(57)【要約】  本開示では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＡＡＤＣベクターなどのＡＡＤＣベクターに関するＡＡＤＣ発現効力（すなわち、酵素活性）を測定および分析するためのＡＡＤＣ効力アッセイを含む、ＡＡＤＣウイルスベクターに関する向上した分析ツール、システム、および方法が提示される。
2021521852.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＡＤＣウイルスベクター効力を測定する方法であって、
（ａ）ＡＡＤＣウイルスベクターを含むＡＡＶ製剤であって、前記ＡＡＤＣウイルスベクターが芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするＡＡＤＣポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターであるＡＡＶ製剤を準備する工程、
（ｂ）前記ＡＡＤＣポリヌクレオチドからＡＡＤＣポリペプチドを産生する細胞がもたらされる条件下で前記ＡＡＶ製剤を前記細胞と接触させる工程、
（ｃ）前記細胞を溶解して、前記ＡＡＤＣポリペプチドの少なくとも一部を含む細胞溶解物を形成する工程、
（ｄ）（ｉ）Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（「Ｌ−ＤＯＰＡ」）を、前記細胞溶解物中の前記ＡＡＤＣポリペプチドの少なくとも一部が、前記Ｌ−ＤＯＰＡの少なくとも一部と反応してドーパミンを産生することを可能にする条件下で、前記細胞溶解物に添加すること、
（ｉｉ）前記ＡＡＤＣポリペプチドと前記Ｌ−ＤＯＰＡとの反応後に、前記細胞溶解物中のドーパミンの量を測定すること、および
（ｉｉｉ）ドーパミン産生のＡＡＤＣウイルスベクター効力参照標準物質を準備すること、
（ｉｖ）前記ＡＡＤＣウイルスベクターの効力が測定されるように、前記ＡＡＤＣウイルスベクターを使用して産出されたドーパミンの量を前記ＡＡＤＣウイルスベクター効力参照標準物質と比較すること
によって前記ＡＡＤＣウイルスベクターの効力を決定する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記ＡＡＤＣウイルスベクター参照標準物質によって産生されたドーパミンの量が、
（ａ）ＡＡＤＣを含む細胞溶解物であって、前記細胞溶解物中の前記ＡＡＤＣが、ＡＡＤＣをコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＤＣウイルスベクター参照標準物質で形質導入された細胞によって産生されたものである細胞溶解物にＬ−ＤＯＰＡを添加すること、および
（ｂ）前記ＡＡＤＣと前記Ｌ−ＤＯＰＡとの反応後に、前記細胞溶解物中で産生されたドーパミンの量を測定すること
によって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、ＨＴ１０８０細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＴ１０８０細胞が、７×１０３〜４×１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングされる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＴ１０８０細胞が、９×１０３〜２×１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングされる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、形質導入１８〜３０時間後に回収される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、形質導入２２〜２６時間後に回収される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＡＡＤＣウイルスベクターが、約１ベクターゲノム（ｖｇ）／細胞〜約１×１０８ｖｇ／細胞の濃度で前記細胞に形質導入される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＡＡＤＣウイルスベクターが、約１０ｖｇ／細胞〜約１×１０５ｖｇ／細胞の濃度で前記細胞に形質導入される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、化学的溶解、機械的溶解、またはそれらの組合せを使用して溶解される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、化学的溶解を使用して溶解され、前記化学的溶解が、プロテアーゼ阻害剤、リン酸緩衝生理食塩水およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含む溶解緩衝液を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶解プロセスは、前記細胞を、室温で５〜２０分間３６５０〜３８００ＲＰＭで遠心分離機にて遠心する工程を含む、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＡＡＤＣ反応緩衝液が、前記Ｌ−ＤＯＰＡと共に前記細胞溶解物に添加され、前記ＡＡＤＣ反応緩衝液が、オクタンスルホン酸ナトリウム塩、リン酸一ナトリウム、およびアセトニトリルを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＡＡＤＣ反応緩衝液が、３．０〜３．５ｍＭオクタンスルホン酸ナトリウム塩、ｐＨ３．０、７２．５ｍＭリン酸一ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、および１０％アセトニトリルを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞溶解物に添加されるＬ−ＤＯＰＡの濃度が、０．０１ｍＭ〜１ｍＭである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞溶解物に添加されるＬ−ＤＯＰＡの濃度が、０．０３ｍＭである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＡＡＤＣとＬ−ＤＯＰＡとの前記反応が、３７℃で行われる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＡＡＤＣとＬ−ＤＯＰＡとの前記反応が、１０〜１２０分間行われる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＡＡＤＣとＬ−ＤＯＰＡとの前記反応が、３０分間行われる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞溶解物が、Ｌ−ＤＯＰＡとのＡＡＤＣ反応の後で２〜８℃の温度に曝露される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＡＡＤＣとＬ−ＤＯＰＡとの前記反応が、氷冷過塩素酸を添加することによってクエンチされる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記氷冷過塩素酸が、０．１Ｍ〜１Ｍの濃度で添加される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記氷冷過塩素酸が、０．５Ｍの濃度で添加される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
試料中のドーパミンの量が、電気化学検出器を有する超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ−ＥＣＤ）を使用して測定される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記試料中のドーパミンの量が、ドーパミンの量をドーパミン標準曲線と比較することによってＵＨＰＬＣ−ＥＣＤを使用して測定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記試料中のドーパミンの量が、紫外線検出器を有する超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ−ＵＶ）を使用して測定される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記試料中のドーパミンの量が、ドーパミンの量をドーパミン標準曲線と比較することによってＵＨＰＬＣ−ＵＶを使用して測定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＡＡＶベクターが、配列番号２と少なくとも８５％同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＡＡＶベクターが、配列番号２と少なくとも９０％同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＡＡＶベクターが、配列番号２と少なくとも９５％同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＡＡＶベクターが、配列番号２を含むポリヌクレオチドを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ２である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
遺伝子療法製品を作製する方法であって、
（ａ）ＡＡＶベクターを含むＡＡＶ製剤であって、前記ＡＡＶベクターが、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするＡＡＤＣポリヌクレオチドを含むＡＡＶ製剤を準備する工程、
（ｂ）請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法を使用して、前記ＡＡＶ製剤のＡＡＤＣウイルスベクター効力を測定する工程、および
（ｃ）前記ＡＡＤＣウイルスベクター効力が測定された後で前記ＡＡＶ製剤を製剤容器に好適にアリコートする工程
を含む方法。
【請求項３４】
遺伝子療法製品を作製する方法であって、前記方法が、ＡＡＶ製剤を製剤容器に好適にアリコートする工程を含み、前記ＡＡＶ製剤がＡＡＶベクターを含み、前記ＡＡＶベクターが、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするＡＡＤＣポリヌクレオチドを含み、前記製剤のＡＡＤＣウイルスベクター効力が、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法を使用して測定されている方法。
【請求項３５】
前記ＡＡＤＣウイルスベクターが、１〜５％、５〜１０％、１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３０％、３０〜３５％、３５〜４０％、４０〜４５％、４５〜５０％、５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％、７５〜８０％、８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜１００％、１００〜１０５％、１０５〜１１０％、１１０〜１１５％、１１５〜１２０％、１２０〜１２５％、１２５〜１３０％、１３０〜１３５％、１３５〜１４０％、１４０〜１４５％、１４５〜１５０％、１５０〜１５５％、１５５〜１６０％、１６０〜１６５％、１６５〜１７０％、１７０〜１７５％、１７５〜１８０％、１８０〜１８５％、１８５〜１９０％、１９０〜１９５％、１９５〜２００％のＡＡＤＣ相対効力を有する、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＡＡＤＣウイルスベクターの前記ＡＡＤＣ相対効力が、閾値ＡＡＤＣ相対効力値と比較される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＡＡＤＣ相対効力が、前記閾値ＡＡＤＣ相対効力値未満である場合、前記ＡＡＤＣウイルスベクターが破棄または放棄される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＡＡＤＣウイルスベクターが、閾値ＡＡＤＣ相対効力値と比較されるＡＡＤＣ相対効力を有し、前記ＡＡＤＣウイルスベクターの前記ＡＡＤＣ相対効力が前記閾値ＡＡＤＣ相対効力値未満である場合、前記ＡＡＤＣウイルスベクターが前記製剤容器にアリコートされない、請求項３３または請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記閾値ＡＡＤＣ相対効力値が、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％、１９５％、または２００％である、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするＡＡＤＣポリヌクレオチドを含むＡＡＤＣウイルスベクターであって、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法により測定されるＡＡＤＣ相対効力を有するＡＡＤＣウイルスベクター。
【請求項４１】
芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするＡＡＤＣポリヌクレオチドを含むＡＡＤＣウイルスベクターであって、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のＡＡＤＣウイルスベクター効力を測定する方法を含むプロセスを使用して調製されるＡＡＤＣウイルスベクター。
【請求項４２】
請求項４０または請求項４１に記載のＡＡＤＣウイルスベクターを含むＡＡＶ製剤。
【請求項４３】
芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするＡＡＤＣポリヌクレオチドを含むＡＡＤＣウイルスベクターを含むＡＡＶ製剤であって、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の方法を含むプロセスを使用して調製されるＡＡＶ製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＡＡＤＣベクターなどのＡＡＤＣベクターに関するＡＡＤＣ発現および生物学的効力（すなわち、酵素活性）を測定および分析するためのＡＡＤＣ効力アッセイを含む、ＡＡＤＣウイルスベクターに関する向上した分析ツール、システム、および方法が提示される。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病
芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）は、ドーパミンおよびセロトニンの合成に関与するホモ二量体ピリドキサールリン酸依存性酵素である。コード化タンパク質は、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡまたはレボドーパ）のドーパミンへの、Ｌ−５−ヒドロキシトリプトファンのセロトニンへの、およびＬ−トリプトファンのトリプタミンへの脱炭酸を触媒する。この遺伝子の欠損は芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ欠損症（ＡＡＤＣＤ）の原因であり、このＡＡＤＣＤは、重度の運動機能障害および自律神経機能障害をもたらすセロトニンおよびカテコールアミン複合欠損につながる神経伝達物質代謝の先天性異常である。
【０００３】
パーキンソン病（ＰＤ）は、感覚および運動症状を生じさせる中枢神経系（ＣＮＳ）の進行性神経変性疾患である。ドーパミン置換（すなわち、レボドーパ）は、ＰＤの運動障害の標準的薬物療法である。しかしながら、ドーパミン療法の利益は、部分的には、ドーパミン生成細胞が徐々に死滅し、それに応じてＡＡＤＣ活性が失われるため、経時的に顕著でなくなってしまう。更に、高用量ドーパミンの全身性投与は、中脳辺縁系のドーパミン作用性刺激に起因する、運動能力の変動、ジスキネジア、および幻覚などの副作用を併発する。ドーパミン作用性機能を回復させ、かつ副作用を最小限に抑える１つの戦略は、ＡＡＤＣをＣＮＳの標的領域に直接送達する遺伝子療法の使用である。
【０００４】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、その遺伝子発現が長期にわたること、ヘルパーウイルス無しでは自律的に複製することができないこと、分裂および非分裂細胞に形質導入することができること、および野生型感染に由来する病原性を欠如することにより、遺伝子療法の魅力的なベクターとして出現している（例えば、非特許文献１を参照）。ＡＡＶは、ディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属に属するヘルパー依存性ＤＮＡパルボウイルスである。
【０００５】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
ＡＡＶは、哺乳類細胞への遺伝子移入のために最も広く研究および利用されているウイルスベクターの１つとして出現している。例えば、非特許文献１および非特許文献２を参照されたい。これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される。
【０００６】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、治療用遺伝子送達の有望な候補であり、臨床治験において安全および効果的であることが証明されている。この目的のための向上したＡＡＶ粒子の設計および産生は、積極的に研究されている分野である。
【０００７】
パルボウイルス科ウイルスは、２つの亜科：脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科および無脊椎動物に感染するデンソウイルス亜科で構成される。パルボウイルスおよびパルボウイルス科の他のメンバーは、非特許文献３に概説されている。その内容は、本明細書において全体として参照により援用される。
【０００８】
ディペンドウイルスとしては、限定はされないが、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ、およびヒツジ種を含む脊椎動物宿主において複製可能なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のウイルスファミリーが挙げられる。
【０００９】
ＡＡＶゲノムは、およそ５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）長の線状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子である。末端逆位配列（ＩＴＲ）は、非構造タンパク質（Ｒｅｐ遺伝子によってコードされる）および構造タンパク質（カプシド遺伝子またはＣａｐ遺伝子によってコードされる）のコードヌクレオチド配列に隣接する。ＡＡＶゲノムは、エネルギー的に安定した二本鎖領域を形成するｓｓＤＮＡの５’末端および３’末端の自己相補的な末端１４５ｎｔによって規定される特徴的なＴ形ヘアピン構造を含む。二本鎖ヘアピン構造は、限定はされないが、宿主ウイルス産生細胞の内因性ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとして機能することによってＤＮＡ複製の起点として働くことを含む、複数の機能を含む。
【００１０】
Ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶゲノムの複製などの機能を調節する非構造タンパク質をコードする。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８は、一般にｐ５プロモータから転写され、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０は、一般にｐ１９プロモータから転写される。
【００１１】
Ｃａｐ遺伝子は、アセンブルされてウイルスカプシドを形成する構造タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３をコードする。Ｃａｐ遺伝子は、一般にｐ４０プロモータから転写される。ＡＡＶのカプシドタンパク質は、一般に、１つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から発現される３つのタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）を使用して四面体形態にアセンブルされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】トラトスキン（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ）ら著、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、５巻（１１号）：ｐ．３２５１〜３２６０（１９８５年）
【非特許文献２】グリム（Ｇｒｉｍｍ）ら著、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１０巻（１５号）：ｐ．２４４５〜２４５０（１９９９年）
【非特許文献３】ケネス  Ｉ．ベルン（Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｉ．Ｂｅｒｎｓ）、「パルボウイルス科：ウイルスおよびそれらの複製（Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」、フィールズ・バイロロジー（ＦＩＥＬＤＳ  ＶＩＲＯＬＯＧＹ）（第３版、１９９６年）の第６９章
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ＡＡＤＣ  ＥＬＩＳＡキットなどの、ＡＡＤＣを含むタンパク質の発現を決定する現行の方法は、タンパク濃度を測定するが、それは生物学的活性の直接的指標ではない。更に、これらの方法は、試料複製物間の変動性をもたらす場合がある。したがって、種々の試料複製物間の一貫性を提供する、ＡＡＤＣウイルスベクターの効力を測定するための向上した方法を含む、ＡＡＤＣウイルスベクターの向上した分析ツールが長年にわたって必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＡＡＤＣベクターなどのＡＡＤＣベクターに関するＡＡＤＣ発現および生物学的効力（すなわち、酵素活性）を測定および分析するためのＡＡＤＣ効力アッセイを含む、ＡＡＤＣウイルスベクターに関する向上した分析ツール、システム、および方法を提供する。
【００１５】
本開示では、ＡＡＤＣウイルスベクターに関する向上した分析ツール、システム、および方法、ならびに分析ツール、システム、および方法の向上した組合せが提示される。特定の実施形態において、分析ツール、システム、および方法は、ＡＡＤＣ効力を測定するためのＡＡＤＣ効力アッセイおよび方法である。特定の実施形態において、ＡＡＤＣ効力アッセイは、ＡＡＤＣベクター、例えばウイルスベクター、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの効力を測定する。特定の実施形態において、ＡＡＤＣ効力アッセイは、ＡＡＤＣ酵素活性に基づいて、ＡＡＤＣベクター、例えばウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターの効力を測定する。
【００１６】
特定の実施形態において、本明細書には、ＡＡＤＣウイルスベクターの効力を測定する方法であって、ＡＡＤＣをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターで形質導入された細胞から産生された細胞溶解物に、Ｌ−ＤＯＰＡを添加する工程、およびＬ−ＤＯＰＡの添加後に細胞溶解物にて産生されたドーパミンの量を測定する工程を含む方法が提供される。別の実施形態において、本明細書では、ＡＡＤＣ  ＡＡＶベクターの効力を測定する方法であって、ＡＡＤＣをコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターで形質導入された細胞から産生された細胞溶解物に、Ｌ−ＤＯＰＡを添加する工程、およびＬ−ＤＯＰＡの添加後に細胞溶解物にて産生されたドーパミンの量を測定する工程を含む方法が提供される。特定の実施形態において、ＡＡＤＣは、ヒトＡＡＤＣである。特定の実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ２である。
【００１７】
また、本明細書では、ＡＡＤＣウイルスベクターの効力を決定する方法であって、ＡＡＤＣをコードするポリヌクレオチドを含む第１のウイルスベクターで形質導入された細胞から産生された細胞溶解物に、Ｌ−ＤＯＰＡを添加する工程、Ｌ−ＤＯＰＡの添加後に細胞溶解物にて産生されたドーパミンの量を測定する工程、および産生されたドーパミンの量を、ウイルスベクター参照標準物質を利用した場合に産生されたドーパミンの量と比較して、第１のウイルスベクターの相対効力を決定する工程を含む方法が提供される。特定の実施形態において、本明細書には、ＡＡＤＣ  ＡＡＶベクターの効力を決定する方法であって、ＡＡＤＣをコードするポリヌクレオチドを含む第１のＡＡＶベクターで形質導入された細胞から産生された細胞溶解物に、Ｌ−ＤＯＰＡを添加する工程、Ｌ−ＤＯＰＡの添加後に細胞溶解物にて産生されたドーパミンの量を測定する工程、および産生されたドーパミンの量を、ＡＡＶベクター参照標準物質を利用した場合に産生されたドーパミンの量と比較して、第１のＡＡＶベクターの相対効力を決定する工程を含む方法が提供される。特定の実施形態において、ＡＡＤＣは、ヒトＡＡＤＣである。特定の実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ２である。
【００１８】
一部の実施形態において、ウイルスベクター参照標準物質、例えばＡＡＶベクター参照標準物質によって産生されたドーパミンの量は、ＡＡＤＣをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターで形質導入された細胞から産生された細胞溶解物に、Ｌ−ＤＯＰＡを添加すること、およびＬ−ＤＯＰＡの添加後に細胞溶解物にて産生されたドーパミンの量を測定することによって決定される。特定の実施形態において、ＡＡＤＣは、ヒトＡＡＤＣである。特定の実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ２である。
【００１９】
一部の実施形態において、本明細書で提示されたアッセイおよび方法に利用される細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、肉腫細胞である。他の実施形態において、細胞は、線維肉腫細胞である。特定の実施形態において、細胞は、初代細胞または初代細胞培養物である。特定の実施形態において、細胞は、細胞株である。具体的な実施形態において、細胞は、ＨＴ１０８０細胞である。
【００２０】
一部の実施形態において、細胞は、１×１０２細胞／ウェル〜１×１０６細胞／ウェルの密度でプレーティングされる。具体的な実施形態において、細胞は、１×１０３細胞／ウェル〜１×１０６細胞／ウェルの密度でプレーティングされる。一部の実施形態において、細胞は、１×１０３細胞／ウェル〜１×１０５細胞／ウェルの密度でプレーティングされる。具体的な実施形態において、細胞は、１〜９×１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングされる。具体的な実施形態において、細胞は、１〜５×１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングされる。具体的な実施形態において、細胞は、１×１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングされる。
【００２１】
特定の実施形態において、例えば、多プレートフォーマットが利用される場合、プレーティングされた細胞の密度は、１ｃｍ２当たりを基準にして調整することができる。特定の実施形態において、細胞は、約３×１０２細胞／ｃｍ２〜約３×１０８細胞／ｃｍ２、例えば、約３×１０２細胞／ｃｍ２〜約３×１０５細胞／ｃｍ２、または３×１０３細胞／ｃｍ２〜約３×１０６細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングされる。
【００２２】
特定の実施形態において、ＡＡＤＣウイルスベクターは、約１ｖｇ／細胞〜約１×１０８ｖｇ／細胞の濃度で細胞に形質導入される。一部の実施形態において、ＡＡＤＣウイルスベクターは、約１０ｖｇ／細胞〜約１×１０５ｖｇ／細胞の濃度で細胞に形質導入される。
【００２３】
一部の実施形態において、細胞は、形質導入の４４〜５２時間後に回収される。一部の実施形態において、ＡＡＤＣウイルスベクターは、１×１０６ｖｇ／μＬ〜１×１０１１ｖｇ／μＬの濃度で細胞に形質導入される。一部の実施形態において、ＡＡＤＣウイルスベクターは、５×１０６ｖｇ／μＬ〜５×１０１０ｖｇ／μＬの濃度で細胞に形質導入される。一部の実施形態において、ＡＡＤＣウイルスベクターは、１×１０７ｖｇ／μＬ〜１×１０１０ｖｇ／μＬの濃度で細胞に形質導入される。一部の実施形態において、ＡＡＤＣウイルスベクターは、２×１０７ｖｇ／μＬ〜２×１０１０ｖｇ／μＬの濃度で細胞に形質導入される。一部の実施形態において、ＡＡＤＣ  ＡＡＶベクターは、１×１０６ｖｇ／μＬ〜１×１０１１ｖｇ／μＬの濃度で細胞に形質導入される。一部の実施形態において、ＡＡＤＣ  ＡＡＶベクターは、５×１０６ｖｇ／μＬ〜５×１０１０ｖｇ／μＬの濃度で細胞に形質導入される。一部の実施形態において、ＡＡＤＣ  ＡＡＶベクターは、１×１０７ｖｇ／μＬ〜１×１０１０ｖｇ／μＬの濃度で細胞に形質導入される。一部の実施形態において、ＡＡＤＣ  ＡＡＶベクターは、２×１０７ｖｇ／μＬ〜２×１０１０ｖｇ／μＬの濃度で細胞に形質導入される。
【００２４】
一部の実施形態において、細胞溶解物がそれらから作製される細胞は、形質導入の１８〜７２時間後に回収される。一部の実施形態において、細胞は、形質導入の２４時間後に回収される。一部の実施形態において、細胞は、形質導入の３６時間後に回収される。一部の実施形態において、細胞は、形質導入の４８時間後に回収される。
【００２５】
一部の実施形態において、細胞溶解物は、化学的および／または機械的溶解を使用して溶解された細胞から形成される。一部の実施形態において、化学的溶解は、プロテアーゼ阻害剤、緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水、および界面活性剤、例えば非イオン性界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含む溶解緩衝液を使用することを含む。一部の実施形態において、溶解プロセスには、細胞を遠心分離して、例えば３７５０ＲＰＭ（毎分回転数）で１０分間室温にて遠心分離して、溶解物を清澄化し、残渣を除去することが関与する。
【００２６】
一部の実施形態において、ＡＡＤＣ反応緩衝液が、Ｌ−ＤＯＰＡと共に細胞溶解物に添加される。特定の実施形態において、ＡＡＤＣ反応緩衝液は、緩衝液、例えば、リン酸ナトリウム緩衝液、例えば５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液などのリン酸緩衝液を含む。一部の実施形態において、ＡＡＤＣ反応緩衝液は、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、アスコルビン酸、ピリドキサル−５’−ホスフェート  ＤＬ−ジチオトレイトール、ＥＤＴＡ、およびパルギリンを含む。一部の実施形態において、ＡＡＤＣ反応緩衝液は、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２、０．１ｍＭアスコルビン酸、０．１ｍＭピリドキサル−５’−ホスフェート、１ｍＭ  ＤＬ−ジチオトレイトール、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１ｍＭパルギリンを含む。一部の実施形態において、ＡＡＤＣ反応緩衝液は、オクタンスルホン酸ナトリウム塩、リン酸一ナトリウム、およびアセトニトリルを含む。一部の実施形態において、ＡＡＤＣ反応緩衝液は、３．０ｍＭ、３．２ｍＭまたは３．５ｍＭオクタンスルホン酸ナトリウム塩、ｐＨ３．０、７２．５ｍＭリン酸一ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、および１０％アセトニトリルを含む。一部の実施形態において、ＡＡＤＣ反応緩衝液は、３．０〜４．０ｍＭ、３．０〜．３．７ｍＭ、３．０〜３．５ｍＭ、３．０〜．３．２ｍＭ、３．０ｍＭ、３．１ｍＭ、３．２ｍＭ、３．３ｍＭ、３．４ｍＭ、３．５ｍＭ、３．６ｍＭ、３．７ｍＭ、３．８ｍＭ、３．９ｍＭ、または４．０ｍＭを含む。
【００２７】
一部の実施形態において、細胞溶解物に添加されるＬ−ＤＯＰＡの濃度は、０．１ｍＭ〜１００ｍＭである。特定の実施形態において、細胞溶解物に添加されるＬ−ＤＯＰＡの濃度は、０．１ｍＭ〜５０ｍＭである。特定の実施形態において、細胞溶解物に添加されるＬ−ＤＯＰＡの濃度は、０．１ｍＭ〜１ｍＭである。特定の実施形態において、細胞溶解物に添加されるＬ−ＤＯＰＡの濃度は、５ｍＭ〜３０ｍＭである。一部の実施形態において、細胞溶解物に添加されるＬ−ＤＯＰＡの濃度は、０．３ｍＭである。一部の実施形態において、細胞溶解物に添加されるＬ−ＤＯＰＡの濃度は、２０ｍＭである。
【００２８】
一部の実施形態において、Ｌ−ＤＯＰＡとのＡＡＤＣの反応は、３７℃で行われる。一部の実施形態において、Ｌ−ＤＯＰＡとのＡＡＤＣの反応は、約１０〜１２０分間行われる。一部の実施形態において、Ｌ−ＤＯＰＡとのＡＡＤＣの反応は、約１０〜９０分間行われる。一部の実施形態において、Ｌ−ＤＯＰＡとのＡＡＤＣの反応は、約２０〜６０分間行われる。一部の実施形態において、Ｌ−ＤＯＰＡとのＡＡＤＣの反応は、約３０±１〜３分間行われる。具体的な実施形態において、Ｌ−ＤＯＰＡとのＡＡＤＣの反応は、３７℃にて約３０±１〜３分間行われる。
【００２９】
一部の実施形態において、Ｌ−ＤＯＰＡとのＡＡＤＣの反応は、過塩素酸で、例えば氷冷過塩素酸を添加することによってクエンチされる。一部の実施形態において、過塩素酸、例えば氷冷過塩素酸は、０．１Ｍ〜１Ｍの濃度で添加される。一部の実施形態において、過塩素酸、例えば氷冷過塩素酸は、０．５Ｍの濃度で添加される。
【００３０】
一部の実施形態において、産生されたドーパミンの量は、クロマトグラフィー、例えば高速液体クロマトグラフィーなどの液体クロマトグラフィーを使用して測定される。特定の実施形態において、産生されたドーパミンの量は、電気化学検出器を有する超高速液体クロマトグラフィー（「ＵＨＰＬＣ−ＥＣＤ」）を使用して測定される。一部の実施形態において、産生されたドーパミンの量は、ドーパミンの量をドーパミン標準曲線と比較することによって、ＵＨＰＬＣ−ＥＣＤを使用して測定される。特定の実施形態において、産生されたドーパミンの量は、紫外線検出器を有する超高速液体クロマトグラフィー（「ＵＨＰＬＣ−ＵＶ」）を使用して測定される。一部の実施形態において、産生されたドーパミンの量は、ドーパミンの量をドーパミン標準曲線と比較することによって、ＵＨＰＬＣ−ＵＶを使用して測定される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＡＡＶ２．ＡＡＤＣベクターによるＨＴ１０８０細胞の形質導入に対するインビトロ用量応答曲線を示す図である。
【図２】９６ウェルプレートを使用したＨＴ１０８０細胞の形質導入に対するインビトロ用量応答曲線を示す図である。
【図３】参照標準物質ＡＡＶ２．ＡＡＤＣの分析のアッセイ間変動性を示す図である。
【図４Ａ】３つの異なる温度におけるドーパミン産生の動力学（挿入図は、２〜８℃と比較した室温での相対的ドーパミン生成である）を実証する図である。
【図４Ｂ】上部基線の変動性がより少ないことを示すＡＡＶ２．ＡＡＤＣの酵素アッセイを実証する図である。
【図４Ｃ】ＨＥＫ２９３／三重トランスフェクト哺乳類細胞で産生されたＡＡＤＣウイルスＡＡＶベクターおよびＳｆ９／バキュロウイルス昆虫細胞で産生されたＡＡＤＣウイルスＡＡＶベクターでのＡＡＤＣ活性が同等であることを示す酵素アッセイの使用を実証する図である。
【図５Ａ】標準曲線およびドーパミン標準曲線のクロマトグラムを示す図である。
【図５Ｂ】標準曲線およびドーパミン標準曲線のクロマトグラムを示す図である。
【図６】３ヵ月間離して融解し、２〜８℃で保管したＡＡＶ２．ＡＡＤＣ参照標準物質の２つのバイアルの酵素活性の比較を示す図である。
【図７】熱処理試料と、ＵＶ処理試料と、未処理試料との間の酵素活性の比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本出願は、ウイルスベクターの効力を測定する方法を提供する。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、目的の分子をコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本出願は、ウイルスベクターの効力を測定する方法であって、ウイルスベクターは、目的の分子の活性に基づいて、目的の分子をコードするポリヌクレオチドを含む方法を提供する。
【００３３】
本方法の一部の実施形態において、ウイルスベクターは、目的のタンパク質の酵素活性に基づいて、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、目的のタンパク質は、ＡＡＤＣである。一部の実施形態において、本出願は、ＡＡＤＣ酵素活性に基づいて、ＡＡＤＣウイルスベクターの効力を測定する方法を提供する。
【００３４】
Ｉ．組成物
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびＡＡＶ粒子
パルボウイルス科のウイルスは、一本鎖ＤＮＡゲノムによって特徴付けられる小型非エンベロープ二十面体カプシドウイルスである。パルボウイルス科ウイルスは、２つの亜科：脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科および無脊椎動物に感染するデンソウイルス亜科で構成される。このウイルスファミリーは、その構造が比較的単純であり、標準的分子生物学技法を使用して容易に操られるため、生物学的ツールとして有用である。ウイルスのゲノムは、所望のペイロードが担持されているかまたは所望のペイロードを発現もしくは送達するように操作されている機能的組換えウイルスまたはウイルス粒子をアセンブリするための最低限の成分を含有するように改変することができ、所望のペイロードを、標的細胞、組織、臓器、または生物に送達することができる。
【００３５】
パルボウイルスおよびパルボウイルス科の他のメンバーは、ケネス  Ｉ．ベルン（Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｉ．Ｂｅｒｎｓ）、「パルボウイルス科：ウイルスおよびそれらの複製（Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」、フィールズ・バイロロジー（ＦＩＥＬＤＳ  ＶＩＲＯＬＯＧＹ）（第３版、１９９６年）の第６９章に概説されている。その内容は全体として参照により援用される。
【００３６】
パルボウイルス科は、限定はされないが、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ、およびヒツジ種を含む脊椎動物宿主において複製可能なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含むディペンドウイルス属を含む。
【００３７】
ベクターゲノムは、およそ５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）長の線状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子である。ＡＡＶウイルスゲノムは、ペイロード領域および少なくとも１つの末端逆位配列（ＩＴＲ）またはＩＴＲ領域を含み得る。ＩＴＲは、伝統的には、非構造タンパク質（Ｒｅｐ遺伝子によってコードされる）および構造タンパク質（カプシド遺伝子またはＣａｐ遺伝子によってコードされる）のコードヌクレオチド配列に隣接する。理論によって束縛されることを望むものではないが、ＡＡＶウイルスゲノムは、典型的には、２つのＩＴＲ配列を含む。ベクターゲノムは、エネルギー的に安定した二本鎖領域を形成するｓｓＤＮＡの５’末端および３’末端の自己相補的な末端１４５ｎｔによって規定される特徴的なＴ形ヘアピン構造を含む。二本鎖ヘアピン構造は、限定はされないが、宿主ウイルス複製細胞の内因性ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとして機能することによってＤＮＡ複製の起点として働くことを含む、複数の機能を含む。
【００３８】
コード化異種性ペイロードに加えて、ＡＡＶ粒子は、全体または一部が、任意の天然に存在するおよび／または組換えのＡＡＶ血清型ヌクレオチド配列またはバリアントのウイルスゲノムを含み得る。ＡＡＶバリアントは、概して物理的および機能的等価物であるコンストラクトを産生し、同様の機序によって複製し、および同様の機序によってアセンブルするように、核酸レベル（ゲノムまたはカプシド）およびアミノ酸レベル（カプシド）において有意に相同性である配列を有し得る。チオリニ（Ｃｈｉｏｒｉｎｉ）ら著、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒ．）、第７１巻、ｐ．６８２３〜３３（１９９７年）；スリバスタバ（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ）ら著、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒ）、第４５巻、ｐ．５５５〜６４（１９８３年）；チオリニ（Ｃｈｉｏｒｉｎｉ）ら著、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒ）、第７３巻、ｐ．１３０９〜１３１９（１９９９年）；ラトリッジ（Ｒｕｔｌｅｄｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒ）、第７２巻、ｐ．３０９〜３１９（１９９８年）；およびウー（Ｗｕ）ら著、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒ）、第７４巻、ｐ．８６３５〜４７（２０００年）。これらの各々の内容は、本明細書において全体として参照により援用される。
【００３９】
一実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子は、複製欠損型である組換えＡＡＶ粒子であり、それらのウイルスゲノム内に機能的ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードする配列を欠如する。これらの欠損ＡＡＶ粒子は、ほとんどのまたは全ての親コード配列を欠如してもよく、本質的に、１つまたは２つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列および細胞、組織、臓器または生物に送達するための目的の核酸のみを有していてもよい。
【００４０】
一実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは、そこにコードされたコード配列の複製、転写および翻訳を提供する少なくとも１つの制御エレメントを含む。コード配列が適切な宿主細胞中で複製、転写および／または翻訳されることが可能である限り、制御エレメントは全てが常に存在する必要があるわけではない。発現制御エレメントの非限定的な例としては、転写開始および／もしくは終結のための配列、プロモータおよび／もしくはエンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的ＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定させる配列、翻訳有効性を増強する配列（例えば、コザックコンセンサス配列）、タンパク質安定性を増強する配列、ならびに／またはタンパク質プロセシングおよび／もしくは分泌を増強する配列が挙げられる。
【００４１】
本開示によれば、療法および／または診断に使用されるＡＡＶ粒子は、目的の核酸ペイロードまたはカーゴの形質導入に必要な最低限の成分へと純化または縮小されているウイルスを含む。このように、ＡＡＶ粒子は、野生型ウイルスに見られる有害な複製および／または組込み特徴を欠きながらも、特異的送達媒体として操作される。
【００４２】
本開示のＡＡＶ粒子は、組換え的に産生されてもよく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）親または参照配列に基づいていてもよい。本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、本明細書に記載される核酸などの異種分子を輸送し、形質導入し、またはその他担体として働く任意の分子または部分を意味する。
【００４３】
一本鎖ＡＡＶ粒子（例えば、ｓｓＡＡＶ）に加えて、本開示はまた、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）粒子も提供する。ｓｃＡＡＶ粒子は、共にアニーリングして二本鎖ＤＮＡを形成するＤＮＡ鎖を含有する。第２鎖の合成をスキップすることにより、ｓｃＡＡＶは、細胞において迅速に発現することが可能である。
【００４４】
一実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子はｓｃＡＡＶである。
一実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子はｓｓＡＡＶである。
ＡＡＶ粒子を作製および／または修飾する方法は、シュードタイプＡＡＶ粒子など、当該技術分野において開示されている（国際公開第２０００２８００４号パンフレット、同第２００１２３００１号パンフレット、同第２００４１１２７２７号パンフレット、同第２００５００５６１０号パンフレットおよび同第２００５０７２３６４号パンフレット、これらの各々の内容は全体として参照により本明細書に援用される）。
【００４５】
ＡＡＶ粒子は、送達効率が増強されるように改変されてもよい。かかる改変されたＡＡＶ粒子は、効率的にパッケージングすることができ、高頻度でおよび最低限の毒性で標的細胞への感染を成功させるために使用することができる。一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子のカプシドは、米国特許出願公開第２０１３０１９５８０１号明細書に記載される方法に従って操作される。この内容は、本明細書において全体として参照によって援用される。
【００４６】
一実施形態において、本開示のポリペプチドをコードするペイロード領域を含むＡＡＶ粒子は、哺乳類細胞に導入することができる。
ウイルスゲノム成分：末端逆位反復配列（ＩＴＲ）
本開示のＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＩＴＲ領域とペイロード領域とを有するウイルスゲノムを含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲを有する。これらの２つのＩＴＲは５’末端および３’末端でペイロード領域に隣接する。ＩＴＲは、複製のための認識部位を含む複製起点として働く。ＩＴＲは、相補的でかつ対称に配置され得る配列領域を含む。本開示のウイルスゲノムに組み込まれるＩＴＲは、天然に存在するポリヌクレオチド配列または組換え的に誘導されたポリヌクレオチド配列を含み得る。
【００４７】
ＩＴＲは、カプシドと同じ血清型に由来してもよい。ＩＴＲはカプシドと異なる血清型であってもよい。一実施形態において、ＡＡＶ粒子は２つ以上のＩＴＲを有する。非限定的な例では、ＡＡＶ粒子は、２つのＩＴＲを含むウイルスゲノムを有する。一実施形態において、ＩＴＲは互いに同じ血清型である。別の実施形態において、ＩＴＲは異なる血清型である。非限定的な例としては、ＩＴＲのうちゼロ個、一方または両方がカプシドと同じ血清型を有することが挙げられる。一実施形態において、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムの両方のＩＴＲがＡＡＶ２  ＩＴＲである。
【００４８】
独立に、各ＩＴＲは約１００〜約１５０ヌクレオチド長であってもよい。ＩＴＲは、約１００〜１０５ヌクレオチド長、１０６〜１１０ヌクレオチド長、１１１〜１１５ヌクレオチド長、１１６〜１２０ヌクレオチド長、１２１〜１２５ヌクレオチド長、１２６〜１３０ヌクレオチド長、１３１〜１３５ヌクレオチド長、１３６〜１４０ヌクレオチド長、１４１〜１４５ヌクレオチド長または１４６〜１５０ヌクレオチド長であってもよい。一実施形態において、ＩＴＲは１４０〜１４２ヌクレオチド長である。ＩＴＲ長さの非限定的な例は、１０２、１４０、１４１、１４２、１４５ヌクレオチド長、およびそれと少なくとも９５％の同一性を有するものである。
【００４９】
ウイルスゲノム成分：プロモータ
一実施形態において、ウイルスゲノムのペイロード領域は、トランス遺伝子標的特異性および発現を増強する少なくとも１つのエレメントを含む（例えば、パウエル（Ｐｏｗｅｌｌ）ら著、「遺伝子療法におけるトランス遺伝子標的特異性および発現を増強するウイルス発現カセットエレメント（Ｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  Ｅｎｈａｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」、２０１５年を参照のこと；この内容は本明細書において全体として参照により援用される）。トランス遺伝子標的特異性および発現を増強するエレメントの非限定的な例としては、プロモータ、内因性ｍｉＲＮＡ、転写後調節エレメント（ＰＲＥ）、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列および上流エンハンサー（ＵＳＥ）、ＣＭＶエンハンサーおよびイントロンが挙げられる。
【００５０】
当業者であれば、標的細胞中での本開示のポリペプチドの発現には、限定はされないが、種特異的な、誘導可能な、組織特異的な、または細胞周期特異的なプロモータを含む、特異的なプロモータが必要とされ得ることを認識し得る（パー（Ｐａｒｒ）ら著、ネイチャー・メディシン（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．）、第３巻、ｐ．１１４５〜９（１９９７年）；この内容は本明細書において全体として参照により援用される）。
【００５１】
一実施形態において、プロモータは、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムのペイロード領域にコードされたポリペプチドの発現をドライブする場合、有効とみなされる。非限定的な例として、そのポリペプチドはＡＡＤＣである。
【００５２】
一実施形態において、プロモータは、標的とされている細胞中で発現をドライブする場合、有効とみなされるプロモータである。
一実施形態において、プロモータは、標的とされている細胞に向性を有するプロモータである。
【００５３】
一実施形態において、プロモータは、標的組織においてペイロードの発現をある期間ドライブする。プロモータによりドライブされた発現は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、３週間、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月、１年、１３ヵ月、１４ヵ月、１５ヵ月、１６ヵ月、１７ヵ月、１８ヵ月、１９ヵ月、２０ヵ月、２１ヵ月、２２ヵ月、２３ヵ月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年または１０年超の期間であってもよい。発現は、１〜５時間、１〜１２時間、１〜２日、１〜５日、１〜２週間、１〜３週間、１〜４週間、１〜２ヵ月、１〜４ヵ月、１〜６ヵ月、２〜６ヵ月、３〜６ヵ月、３〜９ヵ月、４〜８ヵ月、６〜１２ヵ月、１〜２年、１〜５年、２〜５年、３〜６年、３〜８年、４〜８年または５〜１０年であってもよい。非限定的な例として、プロモータは、神経組織においてペイロードを持続的に発現させる弱いプロモータである。
【００５４】
一実施形態において、プロモータは、少なくとも１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１１年、１２年、１３年、１４年、１５年、１６年、１７年、１８年、１９年、２０年、２１年、２２年、２３年、２４年、２５年、２６年、２７年、２８年、２９年、３０年、３１年、３２年、３３年、３４年、３５年、３６年、３７年、３８年、３９年、４０年、４１年、４２年、４３年、４４年、４５年、４６年、４７年、４８年、４９年、５０年、５５年、６０年、６５年、または６５年超にわたって、本開示のポリペプチドの発現をドライブする。
【００５５】
プロモータは、天然に存在してもよくまたは天然に存在しなくともよい。プロモータの非限定的な例としては、ウイルスプロモータ、植物プロモータおよび哺乳類プロモータが挙げられる。一部の実施形態において、プロモータは、ヒトプロモータであってもよい。一部の実施形態において、プロモータは、トランケート型であってもよい。
【００５６】
ほとんどの組織で発現をドライブまたは促進するプロモータとしては、限定はされないが、ヒト伸長因子１α−サブユニット（ＥＦ１α）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサーおよび／もしくはプロモータ、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）およびその誘導体ＣＡＧ、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、またはユビキチンＣ（ＵＢＣ）が挙げられる。限定はされないが、筋肉特異的プロモータ、Ｂ細胞プロモータ、単球プロモータ、白血球プロモータ、マクロファージプロモータ、膵腺房細胞プロモータ、内皮細胞プロモータ、肺組織プロモータ、アストロサイトプロモータ、またはニューロン、アストロサイト、もしくはオリゴデンドロサイトに発現を制限するために使用することができる神経系プロモータなど、組織特異的発現エレメントを使用して、発現を特定の細胞型に限定することができる。
【００５７】
筋肉特異的プロモータの非限定的な例としては、哺乳類筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ、哺乳類デスミン（ＤＥＳ）プロモータ、哺乳類トロポニンＩ（ＴＮＮＩ２）プロモータ、および哺乳類骨格筋型アルファ−アクチン（ＡＳＫＡ）プロモータ（例えば、米国特許出願公開第２０１１０２１２５２９号明細書を参照。その内容は本明細書において全体として参照により援用される）。
【００５８】
ニューロンの組織特異的発現エレメントの非限定的な例としては、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来増殖因子Ｂ鎖（ＰＤＧＦ−β）、シナプシン（Ｓｙｎ）、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）、代謝調節型グルタミン酸受容体２（ｍＧｌｕＲ２）、ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）または重鎖（ＮＦＨ）、β−グロビンミニ遺伝子ｎβ２、プレプロエンケファリン（ＰＰＥ）、エンケファリン（Ｅｎｋ）および興奮性アミノ酸トランスポーター２（ＥＡＡＴ２）プロモータが挙げられる。アストロサイトに対する組織特異的発現エレメントの非限定的な例としては、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびＥＡＡＴ２プロモータが挙げられる。オリゴデンドロサイトに対する組織特異的発現エレメントの非限定的な例としては、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモータが挙げられる。
【００５９】
一実施形態において、プロモータは１ｋｂ未満であってもよい。プロモータは、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００または８００ヌクレオチド超の長さを有してもよい。プロモータは、２００〜３００、２００〜４００、２００〜５００、２００〜６００、２００〜７００、２００〜８００、３００〜４００、３００〜５００、３００〜６００、３００〜７００、３００〜８００、４００〜５００、４００〜６００、４００〜７００、４００〜８００、５００〜６００、５００〜７００、５００〜８００、６００〜７００、６００〜８００または７００〜８００の長さを有してもよい。
【００６０】
一実施形態において、プロモータは、限定はされないが、ＣＭＶおよびＣＢＡなど、同じまたは異なる開始または親プロモータの２つ以上の成分の組合せであってもよい。各成分は、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００または８００超の長さを有してもよい。各成分は、２００〜３００、２００〜４００、２００〜５００、２００〜６００、２００〜７００、２００〜８００、３００〜４００、３００〜５００、３００〜６００、３００〜７００、３００〜８００、４００〜５００、４００〜６００、４００〜７００、４００〜８００、５００〜６００、５００〜７００、５００〜８００、６００〜７００、６００〜８００または７００〜８００の長さを有してもよい。一実施形態において、プロモータは、３８２ヌクレオチドＣＭＶエンハンサー配列と２６０ヌクレオチドＣＢＡプロモータ配列との組合せである。
【００６１】
一実施形態において、ウイルスゲノムはユビキタスプロモータを含む。ユビキタスプロモータの非限定的な例としては、ＣＭＶ、ＣＢＡ（誘導体ＣＡＧ、ＣＢｈ等を含む）、ＥＦ−１α、ＰＧＫ、ＵＢＣ、ＧＵＳＢ（ｈＧＢｐ）、およびＵＣＯＥ（ＨＮＲＰＡ２Ｂ１−ＣＢＸ３のプロモータ）が挙げられる。
【００６２】
ユー（Ｙｕ）ら（モレキュラー・ペイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｉｎ）、２０１１年、第７巻、ｐ．６３；これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）は、レンチウイルスベクターを使用してラットＤＲＧ細胞および初代ＤＲＧ細胞におけるＣＡＧ、ＥＦＩα、ＰＧＫおよびＵＢＣプロモータ下のｅＧＦＰの発現を評価し、ＵＢＣが他の３つのプロモータよりも弱い発現を示し、全てのプロモータについてわずか１０〜１２％のグリア細胞発現しか見られなかったことを見出した。セーデルブロム（Ｓｏｄｅｒｂｌｏｍ）ら（イー・ニューロ（Ｅ．Ｎｅｕｒｏ）、２０１５年；これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）は、運動皮質における注射後のＣＭＶおよびＵＢＣプロモータを含むＡＡＶ８およびＣＭＶプロモータを含むＡＡＶ２におけるｅＧＦＰの発現を評価した。ＵＢＣまたはＥＦＩαプロモータを含むプラスミドの鼻腔内投与は、ＣＭＶプロモータによる発現よりも高い持続的気道発現を示した（例えば、ギル（Ｇｉｌｌ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、２００１年、第８巻、ｐ．１５３９〜１５４６（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）を参照のこと）。フセイン（Ｈｕｓａｉｎ）ら（ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、２００９年；これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）は、ｈＧＵＳＢプロモータ、ＨＳＶ−１ＬＡＴプロモータおよびＮＳＥプロモータを含むＨβＨコンストラクトを評価し、このＨβＨコンストラクトがマウス脳においてＮＳＥよりも弱い発現を示したことを見出した。パッシーニ（Ｐａｓｓｉｎｉ）およびウォルフ（Ｗｏｌｆｅ）（ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、２００１年、ｐ．１２３８２〜１２３９２、これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）は、新生仔マウスにおける脳室内注射後のＨβＨベクターの長期効果を評価し、少なくとも１年間にわたり持続的発現があったことを見出した。スー（Ｘｕ）ら（ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、２００１年、第８巻、ｐ．１３２３〜１３３２；これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）により、ＮＦＬおよびＮＦＨプロモータを使用したとき、ＣＭＶ−ｌａｃＺ、ＣＭＶ−ｌｕｃ、ＥＦ、ＧＦＡＰ、ｈＥＮＫ、ｎＡＣｈＲ、ＰＰＥ、ＰＰＥ＋ｗｐｒｅ、ＮＳＥ（０．３ｋｂ）、ＮＳＥ（１．８ｋｂ）およびＮＳＥ（１．８ｋｂ＋ｗｐｒｅ）と比較して全ての脳領域で低発現が見出された。スー（Ｘｕ）らは、プロモータ活性が、降順に、ＮＳＥ（１．８ｋｂ）、ＥＦ、ＮＳＥ（０．３ｋｂ）、ＧＦＡＰ、ＣＭＶ、ｈＥＮＫ、ＰＰＥ、ＮＦＬおよびＮＦＨであることを見出した。ＮＦＬは６５０ヌクレオチドプロモータであり、ＮＦＨは９２０ヌクレオチドプロモータであり、両方とも肝臓には存在しないが、ＮＦＨは固有受容感覚ニューロン、脳および脊髄に豊富にあり、ＮＦＨは心臓に存在する。ＳＣＮ８Ａは、ＤＲＧ、脊髄および脳全体にわたって発現する４７０ヌクレオチドプロモータであり、特に海馬ニューロンおよび小脳プルキンエ細胞、皮質、視床および視床下部に高発現が見られる（例えば、ドレウス（Ｄｒｅｗｓ）ら著、「ナトリウムチャネル遺伝子ＳＣＮ８Ａにおける、進化的に保存された機能性非コードエレメントの同定」（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｇｅｎｅ  ＳＣＮ８Ａ）、マンマリアン・ゲノム（Ｍａｍｍ  Ｇｅｎｏｍｅ）（２００７年）、第１８巻、ｐ．７２３〜７３１；およびレイモンド（Ｒａｙｍｏｎｄ）ら著、「選択的スプライスによるナトリウムチャネルα−サブユニット遺伝子の発現」（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  Ｓｐｌｉｃｅｄ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈａｎｎｅｌ  α−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｇｅｎｅｓ）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２００４年、２７９（４４）、ｐ．４６２３４〜４６２４１を参照のこと；この各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）。
【００６３】
前述のユー（Ｙｕ）、セーデルブロム（Ｓｏｄｅｒｂｌｏｍ）、ギル（Ｇｉｌｌ）、フセイン（Ｈｕｓａｉｎ）、パッシーニ（Ｐａｓｓｉｎｉ）、スー（Ｘｕ）、ドレウス（Ｄｒｅｗｓ）またはレイモンド（Ｒａｙｍｏｎｄ）によって教示されるプロモータはいずれも、本開示に使用することができる。
【００６４】
一実施形態において、プロモータは細胞特異的ではない。
一実施形態において、プロモータはユビキチンｃ（ＵＢＣ）プロモータである。ＵＢＣプロモータは、３００〜３５０ヌクレオチドのサイズを有し得る。非限定的な例として、ＵＢＣプロモータは３３２ヌクレオチドである。
【００６５】
一実施形態において、プロモータは、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータである。ＧＵＳＢプロモータは、３５０〜４００ヌクレオチドのサイズを有し得る。非限定的な例として、ＧＵＳＢプロモータは３７８ヌクレオチドである。
【００６６】
一実施形態において、プロモータはニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）プロモータである。ＮＦＬプロモータはサイズが６００〜７００ヌクレオチドであり得る。非限定的な例として、ＮＦＬプロモータは６５０ヌクレオチドである。
【００６７】
一実施形態において、プロモータはニューロフィラメント重鎖（ＮＦＨ）プロモータである。ＮＦＨプロモータはサイズが９００〜９５０ヌクレオチドであり得る。非限定的な例として、ＮＦＨプロモータは９２０ヌクレオチドである。
【００６８】
一実施形態において、プロモータはＳＣＮ８Ａプロモータである。ＳＣＮ８Ａプロモータはサイズが４５０〜５００ヌクレオチドであり得る。非限定的な例として、ＳＣＮ８Ａプロモータは４７０ヌクレオチドである。
【００６９】
一実施形態において、プロモータは、フラタキシン（ＦＸＮ）プロモータである。ＦＸＮプロモータは、ＦＲＤＡプロモータと呼ばれる場合もある。
一実施形態において、プロモータは、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモータである。
【００７０】
一実施形態において、プロモータは、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモータである。
一実施形態において、プロモータは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータである。
【００７１】
一実施形態において、プロモータは、Ｈ１プロモータである。
一実施形態において、プロモータは、操作されたプロモータである。
一実施形態において、プロモータは、肝臓または骨格筋プロモータである。肝臓プロモータの非限定的な例としては、ヒトα−１−抗トリプシン（ｈＡＡＴ）およびチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）が挙げられる。骨格筋プロモータの非限定的な例としては、デスミン、ＭＣＫまたは合成Ｃ５−１２が挙げられる。
【００７２】
一実施形態において、プロモータは、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモータである。非限定的な例として、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモータはＵ６である。非限定的な例として、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモータはＨ１である。
【００７３】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのプロモータを含む。非限定的な例として、プロモータは、ＥＦ１αプロモータおよびＣＭＶプロモータである。
一実施形態において、ウイルスゲノムは、エンハンサーエレメント、プロモータおよび／または５’ＵＴＲイントロンを含む。また、エンハンサーエレメントは、本明細書では「エンハンサー」とも称され、限定はされないが、ＣＭＶエンハンサーであってもよく、プロモータは、限定はされないが、ＣＭＶ、ＣＢＡ、ＵＢＣ、ＧＵＳＢ、ＮＳＥ、シナプシン、ＭｅＣＰ２、およびＧＦＡＰプロモータであってもよく、および５’ＵＴＲ／イントロンは、限定はされないが、ＳＶ４０およびＣＢＡ−ＭＶＭであってもよい。非限定的な例として、組合せで使用されるエンハンサー、プロモータおよび／またはイントロンは、（１）ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモータ、ＳＶ４０  ５’ＵＴＲイントロン；（２）ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモータ、ＳＶ４０  ５’ＵＴＲイントロン；（３）ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモータ、ＣＢＡ−ＭＶＭ  ５’ＵＴＲイントロン；（４）ＵＢＣプロモータ；（５）ＧＵＳＢプロモータ；（６）ＮＳＥプロモータ；（７）シナプシンプロモータ；（８）ＭｅＣＰ２プロモータおよび（９）ＧＦＡＰプロモータであってもよい。
【００７４】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、操作されたプロモータを含む。
別の実施形態において、ウイルスゲノムは、天然に発現されるタンパク質のプロモータを含む。
【００７５】
一実施形態において、領域は、プロモータによるペイロードの発現を可能にするために、ペイロードの最初のエクソンの上流およそ５ｋｂに位置する。（例えば、プスパサリ（Ｐｕｓｐａｓａｒｉ）ら著、「ヒトＦＸＮ遺伝子発現の遠距離制御」、プロスワン（ＰＬＯＳ  ＯＮＥ）、２０１１年。その内容は本明細書において全体として参照により援用される。１７ｂｐ領域が、ＦＲＤＡプロモータによる発現を可能にするために、フラタキシン遺伝子の最初のエクソンの上流およそ４．９ｋｂに位置している）。
【００７６】
一実施形態において、ベクターゲノムは、限定はされないが、ＣＭＶまたはＵ６などのプロモータを含み得る。非限定的な例として、本開示のペイロードを含むＡＡＶ粒子のプロモータは、ＣＭＶプロモータである。別の非限定的な例として、本開示のペイロードを含むＡＡＶ粒子のプロモータは、Ｕ６プロモータである。
【００７７】
一実施形態において、ベクターゲノムはＣＭＶおよびＵ６プロモータを含み得る。
一実施形態において、ベクターゲノムはＣＢＡプロモータを含み得る。
ウイルスゲノム成分：非翻訳領域（ＵＴＲ）
定義上、遺伝子の野生型非翻訳領域（ＵＴＲ）は、転写されるが翻訳されない。一般的には、５’ＵＴＲは、転写開始部位から始まり、開始コドンで終了し、３’ＵＴＲは、終止コドンの直後から始まり、転写の終結シグナルまで継続する。
【００７８】
特定の標的臓器の、豊富に発現される遺伝子に典型的に見出される特徴を、ＵＴＲ内に操作して、安定性およびタンパク質産生を増強することができる。非限定的な例として、肝臓において通常発現されるｍＲＮＡ（例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子）に由来する５’ＵＴＲを、本開示のＡＡＶ粒子のウイルスゲノムに使用して、肝細胞株または肝臓での発現を増強することができる。
【００７９】
理論によって束縛されることを望むものではないが、野生型５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、翻訳開始に役割を果たす特徴を含む。コザック配列は、リボソームが多数の遺伝子の翻訳を開始させる過程に関与することが広く知られており、通常は５’ＵＴＲに含まれている。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、式中Ｒは、開始コドン（ＡＴＧ）の３塩基上流にあるプリン（アデニンまたはグアニン）であり、別の「Ｇ」がその後に続く。
【００８０】
一実施形態において、ウイルスゲノムの５’ＵＴＲは、コザック配列を含む。
一実施形態において、ウイルスゲノムの５’ＵＴＲは、コザック配列を含まない。
理論によって束縛されることを望むものではないが、野生型３’ＵＴＲは、アデノシンおよびウリジンのストレッチがそこに埋め込まれていることが知られている。これらのＡＵリッチシグネチャーは、高いターンオーバー率を有する遺伝子において特に広く見受けられる。それらの配列特徴および機能的特性に基づき、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）は、３つのクラスに分離することができる（チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、１９９５年。その内容は本明細書において全体として参照により援用される）：限定はされないが、ｃ−ＭｙｃおよびＭｙｏＤなどのクラスＩ  ＡＲＥは、Ｕリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフの幾つかの分散コピーを含有する。限定はされないが、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−ａなどのクラスＩＩ  ＡＲＥは、２つ以上のオーバーラップＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）ノナマーを有する。限定はされないが、ｃ−ＪｕｎおよびミオゲニンなどのクラスＩＩＩ  ＡＲＥＳは、それほど十分に規定されていない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。ＡＲＥに結合するほとんどのタンパク質は、メッセンジャーを不安定化することが知られているが、ＥＬＡＶファミリーのメンバーである最も顕著にはＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を増加させることが実証されている。ＨｕＲは、３つ全てのクラスのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３’ＵＴＲ内に、操作により加えることは、インビボにて、ＨｕＲ結合を、したがってメッセージの安定化をもたらすことになる。
【００８１】
３’ＵＴＲ  ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去または修飾を使用して、ポリヌクレオチドの安定性を調節することができる。特異的なポリヌクレオチド、例えばウイルスゲノムのペイロード領域を操作する場合、ＡＲＥの１つ以上のコピーを導入して、ポリヌクレオチドをより不安定にし、それにより、翻訳を減らし、結果として生じるタンパク質の産生を減少させることができる。同様に、ＡＲＥを、同定および除去または突然変異させて、細胞内安定性を増加させ、したがって結果として生じるタンパク質の翻訳および産生を増加させることができる。
【００８２】
一実施形態において、ウイルスゲノムの３’ＵＴＲは、ポリＡテールを鋳型付加するためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る。
一実施形態において、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡシード、結合部位または完全な配列を含み得る。ｍｉｃｒｏＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）は、核酸標的の部位に結合し、核酸分子安定性を低減することまたは翻訳を阻害することのいずれかによって遺伝子発現を下方制御する１９〜２５ヌクレオチド非コードＲＮＡである。ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡの２〜８位の領域の配列を含む。この配列は、核酸のｍｉＲＮＡ標的配列に対して完全なワトソンクリック型相補性を有する。
【００８３】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位、配列またはシード領域を含む、変更するまたは除去するように操作されていてもよい。
当該技術分野で公知の任意の遺伝子に由来する任意のＵＴＲを、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムに組み込むことができる。これらのＵＴＲまたはそれらの部分は、それらが選択されたかまたはそれらの配向性もしくは位置が変更され得る遺伝子と同じ配向性に配置され得る。一実施形態において、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムに使用されるＵＴＲは、逆位化、短縮化、延長化、当該技術分野で公知の１つ以上の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲで作製され得る。本明細書で使用されるとき、用語「変更される」は、ＵＴＲに関する場合、ＵＴＲが、参照配列に対して何らかの点で変化していることを意味する。例えば、３’または５’ＵＴＲは、上記で教示されるような配向性または位置の変化によって野生型または天然ＵＴＲに対して変更されていてもよく、または追加ヌクレオチドの介在、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換もしくは転位によって変更されていてもよい。
【００８４】
一実施形態において、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは、野生型ＵＴＲのバリアントでない少なくとも１つの人工ＵＴＲを含む。
一実施形態において、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは、そのタンパク質が、共通の機能、構造、特徴、または特性を共有する転写物のファミリーから選択されているＵＴＲを含む。
【００８５】
ウイルスゲノム成分：ポリアデニル化配列
一実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは少なくとも１つのポリアデニル化配列を含む。ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは、ペイロードコード配列の３’末端と３’ＩＴＲの５’末端との間にポリアデニル化配列を含み得る。
【００８６】
一実施形態において、ポリアデニル化配列または「ポリＡ配列」は、存在しない〜約５００ヌクレオチド長の範囲であってもよい。ポリアデニル化配列は、限定はされないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、および５００ヌクレオチド長であってもよい。
【００８７】
一実施形態において、ポリアデニル化配列は５０〜１００ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は５０〜１５０ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は５０〜１６０ヌクレオチド長である。
【００８８】
一実施形態において、ポリアデニル化配列は５０〜２００ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は６０〜１００ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は６０〜１５０ヌクレオチド長である。
【００８９】
一実施形態において、ポリアデニル化配列は６０〜１６０ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は６０〜２００ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は７０〜１００ヌクレオチド長である。
【００９０】
一実施形態において、ポリアデニル化配列は７０〜１５０ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は７０〜１６０ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は７０〜２００ヌクレオチド長である。
【００９１】
一実施形態において、ポリアデニル化配列は８０〜１００ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は８０〜１５０ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は８０〜１６０ヌクレオチド長である。
【００９２】
一実施形態において、ポリアデニル化配列は８０〜２００ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は９０〜１００ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は９０〜１５０ヌクレオチド長である。
【００９３】
一実施形態において、ポリアデニル化配列は９０〜１６０ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は９０〜２００ヌクレオチド長である。
ウイルスゲノム成分：イントロン
一実施形態において、ペイロード領域は、１つ以上のイントロンまたはそれらの部分など、発現を増強するための少なくとも１つのエレメントを含む。イントロンの非限定的な例としては、ＭＶＭ（６７〜９７ｂｐｓ）、Ｆ．ＩＸトランケート型イントロン１（３００ｂｐ）、β−グロビンＳＤ／免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプター（２５０ｂｐ）、アデノウイルススプライスドナー／イムノグロビンスプライスアクセプター（５００ｂｐ）、ＳＶ４０後期スプライスドナー／スプライスアクセプター（１９Ｓ／１６Ｓ）（１８０ｂｐ）およびハイブリッドアデノウイルススプライスドナー／ＩｇＧスプライスアクセプター（２３０ｂｐ）が挙げられる。
【００９４】
一実施形態において、イントロンまたはイントロン部分は、１００〜５００ヌクレオチド長であってもよい。イントロンは、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０または５００の長さを有してもよい。イントロンは、８０〜１００、８０〜１２０、８０〜１４０、８０〜１６０、８０〜１８０、８０〜２００、８０〜２５０、８０〜３００、８０〜３５０、８０〜４００、８０〜４５０、８０〜５００、２００〜３００、２００〜４００、２００〜５００、３００〜４００、３００〜５００または４００〜５００の長さを有してもよい。
【００９５】
一実施形態において、ベクターゲノムは、イントロンなど、トランス遺伝子標的特異性および発現を増強する少なくとも１つのエレメントを含む（例えば、パウエル（Ｐｏｗｅｌｌ）ら著、「遺伝子療法におけるトランス遺伝子標的特異性および発現を増強するウイルス発現カセットエレメント（Ｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  Ｅｎｈａｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」、２０１５年を参照のこと；この内容は本明細書において全体として参照により援用される）。イントロンの非限定的な例としては、ＭＶＭ（６７〜９７ｂｐｓ）、Ｆ．ＩＸトランケート型イントロン１（３００ｂｐ）、β−グロビンＳＤ／免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプター（２５０ｂｐ）、アデノウイルススプライスドナー／イムノグロビンスプライスアクセプター（５００ｂｐ）、ＳＶ４０後期スプライスドナー／スプライスアクセプター（１９Ｓ／１６Ｓ）（１８０ｂｐ）およびハイブリッドアデノウイルススプライスドナー／ＩｇＧスプライスアクセプター（２３０ｂｐ）が挙げられる。
【００９６】
一実施形態において、イントロンは、１００〜５００ヌクレオチド長であってもよい。イントロンは、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０または５００の長さを有してもよい。イントロンは、８０〜１００、８０〜１２０、８０〜１４０、８０〜１６０、８０〜１８０、８０〜２００、８０〜２５０、８０〜３００、８０〜３５０、８０〜４００、８０〜４５０、８０〜５００、２００〜３００、２００〜４００、２００〜５００、３００〜４００、３００〜５００または４００〜５００の長さを有してもよい。
【００９７】
ウイルスゲノム成分：フィラー配列
一実施形態において、ウイルスゲノムは、１つ以上のフィラー配列を含む。
一実施形態において、ウイルスゲノムは、ウイルスゲノムの長さをパッケージングに最適なサイズにするために、１つ以上のフィラー配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、ウイルスゲノムの長さを約２．３ｋｂにするために、少なくとも１つのフィラー配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、ウイルスゲノムの長さを約４．６ｋｂにするために、少なくとも１つのフィラー配列を含む。
【００９８】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、一本鎖（ｓｓ）ウイルスゲノムであり、限定はされないが、０．１ｋｂ、０．２ｋｂ、０．３ｋｂ、０．４ｋｂ、０．５ｋｂ、０．６ｋｂ、０．７ｋｂ、０．８ｋｂ、０．９ｋｂ、１ｋｂ、１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、または３．８ｋｂなどの、約０．１ｋｂ〜３．８ｋｂの長さを有する１つ以上のフィラー配列を含む。非限定的な例として、ベクターゲノム中のフィラー配列の合計長は、３．１ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中のフィラー配列の合計長は、２．７ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中のフィラー配列の合計長は、０．８ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中のフィラー配列の合計長は、０．４ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中の各フィラー配列の長さは、０．８ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中の各フィラー配列の長さは、０．４ｋｂである。
【００９９】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、自己相補的（ｓｃ）ウイルスゲノムであり、限定はされないが、０．１ｋｂ、０．２ｋｂ、０．３ｋｂ、０．４ｋｂ、０．５ｋｂ、０．６ｋｂ、０．７ｋｂ、０．８ｋｂ、０．９ｋｂ、１ｋｂ、１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、または１．５ｋｂなどの、約０．１ｋｂ〜１．５ｋｂの長さを有する１つ以上のフィラー配列を含む。非限定的な例として、ベクターゲノム中のフィラー配列の合計長は、０．８ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中のフィラー配列の合計長は、０．４ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中の各フィラー配列の長さは、０．８ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中の各フィラー配列の長さは、０．４ｋｂである。
【０１００】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、フィラー配列の任意の部分を含む。ウイルスゲノムは、フィラー配列の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％を含んでいてもよい。
【０１０１】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、一本鎖（ｓｓ）ウイルスゲノムであり、ウイルスゲノムの長さを約４．６ｋｂにするために、１つ以上のフィラー配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、プロモータ配列の５’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、３’ＩＴＲ配列の５’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、２つのイントロン配列間に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、イントロン配列内に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の３’に位置し、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み、第１のフィラー配列は、プロモータ配列の５’に位置し、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の３’に位置し、第２のフィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の５’に位置する。
【０１０２】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、自己相補的（ｓｃ）ウイルスゲノムであり、ウイルスゲノムの長さを約２．３ｋｂにするために、１つ以上のフィラー配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、プロモータ配列の５’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、３’ＩＴＲ配列の５’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、２つのイントロン配列間に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、イントロン配列内に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の３’に位置し、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み、第１のフィラー配列は、プロモータ配列の５’に位置し、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の３’に位置し、第２のフィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の５’に位置する。
【０１０３】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、ウイルスゲノムのより多くの領域の１つの間に１つ以上のフィラー配列を含み得る。一実施形態において、フィラー領域は、限定はされないが、ペイロード領域、末端逆位配列（ＩＴＲ）、プロモータ領域、イントロン領域、エンハンサー領域、ポリアデニル化シグナル配列領域、多重クローニング部位（ＭＣＳ）領域、および／またはエクソン領域などの領域の前に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー領域は、限定はされないが、ペイロード領域、末端逆位配列（ＩＴＲ）、プロモータ領域、イントロン領域、エンハンサー領域、ポリアデニル化シグナル配列領域、多重クローニング部位（ＭＣＳ）領域、および／またはエクソン領域などの領域の後に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー領域は、限定はされないが、ペイロード領域、末端逆位配列（ＩＴＲ）、プロモータ領域、イントロン領域、エンハンサー領域、ポリアデニル化シグナル配列領域、多重クローニング部位（ＭＣＳ）領域、および／またはエクソン領域などの領域の前および後に位置していてもよい。
【０１０４】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、ウイルスゲノムの少なくとも１つの領域を二分する（ｂｉｆｕｒｃａｔｅ）１つ以上のフィラー配列を含み得る。ウイルスゲノムの二分された領域は、フィラー配列領域の５’にある領域の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を含んでいてもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の１０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の９０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の２０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の８０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の３０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の７０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の４０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の６０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の５０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の５０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の６０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の４０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の７０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の３０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の８０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の２０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の９０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の１０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。
【０１０５】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、５’ＩＴＲの後にフィラー配列を含む。
一実施形態において、ウイルスゲノムは、プロモータ領域の後にフィラー配列を含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは、ペイロード領域の後にフィラー配列を含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは、イントロン領域の後にフィラー配列を含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは、エンハンサー領域の後にフィラー配列を含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは、ポリアデニル化シグナル配列領域の後にフィラー配列を含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは、ＭＣＳ領域の後にフィラー配列を含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは、エクソン領域の後にフィラー配列を含む。
【０１０６】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、プロモータ領域の前にフィラー配列を含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは、ペイロード領域の前にフィラー配列を含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは、イントロン領域の前にフィラー配列を含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは、エンハンサー領域の前にフィラー配列を含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは、ポリアデニル化シグナル配列領域の前にフィラー配列を含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは、ＭＣＳ領域の前にフィラー配列を含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは、エクソン領域の前にフィラー配列を含む。
【０１０７】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、３’ＩＴＲの前にフィラー配列を含む。
一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、５’ＩＴＲおよびプロモータ領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、５’ＩＴＲおよびペイロード領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、５’ＩＴＲおよびイントロン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、５’ＩＴＲおよびエンハンサー領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、５’ＩＴＲおよびポリアデニル化シグナル配列領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、５’ＩＴＲおよびＭＣＳ領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。
【０１０８】
一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、５’ＩＴＲおよびエクソン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。
一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、プロモータ領域およびペイロード領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、プロモータ領域およびイントロン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、プロモータ領域およびエンハンサー領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、プロモータ領域およびポリアデニル化シグナル配列領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、プロモータ領域およびＭＣＳ領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、プロモータ領域およびエクソン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、プロモータ領域および３’ＩＴＲなどの、２つの領域間に位置していてもよい。
【０１０９】
一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ペイロード領域およびイントロン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ペイロード領域およびエンハンサー領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ペイロード領域およびポリアデニル化シグナル配列領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ペイロード領域およびＭＣＳ領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ペイロード領域およびエクソン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。
【０１１０】
一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ペイロード領域および３’ＩＴＲなどの、２つの領域間に位置していてもよい。
一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、イントロン領域およびエンハンサー領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、イントロン領域およびポリアデニル化シグナル配列領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、イントロン領域およびＭＣＳ領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、イントロン領域およびエクソン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、イントロン領域および３’ＩＴＲなどの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、エンハンサー領域およびポリアデニル化シグナル配列領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、エンハンサー領域およびＭＣＳ領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、エンハンサー領域およびエクソン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、エンハンサー領域および３’ＩＴＲなどの、２つの領域間に位置していてもよい。
【０１１１】
一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ポリアデニル化シグナル配列領域およびＭＣＳ領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ポリアデニル化シグナル配列領域およびエクソン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ポリアデニル化シグナル配列領域および３’ＩＴＲなどの、２つの領域間に位置していてもよい。
【０１１２】
一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ＭＣＳ領域およびエクソン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ＭＣＳ領域および３’ＩＴＲなどの、２つの領域間に位置していてもよい。
【０１１３】
一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、エクソン領域および３’ＩＴＲなどの、２つの領域間に位置していてもよい。
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１１４】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１１５】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１１６】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１１７】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとプロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとイントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１１８】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１１９】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲとエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１２０】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とペイロード領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１２１】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１２２】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１２３】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１２４】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１２５】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１２６】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、プロモータ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１２７】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とイントロン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１２８】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１２９】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１３０】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１３１】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１３２】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ペイロード領域と３’ＩＴＲ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１３３】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域の間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域の間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とエンハンサー領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１３４】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１３５】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１３６】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１３７】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、イントロン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１３８】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域とポリアデニル化シグナル配列領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１３９】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１４０】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１４１】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、エンハンサー領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１４２】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とＭＣＳ領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１４３】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１４４】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、ＭＣＳ領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１４５】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み得、第１のフィラー配列は、ＭＣＳ領域とエクソン領域との間に位置していてもよく、第２のフィラー配列は、エクソン領域と３’ＩＴＲとの間に位置していてもよい。
【０１４６】
ゲノムサイズ
一実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むＡＡＶ粒子は、一本鎖または二本鎖ベクターゲノムであってもよい。ベクターゲノムのサイズは、小型、中型、大型または最大サイズであってもよい。加えて、ベクターゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
【０１４７】
一実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むベクターゲノムは、小型一本鎖ベクターゲノムであってもよい。小型一本鎖ベクターゲノムは、約２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、および３．５ｋｂサイズなど、２．７〜３．５ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、小型一本鎖ベクターゲノムは３．２ｋｂサイズであってもよい。加えて、ベクターゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
【０１４８】
一実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むベクターゲノムは、小型二本鎖ベクターゲノムであってもよい。小型二本鎖ベクターゲノムは、約１．３、１．４、１．５、１．６、および１．７ｋｂサイズなど、１．３〜１．７ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、小型二本鎖ベクターゲノムは１．６ｋｂサイズであってもよい。加えて、ベクターゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
【０１４９】
一実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むベクターゲノムは、中型一本鎖ベクターゲノムであってもよい。中型一本鎖ベクターゲノムは、約３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２および４．３ｋｂサイズなど、３．６〜４．３ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、中型一本鎖ベクターゲノムは４．０ｋｂサイズであってもよい。加えて、ベクターゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
【０１５０】
一実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むベクターゲノムは、中型二本鎖ベクターゲノムであってもよい。中型二本鎖ベクターゲノムは、約１．８、１．９、２．０、および２．１ｋｂサイズなど、１．８〜２．１ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、中型二本鎖ベクターゲノムは２．０ｋｂサイズであってもよい。加えて、ベクターゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
【０１５１】
一実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むベクターゲノムは、大型一本鎖ベクターゲノムであってもよい。大型一本鎖ベクターゲノムは、約４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９および６．０ｋｂサイズなど、４．４〜６．０ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、大型一本鎖ベクターゲノムは４．７ｋｂサイズであってもよい。別の非限定的な例として、大型一本鎖ベクターゲノムは４．８ｋｂサイズであってもよい。更に別の非限定的な例として、大型一本鎖ベクターゲノムは６．０ｋｂサイズであってもよい。加えて、ベクターゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
【０１５２】
一実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むベクターゲノムは、大型二本鎖ベクターゲノムであってもよい。大型二本鎖ベクターゲノムは、約２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９および３．０ｋｂサイズなど、２．２〜３．０ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、大型二本鎖ベクターゲノムは２．４ｋｂサイズであってもよい。加えて、ベクターゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
【０１５３】
ペイロード
本開示のＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのペイロード領域を含む。本明細書で使用されるとき、「ペイロード」または「ペイロード領域」は、ウイルスゲノムによりもしくはその内にコードされる１つ以上のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域、またはかかるポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域、例えばトランス遺伝子、ポリペプチドもしくはマルチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現産物、または調節性核酸もしくは制御性核酸を指す。本開示のペイロードは、典型的には、ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントをコードする。
【０１５４】
ペイロード領域は、ｍＲＮＡの天然構成と同様のまたは反映した領域を再現するように構築され得る。
ペイロード領域は、コードおよび非コード核酸配列の組合せを含み得る。
【０１５５】
一部の実施形態では、ＡＡＶペイロード領域は、コードまたは非コードＲＮＡをコードし得る。
一実施形態において、ＡＡＶ粒子は、２つ以上の目的のポリペプチドをコードする核酸配列を含むペイロード領域を有するウイルスゲノムを含む。かかる実施形態において、２つ以上のポリペプチドをコードするウイルスゲノムは、ウイルス粒子へと複製またはパッケージングされ得る。２つ以上のポリペプチドを含むウイルス粒子で形質導入された標的細胞は、単一細胞においてポリペプチドの各々を発現し得る。
【０１５６】
一実施形態において、ペイロード領域は、以下の成分を含み得る：ウイルスゲノム内に位置するペイロード領域；ペイロード領域の５’末端および／または３’末端にある少なくとも１つの末端逆位配列（ＩＴＲ）；ならびにペイロード領域内のプロモータ領域、イントロン領域およびコード領域。
【０１５７】
ＡＡＶ粒子ペイロード領域がポリペプチドをコードする場合、ポリペプチドは、ペプチドまたはタンパク質であってもよい。本明細書に記載されるポリペプチドをコードするウイルスゲノムは、ヒト疾患、ウイルス、感染症、獣医学的応用の分野、ならびに様々なインビボおよびインビトロ設定において有用であり得る。
【０１５８】
一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、神経学的疾患および／または障害を治療、予防、緩和、または改善するための医学分野に有用である。
一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、パーキンソン病を治療、予防、緩和または改善するための医学分野に有用である。
【０１５９】
一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、中枢神経系の疾患を治療、予防、緩和または改善するための医学分野に有用である。
ポリペプチドおよびバリアントの性質
本開示のウイルスゲノムのペイロード領域によってコードされるアミノ酸配列は、１つ以上の核酸、核酸の断片または上述のいずれかのバリアントによって独立してコードされ得る、ポリペプチド全体、複数のポリペプチドまたはポリペプチドの断片として翻訳され得る。本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」は、ほとんどの場合でペプチド結合によって連結されているアミノ酸残基（天然または非天然）のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用されるとき、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。一部の場合において、コードされたポリペプチドは、約５０アミノ酸より小さく、その場合は、ポリペプチドはペプチドと称される。ポリペプチドは、ペプチドである場合、少なくとも約２、３、４、または少なくとも５アミノ酸残基長であろう。したがって、ポリペプチドとしては、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、上述のものの相同体、オルソログ、パラログ、断片および他の均等物、バリアント、および類似体が挙げられる。ポリペプチドは、単一分子であってもよく、または二量体、三量体もしくは四量体などの多分子複合体であってもよい。また、それらは、単一鎖または複数鎖のポリペプチドを含んでいてもよく、付随または連結されていてもよい。用語「ポリペプチド」は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも該当し得る。
【０１６０】
用語「ポリペプチドバリアント」は、それらのアミノ酸配列が天然または参照配列と異なる分子を指す。アミノ酸配列バリアントは、天然または参照配列と比較して、アミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失、および／または挿入を有し得る。大抵の場合、バリアントは、天然または参照配列に対して少なくとも約５０％同一性（相同性）を有することになり、好ましくは、天然または参照配列に対して少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％同一（相同性）であるだろう。
【０１６１】
一部の実施形態において、「バリアント模倣体（ｖａｒｉａｎｔ  ｍｉｍｉｃｓ）」が提供される。本明細書で使用されるとき、用語「バリアント模倣体」は、活性化配列を模倣することになる１つ以上のアミノ酸を含有するものである。例えば、グルタミン酸は、リン酸化トレオニンおよび／またはリン酸化セリンの模倣体として働きをし得る。あるいは、バリアント模倣体は、模倣体を含有する非活性化または不活性化産物をもたらし得る。例えば、フェニルアラニンは、チロシンの不活化置換として作用し得る。またはアラニンは、セリンの不活化置換として作用し得る。
【０１６２】
用語「アミノ酸配列バリアント」は、天然または開始配列と比較して、それらのアミノ酸配列に、ある差異を有する分子を指す。アミノ酸配列バリアントは、アミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失、および／または挿入を有し得る。「天然」または「開始」配列は、野生型配列と混同されるべきではない。本明細書で使用されるとき、天然または開始配列は、比較をなし得る元の分子を指す相対的用語である。「天然」または「開始」配列または分子は、野生型（自然界に見出される配列）を表してもよいが、野生型配列である必要はない。
【０１６３】
大抵の場合、バリアントは、天然配列に対して少なくとも約７０％相同性を有することになり、好ましくは、天然配列に対して、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％相同性であるだろう。「相同性」は、アミノ酸配列に適用されるとき、配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入して最大の相同性パーセントを達成した後の、第２の配列のアミノ酸配列の残基と同一である候補アミノ酸配列の残基のパーセンテージとして定義される。アラインメントの方法およびコンピュータプログラムは、当該技術分野で周知である。相同性は、同一性パーセントの計算に依存するが、ギャップおよびペナルティが計算に導入されるため、値が異なり得ることが理解される。
【０１６４】
「相同体」は、アミノ酸配列に適用されるとき、第２の種の第２の配列に対して実質的に同一性を有する他の種の対応する配列を意味する。
「類似体」は、１つ以上のアミノ酸変更、例えば、親ポリペプチドの特性を依然として維持する、アミノ酸残基の置換、付加、または欠失によって異なるポリペプチドバリアントを含むことを意味する。
【０１６５】
配列タグまたは１つ以上のリジンなどのアミノ酸を、本開示のペプチド配列に付加することができる（例えば、Ｎ末端またはＣ末端に）。配列タグは、ペプチド精製または局在化のために使用し得る。リジンは、ペプチド溶解度を増加させるために、またはビオチン化を可能にするために使用し得る。あるいは、任意選択で、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシおよびアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を欠失させて、トランケート型配列を提供してもよい。あるいは、特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端またはＮ末端残基）は、例えば、可溶性であるかまたは固体支持体に連結されているより大きな配列の一部としての配列の発現など、配列の使用に応じて欠失されてもよい。
【０１６６】
「置換バリアント」は、タンパク質を参照する場合、天然または開始配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その代わりに異なるアミノ酸が同じ位置に挿入されているものである。置換は、単一であってもよく、その場合は、分子中の１つのアミノ酸のみが置換されており、または複数であってもよく、その場合は、同じ分子中の２つ以上のアミノ酸が置換されている。
【０１６７】
本明細書で使用されるとき、用語「保存的アミノ酸置換」は、サイズ、電荷、または極性が類似する異なるアミノ酸を有する配列に通常存在するアミノ酸の置換を指す。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリンおよびロイシンなどの無極性（疎水性）残基を別の無極性残基に置換することが挙げられる。同様に、保存的置換の例としては、アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、およびグリシンとセリンとの間など、１つの極性（親水性）残基を別のものに置換することが挙げられる。加えて、リジン、アルギニンまたはヒスチジンなどの塩基性残基を別のものに置換すること、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの１つの酸性残基を別の酸性残基に置換することは、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの無極性（疎水性）アミノ酸残基を、システイン、グルタミン、グルタミン酸またはリジンなどの極性（親水性）残基に置換すること、および／または極性残基を無極性残基に置換することが挙げられる。
【０１６８】
「挿入バリアント」は、タンパク質を参照する場合、１つ以上のアミノ酸が、天然または開始配列の特定の位置のアミノ酸に直に隣接して挿入されているものである。アミノ酸に「直に隣接している」とは、アミノ酸のアルファ−カルボキシまたはアルファ−アミノ官能基のいずれかに接続されていることを意味する。
【０１６９】
「欠失バリアント」は、タンパク質を参照する場合、天然または開始アミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸が除去されているものである。大抵の場合、欠失バリアントは、分子の特定領域の１つ以上のアミノ酸が欠失しているだろう。
【０１７０】
本明細書で使用されるとき、用語「誘導体」は、用語「バリアント」と同義的に使用され、参照分子または開始分子と比べて任意の様式で修飾または変化されている分子を指す。一部の実施形態において、誘導体としては、有機タンパク質性または非タンパク質性誘導体化剤および翻訳後修飾によって修飾されている天然または開始タンパク質が挙げられる。共有結合修飾は、伝統的には、タンパク質の標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応可能である有機誘導体化剤と反応させることにより、または選択された組換え宿主細胞にて機能する翻訳後修飾の機序を活用することにより導入される。得られる共有結合誘導体は、生物学的活性にとって、イムノアッセイにとって、または組換え糖タンパク質の免疫親和性精製用の抗タンパク質抗体の調製にとって重要な残基の同定に向けたプログラムに有用である。かかる修飾は、当該技術分野の通常技術内にあり、過度の実験作業を行わずに実施される。
【０１７１】
特定の翻訳後修飾は、発現されたポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基へと頻繁に翻訳後脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、温和な酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基はいずれかの形態で、本開示に従って使用されるタンパク質に存在し得る。
【０１７２】
他の翻訳後修飾としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化、グリコシル化／糖化、ならびにジスルフィド結合の導入（システイン残基間のジスルフィド結合など）が挙げられる（Ｔ．Ｅ．クレイトン（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．フリーマン＆ＣＯ．社（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．）、サンフランシスコ、ｐ．７９〜８６（１９８３年））。
【０１７３】
「特徴」は、タンパク質を参照する場合、別個のアミノ酸配列に基づく分子成分として定義される。本開示のタンパク質の特徴としては、表面発現（ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ）、局所的立体構造形状、フォールド（ｆｏｌｄ）、ループ、ハーフループ、ドメイン、ハーフドメイン、部位、末端、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
【０１７４】
タンパク質を参照する際に本明細書で使用されるとき、用語「表面発現」は、最外側表面に現れる、ポリペプチドに基づくタンパク質成分を指す。
タンパク質を参照する際に本明細書で使用されるとき、用語「局所的立体構造形状」は、タンパク質の定義可能な空間内に位置する、タンパク質のポリペプチドに基づく構造的発現を意味する。
【０１７５】
タンパク質を参照する際に本明細書で使用されるとき、用語「フォールド」は、エネルギー最小化時に得られるアミノ酸配列の立体構造を意味する。フォールドは、フォールディングプロセスの二次または三次レベルで生じ得る。二次レベルフォールドの例としては、ベータシートおよびアルファヘリックスが挙げられる。三次レベルフォールドの例としては、エネルギー力の集合または分離によって形成されるドメインおよび領域が挙げられる。このようにして形成される領域としては、疎水性および親水性ポケットなどが挙げられる。
【０１７６】
本明細書で使用されるとき、用語「ターン」は、タンパク質立体構造に関する場合、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を変更し、１つ、２つ、または３つ以上のアミノ酸残基が関与し得る屈曲を意味する。
【０１７７】
タンパク質を参照する際に本明細書で使用されるとき、用語「ループ」は、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を逆転させ、４つ以上のアミノ酸残基を含む、ペプチドまたはポリペプチドの構造的特徴を指す。オリバ（Ｏｌｉｖａ）らは、少なくとも５種類のタンパク質ループを同定している（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ）２６６巻（４号）：ｐ．８１４〜８３０；１９９７年）。
【０１７８】
タンパク質を参照する際に本明細書で使用されるとき、用語「ハーフループ」は、それが由来するループのアミノ酸残基の少なくとも半数を有する同定されたループの部分を指す。ループは、必ずしも偶数のアミノ酸残基を含有するとは限らない場合があることが理解される。したがって、ループが奇数のアミノ酸を含有するかまたは含むと同定されている場合、奇数ループのハーフループは、ループの整数部分または次の整数部分を含むことになる（ループのアミノ酸数／２＋／−０．５個のアミノ酸）。例えば、７個アミノ酸のループであると同定されたループは、３個アミノ酸または４個アミノ酸のハーフループを生じさせ得る（７／２＝３．５＋／−０．５は、３または４である）。
【０１７９】
タンパク質を参照する際に本明細書で使用されるとき、用語「ドメイン」は、１つ以上の同定可能な構造的または機能的特徴または特性を有する（例えば、結合能力、タンパク質間相互作用の部位として働く）ポリペプチドのモチーフを指す。
【０１８０】
タンパク質を参照する際に本明細書で使用されるとき、用語「ハーフドメイン」は、それが由来するドメインのアミノ酸残基の少なくとも半数を有する同定されたドメインの部分を意味する。ドメインは、必ずしも偶数のアミノ酸残基を含有するとは限らない場合があることが理解される。したがって、ドメインが奇数のアミノ酸を含有するかまたは含むと同定されている場合、奇数ドメインのハーフドメインは、ドメインの整数部分または次の整数部分を含むことになる（ドメインのアミノ酸数／２＋／−０．５個のアミノ酸）。例えば、７個アミノ酸のドメインであると同定されたドメインは、３個アミノ酸または４個アミノ酸のハーフドメインを生じさせ得る（７／２＝３．５＋／−０．５は、３または４である）。ドメインまたはハーフドメイン内にはサブドメインが同定される場合があり、そうしたサブドメインは、それらが由来したドメインまたはハーフドメインに同定される構造的または機能的特性の全てよりも少ない特性を有することも理解される。ドメインタイプのいずれかを含むアミノ酸は、本明細書では、ポリペプチドの骨格に沿って連続している必要はない（すなわち、非隣接アミノ酸が構造的にフォールディングして、ドメイン、ハーフドメインまたはサブドメインを生じさせ得る）ことも理解される。
【０１８１】
タンパク質を参照する際に本明細書で使用されるとき、用語「部位」は、アミノ酸に基づく実施形態に関する場合、「アミノ酸残基」および「アミノ酸側鎖」と同義的に使用される。部位は、本開示のポリペプチドに基づく分子内で修飾、マニピュレート、変更、誘導体化、または変異され得るペプチドまたはポリペプチド内の位置を表す。
【０１８２】
本明細書で使用されるとき、用語「末端（複数）または末端」は、タンパク質を参照する場合、ペプチドまたはポリペプチドの端部を指す。かかる端部は、ペプチドまたはポリペプチドの最初または最後の部位のみに限定されず、末端領域にある追加のアミノ酸を含み得る。本開示のポリペプチドに基づく分子は、Ｎ末端（遊離アミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸によって終端されている）およびＣ末端（遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸によって終端されている）を両方とも有すると特徴付けされ得る。本開示のタンパク質は、一部の場合、ジスルフィド結合または非共有結合力によって一緒にされた複数のポリペプチド鎖でできている（マルチマー、オリゴマー）。そうした種類のタンパク質は、複数のＮ末端およびＣ末端を有することになる。あるいは、ポリペプチドの末端は、場合によっては、有機コンジュゲートなどの非ポリペプチドに基づく部分から始まるかまたは終わるように修飾されてもよい。
【０１８３】
特徴のいずれかが本開示の分子の成分として同定または定義されたら、そうした特徴の幾つかのマニピュレーションおよび／または修飾はいずれも、移動、交換、逆転、欠失、無作為化または複製によって実施することができる。更に、特徴のマニピュレーションは、本開示の分子に対する修飾と同じ結果をもたらし得ることが理解される。例えば、ドメイン欠失が関与するマニピュレーションは、全長未満の分子をコードするような核酸の修飾が変更することになる場合と全く同じように、分子の長さの変更をもたらすだろう。
【０１８４】
修飾およびマニピュレーションは、指定部位突然変異誘発などの当該技術分野で公知の方法により達成することができる。その後、得られた修飾分子を、本明細書に記載されるようなものなどのインビトロもしくはインビボアッセイまたは当該技術分野で公知の任意の他の好適なスクリーニングアッセイを使用して、活性について試験してもよい。
【０１８５】
ペイロード：ＡＡＤＣポリヌクレオチドコンストラクト
本開示によると、単独でまたは追加の核酸配列との組合せで機能してＡＡＤＣタンパク質をコードする芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ；ドーパデカルボキシラーゼおよびＤＤＣとしても知られている）ポリヌクレオチドが提供される。本明細書で使用されるとき、「ＡＡＤＣポリヌクレオチド」は、ＡＡＤＣタンパク質をコードし、ベクター、プラスミドまたは翻訳可能なコンストラクトに存在する場合、細胞、組織、臓器または生物においてかかるＡＡＤＣタンパク質を発現する任意の核酸ポリマーである。
【０１８６】
ＡＡＤＣポリヌクレオチドとしては、細胞内部でプロセシングされる前駆体分子が挙げられる。ＡＡＤＣポリヌクレオチドまたはそれらのプロセシングされた形態は、プラスミド、ベクター、ゲノムまたは細胞送達用の他の核酸発現ベクターにコードされ得る。
【０１８７】
一部の実施形態において、ＡＡＤＣポリヌクレオチドは、ＡＡＶウイルスゲノムの成分として設計されており、細胞内でプロセシングされて野生型ＡＡＤＣタンパク質を産生するＡＡＶ粒子にパッケージングされている。
【０１８８】
一部の実施形態において、ＡＡＤＣポリヌクレオチドは、ＡＡＶ粒子のペイロードであってもよい。
本明細書で使用されるとき、野生型ＡＡＤＣタンパク質は、ＤＤＣ遺伝子に由来する天然に存在するアイソフォームまたはバリアントのいずれであってもよい。ＡＡＤＣの異なるアイソフォームをコードする複数の選択的スプライス転写バリアントが同定されている。具体的には、ＤＤＣ遺伝子は、６つの別個のアイソフォームをコードする７つの転写バリアントを産生する。ＤＤＣ転写バリアント１および２は両方とも、ＡＡＤＣアイソフォーム１をコードする。一部の実施形態において、ＡＡＤＣポリヌクレオチドは、ＤＤＣ転写バリアント２をコードし、それにより天然ＡＡＤＣアイソフォーム１をコードする（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０００７８１．１）。この配列は、以下の通りである：
ＭＮＡＳＥＦＲＲＲＧＫＥＭＶＤＹＶＡＮＹＭＥＧＩＥＧＲＱＶＹＰＤＶＥＰＧＹＬＲＰＬＩＰＡＡＡＰＱＥＰＤＴＦＥＤＩＩＮＤＶＥＫＩＩＭＰＧＶＴＨＷＨＳＰＹＦＦＡＹＦＰＴＡＳＳＹＰＡＭＬＡＤＭＬＣＧＡＩＧＣＩＧＦＳＷＡＡＳＰＡＣＴＥＬＥＴＶＭＭＤＷＬＧＫＭＬＥＬＰＫＡＦＬＮＥＫＡＧＥＧＧＧＶＩＱＧＳＡＳＥＡＴＬＶＡＬＬＡＡＲＴＫＶＩＨＲＬＱＡＡＳＰＥＬＴＱＡＡＩＭＥＫＬＶＡＹＳＳＤＱＡＨＳＳＶＥＲＡＧＬＩＧＧＶＫＬＫＡＩＰＳＤＧＮＦＡＭＲＡＳＡＬＱＥＡＬＥＲＤＫＡＡＧＬＩＰＦＦＭＶＡＴＬＧＴＴＴＣＣＳＦＤＮＬＬＥＶＧＰＩＣＮＫＥＤＩＷＬＨＶＤＡＡＹＡＧＳＡＦＩＣＰＥＦＲＨＬＬＮＧＶＥＦＡＤＳＦＮＦＮＰＨＫＷＬＬＶＮＦＤＣＳＡＭＷＶＫＫＲＴＤＬＴＧＡＦＲＬＤＰＴＹＬＫＨＳＨＱＤＳＧＬＩＴＤＹＲＨＷＱＩＰＬＧＲＲＦＲＳＬＫＭＷＦＶＦＲＭＹＧＶＫＧＬＱＡＹＩＲＫＨＶＱＬＳＨＥＦＥＳＬＶＲＱＤＰＲＦＥＩＣＶＥＶＩＬＧＬＶＣＦＲＬＫＧＳＮＫＶＮＥＡＬＬＱＲＩＮＳＡＫＫＩＨＬＶＰＣＨＬＲＤＫＦＶＬＲＦＡＩＣＳＲＴＶＥＳＡＨＶＱＲＡＷＥＨＩＫＥＬＡＡＤＶＬＲＡＥＲＥ（配列番号１）
本開示のＡＡＤＣポリヌクレオチドは、ＡＡＤＣポリヌクレオチドコンストラクトを生成するようにアセンブルされたモジュール型の要素および／または配列モチーフを含有するように操作されてもよい。
【０１８９】
本開示によると、ＡＡＤＣポリヌクレオチドが提供される。かかるポリヌクレオチドは、ＡＡＤＣタンパク質の１つ以上のアイソフォームまたはバリアントをコードする連結されたヌクレオシドの領域を含む核酸ポリマーを含む。
【０１９０】
一部の実施形態において、ＡＡＤＣポリヌクレオチドは、ＡＡＤＣタンパク質をコードするコドン最適化転写物を含む。
一部の実施形態において、ＡＡＤＣポリヌクレオチドは、ＡＡＤＣタンパク質の１つ以上の野生型アイソフォームまたはバリアントをコードする配列領域を含む。かかるポリヌクレオチドは、以下のいずれか１つ以上をコードする配列領域も含み得る：５’ＩＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、ＣＭＶプロモータ、ｉｅ１エクソン（ｅｘｏｎ）１、ｉｅ１イントロン（ｉｎｔｒｏｎ）１、ｈｂＢグロビン（ｇｌｏｂｉｎ）イントロン２、ｈＢｇｌｏｂｉｎエクソン３、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ｈＧＨポリ（Ａ）シグナル、および／または３’ＩＴＲ。かかる配列領域は、本明細書で教示されているか、または当該技術分野で公知のもののいずれかであってもよい。
【０１９１】
一部の実施形態において、ＡＡＤＣポリヌクレオチドは、配列番号２またはその断片もしくはバリアントを含む。配列番号２を含むＡＡＤＣポリヌクレオチドの成分領域は、表１に提示される。
【０１９２】
【表１】
2021521852.tif 000003
【０１９３】
一実施形態において、ＡＡＤＣポリヌクレオチドは、配列番号２またはその断片もしくはバリアントのいずれかに対して同一性パーセントを有する配列を含む。ＡＡＤＣポリヌクレオチドは、配列番号２またはその断片もしくはバリアントのいずれかに対して１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％同一性を有してもよい。ＡＡＤＣポリヌクレオチドは、配列番号２またはその断片もしくはバリアントのいずれかに対して１〜１０％、１０〜２０％、３０〜４０％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９９％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９９％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９９％、７０〜１００％、８０〜８５％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜９９％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜９９％、または９０〜１００％を有してもよい。非限定的な例として、ＡＡＤＣポリヌクレオチドは、配列番号２またはその断片もしくはバリアントのいずれかに対して８９％同一性を有する配列を含む。別の非限定的な例として、ＡＡＤＣポリヌクレオチドは、配列番号２またはその断片もしくはバリアントのいずれかに対して８５％同一性を有する配列を含む。別の非限定的な例として、ＡＡＤＣポリヌクレオチドは、配列番号２またはその断片もしくはバリアントのいずれかに対して９０％同一性を有する配列を含む。別の非限定的な例として、ＡＡＤＣポリヌクレオチドは、配列番号２またはその断片もしくはバリアントのいずれかに対して９５％同一性を有する配列を含む。別の非限定的な例として、ＡＡＤＣポリヌクレオチドは、配列番号２またはその断片もしくはバリアントのいずれかに対して９９％同一性を有する配列を含む。
【０１９４】
一部の実施形態において、ＡＡＤＣポリヌクレオチドのコード領域は、１４４０ヌクレオチド長である。かかるＡＡＤＣポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの全てまたは部分にわたってコドン最適化されてもよい。
【０１９５】
一部の実施形態において、ＡＡＤＣポリヌクレオチドは、配列番号２またはその断片もしくはバリアントのいずれかを含むが、５’および／または３’ＩＴＲを欠如する。かかるポリヌクレオチドは、プラスミドまたはベクターに組み込まれ、コード化ＡＡＤＣタンパク質を発現するために使用されてもよい。
【０１９６】
一実施形態において、ＡＡＤＣポリヌクレオチドは、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）で産生されてもよい。
一実施形態において、ＡＡＤＣポリヌクレオチドは、三重トランスフェクションを使用して産生されてもよい。
【０１９７】
一実施形態において、ＡＡＤＣポリヌクレオチドは、ＡＡＤＣ  ｍＲＮＡのコドン最適化オープンリーディングフレーム、少なくとも１つの５’ＩＴＲおよび少なくとも１つの３’ＵＴＲを含み得、５’ＩＴＲの１つ以上はプロモータ領域の５末端に位置してもよく、１つ以上の３’ＩＴＲはポリ（Ａ）シグナルの３’末端に位置していてもよい。ＡＡＤＣ  ｍＲＮＡは、プロモータ領域、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲおよびポリ（Ａ）シグナルを含み得る。プロモータ領域は、限定ではないが、エンハンサーエレメント、プロモータエレメント、第１のエクソン領域、第１のイントロン領域、第２のイントロン領域および第２のエクソン領域を含み得る。非限定的な例として、エンハンサーエレメントおよびプロモータエレメントは、ＣＭＶに由来する。別の非限定的な例として、第１のエクソン領域は、ｉｅ１  エクソン１またはその断片であり、第１のイントロン領域は、ｉｅ１  イントロン１またはその断片であり、第２のイントロン領域は、ｈｂＢｇｌｏｂｉｎ  イントロン２またはその断片であり、第２のエクソン領域は、ｈｂＢｇｌｏｂｉｎ  エクソン３またはその断片である。更に別の非限定的な例として、ポリ（Ａ）シグナルは、ヒト成長ホルモンに由来する。
【０１９８】
一実施形態において、少なくとも１つのエレメントを、本明細書に記載されるＡＡＤＣポリヌクレオチドとともに使用して、トランス遺伝子標的特異性および発現を増強することができる（例えば、パウエル（Ｐｏｗｅｌｌ）ら著、「遺伝子療法におけるトランス遺伝子標的特異性および発現を増強するウイルス発現カセットエレメント（Ｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  Ｅｎｈａｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」、２０１５年を参照のこと；この内容は本明細書において全体として参照により援用される）。トランス遺伝子標的特異性および発現を増強するエレメントの非限定的な例としては、プロモータ、内因性ｍｉＲＮＡ、転写後調節エレメント（ＰＲＥ）、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列および上流エンハンサー（ＵＳＥ）、ＣＭＶエンハンサーおよびイントロンが挙げられる。
【０１９９】
一実施形態において、少なくとも１つのエレメントを、本明細書に記載されるＡＡＤＣポリヌクレオチドとともに使用して、トランス遺伝子標的特異性および発現を増強することができる（例えば、パウエル（Ｐｏｗｅｌｌ）ら著、「遺伝子療法におけるトランス遺伝子標的特異性および発現を増強するウイルス発現カセットエレメント（Ｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  Ｅｎｈａｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」、２０１５年を参照のこと。この内容は本明細書において全体として参照により援用される）。
【０２００】
一実施形態において、ＡＡＤＣポリヌクレオチドは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来してもよいプラスミドまたはベクターにコードされる。ＡＡＶは、限定ではないが、以下のものなどのカプシド血清型を含み得る：ＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．Ａ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３−３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４−４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２−１ｂ、ＡＡＶ４２−２、ＡＡＶ４２−３ａ、ＡＡＶ４２−３ｂ、ＡＡＶ４２−４、ＡＡＶ４２−５ａ、ＡＡＶ４２−５ｂ、ＡＡＶ４２−６ｂ、ＡＡＶ４２−８、ＡＡＶ４２−１０、ＡＡＶ４２−１１、ＡＡＶ４２−１２、ＡＡＶ４２−１３、ＡＡＶ４２−１５、ＡＡＶ４２−ａａ、ＡＡＶ４３−１、ＡＡＶ４３−１２、ＡＡＶ４３−２０、ＡＡＶ４３−２１、ＡＡＶ４３−２３、ＡＡＶ４３−２５、ＡＡＶ４３−５、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ１−７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１−８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２−１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２−３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２−４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２−５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３−９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３−１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ４−８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４−９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ４−１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ５−３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５−２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＤＪ８、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶＨ−１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ−５／ｈｕ．３、ＡＡＶＬＧ−１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ−４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ−９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＮ７２１−８／ｒｈ．４３、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．ｔ  １９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ  Ａ５８６Ｒ突然変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ  Ｒ５３３Ａ突然変異体、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ、ＡＡＶ−ＬＫ０１、ＡＡＶ−ＬＫ０２、ＡＡＶ−ＬＫ０３、ＡＡＶ−ＬＫ０４、ＡＡＶ−ＬＫ０５、ＡＡＶ−ＬＫ０６、ＡＡＶ−ＬＫ０７、ＡＡＶ−ＬＫ０８、ＡＡＶ−ＬＫ０９、ＡＡＶ−ＬＫ１０、ＡＡＶ−ＬＫ１１、ＡＡＶ−ＬＫ１２、ＡＡＶ−ＬＫ１３、ＡＡＶ−ＬＫ１４、ＡＡＶ−ＬＫ１５、ＡＡＶ−ＬＫ１６、ＡＡＶ−ＬＫ１７、ＡＡＶ−ＬＫ１８、ＡＡＶ−ＬＫ１９、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ８、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ−２−プレ−ｍｉＲＮＡ−１０１、ＡＡＶ−８ｈ、ＡＡＶ−８ｂ、ＡＡＶ−ｈ、ＡＡＶ−ｂ、ＡＡＶ  ＳＭ１０−２、ＡＡＶシャッフル１００−１、ＡＡＶシャッフル１００−３、ＡＡＶシャッフル１００−７、ＡＡＶシャッフル１０−２、ＡＡＶシャッフル１０−６、ＡＡＶシャッフル１０−８、ＡＡＶシャッフル１００−２、ＡＡＶ  ＳＭ１０−１、ＡＡＶ  ＳＭ１０−８、ＡＡＶ  ＳＭ１００−３、ＡＡＶ  ＳＭ１００−１０、ＢＮＰ６１  ＡＡＶ、ＢＮＰ６２  ＡＡＶ、ＢＮＰ６３  ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶ４−８／ｒｈ．６４、ＡＡＶＬＧ−９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、トゥルータイプ（ｔｒｕｅ  ｔｙｐｅ）ＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ  ＡＡＶ１０、日本ＡＡＶ１０血清型、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．１、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．１０、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．２、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．３、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．４、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．５、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．７、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．８、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｂ７．３、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｂ７．４、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ１、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ２、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ３、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ４、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ５、ＡＡＶ  ＣＢｒ−ｅ５、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ６、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ７、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ８、ＡＡＶ  ＣＨｔ−１、ＡＡＶ  ＣＨｔ−２、ＡＡＶ  ＣＨｔ−３、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．１、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．１０、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．５、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．６、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．７、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．８、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ１、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ２、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ５、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ６、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ８、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ９、ＡＡＶ  ＣＫｄ−１、ＡＡＶ  ＣＫｄ−１０、ＡＡＶ  ＣＫｄ−２、ＡＡＶ  ＣＫｄ−３、ＡＡＶ  ＣＫｄ−４、ＡＡＶ  ＣＫｄ−６、ＡＡＶ  ＣＫｄ−７、ＡＡＶ  ＣＫｄ−８、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ１、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ２、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ３、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ４、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ５、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ６、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ��、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ８、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ１、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ２、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ３、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ４、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ５、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ６、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｎ３、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｎ４、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｎ９、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ１、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ２、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ３、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ４、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ５、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ６、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ７、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−１、ＡＡＶ  ＣＬｖ１−１、ＡＡＶ  Ｃｌｖ１−１０、ＡＡＶ  ＣＬｖ１−２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−１２、ＡＡＶ  ＣＬｖ１−３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−１３、ＡＡＶ  ＣＬｖ１−４、ＡＡＶ  Ｃｌｖ１−７、ＡＡＶ  Ｃｌｖ１−８、ＡＡＶ  Ｃｌｖ１−９、ＡＡＶ  ＣＬｖ−２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−４、ＡＡＶ  ＣＬｖ−６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ４、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ５、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ７、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｅ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｋ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｋ３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｋ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｌ４、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｌ５、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｌ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ１１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ５、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ７、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ９、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ４、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ５、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ７、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ９、ＡＡＶ  ＣＳｐ−１、ＡＡＶ  ＣＳｐ−１０、ＡＡＶ  ＣＳｐ−１１、ＡＡＶ  ＣＳｐ−２、ＡＡＶ  ＣＳｐ−３、ＡＡＶ  ＣＳｐ−４、ＡＡＶ  ＣＳｐ−６、ＡＡＶ  ＣＳｐ−７、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．１０、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．２、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．４、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．５、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．６、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．７、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．８、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．９、ＡＡＶ  ＣＳｐ−９、ＡＡＶ．ｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶ．ＶＲ−３５５、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶＦ１／ＨＳＣ１、ＡＡＶＦ１１／ＨＳＣ１１、ＡＡＶＦ１２／ＨＳＣ１２、ＡＡＶＦ１３
／ＨＳＣ１３、ＡＡＶＦ１４／ＨＳＣ１４、ＡＡＶＦ１５／ＨＳＣ１５、ＡＡＶＦ１６／ＨＳＣ１６、ＡＡＶＦ１７／ＨＳＣ１７、ＡＡＶＦ２／ＨＳＣ２、ＡＡＶＦ３／ＨＳＣ３、ＡＡＶＦ４／ＨＳＣ４、ＡＡＶＦ５／ＨＳＣ５、ＡＡＶＦ６／ＨＳＣ６、ＡＡＶＦ７／ＨＳＣ７、ＡＡＶＦ８／ＨＳＣ８、ＡＡＶＦ９／ＨＳＣ９、ＰＨＰ．Ｂ  （ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ）、ＰＨＰ．Ａ  （ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ａ）、Ｇ２Ｂ−２６、Ｇ２Ｂ−１３、ＴＨ１．１−３２、ＴＨ１．１−３５、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｎ／ＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＧＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＴＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＧＧＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＮＰ（３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＮＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＮＱＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＧＮ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＰＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＬＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＴＭＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＴＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｓ／Ｇ２Ａ１２、ＡＡＶＧ２Ａ１５／Ｇ２Ａ３、ＡＡＶＧ２Ｂ４、および／またはＡＡＶＧ２Ｂ５、ならびにそれらのバリアント。
【０２０１】
ＩＩ．産生および分析
特定の実施形態において、ヒト芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ｈＡＡＤＣ）遺伝子の相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を有する組換えアデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２）は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモータの制御下にある。
【０２０２】
ベクターの産生には、Ｓｆ９細胞を２つのＢＶ感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）に感染させて、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ２）−ｈＡＡＤＣベクターを生成することが関与する。特定の実施形態において、ＢＩＩＣは、ＢＩＩＣ−ｒｅｐ２／ｃａｐ２、ＢＩＩＣ−ｈＡＡＤＣ、またはＢＩＩＣ：ＢＩＩＣ：ＶＣＤから選択される。
【０２０３】
ベクターは、４つの分子種：ベクターカプシドを形成する３つのウイルスタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）、およびＡＡＶ２末端逆位配列エレメント（ＩＴＲ）によって隣接された導入遺伝子発現カセットからなる、カプシドにパッケージングされた治療用デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）で構成される。あるいは、ベクターは、ＨＥＫ２９３／三重トランスフェクト（ＴＴｘ）系を使用して産生される。
【０２０４】
あるいは、ＨＴ１０８０細胞は、ＡＡＤＣを産生させるためにＡＡＶ２で形質導入される。ＡＡＶ２は、ニューロン細胞株とＨＴ１０８０細胞株との間で類似していると考えられているヘパリン硫酸媒介性結合により進入すると仮定されている（プロクマン（Ｐｌｏｃｈｍａｎｎ）ら著、ＪＶＩ  ２０１２年）。更に、ＨＴ１０８０細胞は、シナプス後ニューロンと同様に内因性ＡＡＤＣのレベルが検出不能であるため、遺伝子導入で発現されるｈＡＡＤＣでのアッセイウィンドウは大きく、正確である。特定の実施形態において、ＴＴ／ＨＥＫ２９３系を、ＡＡＤＣの産生に使用した。
【０２０５】
一部の実施形態において、細胞は、目的のタンパク質をコードするウイルスベクターで形質導入される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、パルボウイルスベクターである。一部の実施形態において、パルボウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。一部の実施形態において、目的のタンパク質は、ＡＡＤＣ、例えばヒトＡＡＤＣである。ＡＡＤＣ、例えばヒトＡＡＤＣのアミノ酸配列は周知である。例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ２０７１１．２のアミノ酸配列は、ヒトＡＡＤＣの代表的なアミノ酸配列である。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、ＡＡＶ２  ＡＡＤＣベクターまたはＡＡＶ２．ＡＡＤＣベクターである。一部の実施形態において、ＡＡＤＣウイルスベクターは、約１ｖｇ／細胞〜約１×１０８ｖｇ／細胞の濃度で細胞に形質導入される。一部の実施形態において、ＡＡＤＣウイルスベクターは、約１０ｖｇ／細胞〜約１×１０５ｖｇ／細胞の濃度で細胞に形質導入される。一部の実施形態において、ＡＡＤＣウイルスベクターは、約１ｖｇ／細胞〜約１×１０７ｖｇ／細胞の濃度で細胞に形質導入される。一部の実施形態において、ＡＡＤＣウイルスベクターは、約１１ｖｇ／細胞〜約１×１０６ｖｇ／細胞の濃度で細胞に形質導入される。一部の実施形態において、ＡＡＤＣウイルスベクターは、約１ｖｇ／細胞〜約１×１０５ｖｇ／細胞の濃度で細胞に形質導入される。一部の実施形態において、ＡＡＤＣウイルスベクターは、約１００ｖｇ／細胞〜約１×１０６ｖｇ／細胞の濃度で細胞に形質導入される。一部の実施形態において、ＡＡＤＣウイルスベクターは、約１００ｖｇ／細胞〜約１×１０５ｖｇ／細胞の濃度で細胞に形質導入される。一部の実施形態において、ＡＡＤＣウイルスベクターは、約１０ｖｇ／細胞〜約１×１０４ｖｇ／細胞の濃度で細胞に形質導入される。一部の実施形態において、ＡＡＤＣウイルスベクターは、約１０ｖｇ／細胞〜約１×１０３ｖｇ／細胞の濃度で細胞に形質導入される。一部の実施形態において、ＡＡＤＣウイルスベクターは、約１０ｖｇ／細胞〜約１×１０２ｖｇ／細胞の濃度で細胞に形質導入される。一部の実施形態において、ＡＡＤＣウイルスベクターは、約１００ｖｇ／細胞〜約１×１０４ｖｇ／細胞の濃度で細胞に形質導入される。一部の実施形態において、ＡＡＤＣウイルスベクターは、約１００ｖｇ／細胞〜約１×１０３ｖｇ／細胞の濃度で細胞に形質導入される。一部の実施形態において、ＡＡＤＣウイルスベクターは、約１ｖｇ／細胞、約１０ｖｇ／細胞、約１００ｖｇ／細胞、約１×１０３ｖｇ／細胞、約１×１０４ｖｇ／細胞  約１×１０５ｖｇ／細胞、約１×１０６ｖｇ／細胞  約１×１０７ｖｇ／細胞、または約１×１０８ｖｇ／の濃度で細胞に形質導入される。
【０２０６】
一部の実施形態において、ＨＴ１０８０細胞は、約３×１０２細胞／ｃｍ２〜約３×１０８細胞／ｃｍ２、約３×１０２細胞／ｃｍ２〜約３×１０７細胞／ｃｍ２、約３×１０２細胞／ｃｍ２〜約３×１０６細胞／ｃｍ２、約３×１０２細胞／ｃｍ２〜約３×１０５細胞／ｃｍ２、約３×１０２細胞／ｃｍ２〜約３×１０４細胞／ｃｍ２、約３×１０２細胞／ｃｍ２〜約３×１０３細胞／ｃｍ２、約３×１０３細胞／ｃｍ２〜約３×１０４細胞／ｃｍ２、約３×１０３細胞／ｃｍ２〜約３×１０５細胞／ｃｍ２、約３×１０３細胞／ｃｍ２〜約３×１０６細胞／ｃｍ２、約３×１０４細胞／ｃｍ２〜約３×１０６細胞／ｃｍ２、または約３×１０５細胞／ｃｍ２〜約３×１０７細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングされる。一部の実施形態において、ＨＴ１０８０は、約３×１０４細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングされる。
【０２０７】
一部の実施形態において、細胞は、約１×１０２細胞／ウェル〜約１×１０８細胞／ウェル、約１×１０２細胞／ウェル〜約１×１０７細胞／ウェル、約１×１０２細胞／ウェル〜約１×１０６細胞／ウェル、約１×１０２細胞／ウェル〜約１×１０５細胞／ウェル、約１×１０２細胞／ウェル〜約１×１０４細胞／ウェル、約１×１０２細胞／ウェル〜約１×１０３細胞／ウェル、約１×１０３細胞／ウェル〜約１×１０４細胞／ウェル、約１×１０３細胞／ウェル〜約１×１０５細胞／ウェル、約１×１０３細胞／ウェル〜約１×１０６細胞／ウェル、約１×１０４細胞／ウェル〜約１×１０６細胞／ウェル、または約１×１０５細胞／ウェル〜約１×１０７細胞／ウェルの密度でプレーティングされる。一部の実施形態において、ＨＴ１０８０細胞は、約１×１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングされる。
【０２０８】
一部の実施形態において、ＨＴ１０８０細胞は、約１×１０２細胞／ウェル〜約１×１０８細胞／ウェル、約１×１０２細胞／ウェル〜約１×１０７細胞／ウェル、約１×１０２細胞／ウェル〜約１×１０６細胞／ウェル、約１×１０２細胞／ウェル〜約１×１０５細胞／ウェル、約１×１０２細胞／ウェル〜約１×１０４細胞／ウェル、約１×１０２細胞／ウェル〜約１×１０３細胞／ウェル、約１×１０３細胞／ウェル〜約１×１０４細胞／ウェル、約１×１０３細胞／ウェル〜約１×１０５細胞／ウェル、約１×１０３細胞／ウェル〜約１×１０６細胞／ウェル、約１×１０４細胞／ウェル〜約１×１０６細胞／ウェル、または約１×１０５細胞／ウェル〜約１×１０７細胞／ウェルの密度でプレーティングされる。一部の実施形態において、ＨＴ１０８０細胞は、約１×１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングされる。一部の実施形態において、ＨＴ１０８０細胞は、５×１０３細胞／ウェルの密度でプレーティングされた。一部の実施形態において、細胞は、３７±２℃にて２４＋２時間インキュベートされる。
【０２０９】
一部の実施形態において、細胞は、目的のタンパク質をコードするウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターで形質導入され、溶解され、細胞溶解物が収集される。一部の実施形態において、細胞は、目的のタンパク質をコードするウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターで形質導入され、形質導入の約１８〜約７２時間後に回収される。一部の実施形態において、細胞は、形質導入の２４時間後に回収される。一部の実施形態において、細胞は、形質導入の約２４時間〜約４４時間後に回収される。一部の実施形態において、細胞は、形質導入の約４４時間〜約５２時間後に回収される。一部の実施形態において、細胞は、形質導入の約５２時間〜約７２時間後に回収される。
【０２１０】
一部の実施形態において、細胞は、化学的および／または機械的溶解を使用して溶解される。一部の実施形態において、化学的溶解は、プロテアーゼ阻害剤、リン酸緩衝生理食塩水およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含む溶解緩衝液を含む。一部の実施形態において、細胞は、溶解緩衝液の添加後に−８０℃にて約３０分〜約７２時間凍結することができる。あるいは、細胞溶解物は、２〜８℃の範囲でまたは室温で保管してもよい。一部の実施形態において、細胞は遠心分離され、細胞溶解物が収集される。一部の実施形態において、これは、室温にて１０分間３，７５０ＲＰＭの遠心分離機で細胞を遠心することによって実施される。
【０２１１】
一部の実施形態において、本出願は、ＡＡＤＣ効力を測定する方法であって、ＡＡＤＣをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターで形質導入された細胞から産生された細胞溶解物に、Ｌ−ＤＯＰＡを添加する工程、およびＬ−ＤＯＰＡとのＡＡＤＣの反応後に細胞溶解物にて産生されたドーパミンの量を測定する工程を含む方法を提供する。
【０２１２】
一部の実施形態において、細胞溶解物は、ＡＡＶ２．ＡＡＤＣベクターで形質導入された細胞から産生されたＡＡＤＣを含む。一部の実施形態において、Ｌ−ＤＯＰＡおよび／またはＡＡＤＣ反応緩衝液を細胞溶解物に添加する。一部の実施形態において、Ｌ−ＤＯＰＡは、Ｌ−ＤＯＰＡとのＡＡＤＣの反応によりドーパミンに変換される。
【０２１３】
一部の実施形態において、ＡＡＤＣ反応緩衝液は、リン酸ナトリウム緩衝液、例えば５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液などのリン酸緩衝液を含む。一部の実施形態において、ＡＡＤＣ反応緩衝液は、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、アスコルビン酸、ピリドキサル−５’−ホスフェート  ＤＬ−ジチオトレイトール、ＥＤＴＡ、およびパルギリンを含む。一部の実施形態において、ＡＡＤＣ反応緩衝液は、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２、０．１ｍＭアスコルビン酸、０．１ｍＭピリドキサル−５’−ホスフェート、１ｍＭ  ＤＬ−ジチオトレイトール、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１ｍＭパルギリンを含む。一部の実施形態において、ＡＡＤＣ反応緩衝液は、オクタンスルホン酸ナトリウム塩、リン酸一ナトリウム、およびアセトニトリルを含む。一部の実施形態において、ＡＡＤＣ反応緩衝液は、３．０ｍＭオクタンスルホン酸ナトリウム塩、ｐＨ３．０、７２．５ｍＭリン酸一ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、および１０％アセトニトリルを含む。一部の実施形態において、ＡＡＤＣ反応緩衝液は、３．２ｍＭオクタンスルホン酸ナトリウム塩、ｐＨ３．０、７２．５ｍＭリン酸一ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、および１０％アセトニトリルを含む。一部の実施形態において、Ｌ−ＤＯＰＡは、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭの濃度で細胞溶解物に添加される。一部の実施形態において、Ｌ−ＤＯＰＡは、約０．０３ｍＭの濃度で細胞溶解物に添加される。
【０２１４】
一部の実施形態において、Ｌ−ＤＯＰＡとのＡＡＤＣの反応は、３７℃で行われる。一部の実施形態において、Ｌ−ＤＯＰＡとのＡＡＤＣの反応は、１０〜１２０分間行われる。一部の実施形態において、Ｌ−ＤＯＰＡとのＡＡＤＣの反応は、３０分間行われる。一部の実施形態において、Ｌ−ＤＯＰＡとのＡＡＤＣの反応を３０分間行い、細胞溶解物を２〜８℃に移して、変換の速度を低減させ、試料間の変動性を最小限に抑える。一部の実施形態において、Ｌ−ＤＯＰＡとのＡＡＤＣの反応は、室温で行われる。
【０２１５】
一部の実施形態において、Ｌ−ＤＯＰＡとのＡＡＤＣの反応は、氷冷過塩素酸を添加することによってクエンチされる。一部の実施形態において、氷冷過塩素酸は、０．１Ｍ〜１Ｍの濃度で添加される。一部の実施形態において、氷冷過塩素酸は、０．５Ｍの濃度で添加される。
【０２１６】
一部の実施形態において、産生されたドーパミンの量は、電気化学検出器を有する超高速液体クロマトグラフィー（「ＵＨＰＬＣ−ＥＣＤ」）を使用して測定される。一部の実施形態において、産生されたドーパミンの量は、ドーパミンの量をドーパミン標準曲線と比較することによって、ＵＨＰＬＣ−ＥＣＤを使用して測定される。
【０２１７】
また、本出願は、ＡＡＤＣウイルスベクター効力を測定する方法であって、ＡＡＤＣをコードするポリヌクレオチドを含む第１のウイルスベクターで形質導入された細胞から産生された細胞溶解物に、Ｌ−ＤＯＰＡを添加する工程、Ｌ−ＤＯＰＡとのＡＡＤＣの反応後に細胞溶解物にて産生されたドーパミンの量を測定する工程、および産生されたドーパミンの量を、ウイルスベクター参照標準物質を利用した場合に産生されたドーパミンの量と比較して、第１のウイルスベクターの効力を測定する工程を含む方法を提供する。
【０２１８】
一部の実施形態において、ウイルスベクター参照標準物質は、上記に記載されているウイルスベクター効力法に適切な範囲を提供する。一部の実施形態において、細胞を１細胞当たりまたはｖｇ／μｌのある範囲のベクターゲノムで形質導入し、細胞を上記に記載のように溶解させ、目的の分子の活性を決定する。一部の実施形態において、用量応答がプロットされる（ドーパミン対１細胞当たりまたはｖｇ／μｌのベクターゲノム）。一部の実施形態において、１細胞当たりのベクターゲノムの範囲は、１細胞当たり約１０〜約１０，０００ベクターゲノムである。一部の実施形態において、１細胞当たりのベクターゲノムの範囲は、最も高い用量の２倍系列希釈を実施することによって均等に離間された用量を含む。
【０２１９】
一部の実施形態において、本開示は、所望の効力を有するウイルスベクターを選択する方法を指す。一部の実施形態において、Ｌ−ＤＯＰＡとのＡＡＤＣの反応後に細胞溶解物にて産生されるドーパミンの量は、ウイルス参照標準物質を利用した際に産生されるドーパミンの量よりも高く、第１のウイルスベクターがウイルスベクター参照物よりも強力であることを示す。一部の実施形態において、Ｌ−ＤＯＰＡとのＡＡＤＣの反応後に細胞溶解物にて産生されるドーパミンの量は、ウイルス参照標準物質を利用した際に産生されるドーパミンの量よりも低く、第１のウイルスベクターがウイルスベクター参照物よりも強力ではないことを示す。一部の実施形態において、Ｌ−ＤＯＰＡとのＡＡＤＣの反応後に細胞溶解物にて産生されるドーパミンの量は、ウイルス参照標準物質を利用した際に産生されるドーパミンの量とほぼ等しく、第１のウイルスベクターがウイルスベクター参照物とほぼ等しく強力であることを示す。
【０２２０】
特定の実施形態において、本明細書に記載されている方法は、規定された許容範囲内の値についてモニターされたウイルスベクターロットを含む陽性対照を使用する工程を更に含み得る。アッセイ実行が許容範囲の外側である陽性対照からの値をもたらす場合、アッセイ実行は、無効であると宣言することができる。そのような陽性対照は、有効性または判定基準としての利益を提供することができる。
【０２２１】
本明細書に記載されている方法は、限定はされないが、細胞プレート、例えば２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、９６ウェルプレート、もしくは３８４ウェルプレート、個々の細胞培養プレートまたはフラスコ、例えばＴ型フラスコもしくは振盪フラスコを含む、幅広い範囲の細胞アッセイフォーマットのいずれかを利用することによって実施することができる。
【０２２２】
一部の実施形態において、データは、以下の数式に従って、４パラメータロジスティック回帰分析を使用して分析される。
【０２２３】
【数１】
2021521852.tif 000004
【０２２４】
式中、Ａは、上部漸近線（「上部」）であり、Ｂは、ダイナミックレンジの傾き（「ヒルスロープ」）であり、Ｃは、ＥＣ５０であり、Ｄは、下部漸近線（「下部」）である。一部の実施形態において、用量応答曲線は、４パラメータ曲線分析に対してフィッティングされる。一部の実施形態において、異なる試料の相対効力は、４パラメータ曲線分析による最大半量有効濃度（ＥＣ５０）の値またはシフトとして表現することができる。この方法が線形性であることにより、バッチ間抗力の正確な比較が可能になり、一貫性が保証される。
【０２２５】
一部の実施形態において、データを相対効力について分析し、それを参照標準物質に由来するＥＣ５０のシフトとして表現することができる。ＡＡＤＣ相対効力は、以下の数式を使用して、参照標準物質のＥＣ５０値の試験試料に対する比として表現することができる。
【０２２６】
【数２】
2021521852.tif 000005
【０２２７】
一部の実施形態において、ＡＡＤＣベクターは、１〜５％、５〜１０％、１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３０％、３０〜３５％、３５〜４０％、４０〜４５％、４５〜５０％、５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％、７５〜８０％、８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜１００％、１００〜１０５％、１０５〜１１０％、１１０〜１１５％、１１５〜１２０％、１２０〜１２５％、１２５〜１３０％、１３０〜１３５％、１３５〜１４０％、１４０〜１４５％、１４５〜１５０％、１５０〜１５５％、１５５〜１６０％、１６０〜１６５％、１６５〜１７０％、１７０〜１７５％、１７５〜１８０％、１８０〜１８５％、１８５〜１９０％、１９０〜１９５％、１９５〜２００％のＡＡＤＣ相対効力を有する。
【０２２８】
一部の実施形態において、ＡＡＤＣベクターのＡＡＤＣ相対効力は、閾値ＡＡＤＣ相対効力値と比較される。一部の実施形態において、ＡＡＤＣベクターは、閾値ＡＡＤＣ相対効力値未満である場合、廃棄または放棄される。一部の実施形態において、ＡＡＶ製剤にはＡＡＤＣウイルスベクターが含まれており、ＡＡＤＣウイルスベクターのＡＡＤＣ相対効力が、閾値ＡＡＤＣ相対効力値未満である場合、ＡＡＶ製剤を製剤容器にアリコートしない。特定の実施形態において、閾値ＡＡＤＣ相対効力値は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％、１９５％、または２００％である。
【０２２９】
一部の実施形態において、本開示のアッセイは、異なる方法によって産生されたＡＡＤＣベクターの酵素活性を測定および／または比較するために使用することができる。一部の実施形態において、本開示のアッセイは、異なる容積中で産生されたＡＡＤＣベクターの酵素活性を測定および／または比較するために使用することができる。一部の実施形態において、本開示のアッセイは、約１０Ｌ〜約５０００Ｌの規模、約５０Ｌ〜約４０００Ｌ、約１００Ｌ〜約３０００Ｌ、または約２０Ｌ〜約２０００Ｌの規模で産生されたＡＡＤＣベクターの酵素活性を測定するために使用することができる。一部の実施形態において、本開示のアッセイは、約１０Ｌ、約２５Ｌ、約５０Ｌ、約７５Ｌ、約１００Ｌ、約１５０Ｌ、約２００Ｌ、約２５０Ｌ、約５００Ｌ、約７５０Ｌ、約１０００Ｌ、約１５００Ｌ、約２０００Ｌ、約３０００Ｌ、約４０００Ｌ、および約５０００Ｌの規模で産生されたＡＡＤＣベクターの酵素活性を測定するために使用することができる。
【０２３０】
理論によって束縛されることを望むものではないが、本明細書に記載されている効力アッセイは、生物学的に関連する文脈における導入遺伝子（例えば、ＡＡＤＣ）発現を評価する方法を提供する。
【０２３１】
アッセイは、ＡＡＤＣを発現するある用量範囲のベクターによる不死化細胞株（ＨＴ１０８０細胞）のインビトロ形質導入を利用するものとして想定される。その後、溶解物を使用して、酵素的にＬ−ＤＯＰＡをドーパミンに変換することになる。ドーパミンの産生は、Ｌ−ＤＯＰＡおよびドーパミンにあるジヒドロキシ芳香環の酸化をＵＨＰＬＣ（またはＨＰＬＣ）、次いで電気化学的検出（「ＵＨＰＬＣ−ＥＣＤ」）によってモニターすることができる。あるいは、ドーパミンの産生は、用量範囲によってモニターすることができ、その後、非線形曲線に対してフィティングされることになる。フィティングパラメータを使用して、試料を参照に対して試験することになる。あるいは、ＵＨＰＬＣ−ＵＶを使用して、ドーパミンの産生を測定する。特定の実施形態において、用量は、３２μＭから３２０μＭまでの範囲である。
【０２３２】
ＡＡＤＣを使用したＬ−ＤＯＰＡのドーパミンへの変換は、以前に文献で実証されている（シエシエルスカ（Ｃｉｅｓｉｅｌｓｋａ）ら著、２０１５年）。変換に必要な試薬／コファクターおよび反応条件を含めて、ＡＡＤＣを発現する回収された組織溶解物を使用してＬ−ＤＯＰＡをドーパミンに変換した。ＨＰＬＣ−ＥＣＤを使用したこの変換の測定。
【０２３３】
本明細書に記載されている効力アッセイの正確性は、ウイルスベクター力価の初期測定によって影響を受ける場合がある。正確であり、精度が良く、再現性が高い力価は、より正確であり、精度が良く、再現性が高い効力読取りを保証し、実験的または臨床的用量の信頼性を保証するために更に使用することができる。力価および効力データは、組み合わせると、ウイルスベクター特徴ならびに有効性および安全性を増強するための適切な用量パラメータを当業者に更に知らせる役目を果たすことができる。力価および効力の複数の測定は、ロット間比較および長期安定性研究の正確性および精度を更に増加させることができる。
【０２３４】
ＡＡＶ粒子を製作する方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、以下の文献に記載されている：米国特許第６２０４０５９号明細書、同第５７５６２８３号明細書、同第６２５８５９５号明細書、同第６２６１５５１号明細書、同第６２７０９９６号明細書、同第６２８１０１０号明細書、同第６３６５３９４号明細書、同第６４７５７６９号明細書、同第６４８２６３４号明細書、同第６４８５９６６号明細書、同第６９４３０１９号明細書、同第６９５３６９０号明細書、同第７０２２５１９号明細書、同第７２３８５２６号明細書、同第７２９１４９８号明細書、および同第７４９１５０８号明細書、同第５０６４７６４号明細書、同第６１９４１９１号明細書、同第６５６６１１８号明細書、同第８１３７９４８号明細書；または国際公開第１９９６０３９５３０号パンフレット、同第１９９８０１００８８号パンフレット、同第１９９９０１４３５４号パンフレット、同第１９９９０１５６８５号パンフレット、同第１９９９０４７６９１号パンフレット、同第２００００５５３４２号パンフレット、同第２００００７５３５３号パンフレットおよび同第２００１０２３５９７号パンフレット；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、リチャード（Ｒｉｃｈａｒｄ）編、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー州（１９９５年）；オライリー（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ）ら著、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）（１９９４年）；サムルスキ（Ｓａｍｕｌｓｋｉ）ら著、Ｊ．Ｖｉｒ．、第６３巻、ｐ．３８２２〜８（１９８９年）；カジガヤ（Ｋａｊｉｇａｙａ）ら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８８巻：ｐ．４６４６〜５０（１９９１年）；ラフィング（Ｒｕｆｆｉｎｇ）ら著、Ｊ．Ｖｉｒ．、第６６巻：ｐ．６９２２〜３０（１９９２年）；キムバウアー（Ｋｉｍｂａｕｅｒ）ら著、Ｖｉｒ．、第２１９巻：ｐ．３７〜４４（１９９６年）；チャオ（Ｚｈａｏ）ら著、Ｖｉｒ．、第２７２巻：ｐ．３８２〜９３（２０００年）。これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される。一実施形態において、ＡＡＶ粒子は、国際公開第２０１５１９１５０８号パンフレット（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載される方法を使用して製作される。
【０２３５】
組換えＡＡＶ粒子の作製に一般的に使用されるウイルス複製細胞としては、限定はされないが、米国特許第６１５６３０３号明細書、同第５３８７４８４号明細書、同第５７４１６８３号明細書、同第５６９１１７６号明細書、および同第５６８８６７６号明細書；米国特許出願公開第２００２／００８１７２１号明細書、および国際公開第００／４７７５７号パンフレット、同第００／２４９１６号パンフレット、および同第９６／１７９４７号パンフレット（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載される通りの、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＫＢ細胞、および他の哺乳類細胞株が挙げられる。
【０２３６】
特定の実施形態において、本開示は、あるＭＯＩ用量範囲のＡＡＶ２−ＡＡＤＣによる不死化細胞株（ＨＴ−１０８０；ヒト線維肉腫細胞）のインビトロ形質導入を利用するアッセイを提供する。その後、溶解物を使用して、Ｌ−ＤＯＰＡを酵素的にドーパミンに変換する。ドーパミンの産生は、Ｌ−ＤＯＰＡおよびドーパミンに存在する芳香環をＵＨＰＬＣ（またはＨＰＬＣ）、次いで紫外線（ＵＶ）検出または電気化学検出（ＥＣＤ）によってモニターすることができる。ＭＯＩ用量の範囲およびそれらの対応するドーパミン値は、非線形４パラメータ曲線に対してフィティングすることができる。４パラメータフィティングデータを使用して、試験試料をベクター参照に対して評価し、相対効力を決定することができる。
【０２３７】
一部の実施形態において、本開示は、１）コンピテント細菌細胞にバクミドベクターおよびウイルスコンストラクトベクターおよび／またはＡＡＶペイロードコンストラクトベクターのいずれかをコトランスフェクトする工程、２）得られたウイルスコンストラクト発現ベクターおよびＡＡＶペイロードコンストラクト発現ベクターを単離し、ウイルス複製細胞を個別にトランスフェクトする工程、３）ウイルスコンストラクト発現ベクターまたはＡＡＶペイロードコンストラクト発現ベクターを含む得られたペイロードおよびウイルスコンストラクト粒子を単離および精製する工程、４）ウイルス複製細胞に、ウイルスコンストラクト発現ベクターまたはＡＡＶペイロードコンストラクト発現ベクターを含むＡＡＶペイロードおよびウイルスコンストラクト粒子の両方を共感染させる工程、ならびに５）ウイルスゲノムを含むＡＡＶ粒子を回収および精製する工程を含む、形質導入効率が増強された（増加した、向上した）ＡＡＶ粒子の作製方法を提供する。
【０２３８】
一部の実施形態において、本開示は、１）限定はされないがＨＥＫ２９３細胞などの哺乳類細胞にペイロード領域、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するコンストラクトならびにヘルパーコンストラクトを同時にコトランスフェクトする工程、２）ウイルスゲノムを含むＡＡＶ粒子を回収および精製する工程を含む、ＡＡＶ粒子の作製方法を提供する。
【０２３９】
一部の実施形態において、本開示は、（ａ）ＡＡＶベクターを含むＡＡＶ製剤を準備する工程、（ｂ）本開示の方法またはシステムを使用してＡＡＶ製剤のウイルスベクター効力を測定する工程、および（ｃ）ウイルスベクター効力が測定された後でＡＡＶ製剤を製剤容器へと好適にアリコートする工程を含み得る、遺伝子療法製品の作製方法を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターは、ウイルスゲノムを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするＡＡＤＣポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、測定されるＡＡＶ製剤のウイルスベクター効力は、ＡＡＤＣウイルスベクター効力である。
【０２４０】
一部の実施形態において、本開示は、（ａ）ＡＡＶ製剤を製剤容器へと好適にアリコートする工程を含み得、ＡＡＶ製剤はＡＡＶベクターを含み、製剤のウイルスベクター効力は、ＡＡＶ製剤を製剤容器へとアリコートする前に本開示の方法またはシステムを使用して測定されている、遺伝子療法製品の作製方法を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは、ウイルスゲノムを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするＡＡＤＣポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、測定されるＡＡＶ製剤のウイルスベクター効力は、ＡＡＤＣウイルスベクター効力である。
【０２４１】
一部の実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは、任意選択で、選択可能なマーカーをコードする。選択可能なマーカーは、限定はされないが、受容体、ＣＤマーカー、レクチン、インテグリン、またはそれらのトランケート型を含む、細胞表面に発現される任意のタンパク質などの、細胞表面マーカーを含み得る。
【０２４２】
一部の実施形態において、選択可能なマーカーレポーター遺伝子は、国際公開第９６／２３８１０号パンフレット；ハイム（Ｈｅｉｍ）ら著、カレント・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２巻：ｐ．１７８〜１８２（１９９６年）；ハイム（Ｈｅｉｍ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、（１９９５年）；またはハイム（Ｈｅｉｍ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、３７３巻：ｐ．６６３〜６６４（１９９５年）；国際公開第９６／３０５４０号パンフレットに記載されている通りである。これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される。
【０２４３】
ＩＩＩ．製剤および組成物
医薬組成物
本開示によると、ＡＡＶ粒子は、医薬組成物として調製することができる。かかる組成物は、１つ以上の有効成分を必ず含み、かつほとんどの場合で薬学的に許容される賦形剤を含むことが理解されるだろう。
【０２４４】
本開示に係る医薬組成物中の有効成分（例えば、ＡＡＶ粒子）、薬学的に許容可能な賦形剤、および／または任意の追加成分の相対量は、治療下の対象のアイデンティティ、サイズ、および／または状態に応じて、更には組成物が投与される経路に応じて異なり得る。例えば、組成物は、０．０００１％〜９９％（ｗ／ｗ）の有効成分を含み得る。例として、組成物は、０．０００１％〜１００％、例えば０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の有効成分を含み得る。
【０２４５】
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子医薬組成物は、少なくとも１つのペイロードを含み得る。非限定的な例として、医薬組成物は、１、２、３、４または５つのペイロードを有するＡＡＶ粒子を含有し得る。
【０２４６】
本明細書で提供される医薬組成物の記載は、主にヒトへの投与に好適な医薬組成物を対象とするが、当業者であれば、かかる組成物が、一般に任意の他の動物、例えば非ヒト動物、例えば非ヒト哺乳類への投与に好適であることを理解するであろう。組成物を種々の動物への投与に好適にするための、ヒトへの投与に好適な医薬組成物の修飾については十分に理解されており、獣医薬理学の当業者は、あったとしても通常通りに過ぎない実験をもって、かかる修飾を設計および／または実施することができる。医薬組成物の投与が企図される対象としては、限定はされないが、ヒトおよび／または他の霊長類；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、ラットなど、商業的に関連性のある哺乳類を含めた哺乳類、家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／またはシチメンチョウなど、商業的に関連性のある鳥類を含めた鳥類が挙げられる。
【０２４７】
一部の実施形態において、組成物は、ヒト、ヒト患者または対象に投与される。
製剤
本開示の製剤は、限定なしで、生理食塩水、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、ＡＡＶ粒子をトランスフェクトした細胞（例えば、対象への移入または移植用の）、およびそれらの組合せを含むことができる。
【０２４８】
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野において公知のまたは今後開発される任意の方法によって調製されてもよい。本明細書で使用されるとき、用語「医薬組成物」は、少なくとも１つの有効成分および任意選択で１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を指す。
【０２４９】
一般的に、かかる調製方法は、有効成分を賦形剤および／または１つ以上の他の補助成分と合わせる工程を含む。本明細書で使用されるとき、語句「有効成分」は、一般に、本開示のポリペプチドをコードするペイロード領域を担持するＡＡＶ粒子、または本明細書に記載されるようなＡＡＶ粒子のウイルスゲノムによってコードされる最終産物のいずれかを指す。
【０２５０】
本明細書に記載されるＡＡＶ粒子および医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野において公知のまたは今後開発される任意の方法によって調製されてもよい。一般に、かかる調製方法は、有効成分を賦形剤および／または１つ以上の他の補助成分と合わせる工程、および次に、必要であればおよび／または望ましい場合には、生成物を所望の単回または複数回用量単位に分割、付形および／または包装する工程を含む。
【０２５１】
本開示に係る医薬組成物は、バルクで、単回単位用量として、および／または複数の単回単位用量として調製、包装、および／または販売されてもよい。本明細書で使用されるとき、「単位用量」は、所定量の有効成分を含む医薬組成物の個別的な量を指す。有効成分の量は、概して対象に投与されるであろう有効成分の投薬量に等しく、および／またはかかる投薬量の好都合な一部、例えばかかる投薬量の２分の１または３分の１である。
【０２５２】
一実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子は、エチレンオキシド／プロピレンオキシドコポリマー（プルロニック（登録商標）またはポロキサマーとしても知られている）と組み合わせてＰＢＳで製剤化され得る。
【０２５３】
一実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子は、ｐＨが約７．０の０．００１％プルロニック酸（Ｆ−６８）（ポロキサマー１８８）を有するＰＢＳで製剤化され得る。
一実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子は、ｐＨが約７．３の０．００１％プルロニック酸（Ｆ−６８）（ポロキサマー１８８）を有するＰＢＳで製剤化され得る。
【０２５４】
一実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子は、ｐＨが約７．４の０．００１％プルロニック酸（Ｆ−６８）（ポロキサマー１８８）を有するＰＢＳで製剤化され得る。
一実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子は、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびエチレンオキシド／プロピレンオキシドコポリマーを含む溶液で製剤化され得る。
【０２５５】
一実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子は、塩化ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一ナトリウムおよびポロキサマー１８８／プルロニック酸（Ｆ−６８）を含む溶液で製剤化され得る。
【０２５６】
一実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子は、ｐＨが７．３の約１８０ｍＭ塩化ナトリウム、約１０ｍＭリン酸ナトリウムおよび０．００１％ポロキサマー１８８を含む溶液で製剤化され得る。最終溶液中の塩化ナトリウムの濃度は、１５０ｍＭ〜２００ｍＭであってもよい。非限定的な例として、最終溶液中の塩化ナトリウムの濃度は、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭまたは２００ｍＭであってもよい。最終溶液中のリン酸ナトリウムの濃度は、１ｍＭ〜５０ｍＭであってもよい。非限定的な例として、最終溶液中のリン酸ナトリウムの濃度は、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、または５０ｍＭであってもよい。ポロキサマー１８８（プルロニック酸（Ｆ−６８））の濃度は、０．０００１％〜１％であってもよい。非限定的な例として、ポロキサマー１８８（プルロニック酸（Ｆ−６８））の濃度は、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、または１％であってもよい。最終溶液は、６．８〜７．７のｐＨを有してもよい。最終溶液のｐＨの非限定的な例としては、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、または７．７のｐＨが挙げられる。
【０２５７】
一実施形態において、本開示のＡＡＶ粒子は、ｐＨが約７．４の約１．０５％塩化ナトリウム、約０．２１２％リン酸二ナトリウム七水和物、約０．０２５％リン酸一ナトリウム一水和物、および０．００１％ポロキサマー１８８を含む溶液で製剤化され得る。非限定的な例として、この製剤化溶液中のＡＡＶ粒子の濃度は、約０．００１％であってもよい。最終溶液中の塩化ナトリウムの濃度は、０．１〜２．０％であってもよく、非限定的な例は、０．１％、０．２５％、０．５％、０．７５％、０．９５％、０．９６％、０．９７％、０．９８％、０．９９％、１．００％、１．０１％、１．０２％、１．０３％、１．０４％、１．０５％、１．０６％、１．０７％、１．０８％、１．０９％、１．１０％、１．２５％、１．５％、１．７５％、または２％である。最終溶液中のリン酸二ナトリウムの濃度は、０．１００〜０．３００％であってもよく、非限定的な例としては、０．１００％、０．１２５％、０．１５０％、０．１７５％、０．２００％、０．２１０％、０．２１１％、０．２１２％、０．２１３％、０．２１４％、０．２１５％、０．２２５％、０．２５０％、０．２７５％、０．３００％が挙げられる。最終溶液中のリン酸一ナトリウムの濃度は、０．０１０〜０．０５０％であってもよく、非限定的な例は、０．０１０％、０．０１５％、０．０２０％、０．０２１％、０．０２２％、０．０２３％、０．０２４％、０．０２５％、０．０２６％、０．０２７％、０．０２８％、０．０２９％、０．０３０％、０．０３５％、０．０４０％、０．０４５％、または０．０５０％である。ポロキサマー１８８（プルロニック酸（Ｆ−６８））の濃度は、０．０００１％〜１％であってもよい。非限定的な例として、ポロキサマー１８８（プルロニック酸（Ｆ−６８））の濃度は、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、または１％であってもよい。最終溶液は、６．８〜７．７のｐＨを有してもよい。最終溶液のｐＨの非限定的な例としては、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、または７．７のｐＨが挙げられる。
【０２５８】
一実施形態において、製剤は、以下のＣＡＳ（化学情報検索サービス機関）登録番号を有する成分を含む：７６４７−１４−１５（塩化ナトリウム）、７７８２−８５−６（リン酸二ナトリウム七水和物）、１００４９−２１−５（リン酸一ナトリウム一水和物）、９００３−１１−６（ポロキサマー１８８）および２２２６６４７−２７−２（組換えアデノ随伴ウイルス２ベクターＶＹ−ＡＡＤＣ０２ヒト芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ特異的）。
【０２５９】
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ製剤は、少なくとも１つの発現機能性ペイロードの発現に十分なＡＡＶ粒子を含有し得る。非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、１、２、３、４または５つの機能性ペイロードをコードするウイルスゲノムを含有し得る。
【０２６０】
本開示によると、ＡＡＶ粒子は、ＣＮＳ送達用に製剤化され得る。脳血液関門を通過する薬剤が使用されてもよい。例えば、分子を脳血液関門内皮へと標的化することができる一部の細胞透過性ペプチドが製剤に使用されてもよい（例えば、マスウパラ（Ｍａｔｈｕｐａｌａ）、エキスパート・オピニオン・オン・セラピュティック・パテント（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｐａｔ．）、２００９年、１９巻、ｐ．１３７〜１４０。この内容は本明細書において全体として参照により援用される）。
【０２６１】
一部の実施形態において、本開示の製剤は、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかでパッケージングされ得る。製剤の容器は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段を含むことになり、その中に製剤が配置され、好ましくは好適にアリコートされ得る。１つを上回ってキットの構成要素が存在する場合（標識化試薬および標識が、一緒にパッケージングされてもよい）、キットはまた、通常、追加の構成要素が別個に配置され得る第２、第３、またはその他の追加の容器も含んでよい。一部の実施形態において、キットはまた、滅菌の薬学的に許容可能な緩衝液および／または他の希釈剤を格納する第２の容器手段を含んでもよい。一部の実施形態において、様々な組合せの構成要素が、１つ以上のバイアルに含まれてもよい。本開示のキットはまた、典型的に、本開示の化合物および／または組成物を格納するための手段、例えば、タンパク質、核酸、および任意の他の試薬の容器を、商業販売のために緊密に封止した状態で含み得る。そのような容器としては、所望されるバイアルが中に保持される、射出成形または吹込み成形された容器を挙げることができる。
【０２６２】
賦形剤および希釈剤
本開示のＡＡＶ粒子は、（１）安定性を増加させるために、（２）細胞トランスフェクションまたは形質導入を増加させるために、（３）ペイロードの持続放出または遅延放出を可能にするために、（４）生体内分布を変更するために（例えば、ウイルス粒子を、特定の組織または細胞タイプへと標的化するために）、（５）コード化タンパク質の翻訳を増加させるために、（６）コード化タンパク質の放出プロファイルを変更するために、および／または（７）本開示のペイロードの制御可能な発現を可能にするために、１つ以上の賦形剤または希釈剤を使用して製剤化され得る。
【０２６３】
一部の実施形態において、薬学的に許容可能な賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の純度であってもよい。一部の実施形態において、賦形剤はヒトへの使用および動物への使用が承認されている。一部の実施形態において、賦形剤は米国食品医薬品局によって承認されていてもよい。一部の実施形態において、賦形剤は医薬品グレードであってもよい。一部の実施形態において、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、および／または国際薬局方の規格に適合し得る。
【０２６４】
賦形剤には、本明細書で使用されるとき、限定はされないが、所望の特定の剤形に適する通りのあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体媒体、分散液または懸濁液助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤などが含まれる。医薬組成物を製剤化するための種々の賦形剤および組成物の調製技法は当該技術分野において公知である（「レミントン：薬学の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版、Ａ・Ｒ・ジェンナロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）著、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ）、メリーランド州ボルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、２００６年を参照のこと；全体として参照により本明細書に援用される）。従来の賦形剤媒体の使用は本開示の範囲内に企図され得るが、ただし、任意の望ましくない生物学的効果を生じたり、またはその他、医薬組成物の任意の他の１つ以上の成分と有害な形で相互作用したりするなどにより、任意の従来の賦形剤媒体が物質またはその誘導体と不適合である場合は除く。
【０２６５】
例示的希釈剤としては、限定はされないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム  ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉末糖等、および／またはこれらの組合せが挙げられる。
【０２６６】
一実施形態において、ＡＡＶ粒子は、投与前にヒドロゲルで製剤化され得る。ヒドロゲルは、それらの著しい含水量の結果として天然組織に類似する柔軟性を有する。
別の実施形態において、ヒドロゲルは、ＡＡＶ粒子製剤の投与前に対象に投与されてもよい。非限定的な例として、ヒドロゲルの投与部位は、ＡＡＶ粒子製剤の投与部位から７．６２センチメートル（３インチ）以内（例えば、７．３６６（２．９）、７．１１２（２．８）、６．８５８（２．７）、６．６０４（２．６）、６．３５（２．５）、６．０９６（２．４）、５．８４２（２．３）、５．５８８（２．２）、５．３３４（２．１）、５．０８（２．０）、４．８２６（１．９）、４．５７２（１．８）、４．３１８（１．７）、４．０６４（１．６）、３．８１（１．５）、３．５５６（１．４）、３．３０２（１．３）、３．０４８（１．２）、２．７９４（１．１）、２．５４（１．０）、２．２８６（０．９）、２．０３２（０．８）、１．７７８（０．７）、１．５２４（０．６）、１．２７（０．５）、１．０１６（０．４）、０．７６２（０．３）、０．５０８（０．２）、０．２５４（０．１）または０．２５４センチメートル（０．１インチ）未満）であってもよい。
【０２６７】
非活性成分
一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子製剤は、少なくとも１つの非活性成分を含み得る。本明細書で使用されるとき、用語「非活性成分」は、製剤に含まれる医薬組成物の有効成分の活性に寄与しない１つ以上の薬剤を指す。一部の実施形態において、本開示の製剤に使用し得る非活性成分は、全てが米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されているか、いずれも承認されていないか、または一部が承認されているものであり得る。
【０２６８】
一実施形態において、ＡＡＶ粒子医薬組成物は、限定ではないが、以下のものなどの少なくとも１つの非活性成分を含む：１，２，６−ヘキサントリオール；１，２−ジミリストイル−Ｓｎ−グリセロ−３−（ホスホ−Ｓ−（１−グリセロール））；１，２−ジミリストイル−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１，２−ジオレオイル−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１，２−ジパルミトイル−Ｓｎ−グリセロ−３−（ホスホ−Ｒａｃ−（１−グリセロール））；１，２−ジステアロイル−Ｓｎ−グリセロ−３−（ホスホ−Ｒａｃ−（１−グリセロール））；１，２−ジステアロイル−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１−Ｏ−トリルビグアニド；２−エチル−１，６−ヘキサンジオール；酢酸；氷酢酸；無水酢酸；アセトン；アセトン重亜硫酸ナトリウム；アセチル化ラノリンアルコール；アセチル化モノグリセリド；アセチルシステイン；アセチルトリプトファン，ＤＬ−；アクリレートコポリマー；アクリル酸−アクリル酸イソオクチルコポリマー；アクリル接着剤７８８；活性炭；Ａｄｃｏｔｅ７２Ａ１０３；接着テープ；アジピン酸；Ａｅｒｏｔｅｘレジン３７３０；アラニン；凝集アルブミン；コロイドアルブミン；ヒトアルブミン；アルコール；無水アルコール；変性アルコール；希釈アルコール；Ａｌｆａｄｅｘ；アルギン酸；アルキルアンモニウムスルホン酸ベタイン；アルキルアリールスルホン酸ナトリウム；アラントイン；アリル．アルファ．−イオノン；アーモンド油；アルファテルピネオール；アルファ−トコフェロール；アルファ−トコフェロールアセテート，Ｄｌ−；アルファ−トコフェロール，Ｄｌ−；酢酸アルミニウム；アルミニウムクロルヒドロキシアラントイネート；水酸化アルミニウム；水和水酸化アルミニウム−スクロース；水酸化アルミニウムゲル；水酸化アルミニウムゲルＦ５００；水酸化アルミニウムゲルＦ５０００；モノステアリン酸アルミニウム；酸化アルミニウム；アルミニウムポリエステル；ケイ酸アルミニウム；オクテニルコハク酸デンプンアルミニウム；ステアリン酸アルミニウム；塩基性酢酸アルミニウム；無水硫酸アルミニウム；Ａｍｅｒｃｈｏｌ  Ｃ；Ａｍｅｒｃｈｏｌ−Ｃａｂ；アミノメチルプロパノール；アンモニア；アンモニア溶液；濃アンモニア溶液；酢酸アンモニウム；水酸化アンモニウム；ラウリル硫酸アンモニウム；アンモニウムノノキシノール−４スルフェート；Ｃ−１２−Ｃ−１５直鎖第一級アルコールエトキシレートのアンモニウム塩；硫酸アンモニウム；アンモニックス；Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃ−２；Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃ−９；アネトール；無水クエン酸；無水デキストロース；無水ラクトース；無水クエン酸三ナトリウム；アニス油；Ａｎｏｘｉｄ  Ｓｂｎ；泡止剤；アンチピリン；アパフルラン；杏仁油Ｐｅｇ−６エスター；Ａｑｕａｐｈｏｒ；アルギニン；Ａｒｌａｃｅｌ；アスコルビン酸；アスコルビン酸パルミテート；アスパラギン酸；ペルーバルサム；硫酸バリウム；みつろう；合成みつろう；ベヘネス−１０；ベントナイト；塩化ベンザルコニウム；ベンゼンスルホン酸；塩化ベンゼトニウム；臭化ベンゾドデシニウム；安息香酸；ベンジルアルコール；安息香酸ベンジル；塩化ベンジル；ベータデクス；��バプシチド（Ｂｉｂａｐｃｉｔｉｄｅ）；次没食子酸ビスマス；ホウ酸；ブロクリナト；ブタン；ブチルアルコール；ビニルメチルエーテルのブチルエステル／無水マレイン酸共重合体（１２５０００Ｍｗ）；ステアリン酸ブチル；ブチル化ヒドロキシアニソール；ブチル化ヒドロキシトルエン；ブチレングリコール；ブチルパラベン；酪酸；Ｃ２０〜４０パレス−２４；カフェイン；カルシウム；炭酸カルシウム；塩化カルシウム；グルセプト酸カルシウム；水酸化カルシウム；乳酸カルシウム；カルコブトロール（Ｃａｌｃｏｂｕｔｒｏｌ）；カルジアミドナトリウム；カロキセト酸三ナトリウム（Ｃａｌｏｘｅｔａｔｅ  Ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ）；カルテリドールカルシウム（Ｃａｌｔｅｒｉｄｏｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ）；カナダバルサム；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド；カプリル酸／カプリン酸／ステアリン酸トリグリセリド；カプタン；カプチゾール；カラメル；カルボマー１３４２；カルボマー１３８２；カルボマー９３４；カルボマー９３４ｐ；カルボマー９４０；カルボマー９４１；カルボマー９８０；カルボマー９８１；カルボマーホモポリマーＢ型（アリルペンタエリトリトール架橋）；カルボマーホモポリマーＣ型（アリルペンタエリトリトール架橋）；二酸化炭素；カルボキシビニルコポリマー；カルボキシメチルセルロース；カルボキシメチルセルロースナトリウム；カルボキシポリメチレン；カラギナン；カラギナン塩；ヒマシ油；ニオイヒバ油；セルロース；微晶質セルロース；Ｃｅｒａｓｙｎｔ−Ｓｅ；セレシン；セテアレス−１２；セテアレス−１５；セテアレス−３０；セテアリルアルコール／セテアレス−２０；エチルヘキサン酸セテアリル；セテス−１０；セテス−２；セテス−２０；セテス−２３；セトステアリルアルコール；塩化セトリモニウム；セチルアルコール；セチルエステルワックス；パルミチン酸セチル；塩化セチルピリジウム；クロロブタノール；クロロブタノール半水和物；無水クロロブタノール；クロロクレゾール；クロロキシレノール；コレステロール；コレス；コレス−２４；クエン酸塩；クエン酸；クエン酸一水和物；含水クエン酸；コカミドエーテルスルフェート；コカミンオキシド；ココベタイン；ココジエタノールアミド；ココモノエタノールアミド；カカオ脂；ココ−グリセリド；ヤシ油；硬化ヤシ油；硬化ヤシ油／パーム核油グリセリド；ココイルカプリロカプラート；コラノキ種子抽出物；コラーゲン；着色料懸濁剤；トウモロコシ油；綿実油；クリーム基材；クレアチン；クレアチニン；クレゾール；クロスカルメロースナトリウム；クロスポビドン；硫酸銅；無水硫酸銅；シクロメチコーン；シクロメチコーン／ジメチコーンコポリオール；システイン；塩酸システイン；無水塩酸システイン；システイン，Ｄｌ−；Ｄ＆ＣレッドＮｏ．２８；Ｄ＆ＣレッドＮｏ．３３；Ｄ＆ＣレッドＮｏ．３６；Ｄ＆ＣレッドＮｏ．３９；Ｄ＆ＣイエローＮｏ．１０；ダルファムプリジン；Ｄａｕｂｅｒｔ１−５  Ｐｅｓｔｒ（Ｍａｔｔｅ）１６４ｚ；デシルメチルスルホキシド；ＤｅｈｙｄａｇワックスＳｘ；デヒドロ酢酸；Ｄｅｈｙｍｕｌｓ  Ｅ；安息香酸デナトニウム；デオキシコール酸；デキストラン；デキストラン４０；デキストリン；デキストロース；デキストロース一水和物；デキストロース溶液；ジアトリゾ酸；ジアゾリジニル尿素；ジクロロベンジルアルコール；ジクロロジフルオロメタン；ジクロロテトラフルオロエタン；ジエタノールアミン；ピロ炭酸ジエチル；セバシン酸ジエチル；ジエチレングリコールモノエチルエーテル；ジエチルヘキシルフタル酸エステル；アミノ酢酸ジヒドキシアルミニウム；ジイソプロパノールアミン；ジイソプロピルアジパート；ジリノール酸ジイソプロピル；ジメチコーン３５０；ジメチコーンコポリオ−ル；ジメチコーンＭｄｘ４−４２１０；ジメチコーン医療用流体３６０；ジメチルイソソルビド；ジメチルスルホキシド；ジメチルアミノエチルメタクリレート−ブチルメタクリレート−メチルメタクリレートコポリマー；ジメチルジオクタデシルアンモニウムベントナイト；ジメチルシロキサン／ジメチルビニルシロキシコポリマー；ジノセブアンモニウム塩；ジパルミトイルホスファチジルグリセロール，Ｄｌ−；ジプロピレングリコール；ココアンホ二酢酸二ナトリウム；スルホコハク酸ラウレス二ナトリウム；スルホコハク酸ラウリル二ナトリウム；スルホサリチル酸二ナトリウム；ジソフェニン；ジビニルベンゼンスチレンコポリマー；Ｄｍｄｍヒダントイン；ドコサノール；ドクセートナトリウム；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ２８０−２５１６；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ３８７−２５１６；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ８０−１１９６；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ８７−２０７０；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ８７−２１９４；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ８７−２２８７；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ８７−２２９６；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ８７−２８８８；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ８７−２９７９；エデト酸カルシウム二ナトリウム；エデト酸二ナトリウム；無水エデト酸二ナトリウム；エデト酸ナトリウム；エデト酸；卵リン脂質；エンツホン；エンツホンナトリウム；エピラクトース；エピテトラサイクリン塩酸塩；Ｅｓｓｅｎｃｅ  Ｂｏｕｑｕｅｔ９２００；エタノールアミン塩酸塩；酢酸エチル；オレイン酸エチル；エチルセルロース；エチレングリコール；エチレン酢酸ビニルコポリマー；エチレンジアミン；エチレンジアミン二塩酸塩；エチレン−プロピレンコポリマー；エチレン−酢酸ビニルコポリマー（２８％酢酸ビニル）；エチレン−酢酸ビニルコポリマー（９％酢酸ビニル）；ヒドロキシステアリン酸エチルヘキシル；エチルパラベン；オイカリプトール；エキサメタジム；食用脂肪；固形脂肪；脂肪酸エステル；脂肪酸ペンタエリトリオールエステル；脂肪酸；クエン酸脂肪アルコール（Ｆａｔｔｙ  Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｃｉｔｒａｔｅ）；脂肪アルコール；Ｆｄ＆ＣブルーＮｏ．１；Ｆｄ＆ＣグリーンＮｏ．３；Ｆｄ＆ＣレッドＮｏ．４；Ｆｄ＆ＣレッドＮｏ．４０；Ｆｄ＆ＣイエローＮｏ．１０（リストから除外）；Ｆｄ＆ＣイエローＮｏ．５；Ｆｄ＆ＣイエローＮｏ．６；塩化第二鉄；酸化第二鉄；香味料８９−１８６；香味料８９−２５９；香味料Ｄｆ−１１９；香味料Ｄｆ−１５３０；香味増強剤；香味料イチジク８２７１１８；香味料ラズベリーＰｆｃ−８４０７；医薬用香味料Ｒｈｏｄｉａ  Ｎｏ．Ｒｆ４５１（Ｆｌａｖｏｒ  Ｒｈｏｄｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｎｏ．Ｒｆ４５１）；フルオロクロロ炭化水素；ホルムアルデヒド；ホルム���ルデヒド溶液；分留ヤシ油；芳香剤３９４９−５；芳香剤５２０ａ；芳香剤６．００７；芳香剤９１−１２２；芳香剤９１２８−Ｙ；芳香剤９３４９８ｇ；芳香剤マツバルサムＮｏ．５１２４；芳香剤Ｂｏｕｑｕｅｔ１０３２８；芳香剤Ｃｈｅｍｏｄｅｒｍ６４０１−Ｂ；芳香剤Ｃｈｅｍｏｄｅｒｍ６４１１；芳香剤Ｃｒｅａｍ  Ｎｏ．７３４５７；芳香剤Ｃｓ−２８１９７；芳香剤Ｆｅｌｔｏｎ０６６ｍ；芳香剤Ｆｉｒｍｅｎｉｃｈ４７３７３；芳香剤Ｇｉｖａｕｄａｎ  Ｅｓｓ９０９０／１ｃ；芳香剤Ｈ−６５４０；芳香剤Ｈｅｒｂａｌ１０３９６；芳香剤Ｎｊ−１０８５；芳香剤Ｐ  Ｏ  Ｆｌ−１４７；芳香剤Ｐａ５２８０５；芳香剤Ｐｅｒａ  Ｄｅｒｍ  Ｄ；芳香剤Ｒｂｄ−９８１９；芳香剤Ｓｈａｗ  Ｍｕｄｇｅ  Ｕ−７７７６；芳香剤Ｔｆ０４４０７８；芳香剤Ｕｎｇｅｒｅｒ  Ｈｏｎｅｙｓｕｃｋｌｅ  Ｋ２７７１；芳香剤Ｕｎｇｅｒｅｒ  Ｎ５１９５；フルクトース；ガドリニウム酸化物；ガラクトース；ガンマシクロデキストリン；ゼラチン；架橋ゼラチン；ゲルフォームスポンジ；ジェランガム（低アシル）；Ｇｅｌｖａ７３７；ゲンチシン酸；ゲンチシン酸エタノールアミド；グルセプト酸ナトリウム；グルセプト酸ナトリウム二水和物；グルコノラクトン；グルクロン酸；グルタミン酸，Ｄｌ−；グルタチオン；グリセリン；硬化ロジンのグリセロールエステル；クエン酸グリセリル；イソステアリン酸グリセリル；ラウリン酸グリセリル；モノステアリン酸グリセリル；オレイン酸グリセリル；オレイン酸グリセリル／プロピレングリコール；パルミチン酸グリセリル；リシノール酸グリセリル；ステアリン酸グリセリル；ステアリン酸グリセリル−ラウレス−２３；ステアリン酸グリセリル／Ｐｅｇステアレート；ステアリン酸グリセリル／Ｐｅｇ−１００ステアレート；ステアリン酸グリセリル／Ｐｅｇ−４０ステアレート；ステアリン酸グリセリル−ステアルアミドエチルジエチルアミン；トリオレイン酸グリセリル；グリシン；グリシン塩酸塩；ジステアリン酸グリコール；ステアリン酸グリコール；グアニジン塩酸塩；グアーガム；ヘアコンディショナー（１８ｎ１９５−１ｍ）；ヘプタン；ヘタスターチ；ヘキシレングリコール；高密度ポリエチレン；ヒスチジン；ヒトアルブミンマイクロスフェア；ヒアルロン酸ナトリウム；炭化水素；可塑化炭化水素ゲル；塩酸；希塩酸；ヒドロコルチゾン；ヒドロゲルポリマー；過酸化
水素；硬化ヒマシ油；硬化パーム油；硬化パーム／パーム核油Ｐｅｇ−６エステル；硬化ポリブテン６３５−６９０；水酸化イオン；ヒドロキシエチルセルロース；ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸；ヒドロキシメチルセルロース；ヒドロキシオクタコサニルヒドロキシステアレート；ヒドロキシプロピルセルロース；ヒドロキシプロピルメチルセルロース２９０６；ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン；ヒプロメロース２２０８（１５０００Ｍｐａ．Ｓ）；ヒプロメロース２９１０（１５０００Ｍｐａ．Ｓ）；ヒプロメロース；イミド尿素；ヨウ素；ヨードキサム酸；イオフェタミン塩酸塩；アイリッシュモス抽出物；イソブタン；イソセテス−２０；イソロイシン；アクリル酸イソオクチル；イソプロピルアルコール；イソステアリン酸イソプロピル；ミリスチン酸イソプロピル；ミリスチン酸イソプロピル−ミリスチルアルコール；パルミチン酸イソプロピル；ステアリン酸イソプロピル；イソステアリン酸；イソステアリルアルコール；等張食塩溶液；Ｊｅｌｅｎｅ；カオリン；カトンＣｇ；カトンＣｇＩＩ；ラクテート；乳酸；乳酸，Ｄｌ−；乳酸，Ｌ−；ラクトビオン酸；ラクトース；ラクトース一水和物；含水ラクトース；ラネス；ラノリン；ラノリンアルコール−鉱油；ラノリンアルコール；無水ラノリン；ラノリンコレステロール；ラノリン非イオン性誘導体；エトキシル化ラノリン；硬化ラノリン；塩化ラウラルコニウム；酸化ラウラミン；ラウルジモニウム加水分解動物コラーゲン；硫酸ラウレス；ラウレス−２；ラウレス−２３；ラウレス−４；ラウリン酸ジエタノールアミド；ラウリン酸ミリスチン酸ジエタノールアミド；ラウロイルサルコシン；乳酸ラウリル；硫酸ラウリル；ラベンデュラ・アングスチホリア（Ｌａｖａｎｄｕｌａ  Ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）花頂部；レシチン；無漂白レシチン；卵レシチン；硬化レシチン；硬化大豆レシチン；大豆レシチン；レモン油；ロイシン；レブリン酸；リドフェニン；軽油；軽油（８５Ｓｓｕ）；リモネン，（＋／−）−；リポコールＳｃ−１５；リジン；酢酸リジン；リジン一水和物；ケイ酸アルミニウムマグネシウム；ケイ酸アルミニウムマグネシウム水和物；塩化マグネシウム；硝酸マグネシウム；ステアリン酸マグネシウム；マレイン酸；マンニトール；マプロフィックス（Ｍａｐｒｏｆｉｘ）；メブロフェニン（Ｍｅｂｒｏｆｅｎｉｎ）；医療用接着剤改変型Ｓ−１５；医療用泡止剤Ａ−Ｆエマルジョン；メドロン酸二ナトリウム；メドロン酸；メグルミン；メントール；メタクレゾール；メタリン酸；メタンスルホン酸；メチオニン；メチルアルコール；メチルグルセス−１０；メチルグルセス−２０；セスキステアリン酸メチルグルセス−２０；セスキステアリン酸メチルグルコース；ラウリン酸メチル；メチルピロリドン；サリチル酸メチル；ステアリン酸メチル；メチルボロン酸；メチルセルロース（４０００Ｍｐａ．Ｓ）；メチルセルロース；メチルクロロイソチアゾリノン；メチレンブルー；メチルイソチアゾリノン；メチルパラベン；微結晶性ワックス；鉱油；モノおよびジグリセリド；クエン酸モノステアリル；モノチオグリセロール；マルチステロール（Ｍｕｌｔｉｓｔｅｒｏｌ）抽出物；ミリ���チルアルコール；乳酸ミリスチル；ミリスチル−．ガンマ．−ピコリニウムクロリド；Ｎ−（カルバモイル−メトキシＰｅｇ−４０）−１，２−ジステアロイル−セファリンナトリウム；Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド；ナイアシンアミド；ニオキシム；硝酸；窒素；ノノキシノールヨード；ノノキシノール−１５；ノノキシノール−９；ノルフルラン；オートミール；オクタデセン−１／マレイン酸コポリマー；オクタン酸；オクチサレート；オクトキシノール−１；オクトキシノール−４０；オクトキシノール−９；オクチルドデカノール；オクチルフェノールポリメチレン；オレイン酸；オレス−１０／オレス−５；オレス−２；オレス−２０；オレイルアルコール；オレイン酸オレイル；オリーブ油；オキシドロン酸二ナトリウム；オキシキノリン；パーム核油；パルミタミンオキシド；パラベン；パラフィン；白色軟質パラフィン；香料Ｃｒｅｍｅ４５／３；ピーナッツ油；精製ピーナッツ油；ペクチン；Ｐｅｇ６−３２ステアレート／ステアリン酸グリコール；Ｐｅｇ植物油；Ｐｅｇ−１００ステアレート；Ｐｅｇ−１２ラウリン酸グリセリル；Ｐｅｇ−１２０ステアリン酸グリセリル；Ｐｅｇ−１２０ジオレイン酸メチルグルコース；Ｐｅｇ−１５コカミン；Ｐｅｇ−１５０ジステアレート；Ｐｅｇ−２ステアレート；Ｐｅｇ−２０ソルビタンイソステアレート；Ｐｅｇ−２２メチルエーテル／ドデシルグリコールコポリマー；Ｐｅｇ−２５プロピレングリコールステアレート；Ｐｅｇ−４ジラウレート；Ｐｅｇ−４ラウレート；Ｐｅｇ−４０ヒマシ油；Ｐｅｇ−４０ソルビタンジイソステアレート；Ｐｅｇ−４５／ドデシルグリコールコポリマー；Ｐｅｇ−５オレアート；Ｐｅｇ−５０ステアレート；Ｐｅｇ−５４硬化ヒマシ油；Ｐｅｇ−６イソステアレート；Ｐｅｇ−６０ヒマシ油；Ｐｅｇ−６０硬化ヒマシ油；Ｐｅｇ−７メチルエーテル；Ｐｅｇ−７５ラノリン；Ｐｅｇ−８ラウレート；Ｐｅｇ−８ステアレート；Ｐｅｇｏｘｏｌ７ステアレート；ペンタデカラクトン；ペンタエリトリトールココエート（Ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ  Ｃｏｃｏａｔｅ）；ペンテト酸五ナトリウム；ペンテト酸カルシウム三ナトリウム；ペンテト酸；ハッカ油；ペルフルトレン；香料２５６７７；香料Ｂｏｕｑｕｅｔ；香料Ｅ−１９９１；香料Ｇｄ５６０４；香料Ｔａｎａ９０／４２Ｓｃｂａ；香料Ｗ−１９５２−１；ワセリン；白色ワセリン；石油蒸留物；フェノール；液化フェノール；フェノニップ（Ｐｈｅｎｏｎｉｐ）；フェノキシエタノール；フェニルアラニン；フェニルエチルアルコール；酢酸フェニル水銀；硝酸フェニル水銀；卵ホスファチジルグリセロール；リン脂質；卵リン脂質；ホスホリポン９０ｇ；リン酸；松葉油（パイナス・シルヴェストリス（Ｐｉｎｕｓ  Ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ））；ピペラジン六水和物；プラスチベース−５０ｗ；ポラクリリン；塩化ポリドロニウム；ポロキサマー１２４；ポロキサマー１８１；ポロキサマー１８２；ポロキサマー１８８；ポロキサマー２３７；ポロキサマー４０７；ポリ（ビス（Ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン無水物）：セバシン酸；末端ブロック化ポリ（ジメチルシロキサン／メチルビニルシロキサン／メチルヒドロゲンシロキサン）ジメチルビニルまたはジメチルヒドロキシまたはトリメチル；ポリ（Ｄｌ−乳酸−Ｃｏ−グリコール酸）、（５０：５０；ポリ（Ｄｌ−乳酸−Ｃｏ−グリコール酸）、エチルエステル終端、（５０：５０；ポリアクリル酸（２５００００Ｍｗ））；ポリブテン（１４００Ｍｗ）；ポリカルボフィル；ポリエステル；ポリエステルポリアミンコポリマー；ポリエステルレーヨン；ポリエチレングリコール１０００；ポリエチレングリコール１４５０；ポリエチレングリコール１５００；ポリエチレングリコール１５４０；ポリエチレングリコール２００；ポリエチレングリコール３００；ポリエチレングリコール３００−１６００；ポリエチレングリコール３３５０；ポリエチレングリコール４００；ポリエチレングリコール４０００；ポリエチレングリコール５４０；ポリエチレングリコール６００；ポリエチレングリコール６０００；ポリエチレングリコール８０００；ポリエチレングリコール９００；酸化第二鉄ブラック含有高密度ポリエチレン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｈｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｆｅｒｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｂｌａｃｋ）（＜１％））；硫酸バリウム含有低密度ポリエチレン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｂａｒｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ）（２０〜２４％）；ポリエチレンＴ；テレフタル酸ポリエチレン；ポリグラクチン；ポリグルセリル−３オレアート；ポリグルセリル−４オレアート；メタクリル酸ポリヒドロキシエチル；ポリイソブチレン；ポリイソブチレン（１１０００００Ｍｗ）；ポリイソブチレン（３５０００Ｍｗ）；ポリイソブチレン１７８−２３６；ポリイソブチレン２４１−２９４；ポリイソブチレン３５−３９；低分子量ポリイソブチレン；中分子量ポリイソブチレン；ポリイソブチレン／ポリブテン接着剤；ポリラクチド；ポリオール；ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン１８００；ポリオキシエチレンアルコール；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンプロピレン；ポリオキシル２０セトステアリルエーテル；ポリオキシル３５ヒマシ油；ポリオキシル４０硬化ヒマシ油；ステアリン酸ポリオキシル４０；ステアリン酸ポリオキシル４００；パルミトステアリン酸ポリオキシル６およびポリオキシル３２；ジステアリン酸ポリオキシル；ポリオキシルステアリン酸グリセリル；ポリオキシルラノリン；パルミチン酸ポリオキシル；ステアリン酸ポリオキシル；ポリプロピレン；ポリプロピレングリコール；ポリクオタニウム−１０；ポリクオタニウム−７（７０／３０アクリルアミド／Ｄａｄｍａｃ；ポリシロキサン；ポリソルベート２０；ポリソルベート４０；ポリソルベート６０；ポリソルベート６５；ポリソルベート８０；ポリウレタン；ポリ酢酸ビニル；ポリビニルアルコール；ポリ塩化ビニル；ポリ塩化ビニル−ポリ酢酸ビニルコポリマー；ポリビニルピリジン；ケシ油；炭酸カリウム；酢酸カリウム；カリウムミョウバン；炭酸水素カリウム；亜硫酸水素カリウム；塩化カリウム；クエン酸カリウム；水酸化カリウム；メタ重亜硫酸カリウム；リン酸二カリウム；リン酸二水素カリウム；カリウム石鹸；ソルビン酸カリウム；ポビドンアクリレートコポリマー；ポビドンヒドロゲ��；ポビドンＫ１７；ポビドンＫ２５；ポビドンＫ２９／３２；ポビドンＫ３０；ポビドンＫ９０；ポビドンＫ９０ｆ；ポビドン／エイコサエンコポリマー；ポビドン；Ｐｐｇ−１２／Ｓｍｄｉコポリマー；Ｐｐｇ−１５ステアリルエーテル；Ｐｐｇ−２０メチルグルコースエーテルジステアレート；Ｐｐｇ−２６オレアート；プロダクトワット（Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｗａｔ）；プロリン；プロムルゲン（Ｐｒｏｍｕｌｇｅｎ）Ｄ；プロムルゲンＧ；プロパン；噴霧剤Ａ−４６；没食子酸プロピル；炭酸プロピレン；プロピレングリコール；プロピレングリコールジアセテート；プロピレングリコールジカプリレート；プロピレングリコールモノラウレート；プロピレングリコールモノパルミトステアレート；プロピレングリコールパルミトステアレート；プロピレングリコールリシノレレート；プロピレングリコール／ジアゾリジニル尿素／メチルパラベン／プロピルパルベン；プロピルパラベン；硫酸プロタミン；タンパク質加水分解物；Ｐｖｍ／Ｍａコポリマー；クアテルニウム−１５；クアテルニウム−１５シス型；クアテルニウム−５２；Ｒａ−２３９７；Ｒａ−３０１１；サッカリン；サッカリンナトリウム；無水サッカリンナトリウム；サフラワー油；Ｓｄアルコール３ａ；Ｓｄアルコール４０；Ｓｄアルコール４０−２；Ｓｄアルコール４０ｂ；セピネオ（Ｓｅｐｉｎｅｏ）Ｐ６００；セリン；ゴマ油；シアバター；Ｓｉｌａｓｔｉｃ商標医療用管材料；Ｓｉｌａｓｔｉｃ医療用接着剤、シリコーンＡ型；歯科用シリカ；ケイ素；二酸化ケイ素；コロイド状二酸化ケイ素；シリコーン；シリコーン接着剤４１０２；シリコーン接着剤４５０２；シリコーン接着剤Ｂｉｏ−Ｐｓａ  Ｑ７−４２０１；シリコーン接着剤Ｂｉｏ−Ｐｓａ  Ｑ７−４３０１；シリコーンエマルジョン；シリコーン／ポリエステルフィルムストリップ；シメチコン；シメチコンエマルジョン；Ｓｉｐｏｎ  Ｌｓ  ２０ｎｐ；ソーダ灰；酢酸ナトリウム；無水酢酸ナトリウム；アルキル硫酸ナトリウム；アスコルビン酸ナトリウム；安息香酸ナトリウム；重炭酸ナトリウム；重硫酸ナトリウム；亜硫酸水素ナトリウム；硼酸ナトリウム；硼酸ナトリウム十水化物；炭酸ナトリウム；炭酸ナトリウム十水化物；炭酸ナトリウム一水和物；セトステアリル硫酸ナトリウム；塩素酸ナトリウム；塩化ナトリウム；塩化ナトリウム注射剤；静菌性塩化ナトリウム注射剤；コレステリル硫酸ナトリ
ウム；クエン酸ナトリウム；ココイルサルコシンナトリウム；デゾキシコール酸ナトリウム；亜ジチオン酸ナトリウム；ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム；ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム；グルコン酸ナトリウム；水酸化ナトリウム；次亜塩素酸ナトリウム；ヨウ化ナトリウム；乳酸ナトリウム；乳酸ナトリウム，Ｌ−；ラウレス−２硫酸ナトリウム；ラウレス−３硫酸ナトリウム；ラウレス−５硫酸ナトリウム；ラウロイルサルコシンナトリウム；ラウリル硫酸ナトリウム；ラウリルスルホ酢酸ナトリウム；メタ重亜硫酸ナトリウム；硝酸ナトリウム；リン酸ナトリウム；リン酸ナトリウム二水和物；リン酸水素ナトリウム；無水リン酸水素ナトリウム；リン酸水素ナトリウム二水和物；リン酸水素ナトリウム十二水和物；リン酸水素ナトリウム七水和物；リン酸一ナトリウム；無水リン酸一ナトリウム；リン酸一ナトリウム二水和物；リン酸一ナトリウム一水和物；ポリアクリル酸ナトリウム（２５０００００Ｍｗ）；ピロリン酸ナトリウム；ピロリドンカルボン酸ナトリウム；デンプングリコール酸ナトリウム；琥珀酸ナトリウム六水化物；硫酸ナトリウム；無水硫酸ナトリウム；硫酸ナトリウム十水化物；亜硫酸ナトリウム；スルホコハク酸ナトリウム化ウンデシレンモノアルキロールアミド（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎａｔｅｄ  Ｕｎｄｅｃｙｃｌｅｎｉｃ  Ｍｏｎｏａｌｋｙｌｏｌａｍｉｄｅ）；酒石酸ナトリウム；チオグリコール酸ナトリウム；チオマリン酸ナトリウム；チオ硫酸ナトリウム；無水チオ硫酸ナトリウム；トリメタリン酸ナトリウム；キシレンスルホン酸ナトリウム；Ｓｏｍａｙ４４；ソルビン酸；ソルビタン；イソステアリン酸ソルビタン；モノラウリン酸ソルビタン；モノオレイン酸ソルビタン；モノパルミチン酸ソルビタン；モノステアリン酸ソルビタン；セスキオレイン酸ソルビタン；トリオレイン酸ソルビタン；トリステアリン酸ソルビタン；ソルビトール；ソルビトール溶液；大豆粉；大豆油；スペアミント油；鯨ろう；スクアラン；安定化オキシクロロ錯体；２−エチルヘキサン酸第一スズ；塩化第一スズ；無水塩化第一スズ；フッ化第一スズ；酒石酸第一スズ；デンプン；アルファ化デンプン１５００；トウモロコシデンプン；塩化ステアラルコニウム；ステアラルコニウムヘクトライト／炭酸プロピレン；ステアルアミドエチルジエチルアミン；ステアレス−１０；ステアレス−１００；ステアレス−２；ステアレス−２０；ステアレス−２１；ステアレス−４０；ステアリン酸；ステアリン酸ジエタノールアミド；ステアロキシトリメチルシラン；ステアルトリモニウム加水分解動物コラーゲン；ステアリルアルコール；吸入用滅菌水；スチレン／イソプレン／スチレンブロックコポリマー；サクシマー；コハク酸；スクラロース；スクロース；ジステアリン酸スクロース；スクロースポリエステル；スルファセタミドナトリウム；スルホブチルエーテル．ベータ．−シクロデキストリン；二酸化硫黄；硫酸；亜硫酸；Ｓｕｒｆａｃｔｏｌ  Ｑｓ；タガトース，Ｄ−；タルク；トール油；獣脂グリセリド；酒石酸；酒石酸，Ｄｌ−；テノックス；テノックス−２；Ｔｅｒｔ−ブチルアルコール；Ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド；Ｔｅｒｔ−ブチ���ヒドロキノン；テトラキス（２−メトキシイソブチルイソシアニド）銅（Ｉ）テトラフルオロボレート；オルトケイ酸テトラプロピル；テトロホスミン；テオフィリン；チメロサール；トレオニン；チモール；スズ；二酸化チタン；トコフェロール；トコフェルソラン；完全非経口栄養剤、脂質エマルジョン；トリアセチン；トリカプリリン；トリクロロモノフルオロメタン；トリデセス−１０；ラウリル硫酸トリエタノールアミン；トリフルオロ酢酸；中鎖トリグリセリド；トリヒドロキシステアリン；トリラネス−４リン酸（Ｔｒｉｌａｎｅｔｈ−４  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）；トリラウレス−４リン酸；クエン酸三ナトリウム二水和物；Ｈｅｄｔａ三ナトリウム；トリトン７２０；トリトンＸ−２００；トロラミン；トロマンタジン；トロメタミン（ＴＲＩＳ）；トリプトファン；チロキサポール；チロシン；ウンデシレン酸；ユニオン７６  Ａｍｓｃｏ−Ｒｅｓ６０３８；尿素；バリン；植物油；硬化植物油グリセリド；硬化植物油；ベルセタミド；Ｖｉｓｃａｒｉｎ；ビスコース／コットン；ビタミンＥ；乳化ワックス；Ｗｅｃｏｂｅｅ  Ｆｓ；白色セレシンワックス；白ろう；キサンタンガム；亜鉛；酢酸亜鉛；炭酸亜鉛；塩化亜鉛；および酸化亜鉛。
【０２６９】
本明細書で開示されるＡＡＶ粒子の医薬組成物製剤は、カチオンまたはアニオンを含み得る。一実施形態において、製剤は、限定はされないが、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｇ＋およびこれらの組合せなどの、金属カチオンを含む。非限定的な例として、製剤は、金属カチオンとのポリマーおよび錯体を含み得る（例えば、米国特許第６，２６５，３８９号明細書および同第６，５５５，５２５号明細書を参照のこと。これらの各々は全体として参照により本明細書に援用される）。
【０２７０】
また、本開示の製剤は、１つ以上の薬学的に許容される塩を含み得る。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容可能な塩」は、開示される化合物の誘導体を指し、ここで親化合物は、既存の酸または塩基部分からその塩形態への変換（例えば、遊離塩基基を好適な有機酸と反応させることによる）によって修飾される。薬学的に許容可能な塩の例としては、限定はされないが、アミン類などの塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが挙げられる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミン陽イオン、例えば、限定はされないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが挙げられる。本開示の薬学的に許容可能な塩には、例えば非毒性無機酸または有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩が含まれる。
【０２７１】
本開示の薬学的に許容可能な塩は、従来の化学的方法により塩基または酸部分を含有する親化合物から合成することができる。概して、かかる塩は、遊離酸または塩基形態のこれらの化合物と、水中または有機溶媒中、またはこれら２つの混合物中（概して、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水性媒体が好ましい）にある化学量論量の適切な塩基または酸とを反応させることにより調製し得る。好適な塩の一覧については、「レミントンの薬学科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１７版、マック・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ペンシルベニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）、１９８５年、ｐ．１４１８、「薬学的塩：特性、選択、および使用（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ）」、Ｐ・Ｈ・シュタール（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ）およびＣ・Ｇ・ウェルムス（Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ）編、ワイリー−ブイシーエイチ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）、２００８年、およびベルジュ（Ｂｅｒｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第６６巻、ｐ．１〜１９、１９７７年が参照される；この各々の内容は全体として参照により本明細書に援用される。
【０２７２】
用語「薬学的に許容可能な溶媒和物」は、本明細書で使用されるとき、好適な溶媒の分子が結晶格子に取り込まれている本開示の化合物を意味する。好適な溶媒は、投与される投薬量で生理学的に忍容可能である。溶媒和物は、有機溶媒、水、またはこれらの混合物を含む溶液から結晶化、再結晶化、または沈殿によって調製されてもよい。好適な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物、および三水和物）、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２−（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２−ピロリドン、安息香酸ベンジルなどである。水が溶媒であるとき、その溶媒和物は「水和物」と称される。
【０２７３】
ＩＶ．定義
本明細書で使用されるとき、目的の１つ以上の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、言及された参照値に類似である値を指す。ある特定の実施形態において、「およそ」または「約」という用語は、別途示されない限りまたは文脈から明らかでない限り、言及された参照値のいずれかの方向で（より大きいかまたは小さい）、２５％以内、２０％以内、１９％以内、１８％以内、１７％以内、１６％以内、１５％以内、１４％以内、１３％以内、１２％以内、１１％以内、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、またはそれ以下に入る値の範囲を指す（ただし、かかる数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
【０２７４】
本明細書で使用されるとき、「会合している」、「コンジュゲートされている」、「連結されている」、「結合している」、および「繋がれている」という用語は、２つ以上の部分に関して使用される場合、これらの部分が、直接的または連結剤として働く１つ以上の追加の部分を介してのいずれかで、互いに物理的に会合または接続されて、十分に安定な構造体を形成しており、その結果、それらの部分が、その構造体が使用される条件、例えば、生理学的条件下において、物理的に会合されたままとなることを意味する。「会合」は、必ずしも、厳密に、直接的な共有結合による化学結合を通じたものとは限らない。これは、イオン結合もしくは水素結合またはハイブリダイゼーションに基づく、「会合している」実体が、物理的に会合したままとなるような十分に安定な接続も示唆し得る。
【０２７５】
本明細書で使用されるとき、核酸配列の「発現」は、以下の事象のうちの１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の産生（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写産物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、および／または３’末端プロセシングによる）、（３）ＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳、（４）ポリペプチドまたはタンパク質のフォールディング、ならびに（５）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
【０２７６】
本明細書で使用されるとき、「ウイルス粒子」は、タンパク質カプシドおよびカプシド内に封入されるポリヌクレオチド配列という少なくとも２つの成分で構成されるウイルスである。
【０２７７】
用語「遺伝子発現」は、核酸配列が首尾よく転写およびほとんどの場合に翻訳を受けてタンパク質またはペプチドを産生する過程を指す。明確にするため、「遺伝子発現」の測定に言及するとき、それは、測定が核酸転写産物、例えばＲＮＡもしくはｍＲＮＡの測定またはアミノ酸翻訳産物、例えばポリペプチドもしくはペプチドの測定であり得ることを意味するものと理解されなければならない。ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチドおよびペプチドの量またはレベルの測定方法は当該技術分野において周知である。
【０２７８】
本明細書で使用されるとき、「製剤」は、少なくとも１つの本開示のポリヌクレオチドおよび／または化合物および／または組成物（例えば、ベクター、ＡＡＶ粒子など）、ならびに送達剤を含む。
【０２７９】
「断片」は、本明細書で使用されるとき、全体のうちのある連続した部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離した全長タンパク質を消化することによって得られる、ポリペプチドを含み得る。一部の実施形態において、タンパク質の断片は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、またはそれ以上のアミノ酸を含む。一部の実施形態において、抗体の断片は、酵素消化に供されるかまたはそのように合成される、抗体の部分を含む。
【０２８０】
本明細書で使用されるとき、「ペイロード」は、ウイルスゲノムによりもしくはその内にコードされる１つ以上のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域、またはかかるポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域、例えばトランス遺伝子、ポリペプチドもしくはマルチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現産物、または調節性核酸もしくは制御性核酸を指す。
【０２８１】
本明細書で使用されるとき、「ペイロードコンストラクト」は、末端逆位配列（ＩＴＲ）配列が一側または両側に隣接している、ペイロードをコードするかまたは含む、１つ以上のポリヌクレオチド領域である。ペイロードコンストラクトは、ウイルス産生細胞において複製されて、ウイルスゲノムを産生する鋳型である。
【０２８２】
本明細書で使用されるとき、「ペイロードコンストラクトベクター」は、ペイロードコンストラクト、ならびに細菌細胞における複製および発現のための制御性領域をコードするかまたは含むベクターである。
【０２８３】
本明細書で使用されるとき、「ペイロードコンストラクト発現ベクター」は、ペイロードコンストラクトをコードするかまたは含み、更に、ウイルス複製細胞におけるウイルス発現のための成分をコードするかまたは含む１つ以上のポリヌクレオチド領域を含むベクターである。
【０２８４】
本明細書で使用されるとき、「ペプチド」は、５０アミノ酸長未満であるかまたはそれに等しく、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長である。
【０２８５】
本明細書で使用されるとき、「ウイルスゲノム」は、少なくとも１つの末端逆位配列（ＩＴＲ）、少なくとも１つの制御性配列、および少なくとも１つのペイロードをコードする、ポリヌクレオチドである。ウイルスゲノムは、ペイロードコンストラクト発現ベクターからのペイロードコンストラクトの複製によって誘導される。ウイルスゲノムは、ペイロードコンストラクトの少なくとも１つのコピーをコードする。
【０２８６】
本明細書で使用されるとき、「トランスフェクション」という用語は、外因性核酸を細胞に導入する方法を指す。トランスフェクション方法としては、限定はされないが、化学的方法、物理的処理、およびカチオン性脂質または混合が挙げられる。
【０２８７】
本明細書で使用されるとき、用語「アッセイ」は、報告された結果に関連する活動の連続を指し、活動としては、限定はされないが、細胞播種、試験材料の調製、感染、溶解、分析、および結果の計算を挙げることができる。
【０２８８】
本明細書で使用されるとき、用語「目的の分子」は、本明細書で提供されるタンパク質、ならびにその断片、突然変異体、バリアント、および変更形態を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「ＡＡＤＣ反応」は、ドーパミンを形成するための、Ｌ−ＤＯＰＡとＡＡＤＣとの反応を指す。
【０２８９】
本明細書で使用されるとき、用語「効力」は、生物学的活性の尺度、例えば、酵素、例えばＡＡＤＣなどのタンパク質の生物学的活性の尺度を指す。特定の実施形態において、ＡＡＤＣの生物学的活性は、ある期間にわたってＬ−ＤＯＰＡのドーパミンへの変換を測定することによって、絶対量として測定することができる。特定の実施形態において、効力は、タンパク質の生物学的活性を、参照標準物質の生物学的活性と比較することによって評価することができる。効力は、ウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターによって産生されたタンパク質の生物学的活性を測定することによって評価することができる。効力は、ウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターによって産生されたタンパク質の生物学的活性を、参照ウイルスベクター、例えば参照ＡＡＶベクターによって産生されたタンパク質の生物学的活性と比較することによって評価することができる。例えば、効力は、ＡＡＤＣの生物学的活性を、参照ＡＡＤＣ標準物質の生物学的活性と比較することによって評価することができる。効力は、ウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターによって産生されたＡＡＤＣの生物学的活性を測定することによって評価することができる。効力は、ウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターによって産生されたＡＡＤＣの生物学的活性を、参照ＡＡＤＣウイルスベクター、例えば参照ＡＡＤＣ  ＡＡＶベクターによって産生されたＡＡＤＣの生物学的活性と比較することによって評価することができる。
【０２９０】
本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」は、ポリヌクレオチドなどの異種分子を輸送し、形質導入し、またはその他担体として働く任意の分子または部分を指す。「ウイルスベクター」は、目的の分子をコードするかまたは含む１つ以上のポリヌクレオチド領域を含むベクターである。本開示の文脈において、ウイルスベクターおよびベクター粒子は、組換え的に産生することができ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）親または参照配列に基づいてもよい。ＡＡＶは、哺乳類細胞への遺伝子移入のために最も広く研究および利用されているウイルスベクターの１つとして出現しており、ウイルスベクターを産生する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、トラトスキン（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ）ら著、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１９８５年、５巻（１１号）：ｐ．３２５１〜３２６０；グリム（Ｇｒｉｍｍ）ら著、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１９９９年、１０巻（１５号）：ｐ．２４４５〜２４５０；チオリニ（Ｃｈｉｏｒｉｎｉ）ら著、Ｊ．Ｖｉｒ．、１９９７年、７１巻：ｐ．６８２３〜３３；スリバスタバ（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ）ら著、Ｊ．Ｖｉｒ．１９８３年、４５巻：ｐ．５５５〜５６４；チオリニ（Ｃｈｉｏｒｉｎｉ）ら著、Ｊ．Ｖｉｒ．１９９９年、７３巻：ｐ．１３０９〜１３１９；ラトリッジ（Ｒｕｔｌｅｄｇｅ）ら著、Ｊ．Ｖｉｒ．１９９８年、７２巻：ｐ．３０９〜３１９；およびウー（Ｗｕ）ら著、Ｊ．Ｖｉｒ．２０００年、７４巻：ｐ．８６３５〜４７を参照されたい。これらの内容の各々は本明細書において全体として参照により援用される。
【０２９１】
本明細書で使用されるとき、用語「感染多重度」または「ＭＯＩ」は、ファージなどの薬剤またはより一般にはウイルスの、細胞などの感染標的に対する比、すなわち、各細胞に感染するウイルス粒子の平均数である。例えば、ウイルス粒子で接種された細胞の群を参照する場合、感染多重度またはＭＯＩは、規定された空間に存在する標的細胞の数に対するウイルス粒子の数の比である。本明細書で使用されるとき、ウイルス、例えばパルボウイルスの文脈での「粒子」は、タンパク質カプシド成分およびカプシド成分内に封入されるポリヌクレオチド配列、例えばゲノムという少なくとも２つの成分を含むウイルスである。
【０２９２】
本明細書中で使用される用語「細胞」または「細胞株」は、ウイルス、例えばパルボウイルスまたはディペンドパルボウイルス（ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、例えばアデノウイルスまたはＡＡＶ、例えばＡＡＶ２の複製を可能にし、培養中で維持することができ、本開示および標準的技法に従ってウイルスベクターで感染させることができる任意の細胞を意味する。特定の実施形態において、細胞は、哺乳類細胞、例えばヒト細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、肉腫細胞、例えば線維肉腫細胞である。細胞株を利用できるのと同様に、初代細胞または初代細胞培養物を利用することができる。細胞株の非限定的な例としては、ＨＴ１０８０（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１２１（商標））ヒト線維肉腫細胞株、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、ＨＥＫ２９３、もしくはＨＥＫ２９３Ｋ細胞株、またはかかる細胞株のバリアントが挙げられる。
【０２９３】
本明細書で使用されるとき、「細胞溶解」は、細胞壁を破損させて、細胞内含有物を放出させることを指す。細胞溶解方法は、溶解させる細胞の細胞培養フォーマットに基づいて選択することができる。一部の実施形態において、化学的溶解を使用して細胞を溶解することができる。
【０２９４】
本明細書で使用されるとき、用語「溶解剤」は、細胞の破壊を助け得る任意の薬剤を指す。一部の場合には、溶解剤は溶液中に導入され、溶解溶液または溶解緩衝液と呼ばれる。
【０２９５】
本明細書で使用されるとき、用語「溶解溶液」は、１つ以上の溶解剤を含む溶液（典型的には水性）を指す。溶解剤に加えて、溶解溶液は、１つ以上の緩衝剤、可溶化剤、界面活性剤、保存剤、凍結保護物質、酵素、酵素阻害薬および／またはキレータを含み得る。溶解緩衝液は、１つ以上の緩衝剤を含む溶解溶液である。溶解溶液の更なる成分としては、１つ以上の可溶化剤を挙げることができる。
【０２９６】
本明細書で使用されるとき、用語「可溶化剤」は、溶液の１つ以上の成分の溶解度および／または溶液が適用される１つ以上の実体の溶解度を増強する化合物を指す。一部の場合には、可溶化剤はタンパク質溶解度を増強する。一部の場合には、可溶化剤は、タンパク質のコンホメーションおよび／または活性を維持しながらもタンパク質溶解度を増強するそれらの能力に基づき選択される。一部の場合には、溶解剤は、溶解塩、両性薬剤、カチオン性薬剤、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤から選択され得る。溶解塩としては、限定はされないが、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）および塩化カリウム（ＫＣｌ）を挙げることができる。
【０２９７】
一部の実施形態において、機械的細胞溶解が行われる。機械的細胞溶解方法としては、１つ以上の溶解条件および／または１つ以上の溶解力の使用を挙げることができる。本明細書で使用されるとき、用語溶解条件とは、細胞破壊を促進する状態または状況、例えば、特定の温度、圧力、浸透圧純度、および塩分などを指す。かかる実施形態により行われる細胞溶解には、凍結融解溶解が含まれ得る。本明細書で使用されるとき、用語凍結融解溶解とは、細胞溶液が１回以上の凍結融解サイクルに供される細胞溶解を指す。凍結融解溶解方法によれば、溶液中の細胞が凍結されて、氷の結晶の形成および拡大によって引き起こされる細胞膜の機械的破壊が誘導される。凍結融解溶解方法により用いられる細胞溶液としては、１つ以上の溶解剤、可溶化剤、緩衝剤、凍結保護物質、界面活性剤、保存剤、酵素、酵素阻害薬および／またはキレータを更に挙げることができる。一部の実施形態において、凍結融解溶解は、米国特許第７，７０４，７２１号明細書（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載される方法のいずれかにより行われてもよい。一部の実施形態において、機械的細胞溶解は、細胞を破壊するために使用される物理的活性（「溶解力」）を含み得る。溶解力としては、限定はされないが、機械的力、音波的力、重力、光学的力、電気的力などを挙げることができる。溶解力により使用され得る機械的力としては、高剪断流体力および／またはスクレイピングによる細胞の物理的破壊を挙げることができる。
【０２９８】
化学的溶解の非限定的な例としては、界面活性剤溶液または塩溶液の使用が挙げられる。細胞の物理的／機械的溶解の非限定的な例としては、超音波処理、凍結／融解、ブレンディング、または粉砕が挙げられる。
【０２９９】
用語「パルボウイルス」は、本明細書で使用されるとき、線状一本鎖ＤＮＡゲノムを含有するＤＮＡ動物ウイルスを指し、自律複製パルボウイルスおよびディペンドパルボウイルスを含むパルボウイルス科を包含する。自律的パルボウイルスとしては、パルボウイルス属、エリスロウイルス属、デンソウイルス属、イテラウイルス属、およびコントラウイルス属のメンバーが挙げられる。例示的な自律的パルボウイルスとしては、限定はされないが、マウス微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、およびＢ１９ウイルスが挙げられる。他の自律的パルボウイルスが当業者に公知である。
【０３００】
本明細書で使用されるとき、用語「芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ」または「ＡＡＤＣ」は、Ｌ−ＤＯＰＡの脱炭酸によるドーパミンの生成に関与する酵素を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「ＨＴ−１０８０細胞」は、線維肉腫を起源とするヒト不死化細胞株を指す。この細胞株は、ＡＴＣＣ（登録商標）（ＣＣＬ−１２１）から供給される。これらの細胞は、ＡＡＶ２に許容性であり、本明細書に記載されるＡＡＶ２．ＡＡＤＣベクターで形質導入されるとＡＡＤＣ酵素を発現する。
【０３０１】
本明細書で使用されるとき、用語「ＵＨＰＬＣ−ＥＣＤ」は、電気化学検出器を有する超高速液体クロマトグラフィーを指す。
本明細書で使用されるとき、用語「ＵＨＰＬＣ−ＵＶ」は、紫外線検出器を有する超高速液体クロマトグラフィーを指す。
【０３０２】
本明細書で使用されるとき、用語「試料」は、分析のための単一の被験物質を指す。
Ｖ．均等物および範囲
当業者は、本明細書に記載される本開示に係る具体的な実施形態の多くの均等物を認識し、またはルーチンに過ぎない実験を用いて確かめることが可能であろう。本開示の範囲が上記の説明に限定されることは意図されず、それはむしろ添付の特許請求の範囲に示される通りである。
【０３０３】
特許請求の範囲では、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、反する旨が示されない限り、または文脈上特に明らかでない限り、１つまたは２つ以上を意味し得る。ある群の１つ以上のメンバーの間に「または」を含むクレームまたは説明は、反する旨が示されない限り、または文脈上特に明らかでない限り、その群メンバーの１つ、２つ以上、または全てが所与の製品または方法に存在する、それに用いられる、または他の形でそれに関連する場合に満たされるものとみなされる。本開示は、群の正確に１つのメンバーが所与の製品または方法に存在する、それに用いられる、または他の形でそれに関連する実施形態を含む。本開示は、２つ以上の、または全ての群メンバーが所与の製品または方法に存在する、それに用いられる、または他の形でそれに関連する実施形態を含む。
【０３０４】
また、用語「〜を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は非限定的（ｏｐｅｎ）であることが意図され、追加の要素または工程の包含を許容するが必須ではないことも注記される。用語「〜を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が本明細書で使用されるとき、したがって用語「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」もまた包含され、開示される。
【０３０５】
別途定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。本開示において使用するための方法および材料が、本明細書に記載されているが、当該技術分野において公知の他の好適な方法および材料もまた、使用することができる。
【０３０６】
範囲が提供されるとき、端点は含まれる。更に、特に指示されない限り、または文脈および当業者の理解から特に明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈上特に明確に指示されない限り、その範囲の下限の単位の１０分の１に至るまでの、本開示の種々の実施形態において明示される範囲内にある任意の具体的な値または部分的範囲を想定し得ることが理解されるべきである。
【０３０７】
加えて、先行技術に含まれる本開示の任意の特定の実施形態は、クレームの任意の１つ以上から明示的に除外され得ることが理解されるべきである。かかる実施形態は当業者に公知であるとみなされるため、除外が本明細書に明示的に示されないとしても、それらは除外され得る。本開示の組成物の任意の詳細な実施形態（例えば、任意の核酸またはそれによりコードされるタンパク質；任意の作製方法；任意の使用方法等）が、先行技術の存在に関係するか否かに関わらず、何らかの理由で任意の１つ以上のクレームから除外されることがある。
【０３０８】
本明細書に引用されている全ての引用資料、例えば、参考文献、刊行物、データベース、データベースエントリ、および技術は、引用中に明示的に言及されていない場合であっても、本出願に参照により援用される。引用資料および本出願の記述に矛盾がある場合には、本出願における記述が優先されるものとする。
【０３０９】
節および表の見出しは、限定することを意図するものではない。
本明細書において言及される刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は全て、全体として参照により援用される。矛盾が生じる場合、定義を含め、本明細書が優先するものとする。加えて、節の見出し、材料、方法、および例は例示に過ぎず、限定を意図するものではない。
【０３１０】
本開示をかなり詳しく、幾つかの説明される実施形態に関するある具体性をもって説明したが、それが任意のかかる具体例もしくは実施形態または任意の具体的な実施形態に限定されるべきであることを意図するものではなく、しかし先行技術を考慮してかかる特許請求の範囲の最も広義の可能な解釈を提供し、したがって本開示の意図される範囲を有効に包含するように添付の特許請求の範囲を参照して解釈されるべきである。
【０３１１】
（実施例）
実施例１．ＵＨＰＬＣ−ＵＶの適性（Ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
２８０ｎｍでＵＶ検出する逆相ＵＨＰＬＣによって、ＡＡＶ２．ＡＡＤＣ形質導入ＨＴ１０８０細胞溶解物中のドーパミンを定量化する方法が、この実施例で記載される。評価したパラメータ（例えば、特異性、精度、正確性、および線形性）は全て、予想範囲内であることが見出された。
【０３１２】
ドーパミン標準物質およびＡＡＶ２．ＡＡＤＣ形質導入ＨＴ１０８０細胞によって産生されたドーパミンのピーク面積を積分し、検量線を計算し、適性パラメータ（ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を評価するために使用した。ＨＴ−１０８０細胞をフラスコで培養し、ＤＭＥＭｃ培地（ＤＭＥＭ＋ＧＬＵＴＡＭＡＸ中１０％ＦＢＳ）を有するプレートに播種した。また、ＡＡＶ２．ＡＡＤＣをＤＭＥＭｃ培地で希釈して、ＨＴ−１０８０細胞に形質導入した。形質導入インキュベーション後、細胞を、溶解緩衝液（１×ＰＢＳ＋Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で溶解した。その後、実施例３で教示される反応緩衝液中で細胞溶解物をＬ−ＤＯＰＡと反応させ、ＡＡＤＣ酵素によってＬ−ｄｏｐａを脱炭酸してドーパミンを得る。
【０３１３】
第１段階
３２０から０．３μＭまでの濃度の３ｌｏｇにわたる定量化に使用する検量線を、２つの異なるプロトコールに従って準備した。１つのプロトコールでは、単純な２倍希釈によって範囲全体を網羅し、別のプロトコールでは、検量線（ｃａｌｂｒａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）の系統的バイアスを回避するために均等に離間された濃度範囲が提供された。検出限界（ＬＯＤ）および定量化限界（ＬＯＱ）をより良好に同定するために、第２の低濃度範囲を後者のプロトコールに追加した。
【０３１４】
試料を、以下のスケジュールに従って注入した：較正標準物質セット１、三重重複のトランスフェクト溶解物、較正標準物質セット２、三重重複のスパイクしたトランスフェクト溶解物、較正標準物質セット３；合計で６４回の注入。各標準物質セットとトランスフェクト溶解物セットとの間で、５０％アセトニトリルによるカラムクリーニングプロトコールを実施した。６４回の注入を５回連続して繰り返した。６４回の注入を最初に遂行した結果が示されており、他の４回のデータは、等価であることが観察された。
【０３１５】
クロマトグラムは、ドーパミン較正標準物質の範囲全体との重なりを示すことが観察された。フィッティングした線形回帰モデルは、０．９９９のＲ２を示した。これらの結果は、データの線形性が許容レベルであることを示す。
【０３１６】
特異性の基準は、１）スパイクした細胞溶解物は単一のピークをもたらさなければならないこと；２）スパイク細胞溶解物および未スパイク細胞溶解物とドーパミン標準物質のみとの間の溶出時間の差は±０．１分でなければならないこと；および３）ブランク対照から干渉ピークが出てこないことであった。本実施例において、トランスフェクト細胞溶解物のピークは、ドーパミン標準物質で観察されるピークと同時溶出することが観察された。クロマトグラムは、２０μＭドーパミン標準物質と、ＭＯＩ  １５６３で形質導入し、１６μＭに対応するドーパミンでスパイクした細胞溶解物とが重なり合うことを示した。スパイクした形質導入溶解物はピークが単一であり、ドーパミン標準物質と同時溶出したことが観察された。最も低いドーパミン濃度（０．３μＭ）は、疑似形質導入全細胞溶解物と重なり合い、疑似形質導入溶解物では干渉ピークが観察されなかった。
【０３１７】
表２には、単一セットの６４回注入の三重重複物に対して実施された計算が例示されている。最下部の３つの列に報告されている、標準物質、形質導入溶解物、およびスパイクした形質導入溶解物の平均時間を比較して算出した溶出時間のシフトは、±０．１分である。特異性に関するプロトコールで指定された基準は全て満たされていた。
【０３１８】
【表２】
2021521852.tif 000006
【０３１９】
正確性の判定基準は、回収率が±２０％であり、回収率標準偏差（ＲＳＤ）が複製物間で１０％以下であることと設定した。表２の試料は全て、これらの基準を満たしていた。
精度は、三重重複物の積分ピーク面積が１０％以下のＲＳＤを有することと規定した。表２は、この規定が、形質導入しスパイクした細胞溶解物試料全てに、ならびに例外を除いて較正標準物に当てはまることを示す。この基準は、最高（３００μＭ）および最低（０．３μＭ）ドーパミン濃度を除いて満たされた。
【０３２０】
繰返し精度は、６４回注入のセットを５回繰り返し、その後、この繰返しにわたって結果を比較することによって評価した。同じ計算により、５回連続の繰返しにわたって平均した。統計は、最初の実行から導き出された結論が、５回の測定の完全セット全体にわたって当てはまることを示した。
【０３２１】
検出限界（ＬＯＤ）を、３．３σ／傾きと規定し、定量化限界（ＬＯＱ）を、１０σ／傾きと規定した。「σ」は、較正直線のｙ切片の標準偏差として算出された、５つの最も低い希釈物での応答の標準偏差であり、「傾き」は、検量線の傾きである。平均ＬＯＱは０．２３３μＭであり、平均ＬＯＤは０．０７０μＭだった。
【０３２２】
第２段階
第２段階では、試料を、以下のスケジュールに従って注入した：較正標準物質セット１、三重重複のトランスフェクト溶解物、較正標準物質セット２、三重重複のスパイクしたトランスフェクト溶解物、および較正標準物質セット３；合計で７２回の注入。各標準物質セットとトランスフェクト溶解物セットとの間で、５０％アセトニトリルによるカラムクリーニングプロトコールを実施した。７２回の注入を、５回連続して繰り返した。
【０３２３】
３２０から３２μＭまでの範囲および２．８８から０．３２μＭまでの低濃度範囲において均等に離間された希釈物を用いた検量線が表３に示される。０．３２から２．８８までの低範囲を使用して、ＬＯＤおよびＬＯＱを算出した。低範囲でのＲ２は、０．９９９６だった。
【０３２４】
【表３】
2021521852.tif 000007
【０３２５】
クロマトグラムは全て、特異性を支持し、実験１の特異性と同等だった。平均ＬＯＱは、０．７２３μＭであることが観察され、平均ＬＯＤは、０．２１７μＭであることが観察された。
【０３２６】
第３段階
第３段階（異なるカラムを有する異なる機器で実施した）では、試料を、以下のスケジュールに従って注入した：較正標準物質セット１、三重重複のトランスフェクト溶解物、較正標準物質セット２、三重重複のスパイクしたトランスフェクト溶解物、較正標準物質セット３；合計で７２回の注入。各標準物質セットとトランスフェクト溶解物セットとの間で、５０％アセトニトリルによるカラムクリーニングプロトコールを実施した。７２回の注入を、５回連続して繰り返した。実験２で使用したものと同じ試料を使用した。
【０３２７】
検量線の線形フィッティングのＲ２は、繰返しの各々で０．９９９だった。代表的なクロマトグラムは、本明細書に記載されている以前の実験でのクロマトグラムと同等だった。実験３は、特異性、正確性、および精度に関して、本明細書に記載されている基準を満たした。定量化限界および検出限界の平均は、それぞれ０．６２５μＭおよび０．１８８μＭだった。
【０３２８】
スパイク試料および未スパイク試料の両方における形質導入細胞溶解物のドーパミン濃度計算値を比較して、中間精度を評価した。適性（ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）プロトコールの判定基準（％ＲＳＤは≦２０％でなければならない）は満たされている。しかし、最も低いＭＯＩの場合、％ＲＳＤは２０に接近している。１つの考え得る理由は、ＭＯＩが２４である場合、平均濃度（０．９μＭ）が、０．６２５〜０．７２３μＭであると決定された定量化限界と非常に近いことである。
【０３２９】
その成分中のランダムな変動性に応じた移動相調製のロバスト性を評価するために、リン酸ナトリウムおよびオクタンスルホン酸の各々の３つのストック溶液を調製し、それらを組み合わせて９つの移動相を調製した。９つの移動相での分析物易動度を、反応緩衝液中のドーパミンを使用して評価および比較することになる。３つの異なるリン酸ナトリウムストック溶液を３つのオクタンスルホン酸ナトリウムストック溶液と混合することによって調製した９つの個々の移動相の性能を示す９つのクロマトグラムの重ね合わせを行った。溶出時間は、表４に示されている。
【０３３０】
【表４】
2021521852.tif 000008
【０３３１】
ドーパミン易動度は、移動相の組成物によって影響を受けることが観察された。変動性は、１．７５に等しい％ＣＶであり、識別可能な傾向は観察されなかった。ドーパミンと最接近成分（ＤＴＴ）との効率的なベースライン分離が、実験全体にわたって観察された。
【０３３２】
実験２および実験３の結果に基づき、理論段数およびピークテーリング係数の判定基準を、較正標準物質中のドーパミンピーク（Ｓ８レベル、９６μＭ）について、およびＭＯＩ  １５６３での細胞溶解物参照標準物質で形質導入された細胞溶解物について決定した。ピーク非対称性は、カラム品質の評価を支援し、理論段数は、カラムの分離能力の尺度である。統計は、下記の表５に報告されている。
【０３３３】
【表５】
2021521852.tif 000009
【０３３４】
この適性（ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）プロトコールによる許容値は、非対称性が、参照標準物質および較正標準物質の両方で１．２３以下であり、段数が、参照標準物質または較正標準物質でそれぞれ≧５３９６または≧５３８５である。測定数が比較的少なく、試験したカラム数が限定的であったことを考慮すると、これらの数値は、将来的に再検討されることになる可能性がある。
【０３３５】
この実施例に詳述されている活動では、２８０ｎｍでのＵＶ検出を用いた逆相ＵＨＰＬＣによる、ＡＡＶ２．ＡＡＤＣ形質導入ＨＴ１０８０細胞溶解物中のドーパミンの定量化が実証され、特異性、線形性、精度、および検出限界（ＬＯＤ）、および定量化限界（ＬＯＱ）の許容レベルが達成され、参照標準物質および較正標準物質のピーク形状の判定基準が確立され、クロマトグラフィー分離に使用される移動相の調製のロバスト性が実証された。
【０３３６】
実施例２．バキュロウイルスによるＡＡＶベクターの産生
ＡＡＶ２．ＡＡＤＣをＳｆ９／バキュロウイルス系にて産生した。細胞バンクを融解して、ＥＦＳ  ＡＦ（商標）昆虫細胞培養培地（エクスプレッション・システムズ社，ＬＣＣ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＬＬＣ））中でＳｆ９細胞培養拡大増殖を開始した。生存Ｓｆ９細胞の数を、振盪フラスコおよびＷＡＶＥバイオリアクター（ＧＥライフサイエンス社（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））を使用して拡大増殖し、２００Ｌ単回使用バイオリアクターへのローリング接種（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）を可能にした。単回使用バイオリアクターにおいて、Ｓｆ９細胞を、２６〜２７℃で更に拡大増殖した。その後、Ｓｆ９細胞を、２６℃にて、ＢＩＩＣ−ｒｅｐ２／ｃａｐ２およびＢＩＩＣ−ｈＡＡＤＣを含んでいたバキュロウイルス（ＢＩＩＣ）に感染させることによってＡＡＶベクター粒子を産生させた。Ｓｆ９細胞の化学的溶解を１８〜２５℃で実施して、ＡＡＶベクター粒子を細胞核から放出させた。免疫親和性クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して、細胞残屑を除去することによって物質を清澄化した。限外ろ過（ＵＦ）およびダイアフィルトレーション（ＤＦ）を使用して、ＡＡＶベクター粒子を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で目標濃度に製剤化し、得られた製剤を、最終充填の直前にナノ濾過および０．２μＭ濾過によって清澄化した。０．００１％プルロニック酸（Ｆ−６８）を最終充填物に添加して、薬物製品を得た。
【０３３７】
実施例３．ＡＡＤＣ効力／発現アッセイ：ＵＨＰＬＣ−ＵＶ
試薬の調製
完全培地（ＤＭＥＭｃ）  −  ウシ胎仔血清の５０ｍＬアリコートを一晩４℃で融解し、その後、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）の新しいボトルにピペットした（バイオセイフティーキャビネット内で）。ＤＭＥＭにＦＢＳを添加した後、０．２２μＭボトルトップフィルターを使用して、得られた培地を清浄な滅菌５００ｍＬ保管ボトルへと滅菌濾過し、ＤＭＥＭｃと標記し、調製日と共に調製日から１ヵ月間が有効期限であることを併記した。
【０３３８】
１×ＰＢＳ＋０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  −  ４９５ｍＬの１×ＰＢＳを、緩衝液ボトル中で５ｍＬのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（２０％ストック溶液）と組み合わせ、旋回させて溶液を混合した。得られた混合物を、５００ｍＬの０．２μｍボトルトップフィルターを通して５００ｍＬ保管ボトルへと濾過し、室温で保管した。
【０３３９】
アスコルビン酸  −  ＨＰＬＣ水を使用して１０ｍＭアスコルビン酸溶液を調製し、１．５ｍＬ微量遠心チューブにアリコートし（各々４５０μＬ）、−２０℃で保管した。
パルギリン（１０ｍＭ）  −  ＨＰＬＣ水を使用して１０ｍＭパルギリン溶液を調製し、１．５ｍＬ微量遠心チューブにアリコートし（各々４５０μＬ）、−２０℃で保管した。
【０３４０】
ジチオトレイトール（１００ｍＭ）  −  ＨＰＬＣ水を使用して１００ｍＭジチオトレイトール溶液を調製し、１．５ｍＬ微量遠心チューブにアリコートし（各々４５０μＬ）、−２０℃で保管した。
【０３４１】
ピリドキサル−５’−ホスフェート（２ｍＭ）  −  ＨＰＬＣ水を使用して２ｍＭピリドキサル−５’−ホスフェート溶液を調製し、４ｍＬ琥珀色ガラスバイアル（各々２．２５ｍＬ）にアリコートし、−２０℃で保管した。
【０３４２】
０．１Ｍ塩酸（ＨＣｌ）  −  換気フード下で、４９．５ｍＬのＨＰＬＣ水を５０ｍＬコニカルチューブ（エッペンドルフ社（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ））に添加した。５００μＬの１０Ｎ  ＨＣｌを、５０ｍＬコニカルチューブ（エッペンドルフ社（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中の水にゆっくりと添加した。チューブに蓋をし、ボルテックスによって混合した。溶液を、酸保管キャビネットに室温で保管した。
【０３４３】
Ｌ−ＤＯＰＡ（２０ｍＭ）  −  ＨＰＬＣ水および０．１Ｍ  ＨＣｌを使用して、２０ｍＭ  Ｌ−ＤＯＰＡ溶液を調製した。得られた溶液を、ホイルで包んだ１５０ｍＬ保管ボトルに接続された１５０ｍＬボトルトップフィルター（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．；カタログ番号４３１１６１）を使用して滅菌濾過し、その後１．５ｍＬ微量遠心チューブ（各々１．２５ｍＬ）にアリコートし、−２０℃で保管した。ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）を使用してＬ−ＤＯＰＡストック濃度を測定し、２８０ｎｍでのＵＶ−Ｖ（ペデスタル、１ｍｍ光路長）吸光度を三重重複で測定し平均した。水を使用して機器のブランクをとった。Ｌ−ＤＯＰＡ濃度は、以下の数式［［Ｌ−ＤＯＰＡ溶液濃度（ｍＭ）＝（（吸光度（２８０ｎｍ））／（（２．６３ｃｍ−１ｍＭ−１）×０．１ｃｍ））×１０］］を使用して算出した。Ｌ−ＤＯＰＡ溶液の得られた濃度は、２０±５ｍＭだった。
【０３４４】
ドーパミン（４ｍＭ）  −  ＨＰＬＣ水を使用して４ｍＭドーパミン溶液を調製した。得られた溶液を、ホイルで包んだ５０ｍＬコニカルチューブに接続された５０ｍＬチューブトップフィルターを使用して滅菌濾過し、その後１．５ｍＬ微量遠心チューブ（各々５００μＬ）にアリコートし、−２０℃で保管した。ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）を使用してドーパミン濃度を測定し、ＵＶ−Ｖ（ペデスタル、１ｍｍ光路長）を使用して２８０ｎｍでの平均吸光度を測定した（三重重複で）。水を使用して機器のブランクをとった。ドーパミン濃度は、以下の数式［［ドーパミンストック濃度（ｍＭ）＝（（吸光度（２８０ｎｍ））／（（２．０７ｃｍ−１ｍＭ−１×０．１ｃｍ）×１０）］］を使用して算出した。ドーパミン溶液の得られた濃度は、４±０．１ｍＭだった。
【０３４５】
０．５Ｍ過塩素酸（ＰＣＡ）  −  換気フード下で、５．４ｍＬの６０％過塩素酸（９．２Ｍ）を、ボトル中の９４．６ｍＬのＨＰＬＣ水にゆっくりと添加し、ボトルに蓋をし、穏やかに旋回させて混合した。溶液を、室温で保管した。
【０３４６】
０．７２４Ｍリン酸一ナトリウム溶液（１０×ストック溶液）、ｐＨ３．０  −  化学天秤を使用して、８６．９ｇのＮａＨ２ＰＯ４を量り取った。８６．９ｇのＮａＨ２ＰＯ４を、磁気撹拌プレート上で撹拌しながらビーカー中の９００ｍＬ  ＨＰＬＣ水に溶解した。溶液のｐＨを、ｐＨプローブを使用して検査した。リン酸を滴下添加することによって、溶液のｐＨを３．０に調整した。溶液を、１Ｌ容積測定用シリンダーに移し（磁気撹拌子を取り除いて）、ＨＰＬＣ水で容積を１０００ｍＬにした。溶液を、１Ｌ保管ボトルに取り付けられた５００ｍＬボトルトップフィルターを通して濾過し、室温で保管した。
【０３４７】
１００ｍＭオクタンスルホン酸  −  化学天秤を使用して、１０．８ｇのオクタンスルホン酸ナトリウムを量り取った。１０．８ｇのオクタンスルホン酸を、磁気撹拌プレート上で撹拌しながらメスシリンダー中の４００ｍＬ  ＨＰＬＣ水に溶解した。磁気撹拌子を取り除き、ＨＰＬＣ水で容積を５００ｍＬにした。溶液を、５００ｍＬ保管ボトルに取り付けられた５００ｍＬボトルトップフィルターを通して濾過した。溶液を、室温で保管した。
【０３４８】
ＡＡＤＣ移動相（緩衝液Ａ）  −  ＨＰＬＣ水（７００ｍＬ）、１００ｍＬのアセトニトリル、１００ｍＬの０．７２４Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４（１０×ストック）、および３２ｍＬの１００ｍＭオクタンスルホン酸を、１０００ｍＬメスシリンダー中で組み合わせ、ＨＰＬＣ水で容積を１０００ｍＬにした。溶液を１Ｌガラスボトルに移し、十分に混合した。溶液のｐＨを、ｐＨプローブを使用して検査した。必要に応じて、リン酸を使用して溶液のｐＨを３．０に調整した。緩衝液を、１０分間超音波処理することによって脱気した。
【０３４９】
５０％アセトニトリル（緩衝液Ｂ）  −  ＨＰＬＣ水（５００ｍＬ）および５００ｍＬのアセトニトリルを、１０００ｍＬメスシリンダー中で組み合わせた。溶液を１Ｌガラスボトルに移し、十分に混合した。緩衝液を、１０分間超音波処理することによって脱気した。
【０３５０】
ＨＴ−１０８０細胞の播種
本明細書に記載されている遺伝子療法ベクターを被殻の細胞に形質導入して、シナプス後ニューロンにてＡＡＤＣ酵素を発現させることが可能である。生物学的活性のＥＣ５０評価に基づいてベクター送達ＡＡＤＣ遺伝子療法の効力を評価するＡＡＤＣ効力／発現アッセイが、本明細書に記載されている。これは、生物学的活性の直接的測定ではない形質導入後のタンパク濃度が測定される入手可能なＡＡＤＣ  ＥＬＩＳＡキットよりも進歩している。この実施例における効力アッセイでは、ＡＡＤＣコード遺伝子療法ベクターで形質導入されている細胞、それら細胞から産生された溶解物中でのＬ−ＤＯＰＡのドーパミンへのＡＡＤＣ媒介性変換、および生成されたドーパミンの測定が分析される。
【０３５１】
具体的には、ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１２１）を、Ｐ３００マルチチャネルピペットを使用して（剪断を回避するために）、５×１０３細胞／ウェルの密度でＣｏｒｎｉｎｇ  ｃｅｌｌｂｉｎｄ  ９６ウェルプレートのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに播種し、３７±２℃で２４±２時間インキュベートした。１つの９６ウェルプレートを、２つのＡＡＤＣベクター試料の試験のために使用した（各ＭＯＩを三重重複で試験した）。１つの追加プレートを、ＡＡＶ２．ＡＡＤＣベクター参照標準物質および陽性対照のために使用した。プレートを多孔性接着フィルムで密封して、蒸発を低減させ、プレート領域を越えるガス交換の均一性を維持した。各プレートの上に蓋を設置した。
【０３５２】
あるいは、１００μＬのＨＴ−１０８０細胞を、１×１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートの完全培地（ＤＭＥＭｃ）に播種し、３７±２℃で２１±３時間インキュベートした。１つのプレートを、ＡＡＶ２．ＡＡＤＣ参照標準物質および陽性対照のために使用した。
【０３５３】
ベクター計算および希釈
バイオセイフティーキャビネット下で、１０ｍＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（１細胞プレート当たり）を、５０ｍＬコニカルチューブ（エッペンドルフ社（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ））中で３７℃の水浴にておよそ５〜３０分間加温した。ＨＴ１０８０細胞に添加するベクターおよびＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳの容積を、各ベクター、陽性対照、および参照標準物質毎に算出した。ベクター希釈を三重重複で実施し、隣接する細胞ウェルで試験した。エラーを低減するため、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに添加するベクターの量は、２０μＬよりも多いが２００μＬ未満だった。ベクターの計算容積がこの範囲外だった場合、ベクターを１×ＰＢＳで希釈した（例えば、１：５、１：１０、１：２０）。２００，０００のＭＯＩを達成するために必要とされるベクターの量を、ベクターのｄｄＰＣＲ力価を使用して算出した。ベクターストックの希釈が必要だった場合、希釈係数は、下記の計算に含まれており、ベクターストックの希釈が必要でなかった場合、希釈係数は１だった。
【０３５４】
【数３】
2021521852.tif 000010
【０３５５】
必要とされるベクターの容積を２００μＬの総容積から減算して、必要とされるＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳの量を決定した。
ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳの容積（μＬ）＝２００μＬ−ベクターの容積（μＬ）
ベクター希釈物を、１×ＰＢＳで１．５ｍＬセーフロック微量遠心チューブ（エッペンドルフ社（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、カタログ番号０２２３６３２１２、または等価物）に調製した。別のプレートにて、１００μＬのＤＭＥＭｃを、一番上の列を除いて全てのウェルに添加した。その後、ＡＡＶ２．ＡＡＤＣベクター（１×ＰＢＳで２×１０８ｖｇ／μＬの開始濃度に希釈された）を、ＤＭＥＭｃで１：８に希釈し、その後２００μＬをプレートの一番上の列に添加した。その後、一番上の列の溶液を、プレートの下方に向かって系列希釈した。マルチチャネルピペットを使用して各連続ウェルに１００μＬを添加することによって、２倍系列希釈を実施した。次の希釈に移る前に各希釈物を混合し、希釈間でピペットチップを付け替えた。ベクターの希釈スキームの例は表６に示されている。
【０３５６】
【表６】
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【０３５７】
細胞形質導入
９６ウェル細胞培養プレートをインキュベータから取り出し、倒立位相差顕微鏡を使用して、細胞が健康に見えること、およびおよそ６０〜８０％コンフルエントであることを確認した。プレートをバイオセイフティーキャビネット（ＢＳＣ）に置いた。
【０３５８】
Ｐ２０マルチチャネルピペットを使用して、ベクター希釈物（２０μＬ）を細胞に、細胞単層の乱れを回避するためにウェルの側面の液表面に一度に１列ずつ添加した。プレートを多孔性接着フィルムで密封して、蒸発を低減させ、プレート領域を越えるガス交換の均一性を維持し、プレートの上に蓋を設置した。その後、細胞を、８の字のように５〜１０回穏やかに振って、ベクターを均一に分布させ、３７±２℃のインキュベータに４８±４時間（通常は４４〜５２時間）にわたって戻した。
【０３５９】
形質導入の後、培地を、真空ラインが引かれている血清学的ピペットに接続された無フィルターＰ２００ピペットチップを使用して、一度に１ウェルずつ吸引した。その後、細胞を、Ｐ２００マルチチャネルピペットを用いて各ウェルの側面にアプライした１００μＬの１×ＰＢＳで洗浄した。細胞の乱れを回避するために、ピペットチップを、ウェルの側面の液表面につけた。細胞の乱れを回避するように注意しつつ、Ｐ２００マルチチャネルピペットを使用してウェルの側面に１００μＬの１×ＰＢＳを添加することによって、細胞を洗浄した。プレートを横方向に穏やかに振った。真空ラインが引かれている血清学的ピペットに接続された無フィルターＰ２００ピペットチップを使用して、ウェルから１×ＰＢＳを吸引した。
【０３６０】
細胞溶解
２つの９６ウェルプレートでは、１００μＬの１００×Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤カクテルを９．９ｍＬの１×ＰＢＳ＋０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に添加することによって、溶解緩衝液の１０ｍＬ溶液を調製した。実行しようとするプレート数に応じて、５ｍＬの倍数で溶液を調製した。溶解緩衝液は、使用する当日に調製し、細胞の溶解に使用しなかった溶液は全て廃棄した。
【０３６１】
形質導入の４８±４時間後に細胞を回収した。Ｐ５０マルチチャネルピペットを使用し、５０μＬの溶解緩衝液（５０μＬの１×Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤カクテル＋１×ＰＢＳ＋０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）で各ウェルの細胞を溶解した。プレートを、パラフィルムで縁端を回り込むように密封した。プレートを−８０℃で３０分間または最長で７２時間凍結させ、氷が全て溶けるまで室温で融解した。Ｐ５０マルチチャネルピペットを使用して、溶解物を上下に数回ピペットすることによって各列の細胞溶解物を混合した。溶解物を９６ウェルＰＣＲプレートに移し、密封フィルムで覆った。９６ウェルＰＣＲプレートを、３５００〜４０００ＲＰＭ、例えば３７５０ＲＰＭで１０分間遠心分離して、細胞残屑をペレットにした。ＡＡＤＣ反応を実行する前に、ウェルの底部にある細胞ペレットの乱れを回避するように注意しつつ、上清（「清澄化細胞溶解物」）を、Ｐ５０マルチチャネルピペットを使用して新しいプレートに移した（溶解物もまた、−８０℃で最長７２時間保管することができる）。プレートを密封フィルムで覆った。
【０３６２】
ドーパミン標準曲線
１．５ｍＬセーフロック微量遠心チューブ（エッペンドルフ社（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、カタログ番号０２２３６３２１２、または等価物）中で４ｍＭドーパミンストックを１×ＰＢＳ＋０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で希釈することによって、１１点ドーパミン標準曲線を作成した。希釈は表７に示されている。ドーパミンストックが正確に４ｍＭでなかった場合、標準物質Ｓ１、Ｓ２、およびＳ３の計算を調整した。
【０３６３】
【表７】
2021521852.tif 000012
【０３６４】
９６ウェルＰＣＲプレートにて、ＡＡＤＣ反応緩衝液（１８０μＬ）を、Ｐ２００マルチチャネルピペットを使用して、１１個の連続ウェル（例えば、Ａ１〜Ａ１１）中の２０μＬの対応するドーパミン標準物質と組み合わせた。２０μＬの対応するドーパミン標準物質を１１個のウェルの各々に添加して、ＡＡＤＣ細胞溶解物のＡＡＤＣ反応への添加を模倣した。「疑似Ｌ−ＤＯＰＡ添加」としての役目を果たすように、１０μＬのＨＰＬＣ水を各ウェルに添加した。Ｐ２００マルチチャネルピペットを使用して、４０μＬの冷却０．５Ｍ過塩素酸を各ウェルに添加して、反応を「擬似クエンチ」した。各ウェルをピペットして混合した。プレートは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＰＸ１（商標）ＰＣＲプレート密封器を使用して熱密封フィルムで密封し、プレートをＵＨＰＬＣオートサンプラーに設置したか、または使用する準備ができるまで４℃で維持した。
【０３６５】
ＡＡＤＣ反応
ＡＡＤＣ反応を、以下のプロトコールによって調製した。凍結されている場合、細胞溶解物（９６ウェルプレートに保管）を実験台上で融解した。陽性対照細胞溶解物の１つのチューブもまた、実験台上で融解し、融解したら氷上または４℃に置いた。
【０３６６】
実験に必要な２０ｍＭ  Ｌ−ＤＯＰＡのチューブを、実験台上で融解した。融解したら、それらを氷上または４℃に置き、同日中に使用したかまたは廃棄した。Ｌ−ＤＯＰＡ（１０μＬの２０ｍＭ）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。その後、プレートを氷浴（２〜８℃）に移した。反応を、予冷却０．５Ｍ過塩素酸（ＰＣＡ）（４０μＬ）の添加によってクエンチした。
【０３６７】
Ｐ２００マルチチャネルピペットまたはピペッターの繰返しのいずれかを使用して、１８０μＬのＡＡＤＣ反応緩衝液を、９６ウェルＰＣＲプレートの使用しようとする各ウェルに添加した。加えて、１８０μＬのＡＡＤＣ反応緩衝液を、陽性対照ＡＡＤＣ反応とは異なるウェルに添加した。２０μＬのＡＡＤＣ細胞溶解物陽性対照を添加し、ピペットして混合した。
【０３６８】
反応緩衝液を含有する残りのウェルに、Ｐ２０マルチチャネルピペットを使用して２０μＬのＡＡＤＣ細胞溶解物を添加し、ピペットで混合した。
プレートを密封フィルムで覆い、９６ウェルプレート遠心分離機で１５秒間遠心して、内容物をウェルの底部に収集した。プレートを、３７℃のインキュベータに５±１分間入れた。
【０３６９】
プレートをインキュベータから取り出し、密封フィルムを廃棄した。Ｌ−ＤＯＰＡチューブの内容物を試薬リザーバに移した。１０μＬの２０ｍＭ  Ｌ−ＤＯＰＡ溶液を、Ｐ２０マルチチャネルピペットを使用して各ウェルに添加し、その後ピペットによって混合した。Ｌ−ＤＯＰＡをプレートに添加すると、反応は迅速に進行することになり、したがって、これらの工程は高度に時間依存性である。
【０３７０】
プレートを密封フィルムで覆い、３７℃に設定されたインキュベータに３０±１分間入れた。大型の氷皿を氷で満たした。１２ｍＬの０．５Ｍ過塩素酸を含有する１５ｍＬコニカルチューブ（エッペンドルフ社（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ））およびプラスチック製９６ウェルプレートホルダーを、氷上に置くことによって冷却した。３０±１分間のインキュベーション後、プレートを５±１分間にわたって氷浴に移して２〜８℃に冷却した。５±１分後、プレートを、冷却したプレートホルダーへと直ちに移し、密封フィルムを取り外した。
【０３７１】
予冷却（２〜８℃）０．５Ｍ過塩素酸（ＰＣＡ）を試薬リザーバに移した。４０μＬの予冷却０．５Ｍ  ＰＣＡを、Ｐ２００電子マルチチャネルピペットを使用して添加し、反応をクエンチした。プレートを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＰＸ１（商標）プレート密封器を使用して熱密封フィルムで密封した。
【０３７２】
ＵＨＰＬＣ−ＵＶ分析
ＵＨＰＬＣ−ＵＶを、試料中のドーパミン検出に使用した。以下のプロトコールを使用してＵＨＰＬＣ−ＵＶを実施した。ドーパミン標準物質および試料を、４℃に設定された予冷却ＵＨＰＬＣオートサンプラーに設置した。新しいガードカートリッジを、ガードカラム（ＢＤＳ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌガードカラム、３×１０ｍｍ、３μｍ、カタログ番号２８１０５−０１３００１（サーモサイエンティフィック社（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に挿入し、５０ｍｍ  Ｃ１８カラムに接続した。緩衝液Ａ１および緩衝液Ｂ１のラインを洗い流し、１０ｍＬの５０％アセトニトリル（緩衝液Ｂ）、および別々に１０ｍＬのＡＡＤＣ移動相（緩衝液Ａ）をカラムに流した。ドーパミン標準物質または試料を流す前に、一連の１０回の試験注入を実施して、カラムおよびＵＨＰＬＣシステムが適切に機能することを確認した。典型的には、ドーパミン標準物質Ｓ１の１０回注入で十分だった。試料を、以下のＵＨＰＬＣ実行パラメータで５０ｍｍ  Ｃ１８カラムに３分間２８０ｎｍで流した：１）ポンプ：０．５ｍＬ／分のＡＡＤＣ移動相（緩衝液Ａ）；２）注入：５μＬの試料；および３）カラム温度：３５℃。
【０３７３】
およそ１２個全ての試料を流した後に、ＵＶクリーニング工程を実施してカラムをクリーニングし、ＵＶ検出器を平衡化した。３分間にわたる０．５ｍＬ／分の５０％アセトニトリル（緩衝液Ｂ）の後、７分間にわたって０．５ｍＬ／分のＡＡＤＣ移動相（緩衝液Ｂ）を流した。ＵＶクリーニング工程後、ドーパミン標準物質ＳＮＥＧの注入を使用して、カラムを平衡化した。保管前にカラムを１０ｍＬの５０％アセトニトリル（緩衝液Ｂ）で洗い流してカラムをクリーニングした。ドーパミンピークを、ＣＨＲＯＭＥＬＥＯＮ（商標）クロマトグラフィーデータシステムソフトウェア（サーモサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））の自動積分機能を使用して積分した。
【０３７４】
ドーパミンピーク面積を、ＣＨＲＯＭＥＬＥＯＮ（商標）クロマトグラフィーデータシステムソフトウェア（サーモサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を使用してドーパミン標準曲線と相関させた（ドーパミン標準物質点：３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、２５、１０、５、０．５μＭ）。各ＭＯＩの複製物全てのドーパミン濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（プリズム社（Ｐｒｉｓｍ））または等価なデータ分析パッケージでプロットした。データを、４パラメータロジスティック曲線（［アゴニスト］対応答−可変傾き（４パラメータ））に対してフィティングした。
【０３７５】
【数４】
2021521852.tif 000013
【０３７６】
式中、Ａ＝上部漸近線（「上部」）；Ｂ＝ダイナミックレンジの傾き（「ヒルスロープ」）；Ｃ＝ＥＣ５０（ＥＣ５０）；およびＤ＝下部漸近線（「下部」）。
相対効力を、参照標準物質のＥＣ５０シフトとして表現した。ＡＡＤＣ相対効力は、以下の数式を使用して、試験試料に対する参照標準物質のＥＣ５０値の比として表現した。
【０３７７】
【数５】
2021521852.tif 000014
【０３７８】
Ｌ−ＤＯＰＡ濃度の最適化
８つの異なるＬ−ＤＯＰＡストック濃度を、以下のＬ−ＤＯＰＡ濃度：０．３ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、９７ｍＭに調製した。一連の３つの実験に対して、ＡＡＤＣ反応を、以前に調製したＡＡＤＣ細胞溶解物および種々の濃度のＬ−ＤＯＰＡストックを使用して、実施例３と同様に実施した。得られたドーパミン用量応答曲線は、２０ｍＭ  Ｌ−ＤＯＰＡでピークドーパミン産生が生成されることを示した。
【０３７９】
ＡＡＤＣ反応インキュベーション時間ロバスト性
用量応答曲線の上部漸近線で観察される変動性の潜在的な供給源には、ＡＡＤＣ反応のタイミングが関与する。酵素反応を早期に停止させるかまたは追加時間にわたって進行させると、生成されるドーパミン産物の量に影響が及ぶ可能性が高いだろう。反応の３つの部分：（１）反応緩衝液および細胞溶解物を３７℃で５分間インキュベーションする部分、（２）Ｌ−ＤＯＰＡを添加してＡＡＤＣ反応を開始させ、それを３７℃で３０分間進行させる部分、および（３）過塩素酸（ＰＣＡ）でクエンチする前に氷上で５分間保持して反応を遅延させる部分について、それらのロバスト性について調査した。
【０３８０】
ＡＡＤＣ反応を、以前に製作したＡＡＤＣ細胞溶解物および反応緩衝液でセットアップし（実施例３と同様に）、Ｌ−ＤＯＰＡを添加する前に、２、５、または１０分間のいずれかにわたって３７℃でインキュベートし、残りの反応を通常通りに進行させた。別の試験では、プレートを氷へと移動させる前に、ＡＡＤＣ反応時間を２８、３０、または３２分間に変更した。最後に、事前インキュベーション工程およびＡＡＤＣ反応工程が通常通りに進行することを可能にするが、クエンチする前の氷上での最終工程を、３、５、または７分間へと変更した。得られたデータは、工程１、工程２および工程３のインキュベーション時間の変更に基づくドーパミン産生のわずかな差があり、好ましい条件は以下の通りであることを示す：工程１：３７℃で５±２分間、工程２：３７℃で３０±２分間、工程３：氷上で５±２分間。
【０３８１】
アッセイ内およびアッセイ間の変動性
単一の実験は１人の作業者によって実施され、陽性対照および参照標準物質を両方とも含有する４つのプレートをＡＡＤＣ活性アッセイの実行に使用した。三重重複データ点を、各ＭＯＩ毎に１プレート実行当たりで平均し、４つのプレートの各々の結果を、４パラメータ曲線に対してフィティングした。より意味のある比較を得るために、下部漸近線（Ｄ）値は全て、４パラメータフィティングを実施する前にゼロに固定した。この値は、４つのパラメータ内の変動性の大きな供給源に寄与するが、曲線フィティングに全体的な影響をほとんど与えないと考えられるからである。４パラメータフィティング後では、４つの変数内で観察される変動性の最大の供給源は、両データセットのＥＣ５０値を起源とする。４つのプレートを含有する単一アッセイ実行内では、陽性対照の平均ＥＣ５０値は、１２，７７９．７５であり、１０．９５％ＣＶであり、参照標準物質の場合、平均ＥＣ５０値は８９６４．７５であり、１７．８７％のＣＶだった。標準物質アッセイでは％ＣＶ値がわずかに高いが、これらの数値は、アッセイ判定基準および試料判定基準の両方について１０〜３０％ＣＶが典型的に設定される細胞に基づく効力アッセイの許容範囲内であるとみなされる。
【０３８２】
実施例４．ＡＡＤＣ効力／発現アッセイ：ＵＨＰＬＣ−ＥＣＤ
試薬の調製
完全培地（ＤＭＥＭｃ）  −  ウシ胎仔血清の５５ｍＬアリコートを、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）の新しいボトルに添加した（バイオセイフティーキャビネット内で）。５．５ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンをボトルに添加し、その後それを旋回させて溶液を混合した。得られた混合物を濾過し、２〜８℃で保管した。
【０３８３】
１×ＰＢＳ＋０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  −  ９９０ｍＬの１×ＰＢＳを、緩衝液ボトル中で５ｍＬ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（２０％ストック溶液）と組み合わせ、旋回させて溶液を混合した。得られた混合物を濾過し、室温で保管した。
【０３８４】
アスコルビン酸（１０ｍＭ）  −  １０ｍＬのＨＰＬＣ水および０．０１７６ｇのアスコルビン酸を使用し、目標濃度に調整して、１０ｍＭアスコルビン酸溶液を調製した。混合物をチューブにアリコートし、２〜８℃で保管する。
【０３８５】
パルギリン（１０ｍＭ）  −  １０ｍＬのＨＰＬＣ水および０．０１９６ｇのパルギリンを使用し、目標濃度に調整して、１０ｍＭパルギリン溶液を調製した。混合物をチューブにアリコートし、２〜８℃で保管する。
【０３８６】
ジチオトレイトール（１００ｍＭ）  −  １０ｍＬのＨＰＬＣ水および０．１５４３ｇのジチオトレイトールを使用し、目標濃度に調整して１００ｍＭジチオトレイトール溶液を調製した。混合物をチューブにアリコートし、２〜８℃で保管する。
【０３８７】
ピリドキサル−５’−ホスフェート（２ｍＭ）  −  ３５ｍＬのＨＰＬＣ水および０．０１７３ｇのピリドキサル−５’−ホスフェートを使用し、目標濃度に調整して、２ｍＭピリドキサル−５’−ホスフェート溶液を調製した。混合物をチューブにアリコートし、２〜８℃で保管する。
【０３８８】
０．１Ｍ塩酸（ＨＣｌ）  −  換気フード下で、４９．５ｍＬのＨＰＬＣ水を５０ｍＬコニカルチューブに添加した。５００μＬの１０Ｎ  ＨＣｌを、５０ｍＬコニカルチューブ中の水にゆっくりと添加した。チューブに蓋をし、ボルテックスして混合した。溶液を、酸キャビネットに室温で保管した。
【０３８９】
Ｌ−ＤＯＰＡ（０．３ｍＭ）  −  １０ｍＬのＨＰＬＣ水および０．００９８６ｇの−ＤＯＰＡを使用し、目標濃度に調整して、０．３ｍＭＬ−ＤＯＰＡ溶液を調製した。混合物を、ホイルで包んだ１５０ｍＬ保管ボトルへと濾過し、その後１．５ｍＬ微量遠心チューブ（各々１．２５ｍＬ）にアリコートし、−２０℃で保管した。ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）を使用してＬ−ＤＯＰＡストック濃度を測定し、ＵＶ−Ｖ（ペデスタル、１ｍｍ光路長）を使用して２８０ｎｍでの平均吸光度を測定した（三重重複で）。水を使用して機器のブランクをとった。Ｌ−ＤＯＰＡ濃度は、以下の数式［［Ｌ−ＤＯＰＡ溶液濃度（ｍＭ）＝（（吸光度（２８０ｎｍ））／（（２．６３ｃｍ−１ｍＭ−１）×０．１ｃｍ））×１０］］を使用して算出した。Ｌ−ＤＯＰＡ溶液の得られた濃度は、０．３ｍＭだった。
【０３９０】
ドーパミン（１ｍＭ）  −  １０ｍＬの０．１Ｍ  ＨＣｌおよび０．００９４８ｇのドーパミンを使用し、目標濃度に調整して、光に曝露させずに１ｍＭドーパミン溶液を調製した。混合物を、ホイルで包んだ５０ｍＬ保管ボトルへと濾過し、その後１．５ｍＬ微量遠心チューブ（各々０．５ｍＬ）にアリコートし、−２０℃で保管した。ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）を使用してドーパミン濃度を測定し、ＵＶ−Ｖ（ペデスタル、１ｍｍ光路長）を使用して２８０ｎｍでの平均吸光度を測定した（三重重複で）。水を使用して機器のブランクをとった。ドーパミン濃度は、以下の数式［［ドーパミンストック濃度（ｍＭ）＝（（吸光度（２８０ｎｍ））／（（２．０７ｃｍ−１ｍＭ−１×０．１ｃｍ）×１０）］］を使用して算出した。ドーパミン溶液の得られた濃度は、１ｍＭだった。
【０３９１】
０．５Ｍ過塩素酸（ＰＣＡ）  −  換気フード下で、５．４ｍＬの６０％過塩素酸（９．２Ｍ）を、ボトル中の９４．６ｍＬ  ＨＰＬＣ水にゆっくりと添加し、ボトルに蓋をし、穏やかに旋回させて混合した。溶液を、室温で保管した。
【０３９２】
反応緩衝液  −  ３００ｍＬの無ヌクレアーゼ水を、アルミニウムホイルで包んだ１Ｌボトルに添加した。以下のものをボトルに添加した：５０ｍＬリン酸ナトリウムｐＨ７．２（５００ｍＭ）；５ｍＬアスコルビン酸（１０ｍＭ）；５ｍＬパルギリン（１０ｍＭ）；５ｍｌジチオトレイトール（１００ｍＭ）；２５ｍＬピリドキサル−５’−ホスフェート（２ｍＭ）；１００μＬ  ＥＤＴＡ（５００ｍＭ）。溶液を混合し、−２０℃で保管する。
【０３９３】
ＨＴ−１０８０細胞の播種、希釈、および形質導入
ＨＴ−１０８０細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１２１）を、１×１０４細胞／ウェルの密度で２４または９６ウェルプレートの完全培地（ＤＭＥＭｃ）に播種し、３７±２℃で１８〜２４時間インキュベートした。別のプレートにて、１００μＬのＤＭＥＭｃを、一番上の列を除いて全てのウェルに添加した。その後、ＡＡＶ２．ＡＡＤＣベクター（１×ＰＢＳで２×１０８ｖｇ／μＬの開始濃度に希釈された）を、ＤＭＥＭｃで１：８に希釈し、その後（２００μＬを）プレートの一番上の列に添加した。その後、一番上の列の溶液を、表８に示されているように、プレートの下方に向かって系列希釈した。ベクター希釈物（２０μＬ）を細胞に添加し、その後細胞を所望の形質導入時間（通常は４４〜５２時間）にわたってインキュベータに戻した。
【０３９４】
【表８】
2021521852.tif 000015
【０３９５】
細胞溶解およびＡＡＤＣ反応
形質導入後、培地を吸引し、その後細胞をＰＢＳで洗浄し、５０μＬの溶解緩衝液（５０μＬの１×Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤カクテル＋１×ＰＢＳ＋０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）で溶解した。プレートを３０分間〜最長７２時間にわたって−８０℃で凍結し、融解し、その後遠心分離した（３７５０ＲＰＭで１０分間）。ＡＡＤＣ反応を実行する前に、上清（「細胞溶解物」）を新しいプレートに移した（溶解物もまた、最長で７２時間にわたって−８０℃で保管することができる）。
【０３９６】
反応緩衝液（１８０μＬ）を、２０μＬの細胞溶解物と組み合わせ、３７℃のインキュベータで５分間インキュベートした。Ｌ−ＤＯＰＡ（１０μＬの０．３ｍＭ）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、その後氷浴（２〜８℃）に移した。反応を、予冷却０．５Ｍ過塩素酸（ＰＣＡ）（４０μＬ）の添加によってクエンチした。その後、試料を、電気化学検出器にカップリングされた超高圧液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ−ＥＣＤ）を使用して分析した。
【０３９７】
ＵＨＰＬＣ−ＥＣＤ分析
ＵＨＰＬＣ−ＥＣＤを、試料中のドーパミン検出に使用した。試料は、５０ｍｍ  Ｃ１８カラム（ＢＤＳ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｃ１８逆相カラム、３×５０ｍｍ、５μｍ、カタログ番号２８１０５−０５３０３０（サーモサイエンティフィック社（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））で、電気化学検出器にカップリングされた超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ−ＥＣＤ）を使用して、以下の実行パラメータを用いて分析した：ポンプ：サーモフィッシャー社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）７０−３８２９番の０．５ｍｌ／分での試験移動相（アセトニトリル、リン酸緩衝液およびイオン対合剤の有機混合物）；注入：５μＬの試料；実行時間：２．５分；ＥＣＤＲＳ１：２５０ｍＶ、ＥＣＤＲＳ２：４００ｍＶ；データ収集頻度：１０Ｈｚ；カラム温度：３５℃。ドーパミンピークを、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアを使用して分析した。
【０３９８】
ドーパミンに対するＵＨＰＬＣ−ＥＣＤの電気化学応答は、電流（μＡ）で測定される。この測定値を、生成されたドーパミンの量に変換するために、ドーパミン標準曲線を利用する。ドーパミンを、０．１Ｍ  ＨＣＩを使用して可溶化し、２８０ｎｍでの吸光度（吸光係数＝２．０７ｃｍ−１ｍＭ−１）を使用して濃度を決定した。吸光係数は経験的に決定した。ドーパミンを水で１ｍＭに希釈し、アリコートし、−２０℃で凍結した。品質保証のため、融解時に凍結ストックの２８０ｎｍでの吸光度を測定する。その後、１ｍＭストックを、ＡＡＤＣ反応緩衝液で、最上部標準物質点（８０μＭ最終濃度）に希釈した。その後、この標準物質を反応緩衝液で系列希釈（２倍希釈）して、標準曲線を作成した。各試料を三重重複で分析したところ、図５Ｂの中で示されるように、クロマトグラムに差異はほとんどなかった。
【０３９９】
生ドーパミン面積をプロットしたところ、２つの最も濃度が高い地点にてある程度の非線形性が存在した。標準曲線からこれら２地点を取り除くことにより、最良フィティング直線が、より低い濃度をより近似的に表すことが可能になる（図５Ａ）。参考のために、ＡＡＶ２．ＡＡＤＣ（４９ｖｇ／細胞）に関して測定された最も低いＭＯＩは、およそ１×１０−３μＡ／分のドーパミン面積を有する。より低いＭＯＩでのドーパミンレベルの定量化を可能にするために、選択された最良フィティング直線のＹ切片を、可能な限りゼロに近づけた。標準曲線中の地点全てによるＹ切片は、３．９×１０−３μＡ／分だった。標準曲線の最上部２地点を取り除くことによって、Ｙ切片は、４．０×１０−４μＡ／分に低減され、これは、最も低いＭＯＩ未満だった。標準曲線の最上部４地点を取り除くことにより、Ｙ切片は、７．３×１０−５μＡ／分に低減された。最上部４地点の除去は、低濃度のドーパミンの感度を向上させたが、それはまた、より高いドーパミン濃度の範囲を低減させた。試験した用量応答範囲で最も高いＭＯＩの場合、ドーパミン面積は、３×１０−２から６×１０−２μＡ／分までの範囲だった。標準曲線の最上部２地点よりも多くを取り除いた場合、より高いＭＯＩでのドーパミン濃度をより正確に決定することができなかった。
【０４００】
参照標準物質の安定性の決定
実施例４で使用したＡＡＶ２．ＡＡＤＣベクター参照標準物質（１．５×１０９ｖｇ／μＬの力価、１バイアル当たり２５０μＬでバイアル化；用量応答範囲で最も高い用量は１ウェル当たりおよそ２×１０８ｖｇ）の２〜８℃における短期安定性を分析した。２つのバイアルを並行して試験した。一方のバイアルは新たに融解したものであり、他方は３ヵ月前に融解し、２〜８℃で保管したものである。２つの試料間のデータは同等だった（図６、表９）。これらのデータは、少なくとも最長で３ヵ月間にわたって参照標準物質を２〜８℃で保持することができることを示す。
【０４０１】
【表９】
2021521852.tif 000016
【０４０２】
溶解物試料安定性の分析
実施例４の細胞溶解物に対して短期安定性研究を実施した。
溶解物試料を、２〜８℃の冷蔵庫、−２０℃の冷凍庫、および−８０℃の冷凍庫で保持した。溶解物は、−８０℃では初日以降に活性を幾らか喪失し、続いて３０日後には活性がわずかに低下することが観察された。対照的に、−２０℃および２〜８℃で保持した細胞溶解物は、最初の４日間にわたって活性の急速な喪失を示した。
【０４０３】
加えて、溶解物を数回凍結／融解して、複数回の凍結／融解後にＡＡＤＣ活性が喪失するか否かを決定した。−８０℃での反復凍結／融解サイクル後、代表的な溶解物は、第１回目および第２回目の凍結／融解間のドーパミン生成の減少（約４０％）を示したが、最初の低下後に安定したことが観察された。
【０４０４】
また、溶解物試料を試験して、熱およびＵＶへの曝露の影響を分析した。図７および表１０に示されている結果は、熱およびＵＶへの曝露が溶解物試料に対して著しい影響を及ぼすことを示した。
【０４０５】
【表１０】
2021521852.tif 000017
【０４０６】
効力アッセイの適正用量範囲（ＭＯＩ）の決定
当該技術分野のＡＡＤＣ  ＥＬＩＳＡアッセイでは、一般に、使用される形質導入の用量範囲が限定的である（１細胞当たり６３、１２５、２５０、５００、および１０００ベクターゲノム）。参照標準物質に対する効力を正確に測定するためには、ＭＯＩ（感染多重度）をログスケールでプロットする場合の上部および下部漸近線の両方を含む、完全な用量応答範囲が必要とされる。
【０４０７】
この効力アッセイの適正範囲を決定するために、ＨＴ１０８０細胞を、実施例４に記載されている方法を使用して１細胞当たり１０〜１０，０００ベクターゲノム（ＶＧ）の量のＡＡＶ２．ＡＡＤＣベクターで形質導入した。細胞を溶解し、酵素活性を決定し、これは図１に示されている。用量応答（ドーパミン対ＭＯＩ）をプロットし、データを４パラメータロジスティック曲線に対してフィティングした。この分析には、フィティングパラメータを読取りとして使用した。この１０〜１０，０００ｖｇ／細胞の用量範囲を使用すると、１細胞当たり１０〜２５ベクターゲノム間で、より低い漸近線が観察された。１細胞当たり２５００ベクターゲノムよりも大きなＭＯＩでは、より上部の漸近線が観察された。
【０４０８】
ＡＡＤＣ効力アッセイのスループットの増加
実施例４Ｆに記載されているアッセイを、２４ウェルプレートを使用して実施した。同様のアッセイを９６ウェルプレートで実行して、より高いアッセイスループットに関する９６ウェルプレートの実施可能性を試験した。
【０４０９】
まず、９６ウェルプレートを、インキュベーション時間に基づく変動性に関して試験した。ＨＴ１０８０細胞を、ＡＡＶ２．ＡＡＤＣベクターを有する９６ウェルプレートで２４または４８時間にわたって形質導入し、その期間の後、実施例４に記載されている溶解緩衝液を使用して細胞を溶解した。９６ウェルプレートでの２４時間および４８時間の用量応答曲線は、形質導入時間依存性を示し、４８時間の形質導入時間試料でより大きなＡＡＤＣ活性が見られた（図２）。５０〜１０，０００の９つの異なるＭＯＩを分析した。各用量を三重重複で試験した。各生物学的複製物での活性の測定は一貫していた（変動係数＜１０％）。
【０４１０】
次に、９６ウェルプレートを、アッセイ間変動性および再現性に関して試験した。ＡＡＶ２．ＡＡＤＣベクターを参照標準物質として使用し、実施例４のＡＡＤＣ効力アッセイの５回の別々の実行において８回分析した。ベクターは、新たに調製したもの（「新鮮」と標記した）または１ヵ月間もしくは３ヵ月間のいずれかにわたって−８０℃で保管されたもののいずれかだった。これらの実行の一貫性および変動性を検討した。各試料の活性を決定し（図３）、データの変動性は、下記の表１１に要約されている。
【０４１１】
【表１１】
2021521852.tif 000018
【０４１２】
表１１に示されているように、フィティングパラメータ変動性を比較すると、上部および下部基線値が最も可変性である。ＡＡＤＣ反応から生成されたドーパミンの量は様々だった。
【０４１３】
クエンチングに関するＡＡＤＣ効力アッセイ変動性の検討
変動性の潜在的な供給源は、酵素反応のクエンチングに関するタイミングである。実施例４の反応は、３７℃で３０分間にわたって生じ、氷冷過塩素酸（ＰＣＡ）を使用してクエンチされる。反応を室温で継続させる場合、プレートの下側にあるウェルは、プレートの上側にあるウェルよりも多くのドーパミン生成を示す可能性がある（上部から下部へのクエンチングパターンを仮定）。
【０４１４】
ドーパミン生成の速度を、３つの異なる温度（３７℃、室温、および２〜８℃）で検討した。図４Ａに示されているデータから、Ｌ−ＤＯＰＡのドーパミンへの酵素変換は、反応を２〜８℃で保持すると、３７℃または室温と比較して遅くなる。室温で生成されるドーパミンの量は、２〜８℃で生成されるドーパミンの量よりもおおよそ２〜２．５倍多い（図４Ａ）。これらのデータは、３０分間のインキュベーションの後にプレートを２〜８℃に移すと変換速度が著しく低減され、それにより、ＰＣＡをウェルに添加している間の試料間変動性が最小限に抑えられることになることを示す。変動性は、マルチチャネルピペット（または９６ウェルプレートピペット）を使用して試料クエンチングを素早く行って、インキュベーション時間の変動性を低減することにより更に最小限に抑えることができる。ウェルをクエンチングする（反応を停止する）方法を、Ｌ−ＤＯＰＡの添加（反応の開始）とアラインさせると、プレートの列間にわたるインキュベーション時間の変動性が低減される。
【０４１５】
これらの改変が試料間の変動性減少をもたらしたか否かを決定するため、細胞を、１０  ＭＯＩで複製して形質導入し、３７℃で３０分間インキュベートし、その後、Ｂｉｏ−Ｒａｄ冷却ブロック（−２０±５℃の冷凍庫で上下逆さまにして保管した）を使用して２〜８℃に冷却して、クエンチする前に反応を遅くした。細胞を含有するプレートを氷上に置き、その後に電子マルチチャネルピペットを使用して氷冷ＰＣＡでクエンチして、タイミングを制御しクエンチを素早く行った。これらの改変を適用することにより、上部傾きの変動性が大幅に低減された（図４Ｂおよび表１２）。
【０４１６】
【表１２】
2021521852.tif 000019
【０４１７】
加えて、最も高い用量の２倍系列希釈を実施することによって、用量をより均等に離間させた。このプレートを、列Ｂから列Ｇまで連続してクエンチした。最も高いＭＯＩでは上昇傾向があり、これは上部基線の変動性に寄与する。列の各々は、各列に同じ系列希釈を使用するのではなく、個々に希釈された試料である。ここに提示されている結果は、試料間変動性が図３よりも非常に少ないことを示す。
【０４１８】
実施例５．ＡＡＤＣ効力／発現アッセイ−ＥＬＩＺＡ−Ａ
ＨＴ−１０８０細胞を、実施例３に提示された手順に従って培養し、播種し、希釈し、形質導入し、および溶解した。
【０４１９】
試薬の調製
洗浄／希釈緩衝液（１×ＴＢＳ−Ｔ）  −  精製水（９５０ｍＬ）を、５００ｍＬのメスシリンダー中で５０ｍＬの２０×ＴＢＳ−Ｔ（ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水＋ｔｗｅｅｎ、ｐＨ７．４）と組み合わせる。洗浄および希釈用に６Ｌが調製されるまで、このプロセスを繰り返す。
【０４２０】
ブロッキング溶液（２％ＢＳＡを有するＴＢＳ−Ｔ）  −  １×ＴＢＳ−Ｔ（１００ｍＬ）をメスシリンダーで量り取り、磁気撹拌子を有するビーカーに移した。２ｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、撹拌しながらゆっくりと溶液に添加した。得られた溶液を、４℃で保管し、光から保護する（最長で２週間）。
【０４２１】
試料希釈緩衝液（０．１％ＢＳＡを有するＴＢＳ−Ｔ）  −  ７５ｍＬの１×ＴＢＳ−Ｔを、２５ｍＬのブロッキング溶液（２％ＢＳＡを有するＴＢＳ−Ｔ）と組み合わせた。得られた溶液を、４℃で保管し、光から保護する（最長で２週間）。
【０４２２】
捕捉抗体によるＡＡＤＣ  ＥＬＩＳＡプレートの準備
１０ｍＬの５０ｍＭ炭酸塩緩衝液（オートクレーブ水１００ｍＬ当たり１つの炭酸塩カプセル）を、０．０１ｍＬのストック捕捉抗体（２μｇ／ｍＬの作業濃度）と組み合わせることによって捕捉抗体溶液を調製する。必要に応じて同じ混合物濃度を使用して追加の捕捉抗体溶液を作製することができる（各ＥＬＩＳＡプレート毎に１０ｍＬの捕捉抗体溶液であり、各々２つの被験物質試料毎に１つのＥＬＩＳＡアッセイプレートが必要である）。
【０４２３】
１００μＬの希釈捕捉抗体を、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加する（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ白色平底プレート）。プレートを密封し、２〜８℃で一晩保管する（１２〜１８時間）。
【０４２４】
ＥＬＩＳＡアッセイプレートを、３００μＬのＴＢＳＴで３回洗浄する。３００μＬのブロッキング緩衝液を、マルチチャネルピペットを使用してアッセイプレートに各ウェルに添加する。プレートを密封し、室温にて少なくとも１時間実験台上でインキュベートする。希釈プレート（９６ウェルＰＣＲプレート）を、以下の配置で試料希釈液緩衝液を添加することによって準備する（表１３）。
【０４２５】
【表１３】
2021521852.tif 000020
【０４２６】
１５μＬの清澄化溶解物を、表１４に従って、９６ウェルＰＣＲ試料希釈緩衝液プレートに添加し、系列希釈する。
【０４２７】
【表１４】
2021521852.tif 000021
【０４２８】
プレートを密封し、室温にて２時間４００ｒｐｍで振盪する。１００μＬの検出抗体溶液を、マルチチャネルピペットを使用して各ウェルに添加する。プレートを密封し、室温にて１時間４００ｒｐｍで振盪し、その後アルミニウムホイルを使用して光から保護する。
【０４２９】
化学発光
各アッセイプレートは、１０ｍＬのルミネッセンス溶液を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅキットを使用して、５ｍＬのルミノール／エンハンサーを１５ｍＬコニカルチューブ中の５ｍＬ過酸化物溶液と混合することによって各試料プレート毎に調製する。
【０４３０】
１００μＬのルミネッセンス溶液を、マルチチャネルピペットを使用して（左から右へと）各ウェルに添加する（一度に１つのプレートずつ）。プレートを密封し、アルミニウムホイルで保護し、４００ｒｐｍで１分間振盪する。化学発光は、ルミネセンス設定を使用してＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５または類似のプレートリーダを使用して捕捉する。
【０４３１】
データ分析
ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５ソフトウェアまたは類似のソフトウェアを使用して、生データを以下のように分析する（表１４のプレートレイアウトを参照）：（ｉ）ウェルＨ１およびＨ２を平均して、陰性ＥＬＩＳＡ対照を得る；（ｉｉ）陰性ＥＬＩＳＡ対照を、プレートの全てのウェルから減算する；（ｉｉｉ）フィッティングした標準曲線を使用して、化学発光シグナルのデータをＡＡＤＣに対して正規化する（ｎｇ／ｍＬ）；（ｉｖ）各試験ウェルを、適切な希釈係数（１：２０、１：４０、１：８０、または１：１６０）によって調整する；（ｖ）各形質導入細胞培養ウェルの希釈物を平均する；（ｖｉ）各試料ＭＯＩの３つの複製物を平均し、標準偏差を決定する；（ｖｉｉ）標準曲線範囲内に入らないあらゆる値を除外し、テンプレートの平均および標準偏差に使用した範囲を調整することによって残りの値を平均する（または３つの値のうち１つのみが有効である場合は単一の値として報告する）。
【０４３２】
データ分析は、以下のものを提供するだろう：（ｉ）ＡＡＤＣ標準曲線の４パラメータフィッティングデータ；（ｉｉ）標準曲線の相関係数；（ｉｉｉ）各ＭＯＩでの平均ＡＡＤＣ濃度；（ｉｉｉ）平均相対ＡＡＤＣ濃度の標準偏差；および（ｉｖ）以下の数式に従って参照標準物質のＭＯＩの平均相対ＡＡＤＣ濃度と比較した各ＭＯＩの平均相対ＡＡＤＣ濃度：
【０４３３】
【数６】
2021521852.tif 000022
【０４３４】
実施例６．ＡＡＤＣ効力／発現アッセイ−ＥＬＩＺＡ−Ｂ
試薬の調製
トリプシン−ＥＤＴＡ  −  トリプシン−ＥＤＴＡの１００ｍＬのボトルを、２〜８℃で一晩融解した。ボトルを完全に融解したら、１０ｍＬの溶液を、複数の１５ｍＬポリプロピレン製滅菌遠心チューブに移した。アリコートを−１５〜−３０℃で保管した。使用前にアリコートを融解し、周囲温度と平衡化させた。融解したら、アリコートを、２〜８℃で保管し、２週間の有効期限を割り当てた。
【０４３５】
ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）溶液  −  ペニシリン−ストレプトマイシンの１００ｍＬボトルを、２〜８℃で一晩融解した。６ｍＬの融解溶液を、複数のポリプロピレン製滅菌遠心チューブに移し、その後−１５〜−３０℃で保管した。
【０４３６】
細胞培養培地（ＣＣＭ）（ＥＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）  −  ５．６ｍＬのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ溶液を、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）の５００ｍＬボトルに添加した。その後、５．６ｍＬのウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を、ＥＭＥＭ＋Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐのボトルに添加した。得られたＣＣＭ溶液を、０．２２μｍ滅菌使い捨てフィルターに通して、滅菌レシーバボトルへと通過させ、２〜８℃で保管した（光から保護した）。
【０４３７】
プロテアーゼ阻害剤を有しない細胞溶解緩衝液（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．８）  −  精製水（４００ｍＬ）を、５００ｍＬのメスシリンダーに添加し、磁気撹拌子を有する１Ｌビーカーに水を移した。撹拌は撹拌プレート上で始めた。リン酸一ナトリウム（０．２５ｇ）およびリン酸二ナトリウム（３．２４ｇ）を、溶解するまで水と混合した。１ｇのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を撹拌溶液に注いだ。溶液を室温で３０分間撹拌した。ｐＨを試験し、溶液がｐＨ７．７〜７．９でなかった場合、ｐＨを必要に応じて０．１Ｎ  ＨＣｌまたは０．１Ｎ  ＮａＯＨで調整した。ビーカーの内容物をメスシリンダーに移し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水で満たして５００ｍＬの容積にした。溶液を、０．２２μｍ滅菌使い捨てフィルターに通して、滅菌レシーバボトルへと通過させた。ボトルをアルミニウムホイルで包んで溶液を光から保護し、室温で保管した。
【０４３８】
ＡＡＤＣ  ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液（炭酸塩緩衝溶液）  −  炭酸塩緩衝液は、ゼラチンカプセルとして提供された。２つのカプセルの内容物を、きれいな滅菌ビーカー中の２００ｍＬの精製水に入れて空にし、磁気撹拌子を添加した。内容物を完全に溶解させた。溶液を、０．２２μｍ滅菌使い捨てフィルターに通して、滅菌レシーバボトルへと通過させた。ボトルに、調製日から１ヵ月間が有効期限であると標記し、室温で保管した。
【０４３９】
ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（１×ＴＢＳ−Ｔ）  −  精製水（１８００ｍＬ）を、２Ｌメスシリンダーに測り取り、２００ｍＬの１０×ＴＢＳ−Ｔ（ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水＋ｔｗｅｅｎ、ｐＨ７．４）溶液を、５００ｍＬのメスシリンダーに測り取った。１０×ＴＢＳ−Ｔを水に添加し、シリンダーをパラフィルムで覆った。シリンダーを、２〜３回逆さまにして混合した。溶液を、０．２２μｍ滅菌使い捨てフィルターに通して、滅菌レシーバボトルへと通過させ、室温で保管した。
【０４４０】
ＥＬＩＳＡブロッキング溶液（２％ＢＳＡを有するＴＢＳ−Ｔ）  −  １×ＴＢＳ−Ｔ（８０ｍＬ）をメスシリンダーで測り取り、磁気撹拌子を有するビーカーに移した。２ｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、室温で３０分間未満の間、撹拌しつつ緩衝液にゆっくりと添加した。ビーカーを、１×ＴＢＳ−Ｔで最終１００ｍＬ容積に調整した。溶液を、きれいな滅菌ボトルに移し、２〜８℃で保管した。
【０４４１】
検出抗体希釈緩衝液（０．５％ＢＳＡを有するＴＢＳ−Ｔ）  −  １×ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（１００ｍＬ）を、メスシリンダーで測り取った。緩衝液を、磁気撹拌子を有するビーカーに移した。０．５ｇのＢＳＡを、室温で最長３０分間、撹拌しつつ緩衝液に添加した。溶液を、きれいな滅菌ボトルに移し、２〜８℃で保管した。
【０４４２】
ＥＬＩＳＡ試料希釈緩衝液（０．１％ＢＳＡを有するＴＢＳ−Ｔ）  −  ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（１００ｍＬ）を、メスシリンダーで測り取った。緩衝液を、磁気撹拌子を有するビーカーに移した。０．１ｇのＢＳＡを、室温で最長３０分間、撹拌しつつ緩衝液に添加した。溶液を、きれいな滅菌ボトルに移し、２〜８℃で保管した。
【０４４３】
ＡＡＤＣ  ＥＬＩＳＡ標準物質  −  凍結乾燥固形物を、１ｍＬのＥＬＩＳＡ希釈緩衝液（０．５％ＢＳＡを有するＴＢＳ−Ｔ）で溶解し、５〜１０秒間ボルテックスして混合した。液体が１〜２分間バイアルの底部へと排出されることを可能にした。ＡＡＤＣ標準物質を、８０μＬ容積で０．５ｍＬ容積の微量遠心チューブにアリコートし、−７０℃未満で保管した。
【０４４４】
ＨＴ−１０８０細胞の細胞懸濁物の調製
細胞懸濁物を、７．５×１０４細胞／ウェルの播種密度に調製した。あるいは、１００μＬのＨＴ−１０８０を、５×１０３細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳにプレーティングした。この工程では、ＨＴ−１０８０細胞の剪断を回避するために、Ｐ３００マルチチャネルピペットを使用した。プレートを多孔性接着フィルムで密封して、蒸発を低減させ、プレート領域を越えるガス交換の均一性を維持し、プレートの上に蓋を設置した。細胞を、３７±２℃で２４±２時間インキュベートした。ＨＴ−１０８０細胞の１つのコンフルエントＴ７５フラスコは、４〜５つの２４ウェルプレートに十分な細胞であるおおよそ２×１０６細胞を有するだろう。完全培養培地（ＣＣＭ）、１×ＨＢＳＳ、およびトリプシン−ＥＤＴＡを、３７℃の水浴で少なくとも１０分間加温した。培地を、コンフルエントＨＴ１０８０単層から１：２漂白剤溶液へと吸引した。血清学的ピペットを使用して１０ｍＬの１×ＨＢＳＳをフラスコに添加することによって細胞を洗浄した。フラスコを前後に振って細胞をすすいだ。ＨＢＳＳを１：２漂白剤溶液へと吸引した。滅菌５ｍＬ血清学的ピペットを使用して、４ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡをフラスコに添加した。フラスコを穏やかに振って、トリプシンがフラスコの底部全体を覆うことを可能にした。４〜６％ＣＯ２インキュベータを用いて４〜５分間３７±２℃にてフラスコをインキュベートした。
【０４４５】
フラスコを顕微鏡で検査して、細胞がフラスコから剥離したことを確認した。フラスコの底部には細胞が無く、細胞はＣＣＭ中を自由に浮遊していると思われた。細胞剥離は強制的ではなかった。しかし、細胞が剥離したら、トリプシンを除去した。細胞がフラスコの底部から剥離したら、１０ｍＬ血清学的ピペットを使用して、８ｍＬのＣＣＭ（室温に加温されている）を添加してトリプシン活性を阻止した。フラスコを前後に振って、残りの接着細胞を取り外した。細胞懸濁物を、滅菌５０ｍＬコニカル遠心チューブに移し、チューブを周囲温度で５分間４００×ｇで遠心分離した。細胞は、５０ｍＬ滅菌遠心チューブの底部にペレットを形成した。バイオセイフティーキャビネットで作業して、ペレットを崩さずにできるだけ多くのＣＣＭを吸引して、細胞懸濁物からトリプシン−ＥＤＴＡを除去した。新鮮な予暖ＣＣＭ（１２ｍＬ）をチューブに添加し、ＣＣＭをピペットで上下させて、細胞ペレットをばらばらにした。最終懸濁物は、均一な密度を有し、細胞の塊を有していなかった。細胞懸濁物を計数した。
【０４４６】
ボルテックスによって穏やかに共に混合した１００μＬの細胞懸濁物および１００μＬのトリパンブルー染色剤を添加することによって、ＨＴ−１０８０細胞をチューブ中で１：２に希釈した。血球計算器の表面を、７０％アルコール溶液できれいにし、ＫＩＭＷＩＰＥＳ（商標）（キンバリー−クラーク社（Ｋｉｍｂｅｒｌｙ−Ｃｌａｒｋ））で乾燥させた。カバーガラスを血球計算器の溝に配置した。２０μＬの単一チャネルピペットを使用して、１０μＬのトリパンブルー染色細胞懸濁物を血球計算器の血球計算盤の各々に負荷した。倒立位相差顕微鏡を使用して、血球計算器の２つのグリッドの５つの四角枠の各々（合計１０個の四角枠）にある細胞の数を計数した。各四角枠で計数された細胞が１００個よりも多い場合、トリパンブルーでの細胞懸濁物の希釈を増加させ、計数を繰り返した。各四角枠には３０個よりも多くの細胞が存在するべきである。血球計算器を使用して懸濁物中の細胞数を計数するために、以下の数式に従って細胞濃度（細胞／ｍＬ）を算出した。
【０４４７】
細胞／ｍＬ＝（細胞総数÷１０）×トリパンブルーでの希釈係数×１０，０００
「１０，０００」は、血球計算器の容積補正係数である。
試験する各試料毎に１つの２４ウェルプレートを準備し、アッセイ対照のために別のプレートを準備した。以下の数式を使用して、細胞をＣＣＭで７．５×１０４細胞／ｍＬに希釈した。
【０４４８】
希釈係数＝（測定された細胞／ｍＬ）／（７．５×１０４細胞／ｍＬ）
必要とされる細胞懸濁物容積（ｍＬ）＝アッセイウェルの数×１ｍＬ／ウェル／希釈係数
必要とされるＣＣＭ希釈剤容積（ｍＬ）＝アッセイウェルの数−必要とされる細胞懸濁物容積
希釈後、細胞懸濁物をプレーティングした。２４ウェルプレートのウェル全てに１ｍＬの細胞懸濁物を播種した。プレートをインキュベータ棚に接触させたまま保持し、それを左右に３〜４回、その後前後に３〜４回動かすことによって細胞を分散させた。細胞を、３７±２℃および５±１％ＣＯ２で１８〜２４時間インキュベートした。
【０４４９】
ＨＴ１０８０細胞の形質導入
細胞懸濁物を調製するためのインキュベーション期間の終了時に、ＣＣＭ、１×ＨＢＳＳ、およびトリプシン−ＥＤＴＡを、３７℃水浴で少なくとも１０分間加温した。各アッセイプレートの１つの「計数」ウェルから培地を吸引し、ＨＢＳＳで洗浄した。トリプシン（１００μＬ）を各洗浄ウェルに添加し、３７±２℃でインキュベートして細胞を表面から剥離させた。１００μＬのＣＣＭをウェルに添加することによって、トリプシンの活性を停止させた。
【０４５０】
血球計算器を使用してトリプシン処理ウェルの細胞密度を決定して、各四角枠が少なくとも１０個の細胞を含有すること保証した。細胞が１×１０５〜３×１０５細胞／ウェルであった場合、感染プロトコールを継続した。
【０４５１】
分析しようとする各試料は、ウイルスゲノム（ｖｇ）力価が、１×１０１１ｖｇ／ｍＬよりも大きかった。ＡＡＶ２．ＡＡＤＣ参照標準物質（ＬＮ−２０１４−０８８−５６；１０ｍＭリン酸ナトリウム、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％プルロニック）の濃度は、３．９０×１０１２ｖｇ／ｍｌだった。ＡＡＶ２．ＡＡＤＣ参照標準物質（ＬＮ−２０１４−０８８−５６）および試験試料ウイルスの初期希釈が１，０００ｖｇ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）もたらすための目標濃度（ｖｇ／ｍＬ）を、下記式を使用して算出した。
【０４５２】
目標濃度（ｖｇ／ｍＬ）＝細胞計数／ウェル×２×１０４
２×１０４という値には、１，０００ＭＯＩに加えて、試料希釈の補正係数およびウェルに送達される容積の量も含まれていた。
【０４５３】
あるいは、ＡＡＶ２．ＡＡＤＣ参照標準物質（ＬＮ−２０１４−０８８−５６）および試験試料のアリコートを完全に融解したか、または２〜８℃で保管した期限が切れていないアリコートを使用した。参照標準物質または試験試料の力価が１×１０１１ｖｇ／ｍＬ以上だった場合、試験物質の初期希釈を１×ＰＢＳで実施した。
【０４５４】
１ｍＬの１，０００ｖｇ／細胞の目標濃度を調製するために必要だった試験試料および参照標準物質の容積は、下記式を使用して算出した。
試験試料または参照標準物質の容積＝（目標濃度×総容積）／（試験試料または参照対照の力価）
表１５に記載されているベクター希釈物を、滅菌２ｍＬ深底９６ウェルプレートにて調製した。各希釈物は三重重複で調製した。系列希釈では同じチップを使用したが、重複物間では異なるチップを使用した。最終５０μＬを最後に破棄して、各ウェルの最終容積が１００μＬであることを保証した。
【０４５５】
【表１５】
2021521852.tif 000023
【０４５６】
各ベクター希釈物を６００μＬの細胞培養培地（ＣＣＭ）に添加し、２〜３秒間ボルテックスして混合した。混合物を、室温で保管した。これらの希釈物を、調製した２時間以内に使用した。１００μＬの１×ＰＢＳおよび６００μＬのＣＣＭの３つの追加試料を、陰性対照として調製した。培地をウェルから一度に１プレートずつ吸引し、ウェルの培地を、３５０μＬのＣＣＭ希釈参照標準物質および試験試料と置換した。プレートにカバーをかけ、３７±２℃および５±１％ＣＯ２インキュベータに２２〜２６時間にわたって戻した（ｒｅｔｕｒｎｄ）。インキュベーション期間の終了時に、ＣＣＭのボトルを３７±２℃の水浴で少なくとも１０分間加温した。感染培地を吸引し、１ウェル当たり１ｍＬの予暖ＣＣＭと置換した。プレートにカバーをかけ、３７±２℃および５±１％ＣＯ２インキュベータに４６〜５０時間にわたって戻した。
【０４５７】
細胞溶解緩衝液を、細胞を回収するために調製した。各プレートには、５８μＬの１００×ＨＡＬＴプロテアーゼ阻害剤を、５．７ｍＬの細胞溶解緩衝液に添加した。一度に１プレートずつ作業して、全てのウェルの培地を吸引し、１ｍＬの１×ＨＢＳＳで洗浄した。ＨＢＳＳを吸引し、３００μＬの細胞溶解緩衝液を各ウェル添加した。プレートを１０〜１５秒間手でゆっくりと振って混合し、その後、プレートにカバーをかけ、−６０℃以下で１時間以上凍結した。
【０４５８】
ＥＬＩＳＡを使用してＡＡＤＣの発現を検出するための試料の調製
ＨＴ−１０８０細胞をＡＡＶ２−ＡＡＤＣで感染させる。３日後に、細胞を溶解し、ヒトＤＤＣ一致ＥＬＩＳＡ抗体ペアセット（シノ・バイオロジカル（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）；カタログ番号：ＳＥＫ１０５６０）を使用して、ＡＡＤＣタンパク質の量を定量化した。
【０４５９】
各２４ウェル感染プレートは、アッセイに１つの９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを必要とした。９６ウェルプレート１つ当たり１０ｍＬの希釈捕捉抗体溶液を調製した。捕捉抗体を、ＡＡＤＣ  ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液で２μｇ／ｍＬの終濃度に希釈した。マルチチャネルピペットを使用して、１００μＬの希釈捕捉抗体を、中実白色不透明ＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）９６ウェルプレート（サーモフィッシャー社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ））の各ウェルに添加した。プレートを密封フィルムで覆い、コーティングしたプレートの上下に空プレートを置いて２〜８℃にて一晩（１２〜１８時間）保管した。
【０４６０】
ｄｏｐａデカルボキシラーゼ（ＤＤＣ）ＥＬＩＳＡプレートをブロッキングするために、プレートを、自動プレート洗浄機を使用して３００μＬ  ＴＢＳ−Ｔを有するＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で３回洗浄した。マルチチャネルピペットを使用して、３００μＬのＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液を、ＥＬＩＳＡプレートの全てのウェルに添加した。プレートをプレート密封器でカバーをかけ、７５±１５分間（少なくとも１時間）室温で保管した。
【０４６１】
２４ウェルプレートを周囲温度で融解することによって、細胞溶解物希釈物を調製した。一度に１つずつ、プレートを室温超音波処理水浴に浮かべて、３０秒間超音波処理した。溶解物がウェルの底部端部で収集されるように、角度をつけてプレートを傾けた。Ｐ１０００ピペットを使用して、細胞溶解物を、ラベル付きの１セットの微量遠心チューブに移した。複製ウェルは、単一のチップで移したが、異なるＭＯＩで感染させた細胞に由来する試料をピペットする場合は、チップを付け替えた。細胞残屑を、室温で５分間１０，０００ＲＰＭで遠心分離することによってペレットにした。清澄化溶解物を、第２のセットのラベル付き微量遠心チューブに移した。
【０４６２】
ＥＬＩＳＡテンプレートを、ＡＡＤＣ標準物質ストックのアリコートを融解することによって調製した。ＡＡＤＣ標準物質ストックを、試料希釈緩衝液で５０ｎｇ／ｍＬに希釈した。各プレートは、４００μＬの５０ｎｇ／ｍＬ  ＡＡＤＣ標準物質を必要とした。テンプレートプレートを、低結合性９６ウェルプレートを使用して準備した。テンプレートは、ＥＬＩＳＡ試料希釈緩衝液を使用して調製された各清澄化溶解物試料の３つの希釈物およびＡＡＤＣ標準物質を含んでいた。溶解物試料希釈は、１：２０、１：４０、および１：８０だった。
【０４６３】
ＡＡＤＣの発現を検出するためのＥＬＩＳＡの実施
ヒトＡＤＤＣ一致ＥＬＩＳＡ抗体ペアセット（シノ・バイオロジカル社（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）；カタログ番号：ＳＥＫ１０５６０）を使用してＥＬＩＳＡを実施し、本明細書に記載されているＡＡＤＣ効力アッセイで使用される同じ溶解物でのＡＡＤＣの発現を確認した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、自動プレート洗浄機を使用してＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。プレートを逆さましてペーパータオル束の上で軽く叩き、残留液体を排水した。
【０４６４】
１２個のチップが装着されたマルチチャネルピペットを使用して、１００μＬの試料および標準物質を吸引し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの対応する列に分配した。ピペットチップを各列で付け替えた。プレートを密封フィルムで覆い、オービタルシェーカにて２時間±１５分間２００ｒｐｍで周囲温度にて撹拌した。各プレートでは、１０ｍＬの希釈検出抗体溶液を０．２μｇ／ｍＬの終濃度に調製した。
【０４６５】
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、自動プレート洗浄機を使用してＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。プレートを逆さましてペーパータオル束の上で軽く叩き、残留液体を排水した。１００μＬの希釈検出抗体溶液を、各ウェルに添加した。プレートを密封フィルムで覆い、オービタルシェーカにて１時間±１０分間２００ｒｐｍで周囲温度にて撹拌した。
【０４６６】
各アッセイプレートでは、１０ｍＬのＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ（商標）ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（サーモフィッシャー社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ））を、５ｍＬのルミノール／エンハンサーを５ｍＬのホースラディッシュ過酸化物溶液と組み合わせることによって調製した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、自動プレート洗浄機を使用してＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。プレートを逆さましてペーパータオル束の上で軽く叩き、残留液体を排水した。１００μＬのＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ（商標）ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（サーモフィッシャー社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ））を、検出直前にマルチチャネルピペットを用いてプレートの各ウェルに添加した（左から右へと）。インキュベーション時間が短くなるように、溶液を１つのプレートに一度に添加した。プレートを、オービタルシェーカにて２±１分間２００ｒｐｍで周囲温度にて撹拌した。
【０４６７】
ＡＭＱ−０２１  ＶＥＲＳＡＭＡＸ（商標）マイクロプレートリーダ（モレキュラー・デバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＬＬＣ））を使用して、基質を添加した２〜１０分後にプレートを読み取った。プレートリーダは、ＥＬＩＳＡプレートのルミネセンスを読み取り、平均ブランクを算出する。ブランクを全てのウェルから減算し、標準物質を４パラメータ曲線に対してフィッティングする。試験試料濃度を標準曲線から内挿して、ＡＡＤＣ濃度を決定する。
【０４６８】
曲線の読取り可能な範囲内にある濃度を希釈係数で乗算し、読取り可能な範囲にあるＭＯＩの希釈補正結果を平均して報告可能な結果を得た。試験データから適切であると考えられる場合、他の計算を実施してもよい。試験で使用される計算は、最終報告に明記されることになる。
【０４６９】
ＶＥＲＳＡＭＡＸ（商標）マイクロプレートリーダ（モレキュラー・デバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＬＬＣ））のＳＯＦＴＭＡＸ（登録商標）Ｐｒｏソフトウェア（モレキュラー・デバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＬＬＣ））の分析テンプレートは、ブランクルミネセンス値を平均し、全てのウェルから平均ブランクルミネセンスを減算した。バックグラウンド補正強度値を、ＡＡＤＣ標準物質対標準物質濃度でプロットした。標準物質点に対して４パラメータロジスティク回帰を実施した。回帰数式およびバックグラウンド補正強度値を使用して、プレートの全てのウェルのＡＡＤＣ濃度を算出した。
【０４７０】
ウェル結果を希釈係数で乗算することによって、標準曲線の読取り可能な範囲内にある全てのウェルの希釈補正濃度を算出した。標準曲線範囲（０．３９〜２５ｎｇ／ｍＬ）の外側にあるＡＡＤＣ濃度計算値を有するウェルは除外した。生物学的複製物の希釈補正ＡＡＤＣ濃度を平均した。標準偏差および％ＣＶを決定した。１００よりも大きな％ＣＶを有する希釈物を分析から除外した。
【０４７１】
ＭＯＩの有効な結果を全て平均して、ＭＯＩ結果を得た。標準曲線の読取り可能な範囲内にある全ての試料の希釈補正結果を、各ＭＯＩで平均し、各ＭＯＩの試験試料平均を参照対照平均で除算することによって相対効力を決定した。試験試料のＭＯＩ結果を、各ＭＯＩでの参照標準物質のＭＯＩ結果で除算して、相対ＭＯＩ効力を算出した。相対ＭＯＩ効力の平均を算出して、報告可能な相対効力を決定した。
【０４７２】
ＭＯＩの定量化の上限は、４０００ｎｇ／ｍＬである。ＭＯＩの定量化の下限は、７ｎｇ／ｍＬである。ＡＡＤＣ  ＥＬＩＳＡ標準物質回帰直線は、０．９８以上のＲ２相関係数を有しなければならない。計算に使用するためのＥＬＩＳＡブランクの平均ルミネセンスは、１０，０００以下だった。その希釈での結果が有効である計算に使用するための、単一希釈物の三重重複感染ウェル間のルミネセンスのＣＶパーセントは、１００以下だった。参照標準物質の各ＭＯＩでは、少なくとも１つの有効な希釈物結果が必要だった。有効でないアッセイを繰り返した。０  ＭＯＩ試料を１：２０希釈した未感染溶解物（０  ＭＯＩ）のＡＡＤＣ濃度報告値は、有効なアッセイでは検出不能だった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月27日(2020.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）ウイルスベクター効力を測定する方法であって、
（ａ）ＡＡＤＣウイルスベクターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）製剤であって、前記ＡＡＤＣウイルスベクターが１以上のＡＡＤＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶであるＡＡＶ製剤を準備する工程、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドから１以上のＡＡＤＣポリペプチドを産生する細胞がもたらされる条件下で前記ＡＡＶ製剤を前記細胞と接触させる工程、
（ｃ）前記細胞を溶解して、前記ＡＡＤＣポリペプチドの少なくとも一部を含む第１の細胞溶解物を形成する工程、
（ｄ）前記ＡＡＤＣウイルスベクターの効力を決定する工程であって、
（ｉ）Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）を、前記第１の細胞溶解物中の前記ＡＡＤＣポリペプチドの少なくとも一部が、前記Ｌ−ＤＯＰＡの少なくとも一部と反応してドーパミンを産生することを可能にする条件下で、前記第１の細胞溶解物に添加すること、
（ｉｉ）前記ＡＡＤＣポリペプチドと前記Ｌ−ＤＯＰＡとの反応後に、前記第１の細胞溶解物中のドーパミンの量を測定すること、
（ｉｉｉ）ドーパミン産生のＡＡＤＣウイルスベクター参照標準物質を準備することであって、前記ＡＡＤＣウイルスベクター参照標準物質が、１以上のＡＡＤＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記_Hlk59020968ＡＡＤＣウイルスベクター参照標準物質_Hlk59020968によって産生されたドーパミンの量が、
前記ＡＡＤＣポリペプチドの少なくとも一部を含む第２の細胞溶解物であって、前記第２の細胞溶解物中の前記ＡＡＤＣポリペプチドが、前記ＡＡＤＣウイルスベクター参照標準物質で形質導入された細胞によって産生されたものである第２の細胞溶解物にＬ−ＤＯＰＡを添加すること、および
前記ＡＡＤＣポリペプチドと前記Ｌ−ＤＯＰＡとの反応後に、前記第２の細胞溶解物中で産生されたドーパミンの量を測定すること、によって決定される、こと、並びに、
（ｉｖ）前記ＡＡＤＣウイルスベクターのＡＡＤＣ相対効力が測定されるように、前記ＡＡＤＣウイルスベクターを使用して産出されたドーパミンの量を前記ＡＡＤＣウイルスベクター参照標準物質と比較すること
によって前記ＡＡＤＣウイルスベクターの効力を決定する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記細胞が、ＨＴ１０８０細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＨＴ１０８０細胞が、７×１０３〜４×１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングされる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＴ１０８０細胞が、９×１０３〜２×１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングされる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、形質導入１８〜３０時間後に回収される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、形質導入２２〜２６時間後に回収される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＡＡＤＣウイルスベクターが、約１ベクターゲノム（ｖｇ）／細胞〜約１×１０８ｖｇ／細胞の濃度で前記細胞に形質導入される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＡＡＤＣウイルスベクターが、約１０ｖｇ／細胞〜約１×１０５ｖｇ／細胞の濃度で前記細胞に形質導入される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、化学的溶解、機械的溶解、またはそれらの組合せを使用して溶解される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、化学的溶解を使用して溶解され、前記化学的溶解が、プロテアーゼ阻害剤、リン酸緩衝生理食塩水およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含む溶解緩衝液を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶解が、前記細胞を、室温で５〜２０分間３６５０〜３８００ＲＰＭで遠心分離機にて遠心する工程を含む、請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＡＡＤＣ反応緩衝液が、前記第１および／または第２の細胞溶解物に添加され、前記ＡＡＤＣ反応緩衝液が、オクタンスルホン酸ナトリウム塩、リン酸一ナトリウム、およびアセトニトリルを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＡＡＤＣ反応緩衝液が、３．０〜３．５ｍＭオクタンスルホン酸ナトリウム塩（ｐＨ３．０）、７２．５ｍＭリン酸一ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、および１０％アセトニトリルを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１および／または第２の細胞溶解物に添加されるＬ−ＤＯＰＡの濃度が、０．０１ｍＭ〜１ｍＭである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１および／または第２の細胞溶解物に添加されるＬ−ＤＯＰＡの濃度が、０．０３ｍＭである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＡＡＤＣポリペプチドとＬ−ＤＯＰＡとの前記反応が、３７℃で行われる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＡＡＤＣポリペプチドとＬ−ＤＯＰＡとの前記反応が、１０〜１２０分間行われる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＡＡＤＣポリペプチドとＬ−ＤＯＰＡとの前記反応が、３０分間行われる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１および／または第２の細胞溶解物が、Ｌ−ＤＯＰＡとのＡＡＤＣ反応の後で２〜８℃の温度に曝露される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＡＡＤＣポリペプチドとＬ−ＤＯＰＡとの前記反応が、氷冷過塩素酸を添加することによってクエンチされる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記氷冷過塩素酸が、０．１Ｍ〜１Ｍの濃度で添加される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記氷冷過塩素酸が、０．５Ｍの濃度で添加される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ドーパミンの量が、電気化学検出器を有する超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ−ＥＣＤ）を使用して測定される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ドーパミンの量が、ドーパミンの量をドーパミン標準曲線と比較することによってＵＨＰＬＣ−ＥＣＤを使用して測定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ドーパミンの量が、紫外線検出器を有する超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ−ＵＶ）を使用して測定される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ドーパミンの量が、ドーパミンの量をドーパミン標準曲線と比較することによってＵＨＰＬＣ−ＵＶを使用して測定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＡＡＤＣウイルスベクターが、配列番号２と少なくとも８５％同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＡＡＤＣウイルスベクターが、配列番号２と少なくとも９０％同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＡＡＤＣウイルスベクターが、配列番号２と少なくとも９５％同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＡＡＤＣウイルスベクターが、配列番号２を含むポリヌクレオチドを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＡＡＤＣウイルスベクターが、ＡＡＶ２カプシドを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
遺伝子療法製品を作製する方法であって、
（ａ）ＡＡＤＣウイルスベクターを含むＡＡＶ製剤であって、前記ＡＡＤＣウイルスベクターが、１以上のＡＡＤＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ製剤を準備する工程、
（ｂ）請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法を使用して、前記ＡＡＶ製剤の前記ＡＡＤＣウイルスベクターのＡＡＤＣ相対効力を測定する工程、
（ｃ）前記ＡＡＤＣ相対効力を、閾値ＡＡＤＣ相対効力値と比較する工程、および
（ｄ）_Hlk59021306前記ＡＡＤＣ相対効力が前記閾値ＡＡＤＣ相対効力値以上である場合_Hlk59021306に前記ＡＡＶ製剤を製剤容器にアリコートする工程
を含む方法。
【請求項３３】
遺伝子療法製品を作製する方法であって、前記方法が、前記ＡＡＤＣ相対効力が前記閾値ＡＡＤＣ相対効力値以上である場合にＡＡＶ製剤を製剤容器にアリコートする工程を含み、前記ＡＡＶ製剤がＡＡＤＣウイルスベクターを含み、前記ＡＡＤＣウイルスベクターが、１以上のＡＡＤＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶであり、前記ＡＡＶ製剤のＡＡＤＣウイルスベクターのＡＡＤＣ相対効力が、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法を使用して測定されている方法。
【請求項３４】
前記ＡＡＤＣウイルスベクターが、１〜５％、５〜１０％、１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３０％、３０〜３５％、３５〜４０％、４０〜４５％、４５〜５０％、５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％、７５〜８０％、８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜１００％、１００〜１０５％、１０５〜１１０％、１１０〜１１５％、１１５〜１２０％、１２０〜１２５％、１２５〜１３０％、１３０〜１３５％、１３５〜１４０％、１４０〜１４５％、１４５〜１５０％、１５０〜１５５％、１５５〜１６０％、１６０〜１６５％、１６５〜１７０％、１７０〜１７５％、１７５〜１８０％、１８０〜１８５％、１８５〜１９０％、１９０〜１９５％、１９５〜２００％のＡＡＤＣ相対効力を有する、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＡＡＤＣウイルスベクターの前記ＡＡＤＣ相対効力が、閾値ＡＡＤＣ相対効力値と比較される、請求項１〜３１および３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＡＡＤＣ相対効力が、前記閾値ＡＡＤＣ相対効力値未満である場合、前記ＡＡＤＣウイルスベクターが破棄または放棄される、請求項３２，３３，および３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記閾値ＡＡＤＣ相対効力値が、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％、１９５％、または２００％である、請求項３２，３３，３５，および３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
１以上のＡＡＤＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＤＣウイルスベクターであって、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法により測定されるＡＡＤＣ相対効力を有するＡＡＤＣウイルスベクター。
【請求項３９】
１以上のＡＡＤＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＤＣウイルスベクターであって、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のＡＡＤＣウイルスベクター効力を測定する方法を含むプロセスを使用して調製されるＡＡＤＣウイルスベクター。
【請求項４０】
請求項３８または請求項３９に記載のＡＡＤＣウイルスベクターを含むＡＡＶ製剤。
【請求項４１】
請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法を含むプロセスを使用して調製される遺伝子療法製品。
【国際調査報告】
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