(57)【要約】  本開示は、アトラノール及び／又はその誘導体を水溶性化合物に転換する方法に関する。特に、本開示は、アトラノール及び／又はその誘導体を転換する方法に関するものであり、前述の方法はアトラノール及び／又はその誘導体を含む組成物をペルオキシダーゼファミリーに属する酵素及び過酸化物と混合する工程を含む。本開示は、１００ｐｐｍ未満のアトラノール及び／又はその誘導体を有するオークモス抽出物を生産する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アトラノール及び／又はその誘導体を含む組成物をペルオキシダーゼファミリーに属する酵素及び過酸化物と混合する工程を含む、アトラノール及び／又はその誘導体を水溶性化合物に転換する方法。
【請求項２】
前記アトラノール及び／又はその誘導体を含む組成物はモス抽出物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アトラノール及び／又はその誘導体を含む組成物はオークモスコンクリートである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記アトラノール及び／又はその誘導体を含む組成物はオークモスアブソリュートである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素はホースラディッシュペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase、ＨＲＰ）である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記過酸化物はＨ２Ｏ２である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記過酸化物の量が、アトラノール及び／又はその誘導体に対して少なくとも０．５モル当量、好ましくは少なくとも１モル当量、より好ましくは少なくとも２モル当量である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ペルオキシダーゼファミリーに属する酵素の量が、アトラノール及び／又はその誘導体の質量に対して少なくとも０．１質量％、好ましくは少なくとも０．５質量％、より好ましくは少なくとも１質量％である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記混合する工程を少なくとも０．５時間、好ましくは少なくとも１時間、より好ましくは少なくとも２時間続ける、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
緩衝水性溶液中で実行される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
８から１０の間に含まれるｐＨで実行される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
アトラノールは式（Ｉ）の水溶性二量体に転換される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【化６】
2021515578.tif 000012
【請求項１３】
ａ）アトラノール及び／又はその誘導体を含むオークモス抽出物をペルオキシダーゼファミリーに属する酵素及び過酸化物と混合する工程と、
ｂ）混合物を培養して、アトラノール及び／又はその誘導体を水溶性化合物に転換する工程と、
ｃ）液液抽出を用いて水溶性化合物を取り除く工程と、
を含む、１００ｐｐｍ未満のアトラノール及び／又はその誘導体を有するオークモス抽出物を生産する方法。
【請求項１４】
モス抽出物からアトラノール及び／又はその誘導体の含有量を減少させるための、ペルオキシダーゼファミリーに属する酵素、好ましくはＨＲＰと、過酸化物、好ましくはＨ２Ｏ２との使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、アトラノール及び／又はその誘導体を水溶性化合物に転換する方法に関する。特に、本開示は、アトラノール及び／又はその誘導体を転換する方法に関するものであり、前述の方法はアトラノール及び／又はその誘導体を含む組成物をペルオキシダーゼファミリーに属する酵素及び過酸化物と混合する工程を含む。
【背景技術】
【０００２】
抽出技術によって得られる複雑天然物は、比較的広範囲の化学族からの多数の個別化合物の混合物である。それらは数千年の間使用されているが、それらは望ましくない有害分子を含むことがある。複雑天然物が香料及び化粧品中で材料として使用される時に、最初にこれらの分子にさらされる器官は、明らかに皮膚である。結果として、発疹、掻痒、できもの（blotches）、及び重症湿疹などのいくつかの症状は、一つ又は複数の望ましくない有害分子の存在に起因すると考えられている。特に香料の天然材料の高級リストに属するオークモス抽出物の場合、アトラノール及びクロロアトラノールの存在が深刻な皮膚炎の原因となることが示されている。結果として、国際香粧品香料協会（ＩＦＲＡ）は、香料中で使用されるオークモス抽出物中のアトラノール及びクロロアトラノールの存在をそれぞれ１００ｐｐｍに制限することを推奨する。
【０００３】
オークモス抽出物中のアトラノール及びクロロアトラノールの含有量を減少させるためにいくつかの方法が提案されている。
欧州特許第０４６８１８９Ａ２号は、低刺激性モス抽出物の生産方法を開示している。モス抽出物、モスコンクリート又はモスアブソリュートは、ロイシン又はリシンなどのアミノ酸で処理される。その結果、アトラノール及びクロロアトラノールを含む種々のアレルギー性成分の含有量は減少される。
【０００４】
国際公開第９３／２３５０９号は、低刺激性のモス抽出物を生産するためのアルデヒド還元剤の使用を開示している。したがって、アトラノール及びクロロアトラノールを含むアルデヒドの含有量は変性モス抽出物中で減少される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】欧州特許第０４６８１８９Ａ２号
【特許文献２】国際公開第９３／２３５０９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、これらの方法は選択性の欠如又は廃棄物の発生などの様々な欠点に悩まされており、変性抽出物の嗅覚的品質の変化又は追加の処理工程をもたらす。
【０００７】
したがって、非変性抽出物と同じ嗅覚性品質を有し、アトラノール及びクロロアトラノールの含有量が減少された変性オークモス抽出物のクリーン（clean）な生産方法に対する必要性がある。
【０００８】
驚くべきことに、本発明者らは、ペルオキシダーゼファミリーに属する酵素及び過酸化物による処理をすると、アトラノールが式（Ｉ）の水溶性二量体生成物に転換されることを見出した。
【化１】
2021515578.tif 000002
【０００９】
二量体生成物の構造は、１Ｈ及び１３ＣＮＭＲ分光法、特にＣＯＳＹ、ＨＭＢＣ、及びＨＭＱＣ、及びＭＳ（ＥＳＩ）によって測定された。二量体のアセチル化は、さらにＨＲＭＳ（ＱＴＯＦ）が実行されるための有機溶媒中に溶解できる生成物をもたらした。これは、二量体生成物の提案された構造を裏付けた。
【００１０】
本発明者らは、この方法は、変性モス抽出物の嗅覚的品質を満足に残しながら、アトラノール及びその誘導体のクロロアトラノールの減少された含有量を有する変性オークモス抽出物の生産のために使用されることができることも見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本開示は、まず、アトラノール及び／又はその誘導体を水溶性化合物に転換する方法に関するものであり、前記方法はアトラノール及び／又はその誘導体を含む組成物をペルオキシダーゼファミリーに属する酵素及び過酸化物と混合する工程を含む。
【００１２】
本開示はまた、１００ｐｐｍ未満のアトラノール及び／又はその誘導体を有するオークモス抽出物を生産する方法に関するものであり、前記方法は、ａ）アトラノール及び／又はその誘導体を含むオークモス抽出物をペルオキシダーゼファミリーに属する酵素及び過酸化物と混合する工程と、ｂ）混合物を培養して、アトラノール及び／又はその誘導体を水溶性化合物に転換する工程と、ｃ）液液抽出を用いて水溶性化合物を取り除く工程と、を含む。
【００１３】
本開示は、モス抽出物からアトラノール及び／又はその誘導体の含有量を減少させるための、ペルオキシダーゼファミリーに属する酵素と過酸化物との使用にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例４（２当量のＨ２Ｏ２及び２時間の反応時間）による、処理前（上）及び処理後（下）のオークモスアブソリュートのＨＰＬＣ−ＰＤＡクロマトグラムを示す。挿入図は、アトラノール及びクロロアトラノールが（それぞれ１６．９及び２０．８分において）溶出するところのクロマトグラムの領域の拡大である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示の個々の実施形態は、本明細書に記載される。各実施形態で特定された特徴は、さらなる実施形態を提供するための他の特定された特徴と組み合わされてもよい。
【００１６】
＜アトラノール及び／又はその誘導体を水溶性化合物に転換する方法＞
【００１７】
本開示は、まず、アトラノール及び／又はその誘導体を水溶性化合物に転換する方法に関するものであり、前記方法はアトラノール及び／又はその誘導体を含む組成物をペルオキシダーゼファミリーに属する酵素及び過酸化物と混合する工程を含む。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「アトラノール及び／又はその誘導体」という用語は、アトラノール、及びある原子と別の原子又は原子団の置換によってアトラノールから得られる化合物を表す。
【００１９】
一実施形態によると、アトラノールの誘導体は、下記に表されるようなクロロアトラノール、ヘマトム酸エチル、クロロヘマトム酸エチル、アトラノリン及びクロロアトラノリンである。したがって、本実施形態において、「アトラノール及び／又はその誘導体」という用語は、アトラノール、クロロアトラノール、ヘマトム酸エチル、クロロヘマトム酸エチル、アトラノリン、クロロアトラノリン、及びこれらの混合物から選択された化合物を表す。
【００２０】
【化２】
2021515578.tif 000003
【００２１】
好ましくは、「アトラノール及び／又はその誘導体」という用語は、アトラノール、クロロアトラノール、及びこれらの混合物から選択された化合物を表す。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「水溶性化合物」という用語は、例えば、２０℃で１００ｍＬの水あたり少なくとも０．１ｇの濃度で水に溶解できる化合物を表す。
【００２３】
本方法の一実施形態によると、アトラノール及び／又はその誘導体は、水溶性二量体に転換される。一実施形態によると、アトラノールは式（Ｉ）の水溶性二量体に転換される。
【００２４】
【化３】
2021515578.tif 000004
【００２５】
有利には、アトラノール及び／又はその誘導体を含む組成物は、モス抽出物、好ましくはモス油、モスコンクリート、又はモスアブソリュートである。本開示で有用なモス抽出物は、一般的に地衣類の溶媒抽出によって得られるものであり、特に、（エベルニア・プルナストリＬ（Evernia prunasti L）からの）オークモスコンクリート及びオークモスアブソリュートを含む。好ましくは、アトラノール及び／又はその誘導体を含む組成物は、オークモス抽出物である。一実施形態によると、アトラノール及び／又はその誘導体を含む組成物は、オークモスコンクリートである。別の実施形態によると、アトラノール及び／又はその誘導体を含む組成物は、オークモスアブソリュートである。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「ペルオキシダーゼファミリーに属する酵素」という用語は、過酸化物を最終酸化剤として使用する有機基質の酸化を触媒する能力を有する酵素を表し、酵素は野生の又は突然変異した生体から得られる。
【００２７】
一実施形態によると、ペルオキシダーゼファミリーに属する酵素は、ホースラディッシュペルオキシターゼ（horseradish peroxidase、ＨＲＰ）、ソイビーンペルオキシターゼ（soybean peroxidase、ＳＰＢ）、ミエロペルオキシターゼ（myeloperoxidase、ＭＰＯ）、ラクトペルオキシターゼ（lactoperoxidase、ＬＰＯ）、シトクロムＣペルオキシターゼ（cytochrome C peroxidase、ＤｉＨＣｃＰ）、及びこれらの混合物から選択される。
【００２８】
好ましい一実施形態によると、ペルオキシダーゼファミリーに属する酵素は、ＨＲＰである。
【００２９】
ペルオキシダーゼファミリーに属する酵素の量は、アトラノール及び／又はその誘導体の質量に対して少なくとも０．１質量％、好ましくは少なくとも０．５質量％、より好ましくは少なくとも１質量％であり得る。一実施形態によると、ペルオキシダーゼファミリーに属する酵素の量は、アトラノール及び／又はその誘導体の質量に対して０．１質量％から２５質量％の間、又は１質量％から１５質量％の間に含まれる。
【００３０】
一実施形態によると、本方法で使用される過酸化物は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ヒドロペルオキシド（ＲＯ２Ｈ）、有機過酸化物（ＲＯ２Ｒ’）及びこれらの混合物の中から選ばれる。本明細書で使用される場合、「ヒドロペルオキシド」という用語は、ＲＯＯＨの骨格を有する化合物を表し、Ｒはオルガニル基（organyl group）であり、好ましくは、Ｒは直鎖又は分枝アルキル基、アセチル又はベンゾイルなどのアシル基、或いはアリール基である。有利には、Ｒは１から１８個の炭素原子を含む。ヒドロペルオキシドには、ペルオキシ酢酸、ペルオキシ安息香酸、及びメタクロロペルオキシ安息香酸などのペルオキシ酸が含まれる。本明細書で使用される場合、「有機過酸化物」という用語は、ＲＯＯＲ’の骨格を有する化合物を表し、Ｒ及びＲ’はオルガニル基であり、好ましくは、Ｒ及びＲ’は、独立して、直鎖又は分枝アルキル基、アセチル又はベンゾイルなどのアシル基、或いはアリール基である。有利には、Ｒ及びＲ’は、独立して、１から１８個の炭素原子を含む。
【００３１】
好ましくは、過酸化物はＨ２Ｏ２である。
【００３２】
過酸化物の量は、アトラノール及び／又はその誘導体に対して少なくとも０．５モル当量、好ましくは少なくとも１モル当量、より好ましくは少なくとも２モル当量であり得る。一実施形態によると、過酸化物の量は、アトラノール及び／又はその誘導体に対して１から５モル当量の間、又は１．５から３モル当量の間に含まれる。
【００３３】
一実施形態によると、混合する工程を少なくとも０．５時間、好ましくは少なくとも１時間、より好ましくは少なくとも２時間続ける。一実施形態によると、混合する工程を１から１０時間、又は２から４時間続ける。
【００３４】
本方法は、水性溶液中で実行され得る。好ましくは、本方法は、炭酸塩緩衝液などの緩衝水性溶液中で実行される。
【００３５】
一実施形態によると、本方法は塩基性のｐＨ、例えば８から１０の間のｐＨで実行される。
【００３６】
一実施形態によると、本開示はアトラノール及び／又はクロロアトラノールを水溶性化合物に転換する方法に関するものであり、前記方法はアトラノール及び／又はクロロアトラノールを含むモス抽出物とＨＲＰ及びＨ２Ｏ２を混合する工程を含む。
【００３７】
一実施形態によると、本開示はアトラノール及び／又はクロロアトラノールを水溶性化合物に転換する方法に関するものであり、前記方法はアトラノール及び／又はクロロアトラノールを含むオークモスコンクリート又はオークモスアブソリュートとＨＲＰ及びＨ２Ｏ２を混合する工程を含み、ここでＨ２Ｏ２の量はアトラノール及び／又はクロロアトラノールに対して少なくとも２モル当量であり、ＨＲＰの量はアトラノール及び／又はその誘導体の質量に対して少なくとも１質量％であり、混合する工程を少なくとも２時間続ける。
【００３８】
本開示は、アトラノールを式（Ｉ）の水溶性二量体に転換する方法にも関する。
【００３９】
【化４】
2021515578.tif 000005
【００４０】
前述の方法は、アトラノール、好ましくはモス抽出物を含む組成物を、ペルオキシダーゼファミリーに属する酵素、好ましくはＨＲＰと、過酸化物、好ましくはＨ２Ｏ２と混合する工程を含む。
【００４１】
＜変性オークモス抽出物を生産する方法＞
【００４２】
本開示はまた、１００ｐｐｍ未満のアトラノール及び／又はその誘導体を有するオークモス抽出物を生産する方法に関するものであり、前記方法は、ａ）アトラノール及び／又はその誘導体を含むオークモス抽出物をペルオキシダーゼファミリーに属する酵素及び過酸化物と混合する工程と、ｂ）混合物を培養して、アトラノール及び／又はその誘導体を水溶性化合物に転換する工程と、ｃ）液液抽出を用いて水溶性化合物を取り除く工程と、を含む。
【００４３】
工程ａ）及び工程ｂ）の間、アトラノール及び／又はその誘導体は、液液抽出を用いて取り除かれ得る水溶性化合物に転換される。有利には、工程ｃ）の液液抽出は、水性溶液及び有機溶媒を用いて実行される。この場合において、変性オークモス抽出物は有機溶媒中で回収され、一方アトラノール及び／又はその誘導体が転換された水溶性化合物は、水相と一緒に捨てられる。得られた変性オークモス抽出物は、１００ｐｐｍ未満のアトラノール及び／又はその誘導体を有するオークモス抽出物である。
【００４４】
好ましくは、オークモス抽出物はオークモスコンクリート又はオークモスアブソリュートである。
【００４５】
一実施形態によると、ペルオキシターゼファミリーに属する酵素は、ホースラディッシュペルオキシターゼ（horseradish peroxidase、ＨＲＰ）、ソイビーンペルオキシターゼ（soybean peroxidase、ＳＰＢ）、ミエロペルオキシターゼ（myeloperoxidase、ＭＰＯ）、ラクトペルオキシターゼ（lactoperoxidase、ＬＰＯ）、シトクロムＣペルオキシターゼ（cytochrome C peroxidase、ＤｉＨＣｃＰ）、及びこれらの混合物から選択される。
【００４６】
好ましい一実施形態によると、ペルオキシダーゼファミリーに属する酵素はＨＲＰである。
【００４７】
ペルオキシダーゼファミリーに属する酵素の量は、アトラノール及び／又はその誘導体の質量に対して少なくとも０．１質量％、好ましくは少なくとも０．５質量％、より好ましくは少なくとも１質量％であり得る。一実施形態によると、ペルオキシダーゼファミリーに属する酵素の量は、アトラノール及び／又はその誘導体の質量に対して０．１質量％から２５質量％の間、又は１質量％から１５質量％の間に含まれる。
【００４８】
一実施形態によると、本方法で使用される過酸化物は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ヒドロペルオキシド（ＲＯ２Ｈ）、有機過酸化物（ＲＯ２Ｒ’）及びこれらの混合物の中から選ばれる。本明細書で使用される場合、「ヒドロペルオキシド」という用語は、ＲＯＯＨの骨格を有する化合物を表し、Ｒはオルガニル基（organyl group）であり、好ましくは、Ｒは直鎖又は分枝アルキル基、アセチル又はベンゾイルなどのアシル基、或いはアリール基である。有利には、Ｒは１から１８個の炭素原子を含む。ヒドロペルオキシドには、ペルオキシ酢酸、ペルオキシ安息香酸、及びメタクロロペルオキシ安息香酸などのペルオキシ酸が含まれる。本明細書で使用される場合、「有機過酸化物」という用語は、ＲＯＯＲ’の骨格を有する化合物を表し、Ｒ及びＲ’はオルガニル基であり、好ましくは、Ｒ及びＲ’は、独立して、直鎖又は分枝アルキル基、アセチル又はベンゾイルなどのアシル基、或いはアリール基である。有利には、Ｒ及びＲ’は、独立して、１から１８個の炭素原子を含む。
【００４９】
好ましくは、過酸化物はＨ２Ｏ２である。
【００５０】
過酸化物の量は、アトラノール及び／又はその誘導体に対して少なくとも０．５モル当量、好ましくは少なくとも１モル当量、より好ましくは少なくとも２モル当量であり得る。一実施形態によると、過酸化物の量は、アトラノール及び／又はその誘導体に対して１から５モル当量の間、又は１．５から３モル当量の間に含まれる。
【００５１】
工程ａ）及び工程ｂ）は、水性溶液中で実行され得る。好ましくは、工程ａ）及び工程ｂ）は、炭酸塩緩衝液などの緩衝水性溶液中で実行される。
【００５２】
一実施形態によると、工程ａ）及び工程ｂ）は、塩基性のｐＨ、例えば８から１０の間のｐＨで実行される。
【００５３】
一実施形態によると、工程ｂ）を、少なくとも０．５時間、好ましくは少なくとも１時間、より好ましくは少なくとも２時間続ける。一実施形態によると、工程ｂ）を、１から１０時間、又は２から４時間続ける。
【００５４】
有利には、水性溶液及び有機溶媒を用いて工程ｃ）の液液抽出を実行する場合、有機溶媒は、エーテル酸化物、炭化水素、又は酢酸エチルなどの一般的な有機溶媒の中から選択される。
【００５５】
本方法は、有機溶媒中に１００ｐｐｍ未満のアトラノール及び／又はその誘導体を有するオークモス抽出物を回収する工程ｄ）を含むこともできる。
【００５６】
一実施形態によると、変性オークモス抽出物は、嗅覚特性に関して最初のオークモスコンクリート又はオークモスアブソリュートと差がないことを示す。
【００５７】
一実施形態によると、本開示はまた、１００ｐｐｍ未満のアトラノール及び／又はクロロアトラノールを有するオークモスコンクリート又はオークモスアブソリュートを生産する方法に関するものであり、前記方法は、ａ）アトラノール及び／又はクロロアトラノールを含むオークモスコンクリート又はオークモスアブソリュートをＨＲＰ及びＨ２Ｏ２と混合する工程であって、Ｈ２Ｏ２の量はアトラノール及び／又はクロロアトラノールに対して少なくとも２モル当量であり、ＨＲＰの量はアトラノール及び／又はクロロアトラノールの質量に対して少なくとも１質量％である工程と、ｂ）少なくとも２時間混合物を培養して、アトラノール及び／又はその誘導体を水溶性化合物に転換する工程と、ｃ）水性溶液を用いて水溶性化合物を取り除く工程と、ｄ）有機溶媒中に１００ｐｐｍ未満のアトラノール及び／又はその誘導体を有するオークモスコンクリート又はオークモスアブソリュートを回収する工程と、を含む。
【００５８】
一実施形態によると、本開示はまた、１００ｐｐｍ未満のアトラノールを有するオークモス抽出物を生産する方法に関するものであり、前記方法は、ａ）アトラノールを含むオークモス抽出物をペルオキシダーゼファミリーに属する酵素及び過酸化物と混合する工程と、ｂ）混合物を培養して、アトラノールを式（Ｉ）の水溶性二量体に転換する工程と、ｃ）液液抽出を用いて式（Ｉ）の水溶性二量体を取り除く工程と、を含む。
【００５９】
【化５】
2021515578.tif 000006
【００６０】
本開示は、モス抽出物からアトラノール及び／又はその誘導体の含有量を減少させるための、ペルオキシダーゼファミリーに属する酵素、好ましくはＨＲＰと、過酸化物、好ましくはＨ２Ｏ２との使用にも関する。好ましくは、モス抽出物はオークモスコンクリート又はオークモスアブソリュートである。
【実施例】
【００６１】
（実施例１：純粋なアトラノールの転換）
【００６２】
アトラノール（０．６６ｍｍｏｌ）を室温でｐＨ９の炭酸塩緩衝液２０ｍＭに溶解し、２ｇ／Ｌの濃度にした。次に、ＨＲＰを１％質量比で導入し、２当量のＨ２Ｏ２（３０％ｗ／ｗ水性溶液）を０．１ｍＬ／ｈの流速でゆっくり加えながら反応を開始した。４時間後、水性相をＡｃＯＥｔで抽出し、有機相と水性相の両方を蒸発させて、分析した。同じプロトコルを用いて対照実験を実行した。異なる条件及び結果を表１に要約する。
【００６３】
【表１】
2021515578.tif 000007
【００６４】
Ｈ２Ｏ２が非存在の場合、ＡｃＯＥｔで抽出すると、１％ｗ／ｗで使用されるＨＲＰを用いてもＨＲＰを用いなくても、アトラノールは変化無く回収された（表１、項目１及び２）。Ｈ２Ｏ２は存在するがＨＲＰは非存在の場合、ＡｃＯＥｔで抽出すると５−メチルピロガロール（methylpyrogallol）を８４％の収率で得た（表１、項目３）。驚くべきことに、ＨＲＰ（１％ｗ／ｗ）及びＨ２Ｏ２（２当量）が存在する場合、ＡｃＯＥｔでの抽出によって、たった２％の５−メチルピロガロールだけが分離された。水性相を蒸発すると、二量体が７５％の収率で得られた。
【００６５】
（実施例２：純粋なアトラノールのＨＲＰ触媒酸化）
【００６６】
ＨＲＰ（１２４Ｕ／ｍｇ、４ｍｇ）を、アトラノール（２００ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）を含むｐＨ９の炭酸塩緩衝液（２０ｍＭ）６５ｍＬに溶解した。反応フラスコをアルミホイルで覆い、過酸化物の分解を防いだ。３０％Ｈ２Ｏ２水性溶液を０．１ｍＬ／ｈでゆっくり加えることによって反応を開始し、アトラノールに対して２当量の過酸化水素（０．２６４ｍＬ）を最後に加えたことを確認した。６時間後室温で、ＨＣｌ水性溶液（０．１Ｍ）をｐＨ４となるまで加えた。この水性層を酢酸エチル（３×７０ｍＬ）で抽出した。水性相を回転蒸発によって濃縮し、二量体を白い粉（１９３ｍｇ、４４％）として得た。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３１０。１Ｈ  ＲＭＮ（Ｄ２Ｏ、４００ｍＨｚ）：δｐｐｍ６．３７（ｔ、１Ｈ）、３．９７（ｄ、１Ｈ）、３．３７（ｓ、Ｈ）、２．６８（ｓ、２Ｈ）、２．６２（ｓ、Ｈ）、２．１４（ｓ、３Ｈ）、１．７９（ｓ、３Ｈ）１３Ｃ  ＲＭＮ：（Ｄ２Ｏ、１００ＭＨｚ）δｐｐｍ１９７．５（Ｃ）、１７８．１（Ｃ）、１７２．３（Ｃ）、１６４．３（Ｃ）、１２７．１（ＣＨ）、８８．９（Ｃ）、８７．１（Ｃ）、８５．７（Ｃ）、７７．７（Ｃ）、６０．２（ＣＨ）、５４．９（ＣＨ）、５２．９（ＣＨ）、２５．７（ＣＨ３）、２３．７（ＣＨ３）。
【００６７】
（実施例３：二量体のアセチル化）
【００６８】
二量体をＧＣ−ＭＳによって直接分析することができなかったため、そのアセチル化された誘導体を調製した。二量体（０．１００ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を蒸留されたＣＨ２Ｃｌ２（２ｍｌ）に溶解した。その後、不活性雰囲気下でトリエチルアミンを加えて（０．２８ｍｌ、２．１ｍｍｏｌ）、続いてＡｃ２Ｏ（０．２ｍｌ；２．１ｍｍｏｌ）を加えた。反応の完了後、粗反応混合物を真空で蒸発した。得られた固体をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、水で洗浄した。ＭｇＳＯ４を用いた有機層の乾燥、及び蒸発後、トリアセチル化された二量体を油（０．１２ｇ、９０％）として得た。ＨＲＭＳ：［ＭＨ＋］に対するＣ２０Ｈ１９Ｏ１０（C20H19O10 for [MH+]），計算値（calc）４１９．０９７８；実測値（found）４１９．０９５０、Δ＝６．６ｐｐｍ。
【００６９】
（実施例４：ミリグラムスケールでのオークモスアブソリュートからのアトラノール（４．３％）及びクロロアトラノール（２．３％）のＨＲＰ触媒除去）
【００７０】
アトラノール（４．３％）及びクロロアトラノール（２．３％）を含むオークモスアブソリュート（２５０ｍｇ）をｐＨ９の炭酸塩緩衝液（２０ｍＭ）２７０ｍＬに溶解した。２時間にわたる反応混合物の超音波処理の後、ＨＲＰ（１２４Ｕ／ｍｇ、２ｍｇ）を加えた。反応フラスコをアルミホイルで覆い、１、２、３又は４当量の３０％Ｈ２Ｏ２水性溶液を加えた。室温で攪拌を２または４時間維持した。酢酸エチルによる抽出物は、硫酸マグネシウムでの乾燥、ろ過、及び回転蒸発による溶媒除去の後の、変性アブソリュート（２３１ｍｇ、９２％、２当量のＨ２Ｏ２及び４時間の反応時間によって）の回収を可能にした。変性オークモスアブソリュートのＨＰＬＣ−ＵＶ−ＭＳ及びＧＣ−ＭＳ分析は、アトラノール及びクロロアトラノールの消失を裏付けた。ここでは、ＵＶ検出法を用いたＨＰＬＣは微量のアトラノールを数値化するのに適していなかったため、質量検出法（MS detection）を外部較正方法で使用した (S. C. Rastogi, R. Bossi, J. D. Johansen, T. Menne, G. Bernard, E. Gimenez-Arnau and J.-P. Lepoittevin,  Content of oak moss allergens atranol and chloroatranol in perfumes and similar products Contact Dermatitis 2004 50, p. 367-370、R. Bossi, S. C. Rastogi, G. Bernard, E. Gimenez-Arnau, J. D. Johansen, J.-P. Lepoittevin and T. Menne A liquid chromatography-mass spectrometric method for the determination of oak moss allergens atranol and chloroatranol in perfumes Journal of Separation Science 2004 27, p. 537-540)。結果を表２に示す。
【００７１】
全体のオークモスアブソリュートの全般的な効果を評価するために、ＨＰＬＣ−ＵＶを使用した。最初のオークモスアブソリュート及び得られた変性オークモスアブソリュートのクロマトグラムを図１に示す。それらはアブソリュートの化学組成が大まかには同じままであることを示す。
【表２】
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【００７２】
２当量超のＨ２Ｏ２を使用した場合に、１００ｐｐｍ未満のアトラノールの残留値（residual value）が得られた。４当量のＨ２Ｏ２及び４時間の反応で、７ｐｐｍと低いアトラノールの残留タイトル（residual title）が見いだされた。
【００７３】
（実施例５：グラムスケールでのオークモスアブソリュートからのアトラノール（４．３％）及びクロロアトラノール（２．３％）のＨＲＰ触媒除去））
【００７４】
オークモスアブソリュート（１．２ｇ）をｐＨ９の炭酸塩緩衝液（２０ｍＭ）１．３Ｌに溶解した。２時間にわたる反応混合物の超音波処理の後、ＨＲＰ（１２４Ｕ／ｍｇ、１０ｍｇ）を加えた。反応フラスコをアルミホイルで覆い、２当量の３０％Ｈ２Ｏ２水性溶液（９７μＬ）を加えた。室温で攪拌を２時間維持した。酢酸エチルによる抽出物は、硫酸マグネシウムでの乾燥、ろ過、及び回転蒸発による溶媒除去の後の、変性アブソリュート（１．１ｇ、９１％）の回収を可能にした。６０ｐｐｍのアトラノール及びクロロアトラノールを含む変性オークモスアブソリュートは検出されなかった（ＨＰＬＣ−ＭＳ、ＳＩＭモード）。ＨＰＬＣ−ＵＶ−ＭＳ及びＧＣ−ＭＳ分析はこの結果を裏付けた。
【００７５】
（実施例６：官能分析）
【００７６】
変性オークモスアブソリュートの保存された嗅覚的品質を、次の３点試験法の官能分析によって評価した。オークモスアブソリュートの２つの試料、及び変性オークモスアブソリュートの１つの試料をＥｔＯＨ（０．５％ｗ／ｗ）中の溶液として含む３つの同一の小びんを、別々に選ばれた変性された試料を特定するように求められた５６人のパネルに提出した。次の式を使用し、ここでｎ１〜３は結果が確実性の規定レベルの統計的分布でないことを確認するために超えるべき値であり、Ｎはパネリストの数である。
【００７７】
【数１】
2021515578.tif 000009
【００７８】
【数２】
2021515578.tif 000010
【００７９】
【数３】
2021515578.tif 000011
【００８０】
５６人のパネルに対して、ｎ１＝２５．９、ｎ２＝２８．０、ｎ３＝３０．９。
【００８１】
結果として、得られた点数は、それぞれ１８、１６、及び２２であった。２２の点数は、最も低い確実性のレベルにおいてさえも、パネルは変性された試料を少しも区別することができないことを意味する。
【図１】
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【国際調査報告】
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