(57)【要約】  本発明は、フィチン酸塩（イノシトールヘキサホスフェート、ＩＰ６）を含むミネラル微粒子に関する。より具体的には、本発明は、生体分子送達又は吸着システムへの使用のための、フィチン酸と、多価金属イオン、例えばＣａ２＋及びＭｇ２＋との塩、それらの製造方法、及びそれらのワクチンアジュバントとして使用を提供する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子送達又は吸着システムとして使用するための多価カチオンＭ２＋及びＭ３＋又は有機ポリカチオンを含む１又は２以上のフィチン酸（ＩＰ６）塩を含むミネラル微粒子。
【請求項２】
前記多価カチオンがニ価のアルカリ土類金属イオンである、請求項１に記載のミネラル微粒子。
【請求項３】
前記ニ価のアルカリ土類金属イオンが、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋又はそれらの混合物から選択される、請求項２に記載のミネラル微粒子。
【請求項４】
以下：
i．少なくとも１．５μｍ及び多くて２μｍの公称サイズ、
ii．１：３〜１：８のフィチン酸：アルカリ土類金属の化学量論比、
を有することにより特徴付けられる、請求項２又は３に記載のミネラル微粒子。
【請求項５】
医学的使用のための、請求項１〜４のいずれか１項記載のミネラル微粒子。
【請求項６】
生体分子送達又は吸着システムとして使用のための、請求項１〜５のいずれか１項記載のミネラル微粒子。
【請求項７】
１：６〜１：８のフィチン酸：カルシウムの化学量論比を有するフィチン酸カルシウムを含む、請求項１〜６のいずれか１項記載のミネラル微粒子。
【請求項８】
前記フィチン酸カルシウムが、少なくとも−３４ｍＶの蒸留水においてｐＨ７．０で測定される場合、公称ゼータ電位を有する、請求項７に記載のミネラル微粒子。
【請求項９】
前記生体分子送達システムがワクチンアジュバントである、請求項１〜８のいずれか１項記載のミネラル微粒子。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項記載のミネラル微粒子を含むアジュバント組成物。
【請求項１１】
前記ミネラル微粒子が、０．５〜１μｍのサイズを有する、請求項１０に記載のアジュバント組成物。
【請求項１２】
前記アジュバントがワクチン組成物を形成するために抗原と組合される、請求項８又は９に記載のアジュバント組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィチン酸塩、及び１又は２以上の多価カチオンＭ２＋、Ｍ３＋又は有機ポリカチオンを含むミネラル微粒子に関する。より具体的には、本発明は、生体分子送達又は吸着システムへの使用のための、例えばワクチンアジュバントとして使用するためのそのようなミネラル微粒子を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ミネラルアジュバントは、例えばリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム及びリン酸カルシウムを含む、アルミニウム含有アジュバントは、死滅された、不活性化された及びサブユニット抗原に対する免疫応答を増強するために何十年にもわたって都合良く使用されて来た。
【０００３】
アルミニウムアジュバントは現在、獣医用ワクチン及びヒトワクチンの両方で最も広く使用されるアジュバントである。リン酸カルシウムはまた、市販の獣医用ワクチンにおけるアジュバントとして限られた範囲でしか使用されて来なかったが、しかしパスツール研究所により商品化された、シフテリア、破傷風、百日咳菌及びポリオに対するワクチンのアジュバントとして使用されて来た（Relyveld, 1986; Coursaget et al., 1986）。リン酸カルシウムは、パスツール研究により約２５年間、ＩＰＡＤシリーズのワクチンにおけるアジュバントとしても使用した。さらに、リン酸カルシウムは、ＨＩＶ由来のｇｐ１６０抗原を用いた実験ワクチンにおけるアジュバントとして試験されている（Relyveld and Chermann, 1994）。
【０００４】
水酸化アルミニウム及びリン酸カルシウムの両方は、アレルギー患者の低感作のための市販の吸着アレルゲン製剤におけるアジュバントとして使用されて来た（Relyveld et al., 1985）。アレルギー患者は、肥満細胞の脱顆粒化及びアナフィラキシーを引起す可能性がある、抗原特異的ＩｇＥ型抗体を一部、進行せしめるので、本出願は特に興味深いものである。
【０００５】
リン酸カルシウムアジュバントに関しては、文献データは、このアジュバントがＩｇＥ抗体の有意な刺激をもたらさないことを示唆している。Vassilev (Vassilev, 1978)は、破傷風トキソイドを抗原として用いて、リン酸アルミニウム又はリン酸カルシウムのいずれかによる２回の免疫化の後、モルモットにおける受動的皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）の点で反応を比較した。リン酸カルシウムにより治療されたモルモットは、Ａｌアジュバントワクチンを受けたグループと比較して、わずかなＩｇＥ力価を有したことが見出された。しかしながら、この分野の研究は少なく、そしてリン酸カルシウムによる免疫化の後のインターロイキンプロファイルに関するデータは、そのような差異の背後にあるメカニズムの可能性ある根本的な差異を説明するために存在しない。
【０００６】
アルミニウムベースのアジュバントと、カルシウムベースのアジュバントとの間の主な差異は、アジュバント接種物のインビボでの除去及び分解生成物の代謝運命にある。リン酸カルシウムの分解に基づいて、その２つの成分はそれぞれ、Ｃａ２＋及びＰＯ４３−の通常の代謝経路で再利用され、ところがＺｎ２＋及びＭｇ２＋のような他の金属イオンとは対照的に、アルミニウムは通常の代謝において必須の微量元素又は補酸素として、明らかに機能しない。
【０００７】
アジュバントへの抗原の結合の強さ及び性質は、抗原がその周囲の生理学的環境にその遊離形で放出される代わりに、粒子形（アジュバント粒子に結合される）で提示される確立を条件付けるので、別の重要なパラメーターである。実際のところ、ワクチンは一般的に、免疫原性が低いことが知られており、そしてアジュバントを添加する必要があるので、これは高い分散定数を有する小さな可溶性のペプチドに特に関連する可能性がある〔Li, W., Joshi, M. D., Singhania, S., Ramsey, K. H., & Murthy, A. K. (2014). Peptide vaccine: progress and challenges. Vaccines, 2(3), 515-536.〕。
【０００８】
アジュバント効力の別の側面は、粒子サイズに関連している可能性がある。例えば、より小さなサイズのアルミニウム含有粒子は、より小さな粒子が最も近い求心性リンパ節に輸送され得るので、特に抗原特異的抗体応答を誘発するために、より大きな粒子に比較して、良好に機能することは、以下により示されている：Morefield et al. (Morefield G.L. et al., Role of aluminum-containing adjuvants in antigen internalization by dendritic cells in vitro, Vaccine, 2005) 及びLi et al. (Li X. et al., Aluminum hydroxide nanoparticles show a stronger vaccine adjuvant activity than traditional aluminum hydroxide micro-particles, J. Control. Release, 2014)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、理想的には、無視できる副作用を発生し、最適な粒子サイズ及び抗原結合強度を有し、そしてアジュバントの単位当たりの高い抗原用量を可能にする代替のアジュバントを開発する必要がある。これは、同じ用量の抗原に対するアジュバントの負荷の削減を潜在的に可能にし、それにより、製造コストの削減につながる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、ミネラル微粒子が生体分子送達又は吸着システムとして使用するための多価カチオンＭ２＋及びＭ３＋又は有機ポリカチオンを含む１又は２以上のフィチン酸（ＩＰ６）塩を含み、そしてそれらのＩＰ６−Ｍ微粒子が、ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバント粒子に比較して、同等の又は改善された抗原結合性質を有することを見出した。
【００１１】
フィチン酸（イノシトールヘキサホスフェート、ＩＰ６）は、イノシトールのリン酸エステルであり、ここでイノシトールにおける６つのヒドロキシ基のそれぞれがオルトリン酸の分子によりエステル化されている。オリトリン酸は三塩基酸であり、そしてわずか１つの水素がイノシトールのエステル化において影響を受けるので、リン酸の各分子は依然としてニ塩基酸として機能する。現在、エステルにおけるイノシトールと関連するそれらのリン酸分子が６つあるので、エステルはドデカバシン酸として機能する。このようにして、フィチン酸は、金属及び他の陽イオンが全ての１２個の水素原子を置換する限界まで、酸中の水素を種々の程度、置換できる塩を形成できる。従って、２価の金属（Ｍ）イオンにより沈殿するフィチン酸（Ｐｈｙ）に関しては、理論的限界はＰｈｙＭ６である。しかしながら、２価の金属イオンが他の陰イオンと共沈する場合、フィチン酸塩は、フィチン酸分子当たり６つの２価の金属イオン、例えばＰｈｙＭ７Ｘ 又は ＰｈｙＭ８Ｘ２を含むことができる。
【００１２】
フィチン酸は、多価カチオン（例えば、Ｍ２＋及びＭ３＋）及び有機ポリカチオンと不溶性塩を形成することは以前に示されている。それらの不溶性塩は粒子状物質を形成し、これは、現在アジュバントとして使用される古典的なアルミニウム塩粒子の可能な代替物であるとして、本発明者により見出された。
【００１３】
従って、本発明のミネラル微粒子は、ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバント粒子について測定されたものと同等か又はそれよりも大きい負のゼータ電位を示す。これは、ＩＰ６−Ｍ粒子が正に荷電された抗原又は免疫増強剤の吸着に十分に適していることを示唆する。
【００１４】
本発明の文脈におけるフィチン酸塩は、１又は２以上の異なる多価金属（Ｍ）カチオン、例えばＣａ２＋、Ｍｇ２＋又はＣａ２＋及びＭｇ２＋の両方を含むことができる。フィチン酸塩はまた、１又は２以上の有機ポリカチオン、例えばポリ−Ｌ−リシン及び／又は脱アシル化ポリ−Ｄ−グルコサミン（別名キトサン）も含むことができる。本発明のフィチン酸塩を含む組成物、例えばアジュバント組成物は、フィチン酸塩より多くを含むことができる。
【００１５】
フィチン酸の１つの利点は、ワクチンの製造のために必要とされる熱滅菌に耐える能力である。リン酸基とイノシトールのアルコールとの間のホスホエステル結合は、そのようなアジュバント製造のために使用されるオートクレービング条件の間の加水分解に対して耐性であり、遊離オルトホスフェート及びイノシトールホスフェートの一部のみを放出する。
【００１６】
さらに、本発明者は、本発明のミネラル微粒子が、正に荷電された生体分子、又は正の電荷のパッチを有する生体分子のための結合性質、より具体的には、抗原結合性質を高めることを見出した。この特性は、おそらく、正に荷電された生体分子、例えば抗原の前記ミネラル微粒子の表面への高められた引力により引起され、高められた吸着用量及び／又は結合強度、すなわち高められた会合定数をもたらす。これを考慮して、本発明の修飾ミネラル微粒子は、例えば改善されたワクチンアジュバントとして使用され得る。
【００１７】
従って、第１の側面によれば、生体分子送達又は吸着システムとして、特にワクチンアジュバントとして使用するための多価カチオンＭ２＋及びＭ３＋又は有機ポリカチオンを含む１又は２以上のフィチン酸（ＩＰ６）塩を含むミネラル微粒子が提供される。
【００１８】
第２の側面によれば、前記第１の側面のミネラル微粒子の製造方法が提供される。
【００１９】
第３の側面によれば、前記第２の側面の製造方法により得られるミネラル微粒子が提供される。
【００２０】
第４の側面によれば、前記第１の側面のミネラル微粒子を含むアジュバント組成物が提供される。
【００２１】
第５の側面によれば、前記第４の側面のアジュバント組成物が、ワクチン組成物を形成するために、１又は２以上の抗原と組合される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ＩＰ６−Ｍｇ沈殿物についてのＫ−殻エネルギーのＥＤＸＳスペクトルを示す。
【００２３】
【図２】図２は、ＩＰ６−Ｃａ沈殿物についてのＫ−殻エネルギーのＥＤＸＳスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義：
特にことわらない限り、本明細書に使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の試験の実施に使用され得るが、好ましい方法及び材料が現在、記載されている。
【００２５】
本明細書及び添付の請求の範囲において、単数形「ａ」及び「ａｎ」及び「the」は、文脈が明確に他を指示しない限り複数形の参照を含む。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「含んでいる（comprising）」、「含む（comprises ）」及び「から構成される（comprised of ）」とは、「含んでいる（including）」、「含む（includes）」、「含んでいる（containing）及び「含む（contains）」と同義であり、そして包括的又はオープンエンドであり、そして追加の列挙されていないメンバー、要素又は方法の工程を除外しない。
【００２７】
用語「含んでいる（comprising）」、「含む（comprises ）」及び「から構成される（comprised of ）」はまた、用語「から成る（consisting of）」も含む。
【００２８】
本明細書において使用される用語「約」とは、測定できる値、例えばパラメーター、量、持続時間などを言及する場合、変動が開示された発明において実施するのに適切である限り、特定の値の及び特定の値から＋/− １０％以下、好ましくは＋/− ５％以下、より好ましくは＋/− １％以下、さらにより好ましくは＋/− ０．１％以下の変動を包含することを意味する。修飾子「約」が参照する値は、その自体も具体的に、好ましくは開示されることが理解されるべきである。
【００２９】
エンドポイントによる数値範囲の列挙は、それぞれの範囲内に含まれる全ての数値及び分数、及び列挙されたエンドポイントを含む。
【００３０】
以下の節においては、本発明の異なる側面又は実施形態が、より詳細に定義される。そのように定義された各側面又は実施形態は、反対に明確に示されない限り、他の任意の側面又は実施形態と組合わされ得る。特に、好ましい又は有利であることを示される任意の特徴は、好ましい又は有利であるとして示される他の任意の特徴又は複数の特徴と組合わされ得る。
【００３１】
本明細書を通して「１つの実施形態（one embodiment）又は（an embodiment）」への言及は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造又は特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書全体の種々の場所での句「１つの実施形態（in one embodiment）又は（an embodiment）」の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指すとは限らないが、そうであり得る。さらに、特定の特徴、構造又は特性は、１又は２以上の実施形態において、本開示から当業者に明らかであるように、任意の適切な態様で組合わされ得る。
【００３２】
本出願の文脈において、「Ｍ」は金属原子を示し、そしてＭ２＋及びＭ３＋は、二価及び三価の金属カチオンの例を示す。
【００３３】
本発明は、多価の金属カチオンＭ２＋、Ｍ３＋又は有機ポリカチオンを含む１又は２以上のフィチン酸（ＩＰ６）塩を含むミネラル微粒子に関する。それらのスチン酸塩含有ミネラル微粒子の生体分子結合性質は、好ましくは、前記生体分子がワクチン抗原である場合、典型的なリン酸塩含有ミネラル微粒子と比較して、同等か又は改善されたことが見出された。特に、リン酸イオン又は水酸化物イオンのフィチン酸塩イオンによる（正式な）置換は、前記微粒子のζ−（ゼータ−）電位の数値を高め、それにより、生体分子、好ましくは抗原の誘引のための静電電位の強度、及び前記微粒子の表面への結合強度を高めることが示された。
【００３４】
従って、本発明のミネラル微粒子は、ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバント粒子について測定されたものと同様の又は数値的に大きな負のゼータ電位を示し、これは、ＩＰ６−Ｍ粒子が正の荷電された抗原又は免疫増強剤の吸着のために非常に適していることを強く示している。
【００３５】
フィチン酸（イノシトールヘキサホスフェート、ＩＰ−６）は、多価カチオン（例えば、Ｍ２＋及びＭ３＋）、及び有機ポリカチオンと実質的に不溶性の塩を形成することが以前に示されている。それらの不溶性塩は、本発明者により、現在アジュバントとして使用される古典的なアルミニウム塩粒子の代替物であると仮定された。
【００３６】
フィチン酸塩をアジュバントとして使用することの１つの利点は、ワクチンの製造のために必要とされる、その熱安定性及び熱滅菌に対する耐性である。リン酸基とイノシトールのヒドロキシ基との間のホスホエステル結合は、そのようなアジュバントの製造のために使用されるオートクレービング条件の間の加水分解に対して耐性であり、遊離オルトホスフェート及びイノシトールリン酸の一部のみを放出する。
【００３７】
本発明の文脈におけるフィチン酸塩は、１又は２以上の異なる多価金属（Ｍ）カチオン、例えばＣａ２＋、Ｍｇ２＋又はＣａ２＋及びＭｇ２＋の両方を含むことができる。フィチン酸塩はまた、１又は２以上の有機ポリカチオン、例えばポリ−Ｌ−リシン及び／又は脱アシル化ポリ−Ｄ−グルコサミン（別名キトサン）も含むことができる。本発明のフィチン酸塩を含む組成物、例えばアジュバント組成物は、フィチン酸塩より多くを含むことができる。
【００３８】
従って、第１の側面によれば、生体分子送達又は吸着システムとして使用するための多価カチオンＭ２＋及びＭ３＋又は有機ポリカチオンを含む１又は２以上のフィチン酸（ＩＰ６）塩を含むミネラル微粒子が提供される。
【００３９】
１つの実施形態によれば、前記多価カチオンは、二価のアルカリ土類金属イオンである。
【００４０】
１つの実施形態によれば、前記多価カチオンは、有機ポリカチオンである。
【００４１】
別の実施形態によれば、前記有機ポリカチオンは、ポリ−Ｌ−リシン及び／又は脱アシル化ポリ−Ｄ−グルコサミン（別名キトサン）から選択される。
【００４２】
別の実施形態によれば、前記ニ価のアルカリ土類金属イオンは、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋、又はそれらの混合物から選択される。
【００４３】
特定の実施形態によれば、前記ミネラル微粒子は、フィチン酸カルシウム微粒子である。
【００４４】
別の特定の形態によれば、前記ミネラル微粒子は、フィチン酸マグネシウム粒子である。
【００４５】
別の実施形態によれば、本発明のミネラル微粒子は、フィチン酸塩以外の少なくとも１つのアニオンを含む。
【００４６】
好ましい実施形態によれば、本発明のミネラル微粒子は、ワクチンアジュバントとして有用である。
【００４７】
本発明の別の利点は、フィチン酸塩と多価カチオン及びそれらの混合物との多数の可能な組合せにあり、そのフィチン酸塩は、１、２又はそれ以上の同一の又は異なる多価カチオンと相互作用できる６つのリン酸基を有するため、これは異なる化学量論比で形成される可能性がある。得られるミネラル微粒子はさらに、異なる粒子サイズで沈殿又は後処理され得る。従って、本発明のミネラル微粒子は、異なる抗原のためのアジュバントとして理想的に一致するよう、生体分子送達又は吸着システムとしてオーダーメイドされ得る。
【００４８】
第２の側面によれば、フィチン酸（ＩＰ６）又はその可溶性塩を、多価カチオンの可溶性塩、例えばＣａｃｌ２又はＭｇＣｌ２のようなニ価のアルカリ土類金属イオンの可溶性塩と、又はポリ−Ｌ−リシンのような可溶性有機カチオンとを混合することを含む、第１の側面のミネラル微粒子の製造方法が提供される。得られる沈殿物は、遠心分離又は濾過により単離され、そして脱イオン水によりすすがれる。
【００４９】
本発明の第２の側面の微粒子は、得られる沈殿物が必ずしも理論的な化学量論比に一致する組成を有するとは限らないので、正確で客観的な用語で説明することは困難である。さらに、反応条件のわずかな変化が、微粒子の結晶化度及び／又は粒子サイズに影響を与える可能性がある。しかしながら、実験は、ミネラル微粒子は、記載される手順に従うことにより、実質的に同一の性能／ゼータ電位により繰り返して得られることを示す。従って、ミネラル微粒子は、本明細書に記載される前記製造方法の生成物として最も正確に記載されている。
【００５０】
従って、第３の側面によれば、第２の側面の製造方法により得ることができるミネラル微粒子が提供される。
【００５１】
第４の側面によれば、第１又は第３の側面のミネラル微粒子を含むアジュバント組成物が提供される。
【００５２】
１つの実施形態によれば、前記アジュバント組成物は、ニ価のアルカリ土類金属イオンを含む。
【００５３】
別の実施形態によれば、前記アジュバント組成物は、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋又はそれらの混合物から選択されてアルカリ土類金属イオンを含む。
【００５４】
特定の実施形態によれば、前記アジュバント組成物は、フィチン酸カルシウム微粒子を含む。
【００５５】
特定の実施形態によれば、本明細書で教示されるミネラル微粒子は、それらの高められた抗原結合能力の結果として、高められた抗原吸着能力を有することができる。それらの高められた抗原吸着能力は、従来技術で利用可能であるそれらと比較して、より多くの感染性病原体からの抗原を含むことができる組合せワクチンの製造を可能にする。アジュバントのタンパク質吸着能力は、種々の分析方法を用いて測定され得る。例えば、アジュバントへの吸着の前後、抗原溶液の水性相中のタンパク質含有量を比較することにより（Lindblad E., Aluminum compounds for use in vaccines, Immunology and Cell Biology, 2004,82:497-505）、又は所望の抗原に対して特異的な抗体が利用可能である場合、吸着、すなわちタンパク質吸着能力は、定量的免疫電気泳動又は単一放射状免疫拡散のいずれかを用いることにより、免疫沈澱技術を用いて測定され得る。抗体を使用しないで、それは、分光光度法により試験され得る（Lindblad E., Aluminum compounds for use in vaccines, Immunology and Cell Biology, 2004,82:497-505）。
【００５６】
第５の側面によれば、第４の側面のアジュバント組成物は、ワクチン組成物を形成するために、１又は２以上の抗原と組合される。
【００５７】
本明細書で使用される場合、用語「微粒子」とは、少なくとも０．０１μｍ及び最大で５μｍ又は最大で２μｍの公称サイズを有する粒子を指す。本発明の微粒子は、好ましくは、５００ｎｍ〜１μｍの公称サイズ及び本明細書の他の場所で定義されたような公称ζ電位を有する。微粒子は種々の形状を有することができ、そして例えば、球形、円錐形、楕円形、複雑な形状、円筒形又は立方体であり得る。さらに、微粒子のコレクション内の微粒子は、全て同じサイズ又は形状を有しているとは限らない。
【００５８】
本明細書で使用される場合、用語「静電電位」、「電位」又は「Ｖ」とは、当業者により理解されるようなこの用語の一般的意味、及び特に、荷電実体の位置エネルギー、特に陽子、分子の近くの特定の位置上の電子又はイオンを示し、そして単位電荷当たりのエネルギー（ｑ）（Ｖ＝Ｕ／ｑ）として定義され得る。静電電位は、ジュール／クーロン又はボルトの単位で表され得る。静電電位は、例えば１つの電位Ｖ１から別の電位Ｖ２に電荷を移動させるのに必要とされるエネルギーを予測及び／又は計算するために使用され得る。
【００５９】
本明細書に使用される場合、用語「ゼータ電位」又は「ζ−電位」とは、流体に懸濁された微粒子の相対電荷の尺度を説明する。より具体的には、ゼータ電位は、粒子の物理的表面、いわゆる拡散層（いわゆる滑り面）の境界から特定の距離にある中間電子を指し、ここでイオンは粒子表面の引力のある静電界と周囲の液体（例えば、溶媒）との間で平衡状態にある。従って、ζ−電位は、粒子の物理的表面から特定の距離での電位を表し、ここで前記粒子の電子の電荷は周囲の液体ともはや干渉しなくなる。ζ−電位は典型的には、＋１００ｍＶ〜−１００ｍＶの範囲であり、そして動電学的モードで、好ましくは２５℃及び／又は脱イオン水中でZetasizer nano ZS (Malvern Instruments Inc.)を用いることにより測定され得る。液体中の微粒子の場合、公称ζ−電位が高いほど、懸濁液中に沈降する傾向が低められるという点で安定性がより高くなる。例えば、＋２５ｍＶ以上か又は−２５ｍＶ未満のζ−電位を有する微粒子は典型的には、高度な安定性を有する。
【００６０】
本明細書で使用される場合、用語「結合する」、「相互作用する」、「特異的に結合する」又は「特定的に相互作用する」とは、剤が１又は２以上の所望の分子又は分析物に結合するか又は影響を及ぼし、ランダム又は無関係である他の分子を実質的に除外し、そして任意には、実質的に、構造的に関連する他の分子を除外することを意味する。用語「結合する」、「相互作用する」、「特異的に結合する」又は「特定的に相互作用する」とは、剤がその意図される標的に排他的に結合することを必ずしも必要としない。例えば、剤は、結合の条件下でそのような意図された標的に対するその親和性が、非標的分子に対するその親和性よりも、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍、さらにより好ましくは少なくとも２５倍、さらにより好ましくは少なくとも約５０倍、及びさらにより好ましくは少なくとも約１００倍高い場合、目的の標的に特異的に結合すると言うことができる。
【００６１】
剤とその意図された標的との間の結合又は相互作用は、非共有結合であり得る（すなわち、非共有結合力、例えばイオン相互作用、水素結合、双極子相互作用、ファンデルクールス相互作用など）。好ましくは、剤は、そのような結合ＫＡ≧１×１０６ Ｍ−１、より好ましくは ＫＡ≧１×１０７ Ｍ−１、 さらにより好ましくは ＫＡ≧１×１０８ Ｍ−１、さらにより好ましくはＫＡ≧１×１０９ Ｍ−１及びさらにより好ましくは ＫＡ≧１×１０１０ Ｍ−１ 又は ＫＡ≧１×１０１１ Ｍ−１の親和性又は会合定数（ＫＡ）で、その意図された標的に結合するか、又は相互作用することができ、ここでＫＡ ＝ ［Ａ＿Ｔ］/［Ａ］［Ｔ］ ＝ ｋａ/ｋｄここでＡは剤、Ｔは目的の標的、kaは吸着速度、kdは脱着速度を示す。ＫＡの決定は、当業界において知られている方法、例えば平衡透析及びスキャチャードプロット分析を用いて実施され得る。
【００６２】
何れの理論にも拘束されることを望まないが、本発明者は、本明細書において教示されるように、生体分子、例えば抗原がミネラル微粒子の表面に結合し得る第２のメカニズムは、生体分子のタンパク質表面での正に荷電されたアミノ酸、好ましくはリシン及びアルギニンと、微粒子（例えば、アジュバント微粒子）の表面での負に荷電されたフィチン酸（ＩＰ６）リン酸基との間のイオン結合の形成を含む、より特異的な相互作用を通してである仮説を立てている。タンパク質、特にリシン及びアルギニンにおける正に荷電されたアミノ酸残基に対するリン酸基の親和性は、ヌクレオチドのホスホリル基が酵素触媒部位のリシン又はアルギニン残基とのイオン対形成に一時的に関与しているプロテインキナーゼ及びホスファターゼの例を伴って、生化学で十分に文書化されている（Mavri J. and Vogel M. J., Ion pair formation of phosphorylated amino acids and lysine and arginine side chains: A theoretical study, Proteins Structure Function and Bioinformatics, 1996）。タンパク質間の相互作用のいくつかの特定の場合、このタイプのイオン結合は、共有結合と同じほど強く（Woods A. S. and Ferre S., Amazing stability of the arginine-phosphate electrostatic interaction, Journal of Proteome Research, 2005）、そしてこの特性はいくつかの出願で活用されている（Fokkens M. et al., A molecular tweezer for lysine and arginine, Journal of the American Chemical Society, 2005; Schug K. A. et al., Noncovalent binding between guanidinium and anionic groups: focus on biological-and synthetic-based arginine/guanidinium interactions with phosph[on]ate and sulf[on]ate residues, Chemical Reviews, 2005）ことが示されている。本発明者はさらに、このタイプの相互作用は、バルク溶媒の適切なｐＨ値及びイオン強度での生体分子送達又は吸着システムとして使用するための、多価カチオンＭ２＋及びＭ３＋又は有機ポリカチオンを含む１又は２以上のフィチン酸（ＩＰ６）塩を含む、リン酸塩含有微粒子（例えば、アジュバントとして使用される）、例えば本明細書に教示されるＩＰ６−Ｍ微粒子の表面で起こり得ると仮定している。
【００６３】
特定の実施形態によれば、本明細書に教示されるようなミネラル微粒子は、以下を有する：
（ｉ）蒸留水においてｐＨ７．０で測定される場合、ＩＰ６−Ｍｇに関して、少なくとも−２８ｍＶの公称ζ−電位、又は
（ｉｉ）蒸留水においてｐＨ７．０で測定される場合、ＩＰ６−Ｃａに関して、少なくとも−３４ｍＶの公称ζ−電位。
【００６４】
特定の実施形態によれば、ＩＰ６−Ｍｇ微粒子は、蒸留水中で測定される場合、少なくとも−２０ｍＶ、少なくとも−２５ｍＶ、少なくとも−３０ｍＶ、又は少なくとも−３５ｍＶ、好ましくは少なくとも−２８ｍＶの公称ζ−電位を有する。
【００６５】
特定の実施形態によれば、ＩＰ６−Ｃａ微粒子は、蒸留水中で測定される場合、少なくとも−２５ｍＶ、少なくとも−３０ｍＶ、少なくとも−３５ｍＶ、又は少なくとも−４０ｍＶ、好ましくは少なくとも−３４ｍＶの公称ζ−電位を有する。
【００６６】
特定の実施形態によれば、本発明のミネラル微粒子は、少なくとも０．１μｍ、最大２ μｍ、少なくとも０．５μｍ、最大２μｍ、少なくとも０．５μｍ、最大１．５μｍ、最大１μｍ、最大０．５μｍ、最大０．２μｍ、最大０．１μｍ、 好ましくは０．５〜１μｍの公称サイズを有する。
【００６７】
本発明の微粒子のフィチン酸／Ｍの化学量論比は、約１：３〜約１：８、好ましくは１：６〜１：８、すなわちフィチン酸分子当たり６〜８Ｍ原子である。
【００６８】
特定の実施形態によれば、本発明のＩＰ６−Ｍｇ微粒子は、１：６のフィチン酸塩：Ｍｇの化学量論比を有する。
【００６９】
特定の実施形態によれば、本発明のＩＰ６−Ｃａ微粒子は、１：８のフィチン酸塩：Ｃａの化学量論比を有する。
【００７０】
上記のように、リン酸アルミニウム、水素化アルミニウム及びリン酸カルシウムを含むミネラル含有アジュバントは、殺された、不活性化された及びサブユニット抗原に対する免疫応答を高めるために、何十年もワクチン調製に都合よく使用されて来た。
【００７１】
特定の実施形態によれば、生体分子送達又は吸着システムとしての使用のための、多価カチオンＭ２＋及びＭ３＋又は有機ポリカチオンを含む１又は２以上のフィチン酸（ＩＰ６）塩を含む、本明細書に教示されるようなミネラル微粒子は、修飾されていないリン酸アルミニウム、非晶性ヒドロキシリン酸アルミニウム、及び／又はリン酸カルシウム微粒子に比較して、高められた生体分子結合性質を有し、好ましくは、ここで前記生体分子は、前記修飾された微粒子と反対の電荷を有し、又は前記生体分子は、前記修飾された微粒子が中性である場合、中性である。例えば、修飾されたリン酸アルミニウム微粒子は、負に荷電されており、そして好ましくは、正に荷電された生体分子に結合する。
【００７２】
用語「生体分子」とは、本明細書において使用される場合、精製又は合成により生物に由来し、そして生物学的に活性であり得る成分又は剤を含むことを意味する。それらの用語には、診断剤及びいわゆる「薬用化粧品」も含まれる。診断剤は例えば、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質又はＧＦＰ）、又は放射性標識分子を含む。薬用化粧品は、個人の外観、例えば肌、髪、唇及び目に対する効果を有する活性成分を含み、そしてしわ防止剤、及び肌の色を改善する剤を含む。それらの用途においては、本明細書で教示されるような修飾された微粒子は好ましくは、外部から投与される。活性医薬成分（また、医薬品又は薬物とも呼ばれる）は特に興味あるものであり、そして生体分子のサブグループを形成する。
【００７３】
生体分子は、以下を含むことができる：小分子（例えば、約１，５００未満の分子量を有するもの）、合成又は天然の小分子、例えば単糖、ニ糖、三糖、オリゴ糖、ペプチド、核酸のみならず、また核酸類似体及び誘導体；又は大分子、例えばプラスミド、ベクター、多糖類、生体高分子、例えばより大きなペプチド（ポリペプチド）、タンパク質、ペプチド類似体及びそれらの誘導体、ペプチド模倣薬、核酸ベースの分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、又はその他のＤＮＡまたはＲＮＡ様分子）、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素、抗生物質、生物学的材料、例えば細菌、植物、真菌、動物の細胞や組織からから製造された抽出物、治療薬、予防薬、診断薬、造影剤、アプタマー（オリゴヌクレオチド又はタンパク質アプタマーを含む）。
【００７４】
１つの実施形態によれば、生体分子は、水溶性、特に水溶性活性医薬成分である。そのような成分は、原薬を以下の４つのクラスに分類する生物薬剤分類システム（ＢＣＳ）のクラスＩ又はクラスIIIに属する可能性がある：クラスI-高い透過性、高い溶解性；クラスII-高い透過性、低い溶解性；クラスIII-低透過性、高溶解性; クラスIV-低透過性、低溶解性。水溶性薬剤はまた、１ｇの化合物を溶解するのに必要とされる水の量（ｇ）によっても特定され得、ここで水溶性薬剤は、以下の溶解性条件を満たすものである：１０〜３０ ｇ（「可溶性」）; ３０〜１００ ｇ（「難溶性」）; １００−１０００ ｇ（「わずかに可溶性」）; １０００〜１００００ ｇ（「非常にわずかに可溶性」又は「難溶性」）；又は特に可溶性、控えめに可溶性及びわずかに可溶性の薬剤。
【００７５】
別の実施形態によれば、生体分子は、抗体又は抗体フラグメントであり得る。用語「抗体」とは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）を含むことを意味する。抗体フラグメントは、抗体の一部、一般的にはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント; ダイアボディ; 線形抗体; 一本鎖抗体分子; 抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を含む。
【００７６】
好ましい実施形態によれば、生体分子は、宿主生物において免疫応答を誘発できる抗原であり得る。従って、好ましい実施形態によれば、本明細書で教示されるようなミネラル微粒子は、修飾されていないリン酸アルミニウム、非晶性ヒドロキシリン酸アルミニウム、及び／又はリン酸カルシウム微粒子に比較して、高められた抗原結合性質を有し、好ましくは、ここで前記抗原は、前記修飾された微粒子と反対の電荷を有し、又は前記抗原は、前記修飾された微粒子が中性である場合、中性である。例えば、修飾されたリン酸アルミニウム微粒子は、負に荷電されており、そして好ましくは、正に荷電された抗原に結合する。
【００７７】
用語「宿主生物」とは典型的には、動物、好ましくは脊椎動物を意味し、鳥、ヒト及び非ヒト哺乳類、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、豚、牛、馬、羊、山羊、犬、猫、又は霊長類を含む。
【００７８】
用語「吸着」とは、本明細書において使用される場合、微粒子の表面と生体分子（例えば、抗原及び／又は有機分子）との間の結合が確立されている物理吸着（例えば、ファンデルワールスカ力による）又は化学吸着（例えば、共有又はイオン結合による）を指す。
【００７９】
前記ミネラル微粒子の生体分子結合特性は、リン酸アルミニウム、非晶性ヒドロキシリン酸アルミニウム、及び／又はリン酸カルシウム微粒子の生体分結合特性よりも、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも ３．５倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍高く、好ましくは、ここで前記生体分子は抗原である。リン酸アルミニウム（ｍｇ／ｇ）、非晶性ヒドロキシリン酸アルミニウム（ｍｇ／ｇ）又はリン酸カルシウム（ｍｇ／ｇ）微粒子に対する吸着生体分子（例えば、抗原）の比率は、修飾された微粒子のタイプ及び生体分子（例えば、抗原）の性質の組合せに依存する。例えば、ミネラル微粒子（ｍｇ／ｇ）に対する生体分子（例えば、抗原）の割合は、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、好ましくは少なくとも１２である。
【００８０】
本発明のミネラル微粒子は、改善された物理化学的特性、すなわち粒子間の高められた静電反発力に起因する可能性がある高められたコロイド安定性又は低められた凝集性；及び／又は改善された生体分子吸着及び結合性を有することができ、好ましくは、ここで前記生体分子は抗原である。
【００８１】
さらに、本発明の別の側面は、本明細書において教示されるような前記ミネラル微粒子の医学への使用である。
【００８２】
特定の実施形態によれば、医学は、ヒト及び／又は獣医学であり得る。
【００８３】
特定の実施形態によれば、本明細書で教示されるようなミネラル微粒子は、生体分子送達又は吸着システムとして使用され得、好ましくは、前記生体分子送達システムは、ワクチンアジュバントである。
【００８４】
特定の実施形態によれば、本明細書で教示されるような前記ミネラル微粒子は、ワクチンにおいて、好ましくは生体分子送達システムとして、より好ましくは、ワクチンアジュバントとして使用され得る。
【００８５】
特定の実施形態によれば、本明細書で教示されるような前記ミネラル微粒子は、ワクチンの製造のために使用され得る。
【００８６】
本明細書で教示されるように、それらの表面に結合される抗原を有するミネラル微粒子は、動物において抗体、例えばポリクローナル抗体を産生するために使用され得る。これは、血清中の抗原特異的抗体の高発現レベルを高めるために、それらの表面に結合される抗原を有する前記ミネラル微粒子の実験用動物又は家畜への注射により達成され、その後、動物から回収され得る。ポリクローナル抗体は血清から直接回収され得るが、モノクローナル抗体は、免疫化されたマウスからの抗体分泌脾臓細胞を、不死の骨髄腫細胞と融合させ、細胞培養上清液において特異的抗体を発現するモノクローナルハイブリドーマ細胞系を創造することにより生成される。
【００８７】
したがって、本発明の別の側面は、本発明のミネラル微粒子の抗体産生のためへの使用である。
【００８８】
生体分子及び／又は汚染物質（すなわち、ヒ素、クロム、硝酸塩、カルシウム、ラジウム、ウラン、フッ化物）を結合できるミネラル微粒子は、生体分子吸着システムとして、例えば、水溶液及び他のイオン含有溶液の精製、分離及び除染の工程において使用され得る（例えば、イオン交換体として機能することによる）。例えば、正に荷電されたミネラル微粒子は、負に荷電されたアルブミンを結合でき、そして従って、血液サンプルからのアルブミンの除去のために使用され得る。別の例においては、荷電されたミネラル微粒子は、種々のサンプル中の酸性又は塩基性タンパク質を選択的に富化するために使用され得る。産業規模では、精製、分離及び除染は、しばしば、吸着カラム（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）を用いて実施される。
【００８９】
従って、本明細書で教示されるようなミネラル微粒子は、精製、分離及び除染工程において生体分子吸着システムとしても使用され得る。
【００９０】
特定の実施形態によれば、本明細書で教示されるようなミネラル微粒子は、血液分別中、所望しないタンパク質の除去のために使用され得る。
【００９１】
本発明は、以下の限定的な例において、さらに示される。
【実施例】
【００９２】
実験１：Ｃａ２＋（Ｍ＝Ｃａ）及びＭｇ２＋（Ｍ＝Ｍｇ）によるフィチン酸沈殿物（ＩＰ６−Ｍ）の形成及び予備的特性評価：
２００ｍＭのフィチン酸（ＩＰ６）及び１ＭのＣａＣｌ２又はＭｇＣｌ２の源溶から、ＣａＣｌ２又はＭｇＣｌ２のいずれかをＩＰ６に徐々に添加し、Ｃａ２＋又はＭｇ２＋及びＩＰ６の最終濃度が５０Ｍになるように混合物を得た（Ｍ２＋／ＩＰ６，１：１）。アルカリ土類金属の添加後すぐに沈殿物が形成された。激しい攪拌の後、沈殿物を、１２０００ｘｇでの３０分間の遠心分離によりペレット化した。ペレットを、多量の脱イオン水（１８ＭΩ）によりすすぎ、遊離対イオンの最終希釈係数が３０００倍になるようにんし、Ｃｌ−イオンについての理論濃度を（５０＊２）／３０００＝３３μＭにした。すすがれた沈殿物を、物理的及び化学的分析のために使用した。
【００９３】
粒子サイズ及びゼータ電位を、動的光散乱法（DLS, Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments）により、沈殿物のアリコートを脱イオン水に懸濁することにより測定した。懸濁液のｐＨ値を記録した。表１の結果は、ＩＰ６−Ｍの粒子サイズが、従来のアジュバント、例えば典型的には、２μｍ〜５μｍで構成されるアルミニウム塩に匹敵することを示す。約１μｍのＩＰ６−Ｃａ粒子サイズは、ＩＰ６−Ｍｇ及びアルミニウム塩粒子よりも小さいようである。この特徴は、それらのより小さなサイズのために刺激特性を増強したことが示されている、１００〜５００ｎｍの範囲の粒子サイズの粒子状アジュバントを処方するというワクチン産業における現在のニーズに応える可能性があるので、興味深いものである。両粒子は、ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバント粒子について測定されたものと類似する負のゼータ電子を示し、これは、それらのＩＰ６−Ｍ粒子が正に荷電された抗原又は免疫増強剤の吸着のために十分に適していることを意味する。
【００９４】
【表１】
2021521216.tif 000002
【００９５】
値は、３つの独立した測定値の平均である。ｐＨ値は、ゼータ電位の測定の前、懸濁液に希ＨＣｌを添加することにより調整された。
【００９６】
（すすがれた）沈殿物中のフィチン酸及びＭ２＋イオンの化学量論比を決定するために、エネルギー分散型Ｘ線散乱（ＥＤＸＳ）分析を実施した。スペクトル（図１及び２）から、化学元素における相対的含有量の判定量値を導き出すことができる（表２）。フィチン酸の元素式はＣ６Ｏ１８Ｈ１２Ｐ６（完全にプロトン化された形）であり、これは２０／６０／２０のＣ／Ｏ／Ｐ化学量論比に変換する（表２、ＩＰ６理論）。炭素についての値を参照にすると、表２は、化学量論比Ｃ／Ｍがそれぞれ、ＩＰ６−Ｃａについて１：１．３６及びＩＰ６−Ｍｇについて１：１であることを示す。
【００９７】
この分析のフィチン酸塩／Ｍ比を考慮すると、フィチン酸塩／Ｍの化学量論比は、ＩＰ６−Ｃａについて１：８．１４及びＰＩ６−Ｍｇについて１：６、すなわちＩＰ６−Ｍｇにおいてフィチン酸分子当たり６Ｍｇ原子であると結論付けられ得、これは、２個のカチオン（ＰｈｙＭ６）により沈殿するフィチン酸についての理論的最大値に対応する。ＩＰ６−Ｃａの場合、より高いＣａの含有量が記録され（ＩＰ６−Ｃａにおけるフィチン酸分子当たり８つのＣａ原子）、この発見は、ＰｈｙＣａ８Ｘ２を形成するために、別のアニオン（Ｘと標示される）により沈殿するフィチン酸カルシウムによりたぶん説明され得る。これはまた、裏付けられていません。
【００９８】
表２の最後の行で強調されるように、フィチン酸についての理論的Ｃ／Ｏ／Ｐ比は、２０／６０／２０である。Ｃ、Ｏ及びＰの測定された相対量が再正規化され、合計１００％（ＩＰ６基準）が生成される場合、Ｏ及びＰがＣに対してわずかに化学量論的に過剰であるように、ＩＰ６−Ｃａ及びＩＰ６−Ｍｇの両方において見えた（表２）。これは、ＩＰ６−Ｍと共沈した、この実験に使用されたＩＰ６のバッチに遊離オルトリン酸塩の存在を示している可能性がある。
【００９９】
上記２つの実験で観察されたもの以外の化学量論的比が可能であり、そしてさらなる調査の対象である。化学量論比は、沈殿物形成の条件、例えば反応物の相的濃度及び形、ｐＨ、温度、反応物の混合のモード及び速度、初期沈殿物の熱力学的安定性などに依存するであろう。同様に、沈殿物の結晶化度及び形もまた、反応の条件に応じて大幅に変化する可能性がある。
【０１００】
【表２】
2021521216.tif 000003
【０１０１】
実験２：ポリ−Ｌ−リシンによるフィチン酸沈殿物の形成及び予備的特性評価：
２００ｍＭのフィチン酸（ＩＰ６）及び１００Ｍｇ／ｍｌの低分子量ポリ−Ｌ−シリン（１０００〜５０００Ｄａ）の原液から、ポリ−Ｌ−リシンをＩＰ６に徐々に添加し、フィチン酸の最終濃度が１００ｍＭになり、そしてポリ−Ｌ−リシンのその最終濃度が２０ｍＭになるように混合物を得た（３０００Ｄａの平均Ｍｗに基づく）。ポリ−Ｌ−リシンの添加後すぐに、沈殿物が形成されたが、形式された粒状物質は遠心分離によりペレット化できず、これは水の密度に近い材料密度を示した。この材料のサンプルを、動的光散乱（DLS, Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments）により、粒子サイズ及びゼータ電位測定のために１０倍に希釈した。表２の結果は、ＩＰ６−ポリ−Ｌ−リシンの粒子サイズは、約１．１μｍであり、そしてそれらの実験条件下でのゼータ電位は−２９ｍＶであることを示している。脱イオン水を用いてのさらなる１００倍への希釈は、光学密度の上昇をもたらし（肉眼で確認できる）、さらなる粒子形成を示す。粒子のサイズは、２．９μｍに上昇し、そしてゼータ電位は著しく変化しなかった。
【０１０２】
フィチン酸とポリ−Ｌ−リシン（低Ｍｗ）との間の複合体形成により形成される粒子の安定性は、コロイドの形成から数時間後、相分離が観察されるので、わずかであるように見える。相の再混合によりコロイドが得られた。
【０１０３】
【表３】
2021521216.tif 000004
【図１】
2021521216.tif 000005
【図２】
2021521216.tif 000006
【国際調査報告】
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2021521216.tif 000008
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