(57)【要約】ある特定の態様では、本開示は、多特異性バインダー（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＴｆｉＲＵポリペプチドを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を提供する。本開示は、かかる多特異性バインダー（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）が、種々の障害または状態を処置するために使用され得ることをさらに提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドの多特異性バインダーを提供する。一部の実施形態では、多特異性バインダータンパク質は、ａ）ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３のうち少なくとも１つ、ならびにｂ）アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８のうち少なくとも１つ、に結合することが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＴβＲＩＩポリペプチドを含むヘテロマルチマー。
【請求項２】
前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドが、
ａ．配列番号５０の２１〜３０位のいずれか１つで始まり配列番号５０の１１０〜１３５位のいずれか１つで終わる配列；
ｂ．配列番号５０の２１位で始まり配列番号５０の１３５位で終わる配列；
ｃ．配列番号５０の３０位で始まり配列番号５０の１１０位で終わる配列；
ｄ．配列番号５１の配列；または
ｅ．配列番号５２の配列
に対して少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のヘテロマルチマー。
【請求項３】
前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドが、
ａ．配列番号５０の２１〜３０位のいずれか１つで始まり配列番号５０の１１０〜１３５位のいずれか１つで終わる配列；
ｂ．配列番号５０の２１位で始まり配列番号５０の１３５位で終わる配列；
ｃ．配列番号５０の３０位で始まり配列番号５０の１１０位で終わる配列；
ｄ．配列番号５１の配列；または
ｅ．配列番号５２の配列
に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のヘテロマルチマー。
【請求項４】
前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドが、
ａ．配列番号５０の２１〜３０位のいずれか１つで始まり配列番号５０の１１０〜１３５位のいずれか１つで終わる配列；
ｂ．配列番号５０の２１位で始まり配列番号５０の１３５位で終わる配列；
ｃ．配列番号５０の３０位で始まり配列番号５０の１１０位で終わる配列；
ｄ．配列番号５１の配列；または
ｅ．配列番号５２の配列
に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のヘテロマルチマー。
【請求項５】
前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドが、
ａ．配列番号５０の２１〜３０位のいずれか１つで始まり配列番号５０の１１０〜１３５位のいずれか１つで終わる配列；
ｂ．配列番号５０の２１位で始まり配列番号５０の１３５位で終わる配列；
ｃ．配列番号５０の３０位で始まり配列番号５０の１１０位で終わる配列；
ｄ．配列番号５１の配列；または
ｅ．配列番号５２の配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のヘテロマルチマー。
【請求項６】
前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドが、
ａ．ＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＡ部分；および
ｂ．異種部分
を含む融合タンパク質である、請求項１に記載のヘテロマルチマー。
【請求項７】
前記ＡｃｔＲＩＩＡ部分が、
ａ．配列番号５０の２１〜３０位のいずれか１つで始まり配列番号５０の１１０〜１３５位のいずれか１つで終わる配列；
ｂ．配列番号５０の２１位で始まり配列番号５０の１３５位で終わる配列；
ｃ．配列番号５０の３０位で始まり配列番号５０の１１０位で終わる配列；
ｄ．配列番号５１の配列；または
ｅ．配列番号５２の配列
に対して少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のヘテロダイマー。
【請求項８】
前記ＡｃｔＲＩＩＡ部分が、
ａ．配列番号５０の２１〜３０位のいずれか１つで始まり配列番号５０の１１０〜１３５位のいずれか１つで終わる配列；
ｂ．配列番号５０の２１位で始まり配列番号５０の１３５位で終わる配列；
ｃ．配列番号５０の３０位で始まり配列番号５０の１１０位で終わる配列；
ｄ．配列番号５１の配列；または
ｅ．配列番号５２の配列
に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のヘテロマルチマー。  
【請求項９】
前記ＡｃｔＲＩＩＡ部分が、
ａ．配列番号５０の２１〜３０位のいずれか１つで始まり配列番号５０の１１０〜１３５位のいずれか１つで終わる配列；
ｂ．配列番号５０の２１位で始まり配列番号５０の１３５位で終わる配列；
ｃ．配列番号５０の３０位で始まり配列番号５０の１１０位で終わる配列；
ｄ．配列番号５１の配列；または
ｅ．配列番号５２の配列
に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のヘテロマルチマー。
【請求項１０】
前記ＡｃｔＲＩＩＡ部分が、
ａ．配列番号５０の２１〜３０位のいずれか１つで始まり配列番号５０の１１０〜１３５位のいずれか１つで終わる配列；
ｂ．配列番号５０の２１位で始まり配列番号５０の１３５位で終わる配列；
ｃ．配列番号５０の３０位で始まり配列番号５０の１１０位で終わる配列；
ｄ．配列番号５１の配列；および
ｅ．配列番号５２の配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のヘテロマルチマー。
【請求項１１】
前記異種部分が、相互作用対の第１または第２のメンバーを含む、請求項６から１０のいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項１２】
前記異種部分が、ヘテロダイマー形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸改変を含む、請求項６から１１のいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項１３】
前記異種部分が、免疫グロブリンＦｃドメインである、請求項６から１２のいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項１４】
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、ヒト免疫グロブリンＦｃドメインである、請求項１３に記載のヘテロマルチマー。
【請求項１５】
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、免疫グロブリンＧ１Ｆｃドメインである、請求項１３または１４に記載のヘテロマルチマー。
【請求項１６】
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、
ａ．配列番号６８のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３５６位にリシン（Ｋ）および３９９位にＫを含む、配列；
ｂ．配列番号６９のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３９２位にアスパラギン酸（Ｄ）および４０９位にＤを含む、配列；
ｃ．配列番号７２のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３５４位にシステイン（Ｃ）および３６６位にトリプトファン（Ｗ）を含む、配列；または
ｄ．配列番号７３のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３４９位にＣ、３６６位にセリン（Ｓ）、３６８位にアラニン（Ａ）および４０７位にバリンを含む、配列
に対して少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のヘテロマルチマー。
【請求項１７】
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、
ａ．配列番号６８のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３５６位にリシン（Ｋ）および３９９位にＫを含む、配列；
ｂ．配列番号６９のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３９２位にアスパラギン酸（Ｄ）および４０９位にＤを含む、配列；
ｃ．配列番号７２のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３５４位にシステイン（Ｃ）および３６６位にトリプトファン（Ｗ）を含む、配列；または
ｄ．配列番号７３のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３４９位にＣ、３６６位にセリン（Ｓ）、３６８位にアラニン（Ａ）および４０７位にバリンを含む、配列
に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のヘテロマルチマー。
【請求項１８】
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、
ａ．配列番号６８のアミノ酸配列；
ｂ．配列番号６９のアミノ酸配列；
ｃ．配列番号７２のアミノ酸配列；および
ｄ．配列番号７３のアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のヘテロマルチマー。
【請求項１９】
前記融合タンパク質が、前記ＡｃｔＲＩＩＡ部分と前記異種部分との間に配置されたリンカードメイン部分をさらに含む、請求項６から１８のいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項２０】
リンカーが、１０アミノ酸長から２５アミノ酸長の間である、請求項１９に記載のヘテロマルチマー。
【請求項２１】
リンカーが、
ａ．（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは２以上である）；
ｂ．（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは３以上である）；
ｃ．（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは４以上である）；ならびに
ｄ．配列番号４〜７、１９、２１、２５、２６、４０および６３〜６７のうちいずれか１つのアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のヘテロマルチマー。
【請求項２２】
リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、式中、ｎは５以上ではない、請求項１９に記載のヘテロマルチマー。
【請求項２３】
ＡｃｔＲＩＩＡ融合タンパク質が、配列番号８４のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％または９９％同一なアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のヘテロマルチマー。
【請求項２４】
ＡｃｔＲＩＩＡ融合タンパク質が、配列番号８４のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のヘテロマルチマー。
【請求項２５】
ＡｃｔＲＩＩＡ融合タンパク質が、配列番号９０のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％または９９％同一なアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のヘテロマルチマー。
【請求項２６】
ＡｃｔＲＩＩＡ融合タンパク質が、配列番号９０のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のヘテロマルチマー。
【請求項２７】
前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドが、
ａ）配列番号５１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列、および１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分；
ｂ）配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列、および５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、リンカー部分；
ｃ）配列番号６８、６９、７２または７３から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列、および２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、異種部分；ならびに
ｄ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）
からなる、またはそれらから本質的になる、請求項６に記載のヘテロマルチマー。
【請求項２８】
前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドが、
ａ）配列番号５１のアミノ酸配列、および１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分；
ｂ）配列番号６のアミノ酸配列、および５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、リンカー部分；
ｃ）配列番号６８、６９、７２または７３から選択されるアミノ酸配列、および２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、異種部分；
ｄ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）
からなる、またはそれらから本質的になる、請求項６に記載のヘテロマルチマー。
【請求項２９】
前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドが、
ａ）配列番号５１の配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分；
ｂ）配列番号６８、６９、７２または７３から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列を含む異種部分；および
ｃ）前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分と前記異種部分とを接続するリンカー部分であって、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列を含む、リンカー部分
を含む、請求項６に記載のヘテロマルチマー。
【請求項３０】
前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドが、
ａ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分；
ｂ）配列番号６８、６９、７２、または７３から選択されるアミノ酸配列を含む異種部分；および
ｃ）前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分と前記異種部分とを接続するリンカー部分であって、配列番号６のアミノ酸配列を含む、リンカー部分
を含む、請求項６に記載のヘテロマルチマー。
【請求項３１】
可溶性である、先行する請求項のいずれかに記載のヘテロマルチマー。
【請求項３２】
組換えタンパク質である、請求項２７に記載のヘテロマルチマー。
【請求項３３】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、
ａ．配列番号１の２３〜３５位のいずれか１つで始まり配列番号１の１５３〜１５９位のいずれか１つで終わる配列；
ｂ．配列番号２の２３〜６０位のいずれか１つで始まり配列番号２の１７８〜１８４位のいずれか１つで終わる配列；
ｃ．配列番号１８の配列；
ｄ．配列番号２７の配列；または
ｅ．配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８および３９のうちいずれか１つの配列
に対して少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のヘテロマルチマー。
【請求項３４】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、
ａ．配列番号１の２３〜３５位のいずれか１つで始まり配列番号１の１５３〜１５９位のいずれか１つで終わる配列；
ｂ．配列番号２の２３〜６０位のいずれか１つで始まり配列番号２の１７８〜１８４位のいずれか１つで終わる配列；
ｃ．配列番号１８の配列；
ｄ．配列番号２７の配列；または
ｅ．配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８および３９のうちいずれか１つの配列
に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載のヘテロマルチマー。
【請求項３５】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、
ａ．配列番号１の２３〜３５位のいずれか１つで始まり配列番号１の１５３〜１５９位のいずれか１つで終わる配列；
ｂ．配列番号２の２３〜６０位のいずれか１つで始まり配列番号２の１７８〜１８４位のいずれか１つで終わる配列；
ｃ．配列番号１８の配列；
ｄ．配列番号２７の配列；または
ｅ．配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８および３９のうちいずれか１つの配列
に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載のヘテロマルチマー。
【請求項３６】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、
ａ．配列番号１の２３〜３５位のいずれか１つで始まり配列番号１の１５３〜１５９位のいずれか１つで終わる配列；
ｂ．配列番号２の２３〜６０位のいずれか１つで始まり配列番号２の１７８〜１８４位のいずれか１つで終わる配列；
ｃ．配列番号１８の配列；
ｄ．配列番号２７の配列；ならびに
ｅ．配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８および３９のうちいずれか１つの配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載のヘテロマルチマー。
【請求項３７】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号１８の配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のヘテロマルチマー。
【請求項３８】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のヘテロマルチマー。
【請求項３９】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、
ａ．ＴβＲＩＩの細胞外ドメインを含むＴβＲＩＩ部分；および
ｂ．異種部分
を含む融合タンパク質である、請求項１に記載のヘテロマルチマー。
【請求項４０】
前記ＴβＲＩＩ部分が、
ａ．配列番号１の２３〜３５位のいずれか１つで始まり配列番号１の１５３〜１５９位のいずれか１つで終わる配列；
ｂ．配列番号２の２３〜６０位のいずれか１つで始まり配列番号２の１７８〜１８４位のいずれか１つで終わる配列；
ｃ．配列番号１８の配列；
ｄ．配列番号２７の配列；または
ｅ．配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８および３９のうちいずれか１つの配列
に対して少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載のヘテロダイマー。
【請求項４１】
前記ＴβＲＩＩ部分が、
ａ．配列番号１の２３〜３５位のいずれか１つで始まり配列番号１の１５３〜１５９位のいずれか１つで終わる配列；
ｂ．配列番号２の２３〜６０位のいずれか１つで始まり配列番号２の１７８〜１８４位のいずれか１つで終わる配列；
ｃ．配列番号１８の配列；
ｄ．配列番号２７の配列；または
ｅ．配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８および３９のうちいずれか１つの配列
に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載のヘテロマルチマー。
【請求項４２】
前記ＴβＲＩＩ部分が、
ａ．配列番号１の２３〜３５位のいずれか１つで始まり配列番号１の１５３〜１５９位のいずれか１つで終わる配列；
ｂ．配列番号２の２３〜６０位のいずれか１つで始まり配列番号２の１７８〜１８４位のいずれか１つで終わる配列；
ｃ．配列番号１８の配列；
ｄ．配列番号２７の配列；または
ｅ．配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８および３９のうちいずれか１つの配列
に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項４１に記載のヘテロマルチマー。
【請求項４３】
前記ＴβＲＩＩ部分が、
ａ．配列番号１の２３〜３５位のいずれか１つで始まり配列番号１の１５３〜１５９位のいずれか１つで終わる配列；
ｂ．配列番号２の２３〜６０位のいずれか１つで始まり配列番号２の１７８〜１８４位のいずれか１つで終わる配列；
ｃ．配列番号１８の配列；
ｄ．配列番号２７の配列；ならびに
ｅ．配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８および３９のうちいずれか１つの配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載のヘテロマルチマー。
【請求項４４】
前記異種部分が、相互作用対の第１または第２のメンバーを含む、請求項３９から４３のいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項４５】
前記異種部分が、ヘテロダイマー形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸改変を含む、請求項３９から４４のいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項４６】
前記異種部分が、免疫グロブリンＦｃドメインである、請求項３９から４５のいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項４７】
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、ヒト免疫グロブリンＦｃドメインである、請求項４６に記載のヘテロマルチマー。
【請求項４８】
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、免疫グロブリンＧ１Ｆｃドメインである、請求項４６または４７に記載のヘテロマルチマー。
【請求項４９】
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、
ａ．配列番号６８のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３５６位にリシン（Ｋ）および３９９位にＫを含む、配列；
ｂ．配列番号６９のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３９２位にアスパラギン酸（Ｄ）および４０９位にＤを含む、配列；
ｃ．配列番号７２のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３５４位にシステイン（Ｃ）および３６６位にトリプトファン（Ｗ）を含む、配列；または
ｄ．配列番号７３のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３４９位にＣ、３６６位にセリン（Ｓ）、３６８位にアラニン（Ａ）および４０７位にバリンを含む、配列
に対して少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載のヘテロマルチマー。
【請求項５０】
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、
ａ．前記配列番号６８のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３５６位にリシン（Ｋ）および３９９位にＫを含む、配列；
ｂ．前記配列番号６９のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３９２位にアスパラギン酸（Ｄ）および４０９位にＤを含む、配列；
ｃ．前記配列番号７２のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３５４位にシステイン（Ｃ）および３６６位にトリプトファン（Ｗ）を含む、配列；または
ｄ．前記配列番号７３のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３４９位にＣ、３６６位にセリン（Ｓ）、３６８位にアラニン（Ａ）および４０７位にバリンを含む、配列
に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項４９に記載のヘテロマルチマー。
【請求項５１】
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、
ａ．前記配列番号６８のアミノ酸配列；
ｂ．前記配列番号６９のアミノ酸配列；
ｃ．前記配列番号７２のアミノ酸配列；および
ｄ．前記配列番号７３のアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５０に記載のヘテロマルチマー。
【請求項５２】
前記融合タンパク質が、前記ＴβＲＩＩ部分と前記異種部分との間に配置されたリンカードメイン部分をさらに含む、請求項３９から５１のいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項５３】
リンカーが、１０アミノ酸長から２５アミノ酸長の間である、請求項５２に記載のヘテロマルチマー。
【請求項５４】
リンカーが、
ａ．（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは２以上である）；
ｂ．（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは３以上である）；
ｃ．（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは４以上である）；ならびに
ｄ．配列番号４〜７、１９、２１、２５、２６、４０および６３〜６７のうちいずれか１つのアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載のヘテロマルチマー。
【請求項５５】
リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、式中、ｎは５以上ではない、請求項５２に記載のヘテロマルチマー。
【請求項５６】
ＴβＲＩＩ融合タンパク質が、配列番号８７のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％または９９％同一なアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載のヘテロマルチマー。
【請求項５７】
ＴβＲＩＩ融合タンパク質が、配列番号８７のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載のヘテロマルチマー。
【請求項５８】
ＴβＲＩＩ融合タンパク質が、配列番号９３のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％または９９％同一なアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載のヘテロマルチマー。
【請求項５９】
ＴβＲＩＩ融合タンパク質が、配列番号９３のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載のヘテロマルチマー。
【請求項６０】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、
ａ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列、および１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、ＴβＲＩＩポリペプチド部分；
ｂ）配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列、および５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、リンカー部分；
ｃ）配列番号６８、６９、７２または７３から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列、および２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、異種部分；ならびに
ｄ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）
からなる、またはそれらから本質的になる、請求項３９に記載のヘテロマルチマー。
【請求項６１】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、
ａ）配列番号１８のアミノ酸配列、および１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、ＴβＲＩＩポリペプチド部分；
ｂ）配列番号６のアミノ酸配列、および５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、リンカー部分；
ｃ）配列番号６８、６９、７２または７３から選択されるアミノ酸配列、および２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、異種部分；ならびに
ｄ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）
からなる、またはそれらから本質的になる、請求項３９に記載のヘテロマルチマー。
【請求項６２】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、
ａ）配列番号１８の配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列を含むＴβＲＩＩポリペプチド部分；
ｂ）配列番号６８、６９、７２または７３から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列を含む異種部分；および
ｃ）前記ＴβＲＩＩポリペプチド部分と前記異種部分とを接続するリンカー部分であって、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列を含む、リンカー部分
を含む、請求項３９に記載のヘテロマルチマー。
【請求項６３】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、
ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＴβＲＩＩポリペプチド部分；
ｂ）配列番号６８、６９、７２または７３から選択されるアミノ酸配列を含む異種部分；および
ｃ）前記ＴβＲＩＩポリペプチド部分と前記異種部分とを接続するリンカー部分であって、配列番号６のアミノ酸配列を含む、リンカー部分
を含む、請求項３９に記載のヘテロマルチマー。
【請求項６４】
グリコシル化されたアミノ酸、ＰＥＧ化されたアミノ酸、ファルネシル化されたアミノ酸、アセチル化されたアミノ酸、ビオチン化されたアミノ酸、および脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸から選択される１つまたは複数の改変されたアミノ酸残基を含む、請求項１から６３のいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項６５】
グリコシル化されている、請求項６４に記載のヘテロマルチマー。
【請求項６６】
ＣＨＯ細胞における前記ポリペプチドの発現に特徴的なグリコシル化パターンを有する、請求項６５に記載のヘテロマルチマー。
【請求項６７】
ＣＨＯ細胞における前記ポリペプチドの発現に特徴的なグリコシル化パターンを有する、請求項６６に記載のヘテロマルチマー。
【請求項６８】
ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３のうち１つまたは複数に結合する、請求項１から６７のいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項６９】
レポーター遺伝子アッセイを使用して決定される、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３シグナル伝達のうち１つまたは複数を阻害する、請求項１から６８のいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項７０】
ヘテロダイマーである、請求項１から６９のいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項７１】
単離されている、請求項１から７０のいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項７２】
組換えである、請求項１から７０のいずれか一項に記載のヘテロマルチマー。
【請求項７３】
先行する請求項のいずれかの前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたは融合タンパク質のコード配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７４】
先行する請求項のいずれかの前記ＴβＲＩＩポリペプチドまたは融合タンパク質のコード配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７５】
先行する請求項のいずれかの前記ＴβＲＩＩポリペプチドまたは融合タンパク質および前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたは融合タンパク質のコード配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７６】
請求項７３から７５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項７７】
請求項７３から７６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項７８】
ＣＨＯ細胞である、請求項９５に記載の細胞。
【請求項７９】
請求項１から７２のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬調製物。
【請求項８０】
ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＴβＲＩＩポリペプチドを含むヘテロマルチマーを作製する方法であって、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＴβＲＩＩポリペプチドの発現に適切な条件下で細胞を培養するステップを含み、前記細胞が、請求項７３に記載の組換えポリヌクレオチドおよび請求項７４に記載の組換えポリヌクレオチドを含む、方法。
【請求項８１】
ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＴβＲＩＩポリペプチドを含むヘテロマルチマーを作製する方法であって、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＴβＲＩＩポリペプチドの発現に適切な条件下で細胞を培養するステップを含み、前記細胞が、請求項７５に記載の組換えポリヌクレオチドを含む、方法。
【請求項８２】
ＴβＲＩＩポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを含むヘテロマルチマーを作製する方法であって、
ａ）ＴβＲＩＩポリペプチドの発現に適切な条件下で第１の細胞を培養するステップであって、前記第１の細胞が、請求項７４に記載の組換えポリヌクレオチドを含む、ステップ；
ｂ）そうして発現された前記ＴβＲＩＩポリペプチドを回収するステップ；
ｃ）ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの発現に適切な条件下で第２の細胞を培養するステップであって、前記第２の細胞が、請求項７３に記載の組換えポリヌクレオチドを含む、ステップ；
ｄ）そうして発現された前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを回収するステップ；
ｅ）ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー形成に適切な条件下で、回収されたＴβＲＩＩポリペプチドおよび回収されたＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを組み合わせるステップ
を含む、方法。
【請求項８３】
ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーに対する細胞の応答をモジュレートする方法であって、前記細胞を、請求項１から７２のいずれか一項に記載のヘテロマルチマーに曝露させるステップを含む、方法。
【請求項８４】
それを必要とする患者においてＴＧＦβスーパーファミリーメンバーと関連する疾患または状態を処置する方法であって、前記患者に、有効量の請求項１から７２のいずれか一項に記載のヘテロマルチマーまたは請求項７９に記載の医薬調製物を投与するステップを含む、方法。
【請求項８５】
それを必要とする患者において肺関連疾患または状態を処置する方法であって、前記患者に、有効量の請求項１から７２のいずれか一項に記載のヘテロマルチマーまたは請求項７９に記載の医薬調製物を投与するステップを含む、方法。
【請求項８６】
前記肺関連疾患または状態が、肺高血圧症、肺動脈性肺高血圧症および特発性肺線維症から選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
それを必要とする患者においてがんを処置する方法であって、前記患者に、有効量の請求項１から７２のいずれか一項に記載のヘテロマルチマーまたは請求項７９に記載の医薬調製物を投与するステップを含む、方法。
【請求項８８】
それを必要とする患者において腎臓関連疾患または状態を処置する方法であって、前記患者に、有効量の請求項１から７２のいずれか一項に記載のヘテロマルチマーまたは請求項７９に記載の医薬調製物を投与するステップを含む、方法。
【請求項８９】
前記腎臓関連疾患または状態が、アルポート症候群、慢性腎臓疾患、多発性嚢胞腎疾患および腎線維症から選択される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
それを必要とする患者において貧血または貧血関連疾患もしくは状態を処置する方法であって、前記患者に、有効量の請求項１から７２のいずれか一項に記載のヘテロマルチマーまたは請求項７９に記載の医薬調製物を投与するステップを含む、方法。
【請求項９１】
前記貧血関連疾患または状態が、サラセミア、骨髄異形成症候群、骨髄線維症および鎌状赤血球症から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
ＴβＲＩＩポリペプチドおよびフォリスタチンポリペプチドを含む多特異性バインダータンパク質。
【請求項９３】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号１７０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項９２に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項９４】
前記フォリスタチンポリペプチドが、配列番号１１１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項９２または９３に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項９５】
異種部分をさらに含む、請求項９２から９４のいずれか一項に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項９６】
前記異種部分が、Ｆｃドメインである、請求項９５に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項９７】
前記Ｆｃドメインが、配列番号１６３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項９６に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項９８】
前記異種部分が、前記フォリスタチンポリペプチドと前記ＴβＲＩＩポリペプチドとの間にある、請求項９５から９７のいずれか一項に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項９９】
前記異種部分が、前記フォリスタチンポリペプチドに直接コンジュゲートされている、請求項９８に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１００】
前記異種部分が、リンカーによって前記フォリスタチンポリペプチドにコンジュゲートされている、請求項９８に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１０１】
前記リンカーが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１００に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１０２】
前記異種部分が、前記ＴβＲＩＩポリペプチドに直接コンジュゲートされている、請求項９８から１０１のいずれか一項に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１０３】
前記異種部分が、リンカーによって前記ＴβＲＩＩポリペプチドにコンジュゲートされている、請求項９８から１０１のいずれか一項に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１０４】
前記異種部分を前記ＴβＲＩＩポリペプチドにコンジュゲートしている前記リンカーが、配列番号１６５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１０３に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１０５】
Ｎ末端からＣ末端へと、前記フォリスタチンポリペプチド、異種ドメインおよび前記ＴβＲＩＩポリペプチドを含む、請求項９５から１０４のいずれか一項に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１０６】
リーダー配列を含む、請求項９２から１０５のいずれか一項に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１０７】
前記リーダー配列が、配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１０６に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１０８】
配列番号１６４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項９２から１０７のいずれか一項に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１０９】
配列番号１８０または１８１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項９２から１０８のいずれか一項に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１１０】
ＴβＲＩＩポリペプチドと、ＧＤＦ８に結合することが可能な抗体または抗原結合性断片とを含む多特異性バインダータンパク質。
【請求項１１１】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号１７０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１１０に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１１２】
前記抗体または抗原結合性断片が、可変重鎖および可変軽鎖を含む、請求項１１０または１１１に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１１３】
前記可変重鎖が、配列番号１５１〜１５３のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、請求項１１２に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１１４】
前記可変軽鎖が、配列番号１５４〜１５６のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、請求項１１２または１１３に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１１５】
前記可変重鎖が、配列番号１６７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１１２から１１４のいずれか一項に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１１６】
前記可変軽鎖が、配列番号１７４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１１２から１１５のいずれか一項に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１１７】
前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１６８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１１０から１１６のいずれか一項に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１１８】
前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１６７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１１０から１１７のいずれか一項に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１１９】
前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１７１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１１０から１１８のいずれか一項に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１２０】
配列番号１７２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１１０から１１９のいずれか一項に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１２１】
配列番号１７５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１１０から１２０のいずれか一項に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１２２】
配列番号１８２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１１０から１２０のいずれか一項に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１２３】
配列番号１７２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、配列番号１８２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列をさらに含む、請求項１１０から１２０のいずれか一項に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１２４】
リーダー配列を含む、請求項１１０から１２３のいずれか一項に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１２５】
前記リーダー配列が、配列番号１７６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１２４に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１２６】
前記抗体または抗原結合性断片が、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンにも結合することが可能である、請求項１１０から１２５のいずれか一項に記載の多特異性バインダータンパク質。
【請求項１２７】
請求項９２から１２６に記載の多特異性バインダータンパク質のいずれかを発現することが可能なポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのコレクション。
【請求項１２８】
請求項１２７に記載のポリヌクレオチドを含むベクターまたはベクターのコレクション。
【請求項１２９】
請求項１２７に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１２８に記載のベクターを含み、それを発現させることが可能な宿主細胞。
【請求項１３０】
請求項９２から１２６のいずれか一項に記載の多特異性バインダーおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１３１】
筋肉障害を有する対象を、請求項９２から１２６のいずれか一項に記載の多特異性バインダータンパク質で処置する方法。
【請求項１３２】
前記対象が、筋ジストロフィーを有する、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記対象が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記対象が、ベッカー型筋ジストロフィーを有する、請求項１３２に記載の方法
【請求項１３５】
前記障害が、筋線維症と関連する、請求項１３１から１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記障害が、筋喪失または筋消耗と関連する、請求項１３１から１３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＴβＲＩＩポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項１３８】
前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドが、配列番号５１または５２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１３７に記載の融合タンパク質。
【請求項１３９】
前記ＴβＲＩＩポリペプチドが、配列番号１７０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１３７または１３８に記載の融合タンパク質。
【請求項１４０】
ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分が、ＴβＲＩＩポリペプチド部分のＮ末端側にある、請求項１３７から１３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４１】
ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分が、ＴβＲＩＩポリペプチド部分のＣ末端側にある、請求項１３７から１４０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４２】
前記融合タンパク質におけるＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分とＴβＲＩＩポリペプチド部分とを異種部分および／または１つもしくは複数のリンカー部分が分離している、請求項１３７から１４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４３】
前記異種部分が、配列番号１６３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むＦｃポリペプチド部分である、請求項１４２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４４】
前記異種部分が、配列番号７２または７３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むＦｃポリペプチド部分（必要に応じて、Ｃ末端リシン残基を欠いてもよい）である、請求項１４２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４５】
前記ＴβＲＩＩポリペプチド部分が、リンカーによってＦｃ部分に融合されている、請求項１４２から１４４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４６】
前記ＴβＲＩＩポリペプチド部分が、グリシン−セリンリッチリンカーによってＦｃ部分に融合されている、請求項１４２から１４４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４７】
前記リンカーが、配列番号１６５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１４６に記載の融合タンパク質。
【請求項１４８】
前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分が、リンカーによって前記Ｆｃ部分に融合されている、請求項１４２から１４７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４９】
前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分が、ＧＧＧリンカーを含むリンカーによって前記Ｆｃ部分に融合されている、請求項１４８に記載の融合タンパク質。
【請求項１５０】
シグナル配列を含む、請求項１３７から１４９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５１】
前記シグナル配列が、配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１５０に記載の融合タンパク質。
【請求項１５２】
配列番号１８３または１９５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１３７から１４９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５３】
マルチマーのユニットである、請求項１３７から１４９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５４】
前記マルチマーが、ホモダイマーである、請求項１５３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５５】
前記マルチマーがヘテロマルチマーであり、前記融合タンパク質が前記ヘテロマルチマーの１つのユニットであり、前記ヘテロマルチマーが第２のタンパク質ユニットを含む、請求項１５３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５６】
前記第２のタンパク質ユニットが、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分を含むが、ＴβＲＩＩポリペプチド部分を欠く、請求項１５５に記載の融合タンパク質。
【請求項１５７】
前記第２のタンパク質ユニットが、ＴβＲＩＩポリペプチド部分を含むが、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分を欠く、請求項１５５に記載の融合タンパク質。
【請求項１５８】
前記ヘテロマルチマーの各ユニットが、相互作用対のメンバーを含む、請求項１５５から１５７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５９】
前記相互作用対の前記メンバーが、Ｆｃドメインを含む、請求項１５８に記載の融合タンパク質。
【請求項１６０】
前記Ｆｃドメインが、ヘテロマルチマー形成を促進するおよび／またはホモマルチマー形成を阻害するアミノ酸改変を含む、請求項１５９に記載の融合タンパク質。
【請求項１６１】
前記Ｆｃドメインが、１つまたは複数の「ノブ−イン−ホール」変異を含むように改変されている、請求項１６０に記載の融合タンパク質。
【請求項１６２】
配列番号１８４または１９６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１５７から１６１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６３】
前記ヘテロマルチマーの第２のユニットが、ＴβＲＩＩポリペプチド部分を含むがＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分を欠き、前記第２のタンパク質ユニットが、配列番号１８５または１９７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１５７から１６１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６４】
前記融合タンパク質が、配列番号１８４または１９６のアミノ酸配列を含み、前記第２のタンパク質ユニットが、配列番号１８５または１９７のアミノ酸配列を含む、請求項１５７から１６１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６５】
請求項１３７から１６４のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１６６】
請求項１６５に記載のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項１６７】
請求項１６５または１６６に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項１６８】
ＣＨＯ細胞である、請求項１６７に記載の細胞。
【請求項１６９】
請求項１３７から１６４のいずれか一項に記載の融合タンパク質および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬調製物。
【請求項１７０】
ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーに対する細胞の応答をモジュレートする方法であって、前記細胞を、請求項１３７から１６４のいずれか一項に記載の融合タンパク質に曝露させるステップを含む、方法。
【請求項１７１】
それを必要とする患者においてＴＧＦβスーパーファミリーメンバーと関連する疾患または状態を処置する方法であって、前記患者に、有効量の請求項１３７から１６４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与するステップを含む、方法。
【請求項１７２】
それを必要とする患者において筋肉関連疾患または状態を処置する方法であって、前記患者に、有効量の請求項１３７から１６４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与するステップを含む、方法。
【請求項１７３】
前記筋肉関連疾患または状態が、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、シャルコー・マリー・トゥース病、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症および筋肉減少症から選択される、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
それを必要とする患者において肺関連疾患または状態を処置する方法であって、前記患者に、有効量の請求項１３７から１６４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与するステップを含む、方法。
【請求項１７５】
前記肺関連疾患または状態が、間質性肺疾患、肺高血圧症、肺動脈性肺高血圧症および特発性肺線維症から選択される、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
それを必要とする患者においてがんを処置する方法であって、前記患者に、有効量の請求項１３７から１６４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与するステップを含む、方法。
【請求項１７７】
それを必要とする患者において腎臓関連疾患または状態を処置する方法であって、前記患者に、有効量の請求項１３７から１６４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与するステップを含む、方法。
【請求項１７８】
前記腎臓関連疾患または状態が、アルポート症候群、慢性腎臓疾患、多発性嚢胞腎疾患および腎線維症から選択される、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１７９】
それを必要とする患者において貧血または貧血関連疾患もしくは状態を処置する方法であって、前記患者に、有効量の請求項１３７から１６４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与するステップを含む、方法。
【請求項１８０】
前記貧血関連疾患または状態が、サラセミア、骨髄異形成症候群、骨髄線維症および鎌状赤血球症から選択される、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
それを必要とする患者において線維性または硬化性の疾患または状態を処置する方法であって、前記患者に、有効量の請求項１３７から１６４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与するステップを含む、方法。
【請求項１８２】
前記線維性または硬化性の疾患または状態が、全身性硬化症、びまん性全身性硬化症、全身性硬化症−間質性肺疾患、骨髄線維症、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）または特発性肺線維症のうちいずれか１つまたは複数である、請求項１８１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１８年５月３日出願の米国仮特許出願第６２／６６６，５４７号および２０１８年１２月１４日出願の米国仮特許出願第６２／７７９，９９８号からの優先権の利益を主張する。上述の出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦβ）スーパーファミリーは、共通の配列エレメントおよび構造的モチーフを共有する種々の増殖因子を含有する。これらのタンパク質は、脊椎動物および無脊椎動物の両方において、多種多様な細胞型に対して生物学的影響を発揮することが公知である。このスーパーファミリーのメンバーは、胚発生の間にパターン形成および組織特異化において重要な機能を果たし、脂肪生成、筋形成、軟骨形成、心発生、造血、神経発生および上皮細胞分化を含む種々の分化プロセスに影響を与え得る。このファミリーは、以下の２つのおおまかな系統発生的クレード：ＴＧＦβ、アクチビンおよびｎｏｄａｌを含む、このスーパーファミリーのより最近進化したメンバーと、いくつかのＢＭＰおよびＧＤＦを含む、このスーパーファミリーのより遠縁のタンパク質のクレードとに分割される［Hinck  (2012)  FEBS  Letters  586:1860-1870］。ＴＧＦβファミリーメンバーは、多様な、しばしば補完的な生物学的影響を有する。ＴＧＦβファミリーのメンバーの活性を操作することによって、しばしば、生物における顕著な生理学的変化を引き起こすことが可能である。例えば、ピエモンテ牛およびベルジャンブルー牛の品種は、ＧＤＦ８（ミオスタチンとも呼ばれる）遺伝子における機能喪失型突然変異を有し、この突然変異は、筋肉量における著しい増加を引き起こす［Grobet  et  al.  (1997)  Nat  Genet  17(1):71-4］。さらに、ヒトでは、ＧＤＦ８の不活性な対立遺伝子は、増加した筋肉量、および報告によれば、並外れた強さと関連する［Schuelke  et  al.  (2004)  N  Engl  J  Med  350:2682-8］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Hinck  (2012)  FEBS  Letters  586:1860-1870
【非特許文献２】Grobet  et  al.  (1997)  Nat  Genet  17(1):71-4
【非特許文献３】Schuelke  et  al.  (2004)  N  Engl  J  Med  350:2682-8
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
種々の組織における変化は、ＴＧＦβファミリーのリガンドによって媒介される細胞内シグナル伝達（例えば、ＳＭＡＤ１、２、３、５および／または８）を増強または阻害することによって達成され得る。したがって、ＴＧＦβスーパーファミリーの種々のリガンドの活性を調節する薬剤が必要とされている。
ＴＧＦβスーパーファミリーは、ＴＧＦβ、アクチビン、ｎｏｄａｌ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、増殖および分化因子（ＧＤＦ）ならびに抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）を含む、３０を超える分泌型因子から構成される［Weiss  et  al.  (2013)  Developmental  Biology,  2(1):  47-63］。ＴＧＦβファミリーは、それらが結合するＩ型受容体およびそれらが活性化するＳｍａｄタンパク質に基づいて、２つの系統発生的分岐に分割され得る。一方は、Ｓｍａｄ２および３を活性化するＩ型受容体を介してシグナル伝達する、例えば、ＴＧＦβ、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ９、ＢＭＰ３およびｎｏｄａｌを含む、より最近進化した分岐である［Hinck  (2012)  FEBS  Letters  586:1860-1870］。他方の分岐は、このスーパーファミリーのより遠縁のタンパク質を含み、Ｓｍａｄ１、５および８を介してシグナル伝達する、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ１、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７を含む。一部においては、本開示は、広範なＳｍａｄ２／３活性化リガンドをアンタゴナイズすることができるＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーを提供する。例えば、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロダイマーが、細胞に基づくアッセイにおいて、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびＧＤＦ１１シグナル伝達経路を阻害することを実証している。対照的に、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＴβＲＩＩホモダイマー単独は、Ｓｍａｄ２／３活性化リガンドのより小さいサブセットを阻害する。さらに、データは、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロダイマーが、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＴβＲＩＩホモダイマーリガンドトラップのアンタゴニスト的プロファイルを単に組み合わせることよりも、驚くべきことにより選択的なＳｍａｄ２／３リガンドアンタゴニストであることを実証している。例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロダイマーは、ＡｃｔＲＩＩＡホモダイマーと同様に、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびＧＤＦ１１シグナル伝達経路を阻害した。しかし、ＢＭＰ１０シグナル伝達経路のＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロダイマー阻害は、ＡｃｔＲＩＩＡホモダイマーと比較して、顕著に低減される。したがって、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、ＡｃｔＲＩＩＡホモダイマーと比較して、Ｓｍａｄ２／３活性化リガンドのより選択的なアンタゴニストである。したがって、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、かかる広いがなおも選択的なＳｍａｄ２／３アンタゴニズムが有利なある特定の適用において、ＡｃｔＲＩＩＡもしくはＴβＲＩＩホモダイマー、またはそれらの組合せよりも有用である。例には、ＢＭＰ１０の減少したアンタゴニズムと共に、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびアクチビンＡＢ）およびＧＤＦ１１のうち１つまたは複数をアンタゴナイズすることが望ましい治療的適用が含まれる。
【０００５】
一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドの多特異性バインダーを提供する。一部の実施形態では、多特異性バインダータンパク質は、ａ）ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３のうち少なくとも１つ、ならびにｂ）アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８のうち少なくとも１つ、に結合することが可能である。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、ａ）ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ３に結合することが可能な第１の部分；ならびにｂ）アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８のうち少なくとも１つに結合することが可能な第２の部分、を含む。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＴβＲＩＩポリペプチドを含むヘテロマルチマーである。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、ＴβＲＩＩポリペプチドおよびフォリスタチンまたはフォリスタチン様タンパク質ドメインを含む。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、ＴβＲＩＩポリペプチドおよび抗体または抗原結合性断片を含み、この抗体または抗原結合性断片は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８のうち１つまたは複数に結合することが可能である。特定の実施形態では、多特異性バインダーは、ＴβＲＩＩポリペプチドおよび抗体または抗原結合性断片を含み、この抗体または抗原結合性断片は、ＧＤＦ８に結合することが可能である。
【０００６】
一部の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＴβＲＩＩポリペプチドを含むヘテロマルチマーを提供する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、ａ）配列番号５０の２１〜３０位のいずれか１つで始まり配列番号５０の１１０〜１３５位のいずれか１つで終わる配列；ｂ）配列番号５０の２１位で始まり配列番号５０の１３５位で終わる配列；ｃ）配列番号５０の３０位で始まり配列番号５０の１１０位で終わる配列；ｄ）配列番号５１の配列；またはｅ）配列番号５２の配列、に対して少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、ａ）配列番号５０の２１〜３０位のいずれか１つで始まり配列番号５０の１１０〜１３５位のいずれか１つで終わる配列；ｂ）配列番号５０の２１位で始まり配列番号５０の１３５位で終わる配列；ｃ）配列番号５０の３０位で始まり配列番号５０の１１０位で終わる配列；ｄ）配列番号５１の配列；またはｅ）配列番号５２の配列、に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、ａ）配列番号５０の２１〜３０位のいずれか１つで始まり配列番号５０の１１０〜１３５位のいずれか１つで終わる配列；ｂ）配列番号５０の２１位で始まり配列番号５０の１３５位で終わる配列；ｃ）配列番号５０の３０位で始まり配列番号５０の１１０位で終わる配列；ｄ）配列番号５１の配列；またはｅ）配列番号５２の配列、に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。
【０００７】
一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、ａ）配列番号５０の２１〜３０位のいずれか１つで始まり配列番号５０の１１０〜１３５位のいずれか１つで終わる配列；ｂ）配列番号５０の２１位で始まり配列番号５０の１３５位で終わる配列；ｃ）配列番号５０の３０位で始まり配列番号５０の１１０位で終わる配列；ｄ）配列番号５１の配列；およびｅ）配列番号５２の配列、から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、ａ）ＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＡ部分；およびｂ）異種部分、を含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ部分は、ａ）配列番号５０の２１〜３０位のいずれか１つで始まり配列番号５０の１１０〜１３５位のいずれか１つで終わる配列；ｂ）配列番号５０の２１位で始まり配列番号５０の１３５位で終わる配列；ｃ）配列番号５０の３０位で始まり配列番号５０の１１０位で終わる配列；ｄ）配列番号５１の配列；またはｅ）配列番号５２の配列、に対して少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ部分は、ａ）配列番号５０の２１〜３０位のいずれか１つで始まり配列番号５０の１１０〜１３５位のいずれか１つで終わる配列；ｂ）配列番号５０の２１位で始まり配列番号５０の１３５位で終わる配列；ｃ）配列番号５０の３０位で始まり配列番号５０の１１０位で終わる配列；ｄ）配列番号５１の配列；またはｅ）配列番号５２の配列、に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ部分は、ａ）配列番号５０の２１〜３０位のいずれか１つで始まり配列番号５０の１１０〜１３５位のいずれか１つで終わる配列；ｂ）配列番号５０の２１位で始まり配列番号５０の１３５位で終わる配列；ｃ）配列番号５０の３０位で始まり配列番号５０の１１０位で終わる配列；ｄ）配列番号５１の配列；またはｅ）配列番号５２の配列、に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。
【０００８】
一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ部分は、ａ）配列番号５０の２１〜３０位のいずれか１つで始まり配列番号５０の１１０〜１３５位のいずれか１つで終わる配列；ｂ）配列番号５０の２１位で始まり配列番号５０の１３５位で終わる配列；ｃ）配列番号５０の３０位で始まり配列番号５０の１１０位で終わる配列；ｄ）配列番号５１の配列；およびｅ）配列番号５２の配列、から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、異種部分は、相互作用対の第１または第２のメンバーを含む。一部の実施形態では、異種部分は、ヘテロダイマー形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸改変を含む。一部の実施形態では、異種部分は、免疫グロブリンＦｃドメインである。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、ヒト免疫グロブリンＦｃドメインである。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、免疫グロブリンＧ１Ｆｃドメインである。
【０００９】
一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、ａ）配列番号６８のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３５６位にリシン（Ｋ）および３９９位にＫを含む、配列；ｂ）配列番号６９のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３９２位にアスパラギン酸（Ｄ）および４０９位にＤを含む、配列；ｃ）配列番号７２のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３５４位にシステイン（Ｃ）および３６６位にトリプトファン（Ｗ）を含む、配列；またはｄ）配列番号７３のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３４９位にＣ、３６６位にセリン（Ｓ）、３６８位にアラニン（Ａ）および４０７位にバリンを含む、配列、に対して少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、ａ）配列番号６８のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３５６位にリシン（Ｋ）および３９９位にＫを含む、配列；ｂ）配列番号６９のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３９２位にアスパラギン酸（Ｄ）および４０９位にＤを含む、配列；ｃ）配列番号７２のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３５４位にシステイン（Ｃ）および３６６位にトリプトファン（Ｗ）を含む、配列；またはｄ）配列番号７３のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３４９位にＣ、３６６位にセリン（Ｓ）、３６８位にアラニン（Ａ）および４０７位にバリンを含む、配列、に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。
【００１０】
一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、ａ）配列番号６８のアミノ酸配列；ｂ）配列番号６９のアミノ酸配列；ｃ）配列番号７２のアミノ酸配列；およびｄ）配列番号７３のアミノ酸配列、から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＡｃｔＲＩＩＡ部分と異種部分との間に配置されたリンカードメイン部分をさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、１０アミノ酸長から２５アミノ酸長の間である。一部の実施形態では、リンカーは、ａ）（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは２以上である）；ｂ）（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは３以上である）；ｃ）（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは４以上である）；ならびにｄ）配列番号４〜７、１９、２１、２５、２６、４０および６３〜６７のうちいずれか１つのアミノ酸配列、から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、式中、ｎは５以上ではない。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ融合タンパク質は、配列番号８４のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％または９９％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ融合タンパク質は、配列番号８４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ融合タンパク質は、配列番号９０のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％または９９％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ融合タンパク質は、配列番号９０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、ａ）配列番号５１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列、および１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分；ｂ）配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列、および５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、リンカー部分；ｃ）配列番号６８、６９、７２または７３から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列、および２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、異種部分；ならびにｃ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）からなる、またはそれらから本質的になる。
【００１１】
一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、ａ）配列番号５１のアミノ酸配列、および１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分；ｂ）配列番号６のアミノ酸配列、および５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、リンカー部分；ｃ）配列番号６８、６９、７２または７３から選択されるアミノ酸配列、および２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、異種部分；ならびにｄ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）からなる、またはそれらから本質的になる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、ａ）配列番号５１の配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分；ｂ）配列番号６８、６９、７２または７３から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列を含む異種部分；およびｃ）ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分と異種部分とを接続するリンカー部分であって、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列を含む、リンカー部分、を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、ａ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分；ｂ）配列番号６８、６９、７２または７３から選択されるアミノ酸配列を含む異種部分；およびｃ）ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分と異種部分とを接続するリンカー部分であって、配列番号６のアミノ酸配列を含む、リンカー部分、を含む。一部の実施形態では、ヘテロマルチマーは、可溶性である。一部の実施形態では、ヘテロマルチマーは、組換えタンパク質である。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ａ）配列番号１の２３〜３５位のいずれか１つで始まり配列番号１の１５３〜１５９位のいずれか１つで終わる配列；ｂ）配列番号２の２３〜６０位のいずれか１つで始まり配列番号２の１７８〜１８４位のいずれか１つで終わる配列；ｃ）配列番号１８の配列；ｄ）配列番号２７の配列；またはｅ）配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８および３９のうちいずれか１つの配列、に対して少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ａ）配列番号１の２３〜３５位のいずれか１つで始まり配列番号１の１５３〜１５９位のいずれか１つで終わる配列；ｂ）配列番号２の２３〜６０位のいずれか１つで始まり配列番号２の１７８〜１８４位のいずれか１つで終わる配列；ｃ）配列番号１８の配列；ｄ）配列番号２７の配列；またはｅ）配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８および３９のうちいずれか１つの配列、に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ａ）配列番号１の２３〜３５位のいずれか１つで始まり配列番号１の１５３〜１５９位のいずれか１つで終わる配列；ｂ）配列番号２の２３〜６０位のいずれか１つで始まり配列番号２の１７８〜１８４位のいずれか１つで終わる配列；ｃ）配列番号１８の配列；ｄ）配列番号２７の配列；またはｅ）配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８および３９のうちいずれか１つの配列、に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ａ）配列番号１の２３〜３５位のいずれか１つで始まり配列番号１の１５３〜１５９位のいずれか１つで終わる配列；ｂ）配列番号２の２３〜６０位のいずれか１つで始まり配列番号２の１７８〜１８４位のいずれか１つで終わる配列；ｃ）配列番号１８の配列；ｄ）配列番号２７の配列；ならびにｅ）配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８および３９のうちいずれか１つの配列、から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１８の配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ａ）ＴβＲＩＩの細胞外ドメインを含むＴβＲＩＩ部分；およびｂ）異種部分、を含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分は、ａ）配列番号１の２３〜３５位のいずれか１つで始まり配列番号１の１５３〜１５９位のいずれか１つで終わる配列；ｂ）配列番号２の２３〜６０位のいずれか１つで始まり配列番号２の１７８〜１８４位のいずれか１つで終わる配列；ｃ）配列番号１８の配列；ｄ）配列番号２７の配列；またはｅ）配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８および３９のうちいずれか１つの配列、に対して少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分は、ａ）配列番号１の２３〜３５位のいずれか１つで始まり配列番号１の１５３〜１５９位のいずれか１つで終わる配列；ｂ）配列番号２の２３〜６０位のいずれか１つで始まり配列番号２の１７８〜１８４位のいずれか１つで終わる配列；ｃ）配列番号１８の配列；ｄ）配列番号２７の配列；またはｅ）配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８および３９のうちいずれか１つの配列、に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む。
【００１４】
一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分は、ａ）配列番号１の２３〜３５位のいずれか１つで始まり配列番号１の１５３〜１５９位のいずれか１つで終わる配列；ｂ）配列番号２の２３〜６０位のいずれか１つで始まり配列番号２の１７８〜１８４位のいずれか１つで終わる配列；ｃ）配列番号１８の配列；ｄ）配列番号２７の配列；またはｅ）配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８および３９のうちいずれか１つの配列、に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ部分は、ａ）配列番号１の２３〜３５位のいずれか１つで始まり配列番号１の１５３〜１５９位のいずれか１つで終わる配列；ｂ）配列番号２の２３〜６０位のいずれか１つで始まり配列番号２の１７８〜１８４位のいずれか１つで終わる配列；ｃ）配列番号１８の配列；ｄ）配列番号２７の配列；ならびにｅ）配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８および３９のうちいずれか１つの配列、から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、異種部分は、相互作用対の第１または第２のメンバーを含む。一部の実施形態では、異種部分は、ヘテロダイマー形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸改変を含む。一部の実施形態では、異種部分は、免疫グロブリンＦｃドメインである。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、ヒト免疫グロブリンＦｃドメインである。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、免疫グロブリンＧ１Ｆｃドメインである。
【００１５】
一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、ａ）配列番号６８のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３５６位にリシン（Ｋ）および３９９位にＫを含む、配列；ｂ）配列番号６９のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３９２位にアスパラギン酸（Ｄ）および４０９位にＤを含む、配列；ｃ）配列番号７２のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３５４位にシステイン（Ｃ）および３６６位にトリプトファン（Ｗ）を含む、配列；またはｄ）配列番号７３のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３４９位にＣ、３６６位にセリン（Ｓ）、３６８位にアラニン（Ａ）および４０７位にバリンを含む、配列、に対して少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、ａ）配列番号６８のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３５６位にリシン（Ｋ）および３９９位にＫを含む、配列；ｂ）配列番号６９のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３９２位にアスパラギン酸（Ｄ）および４０９位にＤを含む、配列；ｃ）配列番号７２のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３５４位にシステイン（Ｃ）および３６６位にトリプトファン（Ｗ）を含む、配列；またはｄ）配列番号７３のアミノ酸配列であって、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームのアミノ酸位置決めに基づいて、３４９位にＣ、３６６位にセリン（Ｓ）、３６８位にアラニン（Ａ）および４０７位にバリンを含む、配列、に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。
【００１６】
一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、ａ）配列番号６８のアミノ酸配列；ｂ）配列番号６９のアミノ酸配列；ｃ）配列番号７２のアミノ酸配列；およびｄ）配列番号７３のアミノ酸配列、から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＴβＲＩＩ部分と異種部分との間に配置されたリンカードメイン部分をさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、１０アミノ酸長から２５アミノ酸長の間である。一部の実施形態では、リンカーは、ａ）（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは２以上である）；ｂ）（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは、３以上である）；ｃ）（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは、４以上である）；ならびにｄ）配列番号４〜７、１９、２１、２５、２６、４０および６３〜６７のうちいずれか１つのアミノ酸配列、から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、式中、ｎは５以上ではない。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ融合タンパク質は、配列番号８７のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％または９９％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ融合タンパク質は、配列番号８７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ融合タンパク質は、配列番号９３のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％または９９％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ融合タンパク質は、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ａ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列、および１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、ＴβＲＩＩポリペプチド部分；ｂ）配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列、および５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、リンカー部分；ｃ）配列番号６８、６９、７２または７３から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列、および２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、異種部分；ならびにｃ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）からなる、またはそれらから本質的になる。
【００１７】
一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ａ）配列番号１８のアミノ酸配列、および１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、ＴβＲＩＩポリペプチド部分；ｂ）配列番号６のアミノ酸配列、および５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、リンカー部分；ｃ）配列番号６８、６９、７２または７３から選択されるアミノ酸配列、および２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む、異種部分；ならびにｄ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）からなる、またはそれらから本質的になる。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ａ）配列番号１８の配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列を含むＴβＲＩＩポリペプチド部分；ｂ）配列番号６８、６９、７２または７３から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列を含む異種部分；およびｃ）ＴβＲＩＩポリペプチド部分と異種部分とを接続するリンカー部分であって、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一なアミノ酸配列を含む、リンカー部分を含む。
【００１８】
一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＴβＲＩＩポリペプチド部分；ｂ）配列番号６８、６９、７２または７３から選択されるアミノ酸配列を含む異種部分；およびｃ）ＴβＲＩＩポリペプチド部分と異種部分とを接続するリンカー部分であって、配列番号６のアミノ酸配列を含む、リンカー部分、を含む。一部の実施形態では、ヘテロマルチマーは、グリコシル化されたアミノ酸、ＰＥＧ化されたアミノ酸、ファルネシル化されたアミノ酸、アセチル化されたアミノ酸、ビオチン化されたアミノ酸、および脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸から選択される１つまたは複数の改変されたアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、ヘテロマルチマーは、グリコシル化されている。一部の実施形態では、ヘテロマルチマーは、ＣＨＯ細胞におけるポリペプチドの発現に特徴的なグリコシル化パターンを有する。一部の実施形態では、ヘテロマルチマーは、ＣＨＯ細胞におけるポリペプチドの発現に特徴的なグリコシル化パターンを有する。一部の実施形態では、ヘテロマルチマーは、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３のうち１つまたは複数に結合する。一部の実施形態では、ヘテロマルチマーは、レポーター遺伝子アッセイを使用して決定される、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３シグナル伝達のうち１つまたは複数を阻害する。一部の実施形態では、ヘテロマルチマーは、ヘテロダイマーである。一部の実施形態では、ヘテロマルチマーは、単離されている。一部の実施形態では、ヘテロマルチマーは、組換えである。
【００１９】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたは融合タンパク質のいずれかのコード配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるＴβＲＩＩポリペプチドまたは融合タンパク質のいずれかのコード配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたは融合タンパク質のいずれかおよび本明細書に開示されるＴβＲＩＩポリペプチドまたは融合タンパク質のいずれかのコード配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれかに作動可能に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される任意のポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるポリペプチドのいずれかおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬調製物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＴβＲＩＩポリペプチドを含むヘテロマルチマーを作製する方法であって、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＴβＲＩＩポリペプチドの発現に適切な条件下で細胞を培養するステップを含み、細胞が、本明細書に開示されるポリヌクレオチドの任意の組合せを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＴβＲＩＩポリペプチドを含むヘテロマルチマーを作製する方法であって、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＴβＲＩＩポリペプチドの発現に適切な条件下で細胞を培養するステップを含み、細胞が、本明細書に開示される組換えポリヌクレオチドのいずれかを含む、方法を提供する。
【００２０】
一部の実施形態では、本開示は、ＴβＲＩＩポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを含むヘテロマルチマーを作製する方法であって、ａ）ＴβＲＩＩポリペプチドの発現に適切な条件下で第１の細胞を培養するステップであって、第１の細胞が、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれかを含む、ステップ；ｂ）そうして発現されたＴβＲＩＩポリペプチドを回収するステップ；ｃ）ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの発現に適切な条件下で第２の細胞を培養するステップであって、第２の細胞が、本明細書に開示される組換えポリヌクレオチドのいずれかを含む、ステップ；ｄ）そうして発現されたＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを回収するステップ；ならびにｅ）ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー形成に適切な条件下で、回収されたＴβＲＩＩポリペプチドおよび回収されたＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを組み合わせるステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーに対する細胞の応答をモジュレートする方法であって、細胞を、本明細書に開示されるヘテロマルチマーのいずれかに曝露させるステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者においてＴＧＦβスーパーファミリーメンバーと関連する疾患または状態を処置する方法であって、患者に、有効量の本明細書に開示されるヘテロマルチマーのいずれかまたは本明細書に開示される医薬調製物のいずれかを投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者において肺関連疾患または状態を処置する方法であって、患者に、本明細書に開示される医薬調製物のいずれかの有効量のヘテロマルチマーを投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、肺関連疾患または状態は、肺高血圧症、肺動脈性肺高血圧症および特発性肺線維症から選択される。一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者においてがんを処置する方法であって、患者に、有効量の本明細書に開示されるヘテロマルチマーのいずれかまたは本明細書に開示される医薬調製物のいずれかを投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者において腎臓関連疾患または状態を処置する方法であって、患者に、有効量の本明細書に開示されるヘテロマルチマーのいずれかまたは本明細書に開示される医薬調製物のいずれかを投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、腎臓関連疾患または状態は、アルポート症候群、慢性腎臓疾患、多発性嚢胞腎疾患および腎線維症から選択される。一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者において貧血または貧血関連疾患もしくは状態を処置する方法であって、患者に、有効量の本明細書に開示されるヘテロマルチマーのいずれかまたは本明細書に開示される医薬調製物のいずれかを投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、貧血関連疾患または状態は、サラセミア、骨髄異形成症候群、骨髄線維症および鎌状赤血球症から選択される。
【００２１】
一部の実施形態では、本開示は、ＴβＲＩＩポリペプチドおよびフォリスタチンポリペプチドを含む多特異性バインダータンパク質を提供する。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１７０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。一部の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、配列番号１１１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。一部の実施形態では、バインダータンパク質は、異種部分をさらに含む。一部の実施形態では、異種部分は、Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号１６３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、異種部分は、フォリスタチンポリペプチドとＴβＲＩＩポリペプチドとの間にある。一部の実施形態では、異種部分は、フォリスタチンポリペプチドに直接コンジュゲートされている。一部の実施形態では、異種部分は、リンカーによってフォリスタチンポリペプチドにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、異種部分は、ＴβＲＩＩポリペプチドに直接コンジュゲートされている。一部の実施形態では、異種部分は、リンカーによってＴβＲＩＩポリペプチドにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、異種部分をＴβＲＩＩポリペプチドにコンジュゲートするリンカーは、配列番号１６５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、フォリスタチンポリペプチド、異種ドメインおよびＴβＲＩＩポリペプチドを含む。一部の実施形態では、タンパク質は、リーダー配列を含む。一部の実施形態では、リーダー配列は、配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、バインダータンパク質は、配列番号１６４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、バインダータンパク質は、配列番号１８０または１８１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【００２２】
一部の実施形態では、本開示は、ＴβＲＩＩポリペプチドと、ＧＤＦ８に結合することが可能な抗体または抗原結合性断片とを含む多特異性バインダータンパク質を提供する。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１７０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、可変重鎖および可変軽鎖を含む。一部の実施形態では、可変重鎖は、配列番号１５１〜１５３のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む。一部の実施形態では、可変軽鎖は、配列番号１５４〜１５６のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む。一部の実施形態では、可変重鎖は、配列番号１６７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、可変軽鎖は、配列番号１７４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【００２３】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、配列番号１６８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、配列番号１６７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、配列番号１７１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号１７２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号１７５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号１８２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号１７２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、配列番号１８２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、タンパク質は、リーダー配列を含む。一部の実施形態では、リーダー配列は、配列番号１７６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ＧＤＦ１１および／またはアクチビンにも結合することが可能である。
【００２４】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される多特異性バインダータンパク質のいずれかを発現することが可能なポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの収集を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれかを含むベクターまたはベクターの収集を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含み、それを発現させることが可能な宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される多特異性バインダーのいずれかおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００２５】
一部の実施形態では、本開示は、筋肉障害を有する対象を、本明細書に開示される多特異性バインダーのいずれかで処置する方法を提供する。一部の実施形態では、対象は、筋ジストロフィーを有する。一部の実施形態では、対象は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する。一部の実施形態では、対象は、ベッカー型筋ジストロフィーを有する。一部の実施形態では、障害は、筋線維症と関連する。一部の実施形態では、障害は、筋肉量低下または筋消耗と関連する。
【００２６】
一部の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＴβＲＩＩポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号５１または５２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１７０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、ＴβＲＩＩポリペプチド部分に対してＮ末端側である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、ＴβＲＩＩポリペプチド部分に対してＣ末端側である。一部の実施形態では、異種部分および／または１つもしくは複数のリンカー部分は、融合タンパク質においてＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分とＴβＲＩＩポリペプチド部分とを分離する。一部の実施形態では、異種部分は、配列番号１６３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むＦｃポリペプチド部分である。一部の実施形態では、異種部分は、配列番号７２または７３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むＦｃポリペプチド部分（Ｃ末端リシン残基を必要に応じて欠いていてもよい）である。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチド部分は、リンカーによってＦｃ部分に融合されている。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチド部分は、グリシン−セリンリッチリンカーによってＦｃ部分に融合されている。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号１６５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、リンカーによってＦｃ部分に融合されている。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、ＧＧＧリンカーを含むリンカーによってＦｃ部分に融合されている。一部の実施形態では、融合タンパク質は、シグナル配列を含む。一部の実施形態では、シグナル配列は、配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【００２７】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１８３または１９５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、マルチマーのユニットである。一部の実施形態では、マルチマーは、ホモダイマーである。一部の実施形態では、マルチマーは、ヘテロマルチマーであり、融合タンパク質は、ヘテロマルチマーの１つのユニットであり、ヘテロマルチマーは、第２のタンパク質ユニットを含む。一部の実施形態では、第２のタンパク質ユニットは、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分を含むがＴβＲＩＩポリペプチド部分を欠く。一部の実施形態では、第２のタンパク質ユニットは、ＴβＲＩＩポリペプチド部分を含むがＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分を欠く。一部の実施形態では、ヘテロマルチマーの各ユニットは、相互作用対のメンバーを含む。一部の実施形態では、相互作用対のメンバーは、Ｆｃドメインを含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヘテロマルチマー形成を促進するおよび／またはホモマルチマー形成を阻害するアミノ酸改変を含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、１つまたは複数の「ノブ−イン−ホール（knob-in-hole）」突然変異を含むように改変されている。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１８４または１９６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ヘテロマルチマーの第２のユニットは、ＴβＲＩＩポリペプチド部分を含むがＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分を欠き、第２のタンパク質ユニットは、配列番号１８５または１９７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１８４または１９６のアミノ酸配列を含み、第２のタンパク質ユニットは、配列番号１８５または１９７のアミノ酸配列を含む。
【００２８】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される融合タンパク質のいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００２９】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれかに作動可能に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドを提供する。
【００３０】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれかを含む細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【００３１】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される融合タンパク質のいずれかと薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬調製物を提供する。
【００３２】
一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーに対する細胞の応答をモジュレートする方法であって、細胞を、本明細書に開示される融合タンパク質のいずれかに曝露させるステップを含む、方法を提供する。
【００３３】
一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者においてＴＧＦβスーパーファミリーメンバーと関連する疾患または状態を処置する方法であって、患者に、有効量の本明細書に開示される融合タンパク質のいずれかを投与するステップを含む、方法を提供する。
【００３４】
一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者において筋肉関連疾患または状態を処置する方法であって、患者に、有効量の本明細書に開示される融合タンパク質のいずれかを投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、筋肉関連疾患または状態は、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Duchene  muscular  dystrophy）、ベッカー型筋ジストロフィー、シャルコー−マリー−トゥース、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症およびサルコペニアから選択される。
【００３５】
一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者において肺関連疾患または状態を処置する方法であって、患者に、有効量の本明細書に開示される融合タンパク質のいずれかを投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、肺関連疾患または状態は、間質性肺疾患、肺高血圧症、肺動脈性肺高血圧症および特発性肺線維症から選択される。
【００３６】
一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者においてがんを処置する方法であって、患者に、有効量の本明細書に開示される融合タンパク質のいずれかの融合タンパク質を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００３７】
一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者において腎臓関連疾患または状態を処置する方法であって、患者に、有効量の本明細書に開示される融合タンパク質のいずれかを投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、腎臓関連疾患または状態は、アルポート症候群、慢性腎臓疾患、多発性嚢胞腎疾患および腎線維症から選択される。
【００３８】
一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者において貧血または貧血関連疾患もしくは状態を処置する方法であって、患者に、有効量の本明細書に開示される融合タンパク質のいずれかを投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、貧血関連疾患または状態は、サラセミア、骨髄異形成症候群、骨髄線維症および鎌状赤血球症から選択される。
【００３９】
一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者において線維性または硬化性の疾患または状態を処置する方法であって、患者に、有効量の本明細書に開示される融合タンパク質のいずれかを投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、線維性または硬化性の疾患または状態は、全身性硬化症、びまん性全身性硬化症、全身性硬化症−間質性肺疾患、骨髄線維症、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）または特発性肺線維症のうちいずれか１つまたは複数である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、ヒトＴＧＦβ受容体ＩＩ型（ｈＴβＲＩＩ）のＢ（短い）アイソフォームに関するネイティブ前駆体のアミノ酸配列（ＮＰ＿００３２３３．４）（配列番号１）を示す。実線の下線はプロセシングされた細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（残基２３〜１５９）を示し、二重下線はＡ（長い）アイソフォームにおいて置き換えられたバリンを示す。破線の下線はリーダーを示す（残基１〜２２）。
【００４１】
【図２】図２は、ヒトＴβＲＩＩのＡ（長い）アイソフォームに関するネイティブ前駆体のアミノ酸配列（ＮＰ＿００１０２００１８．１）（配列番号２）を示す。実線の下線はプロセシングされたＥＣＤ（残基２３〜１８４）を示し、二重下線はスプライシングにより生じたイソロイシンの置換を示す。破線の下線はリーダーを示す（残基１〜２２）。
【００４２】
【図３】図３は、５つの異なるＴβＲＩＩ構築物のリンカー配列の比較を示す。
【００４３】
【図４−１】図４Ａおよび４Ｂは、表形式で、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３といくつかの異なるＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質構築物のうちの１つとの間の結合親和性を示す。
【図４−２】同上。
【００４４】
【図５−１】図５Ａおよび５Ｃは、いくつかの異なるＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質構築物のうちの１つに対するＴＧＦβ１の親和性を試験するレポーター遺伝子アッセイの結果をグラフで示す。図５Ｂおよび５Ｄは、いくつかの異なるＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質構築物のうちの１つに対するＴＧＦβ３の親和性を試験するレポーター遺伝子アッセイの結果をグラフで示す。図５Ｅおよび５Ｆは、表形式で、これらの同じ実験からのＩＣ５０のデータを提供する。
【図５−２】同上。
【図５−３】同上。
【図５−４】同上。
【図５−５】同上。
【図５−６】同上。
【００４５】
【図６】図６は、Ｃｌｕｓｔａｌ  ２．１を使用して、ヒトＩｇＧアイソタイプからのＦｃドメインの複数の配列アライメントを示す。ヒンジ領域を破線の下線で示す。二重下線は、非対称の鎖の対合を促進するためにＩｇＧ１  Ｆｃにおいて操作された位置と、他のアイソタイプＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に対して対応する位置の例を示す。
【００４６】
【図７】図７は、複数のＡｃｔＲＩＩＢおよびＡｃｔＲＩＩＡの結晶構造の複合分析に基づいて、ボックスで示したリガンドに直接接触するための、本発明において推測される残基を有するヒトＡｃｔＲＩＩＡおよびヒトＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインのアライメントを示す。
【００４７】
【図８】図８は、様々な脊椎動物のＡｃｔＲＩＩＡタンパク質（配列番号１０１〜１０７）（それらの細胞内ドメインは含まない）の複数の配列アライメントを示す。
【００４８】
【図９−１】図９Ａ〜９Ｄは、ＴβＲＩＩポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載のものなどの他の種に由来するＴβＲＩＩタンパク質、例えば、配列番号１８、２７、および２８〜３９の細胞外ドメインに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なポリペプチド）およびＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載のものなどの他の種に由来するＡｃｔＲＩＩＡタンパク質、例えば、配列番号５１および５２の細胞外ドメインに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なポリペプチド）を含むヘテロマータンパク質複合体の図式的な例を示す。
【００４９】
例示した実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチド（左から右）は相互作用対（「Ｃ１」）の第１のメンバーを含む融合ポリペプチドの部分であり、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは相互作用対（「Ｃ２」）の第２のメンバーを含む融合ポリペプチドの部分である。好適な相互作用対は、例えば、重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用対、トランケーション、および本明細書に記載されているものなどのそのバリアントを含んだ［例えば、Spiess  et  al  (2015)  Molecular  Immunology  67(2A):  95-106］。各融合ポリペプチドにおいて、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドと相互作用対の対応するメンバーとの間に、リンカーが位置してもよい。相互作用対の第１および第２のメンバーはガイドされない場合があり、これは、その対のメンバーが、実質的な優先度はないが、互いに会合するかまたは自己会合する場合があり、それらが同一であるかまたは異なるアミノ酸配列を有する場合があることを意味する。図９Ａを参照されたい。あるいは、相互作用対は、ガイドされた（非対称の）対である場合があり、これは、対のメンバーが自己会合よりも優先的に互いに会合することを意味する。図９Ｂを参照されたい。より高次の複合体が予想され得る。図９Ｃおよび９Ｄを参照されたい。
【図９−２】同上。
【図９−３】同上。
【図９−４】同上。
【００５０】
【図１０−１】図１０Ａ〜１０Ｇは、２つのＴβＲＩＩポリペプチド（例えば、独立して、ヒトまたは本明細書に記載のものなどの他の種に由来するＴβＲＩＩタンパク質、例えば、配列番号１８、２７、および２８〜３９の細胞外ドメインに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なポリペプチド）および２つのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド（例えば、独立して、ヒトまたは本明細書に記載のものなどの他の種に由来するＡｃｔＲＩＩＡタンパク質、例えば、配列番号５１および５２の細胞外ドメインに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な２つのポリペプチド）を含むヘテロマータンパク質複合体の図式的な例を示す。
【００５１】
例示した実施形態１０Ａでは、第１のＴβＲＩＩポリペプチド（左から右）は相互作用対（「Ｃ１」）の第１のメンバーを含み、相互作用対（「Ａ１」）のさらなる第１のメンバーをさらに含む融合ポリペプチドの部分であり；第２のＴβＲＩＩポリペプチドは相互作用対（「Ｃ２」）の第２のメンバーを含み、相互作用対（「Ａ２」）の第１のメンバーをさらに含む融合ポリペプチドの部分である。第１のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド（左から右）は相互作用対（「Ｂ１」）の第２のメンバーを含む融合ポリペプチドの部分であり；第２のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは相互作用対（「Ｂ２」）の第２のメンバーを含む融合ポリペプチドの部分である。Ａ１およびＡ２は、同じであっても異なっていてもよく；Ｂ１およびＢ２は、同じであっても異なっていてもよく、かつＣ１およびＣ２は同じであっても異なっていてもよい。各融合ポリペプチドにおいて、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドと相互作用対の対応するメンバーとの間ならびに相互作用対間に、リンカーが位置してもよい。図１０Ａは、ガイドされていない相互作用対の会合の一例であり、これは、その対のメンバーが、実質的な優先度はないが、互いに会合するかまたは自己会合する場合があり、それらが同一であるかまたは異なるアミノ酸配列を有する場合があることを意味する。
【００５２】
例示した実施形態１０Ｂでは、第１のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド（左から右）は相互作用対（「Ｃ１」）の第１のメンバーを含み、相互作用対（「Ａ１」）のさらなる第１のメンバーをさらに含む融合ポリペプチドの部分であり；第２のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは相互作用対（「Ｂ２」）の第２のメンバーを含む融合ポリペプチドの部分である。第１のＴβＲＩＩポリペプチド（左から右）は相互作用対（「Ｂ１」）の第２のメンバーを含む融合ポリペプチドの部分であり；第２のＴβＲＩＩポリペプチドは相互作用対（「Ｃ２」）の第２のメンバーを含み、相互作用対（「Ａ２」）の第１のメンバーをさらに含む融合ポリペプチドの部分である。各融合ポリペプチドにおいて、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドと相互作用対の対応するメンバーとの間ならびに相互作用対間に、リンカーが位置してもよい。図１０Ｂは、ガイドされた（非対称の）相互作用対の会合の一例であり、これは、対のメンバーが自己会合よりも優先的に互いに会合することを意味する。
【００５３】
好適な相互作用対は、例えば、重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用対、トランケーション、および本明細書に記載されているそのバリアントを含んだ［例えば、Spiess  et  al  (2015)  Molecular  Immunology  67(2A):  95-106］。より高次の複合体が予想され得る。図１０Ｃ〜１０Ｆを参照されたい。類似する方法を使用して（特に、軽鎖および／または重鎖免疫グロブリン、トランケーション、またはそのバリアントを用いるもの）、相互作用対を使用して、抗体ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２複合体に似ているＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロダイマーを生成することができる［例えば、Spiess  et  al  (2015)  Molecular  Immunology  67(2A):  95-106］。図１０Ｇを参照されたい。
【図１０−２】同上。
【図１０−３】同上。
【図１０−４】同上。
【図１０−５】同上。
【図１０−６】同上。
【図１０−７】同上。
【００５４】
【図１１−１】図１１Ａおよび１１Ｂは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３のうちの１つまたは複数に結合する抗体の抗原結合ドメインおよび少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドドメイン（例えば、ヒトまたは本明細書に記載のものなどの他の種に由来するＡｃｔＲＩＩＡタンパク質、例えば、配列番号５１または５２の細胞外ドメインに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なポリペプチド）を含むヘテロマータンパク質複合体の図式的な例を示す。例示した実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、相互作用対（「Ｃ１」）の第１のメンバーを含み、相互作用対（「Ａ１」）のさらなる第１のメンバーをさらに含む融合ポリペプチドの部分である。第２のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、相互作用対（「Ｂ１」）の第２のメンバーを含む融合ポリペプチドの部分である。可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチドは、相互作用対（「Ｃ２」）の第２のメンバーを含み、相互作用対（「Ａ２」）の第１のメンバーをさらに含む融合ポリペプチドの部分である。可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドは、相互作用対（「Ｂ２」）の第２のメンバーを含む融合ポリペプチドの部分である。各融合ポリペプチドでは、第１または第２のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドと相互作用対の対応するメンバーとの間、相互作用対間、ならびにＶＨおよびＶＬポリペプチドと相互作用対のメンバーとの間に、リンカーが位置してもよい。Ａ１およびＡ２は、同じであっても異なっていてもよく；Ｂ１およびＢ２は、同じであっても異なっていてもよく、かつＣ１およびＣ２は同じであっても異なっていてもよい。好適な相互作用対は、例えば、定常重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用対、トランケーション、および本明細書に記載されているそのバリアントを含んだ［例えば、Spiess  et  al  (2015)  Molecular  Immunology  67(2A):  95-106］。図１１Ａは、第１のＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインおよび第２のＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインを含むヘテロダイマーの一例である。図１１Ｂは、単一のＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインを含むヘテロマルチマーの一例である。
【図１１−２】同上。
【００５５】
【図１２】図１２は、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃホモダイマーおよびＴβＲＩＩ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃホモダイマーと比較した、相対的なＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロダイマーを示す。本明細書に記載されているＡ−２０４  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙによって、ＩＣ５０データを決定した。ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロダイマーは、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモダイマーと同様に、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびＧＤＦ１１シグナル伝達経路を阻害する。しかし、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−ＦｃヘテロダイマーによるＢＭＰ１０シグナル伝達経路の阻害は、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモダイマーと比較して有意に低減する。これらのデータにより、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロダイマーは、対応するＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモダイマーと比較して、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびＧＤＦ１１のより選択的なアンタゴニストであることが実証される。さらに、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロダイマーは、ＴβＲＩＩ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃホモダイマーと同様に、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３シグナル伝達経路を阻害する。
【００５６】
【図１３−１】図１３Ａ〜１３Ｄは、ＴβＲＩＩポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載のものなどの他の種に由来するＴβＲＩＩタンパク質、例えば、配列番号１８、２７、および２８〜３９の細胞外ドメインに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なポリペプチド）およびＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載のものなどの他の種に由来するＡｃｔＲＩＩＡタンパク質、例えば、配列番号５１および５２の細胞外ドメインに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なポリペプチド）を含むヘテロマータンパク質複合体の図式的な例を示す。
【００５７】
例示した実施形態では、ＴβＲＩＩ：ＡｃｔＲＩＩＡ単鎖ポリペプチドは、相互作用対（「Ｃ１」）の第１のメンバーを含む融合ポリペプチドの部分であり、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩポリペプチドは相互作用対（「Ｃ２」）の第２のメンバーを含む融合ポリペプチドの部分である。好適な相互作用対は、例えば、重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用対、トランケーション、および本明細書に記載されているものなどのそのバリアントを含んだ［例えば、Spiess  et  al  (2015)  Molecular  Immunology  67(2A):  95-106］。各融合ポリペプチドにおいて、ＴβＲＩＩおよび／またはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドと相互作用対の対応するメンバーとの間に、リンカーが位置してもよい。相互作用対の第１および第２のメンバーはガイドされない場合があり、これは、その対のメンバーが、実質的な優先度はないが、互いに会合するかまたは自己会合する場合があり、それらが同一であるかまたは異なるアミノ酸配列を有する場合があることを意味する。図１３Ａを参照されたい。あるいは、相互作用対は、ガイドされた（非対称の）対である場合があり、これは、対のメンバーが自己会合よりも優先的に互いに会合することを意味する。図１３Ｂを参照されたい。さらなるタンパク質複合体も予想され得る。図１３Ｃおよび１３Ｄを参照されたい。
【図１３−２】同上。
【図１３−３】同上。
【図１３−４】同上。
【００５８】
【図１４】図１４Ａは、ＴβＲＩＩ（ここで、ＴＧＦＢＲＩＩと称される）ポリペプチド（例えば、配列番号１７０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なポリペプチド）およびフォリスタチンポリペプチド（例えば、配列番号１１１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なポリペプチド）を含む、代表的な多特異性バインダーの図式的な例を示す。図１４Ｂは、ＴβＲＩＩポリペプチド（例えば、配列番号１７０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なポリペプチド）およびＧＤＦ８抗原結合性断片（例えば、配列番号１５１〜１５６の重鎖および軽鎖ＣＤＲを含むポリペプチド）を含む多特異性バインダーの図式的な例を示す。
【００５９】
【図１５】図１５Ａは、２つの融合タンパク質を含む、代表的な「４つのアーム」のホモダイマーの簡略化した概略図を示し、各融合タンパク質は、ＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメイン（ＩＩＢ  ＥＣＤ）、ＧＧＧリンカー、ＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含むＦｃ部分、（Ｇ４Ｓ）４Ｇリンカー、およびＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメイン（ＴＧＦβＲＩＩ  ＥＣＤ）を含む。図１５Ｂは、２つの融合タンパク質を含む、代表的な「３つのアーム」のヘテロマルチマーの簡略化した概略図を示し、第１の融合タンパク質は、ＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメイン（ＩＩＢ  ＥＣＤ）、ＧＧＧリンカー、「ノブ置換基」を有するＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含むＦｃ部分、（Ｇ４Ｓ）４Ｇリンカー、およびＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメイン（ＴＧＦβＲＩＩ  ＥＣＤ）を含み；かつ第２の融合タンパク質は、「ホール置換基」を有するＣＨ２−ＣＨ３  Ｆｃドメインを含むＦｃ部分、（Ｇ４Ｓ）４Ｇリンカー、およびＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメイン（ＴＧＦβＲＩＩ  ＥＣＤ）を含む。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
１．概説
一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドの多特異性バインダーを提供する。一部の実施形態では、多特異性バインダータンパク質は、ａ）ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３のうち少なくとも１つ、ならびにｂ）アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８のうち少なくとも１つ、に結合することが可能である。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、ａ）ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ３に結合することが可能な第１の部分；ならびにｂ）アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８のうち少なくとも１つに結合することが可能な第２の部分、を含む。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＴβＲＩＩポリペプチドを含むヘテロマルチマーである。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、ＴβＲＩＩポリペプチドおよびフォリスタチンまたはフォリスタチン様タンパク質ドメインを含む。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、ＴβＲＩＩポリペプチドおよび抗体または抗原結合性断片を含み、この抗体または抗原結合性断片は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８のうち１つまたは複数に結合することが可能である。特定の実施形態では、多特異性バインダーは、ＴβＲＩＩポリペプチドおよび抗体または抗原結合性断片を含み、この抗体または抗原結合性断片は、ＧＤＦ８に結合することが可能である。
【００６１】
一部の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＴβＲＩＩポリペプチドを含むヘテロマルチマーを提供する。好ましくは、かかるＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体のリガンド結合ドメインを含み、かかるＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴβＲＩＩ受容体のリガンド結合ドメインを含む。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、可溶性である。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、ホモマルチマーの対応する試料と比較して変更されたＴＧＦβスーパーファミリーリガンド特異性を有する（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＡｃｔＲＩＩＡホモダイマーまたはＴβＲＩＩ：ＴβＲＩＩホモダイマーと比較したＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロダイマー）。
【００６２】
ＴＧＦβスーパーファミリーは、ＴＧＦβ、アクチビン、ｎｏｄａｌ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、増殖および分化因子（ＧＤＦ）ならびに抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）を含む、３０を超える分泌型因子から構成される［Weiss  et  al.  (2013)  Developmental  Biology,  2(1):  47-63］。脊椎動物および無脊椎動物の両方において見出されるスーパーファミリーのメンバーは、多様な組織において遍在的に発現され、動物の生存期間を通じて、発生の最も初期の段階の間に機能する。実際、ＴＧＦβスーパーファミリータンパク質は、幹細胞の自己再生、原腸陥入、分化、臓器形態形成および成体の組織恒常性の重要なメディエーターである。この遍在的な活性と一致して、異常なＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達は、例えば、自己免疫性疾患、心血管疾患、線維性疾患およびがんを含む広範なヒト病理と関連する。
【００６３】
ＴＧＦβスーパーファミリーのリガンドは、同じダイマー構造を共有し、このとき、一方のモノマーの中心の３−１／２ターンヘリックスは、他方のモノマーのベータ鎖によって形成される凹面表面に詰め込まれる。ＴＧＦβファミリーメンバーの大部分は、分子間ジスルフィド結合によってさらに安定化される。このジスルフィド結合は、２つの他のジスルフィド結合によって形成される環を通り抜けて、「システインノット（cysteine  knot）」モチーフと呼ばれるものを生成する［Lin  et  al.  (2006)  Reproduction  132:  179-190；およびHinck  et  al.  (2012)  FEBS  Letters  586:  1860-1870］。
【００６４】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達は、リガンド刺激の際に下流のＳＭＡＤタンパク質（例えば、ＳＭＡＤタンパク質１、２、３、５および８）をリン酸化して活性化する、Ｉ型およびＩＩ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体のヘテロマー複合体によって媒介される［Massague  (2000)  Nat.  Rev.  Mol.  Cell  Biol.  1:169-178］。これらのＩ型およびＩＩ型受容体は、システインリッチ領域を有するリガンド結合性細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されたセリン／スレオニンキナーゼ特異性を有する細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。一般に、Ｉ型受容体は、細胞内シグナル伝達を媒介するが、ＩＩ型受容体は、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドを結合するために必要とされる。Ｉ型およびＩＩ型受容体は、リガンド結合後に安定な複合体を形成し、ＩＩ型受容体によるＩ型受容体のリン酸化を生じる。
【００６５】
ＴＧＦβファミリーは、それらが結合するＩ型受容体およびそれらが活性化するＳｍａｄタンパク質に基づいて、２つの系統発生的分岐へと分割され得る。一方は、Ｓｍａｄ２および３を活性化するＩ型受容体を介してシグナル伝達する、例えば、ＴＧＦβ、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ３およびｎｏｄａｌを含む、より最近進化した分岐である［Hinck  (2012)  FEBS  Letters  586:1860-1870］。他方の分岐は、このスーパーファミリーのより遠く関連するタンパク質を含み、Ｓｍａｄ１、５および８を介してシグナル伝達する、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ１、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７を含む。
【００６６】
ＴＧＦβアイソフォームは、ＴＧＦβスーパーファミリーの初期メンバーであり、その中には、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３と呼ばれる、哺乳動物における３つの公知のアイソフォームが存在する。成熟した生理活性ＴＧＦβリガンドは、ホモダイマーとして機能し、Ｉ型受容体ＡＬＫ５を介して大部分はシグナル伝達するが、内皮細胞ではＡＬＫ１を介して追加的にシグナル伝達することも見出されている［Goumans  et  al.  (2003)  Mol  Cell  12(4):  817-828］。ＴＧＦβ１は、最も豊富な、遍在的に発現されるアイソフォームである。ＴＧＦβ１は、創傷治癒において重要な役割を有することが公知であり、構成的に活性なＴＧＦβ１導入遺伝子を発現するマウスは、線維症を発症する［Clouthier  et  al.  (1997)  J  Clin.  Invest.  100(11):  2697-2713］。ＴＧＦβ１は、Ｔ細胞活性化およびＴ調節性細胞の維持にも関与する［Li  et  al.  (2006)  Immunity  25(3):  455-471］。ＴＧＦβ２発現は、ヒト神経膠芽腫細胞において最初に記載され、胚神経系のニューロンおよびアストログリア細胞中に存在する。ＴＧＦβ２は、Ｔリンパ球のインターロイキン−２依存的成長を抑制することが公知である。ＴＧＦβ３は、ヒト横紋筋肉腫細胞系から最初に単離され、それ以降、肺腺癌および腎臓癌細胞系において見出されている。ＴＧＦβ３は、口蓋および肺の形態形成にとって重要であることが公知である［Kubiczkova  et  al.  (2012)  Journal  of  Translational  Medicine  10:183］。
【００６７】
アクチビンは、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーであり、卵胞刺激ホルモンの分泌の制御因子として最初に発見されたが、引き続いて、種々の生殖性および非生殖性の役割が特徴付けられている。２つの密接に関連するβサブユニットのホモ／ヘテロダイマー（それぞれβＡβＡ、βＢβＢおよびβＡβＢ）である、３つの主なアクチビン形態（Ａ、ＢおよびＡＢ）が存在する。ヒトゲノムは、肝臓において主に発現されるアクチビンＣおよびアクチビンＥもまたコードし、βＣまたはβＥを含有するヘテロダイマー形態もまた公知である。ＴＧＦβスーパーファミリーにおいて、アクチビンは、卵巣および胎盤細胞におけるホルモン産生を刺激でき、ニューロン細胞の生存を支持でき、細胞型に依存して細胞周期の進行に正にまたは負に影響を与えることができ、少なくとも両生類の胚において、中胚葉分化を誘導できる、独自の多機能性因子である［DePaolo  et  al.  (1991)  Proc  Soc  Ep  Biol  Med.  198:500-512；Dyson  et  al.  (1997)  Curr  Biol.  7:81-84；およびWoodruff  (1998)  Biochem  Pharmacol.  55:953-963］。いくつかの組織では、アクチビンシグナル伝達は、その関連のヘテロダイマーであるインヒビンによってアンタゴナイズされる。例えば、下垂体からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）分泌の調節において、アクチビンは、ＦＳＨの合成および分泌を促進するが、インヒビンは、ＦＳＨの合成および分泌を低減させる。アクチビンの生物活性を調節し得、および／またはアクチビンに結合し得る他のタンパク質には、フォリスタチン（ＦＳ）、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＬＲＧまたはＦＳＴＬ３としても公知のＦＳＲＰ）およびα２−マクログロブリンが含まれる。
【００６８】
本明細書に記載される場合、「アクチビンＡ」に結合する薬剤は、単離されたβＡサブユニットの観点からであれ、ダイマー複合体（例えば、βＡβＡホモダイマーまたはβＡβＢヘテロダイマー）としてであれ、βＡサブユニットに特異的に結合する薬剤である。ヘテロダイマー複合体（例えば、βＡβＢヘテロダイマー）の場合、「アクチビンＡ」に結合する薬剤は、βＡサブユニット内に存在するエピトープに対して特異的であるが、複合体の非βＡサブユニット（例えば、複合体のβＢサブユニット）内に存在するエピトープには結合しない。同様に、「アクチビンＡ」をアンタゴナイズ（阻害）する本明細書に開示される薬剤は、単離されたβＡサブユニットの観点からであれ、ダイマー複合体（例えば、βＡβＡホモダイマーまたはβＡβＢヘテロダイマー）としてであれ、βＡサブユニットによって媒介される１つまたは複数の活性を阻害する薬剤である。βＡβＢヘテロダイマーの場合、「アクチビンＡ」を阻害する薬剤は、βＡサブユニットの１つまたは複数の活性を特異的に阻害するが、複合体の非βＡサブユニット（例えば、複合体のβＢサブユニット）の活性は阻害しない薬剤である。この原則は、「アクチビンＢ」、「アクチビンＣ」および「アクチビンＥ」に結合するおよび／またはそれを阻害する薬剤にも当てはまる。「アクチビンＡＢ」をアンタゴナイズする本明細書に開示される薬剤は、βＡサブユニットによって媒介される１つまたは複数の活性およびβＢサブユニットによって媒介される１つまたは複数の活性を阻害する薬剤である。同じ原則が、「アクチビンＡＣ」、「アクチビンＢＣ」、「アクチビンＡＥ」および「アクチビンＢＥ」に結合するおよび／またはそれを阻害する薬剤にも当てはまる。
【００６９】
ＢＭＰおよびＧＤＦは一緒になって、ＴＧＦβスーパーファミリーの特徴的なフォールディングを共有するシステインノットサイトカインのファミリーを形成する［Rider  et  al.  (2010)  Biochem  J.,  429(1):1-12］。このファミリーには、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ２ａ、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３ｂ（ＧＤＦ１０としても公知）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９（ＧＤＦ２としても公知）、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１（ＧＤＦ１１としても公知）、ＢＭＰ１２（ＧＤＦ７としても公知）、ＢＭＰ１３（ＧＤＦ６としても公知）、ＢＭＰ１４（ＧＤＦ５としても公知）、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１、ＧＤＦ３（ＶＧＲ２としても公知）、ＧＤＦ８（ミオスタチンとしても公知）、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１５およびデカペンタプレジックが含まれる。ＢＭＰにその名を与えた骨形成を誘導する能力に加えて、ＢＭＰ／ＧＤＦは、広範な組織の発生において形態形成活性を示す。ＢＭＰ／ＧＤＦホモダイマーおよびヘテロダイマーは、Ｉ型およびＩＩ型受容体ダイマーの組合せと相互作用して、複数の可能なシグナル伝達複合体を生じ、ＳＭＡＤ転写因子の２つの競合するセットのうち１つの活性化をもたらす。ＢＭＰ／ＧＤＦは、高度に特異的かつ限局性の機能を有する。これらは、ＢＭＰ／ＧＤＦ発現の発生的制限を含むいくつかの方法で、高い親和性でサイトカインに結合するいくつかの特異的ＢＭＰアンタゴニストタンパク質の分泌を介して、調節される。奇妙なことに、いくつかのこれらのアンタゴニストは、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドと似ている。
【００７０】
増殖および分化因子−８（ＧＤＦ８）は、ミオスタチンとしても公知である。ＧＤＦ８は、骨格筋量の負の制御因子であり、発生中のおよび成体の骨格筋において高度に発現される。トランスジェニックマウスにおけるＧＤＦ８ヌル突然変異は、骨格筋の著しい肥大化および過形成によって特徴付けられる［McPherron  et  al.  Nature  (1997)  387:83-90］。骨格筋量における類似の増加が、ウシ、および際だってはヒトにおけるＧＤＦ８の天然に存在する突然変異において明らかである［Ashmore  et  al.  (1974)  Growth,  38:501-507；Swatland  and  Kieffer,  J.  Anim.  Sci.  (1994)  38:752-757；McPherron  and  Lee,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  (1997)  94:12457-12461；Kambadur  et  al.  Genome  Res.  (1997)  7:910-915；およびSchuelke  et  al.  (2004)  N  Engl  J  Med,  350:2682-8］。研究により、ヒトにおけるＨＩＶ感染と関連する筋消耗に、ＧＤＦ８タンパク質発現における増加が伴うことも示されている［Gonzalez-Cadavid  et  al.,  PNAS  (1998)  95:14938-43］。さらに、ＧＤＦ８は、筋肉特異的酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の産生をモジュレートでき、筋芽細胞の細胞増殖をモジュレートできる［国際特許出願公開番号ＷＯ００／４３７８１］。ＧＤＦ８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ８ドメインダイマーに非共有結合によって結合して、その生物活性を不活性化することができる［Miyazono  et  al.  (1988)  J.  Biol.  Chem.,  263:  6407-6415；Wakefield  et  al.  (1988)  J.  Biol.  Chem.,  263；7646-7654；およびBrown  et  al.  (1990)  Growth  Factors,  3:  35-43］。ＧＤＦ８または構造的に関連するタンパク質に結合し、それらの生物活性を阻害する他のタンパク質には、フォリスタチン、および潜在的にはフォリスタチン関連タンパク質が含まれる［Gamer  et  al.  (1999)  Dev.  Biol.,  208:  222-232］。
【００７１】
ＢＭＰ１１としても公知のＧＤＦ１１は、マウス発生の間に尾芽、肢芽、上顎弓および下顎弓、ならびに後根神経節において発現される分泌型タンパク質である［McPherron  et  al.  (1999)  Nat.  Genet.,  22:  260-264；およびNakashima  et  al.  (1999)  Mech.  Dev.,  80:  185-189］。ＧＤＦ１１は、中胚葉組織および神経組織の両方をパターン形成する際に独自の役割を果たす［Gamer  et  al.  (1999)  Dev  Biol.,  208:222-32］。ＧＤＦ１１は、発生中のニワトリ肢における軟骨形成および筋形成の負の制御因子であることが示された［Gamer  et  al.  (2001)  Dev  Biol.,  229:407-20］。筋肉におけるＧＤＦ１１の発現は、ＧＤＦ８と類似の方法での、筋肉の成長を調節する際のその役割もまた示唆している。さらに、脳におけるＧＤＦ１１の発現は、ＧＤＦ１１が、神経系の機能に関連する活性もまた有し得ることを示唆している。興味深いことに、ＧＤＦ１１は、嗅上皮において神経発生を阻害することが見出された［Wu  et  al.  (2003)  Neuron.,  37:197-207］。したがって、阻害剤ＧＤＦ１１は、筋肉疾患および神経変性疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症）などの疾患の処置において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの適用を有し得る。
【００７２】
骨形成タンパク質（osteogenic  protein）−１（ＯＰ−１）とも呼ばれるＢＭＰ７は、軟骨および骨の形成を誘導することが周知である。さらに、ＢＭＰ７は、多彩な生理学的プロセスを調節する。例えば、ＢＭＰ７は、上皮骨形成の現象を担う骨誘導因子であり得る。ＢＭＰ７は、カルシウム調節および骨恒常性において役割を果たすことも見出されている。アクチビンと同様、ＢＭＰ７は、ＩＩ型受容体であるＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢに結合する。しかし、ＢＭＰ７およびアクチビンは、別個のＩ型受容体をヘテロマー受容体複合体中に動員する。観察された主要なＢＭＰ７  Ｉ型受容体は、ＡＬＫ２であったが、アクチビンは、ＡＬＫ４（ＡｃｔＲＩＩＢ）に排他的に結合した。ＢＭＰ７およびアクチビンは、別個の生物学的応答を惹起し、異なるＳＭＡＤ経路を活性化した［Macias-Silva  et  al.  (1998)  J  Biol  Chem.  273:25628-36］。
【００７３】
本明細書に記載されるように、比較阻害データは、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロダイマーが、広範なＳｍａｄ２／３活性化リガンドをアンタゴナイズできることを実証した。例えば、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロダイマーが、細胞に基づくアッセイにおいて、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびＧＤＦ１１シグナル伝達経路を阻害することを実証している。対照的に、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＴβＲＩＩホモダイマー単独は、Ｓｍａｄ２／３活性化リガンドのより小さいサブセットを阻害する。さらに、データは、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロダイマーが、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＴβＲＩＩホモダイマーリガンドトラップのアンタゴニスト的プロファイルを単に組み合わせることよりも、驚くべきことにより選択的なＳｍａｄ２／３リガンドアンタゴニストであることを実証している。例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロダイマーは、ＡｃｔＲＩＩＡホモダイマーと同様に、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびＧＤＦ１１シグナル伝達経路を阻害した。しかし、ＢＭＰ１０シグナル伝達経路のＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロダイマー阻害は、ＡｃｔＲＩＩＡホモダイマーと比較して、顕著に低減される。したがって、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、ＡｃｔＲＩＩＡホモダイマーと比較して、Ｓｍａｄ２／３活性化リガンドのより選択的なアンタゴニストである。したがって、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロダイマーは、かかる広いがなおも選択的なＳｍａｄ２／３アンタゴニズムが有利である、ある特定の適用において、ＡｃｔＲＩＩＡもしくはＴβＲＩＩホモダイマー、またはそれらの組合せよりも有用である。
【００７４】
本明細書で使用される用語は、一般に、本発明の文脈内で、かつ各用語が使用される具体的な文脈において、当該分野におけるその通常の意味を有する。ある特定の用語は、本発明の組成物および方法ならびにそれらをどのように作製および使用するかを記載して実務者にさらなるガイダンスを提供するために、以下または本明細書の他の場所で議論される。用語の任意の使用の範囲または意味は、その用語が使用される具体的な文脈から明らかとなる。
【００７５】
「相同な」は、その全ての文法的形態およびつづりのバリエーションで、同じ種の生物中のスーパーファミリーからのタンパク質、および異なる種の生物由来の相同なタンパク質を含む、「共通の進化的起源」を有する２つのタンパク質間の関連性を指す。かかるタンパク質（およびそれらのコード核酸）は、パーセント同一性に関してであれ、具体的な残基またはモチーフの存在および保存された位置によってであれ、それらの配列類似性によって反映される、配列相同性を有する。
【００７６】
用語「配列類似性」は、その全ての文法的形態で、共通の進化的起源を共有してもしていなくてもよい核酸配列間またはアミノ酸配列間の同一性または対応の程度を指す。しかし、一般的な用法および本出願では、用語「相同な」は、「高度に」などの副詞で修飾される場合、配列類似性を指し得、共通の進化的起源と関連してもしなくてもよい。
【００７７】
参照ポリペプチド（またはヌクレオチド）配列に関して、「パーセント（％）配列同一性」または「パーセント（％）同一な」は、いずれの保存的置換も配列同一性の一部として考慮に入れずに、配列をアラインさせ、最大のパーセント配列同一性を達成するために必要に応じてギャップを導入した後の、参照ポリペプチド（ヌクレオチド）配列中のアミノ酸残基（または核酸）に対して同一な、候補配列中のアミノ酸残基（または核酸）のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定することを目的としたアラインメントは、当業者の技術範囲内の種々の方法で、例えば、公に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、達成され得る。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメーターを決定できる。しかし、本明細書の目的のために、％アミノ酸（核酸）配列同一性値は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって書かれ、ソースコードは、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、２０５５９においてユーザー文書と共にファイルされており、そこで、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．から公に入手可能である、またはソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルすべきである。全ての配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変動しない。
【００７８】
「アゴナイズする」は、その全ての文法的形態で、（例えば、そのタンパク質の遺伝子発現を活性化もしくは増幅することによって、または不活性なタンパク質を活性状態に入るように誘導することによって）タンパク質および／もしくは遺伝子を活性化するプロセス、またはタンパク質の活性および／もしくは遺伝子の活性を増加させるプロセスを指す。
【００７９】
「アンタゴナイズする」は、その全ての文法的形態で、（例えば、そのタンパク質の遺伝子発現を阻害もしくは減少させることによって、または活性なタンパク質を不活性な状態に入るように誘導することによって）タンパク質および／もしくは遺伝子を阻害するプロセス、またはタンパク質の活性および／もしくは遺伝子の活性を減少させるプロセスを指す。
【００８０】
用語「約」および「およそ」は、本明細書および特許請求の範囲を通じて数値と併せて使用される場合、当業者が精通しており、当業者にとって許容可能な、正確さの区間を示す。
【００８１】
本明細書に開示される数値範囲は、その範囲を規定する数字を含む。
【００８２】
用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、この用語が使用される文脈が明確に他を示さない限り、複数形の指示対象を含む。用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、ならびに用語「１つまたは複数の」および「少なくとも１つの（ｏｎｅ）」は、本明細書で交換可能に使用され得る。さらに、「および／または」は、本明細書で使用される場合、２つまたはそれよりも多くの特定された特色または成分の各々の、他方を伴うまたは伴わない、具体的な開示として解釈すべきである。したがって、用語「および／または」は、本明細書で「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用される場合、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）および「Ｂ」（単独）を含むことを意図する。同様に、用語「および／または」は、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの語句において使用される場合、以下の態様の各々を包含することを意図する：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
【００８３】
本明細書を通じて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのバリエーションは、述べられた整数または整数の群を含むが、他の整数または整数の群をいずれも排除しないことを暗示すると理解される。本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、より狭い用語「〜からなる」および「〜から本質的になる」の使用もまた包含する。
【００８４】
用語「〜から本質的になる」は、特定された材料またはステップ、および本明細書に開示される本発明の基本的かつ新規の特徴に本質的に影響しないものに限定される。
【００８５】
用語「相当な親和性」は、本明細書で使用される場合、５０ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）での結合を意味する。
【００８６】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸の鎖を指すために、本明細書で交換可能に使用される。この鎖は、線状もしくは分岐であり得、改変されたアミノ酸を含み得、および／または非アミノ酸によって中断され得る。これらの用語は、天然に、あるいは介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは改変、例えば、標識化成分とのコンジュゲート化、によって改変されたアミノ酸鎖もまた包含する。この定義の中には、例えば、アミノ酸の１つまたは複数のアナログ（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、および当該分野で公知の他の改変を含むポリペプチドもまた含まれる。ポリペプチドは、単一の鎖または会合した鎖として存在し得ることが理解される。
【００８７】
用語「ヘテロマー」または「ヘテロマルチマー」は、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチドを少なくとも含む複合体であり、この第２のポリペプチド鎖は、少なくとも１アミノ酸残基だけ、第１のポリペプチド鎖とはアミノ酸配列が異なる。ヘテロマーは、第１および第２のポリペプチド鎖によって形成される「ヘテロダイマー」を含み得、または第１および第２のポリペプチド鎖に加えて１つまたは複数のポリペプチド鎖が存在する場合、より高次の構造を形成し得る。ヘテロマルチマーの例示的な構造には、ヘテロダイマー、ヘテロトリマー、ヘテロテトラマーおよびさらにはオリゴマー構造が含まれる。ヘテロダイマーは、本明細書で、Ｘ：Ｙとして、またはＸ−Ｙとして等価に指定され、ここで、Ｘは、第１のポリペプチド鎖を示し、Ｙは、第２のポリペプチド鎖を示す。より高次のヘテロマーおよびオリゴマー構造は、本明細書で、対応する様式で指定される。ある特定の実施形態では、ヘテロマルチマーは、組換えである（例えば、１つまたは複数のポリペプチド成分が、組換えタンパク質であり得る）、単離されているおよび／または精製されている。
【００８８】
本明細書で使用される場合、用語「〜が可能」（例えば、〜に結合することが可能）は、何かが、特定の作用を果たす能力を有するが、全ての特定の時点においてその作用を果たしている必要が必ずしもないことを意味する。例えば、タンパク質が、「リガンドに結合することが可能」な場合、これは、そのタンパク質が、生理学的条件下でリガンドに結合する能力を有するが、全ての特定の時点においてリガンドに結合している必要がないことを意味する。本明細書で明示的に他が示されない限り、用語「〜に結合する」は、何かが「〜に結合することが可能」であることを意味する。
２．ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドの多特異性バインダー
【００８９】
一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドの多特異性バインダーを提供する。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、ａ）ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３のうち少なくとも１つ、ならびにｂ）アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８のうち少なくとも１つ、に結合することが可能である。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、ａ）ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ３に結合することが可能な第１の部分；ならびにｂ）アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８のうち少なくとも１つに結合することが可能な第２の部分、を含む。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＴβＲＩＩポリペプチドを含むヘテロマルチマーである。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、ＴβＲＩＩポリペプチドおよびフォリスタチンまたはフォリスタチン様タンパク質ドメインを含む。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、ＴβＲＩＩポリペプチドおよび抗体または抗原結合性断片を含み、この抗体または抗原結合性断片は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８のうち１つまたは複数に結合することが可能である。特定の実施形態では、多特異性バインダーは、ＴβＲＩＩポリペプチドおよび抗体または抗原結合性断片を含み、この抗体または抗原結合性断片は、ＧＤＦ８に結合することが可能である。
Ａ．ＡｃｔＲＩＩＡおよびＴβＲＩＩポリペプチドならびにそれらのヘテロマルチマー
【００９０】
ある特定の態様では、本開示は、「ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー複合体」または「ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー」と本明細書で一般に呼ばれる、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＡ受容体ポリペプチド（例えば、配列番号５１、５２、８２、８４、８８および９０）および１つまたは複数のＴβＲＩＩ受容体ポリペプチド（例えば、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１８、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４４、４５、８５、８７、９１、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９および１００）を含むヘテロマルチマーに関する。好ましくは、本開示のＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、可溶性である、例えば、ヘテロマルチマーは、ＴβＲＩＩ受容体の可溶性部分（ドメイン）およびＡｃｔＲＩＩＡ受容体の可溶性部分（ドメイン）を含み得る。一般に、ＴβＲＩＩおよびＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメインは、これらの受容体の可溶性部分に対応する。したがって、一部の実施形態では、本開示のヘテロマルチマーは、ＴβＲＩＩ受容体の細胞外ドメインおよびＡｃｔＲＩＩＡ受容体の細胞外ドメインを含む。例示的な細胞外ドメインＴβＲＩＩおよびＡｃｔＲＩＩＡ受容体は、本明細書に開示され、かかる配列、ならびにその断片、機能的バリアントおよび改変形態は、本開示の発明（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー組成物およびその使用）に従って使用され得る。本開示のＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーには、例えば、ヘテロダイマー、ヘテロトリマー、ヘテロテトラマーおよびより高次のオリゴマー構造が含まれる。例えば、図９および１０を参照のこと。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のヘテロマルチマーは、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロダイマーである。好ましくは、本開示のＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ１１、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３のうち１つまたは複数に結合し得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、ＢＭＰ１０に結合しない、またはＢＭＰ１０に実質的に結合しない（例えば、ＢＭＰ１０とＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーとの間の相互作用の一過的な性質に起因して、不明確なＫａまたはＫｄを有する）。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンドによって媒介されるシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄ２／３）を阻害（アンタゴナイズ）するために使用され得る。特に、本開示のＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、例えば、細胞に基づくアッセイ、例えば、本明細書に記載されるものにおいて、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンドによる細胞内シグナル伝達を阻害するために使用され得る。例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲ��Ｉヘテロマルチマーは、細胞に基づくアッセイにおいて、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ１１、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３のうち１つまたは複数によって媒介されるシグナル伝達を阻害し得る。
【００９１】
本明細書で使用される場合、用語「ＴβＲＩＩ」は、任意の種由来のトランスフォーミング増殖因子ベータ受容体ＩＩ（ＴβＲＩＩ）タンパク質のファミリー、および突然変異誘発または他の改変によってかかるＴβＲＩＩタンパク質から誘導されるバリアントを指す。本明細書でのＴβＲＩＩに対する言及は、現在同定されている形態のいずれか１つに対する言及であると理解される。ＴβＲＩＩファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を含むリガンド結合性細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されたセリン／スレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。用語「ＴβＲＩＩポリペプチド」は、ＴβＲＩＩファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチド、および有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合物およびペプチド模倣形態を含む）を含む。
【００９２】
上記のように、ヒトＴβＲＩＩは、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）における選択的スプライシングによって生成される少なくとも２つのアイソフォーム  −  Ａ（長）およびＢ（短）  −  で天然に存在する（図１および２ならびに配列番号１および２）。配列番号１の残基２３〜１５９に対応する配列番号２７は、ＴβＲＩＩの短いアイソフォームの天然の全長細胞外ドメインを示す。配列番号２の残基２３〜１８４に対応する配列番号１８は、ＴβＲＩＩの長いアイソフォームの天然の全長細胞外ドメインを示す。他に示さない限り、ＴβＲＩＩの短いおよび長いアイソフォームに基づくバリアントに関して、アミノ酸位置の番号付けは、それぞれ、天然前駆体である配列番号１および配列番号２中の対応する位置を指す。
【００９３】
ある特定の実施形態では、本開示は、バリアントＴβＲＩＩポリペプチドを提供する。本開示のＴβＲＩＩポリペプチドは、例えばＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３であるがこれらに限定されないＴＧＦβスーパーファミリーメンバーに結合し得、その機能を阻害し得る。ＴβＲＩＩポリペプチドは、天然に存在するＴβＲＩＩポリペプチドの短縮型ＥＣＤドメインに対して少なくとも７０％同一な、必要に応じて少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列からなる、またはそれを含むポリペプチドであって、そのＣ末端が、配列番号１のアミノ酸１５３〜１５９のいずれかに存在する、ポリペプチドを含み得る。ＴβＲＩＩポリペプチドは、天然に存在するＴβＲＩＩポリペプチドの短縮型ＥＣＤドメインに対して少なくとも７０％同一な、必要に応じて少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列からなる、またはそれを含むポリペプチドであって、そのＣ末端が、配列番号２のアミノ酸１７８〜１８４のいずれかに存在する、ポリペプチドを含み得る。特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一な、必要に応じて少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【００９４】
必要に応じて、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１６０〜５６７からなる配列由来または配列番号２のアミノ酸１８５〜５９２からなる配列由来の、５つよりも多く連続するアミノ酸、あるいは１０、２０、３０、４０、５０、５２、６０、７０、８０、９０、１００、１５０よりも多く、または２００もしくはそれよりも多く連続するアミノ酸を含まない。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１６０〜５６７を含まない。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜２２を含まない。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜２２および１６０〜５６７を含まない。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１８５〜５９２を含まない。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜２２を含まない。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜２２および１８５〜５９２を含まない。プロセシングされていないＴβＲＩＩポリペプチドは、任意のシグナル配列、およびシグナル配列に対してＮ末端側の任意の配列を、含み得るまたは排除し得る。本明細書で詳述するように、プロセシングされたＴβＲＩＩポリペプチドのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸２３〜３５または配列番号２のアミノ酸２３〜６０のいずれかに存在し得る。
【００９５】
プロセシングされたＴβＲＩＩポリペプチドの例には、これらに限定されないが、配列番号１のアミノ酸２３〜１５９（配列番号２７に示される）、配列番号１のアミノ酸２９〜１５９（配列番号２８に示される）、配列番号１のアミノ酸３５〜１５９（配列番号２９に示される）、配列番号１のアミノ酸２３〜１５３（配列番号３０に示される）、配列番号１のアミノ酸２９〜１５３（配列番号３１に示される）、配列番号１のアミノ酸３５〜１５３（配列番号３２に示される）、配列番号２のアミノ酸２３〜１８４（配列番号１８に示される）、配列番号２のアミノ酸２９〜１８４（配列番号３３に示される）、配列番号２のアミノ酸６０〜１８４（配列番号２９に示される）、配列番号２のアミノ酸２３〜１７８（配列番号３４に示される）、配列番号２のアミノ酸２９〜１７８（配列番号３５に示される）および配列番号２のアミノ酸６０〜１７８（配列番号３２に示される）が含まれる。ＴβＲＩＩの長いアイソフォームに基づく対応するバリアントが、挿入に対してＣ末端側の隣接位置における保存的Ｖａｌ−Ｉｌｅ置換と共に、２５アミノ酸の挿入をコードするヌクレオチド配列を含むことが、当業者によって理解される。
【００９６】
したがって、ＴβＲＩＩポリペプチドは、短いアイソフォームおよび長いアイソフォームの両方を含む、ＴβＲＩＩポリペプチドの単離された細胞外部分、それらのバリアント（配列番号１のアミノ酸２３〜１５９または配列番号２のアミノ酸２３〜１８４に対応する配列中に、例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０または３５以下のアミノ酸置換を含むバリアントを含む）、それらの断片、および上述のいずれかを含む融合タンパク質を含み得るが、各場合において、好ましくは、上述のＴβＲＩＩポリペプチドのいずれかが、ＴＧＦβ１もしくはＴＧＦβ３のうち少なくとも一方、またはそれら両方に対する実質的な親和性を保持する。一般に、ＴβＲＩＩポリペプチドは、生物学的に適切な温度、ｐＨレベルおよびモル浸透圧濃度において、水溶液中で可溶性であるように設計される。
【００９７】
一部の実施形態では、本開示のバリアントＴβＲＩＩポリペプチドは、細胞外ドメイン中に、変更されたリガンド結合プロファイルを付与する１つまたは複数の突然変異を含む。ＴβＲＩＩポリペプチドは、天然に存在するＴβＲＩＩポリペプチドの対応する部分と比較して、アミノ酸配列中に、１、２、５つまたはそれよりも多くの変更を含み得る。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号１の７０位に対応する位置において、置換、挿入または欠失を生じる。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号１の１１０位に対応する位置において、置換、挿入または欠失を生じる。例としては、これらに限定されないが、配列番号１のそれぞれ７０位および１１０位に対応する位置における、ＮからＤへの置換またはＤからＫへの置換が含まれる。かかるバリアントＴβＲＩＩポリペプチドの例には、これらに限定されないが、配列番号３６〜３９に示される配列が含まれる。ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６もしくは４７、またはそのサイレントバリアント、あるいはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でその相補体にハイブリダイズする核酸のいずれか１つによってコードされる、ポリペプチドまたはその部分を含み得る。特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１２、またはそのサイレントバリアント、あるいはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でその相補体にハイブリダイズする核酸のいずれか１つによってコードされる、ポリペプチドまたはその部分を含み得る。
【００９８】
一部の実施形態では、本開示のバリアントＴβＲＩＩポリペプチドは、ヒトＴβＲＩＩアイソフォームＣ中に天然に存在するような、ヒトＴβＲＩＩ  ＥＣＤのＣ末端近傍に位置するグルタミン酸残基の対（配列番号１の１５１位および１５２位、または配列番号２の１７６位および１７７位）間に、３６アミノ酸の挿入（配列番号４１）をさらに含む（Konrad  et  al.,  BMC  Genomics  8:318,  2007）。
【００９９】
ＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴβＲＩＩリガンドを選択的にアンタゴナイズするように改変することができることが実証されている。Ｎ７０残基は、潜在的グリコシル化部位を示す。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、非グリコシル化されている（aglycosylate）。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、非グリコシル化されている、またはＡｓｎ１５７位において低減されたグリコシル化を有する。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、非グリコシル化されている、またはＡｓｎ７３位において低減されたグリコシル化を有する。
【０１００】
ある特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ１に結合し、このＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ３への実質的な結合を示さない。ある特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ３に結合し、このＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ１への実質的な結合を示さない。結合は、溶液中で、または表面プラズモン共鳴システム、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システム中で、精製されたタンパク質を使用して評価され得る。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ１の細胞シグナル伝達を阻害し、このＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ３シグナル伝達に対して、中間のまたは限定的な阻害効果を有する。ある特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ３の細胞シグナル伝達を阻害し、このＴβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ１シグナル伝達に対して、中間のまたは限定的な阻害効果を有する。細胞シグナル伝達に対する阻害効果は、当該分野で公知の方法によってアッセイされ得る。
【０１０２】
合わせて考えると、ＴβＲＩＩポリペプチドの活性部分は、配列番号１のアミノ酸配列２３〜１５３、２３〜１５４、２３〜１５５、２３〜１５６、２３〜１５７または２３〜１５８、および配列番号１のアミノ酸２４〜３５のいずれかで始まるこれらの配列のバリアントを含み得る。同様に、ＴβＲＩＩポリペプチドの活性部分は、配列番号２のアミノ酸配列２３〜１７８、２３〜１７９、２３〜１８０、２３〜１８１、２３〜１８２または２３〜１８３、および配列番号２のアミノ酸２４〜６０のいずれかで始まるこれらの配列のバリアントを含み得る。例示的なＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列２９〜１５９、３５〜１５９、２３〜１５３、２９〜１５３および３５〜１５３、または配列番号２のアミノ酸配列２９〜１８４、６０〜１８４、２３〜１７８、２９〜１７８および６０〜１７８を含む。これらの範囲内のバリアント、特に、配列番号１または配列番号２の対応する部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するものもまた企図される。配列番号１のアミノ酸１６０〜５６７または配列番号２のアミノ酸１８５〜５９２からなる配列を含まないＴβＲＩＩポリペプチドが選択され得る。特定の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一な、必要に応じて少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
用語「ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩＡファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチド、および有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合物およびペプチド模倣形態を含む）を含む。かかるバリアントＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの例は、本開示を通じて、ならびに国際特許出願公開番号ＷＯ２００６／０１２６２７およびＷＯ２００７／０６２１８８において提供され、これらは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全てのＡｃｔＲＩＩＡ関連ポリペプチドについてのアミノ酸の番号付けは、特記しない限り、以下に提供されるヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質配列（配列番号５０）の番号付けに基づく。
【０１０４】
ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質配列は、以下の通りである：
【化１】
2021522793.tif 000002
【０１０５】
シグナルペプチドは、一重下線によって示される；細胞外ドメインは、太字のフォントで示される；潜在的な内因性Ｎ結合型グリコシル化部位は、二重下線によって示される。
【０１０６】
プロセシングされた細胞外ヒトＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド配列は、以下の通りである：
【化２】
2021522793.tif 000003
【０１０７】
細胞外ドメインのＣ末端「テイル」は、一重下線によって示される。「テイル」が欠失した配列（Δ１５配列）は、以下の通りである：
【化３】
2021522793.tif 000004
【０１０８】
Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１６１６．４のヌクレオチド１５９〜１７００に対応する、ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、以下に示される（配列番号５６）。シグナル配列には下線が付される。
【化４】
2021522793.tif 000005
【化５】
2021522793.tif 000006
【０１０９】
プロセシングされた細胞外ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドをコードする核酸配列は、以下の通りである：
【化６】
2021522793.tif 000007
【０１１０】
ＡｃｔＲＩＩＡは、脊椎動物においてよく保存されており、細胞外ドメインの大きいストレッチは、完全に保存されている。例えば、図８は、種々のＡｃｔＲＩＩＡオルソログと比較した、ヒトＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインのマルチ配列アラインメントを示す。ＡｃｔＲＩＩＡに結合するリガンドの多くもまた、高度に保存されている。したがって、これらのアラインメントから、通常のＡｃｔＲＩＩＡ−リガンド結合活性にとって重要なリガンド結合ドメイン内の重要なアミノ酸位置を予測すること、および通常のＡｃｔＲＩＩＡ−リガンド結合活性を顕著に変更することなしに置換に対して寛容である可能性が高いアミノ酸位置を予測することが可能である。したがって、本明細書に開示される方法に従って有用な活性ヒトＡｃｔＲＩＩＡバリアントポリペプチドは、対応する位置において、別の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＡの配列からの１つもしくは複数のアミノ酸を含み得、またはヒトもしくは他の脊椎動物配列中のものと類似した残基を含み得る。
【０１１１】
限定を意味しないが、以下の例は、活性ＡｃｔＲＩＩＡバリアントを定義するためのこのアプローチを示す。図８に示されるように、ヒト細胞外ドメイン中のＦ１３は、Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ（ヒツジ）（配列番号１０２）、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ（ニワトリ）（配列番号１０４）、Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ（ウシ）（配列番号１０５）、Ｔｙｔｏ  ａｌｂａ（フクロウ）（配列番号１０７）およびＭｙｏｔｉｓ  ｄａｖｉｄｉｉ（コウモリ）（配列番号１０３）のＡｃｔＲＩＩＡではＹであり、これは、Ｆ、ＷおよびＹを含む芳香族残基がこの位置において寛容されることを示している。ヒト細胞外ドメイン中のＱ２４は、Ｂｏｓ  ＴａｕｒｕｓのＡｃｔＲＩＩＡではＲであり、これは、Ｄ、Ｒ、Ｋ、ＨおよびＥを含む荷電残基がこの位置において寛容されることを示している。ヒト細胞外ドメイン中のＳ９５は、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓおよびＴｙｔｏ  ａｌｂａのＡｃｔＲＩＩＡではＦであり、これは、この部位が、極性残基、例えば、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、Ｙ、およびおそらくは疎水性残基、例えば、Ｌ、ＩまたはＦを含む、広範な種々の変化に対して寛容であり得ることを示している。ヒト細胞外ドメイン中のＥ５２は、Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓのＡｃｔＲＩＩＡではＤであり、これは、ＤおよびＥを含む酸性残基がこの位置において寛容されることを示している。ヒト細胞外ドメイン中のＰ２９は、比較的保存されておらず、Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓのＡｃｔＲＩＩＡではＳ、およびＭｙｏｔｉｓ  ｄａｖｉｄｉｉのＡｃｔＲＩＩＡではＬとして現れ、したがって、本質的に任意のアミノ酸が、この位置において寛容されるはずである。
【０１１２】
さらに、上で議論したように、ＡｃｔＲＩＩタンパク質は、構造的／機能的特徴に関して、特に、リガンド結合に関して、当該分野で特徴付けられている［Attisano  et  al.  (1992)  Cell  68(1):97-108；Greenwald  et  al.  (1999)  Nature  Structural  Biology  6(1):  18-22；Allendorph  et  al.  (2006)  PNAS  103(20:  7643-7648；Thompson  et  al.  (2003)  The  EMBO  Journal  22(7):  1555-1566；ならびに米国特許第７，７０９，６０５号、同第７，６１２，０４１号および同第７，８４２，６６３号］。本明細書の教示に加えて、これらの参考文献は、１つまたは複数の所望の活性（例えば、リガンド結合活性）を保持するＡｃｔＲＩＩＡバリアントを生成するための方法についての十分なガイダンスを提供する。
【０１１３】
例えば、スリーフィンガートキシンフォールド（three-finger  toxin  fold）として公知の定義的な構造的モチーフは、Ｉ型およびＩＩ型受容体によるリガンド結合にとって重要であり、各モノマー受容体の細胞外ドメイン内の変動する位置に位置する保存されたシステイン残基によって形成される［Greenwald  et  al.  (1999)  Nat  Struct  Biol  6:18-22；およびHinck  (2012)  FEBS  Lett  586:1860-1870］。したがって、これらの保存されたシステインの最も外側によって境界が定められるヒトＡｃｔＲＩＩＡのコアリガンド結合ドメインは、配列番号５０（ＡｃｔＲＩＩＡ前駆体）の３０〜１１０位に対応する。したがって、これらのシステインによって境界が定められるコア配列に隣接する、構造的にあまり秩序立っていないアミノ酸は、リガンド結合を必ずしも変更せずに、Ｎ末端において約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９残基短縮され得、Ｃ末端において約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５残基短縮され得る。例示的なＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインには、配列番号５１および５２が含まれる。
【０１１４】
したがって、ＡｃｔＲＩＩＡの活性部分（例えば、リガンド結合）の一般式は、配列番号５０のアミノ酸３０〜１１０を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチドである。したがって、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、例えば、配列番号５０のアミノ酸２１〜３０のいずれか１つに対応する残基で始まり（例えば、アミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つで始まる）、配列番号５０のいずれか１つのアミノ酸１１０〜１３５に対応する位置で終わる（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つで終わる）ＡｃｔＲＩＩＡの部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る、それから本質的になり得る、またはそれからなり得る。他の例には、配列番号５０の２１〜３０（例えば、アミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つで始まる）、２２〜３０（例えば、アミノ酸２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つで始まる）、２３〜３０（例えば、アミノ酸２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つで始まる）、２４〜３０（例えば、アミノ酸２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つで始まる）から選択される位置で始まり、配列番号５０の１１１〜１３５（例えば、アミノ酸１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つで終わる）、１１２〜１３５（例えば、アミノ酸１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つで終わる）、１１３〜１３５（例えば、アミノ酸１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つで終わる）、１２０〜１３５（例えば、アミノ酸１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つで終わる）、１３０〜１３５（例えば、アミノ酸１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つで終わる）、１１１〜１３４（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４のいずれか１つで終わる）、１１１〜１３３（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２または１３３のいずれか１つで終わる）、１１１〜１３２（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１または１３２のいずれか１つで終わる）または１１１〜１３１（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０または１３１のいずれか１つで終わる）から選択される位置で終わる構築物が含まれる。これらの範囲内のバリアント、特に、配列番号５０の対応する部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるものもまた企図される。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号５０のアミノ酸３０〜１１０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なポリペプチドを含み得る、それから本質的になり得る、またはそれからなり得る。必要に応じて、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号５０のアミノ酸３０〜１１０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり、リガンド結合ポケット中に１、２、５、１０または１５以下の保存的アミノ酸変化を含むポリペプチドを含む。
【０１１５】
上記のように、本開示は、天然に存在するＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドに対して特定された程度の配列同一性または類似性を共有するＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを提供する。２つのアミノ酸配列のパーセント同一性を決定するために、これらの配列は、最適な比較を目的としてアラインされる（例えば、ギャップが、最適なアラインメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入され得、非相同配列は、比較目的のために無視され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸残基が比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基によって占有される場合、これらの分子は、その位置において同一である（本明細書で使用される場合、アミノ酸「同一性」は、アミノ酸「相同性」と等価である）。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、これらの配列によって共有される同一な位置の数の関数である。
【０１１６】
２つの配列間での配列の比較ならびにパーセント同一性および類似性の決定は、数学アルゴリズムを使用して達成され得る（Computational  Molecular  Biology,  Lesk,  A.  M.,  ed.,  Oxford  University  Press,  New  York,  1988；Biocomputing:  Informatics  and  Genome  Projects,  Smith,  D.  W.,  ed.,  Academic  Press,  New  York,  1993；Computer  Analysis  of  Sequence  Data,  Part  1,  Griffin,  A.  M.,  and  Griffin,  H.  G.,  eds.,  Humana  Press,  New  Jersey,  1994；Sequence  Analysis  in  Molecular  Biology,  von  Heinje,  G.,  Academic  Press,  1987；およびSequence  Analysis  Primer,  Gribskov,  M.  and  Devereux,  J.,  eds.,  M  Stockton  Press,  New  York,  1991）。
【０１１７】
一実施形態では、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（J  Mol.  Biol.  (48):444-453  (1970)）アルゴリズムを使用して決定される。具体的な実施形態では、以下のパラメーターが、ＧＡＰプログラムにおいて使用される：Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップウェイト、および１、２、３、４、５または６のレングスウェイト。さらに別の実施形態では、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Devereux,  J.,  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.  12(1):387  (1984)）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて入手可能）中のＧＡＰプログラムを使用して決定される。例示的なパラメーターには、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ならびに４０、５０、６０、７０または８０のギャップウェイト、および１、２、３、４、５または６のレングスウェイトを使用することが含まれる。他に特定しない限り、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックス、１０のギャップウェイトおよび３のレングスウェイトを使用してＧＡＰプログラムを使用して決定され、かかるアルゴリズムが所望のパーセント同一性を計算できない場合、本明細書に開示される適切な代替法を選択すべきである。
【０１１８】
別の実施形態では、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル、１２のギャップレングスペナルティおよび４のギャップペナルティを使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれたＥ．Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ  （CABIOS,  4:11-17  (1989)）のアルゴリズムを使用して決定される。
【０１１９】
２つのアミノ酸配列間の最良の全体的アラインメントを決定するための別の実施形態は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Comp.  App.  Biosci.,  6:237-245  (1990)）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列アラインメント中、クエリー配列および対象配列は、共にアミノ酸配列である。この全体的配列アラインメントの結果は、パーセント同一性を単位として示される。一実施形態では、アミノ酸配列同一性は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Comp.  App.  Biosci.,  6:237-245  (1990)）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して実施される。具体的な実施形態では、アミノ酸アラインメントのパーセント同一性および類似性を計算するために用いられるパラメーターは、以下を含む：マトリックス＝ＰＡＭ１５０、ｋタプル＝２、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ（Joining  penalty）＝２０、ランダム化グループレングス（Randomization  Group  Length）＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティ＝５およびギャップサイズペナルティ＝０．０５。
【０１２０】
本開示のポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド）は、Ｎ末端において、種々のリーダー配列のいずれかをさらに含み得る。かかる配列は、ペプチドが真核生物系において発現され、分泌経路に標的化されることを可能にする。例えば、Ｅｒｎｓｔら、米国特許第５，０８２，７８３号（１９９２）を参照のこと。あるいは、天然シグナル配列（例えば、天然ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡシグナル配列）が、細胞からの放出をもたらすために使用され得る。可能なリーダー配列には、天然リーダー、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）およびミツバチメリチン（それぞれ、配列番号２２〜２４）が含まれる。ＴＰＡリーダー配列を取り込んでいるＴβＲＩＩ−ＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質の例には、配列番号１１、１３、１５、１７、８２、８５、８８および９１が含まれる。シグナルペプチドのプロセシングは、他の変数のうちでも、選択されるリーダー配列、使用される細胞型、および培養条件に依存して変動し得、したがって、プロセシングされたポリペプチドの実際のＮ末端開始部位は、Ｎ末端方向またはＣ末端方向のいずれかで、１、２、３、４または５アミノ酸シフトし得る。ＴβＲＩＩの長いアイソフォームに基づく対応するバリアントが、挿入に対してＣ末端側の隣接位置における保存的Ｖａｌ−Ｉｌｅ置換と共に、２５アミノ酸の挿入を含むことが、当業者によって理解される。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、本開示は、ポリペプチドのグリコシル化を変更するための、ポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド）の特異的突然変異を企図する。かかる突然変異は、１つまたは複数のグリコシル化部位、例えば、Ｏ結合型またはＮ結合型グリコシル化部位を導入または排除するように選択され得る。アスパラギン結合型グリコシル化認識部位は、一般に、適切な細胞グリコシル化酵素によって特異的に認識されるトリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−スレオニン（またはアスパラギン−Ｘ−セリン）（式中、「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を含む。変更は、野生型ポリペプチドの配列への１つもしくは複数のセリンもしくはスレオニン残基の付加、または１つもしくは複数のセリンもしくはスレオニン残基による置換によってもなされ得る（Ｏ結合型グリコシル化部位について）。グリコシル化認識部位の第１または第３のアミノ酸位置の一方または両方における種々のアミノ酸置換または欠失（および／または第２の位置におけるアミノ酸欠失）は、改変されたトリペプチド配列における非グリコシル化を生じる。ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによるものである。使用されるカップリング様式に依存して、糖（複数可）は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えば、システインのもの；（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えば、セリン、スレオニンもしくはヒドロキシプロリンのもの；（ｅ）芳香族残基、例えば、フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンのもの；または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合されていてもよい。これらの方法は、参照により本明細書に組み込まれる、１９８７年９月１１日公開のＷＯ８７／０５３３０、およびAplin  and  Wriston  (1981)  CRC  Crit.  Rev.  Biochem.,  pp.  259-306に記載されている。ポリペプチド上に存在する１つまたは複数の炭水化物部分の除去は、化学的におよび／または酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化には、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物への、ポリペプチドの曝露が関与し得る。この処理は、アミノ酸配列をインタクトなままにしつつ、連結糖（linking  sugar）（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたは全ての糖の切断を生じる。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin  et  al.  (1987)  Arch.  Biochem.  Biophys.  259:52およびEdge  et  al.  (1981)  Anal.  Biochem.  118:131によってさらに記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura  et  al.  (1987)  Meth.  Enzymol.  138:350によって記載されるように、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。哺乳動物、酵母、昆虫および植物細胞は全て、ペプチドのアミノ酸配列によって影響され得る異なるグリコシル化パターンを導入し得るので、ポリペプチドの配列は、必要に応じて、使用される発現系の型に依存して調整され得る。一般に、ヒトでの使用のためのポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド）は、適切なグリコシル化を提供する哺乳動物細胞系、例えば、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞系において発現されるが、他の哺乳動物発現細胞系、操作されたグリコシル化酵素を有する酵母細胞系、および昆虫細胞も同様に有用であると予想される。
【０１２２】
本開示は、ポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびそれらのヘテロマルチマー）の突然変異体、特に、コンビナトリアル突然変異体のセット、ならびに短縮突然変異体を生成する方法をさらに企図する；コンビナトリアル突然変異体のプールは、機能的バリアント配列を同定するために特に有用である。かかるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、アゴニストもしくはアンタゴニストのいずれかとして作用し得る、またはあるいは、全てが一緒になって新規活性を有する、ポリペプチドバリアントを生成することであり得る。種々のスクリーニングアッセイが以下に提供され、かかるアッセイが、バリアントを評価するために使用され得る。例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＴβＲＩＩポリペプチドバリアントを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、ＡｃＲＩＩＡもしくはＴβＲＩＩリガンドに結合する能力、ＡｃｔＲＩＩＡもしくはＴβＲＩＩリガンドのＡｃｔＲＩＩＡもしくはＴβＲＩＩポリペプチドへの結合を防止する能力、またはＡｃｔＲＩＩＡもしくはＴβＲＩＩリガンドによって引き起こされるシグナル伝達を妨害する能力について、スクリーニングされ得る。
【０１２３】
天然に存在するポリペプチドの細胞外ドメインを含むポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド）と比較して、選択的な、または一般には増加した効力を有する、コンビナトリアル誘導されたバリアントが生成され得る。同様に、突然変異誘発は、対応する野生型ポリペプチドとは劇的に異なる血清半減期を有するバリアントを生じ得る。例えば、変更されたタンパク質は、天然ＴβＲＩＩポリペプチドの破壊を生じるタンパク分解性分解もしくは他のプロセス、または他の方法でのその排除もしくは不活性化に対して、より安定であるかあまり安定でないかのいずれかにされ得る。かかるバリアント、およびそれらをコードする遺伝子は、ＴβＲＩＩポリペプチドの半減期をモジュレートすることによってＴβＲＩＩポリペプチドレベルを変更するために利用され得る。例えば、短い半減期は、より一過的な生物学的影響を生じ得、患者内の組換えポリペプチドレベルのより緊密な制御を可能にし得る。Ｆｃ融合タンパク質では、タンパク質の半減期を変更するための突然変異は、リンカー（存在する場合）および／またはＦｃ部分中でなされ得る。
【０１２４】
コンビナトリアルライブラリーは、潜在的ポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド）配列の少なくとも一部分を各々が含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリーによって産生され得る。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物は、潜在的ポリペプチドのヌクレオチド配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、またはあるいは（例えば、ファージディスプレイのために）より大きい融合タンパク質のセットとして発現可能であるように、遺伝子配列へと酵素的にライゲーションされ得る。
【０１２５】
潜在的ポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド）バリアントのライブラリーが縮重オリゴヌクレオチド配列から生成され得る多くの方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動ＤＮＡ合成機において実施され得、次いで、合成遺伝子は、発現のために適切なベクター中にライゲーションされ得る。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当該分野で周知である（例えば、Narang,  SA  (1983)  Tetrahedron  39:3；Itakura  et  al.,  (1981)  Recombinant  DNA,  Proc.  3rd  Cleveland  Sympos.  Macromolecules,  ed.  AG  Walton,  Amsterdam:  Elsevier  pp273-289；Itakura  et  al.,  (1984)  Annu.  Rev.  Biochem.  53:323；Itakura  et  al.,  (1984)  Science  198:1056；Ike  et  al.,  (1983)  Nucleic  Acid  Res.  11:477を参照のこと）。かかる技術は、他のタンパク質の定向進化において用いられている（例えば、Scott  et  al.,  (1990)  Science  249:386-390；Roberts  et  al.,  (1992)  PNAS  USA  89:2429-2433；Devlin  et  al.,  (1990)  Science  249:  404-406；Cwirla  et  al.,  (1990)  PNAS  USA  87:  6378-6382；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号および同第５，０９６，８１５号を参照のこと）。
【０１２６】
あるいは、他の形態の突然変異誘発が、コンビナトリアルライブラリーを生成するために利用され得る。例えば、ポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド）バリアントは、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発などを使用するスクリーニングによって（Ruf  et  al.,  (1994)  Biochemistry  33:1565-1572；Wang  et  al.,  (1994)  J.  Biol.  Chem.  269:3095-3099；Balint  et  al.,  (1993)  Gene  137:109-118；Grodberg  et  al.,  (1993)  Eur.  J.  Biochem.  218:597-601；Nagashima  et  al.,  (1993)  J.  Biol.  Chem.  268:2888-2892；Lowman  et  al.,  (1991)  Biochemistry  30:10832-10838；およびCunningham  et  al.,  (1989)  Science  244:1081-1085）、リンカースキャニング突然変異誘発によって（Gustin  et  al.,  (1993)  Virology  193:653-660；Brown  et  al.,  (1992)  Mol.  Cell  Biol.  12:2644-2652；McKnight  et  al.,  (1982)  Science  232:316）；飽和突然変異誘発によって（Meyers  et  al.,  (1986)  Science  232:613）；ＰＣＲ突然変異誘発によって（Leung  et  al.,  (1989)  Method  Cell  Mol  Biol  1:11-19）；または化学的突然変異誘発などを含むランダム突然変異誘発によって（Miller  et  al.,  (1992)  A  Short  Course  in  Bacterial  Genetics,  CSHL  Press,  Cold  Spring  Harbor,  NY；およびGreener  et  al.,  (1994)  Strategies  in  Mol  Biol  7:32-34）、ライブラリーから生成および単離され得る。特にコンビナトリアル設定におけるリンカースキャニング突然変異誘発は、短縮型（生理活性）形態のポリペプチドを同定するための魅力的な方法である。
【０１２７】
点突然変異および短縮によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、およびさらに言えば、ある特定の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための広範な技術が、当該分野で公知である。かかる技術は、一般に、ポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド）のコンビナトリアル突然変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングのために適応可能である。大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための最も広く使用される技術は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローニングするステップ、ベクターの得られたライブラリーで適切な細胞を形質転換するステップ、およびその産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を所望の活性の検出が促進する条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させるステップを含む。好ましいアッセイには、リガンド結合アッセイおよびリガンド媒介性細胞シグナル伝達アッセイが含まれる。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、本開示のポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド）は、天然ポリペプチド中に天然に存在する任意の改変に加えて、翻訳後改変をさらに含み得る。かかる改変には、これらに限定されないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコール）およびアシル化が含まれる。結果として、改変されたポリペプチドは、非アミノ酸エレメント、例えば、ポリエチレングリコール、脂質、単糖または多糖、およびリン酸を含有し得る。ポリペプチドの機能性に対するかかる非アミノ酸エレメントの影響は、他のポリペプチドバリアントについて本明細書に記載されたように試験され得る。ポリペプチドが、新生形態のポリペプチドを切断することによって細胞中で産生される場合、翻訳後プロセシングもまた、タンパク質の正確なフォールディングおよび／または機能にとって重要であり得る。異なる細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ−２９３）は、かかる翻訳後活性のための具体的な細胞装置および特徴的な機構を有し、ポリペプチドの正確な改変およびプロセシングを確実にするために選択され得る。
【０１２９】
ある特定の態様では、本開示は、融合タンパク質（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡ融合タンパク質）を提供し、一部の実施形態では、第１の部分（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分）は、リンカーによって異種部分（例えば、Ｆｃ部分）に接続される。一部の実施形態では、リンカーは、グリシンおよびセリンリッチリンカーである。例えば、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、ＰｒｏおよびＡｌａであるがこれらに限定されない、他のほぼ中性のアミノ酸もまた、リンカー配列において使用され得る。一部の実施形態では、リンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒを含有するアミノ酸配列の種々の並べ替えを含む。一部の実施形態では、リンカーは、１０アミノ酸長よりも大きい。さらなる実施形態では、リンカーは、少なくとも１２、１５、２０、２１、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、リンカーは、４０、３５、３０、２５、２２または２０アミノ酸未満である。一部の実施形態では、リンカーは、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２１、１０〜１５、１０、１５〜２５、１７〜２２、２０または２１アミノ酸長である。一部の好ましい実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（ＧＧＧＧＳ）（配列番号１９）、またはその反復（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、式中、ｎは２以上である。特定の実施形態では、ｎは３以上である、またはｎは３〜１０である。本出願は、（ＧＧＧＧＳ）４リンカーによって一緒に融合されたＴβＲＩＩ部分および異種部分を含むタンパク質が、ｎが４未満である場合のＴβＲＩＩ融合タンパク質と比較した、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に対するより強い親和性と関連したという驚くべき知見を教示している。このように、好ましい実施形態では、ｎは４以上である、またはｎは４〜１０である。本出願は、ｎが４よりも大きい（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーを含むタンパク質が、（ＧＧＧＧＳ）４リンカーを有するタンパク質と類似の阻害特性を有したこともまた教示している。このように、一部の実施形態では、（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカー中のｎは、４以下である。一部の実施形態では、ｎは、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜８、５〜７または５〜６である。一部の実施形態では、ｎは、３、４、５、６または７である。特定の実施形態では、ｎは、４である。一部の実施形態では、（ＧＧＧＧＳ）ｎ配列を含むリンカーは、Ｎ末端スレオニンもまた含む。一部の実施形態では、リンカーは、以下のうちいずれか１つである：
【化７】
2021522793.tif 000008
【０１３０】
一部の実施形態では、リンカーは、ＴＧＧＧＰＫＳＣＤＫ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｎ末端スレオニンを欠く配列番号２１、４〜７、２５〜２６または４０のうちいずれか１つである。一部の実施形態では、リンカーは、グリシンリッチであり得（例えば、２〜１０、２〜５、２〜４、２〜３つのグリシン残基）、例えば、スレオニン／セリンおよびグリシンの単一の配列、またはスレオニン／セリンおよび／もしくはグリシンの反復配列、例えば、ＧＧＧ（配列番号６３）、ＧＧＧＧ（配列番号６４）、ＴＧＧＧＧ（配列番号６５）、ＳＧＧＧＧ（配列番号６６）またはＳＧＧＧ（配列番号６７）のシングレットまたは反復を含有し得る。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号２６のアミノ酸配列も配列番号４０のアミノ酸配列も含まない。
【０１３１】
一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号９４〜１００のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９７％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号９４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９７％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、配列番号９８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９７％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【０１３２】
ある特定の態様では、機能的バリアントまたは改変形態のＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの少なくとも一部分および１つまたは複数の異種部分を有する融合タンパク質を含む。かかる異種部分の周知の例には、これらに限定されないが、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）またはヒト血清アルブミンが含まれる。異種部分は、所望の特性を付与するように選択され得る。例えば、一部の異種部分は、アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離にとって特に有用である。親和性精製を目的として、アフィニティークロマトグラフィーに適切なマトリックス、例えば、グルタチオン、アミラーゼ、およびニッケルまたはコバルトコンジュゲートされた樹脂が使用される。かかるマトリックスの多くは、「キット」形態、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＧＳＴ精製システム、および（ＨＩＳ６）融合パートナーと共に有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）で入手可能である。別の例として、異種部分は、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの検出を促進するように選択され得る。かかる検出ドメインの例には、種々の蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、およびそれに対する特異的抗体が入手可能な通常は短いペプチド配列である「エピトープタグ」が含まれる。それに対する特異的モノクローナル抗体が容易に入手可能な周知のエピトープタグには、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）およびｃ−ｍｙｃタグが含まれる。一部の場合には、異種部分は、例えば、第Ｘａ因子またはトロンビンのためのプロテアーゼ切断部位を有し、これにより、適切なプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それによって、組換えタンパク質をそこから放出させることが可能になる。次いで、放出されたタンパク質は、引き続くクロマトグラフィー分離によって、異種部分から単離され得る。ある特定の好ましい実施形態では、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏで安定化するドメイン（「安定剤」ドメイン）と融合されている。「安定化する」とは、破壊の減少、腎臓によるクリアランスの減少、または他の薬物動態学的効果のいずれにこれが起因するかにかかわらず、血清半減期を増加させるものを意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合は、広範なタンパク質に望ましい薬物動態学的特性を付与することが公知である。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合は、望ましい特性を付与し得る。選択され得る他の型の異種部分には、マルチマー化（例えば、ダイマー化、テトラマー化）ドメインおよび機能的ドメインが含まれる。
【０１３３】
融合タンパク質の異なるエレメントは、所望の機能性と矛盾しない任意の様式で整列され得ることが理解される。例えば、ＴβＲＩＩもしくはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、異種ドメインに対してＣ末端側に配置され得、またはあるいは、異種ドメインは、ＴβＲＩＩもしくはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドに対してＣ末端側に配置され得る。ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドドメインおよび異種ドメインは、融合タンパク質中で隣接している必要はなく、さらなるドメインまたはアミノ酸配列が、いずれかのドメインに対してＣ末端側もしくはＮ末端側に、またはドメイン間に含まれ得る。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、用語「免疫グロブリンＦｃドメイン」または単に「Ｆｃ」は、免疫グロブリン鎖定常領域のカルボキシル末端部分、好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常領域、またはその部分を意味すると理解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または５）２つもしくはそれよりも多くのドメインと免疫グロブリンヒンジ領域との組合せ、を含み得る。好ましい実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを少なくとも含み、好ましくは、ＣＨ１ドメインを欠く。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域である。
【０１３５】
一実施形態では、重鎖定常領域が由来する免疫グロブリンのクラスは、ＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３または４）である。
【０１３６】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（Ｇ１Ｆｃ）として使用され得る天然アミノ酸配列の例は、以下に示される（配列番号５８）。点線の下線は、ヒンジ領域を示し、実線の下線は、天然に存在するバリアントを有する位置を示す。一部においては、本開示は、配列番号５８に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチドを提供する。Ｇ１Ｆｃにおける天然に存在するバリアントは、配列番号５８において使用される番号付けシステムに従って、Ｅ１３４ＤおよびＭ１３６Ｌを含む（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５７を参照のこと）。
【化８】
2021522793.tif 000009
【０１３７】
必要に応じて、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、Ａｓｐ−２６５、リシン３２２およびＡｓｎ−４３４などの残基において、１つまたは複数の突然変異を有する。ある特定の場合には、これらの突然変異のうち１つまたは複数（例えば、Ａｓｐ−２６５突然変異）を有する突然変異体ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃγ受容体に結合する低減された能力を有する。他の場合には、これらの突然変異のうち１つまたは複数（例えば、Ａｓｎ−４３４突然変異）を有する突然変異体Ｆｃドメインは、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、ＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）に結合する増加した能力を有する。
【０１３８】
ヒトＩｇＧ２のＦｃ部分（Ｇ２Ｆｃ）として使用され得る天然アミノ酸配列の例は、以下に示される（配列番号５９）。点線の下線は、ヒンジ領域を示し、二重下線は、配列中の、データベースと矛盾がある位置を示す（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１８５９に従う）。一部においては、本開示は、配列番号５９に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチドを提供する。
【化９】
2021522793.tif 000010
【０１３９】
ヒトＩｇＧ３のＦｃ部分（Ｇ３Ｆｃ）として使用され得るアミノ酸配列の２つの例が、以下に示される。Ｇ３Ｆｃ中のヒンジ領域は、他のＦｃ鎖中のヒンジ領域の最大で４倍の長さであり得、類似の１７残基セグメントが先行する３つの同一な１５残基セグメントを含有する。以下に示される第１のＧ３Ｆｃ配列（配列番号６０）は、単一の１５残基セグメントからなる短いヒンジ領域を含有するが、第２のＧ３Ｆｃ配列（配列番号６１）は、全長ヒンジ領域を含有する。各場合において、点線の下線は、ヒンジ領域を示し、実線の下線は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１８５９に従う天然に存在するバリアントを有する位置を示す。一部においては、本開示は、配列番号６０または６１に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチドを提供する。
【化１０】
2021522793.tif 000011
【化１１】
2021522793.tif 000012
【０１４０】
Ｇ３Ｆｃにおける天然に存在するバリアント（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８６０を参照のこと）は、配列番号６０で使用される番号付けシステムに変換した場合、Ｅ６８Ｑ、Ｐ７６Ｌ、Ｅ７９Ｑ、Ｙ８１Ｆ、Ｄ９７Ｎ、Ｎ１００Ｄ、Ｔ１２４Ａ、Ｓ１６９Ｎ、Ｓ１６９ｄｅｌ、Ｆ２２１Ｙを含み、本開示は、これらの変形形態のうち１つまたは複数を含有するＧ３Ｆｃドメインを含む融合タンパク質を提供する。さらに、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ３遺伝子（ＩＧＨＧ３）は、異なるヒンジ長さによって特徴付けられる構造的多型を示す［Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５９を参照のこと］。具体的には、バリアントＷＩＳは、Ｖ領域のほとんどおよびＣＨ１領域の全てを欠いている。これは、ヒンジ領域中に通常存在する１１位に加えて、７位において余分な鎖間ジスルフィド結合を有する。バリアントＺＵＣは、Ｖ領域のほとんど、ＣＨ１領域の全て、およびヒンジの一部を欠く。バリアントＯＭＭは、対立遺伝子形態または別のガンマ鎖サブクラスを示し得る。本開示は、これらのバリアントのうち１つまたは複数を含有するＧ３Ｆｃドメインを含むさらなる融合タンパク質を提供する。
【０１４１】
ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分（Ｇ４Ｆｃ）として使用され得る天然アミノ酸配列の例は、以下に示される（配列番号６２）。点線の下線は、ヒンジ領域を示す。一部においては、本開示は、配列番号６２に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチドを提供する。
【化１２】
2021522793.tif 000013
【０１４２】
Ｆｃドメイン中の種々の操作された突然変異は、Ｇ１Ｆｃ配列（配列番号５８）に関して本明細書に提示され、Ｇ２Ｆｃ、Ｇ３ＦｃおよびＧ４Ｆｃ中の類似の突然変異は、図６中のそれらとＧ１Ｆｃとのアラインメントから誘導され得る。同じでないヒンジ長さに起因して、アイソタイプアラインメント（図６）に基づく類似のＦｃ位置は、配列番号５８、５９、６０、６１および６２において、異なるアミノ酸番号を有する。ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる免疫グロブリン配列（例えば、配列番号５８、５９、６０、６１および６２）中の所与のアミノ酸位置は、番号付けがＩｇＧ１重鎖定常ドメイン全体（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる）を包含する場合のＵｎｉｐｒｏｔデータベース中と同じ位置とは異なる番号によって同定されることもまた理解され得る。
【０１４３】
他のクラスの免疫グロブリン、ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）およびＩｇＭ（Ｉｇμ）が使用され得る。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択は、米国特許第５，５４１，０８７号および同第５，７２６，０４４号で詳細に議論されている。特定の結果を達成するための、ある特定の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択は、当業者の技術水準の範囲内とみなされる。免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡ構築物の部分は、好ましくは、ヒンジドメインの少なくとも一部分、好ましくは、ＦｃガンマのＣＨ３ドメインまたはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはＩｇＭのいずれか中の相同なドメインの少なくとも一部分を含む。
【０１４４】
さらに、免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸の置換または欠失は、本明細書に開示される方法および組成物の実施において有用であり得ることが企図される。１つの例は、上部ＣＨ２領域中にアミノ酸置換を導入して、Ｆｃ受容体に対する低減された親和性を有するＦｃバリアントを創出することである（Cole  et  al.  (1997)  J.  Immunol.  159:3613）。
【０１４５】
例えば、本出願は、操作されたまたはバリアントＦｃ領域を有するＦｃ融合タンパク質をさらに提供する。かかる抗体およびＦｃ融合タンパク質は、例えば、エフェクター機能、例えば、抗原依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をモジュレートする際に有用であり得る。さらに、改変は、抗体およびＦｃ融合タンパク質の安定性を改善し得る。抗体およびＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡ中に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。かかるバリアントは、例えば、本明細書に開示される抗体およびＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列からの欠失、および／またはかかる配列中への挿入、および／またはかかる配列内の残基の置換を含む。最終構築物が所望の特徴を有することを条件として、欠失、挿入および置換の任意の組合せが、最終構築物に到達するためになされる。アミノ酸変化はまた、抗体およびＦｃ融合タンパク質の翻訳後プロセシングを変更し得、例えば、グリコシル化部位の数または位置を変化させる。
【０１４６】
低減されたエフェクター機能を有する抗体およびＦｃ融合タンパク質は、Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅら（ＷＯ９４／２８０２７およびＷＯ９８／４７５３１を参照のこと；Xu  et  al.  2000  Cell  Immunol  200；16-26もまた参照のこと）によって記載されるＡｌａ−Ａｌａ突然変異が含まれるがこれに限定されないアミノ酸配列中の変化を導入することによって産生され得る。したがって、ある特定の実施形態では、定常領域内にＡｌａ−Ａｌａ突然変異を含む突然変異を有する本開示のＦｃ融合タンパク質は、エフェクター機能を低減または無効化するために使用され得る。これらの実施形態によれば、抗体およびＦｃ融合タンパク質は、２３４位にアラニンへの突然変異もしくは２３５位にアラニンへの突然変異、またはそれらの組合せを含み得る。一実施形態では、抗体またはＦｃ融合タンパク質は、ＩｇＧ４フレームワークを含み、Ａｌａ−Ａｌａ突然変異は、２３４位にフェニルアラニンからアラニンへの突然変異（複数可）および／または２３５位にロイシンからアラニンへの突然変異を記載する。別の実施形態では、抗体またはＦｃ融合タンパク質は、ＩｇＧ１フレームワークを含み、Ａｌａ−Ａｌａ突然変異は、２３４位にロイシンからアラニンへの突然変異（複数可）および／または２３５位にロイシンからアラニンへの突然変異を記載する。抗体またはＦｃ融合タンパク質は、あるいは、またはさらに、ＣＨ２ドメイン中の点突然変異Ｋ３２２Ａを含む、他の突然変異を有し得る（Hezareh  et  al.  2001  J  Virol.  75:  12161-8）。
【０１４７】
特定の実施形態では、抗体またはＦｃ融合タンパク質は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増強または阻害するために改変され得る。モジュレートされたＣＤＣ活性は、Ｆｃ領域中に１つまたは複数のアミノ酸置換、挿入または欠失を導入することによって達成され得る（例えば、米国特許第６，１９４，５５１号を参照のこと）。あるいは、またはさらに、システイン残基（複数可）がＦｃ領域中に導入され、それによって、この領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にし得る。こうして生成されたホモダイマー抗体は、改善もしくは低減された内在化能および／または増加もしくは減少した補体媒介性細胞死滅を有し得る。Caron  et  al.,  J.  Exp  Med.  176:1191-1195  (1992)およびShopes,  B.  J.  Immunol.  148:2918-2922  (1992)、ＷＯ９９／５１６４２、Duncan  &  Winter  Nature  322:  738-40  (1988)；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；およびＷＯ９４／２９３５１を参照のこと。
【０１４８】
ある特定の好ましい実施形態では、本明細書に記載されるヘテロマルチマーは、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドと共有結合または非共有結合によって会合した少なくとも１つのＴβＲＩＩポリペプチドを含む。好ましくは、本明細書に開示されるポリペプチドは、ヘテロダイマー複合体を形成するが、例えば、ヘテロトリマー、ヘテロテトラマーおよびさらにはオリゴマー構造であるがこれらに限定されないより高次のヘテロマルチマー複合体もまた含まれる（例えば、図９および１０を参照のこと）。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩおよび／またはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、少なくとも１つのマルチマー化ドメインを含む。本明細書に開示される場合、用語「マルチマー化ドメイン」は、少なくとも第１のポリペプチドと少なくとも第２のポリペプチドとの間での共有結合または非共有結合による相互作用を促進するアミノ酸またはアミノ酸の配列を指す。本明細書に開示されるポリペプチドは、マルチマー化ドメインに共有結合または非共有結合によって結合されていてもよい。好ましくは、マルチマー化ドメインは、第１のポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチド）と第２のポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド）との間の相互作用を促進して、ヘテロマルチマー形成（例えば、ヘテロダイマー形成）を促進し、必要に応じて、ホモマルチマー形成（例えば、ホモダイマー形成）を妨げるかまたは他の方法で嫌い、それによって、所望のヘテロマルチマーの収量を増加させる（例えば、図９および１０を参照のこと）。
【０１４９】
当該分野で公知の多くの方法が、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーを生成するために使用され得る。例えば、天然に存在しないジスルフィド結合は、ジスルフィド結合が第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間で形成されるように遊離チオールが第２のポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド）上の別の遊離チオール含有残基と相互作用するように、第１のポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチド）上の天然に存在するアミノ酸を、遊離チオール含有残基、例えば、システインで置き換えることによって構築され得る。ヘテロマルチマー形成を促進するための相互作用のさらなる例には、これらに限定されないが、例えば、Ｋｊａｅｒｇａａｒｄら、ＷＯ２００７１４７９０１に記載されるイオン性相互作用；例えば、Ｋａｎｎａｎら、米国特許第８，５９２，５６２号に記載される静電ステアリング（electrostatic  steering）効果；例えば、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、米国特許出願公開第２０１２０３０２７３７号に記載されるコイルドコイル相互作用；例えば、Pack  &  Plueckthun,(1992)  Biochemistry  31:  1579-1584に記載されるロイシンジッパー；および例えば、Pack  et  al.,  (1993)  Bio/Technology  11:  1271-1277に記載されるヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフが含まれる。種々のセグメントの連結は、例えば、共有結合を介して、例えば、化学的クロスリンク、ペプチドリンカー、ジスルフィド架橋などによって、または親和性相互作用を介して、例えば、アビジン−ビオチンもしくはロイシンジッパーテクノロジーによって、得られ得る。
【０１５０】
ある特定の態様では、マルチマー化ドメインは、相互作用対の一方の成分を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドは、第２のポリペプチドと共有結合または非共有結合によって会合した第１のポリペプチドを含むタンパク質複合体を形成し得、この第１のポリペプチドは、ＴβＲＩＩポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用対の第１のメンバーのアミノ酸配列を含み；第２のポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用対の第２のメンバーのアミノ酸配列を含む。相互作用対は、複合体、特に、ヘテロダイマー複合体を形成するように相互作用する任意の２つのポリペプチド配列であり得るが、有効な実施形態は、ホモダイマー複合体を形成し得る相互作用対もまた用い得る。相互作用対の一方のメンバーは、例えば、配列番号１８、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、５１および５２のうちいずれか１つの配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド配列を含む、本明細書に記載されるＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドに融合され得る。相互作用対は、改善された特性／活性、例えば、増加した血清半減期を付与するように、または改善された特性／活性を提供するために別の部分が結合されているアダプターとして作用するように、選択され得る。例えば、ポリエチレングリコール部分は、改善された特性／活性、例えば、改善された血清半減期を提供するために、相互作用対の一方または両方の成分に結合されていてもよい。
【０１５１】
相互作用対の第１および第２のメンバーは、非対称対であり得、これは、対のメンバーが、自己会合ではなく、互いに優先的に会合することを意味している。したがって、非対称相互作用対の第１および第２のメンバーは、ヘテロダイマー複合体を形成するように会合し得る（例えば、図９および１０を参照のこと）。あるいは、相互作用対は、ガイドされない場合があり、これは、対のメンバーが、実質的な選好なしに互いに会合し得るまたは自己会合し得、したがって、同じまたは異なるアミノ酸配列を有し得ることを意味している。したがって、ガイドされていない相互作用対の第１および第２のメンバーは、ホモダイマー複合体またはヘテロダイマー複合体を形成するように会合し得る。必要に応じて、相互作用対（例えば、非対称対またはガイドされていない相互作用対）の第１のメンバーは、相互作用対の第２のメンバーと共有結合によって会合する。必要に応じて、相互作用対（例えば、非対称対またはガイドされていない相互作用対）の第１のメンバーは、相互作用対の第２のメンバーと非共有結合によって会合する。
【０１５２】
単一の細胞系からの、非対称な免疫グロブリンに基づくタンパク質の大規模産生において生じる問題は、「鎖会合問題（chain  association  issue）」として公知である。二特異性抗体の産生において顕著に直面するように、鎖会合問題は、異なる重鎖および／または軽鎖が単一の細胞系において産生される場合に内在的に生じる複数の組合せの中から所望の多鎖タンパク質を効率的に産生する上での課題に関する［Klein  et  al  (2012)  mAbs  4:653-663］。この問題は、２つの異なる重鎖および２つの異なる軽鎖が同じ細胞中で産生される場合に最も深刻であり、その場合、典型的には１つだけが所望される場合に、合計で１６の可能な鎖組合せ（これらの一部は同一であるが）が存在する。それにもかかわらず、同じ原則が、２つの異なる（非対称な）重鎖のみを組み込む所望の多鎖融合タンパク質の収量の減少を説明する。
【０１５３】
許容可能な収量で好ましい非対称融合タンパク質を産生するために、単一の細胞系におけるＦｃ含有融合ポリペプチド鎖の所望の対形成を増加させる種々の方法が、当該分野で公知である［Klein  et  al  (2012)  mAbs  4:653-663；およびSpiess  et  al  (2015)  Molecular  Immunology  67(2A):  95-106］。Ｆｃ含有鎖の所望の対形成を得るための方法には、これらに限定されないが、電荷に基づく対形成（静電ステアリング）、「ノブ−イントゥ−ホール」立体対形成、ＳＥＥＤｂｏｄｙ対形成、およびロイシンジッパーに基づく対形成が含まれる［Ridgway  et  al  (1996)  Protein  Eng  9:617-621；Merchant  et  al  (1998)  Nat  Biotech  16:677-681；Davis  et  al  (2010)  Protein  Eng  Des  Sel  23:195-202；Gunasekaran  et  al  (2010)；285:19637-19646；Wranik  et  al  (2012)  J  Biol  Chem  287:43331-43339；米国特許第５９３２４４８号；ＷＯ１９９３／０１１１６２；ＷＯ２００９／０８９００４およびＷＯ２０１１／０３４６０５］。本明細書に記載される場合、これらの方法は、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロマルチマーを生成するために使用され得る。図９および１０を参照のこと。
【０１５４】
例えば、特異的ポリペプチド間での相互作用がそれにより促進され得る１つの手段は、例えば、Ａｒａｔｈｏｏｎら、米国特許第７，１８３，０７６号およびＣａｒｔｅｒら、米国特許第５，７３１，１６８号に記載される、突出−イントゥ−空洞（protuberance-into-cavity）（ノブ−イントゥ−ホール）相補的領域を操作することによるものである。「突出」は、第１のポリペプチド（例えば、第１の相互作用対）の界面からの小さいアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることによって構築される。突出と同一または類似のサイズの相補的「空洞」が、必要に応じて、大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることによって、第２のポリペプチド（例えば、第２の相互作用対）の界面上に創出される。適切に配置されたまたは適切な寸法にされた突出または空洞が、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのいずれかの界面に存在する場合、隣接する界面において、それぞれ対応する空洞または突出を操作することのみが必要である。
【０１５５】
中性ｐＨ（７．０）では、アスパラギン酸およびグルタミン酸は、負に荷電しており、リシン、アルギニンおよびヒスチジンは、正に荷電している。これらの荷電残基は、ヘテロダイマー形成を促進し、同時に、ホモダイマー形成を妨げるために使用され得る。誘引性の相互作用が、反対の電荷間で生じ、反発的な相互作用が、同様の電荷間で生じる。一部においては、本明細書に開示されるタンパク質複合体は、荷電界面残基の部位特異的突然変異誘発を実施することによって、ヘテロマルチマー形成（例えば、ヘテロダイマー形成）を促進するために誘引性の相互作用を使用し、必要に応じて、ホモダイマー形成（例えば、ホモダイマー形成）を妨げるために反発的な相互作用を使用する。
【０１５６】
例えば、ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン界面は、ドメイン−ドメイン相互作用に関与する４つの独自の電荷残基対を含む：Ａｓｐ３５６−Ｌｙｓ４３９’、Ｇｌｕ３５７−Ｌｙｓ３７０’、Ｌｙｓ３９２−Ａｓｐ３９９’およびＡｓｐ３９９−Ｌｙｓ４０９’［第２の鎖中の残基番号付けは、（’）によって示される］。ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン中の残基を指定するために本明細書で使用される番号付けスキームは、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームに従うことに留意すべきである。ＣＨ３−ＣＨ３ドメイン相互作用に存在する２回対称性に起因して、各独自の相互作用は、構造中に２回現れる（例えば、Ａｓｐ−３９９−Ｌｙｓ４０９’およびＬｙｓ４０９−Ａｓｐ３９９’）。野生型配列では、Ｋ４０９−Ｄ３９９’は、ヘテロダイマーおよびホモダイマーの両方の形成を好む。第１の鎖中の電荷極性を切り替える単一の突然変異（例えば、Ｋ４０９Ｅ；陽性の電荷から負の電荷へ）は、第１の鎖のホモダイマーの形成にとって好ましくない相互作用をもたらす。好ましくない相互作用は、同じ電荷（負−負；Ｋ４０９Ｅ−Ｄ３９９’およびＤ３９９−Ｋ４０９Ｅ’）間で生じる反発的な相互作用に起因して生じる。第２の鎖中の電荷極性を切り替える類似の突然変異（Ｄ３９９Ｋ’；負から正へ）は、第２の鎖のホモダイマー形成にとって好ましくない相互作用（Ｋ４０９’−Ｄ３９９Ｋ’およびＤ３９９Ｋ−Ｋ４０９’）をもたらす。しかし、同時に、これら２つの突然変異（Ｋ４０９ＥおよびＤ３９９Ｋ’）は、ヘテロダイマー形成にとって好ましい相互作用（Ｋ４０９Ｅ−Ｄ３９９Ｋ’およびＤ３９９−Ｋ４０９’）をもたらす。
【０１５７】
ヘテロダイマー形成およびホモダイマー阻止に対する静電ステアリング効果は、例えば、Ａｒｇ３５５およびＬｙｓ３６０を含む、第２の鎖中の反対に荷電した残基と対形成してもしなくてもよいさらなる電荷残基の突然変異によってさらに増強され得る。以下の表は、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー形成を増強するために、単独でまたは組み合わせて使用され得る可能な電荷変化突然変異を列挙する。
【表１】
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【０１５８】
一部の実施形態では、本出願の融合タンパク質中のＣＨ３−ＣＨ３界面を構成する１つまたは複数の残基は、相互作用が静電的に好ましくないものになるように、荷電アミノ酸で置き換えられる。例えば、界面中の正に荷電したアミノ酸（例えば、リシン、アルギニンまたはヒスチジン）は、負に荷電したアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置き換えられる。あるいは、または上述の置換と組み合わせて、界面中の負に荷電したアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸で置き換えられる。ある特定の実施形態では、アミノ酸は、所望の電荷特徴を有する天然に存在しないアミノ酸で置き換えられる。負に荷電した残基（ＡｓｐまたはＧｌｕ）をＨｉｓに突然変異させることは、立体問題を引き起こし得る側鎖体積における増加をもたらすことに留意すべきである。さらに、Ｈｉｓの陽子ドナー形態およびアクセプター形態は、局部的な環境に依存する。これらの問題は、設計戦略と共に考慮に入れるべきである。界面残基は、ヒトおよびマウスのＩｇＧサブクラスにおいて高度に保存されているので、本明細書に開示される静電ステアリング効果は、ヒトおよびマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に適用され得る。この戦略は、ＣＨ３ドメイン界面において非荷電残基を荷電残基に改変することにも拡張され得る。
【０１５９】
一部においては、本開示は、電荷対形成（静電ステアリング）に基づいて相補的であるように操作されたＦｃ配列を使用して、非対称Ｆｃ含有ポリペプチド鎖の所望の対形成を提供する。静電気的相補性を有するＦｃ配列の対の一方は、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーを生成するために、必要に応じたリンカーありまたはなしで、構築物のＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドに任意に融合され得る。この単一の鎖は、所望の多鎖構築物（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）の生成を好むように、第１のＦｃに対して相補的なＦｃ配列と共に、最適な細胞において共発現され得る。静電ステアリングに基づくこの例では、配列番号６８［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｅ３５６Ｋ／Ｄ３９９Ｋ）］および配列番号６９［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｋ３９２Ｄ／Ｋ４０９Ｄ）］は、相補的Ｆｃ配列の例であり、配列中、操作されたアミノ酸置換には、二重下線が付され、構築物のＴＧＦβスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドは、配列番号６８または配列番号６９のいずれかに融合され得るが、両方にではない。天然ｈＧ１Ｆｃ、天然ｈＧ２Ｆｃ、天然ｈＧ３Ｆｃおよび天然ｈＧ４Ｆｃ間の高い程度のアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ中の対応する位置におけるアミノ酸置換（図６を参照のこと）が、以下の相補的ｈＧ１Ｆｃ対（配列番号６８および６９）の代わりに使用され得る相補的Ｆｃ対を生成することが理解され得る。
【化１３】
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【化１４】
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【０１６０】
一部においては、本開示は、立体相補性のために操作されたＦｃ配列を使用して、非対称Ｆｃ含有ポリペプチド鎖の所望の対形成を提供する。一部においては、本開示は、立体相補性の例として、ノブ−イントゥ−ホール対形成を提供する。立体相補性を有するＦｃ配列の対の一方は、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーを生成するために、必要に応じたリンカーありまたはなしで、構築物のＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドに任意に融合され得る。この単一の鎖は、所望の多鎖構築物の生成を好むように、第１のＦｃに対して相補的なＦｃ配列と共に、最適な細胞において共発現され得る。ノブ−イントゥ−ホール対形成に基づくこの例では、配列番号７０［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｔ１４４Ｙ）］および配列番号７１［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｙ１８５Ｔ）］が、相補的Ｆｃ配列の例であり、配列中、操作されたアミノ酸置換には、二重下線が付され、構築物のＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号７０または配列番号７１のいずれかに融合され得るが、両方にではない。天然ｈＧ１Ｆｃ、天然ｈＧ２Ｆｃ、天然ｈＧ３Ｆｃおよび天然ｈＧ４Ｆｃ間の高い程度のアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ中の対応する位置におけるアミノ酸置換（図６を参照のこと）が、以下の相補的ｈＧ１Ｆｃ対（配列番号７０および７１）の代わりに使用され得る相補的Ｆｃ対を生成することが理解され得る。
【化１５】
2021522793.tif 000017
【０１６１】
操作されたジスルフィド結合と組み合わせたノブ−イントゥ−ホール対形成に基づくＦｃ相補性の例は、配列番号７２［ｈＧ１Ｆｃ（Ｓ１３２Ｃ／Ｔ１４４Ｗ）］および配列番号７３［ｈＧ１Ｆｃ（Ｙ１２７Ｃ／Ｔ１４４Ｓ／Ｌ１４６Ａ／Ｙ１８５Ｖ）］に開示されている。これらの配列中の操作されたアミノ酸置換には、二重下線が付され、構築物のＴＧＦβスーパーファミリーＩ型またはＩＩ型ポリペプチドは、配列番号７２または配列番号７３のいずれかに融合され得るが、両方にではない。天然ｈＧ１Ｆｃ、天然ｈＧ２Ｆｃ、天然ｈＧ３Ｆｃおよび天然ｈＧ４Ｆｃ間の高い程度のアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ中の対応する位置におけるアミノ酸置換（図６を参照のこと）が、以下の相補的ｈＧ１Ｆｃ対（配列番号７２および７３）の代わりに使用され得る相補的Ｆｃ対を生成することが理解され得る。
【化１６】
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【０１６２】
一部においては、本開示は、ヒトＩｇＧおよびＩｇＡ  ＣＨ３ドメインの相互嵌合性β鎖セグメントを生成するように操作されたＦｃ配列を使用して、非対称Ｆｃ含有ポリペプチド鎖の所望の対形成を提供する。かかる方法は、ＳＥＥＤｂｏｄｙ融合タンパク質の形成を可能にする、鎖交換操作されたドメイン（strand-exchange  engineered  domain）（ＳＥＥＤ）ＣＨ３ヘテロダイマーの使用を含む［Davis  et  al.  (2010)  Protein  Eng  Design  Sel  23:195-202］。ＳＥＥＤｂｏｄｙ相補性を有するＦｃ配列の対の一方は、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡ融合ポリペプチドを生成するために、必要に応じたリンカーありまたはなしで、構築物のＴβＲＩＩまたはＡｃｔＩＩＡに任意に融合され得る。この単一の鎖は、所望の多鎖構築物の生成を好むように、第１のＦｃに対して相補的なＦｃ配列と共に、最適な細胞において共発現され得る。ＳＥＥＤｂｏｄｙ（Ｓｂ）対形成に基づくこの例では、配列番号７４［ｈＧ１Ｆｃ（ＳｂＡＧ）］および配列番号７５［ｈＧ１Ｆｃ（ＳｂＧＡ）］が、相補的ＩｇＧ  Ｆｃ配列の例であり、配列中、ＩｇＡ  Ｆｃから操作されたアミノ酸置換には、二重下線が付され、構築物のＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号７４または配列番号７５のいずれかに融合され得るが、両方にではない。天然ｈＧ１Ｆｃ、天然ｈＧ２Ｆｃ、天然ｈＧ３Ｆｃおよび天然ｈＧ４Ｆｃ間の高い程度のアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ１Ｆｃ、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ中の対応する位置におけるアミノ酸置換（図６を参照のこと）が、以下の相補的ＩｇＧ−ＩｇＡ対（配列番号７４および７５）において使用され得るＦｃモノマーを生成することが理解され得る。
【化１７】
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【化１８】
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【０１６３】
一部においては、本開示は、Ｆｃ  ＣＨ３ドメインのＣ末端において結合された切断可能なロイシンジッパードメインを用いた、非対称Ｆｃ含有ポリペプチド鎖の所望の対形成を提供する。ロイシンジッパーの結合は、ヘテロダイマー抗体重鎖の優先的アセンブリを引き起こすのに十分である［Wranik  et  al  (2012)  J  Biol  Chem  287:43331-43339］。本明細書に開示される場合、ロイシンジッパー形成性鎖に結合されたＦｃ配列の対の一方は、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡ融合ポリペプチドを生成するために、必要に応じたリンカーありまたはなしで、構築物のＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドに任意に融合され得る。この単一の鎖は、所望の多鎖構築物の生成を好むように、相補的ロイシンジッパー形成性鎖に結合されたＦｃ配列と共に、最適な細胞において共発現され得る。精製後の細菌エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃによる構築物のタンパク分解性消化は、ロイシンジッパードメインを放出して、その構造が天然Ｆｃの構造と同一であるＦｃ構築物を生じ得る。ロイシンジッパー対形成に基づくこの例では、配列番号７６［ｈＧ１Ｆｃ−Ａｐ１（酸性）］および配列番号７７［ｈＧ１Ｆｃ−Ｂｐ１（塩基性）］は、相補的ＩｇＧ  Ｆｃ配列の例であり、配列中、操作された相補的ロイシンジッパー配列には、下線が付され、構築物のＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号７６または配列番号７７のいずれかに融合され得るが、両方にではない。天然ｈＧ１Ｆｃ、天然ｈＧ２Ｆｃ、天然ｈＧ３Ｆｃおよび天然ｈＧ４Ｆｃ間の高い程度のアミノ酸配列同一性を考慮すると、必要に応じたリンカーありまたはなしでｈＧ１Ｆｃ、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃに結合されたロイシンジッパー形成性配列（図６を参照のこと）が、以下の相補的ロイシンジッパー形成性対（配列番号７６および７７）において使用され得るＦｃモノマーを生成することが理解され得る。
【化１９】
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【化２０】
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【０１６４】
ある特定の態様では、本開示は、ＴβＲＩＩポリペプチドの等電点（ｐＩ）を変更する１つもしくは複数のアミノ酸改変を含むＴβＲＩＩポリペプチド（例えば、ＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質）および／またはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの等電点を変更する１つもしくは複数のアミノ酸改変を含むＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質）に関する。一部の実施形態では、約５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５または９．０よりも高いｐＩ値を有する１つまたは複数の候補ドメインが、完全マルチドメインタンパク質の構築のために選択される。他の実施形態では、約９．０、８．５、８．０、７．５、７．０、６．５、６．０、５．５または５．０未満のｐＩ値を有する１つまたは複数の候補ドメインが、完全マルチドメインタンパク質の構築のために選択される。単一のタンパク質が複数の電荷形態を有することが、当業者によって理解される。いずれの特定の理論にも束縛されることは望まないが、タンパク質の電荷は、アミノ酸置換、カチオン化、脱アミノ化、カルボキシル末端アミノ酸不均一性、リン酸化およびグリコシル化が含まれるがこれらに限定されないいくつかの異なる機構によって改変され得る。
【０１６５】
タンパク質のｐＩは、等電点電気泳動および種々のコンピューターアルゴリズムが含まれるがこれらに限定されない種々の方法によって決定され得る（例えば、Bjellqvist  et  al.,  1993,  Electrophoresis  14:1023を参照のこと）。一実施形態では、ｐＩは、多温度（multi  temp）冷蔵浴再循環ユニットおよびＥＰＳ  ３５０１  ＸＬ電源を備えたＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ  ２電気泳動システムを使用して決定される。プレキャストａｍｐｈｏｌｉｎｅゲル（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｐＩ範囲２．５〜１０）に、タンパク質試料がロードされる。広範囲のｐＩマーカー標準（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ｐＩ範囲３〜１０、８μＬ）が、タンパク質について相対的ｐＩを決定するために使用される。電気泳動は、例えば、１５００Ｖ、５０ｍＡで１０５分間にわたって実施され得る。ゲルは、例えば、精製水で１×に希釈されたＳｉｇｍａ固定溶液（５×）を使用して固定され、染色が、例えば、Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して室温で一晩実施される。脱染は、例えば、２５％エタノール、８％酢酸および６７％精製水から構成される溶液を用いて実施される。等電点は、標準の検量線と比較して、例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒを使用して決定される。１つまたは複数の測定基準は、異なるｐＨ値、異なる温度、異なる剪断応力および異なる凍結／解凍サイクルからなる群から選択される１つまたは複数の異なる条件下でのドメインの安定性を特徴付ける測定基準をさらに含み得る。
【０１６６】
一部においては、本開示は、所望のヘテロマー種の精製を促進するＦｃドメイン中のさらなる突然変異と組み合わせた上記方法によって、非対称Ｆｃ含有ポリペプチド鎖の所望の対形成を提供する。例は、配列番号７２〜７３に開示される、操作されたジスルフィド結合と組み合わせたノブ−イントゥ−ホール対形成に基づくＦｃドメインの相補性、プラス１つのＦｃ含有ポリペプチド鎖中の２つの負に荷電したアミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸）および相補的Ｆｃ含有ポリペプチド鎖（配列番号７８〜７９）中の２つの正に荷電したアミノ酸（例えば、アルギニン）のさらなる置換である。これら４つのアミノ酸置換は、等電点または正味の分子電荷における差異に基づいた、不均一なポリペプチド混合物からの所望のヘテロマー融合タンパク質の選択的精製を促進する。これらの配列中の操作されたアミノ酸置換には、以下で二重下線が付され、構築物のＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号７８または配列番号７９のいずれかに融合され得るが、両方にではない。天然ｈＧ１Ｆｃ、天然ｈＧ２Ｆｃ、天然ｈＧ３Ｆｃおよび天然ｈＧ４Ｆｃ間の高い程度のアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ中の対応する位置におけるアミノ酸置換（図６を参照のこと）が、以下の相補的ｈＧ１Ｆｃ対（配列番号７８〜７９）の代わりに使用され得る相補的Ｆｃ対を生成することが理解され得る。
【化２１】
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【０１６７】
別の例は、配列番号７２〜７３に開示される、操作されたジスルフィド結合と組み合わせたノブ−イントゥ−ホール対形成に基づくＦｃドメインの相補性、プラス１つのＦｃ含有ポリペプチド鎖（配列番号８０）中の２１３位にヒスチジンからアルギニンへの置換を含む。この置換（Ｋａｂａｔらの番号付けシステムにおいてＨ４３５Ｒと示される）は、プロテインＡに対する親和性における差異に基づく、望ましくないホモダイマーからの所望のヘテロマーの分離を促進する。操作されたアミノ酸置換は、二重下線によって示され、構築物のＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号８０または配列番号７３のいずれかに融合され得るが、両方にではない。天然ｈＧ１Ｆｃ、天然ｈＧ２Ｆｃ、天然ｈＧ３Ｆｃおよび天然ｈＧ４Ｆｃ間の高い程度のアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ中の対応する位置におけるアミノ酸置換（図６を参照のこと）が、配列番号８０（下）および配列番号７３の相補的ｈＧ１Ｆｃ対の代わりに使用され得る相補的Ｆｃ対を生成することが理解され得る。
【化２２】
2021522793.tif 000024
【０１６８】
上記のように、許容される収量で好ましい非対称融合タンパク質を産生するために、単一の細胞系におけるＦｃ含有融合ポリペプチド鎖の所望の対形成を増加させる種々の方法が、当該分野で公知である［Klein  et  al  (2012)  mAbs  4:653-663；およびSpiess  et  al  (2015)  Molecular  Immunology  67(2A):  95-106］。さらに、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、ＴβＲＩＩポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドのいずれかを含む重鎖および軽鎖融合タンパク質の組合せを使用して生成され得る。例えば、一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチドは、リンカードメインありまたはなしで、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部分を含む免疫グロブリン重鎖（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）に融合され得る。同様に、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、リンカードメインありまたはなしで、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）の少なくとも一部分を含む免疫グロブリン軽鎖（カッパまたはラムダ）に融合され得る。代替的な実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、リンカードメインありまたはなしで、ＣＨ１ドメインの少なくとも一部分を含む免疫グロブリン重鎖（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）に融合され得、ＴβＲＩＩポリペプチドは、リンカードメインありまたはなしで、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）の少なくとも一部分を含む免疫グロブリン軽鎖（カッパまたはラムダ）に融合され得る。この設計は、重鎖が軽鎖とヘテロダイマー化する天然の能力を利用する。特に、重鎖および軽鎖のヘテロダイマー化は、ＣＨ１とＣＬとの間で起こり、これは一般に、ジスルフィド架橋を介した２つのドメインの共有結合による連結によって安定化される。全長重鎖、またはヒンジ領域を含む重鎖の少なくとも一部分を用いる構築物は、２つの「軽鎖」および２つの「重鎖」を含む抗体様分子を生じ得る。図１０を参照のこと。この設計の潜在的な利点は、これが天然に存在するＴβＲＩＩ−リガンド−ＡｃｔＲＩＩＡ複合体をより密接に模倣し得、比較できる単一のヘテロダイマーよりも、リガンドに対するより高い親和性を示し得ることである。一部の実施形態では、この設計は、例えば、ＣＨ１ドメインとヒンジドメインの一部または全てとを含む短縮（Ｆ（ａｂ’）２様分子を生じる）およびＣＨ１ドメインまたはその断片のみを含む短縮（Ｆａｂ様分子を生じる）を含む種々の重鎖短縮を組み込むことによって改変され得る。図１０Ｇを参照のこと。かかるヘテロマルチマー構築物を設計するための種々の方法は、米国特許出願公開第２００９／００１０８７９号、Klein  et  al  [(2012)  mAbs  4:653-663]およびSpiess  et  al  [(2015)  Molecular  Immunology  67(2A):  95-106]に記載され、これらの内容は、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６９】
一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ−ＣＬ：ＡｃｔＲＩＩＡ−ＣＨ１ヘテロダイマー対を含む複合体の少なくとも１つの分岐およびＡｃｔＲＩＩＡ−ＣＬ：ＴβＲＩＩ−ＣＨ１ヘテロダイマー対を含む少なくとも１つの第２の分岐を含む抗体様ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロダイマーを生成することが望ましい。例えば、図１０Ｂを参照のこと。かかかるヘテロダイマー複合体は、例えば、重鎖および軽鎖の非対称対形成テクノロジーの組合せを使用して生成され得る［Spiess  et  al  (2015)  Molecular  Immunology  67(2A):  95-106］。例えば、ＣｒｏｓｓＭａｂテクノロジー［Schaefer  et  al  (2011).  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  108:  11187-11192］では、軽鎖誤対形成は、ドメインクロスオーバーを使用して克服され、重鎖は、ノブ−イントゥ−ホールを使用してヘテロダイマー化される［Merchant  et  al  (1998)  Nat.  Biotechnol.  16:  677-681］。ドメインクロスオーバーのために、可変ドメインまたは定常ドメインのいずれかが、可変ドメインの構造的および機能的完全性を維持しつつ、コグネート軽鎖対形成を駆動する２つの非対称Ｆａｂアームを創出するために、軽鎖と重鎖との間で交換される［Fenn  et  al  (2013)  PLoS  ONE  8:  e61953］。軽鎖誤対形成を克服するための代替的アプローチは、直交Ｆａｂ界面を有する重鎖および軽鎖を設計することである［Lewis  (2014)  Nat.  Biotechnol.  32:  191-198］。これは、ＶＨ／ＶＬ界面およびＣＨ１／ＣＬ界面における突然変異を同定するための、Ｘ線結晶構造解析と組み合わせた計算モデリング［Das  et  al  (2008)  Annu.  Rev.  Biochem.77:  363-382］によって達成されている。この方法論を使用して生成されたヘテロダイマーについて、重鎖／軽鎖誤対形成を最小化するために、ＶＨ／ＶＬ界面およびＣＨ１／ＣＬ界面の両方に突然変異を操作することが必要であり得る。設計された直交Ｆａｂ界面は、単一の宿主細胞における効率的なＩｇＧ産生を促進するために、重鎖ヘテロダイマー化戦略と併せて使用され得る。静電ステアリングもまた、かかるヘテロダイマーの構築を促進するために、直交Ｆａｂ界面を生成するために使用され得る。ペプチドリンカーは、「ＬＵＺ−Ｙ」として公知のフォーマットでの軽鎖および重鎖のコグネート対形成を確実にするために使用され得［Wranik  et  al  (2012)  J.  Biol.  Chem.  287:  43331-43339］、このとき、重鎖ヘテロダイマー化は、タンパク質分解によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで引き続いて除去され得るロイシンジッパーを使用して達成される。
【０１７０】
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１１、１３、１５、１７、１８、２７、８５、８７、９１および９３のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、ＴβＲＩＩポリペプチド融合タンパク質、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーを提供する。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチド融合タンパク質、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、配列番号８５、８７、９１および９３のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチド融合タンパク質、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、配列番号８７のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチド融合タンパク質、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、配列番号９３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０１７１】
一部の実施形態では、本開示は、配列番号５１、５２、８２、８４、８８および９０のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド融合タンパク質、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーを提供する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド融合タンパク質、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、配列番号８２、８４、８８および９０のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド融合タンパク質、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、配列番号８４のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド融合タンパク質、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、配列番号９０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０１７２】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＴβＲＩＩ融合タンパク質は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に対する改善された結合親和性を有する。一部の実施形態では、少なくとも１０アミノ酸長のリンカーを含むＴβＲＩＩ融合タンパク質（例えば、配列番号１１、１３および１５のうちいずれか１つのアミノ酸配列を有する融合タンパク質）は、参照ＴβＲＩＩ融合タンパク質（例えば、配列番号９のアミノ酸配列を有するＴβＲＩＩ融合タンパク質）と比較して、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に対する改善された結合親和性を有する。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ融合タンパク質は、２００ｐＭ未満、１５０ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、７５ｐＭ未満、５０ｐＭ未満または２５ｐＭ未満のＫＤで、ＴＧＦβ１に結合する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、７５ｐＭ未満、７０ｐＭ未満、６０ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、４０ｐＭ未満、３５ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、１５未満、１０未満または５ｐＭ未満のＫＤで、ＴＧＦβ３に結合する。
【０１７３】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＴβＲＩＩポリペプチド、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーのいずれかは、測定可能なアッセイにおいて、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ１１、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３のうち１つまたは複数を阻害する。一部の実施形態では、レポーター遺伝子アッセイは、ＣＡＧＡレポーターアッセイである。一部の実施形態では、ＣＡＧＡアッセイは、トランスフェクション効率を制御するためにｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２レポータープラスミド（Dennler  et  al,  1998,  EMBO  17:  3091-3100）ならびにＲｅｎｉｌｌａレポータープラスミド（ｐＲＬＣＭＶ）をトランスフェクトされたヒト肺癌細胞系に基づく。ＣＡＧＡモチーフは、ＴＧＦβ応答性遺伝子（例えば、ＰＡＩ−１）のプロモーター中に存在し、したがって、このベクターは、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３を介してシグナル伝達する因子のために一般に使用される。例えば、実施例２を参照のこと。
【０１７４】
一部の実施形態では、本明細書に開示される融合ポリペプチドのいずれかは、以下の成分を含む：ａ）本明細書に開示されるＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドのいずれか（「Ａ」）、ｂ）本明細書に開示されるリンカーのいずれか（「Ｂ」）、ｃ）本明細書に開示される異種部分のいずれか（「Ｃ」）、および必要に応じて、リンカー（「Ｘ」）。かかる実施形態では、融合ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端へと）以下のように整列され得る：Ａ−Ｂ−ＣまたはＣ−Ｂ−Ａ。かかる実施形態では、融合ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端へと）以下のように整列され得る：Ｘ−Ａ−Ｂ−ＣまたはＸ−Ｃ−Ｂ−Ａ。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、Ａ、ＢおよびＣ（ならびに必要に応じて、リーダー配列、例えば、配列番号２３のアミノ酸配列）の各々を含み、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化を含み得る）。
【０１７５】
一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端へと）以下のように配置されたリーダー配列（例えば、配列番号２３）を含み：Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｃ、融合ポリペプチドは、ＸとＡとの間に１、２、３、４または５つのアミノ酸を含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端へと）以下のように配置されたリーダー配列（例えば、配列番号２３）を含み：Ｘ−Ｃ−Ｂ−Ａ、融合ポリペプチドは、ＸとＣとの間に１、２、３、４または５つのアミノ酸を含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端へと）以下のように配置されたリーダー配列（例えば、配列番号２３）を含み：Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｃ、融合ポリペプチドは、ＸとＡとの間にアラニンを含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端へと）以下のように配置されたリーダー配列（例えば、配列番号２３）を含み：Ｘ−Ｃ−Ｂ−Ａ、融合ポリペプチドは、ＸとＣとの間にアラニンを含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端へと）以下のように配置されたリーダー配列（例えば、配列番号２３）を含み：Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｃ、融合ポリペプチドは、ＸとＡとの間にグリシンおよびアラニンを含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端へと）以下のように配置されたリーダー配列（例えば、配列番号２３）を含み：Ｘ−Ｃ−Ｂ−Ａ、融合ポリペプチドは、ＸとＣとの間にグリシンおよびアラニンを含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端へと）以下のように配置されたリーダー配列（例えば、配列番号２３）を含み：Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｃ、融合ポリペプチドは、ＸとＡとの間にスレオニンを含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端へと）以下のように配置されたリーダー配列（例えば、配列番号２３）を含み：Ｘ−Ｃ−Ｂ−Ａ、融合ポリペプチドは、ＸとＣとの間にスレオニンを含む。
【０１７６】
一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチド、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、本明細書に開示されるＴβＲＩＩポリペプチドアミノ酸配列のいずれか（例えば、配列番号１８または２７）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列を含み、この融合ポリペプチドのＴβＲＩＩポリペプチド部分は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチド、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、本明細書に開示されるリンカー配列のいずれか（例えば、配列番号６）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列を含み、この融合ポリペプチドのリンカー部分は、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチド、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、本明細書に開示される異種部分配列のいずれか（例えば、配列番号６８、６９、７２または７３）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列を含み、この融合ポリペプチドの異種部分は、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチド、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、本明細書に開示されるＴβＲＩＩポリペプチドアミノ酸配列のいずれか（例えば、配列番号１８または２７）を含み、この融合ポリペプチドのＴβＲＩＩポリペプチド部分は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチド、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、本明細書に開示されるリンカー配列のいずれか（例えば、配列番号６）を含み、この融合ポリペプチドのリンカー部分は、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチド、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、本明細書に開示される異種部分配列のいずれか（例えば、配列番号６８、６９、７２または７３）を含み、この融合ポリペプチドの異種部分は、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１つ以下のさらなるア���ノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）。
【０１７７】
一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ融合ポリペプチド、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、本明細書に開示されるＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドアミノ酸配列のいずれか（例えば、配列番号５１または５２）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列を含み、この融合ポリペプチドのＴβＲＩＩポリペプチド部分は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ融合ポリペプチド、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、本明細書に開示されるリンカー配列のいずれか（例えば、配列番号６）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列を含み、この融合ポリペプチドのリンカー部分は、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ融合ポリペプチド、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、本明細書に開示される異種部分配列のいずれか（例えば、配列番号６８、６９、７２または７３）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列を含み、この融合ポリペプチドの異種部分は、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ融合ポリペプチド、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、本明細書に開示されるＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドアミノ酸配列のいずれか（例えば、配列番号５１または５２）を含み、この融合ポリペプチドのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ融合ポリペプチド、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、本明細書に開示されるリンカー配列のいずれか（例えば、配列番号６）を含み、この融合ポリペプチドのリンカー部分は、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ融合ポリペプチド、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、本明細書に開示される異種部分配列のいずれか（例えば、配列番号６８、６９、７２または７３）を含み、この融合ポリペプチドの異種部分は、２５、２０、１５、１０���５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）。
【０１７８】
一部の実施形態では、本開示は、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチド、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーを提供し、この融合ポリペプチドは、ａ）本明細書に開示されるＴβＲＩＩポリペプチドアミノ酸配列のいずれか（例えば、配列番号１８または２７）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列であって、この融合ポリペプチドのＴβＲＩＩポリペプチド部分は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）、アミノ酸配列；ｂ）本明細書に開示されるリンカー配列のいずれか（例えば、配列番号６）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列であって、この融合ポリペプチドのリンカー部分は、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）、アミノ酸配列；およびｃ）本明細書に開示される異種部分配列のいずれか（例えば、配列番号６８、６９、７２または７３）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列であって、この融合ポリペプチドの異種部分は、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）、アミノ酸配列；ならびにｄ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）からなる、またはそれらから本質的になる（必ずしも上記の順序である必要はない）。一部の実施形態では、本開示は、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチド、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーを提供し、この融合ポリペプチドは、ａ）本明細書に開示されるＴβＲＩＩポリペプチドアミノ酸配列のいずれか（例えば、配列番号１８または２７）であって、この融合ポリペプチドのＴβＲＩＩポリペプチド部分は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）、ＴβＲＩＩポリペプチドアミノ酸配列；ｂ）本明細書に開示されるリンカー配列のいずれか（例えば、配列番号６）であって、この融合ポリペプチドのリンカー部分は、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）、リンカー配列；およびｃ）本明細書に開示される異種部分配列のいずれか（例えば、配列番号６８、６９、７２、７３）であって、この融合ポリペプチドの異種部分は、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）、異種部分配列；ならびにｄ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）からなる、またはそれらから本質的になる（必ずしも上記の順序である必要はない）。
【０１７９】
一部の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡ融合ポリペプチド、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーを提供し、この融合ポリペプチドは、ａ）本明細書に開示されるＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドアミノ酸配列のいずれか（例えば、配列番号５１または５２）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列であって、この融合ポリペプチドのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）、アミノ酸配列；ｂ）本明細書に開示されるリンカー配列のいずれか（例えば、配列番号６）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列であって、この融合ポリペプチドのリンカー部分は、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）、アミノ酸配列；およびｃ）本明細書に開示される異種部分配列のいずれか（例えば、配列番号６８、６９、７２または７３）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列であって、この融合ポリペプチドの異種部分は、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）、アミノ酸配列；ならびにｄ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）からなる、またはそれらから本質的になる（必ずしも上記の順序である必要はない）。一部の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡ融合ポリペプチド、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーを提供し、この融合ポリペプチドは、ａ）本明細書に開示されるＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドアミノ酸配列のいずれか（例えば、配列番号５１または５２）であって、この融合ポリペプチドのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドアミノ酸配列；ｂ）本明細書に開示されるリンカー配列のいずれか（例えば、配列番号６）であって、この融合ポリペプチドのリンカー部分は、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）、リンカー配列；およびｃ）本明細書に開示される異種部分配列のいずれか（例えば、配列番号６８、６９、７２、７３）であって、この融合ポリペプチドの異種部分は、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸を含む（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥ��化および／またはグリコシル化を含み得る）、異種部分配列；ならびにｄ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）からなる、またはそれらから本質的になる（必ずしも上記の順序である必要はない）。
【０１８０】
一部の実施形態では、本開示は、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチド、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーを提供し、この融合ポリペプチドは、ａ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列、および１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸からなる（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）ＴβＲＩＩポリペプチド部分；ｂ）配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列、および５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸からなる（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）リンカー部分；およびｃ）配列番号６９または７３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列、および２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸からなる（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）異種部分；ならびにｄ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）からなる、またはそれらから本質的になる（必ずしも上記の順序である必要はない）。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチド、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーを提供し、この融合ポリペプチドは、ａ）配列番号１８のアミノ酸配列、および１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸からなる（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）ＴβＲＩＩポリペプチド部分；ｂ）配列番号６のアミノ酸配列、および５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸からなる（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化およびグリコシル化を含み得る）リンカー部分；およびｃ）配列番号６９または７３のアミノ酸配列、および２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸からなる（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化を含み得る）異種部分；ならびにｄ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）からなる、またはそれらから本質的になる（必ずしも上記の順序である必要はない）。
【０１８１】
一部の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡ融合ポリペプチド、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーを提供し、この融合ポリペプチドは、ａ）配列番号５１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列、および１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸からなる（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分；ｂ）配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列、および５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸からなる（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）リンカー部分；およびｃ）配列番号６８または７２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列、および２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸からなる（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）異種部分；ならびにｄ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）からなる、またはそれらから本質的になる（必ずしも上記の順序である必要はない）。一部の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡ融合ポリペプチド、ならびにそれを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーを提供し、この融合ポリペプチドは、ａ）配列番号５１のアミノ酸配列、および１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸からなる（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化および／またはグリコシル化を含み得る）ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分；ｂ）配列番号６のアミノ酸配列、および５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸からなる（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化およびグリコシル化を含み得る）リンカー部分；およびｃ）配列番号６８または７２のアミノ酸配列、および２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１つ以下のさらなるアミノ酸からなる（しかし、さらなる翻訳後改変、例えば、ＰＥＧ化を含み得る）異種部分；ならびにｄ）必要に応じて、リーダー配列（例えば、配列番号２３）からなる、またはそれらから本質的になる（必ずしも上記の順序である必要はない）。
【０１８２】
一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３のうち１つまたは複数に結合する抗体の抗原結合性ドメインおよび少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドドメイン（例えば、本明細書に記載されるもの、例えば、配列番号５１または５２などの、ヒトまたは他の種由来のＡｃｔＲＩＩＡタンパク質の細胞外ドメインに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なポリペプチド）を含むヘテロマルチマーを提供する。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、相互作用対の第１のメンバー（「Ｃ１」）を含み、相互作用対のさらなる第１のメンバー（「Ａ１」）をさらに含む融合ポリペプチドの一部である。第２のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、相互作用対の第２のメンバー（「Ｂ１」）を含む融合ポリペプチドの一部である。可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチドは、相互作用対の第２のメンバー（「Ｃ２」）を含み、相互作用対の第１のメンバー（「Ａ２」）をさらに含む融合ポリペプチドの一部である。可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドは、相互作用対の第２のメンバー（「Ｂ２」）を含む融合ポリペプチドの一部である。各融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、第１または第２のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドと相互作用対の対応するメンバーとの間、相互作用対間、ならびにＶＨおよびＶＬポリペプチドと相互作用対のメンバーとの間に配置され得る。Ａ１およびＡ２は、同じでも異なってもよく；Ｂ１およびＢ２は、同じでも異なってもよく、Ｃ１およびＣ２は、同じでも異なってもよい。適切な相互作用対は、例えば、本明細書に記載される、定常重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用対、それらの短縮ならびにバリアントを含んだ［例えば、Spiess  et  al  (2015)  Molecular  Immunology  67(2A):  95-106］。図１１Ａは、第１および第２のＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインを含むヘテロダイマーの例である。図１１Ｂは、単一のＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインを含むヘテロマルチマーの例である。一部の実施形態では、本開示は、相互作用対を含むヘテロマルチマーを提供し、この相互作用対の一方のメンバーは、ＴＧＦβ結合性部分を含み、このＴＧＦβ結合性部分は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３のうち任意の１つまたは複数に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり；この相互作用対の第２のメンバーは、本明細書に開示されるＡｃｔＲＩＩＡ配列のいずれかに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分を含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＴＧＦβ１に対してよりも顕著により高い親和性で、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に結合する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ２に対してよりも顕著により高い親和性で、ＴＧＦβ１に結合する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＴＧＦβ１に結合する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＴＧＦβ２に結合しない、または相当な親和性では��ＧＦβ２に結合しない。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＴＧＦβ２にもＴＧＦβ３にも結合しない、または相当な親和性ではＴＧＦβ２にもＴＧＦβ３にも結合しない。一部の実施形態では、第２のメンバーは、本明細書に開示される任意の２つのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分のダイマーを含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、本明細書に開示されるＴβＲＩＩ配列のいずれかに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なＴβＲＩＩポリペプチド部分とダイマー化する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、モノマーまたは「単一アーム」のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分である。一部の実施形態では、相互作用対は、相互作用を促進する異種部分を含む。一部の実施形態では、異種部分は、本明細書に開示されるＦｃ部分のいずれかである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、第１の異種部分（例えば、第１のＦｃ部分）に融合され、抗体またはその抗原結合性断片部分は、第２の異種部分（例えば、第１のＦｃ部分）に融合されている。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、第１のＦｃ部分のＮ末端に融合され、抗体またはその抗原結合性断片部分は、第２のＦｃ部分のＮ末端に融合されている。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、第１のＦｃ部分のＮ末端に融合され、抗体またはその抗原結合性断片部分は、第２のＦｃ部分のＣ末端に融合されている。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、第１のＦｃ部分のＣ末端に融合され、抗体またはその抗原結合性断片部分は、第２のＦｃ部分のＮ末端に融合されている。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、第１のＦｃ部分のＮ末端に融合され、抗体またはその抗原結合性断片部分は、第２のＦｃ部分のＮ末端に融合され；ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、本明細書に開示されるＴβＲＩＩポリペプチドのいずれかとのヘテロダイマーである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、第１のＦｃ部分のＮ末端に融合され、抗体またはその抗原結合性断片部分は、第２のＦｃ部分のＣ末端に融合され；ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、本明細書に開示されるＴβＲＩＩポリペプチドのいずれかとのヘテロダイマーである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、第１のＦｃ部分のＣ末端に融合され、抗体またはその抗原結合性断片部分は、第２のＦｃ部分のＮ末端に融合され；ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、本明細書に開示されるＴβＲＩＩポリペプチドのいずれかとのヘテロダイマーである。ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分およびＴβＲＩＩポリペプチドを含む実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドがＦｃ部分に融合され得、またはＴβＲＩＩポリペプチドがＦｃ部分に融合され得る。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片のＶＬ部分が、Ｆｃ部分に融合され、一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片のＶＨが、Ｆｃ部分に融合されている。本開示は、相互作用対中の成分のいずれか間での融��を促進するためのリンカーを企図する。一部の実施形態では、相互作用対は、ＴβＲＩＩポリペプチドとＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドとの間の相互作用を促進する第２の相互作用対を含む。図１１Ａは、第１のＦｃ部分のＮ末端に融合されたＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分および第２のＦｃ部分のＮ末端に融合された抗体またはその抗原結合性断片部分を含む相互作用対の例示的な例を提供し；ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、ＴβＲＩＩポリペプチドとのヘテロダイマーである。
【０１８３】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるＴβＲＩＩポリペプチドのいずれか（例えば、配列番号１７０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むＴβＲＩＩポリペプチド）に融合された本明細書に開示されるＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドのいずれか（例えば、配列番号５１または５２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド）を含む融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、ＴβＲＩＩポリペプチド部分に対してＮ末端側である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、ＴβＲＩＩポリペプチド部分に対してＣ末端側である。一部の実施形態では、融合タンパク質のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、融合タンパク質のＴβＲＩＩポリペプチド部分に直接融合されている。一部の実施形態では、異種部分（例えば、本明細書に開示されるＦｃ部分のいずれか）および／または１つもしくは複数のリンカー部分は、融合タンパク質においてＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分とＴβＲＩＩポリペプチド部分とを分離する。一部の実施形態では、異種部分は、配列番号１６３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むＦｃポリペプチド部分である。一部の実施形態では、異種部分は、配列番号７２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むＦｃポリペプチド部分（Ｃ末端リシン残基を必要に応じて欠いていてもよい）である。一部の実施形態では、異種部分は、配列番号７３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むＦｃポリペプチド部分（Ｃ末端リシン残基を必要に応じて欠いていてもよい）である。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチド部分は、リンカー（例えば、本明細書に開示されるリンカーのいずれか）によって、Ｆｃ部分に融合されている。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチド部分は、グリシン−セリンリッチリンカー、例えば、配列番号１６５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むリンカーによってＦｃ部分に融合されている。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、リンカー（例えば、本明細書に開示されるリンカーのいずれか）によって、Ｆｃ部分に融合されている。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分は、グリシンリンカーを含むリンカー、例えば、��ＧＧアミノ酸配列を含むリンカーによってＦｃ部分に融合されている。一部の実施形態では、融合タンパク質は、本明細書に開示されるシグナル配列のいずれかを含む。一部の実施形態では、シグナル配列は、配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１８３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１９５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【０１８４】
【化２３】
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【０１８５】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＡｃｔＲＩＩＡおよびＴβＲＩＩポリペプチド融合タンパク質のいずれかは、別のタンパク質とマルチマー化する。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＡｃｔＲＩＩＡおよびＴβＲＩＩポリペプチド融合タンパク質のいずれかは、ホモマルチマー化する（例えば、ホモダイマー化する）。例えば、一部の実施形態では、本開示は、配列番号１８３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む２つまたはそれよりも多くの融合タンパク質を含むホモマルチマーを企図する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、配列番号１９５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む２つまたはそれよりも多くの融合タンパク質を含むホモマルチマーを企図する。
【０１８６】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＡｃｔＲＩＩＡおよびＴβＲＩＩポリペプチド融合タンパク質のいずれかは、１つまたは複数の異なるタンパク質／ポリペプチドとヘテロマルチマー化する。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＡｃｔＲＩＩＡおよびＴβＲＩＩポリペプチド融合タンパク質のいずれかは、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分を含むがＴβＲＩＩポリペプチド部分を欠くタンパク質／ポリペプチドとヘテロマルチマー化する。かかる実施形態では、得られた融合タンパク質は、２つのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分「アーム」を含むが、単一のＴβＲＩＩポリペプチド部分アームを含む。一部の実施形態では、ヘテロマルチマーの各ユニットは、相互作用対のメンバーを含む。一部の実施形態では、相互作用対のメンバーは、本明細書に開示されるＦｃ部分のいずれかである。一部の実施形態では、Ｆｃ部分は、ヘテロマルチマー形成を促進するためおよび／またはホモマルチマー形成を阻害するために改変されている。一部の実施形態では、Ｆｃ部分は、ヘテロダイマー形成を促進するためおよび／またはホモダイマー形成を阻害するために改変されている。一部の実施形態では、Ｆｃ部分は、本明細書に開示される「ノブ−イン−ホール」突然変異のいずれかを含むように改変されている。一部の実施形態では、異種部分は、配列番号７２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むＦｃポリペプチド部分（Ｃ末端リシン残基を必要に応じて欠いていてもよい）である。一部の実施形態では、異種部分は、配列番号７３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むＦｃポリペプチド部分（Ｃ末端リシン残基を必要に応じて欠いていてもよい）である。
【０１８７】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＡｃｔＲＩＩＡおよびＴβＲＩＩポリペプチド融合タンパク質のいずれかは、ＴβＲＩＩポリペプチド部分を含むがＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分を欠くタンパク質／ポリペプチドとヘテロマルチマー化する。かかる実施形態では、得られた融合タンパク質は、２つのＴβＲＩＩポリペプチド部分「アーム」を含むが、単一のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分アームを含む。一部の実施形態では、ヘテロマルチマーの各ユニットは、相互作用対のメンバーを含む。一部の実施形態では、相互作用対のメンバーは、本明細書に開示されるＦｃ部分のいずれかである。一部の実施形態では、Ｆｃ部分は、ヘテロマルチマー形成を促進するためおよび／またはホモマルチマー形成を阻害するために改変されている。一部の実施形態では、Ｆｃ部分は、ヘテロダイマー形成を促進するためおよび／またはホモダイマー形成を阻害するために改変されている。一部の実施形態では、Ｆｃ部分は、本明細書に開示される「ノブ−イン−ホール」突然変異のいずれかを含むように改変されている。一部の実施形態では、異種部分は、配列番号７２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むＦｃポリペプチド部分（Ｃ末端リシン残基を必要に応じて欠いていてもよい）である。一部の実施形態では、異種部分は、配列番号７３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むＦｃポリペプチド部分（Ｃ末端リシン残基を必要に応じて欠いていてもよい）である。一部の実施形態では、かかるヘテロマルチマー中のＡｃｔＲＩＩＡおよびＴβＲＩＩポリペプチド融合タンパク質は、配列番号１８４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチド部分を含むがＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分を欠くタンパク質／ポリペプチドは、配列番号１８５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ヘテロマルチマーは、配列番号１８４のアミノ酸配列を含む第１の融合タンパク質と配列番号１８５のアミノ酸配列を含む第２の融合タンパク質とを含むヘテロダイマーである。一部の実施形態では、かかるヘテロマルチマー中のＡｃｔＲＩＩＡおよびＴβＲＩＩポリペプチド融合タンパク質は、配列番号１９６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチド部分を含むがＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分を欠くタンパク質／ポリペプチドは、配列番号１９７のアミノ酸配列に���して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ヘテロマルチマーは、配列番号１９６のアミノ酸配列を含む第１の融合タンパク質と、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む第２の融合タンパク質とを含むヘテロダイマーである。
【化２４】
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【化２５】
2021522793.tif 000027
【０１８８】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるヘテロマルチマーは、相当な親和性では、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ受容体、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ１、ＣＤ２０、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦＲ２、ＦｏｘＰ３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＴＬＲ１−１０、ＥｒｂＢ−１、ＨＥＲ１、ＥｒｂＢ−３／ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ−４／ＨＥＲ４、ＩＧＦＲ、ＩＧＦＢＰ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ＴＲＫ受容体、エフリン受容体、ＡＸＬ受容体、ＬＴＫ受容体、ＴＩＥ受容体、アンジオポエチン１、２、ＲＯＲ受容体、ＤＤＲ受容体、ＲＥＴ受容体、ＫＬＧ受容体、ＲＹＫ受容体、ＭｕＳＫ受容体、ＩＬβＲ、ＩｌαＲ、ＴＮＴＲＳＦ、ＴＲＡＩＬ受容体、ＡＲＴＣ１、アルファ−アクチニン−４、Ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｂ−ＲＡＦ、カスパーゼ、ベータ−カテニン、フィブロネクチン、ＧＰＮＭＢ、ＧＤＰ−Ｌ、ＬＤＬＲ、ＨＬＡ−Ａ２、ＭＬＡ−Ａ１１、ＨＳＰ７０、ＫＩＡＡ２０５、ＭＡＲＴ２、ＭＵＭ−１、２、３、ＰＡＰ、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ＮＦＹＣ、ＯＧＴ、ＯＳ−９、ｐｍｌ−ＲＡＲアルファ融合タンパク質、ＰＲＤＸ５、ＰＴＰＲＫ、ＫＲＡＳ２、ＮＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＲＢＡＦ６００、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＹＴ−ＳＳＸ１もしくはＳＹＴ−ＳＳＸ２融合タンパク質、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＢＡＧＥ、ＢＡＧＥ−１、ＢＡＧＥ−２、３、４、５、ＧＡＧＥ−１、２、３、４、５、６、７、８、ＧｎＴ−Ｖ、ＨＥＲＶ−Ｋ  ＭＥＬ、ＫＫ−ＬＣ、ＫＭ−ＨＮ−１、ＬＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＣＡＭＥＬ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−ＡＳ、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−Ｂ１、ＭＡＧＥ−Ｂ２、ＭＡＧＥ−Ｂ５、ＭＡＧＥ−Ｂ６、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＡＲＴ−１／メラン−Ａ（ＭＬＡＮＡ）、ｇｐ１００、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７（Ｓ１ＬＶ）、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、ＴＲＰ−１、ＨＡＧＥ、ＮＡ−８８、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２、ＳＡＧＥ、Ｓｐ１７、ＳＳＸ−１、２、３、４、ＴＲＰ２−１ＮＴ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、カリクレイン（Kallikfein）４、マンマグロビン（mammaglobm）−Ａ、ＯＡ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原、ＴＲＰ−１／、７５．ＴＲＰ−２、ＡＩＭ−２、ＢＩＮＧ−４、ＣＰＳＦ、サイクリンＤ１、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｂＡ３、ＦＧＦ−５、ｇｐ２５０、ｉＣＥ、ＡＦＰ、Ｍ−ＣＳＦ、ｍｄｍ−２、ＭＵＣＩ、ｐ５３（ＴＰ５３）、ＰＢＦ、ＦＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ−１、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、ＳＯＸ１０、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン（ＢＩＲＣＳ）、ｈＴＥＲＴ、テロメラーゼ、ＷＴ１、ＳＹＣＰ１、ＢＲＤＴ、ＳＰＡＮＸ、ＸＡＧＥ、ＡＤＡＭ２、ＰＡＧＥ−５、ＬＩＰ１、ＣＴＡＧＥ−１、ＣＳＡＧＥ、ＭＭＡ１、ＣＡＧＥ、ＢＯＲＩＳ、ＨＯＭ−ＴＥＳ−８５、ＡＦ１５ｑ１４、ＨＣＡ６６Ｉ、ＬＤＨＣ、ＭＯＲＣ、ＳＧＹ−１、ＳＰＯ１１、ＴＰＸ１、ＮＹ−ＳＡＲ−３５、ＦＴＨＬＩ７、ＮＸＦ２  ＴＤＲＤ１、ＴＥＸ  １５、ＦＡＴＥ、ＴＰＴＥ、エストロゲン受容体（ＥＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３、ＣＡ  ７２−４、ＣＡ  １５−３、ＣＡ  ２７−２９、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １９−９、ベータ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、１−２ミクログロブリン、扁平上皮癌抗原、ニューロン特異的エノラーゼ（enoJase）、ヒートショックタンパク質ｇｐ９６、ＧＭ２、サルグラモスチム、ＣＴＬＡ−４、７０７−ＡＰ、ＡＲＴ−４、ＣＡＰ−１、ＣＬＣＡ２、Ｃｙｐ−Ｂ、ＨＳＴ−２、ＨＰＶタンパク質、ＥＢＶタンパク質、Ｂ型もしくはＣ型肝炎ウイルスタンパク質、および／またはＨＩＶタンパク質に結合しない。
【０１８９】
一部の実施形態では、本開示は、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、同じ線状配列中に、ＴβＲＩＩドメインに加えて、さらなるリガンド結合ドメインを含まない。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＴβＲＩＩドメインおよび異種部分（例えば、Ｆｃ部分）を含む線状アミノ酸配列を含むが、この線状アミノ酸配列は、いずれのさらなるリガンド結合ドメインも含まない。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＴβＲＩＩドメインおよびＦｃ部分を含む線状アミノ酸配列を含むが、この線状アミノ酸配列は、いずれのさらなるリガンド結合ドメインも含まない。一部の実施形態では、本開示は、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、単一の線状アミノ酸配列中に複数のリガンド結合ドメインを含まない。一部の実施形態では、本開示は、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、単一の線状アミノ酸配列中に、１つよりも多くの連続するリンカー配列を含まない。一部の実施形態では、ポリペプチドは、単一の線状アミノ酸配列中に、複数の連続するグリシンおよび／またはセリンリンカー（例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎを含むリンカー、式中、ｎは４よりも大きい）を含まない。一部の実施形態では、本開示は、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチドを提供し、その異種部分は、Ｆｃドメインであり、ただ１つの連続するリンカーは、Ｆｃドメインに共有結合によって結合されている。一部の実施形態では、ただ１つの連続するリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーを含みまたはそれからなり、式中、ｎは、４よりも大きい。
Ｂ．代替的多特異性バインダー
【０１９０】
一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドの多特異性バインダーを提供する。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、ａ）ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３のうち少なくとも１つ、ならびにｂ）アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８のうち少なくとも１つ、に結合することが可能である。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、ａ）ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ３に結合することが可能な第１の部分；ならびにｂ）アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８のうち少なくとも１つに結合することが可能な第２の部分、を含む。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、ＴβＲＩＩポリペプチドおよびフォリスタチンまたはフォリスタチン様タンパク質ドメインを含む。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、ＴβＲＩＩポリペプチドおよび抗体または抗原結合性断片を含み、この抗体または抗原結合性断片は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８のうち１つまたは複数に結合することが可能である。特定の実施形態では、多特異性バインダーは、ＴβＲＩＩポリペプチドおよび抗体または抗原結合性断片を含み、この抗体または抗原結合性断片は、ＧＤＦ８に結合することが可能である。
ｉ．フォリスタチンおよびフォリスタチン様ポリペプチド
【０１９１】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるＴβＲＩＩポリペプチドのいずれかおよびフォリスタチンまたはフォリスタチン様ポリペプチドを含む多特異性バインダーを提供する。本明細書で使用される場合、用語「フォリスタチン」は、任意の種に由来する、フォリスタチン（ＦＳＴ）タンパク質およびフォリスタチン関連タンパク質のファミリーを指す。フォリスタチンは、高等動物のほぼ全ての組織において発現されるオートクライン糖タンパク質である。これは、卵胞液から最初に単離され、下垂体前葉からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）分泌を阻害するタンパク質画分として同定され、したがって、ＦＳＨ抑制タンパク質（ＦＳＰ）と命名された。引き続いて、その主な機能が、例えば、下垂体前葉におけるＦＳＨの分泌を促進するパラクラインホルモンであるアクチビンを含むＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーの結合および中和であることが同定されている。
【０１９２】
用語「フォリスタチンポリペプチド」は、フォリスタチンファミリーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチド、ならびに例えば、リガンド結合（例えば、ミオスタチン（ＧＤＦ８）、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ）またはヘパリン結合を含む有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合物およびペプチド模倣形態を含む）を指すために使用される。例えば、フォリスタチンポリペプチドは、フォリスタチンポリペプチドの配列に対して少なくとも約８０％同一な配列、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれよりも高い同一性を有する任意の公知のフォリスタチンの配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。用語「フォリスタチンポリペプチド」は、異種（非フォリスタチン）部分と共に上述のポリペプチドのいずれかを含む融合タンパク質を指し得る。アミノ酸配列は、配列番号１１２によって示されるヒトフォリスタチンの長い（３１５アミノ酸）形態中に独自に見出されない場合、フォリスタチンに対して異種であると理解される。異種部分の多くの例が本明細書で提供され、かかる異種部分は、融合タンパク質のフォリスタチンポリペプチド部分に、アミノ酸配列によってすぐに隣接し得、またはリンカーもしくは他の配列などの介在するアミノ酸配列によって分離され得る。
【０１９３】
フォリスタチンは、選択的ｍＲＮＡスプライシングおよびタンパク質の可変グリコシル化に基づいて、３１〜４９ｋＤａの分子量範囲を有する単一鎖ポリペプチドである。選択的にスプライシングされたｍＲＮＡは、３１５アミノ酸（すなわち、ＦＳＴ３１５）および２８８アミノ酸（すなわち、ＦＳＴ２８８）の２つのタンパク質をコードする；フォリスタチン３１５は、タンパク分解的に、フォリスタチン３０３（ＦＳＴ３０３）へとさらに分解され得る。アミノ酸配列の分析により、天然ヒトフォリスタチンポリペプチドが、（Ｎ末端側から）以下の５つのドメインを含むことが明らかになっている：シグナル配列ペプチド（配列番号１１０のアミノ酸１〜２９）、Ｎ末端ドメイン（ＦＳＮ）（配列番号１１０のアミノ酸３０〜９４）、フォリスタチンドメインＩ（ＦＳＤＩ）（配列番号１１０のアミノ酸９５〜１６４）、フォリスタチンドメインＩＩ（ＦＳＤＩＩ）（配列番号１１０のアミノ酸１６８〜２３９）およびフォリスタチンドメインＩＩＩ（ＦＳＤＩＩＩ）（配列番号１１０のアミノ酸２４５〜３１６）。PNAS,  U.S.A.,  1988,  Vol.  85,  No  12,  pp  4218-4222を参照のこと。一部の実施形態では、本明細書に開示されるフォリスタチンポリペプチドのいずれかは、本明細書に開示されるフォリスタチンポリペプチドドメインのうちいずれか１つまたは複数を含む。
【０１９４】
ヒトフォリスタチン−２８８（ＦＳＴ２８８）前駆体は、以下のアミノ酸配列を有し、シグナルペプチドは太字で示され、Ｎ末端ドメイン（ＦＳＮ）は、一重下線によって示され、フォリスタチンドメインＩ〜ＩＩＩ（ＦＳＩ、ＦＳＩＩ、ＦＳＩＩＩ）は、二重下線によって示される。
【化２６】
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【０１９５】
プロセシングされた（成熟）ヒトフォリスタチンバリアントＦＳＴ（２８８）は、以下のアミノ酸配列を有し、Ｎ末端ドメインは、一重下線によって示され、フォリスタチンドメインＩ〜ＩＩＩは、二重下線によって示される。さらに、最初のシステインの前の最初のアミノ酸ＧまたはＮのいずれかが、プロセシングによって除去され得、またはいずれの結果も伴わずに意図的に排除され得、かかるわずかにより小さいポリペプチドを含むポリペプチドがさらに含まれることが理解される。
【化２７】
2021522793.tif 000029
【０１９６】
ヒトフォリスタチン−３１５（ＦＳＴ３１５）前駆体は、以下のアミノ酸配列を有し、シグナルペプチドは、太字で示され、Ｎ末端ドメイン（ＦＳＮ）は、一重下線によって示され、フォリスタチンドメインＩ〜ＩＩＩ（ＦＳＩ、ＦＳＩＩ、ＦＳＩＩＩ）は、二重下線によって示される（ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＨ０４１０７．１；３４４アミノ酸）。
【化２８】
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【０１９７】
プロセシングされた（成熟）ヒトＦＳＴ（３１５）は、以下のアミノ酸配列を有し、Ｎ末端ドメインは、一重下線によって示され、フォリスタチンドメインＩ〜ＩＩＩは、二重下線によって示される。さらに、最初のシステインの前の最初のアミノ酸ＧまたはＮのいずれかが、プロセシングによって除去され得、またはいずれの結果も伴わずに意図的に排除され得、かかるわずかにより小さいポリペプチドを含むポリペプチドがさらに含まれることが理解される。
【化２９】
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【化３０】
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【０１９８】
本明細書のフォリスタチンタンパク質は、ＦＳＴと呼ばれ得る。ＦＳＴ（２８８）のように数字が後に続く場合、これは、タンパク質が、２８８形態のフォリスタチンであることを示している。ＦＳＴ（２８８）−Ｆｃとして示される場合、これは、介在するリンカーを含んでも含まなくてもよい、ＦＳＴ（２８８）へのＣ末端Ｆｃ融合物を示す。この例では、Ｆｃは、任意の免疫グロブリンＦｃ部分であり得、その用語は、本明細書で定義される通りである。ＦＳＴ（２８８）−ＩｇＧ２として示される場合、これは、ヒトＩｇＧ２のＦｃ部分の、ＦＳＴ（２８８）へのＣ末端Ｆｃ融合物を示す。
【０１９９】
用語「生物学的に活性な」は、その全ての文法的形態で、フォリスタチンポリペプチドまたはそのバリアントもしくは断片に関して使用する場合、（１）アクチビンまたは（２）骨形成タンパク質（bone  morphogenic  protein）（ＢＭＰ）クラスのリガンドのうち少なくとも１つからのリガンドを結合する能力を有するポリペプチドを指す。一部の実施形態では、「生物学的に活性な」フォリスタチンは、ＧＤＦ８に結合することが可能である。一部の実施形態では、生物学的に活性なポリペプチドまたはその断片は、（１）アクチビンまたは（２）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）クラスのリガンドのうち少なくとも１つからのリガンドの活性を阻害する。一部の実施形態では、生物学的に活性なフォリスタチンポリペプチドまたはそのバリアントもしくは断片は、配列番号１１１のアミノ酸配列を含むフォリスタチンポリペプチドのＩＣ５０よりも低いＩＣ５０で、細胞に基づくレポーター遺伝子アッセイにおいて、ＧＤＦ８、アクチビンＡおよび／またはＧＤＦ−１１を阻害する。一部の実施形態では、生物学的に活性なフォリスタチンポリペプチドまたはそのバリアントもしくは断片は、配列番号１１１のアミノ酸配列を含むフォリスタチンポリペプチドのＩＣ５０と比較して等しいＩＣ５０で、細胞に基づくレポーター遺伝子アッセイにおいて、ＧＤＦ８、アクチビンＡおよび／またはＧＤＦ−１１を阻害する。一部の実施形態では、生物学的に活性なフォリスタチンポリペプチドまたはそのバリアントもしくは断片は、１ｎＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたは１０ｐＭ未満のＫＤで、ＧＤＦ８（ミオスタチン）、ＧＤＦ１１、アクチビンＡおよびアクチビンＢからなる群から選択される１つまたは複数のリガンドに結合する。一部の実施形態では、生物学的に活性なフォリスタチンポリペプチドまたはそのバリアントもしくは断片は、配列番号１１３のアミノ酸配列を含むフォリスタチンポリペプチドと比較して高い親和性で、ヘパリンを結合する。一部の実施形態では、生物学的に活性なフォリスタチンポリペプチドまたはそのバリアントもしくは断片は、配列番号１１３のアミノ酸配列を含むフォリスタチンポリペプチドと等しい結合親和性で、ヘパリンを結合する。一部の実施形態では、フォリスタチンタンパク質は、配列番号１１１、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４または１２５を含むポリペプチド、およびそのバリアントによって例示される短縮型形態である。一部の実施形態では、本明細書に開示されるフォリスタチンポリペプチド、断片、機能的バリアントおよび改変形態のいずれかは、野生型フォリスタチンポリペプチド（例えば、配列番号１１１または１１３のアミノ酸配列を有するポリペプチド）と比較して、類似、同じ、または改善された生物活性を有し得る。例えば、一部の実施形態では、本開示のフォリスタチンバリアントは、フォリスタチンリガンド（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢおよびＧＤＦ８）に結合し得、その機能を阻害し得る。一部の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、組織、特に筋肉の成長をモジュレートする。フォリスタチンポリペプチドの例には、配列番号１１０〜１２５、１３５、１３７〜１３９お���び１４１〜１４８のいずれかによるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、ならびに配列番号１１０〜１２５、１３５、１３７〜１３９および１４１〜１４８のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、を含む。特定の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、配列番号１１１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。これらのポリペプチドに対する変形形態は、以下のガイダンスに従って調製され得る。他に述べない限り、フォリスタチンポリペプチド中のアミノ酸の番号付けは、天然リーダー配列が使用されるかどうかにかかわらず、配列番号１１０の配列に基づく。上記のように、フォリスタチンは、フォリスタチン−リガンド結合を媒介すると考えられる３つのシステインリッチ領域（すなわち、ＦＳドメインＩ〜ＩＩＩ）によって特徴付けられる。さらに、研究者らは、３つのＦＳ結合ドメインのうち１つ（例えば、ＦＳＤＩ）だけを含むポリペプチド構築物が、ある特定のフォリスタチン−リガンド（例えば、ミオスタチン）に向かう強い親和性を保持し、ｉｎ  ｖｉｖｏで生物学的に活性であることを実証している。Nakatani  et  al.,  The  FASEB  Journal,  Vol.  22477-487  (2008)を参照のこと。したがって、本開示のバリアントフォリスタチンポリペプチドは、フォリスタチンタンパク質の１つまたは複数の活性な部分を含み得る。例えば、本開示の構築物は、配列番号１１２のアミノ酸３０〜９５に対応する残基で始まり得、配列番号１１２のアミノ酸３１６〜３４４に対応する位置で終わり得る。他の例には、配列番号１１０の３０〜９５の位置で始まり、配列番号１１０のアミノ酸１６４〜１６７または２３８〜２４４に対応する位置で終わる構築物が含まれる。他には、配列番号１１６〜１２５のいずれかが含まれ得る。さらなる例には、配列番号１１３のアミノ酸２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４および３０５に対応するアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で終わる構築物が含まれる。一部の実施形態では、本開示のフォリスタチンポリペプチドおよび構築物は、配列番号１１３のアミノ酸２８９〜３１５、２９０〜３１５、２９１〜３１５、２９２〜３１５、２９３〜３１５、２９４〜３１５、２９５〜３１５、２９６〜３１５、２９７〜３１５、２９８〜３１５、２９９〜３１５、３００〜３１５、３０１〜３１５、３０２〜３１５、３０３〜３１５、３０４〜３１５および３０５〜３１５からなる群から選択されるアミノ酸に対応する残基を含まないフォリスタチンポリペプチドを含み得る。
【０２００】
本開示のフォリスタチンポリペプチドには、フォリスタチンタンパク質の任意の天然に存在するドメイン、ならびに有用な活性を保持するそれらのバリアント（例えば、突然変異体、断片およびペプチド模倣形態）が含まれ得る。例えば、ＦＳＴ（３１５）およびＦＳＴ（２８８）が、アクチビン（アクチビンＡおよびアクチビンＢ）およびミオスタチン（および密接に関連したＧＤＦ１１）の両方に対して高い親和性を有すること、ならびにフォリスタチンドメイン（例えば、ＦＳＮおよびＦＳＤＩ〜ＩＩＩ）が、かかるＴＧＦ−βリガンドの結合に関与すると考えられることは周知である。しかし、これら３つのドメインの各々は、これらのＴＧＦ−βリガンドに対して異なる親和性を有し得ると考えられる。例えば、最近の研究により、Ｎ末端ドメイン（ＦＳＮ）およびタンデムな２つのＦＳＤＩドメインのみを含むポリペプチド構築物が、ミオスタチンに対する高い親和性を保持したことが実証され、これは、遺伝子発現によってマウス中に導入された場合、アクチビンに対する親和性がほとんどないまたはないこと、および全身性の筋肉の成長の促進を実証した（Nakatani  et  al.,  The  FASEB  Journal,  Vol.  22477-487  (2008)）。
【０２０１】
さらに、ＦＳＤＩドメインは、ＫＫＣＲＭＮＫＫＮＫＰＲ（配列番号１１４）のアミノ酸配列を有する、ヒトフォリスタチンのヘパリン結合ドメインを含有する。このヘパリン結合ドメインは、ＢＢＸＢＸＸＢＢＸＢＸＢ（配列番号１１５）として示すことができ、式中、「Ｂ」は、塩基性アミノ酸、特に、リシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）を意味する。したがって、本開示は、一部においては、天然に存在するＦＳＴタンパク質（例えば、アクチビンに対する顕著に低減された親和性を有しつつ、ミオスタチンに対する高い親和性を維持する）と比較して、所与のＴＧＦ−βリガンドの選択的結合および／または阻害を実証するバリアントフォリスタチンタンパク質を包含する。
【０２０２】
ある特定の態様では、本開示は、以下に示されるＦＳＮドメインおよび例えば、１つまたは複数の異種ポリペプチドを含むポリペプチドを含み、さらに、最初のシステインの前の最初のアミノ酸ＧまたはＮのいずれかは、以下に示される例（配列番号１１７）と同様に、欠失され得ることが理解される。
【化３１】
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【化３２】
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【０２０３】
ある特定の態様では、本開示は、以下に示されるヘパリン結合と共にミオスタチン（および／またはＧＤＦ１１）結合の最小のコア活性を含有するＦＳＤＩドメインと、例えば、１つまたは複数の異種ポリペプチドとを含むポリペプチドを含む。
【化３３】
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【０２０４】
ＦＳＤＩ配列は、ＦＳＮドメインをさらに含むポリペプチドとしての発現によって、構造的状況において、有利に維持され得る。したがって、本開示は、以下に示されるＦＳＮ−ＦＳＤＩ配列（配列番号１１９）と、例えば、１つまたは複数の異種ポリペプチドを含むポリペプチドとを含み、さらに、最初のシステインの前の最初のアミノ酸ＧまたはＮのいずれかが、プロセシングによって除去され得、またはいずれの結果も伴わずに意図的に排除され得、かかるわずかにより小さいポリペプチドを含むポリペプチドがさらに含まれることが理解される。
【化３４】
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【０２０５】
Ｎａｋａｎｉらによって実証されたように、ＦＳＮ−ＦＳＤＩ−ＦＳＤＩ構築物は、マウスにおいて遺伝的に発現された場合、全身性の筋肉の成長を付与するのに十分であり、したがって、本開示は、以下のアミノ酸配列と、例えば、１つまたは複数の異種ポリペプチドとを含むポリペプチドを含む。
【化３５】
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【０２０６】
ＦＳＤＩ配列は、ミオスタチンおよびＧＤＦ１１結合を付与する。特にアクチビンＡであるが、アクチビンＢでもあるアクチビンもまた、筋肉の負の制御因子であり、したがって、ミオスタチン／ＧＤＦ１１群およびアクチビンＡ／アクチビンＢ群の両方を阻害するフォリスタチンポリペプチドは、より強力な筋肉効果を提供し得ることが実証されている。さらに、ある特定のフォリスタチンポリペプチド、特に、ヘパリン結合ドメインを含むもの、より特には、ホモダイマー形態のもの、例えば、Ｆｃ融合物の低い全身アベイラビリティを実証する本明細書の知見を考慮すると、生殖軸および他の組織に対するアクチビン阻害の公知の影響と関連する安全性の懸念は軽減される。ＦＳＤＩＩがアクチビンＡおよびＢ結合を付与することを考慮すると、本開示は、ＦＳＤＩおよびＦＳＤＩＩ（配列番号１２１）、ならびにＦＳＮ−ＦＳＤＩ−ＦＳＤＩＩ構築物（配列番号１２２）ならびに例えば、１つまたは複数の異種ポリペプチドを含むポリペプチドを提供する。
【化３６】
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【０２０７】
実施例に記載されるように、２９１アミノ酸のフォリスタチンポリペプチド（天然に存在するＦＳＴ−３１５の短縮を示す）は、有利な特性を有する。したがって、プロセシングされていない（配列番号１２３）および成熟ＦＳＴ（２９１）（配列番号１２４）ポリペプチドは、本開示に含まれ、異種タンパク質と組み合わされ得る。さらに、最初のシステインの前の最初のアミノ酸ＧまたはＮのいずれかが、プロセシングによって除去され得、またはいずれの結果も伴わずに意図的に排除され得、以下に示される例（配列番号１２５）などの、かかるわずかにより小さいポリペプチドを含むポリペプチドがさらに含まれることが理解される。
【化３７】
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【化３８】
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【０２０８】
ある特定の実施形態では、本発明は、対象フォリスタチンポリペプチド（例えば、ＦＳＴ−ＩｇＧ融合ポリペプチド）を用いて、フォリスタチンのリガンド（フォリスタチンリガンドとも呼ばれる）をアンタゴナイズすることに関する。したがって、本開示の組成物および方法は、フォリスタチンの１つまたは複数のリガンドの異常な活性と関連する障害を処置するために有用である。フォリスタチンの例示的なリガンドには、一部のＴＧＦ−βファミリーメンバー、例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ミオスタチン（ＧＤＦ８）およびＧＤＦ１１が含まれる。
【０２０９】
本明細書に記載されるフォリスタチン変形形態は、互いに、または異種アミノ酸配列と、種々の方法で組み合わされ得る。例えば、本開示のバリアントフォリスタチンタンパク質には、ＦＳＤＩ（配列番号１１０のアミノ酸９５〜１６４）、ＦＳＤＩＩ（配列番号１１０のアミノ酸１６８〜２３９）またはＦＳＤＩＩＩ（配列番号１１０のアミノ酸２４５〜３１６）から選択される１つまたは複数のＦＳドメインを含むポリペプチド、ならびにＦＳＤＩ（配列番号１１０のアミノ酸９５〜１６４）、ＦＳＤＩＩ（配列番号１１０のアミノ酸１６８〜２３９）またはＦＳＤＩＩＩ（配列番号１１０のアミノ酸２４５〜３１６）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な配列から選択される１つまたは複数のＦＳドメインを含むタンパク質が含まれる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるフォリスタチンポリペプチドのいずれかは、本明細書に開示されるＦＳドメインのいずれかを含む。これらのＦＳドメインは、かかる組換えタンパク質が、例えば、フォリスタチンリガンド結合活性（例えば、ミオスタチン）および生物活性（例えば、筋肉量および／または筋力を含む）を含む所望の活性を維持することを条件として、本開示のバリアントフォリスタチンポリペプチド内で、任意の順序で組み合わされ得る。かかるフォリスタチンバリアントポリペプチドの例には、例えば、ＦＳＤＩ−ＦＳＤＩＩ−ＦＳＤＩＩＩ、ＦＳＤＩ−ＦＳＤＩＩＩ、ＦＳＤＩ−ＦＳＤＩ−ＦＳＤＩＩＩ、ＦＳＤＩ−ＦＳＤＩＩ、ＦＳＤＩ−ＦＳＤＩ、ＦＳＮ−ＦＳＤＩ−ＦＳＤＩＩ−ＦＳＤＩＩＩ、ＦＳＮ−ＦＳＤＩ−ＦＳＤＩＩ、ＦＳＮ−ＦＳＤＩ−ＦＳＤＩ、ＦＳＮ−ＦＳＤＩ−ＦＳＤＩＩＩ、ＦＳＮ−ＦＳＤＩ−ＦＳＤＩ−ＦＳＤＩＩＩなどのドメイン構造を有するポリペプチド、およびこれらのポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に他の異種タンパク質を融合させることによって得られるポリペプチドが含まれる。これらのドメインは、直接連結され得る、またはリンカーポリペプチドを介して連結され得る。必要に応じて、ポリペプチドリンカーは、任意の配列であり得、１〜５０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５アミノ酸を含み得る。ある特定の態様では、好ましいリンカーは、システインアミノ酸を含有しない。
【０２１０】
本明細書で言及される場合、「フォリスタチンバリアント」は、参照野生型フォリスタチンタンパク質（例えば、配列番号１１０〜１１３のいずれかのアミノ酸配列を有するフォリスタチンタンパク質）と比較して、断片および／または突然変異体／改変されたポリペプチドであるフォリスタチンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のフォリスタチンバリアントは、野生型フォリスタチンポリペプチド（例えば、配列番号１１３のアミノ酸配列を有するポリペプチド）と比較して、１つまたは複数のフォリスタチンリガンドに対する低減または無効化された結合親和性を有する。ある特定の態様では、本開示は、野生型フォリスタチンポリペプチド（例えば、配列番号１１３のアミノ酸配列を有するポリペプチド）と比較して、アクチビンに対する低減または無効化された結合親和性を有するフォリスタチンバリアントを提供する。ある特定の態様では、本開示は、野生型フォリスタチンポリペプチド（例えば、配列番号１１３のアミノ酸配列を有するポリペプチド）と比較して、アクチビンに対する低減または無効化された結合親和性を有するが、ミオスタチンに対する高い親和性を保持するフォリスタチンバリアントを提供する。ある特定の態様では、本開示は、野生型フォリスタチンポリペプチド（例えば、配列番号１１３のアミノ酸配列を有するポリペプチド）と比較して、ＧＤＦ１１に対する低減または無効化された結合親和性を有するフォリスタチンバリアントを提供する。
【０２１１】
一部の実施形態では、本開示のフォリスタチン断片またはバリアントは、ヘパリンに対する増加した結合親和性を有する。一部の実施形態では、本開示のフォリスタチン断片またはバリアントは、配列番号１１１を含むフォリスタチンポリペプチドの結合親和性と等価な、ヘパリンに対する結合親和性を有する。一部の実施形態では、フォリスタチン断片またはバリアントは、配列番号１１１を含むフォリスタチンポリペプチドのヘパリンに対する結合親和性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％である、ヘパリンに対する結合親和性を有する。一部の実施形態では、本開示のフォリスタチン断片またはバリアントは、配列番号１１１を含むフォリスタチンポリペプチドの結合親和性よりも高い、ヘパリンに対する結合親和性を有する。一部の実施形態では、本開示のフォリスタチン断片またはバリアントは、配列番号１１３を含むフォリスタチンポリペプチドの結合親和性よりも高い、ヘパリンに対する結合親和性を有する。一部の実施形態では、本開示のフォリスタチン断片またはバリアントは、マスクされないヘパリン結合ドメインを有する。一部の実施形態では、本開示のフォリスタチン断片またはバリアントは、内因性フォリスタチンのヘパリン結合配列を含むヘパリン結合ドメインを含む。一部の実施形態では、本開示のフォリスタチン断片またはバリアントは、内因性フォリスタチンのヘパリン結合配列（例えば、配列番号１１４）を含むヘパリン結合ドメインを含む。一部の実施形態では、本開示のフォリスタチン断片またはバリアントは、異種ヘパリン結合配列を含む。
【０２１２】
ある特定の態様では、本開示は、ＦＳＤＩＩドメインまたは機能的に活性なＦＳＤＩＩドメインに対応する配列を含まない、フォリスタチン断片またはバリアントを提供する。例えば、本開示のフォリスタチンポリペプチドには、ＦＳＤＩＩドメインの部分的または完全な欠失を介して得られるバリアントが含まれ得る。ある特定の態様では、かかるフォリスタチンバリアントは、ＦＳＤＩＩ領域内の１つもしくは複数のシステイン残基の欠失、または非システインアミノ酸による置換を含む。
【０２１３】
本開示のフォリスタチンタンパク質は、シグナル配列を含み得る。シグナル配列は、フォリスタチンタンパク質の天然シグナル配列（例えば、配列番号１１０のアミノ酸１〜２９）、または別のタンパク質由来のシグナル配列、例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）シグナル配列もしくはミツバチメリチン（melatin）（ＨＢＭ）シグナル配列であり得る。一部の実施形態では、シグナル配列は、フォリスタチンタンパク質のプロセシングの間に除去される。
【０２１４】
さらなるＮ結合型グリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）が、フォリスタチンポリペプチドに付加され得、ＦＳＴ−Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期を増加させ得る。Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列は、一般に、リガンド結合ポケットの外側の位置において導入され得る。Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列は、フォリスタチン配列とＦｃまたは他の融合成分との間のリンカー中に導入され得る。かかる部位は、既存のＳもしくはＴに関して正確な位置にＮを導入すること、または既存のＮに対応する位置においてＳもしくはＴを導入することによって、最小の努力で導入され得る。グリコシル化されると予測される任意のＳは、グリコシル化によって得られる保護に起因して、免疫原性部位を創出することなしに、Ｔに変更され得る。同様に、グリコシル化されると予測される任意のＴは、Ｓに変更され得る。したがって、フォリスタチンバリアントは、１つまたは複数のさらなる非内因性Ｎ結合型グリコシル化コンセンサス配列を含み得る。
【０２１５】
ある特定の実施形態では、本開示は、治療有効性または安定性（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏ保存期間、およびｉｎ  ｖｉｖｏのタンパク分解性分解に対する抵抗性）を増強するなどの目的のために、フォリスタチンポリペプチドの構造を改変することによって、機能的バリアントを作製することを企図する。改変されたフォリスタチンポリペプチドは、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加によっても産生され得る。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンによる、アスパラギン酸のグルタミン酸による、スレオニンのセリンによる単独の置き換え、またはあるアミノ酸の、構造的に関連するアミノ酸による類似の置き換え（例えば、保存的突然変異）が、得られた分子の生物活性に対して大した影響を有さないと予想することは、合理的である。保存的置き換えは、側鎖が関連しているアミノ酸のファミリー内で生じる置き換えである。フォリスタチンポリペプチドのアミノ酸配列における変化が機能的ホモログを生じるかどうかは、野生型フォリスタチンポリペプチドと類似の様式で細胞における応答を生じる、または野生型フォリスタチンと類似の様式で１つもしくは複数のリガンド、例えば、アクチビンもしくはミオスタチンに結合する、バリアントフォリスタチンポリペプチドの能力を評価することによって、容易に決定され得る。
【０２１６】
ある特定の実施形態では、本発明は、ポリペプチドのグリコシル化を変更するための、フォリスタチンポリペプチドの特異的突然変異を企図する。かかる突然変異は、１つまたは複数のグリコシル化部位、例えば、Ｏ結合型またはＮ結合型グリコシル化部位を導入または排除するように選択され得る。アスパラギン結合型グリコシル化認識部位は、一般に、適切な細胞グリコシル化酵素によって特異的に認識されるトリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を含む。変更は、野生型フォリスタチンポリペプチドの配列への１つもしくは複数のセリンもしくはスレオニン残基の付加、または１つもしくは複数のセリンもしくはスレオニン残基による置換によってもなされ得る（Ｏ結合型グリコシル化部位について）。グリコシル化認識部位の第１または第３のアミノ酸位置の一方または両方における種々のアミノ酸置換または欠失（および／または第２の位置におけるアミノ酸欠失）は、改変されたトリペプチド配列における非グリコシル化を生じる。フォリスタチンポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、フォリスタチンポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによるものである。使用されるカップリング様式に依存して、糖（複数可）は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えば、システインのもの；（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えば、セリン、スレオニンもしくはヒドロキシプロリンのもの；（ｅ）芳香族残基、例えば、フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンのもの；または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合されていてもよい。これらの方法は、参照により本明細書に組み込まれる、１９８７年９月１１日公開のＷＯ８７／０５３３０、およびAplin  and  Wriston  (1981)  CRC  Crit.  Rev.  Biochem.,  pp.  259-306に記載されている。ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド上に存在する１つまたは複数の炭水化物部分の除去は、化学的におよび／または酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化には、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物への、フォリスタチンポリペプチドの曝露が関与し得る。この処理は、アミノ酸配列をインタクトなままにしつつ、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたは全ての糖の切断を生じる。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin  et  al.  (1987)  Arch.  Biochem.  Biophys.  259:52およびEdge  et  al.  (1981)  Anal.  Biochem.  118:131によってさらに記載されている。フォリスタチンポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura  et  al.  (1987)  Meth.  Enzymol.  138:350によって記載されるように、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。哺乳動物、酵母、昆虫および植物細胞は全て、ペプチドのアミノ酸配列によって影響され得る異なるグリコシル化パターンを導入し得るので、フォリスタチンポリペプチドの配列は、適宜、使用される発現系の型に依存して調整され得る。一部の実施形態では、ヒトでの使用のためのフォリスタチンタンパク質は、適切なグリコシル化を提供する細胞系（例えば、哺乳動物細胞系）、例えば、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞系において発現されるが、他の発現細胞系も同様に有用であると予想される。
【０２１７】
本開示は、バリアント、特に、必要に応じて短縮バリアントを含む、フォリスタチンポリペプチドのコンビナトリアルバリアントのセットを生成する方法をさらに企図する；コンビナトリアル突然変異体のプールは、機能的バリアント配列を同定するために特に有用である。かかるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、野生型フォリスタチンポリペプチド（例えば、配列番号１１１または１１３のアミノ酸配列を有するポリペプチド）と比較して、変更された特性、例えば、変更された薬物動態または変更されたリガンド結合を有するフォリスタチンポリペプチドバリアントを生成することであり得る。種々のスクリーニングアッセイが以下に提供され、かかるアッセイが、バリアントを評価するために使用され得る。例えば、フォリスタチンポリペプチドバリアントは、フォリスタチンリガンドに結合する能力、および／またはフォリスタチンリガンドのフォリスタチンポリペプチドへの結合を防止する能力について、スクリーニングされ得る。
【０２１８】
フォリスタチンポリペプチドまたはそのバリアントの活性は、細胞に基づくアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいても試験され得る。例えば、筋肉産生に関与する遺伝子の発現に対するフォリスタチンポリペプチドバリアントの影響が、評価され得る。これは、必要な場合に、１つまたは複数の組換えフォリスタチンリガンドタンパク質（例えば、アクチビンＡ）の存在下で実施され得、細胞は、フォリスタチンポリペプチドおよび／またはそのバリアント、ならびに必要に応じて、フォリスタチンリガンドを産生するようにトランスフェクトされ得る。同様に、フォリスタチンポリペプチドは、マウスまたは他の動物に投与され得、１つまたは複数の筋肉特性、例えば、筋肉量または筋力が評価され得る。一部の実施形態では、本明細書に開示されるフォリスタチンポリペプチドのいずれかは、筋拘縮の動物モデルに投与され得、この動物モデルに対するフォリスタチンポリペプチドの影響が評価され得る（例えば、実施例８を参照のこと）。かかるアッセイは、本出願中に記載されているか、または当該分野で周知かつ慣用的であるかのいずれかである。応答性レポーター遺伝子が、下流のシグナル伝達に対する影響をモニタリングするために、かかる細胞系において使用され得る。
【０２１９】
天然に存在するフォリスタチンポリペプチドと比較して選択的な効力を有する、コンビナトリアル誘導されたバリアントが生成され得る。組換えＤＮＡ構築物から発現される場合、かかるバリアントタンパク質は、遺伝子治療プロトコールにおいて使用され得る。同様に、突然変異誘発は、対応する野生型フォリスタチンポリペプチドとは劇的に異なる細胞内半減期を有するバリアントを生じ得る。例えば、変更されたタンパク質は、天然フォリスタチンポリペプチドの破壊を生じるタンパク分解性分解もしくは他のプロセス、または他の方法でのその不活性化に対して、より安定であるかあまり安定でないかのいずれかにされ得る。かかるバリアント、およびそれらをコードする遺伝子は、フォリスタチンポリペプチドの半減期をモジュレートすることによってフォリスタチンポリペプチドレベルを変更するために利用され得る。例えば、短い半減期は、より一過的な生物学的影響を生じ得、誘導可能な発現系の一部である場合、細胞内の組換えフォリスタチンポリペプチドレベルのより緊密な制御を可能にし得る。
【０２２０】
ある特定の実施形態では、本開示のフォリスタチンポリペプチドは、フォリスタチンポリペプチド中に天然に存在する任意の改変に加えて、翻訳後改変をさらに含み得る。かかる改変には、これらに限定されないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が含まれる。結果として、改変されたフォリスタチンポリペプチドは、非アミノ酸エレメント、例えば、ポリエチレングリコール、脂質、多糖または単糖、およびリン酸を含有し得る。フォリスタチンポリペプチドの機能性に対するかかる非アミノ酸エレメントの影響は、他のフォリスタチンポリペプチドバリアントについて本明細書に記載されたように試験され得る。フォリスタチンポリペプチドが、新生形態のフォリスタチンポリペプチドを切断することによって細胞中で産生される場合、翻訳後プロセシングもまた、タンパク質の正確なフォールディングおよび／または機能にとって重要であり得る。異なる細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ２９３）は、かかる翻訳後活性のための具体的な細胞装置および特徴的な機構を有し、フォリスタチンポリペプチドの正確な改変およびプロセシングを確実にするために選択され得る。
【０２２１】
ある特定の態様では、フォリスタチンポリペプチドの機能的バリアントまたは改変形態は、フォリスタチンポリペプチドの少なくとも一部分および１つまたは複数の融合ドメインを有する融合タンパク質を含む。かかる融合ドメインの周知の例には、これらに限定されないが、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（例えば、Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）またはヒト血清アルブミンが含まれる。融合ドメインは、所望の特性を付与するように選択され得る。例えば、一部の融合ドメインは、アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離にとって特に有用である。親和性精製を目的として、アフィニティークロマトグラフィーに適切なマトリックス、例えば、グルタチオン、アミラーゼ、およびニッケルまたはコバルトコンジュゲートされた樹脂が使用される。かかるマトリックスの多くは、「キット」形態、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＧＳＴ精製システム、および（ＨＩＳ６）融合パートナーと共に有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）で入手可能である。別の例として、融合ドメインは、フォリスタチンポリペプチドの検出を促進するように選択され得る。かかる検出ドメインの例には、種々の蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、およびそれに対する特異的抗体が入手可能な通常は短いペプチド配列である「エピトープタグ」が含まれる。それに対する特異的モノクローナル抗体が容易に入手可能な周知のエピトープタグには、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）およびｃ−ｍｙｃタグが含まれる。一部の場合には、融合ドメインは、例えば、第Ｘａ因子またはトロンビンのためのプロテアーゼ切断部位を有し、これにより、適切なプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それによって、組換えタンパク質をそこから放出させることが可能になる。次いで、放出されたタンパク質は、引き続くクロマトグラフィー分離によって、融合ドメインから単離され得る。ある特定の好ましい実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、フォリスタチンポリペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏで安定化するドメイン（「安定剤」ドメイン）と融合されている。「安定化する」とは、破壊の減少、腎臓によるクリアランスの減少、または他の薬物動態学的効果のいずれにこれが起因するかにかかわらず、血清半減期を増加させるものを意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合は、広範なタンパク質に望ましい薬物動態学的特性を付与することが公知である。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合は、望ましい特性を付与し得る。選択され得る他の型の融合ドメインには、マルチマー化（例えば、ダイマー化、テトラマー化）ドメインおよび機能的ドメイン（さらなる生物学的機能、例えば、筋肉の成長のさらなる刺激を付与する）が含まれる。
【０２２２】
具体例として、本開示は、異種部分／ドメインを含むポリペプチドに融合されたフォリスタチンポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、異種部分は、血清アルブミンである。一部の実施形態では、異種部分は、免疫グロブリンの定常ドメイン、例えば、免疫グロブリンのＣＨ１、ＣＨ２もしくはＣＨ３ドメイン、またはＦｃである。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ２に由来するＦｃドメインは、以下に提供される（それぞれ、配列番号１２６および配列番号１２７）。本明細書に記載される場合、それらのＦｃ種は、これらのヘパリン結合ポリペプチドが付着し得る細胞にとって有害であり得るＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性が低減されているので、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４またはＩｇＧ２／４  Ｆｃドメインは、ヘパリン結合活性を保持するフォリスタチンポリペプチドとの融合のために、特に有利である。ＣＤＣ活性またはＡＤＣＣ活性のいずれかを減少させる他の突然変異は公知であり、集合的に、これらのバリアントのいずれかが本開示に含まれ、フォリスタチン融合タンパク質の有利な成分として使用され得る。一部の実施形態では、本明細書に開示されるフォリスタチンポリペプチドのいずれかは、配列番号１２６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列を含むＦｃドメイン、またはその断片にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、本明細書に開示されるフォリスタチンポリペプチドのいずれかは、配列番号１２７のアミノ酸配列に対して少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列を含むＦｃドメイン、またはその断片にコンジュゲートされている。必要に応じて、配列番号１２６のＦｃドメイン（またはそのバリアントもしくは断片）は、Ａｓｐ−２６５、Ｌｙｓ−３２２およびＡｓｎ−４３４（対応する全長ＩｇＧ１に従って番号付けした）などの残基において、１つまたは複数の突然変異を有する。ある特定の場合には、これらの突然変異のうち１つまたは複数（例えば、Ａｓｐ−２６５突然変異）を有する突然変異体Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃγ受容体に結合する低減された能力を有する。他の場合には、これらの突然変異のうち１つまたは複数（例えば、Ａｓｎ−４３４突然変異）を有する突然変異体Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して、ＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）に結合する増加した能力を有する。
【０２２３】
用いられ得るヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ２アミノ酸配列の例は、以下に示される：
【化３９】
2021522793.tif 000041
【０２２４】
融合タンパク質の異なるエレメントは、所望の機能性と矛盾しない任意の様式で整列され得ることが理解される。例えば、フォリスタチンポリペプチドは、異種部分／ドメインに対してＣ末端側に配置され得、またはあるいは、異種部分／ドメインは、フォリスタチンポリペプチドに対してＣ末端側に配置され得る。フォリスタチンポリペプチドドメインおよび異種ドメインは、融合タンパク質中で隣接している必要はなく、さらなるドメインまたはアミノ酸配列が、いずれかのドメインに対してＣ末端側もしくはＮ末端側に、またはドメイン間に含まれ得る。一部の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、異種部分／ドメインに直接コンジュゲートされている。他の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、リンカーによって異種部分／ドメインにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン、スレオニンおよび／またはセリンリッチリンカーである。例えば、Ａｓｎ、ＰｒｏおよびＡｌａであるがこれらに限定されない、他のほぼ中性のアミノ酸もまた、リンカー配列において使用され得る。一部の実施形態では、リンカーは、ＧｌｙおよびＴｈｒを含むアミノ酸配列の種々の並べ替えを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒを含有するアミノ酸配列の種々の並べ替えを含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも３、４、５、７、１０、１２、１５、２０、２１、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、リンカーは、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（ＧＧＧ）、またはその反復を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＴｈｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（ＴＧＧＧ）（配列番号１２８）のアミノ酸配列、またはその反復を含む。一部の実施形態では、リンカーは、１〜５、１〜１０または１〜１５アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、ＴｈｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（ＴＧＧＧ）（配列番号１２８）からなる。一部の実施形態では、リンカーは、１０アミノ酸長よりも大きい。一部の実施形態では、リンカーは、１０〜１００の間、１０〜９０の間、１０〜８０の間、１０〜７０の間、１０〜６０の間、１０〜５０の間、１０〜４０の間、１０〜３０の間、１０〜２０の間、１０〜１５の間のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰ（配列番号１２９）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列、またはその断片を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰ（配列番号１３０）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一なアミノ酸配列、またはその断片を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰ（配列番号１３１）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一な配列、またはその断片を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＡＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１３２）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号１２９〜１３２のうちいずれか１つのアミノ酸配列からならない、またはそれを含まない。
【０２２５】
本明細書で使用される場合、用語「免疫グロブリンＦｃドメイン」または単に「Ｆｃ」は、免疫グロブリン鎖定常領域のカルボキシル末端部分、好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常領域、またはその部分を意味すると理解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または５）２つもしくはそれよりも多くのドメインと免疫グロブリンヒンジ領域との組合せ、を含み得る。好ましい実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを少なくとも含み、好ましくは、ＣＨ１ドメインを欠く。フォリスタチンポリペプチドは、免疫グロブリンのドメイン、例えば、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのみを含み得ることも理解される。これらのドメインの多くは、望ましい薬物動態学的特性、およびダイマー化またはより高次のマルチマー化を付与する。
【０２２６】
一実施形態では、重鎖定常領域が由来する免疫グロブリンのクラスは、ＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３または４）である。他のクラスの免疫グロブリン、ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）およびＩｇＭ（Ｉｇμ）が使用され得る。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択は、米国特許第５，５４１，０８７号および同第５，７２６，０４４号で詳細に議論されている。特定の結果を達成するための、ある特定の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択は、当業者の技術水準の範囲内とみなされる。ある特定の実施形態では、ＩｇＧ免疫グロブリンの定常ドメインは、天然ヒトＩｇＧ１と比較して、低減されたＡＤＣＣおよび／もしくはＣＤＣ活性を有する、または実質的なＡＤＣＣおよび／もしくはＣＤＣ活性を有さない。免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡ構築物の部分は、好ましくは、ヒンジドメインの少なくとも一部分、好ましくは、ＦｃガンマのＣＨ３ドメインまたはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはＩｇＭのいずれか中の相同なドメインの少なくとも一部分を含む。
【０２２７】
さらに、免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸の置換または欠失は、本明細書に開示される方法および組成物の実施において有用であり得ることが企図される。１つの例は、上部ＣＨ２領域中にアミノ酸置換を導入して、Ｆｃ受容体に対する低減された親和性を有するＦｃバリアントを創出することである（Cole  et  al.  (1997)  J.  Immunol.  159:3613）。さらに、多くの例では、Ｃ末端リシン、すなわちＫは除去され、したがって、本明細書に記載されるポリペプチドのいずれかは、配列番号１２６または配列番号１２７に示されるものなどのＦｃドメイン中に見出されるＣ末端Ｋを省略し得る。
【０２２８】
ある特定の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドの最後（カルボキシ末端）のリシン、すなわちＫは、存在しない。例えば、タンパク質は、配列番号１４４または１４５の配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、それぞれ、配列番号１４４または１４５の最後（カルボキシ末端）のリシン（Ｋ）は、必要に応じて、存在しない。
【０２２９】
ある特定の実施形態では、本開示のフォリスタチンポリペプチドは、フォリスタチンポリペプチドを安定化することが可能である１つまたは複数の改変を含有する。例えば、このような改変によって、フォリスタチンポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期が増強されるか、フォリスタチンポリペプチドの循環半減期が増強されるかまたはフォリスタチンポリペプチドのタンパク質分解が低減される。このような安定化改変としては、以下に限定されないが、融合タンパク質（例えば、フォリスタチンポリペプチドおよび安定化ドメインを含む融合タンパク質を含む）、グリコシル化部位の改変（例えば、フォリスタチンポリペプチドへのグリコシル化部位の付加を含む）、および炭水化物部分の改変（例えば、フォリスタチンポリペプチドからの炭水化物部分の除去を含む）が挙げられる。融合タンパク質の場合には、フォリスタチンポリペプチドは、ＩｇＧ分子などの安定化ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）に融合されている。本明細書で使用される場合、「安定化ドメイン」という用語は、融合タンパク質の場合のように融合ドメイン（例えば、Ｆｃ）を指すだけでなく、炭水化物部分などの非タンパク質性改変、またはポリエチレングリコールなどの非タンパク質性ポリマーも含む。
【０２３０】
代表的なフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、ＦＳＴ（２８８）−ＩｇＧ２融合物であり、これは、以下に示されるプロセシングされていない成熟アミノ酸配列を有する。
【０２３１】
プロセシングされていないＦＳＴ（２８８）−ＩｇＧ２（配列番号１３５）
【化４０】
2021522793.tif 000042
【０２３２】
これは、以下の核酸配列（配列番号１３６）によってコードされている。
【化４１】
2021522793.tif 000043
【０２３３】
成熟ＦＳＴ（２８８）−ＩｇＧ２（配列番号１３７）
【化４２】
2021522793.tif 000044
【０２３４】
最初の「ＧＮ」配列を除去して、以下のポリペプチドを得ることができる。（配列番号１３８）
【化４３】
2021522793.tif 000045
【０２３５】
さらなる代表的なフォリスタチン−Ｆｃ融合タンパク質は、ＦＳＴ（３１５）−ＩｇＧ２融合物であり、これは、以下に示されるプロセシングされていない成熟アミノ酸配列を有する。
【０２３６】
プロセシングされていないＦＳＴ（３１５）−ＩｇＧ２（配列番号１３９）
【化４４】
2021522793.tif 000046
【０２３７】
これは、以下の核酸配列（配列番号１４０）によってコードされている。
【化４５】
2021522793.tif 000047
【化４６】
2021522793.tif 000048
【０２３８】
成熟ＦＳＴ（３１５）−ＩｇＧ２（配列番号１４１）
【化４７】
2021522793.tif 000049
【０２３９】
最初の「ＧＮ」配列を除去して、以下のポリペプチドを得ることができる。（配列番号１４２）
【化４８】
2021522793.tif 000050
【０２４０】
さらなる代表的なフォリスタチン−Ｆｃ融合物は、ＦＳＴ（２９１）−ＩｇＧ１融合物であり、これは、以下に示されるプロセシングされていない成熟アミノ酸配列を有する。
【０２４１】
プロセシングされていないＦＳＴ（２９１）−ＩｇＧ１（配列番号１４３）
【化４９】
2021522793.tif 000051
【０２４２】
成熟ＦＳＴ（２９１）−ＩｇＧ１（配列番号１４４）
【化５０】
2021522793.tif 000052
【０２４３】
最初の「ＧＮ」配列を除去して、以下のポリペプチドを得ることができる。（配列番号１４５）
【化５１】
2021522793.tif 000053
【０２４４】
ＦＳＴ（２９１）−ＩｇＧ２融合物は、以下に示されるプロセシングされていない成熟アミノ酸配列を有する。
【０２４５】
プロセシングされていないＦＳＴ（２９１）−ＩｇＧ２（配列番号１４６）
【化５２】
2021522793.tif 000054
【０２４６】
成熟ＦＳＴ（２９１）−ＩｇＧ２（配列番号１４７）
【化５３】
2021522793.tif 000055
【０２４７】
最初の「ＧＮ」配列を除去して、以下のポリペプチドを得ることができる。（配列番号１４８）
【化５４】
2021522793.tif 000056
【０２４８】
ある特定の実施形態では、本発明は、他のタンパク質から単離されるか、またはそうでなければ他のタンパク質を実質的に含まない、フォリスタチンポリペプチドの利用可能な単離された形態および／または精製された形態を作製する。
【０２４９】
ある特定の実施形態では、本開示のフォリスタチンポリペプチド（改変されていないかまたは改変された）は、様々な当技術分野で公知の技法によって生成することができる。例えば、このようなフォリスタチンポリペプチドは、Bodansky,  M.  Principles  of  Peptide  Synthesis,  Springer  Verlag,  Berlin  (1993)およびGrant  G.  A.  (ed.),  Synthetic  Peptides:  A  User's  Guide,  W.  H.  Freeman  and  Company,  New  York  (1992)に記載されているものなどの、標準的なタンパク質化学技法を使用して合成することができる。さらに、自動化ペプチド合成機は市販されている（例えば、Advanced  ChemTech  Model  396;  Milligen/Biosearch  9600）。あるいは、フォリスタチンポリペプチド、その断片またはバリアントは、当技術分野で周知であるように（以下も参照されたい）、様々な発現系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＣＯＳ細胞、バキュロウイルス）を使用して組換えによって産生することができる。さらなる実施形態では、改変されたまたは改変されていないフォリスタチンポリペプチドは、天然に存在するかまたは組換えによって産生された全長フォリスタチンポリペプチドの、例えば、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、ペプシン、または塩基性アミノ酸対変換酵素（ＰＡＣＥ）を使用することによる消化によって産生することができる。コンピューター分析（市販のソフトウェア、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｏｍｅｇａ、ＰＣＧｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．を使用する）を使用して、タンパク質分解による切断部位を特定することができる。あるいは、このようなフォリスタチンポリペプチドは、天然に存在するかまたは組換えによって産生された全長フォリスタチンポリペプチドから、当技術分野で公知の標準的技法によって、例えば、化学的切断（例えば、臭化シアン、ヒドロキシルアミン）によって産生することができる。
【０２５０】
一部の実施形態では、本明細書に開示されているフォリスタチンまたはフォリスタチン様ポリペプチドのいずれかは、本明細書に開示されているＴβＲＩＩポリペプチドのいずれかにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、フォリスタチンまたはフォリスタチン様ポリペプチドは、ＴβＲＩＩポリペプチドに直接融合されている。一部の実施形態では、フォリスタチンまたはフォリスタチン様ポリペプチドは、リンカーによってＴβＲＩＩポリペプチドに融合されている。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、図１４Ａに示されたものと類似のフォーマットでレイアウトされている。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、配列番号１１１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なフォリスタチンアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、異種ドメインを含む。一部の実施形態では、異種ドメインはＦｃドメインである。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、配列番号１６３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【化５５】
2021522793.tif 000057
【化５６】
2021522793.tif 000058
【０２５１】
一部の実施形態では、多特異性バインダーは、フォリスタチンポリペプチド部分とＦｃ部分の間にリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧのアミノ酸配列または配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【０２５２】
一部の実施形態では、多特異性バインダーは、配列番号１６４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【化５７】
2021522793.tif 000059
【０２５３】
一部の実施形態では、多特異性バインダーは、配列番号１７０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なＴβＲＩＩポリペプチド部分を含む。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチド部分は、リンカーによって、フォリスタチンポリペプチド部分またはＦｃ部分に融合されている。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチド部分は、リンカーによって、Ｆｃ部分のＣ末端（例えば、配列番号１６４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列のＣ末端）に融合されている。一部の実施形態では、ＴβＲＩＩポリペプチド部分に対してフォリスタチンポリペプチド部分またはＦｃ部分を融合させるために使用されるリンカーは、配列番号１６５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。
ＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１６５）
【０２５４】
多特異性バインダーの一部をコードする代表的なヌクレオチドは、配列番号１６６のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なヌクレオチド配列を含んでもよい。
【化５８】
2021522793.tif 000060
【化５９】
2021522793.tif 000061
【０２５５】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている多特異性バインダーのいずれかは、配列番号１８０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【化６０】
2021522793.tif 000062
【化６１】
2021522793.tif 000063
【０２５６】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている多特異性バインダーのいずれかは、配列番号１８１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。
【化６２】
2021522793.tif 000064
ｉｉ．抗体およびその抗原結合性断片
【０２５７】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されているＴβＲＩＩポリペプチドのいずれかおよび抗体またはその抗原結合性断片を含む多特異性バインダーを提供する。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、ＴβＲＩＩポリペプチドおよび抗体またはその抗原結合性断片を含み、抗体またはその抗原結合性断片は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ＧＤＦ１１、および／またはＧＤＦ８のうちの１つまたは複数に結合することが可能である。特定の実施形態では、多特異性バインダーは、ＴβＲＩＩポリペプチドおよび抗体またはその抗原結合性断片を含み、抗体またはその抗原結合性断片は、ＧＤＦ８に結合することが可能である。
【０２５８】
本明細書で使用される場合、「抗体」（Ａｂ）という用語は、「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語と同義であり、ジスルフィド結合によって相互接続した２本の重（Ｈ）鎖（約５０〜７０ｋＤａ）および２本の軽（Ｌ）鎖（約２５ｋＤａ）を含むテトラマーを意味する。２種類の軽鎖：λおよびκが存在する。ヒトでは、これらは類似するが、１種類のみが各抗体中に存在する。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンに分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ１として抗体のアイソタイプを定義する。全般的に、Fundamental  Immunology  Ch.  7  (Paul,  W.,  ed.,  2nd  ed.  Raven  Press,  N.Y.  (1989))を参照されたい。各重鎖（本明細書では、Ｈ鎖またはＨｃと称されることもある）は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ、またはＨ可変ドメイン）および重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各軽鎖（本明細書では、Ｌ鎖またはＬｃと称されることもある）は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ、またはＬ可変ドメイン）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成される。軽鎖および重鎖内では、可変領域と定常領域は、約１２またはそれより多いアミノ酸からなる「Ｊ」領域によって接合しており、重鎖はまた、約３つまたはそれより多いアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。ＶＨ領域とＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と称されるより保存されている領域が点在する、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに再分割することができる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲ（Ｈ−ＣＤＲは、本明細書において、重鎖からのＣＤＲを示し；およびＬ−ＣＤＲは、本明細書において、軽鎖からのＣＤＲを示す）および４つのＦＲから構成され、これらは、アミノ末端からカルボキシル末端へと以下の順序で配列している：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。一部の実施形態では、各ドメインへのアミノ酸の配置は、Kabat,  Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest  (National  Institutes  of  Health,  Bethesda,  MD  (1987  and  1991))またはChothia  &  Lesk,  J.  MoI.  Biol.  196:901-917  (1987)；  Chothia  et  al.,  Nature  342:878-883  (1989)の定義に従う。
【０２５９】
本明細書で使用される場合、「抗原結合性断片」という用語は、抗原に対して特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片を指す。これは、全長抗体の断片によって抗体の抗原結合機能が果たされ得ることを示している。「抗原結合性断片」という用語に包含される結合性断片の非限定的な例として、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られるＦａｂ’断片；（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward  et  al.,  (1989)  Nature  341:544-546）；（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；ならびに（ｖｉｉｉ）ジスルフィド結合によって安定化したＶＨ：ＶＬヘテロダイマーからなるｄｓＦｖが挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、ＶＬおよびＶＨは、これらを単一のタンパク質鎖（ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価の分子が形成されている（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている））とすることができる合成リンカーによって、組換え方法を使用して接合され得る；例えば、Bird  et  al.  Science  242:423-426  (1988)およびHuston  et  al.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  85:5879-5883  (1988)）を参照されたい。また、ＶＨおよび／またはＶＬを含む抗原結合分子もこの開示の範囲内であり、ＶＨの場合には、分子は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３領域のうちの１つまたは複数も含んでもよい。このような単鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合性断片」という用語に包含されることが意図される。単鎖抗体の他の形態、例えば、ダイアボディもまた包含される。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖において発現される二価の、二重特異性抗体であるが、短すぎて同一の鎖における２つのドメイン間で対合することができないリンカーを使用して、それによって、ドメインを別の鎖の相補性ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を創出する（例えば、Holliger  et  al.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  90:6444-6448  (1993)；Poljak  et  al.  Structure  2:1121-1123  (1994)を参照されたい）。
【０２６０】
本明細書で使用される場合、「抗原結合性断片」という用語はまた、例えば、ラクダ化単一ドメイン抗体などの単一ドメイン抗体も含む。例えば、その全てがその全体として参照により本明細書に組み込まれる、Muyldermans  et  al.  (2001)  Trends  Biochem  Sci  26:230-235；Nuttall  et  al.  (2000)  Curr  Pharm  Biotech  1:253-263；Reichmann  et  al.  (1999)  J  Immunol  Meth  231:25-38；ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９４／０４６７８号および同第ＷＯ９４／２５５９１号；ならびに米国特許第６，００５，０７９号を参照されたい。一部の実施形態では、本開示は、単一ドメイン抗体が形成されるような改変を有する２つのＶＨドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。
【０２６１】
本明細書で使用される場合、「抗リガンド抗体」または「抗リガンド抗原結合性断片」などという用語を使用して、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのリガンド（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ノダル、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８）に結合する／これを標的とすることが可能である抗体に言及する。一部の実施形態では、抗リガンド抗体またはその抗原結合性断片は、ＧＤＦ８に結合する／これを標的とすることが可能である。一部の実施形態では、抗リガンド抗体またはその抗原結合性断片は多特異性であり、複数のＴＧＦ−βスーパーファミリーのリガンド（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ノダル、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８のうちの２つ以上）に結合する／これを標的とすることが可能である。
【０２６２】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原（例えば、ＧＤＦ８）上の部位を指す。エピトープは、連続アミノ酸またはタンパク質の三次フォールディングによって並列した非連続アミノ酸の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒に曝露されても保持されるが、一方、三次フォールディングによって形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒によって処理されると消失する。エピトープは、典型的には、特有の空間的立体構造中に、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含む。所与の抗体がどのエピトープに結合するか（すなわち、エピトープマッピング）を決定するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、重複しているかまたは連続するペプチド、例えば、ＧＤＦ８が、所与の抗体または抗原結合性断片との反応性について試験される、免疫ブロッティングアッセイおよび免疫沈降アッセイを含む。エピトープの空間的立体構造を決定する方法としては、当技術分野の技法および本明細書に記載のもの、例えば、ｘ線結晶構造解析および２次元核磁気共鳴が挙げられる（例えば、Epitope  Mapping  Protocols  in  Methods  in  Molecular  Biology,  Vol.  66,  G.  E.  Morris,  Ed.  (1996)を参照されたい）。
【０２６３】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている抗リガンド抗体または抗原結合性断片のいずれかは、結合したリガンドが受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ７、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ６、および／またはＴＧＦβＲＩＩ）と相互作用することがもはや不可能であるように、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのリガンド（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ノダル、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８）に結合することが可能である。一部の実施形態では、本明細書に開示されている抗リガンド抗体または抗原結合性断片のいずれかは、結合したリガンドがいかなる下流のシグナル伝達事象も誘発することがもはや不可能であるように、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのリガンド（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、ノダル、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８）に結合することが可能である。一部の実施形態では、抗リガンド抗体または抗原結合性断片のいずれかは、細胞内のＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５および／またはＳＭＡＤ８シグナル伝達を阻害することが可能である。一部の実施形態では、抗リガンド抗体または抗原結合性断片のいずれかは、抗体または抗原結合性断片の非存在下で本質的に同じ条件下の同じ細胞型と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％、細胞内のＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５および／またはＳＭＡＤ８シグナル伝達を阻害することが可能である。特定の実施形態では、抗リガンド抗体または抗原結合性断片のいずれかは、細胞内のＳＭＡＤ２および／またはＳＭＡＤ３シグナル伝達を阻害することが可能である。特定の実施形態では、抗リガンド抗体または抗原結合性断片のいずれかは、抗体または抗原結合性断片の非存在下で類似する条件下の同じ細胞型と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％、細胞内のＳＭＡＤ２および／またはＳＭＡＤ３シグナル伝達を阻害することが可能である。
【０２６４】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ＧＤＦ８ポリペプチドに結合することが可能である。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、配列番号１４９のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を有するＧＤＦ８ポリペプチド、またはその機能的断片に結合することが可能である。ＧＤＦ８の機能的断片は、１つまたは複数のＴＧＦβ−スーパーファミリーの受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４および／またはＡＬＫ７）に結合し、受容体の下流のシグナル伝達を誘発することが可能となる。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ＧＤＦ８のリスト領域（ｗｒｉｓｔ  ｒｅｇｉｏｎ）に結合する（例えば、Walker  et  al.,  2017,  BMC  Biol.,  15:19を参照されたい）。
配列番号１４９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５２５０．１）：
【化６３】
2021522793.tif 000065
【０２６５】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ＧＤＦ１１ポリペプチドに結合することが可能である。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、配列番号１５０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を有するＧＤＦ１１ポリペプチド、またはその機能的断片に結合することが可能である。ＧＤＦ１１の機能的断片は、１つまたは複数のＴＧＦβ−スーパーファミリーの受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４および／またはＡＬＫ７）に結合し、受容体の下流のシグナル伝達を誘発することが可能となる。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ＧＤＦ１１のリスト領域に結合する（例えば、Walker  et  al.,  2017,  BMC  Biol.,  15:19を参照されたい）。
配列番号１５０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号  ＮＰ＿００５８０２．１）：
【化６４】
2021522793.tif 000066
【０２６６】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ＧＤＦ８とＧＤＦ１１の両方に結合する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ＧＤＦ８とＧＤＦ１１の両方に対して共通するエピトープに結合する。
【０２６７】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、配列番号１５１〜１６２からなる群から選択されるＣＤＲのうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、配列番号１５１〜１６２からなる群から選択されるＣＤＲであるが、１、２、３、４、５または６個の保存的置換を含むＣＤＲのうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、ＶＨ  ＣＤＲ１は配列番号１５１または配列番号１５７を含み、ＶＨ  ＣＤＲ２は配列番号１５２または配列番号１５８を含み、およびＶＨ  ＣＤＲ３は配列番号１５３または配列番号１５９を含み；ならびにＶＬ  ＣＤＲ１は配列番号１５４または配列番号１６０を含み、ＶＬ  ＣＤＲ２は配列番号１５５または配列番号１６１を含み、およびＶＬ  ＣＤＲ３は配列番号１５６または配列番号１６２を含む。
【化６５】
2021522793.tif 000067
【０２６８】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、全長抗体である。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。
【０２６９】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、キメラ抗体である。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ヒト化抗体または抗原結合性断片である。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、抗原結合性断片である。一部の実施形態では、抗原結合性断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、ｄＡｂ、またはｓｃＦｖからなる群から選択される。
【０２７０】
公知の抗体と同じかもしくは重複するエピトープを認識するかまたは公知の抗体との結合に対して競合する抗体は、通常の技法を使用して特定することができる。このような技法としては、例えば、ある抗体の、標的抗原に対する別の抗体の結合をブロックする能力を示すイムノアッセイ、すなわち、競合結合アッセイが挙げられる。競合結合は、試験下の免疫グロブリンが、共通の抗原、例えば、ＧＤＦ８に対する参照抗体の特異的結合を阻害するアッセイにおいて決定される。多数の種類の競合結合アッセイ、例えば：固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Stahli  et  al.,  Methods  in  Enzymology  9:242  (1983)を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Kirkland  et  al.,  J.  Immunol.  137:3614  (1986)を参照されたい）；固相直接標識化アッセイ、固相直接標識化サンドイッチアッセイ（Harlow  and  Lane,  Antibodies:A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Press  (1988)を参照されたい）;Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（Morel  et  al.,  Mol.  Immunol.  25(1):7  (1988)を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Cheung  et  al.,  Virology  176:546  (1990)）；および直接標識化ＲＩＡ．（Moldenhauer  et  al.,  Scand.  J.  Immunol.  32:77  (1990)）が公知である。典型的には、このようなアッセイは、これら、すなわち、標識されていない試験免疫グロブリンおよび標識された参照免疫グロブリンのいずれかを有する固体表面または細胞に結合した精製抗原の使用に関与する。競合的阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で、固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することによって測定される。通常、試験免疫グロブリンは過剰に存在する。通常、競合する抗体が過剰に存在する場合、これは、共通抗原に対する参照抗体の特異的結合を少なくとも約５０〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜７５％またはそれより高い割合で阻害することになる。
【０２７１】
他の技法としては、例えば、エピトープマッピング方法、例えば、抗原の結晶のｘ線分析：エピトープの原子分解をもたらす抗体複合体および抗原：抗体相互作用の立体構造と動力学を研究する水素／重水素（Ｈ／Ｄ）交換と組み合わせた質量分析が挙げられる。他の方法は、抗原断片または抗原の変異した変種に対する抗体の結合をモニターするものであり、ここで、抗原配列内のアミノ酸残基の改変による結合の損失は、エピトープ構成成分の指標と考えられることが多い。さらに、エピトープマッピングのための計算的コンビナトリアル方法も使用することができる。これらの方法は、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから、特定の短鎖ペプチドを親和性により単離する目的の抗体の能力に依拠する。次いで、ペプチドを、ペプチドライブラリーをスクリーニングするために使用される抗体に対応するエピトープの定義に対する手がかりとみなす。エピトープマッピングでは、コンピューターアルゴリズムも開発されており、これは、立体構造として非連続的なエピトープをマッピングすることが示されている。
【０２７２】
本開示は、本明細書に記載の抗リガンド抗体またはその抗原結合性断片のいずれかを産生するための方法も特色とする。一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体を調製するための方法は、適切な免疫原（例えば、ＧＤＦ８）により対象（例えば、非ヒト哺乳動物）を免疫化するステップを含むことができる。本明細書に記載の抗体のいずれかを生成するために好適な免疫原を本明細書において示す。例えば、ＧＤＦ８に結合する抗体を生成するために、当業者は、ヒトＧＤＦ８で好適な対象（例えば、非ヒト哺乳動物、例えば、ラット、マウス、アレチネズミ、ハムスター、イヌ、ネコ、ブタ、ヤギ、ウマ、または非ヒト霊長類）を免疫化することができる。
【０２７３】
好適な対象（例えば、非ヒト哺乳動物）は、哺乳動物による抗体の産生を誘発するのに十分な回数、次のブースター免疫化と一緒に適切な抗原で免疫化され得る。免疫原は、アジュバントと共に対象（例えば、非ヒト哺乳動物）に投与することができる。対象において抗体を産生するのに有用なアジュバントとしては、以下に限定されないが、タンパク質アジュバント；細菌アジュバント、例えば、細菌全体（ＢＣＧ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）ならびに結核菌の細胞壁骨格、トレハロースジミコレート、モノホスホリル脂質Ａ、メタノール抽出可能な残基（ＭＥＲ）を含む細菌成分、完全または不完全フロインドアジュバント；ウイルスアジュバント；化学アジュバント、例えば、水酸化アルミニウム、およびヨードアセテートおよびコレステリルヘミスクシネートが挙げられる。免疫応答を誘導するための方法において使用することができる他のアジュバントとしては、例えば、コレラ毒素およびパラポックスウイルスタンパク質が挙げられる。Bieg  et  al.  (1999)  Autoimmunity  31(1):15-24も参照されたい。例えば、Lodmell  et  al.  (2000)  Vaccine  18:1059-1066；Johnson  et  al.  (1999)  J  Med  Chem  42:4640-4649；Baldridge  et  al.  (1999)  Methods  19:103-107；およびGupta  et  al.  (1995)  Vaccine  13(14):  1263-1276も参照されたい。
【０２７４】
一部の実施形態では、本方法は、免疫原に結合するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系を調製するステップを含む。例えば、実験用マウスなどの好適な哺乳動物を上記のように、リガンド、例えば、ＧＤＦ８で免疫化する。免疫化された哺乳動物の抗体産生細胞（例えば、脾臓のＢ細胞）を免疫原を少なくとも１回ブースター免疫化した２から４日後に単離し、次いで、好適な骨髄腫細胞系の細胞と融合させる前に、培養下で一時的に成長させることができる。例えば、ワクシニアウイルスまたはポリエチレングリコールなどの融合プロモーターの存在下で、細胞を融合させることができる。融合において得られたハイブリッド細胞をクローニングし、所望の抗体を分泌する細胞クローンを選択する。例えば、好適な免疫原で免疫化したＢａｌｂ／ｃマウスの脾細胞を骨髄腫細胞系ＰＡＩまたは骨髄腫細胞系Ｓｐ２／０−Ａｇ  １４の細胞と融合させることができる。融合後に、選択培地、例えば、ＨＡＴ培地を補充した好適な培養培地中で、正常な骨髄腫細胞が所望のハイブリドーマ細胞を過剰に成長させないために規則的な間隔で、細胞を増殖させる。次いで、所望の抗体、例えば、本明細書に記載されているように、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのリガンド（例えば、ＧＤＦ８）に結合する抗体の分泌について、得られたハイブリッド細胞をスクリーニングする。
【０２７５】
一部の実施形態では、当業者は、例えば、米国特許第６，３００，０６４号（Knappik  et  al.;  Morphosys  AGに対する）およびSchoonbroodt  et  al.  (2005)  Nucleic  Acids  Res  33(9):e81に記載されている偏りのある非免疫ライブラリーに由来する抗リガンド抗体を特定することができる。
【０２７６】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、例えば、以下の技術に関与するかまたは以下の技術と共に使用することができる：ファージディスプレイ技術、細菌ディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、真核生物のウイルスディスプレイ、哺乳動物細胞ディスプレイ、および無細胞（例えば、リボソームディスプレイ）抗体スクリーニング技術（例えば、Etz  et  al.  (2001)  J  Bacteriol  183:6924-6935；Cornelis  (2000)  Curr  Opin  Biotechnol  11:450-454；Klemm  et  al.  (2000)  Microbiology  146:3025-3032；Kieke  et  al.  (1997)  Protein  Eng  10:1303-1310；Yeung  et  al.  (2002)  BiotechnolProg  18:212-220；Boder  et  al.  (2000)  Methods  Enzymology328:430-444；Grabherr  et  al.  (2001)  Comb  Chem  High  Throughput  Screen  4:185-192；Michael  et  al.  (1995)  Gene  Ther  2:660-668；Pereboev  et  al.  (2001)  J  Virol  75:7107-7113；Schaffitzel  et  al.  (1999)  J  Immunol  Methods  231:119-135；およびHanes  et  al.  (2000)  Nat  Biotechnol  18:1287-1292を参照されたい）。
【０２７７】
様々なファージディスプレイ法を使用して抗体を特定するための方法は、当技術分野で公知である。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に提示される。このようなファージを利用して、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現した、抗体の抗原結合ドメイン、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはジスルフィド結合によって安定化されたＦｖ抗体断片を提示することができる。これらの方法において使用されるファージは、典型的には、繊維状ファージ、例えば、ｆｄおよびＭ１３である。抗原結合ドメインは、組換えによってファージ被覆タンパク質ｐＩＩＩ、ｐＶＩＩＩ、またはｐＩＸのいずれかに融合したタンパク質として発現される。例えば、Shi  et  al.  (2010)  JMB  397:385-396を参照されたい。本明細書に記載の免疫グロブリン、またはその断片を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の例としては、Brinkman  et  al.  (1995)  J  Immunol  Methods  182:41-50；Ames  et  al.  (1995)  J  Immunol  Methods  184:177-186；Kettleborough  et  al.  (1994)  Eur  J  Immunol  24:952-958；Persic  et  al.  (1997)  Gene  187:9-18；Burton  et  al.  (1994)  Advances  in  Immunology  57:191-280；ならびにＰＣＴ公開番号第ＷＯ９０／０２８０９号、同第ＷＯ９１／１０７３７号、同第ＷＯ９２／０１０４７号、同第ＷＯ９２／１８６１９号、同第ＷＯ９３／１１２３６号、同第ＷＯ９５／１５９８２号、および同第ＷＯ９５／２０４０１号に開示されているものが挙げられる。好適な方法はまた、例えば、米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号にも記載されている。
【０２７８】
一部の実施形態では、ファージディスプレイ抗体ライブラリーは、免疫化した哺乳動物に由来するＢ細胞から採取したｍＲＮＡを使用して作成することができる。例えば、Ｂ細胞を含む脾細胞試料は、上記のように、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのリガンド（例えば、ＧＤＦ８）により免疫化したマウスから単離することができる。ｍＲＮＡは、これらの細胞から単離し、標準的な分子生物学の技法を使用してｃＤＮＡに変換することができる。例えば、Sambrook  et  al.  (1989)  "Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  2nd  Edition,"  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.；Harlow  and  Lane  (1988)、上掲；Benny  K.  C.  Lo  (2004)、上掲；およびBorrebaek  (1995)、上掲を参照されたい。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖ポリペプチドの可変領域をコードするｃＤＮＡを使用して、ファージディスプレイライブラリーを構築する。このようなライブラリーを作成するための方法は、例えば、Merz  et  al.  (1995)  J  Neurosci  Methods  62(1-2):213-9；Di  Niro  et  al.  (2005)  Biochem  J  388(Pt  3):889-894；およびEngberg  et  al.  (1995)  Methods  Mol  Biol  51:355-376に記載されている。
【０２７９】
一部の実施形態では、選択とスクリーニングを組み合わせて用い、例えば、ハイブリドーマに由来する抗体の集団またはファージディスプレイ抗体のライブラリーから目的の抗体を特定することができる。好適な方法は当技術分野で公知であり、例えば、Hoogenboom  (1997)  Trends  in  Biotechnology  15:62-70；Brinkman  et  al.  (1995)、上掲；Ames  et  al.  (1995)、上掲；Kettleborough  et  al.  (1994)、上掲；Persic  et  al.  (1997)、上掲；およびBurton  et  al.  (1994)、上掲に記載されている。例えば、バクテリオファージ被覆タンパク質（例えば、Ｍ１３ファージのｐＩＩＩ、ｐＶＩＩＩ、またはｐＩＸ）および異なる抗原結合領域の融合タンパク質をそれぞれがコードする複数のファージミドベクターを標準的な分子生物学の技法を使用して生成し、次いで、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）の集団へと導入する。細菌中のバクテリオファージの発現は、一部の実施形態では、ヘルパーファージの使用を必要とする場合がある。一部の実施形態では、ヘルパーファージは必要とされない（例えば、Chasteen  et  al.,  (2006)  Nucleic  Acids  Res  34(21):e145を参照されたい）。細菌から生成されたファージを回収し、次いで、例えば、固体支持体に結合した（固定された）標的抗原へと接触させる。ファージを溶液中で抗原に接触させてもよく、次に、複合体を固体支持体に結合させる。
【０２８０】
上記方法を使用してスクリーニングした抗体の亜集団は、当技術分野で公知の任意の免疫学または生化学に基づく方法を使用して、特定の抗原（例えば、ＧＤＦ８）に対するそれらの特異性および結合親和性について特徴付けることができる。例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのリガンド（例えば、ＧＤＦ８）への抗体の特異的結合は、例えば、以下に限定されないが、上記のような、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＳＰＲアッセイ、免疫沈降アッセイ、アフィニティークロマトグラフィー、および平衡透析などの免疫学または生化学に基づく方法を使用して、決定することができる。抗体の免疫特異的結合および交差反応性を分析するために使用することができるイムノアッセイとしては、以下に限定されないが、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着アッセイ）などの技法を使用する競合的および非競合的アッセイ系、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射定量測定アッセイ、蛍光イムノアッセイ、およびプロテインＡイムノアッセイなどの技法を使用する競合的および非競合的アッセイ系が挙げられる。このようなアッセイは、日常的であり当技術分野で周知である。
【０２８１】
選択されたＣＤＲアミノ酸配列が短い配列（例えば、１０〜１５アミノ酸長より短い）である実施形態では、ＣＤＲをコードする核酸は、例えば、Shiraishi  et  al.  (2007)  Nucleic  Acids  Symposium  Series  51(1):129-130および米国特許第６，９９５，２５９号に記載されているように、化学的に合成することができる。アクセプター抗体をコードする所与の核酸配列では、ＣＤＲをコードする核酸配列の領域を標準的な分子生物学の技法を使用して化学的に合成された核酸と置き換えることができる。化学的に合成された核酸の５’末端および３’末端は、核酸を、ドナー抗体の可変領域をコードする核酸中にクローニングするのに有用な付着末端制限酵素部位を含むよう合成することができる。
【０２８２】
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗リガンド抗体は、その対応する変更されていない定常領域に対してエフェクター機能が低下した（またはなくなった）、変更された重鎖定常領域を含む。抗リガンド抗体の定常領域に関するエフェクター機能は、定常領域またはＦｃ領域の特性を変更することによってモジュレートすることができる。変更されたエフェクター機能としては、例えば、以下の活性のうちの１つまたは複数におけるモジュレーションが挙げられる：抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、アポトーシス、１つまたは複数のＦｃ受容体への結合、および炎症促進性の応答。モジュレーションは、定常領域の変更されていない形態の活性と比較した、変更された定常領域を含有する対象抗体によって呈されるエフェクター機能活性の増加、減少、または排除を指す。特定の実施形態では、モジュレーションは、活性が消失するかまたは完全に存在しない状況を含む。
【０２８３】
変更されたＦｃＲ結合親和性および／もしくはＡＤＣＣ活性ならびに／または変更されたＣＤＣ活性を有する変更された定常領域は、定常領域の変更されていない形態と比較して増強されたかまたは減少したＦｃＲ結合活性および／もしくはＡＤＣＣ活性ならびに／またはＣＤＣ活性を有するポリペプチドである。ＦｃＲに対して増加した結合を示す変更された定常領域は、変更されていないポリペプチドよりも高い親和性で、少なくとも１つのＦｃＲに結合する。ＦｃＲに対して減少した結合を示す変更された定常領域は、定常領域の変更されていない形態よりも低い親和性で、少なくとも１つのＦｃＲに結合する。ＦｃＲに対して減少した結合を示すこのようなバリアントは、ＦｃＲに対する認識可能な結合をほとんど有さないかまたは全く有さず、例えば、ＦｃＲに対するネイティブ配列の免疫グロブリン定常領域またはＦｃ領域の結合レベルと比較して、ＦｃＲに対する結合の０から５０％（例えば、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％未満）の認識可能な結合しか有さない。同様に、モジュレートされたＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を呈する変更された定常領域は、変更されていない定常領域と比較して、増加したかまたは低下したＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を呈する場合がある。例えば、一部の実施形態では、変更された定常領域を含む抗リガンド抗体は、定常領域の変更されていない形態のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性のおよそ０から５０％（例えば、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％未満）を呈することができる。低下したＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを呈する変更された定常領域を含む本明細書に記載の抗リガンド抗体は、低下したＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を呈するかまたはＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を呈さない場合がある。
【０２８４】
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗リガンド抗体または抗原結合性断片は、低下したエフェクター機能を呈するかまたはエフェクター機能を呈さない。一部の実施形態では、抗リガンド抗体は、ハイブリッド定常領域、またはその一部、例えば、Ｇ２／Ｇ４ハイブリッド定常領域を含む（例えば、Burton  et  al.  (1992)  Adv  Immun  51:1-18；Canfield  et  al.  (1991)  J  Exp  Med  173:1483-1491；およびMueller  et  al.  (1997)  Mol  Immunol  34(6):441-452を参照されたい）。上記を参照されたい。
【０２８５】
一部の実施形態では、抗リガンド抗体または抗原結合性断片は、増強されたかまたは低下した補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を呈する変更された定常領域を含有してもよい。ＣＤＣ活性のモジュレートは、抗体のＦｃ領域において１つまたは複数のアミノ酸置換、挿入、または欠失を導入することによって達成することができる。例えば、米国特許第６，１９４，５５１号を参照されたい。あるいはまたはさらに、システイン残基をＦｃ領域中に導入し、それによって、この領域において鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にすることができる。このようにして生じたホモダイマー抗体は、改善したかもしくは低下した内在化能および／または増加したかもしくは減少した補体に媒介される細胞死滅を有する場合がある。例えば、Caron  et  al.  (1992)  J  Exp  Med  176:1191-1195およびShopes  (1992)  Immunol  148:2918-2922；ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９９／５１６４２号および同第ＷＯ９４／２９３５１号；Duncan  and  Winter  (1988)  Nature  322:738-40；ならびに米国特許第５，６４８，２６０号および同第５，６２４，８２１号を参照されたい。
【０２８６】
本明細書に記載の抗体またはその抗原結合性断片は、分子生物学およびタンパク質化学の技術分野において公知の種々の技法を使用して産生することができる。例えば、抗体の重鎖および軽鎖ポリペプチドの一方または両方をコードする核酸を、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および停止配列、翻訳開始配列および停止配列、転写終結シグナル、ポリアデニル化シグナル、ならびにエンハンサー配列またはアクチベーター配列を含む転写および翻訳調節配列を含有する発現ベクター中に挿入することができる。調節配列としては、プロモーター配列ならびに転写開始配列および停止配列が挙げられる。さらに、発現ベクターは、２つ以上の複製系を含むことができ、その結果、発現ベクターは、２種の異なる生物、例えば、発現に関しては哺乳動物または昆虫細胞ならびにクローニングおよび増幅に関しては原核生物の宿主中に維持され得る。
【０２８７】
いくつかの可能なベクター系は、哺乳動物細胞において核酸からクローニングされた重鎖および軽鎖ポリペプチドの発現に利用することができる。１つの分類のベクターは、宿主細胞のゲノム中への所望の遺伝子配列の組込みに依拠する。安定して組み込まれたＤＮＡを有する細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉのｇｐｔ（Mulligan  and  Berg  (1981)  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  78:2072）またはＴｎ５  ｎｅｏ（Southern  and  Berg  (1982)  Mol  Appl  Genet  1:327）などの薬物耐性遺伝子を同時に導入することによって選択することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ遺伝子配列に連結されるか、または同時トランスフェクションによって同じ細胞中に導入される（Wigler  et  al.  (1979)  Cell  16:77）可能性がある。第２の分類のベクターは、染色体外プラスミドに対して自律複製能を付与するＤＮＡエレメントを利用する。これらのベクターは、動物のウイルス、例えば、ウシパピローマウイルス（Sarver  et  al.  (1982)  Proc  Natl  Acad  Sci  USA,  79:7147）、サイトメガロウイルス、ポリオーマウイルス（Deans  et  al.  (1984)  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  81:1292）、またはＳＶ４０ウイルス（Lusky  and  Botchan  (1981)  Nature  293:79）に由来し得る。
【０２８８】
発現ベクターは、核酸の次の発現に好適な方法で細胞中に導入することができる。導入方法は、以下で議論される標的とされる細胞型によって主として指定される。例示的な方法としては、ＣａＰＯ４沈殿、リポソーム融合、カチオン性リポソーム、電気穿孔、ウイルス感染、デキストランに媒介されるトランスフェクション、ポリブレンに媒介されるトランスフェクション、プロトプラスト融合、および直接マイクロインジェクションが挙げられる。
【０２８９】
抗体またはその抗原結合性断片の発現に対して適切な宿主細胞としては、酵母、細菌、昆虫、植物、および哺乳動物の細胞が挙げられる。特に興味深いのは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどの真菌、ＳＦ９などの昆虫細胞、哺乳動物細胞系（例えば、ヒト細胞系）、ならびに初代細胞系である。
【０２９０】
一部の実施形態では、抗体またはその断片は、トランスジェニック動物（例えば、トランスジェニック哺乳動物）において発現され、かつそれから精製され得る。例えば、抗体は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物（例えば、齧歯類）において産生され得、例えば、Houdebine  (2002)  Curr  Opin  Biotechnol  13(6):625-629；van  Kuik-  Romeijn  et  al.  (2000)  Transgenic  Res  9(2):155-159；およびPollock  et  al.  (1999)  J  Immunol  Methods  231(1-2):147-157に記載されているように、ミルクから単離することができる。
【０２９１】
抗体およびその断片は、タンパク質の発現を可能にするのに十分な条件下で、かつタンパク質の発現を可能にするのに十分な時間量で、抗体または断片をコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによって、細胞から産生され得る。タンパク質発現に関するこのような条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって変わり、日常的な実験によって当業者に容易に確認されるであろう。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現される抗体は、封入体からリフォールディングされ得る（例えば、Hou  et  al.  (1998)  Cytokine  10:319-30を参照されたい）。細菌の発現系およびこれらを使用するための方法は、当技術分野で周知である（Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Wiley  &  Sons,  and  Molecular  Cloning--A  Laboratory  Manual  --3rd  Ed.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  New  York  (2001)を参照されたい）。コドン、好適な発現ベクターおよび好適な宿主細胞の選択は、いくつかの因子に応じて変わり、必要に応じて容易に最適化することができる。本明細書に記載の抗体（またはその断片）は、哺乳動物細胞においてまたは以下に限定されないが、酵母、バキュロウイルス、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系を含む他の発現系において発現され得る（例えば、Kaszubska  et  al.  (2000)  Protein  Expression  and  Purification  18:213-220を参照されたい）。
【０２９２】
発現の後、抗体およびその断片を単離することができる。試料中に存在する他の構成成分に応じて、当業者に公知の種々の方法において、抗体またはその断片を単離または精製することができる。標準的な精製方法としては、電気泳動法、分子技術、免疫学的技法、およびイオン交換、疎水性、アフィニティー、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー技法が挙げられる。例えば、標準的な抗抗体カラム（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧカラム）を使用して、抗体を精製することができる。タンパク質濃度に合わせて、限外濾過および透析濾過技法も有用である。例えば、Scopes  (1994)  "Protein  Purification,  3rd  edition,"  Springer-Verlag,  New  York  City,  New  Yorkを参照されたい。必要な精製の程度は、所望の使用に応じて変わることになる。一部の場合には、発現した抗体またはその断片の精製は必要とされない。
【０２９３】
精製された抗体またはその断片の収率または純度を決定するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、ブラッドフォードアッセイ、ＵＶ分光法、ビウレットタンパク質アッセイ、ローリータンパク質アッセイ、アミドブラックタンパク質アッセイ、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析（ＭＳ）、およびゲル電気泳動法（例えば、クマシーブルー染色またはコロイド銀染色などのタンパク質染色を使用する）を含む。
【０２９４】
抗体またはその抗原結合性断片は、それらの発現および精製後に改変され得る。改変は、共有結合または非共有結合による改変であってもよい。このような改変は、例えば、ポリペプチドの標的化されるアミノ酸残基を選択された側鎖または末端の残基と反応することが可能である有機誘導化剤と反応させることによって、抗体または断片中に導入され得る。改変の好適な部位は、例えば、抗体または断片の構造分析またはアミノ酸配列分析を含む種々の基準のいずれかを使用して選択することができる。
【０２９５】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、異種部分にコンジュゲートされていてもよい。異種部分は、例えば、異種ポリペプチド、治療剤（例えば、薬物）、または以下に限定されないが、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、重金属標識、ルミネセンス標識、またはビオチンもしくはストレプトアビジンなどのアフィニティータグなどの検出可能な標識であってもよい。好適な異種ポリペプチドとしては、例えば、抗体もしくは断片を精製する際に使用するための抗原タグ（例えば、ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１７７））、ポリヒスチジン（６−Ｈｉｓ；ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１７８））、ヘマグルチニン（ＨＡ；ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号１７９））、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が挙げられる。異種ポリペプチドとしてはまた、診断マーカーまたは検出可能なマーカーとして有用であるポリペプチド（例えば、酵素）、例えば、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）も挙げられる。好適な放射性標識としては、例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、および３Ｈが挙げられる。好適な蛍光標識としては、限定されないが、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）４８８、フィコエリトリン（ＰＥ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ＰｅｒＣＰ、ＰＥ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ｃｙ５、アロフィコシアニン、およびＣｙ７が挙げられる。ルミネセンス標識としては、例えば、種々のルミネセンスランタニド（例えば、ユーロピウムまたはテルビウム）キレートのいずれかが挙げられる。例えば、好適なユーロピウムキレートとしては、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはテトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）が挙げられる。酵素標識としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ＣＡＴ、ルシフェラーゼ、およびセイヨウワサビペルオキシダーゼが挙げられる。
【０２９６】
２つのタンパク質（例えば、抗体および異種部位）は、いくつかの公知の化学的架橋リンカーのいずれかを使用して架橋され得る。このような架橋リンカーの例は、「ヒンダード」ジスルフィド結合を含む連結を介して２つのアミノ酸残基を連結するものである。これらの連結では、架橋ユニット内のジスルフィド結合は、例えば、還元されたグルタチオンの作用または酵素ジスルフィドレダクターゼによる還元から（ジスルフィド結合のいずれかの側の障害基によって）保護される。１つの好適な試薬である、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）は、タンパク質の一方の末端のリシンおよび他方の末端のシステインを利用して２つのタンパク質間にこのような連結を形成する。各タンパク質の異なるカップリング部分で架橋するヘテロ二官能試薬も使用することができる。他の有用な架橋剤としては、限定されないが、２つのアミノ基を連結する試薬（例えば、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド）、２つのスルフヒドリル基（例えば、１，４−ビス−マレイミドブタン）、アミノ基とスルフヒドリル基（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、アミノ基とカルボキシル基（例えば、４−［ｐ−アジドサリチルアミド］ブチルアミン）、およびアミノ基とアルギニンの側鎖に存在するグアニジニウム基（例えば、ｐ−アジドフェニルグリオキサール一水和物）が挙げられる。
【０２９７】
一部の実施形態では、放射性標識は、抗体のアミノ酸骨格に直接コンジュゲートされていてもよい。あるいは、放射性標識は、より大きな分子（例えば、遊離アミノ基に結合して関連タンパク質のメタ−ヨードフェニル（ｍＩＰ）誘導体を形成する、メタ−［１２５Ｉ］ヨードフェニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド中の１２５Ｉ（［１２５Ｉ］ｍＩＰＮＨＳ）（例えば、Rogers  et  al.  (1997)  J  Nucl  Med  38:1221-1229を参照されたい）またはタンパク質骨格に順次結合されるキレート（例えば、ＤＯＴＡまたはＤＴＰＡ）の一部として含まれ得る。本明細書に記載の抗体または抗原結合性断片に放射性標識またはそれらを含有するより大きな分子／キレートをコンジュゲートさせる方法は、当技術分野において公知である。このような方法は、タンパク質への放射性標識またはキレートの結合を促進する条件下で（例えば、ｐＨ、塩濃度、および／または温度）、タンパク質を放射性標識と共にインキュベートすることを含む（例えば、米国特許第６，００１，３２９号を参照されたい）。
【０２９８】
タンパク質（例えば、抗体）に蛍光標識（「フルオロフォア」とも称されることがある）をコンジュゲートさせるための方法は、タンパク質化学の技術分野において公知である。例えば、フルオロフォアは、フルオロフォアに結合したスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルまたはテトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル部分を使用して、タンパク質の遊離アミノ基（例えば、リシンの）またはスルフヒドリル基（例えば、システイン）にコンジュゲートされていてもよい。一部の実施形態では、フルオロフォアは、スルホ−ＳＭＣＣなどのヘテロ二官能架橋部分にコンジュゲートされていてもよい。好適なコンジュゲーションの方法は、タンパク質へのフルオロフォアの結合を促進する条件下で、抗体タンパク質、またはその断片をフルオロフォアと共にインキュベートすることを含む。例えば、Welch  and  Redvanly  (2003)  "Handbook  of  Radiopharmaceuticals:  Radiochemistry  and  Applications,"  John  Wiley  and  Sons  (ISBN  0471495603)を参照されたい。
【０２９９】
一部の実施形態では、抗体または断片は、例えば、循環中、例えば、血液、血清、または他の組織中の抗体の安定化および／または保持を改善する部分で改変され得る。例えば、抗体または断片は、例えば、Lee  et  al.  (1999)  Bioconjug  Chem  10(6):  973-8；Kinstler  et  al.  (2002)  Advanced  Drug  Deliveries  Reviews  54:477-485；およびRoberts  et  al.  (2002)  Advanced  Drug  Delivery  Reviews  54:459-476に記載されているようにペグ化されるか、またはヘシル化（ＨＥＳｙｌａｔｅｄ）され得る（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｋａｂｉ、Ｇｅｒｍａｎｙ；例えば、Pavisic  et  al.  (2010)  Int  J  Pharm  387(1-2):110-119を参照されたい）。安定化部分は、少なくとも約１．５（例えば、少なくとも約２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、もしくは５０またはそれより多く）倍、抗体（または断片）の安定性、または保持を改善することができる。
【０３００】
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合性断片は、グリコシル化されてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合性断片を、還元グリコシル化を受けるかまたはグリコシル化を受けないように、酵素もしくは化学的処理に供するか、または細胞から産生させることができる。還元グリコシル化された抗体を産生するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，９３３，３６８号；Wright  et  al.  (1991)  EMBO  J  10(10):2717-2723；およびCo  et  al.  (1993)  Mol  Immunol  30:1361に記載されている。
【０３０１】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている多特異性バインダーのいずれかは、本明細書に開示されているＴβＲＩＩ部分のいずれかおよび本明細書に開示されている抗体または抗原結合性断片部分のいずれかを含む。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、図１４Ｂに例示されているものに類似する構造的レイアウトを有する。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、配列番号１６７〜１７５のいずれか１つまたは組合せのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、配列番号１６７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、配列番号１７０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、配列番号１７４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、多特異性バインダーは、配列番号１６７、１７０および１７４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、多特異性バインダーは、配列番号１７２および１８２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、多特異性バインダー中のポリペプチドは、リーダー／シグナル配列（例えば、配列番号１７６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を有するシグナル配列）を含む。
配列番号１６７−（可変重鎖）
【化６６】
2021522793.tif 000068
配列番号１６８−（定常領域デルタＫ）
【化６７】
2021522793.tif 000069
配列番号１６９−（リンカー）
【化６８】
2021522793.tif 000070
配列番号１７０−（ＴβＲＩＩ）
【化６９】
2021522793.tif 000071
配列番号１７１−（重鎖の定常領域＋ＴβＲＩＩ）
【化７０】
2021522793.tif 000072
配列番号１７２−（重鎖＋ＴβＲＩＩ）
【化７１】
2021522793.tif 000073
配列番号１７３−（重鎖＋ＴβＲＩＩ＋リーダー）
【化７２】
2021522793.tif 000074
配列番号１７４−（可変軽鎖）
【化７３】
2021522793.tif 000075
配列番号１７５−（定常カッパＬＣ）
【化７４】
2021522793.tif 000076
配列番号１８２：（軽鎖）
【化７５】
2021522793.tif 000077
配列番号１７６−（リーダー配列）
【化７６】
2021522793.tif 000078
３．核酸および製造方法
【０３０２】
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびこれらを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）のポリペプチド（他のタンパク質および／または他のポリペプチド種から単離されたか、またはそうでなければこれらを実質的に含まない（例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％含まない））の利用可能な単離されたおよび／または精製された形態を作製する。ポリペプチドは、一般的に、組換え核酸からの発現によって産生されることになる。
【０３０３】
ある特定の実施形態では、本開示は、タンパク質（例えば、ＴβＲＩＩおよび／またはＡｃｔＲＩＩＡタンパク質）の細胞外部分に関するコード配列を含む、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびこれらを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）の可溶性ポリペプチドをコードする核酸を含む。さらなる実施形態では、この開示は、このような核酸を含む宿主細胞にも関する。宿主細胞は、任意の原核生物の細胞または真核生物の細胞であってもよい。例えば、本開示のポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用する）、酵母、または哺乳動物細胞において発現され得る。他の好適な宿主細胞は、当業者に公知である。したがって、本開示の一部の実施形態は、ポリペプチドを産生する方法にさらに関する。
【０３０４】
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に開示されている断片、機能的バリアントおよび融合タンパク質を含む、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびこれらを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）のポリペプチドのいずれかをコードする単離されたおよび／または組換え核酸を提供する。配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６、４７、５６、５７、８３、８６、８９、および９２は、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＩｇＧ  Ｆｃドメインに融合した細胞外ドメインを含むそのバリアントをコードする。本開示の他のヌクレオチド配列は、配列番号１３６、１４０、および１６６を含む。対象の核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。このような核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であってもよい。これらの核酸は、例えば、ポリペプチドを作製するための方法において使用されるかまたは直接的な治療剤（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉまたは遺伝子治療のアプローチにおいて）として使用されてもよい。
【０３０５】
ある特定の態様では、ポリペプチドをコードする対象の核酸は、配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６、４７、５６、５７、８３、８６、８９、９２、１３６、１４０、および１６６のバリアントである核酸を含むことがさらに理解される。バリアントのヌクレオチド配列は、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加または欠失によって異なる配列、例えば、対立遺伝子変異型を含む。
【０３０６】
ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６、４７、５６、５７、８３、８６、８９、９２、１３６、１４０、および１６６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な単離されたまたは組換え核酸配列を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号８３、８６、８９、９２、１３６、１４０、および１６６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な単離されたまたは組換え核酸配列またはその断片を提供する。当業者であれば、配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６、４７、５６、５７、８３、８６、８９、９２、１３６、１４０、および１６６に対して相補的な核酸配列および配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６、４７、５６、５７、８３、８６、８９、９２、１３６、１４０、および１６６のバリアントが、この開示の範囲内にもあることを認識するであろう。さらなる実施形態では、本開示の核酸配列は、単離され、組換え体であり、および／もしくは異種ヌクレオチド配列と融合され、またはＤＮＡライブラリー内にあってもよい。
【０３０７】
他の実施形態では、本開示の核酸は、非常にストリンジェントな条件下で、配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６、４７、５６、５７、８３、８６、８９、９２、１３６、１４０、および１６６において示されたヌクレオチド配列に対して、配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６、４７、５６、５７、８３、８６、８９、９２、１３６、１４０、および１６６の相補的配列またはその断片をハイブリダイズさせるヌクレオチド配列も含む。上記で議論したように、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェントな条件が変更され得ることを当業者は容易に理解するであろう。例えば、約４５℃における６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーションと、その後の５０℃における２．０×ＳＳＣの洗浄を実施することができる。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、５０℃で約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃で約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまでから選択され得る。さらに、洗浄ステップにおける温度は、室温（約２２℃）における低ストリンジェンシー条件から、約６５℃における高ストリンジェンシー条件まで上昇され得る。温度と塩の両方は変更されてもよく、または他の変数が変更される一方で温度または塩濃度は一定を保持してもよい。一部の実施形態では、本開示は、室温で６×ＳＳＣの低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、その後、室温において２×ＳＳＣで洗浄される核酸を提供する。
【０３０８】
遺伝子コードにおける縮重により、配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６、４７、５６、５７、８３、８６、８９、９２、１３６、１４０、および１６６において示されている核酸とは異なる単離された核酸も本開示の範囲内にある。例えば、いくつかのアミノ酸は、２つ以上のトリプレットで示される。同じアミノ酸を特定するコドン、またはシノニム（例えば、ＣＡＵとＣＡＣはヒスチジンに関するシノニムである）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」変異を生じ得る。しかし、対象のタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列の多型が哺乳動物の細胞中に存在することが期待される。当業者であれば、特定のタンパク質をコードする核酸の１つまたは複数のヌクレオチドのこれらの変異（ヌクレオチドのうちの最大約３〜５％）が、天然の対立遺伝子変異により、所与の種の個体間に存在する場合があることを認識するであろう。任意のおよび全てのこのようなヌクレオチド変異および得られるアミノ酸多型は、この開示の範囲内にある。
【０３０９】
ＴβＲＩＩの長いアイソフォームを基にした対応するバリアントは、２５アミノ酸の挿入をコードするヌクレオチド配列を、その挿入のＣ末端に隣接する位置における保存的Ｖａｌ−Ｉｌｅ置換と一緒に含むことが当業者によって認識されるであろう。ＴβＲＩＩの長いアイソフォーム（Ａ）または短いアイソフォーム（Ｂ）のいずれかを基にした対応するバリアントは、天然に存在するＴβＲＩＩアイソフォームＣについて記載されたのと同じ位置に、３６アミノ酸の挿入（配列番号４１）をコードする１０８ヌクレオチドの挿入を含むバリアントヌクレオチド配列を含むことも認識されるであろう。
【０３１０】
ある特定の実施形態では、本開示の組換え核酸は、発現構築物において１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結されてもよい。調節ヌクレオチド配列は、一般的に、発現のために使用される宿主細胞にとって適したものであろう。多数の種類の適切な発現ベクターおよび好適な調節配列が、種々の宿主細胞について当技術分野で公知である。典型的には、前記１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列としては、以下に限定されないが、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列が挙げられ得る。当技術分野で公知の構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが、本開示で企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または２つ以上のプロモーターの要素を組み合わせるハイブリッドプロモーターのいずれかであってもよい。発現構築物は、細胞内で、プラスミドなどのエピソーム上に存在してもよく、または発現構築物は染色体中に挿入されてもよい。好ましい実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含有する。選択可能なマーカー遺伝子は当技術分野で周知であり、使用される宿主細胞に関して変わることになる。
【０３１１】
本明細書に開示されているある特定の態様では、対象の核酸は、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびこれらを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター中に与えられ、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されている。調節配列は、当技術分野で認識され、Ｔポリペプチドの発現を指示するために選択される。したがって、調節配列という用語は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメントを含む。例示的な調節配列は、Goeddel;  Gene  Expression  Technology:    Methods  in  Enzymology,  Academic  Press,  San  Diego,  CA  (1990)に記載されている。例えば、ＤＮＡ配列の発現を制御する多種多様な発現制御配列のいずれかを、ＤＮＡ配列に作動可能に連結させて、これらのベクターにおいて使用して、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびこれらを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させることができる。このように有用な発現制御配列として、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルスの最初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって発現が指示されるＴ７プロモーター、ファージラムダの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄ被覆タンパク質に対する制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の解糖酵素のプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター、例えば、Ｐｈｏ５、酵母α接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多面体プロモーター、原核生物細胞もしくは真核生物細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列、ならびにこれらの種々の組合せが挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現されるのが望ましいタンパク質の種類などの因子に依存し得ることが理解されるべきである。さらに、ベクターの複製数、その複製数を制御する能力およびベクターによってコードされる任意の他のタンパク質、例えば、抗生物質マーカーの発現も考慮されるべきである。
【０３１２】
本開示に含まれる組換え核酸は、クローニングされた遺伝子、またはその一部を、原核細胞、真核細胞（酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物）のいずれか、またはその両方における発現に好適なベクター中にライゲーションすることによって生成され得る。本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびこれらを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）の組換えポリペプチドを産生するための発現ビヒクルは、プラスミドおよび他のベクターを含む。例えば、好適なベクターは、以下の種類のプラスミドを含む：Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞の発現に関するｐＢＲ３２２由来のプラスミド、ｐＥＭＢＬ由来のプラスミド、ｐＥＸ由来のプラスミド、ｐＢＴａｃ由来のプラスミドおよびｐＵＣ由来のプラスミド。
【０３１３】
いくつかの哺乳動物の発現ベクターは、細菌においてベクターの伝播を容易にする原核配列と、真核細胞において発現される１つまたは複数の真核転写ユニットとの両方を含有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来のベクターは、真核細胞のトランスフェクションに好適な哺乳動物の発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかを細菌のプラスミド由来の配列、例えば、ｐＢＲ３２２で改変させて、原核細胞と真核細胞の両方における複製と薬物耐性の選択を容易にする。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）、またはエプスタインバーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）などのウイルスの誘導体を真核細胞におけるタンパク質の一過的発現のために使用することができる。他のウイルス（レトロウイルスを含む）の発現系の例は、遺伝子療法の送達系についての記載において以下に見出すことができる。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において用いられる様々な方法は、当技術分野で周知である。原核細胞と真核細胞の両方に対して好適な他の発現系、および一般的な組換えの手順については、Molecular  Cloning  A  Laboratory  Manual,  3rd  Ed.,  ed.  by  Sambrook,  Fritsch  and  Maniatis  (Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  2001)を参照されたい。一部の場合には、バキュロウイルスの発現系の使用によって、組換えポリペプチドを発現させることが望ましい場合がある。このようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来のベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来のベクター（例えば、ｐＡｃＵＷ１）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター（例えば、ｐＢｌｕｅＢａｃ  ＩＩＩを含有するβ−ｇａｌ）が挙げられる。
【０３１４】
ある特定の実施形態では、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃ．）などは、ＣＨＯ細胞において、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびこれらを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）の当該ポリペプチドを産生するために設計されることになる。好ましい実施形態では、ベクターは、ＨＥＫ−２９３細胞において当該ポリペプチドを産生するために設計されることになる。明らかであるように、対象の遺伝子構築物を使用して、培養中に増殖した細胞において当該ポリペプチドを発現させる、例えば、精製するために、融合タンパク質またはバリアントタンパク質を含むタンパク質を産生することができる。
【０３１５】
本開示はまた、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびこれらを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）の当該ポリペプチドのうちの１つまたは複数に関するコード配列（例えば、配列番号８、１０、１２、１４、１６、４６、４７、５６、５７、８３、８６、８９、９２、１３６、１４０、および１６６）を含む組換え遺伝子をトランスフェクトした宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の原核生物の細胞または真核生物の細胞であってもよい。例えば、本明細書に開示されているＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用する）、酵母、または哺乳動物細胞において発現され得る。他の好適な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０３１６】
したがって、本開示は、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびこれらを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）の当該ポリペプチドを産生する方法にさらに関する。例えば、ポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞を適切な条件下で培養して、ポリペプチドの発現を起こさせることができる。ポリペプチドは、そのポリペプチドを含有する細胞と培地との混合物から分泌および単離され得る。あるいは、ポリペプチドを細胞質によってまたは膜画分中に保持し、細胞を回収し、溶解して、タンパク質を単離することができる。細胞培養物は、宿主細胞、および培地を含む。細胞培養に好適な培地は、当技術分野で周知である。イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ポリペプチドの特定のエピトープに対して特異的な抗体との免疫アフィニティー精製およびポリペプチドに融合したドメインに結合する薬剤とのアフィニティー精製（例えば、プロテインＡカラムは、Ｆｃ融合物を精製するために使用することができる）を含む、タンパク質を精製するための、当技術分野で公知の技法を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、またはこの両方から、当該ポリペプチドを単離することができる。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、その精製を容易にするドメインを含有する融合タンパク質である。例として、例えば、いずれかの順序で、プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれより多くを含む一連のカラムクロマトグラフィーステップによって精製を達成することができる：。精製は、ウイルス濾過と緩衝液交換により完了され得る。
【０３１７】
別の実施形態では、精製リーダー配列、例えば、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびこれらを含むＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）の組換えポリペプチドの所望の部分のＮ末端におけるポリ（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位の配列をコードする融合遺伝子によって、Ｎｉ２＋金属樹脂を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって発現された融合タンパク質の精製が可能となる。次いで、精製リーダー配列を、エンテロキナーゼで処理することによって、次に除去し、精製したポリペプチドを得ることができる（例えば、Hochuli  et  al.,  (1987)  J.  Chromatography  411:177；およびJanknecht  et  al.,  PNAS  USA  88:8972を参照されたい）。
【０３１８】
融合遺伝子を作製する技法は周知である。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡ断片の接合は、ライゲーションのための平滑末端または突出末端、適切な末端をもたらすための制限酵素消化、必要に応じた粘着末端の平滑化、望ましくない接合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素によるライゲーションを用いる従来の技法に従って実施される。別の実施形態では、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技法によって、融合遺伝子を合成することができる。あるいは、２つの連続した遺伝子断片の間に相補的な突出部を生じるアンカープライマーを使用して、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行うことができ、次に、これをアニーリングさせて、キメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  eds.  Ausubel  et  al.,  John  Wiley  &  Sons:  1992を参照されたい）。
４．スクリーニングアッセイ
【０３１９】
ある特定の態様では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＴβＲＩＩシグナル伝達経路のアゴニストまたはアンタゴニストである化合物（薬剤）を特定するために、ＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダー、例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー（例えば、可溶性のＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロダイマー）の使用に関する。このスクリーニングによって特定された化合物を試験して、例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、アクチビン、ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ１１のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのシグナル伝達活性をモジュレートするそれらの能力を評価することができる。必要に応じて、動物モデルにおいて、これらの化合物をさらに試験して、ｉｎ  ｖｉｖｏで組織の成長をモジュレートするそれらの能力を評価することができる。
【０３２０】
ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、アクチビン、ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ１１ポリペプチドを標的とすることによって、組織の成長をモジュレートするための治療剤に関するスクリーニングに対して、多数のアプローチが存在する。ある特定の実施形態では、化合物のハイスループットスクリーニングを行って、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＴβＲＩＩに媒介される細胞のシグナル伝達を混乱させる薬剤を特定することができる。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、アクチビン、ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ１１に対するＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの結合を特異的に阻害するかまたは低減する化合物をスクリーニングおよび特定するために、アッセイが行われる。あるいは、このアッセイを使用して、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、アクチビン、および／またはＧＤＦ１１に対するＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの結合を増強する化合物を特定することができる。さらなる実施形態では、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＡｃｔＲＩＩＡ、またはＴβＲＩＩポリペプチドと相互作用するそれらの能力によって、化合物を特定することができる。
【０３２１】
種々のアッセイ形式で十分であろうが、それにもかかわらず、本開示に鑑みて、本明細書に明示的に記載されていないアッセイ形式も当業者によって理解されるであろう。本明細書に記載されているように、本発明の試験化合物（薬剤）は、任意のコンビナトリアル化学方法によっても作成することができる。あるいは、対象の化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成された天然に存在する生体分子であってもよい。組織成長のモジュレーターとして働く能力について試験される化合物（薬剤）、例えば、細菌、酵母、植物または他の生物（例えば、天然産物）によって生成されてもよく、化学的に（例えば、ペプチド模倣体を含む小分子）生成されてもよく、または組換えによって生成されてもよい。本発明によって企図される試験化合物としては、非ペプチジル有機分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、糖類、ホルモン、および核酸分子が挙げられる。具体的な実施形態では、試験薬剤は、約２，０００ダルトン未満の分子量を有する有機小分子である。
【０３２２】
本発明の試験化合物は、単一の別個の実体として提供することができ、またはより複雑な、例えば、コンビナトリアル化学によって作製されたライブラリーにおいて提供されてもよい。これらのライブラリーは、例えば、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテルおよび他の分類の有機化合物を含むことができる。この試験系に対する試験化合物の提示は、単離された形態であっても、特に初期のスクリーニングステップにおける化合物の混合物としてであってもよい。必要に応じて、化合物は、他の化合物を用いて誘導化されてもよく、化合物の単離を容易にする誘導体化基を有する。誘導体化基の非限定的な例として、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、緑色蛍光タンパク質、同位体、ポリヒスチジン、磁気ビーズ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光活性化可能な架橋剤（ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔｉｂｌｅ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）またはこれらの任意の組合せが挙げられる。
【０３２３】
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムでは、所与の期間に調査される化合物の数を最大化するために、ハイスループットアッセイが望ましい。精製または半精製タンパク質により得ることができるような無細胞系において実施されるアッセイは、それらが、試験化合物によって媒介される分子標的の変更の急速な発生と比較的容易な検出を可能にするために作成され得るという点で、「一次」スクリーニングとして好ましいことが多い。さらに、試験化合物の細胞毒性またはバイオアベイラビリティの効果は、全体的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系では無視することができ、代わりに、このアッセイは、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドとＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、アクチビン、ＧＤＦ８、および／またはＧＤＦ１１ポリペプチドとの間の結合親和性の変化が明らかであり得るように、分子標的に対する薬物の効果に主に焦点を当てている。
【０３２４】
本発明の例示的なスクリーニングアッセイにおいて、例示するに過ぎないが、目的の化合物を、通常、ＴＧＦβ１およびアクチビンＡに結合することが可能である、単離および精製されたＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーと接触させる。次いで、化合物とＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーの混合物に、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩ結合リガンド（例えば、ＴＧＦβ１またはアクチビンＡ）を含有する組成物を添加する。ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩ／ＴＧＦβ１またはＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩ／アクチビンＡ複合体の検出および定量によって、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩタンパク質とＴＧＦβ１またはアクチビンＡの間の複合体形成を阻害する（または増強する）化合物の有効性を決定する手段が提供される。化合物の有効性は、試験化合物の様々な濃度を使用して得たデータから用量応答曲線を作成することによって評価することができる。さらに、対照アッセイも、比較のためのベースラインを提供するために実施することができる。例えば、対照アッセイでは、単離および精製したＴＧＦβ１またはアクチビンＡをＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーを含有する組成物に添加し、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩ／ＴＧＦβ１またはＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩ／アクチビンＡ複合体の形成を、試験化合物の非存在下で定量する。一般的に、反応物を混合する順序は変更されてもよく、同時に混合されてもよいことが理解されるであろう。さらに、精製したタンパク質の代わりに、細胞抽出物および溶解液を使用して、好適な無細胞アッセイ系としてもよい。
【０３２５】
本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）とＴＧＦβ１、ＧＤＦ８および／またはアクチビンＡとの間の複合体形成は、種々の技法によって検出され得る。例えば、複合体形成のモジュレーションは、例えば、検出可能に標識されたタンパク質、例えば、放射標識（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ）、または酵素標識されたＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーまたはＴＧＦβ１もしくはアクチビンＡをイムノアッセイ、またはクロマトグラフィーによる検出によって定量することができる。
【０３２６】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーとその結合タンパク質との間の相互作用の度合いを直接または間接的に測定する際の、蛍光偏光アッセイおよび蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイの使用を企図する。さらに、他の検出方式、例えば、光導波路（ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／２６４３２号および米国特許第５，６７７，１９６号）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、表面荷電センサー、および表面力センサーに基づくものなどが、本発明の多くの実施形態と適合可能である。
【０３２７】
さらに、本発明は、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）とその結合タンパク質の間の相互作用を破壊するかまたは増強させる薬剤を特定するための、「ツーハイブリッドアッセイ」としても公知の、相互作用トラップアッセイの使用を企図する。例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Zervos  et  al.  (1993)  Cell  72:223-232；Madura  et  al.  (1993)  J  Biol  Chem  268:12046-12054；Bartel  et  al.  (1993)  Biotechniques  14:920-924；およびIwabuchi  et  al.  (1993)  Oncogene  8:1693-1696）を参照されたい。具体的な実施形態では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーとその結合タンパク質の間の相互作用を解離される化合物（例えば、小分子またはペプチド）を特定するためのリバースツーハイブリッド系の使用を企図する。例えば、Vidal  and  Legrain,  (1999)  Nucleic  Acids  Res  27:919-29；Vidal  and  Legrain,  (1999)  Trends  Biotechnol  17:374-81；および米国特許第５，５２５，４９０号；同第５，９５５，２８０号、および同第５，９６５，３６８号を参照されたい。
【０３２８】
ある特定の実施形態では、対象の化合物を本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）とＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、アクチビン、ＧＤＦ８、および／またはＧＤＦ１１ポリペプチドとを相互作用させるそれらの能力によって特定する。この化合物と多特異性バインダーまたはＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、アクチビン、および／もしくはＧＤＦ１１ポリペプチドとの間の相互作用は、共有結合であっても、または非共有結合であってもよい。例えば、このような相互作用は、光架橋、放射標識リガンド結合、およびアフィニティークロマトグラフィー（Jakoby  WB  et  al.,  1974,  Methods  in  Enzymology  46:  1）を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生化学的方法を使用して、タンパク質レベルで特定することができる。ある特定の場合には、機序に基づくアッセイ、例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、アクチビン、および／もしくはＧＤＦ１１ポリペプチドまたは多特異性バインダー（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）に結合する化合物を検出するためのアッセイにおいて、この化合物をスクリーニングしてもよい。これらには、固相または流体相結合事象が含まれてもよい。あるいは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、アクチビン、および／もしくはＧＤＦ１１ポリペプチドまたは多特異性バインダー（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）をコードする遺伝子をレポーター系（例えば、βーガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質）を用いて細胞中にトランスフェクトし、好ましくはハイスループットスクリーニングによってライブラリーに対して、またはライブラリーの個々のメンバーに関してスクリーニングすることができる。他の機序に基づく結合アッセイ、例えば、自由エネルギーの変化を検出する結合アッセイを使用してもよい。ウェル、ビーズまたはチップに固定されたか、または固定化抗体によって捕捉されたか、またはキャピラリー電気泳動によって分解された標的に関して結合アッセイを実施することができる。結合した化合物は、通常、比色または蛍光または表面プラズモン共鳴を使用して検出することができる。
【０３２９】
ある特定の態様では、本発明は、ＴＧＦβ１−、ＴＧＦβ３−、アクチビン−、ＧＤＦ８−、ＧＤＦ１１−媒介性細胞シグナル伝達をモジュレートする（刺激するまたは阻害する）ための方法および薬剤を提供する。したがって、特定された任意の化合物は、全細胞または組織において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで試験し、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、アクチビン、ＧＤＦ８、および／またはＧＤＦ１１のシグナル伝達をモジュレートするそれらの能力を確認することができる。当技術分野で公知の様々な方法をこの目的のために利用することができる。
５．例示的な治療用途
【０３３０】
本明細書で使用される場合、障害または状態を「防止する」治療薬は、統計的試料において、処置された試料における障害もしくは状態の発症率が未処置の対照試料に対して低下するか、または障害もしくは状態のうちの１つもしくは複数の症状の発症が未処置の対照試料に対して遅延されるかもしくはその重症度が未処置の対照試料に対して低下する化合物を指す。
【０３３１】
「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「軽減（ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ）」などの用語は、全体的に、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するために本明細書において使用され、処置される状態のうちの１つまたは複数の症状の重症度を改善、軽減、および／または低下させることを指すためにも使用することができる。効果は、疾患、状態、もしくはその症状の発症または再発を完全にまたは部分的に遅延させるという点で予防的であってもよく、ならびに／または疾患もしくは状態および／または疾患もしくは状態に起因する有害事象の部分的または完全な治癒という点で治療的であってもよい。「処置」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物、特にヒトにおける疾患（障害）または状態の任意の処置を包含し、（ａ）疾患もしくは状態の素因をもち得るが、それを有すると未だ診断されていない対象において、疾患もしくは状態の発症の防止；（ｂ）疾患もしくは状態の阻害（例えば、その発症の阻止）こ；または（ｃ）疾患もしくは状態の緩和（例えば、疾患または状態を後退させる、１つまたは複数の症状の改善をもたらす）を含む。
【０３３２】
「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」、「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」、または「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかを指す。これらの用語には、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、実験動物、家畜動物（ウシ、ブタ、ラクダなどを含む）、伴侶動物（例えば、イヌ、ネコ、他の飼い慣らされた動物など）および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれる。特定の実施形態では、患者、対象または個体は、ヒトである。
【０３３３】
本明細書で使用される場合、「組合せ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」、「組み合わせて（ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ）」、「共同投与（ｃｏｎｊｏｉｎｔ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」などは、第２の治療が体内で依然として有効であるような任意の形態の投与を指す（例えば、２つの化合物は患者において同時に有効であり、これは、２つの化合物の相乗効果を含む場合もある）。有効性は、血液、血清、または血漿中の薬剤の測定可能な濃度に相関しない場合もある。例えば、異なる治療化合物を同じ製剤中でまたは別々の製剤中で、同時にまたは連続して、かつ異なるスケジュールで投与することもできる。よって、このような処置を受ける個体は、異なる治療の組み合わされた作用から利益を受けることができる。本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）のうちの１つまたは複数を、１つまたは複数の他の追加の薬剤または支持療法と同時に、その前に、またはその後に投与することもできる。一般的に、各治療剤は、その特定の薬剤に関して決定された用量および／またはタイムスケジュールで投与されることになる。レジメンにおいて用いるための特定の組合せは、治療および／または達成される所望の治療効果と本開示のアンタゴニストの適合性を考慮することになる。
【０３３４】
天然に存在するＡｃｔＲＩＩＡおよびＴβＲＩＩ受容体−リガンド複合体は、組織成長および様々な構造の正確な形成などの初期発生プロセスにおいて、または１つもしくは複数の発生後の能力において必須の役割を果たす。よって、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩに関連する状態または障害としては、以下に限定されないが、異常な組織成長および発生異常が挙げられる。さらに、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩに関連する状態または障害としては、以下に限定されないが、赤血球形成の状態または障害（例えば、貧血）、肺の状態または疾患、腎臓の状態または疾患、および腫瘍またはがんが挙げられる。
【０３３５】
部分的に、本開示は、それを必要とする患者に、有効量のＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーを投与することによって、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩに関連する状態または疾患を処置する方法を提供する。例えば、一部の実施形態では、この方法は、有効量の本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を投与することによって、それを必要とする患者におけるＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩに関連する状態または疾患の重症度および／または持続期間を防止または低減することに関する。必要に応じて、このような方法は、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）をＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩに関連する状態または疾患を処置するための１つまたは複数の追加の活性剤または支持療法と組み合わせて投与するステップをさらに含む。
【０３３６】
一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を投与するステップを含む、肺高血圧症（例えば、肺動脈性肺高血圧症）を処置する方法に関する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を投与するステップを含む、肺高血圧症（例えば、肺動脈における平滑筋および／または内皮細胞の増殖、肺動脈における血管新生、呼吸困難、胸部痛、肺血管リモデリング、右心肥大、および肺線維症）のうちの１つまたは複数の合併症の重症度または進行速度を防止または低減する方法に関する。必要に応じて、肺高血圧症を処置するための本明細書に開示されている方法は、患者に、肺高血圧症を処置するための１つまたは複数の支持療法または追加の活性剤を投与するステップをさらに含む場合がある。例えば、患者にはまた、プロスタサイクリンおよびその誘導体（例えば、エポプロステノール、トレプロスチニル、およびイロプロスト）；プロスタサイクリン受容体アゴニスト（例えば、セレキシパグ）；エンドセリン受容体アンタゴニスト（例えば、テリン、アンブリセンタン、マシテンタン、およびボセンタン）；カルシウムチャネル遮断薬（例えば、アムロジピン、ジルチアゼム、およびニフェジピン）；抗凝固薬（例、ワルファリン）；利尿剤；酸素療法；心房中隔切開術；肺血栓内膜摘除術；ホスホジエステラーゼ５型阻害剤（例えば、シルデナフィルおよびタダラフィル）；可溶性グアニル酸シクラーゼの活性化剤（例えば、シナシグアットおよびリオシグアット）；ＡＳＫ−１阻害剤（例えば、ＣＩＩＡ；ＳＣＨ７９７９７；ＧＳ−４９９７；ＭＳＣ２０３２９６４Ａ；３Ｈ−ナフト［１，２，３−デ］キニリン（ｑｕｉｎｉｌｉｎｅ）−２，７−ジオン、ＮＱＤＩ−１；２−チオキソ−チアゾリジン、５−ブロモ−３−（４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデン）−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オン）；ＮＦ−κＢアンタゴニスト（例えば、ｄｈ４０４、ＣＤＤＯ−エポキシド；２，２−ジフルオロプロピオンアミド；Ｃ２８イミダゾール（ＣＤＤＯ−Ｉｍ）；２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアン−１，９−ジエン−２８−オイック酸（ＣＤＤＯ）；３−アセチルオレアノール酸；３−トリフルオロアセチルオレアノール酸；２８−メチル−３−アセチルオレアナン；２８−メチル−３−トリフルオロアセチルオレアナン；２８−メチルオキシオレアノール酸；ＳＺＣ０１４；ＳＣＺ０１５；ＳＺＣ０１７；オレアノール酸のＰＥＧ化誘導体；３−Ｏ−（ベータ−Ｄ−グルコピラノシル）オレアノール酸；３−Ｏ−［ベータ−Ｄ−グルコピラノシル−（１−−＞３）−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル］オレアノール酸；３−Ｏ−［ベータ−Ｄ−グルコピラノシル−（１−−＞２）−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル］オレアノール酸；３−Ｏ−［ベータ−Ｄ−グルコピラノシル−（１−−＞３）−ベータ��Ｄ−グルコピラノシル］オレアノール酸２８−Ｏ−ベータ−Ｄ−グルコピラノシルエステル；３−Ｏ−［ベータ−Ｄ−グルコピラノシル−（１−−＞２）−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル］オレアノール酸２８−Ｏ−ベータ−Ｄ−グルコピラノシルエステル；３−Ｏ−［ａ−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−−＞３）−ベータ−Ｄ−グルクロノピラノシル］オレアノール酸；３−Ｏ−［アルファ−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−−＞３）−ベータ−Ｄ−グルクロノピラノシル］オレアノール酸２８−Ｏ−ベータ−Ｄ−グルコピラノシルエステル；２８−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルオレアノール酸；３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１−＞３）−β−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（ＣＳ１）；オレアノール酸３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１−＞３）−β−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（ＣＳ２）；メチル３，１１−ジオキソオレアン−１２−エン−２８−オレート（ＤＩＯＸＯＬ）；ＺＣＶＩ４−２；ベンジル３−デヒドロ−オキシ−１，２，５−オキサジアゾロ［３’，４’：２，３］オレアノレート）、肺および／または心臓移植からなる群から選択される１つもしくは複数の支持療法または活性剤が投与されてもよい。
【０３３７】
肺高血圧症（ＰＨ）は、以前、原発性（特発性）または二次性として分類されてきた。近年、世界保健機関（ＷＨＯ）は、肺高血圧症を５つの群に分類した：群１：肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）；群２：左心疾患を伴う肺高血圧症；群３：肺疾患および／または低酸素血症を伴う肺高血圧症；群４：慢性血栓性疾患および／または塞栓性疾患に起因する肺高血圧症；ならびに群５：種々の状態（例えば、サルコイドーシス、ヒスチオサイトーシスＸ、リンパ管腫症および肺血管の圧迫）。例えば、Rubin  (2004)  Chest  126:7-10を参照されたい。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、ＷＨＯによる群１〜５のいずれか１つとして示されたＰＨを処置することに関する。一部の実施形態では、方法は、ＰＡＨを処置することに関する。
【０３３８】
肺動脈性肺高血圧症は、根深い血管収縮および肺動脈壁における平滑筋細胞の異常な増殖によって特徴付けられる、肺血管系の重篤な、進行性かつ生命を脅かす疾患である。肺の血管の重篤な収縮は、非常に高い肺動脈圧をもたらす。これらの高い圧力は、心臓が、酸素化されるべき肺のいたるところに血液を送り出すことを困難にする。ＰＡＨを有する患者は、心臓はどうにかして、これらの高い圧力に抗って血液を送り出すので、極度の息切れに苦しんでいる。ＰＡＨを有する患者は、典型的には、肺血管抵抗（ＰＶＲ）の顕著な増大および肺動脈圧（ＰＡＰ）の持続した上昇を生じ、これらは、最終的には、右室不全および死亡をもたらす。ＰＡＨを有すると診断された患者は、予後不良を有し、等しく生活の質を損ない、処置されなければ、平均余命は、診断時から２から５年である。
【０３３９】
種々の因子が、血管リモデリング（すなわち、過形成）に寄与し得る肺細胞の増殖を含む肺高血圧症の病因に寄与する。例えば、肺血管リモデリングは、肺高血圧症を有する患者の動脈内皮細胞および平滑筋細胞の増殖によって主として起こる。様々なサイトカインの過剰発現が肺高血圧症を促進すると考えられる。さらに、肺高血圧症は、肺動脈平滑筋細胞および肺内皮細胞の過剰増殖から生じ得ることが判明した。なおさらに、進行ＰＡＨは、遠位肺細動脈の筋性化、求心性内膜肥厚、および増殖性内皮細胞による血管腔の閉塞を特徴とし得る。Pietra  et  al.,  J.  Am.  Coll.  Cardiol.,  43:255-325  (2004)。
【０３４０】
一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を投与するステップを含む、間質性肺疾患（例えば、特発性肺線維症）を処置する方法に関する。一部の実施形態では、間質性肺疾患は、肺線維症である。一部の実施形態では、間質性肺疾患は、以下のうちのいずれか１つを原因とする：ケイ肺症、石綿肺症、ベリリウム症、過敏性肺炎、薬物使用（例えば、抗生物質、化学療法薬、抗不整脈剤、スタチン）、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、感染症（例えば、非定型肺炎、ニューモシスチス肺炎、肺結核、トラコーマクラミジア、および／または呼吸器多核体ウイルス）、リンパ管性管腫症、喫煙、または発達障害。一部の実施形態では、間質性肺疾患は、特発性（例えば、サルコイドーシス、特発性肺線維症、ハンマンリッチ症候群、および／または抗シンテターゼ症候群）。特定の実施形態では、間質性肺疾患は、特発性肺線維症である。一部の実施形態では、特発性肺線維症に対する処置は、追加の治療剤と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、追加の治療剤は、ピルフェニドン、Ｎ−アセチルシステイン、プレドニゾン、アザチオプリン、ニンテダニブ、これらの誘導体およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【０３４１】
一部の実施形態では、本開示は、線維性または硬化性疾患、障害または状態を処置する方法に関する。本明細書で使用される場合、「線維性障害」、「線維性状態」、および「線維性疾患」という用語は、線維症によって特徴付けられる障害、状態または疾患を指すために交換可能に使用される。線維性障害の例としては、以下に限定されないが、狼瘡、硬化性障害（例えば、強皮症、アテローム性動脈硬化症、ならびに例えば、びまん性全身性硬化症および進行性全身硬化症を含む全身性硬化症）、血管性線維症、膵臓線維症、肝臓線維症（例えば、肝硬変）、腎線維症、筋骨格線維症、心線維症（例えば、心内膜心筋線維症、特発性心筋症）、皮膚線維症（例えば、強皮症、外傷後、手術皮膚瘢痕、ケロイドおよび皮膚ケロイド形成）、眼線維症（例えば、緑内障、眼の硬化症、結膜および角膜瘢痕、ならびに翼状片）、骨髄線維症、慢性移植片対宿主病、ペロニー病、膀胱鏡検査後尿道狭窄症、特発性および薬理学的に誘導された後腹膜線維症、縦隔線維症、増殖性線維症、新生物性線維症、デュピュイトラン病、狭窄、神経瘢痕、皮膚瘢痕、特発性肺線維症ならびに放射線誘発線維症が挙げられる。
【０３４２】
一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を投与するステップを含む、腫瘍またはがんを処置する方法に関する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、腫瘍またはがんの１つまたは複数の合併症の重症度または進行速度を防止または低減する方法に関する。必要に応じて、腫瘍またはがんを処置するための本明細書に開示されている方法は、患者に、腫瘍またはがんを処置するための１つまたは複数の支持療法または追加の活性剤を投与するステップをさらに含み得る。さらに、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を使用して、悪性または前悪性状態を処置するおよび以下に限定されないが、本明細書に記載のこれらの障害を含む、新生物性または悪性状態への進行を防止することができる。新生物またはがんに対して、特に、過形成、異形成、または最も詳細には、異常形成からなる非新生物性細胞増殖が生じる場合に、公知の状態または前述の進行を疑われる状態において、このような使用が示される。
【０３４３】
一般的に、「腫瘍」は、良性および悪性のがんならびに休眠腫瘍を指す。一般的に、「がん」は、原発性悪性細胞または腫瘍（例えば、その細胞が、元の悪性腫瘍または腫瘍の部位以外の対象の体の部位に移動していないもの）および二次悪性細胞または腫瘍（例えば、転移、元の腫瘍の部位と異なる二次的な部位への悪性細胞または腫瘍細胞の移動から生じるもの）を指す。転移は、局所的であってもまたは遠位であってもよい。転移は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、血液および血小板数、肝機能研究、胸部Ｘ線、特異的症状のモニタリングに加えた骨のスキャン、ならびにこれらの組合せのうちの単一のまたは組み合わせた使用によって、最も高い頻度で検出される。
【０３４４】
一部の実施形態では、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を、以下に限定されないが、膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、子宮頚部、膵臓、直腸、前立腺、胃、表皮のがん；リンパ系統または骨髄系統の造血器腫瘍；線維肉腫または横紋筋肉腫などの間葉起源の腫瘍；他の腫瘍型、例えば、黒色腫、奇形癌腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、腺癌および非小細胞肺癌を含む様々な形態のがんの処置において使用することができる。がんの例としては、以下に限定されないが、癌腫、リンパ腫、神経膠芽腫、黒色腫、肉腫、および白血病、骨髄腫、またはリンパ系腫瘍が挙げられる。このようながんのより詳細な例は、以下に記載され：扁平上皮がん（例えば、上皮の扁平上皮がん）、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、星細胞腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む肺がん、腹膜のがん、肝細胞がん、消化管がんを含む胃部または胃がん、膵臓がん、多形性神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、肝細胞腫、肝細胞癌、神経内分泌腫瘍、髄様甲状腺がん、分化型甲状腺癌、乳がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮癌、唾液腺癌、腎部または腎臓がん、前立腺がん、外陰がん、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頚部がんを含む。
【０３４５】
がんまたは悪性腫瘍の他の例としては、以下に限定されないが、急性小児リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞がん、成人（原発性）肝臓がん、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝臓がん、成人軟組織肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門がん、星細胞腫、胆管がん、骨がん、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳がん、腎盂および尿管のがん、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫、子宮頸がん、小児（原発性）肝細胞がん、小児（原発性）肝臓がん、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部および視覚路膠腫、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果体およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児原発性肝臓がん、小児横紋筋肉腫、小児軟組織肉腫、小児視覚路および視床下部膠腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞癌、子宮内膜がん、上衣腫、上皮がん、食道がん、ユーイング肉腫および関連腫瘍、外分泌膵臓がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼のがん、女性の乳がん、ゴーシェ病、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管腫瘍、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、毛髪様細胞白血病、頭頚部がん、肝細胞がん、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭がん、腸がん、眼内黒色腫、島細胞癌、島細胞膵臓がん、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭がん、口唇口腔がん、肝臓がん、肺がん、リンパ増殖性障害、マクログロブリン血症、男性の乳がん、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部がん、原発転移性扁平上皮性頸部がん、転移性扁平上皮性頸部がん、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異常形成症候群、骨髄性白血病、骨髄性白血病、骨髄増殖性障害、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚がん、非小細胞肺がん、原発不明転移性扁平上皮性頸部がん、中咽頭がん、骨／悪性線維肉腫、骨肉腫／悪性線維組織球腫、骨肉腫／骨の悪性線維組織球腫、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、境界悪性卵巣腫瘍、膵臓がん、パラプロテイン血症、副甲状腺がん、陰茎がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓がん、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、腎盂および尿管がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟組織肉腫、扁平上皮性頸部がん、胃がん、テント上原始神経外胚葉性および松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、胸腺腫、甲状腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、移行性腎盂および尿管がん、栄養膜腫瘍、尿管および腎盂細胞がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、視覚路および視床下部膠腫、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、ならびに上に挙げた臓器系に位置する新生物の他の任意の他の過剰増殖疾患が挙げられる。
【０３４６】
異常形成は、がんの前兆であることが多く、主に上皮に見られる。異常形成は、非新生物細胞増殖のうちの最も障害が重い形態であり、個々の細胞の均一性および細胞の構造的な定位の喪失を含む。異常形成は、慢性刺激または炎症の存在する場所で生じるのが特徴的である。一部の実施形態では、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を異常形成障害を処置するために使用することができる。異常形成障害としては、以下に限定されないが、無汗性外胚葉性異常形成、前後異常形成、窒息性胸郭異常形成、心房指異常形成、気管支肺異常形成、大脳異常形成、子宮頚部上異常形成、軟骨外胚葉異常形成、鎖骨頭蓋骨異形性、先天性外胚葉性異常形成、頭蓋骨幹異常形成、頭蓋手根骨足根骨異常形成、頭蓋骨幹端異常形成、象牙質異常形成症、骨幹異常形成、外胚葉性異常形成、エナメル質異常形成、脳眼形成不全症、骨端異常形成半肢症、多発性骨端異常形成、点状骨端異常形成、上皮性異常形成、顔面指趾生殖器異常形成、家族性線維性顎異常形成、家族性白色襞性異常形成、線維筋性異常形成、線維性骨異常形成、開花性骨性異常形成、遺伝性腎−網膜異常形成、発汗性外胚葉性異常形成、発汗減少症性外胚葉性異常形成、リンパ性減少性胸腺異常形成、乳房異常形成、下顎顔面異常形成、骨幹端異常形成、モンディニ異常形成、単発性線維性異常形成、粘膜上皮異常形成、多発性骨端異常形成、眼耳脊椎異常形成、眼歯指異常形成、眼脊椎異常形成、歯原性異常形成、眼底下顎骨異常形成、根尖端セメント質異常形成、多発性線維性骨異常形成、偽軟骨発育不全脊椎骨端異常形成、網膜異常形成、中隔視神経異常形成、脊椎骨端異常形成、および心室橈骨異常形成が挙げられる。
【０３４７】
本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）で処置することができるさらなる前新生物性障害としては、以下に限定されないが、良性異常増殖性障害（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞性状態、組織肥大、腸ポリープまたは腺腫、および食道異常形成）、白板症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、太陽性口唇炎、および日光角化症が挙げられる。
【０３４８】
本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）で処置することができる、さらなる過剰増殖性疾患、障害、および／または状態としては、以下に限定されないが、悪性腫瘍および関連する障害、例えば、白血病（急性白血病；例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄球白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病を含む））および慢性白血病（例えば、慢性骨髄球（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、ならびに以下に限定されないが、肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝がん、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫（emangioblastoma）、聴神経腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫が挙げられる固形腫瘍の、進行、および／または転移が挙げられる。
【０３４９】
ある特定の態様では、がん治療剤、例えば、細胞傷害剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、免疫調節剤、抗生物質、ホルモン、ホルモン拮抗薬、ケモカイン、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素または他の活性剤を本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）と組み合わせて使用することができる。有用な薬物は、例えば、抗有糸分裂剤、抗キナーゼ剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生剤、アルカロイド剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、およびこれらの組合せから選択される医薬特性を有し得る。
【０３５０】
例えば、抗ＰＤ１抗体は、黒色腫、非小細胞肺がん、膀胱がん、前立腺がん、結腸直腸がん、頭頚部がん、トリプルネガティブ乳がん、白血病、リンパ腫および腎細胞がんの処置のために使用されてきた（Topalian  et  al.,  2012,  N  Engl  J  Med  366:2443-54；Lipson  et  al.,  2013,  Clin  Cancer  Res  19:462-8；Berger  et  al.,  2008,  Clin  Cancer  Res  14:3044-51；Gildener-Leapman  et  al.,  2013,  Oral  Oncol  49:1089-96；Menzies  &  Long,  2013,  Ther  Adv  Med  Oncol  5:278-85）。例示的な抗ＰＤ１抗体としては、ランブロリズマブ（ＭＫ−３４７５、ＭＥＲＣＫ）、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ＡＭＰ−２２４（Ｍｅｒｃｋ）、およびピジリズマブ（ＣＴ−０１１、Ｃｕｒｅｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．）が挙げられる。抗ＰＤ１抗体は、例えば、ＡＢＣＡＭ（ＡＢ１３７１３２）、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（ＥＨ１２．２Ｈ７、ＲＭＰ１−１４）およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊ１０５、Ｊ１１６、ＭＩＨ４）から市販されている。
【０３５１】
抗ＣＴＬ４Ａ抗体は、黒色腫、前立腺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がんの処置に関する臨床試験において使用されている（Robert  &  Ghiringhelli,  2009,  Oncologist  14:848-61；Ott  et  al.,  2013,  Clin  Cancer  Res  19:5300；Weber,  2007,  Oncologist  12:864-72；Wada  et  al.,  2013,  J  Transl  Med  11:89）。例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体としては、イピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）およびトレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。抗ＰＤ１抗体は、例えば、ＡＢＣＡＭ（ＡＢ１３４０９０）、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．（１１１５９−Ｈ０３Ｈ、１１１５９−Ｈ０８Ｈ）、およびＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ（ＰＡ５−２９５７２、ＰＡ５−２３９６７、ＰＡ５−２６４６５、ＭＡ１−１２２０５、ＭＡ１−３５９１４）から市販されている。イピリムマブは、最近、転移性黒色腫の処置に関するＦＤＡの承認を受けた（Wada  et  al.,  2013,  J  Transl  Med  11:89）。
【０３５２】
ＣＴＬＡ４、ＰＤ１およびＰＤ−Ｌ１に対するチェックポイント阻害剤が臨床的に最も進歩しているが、他の潜在的なチェックポイント抗原も公知であり、対象のＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー、例えば、ＬＡＧ３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４およびＴＩＭ３と組み合わせて治療用阻害剤の標的として使用することができる（Pardoll,  2012,  Nature  Reviews  Cancer  12:252-264）。これらの薬剤ならびに腫瘍および／または病原体に対する免疫応答を刺激する他の公知の薬剤を、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーと、単独でまたはがん治療の改善のために、インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、および／または抗体−薬物コンジュゲートとさらに組み合わせて使用することができる。組み合わせて使用することができる他の公知の同時刺激性経路モジュレーターとしては、以下に限定されないが、アガトリモド、ベラタセプト、ブリナツモマブ、ＣＤ４０リガンド、抗Ｂ７−１抗体、抗Ｂ７−２抗体、抗Ｂ７−Ｈ４抗体、ＡＧ４２６３、エリトラン、抗ＯＸ４０抗体、ＩＳＦ−１５４、およびＳＧＮ−７０；Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ４８、ＬＦＡ−３、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、熱安定抗原、Ｂ７ｈ、ＯＸ４０リガンド、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ７０およびＣＤ２４が挙げられる。
【０３５３】
一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者に、有効量の本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を投与するステップを含む、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）（腎（ｒｅｎａｌ））疾患または状態を処置する方法に関する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、腎臓疾患または状態の１つまたは複数の合併症の重症度または進行速度を防止または低減する方法に関する。必要に応じて、腎臓疾患または状態を処置するための本明細書に開示されている方法は、患者に、腎臓疾患または状態を処置するための１つまたは複数の支持療法または追加の活性剤を投与するステップをさらに含み得る。例えば、患者には、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬、ウォーターピル、スタチン、エリスロポエチン、利尿剤、カルシウムおよび／またはビタミンＤサプリメント、ホスフェートバインダー、カルシウム、血液透析および／または腹膜透析によるグルコースまたはナトリウムポリスチレンスルホネート（例えば、Ｋａｙｅｘａｌａｔｅ、Ｋｉｏｎｅｘ）、Ｌａｓｉｘ（登録商標）（フロセミド）、Ｄｅｍａｄｅｘ（登録商標）（トルセミド）、Ｅｄｅｃｒｉｎ（登録商標）（エタクリン酸）、ならびにナトリウムエデクリンからなる群から選択される１つまたは複数の支持療法または活性剤も投与することができる。
【０３５４】
腎臓は、体積、ｐＨバランス、電解質濃度、および血圧を含む血液の多くの特徴を維持し、ならびに毒素および老廃物の濾過のための負担を担う。これらの機能は、腎臓ネフロンの入り組んだ構造、腎臓の様々な毛細血管を通る一定の血流、および内分泌ホルモンを含む身体の残りの部分からのシグナルによる腎臓の調節に依存する。腎臓機能の問題は、直接な機序（例えば、遺伝的欠陥、感染症、または毒素への曝露）により、ならびに肥大および過剰濾過（それら自体が腎臓機能に対するより直接的な損傷の結果である場合が多い）のような長期的ストレス因子から次第に進行する間接的機序により現れる。血液メンテナンスおよび老廃物排泄での腎臓の中心的役割に起因して、腎臓関連疾患の徴候は多数かつ多様であり；それらは、Harrison's  Principles  of  Internal  Medicine,  18th  edition,  McGraw  Hill,  N.Y.,  Part  13,  Chp  277-289において再検討することができる。
【０３５５】
したがって、本開示の方法を様々な腎臓関連疾患または状態に対して適用することができる。本明細書で使用される場合、腎臓関連疾患または状態は、腎臓または腎系に影響を及ぼす任意の疾患、障害、または状態を指し得る。腎臓関連疾患または状態の例としては、以下に限定されないが、慢性腎臓疾患（または不全）、急性腎臓疾患（または不全）、原発性腎臓疾患、非糖尿病性腎臓疾患、糸球体腎炎、間質性腎炎、糖尿病性腎臓疾患、糖尿病性慢性腎臓疾患、糖尿病性腎症、糸球体硬化、急速進行性糸球体腎炎、腎線維症、アルポート症候群、ＩＤＤＭ腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、半月体形成性糸球体腎炎、腎間質性線維症、巣状分節状糸球体硬化、膜性腎症、微小変化型疾患、微量免疫型急速進行性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、多発性嚢胞腎、デント病、腎シスチン蓄積症（nephrocytinosis）、ヘイマン腎炎、多発性嚢胞腎（例えば、常染色体優性（成人型）多発性嚢胞腎および常染色体劣性（小児型）多発性嚢胞腎）、急性腎傷害、ネフローゼ症候群、腎虚血症、有足細胞疾患または有足細胞障害、タンパク尿症、糸球体疾患、膜性糸球体腎炎、巣状分節状糸球体腎炎、子癇前症、子癇、腎臓病変、膠原血管病、良性起立性（体位性）タンパク尿症、ＩｇＭ腎症、膜性腎症、サルコイドーシス、真性糖尿病、薬物に起因する腎臓損傷、ファブリー病、アミノ酸尿症、ファンコーニ症候群、高血圧性腎硬化症、間質性腎炎、急性間質性腎炎、鎌状赤血球症、ヘモグロビン尿症、ミオグロビン尿症、ウェゲナー肉芽腫症、１型糖原病、慢性腎臓疾患、慢性腎不全、糸球体濾過率（ＧＦＲ）低下症、腎血管硬化症、ループス腎炎、ＡＮＣＡ陽性微量免疫型半月体形成性糸球体腎炎、慢性移植腎症、腎臓毒性、腎毒性、腎臓壊死、腎臓損傷、糸球体尿細管傷害、腎臓機能不全、腎炎症候群、急性腎不全、慢性腎不全、近位尿細管機能不全、急性腎移植拒絶、慢性腎移植拒絶、非ＩｇＡメサンギウム増殖性糸球体腎炎、感染後糸球体腎炎、任意の種類の腎関与を伴う血管炎、任意の遺伝性腎臓疾患、任意の間質性腎炎、腎移植不全、腎臓がん、他の状態（例えば、高血圧症、糖尿病、および自己免疫疾患）と関連する腎臓疾患、デント病、腎シスチン蓄積症、ヘイマン腎炎、原発性腎臓疾患、虚脱性糸球体症、デンスデポジット病、寒冷グロブリン血症関連糸球体腎炎、ヘノッホ−シェーンライン病、感染後糸球体腎炎、細菌性心内膜炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ−ストラウス症候群、抗ＧＢＭ抗体介在型糸球体腎炎、アミロイドーシス、モノクローナル免疫グロブリン沈着症、線維性糸球体腎炎、イムノタクトイド糸球体症、虚血性尿細管傷害、薬物治療誘導性尿細管間質性腎炎、毒性尿細管間質性腎炎、感染性尿細管間質性腎炎、細菌性腎盂腎炎、ポリオーマウイルス感染またはＨＩＶ感染から生じるウイルス感染性尿細管間質性腎炎、代謝誘導性尿細管間質性疾患、混合性結合組織疾患、円柱腎症、尿酸結晶またはシュウ酸結晶または薬物誘導性結晶の沈着から生じ得る結晶腎症、急性細胞性尿細管間質性同種移植片拒絶、リンパ腫または移植後リンパ増殖性疾患から生じる腫瘍性浸潤性疾患、腎臓の閉塞性疾患、血管疾患、血栓性微小血管症、腎血管硬化症、アテローム塞栓性疾患、混合性結合組織疾患、結節性多発動脈炎、カルシニューリン阻害剤誘導性血管疾患、急性細胞性血管性同種移植片拒絶、急性体液性同種移植片拒絶、早期腎機能低下症（ＥＲＦＤ）、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、腎静脈血栓症、急性尿細管壊死、急性間質性腎炎、確立された慢性腎臓疾患、腎動脈狭窄症、虚血性腎症、尿毒症、薬物毒素誘導性慢性尿細管間質性腎炎、逆流腎症、腎臓結石、グッドパスチャー症候群、正球性正色素性貧血、腎性貧血、糖尿病性慢性腎臓疾患、ＩｇＧ４関連疾患、フォンヒッペル−リンダウ症候群、結節性硬化症、ネフロン癆、髄質性嚢胞腎臓疾患、腎細胞癌、腺癌、腎芽細胞腫、リンパ腫、白血病、低シアリル化障害、慢性シクロスポリン腎症、腎再灌流傷害、腎形成異常、高窒素血症、両側性動脈閉塞、急性尿酸性腎症、血液量減少、急性両側性閉塞性尿路疾患、高カルシウム血性腎症、溶血性尿毒症症候群、急性尿貯留、悪性腎硬化症、分娩後糸球体硬化症、強皮症、非グッドパスチャー抗ＧＢＭ病、顕微鏡的結節性多発動脈炎、アレルギー性肉芽腫症、急性放射線腎炎、溶連菌感染後糸球体腎炎、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症、鎮痛薬性腎症、動静脈フィステル、動静脈移植、透析、異所性腎、海綿腎、腎性骨形成異常症、単腎症、水腎、微量アルブミン尿症、尿毒症、血尿、高脂血症、低アルブミン血症、脂肪尿、アシドーシス、浮腫、尿細管間質性腎線維症、高血圧性硬化症、傍糸球体細胞腫、フレイザー症候群、馬蹄腎、腎尿細管形成異常、低カリウム血症、低マグネシウム血症、高カルシウム血症、低リン血症、ウロモジュリン関連腎臓疾患、爪−膝蓋骨症候群、リチウム腎臓毒性、ＴＮＦ−アルファ腎臓毒性、ミツバチ樹脂関連腎不全、サトウキビ収穫急性腎不全、完全ＬＣＡＴ欠損症、フレーリー症候群、ページ腎、逆流腎症、バルデー−ビードル症候群、膠原繊維性糸球体腎症、デント病、デニス−ドラッシュ症候群、先天性ネフローゼ症候群、イムノタクトイド糸球体腎症、フィブロネクチン糸球体腎症、ギャロウェイモワト症候群、リポタンパク質糸球体腎症、メソアメリカ腎症、ベータ−サラセミア腎疾患、溶血性尿毒症症候群、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、後腹膜線維症、結節性多発動脈炎、心腎臓症候群、髄質性腎臓疾患、腎動脈狭窄症、ウロモジュリン腎臓疾患、および高カリウム血症が挙げられる。
【０３５６】
一部の実施形態では、本開示の本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を使用して、必要に応じて、慢性腎臓疾患を処置するための１つまたは複数の支持療法と組み合わせて、慢性腎臓疾患を処置することができる。慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）は、慢性腎疾患としても公知であり、数ヵ月または数年の期間にわたる腎機能の進行性喪失である。悪化する腎臓機能の症状としては、全身的な体調不良の感覚および食欲低下を挙げることができる。多くの場合、慢性腎臓疾患は、高血圧または糖尿病を有する人々およびＣＫＤと血縁関係を有する人々などの、腎臓の問題のリスクを有することが知られている人々のスクリーニングの結果として診断される。この疾患はまた、心血管疾患、貧血、および心膜炎などの、認識されるその合併症のうちの１つを生じさせる場合に、特定することができる。近年の専門家用ガイドラインでは、ＣＫＤの重症度は５つのステージに分類され、ステージ１は最も軽症でありかつ通常はほとんど症状を引き起こさず、ステージ５は未処置であればわずかな余命を有する重症の病状である。ステージ５のＣＫＤは、多くの場合に、終末期腎臓疾患、終末期腎疾患、または終末期腎臓不全と称され、現在は古めかしい用語である慢性腎不全または慢性腎臓不全とほぼ同義であり；通常は、患者が腎臓交換療法を必要とする（これは、透析の形態を含み得るが、理想的には腎臓移植を構成する）ことを意味する。ＣＫＤは、当初は特異的な症状を伴わず、一般的には血清クレアチニンまたは尿中タンパク質の増加としてのみ検出される。腎臓機能が低下するにつれ、種々の症状が下記の通りに現れ得る。体液過剰およびレニン−アンジオテンシン系を介して腎臓によって作出される血管作用性ホルモンの産生に起因して、血圧が上昇する場合があり、このことは、高血圧の発症および／または鬱血性心不全に罹患するリスクを増大させる。尿素が蓄積し、それにより高窒素血症および最終的には尿毒症（倦怠感から心膜炎および脳症までの範囲の症状）につながる。その高度な全身性循環に起因して、尿素は、高濃度でエクリン汗中に排出され、汗が蒸発すると皮膚上で結晶化する（「尿素霜」）。カリウムが血中に蓄積する場合がある（不快感から致死性の可能性がある不整脈を含む範囲の症状を伴う高カリウム血症）。高カリウム血症は、通常、糸球体濾過率が２０〜２５ｍＬ／分／１．７３ｍ２未満まで低下するまで発症せず、この時点では、腎臓はカリウムを排出する能力が低下している。ＣＫＤでの高カリウム血症は、酸血症（カリウムの細胞外シフトをもたらす）およびインスリンの欠乏により悪化する可能性がある。エリスロポエチン合成が減少して、貧血を引き起こす場合がある。体液体積過剰症状は、軽度の浮腫から生命を脅かす肺水腫までの範囲で生じ得る。リン酸塩排出の低下に起因する高リン血症は、糸球体濾過の低減に続いて一般的に生じ得る。高リン血症は、血管石灰化に対する直接的な刺激である、心血管リスクの増大を伴う。高カルシウム血症が顕在化する場合があり、これは、一般的に、線維化細胞増殖因子−２３の刺激によって引き起こされる。骨細��は、ＦＧＦ２３の産生の増加を担い、ＦＧＦ２３は、酵素１−アルファ−ヒドロキシラーゼ（２５−ヒドロキシコレカルシフェロールから１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３への変換を担う）の強力な阻害剤である。その後、これは、二次的副甲状腺機能亢進症、腎性骨ジストロフィー、および心機能をさらに損なわせる血管石灰化へと進行する。代謝性アシドーシス（硫酸塩、リン酸塩、尿酸などの蓄積に起因する）が生じる場合があり、これは、酵素に関して作用する過剰な酸による酵素活性の変化を引き起こし；およびまた過剰な酸（酸血症）に起因する高カリウム血症の促進により、心膜および神経膜の興奮性を高め得る。アシドーシスはまた、近位尿細管の細胞から十分なアンモニアを生成する能力が低下することにも起因する。鉄欠乏性貧血は、腎臓機能が低下すると有病率が増加し、血液透析を必要とするものにおいて特に蔓延している。その原因は多因子性であるが、炎症増大、エリスロポエチンの減少、および骨髄抑制につながる高尿酸血症が挙げられる。ＣＫＤを有する人は、アテローム性動脈硬化が促進され、一般的な集団よりも心血管疾患を発症し易い。ＣＫＤおよび心血管疾患に罹患している患者は、後者のみに罹患している患者よりも著明に悪い予後を有する傾向がある。
【０３５７】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ｉ）ＴβＲＩＩ部分およびｉｉ）フォリスタチンもしくはフォリスタチン様ポリペプチド部分または抗ＧＤＦ８抗体もしくは抗原結合性部分のいずれかを含む多特異性バインダー）を筋障害に対する処置の一部として使用することができる。一部の実施形態では、筋障害は、筋消耗または筋喪失と関連する。一部の実施形態では、筋障害は、筋線維症と関連する。一部の実施形態では、筋障害は、筋消耗／喪失と筋線維症の両方と関連する。一部の実施形態では、本明細書に開示されている多特異性バインダーのいずれかは、対象における筋消耗／喪失および筋線維症の両方を処置する。
【０３５８】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ｉ）ＴβＲＩＩ部分およびｉｉ）フォリスタチンもしくはフォリスタチン様ポリペプチド部分または抗ＧＤＦ８抗体もしくは抗原結合性部分のいずれかを含む多特異性バインダー）を筋ジストロフィーに対する処置の一部として使用することができる。「筋ジストロフィー」という用語は、骨格筋ならびに場合によっては心筋および呼吸筋の段階的な衰弱および悪化によって特徴付けられる変性性筋疾患の群を指す。筋ジストロフィーは、筋肉の顕微鏡的変化で始まる、進行性の筋消耗および筋衰弱によって特徴付けられる遺伝性障害である。経時的に筋肉が変性するにつれ、人の筋力は低下する。対象のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーのヘテロマルチマー複合体を含むレジメンを用いて処置され得る例示的な筋ジストロフィーとしては、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリー・ドライフス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨまたはＦＳＨＤ）（ランドジー・デジェリーヌとしても知られる）、筋緊張性ジストロフィー（ＭＭＤ；スタイナート病としても知られる）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー（ＤＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）が挙げられる。
【０３５９】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、１８６０年代にフランス人神経学者Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ａｍａｎｄ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅによって初めて記載された。ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、１９５０年代にＤＭＤのこのバリアントについて初めて記載したドイツ人医師Ｐｅｔｅｒ  Ｅｍｉｌ  Ｂｅｃｋｅｒにちなんで命名されている。ＤＭＤは男性における最も頻度の高い遺伝性疾患の１つであり、男児３，５００人に１人が罹患する。ＤＭＤは、Ｘ染色体の短いアーム上に位置するジストロフィン遺伝子に欠陥がある場合に発症する。男性はＸ染色体を１コピーしか有さないため、ジストロフィン遺伝子も１コピーしか存在しない。ジストロフィンタンパク質が存在しないと、筋肉は収縮および弛緩の周期中に容易に損傷を受ける。疾患の初期には筋肉は再生によって補われるが、その後は、筋肉前駆細胞が損傷の進行に対応することができず、健常な筋肉が非機能的な線維脂肪組織に置き換えられる。
【０３６０】
ＤＭＤ患者では、筋肉が損傷し始め、したがって、筋肉は再生および回復を試みる。筋肉は、損傷した後に再生する能力を有する。骨格筋再生には２つのプロセス：筋融解および筋肉の再構築が関与する。筋融解は、筋線維の分解とその後の損傷部位への炎症性細胞の浸潤に関与する。筋肉の再構築は、筋芽細胞を増殖および分化させ筋線維を形成するための筋幹細胞とサテライト細胞の活性化に関与する。筋芽細胞を分化させることにより、適切な筋肉を再構築することを目標として、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が合成されるが、筋肉の再生は、線維症へと進展するＥＣＭの蓄積をもたらすことも多い（Delaney,  K.,  et  al.,  2017,  Cell  Biology  International,  41(7),  706-715）。ＴＧＦβシグナル伝達は、骨格筋と筋肉量の発達を負に調節することが見い出されている。胚発生の間に、ＴＧＦβ１は筋形成中に発現され、周囲の筋管の線維型組成と相関する（McLennan,  1993,  Developmental  Dynamics,  197(4):281-290）。成熟した成人の筋肉では、ＴＧＦβは、サテライト細胞の休眠集団を阻害するかまたは影響を及ぼすことによって、ならびに筋線維融合およびＳＭＡＤ３シグナル伝達経路を介するＭｙｏＤとミオゲニンなどの筋肉特異的遺伝子の発現を低下させることによって、骨格筋の再生を負に調節することが示されている（Allen,  1987,  Journal  of  Cellular  Physiology,  133(3):567-72；およびLiu,  2001,  Genes  &  Development,  15(22):2950-66）。この阻害は、筋委縮をもたらす可能性もある（Narola,  2013,  PLoS  One,  8(11):E79356）。筋喪失および加齢を研究するマウスモデルでは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３が加齢に関連する筋喪失と相関することが見い出された。ＴＧＦβが抑制される場合、筋成長に改善がみられ、これは、高レベルのＴＧＦβが筋喪失に寄与することを意味する（Beggs,  2004,  Aging  Cell,  3(6):353-361）。ＴＧＦβスーパーファミリーのシグナル伝達の上方調節は、ＤＭＤ病理において重要な役割を果たすことが示されている。より高レベルのＴＧＦβ１、ＴＧＦβＩ型およびＴＧＦβＩＩ型受容体は、ｍｄｘマウスのＤＭＤ表現型の重症度に関連する（Zhou,  2006）。ＤＭＤ患者では、様々な疾患ステージの患者に由来するＤＭＤ筋組織を使用するｍＲＮＡプロファイリング研究によって、ＴＧＦβ−１シグナル伝達レベルの上昇が示された（Chen,  2005）。別の研究でも、ＤＭＤ患者の骨格筋における上方調節されたＴＧＦβ１の発現が、線維性の病理と臨床重症度の間で相関することが示されている（Song,  2017,  Experimental  and  Therapeutic  Medicine,  13(4):1209-1214）。ＤＭＤ病理の１つの特徴は、ジストロフィーの筋肉における組織の筋肉の構成の不可逆的な組織損傷を導く、筋肉における結合組織の増殖である。この特徴は、ＴＧＦβ−１の上方調節が細胞外マトリックスの形成を誘発するという観察とも相関する（Bernasconi,  1995,  Journal  of  Clinical  Investigation,  96(2):1137-44）。例えば、ＴＧＦβ１は、線維芽細胞の生成および特定の細胞外マトリックスタンパク質、すなわちＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンを増加させることによって、細胞外マトリックスを調節する（Gumucio,  2015,  Exercise  and  Sport  Sciences  Reviews,  43(2):93-99）。さらに、ＴＧＦβ１は、筋肉由来幹細胞（ＭＤＳＣ）を刺激し、筋線維芽細胞へと分化させ、次いで、細胞外マトリックスの過剰生成をもたらし、マトリックスの分解を阻害し、最終的に筋線維症をもたらす（Li,  2004）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの筋肉細胞におけるＴＧＦβ１の発現は、ＴＧＦβ１が線維性カスケードを刺激することを示す（Li,  2004,  American  Journal  of  Pathology,  164(3):1007-1019；Serrano,  2010,  Experimental  Cell  Research,  316(18):3050-3058）。これらの研究は全て、ＤＭＤにおける、特に筋線維症をもたらす結合組織の増殖におけるＴＧＦβ１の役割を実証する。より多くのエビデンスによって、ＤＭＤ病理におけるＴＧＦβの役割が支持される。マクロファージはＴＧＦβ１を生成する供給源であり、コラーゲンおよび細胞外マトリックスを作出する他の因子を生成する線維芽細胞を活性化することによって線維症に寄与する（Wynn,  2007,  Journal  of  Pathology,  214(2):199-210）。ＤＭＤでは、マクロファージ、Ｔ細胞、好中球、マスト細胞、および好酸球の動員と共に炎症性応答も広がっている。様々な炎症細胞集団が動員されるが、ＤＭＤモデルは非常に多数のマクロファージを示す（Villalta,  2010,  Human  Molecular  Genetics,  20(4):790-805）。ｍｄｘモデルでマクロファージが枯渇していると、ミオパチーは軽減した。したがって、マクロファージは筋肉の病理において役割を果たし得る（Tidball,  2010,  American  Journal  of  Physiology-Regulatory  Integrative  and  Comparative  Physi,  298(5):R1173-R1187）。
【０３６１】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている多特異性バインダーのいずれか（例えば、ｉ）ＴβＲＩＩ部分およびｉｉ）フォリスタチンもしくはフォリスタチン様ポリペプチド部分または抗ＧＤＦ８抗体もしくは抗原結合性部分のいずれかを含む多特異性バインダー）を筋消耗／筋喪失と筋線維症の両方と関連する障害を処置するために使用することができる。一部の実施形態では、多特異性バインダーは、筋肉量を増加させることと筋障害（例えば、ＤＭＤ）を有する対象における筋線維症を減少させることの両方を可能とする。
【０３６２】
ＢＭＤは、ジストロフィン遺伝子における様々な変異から生じる。ＢＭＤ患者はいくつかのジストロフィンを有するが、これは、量が不十分であるかまたは質が低いかのいずれかである。いくつかのジストロフィンの存在によって、ＢＭＤを有する患者の筋肉は、ＤＭＤを有する患者の筋肉と同程度に著しくまたは同程度に素早く分解することから保護される。
【０３６３】
同様に、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ｉ）ＴβＲＩＩ部分およびｉｉ）フォリスタチンもしくはフォリスタチン様ポリペプチド部分または抗ＧＤＦ８抗体もしくは抗原結合性部分のいずれかを含む多特異性バインダー）によって、筋成長を必要とする他の疾患状態において筋肉量を増加させるための有効な手段が提供され得る。例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、ルーゲーリック病または運動神経疾患とも称され、骨格筋収縮の開始に必要とされる中枢神経系の構成成分である、運動神経を攻撃する慢性の、進行性、かつ不治のＣＮＳ障害である。ＡＬＳでは、運動神経が変質し、最終的には死滅し、かつヒトの脳は、通常、十分に機能し、かつ覚醒したままであるが、筋収縮の開始は脊髄レベルでブロックされる。ＡＬＳを発症する個体は、典型的には、４０から７０歳の間であるが、最初の運動神経の変質は、腕または足の神経を支配するものである。ＡＬＳを有する患者は、歩くのが困難であり、物を落とす、落下する、話し言葉が不明瞭であり、制御不能に笑ったり泣いたりする場合がある。疾患が進行するにつれて、足の筋肉は、使用しないことから萎縮し始める。筋力低下により衰弱し、最終的に、患者は車いすを必要とするかまたは寝たきりになる。ほとんどのＡＬＳ患者は、疾患の発症から３〜５年で、肺炎のような呼吸不全または人工呼吸器による補助の合併症から死亡する。
【０３６４】
別の実施形態では、本開示の本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）は、慢性腎臓疾患骨塩障害（ＣＫＤ−ＭＢＤ）、腎臓疾患から生じる、相互関係にある骨格、心血管、および塩代謝障害の広範な症候群を有する患者において使用することができる。ＣＫＤ−ＭＢＤは、腎性骨異栄養症（ＲＯＤ）と称されることの多い様々な骨格病理を包含し、アクチビンおよび／またはＧＤＦアンタゴニスト、またはこのようなアンタゴニストの組合せによる処置の好ましい実施形態である。様々な病原因子の相対的寄与に応じて、ＲＯＤは、骨リモデリングの多様な病態パターンとして顕在化する（Hruska  et  al.,  2008,  Chronic  kidney  disease  mineral  bone  disorder  (CKD-MBD);  in  Rosen  et  al.  (ed)  Primer  on  the  Metabolic  Bone  Diseases  and  Disorders  of  Mineral  Metabolism,  7th  ed.  American  Society  for  Bone  and  Mineral  Research,  Washington  D.C.,  pp  343-349）。スペクトルの一端は、尿毒症性骨ジストロフィーおよび骨代謝の低下を有するＲＯＤであり、活性リモデリング部位の数が少ないこと、骨形成がかなり抑制されること、および骨吸収が低いことによって特徴付けられる。もう片方の一端は、副甲状腺機能亢進症、骨代謝の上昇、および線維性骨炎を有するＲＯＤである。本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）が、同化作用と骨吸収抑制作用の両方を発揮し得る場合、これらの薬剤は、患者において、ＲＯＤの病理スペクトルにわたって有用であり得る。
【０３６５】
一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者（例えば、貧血または貧血関連疾患もしくは状態を処置するために）に、有効量の本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を投与するステップを含む、患者の赤血球レベルを上昇される方法に関する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、貧血のうちの１つまたは複数の合併症の重症度または進行速度を防止または低減する方法に関する。必要に応じて、貧血または貧血に関連する疾患もしくは状態を処置するために本明細書に開示されている方法は、患者に、貧血または貧血に関連する疾患もしくは状態を処置するための１つまたは複数の支持療法または追加の活性剤を投与するステップをさらに含んでもよい。
【０３６６】
一部の実施形態では、本開示の本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を使用して、健康な個体における赤血球、ヘモグロビンまたは網状赤血球レベルを上昇させてもよく、このような多特異性バインダーを選択された患者集団において使用してもよい。適切な患者集団の例としては、望ましくない低い赤血球またはヘモグロビンのレベルを有する患者、例えば、貧血を有する患者、および望ましくない低い赤血球またはヘモグロビンレベルを生じる危険のある者、例えば、相当な失血をもたらす可能性のある大きな手術または他の手順を受けようとしている患者が挙げられる。一実施形態では、適当な赤血球レベルを有する患者を本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）で処置して、赤血球レベルを上昇させ、次いで、採血し、後に輸血で使用するために保存する。
【０３６７】
一部の実施形態では、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を使用して、貧血を有する患者における赤血球レベルを上昇させてもよい。ヒトにおいてヘモグロビンレベルを観察する場合、適切な年齢および性別カテゴリーの正常値未満のレベルは、貧血を示し得るが、個体の変動が考慮される。例えば、ヘモグロビンレベル１２ｇ／ｄｌは、一般的には、一般的な成人集団の正常の下限と考えられる。潜在的原因としては、血液喪失、栄養欠乏、医薬品反応、骨髄の様々な問題および多くの疾患が挙げられる。より詳細には、貧血は、例えば、慢性腎不全、骨髄異常形成症候群、関節リウマチ、骨髄移植を含む、種々の障害と関連している。貧血は、以下の状態にも関連し得る：固形腫瘍（例えば、乳がん、肺がん、結腸がん）；リンパ系の腫瘍（例えば、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンおよびホジキンリンパ腫）；造血系の腫瘍（例えば、白血病、骨髄異常形成症候群、多発性骨髄腫）；放射線療法；化学療法（例えば、白金含有レジメン）；以下に限定されないが、関節リウマチ、他の炎症性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、急性または慢性の皮膚疾患（例えば、乾癬）、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）を含む炎症性および自己免疫疾患；特発性または先天性の状態を含む急性または慢性の腎臓疾患または不全症；急性または慢性の肝疾患；急性または慢性の出血；赤血球の輸血が患者の同種異系抗体または自己抗体のために、および／または宗教上の理由（例えば一部のエホバの証人）のために不可能な状況；感染症（例えばマラリア、骨髄炎）；例えば鎌状赤血球症、サラセミアを含むヘモグロビン異常症；薬物使用または乱用、例えばアルコール乱用；輸血を回避する任意の理由からの小児貧血患者；ならびに、循環過負荷に対する懸念のために輸血を受けることができない、貧血を伴う基礎心肺疾患を有する高齢患者または患者。
【０３６８】
一部の実施形態では、本開示の本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を無効赤血球生成を処置するために使用することができる。当初、鉄動態研究に基づいて再生不良性貧血、出血、または末梢の溶血と識別して（Ricketts  et  al.,  1978,  Clin  Nucl  Med  3:159-164）、無効赤血球生成には、成熟ＲＢＣの生成が、骨髄に存在する赤血球前駆体（赤芽球）の期待された所与の数よりも少ない、様々な群の貧血が記載される（Tanno  et  al.,  2010,  Adv  Hematol  2010:358283）。このような貧血では、成熟ＲＢＣの生成が有効ではないためにエリスロポエチンレベルの上昇にもかかわらず、組織の低酸素症が持続する。最終的に、エリスロポエチンレベルの上昇によって、骨髄外の赤血球形成により、脾腫（脾臓の拡大）をもたらす可能性のある赤芽球の大量の増殖（Aizawa  et  al,  2003,  Am  J  Hematol  74:68-72）、赤芽球に誘導される骨の病理（Di  Matteo  et  al,  2008,  J  Biol  Regul  Homeost  Agents  22:211-216）、および治療的ＲＢＣ注入（Pippard  et  al,  1979,  Lancet  2:819-821）がなくても組織の鉄過剰症が引き起こされる悪循環が生じる。よって、赤血球形成の有効性を高めることによって、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーは、前述のサイクルを破壊し、根底にある貧血だけでなく、エリスロポエチンレベルの上昇、脾腫、骨の病理、および組織の鉄過剰症という関連する合併症も軽減することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーを使用して、貧血およびＥＰＯレベルの上昇を含む無効赤血球生成、ならびに脾腫、赤芽球に誘導される骨の病理、および鉄過剰症、ならびにそれらに付随する病理などの合併症を処置することができる。脾腫に関して、このような病理としては、胸郭痛または腹部痛および網内系過形成が挙げられる。骨髄外の造血は、脾臓においてだけではなく、骨髄外の造血偽腫瘍の形態の他の組織でも潜在的に生じ得る（Musallam  et  al.,  2012,  Cold  Spring  Harb  Perspect  Med  2:a013482）。赤芽球に誘導される骨の病理、付随する病理としては、骨塩量の低下、骨粗しょう症、および骨疼痛が挙げられる（Haidar  et  al.,  2011,  Bone  48:425-432）。鉄過剰症に関して、付随する病理としては、ヘプシジン抑制および食事鉄の過剰吸収（Musallam  et  al.,  2012,  Blood  Rev  26(Suppl  1):S16-S19）、複数の内分泌疾患および肝線維症／肝硬変（Galanello  et  al.,  2010,  Orphanet  J  Rare  Dis  5:11）、ならびに鉄過剰心筋症（Lekawanvijit  et  al.,  2009,  Can  J  Cardiol  25:213-218）が挙げられる。
【０３６９】
一部の実施形態では、本開示の本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）をサラセミアを処置するために使用することができる。無効な赤血球形成の最も一般的な原因は、無傷のアルファおよびベータ−ヘモグロビン鎖の生成における不均衡が赤芽球成熟中のアポトーシスの増加をもたらす遺伝性異常ヘモグロビン症である、サラセミア症候群である（Schrier,  2002,  Curr  Opin  Hematol  9:123-126）。サラセミアは、世界中で最も頻度の高い遺伝子障害の総称であり、米国と世界の両方で増大している公衆衛生上の問題の一因であることが予測される疫学的パターンの変化を伴う（Vichinsky,  2005,  Ann  NY  Acad  Sci  1054:18-24）。サラセミア症候群は、それらの重症度によって命名される。よって、α−サラセミアとしては、α−サラセミアマイナー（α−サラセミア形質としても公知；α−グロブリン遺伝子に影響を及ぼす２つのもの）、ヘモグロビンＨ疾患（α−グロブリン遺伝子に影響を及ぼす３つのもの）、およびα−サラセミアメジャー（胎児水腫としても公知；α−グロブリン遺伝子に影響を及ぼす４つのもの）が挙げられる。β−サラセミアとしては、β−サラセミアマイナー（β−サラセミア形質としても公知；β−グロブリン遺伝子に影響を及ぼす１つのもの）、β−サラセミアインターメディア（β−グロブリン遺伝子に影響を及ぼす２つのもの）、ヘモグロビンＥサラセミア（β−グロブリン遺伝子に影響を及ぼす２つのもの）、およびβ−サラセミアメジャー（クーリー貧血症としても公知；β−グロブリンタンパク質の完全な非存在をもたらすβ−グロブリン遺伝子に影響を及ぼす２つのもの）が挙げられる。β−サラセミアは、多くの器官に影響を及ぼし、かなりの病的状態および死亡率に関連し、現在は終生の治療を必要とする。β−サラセミアを有する患者の平均余命は、鉄のキレート化と組み合わせた定期的な輸血の使用により、近年増加しているが、鉄の注入と過剰な胃腸管吸収の両方から生じる鉄過剰症は、心疾患、血栓症、性腺機能低下症、甲状腺機能低下症、糖尿病、骨粗しょう症、および骨減少症などの重篤な合併症の原因となる場合がある（Rund  et  al,  2005,  N  Engl  J  Med  353:1135-1146）。
【０３７０】
一部の実施形態では、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を、サラセミア症候群以外の無効赤血球生成の疾患を処置するために使用することができる。このような障害としては、鉄芽球性貧血（siderblastic  anemia）（遺伝性または後天性）；赤血球生成異常性貧血（Ｉ型およびＩＩ型）；鎌状赤血球貧血（鎌状赤血球症）；遺伝性球状赤血球症；ピルビン酸キナーゼ欠損症；葉酸欠損症（先天性疾患、摂取量の減少、または要求量の増加に起因する）、コバラミン欠損症（先天性疾患、悪性貧血、吸収障害、膵臓機能不全、または摂取量の減少に起因する）、ある特定の薬物、または説明されていない原因などの状態により潜在的に引き起こされる巨赤芽球性貧血（先天性赤血球生成異常性貧血、不応性巨赤芽球性貧血、または赤白血病）；骨髄線維症（骨髄化生）および骨髄ろうを含む骨髄ろう性貧血；先天性赤芽球性ポルフィリン症；ならびに鉛中毒が挙げられる。
【０３７１】
一部の実施形態では、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を処置するために使用することができる。ＭＤＳは、骨髄の血球の生成が無効であることおよび急性骨髄性白血病（acute  mylogenous  leukemia）への転換のリスクによって特徴付けられる血液学的状態の多様なコレクションである。ＭＤＳ患者では、血液幹細胞は健康な赤血球、白血球、または血小板へと成熟しない。ＭＤＳ障害としては、例えば、不応性貧血、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、過剰な芽球を伴う不応性貧血、転換におけて過剰な芽球を伴う不応性貧血、多系列の異常形成を伴う不応性血球減少、および単離した５ｑ染色体異常に関連する骨髄異形成症候群が挙げられる。これらの障害は、造血細胞の量と質の両方において不可逆的な欠陥として現れるため、ほとんどのＭＤＳ患者は慢性貧血に罹患する。したがって、ＭＤＳ患者は、最終的に、赤血球レベルを上昇させるために、輸血および／または増殖因子（例えば、エリスロポエチンまたはＧ−ＣＳＦ）による処置が必要になる。しかし、多くのＭＤＳ患者は、このような治療の頻度によって副作用を発症する。例えば、頻回に赤血球の輸血を受ける患者は、過剰な鉄の蓄積から組織および器官が損傷を有し得る。一部の実施形態では、ＭＤＳを患っている患者は、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーならびに例えば、サリドマイド、レナリドミド、アザシタジン、デシタビン、エリスロポエチン、デフェロキサミン、抗胸腺細胞グロブリン（antihymocyte  globulin）、フィルグラスチム（filgrastrim）（Ｇ−ＣＳＦ）およびエリスロポエチンシグナル伝達経路アゴニストを含むＭＤＳを処置するための１つまたは複数の追加の治療剤の組合せを使用して処置され得る。
【０３７２】
一部の実施形態では、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか、（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を、典型的には、赤血球（ＲＢＣ）形態にほとんど変化がないことと関連する、低増殖性骨髄の貧血を処置するために使用することができる。低増殖性貧血としては、１）慢性疾患の貧血、２）腎臓疾患の貧血、および３）低代謝状態に関連する貧血が挙げられる。これらのいずれのタイプでも、内因性のエリスロポエチンレベルは低く、貧血の程度を観察するのに適していない。他の低増殖性貧血としては、４）初期段階の鉄欠乏性貧血、および５）骨髄への損傷によって引き起こされる貧血が挙げられる。これらのタイプでは、内因性のエリスロポエチンレベルは上昇し、貧血の程度を観察するのに適している。
【０３７３】
一部の実施形態では、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を慢性疾患に関連する貧血を処置するために使用することができる。最も一般的な種類は慢性疾患貧血であり、これは、炎症、感染、組織損傷、およびがんなどの状態を包含し、低エリスロポエチンレベルと、骨髄におけるエリスロポエチンに対する不十分な応答によって識別される（Adamson,  2008,  Harrison's  Principles  of  Internal  Medicine,  17th  ed.;  McGraw  Hill,  New  York,  pp  628-634）。がん関連貧血に多くの因子が寄与している可能性がある。疾患プロセスそれ自体に関連するものや、インターロイキン−１、インターフェロン−ガンマ、および腫瘍壊死因子などの炎症性サイトカインの生成に関連するものがある（Bron  et  al.,  2001,  Semin  Oncol  28(Suppl  8):1-6）。その効果の中でも、炎症が、重要な鉄調節ペプチドであるヘプシジンを誘導することによって、マクロファージからの鉄の排出が阻害され、一般的に、赤血球生成に関する鉄の利用能が制限される（Ganz,  2007,  J  Am  Soc  Nephrol  18:394-400）。がん関連貧血に様々な経路を介する失血が寄与している可能性もある。がんの進行による貧血の有病率は、がんの種類によって異なり、前立腺がんにおける５％から多発性骨髄腫における９０％までの範囲である。がん関連貧血は、疲労感および生活の質の低下、処置の有効性の低下、ならびに致死率の増加を含む、患者にとって深刻な結果をもたらす。
【０３７４】
慢性腎臓疾患は、重症度の変化する低増殖性貧血を伴う。代謝率の低下をもたらす多くの状態によって、軽度から中等度の低増殖性貧血が生じ得る。このような状態の中には、内分泌欠乏状態がある。例えば、貧血は、アディソン病、甲状腺機能低下症、副甲状腺機能亢進症、または去勢したかまたはエストロゲンで処置した男性において生じ得る。軽度から中等度の貧血は、タンパク質の食事摂取の低減、特に年配者に蔓延している状態でも生じ得る。最後に、貧血は、ほとんど全ての原因で生じる慢性肝疾患を有する患者において発症し得る（Adamson,  2008,  Harrison's  Principles  of  Internal  Medicine,  17th  ed.;  McGraw  Hill,  New  York,  pp  628-634）。
【０３７５】
一部の実施形態では、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を急性失血から生じる貧血を処置するために使用することができる。外傷または分娩後出血などの相当な体積の急性失血から生じる貧血は、急性出血後貧血として公知である。急性失血は、ＲＢＣが他の血液成分と比例して減少するため、最初に、貧血を伴わない血液量減少を引き起こす。しかし、血液量減少は、体液を血管外から血管の区画へとシフトさせる生理的機序を急速に誘発することになり、血液希釈および貧血をもたらす。慢性の失血は、体内の鉄の貯蔵を徐々に枯渇させ、最終的に鉄結合をもたらす。
【０３７６】
一部の実施形態では、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を鉄欠乏性貧血を処置するために使用することができる。鉄欠乏性貧血は、中間段階として負の鉄バランスおよび鉄欠乏性赤血球生成を含む、増加する鉄欠乏の段階的な進行における最終段階である。鉄欠乏は、妊娠、不適切な食事、腸吸収不良、急性または慢性の炎症、および急性または慢性の失血などの状態において例証される通り、鉄需要の増加、鉄摂取の減少、または鉄損失の増加に起因し得る。この種の軽度から中等度の貧血により、骨髄は低増殖性を維持し、ＲＢＣ形態は大部分が正常である。しかし、軽度の貧血であっても、いくつかの小球性低色素性ＲＢＣをもたらすことがあり、重症鉄欠乏性貧血への移行は、骨髄の過剰増殖ならびにますます蔓延する小球性および低色素性ＲＢＣを伴う（Adamson,  2008,  Harrison's  Principles  of  Internal  Medicine,  17th  ed.;  McGraw  Hill,  New  York,  pp  628-634）。鉄欠乏性貧血に適切な治療は、その原因および重症度に依存し、主要な従来の選択肢として経口鉄調製物、非経口的鉄製剤、およびＲＢＣ輸血を含む。
【０３７７】
一部の実施形態では、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を低増殖性貧血を処置するために使用することができる。低増殖性貧血は、炎症、感染症、またはがん進行に次いで起こる機能障害の代わりに、骨髄の原発性の機能障害または不全に起因し得る。顕著な例は、がん化学療法薬またはがん放射線療法が原因の骨髄抑制である。臨床試験の広範な総説は、軽度の貧血が、化学療法後の患者の１００％において起こり得るが、より重症な貧血が、このような患者の最大８０％において起こり得ることを見出した（Groopman  et  al.,  1999,  J  Natl  Cancer  Inst  91:1616-1634）。骨髄抑制薬としては、１）ナイトロジェンマスタード（例えば、メルファラン）およびニトロソウレア（例えば、ストレプトゾシン）などのアルキル化剤；２）葉酸アンタゴニスト（例えば、メトトレキサート）、プリンアナログ（例えば、チオグアニン）、およびピリミジンアナログ（例えば、ゲムシタビン）などの代謝拮抗薬；３）アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン）などの細胞傷害性抗生物質（antibotics）；４）キナーゼ阻害剤（例えば、ゲフィチニブ）；５）タキサン（例えば、パクリタキセル）およびビンカアルカロイド（例えば、ビノレルビン）などの有糸分裂阻害剤；６）モノクローナル抗体（例えば、リツキシマブ）；ならびに７）トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、トポテカンおよびエトポシド）が挙げられる。
【０３７８】
一部の実施形態では、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を、小振りの（小球性）、大振りの（大球性）、奇形の、または異常な色の（低色素性）ＲＢＣによって、部分的に特徴付けられる混乱したＲＢＣ成熟の貧血を処置するために使用することができる。
【０３７９】
一部の実施形態では、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を貧血または貧血を伴う疾患を処置するための支持療法と組み合わせて使用することができる。このような治療は、貧血を処置するための赤血球または全血のいずれかによる輸血を含む。慢性または遺伝性貧血では、鉄ホメオスタシスに関する正常な機序が繰り返し行われる輸血によって圧倒され、最終的に、心臓、肝臓、および内分泌腺などの生体組織における有毒かつ致死の可能性のある鉄の蓄積をもたらす。よって、貧血、特に無効赤血球生成に慢性的に罹患している患者に対する支持療法には、尿および／または便における鉄の排出を促進する１つまたは複数の鉄キレート分子による処置が含まれ、それによって、組織の鉄過剰症を防止、または逆転する（Hershko,  2006,  Haematologica  91:1307-1312；Cao  et  al,  2011,  Pediatr  Rep  3(2):e17）。有効な鉄キレート化剤は、ヒドロキシラジカルと酸化生成物の触媒による製造の中で最も高い鉄毒性を占める傾向のある、トランスフェリンと結合していない鉄の酸化形態である第二鉄に選択的に結合し、これを中和することができなければならない（Esposito  et  al,  2003,  Blood  102:2670-2677）。これらの薬剤は構造的に多様であるが、全てが、個々の鉄原子の化学量論が１：１（六座剤（ｈｅｘａｄｅｎｔａｔｅ  ａｇｅｎｔ））、２：１（三座）、または３：１（二座）である中和性八面体配位錯体を形成することができる酸素または窒素ドナー原子を有する（Kalinowski  et  al,  2005,  Pharmacol  Rev  57:547-583）。有効な鉄キレート化剤はまた、比較的低分子量（７００ダルトン未満）であり、罹患した組織に接近できるように水と脂質の両方に対して溶解性である。鉄キレート化分子の具体例は、デフェロキサミン、毎日の非経口投与が必要な細菌起源の六座剤、ならびに経口的に活性な合成薬剤であるデフェリプロン（二座）およびデフェラシロクス（三座）である。２つの鉄キレート化剤の同日投与からなる併用療法は、キレート化単剤療法に対して不応答性の患者において有望であり、デフェロキサミン（dereroxamine）単独で用いる場合の患者のコンプライアンスが不十分であるという問題を克服することにおいても有望であることを示している（Cao  et  al,  2011,  Pediatr  Rep  3(2):e17；Galanello  et  al,  2010,  Ann  NY  Acad  Sci  1202:79-86）。
【０３８０】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を貧血、特に無効赤血球生成を伴う貧血を処置するためのヘプシジンアゴニストと組み合わせて使用することができる。主に肝臓で生成される循環ポリペプチドであるヘプシジンは、吸収腸細胞、肝細胞、およびマクロファージに局在化する鉄排出タンパク質であるフェロポーチンの分解を誘導するその能力のために、鉄代謝の主要な調節因子であると考えられている。大まかに述べると、ヘプシジンは、細胞外の鉄の利用可能性を低減するため、ヘプシジンアゴニストは、無効赤血球生成の処置において有益であり得る（Nemeth,  2010,  Adv  Hematol  2010:750643）。この視点は、β−サラセミアのマウスモデルにおけるヘプシジン発現増大の有益な効果により裏付けられている（Gardenghi  et  al,  2010,  J  Clin  Invest  120:4466-4477）。
【０３８１】
一部の実施形態では、本開示の本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を低用量範囲で赤血球の増加を達成するＥＰＯ受容体活性化剤と組み合わせて使用することができる。これは、高用量のＥＰＯ受容体活性化剤に関連する公知のオフターゲット作用およびリスクを低減する際に有用であり得る。ある特定の実施形態では、本発明は、個体に、治療有効量の本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）または多特異性バインダーとＥＰＯ受容体活性化剤との組合せ（または併用療法）を投与することによって、それを必要とする個体の貧血を処置または防止する方法を提供する。
【０３８２】
本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を、ＥＰＯの有害効果を受けやすい患者において、これらの活性化剤の必要用量を低減するために、ＥＰＯ受容体活性化剤と組み合わせて使用することができる。ＥＰＯの主な有害効果は、ヘマトクリットまたはヘモグロビンレベルの過剰な上昇および赤血球増加症である。ヘマトクリットレベルが上昇することにより、高血圧（より詳細には、高血圧の深刻化）および血管の血栓症がもたらされ得る。報告されているＥＰＯの他の有害効果（このうちのいくつかは、高血圧に関する）は、頭痛、インフルエンザ様症候群、バイパスの閉塞、血栓症に起因する心筋梗塞および大脳痙攣、高血圧性脳障害、ならびに赤血球血球無形成（red  cell  blood  cell  applasia）である（Singibarti,  (1994)  J.  Clin  Investig  72(suppl  6),  S36-S43；Horl  et  al.  (2000)  Nephrol  Dial  Transplant  15(suppl  4),  51-56；Delanty  et  al.  (1997)  Neurology  49,  686-689；  Bunn  (2002)  N  Engl  J  Med  346(7),  522-523）。
【０３８３】
一部の実施形態では、標的レベルが低いほど、より少ない心血管の副作用しか引き起こされない場合があるが、標的ヘモグロビンレベル、通常は、約１０ｇ／ｄｌから約１２．５ｇ／ｄｌの間、典型的には、約１１．０ｇ／ｄｌまで回復させることを意図した多特異性バインダーの投薬レジメンにより、患者を処置することができる（Jacobs  et  al.  (2000)  Nephrol  Dial  Transplant  15,  15-19も参照されたい）。あるいは、ヘマトクリットレベル（細胞に占有される血液試料の体積のパーセンテージ）は、赤血球の状態の尺度として使用することができる。健康な個体のヘマトクリットレベルは、成人男性では４１から５１％、成人女性では３５から４５％の範囲に及ぶ。標的ヘマトクリットレベルは、通常、３０〜３３％前後である。さらに、ヘモグロビン／ヘマトクリットレベルは、個人間で変動する。よって、最適には、標的ヘモグロビン／ヘマトクリットレベルは、患者毎に個別化することができる。
【０３８４】
ある特定の実施形態では、本発明は、患者における１つまたは複数の血液学的パラメーターを測定することによって、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）で処置したか、またはそれで処置される候補である患者を管理するための方法を提供する。血液学的パラメーターは、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）で処置される、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）による処置の間に血液学的パラメーターをモニターする、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）による処置の間に投薬量を調整するかどうかを評価する、および／またはＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーの適切な維持用量を評価する候補である患者に対しての適切な投与を評価するために使用され得る。血液学的パラメーターのうちの１つまたは複数が正常レベルの範囲外である場合、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）による投与は低減されるか、遅延させるかまたは終了され得る。
【０３８５】
本明細書において提供される方法に従って測定することができる血液学的パラメーターとしては、例えば、赤血球レベル、血圧、鉄貯蔵、および当技術分野で認識される方法を使用して赤血球レベルの上昇と相関する体液中に見られる他の薬剤が挙げられる。このようなパラメーターは、患者由来の血液試料を使用して決定することができる。赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、および／またはヘマトクリットレベルの上昇によって、血圧の上昇がもたらされ得る。
【０３８６】
一実施形態では、１つまたは複数の血液学的パラメーターが正常範囲外であるか、または正常範囲の高い側にある場合、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）で処理される候補である患者において、次いで、血液学的パラメーターが自然にまたは治療介入によって正常または許容可能なレベルに戻るまで、多特異性バインダーの投与の開始が遅らされてもよい。例えば、候補である患者が高血圧症または前高血圧症である場合、よって、患者の血圧を低下させるために、患者は血圧低下剤で処置されてもよい。例えば、利尿剤、アドレナリン阻害剤（アルファ遮断剤およびベータ遮断剤を含む）、血管拡張剤、カルシウムチャネルブロッカー、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、またはアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬を含む、個々の患者の状態に対して適切ないずれかの血圧低下剤を使用してもよい。あるいは、食事および運動レジメンを使用して血圧を処置してもよい。同様に、候補である患者の鉄貯蔵が正常より少ないか、または正常の低い側にある場合、よって、患者の鉄貯蔵が正常または許容可能なレベルに戻るまで、患者を食事および／または鉄サプリメントの適切なレジメンで処置してもよい。正常な赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンレベルよりも高いレベルを有する患者では、次いで、それらのレベルが正常または許容可能なレベルに戻るまで、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）の投与が遅らされてもよい。
【０３８７】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の血液学的パラメーターが正常範囲外であるか、または正常範囲の高い側にある場合、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）で処理される候補である患者において、次いで、投与の開始が遅らされてもよい。しかし、多特異性バインダーの投薬量または投与頻度を、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマーの投与の際に生じる血液学的パラメーターの許容できない増加のリスクを低減する量に設定することができる。あるいは、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を血液学的パラメーターの望ましくないレベルを対象とする治療剤と組み合わせる治療レジメンを患者のために開発することができる。例えば、患者の血圧が上昇した場合、次いで、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）および血圧低下剤の投与を含む治療レジメンを設計することができる。所望の鉄貯蔵より低い鉄貯蔵しか有さない患者には、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）および鉄サプリメントの治療レジメンを開発することができる。
【０３８８】
一実施形態では、１つまたは複数の血液学的パラメーターに対するベースラインパラメーターを本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）で処理される候補である患者に対して確立することができ、適切な投与レジメンをそのベースライン値に基づいてその患者のために確立することができる。あるいは、患者の病歴に基づいて確立したベースラインパラメーターを使用して、患者に対して適切な多特異性バインダーの投与レジメンを知らせることができる。例えば、健康な患者が規定された正常範囲を超える確立されたベースライン血圧読み取り値を有する場合、多特異性バインダーによる処置の前に、患者の血圧を一般的集団に対して正常と考えられる範囲にする必要はない場合もある。本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）による処置の前の１つまたは複数の血液学的パラメーターに対する患者のベースライン値は、多特異性バインダーによる処置の間の血液学的パラメーターに対する何らかの変化をモニターするための関連する比較値として使用してもよい。
【０３８９】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の血液学的パラメーターは、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）で処置されている患者において測定される。血液学的パラメーターを使用して、処置の間、患者をモニターし、多特異性バインダーによる投与または別の治療剤による追加の投与を調整または終了させることもできる。例えば、多特異性バインダーの投与により、血圧、赤血球レベル、もしくはヘモグロビンレベルの上昇、または鉄貯蔵の低減が生じる場合、次いで、多特異性バインダーの用量は、１つまたは複数の血液学的パラメーターに対する多特異性バインダーの作用を低下させるために、量または頻度を低減させてもよい。投与または多特異性バインダーにより、患者に対して有害である１つまたは複数の血液学的パラメーターの変化が生じる場合、次いで、多特異性バインダーの投与は、一時的に、血液学的パラメーターが許容可能なレベルに戻るまで、または永遠にのいずれかで終了されてもよい。同様に、１つまたは複数の血液学的パラメーターが、多特異性バインダーであるヘテロマルチマーの用量または投与頻度を低減させた後に許容可能な範囲内にならない場合、投与は終了されてもよい。多特異性バインダーによる投与を低減または終了する代わりとして、またはそれに加えて、血液学的パラメーターの望ましくないレベルを対象とする追加の治療剤、例えば、血圧低下剤または鉄サプリメントなどを患者に投与してもよい。例えば、多特異性バインダーにより処置されている患者の血圧が上昇した場合、次いで、多特異性バインダーによる投与は同じレベルで継続され、かつ血圧低下剤が処置レジメンに加えられるか、多特異性バインダーによる投与を低減させ（例えば、量および／または頻度において）、かつ血圧低下剤を処置レジメンに加えるか、または多特異性バインダーによる投与を終了させてもよい。
６．医薬組成物
【０３９０】
本明細書に記載の治療剤（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）は、医薬組成物に製剤化され得る。本開示に従って使用するための医薬組成物は、１つまたは複数の生理学的に許容される担体または賦形剤を使用して、従来の方法で製剤化することができる。このような製剤は、一般的に、ほとんどの規制要件に従い、実質的にパイロジェン−フリーとなる。
【０３９１】
ある特定の実施形態では、本開示の治療方法は、組成物を全身的に、またはインプラントもしくはデバイスとして局所的に投与するステップを含む。投与された際に、この開示において使用するための治療用組成物は、パイロジェン−フリーの、生理学的に許容される形態である。上記のように、必要に応じて組成物中にも含まれ得る多特異性バインダー以外の治療上有用な薬剤は、本明細書に開示されている方法において、対象の化合物と同時にまたは連続的に投与されてもよい。
【０３９２】
典型的には、本明細書に開示されているタンパク質治療剤は、非経口的に、特に静脈内または皮下に投与される。非経口投与に好適な医薬組成物は、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）の１つまたは複数を、１つまたは複数の薬学的に許容される滅菌等張水性溶液もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液またはエマルジョン、あるいは使用直前に再構築して滅菌注射用溶液または分散液（抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする製剤または懸濁化剤もしくは増粘剤を含有し得る）にすることができる滅菌粉末と組み合わせて含み得る。本開示の医薬組成物において用いることができる好適な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）および好適なこれらの混合物、植物油、例えば、オリーブ油、および注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルを含む。適切な流動性は、例えば、コーティング材、例えば、レシチンの使用により、分散液の場合は必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。
【０３９３】
組成物および製剤は、所望により、有効成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有し得るパックまたは分注装置中で提供することができる。パックは、例えば、金属またはプラスチックホイル、例えば、ブリスターパックを含み得る。パックまたは分注装置には、投与についての使用説明書を添付することができる。
【０３９４】
さらに、組成物は、標的組織部位に送達するための形態で封入または注射することができる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、１つまたは複数の治療用化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）を標的組織部位に送達し、成長中の組織のための構造を提供することが可能であり、および最適には体内に再吸収されることが可能なマトリックスを含み得る。例えば、マトリックスは、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）のゆっくりとした放出をもたらすことができる。このようなマトリックスは、他の埋め込み型医学的適用に現在使用されている材料で形成することができる。
【０３９５】
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容的外観および界面特性に基づく。対象の組成物の特定の適用により、適切な製剤が規定される。組成物のための潜在的なマトリックスは、生分解性であり、化学的に定義された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ酸無水物であり得る。他の潜在的な材料は、骨または皮膚のコラーゲンなどの、生分解性であり、生物学的に明確に定義されているものである。さらなるマトリックスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリックス構成成分で構成される。他の潜在的なマトリックスは、例えば、焼結したヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、または他のセラミックスなどの、非生分解性であり、化学的に定義されたものである。マトリックスは、例えば、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイトまたはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムなど、上記のタイプの材料のいずれかの組合せで構成され得る。バイオセラミックスの組成を、例えば、カルシウム−アルミネート−ホスフェートなどに変更し、孔径、粒子サイズ、粒子の形状、および生分解性が変更されるように加工することができる。
【０３９６】
ある特定の実施形態では、本発明の方法を、経口的に、例えば、それぞれが所定量の薬剤を有効成分として含有する、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（風味を付けた基剤、通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガントを使用する）、散剤、顆粒剤の形態で、または水性もしくは非水性液中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油もしくは油中水エマルジョン液として、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、またはパステル剤（不活性な基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムを使用する）ならびに／または口内洗浄剤などとして投与することができる。薬剤は、ボーラス、舐剤またはペースト剤として投与することもできる。
【０３９７】
経口投与用の固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤など）では、１つまたは複数の本発明の治療用化合物は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、例えば、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、および／または以下のいずれかと混合することができる：（１）増量剤もしくはエキステンダー、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／もしくはケイ酸；（２）バインダー、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、および／もしくはアラビアゴムなど；（３）保湿剤、例えば、グリセロール；（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、バレイショデンプンもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のシリケート、および炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延剤、例えば、パラフィン；（６）吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物；（７）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなど；（８）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイトクレー；（９）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物；ならびに（１０）着色剤。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合は、医薬組成物は、緩衝剤をさらに含んでもよい。ラクトースまたは乳糖などの賦形剤、および高分子量ポリエチレングリコールなどを使用した軟ゼラチンカプセル剤および硬ゼラチンカプセル剤中の増量剤として同様のタイプの固体組成物を使用してもよい。
【０３９８】
経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤、およびエリキシル剤が挙げられる。有効成分に加えて、液体剤形は、当技術分野において通常使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカルボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含有してもよい。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味料、香味剤、着色剤、香料、および保存剤などのアジュバントを含んでもよい。
【０３９９】
活性化合物に加えて、懸濁液は、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、およびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガント、ならびにこれらの混合物などの懸濁化剤も含有し得る。
【０４００】
本発明の組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含有し得る。微生物による作用の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを組成物中に含めることによって確実にすることができる。糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤も組成物に含めることが望ましい場合がある。さらに、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることにより、注射可能な医薬形態の持続的な吸収をもたらすことができる。
【０４０１】
投与量レジメンは、主治医により、本発明の対象の化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）の作用を改変する様々な因子を考慮して決定されることが理解される。様々な因子としては、以下に限定されないが、患者の年齢、性別、および食事、疾患の重症度、投与時間、および他の臨床的因子が挙げられる。必要に応じて、再構築に使用するマトリックスの種類および組成物中の化合物の種類に応じて投薬量を変えることができる。他の公知の増殖因子を最終的な組成物に添加することも、投薬量に影響を及ぼし得る。進行は、骨の成長および／または修復の周期的な評価、例えば、Ｘ線（ＤＥＸＡを含む）、組織形態計測的決定、およびテトラサイクリン標識によってモニターすることができる。
【０４０２】
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に開示されているＴＧＦβ−スーパーファミリーのリガンドの多特異性バインダーのいずれか（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロマルチマー）をｉｎ  ｖｉｖｏで産生するための遺伝子療法も提供する。このような療法は、多特異性バインダーポリヌクレオチド配列を上に列挙した障害を有する細胞または組織中に導入することによってその治療効果を達成する。多特異性バインダーポリヌクレオチド配列の送達は、キメラウイルスまたはコロイド分散系などの組換え発現ベクターを使用して達成することができる。多特異性バインダーポリヌクレオチド配列の治療的送達には、標的化リポソームの使用が好ましい。
【０４０３】
本明細書で教示した遺伝子療法に利用することができる様々なウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または、好ましくはレトロウイルスなどのＲＮＡウイルスが挙げられる。レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリレトロウイルスの誘導体であることが好ましい。単一の外来遺伝子を挿入することができるレトロウイルスベクターの例としては、以下に限定されないが：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられる。いくつかの追加のレトロウイルスベクターに複数の遺伝子を組み込むことができる。これらのベクターは全て、遺伝子を選択可能なマーカーとして導入するかまたは組み込むことができ、その結果、形質導入された細胞を同定し、生成することができる。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質、またはタンパク質を付着させることによって標的特異的とすることができる。好ましい標的化は、抗体を使用することによって達成される。多特異性バインダーポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベクターの標的特異的な送達を可能にするために、特異的なポリヌクレオチド配列をレトロウイルスゲノムに挿入することまたはウイルス外被に付着させることができることを当業者は認識するであろう。好ましい実施形態では、ベクターは、骨または軟骨を標的化する。
【０４０４】
あるいは、組織培養細胞にレトロウイルスの構造遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをコードするプラスミドを従来のリン酸カルシウムトランスフェクションによって直接トランスフェクトすることができる。次いで、これらの細胞に目的の遺伝子を含有するベクタープラスミドをトランスフェクトする。得られる細胞は、レトロウイルスベクターを培養培地中に放出する。
【０４０５】
多特異性バインダーポリヌクレオチドに関する別の標的化送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および脂質に基づく系（水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む）が挙げられる。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの送達ビヒクルとして有用な人工膜ベシクルである。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび無傷のビリオンは、水性内部内に封入することができ、生物学的に活性な形態で細胞に送達することができる（例えば、Fraley,  et  al.,  Trends  Biochem.  Sci.,  6:77,  1981を参照されたい）。リポソームビヒクルを使用する効率的な遺伝子移入のための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Mannino,  et  al.,  Biotechniques,  6:682,  1988を参照されたい。リポソームの組成物は、通常、リン脂質の組合せ、通常、ステロイド、特にコレステロールとの組合せである。他のリン脂質または他の脂質も使用することができる。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。
【０４０６】
リポソーム生成において有用な脂質の例としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴリピド、セレブロシド、およびガングリオシドなどのホスファチジル化合物が挙げられる。例示的なリン脂質としては、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。リポソームの標的化はまた、例えば、器官特異性、細胞特異性、およびオルガネラ特異性に基づく可能性があり、当技術分野で公知である。
【０４０７】
本開示は、ｐＨを調整するための酸および塩基を含むよう変更することができる製剤；ならびに狭い範囲内にｐＨを保持するための緩衝剤を提供する。
適例
【０４０８】
ここで、本発明は、一般的に、本発明の特定の実施形態の例示のみを目的として含まれ、本発明を限定することを意図しない以下の実施例を参照してより容易に理解されるように記載される。
【実施例】
【０４０９】
（実施例１）
ＴβＲＩＩ受容体融合タンパク質バリアントの生成
ＴβＲＩＩ  ＥＣＤバリアント
ヒトＴβＲＩＩの可溶性細胞外部分およびヒトＦｃ部分を含むＴβＲＩＩ融合タンパク質を生成した。各融合タンパク質について、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＴβＲＩＩアミノ酸配列を、いくつかの異なるリンカーのうちの１つによって、配列番号４９のアミノ酸配列を有するＩｇＧ  Ｆｃ部分に融合させた。各融合タンパク質は、配列番号２３（以下）のアミノ酸配列を有するＴＰＡリーダー配列も含んだ。
組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）：
ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号２３）
【０４１０】
設計された構築物のうちのいくつかの例示的概要を図３に提供する。適例のセクションにおいて試験した様々な構築物について配列を詳細に説明する表を以下に提供する。
【表２】
2021522793.tif 000079
【０４１１】
構築物の構成成分および構築物のそれぞれについてのアミノ酸配列を、これらの構築物を発現するために使用される核酸配列と一緒に以下に提供する。
ＴβＲＩＩ部分：アミノ酸配列
【化７７】
2021522793.tif 000080
Ｆｃ部分：アミノ酸配列
【化７８】
2021522793.tif 000081
ｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃ核酸配列
【化７９】
2021522793.tif 000082
【化８０】
2021522793.tif 000083
ｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃ：アミノ酸配列
【化８１】
2021522793.tif 000084
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）３−ｈＦｃ：核酸配列
【化８２】
2021522793.tif 000085
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）３−ｈＦｃ：アミノ酸配列
【化８３】
2021522793.tif 000086
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ：核酸配列
【化８４】
2021522793.tif 000087
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ：アミノ酸配列
【化８５】
2021522793.tif 000088
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ：リーダー配列を欠くアミノ酸配列
【化８６】
2021522793.tif 000089
【化８７】
2021522793.tif 000090
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ：リーダー配列を欠き、ｈＴβＲＩＩ部分の前のグリシンを欠くアミノ酸配列
【化８８】
2021522793.tif 000091
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ：リーダー配列を欠き、ｈＴβＲＩＩ部分の前のグリシンおよびアラニンを欠くアミノ酸配列
【化８９】
2021522793.tif 000092
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ：リーダー配列を欠き、ｈＴβＲＩＩ部分の前のグリシン、アラニン、およびスレオニンを欠くアミノ酸配列
【化９０】
2021522793.tif 000093
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ：リーダー配列を欠き、ｈＴβＲＩＩ部分の前のグリシン、アラニン、スレオニンを、およびイソロイシンを欠くアミノ酸配列
【化９１】
2021522793.tif 000094
【化９２】
2021522793.tif 000095
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ：リーダー配列を欠き、ｈＴβＲＩＩ部分の前のグリシン、アラニン、スレオニンを、イソロイシン、およびプロリンを欠くアミノ酸配列
【化９３】
2021522793.tif 000096
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ：リーダー配列を欠き、ｈＴβＲＩＩ部分の前のグリシン、アラニン、スレオニンを、イソロイシン、プロリン、およびプロリンを欠くアミノ酸配列
【化９４】
2021522793.tif 000097
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）２−ｈＦｃ：核酸配列
【化９５】
2021522793.tif 000098
【化９６】
2021522793.tif 000099
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）２−ｈＦｃ：アミノ酸配列
【化９７】
2021522793.tif 000100
ｈＴβＲＩＩが伸長したヒンジ−ｈＦｃ：核酸配列
【化９８】
2021522793.tif 000101
ｈＴβＲＩＩが伸長したヒンジ−ｈＦｃ：アミノ酸配列
【化９９】
2021522793.tif 000102
【化１００】
2021522793.tif 000103
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）５−ｈＦｃ：アミノ酸配列
【化１０１】
2021522793.tif 000104
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）６−ｈＦｃ：アミノ酸配列
【化１０２】
2021522793.tif 000105
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）５−ｈＦｃ：ヌクレオチド配列
【化１０３】
2021522793.tif 000106
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）６−ｈＦｃ：ヌクレオチド配列
【化１０４】
2021522793.tif 000107
【０４１２】
様々な構築物をＣＨＯ細胞において発現させ、分析的サイズ排除クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるように、高純度まで精製することに成功した。３７℃で１３日間ＰＢＳ中で維持した場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定されるように、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）２−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）３−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）５−ｈＦｃおよびｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）６−ｈＦｃタンパク質は、同様に強力な安定性を示した。ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）２−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）３−ｈＦｃ、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃタンパク質はまた、ラット、マウスまたはヒトの血清中で維持され、同様に強力な安定性を示した。
ＴβＲＩＩ  ＥＣＤバリアント
【０４１３】
上記の融合タンパク質（例えば、配列番号１８）中に含まれるＴβＲＩＩドメインに加えて、本開示は、代替のＴβＲＩＩドメインを含む融合タンパク質も企図する。例えば、融合タンパク質は、以下（配列番号２７）に示される野生型ｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５９）配列または以下に開示されている他のＴβＲＩＩポリペプチドのいずれかを含んでもよい：
【化１０５】
2021522793.tif 000108
【化１０６】
2021522793.tif 000109
【０４１４】
（１）以下に示されているｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５９／Ｄ１１０Ｋ）アミノ酸配列（配列番号３６）、配列中、置換された残基には下線が付されている。
【化１０７】
2021522793.tif 000110
【０４１５】
（２）以下に示されているＮ末端で切断されたｈＴβＲＩＩ短（２９〜１５９）アミノ酸配列（配列番号２８）。
【化１０８】
2021522793.tif 000111
【０４１６】
（３）以下に示されているＮ末端で切断されたｈＴβＲＩＩ短（３５〜１５９）アミノ酸配列（配列番号２９）。
【化１０９】
2021522793.tif 000112
【０４１７】
（４）以下に示されているＣ末端で切断されたｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５３）アミノ酸配列（配列番号３０）。
【化１１０】
2021522793.tif 000113
【０４１８】
（５）以下に示されているＣ末端で切断されたｈＴβＲＩＩ短（２３〜１５３／Ｎ７０Ｄ）アミノ酸配列（配列番号３８）、配列中、置換された残基には下線が付されている。
【化１１１】
2021522793.tif 000114
【０４１９】
出願人らは、上記および下記に示されている野生型ｈＴβＲＩＩ長（２３〜１８４）配列（配列番号２０）に基づいて５つの対応するバリアント（配列番号３７、３３、３４、３９）についても予想し、配列中、２５アミノ酸の挿入に下線を付す。スプライシングによって、挿入のＣ末端に近接する位置における保存的アミノ酸置換（Ｖａｌ→Ｉｌｅ）が生じることに留意されたい。
【化１１２】
2021522793.tif 000115
【０４２０】
（１）以下に示されているｈＴβＲＩＩ長（２３〜１８４／Ｄ１３５Ｋ）アミノ酸配列（配列番号３７）、配列中、置換された残基に二重下線を付す。
【化１１３】
2021522793.tif 000116
【０４２１】
（２）以下に示されているＮ末端で切断されたｈＴβＲＩＩ長（２９〜１８４）アミノ酸配列（配列番号３３）。
【化１１４】
2021522793.tif 000117
【０４２２】
（３）以下に示されているＮ末端で切断されたｈＴβＲＩＩ長（６０〜１８４）アミノ酸配列（配列番号２９と同一）。
【化１１５】
2021522793.tif 000118
【０４２３】
（４）以下に示されているＣ末端で切断されたｈＴβＲＩＩ長（２３〜１７８）アミノ酸配列（配列番号３４）。
【化１１６】
2021522793.tif 000119
【０４２４】
（５）以下に示されているＣ末端で切断されたｈＴβＲＩＩ長（２３〜１７８／Ｎ９５Ｄ）アミノ酸配列（配列番号３９）、配列中、置換された残基に二重下線を付す。
【化１１７】
2021522793.tif 000120
さらなるＴβＲＩＩ  ＥＣＤバリアントは以下を含む：
【０４２５】
（Ａ）以下に示されているＮおよびＣ末端で切断されたｈＴβＲＩＩ短（３５〜１５３）またはｈＴβＲＩＩ長（６０〜１７８）アミノ酸配列（配列番号３２）。
【化１１８】
2021522793.tif 000121
【０４２６】
（Ｂ）以下に示されているＮおよびＣ末端で切断されたｈＴβＲＩＩ短（２９〜１５３）アミノ酸配列（配列番号３１）。
【化１１９】
2021522793.tif 000122
【０４２７】
（Ｃ）以下に示されているＮおよびＣ末端で切断されたｈＴβＲＩＩ長（２９〜１７８）アミノ酸配列（配列番号３５）。
【化１２０】
2021522793.tif 000123
【０４２８】
上記バリアント（配列番号３６、２８、２９、３０、３８、３７、３３、３４、３９、３２、３１、および３５）のいずれかによって、ｈＴβＲＩＩアイソフォームＣにおいて天然に生じるように、ｈＴβＲＩＩ  ＥＣＤのＣ末端付近に位置するグルタメート残基の対（配列番号１の１５１および１５２位、または配列番号２の１７６および１７７位）の間に３６アミノ酸（配列番号４１）の挿入が組み込まれ得る（Konrad  et  al.,  BMC  Genomics  8:318,  2007）。
【化１２１】
2021522793.tif 000124
【０４２９】
例として、必要に応じた挿入部位に隣接する対合したグルタメート残基をｈＴβＲＩＩ短（２９〜１５９）バリアント（配列番号２８）について以下に示す（下線を付した）。
【化１２２】
2021522793.tif 000125
Ｆｃドメインバリアント
【０４３０】
上記構築物を配列番号４９のアミノ酸配列を有するＦｃドメインに関して生成したが、本開示は、ヒトＩｇＧ２  Ｆｃドメイン（以下の配列番号４２）または全長ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（ｈＧ１Ｆｃ）（以下の配列番号４３）を含む代替のＦｃドメインを含むｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃ融合タンパク質を企図する。必要に応じて、Ｆｃドメインに関連しないポリペプチドをＦｃドメインの代わりに結合させることができる。
【化１２３】
2021522793.tif 000126
リーダー配列バリアント
【０４３１】
上記の生成された構築物はＴＰＡリーダー配列を含んだが、ネイティブリーダー配列（以下の配列番号２２）またはミツバチのメリチン（以下の配列番号２４）リーダー配列などの代替のリーダー配列を使用してもよい。
ネイティブ：ＭＧＲＧＬＬＲＧＬＷＰＬＨＩＶＬＷＴＲＩＡＳ（配列番号２２）
ミツバチのメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号２４）
（実施例２）
細胞に基づくアッセイにおける受容体融合タンパク質バリアントによる差示的なリガンドの阻害
【０４３２】
ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）２−ｈＦｃ；ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）３−ｈＦｃ；ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ；ｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃ；およびｈＴβＲＩＩにより伸長したヒンジ−ｈＦｃタンパク質に対するＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３の親和性をＢｉａｃｏｒｅ（商標）機器を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価し、結果を図４Ａおよび４Ｂにまとめる。各融合タンパク質は、高い親和性でＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に結合することが可能であるが、（Ｇ４Ｓ）４より長いかまたはそれに等しい長さのリンカーを有する構築物は、驚くべきことに、（Ｇ４Ｓ）４より短い長さのリンカーを有する構築物よりも高い親和性で、ＴＧＦβ１とＴＧＦβ３の両方に結合することが可能であった。ＴＧＦβ２と構築物のいずれかとの間の結合は、低いかまたは一過的であった。構築物の脱グリコシル化によって結合に変化はなかった。
【０４３３】
Ａ５４９細胞におけるレポーター遺伝子アッセイを使用して、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３の活性を阻害するｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃバリアントの能力を決定した。このアッセイは、トランスフェクション効率を制御するために、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２レポータープラスミド（Dennler  et  al,  1998,  EMBO  17:  3091-3100）およびウミシイタケレポータープラスミド（ｐＲＬＣＭＶ）をトランスフェクトしたヒト肺癌細胞系に基づく。ＣＡＧＡモチーフはＴＧＦβ−応答性遺伝子（例えば、ＰＡＩ−１）のプロモーター中に存在するため、このベクターは、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３によりシグナル伝達する因子にとって一般的に有用である。
【０４３４】
アッセイの１日目に、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）：ＣＣＬ−１８５（商標））を４８ウェルプレート中に分配した。２日目に、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２、ｐＲＬＣＭＶ、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ９（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、およびＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する溶液をプレインキュベートし、次いで、０．１％のＢＳＡを補充したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ、ＡＴＣＣ（登録商標））に添加し、これをプレーティングした細胞に適用し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。３日目に、培地を除去し、細胞を、以下に記載したように調製したリガンドと阻害剤の混合物と共に、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
【０４３５】
アッセイ緩衝液（ＥＭＥＭ＋０．１％のＢＳＡ）中の４８ウェルプレートにおいて、試験物の連続希釈を行った。等しい体積の試験リガンドを含有するアッセイ緩衝液を添加して、以前に決定したＥＣ５０に等しい濃度の最終リガンドを得た。ヒトＴＧＦβ１、ヒトＴＧＦβ２、およびヒトＴＧＦβ３をＰｅｐｒｏＴｅｃｈから入手した。試験溶液を３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、混合物の一部を全てのウェルに添加した。試験溶液との一晩のインキュベーション後に、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を濯ぎ、次いで、受動溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１９４１）で溶解させ、−７０℃で一晩保存した。４日目と最終日に、プレートを穏やかに振盪させながら室温まで温めた。細胞溶解液を二連で化学ルミネセンスプレート（９６ウェル）に移し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１９８０）からの試薬を用いてルミノメーターで分析し、正規化したルシフェラーゼ活性を決定した。
【０４３６】
図５Ａ〜５Ｆに例示したように、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）２−ｈＦｃ；ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）３−ｈＦｃ；ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ；ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）５−ｈＦｃ；ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）６−ｈＦｃ；ｈＴβＲＩＩ−ｈＦｃ；およびｈＴβＲＩＩにより伸長したヒンジ−ｈＦｃタンパク質は全て、ＴＧＦβ１とＴＧＦβ３の両方を阻害することが可能であった。興味深いことに、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３阻害の改善とｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）２−ｈＦｃ；ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）３−ｈＦｃおよびｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）４−ｈＦｃ構築物に対するリンカーの長さとの間には相関関係があるが（図５Ｅ）、この改善の傾向は、ｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）５−ｈＦｃおよびｈＴβＲＩＩ（Ｇ４Ｓ）６−ｈＦｃ構築物に関して定常となったようであった（図５Ｆ）。
（実施例３）
ＡｃｔＲＩＩＡ：ＴβＲＩＩヘテロダイマーの生成
【０４３７】
細胞外ドメインとＦｃドメインの間に位置するリンカーによりＦｃドメインにそれぞれ別々に融合したヒトＡｃｔＲＩＩＡおよびヒトＴβＲＩＩの細胞外ドメインを含む可溶性ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロマー複合体を構築した。個々の構築物は、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドと称され、それぞれに関する配列を以下に提供する。
【０４３８】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃまたはＴβＲＩＩ−Ｆｃホモダイマー複合体と対照的に、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロマー複合体の形成を促進するための方法は、非対称ヘテロマー複合体の形成をガイドするＦｃドメインのアミノ酸配列に変更を導入することである。Ｆｃドメインを使用して非対称相互作用対を作製するための多くの異なるアプローチについて、本開示において記載する。
【０４３９】
１つのアプローチでは、それぞれ、配列番号８２、８４、８５および８７のＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃおよびＴβＲＩＩ−Ｆｃポリペプチド配列において例示されるように、一方のＦｃドメインを変更して相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入する一方で、他方のＦｃドメインを変更して相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入する。ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドはそれぞれ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）リーダー：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号２３）およびＡｃｔＲＩＩＡまたはＴβＲＩＩ細胞外部分と改変されたＦｃ部分の間に位置する（Ｇ４Ｓ）４リンカーを用いる。
【０４４０】
ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号８２）は以下に示される：
【化１２４】
2021522793.tif 000127
【化１２５】
2021522793.tif 000128
【０４４１】
リーダー（シグナル）配列とリンカーに下線を付す。可能なホモダイマー複合体のいずれかよりもむしろ、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロダイマーの形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（酸性アミノ酸をリシンで置き換えること）を上記二重下線によって示したように、ＡｃｔＲＩＩＡ融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号８２のアミノ酸配列は、必要に応じて、Ｃ末端から除去されたリシン（Ｋ）と共に提供され得る。
【０４４２】
このＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸配列（配列番号８３）によってコードされている。：
【化１２６】
2021522793.tif 000129
【０４４３】
プロセシングされたＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号８４）は以下の通りであり、必要に応じて、Ｃ末端から除去したリシン（Ｋ）と共に提供され得る。
【化１２７】
2021522793.tif 000130
【化１２８】
2021522793.tif 000131
【０４４４】
ＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号８５）の相補的形態は以下の通りである：
【化１２９】
2021522793.tif 000132
【０４４５】
リーダー配列とリンカーに下線を付す。上記配列番号８２および８４のＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチドによるヘテロダイマー形成をガイドするために、２つのアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を上記二重下線によって示したように、ＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号８５のアミノ酸配列は、必要に応じて、Ｃ末端にリシン（Ｋ）を付加して与えられてもよい。
【０４４６】
このＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸（配列番号８６）によってコードされる：
【化１３０】
2021522793.tif 000133
【化１３１】
2021522793.tif 000134
【０４４７】
プロセシングされたＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質の配列（配列番号８７）は以下の通りであり、必要に応じて、Ｃ末端にリシン（Ｋ）を付加して与えられてもよい。
【化１３２】
2021522793.tif 000135
【化１３３】
2021522793.tif 000136
【０４４８】
それぞれ、配列番号８４および配列番号８７のＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃおよびＴβＲＩＩ−Ｆｃタンパク質は、同時に発現され、ＣＨＯ細胞系から精製され、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じ得る。
【０４４９】
非対称のＦｃ融合タンパク質を使用してヘテロマルチマー複合体の形成を促進する別のアプローチでは、Ｆｃドメインを変更して、相補的疎水性相互作用ならびにそれぞれ、配列番号８８〜９０および９１〜９３のＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃおよびＴβＲＩＩ−Ｆｃポリペプチド配列に例示したように、追加の分子間ジスルフィド結合を導入する。ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチドとＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドはそれぞれ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）リーダーを用いる。
ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号８８）は以下に示される：
【化１３４】
2021522793.tif 000137
【０４５０】
リーダー（シグナル）配列とリンカーに下線を付す。可能なホモダイマー複合体のいずれかよりもむしろ、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロダイマーの形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインでおよびスレオニンをトリプトファン（trytophan）で置き換えること）を上記二重下線によって示したように、融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号８８のアミノ酸配列は、必要に応じて、Ｃ末端から除去されたリシン（Ｋ）と共に提供され得る。
【０４５１】
このＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸配列（配列番号８９）によってコードされている。：
【化１３５】
2021522793.tif 000138
【化１３６】
2021522793.tif 000139
【０４５２】
プロセシングされたＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチドは以下の通りである：
【化１３７】
2021522793.tif 000140
【０４５３】
ＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号９１）の相補的形態は以下の通りであり、必要に応じて、Ｃ末端から除去したリシン（Ｋ）と共に提供され得る。
【化１３８】
2021522793.tif 000141
【化１３９】
2021522793.tif 000142
【０４５４】
リーダー配列とリンカーに下線を付す。上記配列番号８８および９１のＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチドによるヘテロダイマー形成をガイドするために、４つのアミノ酸置換を上記二重下線によって示したように、ＴβＲＩＩ融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号９１のアミノ酸配列は、必要に応じて、Ｃ末端から除去されたリシン（Ｋ）と共に提供され得る。
【０４５５】
このＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸配列（配列番号９２）によってコードされている：
【化１４０】
2021522793.tif 000143
【０４５６】
プロセシングされたＴβＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質の配列は以下の通りであり、必要に応じて、Ｃ末端から除去したリシン（Ｋ）と共に提供され得る。
【化１４１】
2021522793.tif 000144
【化１４２】
2021522793.tif 000145
【０４５７】
それぞれ、配列番号９０および配列番号９３のＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃおよびＴβＲＩＩ−Ｆｃタンパク質は、同時に発現され、ＣＨＯ細胞系から精製され、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じ得る。
【０４５８】
ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロダイマーの活性を比較するために、それぞれ、配列番号８２、８４、８５、８７、８８、９０、９１、または９３のいずれか１つに存在するようなＡｃｔＲＩＩＡまたはＴβＲＩＩ細胞外ドメインのいずれか；改変されていないｈＧ１Ｆｃドメイン（ホモダイマーの形成を促進する）；およびＡｃｔＲＩＩＡまたはＴβＲＩＩ細胞外部分と改変されていないＦｃ部分の間に位置する（Ｇ４Ｓ）４リンカーを含む、ＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃホモダイマーとＴβＲＩＩ−Ｆｃホモダイマーを生成した。これらのホモダイマーの両方が、配列番号２３のＴＰＡリーダー配列を使用して発現された。
【０４５９】
上記の様々なヘテロダイマーおよびホモダイマーの精製は、例えば、任意の順序で、以下のもののうちの３つまたはそれより多くを含む一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成され得る：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびエピトープに基づくアフィニティークロマトグラフィー（例えば、ＴβＲＩＩまたはＡｃｔＲＩＩＡ上のエピトープを対象とする抗体または機能的に同等のリガンドを用いる）、ならびにマルチモーダルクロマトグラフィー（例えば、静電リガンドと疎水性リガンドの両方を含有する樹脂を用いる）。精製は、ウイルス濾過と緩衝液交換により完了され得る。
（実施例４）
細胞に基づくアッセイにおける受容体融合タンパク質バリアントによる差示的なリガンドの阻害
【０４６０】
Ａ５４９細胞におけるレポーター遺伝子アッセイを使用して、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、およびＢＭＰ１０の活性を阻害するＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロダイマーの能力を決定し、ＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃホモダイマーおよびＴβＲＩＩ−Ｆｃホモダイマーの活性の阻害と比較したが、これらは全て実施例３において上記されている。このアッセイは、トランスフェクション効率を制御するために、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２レポータープラスミド（Dennler  et  al,  1998,  EMBO  17:  3091-3100）およびウミシイタケレポータープラスミド（ｐＲＬＣＭＶ）をトランスフェクトしたヒト肺癌細胞系に基づく。ＣＡＧＡモチーフはＴＧＦβ−応答性遺伝子（例えば、ＰＡＩ−１）のプロモーター中に存在するため、このベクターは、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３によりシグナル伝達する因子にとって一般的に有用である。
【０４６１】
アッセイの１日目に、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）：ＣＣＬ−１８５（商標））を４８ウェルプレート中に分配した。２日目に、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２、ｐＲＬＣＭＶ、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ９（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、およびＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する溶液をプレインキュベートし、次いで、０．１％のＢＳＡを補充したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ、ＡＴＣＣ（登録商標））に添加し、これをプレーティングした細胞に適用し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。３日目に、培地を除去し、細胞を、以下に記載したように調製したリガンドと阻害剤の混合物と共に、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
【０４６２】
アッセイ緩衝液（ＥＭＥＭ＋０．１％のＢＳＡ）中の４８ウェルプレートにおいて、試験物の連続希釈を行った。等しい体積の試験リガンドを含有するアッセイ緩衝液を添加して、以前に決定したＥＣ５０に等しい濃度の最終リガンドを得た。試験溶液を３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、混合物の一部を全てのウェルに添加した。試験溶液との一晩のインキュベーション後に、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を濯ぎ、次いで、受動溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１９４１）で溶解させ、−７０℃で一晩保存した。４日目と最終日に、プレートを穏やかに振盪させながら室温まで温めた。細胞溶解液を二連で化学ルミネセンスプレート（９６ウェル）に移し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１９８０）からの試薬を用いてルミノメーターで分析し、正規化したルシフェラーゼ活性を決定した。
【０４６３】
図１２に例示したように、ＴβＲＩＩ−Ｆｃホモダイマーは、この細胞に基づくアッセイにおいて、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３を阻害することが可能であるが、ＴＧＦβ２、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、またはＢＭＰ１０を阻害しなかった。対照的に、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃホモダイマーは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、およびＢＭＰ１０を阻害することが可能であるが、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、またはＴＧＦβ３を阻害しなかった。ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロダイマーは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびＧＤＦ１１を阻害することが可能であるが、ＢＭＰ１０またはＴＧＦβ２を阻害しなかった。これらのデータは、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロダイマーが、ＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃホモダイマーとＴβＲＩＩ−Ｆｃホモダイマーの強力な阻害剤の特徴のうちの多くを保持し、よって、Ｓｍａｄ２／３に関連するＴＧＦβスーパーファミリーのリガンドの２つの別個の群（すなわち、ＴＧＦβ３およびアクチビン／ＧＤＦ）に、特有に影響を及ぼすことが可能であるリガンドトラップの興味深い分類を表すことを実証する。さらに、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−ＦｃヘテロダイマーはＢＭＰ９１０を阻害せず、よって、ＡｃｔＲＩＩＡに関連するリガンドに対して、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃは、ＡｃｔＲＩＩＡホモダイマーよりもより選択的なアンタゴニストである。したがって、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＴβＲＩＩ−Ｆｃヘテロダイマーは、このような選択的アンタゴニズムがＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３の阻害と組み合わせて所望されるある特定の適用において、ＡｃｔＲＩＩＡホモダイマーよりもより有用であろう。
（実施例５）
代替の多特異性バインダーの合成
【０４６４】
フォリスタチン−ＴＧＦβＲＩＩまたはαＧＤＦ８−ＴＧＦβＲＩＩを介してＧＤＦ８とＴＧＦβの両方に結合することが可能である多特異性バインダーを生成する。
【０４６５】
フォリスタチンおよびＴＧＦＢＲＩＩの結合ドメインからなる融合タンパク質であるフォリスタチン−ＴＧＦβＲＩＩ（この例では、ＦＳ２８８．Ｆｃ（Ｇ４Ｓ）４−ＴＧＦβＢＲＩＩと称される）は、単一の二官能構築物中に存在するように設計される。ＦＳ２８８．Ｆｃ（Ｇ４Ｓ）４−ＴＧＦβＲＩＩの設計は、フォリスタチンのネイティブシグナルペプチド、それに続いてフォリスタチン−２８８のアイソフォーム（配列番号１１１）、Ｆｃ  ＩｇＧ２ドメインに対するＴＧＧＧリンカー（配列番号１６３）（２つのジスルフィド結合を含有するヒンジ領域を含む）、（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号１６５）、次いでＴＧＦβＲＩＩ  ＥＣＤ（配列番号１７０）からなる（図１４Ａ）。一部の実施形態では、ＦＳ２８８．Ｆｃ（Ｇ４Ｓ）４−ＴＧＦβＲＩＩは、配列番号１８０または１８１のアミノ酸配列を含むことになる。
【０４６６】
ＧＤＦ８に結合することが可能なＴＧＦＢＲＩＩ部分および抗原結合性断片部分を含む第２のタンパク質が開発される（この実施例では、αＧＤＦ８−ｈＩｇＧ１−（Ｇ４Ｓ）４−ＴＧＦβＲＩＩと称される）。αＧＤＦ８−ｈＩｇＧ１−（Ｇ４Ｓ）４−ＴＧＦＢＲＩＩは、２つのタンパク質の副分子のアセンブリによって作製される。１つは、αＧＤＦ８抗体の重鎖可変領域の配列（配列番号１６７）、それに続いて２つのジスルフィド結合を有するヒンジ領域を含むヒトＩｇＧ１定常領域の配列（配列番号１６８）、（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号１６９）、次いでＴＧＦβＲＩＩ  ＥＣＤ（配列番号１７０）を含有する（図１４Ｂ）。第２のタンパク質の副分子は、αＧＤＦ８抗体の軽鎖可変領域の配列（配列番号１７４）、それに続いてヒトカッパ軽鎖定常領域の配列（配列番号１７５）を含有する。発現する全てのタンパク質が、細胞の外側であってかつ条件培地中に分泌されるように、シグナルペプチド（配列番号１７６）を使用する。これらの２つの新たな分子のＤＮＡ構築物は、既存の構築物を使用して合成されるかまたはクローニングされる。一部の実施形態では、αＧＤＦ８−ｈＩｇＧ１−（Ｇ４Ｓ）４−ＴＧＦＢＲＩＩは、配列番号１７２および１８２のアミノ酸配列を含むことになる。
【０４６７】
構築物が作製されるかどうか、および大規模トランスフェクションへと材料および時間を費やす前に、細胞が適正に分子を発現することができるかどうかを検証するために、新たに構築されたプラスミドの小規模の発現をＨＥＫ２９３ＦＴ細胞において実施する。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞は高いトランスフェクション効率およびタンパク質産生を呈し、かつ小規模発現実験に関して使用される。タンパク質の産生および質をウエスタンブロットアッセイおよび抗ＩｇＧ  Ｆｃ抗体による検出によってチェックする。
【０４６８】
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞においてこれら２つの新たな分子の発現を検証した後に、研究される全ての分子はＥＸＰＩ−ＣＨＯ細胞中で発現される。チャイニーズハムスターの卵巣由来の上皮細胞系であるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、組換えタンパク質の工業的生産のために最も一般的に使用される哺乳動物宿主である。ＥＸＰＩ−ＣＨＯは、ＣＨＯ細胞の亜型である。条件培地を回収し、ｍＡｂプロテインＡドリップカラムを介して精製する。プロテインＡから作製されるｍＡｂカラムは、ＩｇＧタンパク質の重鎖定常領域（Ｆｃ）に結合し、したがって、この種の精製によって、単一ステップで高純度のＦｃ融合タンパク質を得ることができる。精製されたタンパク質を採取した後、研究されるタンパク質をＥＬＩＳＡ分析およびレポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）のために使用し、それらのリガンドへの結合および細胞に基づくアッセイにおけるリガンドに媒介されるシグナル伝達経路を変更するそれらの活性を特徴付ける。
【０４６９】
ＥＬＩＳＡを使用して、特異性の高いタンパク質対タンパク質の相互作用を介してタンパク質を検出および定量する。以下の様々なリガンドを用いてプレートをコーティングする：ＦＳ２８８に結合するＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、およびアクチビンＢ；αＧＤＦ８抗体に結合するＧＤＦ１１およびＧＤＦ８；ＴＧＦβＲＩＩに結合するＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３。ＦＳ２８８．Ｆｃ（Ｇ４Ｓ）４−ＴＧＦβＢＲＩＩ、αＧＤＦ８−ｈＩｇＧ１−（Ｇ４Ｓ）４−ＴＧＦβＲＩＩおよびそれらの対照分子、αＧＤＦ８抗体、ＦＳ２８８．Ｆｃ、およびＴＧＦβＲＩＩ．Ｆｃをリガンドをコーティングしたプレートに適用し、結合を決定する。最後に、抗ＩｇＧ  Ｆｃ抗体を使用して、結合シグナルを検出および増幅する。陰性対照として、リガンドを含まない目的のタンパク質をコーティングしたウェルを使用して、非特異的結合による何らかのバックグラウンドシグナルが存在するかどうかを決定する。
【０４７０】
ＲＧＡは、特定のシグナル伝達経路の活性化を特徴付けるために使用される細胞に基づくアッセイである。ＲＧＡアッセイを使用して、応答エレメントとしてＣＡＧＡ１２およびレポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼを含有するレポーター遺伝子プラスミドを使用して、ＴＧＦβ  ＳＭＡＤ２／３シグナル伝達活性の活性化を調査することができる。ＣＭＶ−ウミシイタケルシフェラーゼを含有する別のプラスミドは、トランスフェクション対照として使用される。細胞表面の受容体へのＳＭＡＤ２／３に関連するリガンドの結合に際し、細胞内のＳＭＡＤシグナル伝達複合体は核に転位し、ＣＡＧＡ１２に結合して、プロモーターの活性化およびルシフェラーゼの転写を刺激する。研究される分子が特定のリガンドを捕捉すると仮定される場合、ＣＡＧＡ１２に媒介されるルシフェラーゼ活性の活性化は、それによって低下する。
【０４７１】
ＦＳ２８８．Ｆｃ（Ｇ４Ｓ）４−ＴＧＦβＢＲＩＩがＥＬＩＳＡによって試験した全てのリガンドに結合し、ＲＧＡによって試験した全てのリガンドのシグナル伝達活性を捕捉して中和することが期待される。しかし、αＧＤＦ８−ｈＩｇＧ１−（Ｇ４Ｓ）４−ＴＧＦβＲＩＩでは、αＧＤＦ８抗体はＧＤＦにのみ結合しアクチビンに結合しないため、この分子のアクチビンへの結合およびその後の中和は期待されない。提案した知見では、これら２種のタンパク質は、ＤＭＤを有する患者に対して治療として潜在的に使用することができ、筋機能を改善させることによって患者の生活の質を向上させることができる。
【０４７２】
ＦＳ２８８．Ｆｃ（Ｇ４Ｓ）４−ＴＧＦβＢＲＩＩおよび／またはαＧＤＦ８−ｈＩｇＧ１−（Ｇ４Ｓ）４−ＴＧＦβＲＩＩ分子を使用して、ＤＭＤ動物モデル（例えば、ｍｄｘマウスモデル）またはヒトモデルを処置することもできる。
（実施例６）
４つのアームおよび３つのアームを有するＡｃｔＲＩＩＡ−ＴＧＦβＲＩＩマルチマーの合成
【０４７３】
２つのＡｃｔＲＩＩＡ−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質を含む「４つのアームを有する」ホモダイマーを生成する。ホモダイマーにおける各ＡｃｔＲＩＩＡ−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質（ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）４−ＴＧＦＢＲＩＩとも称される）は、ＡｃｔＲＩＩＡとＴＧＦＢＲＩＩの結合ドメインを含み、単一の二官能構築物において設計される。ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）４−ＴＧＦＢＲＩＩの設計は、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分（配列番号５１）、それに続いてＧＧＧリンカー、それに続いてＦｃ部分（配列番号１６３）、それに続いてリンカー（配列番号１６５）、次いでＴＧＦβＲＩＩ  ＥＣＤ（配列番号１７０）（図１５Ａ）を含むことになる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）４−ＴＧＦＢＲＩＩは、配列番号１８３のアミノ酸配列を含むことになる。
【０４７４】
さらに、ａ）ＴＧＦＢＩＩポリペプチド部分およびＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分を含む１つの融合タンパク質（ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ−ノブ−（Ｇ４Ｓ）４Ｇ−ＴＧＦＢＲＩＩと称される）ならびにｂ）ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチド部分を含むがＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分を欠く融合タンパク質（Ｆｃ１−ホール−（Ｇ４Ｓ）４Ｇ−ＴＧＦＢＲＩＩと称される）を含む「３つのアームを有する」ヘテロダイマーが生成される（図１５Ｂ）。ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ−ノブ−（Ｇ４Ｓ）４Ｇ−ＴＧＦＢＲＩＩタンパク質は、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド部分（配列番号５１）、それに続いてＧＧＧリンカー、それに続いてＦｃ部分（配列番号７２、但し、Ｃ末端のリシンを欠く）、それに続いてリンカー（配列番号１６５）、それに続いてＴＧＦＢＲＩＩポリペプチド部分（配列番号１７０）を含むことになる。Ｆｃ１−ホール−（Ｇ４Ｓ）４Ｇ−ＴＧＦＢＲＩＩタンパク質は、ＣＨ１由来の９個のアミノ酸（ＳＮＴＫＶＤ  ＫＲＶ−配列番号１８９）、それに続いてリンカー（ＴＧＧＧ）、それに続いてＦｃ部分（配列番号７３）、それに続いてリンカー（配列番号１６５）、それに続いてＴＧＦＢＲＩＩポリペプチド部分（配列番号１７０）を含むことになる（図１５Ｂ）。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ−ノブ−（Ｇ４Ｓ）４Ｇ−ＴＧＦＢＲＩＩタンパク質は、配列番号１８４のアミノ酸配列を含み、Ｆｃ１−ホール−（Ｇ４Ｓ）４Ｇ−ＴＧＦＢＲＩＩタンパク質は、配列番号１８５のアミノ酸配列を含むことになる。
【０４７５】
構築物が作製されるかどうか、および大規模トランスフェクションへと材料および時間を費やす前に、細胞が適正にマルチマーを発現することができるかどうかを検証するために、ａ）ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ（Ｇ４Ｓ）４−ＴＧＦＢＲＩＩ、またはｂ）ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ−ノブ−（Ｇ４Ｓ）４Ｇ−ＴＧＦＢＲＩＩおよびＦｃ１−ホール−（Ｇ４Ｓ）４Ｇ−ＴＧＦＢＲＩＩをコードするプラスミドの小規模での発現をＨＥＫ２９３ＦＴ細胞において実施する。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞は高いトランスフェクション効率およびタンパク質産生を呈し、かつ小規模発現実験に使用される。マルチマーの産生および質を、ウエスタンブロットアッセイおよび抗ＩｇＧ  Ｆｃ抗体による検出によってチェックする。
【０４７６】
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞における４つのアームおよび／または３つのアームを有するマルチマーの発現を検証した後、研究されるマルチマーの全てを、ＥＸＰＩ−ＣＨＯ細胞において発現させる。条件培地を回収し、ｍＡｂプロテインＡドリップカラムを介して精製する。プロテインＡから作製されるｍＡｂカラムは、ＩｇＧタンパク質の重鎖定常領域（Ｆｃ）に結合し、したがって、この種の精製によって、単一ステップで高純度のＦｃ融合タンパク質を得ることができる。
【０４７７】
実施例４において記載したアッセイに類似するＡ５４９細胞におけるレポーター遺伝子アッセイを使用して、ＡｃｔＲＩＩＡ−ＦｃホモダイマーおよびＴβＲＩＩ−Ｆｃホモダイマーの活性の阻害と比較した、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、および／またはＢＭＰ１０の活性を阻害する３つのアームおよび／または４つのアームを有するマルチマーの能力を決定する（これらは全て実施例３において上記されている）。
参照による組込み
【０４７８】
本明細書において言及される全ての刊行物および特許は、それぞれ個々の刊行物または特許が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されているかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０４７９】
主題の具体的な実施形態について議論してきたが、上記明細書は例示的であり限定的ではない。この明細書および以下の特許請求の範囲を再考すれば、多くの変更が当業者にとって明らかとなるであろう。本発明の全範囲は、特許請求の範囲を均等の全範囲と共に、および本明細書をこのような変更と共に参照することによって決定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１０−７】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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