(57)【要約】  ヒルログ及びその使用を提供し、具体的には、インビトロマクロファージの移動を阻害する活性を有し、アテローム性動脈硬化症の予防及び発展に使用できる合成ヒルログを提供する。まず、ウマビルからスイテツ酵素分解物ＨＥを調製して得て、更なる分析、シーケンシングによって、最終的にヒルログＨＥ４−１のアミノ酸配列を取得して人工合成を行う。試験により確認されるように、人工合成されるヒルログは、同様にマクロファージの移動を阻害する活性を有し、良好な応用価値を有する。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒルポリペプチドであって、ヒルポリペプチドを構成するアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示す、ことを特徴とするヒルポリペプチド。
【請求項２】
ヒルポリペプチドフラグメントであって、アミノ酸主配列が請求項１に記載のヒルポリペプチドのアミノ酸配列と７０％以上の同一性及び９０％以上の類似性を有し、フラグメントは、前記１５個のアミノ酸の配列について、任意の位置で３個又は４個又は５個のアミノ酸で構成され、前記ヒルポリペプチドと同じ生物学的活性を有するヒルポリペプチドに切断したものである、ことを特徴とするヒルポリペプチドフラグメント。
【請求項３】
ヒルポリペプチドの類似体であって、請求項１に記載のヒルポリペプチドと同じ生物学的活性を有し、前記ヒルポリペプチドを別の化合物と融合し、又は前記ヒルポリペプチドのアミノ酸配列を別のポリペプチド又はタンパク質と融合してなる、生物学的活性を有するポリペプチド配列又はタンパク質である、ことを特徴とするヒルポリペプチドの類似体。
【請求項４】
ヒルポリペプチド誘導体であって、アミノ酸配列が、請求項１に記載のヒルポリペプチドのアミノ酸主配列と７０％以上の同一性及び９０％以上の類似性を有し、該ヒルポリペプチド誘導体は、前記アミノ酸配列中の１つ又はいくつかのアミノ酸のある基を別の基で置換した、前記ヒルポリペプチドと同じ生物学的活性を有するヒルポリペプチドを指す、ことを特徴とするヒルポリペプチド誘導体。
【請求項５】
ヒルポリペプチド変異体であって、アミノ酸配列が、請求項１に記載のヒルポリペプチドのアミノ酸主配列と７０％以上の同一性及び９０％以上の類似性を有し、該変異体は、１つ又は複数のアミノ酸又はヌクレオチドが変化したアミノ酸配列、又はそれらをコードするヌクレオチド配列を指し、前記変化は、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列において、配列の途中の任意の位置で、アミノ酸又はヌクレオチドを削除、挿入又は置換するか、配列の両端にアミノ酸又はヌクレオチドを追加することを含む、ことを特徴とするヒルポリペプチド変異体。
【請求項６】
請求項１に記載のヒルポリペプチド、請求項２に記載のヒルポリペプチドフラグメント、請求項３に記載のヒルポリペプチドの類似体、請求項４に記載のヒルポリペプチド誘導体又は請求項５に記載のヒルポリペプチド変異体をコードするヌクレオチドであって、好ましくは、
（ａ）前記アミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのフラグメント、類似体、誘導体又は変異体をコードするヌクレオチド群と、
（ｂ）（ａ）に記載されている前記ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド群と、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載されているヌクレオチドと７５％以上の同一性を持つヌクレオチド群とのいずれかを含み、人工合成方法によって調製される、ヌクレオチド。
【請求項７】
固相ペプチド合成法によって調製される、ことを特徴とする請求項１に記載のヒルポリペプチド。
【請求項８】
請求項１に記載のヒルポリペプチド、請求項２に記載のヒルポリペプチドフラグメント、請求項３に記載のヒルポリペプチドの類似体、請求項４に記載のヒルポリペプチド誘導体又は請求項５に記載のヒルポリペプチド変異体の、マクロファージの移動により引き起こされる一連の関連疾患を予防及び／又は治療し、関連疾患の発症及び関連疾患の発症の悪性度を診断及び検出する医薬品の調製における使用。
【請求項９】
前記疾患は、アテローム性動脈硬化症である、ことを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
請求項１に記載のヒルポリペプチド、請求項２に記載のヒルポリペプチドフラグメント、請求項３に記載のヒルポリペプチドの類似体、請求項４に記載のヒルポリペプチド誘導体又は請求項５に記載のヒルポリペプチド変異体の、プロテアーゼ阻害剤又は促進剤又は親和性試薬である医薬品又は検出試薬の調製における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ医薬品の技術分野に属し、具体的には、ヒルログ及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
該背景技術に開示されている情報は、本発明の全体的な背景の理解を深めることのみを目的としており、必ずしもこの情報が当業者により知られている先行技術を構成することを確認するか、又は何らかの形で示唆すると見なされない。
【０００３】
心血管疾患及び脳血管疾患は、発症率、死亡率や障害率が世界の第一位にある疾患であり、人間の生存と生活の質を深刻に脅かしている。ＷＨＯのデータによると、世界中で毎年約１７５０万人が心血管疾患で死亡している。中国血管疾患センターが発表した『中国心血管疾患レポート２０１８』は、中国には約２億９０００万人の心血管患者がおり、心血管疾患が疾患による死亡の４０％以上を占めていると記載しており、中国の人口の死亡原因の第１位にあり、中国の主要な公衆衛生問題となっている。アテローム性動脈硬化症（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ＡＳ）は、心血管疾患及び脳血管疾患の発症や進行の重要な病理学的根拠である。ＡＳの進行は数十年に亘る可能性があり、それによって引き起こされる心血管疾患は、一般に、一旦症状が現れると、後期に入っている。実際、ＡＳの初期段階での脂質縞の形成は、小児期に見られ、臨床症状を引き起こすことはないものの、この疾患の発生は、緩慢に発展していく長期的なプロセスであることが分かり、ＡＳの早期の予防と治療が特に重要になる。
【０００４】
ＡＳは、病因が複雑な慢性疾患であり、数十年に及ぶ研究室及び臨床研究により、ＡＳの病理学的過程が予備的に理解されてきた。１９８０年に、Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｒｏｓｓによって提案された「炎症−傷害−応答」理論は広くサポートされて認められ、「脂質浸透理論」を補完して、ＡＳの発症、進行のプロセス全体を完全に説明している。現在、ＡＳの初期段階では、高脂血症、高血圧、高血糖、喫煙などのさまざまな危険因子が血管内皮細胞や単球に損傷を与え、両方の細胞の表面に多数の細胞接着分子を発現させ、血管内皮細胞上のＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、及び単球上のＬ−セレクチンがそのリガンドに結合されて、血管内皮細胞上の単球の最初のローリング接着を仲介すると考えられている。血管内皮細胞は、単球走化性タンパク質−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１、ＭＣＰ−１）などのケモカインを放出して、その細胞膜上に血管細胞接着分子−１（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１、ＶＣＡＭ−１）、細胞間接着分子−１（  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１、ＩＣＡＭ−１）を活性化させ、それぞれ白血球の表面にあるインテグリン、例えば、非常に遅い抗原−４（ｖｅｒｙ  ｌａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−４、ＶＬＡ−４）やリンパ球機能関連抗原（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｇｅｎ−１、ＬＦＡ−１）と結合させ、強い接着を引き起こす。強い接着が完了すると、単球は血管内皮を横切って血管内膜に移動する。内膜に浸潤する単核細胞は、マクロファージコロニー刺激因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ、ＭＣＳＦ）の作用によりマクロファージに分化する。マクロファージは、ＣＤ３６などのスカベンジャー受容体を介して脂質を大量に貪食し、マクロファージに由来する泡沫細胞に変換する。また、マクロファージはケモカインも放出して、中膜平滑筋細胞の内膜への移動を誘導し、後者も脂質を貪食して、平滑筋細胞に由来する泡沫細胞に変換することができる。泡沫細胞は内膜に蓄積し、ＡＳの初期病変である脂肪線条を形成する。ＡＳが発達し続けると、Ｔ細胞はγインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、ＣＤ４０活性化マクロファージを発現させ、活性化させたマクロファージはさらにサイトカインや成長因子を分泌して、平滑筋細胞の移動と増殖を促進する。後者は、プラークの表面を覆う大量のコラーゲン線維を合成して分泌し、ＡＳ線維プラークの段階となる。炎症が続くと、マクロファージはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ、ＭＭＰ）を放出してコラーゲンを分解し、一方、ＮＯを放出して泡沫細胞のアポトーシスを誘導し、それによって、ＡＳはアテローム期に進行する。動脈硬化性プラークは不安定であるため、血栓症、プラーク破裂、プラーク内出血、動脈瘤などの多くの二次的病変を引き起こしやすく、心筋梗塞、脳出血、脳梗塞などの深刻な心血管疾患を引き起こす。したがって、単球／マクロファージは、まずＡＳ部位に入る免疫細胞であるだけでなく、ＡＳプラークの形成、進行、及び��帰においても重要な役割を果たす。
【０００５】
ＡＳは、複数の要因の共同作用により発症し、現在、ＡＳに対して危険な多くの要因があるが、現在の標的治療及び制御効果はいずれも理想的ではなく、脂質低下及び抗炎症治療が現在最も重要な治療手段である。ますます多くの証拠から、免疫応答（最初はマクロファージである）がＡＳ進行のすべての側面に関与していることが示されている。通常のマウスと比較して、免疫不全マウスでは、ＡＳの重症度が約７０％低減したが、血清コレステロールレベルは変化しなかった。したがって、炎症性免疫調節メカニズムは現在のＡＳ研究のホットスポットとなっており、このメカニズムの研究は、ＡＳの治療のために新しい道を開く。ただし、免疫系を完全に抑制することによる有害反応が多すぎて、ＡＳの発症と進行の過程から分かるように、単球／マクロファージがＡＳに関与する免疫系の主な細胞であり、ＡＳプラークの退縮もプラークにおけるマクロファージの減少を伴い、逆に、ＡＳプラークの進行はマクロファージの増加を伴う。したがって、マクロファージのＡＳ部位への移動を阻害することができれば、免疫系への影響が少ない場合、ＡＳの進行を遅らせることができ、それは、ＡＳの発症を予防する上で実用上重要な意義がある。
【０００６】
ヒル（Ｗｈｉｔｍａｎｉａｐｉｇｒａ  Ｗｈｉｔｍａｎ）は、一般的に使用されている伝統的な漢方薬の１種であり、古代の医学書でさまざまな疾患の治療に使用されており、『神農本草経』では、「主に、悪血、うっ血、無月経、血液の蓄積解消などの機能がある」との記載がある。ヒルには、抗凝固、抗血栓、抗腫瘍、抗炎症や抗線維化作用など、幅広い薬理学的作用がある。近年、心血管疾患及び脳血管疾患におけるヒルの研究が絶えず行われており、心血管疾患及び脳血管疾患におけるその使用も増加している。臨床的には、ヒルは、冠状動脈性心臓病、狭心症、急性心筋梗塞、虚血性脳卒中、脳出血、アテローム性動脈硬化症や末梢血管疾患などの疾患の治療に広く使用されている。現在、トロンビン阻害作用を有するヒルジン及びその誘導体を除いて、他の製剤のほとんどは、本格的な分離と精製を行わずに、ヒル全体として薬品として利用されている。漢方薬であるヒルは、臨床的に広く使用されているが、本発明者は、ヒルの組成が複雑であるため、生薬の品質を制御しにくく、多くの副作用があることを見出し、そのうち、最大の副作用は、出血を引き起こしやすいことであり、このため、ヒル製剤を長期的に服用する患者は、血液凝固を定期的に監視する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記従来技術の欠陥に基づいて、インビトロマクロファージの移動を体外で阻害する活性を有し、アテローム性動脈硬化症の予防及び発展に応用できるヒルログを提供する。本発明は、まず、ウマビルからスイテツ酵素分解物ＨＥを調製して得て、更なる分析、シーケンシングによって、最終的にヒルログＨＥ４−１のアミノ酸配列を取得して人工合成を行い、試験により確認されるように、人工合成されるヒルログは、同様にマクロファージの移動を阻害する活性を有し、従って、良好な実際応用価値を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１側面は、ヒルポリペプチドであって、ヒルポリペプチドを構成するアミノ酸配列がＥＡＧＳＡＫＥＬＥＧＤＰＶＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）である、ヒルポリペプチドを提供する。該ヒルポリペプチドは、マクロファージの移動活性を阻害する役割を有し、固相ペプチド合成法によって合成することができる。
【０００９】
本発明の第２側面は、ヒルポリペプチドフラグメントであって、アミノ酸主配列が上記ヒルポリペプチドのアミノ酸主配列と７０％以上の同一性及び９０％以上の類似性を有し、フラグメントは、前記１５個のアミノ酸の配列について、任意の位置で３個又は４個又は５個のアミノ酸で構成され、前記ヒルポリペプチドと同じ生物学的活性を有するヒルポリペプチドに切断したものである、ヒルポリペプチドフラグメントを提供する。
【００１０】
本発明の第３側面は、マクロファージの移動を阻害するヒルポリペプチドの類似体であって、前記ヒルポリペプチドと同じ生物学的活性を有し、前記ヒルポリペプチドの類似体は、前記ヒルポリペプチドを別の化合物と融合し、又は前記ヒルポリペプチドのアミノ酸配列を別のポリペプチド又はタンパク質と融合してなる、生物学的活性を有するポリペプチド配列又はタンパク質である、ヒルポリペプチドの類似体を提供する。
【００１１】
本発明の第４側面は、マクロファージの移動を阻害するヒルポリペプチド誘導体であって、アミノ酸配列がヒルポリペプチドのアミノ酸主配列と７０％以上の同一性及び９０％以上の類似性を有し、該誘導体は、前記アミノ酸配列中の１つ又はいくつかのアミノ酸のある基を別の基で置換した、前記ヒルポリペプチドと同じ生物学的活性を有するヒルポリペプチドを指す、ヒルポリペプチド誘導体を提供する。
【００１２】
本発明の第５側面は、マクロファージの移動を阻害するヒルポリペプチド変異体であって、アミノ酸配列がヒルポリペプチドのアミノ酸主配列と７０％以上の同一性及び９０％以上の類似性を有し、該変異体は、１つ又は複数のアミノ酸又はヌクレオチドが変化したアミノ酸配列、又はそれらをコードするヌクレオチド配列を指し、前記変化は、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列において、配列の途中の任意の位置で、アミノ酸又はヌクレオチドを削除、挿入又は置換するか、配列の両端にアミノ酸又はヌクレオチドを追加することを含む、ヒルポリペプチド変異体を提供する。
【００１３】
本発明の第６側面は、前記ヒルポリペプチド、ヒルポリペプチドフラグメント、ヒルポリペプチドの類似体、ヒルポリペプチド誘導体又はヒルポリペプチド変異体をコードするヌクレオチドであって、
（ａ）前記アミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのフラグメント、類似体、誘導体又は変異体をコードするヌクレオチド群と、
（ｂ）（ａ）に記載されている前記ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド群と、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載されているヌクレオチドと７５％以上の同一性を持つヌクレオチド群とのいずれかを含む、ヌクレオチドを提供する。
【００１４】
前記ヌクレオチドは、人工合成方法によって調製される。
【００１５】
本発明の第７側面は、上記ヒルポリペプチド、ヒルポリペプチドフラグメント、ヒルポリペプチドの類似体、ヒルポリペプチド誘導体及びヒルポリペプチド変異体の、マクロファージの移動により引き起こされる一連の関連疾患を予防及び／又は治療し、関連疾患の発症及び関連疾患の発症の悪性度を診断及び検出する医薬品の調製における使用を提供する。
【００１６】
好ましくは、前記疾患には、アテローム性動脈硬化症が含まれる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の有益な技術的効果は以下のとおりである。
本発明は、ウマビルからスイテツ酵素分解物ＨＥを調製して得て、更なる分析、シーケンシングによって、最終的にヒルログＨＥ４−１のアミノ酸配列を取得して人工合成を行い、試験により確認されるように、人工合成されるヒルログは、同様にマクロファージの移動を阻害する活性を有し、それにより、アテローム性動脈硬化症及びその関連疾患を予防及び／又は治療する潜在的な価値有し、良好な将来の実際応用性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
本発明の一部を構成する図面は、本発明に対する更なる理解を提供するためのものであり、本発明の例示的な実施例及びその説明は、本発明を解釈するためのものであり、本発明に対する不適切な限定を構成するものではない。
【図１】本発明の実施例１においてＨＥをＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ強塩基性陰イオンカラムクロマトグラフィーで溶出した曲線図である。
【図２】本発明の実施例１におけるＨＥ１−ＨＥ６によるマクロファージＲＡＷ２６４．７移動活性への影響の図であり、図２（Ａ）は、マクロファージＲＡＷ２６４．７移動の結果図（１００×）であり、図２（Ｂ）は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーの下層細胞数の統計結果図である。＊＊ｐ＜０．０１ＶＳ対照群、＃ｐ＜０．０５ＶＳＬＰＳ群、＃＃ｐ＜０．０１ＶＳＬＰＳ群。
【図３】本発明の実施例１においてＨＥ４をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０ゲルろ過クロマトグラフィーで溶出した曲線図である。
【図４】本発明の実施例１におけるＨＥ１−ＨＥ６によるマクロファージＲＡＷ２６４．７生存率への影響の図である。
【図４（Ａ）】ＨＥ４−１処理後のマクロファージＲＡＷ２６４．７移動の結果図（１００×）である。
【図４（Ｂ）】ＨＥ４−１処理後のＴｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーの下層細胞数の統計結果図である。
【図４（Ｃ）】ＨＥ４−２処理後のマクロファージＲＡＷ２６４．７移動の結果図（１００×）である。
【図４（Ｄ）】ＨＥ４−２処理後のＴｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーの下層細胞数の統計結果図である。＊ｐ＜０．０５ＶＳ対照群、＊＊ｐ＜０．０１ＶＳ対照群、＃ｐ＜０．０５ＶＳＬＰＳ群。
【図５】本発明の実施例１においてＨＥ４−１をＳｕｐｅｒｄｅｘｐｅｐｔｉｄｅゲルろ過クロマトグラフィーで溶出した曲線図である。
【図６】本発明の実施例１においてＨＥ４−１をＧ１０ゲルろ過クロマトグラフィーで溶出した曲線図である。
【図７】本発明の実施例１におけるＨＥ４−１によるマクロファージＲＡＷ２６４．７移動活性への影響の図であり、図７（Ａ）は、マクロファージＲＡＷ２６４．７移動の結果図（１００×）であり、図７（Ｂ）は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーの下層細胞数の統計結果図である。＊＊ｐ＜０．０１ＶＳ対照群、＃ｐ＜０．０５ＶＳＬＰＳ群。
【図８】本発明の実施例２におけるＨＥ４−１のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。
【図９】本発明の実施例２におけるＨＥ４−１のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ質量スペクトルである。
【図１０】本発明の実施例４におけるＨＥ−ＤによるマクロファージＲＡＷ２６４．７移動活性への影響の図であり、図１０（Ａ）は、ＴｒａｎｓｗｅｌｌＴｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーＨＥ−Ｄに基づくマクロファージＲＡＷ２６４．７移動活性の写真であり、図１０（Ｂ）は、データ統計のヒストグラムである。
【図１１】本発明の実施例５においてＨＥ−Ｄによる、ＬＰＳにより誘導されるＲＡＷ２６４．７細胞中のＪＮＫ、ｐ３８シグナル伝達経路への影響であり、図１１（Ａ）は、ＪＮＫ、ｐ３８シグナル伝達経路のＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ結果図であり、図１１（Ｂ）はＩｍａｇｅ  Ｊデータ処理の結果図である。＊ｐ＜０．０５  ＶＳ  ＬＰＳ群。
【図１２】本発明の実施例６におけるＨＥ−ＤによるＲＡＷ２６４．７細胞貪食能及びリゾチーム分泌能への影響の図であり、図１２（Ａ）は、ＨＥ−Ｄがマクロファージの貪食能へ明らかな影響を与えない場合の図であり、図１２（Ｂ）は、ＨＥ−Ｄがマクロファージのリゾチーム分泌能へ明らかな影響を与えない場合の図である。＊＊＊ｐ＜０．００１  ＶＳ  対照群。
【図１３】本発明の実施例６におけるＨＥ−ＤによるＲＡＷ２６４．７細胞分泌ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αへの影響の図であり、図１３（Ａ）は、ＨＥ−ＤがマクロファージＩＬ−１の分泌能へ明らかな影響を与えない場合の図であり、図１３（Ｂ）は、ＨＥ−ＤがマクロファージＩＬ−６の分泌能へ明らかな影響を与えない場合の図であり、図１３（Ｃ）は、ＨＥ−ＤがマクロファージＩＬ−１２の分泌能へ明らかな影響を与えない場合の図であり、図１３（Ｄ）は、４００、８００μｇ／ｍＬのＨＥ−ＤがＴＮＦ−αの分泌を促進できる場合の図である。＊ｐ＜０．０５  ＶＳ対照群，＊＊＊ｐ＜０．００１  ＶＳ  対照群。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ただし、以下、詳細に説明されるものは、すべて例示的なものであり、本発明に更なる説明を提供するためのものである。別途定義がなされていない限り、本発明において用いられるすべての科学・技術用語は、当業者によって広く理解されているのと同じ意味を有する。
【００２０】
注意すべきものとして、ここで用いられる用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、本発明に係る例示的実施形態を限定することを意図するものではない。ここで用いられるように、前後関係を別途明白に指示しない限り、さもないと単数形態は複数形も含むことを意図し、また、本明細書で「含む」及び／又は「含んでいる」という用語が用いられる場合、特徴、ステップ、操作、要素、ユニット及び／又はそれらの組合せの存在を明記する、ということはさらに理解される。
【００２１】
前記のとおり、ヒルの組成が複雑であるため、生薬の品質を制御しにくく、多くの副作用があり、そのうち、最大の副作用は、出血を引き起こしやすいことであり、このため、ヒル製剤を長期的に服用する患者は、血液凝固を定期的に監視する必要がある。
【００２２】
これに鑑みて、本発明の１つの典型的な実施形態では、ヒルポリペプチドであって、ヒルポリペプチドを構成するアミノ酸主配列がＥＡＧＳＡＫＥＬＥＧＤＰＶＡＧである、ヒルポリペプチドが提供される。該ヒルポリペプチドは、マクロファージの移動活性を阻害する役割を有する。
【００２３】
本発明に記載の合成ヒルログ（略号がＨＥ−Ｄである）は、配列の省略形がＥＡＧＳＡＫＥＬＥＧＤＰＶＡＧ、分子量が１４２９．２９４  Ｄａ、配列がＧｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙである。
Ｇｌｕは、英語名がｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄのアミノ酸の対応する残基を示し、
Ａｌａは、英語名がａｌａｎｉｎｅのアミノ酸の対応する残基を示し、
Ｇｌｙは、英語名がｇｌｉｃｉｎｅのアミノ酸の対応する残基を示し、
Ｓｅｒは、英語名がｓｅｒｉｎｅのアミノ酸の対応する残基を示し、
Ｌｙｓは、英語名がｌｙｓｉｎｅのアミノ酸の対応する残基を示し、
Ｌｅｕは、英語名がｌｅｕｃｉｎｅのアミノ酸の対応する残基を示し、
Ａｓｐは、英語名がａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄのアミノ酸の対応する残基を示し、
Ｐｒｏは、英語名がｐｒｏｌｉｎｅのアミノ酸の対応する残基を示し、
Ｖａｌは、英語名がｖａｌｉｎｅのアミノ酸の対応する残基を示す。
【００２４】
本発明の上記ポリペプチドは、固相ペプチド合成法を用いて人工的に合成することができ、具体的には、前記アミノ酸配列は、標準的なＦｍｏｃスキームを採用しており、樹脂スクリーニングによる合理的なポリペプチド合成法である。目標ポリペプチドのＣ−末端のカルボキシル基を共有結合で不溶性高分子樹脂に連結した後、このアミノ酸のアミノ基を出発点として、他のアミノ酸のカルボキシル基とペプチド結合を形成する。このプロセスを継続的に繰り返すと、目標ポリペプチド産物が得られ得る。合成反応終了後、保護基を除去して、ペプチド鎖を樹脂から分離すると、目標産物が得られる。ポリペプチド合成は、アミノ酸を繰り返して添加する過程であり、Ｃ−末端からＮ−末端へと固相合成される。
【００２５】
試験により証明されるように、本発明によるヒルポリペプチドＨＥ−Ｄは、ＪＮＫ及びｐ３８リン酸化レベルを調整することによりマクロファージの移動を阻害する役割を果たすことができる。ＨＥ−Ｄは、基本的にはマクロファージの生物学的機能に影響を与えずにマクロファージの移動を阻害し、ＨＥ−Ｄの副作用を効果的に低減できる。したがって、合成ヒルログＨＥ−Ｄはアテローム性動脈硬化の早期予防に使用でき、ＡＳのさらなる進行を防ぐ潜在力がある。
【００２６】
本発明のさらに別の特定の実施形態では、前記ヒルポリペプチドフラグメントであって、アミノ酸主配列が、このヒルポリペプチドのアミノ酸主配列と７０％以上の同一性及び９０％以上の類似性を有し、フラグメントは、前記１５個のアミノ酸の配列について、任意の位置で３個、４個又は５個のアミノ酸で構成され、前記ヒルポリペプチドと同じ生物学的活性を有するヒルポリペプチドに切断したものである。
【００２７】
本発明のさらに別の特定の実施形態では、マクロファージの移動を阻害するヒルポリペプチドの類似体であって、前記ヒルポリペプチドと同じ生物学的活性を有し、前記類似体は、前記ヒルポリペプチドを別の化合物と融合し、又は前記ヒルポリペプチドのアミノ酸配列を別のポリペプチド又はタンパク質と融合してなる、生物学的活性を有するポリペプチド配列又はタンパク質である、ヒルポリペプチドの類似体が提供される。
【００２８】
本発明のさらに別の特定の実施形態では、マクロファージの移動を阻害するヒルポリペプチド誘導体であって、アミノ酸配列が、ヒルポリペプチドのアミノ酸主配列と７０％以上の同一性及び９０％以上の類似性を有し、該誘導体は、前記アミノ酸配列中の１つ又はいくつかのアミノ酸のある基を別の基で置換した、前記ヒルポリペプチドと同じ生物学的活性を有するヒルポリペプチドを指す、ヒルポリペプチド誘導体が提供される。
【００２９】
本発明のさらに別の特定の実施形態では、マクロファージの移動を阻害するヒルポリペプチド変異体であって、アミノ酸配列が、ヒルポリペプチドのアミノ酸主配列と７０％以上の同一性及び９０％以上の類似性を有し、該変異体は、１つ又は複数のアミノ酸又はヌクレオチドが変化したアミノ酸配列、又はそれらをコードするヌクレオチド配列を指し、前記変化は、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列において、配列の途中の任意の位置で、アミノ酸又はヌクレオチドを削除、挿入又は置換するか、配列の両端にアミノ酸又はヌクレオチドを追加することを含む、ヒルポリペプチド変異体が提供される。
【００３０】
本発明のさらに別の特定の実施形態では、前記ヒルポリペプチド、ヒルポリペプチドフラグメント、ヒルポリペプチドの類似体、ヒルポリペプチド誘導体又はヒルポリペプチド変異体をコードするヌクレオチドであって、
（ａ）前記アミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのフラグメント、類似体、誘導体又は変異体をコードするヌクレオチド群と、
（ｂ）（ａ）に記載されている前記ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド群と、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載されているヌクレオチドと７５％以上の同一性を持つヌクレオチド群とのいずれかを含む、ヌクレオチドが提供される。
【００３１】
前記ヌクレオチドは、人工合成方法によって調製される。
【００３２】
本発明のさらに別の特定の実施形態では、上記ヒルポリペプチド、ヒルポリペプチドフラグメント、ヒルポリペプチドの類似体、ヒルポリペプチド誘導体及びヒルポリペプチド変異体のアテローム性動脈硬化症など、マクロファージの移動により引き起こされる一連の関連疾患を予防及び／又は治療し、関連疾患の発症及び関連疾患の発症の悪性度を診断及び検出する医薬品の調製における使用が提供される。前記疾患には、アテローム性動脈硬化症が含まれる。
【００３３】
本発明のさらに別の特定の実施形態では、ヒルポリペプチドの、プロテアーゼ阻害剤又は促進剤又は親和性試薬である医薬品又は検出試薬の調製における使用。
【００３４】
以下の実施例は本発明をさらに説明するが、本発明の限定を構成するものではない。なお、これらの実施例は、本発明を説明するために過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００３５】
実施例１  ヒルログの分離精製
本実施例では、酵素分解法を使用して、ウマビルからヒル酵素分解物ＨＥを調製した。ＬＰＳ誘導マクロファージＲＡＷ２６４．７移動モデルを作成した後、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバー検出により、ＨＥがマクロファージの移動を濃度依存的に阻害できることを発見した。次に、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ強塩基性陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０、Ｓｕｐｅｒｄｅｘｐｅｐｔｉｄｅ及びＧ１０ゲルカラムクロマトグラフィーを使用して、ＨＥを分離して精製し、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ実験と組み合わせて活性追跡を行い、最終的に、マクロファージＲＡＷ２６４．７移動阻害活性を有するヒルログＨＥ４−１を分離した。
【００３６】
ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ強塩基性アニオンカラムを使用してＨＥに対して一回目の分離を行い、図１に示すように、ＨＥは合計６つのピークを分離し、溶出した各ピークの産物を収集し、アルコール沈殿で脱塩した後、凍結乾燥させてＨＥ１−ＨＥ６を得た。
【００３７】
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーを使用して、ＨＥ１−ＨＥ６によるマクロファージ移動阻害活性を検出した結果、図２に示すように、ＬＰＳ誘導後、マクロファージ移動活性は大幅に増加した。６種類の溶出産物を追加して処理したところ、ＨＥ３及びＨＥ４は、マクロファージＲＡＷ２６４．７のＬＰＳ誘導移動を大幅に阻害できる。ＨＥ３溶出物の収量が低く、高濃度でのみ移動阻害活性があることを考慮して、次に主にＨＥ４をさらに分離して精製した。
【００３８】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０ゲルカラムを使用してＨＥ４を分離すると、図３に示すように、ＨＥ４は合計２つのピークを分離し、溶出ピーク産物を収集し、アルコール沈殿で脱塩して、凍結乾燥させ、溶出産物ＨＥ４−１及びＨＥ４−２を得た。
【００３９】
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーを使用して、ＨＥ４−１及びＨＥ４−２のマクロファージ移動阻害活性を検出した結果、図４に示すように、８００μｇ／ｍＬのＨＥ４−１は、ＬＰＳによって誘導されるマクロファージＲＡＷ２６４．７の移動を大幅に阻害でき、その阻害率は１５．２％に達した。
【００４０】
ＨＥ４−１をＳｕｐｅｒｄｅｘｐｅｐｔｉｄｅゲルろ過クロマトグラフィーにかけた結果、図５に示されるように、単一のピークであるＨＥ４−１のみが溶出された。次に、ＨＥ４−１をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０ゲルカラムに通して脱塩処理し（図６）、塩のピークの前のＨＥ４−１ピークを最終的な分離及び精製産物として収集した。
【００４１】
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーを使用して、最終溶出産物ＨＥ４−１のマクロファージＲＡＷ２６４．７移動阻害活性を検出した結果、図７に示すように、１μｇ／ｍＬのＬＰＳは、マクロファージの移動を大幅に促進でき、８００μｇ／ｍＬのＨＥ４−１はＬＰＳによって誘導されるマクロファージＲＡＷ２６４．７の移動を阻害でき、その阻害率は１５．２％に達した。
【００４２】
実施例２  ヒルログのシーケンシング
ヒルログＨＥ４−１を北京華大蛋白に送り、ＬＣ−ＥＳＩ−ＱＵＡＤ−ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳによってアミノ酸配列を検出した。クロマトグラフィーカラム：Ｔｒａｐカラム：ＡｃｃｌａｉｍＰｅＰｍａｐ１００（７５μｍ×２ｃｍ、３μｍ、１００Ａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；分析カラム：華大蛋白自作スプレーニードル一体型カラム；パッキング：Ｖｅｎｕｓｉｌ×ＢＰＣ、Ｃ１８（Ｌ）、５μｍ、１５０Ａ（ＡｇｅｌａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。クロマトグラフィー条件：移動相Ａ  ０．１％ギ酸水溶液、移動相Ｂ  ０．１％ギ酸アセトニトリル；勾配溶出条件：０−４８ｍｉｎ、Ａ：９５％−２０％、Ｂ：５％−８０％；４８−５６ｍｉｎ  Ａ  ：２０％−２０％、Ｂ：８０％−８０％；流速０．４μＬ／ｍｉｎ。
【００４３】
高分解能質量分析の結果、ヒルログＨＥ４−１の分子量は１４２９．２９４Ｄａ（図８を参照）で、アミノ酸配列はＥＡＧＳＡＫＥＬＥＧＤＰＶＡＧ（図９を参照）であった。
【００４４】
実施例３  ヒルログＨＥ−Ｄの全合成
測定したアミノ酸配列であるＧｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙを生工生物工程（上海）に送り、ポリペプチドを合成し、合成ペプチドをＨＥ−Ｄと命名し、ＨＰＬＣ検出の結果、その純度は９５％以上であり、構造はＥＳＩ−ＭＳで同定された。
【００４５】
実施例４  合成ヒルログＨＥ−Ｄのマクロファージ移動阻害活性
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーを使用して、ＨＥ−ＤのマクロファージＲＡＷ２６４．７移動阻害活性を検出し、実験は、空白対照群、ＬＰＳモデリング群、ＨＥ−Ｄ２００、４００、８００μｇ／ｍＬ群を含む５群に分けられた。その結果、図１０に示すように、１μｇ／ｍＬのＬＰＳはマクロファージの移動を大幅に促進でき、８００−μｇ／ｍＬのＨＥ−ＤはＬＰＳによって誘発されるマクロファージＲＡＷ２６４．７の移動を阻害でき、その阻害率は１４．９％に達した。
【００４６】
実施例５  合成ヒルログＨＥ−Ｄによるマクロファージ移動のシグナル伝達経路阻害についての研究
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ実験を使用して、ＨＥ−ＤがマクロファージＲＡＷ２６４．７に対する阻害作用を検出した結果、図１１に示すように、ＨＥ−ＤはＪＮＫ及びｐ３８総タンパク質の発現に有意な影響を与えないが、８００−μｇ／ｍＬのＨＥ−Ｄは、ＬＰＳによって誘導されるＪＮＫ及びｐ３８リン酸化タンパク質の発現量の上昇を大幅に阻害でき、これは、ＨＥ−ＤがＪＮＫ及びｐ３８リン酸化レベルを調整することによりマクロファージの移動を阻害できる役割を果たすことを示している。
【００４７】
実施例６  マクロファージの生物学的機能に対する合成ヒルログＨＥ−Ｄの影響
マクロファージＲＡＷ２６４．７の貪食能とリゾチーム活性に対するＨＥ−Ｄの影響を、ニュートラルレッド貪食実験とリゾチーム活性測定実験によって検出した。その結果、図１２に示すように、１μｇ／ｍＬのＨＥ−Ｄは、マクロファージの貪食能及びリゾチーム活性を明らかに向上させ、０−８００μｇ／ｍＬのＨＥ−Ｄは、マクロファージＲＡＷ２６４．７の貪食能及びリゾチーム活性に有意な影響を与えなかった。
【００４８】
マクロファージＲＡＷ２６４．７による炎症関連因子ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、及びＴＮＦ−αの分泌に対するＨＥ−Ｄの影響を、ＥＬＩＳＡ法によって検出した。その結果、図１３に示すように、１μｇ／ｍＬのＬＰＳは、４種類の炎症性因子の放出を大幅に促進し、０−８００μｇ／ｍＬのＨＥ−Ｄは、３種類の炎症誘発性因子ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２マクロファージの分泌能に明らかな影響がなく、４００、８００μｇ／ｍＬのＨＥ−Ｄは、ＴＮＦ−αの分泌を促進できるが、その影響が少なく、最大で１１．４％上昇した。
【００４９】
前記のとおり、ＨＥ−ＤはＪＮＫ及びｐ３８総タンパク質の発現に有意な影響を与えないが、８００μｇ／ｍＬのＨＥ−Ｄは、ＬＰＳによって誘導されるＪＮＫ及びｐ３８リン酸化タンパク質の発現量の上昇を大幅に阻害でき、これは、ＨＥ−Ｄが、ＪＮＫ及びｐ３８リン酸化レベルを調節することにより、マクロファージの移動を阻害する役割を果たせることを示した。ＨＥ−Ｄは、基本的にはマクロファージの生物学的機能に影響を与えずにマクロファージの移動を阻害し、ＨＥ−Ｄの副作用を効果的に低減することができた。したがって、合成ヒルログＨＥ−Ｄは、アテローム性動脈硬化の早期予防に使用でき、ＡＳのさらなる進行を防ぐ潜在力があった。
【００５０】
最後に、以上は、本発明の好適な実施例にすぎず、本発明を限定するためのものではなく、前述実施例を参照しながら本発明について詳細に説明したが、当業者にとっては、前述実施例に記載された技術案を改定したり、その一部に対して等価置換を行ったりすることができることに留意すべきである。本発明の趣旨とその実質を逸脱しない場合に、いかなる改定、等価置換、改良などは、いずれも本発明の特許請求の範囲内に含まれる。以上、本発明の特定の実施形態について説明したが、本発明の特許請求の範囲を限定するものではなく、当業者であれば、本発明の技術案を基礎として、当業者が進歩性のある労働を必要とせずに得られる様々な改定や変形は、本発明の特許請求の範囲内に属する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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