１１５】
１０）ＶＥＧＦＡ−Ｒ６−Ｄ（Ｒ構造、ｎ＝６）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ６は順に表１の６０〜６５である。
【０１１６】
１１）ＶＥＧＦＡ−Ｒ６−Ｅ（Ｒ構造、ｎ＝６）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ６は順に表１の配列６６〜７１である。
【０１１７】
標的遺伝子がＴＰ５３である高分子核酸は、以下の１）〜１１）である。
【０１１８】
１）ＴＰ５３−Ｒ６−Ａ（Ｒ構造、ｎ＝４）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ６は順に表２の配列７２〜７７である。
【０１１９】
２）ＴＰ５３−Ｒ６−Ｂ（Ｒ構造、ｎ＝６）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ６は順に表２の配列７８〜８３である。
【０１２０】
３）ＴＰ５３−Ｒ６−Ｃ（Ｒ構造、ｎ＝６）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ６は順に表２の配列８４〜８９である。
【０１２１】
４）ＴＰ５３−Ｒ５−Ａ（Ｒ構造、ｎ＝５）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ５は順に表２の配列７３〜７７である。
【０１２２】
５）ＴＰ５３−Ｒ５−Ｂ（Ｒ構造、ｎ＝５）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ５は順に表２の配列７９〜８３である。
【０１２３】
６）ＴＰ５３−Ｒ５−Ｃ（Ｒ構造、ｎ＝５）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ５は順に表２の配列８５〜８９である。
【０１２４】
７）ＴＰ５３−Ｒ４−Ａ（Ｒ構造、ｎ＝４）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ４は順に表２の配列７４〜７７である。
【０１２５】
８）ＴＰ５３−Ｒ４−Ｂ（Ｒ構造、ｎ＝４）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ４は順に表２の配列８０〜８３である。
【０１２６】
９）ＴＰ５３−Ｒ４−Ｃ（Ｒ構造、ｎ＝５）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ４は順に表２の配列８６〜８９である。
【０１２７】
１０）ＴＰ５３−Ｒ６−Ｄ（Ｒ構造、ｎ＝６）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ６は順に表２の配列９０〜９５である。
【０１２８】
１１）ＴＰ５３−Ｒ６−Ｅ（Ｒ構造、ｎ＝６）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ６は順に表２の配列９６〜１０１である。
【０１２９】
核酸ユニットの配列
【０１３０】
【表１】
2021515600.tif 000002
【０１３１】
核酸ユニットの配列
【０１３２】
【表２】
2021515600.tif 000003
【０１３３】
注：小文字は、該ヌクレオチドのリボースが２’−Ｏ−メチル基リボースによって修飾されたことを表す。下線付きの配列は標的配列である。
【０１３４】
２、抑制実験
５×１０５個のＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ番号はＣＲＬ−１９５８である）を１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培養培地の１２ウェル培養用プレートに接種して、それぞれ工程１で調製された高分子核酸をＨｅＬａ細胞にトランスフェクションする。すなわち、高分子核酸とトランスフェクション試薬、緩衝液（広州市鋭博生物科学技術有限会社、名称ｒｉｂｏＦＥＣＴＴＭ  ＣＰ  Ｂｕｆｆｅｒ、品番Ｃ１０５１１−１）を混合して細胞培養培地に添加し、１ウェルの体積は１ｍＬであり、高分子核酸のトランスフェクションする終濃度を５０ｎＭとし、培養用プレートを５％  ＣＯ２、３７℃インキュベータに入れて４８ｈ培養した。トランスフェクション試薬とトランスフェクションの具体的な工程についてはｒｉｂｏＦｅｃｔＴＭ（広州市鋭博生物科学技術有限会社）での方法を参照することができる。
【０１３５】
毎回細胞をプレートに塗布する時に、試験グループ以外に、陰性対照グループ（ＮＣ）と未処理対象グループ（ＮＴ）を設置した。試験グループと対照グループはいずれも三つの重複がある。ＮＣグループの対照配列はｓｉＲＮＡであり、５'−ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵｄＴｄＴ−３'と５'−ＡＣＧＵＧＡＣＡＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡｄＴｄＴ−３'の２本の一本鎖ＲＮＡ分子が相補的に結合して得られた二本鎖ＲＮＡ分子である。
【０１３６】
３７℃、５％  ＣＯ２で４８ｈ孵化してトランスフェクション後の細胞を収集し、ｒｉｚｏｌ方法でトランスフェクション後の細胞のＲＮＡを抽出してリアルタイム定量ＰＣＲを実行して、標的遺伝子ｍＲＮＡの発現レベルを検出し、ｑ−ＰＣＲを３回繰り返し、その結果は全部平均値±ＳＤで表す。標的遺伝子を検出するリアルタイム定量ＰＣＲのプライマー配列は表に示すとおりである。
【０１３７】
表３に検出結果を示す。実験の結果、上述した異なる構造の高分子分子はいずれも標的遺伝子の発現を有効に抑制することができる。
【０１３８】
ｍＲＮＡの相対的な発現レベル
【０１３９】
【表３】
2021515600.tif 000004
【０１４０】
注：陰性対照発現レベルは１である。
【０１４１】
（二）Ｒ構造の高分子核酸：低濃度抑制実験。
【０１４２】
１、高分子核酸
工程（一）に従って、ＶＥＧＦＡ−Ｒ６−Ａ高分子核酸のＸユニット配列と高分子核酸ＴＰ５３−Ｒ６−ＡのＸユニット配列を調製した。Ｐ６５−Ｒ６−Ａ高分子核酸のＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ６が順に表５に示す配列１５、１６、１７、２３、２４、２５であるように調製した。
【０１４３】
２、抑制実験
工程（一）における抑制実験の高分子核酸のトランスフェクションする終濃度を１ｎＭに変更し、その他の工程は不変に保持した。
【０１４４】
表４に検出結果を示す。実験の結果、低濃度の本発明の高分子核酸も標的遺伝子の発現レベルを低下させる目的を実現することができる。
【０１４５】
ｍＲＮＡ相対的な発現レベル
【０１４６】
【表４】
2021515600.tif 000005
【０１４７】
注：陰性対照発現レベルは１である。
【０１４８】
（三）３種類の構造の高分子核酸：同一の遺伝子の異なる領域を標的とする抑制実験
１、高分子核酸
以下の構造の高分子核酸を調製し、各構造の標的核酸ユニットはそれぞれ、ＰＰＩＢまたはＰ６５遺伝子の４個または６個の異なる領域を標的とする。
【０１４９】
標的遺伝子がＰＰＩＢである高分子核酸は以下の１）〜５）である：
１）ＰＰＩＢ−Ｒ４（Ｒ構造、ｎ＝４）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ４は順に表５における配列１〜４である。
【０１５０】
２）ＰＰＩＢ−Ｌ４（Ｌ構造、ｎ＝４）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ４は順に表５における配列１〜３、配列５であり、そのＨ１ユニットの配列は配列２０であり、Ｈ４ユニットの配列は配列２１である。
【０１５１】
３）ＰＰＩＢ−Ｃｒ４（Ｃｒ構造、ｎ＝４）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ４は順に表５における配列１〜４であり、Ｃユニットの配列は配列８である。
【０１５２】
４）ＰＰＩＢ−Ｒ６（Ｒ構造、ｎ＝６）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ６は順に表５における配列２、３、９、１０、１１、１２である。
【０１５３】
５）ＰＰＩＢ−Ｌ６（Ｌ構造、ｎ＝６）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ６は順に表５における配列２、３、９、１０、１１、１３であり、Ｈ１ユニットの配列は配列６で、Ｈ６ユニットの配列は配列１４である。
【０１５４】
標的遺伝子がＰ６５である高分子核酸は以下の１）〜５）である：
１）Ｐ６５−Ｒ４（Ｒ構造、ｎ＝４）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ４は順に表５における配列１５〜１８である。
【０１５５】
２）Ｐ６５−Ｌ４（Ｌ構造、ｎ＝４）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ４は順に表５における配列１５〜１７、配列１９であり、Ｈ１ユニットの配列は配列６で、Ｈ４ユニットの配列は配列７である。
【０１５６】
３）Ｐ６５−Ｃｒ４（Ｃｒ構造、ｎ＝４）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ４は順に表５における配列１５〜１８であり、Ｃユニットの配列は配列２２である。
【０１５７】
４）Ｐ６５−Ｒ６（Ｒ構造、ｎ＝６）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ６は順に表５における配列１５、１６、１７、２３、２４、２５である。
【０１５８】
５）Ｐ６５−Ｌ６（Ｌ構造、ｎ＝６）：そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ６は順に表５における配列１５、１６、１７、２３、２４、２６であり、Ｈ１ユニットの配列は配列２０で、Ｈ６ユニットの配列は配列２７である。
【０１５９】
核酸ユニットの配列
【０１６０】
【表５】
2021515600.tif 000006
【０１６１】
注：小文字は、該ヌクレオチドのリボースが２−Ｏ−メチル基リボースによって修飾されたことを表す。下線付きの配列は標的配列である。Ｘユニット：第１〜１２位がＴ１で、第１３〜１８位がＴ２で、第１９〜３０がＡ３である。Ｈ１ユニット：第１〜４位がＨｙで、第５〜１６位がＨｘである。Ｈ４ユニット：第１〜１２位がＨｘで、第１３〜１６位がＨｙである。Ｃユニット：第１〜６位がＣ４で、第７〜１２位がＣ３で、第１３〜１８位がＣ２で、第１９〜２４位がＣ１である。
【０１６２】
２、抑制実験
抑制実験の工程は工程（一）と同様である。
【０１６３】
図７に抑制結果を示す。５種類の構造の高分子核酸がいずれも標的遺伝子の発現を有効に抑制することが分かる。標的遺伝子ＰＰＩＢに対する抑制レベルはいずれも８０％以上であり、標的遺伝子Ｐ６５に対する抑制レベルはいずれも７５％以上である。
（四）Ｒ構造の高分子核酸の異なる遺伝子を標的とする場合の抑制実験（ｎ＝４、６）。
【０１６４】
１、高分子核酸
以下のＲ構造の高分子核酸を調製し、該高分子核酸は４個または６個の異なる標的遺伝子を標的とする。
【０１６５】
ＢＣＣＣ−Ｒ４：標的遺伝子はＢＩＲＣ５、ＣＴＮＮＢ、ＣＯＰＳ５、ＣＬＵであり、そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ４は順に表３に示す配列２８〜３１である。
【０１６６】
ＢＣＣＣＥＨ−Ｒ６：標的遺伝子はＢＩＲＣ５、ＣＴＮＮＢ、ＣＯＰＳ５、ＣＬＵ、ＥＩＦ４Ｅ、ＨＩＦ１Ａであり、そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ６は順に表６に示す配列３２、３３、２８、２９、３０、３４である。
【０１６７】
２、抑制実験
抑制実験の工程は工程（一）と同様である。
【０１６８】
核酸ユニットの配列
【０１６９】
【表６】
2021515600.tif 000007
【０１７０】
注：小文字は、該ヌクレオチドのリボースが２−Ｏ−メチル基リボースによって修飾されたことを表す。下線付きの配列は標的配列である。Ｘユニット：第１〜１２位がＴ１で、第１３〜１８位がＴ２で、第１９〜３０がＡ３である。
【０１７１】
図８に抑制実験の結果を示す。２種類の構造の高分子核酸がいずれも４個または６個の標的遺伝子の発現を有効に抑制することが分かる。Ｒ４構造の高分子核酸が標的とした４種類の遺伝子の発現レベルはいずれも０．２以下に低下された。
【０１７２】
（五）Ｒ構造、Ｌ構造、Ｃｒ構造の高分子核酸が異なる遺伝子を標的とする場合の抑制実験（ｎ＝４）
１、高分子核酸
以下の各構造の高分子核酸を調製し、該高分子核酸は４個の異なる標的遺伝子を標的とする。
【０１７３】
ＳＰＰＶ−Ｒ４：標的遺伝子がＳＯＤ１、ＰＰＩＢ、Ｐ６５、ＶＥＧＦＡであり、そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ４は順に表７に示す配列３５〜３８である。
【０１７４】
ＳＰＰＶ−Ｌ４：標的遺伝子がＳＯＤ１、ＰＰＩＢ、Ｐ６５、ＶＥＧＦＡであり、そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ４は順に表７に示す配列３５〜３８であり、そのＨ１ユニットの配列は配列３９で、Ｈ４ユニットの配列は配列４０である。
【０１７５】
ＳＰＰＶ−Ｃｒ４：標的遺伝子がＳＯＤ１、ＰＰＩＢ、Ｐ６５、ＶＥＧＦＡであり、そのＸユニットの配列のＸ１〜Ｘ４は順に表７に示す配列３５〜３８であり、Ｃユニットの配列は配列４１である。
【０１７６】
２、抑制実験
工程（一）と同様な抑制実験を行った。
【０１７７】
図９に抑制実験の結果を示す。３種類の構造の高分子核酸がいずれも４種類の標的遺伝子の発現を有効に抑制することが分かる。そして、３種類の高分子構造において、Ｃｒ４構造の高分子核酸の抑制効果が一番優れていて、各標的遺伝子の発現レベルがいずれも最低であった。
【０１７８】
核酸ユニットの配列
【０１７９】
【表７】
2021515600.tif 000008
【０１８０】
注：小文字は、該ヌクレオチドのリボースが２−Ｏ−メチル基リボースによって修飾されたことを表す。下線付きの配列は標的配列である。Ｘユニット：第１〜１２位がＴ１で、第１３〜１８位がＴ２で、第１９〜３０がＡ３である。Ｈ１ユニット：第１〜４位がＨｙで、第５〜１６位がＨｘである。Ｈ４ユニット：第１〜１２位がＨｘで、第１３〜１６位がＨｙである。Ｃユニット：第１〜６位がＣ４で、第７〜１２位がＣ３で、第１３〜１８位がＣ２で、第１９〜２４位がＣ１である。
【０１８１】
表８に上記各実験において標的遺伝子を検出するリアルタイム定量ＰＣＲのプライマー配列を示す。
【０１８２】
標的遺伝子を検出するリアルタイム定量ＰＣＲのプライマー配列
【０１８３】
【表８】
2021515600.tif 000009
【産業上の利用可能性】
【０１８４】
本発明は、新規の高分子核酸を構成することのできる核酸ユニット及び目的遺伝子の発現を干渉することのできる高分子核酸を提供する。本発明によると、新規の核酸ユニット及びその自己組織化しる高分子核酸を設計して構築することで、マルチ標的の干渉を実現し、疾患が発生または進行する信号通路における複数の遺伝子の発現を抑制し、または複数の疾患の標的遺伝子の発現を同時に抑制して、生物学、化学等の多くの学科分野で幅広い応用の見込みがある。該高分子核酸によると、一つの遺伝子に位置するかまたは複数の遺伝子に位置する複数の配列を同時に標的とすることができる。本発明によると、１）ＲＮＡｉ効果が高く、２）安定性が優れ、３）オフターゲット率を低下させ、４）細胞への導入能力が強化され、５）モジュール化設計が可能であるメリットを有する。
【図１】
2021515600.tif 000010
【図２】
2021515600.tif 000011
【図３】
2021515600.tif 000012
【図４】
2021515600.tif 000013
【図５】
2021515600.tif 000014
【図６】
2021515600.tif 000015
【図７】
2021515600.tif 000016
【図８】
2021515600.tif 000017
【図９】
2021515600.tif 000018
【配列表】
2021515600000001.app
【国際調査報告】
2021515600.tif 000019
2021515600.tif 000020
2021515600.tif 000021
2021515600.tif 000022
2021515600.tif 000023
2021515600.tif 000024