(57)【要約】  本発明は、神経成長因子に対するモノクローナル抗体、並びにそれをコードする遺伝子及びその使用を開示する。本発明の神経成長因子に対するモノクローナル抗体は、重鎖定常領域及び重鎖可変領域を含む重鎖を含む。前記重鎖可変領域は３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに軽鎖可変領域が３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。本発明の神経成長因子に対するモノクローナル抗体は神経成長因子に特異的に結合でき、そして神経成長因子のその存在及び／又はレベルを検出するために、及びＴＦ−１細胞の神経成長因子依存性の増殖を阻害するための薬物を調製するために、そして神経障害性疼痛、慢性疼痛、及び炎症性疼痛の少なくとも一つを治療するため若しくは予防するための薬物を調製するために用いられうり、それゆえ良好な応用展望及びマーケティング価値を有しうる。
2021521881.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖定常領域及び重鎖可変領域を含む重鎖、並びに軽鎖定常領域及び軽鎖可変領域を含む軽鎖を含み、重鎖可変領域が３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに軽鎖可変領域が３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み；
前記相補性決定領域ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に記述され；
前記相補性決定領域ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に記述され；
前記相補性決定領域ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に記述され；
前記相補性決定領域ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に記述され；
前記相補性決定領域ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に記述され；及び
前記相補性決定領域ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に記述された；
神経成長因子に対するモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に記述され；前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記述された請求項１に記載の神経成長因子に対するモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記神経成長因子に対するモノクローナル抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び二重特異性抗体より選択される請求項１に記載の神経成長因子に対するモノクローナル抗体。
【請求項４】
前記神経成長因子に対するモノクローナル抗体が、ＮＧＦタンパク質と結合し１００ｎＭ未満のＥＣ５０を有する請求項１に記載の神経成長因子に対する前記モノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の神経成長因子に対するモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド配列。
【請求項６】
前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記述され；前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記述された請求項５に記載のヌクレオチド配列。
【請求項７】
請求項５又は６に記載のヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項８】
請求項５、６又は７に記載のヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の神経成長因子に対するモノクローナル抗体、及びそれに結合した複合体部分を含み、前記複合体部分が検出可能な標識であるモノクローナル抗体複合体。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載の神経成長因子に対するモノクローナル抗体及び／又は請求項９に記載のモノクローナル抗体複合体を含むキット。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の神経成長因子に対するモノクローナル抗体を特異的に認識する第二の抗体をさらに含む請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
神経成長因子の存在及び／又はレベルを検出するためのキットを調製することにおける請求項１又は２に記載の神経成長因子に対するモノクローナル抗体及び／又は請求項９に記載のモノクローナル抗体複合体の使用。
【請求項１３】
神経成長因子に特異的に結合する薬物；神経成長因子依存性ＴＦ−１細胞の増殖を阻害する薬物；並びに／又は神経障害性疼痛、慢性疼痛、及び炎症性疼痛の少なくとも一つを治療する又は予防するための薬物：を調製することにおける請求項１又は２に記載の神経成長因子に対するモノクローナル抗体及び／又は請求項９に記載のモノクローナル抗体複合体の使用。
【請求項１４】
有効成分として請求項１又は２に記載の神経成長因子に対するモノクローナル抗体及び／又は請求項９に記載のモノクローナル抗体複合体、及び医薬的に許容可能な担体又は賦形剤を含む薬物。
【請求項１５】
前記薬物が神経成長因子に特異的に結合し、ＴＦ−１細胞の神経成長因子依存性の増殖を阻害し、並びに／又は神経障害性疼痛、慢性疼痛、及び炎症性疼痛の少なくとも一つを治療する若しくは予防する請求項１４に記載の薬物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫学及び分子生物学の技術分野に属する。より詳しくは、本発明は神経成長因子に対するモノクローナル抗体、それをコードする遺伝子、並びに検出キット及び様々な薬物を調製することにおけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経成長因子（ＮＧＦ）は早期に特定された神経成長栄養因子の一つであり、そして生物学的なニューロンの発生、分化及び機能維持に重要な役割を果たす。ＮＧＦはトロポミオシン受容体キナーゼＡ（ＴｒＫＡ）に高親和性を有して結合でき、Ｐ７５NTR受容体に非特異的に結合できる。より多くの証拠は、成長、ニューロンの発生及び生存を促進することの生物学的な効果を有することを示すのに加え、ＮＧＦは持続性疼痛及び慢性疼痛の仲介者であると広く考えられた。例えば、ＮＧＦの点滴静注が全身痛反応を引き起こすことがあり、そしてＮＧＦの局所注射は注射部位に痛覚過敏及び異常な痛みを生じさせうる。炎症箇所でＮＧＦの分泌が急増し、そして長時間存続させる。加えて、ある型の癌において、過剰なＮＧＦは神経線維の成長及び浸潤を促進し、そのため癌による疼痛を誘導する。ＴｒＫＡ受容体ノックアウトマウスは痛みの欠失を示すことが報告され、そしてＮＧＦは痛みに密接に関する分子であると考えられる。証拠はＮＧＦ阻害剤の使用が神経障害的及び慢性的な炎症性疼痛の動物モデルにおける疼痛反応を緩和しうることを示唆する。ＮＧＦに対する中和抗体はマウスの癌疼痛モデルの疼痛を著しく緩和しうる。
【０００３】
抗体医薬、特にモノクローナル抗体は、様々な疾病の治療に良好な効果をもたらした。安全で、効果的な抗ＮＧＦモノクローナル抗体を調製することは、慢性的疼痛及び癌疼痛治療において、中毒性のある又は消化管内に副作用を生じるアヘン剤、非ステロイド剤等とは異なる新たなクラスの鎮痛剤を提供しうる。現在、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，によって開発されているタネズマブは、前臨床及び臨床研究において良好な鎮痛効果を示している。しかしながら、未だに高い活性を有する他の抗ＮＧＦ抗体が不足している。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の目的は先行技術における神経成長因子に対する抗体の低活性及び種差の欠点を克服することであり、そして高活性及び種差を除去することを有する神経成長因子に対するモノクローナル抗体、並びにそれをコードする遺伝子及びその使用、並びに検出キット及び様々な薬物を調製することにおけるその使用を提供する。
【０００５】
上記の本発明の目的を成し遂げるために、本発明では、重鎖及び軽鎖を含み、その重鎖が重鎖の定常領域及び可変領域を含み、そしてその軽鎖が軽鎖の定常領域及び可変領域を含むヒト神経成長因子に特異的に結合しうるモノクローナル抗体を提供する。
【０００６】
前記軽鎖及び前記重鎖の可変領域は抗原の結合を決定する；各鎖のその可変領域は、３つの超可変領域を含み、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）（前記重鎖（Ｈ）のそのＣＤＲｓはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖（Ｌ）のそのＣＤＲｓはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み；これらはＫａｂａｔ  ｅｔ．ａｌ．，により名付けられた。Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９１），Ｖｏｌｕｍｅ  １−３，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ参照）と称される。
【０００７】
本発明における、その重鎖可変領域は３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、並びにその軽鎖可変領域は３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み；
ここでその相補性決定領域ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に記述され；
その相補性決定領域ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に記述され；
その相補性決定領域ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に記述され；
その相補性決定領域ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に記述され；
その相補性決定領域ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に記述され；及びその相補性決定領域ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に記述される。
【０００８】
本発明では６つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列が構築され、特定の修飾を行い抗体可変領域の抗原結合活性が改善された。ＣＤＲ領域のその変化を適応させるために、フレームワーク領域もまた改変された。しかしながら、これらのフレームワーク領域のその改変は、未だにヒト生殖細胞系列に適合することを保証することが必要である。また、フレームワークの改変は、これらの変化が抗原へのそのＣＤＲ領域の結合に影響しない変化であることを保証することを分析されるだろう。
【０００９】
当業者に知られる技術的な手段を通じて、例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトを通じて、モノクローナル抗体のその重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）が分析され、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏｓ：５〜７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏｓ：８〜１０上に記述されている。本発明において、このモノクローナル抗体はＨ２６Ｌ１７として称される。
【００１０】
本発明の神経成長因子に対するモノクローナル抗体の好ましい技術スキームとして、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ；２に記述され；前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記述される。
【００１１】
本発明の神経成長因子に対するモノクローナル抗体のさらに好ましい技術スキームとして、その重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記述され；その軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記述される。
【００１２】
本発明の神経成長因子に対するモノクローナル抗体の一の態様において、その神経成長因子に対するモノクローナル抗体はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び二重特異性抗体より選択される。
【００１３】
本発明の神経成長因子に対するモノクローナル抗体の一の態様において、神経成長因子に対するモノクローナル抗体はＮＧＦタンパク質に１００ｎＭ未満（例えば、約１０ｎＭ未満、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、又はそれ未満）のＥＣ50を有して結合する。ここで、ＥＣ50はサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定されうる。
【００１４】
本発明の神経成長因子に対するモノクローナル抗体の一の態様において、神経成長因子に対するモノクローナル抗体は非ＣＤＲ領域を含み、そしてその非ＣＤＲ領域はマウス以外の種類、例えばヒト抗体由来である。
【００１５】
また、本発明の上記の目的を成し遂げるために、本発明は神経成長因子に対し上記のモノクローナル抗体をコードする遺伝子を提供する。
【００１６】
また、本発明の上記の目的を成し遂げるために、本発明は重鎖可変領域のヌクレオチド配列及び／又は軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
【００１７】
また、本発明の上記の目的を成し遂げるために、本発明は重鎖可変領域のヌクレオチド配列及び／若しくは軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を含む宿主細胞；又は、重鎖可変領域のヌクレオチド配列及び／若しくは軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
【００１８】
また、本発明の上記の目的を成し遂げるために、本発明は神経成長因子に対するモノクローナル抗体を調製する方法を提供し、この方法は適当な条件下で本発明の宿主細胞を増殖すること、及び細胞培養から神経成長因子に対するモノクローナル抗体を分離することを含む。
【００１９】
また、本発明は、神経成長因子に対するモノクローナル抗体、それに結合した複合体部分を含むモノクローナル抗体複合体を提供し、ここでその複合体部分は検出可能な標識である。好ましくは、その複合体部分はラジオアイソトープ、発光基質、有色基質又は酵素である。
【００２０】
また、本発明は神経成長因子に対するモノクローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体複合体を含む、キットを提供する。
【００２１】
本発明のキットの好ましい技術スキームとして、キットはさらに神経成長因子に対するモノクローナル抗体を特異的に認識する第二の抗体を含み；加えて、第二の抗体はさらに検出可能な標識、例えばラジオアイソトープ、発光基質、有色基質、又は酵素を含む。
【００２２】
また、本発明は神経成長因子の存在及び／又はレベルを検出できるキット内の神経成長因子に対するモノクローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体複合体の使用を提供する。そのキットを用いて試料中のＮＧＦの存在又はレベルを検出する。
【００２３】
また、本発明は、神経成長因子に対するモノクローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体複合体を提供し；任意に、さらに医薬的に許容可能な担体及び／又は賦形剤を含む。
【００２４】
上記の薬物は神経成長因子に特異的に結合し、そして神経成長因子に媒介される生物学的効果、例えばＴＦ−１細胞の増殖を阻害する；
並びに／又は
神経障害性疼痛、慢性疼痛、及び炎症性疼痛を治療又は予防するために用いることができ。
【００２５】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験を通じて、本発明の神経増殖因子に対するモノクローナル抗体が、Ｌｅｎｔｉ−ＩＬ−１β―ＮＩＨ／３Ｔ３マウスの膝関節炎疼痛モデルにおいて、患肢の歩行方法の変化及び動物の体重減少の状態を改善できることを発見した。
【００２６】
本発明において、特に断りのない限り、本明細書で用いられる科学的及び技術的用語は、一般的に当業者に理解される意味を有する。加えて、本発明に用いられる細胞培養、分子遺伝学、核酸化学及び免疫学の実験操作は対応の分野に広く用いられる通例の操作である。一方、本発明をより理解するために、関連用語の定義及び説明を以下に提供する。
【００２７】
本発明に用いられるように、「抗体」という用語は一般的にポリペプチド鎖（一つの「軽」（Ｌ）鎖及び一つの「重」（Ｈ）鎖を有する各ペア）の２つのペアからなる免疫グロブリン分子を意味する。抗体の軽鎖はκ及びλ軽鎖として分類される。重鎖はμ、σ、γ、α又はεとして分類される。そして抗体のアイソタイプは、ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＧ，ＩｇＡ及びＩｇＥとしてそれぞれ定義される。軽鎖及び重鎖において、可変領域及び定常領域は約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって関連しており、そしてまた、重鎖は約３以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。各重鎖は重鎖可変領域（ＶH）及び重鎖定常領域（ＣH）からなる。その重鎖定常領域は３つのドメイン（ＣH１、ＣH２、ＣH３）からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（ＶL）及び軽鎖定常領域（ＣL）からなる。軽鎖定常領域は一つのドメインＣLからなる。抗体の定常領域は宿主の組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介でき、免疫機構の多様な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）の結合を含む。そのＶH及びＶL領域はさらに高度可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲｓ）と称される）に細分化でき、その間にフレームワーク領域（ＦＲｓ）と称される保存された領域が分布する。３つのＣＤＲｓ及び４つのＦＲｓからなる各ＶH及びＶLはアミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序で配置する：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。各重／軽鎖ペアの可変領域（ＶH及びＶL）は、それぞれ、抗体結合部位を形成する。各領域又はドメインへのアミノ酸の帰属は、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．（１９８７  ａｎｄ  １９９１））、又はＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３の定義に従う。「抗体」という用語は抗体を産生する任意の特定の方法に限られない。例えば、抗体は、特に、リコンビナント抗体、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を含む。抗体は異なる抗体のアイソタイプ、例えばＩｇＧ抗体（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２，ＩｇＤ，ＩｇＥ又はＩｇＭでありうる。
【００２８】
本発明に用いられるように、抗体の「抗原結合断片」という用語は、「抗原結合部分」としても知られ、全長抗体の断片を含むポリペプチドを意味し、全長抗体が結合するのと同じ抗原に特異的に結合する能力及び／又は抗原に対する特異的な結合について全長抗体と競合する能力を維持する。一般的に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照し，その全体があらゆる目的において参照により本明細書に取り込まれる）。
【００２９】
抗体の抗原結合断片はリコンビナントＤＮＡ技術又はインタクトの抗体の酵素学的な又は化学的な開裂によって産生されうる。ある場合において、抗原結合断片はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、二重特異性抗体及び少なくともポリペプチドへの特異的な抗原結合能を十分に授ける抗体の部分を含むポリペプチドを含む。
【００３０】
本発明に用いられるように、「Ｆｄ断片」という用語はＶH及びＣH１ドメインからなる抗体断片を意味し；「Ｆｖ断片」という用語は抗体の単一のアームのＶL及びＶHドメインからなる抗体断片を意味し；「ｄＡｂ断片」という用語はＶHドメインからなる抗体断片を意味し（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９））；「Ｆａｂ断片」という用語はＶL、ＶH、ＣL、及びＣH１ドメインからなる抗体断片を意味し；そして「Ｆ（ａｂ’）2断片」という用語はヒンジ領域のジスルフィド架橋によって連結する２つのＦａｂ断片を含む抗体断片を意味する。
【００３１】
ある場合において、その抗体の抗原結合断片は一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）であり、ＶL及びＶHドメインが対になり、一本鎖ポリペプチド鎖を産生することを可能にするリンカーを介して一価の分子を形成する（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）及び  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）参照）。当該ｓｃＦｖ分子は一般的な構造を有する：ＮＨ2−ＶL−リンカー−ＶH−ＣＯＯＨ又はＮＨ2−ＶH−リンカー−ＶL−ＣＯＯＨ。適当な先行技術のリンカーは繰り返しＧＧＧＧＳアミノ酸配列又はその変異体からなる。例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）4を有するリンカーが用いられうるが、またその変異体も用いられうる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８）。本発明において用いられうる他のリンカーはＡｌｆｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：７２５−７３１，Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：９４−１０６，Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３０５５−３０６１，Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：４１−５６  及びＲｏｏｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌにより記載される。
【００３２】
ある場合において、抗体の抗原結合断片は二重特異性抗体であって、ＶH及びＶLドメインが一本鎖ポリペプチド鎖に発現している二価の抗体である。しかしながら、２つのドメインが一本の鎖上で対形成するには使用するリンカーは短すぎるため、これらのドメインは別の鎖上でその相補鎖との対形成が余儀なくされ、それによって２つの抗原結合部位が構築される（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３），及びＰｏｌｊａｋ  Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３（１９９４）参照）。
【００３３】
抗体の抗原結合断片は当業者に既知の従来の技術を用いることによって与えられた抗体から得られうる（例えばリコンビナントＤＮＡ技術又は酵素学的若しくは化学的切断）、そしてその抗体の抗原結合断片はインタクトの抗体に対して同様な方法において特異性を評価される。
【００３４】
本発明において、本明細書中に特に断りのない限り、「抗体」という用語を意味する場合、インタクトの抗体だけでなく抗体の抗原結合断片も含む。
【００３５】
本発明に用いられるように、「ＭｃＡｂ」及び「モノクローナル抗体」という用語は、高い相同性の抗体の群由来の抗体又は抗体の断片を意味し、すなわち、同時に起こりうる天然の変異を除いた、同一の抗体分子の群由来である。前記モノクローナル抗体は抗原の単一のエピトープに高い特異性を有する。そのポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体に比べ、一般的に抗原の異なるエピトープを認識する少なくとも二以上の異なる抗体を一般的に含む。モノクローナル抗体は、一般的にｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５）により最初に報告されたハイブリドーマ技術により得られうるが、しかしまたリコンビナントＤＮＡ技術により得られうる（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ４，８１６，５６７参照）。
【００３６】
本発明に用いられるように、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン（レセプター抗体）のＣＤＲ領域の全て又は一部が非ヒト抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ領域により置き換えられた場合の、抗体又は抗体断片を意味し、ここでそのドナー抗体は、期待された特異性、親和性又は反応性を有する非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット又はウサギ）でありうる。加えて、レセプター抗体のフレームワーク領域（ＦＲｓ）におけるいくつかのアミノ酸残基は、対応する非ヒト抗体のアミノ酸残基により又は他の抗体のアミノ酸残基により置き換えられうり、さらに抗体の性能を改善又は最適化しうる。ヒト化抗体のより詳細については、例えば、Ｊｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）；及びＣｌａｒｋ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ２１：３９７−４０２（２０００）を参照。
【００３７】
本発明に用いられるように、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン又は抗体が特異的に結合する抗原の部位を意味する。また、「エピトープ」は当業者に「抗原決定基」として称される。前記エピトープ又は抗原決定基は一般的に、分子の化学的に活性化した表面基、例えばアミノ酸又は炭水化物又は糖の側鎖からなり、そして通常特定の三次元構造的な特徴及び特定の電荷的な特徴を有する。例えば、前記エピトープは、一般的に特有の空間的な構造における少なくとも３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４、又は１５の連続的な又は非連続的なアミノ酸を含み、それらは「線形」又は「コンフォメーション的」でありうる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）参照。線形のエピトープにおいて、タンパク質と相互作用する分子（例えば抗体）との全ての相互作用部位はタンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線形に存在する。コンフォメーション的なエピトープにおいて、相互作用部位はお互いに離れたタンパク質のアミノ酸残基に渡って存在する。
【００３８】
本発明に用いられるように、「単離された」という用語は「天然の状態から人工的な手法により得た」ことを意味する。ある「単離された」基質又は構成物が天然に現れれば、その天然の環境において変化したせいでありうり、又は天然の環境から単離されたか、又は両方でありうる。例えば、ある単離されないポリヌクレオチド又はポリペプチドはある生きた動物において天然に存在し、そしてその天然の状態から高い精製度により単離された同様のポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離されたポリヌクレオチド又はポリペプチドと称される。「単離された」という用語は、基質の活性に影響を与えない人工的な又は合成的な基質又は他の不純物の存在を除かない。
【００３９】
本発明に用いられるように、「Ｅ．ｃｏｌｉ発現系」という用語はＥ．Ｃｏｌｉ（菌株）及びベクターからなる発現系を意味し、ここでそのＥ．Ｃｏｌｉ（菌株）は商業的に利用可能な株より由来するが、例えばＧＩ６９８、ＥＲ２５６６、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、及びＢＬＲ（ＤＥ３）に限定されない。
【００４０】
本発明に用いられる、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドがその中に挿入されうる核酸のビヒクルを意味する。前記ベクターがその挿入されたポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質の発現を可能にする場合、そのベクターは発現ベクターと称される。そのベクターは形質転換、形質導入、又は形質移入により宿主細胞に導入されうり、ベクターにより運搬される遺伝的な基質因子は宿主細胞内において発現されうる。ベクターは当業者において十分知られているが、これらに限定されるものではないが、例えば、：プラスミド；ファージミド；コスミド；人工染色体、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１−由来人工染色体（ＰＡＣ）；ラムダファージ又はＭ１３ファージのようなファージ、及び動物のウイルス等を含む。ベクターとして用いられうる動物のウイルスは、これらに限定されるものではないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、及びパルボウイルス（例えばＳＶ４０）を含む。ベクターは、発現を制御する因子の変種、これらに限定されるものではないが、例えばプロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択的な因子、及びレポーター遺伝子を含みうる。加えて、さらにそのベクターは複製開始点を含みうる。
【００４１】
本発明に用いられるように、「宿主細胞」という用語はベクターを導入するために用いられうる細胞を意味し、これらに限定されるものではないが、Ｅ．Ｃｏｌｉ若しくはｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのような真核細胞、酵母細胞若しくはアスペルギルスのような真菌細胞、Ｓ２ショウジョウバエ細胞若しくはＳｆ９のような昆虫細胞、又は動物細胞若しくはヒト細胞、例えば線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞を含む。
【００４２】
本発明に用いられるように、「特異的に結合する」という用語は、２つの分子間のランダムでない結合反応、例えば抗体とその標的の抗原との間の反応を意味する。いくつかの態様において、抗原（又は抗原に対して特異的である抗体）と特異的に結合する抗体は、約１０-5Ｍ未満、例えば約１０-6Ｍ、１０-7Ｍ、１０-8Ｍ、１０-9Ｍ、１０-10Ｍ又はそれ未満の親和性（ＫD）により抗体が抗原と結合することを意味する。
【００４３】
本発明に用いられるように、「ＫD」という用語は特異的な抗原抗体反応についての解離平衡定数を意味し、抗体と抗原との間の結合親和性を表すために用いられる。解離平衡定数が小さくなれば、抗体と抗原との結合はより強固となり、そして抗体と抗原との間の親和性がより高くなる。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いたＢＩＡＣＯＲＥ装置において特定されるように、一般的に、抗体は抗原（例えばＬ１タンパク質）に約１０-5Ｍ未満、例えば１０-6Ｍ、１０-7Ｍ、１０-8Ｍ、１０-9Ｍ、１０-10Ｍ、又はそれ未満の解離平衡定数により結合する。
【００４４】
本発明に用いられるように、「モノクローナル抗体」及び「ＭｃＡｂ」という用語は同じ意味を有し、言い換え可能でありうり：「ポリクローナル抗体」及び「ＰｃＡｂ」という用語は同じ意味を有し、言い換え可能でありうり、；「ポリペプチド」及び「タンパク質」は同じ意味を有し、言い換え可能でありうる。そして本発明において、アミノ酸は一般的に当該分野で既知であるように一文字又は三文字表記により示される。例えば、アラニンはＡ又はＡｌａにより示されうる。
【００４５】
本発明に用いられるように、「有効量」という用語は、所望される効果を得るため又は少なくとも部分的に得るための十分量を意味する。例えば、予防有効量は疾病の発症の予防、停止、又は遅延するための十分量を意味し；治療有効量は、疾病に苦しむ患者における治療のための又は少なくとも部分的に疾病及びその合併症を停止する十分量を意味する。そのような有効量を決定することは当業者の能力の範囲内である。例えば、治療の使用のための有効量は、治療される疾病の重篤性、患者の免疫機構の全体の状態、年齢、体重及び性別のような患者の一般的な状態、薬物投与方法、及びその他の同時に投与される治療等に依存する。
【００４６】
先行技術と比較して、本発明は以下の利点を有する：本発明の神経成長因子に対するモノクローナル抗体は神経成長因子に特異的に結合しうり、高い活性等の利点を有し、そして神経成長因子の存在及び／又はレベルを検出するために、並びに神経増殖因子と拮抗させるための薬物を調製するために、並びに神経疼痛、慢性疼痛、及び炎症性疼痛を治療する又は予防するための薬物を調製するために用いられうり、それゆえ良好な投与予後及びマーケットバリューを有する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は本発明の神経成長因子に対するＨ２６Ｌ１７モノクローナル抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す。左から右の四つのレーンの試料とその対応のロード量は：１μｇの非還元性タンパク質電気泳動用ローディングバッファーにおける抗体；１μｇの還元性タンパク質電気泳動用ローディングバッファー；５μＬのタンパク質分子量マーカー（マーカー）；１μｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。
【００４８】
【図２】図２はＨ２６Ｌ１７及びタネズマブのヒトβ−ＮＧＦ抗原への結合活性の分析結果を示す。
【００４９】
【図３】図３はＣＣＫ−８法によるＴＦ−１細胞増殖のＨ２６Ｌ１７及びタネズマブの阻害について結果の標準曲線を示す。
【００５０】
【図４】図４は本発明の神経成長因子に対するモノクローナル抗体Ｈ２６Ｌ１７によってＮＧＦ誘導したＴＦ−１細胞増殖の阻害の７２時間後の細胞量を示す。
【００５１】
【図５】図５はＣＣＫ−８法によるＨ２６Ｌ１７及びタネズマブによるＴＦ−１細胞増殖の阻害を測定することにおける各群のＯＤ値を示す。
【００５２】
【図６】図６はＮＧＦ誘導したＴＦ−１細胞増殖を阻害するＨ２６Ｌ１７のフィッティングカーブを示す。ｘ軸として抗体濃度（ｎＭ）のログを、ｙ軸としてＯＤ４５０ｎｍ値をとり、用量効果カーブフィッティングが実施され、異なる抗体のＥＣ50と比較した。
【００５３】
【図７】図７はＬｅｎｔｉ−ＩＬ−１β―ＮＩＨ／３Ｔ３マウスの膝関節炎疼痛モデルにおいて、患肢の歩行方法のＨ２６Ｌ１７の効果を示す。
【００５４】
【図８】図８はＬｅｎｔｉ−ＩＬ−１β―ＮＩＨ／３Ｔ３マウスの膝関節炎疼痛モデルにおいて、マウスの体重のＨ２６Ｌ１７の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明の態様は、実施例に参照により以下に詳細に記載される。当業者は以下の実施例が本発明を説明するために用いられるのみであり、本発明の範囲を限定するものとみなすべきではない。特定の技術又は条件の記載のない場合には当該分野の参考文献に記載された特定の技術又は条件に従い（例えば、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，  Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，著、Ｈｕａｎｇ  Ｐｅｉｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  訳、第三版、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓ参照）、又は製品マニュアルに従い実施した。使用された試薬又は装置は、その製造者が特定されていない場合には、商用利用可能な慣習の製品である。
【００５６】
本発明の以下の実施例において、用いたＣ５７ＢＬ／６マウスはＧｕａｎｇｄｏｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒから購入した。
【００５７】
用いられた陽性コントロールのタネズマブ抗体はＰｆｉｚｅｒ社のタネズマブ抗体であった（Ｄａｖｉｄ  Ｌ．Ｓｈｅｌｔｏｎ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｂｏｎｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ  ａ  Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．ＵＳＡ，２０１１０２４３９６１Ａ１．２０１１−０６−０６）。
【実施例】
【００５８】
実施例１．Ｈ２６Ｌ１７重鎖及び軽鎖配列の設計、発現及び精製
【００５９】
１．抗体の設計
【００６０】
抗ヒトＮＧＦ抗体Ｈ２６Ｌ１７を作り出すために、本発明者はＮＧＦタンパク質配列及びその三次元結晶構造等に基づく一連の抗体配列を創造的に設計した。大規模なスクリーニング及び分析を通じて、ＮＧＦに特異的に結合するＨ２６Ｌ１７抗体が、最終的に得られた。抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列並びにそれをコードしたＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４に記述された。
【００６１】
２．抗体の発現及び精製
【００６２】
Ｈ２６Ｌ１７の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記述され；その定常領域がＩｇ  ｇａｍｍａ−１Ｃ鎖部である、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８５７）及び軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記述され；その定常領域がＩｇ  ｌａｍｂｄａ−２Ｃ鎖部である；ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０ＣＧ０５．１）は独立してｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅベクター（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔより供給）にクローニングされ、そしてｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−Ｈ２６Ｌ１７Ｈ及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−Ｈ２６Ｌ１７Ｌプラスミドをそれぞれ得た。
【００６３】
ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−Ｈ２６Ｌ１７Ｈ及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−Ｈ２６Ｌ１７Ｌプラスミドを切断（ＨｉｎｄＩＩＩ＆ＥｃｏＲＩ）し、そして重鎖及び軽鎖のヌクレオチド配列を電気泳動により回収して、独立してｐｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングし、そしてそのリコンビナントプラスミドを抽出し、２９３Ｆ細胞に同時導入した。２９３Ｆ細胞に同時導入した後７日間培養し、培養培地を高速遠心し、そして得られた上清を濃縮し、ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラムにロードした。そのタンパク質を溶出剤により一段階で溶出し、標的試料を分離した。その抗体試料をＰＢＳ緩衝液内に保存した。
【００６４】
前記精製した試料を還元性タンパク質電気泳動用ローディングバッファー及び非還元性タンパク質電気泳動用ローディングバッファーの両方に添加し、続いて煮沸した。Ｈ２６Ｌ１７の電気泳動図を図１に示す。還元性バッファーにおける標的タンパク質のサンプルは４５ｋＤａ及び３０ｋＤａであり、そして非還元性バッファーにおける標的タンパク質サンプル（単一の抗体）は１５０ｋＤａである。
【００６５】
本実施例において調製されたＨ２６Ｌ１７を以下の実施例２から４内で用いた。
【００６６】
実施例２．Ｈ２６Ｌ１７のヒトβ−ＮＧＦ抗原への結合活性の分析
【００６７】
本試験において、ＥＬＩＳＡ法をヒトβ−ＮＧＦに結合するＨ２６Ｌ１７のＥＣ50（半有効濃度）を決定し、抗体のヒトβ−ＮＧＦへの結合特異性及び親和性を調査した。
【００６８】
５０μＬの０．５μｇ／ｍＬヒトβ−ＮＧＦによりマイクロプレートの各ウエルをコートして、そして４℃で一晩インキュベートした。そのマイクロプレートを一度洗浄して、水気を取り、各ウエルを３００μＬの（ＰＢＳに溶解した）１％ＢＳＡ溶液によりブロックした。そのマイクロプレートを３７℃で２時間インキュベートし、そして３回洗浄した後に水気を取った。抗体を初期濃度として１μｇ／ｍＬで希釈して、そして１：３の勾配希釈をマイクロプレートで実施し、ブランクのコントロールのウエルを加えて、全７濃度を得た。ウエル当たり１００μＬの最終液量を有する、二連のウエルを上記の濃度で設定し、そして３７℃で３０分インキュベートした。マイクロプレートを３回洗浄した後、水気を取り、５０μＬのホースラディッシュペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体の希釈溶液を各ウエルに添加して、そしてそのマイクロプレートを３７℃で３０分間インキュベートした。マイクロプレートを４回洗浄した後、水気を取り、５０μＬのＴＭＢ発色溶液を各ウエルに添加し、室温で５分間消光下で発色を進行し、続けて５０μＬの停止液を各ウエルに添加して発色の進行反応を停止した。反応を停止した後すぐに、マイクロプレートをマイクロプレートリーダーに置き、そして４５０ｎｍの光の波長を選択して、マイクロプレートの各ウエルのＯＤ値を読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ６．２．１  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析し、データを加工した。表２及び図２より、４５０ｎｍの読み取り結果ではＨ２６Ｌ１７が効果的にヒトβ−ＮＧＦと結合しうることを示し、そして結合効率は用量依存性であったことが見られうる。横軸として抗体濃度、縦軸として吸光度値をとり、４−パラメータフィッティングカーブをプロットし、０．０７１ｎＭの結合ＥＣ50という結果をもたらし、タネズマブの結合ＥＣ50と同等だった。表２のＨ２６Ｌ１７及びタネズマブのヒトβ−ＮＧＦとの結合活性の分析結果を参照。本結果は、０．０７１ｎＭの結合ＥＣ50により、Ｈ２６Ｌ１７のヒトβ−ＮＧＦ抗原への結合が用量依存性であり、タネズマブと同等であったことを示す。
【００６９】
表２．Ｈ２６Ｌ１７及びタネズマブのヒトβ−ＮＧＦ抗原の結合活性の分析結果
【表１】
2021521881.tif 000003
【００７０】
実施例３．Ｈ２６Ｌ１７の細胞生物活性の分析
【００７１】
１．ＮＧＦ誘導ＴＦ−１細胞増殖を阻害することにおけるＨ２６Ｌ１７の薬理学的な活性の分析
【００７２】
ＮＧＦ依存性ＴＦ−１細胞増殖を阻害することにおけるＨ２６Ｌ１７の効果を分析するために、異なる濃度の抗体、ＮＧＦ及びＴＦ−１細胞を共培養し、その細胞増殖を培養７２時間後に測定した。その特定の工程を以下に示す：
【００７３】
ＴＦ−１細胞を遠心分離により収集し、カウントし、そして４０，０００細胞数を９６ウエルプレートの各ウエルに播種した。投与のために、コントロール群を３つのＮＧＦ濃度０．２、２、及び２０ｎｇ／ｍＬにより設定し、そして抗体群を２０ｎｇ／ｍＬのＮＧＦにより設定し、；その抗体濃度を５つの濃度：０．０１６ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．４ｎＭ、２ｎＭ、及び１０ｎＭにより設定した。細胞へＮＧＦ／抗体プレミックスを投与する前に抗体及びＮＧＦを３７℃で３０分間前培養した。また、本試験において、アイソタイプのコントロール群を含む。処理後、（２４時間ごとに一度ピペッティング及びホモジナイズし、）細胞を７２時間培養した後、細胞培養をＣＣＫ−８テストキットの説明書に従い測定した（１００μＬの液体を分析のために得た）。細胞増殖の標準曲線を図３に示す。細胞インキュベーションの７２時間後の細胞増殖の分析結果を図４に示す。図４に見られるように、Ｈ２６Ｌ１７は用量依存的な様式においてＴＦ−１の細胞増殖のＮＧＦの刺激効果を阻害する。特に、抗体濃度が０．０８ｎＭ未満の場合に、前記Ｈ２６Ｌ１７抗体は、ＴＦ−１細胞増殖のＮＧＦの効果を阻害することにおいて陽性コントロール抗体のタネズマブよりも有意に良い。
【００７４】
２．ＮＧＦ誘導したＴＦ−１細胞増殖を阻害することにおけるＨ２６Ｌ１７の試験において、ＮＧＦを中和するＨ２６Ｌ１７のＥＣ50値
【００７５】
ＮＧＦ誘導したＴＦ−１細胞増殖を阻害することにおけるＨ２６Ｌ１７の医薬的な活性を分析するため及びＮＧＦを中和するＨ２６Ｌ１７のＥＣ50を測定するために、異なる濃度の抗体、ＮＧＦ及びＴＦ−１細胞を共培養し、細胞増殖を培養７２時間後に測定した。特定の工程又は方法を以下に簡潔に記載した：
【００７６】
ＴＦ−１細胞を遠心分離により収集し、９６ウエルプレートに１ウエルあたり４０，０００細胞数で播種した。投与のために、コントロール群を０．０６ｎＭ、０．３ｎＭ、及び１．５ｎＭの３つのＮＧＦ濃度に設定した。ＮＧＦ／抗体プレミックス群におけるＮＧＦの終濃度は１．５ｎＭであり、そして抗体の濃度をそれぞれ、０．０４６８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．１０５ｎＭ、０．１５８ｎＭ、０．２３７ｎＭ、０．３５６ｎＭ、０．５３３ｎＭ、及び０．８ｎＭで設定した。ＮＧＦ／抗体プレミックスの細胞への投与前に、その抗体及びＮＧＦを３７℃で３０分間前培養した。本試験において、１．５ｎＭの濃度を有するアイソタイプの抗体コントロール群を含む。処理後、（２４時間ごとに一度ピペッティング及びホモジナイズし、）細胞を７２時間培養した後、細胞増殖をＣＣＫ−８テストキットの説明書に従い測定した（１００μＬの液体を分析のために得た）。
【００７７】
ＣＣＫ−８試験において測定した各群のＯＤ値を図５に示した。ｘ軸として抗体濃度（ｎＭ）のログを、ｙ軸としてＯＤ４５０値をとり、用量効果カーブフィッティングを実施し、異なる抗体のＥＣ50と比較し、そしてそのフィッティングカーブを図６に示す。Ｈ２６Ｌ１７は用量依存的な様式においてＮＧＦ誘導ＴＦ−１細胞増殖を阻害しうり、ＮＧＦに対して中和活性を示し、そしてその活性は、同じ標的について市販される薬物のタネズマブの活性よりごくわずかに良い。前記二つのＮＧＦへの中和ＥＣ50はそれぞれ０．１６ｎＭと０．２１ｎＭであり、そしてそのＨ２６Ｌ１７抗体はＴＦ−１細胞増殖のＮＧＦの効果を阻害することにおいて陽性コントロールのタネズマブ抗体よりも有意に良い。
【００７８】
実施例４．Ｈ２６Ｌ１７は、Ｌｅｎｔｉ−ＩＬ−１β―ＮＩＨ／３Ｔ３マウスの膝関節炎疼痛モデルにおいて、患肢の歩行方法及び体重減少の状態を改善できる。
【００７９】
関節炎を患う患者は疼痛により跛行及び他の行動変化を経験すると考えられ、そして悪寒による食物摂取の減少により生じる体重減少は疼痛によって誘導される。抗ＮＧＦ抗体の膝関節痛反応の減少を測定するために、Ｌｅｎｔｉ−ＩＬ−１β―ＮＩＨ／３Ｔ３によって誘導されるマウスの膝関節痛モデルを確立し、そして薬物効果をマウスの行動改善によって評価した。本モデルにおいて、Ｌｅｎｔｉ−ＩＬ−１β―ＮＩＨ／３Ｔ３細胞をマウスの関節腔内にＩＬ−１βを過剰発現し、注射部位で順番に関節炎及び疼痛を引き起こした。本試験において、１群あたり１０動物数で、通常群（生理食塩水、Ｓ．Ｃ．）、モデル群（抗ＨＥＬ、２０ｍｇ／ｋｇ，Ｓ．Ｃ．）、タネズマブ群（タネズマブ、２０ｍｇ／ｋｇ，Ｓ．Ｃ．）及びＨ２６Ｌ１７抗体低用量群（Ｈ２６Ｌ１７，０．２ｍｇ／ｋｇ、Ｓ．Ｃ．）、中間用量群（Ｈ２６Ｌ１７，２ｍｇ／ｋｇ、Ｓ．Ｃ．）、及び高用量群（Ｈ２６Ｌ１７，２０ｍｇ／ｋｇ，Ｓ．Ｃ．）と称し、６０Ｃ５７ＢＬ／６マウスを体重に従い６群に分割した。分類日を０日目（Ｄ０）として記録した。分類後、マウスの体重を測定し、そして対応の薬物を分類後Ｄ０、Ｄ３及びＤ６にそれぞれ皮下注射した。分類日の投与後に、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞懸濁液（５０，０００細胞数／マウス）を用いて通常群の１０Ｃ５７ＢＬ／６マウスの膝関節腔内に接種し、そして残りの群中の他の５０Ｃ５７ＢＬ／６マウスの膝関節腔内にＬｅｎｔｉ−ＩＬ−１β―ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を接種した。続けて、分類日の投与後Ｄ３、Ｄ５及びＤ１１にマウスの行動スコア化を実施した。
【００８０】
マウスの膝関節痛反応の抗ＮＧＦ抗体の効果の結果を図７に示す。陽性コントロールのタネズマブ（２０ｍｇ／ｋｇ，Ｓ．Ｃ．）と比較して、Ｈ２６Ｌ１７抗体高用量群（２０ｍｇ／ｋｇ，Ｓ．Ｃ．）では有意に疼痛反応を減少し；陽性コントロールのタネズマブ（２０ｍｇ／ｋｇ，Ｓ．Ｃ．）と比較して、Ｈ２６Ｌ１７抗体低用量群（０．２ｍｇ／ｋｇ，Ｓ．Ｃ．）及びＨ２６Ｌ１７中間用量群（２ｍｇ／ｋｇ，Ｓ．Ｃ．）ではマウスにおいて疼痛を減少することにおける等価な効果を有する。マウス膝関節痛モデルにおけるマウスの体重減少を軽減する抗ＮＧＦ抗体の結果を図８に示す。Ｈ２６Ｌ１７抗体の中間及び高用量群ではマウス膝関節痛モデルにおけるマウスの体重減少を軽減することにおいて、陽性コントロールのタネズマブ抗体と等価の効果を有し、アイソタイプ抗体の抗ＨＥＬよりも有意に効果を有する。
【００８１】
本発明の好ましい態様は、上記に詳細を記載するが、本発明はその態様に制限されない。当業者は本発明の精神に違反することなく、様々な同等の修飾又は置換を構成できる。これらの同等の修飾又は置換は本適用の請求の範囲に含まれる。
【図１】
2021521881.tif 000004
【図２】
2021521881.tif 000005
【図３】
2021521881.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2021521881.tif 000011
【配列表】
2021521881000001.xml
【手続補正書】
【提出日】令和2年10月26日(2020.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021521881000001.app
【国際調査報告】
2021521881.tif 000017
2021521881.tif 000018
2021521881.tif 000019
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