(57)【要約】  本発明は、ある期間にわたる製品への電磁界の適用を可能にして、前記製品の状態を変更するための装置及び方法に関する。状態の変化は、行われているプロセスを加速させることができ、及び／又は製品の後の使用の経験の質を変えることができる。装置は、支持台と、前記製品が位置する容器とを含み、及び支持台は、パルス電磁界（ＰＥＭＦ）の生成のための１つ以上のモジュールを含み、及び支持台、したがってモジュールは、ＰＥＭＦの生成を制御するための制御手段に接続されており、かつ生成される前記ＰＥＭＦに製品が暴露されることを可能にするように前記製品に対して配置可能である。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある期間にわたる製品への電磁界の適用を可能にして、前記製品の状態を変更するための装置であって、少なくとも１つの支持台と、前記製品が位置する容器とを含み、前記支持台は、パルス電磁界（ＰＥＭＦ）の生成のための１つ以上のモジュールを含み、前記支持台は、前記ＰＥＭＦの前記生成を制御するための制御手段を含むか又はそれに接続され、生成される前記パルス電磁界に前記製品が暴露されることを可能にするように前記製品に対して配置可能である、装置。
【請求項２】
前記製品の成分の混和を促すために前記ＰＥＭＦの伝送を可能にするように提供される、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記制御手段は、放出される前記ＰＥＭＦの周波数及びデジタルシーケンスを、その時点で前記容器内に保持される前記製品の誘電特性及び／他の特性に対応するように制御する、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記制御手段は、前記支持台に提供された集積回路の形態で提供される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
前記制御手段は、デバイスからの前記ＰＥＭＦの前記生成の使用者制御を可能にするためのソフトウェアベースのユーザインタフェースによって順番に動作可能である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
前記支持台及び／又は前記モジュールは、前記容器内に保持される前記製品が前記ＰＥＭＦに暴露されることを可能にするように前記容器に対して位置付け可能である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７】
複数の前記モジュールは、ＰＥＭＦの増加した範囲及び／又は強度を提供するために、固定された配列又は配置で前記支持台に提供される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８】
前記支持台は、前記容器の外部に位置し、前記ＰＥＭＦは、前記製品が位置する前記容器の１つ以上の壁を通して前記製品に適用される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
少なくとも、前記ＰＥＭＦを生成するための前記１つ又はモジュールを含む前記支持台の部分は、前記容器の内部に位置する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１０】
複数の支持台は、前記ＰＥＭＦへの均一な暴露を提供するために、前記容器内の異なる場所に位置する、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記支持台は、前記容器の１つ以上の壁によって形成されており、及び前記モジュールは、前記１つ以上の壁の一部として取り付けられている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１２】
前記支持台は、前記容器の１つ以上の壁内に位置する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１３】
前記支持台は、前記１つ以上のモジュールが位置するハウジングの形態で提供される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１４】
前記支持台は、前記モジュールが位置するシート材として提供される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１５】
前記支持台は、使用のために滅菌形態で提供され、かつ単回使用のために提供される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１６】
前記モジュールは、特定の周波数範囲内の前記ＰＥＭＦの無線近距離通信を可能にするためのアンテナ及び送信機を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１７】
前記特定の周波数範囲は、工業用、科学的及び医療用（ＩＳＭ）近距離無線周波数帯である、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
前記周波数は、２．４ＧＨｚである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１９】
前記送信機は、最大１５メートルの距離の前記ＰＥＭＦを生成することが可能である、請求項１６に記載の装置。
【請求項２０】
前記制御手段は、継続時間において０．５〜１．５ｍｓの範囲内のパルスでの前記ＰＥＭＦの伝送を可能にする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２１】
前記パルスは、４０〜６６ｍｓの範囲内の休止期間によって離隔される、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
ＰＥＭＦパルスは、毎秒１２〜２０パルスの範囲内で放出される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２３】
前記支持台及び／又は前記支持台に位置する前記モジュールは、前記製品に対して無指向性的に前記ＰＥＭＦを生成するように前記容器に対して配置される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２４】
前記モジュールは、パーソナルエリアネットワークシステムデバイスに基づく、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２５】
製品の状態の変化のための方法であって、第１の状態にあるとき、前記製品の前記第１の状態を、後の使用又は更なるプロセシングのための所望の更なる製品に変えるために、所定の周波数においてかつ所定の期間にわたって１つ以上のモジュールから前記製品にパルス電磁界を適用する工程を含む方法。
【請求項２６】
前記状態の変化は、発酵の実施及び／又は前記製品の細胞培養システムの進展の結果としてのものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＰＥＭＦは、前記製品の要素又は原料の形態における前記製品の１つ以上の成分の前記状態の変化を可能にする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰＥＭＦは、発酵及び／又は前記製品における細胞培養の進展を生じさせるように前記製品の処理の段階として適用される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記状態の変化は、前記製品のプロセシング工程が行われる速度を増加させることである、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記プロセシング工程は、細胞培養の進展である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＰＥＭＦは、哺乳類の細胞培養の増殖の速度を増加させるために適用される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記製品に対するＰＥＭＦの前記適用は、前記製品のプロセシングの他の段階中に意図的に使用されない、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＰＥＭＦは、特定の製品及び／又は前記製品の量に関して決定される所定の期間にわたって適用される、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ＰＥＭＦ周波数は、工業用、科学的及び医療用目的に使用される電磁スペクトルの帯域幅内である、請求項２５〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
電磁エネルギーは、継続時間において０．５〜１．５ｍｓの範囲内のパルスで送達される、請求項２５〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記パルスは、範囲内の休止期間によって離隔され、前記パルスは、４０〜６６ｍｓの範囲内の休止期間によって離隔される、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願が関連する本発明は、製品の状態の変化を提供するための、より具体的には、発酵及び細胞培養バイオシステムなどの生物系の代謝生産性のいずれかを変えるための、及び／又はこのようなシステムの生産速度を増加させるためのパルス電磁界（ＰＥＭＦ）（電磁気のデジタルシーケンスとも呼ばれ得る）の適用である。
【背景技術】
【０００２】
微生物培養の分野では、これらは、人間又は動物が消費する多くの種類の食品及び飲料を生産するために長年にわたって活用されてきた。例えば、酵母（サッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ））の発酵プロセスは、ビール、ワイン及び発酵させて膨らませたパンの生産プロセスの鍵となる部分である。この形態の食品製造の進展は、元来、天然培養物の偶然の発見に基づくものであり、後に生産プロセスに採用されたものである。その後、発酵製品生産の管理知識の増加により進展が進むことになったが、依然として主に「試行錯誤」に基づいており、使用した生産プロセスの観察と、犯した失敗からのその後の学習とに関連している。
【０００３】
より最近では、進展プロセスは、より規制された科学的なものになってきたが、科学的進歩の多くは、一次発酵自体の生産性を向上させることよりもむしろ、腐敗の回避と犯した誤りからの回復とに関連するものと論じられることがある。これにもかかわらず、ワイン造りプロセスなどの多くの生産方法では、ブドウの表面に常在する天然酵母に依然として依存しており、清浄度の向上及び現代的なベッセル設計にもかかわらず、使用される一次発酵プロセスは、依然として古代に使用されていたものに非常に近い。同様に、ビール、チーズ及び発酵させて膨らませたパンの生産も、元来使用される一次微生物プロセスから実質的に変化していない。
【０００４】
更に、飲料に二酸化炭素が含まれる場合、液体の味、テクスチャ及び喉の渇きを癒す特性に更なる次元が提供される。ガスは、液体中に二酸化炭素をスパージングすることによって直接添加されるか、又は代わりに酵母及び溶解した糖の作用によって提供され得る。樽ビール及びボトルビールのような特定の場合、二酸化炭素添加の両方の方法が使用され得る。二酸化炭素の含有を活用して発泡を提供し、このようにして飲酒経験の味及びテクスチャを引き上げ、拡張する、ノンアルコールの果実及び砂糖ベースの液体並びにアルコールベースの飲料などの多くの液体飲料がある。上記の全てにおいて、二酸化炭素と水性媒地との混和があると想定されるが、特に混合物中にアルコールも存在する場合、分子レベルで従来達成されている混合は、全体的な飲酒経験に負の影響を及ぼすことが発見されている。これは、水が、媒地中にランダムに分布するクラスターをもたらす不規則な分子間水素結合を形成する自然な傾向に起因すると考えられる。同様に、アルコールは、クラスタリングになりやすく、これは、飲料製品内の最適に満たない二酸化炭素の分布につながる。したがって、例えば、二酸化炭素が水及びアルコールと混合された口中感覚である、シャンパンのムースなどの液体の特定の側面は、所望する程度まで達成されない。更なる課題は、特にスパージングによるガスの添加は、液体の開裂した水素結合構造を過度に乱す原因となり、結果的にクラスタリングの原因となることである。従来、解決策は、液体を通常容器内に長期間貯蔵して自然な動力学的運動を可能にし、系を均質化させることとされてきた。これは、ガス及びアルコールが均一に収められ得る液体の好ましい粗な構造を製品に取り戻させるために、高価な貯蔵に何年もかかる場合がある。
【０００５】
より最近では、醸造及びワイン造りから得られた技能及び経験の多くは、例えば、バイオ医薬品の生産に活用されている。バイオ医薬品の生産では、採用されている発酵システム及び使用されている機器は、概ね同様であるが、比較的厳格な規制パラメータに準拠する必要があり、使用される生物は、遺伝子操作されたものである。しかしながら、この場合にも、培養物の増殖及び性能は、元の生物の固有の挙動に依然として本質的に依存している。これらのプロセスは、栄養素の賢明な選択並びに温度、ガス交換及び／又は他のバッチ製造条件の慎重な制御によって最適化できることが分かっているが、微生物の生産性は、関与する微生物の自然の限界を超えることができないことが分かっている。
【０００６】
更に、上記の現代的なプロセス及び旧来のプロセスの両方の全てに共通の因子は、酵母及び／又は他の生物が製品中でそれらの機能を最大の能力で実施できるようにするために、プロセスの開始とプロセスの終了との間に時間枠の経過を必要とすることである。この時間の遅れは、所望の形態の製品のより大規模かつより効率的な製造に対する顕著な障壁となり得、及び／又は完全な機能を実施するために与えられる時間が不十分な場合に最終製品が劣った品質のものとなることを意味し得る。したがって、微生物培養は、生産性の観点におけるそれらの自然の限度並びに栄養素、増殖条件及び／又は機器の最適化により達成され得る限度に既に到達していると考えられるため、商業的に顕著な生産性は、制限されているか又は達成することができない。したがって、従来、特定の製品に関連して使用されるプロセスは、品質を妥協することなく及び／又は規制に違反することなく変更することが困難であると考えられていた。
【０００７】
例えば、医療業界及びバイオテクノロジー業界を横断する多くのセクターで酵素、ホルモン及び抗体を含む広範な製品を生成するために使用される哺乳類の細胞培養の分野において、哺乳類の細胞を使用する生物学的製剤の生産は、細胞の増殖速度の遅さ、高度に特殊な条件及び従来の微生物系よりも汚染のリスクが高いことが原因で、従来、非常に高価であるが、従来の手法が唯一の実施可能な解決策であると考えられている。
【０００８】
本出願人は、その内容が本明細書に組み込まれるその同時係属中の出願である国際出願ＰＣＴ／ＧＢ２０１８／０５３４９３号明細書において、電磁界をパルスで提供する能力と、発酵及び細胞培養など、液体の生物系の代謝生産性の変化を可能にするための、特定の製品に対するこの暴露とについて開示している。
【０００９】
しかしながら、本出願を効果的にするために、パルス電磁界に対する液体の暴露の各機会で方法の効果が達成されることを確実にするために、電磁界を、信頼性が高くかつ再現性のある手法で適用することを確実にできる必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の目的は、製品の進展及び所望の形態を得るために使用される品質及び手順の向上を可能にし、それにより最終製品の品質を向上させ、及び／又は最終製品を達成することができる手段を速める、上述の課題に対する解決策を提供することである。したがって、更なる目的は、非侵襲的であり、容易に適用され、収率の増加を与えることができ、及び／又はバッチ生産時間を減少させることができる方法を提供することである。
【００１１】
本発明の更なる目的は、容易に再現可能であり、かつ好ましくは必要に応じて非当業者により実施され得る手法での、製品に対する電磁界の効果的な適用を可能にする装置を提供することである。更なる目的は、処理される製品が保持された容器と共に装置を使用することを可能にする形態で装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第１の態様では、ある期間にわたる製品への電磁界の適用を可能にして、前記製品の状態を変更するための装置であって、少なくとも１つの支持台と、前記製品が位置する容器とを含み、前記支持台は、パルス電磁界（ＰＥＭＦ）の生成のための１つ以上のモジュールを含み、及び前記支持台は、ＰＥＭＦの生成を制御するための制御手段を含むか又はそれに接続され、かつ生成される前記パルス電磁界に製品が暴露されることを可能にするように前記製品に対して配置可能である、装置が提供される。
【００１３】
典型的には、装置は、製品の成分の混和を促すためにＰＥＭＦの伝送を可能にするように提供される。
【００１４】
一実施形態では、装置制御手段は、放出されるＰＥＭＦの周波数及びデジタルシーケンスを、その時点で容器内に保持される製品の誘電特性及び／他の特性に対応するように制御する。
【００１５】
一実施形態では、制御手段は、支持台に提供された集積回路の形態で提供され、送信機を含み得、送信機は、前記モジュールから放出されるＰＥＭＦに加えて、送信機からのＰＥＭＦの放出を可能にする。
【００１６】
一実施形態では、制御手段は、デバイスからのＰＥＭＦの生成の使用者制御を可能にするためのソフトウェアベースのユーザインタフェースによって順番に動作可能である。
【００１７】
一実施形態では、支持台及び／又はモジュールは、容器内に保持される製品がＰＥＭＦに暴露されることを可能にするように容器に対して位置付け可能である。
【００１８】
一実施形態では、複数の前記モジュールは、ＰＥＭＦの増加した範囲及び／又は強度を提供するために、固定された配列又は配置で支持台に提供される。
【００１９】
一実施形態では、支持台は、容器の外部に位置し、及びＰＥＭＦは、製品が位置する容器の１つ以上の壁を通して製品に適用される。
【００２０】
代替的な実施形態では、少なくとも、ＰＥＭＦを生成するための１つ又はモジュールを含む支持台の部分は、容器の内部に位置する。
【００２１】
典型的には、複数の支持台は、前記支持台と共に位置するモジュールから生成されるＰＥＭＦへの均一な暴露を提供するために、容器内の異なる場所に位置することができる。
【００２２】
一実施形態では、前記支持台は、容器の１つ以上の壁によって形成されており、及びモジュールは、前記１つ以上の壁の一部として取り付けられている。代替的な実施形態では、前記支持台は、容器の１つ以上の壁内に位置する。
【００２３】
一実施形態では、支持台は、前記１つ以上のモジュールが位置するハウジングの形態で提供されるか、又は別の実施形態では、支持台は、モジュールが位置するシート材として提供される。
【００２４】
一実施形態では、支持台は、使用のために滅菌形態で提供され、かつ一実施形態では単回使用のために提供され得る。
【００２５】
一実施形態では、前記モジュールは、特定の周波数範囲内のＰＥＭＦの無線近距離通信を可能にするためのアンテナ及び送信機を含む。一実施形態では、特定の周波数範囲は、工業用、科学的及び医療用（ＩＳＭ）近距離無線周波数帯である。一実施形態では、周波数は、２．４ＧＨｚである。
【００２６】
一実施形態では、送信機は、最大１５メートルの距離のＰＥＭＦを生成することが可能である。
【００２７】
一実施形態では、制御手段は、継続時間において０．５〜１．５ｍｓの範囲内のパルスでのＰＥＭＦの伝送を可能にし、及び／又は前記パルスは、４０〜６６ｍｓの範囲内の休止期間によって離隔され、及び／又はＰＥＭＦパルスは、毎秒１２〜２０パルスの範囲内で放出される。
【００２８】
典型的には、支持台及び／又は支持台に位置するモジュールは、製品に対して無指向性的にＰＥＭＦを生成するように容器に対して配置される。
【００２９】
一実施形態では、モジュールは、パーソナルエリアネットワークシステムデバイスに基づく。
【００３０】
一実施形態では、制御手段及びＰＥＭＦを放出するモジュールには、無線に対して透明なハウジングの形態であり、かつモジュールが位置する支持台が提供され、ハウジングの形状及びモジュールの間隔は、これらを１つの又は様々な容器種類に対して使用することを可能にするように適合され得る。
【００３１】
一実施形態では、ハウジング、したがって装置は、容器と共に使用され得る別の物品の一体部品として提供されるか、又は液体が保持される容器の一部として形成される。
【００３２】
一実施形態では、支持台は、支持台と共に使用される特定の容器のプロファイルにフィットするモールドなどの形状で提供されるため、装置の位置付け手段は、装置と容器とのフィッティングを確実にすることを可能にし、したがって装置を一実施形態では製品の消費の直前に使用することを可能にする。
【００３３】
一実施形態では、容器は、個々のボトル若しくはグラスのいずれかであるか、又はいくつかのボトル若しくはグラスなどの容器のグループであり得、製品が保持され、製品は、一実施形態ではスパークリング液体であり、及び／又はシャンパン、プロセッコ、カヴァ等のようなアルコールを含有する。
【００３４】
別の実施形態では、容器は、バイオリアクターベッセルの形態であり得、使用される容器は、容器内に保持される製品及び／又は製品に対してかつ追加的な工程として若しくは工程の少なくとも１つ中にＰＥＭＦが選択的に適用される製品に対して実施されるプロセス工程に適した形態で提供されると認識されるべきである。
【００３５】
一実施形態では、装置には、その上に容器の底部を置くことを可能にする位置付け手段が提供され、及び／又は容器の周りに置かれる係合手段が提供され得る。
【００３６】
一実施形態では、装置は、ボトルのネックにフィットするハウジングの形態で提供される。
【００３７】
典型的には、装置は、バッテリー若しくは他の電源手段を含み、及び／又は電磁界パルスを放出するための電力を供給することを可能にするために充電することができる。
【００３８】
別の実施形態では、装置は、スリーブの形態で提供され、スリーブは、容器の周りに提供され得、また容器内の液体の冷却を可能にするための手段が提供され得る。
【００３９】
一実施形態では、装置は、例えば、容器がグラスである場合に追加の視覚的次元を提供するために、及び／又はＰＥＭＦが生成されている場合、装置の動作の指示を提供するために、装置に照明を提供するなどのために、容器の外観を変えることを可能にする少なくとも１つの特徴を含む。
【００４０】
本発明の更なる態様では、製品の状態を変えるための方法であって、第１の状態にあるとき、製品の前記第１の状態を、後の使用又は更なるプロセシングのための所望の更なる製品に変えるために、所定の周波数においてかつ所定の期間にわたって１つ以上のモジュールから製品にパルス電磁界を適用する工程を含む方法が提供される。
【００４１】
一実施形態では、状態の変化は、発酵の実施及び／又は製品の細胞培養システムの進展の結果としてのものである。
【００４２】
一実施形態では、前記ＰＥＭＦは、製品の要素又は原料の形態における製品の１つ以上の成分の状態の変化を可能にする。
【００４３】
一実施形態では、ＰＥＭＦは、発酵及び／又は製品における細胞培養の進展を生じさせるように製品の処理の段階として適用される。
【００４４】
一実施形態では、状態の変化は、製品のプロセシング工程が行われる速度を増加させることである。一実施形態では、プロセシング工程は、細胞培養の進展である。
【００４５】
一実施形態では、ＰＥＭＦは、哺乳類の細胞培養の増殖の速度を増加させるために適用される。
【００４６】
一実施形態では、製品に対するＰＥＭＦの適用は、製品のプロセシングの他の段階中に意図的に使用されない。
【００４７】
一実施形態では、ＰＥＭＦは、特定の製品及び／又は製品の量に関して決定される所定の期間にわたって適用される。
【００４８】
一実施形態では、ＰＥＭＦ周波数は、工業用、科学的及び医療用目的に使用される電磁スペクトルの帯域幅内である。
【００４９】
一実施形態では、電磁エネルギーは、継続時間において０．５〜１．５ｍｓの範囲内のパルスで送達される。
【００５０】
一実施形態では、パルスは、４０〜６６ｍｓの範囲内の休止期間によって離隔される。
【００５１】
一実施形態では、複数の前記デバイスは、固定された配列で提供されるか、又はより強いパルス磁界若しくはより広範囲のパルス磁界を提供するための配列に選択的に配置される。
【００５２】
一実施形態では、ＰＥＭＦは、容器が特定の配列に位置した状態で、複数容器内に保持された製品に、装置を使用して同時に適用される。
【００５３】
一実施形態では、容器は、ワインなどのスパークリング液体を収容するボトルである。
【００５４】
一実施形態では、本発明によるパルス電磁界の使用は、バイオ燃料の生産、遺伝子組換え細胞及び生物の培養、インスリン、モノクローナル抗体、成長ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、血液因子ＶＩＩａ、血液因子ＶＩＩＩ、血液因子ＩＸ、エリスロポエチン、ゴナドトロピン、グルカゴン、ワクチン抗原配列、哺乳類の細胞培養のいずれか又は任意の組み合わせの生産性の増加を提供する。
【００５５】
したがって、本発明によれば、製品が位置する環境を作成するためのパルス電磁界の生成を追加して、製品形成のために従来のリアクター条件及び機器を引き続き使用することができる。
【００５６】
典型的には、微生物有機体は、電磁気系であり、電磁気の変化に応答する。
【００５７】
典型的には、培養物に、装置を使用してＰＥＭＦが照射され、装置は、装置の使用が非侵襲的であり、したがって製品のいかなる栄養素又は配合成分も変更しないように配置された無線又はマイクロ波送信機を含む。
【００５８】
一実施形態では、放射周波数は、好ましくは、２．４Ｇｈｚである。
【００５９】
典型的には、パルスは、継続時間が０．５〜１．５ミリ秒の範囲内であり、より好ましくは１ミリ秒の継続時間である。典型的には、パルスは、一実施形態では、４０〜６０ミリ秒の範囲内、より好ましくは５０ミリ秒の休止期間によって離隔される。
【００６０】
パルス間に休止期間を提供すると、微小動植物が電磁エネルギーにより圧倒されるのではなく、代わりに代謝プロセスの増加及び増殖速度の増加が促進されることを確実にする。これにより、代謝物の発現の増加及び栄養素の製品へのより効率的な転換、したがって収率の増加及び／又は所望の結果を達成するのに必要な生産時間の減少をもたらすことが分かった。更に、パルス間の休止期間は、ＰＥＭＦによって製品中に生成される活動を緩和することを可能にし、したがって、パルシングは、均一性を促す。なぜなら、クラスターをばらばらにし、熱力学的に好ましい製品の粗な構造を自然に形成するからである。
【００６１】
一実施形態では、ＰＥＭＦの生成を検出するために、電子磁界検出器が装置の近傍で用いられ得る。製品の状態の変化は、特徴及び／又は製品プロセスの１つ若しくは組み合わせであり得る。
【００６２】
一実施形態では、制御手段は、放出される電磁界の周波数及びデジタルシーケンスが、その時点で容器内に保持されている製品の誘電特性及び／又は他の特性に対応することを可能にする。
【００６３】
一実施形態では、生成される電磁界は、２．４ＧＨｚのパルスで提供され、システムは、低磁場の、典型的にはミリワットのエネルギーパルスを提供する。回路は、デューティサイクルが典型的には１〜２％の範囲内であるように、典型的には２．４ＧＨｚの１ミリ秒のパルスを１０〜２０Ｈｚの低いパルス周波数で提供するようにプログラムされる。
【００６４】
一実施形態では、電磁界パルスの適用の継続時間は、３０分〜２時間の範囲内であり、必要に応じて液体を冷やすことなどの別の機能と同時に実施され得る。電磁界のパルスの適用の継続時間は、処理される液体の種類及び／又は量に依存することも認識すべきである。
【００６５】
ＰＥＭＦが生成される周波数の範囲は、工業用、科学的及び医療用帯域として知られ、その特性は、一般に、この帯域がミリワット範囲の低磁場又は低エネルギーとして提供され、約１ミリ秒の短パルス幅で提供され、典型的には１５Ｈｚの低周波数パルスレートを有するというものである。
【００６６】
一般に、この形態の電磁界は、例えば、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈを使用するスマートフォンのサービスに使用されており、この電磁界は、これらの周波数を送達するように修正され得る。
【００６７】
したがって、本発明は、成分が指数関数期に入るためにかかる時間を削減し、それにより発酵成分のプロセシングの全体的なサイクルタイムの削減を可能にするという観点における顕著な向上を可能にする。例えば、バイオエタノールの製造では、本明細書中に詳述する向上により、生産時間の大幅な削減を可能にし、それにより従来使用されている同様の装置からのスループット及び収率の向上を可能にする。
【００６８】
一実施形態では、ＰＥＭＦの使用は、好気性条件で使用されるように制御され、一実施形態では、材料に対するＰＥＭＦの適用は、好気性環境内で提供される。別の実施形態では、方法は、バイオ燃料を形成するための、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのブタノールの生産において使用される。
【００６９】
したがって、本発明によれば、パルス電磁界を提供するための本明細書に記載される方法及び装置の使用により、製品の品質に悪影響を及ぼすことなく生産の強化及び向上を可能にする。
【００７０】
ここで、添付の図面を参照しながら本発明の特定の実施形態について説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明の一実施形態に従って使用される装置を概略的に図示する。
【図２】パルス電磁界を放出するためのデバイスが、処理される製品培地と共に使用される手法を図示する。
【図３】製品培地に対するデバイスの代替的な配置を図示する。
【図４】デバイスの使用を、処理される製品培地が収容された容器と共に図示する。
【図５】図４の配置の更なる実施形態を図示する。
【図６】１つ以上のデバイスを循環装置の一部として使用することができる手法を図示する。
【図７】本発明の一実施形態による装置を図示し、装置と共に使用するための制御手段構成要素を示す。
【図８】本発明の一実施形態による、ボトルに装着された装置を図示する。
【図９】装置をボトルと共に位置させることができる代替的な形態を図示する。
【図１０】ボトルとの係合を可能にするための装置の代替的な実施形態を図示する。
【図１１】ボトルとの係合を可能にするための装置の代替的な実施形態を図示する。
【図１２】装置の代替的な実施形態を図示する。
【図１３】別の物品との装置の組み込みを図示する。
【図１４ａ】グラスの形態の容器と共に使用され得る本発明による装置の更なる実施形態を図示する。
【図１４ｂ】グラスの形態の容器と共に使用され得る本発明による装置の更なる実施形態を図示する。
【図１４ｃ】グラスの形態の容器と共に使用され得る本発明による装置の更なる実施形態を図示する。
【図１５】時間に対する光学濃度に関する、対照の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の量と、ＰＥＭＦを使用して処理された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）との間の比較をグラフで図示する。
【図１６】経時的な乾燥細胞重量に関する、対照の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の量と、ＰＥＭＦを使用して処理した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）との間の比較を図示する。
【図１７】経時的なｐＨ値に関連する、対照としての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の量と、本発明によるＰＥＭＦを使用して処理された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の量とをグラフで図示する。
【図１８ａ】経時的な細胞呼吸に関する、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の対照の量及びＰＥＭＦ処理された量を図示する。
【図１８ｂ】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の酸生産を図示する。
【図１８ｃ】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の代謝中間体を図示する。
【図１９ａ】それぞれ光学濃度及びＤＣＷに関連する、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の対照量と、ＰＥＭＦを使用して処理した同じ材料との比較をグラフで図示する。
【図１９ｂ】それぞれ光学濃度及びＤＣＷに関連する、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の対照量と、ＰＥＭＦを使用して処理した同じ材料との比較をグラフで図示する。
【図２０】経時的なｐＨに関する、Ｓセレビシエ（Ｓ  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の対照量と、ＰＥＭＦを使用して処理した同じ材料との比較をグラフで図示する。
【図２１】経時的な細胞呼吸に関する、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の対照量と、ＰＥＭＦを使用して処理した同じ材料との比較をグラフで図示する。
【図２２】Ｓ．セレビシエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の代謝活動を図示する。
【図２３ａ】Ｓ．セレビシエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の代謝活動を図示する。
【図２３ｂ】Ｓ．セレビシエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の代謝活動を図示する。
【図２４】Ｓ．セレビシエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の代謝中間体を図示する。
【図２５】Ｓ．セレビシエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のエタノール生産を図示する。
【図２６】処理される製品が位置する容器へのパルス電磁界の導入で使用するための装置の一実施形態を図示する。
【図２７】図２６の装置の潜在的な使用を容器と共に図示する。
【図２８】図２６の装置の潜在的な使用を容器と共に図示する。
【図２９】本発明による装置の更なる実施形態を図示する。
【図３０】本発明の一実施形態による哺乳類の細胞培養試験結果に関連する。
【図３１】本発明の一実施形態による哺乳類の細胞培養試験結果に関連する。
【図３２】本発明の一実施形態による哺乳類の細胞培養試験結果に関連する。
【図３３】本発明の一実施形態による哺乳類の細胞培養試験結果に関連する。
【図３４】本発明の一実施形態による哺乳類の細胞培養試験結果に関連する。
【図３５】本発明の一実施形態による哺乳類の細胞培養試験結果に関連する。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
まず、図２６を参照すると、処理される製品が位置する容器にパルス電磁界を導入するために使用され得る装置の一実施形態が示される。
【００７３】
一実施形態では、プローブ１は、ガラス管などの外側のハウジング３が提供され、外側のハウジング３は、一実施形態では、シーリングキャップ５を有し、シーリングキャップ５は、一端でガラスハウジング７に固定され、気密シールを作成することを可能にするためのフランジを典型的に含む適切な取付配置を有する。これにより、プローブ１を挿入する容器の壁又は別の構成要素にプローブ１を取り付け、それによりプローブを付着した状態で取り付けることを可能にする。プローブの大半、典型的にはガラスハウジング１は、容器内に位置することになる。ハウジング３内には、モジュール型電力のための並列回路トレースと、モジュールデータフィードバック及びプログラミング入力のための直列回路トレースとを有するプリント回路基板７が提供される。回路基板は、再充電され得るバッテリーも含み、したがって、プリント回路基板は、モジュール９に電力を提供し、かつモジュールが必要とされる手法で動作するようにモジュールに及びモジュールから制御データを提供するための手段として機能すると認識される。
【００７４】
特定の使用に必要な配置で位置し、この場合、ハウジング３の長さに沿って等間隔を空けて配置される一連の離隔されたモジュール９である。各モジュールは、容器内に保持された製品に影響を与えるように、ハウジングの壁を介して容器内にパルス周波数を放出することが可能である。コアサポート１１に位置するモジュール９の提供により、ハウジング３の壁からのモジュール９の適切な間隔を可能とし、したがって容器内における滅菌プロセスなどの他のプロセスにより作成され得る熱からのある程度の断熱を提供し、したがって蒸気によりハウジングを滅菌することを可能にする。一実施形態では、コア１１は、このプロセス中に取り除かれ、その後、ハウジングに再挿入され得る。
【００７５】
図２７及び図２８は、本発明によるプローブ１の潜在的な異なる使用を示す。図２７には、電磁界パルスをプローブからプローブの周囲３６０度にわたって放出することを可能にし、それにより容器内の製品の実質的に均一な処理を提供するために、プローブが容器内の中心かつ軸方向に配置されるように、容器１３の上部から容器１３の内部に導入されたプローブ１が示される。
【００７６】
図２８は、複数のプローブ１が提供され得る手法を示す。複数のプローブ１は、容器壁内の各々のポートを介して位置し、この実施形態では、プローブ１は、各プローブから電磁界パルスが提供されるように、水平にかつ９０度ずれて容器１３内に延びる。この及び他のマルチプローブ配置は、より大容量の容器及び／又は容器内に保持された、電磁界へのより強力な暴露から利益を受ける製品での使用に適し得ると想定される。
【００７７】
図２９は、同じく、容器１３が提供された装置の更なる実施形態を示す。この容器１３は、容器１３中で処理される製品を含む。この実施形態では、円筒形であり、複数のモジュール９からパルス電磁界を放出するための、選択されたマトリックス配置で位置するスリーブ１５と、また電力及び制御データがモジュール９から送信及び受信されることを可能にするために、典型的には、シリンダ材料と一体的に位置するワイヤによって各モジュールに接続された制御モジュール７とが提供される。示される実施形態では、スリーブ１５は、矢印１７によって示されるように移動され、容器の周りに配置され得るか、又は別の実施形態においてかつ特に同じ目的のために繰り返し使用される容器と共に使用するために、スリーブは、容器の壁構造の一体部品として提供され得るか、又はモジュールは、必要なマトリックス配置で提供され得、かつ支持スリーブの必要なしに壁構造と共に位置し得る。
【００７８】
ここで、図１を参照すると、本発明による装置の更なる形態が提供され、この実施形態において、装置は、この実施形態では、典型的には製品の一部として提供される微生物系の生きた培養物を処理し、それらの生産性を高めるために提供される。これは、マイクロ波領域内であり得、例えば１０〜２００Ｈｚの低周波数でパルス化され得る周波数の、典型的には培養培地１リットル当たりマイクロワットのオーダーの比較的低エネルギーのパルス電磁界（ＰＥＭＦ）に培養物を暴露することによって達成される。この方法工程は、微生物培養の増殖速度及び発現レベルを向上させることが分かっている。
【００７９】
一実施形態では、ＰＥＭＦの伝送は、１つ以上のモジュールからのものであり得る。１つ以上のモジュールは、制御手段と送信機とを含み、送信機は、パーソナルエリアネットワークシステムで使用されるものに類似し、モジュールからＰＥＭＦが生成されることを可能にするように制御され得ると共に、バッテリーによって又は電気源から直接給電される。図１は、モジュール２からＰＥＭＦを生成するために必要な構成要素の例を示す。構成要素は、電源４と、データプロセッサ６と、メモリ８と、信号発生器１０と、アンテナ１２とを含む。
【００８０】
モジュール２は、アルコールと二酸化炭素とを生成するための微生物培養物１６、例えば糖ベースの培地内の酵母の発酵物の下に又はそれに対して置かれ得る。生成される信号は、無指向性であり、位置に依存せず近接性のみに依存するため、発酵槽は、いずれの方向からも暴露され得、好ましくは発酵ベッセルの壁に触れている。
【００８１】
図２は、矢印１７で示されるように電磁界パルスが培養物内を上向きに移動するように培養培地１６が位置するベッセル１４の下にモジュール２が配置される１つの可能な配置を示す。しかしながら、モジュールは、パルス電磁界の放出の方向の観点において無指向性であるため、図３に示すもののような他の形式も可能である。この形式では、モジュール２は、矢印２０で示される方向にＰＥＭＦが適用され得るように、ベッセル１４の側面１８に取り付けられている。
【００８２】
更なる実施形態では、図４及び図５に示すように、複数の発酵ベッセル又はバイオリアクターベッセルが同時に処理され得る。例えば、図４において、この例では発酵アルコール飲料の形態の製品を含むいくつかの容器２２を上からの図で示す。飲料は、スパークリングワイン又は低温殺菌されていないボトルビールであり得、各ボトル２２がモジュール２のＰＥＭＦアンテナ１２から等距離にあるように、ボトル２２などの容器は、示されるように、モジュール２の周りに位置し、したがって、各ボトル内の製品１６中の発酵成分は、ＰＥＭＦに対する同一の暴露を受ける。
【００８３】
図５には、モジュール２の配列からＰＥＭＦに暴露される発酵微生物培養物の複数容器２２の別の実施形態が示される。この実施形態では、複数容器２２は、モジュール２’が４つの容器のグループ２４に寄与し、第２のモジュール２’’が容器のグループ２６に寄与し、モジュール２’’’が容器のグループ２８に寄与し、モジュール２’’’’が容器のグループ３０に寄与するように形成された配列によって同時にＰＥＭＦに暴露される。これらの容器及び容器内に収容された培養物が暴露のために容器の新たなグループに移動する前に一定期間暴露され得るように、配列は、保管中に容易に運搬及び装着されるように編成され得ることが認識されるであろう。
【００８４】
発酵又は細胞培養のためのＰＥＭＦのより大規模な生成では、モジュール２は、用いられる電磁周波数に対して透明なハウジングの形態の防水無菌支持台内に収容され得る。このように記載されるＰＥＭＦモジュール２は、図６に示すように、容器ベッセル内の培地１６中に矢印２６で示されるようにＰＥＭＦを放出する前記モジュールの広範囲の配列を提供するようにベッセルの壁２４の周りに置かれ得る。別の実施形態では、製品がモジュールの近くを流れ、近くを流れる際にＰＥＭＦ照射を受けるように、モジュールは、循環サイドアームの形態の支持台内に置かれ得る。これら実施形態は、大規模微生物培養に特に適している。ここで記載されている概要を有するＰＥＭＦによる処理は、生きた細胞内の荷電表面に電磁妨害を提供し、代謝物の増殖及び／又は発現の増加を誘発することが想定される。
【００８５】
スパークリングワインのボトルの場合、二酸化炭素生産の増加は、口中での発泡性ワインの泡立ち及びテクスチャを向上させると推論することができる。アルコールを含む他の製品種類では、ＰＥＭＦによってこの場合には酵母がより多くのアルコール（主にエタノール）を生産するように誘発及び促進されるため、アルコールの活性化は、生産性の増大を生じさせることができる。この場合、アルコールは、ワイン及びビールなどの発酵飲料製品又は蒸留前の発酵麦芽汁内に含有され得るものである。
【００８６】
本明細書に記載される、バイオ燃料の製造における更なる及び／又はより高速度のアルコール生産を提供するための方法による生産性の増加についても、本発明の使用として記載される。
【００８７】
図７には、装置１０２が図示される。装置１０２は、ボトル内に保持された液体１１２にパルスの電磁界を生成するために装置を使用できるようにする構成要素を有するハウジング１１０を有する。装置の構成要素は、ハウジング１１０内に位置する電源、この場合にはバッテリー１１４を含む。バッテリーは、再充電式であり得るか、又は切れたときに交換可能であり得る。
【００８８】
スイッチ１１６は、装置をオン及びオフにすることを可能にするために提供され、表示装置１１８は、装置の動作及び／若しくは装置１０２への電力の供給を単に示すための形式又は表示装置１１８が機能的効果に加えて装飾的効果を提供する、例えば装置と共に使用されることになる、例えばボトル内の液体の製造元であり得る企業のロゴを表示するために提供されるなどの他の形態のいずれかにおいて提供され得る。
【００８９】
別の指示は、光源１２０の形態で提供され、光源１２０は、装置の使用を停止することができること及び液体１１２が電磁界を使用して十分な時間にわたりコンディショニングされたことを示すために、ある量の液体を効果的に処理するのに十分な電磁界放出期間が経過したら点灯することができる。
【００９０】
ボトル及びボトル内に保持された液体に関連する装置の動作の特定時間を使用者が選択できるようにする計時手段１１２が提供され得る。上記構成要素に加えて、電気制御回路並びにパルスの電磁界の放出及び生成を必要な形式に制御するための構成要素もハウジング１１０内に提供され、ハウジングの壁１２２は、ハウジング１１０が容器４と共に位置したとき、電磁界がハウジングの壁１２２を通過し、容器４に入ることを可能にするために、電磁界に対して事実上透明であるように提供されると認識されるべきである。
【００９１】
図８は、この場合、ボトル１０４と装置ハウジング１１０と間のインターフェース１２６においてボトル１０４と装置ハウジング１１０とを取り囲み、ボトル１０４と装置ハウジング１１０とを互いに係合させるスリーブ１２４（断面で示される）の提供により、ハウジング１１０をボトル１０４と共に位置させることができる手段の一実施形態を示す。
【００９２】
図９には、カラー１３０と共に位置するストラップ１２８の形態の係合手段の別の実施形態の提供が示され、カラーは、ボトルのネック１０８を取り囲み、ストラップ１２８は、装置ハウジングからカラーまで延び、それによりインターフェース１２６において装置ハウジング１１０をボトルの底部１３０と接触又は隣接した状態に保つ。典型的には、ストラップは、弾性であるように提供され、したがって装置１０２をボトル底部１３０に向かって付勢する。
【００９３】
図１０には、装置ハウジングが、この実施形態では、突起１３２を有する表面１２２を形成するように形作られ得る手法が示される。突起１３２は、図７に示されるように、ボトルの底部１３０のくぼみ１３４内に位置するように形作られる。
【００９４】
代わりに、図１１に示すように、装置の位置付け手段は、単にハウジング１１０の平坦部分１２２であり得、容器１０４は、平坦部分１２２に置かれ、自立する。
【００９５】
他の実施形態では、装置は、他の機能を有する物品に組み込むことができ、図１２には冷却スリーブ１３６が示される。冷却スリーブ１３６内には、ボトル１０４が空洞１３８内に置かれると冷却することを可能にするための冷却手段が提供される。本発明によれば、冷却手段に更に加えて、スリーブからボトル１０４内に保持された液体１１２に電磁界を放出するために底部１４０及び／又は側壁１４２内に提供される、図１に関して記載したような構成要素も提供される。
【００９６】
図１３には、その中に氷及び水１４６を受け入れるための空洞１４４を有するアイスバケツ１４２が示され、更に、アイスバケツの底部１５０及び／又は壁１４８には、ボトル１０４が空洞内に保持されると、回路からボトル１０４内の液体に電磁界を生成することを可能にするための適切な回路が提供されている。
【００９７】
ここで、図１４ａ〜図１４ｄを参照すると、底部１５４と、ネック部分１５６と、液体が保持される空洞部分１５８とを有するグラス１５２の形態の容器が示される。再度、装置ハウジング１１０は、この場合に示すように、スリーブ１６０又はカラー１６２を含むいくつかの異なる形態で提供され得る。典型的には、装置と共に使用される特定の容器の種類を問わず、装置には、同じ構成要素が含まれ、一実施形態では、図１４ｂに示されるように、照明手段１６４は、グラスの一部に機能的効果と視覚装飾的効果との両方を提供する。
【００９８】
ここで、図１〜図１４ｄに関して本明細書中に記載する装置及び方法の使用の特定の実施例を提供する。
【実施例】
【００９９】
実施例１  −  典型的な家庭でのワイン発酵における酵母の増殖速度。
【０１００】
実験は、Ｈａｄｄｅｎｈａｍ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅにおいて２０１８年５月７日から２０１８年５月１４日まで行った。
【０１０１】
２つの市販のワインキットを得、同様に５リットルの細口大瓶に入れて用意及び開始した。提供された酵母を添加し、２つの培養物を３０フィート超離した。スマートフォンを細口大瓶の１つ（活性化サンプル）のグラスに立て掛けて置いた。スマートフォン、Ｇａｌａｘｙ  Ｓ４に、以下で詳述する特性を有するパルス電磁界を送達するパーソナルエリアネットワーク（ＰＡＮ）マイクロ波システム（商品名、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ）の制御を行うアプリを入れた。もう一方の細口大瓶は、そのままにして照射通常発酵（対照サンプル）に従うようにした。
【０１０２】
照射手順
【０１０３】
専門のアプリを活性化モードにしたスマートフォンを活性化細口大瓶の外側に対して置いた。制御アプリは、ＰＡＮを制御するために使用され、２．４ＧＨｚを１ミリ秒のパルスで１５Ｈｚのパルスレートにおいて提供する。スマートフォンは、２時間にわたって活性化モードのままとした。これを１２時間毎に（即ち２時間の活性化パルス照射）１週間にわたって繰り返した。
【０１０４】
細口大瓶を定期的に観察した。エアロックシステムを通る気泡速度から明らかなように、活性化細口大瓶内での二酸化炭素発生は、３日目において、平均で対照のものの２倍を超えることが分かった。
【０１０５】
３日目の気泡発生速度
【０１０６】
活性化細口大瓶：９気泡毎分
【０１０７】
対照細口大瓶：４気泡毎分
【０１０８】
１週間の終了時、澱（消費された酵母細胞）が観察され、対照細口大瓶と比較された。澱の深さから明らかなように、活性化サンプルにおいて大幅により多くの増殖が起こったことが分かった。
【０１０９】
活性化サンプル：澱の深さ１８０ｍｍ
【０１１０】
対照サンプル：澱の深さ８０ｍｍ
【０１１１】
酵母増殖の２２５％の増加は、代謝の増加、したがってアルコール及び二酸化炭素の生産性の増加を示す（上記の気泡発生速度によって明らかなように）。
【０１１２】
実施例２  生の、ボトル詰めされコンディショニングされたビール
【０１１３】
実験は、Ｈａｄｄｅｎｈａｍ  Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅにおいて２０１８年５月１０日から２０１８年５月１２日まで２日間にわたって行った。
【０１１４】
サンプルは、５００ｍｌのＳｔ  Ａｕｓｔｅｌｌ  Ｂｒｅｗｅｒｙ、「Ｐｒｏｐｅｒ  Ｊｏｂ」Ｉｎｄｉａ  Ｐａｌｅ  Ａｌｅ（生の、ボトル入りのコンディショニングされたビールであった、低温殺菌されていないため、パルス電磁界に応答することができる生きた酵母がボトル内に残っている。
【０１１５】
上記ビールの２つのボトルは、Ｔｈａｍｅ  Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅに所在のＷａｉｔｒｏｓｅの同じ棚から購入し、その後、Ｈａｄｄｅｎｈａｍに所在の施設において少なくとも３０フィート離し、活性化サンプルのみがスマートフォンからＰＥＭＦを受けることを確実とした。
【０１１６】
Ｇｏｏｇｌｅ  Ｐｌａｙストアから購入した適切なアプリを入れたＧａｌａｘｙ  Ｓ４スマートフォンを、アプリを活性化モードで起動させた状態で生ビールのボトルに対して置いた。これは、活性化サンプルであった。
【０１１７】
活性化サンプルは、上記のように、２日間にわたり１日２回、２時間にわたって処理した。
【０１１８】
スマートフォンから少なくとも３０フィートの距離を開けた同一ビールのもう一方のボトルは非処理のまま、即ちＰＥＭＦなしであった。これは、対照サンプルであった。
【０１１９】
２日後、ボトルを開け、大きいビールグラスに注ぎ、特性を観察した。その後、２つのビールをテイスティングし、官能的な差について評価した。
【０１２０】
活性化ビール：これは、大幅により多くの発泡性があるように見え、泡を落ち着かせるために注ぐのを中断しなければならなかった。グラス内にあるとき、ビールの上のガス泡は、８分間持続し、気泡は、２０分間継続的に上昇することが見られた。対照と比較すると、ビールの色は、琥珀色の色相で２シェード暗かった。
【０１２１】
テイスティングすると、このビールは、クリーミーでシルキーなテクスチャを有し、対照と比較して極めて味わい深いことが明らかであった。このビールは、対照と顕著に異なる余韻の長さ及び後味も有していた。以下を参照されたい。
【０１２２】
対照ビール：このビールは、泡がグラス内に一貫して保たれた状態で中断なく注ぐことができた。泡のヘッドは、２．５分以内に迅速に消失し、気泡は４分以内に止まった。
【０１２３】
テイスティングすると、対照ビールは、活性化サンプルのクリーミーでビロードのようなテクスチャが欠けており、口内で風味を伝える発泡の影響がより少なかった。活性化サンプルと比較すると後味が短く、風味の鮮明さに欠けていた。
【０１２４】
実施例３：スパークリングワイン（カヴァ及びシャンパン）
【０１２５】
実験は、Ｈａｄｄｅｎｈａｍ  Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅにおいて２０１８年５月１４日〜２０１８年５月２１日に行った。
【０１２６】
３ペアのスパークリングワインを、Ｔｈａｍｅ  Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅに所在のＷａｉｔｒｏｓｅから選択した。１ペアのＢｏｌｌｉｎｇｅｒシャンパン、１ペアのＧＨ  Ｍｕｍｍ  Ｃｏｒｄｏｎ  Ｒｏｕｇｅシャンパン及び１ペアのＷａｉｔｒｏｓｅ自社ブランドのカヴァであった。
【０１２７】
ペアは、各１つが活性化サンプルになるように離され、各同一ペアのもう一方の部分は、少なくとも３０フィート離された。
【０１２８】
活性化のための３つのボトルは、各ボトルがスマートフォンから等距離となるように、Ｇａｌａｘｙ  Ｓ４スマートフォンがこの３つの中央にある状態で一緒に置いた。スマートフォンには、実験前に適切なアプリケーションを入れた。このアプリは、起動させるとＰＡＮシステムの制御を行い、２．４ＧＨｚの１ミリ秒パルスを１５Ｈｚのパルスレートで送達する。
【０１２９】
アプリを起動させたスマートフォンを、実験の継続時間にわたり１日２回、上述のように活性化サンプル間に２時間にわたって置いた。７日間の処理後、ボトルをそれらの対照ペアと組み合わせ、テイスティング前に冷やした。
【０１３０】
スパークリングワインのテイスティングは、ワイン輸入業者Ｃｏｒｎｅｙ  ａｎｄ  Ｂａｒｒｏｗのヘッドテイスター（ヘッドノーズ（Ｈｅａｄ  Ｎｏｓｅ））により、１  Ｔｈｏｍａｓ  Ｍｏｏｒｅ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｌｏｎｄｏｎに所在の同社の施設にある同社のテイスティング室で実施された。
【０１３１】
テイスティングの結果：各スパークリングワインは、通常どおりに開けられたが、処理されたサンプルは、各場合において、開けた際、より大きく、より低い周波数の「低音の」ポンという音があったことに留意されたい。
【０１３２】
処理されたサンプルは、対照と比較してグラス内により多くの気泡を生じ、気泡は、グラス内にかなり長く持続した。「ノーズ」は、それぞれ「マウス（ｍｏｕｓｅ）」の劇的な向上についてコメントし、滑らかなシルクのようであると描写した。
【０１３３】
各「ノーズ」は、Ｂｏｌｌｉｎｇｅｒ、Ｍｕｍｍ及びＷａｉｔｒｏｓｅカヴァの各場合において飲酒経験の全体的な質が高まったとコメントした。
【０１３４】
他の実施形態では、モジュール９、２の上記配列は、製品が保持される容器の外部及び内部の両方において、例えば飲料業界においてクエン酸を生産するアスペルギルスなどの工業用製品発酵物の生産性の増加を選択的に誘発することができる。
【０１３５】
別の実施形態では、ＰＥＭＦを受ける製品細胞培養物又は発酵物は、遺伝子組換え生物である。この場合、必要な代謝製品は、組換え酵母又はモノクローナル抗体などの他のバイオ医薬品タンバク質、グルカゴン、成長ホルモン、ゴナドトロピンなどの他のホルモン、エリスロポエチン又はコロニー刺激因子などの造血因子からのインスリンであり得る。また、収率又は生産性を向上させるタンバク質は、インターフェロン、インターロイキン並びに因子ＶＩＩａ、因子ＶＩＩＩ及び因子ＩＸなどの血液因子を含むが、これらに限定されない。また、細胞培養によって製造される血栓溶解薬は、組織プラスミノゲン因子を含む。更に、本発明による生産性の増加を受けることができる他のバイオ医薬品製品は、Ｂ型肝炎又はインフルエンザ抗原などのワクチンである。
【０１３６】
電磁変調は、異なる周波数及び波形形状を有し得る。また、発酵及び培養微生物系における増殖を促進するのに十分な多くのパルス周波数が存在し得る。
【０１３７】
実際のところ、電磁周波数の使用は、法律によって管理されている。２．４ＧＨｚ周辺の帯域は、これが、２．４ＧＨｚの存在下で水が回転するような水の変調電界と誘電特性との良好なバランスを提供すると考えられることから選択されている。また、２．４ＧＨｚ及びその隣接する周波数は、ライセンス不要であり、国際政府によって工業界、科学界及び医療界による使用のために確保されている。いわゆるＩＳＭ帯域である。
【０１３８】
異なる実施形態では、パルスの継続時間、パルス周波数及び電磁周波数は、処理される製品培養に従って変えられ得、処理の継続時間は、数時間〜数日又は数週間で変えられ得、ＰＥＭＦへの暴露は、連続的であるか又は定期的に与えられ得る。
【０１３９】
ここで、図１５〜図１８ｃを参照すると、本発明の一実施形態による、対照の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の量と、ＰＥＭＦを使用して処理された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）との間の比較の結果がグラフで図示されている。
【０１４０】
まず、図１５を参照すると、図解は、６００ｎｍにおける光学濃度の測定値が、対照の発酵と、ＰＥＭＦを使用して処理された材料との間に有意差を何ら示さないことを示す一方、図１６は、２４時間のインキュベーション後に到達した乾燥細胞重量（グラム毎リットル（ｇ／Ｌ））の観点における最終細胞濃度が、対照の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の量よりもむしろ、ＰＥＭＦに暴露された材料において５７％増加したことを示す。
【０１４１】
図１７は、次いで、ｐＨに関して、ＰＥＭＦを使用して処理した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｐＨ値７．５９と比較して異なる開始ｐＨ６．６８を対照大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が有するにもかかわらず、両方の実験において、ｐＨ値は、７に制御され、ＰＥＭＦ発酵において、培養物の酸性化活性は、ＰＥＭＦに暴露されなかった大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と比べてはるかに強かったことを示す。制御システムは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の対照部分の６．５８に対して、ｐＨ値を十分に速く調節してｐＨを６．２０に減少させることができず、これは、ＰＥＭＦがより多くの有機酸の生産に関与していることを意味し得る。
【０１４２】
次いで、図１８ａに関して、生産され、培地に放出されたＣＯ2が、７４％と、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の対照部分よりも非常に高いため、ＰＥＭＦに暴露された材料の量に関して全体的により高い代謝活動がある。したがって、これは、ＰＥＭＦ条件下で細胞呼吸がより重要であることを意味し、結果的に、ギ酸塩及び酢酸塩などの二次代謝物の生産が起こり、これにより観測されたｐＨ値のより鋭い減少を説明することができる。
【０１４３】
図１８ｂは、ＰＥＭＦに暴露された材料において、ｐＨを上昇させるために発酵槽に移された塩基の総量が対照条件よりも多かったことを図示する。これは、バクテリアがＰＥＭＦ条件においてより多くの総酸を生産することを示唆する。
【０１４４】
次いで、図１８ｃでは、対照大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）材料において対数増殖期の全体を通して未確認の代謝中間体が生産され、これは、定常期後期まで継続する。しかしながら、ＰＥＭＦに暴露された材料では、この中間体は、消費される前、対数増殖期中の短時間にわたって出現するのみである。これは、ＰＥＭＦ条件における発酵が、中間体の形態での短期的なエネルギー貯蔵を必要としないことを示唆する。
【０１４５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、２つの有機酸である酢酸及びギ酸を発現する株であるため、この生物は、これらの化合物を明らかにより多く、約１５％発現している。この差は、統計的に有意である。この発現の増加が医薬品生産のために操作された株で繰り返されれば、有利な利益を得ることができることは、明らかである。
【０１４６】
ここで、図１９ａ〜図２５を参照すると、図１５〜図１８ｃに関するものと同じ試験が行われたが、この場合、酵母、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）材料に関連するものである。これらの結果に関して、ＰＥＭＦに暴露された材料は、対照量よりも速く増殖し、また対照量よりも先に増殖の指数関数期に入った。５時間の遅滞期後、ＰＥＭＦに暴露された発酵物は、６時間のインキュベーション後に指数関数期に入った。実際、この時点から開始して、より高いＯＤ値及びＤＣＷ値が記録された。対照材料及びＰＥＭＦ暴露材料の２５時間のインキュベーション後の最終細胞濃度は、同等であり、対照の発酵は、ＰＥＭＦ刺激下の材料に最終的に追いついたことを意味し得るが、これらの結果は、ＰＥＭＦ暴露を使用するとより速いスループットが可能であり、少なくとも同じレベルの発酵が、ＰＥＭＦに暴露されていない材料と比べてより迅速に達成されることを示していない。
【０１４７】
次いで、図２０に示されるｐＨ値に関して、ＰＥＭＦ発酵において、培養物の酸性化活性は、対照の材料よりも３０分〜１時間先に開始される。したがって、この場合にも、発酵のより速いスループットという潜在的利点が存在し得る。
【０１４８】
図２１及び細胞呼吸に関して、ＣＥＯ変換率（ＣＴＲ）は、ＰＥＭＦ刺激下で細胞がより先に増殖の便宜的期に入ったことに起因し得る全体的な最大細胞呼吸により早く到達したが、全体的な細胞呼吸に有意差がなかったことを示した。したがって、結論として、図１９ａ〜図２１に関して、より速いスループット速度は、達成される発酵の最終レベルに悪影響を及ぼすことなく達成され得ることが示される。その結果、ある使用では、酵母は、より多くの量のエタノールをより短時間で産生し、それにより商業用及び工業用ベースで生産性レートの増加を提供する。
【０１４９】
図２２並びに図２３ａ及び図２３ｂは、ＰＥＭＦ条件においてＳ．セレビシエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の増殖速度、呼吸及び酸生産が対照条件よりも先に増加することを図示する。これは、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）がＰＥＭＦ条件においてより先に対数増殖期、したがって生産期に到達することを示唆する。
【０１５０】
ＰＥＭＦを使用した処理により達成された発酵の著しい差は、より高濃度のアルコールが生産されることを示すものであり、特定の例では、ＰＥＭＦに暴露されていない材料よりも、発酵プロセスのより先の段階でこの材料による最大アルコール生産に到達すると考えられる。
【０１５１】
図２４に関して、対照材料及び条件において、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）培養物は、発酵プロセスの全体を通してかなり一定の量の未確認代謝中間体を含有することが図示される。しかしながら、ＰＥＭＦ条件に暴露された材料では、この中間体は、早期対数増殖期に完全に消失して、対数増殖期の後期にのみ再出現し、中間体が何らかの手法で費やされるものの、後に再び生産されることを示唆する。
【０１５２】
図２５に関して、ＰＥＭＦに対する材料の暴露が図示されており、この材料は、対照材料と比べて発酵のかなり後でエタノールを生産していることが示されている。しかしながら、発酵のより後期におけるエタノールの濃度は、生産の遅延にもかかわらず、ＰＥＭＦ条件に暴露された材料においてより高く、これは、ＰＥＭＦの使用がこの株におけるアルコールの生産に顕著な効果を及ぼしたことを示唆する。
【０１５３】
結果は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びセレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に関連して実施された試験によるものであるが、例えば、哺乳類の細胞培養物などの他の培養物を使用することができることが認識されるべきである。哺乳類の細胞培養物は、完全に好気性であるため、これらの培養物による結果は、これを超えるかは分からないにしても、上記で開示したものと等しく発明的かつ新規なものとなるであろうと考えられる。
【０１５４】
したがって、要約すると、試験結果は、対照量と比較して、ＰＥＦＭシステムの適用によって５７％多い重量の培養物が生産され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の代謝活動が７４％多いという観点における、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による驚くほど有益なデータを示す。酵母に関して、ＰＥＦＭを使用して処理された材料は、大幅により早く指数関数期に入り、バイオエタノール生産における全体的なバッチサイクルタイムが減少する可能性がある。
【０１５５】
この実施形態では、本発明による装置及び方法は、酵母がアルコールの生産を始める前であり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が一定の好気性条件下にある好気性条件下において特に有効である。多くのバイオ薬品は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から発現されるため、これは、医薬品生産において大きい利点を有する可能性がある。
【０１５６】
したがって、ＰＥＭＦ技術の使用は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の代謝活動を増加し、サッコロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈｏｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアルコール生産速度を増加し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びＳ．セレビシエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の代謝中間体の生産に有利に影響する。
【０１５７】
本発明の使用の更なる実施形態及び例は、哺乳類の細胞培養物に対するパルス電磁界（ＰＥＭＦ）パターンの使用である。本発明によれば、ＰＥＭＦ技術をガラス製撹拌タンクバイオリアクターと共に使用して、従来の細胞培養フラスコ及びＳＴＲ内で予め増殖させたＩｇＧ発現ハイブリドーマ細胞系からＩｇＧサブクラス２（ＩｇＧ２）を産生し、透析及び濃縮後のＩｇＧの収率は、それぞれおよそ３０〜５０μｇ／ｍＬ及び１３０μｇ／ｍＬの領域であった。
【０１５８】
この試験の目的は、ＰＥＭＦが哺乳類の細胞代謝、特にＩｇＧ産生の増加に関して影響を及ぼすかどうかを評価すること及びＳＴＲでのＩｇＧ発現細胞系の育成が競争力の高いＩｇＧの収率（目標３００〜５００μｇ／ｍＬ）につながり得るかどうかを評価することであり、２つの別々の実験を実施した。
【０１５９】
１．第１の実験の目的は、あらゆる周囲ＰＥＭＦなしに増殖させたベンチトップ１Ｌ細胞培養物の４倍化を果たすことであった（ネガティブコントロール実験）。この実験中、ＳＴＲ内の細胞系を増殖させるためのパラメータセットは、文献の精査、機器供給業者の助言、テストラン及び細胞系に関する内部知識を使用して決定された。
【０１６０】
２．第２の実験の目的は、ＰＥＭＦの存在下で増殖させたベンチトップ１Ｌ細胞培養物の４倍化を果たすことであった（試験実験）。この実験中、前に到達した収率を問わず、目的１で事前に決定されたものと同じパラメータセットが再度使用された。
【０１６１】
プロトコルでは、以下のパラメータが使用された。
【０１６２】
１．７．５％の炭酸水素ナトリウム及びＣＯ２を使用してｐＨを制御し、ｐＨを７〜８に維持する。
【０１６３】
２．ガス流量を３Ｌ／ｈに設定してバイオリアクターの流量偏差を最小限にし、実験の再現性を向上させる。
【０１６４】
３．ＰＥＭＦラン中に４つのバイオリアクターの１つにそれぞれ直接取り付けられる４つのＰＥＭＦモジュールを実装する。
【０１６５】
４．空気を使用してＤＯを制御し、４０％の最低溶存酸素濃度を維持する。
【０１６６】
試験では、ＰＥＭＦ装置配置は、固有のＰＥＭＦパターンを放出する４つのモジュールであった。対照条件について、ＰＥＭＦ装置は、使用されず、他の全てのＰＥＭＦ／Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈデバイスは、オフにされ、細胞培養の全体を通してラボから除去された。実験条件について、他の全てのＰＥＭＦ／Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈデバイスがラボから出されている間、４つのＰＥＭＦ装置モジュールのそれぞれは、ガラス製撹拌タンクバイオリアクター（ＳＴＲ）の１つと直接接触して置かれ、オンにされ、細胞培養の全体を通してオンの状態を継続させた。細胞培養は、オンラインガス分析器、オンライン及びオフラインｐＨモニタリング、オフライン細胞計数測定及びＩｇＧ産生のＨＰＬＣ分析を使用して監視された。マウスハイブリドーマ細胞系及び培地は、Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｍｐａｎｙにより、予め混合された状態で１Ｌの無菌ボトルにおいて提供された。培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、低ＩｇＧウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とから構成されたものである。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、リアクター内での発泡を減少させるために１：１００の希釈で添加した。培地組成に関する更なる情報については、添付を参照されたい。
【０１６７】
細胞培養をそれぞれセットする前に、ＤＡＳＧＩＰリアクターは、接種の前日にオートクレーブ処理された。リアクターは、無菌性を維持するために定期的な紫外線処理を伴い、層流フード内で一晩保管した。
【０１６８】
対照ラン：マウスハイブリドーマ細胞の前培養物は、Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｍｐａｎｙによって調製され、３．５×１０5細胞／ｍＬの濃度、６４．８％の細胞生存率で４×１Ｌボトルの培地（上記のように）に分割された。
【０１６９】
ＰＥＭＦラン：マウスハイブリドーマ細胞の前培養物は、４．８７×１０5細胞／ｍＬの濃度、７７％の細胞生存率で４×１Ｌボトルの培地（上記のように）に分割された。
【０１７０】
これらは、ＦｌｅｘＢｉｏに即座に運搬され、そこで、１Ｌの前培養物は、ピッチブレードインペラを備えたＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＤＡＳＧＩＰパラレルバイオリアクターシステムの各リアクター内に置かれた。
【０１７１】
表１  各ランにおいて4つのリアクターの対照で使用した条件。
【表１】
2021526852.tif 000003
表２に明記されるサンプル点で各発酵槽から７ｍＬのサンプルを採取した。
【０１７２】
表２  このレポートでは、接種の終了から各サンプル点の開始までの時間について記載する。サンプル時間は、結果セクションの全体を通して最も近い日に四捨五入されている。
【表２】
2021526852.tif 000004
【０１７３】
Ｐｕｌｓａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用する細胞培養について、４つのＰＥＭＦデバイスは、１つのデバイスを４つのガラス製ＤＡＳＧＩＰリアクターのそれぞれに取り付けることによりセットアップされ、オンにされた。これらは、細胞培養ランの全体を通してオンにされ、プラグに差し込まれたままであった。残念ながら、１つのバイオリアクターは、動作セッティングにおける障害が原因で停止させた。
【０１７４】
以下のパラメータを分析した。
【０１７５】
オフラインｐＨは、ＨＡＮＮＡ  ＨＩ８４２４  ｐＨ計（Ｈａｎｎａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して測定した。
【０１７６】
２ｍＬのサンプルを１５ｍＬのファルコンチューブに移し、プローブをチューブ内の液体線の下まで挿入した。これは、急速なＣＯ２脱気、したがってサンプルのｐＨへの影響を減少させるために、リアクターからサンプルを取り出してから２分以内に行った。
【０１７７】
増殖速度は、残った未濾過のサンプルを使用し、５０μＬを、５０μＬのトリパンブルー（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を収容するＥｐｐｅｎｄｏｒｆに移すことにより測定した。サンプルは、緩やかに上下にピペット操作することにより染色剤と混合した。染色されたサンプルは、細胞計数スライド（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に適用し、細胞は、自動化されたＮｅｘｃｅｌｏｍ  Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して計数した。
【０１７８】
この手順から以下の情報が記録された。
【０１７９】
・総細胞計数（細胞／ｍＬ）
【０１８０】
・生細胞計数（細胞／ｍＬ）
【０１８１】
・生細胞／死細胞の割合
【０１８２】
・平均細胞径（μｍ）
【０１８３】
・生存率（％）
【０１８４】
グルコース濃度は、０．２２μｍで濾過して全ての細胞を除去したサンプルの残り及び市販のグルコースメーター（Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋ  Ｍｏｂｉｌｅ）を使用することにより測定し、製造業者の指示に従い、１０μＬの濾過されたサンプルをストリップ上に移し、表示された値を記録した。
【０１８５】
モノクローナル抗体の濃度は、ある量のサンプルを−２０℃で貯蔵し、後に無菌条件下で解凍することにより測定した。
【０１８６】
ＩｇＧ濃度を決定するために、イオン排除クロマトグラフィーを使用して上清サンプルを分析した。
【０１８７】
ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ  １２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ
【０１８８】
カラム：Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｏｒｏｓ  Ａ２０。バッファＡ：５０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭＮａＣｌ
【０１８９】
バッファＢ：１２ｍＭ塩酸、１５０ｍＭＮａＣｌ。溶出：勾配溶出（表３）
【０１９０】
注入量：２０μＬ
【０１９１】
測定：２８０ｎｍ及び２１４ｎｍにおける吸光度
【０１９２】
標準２：正常マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、１２−３７１）（標準曲線が生成される）
【０１９３】
表３  ＩｇＧ分析で使用した勾配溶出の概要。
【表３】
2021526852.tif 000005
【０１９４】
統計的分析
【０１９５】
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（２０１６）を使用して、グラフ生成、データ分布及び統計的分析を実施した。スチューデントのｔ検定を使用して実験を分析し、独立サンプルデータを比較した。統計的有意性は、Ｐ＜０．０５の場合に達成された。全ての統計的分析は、対照群の４つの独立生物学的複製物（ｎ＝４）及び処理群の３つの独立生物学的複製物（ｎ＝３）から得られたデータを使用して行った。エラーバーは、サンプル群の標準偏差を示す。
【０１９６】
結果の分析により、増殖速度及び代謝活動に関して、ＰＥＭＦに暴露された細胞培養物の平均総細胞計数は、細胞がＰＥＭＦデバイスなしで培養された場合（対照培養物）に記録された平均値よりも高いことが明らかになった（図３０）。４日の増殖後、ＰＥＭＦ処理細胞及び非処理細胞間に有意差（ｐ＝０．０４８）があった（図３０）。ＰＥＭＦ暴露培養物が６．０６×１０６細胞／ｍＬの平均総細胞計数に到達したのと比較して、対照バイオリアクターは、接種後６日で１．４４×１０６細胞／ｍＬの最大平均総細胞計数に到達した（図３０）。４日の増殖後、処理された培養物の平均総細胞数は、対照よりも高いままであったが、有意差は、記録されなかった（ｐ＞０．３５）（図３０）。
【０１９７】
０日目〜２日目において、ＰＥＭＦ暴露培養物の平均総生細胞数は、対照培養物と比較して高かったが、この差は、有意ではなかった（ｐ＞０．１２２）。３日の増殖後、対照培養物と比較して、ＰＥＭＦ処理培養物に有意により高い数の生細胞が存在した（ｐ＝０．００９）（図３０）。３日の増殖後、ＰＥＭＦ暴露培養物の平均総生細胞数は、減少した一方、対照培養物の生細胞の数は、わずかに増加し続けた（図３０）。
【０１９８】
両方のランにおいて、グルコース消費は、同じパターンに従っており、グルコースは、接種後１〜３日目に急速に消費され、その後、採取まで比較的一定のままである（図３１）。有意とは見なされない（ｐ＞０．０５）が、１日目〜３日目において、ＰＥＭＦ処理細胞のグルコース濃度は、対照培養物のグルコース濃度よりも一貫して低かった（図３１）。
【０１９９】
ＰＥＭＦ処理細胞培地におけるグルコースの濃度がより低いことは、この培養物におけるグルコース消費が対照培養物と比較してより高速度であることを示唆し得る。これは、上で言及したように、ＰＥＭＦ暴露細胞で観察されたより高い細胞計数に直接関連している可能性がある（図３０）。したがって、ＰＥＭＦは、（細胞分裂に必要な）より高速度の細胞呼吸を示し得るより高速度のグルコース消費を誘発したとの仮説を立てることができる。しかしながら、この仮定が正しいかどうかを決定するためには、更なる研究を行わなければならないであろう。
【０２００】
先行研究（ＥＣＯ−４１０）の結果は、細胞培養培地の酸性度に対する乳酸産生の影響を相殺するためにより厳重なｐＨ制御が必須であることを示している。本研究中、培養物のｐＨは、ＣＯ２及び７．５％炭酸水素ナトリウムを使用して制御し、ｐＨが７．３〜７．８の範囲内に留まることを確実にした（図３２）。ＰＥＭＦ処理培養物及び非処理培養物の両方のｐＨは、図３２に示すように、実験的ランの全体を通してかなり安定したままであった。
【０２０１】
ＰＥＭＦ暴露細胞の酸素摂取は、対照と比較してわずかに速い速度で起こり、ＰＥＭＦ暴露培養物は、３．５日以内にその最低溶存酸素率（６．７％）に到達した対照培養物と比較して、３日以内にその最低溶存酸素率（１０．５％）に到達した（図３３）。先行研究に記載されているように、好気性呼吸中（酸素の存在下）、グルコースは、異化し、溶存酸素は、培地から取り込まれ、ＡＴＰを生成するために電子伝達系で利用される。細胞は、その指数関数期に入ると急速に分裂して多くのＡＴＰを生成及び利用する。酸素レベルが低すぎる場合、細胞は、酸化的リン酸化から乳酸発酵に切り替え、細胞分裂は、停止する一方、溶存酸素率（ＤＯ）は、再度上昇する。本研究では、ＰＥＭＦ暴露細胞において、溶存酸素の消費は、グルコース消費及び総細胞計数と同様に、３日目までが最も急激であった（図３０、図３１、図３３）。したがって、総合的に解釈すると、データは、より高い細胞の代謝活動がＰＥＭＦによって実際に誘発されたことを示唆しているように思われる。
【０２０２】
細胞培養ラン中のエアフローは、対照培養物と比較してＰＥＭＦ暴露培養物においてより高い比率で増加し、それぞれ２．５日の増殖と比較してほぼ２日以内の増殖でその最大流量（３ｓＬ／ｈ）に到達した（図３３）。両方の実験的ラン中の溶存酸素率の減少は、細胞が酸素を、培地に導入され得る速度よりも速い速度で取り込んでいたことを示唆する（図３３）。
【０２０３】
ランの全体を通して３ｓＬ／ｈの総ガス流量を維持することで、システムにより多くの空気を送り込むことが可能である。
【０２０４】
ＤＡＳＧＩＰバイオリアクターシステムは、実験的ランの継続時間にわたって４つのバイオリアクターのそれぞれに最大３つの異なるガス（又はガス組成物）を導入することを可能にする。この研究中、３つの別々のガスは、二酸化炭素（ＣＯ２）、窒素（Ｎ２）及び空気混合物（約２１％の酸素、７８％の窒素、０．０４％のＣＯ２）であった。ガス流量は、３ｓＬ／ｈに設定され、これは、図３４に「総最大流量」として示される３つのガスの全ての合計流量が常に３ｓＬ／ｈに等しくなければならないことを意味する。この研究では、所望のガス流量を維持するために不活性ガスとして窒素を利用した（図３４）。実験的ランの開始時、細胞は、培地からの酸素を低速度で利用しており、したがって、システムに入るＮ２と空気の比率は、かなり等しかった（図３４）。ランが継続し、培養物の酸素必要量が増加するにつれて、総ガス混合物中の空気の比率が最大限度（３ｓＬ／ｈ）まで増加し、ｐＨ制御のために、ＣＯ２は、少量が配分され、Ｎ２は、ほとんど配分されない（図３４）。細胞が嫌気性呼吸に入ると、グルコース濃度が枯渇して細胞の分裂が停止し、嫌気性発酵代謝に切り替わる。上で説明したように、Ｏ２の必要性が減少し、システムに入る空気の量の減少につながる。これは、総ガス流量が３ｓＬ／ｈに近いままであることを確実にするように、窒素の量を増加させることにより補償される（図３４）。
【０２０５】
塩基添加の開始は、対照培養物と比較してＰＥＭＦ処理培養物において先に行われ、それぞれほぼ６８時間（３日）と比較して接種後ほぼ５７．５時間（２．５日）である（図３５）。非処理細胞と比較してＰＥＭＦ処理細胞により多くの塩基が添加され、それぞれ１４．２ｍＬと比較して１５．２ｍＬである（図３５）。より先の添加及びより多い塩基総量は、ＰＥＭＦ暴露培養物中の細胞が、対照培養物と比較して、細胞培養ランでより先により高い濃度で乳酸を産生していたことを強く示唆する。より高速度の酸素摂取及びグルコース消費と矛盾せず、これは、ＰＥＭＦ暴露培養物内の細胞が酸素を速い速度で利用し、対照培養物内の細胞より前に乳酸発酵に入っていることを示し得る（図３１、図３３及び図３５）。
【０２０６】
上記のように、ＰＥＭＦが代謝を最大化することに基づき、グルコース摂取は、増殖の第１期中に最大化された一方、乳酸産生もＰＥＭＦ暴露条件時に最終的に最大化された。実際、細胞は、ｐＨ制御環境内における電磁界のバイオスティミュレーション下において、細胞がＰＥＭＦに暴露された場合にエタノール生産（また嫌気性発酵による副産物）が２０％高かったＳ．セレビシエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（同じく真核細胞）と同様に、より高い濃度の乳酸（嫌気性条件中に生成される副産化合物）を産生し得る。
【０２０７】
ハイブリドーマ細胞の総細胞密度は、増殖の第１期中（接種からグルコース枯渇まで）において、対照培養物と比較した場合、ＰＥＭＦ暴露培養物でより高くなることが示された。生細胞計数も同じ期間でＰＥＭＦ処理培養物においてより多いことが分かった。グルコース代謝速度も、ＰＥＭＦに暴露された細胞において増加し、これは、ＰＥＭＦ装置及びその使用が、栄養素摂取を刺激し、最大化することにより、マウスハイブリドーマ細胞の増殖及び代謝にプラスの影響を与えることを示し得る。
【０２０８】
対照細胞及びＰＥＭＦ暴露細胞の両方において、細胞は、指数関数的増殖中に倍増し、したがってより高い酸素需要を必要とする。これは、ＤＯレベルの低下で観察される。具体的には、ＰＥＭＦ暴露細胞は、より強くかつ速い増殖を示し、これは、より高いグルコース摂取で裏付けられる。これは、対照細胞よりも先に酸素制限条件を達成すること、したがって乳酸産生も先に誘発することにつながった。また、ＰＥＭＦ暴露細胞は、ｐＨ７．４に制御された環境において、対照培養物よりも高い濃度の乳酸（より多い塩基添加によって間接的に観察された）を産生することができるようであった。乳酸は、ＩｇＧ産生に対して抑制的であり、ＰＥＭＦ暴露細胞でより低いレベルのＩｇＧが記録された。
【０２０９】
ＤＯ制御は、撹拌バイオリアクター内でのマウスハイブリドーマの細胞培養において最大の増殖速度を確実にし、乳酸産生の誘発を防ぐための因子である。加えて、この実験はまた、ＰＥＭＦが乳酸の産生を刺激し、同様にグルコースの消費を刺激する（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で以前に同様の現象が観察されたように）可能性を上昇させた。溶存酸素レベルは、一定かつ高いままとすべきである（ＤＯ＞４０％）。これを達成するために、この特定の細胞系では、ガス流量を０．０５ｖｖｍから０．１ｖｖｍ（１Ｌの作業容積で６Ｌ／ｈ）に増加させること及び／又は酸素供給ガスとして圧縮空気の代わりに純酸素圧縮ガスのみを使用することが推奨される。これにより、細胞培養の全体を通して高レベルの酸素が維持されることが確実になり、乳酸の産生を防ぐはずである。
【０２１０】
したがって、哺乳類の細胞培養に関連する方法及び装置の使用に関して、モジュールを使用し、製品に対して３日の期間にわたりＰＥＭＦを生成すると、ＩｇＧの濃度及び収率を維持する一方、３日目における２７％高い細胞増殖の加速に見られたように、代謝速度の増加を誘発することが示される。ＰＥＭＦの使用以外の全ての細胞及び条件は、同一であるため、これは、顕著な利点である。そのため、本発明による方法及び装置の使用は、細胞毎の発現レベルの増加により示されるように、より大きい代謝活動を誘発し、細胞分裂の３０％近辺の顕著な加速によって細胞代謝が増加し、ＩｇＧの細胞発現の２５％近辺の顕著な増加を示し、そのため、全体的に場合により６０％超の生産性の増大がある（３０％多くの細胞が１つの細胞毎に２５％多く産生する）ことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１４ｄ】
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【図１５】
2021526852.tif 000023
【図１６】
2021526852.tif 000024
【図１７】
2021526852.tif 000025
【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
2021526852.tif 000027
【図１８ｃ】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
2021526852.tif 000030
【図２０】
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【図２１】
2021526852.tif 000032
【図２２】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【国際調査報告】
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