(57)【要約】本発明は、５−（｛６−アミノ−２−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２/７）−イル］−３−メチルヘキサノイル｝アミノ）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−カルボキサミド、メチルヘキサノイルアミノ）ピラゾロ[1,5-cdpyridinc-3-カルボキサミド、その調製プロセス、疾病、特に、心血管障害、好ましくは血栓性または血栓塞栓性障害、浮腫、さらには眼科障害の治療および/または予防のためのその使用ならびに体外処置および分析アッセイを実施するための血漿カリクレイン活性の妨害を阻害するためのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）  
【化１】
2021521132.tif 000021
の化合物５−（｛６−アミノ−２−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−３−メチルヘキサノイル｝アミノ）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−カルボキサミド又はその塩、その溶媒和物もしくはその塩の溶媒和物の一つ。
【請求項２】
式（Ｉａ）  
【化２】
2021521132.tif 000022
の５−（｛６−アミノ−２−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−３−メチルヘキサノイル｝アミノ）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−カルボキサミドトリフルオロ酢酸塩である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式（Ｉｂ）  
【化３】
2021521132.tif 000023
の５−（｛（２Ｓ）−６−アミノ−２−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−３−メチルヘキサノイル｝アミノ）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−カルボキサミド又はその塩、その溶媒和物もしくはその塩の溶媒和物の一つである請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
疾患の治療および／または予防のための、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
疾患の治療および／または予防のための医薬を製造するための、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項６】
血栓性または血栓塞栓性障害の治療および／または予防のための医薬を製造するための、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項７】
血栓性または血栓塞栓性障害の治療および／または予防のための請求項５に記載の医薬。
【請求項８】
治療有効量の本発明の化合物を使用する血栓性障害または血栓塞栓性障害の治療および／または予防のための方法における使用のための、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
血漿カリクレイン（ＰＫ）による生理学的および人工的基質の代謝回転によって引き起こされる妨害効果を防止するために、生物学的試料を含有する血漿プレカリクレイン（ＰＰＫ）または血漿カリクレイン（ＰＫ）において使用するための、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−（｛６−アミノ−２−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−３−メチルヘキサノイル｝アミノ）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−カルボキサミド、その製造方法、その疾患の治療および／または予防のための使用、ならびに疾患、特に心血管障害、好ましくは血栓性または血栓塞栓性障害、および浮腫、ならびに眼科障害の治療および／または予防のための医薬の調製のためのその使用、ならびに体外処置および分析アッセイの実施のための妨害血漿カリクレイン活性を阻害するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固は生体の防御機構であり、血管壁の欠損を迅速かつ確実に「密封」するのに役立つ。したがって、血液の喪失は避けることができ、または最小限に保つことができる。血管損傷後の止血は、主に血漿蛋白質の複雑な反応の酵素的カスケードが引き起こされる凝固系によって行われる。この過程には多数の血液凝固因子が関与し、それぞれの因子は活性化すると次の不活性な前駆体をそれぞれその活性型に変換する。カスケードの最後に、可溶性フィブリノーゲンが不溶性フィブリンに変換され、血液凝塊が形成される。
【０００３】
凝固系は、外来細胞（例えば、細菌）の表面構造だけでなく、血管プロテーゼ、ステントおよび共腎外循環などの人工表面も含む、特に負に帯電した表面上で活性化することができることが焦点となる。表面上では、最初に第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）が第ＸＩＩａ因子に活性化され、これが、続いて第ＸＩ因子を第ＸＩａ因子に活性化する。加えて、第ＸＩＩａ因子は血漿プレカリクレイン（ＰＰＫ）を血漿カリクレイン（ＰＫ）に活性化し、これは増強ループにおいて、第一にさらなる第ＸＩＩ因子活性化につながり、全体的に凝固カスケードの開始の増幅をもたらす。さらに、ＰＫは重要なブラジキニン放出プロテアーゼであり、したがって、これはとりわけ内皮透過性の増加をもたらす。さらなる基質はプロレニンおよびプロウロキナーゼであり、その活性化はレニン−アンジオテンシン系および線維素溶解の調節過程に影響を及ぼす可能性がある。したがって、ＰＫの活性化は凝固過程と炎症過程の重要な関連である。
【０００４】
凝固系の制御不能な活性化または活性化過程の阻害不良は、血管（動脈、静脈、リンパ管）または心腔における局所的な血栓症または塞栓症の形成につながる可能性がある。さらに、全身性の凝固能亢進は、血栓の系全体の形成につながり、最終的には播種性血管内凝固症候群との関連での消費性凝固障害につながる可能性がある。血栓塞栓性合併症は、血液透析中などの体外循環系においても、また人工血管や人工心臓弁やステントにおいても起こりうる。
【０００５】
血漿カリクレイン（ＰＫ）は、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫および遺伝性血管浮腫または慢性炎症性腸疾患における場合のような血管透過性の増加または慢性炎症性疾患と関連する他の疾患と関連する。糖尿病性網膜症は、主に微小血管の欠損によって引き起こされる。微小血管の欠損は、血管の基底膜の肥厚と血管化した周皮細胞の消失に続いて血管閉塞と網膜虚血を引き起こし、このようにして引き起こされた網膜低酸素のため、血管透過性の亢進に続いて黄斑浮腫が形成され、全ての過程のために、患者が盲目になることがある。遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）では、生理学的カリクレイン阻害物質、Ｃ１‐エステラーゼインヒビターの形成の低下は、劇症浮腫形成および強い痛みを伴う炎症を引き起こすコントロールされていない血漿カリクレイン活性化を引き起こす。実験動物モデルから、血漿カリクレインの阻害は、血管透過性の増加を阻害し、従って、黄斑浮腫および／または糖尿病性網膜症の形成を防止するか、またはＨＡＥの急性症状を改善するかもしれないという指摘がある。経口血漿カリクレイン阻害剤はまた、ＨＡＥの予防のために使用され得る。
【０００６】
血漿カリクレインによって生成されるキニンは、慢性炎症性腸疾患（ＣＩＤ）の進行において特に原因的役割を有する。ブラジキニン受容体の活性化を介したそれらの炎症誘発作用は、疾患進行を誘導し、増強する。クローン病患者に関する研究では、腸管上皮におけるカリクレイン濃度と腸管炎症の程度との間に相関が示されている。カリクレイン−キニン系の活性化は、実験動物試験でも同様に観察された。従って、カリクレイン阻害剤によるブラジキニン合成の阻害は、慢性炎症性腸疾患の予防および／または治療にも使用することができる。
【０００７】
多くの疾患について、抗血栓性および抗炎症性の原理の組み合わせは、凝固および炎症の相互の増強を防止するために特に魅力的である。
【０００８】
ＷＯ  ２００６／０３００３２は、とりわけ、ｍＧｌｕＲ２レセプターのアロステリックモジュレーターとしての置換ピリジノンを記載し、ＷＯ  ２００８／０７９７８７は、置換ピリジン−２−オンおよびグルコキナーゼアクチベーターとしてのそれらの使用を記載する。ＷＯ２００５／１２３６８０、ＷＯ  ２０１４／１５４７９４、ＷＯ  ２０１４／１６０５９２、ＷＯ  ２０１４／０１１０８７、ＷＯ  ２０１４／１６０５９２、ＷＯ  ２０１５／０６３０９３、ＷＯ  ２０１５／１２０７７７、ＷＯ  ２０１５／１２０７７７、ＷＯ  ２０１６／０４６１５６、ＷＯ  ２０１６／０４６１５７、ＷＯ  ２０１６／０４６１５７、ＷＯ  ２０１６／０４６１５６、ＷＯ  ２０１７／０３７０５１およびＷＯ  ２０１８／０４１１２２は、置換ピリジン−２−オン、ならびにＸＩａ因子阻害剤および／またはカリクレイン阻害剤としてのそれらの使用を記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ  ２００６／０３００３２
【特許文献２】ＷＯ  ２００８／０７９７８７
【特許文献３】ＷＯ２００５／１２３６８０
【特許文献４】ＷＯ  ２０１４／１５４７９４
【特許文献５】ＷＯ  ２０１４／１６０５９２
【特許文献６】ＷＯ  ２０１４／０１１０８７
【特許文献７】ＷＯ  ２０１４／１６０５９２
【特許文献８】ＷＯ  ２０１５／０６３０９３
【特許文献９】ＷＯ  ２０１５／１２０７７７
【特許文献１０】ＷＯ  ２０１６／０４６１５６
【特許文献１１】ＷＯ  ２０１６／０４６１５７
【特許文献１２】ＷＯ  ２０１６／０４６１５７
【特許文献１３】ＷＯ  ２０１６／０４６１５６
【特許文献１４】ＷＯ  ２０１７／０３７０５１
【特許文献１５】ＷＯ  ２０１８／０４１１２２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の目的は、ヒトおよび動物における心血管障害、特に血栓性障害または血栓塞栓性障害の治療のための、ならびにＰＫによる生理学的および人工基質の代謝回転によって引き起こされる妨害効果を防止するための、生物学的試料を含有する血漿プレカリクレイン（ＰＰＫ）または血漿カリクレイン（ＰＫ）における使用のための、新規な化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
驚くべきことに、特定の置換オキソピリジン誘導体は、非常に強力で選択的な血漿カリクレイン阻害剤を表すことが現在見出されている。
【００１２】
本発明は、式（Ｉ）の化合物に対応する化合物５−（｛６−アミノ−２−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−３−メチルヘキサノイル｝アミノ）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−カルボキサミド及びその塩、その溶媒和物及びその塩の溶媒和物を提供する。
【化１】
2021521132.tif 000002
【００１３】
さらに、本発明は、式（Ｉａ）の化合物に対応する化合物５−（｛６−アミノ−２−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−３−メチルヘキサノイル｝アミノ）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−カルボキサミドトリフルオロアセテートを提供する。
【００１４】
【化２】
2021521132.tif 000003
【００１５】
好ましくは、式（Ｉｂ）の化合物に対応する化合物５−（｛（２Ｓ）−６−アミノ−２−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−３−メチルヘキサノイル｝アミノ）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−カルボキサミド及びその塩、その溶媒和物及びその塩の溶媒和物が挙げられる。
【００１６】
【化３】
2021521132.tif 000004
【００１７】
さらに、好ましくは、式（Ｉｃ）の化合物に対応する化合物５−（｛（２Ｓ）−６−アミノ−２−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−３−メチルヘキサノイル｝アミノ）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−カルボキサミドトリフルオロアセテートが挙げられる。
【００１８】
【化４】
2021521132.tif 000005
【００１９】
本発明の化合物は、それらの構造に応じて、異なる立体異性体形態で、すなわち立体配置異性体の形態で、または、適切であれば、立体配座異性体（エナンチオマーおよび／またはジアステレオマー、アトロプ異性体の場合を含む）として存在し得る。したがって、本発明は、エナンチオマーおよびジアステレオマー、ならびにそれらのそれぞれの混合物を包含する。立体異性的に均一な成分は、公知の様式で、エナンチオマーおよび／またはジアステレオマーのこのような混合物から単離することができ、これには、好ましくはクロマトグラフィープロセス、特にアキラル相またはキラル相上のＨＰＬＣクロマトグラフィーが使用される。
【００２０】
本発明による化合物が互変異性形態で生じ得る場合、本発明は、すべての互変異性形態を包含する。
【００２１】
本発明の文脈において、用語「エナンチオマー的に純粋な」は、キラル中心の絶対配置に関して問題となる化合物が９５％超、好ましくは９７％超のエナンチオマー過剰で存在することを意味すると理解されるべきである。エナンチオマー過剰率ｅｅは、ここでは、以下の式を使用して、キラル相上の対応するＨＰＬＣクロマトグラムを評価することによって計算される：
ｅｅ  ＝  ［ＥＡ  （面積％）  −  ＥＢ  （面積％）］  ｘ  １００％  ／  ［ＥＡ  （面積％）  ＋  ＥＢ  （面積％）］
（ＥＡ：メジャーエナンチオーマ、ＥＢ：マイナーエナンチオーマ）
【００２２】
本発明はまた、本発明の化合物のすべての適切な同位体変異体を包含する。本発明の化合物の同位体変異体は、ここでは、本発明の化合物内の少なくとも１つの原子が、同じ原子番号の別の原子と交換されているが、通常または主に天然に存在する原子質量とは異なる原子質量を有する化合物を意味すると理解される。本発明の化合物に組み込むことができる同位体の例は、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素（例えば、２  Ｈ（重水素）、３  Ｈ（トリチウム），  １３  Ｃ，  １４  Ｃ，  １５  Ｎ，  １７  Ｏ，  １８  Ｏおよび３６  Ｃｌ）のものである。本発明の化合物の特定の同位体変異体、特に、１つ以上の放射性同位体が組み込まれたものは、例えば、作用機序または体内における活性成分分布の試験に有益であり得る；比較的容易な調製性および検出性、とりわけ、３  Ｈまたは１４  Ｃ同位体で標識された化合物は、この目的に適している。さらに、同位体、例えば重水素の取り込みは、化合物のより大きな代謝安定性、例えば、体内半減期の延長または必要とされる活性用量の減少の結果として、特定の治療利益をもたらし得る；したがって、本発明の化合物のこのような修飾は、場合によっては、本発明の好ましい実施形態も構成し得る。本発明の化合物の同位体変異体は、それぞれの試薬および／または出発化合物の対応する同位体修飾を使用することによって、例えば、さらに下に記載された方法および実施例に記載された手順によって、当業者に公知のプロセスによって調製することができる。
【００２３】
本発明の文脈における好ましい塩は、本発明による化合物の生理学的に許容される塩である。しかしながら、本発明はまた、それ自体は医薬用途には不適当であるが、例えば、本発明による化合物の単離または精製に使用することができる塩を包含する。
【００２４】
本発明による化合物の生理学的に許容される塩は、鉱酸、カルボン酸およびスルホン酸の酸付加塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸および安息香酸の塩を含む。
【００２５】
本発明の文脈において溶媒和物として指定されるのは、溶媒分子との配位によって固体または液体状態で複合体を形成する本発明による化合物の形態である。水和物は、配位が水である溶媒和物の特定の形態である。
【００２６】
本発明はさらに、本発明の化合物のプロドラッグも包含する。用語「プロドラッグ」は、それらの部分が生物学的に活性または不活性であり得るが、体内でのそれらの滞留時間中に本発明による化合物に変換される（例えば、代謝または加水分解によって）化合物を包含する。
【００２７】
本発明の文脈において、用語「治療」または「治療すること」は、疾患、状態、障害、傷害または健康問題の阻害、遅延、チェック、緩和、減弱、制限、低減、抑制、忌避または治癒、またはそのような状態および／またはそのような状態の症状の進行または進行を含む。用語「治療」は、ここでは、用語「治療」と同義で使用される。
【００２８】
用語「防止」、「予防」および「排除」は、本発明の文脈において同義的に使用され、病気、状態、無秩序、傷害または健康問題、またはそのような状態の発達または前進および／またはそのような状態の症状を収縮、経験、被害、または有するリスクの回避または低減を指す。
【００２９】
疾病、状態、障害、外傷または健康上の問題の治療または予防は、部分的なものであっても完全なものであってもよい。
【００３０】
本発明はさらに、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）および（Ｉｃ）の化合物、またはその塩、その溶媒和物またはその塩の溶媒和物を調製するための方法を提供する。化合物は、合成スキーム１に例示されるように合成することができる：
【００３１】
【化５】
2021521132.tif 000006
【００３２】
本発明による化合物は、予期せぬ有用な薬理学的活性スペクトルを有する。それらは、セリンプロテアーゼ血漿カリクレイン（ＰＫ）のタンパク質分解活性に影響を及ぼす化合物である。本発明の化合物は、血液凝固の活性化、血小板の凝集、および炎症プロセス（特に血管透過性の増加を含む）において必須の役割を有する、ＰＫによって触媒される基質の酵素的切断を阻害する。
したがって、それらは、ヒトおよび動物における疾患の治療および／または予防のための医薬としての使用に適している。
【００３３】
本発明はさらに、障害、特に心血管障害、好ましくは血栓性または血栓塞栓性障害および／または血栓塞栓性合併症、および／または眼障害、特に糖尿病性網膜症または黄斑浮腫、および／または炎症性障害、特に遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）または慢性炎症性障害、特にクローン病などの腸の過剰な血漿カリクレイン活性に関連するものの治療および／または予防のための本発明の化合物の使用を提供する。
【００３４】
第ＸＩＩａ因子は、特に増強ループにおいて、さらなる第ＸＩＩ因子活性化を導き、全体的に、表面での凝固カスケードの開始の増幅をもたらす内因性活性化との関連において、血漿プレカリクレイン（ＰＰＫ）を血漿カリクレイン（ＰＫ）に活性化する。したがって、本発明に従う化合物のＰＫ阻害活性は、表面活性化を介する凝固を減少させ、したがって抗凝固効果を有する。
【００３５】
従って、本発明の化合物は、凝塊の形成から生じ得る障害または合併症の治療および／または予防に適している。
【００３６】
本発明の目的において、「血栓性または血栓塞栓性障害」は、動脈および静脈血管系の両方で発生し、特に本発明による化合物で治療できる障害、例えば、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）、ＳＴセグメント上昇を伴う心筋梗塞（ＳＴＥＭＩ）およびＳＴセグメント上昇を伴わない心筋梗塞（非ＳＴＥＭＩ）、安定狭心症、不安定狭心症、血管形成術、ステント移植または大動脈冠動脈バイパス術などの冠動脈介入後の再閉塞および再狭窄、ならびに末梢動脈閉塞性障害、肺塞栓症、静脈血栓塞栓症、静脈血栓症、特に下肢深部静脈および腎静脈における血栓性または血栓塞栓性障害および  一過性脳虚血発作および血栓塞栓性脳卒中を含む。
【００３７】
凝固系の刺激は、様々な原因または関連する障害によって起こりうる。外科的介入、不動状態、ベッドへの閉じ込め、感染症、炎症または癌または癌治療との関連において、特に凝固系は高度に活性化され得、そして血栓性合併症、特に静脈血栓症があり得る。したがって、本発明による化合物は、癌に罹患している患者における外科的介入との関連において、血栓症の予防に適している。したがって、本発明による化合物は、例えば、記載された刺激状況において、活性化凝固システムを有する患者における血栓症の予防にも適している。
【００３８】
したがって、本発明の化合物は、心原性血栓塞栓症、例えば、脳虚血、脳卒中および全身性血栓塞栓症および虚血の予防および治療、急性、間欠性または持続性の心臓不整脈、例えば、心房細動の患者、および電気的除細動を受ける患者、ならびに心臓弁障害または人工心臓弁を有する患者の予防および治療にも適している。
【００３９】
さらに、本発明の化合物は、特に敗血症に関連して起こり得る広範な血管内凝固（ＤＩＣ）の治療および予防に適しているが、外科的介入、新生物性障害、火傷または他の損傷のためでもあり、微小血栓症を介して重度の臓器損傷をもたらし得る。
【００４０】
さらに、血栓血麻酔複雑症は、血栓溶血性貧血および血液が体外循環の関連で、例えば、血液透析、ＥＣＭＯ（「体外膜酸素付加」）、ＬＶＡＤ（「左室補助装置」）および同様の方法、ＡＶフィッシュラス、血管および心臓弁補綴物などの体外循環の関連で、異種表面に接触することによって発生する。
【００４１】
さらに、本発明の化合物は、血管性認知症またはアルツハイマー病などの認知症障害をもたらし得る脳血管におけるマイクロロット形成またはフィブリン沈着を含む障害の治療および／または予防に適している。ここで、凝血塊は、閉塞を介して、およびさらなる疾患関連因子を結合することによって、疾患に寄与する可能性がある。
【００４２】
さらに、本発明による化合物は、特に、プロ凝固剤成分に加えて、プロ炎症成分も必須の役割を果たす障害の治療および／または予防に適している。凝固および炎症の相互増強は、特に、本発明による化合物によって防止することができ、したがって、血栓性合併症の確率を決定的に低下させる。この場合、（トロンビン産生の阻害を介して）第ＸＩａ因子阻害成分とＰＫ阻害成分の両方が、（例えばブラジキニンを介して）抗凝固作用と抗炎症作用に寄与しうる。したがって、アテローム硬化性血管障害、運動系のリウマチ性疾患との関連における炎症、肺線維症などの肺の炎症性障害、糸球体腎炎などの腎臓の炎症性障害、クローン病または潰瘍性大腸炎などの腸の炎症性障害、または糖尿病性網膜症または腎症などの糖尿病性基礎疾患との関連において存在しうる障害との関連における治療および／または予防は、とりわけ考慮されうる。
【００４３】
血漿カリクレインによって生成されるキニンは、とりわけ、慢性炎症性腸疾患（ＣＩＤ）の進行における原因的役割を有する。ブラジキニン受容体の活性化を介したそれらの炎症誘発作用は、疾患進行を誘導し、増強する。クローン病患者に関する研究では、腸管上皮におけるカリクレイン濃度と腸管炎症の程度との間に相関が示されている。カリクレイン−キニン系の活性化は、実験動物試験でも同様に観察された。従って、カリクレイン阻害剤によるブラジキニン合成の阻害は、慢性炎症性腸疾患の予防および／または治療にも使用することができる。
【００４４】
さらに、本発明の化合物は、腫瘍の成長および転移の形成を阻害するために、また、例えば、静脈血栓塞栓症などの血栓塞栓性合併症の予防および／または治療のために、腫瘍患者、特に、主要な外科的介入または化学療法または放射線療法を受ける患者に使用することができる。
【００４５】
さらに、本発明による化合物は、感染症、および／または全身性炎症症症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症性臓器機能不全、敗血症性臓器不全および多臓器不全、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）、敗血症性ショックおよび／または敗血症性臓器不全の状況における播種性血管内凝固の治療および／または予防にも適している。
【００４６】
感染の経過中に、様々な臓器における微小血栓症および二次的な出血性合併症を伴う凝固系の全般的な活性化（播種性血管内凝固症候群または消費性凝固障害、以下「ＤＩＣ」と呼ぶ）がみられることがある。さらに、血管の透過性の増加、および血管外腔への流体およびタンパク質の拡散を伴う内皮損傷が存在し得る。感染症が進行すると、臓器不全（腎不全、肝不全、呼吸不全、中枢神経障害、心血管不全など）や多臓器不全が起こる。
【００４７】
ＤＩＣの場合、損傷した内皮細胞、異物の表面または架橋した血管外組織の表面で凝固系の大量の活性化が存在する。その結果、低酸素症とそれに続く臓器機能不全を伴う様々な臓器の小血管に凝固がみられる。二次的な効果は、凝固因子（例えば、第Ｘ因子、プロトロンビンおよびフィブリノーゲン）および血小板の消費であり、これは、血液の凝固性を低下させ、重度の出血をもたらし得る。
【００４８】
抗凝固活性に加えて、血漿カリクレインは重要なブラジキニン放出プロテアーゼであり、したがって、これはとりわけ内皮透過性の増加をもたらす。したがって、本化合物は、眼障害、特に糖尿病性網膜症または黄斑浮腫または遺伝性血管浮腫などの浮腫形成を含む障害の治療および／または予防に使用することができる。
【００４９】
本発明の文脈における「眼障害」は、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症に伴う黄斑浮腫、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶＭ）、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、網膜上膜（ＥＲＭ）および黄斑穿孔、近視関連脈絡膜新生血管条、色素線条、血管条、網膜剥離、網膜色素上皮の萎縮性変化、網膜色素上皮の肥大性変化、網膜静脈閉塞症、網膜色素変性症、スターガルト病、未熟児網膜症、緑内障、ぶどう膜炎、強膜炎または眼内炎などの炎症性眼障害、白内障、近視、遠視または乱視および円錐角膜などの屈折異常、例えば角膜炎の後遺症としての角膜血管新生、角膜移植または角膜移植、低酸素症の後遺症としての角膜血管新生（例えばコンタクトレンズの過剰使用による）、翼状結膜、角膜下浮腫  および角膜内浮腫を含む。
【００５０】
本発明の化合物はまた、遺伝子突然変異が酵素の活動の増強をもたらし、または酵素原のレベルの増加をもたらし、これらが酵素活動または酵素原濃度の関連する試験／測定によって確立される患者において、血栓性または血栓塞栓性障害および／または炎症性障害および／または血管透過性の増加を伴う障害の一次予防に適している。
【００５１】
本発明はさらに、障害、特に上記の障害の処置および／または予防のための本発明による化合物の使用を提供する。
【００５２】
本発明はさらに、障害、特に上記障害の治療および／または予防のための医薬の製造のための本発明による化合物の使用を提供する。
【００５３】
本発明はさらに、治療有効量の本発明による化合物を使用する、障害、特に上記障害の処置および／または予防のための方法を提供する。
【００５４】
本発明はさらに、治療有効量の本発明による化合物を使用して、障害、特に上記障害の治療および／または予防のための方法において使用するための本発明による化合物を提供する。
【００５５】
特に、本発明は、治療有効量の本発明による化合物を使用して、血栓性障害または血栓塞栓性障害の治療および／または予防のための方法において使用するための、本発明による化合物を提供する。
【００５６】
本発明はさらに、本発明による化合物および１つ以上のさらなる活性化合物を含む医薬を提供する。
【００５７】
さらに、本発明の化合物は、生体外での凝固の防止、例えば、凝血塊の形成によって引き起こされる臓器損傷に対する移植される臓器の保護、および移植された臓器からの血栓塞栓から臓器レシピエントを保護するために、血液および血漿製品を保存するために、カテーテルおよび他の医療助剤および器具を洗浄／前処理するために、生体内または生体外で使用される医療助剤および器具の合成表面をコーティングするために、使用することもできる。
【００５８】
本発明による化合物はまた、ＰＫによる生理学的および人工的基質の代謝回転によって引き起こされる妨害効果を防止するために、生物学的試料を含有する血漿プレカリクレイン（ＰＰＫ）または血漿カリクレイン（ＰＫ）において使用され得る。
【００５９】
さらに、本発明は、インビトロでの血液の凝固を防止するための方法、特に血漿カリクレインを含み得るバンクド血液または生物学的サンプルを提供し、この方法は、本発明による化合物の抗凝固有効量が添加されることを特徴とする。
【００６０】
本発明は、さらに、本発明による化合物と、１つ以上のさらなる活性化合物とを含む医薬、特に、上記の障害の治療および／または予防を提供する。
【００６１】
本発明の目的のための「組み合わせ」とは、全ての成分（いわゆる固定された組み合わせ）を含有する剤形および互いに分離した成分を含有する組み合わせパックだけでなく、それらが同じ疾患の予防および／または治療のために使用されることを条件として、同時にまたは連続して投与される成分も意味する。同様に、２つ以上の活性成分を互いに組み合わせることが可能であり、したがって、それらは、それぞれが２成分または多成分の組み合わせであることを意味する。
【００６２】
本発明の化合物は、全身的および／または局所的に作用することができる。この目的のために、それらは、適切な様式で、例えば、経口、非経口、肺、鼻、舌下、舌、頬側、直腸、皮膚、経皮、結膜または耳経路によって、またはインプラントまたはステントとして投与され得る。
【００６３】
本発明の化合物は、これらの投与経路に適した投与形態で投与することができる。
【００６４】
経口投与に適した投与形態は、従来技術に従って機能し、本発明化合物を迅速かつ／または改変様式で送達するものであり、本発明化合物を結晶および／または非晶質および／または溶解形態で含有するもの、例えば錠剤（例えば、腸溶コーティングまたはコーティングを有し、遅延で溶解または溶解し、本発明化合物の放出を制御する）、口中で急速に崩壊する錠剤、またはフィルム／ウェーハ、フィルム／凍結乾燥物、カプセル（例えば、硬質または軟質ゼラチンカプセル）、糖被覆錠剤、顆粒、ペレット、粉末、エマルジョン、懸濁液、エアロゾルまたは溶液である。
【００６５】
非経口投与は、吸収段階の回避（例えば、静脈内、動脈内、心臓内、脊髄内または腰部内経路による）または吸収の封入（例えば、筋肉内、皮下、皮内、経皮または腹腔内経路による）を伴って達成することができる。非経口投与に適した投与形態としては、溶液、懸濁液、エマルジョン、凍結乾燥物または滅菌粉末の形態の注射および注入のための調製物が挙げられる。
【００６６】
眼外（局所）投与に適しているのは、従来技術に従って作動する投与形態であり、この投与形態は、活性化合物を迅速におよび／または修飾または制御された様式で放出し、活性化合物を結晶性および／または非晶質および／または溶解形態で含有する、例えば、点眼剤、スプレーおよびローション（例えば、溶液、懸濁液、小胞／コロイド系、乳濁液、エアロゾル）、点眼剤、スプレーおよびローションのための粉末（例えば、粉砕活性化合物、混合物、凍結乾燥物、沈降活性化合物）、半固体眼製剤（例えば、ヒドロゲル、インサイチュヒドロゲル、クリームおよび軟膏）、眼挿入物（固体および半固体製剤、例えば、バイオ接着剤、フィルム／ウエハ、コンタクトレンズ）である。
【００６７】
眼内投与には、例えば、硝子体内、網膜下、強膜下、脈絡膜内、結膜下、球後およびエノン下投与が含まれる。眼内投与に適しているのは、従来技術に従って作動する投与形態であり、この投与形態は、活性化合物を迅速におよび／または修飾もしくは制御された様式で放出し、活性化合物を結晶性および／または非晶質および／または溶解形態で含有し、注射用調製物（例えば、溶液、懸濁液、小胞／コロイド系、エマルジョン）、注射用調製物の粉末（例えば、粉砕活性化合物、混合物、凍結乾燥物、沈降活性化合物）、注射用調製物のゲル（半固体調製物、例えば、ヒドロゲル、ｉｎ−ｓｉｔｕヒドロゲル）および移植物（固体調製物、例えば、生分解性および非生分解性移植物、移植可能ポンプ）などの注射用調製物および濃縮物を含む。
【００６８】
経口投与、または眼科的疾患の場合は、外眼部および内眼部投与を優先する。
【００６９】
他の投与経路に適した投与形態は、例えば、吸入のための医薬形態（粉末吸入器、ネブライザーを含む）、点鼻剤、溶液またはスプレー；舌下、舌下または口腔内投与のための錠剤、フィルム／ウェーハまたはカプセル、座薬、耳または眼のための調製物、膣カプセル、水性懸濁液（ローション、振盪混合物）、親油性懸濁液、軟膏、クリーム、経皮治療システム（例えばパッチ）、ミルク、ペースト、泡、粉塵粉末、インプラントまたはステントである。
【００７０】
本発明の化合物は、言及される投与形態に変換することができる。これは、それ自体公知の方法で、不活性で、無毒性で、薬学的に適当な賦形剤と混合することによって達成することができる。これらの賦形剤には、担体（例えば、微結晶セルロース、ラクトース、マンニトール）、溶媒（例えば、液体ポリエチレングリコール）、乳化剤および分散剤または湿潤剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシソルビタンオレエート）、結合剤（例えば、ポリビニルピロリドン）、合成および天然ポリマー（例えば、アルブミン）、安定剤（例えば、アスコルビン酸などの酸化防止剤）、着色剤（例えば、無機顔料、例えば、酸化鉄）ならびに香味剤および／または臭気矯正剤が含まれる。
【００７１】
本発明はさらに、少なくとも１つの本発明化合物を、好ましくは１つ以上の不活性な無毒性の薬学的に適切な賦形剤と一緒に含む医薬、および上記の目的のためのその使用を提供する。
【００７２】
非経口投与の場合、有効な結果を達成するために、２４時間毎に約５〜２５０ｍｇの量を投与することが一般に有利であることが見出されている。経口投与の場合、その量は２４時間毎に約５〜５００ｍｇである。
【００７３】
これにもかかわらず、適切であれば、特に体重、投与経路、活性成分に対する個々の挙動、製剤のタイプ、および投与の時間または間隔に応じて、指定された量から逸脱することが必要であり得る。
【００７４】
特に明記しない限り、以下に続く試験および実施例におけるパーセンテージは重量パーセントであり；部は重量部である。液体／液体溶液の溶媒比、希釈比および濃度データは、それぞれの場合において体積に基づいている。「ｗ／ｖ」は「重量／体積」を意味し、例えば、「１０％  ｗ／ｖ」は、１００ｍｌの溶液または懸濁液が１０ｇの物質を含むことを意味する。
【００７５】
【表１】
2021521132.tif 000007
【００７６】
ＬＣ−ＭＳ法：
第１法：器具ＭＳ：サーモサイエンティフィックＦＴ−ＭＳ；  ＨＰＬＣ器具：サーモサイエンティフィックＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００；カラム：ウォーターズ・アキティ・ＵＰＬＣ  ＨＳＳ  Ｔ３、１００μｍ、１．８μｍ、２．１ｍｍ  ｘ７５ｍｍ；溶離剤Ａ：  １  ｌ水＋０．０１％ギ酸；溶離剤Ｂ：  １  ｌアセトニトリル＋０．０１％ギ酸；勾配：０．０分１０％  Ｂ  →  ２．５分９５％  Ｂ  →  ３．５分９５％  Ｂ；  Ｏｖｅｎ：  ５０℃；流量：０．９０ｍｌ／分；  ＵＶ検出：  ２１０ｎｍ／最適積分経路２１０〜３００ｎｍ。
方法２：器具：水取得ＳＱＤ  ＵＰＬＣシステム；カラム：水取得ＵＰＬＣ  ＨＳＳ  Ｔ３、１００  Å、１．８μｍ；１ｍｍ  ｘ  ５０ｍｍ；溶離液Ａ：  １  ｌ水  ＋  ０．２５ｍｌ  ９９％ギ酸、溶離液Ｂ：  １  ｌアセトニトリル  ＋  ０．２５ｍｌ  ９９％ギ酸；勾配：０．０  ｍｉｎ  ９０％  Ａ  →  １．２  ｍｉｎ  ５％  Ａ  →  ２．０  ｍｉｎ  ５％  Ａ；オーブン：  ５０℃；流量：０．４０ｍｌ／ｍｉｎ；  ＵＶ−検出：  ２１０ｎｍ。
【００７７】
溶離剤が添加剤、例えば、トリフルオロ酢酸、ギ酸またはアンモニアを含有するクロマトグラフィーによって本発明による化合物を精製する場合、本発明による化合物が十分に塩基性または酸性の官能性を含有するならば、本発明による化合物は、塩の形態、例えば、トリフルオロ酢酸塩、ギ酸塩またはアンモニウム塩として得られ得る。このような塩は、当業者に公知の種々の方法によって、対応する遊離塩基または酸に変換することができる。
【００７８】
以下に記載される本発明の合成中間体および実施例の場合、対応する塩基または酸の塩の形態で特定される任意の化合物は、それぞれの調製および／または精製プロセスによって得られるように、一般に、未知の正確な化学量論組成の塩である。より詳しく明記しない限り、「塩酸塩」、「トリフルオロ酢酸塩」、「ナトリウム塩」または「ｘ  ＨＣｌ」、「ｘ  ＣＦ３  ＣＯＯＨ」、「ｘ  Ｎａ＋」のような名称および構造式への付加は、したがって、そのような塩のケースにおいて化学量論的な意味で理解されるべきではなく、その中に存在する塩形成成分に関して単なる記述的特徴を有する。
【００７９】
これは、記載された調製及び／又は精製プロセスによって、化学量論組成が未知の溶媒和物、例えば水和物の形態で合成中間体又は実施例又はその塩が得られた場合にも（それらが規定されたタイプのものである場合には）、相応に適用される。
【００８０】
出発化合物
【００８１】
実施例１Ａ
（２Ｅ）  −ブタ−２−エン−１−イル［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］アセテート
【化６】
2021521132.tif 000008
【００８２】
ＤＭＦ  （９０ｍｌ）中の４−クロロ−２−（５−メトキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−４−イル）ベンゾニトリル［ＣＡＳ−ＲＮ  １６３０１９３−８３−７；  ＷＯ２０１５／０６３０９３，  ｐ．  ７３ｆ．，  ｅｘｐｌ．  ２．１Ｃ］  （１１．３ｇ，  ４３．２ｍｍｏｌ）、（２Ｅ）−ブタ−２−エン−１−イルブロモアセテート［ＣＡＳ−ＲＮ  ９３４５５−１９−７；  Ｓ．  Ｍ．  Ｗｅｉｎｒｅｂら、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  １９８４，  ４９，  ５０５８−５０６４］（１０．０ｇ，  ５１．８ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（８．９５ｇ，  ６４．８ｍｍｏｌ）の混合物を１００℃に４５分間加熱した。続いて、溶媒を真空中で除去した。水を加え、混合物を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；溶離剤：シクロヘキサン−酢酸エチル勾配）によって精製して、１０．８ｇ（純度９２％、収率６２％）の表題化合物を得た。
【００８３】
ＬＣ−ＭＳ  （方法２）：  Ｒｔ  ＝  ０．９２  分；  ＭＳ  （ＥＳＩｐｏｓ）：  ｍ／ｚ  ＝  ３７３  ［Ｍ＋Ｈ］＋
１  Ｈ−ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ［ｐｐｍ］  ＝  ８．０１−７．９７  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７５−７．７１  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５８  （ｓ，  １Ｈ），  ６．５２  （ｓ，  １Ｈ），  ５．８８−５．７８  （ｍ，  １Ｈ），  ５．６５−５．５５  （ｍ，  １Ｈ），  ４．７４  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．５９  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．６２  （ｓ，  ３Ｈ），  １．７０  （ｄｄ，  ３Ｈ）．
【００８４】
実施例２Ａ
２−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−３−メチルペンタ−４−エン酸（ジアステレオマーのラセミ混合物）
【化７】
2021521132.tif 000009
（２Ｅ）  −ブタ−２−エン−１−イル［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］アセテート（１０．８ｇ、純度９２％、２６．７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ  （１５０ｍｌ）に溶解し、−７８℃に冷却した。リチウムビス（トリメチルシリル）アミド（５８ｍｌ、ＴＨＦ中１．０Ｍ、５８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を−７８℃で３０分間撹拌した。続いて、クロロ（トリメチル）シラン（７．４ｍｌ、５８ｍｍｏｌ）を添加した。６０℃に加温し、１時間撹拌した。反応混合物に水を加え、１Ｎ水性塩酸で酸性化した。それをジクロロメタンで３回抽出した。合わせた有機層を１Ｎ水酸化ナトリウム溶液で３回抽出した。合わせた塩基層を４Ｎ水性塩酸で酸性化し、ジクロロメタンで５回抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発して、標記化合物６．９５ｇ（収率７０％）をジアステレオマーのラセミ混合物（比３８：６２）で得た。
【００８５】
ＬＣ−ＭＳ  （方法１）：Ｒｔ＝１．５９分（副異性体）、１．６２分（主異性体）；  ＭＳ  （ＥＳＩｐｏｓ）：  ｍ／ｚ  ＝  ３７３［Ｍ＋Ｈ］＋
１  Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ［ｐｐｍ］  ＝１３．１６（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、７．９９（ｄ、１Ｈ主異性体）および７．９８（ｄ、１Ｈ副異性体）、７．７６−７．６９（ｍ、２Ｈ）、７．４４（ｓ、１Ｈ主）および７．３８（ｓ、１Ｈ副）、６．５２（ｓ、１Ｈ主）および６．４６（ｓ、１Ｈ副）、５．９５（ｄｄ、１Ｈ主）および５．５９（ｄｄ、１Ｈ副）、５．２０（ｄ、１Ｈ主）および５．０２（ｄ、１Ｈ副）、５．１８−５．１５（ｍ、１Ｈ）、５．１１（ｄｄ、１Ｈ主）および４．９２（ｄｄ、１Ｈ副）、３．６５（ｓ、３Ｈ主）  ３．１１  （ｍ，  １Ｈ），  １．１８  （ｄ，  ３Ｈ  副）および０．８７  （ｄ，  ３Ｈ  主）。
【００８６】
実施例３Ａ
２−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−３−メチル−Ｎ−（プロピ−２−エン−１−イル）−ペンタ−４−エナミド（ジアステレオマーのラセミ混合物）
【化８】
2021521132.tif 000010
２−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−３−メチルペント−４−エン酸（ジアステレオマーのラセミ混合物）（４．００ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）およびプロパ−２−エン−１−アミン（１２ｍｌ、１６０ｍｍｏｌ）をピリジン（４０ｍｌ）に溶解し、６０℃に加熱した。酢酸エチル（１９ｍｌ、純度５０％、３２ｍｍｏｌ）中のＴ３Ｐの溶液を滴下し、混合物を６０℃で１時間さらに撹拌した。水を加え、酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を真空下で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；溶離剤：シクロヘキサン−酢酸エチル勾配）により精製して、標記化合物２．５６ｇ（収率５８％）をジアステレオマーのラセミ混合物として得た。
【００８７】
ＬＣ−ＭＳ  （方法１）：  Ｒｔ  ＝  １．８１  分；  ＭＳ  （ＥＳＩｐｏｓ）：  ｍ／ｚ  ＝  ４１２  ［Ｍ＋Ｈ］＋
１  Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ［ｐｐｍ］  ＝８．８４（ｔ、１Ｈ副異性体）および８．６９（ｔ、１Ｈ主異性体）、７．９９（ｄ、１Ｈ主）および７．９７（ｄ、１Ｈ副）、７．７６〜７．６８（ｍ、２Ｈ）、７．６４（ｓ、１Ｈ副）および７．６２（ｓ、１Ｈ副）、６．５２（ｓ、１Ｈ副，  ３Ｈ主）。
【００８８】
実施例４Ａ
ｔｅｒｔ−ブチルアリル｛２−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−３−メチルペンタ−４−エノイル｝カルバメート（ジアステレオマーのラセミ混合物）
【化９】
2021521132.tif 000011
２−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−３−メチル−Ｎ−（プロピ−２−エン−１−イル）ペンタ−４−エナミド（ジアステレオマーのラセミ混合物）（２．５０ｇ、６．０７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１２０ｍｌ）に溶解した。ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（２．８ｍｌ、１２ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（２９７ｍｇ、２．４３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を６０℃に１時間加熱した。次いで、混合物を真空中で濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；溶離剤：シクロヘキサン−酢酸エチル勾配）によって直接精製して、３．０７ｇ（収率９９％）の標記化合物をジアステレオマーのラセミ混合物として得た。
【００８９】
ＬＣ−ＭＳ  （方法１）：  Ｒｔ  ＝  ２．４１  分；  ＭＳ  （ＥＳＩｐｏｓ）：  ｍ／ｚ  ＝  ５１２  ［Ｍ＋Ｈ］＋
１  Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ［ｐｐｍ］  ＝７．９９（ｄ、１Ｈ主異性体）および７．９７（ｄ、１Ｈ副異性体）、７．７５−７．６３（ｍ、２Ｈ）、７．４２（ｓ、１Ｈ主）および７．３９（ｓ、１Ｈ副）、６．５１（ｓ、１Ｈ主）および６．４６（ｓ、１Ｈ副）、６．４５（ｂｒ．  ｄ、１Ｈ主）および６．３６（ｂｒ．  ｄ、１Ｈ副）、５．９６−５．５８（ｍ、２Ｈ）、５．２２−４．９２（ｍ、４Ｈ）、４．２４−４．０７（ｍ、２Ｈ）、３．６６（ｓ、３Ｈ主）および３．６２（ｓ、３Ｈ副）、３．３５  ．４７８  （ｓ，  ９Ｈ  主）、１．１６  （ｄ，  ３Ｈ  副）、および０．８９  （ｄ，  ３Ｈ  主）。
【００９０】
実施例５Ａ
ｔｅｒｔ−ブチル３−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−４−メチル−２−オキソ−２，３，４，７−テトラヒドロ−１Ｈ−アゼピン−１−カルボキシレート（ジアステレオマーのラセミ混合物）
【化１０】
2021521132.tif 000012
ｔｅｒｔ−ブチルアリル｛２−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−３−メチルペント−４−エノイル｝カルバメート（ジアステレオマーのラセミ混合物）（３．００ｇ、５．８６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１．０ｌ）に溶解し、溶液を脱気した。ベンジリデン［１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）イミダゾリジン−２−イリデン］ジクロルテニウム−トリシクロヘキシルホスファン（１／１）  ［ＣＡＳ−ＲＮ  ２４６０４７−７２−３］（２４９ｍｇ、２９３μｍｏｌ）を添加し、反応物を４５℃で１．５時間撹拌した。続いて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を添加した。有機層を分離し、水層をジクロロメタンで２回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；溶離剤：シクロヘキサン−酢酸エチル勾配）によって精製して、２．７５ｇ（収率９７％）の標記化合物をジアステレオマーのラセミ混合物として得た。
【００９１】
ＬＣ−ＭＳ  （方法１）：Ｒｔ＝２．０４（主異性体）および２．０６分（副異性体）；  ＭＳ  （ＥＳＩｎｅｇ）：  ｍ／ｚ  ＝  ４８２［Ｍ−Ｈ］−
１  Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ［ｐｐｍ］  ＝８．０１（ｍ、１Ｈ副異性体）および８．００（ｄ、１Ｈ主異性体）、７．７８〜７．７１（ｍ、２Ｈ）、７．４７（ｓ、１Ｈ主）および７．３１（ｓ、１Ｈ副）、６．６０（ｓ、１Ｈ副）および６．５６（ｓ、１Ｈ主）、６．３４（ｄ、１Ｈ主）および６．１８（ｄ、１Ｈ副）、６．０３〜５．９４（ｍ、１Ｈ）、５．９０〜５．８３（ｍ、１Ｈ副）および５．８３〜５．７７（ｍ、１Ｈ主）、４．５７（ｄｄ、１Ｈ副）および４．４７（６７６  （ｓ，  ３Ｈ  主）、３．４８−３．３８  （ｍ，  １Ｈ  副）、３．０７−２．９７  （ｍ，  １Ｈ  副）、１．４６  （ｓ，  ９Ｈ  主）および１．４５  （ｓ，  ９Ｈ  副）、１．１８  （ｄ，  ３Ｈ  副）および０．９１  （ｄ，  ３Ｈ  主）
【００９２】
実施例６Ａ
ｔｅｒｔ−ブチル３−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−４−メチル−２−オキソアゼパン−１−カルボキシレート（ジアステレオマーのラセミ混合物）
【化１１】
2021521132.tif 000013
ｔｅｒｔ−ブチル３−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−４−メチル−２−オキソ−２，３，４，７−テトラヒドロ−１Ｈ−アゼピン−１−カルボキシレート（ジアステレオマーのラセミ混合物）（２．７０ｇ、５．５８ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（２５０ｍｌ）に溶解し、パラジウム（木炭上１０％、５９４ｍｇ）を加えた。反応物を水素下（大気圧）で４時間撹拌した。混合物を珪藻土を通して濾過し、溶媒を真空中で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；溶離剤：シクロヘキサン−酢酸エチル勾配）により精製して、０．５４ｇの出発物質の主異性体および１．７８ｇ（６６％収率、８２％収率ｂｒｓｍ）の標記化合物をジアステレオマーのラセミ混合物として得た。
【００９３】
ＬＣ−ＭＳ  （方法１）：  Ｒｔ  ＝  ２．０５  分；  ＭＳ  （ＥＳＩｎｅｇ）：  ｍ／ｚ  ＝  ４８４  ［Ｍ−Ｈ］−
１  Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ［ｐｐｍ］  ＝８．００（ｄ、１Ｈ）および７．９９（ｄ、１Ｈ）、７．７７〜７．７１（ｍ、２Ｈ）、７．４２（ｓ、１Ｈ副異性体）および７．１６（ｓ、１Ｈ主異性体）、６．５６（ｓ、１Ｈ主）および６．５２（ｓ、１Ｈ副）、５．８９（ｓ、１Ｈ主）および５．８６〜５．６６（ｍ、１Ｈ副）、４．２３〜４．１３（ｍ、１Ｈ）、３．６８（ｓ、３Ｈ主）および３．６６（ｓ、３Ｈ副）、３．６５〜３．５５（ｍ、１Ｈ）、２．６４〜２．５６（ｍ、，  １．４６  （ｓ，  ９Ｈ），  １．１４  （ｄ，  ３Ｈ  主）および０．８６  （ｄ，  ３Ｈ  副）。
【００９４】
実施例７Ａ
６−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−２−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−３−メチルヘキサン酸（ジアステレオマーのラセミ混合物）
【化１２】
2021521132.tif 000014
ｔｅｒｔ−ブチル３−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−４−メチル−２−オキソアゼパン−１−カルボキシレート（ジアステレオマーのラセミ混合物）（１．７７ｇ、３．６４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ  （２５ｍｌ）に溶解し、水酸化リチウムの水溶液（３．６ｍｌ、２．０Ｍ、７．２  ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を３０℃で１時間撹拌し、次いで真空中で濃縮し、残渣を水に溶解した。酢酸エチルで洗浄した。水相を１Ｎ  ａｑ．塩酸で酸性化し、酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して、標記化合物１．７８ｇ（収率９７％）をジアステレオマーのラセミ混合物として得た。
【００９５】
ＬＣ−ＭＳ  （方法１）：Ｒｔ＝１．８０分（副異性体）および１．８４分（主異性体）；  ＭＳ  （ＥＳＩｐｏｓ）：  ｍ／ｚ  ＝  ５０４［Ｍ＋Ｈ］＋
１  Ｈ−ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ［ｐｐｍ］  ＝  １３．１３  （ｂｒ．  ｓ，  １Ｈ），  ８．０１−７．９７  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７６−７．７１  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３８  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８０  （ｂｒ．  ｔ，  １Ｈ  主異性体）  ａｎｄ  ６．７０  （ｂｒ．  ｔ，  １Ｈ  副異性体），  ６．５１  （ｓ，  １Ｈ），  ５．１０  （ｄ，  １Ｈ  副）  ａｎｄ  ５．０５  （ｄ，  １Ｈ  主，  ３．６４  （ｓ，  ３Ｈ  副）  ａｎｄ  ３．６３  （ｓ，  ３Ｈ  主），  ３．０１−２．７１  ａｎｄ  ２．４９−２．３７  （ｍ，  共通  ３Ｈ），  １．６４−１．４０および１．３１−１．１３  および  １．０２−０．９３  （ｍ，  共通  ４Ｈ），  １．３８  （ｓ，  ９Ｈ  主）  １．３４  （ｓ，  ９Ｈ  副），  １．０５  （ｄ，  ３Ｈ  副），  ０．７２  （ｄ，  ３Ｈ  主）
【００９６】
実施例８Ａ
ｔｅｒｔ−ブチル｛６−［（３−カルバモイルピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−５−イル）アミノ］−５−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−４−メチル−６−オキソヘキシル｝カルバメート（ジアステレオマーのラセミ混合物）
【化１３】
2021521132.tif 000015
６−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−２−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−３−メチルヘキサン酸（ジアステレオマーのラセミ混合物）（１．０８ｇ、２．１４ｍｍｏｌ）および５−アミノピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−カルボキサミドトリフルオロ酢酸［ＣＡＳ−ＲＮ  １８９１０７１−１１−６；  ＷＯ２０１６／０４６１５８、ｐ．５３、ｅｘｐｌ．１．１Ｃ］  （７４６ｍｇ、２．５７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ  （４．０ｍｌ）に溶解した。ＤＭＦ  （２．０ｍｌ）中の溶液としてのＨＡＴＵ  （１．２２ｇ、３．２１ｍｍｏｌ）、続いてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３７０μｌ、２．１ｍｍｏｌ）を滴下して添加した。反応物を室温で１．５時間撹拌した。さらに５−アミノピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−カルボキサミドトリフルオロアセテート（１８７ｍｇ、６４３μｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３７０μｌ、２．１ｍｍｏｌ）を添加した。一晩撹拌した後、さらにＨＡＴＵ  （４０７ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３７０μｌ、２．１ｍｍｏｌ）を添加し、１時間後、反応物を真空中で濃縮した。残渣を水で結晶化し、吸引濾過によって収集し、水で洗浄し、真空中で乾燥した。化合物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；溶離剤：ジクロロメタン／メタノール勾配）により精製して、標記化合物１．２０ｇ（収率８４％）をジアステレオマーのラセミ混合物として得た。
【００９７】
ＬＣ−ＭＳ  （方法１）：  Ｒｔ  ＝  １．７５  分；  ＭＳ  （ＥＳＩｐｏｓ）：  ｍ／ｚ  ＝  ６６２  ［Ｍ＋Ｈ］＋
１  Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ［ｐｐｍ］  ＝１１．１４（ｂｒ．  ｓ、１Ｈ主異性体）および１１．１２（ｂｒ．  ｓ、１Ｈ副異性体）、８．７３〜８．６６（ｍ、２Ｈ）、８．４７（ｓ、１Ｈ主）および８．４６（ｓ、１Ｈ副）、８．００（ｄ、１Ｈ主）および７．９９（ｄ、１Ｈ副）、７．７７〜７．７１（ｍ、２Ｈ）、７．６３（ｓ、１Ｈ）、７．６０（ｂｒ．  ｓ、１Ｈ）、７．２６（ｄｄ、１Ｈ）、６．９８（ｂｒ．  ｓ、１Ｈ）、６．７６〜６．７０（ｍ、１Ｈ）、６．５６（ｓ、１Ｈ副）および６．５５（ｓ、１  マイナー、３．７２  （ｓ，  ３Ｈ  主）  および３．７１  （ｓ，  ３Ｈ  副）、２．９６−２．７６  （ｍ，  ２Ｈ）、１．６４−０．９６  （ｍ，  ５Ｈ）、１．３４  （ｓ，  ９Ｈ主）  および１．２８  （ｓ，  ９Ｈ  ｍｉｎｏｒ）、１．０５  （ｄ，  ３Ｈ  主）  および０．７８  （ｄ，３Ｈ副）
【００９８】
４つの立体異性体の分離は、キラルクロマトグラフィーによって達成することができる：カラムおよび固相：  ２５０ｍｍ×２０ｍｍ、キラルパックＩＥ、５μｍ；溶離剤：エタノール；流速１５．０ｍｌ／分。３つのピーク（７．０〜８．５分、１１．１分、１３．９分）を生じる。第１のピークは、分離のためにさらにクロマトグラフィーを必要とする：カラムおよび固相：  ２５０ｍｍ×２０ｍｍ、Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＣ、５μｍ；溶離液：エタノール；流速１５．０ｍｌ／分。２つのピーク（６．２９分、７．３３分）を生じる。
【００９９】
分析ＨＰＬＣ：カラム２５０ｍｍ×４．６ｍｍ、キラルセルＯＸ−Ｈ、５μｍ；溶離液：イソヘキサン／エタノール１：１；流量１．０ｍｌ／分；温度：  ４０℃。
立体異性体１：  Ｒｔ  ＝  １０．９０分。
立体異性体２：  Ｒｔ  ＝  ７．５０分。
立体異性体３：  Ｒｔ  ＝  ８．８５分。
立体異性体４：  Ｒｔ  ＝  ９．１９分。
立体異性体１および４ならびに立体異性体２および３は、互いにエナンチオマーである。
立体異性体１および４：
１  Ｈ−ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ［ｐｐｍ］  ＝  １１．１４  （ｂｒ．  ｓ，  １Ｈ），  ８．７０−８．６７  （ｍ，  ２Ｈ），  ８．４７  （ｓ，  １Ｈ），  ８．００  （ｄ，  １Ｈ），  ７．７５−７．７１  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．６０  （ｂｒ．  ｓ，  １Ｈ），  ７．６２  （ｂｒ．  ｓ，  １Ｈ），  ７．２５  （ｄｄ，  １Ｈ），  ６．９８  （ｂｒ．  ｓ，  １Ｈ），  ６．７６−７．７０  （ｍ，  １Ｈ），  ６．５５  （ｓ，  １Ｈ），  ５．５７  （ｄ，  １Ｈ），  ３．７１  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．９３−２．７４  （ｍ，  ２Ｈ），  １．５２−１．２９  （ｍ，  ３Ｈ），  １．３４  （ｓ，  ９Ｈ），  １．２６−０．９６  （ｍ，  ２Ｈ），  １．０５  （ｄ，  ３Ｈ）。
立体異性体２および３：
１  Ｈ−ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ［ｐｐｍ］  ＝  １１．１２  （ｂｒ．  ｓ，  １Ｈ），  ８．７１  （ｄ，  １Ｈ），  ８．６８  （ｄ，  １Ｈ），  ８．４６  （ｓ，  １Ｈ），  ７．９９  （ｄ，  １Ｈ），  ７．７６  （ｄ，  １Ｈ），  ７．７３  （ｄｄ，  １Ｈ），  ７．６２  （ｓ，  １Ｈ），  ７．５９  （ｂｒ．  ｓ，  １Ｈ），  ７．２５  （ｄｄ，  １Ｈ），  ６．９９  （ｂｒ．  ｓ，  １Ｈ），  ６．７５  （ｂｒ．  ｔ，  １Ｈ），  ６．５６  （ｓ，  １Ｈ），  ５．５６  （ｄ，  １Ｈ），  ３．７０  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．９５−２．８３  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．４８−２．３９  （ｍ，  １Ｈ），  １．６６−１．５３  （ｍ，  １Ｈ），  １．５１−１．２９  （ｍ，  ３Ｈ），  １．２８  （ｓ，  ９Ｈ），  ０．７７  （ｄ，  ３Ｈ）．
【０１００】
実施例
実施例１
５−（｛６−アミノ−２−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−３−メチル−ヘキサノイル｝アミノ）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−カルボキサミドトリフルオロアセテート（ジアステレオマーのラセミ混合物）
【化１４】
2021521132.tif 000016
ｔｅｒｔ−ブチル｛６−［（３−カルバモイルピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−５−イル）アミノ］−５−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−４−メチル−６−オキソヘキシル｝カルバメート（ジアステレオマーのラセミ混合物）（１．２０ｇ、１．８１ｍｍｏｌ）をジクロロメタンに溶解し、氷水で冷却した。トリフルオロ酢酸（２．８ｍｌ、３６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温に温め、そして１時間撹拌した。次いで、混合物を蒸発させた。ジクロロメタンを加え、減圧下で除去した。この手順を１回繰り返した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；溶離剤：ジクロロメタン／メタノール勾配）により精製して、７８５ｍｇ  （収率６４％）の標記化合物をジアステレオマーのラセミ混合物として得た。
【０１０１】
ＬＣ−ＭＳ  （方法２）：  Ｒｔ  ＝  ０．６４  ｍｉｎ  （メジャーアイソマー）  ０．６８  （マイナーアイソマー）；  ＭＳ  （ＥＳＩｐｏｓ）：  ｍ／ｚ  ＝  ５６２  ［Ｍ＋Ｈ］＋
１  Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ［ｐｐｍ］  ＝１１．１７（ｓ、１Ｈ主異性体）および１１．１４（ｓ、１Ｈ副異性体）、８．７３−８．６７（ｍ、２Ｈ）、８．４８（ｓ、１Ｈ）、８．００（ｄ、１Ｈ主）および７．９９（ｄ、１Ｈ副）、７．７６−７．７２（ｍ、２Ｈ）、７．６９（ｂｒ．  ｓ、４Ｈ）、７．６５（ｓ、１Ｈ主）および７．６１（ｓ、１Ｈ副）、７．２８−７．２５（ｍ、１Ｈ）、６．９８（ｂｒ．  ｓ、１Ｈ）、６．５８（ｓ、１Ｈ副）および６．５７（ｓ、１Ｈ主）、５．６１−５．５５（ｍ、  副）、２．８７〜２．５１（ｍ，  ３Ｈ）、１．８０〜１．０９（ｍ，  ４Ｈ）、１．０８（ｄ，  ３Ｈ  主）、および０．７９（ｄ，  ３Ｈ  副）。
【０１０２】
実施例２
５−（｛（２Ｓ）−６−アミノ−２−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−３−メチルヘキサノイル｝アミノ）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−カルボキサミドトリフルオロ酢酸塩（立体異性体３）
【化１５】
2021521132.tif 000017
実施例１に記載した手順に従って、実施例８Ａ立体異性体３の分離したカルバメートを個々に脱保護した。
【０１０３】
立体異性体３：
ＬＣ−ＭＳ  （方法１）：  Ｒｔ  ＝  １．０５  分；  ＭＳ  （ＥＳＩｐｏｓ）：  ｍ／ｚ  ＝  ５６２  ［Ｍ＋Ｈ］＋
１  Ｈ−ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ［ｐｐｍ］  ＝  １１．１５  （ｓ，  １Ｈ），  ８．７２  （ｄ，  １Ｈ），  ８．６９  （ｄ，  １Ｈ），  ８．４８  （ｓ，  １Ｈ），  ８．００  （ｄ，  １Ｈ），  ７．７６−７．７２  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．６０  （ｓ，  １Ｈ），  ７．６３  （ｂｒ  ｓ，  ４Ｈ），  ７．２７  （ｄｄ，  １Ｈ），  ６．９８  （ｂｒ  ｓ，  １Ｈ），  ６．５８  （ｓ，  １Ｈ），  ５．５６  （ｄ，  １Ｈ），  ３．７０  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．８８−２．７２  （ｍ，  ２Ｈ），  （１Ｈ  ｕｎｄｅｒ  ＤＭＳＯ），  １．８１−１．６７  （ｍ，  １Ｈ），  １．６３−１．４４  （ｍ，  ２Ｈ），  １．３９−１．２８  （ｍ，  １Ｈ），  ０  ．７９  （ｄ，  ３Ｈ）。
【０１０４】
実施例３
５−（｛（２Ｓ）−６−アミノ−２−［４−（５−クロロ−２−シアノフェニル）−５−メトキシ−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル］−３−メチルヘキサノイル｝アミノ）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−カルボキサミドトリフルオロ酢酸塩（立体異性体４）
【化１６】
2021521132.tif 000018
実施例１に記載した手順に従って、実施例８Ａ立体異性体４の分離したカルバメートを個々に脱保護した。
【０１０５】
立体異性体４：
ＬＣ−ＭＳ  （方法１）：  Ｒｔ  ＝  ０．９９  分；  ＭＳ  （ＥＳＩｐｏｓ）：  ｍ／ｚ  ＝  ５６２  ［Ｍ＋Ｈ］＋
１  Ｈ−ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ［ｐｐｍ］  ＝  １１．１７  （ｓ，  １Ｈ），  ８．７２−８．６７  （ｍ，  ２Ｈ），  ８．４８  （ｓ，  １Ｈ），  ８．０３−７．９８  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７７−７．７２  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．６５  （ｓ，  １Ｈ），  ７．６２  （ｂｒ  ｓ，  ４Ｈ），  ７．２６  （ｄｄ，  １Ｈ），  ６．９８  （ｂｒ  ｓ，  １Ｈ），  ６．５７  （ｓ，  １Ｈ），  ５．５９  （ｄ，  １Ｈ），  ３．７２  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．８３−２．６２  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．５８−２．５１  （ｍ，  １Ｈ），  １．７０−１．４４  （ｍ，  ２Ｈ），  １．０８  （ｄ，  ３Ｈ），  １．２６−１．０６  （ｍ，  ２Ｈ）  ．
【０１０６】
Ｂ）     生理学的有効性の評価
血栓塞栓性障害を処置するための本発明による化合物の適切性は、以下のアッセイ系において実証され得る：
【０１０７】
ａ）試験内容（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
ａ．１）  血漿カリクレイン活性の測定
本発明による物質の血漿カリクレイン阻害を測定するために、ペプチド性血漿カリクレイン基質の反応を利用してヒト血漿カリクレインの酵素活性を測定する生化学的試験系が使用される。ここで、血漿カリクレインは、ペプチックプラズマカリクレイン基質からＣ末端アミノメチルクマリン（ＡＭＣ）を切断し、その蛍光を測定する。測定はマイクロタイタープレートで行う。
【０１０８】
被験物質をジメチルスルホキシドに溶解し、ジメチルスルホキシド（３０００μＭ〜０．００７８μＭ；試験における最終濃度：  ５０μＭ〜０．０００１３μＭ）で連続希釈する。それぞれの場合において、１μｌの希釈物質溶液を、Ｇｒｅｉｎｅｒからの白色マイクロタイタープレートのウェル（３８４ウェル）に入れる。次いで、２０μｌのアッセイ緩衝液（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ  ｐＨ  ７．４；  １００ｍＭ塩化ナトリウム溶液；  ５ｍＭの塩化カルシウム溶液；０．１％のウシ血清アルブミン）およびＫｏｒｄｉａからの２０μｌの血漿カリクレイン（アッセイ緩衝液中０．６  ｎＭ）を連続的に添加する。１５分間のインキュベーションの後、Ｂａｃｈｅｍからのアッセイ緩衝液に溶解した２０μｌの基質Ｈ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（アッセイ緩衝液中１０μＭ）の添加によって酵素反応を開始し、混合物を室温（２２℃）で３０分間インキュベートし、次いで蛍光を測定する（励起：  ３６０ｎｍ、発光：  ４６０ｎｍ）。被験物質を用いた試験バッチの測定された排出量を、被験物質を含まない対照バッチ（ジメチルスルホキシド中の被験物質の代わりにジメチルスルホキシドのみ）の排出量と比較し、濃度／活性相関からＩＣ５０を計算する。この試験からの活性データを以下の表Ａに列挙する（いくつかは、複数の独立した個々の決定からの平均値として）：
【表２】
2021521132.tif 000019
【０１０９】
ａ．２）ＦＸＩａ阻害の測定  
本発明に係る物質の第ＸＩａ因子阻害は、ペプチド性第ＸＩａ因子基質の反応を利用してヒト第ＸＩａ因子の酵素活性を決定する生化学的試験系を用いて決定される。ここで、第ＸＩａ因子は、Ｃ末端アミノメチルクマリン（ＡＭＣ）をペプチド性第ＸＩａ因子基質から切断し、その蛍光が測定される。測定はマイクロタイタープレートで行う。
【０１１０】
被験物質をジメチルスルホキシドに溶解し、ジメチルスルホキシド（３０００μＭ〜０．００７８μＭ；試験における最終濃度：  ５０μＭ〜０．０００１３μＭ）で連続希釈する。それぞれの場合において、１μｌの希釈物質溶液を、Ｇｒｅｉｎｅｒからの白色マイクロタイタープレートのウェル（３８４ウェル）に入れる。次いで、２０μｌのアッセイ緩衝液（５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ  ｐＨ  ７．４；  １００ｍＭの塩化ナトリウム；  ５ｍＭの塩化カルシウム；０．１％のウシ血清アルブミン）および２０μｌのＫｏｒｄｉａからの第ＸＩａ因子（アッセイ緩衝液中０．４５  ｎＭ）を連続的に添加する。１５分間のインキュベーションの後、Ｂａｃｈｅｍからのアッセイ緩衝液に溶解した２０μｌの第ＸＩａ因子基質Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（アッセイ緩衝液中１０μＭ）の添加によって酵素反応を開始し、混合物を室温（２２℃）で３０分間インキュベートし、次いで蛍光を測定する（励起：  ３６０ｎｍ、発光：  ４６０ｎｍ）。被験物質を用いた試験バッチの測定された排出量を、被験物質を含まない対照バッチ（ジメチルスルホキシド中の被験物質の代わりにジメチルスルホキシドのみ）の排出量と比較し、濃度／活性相関からＩＣ５０を計算する。この試験からの活性データを以下の表Ｂに列挙する（いくつかは、複数の独立した個々の決定からの平均値として）：
【表３】
2021521132.tif 000020
【０１１１】
ａ．３）選択性の決定  
ＦＸＩａ阻害に関する物質の選択性を実証するために、第Ｘａ因子、トリプシンおよびプラスミンなどの他のヒトセリンプロテアーゼの阻害について試験物質を試験する。第Ｘａ因子（Ｋｏｒｄｉａから１．３  ｎｍｏｌ／ｌ）、トリプシン（Ｓｉｇｍａから８３  ｍＵ／ｍｌ）およびプラスミン（Ｋｏｒｄｉａから０．１μｇ／ｍｌ）の酵素活性を測定するために、これらの酵素を溶解し（５０ｍｍｏｌ／ｌのトリス緩衝液［Ｃ，Ｃ，Ｃ−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］、１００ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、０．１％  ＢＳＡ  ［ウシ血清アルブミン］、５ｍｍｏｌ／ｌの塩化カルシウム、ｐＨ  ７．４）、ジメチルスルホキシド中の種々の濃度の試験物質および試験物質なしのジメチルスルホキシドと共に１５分間インキュベートする。次いで、酵素反応を、適切な基質（Ｘａ因子およびトリプシンについてはＢａｃｈｅｍからのＢｏｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣの５μｍｏｌ／ｌ、プラスミンについてはＢａｃｈｅｍからのＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＡＭＣの５０μｍｏｌ／ｌ）の添加によって開始する。２２℃で３０分間インキュベートした後、蛍光を測定する（励起：  ３６０ｎｍ、発光：  ４６０ｎｍ）。被験物質を含む試験混合物の測定された排出量を、被験物質を含まない対照混合物（ジメチルスルホキシド中の被験物質の代わりにジメチルスルホキシドのみ）と比較し、濃度／活性相関からＩＣ５０を計算する。
【０１１２】
ａ．４）  抗凝固活性の測定
被験物質の抗凝固活性は、ヒト血漿およびラット血漿中のｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定される。この目的のために、レシーバーとして０．１１Ｍのクエン酸ナトリウム溶液を使用して、１：９のクエン酸ナトリウム／血液の混合比中に採血する。採血後直ちに十分に混合し、約４０００ｇで１５分間遠心分離する。上清をピペットで除去する。
【０１１３】
活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）は、様々な濃度の被験物質または対応する溶媒の存在下で、市販の試験キット（Ｓｉｅｍｅｎｓ社のａＰＴＴ試薬）を使用して決定される。試験化合物を血漿およびａＰＴＴ試薬と共に３７℃で３分間インキュベートする。次いで、２５ｍＭ塩化カルシウムの添加によって凝固を開始し、凝固が起こる時間を決定する。ＡＰＴＴの５０％延長または倍加をもたらす被験物質の濃度を測定する。
【０１１４】
ａ．５）  内皮の完全性の決定
本発明による化合物の活性は、「ヒト臍静脈細胞」（ＨＵＶＥＣ）に対するインビトロ透過性アッセイによって特徴付けられる。ＥＯＳ装置（ＥＣ  ＩＳ：  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｅｌｌ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  Ｓｅｎｓｉｎｇ；  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｉｎｃ；  Ｔｒｏｙ，  ＮＹ）を使用して、金電極上にプレーティングされた内皮細胞単層を横切る経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の連続的変動を測定することが可能である。ＨＵＶＥＣを９６ウェルセンサー電極プレート（９６Ｗ１  Ｅ，  Ｉｂｉｄｉ  ＧｍｂＨ，  Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種する。形成されたコンフルエントな細胞単層の高透過性は、キニノーゲン、プレカリクレインおよび第ＸＩＩ因子（それぞれ１００  ｎＭ）による刺激によって誘導される。本発明による化合物は、上記の物質の添加の前に添加される。通常、１  ｘ  １０  −１０  〜１  ｘ  １０  −６  Ｍ  が使用される。
【０１１５】
ａ．６）  内皮細胞のインビトロ透過性の決定
さらなる高透過性モデルにおいて、高分子透過性の調節に対する物質の活性が決定される。ＨＵＶＥＣをフィブロネクチンでコーティングしたトランスウェルフィルター膜（２４ウェルプレート、０．４μのポリカーボネート膜を有する６．５ｍｍインサート；  Ｃｏｓｔａｒ  ＃３４１３）上に播種する。フィルター膜は、上部を下部細胞培養空間から分離し、融合内皮細胞層は、上部細胞培養空間の床上にある。２５０ｇ／ｍｌの４０ｋＤａ  ＦＩＴＣデキストラン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｄ１８４４）を上部チャンバーの培地に添加する。単層の高透過性は、キニノーゲン、プレカリクレインおよび第ＸＩＩ因子（それぞれ１００  ｎＭ）による刺激によって誘導される。３０分ごとに、培地サンプルを下部チャンバーから取り出し、時間の関数としての高分子透過性の変化のためのパラメータとしての相対蛍光を蛍光光度計を使用して決定する。本発明による化合物は、上記の物質の添加の前に添加される。通常、１  ｘ  １０  −１０  〜１  ｘ  １０  −６  Ｍ  が使用される。
【０１１６】
ｂ）抗血栓活性の測定（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
ｂ．１）  ウサギの耳出血時間と併用した動脈血栓症モデル（塩化鉄（ＩＩ）誘発血栓症）
ＦＸＩａ阻害薬の抗血栓活性は、動脈血栓症モデルにおいて試験される。血栓形成は、ウサギにおいて頸動脈の領域に化学的損傷を引き起こすことによってここで引き起こされる。同時に耳出血時間を測定する。
【０１１７】
正常な食餌を与え、体重が２．２〜２．５ｋｇの雄ウサギ（Ｃｒｌ：ＫＢＬ  （ＮＺＷ）ＢＲ、チャールス川）にキシラジンおよびケタミン（Ｒｏｍｐｕｎ、Ｂａｙｅｒ、５ｍｇ／ｋｇおよびＫｅｔａｖｅｔ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ  ＧｍｂＨ、４０ｍｇ／ｋｇ体重）を筋肉内投与することによって麻酔する。さらに、右耳介静脈から同一製剤（ボーラス：持続注入）を静脈内投与することにより麻酔を維持する。
右頸動脈を露出させ、血管損傷を、次いで、血液流を妨害することなく、頸動脈の周りにＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）ストリップ（２５ｍｍ×１２ｍｍ）上に濾紙片（１０ｍｍ×１０ｍｍ）を巻くことによって引き起こす。濾紙は、水中の塩化鉄（ＩＩ）（Ｓｉｇｍａ）の１３％強度溶液１００μＬを含有する。５分後、濾紙を除去し、容器を０．９％塩化ナトリウム水溶液で２回すすぐ。損傷３０分後、頸動脈の損傷領域を外科的に抽出し、任意の血栓性物質を除去し、秤量する。
【０１１８】
被験物質は、麻酔動物に大腿静脈を介して静脈内投与するか、覚醒動物に強制経口投与するかのいずれかで、それぞれ損傷の５分前および２時間前に投与する。
【０１１９】
耳出血時間は、頸動脈の損傷から２分後に決定される。この目的のために、左耳を剃毛し、規定された長さ３ｍｍの切開（ブレードアート番号１０−１５０−１０、Ｍａｒｔｉｎ、Ｔｕｔｔｌｉｎｇｅｎ、ドイツ）を耳の縦軸に平行に作製する。ここでは、目に見える血管を損傷しないように注意する。漏出した血液は、創傷に直接触れることなく、正確に秤量した濾紙片を用いて１５秒間隔で採取する。出血時間は、切開創を作製してから、濾紙上でこれ以上血液を検出することができない時点までの時間として計算される。漏出血液の体積は、濾紙片の重量を測定した後に計算される。
【０１２０】
ｃ）眼における血管外漏出／浮腫形成及び／又は血管新生に対する影響の測定（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
ｃ．１）  レーザー誘発脈絡膜新生血管モデルにおける物質の有効性の試験
本試験は、レーザー誘発脈絡膜新生血管のラットモデルにおいて、血管外漏出／浮腫形成および／または脈絡膜新生血管の減少に対する被験物質の有効性を検討するために役立つ。
【０１２１】
この目的のために、眼疾患の徴候を全く示さないＢｒｏｗｎ−Ｎｏｒｗａｙ系統の有色ラットを選択し、治療群に無作為に割り付ける。０日目に、動物を腹腔内注射（１５ｍｇ／ｋｇのキシラジンおよび８０ｍｇ／ｋｇのケタミン）によって麻酔する。瞳孔を拡張させるために０．５％強度のトロピカミド溶液を滴下した後、５３２ｎｍアルゴンレーザー光凝固器（直径５０〜７５μｍ、強度１５０ｍＷ、持続時間１００ｍｓ）を用いて、脈絡膜血管新生を光神経周囲の６つの規定された位置でトリガーする。被験物質および適切な媒体（例えば、ＰＢＳ、等張生理食塩水）は、経口または腹腔内経路によって全身的に、または点眼剤または硝子体内注射としての反復投与によって眼に局所的に投与される。すべての動物の体重は試験開始前に測定し、その後試験中は毎日測定する。
【０１２２】
２１日目に、蛍光眼底カメラ（例えば、Ｋｏｗｅ、ＨＲＡ）を使用して血管造影を実施する。麻酔下およびその後の瞳孔散大の後、１０％強度のフルオレセインナトリウム色素を皮下注射（ｓ．ｃ．）し、２〜１０分後、眼のバックグラウンドの写真を撮影する。血管外漏出／浮腫の程度は、フルオレセインの漏出で表され、２〜３人の盲検化された観察者によって評価され、０（血管外漏出なし）から３（実際の病変を超える強い色調）までの重症度に分類される。
【０１２３】
動物を２３日目に屠殺し、その後、眼を取り出し、４％強度パラホルムアルデヒド溶液中で室温で１時間固定する。１回の洗浄後、網膜を注意深く剥離し、ＦＩＴＣイソレクチンＢ４抗体を用いて強膜−脈絡膜複合体を染色し、次いで顕微鏡スライドに平らに適用する。このようにして得られた調製物を、励起波長４８８ｎｍの蛍光顕微鏡（Ａｐｏｔｏｍ，  Ｚｅｉｓｓ）を用いて評価する。脈絡膜血管新生の面積または体積（それぞれμｍ２およびμｍ３）は、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ  ４．６ソフトウェアを使用する形態計測分析によって計算される。
【０１２４】
ｃ．２）  酸素誘発網膜症モデルにおける物質の有効性の試験
酸素誘発網膜症は病理学的網膜血管新生の研究に有用な動物モデルであることが示されている。このモデルは、網膜における出生後早期の発達中の高酸素症が、正常な網膜血管の成長の停止または遅延を引き起こすという観察に基づいている。７日間の高酸素相の後、動物を正常酸素室の空気に戻すと、これは相対的低酸素と同等である。なぜなら、正常酸素条件下で神経組織の十分な供給を確保するために必要とされる正常血管が網膜に欠けているからである。このようにして引き起こされた虚血状態は、ウェットＡＭＤのような眼疾患における病態生理学的新生血管といくらかの類似性を有する異常な新生血管を生じる。さらに、引き起こされる新生血管は、再現性が高く、定量可能であり、様々な形態の網膜障害に対する疾患機序および可能な治療を検討するための重要なパラメータである。
【０１２５】
本研究の目的は、酸素誘発網膜症モデルにおける網膜血管の成長に対する被験化合物の連日全身投与用量の有効性を検討することである。Ｃ５７Ｂｌ  ／６マウスの新生児とその母親は、生後７日目（ＰＤ７）に高酸素（７０％酸素）に５日間曝露される。ＰＤ１２から、マウスをＰＤ１７まで正常酸素条件下（室内空気、２１％酸素）に保つ。１２日目から１７日目まで、マウスに被験物質または対応する溶媒を毎日投与する。１７日目に、すべてのマウスをイソフルランで麻酔した後、頸部骨折により屠殺する。眼を摘出し、４％ホルマリンで固定する。リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、網膜を切除し、その平坦な調製物を作製し、これをイソレクチンＢ４抗体で染色する。新生血管形成の定量は、Ｚｅｉｓｓ  ＡｐｏＴｏｍｅを用いて行われる。
【０１２６】
Ｃ） 医薬組成物の実施例
本発明による物質は、以下のように医薬調製物に変換することができる：
【０１２７】
錠剤：
組成物：
実施例１の化合物１００ｍｇ、ラクトース（一水和物）５０ｍｇ、トウモロコシデンプン５０ｍｇ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ  ２５）（ドイツＢＡＳＦ社製）１０ｍｇおよびステアリン酸マグネシウム２ｍｇ。
錠剤重量２１２ｍｇ。直径８ｍｍ、曲率半径１２ｍｍ。
製造：
実施例１の化合物、ラクトースおよびデンプンの混合物を、水中のＰＶＰの５％強度溶液（ｍ／ｍ）で顆粒化する。乾燥後、顆粒をステアリン酸マグネシウムと５分間混合する。この混合物を通常の打錠プレスで圧縮する（錠剤のフォーマットについては上記を参照のこと）。
【０１２８】
経口懸濁液：
組成物：
１０００ｍｇの実施例１の化合物、１０００ｍｇのエタノール（９６％）、４００ｍｇのＲｈｏｄｉｇｅｌ  （キサンタンガム）（米国ＦＭＣから）、および９９ｇの水。
１０ｍｌの経口懸濁液は、１００ｍｇの本発明の化合物の単回用量に相当する。
製造：
Ｒｈｏｄｉｇｅｌをエタノールに懸濁し、実施例１の化合物を懸濁液に添加する。攪拌しながら水を加える。混合物を、Ｒｈｏｄｉｇｅｌの膨潤が完了するまで、約６時間撹拌する。
【０１２９】
眼に局所投与するための溶液または懸濁液（点眼剤）：
眼への局所投与のための無菌医薬調製物は、本発明化合物の凍結乾燥物を無菌生理食塩水中に再構成することによって調製することができる。このような溶液または懸濁液に好適な防腐剤は、例えば、０．００１〜１重量％の濃度範囲の塩化ベンザルコニウム、チオマーサールまたは硝酸フェニル水銀である。
【０１３０】
眼に局所投与するための溶液または懸濁液（点眼剤）：
眼への局所投与のための無菌医薬調製物は、本発明化合物の凍結乾燥物を無菌生理食塩水中に再構成することによって調製することができる。このような溶液または懸濁液に好適な防腐剤は、例えば、０．００１〜１重量％の濃度範囲の塩化ベンザルコニウム、チオマーサールまたは硝酸フェニル水銀である。
【国際調査報告】
2021521132.tif 000024
2021521132.tif 000025