(57)【要約】  外因性ＩＦＮβと外因性ＣＤ４０−配位子（ＣＤ４０−Ｌ、ＣＤ１５４としても知られる）の組み合わせをコードする１つ以上の異種核酸配列を介して、外因性Ｉ型ＦＮβと外因性ＣＤ４０−Ｌの組み合わせ、例えば、外因性ＩＦＮβと外因性ＣＤ４０−Ｌの組み合わせを発現する、ＤＣ等のＡＰＣを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性Ｉ型インターフェロン及び外因性ＣＤ４０−Ｌの組み合わせ、又は外因性Ｉ型ＩＦＮと外因性ＣＤ４０−Ｌの組み合わせをコ−ドする１つ以上の異種核酸配列を含む、抗原提示細胞（ＡＰＣ）。
【請求項２】
請求項１に記載のＡＰＣであって、
ａ）前記Ｉ型ＩＦＮは、ヒトＩＦＮα（配列番号１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮα、ヒトＩＦＮβ（配列番号２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮβ、ヒトＩＦＮε（配列番号３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮε、ヒトＩＦＮκ（配列番号４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮκ、又はヒトＩＦＮω（配列番号５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮωであり、及び／又は
ｂ）前記ＣＤ４０−Ｌは、ヒトＣＤ４０−Ｌ（配列番号６）に対して少なくとも８０％の配列同一性、配列番号７〜１８から選択される配列を有するキメラＣＤ４０−Ｌに対して少なくとも８０％の配列同一性、又は配列番号１２の配列を有するキメラＣＤ４０−Ｌに対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、及び／又は
ｃ）前記Ｉ型ＩＦＮは、ヒトＩＦＮβ（配列番号２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮβであり、かつ、前記ＣＤ４０−Ｌは、配列番号１２の配列を有するキメラＣＤ４０−Ｌに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、ＡＰＣ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＡＰＣであって、
前記Ｉ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌの組合せをコードする１つ以上の異種核酸配列は、１つ以上のウイルス構築物中にある、ＡＰＣ。
【請求項４】
請求項３に記載のＡＰＣであって、１つ以上のウイルス構築物の各々が、独立して、アデノウイルス構築物、アデノ随伴ウイルス構築物（ＡＡＶ）、ポックスウイルス構築物、レンチウイルス構築物、アルファウイルス構築物、ヘルペスウイルス構築物、レトロウイルス構築物、ワクシニアウイルス構築物、水疱性口内炎ウイルス構築物、又は単純ヘルペスウイルス構築物である、ＡＰＣ。
【請求項５】
前記ＡＰＣは、ヒトＡＰＣである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＰＣ。
【請求項６】
ＡＰＣがＤＣである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＡＰＣ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＡＰＣと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項８】
アジュバントをさらに含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
悪性腫瘍を処置する方法であって、
該処置を必要とする対象に、請求項１〜８のいずれか一項に記載の有効量のＡＰＣを投与することを含む、悪性腫瘍を処置する方法。
【請求項１０】
ＡＰＣは、自家細胞である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法は、１つ以上の追加の抗癌剤を対象に投与することをさらに含む、請求項９又は１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法は、化学療法薬（例えば、メルファラン）、免疫調節薬、アジュバント、貧血薬（例えば、エリスロポエチン）、放射線療法、幹細胞移植、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−発現Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）、又は前述のもののうちの２つ以上の組み合わせを投与することをさらに含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＡＰＣを投与する前に放射線療法を処方することを含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象は、ヒトである、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＡＰＣは、皮内注射、腫瘍内注射、又は腫瘍内に流出するリンパ節への注射によって投与される、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記皮内注射は、前記対象の腋窩及び／又は鼠径リンパ節流域に流れ出る解剖学的部位にある、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＡＰＣは、数日間にわたって複数回投与される、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法は、前記対象に対して造血細胞移植（例えば、骨髄、末梢血、又は臍帯血からの造血幹細胞又は前駆細胞）を実施することをさらに含む、請求項９〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記造血細胞移植は、自家である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記ＡＰＣは、前記造血細胞移植の前後に投与される、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象上で幹細胞動員（例えば、Ｇ−ＣＳＦを使用）を行い、自己造血細胞移植の前に前記対象から造血細胞を収集することをさらに含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＡＰＣを投与する前に、前記対象に投与される前記ＡＰＣの産生のために前記対象から前記ＡＰＣを収集することをさらに含む、請求項９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＡＰＣは、前記投与の前に凍結保存される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＡＰＣの投与前、投与中、又は投与後に、化学療法剤（例えば、メルファラン）を投与することをさらに含む、請求項９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記造血細胞移植中に化学療法剤（例えば、メルファラン）を投与することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
チェックポイント阻害剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記チェックポイント阻害剤は、細胞毒性Ｔ−白血球抗原４（ＣＴＬＡ４、ＣＤ１５２としても知られる）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１、ＣＤ２７９としても知られる）又はプログラム細胞死１配位子１（ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７４としても知られる）の阻害剤である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
ＣＴＬＡ４の前記阻害剤は、ＣＴＬＡ４に結合する抗体であり、ＰＤ−１の前記阻害剤は、ＰＤ−１に結合する抗体であり、ＰＤ−Ｌ１の前記阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
Ｉ型インターフェロンとＣＤ４０Ｌの組み合わせ、又はＩ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌの組み合わせをコードする１つ以上の核酸配列を含む腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３０】
請求項２９に記載の腫瘍溶解性ウイルスであって、
ａ）前記Ｉ型ＩＦＮは、ヒトＩＦＮα（配列番号１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮα、ヒトＩＦＮβ（配列番号２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮβ、ヒトＩＦＮε（配列番号３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮε、ヒトＩＦＮκ（配列番号４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮκ、又はヒトＩＦＮω（配列番号５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮω、及び／又は
ｂ）前記ＣＤ４０−Ｌは、ヒトＣＤ４０−Ｌ（配列番号６）に対して少なくとも８０％の配列同一性、又は配列番号７〜１８から選択される配列を有するキメラＣＤ４０−Ｌに対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、及び／又は
ｃ）前記Ｉ型ＩＦＮは、ヒトＩＦＮβ（配列番号２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮβであり、前記ＣＤ４０−Ｌは、配列番号１２の配列を有するキメラＣＤ４０−Ｌに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３１】
前記腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルス、レオウイルス、ヘルペスウイルス、ピコルナウイルス（例えば、コクサッキーウイルス、ポリオウイルス、及びセネカバレーウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹ウイルス及びニューカッスル病ウイルス）、パルボウイルス、ラブドウイルス（例えば、水疱性口内炎ウイルス）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、シンドビスウイルス、粘液腫ウイルス、マラバウイルス、インフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、アレナウイルス、ワクシニアウイルス、又はＥ１Ａデルタ−２４欠失、Ｅ１ｂ−５５Ｋ欠失、及びＥ３領域欠失を含む組換えアデノウイルスである、請求項２９〜３０のいずれかに記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３２】
請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルスと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項３３】
アジュバントをさらに含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
悪性腫瘍を処置する方法であって、
該処置を必要とする対象に、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ウイルス又は請求項３１又は３２の組成物の有効量を投与することを含む、悪性腫瘍を処置する方法。
【請求項３５】
前記方法は、１つ以上の追加の抗癌剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記方法は、化学療法薬（例えば、メルファラン）、免疫調節薬、アジュバント、貧血薬（例えば、エリスロポエチン）、放射線療法、幹細胞移植、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−発現Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）、又は前述のものの２つ以上の組み合わせを投与することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記対象は、ヒトである、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記腫瘍溶解性ウイルスは、数日間にわたって複数回投与される、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記腫瘍溶解性ウイルスは、皮内注射、腫瘍内注射、静脈内注射、又は腫瘍内に流出するリンパ節への注射によって投与される、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記皮内注射は、前記対象の腋窩及び／又は鼠径リンパ節流域に流れ出る解剖学的部位にある、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記方法は、前記対象に対して造血細胞移植（例えば、骨髄、末梢血、又は臍帯血からの造血幹細胞又は前駆細胞）を実施することをさらに含む、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記造血細胞移植は、自家である、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記腫瘍溶解性ウイルスは、前記造血細胞移植の前後に投与される、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象上で幹細胞動員（例えば、Ｇ−ＣＳＦを使用）を行い、自己造血細胞移植の前に前記対象から前記造血細胞を収集することをさらに含む、請求項３４〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記腫瘍溶解性ウイルスを投与する前、投与中、又は投与後に化学療法剤（例えば、メルファラン）を投与することをさらに含む、請求項３４〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記造血細胞移植中に化学療法剤（例えば、メルファラン）を投与することをさらに含む、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
チェックポイント阻害剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項３４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記チェックポイント阻害剤は、細胞毒性Ｔ−白血球抗原４（ＣＴＬＡ４、ＣＤ１５２としても知られる）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１、ＣＤ２７９としても知られる）又はプログラム細胞死１配位子１（ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７４としても知られる）の阻害剤である、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記ＣＴＬＡ４の前記阻害剤は、ＣＴＬＡ４に結合する抗体であり、ＰＤ−１の前記阻害剤は、ＰＤ−１に結合する抗体であり、ＰＤ−Ｌ１の前記阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体である、請求項４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願を相互参照
本出願は、２０１８年６月１９日出願の米国仮出願第６２／６８７，０７６号の優先権を主張するものであり、内容を参照することにより組み込まれる。
【０００２】
政府支援
本発明は、ＮＣＩ  Ｓｋｉｎ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅによって授与されたグラント番号５Ｐ５０ＣＡ１６８５３６−０３の下で政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明においてある種の権利を有する。
【０００３】
ヒト腫瘍はＴリンパ球（Ｔ細胞）によって認識され得る多数のタンパク質抗原を発現し、癌免疫療法の潜在的標的を提供する。本発明は、概して、癌免疫療法、細胞ワクチン、ウイルス学、免疫学、及び薬物療法の分野に関し、特に、癌の治療のための樹状細胞ワクチン及び腫瘍溶解性ウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【０００４】
樹状細胞（ＤＣ）は、Ｔ細胞依存性免疫応答の開始に関与する抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。ＤＣワクチンはいくつかの癌の処置に有望であることが示されているが、現在、前立腺癌を治療するための１つの薬剤、シプリューセル−Ｔ（ＰＲＯＶＥＮＧＥ（登録商標））のみが、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている。ワクチン細胞だけがＴ細胞の活性化につながるという理論的根拠に基づいて、ＤＣの活性化にさまざまなサイトカインのカクテルが用いられている。実際、ＤＣは、異なる機能を有する多様なサブセットを表す。ＤＣワクチンが強固なＴ細胞活性化を誘導するのに十分であるかどうかは明らかではない。加えて、前臨床研究によれば、異なるＤＣサブセットが、例えば、流出リンパ節への腫瘍抗原の運搬において、リンパ節におけるＴ細胞活性化に対して、異なる機能を有することを示した。
【０００５】
腫瘍溶解性ウイルスは、以下の作用機序の１つ又は両方を有する癌治療薬の１つの部類である。１）直接的な腫瘍溶解をもたらす腫瘍細胞における選択的ウイルス複製による腫瘍細胞殺傷、及び２）破壊された腫瘍細胞から抗原を放出することによる全身性抗腫瘍免疫の誘導。ＦＤＡは、２０１５年に初めての腫瘍溶解性ウイルスで、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をコードする遺伝子組換え腫瘍溶解性ヘルペスウイルスであるタリモジェンラヘルパレプベック（ＩＭＬＹＧＩＣ（登録商標））をメラノーマの局所治療薬として承認した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の特定の実施形態は、例えば、外因性ＩＦＮβと外因性ＣＤ４０−配位子（ＣＤ４０−Ｌ、ＣＤ１５４としても知られる）の組み合わせをコードする１つ以上の異種核酸配列を介して、外因性Ｉ型ＦＮβと外因性ＣＤ４０−Ｌの組み合わせ等の、外因性ＩＦＮＮと外因性ＣＤ４０−Ｌの組み合わせを発現する、ＤＣ等のＡＰＣを提供する。
【０００７】
本発明の他の実施形態は、例えば、ＩＦＮβとＣＤ４０−Ｌの組み合わせをコードする１つ以上の異種核酸配列を介して、Ｉ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌの組み合わせを発現する腫瘍溶解性ウイルスを提供する。
【０００８】
本発明の好ましい実施形態は、例えば、ＩＦＮβとＣＤ４０−Ｌの組み合わせをコードする１つ以上の異種核酸配列を介して、Ｉ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌの組み合わせを発現する腫瘍溶解性アデノウイルスを提供する。
【０００９】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中に開示されるＤＣ等のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスを投与することによって、そして任意で、対象にチェックポイント阻害剤を投与することを組み合わせて、対象における悪性腫瘍を処置する方法を提供する。本発明のＤＣ等のＡＰＣが対象に投与される場合、放射線療法もまた、ＡＰＣ又はＤＣを投与する前に対象に処方される。
【００１０】
ＩＦＮβとＣＤ４０−Ｌの組み合わせ等、Ｉ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌの組み合わせを発現する腫瘍溶解性ウイルスは、放射線療法なしで投与することができる。しかしながら、本明細書に開示される腫瘍溶解性ウイルスの投与は、チェックポイント阻害剤の投与と組み合わせることができる。
好ましい実施形態において、悪性腫瘍に罹患している対象は、チェックポイント阻害剤を用いた治療に不応である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明による悪性腫瘍を処置する方法の実施形態の模式図を示す。図１における「ＩＦＮβ」は任意のＩ型ＩＦＮの代表例であり、「樹状細胞」又は「ＤＣ」は、任意のＡＰＣの代表例である。
【図２】図２は、ＣＤ４０−Ｌ及びＩＦＮβをコードする二重発現カセットを有する腫瘍溶解性アデノウイルスの概略構成を示す。
【図３】図３は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって隔てられたＣＤ４０−Ｌ及びＩＦＮβをコードする単一の発現カセットを有する腫瘍溶解性ウイルスの概略構成を示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、攻撃性Ｂ１６皮下メラノーマ腫瘍を有するマウスの腫瘍成長及び生存を示す。対照未処理マウス（ｎ＝５）、ＩＦＮβ（ＩＦＮβ）を発現する樹状細胞を注射したマウス（ｎ＝６）、アデノウイルス−ＭＥＭ４０（ＭＥＭ４０）（ｎ＝６）、及び二剤投与（ｎ＝５）を示す。アデノウイルス−ＭＥＭ４０（腫瘍当たり１０１０ウイルス粒子）を、示されるようにＤＣと同じ日に注射した。腫瘍の平均成長を（Ａ）及びマウスの生存期間（腫瘍移植後３６日）を（Ｂ）に示す。ＤＣ−ＩＦＮβとＡｄ−ＭＥＭ４０による併用処置は、他の処置群と比較して腫瘍増殖を大幅に低下させた（ｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、ＭＥＭ４０及びＩＦＮβ（ＭＥＭ−２８８）を発現する腫瘍溶解性アデノウイルスが、ＭＥＭ４０（ＭＥＭ−１８８）のみを発現する腫瘍溶解性ウイルス及び対照腫瘍溶解性アデノウイルス（対照ｏＡｄｖ、未承認アデノウイルス）と比較して、それぞれ７倍及び１００倍高い腫瘍殺傷及び免疫活性化特性を示すことを示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、ＭＥＭ４０及びＩＦＮβ（ＭＥＭ−２８８）を発現する腫瘍溶解性アデノウイルスが、複数の腫瘍型及び癌遺伝子によって引き起こされる癌を死滅させるのに有効であることを示す。（Ａ）ヒト膀胱、肝臓、膵臓腫瘍の殺傷における対照腫瘍溶解性アデノウイルスとの比較、及び（Ｂ）ＫＲＡＳ変異型肺腫瘍（ＨＣＣ４４細胞株）の殺傷におけるＭＥＭ４０（ＭＥＭ−１８８）のみを発現する腫瘍溶解性アデノウイルスとの比較。
【図７】図７は、複数の細胞株においてＭＥＭ４０及びＩＦＮβ（ＭＥＭ−２８８）を発現する腫瘍溶解性アデノウイルスによるＭＥＭ４０及びＩＦＮβの二重導入遺伝子発現を示す。
【図８】図８は、ＭＥＭ４０及びＩＦＮβを発現する腫瘍溶解性ウイルスの増強された導入遺伝子発現及び複製を示す。Ａ５４９細胞株におけるＭＥＭ−１８８及びＭＥＭ−２８８感染後のＭＥＭ４０発現の比較を示す。細胞を、腫瘍溶解性ＭＥＭ−１８８又はＭＥＭ−２８８を用いて／用いずに、異なるＭＯＩで２、４及び６日間感染させた。ＭＥＭ４０発現をＦＡＣＳによって決定した。ＦＡＣＳの結果：赤線−２日目、青線−４日目及びオレンジ線−６日目。（Ａ）非感染細胞、（Ｂ）ＭＥＭ−１８８  ＭＯＩ＝１００、（Ｃ）ＭＥＭ−１８８  ＭＯＩ＝１０、（Ｄ）ＭＥＭ−１８８  ＭＯＩ＝１、（Ｅ）ＭＥＭ−２８８  ＭＯＩ＝１００、（Ｆ）ＭＥＭ−２８８  ＭＯＩ＝１０、（Ｇ）ＭＥＭ−２８８  ＭＯＩ＝１。
【図９】図９は、ＭＥＭ４０（ＭＥＭ−１８８）のみを発現する腫瘍溶解性ウイルスと比較した、ＭＥＭ４０及びＩＦＮβ（ＭＥＭ−２８８）を発現する腫瘍溶解性アデノウイルスに感染させた後のＡ５４９肺腫瘍細胞株におけるＭＥＭ４０発現の比較を示す。
【図１０】図１０は、ＭＥＭ４０（ＭＥＭ−１８８）のみを発現する腫瘍溶解性ウイルスと比較した、ＭＥＭ４０及びＩＦＮβを発現する腫瘍溶解性アデノウイルスによる感染後のいくつかの癌細胞株における増強した腫瘍溶解能を示す。感染の３日後に細胞をクリスタルバイオレットで染色した。
【図１１】図１１は、ＭＥＭ４０のみを発現する腫瘍溶解性ウイルス（ＭＥＭ−１８８）と比較した、ＭＥＭ４０及びＩＦＮβを発現する腫瘍溶解性アデノウイルス（ＭＥＭ−２８８）による感染後のいくつかの癌細胞株におけるＭＥＭ４０の増強した発現を示す。細胞を、腫瘍溶解性ＭＥＭ−１８８又はＭＥＭ−２８８を用いて、あるいは用いずに、ＭＯＩ＝１００で３日間感染させた。ＭＥＭ４０発現を、（Ａ）ＰＣ９、（Ｂ）Ａ５４９、（Ｃ）Ｈ２３及び（Ｄ）ＨＣＣ４４細胞株におけるＦＡＣＳによって決定した。ＦＡＣＳの結果：赤線＝染色されていない、青線＝未処理、緑線＝ＭＥＭ−１８８、オレンジ線＝ＭＥＭ−２８８。
【図１２】図１２は、アデノウイルスに感染していないＡ５４９細胞株バイスタンダー細胞におけるＰＤＬ１の発現を示す。細胞を、腫瘍溶解性ＭＥＭ−１８８又はＭＥＭ−２８８を用いて、あるいは用いずに、示されるように異なるＭＯＩで３日間感染させた。示されるように、ＭＥＭ−１８８感染も外因性ＩＦＮβ添加と組み合わせた。ＰＤＬ１発現はＭＥＭ４０を発現していない（すなわち、感染していない）細胞において具体的には、ＦＡＣＳによって決定した。
【図１３】図１３は、ＭＥＭ４０及びＩＦＮβ（ＭＥＭ−２８８）を発現する腫瘍溶解性アデノウイルスを示すベクターマップの例を示す。
【発明を実施するための形態】
【発明の詳細な説明】
【００１２】
本発明によれば、Ｉ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌの組み合わせが、ＤＣ等のＡＰＣの機能を活性化して、Ｔ細胞活性化が促進される。特に、Ｉ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌの組み合わせは、ＣＤ８  Ｔ細胞を活性化するＤＣのようなＡＰＣのクロスプライミング機能を増強することができる。従って、ＤＣ等のＡＰＣにおけるＩ型ＩＦＮ、例えば、ＩＦＮ−α（又はＩＦＮ−αのサブタイプ、例えば、サブタイプα１、α２、α４、α５、α６、α７、α８、α１０、α１３、α１４、α１６、α１７、又はα２１）、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、及びＩＦＮ−ωとＣＤ４０−Ｌの組み合わせの安定した発現は、ＡＰＣ又はＤＣの固有の機能性を増強し、また内因性ＤＣの強力な活性化が可能なワクチンを産生し、それによって、Ｔ細胞を活性化する内因性ＤＣの能力を増強する。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、用語「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、樹状細胞、マクロファージ、及びＢ細胞の中から選択されるプロフェッショナル抗原提示細胞をいう。ある実施形態において、ＡＰＣはＤＣである。ある実施形態において、ＡＰＣは哺乳動物細胞である。ある実施形態において、ＤＣ、マクロファージ、又はＢ細胞等のＡＰＣは、ヒト細胞である。
【００１４】
従って、本発明の特定の実施形態は、例えば、外因性ＩＦＮβ及び外因性ＣＤ４０−Ｌをコードする１つ以上の異種核酸配列を介して、Ｉ型ＩＦＮ（例えば、ＩＦＮβ）とＣＤ４０−Ｌの組み合わせを発現するＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を提供する。このようなＡＰＣ、特にＤＣ、ワクチンは、細胞死誘導処置と組み合わせると、強力な全身性Ｔ細胞応答を誘導するのであろう。特定の実施形態において、ＤＣ等のＡＰＣは、複製欠損ウイルスを含む。
【００１５】
特定の実施形態において、本発明は、ＩＦＮβとＣＤ４０−Ｌの組み合わせを発現する、レンチウイルス等のウイルスベクターを有するＤＣを含むＤＣワクチンを提供する。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態は、例えば、ＩＦＮβとＣＤ４０−Ｌの組み合わせをコードする１つ以上の異種核酸配列を介して、Ｉ型ＩＦＮ、例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、及びＩＦＮ−ωとＣＤ４０−Ｌの組み合わせを発現する腫瘍溶解性ウイルスを提供する。任意の腫瘍溶解性ウイルスを利用することができる。ある実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルス、レオウイルス、ヘルペスウイルス、ピコルナウイルス（コクサッキーウイルス、ポリオウイルス、及びセネカバレーウイルスを含む）、パラミクソウイルス（麻疹ウイルス及びニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）を含む）、パルボウイルス、ラブドウイルス（水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を含む）、又はワクシニアウイルスである。好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは複製コンピテントである。
【００１７】
本発明のさらなる実施形態は、対象にチェックポイント阻害剤を投与することによって、本明細書に開示されるＤＣ等のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスを併用して投与することによって、対象における悪性腫瘍を処置する方法を提供する。本発明のＤＣ等のＡＰＣが対象に投与される場合、放射線療法は、ＡＰＣ又はＤＣを投与する前に対象に処方される。図１は、本発明による悪性腫瘍を処置する方法の実施形態の模式図である（選択肢１〜５）。
【００１８】
ＩＦＮαは、配列番号１の配列によって表されるヒトＩＦＮαである。ＩＦＮαは哺乳動物ＩＦＮα、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ネコ、イヌ、又はウシＩＦＮαである。他の哺乳動物由来のＩＦＮαのさらなる実施形態は当業者に公知であり、そしてこのような実施形態は、本発明の範囲内である。特定の実施形態において、ＩＦＮαはヒト野生型ＩＦＮα（例えば、配列番号１のＩＦＮα）と８０．００％〜９９．９９％（例えば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）までの配列同一性を有する。
【００１９】
ＩＦＮβは配列番号２の配列によって表されるヒトＩＦＮβである。ＩＦＮβは哺乳動物ＩＦＮβ、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ネコ、イヌ、又はウシＩＦＮβである。他の哺乳動物由来のＩＦＮβのさらなる実施形態は当業者に公知であり、そしてこのような実施形態は、本発明の範囲内である。特定の実施形態において、ＩＦＮβはヒト野生型ＩＦＮβ、例えば、配列番号２のＩＦＮβと８０．００％〜９９．９９％（例えば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）の配列同一性を有する。特定の実施形態においてＩＦＮβは配列番号２の最初の２２個のアミノ酸を欠き、任意で、結果として生じる１６５個のアミノ酸ペプチドのシステイン１７は、さらにセリンに置換される。
【００２０】
ＩＦＮεは配列番号３の配列によって表されるヒトＩＦＮεである。ＩＦＮεはマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ネコ、イヌ、又はウシＩＦＮεのような哺乳動物ＩＦＮεである。他の哺乳動物由来のＩＦＮεのさらなる実施形態は当業者に公知であり、そしてこのような実施形態は、本発明の範囲内である。特定の実施形態において、ＩＦＮεはヒト野生型ＩＦＮε、例えば、配列番号３のＩＦＮεと８０．００％〜９９．９９％（例えば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）までの配列同一性を有する。
【００２１】
ＩＦＮκは、配列番号４の配列によって表されるヒトＩＦＮκである。ＩＦＮκは哺乳動物ＩＦＮκ、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ネコ、イヌ、又はウシＩＦＮκである。他の哺乳動物由来のＩＦＮκのさらなる実施形態は当業者に公知であり、そしてこのような実施形態は、本発明の範囲内である。特定の実施形態において、ＩＦＮκはヒト野生型ＩＦＮκ、例えば、配列番号４のＩＦＮκと８０．００％〜９９．９９％（例えば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）までの配列同一性を有する。
【００２２】
ＩＦＮωは、配列番号５の配列によって表されるヒトＩＦＮωである。ＩＦＮωは哺乳動物ＩＦＮω、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ネコ、イヌ、又はウシＩＦＮωである。他の哺乳動物由来のＩＦＮωのさらなる実施形態は当業者に公知であり、そしてこのような実施形態は、本発明の範囲内である。特定の実施形態において、ＩＦＮωはヒト野生型ＩＦＮω、例えば、配列番号５のＩＦＮωと８０．００％〜９９．９９％（例えば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）までの配列同一性を有する。
【００２３】
ＣＤ４０−Ｌは、配列番号６の配列によって表されるヒトＣＤ４０−Ｌである。ＣＤ４０−Ｌは哺乳動物ＣＤ４０−Ｌ、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ネコ、イヌ、又はウシＣＤ４０−Ｌである。他の哺乳動物由来のＣＤ４０−Ｌのさらなる実施形態は当業者に公知であり、そしてこのような実施形態は、本発明の範囲内である。特定の実施形態において、ＣＤ４０−Ｌはヒト野生型ＣＤ４０−Ｌ（例えば、配列番号６のＣＤ４０−Ｌ）と８０．００％から９９．９９％（例えば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）までの配列同一性を有する。
【００２４】
ＣＤ４０−Ｌは、キメラＣＤ４０−Ｌ又は非キメラＣＤ４０−Ｌポリペプチドである。ある実施形態において、本発明のＤＣ等のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスにおいて発現されるＣＤ４０−ＬはキメラＣＤ４０−Ｌである。このようなキメラＣＤ４０−Ｌポリペプチドは、少なくとも２つの異なる種、例えばヒト及びマウスＣＤ４０−Ｌ由来のＣＤ４０−Ｌドメイン又はサブドメインを含む。キメラＣＤ４０−Ｌは、天然に存在するＣＤ４０−Ｌと比較して、免疫応答のより高い刺激を与える。本発明での使用に適したキメラＣＤ４０−Ｌの例は、米国特許第７，４９５，０９０号、第７，９２８，２１３号、第７，９２８，２１３号、第８，１３８，３１０号に開示されている。これらの各特許は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２５】
キメラＣＤ４０−Ｌの特定の実施形態において、ヒトＣＤ４０−Ｌの開裂部位を含むＣＤ４０−Ｌの少なくとも１つのドメイン又はサブドメインは、非ヒトＣＤ４０−Ｌ、好ましくはマウスＣＤ４０−Ｌの対応するドメイン又はサブドメインで置換される。さらに、キメラＣＤ４０−Ｌは、ＣＤ４０−Ｌ受容体に結合するヒトＣＤ４０−Ｌのドメイン又はサブドメインを含み得る。ヒトＣＤ４０−Ｌ（配列番号６）のドメインＩ〜ＩＶは、配列番号６のアミノ酸部分１〜１４、１４〜４５、４６〜１１０、及び１１１〜２６１に対応する。当業者であれば、非ヒトＣＤ４０−ＬとヒトＣＤ４０−Ｌとの配列アラインメントに基づいて、非ヒトＣＤ４０−ＬのドメインＩ〜ＩＶを決定することができる。非ヒトＣＤ４０−Ｌの特定のドメイン位置は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４９５，０９０号の表１に提供されている。
【００２６】
ある実施形態において、キメラＣＤ４０−Ｌは、ヒトＣＤ４０−Ｌの開裂部位と置換される非ヒトＣＤ４０−Ｌの第１のサブドメインと、ＣＤ４０−Ｌ受容体に結合するヒトＣＤ４０−Ｌの第２のサブドメインとを含む。
【００２７】
第１のサブドメインは、非ヒトＣＤ４０−ＬのドメインＩＶのサブドメインを含む。さらに、第１のサブドメインは、非ヒトＣＤ４０−ＬのドメインＩＩＩ、又はサブドメインもしくはドメインＩＩＩをさらに含むことができる。特定の実施形態において、第１のサブドメインは、ヒトＣＤ４０−Ｌの開裂部位の一部と置換される。さらなる実施形態において、ドメインＩＶ又はドメインＩＶのサブドメイン、及び任意でドメインＩＩＩ又はドメインＩＩＩのサブドメインに加えて、キメラＣＤ４０−Ｌは、非ヒトＣＤ４０−ＬのドメインＩＩ又はドメインＩＩのサブドメインをさらに含む。さらに、キメラＣＤ４０−Ｌの第１のサブドメインは、非ヒトＣＤ４０−ＬのドメインＩ又はサブドメイン又はドメインＩを含むことができる。従って、特定のキメラＣＤ４０−Ｌにおいて、第１のサブドメインは、非ヒトＣＤ４０−ＬのドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶのドメイン又はサブドメインを含む。好ましい実施形態において、非ヒトＣＤ４０−ＬはマウスＣＤ４０−Ｌである。
【００２８】
好ましい実施形態において、キメラヒト／マウスＣＤ４０配位子は、ヒトＣＤ４０Ｌ（配列番号１２）と９２％のアミノ酸配列相同性を有する（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４９５，０９０号を参照のこと、本明細書中で「ＭＥＭ４０」と呼ばれる）「ＣＤ４０配位子」及び「ＣＤ４０−Ｌ」は、本明細書中で区別せずに用いられ、また、「ＣＤ１５４」とも呼ばれる）。具体的には、ドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩ（それぞれ、この分子の細胞内、膜内、及び近位細胞外ドメインを含む領域）は完全にヒト化されている。分子のＣＤ４０結合部分を含むドメインＩＶでは、細胞における最適なＣＤ４０配位子発現に必要なマウスドメインのみが保持される。ＭＥＭ４０は、分子の３'末端で完全にヒト化され、ここで抗体結合はヒトに投与された場合、マウスＣＤ１５４（ＣＤ４０配位子）の活性を中和する。
【００２９】
本発明において有用なキメラＣＤ４０−Ｌは、これらに限定されるものではないが、以下の配列を含む。
配列番号７
ＭＩＥＴＹＳＱＰＳＰＲＳＶＡＴＧＬＰＡＳＭＫＩＦＭＹＬＬＴＶＦＬＩＴＱＭＩＧＳＶＬＦＡＶＹＬＨＲＲＬＤＫＶＥＥＥＶＮＬＨＥＤＦＶＦＩＫＫＬＫＲＣＮＫＧＥＧＳＬＳＬＬＮＣＥＥＭＲＲＱＦＥＤＬＶＫＤＩＴＬＮＫＥＥＫＫＥＮＳＦＥＭＱＲＧＤＥＤＰＱＩＡＡＨＶＶＳＥＡＮＳＮＡＡＳＶＬＱＷＡＫＫＧＹＹＴＭＫＳＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＰＳＳＱＲＰＦＩＶＧＬＷＬＫＰＳＳＧＳＥＲＩＬＬＫＡＡＮＴＨＳＳＳＱＬＣＥＱＱＳＶＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
配列番号８：
ＭＩＥＴＹＮＱＴＳＰＲＳＡＡＴＧＬＰＩＳＭＫＩＦＭＹＬＬＴＶＦＬＩＴＱＭＩＧＳＡＬＦＡＶＹＬＨＲＲＬＤＫＩＥＤＥＲＮＬＨＥＤＦＶＦＭＫＴＩＱＲＣＮＴＧＥＲＳＬＳＬＬＮＣＥＥＩＫＳＱＦＥＧＦＶＫＤＩＭＬＮＫＥＥＴＫＫＤＥＤＰＱＩＡＡＨＶＶＳＥＡＮＳＮＡＡＳＶＬＱＷＡＫＫＧＹＹＴＭＫＳＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＰＳＳＱＲＰＦＩＶＧＬＷＬＫＰＳＳＧＳＥＲＩＬＬＫＡＡＮＴＨＳＳＳＱＬＣＥＱＱＳＶＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
配列番号９
ＭＩＥＴＹＳＱＰＳＰＲＳＶＡＴＧＬＰＡＳＭＫＩＦＭＹＬＬＴＶＦＬＩＴＱＭＩＧＳＶＬＦＡＶＹＬＨＲＲＬＤＫＶＥＥＥＶＮＬＨＥＤＦＶＦＩＫＫＬＫＲＣＮＫＧＥＧＳＬＳＬＬＮＣＥＥＭＲＲＱＦＥＤＬＶＫＤＩＴＬＮＫＥＥＫＫＥＮＳＦＥＭＱＲＧＤＥＤＰＱＩＡＡＨＶＶＳＥＡＮＳＮＡＡＳＶＬＱＷＡＫＫＧＹＹＴＭＫＳＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＶＧＬＷＬＫＰＳＳＧＳＥＲＩＬＬＫＡＡＮＴＨＳＳＳＱＬＣＥＱＱＳＶＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
配列番号１０
ＭＩＥＴＹＮＱＴＳＰＲＳＡＡＴＧＬＰＩＳＭＫＩＦＭＹＬＬＴＶＦＬＩＴＱＭＩＧＳＡＬＦＡＶＹＬＨＲＲＬＤＫＩＥＤＥＲＮＬＨＥＤＦＶＦＭＫＴＩＱＲＣＮＴＧＥＲＳＬＳＬＬＮＣＥＥＩＫＳＱＦＥＧＦＶＫＤＩＭＬＮＫＥＥＴＫＫＤＥＤＰＱＩＡＡＨＶＶＳＥＡＮＳＮＡＡＳＶＬＱＷＡＫＫＧＹＹＴＭＫＳＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＶＧＬＷＬＫＰＳＳＧＳＥＲＩＬＬＫＡＡＮＴＨＳＳＳＱＬＣＥＱＱＳＶＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
配列番号１１
ＭＩＥＴＹＳＱＰＳＰＲＳＶＡＴＧＬＰＡＳＭＫＩＦＭＹＬＬＴＶＦＬＩＴＱＭＩＧＳＶＬＦＡＶＹＬＨＲＲＬＤＫＶＥＥＥＶＮＬＨＥＤＦＶＦＩＫＫＬＫＲＣＮＫＧＥＧＳＬＳＬＬＮＣＥＥＭＲＲＱＦＥＤＬＶＫＤＩＴＬＮＫＥＥＫＫＥＮＳＦＥＭＱＲＧＤＥＤＰＱＩＡＡＨＶＶＳＥＡＮＳＮＡＡＳＶＬＱＷＡＫＫＧＹＹＴＭＫＳＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＶＧＬＷＬＫＰＳＳＧＳＥＲＩＬＬＫＡＡＮＴＨＳＳＳＱＬＣＥＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
配列番号１２
ＭＩＥＴＹＮＱＴＳＰＲＳＡＡＴＧＬＰＩＳＭＫＩＦＭＹＬＬＴＶＦＬＩＴＱＭＩＧＳＡＬＦＡＶＹＬＨＲＲＬＤＫＩＥＤＥＲＮＬＨＥＤＦＶＦＭＫＴＩＱＲＣＮＴＧＥＲＳＬＳＬＬＮＣＥＥＩＫＳＱＦＥＧＦＶＫＤＩＭＬＮＫＥＥＴＫＫＤＥＤＰＱＩＡＡＨＶＶＳＥＡＮＳＮＡＡＳＶＬＱＷＡＫＫＧＹＹＴＭＫＳＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＶＧＬＷＬＫＰＳＳＧＳＥＲＩＬＬＫＡＡＮＴＨＳＳＳＱＬＣＥＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
配列番号１３
ＭＩＥＴＹＳＱＰＳＰＲＳＶＡＴＧＬＰＡＳＭＫＩＦＭＹＬＬＴＶＦＬＩＴＱＭＩＧＳＶＬＦＡＶＹＬＨＲＲＬＤＫＶＥＥＥＶＮＬＨＥＤＦＶＦＩＫＫＬＫＲＣＮＫＧＥＧＳＬＳＬＬＮＣＥＥＭＲＲＱＦＥＤＬＶＫＤＩＴＬＮＫＥＥＫＫＥＮＳＦＥＭＱＲＧＤＥＤＰＱＩＡＡＨＶＶＳＥＡＮＳＮＡＡＳＶＬＱＷＡＫＫＧＹＹＴＭＫＳＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＶＧＬＷＬＫＰＳＳＧＳＥＲＩＬＬＫＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＣＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
配列番号１４
ＭＩＥＴＹＮＱＴＳＰＲＳＡＡＴＧＬＰＩＳＭＫＩＦＭＹＬＬＴＶＦＬＩＴＱＭＩＧＳＡＬＦＡＶＹＬＨＲＲＬＤＫＩＥＤＥＲＮＬＨＥＤＦＶＦＭＫＴＩＱＲＣＮＴＧＥＲＳＬＳＬＬＮＣＥＥＩＫＳＱＦＥＧＦＶＫＤＩＭＬＮＫＥＥＴＫＫＤＥＤＰＱＩＡＡＨＶＶＳＥＡＮＳＮＡＡＳＶＬＱＷＡＫＫＧＹＹＴＭＫＳＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＶＧＬＷＬＫＰＳＳＧＳＥＲＩＬＬＫＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
配列番号１５
ＭＩＥＴＹＳＱＰＳＰＲＳＶＡＴＧＬＰＡＳＭＫＩＦＭＹＬＬＴＶＦＬＩＴＱＭＩＧＳＶＬＦＡＶＹＬＨＲＲＬＤＫＶＥＥＥＶＮＬＨＥＤＦＶＦＩＫＫＬＫＲＣＮＫＧＥＧＳＬＳＬＬＮＣＥＥＭＲＲＱＦＥＤＬＶＫＤＩＴＬＮＫＥＥＫＫＥＮＳＦＥＭＱＲＧＤＥＤＰＱＩＡＡＨＶＶＳＥＡＮＳＮＡＡＳＶＬＱＷＡＫＫＧＹＹＴＭＫＳＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＰＳＳＱＲＰＦＩＶＧＬＷＬＫＰＳＳＧＳＥＲＩＬＬＫＡＡＮＴＨＳＳＳＱＬＣＥＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
配列番号１６
ＭＩＥＴＹＮＱＴＳＰＲＳＡＡＴＧＬＰＩＳＭＫＩＦＭＹＬＬＴＶＦＬＩＴＱＭＩＧＳＡＬＦＡＶＹＬＨＲＲＬＤＫＩＥＤＥＲＮＬＨＥＤＦＶＦＭＫＴＩＱＲＣＮＴＧＥＲＳＬＳＬＬＮＣＥＥＩＫＳＱＦＥＧＦＶＫＤＩＭＬＮＫＥＥＴＫＫＤＥＤＰＱＩＡＡＨＶＶＳＥＡＮＳＮＡＡＳＶＬＱＷＡＫＫＧＹＹＴＭＫＳＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＰＳＳＱＲＰＦＩＶＧＬＷＬＫＰＳＳＧＳＥＲＩＬＬＫＡＡＮＴＨＳＳＳＱＬＣＥＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
配列番号１７
ＭＩＥＴＹＳＱＰＳＰＲＳＶＡＴＧＬＰＡＳＭＫＩＦＭＹＬＬＴＶＦＬＩＴＱＭＩＧＳＶＬＦＡＶＹＬＨＲＲＬＤＫＶＥＥＥＶＮＬＨＥＤＦＶＦＩＫＫＬＫＲＣＮＫＧＥＧＳＬＳＬＬＮＣＥＥＭＲＲＱＦＥＤＬＶＫＤＩＴＬＮＫＥＥＫＫＥＮＳＦＥＭＱＲＧＤＥＤＰＱＩＡＡＨＶＶＳＥＡＮＳＮＡＡＳＶＬＱＷＡＫＫＧＹＹＴＭＫＳＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＰＳＳＱＲＰＦＩＶＧＬＷＬＫＰＳＳＧＳＥＲＩＬＬＫＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
配列番号１８
ＭＩＥＴＹＮＱＴＳＰＲＳＡＡＴＧＬＰＩＳＭＫＩＦＭＹＬＬＴＶＦＬＩＴＱＭＩＧＳＡＬＦＡＶＹＬＨＲＲＬＤＫＩＥＤＥＲＮＬＨＥＤＦＶＦＭＫＴＩＱＲＣＮＴＧＥＲＳＬＳＬＬＮＣＥＥＩＫＳＱＦＥＧＦＶＫＤＩＭＬＮＫＥＥＴＫＫＤＥＤＰＱＩＡＡＨＶＶＳＥＡＮＳＮＡＡＳＶＬＱＷＡＫＫＧＹＹＴＭＫＳＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＰＳＳＱＲＰＦＩＶＧＬＷＬＫＰＳＳＧＳＥＲＩＬＬＫＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
【００３０】
配列番号７〜１８のキメラＣＤ４０−Ｌをコードする特定のヌクレオチド配列は、米国特許第７，４９５，０９０号、第７，９２８，２１３号、及び第８，１３８，３１０号に開示されている。これらのヌクレオチド配列は、参照により本明細書に組み込まれ、このようなヌクレオチド配列の使用は本明細書において想定される。
【００３１】
本発明のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスは、ＩＦＮαをコードする核酸を含むことができ、ここで、ＩＦＮαはヒト野生型ＩＦＮα（配列番号１）又は８０．００％〜９９．９９％（例えば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）の間の配列同一性を有するＩＦＮα、例えば、配列番号１のＩＦＮαを含む。
【００３２】
本発明のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスは、ＩＦＮβをコードする核酸を含むことができ、ここで、ＩＦＮβはヒト野生型ＩＦＮβ（配列番号２）又は８０．００％〜９９．９９％（例えば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）の配列同一性を有するＩＦＮβ、例えば、配列番号２のＩＦＮβを含む。特定の実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号２の最初の２２個のアミノ酸を欠くＩＦＮβをコードし、任意で、結果として生じる１６５個のアミノ酸ペプチドのシステイン１７は、さらにセリンに置換される。
【００３３】
本発明のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスはＩＦＮεをコードする核酸を含むことができ、ここで、ＩＦＮεはヒト野生型ＩＦＮε（配列番号３）、又は８０．００％〜９９．９９％（例えば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）の間の配列同一性を有するＩＦＮε、例えば、配列番号３のＩＦＮεを含む。
【００３４】
本発明のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスはＩＦＮκをコードする核酸を含むことができ、ここで、ＩＦＮκはヒト野生型ＩＦＮκ（配列番号４）又は８０．００％から９９．９９％までの間（例えば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）の配列同一性を有するＩＦＮκ、例えば、配列番号４のＩＦＮκを含む。
【００３５】
本発明のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスは、ＩＦＮωをコードする核酸を含むことができ、ここで、ＩＦＮωはヒト野生型ＩＦＮω（配列番号５）又は８０．００％から９９．９９％までの間（例えば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）の配列同一性を有するＩＦＮω、例えば、配列番号５のＩＦＮωを含む。
【００３６】
本発明のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスはＣＤ４０−Ｌをコードする核酸を含むことができ、ここで、ＣＤ４０−Ｌはヒト野生型ＣＤ４０−Ｌ（配列番号６）又は８０．００％〜９９．９９％（例えば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）の間の配列同一性を有するＣＤ４０−Ｌ、例えば、配列番号６のＣＤ４０−Ｌを含む。本発明のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスはまた、キメラＣＤ４０−Ｌをコードする核酸を含むことができ、ここで、キメラＣＤ４０−Ｌは配列番号７〜１８から選択される配列、又は配列番号７〜１８から選択される配列を有するキメラＣＤ４０−Ｌと８０．００％〜９９．９９％（例えば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）までの配列同一性を有するＣＤ４０−Ｌから選択される配列を有する。
【００３７】
好ましい実施形態において、本発明のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスは、ＭＥＭ４０をコード化する核酸を含むことができる。例えば、好ましい実施形態において、本発明のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスは、ヒトＩＦＮβ（配列番号２）と少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮβを含み、ＣＤ４０−Ｌは、配列番号１２の配列を有するキメラＣＤ４０−Ｌと少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【００３８】
Ｉ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌの組み合わせをコードする１つ以上の異種核酸配列は、１つ以上のウイルス構築物中に存在し得る。ウイルス構築物の非限定的な例としては、アデノウイルス構築物、アデノ随伴ウイルス構築物（ＡＡＶ）、ポックスウイルス構築物、レンチウイルス構築物、アルファウイルス構築物、ヘルペスウイルス構築物、レトロウイルス構築物、ワクシニアウイルス構築物、水疱性口内炎ウイルス構築物、又は単純ヘルペスウイルス構築物が挙げられる。
【００３９】
Ｉ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮβ）とＣＤ４０−Ｌ（キメラヒト／マウスＣＤ４０Ｌ）をコードする核酸に加えて、本発明による腫瘍溶解性ウイルスは、そのゲノムに他の変形例をさらに含み得る。例えば、それは、既に不活性化された遺伝子に挿入された、又は欠失された遺伝子に置換されたさらなるＤＮＡを含み得る。腫瘍溶解性ウイルスはまた、増強されたレベルの腫瘍細胞特異性をウイルスに付与する１つ以上のプロモーターをその中に組み込んでもよい。このようにして、腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞特異的プロモーターを用いて、特定の癌タイプを標的化する。「腫瘍細胞特異的プロモーター」又は「腫瘍細胞特異的転写調節配列」又は「腫瘍特異的プロモーター」又は「腫瘍特異的転写調節配列」という用語は、正常細胞よりも標的癌細胞中に高いレベルで存在する転写調節配列、プロモーター及び／又はエンハンサーを示す。例えば、本発明における使用のための腫瘍溶解性ウイルスは、外因的に添加された調節因子の制御下にある。
【００４０】
好ましい実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスはアデノウイルス（Ａｄ）である。Ａｄはヒトに感染する大型（約３６ｋｂ）のＤＮＡウイルスであるが、宿主域も広い。物理的には、アデノウイルスは二本鎖の線状ＤＮＡゲノムを含む正二十面体ウイルスである。ヒトアデノウイルスには約５０種類の血清型があり、分子的、免疫学的、機能的基準に基づいて６つの系列に分けられる。成人期までに、事実上全てのヒトが、より一般的なアデノウイルス血清型に感染し、その主な影響は風邪様症状である。
【００４１】
宿主細胞のアデノウイルス感染は、アデノウイルスＤＮＡをエピソームで維持し、これは、組み込みベクターに関連する潜在的な遺伝毒性を低下させる。さらに、アデノウイルスは、構造的に安定であり、広範な増幅後もゲノム再編成は検出されていない。アデノウイルスは、その細胞周期の段階にかかわらず、ほとんどの上皮細胞に感染する。これまでのところ、アデノウイルス感染は、ヒトの急性呼吸器疾患のような軽度の疾患にのみ関連しているとみられている。
【００４２】
アデノウイルスの感染サイクルは、アデノウイルスゲノムの複製開始に先立って、ウイルスＤＮＡの複製及び転写に関与する調節タンパク質及びタンパク質の産生を可能にする初期相と、構造タンパク質の合成を導く後期相の２ステップで行われる。初期遺伝子は、Ｅ１〜Ｅ４（「Ｅ」は「初期」を意味する）と指定されるアデノウイルスゲノムに分散している４つの領域に分布している。初期領域は、少なくとも６つの転写単位を含み、その各々は、それ自体のプロモーターを有する。初期遺伝子の発現そのものは調節されており、ある遺伝子は他の遺伝子よりも前に発現している。ウイルスの複製には、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４の３つの領域が必須である。従って、アデノウイルスがこれらの機能の１つに欠陥がある場合、このタンパク質はトランスで供給されなければならず、そうでないと、ウイルスは複製できない。
【００４３】
Ｅ１初期領域は、アデノウイルスゲノムの５'末端に位置し、２つのウイルス転写単位、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを含む。この領域は、ウイルス周期のごく初期に関与するタンパク質をコードし、アデノウイルスの他のほとんど全ての遺伝子の発現に必須である。特に、Ｅ１Ａ転写単位は、他のウイルス遺伝子の転写の転写促進をするタンパク質をコードし、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、及びＥ４領域のプロモーター及び後期遺伝子からの転写を誘導する。
【００４４】
アデノウイルスは、細胞表面受容体を介して許容宿主細胞に侵入した後、細胞内に取り込まれる。複製サイクルの最初の段階に必要なある種のウイルスタンパク質と結合したウイルスＤＮＡは、感染細胞の核に入り、そこで転写が開始される。アデノウイルスＤＮＡの複製は、感染細胞の核内で行われ、細胞複製を必要としない。新たなウイルス粒子又はビリオンが集合した後、それらが感染細胞から放出され、他の許容細胞に感染する。
【００４５】
アデノウイルスは魅力ある送達システムである。本開示の実施形態は、タンパク質、血清、及び動物由来の成分を含まないか、又は本質的に含まない製造工程を利用することができ、広範囲の予防及び治療ワクチン製品の両方に適したものにする。
【００４６】
アデノウイルスが条件付きで複製可能（ある条件下では複製コンピテント）であるように突然変異されている場合、ヘルパー細胞がウイルス複製に必要とされることがある。必要に応じて、ヘルパー細胞株は、ヒト胚性腎臓細胞、筋肉細胞、造血細胞又は他のヒト胚性間葉細胞もしくは上皮細胞のようなヒト細胞由来であってもよい。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスを許容する他の哺乳動物種の細胞に由来するものであってもよい。このような細胞としては、例えば、ベロ細胞又は他のサル胚性間葉細胞もしくは上皮細胞が挙げられる。ある態様において、ヘルパー細胞株は２９３である。宿主細胞及びヘルパー細胞を培養する種々の方法は、当該分野で知られている（例えば、Ｒａｃｈｅｒ、Ａ．Ｊ．、Ｆｏｏｋｓ、Ａ．Ｒ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、Ｊ．Ｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｔｅｃｈ（１９９５）９：１６９）。
【００４７】
アデノウイルスは、異なる方法を用いて単離することができる。ほとんどの場合、Ａｄゲノムのトランスフェクション後、アガロースオーバーレイ細胞からアデノウイルスプラークを単離し、ウイルス粒子を分析のために増殖する。詳細なプロトコールについては、当業者であれば、（Ｇｒａｈａｍ、Ｆ．Ｌ．及びＰｒｅｖｅｃ、Ｌ（１９９１）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７、１０９−１２８）を参照されたい。
【００４８】
アデノウイルスベクターの生成のための代替技術には、細菌人工染色体（ＢＡＣ）システムの利用、相補的なアデノウイルス配列を含む２つのプラスミドを利用するｒｅｃＡ＋細菌株におけるin vivo細菌組換え、及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）システム（参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第９５／２７０７１号及び第９６／３３２８０号）がある。
【００４９】
抗癌剤としての開発において、アデノウイルスを含む広範囲の腫瘍溶解性ウイルス型が存在する（その全体が参照により本明細書に組み込まれるＲｕｓｓｅｌｌら、２０１２  ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．；３０（７）：６５８−６７０；Ｌａｗｌｅｒら、２０１７  ＪＡＭＡ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ；３（６）：８４１−８４９；Ｃｈｏｉら、２０１６、Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ；４（３）：１８及びＣｈｉｏｃｃａ及びＲａｂｋｉｎ、２０１４  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．２（４）：２９５−３００を参照のこと）。
【００５０】
複数の生物学的特性が、所望の治療活性のための治療的腫瘍溶解性アデノウイルスの選択又は設計において考慮され、例えば、細胞表面タンパク質の自然親和性を介する、又は癌細胞を直接標的とするアデノウイルスの工学的操作による、感染についての癌細胞の選択的ターゲティング；癌細胞における選択的複製；ウイルス病原性の減衰；溶菌活性の増強；アデノウイルスの迅速なクリアランスにつながり得る抗ウイルス免疫応答の改変；及びサイトカイン、免疫アゴニスト又は免疫チェックポイント阻害剤を組み込むためのアデノウイルスの遺伝子改変による全身性抗腫瘍免疫の改変が挙げられる。
【００５１】
複製コンピテント腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、広範囲の細胞型及び腫瘍型の感染能、非分裂細胞の感染、ゲノム集積化の欠如、高力価、導入遺伝子を運搬する能力、in vitro及びin vivo安定性、及び導入遺伝子の高レベルの発現を含む、それらを治療用途に理想的なものとする、いくつかの特性を有する。アデノウイルス発現ベクターは、（ａ）構築物のパッケージングを支持し、（ｂ）その中にクローニングされた組換え遺伝子構築物を最終的に発現するのに十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含む。
【００５２】
腫瘍溶解性アデノウイルスの生物学的特性の変調は、癌処置に実際、有益又は有害な、広範囲の免疫相互作用に影響し得る。相互作用は、特定の腫瘍、疾患の部位と範囲、免疫抑制性腫瘍微小環境、腫瘍溶解性ウイルスプラットフォーム、ドーズ量、時間、送達条件、ならびに個々の患者の応答に依存する（概して、Ａｕｒｅｌｉａｎ  Ｌ．"Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｒｅｍａｉｎｉｎｇ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ"「免疫療法としての腫瘍溶解性ウイルス：進歩と残された課題」Ｏｎｃｏ．Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｔｈｅｒ．２０１６；９：２６２７−２６３７参照）。例えば、アデノウイルスＥ３遺伝子の存在は、in vitro及びin vivoで、条件的複製アデノウイルスの腫瘍溶解能を増加させることが報告されている（Ｓｕｚｕｋｉ  Ｋ、Ａｌｅｍａｎｙ  Ｒ、Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｍ及びＣｕｒｉｅｌ  ＤＴ"Ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅ３  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ"「アデノウイルスＥ３領域の存在は条件的複製アデノウイルスの腫瘍溶解能を改善する」ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２  Ｎｏｖ；８（１１）：３３４８−５９参照）。特に、Ｅ３−１１．６ｋＤａアデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）は効率的な細胞死に必要であると考えられている（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ  Ａ、Ｒｙｅｒｓｅ  Ｊ、及びＳｃａｒｉａ  Ａら"Ｔｈｅ  Ｅ３−１１．６−ｋＤａ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｄｅａｔｈ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＡＤＰ）  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ：  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｄｐ  ｍｕｔａｎｔｓ，"「Ｅ３−１１．６−ｋＤａアデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）は効率的な細胞死に必要である：ａｄｐ突然変異体に感染した細胞の特徴付け」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９６；２２０：１５２−１６２を参照）。しかしながら、癌の処置に対する免疫療法的アプローチのためには、抗癌免疫応答の最適な誘導のために、迅速な細胞死と免疫調節タンパク質の十分な発現とのバランスをとることが重要である。本開示は、そのような腫瘍溶解性アデノウイルスを提供する。
【００５３】
５７のヒトアデノウイルス血清型（ＨＡｄＶ−１〜５７）のいずれかの部類は、外因性分子をコードする異種核酸（例えば、本明細書中に開示されるような外因性Ｉ型ＩＦＮ及び外因性ＣＤ４０配位子）を組み込む。ヒトＡｄ５は、遺伝的及び生化学的に十分に特徴付けられている（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ７３２６０；ＡＣ０００００８）。従って、特定の実施形態において、腫瘍溶解性アデノウイルスは、複製コンピテントＡｄ５血清型又はＡｄ５成分を含むハイブリッド血清型である。アデノウイルスは野生型株であってもよいが、例えば、腫瘍細胞におけるウイルスの複製能力に影響することなく、通常静止細胞内で複製するウイルスの能力を弱めることによって、腫瘍選択性を高めるように遺伝子改変されてもよい。本開示に包含される複製コンピテント腫瘍溶解性アデノウイルスの非限定的な例としては、Ｄｅｌｔａ−２４、Ｄｅｌｔａ−２４−ＲＧＤ、ＩＣＯＶＩＲ−５、ＩＣＯＶＩＲ−７、ＯＮＹＸ−０１５、ＣｏｌｏＡｄ１、Ｈ１０１及びＡＤ５／３−Ｄ２４−ＧＭＣＳＦが挙げられる。Ｏｎｙｘ−０１５は、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ及びＥ３Ｂ領域に欠失を有するウイルス血清型Ａｄ２及びＡｄ５のハイブリッドであり、癌選択性を高める。Ｈ１０１は、Ｏｎｙｘ−０１５の修正版である。ＩＣＯＶＩＲ−５及びＩＣＯＶＩＲ−７は、Ｅ１ＡのＲｂ結合部位欠失及びＥ２ＦプロモーターによるＥ１Ａプロモーターの置換を含む。ＣｏｌｏＡｄ１はキメラＡｄｄ１１ｐ／Ａｄ３血清型である。Ａｄ５／３−Ｄ２４−ＧＭＣＳＦ（ＣＧＴＧ−１０２）は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする血清型５／３カプシド修飾アデノウイルスである（Ａｄ５カプシドタンパク質ノブが血清型３由来のノブドメインと置換される）。
【００５４】
腫瘍に注射された腫瘍溶解性アデノウイルスは、細胞死及び新たなアデノウイルス子孫の放出を誘導し、それは、隣接する細胞に感染することにより、停止しない場合、腫瘍の全破壊につながる可能性がある処置波を生成する。
【００５５】
本開示のある実施形態において、Ｉ型ＩＦＮ及びＣＤ４０−Ｌをコードする異種配列の組み合わせを、アデノウイルスの非必須領域に組み込むことができる。本開示の好ましい実施形態において、アデノウイルスは、癌選択性を増強するために、Ｅ１における２４ヌクレオチド欠失、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ領域の欠失、及びＥ３Ｂ領域の欠失を含む。
【００５６】
ウイルス領域は、所望の治療特性を付与するために、複数の目的のために改変されてもよい。治療特性の非限定的な例としては、ウイルスの複製及び拡散の増強、腫瘍溶解の増強、正常細胞よりも腫瘍細胞の優先的なターゲティング、増強された免疫活性化、及び宿主免疫系からのウイルスの保護が挙げられる。上記の目的のためのウイルス領域は、排除され得るか（完全又は部分的な欠失）、非機能的にされ得るか、機能を弱めるように改変され得るか、又は他の配列によって置換され得るかのいずれかである。腫瘍溶解性ウイルスはまた、治療用タンパク質及び／又は免疫調節性タンパク質をコードする１つ以上の異種遺伝子を含むように改変されてもよい。特定の実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、ＩＦＮβとＣＤ４０−Ｌの組み合わせを発現するように改変される。
【００５７】
任意で、シグナルペプチド、又はそれらをコードする核酸を、所望のポリペプチドの表面局在化のために使用してもよい。
【００５８】
好ましい実施形態において、ＤＣ等のＡＰＣは、ヒトＡＰＣ又はＤＣである。好ましくは、悪性腫瘍を有するヒト対象のＤＣ等のＡＰＣは、例えば、ＩＦＮβとＣＤ４０−Ｌの組み合わせをコードする１つ以上の異種核酸配列を介して、外因性Ｉ型ＩＦＮ及び外因性ＣＤ４０−Ｌの組み合わせを発現するように単離され、遺伝的に改変される。好ましい実施形態において、ＣＤ４０−ＬはＭＥＭ４０である。
【００５９】
腫瘍溶解性ウイルスは、癌の処置に使用するために、癌細胞における選択的複製、ウイルス病原性の減衰、溶解活性の増強、ウイルスの迅速なクリアランスにつながり得る抗ウイルス免疫応答の改変；及びウイルス誘導全身性抗腫瘍免疫の改変を含む、１つ以上の特性を改善するためにさらに遺伝子改変されてもよい。
【００６０】
腫瘍溶解性ウイルスがＲＮＡゲノムを有する実施形態において、Ｉ型ＩＦＮ及びＣＤ４０−Ｌをコードする遺伝子は、ゲノムへの遺伝子の挿入前にＲＮＡウイルスゲノムからの発現に適しているようなものにすることができる。例えば、Ｉ型ＩＦＮ及びＣＤ４０−Ｌをコードする遺伝子は、ＲＮＡウイルスゲノムからの発現を容易にするために、チミンをウラシルに置換する。このような実施形態に適し得る他の変形例は、当業者に知られているのであろう。
【００６１】
本開示に有用なベクターに含まれる発現カセットは、（５'から３'方向に）タンパク質コード配列に作動可能に連結された転写プロモーター、介在配列を含むスプライスシグナル、及び転写終結／ポリアデニル化配列を含む。真核生物細胞においてタンパク質コード遺伝子の転写を制御するプロモーター及びエンハンサーは、多数の遺伝子エレメントから構成される。細胞装置は、各エレメントによって伝達される調節情報を集めて統合し、異なる遺伝子が、転写調節の独特で複雑なパターンを展開させることを可能にしている。本開示の文脈において使用されるプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、及び組織特異的プロモーターを含む。
【００６２】
Ｉ型ＩＦＮ及びＣＤ４０−Ｌ核酸発現は、ヒト腫瘍細胞のような哺乳動物細胞において機能的なプロモーターの制御下にある。一実施形態において、Ｉ型ＩＦＮ及びＣＤ４０−Ｌの発現を指示するプロモーターは、それぞれＳＶプロモーターとサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。
【００６３】
本明細書における発現構築物は、プログラム遺伝子の発現を駆動するためのプロモーターを含む。プロモーターは、一般に、ＲＮＡ合成の開始部位を位置決めするように機能する配列を含む。この最良の例はＴＡＴＡボックスであるが、哺乳類のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターやＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターのように、ＴＡＴＡボックスを欠くプロモーターの中には開始部位そのものを覆う離散的な要素が開始の場所を固定するのに役立っているものもある。さらなるプロモーターエレメントは転写開始の頻度を調節する。これらは典型的には、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域にあるが、プロモーターは開始部位の下流に機能的エレメントを含むことも示されている。プロモーターの「制御下」にあるコード配列を得るために、１つは、選択されたプロモーターの（すなわち３−プライムの）転写リーディングフレームの転写開始部位の５−プライム末端を位置づける。「上流」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促進する。
【００６４】
プロモーターエレメント間の間隔は、自由に変えられることが多いので、エレメントが反転されるか、相対的に動くときに、プロモーター機能は保たれる。プロモーターによっては、個々のエレメントが協同して、あるいは独立に機能して転写を活性化するようである。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列を指す「エンハンサー」と組み合わせて使用されてもされなくてもよい。
【００６５】
プロモーターは、核酸配列と自然に関連し、コードセグメント及び／又はエキソンの上流に位置する５プライム非コード配列を単離することによって得られる。このようなプロモーターは、「内因性」とされる。同様に、エンハンサーは、その配列の下流又は上流のいずれかに位置する核酸配列と自然に関連する。あるいは、コード核酸セグメントを組換え又は異種プロモーター（その天然環境において核酸配列と通常関連しないプロモーターをいう）の制御下に配置することによって、特定の利点が得られる。組換え又は異種エンハンサーはまた、その天然環境において核酸配列と通常関連しないエンハンサーをいう。このようなプロモーター又はエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、及び任意の他のウイルス、又は原核細胞もしくは真核細胞から単離されたプロモーター又はエンハンサー、ならびに「天然に存在する」ものではない、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント、及び／又は発現を変化させる突然変異体を含むプロモーター又はエンハンサーを含む。
【００６６】
発現のために選択されたオルガネラ、細胞型、組織、器官、又は生物におけるＤＮＡセグメントの発現を効果的に指示するプロモーター及び／又はエンハンサーを使用することができる。分子生物学の当業者であれば、概して、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー、及び細胞型の組み合わせの使用について知っている。使用されるプロモーターは、組換えタンパク質及び／又はペプチドの大規模生産において有利であるような、導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指示する適切な条件下で、構成的、組織特異的、誘導可能で、有用なものである。プロモーターは、異種であっても内因性であってもよい。
【００６７】
プロモーターの非限定的な例には、初期又は後期ウイルスプロモーター、例えば、ＳＶ４０初期又は後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーター、及び真核細胞プロモーターが含まれる。
【００６８】
特定の開始シグナルを、コード配列の効率的な翻訳のために、本開示において提供される発現構築物において使用してもよい。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドン又は隣接する配列が含まれる。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを提供するのが必要な場合がある。当業者であれば、必要な信号を容易に提供することができる。開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと「インフレーム」でなければならないことは周知である。外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然又は合成のいずれかである。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含むことによって増進される。
【００６９】
特定の実施形態において、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを使用して多重遺伝子、又はポリシストロニックメッセージを作製する。ＩＲＥＳエレメントは、５プライムメチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回し、内部部位で翻訳を開始する（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒら、１９８８  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）。ピコルナウイルス系列の２つの部類（ポリオ及び脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメント（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒら、１９８８  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、及び哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳ（Ｍａｃｅｊａｋら、１９９１  Ｎａｔｕｒｅ）についての記載がある。ＩＲＥＳエレメントは、異種オープンリーディングフレームに連結させることができる。多数のオープンリーディングフレームを一緒に転写させることができ、各々はＩＲＥＳによって分離され、ポリシストロニックメッセージを生じる。ＩＲＥＳエレメントは、効率的な翻訳のために、各オープンリーディングフレームがリボソームにアクセシブルとさせる。単一のプロモーター／エンハンサーを用いて複数の遺伝子を効率的に発現させて、単一のメッセージを転写することができる（それぞれ、本明細書中に参照により組み込まれる米国特許第５，９２５，５６５号及び第５，９３５，８１９号）。特定の実施形態において、Ｉ型ＩＦＮ及びＣＤ４０−Ｌは、両方の遺伝子の効率的な発現のためにＩＲＥＳエレメントによって連結される。
【００７０】
本発明のさらなる実施形態は、ＤＣ等のＡＰＣ又は本発明の腫瘍溶解性ウイルスと、薬学的に許容される担体又はアジュバントとを含む組成物を提供する。
【００７１】
上記のように、本発明は、細胞死誘導処置と組み合わせた場合に、Ｉ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌの組み合わせを発現するＤＣ等のＡＰＣが、強力な全身性Ｔ細胞応答を誘導することを提供する。このような効果はまた、例えば、ＩＦＮβとＣＤ４０−Ｌの組み合わせをコードする１つ以上の異種核酸配列を介して、Ｉ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌの組み合わせを発現する腫瘍溶解性ウイルスを投与することによっても提供され得る。
【００７２】
従って、本発明の特定の実施形態は、例えば、ＩＦＮβとＣＤ４０−Ｌの組み合わせをコードする１つ以上の異種核酸配列を介して、外因性Ｉ型ＩＦＮ及び外因性ＣＤ４０−Ｌの組み合わせを発現する本発明のＤＣ等のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスの有効量を、処置を必要とする対象に投与することを含む、悪性腫瘍を処置するための方法を提供する。
【００７３】
好ましい実施形態において、本発明の方法において使用されるＤＣ等のＡＰＣは、自家ＡＰＣであり、すなわち、悪性腫瘍に罹患している対象からのＡＰＣは、例えば、ＩＦＮβとＣＤ４０−Ｌの組み合わせをコードする１つ以上の異種核酸配列を介して、外因性Ｉ型ＩＦＮと外因性ＣＤ４０−Ｌの組み合わせを発現するように単離及び改変され、対象に投与される。ただし、ＡＰＣは自家、同種、又は異種であってよい。
【００７４】
Ｉ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌの組み合わせを含む本発明のＤＣ等のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスは、単独で、又は１つ以上のさらなる抗癌剤と組み合わせて投与することができる。このような薬剤には、化学療法薬（例えば、メルファラン）、免疫調節薬、アジュバント、貧血薬（例えば、エリスロポエチン）、放射線療法、幹細胞移植、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）、又はこれらの２つ以上の組み合わせが含まれる。特定の実施形態において、このような治療薬は、ＤＣ等のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスを投与する前、投与中、又は投与後に投与される。
【００７５】
本発明のＤＣ等のＡＰＣの最適な活性は、腫瘍抗原が豊富な場合にのみ観察される。放射線治療（ＩＲ）を受けているヒト癌患者で観察される現象は、ＩＲが放射線照射野外の腫瘍の退縮を誘発する可能性がある、アブスコパル効果である。アブスコパル効果は、腫瘍抗原の解除につながるＩＲ誘導細胞死に続くＴ細胞活性化に基づく。この効果の希少性は、ＤＣ及びＴ細胞活性化に必要なシグナルがＩＲ単独では提供されないことによる。アブスコパル効果は、抗腫瘍性Ｔ細胞免疫反応を誘導するＩＲによる腫瘍抗原の放出に基づいていると考えられているが、より多くの患者に利益をもたらすためにアブスコパル効果をより一般的なものにする手段は不明である。本発明によれば、放射線単独ではＤＣ活性化及び抗原提示につながる先天性免疫の十分に強力なアクチベーターではない可能性がある。従って、本発明は、先天性免疫の刺激因子の外因性投与によって、抗腫瘍Ｔ細胞応答を増大させ、より大きなアブスコパル効果をもたらすことを提供する。
【００７６】
先天性免疫の１つのこのような刺激因子は、Ｉ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌの組み合わせを含むＤＣ等のＡＰＣ、例えば、ＤＣ等のレンチウイルス形質導入ＡＰＣ、高レベルのＩＦＮβとＣＤ４０−Ｌの組み合わせを発現するワクチンであり、これは、ＤＣ等のＡＰＣ活性化を調節する。本明細書中に開示されるＤＣのようなＡＰＣは、腫瘍内注射のために使用され得る。本発明は、Ｉ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌの組み合わせ、例えば、ＩＦＮβとＣＤ４０−Ｌの組み合わせを含むＩＲとＡＰＣの組み合わせを提供し、これによって、強いＴ細胞活性化を介する強い抗腫瘍アブスコパル効果が生じる。この処置は、チェックポイント遮断療法と併用すると特に有効であった。
【００７７】
本発明によれば、Ｉ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌの組み合わせ、例えばＩＦＮβとＣＤ４０−Ｌの組み合わせを含むＤＣ等のＡＰＣを照射腫瘍に投与することによって、アブスコパル効果が増強される。
【００７８】
従って、対象における悪性腫瘍を処置する特定の方法では、対象に放射線療法を施し、続いて、例えば、ＩＦＮβとＣＤ４０−Ｌの組み合わせをコードする１つ以上の異種核酸配列を介して、外因性Ｉ型ＩＦＮと外因性ＣＤ４０−Ｌの組み合わせ、例えば、ＩＦＮβとＣＤ４０−Ｌの組み合わせを含む、ＤＣ等のＡＰＣを投与することを含む。ＤＣ等のＡＰＣは、約１日〜約７日以内、好ましくは約２日〜約６日以内、より好ましくは約３〜５日以内、さらにより好ましくは約４日以内に投与する。ＤＣ等のＡＰＣは、数日間にわたって複数回投与することができる。さらなる実施形態において、ＤＣ等のＡＰＣは、放射線を施した後、約２０〜４０時間、好ましくは約２５〜３５時間、さらにより好ましくは約３０時間、最も好ましくは約２４時間で投与する。
【００７９】
対象に施される放射線は、好ましくはＸ線、ガンマ線、ラドン、又は他の形態の高エネルギー放射線等の電離照射である。
【００８０】
特定の実施形態において、ＤＣ等のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスは、皮内注射によって、特に、対象の腋窩及び／又は鼠径リンパ節流域に流れ出る解剖学的部位に投与される。他の実施形態において、ＤＣ等のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍（腫瘍内）又は対象の鼠径リンパ節等のリンパ節内に投与される。他の実施形態において、ＤＣ等のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスは血管内（例えば、静脈内）注射によって投与される。
【００８１】
ある実施形態において、放射線療法及びＤＣ等のＡＰＣを施すこと、又は本発明の腫瘍溶解性ウイルスを投与することに加えて、本方法はさらに、対象に対して造血細胞移植（例えば、骨髄、末梢血、又は臍帯血からの造血幹細胞又は前駆細胞）を行うことを包含する。造血細胞移植には、自家移植と同種移植がある。ＤＣ等のＡＰＣ又は本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、造血細胞移植の前及び／又は後に投与することができる。
【００８２】
さらなる実施形態において、放射線療法及びＤＣ等のＡＰＣを施すこと、又は本発明の腫瘍溶解性ウイルスを投与すること、及び任意で造血細胞移植を行うことに加えて、本方法はさらに、幹細胞動員（例えば、Ｇ−ＣＳＦを使用して）を対象に対して実施すること、及び自己造血細胞移植の前に対象から造血細胞を収集することを包含する。
【００８３】
典型的に、ＤＣ等のＡＰＣは、対象から収集され、本発明に従って修飾され、対象に投与される。ＤＣ等のＡＰＣは、対象に投与する前に凍結保存することができる。
【００８４】
特定の実施形態において、本方法は、本発明のＤＣ等のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスを投与する前、投与中、又は投与後に化学療法剤（例えば、メルファラン）を投与することを含む。
【００８５】
特定の実施形態において、本発明の放射線療法及びＤＣ等のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスを投与した後、本方法は、チェックポイント阻害剤を対象に投与する工程をさらに包含する。
【００８６】
特定のチェックポイント阻害薬が癌治療に使用されている。チェックポイントとは、末梢組織の損傷を最小限に抑えるために、自己寛容を維持し、免疫システム応答の程度を調節する役割を担う免疫システムの抑制経路を指す。腫瘍細胞は、免疫系チェックポイントを活性化して、腫瘍組織に対する免疫応答の効力を低下させる。チェックポイント阻害薬を投与すると、免疫系に対する抑制が解除され、腫瘍細胞に対する免疫系の活性が可能になる。チェックポイント阻害剤としては、細胞毒性Ｔ−リンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４、別名ＣＤ１５２）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１、別名ＣＤ２７９）及びプログラム細胞死１配位子１（ＰＤ−Ｌ１、別名ＣＤ２７４）に対する抗体等の阻害剤が例示される。抗ＰＤ−１抗体は市販されており、ペンブロリズマブ、ラムブロリズマブ、ニボルマブ、ＡＭＰ−２２４、及びピジリズマブが例示される。抗ＰＤ−Ｌ１免疫も市販されており、アテゾリズマブ、ＭＤＸ−１１０５、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＭＳ−９３６５５９、及びＭＩＨ１が例示される。抗ＣＴＬＡ４抗体としては、イピリムマブ及びトレメリムマブが例示される。イピリムマブは転移性メラノーマの治療薬としてＦＤＡの承認を受けている（Ｗａｄａら、２０１３、Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  １１：８９）。チェックポイントタンパク質対象のさらなる例としては、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４（ＣＤ２系列の分子に属し、全てのＮＫ細胞及びメモリＣＤ８＋Ｔ細胞上で発現される）、ＣＤ１６０（別名ＢＹ５５）、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１及びＣＨＫ２キナーゼ、Ａ２ａＲ、ならびに種々のＢ−７系列配位子が挙げられるが、これらに限定されない。抗体の非限定的な例としては、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ−５１４）、ＡＵＮＰ−１２、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、ＢＭＳ９３５５５９（ＭＤＸ−１１０５）、ｒＨＩＧＭ１２Ｂ７、ＢＭＳ−９８６０１６、ＧＳＫ２８３１７８１、ＩＭＰ３２１、リリルマブ（ＢＭＳ−９８６０１５）、ＩＰＨ２１０１（１−７Ｆ９）、インドキシモド（ＮＬＧ  ９１８９）、ＮＬＧ  ９１９、ＩＮＣＢ０２４３６０、ＰＦ−０５０８２５６６、ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）、及びＭＥＤＩ６４６９が挙げられる。
【００８７】
使用されるチェックポイント阻害剤の非限定的な例を、以下の表１にリストする。
【００８８】
【表１】
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【表２】
2021526842.tif 000003
【００８９】
一実施形態において、２つ以上のチェックポイント阻害剤の組み合わせが対象に投与される。一実施形態において、チェックポイント阻害剤の組み合わせは表１のもの中から選択される。２つ以上のチェックポイント阻害剤を、互いに対して同時に又は連続的に投与することができる。さらなる実施形態において、２つ以上のチェックポイント阻害剤の組み合わせは、２つの異なるチェックポイントタンパク質、例えば、ＰＤ−１（例えば、ニボルマブ又は他のＰＤ−１阻害剤）及びＣＴＬＡ−４（例えば、イピルムマブ又は他のＣＴＬＡ−４阻害剤）を標的とし、互いに対して同時に又は連続して対象に投与される。一実施形態において、２つ以上のチェックポイント阻害剤の組み合わせは、次の２つ以上の異なるチェックポイントタンパク質をターゲットとする：ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１キナーゼ、ＣＨＫ２キナーゼ、Ａ２ａＲ、及びＢ−７系列配位子。一実施形態において、２つ以上の異なるチェックポイントタンパク質を標的とする２つ以上のチェックポイント阻害剤の組み合わせは、表１の中から選択される。
【００９０】
チェックポイント阻害剤の投薬レベル、投薬頻度、投薬期間及び投与のその他態様は、患者の臨床症状、疾患の期間又は経過、合併症、及び臨床ケアの他の態様に応じて最適化される。本発明は、本明細書中に具体化された方法のチェックポイント阻害剤成分の特定の態様に関して、限定するものではない。さらなるチェックポイント阻害剤は当業者に周知されており、このような実施形態は、本発明の範囲内である。
【００９１】
本明細書中に開示される材料及び方法に従って処置され得る癌の例としては癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のより具体的な例には、乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、腹膜癌、肝臓癌、例えば、肝癌、膀胱癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、及び甲状腺癌が含まれる。ある実施形態において、癌は、メラノーマ、ＭＤＳ、卵巣癌、乳癌、又は多発性骨髄腫である。
【００９２】
癌の他の非限定的な例は、基底細胞癌、胆道癌、骨癌、脳及びＣＮＳ癌、絨毛癌、結合組織癌、食道癌、眼癌、頭頸部の癌、胃癌、上皮内新生物、喉頭癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、メラノーマ、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌（例えば、口唇、舌、口、及び咽頭）、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系の癌、肉腫、皮膚癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、泌尿器系の癌、ならびに他の癌腫及び肉腫である。本発明の組成物及び方法で処置され得る癌型の例を、表２にリストする。
【００９３】
癌の種類の例
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【００９４】
本明細書で使用する「腫瘍」という用語は、悪性であるか良性であるかにかかわらず、全ての新生物細胞の成長及び増殖を指し、全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を指す。例えば、特定の癌は、固形腫瘤腫瘍又は非固形腫瘤腫瘍によって特徴付けられ得る。固形腫瘍の塊は、存在する場合、原発腫瘍塊のことがある。原発性腫瘍塊とは、その組織の正常細胞の形質転換により生じる組織中の癌細胞の成長物をさす。多くの場合、原発性腫瘍塊は、目視若しくは触診法を通じて、又は組織の形状の不規則性、質感、若しくは重量により発見され得る嚢腫の存在により識別される。しかしながら、いくつかの原発腫瘍は触知できず、Ｘ線（例えば、マンモグラフィー）又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）のような医学的画像化技術、又は針吸引によってのみ検出することができる。これら後者の技術の使用は、早期発見においてより一般的である。組織内の癌細胞の分子的及び表現型解析は、通常、癌が組織に内因性であるかどうか、又は病変が別の部位からの転移によるものかどうかを確認するために用いることができる。切除不能な腫瘍もある（例えば、転移巣の数のため、又は手術危険域にあるため、外科的に切除できない）。本発明の処置及び予後方法は、早期、中期、又は後期の疾患、及び急性又は慢性の疾患に利用することができる。
【００９５】
組成物及び処置
ＩＦＮβとＣＤ４０−Ｌの組み合わせのようなＩ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌの組み合わせを送達するために、又はＩＦＮβとＣＤ４０−Ｌの組み合わせのようなＩ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌの組み合わせをコードする核酸配列を送達して、本発明のＡＰＣ、特定のＤＣ、又は腫瘍溶解性ウイルスを生成するために、種々の方法が使用される。
【００９６】
本発明のＤＣ等のＡＰＣを生成する、Ｉ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌポリペプチドの組み合わせ、又はＩ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌの組み合わせをコードする１つ以上の核酸分子を送達するために利用される方法としては、これらに限られるものではないが、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、水疱性口内炎ウイルス、又は単純ヘルペスウイルス）、ナノ粒子、ネイキッド又はパックドタンパク質、遺伝子編集系（例えば、ＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）又はＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）／Ｃａｓ９系（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＮｅｍｕｄｒｙｉ  ＡＡら、Ａｃｔａ  Ｎａｔｕｒａｅ、２０１４年７月−９月６（３）：１９−４０を参照）、ＤＮＡ（ネイキッド又はパッケージド）、エレクトロポレーション、ソノポレーション、遺伝子銃、金又は他の金属粒子、マグネトフィケーション、ハイドロダイナミックデリバリー、ＤＮＡプラスミド、ｓｉｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、リポプレックス、リポタンパク質、ホーミングヌクレアーゼ、ポリマーソーム、ポリプレックス、トランスポゾン（例えば、睡眠美容トランスポゾン、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＩｖｉｃｓ  Ｚら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０１１、２２（９）：１０４３−１０５１参照）、デンドリマー、巨大分子、無機ナノ粒子、量子ドット、細胞浸透ペプチド（ペプチド形質導入ドメインとしても知られる）、例えば、ＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質、アンテナペディア形質導入ドメイン、トランスポータン、又はポリアルギニン（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＣｏｐｏｌｏｖｉｃｉ  ＤＭら、ＡＣＳ  Ｎａｎｏ、２０１４、８（３）：１９７２−１９９４；Ｗａｇｓｔａｆｆ  ＫＭら、Ｃｕｒｒ  Ｍｅｔｈ  Ｃｈｅｍ、２００６、１３（１２）：１３７１−８７及びＴｒａｂｕｌｏ  Ｓら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、２０１０、３：９６１−９９３参照）、ビロソーム、ハイブリダイズウイルス、バクテリオファージや遺伝子ターゲッティングが例示される。
【００９７】
ＤＣ等のＡＰＣを作製するための方法、他の腫瘍抗原を有するワクチン、及び癌免疫療法のためのそれらの使用は公知であり、そして本明細書中に記載されるＩ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌの組み合わせと共に使用される（例えば、の全体が参照により本明細書に組み込まれるＰａｌｕｃｋａ  Ｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１２，１２：２６５−２７７参照）。
【００９８】
ウイルス又は非ウイルス遺伝子送達方法を使用して、Ｉ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌの組み合わせをコードする１つ以上の核酸配列を用いて、ＤＣ等のＡＰＣのような細胞を形質導入する。
【００９９】
核酸配列を送達するために使用され得るウイルスベクターの例としては、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルス、レンチウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、及びワクシニアウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ＤＣ等のＡＰＣで使用される場合、ウイルスは典型的には複製欠損である。
【０１００】
遺伝子送達のための非ウイルス方法としては、ネイキッドＤＮＡ注射、無機粒子、合成又は天然の生分解性粒子、ならびに物理的な方法、例えば、針注射、バリスティックＤＮＡ注射、エレクトロポレーション、ソノポレーション、フォトポレーション、マグネトフェクトイン、及びヒドロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない。無機粒子の例としては、リン酸カルシウム、シリカ、金、及び磁性粒子が挙げられる。合成又は天然の生分解性粒子の例には、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（エチレンイミン４）（ＰＥＩ）、キトサン、デンドリマー、及びポリメタクリレート等のポリマーベース非ウイルスベクター、カチオン性リポソーム、カチオン性エマルジョン、及び固体脂質ナノ粒子等のカチオン性脂質ベース非ウイルスベクター、ならびにポリ−Ｌ−リジン等のペプチドベース非ウイルスベクターが含まれる。
【０１０１】
任意で、本発明のＤＣ等のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスは、１つ以上の他の薬剤と同時に又は連続して、対象に同時投与することができる。投与され得る抗癌剤としては表１及び３にリストしたものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
同時投与は、本明細書中に開示される１つ以上の化合物の前及び／又は後に投与される追加の薬剤と同時に（同じ又は別の処方で）又は連続的に行うことができる。
【０１０３】
このように、本発明のＤＣ等のＡＰＣは、腫瘍溶解性ウイルスを、個別に投与するか、又は医薬組成物として投与するかにかかわらず、種々の他の成分を含むことができる。関連する事情で使用することができる許容される成分又は助剤の例には、抗酸化剤、フリーラジカル捕捉剤、ペプチド、成長因子、抗生物質、静菌剤、免疫抑制剤、抗凝固剤、緩衝剤、抗炎症剤、抗血管新生剤、解熱剤、徐放性結着剤、麻酔剤、ステロイド、及びコルチコステロイドが含まれる。このような成分によって、さらなる治療的利益が得られ、ＤＣ等のＡＰＣの治療的作用に影響を及ぼすように作用し、化合物の投与の結果としてもたらされ得る潜在的な副作用を予防するように作用する。
【０１０４】
例えば、対象において、同じ又は個別の処方として、in vitro又はin vivoで標的細胞に同時投与され得るさらなる薬剤には、免疫調節薬のような、所与の生物学的応答を改変するものが含まれる。追加の薬剤は、例えば、小分子、ポリペプチド（タンパク質、ペプチド、又は抗体もしくは抗体断片）、又は核酸（ポリペプチド又は阻害核酸、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドや干渉ＲＮＡをコードする）であってもよい。例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン（α−インターフェロン及びβ−インターフェロン等）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、及び組織プラスミノーゲン活性化因子等のタンパク質を投与することができる。リンホカイン、インターロイキン（インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）等）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、その他の成長因子等の生物学的反応修飾物質を投与することができる。一実施形態において、本発明の方法及び組成物は、細胞毒性剤、化学療法剤、抗シグナル伝達剤、及び抗血管新生剤等の１つ又は複数の抗癌剤を組み込む。
【０１０５】
ある実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも１つの追加の抗癌剤（例えば、化学療法剤）を含む。本発明の方法のある実施形態において、少なくとも１つの追加の抗癌剤は、本発明の組成物と共に投与される。ある実施形態において、抗癌剤は、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤、三酸化ヒ素、ドキソルビシン又は他のアントラサイクリンＤＮＡインターカレート剤、及びエトポシド又は他のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤の中から選択される。
【０１０６】
ある実施形態において、組成物は、１つ以上のプロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、オートファジー阻害剤（例えば、クロロキン）、アルキル化剤（例えば、メルファラン、シクロホスファミド）、ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ９８５０９）、ＦＡＫ／ＰＹＫ２阻害剤（例えば、ＰＦ５６２２７１）、又はＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ）、又は前述の２つ以上の組合せを含むことができ、方法はそれらの投与を含む。
【０１０７】
従って、免疫療法剤は、個別に投与されるか、又は医薬組成物として投与されるかにかかわらず、添加剤として種々の他の成分を含む。関連する事情で使用することができる許容される成分又は補助剤の例には、抗酸化剤、フリーラジカル捕捉剤、ペプチド、成長因子、抗生物質、静菌剤、免疫抑制剤、抗凝固剤、緩衝剤、抗炎症剤、抗血管新生剤、解熱剤、徐放性結着剤、麻酔剤、ステロイド、及びコルチコステロイドが含まれる。このような成分は、さらなる治療的利益を与え、本発明の化合物の治療的作用に影響を及ぼすように作用し、又は化合物の投与の結果として、潜在的な副作用を予防するように作用する。免疫治療剤は、治療剤又は他の薬剤にコンジュゲートすることもできる。
【０１０８】
本明細書中で使用される場合、「免疫療法」という用語は、癌又は他の有害なタンパク質、細胞又は組織に対する適応免疫又は自然免疫（能動的又は受動的）を誘発又は増幅するための、対象の免疫系の刺激、誘導、破壊、模倣、増強、増加又は任意の他の調節を介する疾患の処置をいう。免疫療法（すなわち、免疫療法薬）には、癌ワクチン、免疫調節薬、モノクローナル抗体（例えば、ヒト化モノクローナル抗体）、免疫刺激薬、樹状細胞、及びウイルス療法が含まれ、これらは既存の癌の処置又は癌の発生を予防するように設計されているか、又は癌の再発の可能性を低下させるための補助療法で使用される。癌ワクチンの例には、ＧＶＡＸ、Ｓｔｉｍｕｖａｘ、ＤＣＶａｘ及び腫瘍及びＭＵＣ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ、ｐ５３等を含む他の抗原に対する免疫応答を誘発するように設計された他のワクチンが含まれる。免疫調節薬の例には、１ＭＴ、イピリムマブ、トレメリムマブ及び／又は腫瘍又は他の抗原に対する細胞毒性又は他のＴ細胞活性を脱抑制又は調節するように設計された任意の薬物が含まれ、これには遮断、アゴニスト又はアンタゴニストを介して、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ、Ｂ７−ＤＣ、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ２８、他のＴＣＲ、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＩＣＯＳ及びそれらの配位子を介してＴ−Ｒｅｇ細胞制御経路を調節する処置が含まれるが、これらに限定されない。免疫刺激剤の例は、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２）、インターフェロン等のサイトカイン、及びその他を含むが、これらに限定されない、ステロイド性又は非ステロイド性の、コルチコステロイド及び任意の他の抗−又はプロ−炎症剤を含む。樹状細胞（ＤＣ）療法の例には、ｍＲＮＡ、ファージディスプレイ、又はその他の修飾による、修飾樹状細胞及びその他の抗原提示細胞、自家又はゼノ、多数の抗原、全癌細胞、単一抗原による修飾が挙げられ、これらに限られるものではないが、抗原特異的Ｔ細胞免疫を誘導するためのex vivoで生成された抗原負荷樹状細胞（ＤＣ）、体液性免疫を誘導するためのex vivo遺伝子負荷ＤＣ、体液性免疫を誘導するためのex vivo遺伝子負荷ＤＣ、ex vivoで生成された抗原負荷ＤＣ、腫瘍特異的免疫を誘導するためのex vivoで生成された抗原負荷ＤＣ、これらに限定されないが、Ｐｒｏｖｅｎｇｅ及びその他を含む免疫寛容を誘導するためのex vivoで生成された未成熟ＤＣが含まれる。ウイルス療法の例には、抗腫瘍免疫を誘発するように設計された腫瘍溶解性ウイルス又はウイルス由来の遺伝その他材料、及びプロファージ系列における薬物のような腫瘍発生に関連する感染性ウイルスの阻害剤が含まれる。モノクローナル抗体の例としては、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、オゾガミシン、リツキシマブ、トラスツズマブ、ラジオイムノセラピー、イブリツモマブ、チウキセタン、トシツモマブ／ヨウ素トシツモマブレジメンが挙げられる。免疫療法は、単剤療法であってもよく、又は１つ以上の他の療法（１つ以上の他の免疫療法又は非免疫療法）と組み合わせて使用されてもよい。
【０１０９】
本発明細書で使用する「細胞毒性剤」という用語は、細胞の機能を阻止又は妨害、及び／又は細胞のin vitro又はin vivoでの破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、及びＬｕの放射性同位元素）、化学療法剤、細菌、真菌、植物又は動物起源の低分子毒素又は酵素活性毒素のような毒素、及び抗体（その断片及び／又は変異体を含む）を含むものである。
【０１１０】
本明細書で使用される「化学療法剤」という用語は、例えば、パクリタキセル及びドセタキセル等のタキサン、クロラムブシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェンを含む抗エストロゲン、ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン等の抗アンドロゲン等の、癌の処置に役立つ化学化合物である。本発明の化合物と組み合わせて使用される化学療法剤を含む抗癌剤の例を、表３にリストする。好ましい実施形態において、化学療法剤は、一種以上のアントラサイクリンである。アントラサイクリンは、化学療法薬の系列であり、抗生物質でもある。アントラサイクリンは、（１）ＤＮＡ小溝の塩基対にインターカレートすること、（２）ＤＮＡ中のリボースのフリーラジカル損傷を引き起こすことにより、ＤＮＡの構造を破壊し、その機能を終結させることによって細胞分裂を妨げるように作用する。アントラサイクリンは、白血病治療に使われることが多い。アントラサイクリンの例としては、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、及びイダルビシンが挙げられる。
【０１１１】
【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【０１１２】
本発明のＤＣ等のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスは、単離された薬剤として対象に投与することができるが、医薬組成物の一部としてこれらの細胞又はウイルスを投与することが好ましい。従って、本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と関連して、ＤＣ等のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物をさらに提供する。薬学的組成物は、経腸的、非経口的、静脈内、筋肉内、局所、皮下等、各種投与経路に合わせることができる。投与は、当業者が判断できるように、連続的又は特定の間隔でよい。
【０１１３】
本発明の方法に従って投与される組成物は、薬学的に有用な組成物を調製する公知の方法に従って処方できる。処方は当業者に周知であり容易に入手できる多くの情報源に記載されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｒｔｉｎ、Ｅ．Ｗ．、１９９５、Ｅａｓｔｏｎ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９版）には、本発明に関連して使用することができる処方が記載されている。投与に適した処方としては、例えば、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及びその処方に対象受容者の血液との等張性を与える溶質を含み得る水性無菌注射溶液や、懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の無菌懸濁物が挙げられる。処方は、単位ドーズ量又は複数回ドーズ量容器、例えば、密封されたアンプルやバイアルの中に入れたり、使用前に無菌溶液担体、例えば、注射用の水の状態のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即席の注射溶液及び懸濁物は、無菌粉末、顆粒、錠剤等から調製される。本発明の組成物は、上記の詳細に言及した成分に加えて、当該処方の類型に関連して当技術分野において慣用されるその他の薬剤を含むものとする。
【０１１４】
薬学的に許容される塩の例は、生理学的に許容される陰イオンを生じる酸と共に形成される有機酸付加塩、例えば、トシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、アルファ−ケトグルタル酸塩、及びアルファ−グリセロリン酸塩である。塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、及び炭酸塩を含む、好適な無機塩も形成できる。
【０１１５】
化合物の薬学的に許容される塩は、例えば、アミン等の十分に塩基性の化合物を好適な酸と反応させて生理学的に許容されるアニオンを与えることによって、当技術分野で周知の標準的な手順を用いて得ることができる。カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム又はリチウム）又はアルカリ土類金属（例えばカルシウム）塩も製造することができる。
【０１１６】
本発明の組成物、ＤＣ等のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルス、及び本発明の方法で使用される他の薬剤は、任意で、不活性希釈剤等の薬学的に受容可能な担体と組み合わせて、望ましくない細胞成長部位等、１つ以上の解剖学的部位（腫瘍部位、例えば、腫瘍に注射又は局所適用される））に局所的に投与される。本発明の組成物及び本発明の方法において使用される他の薬剤は、静脈内又は経口等、全身投与されてもよく、任意で、不活性希釈剤等の薬学的に許容される担体、又は経口送達のための同化可能な食用担体と組み合わせて投与されてもよい。これらは硬質又は軟質ゼラチンカプセルに内包されても、錠剤として圧縮されても、又は患者の食事用の食物に直接加えられてもよい。経口治療投与のために、薬剤は、１つ以上の賦形剤と組み合わせて、摂取可能な錠剤、口腔錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハ、エアロゾルスプレー等の形態で使用できる。
【０１１７】
錠剤、トローチ、丸剤、カプセル等はまた、トラガカントゴム、アカシア、トウモロコシデンブンやゼラチン等の結合剤、リン酸二カルシウム等の賦形剤、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、スクロース、フルクトース、ラクトースやアスパルテーム等の甘味剤を含んでもよく、ペパーミント、冬緑油、若しくはチェリーフレーバー等の着香剤が添加されてもよい。単位剤形がカプセル剤の場合、上記物質以外に、植物油又はポリエチレングリコール等の液体担体を含有していてもよい。種々のその他物質が、コーティングその他固形の単位剤形の物理形状を変えるために加えられる。例えば、錠剤、丸剤、又はカプセルは、ゼラチン、蝋、シェラック、又は糖等でコーティングされる。シロップ又はエリキシルは、活性化合物、甘味料としてのショ糖又はフルクトース、保存剤としてのメチル及びプロピルパラベン、着色料、ならびにチェリー又はオレンジフレーバーのような香味料を含有してよい。当然のことながら、任意の単位剤形の調製に使用される任意の材料は、その使用量で薬学的に許容されかつ実質的に非毒性でなければならない。さらに、組成物及び薬剤は、徐放性調製物及びデバイスに組み込まれてもよい。
【０１１８】
本発明の活性剤（例えば、ＤＣ等ＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルス）は、腫瘍（腫瘍内）又はリンパ節、例えば、対象の鼠径リンパ節、に投与することができる。本発明の活性剤はまた、注入又は注射によって、皮内、静脈内、又は腹腔内に投与され得る。ある実施形態において、ＤＣ等のＡＰＣは、対象の腋窩及び／又は鼠径リンパ節流域に流れ出る解剖学的部位等の皮内注射によって投与される。活性剤の溶液は水中で調製することができ、任意で非毒性界面活性剤と混合することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、それらの混合物、及び油において調製できる。保存及び使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために防腐剤を含むことができる。
【０１１９】
注射又は注入に適した薬学的投薬形態は、本発明のＤＣ等のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスを含む滅菌水溶液又は分散液又は滅菌粉末を含み、任意にリポソームに封入された滅菌注射又は注入可能溶液又は分散液の即席調製に適合されるものである。最終的な剤形は無菌、流動性で、製造及び貯蔵の条件下で安定なものでなければならない。液体坦体又は賦形剤は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、植物油、非毒性グリセリルエステル、及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は液体分散媒体である。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成により、分散液の場合には、必要とされる粒子サイズの維持により、又は界面活性剤の使用により維持することができる。任意で、微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってなされる。たいていの場合、等張剤、例えば、糖、緩衝剤又は塩化ナトリウムを含めるのが好ましい。注射可能な組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含有させることによって行われる。
【０１２０】
滅菌注射溶液は、ＤＣ等のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルス及び他の薬剤を、必要な量で、適切な溶媒中に、上記に列挙した種々の他の成分と共に組み込み、必要に応じて、続いて、濾過滅菌することによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それらは、活性成分の粉末プラス前の無菌濾過溶液に存在した追加の所望の成分を与える。
【０１２１】
局所投与のために、組成物及び薬剤は純粋な形態で、すなわち、それらが液体である場合に適用される。しかし、一般的に、皮膚科学的に許容される坦体と組み合わせた、固体又は液体である組成物としてそれらを皮膚に局所投与するのが望ましい。
【０１２２】
有用な固体担体としては、微細固体、例えば、タルク、粘土、微結晶セルロース、シリカ、アルミナ等が挙げられる。有用な液体担体としては、水、アルコール、グリセロール、又は水−アルコール／グリコールブレンドが挙げられ、任意で、非毒性界面活性剤の助けを借りて、ペプチドは、有効なレベルで溶解又は分散される。芳香剤及び追加の抗菌剤等の添加剤を添加して、所与の用途のための特性を最適化することができる。得られた液体組成物は、吸収性パッドから適用することができ、包帯及び他の包帯に含浸させるために使用することができ、例えば、ポンプ型又はエアゾール噴霧器を使用して患部に噴霧することができる。
【０１２３】
合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩及び脂肪酸エステル、脂肪アルコール、変性セルロース又は変性無機物等の増粘剤もまた、使用者の皮膚に直接適用するための展延性のペースト、ゲル、軟膏、せっけん等を形成するために、液体坦体と共に用いられる。ペプチドを皮膚に送達するために使用することができる有用な皮膚科学的組成物の例は、Ｊａｃｑｕｅｔら（米国特許第４，６０８，３９２号）、Ｇｅｒｉａ（米国特許第４，９９２，４７８号）、Ｓｍｉｔｈら（米国特許第４，５５９，１５７号）及びＷｏｌｔｚｍａｎ（米国特許第４，８２０，５０８号）に開示されている。
【０１２４】
本発明の薬学的組成物の有用なドーズ量は、動物モデルにおけるin vitro活性とin vivo活性を比較することにより決めることができる。マウス及び他の動物におけるヒトに対する有効ドーズ量の外挿のための方法は当該分野で公知である。例えば、米国特許第４，９３８，９４９号を参照のこと。
【０１２５】
従って、本発明は、任意で、薬学的に許容される担体と組み合わせて、ＤＣ等のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスを含む医薬組成物を含む。ある量のＤＣ等のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルスを含む、経口、局所又は非経口投与に適合された医薬組成物は、本発明の好ましい実施形態を構成する。本発明において、患者、特に、ヒトに投与されるドーズ量は致死的な毒性を伴わずに、そして好ましくは許容可能なレベルを超えない副作用又は罹患率で、妥当な時間枠にわたって患者に治療応答を達成するのに十分であるべきである。当業者であれば、ドーズ量が、対象の状態（健康状態）、対象の体重、併用する処置の種類、状況によっては処置の頻度、治療可能比、病理学的状態の重篤度及びステージを含む多種の要因に応じて異なることが認識されるはずである。有利には、ある実施形態において、本発明の化合物の投与が、対象における体重減少や毒性の明白な徴候につながるものではない。
【０１２６】
処置される障害や疾患の状態（例えば、骨髄腫等の悪性腫瘍）に応じて、適切なドーズ量は、標的細胞の急増や増殖を減少させたり、細胞死を誘導する量である。癌において、好適なドーズ量であると、悪性腫瘍のような癌組織において、ある濃度の活性物質となり、所望の応答を達成することが知られている。好ましいドーズ量は管理不能な副作用なしに、癌細胞増殖を最大限阻止する量である。ＤＣ等のＡＰＣ又は腫瘍溶解性ウイルス及び他の薬剤の投与は、当業者によって決定されるように、連続的であるか、又は特定の間隔である。
【０１２７】
所望の治療処置のためのこのようなドーズ量の投与を提供するために、ある実施形態において、本発明の医薬組成物は、担体又は希釈剤を含む全組成物の重量に基づいて、本発明の１つ以上の薬剤の合計の約０．１重量％〜４５重量％、特に１重量％〜１５重量％を含む。具体的には、動物重量（体重）１ｋｇあたりに投与される活性成分のドーズ量レベルは、静脈内０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、皮下０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、筋内０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、経口０．０１〜約２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１〜１００ｍｇ／ｋｇ、鼻腔内滴下０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ及びエアゾール０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇである。
【０１２８】
ＤＣ等のＡＰＣの調製
ＡＰＣは、効果的な免疫応答を誘発するのに重要である。ＡＰＣは、抗原特異的受容体をもつＴ細胞に抗原を提示するだけでなく、Ｔ細胞の活性化に必要なシグナルを提供する。このようなシグナルは完全には定義されていないが、種々の細胞表面分子及びサイトカイン又は成長因子を含むことが知られている。ナイーブ又は無感作Ｔ細胞の活性化に必要な因子は、以前の感作メモリーＴ細胞の再活性化に必要な因子とは異なる可能性がある。単球及びＢ細胞は、コンピテントＡＰＣであることが示されているが、それらの抗原提示能は、以前の感作Ｔ細胞の再活性化に限定されるようである。従って、これらは、機能的にナイーブ又は無感作Ｔ細胞集団を直接活性化することはできない。一方、ＤＣは、ナイーブと以前に無感作のＴ細胞の両方を活性化することができる。
【０１２９】
ＤＣは、特有の形態及び血液を含む広範な組織分布を有する。樹状細胞の細胞表面は、通常とは異なり、特徴的なベール状の突起がある。成熟樹状細胞は、一般に、ＣＤ３−、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１９−、ＣＤ８３＋、ＣＤ８６＋及びＨＬＡ−ＤＲ＋として同定される。
【０１３０】
ＤＣは、抗原を処理して提示し、ナイーブ及び無感作Ｔ細胞及びメモリーＴ細胞からの応答を刺激する。特に、ＤＣは、ＭＨＣ制限Ｔ細胞を感作する能力が高く、Ｔ細胞への抗原提示、Ｔ細胞発現や免疫寛容時の自己抗原、免疫応答時の外来抗原のいずれにも非常に有効である。ＤＣは、抗原提示における役割に加えて、非リンパ組織とも直接的にコミュニケートし、傷害シグナル（例えば、虚血、感染、又は炎症）又は腫瘍増殖について非リンパ組織を調べる。一旦シグナルが伝達されると、ＤＣはリンパ球及び単球の活性を刺激するサイトカインを放出することによって免疫応答を開始する。
【０１３１】
抗原提示におけるそれらの有効性のために、ＤＣは、in vivoとex vivoの両方で、免疫刺激剤として使用される。しかしながら、免疫刺激剤としての単離されたＤＣの使用は、末梢血中のＤＣの頻度が低く、従来の方法によって単離されたＤＣの純度が低いために制限されてきた。特に、ヒト末梢血中のＤＣの頻度は、白血球の約０．１％と推定されている。同様に、他の組織、例えば、リンパ器官、からのＤＣのアクセシビリティは限られている。ＤＣが低頻度であると、ＤＣ前駆体に富む細胞集団を単離し、これらの前駆体をex vivo又はin vitroで培養して、未成熟又は成熟ＤＣの富化集団を得ることに関心が集まる。ＤＣ前駆体の特性の定義は尚不完全であるため、ＤＣ前駆体を単離するために典型的に使用される方法は、所望の前駆体の精製画分とはならず、一般に、ＤＣ前駆体に富む白血球の混合集団を生成する。いくつかの細胞型は、ＤＣ前駆体として機能する可能性を有すると認識されている。血液由来ＣＤ１４＋単球、特に、増殖因子顆粒球−単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の受容体をその表層に発現する単球は、既知のＤＣ前駆体である。他の血液由来ＤＣ前駆体は、最初に、単球及び他の「非樹状細胞前駆体」（例えば、米国特許第５，９９４，１２６号及び第５，８５１，７５６号を参照のこと）を除去することによって単離することができる。他の公知のＤＣ前駆体には、ＣＤ３４細胞表面マーカーを発現する骨髄由来細胞が含まれる。
【０１３２】
ＤＣ前駆体に富んだ細胞集団は、種々の方法によって得られており、本発明で利用され、例えば、密度勾配分離、蛍光活性化細胞選別、免疫学的細胞分離技術、例えば、パニング、補体溶解、ロゼッティング、磁気細胞分離技術、ナイロンウール分離、及びこのような方法の組み合わせである（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、例えば、Ｏ'Ｄｏｈｅｒｔｙら、ＪＥｘｐＭｅｄ．１７８：１０６７−７６（１９９３）；Ｙｏｕｎｇ及びＳｔｅｉｎｍａｎ、ＪＥｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：１３１５−３２（１９９０）、Ｆｒｅｕｄｅｎｔｈａｌ及びＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：７６９８−７０２（１９９０）、Ｍａｃａｔｏｎｉａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７：２８５−８９（１９８９）、Ｍａｒｋｏｗｉｃｚ及びＥｎｇｌｅｍａｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：９５５−６１（１９９０）を参照のこと）。ＤＣを免疫選択するための方法は、例えば、樹状細胞前駆体に関連する細胞表面マーカーに対する抗体、例えば、基質に結合した抗ＣＤ３４及び／又は抗ＣＤ１４抗体、を使用することを含む（例えば、Ｂｅｒｎｈａｒｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：１０９９−１０４（１９９５）、Ｃａｕｘら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：２５８−６１（１９９２）を参照のこと）。
【０１３３】
１つの典型的な例示的方法において、白血球は、白血球除去手順によって単離される。ＤＣ及び／又はＤＣ前駆体を含有すると考えられる細胞画分を濃縮するために、さらなる精製のための追加の方法が典型的に用いられる。同様に、分画遠心分離（例えば、バフィーコートの単離）、特定の細胞表面タンパク質に特異的なモノクローナル抗体でのパニング（例えば、正負選択）、及び濾過のような方法はまた、ＤＣ前駆体を含む白血球の粗混合物を生成する。
【０１３４】
増殖ＤＣ前駆体を単離するための他の報告された方法は、接着性単球及び他の「非樹状細胞前駆体」を選択的に除去するために、商業的に処理されたプラスチック基質（例えば、ビーズ又は磁気ビーズ）を使用することである（例えば、米国特許第５，９９４，１２６号及び第５，８５１，７５６号を参照のこと）。接着性単球及び非ＤＣ前駆体は廃棄されるが、非接着性細胞はex vivo培養及び成熟のために保持される。別の方法では、アフェレーシス細胞をプラスチック培養バッグ中で培養し、これにプラスチック、すなわちポリスチレン又はスチレン、マイクロキャリアビーズを添加して、バッグの表面積を増加させた。細胞がビーズに付着するのに十分な時間、細胞を培養し、非付着細胞をバッグから洗浄した（参照により本明細書に組み込まれるＭａｆｆｅｉら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４０：１４１９−１４２０（２０００）、ＷＯ第０２／４４３３８号）。
【０１３５】
ＤＣ前駆体について濃縮された細胞集団を調製するための報告された方法の実質的に全てに続いて、ＤＣ前駆体の分化又は維持及び／又はＤＣの増殖のために、典型的にはex vivo又はin vitroで細胞集団を培養する。簡単に述べると、単球ＤＣ前駆体のex vivo分化には、サイトカイン等の細胞成長因子の組み合わせの存在下でＤＣ前駆体を濃縮した混合細胞集団を培養することが含まれている。例えば、単球性ＤＣ前駆体は、抗原の取り込み、処理、及び／又は提示のために最適な状態に細胞を分化させるために、例えば、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）等のいずれかから選択される少なくとも１つの他のサイトカインと組み合わせて、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を必要とする。単球及び他の非ＤＣ前駆細胞の除去（プラスチック面への吸着）又はＣＤ３４＋細胞の選択によって得られるような、非単球ＤＣ前駆体からのＤＣの数もまた、特定のサイトカインの存在下での培養によって増えている。ＧＭ−ＣＳＦ単独又はＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４の組合せのいずれかが、治療的使用のために、かかる増殖ＤＣ前駆体からＤＣ集団を産生する方法において使用されてきた。
【０１３６】
しかしながら、このようなex vivo分化、維持及び／又は増殖の有効性は、ＤＣ及びＤＣ前駆体に富む出発集団の質によって制限されてきた。ある培養条件下では、好中球、マクロファージ及びリンパ球、又はそれらの組み合わせで重度に汚染されたＤＣ及びＤＣ前駆体の集団は、後者の細胞によって追い抜かれ、ＤＣの収量が劣る。多数の好中球、マクロファージ及びリンパ球、又はそれらの組み合わせを含むＤＣの培養は、免疫刺激調製物としての使用にあまり適していない。
【０１３７】
ＤＣ等のＡＰＣは、ボーラス注射、連続注入、インプラントからの持続放出、又は業界で公知の他の適切な技術によって、免疫応答を刺激するために、対象に投与される。ＤＣ等のＡＰＣはまた、生理学的に許容される担体、賦形剤、緩衝剤及び／又は希釈剤と同時投与することができる。さらに、ＤＣ等のＡＰＣを用いて、当業者に周知の方法を用いてex vivoでＴ細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化することができる。これらの組成物はそれ自体で、又は他の治療（例えば、外科的切除、化学療法、放射線療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−発現Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）、及びそれらの組み合わせ）、ならびに処置される状態に適した他の治療様式に対するアジュバントとして使用される。
【０１３８】
定義
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」及び「実質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、それらの標準的な意味に従って定義される。これらの用語は各用語に関連する特定の意味をつけるために、本出願を通じて互いに代替されてもよい。
【０１３９】
「単離された」又は「生物学的に純粋である」という用語は、その天然の状態で見出されるような材料に通常付随する成分を実質的に又は本質的に含まない材料を指す。従って、本発明による化合物は、好ましくはそのin situ環境においてペプチドと通常関連する材料を含まない。
【０１４０】
本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は文脈が明らかに沿わないと指示されない限り、複数の参照を含み、従って、例えば、「化合物」には、２つ以上のそのような化合物が含まれ、「細胞」には、２つ以上のそのような細胞が含まれる、等である。
【０１４１】
本明細書中で使用される、「腫瘍溶解性ウイルス」という用語は、以下の作用機序の１つ又は両方を有する癌治療用ウイルスの部類を意味する。１）直接的な腫瘍溶解をもたらす腫瘍細胞における選択的ウイルス複製を介した腫瘍細胞殺傷、及び２）破壊された腫瘍細胞から抗原を放出することによる全身性抗腫瘍免疫の誘導。
【０１４２】
本発明の実施は、特に断りのない限り、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、電気生理学、及び薬理学の従来の技術を使用することができ、これらは当業者の技術の範囲内である。このような技術は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる文献に十分に説明されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ及びＩＩ巻（ＤＮＧｌｏｖｅｒ編１９８５）；Ｐｅｒｂａｌ、Ｂ．、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；シリーズ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＳＣｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  ＮＫａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓら編、１９８４）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（ＪＨＭｉｌｌｅｒら編（１９８７）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）；Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）；及びＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら編（１９９１）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと）。
【０１４３】
ＩＦＮβとＣＤ４０−Ｌの組み合わせのような外因性Ｉ型ＩＦＮと外因性ＣＤ４０−Ｌの組み合わせを含むＤＣ等のＡＰＣにおいて、Ｉ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌは、Ｉ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌをコードする異種遺伝子、すなわちＤＣ等のＡＰＣ内の自然発生遺伝子以外の遺伝子を含む１つ以上の異種核酸配列を介して発現する。Ｉ型ＩＦＮ及びＣＤ４０−Ｌをコードする異種遺伝子は、ＤＣ等のＡＰＣに存在する天然に存在する対応する遺伝子と同じ配列を有していてもよい。異種遺伝子はＤＣ等のＡＰＣ中に存在する対応する天然に存在する遺伝子と比較して、異なる配列を有する。異種遺伝子は、同じ又は異なるＩ型ＩＦＮ、及び／又はＤＣ等のＡＰＣ中の対応する天然に存在する遺伝子によってコードされるものとは同じ又は異なるＣＤ４０−Ｌをコードする。
【０１４４】
ＣＤ４０−Ｌの「開裂部位」という用語は、マトリックスメタロプロテアーゼ等のプロテアーゼによって認識されるアミノ酸の配列を意味する。プロテアーゼはＣＤ４０−Ｌが発現している細胞の表面からＣＤ４０−Ｌを開裂する。ＣＤ４０−Ｌの開裂部位は、典型的にはＣＤ４０−ＬのドメインＩＩＩ及びＩＶの境界又はその周囲に見出される。１つのこのような開裂部位は、配列番号６の各種アミノ酸１０８〜１１６の略間の領域に位置する。
【０１４５】
開裂されにくいＣＤ４０−Ｌは、天然のヒトＣＤ４０−Ｌのものと比較して、キメラＣＤ４０−Ｌのタンパク質分解開裂に対してより高い耐性があることを意味する。キメラＣＤ４０−Ｌの開裂に対する感受性は、典型的には、一定期間にわたって与えられた数の細胞によって生成される可溶性ＣＤ４０−Ｌの量によって測定される。本発明のキメラＣＤ４０−Ｌは、天然ＣＤ４０−Ｌの速度より少なくとも９０％低いレートで開裂される。
【０１４６】
「配列同一性」という用語は、２つのアミノ酸配列間又は等しい長さの２つの核酸配列間の相同性の程度の定量的尺度を示す。比較されるべき２つの配列が等しい長さでない場合、それらは、可能な限り最良のフィット性を与えるように整列されなければならず、ギャップの挿入、又は代わりに、ポリペプチド配列又はヌクレオチド配列の末端での切断を可能にする。
【０１４７】
ヌクレオチド配列に関する本発明の全ての実施形態に関して、１つ以上の配列間の配列同一性のパーセンテージはまた、デフォルト設定で、ｃｌｕｓｔａｌＷソフトウェア（world-wide website: ebi.ac.uk/clustalW/index.htmlを参照のこと）のような任意の適切なソフトウェアを使用するアラインメントに基づいて得ることもできる。ヌクレオチド配列アラインメントについては、設定は、Alignment = 3Dfull、Gap Open 10.00、Gap Ext.0.20, Gap separation Dist.4, DNA weight matrix: identity (IUB)である。あるいは、ヌクレオチド配列は、DNASIS Maxのような任意の適切なソフトウェアを使用して分析され、配列の比較はworld-wide website:paralicin.orci/で行われる。このサービスは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（ＳＷ）及びＰａｒＡｌｉｇｎと呼ばれる２つの比較アルゴリズムに基づいている。最初のアルゴリズムは、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）によって公表され、２つの配列の最適な局所的アラインメントを見出すのに十分に確立された方法である。もう一方のアルゴリズム、ＰａｒＡｌｉｇｎは、配列アラインメントのための発見的な方法であり、この方法の詳細は、Ｒｏｇｎｅｓ（２００１）に公開されている。スコアマトリックス及びギャップペナルティならびにＥ値のデフォルト設定を使用した。
【０１４８】
相補的配列に言及する場合、Ｇ対Ｃ及びＵ、Ａ対Ｔ及びＵの塩基対形成規則を適用することができる。「核酸配列」及び「ポリヌクレオチド配列」は、本発明において区別なく、用いられる用語である。
【０１４９】
「ベクター」という用語は、組換え遺伝物質を宿主細胞に移入する媒体として用いられるＤＮＡ分子を指し、４つの主要なタイプのベクターは、プラスミド、バクテリオファージその他のウイルス、コスミド、人工染色体である。ベクター自体は、概して、挿入断片（異種核酸配列、導入遺伝子）とベクターの「骨格」となるより大きな配列からなるＤＮＡ又はＲＮＡ配列である。遺伝情報を宿主に伝達するベクターの目的は、典型的には、標的細胞中の挿入物を単離、増殖、又は発現することである。発現ベクター（発現構築物）と呼ばれるベクターは、標的細胞における異種配列の発現に特に適合され、そして、概して、異種配列の発現を駆動するプロモーター配列を有する。転写ベクターとよばれる単純なベクターは、転写されるだけで翻訳されることはない。すなわち、発現ベクターと違って、標的細胞では複製できるが、発現されない。転写ベクターを用いて、挿入された異種配列を増幅する。その後、転写物を単離し、in vitro翻訳システムに適したテンプレートとして使用することができる。本発明の実施形態において使用されるベクターの選択は、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドをコードするベクターの特定の用途による。ある実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。他の実施形態において、ベクターは非ウイルスベクターである。
【０１５０】
「作用可能に連結された」という用語は、遺伝子又はオープンリーディングフレーム（例えば、ＩＦＮβをコードする）等の機能単位の一部であるエレメントの連結を指す。従って、ＩＦＮβをコードする核酸配列にプロモーターを作用可能に連結することによって、２つのエレメントは、遺伝子の機能単位の一部となる。発現制御配列（プロモーター）の核酸配列への連結は、プロモーターによって指向される核酸配列の転写を可能にする。発現制御配列は、発現構築物により、ＩＦＮβ又はＣＤ４０−Ｌをコードする核酸配列に連結される。例えば、ＩＦＮβ及びＣＤ４０−Ｌをコードする核酸配列は両方とも、同じ発現制御、すなわち、発現制御の単一コピーの制御下にある。あるいは、ＩＦＮβ及びＣＤ４０−Ｌをコードする核酸配列の各々が、個別の発現制御下、すなわち、発現制御配列の第１のコピーは発現ＩＦＮβを制御し、発現制御配列の第２のコピーはＣＤ４０−Ｌの発現を制御する。ある実施形態において、第１の発現制御配列は発現ＩＦＮβを制御し、第２の発現制御配列はＣＤ４０−Ｌの発現を制御する、すなわち、２つの発現制御配列が互いに異なる。
【０１５１】
材料及び方法
樹状細胞生成及びペプチドプールローディング。ＤＣは、無血清ＸＶＩＶＯ−１５培地（ロンザ、アレンダレ、ニュージャージー州）中に７〜１１×１０６ＰＢＭＣ／ｍＬを懸濁し、続いて２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（コーニング、コーニング、ニューヨーク州）中で３時間培養することによって生成することができる。次いで、細胞をＰＢＳ中で２回洗浄して、非接着細胞を除去することができる。接着細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）のそれぞれ１０００単位／ｍｌを添加した無血清Ｘ−ＶＩＶＯ培地中で６日間培養することができる。次いで、ＤＣを収集し、洗浄し、そしてカウントする。１μｇ／ペプチド／ｍｌを補充した１００μｌのＸＶＩＶＯ−１５培地中で３７℃で１時間インキュベートすることによって、ＤＣに示されたペプチドプールをロードすることができる。
【０１５２】
樹状細胞形質導入。プラスチック接着生成に続いて、ＤＣを、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を添加した無血清ＸＶＩＶＯ−１５培地５００μＬに再懸濁し、ＩＦＮβ及びＣＤ４０−Ｌを発現するウイルスの２０，０００個のウイルス粒子／細胞を３７℃で２時間形質導入することができる（２５）。２時間後、２×１０５ＤＣ／ウェルを２４ウェルプレートに播種し、１．５ｍＬの完全培養培地（ＸＶＩＶＯ−１５＋１０％ヒト血清（ＳｅｒａＣａｒｅ）＋ペニシリン／ストレプトマイシン）をさらに２４時間補充した。
【０１５３】
本発明の実施形態の例には、これらに限定されないが、以下が含まれる：
実施形態１  外因性Ｉ型インターフェロン及び外因性ＣＤ４０−Ｌの組み合わせ、又は外因性Ｉ型ＩＦＮと外因性ＣＤ４０−Ｌの組み合わせをコードする１つ以上の異種核酸配列を含む、抗原提示細胞（ＡＰＣ）。
実施形態２  実施形態１に記載のＡＰＣであって、
ａ）前記Ｉ型ＩＦＮは、ヒトＩＦＮα（配列番号１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮα、ヒトＩＦＮβ（配列番号２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮβ、ヒトＩＦＮε（配列番号３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮε、ヒトＩＦＮκ（配列番号４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮκ、又はヒトＩＦＮω（配列番号５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮωであり、及び／又は
ｂ）前記ＣＤ４０−Ｌは、ヒトＣＤ４０−Ｌ（配列番号６）に対して少なくとも８０％の配列同一性、配列番号７〜１８から選択される配列を有するキメラＣＤ４０−Ｌに対して少なくとも８０％の配列同一性、又は配列番号１２の配列を有するキメラＣＤ４０−Ｌに対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、及び／又は
ｃ）前記Ｉ型ＩＦＮは、ヒトＩＦＮβ（配列番号２）に対して少なくとも８０の配列同一性を有するＩＦＮβであり、かつ、前記ＣＤ４０−Ｌは、配列番号１２の配列を有するキメラＣＤ４０−Ｌに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、ＡＰＣ。
実施形態３  実施形態１又は２に記載のＡＰＣであって、
Ｉ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌの組合せをコードする１つ以上の異種核酸配列は、１つ以上のウイルス構築物中にある、ＡＰＣ。
実施形態４  実施形態３に記載のＡＰＣであって、１つ以上のウイルス構築物の各々が、独立して、アデノウイルス構築物、アデノ随伴ウイルス構築物（ＡＡＶ）、ポックスウイルス構築物、レンチウイルス構築物、アルファウイルス構築物、ヘルペスウイルス構築物、レトロウイルス構築物、ワクシニアウイルス構築物、水疱性口内炎ウイルス構築物、又は単純ヘルペスウイルス構築物である、ＡＰＣ。
実施形態５  前記ＡＰＣは、ヒトＡＰＣである、前述の実施形態のいずれか１つに記載のＡＰＣ。
実施形態６  前記ＡＰＣがＤＣである、前述の実施形態のいずれか１つに記載のＡＰＣ。
実施形態７  前述の実施形態のいずれか１つに記載のＡＰＣと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
実施形態８  アジュバントをさらに含む、実施形態７に記載の組成物。
実施形態９  悪性腫瘍を処置する方法であって、該処置を必要とする対象に、前述の実施形態のいずれか１つに記載の有効量のＡＰＣを投与することを含む、悪性腫瘍を処置する方法。
実施形態１０  前記ＡＰＣは、自家細胞である実施形態９に記載の方法。
実施形態１１  前記方法は、１つ以上の追加の抗癌剤を対象に投与することをさらに含む、実施形態９又は１０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２  前記方法は、化学療法薬（例えば、メルファラン）、免疫調節薬、アジュバント、貧血薬（例えば、エリスロポエチン）、放射線療法、幹細胞移植、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−発現Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）、又は前述のもののうちの２つ以上の組み合わせを投与することをさらに含む、実施形態９〜１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３  前記ＡＰＣを投与する前に放射線療法を処方することを含む、実施形態９〜１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４  前記対象は、ヒトである、実施形態９〜１３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５  前記ＡＰＣは、皮内注射、腫瘍内注射、又は腫瘍内に流出するリンパ節への注射によって投与される、実施形態９〜１４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６  前記皮内注射は、前記対象の腋窩及び／又は鼠径リンパ節流域に流れ出る解剖学的部位にある、実施形態１５に記載の方法。
実施形態１７  前記ＡＰＣは、数日間にわたって複数回投与される、実施形態９〜１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８  前記方法は、前記対象に対して造血細胞移植（例えば、骨髄、末梢血、又は臍帯血からの造血幹細胞又は前駆細胞）を実施することをさらに含む、実施形態９〜１７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９  前記造血細胞移植は、自家である、実施形態１８記載の方法。
実施形態２０  前記ＡＰＣは、前記造血細胞移植の前後に投与される、実施形態１８又は１９に記載の方法。
実施形態２１  前記対象上で幹細胞動員（例えば、Ｇ−ＣＳＦを使用）を行い、自己造血細胞移植の前に前記対象から造血細胞を収集することをさらに含む、実施形態１８〜２０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２２  前記ＡＰＣを投与する前に、前記対象に投与される前記ＡＰＣの産生のために前記対象から前記ＡＰＣを収集することをさらに含む、実施形態９〜２１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２３  前記ＡＰＣは、前記投与の前に凍結保存される、実施形態２２に記載の方法。
実施形態２４  前記ＡＰＣの投与前、投与中、又は投与後に、化学療法剤（例えば、メルファラン）を投与することをさらに含む、実施形態９〜２３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２５  前記造血細胞移植中に化学療法剤（例えば、メルファラン）を投与することをさらに含む、実施形態２４に記載の方法。
実施形態２６  チェックポイント阻害剤を前記対象に投与することをさらに含む、実施形態９〜２４のいずれかに記載の方法。
実施形態２７  前記チェックポイント阻害剤は、細胞毒性Ｔ−白血球抗原４（ＣＴＬＡ４、ＣＤ１５２としても知られる）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１、ＣＤ２７９としても知られる）又はプログラム細胞死１配位子１（ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７４としても知られる）の阻害剤である、実施形態２６記載の方法。
実施形態２８  ＣＴＬＡ４の前記阻害剤は、ＣＴＬＡ４に結合する抗体であり、ＰＤ−１の前記阻害剤は、ＰＤ−１に結合する抗体であり、ＰＤ−Ｌ１の前記阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体である、実施形態２７に記載の方法。
実施形態２９  Ｉ型インターフェロンとＣＤ４０Ｌの組み合わせ、又はＩ型ＩＦＮとＣＤ４０−Ｌの組み合わせをコードする１つ以上の核酸配列を含む腫瘍溶解性ウイルス。
実施形態３０  実施形態２９に記載の腫瘍溶解性ウイルスであって、
ａ）前記Ｉ型ＩＦＮは、ヒトＩＦＮα（配列番号１）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮα、ヒトＩＦＮβ（配列番号２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮβ、ヒトＩＦＮε（配列番号３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮε、ヒトＩＦＮκ（配列番号４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮκ、又はヒトＩＦＮω（配列番号５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮω、及び／又は
ｂ）前記ＣＤ４０−Ｌは、ヒトＣＤ４０−Ｌ（配列番号６）に対して少なくとも８０％の配列同一性、又は配列番号７〜１８から選択される配列を有するキメラＣＤ４０−Ｌに対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、及び／又は
ｃ）前記Ｉ型ＩＦＮは、ヒトＩＦＮβ（配列番号２）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＩＦＮβであり、前記ＣＤ４０−Ｌは、配列番号１２の配列を有するキメラＣＤ４０−Ｌに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、腫瘍溶解性ウイルス。
実施形態３１  前記腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルス、レオウイルス、ヘルペスウイルス、ピコルナウイルス（例えば、コクサッキーウイルス、ポリオウイルス、及びセネカバレーウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹ウイルス及びニューカッスル病ウイルス）、パルボウイルス、ラブドウイルス（例えば、水疱性口内炎ウイルス）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、シンドビスウイルス、粘液腫ウイルス、マラバウイルス、インフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、アレナウイルス、ワクシニアウイルス、又はＥ１Ａデルタ−２４欠失、Ｅ１ｂ−５５Ｋ欠失、及びＥ３領域欠失を含む組換えアデノウイルスである、実施形態２９〜３０のいずれかに記載の腫瘍溶解性ウイルス。
実施形態３２  実施形態２９〜３１のいずれか１つに記載の腫瘍溶解性ウイルスと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
実施形態３３  アジュバントをさらに含む、実施形態３２に記載の組成物。
実施形態３４  悪性腫瘍を処置する方法であって、該処置を必要とする対象に、実施形態２９〜３１のいずれか１つの腫瘍溶解性ウイルス又は実施形態３１又は３２の組成物の有効量を投与することを含む、悪性腫瘍を処置する方法。
実施形態３５  前記方法は、１つ以上の追加の抗癌剤を前記対象に投与することをさらに含む、実施形態３４に記載の方法。
実施形態３６  前記方法は、化学療法薬（例えば、メルファラン）、免疫調節薬、アジュバント、貧血薬（例えば、エリスロポエチン）、放射線療法、幹細胞移植、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−発現Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）、又は前述のものの２つ以上の組み合わせを投与することをさらに含む、実施形態３５に記載の方法。
実施形態３７  前記対象は、ヒトである、実施形態３４〜３６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３８  前記腫瘍溶解性ウイルスは、数日間にわたって複数回投与される、実施形態３４〜３７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３９  前記腫瘍溶解性ウイルスは、皮内注射、腫瘍内注射、静脈内注射、又は腫瘍内に流出するリンパ節への注射によって投与される、実施形態３４〜３８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４０  前記皮内注射は、前記対象の腋窩及び／又は鼠径リンパ節流域に流れ出る解剖学的部位にある、実施形態３９に記載の方法。
実施形態４１  前記方法は、前記対象に対して造血細胞移植（例えば、骨髄、末梢血、又は臍帯血からの造血幹細胞又は前駆細胞）を実施することをさらに含む、実施形態３４〜４０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４２  前記造血細胞移植は、自家である、実施形態４１記載の方法。
実施形態４３  前記腫瘍溶解性ウイルスは、前記造血細胞移植の前後に投与される、実施形態４１又は４２に記載の方法。
実施形態４４  前記対象上で幹細胞動員（例えば、Ｇ−ＣＳＦを使用）を行い、自己造血細胞移植の前に前記対象から前記造血細胞を収集することをさらに含む、実施形態３４〜４３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４５  前記腫瘍溶解性ウイルスを投与する前、投与中、又は投与後に化学療法剤（例えば、メルファラン）を投与することをさらに含む、実施形態３４〜４４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４６  前記造血細胞移植中に化学療法剤（例えば、メルファラン）を投与することをさらに含む、実施形態４３〜４５のいずれかに記載の方法。
実施形態４７  チェックポイント阻害剤を前記対象に投与することをさらに含む、実施形態３４〜４６のいずれかに記載の方法。
実施形態４８  前記チェックポイント阻害剤は、細胞毒性Ｔ−白血球抗原４（ＣＴＬＡ４、ＣＤ１５２としても知られる）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１、ＣＤ２７９としても知られる）又はプログラム細胞死１配位子１（ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７４としても知られる）の阻害剤である、実施形態４７記載の方法。
実施形態４９  ＣＴＬＡ４の前記阻害剤は、ＣＴＬＡ４に結合する抗体であり、ＰＤ−１の前記阻害剤は、ＰＤ−１に結合する抗体であり、ＰＤ−Ｌ１の前記阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体である、実施形態４８に記載の方法。
【０１５４】
本明細書に言及又は引用した全特許、特許出願、仮出願、及び刊行物はそれらが本明細書の明白な開示と矛盾しない限り、その図面及び表を含む全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５５】
以下は、本発明を実施するための手順を例示する。これらの実施例は限定とはみなされない。全てのパーセンテージは重量で表示されており、全ての混合比率は特に注意がない限り体積比である。
【０１５６】
実施例１−二重発現カセットＭＥＭ４０及びＩＦＮβ腫瘍溶解性アデノウイルスの構築
ＣＭＶプロモーター、ＭＥＭ４０ヌクレオチド配列、及びポリアデニル化配列を含むＭＥＭ４０の発現カセットにより、腫瘍溶解性アデノウイルス５型を構築した。発現カセットを、２４ヌクレオチド欠失を含むアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子領域の上流に挿入した。さらに、ＳＶ４０プロモーター、ＩＦＮβヌクレオチド配列、及びポリアデニル化配列を含むＩＦＮβの第２の発現カセットを、アデノウイルスＥ３領域が欠失されたアデノウイルスゲノム位置に挿入した。アデノウイルスゲノムのＥ１ｂ  ５５ｋ領域も欠失している。図２は、ＣＤ４０−Ｌ及びＩＦＮβをコードする二重発現カセットを有する例示された腫瘍溶解性アデノウイルスの概略構成を示す。
【０１５７】
実施例２−単一発現カセットＭＥＭ４０及びＩＦＮβ腫瘍溶解性アデノウイルスの構築
腫瘍溶解性アデノウイルス５型を、ＣＭＶプロモーター、内部リボソーム侵入部位により分離されたＭＥＭ４０及びＩＦＮβヌクレオチド配列、ならびにポリアデニル化配列を含むＭＥＭ４０及びＩＦＮβの発現カセットで構築した。発現カセットを、２４ヌクレオチド欠失を含むアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子領域の上流に挿入した。アデノウイルスは、Ｅ３及びＥ１ｂ  ５５ｋ領域欠失を含む。図３は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により分離されたＣＤ４０−Ｌ及びＩＦＮβをコードする単一の発現カセットを有する例示された腫瘍溶解性ウイルスの概略構成を示す。
【０１５８】
実施例３−ＩＦＮβ及びＭＥＭ４０を発現するウイルスの腫瘍溶解活性
攻撃性Ｂ１６皮下メラノーマを有するマウスの腫瘍増殖に対するＩＦＮβ及びＭＥＭ４０発現の個別及び複合効果を試験した。ＩＦＮβを発現する樹状細胞（ＩＦＮβを発現するレンチウイルスにより形質導入された１０６細胞）及びＭＥＭ４０を発現する複製欠損アデノウイルス（Ａｄ−ＭＥＭ４０、１０１０ウイルス粒子）を、図４Ａに示すように腫瘍に注射した。重要なのは、いずれかの薬剤単独と比較して、組み合わせた処置は、腫瘍増殖を大幅に減少させたことである（図４Ａ）。図４Ｂに示すように、両剤による処置の後、攻撃的なＢ１６メラノーマ腫瘍細胞を移植したマウスは、実験終了時に全て生存していた。対照的に、Ａｄ−ＭＥＭ４０での処置後、Ｂ１６メラノーマ腫瘍細胞を移植したマウスのいずれも、実験終了時には生存していなかった。そしてＩＦＮβのみを発現するＤＣでの処置後、Ｂ１６メラノーマ腫瘍細胞を移植したマウスで、実験終了時に生存していたのは僅か１７％であった。
【０１５９】
ＭＥＭ４０及び／又はＩＦＮβを発現するアデノウイルス（Δ２４）について、様々な癌モデルにおける腫瘍溶解能を試験した。ＭＥＭ−１８８は、ＭＥＭ４０のみを発現するアデノウイルスΔ２４を指し、ＭＥＭ−２８８は、ＭＥＭ４０及びＩＦＮβの両方を発現するアデノウイルスΔ２４を指す。Ａ５４９肺腫瘍細胞において、ＭＥＭ−２８８は、対照ｏＡｄｖ及びＭＥＭ−１８８と比較して、それぞれ７倍及び１００倍高い腫瘍殺傷及び免疫活性化を示す。例えば、図５Ａは、ＭＥＭ−２８８のドーズ量を増加させたＡ５４９肺腫瘍細胞における感染が約５％という非常に低い細胞生存率になったことを示す。２６の多重感染（ＭＯＩ）のＬＤ５０がＭＥＭ−２８８で得られた。対照的に、ＭＥＭ−１８８のドーズ量を増加させたＡ５４９肺癌細胞における感染は、約１５％のいくらか高い細胞生存率及び１９４  ＭＯＩのはるかに高いＬＤ５０となった。対照ｏＡｄｖは、有意の細胞殺傷特性を示さなかった。これらの実験について、細胞生存率をルシフェラーゼ活性アッセイによって求めた。
【０１６０】
ＩＦＮβ  ＣＸＣＬ１０の下流標的を、ＭＥＭ−１８８、ＭＥＭ−２８８又は対照ｏＡｄｖによる４８時間感染後にｑＲＴ−ＰＣＲにより判断した（図５Ｂ）。図５Ｂは、ＭＥＭ−２８８による感染の約４８時間後に、インターフェロン誘導性ケモカイン及びＴ細胞活性化因子であるＣＸＣＬ１０の発現が、約２００〜３００倍増加したことを示す。対照ｏＡｄｖによる感染はそのような増加を示さず、ＭＥＭ−１８８による感染は約２〜３倍の中等度の増加を示した。
【０１６１】
図６Ａは、ＭＥＭ−２８８がいくつかの腫瘍型に対して広く活性であることを示す。異なった癌腫瘍種をＭＥＭ−２８８（青）又は対照ｏＡｄｖ（灰色）で感染し、４８時間後に細胞死を解析した。ＭＥＭ−２８８による感染は、対照ｏＡｄｖによる感染と比較して有意に高い細胞毒性をもたらした。
【０１６２】
肺アデノカルシノーマの最も一般的なオンコジェニック誘発型変形の例であるＫＲＡＳの変異型肺腫瘍（ＨＣＣ４４細胞株）を、増量したドーズ量のＭＥＭ−１８８及びＭＥＭ−２８８で感染させた。細胞生存率をクリスタルバイオレット染色（紫＝生存、クリア＝死滅）によって測定した。図６Ｂは、ＭＥＭ−１８８と比較して、ＭＥＭ−２８８がこの腫瘍細胞株を殺傷するのに約１００倍効果的であったことを示す。肺腫瘍細胞株を付加しても同様の結果であった（図１０）。
【０１６３】
異なる腫瘍細胞株におけるＭＥＭ４０及びＩＦＮβのin vitro発現を試験した。結果を図７に示す。細胞をＭＯＩ２５０で２日間ＭＥＭ−２８８に感染させた。ＭＥＭ４０発現を、ヒトＡ５４９肺癌株、マウス肺癌ＬＫＲ及び３４４株、ならびにマウスＢ１６−ＯＶＡメラノーマ細胞株における蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって判断し、一方、ＩＦＮβ発現は、ＥＬＩＳＡアッセイによって判断した。全ての細胞株は、ＭＥＭ４０の検出可能な細胞表面に発現し、培養上清へＩＦＮβが放出された。
【０１６４】
図８は、ヒト肺癌細株Ａ５４９において感染されたＭＥＭ−２８８の導入遺伝子発現及び複製の増強を示す。この実験では、Ａ５４９は、感染していない（Ａ）又はＭＥＭ−１８８（Ｂ−Ｄ）又はＭＥＭ−２８８（Ｅ−Ｇ）の示されたＭＯＩで感染していた。ＭＥＭ４０発現を、マウスＣＤ４０Ｌに対する抗体を使用するフローサイトメトリーによって検出した。ＭＥＭ４０発現は、示されたように異なるＭＯＩで両ウイルスの感染後２、４及び６日目に検出された。ＭＥＭ−１８８感染後のＭＥＭ４０発現は２日目に高かったが、６日目までに実質的に減少した（図８Ｂ）。対照的に、ＭＥＭ−２８８感染細胞は、４日目及び６日目に高いＭＥＭ４０発現を保持した（図８Ｅ）。１０のＭＯＩにおいて、ＭＥＭ４０発現はＭＥＭ−２８８（図８Ｆ）感染細胞において容易に検出されたが、ＭＥＭ−１８８感染細胞においては検出されなかった（図８Ｃ）。１のＭＯＩでのＭＥＭ−２８８感染後、ＭＥＭ４０は２日目、４日目、及び６日目に、それぞれ、低発現から高発現に一時的に増加した（図８Ｇ）。このような変化は、ＭＥＭ−１８８感染細胞では起こらなかった（図８Ｄ）。この結果は、ＭＥＭ−２８８がＭＥＭ−１８８に比べてかなり高い複製活性を有していることを示している。図８の結果からのＡ５４９細胞株におけるＭＥＭ−１８８又はＭＥＭ−２８８での感染後のＭＥＭ４０の発現をプロットし、図９に示す。
【０１６５】
ＭＥＭ−２８８の腫瘍溶解能を種々の肺癌細胞株で試験した。細胞を、異なるＭＯＩで３日間、ＭＥＭ−１８８又はＭＥＭ−２８８で感染させた。細胞生存率を、ＰＣ９、Ａ５４９、Ｈ２３、及びＨＣＣ４４細胞株における細胞計数アッセイ及びクリスタルバイオレットアッセイによって決定した。ＭＥＭ−２８８は、これらの細胞株の全てに対して１０及び１００のＭＯＩでより高い細胞殺傷能力を示す（図１０）。図１０に示す細胞株におけるＭＥＭ４０の発現を図１１に示す。細胞を、腫瘍溶解性ＭＥＭ−１８８又はＭＥＭ−２８８を用いて、あるいは用いずに、ＭＯＩ＝１００で３日間感染させ、その後、ＭＥＭ４０発現は、ＭＥＭ−２８８感染細胞において実質的に高いことが見出された。
【０１６６】
図１２は、ＭＥＭ−２８８による感染細胞及び非感染細胞の混合培養における細胞、そして、バイスタンダー非感染細胞がＰＤＬ１発現をアップレギュレートすることを示す。外因性ＩＦＮβを加えない限り、ＭＥＭ−１８８感染はバイスタンダー細胞におけるＰＤＬ１発現をアップレギュレートしなかった。従って、ＩＦＮβはＭＥＭ−２８８感染時にバイスタンダー非感染細胞のＰＤＬ１発現を増加させる。
【０１６７】
図１３は、ＭＥＭ−２８８、ならびにＭＥＭ４０及び／又はＩＦＮβを発現する腫瘍溶解性アデノウイルス（Δ２４）のウイルスベクターマップを示す。
【０１６８】
本明細書に記述の実施例及び態様は説明する目的に限られ、それに照らした様々な改変又は変更が、当業者に提案されるがそれらも本出願の趣旨及び範囲ならびに添付の請求の範囲の範囲に含まれると理解すべきである。さらに、本明細書に開示された任意の発明又はその実施形態の任意の要素又は制限は本明細書に開示された任意の及び／又は全ての他の要素又は制限（個別に又は任意の組み合わせで）又は任意の他の発明又はその実施形態と組み合わせることができ、全てのそのような組み合わせは、それに限定されることなく本発明の範囲で企図される。
【配列表フリーテキスト】
【０１６９】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ヒト野生型インターフェロンα（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ参照番号Ｐ０５０１４）のアミノ酸配列である。
ＭＡＬＳＦＳＬＬＭＡＶＬＶＬＳＹＫＳＩＣＳＬＧＣＤＬＰＱＴＨＳＬＧＮＲＲＡＬＩＬＬＡＱＭＧＲＩＳＨＦＳＣＬＫＤＲＨＤＦＧＦＰＥＥＥＦＤＧＨＱＦＱＫＡＱＡＩＳＶＬＨＥＭＩＱＱＴＦＮＬＦＳＴＥＤＳＳＡＡＷＥＱＳＬＬＥＫＦＳＴＥＬＹＱＱＬＮＤＬＥＡＣＶＩＱＥＶＧＶＥＥＴＰＬＭＮＥＤＳＩＬＡＶＲＫＹＦＱＲＩＴＬＹＬＴＥＫＫＹＳ  ＰＣＡＷＥＶＶＲＡＥ  ＩＭＲＳＬＳＦＳＴＮ  ＬＱＫＲＬＲＲＫＤ
配列番号２は、ヒト野生型インターフェロン−β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ参照番号Ｐ０１５７４）のアミノ酸配列である。
ＭＴＮＫＣＬＬＱＩＡＬＬＬＣＦＳＴＴＡＬＳＭＳＹＮＬＬＧＦＬＱＲＳＳＮＦＱＣＱＫＬＬＷＱＬＮＧＲＬＥＹＣＬＫＤＲＭＮＦＤＩＰＥＥＩＫＱＬＱＱＦＱＫＥＤＡＡＬＴＩＹＥＭＬＱＮＩＦＡＩＦＲＱＤＳＳＳＴＧＷＮＥＴＩＶＥＮＬＬＡＮＶＹＨＱＩＮＨＬＫＴＶＬＥＥＫＬＥＫＥＤＦＴＲＧＫＬＭＳＳＬＨＬＫＲＹＹＧＲＩＬＨＹＬＫＡＫＥＹＳＨＣＡＷＴＩＶＲＶＥＩＬＲＮＦＹＦＩＮＲＬＴＧＹＬＲＮ
配列番号３は、ヒト野生型インターフェロン−ε（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ参照番号Ｑ８６ＷＮ２）のアミノ酸配列である。
ＭＩＩＫＨＦＦＧＴＶＬＶＬＬＡＳＴＴＩＦＳＬＤＬＫＬＩＩＦＱＱＲＱＶＮＱＥＳＬＫＬＬＮＫＬＱＴＬＳＩＱＱＣＬＰＨＲＫＮＦＬＬＰＱＫＳＬＳＰＱＱＹＱＫＧＨＴＬＡＩＬＨＥＭＬＱＱＩＦＳＬＦＲＡＮＩＳＬＤＧＷＥＥＮＨＴＥＫＦＬＩＱＬＨＱＱＬＥＹＬＥＡＬＭＧＬＥＡＥＫＬＳＧＴＬＧＳＤＮＬＲＬＱＶＫＭＹＦＲＲＩＨＤＹＬＥＮＱＤＹＳＴＣＡＷＡＩＶＱＶＥＩＳＲＣＬＦＦＶＦＳＬＴＥＫＬＳＫＱＧＲＰＬＮＤＭＫＱＥＬＴＴＥＦＲＳＰＲ
配列番号４は、ヒト野生型インターフェロン−κ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ参照番号Ｑ９Ｐ０Ｗ０）のアミノ酸配列である。
ＭＳＴＫＰＤＭＩＱＫＣＬＷＬＥＩＬＭＧＩＦＩＡＧＴＬＳＬＤＣＮＬＬＮＶＨＬＲＲＶＴＷＱＮＬＲＨＬＳＳＭＳＮＳＦＰＶＥＣＬＲＥＮＩＡＦＥＬＰＱＥＦＬＱＹＴＱＰＭＫＲＤＩＫＫＡＦＹＥＭＳＬＱＡＦＮＩＦＳＱＨＴＦＫＹＷＫＥＲＨ  ＬＫＱＩＱＩＧＬＤＱＱＡＥＹＬＮＱＣＬＥＥＤＫＮＥＮＥＤＭＫＥＭＫＥＮＥＭＫＰＳＥＡＲＶＰＱＬＳＳＬＥＬＲＲＹＦＨＲＩＤＮＦＬＫＥＫＫＹＳＤＣＡＷＥＩＶＲＶＥＩＲＲＣＬＹＹＦＹＫＦＴＡＬＦＲＲＫ
配列番号５は、ヒト野生型インターフェロンω（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ参照番号Ｐ０５０００）のアミノ酸配列である。
ＭＡＬＬＦＰＬＬＡＡＬＶＭＴＳＹＳＰＶＧＳＬＧＣＤＬＰＱＮＨＧＬＬＳＲＮＴＬＶＬＬＨＱＭＲＲＩＳＰＦＬＣＬＫＤＲＲＤＦＲＦＰＱＥＭＶＫＧＳＱＬＱＫＡＨＶＭＳＶＬＨＥＭＬＱＱＩＦＳＬＦＨＴＥＲＳＳＡＡＷＮＭＴＬＬＤＱＬＨＴＧＬＨＱＱＬＱＨＬＥＴＣＬＬＱＶＶＧＥＧＥＳＡＧＡＩＳＳＰＡＬＴＬＲＲＹＦＱＧＩＲＶＹＬＫＥＫＫＹＳＤＣＡＷＥＶＶＲＭＥＩＭＫＳＬＦＬＳＴＮＭＱＥＲＬＲＳＫＤＲＤＬＧＳＳ
配列番号６は、ヒトＣＤ４０−Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ参照番号Ｐ２９９６５）のアミノ酸配列である。
ＭＩＥＴＹＮＱＴＳＰＲＳＡＡＴＧＬＰＩＳＭＫＩＦＭＹＬＬＴＶＦＬＩＴＱＭＩＧＳＡＬＦＡＶＹＬＨＲＲＬＤＫＩＥＤＥＲＮＬＨＥＤＦＶＦＭＫＴＩＱＲＣＮＴＧＥＲＳＬＳＬＬＮＣＥＥＩＫＳＱＦＥＧＦＶＫＤＩＭＬＮＫＥＥＴＫＫＥＮＳＦＥＭＱＫＧＤＱＮＰＱＩＡＡＨＶＩＳＥＡＳＳＫＴＴＳＶＬＱＷＡＥＫＧＹＹＴＭＳＮＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＡＳＬＣＬＫＳＰＧＲＦＥＲＩＬＬＲＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ
配列番号７〜１８は、キメラＣＤ４０−Ｌアミノ酸配列の例である。
配列番号１９〜２３は、キメラヒト／マウスＣＤ４０−Ｌをコードする核酸配列である。
配列番号２４は、キメラヒト／マウスＣＤ４０−Ｌ  ＭＥＭ４０をコードする核酸配列である。
配列番号２５〜３０は、キメラヒト／マウスＣＤ４０−Ｌをコードする核酸配列である。
【図１】
2021526842.tif 000016
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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