(57)【要約】本明細書は、非アゴニストリガンド、特に抗体の使用に関する。詳細には、ＧＭ−ＣＳＦまたはＣＤ１１６、ＣＤ１３１、もしくはＣＤ１１６とＣＤ１３１とを含むＧＭ−ＣＳＦ受容体のいずれかに特異的に結合する非アゴニストリガンドであって、ａｌｌｏ−ＨＣＴを受けた患者における白血病の治療、または免疫学的に非同一のドナーからの造血細胞移植の結果として生じる他の合併症の治療における使用のためのものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植片対宿主病、および／または血液悪性腫瘍に罹患しているか、または罹患の危険性がある患者を治療する方法であって、
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、またはＣＤ１１６、ＣＤ１３１もしくはＣＤ１１６とＣＤ１３１とを含む顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体のうちの少なくとも１つに特異的に結合する非アゴニストリガンドを患者に投与するステップを含み、
それにより、移植片対宿主病の発生を治療および／または抑制し、および／または血液悪性腫瘍を治療する方法。
【請求項２】
前記患者が同種移植を受けている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記同種移植が同種造血幹細胞移植である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記血液悪性腫瘍が白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫である、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記白血病が、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病および急性単球性白血病を含む群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記リンパ腫がホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記リガンドが抗体、抗体フラグメント、アプタマーまたは抗体様分子である、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記リガンドがヒト抗体またはヒト化抗体であり、特に前記リガンドが中和性ヒト抗体または中和性ヒト化抗体である、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記リガンドが、マヴリリムマブ、ナミルマブ、レンジルマブ、オチリマブ、およびギムシルマブを含む群から選択される、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記リガンドの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、またはＣＤ１１６、ＣＤ１３１もしくはＣＤ１１６およびＣＤ１３１を含む顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体のいずれかへの結合が、１０−７ｍｏｌＬ−１よりも小さいＫＤを有し、とりわけ、１０−８ｍｏｌＬ−１よりも小さいか、または１０−９ｍｏｌＬ−１よりも小さいＫＤを有することを特徴とする、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記リガンドが、前記患者に投与された核酸によってエンコードされるポリペプチドである、請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
同種移植を必要とする患者を治療し、関連する移植片対宿主病の発症を抑制または重症化を軽減する方法であって、
前記患者に同種移植を行うステップと、
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子に特異的に結合する非アゴニストリガンド、またはＣＤ１１６、ＣＤ１３１もしくはＣＤ１１６とＣＤ１３１とを含む顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体の少なくとも１つを患者に投与するステップにより、前記移植片対宿主病の発症を阻害したり、重症度を低下させたりする方法。
【請求項１３】
前記同種移植が同種造血幹細胞移植であり、前記同種造血幹細胞移植が、血液悪性腫瘍の治療において前記患者に提供される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記リガンドが、前記同種移植と同時にまたはその後に患者に提供される、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記血液悪性腫瘍が、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病および急性単球性白血病を含む群から選択される白血病である、請求項１２から請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記リガンドが抗体、抗体フラグメント、アプタマーまたは抗体様分子である、請求項１２から請求項１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記リガンドが、マヴリリムマブ、ナミルマブ、レンジルマブ、オチリマブ、およびギムシルマブを含む群から選択される、請求項１２から請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、またはＣＤ１１６、ＣＤ１３１もしくはＣＤ１１６とＣＤ１３１とを含む顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体の少なくとも１つに特異的に結合する非アゴニストポリペプチドリガンドであって、同種造血幹細胞移植を受けた患者の血液悪性腫瘍の治療に使用するための、非アゴニストポリペプチドリガンド。
【請求項１９】
請求項１８に記載の同種造血幹細胞移植を受けた患者の血液悪性腫瘍の治療に使用するためのリガンドであって、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、またはＣＤ１１６、ＣＤ１３１、もしくはＣＤ１１６とＣＤ１３１とを含む前記顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体のいずれかの生理学的機能を中和する抗体、抗体フラグメント、アプタマーまたは抗体様分子である、リガンド。
【請求項２０】
請求項１８または請求項１９に記載の同種造血幹細胞移植を受けた患者の血液悪性腫瘍の治療に使用するためのリガンドであって、前記リガンドがヒト抗体またはヒト化抗体であり、特に中和ヒト抗体または中和ヒト化抗体である、リガンド。
【請求項２１】
上記の請求項１８から請求項２０のいずれか１項に記載の種造血幹細胞移植を受けた患者の血液悪性腫瘍の治療に使用するためのリガンドであって、マヴリリムマブ、ナミルマブ、レンジルマブ、オチリマブ、およびギムシルマブから選択される、リガンド。
【請求項２２】
上記の請求項のいずれか１項に記載の同種造血幹細胞移植を受けた患者の血液悪性腫瘍の治療に使用するためのリガンドであって、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、またはＣＤ１１６、ＣＤ１３１、もしくはＣＤ１１６とＣＤ１３１とを含む前記顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体のいずれかへの結合が、ＫＤ＜１０−７ｍｏｌＬ−１であり、特にＫＤ＜１０−８ｍｏｌＬ−１であって、より具体的にはＫＤ＜１０−９ｍｏｌＬ−１であることを特徴とする、リガンド。
【請求項２３】
同種造血幹細胞移植を受けた患者における血液悪性腫瘍の治療に使用するための、上記の請求項１８から請求項２２のいずれか１項に記載のリガンドをコードする核酸分子。
【請求項２４】
請求項２３に記載の同種造血幹細胞移植を受けた患者の血液悪性腫瘍の治療に使用するための核酸分子であって、前記核酸分子がＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である、核酸分子。
【請求項２５】
同種造血幹細胞移植を受けた患者の血液悪性腫瘍の治療に使用するための、請求項２３または２４に記載の核酸分子を含む、核酸発現構築物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の同種造血幹細胞移植を受けた患者の血液悪性腫瘍の治療に使用するための核酸発現構築物であって、前記発現構築物が、ＤＮＡプラスミド、二本鎖リニアＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよびウイルスであって、特にレンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスから選択される、核酸発現構築物。
【請求項２７】
同種造血幹細胞移植を受けた患者の血液悪性腫瘍の治療に使用するための医薬組成物であって、上記の請求項１８から請求項２２までのいずれか１項に記載のリガンド、請求項２３から請求項２４までのいずれか１項に記載の核酸分子、または請求項２５から請求項２６までのいずれか１項に記載の核酸発現構築物と、薬学的に許容される担体、特に非経口投与用の投与形態、特に静脈内投与用の投与形態として製剤化された担体とを含む、医薬組成物。
【請求項２８】
同種造血幹細胞移植の結果として生じる合併症の治療のために使用される、上記の請求項１８から請求項２２までのいずれか１項に記載のリガンド、請求項２３から請求項２４までのいずれか１項に記載の核酸分子、または請求項２５から請求項２６までのいずれか１項に記載の核酸発現構築物。
【請求項２９】
前記請求項１８から請求項２２までのいずれか１項に記載のリガンド、請求項２３から請求項２４までのいずれか１項に記載の核酸分子、または前記血液悪性腫瘍が白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫である請求項２５から請求項２６までのいずれか１項に記載の核酸発現構築物。
【請求項３０】
前記請求項１８から請求項２２までのいずれか１項に記載のリガンド、請求項２３から請求項２４までのいずれか１項に記載の核酸分子、または前記血液悪性腫瘍が、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、急性単球性白血病、またはホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫から選択される請求項２５から請求項２６までのいずれか１項に記載の核酸発現構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
２０１８年２月２２日出願のヨーロッパ特許出願第１８１５８１６９．５号明細書、２０１８年８月１７日出願のヨーロッパ特許出願第１８１８９５６２．４号明細書、２０１８年９月１４日出願のヨーロッパ特許出願第１８１９４５４９．４号明細書、および米国特許第１６／２６９，５７２号明細書の利益を主張しており、それらの出願の全開示は、引用を以って本明細書の一部となす。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、ａｌｌｏ−ＨＣＴを受けた患者の血液悪性腫瘍の治療に使用するための、ＧＭ−ＣＳＦ（ＣＳＦ−２）またはＣＳＦ２ＲＰ（ＣＤ１３１）およびＣＳＦ２Ｒａ（ＣＤ１１６）を含む受容体複合体に特異的に結合する非アゴニストリガンド、特に抗体に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
血液悪性腫瘍を患っている患者にとって、同種造血細胞移植（ａｌｌｏ−ＨＣＴ）は治癒と救命の可能性がある治療法である。一方で、全患者の４０〜６０％は臨床的に重大な急性または慢性の移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を発症し、これらを合わせると約５０％の死亡率となる。ドナー由来のＴ細胞は以下の両プロセスを媒介する。移植片からのａｌｌｏ反応性Ｔ細胞は宿主の悪性細胞を攻撃し、有益な移植片対腫瘍効果（ＧｖＬ）をもたらす。一方、このａｌｌｏ反応性Ｔ細胞は健康な組織（典型的には皮膚、腸、肝臓）を標的とする可能性があり、ＧｖＨＤをもたらす。ａｌｌｏ−ＨＣＴの前にドナー材料からＴ細胞を枯渇させることは、ＧｖＨＤを予防／減少させることができるが、移植片対腫瘍効果（ＧｖＬ）活動の低下と再発率の増加という犠牲が伴う。したがって、ＧｖＬとＧｖＨＤのメカニズムをＴ細胞レベルで分離し、臨床的利益のためにどのように変調させることができるのかを理解することが急務となっている。
【０００４】
多くの研究では、マウスモデルにおいてＧｖＨＤを支える主要なＴ細胞サブセットとサイトカインの定義を試みてきたが、これまでのところ一貫した結論はほとんど得られていない。ＧｖＨＤはもともとＴＨ１が介在する病態であると提案されていたが、マウスを用いた研究により、ＴＨ１サイトカインＩＦＮｙを欠損したドナーＴ細胞が疾患を悪化させることが明らかになった。ＴＨ２細胞は、実験的なＧｖＨＤを抑制し、肝臓や皮膚に影響を与えるＧｖＨＤを誘発する。同様に、ＩＬ−１７Ａ産生Ｔ細胞が炎症性疾患全般における組織損傷の顕著な媒介であるという証拠がある一方で、ＧｖＨＤにおけるＩＬ−１７の役割については、マウスモデルでは、実験条件に応じて、ＧｖＨＤを促進または改善することができるように思われるため、論争の的となっている。このように、分極したＴＨ細胞はＧｖＨＤの発生と永続化に明らかに関係しているが、これまでのところ、マウスモデルでもヒトでも、この疾患の発症に再現性があり、かつ重複しない機能を持つ特定の可溶性メディエーターを同定することはできなかった。上述の技術水準に基づいて、本発明の目的は、有益なＧｖＬ効果を維持しながらＧｖＨＤを減衰させるための手段および方法を提供することである。この目的は、本明細書の独立請求項の主題によって達成される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第１の態様は、同種移植を受けた患者において、移植片対宿主病に罹患している患者を治療する方法、または移植片対宿主病の発生を予防、抑制、または重症度を低下させる方法に関する。本発明の第２の態様は、がん、特に血液悪性腫瘍に罹患している患者を治療する方法であって、同種造血幹細胞移植（ａｌｌｏ−ＨＣＴ）を受けた患者を治療する方法に関する。本発明の任意の局面に従った方法は、ＧｖＨＤを誘発する免疫サイトカインＧＭ−ＣＳＦの信号伝達を妨害するステップを含む。これは、リガンド、特に抗体、より具体的には中和抗体によってＧＭ−ＣＳＦを阻害することで達成することができる。本発明の目的はまた、ＧＭ−ＣＳＦがその天然の受容体に結合することを妨害するステップによって、またはこれらの受容体に非アゴニストリガンドを投与するステップ、特にＧＭ−ＣＳＦ受容体に対する中和抗体を投与するステップを経て信号カスケードを阻害するステップによっても達成することができる。他の考えられるメカニズムは、核酸干渉（ＲＮＡｉ、アンチセンス）によって、ＧＭ−ＣＳＦまたはその受容体のいずれかの発現を、一過性またはより長い期間にわたって抑制することである。特定の実施形態では、本発明は、非アゴニストリガンド、特に抗体、より具体的には、ＧＭ−ＣＳＦまたはＣＤ１１６、ＣＤ１３１、およびＣＤ１１６およびＣＤ１３１を含むＧＭ−ＣＳＦ受容体のいずれかに反応する中和非アゴニスト抗体を患者に投与するステップを含む。この態様は、血液悪性腫瘍に苦しんでいる患者のＧｖＨＤの治療または予防に使用するために、他に以下から選択される薬剤の供給を以て実施することができる。
−中和ポリペプチドリガンド、特にＧＭ−ＣＳＦ、またはＣＤ１１６、ＣＤ１３１もしくはＣＤ１１６とＣＤ１３１とを含むＧＭ−ＣＳＦ受容体のいずれかに反応する中和抗体および
−ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１１６、および／またはＣＤ１３１の発現を阻害する核酸剤
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１Ａ〜１Ｈは、ドナーＴ細胞の同種移植反応時におけるＧＭ−ＣＳＦとＩＦＮγの分泌を示す図である。
【０００７】
【図１Ａ】ＣＤ４５．１＋  ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６  ＴＣＤ−ＢＭ単独またはＣＤ４５．１＋  ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６脾臓細胞との併用によるａｌｌｏ−ＨＣＴ後に致死量の放射線を照射したＣＤ４５．２＋  ＢＡＬＢ／ｃマウスの生存率を示す図である。データは、４つの個々の実験からプールされ、それぞれがｎ＝５／グループである。生存曲線の比較には、ログランク（マンテル・コックス）検定を使用し、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図１Ｂ】ａｌｌｏ−ＨＣＴ後３日目と６日目の脾臓、肝臓、皮膚におけるライブシングレット内のＣＤ４５．１＋細胞の頻度を示す図である。データはｎ＝１０／グループを得るためにプールされた。
【図１Ｃ】ａｌｌｏ−ＨＣＴ後３日目のマウスの肝臓からのＣＤ４５．１＋群内のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を産生するＩＦＮγ−、ＧＭ−ＣＳＦ−およびＩＬ−１７Ａ−の頻度を示す図である。代表的なプロットは、３つの独立した実験の合計から示している。
【図１Ｄ】ａｌｌｏ−ＨＣＴ後３日目と６日目のマウスの肝臓、脾臓および皮膚からのＣＤ４５．１＋群内のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を産生するＩＦＮγ−、ＧＭ−ＣＳＦ−およびＩＬ−１７Ａ−の頻度を示す図である。データは３つの個々の実験、合計ｎ＝１０／グループからプールした。
【図１Ｅ】ａｌｌｏ−ＨＣＴ後６日目のマウスの血清ＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦレベルを示す図である。データは３つの個々の実験からプールし、ｎ＝２−５／グループである。平均値の比較のためにウェルチの補正を用いた対応のない２群についてのｔ検定を使用し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。
【図１Ｆ】同系間（Ｃ５７ＢＬ／６）、同種（ＢＡＬＢ／ｃ）脾臓ＣＤ１１ｃ＋ＤＣのいずれかとＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのＴ細胞の共培養から得られた上清内のＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１７Ａを示す図である。データは３つの実験からプールされ、ｎ＝３−５／グループである。平均値の比較のためにウェルチの補正を用いた対応のない２群についてのｔ検定を使用し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１である。
【図１Ｇ】Ｃ５７ＢＬ／６ｗｔ、Ｉｆｎｇ−／−、Ｃｓｆ２−／−、またはＩＩ１７ａ−／−マウスのＴ細胞と同系（Ｃ５７ＢＬ／６）または同種（ＢＡＬＢ／ｃ）脾臓ＣＤ１１ｃ＋ＤＣｓを共培養したＴ細胞によるトリチウムチミジン取り込みを示す図である。データは３つの個々の実験からプールされ、ｎ＝２−５／グループである。平均値の比較のために、ボンフェローニ事後検定を用いた一元配置分散分析を使用した。データは、図１Ｂでは平均＋／−ＳＤとして表示され、図１Ｄ〜１Ｇでは平均＋／−ＳＥＭとして表示される。
【図１Ｈ】ａｌｌｏ−ＨＣＴ後３日目および６日目の肝臓および脾臓からのＣＤ４５．１＋群内のＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ産生ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す図である。３つの実験の１つからプールされた代表的なデータを示し、ｎ＝３−４／グループである。
【０００８】
略語について、ＴＣＤはＴ細胞枯渇、ＢＭは骨髄、ＨＣＴは造血細胞移植、ＷＴは野生型、Ｃｐｍは１分間のカウントを示す。
【０００９】
図２Ａ〜２Ｋにおいて、ＧＭ−ＣＳＦは、完全なＭＨＣミスマッチのａｌｌｏ−ＨＣＴ後の急性ＧｖＨＤに重要であることを示す。
【００１０】
【図２Ａ】ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６  ＴＣＤ−ＢＭ単独で、またはＣ５７ＢＬ／６  ＷＴ  Ｃｓｆ２−／−、Ｉｆｎｇ−／−、またはＩＩ１７ａ−／−マウスの脾臓細胞との組み合わせによるａｌｌｏ−ＨＣＴを受けたＢＡＬＢ／ｃマウスが、致死量の放射線を照射された場合の生存率を示す図である。データは、４つの個々の実験からプールされ、それぞれがｎ＝５／グループであった。生存曲線の比較（ＷＴ対他のグループ）には、ログランク（マンテル・コックス）検定を使用し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１である。
【図２Ｂ】ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６  ＴＣＤ−ＢＭ単独またはＣ５７ＢＬ／６  ＷＴまたはＣｓｆ２−／−マウスの脾臓から精製されたＴ細胞との組み合わせによるａｌｌｏ−ＨＣＴを受けたＢＡＬＢ／ｃマウスが、致死量の放射線を照射された場合の生存率を示す図である。データは、各ｎ＝５／グループの３つの個別の実験からプールされた。生存曲線（ＷＴとＣｓｆ２−／−）の比較には、ログランク（マンテル・コックス）検定を使用し、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図２Ｃ】ａｌｌｏ−ＨＣＴ後６日目のＢＡＬＢ／ｃマウスから肝臓、小腸、皮膚の複合病理組織学的スコアを示す図である。３つの個々の実験からプールされたデータを示しており、ｎ＝５／グループである。平均値（ＷＴ対Ｃｓｆ２−／−）の比較には、対応のない２群についてのｔ検定を使用した。
【図２Ｄ】ＷＴまたはＣｓｆ２−／−  Ｃ５７ＢＬ／６マウスのいずれかからの脾臓細胞とＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６  ＴＣＤ−ＢＭを組み合わせたａｌｌｏ−ＨＣＴ後６日目のマウスの皮膚および小腸からのヘマトキシリンおよびエオシン染色切片の代表的な画像を示す図であり、ｎ＝４−５／グループ（スケールバー：１００μｍ）である。
【図２Ｅ】ＷＴまたはＣｓｆ２−／−  Ｃ５７ＢＬ／６マウスのいずれかからの脾臓細胞とＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６  ＴＣＤ−ＢＭを組み合わせたａｌｌｏ−ＨＣＴ後６日目のマウスの肝臓からの切片におけるｐ２２ｐｈｏｘ標識の代表的な画像（スケールバー：１００μｍ）を示し、ｎ＝４−５／グループ（上のパネル）である。視野ごとのｐ２２ｐｈｏｘについて陽性と標識された総面積の平均％を定量化している。平均値の比較（ＷＴ対Ｃｓｆ２−／−）には、対応のない２群についてのｔ検定を使用し、＊＊ｐ＜０．０１である。
【図２Ｆ】ＷＴまたはＣｓｆ２−／−  Ｃ５７ＢＬ／６マウスのいずれかからの脾臓細胞と組み合わせたＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６  ＴＣＤ−ＢＭを用いたａｌｌｏ−ＨＣＴ後６日目の小腸からの切片におけるｐ２２ｐｈｏｘ標識の代表的な画像（スケールバー：１００μｍ）を示し、ｎ＝４−５／グループ（上のパネル）である。視野ごとのｐ２２ｐｈｏｘについて陽性と標識された総面積の平均％を定量化している。平均値の比較（ＷＴ対Ｃｓｆ２−／−）には、対応のない２群についてのｔ検定を使用し、＊＊ｐ＜０．０１である。
【図２Ｇ】ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６  ＴＣＤ−ＢＭ単独、またはＣ５７ＢＬ／６  ＷＴマウスの脾臓細胞との組み合わせによるａｌｌｏ−ＨＣＴを受けたＢＡＬＢ／ｃマウスが、致死量の放射線を照射された場合の生存率を示す図である。マウスには、ＨＣＴの２日前から実験期間中ＰＢＳ、アイソタイプコントロール抗体、または抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体を３回／週に分けて投与した。データは、それぞれｎ＝５／グループで２つの個々の実験からプールされた。生存曲線（ａＧＭ−ＣＳＦ対アイソタイプ）の比較については、ログランク（マンテル・コックス）検定を使用し、＊＊＊ｐ＜０．００１である。データは平均＋／−ＳＥＭとして表示される。
【図２Ｈ】ａに記載したように、ａｌｌｏ−ＨＣＴの６日後のＢＡＬＢ／ｃマウスの結腸の長さ（ｃｍ）を示す図である。データは２つの個別の実験からプールされた。
【図２Ｉ】ａに記載したように、ａｌｌｏ−ＨＣＴ後６日目のＢＡＬＢ／ｃマウスからの大腸内のアポトーシス細胞（ＴＵＮＥＬ染色）の代表的な画像および定量化を示す図である。データは３つの個々の実験（スケールバー上５０μｍ、下２０μｍ）からプールされた。
【図２Ｊ】ａｌｌｏ−ＨＣＴ後６日目のＢＡＬＢ／ｃマウスからの血清中のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）およびアルブミンのレベルを示す図である。データは、ｎ＝３−５／グループで、２つの個別の実験を示している。
【図２Ｋ】ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６  ＴＣＤＢＭ単独、またはＣ５７ＢＬ／６  ＷＴまたはＣｓｆ２−／−マウス（ＣＤ４ＷＴＣＤ８ＷＴ、ＣＤ４ＷＴＣＤ８Ｃｓｆ２−／−、ＣＤ４Ｃｓｆ２−／−、ＣＤ４Ｃｓｆ２−／−ＣＤ８ＷＴおよびＣＤ４Ｃｓｆ２−／−ＣＤ８Ｃｓｆ２−／−）の脾臓から精製したＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞との組み合わせによるａｌｌｏ−ＨＣＴを受けたＢＡＬＢ／ｃマウスが、致死量の放射線を照射された場合の生存率を示す図である。ＴＣＤ−ＢＭ単独で処置したマウスを対照として使用した。データは、ｎ＝５／グループの２つの個々の実験を示している。生存曲線の比較（ＣＤ４ＷＴＣＤ８ＷＴ対他のグループ）には、ログランク（マンテル・コックス）検定を使用し、ｎｓ（非有意）、＊＊ｐ＜０．０１である。
【００１１】
略語について、ＴＣＤはＴ細胞枯渇、ＢＭは骨髄、ＨＣＴは造血細胞移植、ＷＴは野生型を示す。
【００１２】
図３Ａ〜３Ｈは、ＧＭ−ＣＳＦについて、部分的なＭＨＣミスマッチのａｌｌｏ−ＨＣＴ後のＧｖＨＤ病理学の媒介を示す図である。
【００１３】
【図３Ａ】ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６  ＴＣＤ−ＢＭ単独でまたはＣ５７ＢＬ／６  ＷＴ、Ｃｓｆ２−／−またはＩｆｎｇ−／−マウスからの脾臓細胞と組み合わせて、部分的なＭＨＣミスマッチのａｌｌｏ−ＨＣＴを受けたＢ６Ｄ２Ｆ１マウスが、致死量の放射線を照射された場合の生存率を示す図である。データは、５つの個々の実験からプールされ、それぞれがｎ＝５／グループである。生存曲線の比較（ＷＴ対他のグループ）には、ログランク（マンテル・コックス）検定を使用し、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図３Ｂ】ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６  ＴＣＤ−ＢＭ単独、またはＣ５７ＢＬ／６  ＷＴ、Ｃｓｆ２−／−またはＩｆｎｇ−／−マウスの脾臓から精製されたＴ細胞との組み合わせによるａｌｌｏ−ＨＣＴを受けたＢ６Ｄ２Ｆ１マウスが、致死量の放射線を照射された場合の生存率を示す図である。データは、２つの個別の実験からプールされ、それぞれがｎ＝５／グループである。生存曲線の比較（ＷＴ対他のグループ）には、ログランク（マンテル・コックス）検定を使用し、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図３Ｃ】ａｌｌｏ−ＨＣＴ後１１日目のＢ６Ｄ２Ｆ１マウスからの肝臓、小腸および皮膚切片の複合病理組織学的スコアを示す図である。データは、２つの個々の実験からプールされ、ｎ＝５／グループである。平均値（ＷＴ、Ｃｓｆ２−／−およびＩｆｎｇ−／−）の比較には、ボンフェローニ事後検定を用いた一元配置分散分析を使用し、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図３Ｄ】ＷＴ、Ｉｆｎｇ−／−またはＣｓｆ２−／−Ｃ５７ＢＬ／６マウスのいずれかからの脾臓細胞との組み合わせによるＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６  ＴＣＤ−ＢＭを用いたａｌｌｏ−ＨＣＴ後１１日目のマウスの皮膚からのヘマトキシリンおよびエオシン染色切片の代表的な画像を示す図であり、ｎ＝４−５／グループ（スケールバー：１００μｍ）である。
【図３Ｅ】ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６  ＴＣＤ−ＢＭとＣ５７ＢＬ／６  ＷＴまたはＣｓｆ２−／−マウスの脾臓細胞を組み合わせたａｌｌｏ−ＨＣＴ後９日目のマウスの肝臓からの切片におけるｐ２２ｐｈｏｘ（上側のパネル）およびＦ４／８０の標識の代表的な画像を示す図であり、ｎ＝４−５／グループである。視野ごとのｐ２２ｐｈｏｘまたはＦ４／８０について陽性と認識された総面積の％を定量化している。平均値（ＷＴ対Ｃｓｆ２−／−）の比較には、対応のない２群についてのｔ検定を使用し、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１である。
【図３Ｆ】ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６  ＴＣＤ−ＢＭとＣ５７ＢＬ／６  ＷＴまたはＣｓｆ２−／−マウスの脾臓細胞を組み合わせたａｌｌｏ−ＨＣＴ後９日目のマウスの小腸（スケールバー：１００μｍ）からの切片におけるｐ２２ｐｈｏｘ（上側のパネル）およびＦ４／８０の標識の代表的な画像を示す図であり、ｎ＝４−５／グループである。視野ごとのｐ２２ｐｈｏｘまたはＦ４／８０について陽性と認識された総面積の％を定量化している。平均値（ＷＴ対Ｃｓｆ２−／−）の比較には、対応のない２群についてのｔ検定を使用し、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１である。
【図３Ｇ】Ｃ５７ＢＬ／６  ＷＴ、Ｉｆｎｇ−／−またはＣｓｆ２−／−マウスの脾臓細胞と組み合わせたＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６  ＴＣＤ−ＢＭを用いたａｌｌｏ−ＨＣＴ後９日目のマウスにおける血清ＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦレベルを示す図である。データは、２〜３の個々の実験からプールされ、ｎ＝４−５／グループである。平均値（ＷＴ対Ｉｆｎｇ−／−またはＷＴ対Ｃｓｆ２−／−）の比較には、ウェルチの補正を用いた対応のない２群についてのｔ検定を使用し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。データは平均値＋／−ＳＥＭとして表示されている。
【図３Ｈ】ａに記載されているように、ａｌｌｏ−ＨＣＴ後９日目または２８日目のＢ６Ｄ２Ｆ１マウスの肝臓切についての複合病理組織学的スコアを示す図である。データは２つの独立した実験を示しており、ｎ＝４−６／グループである。
【００１４】
略語について、ＴＣＤはＴ細胞枯渇、ＢＭは骨髄、ＨＣＴは造血細胞移植、ＷＴは野生型を示す。
【００１５】
図４Ａ〜４Ｈは、ＧＭ−ＣＳＦが、ａｌｌｏ−ＨＣＴ後の抗腫瘍活性のために不要であることを示している。
【００１６】
図４Ａ〜４Ｄは、致死量の放射線を照射されたＢＡＬＢ／ｃマウスにＧＦＰおよびルシフェラーゼを発現するＡ２０腫瘍細胞と、ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６  ＷＴ  ＴＣＤ−ＢＭ単独、またはＣ５７ＢＬ／６  ＷＴマウスまたはＣｓｆ２−／−マウスの脾臓から精製されたＴ細胞と組み合わせたＭＨＣミスマッチのａｌｌｏ−ＨＣＴを同時に静脈内注射した状態を示す図である。ＴＣＤ−ＢＭ単独で処理したマウスを対照として使用した。
【００１７】
【図４Ａ】生体内生物発光イメージングによってモニターした腫瘍の成長を示す図である。２つの代表的な実験からの画像を示している。
【図４Ｂ】関心領域（ＲＯＩ）の信号強度の経時的なモニターを示す図である。
【図４Ｃ】経時的生存率を、致死的なＧｖＨＤ（灰色）、腫瘍（黒色）または生存者（白色）の各処置群のマウスの割合として示す図である。データは、ｎ＝５／グループの２つの個別の実験からプールされた。生存曲線（ＷＴ対他の群）の比較には、ログランク（マンテル・コックス）検定を使用し、ｎｓ（有意ではない）、＊＊ｐ＜０．０１である。
【図４Ｄ】死因を、致死量のＧｖＨＤ（灰色）、腫瘍（黒色）または生存者（白色）を有する各処置群のマウスの割合として示す図である。データは、ｎ＝５／グループの２つの個別の実験からプールされた。生存曲線（ＷＴ対他の群）の比較には、ログランク（マンテル・コックス）検定を使用し、ｎｓ（有意ではない）、＊＊ｐ＜０．０１である。
【００１８】
図４Ｅ〜４Ｈは、致死量の放射線を照射したＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＧＦＰおよびルシフェラーゼを発現するＡ２０腫瘍細胞と、ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６  ＴＣＤ−ＢＭ単独、またはＣ５７ＢＬ／６  ＷＴマウスの脾臓から精製したＴ細胞と組み合わせて、ＭＨＣミスマッチのａｌｌｏ−ＨＣＴと同時に静脈内に注入した状態を示す図である。ＴＣＤ−ＢＭ単独で処理したマウスを対照として使用した。マウスへは、ＨＣＴの２日前から実験期間中、アイソタイプコントロール、または抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体を３回／週に分けて投与した。
【００１９】
【図４Ｅ】生体内生物発光イメージングによってモニターした腫瘍の成長を示す図である。ｎ＝６−７／グループの１つの実験からの画像を示している。
【図４Ｆ】関心領域（ＲＯＩ）の信号強度の経時的なモニターを示す図である。
【図４Ｇ】経時的生存率を、致死的ＧｖＨＤ（灰色）、腫瘍（黒色）または生存者（白色）を有する各治療群のマウスの割合として示す図である。生存曲線の比較（ＷＴ対ｃｓｆ２−／−）には、ログランク（マンテル・コックス）検定を使用し、＊ｐ＜０．０５である。データは平均値＋／−ＳＥＭとして表示されている。
【図４Ｈ】死因を、致死的ＧｖＨＤ（灰色）、腫瘍（黒色）または生存者（白色）を有する各治療群のマウスの割合として示す図である。生存曲線の比較（ＷＴ対ｃｓｆ２−／−）には、ログランク（マンテル・コックス）検定を使用し、＊ｐ＜０．０５である。データは平均値＋／−ＳＥＭとして表示されている。
【００２０】
略語について、ＴＣＤはＴ細胞枯渇、ＢＭは骨髄、ＨＣＴは造血細胞移植、ＷＴは野生型、ＢＬＩは生物発光イメージング、ＲＯＩは関心領域を示す。
【００２１】
図５Ａ〜５Ｄは、重度のＧｖＨＤ患者では、腸管生検でＧＭ−ＣＳＦが高レベルで発現することを示す図である。
【００２２】
【図５Ａ】異なるＧｖＨＤグレードを有する患者からの消化管生検におけるｍＲＮＡレベルでのＧＭ−ＣＳＦの相対的な発現を示す図であり、表３を参照されたい。平均値の比較には、ボンフェローニ事後検定を用いた一元配置分散分析を使用し、＊＊ｐ＜０．０１である。データは平均＋／−ＳＥＭとして表示されている。
【図５Ｂ】ａｌｌｏ−ＨＣＴ患者の小腸からの対照およびＧｖＨＤグレードＩＶ生検におけるＧＭ−ＣＳＦ標識を示す画像であり、表１および２を参照されたい。茶色は抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ、青色はヘマトキシリンを示す。スケールバーは１００μｍ（ズーム画像では２０μｍ）である。３つの個々の対照と患者のサンプルの代表的な画像を示している。
【図５Ｃ】ＧｖＨＤ患者グレードＩＶからの消化管生検のＣＤ３（ピンク）、ＣＤ６８（緑）およびＧＭ−ＣＳＦ（赤）の免疫蛍光染色を示す図である。３つの個々の患者サンプルの代表的な写真を示す。核は、青色（ＤＡＰＩ）で描かれている（スケールバー上５０μｍ、下２０μｍ）。
【図５Ｄ】ＰＭＡ／イオノマイシンで４時間刺激した健康なドナー（ＨＤ）およびＧｖＨＤ患者（ＧＰ）から採取したＰＢＭＣのフローサイトメトリー解析を示す図である。サイトカインを発現するＴ細胞の代表的なＦＡＣＳ−Ｐｌｏｔを示している。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ、およびＩＬ−１７産生ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、個体の頻度として示されており、ｎ＝１０−９／ｇｒｏｕｐ  ＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。
【００２３】
略語について、ＴＣＤはＴ細胞枯渇、ＢＭは骨髄、ＨＣＴは造血細胞移植を示す。
【００２４】
図６Ａ〜６ＤはＷＴマウスおよびＣｓｆ２−／−マウスのＴ細胞集団の比較表現型分析を示す図である。
【００２５】
【図６Ａ】ナイーブＣ５７ＢＬ／６  ＷＴおよびＣｓｆ２−／−マウスにおける脾臓のＴ細胞集団頻度のフローサイトメトリー分析を示す図である。データは、各ｎ＝３／グループの２つの個々の実験からプールされた。
【図６Ｂ】ナイーブＣ５７ＢＬ／６  ＷＴおよびＣｓｆ２−／−マウスにおける脾臓の活性化マーカー発現頻度のフローサイトメトリー分析を示す図である。データは、各ｎ＝３／グループの２つの個々の実験からプールされた。
【図６Ｃ】Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴまたはＣｓｆ２−／−マウスの脾臓細胞と組み合わせたＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６  ＴＣＤ−ＢＭで再構成した致死量の放射線を照射されたＢＡＬＢ／ｃマウスの、ａｌｌｏ−ＨＣＴ後２日目および５日目における、レシピエントリンパ節（ＬＮ）、脾臓、肝臓および皮膚におけるドナーＴ細胞浸潤のフローサイトメトリー解析を示す図である。細胞は、Ｈ２−ＤｂおよびＣＤ４５にゲートし、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞は、ＣＤ３に予めゲートした。ｎ＝４／グループでの実験を示す。データは、平均＋／−ＳＥＭとして表示されている。
【図６Ｄ】Ｃ５７ＢＬ／６  ＷＴまたはＣｓｆ２−／−マウスからの脾臓細胞とＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６  ＴＣＤ−ＢＭとを組み合わせて再構成した致死量の放射線を照射されたＢＡＬＢ／ｃマウスの、ａｌｌｏ−ＨＣＴ後５日目のレシピエントＬＮおよび脾臓におけるドナーＴ細胞浸潤のフローサイトメトリー解析を示す図である。細胞は、Ｈ２−ＤｂおよびＣＤ４５、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞にゲートした。ｎ＝４／グループでの実験を示す。データは、平均＋／−ＳＥＭとして表示されている。
【００２６】
略語について、ＴＣＤはＴ細胞枯渇、ＢＭは骨髄、ＨＣＴは造血細胞移植、ＷＴは野生型を示す。
【００２７】
図７Ａおよび７Ｂはそれぞれ、Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴマウスまたはＣｓｆ２-／-マウスの脾臓およびリンパ節から単離したＡ２０腫瘍細胞およびＴ細胞を用いたキリングアッセイを示す。
【００２８】
【図７Ａ】ＴＯ−ＰＲＯ３染色による死細胞のフローサイトメトリー解析、代表的なプロットを示す図である。
【図７Ｂ】Ｔ細胞がエフェクター比１：１、１：２０および１：５０を標的として表したＡ２０腫瘍細胞の特異的な溶解を示す図である。データは、各グループにつきｎ＝３のマウスを用いた２つの実験の代表である。データは、平均＋／−ＳＥＭとして表示される。
【００２９】
略語について、ＷＴは野生型を示す。
【００３０】
【図８Ａ】致死量の放射線を照射されたＣ５７ＢＬ／６  ＷＴマウスまたはＣｓｆ２ｒｂ−／−マウスの、ＷＴ  Ｂａｌｂ／ｃ  Ｔ細胞枯渇（ＴＣＤ）−ＢＭ単独またはＢａｌｂ／ｃ  ＷＴマウスの脾臓細胞との組み合わせによるａｌｌｏ−ＨＣＴ後の生存率を示す図である。データは、２つの個別の実験からプールされ、それぞれｎ＝５−７／グループである。
【図８Ｂ】致死量の放射線を照射されたＢａｌｂ／ｃ  ＷＴマウスの、Ｃ５７ＢＬ／６  ＷＴまたはＣｓｆ２ｒｂ−／− ＴＣＤ−ＢＭ単独またはＣ５７ＢＬ／６  ＷＴマウスの脾臓細胞との組み合わせによるａｌｌｏ−ＨＣＴ後の生存率を示す図である。データは、２つの個別の実験からプールされ、それぞれｎ＝５−７／グループである。
【００３１】
図９Ａ〜９Ｈは、ＧＭ−ＣＳＦが、ドナー由来のミエロイド細胞を介してＧｖＨＤを駆動する状態を示す図である。
【００３２】
【図９Ａ】致死量の放射線を照射したＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６およびＣｓｆ２ｒｂ−／−マウスの、ＷＴ  Ｂａｌｂ／ｃ  ＴＣＤ−ＢＭ単独またはＢａｌｂ／ｃ  ＷＴマウスの脾臓細胞との組み合わせによるＭＨＣミスマッチのａｌｌｏ−ＨＣＴ後の生存率を示す図である。データは、２つの個別の実験からプールされ、それぞれがｎ＝５／グループである。
【図９Ｂ】致死量の放射線を照射されたＢａｌｂ／ｃ  ＷＴマウスにおいて、Ｃ５７ＢＬ／６  ＷＴマウスまたはＣｓｆ２ｒｂ−／−マウスＴＣＤ−ＢＭ単独またはＣ５７ＢＬ／６  ＷＴマウスの脾臓細胞との組み合わせによるＭＨＣミスマッチのａｌｌｏ−ＨＣＴ後の生存率を示す図である。データは、２つの個々の実験からプールされ、それぞれｎ＝５／グループである。生存曲線の比較（ＷＴ対Ｃｓｆ２ｒｂ−／−レシピエント／ドナー）には、ａおよびｂでログランク（マンテル・コックス）検定を使用し、＊＊ｐ＜０．０１である。
【図９Ｃ】フローサイトメトリー解析によって分析された、ＧＭ−ＣＳＦ刺激時にＳＴＡＴ５リン酸化（黒から黄色の勾配）を示すＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６およびＣｓｆ２ｒｂ−／−マウスの骨髄からランダムにサンプリングされた２００，０００個の細胞を表示する注釈付きのｔ−ＳＮＥマップを示す図である。データは、２つの独立した実験ｎ＝３／グループを示す。
【図９Ｄ】図９Ｂに重ねて示したＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＣｓｆ２ｒｂ−／−マウスの単球および好中球におけるＧＭ−ＣＳＦ誘発性ｐＳＴＡＴ５上方制御の頻度を示す図である。
【図９Ｅ】ＨＣＴ後の異なるミエロイド細胞集団（ＤＣｓ、好中球、単球およびＭＤＣ）のフローサイトメトリー解析を示す図である。肝臓のゲーティング例が示されている。
【図９Ｆ】脾臓（上段）および肝臓（下段）におけるミエロイド細胞群の定量（図９Ｅより）を示す図である。３つの個々の実験から１つの代表を示し、ｎ＝４−５／グループである。
【図９Ｇ】ａｌｌｏ−ＨＣＴ後６日目のマウスの脾臓からのＨ２Ｄｂ＋、ＣＤ４５＋群内のｐｒｏ−ＩＬ−１β好中球および単球の産生の頻度を示す図である。代表的なプロットは、好中球、単球およびＭＤＣ（ｅのようにゲートされている）のために示されている。データは、２つの独立した実験ｎ＝５／グループを表す。
【図９Ｈ】ａｌｌｏ−ＨＣＴ後６日目のマウスにおけるＲＯＳ（ＣｅｌｌＲＯＸ試薬）のフローサイトメトリー解析を示す図である。好中球、単球およびＭＤＣ（図９Ｅのようにゲートされた）のＭＦＩの代表的なヒストグラムを示している。データは、ｎ＝５−７／グループで１つの実験を表している。平均値の比較のために対応のない２群についてのｔ検定がｆ−ｈで使用され、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５である。データは平均＋／−ＳＥＭとして表示されている。
【００３３】
略語について、ＴＣＤはＴ細胞枯渇、ＢＭは骨髄、ＨＣＴは造血細胞移植、ＷＴは野生型を示す。
【００３４】
記述されたシーケンスの簡単な説明
本明細書で提供される核酸配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されるヌクレオチド塩基の標準的な文字略語を用いて示されている。各核酸配列の一本の鎖のみが示されているが、相補的な鎖は、示された鎖への任意の参照により含まれるものとして理解されたい。配列表は、「Ｓｅｑ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｕｚ３４９ｗｏ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称の約２ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出され、参照により本明細書に組み込まれるものとする。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１およびＮｏ．２はＣＳＦ２遺伝子のフォワードおよびリバースＰＣＲ増幅プライマーである。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３およびＮｏ．４は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のフォワードおよびリバースＰＣＲ増幅プライマーである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
用語と定義
本明細書の文脈での用語ＧｖＨＤは、遺伝的に異なる患者への免疫細胞の移植から生じる合併症である移植片対宿主病に関する。ＧｖＨＤは一般的に幹細胞移植、特に血液悪性腫瘍の治療の状況で発生するが、他の移植の状況で発生することがある。本明細書の文脈での用語ａｌｌｏ−ＨＣＴは、同種造血細胞移植に関連する。本明細書の文脈での用語ＧＭ−ＣＳＦは、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０４１４１、ＣＡＳＮｏ．８３８６９−５６−１）に関する。本明細書の文脈での用語ＣＤ１１６は、ＧＭ−ＣＳＦ受容体のα鎖としても知られているＣｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  １１６に関する（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ１５５０９）。ＧＭ−ＣＳＦ受容体は、ＩＬ−３ＲやＩＬ−５Ｒのインターロイキン受容体にも存在するＧＭ−ＣＳＦ特異的α鎖（ＣＤ１１６）とβ鎖（ＣＤ１３１）から構成されている。本発明のＧＭ−ＣＳＦのリガンドまたはＣＤ１１６、ＣＤ１３１およびＣＤ１３１を含むＧＭ−ＣＳＦ受容体のいずれかは、ＧＭ−ＣＳＦがその受容体に結合したときに開始される信号伝達を阻害するか、または中和することができる。本明細書の文脈での用語ＣＬＬは、急性慢性リンパ球性白血病またはリンパ芽球性白血病に関する。本明細書の文脈における用語ＡＬＬは、急性リンパ芽球性白血病に関する。本明細書の文脈における用語ＣＭＬは、慢性骨髄性白血病または骨髄性白血病に関連する。本明細書の文脈におけるＡＭＬという用語は、急性骨髄性白血病に関連する。本明細書の文脈における用語ＡＭｏＬは、急性単球性白血病に関する。
【００３６】
本明細書の文脈での抗体という用語は、細胞生物学および免疫学の分野で公知の意味で使用され、それは、免疫グロブリンタイプＧ（ＩｇＧ）、タイプＡ（ＩｇＡ）、タイプＤ（ＩｇＤ）、タイプＥ（ＩｇＥ）またはタイプＭ（ＩｇＭ）を含むがこれらに限定されない全抗体、任意の抗原結合フラグメントまたはその一本鎖および関連するまたは派生した構成を指す。全抗体とは、少なくとも２本の重鎖（Ｈ）と２本の軽鎖（Ｌ）がジスルフィド結合で相互に連結された糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定数領域（ＣＨ）とで構成されている。重鎖定数領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３つのドメインで構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（以下、ＶＬと略記）と軽鎖定数領域（ＣＬ）とを含んでいる。軽鎖定数領域は、１のドメインＣＬで構成されている。重鎖および軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれている。抗体の定数領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体システムの第１の構成要素を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介してもよい。同様に、この用語は、いわゆるナノボディまたはシングルドメイン抗体、すなわち単一の単量体可変抗体ドメインを含む抗体断片を包含する。
【００３７】
抗体という用語は、ラクダ抗体、特にヒト化ラクダ抗体を包含する。本明細書の文脈における用語「抗体様分子」は、高い親和性を有する他の分子または標的に特異的に結合することが可能な分子／aＫｄ≦１０Ｅ-８ｍｏｌ／Ｌを指す。抗体様分子は、抗体の特異的結合と同様に標的に結合する。抗体様分子という用語は、設計されたアンキリンリピートタンパク質（モレキュラーパートナーズ、チューリッヒ）、高度に特異的で高親和性の標的タンパク質結合を示す人工抗体擬態タンパク質などのリピートタンパク質を包含する（米国特許第２０１２／１４２６１１号明細書、米国特許第２０１６／２５０３４１号明細書、米国特許第２０１６／０７５７６７号明細書および米国特許第２０１５／３６８３０２号明細書を参照されたい。これらのすべては引用を以って本明細書の一部となす）。抗体様分子という用語は、アルマジロリピートタンパク質に由来するポリペプチド、ロイシンリッチリピートタンパク質に由来するポリペプチド、およびテトラトリコペプチドリピートタンパク質に由来するポリペプチドをさらに包含するが、これらに限定されない。抗体様分子という用語は、タンパク質Ａドメイン由来のポリペプチド、フィブロネクチンドメインＦＮ３由来のポリペプチド、コンセンサスフィブロネクチンドメイン由来のポリペプチド、リポカリン由来のポリペプチド、ジンクフィンガー由来のポリペプチド、Ｓｒｃホモロジードメイン２（ＳＨ２）由来のポリペプチド、Ｓｒｃホモロジードメイン３（ＳＨ３）由来のポリペプチド、ＰＤＺドメイン由来のポリペプチド、γ−クリスタチン由来のポリペプチド、ユビキチン由来のポリペプチド、システインノット由来のポリペプチド、ノッチン由来のポリペプチド、シスタチン由来のポリペプチド、三重らせん構造のコイルドコイル（アルファボディとしても知られる）Ｓａｃ７ｄ由来のポリペプチド、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤のクニッツドメインに由来するポリペプチド、および炭水化物結合モジュール３２−２に由来するポリペプチドを包含する。
【００３８】
タンパク質Ａドメイン由来ポリペプチドという用語は、タンパク質Ａの誘導体であり、免疫グロブリンのＦｃ領域およびＦａｂ領域に特異的に結合することができる分子を指す。アルマジロリピートタンパク質という用語は、少なくとも1つのアルマジロリピートを含むポリペプチドを指し、アルマジロリピートは、ヘアピン構造を形成する1対のαヘリックスを特徴とする。
【００３９】
本明細書の文脈でヒト化抗体という用語は、細胞生物学および生化学の分野で公知のその意味で使用され、それは、本来非ヒト種の免疫細胞によって産生された抗体を指し、そのタンパク質配列は、ヒトにおいて自然に産生される抗体バリアントとの類似性を高めるように改変されている。本明細書の文脈における用語「ヒト化ラクダ抗体」とは、重鎖または重鎖の可変ドメイン（ＶＨＨドメイン）のみを含む抗体であって、そのアミノ酸配列が、ヒトにおいて天然に産生される抗体との類似性を高めるように改変されている抗体を指す。したがって、ヒトに投与すると、免疫原性の低下を示す。ラクダ抗体をヒト化するための一般的な戦略は、２００９年１月３０日発行、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍの２８４（５）、３２７３−３２８４に掲載されたＶｉｎｃｋｅらの「Ｇｅｎｅｒａｌ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏ  ｈｕｍａｎｉｚｅ  ａ  ｃａｍｅｌｉｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｎａｎｏｂｏｄｙ  ｓｃａｆｆｏｌｄ」および米国特許第２０１１／１６５６２１Ａ１号明細書に記載されている。
【００４０】
本明細書の文脈では、キメラ抗体という用語は、細胞生物学および免疫学の分野で公知の意味で使用され、抗原結合部位（可変領域）が、異なるまたは変更されたクラス、エフェクター機能および／または種、またはキメラ抗体に新たな特性を付与する全く異なる分子、例えば、酵素、サイトカイン、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などのような定数領域またはその一部が変更、置換または交換された抗体分子を指す。例えば、抗体は、その定数領域をサイトカインに置き換えることで修飾することができる。分子の機能（一部）を持ちながら、抗原を認識する特異性を保持することができる。
【００４１】
本明細書の文脈で用語解離定数（ＫＤ）は、化学および物理学の分野で公知の意味で使用される。それは、複合体がその構成分子に分解されるときのように、より大きな物体がより小さな成分に可逆的に解離する傾向を測定する平衡定数を指す。ＫＤはモル単位［Ｍ］で表され、［Ａｇ］の結合部位が半分を占める［Ａｂ］の濃度に対応している。換言すれば、未結合の［Ａｂ］の濃度は［ＡｂＡｇ］複合体の濃度に等しい。解離定数は、次の式に従って計算することができる。
2021514368.tif 000002
［Ａｂ］＝抗体の濃度、［Ａｇ］＝抗原の濃度、［ＡｂＡｇ］＝抗体抗原複合体の濃度
【００４２】
本明細書の文脈では、オフレート（Ｋｏｆｆ、［１／ｓｅｃ］）およびオンレート（Ｋｏｎ、［１／ｓｅｃ＊Ｍ］）という用語は、化学および物理学の分野で公知の意味で使用され、それらは、標的抗原と抗体５の解離（Ｋｏｆｆ）または結合（Ｋｏｎ）を測定する速度定数を指す。ＫｏｆｆおよびＫｏｎは、当技術分野で確立された方法を用いて実験的に決定することができる。抗体のＫｏｆｆとＫｏｎを決定する方法は、表面プラズモン共鳴を利用している。これは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）やＰｒｏｔｅＯｎ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムの原理である。また、以下の式を使用して解離定数ＫＤを決定することもできる。
2021514368.tif 000003
【００４３】
本明細書で使用される任意の疾患または障害（例えば、がんまたは移植片対宿主疾患）の「（ｔｒｅａｔｉｎｇ）治療する」または「（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）治療」という用語は、一実施形態では、疾患または障害を改善すること（例えば、疾患またはその臨床症状の少なくとも１つの発症を遅らせるか、または停止させるか、または減少させること）を指す。
【００４４】
別の実施形態では、「治療する」または「治療」は、患者が識別できないかもしれないものを含む少なくとも１つの物理的パラメータを緩和または改善することを指す。
【００４５】
さらに別の実施形態において、「治療する」または「治療」は、物理的に、（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的に、（例えば、物理的パラメータの安定化）、またはその両方のいずれかで、疾患または障害を調節することを指す。疾患の治療および／または予防を評価するための方法は、本明細書に具体的に記載されていない限り、当技術分野で一般的に知られている。
【００４６】
本明細書の文脈で用語アプタマーは、Ｋｄ≦１０Ｅ−８ｍｏｌ／Ｌを有する高親和性で他の分子または標的に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドまたはペプチドを指す。アプタマーは、抗体の特異的結合と同様に、その標的に結合する。アプタマーという用語は、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子、核酸類似体またはペプチド分子を包含する。アプタマーはまた、自己切断型ＲＮＡ分子、いわゆるリボザイムに結合することもある。アプタマーのデノボを得るための方法が知られているが、これには、いわゆる「ｓｅｌｅｘ」アプローチや、ランダムな選択から特定の結合剤を進化させることに基づく他の方法が含まれる。
【００４７】
本発明者らは、完全および部分的にＭＨＣミスマッチのＨＣＴのマウスモデルを用いて、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｃｓｆ−２）が、炎症性疾患の範囲にわたって新たな役割を持つサイトカインであり、移植後早期にドナーＴ細胞によって豊富に産生されることを示した。ドナーＴ細胞がＧＭ−ＣＳＦを欠くと、ＧｖＨＤは大幅に改善された。重要かつ驚くべきことに、ＧＭ−ＣＳＦの不存在は、マウスにおける腫瘍増殖を制御するドナーＴ細胞の能力（ＧｖＬ効果）に影響を与えず、この制御は、完全なＭＨＣミスマッチの文脈においてもＧｖＨＤの出現なしに達成された。本発明者らはまた、ＧｖＨＤ患者からの消化管生検において高レベルのＧＭ−ＣＳＦを発見したが、これは、ヒトの状態における平行した役割と一致する。したがって、本発明者らは、ＧＭ−ＣＳＦを、ａｌｌｏ−ＨＣＴを受けている患者がＧｖＬを維持しながらＧｖＨＤを減衰させるための新規の治療標的として提案する。
【００４８】
抗ＧＭＣＳＦ抗体または抗ＧＭＣＳＦＲ抗体の使用は、ＧｖＨＤの文脈で提案されてきたが、ここに提示されたデータは、ＧｖＨＤが、全原性移植の治療上の利益に影響を与えることなく、治療または抑制することができることを初めて示し、ＧｖＨＤ（貪食球媒介）を抑制しながら、体が移植片対白血病応答をマウントすることを可能にするために、本発明のリガンドを採用する臨床的根拠があることを示している。これにより、ＧｖＨＤのリスクのために現在はａｌｌｏ−ＨＣＴを予定していない患者をａｌｌｏ−ＨＣＴに含めることが可能になり、ａｌｌｏ−ＨＣＴ後の免疫抑制剤の使用をさらに制限することが可能になる可能性がある。
【００４９】
本発明の第１の態様は、ＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合する非アゴニストリガンド、またはＣＤ１１６、ＣＤ１３１、もしくはＣＤ１１６およびＣＤ１３１を含むＧＭ−ＣＳＦ受容体のいずれかに特異的に結合する非アゴニストリガンドであって、同種造血幹細胞移植（ａｌｌｏ−ＨＣＴ）を受けた患者における白血病の治療に使用するためのものに関する。すなわち、このリガンドは、同種造血幹細胞移植後の白血病の治療に用いられる。本発明の非アゴニストリガンドは、ＧＭ−ＣＳＦによってその受容体上に発現する生物学的信号を抑止し、ＧＭ−ＣＳＦの相互作用の下流効果をもたらす。従って、本明細書に記載された方法は、ＧｖＨＤが起こり得る任意の同種移植の文脈において、ＧｖＨＤの重症度を阻害または減少させるために使用されてもよいが、同種移植の有益な効果を著しく減少させることなく使用され得ることが理解されるであろう。
【００５０】
特定の実施形態において、本明細書に記載される方法は、白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫を含む血液悪性腫瘍を治療するための方法であって、悪性腫瘍に対するａｌｌｏ−ＨＣＴ治療の提供と同時に、またはそれに続いて、記載された非アゴニストリガンドを患者に投与することにより治療する方法である。
【００５１】
他の実施形態では、ＧｖＨＤの重症度を阻害または低減するための方法は、ＧＭ−ＣＳＦ産生または誘導細胞を十分に産生することによってＧｖＨＤを誘導する危険性が存在する同種間移植を、全同種と共に提供することを可能にする。肝臓移植は、そのような移植の非限定的な一例である。
【００５２】
特定の実施形態において、非アゴニスト抗ＧＭ−ＣＳＦ、抗ＣＤ１１６、抗ＣＤ１３１または抗ＧＭ−ＣＳＦレセプターリガンドは、抗体、抗体フラグメント、抗体様分子、アプタマーまたはタンパク質Ａドメイン由来のポリペプチドである。抗体、特にモノクローナル抗体の使用は、ヒト患者における治療のために一般的であり、実際、ＧＭ−ＣＳＦ特異的抗体およびＣＤ１１６特異的抗体は、他の治療目的のために開発されてきたが、当業者は、ＤＡＲＰＩＮｓ、アプタマー、または抗体由来分子のような他のモダリティが、本質的に同じ目的を果たすために使用されることがあると理解している。
【００５３】
いくつかの実施形態では、非アゴニスト抗ＧＭ-ＣＳＦ、抗ＣＤ１１６、抗ＣＤ１３１または抗ＧＭ-ＣＳＦ受容体ポリペプチドリガンドは、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む免疫グロブリンである。
【００５４】
いくつかの実施形態では、非アゴニスト抗ＧＭ−ＣＳＦ、抗ＣＤ１１６、抗ＣＤ１３１または抗ＧＭ−ＣＳＦ受容体ポリペプチドリガンドは、重鎖または軽鎖から単離された可変ドメインを含む単一ドメイン抗体である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、非アゴニスト抗ＧＭ−ＣＳＦ、抗ＣＤ１１６、抗ＣＤ１３１または抗ＧＭ−ＣＳＦ受容体ポリペプチドリガンドは、ラクダ類に見られる抗体のような重鎖のみを含む重鎖抗体である。
【００５６】
特定の実施形態では、非アゴニスト抗ＧＭ−ＣＳＦ、抗ＣＤ１１６、抗ＣＤ１３１または抗ＧＭ−ＣＳＦ受容体ポリペプチドリガンドは、抗体フラグメントである。
【００５７】
特定の実施形態では、非アゴニスト抗ＧＭ−ＣＳＦ、抗ＣＤ１１６、抗ＣＤ１３１または抗ＧＭ−ＣＳＦ受容体ポリペプチドリガンドは、特定の実施形態では、非アゴニスト抗ＧＭ−ＣＳＦ、抗ＣＤ１１６、抗ＣＤ１３１または抗ＧＭ−ＣＳＦレセプターポリペプチドリガンドは、Ｆａｂフラグメント、すなわち抗体の抗原結合フラグメント、または一本鎖可変フラグメント、すなわちペプチドリンカーによって連結された抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の融合タンパク質である。
【００５８】
ａｌｌｏ−ＨＣＴ後の白血病治療のマウスモデルにおける、ＧＭ−ＣＳＦに対する抗体を用いた治療の効果を図４に示す。
【００５９】
特定の実施形態では、リガンドはモノクローナル抗体であり、特定の実施形態では、リガンドはヒト抗体である。
【００６０】
特定の実施形態では、白血病などの血液悪性腫瘍を治療する方法で使用するためのリガンドは、同種造血幹細胞移植（ａｌｌｏ−ＨＣＴ）を受けた患者におけるヒト化抗体である。特定の実施形態では、リガンドはキメラ抗体である。
【００６１】
特定の実施形態では、ａｌｌｏ−ＨＣＴを受けた患者における白血病などの血液悪性腫瘍の治療方法で使用するためのリガンドは、マヴリリムマブ（ＣＡＳ  Ｎｏ．１０８５３３７−５７−０）である。特定の実施形態では、ａｌｌｏ−ＨＣＴを受けた患者における白血病などの血液悪性腫瘍の治療方法で使用するためのリガンドは、ナミルマブ（ＣＡＳ  Ｎｏ．１２０６６８１−３９−１）である。特定の実施形態では、ａｌｌｏ−ＨＣＴを受けた患者の白血病などの血液悪性腫瘍を治療する方法で使用するためのリガンドは、レンジルマブ（ＣＡＳ  Ｎｏ．１２２９５７５−０９−０）である。特定の実施形態では、ａｌｌｏ−ＨＣＴを受けた患者における白血病などの血液悪性腫瘍の治療方法における使用のためのリガンドは、オチリマブ（ＭＯＲ１０３またはＧＳＫ−３１９６１６５、ＣＡＳ  Ｎｏ．１６３８３３２−５５−４）である。特定の実施形態では、ａｌｌｏ−ＨＣＴを受けた患者における白血病などの血液悪性腫瘍の治療方法で使用するためのリガンドは、ギムシルマブ（ＭＯＲＡｂ−０２２、ＣＡＳ  Ｎｏ．１６４８７９６−２９−５）である。
【００６２】
特定の実施形態では、マヴリリムマブ、ナミルマブ、レンジルマブ、オチリマブ、またはギムシルマブのような抗体が、ＧｖＨＤの発生を阻害するか、またはその重症度を減少させる、同種移植を提供するための方法において使用され得ることが理解されるであろう。
【００６３】
特定の実施形態では、ａｌｌｏ−ＨＣＴを受けた患者における白血病の治療方法において使用するためのリガンドは、１０−７ｍｏｌＬ−１よりも小さいＫＤ、特にＫＤ＜１０−８ｍｏｌＬ−１、より具体的にはＫＤ＜１０−９ｍｏｌＬ−１であることを特徴とする。
【００６４】
本発明の第２の側面は、ａｌｌｏ−ＨＣＴを受けた患者の白血病を治療するための、本発明の第１の側面またはその特定の実施形態のいずれかに記載のリガンドをコードする核酸分子に関する。
【００６５】
特定の実施形態では、ａｌｌｏ−ＨＣＴを受けた患者の白血病などの血液悪性腫瘍の治療に使用するための核酸分子は、一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡ分子、または一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡ分子である。
【００６６】
特定の実施形態において、本発明に従ってａｌｌｏ−ＨＣＴを受けた患者の白血病または他の悪性腫瘍の治療に使用するための核酸分子は、哺乳動物細胞において作動可能なプロモーターの制御の下で、上記で規定された核酸配列からなる核酸発現構築物である。
【００６７】
特定の実施形態では、ａｌｌｏ−ＨＣＴを受けた患者における白血病などの血液悪性腫瘍の治療に使用するための核酸分子は、ＤＮＡプラスミド、二本鎖リニアＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、およびウイルスであって、特にレンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスから選択される発現構築物である。核酸発現構築物は、特定の遺伝子を標的細胞に導入するために使用され、遺伝子によってコードされるタンパク質を産生するために、細胞のタンパク質合成機構を指揮することができる。核酸発現構築物は、プロモーター領域として作用する調節配列、および任意にエンハンサー領域として作用する配列を含み、発現構築物上に担持された遺伝子の効率的な転写を導くように設計されている。
【００６８】
記載された方法で使用するための核酸発現ベクターは、当技術分野で一般的である。  哺乳類タンパク質の発現のための例示的なベクターは、特に、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ（マディソン、ウィスコンシン州）およびＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（ウォルサム、マサチューセッツ州）から入手可能なものが含まれる。
【００６９】
別の実施形態では、非アゴニストリガンドを投与する代わりに、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦの受容体（ＣＤ１１６およびＣＤ１３１）、またはＧＭ-ＣＳＦ受容体の個々のサブユニット（ＣＤ１１６および／またはＣＤ１３１）の発現を阻害することを含む治療方法を記載している。そのような方法では、ＧＭ−ＣＳＦまたはその受容体ペプチドの発現を阻害することが可能な核酸が、それを必要とする患者に提供される（例えば、ａｌｌｏ−ＨＣＴの後に、またはａｌｌｏ−ＨＣＴの間に）。特定の実施形態では、ターゲティング核酸は、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはそのようなものであってよい。適切な標的およびターゲティング配列を決定する方法は、当技術分野で公知である。
【００７０】
本発明の上記の他の側面では、ａｌｌｏ−ＨＣＴを受けた患者における白血病などの血液悪性腫瘍の治療に使用するための医薬組成物に関する。組成物は、ＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合する非アゴニストリガンド、またはＣＤ１１６、ＣＤ１３１もしくはＣＤ１１６とＣＤ１３１とを含むＧＭ−ＣＳＦ受容体のいずれか、またはそれをコードする核酸発現構築物と、薬学的に許容される担体であって、特に非経口投与用の投与形態、特に静脈内投与用の投与形態として製剤化された担体とから構成される。ＧＭ−ＣＳＦに対する抗体、およびＣＤ１１６、ＣＤ１３１、もしくはＣＤ１１６とＣＤ１３１とを含むＧＭ−ＣＳＦ受容体のいずれかに対する抗体が当技術分野で公知である。
【００７１】
ＧＭ−ＣＳＦに特異的なモノクローナル抗体が開発され、関節リウマチの有効性について臨床試験が行われている。本発明を実施するための抗体の非限定的な例としては、Ｃｏｈｅｎらの米国特許第２０１４／０７９７０８号明細書、米国特許第２０１２／１４１４６４号明細書、米国特許第２００９／１３００９３号明細書、米国特許第２０１４／０７９７０８号明細書および米国特許第２０１５／３７６２８５号明細書にすべて開示されているＣＤ１１６／１３１抗体が含まれ（マヴリリムマブ）、引用を以って本明細書の一部となす。
【００７２】
他の非限定的な例は、Ｈａｅｒｔｌｅらの米国特許第２０１５／２４６９６９号明細書に開示されたＧＭ−ＣＳＦ抗体（オチリマブ）、およびＫｉｒｃｈｎｅｒらの米国特許第２０１１／１８９０８２号明細書および米国特許第２０１３／０７１９２３号明細書の抗体であり、これらはすべて引用を以って本明細書の一部となす。
【００７３】
他の非限定的な例は、Ｓｔｅｉｄｌらの米国特許第２００９／０５３２１３号明細書、米国特許第２０１１／０４５０００号明細書、米国特許第２０１７／２１８０６１号明細書に開示されたＧＭ−ＣＳＦ抗体であり、これらはすべて引用を以って本明細書の一部となす。
【００７４】
また、ＧＭ−ＣＳＦに対する抗体は、武田薬品が関節リウマチに使用するために「Ｎａｍｉｌｕｍａｂ」の名称で開発を進めている。
【００７５】
ＧＭ−ＣＳＦに対するもう一つの抗体は、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＭＬ）の前治療歴のある患者を対象に、レンジルマブ（ＣＡＳ  Ｎｏ．１２２９５７５−０９−０）の名称で臨床試験が行われている。
【００７６】
同様に、本発明の範囲内では、ａｌｌｏ−ＨＣＴを受けた患者において白血病などの血液悪性腫瘍を治療する方法であって、非アゴニストリガンド、特に抗体、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＣＤ１１６、ＣＤ１３１もしくはＣＤ１１６とＣＤ１３１とを含むＧＭ−ＣＳＦ受容体のいずれかに特異的に結合する抗体を患者に投与するステップを含む方法が、上記の記載にしたがって提供される。
【００７７】
同様に、本発明の上記の側面のいずれかに従ったリガンドまたは核酸構築物を含む、ａｌｌｏ−ＨＣＴを受けた患者における白血病の予防または治療のための剤形が提供される。剤形は、経腸投与用のものであれば、例えば、経鼻投与用、頬側投与用、直腸投与用、経皮投与用、経口投与用、吸入投与用、坐剤投与用などがある。あるいは、皮下、静脈内、肝内、または筋肉内注射の形態などの非経口投与が使用されてもよい。必要に応じて、薬学的に許容される担体および／または賦形剤が存在してもよい。
【００７８】
本明細書で「実施形態」として単一の分離可能な特徴の代替案が示される場合は常に、そのような代替案を自由に組み合わせて、本明細書で開示される本発明の個別の実施形態を形成できることを理解されたい。
【００７９】
本発明は、以下の項目によって例示的にさらに説明される。
項目１：特異的に結合し、中和することができる非アゴニストリガンドの生理機能であって、ＧｖＨＤの治療に使用するためのもの。
−ＧＭ−ＣＳＦまたは
−ＣＤ１１６、ＣＤ１３１、およびＣＤ１１６とＣＤ１３１とを含むＧＭ−ＣＳＦ受容体の１つ
項目２：項目１に記載のＧｖＨＤの治療に使用するためのリガンドであって、抗体、抗体フラグメント、アプタマーまたは抗体様分子であるリガンド。
項目３：リガンドがヒト抗体またはヒト化抗体である、ＧｖＨＤの治療に使用するための項目１または２に記載のリガンド。
項目４：マヴリリムマブ、ナミルマブ、レンジルマブ、ＭＯＲ１０３およびＭＯＲａｂ−０２２から選択される、ＧｖＨＤの治療に使用するための前記項目のいずれか１項に記載のリガンド。
項目５：ＧｖＨＤの治療に使用するための前記項目のいずれか１つに従うリガンドであって、前記リガンドのＧＭ−ＣＳＦ、またはＣＤ１１６、ＣＤ１３１もしくはＣＤ１１６とＣＤ１３１とを含むＧＭ−ＣＳＦ受容体のいずれかへの結合が、１０−７よりも小さいＫＤ、特にＫＤ＜１０−８、より詳細にはＫＤ＜１０−９であることを特徴とする、ＧｖＨＤの治療に使用するための前記項目のいずれか１項に記載のリガンド。
項目６：ＧｖＨＤの治療に使用するための、上記の項目１〜４のいずれか１項に記載のリガンドをコードする核酸分子。
項目７：項目６に記載のＧｖＨＤの治療に使用するための核酸分子であって、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である核酸分子。
項目８：項目５または７に記載のＧｖＨＤの治療に使用するための、核酸配列を含む核酸発現構築物。
項目９：項目８に記載のＧｖＨＤの治療に使用するための核酸発現構築物であって、ＤＮＡプラスミド、二本鎖リニアＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、およびウイルス、特にレンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスから選択される核酸発現構築物。
項目１０：ａｌｌｏ−ＨＣＴの結果として生じる合併症の治療に使用するための、前記項目１〜５のいずれか１項に記載のリガンド、または項目６もしくは７に記載の核酸分子、または項目８もしくは９に記載の核酸発現構築物。
項目１１：前記項目１〜５のいずれか１項に記載のリガンド、または前記項目６もしくは７に記載の核酸分子、または前記項目８もしくは９に記載の核酸発現構築物であって、血液悪性腫瘍に罹患しているか、または回復している患者のａｌｌｏ−ＨＣＴの結果として生じる合併症の治療に使用するためものであり、前記血液悪性腫瘍は、
−特に白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫から選択される血液悪性腫瘍、
−より具体的には、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）および急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）から選択される血液悪性腫瘍であって、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫である。
【００８０】
本発明は、以下の実施例および図によってさらに例示され、そこからさらなる実施形態および利益を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を例示することを意図しているが、その範囲を限定するものではない。
【００８１】
例
材料と方法
研究デザイン
この研究は、ある種のＴ細胞由来のサイトカインがＧｖＨＤとＧｖＬを分離できるかどうかを判断するために開始されたもので、血液悪性腫瘍の治療における有望な新規治療標的となる可能性がある。この目的を達成するために、ＧｖＨＤの実験モデルであるＧｖＬの実験モデルとヒトの実験モデルの２種類を用いた。すべての動物実験は、地方自治体（スイス・カントーナル獣医局）の承認を受け、適切な実験ライセンス（７６／２０１２および０５２／２０１５）に基づいて実施された。動物を無作為に実験グループに割り当て、生存期間の臨床スコアを盲検法で実施したほか、臓器切片の画像分析処理を行った。サンプルサイズと疾患の終了時点は、先行研究に基づいて選択した。フローサイトメトリー、病理組織学的分析、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）、キリングアッセイ、サイトカイン分析を行い、ＧｖＨＤ／ＧｖＬ標的臓器の特徴を明らかにした。特異的なＧＭ−ＣＳＦブロッキング抗体の臨床スコアに対する効果を、治療の盲検化を行った治験責任医師が評価した。信頼できる統計分析を行うために、図の凡例で特に示されていない限り、原稿に示されている各データに対して少なくとも３つの独立した実験が行われた。すべてのヒトサンプルは、書面によるインフォームドコンセントに基づき、ドイツのアルベルト・ルートヴィヒ大学フライブルク校倫理委員会（プロトコル番号：２６７／１１）の承認を得た後に採取した。腸生検では免疫組織化学と定量的ＲＴ−ＰＣＲを、ＰＢＭＣではマルチパラメーターフローサイトメトリーを行った。
【００８２】
マウスおよび生体内操作
マウスは、特定の病原体のない条件で、個別に換気されたケージで飼育された。ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃおよびＢ６Ｄ２Ｆ１マウスは、フランスのＪａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。先天性Ｃ５７ＢＬ／６  ＣＤ４５．１マウスを社内で飼育した。Ｉｆｎｇ−／−マウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、Ｃｓｆ２−／−マウスはＪｅｆｆｒｅｙ  Ｗｈｉｔｓｅｔｔから提供され、さらにスピードコンジェニック法を用いてＣ５７ＢＬ／６に逆交配した。ＩＩ１７ａ−／−マウスはＹ．Ｉｗａｋｕｒａより提供された。すべての動物実験は、地方自治体（スイス、カントーナル獣医局）の認可を受け、適切な実験ライセンス（７６／２０１２および０５２／２０１５）に基づいて実施された。実験には７〜１２週齢の雌マウスを使用した。
【００８３】
ＧｖＨＤの誘導：ドナーＣ５７ＢＬ／６マウスまたはＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓およびＢＭからの単細胞懸濁液を以下のように調製した（「リンパ球の単離」の項参照）。ＢＭのＴ細胞枯渇のために、細胞を２５×１０６／ｍＬで完全なＲＭＰＩ（ＲＰＭＩ１６４０、１０％のＦＣＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび０．５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む）中で、αＣＤ９０．２−ビオチン（１：１００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を添加して、撹拌しながら４℃で３０分間インキュベートした。その後、冷たいＭＡＣＳ緩衝液（０．５％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ）で洗浄するステップの後、細胞をＭＡＣＳ緩衝液中で１００×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで再懸濁し、抗ビオチンビーズ（１：５、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）またはストレプトアビジンビーズ（１：１０、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で撹拌しながら４℃で２０分間インキュベートした。ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＡｕｔｏＭＡＣＳＰｒｏで、「ｄｅｐｌｅｔｅｓ」プログラムを用いて細胞を分離した。陰性画分を収集し、血算盤を用いて細胞数を測定した。枯渇効率はフローサイトメトリーで分析した。ＢＭ中のＴ細胞頻度は１〜３％から０．０５５＋／−０．０２２％に減少した。脾臓細胞から非標識Ｔ細胞を分離するために、製造者のプロトコルに従って、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社のＰａｎ  Ｔ細胞分離キット（ＩＩ）を使用した。 Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＡｕｔｏＭＡＣＳＰｒｏで、「ｄｅｐｌｅｔｅｓ」プログラムを用いて細胞を分離した。陰性画分を収集し、血算盤を用いて細胞数を測定した。濃縮効率はフローサイトメトリーで分析し、Ｔ細胞純度は通常  ９５．２＋／−２．１６％であった。ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞は、メーカーの指示（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）に従って、ＭｏｊｏＳｏｒｔＭｏｕｓｅ  ＣＤ４  Ｔ細胞単離キットおよびＭｏｊｏＳｏｒｔＭｏｕｓｅ  ＣＤ８  Ｔ細胞単離キットを用いて分離した。
【００８４】
レシピエントＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＢ６Ｄ２Ｆ１マウスを、フィルターケージ内の特定の病原体のない条件下で、８５０（ＢＡＬＢ／ｃ）、１２００（Ｂ６Ｄ２Ｆ１）または１１００（Ｃ５７ＢＬ／６）ｒａｄの分割線量で致死的に照射し、少なくとも５時間の間隔を置いた。レシピエントには、Ｃ５７ＢＬ／６またはＢ６Ｄ２Ｆ１マウス１匹あたり、ＢＭ細胞５×１０６個、脾臓細胞０．１−１０×１０６個、またはＴ細胞６−７．５＊１０６個を静脈注射した。レシピエントに、７×１０６個のＢＭ細胞と２０×１０６個の脾臓細胞／ＢＡＬＢ／ｃマウスをｉ．ｖ．注射したマウスには、細菌感染を防ぐために、飲料水に０．１％のＢｏｒｇａｌ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ）を３週間投与した。マウスはまた、（Ｃｏｏｋｅ、Ｋ．Ｒ．他「Ａｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｆｔｅｒ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：  Ｉ．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｍｉｎｏｒ  Ｈ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ．」Ｂｌｏｏｄ８８，  ３２３０−３２３９（１９９６））および補足表４に示されているものから適応するＧｖＨＤ症状のために毎日スコアされた。研究者はＧｖＨＤをスコアリングする際、グループの割り付けを盲検化した。基準体重は０日目、移植細胞注入前に測定した。ＧＭ-ＣＳＦのブロッキングのために、マウスをＰＢＳ、３００μｇアイソタイプコントロール（２Ａ３）または３００μｇ抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体（ＭＰ１）（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）でＨＣＴの２日前から３回／週に分けて処理した。
【００８５】
ＧｖＬの誘導：Ａ２０−ルシフェラーゼ＋ＧＦＰ＋Ｂ細胞リンパ腫細胞株（Ａ２０−ｌｕｃ−ｇｆｐ、Ｅｍｍａ  Ｓｖｅｎｓｓｏｎ、免疫学、遺伝学および病理学部門、スウェーデン、ウプサラ大学より提供）は、Ａ２０（ＡＴＣＣ）をＣＭＶ−ＧＦＰ−（Ｔ２Ａ）−Ｌｕｃをコードするレンチウイルスで導入することにより、ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドで生成された。ＷＥＨＩ−３−ルシフェラーゼ＋細胞は、Ｒ．Ｚｅｉｓｅｒによって提供された。ＨＣＴ当日、マウス１匹あたり２．５×１０５個のＡ２０細胞、５×１０５個のＡ２０細胞、または１×１０５個のＷＥＨＩ−３細胞と、５×１０６  ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６  ＢＭ細胞と、ＷＴマウスもしくはＣｓｆ２−／−  Ｃ５７ＢＬ／６マウスのいずれかからの１×１０５精製脾臓Ｔ細胞／マウスを単独で、または一緒に静脈内注射した。ＨＣＴ当日、マウス１匹あたり２．５×１０５個のＡ２０細胞と、５×１０６  ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６  ＢＭ細胞と、ＷＴもしくはＣｓｆ２−／−  Ｃ５７ＢＬ／６マウスのいずれかからの１×１０５精製脾臓Ｔ細胞／マウスを単独または一緒に静脈内注射した。腫瘍の進行は、生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって監視した。Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  ２００  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ウォルサム、マサチューセッツ州）を使用してイメージングする１０分前にＰＢＳでＤ−ルシフェリン（プロメガ）の１５０ｍｇ／ｋｇをマウスの腹腔内に注入した。露光時間１〜１２０秒、ビニング２〜８、視野１５ｃｍ、絞り値１、フィルタなしである。
【００８６】
マウスは、イメージングの前と中にイソフルラン（２％はＯ２で気化）で麻酔をかけた。全光子束（光子／秒）は、リビングイメージソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を使用して、全身にわたって固定された関心領域（ＲＯＩ）から測定した。写真は常に各ケージで撮影され、マウスの異なるグループが同じケージ内で混合されたときにはトリミングされている。腫瘍とＧｖＨＤの死亡率は、ＢＬＩ信号強度（腫瘍の発生率についてはＲＯＩ＞１＊１０７）、後肢麻痺（腫瘍の発生を示す）およびＧｖＨＤの臨床症状（個々のＧｖＨＤ基準のうち２つで少なくともグレード２）によって区別された。ＧＭ−ＣＳＦをブロックするために、マウスをＨＣＴの２日前から３００μｇのアイソタイプコントロール（２Ａ３）または３００μｇの抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体（ＭＰ１）（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）で週３回処理した。３週目からは抗体の投与量を１５０μｇに減少させた。
【００８７】
リンパ球の分離
ＣＯ２吸入を用いてマウスを安楽死させ、４０ｍＬの低温ＰＢＳで灌流した。以下で特に指定しない限り、臓器を採取し、小片に切断し、３７℃でコラゲナーゼを用いてインキュベートし、次いで２０ゲージ針を介して繰り返し通過させることにより機械的に破壊した。赤血球溶解を行い、得られた細胞懸濁液は、次いで、７０μｍの細胞ストレーナーで濾過し、さらなる手順に使用した。
【００８８】
脾臓：骨ミエロイド細胞の単離のために、臓器片を２ｍＬのコラゲナーゼＤ（０．４ｍｇ／ｍＬ、Ｒｏｃｈｅ社）および０．１ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ社）のＲＰＭＩ中において３７℃で３０分間インキュベートした。Ｔ細胞の単離のために、脾臓を機械的破壊によってホモジナイズし、７０μｍのセルストレーナーを介してろ過した。
【００８９】
ＢＭ：大腿骨、脛骨、骨盤をＰＢＳフラッシングし、ＢＭ幹細胞を得た。
【００９０】
肝臓：臓器片を、１０％のＦＣＳを含むＨＢＳＳ中の１．６ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼタイプＩＶ（クロストリジウム  ヒストリチクム、Ｓｉｇｍａ社）中において３７℃で約４５分間インキュベートした。細胞を１０ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ（連続勾配、２７％、ＧＥ）に再懸濁し、ＲＴ１７００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。脂肪および上清を除去し、ペレットを赤血球溶解にかけた。
【００９１】
皮膚：臓器片を、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼタイプＩＶ（クロストリジウム  ヒストリチクム、Ｓｉｇｍａ社）および０．１ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ社）をＲＰＭＩにおいて３７℃で１．５〜２時間インキュベートした。
【００９２】
小腸：器官について、管腔粘液を機械的に除去する前に腸間膜脂肪から分離した。そして、器官を、２％のＦＣＳ、１ｍＭのＤＴＴおよび１．３５ｍＭのＥＤＴＡを含むカルシウムおよびマグネシウムを含まないＨＢＳＳ中において３７℃で１５分間インキュベートした。ＥＤＴＡを補ったＨＢＳＳにおいて３７℃で３０分間さらにインキュベーションした後、大腸を切断し、３７℃で４５分間、０．４ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用して消化した。サンプルは、その後、１８ゲージ針とシリンジを使用してホモジナイズし、７０μｍの細胞ストレーナーを介してろ過した。
【００９３】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析を、（Ｐｅｒｆｅｔｔｏ，Ｓ．Ｐ．Ｐ．、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ，Ｐ．Ｋ．およびＲｏｅｄｅｒｅｒ，Ｍ．の「Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ−ｃｏｌｏｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、ｕｎｒａｖｅｌｌｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．」Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４，  ６４８−６５５（２００４））でレビューされている標準的な方法に従って行った。全ての蛍光色素コンジュゲート抗体について、滴定実験を用いて最適濃度を決定した。ＣＤ４（ＧＫ１．５）、ＣＤ８（５３−６．７）、ＣＤ３（１７Ａ２）、ＣＤ４５（３０Ｆ１１）、ＣＤ４５．１（Ａ２０）、ＣＤ４５．１（１０４）、ＣＤ４４（ＩＭ７）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４）、ＣＤ６９（Ｈ１．  ２Ｆ３）、ＭＨＣクラスＩ  Ｈ２−Ｄｄ（３４−２−１２）およびＨ２−Ｄｂ（ＫＨ９５）、ＧＭ  ＣＳＦ（ＭＰ１−２２Ｅ９）、ＩＦＮγ（ＴＣ１１−１８Ｈ１０）、ＩＬ−１７Ａ（ＸＭＧ１．２）およびＦｏｘＰ３（ＦＪＫ−１６ｓ）は、ＢＤ社、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社のいずれかから入手した。表面染色のために、細胞をそれぞれの抗体と共に４℃で２０〜３０分間インキュベートした。すべての実験で、死細胞は、アクアまたは近赤外ライブ／死固定染色試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して分析から除外され、ダブレットは、ＦＳＣ−Ａｒｅａ対ＦＳＣ−Ｈｅｉｇｈｔゲーティングによって除外された。細胞内サイトカイン染色のために、Ｔ細胞を、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍＬ）、イオノマイシン（５００ｎｇ／ｍＬ）およびゴルジプラグ（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ、ＢＤを１：１００００希釈で含む）を含む１０％のＦＣＳのＲＰＭＩ中で、３７℃で４〜５時間インキュベートした。表面染色後、メーカーの指示に従ってＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ社）を使用し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーは自社で調製した（０．５％のサポニンと５％のＢＳＡを含むＰＢＳ）。細胞内染色のために、細胞をそれぞれの抗体と一緒に４℃で２０〜３０分間インキュベートした。核内ＦｏｘＰ３染色については、表面染色後にＦｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用し、次いで社内で調製したＰｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーを使用した。
【００９４】
一般に、細胞は、破片を除外するためにＦＳＣ−ＡｒｅａおよびＳＳＣ−Ａｒｅａに基づいてゲーティングされ、ダブレットは、ＦＳＣ−Ａｒｅａ対ＦＳＣ−Ｈｅｉｇｈｔゲーティングによって除外された。死細胞は、ＡｑｕａまたはＮｅａｒ−ＩＲ  Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  固定染色試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社／ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を用いて分析から除外した。該当する場合は、ＣＤ４５．１細胞をＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞にゲーティングする前にゲーティングした。ゲーティングに使用したすべてのマーカー（ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９）は、陰性集団と陽性集団の明確な分離を示した。キリングアッセイ細胞については、シングレットを上記のようにゲーティングし、次いで腫瘍細胞をＣｅｌｌｌ  Ｔｒａｓｅ  ｖｉｏｌｏｔｅによって同定し、ＴＯＰＲＯ−３取り込みを示すヒストグラムを生成した。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ社）またはＬＳＲ  ＩＩ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（特注研究製品、ＢＤ社、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍおよび６４０ｎｍのレーザーラインを装備）のいずれかを用いて、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを用いて実施した。データ解析はＦｌｏｗＪｏ  １０．０．ｘ（Ｔｒｅｅ  ｓｔａｒ社）を用いて行った。
【００９５】
ＳＴＡＴ５リン酸化のフローサイトメトリー解析
骨髄の単細胞懸濁液を２０分間表面染色し、その後ＧＭ−ＣＳＦ含有培地（２０ｎｇ／ｍＬ）を添加した。細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、ＳＴＡＴ５のリン酸化を誘導した後、４％のＰＦＡ溶液（ｐＨ７．４）を最終濃度の２％に添加した。細胞を２０分間固定し、洗浄し、１ｍＬの４℃メタノール中に再懸濁した。４０分後、細胞を２回洗浄し、４５μＬのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁した５μＬの抗ｐＳＴＡＴ５  ＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を、１：１０の最終染色比になるように添加した。細胞を、最終的な洗浄ステップおよび捕捉の前に、４℃で４５分間インキュベートした。 フローサイトメトリー解析は、ＬＳＲ  ＩＩ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（特注研究品、ＢＤ社、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、６４０ｎｍのレーザーラインを搭載）を用いて、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて行った。データ解析はＦｌｏｗＪｏ  １０．０．ｘ（Ｔｒｅｅ  ｓｔａｒ社）を用いて行った。
【００９６】
フローサイトメトリーによるヒトＰＢＭＣの表現型分析
３７℃の水浴で解凍するまで、凍結保存したＰＢＭＣを液体窒素中で保存した。細胞を、１：１０，０００ベンゾナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で補充した、１ｍＬの予め加温した細胞培養培液（ＣＣＭ、ＲＰＭＩ−１６４０（ＰＡＮ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）、１０％のＦＣＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社））、１×Ｌ−グルタミン、および１×ペニシリン／ストレプトマイシン（いずれもＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｅｓ社））中で穏やかに再懸濁した。その後、細胞を５ｍＬチューブに移し、ＣＣＭで洗浄し、細胞を計数し、ＣＣＭ中で２０×１０６細胞／ｍＬに調整した。フローサイトメトリーでサイトカイン産生を決定するためにゴルジプラグ（ブレフェルジンＡ、ＢＤ社、１：１０００希釈）およびゴルジストップ（モネンシン、ＢＤ社、１：１０００希釈）の存在下において、５０ｎｇ／ｍＬのフォルボル１２−ミリスチン酸１３−アセテート（ＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）および１μｇ／ｍＬ  のイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で、細胞を３７℃で４時間刺激した。非特異的結合は、Ｈｕｍａｎ  ＴｒｕＳｔａｉｎ  ＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を用いてブロックした。
【００９７】
Ｃ５７ＢＬ／６  ＷＴ、Ｃｓｆ２−／−、Ｉｆｎｇ−／−、またはＩｌ１７ａ−／−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ  Ｔ細胞を、ＢＡＬＢ／ｃ（同種遺伝子）マウスまたはＣ５７ＢＬ／６（同系遺伝子）マウスのＤＣと共培養した。あるいは、ＢＡＬＢ／ｃ  ＷＴ  ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ  Ｔ細胞を、ＢＡＬＢ／ｃ（同系遺伝子）またはＣ５７ＢＬ／６  ＷＴおよびＣｓｆ２ｒｂ−／−  ＤＣｓ（同種遺伝子）からのＤＣと共培養した。Ｔ細胞およびＤＣは、それぞれ抗ＣＤ４および抗ＣＤ８（Ｔ細胞用）または抗ＣＤ１１ｃ（ＤＣ用）磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）およびＡｕｔｏＭＡＣＳ  Ｐｒｏを用いたポジティブセレクションにより脾臓細胞から精製した。細胞は、３７℃、５％のＣＯ２の完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で３日間、１／１０（２＊１０４ＤＣｓ、２＊１０５Ｔ細胞）の刺激剤／応答剤比でＵ底９６ウェルプレート中に３倍速でプレーティングした。その後、培養上清を回収し、希釈した３Ｈ−チミジン（１／１００、５０μＣｉ）で１６時間置換した。細胞を９６ウェルハーベスター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）によって採取し、シンチレーションをβカウンター（１４５０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｐｌｕｓ，Ｗａｌｌａｃ）で測定した。
【００９８】
キリングアッセイ
Ｐａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ，  ｍｏｕｓｅ（ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いて、脾臓およびリンパ節のＴ細胞を単離した。  Ａ２０−ルシフェラーゼ＋ＧＦＰ＋またはＷＥＨＩ−３−ルシフェラーゼ＋細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃ３４５５７）で染色した。細胞を、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ中で、可溶性α−ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）およびα−ＣＤ２８（０．５μｇ／ｍＬ）の存在下においてエフェクター／ターゲット比１：１、２０：１、５０：１で、５％のＣＯ２中で３７℃、２４時間インキュベートした。培地を除去した後、Ｔｏｐｒｏ（０．８μＭ）を細胞に添加し、ＬＳＲＩＩ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ社）上で細胞を取得した。データは、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｘ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を用いて分析した。パーセンテージ比溶出は、以下のように計算した。
［（実験的溶解−自発的溶解）／（最大溶解−自発的溶解）］×１００％
【００９９】
Ｔｒｅｇ抑制アッセイ
前述のように、Ｃ５７ＢＬ／６  ＷＴマウスおよびＣｓｆ２−／−マウスからリンパ節および脾臓からＴ細胞を単離した。ＣＤ４  Ｔ細胞は、まずＣＤ４単離キット（ＭｏｊｏＳｏｒｔ、Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ４  Ｎａｎｏｂｅａｄｓ）を用いて濃縮し、次いでＣＤ４５、ＣＤ２５、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４で染色した。純度９８〜９９％のＢＤ  ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩセルソーターを使用し、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ６２Ｌ＋（Ｔｃｏｎｖ）およびＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ（Ｔｒｅｇ）細胞をフローサイトメトリーで選別した。  ＡＰＣを＞３４００ラド（４分、１２．２Ｇｙ／ｍｉｎ、２２５ｋＶ、１７．７ｍＡ）で照射し、１０％のクローン培液中で４ｘ１０６／ｍＬ（または２ｘ１０６細胞／ｍＬ）に希釈した。ＡＰＣおよびＴｃｏｎｖ細胞は、９６ウェル丸底プレート（ウェルあたり４ｘ１０４  Ｔｃｏｎｖ）中で、濃度を変えて自家Ｔｒｅｇ細胞と共培養した。細胞を、１μｇ／ｍＬの濃度のαＣＤ３において３７℃で２日間刺激し、次いで３Ｈ−チミジンで１６時間インキュベートした。細胞をＦｉｌｔｅｒＭａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて採取し、プログラムＭｉｃｒｏｂｅｔａを用いてβカウンターで分析した。Ｔｒｅｇ抑制率は、生きている細胞の中で［（（ｃｐｍ  Ｔｃｏｎｖ−ｃｐｍ  Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎｖ）／ｃｐｍＴｃｏｎｖ単独）＊１００］として計算し、ｃｐｍは１分間のカウント数で、Ｔｃｏｎｖ細胞の抑制率として計算した。
【０１００】
サイトカイン分析
血清は、ａｌｌｏ−ＨＣＴレシピエントマウスから指定された時間に得た。ＭＬＲの培養上清は、３日間の共培養後に採取した。血清または細胞培養上清中のＧＭ-ＣＳＦ、ＩＦＮγおよびＩＬ-１７Ａの測定は、製造者の指示（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社およびＢｉｏｌｏｇｅｎｄ社）に従ってサイトカイン特異的ＥＬＩＳＡにより行った。
【０１０１】
肝機能パラメータ
肝酵素（（アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ））、アルブミン及び血中尿素窒素（ＢＵＮ）は、Ｐｉｃｃｏｌｏ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐａｎｅｌ  Ｐｌｕｓ（Ａｂａｘｉｓ社）を用いてマウスの血清中で測定した。
【０１０２】
組織学
病理組織学的評価のために、臓器をＨＯＰＥ（ＤＣＳ、ハンブルグ、ドイツ）に固定し、パラフィンに埋め込んだ。３〜５μｍの切片をマイクロトーム（Ｍｉｃｒｏ  ＨＭ  ３２５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で切断し、その後ヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。組織学的ＧｖＨＤスコアを生成するために、半定量的な組織特異的スコアリングシステムを使用した。絨毛の鈍化、陰窩の再生、陰窩細胞のアポトーシス、徹底的な陰窩破壊と粘膜固有層リンパ球浸潤を含む小腸のパラメータのために、次のスコアで評価された。０＝正常、０．５＝焦点性でまれ、１＝焦点性で軽度、２＝拡散性で軽度、３＝拡散性で中程度、４＝拡散性で重度、（Ｈｉｌｌ，  Ｇ．  Ｒ．他「Ｔｏｔａｌ  ｂｏｄｙ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ、  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．」Ｂｌｏｏｄ９０、３２０４-３２１３（１９９７））から引用。
【０１０３】
皮膚については、以下のパラメータが評価された。推定毛包数：０＝正常（比較的接近して配置）、０．５＝わずかに減少（通常は局所的）、推定皮脂腺数：０＝正常（比較的大きな細胞、小さなグループ、ヘアネックレベル）、１．０＝わずかに減少（数とサイズ、通常は局所的）、２．０＝明らかに減少（少数の細胞のみ存在）、皮脂腺アポトーシスと変性：０＝存在しない、０．５＝まれ、１＝関与する腺の数が少ない、２＝中程度の数の腺が関与する毛包のアポトーシス＆変性。０＝存在しない、０．５＝まれ、１＝関与する毛包の数が少ない、２＝関与する毛包の数が中程度、３＝関与する毛包の数が多い。白血球浸潤（付属外）：０＝低、１＝わずかに増加、２＝中等度に増加。白血球浸潤（付属）：０＝存在しない、１＝わずか、２＝中等度。表皮（アポトーシス細胞、白血球浸潤）：０＝存在しない、０．５＝まれ、１＝少ない、２＝中等度、３＝多い。皮下脂肪：０＝連続、１＝連続していない、２＝不在、（Ｋａｐｌａｎ，  Ｄ．  Ｈ．他、「Ｔａｒｇｅｔ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３、５４６７-５４７５（２００４））から引用。
【０１０４】
門脈拡張と浸潤、胆管浸潤、核胆管多層化、ピクノティック胆管細胞、上皮内胆管細胞、血管内皮炎、肝細胞汎小葉壊死、好酸球、微小膿瘍、細胞分裂の数値、肝細胞ステアトーシスを含む肝臓のパラメータについて、以下のスコアで評価した。０＝正常、０．５＝局所的でまれ、１＝局所的で軽度、２＝拡散性で軽度、３＝拡散性で中等度、４＝拡散性で重度、（Ｈｉｌｌ，  Ｇ．  Ｒ．他、「Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１１  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ａｃｕｔｅ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｆｔｅｒ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．」  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０２，  １１５-１２３（１９９８））から引用。すべてのスライドをコード化し、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４１  ＴＦ顕微鏡上においてブラインド方式で読み取った。
【０１０５】
人間の被験体
すべてのヒトサンプルは、書面によるインフォームドコンセントに基づき、アルベルト・ルートヴィヒ大学フライブルク校（ドイツ）の倫理委員会（プロトコル番号：２６７／１１）の承認を得た後に収集された。腸管組織生検は、２００７年から２０１４年の間にＧｖＨＤ患者または健常対照者から前向きな方法で収集された。腸ＧｖＨＤの等級付けは、公表された病期分類システム（Ｌｅｒｎｅｒ，  Ｋ．  Ｇ．他、「Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｇｒａｆｔ−ｖｓ．−ｈｏｓｔ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  （ＧｖＨＲ）  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｏｆ  ｍａｒｒｏｗ  ｆｒｏｍ  ＨＬ−Ａ−ｍａｔｃｈｅｄ  ｓｉｂｌｉｎｇ  ｄｏｎｏｒｓ．」Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  Ｐｒｏｃ．  ６，  ３６７-３７１（１９７４））に従い、病理組織学に基づいて経験豊富な病理医によって行われた。対照個体は腸生検で異常を示さなかった。レシピエントの年齢、性別、基礎となる診断、ドナーおよび移植片の種類、前処置レジメン、免疫抑制レジメンおよびＧｖＨＤのグレードを含む患者の特徴は、ＧｖＨＤ患者については補足表１および３に、対照者については補足表２に詳細に記載されている。
【０１０６】
免疫組織化学
製造者の指示に従って、固定パラフィン包埋組織切片において、二段階ＩＨＣ染色キットＥｎＶｉｓｉｏｎ＋Ｓｙｓｔｅｍ  ＨＲＰ  ＤＡＫＯ（グロストルプ、デンマーク）を用いて免疫組織化学を実施した。切片について、Ｄａｋｏ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１ｘ）で１０分間熱媒介抗原検索を行った。内因性ペルオキシダーゼ活性を、ＤＡＫＯ内因性ペルオキシダーゼブロッキングキットを用いて、ＲＴで３０分間ブロックした。一次抗体をＰＢＳ＋５％のＮｏｒｍａｌ  Ｇｏａｔ  Ｓｅｒｕｍ（ＮＧＳ）で希釈した。単一免疫染色は、ヒト被験者からの生検については非共役ｍＡｂ抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体（クローン３２０９．１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＩｇＧアイソタイプコントロール、マウス組織切片についてはラットα−Ｆ４／８０（クローンＣＩ、Ａ３−１、ＢｉｏＲａｄ）およびウサギα−ｐ２２ｐｈｏｘ（クローンＦＬ−１９５、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いて、４℃で一晩インキュベートすることで行った。クロモゲンとしてＤＡＢを使用した。次いで、切片をヘマトキシリンで対比染色し、ＤＰＸでマウントし、カラーカメラＣｏｌｏｒＶｉｗｅｒＩＩＩｕ（Ｏｌｙｍｐｕｓ社）と結合した光顕微鏡オリンパスＢＸ４１で分析し、Ｆｉｊｉ／ＩｍａｇｅＪソフトウェアパッケージ（ＧＮＵ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｌｉｃｅｎｓｅ）を用いて分析した。
【０１０７】
免疫蛍光法
組織を免疫組織化学のためにＨｙｒａｘ  Ｃ６０  ｃｒｙｏｓｔａｔ（Ｚｅｉｓｓ社）を使用して凍結切除（厚さ１０μｍ）し、−８０℃で保存した。切片は、４％ＰＦＡで固定し、ＰＢＳで洗浄し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と４％の正常ヤギ血清を補充したＰＢＳでブロックした。その後、切片を、以下の一次抗体、ラット抗ＧＭＣＳＦ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、クローンＢＶＤ２−２１Ｃ１１、１：５０）、ウサギα−ＣＤ３（Ｎｏｖｕｓ、クローンＳＰ７、１：２００）およびマウス抗ＣＤ６８抗体（ＤＡＫＯ、クローンＥＭＢ１１、１：５０）でインキュベートし、一晩４℃のブロッキング溶液中で希釈した。切片を、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）含有のＳｌｏｗＦａｄｅ  Ｇｏｌｄ褐色防止用封入剤でマウントした。蛍光顕微鏡写真は、アルゴンおよびヘリウムレーザーを備えたライカ共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＳＰ５、Ｌｅｉｃａ社、ヘーアブルーク、スイス）の４０倍対物レンズ（油浸、ＮＡ１．２５）を使用して撮影した。画像は、Ｉｍａｒｉｓイメージングソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ社、チューリッヒ、スイス）によって処理され、マージされた。
【０１０８】
ＴＵＮＥＬアッセイ
４％のＰＦＡで固定した切片を、大腸内の断片化された核を検出するためにＴＵＮＥＬアッセイのために処理した。メーカーの指示にしたがって、ＡｐｏｐＴａｇ  Ｒｅｄ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用した。簡潔に言えば、スライドをＨ２Ｏ２で前処理し、３７℃で１時間、ＴｄＴおよびジゴキシゲニン結合ｄＵＴＰを含む反応混合物でインキュベートした。標識ＤＮＡはＡＦ４８８標識二次抗体で可視化した。蛍光顕微鏡写真は、４０倍対物レンズ（油浸、ＮＡ１．２５）を使用して、アルゴンおよびヘリウムレーザーを装備したＳＰ５ライカ共焦点レーザー走査顕微鏡（ＳＰ５、Ｌｅｉｃａ社、ヘーアブルーク、スイス）を用いて撮影した。画像は、Ｉｍａｒｉｓイメージングソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ社、チューリッヒ、スイス）によって処理され、マージされた。
【０１０９】
ＲＮＡ分離および定量的ｒｔ−ＰＣＲ
メーカーの指示に従い、ＲＮｅａｓｙ  ＦＦＰＥキット（Ｑｉａｇｅｎ社、キシレンを用いた脱パラフィン化）を用いて、固定パラフィン包埋組織切片からＲＮＡを単離した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて推定した。第１鎖ｃＤＮＡ合成には、メーカーの指示に従ってＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用した。遺伝子発現は、ＣＦＸ  ３８４リアルタイム検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、ハーキュリーズ、カリフォルニア、ＵＳＡ）とＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を使用したリアルタイム定量ＰＣＲ分析によって測定した。ＰＣＲプライマーの配列は、以下の表に示すとおりである。トランスクリプト発現をＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子に正規化し、２−ΔΔＣＴ（ΔΔＣＴ＝ΔＣＴ−ΔＣＣｏｎｔｒｏｌ）として表した。
【０１１０】
2021514368.tif 000004
【０１１１】
高次元データ解析における母集団識別の自動化
ＢＤ  ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙＴＭセルアナライザーで取得したデータを補正し、ＦｌｏｗＪｏ  バージョン  ｖ１０．４（ＴｒｅｅＳｔａｒ社）でエクスポートし、Ｃｙｔ  ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（バージョン２０１７ｂ）を用いて正規化し、非バイアス分析を、以下に記載されているように行った（Ｎｏｗｉｃｋａ他、Ｆ１０００Ｒｅｓ  ６，  ７４８（２０１７）、Ｈａｒｔｍａｎｎ他、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ２１３，  ２６２１-２６３３（２０１６））。
【０１１２】
統計学
グラフは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて作成した。生存曲線はカプラン・マイヤー法でプロットされ、生存曲線の比較にはログランク（マンテル・コックス）検定を使用した。データは、個々のデータポイントとして、または図の凡例に示されているように、平均＋／−標準偏差（ＳＤ）または平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表示される。平均の比較は、対応のない２群についてのｔ検定（該当する場合はウェルチ補正を含む）、またはボンフェローニ事後検定を用いた一元および二元配置分析を用いて、それぞれ実施した。サンプルサイズを決定するための統計的手法は使用されていないが、我々のサンプルサイズは現場で一般的に使用されているものと同様であった。無作為化の方法は使用しなかった。
【０１１３】
データの可用性
本研究の間に生成されたデータセット、および/または分析されたデータセットは、合理的な要求があれば、対応する著者から入手可能である。
【０１１４】
例１
組織浸潤ドナーＴ細胞は、ＭＨＣミスマッチのＨＣＴに続いてＧＭ−ＣＳＦとＩＦＮγを産生する。急性ＧｖＨＤに対するＴ細胞由来ＧＭ−ＣＳＦの寄与を理解するために、本発明者らは、まず、ＭＨＣミスマッチのＨＣＴのモデルを採用した。本発明者らは、野生型（ＷＴ）ＢＡＬＢ／ｃ  ＣＤ４５．２＋マウス（ＭＨＣハプロタイプＨ２ｄ）に致死量の放射線を照射した後、成熟Ｔ細胞の供給源となるＢ６  ＣＤ４５．１＋脾臓細胞の有無にかかわらず、ＷＴ  ＣＤ４５．１  Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウス（ＭＨＣハプロタイプＨ２ｂ）から得たＴ細胞枯渇（ＴＣＤ）骨髄（ＢＭ）細胞を静脈内に注入した。ＢＭと脾臓細胞のレシピエントは、３日目から６日目までの間に致命的なＧｖＨＤを発症し（図１Ａ）、これは脾臓、肝臓、皮膚のドナーＣＤ４５．１＋細胞の再構成と拡張と一致している（図１Ｂ）。ＣＤ４５．１＋ドナーのコンパートメント内では、Ｔ細胞集団は高頻度のＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮγ産生細胞を含んでおり、ａｌｌｏ−ＨＣＴ後３日目から肝臓（図１Ｃ）および脾臓（図１Ｄ）で最初に見られ、６日目からは皮膚で見られた（図１Ｄ）。これらの集団ではＩＬ−１７Ａはほとんど検出されなかった（図１Ｃ、１Ｄ）。従って、本発明者らは、ＢＭプラス脾臓細胞を受けたマウスの血清中に、ＢＭ単独の場合と比較して有意に高い量のＧＭ-ＣＳＦおよびＩＦＮγを見いだした（図１Ｅ）。本発明者らは、同種混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を用いて、生体内における同種反応中のＧＭ-ＣＳＦおよびＩＦＮγの産生を確認した（図１Ｆ）。さらに、ｗｔ、Ｃｓｆ２−／−、Ｉｌ１７ａ−／−およびＩｆｎｇ−／−のＴ細胞は、同種ＤＣとの共培養後、これらの細胞の増殖能の先験的な差異を除いて、等しく増殖した（図１Ｇ）。まとめると、ＧＭ−ＣＳＦとＩＦＮγは、ＩＬ−１７Ａではなく、ＧｖＨＤの間に標的臓器に浸潤するＴ細胞によって産生される。
【０１１５】
例２
同種Ｔ細胞によるＧＭ−ＣＳＦ産生はＧｖＨＤの病態に不可欠
ａｌｌｏ反応性ＴＨ細胞によるＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮγの産生を考慮して、本発明者らは、急性ＧｖＨＤの重症度を決定する上でのこれらのサイトカインの関連性を評価した。上記のように、本発明者らは、ＷＴ  ＢＡＬＢ／ｃマウスに致死量の放射線を照射した後、ＷＴ  Ｂ６マウスまたはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ（Ｉｆｎｇ−／−）またはＩＬ−１７（Ｉｌ１７ａ−／−）を欠くＢ６マウス（Ｃｓｆ２−／−）からの脾細胞の有無にかかわらず、ＷＴ  Ｂ６マウスからのＴＣＤ−ＢＭ細胞注入の結果を比較した。ＢＭプラスＣｓｆ２−／−脾臓細胞を受けたマウスは、ａｌｌｏ−ＨＣＴ後２０日目まで致死的なＧｖＨＤから保護されたが、ＢＭプラスＷＴ脾臓細胞を受けたマウスはすべてＨＣＴ後１５日目までに死亡していた（図２Ａ）。ＢＭプラスＩｆｎｇ-／-またはＩｌ１７ａ-／-脾臓細胞をマウスに注射することもまた、致死的なＧｖＨＤの動態に有意な影響を与えたが、それでもこれらのマウスのほぼ１００％は２０日目までに死亡した（図２Ａ）。
【０１１６】
ドナー脾臓の調製物が複数の異なる免疫細胞タイプを含むため、本発明者らは、その後、Ｔ細胞が、我々のＧｖＨＤモデルにおけるＧＭ−ＣＳＦの生物学的に重要な供給源であるかどうかを調査した。本発明者らは、致死的に照射されたＢＡＬＢ／ｃレシピエントに、ＷＴまたはＣｓｆ２−／−  Ｂ６マウスの脾臓から単離された精製Ｔ細胞の有無にかかわらず、ＷＴ  Ｂ６ドナーからのＴＣＤ−ＢＭ細胞を注入した。この方法により、Ｃｓｆ２−／−  Ｔ細胞を受けたマウスは、ＷＴのＴ細胞を受けたマウスとは対照的に、ａｌｌｏ−ＨＣＴ後７０日まで致死的なＧｖＨＤから完全に保護されていることが確認された（図２Ｂ）。２つの集団が同等の組成（図６Ａ）、活性化状態（図６Ｂ）、ＨＣＴ後のＧｖＨＤ標的臓器への浸潤能力（図６Ｃ）、脾臓または末梢リンパ節（ＬＮ）における活性化（ＣＤ４４ｈｉｇｈ）Ｔ細胞の頻度（図６Ｄ）、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）の頻度およびグランザイム産生（データは示していない）、またはＩＦＮγ、ＴＮＦαまたはＩＬ−１７Ａのような炎症性サイトカインを産生するそれらの能力を示したため、この保護効果がＷＴおよびＣｓｆ２−／−マウスの脾臓Ｔ細胞の間の生来の違いと関連しているという証拠はなかった。
【０１１７】
次に、本発明者らは、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞からのＧＭ−ＣＳＦのＧｖＨＤ病理学に対する相対的な寄与を調べた。この目的のために、本発明者らは、以下４つの組み合わせを用いて「クリスクロス」実験を行った。ＣＤ４  ＷＴ  Ｔ細胞＋ＣＤ８  ＷＴ  Ｔ細胞、ＣＤ４  ＷＴ  Ｔ細胞＋ＣＤ８  Ｃｓｆ２−／−Ｔ細胞、ＣＤ４  Ｃｓｆ２−／−Ｔ細胞＋ＣＤ８  ＷＴ  Ｔ細胞、およびＣＤ４  Ｃｓｆ２−／−Ｔ細胞＋ＣＤ８  Ｃｓｆ２−／−Ｔ細胞である。ＣＤ４  Ｔ細胞からＧＭ−ＣＳＦが欠落している組み合わせのみが致死的なＧｖＨＤに対する防御効果を示した（図２Ｋ）ことから、ａｌｌｏ反応性ＴＨ細胞がＧｖＨＤの発症におけるＧＭ−ＣＳＦの主要な供給源であるという考えを支持する。したがって、本発明者らは、Ｔ細胞由来のＧＭ−ＣＳＦが、ＭＨＣミスマッチのＨＣＴに続く致死的ＧｖＨＤの誘発に関与していると結論付けた。ＧＭ−ＣＳＦを欠いたＴ細胞のａｌｌｏ−ＨＣＴによって与えられた生存の優位性は、個々のＧｖＨＤターゲット組織のレベルでも明らかであった。ａｌｌｏ−ＨＣＴ後６日目の組織病理学的分析により、Ｃｓｆ２−／−脾臓細胞の移植は、ＷＴ脾臓細胞の移植と比較して、皮膚および小腸の組織損傷を有意に減少させたことが明らかになった（図２Ｃ、２Ｄ）。より詳細には、Ｃｓｆ２−／−細胞を投与されたマウスの皮膚は、毛包および表皮の周囲および内の細胞のアポトーシスおよび細胞浸潤の減少を示したのに対し、小腸は完全な陰窩破壊の減少を示した（図２Ｄ）。
【０１１８】
本発明者らはさらに、ここでは、増加した結腸長および減少したアポトーシス指数（図２Ｈ、２Ｉ）によって示されるように、Ｃｓｆ２-／-細胞移植に伴う減少した結腸病理を報告している。また、肝機能障害の無症状の徴候をスクリーニングしたところ、Ｃｓｆ２−／−脾臓細胞を移植したマウスでは、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）および血中尿素窒素（ＢＵＮ）の血清レベルがＷＴマウスと比較して低下していることが示された（図２Ｇ）。また、ＧＭＣＳＦ不存在下では、全身のＴＮＦα血清レベルが低下したが、ＩＬ-６の量は変化しなかった（データは示していない）。活性酸素種（ＲＯＳ）がＧｖＨＤの組織損傷に関与しているので、本発明者らは、この組織損傷の減少がＲＯＳ産生の低レベルと関連しているかどうかを調査した。本発明者らは、Ｃｓｆ２−／−脾臓細胞を移植した６日後のマウスの肝臓および小腸からの切片が、食細胞の活性酸素産生機械の重要な構成要素であるｐ２２ｐｈｏｘを発現する細胞を、ＷＴ脾臓細胞を投与されたマウスの切片よりも有意に少ない数で含んでいることを見出した（図２Ｅ、２Ｆ）。ＧｖＨＤにおけるＧＭ−ＣＳＦの機能的役割をさらに確認するために、本発明者らは、ＢＡＬＢ／ｃマウスについてＭＨＣミスマッチのＨＣＴの前に、ＷＴ Ｂ６ ＴＣＤ-ＢＭを単独またはＢＭプラスＷＴ 脾臓細胞を用いて、レシピエントマウスを抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体で処理した。ＧＭ−ＣＳＦの作用を体系的に遮断することで、これらのマウスにＣｓｆ２−／−脾臓細胞を移植した際の生存優位性を複製することに成功した（図２Ｇ）。
【０１１９】
完全なＭＨＣミスマッチのＨＣＴのマウスモデルは有益であるが、本発明者らは次に、ＧｖＨＤ病理におけるＧＭ−ＣＳＦの役割が、急性ＧｖＨＤのハプロミスマッチモデルのより臨床的に関連する環境において維持されているかどうかを調査した。本発明者らは、ＷＴ  Ｂ６  ＴＣＤ−ＢＭとＷＴ、Ｃｓｆ２−／−またはＩｆｎｇ−／−の脾臓細胞を組み合わせ、致死量の放射線を照射したＢ６Ｄ２Ｆ１マウスに細胞を移植したが、これはＢ６とＤＢＡマウスとの交配であるため、ＭＨＣハプロタイプＨ２ｂ／ｄを有するものである。また、Ｃｓｆ２−／−脾臓細胞を移植することで、ＷＴ脾臓細胞を移植したマウスと比較して有意に生存率が向上し、致死的なＧｖＨＤからマウスをＴＣＤ−ＢＭ単独とほぼ同等のレベルまで保護することができたが（図３Ａ）、これは、精製されたＣｓｆ２脾臓Ｔ細胞の移入時に再び複製された（図３Ｂ）。脾臓細胞とＴ細胞を移植した実験において、本発明者らはまた、Ｉｆｎｇ−／−細胞を移植した後の死亡率が著しく増加したことにも注目した（図３Ａ、３Ｂ）が、これはＧｖＨＤにおけるこのサイトカインの既知の、防御的免疫調節機能と一致する。ＨＣＴ後９日目に、組織学的スコアが最も高い臓器は皮膚であった。ここで、本発明者らは、ＷＴ脾臓細胞と比較してＣｓｆ２−／−を受けたマウスでは組織損傷が少なく、Ｉｆｎｇ−／−脾臓細胞を受けたマウスではより多くの組織損傷が見られた（図３Ｃ、３Ｄ）。これは、皮脂腺の数の変化、組織構成および毛包や表皮の周囲や内部の細胞浸潤の変化と一致している（図３Ｄ）。
【０１２０】
ａｌｌｏ−ＨＣＴの後の段階（２８日間）では、Ｃｓｆ２−／−脾臓細胞の移植はまた、門脈管浸潤と胆管の乱れの変化を特徴とする肝臓病理学（図３Ｈ）の減少をもたらした。 この部分的ミスマッチモデルにおいて、皮膚は、最も高いＧｖＨＤスコアを有する最も影響を受けた器官であった。ここで、本発明者らは、ＷＴ脾臓細胞と比較してＣｓｆ２−／−を受けたマウスでは組織損傷が有意に少なく、Ｉｆｎｇ−／−脾臓細胞を受けたマウスでは組織損傷が著しく多いことを理解した（図３Ｃ、３Ｄ）。細胞レベルでは、本発明者らはまた、Ｃｓｆ２−／−細胞を受けたマウスの肝臓および小腸においてＧｖＨＤの減少の徴候を観察したが、これは、Ｆ４／８０＋ミエロイド細胞の浸潤の減少を伴うｐ２２ｐｈｏｘ＋細胞の有意な減少をもたらした（図３Ｅ、３Ｆ）。これらのマウスで見られたＩＦＮγのＧｖＨＤ保護的役割を考えると、本発明者らは次に、ＧＭ−ＣＳＦの不存在がこのサイトカインのレベルに関係しているかどうかを調べた。ハプロミスマッチＨＣＴの１０日後、本発明者らは、Ｃｓｆ２−／−脾臓細胞を受けたマウスにおいて、ＷＴ脾臓細胞と比較してＩＦＮγのレベルが有意に高いことを発見した（図３Ｇ）。興味深いことに、本発明者らはまた、Ｉｆｎｇ−／−脾臓細胞を受けたマウスの血清中のＧＭ−ＣＳＦが増加した証拠を発見した（図３Ｇ）。これは、ＧＭ−ＣＳＦがさらにＩＦＮγの不存在によって誘導されるＧｖＨＤの増強を媒介している可能性を示唆している。以上のことから、Ｔ細胞由来のＧＭ−ＣＳＦは、２つのマウスａｌｌｏ−ＨＣＴモデルにおけるＧｖＨＤ免疫病理学の発症に重要な役割を果たしていると結論づけた。
【０１２１】
例３
ＧＭ−ＣＳＦは、ドナー由来の骨髄細胞を介してＧｖＨＤの致死を仲介する
致死的条件付けに続いて、放射線感受性宿主抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＨＣＴ後の最初の数日以内に失われ、ドナーからのＡＰＣで置換される。宿主ＡＰＣがＧｖＨＤのプライミングフェーズに必要とされるのに対し、ドナーＡＰＣは病気の誘発にはあまり役割を果たさないが、組織の損傷を永続させることに関与している可能性がある。病理的に関連するＧＭ−ＣＳＦ応答細胞型がドナー由来であるか宿主由来であるかを明確にするために、本発明者らは、ＧＭ−ＣＳＦＲのベータサブユニットを欠損したＣｓｆ２ｒｂ−／−マウスをＨＣＴのドナーまたは宿主として使用した。レシピエントコンパートメントにおけるＧＭ−ＣＳＦＲ欠損は、ＧｖＨＤの生存に影響を与えなかった（図９Ａ）。対照的に、Ｃｓｆ２ｒｂ−／−マウスからのＢＭの移植は、劇的に遅延した死亡率（図９Ｂ）をもたらし、Ｃｓｆ２−／−脾臓細胞の移植をフェノコピーした（図２Ａ）。
【０１２２】
本発明者らは、教師なしの非線形次元削減（ｔ−ＳＮＥ）を用いて、ドナーグラフト内のＧＭ−ＣＳＦ応答細胞を同定し、可視化した。このアプローチにより、本発明者らは、単球および好中球がＧＭ−ＣＳＦに対して特に敏感であることを見出したが、これは、ＧＭ−ＣＳＦ受容体複合体の下流の転写因子であるリン酸化されたＳＴＡＴ−５の単細胞分析によって評価された。Ｃｓｆ２ｒｂ−／−マウスを、ＧＭ−ＣＳＦ未応答細胞の供給源として使用した（図９Ｃ、９Ｄ）。ＧＭ-ＣＳＦに応答する細胞が骨髄コンパートメントに限定されることを確認したことから、本発明者らは、ａｌｌｏ−ＨＣＴの５日後に炎症を起こした標的臓器に見られる骨髄細胞サブセットの徹底的な特徴付けを行った。Ｃｓｆ２−／−脾臓細胞の移植は、樹状細胞（ＤＣ）、好中球、単球および単球由来細胞（ＭＤＣ）を含むいくつかの骨髄サブセットの頻度の減少をもたらした（図９Ｅ、９Ｆ）。好中球および単球／ＭＤＣｓの減少は、抗ＧＭ−ＣＳＦ治療の標的臓器でも認められたが、これらの骨髄系サブセットの全身的な数は変化しなかった。本発明者らは、ドナー単球／ＭＤＣが、ＧＭ−ＣＳＦの非存在下でより少ないＩＬ-１βを産生することを観察した（図９Ｇ）。重要なことに、ＩＬ-１βは、ＧＭ−ＣＳＦによって誘発される病原性プログラムのシグネチャーサイトカインであり、ＧｖＨＤの発生において重要な役割を果たすことが示された。本発明者らはまた、ａｌｌｏ−ＨＣＴ後のドナー骨髄細胞による活性酸素の発現について、同種のＣｓｆ２−／−Ｔ細胞を受けたマウスの組織切片においてそれらが低レベルであること、および組織損傷の駆動におけるそれらの報告された役割を考慮して、調査した。本発明者らは、Ｃｓｆ２−／−脾臓細胞の移植は、単球／ＭＤＣおよび好中球サブセットの両方におけるＲＯＳ産生の減少をもたらしたことを見出した（図９Ｈ）。まとめると、これらの知見は、ＧＭ−ＣＳＦライセンスされたドナー由来のミエロイド細胞が、ＧｖＨＤの病理学に極めて重要であることを実証している。
【０１２３】
例４
ＧＭ−ＣＳＦ非存在下でも効率的にＧｖＬが維持される
ＧｖＨＤにおける組織損傷につながる免疫応答とＧｖＬにおける腫瘍除去は、同じメカニズムを介して媒介されると広く考えられている。ドナーＴ細胞由来のＧＭ−ＣＳＦは致死的なＧｖＨＤに必須であることから、本発明者らは、ＭＨＣミスマッチのＨＣＴモデルにおいてもＧｖＬを媒介するかどうかを検討した。これを試験するために、本発明者らは、ＧＦＰおよびルシフェラーゼを共発現するＡ２０  Ｂ細胞リンパ腫細胞（ＢＡＬＢ／ｃ由来）（Ａ２０−ＧＦＰ−Ｌｕｃ）を、ＷＴ  Ｂ６  ＴＣＤ−ＢＭ細胞と共に、単独で、または精製Ｂ６  ＷＴ細胞またはＣｓｆ２−／−脾臓Ｔ細胞と共に、致死量を照射されたＢＡＬＢ／ｃのレシピエントに静脈内注射した。腫瘍の成長を、生物発光イメージング（ＢＬＩ）によってモニターした。Ａ２０細胞をＴＣＤ−ＢＭ単独で注入した場合、すべてのレシピエントは３５日以内に成長した腫瘍により死亡し（図４Ａ〜４Ｃ）、ＧｖＬ効果におけるＴ細胞の重要な役割と一致した。従って、ＷＴまたはＣｓｆ２−／−Ｔ細胞をＢＭトランスファーに添加すると、腫瘍増殖の効率的な制御が得られたが（図４Ａ〜４Ｃ）、Ｃｓｆ２−／−Ｔ細胞を受けたマウスのみが生存期間の有意な改善を示した（図４Ｃ）。ＴＣＤ−ＢＭプラスＷＴ  Ｔ細胞を受けたリンパ腫保有マウスは主に重度のＧｖＨＤで死亡したのに対し、ＴＣＤ−ＢＭプラスＣｓｆ２−／−Ｔ細胞を受けたマウスのＧｖＬ効果は低下しなかったが、ＧｖＨＤからは保護された（図４Ｃ、４Ｄ）。Ｃｓｆ２−／−Ｔ細胞を受けたマウスの生存率のこの改善は、単球細胞株ＷＥＨＩ−３を用いた代替ＧｖＬモデルにおいても観察された。
【０１２４】
また、本発明者らが、接種したＡ２０リンパ腫細胞の数を増やすと、Ｃｓｆ２−／−のＴ細胞は、ＷＴ細胞よりもさらに効率的にＧｖＬを実行し、全生存期間の有意な増加をもたらした。一貫して、ナイーブまたはａｌｌｏ−ＨＣＴを受けたマウスから分離されたＣｓｆ２−／−およびＷＴ  Ｔ細胞は、生体外でＡ２０リンパ腫およびＷＥＨＩ−３細胞を殺すことが等しく可能であり、脾臓およびＬＮで等しく拡大し、活性化細胞（ＣＤ４４ｈｉｇｈ）、増殖細胞（Ｋｉ６７＋）およびグランザイムＢ産生細胞の類似の頻度を示した。臨床環境における所見の移植可能性を試験するために、本発明者らはＧＭ−ＣＳＦに対する中和性ｍＡｂを使用した。印象的なことに、ＴＣＤ−ＢＭプラスＴ細胞を受けた抗ＧＭ−ＣＳＦ治療済みである白血病のマウスは、強力なＧｖＬ効果を示し、アイソタイプ治療されたコントロールマウスよりも有意に良好な生存を示した（図４Ｅ〜４Ｈ）。より高い生存率は、ＧｖＨＤの発生率の減少と関連していた（図４Ｈ）。注目すべきことに、ＧＭ−ＣＳＦの中和は、ＨＣＴを受けなかったマウスでは腫瘍の成長に影響を与えなかった。本発明者らは、異なるグループ間で死因（腫瘍またはＧｖＨＤ）を比較した。リンパ腫保有マウスは、ＨＣＴを受けず、撤退基準に達し、安楽死させる必要があった。ＴＣＤ−ＢＭとＷＴ  Ｔ細胞を受けたリンパ腫保有マウスは、腫瘍の進行が遅れたが、代わりに重度のＧｖＨＤで死亡したのに対し、ＴＣＤ−ＢＭとＣｓｆ２−／−Ｔ細胞を受けたマウスは、強いＧｖＬ効果を示し、ＧｖＨＤから保護された（図４Ｄ）。
【０１２５】
これらのデータと一致するように、Ｃｓｆ２−／−およびＷＴ  Ｔ細胞は、Ａ２０リンパ腫細胞を生体外で殺傷する能力を等しく有していた（図７Ａ、７Ｂ）。本発明者らは、臨床現場での知見の翻訳可能性を検証するために、ＧＭ−ＣＳＦに対する中和性ｍＡｂを使用した。驚くべきことに、ＴＣＤ-ＢＭプラスＴ細胞を受けた抗ＧＭ-ＣＳＦ治療済みの白血病マウスは、強力なＧｖＬ効果を示し、アイソタイプ処理したコントロールマウスよりも有意に良好な生存率を示した（図４Ｅ〜４Ｈ）。より高い生存率は、ＧｖＨＤの発生率の減少と関連していた（図４Ｈ）。注目すべきことに、ＧＭ−ＣＳＦの中和は、ＨＣＴを受けなかったマウスでは腫瘍の成長に影響を与えなかった。注目すべきことに、Ｃｓｆｒｂ２−／−ドナーからａｌｌｏ−ＨＣＴを受けたマウスは、ＷＴドナーと比較して有意な生存率の改善を示し（図８Ａおよび８Ｂ）、ＧＭ−ＣＳＦ受容体の中和がＧｖＨＤの緩和に有効であることを実証した。このように、ＧＭ−ＣＳＦの非存在下では、ドナーＴ細胞は、ＭＨＣミスマッチのａｌｌｏ−ＨＣＴの高度な免疫原性のコンテキストであっても、致死的なＧｖＨＤを誘導することなく、マウスにおける治療的ＧｖＬ応答の効果的なメディエーターとなる。
【０１２６】
例５
ヒト生検におけるＧＭ−ＣＳＦの上昇
次に、本発明者らは、ＧＭ−ＣＳＦがヒトＨＣＴレシピエントにおけるＧｖＨＤにおいて同様の役割を果たすという証拠があるかどうかを調べた。本発明者らは、様々な異なる状態について、ＨＣＴ後の臨床的に文書化されたＧｖＨＤの異なるグレードを有する患者からの消化管生検におけるＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の発現およびタンパク質の豊富さを評価した（表１〜３）。転写レベルでは、本発明者らは、グレードＩＶを有する患者からの消化管生検において、グレードＩのＧｖＨＤと比較して有意に高いＧＭ−ＣＳＦの発現を検出した（図５Ａ）。さらに、本発明者らは、グレードＩＶのＧｖＨＤを有する患者からのサンプルにおいて、間質コンパートメントにおけるＧＭ−ＣＳＦに対する強い免疫反応性を観察した。一方、本発明者らは、ＧｖＨＤを有しない患者からの生検においては、ＧＭ−ＣＳＦを検出しなかった（図５Ｂ）。合わせて、これらの結果は、ＧＭ−ＣＳＦとヒト患者におけるａｌｌｏ−ＨＣＴ後の重篤なＧｖＨＤの存在との間に相関関係があることを示している。
【０１２７】
考察
様々なＴＨ細胞サブセットとそのシグネチャーサイトカインがＧｖＨＤにどのように寄与しているかについては多くの文献があるが、炎症とそれに続く組織破壊のメカニズムは完全には解明されていない。ここでは、ＧＭ−ＣＳＦがマウスの致死的なＧｖＨＤの推進にこれまで知られていなかった役割を果たしており、重度のＧｖＨＤを持つヒトのａｌｌｏ−ＨＣＴ患者でも同様に上昇していることを明らかにした。さらに、ＧＭ−ＣＳＦは、ＧｖＬ効果に不可欠ではないようであり、ＧｖＨＤの予防と治療における新たな治療標的として有望視されている。また、急性ＧｖＨＤにおけるＴ細胞由来のＩＬ−１７Ａの役割は除外されているが、ＩＦＮγの保護効果は実証されている。
【０１２８】
ＧＭ−ＣＳＦは、いくつかの病理学的炎症性疾患に関与しており、骨髄系細胞に強力な炎症促進作がある。ここで、本発明者らは、急性ＧｖＨＤの２つの異なるマウスモデルを使用して、ドナーＴ細胞由来のＧＭ−ＣＳＦが重度のＧｖＨＤを直接仲介することを示しているが、これは豊富な骨髄細胞浸潤とＲＯＳ産生機構の構成要素における組織染色の増加に関連しており、病原体に対する宿主防御のために食細胞によって古典的に使用されている。組織損傷と白血球浸潤が手を取り合って進行するＧｖＨＤの免疫病理学においても、同じメカニズムは明らかに有害である。ここでは、ａｌｌｏ反応性Ｃｓｆ２−／−Ｔ細胞を受けた動物で観察されたＧｖＨＤ感受性臓器における骨髄性駆動型酸化ストレスの減少は、この考えを支持するものである。慢性腸管炎症におけるＧＭ−ＣＳＦの重要な役割、およびＧｖＨＤ患者からの消化管生検で発見された高量のＧＭ−ＣＳＦは、この特定の器官におけるこのサイトカインの量を調節することがＧｖＨＤの予防および／または治療のために非常に有益である可能性を示唆している。
【０１２９】
本発明者らはまた、ＧｖＨＤ中のマウスにおけるＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮγの潜在的な相互調節の証拠を明らかにした。活性化されたドナーＴ細胞によって産生されるＩＦＮγは、ＧｖＨＤを促進し、保護することが以前に示されている。活性化されたドナーＴ細胞によって産生されるＩＦＮγは、ＧｖＨＤを促進し、保護することが以前に示されている。ここでは、ＩＦＮγ欠損脾臓細胞を用いた部分的なＭＨＣミスマッチのＨＣＴを受けたマウスは、ＷＴ脾臓細胞を受けたマウスよりも致死的なＧｖＨＤに対して著しく感受性が高いことが明らかになった。興味深いことに、これらのマウスの血清ＧＭ−ＣＳＦレベルが上昇したのに対し、ＧＭ−ＣＳＦ欠損脾臓細胞を受けたマウスは血清中のＩＦＮγが上昇した。ＩＦＮγがエフェクターＴＨ細胞においてＧＭ−ＣＳＦをネガティブに制御することは以前に報告されているが、ＧＭ−ＣＳＦは受容体複合体を発現していないＴ細胞には直接影響を与えないため、ＧＭ−ＣＳＦがＩＦＮγ産生に影響を与えるメカニズムについては、さらに研究が必要である。
【０１３０】
ドナーＴ細胞主導のＧｖＨＤと治療的ＧｖＬ効果は同じメカニズムを介して媒介されているという長年の仮説があった。ここに提示されたデータは、この説に挑戦している。ａｌｌｏ−ＨＣＴの前にＧＭ−ＣＳＦ阻害抗体でマウスを治療すると、致死的な急性ＧｖＨＤの発生から有意に保護された。一方、抗ＧＭ−ＣＳＦで治療された担腫瘍マウスは、腫瘍の成長とＧｖＨＤからの保護の効果的な制御から恩恵を受けた。したがって、ＧＭ−ＣＳＦは、Ｔ細胞媒介の悪性リンパ系細胞の殺傷を制御しない。代わりに本発明者らは、理論に縛られることを望まず、ＧｖＨＤにおいて、ＧＭ−ＣＳＦは、病原性Ｔ細胞と骨髄系細胞との間のコミュニケーション導管として機能し、後者が組織破壊を引き起こすことを提示するＧｖＬはＴ細胞による直接的な細胞毒性に依存している可能性が高いが、骨髄細胞のＧＭ−ＣＳＦ駆動型反応はＧｖＨＤの病理学的意義をより強く示唆しており、ＧｖＬの効果とＧｖＨＤを分離する潜在的なメカニズムを表していると考えられる。自己免疫疾患や炎症性疾患におけるＧＭ−ＣＳＦの病理学的役割は、ヒト疾患におけるＧＭ−ＣＳＦ経路を標的とするモノクローナル抗体の開発につながっている。今回の実験的ＧｖＨＤにおけるＧＭ−ＣＳＦの中和効果を考えると、ａｌｌｏ−ＨＣＴ患者においてＧＭ−ＣＳＦをブロックすると臨床転帰が改善することは明らかである。重度のＧｖＨＤ患者の罹患組織で観察されたこのサイトカインのレベルの著しい増加は、この考えをさらに裏付けている。しかし、ＧＭ−ＣＳＦは界面活性剤のホメオスタシスや肺宿主の防御に重要な役割を果たしているため、臨床現場でＧＭ−ＣＳＦをブロックする際には、肺疾患のパラメータを厳密にモニターすることが重要になるだろう。ＧＭ−ＣＳＦがＩＬ−２３媒介の免疫応答に決定的に寄与し、抗ＩＬ−２３ｐ１９療法がＧｖＨＤ関連大腸炎を改善することができることがマウスで証明されている。このように、ＧＭ−ＣＳＦの直接遮断は、ＩＬ−２３を標的とした臨床試験を補完する貴重なものとなるかもしれない。ＧＭ−ＣＳＦの不存在は、ＧｖＬの応答を損なうことなくＧｖＨＤの発症を停止させることができるという事実は、臨床試験でａｌｌｏ−ＨＣＴ後のＧｖＨＤの予防と治療のためのこの治療戦略を検証することを容易にする。さらに、ＧＭ−ＣＳＦがＧｖＨＤの最も重篤な症状を示す患者で上昇したことは、この治療法が最も予後が悪く致死リスクが高い患者群に対して特に有望であることを意味する。
【０１３１】
表１．ＧｖＨＤ患者セットＩの臨床病理学的特徴
【０１３２】
【表１】
2021514368.tif 000005
ＣＶＩＤ：分類不能型免疫不全症、ｓＡＭＬ：二次性急性骨髄性白血病、Ｔ−ＡＬＬ：Ｔ細胞急性リンパ性白血病、ＭＤＳ：骨髄異形成症候群、ＭＲＤ：ＨＬＡ適合血縁ドナー、ＭＭＵＲＤ：ＨＬＡ非適合血縁ドナー、ＭＵＲＤ：ＨＬＡ適合非血縁ドナー、ＰＢＳＣ：末梢血幹細胞、ＢＭ：骨髄、ＦＬＵ：フルダラビン、ＢＣＮＵ：ビス−クロロエチルニトロソウレア、ＭＥＬ：メルファラン、ＴＢＩ：全身放射線照射、ＶＰ１６：エトポシド、ＴＴ：チオテパ、ＡＴＧ：抗胸腺細胞グロブリン、ＣｙＡ：シクロスポリンＡ、ＭＭＦ：ミコフェノール酸モフェチル、ＭＴＸ：メトトレキサート
【０１３３】
表２．制御対象の特徴
【０１３４】
【表２】
2021514368.tif 000006
【０１３５】
表３．ＧｖＨＤ患者セットＩＩの臨床病理学的特徴
【０１３６】
【表３】
2021514368.tif 000007
ＡＭＬ：急性骨髄性白血病、Ｂ−ＡＬＬ：Ｂ細胞急性リンパ性白血病、ＣＶＩＤ：分類不能型免疫不全症、ＭＤＳ：骨髄異形成症候群、ＲＡＥＢ：芽球増加を伴う不応性貧血、Ｔ−ＮＨＬ：Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、ｓＡＭＬ：二次性急性骨髄性白血病、ＭＰＮ：骨髄増殖性腫瘍、ＭＭ：多発性骨髄腫、ＭＭＵＲＤ：ＨＬＡ非適合血縁ドナー、ＭＲＤ：ＨＬＡ適合血縁ドナー、ＭＵＲＤ：ＨＬＡ適合非血縁ドナー、ＰＢＳＣ：末梢血幹細胞、  ＦＬＵ：フルダラビン、ＢＣＮＵ：ビス−クロロエチルニトロソウレア、ＭＥＬ：メルファラン、ＴＲＥＯＳ：トレオスルファン、ＴＢＩ：全身放射線照射、ＶＰ１６：エトポシド、ＴＴ：チオテパ、ＢＵ：ブスルファン、ＣＹ：シクロホスファミド、ＣｙＡ：シクロスポリンＡ、ＭＴＸ：メトトレキサート、ＭＭＦ：ミコフェノール酸モフェチル、ＡＴＧ：抗胸腺細胞グロブリン
【０１３７】
表４．ａｌｌｏ−ＨＣＴマウスのＧｖＨＤスコアリングシステム
【０１３８】
【表４】
2021514368.tif 000008
【図１Ａ】
2021514368.tif 000009
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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