(57)【要約】  本発明は、術後の患者における肺癌の再発を予測する方法であって、患者の試料由来の循環腫瘍ＤＮＡの分析を含む方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における突然変異量を判定するための方法であって、以下：
（ａ）前記患者から取得された無細胞血液試料から核酸を単離するステップ、
（ｂ）前記単離された核酸において、表１に列挙するバイオマーカーの各々の少なくとも一部の配列を決定するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）において決定された配列を基準配列と比較し、かつ突然変異を同定するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）において配列決定した核酸の塩基数に対するステップ（ｃ）において同定された突然変異数の比として突然変異量を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記患者が、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病またはリンパ腫のうちの１つと診断された、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非同義的突然変異のみが、ステップ（ｄ）において前記比を決定する上で使用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
癌ドライバー遺伝子における突然変異が、ステップ（ｄ）において前記比を決定する上で除外される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
以下：
（ａ）前記患者から取得された無細胞血液試料から核酸を単離するステップ、
（ｂ）前記単離された核酸において、表１に列挙するバイオマーカーの各々の少なくとも一部の配列を決定するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）において決定された配列を基準配列と比較し、かつ突然変異を同定するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）において配列決定した核酸の塩基数に対するステップ（ｃ）において同定された突然変異数の比として突然変異量を決定するステップ、
（ｅ）前記突然変異量が多い場合、免疫療法薬を投与し、前記突然変異量が少ない場合、前記免疫療法薬を投与しないステップ、
を含む、癌患者の処置の方法。
【請求項６】
非同義的突然変異のみが、ステップ（ｄ）において前記比を決定する上で使用される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
癌ドライバー遺伝子における突然変異が、ステップ（ｄ）において前記比を決定する上で除外される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫療法薬が、免疫調節抗体である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４抗体から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗ＰＤ−１抗体が、４８０ｍｇで４週間ごとに、または２４０ｍｇで２週間ごとに投与されるニボルマブである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗ＣＴＬＡ４抗体が、１０ｍｇ／ｋｇで３週間ごとに投与されるイピリムマブである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
以下：
（ａ）前記患者から取得された無細胞血液試料から核酸を単離するステップ、
（ｂ）前記単離された核酸において、表１に列挙するバイオマーカーの各々の少なくとも一部の配列を決定するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）において決定された配列を基準配列と比較し、かつ突然変異を同定するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）において配列決定した核酸の塩基数に対するステップ（ｃ）において同定された突然変異数の比として突然変異量を決定するステップ、
（ｅ）前記突然変異量が多い場合、追加の療法を投与し、前記突然変異量が少ない場合、前記追加の療法を投与しないステップ、
を含む、癌患者の処置の方法。
【請求項１３】
以下：
（ａ）前記患者から取得された無細胞血液試料から核酸を単離するステップ、
（ｂ）前記単離された核酸において、表１に列挙するバイオマーカーの各々の少なくとも一部の配列を決定するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）において決定された配列を基準配列と比較し、かつ突然変異を同定するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）において配列決定した核酸の塩基数に対するステップ（ｃ）において同定された突然変異数の比として突然変異量を決定するステップ、
（ｅ）前記突然変異量が多い場合、予後を不良と判定し、前記突然変異量が少ない場合、予後を良好と判定するステップ、
を含む、癌患者のための予後を判定する方法。
【請求項１４】
患者における突然変異量を判定するためのシステムであって、
癌患者由来の試料における突然変異量を検出するためのアルゴリズムを実施するよう設計されたコンピュータを備えており、
前記アルゴリズムは、
表１由来のバイオマーカーに関する配列決定データを解析し、かつ
突然変異検出のステップと、
エラー修正のステップと、
配列決定された核酸の塩基数に対する同定された突然変異数の比として突然変異量を決定するステップと、
前記試料における突然変異量が、同じ種類の癌由来の試料の低三分位数を上回るかまたは下回るかを判定するステップと、
を含有する、システム。
【請求項１５】
患者が免疫療法投与計画から利益を得ることになるかどうかを判定するためのシステムであって、
前記癌患者由来の試料における突然変異量を検出するためのアルゴリズムを実施するよう設計されたコンピュータを備えており、
前記アルゴリズムは、
表１由来のバイオマーカーに関する配列決定データを解析し、かつ
突然変異検出のステップと、
エラー修正のステップと、
配列決定された核酸の塩基数に対する同定された突然変異数の比として突然変異量を決定するステップと、
前記試料が、同じ種類の癌由来の試料の低三分位数を下回る場合、前記突然変異量は少なく、または前記試料が、同じ種類の癌由来の試料の低三分位数以上である場合、前記突然変異量は多いと判定するステップと、
前記突然変異量が多い場合、前記患者が免疫療法投与計画から利益を得ることになり、または前記突然変異量が少ない場合、前記患者が免疫療法投与計画から利益を得ないことになることを報告するステップと、
を含有する、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍学の分野に関する。より具体的には、本発明は、癌患者の核酸に基づく検査の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍細胞は、腫瘍の発達および増悪の間に体細胞突然変異を蓄積することが公知である。腫瘍突然変異量（ＴＭＢ）は、患者由来の腫瘍試料におけるいくつかの突然変異として定義される。ＴＭＢとは、一連の固形転移性悪性腫瘍のための化学療法および癌免疫療法のための確立されたバイオマーカーである。ＴＭＢはしばしば、全エキソーム配列決定（ＷＥＳ）によって、または多重メガベースのパネルの配列決定によって測定される。これらの確立された方法は、単に経費がかさむだけでなく、組織検体も必要とする。後期癌患者のうちの一部にとって、組織生検は入手しにくい。療法を最適に誘導するために、患者の突然変異状態およびＴＭＢを評価するための信頼できかつ実用的な方法についての必要性がある。
【発明の概要】
【０００３】
いくつかの実施形態において、本発明は、患者における突然変異量を判定するための方法であって、該患者から取得された無細胞血液試料から核酸を単離するステップと、該単離された核酸において、表１に列挙するバイオマーカーの各々の少なくとも一部の配列を決定するステップと、該配列を基準配列と比較し、かつ突然変異を同定するステップと、突然変異量を、配列決定された核酸の塩基数に対する突然変異数の比として決定するステップとを含む、方法である。該患者は、癌腫、リンパ腫、肉腫、骨髄腫、白血病またはリンパ腫のうちの１つと診断された癌患者とすることができる。いくつかの実施形態において、非同義的な突然変異のみが、突然変異量を決定する上で使用される。いくつかの実施形態において、癌ドライバー遺伝子における突然変異は、該突然変異量を決定する上で除外される。
【０００４】
いくつかの実施形態において、本発明は、癌患者の処置の方法であって、該患者から取得された無細胞血液試料から核酸を単離するステップと、該単離された核酸において、表１に列挙するバイオマーカーの各々の少なくとも一部の配列を決定するステップと、該配列を基準配列と比較し、かつ突然変異を同定するステップと、突然変異量を、配列決定された核酸の塩基数に対する突然変異数の比として決定するステップと、該突然変異量が多い場合、免疫療法薬を投与し、該突然変異量が少ない場合、該免疫療法薬を投与しないステップとを含む、方法である。いくつかの実施形態において、該突然変異量は、同じ種類の癌に罹患している患者の突然変異量の低三分位数以下である場合、低く、同じ種類の癌に罹患している患者の突然変異量の低三分位数を超える場合、高い。いくつかの実施形態において、非同義的な突然変異のみが、突然変異量を決定する上で使用される。いくつかの実施形態において、癌ドライバー遺伝子における突然変異は、該突然変異量を決定する上で除外される。
【０００５】
いくつかの実施形態において、該免疫療法薬は、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４抗体から選択される免疫調節抗体である。いくつかの実施形態において、該抗ＰＤ−１抗体は、４８０ｍｇで４週間ごとに、または２４０ｍｇで２週間ごとに投与されるニボルマブである。いくつかの実施形態において、該ＣＴＬＡ−４抗体は、１０ｍｇ／ｋｇで３週間ごとに投与されるイピリムマブである。
【０００６】
いくつかの実施形態において、本発明は、癌患者の処置の方法であって、該患者から取得された無細胞血液試料から核酸を単離するステップと、該単離された核酸において、表１に列挙するバイオマーカーの各々の少なくとも一部の配列を決定するステップと、該配列を基準配列と比較し、かつ突然変異を同定するステップと、突然変異量を、配列決定された核酸の塩基数に対する突然変異数の比として決定するステップと、該突然変異量が多い場合、追加の療法を投与し、該突然変異量が少ない場合、該追加の療法を投与しないステップとを含む、方法である。いくつかの実施形態において、追加の療法は、新生アジュバント設定またはアジュバント設定において投与される化学療法、化学放射線療法または標的療法のうちの１つ以上である。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本発明は、癌患者のための予後を判定する方法であって、該患者から取得された無細胞血液試料から核酸を単離するステップと、該単離された核酸において、表１に列挙するバイオマーカーの各々の少なくとも一部の配列を決定するステップと、該配列を基準配列と比較し、かつ突然変異を同定するステップと、突然変異量を、配列決定された核酸の塩基数に対する突然変異数の比として決定するステップと、該突然変異量が多い場合、予後を不良として判定し、該突然変異量が少ない場合、予後を良好として判定するステップとを含む、方法である。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本発明は、患者における突然変異量を判定するためのシステムであって、癌患者由来の試料における突然変異量を検出するためのアルゴリズムを実施するよう設計されたコンピュータを備えており、該アルゴリズムは、表１由来のバイオマーカーに関する配列決定データを解析し、かつ突然変異検出のステップと、エラー修正のステップと、配列決定された核酸の塩基数に対する同定された突然変異数の比として突然変異量を決定するステップと、該試料における突然変異量が、同じ種類の癌由来の試料の低三分位数を上回るかまたは下回るかを判定するステップとを含有する、システムである。いくつかの実施形態において、本発明は、患者が免疫療法投与計画から利益を得ることになるかどうかを判定するためのシステムであって、該癌患者由来の試料における突然変異量を検出するためのアルゴリズムを実施するよう設計されたコンピュータを備えており、該アルゴリズムは、表１由来のバイオマーカーに関する配列決定データを解析し、かつ突然変異検出のステップと、エラー修正のステップと、配列決定された核酸の塩基数に対する同定された突然変異数の比として突然変異量を決定するステップと、該試料が、同じ種類の癌由来の試料の低三分位数を下回る場合、該突然変異量は少なく、または該試料が、同じ種類の癌由来の試料の低三分位数以上である場合、該突然変異量は多いと判定するステップと、該突然変異量が多い場合、該患者が免疫療法投与計画から利益を得ることになり、または該突然変異量が少ない場合、該患者が免疫療法投与計画から利益を得ないことになることを報告するステップとを含有する、システムである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】1遺伝子パネルに基づく突然変異計数と肺癌試料に由来する全エキソームに基づく突然変異計数との相関を示すグラフである。
【図２】遺伝子パネルに基づく突然変異量によって分類される患者の無増悪生存期間（ＰＦＳ）および全生存期間（ＯＳ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
定義
次の定義は、本開示を制限しているものではなく、本開示を理解する上で単に支援するものである。
【００１１】
「ＰＦＳ」という用語は、本明細書では、患者についての無増悪生存期間（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｆｒｅｅ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ）の時間を説明するために使用される。
【００１２】
「ＯＳ」という用語は、本明細書では、患者についての全生存期間（Ｏｖｅｒａｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ）の時間を説明するために使用される。
【００１３】
「循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）」という用語は、腫瘍を源にするヒト血液の血漿または血清において認められる無細胞ＤＮＡの一部を説明するために使用される。循環腫瘍ＤＮＡは、腫瘍の突然変異特徴によって非腫瘍ＤＮＡとは区別される。本発明の脈絡において、ｃＤＮＡを検出することは、突然変異した無細胞ＤＮＡを検出することを意味する。
【００１４】
「癌ドライバー遺伝子」という用語は、本明細書では、突然変異および結果として生じる異常な活性が正味の細胞成長を上昇させるものを説明するために使用される。癌ドライバー遺伝子のいくつかの例としては、ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＡＬＫが挙げられる。
【００１５】
「バイオマーカー」という用語は、本明細書では、生物学的現象または臨床上の現象と関連した情報を含有するヌクレオチド配列を説明するために使用される。例えば、該情報は、配列の突然変異状態であってよい。該バイオマーカーは、遺伝子（コード配列、調節配列、イントロンまたはスプライス部位を含む）または遺伝子間領域であり得る。該臨床上の現象は、悪性細胞、例えば、患者の試料における腫瘍細胞の存在であり得る。
【００１６】
「ＷＧＳの全ゲノム配列決定」という用語は、細胞または１つもしくは複数の細胞が由来する生物の全ゲノムの配列決定を説明するために使用される。「ＷＥＳの全エキソーム配列決定」という用語は、ゲノムの遺伝子全部において存在するエキソン全部の配列決定を説明するために使用される。ヒトまたは他の比較的高次の脊椎動物のゲノムに関するＷＧＳおよびＷＥＳはいずれも、多量の配列情報を収集しおよび保存することができる超並列配列決定法（次世代配列決定法）を用いて実行される。
【００１７】
本発明は、代替的なアプローチを、現に確立されているＴＭＢ測定に提供することが意図されている。腫瘍がＤＮＡを循環内へと漏逸したと考慮すると、本発明者らは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における突然変異計数が組織に基づくＴＭＢ測定に対する代替物として機能することができるという仮説を立てた。しかしながら、ｃｔＤＮＡにおける突然変異を検出することは、組織に基づく配列決定よりも非常に大きな深度の配列決定を必要とし、このことは、本発明者らが、固形腫瘍において通常突然変異した遺伝子を豊富にする、より小さな標的配列決定パネルを使用することを必要とする。この目的のために、本発明者らは、ベースライン血漿試料に関して、１９８キロベースの標的次世代配列決定パネルであるＡＶＥＮＩＯ  ｃｔＤＮＡ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  Ｋｉｔを用いて、突然変異計数を評価した。本発明者らは、この小さなパネルが、多重メガベースの配列決定またはＷＥＳについての代理として機能することができるという仮説を立てた。
【００１８】
本発明者らは、ＡＶＥＮＩＯ  ｃｔＤＮＡ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  Ｐａｎｅｌが腫瘍組織に基づくＴＭＢ測定のための代理として機能することができることを実証するために、２つの独立したアプローチを採用した。第１に、本発明者らは、公表されている全エキソーム配列（ＷＥＳ）データセットのインシリコの解析を行い、ＡＶＥＮＩＯ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅパネルを用いて、総突然変異計数と突然変異のインシリコの捕獲に由来する突然変異計数とを比較した。実施例１において詳細に説明するように、相関を取得した（図１）。第２に、患者由来試料のセットを、ＡＶＥＮＩＯ  ｃｔＤＮＡ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  Ｐａｎｅｌを用いて分析した。患者を突然変異量によって群分けした（実施例２）。次に、多量突然変異群および少量突然変異群の無増悪生存期間（ＰＦＳ）および全生存期間（ＯＳ）を比較した。該群間における明確な区別が観察された。（図２）。
【００１９】
まとめると、本結果は、本発明の有用性を実証する。本発明は、無細胞腫瘍ＤＮＡに適用される限定された遺伝子パネルを用いて、患者における総突然変異量（ＴＭＢ）を評価する新規のアプローチを含む。本結果は、メガベースの１／５の大きさのパネルの分析が、患者の全エキソームを配列決定することによって従来評価されたＴＭＢについての代理であることを実証する。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本発明は、患者由来の血液試料を利用する。該患者は、癌患者または癌の疑いのある患者であってよく、該癌は、癌腫（膀胱癌、肺癌、腎癌または黒色腫を含む）、肉腫、骨髄腫、白血病またはリンパ腫から選択される。
【００２１】
該試料は、血液の何らかの画分、例えば、血清または血漿を含むことができ、該画分は、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡまたはｃｔＤＮＡ）を含む無細胞ＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、１つ以上の試料は、処置中、例えば、術前および術後または化学療法投与計画、化学放射線療法投与計画もしくはアジュバント療法の投与計画の前、後および間の種々の時刻に連続して採取される。血液試料は、保存培地中に血液または血液の血漿を収集することを含む、無細胞ＤＮＡを中に保存する適切な手段によって収集することができる。
【００２２】
本発明は、遺伝子パネルまたは突然変異パネルまたは体細胞変異形パネルを含む、バイオマーカーパネルを利用する。突然変異は、遺伝子のコード領域において生じる場合、オンセンスミスセンス突然変異およびフレームシフト突然変異に対応する単一ヌクレオチドの変化（ＳＮＶ）、欠失および挿入（挿入−欠失）を含むことができる。他の種類の突然変異は、遺伝子の融合および転座を含む。このようなパネルの選択、大きさおよび含有量は、例えば、米国特許出願番号第１４／７７４，５１８号および「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ」という表題の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４９８３８号において説明されてきた。いくつかの実施形態において、本発明は、パネルにおけるバイオマーカー、例えば、表１に列挙する遺伝子の配列を決定することを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子の全配列が決定される。他の実施形態において、遺伝子の全コード配列が決定される。他の実施形態において、癌において突然変異誘発を受けることが公知の遺伝子の一部の配列のみが決定される。さらに他の実施形態において、バイオマーカーは、コード配列と会合していないが、調節配列またはヒト腫瘍において突然変異することが公知の未知の機能の配列と会合している。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本発明は、バイオマーカーパネルを利用し、該パネルには、患者が循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を有しているかどうかを同定するために、術後の患者の血液を分析することができるＡＶＥＮＩＯ（登録商標）ｃｔＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，カリフォルニア州プレザントン市）などがある。いくつかの実施形態において、標的療法（１７種類の遺伝子）についてＮＣＣＮガイドラインの推奨するバイオマーカーを表すパネルが使用される。他の実施形態において、療法耐性マーカー（合計６０種類の遺伝子）をさらに含む、より広範なパネルが使用される。さらに別の例において、癌のホットスポット突然変異（合計１８０種類の遺伝子）を含む、より広範なパネルが使用される（特許出願「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ」、上述を参照されたい）。ＡＶＥＮＩＯ（登録商標）ｃｔＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｋｉｔにおけるバイオマーカーパネルの組成を表１に示す。
【表１−１】
2021521875.tif 000002
【表１−２】
2021521875.tif 000003
【００２４】
いくつかの実施形態において、本発明はさらに、臨床試料から取得された結果に基づいて、バイオマーカーパネルを改善するステップを含む。いくつかの実施形態において、本発明は、統計的に有意な数の患者由来の無細胞ＤＮＡにおけるバイオマーカーの存在と、Ａ）ＲＦＳ、Ｂ）ＴＴＲ（またはＤＦＳ）、およびＣ）ＯＳとの間の相関を解析するステップを含む。予測相関を示すバイオマーカーは、該パネルに含まれることになっている。統計的に有意な予測相関を示さないバイオマーカーは、該パネルから除外されることになっている。
【００２５】
本発明の脈絡において、バイオマーカーの配列は、当技術分野で公知の何らかの適切な方法を介して決定することができる。該適切な方法は、十分な正確性、例えば、稀有な配列を低いエラー率で検出する感度および特異度を有するであろう。いくつかの実施形態において、該配列決定方法は、例えば、特許出願「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ」，上述を参照する上で説明されるような、分子バーコード、エラーの定型化およびエラー抑制に関する他の化学的方法または計算方法など、エラー修正ステップを含む。該配列決定方法は、アレイに基づく配列決定法（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カリフォルニア州サンディエゴ市）、エマルションに基づく配列決定法（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム市）光学測定に基づく配列決定法（Ｐａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州メンローパーク市）またはナノポアに基づく配列決定法（Ｒｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、カリフォルニア州サンタクララ市）、もしくはＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ（英国オックスフォード区）を含む超並列配列決定法を含むことができる。
【００２６】
該配列データは、突然変異を判定するために基準ゲノム配列と比較される。いくつかの実施形態において、該基準配列は、正準ヒトゲノムアセンブリ、例えば，ＨＧ３８である。該基準ゲノムと比較した核酸配列における変化は、突然変異スコアを決定するために加算される。最終的な突然変異スコア（突然変異量）は、突然変異数を、配列決定した塩基対の数によって除算することによって決定される。いくつかの実施形態において、１つ以上のフィルタを適用して、すなわち、突然変異スコアへ加算されるために、点数化されることになる突然変異を選択する。いくつかの実施形態において、コード領域における突然変異のみが点数化される。いくつかの実施形態において、コード領域における非同義的突然変異のみが点数化される。他の実施形態において、コード領域における非同義的突然変異および同義的突然変異のいずれもが点数化される。さらに他の実施形態において、より低い頻度の突然変異事象の検出を可能にするために、癌ドライバー遺伝子における突然変異が点数化から除外される。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本発明により決定される突然変異量は、多または少として評価される。いくつかの実施形態において、該突然変異量は、集団レベルで評価され、関連する集団は、同じ種類の癌と診断された癌患者からなる。いくつかの実施形態において、該突然変異量が該集団における分位数未満に収まる場合、少と定義され、該突然変異量が該集団における分位数以上に収まる場合、多と定義される。該分位数は、四分位数、三分位数または中央値であってよい。いくつかの実施形態において、該分位数は三分位数であり、該突然変異量は、該集団における第１の三分位数未満に収まる場合、少と定義され、該突然変異量は、該集団における第１の三分位数以上に収まる場合、多と定義される。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本発明はまた、患者における癌の状態を評価するステップも含む。いくつかの実施形態において、該評価することは、該癌の再発を経験しそうなまたは経験しそうにない患者を特定することを含む。他の実施形態において、該評価することは、無増悪生存期間（ＰＦＳ）および全生存期間（ＯＳ）の予測される持続時間として表される患者の予後を決定することを含む。該評価することは、本明細書に説明するように決定される突然変異量に基づく。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本発明は、患者についての臨床的に関連する予測を決定するための統計分析のステップを含む。いくつかの実施形態において、該予測は、無再発生存期間（ＲＦＳ）、再発までの合計時間（ＴＴＲ）および全生存期間（ＯＳ）から選択される。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本発明はまた、患者における癌に対して療法を推奨するまたは投与するステップも含む。いくつかの実施形態において、本発明は、該患者が療法に対して応答しそうかどうかを判定するステップを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、該療法は、化学療法、化学放射線療法または免疫療法である。
【００３２】
いくつかの実施形態において、該療法は、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、およびＬＡＧ−３）を用いた免疫チェックポイント調節療法を含む免疫療法である。癌細胞における突然変異のおよびそれゆえ潜在的な新生エピトープの全体的な数および割合は、免疫療法に対する、特に免疫チェックポイント調節薬療法に対する臨床応答を予測することができることは既に報告されている。（ＷＯ２０１６０８１９４７）。本発明による突然変異概算値によって、療法に対する、特に免疫チェックポイント調節薬療法などの免疫療法に対する腫瘍応答性を評価することができる。いくつかの実施形態において、このような療法は、抗ＰＤ−１抗体を含む組成物を用いたプログラム細胞死１（ＰＤ−１）の遮断を包含する。いくつかの特定の実施形態において、このような療法は、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８）、またはペンブロリズマブ（ＭＫ−３４７５）のうちの１つ以上の投与を包含する。いくつかの実施形態において、該療法は、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）またはデュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）を含む、ＰＤ−１リガンドＰＤ−Ｌ１に対する抗体の投与を包含する。いくつかの実施形態において、該療法は、イピリミマブおよびトレメリムマブを含む、ＣＴＬＡ−４に対する抗体の投与を包含する。小細胞もしくは非小細胞肺癌、膀胱癌、腎癌、頭頚部癌、および黒色腫を含むある特定の癌について、突然変異が多数である患者は、突然変異量がより少数である患者よりも免疫チェックポイント調節薬による処置から利益をより受けそうである。いくつかの実施形態において、体細胞突然変異がより多数である患者は、全体的な突然変異が有意により少数である患者よりも、ＰＤ−１遮断（例えば、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体による）に対してより良好に応答する。（ＷＯ２０１６０８１９４７を参照されたい）。
【００３３】
本明細書に開示する方法によって検出されるものなどの体細胞突然変異は、癌細胞を含む体細胞におけるＤＮＡの変化を含む。これらの突然変異は、腫瘍細胞によって血流内へと放出されたＤＡＮ（循環腫瘍ＤＮＡまたはｃｔＤＮＡ）において検出される。タンパク質コード領域における体細胞突然変異は結果的に、免疫系によって認識される新たなエピトープ（新生抗原）を生じることができる。ＰＤ−１による（例えば、先に列挙したＰＤ−１遮断薬またはＰＤ−Ｌ１遮断薬による）阻害の上昇の際、新生抗原を含む腫瘍は、患者の免疫系による攻撃を受けやすい。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本発明は、免疫チェックポイント調節薬による処置および免疫チェックポイント調節薬により患者を処置することに対して好ましく応答するようである癌患者を特定するための方法を提供する。本発明はまた、免疫チェックポイント調節薬による処置に対して好ましく応答しないようである癌患者を特定するための、および免疫チェックポイント調節薬を用いて処置されない患者に該方法を推奨するための方法も提供する。具体的には、本発明は、癌患者の処置の方法であって、該患者から取得された無細胞血液試料から核酸を単離するステップと、該単離された核酸において、表１に列挙するバイオマーカーの各々の少なくとも一部の配列を決定するステップと、該配列を基準配列と比較し、かつ突然変異を同定するステップと、突然変異量を、配列決定された核酸の塩基数に対する突然変異数の比として決定するステップと、該突然変異量が多い場合、免疫療法薬を投与し、該突然変異量が少ない場合、該免疫療法薬を投与しないステップとを含む、方法である。いくつかの実施形態において、該免疫療法は、４８０ｍｇで４週間ごとに、または２４０ｍｇで２週間ごとに投与されるニボルマブなどの抗ＰＤ−１抗体である。他の実施形態において、該免疫療法薬は、１０ｍｇ／ｋｇで３週間ごとに投与されるイピリムマブなどの抗ＣＴＬＡ４抗体である。
【００３５】
本発明の一態様は、患者における突然変異量を検出するためのシステムを含む。該システムは、プロセッサと該プロセッサへ連結された非一時的計算機可読媒体とを備えており、該媒体は、表１由来のバイオマーカーに関する配列決定データを解析するステップと、配列比較および突然変異検出、エラー修正を実行するステップと、同定された突然変異の数と配列決定された核酸の塩基数との比として突然変異量を決定するステップと、試料中の突然変異量が事前に決めておいた閾値、例えば、集団に基づく閾値を上回って収まるかまたは下回って収まるかを決定するステップとを含む方法を実行するために、該プロセッサによって実行可能なコードを含む。いくつかの実施形態において、該突然変異量が該閾値以上である場合、該システムは、該患者を、多量の突然変異量を有するとして分類し、場合により、多量の突然変異量についての予後または療法推奨を出力する。同時に、該突然変異量が該閾値未満である場合、該システムは、該患者を、少量の突然変異量を有するとして分類し、場合により、少量の突然変異量についての予後または療法推奨を出力する。
【００３６】
いくつかの実施形態において、１つ以上の記憶装置を備えることができる該計算機可読媒体は、該患者における突然変異量に応じて利用可能な療法の一覧表を含むデータベースを含む。該計算機可読媒体はさらに、適切な療法を一覧表作成する報告を生じるための命令を有するプログラムコードを含む。
【００３７】
該システムは、種々の機能的態様、すなわち、デジタルデータを処理するためのプロセッサと、デジタルデータを保存するために該プロセッサへ連結されたメモリと、デジタルデータを入力するために該プロセッサへ連結された入力ディジタイザと、該メモリ内に保存されかつ該プロセッサによってアクセス可能なプログラムコードと、デジタルデータから得られた情報を表示するために該プロセッサおよびメモリへ連結された表示装置と、データネットワーク化と、１つ以上の情報データベースとを備えたこのようなサーバーを備えることができる。該データベースは、患者データ、患者試料データ、先行処置データを含む臨床データ、療法と治療薬とのリスト、患者追跡データなどを含むことができる。
【実施例】
【００３８】
実施例１．インシリコでのＴＭＢを評価するための全エキソーム配列決定および選択された遺伝子パネルの比較
本実施例において、次世代配列決定に基づくＡＶＥＮＩＯ（登録商標）ｃｔＤＮＡ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，カリフォルニア州プレザントン市）からの遺伝子パネルを使用して、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）からの肺癌試料についての全エキソーム配列決定（ＷＥＳ）データセットを解析した。該インシリコ解析は、ＡＶＥＮＩＯ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅパネルを用いて、ＷＥＳ由来の総突然変異量（ＴＭＢ）とインシリコでの捕獲に由来する突然変異計数とを比較した（表１）。ＴＭＢを、公知のドライバー突然変異、腫瘍抑制遺伝子における再発性突然変異ならびにｄｂＳＮＰおよびＥｘＡＣ内での存在から評価されるような生殖細胞系突然変異をフィルタにかけた後のメガベースあたりのコードＳＮＶ数、挿入および欠失として定義した。該インシリコでの結果は、ＡＶＥＮＩＯ  ｃｔＤＮＡ監視パネルが、図１に示すように、ＷＥＳによって測定されたＴＭＢについての代理として実際に機能することができることを確証した。
【００３９】
実施例２．患者試料における突然変異量の予測値の評価
本実施例において、ＡＶＥＮＩＯ（登録商標）ｃｔＤＮＡ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  Ｋｉｔパネルを用いて、患者試料における突然変異を評価した。前処理血漿試料を、第１の選択の化学療法または化学放射線療法で処置した４３名の後期肺腺癌患者を最初に評価した前向き観察研究から取得した。患者由来の無細胞ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を単離し、ＡＶＥＮＩＯ（登録商標）ｃｔＤＮＡ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  Ｋｉｔの製造元の説明書によって分析した。同義的かつ一般的なドライバー突然変異を、検出された体細胞突然変異からフィルタにかけた後、メガベースあたりの突然変異計数を計算した。フィルタにかけた体細胞突然変異計数が対象の癌の種類の低三分位数を上回る場合、該対象を多量の突然変異計数として分類した。「多量」突然変異群および「少量」突然変異群の患者の無増悪生存期間（ＰＦＳ）および全生存期間（ＯＳ）を評価した（図２）。ＡＶＥＮＩＯ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅパネルを用いて評価したＴＭＢは、癌患者におけるＰＦＳおよびＯＳの予測因子である。
【図１】
2021521875.tif 000004
【図２】
2021521875.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】令和3年2月4日(2021.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における突然変異量を判定するための方法であって、以下：
（ａ）前記患者から取得された無細胞血液試料から核酸を単離するステップ、
（ｂ）前記単離された核酸において、表１に列挙するバイオマーカーの各々の少なくとも一部の配列を決定するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）において決定された配列を基準配列と比較し、かつ突然変異を同定するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）において配列決定した核酸の塩基数に対するステップ（ｃ）において同定された突然変異数の比として突然変異量を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記患者が、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病またはリンパ腫のうちの１つと診断された、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非同義的突然変異のみが、ステップ（ｄ）において前記比を決定する上で使用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
癌ドライバー遺伝子における突然変異が、ステップ（ｄ）において前記比を決定する上で除外される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
癌患者の処置のための指標を提供する方法であって、
（ａ）前記患者から取得された無細胞血液試料から核酸を単離するステップ、
（ｂ）前記単離された核酸において、表１に列挙するバイオマーカーの各々の少なくとも一部の配列を決定するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）において決定された配列を基準配列と比較し、かつ突然変異を同定するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）において配列決定した核酸の塩基数に対するステップ（ｃ）において同定された突然変異数の比として突然変異量を決定するステップ、
（ｅ）前記突然変異量が多い場合、免疫療法薬を投与し、前記突然変異量が少ない場合、前記免疫療法薬を投与しないという指標を提供するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項６】
非同義的突然変異のみが、ステップ（ｄ）において前記比を決定する上で使用される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
癌ドライバー遺伝子における突然変異が、ステップ（ｄ）において前記比を決定する上で除外される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫療法薬が、免疫調節抗体である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４抗体から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗ＰＤ−１抗体が、４８０ｍｇで４週間ごとに、または２４０ｍｇで２週間ごとに投与されるニボルマブである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗ＣＴＬＡ４抗体が、１０ｍｇ／ｋｇで３週間ごとに投与されるイピリムマブである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
癌患者の処置のための指標を提供する方法であって、
（ａ）前記患者から取得された無細胞血液試料から核酸を単離するステップ、
（ｂ）前記単離された核酸において、表１に列挙するバイオマーカーの各々の少なくとも一部の配列を決定するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）において決定された配列を基準配列と比較し、かつ突然変異を同定するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）において配列決定した核酸の塩基数に対するステップ（ｃ）において同定された突然変異数の比として突然変異量を決定するステップ、
（ｅ）前記突然変異量が多い場合、追加の療法を投与し、前記突然変異量が少ない場合、前記追加の療法を投与しないという指標を提供するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項１３】
癌患者のための予後を判定するための指標を提供する方法であって、
（ａ）前記患者から取得された無細胞血液試料から核酸を単離するステップ、
（ｂ）前記単離された核酸において、表１に列挙するバイオマーカーの各々の少なくとも一部の配列を決定するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）において決定された配列を基準配列と比較し、かつ突然変異を同定するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）において配列決定した核酸の塩基数に対するステップ（ｃ）において同定された突然変異数の比として突然変異量を決定するステップ、
（ｅ）前記突然変異量が多い場合、予後を不良と判定し、前記突然変異量が少ない場合、予後を良好と判定するための指標を提供するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項１４】
患者における突然変異量を判定するためのシステムであって、
癌患者由来の試料における突然変異量を検出するためのアルゴリズムを実施するよう設計されたコンピュータを備えており、
前記アルゴリズムは、
表１由来のバイオマーカーに関する配列決定データを解析し、かつ
突然変異検出のステップと、
エラー修正のステップと、
配列決定された核酸の塩基数に対する同定された突然変異数の比として突然変異量を決定するステップと、
前記試料における突然変異量が、同じ種類の癌由来の試料の低三分位数を上回るかまたは下回るかを判定するステップと、
を含有する、システム。
【請求項１５】
患者が免疫療法投与計画から利益を得ることになるかどうかを判定するためのシステムであって、
前記癌患者由来の試料における突然変異量を検出するためのアルゴリズムを実施するよう設計されたコンピュータを備えており、
前記アルゴリズムは、
表１由来のバイオマーカーに関する配列決定データを解析し、かつ
突然変異検出のステップと、
エラー修正のステップと、
配列決定された核酸の塩基数に対する同定された突然変異数の比として突然変異量を決定するステップと、
前記試料が、同じ種類の癌由来の試料の低三分位数を下回る場合、前記突然変異量は少なく、または前記試料が、同じ種類の癌由来の試料の低三分位数以上である場合、前記突然変異量は多いと判定するステップと、
前記突然変異量が多い場合、前記患者が免疫療法投与計画から利益を得ることになり、または前記突然変異量が少ない場合、前記患者が免疫療法投与計画から利益を得ないことになることを報告するステップと、
を含有する、システム。
【国際調査報告】
2021521875.tif 000006
2021521875.tif 000007
2021521875.tif 000008
2021521875.tif 000009