(57)【要約】  本発明は、患者のＴ細胞と組み合わせた患者の腫瘍細胞由来のネオ抗原を使用し、細胞選別、ゲノム配列決定、ＴＣＲ遺伝子の発現、ＭＨＣ複合体での腫瘍ネオ抗原の提示、及び、ＴＣＲ認識が生じ、ＴＣＲ認識複合体の全ての構成要素をタグ付けする場合の、Ｔ細胞の一意的なバーコード化を使用する、Ｔ細胞受容体に対する同種抗原を識別する方法である。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
α鎖（ＴＣＲα）及びβ鎖（ＴＣＲβ）で構成されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に対する同種抗原を識別する方法であって、
ａ．患者から、各Ｔ細胞がＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを含むＴ細胞の集団を入手することと、
ｂ．各Ｔ細胞の核酸を細胞特異的バーコードでバーコード化することと、
ｃ．前記バーコード化した核酸を配列決定して、前記ＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖をコードするＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子配列を入手することと、
ｄ．機能性ＴＣＲをコードする遺伝子対と同じバーコードを有するＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子を識別することと、
ｅ．工程ｄにて識別された前記ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子対を、それぞれのＴ細胞に導入することと、
ｆ．それぞれ、場合により１つ以上の腫瘍ネオ抗原を含んでいる前記患者から腫瘍細胞の集団を入手することと、
ｇ．腫瘍ネオ抗原遺伝子を識別することと、
ｈ．工程ｇ．で識別したネオ抗原遺伝子からネオ抗原ペプチドを形成することと、
ｉ．工程ｈの前記ネオ抗原ペプチドを、ＭＨＣ−１抗原提示複合体及びオリゴヌクレオチドバーコードと組み合わせて、バーコード化ＭＨＣネオ抗原ペプチド複合体を形成することと、
ｊ．工程ｅの前記Ｔ細胞を、工程ｉの前記バーコード化ＭＨＣネオ抗原ペプチド複合体と接触させて、細胞が結合したＭＨＣネオ抗原ＴＣＲ複合体を形成することと、
ｋ．前記ＴＣＲ遺伝子、及び、工程ｊの各Ｔ細胞からの前記ＭＨＣネオ抗原複合体バーコードを、細胞特異的なバーコードによりバーコード化することと、
ｌ．工程ｋからの前記Ｔ細胞において、細胞特異的バーコードと関連する前記ＴＣＲ遺伝子、及び細胞特異的バーコードと関連する前記ＭＨＣネオ抗原複合体バーコードを配列決定することと、
ｍ．前記ＴＣＲ遺伝子及びＭＨＣネオ抗原複合体バーコードのうち少なくとも１つが、同じ細胞特異的バーコードと関連している場合に、前記ネオ抗原を前記ＴＣＲに対する前記同種抗原と識別すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記Ｔ細胞の集団は、腫瘍組織の解離により入手される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖をコードするＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子配列は、再配列されたＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｔ細胞の集団は、タンパク質マーカー発現ベースの捕捉により前記腫瘍から入手される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
工程ｂ及びｋの１つ又は両方の工程における前記Ｔ細胞バーコード化は、
ａ．前記複数のＴ細胞を、遺伝子特異的配列及びバーコードオリゴヌクレオチドアニーリング領域を含むプライマーの混合物と接触させることと、
ｂ．前記複数のＴ細胞を、前記プライマー内のバーコードオリゴヌクレオチドアニーリング領域に相補性のバーコードオリゴヌクレオチドと接触させることと、
ｃ．スプリットプール合成の１つ以上のラウンドのそれぞれにおいて、前記複数のＴ細胞を、各ラウンドの前記バーコード化オリゴヌクレオチドが以前のラウンドの前記バーコードオリゴヌクレオチドの前記アニーリング領域に相補性のアニーリング領域を含む追加のバーコードオリゴヌクレオチドと接触させ、前記複数のＴ細胞のそれぞれにおける各プライマー上に細胞特異的バーコードを組み立てること、
を含む方法により実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程ｂにおける前記核酸のバーコード化は、
ａ．前記核酸を含有するＴ細胞の集団を、１つの細胞を含有する複数の第１の分画に分画することと、
ｂ．前記細胞を含有する分画を、それぞれが、遺伝子特異的配列及びバーコードを含む、バーコード化オリゴヌクレオチドプライマーの複数のコピーを含有する複数の第２の分画と混合することであって、前記バーコードは、各分画内で同じであるが、分画間では異なっている、混合することと、
ｃ．前記第１及び第２の分画を融合することと、
ｄ．バーコード化オリゴヌクレオチドプライマーでアンプリコンを形成し、前記核酸をバーコード化すること、
を含む方法により実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程ｂにおける前記バーコード化、及び工程ｃにおける配列決定は、
ａ．前記Ｔ細胞の集団を、細胞の群を含有する複数の分画に分画することと、
ｂ．バーコード化アダプターを、各分画内の核酸にライゲーションすることと、
ｃ．前記アダプター化した核酸内の前記ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢを配列決定して、バーコード化ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ配列を入手することと、
ｄ．ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子対塩基の、分画内で同時発生する頻度を測定すること、
を含む方法により実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記バーコード化ＴＣＲ遺伝子の配列決定は、前記遺伝子の前記ＣＤＲ３超可変領域を配列決定することである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＴＣＲ遺伝子の識別は、前記遺伝子の前記ＣＤＲ３超可変領域を識別することである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ネオ抗原遺伝子は、前記腫瘍細胞内の前記核酸を配列決定し、非サイレント変異を有する遺伝子をネオ抗原遺伝子として識別することにより識別される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ネオ抗原遺伝子は、ペプチドアレイを患者の血清でスクリーニングすることにより識別される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
工程ｅにおける前記遺伝子は発現ベクターに導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記受容性Ｔ細胞は内因性ＴＣＲ遺伝子を欠いている、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
工程ｅにおける前記遺伝子は転写活性ＤＮＡ断片として導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
工程ｅにおける前記遺伝子はｍＲＮＡとして導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記識別されたネオ抗原が前記ＭＨＣ−Ｉ分子に結合する能力により更に選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ネオ抗原ＴＣＲ複合体内で前記ネオ抗原及び前記ＴＣＲをバーコード化することは、各複合体をバーコードを含有する反応体積に区画化することを含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学及び腫瘍抗原の分野に関し、より具体的には、抗腫瘍免疫細胞及び腫瘍抗原を識別する、組み合わせバーコード化の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞は、適応免疫系に一体化しており、病原体及び癌に対する保護をもたらす。これらは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）により、抗原の細胞外認識を通して機能し、抗原提示細胞上の、ヒト白血球抗原がコードされたＭＨＣ（主要組織適合複合体）構造にて提示される短いペプチド類に対する特異的な親和性を表示する。ＴＣＲ、ペプチド、及びＭＨＣ分子に固有の多様性により、いずれか１つのＴＣＲの特異性を識別するのが、極めて複雑な問題となる（Ｇｅｅ，Ｍ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｏｒｐｈａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  Ｔｕｍｏｒ−Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｃｅｌｌ，２０１７）。Ｔ細胞及びそのＴＣＲ配列の分子特性決定を可能にする技術は相当改善されているものの、Ｔ細胞の抗原特異性を測定して研究する能力は、主たるボトルネックのままである。「オーファン」ＴＣＲの特異性（即ち、未知の抗原特異性のＴＣＲ）を測定するアプローチは、癌免疫治療法、自己免疫、及び感染症の潜在的な標的を明らかにする一助となり得る（Ｇｅｅ，ｓｕｐｒａを参照のこと）。「オーファン」ＴＣＲの特異性を測定するために、多数の方法が使用されてきた（例えば、Ｂｉｒｎｂａｕｍ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ，２０１４．１５７（５）：ｐ．１０７３−８７を参照のこと）。質量分析では、抗原単離の偏りのない方法（Ｙａｄａｖ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｔｕｍｏｕｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｅｘｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１４．５１５（７５２８）：ｐ．５７２−６）を提供することができるが、多数の細胞数（典型的には１０７〜１０９個の細胞）が必要となる。Ｔ細胞抗原特異性の大部分の研究には、候補抗原を実験により試験することが伴う。例えば、抗腫瘍Ｔ細胞特異性の研究は、ネオ抗原に対する増殖性Ｔ細胞応答を示している。このような研究には、腫瘍を配列決定して変異を識別すること、エピトープ予測アルゴリズムを使用して免疫原性変異体ペプチドを予測すること、及び、これらの変異体ペプチドに向けられるＴ細胞応答を試験することを必要とする（Ｚｏｌｋｉｎｄ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｓｎｙｄｅｒ，Ａ．ａｎｄ  Ｔ．Ａ．Ｃｈａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１５．３０（０）：ｐ．７−１６を参照のこと）。他の方法クエリは、ｐＨＬＡ多量体を使用することで、患者におけるＴ細胞特異性を確立した。Ｌｅｏｎｇ，Ｍ．Ｌ．ａ��ｄ  Ｅ．Ｗ．Ｎｅｗｅｌｌ，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ  Ｔｅｔｒａｍｅｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｍａｓｓ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２０１５．１３４６：ｐ．１１５−３１，Ｎｅｗｅｌｌ，Ｅ．Ｗ．ａｎｄ  Ｍ．Ｍ．Ｄａｖｉｓ，Ｂｅｙｏｎｄ  ｍｏｄｅｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ：ｈｉｇｈ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１４．３２（２）：ｐ．１４９−５７
【０００３】
独自の各Ｔ細胞受容体を、それが認識するペプチド配列に接続する必要が存在する。特に、腫瘍由来のペプチド及び抗腫瘍Ｔ細胞の識別及びマッチングに関心が持たれている。
【発明の概要】
【０００４】
一実施形態では、本発明は、α鎖（ＴＣＲα）及びβ鎖（ＴＣＲβ）で構成されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に対する同種抗原を識別する方法であって、患者から、各Ｔ細胞がＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを含むＴ細胞の集団を入手することと、各Ｔ細胞の核酸を細胞特異的バーコードでバーコード化することと、バーコード化した核酸を配列決定して、ＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖をコードするＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子配列を入手することと、機能性ＴＣＲをコードする遺伝子対と同じバーコードを有するＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子を識別することと、ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子対を、対応するＴ細胞に導入することと、それぞれ、場合により１つ以上の腫瘍ネオ抗原を含んでいる患者から腫瘍細胞の集団を入手することと、腫瘍ネオ抗原遺伝子を識別することと、ネオ抗原遺伝子からネオ抗原ペプチドを形成することと、ネオ抗原ペプチドを、ＭＨＣ−１抗原提示複合体及びオリゴヌクレオチドバーコードと組み合わせて、バーコード化ＭＨＣネオ抗原ペプチド複合体を形成することと、トランスフェクションしたＴ細胞を、バーコード化ＭＨＣネオ抗原ペプチド複合体と接触させて、細胞が結合したＭＨＣネオ抗原ＴＣＲ複合体を形成することと、ＴＣＲ遺伝子、及び、各Ｔ細胞からのＭＨＣネオ抗原複合体バーコードを、細胞特異的なバーコードによりバーコード化することと、Ｔ細胞内で、関連する細胞特異的バーコードを有するＴＣＲ遺伝子、及び細胞特異的バーコードと関連するＭＨＣネオ抗原複合体バーコードを配列決定することと、ＴＣＲ遺伝子及びＭＨＣネオ抗原複合体バーコードのうち少なくとも１つが、同じ細胞特異的バーコードと関連している場合に、ネオ抗原をＴＣＲに対する同種抗原と識別すること、を含む方法である。
【０００５】
Ｔ細胞は、腫瘍組織の解離により入手することができる。ＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖をコードするＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子配列は、再配列したＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列であることができる。
【０００６】
Ｔ細胞の集団は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの、タンパク質マーカー発現をベースにする捕捉により、腫瘍から入手される。Ｔ細胞は、ＣＤ３＋／ＣＤ８＋／ＴＣＲ＋Ｔ細胞として、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞として、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋セントラルメモリーＴ細胞として、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−エフェクターメモリーＴ細胞として、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−エフェクターＴ細胞として、又は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞として、選択されることができる。
【０００７】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞バーコード化は、複数のＴ細胞を、遺伝子特異的配列及びバーコードオリゴヌクレオチドアニーリング領域を含むプライマーの混合物と接触させることと、複数のＴ細胞を、プライマー内のバーコードオリゴヌクレオチドアニーリング領域に相補性のバーコードオリゴヌクレオチドと接触させることと、スプリットプール合成の１つ以上のラウンドのそれぞれにおいて、複数のＴ細胞を、各ラウンドのバーコード化オリゴヌクレオチドが以前のラウンドのバーコードオリゴヌクレオチドのアニーリング領域に相補性のアニーリング領域を含む追加のバーコードオリゴヌクレオチドと接触させ、複数のＴ細胞のそれぞれにおける各プライマー上に細胞特異的バーコードを組み立てること、を含む方法により実施される。遺伝子特異的配列は、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＦｏｘＰ３から選択することができる。
【０００８】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞バーコード化は、核酸を含有するＴ細胞の集団を、１つの細胞を含有する複数の第１の分画に分画することと、細胞を含有する分画を、それぞれが、遺伝子特異的配列及びバーコードを含む、バーコード化オリゴヌクレオチドプライマーの複数のコピーを含有する複数の第２の分画と混合することであって、バーコードは、各分画内で同じであるが、分画間では異なっている、混合することと、第１及び第２の分画を融合することと、バーコード化オリゴヌクレオチドプライマーでアンプリコンを形成し、核酸をバーコード化すること、を含む方法により実施される。遺伝子特異的配列は、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＦｏｘＰ３から選択することができる。
【０００９】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞バーコード化及び配列決定は、Ｔ細胞の集団を、細胞の群を含有する複数の分画に分画することと、バーコード化アダプターを、各分画内の核酸にライゲーションすることと、アダプター化した核酸内のＴＣＲＡ及びＴＣＲＢを配列決定して、バーコード化ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ配列を入手することと、ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子対塩基の、分画内で同時発生する頻度を測定すること、を含む方法により実施される。
【００１０】
バーコード化ＴＣＲ遺伝子の配列決定は、遺伝子のＣＤＲ３超可変領域を配列決定することであり、ＴＣＲ遺伝子の識別は、遺伝子のＣＤＲ３超可変領域を識別することである。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ネオ抗原遺伝子は、腫瘍細胞内の核酸を配列決定し、非サイレント変異を有する遺伝子をネオ抗原遺伝子として識別することにより識別される。配列決定は、全ゲノム配列決定、又は全エクソーム配列決定であることができる。ネオ抗原は配列アラインメントにより識別することができる。ネオ抗原は、ペプチドアレイを患者の血清でスクリーニングすることによってもまた、識別することができる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ遺伝子は、発現ベクター、例えば、ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子の一方又は両方を含むベクター内の、受容性Ｔ細胞に導入することができる。発現ベクターは、ＣＤ３タンパク質を発現するベクター、及びＣＤ８タンパク質を発現するベクターを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、受容性Ｔ細胞は、内因性のＴＣＲ遺伝子発現を欠いている。
【００１３】
いくつかの実施形態では、遺伝子は、転写活性ＤＮＡ断片として、又はｍＲＮＡとして、受容性細胞に導入される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、識別されたネオ抗原は更に、ＭＨＣ−Ｉ分子に結合する能力により選択される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ−Ｉ分子に結合する能力は、インシリコ分析により測定される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ネオ抗原ペプチドは、８〜１００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ−１タンパク質は、患者特異的配列を有する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ＭＨＣネオ抗原ＴＣＲ複合体は、形成後に架橋する。いくつかの実施形態では、ネオ抗原ＴＣＲ複合体内でネオ抗原及びＴＣＲをバーコード化することは、各複合体をバーコードを含有する反応体積に区画化することを含む。いくつかの実施形態では、方法における配列決定工程は、超並列配列決定を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、腫瘍試料の入手から、ネオ抗原及びＴ細胞受容体配列の格付けリストを生成するまでの方法の工程の図面を示す。示した例は任意のものである故、本出願の文脈とは無関係である。
【図２−１】図２は、ネオ抗原及びＴ細胞受容体配列の格付けリストの生成から、同種ＴＣＲ遺伝子対、及び一致する高原ペプチドを分析するまでの方法の工程の図面を示す。
【図２−２】図２は、ネオ抗原及びＴ細胞受容体配列の格付けリストの生成から、同種ＴＣＲ遺伝子対、及び一致する高原ペプチドを分析するまでの方法の工程の図面を示す。
【図３】図３は、バーコードを使用して、Ｔ細胞受容体を、Ｔ細胞内のその同種抗原に一致させることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
以下の定義は、本開示を理解するのに役立つ。
【００１９】
用語「試料」とは、標的核酸を含有する、又は含有すると推定される、あらゆる組成物を意味する。これには、個体から単離した組織又は流体の試料、例えば皮膚、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、血液細胞、臓器、及び腫瘍を含み、並びに、ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）及びこれから単離した核酸を含む、個体から採取した細胞から確立される、インビトロ培養液の試料もまた含む。試料は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）又は環状腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含有する無細胞血液分画物などの、無細胞物質を含むこともまたできる。
【００２０】
用語「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、並びに、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの、これらのサブカテゴリーを含む、ヌクレオチドのポリマー（例えば、天然及び非天然の両方の、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチド）を意味する。核酸は、一本鎖又は二本鎖であることができ、一般的に、５’−３’ホスホジエステル結合を含有するが、場合によっては、ヌクレオチド類似体が他の結合を有する場合がある。核酸は、天然に存在する塩基（アデノシン、グアノシン、シトシン、ウラシル、及び）、並びに非天然の塩基を含むことができる。非天然塩基のいくつかの例としては、例えばＳｅｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ８２：１６４０に記載されているものが挙げられる。非天然塩基は、特定の機能、例えば、核酸二重鎖の安定性の増加、ヌクレアーゼ分解の阻害、又はプライマー伸長若しくは鎖重合の遮断を有することができる。
【００２１】
用語「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、同じ意味で用いられる。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖核酸である。オリゴヌクレオチドは、場合によってはより短いポリヌクレオチドを説明するために使用される用語である。オリゴヌクレオチドは、当該技術分野において公知の任意の好適な方法によって、例えば、Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５−３１９１に記載されているような、直接化学合成を伴う方法によって、調製される。
【００２２】
用語「プライマー」とは、標的核酸（「プライマー結合部位」）内で配列とハイブリダイズするする一本鎖オリゴヌクレオチドを意味し、このような合成に好適な条件下にて、核酸の相補鎖に沿って、合成の開始点として作用することができる。
【００２３】
用語「アダプター」とは、別の配列に付加されて、その配列に追加の性質を組み込むことができるヌクレオチド配列を意味する。アダプターは典型的には、一本鎖若しくは二本鎖であることができるオリゴヌクレオチドである、又は、一本鎖部分と二本鎖部分の両方を有することができる。
【００２４】
用語「ライゲーション」とは、一方の分子の５’−ホスフェート基が、別の分子の３’−ヒドロキシル基と反応する、２つの核酸鎖を結合させる縮合反応を意味する。ライゲーションは典型的には、リガーゼ又はトポイソメラーゼにより触媒される、触媒反応である。ライゲーションは、２つの一本鎖を結合して、１つの一本鎖分子を作製することができる。ライゲーションはまた、それぞれが二本鎖分子に属する２つの鎖を結合することもできるため、２つの二本鎖分子を結合する。ライゲーションはまた、二本鎖分子の両方の鎖を、別の二本鎖分子の両方の鎖に結合することもできるため、２つの二本鎖分子を結合する。ライゲーションはまた、二本鎖分子内の鎖の２つの末端を結合することができるため、二本鎖分子内のニックを修復する。
【００２５】
用語「バーコード」とは、検出及び識別可能な核酸配列を意味する。バーコードは、様々な核酸に組み込むことができる。バーコードは十分に長い、例えば、２、５、２０ヌクレオチドであるため、試料内において、バーコードを組み込む核酸は、バーコードに従い区別することができる、又はグルーピングすることができる。
【００２６】
用語「多重識別子」又は「ＭＩＤ」とは、標的核酸の源（例えば、核酸が由来する試料）を識別するバーコードを意味する。同じ試料由来の、全て、又は実質的に全ての標的核酸は、同じＭＩＤを共有している。異なる源又は試料由来の標的核酸は、混合して同時に配列決定することができる。ＭＩＤを使用することで、配列リードを、標的核酸が由来する個別の試料に割り当てることができる。
【００２７】
用語「固有分子識別子」又は「ＵＩＤ」とは、結合されている核酸分子を識別するバーコードを意味する。同じ試料由来の、全て、又は実質的に全ての標的核酸は、異なるＵＩＤを共有している。同じ元の標的核酸に由来する、全て、又は実質的に全ての後代（例えば、アンプリコン）は、同じＵＩＤを共有する。
【００２８】
用語「量子バーコード化」又は「ＱＢＣ」とは、細胞の混合物中における個別の細胞が、固有の核酸バーコードにより標識されることができるプロセスであって、細胞の混合物を、標的結合配列及びバーコードオリゴヌクレオチドアニーリング領域を含む結合剤の混合物と接触させる工程と、細胞を、結合剤中のバーコードオリゴヌクレオチドアニーリング領域に相補性のバーコードオリゴヌクレオチドと接触させる工程と、スプリットプール合成の１つ以上のラウンドのそれぞれにおいて、細胞を、各ラウンドのバーコード化オリゴヌクレオチドが以前のラウンドのバーコードオリゴヌクレオチドのアニーリング領域に相補性のアニーリング領域を含む追加のバーコードオリゴヌクレオチドと接触させ、各細胞内で細胞特異的バーコードを組み立てる工程とを含む、プロセスを意味する（２０１６年４月１５日に出願された、米国出願番号１３／９８１，７１１号を参照のこと）。
【００２９】
本明細書で使用する場合、用語「標的配列」、「標的核酸」、又は「標的」とは、検出又は分析される、試料内での核酸配列の部分を意味する。用語「標的」は、標的配列のあらゆる多様体、例えば、１つ以上の変異体多様体、及び野生型多様体を含む。
【００３０】
用語「増幅」とは、標的核酸の更なるコピーを作製するプロセスを意味する。増幅は、２回以上のサイクル、例えば、複数サイクルの、指数関数的増幅を有することができる。増幅は、（標的核酸の単一コピーを作製する）１回のみのサイクルを有することができる。コピーは、例えば、増幅に用いられるプライマーに存在するものなどの、追加の配列を有することができる。増幅は、一本鎖（線形増幅）のみ、又は優先的に一本鎖（非対称ＰＣＲ）のコピーもまた作製することができる。
【００３１】
用語「配列決定」とは、標的核酸内のヌクレオチドの配列を測定する、あらゆる方法を意味する。
【００３２】
用語「ＭＨＣ」とは、（ＭＨＣ−Ｉに対する）α１、α２、及びα３ペプチド並びにβ２マイクログロブリンペプチドの非共有複合体、又は、（ＭＨＣ−ＩＩに対する）α１、α２、β１、及びβ２ペプチドの非共有複合体を含む、四級ペプチド構造である、主要組織適合遺伝子複合体を意味する。ペプチド抗原に結合したＭＨＣは、「ｐＭＨＣ」と呼ばれる。
【００３３】
用語「ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ」、「ＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータ」、並びに「ＴＣＲα及びＴＣＲβ」は同じ意味で用いられ、（文脈に応じて）Ｔ細胞受容体α及びβペプチド鎖、並びにこれらをコードする遺伝子を意味する。Ｔｈｏｍａｓ  Ｊ．Ｋｉｎｄｔ；Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａ．Ｇｏｌｄｓｂｙ；Ｂａｒｂａｒａ  Ａｎｎｅ  Ｏｓｂｏｒｎｅ；Ｊａｎｉｓ  Ｋｕｂｙ（２００７）．Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｍａｃｍｉｌｌａｎを参照のこと。
【００３４】
本発明は、Ｔ細胞受容体に対する抗原を識別する方法である。より正確には、本発明は、ＴＣＲα及びＴＣＲβペプチド鎖からなる機能性Ｔ細胞受容体を形成する、一対の、Ｔ細胞レセプターをコードする遺伝子ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢを識別する方法、並びに更に、機能性Ｔ細胞受容体に対する同種抗原の配列を識別する方法である。本発明は、以下のいくつかの革新的なアプローチに依存している：ｉ．超並列ＤＮＡ塩基配列決定法のための、腫瘍組織のそれぞれのサンプリング；ｉｉ．生物学的に関係のある複合体の一部である全てのシステム構成要素をタグするための、分子バーコードの利用；ＴＣＲとペプチドリガンドとの間での、高親和性で安定した複合体の調製；及び、ｉｖ．超並列ＤＮＡ塩基配列決定法により読み取り可能な核酸バーコードを使用した、タグ付けされたシステム構成要素の調査。
【００３５】
図１にまとめているように、本発明は、（１）腫瘍組織を入手する工程と、（２）組織を細胞又は細胞核、原子核に解離させる工程と、（３）腫瘍細胞、通常細胞、及び免疫細胞をソートする工程と、（４）腫瘍細胞分画、通常細胞分画、及び免疫細胞分画を入手する工程と、（５）細胞分画からＤＮＡを単離する工程と、（６）腫瘍ＤＮＡを、腫瘍ＤＮＡ配列決定のための配列決定ライブラリーに転換する工程と、（７）対形成したＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子を、配列決定のために調製する工程と、（８）ＤＮＡ塩基配列決定を行う工程と、（９）配列決定データを解釈する工程と、（１０）予測した免疫原性ネオ抗原ペプチドをコードする遺伝子の、格付けリストを形成する工程と、（１１）観察された、又は推定されたＴＣＲＡ／ＴＣＲＢ対形成を有するＴ細胞受容体配列（ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ）の、格付けリストを形成する工程と、を含む。
【００３６】
図２にまとめているように、（１）予想された免疫原性ネオ抗原ペプチドをコードする遺伝子の格付けリスト、及び（２）図１で観察された、又は推定されたＴＣＲＡ／ＴＣＲＢ対形成を有するＴ細胞受容体配列（ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ）の格付けリストから始まり、本発明は、（３）ＤＮＡバーコード化ネオ抗原ペプチドＭＨＣ複合体のライブラリーを形成する工程と、（４）識別され格付けされたＴＣＲ−Ａ／Ｂ配列、ＣＤ３受容体、及びＣＤ８同時受容体を発現するトランスジェニックＴ細胞を形成する工程と、（５）ＴＣＲを発現するトランスジェニックＴ細胞の集団を、ＤＮＡバーコード化ネオ抗原ペプチドＭＨＣ複合体でインキュベートする工程と、（６）複合体（５）を、ＤＮＡバーコード化ペプチドＭＨＣ複合体由来の、コンビナトリアルバーコード化、並びに、ＴＣＲＡ  ｍＲＮＡ（プラスミド）、ＴＣＲＢ  ｍＲＮＡ（プラスミド）、及びバーコードのＮＧＳ配列決定に通す工程と、（７）バーコードを配列決定して配列決定データを解釈し、同種ＴＣＲ対及び一致ペプチドを分析する工程と、を更に含む。
【００３７】
図１の工程１を参照すると、試料は、対象又は患者に由来している。いくつかの実施形態では、試料は、例えば生検又は外科的切除によって対象又は患者に由来する、充実性組織又は充実性腫瘍の断片を含むことができる。図１の工程２を参照すると、方法は、腫瘍を解離して、細胞の混合物又は懸濁液を得る工程を含む。腫瘍組織は、新鮮であるか、（例えば液体窒素で）急速冷凍されるか、又は、ホルマリン、パラホルムアルデヒドなどを使用して固定されるかの、いずれかであることができる。腫瘍組織は、機械的解離（例えば、Ｔｕｂｅ  Ｍｉｌｌ，（ＩＫＡ  Ｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）などのホモジナイザーを使用するブレンド）と、タンパク質分解酵素による酵素的分解との組み合わせを使用して、均質化することができる。いくつかの実施形態では、組織解離は排他的に酵素によるものであり、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ（中性プロテアーゼ）、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、プロテイナーゼＫ、及びプロナーゼのうちの１つ以上を用いる。
【００３８】
典型的な腫瘍試料は、均質ではないが、腫瘍細胞、並びに通常の細胞及び免疫細胞の、不均質な集団を含有する。腫瘍内の免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球を含むことができる。試料内の各種類の細胞は、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による、細胞分離に使用可能な１つ以上のバイオマーカーにより特性決定される。図１の工程３及び４を参照すると、細胞は分画に分離されている。腫瘍細胞は典型的には多倍数体であるため、腫瘍細胞又は細胞核は、サイトケラチン、ｐ５３、ｐ６３タンパク質を含む腫瘍バイオマーカーにより、又は、ＤＮＡ内容物により特性決定される。いくつかの実施形態では、細胞は、リン脂質又は糖脂質内容物により特性決定される。種類に応じて、リンパ球は、単独で又は組み合わせでの、一組の表面タンパク質、リンパ球の種類に関するバイオマーカーとして機能する有無により特性決定される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、バイオマーカーＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＣＲ＋の組み合わせにより区別される。いくつかの実施形態では、ナイーブＴ細胞は、バイオマーカーＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋の組み合わせにより区別される。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞は、バイオマーカーＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌの組み合わせにより区別される。いくつかの実施形態では、エフェクターメモリーＴ細胞は、バイオマーカーＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−の組み合わせにより区別される。いくつかの実施形態では、エフェクターＴ細胞は、バイオマーカーＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−の組み合わせにより区別される。いくつかの実施形態では、制御性Ｔ細胞は、バイオマーカーＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋の組み合わせにより区別される。
【００３９】
いくつかの実施形態では、抗原配列及びＴＣＲ配列は、分画した細胞から単離した核酸を配列決定することにより測定される（図１の工程５）。
【００４０】
いくつかの実施形態では、機能性ＴＣＲを形成するペプチドをコードするＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ配列は、区画化、ＰＣＲ増幅、及びＴＣＲ配列の配列決定により、同じ区画内に存在するＴＣＲＡ及びＴＣＲＢを発見することを伴う方法を使用して識別される（例えば、Ｈｏｗｉｅ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｐａｉｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α  ａｎｄ  β  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５．７（３０１）：ｐ．３０１ｒａ１３１−３０１ｒａ１３１を参照のこと）。要約すると、Ｔ細胞は個別の区画内で区画化される。ＴＣＲ鎖をコードする核酸は、ゲノムＤＮＡから、又は、（ｃＤＮＡに転換した）全細胞ＲＮＡから入手される。ｍＲＮＡの複数の分子が存在することにより、ｃＤＮＡがゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に対して好ましくなる。ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ配列を次に、各ウェル内でＰＣＲ増幅させる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、（図１の工程７を参照）対形成したＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子は、Ｔ細胞の集団を、１つの細胞を含有する複数の第１の分画に分画することと、細胞を含有する分画を、それぞれが、ＴＣＲ遺伝子結合配列及びバーコードを含む、バーコード化オリゴヌクレオチドＴＣＲプライマーの複数のコピーを含有する複数の第２の分画と混合することであって、バーコードは、各分画内で同じであるが、分画間では異なっている、混合することと、第１及び第２の分画を融合することと、バーコード化ＴＣＲプライマーを有するＴＣＲ遺伝子をコピーして、バーコード化ＴＣＲ遺伝子アンプリコンを形成することと、バーコード化ＴＣＲアンプリコンを配列決定して、どのＴＣＲＡ及びＴＣＲＢアンプリコンが、１つの細胞内で同時発生しているかを示す同じバーコードを有するかを測定することと、を含む方法により識別される。（図１の工程８）。
【００４２】
いくつかの実施形態では、対形成したＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子は、配列決定及びコンビナトリアル分析を含む方法により識別される（例えば、Ｈｏｗｉｅ，Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｐａｉｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α  ａｎｄ  β  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７，ｎｏ．３０１（２０１５）：３０１ｒａ１３１−３０１ｒａ１３１を参照のこと）。要約すると、方法は、Ｔ細胞の集団を、細胞の群を含有する複数の分画に分画することと、バーコード化アダプターを、各分画内の核酸にライゲーションすることと、アダプター化した核酸内のＴＣＲＡ及びＴＣＲＢを配列決定して、バーコード化ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ配列を入手することと、ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子対塩基の、分画内で同時発生する頻度を測定することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ遺伝子内のＣＤＲ３領域が、例えば、Ｖ及びＣ遺伝子に対して特異的なプライマー、又は、ＣＤＲ３領域に存在する任意のセグメントにより、標的となる。いくつかの実施形態では、配列決定は、各鎖に対して、受容体配列とバーコードの両方をもたらす、ハイスループットＤＮＡ塩基配列決定法用のバーコード化アンプリコンをプールすることにより達成される。配列決定したバーコードにより、受容体配列を元のウェルにマッピングすることが可能となる。いくつかの実施形態では、ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢのマッチングには、統計分析を用いる。統計分析を使用して、各ＴＣＲＢ配列のウェル占有パターンに対する、各ＴＣＲＡ配列のウェル占有パターンを比較する。偶然にも、予想よりも多くのウェルを共有する配列は、可能性のある対形成パートナーとしてマークする。更なる統計的手法、例えば、順列によるヌル分布を生成し、標的偽発見率を満たす対を識別することを含む方法を使用して、機能性ＴＣＲをコードするＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ塩基対を識別する。米国特許出願公開第２０１００３３０５７１号を参照のこと。
【００４３】
いくつかの実施形態では、機能性ＴＣＲを形成するペプチドをコードするＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ配列は、個別のＴ細胞から識別される。Ｔ細胞がクローニングされ、例えば、ハイブリッド捕捉及び配列決定を伴う方法により、ＴＣＲ遺伝子が配列決定される（例えば、Ｌｉｎｎｅｍａｎｎ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＴＣＲｓ  ｂｙ  ＴＣＲ  ｇｅｎｅ  ｃａｐｔｕｒｅ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ，２０１３．１９（１１）：ｐ．１５３４−１５４を参照のこと）。要約すると、一例において、おとりライブラリーを使用して、それぞれの座位当たり、８及び６個のおとりにて、ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ内の、各個別の可変（Ｖ）及び結合（Ｊ）エレメントを標的にする。おとりは、ゲノムＤＮＡ由来のＴＣＲコード配列を捕捉する。捕捉された配列は、バーコード化アダプターのライゲーション、及び、対形成が終わった深い配列決定、を含む方法により配列決定される。配列データを分析して、ＴＣＲ  Ｊ遺伝子、ＴＣＲＢ  Ｄ遺伝子、及びＴＣＲ  Ｖ遺伝子を再構築する。ＣＤＲ３領域配列を、保存されたＴＣＲ  Ｖシステインと、ＴＣＲ  Ｊフェニルアラニン残基との間のヌクレオチド配列として測定する。別の実施形態において、個別のＴ細胞を、容器特異的なバーコード（例えば、ＴＣＲ遺伝子のｍＲＮＡの逆転写用の、逆転写（ＲＴ）プライマーとして機能するオリゴヌクレオチド）と共に、容器（例えば、油中水型エマルション）に封入する。例えば、出願シリアル番号ＷＯ２０１６１７６３２２を参照のこと。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本発明は、それぞれが、ＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖をコードする、一対のＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子を含む、格付けＴ細胞受容体配列の格付けリストを形成することを含む。（図１の工程９及び１１）。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本発明は、改変ＴＣＲを発現するＴ細胞を形成する工程を含む。（図２、工程４）。細胞は、後のセクションで詳細に説明するように、内因性ＴＣＲを作製しないＴ細胞であるのが好ましい。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞を作製するいくつかの方法が当技術分野において既知である（例えば、Ｅｓｓａｎｄ，Ｍ．ａｎｄ  Ａ．Ｓ．Ｌｏｓｋｏｇ，Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ，２０１３．２７３（２）：ｐ．１６６−８１を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ウイルスベクター、例えば、遺伝子が、ピコルナウイルス２Ａ自己開裂ペプチドリンカーと融合したＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖をコードする場合において、レトロウイルスベクター、を使用して、ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子を導入する（例えば、Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｃｏｎｆｅｒｓ  Ａｎｔｉ−ＨＣＶ  Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．ＰＬＯＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，２０１０．６（７）：ｐ．ｅ１００１０１８  ａｎｄ  Ｗａｌｃｈｌｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１１．６（１１）：ｐ．ｅ２７９３０を参照のこと）。いくつかの実施形態では、要素を導入して、改変ＴＣＲの形成を向上させる。向上には、マウス定常ＴＣＲドメインを使用してＴＣＲ発現を向上させること、ジッパードメインを細胞内ＴＣＲドメインに付加して、鎖間認識及び結合を促進すること、又は、定常領域の細胞外部分におけるジスルフィド結合を改変し、鎖間親和性を増加させること、が含まれる（例えば、米国特許第９６２４２９２Ｂ２号、及び、Ｋｕｂａｌｌ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ  ｍａｔｃｈｅｄ  ｐａｉｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＴＣＲ  ｃｈａｉｎｓ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎｔｏ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ，２００７．１０９（６）：ｐ．２３３１を参照のこと）。追加の向上としては、ＴＣＲの細胞表面発現レベルを改善するために、ＭＳＣＶ標的細胞を、クローン化したヒトＣＤ３複合体を有するＭＳＣＶベクターとコトランスフェクションすることが挙げられる（例えば、Ｇｕｏ，Ｘ．−ｚ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｉｒｅｄ  αβ  ａｎｄ  γδ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｈａｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１６．３：ｐ．１５０５４を参照のこと）。
【００４６】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは使用されないが、ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子対が、ＰＣＲアンプリコンなどの転写活性ＤＮＡ断片として、細胞に導入される。いくつかの実施形態では、トランスフェクションを促進する試薬、例えばＴｒａｎｓＩＴ−２９３試薬（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ．）が使用される。更に他の実施形態において、ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子対を、機能性ｍＲＮＡ、例えばインビトロ転写ｍＲＮＡとして、細胞に導入する。例えば、Ｓｉｍｏｎ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＴＣＲ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ｆｒｏｍ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｎｏｖｅｌ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ，２０１４．２（１２）：ｐ．１２３０−１２４４を参照のこと。ここでは、ｍＲＮＡはＴ７ポリメラーゼにより作製され、ＲＮＡ安定性及び翻訳効率の増加のために、ヒトβグロビン遺伝子の３’ＵＴＲなどの、３’改変を含んだ。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子対はそれぞれのＴ細胞に導入される。（図２、工程５）。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、内因性ＴＣＲ遺伝子を欠いている。例えば、Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｃｏｎｆｅｒｓ  Ａｎｔｉ−ＨＣＶ  Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．ＰＬＯＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，２０１０．６（７）：ｐ．ｅ１００１０１８、及びＳｉｍｏｎ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＴＣＲ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ｆｒｏｍ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｎｏｖｅｌ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ，２０１４．２（１２）：ｐ．１２３０−１２４４，ｅｘａｍｐｌｅｓ  ｏｆ  ＴＣＲＡ／Ｂ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｊｕｒｋａｔ７６  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅを参照のこと。別の実施形態において、細胞はＴ細胞ハイブリドーマである（例えば、Ｓｉｅｗｅｒｔ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｆ  ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｓｈｏｒｔ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ，２０１２．１８（５）：ｐ．８２４−８を参照のこと）。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を更に改変して、ＣＤ４同時受容体を発現するようにする。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を更に改変して、ＴＣＲ抗原認識、及びその後のＴ細胞活性化の際にレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ又はルシフェラーゼなどの蛍光タンパク質）を発現するようにすることができる。レポーター構築物は、Ｔ細胞活性化の際に上方制御される、ＮＦＡＴタンパク質応答性プロモーターなどの、応答性プロモーターを含むことができる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列決定の準備ができた標的核酸のライブラリーを作製し、配列決定する工程を含む。標的核酸は、試料から入手したＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子を含むことができる。標的核酸は、腫瘍ネオ抗原（腫瘍エクソーム）に対するコード配列を含む、腫瘍エクソームであることもまた可能である。本明細書中に記載のように、ライブラリーは、アダプター、バーコード、及びプライマー結合部位を含むがこれらに限定されない、追加のフィーチャーを有する個々の分子を含む。標的配列を、上記追加のフィーチャーに（例えば、ライゲーションにより、又はプライマー伸長により）抱合体化する。
【００４９】
いくつかの実施形態では、腫瘍物質から単離された核酸を配列決定することには、ライブラリー調製の工程を伴う。（図１の工程６）。工程は、アダプター分子が標的核酸にライゲーションされ、バーコード化及び配列決定が可能となる、アダプター化した核酸を形成することを含む。ライゲーションは、平滑末端ライゲーション、又はより効果的な、凝集性末端ライゲーションであることができる。標的核酸又はアダプターは、鎖充填を含む「末端修復」、すなわち、ＤＮＡポリメラーゼによって３’末端を伸長して５’オーバーハングを除去することによって、平滑末端にすることができる。いくつかの実施形態では、平滑末端アダプター及び標的核酸は、例えばＤＮＡポリメラーゼ又は末端トランスフェラーゼによって、アダプターの３’末端への単一ヌクレオチド及び標的核酸の３’末端への単一相補的ヌクレオチドを付加することで付着性にすることができる。更に他の実施形態では、アダプター及び標的核酸は、制限エンドヌクレアーゼでの消化によって付着末端（オーバーハング）を獲得し得る。後者の選択肢は、制限酵素認識部位を含有することが知られている既知の標的配列に対してより有利である。いくつかの実施形態では、他の酵素工程が、ライゲーションを達成するために必要とされ得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドキナーゼは、標的核酸分子及びアダプター分子に５’−リン酸を加えるために使用され得る。
【００５０】
アダプターが、例えばライゲーションにより、標的核酸の配列とは独立して付加される実施形態において、試料内の標的核酸は、各末端にて同じアダプター分子を受ける。もたらされる、アダプター化した標的核酸の鎖を区別するために、アダプターは、Ｙ構造を有することができる（例えば、米国特許第８０５３１９２号、同第８１８２９８９号、及び同第８８２２１５０号を参照のこと）。
【００５１】
いくつかの実施形態では、アダプターはプライマー結合部位、例えば、増幅プライマー結合部位、又は、配列決定プライマー結合部位を含む。いくつかの実施形態では、アダプター分子は、インビトロ合成人工配列である。他の実施形態では、アダプター分子は、インビトロ合成天然配列である。更に他の実施形態では、アダプター分子は、天然分子から単離される。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本発明は、標的核酸を増幅する工程を含む方法である。増幅は、指数関数的ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）、一方の鎖のみの線形増幅、又はオリゴヌクレオチドプライマーを利用する任意の他の方法によるものであってもよい。様々なＰＣＲ条件は、ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ，ａｎｄ  Ｊ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ  ｅｄｓ．，１９９５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）ａｔ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １４；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｊ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ，ａｎｄ  Ｔ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９０）に記載されている。
【００５３】
いくつかの実施形態では、増幅には、上述したように標的配列に抱合体化したアダプターに存在する、ユニバーサルプライマー結合部位を利用する。その他の実施形態では、遺伝子特異的（標的特異的）プライマー又はプライマー対を使用する。いくつかの実施形態では、プライマーは、アダプター配列、例えばバーコード又は配列決定プライマー結合部位を含む５’オーバーハングを含有する。このようなプライマーを使用することで、本発明の方法のアダプターライゲーション工程なしで済ませられる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本発明は、特に配列決定のための、バーコードを標的核酸に導入することを含む。個々の分子の配列決定は、典型的には、例えば、米国特許第７，３９３，６６５号、同第８，１６８，３８５号、同第８，４８１，２９２号、同第８，６８５，６７８号、同第８，７２２，３６８号、及び同第７，２６４，９２９号に記載されているような分子バーコードを必要とする。固有分子バーコードは、典型的にはインビトロ操作の最初の工程の間に患者の試料などの試料中の各分子に加えられる、短い人工配列である。バーコードは分子とその子孫を標識する。固有分子バーコード（ｕｎｉｑｕｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｒｃｏｄｅ：ＵＩＤ）には複数の用途がある。バーコードは、試料中の個々の核酸分子を追跡して、例えば、生検なしに癌を検出し監視するために、患者の血液中の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）分子の存在及び量を評価することを可能にする。米国特許出願第１４／７７４，５１８号を参照されたい。固有分子バーコードはまた、配列決定のエラー訂正にも使用できる。単一の標的分子の子孫全体が同じバーコードで標識され、バーコード化されたファミリーを形成する。バーコード化されたファミリーの全メンバに共有されていない配列の変動は、人工物として廃棄され、これは真の突然変異ではない。バーコードはまた、ファミリー全体が元の試料中の単一分子を表しているため、位置的重複排除及び標的の定量化にも使用することができる。Ｉｄを参照のこと。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態では、アダプターは、１つ以上のバーコードを含む。バーコードは、試料が混合（多重化）される試料の源を識別するために使用される多重試料ＩＤ（ＭＩＤ）であってもよい。バーコードはまた、各元の分子及びその子孫を識別するために使用されるＵＩＤとしても機能する。バーコードはまた、ＵＩＤとＭＩＤとの組合せであってもよい。いくつかの実施形態では、単一のバーコードが、ＵＩＤ及びＭＩＤの両方として使用される。いくつかの実施形態では、各バーコードは、所定の配列を含む。他の実施形態では、バーコードは、ランダム配列を含む。バーコードは１〜２０ヌクレオチド長であり得る。
【００５６】
配列決定は、当技術分野で周知の任意の方法によって行うことができる。環状標的核酸の読み取りが可能な、ハイスループット単一分子配列決定が、特に有利である。このような技術の例としては、ＳＯＬｉＤプラットフォーム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌ．）、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ蛍光ベース配列決定機器（Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）、ＳＭＲＴ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌ．）を利用するＰａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓプラットフォーム、又は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）若しくはＲｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｒｏｃｈｅ  Ｇｅｎｉａ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａｌ．）により製造されるものなどの、ナノ孔技術を利用するプラットフォーム、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＢＳ）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌ．）による可逆的ターミネーター配列決定によるもの、並びに、合成による配列決定を伴う、又は伴わない、既存の、又は将来的な、任意の他のＤＮＡ塩基配列決定法が挙げられる。配列決定工程は、プラットフォーム特異的配列決定プライマーを利用することができる。これらのプライマー用の結合部位を、本明細書に記載したとおりに、即ち、第２のアダプター又は増幅プライマーの一部として、本発明の方法に導入することができる。
【００５７】
分析及び誤差修正
いくつかの実施形態では、配列決定工程には、配列位置合わせの工程を含む、配列分析を伴う。いくつかの実施形態では、アラインメントを使用して、複数の配列、例えば同じバーコード（ＵＩＤ）を有する複数の配列からコンセンサス配列を決定する。いくつかの実施形態では、バーコード（ＵＩＤ）は、全てが同一のバーコード（ＵＩＤ）を有する複数の配列からコンセンサスを決定するために使用される。他の実施形態では、バーコード（ＵＩＤ）は、を使用して、人工物、すなわち、同一のバーコード（ＵＩＤ）を有する一部の配列に存在するが全ての配列には存在しない変動を除去するために使用される。ＰＣＲエラー又は配列決定エラーから生じるこのような人工物は、除去され得る。
【００５８】
いくつかの実施形態では、試料中の各配列の数は、試料中の各バーコード（ＵＩＤ）を有する配列の相対数を定量化することによって定量化することができる。各ＵＩＤは、元の試料中の単一の分子を表し、各配列多様体に関連する異なるＵＩＤを計数することによって、元の試料中の各配列の画分を決定することができる。当業者は、コンセンサス配列を決定するために必要な配列読取りの数を決定することができる。いくつかの実施形態では、関連する数は、正確な定量的結果のために必要なＵＩＤ（「配列深度（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｐｔｈ）」）当たりの読取りである。いくつかの実施形態では、所望の深度はＵＩＤ当たり５〜５０読取りである。
【００５９】
本発明は、腫瘍ネオ抗原を識別する工程を更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）、全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）、又は、腫瘍に関連して発現する遺伝子に対する強化された遺伝物質の、より選択的な配列決定による、腫瘍関連遺伝物質の配列決定工程を含む。（図１の工程５、６、及び８）。方法は更に、参照ゲノムへのアラインメントを含む。これにより、ネオ抗原は、参照ゲノムと比較したときに、コード配列に差（変異）を含む配列として識別される。ミスセンス変異（即ち、アミノ酸コーディングを変化させる変異）のみが、潜在的なネオ抗原性変異としてスコアリングされる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ネオ抗原は、ペプチドアレイを使用する血清抗体スクリーニングにより発見される。本実施形態において、８〜２０アミノ酸長における、最大２５０万のペプチドの、アドレス指定可能なアレイは、米国特許第９３４６８９２号に記載されているように合成される。アレイは、腫瘍患者の血清によりスクリーニングされ、抗体結合は、比色分析又は蛍光アッセイ、例えばＥＬＩＳＡアッセイにより検出される。免疫応答（抗体結合）を有するものとして識別されるアレイペプチドは、ネオ抗原として選択される。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ネオ抗原を識別する工程は、例えば、Ｋｖｉｓｔｂｏｒｇ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｐｒｉｍｅｒ：ｗｈｏｌｅ  ｅｘｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｆｏｒ  ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１６．４（１）：ｐ．２２．Ｔｒａｎ，Ｅ．，Ｐ．Ｆ．Ｒｏｂｂｉｎｓ，ａｎｄ  Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，’Ｆｉｎａｌ  ｃｏｍｍｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｒａｎｄｏｍ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１７．１８（３）：ｐ．２５５−２６２．；Ａｎａｇｎｏｓｔｏｕ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  Ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎ  Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ，２０１６．；Ｚｏｌｋｉｎｄ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．；Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｎｔ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｄｒｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１５．５２０（７５４９）：ｐ．６９２−６．；Ｈｅｇｄｅ，Ｐ．Ｓ．，Ｖ．Ｋａｒａｎｉｋａｓ，ａｎｄ  Ｓ．Ｅｖｅｒｓ，Ｔｈｅ  Ｗｈｅｒｅ，ｔｈｅ  Ｗｈｅｎ，ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｈｏｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｒａ  ｏｆ  Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１６．２２（８）：ｐ．１８６５−７４；Ｙｕａｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｏｖｅｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１６．４：ｐ．３．に記載されている、仮のネオエピトープ予測工程、又は、仮の抗原性ペプチド予測工程を更に含む。例えば、以下の好ましい特徴のうちの１つ以上が見いだされた場合に、変異体ペプチドはネオ抗原と識別される：変異が腫瘍と関連していることが知られている、例えば、ＣＯＳＭＩＣデータベース（ヒトの癌で見いだされる体細胞突然変異の包括的なリストを含有するデータベース）に存在する、変異ペプチドが８〜１５アミノ酸長である、変異ペプチド配列が、プロテアソーム開裂を促進する配列の付近のタンパク質の中に位置する、変異ペプチド配列が、抗原プロセッシング（ＴＡＰ）と関連するトランスポーターに対する認識部位の付近のタンパク質の中に位置する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本発明は、ネオ抗原の、ＭＨＣ対立遺伝子への結合度合いを予測する工程を更に含む。いくつかの実施形態では、結合度合いは、配列ベースのインシリコ評価により測定される（例えば、予測は、隠れマルコフモデル、機械学習アルゴリズム、及びニューラルネットワークのうちの１つ以上を使用して作製される）。別の実施形態において、結合度合いは、例えば、既知のペプチド抗原結晶構造を使用して構造ベースのインシリコ評価により測定され、所与のペプチドがＭＨＣ分子に結合するか否かについての予測を行うことができる（例えば、Ｓｈａｒｍａ，Ｇ．ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｈｏｌｔ，Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１４．７５（６）：ｐ．５１４−５１９を参照のこと）。更に他の実施形態において、結合度合いは実験により測定され、測定した、ＭＨＣに対するペプチドの親和性は１マイクロモル未満、例えば５００ｎＭ、２００ｎＭ、又は、最低で５０ｎＭ以下である。
【００６３】
いくつかの実施形態では、方法は、腫瘍由来のネオ抗原抗原の格付けリストを生成する工程を含む。（図１の工程９及び１０）。
【００６４】
本発明は、候補のネオ抗原ペプチドを形成して、これらをＭＨＣ分子と結合して、抗原を発現する複合体を形成する工程を更に含む（図２の工程３）。いくつかの実施形態では、ペプチドは、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１−３４７（１９８６），Ｂａｒａｎｙ＆Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ＆Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．（Ｎ．Ｙ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．１−２８４（１９７９）；及びＳｔｅｗａｒｔ＆Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，Ｐｉｅｒｃｅ），２ｄ  Ｅｄ．（１９８４）に記載されているものなどの、既存のインビトロペプチド合成法を使用して形成される。ペプチドは、米国特許第９３４６８９２号に記載されている、アミノ酸が、感光性保護基により保護されているアミノ基により導入されている、マイクロアレイを使用してもまた合成することができる。
【００６５】
本発明は、抗原提示ポリペプチド複合体を形成する工程を更に含む。複合体は、α１、α２、及びα３ペプチド、並びにβ２マイクログロブリンペプチドの非共有複合体を含むＭＨＣ−Ｉ複合体、又は、α１、α２、β１、及びβ２ペプチドの非共有複合体を含むＭＨＣ−ＩＩ複合体である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣペプチドは患者特異的である。患者特異的タンパク質配列は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、及びＨＬＡ−Ｇ座位のうちの１つ以上を含む、患者のクラスＩａ及びクラスＩｂ遺伝子配列のうちの１つ以上の核酸配列を測定することにより入手される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣペプチドを作製するための発現ベクターは、患者のＨＬＡ遺伝子配列から形成される。いくつかの実施形態では、患者のＨＬＡ遺伝子配列は、ＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂ遺伝子の低解像度タイピング、並びに、配列格付けにより、最も可能性の高い対立遺伝子を測定することにより測定される（例えば、Ｅｍｅｒｓｏｎ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ａｎｄ  ＨＬＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４９，ｎｏ．５（２０１７）：６５９を参照のこと）。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ＭＨＣ複合体の多量体を使用する。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ多量体は二量体、四量体、又は八量体である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ多量体は、主鎖分子上で複数のＭＨＣモノマーを捕捉することにより作製される。いくつかの実施形態では、主鎖は、デキストラン又は他の炭水化物ポリマーなどの、ポリマー分子である。いくつかの実施形態では、主鎖は、親和性捕捉分子を含有する。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ多量体は、デキストランに結合した、ストレプトアビジン、又はアビジン上で、組み換えにより作製したビオチン化ＭＨＣモノマーを捕捉することにより形成される。いくつかの実施形態では、多量体は四量体である。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ＭＨＣ多量体を、検出分子に抱合体化する。いくつかの実施形態では、検出分子は、主鎖に抱合体化し、フローサイトメトリーにより、ＭＨＣ多量体に結合したＴ細胞の単離を可能にする、蛍光色素である。いくつかの実施形態では、検出分子は、（例えば、Ｎｅｗｅｌｌ，Ｅ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｂｙ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｓｈｏｗｓ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｅｌｌ  ｎｉｃｈｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ  ｏｆ  ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３６（１），１４２−１５２に記載されている方法により）主鎖に抱合体化し、質量分析により検出が可能となった、重金属である。Ｓｈａｒｍａ，Ｇ．ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｈｏｌｔ，Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１４．７５（６）：ｐ．５１４−５１９；Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄ  Ｍ．Ｍ．Ｄａｖｉｓ，ＭＨＣ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｔｒａｍｅｒｓ  ｔｏ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１６．１１５：ｐ．１７  ３  １−１７  ３  ４４を参照のこと。
【００６８】
本発明は、ＭＨＣ多量体のバーコード化を更に含む。いくつかの実施形態では、バーコードは、一本鎖又は二本鎖核酸分子である。バーコード核酸分子は、ＭＨＣ多量体と同じ主鎖に捕捉されることができる。一例では、バーコードは、ＭＨＣ分子が結合するストレプトアビジン、又はアビジンで改変された、同じデキストラン上で捕捉される、ビオチン化ＤＮＡ分子である。Ｂｅｎｔｚｅｎ，Ａ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ−Ｉ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  ｂａｒｃｏｄｅｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１６．３４（１０）：ｐ．１０３７−１０４５を参照のこと。いくつかの実施形態では、核酸バーコードは、１０、１５、２０、又は２５塩基、又は塩基対の長さである。バーコード化は、最大で約１０１０個の、異なるＭＨＣ多量体のラベリングの潜在性を有する。いくつかの実施形態では、細胞を捕捉するために使用したＭＨＣ多量体を、オリゴヌクレオチドプローブに捕捉する。細胞捕捉の後、抱合体化したオリゴヌクレオチドの領域に相補性の核酸プローブを、各細胞に結合した各ｐＭＨＣ多量体にハイブリダイズする。
【００６９】
本発明は、ＭＨＣ多量体に結合したＴ細胞を捕捉する工程を更に含む。いくつかの実施形態では、細胞は、標準的な免疫学的手順を使用して、バーコード化ｐＭＨＣ多量体により染色され、ｍＡｂと同時染色される。例えば、ヒトＴ細胞はＦｃ遮断剤によりインキュベートし、次いで、ｐＭＨＣ多量体でインキュベートして、ＱＢＣ手順に移る。
【００７０】
本発明は、Ｔ細胞のバーコード化工程を更に含む。一態様では、Ｔ細胞をバーコード化して、同じＴ細胞で見いだされる（故に、機能性ＴＣＲを形成する）ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子を識別する。別の態様においては、Ｔ細胞をバーコード化して、バーコード化ＭＨＣ多量体に結合した各細胞を識別する。
【００７１】
いくつかの実施形態では、細胞バーコード化は、例えば、２０１６年４月１５日に出願された、米国特許出願第１３／９８１，７１１号に記載されている、量子バーコード化（ＱＢＣ）法である。手短かに言えば、混合物中の複数の細胞を、以下のプロセスに通す：細胞を、細胞内核酸標的に特異的なオリゴヌクレオチドの混合物と接触させる。オリゴヌクレオチドは、遺伝子結合配列、及びバーコードオリゴヌクレオチドアニーリング領域を有し、細胞を更に、ＴＣＲプライマー内のバーコードオリゴヌクレオチドアニーリング領域に相補性のバーコードオリゴヌクレオチドと接触させる。細胞を更に、スプリットプール合成の１つ以上のラウンドのそれぞれにおいて、各ラウンドのバーコード化オリゴヌクレオチドが以前のラウンドのバーコードオリゴヌクレオチドのアニーリング領域に相補性のアニーリング領域を含む追加のバーコードオリゴヌクレオチドと接触させ、複数のＴ細胞のそれぞれにおける各ＴＣＲプライマー上に細胞特異的バーコードを組み立てる。
【００７２】
プローブ標的は、ＲＮＡ転写産物又はＤＮＡ配列であることができる。ＴＣＲ遺伝子の識別を目的にする、バーコード化の第１ラウンドにおいて、プローブは、ＴＣＲ遺伝子に特異的であることができる。ＭＨＣに結合した細胞の識別を目的にする、バーコード化の第２ラウンドにおいて、プローブは、任意の、即ち、Ｔ細胞マーカー転写物（ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３など：転写物は、ゲノム又はトランスフェクションＤＮＡ配列のいずれかに由来する）から選択される、細胞内標的に特異的であることができる。
【００７３】
本発明は、Ｔ細胞受容体をその同種抗原に一致させるための、各抗原結合Ｔ細胞からの配列決定データを入手する工程を更に含む。（図２の工程７）。この工程は、各細胞内で、ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子の配列と、（例えば、ＱＢＣにより入手した）固有の細胞バーコードの配列と、Ｔ細胞に結合したＭＨＣ多量体と関係するバーコードの配列と、を測定することを含む。図２に示すように、そして、図３により詳細に示すように、一致により、以下のスキームに従いＴＣＲが結合した抗原を識別することが可能となる。
（細胞バーコード１＋ＴＣＲＡ配列ｘ１）＋（細胞バーコード１＋ＴＣＲＢ配列ｙ１）＋（細胞バーコード１＋ｐＭＨＣバーコードｚ１）
（細胞バーコード２＋ＴＣＲＡ配列ｘ２）＋（細胞バーコード２＋ＴＣＲＢ配列ｙ２）＋（細胞バーコード２＋ｐＭＨＣバーコードｚ２）
（細胞バーコードｎ＋ＴＣＲＡ配列ｘｎ）＋（細胞バーコードｎ＋ＴＣＲＢ配列ｙｎ）＋（細胞バーコードｎ＋ｐＭＨＣバーコードｚｎ）
【実施例】
【００７４】
実施例１（予測）。
本実施例では、外科的に切除した腫瘍の断片を入手する。機械的及び酵素的組織解離法を組み合わせて使用して、腫瘍試料を単一細胞に解離させる。各細胞の種類に特異的な、表面、細胞内、又は核マーカーを使用して、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により、解離した細胞を腫瘍細胞、通常の組織細胞、及び免疫細胞（腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ））にソートする。腫瘍細胞バイオマーカーはサイトケラチンであるが、Ｔ細胞バイオマーカーの組み合わせは、ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＣＲ＋である。核酸は、腫瘍細胞、通常の細胞、及びＴ細胞の個別の分画から単離され、任意に、ＫＡＰＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ｋｉｔ  ａｎｄ  ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＱＣ  ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）を使用して定量化される。
【００７５】
腫瘍及び通常（非リンパ球）細胞由来の核酸を、ＫＡＰＡ  Ｈｙｐｅｒ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔを使用して、配列決定ライブラリー調製に通し、ＳｅｑＣａｐ（登録商標）ＥＺ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｍｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｖ３．０（Ｒｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ．）を使用して、エクソーム配列捕捉に通す。メーカーの推奨に従い、任意のＩｌｌｕｍｉｎａ機器（ＭｉＳｅｑ（登録商標），ＮｅｘｔＳｅｑ，ＨｉＳｅｑ（登録商標）又はＮｏｖａＳｅｑ（登録商標））にて、捕捉したライブラリー核酸を配列決定する。
【００７６】
配列アラインメントアルゴリズムにより配列データを比較して、潜在的なネオ抗原として、コード領域内での非同義置換を識別する。潜在的なネオ抗原の、患者のＭＨＣ−Ｉ複合体に結合する能力をインシリコで評価する。評価により、抗原性ネオ抗原の格付けリストが作製される。ＭＨＣに高親和性で結合すると予測されるペプチドを使用して、ネオ抗原ライブラリーを構築する。米国特許９３４６８９２号に記載されているアレイ法を使用して、ペプチドをインビトロで合成する。
【００７７】
α１鎖、α２鎖、及びβ２マイクログロブリンを含むＭＨＣ分子を、ビオチン化ペプチド鎖と、デキストラン主鎖を含有するストレプトアビジンとを組み合わせることで形成する。複合体をビオチン化ＤＮＡバーコードと接触させて、ＤＮＡバーコード化ＭＨＣ四量体を形成する。バーコード化ＭＨＣ四量体を、抗原性ペプチドと組み合わせて、バーコード化抗原提示複合体（ＡＰＣ）を形成する。ペプチドを使用して、ＤＮＡバーコード化ペプチドＭＨＣ複合体のライブラリーを形成する。
【００７８】
バーコード化ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子の配列をバーコードにより一致させ、出現度数を分析して、観察される、又は推定されるα／β対形成、推定される患者のＨＬＡの種類を含む、浸潤腫瘍リンパ球Ｔ細胞受容体配列の格付けリストを形成する。発現プラスミドにて選択されるＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ遺伝子を、ヒトＣＤ８α及びβサブユニットを発現するプラスミド、並びに、ＧＦＰレポータープラスミドと共に、Ｊｕｒｋａｔ細胞にコトランスフェクションする。ＴＣＲ特異的トランスジェニックＴ細胞の集団を、抗原ＴＣＲ結合のために、ＤＮＡバーコード化ペプチドＭＨＣ複合体と共にインキュベートした。細胞は、標準的な免疫学的手順を使用して、バーコード化ｐＭＨＣ多量体により染色され、ｍＡｂと同時染色される。更なる抗体は、細胞種識別マーカー（例えばＣＤ４又はＣＤ８）を標的にすることができる。例えば、ヒトＴ細胞を、Ｆｃ遮断剤と共に３０分間０℃にて、染色緩衝液（０．５％  ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水）内でインキュベートする。次に、細胞を染色緩衝液内で洗浄し、実験で測定したｐＭＨＣ多量体及び／又は抗体の濃度にて、３０分間〜１時間、０℃、又は室温にてインキュベートする。染色後、細胞を染色緩衝液内で数回洗浄し、下流コンビナトリアルバーコード化（量子バーコード化、即ちＱＢＣ）手順のために、ＰＢＳ内で所望の濃度にて再構成する。
【００７９】
ペプチドＭＨＣ複合体に結合した細胞は、コンビナトリアルバーコード化（ＱＢＣ）のプロセスを受ける。ここで、細胞表面にて発現するＴ細胞受容体に結合したＴＣＲＡ  ｍＲＮＡ、ＴＣＲＢ  ｍＲＮＡ、及びｐＭＨＣは、同じ細胞特異的バーコードで標識される（図３）。図３に示すように、（１）細胞表面エピトープ（ａ）は、標的特異的核酸バーコード（ｂ）でバーコード化された、及び、更に、細胞特異的核酸バーコード（ｃ）でバーコード化された抗体により認識されることができる。細胞内エピトープ（２）は、標的特異的核酸バーコード（ｄ）でバーコード化された、及び、更に、同じ細胞特異的核酸バーコード（ｃ）でバーコード化された抗体により認識されることができる。細胞内の任意の核酸標的（３）は、配列（ｅ）を有し、同じ細胞特異的核酸バーコード（ｃ）によりバーコード化することができる。これらの配列の例としては、細胞特性決定バイオマーカー、例えばＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＦｏｘＰ３が挙げられる。ＴＣＲ遺伝子（４）のＴＣＲＡ（ｆ）、及びＴＣＲＢ（ｇ）は、同じ細胞特異的核酸バーコード（ｃ）によりバーコード化することができる。ＴＣＲＡ（ｆ）及びＴＣＲＢ（ｇ）遺伝子は、ペプチド関連核酸バーコード（ｈ）、同じ細胞特異的核酸バーコード（ｃ）、を有するＭＨＣペプチド多量体（６）に結合した、ＴＣＲ（５）内でアセンブルされたペプチドをコードする。
【００８０】
ＱＢＣ手順は、抗体に結合した、又は核酸標的に直接結合したバーコードなどの、標的特異的核酸に結合したＤＮＡバーコードのアセンブリを含む、方法である。ＤＮＡバーコードは、数サイクルのスプリットプール合成により組み立てられ、各ラウンドで追加されたバーコード化オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、以前のラウンドのバーコードオリゴヌクレオチドのアニーリング領域に相補性のアニーリング領域を含むことにより、各プライマー上に細胞特異的バーコードを組み立てる（２０１６年４月１５日に出願された、米国出願番号１３／９８１，７１１号を参照のこと）。
【００８１】
最終工程にて、バーコード化ＴＣＲＡ  ｍＲＮＡ、バーコード化ＴＣＲＢ  ｍＲＮＡ、及び、ペプチドＭＨＣ複合体からのＤＮＡバーコードの配列決定をする。同種ＴＣＲ遺伝子対を分析し、ペプチドに一致するデータを、同じ細胞バーコードを有するものとして解釈する。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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