(57)【要約】本開示は、レバウジオシドＡを基質として使用することによるステビオール配糖体であるレバウジオシドＪ及びレバウジオシドＮの製造、並びに様々な１，２ＲｈａＴ−ラムノシルトランスフェラーゼを含む生合成経路に関する。本開示は、いくつかの実施形態では、ＲｅｂＡからＲｅｂＪを調製する方法と並んで、ＲｅｂＪの中間体によるＲｅｂＡからＲｅｂＮの調製を包含する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＲｅｂＩからＲｅｂＮを調製する方法と並んで、ＲｅｂＩの中間体によるＲｅｂＡからＲｅｂＮの調製を提供する。
2021515555.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レバウジオシドＮを調製する生合成方法であって、
１，２−ラムノシトランスフェラーゼ活性を有する第１の組み換えポリペプチドの存在下で、ステビオール配糖体組成物をラムノース供与部分と反応させることを含み、前記第１の組み換えポリペプチドが、配列番号３、配列番号９、又は配列番号１９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項２】
前記第１の組み換えポリペプチドが、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の組み換えポリペプチドが、配列番号９と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の組み換えポリペプチドが、配列番号１９と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の組み換えポリペプチドを形質転換細胞系で発現させることを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記形質転換細胞系が、酵母、非ステビオール配糖体産生植物、藻類、真菌、及び細菌からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記形質転換細胞系が、エシェリヒア（Escherichia）；サルモネラ（Salmonella）；バチルス（Bacillus）；アシネトバクター（Acinetobacter）；ストレプトマイセス（Streptomyces）；コリネバクテリウム（Corynebacterium）；メチロシヌス（Methylosinus）；メチロモナス（Methylomonas）；ロドコッカス（Rhodococcus）；シュードモナス（Pseudomonas）；ロドバクター（Rhodobacter）；シネコシスティス（Synechocystis）；サッカロマイセス（Saccharomyces）；ジゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）；クルイベロマイセス（Kluyveromyces）；カンジダ（Candida）；ハンセヌラ（Hansenula）；デバリオマイセス（Debaryomyces）；ムコール（Mucor）；ピキア（Pichia）；トルロプシス（Torulopsis）；アスペルギルス（Aspergillus）；アルツロボトリス（Arthrobotlys）；ブレビバクテリア（Brevibacteria）；ミクロバクテリウム（Microbacterium）；アルスロバクター（Arthrobacter）；シトロバクター（Citrobacter）；クレブシエラ（Klebsiella）；パントエア（Pantoea）；及びクロストリジウム（Clostridium）からなる群から選択される細菌又は酵母である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記反応工程が、前記形質転換細胞系で行われる、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の組み換えポリペプチドを前記形質転換細胞系から単離することを含み、前記反応工程がインビトロで行われる、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ラムノース供与部分が、ＵＤＰ−Ｌ−ラムノースである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステビオール配糖体組成物がレバウジオシドＡを含み、前記反応工程が、レバウジオシドＪの製造をもたらす、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記レバウジオシドＪを、グルコシルトランスフェラーゼ活性を有する第２の組み換えポリペプチドの存在下で、グルコース供与部分と反応させることを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記グルコース供与部分がインサイチュで生成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２の組み換えポリペプチドが、グルコシルトランスフェラーゼ活性及びスクロースシンターゼ活性の両方を有する、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の組み換えポリペプチドが、配列番号７、配列番号１１、配列番号１３、又は配列番号１５と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項１６】
前記レバウジオシドＪを、スクロースシンターゼ活性を有する第３の組み換えポリペプチドの存在下で、グルコース供与部分と反応させることを含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ステビオール配糖体組成物がレバウジオシドＩを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記レバウジオシドＩが、グルコシルトランスフェラーゼ活性を有する第２の組み換えポリペプチドの存在下で、レバウジオシドＡを含むステビオール配糖体組成物をグルコース供与部分と反応させることによって調製される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記グルコース供与部分がインサイチュで生成される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の組み換えポリペプチドが、グルコシルトランスフェラーゼ活性及びスクロースシンターゼ活性の両方を有する、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の組み換えポリペプチドが、配列番号７、配列番号１１、配列番号１３、又は配列番号１５と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８又は１９記載の方法。
【請求項２２】
スクロースシンターゼ活性を有する前記第３の組み換えポリペプチドの存在下で、レバウジオシドＡを含む前記ステビオール配糖体組成物をグルコース供与部分と反応させることを含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２３】
レバウジオシドＪを調製する生合成方法であって、
１，２−ラムノシルトランスフェラーゼ活性を有する組み換えポリペプチドの存在下で、レバウジオシドＡを含むステビオール配糖体組成物をラムノース供与部分と反応させる工程を含み、前記組み換えポリペプチドが、配列番号３、配列番号９、又は配列番号１９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項２４】
前記組み換えポリペプチドが、配列番号３と少なくともの９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記組み換えポリペプチドが、配列番号９に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記組み換えポリペプチドが、配列番号１９と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記組み換えポリペプチドを形質転換細胞系で発現させることを含む、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記形質転換細胞系が、酵母、非ステビオール配糖体産生植物、藻類、真菌、及び細菌からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記形質転換細胞系が、エシェリヒア；サルモネラ；バチルス；アシネトバクター；ストレプトマイセス；コリネバクテリウム；メチロシヌス；メチロモナス；ロドコッカス；シュードモナス；ロドバクター；シネコシスティス；サッカロマイセス；ジゴサッカロマイセス；クルイベロマイセス；カンジダ；ハンセヌラ；デバリオマイセス；ムコール；ピキア；トルロプシス；アスペルギルス；アルツロボトリス；ブレビバクテリア；ミクロバクテリウム；アルスロバクター；シトロバクター；クレブシエラ；パントエア；及びクロストリジウムからなる群から選択される細菌又は酵母である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記反応工程が、前記形質転換細胞系で行われる、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記組み換えポリペプチドを前記形質転換細胞系から単離することを含み、前記反応工程がインビトロで行われる、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ラムノース供与部分が、ＵＤＰ−Ｌ−ラムノースである、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるレバウジオシド。
【請求項３４】
配列番号３、配列番号９、又は配列番号１９と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む、核酸。
【請求項３５】
請求項３４に記載の核酸を含む、細胞。
【請求項３６】
配列番号３、配列番号９、又は配列番号１９と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む、組成物。
【請求項３７】
配列番号３、配列番号９、又は配列番号１９と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つの少なくとも１つのポリペプチドを含む、細胞。
【請求項３８】
前記細胞が、酵母細胞、非ステビオール配糖体産生植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、又は細菌細胞である、請求項３５又は３７に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１８年３月１２日出願の米国仮特許出願第６２／６４１，５９０号及び２０１８年６月８日出願の米国仮特許出願第６２／６８２，２６０号の優先権を主張し、両出願の内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、概して、ステビオール配糖体の生合成に関する。より具体的には、本開示は、レバウジオシドＪ（「ＲｅｂＪ」）及び／又はレバウジオシドＮ（「ＲｅｂＮ」）を含む組成物を調製するための生体触媒プロセスと並んで、ＲｅｂＪ及び／又はＲｅｂＮを製造するための関連する生合成経路において有用な酵素活性を有する組み換えポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
ステビオール配糖体は、高甘味度で低カロリーの甘味料として使用することができるステビア・レバウディアナ（Stevia  rebaudiana）植物の葉に見られる一種の化合物である。これらの天然起源のステビオール配糖体は、同じ塩基性ジテルペン構造（ステビオール骨格）を共有するが、ステビオール骨格のＣ１３及びＣ１９の位置にある糖残基（例えば、グルコース残基、ラムノース残基、及びキシロース残基）の数及び種類が異なる。興味深いことに、塩基性ステビオール構造の糖「修飾（ornamentation）」におけるこれらの変化は、結果として得られるステビオール配糖体の特性に劇的で予測不可能な影響を及ぼすことが多い。影響を受ける特性としては、いくつかある違いのなかでも、全体的な味覚プロファイル、任意の異臭の存在及び程度、結晶化点、「口当たり（mouth-feel）」、溶解度、並びに知覚される甘味を挙げることができるが、これらに限定されない。既知の構造を有するステビオール配糖体としては、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＮ、及びズルコシドＡが挙げられる。
【０００４】
乾燥重量基準で、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＣ、及びズルコシドＡは、野生型ステビアの葉に見られる全てのステビオール配糖体の総重量のおよそ９．１％、３．８％、０．６％、及び０．３％をそれぞれ占める。ＲｅｂＪ及びＲｅｂＮなどの他のステビオール配糖体は、かなり少ない量で存在する。ステビア・レバウディアナ植物に由来する抽出物が市販されている。かかる抽出物では、ステビオシド及びレバウジオシドＡは、典型的には主成分であるが、他の既知のステビオール配糖体は微量成分又は痕跡成分として存在する。任意の所与のステビア抽出物中の様々なステビオール配糖体の実際の含量レベルは、例えば、ステビア植物を成長させる気候及び土壌、ステビアの葉が収穫される条件、並びに所望のステビオール配糖体を抽出するために使用されるプロセスに応じて変化し得る。例示すると、市販の調製物中のレバウジオシドＡの量は、総ステビオール配糖体含量の約２０重量％〜約９０重量％超で変化し得るが、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、及びレバウジオシドＤの量は、それぞれ総ステビオール含量の約１重量％〜２重量％、約７重量％〜１５重量％、及び約２重量％となり得る。かかる抽出物では、典型的には、レバウジオシドＪ及びレバウジオシドＮは個別に、総ステビオール配糖体含量の０．５％未満を占める。
【０００５】
天然甘味料として、異なるステビオール配糖体は、異なる程度の甘味、口当たり、及び後味を有する。ステビオール配糖体の甘味は、グラニュー糖（すなわち、スクロース）の甘味よりも著しく高い。例えば、ステビオシド自体はスクロースよりも１００倍〜１５０倍甘いが、多く味覚試験で確認されているように後味が苦く、一方、レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＥはスクロースよりも２５０倍〜４５０倍甘く、後味プロファイルはステビオシドよりもはるかに良好である。しかしながら、これらのステビオール配糖体自体は、依然として顕著な後味を保持する。したがって、任意のステビア抽出物の全体的な味覚プロファイルは、抽出物中の様々なステビオール配糖体の相対含量によって大きく影響を受け、次いで、植物の供給源、環境因子（土壌の内容物及び気候など）、及び抽出プロセスによって影響を受ける可能性がある。具体的には、抽出条件の変化により、ステビア抽出物中のステビオール配糖体の一貫性のない組成物がもたらされる可能性があるため、抽出生成物の異なるバッチ間で味覚プロファイルが変化する。ステビア抽出物の味覚プロファイルはまた、抽出プロセス後に生成物中に残る植物由来又は環境由来の汚染物質（顔料、脂質、タンパク質、フェノール、及び糖類など）によって影響を受ける場合がある。これらの汚染物質には、典型的には、甘味料としてのステビア抽出物の使用に望ましくない異臭がある。加えて、ステビア抽出物中に豊富ではないステビオール配糖体の個々の又は特定の組み合わせを単離するプロセスは、費用及び資源の点で禁止される場合がある。
【０００６】
さらに、植物からの抽出プロセスは、典型的には、ヘキサン、クロロホルム、及びエタノールなどの溶媒を使用する固液抽出技術を採用する。溶媒抽出は、エネルギー集約的なプロセスであり、有毒廃棄物の廃棄に関連する問題をもたらす場合がある。したがって、ステビオール配糖体製造のコストを低減すると共に、大規模培養及び処理の環境影響を軽減するために新たな製造方法が必要とされている。
【０００７】
したがって、より良好でより一貫した味覚プロファイルを有する生成物を得ることができるステビオール配糖体、特にＲｅｂＪ及びＲｅｂＮなどの微量のステビオール配糖体の新規調製方法が技術分野において必要とされている。より好ましくは、かかる調製方法は、製造コストを低減するために、ＲｅｂＡなどのより豊富なステビオール配糖体を使用することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、いくつかの実施形態では、ＲｅｂＡからＲｅｂＪを調製する方法と並んで、ＲｅｂＪの中間体によるＲｅｂＡからＲｅｂＮの調製を包含する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＲｅｂＩからＲｅｂＮを調製する方法と並んで、ＲｅｂＩの中間体によるＲｅｂＡからＲｅｂＮの調製を提供する。
【０００９】
一実施形態では、本開示は、本明細書に記載の様々な１，２−ラムノシルトランスフェラーゼ酵素による、ＲｅｂＡからのステビオール配糖体レバウジオシドＪ「ＲｅｂＪ」、すなわち１３−［（２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］ｅｎｔ−カウル−１６−エン−１９−酸−［（２−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）エステル］の製造を提供する。図１は、ＲｅｂＪの化学構造を示す。
【００１０】
別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される様々なＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼによる、ＲｅｂＪからのステビオール配糖体レバウジオシドＮ「ＲｅｂＮ」、すなわち、１３−［（２−Ｏ−β−グルコピラノシル−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］ｅｎｔ−カウル−１６−エン−１９−酸−［（２−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル）エステル］の製造を提供する。図２は、ＲｅｂＮの化学構造を示す。
【００１１】
本方法は、所定の明確な合成経路を使用して特定のステビオール配糖体を合成するためのアプローチを提供する。
【００１２】
製品／商業的有用性の点から、米国ではステビオール配糖体を含有する数十の製品が市販されており、食品、飲料及び栄養補助食品から鎮痛剤及び害虫忌避剤まであらゆる用途に使用することができる。ステビオール配糖体を含有する製品は、液体、粒状製剤、ゲル又はエアロゾルの場合がある。
【００１３】
本明細書では、とりわけ、レバウジオシドＮなどのレバウジオシドを調製する生合成方法が提供され、方法は、１，２ラムノシルトランスフェラーゼ活性を有する第１の組み換えポリペプチドの存在下で、ステビオール配糖体組成物をラムノース供与部分と反応させることを含み、ここで、第１の組み換えポリペプチドは、配列番号３、配列番号９、又は配列番号１９と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、第１の組み換えポリペプチドは、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、第１の組み換えポリペプチドは、配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、第１の組み換えポリペプチドは、配列番号１９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される生合成方法は、形質転換細胞系において第１の組み換えポリペプチドを発現させることを含む。いくつかの実施形態では、形質転換細胞系は、酵母、非ステビオール配糖体産生植物、藻類、真菌、及び細菌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細菌又は酵母は、エシェリヒア（Escherichia）；サルモネラ（Salmonella）；バチルス（Bacillus）；アシネトバクター（Acinetobacter）；ストレプトマイセス（Streptomyces）；コリネバクテリウム（Corynebacterium）；メチロシヌス（Methylosinus）；メチロモナス（Methylomonas）；ロドコッカス（Rhodococcus）；シュードモナス（Pseudomonas）；ロドバクター（Rhodobacter）；シネコシスティス（Synechocystis）；サッカロマイセス（Saccharomyces）；ジゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）；クルイベロマイセス（Kluyveromyces）；カンジダ（Candida）；ハンセヌラ（Hansenula）；デバリオマイセス（Debaryomyces）；ムコール（Mucor）；ピキア（Pichia）；トルロプシス（Torulopsis）；アスペルギルス（Aspergillus）；アルツロボトリス（Arthrobotlys）；ブレビバクテリア（Brevibacteria）；ミクロバクテリウム（Microbacterium）；アルスロバクター（Arthrobacter）；シトロバクター（Citrobacter）；クレブシエラ（Klebsiella）；パントエア（Pantoea）及びクロストリジウム（Clostridium）からなる群から選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される生合成方法は、形質転換細胞系において行われる反応工程を含む。他の実施形態では、反応工程は、インビトロで行うことができる。いくつかの実施形態では、生合成方法は、形質転換された細胞系から第１の組み換えポリペプチドを単離することを含み、反応工程はインビトロで実施することができる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ラムノース供与体はラムノースである。いくつかの実施形態では、ラムノース供与体はＬ−ラムノースである。いくつかの実施形態では、ラムノース供与部分は、ＵＤＰ−Ｌ−ラムノースである。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ステビオール配糖体組成物はレバウジオシドＡを含み、反応工程はレバウジオシドＪの製造をもたらす。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される生合成方法は、グルコシルトランスフェラーゼ活性を有する第２の組み換えポリペプチドの存在下で、レバウジオシドＪをグルコース供与部分と反応させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、グルコース供与部分はインサイチュで生成される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、第２の組み換えポリペプチドは、グルコシルトランスフェラーゼ活性及びスクロースシンターゼ活性の両方を有する。いくつかの実施形態では、第２の組み換えポリペプチドは、配列番号７、配列番号１１、配列番号１３、又は配列番号１５と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、第２の組み換えポリペプチドは、配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、第２の組み換えポリペプチドは、配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、第２の組み換えポリペプチドは、配列番号１３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、第２の組み換えポリペプチドは、配列番号１５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される生合成方法は、スクロースシンターゼ活性を有する第３の組み換えポリペプチドの存在下で、レバウジオシドＪをグルコース供与部分と反応させることをさらに含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ステビオール配糖体組成物はレバウジオシドＩを含むことができる。いくつかの実施形態では、レバウジオシドＩは、グルコシルトランスフェラーゼ活性を有する第２の組み換えポリペプチドの存在下で、レバウジオシドＡを含むステビオール配糖体組成物をグルコース供与部分と反応させることによって調製され得る。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される生合成方法は、スクロースシンターゼ活性を有する当該第３の組み換えポリペプチドの存在下で、レバウジオシドＡを含むステビオール配糖体をグルコース供与部分と反応させることをさらに含む。
【００３０】
また本明細書では、とりわけ、レバウジオシドＪなどのレバウジオシドを調製する生合成方法が提供され、方法は、１，２−ラムノシルトランスフェラーゼ活性を有する組み換えポリペプチドの存在下で、レバウジオシドＡを含むステビオール配糖体組成物をラムノース供与部分と反応させることを含み；当該組み換えポリペプチドは、配列番号３、配列番号９、又は配列番号１９と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、１，２−ラムノシルトランスフェラーゼ活性を有する第２の組み換えポリペプチドは、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、１，２−ラムノシルトランスフェラーゼ活性を有する第２の組み換えポリペプチドは、配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、１，２−ラムノシルトランスフェラーゼ活性を有する組み換えポリペプチドは、配列番号１９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００３４】
本開示の態様はまた、上述の実施形態のいずれかを含む、本明細書に記載の任意の生合成方法によって得ることができる又は製造される、レバウジオシドを提供する。
【００３５】
本開示の態様はまた、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号３、配列番号９、又は配列番号１９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号４、配列番号１０、又は配列番号２０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は配列番号４の配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は配列番号１０の配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は配列番号２０の配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸はプラスミド又は他のベクターである。
【００３６】
本開示の態様はまた、上述の実施形態のいずれかを含む、本明細書に記載の核酸を含む細胞を提供する。
【００３７】
本開示の他の態様は、配列番号３、配列番号９、又は配列番号１９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は配列番号３の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は配列番号９の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は配列番号１９の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、例えば、本明細書に記載のラムノース供与部分と、本明細書に記載のステビオール配糖体組成物とを含む、インビトロ反応混合物である。
【００３８】
本開示の態様は、配列番号３、配列番号９、又は配列番号１９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は配列番号３の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞は配列番号９の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞は配列番号１９の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、酵母細胞、非ステビオール配糖体産生植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、又は細菌細胞である。いくつかの実施形態では、細菌又は酵母細胞は、エシェリヒア；サルモネラ；バチルス；アシネトバクター；ストレプトマイセス；コリネバクテリウム；メチロシヌス；メチロモナス；ロドコッカス；シュードモナス；ロドバクター；シネコシスティス；サッカロマイセス；ジゴサッカロマイセス；クルイベロマイセス；カンジダ；ハンセヌラ；デバリオマイセス；ムコール；ピキア；トルロプシス；アスペルギルス；アルツロボトリス；ブレビバクテリア；ミクロバクテリウム；アルスロバクター；シトロバクター；クレブシエラ；パントエア及びクロストリジウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号７、配列番号１１、配列番号１３、又は配列番号１５と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドなどの、本明細書に記載のグルコシルトランスフェラーゼ活性又はグルコシルトランスフェラーゼ活性及びスクロースシンターゼ活性を有する第２のポリペプチドをさらに含む。
【００３９】
本実施形態の細胞系に関して、細胞系は、１つ以上の細菌、１つ以上の酵母、及びそれらの組み合わせ、又は選択された遺伝子による遺伝子形質転換、その後所望のステビオール配糖体の生合成生成を可能にし得る任意の細胞系からなる群から選択することができる。最も好ましい微生物系では、大腸菌（E.coli）を使用して、所望のステビオール配糖体化合物を製造する。
【００４０】
他の態様では、本開示は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、ＥＵＣＰ１として識別されるＥＵ１１酵素の変異体を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号３と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む組み換えポリペプチドを提供する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＥＵＣＰ１に対応する配列を有し、配列番号４を含むＤＮＡ分子を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％）の同一性を有する配列を有する核酸分子を提供する。
【００４２】
他の態様では、本開示は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＵ１１酵素の変異体を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む組み換えポリペプチドを提供する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＥＵ１１に対応する配列を有し、配列番号２を含むＤＮＡ分子を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％）の同一性を有する配列を有する核酸分子を提供する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号：９のアミノ酸配列を含む、本明細書でＵＧＴ２Ｅ−Ｂと呼ばれる酵素を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む組み換えポリペプチドを提供する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＵＧＴ２Ｅ−Ｂに対応する配列を有し、配列番号１０を含むＤＮＡ分子を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１０と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％）の同一性を有する配列を有する核酸分子を提供する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号：１９のアミノ酸配列を含む、本明細書でＮＸ１１４と呼ばれる酵素を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む組み換えポリペプチドを提供する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＮＸ１１４に対応する配列を有し、配列番号２０を含むＤＮＡ分子を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２０と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％）の同一性を有する配列を有する核酸分子を提供する。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の１つ以上の酵素を産生できるベクターを含む微生物宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、酵素は、ＥＵＣＰ１［配列番号３］、ＵＧＴ２Ｅ−Ｂ［配列番号９］、及びＮＸ１１４［配列番号１９からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、酵素は、ＣＰ１［配列番号１１］及びＣＰ２［配列番号１３］からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、酵素は、本明細書でＧＳ［配列番号１５］と呼ばれる融合酵素であり得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌、酵母、糸状菌、シアノバクテリア（cyanobacteria  alga）、及び植物の細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、エシェリヒア；サルモネラ；バチルス；アシネトバクター；ストレプトマイセス；コリネバクテリウム；メチロシヌス；メチロモナス；ロドコッカス；シュードモナス；ロドバクター；シネコシスティス；サッカロマイセス；ジゴサッカロマイセス；クルイベロマイセス；カンジダ；ハンセヌラ；デバリオマイセス；ムコール；ピキア；トルロプシス；アスペルギルス；アルツロボトリス；ブレビバクテリア；ミクロバクテリウム；アルスロバクター；シトロバクター；クレブシエラ；パントエア；コリネバクテリウム；クロストリジウム（例えば、クロストリジウム・アセトブチリクム（Clostridium  acetobutylicum））からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、綿、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、オーツムギ、ソルガム、コメ、ブロッコリ、カリフラワー、キャベツ、パースニップ、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト；ジャガイモ、イチゴ、ピーナッツ、ブドウ、草種子作物（grass  seed  crop）、サトウキビ、サトウダイコン、マメ、エンドウマメ、ライムギ、亜麻、広葉樹木、針葉樹、イネ科牧草、シロイヌナズナ（Arabidopsis  thaliana）；コメ（オリザ・サティヴァ（Oryza  sativa））；ホルデウム・ウルガレ（Hordeum  yulgare）；スイッチグラス（パニカム・ヴィグラツム（Panicum  vigratum））；ブラキポディウム（Brachypodium）亜種；ブラシカ（Brassica）亜種；及びクランベ・アビシニカ（Crambe  abyssinica）からなる群から選択される植物から単離される細胞である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本開示は、レバウジオシドＪの製造方法を提供し、方法は、配列番号３、配列番号９、又は配列番号１９と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む組み換えポリペプチドと共に基質をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、組み換えポリペプチドは、配列番号３、配列番号９、又は配列番号１９と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）の同一性を有する１，２−ラムノシルトランスフェラーゼである。いくつかの実施形態では、基質は、ルブソシド、ステビオシド又はレバウジオシドＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本開示は、上述の方法の実施形態のいずれかによって製造されたＲｅｂＪを含む甘味料を提供する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本開示は、レバウジオシドＮの製造方法を提供し、方法は、配列番号３、又は配列番号９又は配列番号１９と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の組み換えポリペプチドと共に基質をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、基質は、ＲｅｂＪ、ＲｅｂＩ、ＲｅｂＡ、ステビオシド又はルブソシド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、基質はＲｅｂＪを含む。他の実施形態では、基質はＲｅｂＩを含む。いくつかの実施形態では、方法は、グルコシルトランスフェラーゼ活性を有する第２の組み換えポリペプチド及び任意に組み換えスクロースシンターゼを、基質及び第１の組み換えポリペプチドと共にインキュベートすることをさらに含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本開示は、上述の方法の実施形態のいずれかによって製造されたＲｅｂＮを含む甘味料を提供する。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本開示は、レバウジオシドＪからレバウジオシドＮを合成する方法を提供し、方法は、レバウジオシドＪと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）及びウリジン二リン酸グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群から選択されるグルコース供与部分と、ＵＧＴ酵素とを含む反応混合物を調製すること、レバウジオシドＮを製造するのに十分な時間、反応混合物をインキュベートすることを含み、ここで、レバウジオシドＮを製造するため、グルコースはレバウジオシドＪに共有結合されている。様々な実施形態において、ＵＧＴ酵素は、ＵＧＴ７６Ｇ１［配列番号７］、ＣＰ１［配列番号１１］、ＣＰ２［配列番号１３］、又はＧＳ［配列番号１５］と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、方法は、スクロースシンターゼを反応混合物に添加することをさらに含む。いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼは、アラビドプシススクロースシンターゼ１、アラビドプシススクロースシンターゼ３、及びヴィグナ・ラディアテ（Vigna  radiate）スクロースシンターゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、スクロースシンターゼは、アラビドプシス・サリアス（Arabidopsis  thaliana）スクロースシンターゼ１（配列番号１７）である。
【００５４】
いくつかの実施形態では、当該ＲｅｂＮは、７０％超（例えば、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、又は９９％超）の純度である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本開示は、アミノ酸配列が配列番号３、配列番号９、又は配列番号１９である酵素を製造できるベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌、酵母、糸状菌、シアノバクテリア（cyanobacteria  alga）、及び植物の細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、エシェリヒア；サルモネラ；バチルス；アシネトバクター；ストレプトマイセス；コリネバクテリウム；メチロシヌス；メチロモナス；ロドコッカス；シュードモナス；ロドバクター；シネコシスティス；サッカロマイセス；ジゴサッカロマイセス；クルイベロマイセス；カンジダ；ハンセヌラ；デバリオマイセス；ムコール；ピキア；トルロプシス；アスペルギルス；アルツロボトリス；ブレビバクテリア；ミクロバクテリウム；アルスロバクター；シトロバクター；クレブシエラ；パントエア；コリネバクテリウム；クロストリジウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、綿、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、オーツムギ、ソルガム、コメ、ブロッコリ、カリフラワー、キャベツ、パースニップ、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト；ジャガイモ、イチゴ、ピーナッツ、ブドウ、草種子作物（grass  seed  crop）、サトウキビ、サトウダイコン、マメ、エンドウマメ、ライムギ、亜麻、広葉樹木、針葉樹、イネ科牧草、シロイヌナズナ（Arabidopsis  thaliana）；コメ（オリザ・サティヴァ（Oryza  sativa））；ホルデウム・ウルガレ（Hordeum  yulgare）；スイッチグラス（パニカム・ヴィグラツム（Panicum  vigratum））；ブラキポディウム（Brachypodium）亜種；ブラシカ（Brassica）亜種；及びクランベ・アビシニカ（Crambe  abyssinica）からなる群から選択される植物から単離される細胞である。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本開示は、約１２５ｐｐｍまでのレバウジオシドＮと、ＲｅｂＪ、ＲｅｂＷ、ＲｅｂＶ、ＲｅｂＤ４、ＲｅｂＥ及びＲｅｂＭ、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの非栄養甘味料とを含む飲料製品を提供し、ここで、少なくとも１つの非栄養甘味料は約３０ｐｐｍ〜約６００ｐｐｍの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非栄養甘味料は、ＲｅｂＪ、ＲｅｂＷ、ＲｅｂＶ、ＲｅｂＤ４、ＲｅｂＥ及びＲｅｂＭ、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択され、ここで、ＲｅｂＮ及び少なくとも１つの非栄養甘味料は約１：５の重量比で存在する。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＵＧＴ７６Ｇ１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する第１のドメインと、ＡｔＳＵＳ１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する第２のドメインとを含むＧＳ融合酵素を提供する。ＧＳ融合酵素は、配列番号１５を含むアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む組み換えポリペプチドを提供する。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＧＳに対応する配列を有し、配列番号１６を含むＤＮＡ分子を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１６と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％）の同一性を有する配列を有する核酸分子を提供する。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＵＧＴ２Ｅ−Ｂ酵素を含み、配列番号：９のアミノ酸配列を有するＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む組み換えポリペプチドを提供する。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＵＧＴ２Ｅ−Ｂに対応する配列を有し、配列番号１０を含むＤＮＡ分子を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１０と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％）の同一性を有する配列を有する核酸分子を提供する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＵＧＴ２Ｅ−Ｂ酵素を製造できるベクターを含む微生物宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌、酵母、糸状菌、シアノバクテリア（cyanobacteria  alga）、及び植物の細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、エシェリヒア；サルモネラ；バチルス；アシネトバクター；ストレプトマイセス；コリネバクテリウム；メチロシヌス；メチロモナス；ロドコッカス；シュードモナス；ロドバクター；シネコシスティス；サッカロマイセス；ジゴサッカロマイセス；クルイベロマイセス；カンジダ；ハンセヌラ；デバリオマイセス；ムコール；ピキア；トルロプシス；アスペルギルス；アルツロボトリス；ブレビバクテリア；ミクロバクテリウム；アルスロバクター；シトロバクター；クレブシエラ；パントエア；コリネバクテリウム；クロストリジウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、綿、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、オーツムギ、ソルガム、コメ、ブロッコリ、カリフラワー、キャベツ、パースニップ、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト；ジャガイモ、イチゴ、ピーナッツ、ブドウ、草種子作物、サトウキビ、サトウダイコン、マメ、エンドウマメ、ライムギ、亜麻、広葉樹木、針葉樹、イネ科牧草、シロイヌナズナ；コメ（オリザ・サティヴァ）；ホルデウム・ウルガレ；スイッチグラス（パニカム・ヴィグラツム）；ブラキポディウム亜種；ブラシカ亜種；及びクランベ・アビシニカからなる群から選択される植物から単離される細胞である。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本開示は、レバウジオシドＮの製造方法を提供し、方法は、配列番号１１又は配列番号１３又は配列番号１５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む組み換えポリペプチドと共に基質をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、基質は、ＲｅｂＪ、ＲｅｂＡ、ステビオシド又はルブソシド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、方法は、組み換えスクロースシンターゼを基質及び組み換えポリペプチドとインキュベートすることをさらに含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本開示は、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号１１及び配列番号１３に対応する、ＣＰ１及びＣＰ２の酵素を製造できるベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌、酵母、糸状菌、シアノバクテリア（cyanobacteria  alga）、及び植物の細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、エシェリヒア；サルモネラ；バチルス；アシネトバクター；ストレプトマイセス；コリネバクテリウム；メチロシヌス；メチロモナス；ロドコッカス；シュードモナス；ロドバクター；シネコシスティス；サッカロマイセス；ジゴサッカロマイセス；クルイベロマイセス；カンジダ；ハンセヌラ；デバリオマイセス；ムコール；ピキア；トルロプシス；アスペルギルス；アルツロボトリス；ブレビバクテリア；ミクロバクテリウム；アルスロバクター；シトロバクター；クレブシエラ；パントエア；コリネバクテリウム；クロストリジウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、綿、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、オーツムギ、ソルガム、コメ、ブロッコリ、カリフラワー、キャベツ、パースニップ、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト；ジャガイモ、イチゴ、ピーナッツ、ブドウ、草種子作物、サトウキビ、サトウダイコン、マメ、エンドウマメ、ライムギ、亜麻、広葉樹木、針葉樹、イネ科牧草、シロイヌナズナ；コメ（オリザ・サティヴァ）；ホルデウム・ウルガレ；スイッチグラス（パニカム・ヴィグラツム）；ブラキポディウム亜種；ブラシカ亜種；及びクランベ・アビシニカからなる群から選択される植物から単離される細胞である。
【００６４】
いくつかの態様では、本開示は、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、ＣＰ１として識別される変異酵素を提供する。
【００６５】
いくつかの態様では、本開示は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＣＰ２として識別される変異酵素を提供する。
【００６６】
本開示は様々な修正及び代替形態をとり得るが、その特定の実施形態が図面において例として示され、本明細書において詳細に説明される。しかしながら、本明細書において示される図面及び詳細な説明は、本開示を開示される特定の実施形態に限定するものではなく、逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨及び範囲内の全ての修正、均等物、及び代替物を包含するものであることを理解されたい。
【００６７】
本発明の他の特徴及び利点は、添付の図面を参照してなされる、本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明において明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】レバウジオシドＪ（「ＲｅｂＪ」）の化学構造を示す。
【００６９】
【図２】レバウジオシドＮ（「ＲｅｂＮ」）の化学構造を示す。
【００７０】
【図３Ａ】ＲｅｂＪ及びＲｅｂＮの製造のための生合成経路を示す。より具体的には、レバウジオシドＡ（「ＲｅｂＡ」）から出発して、１，２ラムノシルトランスフェラーゼ（「１，２ＲｈａＴ」）を使用して、ＵＤＰ−ラムノース供与体からＲｅｂＡ受容体の１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’へのラムノース部分の転移を触媒することによってＲｅｂＪを製造することができる。続く反応では、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（「ＵＧＴ」）を使用して、ＵＤＰ−グルコースからＲｅｂＪ受容体の１９−Ｏ−グルコースのＣ−３’へのグルコース部分の転移を触媒することにより、ＲｅｂＪからＲｅｂＮを製造することができる。
【図３Ｂ】ＵＧＴを使用してＲｅｂＡからＲｅｂＩを製造するための生合成経路を示す。次いで、１，２ＲｈａＴを使用してＲｅｂＩをＲｅｂＮに変換することができる。
【００７１】
【図４】ＨＰＬＣ分析による、選択された１，２ＲｈａＴ酵素によって触媒されるＲｅｂＡからのＲｅｂＪのインビトロ製造を示す。パネルＡは、ＲｅｂＡ標準の保持時間を示す。パネルＢは、ＲｅｂＪ標準の保持時間を示す。パネルＣは、ＲｅｂＡを基質として使用する、ＥＵ１１（配列番号１）により触媒される反応系から得られた生成物の保持時間を示す。パネルＤは、ＲｅｂＡを基質として使用する、ＥＵＣＰ１（配列番号３）によって触媒される反応系から得られた生成物の保持時間を示す。パネルＥは、ＲｅｂＡを基質として使用する、ＨＶ１（配列番号５）により触媒される反応系から得られた生成物の保持時間を示す。矢印はＲｅｂＪの存在を示す。
【００７２】
【図５】ＨＰＬＣ分析によって、ＵＧＴ２Ｅ−Ｂにより触媒されるＲｅｂＡからのＲｅｂＪのインビトロ製造を示す。パネルＡは、ＲｅｂＡ標準の保持時間を示す。パネルＢは、ＲｅｂＪ標準の保持時間を示す。パネルＣは、ＲｅｂＡを基質として使用する、ＵＧＴ２Ｅ−Ｂ（配列番号９）により触媒される反応系から得られた生成物の保持時間を示す。矢印はＲｅｂＪの存在を示す。
【００７３】
【図６】ＨＰＬＣ分析による、ＮＸ１１４により触媒されるＲｅｂＡからのＲｅｂＪのインビトロ製造を示す。パネルＡは、ＲｅｂＪ標準の保持時間を示す。パネルＢは、ＲｅｂＡ標準の保持時間を示す。パネルＣは、ＲｅｂＡを基質として使用する、ＮＸ１１４（配列番号１９）により触媒される反応系から得られた生成物の保持時間を示す。矢印はＲｅｂＪの存在を示す。
【００７４】
【図７】ＨＰＬＣ分析による、ＵＧＴ７６Ｇ１により触媒されるＲｅｂＪからのＲｅｂＮのインビトロ製造を示す。パネルＡは、様々なステビオール配糖体標準の保持時間を示し、レバウジオシドＯ、ＲｅｂＮ、レバウジオシドＣ、及びズルコシドＡを含む。パネルＢは、ＥＵ１１触媒反応から得られたＲｅｂＪを使用する、ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号７）により触媒される反応系から得られた製品の保持時間を示す。パネルＣは、ＥＵＣＰ１触媒反応から得られたＲｅｂＪを使用する、ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号７）により触媒される反応系から得られた生成物の保持時間を示す。矢印は、ＲｅｂＮの存在を示す。
【００７５】
【図８】ＨＰＬＣ分析による、選択されたＵＧＴ酵素により触媒されるＲｅｂＪからのＲｅｂＮのインビトロ製造を示す。パネルＡは、様々なステビオール配糖体標準の保持時間を示し、レバウジオシドＯ、ＲｅｂＮ、レバウジオシドＣ、及びズルコシドＡを含む。パネルＢは、ＲｅｂＪ標準の保持時間を示す。パネルＢは、ＥＵＣＰ１触媒反応から得られたＲｅｂＪ中間体（矢印で示される）の保持時間を示す。パネルＤは、パネルＢに示されるＲｅｂＪ中間体を使用する、ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号７）により触媒される反応系から得られたＲｅｂＮ生成物の保持時間を示す。パネルＥは、パネルＢに示されるＲｅｂＪ中間体（矢印で示される）を使用する、ＣＰ１（配列番号１１）によって触媒される反応系から得られるＲｅｂＮ生成物の保持時間を示す。パネルＦは、パネルＢに示されるＲｅｂＪ中間体（矢印で示される）を使用する、ＣＰ２（配列番号１３）により触媒される反応系から得られるＲｅｂＮ生成物の保持時間を示す。パネルＧは、パネルＢに示されるＲｅｂＪ中間体（矢印で示される）を使用する、融合酵素ＧＳ（配列番号１５）により触媒される反応系から得られたＲｅｂＮ生成物の保持時間を示す。
【００７６】
【図９】ＨＰＬＣ分析によって、選択されたＵＧＴ酵素により触媒されるＵＤＰ及びスクロースの存在下でのＲｅｂＪからのＲｅｂＮのインビトロ製造を示す。パネルＡは、ＲｅｂＮ標準の保持時間を示す。パネルＢは、ＲｅｂＪ標準の保持時間を示す。パネルＣは、ＵＧＴ７６Ｇ１触媒反応から得られた生成物の保持時間を示す。ＲｅｂＮの製造は観察されない。矢印は、ＲｅｂＪの存在を示す。パネルＤは、ＵＧＴ７６Ｇ１及びＡｔＳＵＳ１（配列番号１７）の両方によって触媒される反応系から得られた生成物の保持時間を示す。矢印は、ＲｅｂＮの存在を示す。パネルＥは、融合酵素ＧＳ（配列番号１５）により触媒される反応系から得られた生成物の保持時間を示す。矢印は、ＲｅｂＮの存在を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
本明細書において使用される用語の説明：
ステビオール配糖体は、南米のステビア・レバウディアナ（キク科）植物の葉の甘味を担う一種の化学化合物であり、食品、飼料、及び飲料の甘味料として使用することができる。
定義：
【００７８】
細胞系は、異所性タンパク質の発現を提供する任意の細胞である。これは、細菌、酵母、植物細胞、及び動物の細胞を含む。これは、原核細胞及び真核細胞の両方を含む。また、これは、リボソーム等の細胞成分に基づくタンパク質のインビトロ発現を含む。
【００７９】
コーディング配列は、当業者にとって通常の慣習的な意味を与えられるものであり、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指すため限定されずに使用される。
【００８０】
細胞系の成長。成長は、細胞を増殖及び分化させることを可能にする適切な培地を提供することを含む。これはまた、細胞又は細胞成分が、組み換えタンパク質を翻訳及び作製できるような供給源を提供することも含む。
【００８１】
タンパク質発現。タンパク質生成は、遺伝子発現後に生じ得る。これは、ＤＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写された後の段階からなる。次いで、ｍＲＮＡは、ポリペプチド鎖に翻訳され、最終的にタンパク質に折り畳まれる。ＤＮＡは、核酸を細胞中に意図的に導入するプロセスであるトランスフェクションを介して細胞中に存在してもよい。この用語は、多くの場合、真核細胞の非ウイルス法に使用される。これはまた、他の方法及び細胞型を指す場合があるが、他の用語が好ましい。「形質転換」は、細菌、植物細胞を含む非動物真核細胞における非ウイルスＤＮＡ移送を説明するためにより頻繁に使用される。動物細胞では、形質転換はまたこれらの細胞におけるがん性状態（発がん性）への進行を指すために使用されるため、トランスフェクションが好ましい用語である。形質導入は、多くの場合、ウイルス媒介ＤＮＡ移送を説明するために使用される。形質転換、形質導入、及びウイルス感染は、本出願においてトランスフェクションの定義に含まれる。
【００８２】
酵母。本開示によれば、本明細書において特許請求される酵母は、真菌界のメンバーとして分類される真核生物の単一細胞微生物である。酵母は、多細胞性の祖先から進化した単細胞生物であるが、本開示に有用ないくつかの種は、仮性菌糸又は偽菌糸として知られる接続した出芽性細胞のストリングを形成することにより多細胞の特性を発達させる能力を有するものである。
【００８３】
ＵＧＴ名。本開示で使用されるＵＧＴ酵素の名称は、ＵＧＴ命名委員会（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  ＵＤＰ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｓｕｐｅｒ  ｆａｍｉｌｙ：ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｕｐｄａｔｅｄ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ，」ＰＨＡＲＭＡＣＯＧＥＮＥＴＩＣＳ，１９９７，ｖｏｌ．７，ｐｐ．２５５−２６９）によって採用される、ファミリー番号、サブファミリーを表す文字、及び個々の遺伝子の番号の組み合わせによってＵＧＴ遺伝子を分類する命名体系と一致する。例えば、「ＵＧＴ７６ＧＩ」という名称は、ＵＧＴファミリー番号７６（植物起源のもの）、サブファミリーＧ、及び遺伝子番号１に属する遺伝子によってコードされるＵＧＴ酵素を指す。
構造上の用語：
【００８４】
本明細書で使用する場合、単数形「１つの（a,  an）」、及び「その（the）」は、文脈に別段の明示がない限り、複数の参照を含む。
【００８５】
「含む」、「有する」などの用語は明細書又は特許請求の範囲で使用されている限り、「含む」は特許請求の範囲で転換語として使用される際に解釈されることから、かかる用語は、「含む」という用語と同じように包括されることが意図される。
【００８６】
「例示的な」という語は、本明細書では、「一例、例、又は実例としての役割を果たすこと」を意味する。本明細書で「例示的な」として記載される任意の実施形態は、必ずしも他の実施形態よりも好ましい又は有利であると解釈されるべきではない。
【００８７】
「相補的」という用語は、当業者にとって通常の慣習的な意味を与えられるものであり、互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を説明するため、限定されずに使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンと相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、主題の技術はまた、添付の配列表に報告される完全配列に相補的である単離された核酸フラグメントと並んで、それらの実質的に同様の核酸配列も含む。
【００８８】
「核酸」及び「ヌクレオチド」という用語は、当業者にとってそれぞれの通常の慣習的な意味を与えられるものであり、一本鎖又は二本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそれらのポリマーのいずれかを指すため限定されずに使用される。別段の限定がない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチドの既知の類縁体を含有する核酸を包含し、天然起源のクレオチドと同様の方法で代謝される。別段の明示がない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に改変又は縮重変異体（例えば、縮重コドン置換）及び相補的配列と並んで、明示的に示される配列を暗示的に包含する。
【００８９】
「単離された」という用語は、当業者にとって通常の慣習的な意味を与えられるものであり、単離された核酸又は単離ポリペプチドの文脈で使用される場合、人の手によって天然の環境から離れて存在し、したがって天然の生成物ではない核酸又はポリペプチドを指すため限定されずに使用される。単離された核酸又はポリペプチドは、精製された形態で存在してもよく、又は、例えば、トランスジェニック宿主細胞などの非天然環境に存在し得る。
【００９０】
本明細書で使用する場合、「インキュベートする」及び「インキュベーション」という用語は、２つ以上の化学物質又は生物学的実体（化学化合物及び酵素など）を混合して、ステビオール配糖体組成物を製造するのに好ましい条件下でそれらを相互作用させるプロセスを意味する。
【００９１】
「縮重変異体」という用語は、１つ以上の縮重コドン置換によって参照核酸配列とは異なる残基配列を有する核酸配列を指す。縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの第３の位置が、混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成され得る。核酸配列及びその全ての縮重変異体は、同じアミノ酸又はポリペプチドを発現する。
【００９２】
「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」という用語は、当業者にとってそれぞれの通常の慣習的な意味を与えられるものであり、３つの用語は、そのサイズ又は機能にかかわらず、同じ意味で使用されることがあり、アミノ酸又はアミノ酸類縁体のポリマーを指すため限定されずに使用される。「タンパク質」は、多くの場合、比較的大きなポリペプチドを指して使用されるが、「ペプチド」は、多くの場合、小さなポリペプチドを指して使用され、技術分野におけるこれらの用語の使用は、重複し、変化する。本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、別段の明示がない限り、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を指す。「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、本明細書において、ポリヌクレオチド生成物を指す場合に同じ意味で使用される。したがって、例示的なポリペプチドとしては、ポリヌクレオチド産物、天然起源のタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、フラグメント、及び他の等価物、変異体、並びにそれらの類縁体が挙げられる。
【００９３】
参照ポリペプチドを参照して使用する場合、「ポリペプチドフラグメント」及び「フラグメント」という用語は、当業者にとって通常の慣習的な意味を与えられるものであり、参照ポリペプチド自体と比較してアミノ酸残基が欠失しているが、残りのアミノ酸配列は、通常、参照ポリペプチドの対応する位置と同一であるポリペプチドを指すため限定されずに使用される。かかる欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端、あるいはその両方で生じ得る。
【００９４】
ポリペプチド又はタンパク質の「機能的フラグメント」という用語は、全長ポリペプチド若しくはタンパク質の一部であり、実質的に同じ生物学的活性を有するか、又は全長ポリペプチド若しくはタンパク質と実質的に同じ機能を持つ（例えば、同じ酵素反応を実施する）、ペプチドフラグメントを指す。
【００９５】
同じ意味で使用される「変異体ポリペプチド」、「改変アミノ酸配列」又は「改変ポリペプチド」という用語は、例えば、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加によって、参照ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を指す。一態様では、変異体は、参照ポリペプチドの能力の一部又は全てを保持する「機能的変異体」である。
【００９６】
「機能性変異体」という用語は、保存的に置換された変異体をさらに含む。「保存的に置換された変異体」という用語は、１つ以上の保存的アミノ酸置換によって参照ペプチドとは異なり、且つ参照ペプチドの活性の一部又は全てを維持するアミノ酸配列を有するペプチドを指す。「保存的アミノ酸置換」は、機能的に類似した残基によるアミノ酸残基の置換である。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、メチオニンなどの非極性（疎水性）残基の別の残基への置換；アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、スレオニンとセリンとの間などの、１つの帯電した若しくは極性（親水性）の残基の別の残基への置換；リジン若しくはアルギニンなどの１つの塩基性残基の別の残基への置換；又は、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸などの１つの酸性残基の別の残基への置換；又はフェニルアラニン、チロシン、トリプトファンなどの１つの芳香族残基の別の残基への置換が挙げられる。かかる置換は、タンパク質又はポリペプチドの見かけの分子量又は等電点にほとんど又は全く影響を及ぼさないことが予想される。「保存的に置換された変異体」という語句はまた、残基が化学的に誘導体化された残基と置換されているペプチドを含み、ただし、得られるペプチドは、本明細書に記載されるように、参照ペプチドの活性の一部又は全てを維持する。
【００９７】
主題の技術のポリペプチドに関連する「変異体」という用語は、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらには１００％同一であるアミノ酸配列を有する機能的に活性なポリペプチドをさらに含む。
【００９８】
「相同な」という用語は、全ての文法的形態及び綴りの変化で、スーパーファミリー由来のポリヌクレオチド又はポリペプチド、及び異なる種由来の相同なポリヌクレオチド又はタンパク質を含む、「共通の進化的起源」を持つポリヌクレオチド又はポリペプチド間の関係を指す（Ｒｅｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＥＬＬ  ５０：６６７，１９８７）。かかるポリヌクレオチド又はポリペプチドは、同一性パーセント又は保存位置に特定のアミノ酸若しくはモチーが存在するかどうかという配列類似性によって反映される、配列相同性を有する。例えば、２つの相同なポリペプチドは、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９００、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらに１００％同一であるアミノ酸配列を有し得る。
【００９９】
「好適な調節配列」は、当業者にとって通常の慣習的な意味を与えられるものであり、コード配列の上流（５’非コード配列）、その内部又はその下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指すため限定されずに使用され、転写、ＲＮＡプロセッシング若しくは安定性、又は関連するコード配列の翻訳に影響を及ぼす。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、及びポリアデニル化認識配列を含み得る。
【０１００】
「プロモーター」は、当業者にとって通常の慣習的な意味を与えられるものであり、コード配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指すため限定されずに使用される。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、それらの全体が天然の遺伝子に由来してもよく、又は天然に見られる種々のプロモーターに由来する異なる要素で構成されてもよく、又は合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。異なるプロモーターは、異なる組織若しくは細胞型、又は異なる発達段階で、又は異なる環境条件に応じて、遺伝子の発現を指示し得ることが当業者には理解される。大抵の場合ほとんどの細胞型で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成型プロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全に定義されていないため、異なる長さのＤＮＡフラグメントは同一のプロモーター活性を有し得ることがさらに認識される。
【０１０１】
「制御可能に連結された」という用語は、１つの機能が他方の影響を受けるような、単一の核酸フラグメント上の核酸配列の関連を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に影響を及ぼし得る場合にコード配列と制御可能に連結されている（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センス又はアンチセンスの向きで調節配列に制御可能に連結され得る。
【０１０２】
本明細書で使用する場合、「発現」という用語は、当業者にとって通常の慣習的な意味を与えられるものであり、主題の技術の核酸フラグメントに由来するセンス（ｍＲＮＡ）又はアンチセンスＲＮＡの転写及び安定な蓄積を指すため限定されずに使用される。「過剰発現」は、正常又は非形質転換生物における産生レベルを超える、トランスジェニック又は組み換え生物における遺伝子産物の産生を指す。
【０１０３】
「形質転換」は、当業者にとって通常の慣習的な意味を与えられるものであり、標的細胞へのポリヌクレオチドの移動を指すため限定されずに使用される。移動したポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノム又は染色体ＤＮＡに組み込むことができ、遺伝的に安定な遺伝をもたらすか、又は宿主染色体から独立して複製され得る。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物は、「トランスジェニック」又は「形質転換」と呼ばれる。
【０１０４】
「形質転換」、「トランスジェニック」、及び「組み換え」という用語は、宿主細胞に関連して本明細書で使用する場合、当業者にとってそれぞれ通常の慣習的な意味を与えられるものであり、異種核酸分子が導入される植物又は微生物細胞などの宿主生物の細胞を指すため限定されずに使用される。核酸分子は、宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれてもよく、又は核酸分子は、染色体外分子として存在し得る。かかる染色体外分子は、自己複製であり得る。形質転換された細胞、組織、又は被験体は、形質転換プロセスの最終産物だけでなく、形質転換前駆体も包含することが理解される。
【０１０５】
ポリヌクレオチドに関連して本明細書で使用する場合、「組み換え」、「異種」、及び「外因性」という用語は、当業者にとって通常の慣習的な意味を与えられるものであり、特定の宿主に対して外来の供給源を起源とする、又は同じ供給源に由来する場合にはその元の形態から改変されているポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列又は遺伝子）を指すため限定されずに使用される。したがって、宿主細胞中の異種遺伝子は、特定の宿主細胞にとって内因性であるが、例えば、部位特異的突然変異誘発又は他の組み換え技術の使用によって改変されている遺伝子を含む。この用語はまた、天然起源のＤＮＡ配列の非天然起源の複数のコピーを含む。したがって、この用語は、細胞にとって外来又は異種であるＤＮＡセグメント、又は細胞に相同であるが、その要素が通常見られない宿主細胞内の位置にあるか若しくは宿主細胞の形態であるＤＮＡセグメントを指す。
【０１０６】
同様に、「組み換え」、「異種」、及び「外因性」という用語は、本明細書でポリペプチド又はアミノ酸配列と関連して使用される場合、特定の宿主細胞に対して外来の供給源を起源とする、又は同じ供給源に由来する場合には、その元の形態から改変されているポリペプチド若しくはアミノ酸配列を意味する。したがって、組み換えＤＮＡセグメントは、組み換えポリペプチドを製造するために宿主細胞内で発現させることができる。
【０１０７】
「プラスミド」、「ベクター」、及び「カセット」という用語は、当業者にとってそれぞれの通常の慣習的な意味を与えられるものであり、細胞の中心代謝の一部ではない遺伝子をしばしば担持し、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である、余分な染色体要素を指すため限定されずに使用される。かかる要素は、任意の供給源に由来する自律複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージ又はヌクレオチドの配列、直鎖若しくは環状の一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡの配列であってもよく、いくつかのヌクレオチド配列が、プロモーターフラグメント及び選択された遺伝子産物に対するＤＮＡ配列を、適切な３’非翻訳配列と共に細胞に導入することができる固有のコンストラクトに結合又は組み換えられている。「形質転換カセット」は、特定の宿主細胞の形質転換を促進する外来遺伝子に加えて、外来遺伝子を含有し、要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、外来宿主におけるその遺伝子の発現の増強を可能にする外来遺伝子に加えて要素を有する特定のベクターを指す。
【０１０８】
本開示は、いくつかの実施形態では、ラムノシル化反応において、ＵＤＰ−Ｌ−ラムノースからステビオール配糖体受容体にラムノース部分を転移することができる、本明細書に記載の少なくとも１つの新規ＵＤＰ−ラムノシルトランスフェラーゼ（ＲｈａＴ）を使用するＲｅｂＡからの目的のステビオール配糖体、すなわちＲｅｂＮの製造に関する。図３を参照すると、合成経路は、中間体としてレバウジオシドＪ（図３Ａ）、又は中間体としてレバウジオシドＩを含み得る（図３Ｂ）。主題の技術は、いくつかの実施形態では、ステビオール配糖体を合成するためのＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ活性を有する組み換えポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、組み換えポリペプチドは、１，２−１９−Ｏ−ラムノースグリコシル化活性を有し得る。いくつかの実施形態では、組み換えポリペプチドは、１，３−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性を有し得る。主題の技術の組み換えポリペプチドは、ステビオール配糖体化合物の生合成に有用である。本開示では、ＵＤＰ−ラムノシルトランスフェラーゼ（ＲｈａＴ）は、活性化供与分子（典型的にはＵＤＰ−Ｌラムノース）から受容体であるステビオール配糖体分子にラムノース糖部分を転移させる酵素を指す。１，２ＲｈａＴは、ＵＤＰ−Ｌ−ラムノースからステビオール配糖体の１９−Ｏ−グルコース又は１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’にラムノース部分を転移する酵素活性を指す。１，２−１９−Ｏ−ラムノースグリコシル化活性はレバウジオシドＡ（レバウジオシドＪを製造するため）又はレバウジオシドＩ（レレバウジオシドＮを製造するため）などのステビオール配糖体の１９−Ｏグルコース部分のＣ−２’に、ラムノース部分を転移する酵素活性を指す。１，３−１９−Ｏ−グルコースグリコシル化活性は、レバウジオシドＪ（レバウジオシドＮを製造するため）又はレバウジオシドＡ（レバウジオシドＩを製造するため）などのステビオール配糖体の１９−Ｏグルコース部分のＣ−３’にグルコース部分を転移する酵素活性を指す（図３）。
合成生物学
【０１０９】
本発明で使用される標準的な組み換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は、技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ  ｅｄ．；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９（ｈｅｒｅｉｎａｆｔｅｒ「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；及びＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．ＥｘＰＥＲＩＭＥＮＴＳ  ＷＩＴＨ  ＧＥＮＥ  ＦＵＳＩＯＮＳ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８４；及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＩＮ  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７（それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる）により記載されている。
【０１１０】
別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるそれらと同様若しくは同等であるいずれの材料及び方法も、本開示の実践又は試験に使用され得るが、好ましい方法及び方法が以下に説明されている。
【０１１１】
本開示は、以下の非限定的な実施例を考慮すれば、より完全に理解されるであろう。これらの実施例は、主題の技術の好ましい実施形態を示しているが、例示としてのみ与えられることを理解されたい。上記の検討及びこれらの実施例から、当業者は、主題の技術の本質的な特性を確認することができ、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な用途及び条件に適合させるために、主題の技術の様々な変更及び修正を行うことができる。
【０１１２】
グリコシル化は、多くの場合、植物天然生成物の生物学的活性及び貯蔵を制御するユビキチン反応であると考えられる。小分子のグリコシル化は、今日まで研究されているほとんどの植物種におけるトランスフェラーゼのスーパーファミリーによって触媒される。これらのグリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）は、６０超のファミリーに分類されている。これらのうち、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）及びＵＤＰ−ラムノシルトランスフェラーゼとしても知られるＧＴ酵素のファミリーは、糖部分を特定の受容体分子に転移する。これらは、ステビオール配糖体のかかる糖部分を転移して様々なレバウジオシドを作製するのに役立つ分子である。これらの酵素はそれぞれ、独自の活性プロファイル、及び活性化された糖部分を転移する好ましい構造位置を有する。
製造システム
【０１１３】
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も多くは、融合又は非融合のいずれかのタンパク質の発現を指示する構成型又は誘導性のプロモーターを含有するベクターを用いて細菌宿主細胞で行われる。融合ベクターは、その中にコードされたタンパク質に、通常は組み換えタンパク質のアミノ末端にいくつかのアミノ酸を付加する。かかる融合ベクターは、典型的には、１）組み換えタンパク質の発現を増加させること、２）組み換えタンパク質の溶解度を増加させること、及び３）親和性精製においてリガンドとして作用することによって組み換えタンパク質の精製を補助するという３つの目的を果たす。多くの場合、融合タンパク質の精製後の融合部分からの組み換えタンパク質の分離を可能にするため、融合部分と組み換えタンパク質との接合部にタンパク質分解性切断部位が導入される。かかるベクターは、本開示の範囲に含まれる。
【０１１４】
一実施形態では、発現ベクターは、細菌細胞における組み換えポリペプチドの発現のためのそれらの遺伝要素を含む。細菌細胞における転写及び翻訳のための要素は、プロモーター、タンパク質複合体のコード領域、及び転写ターミネーターを含むことができる。
【０１１５】
当業者は、発現ベクターの調製に利用可能な分子生物学的技術を認識するであろう。上記のように、主題の技術の発現ベクターに組み込むために使用されるポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの常法により調製することができる。
【０１１６】
相補的な付着端を介してＤＮＡをベクターに制御可能に連結するため、分子生物学的技術がいくつか開発されてきた。一実施形態では、相補的なホモポリマートラクトを、ベクターＤＮＡに挿入される核酸分子に付加することができる。次いで、ベクター及び核酸分子は、相補的ホモポリマーテール間の水素結合によって結合され、組み換えＤＮＡ分子を形成する。
【０１１７】
別の実施形態では、１つ以上の制限部位を含有する合成リンカーは、主題の技術のポリヌクレオチドを発現ベクターに制御可能に連結するために使用される。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成される。一実施形態では、突出すなわち３’−一本鎖末端をそれらの３’−５’−エキソヌクレアーゼ活性除去し、それらの重合活性により３’凹末端を埋めることで、平滑末端ＤＮＡセグメントを生成する、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ又は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩで核酸分子を処理する。次いで、平滑末端セグメントを、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡリガーゼなどの平滑端ＤＮＡ分子のライゲーションを触媒することができる酵素の存在下で、大モル過剰のリンカー分子と共にインキュベートする。したがって、反応の生成物は、その末端に高分子リンカー配列を持つポリヌクレオチドである。次いで、これらのポリヌクレオチドを適切な制限酵素で切断し、ポリヌクレオチドの末端と適合性の末端を生じる酵素により切断された発現ベクターにライゲーションする。
【０１１８】
あるいは、ライゲーション独立クローニング（ＬＩＣ：ligation-independent-cloning）部位を有するベクターを用いることができる。次いで、必要とされるＰＣＲ増幅されたポリヌクレオチドを、制限酵素消化又はライゲーションによらずにＬＩＣベクターへとクローニングすることができる（参照により本明細書に組み込まれる、Ａｓｌａｎｉｄｉｓ  ａｎｄ  ｄｅ  Ｊｏｎｇ，ＮＵＣＬ．ＡＣＩＤ．ＲＥＳ．１８  ６０６９−７４，（１９９０），Ｈａｕｎ，ｅｔ  ａｌ，ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ１３，５１５−１８（１９９２））。
【０１１９】
一実施形態では、選択されたプラスミドへの挿入のための目的のポリヌクレオチドを単離及び／又は改変するためには、ＰＣＲを使用することが適している。配列のＰＣＲ調製に使用するための適切なプライマーは、核酸分子の必要なコード領域を単離し、制限エンドヌクレアーゼ又はＬＩＣ部位を付加し、コード領域を所望の読み取りフレームに配置するように設計することができる。
【０１２０】
一実施形態では、主題の技術の発現ベクターに組み込むためのポリヌクレオチドは、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲを使用して調製される。コード領域は増幅され、一方、プライマー自体が増幅された配列産物に組み込まれる。一実施形態では、増幅プライマーは、増幅された配列産物を適切なベクターにクローニングすることを能可にする制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有する。
【０１２１】
発現ベクターは、従来の形質転換又はトランスフェクションの技術によって、植物又は微生物の宿主細胞に導入することができる。主題の技術の発現ベクターによる適切な細胞の形質転換は、技術分野において既知の方法によって達成され、典型的には、ベクター及び細胞の種類の両方に依存する。好適な技術としては、リン酸カルシウム又は塩化カルシウムの共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、ケモポレーション、又はエレクトロポレーションが挙げられる。
【０１２２】
正常に形質転換された細胞、すなわち、発現ベクターを含有するそれらの細胞は、技術分野において周知の技術によって識別することができる。例えば、主題の技術の発現ベクターでトランスフェクトされた細胞を培養して、本明細書に記載のポリペプチドを製造することができる。細胞は、技術分野において周知の技術によって、発現ベクターＤＮＡの存在について調査することができる。
【０１２３】
宿主細胞は、前述の発現ベクターの単一コピー、あるいは発現ベクターの複数のコピーを含有することができる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、形質転換細胞は、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、又は酵母細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、キャノーラ植物細胞、ナタネ植物細胞、ヤシ植物細胞、ヒマワリ植物細胞、綿植物細胞、トウモロコシ植物細胞、ピーナッツ植物細胞、亜麻植物細胞、ゴマ植物細胞、ダイズ植物細胞、及びペチュニア植物細胞からなる群から選択される植物細胞である。
【０１２５】
外来タンパク質の高レベル発現を誘導する調節配列を含有する微生物宿主細胞発現系及び発現ベクターは、当業者に周知である。これらのうちのいずれかを使用して、微生物宿主細胞における主題の技術の組み換えポリペプチドの発現用にベクターを構築することができる。次いで、これらのベクターを形質転換を経て適切な微生物に導入し、主題の技術の組み換えポリペプチドの高レベル発現を可能にすることができる。
【０１２６】
好適な微生物宿主細胞の形質転換に有用なベクター又はカセットは、技術分野において周知である。典型的には、ベクター又はカセットは、関連するポリヌクレオチドの転写及び翻訳を指示する配列、選択マーカー、及び自律複製、又は染色体組み込みを可能にする配列を含有する。好適なベクターは、転写開始制御を持つポリヌクレオチドの５’領域と、転写終結を制御するＤＮＡフラグメントの３’領域とを含む。形質転換された宿主細胞に相同な遺伝子に由来する両方の制御領域が好ましいが、かかる制御領域は、宿主として選択される特定の種に対して天然の遺伝子に由来する必要はないことを理解されたい。
【０１２７】
所望の微生物宿主細胞における組み換えポリペプチドの発現を駆動するのに有用な開始制御領域又はプロモーターは数多くあり、当業者によく知られている。事実上、限定されないが、ＣＹＣＩ、ＨＩＳ３、ＧＡＬＩ、ＧＡＬＩＯ、ＡＤＨＩ、ＰＧＫ、ＰＨ０５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣＩ、ＴＲＰＩ、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロマイセスでの発現に有用）；ＡＯＸＩ（ピキアでの発現に有用）；並びにｌａｃ、ｔｒｐ、ＪＰＬ、ＩＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ及びｔｒｃ（エシェリヒア・コリでの発現に有用）を含むこれらの遺伝子を駆動することが可能な任意のプロモーターは、主題の技術に適している。
【０１２８】
終止制御領域はまた、微生物宿主に対して天然の様々な遺伝子に由来し得る。終止部位は、任意に、本明細書に記載の微生物宿主に含まれてもよい。
【０１２９】
植物細胞において、主題の技術の発現ベクターは、所望の発達段階において、所望の組織における主題の技術の組み換えポリペプチドの発現を指示することができるプロモーターに制御可能に連結されたコード領域を含むことができる。便宜上、発現されるポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチドに由来するプロモーター配列及び翻訳リーダー配列を含み得る。転写終結シグナルをコードする３’非コード配列も存在しなければならない。発現ベクターはまた、ポリヌクレオチドの発現を促進するための１つ以上のイントロンも含み得る。
植物宿主細胞の場合、コード領域の発現を誘導することができる任意のプロモーター及び任意のターミネーターの任意の組み合わせを、主題の技術のベクター配列に使用してもよい。プロモーター及びターミネーターのいくつかの好適な例としては、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）、及びカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の遺伝子に由来するものが挙げられる。使用され得る一種の効率的な植物プロモーターは、高レベルの植物プロモーターである。かかるプロモーターは、主題の技術の発現ベクターと制御可能に連結している場合、ベクターの発現を促進することができるはずである。主題の技術で使用され得る高レベルの植物プロモーターとしては、例えばダイズに由来するリブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓ）のプロモーター、（それぞれの全体が本明細書と矛盾しない範囲で本明細書に組み込まれる、Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＡＰＰ．ＧＥＮ，１：４８３  ４９８（１９８２））、及びクロロフィルのａｌｂ結合タンパク質のプロモーターが挙げられる。これらの２つのプロモーターは、植物細胞において光誘導性であることが知られている（例えば、それらの全体が本明細書と矛盾しない範囲で本明細書に組み込まれる、ＧＥＮＥＴＩＣ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＯＦ  ＰＬＡＮＴＳ，ＡＮ  ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ  ＰＥＲＳＰＥＣＴＩＶＥ，Ａ．Ｃａｓｈｍｏｒｅ，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎ．Ｙ．（１９８３），ｐａｇｅｓ  ２９  ３８；Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，２５８：１３９９（１９８３）；及びＤｕｎｓｍｕｉｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ，２：２８５（１９８３）を参照されたい）。
ＲｅｂＪ又はＲｅｂＩの前駆体合成
【０１３０】
前述のステビオール配糖体は、アメリカのステビア・レバウディアナ植物（キク科）の葉、及びルブス・チンギイ（Rubus  chingii）植物（バラ科）の甘味を担う化学化合物である。これらの化合物は、グリコシル化ジテルペンである。具体的には、それらの分子は、ステビオール分子として見ることができ、そのヒドロキシル水素原子はグルコース分子で置換されてエステルを形成し、ヒドロキシル水素がグルコースとラムノースとの組み合わせと共にアセタールを形成する。
【０１３１】
本開示において目的の化合物を作製する１つの方法は、化学的に誘導されるか、又は細菌及び／又は酵母などの操作された微生物内での生合成を介して製造され、ＲｅｂＪ又はＲｅｂＩなどの既知の又は安価な方法により標的化ステビオール配糖体を合成する、ステビオール、ステビオシド、ＲｅｂＡ、又はルボソシドなどの一般的又は安価な前駆体を得ることである。
【０１３２】
本開示の態様は、ステビオールを製造することができる微生物系において酵素を組み換え的に発現させることを含む方法に関する。一般に、かかる酵素としては、コパリルジホスフェートシンターゼ（ＣＰＳ）、カウレンシンターゼ（ＫＳ）及びゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼ（ＧＧＰＰＳ）の酵素を挙げることができる。これは、非メバロン酸（ＭＥＰ）経路又はメバロン酸経路（ＭＶＡ）などの内因性イソプレノイド合成経路を発現する微生物株において生じるはずである。いくつかの実施形態では、細胞は、大腸菌を含む細菌細胞、又はサッカロマイセス細胞、ピキア細胞若しくはヤロウィア細胞などの酵母細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は藻類細胞又は植物細胞である。
【０１３３】
その後、化学合成に使用するために、発酵培養物から前駆体を回収する。典型的には、これはステビオールであるが、カウレンであってもよく、又は細胞培養物由来のステビオール配糖体であってもよい。いくつかの実施形態では、ステビオール、カウンレン及び／又はステビオール配糖体は、気相から回収されるが、他の実施形態では、有機層又はポリマー樹脂を細胞培養物に添加して、カウレン、ステビオール及び／又はステビオール配糖体が有機層又はポリマー樹脂から回収される。いくつかの実施形態では、ステビオール配糖体は、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＪ、又はズルコシドＡから選択される。いくつかの実施形態では、生成されたテルペノイドは、ステビオールビオシド又はステビオシドである。いくつかの実施形態では、１つ以上のグリコシル化工程などの少なくとも１つの酵素工程はエクスビボで行われることも理解されたい。
【０１３４】
本開示の一部は、ＲｅｂＮへのさらなる酵素変換に供することができるＲｅｂＪステビオール配糖体の製造である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるラムノシルトランスフェラーゼ（ＲｈａＴ）、例えば、ＥＵ１１、ＥＵＣＰ１、ＨＶ１、ＵＧＴ２Ｅ−Ｂ又はＮＸ１１４、及びＵＤＰ−ラムノース等のラムノース供与体部分を使用して、ＲｅｂＡをＲｅｂＪに変換することができる。いくつかの実施形態では、所望のステビオール配糖体（例えば、ＲｅｂＮ）への微生物産生ステビオールの変換のための生合成は、ジテルペノイドステビオールが、本発明者らによって生成された具体的に同定された及び／又は改変された酵素を利用して、ステビオール骨格の糖部分の複数工程の化学アセンブリを用いて、ルブソシド及びステビオシドに変換される際に生じる。本明細書で利用されるＥＵ１１、ＥＵＣＰ１、ＨＶ１、及びＵＧＴ７６Ｇ１の酵素に加えて、これらのステビオールレバウジオシドを送達するために機能し得る他の酵素も同定された。例えば、他のＵＧＴ酵素（それぞれＣＰ１及びＣＰ２、配列番号：１１〜配列番号１３）及びＵＧＴ７６Ｇ１−ＡｔＳＵＳ１融合酵素は、ＲｅｂＪをＲｅｂＮに変換できることが特定された。
【０１３５】
本開示の一部は、ＲｅｂＡからのＲｂＩステビオール配糖体の製造であり、ＲｅｂＩステビオール配糖体は、ＲｅｂＮへのさらなる酵素変換に供することができる。いくつかの実施形態では、ＲｅｂＡからＲｅｂＩへの変換の生合成は、グルコシルトランスセラーゼ活性を有する組み換えポリペプチドの存在下でＲｅｂＡをグルコース供与部分と反応させることにより起こる。いくつかの実施形態では、グルコース供与部分はインサイチュで生成される。いくつかの実施形態では、グルコース供与部分が反応に添加される。いくつかの実施形態では、グルコシルトランスフェラーゼ活性を有する組み換えポリペプチドは、スクロースシンターゼ活性をさらに備える。例えば、いくつかの実施形態では、ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号７）として識別される酵素は、ＲｅｂＡをＲｅｂＩに変換することができる。いくつかの実施形態では、他のＵＧＴ酵素（例えば、それぞれＣＰ１及びＣＰ２−配列番号：１１及び配列番号１３）はＲｅｂＡをＲｅｂＩに変換することができる。いくつかの実施形態では、ＵＣＴ７６Ｇ１−ＡｔＳＵＳ１融合酵素は、ＲｅｂＡをＲｅｂＩに変換することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のラムノシルトランスフェラーゼ（ＲｈａＴ）、例えば、ＥＵ１１、ＥＵＣＰ１、ＨＶ１、ＵＧＴ２Ｅ−Ｂ又はＮＸ１１４、及びＵＤＰ−ラムノースなどのラムノース供与部分を使用して、ＲｅｂＩをＲｅｂＮに変換することができる。
ステビオール配糖体の生合成
【０１３６】
本明細書に記載されるように、本技術の組み換えポリペプチドは、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ及び／又はＵＤＰ−ラムノシルトランスフェラーゼ）活性を有し、それぞれ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＩ、及びレバウジオシドＮ等の天然に存在しないか、又は典型的には天然供給源中には少ししか存在しないステビオール配糖体を調製する生合成方法を開発するのに有用である。本技術の組み換えポリペプチドは、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ活性を有し、レバウジオシドＪ又はレバウジオシドＩなどのステビオール配糖体を調製し、レバウジオシドＮの合成製造に到達するための生合成方法を開発するのに有用である。
【０１３７】
基質又は出発ステビオール配糖体組成物は、１つ以上のＵＤＰ−ラムノシルトランスフェラーゼによって触媒される反応においてステビオール配糖体化合物に変換することができる任意の天然又は合成の化合物であり得る。例えば、基質は、天然ステビア抽出物、ステビオール、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド、ステビオール−１，２−ビオシド、ルブソシド、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ又はレバウジオシドＩであり得る。基質は、純粋な化合物又は種々の化合物の混合物であり得る。基質は、ルブソシド、ステビオシド、ステビオール、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＪ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される化合物を含むことが好ましい。
【０１３８】
本明細書に記載の方法はまた、本明細書に記載される組み換えペプチドが、１つ以上の追加の酵素と組み合わせて機能して、効率を改善するか、又はステビオール配糖体化合物の全体的な生合成の結果を修飾することができるカップリング反応系も提供する。例えば、追加の酵素は、ラムノシル化反応に必要なＵＤＰ−ラムノースを再生成し得て（例えば、その全開示が参照により本明細書に組み込まれるＰｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＵＤＰ−ｒｈａｍｎｏｓｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂｙ  ａ  ｔｗｏ−ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄ，」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１３９：３３−４２（２０１８）を参照されたい）、追加の酵素は、グリコシル化反応から製造されたＵＤＰを（例えば、グルコース残基の供与体としてスクロースを使用して）ＵＤＰ−グルコースに変換して戻すことによりグリコシル化反応に必要なＵＤＰ−グルコースを再生成して、グリコシル化反応の効率を改善することができる。
【０１３９】
別の実施形態では、主題の方法は、本開示にかかる組み換え及び新規のＵＤＰ−ラムノシルトランスフェラーゼ（ＲｈａＴ）を、本明細書に記載の基質及び１つ以上の追加の組み換えポリペプチド（例えば、組み換えＵＧＴ）と共にインキュベートすることをさらに含む。組み換えＵＧＴは、ＲｅｂＪ及びＲｅｂＮの製造をもたらす主題の技術の組み換えポリペプチドによって触媒されるものとは異なるグリコシル化反応を触媒することができる。
【０１４０】
好適なＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼとしては、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、又はこれらの機能的ホモログなどのステビオール配糖体化合物の生合成の１つ以上の反応を触媒することができる、技術分野において既知の任意のＵＧＴが挙げられる。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、主題の技術のインビトロ法では、ＵＤＰ−グルコース及び／又はＵＤＰ−Ｌラムノースを、約０．２ｍＭ〜約５ｍＭ、好ましくは約０．５ｍＭ〜約２ｍＭ、より好ましくは約０．７ｍＭ〜約１．５ｍＭの濃度で緩衝液中に含むことができる。一実施形態では、組み換えスクロースシンターゼが反応に含まれる場合、スクロースはまた、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、好ましくは約２００ｍＭ〜約４００ｍＭ、より好ましくは約２５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの濃度で緩衝液中に含まれる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、主題の技術のインビトロ方法では、乾燥重量基準で基質に対する組み換えポリペプチドの重量比は、約１：１００〜約１：５、好ましくは約１：５０〜約１：１０、より好ましくは約１：２５〜約１：１５である。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、インビトロ方法の反応温度は、約２０℃〜約４０℃、好適には２５℃〜約３７℃である。
【０１４４】
当業者であれば、本明細書に記載の方法により製造されるステビオール配糖体組成物をさらに精製し、他のステビオール配糖体、香料又は甘味料と混合して、所望の香料又は甘味料の組成物が得られることを認識するであろう。例えば、本明細書に記載されるように製造されたＲｅｂＪ又はＲｅｂＮを濃縮した組成物を、レバウジオシドＡを主なステビオール配糖体として含有する天然ステビア抽出物、又は他の合成若しくは天然のステビオール配糖体生成物と混合して、所望の甘味料組成物を作製してもよい。あるいは、本明細書に記載の方法から得られる実質的に精製されたステビオール配糖体（例えば、レバウジオシドＪ及びレバウジオシドＮ）は、スクロース、マルトデキストリン、アスパルテーム、スクラロース、ネオテーム、アセスルファムカリウム及びサッカリンなどの他の甘味料と組み合わせることができる。他の甘味料に対するステビオール配糖体の量を、技術分野において既知の所望の味を得るように調整することができる。本明細書に記載のステビオール配糖体（レバウジオシドＮ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＪ、又はこれらの組み合わせを含む）は、食品製品（飲料、ソフトドリンク、アイスクリーム、乳製品、菓子、シリアル、チューインガム、焼き菓子など）、栄養補助食品、医療栄養、並びに医薬品に含まれ得る。
同一性スコアを使用した配列類似性の分析
【０１４５】
本明細書において使用される場合、「配列同一性」とは、２つの最適に整列したポリヌクレオチド又はペプチド配列が、成分、例えばヌクレオチド又はアミノ酸の整列のウィンドウ全体にわたり不変である程度を指す。試験配列及び参照配列の整列セグメントの「同一性割合」は、２つの整列した配列により共有される同一成分の数を、参照配列セグメント、すなわち参照配列全体又は参照配列のより小さい所定の部分における成分の総数で除した値である。
【０１４６】
本明細書において使用される場合、「配列同一性パーセント」又は「同一性パーセント」という用語は、２つの配列が最適に整列した場合の、試験（「対象」）ポリヌクレオチド分子（又はその相補鎖）と比較した、参照（「クエリ」）ポリヌクレオチド分子（又はその相補鎖）の直線ポリヌクレオチド配列における同一ヌクレオチドのパーセンテージを指す（比較ウィンドウにわたり、適切なヌクレオチド挿入、欠失、又はギャップは合計して参照配列の２０パーセント未満である）。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適な整列は、当業者に周知であり、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの局所的ホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのホモロジー整列アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性検索方法等のツールによって、並びに好ましくはＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ等のアルゴリズムのコンピュータ実装により行われてもよい。試験配列及び参照配列の整列セグメントの「同一性割合」は、２つの整列した配列により共有される同一成分の数を、参照配列セグメント、すなわち参照配列全体又は参照配列のより小さい所定の部分における成分の総数で除した値である。配列同一性パーセントは、１００を乗じた同一性割合として表される。１つ以上のポリヌクレオチド配列の比較は、全長ポリヌクレオチド配列若しくはその一部、又はより長いポリヌクレオチド配列にわたってもよい。本開示の目的において、「同一性パーセント」はまた、翻訳されたヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＸバージョン２．０、及びポリヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を使用して決定され得る。
【０１４７】
配列同一性のパーセントは、好ましくは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（商標）（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の「Ｂｅｓｔ  Ｆｉｔ」又は「Ｇａｐ」プログラムを使用して決定される。「Ｇａｐ」は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムを利用して、マッチの数を最大化してギャップの数を最小化する２つの配列の整列を見つける。「ＢｅｓｔＦｉｔ」は、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，２：４８２−４８９，１９８１、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：２２０５−２２２０，１９８３）の局所的ホモロジーアルゴリズムを使用して、２つの配列間の類似性の最善のセグメントの最適な整列を実行し、マッチの数を最大化するためにギャップを挿入する。同一性パーセントは、最も好ましくは、「Ｂｅｓｔ  Ｆｉｔ」プログラムを使用して決定される。
【０１４８】
配列同一性を決定するための有用な方法はまた、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）から公的に利用可能なＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）プログラムに開示されている。ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＣＢＩ，ＮＬＭ，ＮＩＨ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）を参照されたい。ＢＬＡＳＴプログラムのバージョン２．０以降では、整列内にギャップ（欠失及び挿入）を導入することができる。ペプチド配列については、ＢＬＡＳＴＸを使用して配列同一性を決定することができ、ポリヌクレオチド配列についてＢＬＡＳＴＮを使用して配列同一性を決定することができる。
【０１４９】
本明細書において使用される場合、「実質的な配列同一性パーセント」という用語は、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、又はさらにより高い配列同一性、例えば約９８％若しくは約９９％の配列同一性の配列同一性パーセントを指す。したがって、本開示の一実施形態は、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、又はさらにより高い配列同一性、例えば約９８％若しくは約９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド分子である。本開示の１，２ＲｈａＴ及びＵＧＴ酵素の活性を有するポリヌクレオチド分子は、様々なステビオール配糖体の生成を導くことができ、本明細書において提供されるポリヌクレオチド配列に対して実質的な配列同一性パーセントを有し、本開示の範囲内に包含される。
同一性及び類似性
【０１５０】
同一性は、配列の整列（配列情報若しくは構造情報のみ、又はいくつかの他の情報を使用して行うことができるが、通常は配列情報のみに基づく）後に配列の対の間で同じであるアミノ酸の割合であり、類似性は、いくつかの類似性マトリックスを使用した整合に基づいて割り当てられたスコアである。類似性指数は、タンパク質の配列整列のために当業者により使用される以下のＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、若しくはＧＯＮＮＥＴ、又は任意のマトリックスのうちのいずれか１つであり得る。
【０１５１】
同一性は、２つの下位配列間の対応度である（配列間にギャップはない）。２５％以上の同一性は、機能の類似性を示し、１８〜２５％は構造又は機能の類似性を示す。２つの完全に無関係な又はランダム配列（１００残基を超える）が２０％超の同一性を有し得ることに留意されたい。類似性は、それらが比較された場合の２つの配列間の類似度である。これは、それらの同一性に依存する。
【０１５２】
前述の説明から明らかであるように、本開示のある特定の態様は、本明細書において例示される実施例の具体的な詳細によって限定されず、したがって、当業者は、他の修正及び用途、又はそれらの等価物を思いつくことが企図される。したがって、特許請求の範囲は、本開示の趣旨及び範囲から逸脱しない全てのそのような修正及び用途を網羅するものであることが意図される。
【０１５３】
さらに、別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載される、又はそれらと同様若しくは同等であるいずれの方法及び材料も、本開示の実践又は試験に使用され得るが、好ましい方法及び材料が上で説明されている。
【０１５４】
上記発明は、理解の目的のために例証及び例示としてある程度詳細に説明されているが、ある特定の変更及び修正が実践され得ることが当業者には明らかであろう。したがって、説明及び実施例は、添付の特許請求の範囲により説明される本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１５５】
実施例
実施例１：１，２ＲｈａＴ酵素の酵素活性スクリーニング
系統発生、遺伝子クラスター、及びタンパク質ＢＬＡＳＴの分析を使用して、候補１，２ＲｈａＴトランスフェラーゼ遺伝子を同定した。候補１，２ＲｈａＴトランスフェラーゼ遺伝子の全長ＤＮＡフラグメントを最適化し、大腸菌（ニュージャージー州のＧｅｎｓｃｒｉｐｔ）のコドン選好に従って合成した。合成されたＤＮＡフラグメントを、細菌発現ベクターｐＥＴｉｔｅ  Ｎ−Ｈｉｓ  ＳＵＭＯ  Ｋａｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）にクローニングした。
【０１５６】
各発現コンストラクトを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、続いて、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ培地中、３７℃で、０．８〜１．０のＯＤ６００に達するまで成長させた。１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、培養物をさらに１６℃で２２時間インキュベートすることにより、タンパク質発現を誘導した。遠心分離（３０００×ｇ、１０分、４℃）により細胞を採取した。細胞ペレットを回収して、直ちに使用するか、又は−８０℃で保存した。
【０１５７】
細胞ペレットを、典型的には、溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、２５μｇ／ｍＬリゾチーム、５μｇ／ｍＬ  ＤＮＡｓｅ  Ｉ、２０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、及び０．４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に再懸濁した。細胞を４℃で超音波処理により破壊し、細胞残屑を遠心分離（１８０００×ｇ；３０分）により清澄化した。平衡化した（平衡緩衝液：５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、２０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール）Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）親和性カラムに上清を充填した。タンパク質試料を充填した後、カラムを平衡緩衝液で洗浄して、結合していないタンパク質夾雑物を除去した。Ｈｉｓタグ付き１，２ＲｈａＴ組み換えポリペプチドを、２５０ｍＭのイミダゾールを含有する平衡緩衝液で溶出した。
【０１５８】
精製した候補１，２ＲｈａＴ組み換えポリペプチドを、ＵＤＰ−ラムノシルトランスフェラーゼ活性についてアッセイした。典型的には、組み換えポリペプチド（２０〜５０μｇ）を２００μＬのインビトロ反応系で試験した。反応系は、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２５〜１ｍｇ／ｍＬのレバウジオシドＡ及びＵＤＰ−Ｌラムノースを含有する。反応を３０〜３７℃で行い、１−ブタノールを添加して終了させた。
【０１５９】
生成物試料を２００μＬの１−ブタノールで３回抽出した。プールした画分を乾燥させ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析のため、１００μＬの８０％メタノール中に溶解した。
【０１６０】
クォータナリポンプ、温度制御カラムコンポーネント、オートサンプラー、及びＵＶ吸光度検出器を備えるＤｉｏｎｅｘ  ＵＰＬＣ  ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００システム（カリフォルニア州のＳｕｎｎｙｖａｌｅ）を使用して、ＨＰＬＣ分析を実施した。ガードカラムを備えたＳｙｎｅｒｇｉ  Ｈｙｄｒｏ−ＲＰカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を、プールした試料中のステビオール配糖体の特性評価に使用した。ＨＰＬＣ分析で使用した検出波長は、２１０ｎｍであった。
【０１６１】
活性スクリーニング後、ＲｅｂＡからＲｅｂＪへのバイオ変換について、ＵＤＰ−ラムノシルトランスフェラーゼ活性を有するいくつかの１，２ＲｈａＴ酵素を同定した。
実施例２：ＲｅｂＡのＲｅｂＪへの酵素的バイオ変換
【０１６２】
レバウジオシドＪの生合成は、アグリコンステビオールのグルコシル化及びラムノシル化を伴う。具体的には、ＲｅｂＪは、ＲｅｂＡの１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’のラムノシル化、すなわち、α１，２ラムノシル化によって製造され得る（図３）。
【０１６３】
図４〜図６は、ＨＰＬＣにより分析したＲｅｂＡ及びＲｅｂＪ標準の保持時間を、候補１，２ＲｈａＴ酵素により触媒されるラムノシル化反応から得られた反応生成物の保持時間と比較する。
【０１６４】
ＥＵ１１、ＥＵＣＰ１及びＨＶ１は、グルコシル化活性を有し、ＵＤＰ−グルコースからステビオール配糖体にグルコース部分を転移させることができ、ステビオシド、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＶ、及びレバウジオシドＤ３等の化合物を製造することができると報告されている。
【０１６５】
図４（Ｃ）〜図４（Ｅ）に示されるように、ＲｅｂＡを、本明細書でＥＵＣＰ１（配列番号３）及びＨＶ１（配列番号５）とそれぞれ命名されるＥＵ１１の循環置換である、ＥＵ１１（配列番号１）により触媒される反応系でＲｅｂＪに変換し、グルコシル化活性に加えて、これらの酵素はまた、１，２ラムノシルトランスフェラーゼ活性を有することを実証した。ＥＵＣＰ１は、ＥＵ１１よりも高い１，２ラムノシルトランスフェラーゼ活性を有することが見出されたが、ＥＵ１１は、ＨＶ１よりもはるかに高い１，２ラムノシルトランスフェラーゼ活性を示した。
【０１６６】
図５は、ＵＧＴ２Ｅ−Ｂ（配列番号９）により触媒される反応系においてＲｅｂＡがＲｅｂＪに変換されたことを示す。図６は、ＮＸ１１４（配列番号１９）により触媒される反応系においてＲｅｂＡがＲｅｂＪに変換されたことを示す。
【０１６７】
総じて、これらのデータは、酵素ＥＵ１１、ＥＵＣＰ１、ＨＶ１、ＵＧＴ２Ｅ−Ｂ、及びＮＸ１１４が、１，２ＲｈａＴ活性を呈し、α１，２ラムノシル化反応においてＵＤＰ−Ｌ−ラムノース供与体からＲｅｂＡの１９−Ｏ−グルコース部分のＣ−２’にラムノース部分を転移することによってＲｅｂＪを製造できることを実証している。
実施例３：ＬＣ−ＭＳ分析によるＲｅｂＪ製造の確認
【０１６８】
１，２ＲｈａＴ候補酵素により触媒される反応において生成された化合物の同一性を確認するため、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈｙｄｒｏ−ＲＰカラムを使用して、ＬＣ−ＭＳ分析を行った。移動相Ａは、水中の０．１％ギ酸であり、移動相Ｂはアセトニトリル中の０．１％ギ酸であった。流速は０．６ｍＬ／分であった。試料の質量分析による分析を、Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、正イオンモードの最適化された方法で行った。
【０１６９】
ＬＣ−ＭＳ分析により、ＥＵ１１、ＥＵＣＰ１、ＨＶ１、ＵＧＴ２Ｅ−Ｂ、及びＮＸ１１４によりそれぞれ触媒されるラムシル化反応から得られる生成物が、ＲｅｂＪ標準と同じ質量［（Ｍ＋Ｎａ＋）１１３５．４８ｍ／ｚ］及び保持時間（２．６１分）を有することが確認された。
実施例４：ＲｅｂＪのＲｅｂＮへの酵素によるバイオ変換
【０１７０】
再び図３を参照すると、β１，３グルコシル化反応においてＲｅｂＪの１９−Ｏ−グルコースのＣ−３’のグルコシル化によって、ＲｅｂＮを生成することができる。
【０１７１】
ＲｅｂＮへのＲｅｂＪのバイオ変換に適したＵＧＴを特定するため、実施例１で得られたＲｅｂＪ生成物を使用して酵素候補をアッセイした。
【０１７２】
加熱することによって（１，２ＲｈａＴ酵素を変性させるため）ＲｅｂＪ製造を終了した後、ＵＧＴ候補酵素（反応混合物２００μＬ当たり５μｇの酵素）及び１ｍＭのＵＤＰ−グルコースを反応混合物に添加した。グルコシル化反応を３７℃で３時間行った。
【０１７３】
図７は、実施例１のＥＵ１１触媒（図７（Ｂ））及びＥＵＣＰ１触媒（図７（Ｃ））の反応系からそれぞれ得られたＲｅｂＪ生成物を基質として使用して、ＨＰＬＣによって分析されたＲｅｂＯ、ＲｅｂＮ、ＲｅｂＣ及びズルコシドＡ（「ｄＡ」）標準の保持時間を、ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号７）によって触媒されるグルコシル化反応から得られた反応生成物の保持時間と比較する。図７（Ｂ）及び図７（Ｃ）に示されるように、ＵＧＴ７６Ｇ１の存在下で、ＲｅｂＪはＲｅｂＮに変換された。
【０１７４】
ＵＧＴ７６Ｇ１の構造に基づいて、本発明者らは、ＵＧＴ７６Ｇ１の循環置換であるＣＰ１（配列番号１１）、ＣＰ１の変異体であってＣＰ１のＣ末端とＮ末端の間にリンカーを挿入することによって生成されたＣＰ２（配列番号１３）、及びスクロースシンターゼ（ＳＵＳ）ドメインであるＡｔＳＵＳ１に連結されたＤＵＰグルリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ドメインＵＧＴ７６Ｇ１を含む融合酵素ＧＳ（配列番号１５）を設計することができた。
【０１７５】
図８を参照すると、図８（Ａ）は、ＲｅｂＪ標準の保持時間を示す。図８（Ｂ）は、ＥＵＣＰ１によって触媒されるＲｅｂＡのＲｅｂＪへのバイオ変換を確認する。ＥＵＣＰ１で触媒される反応から得られたＲｅｂＪ生成物を基質として使用し、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＣＰ１、ＣＰ２、及びＧＳを、ＲｅｂＪをＲｅｂＮに変換するそれらのグルコシル化活性についてアッセイした。Ｒｅｂ  Ｎ標準の保持時間を示す図８（Ｃ）と比較すると、図８（Ｄ）、図８（Ｅ）、図８（Ｆ）及び図８Ｇは、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＣＰ１、ＣＰ２、及びＧＳの各酵素が、β１，３グルコシル化反応においてＵＤＰ−グルコースからＲｅｂＪの１９−Ｏ−グルコースのＣ−３’にグルコース部分を転移することにより、ＲｅｂＮが生成することを実証している。
【０１７６】
ＲｅｂＪからＲｅｂＮへのバイオ変換におけるＵＧＴ−ＳＵＳ融合酵素の活性をさらに評価するため、ＵＤＰ及びスクロースの存在下で、ＵＤＰ−グルコースなしで、以下の酵素系を使用してアッセイを行った。（１）ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号７）自体、（２）ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号７）とスクロースシンターゼＡｔＳＵＳ１（配列番号１７）の両方の追加、及び（３）ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ活性とスクロースシンターゼ活性の両方を持つスクロースシンターゼ（ＳＵＳ）ドメインＡｔＳＵＳ１に連結されたＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ドメイン、ＵＧＴ７６Ｇ１を含む融合酵素ＧＳ（配列番号１５）。
【０１７７】
図９（Ｃ）に示すように、ＵＧＴ７６Ｇ１は、ＵＤＰ及びスクロースのみが反応系に存在する場合、ＲｅｂＪをＲｅｂＮに変換することができない。一方、ＵＧＴ酵素（例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１）及びＳＵＳ酵素（例えば、ＡｔＳＵＳ１）の両方を含む触媒系を使用することにより、ＵＤＰ及びスクロースからＵＤＰ−グルコースを生成することができ、ＵＧＴ酵素は、ＵＤＰ−グルコースからＲｅｂＪにグルコース部分を転移することによってＲｅｂＮを生成することができた（図９（Ｄ））。同様に、融合酵素ＧＳは、ＲｅｂＪからＲｅｂＮを製造でき（図９（Ｅ））、融合酵素がスクロースシンターゼ活性を有し、ＵＤＰ及びスクロースからＵＤＰ−グルコースを生成できたことを示す。さらに、融合酵素ＧＳは、ＵＧＴ７６Ｇ１及びＡｔＳＵＳ１が個々の酵素として存在する反応系と比較して、より高い酵素活性を有することがわかった（より多くのＲｅｂＮが製造された）。
実施例５：ＬＣ−ＭＳ分析によるＲｅｂＮ製造の確認
【０１７８】
ＵＧＴ酵素により触媒される反応において製造された化合物のさらなる同一性を確認するため、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈｙｄｒｏ−ＲＰカラムを使用して、ＬＣ−ＭＳ分析を行った。移動相Ａは、水中の０．１％ギ酸であり、移動相Ｂはアセトニトリル中の０．１％ギ酸であった。流速は０．６ｍＬ／分であった。試料の質量分析による分析を、Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、正イオンモードの最適化された方法で行った。
【０１７９】
ＬＣ−ＭＳ分析により、基質としてＲｅｂＪ（実施例１に記載のＥＵ１１／ＥＵＣＰ１／ＨＶ１／ＵＧＴ２Ｅ−Ｂ／ＮＸ１１４によって触媒されるラムノシル化反応から製造される）を使用し、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＣＰ１、ＣＰ２、及びＧＳによってそれぞれ触媒されるグルコシル化反応から得られる生成物が、ＲｅｂＮ標準と同じ質量［（Ｍ＋Ｎａ＋）１２９７．５３ｍ／ｚ］及び保持時間（２．４３分）を有することを確認した。
目的の配列：
配列：
ＥＵ１１アミノ酸配列（配列番号１）
ＭＤＳＧＹＳＳＳＹＡＡＡＡＧＭＨＶＶＩＣＰＷＬＡＦＧＨＬＬＰＣＬＤＬＡＱＲＬＡＳＲＧＨＲＶＳＦＶＳＴＰＲＮＩＳＲＬＰＰＶＲＰＡＬＡＰＬＶＡＦＶＡＬＰＬＰＲＶＥＧＬＰＤＧＡＥＳＴＮＤＶＰＨＤＲＰＤＭＶＥＬＨＲＲＡＦＤＧＬＡＡＰＦＳＥＦＬＧＴＡＣＡＤＷＶＩＶＤＶＦＨＨＷＡＡＡＡＡＬＥＨＫＶＰＣＡＭＭＬＬＧＳＡＨＭＩＡＳＩＡＤＲＲＬＥＲＡＥＴＥＳＰＡＡＡＧＱＧＲＰＡＡＡＰＴＦＥＶＡＲＭＫＬＩＲＴＫＧＳＳＧＭＳＬＡＥＲＦＳＬＴＬＳＲＳＳＬＶＶＧＲＳＣＶＥＦＥＰＥＴＶＰＬＬＳＴＬＲＧＫＰＩＴＦＬＧＬＭＰＰＬＨＥＧＲＲＥＤＧＥＤＡＴＶＲＷＬＤＡＱＰＡＫＳＶＶＹＶＡＬＧＳＥＶＰＬＧＶＥＫＶＨＥＬＡＬＧＬＥＬＡＧＴＲＦＬＷＡＬＲＫＰＴＧＶＳＤＡＤＬＬＰＡＧＦＥＥＲＴＲＧＲＧＶＶＡＴＲＷＶＰＱＭＳＩＬＡＨＡＡＶＧＡＦＬＴＨＣＧＷＮＳＴＩＥＧＬＭＦＧＨＰＬＩＭＬＰＩＦＧＤＱＧＰＮＡＲＬＩＥＡＫＮＡＧＬＱＶＡＲＮＤＧＤＧＳＦＤＲＥＧＶＡＡＡＩＲＡＶＡＶＥＥＥＳＳＫＶＦＱＡＫＡＫＫＬＱＥＩＶＡＤＭＡＣＨＥＲＹＩＤＧＦＩＱＱＬＲＳＹＫＤ
ＥＵ１１ＤＮＡ配列（配列番号２）
ＡＴＧＧＡＴＴＣＧＧＧＴＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＡＴＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＧＴＡＴＧＣＡＣＧＴＴＧＴＴＡＴＣＴＧＴＣＣＧＴＧＧＣＴＧＧＣＴＴＴＴＧＧＴＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＴＧＣＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＡＣＡＧＣＧＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＧＣＧＧＣＣＡＴＣＧＴＧＴＣＡＧＣＴＴＣＧＴＧＴＣＴＡＣＣＣＣＧＣＧＣＡＡＴＡＴＴＴＣＧＣＧＴＣＴＧＣＣＧＣＣＧＧＴＴＣＧＴＣＣＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＴＧＧＴＴＧＣＡＴＴＴＧＴＣＧＣＴＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＧＣＧＴＧＧＡＡＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＡＴＧＧＴＧＣＧＧＡＡＡＧＴＡＣＣＡＡＣＧＡＣＧＴＧＣＣＧＣＡＴＧＡＴＣＧＣＣＣＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＧＡＡＣＴＧＣＡＣＣＧＴＣＧＴＧＣＡＴＴＣＧＡＴＧＧＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＧＴＴＴＴＣＣＧＡＡＴＴＴＣＴＧＧＧＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＧＣＣＧＡＴＴＧＧＧＴＧＡＴＣＧＴＴＧＡＣＧＴＣＴＴＴＣＡＴＣＡＣＴＧＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＡＣＡＴＡＡＡＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＣＡＡＴＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＣＴＣＡＣＡＴＧＡＴＴＧＣＧＴＣＧＡＴＣＧＣＡＧＡＣＣＧＴＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＧＴＧＣＡＧＡＡＡＣＣＧＡＡＡＧＴＣＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＡＣＣＴＴＣＧＡＡＧＴＧＧＣＣＣＧＣＡＴＧＡＡＡＣＴＧＡＴＴＣＧＴＡＣＧＡＡＡＧＧＣＡＧＣＴＣＴＧＧＴＡＴＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＧＣＴＴＴＡＧＴＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＧＴＡＧＴＴＣＣＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＣＧＣＡＧＴＴＧＣＧＴＴＧＡＡＴＴＴＧＡＡＣＣＧＧＡＡＡＣＣＧＴＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＴＣＣＡＣＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＡＡＡＣＣＧＡＴＣＡＣＣＴＴＴＣＴＧＧＧＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＡＴＧＡＡＧＧＣＣＧＴＣＧＣＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＡＡＣＧＧＴＧＣＧＴＴＧＧＣＴＧＧＡＴＧＣＡＣＡＧＣＣＧＧＣＴＡＡＡＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＴＧＴＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＣＴＧＡＡＧＴＧＣＣＧＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＡＡＧＴＴＣＡＣＧＡＡＣＴＧＧＣＡＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＣＴＧＧＣＡＣＣＣＧＣＴＴＣＣＴＧＴＧＧＧＣＡＣＴＧＣＧＴＡＡＡＣＣＧＡＣＧＧＧＴＧＴＧＡＧＣＧＡＴＧＣＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＣＧＧＴＴＴＴＧＡＡＧＡＡＣＧＴＡＣＣＣＧＣＧＧＣＣＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＣＧＣＡＡＣＧＣＧＴＴＧＧＧＴＣＣＣＧＣＡＡＡＴＧＡＧＣＡＴＴＣＴＧＧＣＧＣＡＴＧＣＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＧＣＣＴＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＣＴＧＴＧＧＴＴＧＧＡＡＣＡＧＣＡＣＧＡＴＣＧＡＡＧＧＣＣＴＧＡＴＧＴＴＴＧＧＴＣＡＣＣＣＧＣＴＧＡＴＴＡＴＧＣＴＧＣＣＧＡＴＣＴＴＣＧＧＣＧＡＴＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＡＣＧＣＡＣＧＴＣＴＧＡＴＴＧＡＡＧＣＧＡＡＡＡＡＴＧＣＣＧＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＴＧＣＧＣＧＣＡＡＣＧＡＴＧＧＣＧＡＣＧＧＴＴＣＴＴＴＣＧＡＣＣＧＴＧＡＧＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧＣＧＧＣＣＡＴＴＣＧＣＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＡＧＴＴＴＴＴＣＡＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＡＡＣＴＧＣＡＡＧＡＡＡＴＣＧＴＣＧＣＧＧＡＴＡＴＧＧＣＣＴＧＣＣＡＣＧＡＡＣＧＣＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＧＴＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣＡＡＣＴＧＣＧＣＴＣＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＴＡＡ
ＥＵＣＰ１：アミノ酸配列（配列番号３）
ＭＧＳＳＧＭＳＬＡＥＲＦＳＬＴＬＳＲＳＳＬＶＶＧＲＳＣＶＥＦＥＰＥＴＶＰＬＬＳＴＬＲＧＫＰＩＴＦＬＧＬＭＰＰＬＨＥＧＲＲＥＤＧＥＤＡＴＶＲＷＬＤＡＱＰＡＫＳＶＶＹＶＡＬＧＳＥＶＰＬＧＶＥＫＶＨＥＬＡＬＧＬＥＬＡＧＴＲＦＬＷＡＬＲＫＰＴＧＶＳＤＡＤＬＬＰＡＧＦＥＥＲＴＲＧＲＧＶＶＡＴＲＷＶＰＱＭＳＩＬＡＨＡＡＶＧＡＦＬＴＨＣＧＷＮＳＴＩＥＧＬＭＦＧＨＰＬＩＭＬＰＩＦＧＤＱＧＰＮＡＲＬＩＥＡＫＮＡＧＬＱＶＡＲＮＤＧＤＧＳＦＤＲＥＧＶＡＡＡＩＲＡＶＡＶＥＥＥＳＳＫＶＦＱＡＫＡＫＫＬＱＥＩＶＡＤＭＡＣＨＥＲＹＩＤＧＦＩＱＱＬＲＳＹＫＤＤＳＧＹＳＳＳＹＡＡＡＡＧＭＨＶＶＩＣＰＷＬＡＦＧＨＬＬＰＣＬＤＬＡＱＲＬＡＳＲＧＨＲＶＳＦＶＳＴＰＲＮＩＳＲＬＰＰＶＲＰＡＬＡＰＬＶＡＦＶＡＬＰＬＰＲＶＥＧＬＰＤＧＡＥＳＴＮＤＶＰＨＤＲＰＤＭＶＥＬＨＲＲＡＦＤＧＬＡＡＰＦＳＥＦＬＧＴＡＣＡＤＷＶＩＶＤＶＦＨＨＷＡＡＡＡＡＬＥＨＫＶＰＣＡＭＭＬＬＧＳＡＨＭＩＡＳＩＡＤＲＲＬＥＲＡＥＴＥＳＰＡＡＡＧＱＧＲＰＡＡＡＰＴＦＥＶＡＲＭＫＬＩＲＴＫ
ＥＵＣＰ１：ＤＮＡ配列（配列番号４）
ＡＴＧＧＧＴＡＧＣＴＣＧＧＧＣＡＴＧＴＣＣＣＴＧＧＣＧＧＡＡＣＧＣＴＴＴＴＣＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＴＣＧＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧＧＴＣＧＣＡＧＴＴＧＴＧＴＴＧＡＡＴＴＴＧＡＡＣＣＧＧＡＡＡＣＣＧＴＴＣＣＧＣＴＧＣＴＧＴＣＴＡＣＧＣＴＧＣＧＣＧＧＣＡＡＡＣＣＧＡＴＴＡＣＣＴＴＣＣＴＧＧＧＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＡＴＧＡＡＧＧＣＣＧＴＣＧＣＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＣＧＧＴＧＣＧＴＴＧＧＣＴＧＧＡＴＧＣＴＣＡＧＣＣＧＧＣＧＡＡＡＴＣＧＧＴＧＧＴＴＴＡＴＧＴＣＧＣＡＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣＣＧＣＴＧＧＧＴＧＴＣＧＡＡＡＡＡＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＣＴＴＴＣＴＧＴＧＧＧＣＡＣＴＧＣＧＴＡＡＡＣＣＧＡＣＧＧＧＣＧＴＴＡＧＣＧＡＴＧＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＧＧＴＴＴＣＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＣＣＣＧＣＧＧＣＣＧＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＣＣＡＣＣＣＧＴＴＧＧＧＴＧＣＣＧＣＡＡＡＴＧＴＣＣＡＴＴＣＴＧＧＣＴＣＡＴＧＣＧＧＣＣＧＴＴＧＧＣＧＣＡＴＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＣＴＧＣＧＧＴＴＧＧＡＡＣＡＧＣＡＣＧＡＴＣＧＡＡＧＧＣＣＴＧＡＴＧＴＴＴＧＧＴＣＡＴＣＣＧＣＴＧＡＴＴＡＴＧＣＴＧＣＣＧＡＴＣＴＴＣＧＧＣＧＡＴＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＡＣＧＣＡＣＧＣＣＴＧＡＴＣＧＡＡＧＣＣＡＡＡＡＡＴＧＣＡＧＧＣＣＴＧＣＡＡＧＴＴＧＣＧＣＧＴＡＡＣＧＡＴＧＧＣＧＡＣＧＧＴＡＧＣＴＴＴＧＡＣＣＧＣＧＡＡＧＧＴＧＴＣＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＴＴＣＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＧＧＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＣＡＧＣＡＡＡＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＣＣＡＡＡＧＣＧＡＡＡＡＡＡＣＴＧＣＡＡＧＡＡＡＴＣＧＴＧＧＣＴＧＡＴＡＴＧＧＣＧＴＧＴＣＡＴＧＡＡＣＧＣＴＡＴＡＴＴＧＡＣＧＧＣＴＴＴＡＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＡＣＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＴＡＴＡＧＴＴＣＣＴＣＡＴＡＣＧＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＧＧＧＴＡＴＧＣＡＴＧＴＴＧＴＣＡＴＴＴＧＣＣＣＧＴＧＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＧＧＴＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＴＧＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＡＣＡＧＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＣＴＣＧＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＧＴＴＴＣＧＴＴＣＧＴＣＡＧＣＡＣＣＣＣＧＣＧＣＡＡＴＡＴＣＡＧＴＣＧＴＣＴＧＣＣＧＣＣＧＧＴＴＣＧＴＣＣＧＧＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＣＴＧＧＴＴＧＣＧＴＴＣＧＴＴＧＣＡＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＧＴＧＴＧＧＡＡＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＡＴＧＧＴＧＣＣＧＡＡＴＣＧＡＣＣＡＡＣＧＡＣＧＴＴＣＣＧＣＡＴＧＡＴＣＧＴＣＣＧＧＡＣＡＴＧＧＴＣＧＡＡＣＴＧＣＡＴＣＧＴＣＧＣＧＣＣＴＴＴＧＡＴＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＣＡＣＣＧＴＴＴＡＧＣＧＡＡＴＴＴＣＴＧＧＧＴＡＣＧＧＣＣＴＧＣＧＣＡＧＡＴＴＧＧＧＴＣＡＴＴＧＴＧＧＡＣＧＴＴＴＴＴＣＡＣＣＡＣＴＧＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＡＣＡＴＡＡＡＧＴＧＣＣＧＴＧＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＴＴＣＣＧＣＣＣＡＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＣＡＡＴＣＧＣＧＧＡＴＣＧＴＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＧＴＧＣＣＧＡＡＡＣＣＧＡＡＡＧＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＧＣＣＡＧＧＧＴＣＧＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＣＴＴＴＧＡＡＧＴＧＧＣＡＣＧＴＡＴＧＡＡＡＣＴＧＡＴＴＣＧＣＡＣＧＡＡＡＴＡＡ
ＨＶ１：アミノ酸配列（配列番号５）
ＭＤＧＮＳＳＳＳＰＬＨＶＶＩＣＰＷＬＡＬＧＨＬＬＰＣＬＤＩＡＥＲＬＡＳＲＧＨＲＶＳＦＶＳＴＰＲＮＩＡＲＬＰＰＬＲＰＡＶＡＰＬＶＤＦＶＡＬＰＬＰＨＶＤＧＬＰＥＧＡＥＳＴＮＤＶＰＹＤＫＦＥＬＨＲＫＡＦＤＧＬＡＡＰＦＳＥＦＬＲＡＡＣＡＥＧＡＧＳＲＰＤＷＬＩＶＤＴＦＨＨＷＡＡＡＡＡＶＥＮＫＶＰＣＶＭＬＬＬＧＡＡＴＶＩＡＧＦＡＲＧＶＳＥＨＡＡＡＡＶＧＫＥＲＰＡＡＥＡＰＳＦＥＴＥＲＲＫＬＭＴＴＱＮＡＳＧＭＴＶＡＥＲＹＦＬＴＬＭＲＳＤＬＶＡＩＲＳＣＡＥＷＥＰＥＳＶＡＡＬＴＴＬＡＧＫＰＶＶＰＬＧＬＬＰＰＳＰＥＧＧＲＧＶＳＫＥＤＡＡＶＲＷＬＤＡＱＰＡＫＳＶＶＹＶＡＬＧＳＥＶＰＬＲＡＥＱＶＨＥＬＡＬＧＬＥＬＳＧＡＲＦＬＷＡＬＲＫＰＴＤＡＰＤＡＡＶＬＰＰＧＦＥＥＲＴＲＧＲＧＬＶＶＴＧＷＶＰＱＩＧＶＬＡＨＧＡＶＡＡＦＬＴＨＣＧＷＮＳＴＩＥＧＬＬＦＧＨＰＬＩＭＬＰＩＳＳＤＱＧＰＮＡＲＬＭＥＧＲＫＶＧＭＱＶＰＲＤＥＳＤＧＳＦＲＲＥＤＶＡＡＴＶＲＡＶＡＶＥＥＤＧＲＲＶＦＴＡＮＡＫＫＭＱＥＩＶＡＤＧＡＣＨＥＲＣＩＤＧＦＩＱＱＬＲＳＹＫＡ
ＨＶ１：ＤＮＡ配列（配列番号６）
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ＵＧＴ７６Ｇ１：アミノ酸配列（配列番号７）
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ＵＧＴ７６Ｇ１：ＤＮＡ配列（配列番号８）
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ＵＧＴ２Ｅ−Ｂ：アミノ酸配列（配列番号９）
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ＵＧＴ２Ｅ−Ｂ：ＤＮＡ配列（配列番号１０）
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ＣＰ１：アミノ酸配列（配列番号１１）
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ＣＰ１：ＤＮＡ配列（配列番号１２）
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ＣＰ２：アミノ酸配列（配列番号１３）
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ＣＰ２：ＤＮＡ配列（配列番号１４）
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ＧＳ：アミノ酸配列（配列番号１５）
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ＧＳ：ＤＮＡ配列（配列番号１６）
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ＡｔＳＵＳ１：アミノ酸配列（配列番号１７）
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ＡｔＳＵＳ１：ＤＮＡ配列（配列番号１８）
ＡＴＧＧＣＡＡＡＣＧＣＴＧＡＡＣＧＴＡＴＧＡＴＴＡＣＣＣＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＡＡＣＧＣＧＡＡＣＧＣＣＴＧＡＡＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＴＣＧＧＡＡＣＧＣＡＡＣＧＡＡＧＴＴＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＧＴＧＴＧＧＡＡＧＣＴＡＡＧＧＧＣＡＡＡＧＧＴＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＡＣＣＡＧＡＴＴＡＴＣＧＣＧＧＡＡＴＴＴＧＡＡＧＣＣＣＴＧＣＣＧＧＡＡＣＡＡＡＣＣＣＧＣＡＡＡＡＡＧＣＴＧＧＡＡＧＧＣＧＧＴＣＣＧＴＴＴＴＴＣＧＡＴＣＴＧＣＴＧＡＡＡＴＣＴＡＣＧＣＡＧＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＣＣＧＣＣＧＴＧＧＧＴＣＧＣＡＣＴＧＧＣＡＧＴＧＣＧＴＣＣＧＣＧＴＣＣＧＧＧＣＧＴＴＴＧＧＧＡＡＴＡＴＣＴＧＣＧＴＧＴＣＡＡＣＣＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＡＴＴＴＣＴＧＣＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＴＴＧＡＣＧＧＣＧＴＣＡＡＡＡＡＣＧＧＴＡＡＴＴＴＴＡＣＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＴＴＴＧＡＡＣＣＧＴＴＣＡＡＴＧＣＣＡＧＴＡＴＣＣＣＧＣＧＴＣＣＧＡＣＧＣＴＧＣＡＴＡＡＡＴＡＴＡＴＴＧＧＣＡＡＣＧＧＴＧＴＧＧＡＣＴＴＴＣＴＧＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＧＣＧＣＡＡＡＧＣＴＧＴＴＣＣＡＣＧＡＴＡＡＡＧＡＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＣＧＴＣＴＧＣＡＴＡＧＴＣＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＣＣＧＡＡＡＡＡＡＴＴＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＴＧＣＡＡＣＡＣＡＣＧＣＴＧＣＧＣＡＡＧＧＣＧＧＡＡＧＡＡＴＡＣＣＴＧＧＣＣＧＡＡＣＴＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＣＣＣＴＧＴＡＣＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＡＡＧＣＡＡＡＧＴＴＣＧＡＡＧＡＡＡＴＴＧＧＣＣＴＧＧＡＡＣＧＴＧＧＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧＣＴＧＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡＴＧＡＴＣＣＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＣＡＣＣＧＧＡＣＣＣＧＴＧＣＡＣＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧＴＣＧＣＧＴＧＣＣＧＡＴＧＧＴＴＴＴＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＴＴＣＴＧＴＣＣＣＣＧＣＡＴＧＧＣＴＡＴＴＴＴＧＣＡＣＡＧＧＡＣＡＡＴＧＴＧＣＴＧＧＧＴＴＡＣＣＣＧＧＡＴＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＧＧＴＴＧＴＣＴＡＴＡＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＣＴＧＧＡＡＡＴＴＧＡＡＡＴＧＣＴＧＣＡＧＣＧＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＡＡＡＣＣＧＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＴＣＣＴＧＡＣＣＣＧＴＣＴＧＣＴＧＣＣＧＧＡＴＧＣＡＧＴＴＧＧＴＡＣＣＡＣＧＴＧＣＧＧＴＧＡＡＣＧＴＣＴＧＧＡＡＣＧＣＧＴＣＴＡＴＧＡＣＡＧＣＧＡＡＴＡＣＴＧＴＧＡＴＡＴＴＣＴＧＣＧＴＧＴＣＣＣＧＴＴＴＣＧＣＡＣＣＧＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＴＧＴＧＣＧＴＡＡＡＴＧＧＡＴＣＡＧＴＣＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＴＴＧＧＣＣＧＴＡＴＣＴＧＧＡＡＡＣＣＴＡＣＡＣＧＧＡＡＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＡＡＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＣＴＧＡＴＴＡＴＣＧＧＣＡＡＣＴＡＴＡＧＣＧＡＴＧＧＴＡＡＴＣＴＧＧＴＣＧＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＧＧＧＴＧＴＧＡＣＣＣＡＧＴＧＣＡＣＧＡＴＴＧＣＡＣＡＣＧＣＴＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＣＣＡＡＡＴＡＴＣＣＧＧＡＴＴＣＡＧＡＣＡＴＣＴＡＣＴＧＧＡＡＡＡＡＧＣＴＧＧＡＴＧＡＣＡＡＡＴＡＴＣＡＴＴＴＴＴＣＧＴＧＴＣＡＧＴＴＣＡＣＣＧＣＧＧＡＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＡＴＧＡＡＣＣＡＣＡＣＧＧＡＴＴＴＴＡＴＴＡＴＣＡＣＣＡＧＴＡＣＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＡＴＣＧＣＧＧＧＣＴＣＣＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＧＧＴＣＡＡＴＡＣＧＡＡＴＣＡＣＡＴＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＣＧＣＴＧＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＡＴＣＧＴＧＴＧＧＴＴＣＡＣＧＧＴＡＴＣＧＡＴＧＴＴＴＴＴＧＡＣＣＣＧＡＡＡＴＴＣＡＡＴＡＴＴＧＴＣＡＧＴＣＣＧＧＧＣＧＣＧＧＡＴＡＴＧＴＣＣＡＴＣＴＡＴＴＴＴＣＣＧＴＡＣＡＣＣＧＡＡＧＡＡＡＡＧＣＧＴＣＧＣＣＴＧＡＣＧＡＡＡＴＴＣＣＡＴＴＣＡＧＡＡＡＴＴＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＴＡＣＴＣＧＧＡＣＧＴＧＧＡＡＡＡＣＡＡＧＧＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＴＧＴＴＣＴＧＡＡＡＧＡＴＡＡＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＡＴＣＣＴＧＴＴＴＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＧＴＣＴＧＧＡＴＣＧＣＧＴＧＡＡＧＡＡＴＣＴＧＴＣＡＧＧＣＣＴＧＧＴＴＧＡＡＴＧＧＴＡＴＧＧＴＡＡＡＡＡＣＡＣＧＣＧＴＣＴＧＣＧＣＧＡＡＣＴＧＧＣＡＡＡＴＣＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＴＧＧＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＣＧＣＡＡＧＧＡＡＴＣＧＡＡＡＧＡＴＡＡＣＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＣＴＧＡＡＡＴＧＡＡＧＡＡＡＡＴＧＴＡＣＧＡＴＣＴＧＡＴＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＣＡＧＴＴＴＣＧＴＴＧＧＡＴＣＡＧＣＴＣＴＣＡＡＡＴＧＧＡＣＣＧＴＧＴＧＣＧＣＡＡＴＧＧＣＧＡＡＣＴＧＴＡＴＣＧＣＴＡＣＡＴＴＴＧＣＧＡＴＡＣＣＡＡＧＧＧＴＧＣＧＴＴＴＧＴＴＣＡＧＣＣＧＧＣＡＣＴＧＴＡＣＧＡＡＧＣＴＴＴＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＧＴＣＧＴＧＧＡＡＧＣＣＡＴＧＡＣＧＴＧＣＧＧＴＣＴＧＣＣＧＡＣＣＴＴＴＧＣＧＡＣＧＴＧＴＡＡＡＧＧＣＧＧＴＣＣＧＧＣＣＧＡＡＡＴＴＡＴＣＧＴＧＣＡＴＧＧＣＡＡＡＴＣＴＧＧＴＴＴＣＣＡＴＡＴＣＧＡＴＣＣＧＴＡＴＣＡＣＧＧＴＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＣＴＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＣＧＧＡＴＴＴＣＴＴＴＡＣＧＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＡＡＧＡＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＴＴＴＣＧＡＡＧＧＧＣＧＧＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＴＣＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＡＣＣＴＧＧＣＡＧＡＴＴＴＡＣＡＧＣＣＡＡＣＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＧＧＧＣＧＴＣＴＡＣＧＧＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＴＧＴＧＴＣＴＡＡＴＣＴＧＧＡＴＣＧＣＣＴＧＧＡＡＧＣＣＣＧＴＣＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＡＡＴＧＴＴＴＴＡＣＧＣＡＣＴＧＡＡＧＴＡＴＣＧＣＣＣＧＣＴＧＧＣＡＣＡＡＧＣＣＧＴＴＣＣＧＣＴＧＧＣＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＴＡＡ
ＮＸ１１４：アミノ酸配列（配列番号１９）
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ＮＸ１１４：ＤＮＡ配列（配列番号２０）
ＡＴＧＧＡＡＡＡＴＧＧＴＡＧＣＡＧＴＣＣＧＣＴＧＣＡＴＧＴＴＧＴＴＡＴＴＴＴＴＣＣＧＴＧＧＣＴＧＧＣＡＴＴＴＧＧＴＣＡＴＣＴＧＣＴＧＣＣＧＴＴＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＧＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＧＴＧＴＴＡＧＣＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＣＡＣＣＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＧＣＡＣＧＴＣＴＧＣＧＴＣＣＧＧＴＴＣＧＴＣＣＧＧＣＡＣＴＧＣＧＴＧＧＴＣＴＧＧＴＴＧＡＴＣＴＧＧＴＴＧＣＡＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＴＣＧＴＧＴＴＣＡＴＧＧＴＣＴＧＣＣＧＧＡＴＧＧＴＧＣＣＧＡＡＧＣＡＡＣＣＡＧＴＧＡＴＧＴＴＣＣＧＴＴＴＧＡＡＡＡＡＴＴＴＧＡＡＣＴＧＣＡＣＣＧＣＡＡＡＧＣＡＴＴＴＧＡＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＧＴＴＴＡＧＣＧＣＡＴＴＴＣＴＧＧＡＴＧＣＡＧＣＡＴＧＴＧＣＣＧＧＴＧＡＴＡＡＡＣＧＴＣＣＧＧＡＴＴＧＧＧＴＴＡＴＴＣＣＧＧＡＴＴＴＴＡＴＧＣＡＴＴＡＴＴＧＧＧＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＣＧＴＧＧＴＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＣＡＧＴＴＣＴＧＡＴＴＣＣＧＴＧＴＡＧＣＧＣＡＧＡＴＧＴＴＡＴＧＧＣＡＣＴＧＴＡＴＧＧＴＣＡＧＣＣＧＡＣＣＧＡＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＡＡＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＡＴＴＧＣＡＣＧＴＡＧＣＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＣＣＧＡＧＣＴＴＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡＣＧＴＡＡＴＡＣＣＧＡＡＧＡＡＴＡＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＣＧＧＴＧＴＴＡＧＣＡＴＴＡＴＧＡＣＣＣＧＴＴＴＴＡＧＴＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴＣＡＡＡＡＣＴＧＧＴＴＧＣＣＣＴＧＣＧＴＡＧＣＴＧＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＣＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＣＣＧＴＧＴＴＴＡＴＡＧＣＡＡＡＣＣＧＧＴＴＧＴＧＣＣＧＴＴＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＡＣＡＴＧＧＴＧＴＴＣＧＴＡＡＡＡＡＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＣＣＡＴＴＡＴＴＣＧＴＴＧＧＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＡＡＡＡＧＣＧＴＴＧＴＴＴＡＴＧＴＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＡＧＣＧＡＡＧＣＡＣＣＧＧＴＴＴＣＡＧＣＣＧＡＴＣＴＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＣＴＧＧＣＡＣＡＴＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＴＡＧＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＴＴＴＴＣＴＧＴＧＧＧＣＴＣＴＧＣＧＴＣＧＴＣＣＴＧＣＣＧＧＴＧＴＴＡＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＡＧＣＡＴＴＣＴＧＣＣＧＡＡＴＧＧＴＴＴＴＣＴＧＧＡＡＣＧＴＡＣＣＧＧＴＧＡＡＣＧＣＧＧＴＣＴＧＧＴＴＡＣＣＡＣＣＧＧＴＴＧＧＧＴＴＣＣＧＣＡＧＧＴＴＡＧＴＡＴＴＣＴＧＧＣＣＣＡＴＧＣＡＧＣＡＧＴＴＴＧＴＧＣＡＴＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＴＴＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＡＧＣＧＴＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴＴＴＡＣＡＧＴＴＴＧＧＣＣＡＴＣＣＧＣＴＧＡＴＴＡＴＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＡＴＴＧＧＴＧＡＴＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＡＴＧＣＡＣＧＣＴＴＴＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣＧＴＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＴＴＧＣＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＡＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＴＡＧＣＴＴＴＧＡＴＣＧＴＡＧＣＧＧＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＣＧＴＴＣＧＴＧＣＡＧＴＴＧＣＡＧＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＴＡＡＡＧＣＣＴＴＴＧＣＡＧＣＡＡＡＴＧＣＣＣＧＴＡＡＡＣＴＧＣＡＡＧＡＡＡＴＴＧＴＴＧＣＡＧＡＴＣＧＴＧＡＡＣＧＴＧＡＴＧＡＡＣＧＴＴＧＴＡＣＣＧＡＴＧＧＴＴＴＴＡＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＴＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡ
【図１】
2021515555.tif 000003
【図２】
2021515555.tif 000004
【図３Ａ】
2021515555.tif 000005
【図３Ｂ】
2021515555.tif 000006
【図４】
2021515555.tif 000007
【図５】
2021515555.tif 000008
【図６】
2021515555.tif 000009
【図７】
2021515555.tif 000010
【図８】
2021515555.tif 000011
【図９】
2021515555.tif 000012
【配列表】
2021515555000001.app
【国際調査報告】
2021515555.tif 000013
2021515555.tif 000014
2021515555.tif 000015
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