(57)【要約】本発明は、CD19、CD3、および血清アルブミンに結合する多重特異性結合タンパク質に関する。本発明はまた、これらの多重特異性結合タンパク質を含む薬学的組成物、これらの多重特異性結合タンパク質を作製するための発現ベクターおよび宿主細胞、ならびに血液がんの処置における、これらの多重特異性結合タンパク質の使用方法にも関する。2021526862.tif 000049
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)ヒトCD19に結合する第1の抗原結合部位;
(b)ヒトCD3に結合する第2の抗原結合部位;および
(c)ヒト血清アルブミン(HSA)に結合する第3の抗原結合部位
を含む、多重特異性結合タンパク質。
【請求項２】
1本のポリペプチド鎖を含む、前記請求項のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項３】
前記ポリペプチド鎖において、第3の抗原結合部位が第1の抗原結合部位と第2の抗原結合部位との間に配置されていない、請求項2記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項４】
前記ポリペプチド鎖において、第3の抗原結合部位が、第1の抗原結合部位と第2の抗原結合部位の両方のN末端側に配置されている、請求項3記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項５】
前記ポリペプチド鎖において、第3の抗原結合部位が第1の抗原結合部位のN末端側に配置されており、かつ第1の抗原結合部位が第2の抗原結合部位のN末端側に配置されている、請求項4記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項６】
前記ポリペプチド鎖において、第3の抗原結合部位が第2の抗原結合部位のN末端側に配置されており、かつ第2の抗原結合部位が第1の抗原結合部位のN末端側に配置されている、請求項4記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項７】
前記ポリペプチド鎖において、第3の抗原結合部位が、第1の抗原結合部位と第2の抗原結合部位の両方のC末端側に配置されている、請求項3記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項８】
前記ポリペプチド鎖において、第1の抗原結合部位が第2の抗原結合部位のN末端側に配置されており、かつ第2の抗原結合部位が第3の抗原結合部位のN末端側に配置されている、請求項7記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項９】
前記ポリペプチド鎖において、第2の抗原結合部位が第1の抗原結合部位のN末端側に配置されており、かつ第1の抗原結合部位が第3の抗原結合部位のN末端側に配置されている、請求項7記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項１０】
前記ポリペプチド鎖において、第1の抗原結合部位が第3の抗原結合部位のN末端側に配置されており、かつ第3の抗原結合部位が第2の抗原結合部位のN末端側に配置されている、請求項2記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項１１】
前記ポリペプチド鎖において、第2の抗原結合部位が第3の抗原結合部位のN末端側に配置されており、かつ第3の抗原結合部位がN末端側結合タンパク質第1抗原結合部位に配置されている、請求項2記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項１２】
第1の抗原結合部位が単鎖可変断片(scFv)またはシングルドメイン抗体(sdAb)を含む、前記請求項のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項１３】
第1の抗原結合部位が単鎖可変断片(scFv)を含む、請求項12記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項１４】
第1の抗原結合部位が、20nMに等しいかまたはこれより低い解離定数(KD)でヒトCD19に結合する、前記請求項のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項１５】
第1の抗原結合部位が少なくとも60℃の融解温度を有する、前記請求項のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項１６】
第1の抗原結合部位が、相補性決定領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む重鎖可変ドメイン(VH)と、相補性決定領域LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン(VL)とを含み、
(a)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:3、4、5、6、7、および8に示したアミノ酸配列を含む、ならびに/または
(b)VHが、SEQ ID NO:1と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含み、かつVLが、SEQ ID NO:2と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む、
請求項1〜15のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項１７】
VHが、SEQ ID NO:1に示したアミノ酸配列を含み、かつVLが、SEQ ID NO:2に示したアミノ酸配列を含む、請求項16記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項１８】
第1の抗原結合部位が、相補性決定領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHと、相補性決定領域LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むVLとを含み、
(a)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:12、13、14、15、16、および17に示したアミノ酸配列を含む、ならびに/または
(b)VHが、SEQ ID NO:10と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含み、かつVLが、SEQ ID NO:11と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む、
請求項1〜15のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項１９】
VHが、SEQ ID NO:10に示したアミノ酸配列を含み、かつVLが、SEQ ID NO:11に示したアミノ酸配列を含む、請求項18記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項２０】
第2の抗原結合部位がscFvまたはsdAbを含む、前記請求項のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項２１】
第2の抗原結合部位がscFvを含む、請求項20記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項２２】
第2の抗原結合部位がヒトCD3εに結合する、前記請求項のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項２３】
第2の抗原結合部位が、10nMに等しいかまたはこれより低いKDでヒトCD3に結合する、前記請求項のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項２４】
第2の抗原結合部位が、10nMに等しいかまたはこれより低いKDでヒトCD3εに結合する、前記請求項のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項２５】
第2の抗原結合部位が少なくとも60℃の融解温度を有する、前記請求項のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項２６】
第2の抗原結合部位が、相補性決定領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHと、相補性決定領域LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むVLとを含み、
(a)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:99、100、101、102、103、および104に示したアミノ酸配列を含む;ならびに/または
(b)VHが、SEQ ID NO:97と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含み、かつVLが、SEQ ID NO:98と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む、
請求項1〜25のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項２７】
VHが、SEQ ID NO:97に示したアミノ酸配列を含み、かつVLがSEQ ID NO:98に示したアミノ酸配列を含む、請求項26記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項２８】
第3の抗原結合部位がscFvまたはsdAbを含む、前記請求項のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項２９】
第3の抗原結合部位がsdAbを含む、請求項28記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項３０】
第3の抗原結合部位が、20nMに等しいかまたはこれより低いKDでHSAに結合する、前記請求項のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項３１】
第3の抗原結合部位が少なくとも60℃の融解温度を有する、前記請求項のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項３２】
第3の抗原結合部位が、相補性決定領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHを含み、
(a)HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:122または123、124または125、および126に示したアミノ酸配列を含む、ならびに/または
(b)VHが、SEQ ID NO:121と少なくとも85％同一のアミノ酸配列を含む、
請求項1〜31のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項３３】
VHがSEQ ID NO:121に示したアミノ酸配列を含む、請求項32記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項３４】
少なくとも2つの隣接する抗原結合部位がペプチドリンカーによって接続されている、請求項1〜33のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項３５】
隣接する抗原結合部位のそれぞれがペプチドリンカーによって接続されている、請求項34記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項３６】
ペプチドリンカーがSEQ ID NO:298、299、または302のアミノ酸配列を含む、請求項34または35記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項３７】
ペプチドリンカーがSEQ ID NO:298、299、または302のアミノ酸配列からなる、請求項34または35記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項３８】
抗体Fc領域を含まない、前記請求項のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項３９】
多重特異性結合タンパク質の分子量が少なくとも65kDである、請求項1〜38のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項４０】
多重特異性結合タンパク質の分子量が50〜90kD、50〜80kD、50〜70kD、50〜60kD、60〜90kD、60〜80kD、60〜70kD、65〜90kD、65〜80kD、65〜70kD、70〜90kD、または70〜80kDの範囲である、請求項1〜38のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項４１】
多重特異性結合タンパク質の血清半減期が少なくとも24時間、36時間、48時間、または60時間である、前記請求項のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質。
【請求項４２】
請求項1〜41のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項４３】
請求項1〜41のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４４】
請求項43記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項４５】
請求項43記載のポリヌクレオチドまたは請求項44記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項４６】
多重特異性結合タンパク質を産生する方法であって、該多重特異性結合タンパク質の発現を可能にする適切な条件下で請求項45記載の宿主細胞を培養する工程を含む、方法。
【請求項４７】
多重特異性結合タンパク質を単離する工程をさらに含む、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
単離された多重特異性結合タンパク質を、薬学的に許容される担体と共に製剤化する工程をさらに含む、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
CD19を発現する細胞に対する免疫応答を刺激する方法であって、該細胞およびTリンパ球を、請求項1〜41のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質または請求項42記載の薬学的組成物に曝露する工程を含む、方法。
【請求項５０】
その必要がある対象において血液がんを処置する方法であって、有効量の請求項1〜41のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質または請求項42記載の薬学的組成物を該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項５１】
血液がんがB細胞血液悪性腫瘍である、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
CD3を発現するT細胞と、CD19を発現するB細胞と、請求項1〜41のいずれか一項記載の多重特異性結合タンパク質とを含む、複合体であって、該多重特異性結合タンパク質が該T細胞と該B細胞の両方に同時に結合する、複合体。
【請求項５３】
HSAをさらに含む、請求項52記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2018年6月7日に出願された米国仮特許出願第62/681,784号の恩典を主張し、これに基づく優先権を主張する。米国仮特許出願第62/681,784号の全開示は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、CD19、CD3、および血清アルブミンに結合する多重特異性結合タンパク質に関する。本発明はまた、これらの多重特異性結合タンパク質を含む薬学的組成物、これらの多重特異性結合タンパク質を作製するための発現ベクターおよび宿主細胞、ならびに血液がんの処置における、これらの多重特異性結合タンパク質の使用方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
二重特異性分子、例えば、BiTE(登録商標)(二重特異性T細胞誘導(bispecific T-cell engager))構築物は、可動連結された2つの抗体由来結合ドメインから作られた組換えタンパク質構築物である。BiTE(登録商標)構築物の一方の結合ドメインは、標的細胞上にある選択された腫瘍関連表面抗原に特異的であり、他方の結合ドメインは、T細胞上にあるT細胞受容体複合体のサブユニットであるCD3に特異的である。この設計によって、BiTE(登録商標)構築物はT細胞と標的細胞を一時的に接続すると同時に、標的細胞に対するT細胞の固有の細胞溶解能力を強力に活性化することができる。
【０００４】
CD3受容体複合体は、4本のポリペプチド鎖で構成されるタンパク質複合体である。哺乳動物では、この複合体は、1本のCD3γ(ガンマ)鎖、1本のCD3δ(デルタ)鎖、および2本のCD3ε(イプシロン)鎖を含有する。CD3γ(ガンマ)、CD3δ(デルタ)、およびCD3ε(イプシロン)鎖は、1つの細胞外免疫グロブリンドメインを含有する、免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連する細胞表面タンパク質である。これらの鎖はT細胞受容体(TCR)と結合してTCR-CD3複合体を形成し、抗原が結合するとTリンパ球において活性化シグナルを発生させる。T細胞の約95％は、1本のα(アルファ)鎖と1本のβ(ベータ)鎖を含有するαβTCRを発現する。TCR-CD3複合体には2本のTCRξ(ゼータ)鎖も存在する。αβTCRは、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)が提示する抗原の認識を担当している。TCRが抗原性ペプチドおよびMHC複合体と結合すると、Tリンパ球は、関連する酵素、補助受容体、専門のアダプター分子、および活性化または放出された転写因子によって媒介される一連の生化学的事象によって活性化される。
【０００５】
以前のBiTE(登録商標)構築物はCD3のコンホメーションエピトープに結合し、典型的には種特異的である(PCT公開番号WO2008119567A2(特許文献1)を参照されたい)。改良されたBiTE(登録商標)構築物、例えば、ブリナツモマブ(AMG103とも呼ばれる;PCT公開番号WO1999054440A1(特許文献2)を参照されたい)およびソリトマブ(solitomab)(AMG110とも呼ばれる;PCT公開番号WO2005040220A1(特許文献3)を参照されたい)は、CD3ε鎖のN末端にある、状況に依存しない(context-independent)エピトープ(例えば、ヒトCD3ε細胞外ドメインのアミノ酸残基1〜27)に結合し、ヒト、マーモセット(Callithrix jacchus)、ワタボウシタマリン(Saguinus Oedipus)、およびリスザル(Saimiri sciureus)CD3ε鎖に対して異種間特異性を示す(同書を参照されたい)。これらの構築物は、以前のBiTE(登録商標)構築物で観察されたものと同じ程度でT細胞を非特異的に活性化せず、従って、副作用の危険性は低いと考えられている(Brischwein et al. (2007) J. Immunother., 30(8): 798-807(非特許文献1)を参照されたい)。
【０００６】
BiTE(登録商標)構築物は身体からの急速なクリアランスを欠点としてもつと考えられている。従って、BiTE(登録商標)構築物は多くの身体領域に急速に浸透することができ、すぐに生成でき、取り扱いやすいが、インビボでは短時間しか残存しないことでインビボ用途は制限される場合がある。短いインビボ半減期のためにブリナツモマブおよびソリトマブの治療効果を実現するのには、連続静脈内注入による長期投与が必要な場合がある。しかしながら、このような連続静脈内注入は患者にとって不便であり、治療費用を増大する可能性がある。
【０００７】
多重特異性結合タンパク質の構築には大きな進展があったが、十分な治療効力と、製造が簡単なフォーマットと、長い半減期などの好ましい薬物動態学的特性とを有する、がんを処置するための新しい、かつ有用な多重特異性結合タンパク質が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO2008119567A2
【特許文献２】WO1999054440A1
【特許文献３】WO2005040220A1
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Brischwein et al. (2007) J. Immunother., 30(8): 798-807
【発明の概要】
【００１０】
本明細書において開示される多重特異性結合タンパク質は、CD19(例えば、ヒトCD19)に結合する第1のドメイン、CD3(例えば、ヒトおよび/またはマカクCD3)に結合する第2のドメイン、ならびに血清アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン(HSA))に結合する第3のドメインを含む。これらのドメインは、好ましい治療効力およびインビボ半減期のために、ある特定のやり方で連結されている。多重特異性結合タンパク質は、CD19発現細胞に対する免疫応答を刺激するのに使用することができる。結果として、多重特異性結合タンパク質は、ある特定のB細胞血液がんなどの、CD19を発現する異常細胞に関連する疾患または障害を処置するのに使用することができる。
【００１１】
一局面では、本開示は、(a)ヒトCD19に結合する第1の抗原結合部位;(b)ヒトCD3に結合する第2の抗原結合部位;および(c)ヒト血清アルブミン(HSA)に結合する第3の抗原結合部位を含む多重特異性結合タンパク質を提供する。
【００１２】
ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質は1本のポリペプチド鎖を含む。ある特定の態様では、ポリペプチド鎖において、第3の抗原結合部位は第1の抗原結合部位と第2の抗原結合部位との間に配置されていない。
【００１３】
ある特定の態様では、ポリペプチド鎖において、第3の抗原結合部位は第1の抗原結合部位と第2の抗原結合部位の両方のN末端側に配置されている。ある特定の態様では、ポリペプチド鎖において、第3の抗原結合部位は第1の抗原結合部位のN末端側に配置されており、かつ第1の抗原結合部位は第2の抗原結合部位のN末端側に配置されている。ある特定の態様では、ポリペプチド鎖において、第3の抗原結合部位は第2の抗原結合部位のN末端側に配置されており、かつ第2の抗原結合部位は第1の抗原結合部位のN末端側に配置されている。
【００１４】
ある特定の態様では、ポリペプチド鎖において、第3の抗原結合部位は第1の抗原結合部位と第2の抗原結合部位の両方のC末端側に配置されている。ある特定の態様では、ポリペプチド鎖において、第1の抗原結合部位は第2の抗原結合部位のN末端側に配置されており、かつ第2の抗原結合部位は第3の抗原結合部位のN末端側に配置されている。ある特定の態様では、ポリペプチド鎖において、第2の抗原結合部位は第1の抗原結合部位のN末端側に配置されており、かつ第1の抗原結合部位は第3の抗原結合部位のN末端側に配置されている。
【００１５】
ある特定の態様では、ポリペプチド鎖において、第1の抗原結合部位は第3の抗原結合部位のN末端側に配置されており、かつ第3の抗原結合部位は第2の抗原結合部位のN末端側に配置されている。ある特定の態様では、ポリペプチド鎖において、第2の抗原結合部位は第3の抗原結合部位のN末端側に配置されており、かつ第3の抗原結合部位はN末端側結合タンパク質第1抗原結合部位に配置されている。
【００１６】
ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は単鎖可変断片(scFv)またはシングルドメイン抗体(sdAb)を含む。ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は単鎖可変断片(scFv)を含む。ある特定の態様では、第1の抗原結合部位はヒトCD19に、20nMに等しいかまたはこれより低い解離定数(KD)で結合する(すなわち、20nMに等しいかまたはこれより強く結合する)。ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は少なくとも60℃の融解温度を有する。
【００１７】
ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は、相補性決定領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む重鎖可変ドメイン(VH)と、相補性決定領域LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン(VL)とを含み、(i)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3は、それぞれ、SEQ ID NO:3、4、5、6、7、および8に示したアミノ酸配列を含む、ならびに/または(ii)VHは、SEQ ID NO:1と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含み、VLは、SEQ ID NO:2と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、VHは、SEQ ID NO:1に示したアミノ酸配列を含み、VLは、SEQ ID NO:2に示したアミノ酸配列を含む。
【００１８】
ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は、相補性決定領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHと、相補性決定領域LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むVLとを含み、(i)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3は、それぞれ、SEQ ID NO:12、13、14、15、16、および17に示したアミノ酸配列を含む、ならびに/または(ii)VHは、SEQ ID NO:10と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含み、VLは、SEQ ID NO:11と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、VHは、SEQ ID NO:10に示したアミノ酸配列を含み、VLは、SEQ ID NO:11に示したアミノ酸配列を含む。
【００１９】
ある特定の態様では、第2の抗原結合部位はscFvまたはsdAbを含む。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位はscFvを含む。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位はヒトCD3εに結合する。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位はヒトCD3に、10nMに等しいかまたはこれより低いKDで結合する(すなわち、10nMに等しいかまたはこれより強く結合する)。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位はヒトCD3εに、10nMに等しいかまたはこれより低いKDで結合する。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位は少なくとも60℃の融解温度を有する。
【００２０】
ある特定の態様では、第2の抗原結合部位は、相補性決定領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHと、相補性決定領域LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むVLとを含み、(i)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3は、それぞれ、SEQ ID NO:99、100、101、102、103、および104に示したアミノ酸配列を含む、ならびに/または(ii)VHは、SEQ ID NO:97と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含み、VLは、SEQ ID NO:98と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、VHは、SEQ ID NO:97に示したアミノ酸配列を含み、VLは、SEQ ID NO:98に示したアミノ酸配列を含む。
【００２１】
ある特定の態様では、第3の抗原結合部位はscFvまたはsdAbを含む。ある特定の態様では、第3の抗原結合部位はsdAbを含む。ある特定の態様では、第3の抗原結合部位はHSAに、20nMに等しいかまたはこれより低いKDで結合する(すなわち、20nMに等しいかまたはこれより強く結合する)。ある特定の態様では、第3の抗原結合部位は少なくとも60℃の融解温度を有する。
【００２２】
ある特定の態様では、第3の抗原結合部位は、相補性決定領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHを含み、(i)HCDR1、HCDR2、およびHCDR3は、それぞれ、SEQ ID NO:122または123、124または125、および126に示したアミノ酸配列を含む、ならびに/または(ii)VHは、SEQ ID NO:121と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、VHは、SEQ ID NO:121に示したアミノ酸配列を含む。
【００２３】
ある特定の態様では、少なくとも2つの隣接する抗原結合部位はペプチドリンカーによって接続されている。ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質において、隣接する抗原結合部位のそれぞれがペプチドリンカーによって接続されている。ある特定の態様では、ペプチドリンカーは、SEQ ID NO:298、299、または302のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、ペプチドリンカーは、SEQ ID NO:298、299、または302のアミノ酸配列からなる。
【００２４】
ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質は抗体Fc領域を含まない。
【００２５】
ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質の分子量は少なくとも65kDである。ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質の分子量は、50〜90kD、50〜80kD、50〜70kD、50〜60kD、60〜90kD、60〜80kD、60〜70kD、65〜90kD、65〜80kD、65〜70kD、70〜90kD、または70〜80kDの範囲である。
【００２６】
ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質の血清半減期は少なくとも24時間、36時間、48時間、または60時間である。
【００２７】
別の局面では、本開示は、本明細書において開示される多重特異性結合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。
【００２８】
別の局面では、本開示は、本明細書において開示される多重特異性結合タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の局面では、本開示は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。別の局面では、本開示は、前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。
【００２９】
別の局面では、本開示は、多重特異性結合タンパク質を産生する方法であって、多重特異性結合タンパク質の発現を可能にする適切な条件下で、本明細書において開示される宿主細胞を培養する工程を含む、方法を提供する。ある特定の態様では、前記方法は、多重特異性結合タンパク質を単離する工程をさらに含む。ある特定の態様では、前記方法は、単離された多重特異性結合タンパク質を、薬学的に許容される担体と共に製剤化する工程をさらに含む。
【００３０】
別の局面では、本開示は、CD19を発現する細胞に対する免疫応答を刺激する方法であって、前記細胞およびTリンパ球を、本明細書において開示される多重特異性結合タンパク質または薬学的組成物に曝露する工程を含む、方法を提供する。
【００３１】
別の局面では、本開示は、その必要がある対象において血液がんを処置する方法であって、有効量の本明細書において開示される多重特異性結合タンパク質または薬学的組成物を対象に投与する工程を含む、方法を提供する。ある特定の態様では、血液がんはB細胞血液悪性腫瘍である。
【００３２】
別の局面では、本開示は、CD3を発現するT細胞と、CD19を発現するB細胞と、本明細書において開示される多重特異性結合タンパク質とを含む、複合体であって、多重特異性結合タンパク質がT細胞とB細胞に同時に結合する、複合体を提供する。ある特定の態様では、前記複合体はHSAをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】単鎖多重特異性結合タンパク質の6ドメイン配置の模式図である。シングルドメイン抗体(sdAb)の形をしたCD19結合ドメイン、単鎖可変断片(scFv)の形をしたCD3結合ドメイン、およびsdAbの形をしたHSA結合ドメインが様々な位置付けで連結されている。各構築物の上部は、ある特定のポリペプチド鎖のN末端を表しており、各構築物の下部はC末端を表している。
【図２】単鎖多重特異性結合タンパク質の6ドメイン配置の模式図である。scFvの形をしたCD19結合ドメイン、scFvの形をしたCD3結合ドメイン、およびsdAbの形をしたHSA結合ドメインが様々な位置付けで連結されている。各構築物の上部は、ある特定のポリペプチド鎖のN末端を表しており、各構築物の下部はC末端を表している。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
詳細な説明
本明細書において開示される多重特異性結合タンパク質は、CD19(例えば、ヒトCD19)に結合する第1のドメイン、CD3(例えば、ヒトCD3)に結合する第2のドメイン、および血清アルブミン(例えば、HSA)に結合する第3のドメインを含む。これらのドメインは、好ましい治療効力およびインビボ半減期のために、ある特定のやり方で連結されている。多重特異性結合タンパク質を含む薬学的組成物、多重特異性結合タンパク質または薬学的組成物を用いて疾患または障害を処置する方法、ならびに多重特異性結合タンパク質を産生する方法も提供される。本発明の様々な局面が下記のセクションにおいて説明される。しかしながら、ある特定のセクションにおいて説明される本発明の局面は、どの特定のセクションにも限定されてはならない。
【００３５】
本発明の理解を容易にするために、多くの用語と句が下記で定義される。
【００３６】
「多重特異性結合タンパク質」という用語は、構造および/または機能が、抗体、例えば、完全長または全免疫グロブリン分子の構造および/または機能に基づいている、あるいは抗体の重鎖可変ドメイン(VH)および/もしくは軽鎖可変ドメイン(VL)ならびに/またはその単鎖変種に基づいている多重特異性分子を指す。従って、多重特異性結合タンパク質はその特異的な標的または抗原に結合することができる。さらに、本発明に従う多重特異性結合タンパク質の結合ドメインのいずれか1つは、標的結合を可能にする、抗体の構造最小要件を含む。この最小要件は、例えば、少なくとも、3つの重鎖CDR(すなわち、VHドメインのCDR1、CDR2、およびCDR3)ならびに/または3つの軽鎖CDR(すなわち、VLドメインのCDR1、CDR2、およびCDR3)の存在によって定義され得る。抗体の構造最小要件を定義する別のアプローチは、抗体が結合する特異的標的のエピトープを定義すること、または既知の抗体が結合する同じエピトープに抗体が結合するように競合する既知の抗体について言及することである。本発明に従う構築物の基礎となる抗体には、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫化(deimmunized)抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体が含まれる。
【００３７】
本発明に従う多重特異性結合タンパク質の結合ドメインのいずれか1つが、CDRの上記で言及された群を含む場合がある。これらのCDRはVHおよび/またはVLのフレームワークの中に含まれてもよい。Fd断片は、例えば、2つのVHドメインを有し、多くの場合、インタクトな抗原結合ドメインのいくらかの抗原結合機能を保持している。抗体断片、抗体変種、または結合ドメインのフォーマットのさらなる例には、(1)VL、VH、CLおよびCH1ドメインを有する一価断片であるFab断片;(2)2つのFab断片がヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結されている二価断片であるF(ab')2断片;(3)2つのVHおよびCH1ドメインを有するFd断片;(4)抗体のシングルアームのVLドメインおよびVHドメインを有するFv断片;(5)dAb断片(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)。dAb断片はVHドメインを有する;(6)単離された相補性決定領域(CDR);ならびに(7)単鎖Fv(scFv)が含まれる。単鎖Fv(scFv)は、例えば、scFvライブラリーに由来する場合がある。本発明に従う多重特異性結合タンパク質の例示的なフォーマットは、例えば、WO2000006605A2、WO2005040220A1、WO2008119567A2、WO2010037838A2、WO2013026837A1、WO2013026833A1、US20140308285A1、US20140302037A1、WO2014144722A2、WO2014151910A1、およびWO2015048272A1に記載されている。
【００３８】
本発明に従う多重特異性結合タンパク質はまた、抗体変種、例えば、di-scFvもしくはbi(s)-scFv、scFv-Fc、scFv-zipper、scFab、Fab2、Fab3、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ(Tandab's)、タンデムdi-scFv、タンデムtri-scFv、「マルチボディ」、例えば、トリアボディまたはテトラボディ、あるいはシングルドメイン抗体、例えば、ナノボディ、または他のV領域もしくはドメインとは独立して抗原もしくはエピトープに特異的に結合する、VH(sdAbの状況ではVHHとも呼ばれる)もしくはVLの場合がある、シングル可変ドメインを含むシングル可変ドメイン抗体とも呼ばれる、改変された抗体断片を含む場合がある。
【００３９】
本明細書で使用する「単鎖Fv」、「単鎖抗体」、および「scFv」という用語は、重鎖および軽鎖に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠く単ポリペプチド鎖抗体断片を指す。一般的に、単鎖抗体は、望ましい構造を形成して抗原に結合することを可能にする、VHドメインとVLドメインを接続するペプチドリンカーをさらに含む。単鎖抗体は、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315(1994)に詳細に議論されている。米国特許第4,694,778号および同第5,260,203号;国際特許出願公開番号WO88/01649; Bird (1988) Science 242:423-442; Huston et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Ward et al.(1989) Nature 334:54454; Skerra et al.(1988) Science 242:1038-1041に記載の方法を含む、単鎖抗体を作製する様々な方法が公知である。特定の態様では、単鎖抗体はまた二重特異性、多重特異性、ヒト、ヒト化、および/または合成でもよい。
【００４０】
さらに、本明細書に記載の「多重特異性結合タンパク質」は一価構築物でもよく、二価構築物でもよく、多価(polyvalent)/多価(multivalent)構築物でもよい。さらに、本明細書に記載の「多重特異性結合タンパク質」は1本だけのポリペプチド鎖からなる分子を含んでもよく、複数のポリペプチド鎖からなる分子を含んでもよく、これらの鎖は同一でもよく(ホモ二量体、ホモ三量体、またはホモオリゴマー)、異なってもよい(ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、またはヘテロオリゴマー)。上記の特定された抗体およびその変種または誘導体の例は、例えば、Harlow and Lane, Antibodies a laboratory manual, CSHL Press (1988); Using Antibodies: a laboratory manual, CSHL Press (1999); Kontermann and Dibel, Antibody Engineering, Springer, 2nd ed. 2010;およびLittle, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009に記載されている。
【００４１】
本発明の多重特異性結合タンパク質のドメインは1つまたは複数のペプチド結合および/またはペプチドリンカーを介して接続される場合がある。「ペプチドリンカー」という用語は、本発明によれば、2つのドメインを連結するアミノ酸配列を含む。ペプチドリンカーはまた第3のドメインを本発明の多重特異性結合タンパク質の他のドメインと融合するのに使用することもできる。このようなペプチドリンカーの必須の技術的特徴は重合活性を全く含まないことである。適切なペプチドリンカーには、米国特許第4,751,180号および同第4,935,233号またはWO198809344A1に記載のペプチドリンカーが含まれる。
【００４２】
本発明の多重特異性結合タンパク質は、インビトロで生成された多重特異性結合タンパク質でもよい。「インビトロで生成された多重特異性結合タンパク質」という用語は、可変領域の全てまたは一部(例えば、少なくとも1つのCDR)が、非免疫細胞選択、例えば、インビトロファージディスプレイ、タンパク質チップ、または抗原に結合する能力があるかどうか候補配列を試験することができる他の任意の方法によって生成された、上記の定義に従う多重特異性結合タンパク質を指す。本発明の多重特異性結合タンパク質はまた、動物における免疫細胞中でのゲノム再編成によって生成されてもよい。「組換え抗体」は、組換えDNA技術または遺伝子工学の使用によって作製された抗体である。
【００４３】
本発明の多重特異性結合タンパク質はモノクローナルでもよい。本明細書で使用する「モノクローナル」という用語は、集団から得られたタンパク質が実質的に均一である、すなわち、集団内にある個々のタンパク質が、存在する可能性がある天然の変異および/または翻訳後修飾(例えば、異性化、アミド化)を除いて同一であることを意味する。抗体という面に関して、典型的に、異なる決定基(またはエピトープ)に対して作られた異なる抗体を含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体は高度に特異的であり、抗原上にある1つの抗原性側面(side)または決定基に対して作られている。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られたという抗体の特徴を示し、特定の方法による抗体の産生が必要であると解釈してはならない。
【００４４】
本発明の多重特異性結合タンパク質またはその1つもしくは複数の抗原結合部位は親和性成熟されてもよい。免疫学では、親和性成熟は、B細胞が、免疫応答中に抗原に対して高い親和性で抗体を産生するプロセスである。同じ抗原に繰り返し曝露されると、宿主は、連続して大きくなった親和性の抗体を産生する。天然のプロトタイプとは異なり、インビトロ親和性成熟は変異と選択の原理に基づいている。ファージディスプレイなどのディスプレイ法を用いて2回または3回の変異と選択を行うと、親和性が低ナノモル濃度範囲の抗体断片を得ることができる。
【００４５】
親抗体の1つまたは複数の超可変領域残基を置換することによってアミノ酸置換変化を多重特異性結合タンパク質(例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体)に導入することができる。一般的に、さらなる開発のために選択された、結果として生じた変種は、変種の元となった親抗体と比べて改善した生物学的特性を有する。このような置換変種を作製するための便利な手法は、ファージディスプレイを用いた親和性成熟を伴う。簡単に言うと、いくつかの超可変領域側面(例えば、6〜7の側面)を、それぞれの側面において可能性がある全てのアミノ酸置換を生成するように変異させる。このように生成された抗体変種を、繊維状ファージ粒子から、それぞれの粒子の中に入れられたM13遺伝子III産物の融合として一価でディスプレイする。次いで、本明細書において開示されるように生物学的活性(例えば、結合親和性)があるかどうか、ファージにディスプレイされた変種をスクリーニングする。改変のために候補超可変領域側面を特定するために、アラニンスキャニング変異誘発を行って、抗原結合に大きく寄与する超可変領域残基を特定することができる。その代わりに、またはそれに加えて、結合ドメイン間の接触点を特定するために抗原-抗体複合体の結晶構造を分析することが有益な場合がある。このような接触残基および隣接残基は、本明細書において詳しく説明されている技法に従って置換するための候補である。このような変種が作製されたら、変種パネルを、本明細書に記載のようにスクリーニングに供する。さらなる開発のために、1つまたは複数の関連するアッセイにおいて優れた特性を有する抗体が選択される場合がある。
【００４６】
本発明の多重特異性結合タンパク質は、具体的には、望ましい生物学的活性を示す限り、重鎖および/または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同であり、鎖の残りが、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)またはその断片を含んでもよい(米国特許第4,816,567号; Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81: 6851-55)。本明細書において関心対象のキメラ抗体は、非ヒト霊長類(例えば、旧世界ザル、類人猿など)に由来する可変ドメイン抗原結合配列またはヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む。キメラ抗体を作製する様々なアプローチが説明されている。例えば、Morrison et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:6851; Takeda et al. (1985) Nature, 314: 452;米国特許第4,816,567号;米国特許第4,816,397号;欧州特許第EP0171496号;欧州特許出願公開番号EP0173494;および英国特許番号GB2177096を参照されたい。
【００４７】
「結合ドメイン」または「(抗原)に結合するドメイン」という用語は、本発明に関連して、標的分子(抗原)、例えば、CD19、血清アルブミン、およびCD3上にある、ある特定の標的エピトープまたはある特定の標的側面に(特異的に)結合するか、またはこれと(特異的に)相互作用するドメインを特徴付ける。第1の結合ドメイン、第2の結合ドメイン、および/または第3の結合ドメインの構造および機能は、抗体、例えば、完全長または全免疫グロブリン分子の構造および/または機能に基づく場合がある。結合ドメインは抗体のVHおよび/もしくはVLまたはVHHドメインあるいはその断片から得ることができる。例えば、結合ドメインは3つの軽鎖CDR(すなわち、VLドメインのCDR1、CDR2、およびCDR3)ならびに/または3つの重鎖CDR(すなわち、VHドメインのCDR1、CDR2、およびCDR3)を含んでもよい。結合ドメインはまたVHH CDR(すなわち、VHH領域のCDR1、CDR2、およびCDR3)も含んでよい。
【００４８】
「可変ドメイン」および「可変領域」という用語は同義で用いられ、配列中に可変性を示し、特定の抗体の特異性および結合親和性の決定に関与する、抗体または免疫グロブリンドメインの部分を指す。可変性は抗体の可変ドメイン全体に均一に分布していない。すなわち、可変性は重鎖可変領域および軽鎖可変領域それぞれのサブドメインに集中している。これらのサブドメインは「超可変領域」または「相補性決定領域」(CDR)と呼ばれる。可変ドメインのもっと保存されている(すなわち、非超可変の)部分は「フレームワーク」領域(FRMまたはFR)と呼ばれ、6つのCDRが三次元空間で抗原結合表面を形成するための足場となる。
【００４９】
本発明では、多重特異性結合タンパク質の結合ドメインのいずれか1つがシングルドメイン抗体(sdAb)を含む場合がある。シングルドメイン抗体は、他の可変領域またはドメインに関係なく、特異的抗原に選択的に結合することができる1つの単量体抗体可変ドメインを含む。第1のシングルドメイン抗体を、ラクダ科の動物において見出される重鎖抗体から操作した。これらはVHH断片と呼ばれる。軟骨魚類も重鎖抗体(IgNAR)を有し、重鎖抗体(IgNAR)からVNAR断片と呼ばれるシングルドメイン抗体を得ることができる。代替アプローチは、よくある免疫グロブリン、例えば、ヒトまたはげっ歯類に由来する二量体可変ドメインを単量体に分割し、従って、シングルドメイン抗体としてVHまたはVLを得ることである。現在、シングルドメイン抗体のほとんどの研究は重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖に由来するナノボディも標的エピトープに特異的に結合することが示されている。シングルドメイン抗体の例にはナノボディおよびシングル可変ドメイン抗体が含まれる。
【００５０】
本明細書で使用する「抗原結合部位」という用語は、抗原結合に関与する、免疫グロブリン分子の一部またはその誘導体もしくは変種を指す。ヒト抗体において、抗原結合部位は重(「H」)鎖および軽(「L」)鎖のN末端可変(「V」)領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のV領域内にある3つの高度に多岐にわたる区間は「超可変領域」と呼ばれ、「フレームワーク領域」または「FR」として知られる、より保存された隣接区間の間に挿入されている。従って、「FR」という用語は、免疫グロブリンにおいて超可変領域間にあり、かつ超可変領域に隣接して天然で見出されるアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子では、軽鎖の3つの超可変領域と、重鎖の3つの超可変領域が三次元空間で抗原結合表面を形成するように互いに配置されている。抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面に相補的であり、重鎖および軽鎖それぞれの3つの超可変領域は「相補性決定領域」または「CDR」と呼ばれる。ラクダおよび軟骨魚類などの、ある特定の動物では、抗原結合部位は、「シングルドメイン抗体」を提供する1本の抗体鎖によって形成される。抗原結合部位はインタクトな抗体に存在してもよく、抗原結合表面を保持する抗体の抗原結合断片に存在してもよく、1本のポリペプチドにおいて重鎖可変ドメインを軽鎖可変ドメインに接続するペプチドリンカーを用いて組換えポリペプチド、例えば、scFvに存在してもよい。
【００５１】
本明細書で使用する「1つの(a)」および「1つの(an)」という用語は「1つまたは複数の」を意味し、文脈が不適切でない限り複数を含む。
【００５２】
本明細書で使用する「対象」および「患者」という用語は、本明細書に記載の方法および組成物によって処置される生物を指す。このような生物には、好ましくは、哺乳動物(例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど)が含まれるが、これに限定されず、より好ましくは、ヒトが含まれる。
【００５３】
本明細書で使用する「有効量」という用語は、有益な、または望ましい結果をもたらすのに十分な、化合物(例えば、本発明の化合物)の量を指す。有効量は1回または複数回の投与、適用、または投薬で投与することができ、特定の製剤または投与経路に限定されることが意図されない。本明細書で使用する「処置する」という用語は、状態、疾患、障害などの改善をもたらす、またはその症状を寛解させる、任意の効果、例えば、和らげる、軽減する、調節する、寛解させる、もしくは排除する効果を含む。
【００５４】
本明細書で使用する「薬学的組成物」という用語は、活性薬剤と、不活性または活性な担体との組み合わせを指し、これにより、前記組成物はインビボまたはエクスビボでの診断用途または治療用途に特に適するようになる。
【００５５】
本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」という用語は、任意の標準的な薬学的担体、例えば、リン酸緩衝食塩溶液、水、エマルジョン(例えば、油/水または水/油エマルジョン)、および様々なタイプの湿潤剤を指す。前記組成物はまた安定剤および防腐剤も含んでよい。担体、安定剤、およびアジュバントの例については、例えば、Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA (1975)を参照されたい。
【００５６】
説明全体を通して、組成物が特定の成分を有する、含む(including)、もしくは含む(comprising)と説明されている場合、またはプロセスおよび方法が特定の工程を有する、含む(including)、もしくは含む(comprising)と説明されている場合、列挙された成分から本質的になるか、または列挙された成分からなる本発明の組成物がさらにあり、列挙された処理工程から本質的になるか、または列挙された処理工程からなる本発明に従うプロセスおよび方法があると意図される。
【００５７】
一般事項として、パーセントを明記する組成物は、他で特定しない限り重量パーセントである。さらに、変数が定義を伴わなければ、変数の以前の定義が優先される。
【００５８】
I.多重特異性結合タンパク質
一局面では、本開示は、CD19(例えば、ヒトCD19)に結合する第1のドメイン、CD3(例えば、ヒトおよび/またはマカクCD3)、例えば、CD3ε(イプシロン)、CD3δ(デルタ)、および/またはCD3γ (ガンマ)に結合する第2のドメイン、ならびに血清アルブミン(例えば、HSA)に結合する第3のドメインを含む多重特異性結合タンパク質を提供する。
【００５９】
ある特定の態様では、第1のドメインは、CD19に結合する第1の抗原結合部位である。ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は抗体重鎖可変ドメイン(VH)を含む。ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は抗体軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。ある特定の態様では、第1の抗原結合部位はVHおよびVLを含む。ある特定の態様では、第1の抗原結合部位はsdAbを含む。ある特定の態様では、第1の抗原結合部位はscFvを含む。
【００６０】
ある特定の態様では、第2のドメインは、CD3に結合する第2の抗原結合部位である。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位はVHを含む。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位はVLを含む。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位はVHおよびVLを含む。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位はsdAbを含む。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位はscFvを含む。
【００６１】
ある特定の態様では、第3のドメインは、血清アルブミンに結合する第3の抗原結合部位である。ある特定の態様では、第3の抗原結合部位はVHを含む。ある特定の態様では、第3の抗原結合部位はVL領域を含む。ある特定の態様では、第3の抗原結合部位はVH領域およびVL領域を含む。ある特定の態様では、第3の抗原結合部位はsdAbを含む。ある特定の態様では、第3の抗原結合部位はscFvを含む。
【００６２】
または、結合ドメインの1つまたは複数は抗原結合部位を含まない場合があることも意図される。例えば、米国特許出願公開番号US20130316952A1は、
2021526862.tif 000003
のアミノ酸配列を有する血清アルブミンに結合するポリペプチドを開示する。HSAに結合する、さらなる例示的なポリペプチドは、Dennis et al. (2002) J. Biol. Chem., 277: 35035-43; Jacobs et al. (2015) Protein Eng. Des. Sel., 28: 385-93;およびZorzi et al. (2017) Nat. Commun., 8: 16092に記載されている。
【００６３】
ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質は抗体Fc領域をさらに含む。Fc領域が存在すると多重特異性結合タンパク質の血清半減期が延長する場合がある。使用される特定のFcサブタイプおよび変種に応じて、Fc領域は多重特異性結合タンパク質の活性(例えば、細胞傷害活性)も変える場合がある。
【００６４】
他の態様では、多重特異性結合タンパク質は抗体Fc領域を含まない。Fcの非存在は多重特異性結合タンパク質のサイズの小型化に寄与し、これは、改善された組織浸透および薬物動態学的特性を示すことができる。ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質は、第1の抗原結合部位、第2の抗原結合部位、および第3の抗原結合部位と、これらの間にあるリンカーからなるか、またはこれらから本質的になる。ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質は、第1の抗原結合部位、第2の抗原結合部位、および第3の抗原結合部位から本質的になる。
【００６５】
ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質はCD19、CD3、および/または血清アルブミンに一価で結合する。さらなる結合ドメインを除外すると、非特異的な免疫細胞活性化のリスクが低下し、多重特異性結合タンパク質のサイズが小さくなる。
【００６６】
A.第1の抗原結合部位
多重特異性結合タンパク質の第1の抗原結合部位はCD19(例えば、ヒトCD19)に結合する。
【００６７】
CD19はB細胞表面抗原B4またはLeu-12とも知られ、Bリンパ球および濾胞性樹状細胞上で発現する膜貫通タンパク質である。CD19は、Bリンパ球上にあるB細胞抗原受容体複合体の補助受容体である(Carter et al. (2002) Science, 256: 105-07; van Zelm et al. (2006) N. Eng. J. Med., 354: 1901-12を参照されたい)。CD19はCD21、CD81、およびLeu-13に結合し、B細胞受容体(BCR)シグナル伝達を増強する。BCRと共にCD19は、B細胞のクローン増殖および体液性免疫に重要な内因性の、かつ抗原受容体によって誘導されるシグナル伝達閾値を調節する。活性化されるとCD19の細胞質テールはリン酸化することで、Src-ファミリーキナーゼが結合し、PI-3キナーゼが動員される。
【００６８】
CD19は、プレB細胞発生の初期段階から、形質細胞に向かう終末分化まで発現するヒトB細胞表面マーカーである。CD19はまた、多くの非ホジキンリンパ腫(NHL)細胞と、ある特定の白血病でも発現する。CD19に結合する抗体が開発されており、リンパ系由来のがん、例えば、B細胞悪性腫瘍に対する臨床研究において試験されている(例えば、Hekman et al. (1991) Cancer Immunol. Immunother., 32: 364-72; Vlasfeld et al. (1995) Cancer Immunol. Immunother., 40: 37-47; Corny et al. (1995) J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol., 18: 231-41;およびManzke et al. (2001) Int. J. Cancer, 91: 516-22を参照されたい)。さらに、ブリナツモマブと呼ばれるBiTE(登録商標)構築物が臨床用途に開発されている。
【００６９】
CD19に結合する第1の抗原結合部位は、例えば、MT-103(単鎖二重特異性CD19/CD3抗体; Hoffman et al. (2005) Int. J. Cancer, 115: 98-104; Schlereth et al. (2006) Cancer Immunol. Immunother. 55: 503-14を参照されたい)、CD19/CD16ダイアボディ(Schlenzka et al. (2004) Anti-cancer Drugs 15: 915-19; Kipriyanov et al. (2002) J. Immunol. 169: 137-44を参照されたい)、BU12-サポリン(Flavell et al. (1995) Br. J. Cancer 72: 1373-79を参照されたい)、および抗CD19-イダルビシン(Rowland et al. (1993) Cancer Immunol. Immunother. 55: 503-14を参照されたい)から得ることができる。本発明の第1の抗原結合部位が導き出され得る、CD19に結合するさらなる例示的な抗原結合部位は、米国特許出願公開番号US20170174786A1、US20090042291A1、US20160046730A1、US20070154473A1、US20090142349A1、US20180142018A1、US20090136526A1、US20060257398A1、およびUS20180230225A1、およびPCT公開番号WO2019057100A1に開示される。
【００７０】
CD19に結合する第1の抗原結合部位は、3つの相補性領域(HCDR1、HCDR2、およびHCDR3)を含むVH、ならびに/または3つの相補性領域(LCDR1、LCDR2、およびLCDR3)を含むVLを含むことができる。表1は、各可変領域について、可変領域のCDR、ならびに示された重鎖可変領域および軽鎖可変領域に基づくscFv構築物をまとめたものである。第1の抗原結合部位は、表1に列挙したような例示的な可変ドメインおよびCDR配列から得ることができる。
【００７１】
（表１）例示的な第1の抗原結合部位の配列
2021526862.tif 000004
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VLおよびLCDR配列が「N/A」で示されている場合、抗原結合部位は、VH(例えば、VHH)のみを有するsdAbである。
【００７２】
ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は、相補性決定領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHと、相補性決定領域LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むVLとを含む。ある特定の態様では、VHは、表1に示した抗体のVHと少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含み、VLは、表1に示した抗体のVLと少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、VHは、表1に示した抗体のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3配列を含み、VLは、表1に示した抗体のLCDR1、LCDR2、およびLCDR3配列を含む。ある特定の態様では、VHは、表1に示した抗体のVHのアミノ酸配列を含み、VLは、表1に示した抗体のVLのアミノ酸配列を含む。
【００７３】
ある特定の態様では、第1の抗原結合部位のVHは、SEQ ID NO:1と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含み、第1の抗原結合部位のVLは、SEQ ID NO:2と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、VHは、それぞれSEQ ID NO:3、4、および5に示したHCDR1、HCDR2、およびHCDR3配列を含み、VLは、それぞれSEQ ID NO:6、7、および8に示したLCDR1、LCDR2、およびLCDR3配列を含む。ある特定の態様では、VHは、SEQ ID NO:1に示したアミノ酸配列を含み、VLは、SEQ ID NO:2に示したアミノ酸配列を含む。
【００７４】
ある特定の態様では、第1の抗原結合部位のVHは、SEQ ID NO:10と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含み、第1の抗原結合部位のVLは、SEQ ID NO:11と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、VHは、それぞれSEQ ID NO:12、13、および14に示したHCDR1、HCDR2、およびHCDR3配列を含み、VLは、それぞれSEQ ID NO:15、16、および17に示した LCDR1、LCDR2、およびLCDR3配列を含む。ある特定の態様では、VHは、SEQ ID NO:10に示したアミノ酸配列を含み、VLは、SEQ ID NO:11に示したアミノ酸配列を含む。
【００７５】
ある特定の態様では、第1の抗原結合部位のVHは、SEQ ID NO:19と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含み、第1の抗原結合部位のVLは、SEQ ID NO:20と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、VHは、それぞれSEQ ID NO:21、22、および23に示したHCDR1、HCDR2、およびHCDR3配列を含み、VLは、それぞれSEQ ID NO:24、25、および26に示したLCDR1、LCDR2、およびLCDR3配列を含む。ある特定の態様では、VHは、SEQ ID NO:19に示したアミノ酸配列を含み、VLは、SEQ ID NO:20に示したアミノ酸配列を含む。
【００７６】
ある特定の態様では、第1の抗原結合部位のVHは、SEQ ID NO:27と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含み、第1の抗原結合部位のVLは、SEQ ID NO:28と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、VHは、それぞれSEQ ID NO:29、30、および31に示したHCDR1、HCDR2、およびHCDR3配列を含み、VLは、それぞれSEQ ID NO:32、33、および34に示したLCDR1、LCDR2、およびLCDR3配列を含む。ある特定の態様では、VHは、SEQ ID NO:27に示したアミノ酸配列を含み、VLは、SEQ ID NO:28に示したアミノ酸配列を含む。
【００７７】
ある特定の態様では、第1の抗原結合部位のVHは、SEQ ID NO:35と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含み、第1の抗原結合部位のVLは、SEQ ID NO:36と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、VHは、それぞれSEQ ID NO:29、30、および31に示したHCDR1、HCDR2、およびHCDR3配列を含み、VLは、それぞれSEQ ID NO:32、33、および34に示したLCDR1、LCDR2、およびLCDR3配列を含む。ある特定の態様では、VHは、SEQ ID NO:35に示したアミノ酸配列を含み、VLは、SEQ ID NO:36に示したアミノ酸配列を含む。
【００７８】
ある特定の態様では、第1の抗原結合部位のVHは、SEQ ID NO:37と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含み、第1の抗原結合部位のVLは、SEQ ID NO:38と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、VHは、それぞれSEQ ID NO:39、40、および41に示したHCDR1、HCDR2、およびHCDR3配列を含み、VLは、それぞれSEQ ID NO:42、43、および44に示したLCDR1、LCDR2、およびLCDR3配列を含む。ある特定の態様では、VHは、SEQ ID NO:37に示したアミノ酸配列を含み、VLは、SEQ ID NO:38に示したアミノ酸配列を含む。
【００７９】
ある特定の態様では、第1の抗原結合部位のVHは、SEQ ID NO:45と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含み、第1の抗原結合部位のVLは、SEQ ID NO:46と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、VHは、それぞれSEQ ID NO:47、48、および49に示したHCDR1、HCDR2、およびHCDR3配列を含み、VLは、それぞれSEQ ID NO:50、51、および52に示したLCDR1、LCDR2、およびLCDR3配列を含む。ある特定の態様では、VHは、SEQ ID NO:45に示したアミノ酸配列を含み、VLは、SEQ ID NO:46に示したアミノ酸配列を含む。
【００８０】
ある特定の態様では、第1の抗原結合部位のVHは、SEQ ID NO:86と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含み、第1の抗原結合部位のVLは、SEQ ID NO:87と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、VHは、それぞれSEQ ID NO:88、89、および90に示したHCDR1、HCDR2、およびHCDR3配列を含み、VLは、それぞれSEQ ID NO:91、92、および93に示したLCDR1、LCDR2、およびLCDR3配列を含む。ある特定の態様では、VHは、SEQ ID NO:86に示したアミノ酸配列を含み、VLは、SEQ ID NO:87に示したアミノ酸配列を含む。
【００８１】
このような抗原結合部位はscFvの形をとる場合がある。ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は、表1に示したscFv配列と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は、SEQ ID NO:9、18、96、212、215、218、221、224、227、230、233、236、239、242、245、248、251、254、または257と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。
【００８２】
他の態様では、第1の抗原結合部位は、相補性決定領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHを含むsdAbを含む。ある特定の態様では、VHは、表1に示したsdAb抗体のVHと少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、VHは、表1に示した抗体のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3配列を含む。ある特定の態様では、VHは、表1に示したsdAbのVHのアミノ酸配列を含む。
【００８３】
ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は、CD19(例えば、ヒトCD19)との結合において、表1に示したVH、VL、および/またはscFv配列を含む抗体またはその抗原結合断片と競合する。
【００８４】
ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質の第1の抗原結合部位はCD19(例えば、ヒトCD19)に約10pM〜約1μMの解離定数(KD)で結合する。KDは当技術分野において公知の方法によって測定することができる。ある特定の態様では、KDは、チップ上に固定化されたCD19またはその細胞外断片に対するSPRによって測定される。ある特定の態様では、KDは、例えば、以下の実施例5に記載の方法に従って、細胞表面に発現しているCD19に対するフローサイトメトリーによって測定される。
【００８５】
ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は、CD19に、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM、40pM、30pM、20pM、または10pMより低いか、またはこれに等しいKDで結合する。例えば、ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は、CD19に、約10pM〜約1nM、約10pM〜約0.9nM、約10pM〜約0.8nM、約10pM〜約0.7nM、約10pM〜約0.6nM、約10pMnM〜約0.5nM、約10pM〜約0.4nM、約10pM〜約0.3nM、約10pM〜約0.2nM、約10pM〜約0.1nM、約10pM〜約50pM、0.1nM〜約10nM、約0.1nM〜約9nM、約0.1nM〜約8nM、約0.1nM〜約7nM、約0.1nM〜約6nM、約0.1nM〜約5nM、約0.1nM〜約4nM、約0.1nM〜約3nM、約0.1nM〜約2nM、約0.1nM〜約1nM、約0.1nM〜約0.5nM、約0.5nM〜約10nM、約1nM〜約10nM、約2nM〜約10nM、約3nM〜約10nM、約4nM〜約10nM、約5nM〜約10nM、約6nM〜約10nM、約7nM〜約10nM、約8nM〜約10nM、または約9nM〜約10nMのKDで結合する。
【００８６】
ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は、CD19に、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、または100nMより大きいか、またはこれに等しいKDで結合する。ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は、CD19に、約10nM〜約1000nM、約10nM〜約900nM、約10nM〜約800nM、約10nM〜約700nM、約10nM〜約600nM、約10nM〜約500nM、約10nM〜約400nM、約10nM〜約300nM、約10nM〜約200nM、約10nM〜約100nM、約10nM〜約50nM、約50nM〜約1000nM、約100nM〜約1000nM、約200nM〜約1000nM、約300nM〜約1000nM、約400nM〜約1000nM、約500nM〜約1000nM、約600nM〜約1000nM、約700nM〜約1000nM、約800nM〜約1000nM、または約900nM〜約1000nMのKDで結合する。
【００８７】
第1の抗原結合部位のみの場合の、CD19に対する結合親和性は、本明細書において開示される多重特異性結合タンパク質の状況での同じ抗原結合部位の結合親和性とは異なる場合があると理解される。これは、おそらく、他のドメインからのコンホメーション制約が原因である。状況に依存する結合親和性は、「結合親和性」という表題のサブセクションI.Gに記載されている。
【００８８】
融解温度は抗原結合部位の耐熱性を表しており、例えば、Durowoju et al. (2017) J. Vis. Exp. (121): 55262に記載のように示差走査蛍光定量法によって測定することができる。抗体またはその断片の耐熱性は、McConnell et al. (2014) MAbs, 6(5): 1274-82;およびGoldman et al. (2017) Front. Immunol., 8: 865に記載のように、CDRを安定したフレームワークにつなぐことによって、非古典的ジスルフィド結合を導入することによって、および他の変異誘発によって強化される場合がある。
【００８９】
ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は少なくとも50℃、少なくとも55℃、少なくとも56℃、少なくとも57℃、少なくとも58℃、少なくとも59℃、少なくとも60℃、少なくとも61℃、少なくとも62℃、少なくとも63℃、少なくとも64℃、少なくとも65℃、少なくとも70℃、少なくとも75℃、または少なくとも80℃の融解温度を有する。ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は50〜80℃、50〜70℃、50〜65℃、50〜60℃、50〜55℃、55〜70℃、55〜65℃、55〜60℃、56〜65℃、56〜60℃、57〜65℃、57〜60℃、58〜65℃、58〜60℃、59〜65℃、59〜60℃、60〜80℃、60〜75℃、60〜70℃、60〜65℃、65〜80℃、65〜75℃、65〜70℃、70〜80℃、または70〜75℃の範囲の融解温度を有する。
【００９０】
B.第2の抗原結合部位
多重特異性結合タンパク質の第2の抗原結合部位はCD3(例えば、ヒトCD3および/またはマカクCD3)に結合する。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位はCD3ε(イプシロン)に結合する。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位はCD3δ(デルタ)に結合する。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位はCD3γ(ガンマ)に結合する。
【００９１】
ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質の第2の抗原結合部位は、CD3ε鎖のN末端にあるエピトープに結合する。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位は、ヒトCD3ε細胞外ドメインのアミノ酸残基1〜27に局在するエピトープに結合する。このエピトープまたはその相同変種はまた、ある特定の非ヒト霊長類にも存在する。従って、ある特定の態様では、第2の抗原結合部位は、様々な霊長類、例えば、ヒト、新世界霊長類(例えば、マーモセット、ワタボウシタマリン、またはリスザル)、旧世界霊長類(例えば、ヒヒおよびマカク)、ギボン、ならびに非ヒト類人のCD3に結合する。マーモセットおよびワタボウシタマリンはマーモセット科(Callitrichidae)に属する新世界霊長類である。これに対して、リスザルはオマキザル科(Cebidae)に属する新世界霊長類である。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位はヒトCD3εおよび/またはマカクCD3εに結合する。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位はマーモセット、ワタボウシタマリン、および/またはリスザルのCD3εにさらに結合する。
【００９２】
ヒトおよび/またはマカクCD3の細胞外エピトープに結合する第2の抗原結合部位は、例えば、ムロモナブ-CD3(OKT3)、オテリキシズマブ(TRX4)、テプリズマブ(MGA031)、ビジリズマブ(Nuvion)、SP34、X35、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、Fl11-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1、WT-31、およびWO2008119567A2に記載の抗体から得ることができる。例えば、第2の結合ドメインは、任意で、(a)WO2008119567A2のSEQ ID NO:27に図示されたCDR-L1、WO2008119567A2のSEQ ID NO:28に図示されたCDR-L2、およびWO2008119567A2のSEQ ID NO:29に図示されたCDR-L3;(b)WO2008119567A2のSEQ ID NO:117に図示されたCDR-L1、WO2008119567A2のSEQ ID NO:118に図示されたCDR-L2、およびWO2008119567A2のSEQ ID NO:119に図示されたCDR-L3;ならびに(c) WO2008119567A2のSEQ ID NO:153に図示されたCDR-L1、WO2008119567A2のSEQ ID NO:154に図示されたCDR-L2、および WO2008119567A2のSEQ ID NO:155に図示されたCDR-L3より選択される、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含むVLドメインを含んでもよい。または、1つまたは複数のアミノ酸変異をCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3の(a)、(b)、または(c)群に導入することができ、第2の結合ドメインはCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3のどの変異群も含んでよい。
【００９３】
例えば、第2の結合ドメインは、(a)WO2008119567A2のSEQ ID NO:12に図示されたCDR-H1、WO2008119567A2のSEQ ID NO: 13に図示されたCDR-H2、およびWO2008119567A2のSEQ ID NO:14に図示されたCDR-H3;(b)WO2008119567A2のSEQ ID NO:30に図示されたCDR-H1、WO2008119567A2のSEQ ID NO:31に図示されたCDR-H2、およびWO2008119567A2のSEQ ID NO:32に図示されたCDR-H3;(c)WO2008119567A2のSEQ ID NO:48に図示されたCDR-H1、WO2008119567A2のSEQ ID NO:49に図示されたCDR-H2、およびWO2008119567A2のSEQ ID NO:50に図示されたCDR-H3;(d)WO2008119567A2のSEQ ID NO:66に図示されたCDR-H1、WO2008119567A2のSEQ ID NO:67に図示されたCDR-H2、およびWO2008119567A2のSEQ ID NO:68に図示されたCDR-H3;(e)WO2008119567A2のSEQ ID NO:84に図示されたCDR-H1、WO2008119567A2のSEQ ID NO:85に図示されたCDR-H2、およびWO2008119567A2のSEQ ID NO:86に図示されたCDR-H3;(f)WO2008119567A2のSEQ ID NO:102に図示されたCDR-H1、WO2008119567A2のSEQ ID NO:103に図示されたCDR-H2、およびWO2008119567A2のSEQ ID NO:104に図示されたCDR-H3;(g)WO2008119567A2のSEQ ID NO:120に図示されたCDR-H1、WO2008119567A2のSEQ ID NO:121に図示されたCDR-H2、およびWO2008119567A2のSEQ ID NO:122に図示されたCDR-H3;(h)WO2008119567A2のSEQ ID NO:138に図示されたCDR-H1、WO2008119567A2のSEQ ID NO:139に図示されたCDR-H2、およびWO2008119567A2のSEQ ID NO:140に図示されたCDR-H3;(i)WO2008119567A2のSEQ ID NO:156に図示されたCDR-H1、WO2008119567A2のSEQ ID NO:157に図示されたCDR-H2、およびWO2008119567A2のSEQ ID NO:158に図示されたCDR-H3;ならびに(j)WO2008119567A2のSEQ ID NO:174に図示されたCDR-H1、WO2008119567A2のSEQ ID NO:175に図示されたCDR-H2、およびWO2008119567A2のSEQ ID NO:176に図示されたCDR-H3より選択される、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含むVLドメインを含んでもよい。または、1つまたは複数のアミノ酸変異をCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、および(j)群に導入することができ、第2の結合ドメインはCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3のどの変異群も含んでよい。WO2008119567A2に開示された言及された配列は、本明細書において参照により組み入れられる。
【００９４】
または、第2のドメインは、既存のCD3抗体、例えば、WO2008101154に図示されたムロモナブ-CD3(OKT3)、WO2007145941A2に図示されたオテリキシズマブ(TRX4)、WO2013040164A1に図示されたテプリズマブ(MGA031)、WO2004052397A1に図示されたビジリズマブ(Nuvion)、WO2015181098A1に図示されたSP34、WO2015006749A2に図示されたX35、WO2015006749A2に図示されたVIT3、WO2015006749A2に図示されたBMA030(BW264/56)、WO2004106381A1に図示されたCLB-T3/3、WO2004106381A1に図示されたCRIS7、WO2004106383A1に図示されたYTH12.5、WO2012084895A2に図示されたFl 11-409、WO2004106381A1に図示されたCLB-T3.4.2、WO2013158856A2に図示されたTR-66、WO2004106381A1に図示されたWT32、WO2004106383A1に図示されたSPv-T3b、WO2004106381A1に図示された11D8、WO2004106381A1に図示されたXIII-141、WO2004106381A1に図示されたXIII-46、WO2004106381A1に図示されたXIII-87、WO2004106381A1に図示された12F6、WO2004106381A1に図示されたT3/RW2-8C8、WO2004106381A1に図示されたT3/RW2-4B6、WO2004106381A1に図示されたOKT3D、WO2004106381A1に図示されたM-T301、WO2004106381A1に図示されたSMC2、WO2004106381A1に図示されたF101.01、WO2000041474A2に図示されたUCHT-1、およびWO2016085889A1に図示されたWT-31から得ることができる。WO2008101154、WO2007145941A2、WO2013040164A1、WO2004052397A1、WO2015181098A1、WO2015006749A2、WO2004106381A1、WO2004106383A1、WO2012084895A2、WO2013158856A2、WO2000041474A2、およびWO2016085889A1において開示された、上記の言及された配列は本明細書において参照により組み入れられる。
【００９５】
CD3に結合する第2の抗原結合部位は3つの相補性領域(HCDR1、HCDR2、およびHCDR3)を含むVHならびに/または3つの相補性領域(LCDR1、LCDR2、およびLCDR3)を含むVLを含むことができる。表2は、各可変領域について、可変領域のCDR、ならびに示された重鎖可変領域および軽鎖可変領域に基づくscFv構築物をまとめたものである。第2の抗原結合部位は、表2に列挙したような例示的な可変ドメインおよびCDR配列から得ることができる。
【００９６】
（表２）例示的な第2の抗原結合部位の配列
2021526862.tif 000019
2021526862.tif 000020
2021526862.tif 000021
2021526862.tif 000022
2021526862.tif 000023
2021526862.tif 000024
2021526862.tif 000025
2021526862.tif 000026
2021526862.tif 000027
VLおよびLCDR配列が「N/A」で示されている場合、抗原結合部位は、VH(例えば、VHH)のみを有するsdAbである。
【００９７】
ある特定の態様では、第2の抗原結合部位は、相補性決定領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHと、相補性決定領域LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むVLとを含む。ある特定の態様では、VHは、表2に示した抗体のVHと少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含み、VLは、表2に示した抗体のVLと少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、VHは、表2に示した抗体のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3配列を含み、VLは、表2に示した抗体のLCDR1、LCDR2、およびLCDR3配列を含む。ある特定の態様では、VHは、表2に示した抗体のVHのアミノ酸配列を含み、VLは、表2に示した抗体のVLのアミノ酸配列を含む。
【００９８】
ある特定の態様では、第2の抗原結合部位のVHは、SEQ ID NO:97と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含み、第2の抗原結合部位のVLは、SEQ ID NO:98と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、VHは、それぞれSEQ ID NO:99、100、および101に示したHCDR1、HCDR2、HCDR3配列を含み、VLは、それぞれSEQ ID NO:102、103、および104に示したLCDR1、LCDR2、およびLCDR3配列を含む。ある特定の態様では、VHは、SEQ ID NO:97に示したアミノ酸配列を含み、VLは、SEQ ID NO:98に示したアミノ酸配列を含む。
【００９９】
ある特定の態様では、第2の抗原結合部位のVHは、SEQ ID NO:106と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含み、第2の抗原結合部位のVLは、SEQ ID NO:107と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、VHは、それぞれSEQ ID NO:108、109、および110に示したHCDR1、HCDR2、およびHCDR3配列を含み、VLは、それぞれSEQ ID NO:111、112、および113に示したLCDR1、LCDR2、およびLCDR3配列を含む。ある特定の態様では、VHは、SEQ ID NO:106に示したアミノ酸配列を含み、VLは、SEQ ID NO:107に示したアミノ酸配列を含む。
【０１００】
このような抗原結合部位はscFvの形をとる場合がある。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位は、表2に示したscFv配列と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位は、SEQ ID NO:105または114と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。
【０１０１】
他の態様では、第2の抗原結合部位は、相補性決定領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHを含むsdAbを含む。ある特定の態様では、VHは、表2に示したsdAb抗体のVHと少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、VHは、表2に示した抗体のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3配列を含む。ある特定の態様では、VHは、表2に示したsdAbのVHのアミノ酸配列を含む。
【０１０２】
ある特定の態様では、第2の抗原結合部位は、CD3(例えば、ヒトCD3および/またはマカクCD3)との結合において、表2に示したVH、VL、および/またはscFv配列を含む抗体またはその抗原結合断片と競合する。
【０１０３】
ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質の第2の抗原結合部位は、CD3(例えば、ヒトCD3および/またはマカクCD3)に約0.1nM〜約1μMの解離定数(KD)で結合する。KDは、当技術分野において公知の方法によって測定することができる。ある特定の態様では、KDは、チップ上に固定化されたCD3またはその細胞外断片に対するSPRによって測定される。ある特定の態様では、KDは、例えば、以下の実施例5に記載の方法に従って、細胞表面に発現しているCD3に対するフローサイトメトリーによって測定される。
【０１０４】
ある特定の態様では、第2の抗原結合部位は、CD3に、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM、40pM、30pM、20pM、または10pMより低いか、またはこれに等しいKDで結合する。例えば、ある特定の態様では、第1の抗原結合部位は、CD3に、約10pM〜約1nM、約10pM〜約0.9nM、約10pM〜約0.8nM、約10pM〜約0.7nM、約10pM〜約0.6nM、約10pMnM〜約0.5nM、約10pM〜約0.4nM、約10pM〜約0.3nM、約10pM〜約0.2nM、約10pM〜約0.1nM、約10pM〜約50pM、0.1nM〜約10nM、約0.1nM〜約9nM、約0.1nM〜約8nM、約0.1nM〜約7nM、約0.1nM〜約6nM、約0.1nM〜約5nM、約0.1nM〜約4nM、約0.1nM〜約3nM、約0.1nM〜約2nM、約0.1nM〜約1nM、約0.1nM〜約0.5nM、約0.5nM〜約10nM、約1nM〜約10nM、約2nM〜約10nM、約3nM〜約10nM、約4nM〜約10nM、約5nM〜約10nM、約6nM〜約10nM、約7nM〜約10nM、約8nM〜約10nM、または約9nM〜約10nMのKDで結合する。
【０１０５】
ある特定の態様では、第2の抗原結合部位は、CD3に、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、または100nMより大きいか、またはこれに等しいKDで結合する。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位は、CD3に、約10nM〜約1000nM、約10nM〜約900nM、約10nM〜約800nM、約10nM〜約700nM、約10nM〜約600nM、約10nM〜約500nM、約10nM〜約400nM、約10nM〜約300nM、約10nM〜約200nM、約10nM〜約100nM、約10nM〜約50nM、約50nM〜約1000nM、約100nM〜約1000nM、約200nM〜約1000nM、約300nM〜約1000nM、約400nM〜約1000nM、約500nM〜約1000nM、約600nM〜約1000nM、約700nM〜約1000nM、約800nM〜約1000nM、または約900nM〜約1000nMのKDで結合する。
【０１０６】
第2の抗原結合部位のみの場合の、CD3に対する結合親和性は、本明細書において開示される多重特異性結合タンパク質の状況での同じ抗原結合部位の結合親和性とは異なる場合があると理解される。これは、おそらく、他のドメインからのコンホメーション制約が原因である。状況に依存する結合親和性は、「結合親和性」という表題のサブセクションI.Gに記載されている。
【０１０７】
ある特定の態様では、第2の抗原結合部位は少なくとも50℃、少なくとも55℃、少なくとも56℃、少なくとも57℃、少なくとも58℃、少なくとも59℃、少なくとも60℃、少なくとも61℃、少なくとも62℃、少なくとも63℃、少なくとも64℃、少なくとも65℃、少なくとも70℃、少なくとも75℃、または少なくとも80℃の融解温度を有する。ある特定の態様では、第2の抗原結合部位は50〜80℃、50〜70℃、50〜65℃、50〜60℃、50〜55℃、55〜70℃、55〜65℃、55〜60℃、56〜65℃、56〜60℃、57〜65℃、57〜60℃、58〜65℃、58〜60℃、59〜65℃、59〜60℃、60〜80℃、60〜75℃、60〜70℃、60〜65℃、65〜80℃、65〜75℃、65〜70℃、70〜80℃、または70〜75℃の範囲の融解温度を有する。
【０１０８】
C.第3の抗原結合部位
多重特異性結合タンパク質の第3の抗原結合部位は血清アルブミン(例えば、HSA)に結合する。ある特定の態様では、第3の抗原結合部位のヒト血清アルブミンに対する結合親和性はマウス血清アルブミンに対する結合親和性より大きい。ある特定の態様では、第3の抗原結合部位はHSAのD-IIIドメインに結合しない。ある特定の態様では、第3の抗原結合部位は多重特異性結合タンパク質の血清半減期を延ばす。
【０１０９】
血清アルブミンに結合する第3の抗原結合部位は、例えば、米国特許第8,188,223号、およびPCT公開番号WO2017085172、およびWO2018050833に開示される抗原結合部位からから得ることができる。
【０１１０】
HSAに結合する第3の抗原結合部位は、3つの相補性領域(HCDR1、HCDR2、およびHCDR3)を含むVHならびに/または3つの相補性領域(LCDR1、LCDR2、およびLCDR3)を含むVLを含むことができる。表3は、各可変領域について、可変領域のCDR、ならびに示された重鎖可変領域および軽鎖可変領域に基づくscFv構築物をまとめたものである。第3の抗原結合部位は、表3に列挙したような例示的な可変ドメインおよびCDR配列から得ることができる。
【０１１１】
（表３）例示的な第3の抗原結合部位の配列
2021526862.tif 000028
2021526862.tif 000029
2021526862.tif 000030
2021526862.tif 000031
2021526862.tif 000032
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2021526862.tif 000034
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2021526862.tif 000037
2021526862.tif 000038
2021526862.tif 000039
2021526862.tif 000040
VLおよびLCDR配列が「N/A」で示されている場合、抗原結合部位は、VH(例えば、VHH)のみを有するsdAbである。VHおよびHCDR配列が「N/A」で示されている場合、抗原結合部位は、VLのみを有するsdAbである。
【０１１２】
ある特定の態様では、第3の抗原結合部位は、相補性決定領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHと、相補性決定領域LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むVLとを含む。ある特定の態様では、VHは、表3に示した抗体のVHと少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含み、VLは、表3に示した抗体のVLと少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、VHは、表3に示した抗体のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3配列を含み、VLは、表3に示した抗体のLCDR1、LCDR2、およびLCDR3配列を含む。ある特定の態様では、VHは、表3に示した抗体のVHのアミノ酸配列を含み、VLは、表3に示した抗体のVLのアミノ酸配列を含む。
【０１１３】
他の態様では、第3の抗原結合部位は、相補性決定領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHを含むsdAbを含む。ある特定の態様では、VHは、表3に示したsdAb抗体のVHと少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、VHは、表3に示した抗体のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3配列を含む。ある特定の態様では、VHは、表3に示したsdAbのVHのアミノ酸配列を含む。
【０１１４】
ある特定の態様では、第3の抗原結合部位のVHは、SEQ ID NO:121と少なくとも60％(例えば、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、VHは、SEQ ID NO:122または123に示したHCDR1配列、SEQ ID NO:124または125に示したHCDR2配列、およびSEQ ID NO:126に示したHCDR3配列を含む。ある特定の態様では、VHは、それぞれSEQ ID NO:122、125、および126に示したHCDR1、HCDR2、およびHCDR3配列を含む。ある特定の態様では、VHは、それぞれSEQ ID NO:123、124、126に示したHCDR1、HCDR2、およびHCDR3配列を含む。ある特定の態様では、VHは、SEQ ID NO:121に示したアミノ酸配列を含む。
【０１１５】
ある特定の態様では、第3の抗原結合部位は、血清アルブミン(例えば、HSA)との結合において、表3に示したVH、VL、および/またはscFv配列を含む抗体またはその抗原結合断片と競合する。
【０１１６】
ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質の第3の抗原結合部位は、血清アルブミン(例えば、HSA)に約0.1nM〜約100μMの解離定数(KD)で結合する。KDは、当技術分野において公知の方法によって測定することができる。ある特定の態様では、KDは、チップ上に固定化された血清アルブミンまたはその断片に対するSPRによって測定される。
【０１１７】
ある特定の態様では、第3の抗原結合部位は、血清アルブミンに、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM、40pM、30pM、20pM、もしくは10pMより低いか、またはこれに等しいKDで結合する。例えば、ある特定の態様では、第3の抗原結合部位は、血清アルブミンに、約10pM〜約1nM、約10pM〜約0.9nM、約10pM〜約0.8nM、約10pM〜約0.7nM、約10pM〜約0.6nM、約10pMnM〜約0.5nM、約10pM〜約0.4nM、約10pM〜約0.3nM、約10pM〜約0.2nM、約10pM〜約0.1nM、約10pM〜約50pM、0.1nM〜約10nM、約0.1nM〜約9nM、約0.1nM〜約8nM、約0.1nM〜約7nM、約0.1nM〜約6nM、約0.1nM〜約5nM、約0.1nM〜約4nM、約0.1nM〜約3nM、約0.1nM〜約2nM、約0.1nM〜約1nM、約0.1nM〜約0.5nM、約0.5nM〜約10nM、約1nM〜約10nM、約2nM〜約10nM、約3nM〜約10nM、約4nM〜約10nM、約5nM〜約10nM、約6nM〜約10nM、約7nM〜約10nM、約8nM〜約10nM、約9nM〜約10nM、約1nM〜約15nM、約2nM〜約15nM、約3nM〜約15nM、約4nM〜約15nM、約5nM〜約15nM、約6nM〜約15nM、約7nM〜約15nM、約8nM〜約15nM、約9nM〜約15nM、約10nM〜約15nM、約11nM〜約15nM、約12nM〜約15nM、約13nM〜約15nM、約14nM〜約15nM、約1nM〜約20nM、約2nM〜約20nM、約3nM〜約20nM、約4nM〜約20nM、約5nM〜約20nM、約6nM〜約20nM、約7nM〜約20nM、約8nM〜約20nM、約9nM〜約20nM、約10nM〜約20nM、約11nM〜約20nM、約12nM〜約20nM、約13nM〜約20nM、約14nM〜約20nM、約15nM〜約20nM、約16nM〜約20nM、約17nM〜約20nM、約18nM〜約20nM、または約19nM〜約20nMのKDで結合する。
【０１１８】
ある特定の態様では、第3の抗原結合部位は、血清アルブミンに、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、もしくは100nMより大きいか、またはこれに等しいKDで結合する。ある特定の態様では、第3の抗原結合部位は、血清アルブミンに、約10nM〜約1000nM、約10nM〜約900nM、約10nM〜約800nM、約10nM〜約700nM、約10nM〜約600nM、約10nM〜約500nM、約10nM〜約400nM、約10nM〜約300nM、約10nM〜約200nM、約10nM〜約100nM、約10nM〜約50nM、約50nM〜約1000nM、約100nM〜約1000nM、約200nM〜約1000nM、約300nM〜約1000nM、約400nM〜約1000nM、約500nM〜約1000nM、約600nM〜約1000nM、約700nM〜約1000nM、約800nM〜約1000nM、または約900nM〜約1000nMのKDで結合する。
【０１１９】
第3の抗原結合部位のみの場合の、血清アルブミンに対する結合親和性は、本明細書において開示される多重特異性結合タンパク質の状況での同じ抗原結合部位の結合親和性とは異なる場合があると理解される。これは、おそらく、他のドメインからのコンホメーション制約が原因である。状況に依存する結合親和性は、「結合親和性」という表題のサブセクションI.Gに記載されている。
【０１２０】
ある特定の態様では、第3の抗原結合部位は少なくとも50℃、少なくとも55℃、少なくとも56℃、少なくとも57℃、少なくとも58℃、少なくとも59℃、少なくとも60℃、少なくとも61℃、少なくとも62℃、少なくとも63℃、少なくとも64℃、少なくとも65℃、少なくとも70℃、少なくとも75℃、または少なくとも80℃の融解温度を有する。ある特定の態様では、第3の抗原結合部位は50〜80℃、50〜70℃、50〜65℃、50〜60℃、50〜55℃、55〜70℃、55〜65℃、55〜60℃、56〜65℃、56〜60℃、57〜65℃、57〜60℃、58〜65℃、58〜60℃、59〜65℃、59〜60℃、60〜80℃、60〜75℃、60〜70℃、60〜65℃、65〜80℃、65〜75℃、65〜70℃、70〜80℃、または70〜75℃の範囲の融解温度を有する。
【０１２１】
D.ヒト化および脱免疫化(Deimmunization)
多重特異性結合タンパク質の免疫原性および結合特性を最適化し、それによって、多重特異性結合タンパク質の治療指数を向上させるために、本明細書において開示される多重特異性結合タンパク質の第1の抗原結合部位、第2の抗原結合部位、および/または第3の抗原結合部位は、例えば、前記で開示された1つまたは複数の抗原結合部位からヒト化される場合がある。
【０１２２】
「ヒト化」抗体またはその断片(例えば、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、sdAb、scFv、または抗体の他の抗原結合部分配列)は大部分がヒト配列を含有するが、(a)非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列も含有する。ヒト化抗体は大半は、レシピエントの1つまたは複数の超可変領域(CDR)に由来する残基が、望ましい特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)、例えば、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、もしくはハムスター)、ウサギ、またはラクダ科の動物(例えば、ラマ)の1つまたは複数の超可変領域に由来する残基と交換されているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基が、対応する非ヒト残基と交換されている。さらに、本明細書で使用する「ヒト化抗体」はまた、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基も含む場合がある。これらの改変は、抗体性能をもっと洗練および最適化するために加えられる。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部も含むことがある。さらなる詳細については、Jones et al. (1986) Nature, 321: 522-25; Reichmann et al.(1988) Nature, 332: 323-29;およびPresta (1992) Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-96を参照されたい。
【０１２３】
ヒト化抗体は、ヒト重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を発現するが、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を発現できないマウスなどのトランスジェニック動物を用いて産生される場合がある。Winterは、本明細書に記載のヒト化抗体を調製するのに用いられ得る例示的なCDRグラフティング法について述べている(米国特許第5,225,539号を参照されたい)。特定のヒト抗体のCDRの全てが少なくとも非ヒトCDRの一部と交換される場合がある、またはCDRの一部だけが非ヒトCDRと交換される場合がある。必要なのは、ヒト化抗体を、予め決められた抗原に結合させるのに必要な数のCDRを交換することだけである。
【０１２４】
ヒト化抗体は、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖系列置換、および/または逆突然変異を導入することによって最適化することができる。このような変化した免疫グロブリン分子は、当技術分野において公知のいくつかの技法のどれでも作製することができる(例えば、Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol, 92: 3-16, 1982、およびEP 239 400)。
【０１２５】
抗体またはその断片はまた、「脱免疫化」と呼ばれるプロセスにおいてヒトT細胞エピトープを特異的に欠失させることで改変される場合がある。脱免疫化法は、例えば、WO1998052976A1またはWO2000034317A2において開示されている。簡単に言うと、MHCクラスIIに結合するペプチドがあるかどうか、抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを分析することができる。これらのペプチドは潜在的なT細胞エピトープである。潜在的なT細胞エピトープを検出するために、「ペプチドスレッディング(peptide threading)」と呼ばれるコンピュータモデリングアプローチを適用することができ、それに加えて、VH配列およびVL配列に存在するモチーフがあるかどうかヒトMHCクラスII結合ペプチドのデータベースを検索することができる。これらのモチーフは18の主要なMHCクラスII DRアロタイプのいずれにも結合し、従って、潜在的なT細胞エピトープを構成する。可変ドメインにある少数のアミノ酸残基を置換することによって、または好ましくは一アミノ酸置換によって、検出された潜在的なT細胞エピトープを排除することができる。典型的には、保存的置換が行われる。多くの場合、ヒト生殖系列抗体配列中の位置に共通して見られるアミノ酸が用いられる場合があるが、これに限らない。ヒト生殖系列配列は、例えば、Tomlinson, et al.(1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242;およびTomlinson et al.(1995) EMBO J. 14: 4628-38に開示されている。V BASEディレクトリはヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的なディレクトリを提供する(Tomlinson, L A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UKにより編集)。これらの配列は、ヒト配列、例えば、フレームワーク領域およびCDRの情報源として使用することができる。コンセンサスヒトフレームワーク領域はまた、例えば、米国特許第6,300,064号に記載のように使用することができる。
【０１２６】
E.構築物フォーマット
第1の抗原結合部位、第2の抗原結合部位、および第3の抗原結合部位は様々な形をとる場合がある。ある特定の態様では、第1の抗原結合部位、第2の抗原結合部位、および/または第3の抗原結合部位は2つの抗体可変ドメイン(例えば、VHおよびVL)を含む。抗原結合部位を安定化するジスルフィド結合を(例えば、H44とL100との間に)導入するようにVHおよびVLを変異することができる(Zhao et al. (2010) Int. J. Mol. Sci., 12(1):1-11を参照されたい)。ある特定の態様では、第1の抗原結合部位、第2の抗原結合部位、および/または第3の抗原結合部位は1つの抗体可変ドメイン(例えば、sdAb)を構成する。
【０１２７】
VHおよびVLを含有する抗原結合部位では、scFvを形成するようにVHとVLを連結することができる。VLのN末端側またはC末端側にVHを配置することができる。VHおよびVLは、典型的には、ペプチドリンカーなどのリンカーを介して連結される。ペプチドリンカーの例示的な配列を、「リンカー」という表題のサブセクションI.Fに示した。ある特定の態様では、抗原結合ドメインのVHは、表4に列挙したアミノ酸配列を有するペプチドリンカーを介して抗原結合ドメインのVLに接続される。特定の態様では、抗原結合ドメインのVHは、SEQ ID NO:298、299、または302のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーを介して抗原結合ドメインのVLに接続され、VHはVLのN末端側に配置されている。他の特定の態様では、抗原結合ドメインのVHは、SEQ ID NO:298、299、または302のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーを介して抗原結合ドメインのVLに接続され、VHはVLのC末端側に配置されている。
【０１２８】
または、VHおよびVLは別々のポリペプチド鎖に存在してもよく、VH-VL複合体の形成が、抗体定常領域CH1およびCLなどのさらなるドメインによって容易になる場合がある。従って、ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質は、本明細書において開示されるVHおよびVLを含むFabを含む。
【０１２９】
ある特定の態様では、本発明の多重特異性結合タンパク質は、1つの抗体可変ドメインを含む第1の抗原結合部位、1つの抗体可変ドメインを含む第2の抗原結合部位、および1つの抗体可変ドメインを含む第3の抗原結合部位を含む。ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質は、sdAbフォーマットの第1の抗原結合部位、sdAbフォーマットの第2の抗原結合部位、およびsdAbフォーマットの第3の抗原結合部位を含む。
【０１３０】
ある特定の態様では、本発明の多重特異性結合タンパク質は、1つの抗体可変ドメインを含む第1の抗原結合部位、1つの抗体可変ドメインを含む第2の抗原結合部位、および2つの抗体可変ドメインを含む第3の抗原結合部位を含む。ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質は、sdAbフォーマットの第1の抗原結合部位、sdAbフォーマットの第2の抗原結合部位、およびscFvフォーマットの第3の抗原結合部位を含む。
【０１３１】
ある特定の態様では、本発明の多重特異性結合タンパク質は、1つの抗体可変ドメインを含む第1の抗原結合部位、2つの抗体可変ドメインを含む第2の抗原結合部位、および1つの抗体可変ドメインを含む第3の抗原結合部位を含む。ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質は、sdAbフォーマットの第1の抗原結合部位、scFvフォーマットの第2の抗原結合部位、およびsdAbフォーマットの第3の抗原結合部位を含む。
【０１３２】
ある特定の態様では、本発明の多重特異性結合タンパク質は、1つの抗体可変ドメインを含む第1の抗原結合部位、2つの抗体可変ドメインを含む第2の抗原結合部位、および2つの抗体可変ドメインを含む第3の抗原結合部位を含む。ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質は、sdAbフォーマットの第1の抗原結合部位、scFvフォーマットの第2の抗原結合部位、およびscFvフォーマットの第3の抗原結合部位を含む。
【０１３３】
ある特定の態様では、本発明の多重特異性結合タンパク質は、2つの抗体可変ドメインを含む第1の抗原結合部位、1つの抗体可変ドメインを含む第2の抗原結合部位、および1つの抗体可変ドメインを含む第3の抗原結合部位を含む。ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質は、scFvフォーマットの第1の抗原結合部位、sdAbフォーマットの第2の抗原結合部位、およびsdAbフォーマットの第3の抗原結合部位を含む。
【０１３４】
ある特定の態様では、本発明の多重特異性結合タンパク質は、2つの抗体可変ドメインを含む第1の抗原結合部位、1つの抗体可変ドメインを含む第2の抗原結合部位、および2つの抗体可変ドメインを含む第3の抗原結合部位を含む。ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質は、scFvフォーマットの第1の抗原結合部位、sdAbフォーマットの第2の抗原結合部位、およびscFvフォーマットの第3の抗原結合部位を含む。
【０１３５】
ある特定の態様では、本発明の多重特異性結合タンパク質は、2つの抗体可変ドメインを含む第1の抗原結合部位、2つの抗体可変ドメインを含む第2の抗原結合部位、および1つの抗体可変ドメインを含む第3の抗原結合部位を含む。ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質は、scFvフォーマットの第1の抗原結合部位、scFvフォーマットの第2の抗原結合部位、およびsdAbフォーマットの第3の抗原結合部位を含む。
【０１３６】
ある特定の態様では、本発明の多重特異性結合タンパク質は、2つの抗体可変ドメインを含む第1の抗原結合部位、2つの抗体可変ドメインを含む第2の抗原結合部位、および2つの抗体可変ドメインを含む第3の抗原結合部位を含む。ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質は、scFvフォーマットの第1の抗原結合部位、scFvフォーマットの第2の抗原結合部位、およびscFvフォーマットの第3の抗原結合部位を含む。
【０１３７】
多重特異性結合タンパク質の3つの抗原結合部位はアミノからカルボキシルの方向で以下の位置付け:
(i)第1の抗原結合部位(CD19結合ドメイン)―第2の抗原結合部位(CD3結合ドメイン)―第3の抗原結合部位(血清アルブミン結合ドメイン);
(ii)第1の抗原結合部位(CD19結合ドメイン)―第3の抗原結合部位(血清アルブミン結合ドメイン)―第2の抗原結合部位(CD3結合ドメイン);
(iii)第2の抗原結合部位(CD3結合ドメイン)―第1の抗原結合部位(CD19結合ドメイン)―第3の抗原結合部位(血清アルブミン結合ドメイン);
(iv)第2の抗原結合部位(CD3結合ドメイン)―第3の抗原結合部位(血清アルブミン結合ドメイン)―第1の抗原結合部位(CD19結合ドメイン);
(v)第3の抗原結合部位(血清アルブミン結合ドメイン)―第1の抗原結合部位(CD19結合ドメイン)―第2の抗原結合部位(CD3結合ドメイン);および
(vi)第3の抗原結合部位(血清アルブミン結合ドメイン)―第2の抗原結合部位(CD3結合ドメイン)―第1の抗原結合部位(CD19結合ドメイン)
のいずれか1つで連結することができ、上記のダッシュ記号は、ペプチド結合および/またはリンカー(例えば、ペプチドリンカー)を表す。
【０１３８】
ある特定の態様では、第3の抗原結合部位は第1の抗原結合部位と第2の抗原結合部位との間に配置されていない。ある特定の態様では、第3の抗原結合部位は第1の抗原結合部位と第2の抗原結合部位の両方のN末端側に配置されているか、または第1の抗原結合部位と第2の抗原結合部位の両方のC末端側に配置されている。ある特定の態様では、第3の抗原結合部位は第1の抗原結合部位と第2の抗原結合部位の両方のN末端側に配置されている。ある特定の態様では、第3の抗原結合部位は第1の抗原結合部位と第2の抗原結合部位の両方のC末端側に配置されている。
【０１３９】
ある抗原結合部位の、別の抗原結合部位に対する位置(N末端またはC末端)は、1本のポリペプチド鎖が両方の抗原結合部位を含むのであれば、当技術分野において公知のように「N末端」および「C末端」を定義することによって決定される。抗原結合部位が2つの別々のポリペプチド鎖を含む場合、抗原結合部位の、(1本のポリペプチド鎖または2本のポリペプチド鎖を有する)別の抗原結合部位に対する位置(N末端またはC末端)も、1本のポリペプチド鎖が前者の少なくとも1つのポリペプチド鎖と後者の少なくとも1つのポリペプチド鎖とを含むのであれば、同じように決定することができると理解される。さらに、抗原結合部位Aが抗原結合部位BのN末端側にあり、抗原結合部位Bが抗原結合部位CのN末端側にある場合、抗原結合部位AおよびCが1本の共通するポリペプチド鎖に存在しなくても、抗原結合部位Aは抗原結合部位CのN末端側に配置されていると考えられると理解される。多重特異性結合タンパク質のもっと複雑な構造も意図され、これらの一部は、例えば、あるポリペプチド鎖上での2つの抗原結合部位の相対的位置と、別のポリペプチド鎖上での相対的位置が異なるために、またはループ構造が存在するために、前述した「N末端」および「C末端」の用語を用いて特徴付けることが難しい位置付けを有する場合がある。
【０１４０】
本発明によれば、多重特異性結合タンパク質およびその構成要素である結合ドメインは1つまたは複数のポリペプチドの形をしている。このようなポリペプチドはタンパク質部分と非タンパク質部分(例えば、化学リンカーまたは化学架橋剤、例えば、グルタルアルデヒド)を含む場合がある。ある特定の態様では、本発明の多重特異性結合タンパク質は第1の抗原結合部位、第2の抗原結合部位、および第3の抗原結合部位を含み、これらの全てが一緒に連結されて1本のポリペプチド鎖を形成する。ある特定の態様では、第1の抗原結合部位、第2の抗原結合部位、および第3の抗原結合部位は、1本のポリペプチド鎖を形成するように、例えば、前記の組み合わせで、scFvおよび/またはsdAbの形をとる。
【０１４１】
F.リンカー
上記のように、本発明の多重特異性結合タンパク質の抗原結合部位はペプチド結合またはリンカー(例えば、ペプチドリンカー)を介して連結することができる。ある特定の態様では、少なくとも2つの隣接する抗原結合部位はリンカー(例えば、ペプチドリンカー)によって接続されている。ある特定の態様では、2つの隣接する抗原結合部位はそれぞれリンカー(例えば、ペプチドリンカー)によって接続されている。
【０１４２】
ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質の3つの抗原結合部位はアミノからカルボキシルの方向で以下の位置付け:
(i)第1の抗原結合部位(CD19結合ドメイン)―L1―第2の抗原結合部位(CD3結合ドメイン)―L2―第3の抗原結合部位(血清アルブミン結合ドメイン);
(ii)第1の抗原結合部位(CD19結合ドメイン)―L1―第3の抗原結合部位(血清アルブミン結合ドメイン)―L2―第2の抗原結合部位(CD3結合ドメイン);
(iii)第2の抗原結合部位(CD3結合ドメイン)―L1―第1の抗原結合部位(CD19結合ドメイン)―L2―第3の抗原結合部位(血清アルブミン結合ドメイン);
(iv)第2の抗原結合部位(CD3結合ドメイン)―L1―第3の抗原結合部位(血清アルブミン結合ドメイン)―L2―第1の抗原結合部位(CD19結合ドメイン);
(v)第3の抗原結合部位(血清アルブミン結合ドメイン)―L1―第1の抗原結合部位(CD19結合ドメイン)―L2―第2の抗原結合部位(CD3結合ドメイン);および
(vi)第3の抗原結合部位(血清アルブミン結合ドメイン)―L1―第2の抗原結合部位(CD3結合ドメイン)―L2―第1の抗原結合部位(CD19結合ドメイン)
のいずれか1つで、L1およびL2と示したリンカー(例えば、ペプチドリンカー)によって連結することができる。ある特定の構築物において、L1またはL2はペプチド結合と交換され得ると理解される。
【０１４３】
1本のポリペプチド鎖が2つの隣接する抗原結合部位を含むのであれば、2つの抗原結合部位を接続するペプチドリンカーは、2つの抗原結合部位の間にあるアミノ酸配列だと理解される。抗原結合部位が2つの別々のポリペプチド鎖を含むのであれば、ポリペプチド鎖の一方は、隣接する抗原結合部位またはそのポリペプチド鎖として1本の共通するポリペプチドに存在し、2つの抗原結合部位を接続するペプチドリンカーは、共通する1本のポリペプチドの中で2つの抗原結合部位の間にあるアミノ酸配列である。
【０１４４】
ある特定の態様では、リンカーL1およびL2はペプチドリンカーである。L1およびL2の適切な長さは独立して選択することができる。例えば、ある特定の態様では、L1および/またはL2は長さが約50個以下のアミノ酸残基である。ある特定の態様では、L1は約50個以下のアミノ酸残基からなる。ある特定の態様では、L1は約20個以下のアミノ酸残基からなる。ある特定の態様では、L2は約50個以下のアミノ酸残基からなる。ある特定の態様では、L2は約20個以下のアミノ酸残基からなる。ある特定の態様では、L1およびL2は独立して約50個以下のアミノ酸残基からなる。ある特定の態様では、L1およびL2は独立して約20個以下のアミノ酸残基からなる。
【０１４５】
一部の態様では、ペプチドリンカーL1およびL2は、最適化された長さおよび/またはアミノ酸組成を有する。一部の態様では、L1およびL2は同じ長さであり、同じアミノ酸組成を有する。他の態様では、L1およびL2は異なる。ある特定の態様では、L1および/またはL2は「短い」、すなわち、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、または12個のアミノ酸残基からなる。従って、ある特定の態様では、リンカーは約12個以下のアミノ酸残基からなる。ある特定の態様では、L1および/またはL2は「長い」、例えば、15個、20個、または25個のアミノ酸残基からなる。一部の態様では、L1および/またはL2は約3〜約15個、例えば8個、9個、または10個の連続したアミノ酸残基からなる。
【０１４６】
L1およびL2のアミノ酸組成に関して、本発明の多重特異性結合タンパク質に可動性を付与する特性、結合ドメインを妨害しない特性、ならびにプロテアーゼからの切断に耐える特性を有するペプチドが選択される。例えば、グリシン残基およびセリン残基は一般的にプロテアーゼ耐性をもたらす。多重特異性結合タンパク質においてドメインを連結するのに適したリンカーの例には、(GS) n、(GGS) n、(GGGS) n、(GGSG) n、(GGSGG) n、および(GGGGS) nが含まれるが、これに限定されず、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20である。一部の態様では、L1および/またはL2は、独立して、表4に列挙されたペプチド配列より選択される。一部の態様では、L1および/またはL2は、独立して、SEQ ID NO:292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、または302より選択される。一部の態様では、L1および/またはL2は、独立して、SEQ ID NO:298、299、および302より選択される。一部の態様では、L1および/またはL2は、SEQ ID NO:298、299、または302のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、L1および/またはL2は、SEQ ID NO:298、299、または302のアミノ酸配列からなる。一部の態様では、L1およびL2はそれぞれ、SEQ ID NO:298、299、または302のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、L1およびL2はそれぞれ、SEQ ID NO:298、299、または302のアミノ酸配列からなる。
【０１４７】
（表４）例示的なペプチドリンカーの配列
2021526862.tif 000041
【０１４８】
本明細書において開示されるリンカー、例えば、ペプチドリンカーはまた、「構築物フォーマット」という表題のサブセクションI.Eにおいて言及されるように、scFvのVHおよびVLを接続するのに使用することもできる。
【０１４９】
G.結合親和性
ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質は、CD19(例えば、ヒトCD19)、CD3(例えば、ヒトCD3および/もしくはマカクCD3)、ならびに/または血清アルブミン(例えば、HSA)に約0.1nM〜約100μMのKDで結合する。KDは、当技術分野において公知の方法によって、例えば、以下の実施例5に記載のようにSPRまたはフローサイトメトリーによって測定することができる。
【０１５０】
ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質は、CD19、CD3、および/または血清アルブミンに、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM、40pM、30pM、20pM、もしくは10pMより低いか、またはこれに等しいKDで結合する。例えば、ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質は、CD19、CD3、および/または血清アルブミンに、約10pM〜約1nM、約10pM〜約0.9nM、約10pM〜約0.8nM、約10pM〜約0.7nM、約10pM〜約0.6nM、約10pMnM〜約0.5nM、約10pM〜約0.4nM、約10pM〜約0.3nM、約10pM〜約0.2nM、約10pM〜約0.1nM、約10pM〜約50pM、0.1nM〜約10nM、約0.1nM〜約9nM、約0.1nM〜約8nM、約0.1nM〜約7nM、約0.1nM〜約6nM、約0.1nM〜約5nM、約0.1nM〜約4nM、約0.1nM〜約3nM、約0.1nM〜約2nM、約0.1nM〜約1nM、約0.1nM〜約0.5nM、約0.5nM〜約10nM、約1nM〜約10nM、約2nM〜約10nM、約3nM〜約10nM、約4nM〜約10nM、約5nM〜約10nM、約6nM〜約10nM、約7nM〜約10nM、約8nM〜約10nM、または約9nM〜約10nMのKDで結合する。
【０１５１】
ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質は、CD19、CD3、および/または血清アルブミンに、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、もしくは100nMより大きいか、またはこれに等しいKDで結合する。ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質は、CD19、CD3、および/または血清アルブミンに、約10nM〜約1000nM、約10nM〜約900nM、約10nM〜約800nM、約10nM〜約700nM、約10nM〜約600nM、約10nM〜約500nM、約10nM〜約400nM、約10nM〜約300nM、約10nM〜約200nM、約10nM〜約100nM、約10nM〜約50nM、約50nM〜約1000nM、約100nM〜約1000nM、約200nM〜約1000nM、約300nM〜約1000nM、約400nM〜約1000nM、約500nM〜約1000nM、約600nM〜約1000nM、約700nM〜約1000nM、約800nM〜約1000nM、または約900nM〜約1000nMのKDで結合する。
【０１５２】
ある特定の態様では、CD19またはCD3に対する結合のKDは血清アルブミン(例えば、HSA)の存在下で測定される。ある特定の態様では、CD19またはCD3に対する結合のKDは血清アルブミン(例えば、HSA)の大幅な非存在下で測定される。ある特定の態様では、CD19またはCD3に対する結合のKDは、血清アルブミン(例えば、HSA)の存在下で、例えば、約10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、または50mg/mL血清アルブミン(例えば、HSA)の存在下で測定される。
【０１５３】
ある特定の態様では、本開示の多重特異性結合タンパク質は、CD19、CD3、および/または血清アルブミンに、それぞれの抗原結合部位のみのもの、または同一抗原結合部位を有するモノクローナル抗体のものと同様のKD値で結合する。ある特定の態様では、CD19、CD3、および/または血清アルブミンに対する多重特異性結合タンパク質のKD値は、それぞれの抗原結合部位のみのもの、または同一抗原結合部位を有するモノクローナル抗体のものと比較して1.5倍以下、2倍以下、3倍以下、4倍以下、5倍以下、6倍以下、7倍以下、8倍以下、9倍以下、10倍以下、15倍以下、20倍以下、25倍以下、30倍以下、35倍以下、40倍以下、45倍以下、または50倍以下の増加である。
【０１５４】
ある特定の態様では、血清アルブミンの存在下で本開示の多重特異性結合タンパク質は、血清アルブミンの非存在下または大幅な非存在下と同様のKD値でCD19および/またはCD3に結合する。ある特定の態様では、血清アルブミンの存在下でCD19および/またはCD3に結合するための多重特異性結合タンパク質のKD値は、血清アルブミンの非存在下または大幅な非存在下と比較して1.5倍以下、2倍以下、3倍以下、4倍以下、5倍以下、6倍以下、7倍以下、8倍以下、9倍以下、10倍以下、15倍以下、20倍以下、25倍以下、30倍以下、35倍以下、40倍以下、45倍以下、または50倍以下の増加である。
【０１５５】
H.構築物の治療活性
本明細書において開示される多重特異性結合タンパク質はB細胞とT細胞に同時に結合するように設計されている。T細胞が動員されると、細胞溶解性シナプス形成とパーフォリンおよびグランザイムの送達を伴ってB細胞溶解が促進される。結合したT細胞は連続して標的細胞を溶解することができ、ペプチド抗原処理および提示、またはクローンT細胞分化を妨害する免疫回避機構の影響を受けない。例えば、WO2007042261A2を参照されたい。従って、多重特異性結合タンパク質と標的B細胞が結合すると標的細胞が破壊される、および/またはB細胞関連疾患の進行が減じられる。
【０１５６】
本発明の多重特異性結合タンパク質によって媒介される細胞傷害性はインビトロで様々なやり方で測定することができる。エフェクター細胞は、例えば、刺激済み濃縮済みの(ヒト)CD8陽性T細胞または未刺激の(ヒト)末梢血単核球(PBMC)でもよい。標的細胞がマカクに由来するか、または第1のドメインが結合したマカク標的細胞表面抗原を発現するか、もしくはこれをトランスフェクトされている場合、エフェクター細胞も、マカクT細胞株、例えば、4119LnPxなどマカクに由来しなければならない。標的細胞は、CD19、例えば、ヒトまたはマカクCD19を発現しなければならない。標的細胞は、CD19を安定に、または一過的にトランスフェクトされた細胞株(例えば、CHO)でもよい。または、標的細胞は、Bリンパ球などのCD19を天然に発現する細胞株でもよい。通常、エフェクター:標的細胞(E:T)比は約10:1であるが、これも変化することがある。標的細胞の死滅は51Cr放出アッセイにおいて測定されてもよく(約18時間のインキュベーション時間)、FACSに基づく細胞傷害性アッセイにおいて測定されてもよい(約48時間のインキュベーション時間)。細胞死を測定する他の方法、例えば、MTTまたはMTSアッセイ、生物発光アッセイを含むATPに基づくアッセイ、スルホローダミンB(SRB)アッセイ、WSTアッセイ、試験管内腫瘍細胞感受性試験(clonogenic assay)、およびECIS技術が当業者に周知である。
【０１５７】
ある特定の態様では、本明細書において開示される多重特異性結合タンパク質によって媒介される細胞傷害活性は、前記の細胞に基づく細胞傷害性アッセイにおいて測定される。これは、半有効濃度(ベースラインと最大値の中間の細胞傷害応答を誘導する多重特異性結合タンパク質の濃度)に対応するEC50値で表される。ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質のEC50値は、≦5000pM、例えば、≦4000pM、≦3000pM、≦2000pM、≦1000pM、≦500pM、≦400pM、≦300pM、≦200pM、≦100pM、≦50pM、≦20pM、≦10pM、≦5pM、≦4pM、≦3pM、≦2pM、または≦1pMである。
【０１５８】
EC50値は、一般的に、刺激/濃縮済みCD8+T細胞がエフェクター細胞として用いられた時には未刺激のPBMCと比較して低いと理解される。さらに、EC50値は、一般的に、標的細胞が高レベルの標的細胞表面抗原を発現する時には低レベルの標的抗原と比較して低いと理解される。例えば、刺激/濃縮済みヒトCD8+T細胞がエフェクター細胞として用いられた時(そして、標的細胞表面抗原をトランスフェクトされた細胞、例えば、CHO細胞、または標的細胞表面抗原が陽性のヒト細胞株のいずれかが、標的細胞として用いられた時)、多重特異性結合タンパク質のEC50値は、≦1000pM、例えば、≦500pM、≦250pM、≦100pM、50pM、≦10pM、または≦5pMである。ヒトPBMCがエフェクター細胞として用いられた時、多重特異性結合タンパク質のEC50値は、≦5000pM、例えば、≦4000pM、≦2000pM、≦1000pM、≦500pM、≦200pM、≦150pM、≦100pM、≦50pM、≦10pM、または≦5pMである。LnPx4119などのマカクT細胞株がエフェクター細胞として用いられ、マカク標的細胞表面抗原をトランスフェクトされた細胞、例えば、CHO細胞が標的細胞として用いられた時、多重特異性結合タンパク質のEC50値は、≦2000pM、例えば、≦1500pM、≦1000pM、≦500pM、≦300pM、≦250pM、≦100pM、≦50pM、≦10pM、または≦5pMである。
【０１５９】
従って、ある特定の態様では、EC50値は、エフェクター細胞として、刺激/濃縮済みヒトCD8+T細胞を用いて測定される。ある特定の態様では、EC50値は、エフェクター細胞としてヒトPBMCを用いて測定される。ある特定の態様では、EC50値は、エフェクター細胞としてLnPx4119などのマカクT細胞株と、標的細胞として、マカクCD19を発現するように操作された細胞(例えば、CHO細胞)を用いて測定される。
【０１６０】
ある特定の態様では、本発明の多重特異性結合タンパク質は、CD19を発現しない細胞の溶解を誘導も媒介もしない。「溶解を誘導しない」もしくは「溶解を媒介しない」という用語またはその文法上の相当語句は、多重特異性結合タンパク質が、最大500nMの濃度で、CD19を発現しない細胞の30％超の溶解を誘導も媒介もせず、例えば、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、または5％以下であり、それによって、CD19発現細胞の溶解が100％になるように設定されることを意味する。
【０１６１】
ある特定の態様では、本明細書において開示される多重特異性結合タンパク質は、同じモル濃度の対応するそれぞれの抗CD19モノクローナル抗体または抗CD3モノクローナル抗体よりも、CD19発現細胞(例えば、がん細胞)を死滅させるのに有効である。ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質は、それぞれが同じモル濃度の対応するそれぞれの抗CD19モノクローナル抗体と抗CD3モノクローナル抗体の組み合わせよりも、CD19発現細胞(例えば、がん細胞)を死滅させるのに有効である。
【０１６２】
多重特異性結合タンパク質の細胞傷害活性は血清アルブミン(例えば、HSA)の存在下または非存在下で測定することができる。ある特定の態様では、上記で開示された細胞傷害活性は血清アルブミン(例えば、HSA)の非存在下で測定される。ある特定の態様では、上記で開示された細胞傷害活性は血清アルブミン(例えば、HSA)の大幅な非存在下で測定される。ある特定の態様では、上記で開示された細胞傷害活性は、血清アルブミン(例えば、HSA)の存在下で、例えば、約10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、または50mg/mL血清アルブミン(例えば、HSA)の存在下で測定される。
【０１６３】
ある特定の態様では、血清アルブミンの存在下で本開示の多重特異性結合タンパク質は、血清アルブミンの非存在下または大幅な非存在下のEC50値に類似するEC50値でCD19発現細胞を死滅させる。ある特定の態様では、血清アルブミンの存在下でCD19発現細胞を死滅させるための多重特異性結合タンパク質のEC50値は、血清アルブミンの非存在下または大幅な非存在下と比較して、1.5倍以下、2倍以下、3倍以下、4倍以下、5倍以下、6倍以下、7倍以下、8倍以下、9倍以下、10倍以下、15倍以下、20倍以下、25倍以下、30倍以下、35倍以下、40倍以下、45倍以下、または50倍以下の増加である。血清アルブミン(例えば、約10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、または50mg/mL血清アルブミン)の存在はまた多重特異性結合タンパク質のEC50値を非特異的に変える場合があることも理解される。非特異的効果は、血清アルブミンの存在下または非存在下での、血清アルブミン結合ドメインを含有しない対照タンパク質のEC50値を比較することによって評価することができる。ある特定の態様では、変化倍率は、対照タンパク質、例えば、CD19とCD3に結合する二重特異性タンパク質に対する血清アルブミンの非特異的効果によって相殺される。
【０１６４】
I.構築物サイズ
ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質の分子量は約40kD〜約100kDである。ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質の分子量は、少なくとも60kD、少なくとも65kD、少なくとも70kD、少なくとも75kD、少なくとも80kD、少なくとも85kD、少なくとも90kD、または少なくとも95kDである。小さなサイズは一般的に急速な拡散および組織浸透に寄与するが、サイズの縮小は、血中で標的細胞(例えば、がん細胞)のかなりの存在感がある適応症を処置する目的では重要でない場合があると理解される。
【０１６５】
ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質の分子量は、約約40kD〜約90kD、約40kD〜約80kD、約40kD〜約70kD、約40kD〜約60kD、約40kD〜約50kD、約50kD〜約100kD、約50kD〜約90kD、約50kD〜約80kD、約50kD〜約70kD、約50kD〜約60kD、約60kD〜約100kD、約60kD〜約90kD、約60kD〜約80kD、約60kD〜約70kD、約65kD〜約100kD、約65kD〜約90kD、約65kD〜約80kD、約65kD〜約70kD、約70kD〜約100kD、約70kD〜約90kD、約70kD〜約80kD、約80kD〜約100kD、約80kD〜約90kD、または約90kD〜約100kDである。ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質は40kDより小さい。ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質は、約50kD〜約90kD、約50kD〜約80kD、約50kD〜約70kD、約50kD〜約60kD、約60kD〜約90kD、約60kD〜約80kD、約60kD〜約70kD、約65kD〜約90kD、約65kD〜約80kD、約65kD〜約70kD、約70kD〜約90kD、または約70kD〜約80kDである。
【０１６６】
J.血清半減期
小さなタンパク質、特に、抗体断片のインビボ半減期を延ばすために融合タンパク質が開発されている。例えば、ヘテロ二量体抗体Fc領域、例えば、インビボ半減期を延ばす1つまたは複数の変異を有するFcとの融合が米国特許出願公開番号US20140302037A1、US20140308285A1、ならびにPCT公開番号WO2014144722A2、WO2014151910A1、およびWO2015048272A1に記載されている。代替戦略は、ヒト血清アルブミン(HSA)またはHSA結合ペプチドとの融合である(例えば、PCT公開番号WO2013128027A1およびWO2014140358A1を参照されたい)。胎児性Fc受容体(FcRn)は循環中でのアルブミンの寿命の延長に関与するように見える(Chaudhury et al. (2003) J. Exp. Med., 3: 315-22を参照されたい)。アルブミンおよびIgGはFcRnの別個の部位に非協同的に結合し、三分子(tri-molecular)を形成する(同書を参照されたい)。ヒトFcRnとHSAとの結合およびヒトFcRnとヒトIgGとの結合はpH依存性であり、酸性pHでは強く、中性または生理学的pHでは弱い(同書を参照されたい)。この観察から、アルブミンを含有するタンパク質およびタンパク質複合体は、IgG(特に、Fc)を含有するものと同様に、FcRnとのpH感受性相互作用によって分解から保護されていると示唆される(同書を参照されたい)。固定化された可溶性ヒトFcRnに個々のHSAドメインが結合する能力を測定するために表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて、FcRnとアルブミンはIgG結合部位とは別個の部位においてアルブミンのD-IIIドメインを介してpH依存的に相互作用することが示されている(Chaudhury et al. (2006) Biochemistry 45:4983-90およびPCT公開番号WO2008068280A1を参照されたい)。
【０１６７】
本開示は、半減期が延長した多重特異性結合タンパク質を提供する。ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質の血清半減期は少なくとも24時間、36時間、48時間、60時間、72時間、84時間、または96時間である。ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質の血清半減期は少なくとも約50時間である。ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質の血清半減期は少なくとも約100時間である。血清半減期を測定する方法は当技術分野において公知であり、例示的な方法は実施例4に記載されている。ある特定の態様では、血清半減期は非ヒト霊長類において測定される。ある特定の態様では、血清半減期はヒトにおいて測定される。
【０１６８】
ある特定の態様では、対象に静脈内投与して50時間後の多重特異性結合タンパク質の血清中濃度は、前記対象に投与して1時間後の多重特異性結合タンパク質の血清中濃度の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％である。
【０１６９】
ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質の血清半減期は対照多重特異性結合タンパク質より少なくとも20％長く、対照多重特異性結合タンパク質は、多重特異性結合タンパク質の第1の抗原結合部位と同一の第1のドメイン、多重特異性結合タンパク質の第2の抗原結合部位と同一の第2のドメインを含むが、多重特異性結合タンパク質の第3の抗原結合部位と同一または実質的に同一の第3のドメインを含まない。ある特定の態様では、対照多重特異性結合タンパク質は、第3の抗原結合部位が存在しない以外は多重特異性結合タンパク質と同一である。ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質の血清半減期は対照多重特異性結合タンパク質の血清半減期より少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％長い。ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質の血清半減期は対照多重特異性結合タンパク質の血清半減期より少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、または少なくとも10倍長い。
【０１７０】
II.調製方法
前記の多重特異性結合タンパク質は、当業者に周知の組換えDNA技術を用いて作製することができる。例えば、多重特異性結合タンパク質をコードする1つまたは複数の単離されたポリヌクレオチドを、例えば、定常領域コード配列および発現制御配列を含む他の適切なヌクレオチド配列と連結して、望ましい多重特異性結合タンパク質をコードする従来の遺伝子発現構築物(すなわち、発現ベクター)を生成することができる。定義された遺伝子構築物の生成は当技術分野における日常的な技術の範囲内である。
【０１７１】
望ましい多重特異性結合タンパク質をコードする核酸を発現ベクターに組み込み(連結し)、従来のトランスフェクション法または形質転換法によって宿主細胞に導入することができる。例示的な宿主細胞は、大腸菌(E.coli)細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胚腎臓293(HEK293)細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞がん細胞(例えば、HepG2)、およびIgGタンパク質を産生しないミエローマ細胞である。宿主細胞が、多重特異性結合タンパク質をコードする遺伝子を発現できる条件下で、形質転換された宿主細胞を増殖することができる。
【０１７２】
特異的発現および精製の条件は、使用する発現系に応じて変化する。例えば、遺伝子を大腸菌において発現させる場合、最初に、操作された遺伝子を適切な細菌プロモーター、例えば、TrpまたはTac、および原核生物シグナル配列の下流に配置することによって発現ベクターにクローニングする。発現タンパク質は分泌される場合がある。発現タンパク質は屈折体(refractile)または封入体に蓄積する場合があり、これは、フレンチプレスまたは超音波処理によって細胞を破壊した後に収集することができる。次いで、屈折体(refractile body)が可溶化され、タンパク質は当技術分野において公知の方法によって再び折り畳まれる、および/または切断される場合がある。
【０１７３】
操作された遺伝子を真核生物宿主細胞、例えば、CHO細胞において発現させる場合、最初に、適切な真核生物プロモーター、分泌シグナル、ポリA配列、および停止コドンを含有する発現ベクターに挿入する。任意で、ベクターまたは遺伝子構築物はエンハンサーおよびイントロンを含有してもよい。抗体またはその一部を含む融合タンパク質を伴う態様では、発現ベクターは、任意で、定常領域の全てまたは一部をコードする配列を含有し、これにより、重鎖または軽鎖の全てまたは一部を発現することが可能になる。従来の技法を用いて、この遺伝子構築物を真核生物宿主細胞に導入することができる。
【０１７４】
本明細書において開示される多重特異性結合タンパク質は1本のポリペプチド鎖を含んでもよい。この場合、ポリペプチドを発現する1種類のベクター(例えば、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された発現制御配列を含有する)を宿主細胞にトランスフェクトすることができる。または、本明細書において開示される多重特異性結合タンパク質は2種類以上のポリペプチドを含んでもよい。この場合、複数種の発現ベクター、例えば、それぞれのポリペプチドを発現する1つの発現ベクターを宿主細胞にコトランスフェクトすることができる。また、2種類以上のポリペプチドを発現する1つの発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることもできる。例えば、2種類以上のポリペプチドのコード配列を異なる発現制御配列(例えば、プロモーター、エンハンサー、および/または配列内リボソーム進入部位(IRES))に機能的に連結することができる。2種類以上のポリペプチドのコード配列をリボソームスキップ配列または自己切断配列、例えば、2Aペプチドによって分けることもできる。
【０１７５】
ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質を発現するために、N末端シグナル配列がタンパク質構築物に含まれる。例示的なN末端シグナル配列は、インターロイキン-2、CD-5、IgGκ軽鎖、トリプシノゲン、血清アルブミン、およびプロラクチンに由来するシグナル配列を含む。
【０１７６】
トランスフェクションの後、限界希釈、ELISA、FACS、顕微鏡、またはClonepixなどの当技術分野において公知の方法を用いて、細胞バンクを作製するためにシングルクローンを単離することができる。多重特異性結合タンパク質のバイオリアクタースケールアップおよび発現維持に適した条件下でクローンを培養することができる。
【０１７７】
多重特異性結合タンパク質は、遠心分離、デプス濾過(depth filtration)、細胞溶解、ホモジナイゼーション、凍結-解凍、アフィニティ精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィー、および混合モード(mixed-mode)クロマトグラフィーを含む当技術分野において公知の方法を用いて単離および精製することができる。
【０１７８】
III.薬学的組成物
本開示はまた、治療的有効量の本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質を含有する薬学的組成物も特徴とする。前記組成物は様々な薬物送達系での使用のために製剤化することができる。適切な製剤化のために、1種類または複数種の生理学的に許容される賦形剤または担体も組成物に含めることができる。本開示において使用するのに適した製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985において見出される。薬物送達方法の簡潔な総説については、例えば、Langer(Science 249:1527-1533, 1990)を参照されたい。
【０１７９】
ある特定の態様では、薬学的組成物は、例えば、pH、オスモル濃度、粘性、透明性、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解速度または放出速度、組成物の吸着または浸透を改変、維持、または保存するための製剤材料を含有する場合がある。このような態様では、適切な製剤材料には、アミノ酸(例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジン);抗菌剤;抗酸化物質(例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、もしくは亜硫酸水素ナトリウム);緩衝液(例えば、ホウ酸、重炭酸、Tris-HCl、クエン酸、リン酸、もしくは他の有機酸);増量剤(bulking agent)(例えば、マンニトールもしくはグリシン);キレート剤(例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA));錯化剤(例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β-シクロデキストリン、もしくはヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン);増量剤(filler);単糖;二糖;および他の炭水化物(例えば、グルコース、マンノース、もしくはデキストリン);タンパク質(例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン);着色剤、着香剤、および希釈剤;乳化剤;親水性ポリマー(例えば、ポリビニルピロリドン);低分子量ポリペプチド;塩形成対イオン(例えば、ナトリウム);防腐剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、もしくは過酸化水素);溶媒(例えば、グリセリン、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコール);糖アルコール(例えば、マンニトールもしくはソルビトール);懸濁剤;サーファクタントもしくは湿潤剤(例えば、プルロニック、PEG、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート20、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール);安定性向上剤(例えば、スクロースもしくはソルビトール);張性向上剤(例えば、アルカリ金属ハライド、好ましくは、塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム、マンニトールソルビトール);送達ビヒクル;希釈剤;賦形剤、ならびに/または薬学的アジュバント(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(Mack Publishing Company, 1990を参照されたい)が含まれるが、これに限定されない。
【０１８０】
ある特定の態様では、薬学的組成物は、ナノ粒子、例えば、ポリマーナノ粒子、リポソーム、またはミセル(Anselmo et al. (2016) BIOENG. TRANSL. MED. 1: 10-29を参照されたい)を含有する場合がある。
【０１８１】
ある特定の態様では、薬学的組成物は持続送達製剤または制御送達製剤を含有する場合がある。持続送達手段または制御送達手段を製剤化するための技法、例えば、リポソーム担体、生体腐食性(bio-erodible)微粒子または多孔性ビーズ、およびデポー注射も当業者に公知である。持続放出製剤には、例えば、多孔性ポリマー微粒子、または成型物品、例えば、フィルム、もしくはマイクロカプセルの形をした半透性ポリマーマトリックスが含まれ得る。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸、L-グルタミン酸とγエチル-L-グルタミン酸のコポリマー、ポリ(2-ヒドロキシエチル-イネタクリレート(inethacrylate))、エチレン酢酸ビニル、またはポリ-D(-)-3-ヒドロキシ酪酸を含む場合がある。持続放出組成物は、当技術分野において公知のいくつかの方法のいずれでも調製することができるリポソームを含む場合がある。
【０１８２】
本明細書において開示される多重特異性結合タンパク質を含有する薬学的組成物は投与単位の形で提供することができ、任意の適切な方法によって調製することができる。薬学的組成物は、その意図された投与経路と適合するように製剤化しなければならない。投与経路の例は、静脈内(IV)投与、皮内投与、吸入投与、経皮投与、局部投与、経粘膜投与、くも膜下腔内投与、および直腸投与である。ある特定の態様では、組換えヒトシアリダーゼ、組換えヒトシアリダーゼ融合タンパク質、または本明細書において開示される抗体結合体がIV注入によって投与される。ある特定の態様では、組換えヒトシアリダーゼ、組換えヒトシアリダーゼ融合タンパク質、または本明細書において開示される抗体結合体が腫瘍内注射によって投与される。有用な製剤は薬学分野において公知の方法によって調製することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(Mack Publishing Company, 1990)を参照されたい。非経口投与に適した製剤成分には、滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒;抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン;抗酸化物質、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム;キレート剤、例えば、EDTA;緩衝液、例えば、酢酸、クエン酸、またはリン酸;および張性を調節するための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースが含まれる。
【０１８３】
静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Cremophor ELTM(BASF, Parsippany, NJ)、またはリン酸緩衝食塩水(PBS)が含まれる。担体は製造および保管の条件下で安定でなければならず、微生物から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレン(polyetheylene)グリコール)、およびその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒でもよい。
【０１８４】
静脈内薬物送達製剤が注射器、ペン、またはバッグの中に入れられる場合がある。ある特定の態様では、バッグは、チューブおよび/または針を備える導管に接続される場合がある。ある特定の態様では、前記製剤は凍結乾燥製剤または液体製剤である場合がある。ある特定の態様では、前記製剤はフリーズドライ(凍結乾燥)され、約12〜60個のバイアルに入れられる場合がある。ある特定の態様では、前記製剤はフリーズドライされてもよく、45mgのフリーズドライ製剤が1個のバイアルに入れられてもよい。ある特定の態様では、約40mg〜約100mgのフリーズドライ製剤が1個のバイアルに入れられる場合がある。ある特定の態様では、静脈内薬物製剤中のタンパク質の治療量を得るために、12個、27個、または45個のバイアルからのフリーズドライ製剤が組み合わされる。ある特定の態様では、前記製剤は液体製剤であり、約250mg/バイアル〜約1,000mg/バイアルとして保管される場合がある。ある特定の態様では、前記製剤は液体製剤であり、約600mg/バイアルとして保管される場合がある。ある特定の態様では、前記製剤は液体製剤であり、約250mg/バイアルとして保管される場合がある。
【０１８５】
これらの組成物は従来の滅菌技法によって滅菌されてもよく、滅菌濾過されてもよい。結果として生じた水溶液は、使用のためにそのままで包装されてもよく、凍結乾燥されて包装されてもよく、凍結乾燥された調製物は投与の前に滅菌した水性担体と混合される。調製物のpHは典型的に3〜11であり、より好ましくは5〜9または6〜8であり、最も好ましくは7〜8、例えば、7〜7.5である。固体の形をとる、結果として生じた組成物は複数の単一用量単位として包装されてもよく、それぞれの単位が、ある決まった量の上述した薬剤を含有する。固体の形をとる組成物はまた、変更がきく量のために容器に入れられて包装することもできる。
【０１８６】
ある特定の態様では、本開示は、本開示のタンパク質と、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ポリソルベート80、水、および水酸化ナトリウムの組み合わせを含む、貯蔵寿命が長い製剤を提供する。
【０１８７】
ある特定の態様では、pH緩衝溶液中に本開示のタンパク質を含む水性製剤が調製される。本発明の緩衝液のpHは、約4〜約8、例えば、約4.5〜約6.0、または約4.8〜約5.5でもよく、本発明の緩衝液のpHは約5.0〜約5.2でもよい。上記の列挙されたpHの中間の範囲も本開示の一部であると意図される。例えば、上限および/または下限として上記の列挙された任意の値の組み合わせを用いた値の範囲が含まれると意図される。この範囲内にpHを制御する緩衝液の例には、酢酸塩(例えば、酢酸ナトリウム)、コハク酸塩(例えば、コハク酸ナトリウム)、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩、および他の有機酸緩衝液が含まれる。
【０１８８】
ある特定の態様では、製剤は、pHを約4〜約8の範囲に維持するためにクエン酸塩およびリン酸塩を含有する緩衝系を含む。ある特定の態様では、pH範囲は約4.5〜約6.0、または約pH4.8〜約5.5でもよく、pH範囲は約5.0〜約5.2でもよい。ある特定の態様では、緩衝系は、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム二水和物、および/またはリン酸二水素ナトリウム二水和物を含む。ある特定の態様では、緩衝系は、約1.3mg/mlのクエン酸(例えば、1.305mg/ml)、約0.3mg/mlのクエン酸ナトリウム(例えば、0.305mg/ml)、約1.5mg/mlのリン酸水素二ナトリウム二水和物(例えば、1.53mg/ml)、約0.9mg/mlのリン酸二水素ナトリウム二水和物(例えば、0.86)、および約6.2mg/mlの塩化ナトリウム(例えば、6.165mg/ml)を含む。ある特定の態様では、緩衝系は、1〜1.5mg/mlのクエン酸、0.25〜0.5mg/mlのクエン酸ナトリウム、1.25〜1.75mg/mlのリン酸水素二ナトリウム二水和物、0.7〜1.1mg/mlのリン酸二水素ナトリウム二水和物、および6.0〜6.4mg/mlの塩化ナトリウムを含む。ある特定の態様では、製剤のpHは水酸化ナトリウムで調節される。
【０１８９】
ポリオールは張性剤(tonicifier)として作用し、多重特異性結合タンパク質を安定化する可能性があり、これも前記製剤に含まれる場合がある。ポリオールは、前記製剤の望ましい等張性に関して変化する場合がある量で前記製剤に添加される。ある特定の態様では、水性製剤は等張性の場合がある。添加されるポリオールの量はまたポリオール分子量についても変化する場合がある。例えば、二糖(例えば、トレハロース)と比較して少量の単糖(例えば、マンニトール)が添加される場合がある。ある特定の態様では、張性薬剤として前記製剤に用いられ得るポリオールはマンニトールである。ある特定の態様では、マンニトール濃度は約5〜約20mg/mlの場合がある。ある特定の態様では、マンニトール濃度は約7.5〜15mg/mlの場合がある。ある特定の態様では、マンニトール濃度は約10〜14mg/mlの場合がある。ある特定の態様では、マンニトール濃度は約12mg/mlの場合がある。ある特定の態様では、ポリオールソルビトールが前記製剤に含まれる場合がある。
【０１９０】
界面活性剤またはサーファクタントも前記製剤に添加される場合がある。例示的な界面活性剤には、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート(例えば、ポリソルベート20、80など)またはポロキサマー(例えば、ポロキサマー188)が含まれる。添加される界面活性剤の量は、製剤化された抗体の凝集を低減する、および/または製剤中での粒子の形成を最小にする、および/または吸着を低減するような量である。ある特定の態様では、前記製剤は、ポリソルベートであるサーファクタントを含む場合がある。ある特定の態様では、前記製剤は界面活性剤ポリソルベート80またはTween80を含有してもよい。Tween80は、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエートを表すために用いられる用語である(Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4th edi., 1996を参照されたい)。ある特定の態様では、前記製剤は約0.1mg/mL〜約10mg/mLのポリソルベート80、または約0.5mg/mL〜約5mg/mLを含有する場合がある。ある特定の態様では、約0.1％ポリソルベート80が前記製剤に添加される場合がある。
【０１９１】
態様において、本開示のタンパク質製品は液体製剤として製剤化される。液体製剤は、ゴム栓で閉じ、アルミニウムのクリンプシールクロージャー(crimp seal closure)で密封したUSP/Ph EurタイプI 50Rバイアルに入れられて10mg/mL濃度で提供される場合がある。栓は、USPおよびPh Eurに準拠するエラストマーで作られる場合がある。ある特定の態様では、液体製剤は0.9％食塩水で希釈される場合がある。
【０１９２】
ある特定の態様では、本開示の液体製剤は、安定化レベルの糖と組み合わせて10mg/mL濃度の溶液として調製される場合がある。ある特定の態様では、液体製剤は水性担体に溶解して調製される場合がある。ある特定の態様では、静脈内投与に望ましくない、または不適切な粘性をもたらす可能性がある量を超えない量で安定剤が添加される場合がある。ある特定の態様では、糖は二糖、例えば、スクロースの場合がある。ある特定の態様では、液体製剤はまた緩衝剤、サーファクタント、および防腐剤の1つまたは複数も含む場合がある。
【０１９３】
ある特定の態様では、液体製剤のpHは、薬学的に許容される酸および/または塩基を添加することによって調節される場合がある。ある特定の態様では、薬学的に許容される酸は塩酸の場合がある。ある特定の態様では、塩基は水酸化ナトリウムの場合がある。
【０１９４】
本明細書において関心対象の水性担体は、薬学的に許容され(ヒトへの投与に安全かつ無毒であり)、液体製剤の調製に有用なものである。例示的な担体には、滅菌注射用水(SWFI)、静菌注射用水(BWFI)、pH緩衝溶液(例えば、リン酸緩衝食塩水)、滅菌食塩水、リンガー溶液、またはデキストロース溶液が含まれる。
【０１９５】
細菌の働きを低減するために、本明細書において任意で防腐剤が製剤に添加されてもよい。防腐剤を添加すると、例えば、多目的(複数回投与)製剤の生産が容易になる場合がある。
【０１９６】
多重特異性結合タンパク質は、タンパク質およびリオプロテクタント(lyoprotectant)を含む凍結乾燥製剤を生成するように凍結乾燥される場合がある。リオプロテクタントは糖、例えば、二糖の場合がある。ある特定の態様では、リオプロテクタントはスクロースまたはマルトースの場合がある。凍結乾燥製剤はまた、緩衝剤、サーファクタント、増量剤、および/または防腐剤の1つまたは複数も含む場合がある。
【０１９７】
凍結乾燥製剤の安定化に有用なスクロースまたはマルトースの量は少なくとも1:2のタンパク質:スクロースまたはマルトースの重量比でもよい。ある特定の態様では、タンパク質:スクロースまたはマルトース重量比は1:2〜1:5の場合がある。ある特定の態様では、製剤のpHは凍結乾燥前に、薬学的に許容される酸および/または塩基を添加することによって調節される場合がある。ある特定の態様では、薬学的に許容される酸は塩酸の場合がある。ある特定の態様では、薬学的に許容される塩基は水酸化ナトリウムの場合がある。凍結乾燥前に、本開示のタンパク質を含有する溶液のpHは6〜8に調節される場合がある。ある特定の態様では、凍結乾燥製剤のpH範囲は7〜8の場合がある。
【０１９８】
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投与量レベルは、患者への毒性無く、特定の患者、組成物、および投与方法について望ましい治療応答を実現するのに有効な活性成分量を得るように変えることができる。
【０１９９】
特定の用量は、各患者に一様な用量、例えば、50〜5,000mgのタンパク質でもよい。または、患者の用量を患者のおおよその体重または表面積に合わせることができる。適切な投与量を決定する際の他の要因には、処置または予防しようとする疾患または状態、疾患の重篤度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別、および医学的状態が含まれ得る。処置に適した投与量を決定するのに必要な計算のさらなる改善が、特に、本明細書において開示される投与量情報およびアッセイを考慮して当業者によって日常的に行われる。投与量はまた、適切な用量反応データと共に使用される投与量を決定するための既知のアッセイの使用によって決定することもできる。疾患の進行がモニタリングされるにつれて、個々の患者の投与量を調節することができる。患者における標的化可能な構築物または複合体の血中濃度を測定して、有効濃度に到達するために、または有効濃度を維持するために投与量を調節する必要があるかどうか見ることができる。ある特定の個体に対して、どの標的化可能な構築物および/または複合体ならびにその投与量が有効である可能性が最も高いか確かめるためにファーマコゲノミクスが用いられる場合がある(Schmitz et al., Clinica Chimica Acta 308: 43-53, 2001; Steimer et al., Clinica Chimica Acta 308: 33-41, 2001)。
【０２００】
一般的に、体重に基づく投与量は、約0.01μg〜約100mg/kg体重、例えば、約0.01μg〜約100mg/kg体重、約0.01μg〜約50mg/kg体重、約0.01μg〜約10mg/kg体重、約0.01μg〜約1mg/kg体重、約0.01μg〜約100μg/kg体重、約0.01μg〜約50μg/kg体重、約0.01μg〜約10μg/kg体重、約0.01μg〜約1μg/kg体重、約0.01μg〜約0.1μg/kg体重、約0.1μg〜約100mg/kg体重、約0.1μg〜約50mg/kg体重、約0.1μg〜約10mg/kg体重、約0.1μg〜約1mg/kg体重、約0.1μg〜約100μg/kg体重、約0.1μg〜約10μg/kg体重、約0.1μg〜約1μg/kg体重、約1μg〜約100mg/kg体重、約1μg〜約50mg/kg体重、約1μg〜約10mg/kg体重、約1μg〜約1mg/kg体重、約1μg〜約100μg/kg体重、約1μg〜約50μg/kg体重、約1μg〜約10μg/kg体重、約10μg〜約100mg/kg体重、約10μg〜約50mg/kg体重、約10μg〜約10mg/kg体重、約10μg〜約1mg/kg体重、約10μg〜約100μg/kg体重、約10μg〜約50μg/kg体重、約50μg〜約100mg/kg体重、約50μg〜約50mg/kg体重、約50μg〜約10mg/kg体重、約50μg〜約1mg/kg体重、約50μg〜約100μg/kg体重、約100μg〜約100mg/kg体重、約100μg〜約50mg/kg体重、約100μg〜約10mg/kg体重、約100μg〜約1mg/kg体重、約1mg〜約100mg/kg体重、約1mg〜約50mg/kg体重、約1mg〜約10mg/kg体重、約10mg〜約100mg/kg体重、約10mg〜約50mg/kg体重、約50mg〜約100mg/kg体重である。
【０２０１】
用量は、一日に、一週間に、一ヶ月に、もしくは一年に一回もしくはそれより多く、またはそれどころか2〜20年に一回与えられてもよい。当業者は、体液または組織における、標的化可能な構築物または複合体の測定された滞留時間および濃度に基づいて、投薬するための反復率を容易に評価することができる。本発明の投与は、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、胸膜内投与、くも膜下腔内投与、腔内投与でもよく、カテーテルを介した灌流によるものでもよく、直接的な病巣内注射によるものでもよい。これは、一日に一回もしくはそれより多く、一週間に一回もしくはそれより多く、一ヶ月に一回もしくはそれより多く、一年に一回もしくはそれより多く投与されてもよい。
【０２０２】
IV.治療用途
多重特異性結合タンパク質は単独で、または他の治療剤と組み合わせて使用できると意図される。
【０２０３】
A.適応症
本開示は、その必要がある対象において、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生生物反応、移植片対宿主病、または宿主対移植片病を処置するまたは寛解させるための方法であって、本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質の投与を含む方法を提供する。
【０２０４】
ある特定の態様では、処置しようとするがんは、非ホジキンリンパ腫、例えば、B細胞リンパ腫である。ある特定の態様では、非ホジキンリンパ腫は、B細胞リンパ腫、例えば、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、原発性縦隔B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、節外性辺縁帯B細胞リンパ腫、節性辺縁帯B細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、毛様細胞性白血病、慢性リンパ性白血病、または原発性中枢神経系リンパ腫である。ある特定の他の態様では、処置しようとするがんは多発性骨髄腫である。ある特定の他の態様では、処置しようとするがんは急性リンパ芽球性白血病(ALL)である。ある特定の態様では、ALLは再発性/難治性の成人ALLおよび小児ALLである。
【０２０５】
B.併用療法
本明細書に記載の方法および組成物は単独で、または他の治療剤および/もしくはモダリティーと組み合わせて使用することができる。本明細書で使用する「組み合わせて」投与されるという用語は、対象が障害に苦しんでいる間に、患者に対する処置の効果がある時点で重複するように、2つの(またはそれより多い)異なる処置が対象に送達されることを意味すると理解される。ある特定の態様では、投与期間に重複があるように、第2の送達が開始する時に、ある処置の送達が依然として行われている。これは本明細書において「同時の」または「同時発生的送達」と呼ばれる時がある。他の態様では、一方の処置の送達は、他方の処置の送達が開始する前に終了する。どちらの場合の特定の態様でも、組み合わされた投与が理由で処置の効果が高まる。例えば、第2の処置の方が効果が高い。例えば、第1の処置の非存在下で第2の処置が投与された場合に見られる効果と等価な効果が第2の処置では見られないか、もしくは第1の処置の非存在下で第2の処置が投与された場合に見られる効果よりも大きな程度で第2の処置が症状を低減するか、または同様の状況が第1の処置で見られる。ある特定の態様では、送達は、症状、または障害に関連する他のパラメータの低減が、他方の処置の非存在下で送達された一方の処置で観察されたものよりも大きくなるような送達である。2つの処置の効果は部分的に相加的でもよく、全体的に相加的でもよく、相加効果より大きくてもよい。送達は、第2の処置が送達された時に、送達された第1の処置の効果が依然として検出可能になるようなものでもよい。
【０２０６】
一局面では、本開示は、1種類または複数種の本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質と組み合わせて第2の治療剤を投与することによって対象を処置する方法を提供する。
【０２０７】
がんの処置において併用療法の一部として用いられる場合がある例示的な治療剤には、例えば、放射線、マイトマイシン、トレチノイン、リボマスチン(ribomustin)、ゲムシタビン、ビンクリスチン、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキセート、ドキソルビシン、カルボコン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリクス、レトロゾール、ラルチトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、ホテムスチン、サイマルファシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビノレルビン、ベスナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、酢酸エリプチニウム、ケタンセリン、ドキシフルリジン、エトレチナート、イソトレチノイン、ストレプトゾシン、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル(drogenil)、ブトシン(butocin)、カルモフール、ラゾキサン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフール、イホスファミド、プレドニムスチン、ピシバニール、レバミゾール、テニポシド、インプロスルファン、エノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステロン、メピチオスタン、エピチオスタノール、ホルメスタン、インターフェロン-α、インターフェロン-2α、インターフェロン-β、インターフェロン-γ、コロニー刺激因子-1、コロニー刺激因子-2、デニロイキンジフチトクス、インターロイキン-2、黄体ホルモン放出因子、およびそのコグネイト受容体と特異的な結合を示し、血清半減期の増加または減少を示し得る前述した薬剤のバリエーションが含まれる。
【０２０８】
がんの処置において併用療法の一部として用いられる場合がある、さらなる薬剤クラスは免疫チェックポイント阻害剤である。チェックポイント阻害剤は、例えば、PD-1アンタゴニスト、PD-L1アンタゴニスト、CTLA-4アンタゴニスト、アデノシンA2A受容体アンタゴニスト、B7-H3アンタゴニスト、B7-H4アンタゴニスト、BTLAアンタゴニスト、KIRアンタゴニスト、LAG3アンタゴニスト、TIM-3アンタゴニスト、VISTAアンタゴニスト、またはTIGITアンタゴニストより選択され得る。
【０２０９】
ある特定の態様では、チェックポイント阻害剤はPD-1阻害剤またはPD-L1阻害剤である。PD-1は、あまりに活発な免疫応答を阻止するのに適切な時に、T細胞活性を阻害するか、または別のやり方で調節する免疫系チェックポイントとして役立つT細胞表面に存在する受容体である。しかしながら、がん細胞は、T細胞活性をシャットダウンまたは調節するようにT細胞表面にあるPD-1と相互作用するリガンド、例えば、PD-L1を発現することによって、このチェックポイントを利用することができる。例示的なPD-1/PD-L1に基づく免疫チェックポイント阻害剤には、抗体に基づく治療剤が含まれる。PD-1/PD-L1に基づく免疫チェックポイント阻害を使用する例示的な治療方法は米国特許第8,728,474号および同第9,073,994号ならびに欧州特許第1537878号B1に記載されており、例えば、抗PD-1抗体の使用を含む。例示的な抗PD-1抗体は、例えば、米国特許第8,952,136号、同第8,779,105号、同第8,008,449号、同第8,741,295号、同第9,205,148号、同第9,181,342号、同第9,102,728号、同第9,102,727号、同第8,952,136号、同第8,927,697号、同第8,900,587号、同第8,735,553号、および同第7,488,802号に記載されている。例示的な抗PD-1抗体には、例えば、ニボルマブ(Opdivo(登録商標), Bristol-Myers Squibb Co.)、ペンブロリズマブ(Keytruda(登録商標), Merck Sharp & Dohme Corp.)、PDR001(Novartis Pharmaceuticals)、およびピディリズマブ(CT-011, Cure Tech)が含まれる。例示的な抗PD-L1抗体は、例えば、米国特許第9,273,135号、同第7,943,743号、同第9,175,082号、同第8,741,295号、同第8,552,154号、および同第8,217,149号に記載されている。例示的な抗PD-L1抗体には、例えば、アテゾリズマブ(Tecentriq(登録商標), Genentech)、デュバルマブ(duvalumab)(AstraZeneca)、MEDI4736、アベルマブ、およびBMS936559(Bristol Myers Squibb Co.)が含まれる。
【０２１０】
ある特定の態様では、本明細書に記載の方法または組成物はCTLA-4阻害剤と組み合わせて投与される。CTLA-4経路では、T細胞上にあるCTLA-4と、(がん細胞ではなく)抗原提示細胞の表面にある、そのリガンド(例えば、B7-1とも知られるCD80、およびCD86)が相互作用するとT細胞が阻害される。例示的なCTLA-4に基づく免疫チェックポイント阻害方法は、米国特許第5,811,097号、同第5,855,887号、同第6,051,227号に記載されている。例示的な抗CTLA-4抗体は、米国特許第6,984,720号、同第6,682,736号、同第7,311,910号;同第7,307,064号、同第7,109,003号、同第7,132,281号、同第6,207,156号、同第7,807,797号、同第7,824,679号、同第8,143,379号、同第8,263,073号、同第8,318,916号、同第8,017,114号、同第8,784,815号、および同第8,883,984号、国際(PCT)公開番号WO98/42752、WO00/37504、およびWO01/14424、ならびに欧州特許第EP1212422B1に記載されている。例示的なCTLA-4抗体にはイピリムマブまたはトレメリムマブが含まれる。
【０２１１】
ある特定の態様では、本明細書に記載の方法または組成物は、(i)PD-1またはPD-L1阻害剤、例えば、本明細書において開示されるPD-1またはPD-L1阻害剤、および(ii)CTLA-4阻害剤、例えば、本明細書において開示されるCTLA-4阻害剤と組み合わせて投与される。
【０２１２】
ある特定の態様では、本明細書に記載の方法または組成物はIDO阻害剤と組み合わせて投与される。例示的なIDO阻害剤には、1-メチル-D-トリプトファン(インドキシモド(indoximod)として知られる)、エパカドスタット(INCB24360)、ナボキシモド(navoximod)(GDC-0919)、およびBMS-986205が含まれる。
【０２１３】
がんの処置において併用療法の一部として用いられる場合がある、さらに他の薬剤は、非チェックポイント標的を標的とするモノクローナル抗体薬剤(例えば、ハーセプチン)および非細胞傷害薬剤(例えば、チロシン-キナーゼ阻害剤)である。
【０２１４】
抗がん剤のさらに他のカテゴリーには、例えば、(i)ALK阻害剤、ATR阻害剤、A2Aアンタゴニスト、Base Excision Repair Inhibitor、Bcr-Ablチロシンキナーゼ阻害剤、Brutonのチロシンキナーゼ阻害剤、CDC7阻害剤、CHK1阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、DNA-PK阻害剤、DNA-PKとmTOR両方の阻害剤、DNMT1阻害剤、DNMT1阻害剤+2-クロロ-デオキシアデノシン、HDAC阻害剤、ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤、IDO阻害剤、JAK阻害剤、mTOR阻害剤、MEK阻害剤、MELK阻害剤、MTH1阻害剤、PARP阻害剤、ホスホイノシチド3-キナーゼ阻害剤、PARP1とDHODH両方の阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼ-II阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、VEGFR阻害剤、およびWEE1阻害剤より選択される阻害剤;(ii)OX40、CD137、CD40、GITR、CD27、HVEM、TNFRSF25、またはICOSのアゴニスト;ならびに(iii)IL-12、IL-15、GM-CSF、およびG-CSFより選択されるサイトカインが含まれる。
【０２１５】
本明細書において開示される多重特異性抗体はTリンパ球を活性化するように設計されており、神経毒性などの副作用を引き起こす場合があると理解される。従って、ある特定の態様では、多重特異性結合タンパク質と組み合わせて使用することができる第2の治療剤は、多重特異性結合タンパク質の副作用を緩和する、例えば、神経毒性を低減する薬剤を含む。ある特定の態様では、第2の治療剤はT細胞輸送を阻害する、例えば、免疫細胞が血液脳関門を横断するのを低減または阻害する。このような治療剤の非限定的な例には、免疫細胞の表面にある接着分子(例えば、α4インテグリン)のアンタゴニスト(例えば、アンタゴニスト抗体)、例えば、ナタリズマブが含まれる。ある特定の態様では、第2の治療剤、例えば、フィンゴリモドまたはオザニモド(ozanimod)は、スフィンゴシン-1-リン酸(SIP)受容体(例えば、S1PR1またはS1PR5)の内部移行を増大させる。ある特定の態様では、第2の治療剤は、一酸化窒素合成酵素(NOS)阻害剤、例えば、ロノプテリン(ronopterin)、シンダニスタット(cindunistat)、A-84643、ONO-1714、L-NOARG、NCX-456、VAS-2381、GW-273629、NXN-462、CKD-712、KD-7040、またはグアニジノエチルジスルフィド(guanidinoethyldisulfide)である。ある特定の態様では、第2の治療剤は、CSF1またはCSF1Rのアンタゴニスト、例えば、ペキシダルチニブ(pexidartinib)、エマクツズマブ(emactuzumab)、カビラリズマブ(cabiralizumab)、LY-3022855、JNJ-40346527、またはMCS110である。第2の治療剤のさらなる非限定的な例には、多硫酸ペントサン、ミノサイクリン、抗ICAM-1抗体、抗P-セレクチン抗体、抗CD11a抗体、抗CD162抗体、および抗IL-6R抗体(例えば、トシリズマブ)が含まれる。
【０２１６】
望ましい組み合わされた治療効果を実現するように、多重特異性結合タンパク質とさらなる治療剤の量ならびに相対的な投与タイミングが選択される場合がある。例えば、併用療法を、このような投与を必要とする患者に投与する場合、組み合わされた治療剤、またはこのような治療剤を含む薬学的組成物は任意の順番で、例えば、連続して、同時発生的に、一緒に、同時になど投与することができる。さらに、例えば、多重特異性結合タンパク質は、さらなる治療剤が予防効果または治療効果を発揮する間に投与されてもよく、逆もまた同じである。
【０２１７】
説明全体を通して、組成物が特定の成分を有する、含む(including)、もしくは含む(comprising)と説明されている場合、またはプロセスおよび方法が特定の工程を有する、含む(including)、もしくは含む(comprising)と説明されている場合、列挙された成分から本質的になるか、または列挙された成分からなる本発明の組成物がさらにあり、列挙された処理工程から本質的になるか、または列挙された処理工程からなる本発明に従うプロセスおよび方法があると意図される。
【０２１８】
この出願において、要素もしくは成分が、列挙された要素もしくは成分のリストに含まれる、および/または列挙された要素もしくは成分のリストより選択されると言われる場合、要素もしくは成分は、列挙された要素もしくは成分のいずれか1つでもよい、または要素もしくは成分は、列挙された要素もしくは成分のうちの2つ以上からなる群より選択されてもよいと理解しなければならない。
【０２１９】
さらに、本明細書に記載の組成物または方法の要素および/または特徴は、本明細書において明示的でも暗示的でも、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々なやり方で組み合わせることができると理解しなければならない。例えば、特定の化合物について言及されている場合、文脈から異なって理解される場合を除いて、この化合物は本発明の組成物の様々な態様および/または本発明の方法において使用することができる。言い換えると、本願の中では、明瞭かつ簡潔な出願が書かれる、および描かれるのを可能にするやり方で態様は説明および図示されているが、本開示および本発明から外れることなく、これらの態様は多様に組み合わせることができる、または分けることができると意図され、かつ理解される。例えば、本明細書において説明および図示されている全ての特徴が、本明細書において説明および図示されている本発明の全ての局面に適用可能だと理解される。
【０２２０】
「の少なくとも1つ」という表現は、文脈および使用から異なって理解される場合を除いて、この表現の後にある列挙された対象物のそれぞれを個々に含み、かつ列挙された対象物のうちの2つ以上の組み合わせを含むと理解しなければならない。3つ以上の列挙された対象物に関連する「および/または」という表現は、文脈から異なって理解される場合を除いて同じ意味を有すると理解しなければならない。
【０２２１】
特にことわらない限り、または文脈から異なって理解される場合を除いて、「含む(include)」、「含む(includes)」、「含む(including)」、「有する(have)」、「有する(has)」、「有する(having)」、「含有する(contain)」、「含有する(contains)」、または「含有する(containing)」という用語の使用は、その文法上の相当語句を含めて、例えば、列挙されていない追加の要素または工程を除外することなく、一般的にオープンエンドかつ非限定的だと理解しなければならない。
【０２２２】
「約」という用語の使用が定量値の前にある場合、本発明は、特にことわらない限り、特定の定量値そのものも含む。本明細書で使用する「約」という用語は、他に特別の指示または推測がない限り公称値からの±10％のばらつきを指す。
【０２２３】
本発明が操作可能な限り、工程の順番またはある特定の行為を行う順番は重要でないと理解しなければならない。さらに、2つ以上の工程または行為が同時に実施されてもよい。
【０２２４】
任意のおよび全ての実施例、または本明細書における例示的な言葉、例えば、「などの」または「を含む」の使用は単に本発明をより良く例示することを目的とし、クレームに記載されていない限り、本発明の範囲に制約をもたらさない。本明細書中にある言葉が、クレームに記載されていない要素を、本発明の実施に不可欠なものとして示していると解釈してはならない。
【０２２５】
上記の説明は本発明の複数の局面および態様について述べている。本特許出願は、特に、これらの局面および態様の全ての組み合わせおよび並べ換えを意図する。
【実施例】
【０２２６】
これより本発明を概説するが、本発明は、以下の実施例を参照することによって容易に理解されるであろう。実施例は本発明のある特定の局面および態様を例示するためだけに含まれ、本発明を限定することは意図されない。
【０２２７】
実施例1.多重特異性結合タンパク質の産生
本実施例は多重特異性結合タンパク質の産生および精製について説明する。
【０２２８】
単鎖多重特異性結合タンパク質をコードする核酸(表5を参照されたい)を構築し、ヒト細胞において発現するようにコドン最適化し、標準的な手順に従って哺乳動物発現ベクターにクローニングした。配列検証後に、プラスミドの形をしている発現ベクターを、Plasmid Plus purification kits(Qiagen)を用いてトランスフェクションに十分な量で調製した。一過的トランスフェクションのためにヒト胚腎臓293(HEK293)細胞を適切な密度まで継代した。細胞に発現ベクターを一過的にトランスフェクトし、6日間培養した。
【０２２９】
様々な多重特異性結合タンパク質のアミノ酸配列を表5にまとめた。構築物tAb0027〜tAb0032はそれぞれ、SEQ ID NO:9に示したアミノ酸配列を有する抗CD19scFv、SEQ ID NO:105に示したアミノ酸配列を有する抗CD3 scFv、およびSEQ ID NO:121に示したアミノ酸配列を有する抗HSA sdAbを含んだ。構築物tAb0033〜tAb0038はそれぞれ、SEQ ID NO:18に示したアミノ酸配列を有する抗CD19 scFv、SEQ ID NO:105に示したアミノ酸配列を有する抗CD3 scFv、およびSEQ ID NO:121に示したアミノ酸配列を有する抗HSA sdAbを含んだ。
【０２３０】
（表５）例示的な多重特異性結合タンパク質
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【０２３１】
培養物を4000rpmの遠心分離によって収集し、上清を0.22mmフィルターによって濾過した。C末端に10×Hisタグを有する多重特異性結合タンパク質を2段階で精製した。第1の段階は、400mMイミダゾールを含有するPBSを用いた溶出を伴うニッケルアフィニティクロマトグラフィーであった。第2の段階は、PBS(リン酸緩衝食塩水)pH7.2中での溶出を伴うサイズ排除クロマトグラフィーであった。多重特異性結合タンパク質濃度をUV分光法によって求め、必要な時にタンパク質試料を濃縮した。タンパク質の純度をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)と高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって求めた。具体的には、HPLCを、0.2mL/minでPBSを流すMabPacサイズ排除カラムを用いるAgilent 1100シリーズ装置において行った。さらに特徴付けるために溶出時間が約225〜240分の画分を収集した。
【０２３２】
上記のように、生成された構築物は、SEQ ID NO:9または18に示したアミノ酸配列を有する抗CD19 scFvを含有した。CD19に対する2種類のCD19結合ドメインの結合親和性を、ヒトIgG1 Fcと融合した単量体CD19細胞外ドメインおよび二量体CD19細胞外ドメインを用いてSPRによって測定した。結合速度パラメータを、一般的に、以前に説明されたように(Estep et al. (2013) MAbs, 5(2): 270-78を参照されたい)ForteBio装置を用いて測定した。単量体CD19タンパク質を用いて測定した時に、SEQ ID NO:9の配列を有するCD19結合ドメインのKD値は7nMであり、SEQ ID NO:18の配列を有するCD19結合ドメインのKD値は11nMであった。二量体CD19タンパク質を用いて測定した時に、SEQ ID NO:9の配列を有するCD19結合ドメインのKD値は5nMであり、SEQ ID NO:18の配列を有するCD19結合ドメインのKD値は15nMであった。
【０２３３】
実施例2.多重特異性結合タンパク質はCD19+標的細胞に対するT細胞細胞傷害性を誘導する
本実施例は、多重特異性結合タンパク質の細胞傷害活性について説明する。
【０２３４】
多重特異性結合タンパク質およびBiTEタンパクのT細胞リダイレクション活性をKILR Raji Cell Modelを用いて評価した。簡単に言うと、panT細胞を、市販のキット(例えば、Easy Sep Human T Cell Enrichment Kit, StemCell Technologies)を用いた負の選択によって1人の健常ドナーに由来する初代ヒトPBMCから単離した。T細胞を拡大するために、10％血清と300IU/mL IL-2を加えたRPMI1640培地中でT細胞を維持した。血清を除去するために、収集したT細胞を2回洗浄した。
【０２３５】
KILR Raji細胞は表面にCD19を発現し、標的細胞として使用した。標的細胞をオプソニン化するために、5％熱失活済み低IgG胎仔ウシ血清とペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミンを加えたRPMI1640中で、それぞれの多重特異性結合タンパク質またはBiTE(表5を参照されたい)を標的細胞と37℃で30分間インキュベートした。前記タンパク質を10の異なる用量で段階希釈して添加し、それぞれの用量を二度繰り返して行った。ヒト血清アルブミンを、最終濃度15mg/mLで、ある試料の培地に添加した。選択タンパク質を、負の対照としてCD19陰性であるKILR SKOV3細胞も用いて評価した。
【０２３６】
オプソニン化の後に、標的細胞をpanT細胞と10:1のエフェクター:標的(E:T)比で37℃で6時間インキュベートした。KILR Raji細胞が死滅すると、これらの細胞から標識ハウスキーピングタンパク質が培地に放出された。KILR検出試薬(DiscoverX)を添加することで標識ハウスキーピングタンパク質を定量した。全てのウェルに由来する発光シグナルをEnvisionプレートリーダーで読み取った。死滅パーセントを計算するために、自然放出対照および全溶解対照を各プレートに含めた。
【０２３７】
以下の式:
死滅％=(試験タンパク質試料からの値-自然放出対照からの平均値)/(全溶解対照からの平均値-自然放出対照からの平均値)×100
を用いて死滅パーセントを発光シグナル値から計算した。GraphPad Prismソフトウェアを用いて用量反応曲線とフィッティングすることによって死滅パーセントからEC50値を計算した。
【０２３８】
表6は、ヒト血清アルブミンの非存在下および存在下での、例示的な多重特異性結合タンパク質および対照薬である抗CD19 BiTEタンパク質を対象にしたT細胞リダイレクト死滅のEC50値を列挙する。CD19陰性KILR SKOV3細胞を用いて大量の死滅は観察されなかった。
【０２３９】
（表６）多重特異性結合タンパク質の細胞傷害活性
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【０２４０】
表6に示したように、構築物フォーマット、CD3結合ドメイン、HSA結合ドメイン、およびアッセイ培地中でのHSAの存在または非存在に関係なく、SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を有する抗CD19 scFvを含有する多重特異性結合タンパク質は、SEQ ID NO:18のアミノ酸配列を有する抗CD19 scFvを含有するものより強い細胞傷害活性を示した。このデータから、CD19に対して高い結合親和性を有する、この抗CD19 scFvを含有する構築物は、低い結合親和性を有する他の抗CD19 scFvを含有する構築物よりも強い治療活性を示すと考えられる。
【０２４１】
さらに、試験した多重特異性結合タンパク質は全て、HSAの非存在下では、HSAの存在下よりも低いEC50値を示した(すなわち、細胞傷害性を誘導する能力が強い)。理論に拘束されるつもりはないが、HSAが存在するとタンパク質複合体が変化すると思われる。これは、ブリナツモマブで観察されるような非特異的効果ではなく、HSA結合ドメインを含有する多重特異性結合タンパク質に特異的なものであった。HSAの存在下でのEC50値とHSAの非存在下でのEC50値の比は本明細書において「変化倍率」とも呼ばれ、多重特異性結合タンパク質の潜在的な治療活性に対するHSAの効果を評価するのに使用した。表6に示したように、CD19結合ドメインおよびCD3結合ドメインの両方のN末端側にHSA結合ドメインがある構築物フォーマット(すなわち、tAb0031、tAb0032、tAb0037、およびtAb0038)は、どのCD19結合ドメインを構築物に使用したかに関係なく他の構築物フォーマットよりも少ない変化倍率を示した。
【０２４２】
さらに、同じCD19結合ドメイン、CD3結合ドメイン、およびHSA結合ドメインを有する構築物の中で、CD19:CD3:HSAフォーマット(すなわち、CD19結合ドメインがCD3結合ドメインのN末端側に配置され、CD3結合ドメインがHSA結合ドメインのN末端側に配置されている)の構築物、すなわち、tAb0027およびtAb0033はHSAの非存在下および存在下で最低のEC50値または二番目に低いEC50値を示した。
【０２４３】
実施例3.CD19+標的細胞に対する多重特異性結合タンパク質の細胞傷害性
本実施例は、多重特異性結合タンパク質の細胞傷害活性を求めるための代替方法を提供する。
【０２４４】
本明細書において開示される多重特異性結合タンパク質は、B細胞抗原陽性標的細胞に対するT細胞依存性細胞傷害性の媒介に関するインビトロアッセイにおいて評価することができる。例えば、本明細書において開示されるCD19結合多重特異性結合タンパク質は、CD19+標的細胞に対するT細胞依存性細胞傷害性の媒介に関するインビトロアッセイにおいて評価される。
【０２４５】
蛍光標識CD19+MEC-1細胞(CD19+ヒト慢性B細胞白血病細胞株)を、CD19結合多重特異性結合タンパク質の存在下で、エフェクター細胞として、無作為ドナーの単離されたPBMCまたはCB15 T細胞(標準化されたT細胞株)とインキュベートする。加湿したインキュベーターの中で37℃で4時間インキュベートした後に、標的細胞から上清への蛍光色素放出を分光蛍光計で確かめる。CD19結合多重特異性結合タンパク質なしでインキュベートした標的細胞は負の対照として役立ち、インキュベーションの終わりにサポニンを添加することで完全に溶解した標的細胞は正の対照として役立つ。残存している標的生細胞の測定値に基づいて、以下の式:[1-(生存標的(試料)の数/生存標的(自然)の数]×100％に従って特異的細胞溶解のパーセントを計算することができる。シグモイド用量反応曲線およびEC50値を、GraphPadソフトウェアを用いて非線形回帰/4パラメータロジスティックフィット(4-parameter logistic fit)によって計算する。ある特定の多重特異性結合タンパク質濃度について得られた溶解値を用いて、Prismソフトウェアを用いて4パラメータロジスティックフィット分析によってシグモイド用量反応曲線を計算する。CD19結合多重特異性結合タンパク質によって誘導された標的細胞溶解率は、CD19結合ドメインまたはCD3結合ドメインを欠く類似の構築物によって誘導された標的細胞溶解率より高いと予想される。
【０２４６】
または、多重特異性結合タンパク質が、腫瘍細胞を死滅させるようにT細胞を誘導する能力を測定するためにヒトT細胞依存性細胞傷害(TDCC)アッセイが用いられる(Nazarian et al. 2015, J. Biomol. Screen, 20:519-27)。このアッセイでは、T細胞と標的がん細胞株細胞が384ウェルプレートの中で10:1比で一緒に混合され、様々な量の多重特異性結合タンパク質が添加される。48時間後にT細胞が洗い流され、プレートには、T細胞によって死滅されなかった標的細胞が付着したままになる。残存している生細胞を定量するために、CellTiter-Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay(Promega)が用いられる。CD19結合多重特異性結合タンパク質によって誘導された、B細胞抗原を発現するがん細胞の死滅率は、CD19結合ドメインもしくはCD3結合ドメインのいずれかを欠く類似の構築物および/または他の負の対照分子によって誘導された死滅率よりも高いと考えられる。
【０２４７】
実施例4.HSA結合ドメインを有する多重特異性結合タンパク質の薬物動態
本実施例は、多重特異性結合タンパク質の薬物動態を求めるように設計されている。
【０２４８】
多重特異性結合タンパク質の血清排出時間を評価するために、薬物動態学的(PK)研究という面に関して、CD19に結合するドメイン、CD3に結合するドメイン、および血清アルブミンに結合するドメインを含有する多重特異性結合タンパク質をカニクイザルにおいて試験する。
【０２４９】
多重特異性結合タンパク質を静脈内ボーラスまたは静脈内注入として投与する。多重特異性結合タンパク質を、0.5μg/kg〜3μg/kg、6μg/kg、12μg/kg、および15μg/kgの用量直線的な薬物動態学的関連範囲で投与する。比較の目的で多重特異性結合タンパク質の血清中濃度を用量に標準化し、分子量に標準化する(nmolで表す)。
【０２５０】
それぞれの多重特異性結合タンパク質について少なくとも2〜3匹の動物からなる群を使用する。多重特異性結合タンパク質の血清中濃度を求めるために血液試料を収集し、血清を調製する。血清中の多重特異性結合タンパク質レベルをイムノアッセイを用いて測定する。このアッセイはCD19結合ドメインを介して多重特異性結合タンパク質を捕獲することによって行い、これに対して、多重特異性結合タンパク質のCD3結合ドメインに対して作られた抗体を検出に使用する。血清中濃度-時間プロファイルは、既知の分析方法、例えば、Ritschel W A and Kearns G L, 1999, IN: Handbook Of Basic Pharmacokinetics Including Clinical Applications, 5th edition, American Pharmaceutical Assoc., Washington, D.C.に記載の方法とソフトウェア、例えば、WinNonlinソフトウェア (WinNonlin(登録商標)Professional V. 3.1 WinNonlin(商標)Copyright 1998-1999. Pharsight Corporation. Mountain View, Calif.)を用いてPKパラメータを求めるのに用いられる。
【０２５１】
または、血清アルブミン結合ドメインを含有する様々な多重特異性結合タンパク質の血清半減期と、CD19およびCD3に結合することができるが血清アルブミン結合ドメインを欠く照構築物の血清半減期を、対照構築物を与える別のカニクイザル群を実験に含めることによって比較する。対照構築物がサイズの点で多重特異性結合タンパク質と類似するように、さらなるドメインを含めることができる。
【０２５２】
CD19に結合する多重特異性結合タンパク質の血清半減期は、CD19およびCD3に結合できるが血清アルブミン結合ドメインを欠く類似の構築物および/または他の負の対照分子と比較して有意に長いと予想される。
【０２５３】
実施例5.フローサイトメトリーによる抗原親和性の決定
本実施例は、抗原に対する多重特異性結合タンパク質の親和性を求めるように設計されている。
【０２５４】
様々な本明細書において開示される多重特異性結合タンパク質を、ヒトCD3+細胞および対応するB細胞表面抗原陽性細胞、例えば、ヒトCD19+細胞に対する結合親和性について試験する。多重特異性結合タンパク質を、カニクイザルCD3+細胞および対応するB細胞表面抗原陽性細胞、例えば、カニクイザルCD19+細胞に対する結合親和性についても試験する。
【０２５５】
CD3+細胞およびCD19+細胞を多重特異性結合タンパク質の段階希釈液100μLとインキュベートする。FACS緩衝液で3回洗浄した後に、細胞を、同じ緩衝液に溶解した10μg/mLマウスモノクローナル抗体イディオタイプ抗体0.1mLと45分間氷上でインキュベートする。2回目の洗浄サイクルの後に、細胞を、以前と同じ条件下で15μg/mL FITC結合ヤギ抗マウスIgG抗体0.1mLとインキュベートする。対照として、細胞を抗His IgGとインキュベートした後に、多重特異性結合タンパク質なしでFITC結合ヤギ抗マウスIgG抗体とインキュベートする。次いで、細胞を再洗浄し、死細胞を排除するために、2μg/mLヨウ化プロピジウム(PI)を含有するFACS緩衝液0.2mLに再懸濁する。1×104個の生細胞の蛍光を、市販のフローサイトメーターおよびソフトウェアを用いて測定する。細胞試料の平均蛍光強度を、CXP software (Beckman-Coulter, Krefeld, Germany)またはIncyte software(Merck Millipore, Schwalbach, Germany)などのソフトウェアを用いて計算する。1部位結合のKD値を、標準化された蛍光強度値と、既知の計算式、例えば、GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad Software, La Jolla Calif. USA)の中で供給される計算式を用いて計算することができる。CD3結合親和性と交差反応性を、CD3+ジャーカット細胞およびカニクイザルCD3+HSC-F細胞株に対する滴定およびフローサイトメトリー実験において評価する。CD19結合と交差反応性をヒトCD19+腫瘍細胞株において評価する。交差反応性のKD比は、組換えヒト抗原または組換えカニクイザル抗原のいずれかを発現するCHO細胞株に対して求めたKD値を用いて計算することができる。
【０２５６】
実施例6.多重特異性結合タンパク質によって誘導されたサイトカイン産生
本実施例は、多重特異性結合タンパク質が免疫細胞からサイトカイン産生を誘導する能力を確かめるように設計されている。
【０２５７】
CD19+B細胞などの標的細胞の存在下で本発明の多重特異性結合タンパク質、例えば、CD19に結合する多重特異性結合タンパク質によってT細胞が活性化されるという証拠を得るために、TNFαおよびインターフェロンγを対象にしたAlphaLISAアッセイ(Perkin Elmer)が用いられる。このアッセイのために、細胞傷害アッセイという名で説明されたように、初代ヒトT細胞と、B細胞表面抗原を発現するヒト腫瘍細胞を、CD19に結合する多重特異性結合タンパク質の存在下でインキュベートする。48時間インキュベートした後に、アッセイ上清の2マイクロリットルアリコートを製造業者の説明書に従って分析する。CD19に結合する多重特異性結合タンパク質によって誘導されたTNFαまたはインターフェロンγのレベルは、CD19結合ドメインもしくはCD3結合ドメインを欠く類似の構築物および/または他の負の対照分子によって誘導されたものより高いと考えられる。
【０２５８】
実施例7.ヒトCD3εに結合するscFv変種の特定
本実施例は、ヒトCD3εに結合する、本明細書において開示される抗原結合部位の変種を特定するように設計されている。
【０２５９】
ビオチン-CD3εおよびビオチン-HSAに対する親CD3ε結合構築物の結合特性を特徴付ける。抗CD3ε scFvファージライブラリーを構築するために重鎖CDR1、重鎖CDR2、重鎖CDR3、軽鎖CDR1、軽鎖CDR2、および軽鎖CDR3ドメインの一置換ライブラリーを用意する。変異誘発によって残基を一度に一つずつ変える。クローンを選択し、結合親和性を確かめるために、一置換ライブラリーをビオチン化ヒトCD3εに結合させ、洗浄し、溶出させ、計数する。ビオチン化カニクイザルCD3εを1回目の選択標的として使用し、2つの独立したライブラリーからのコンビナトリアルファージ結合の後に4時間洗浄する(約2×選択)。ビオチン化ヒトCD3εを2回目の選択標的として使用し、両ライブラリーの結合後に3時間洗浄する(<2×選択)。2回目の選択からのPCRedインサートをpcDNA3.4 His6発現ベクターにサブクローニングする。180個のクローンをつつき、DNAを精製し、配列決定し、トランスフェクションによってExpi293に導入する。解離定数(KD)、解離速度(kdまたはkoff)、および会合速度(kaまたはkon)などのパラメータをもっと正確に求めるために、ヒトCD3εに対して、ある範囲の親和性がある16個のクローンからなるパネルを選択する。
【０２６０】
参照による組み入れ
上記または下記に関係なく、本明細書の本文全体を通して引用された刊行物および特許(全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書などを含む)は全て、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。参照により組み入れられる実体が本明細書と矛盾するまたは本明細書と一致しない範囲では、本明細書が、このような実体に優先する。
【０２６１】
均等物
本発明は、本発明の精神または必須の特徴から逸脱することなく他の特定の形で具体化され得る。従って、前述の態様は全ての点において例示だとみなされ、本明細書に記載の発明を限定するものとはみなされない。従って、本発明の範囲は、前述の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲の均等物の意味および範囲内にある全ての変更が本発明の範囲内にあると意図される。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年2月16日(2021.2.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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