(57)【要約】細胞トランスフェクションのエレクトロポレーション装置及び方法を提供する。第１電極、第２電極及びエレクトロポレーションチャンバー内で規定された経路を含む、エレクトロポレーションチャンバーを有するエレクトロポレーション装置を用いて、細胞、例えば哺乳動物細胞及び非哺乳動物細胞をトランスフェクトするためのシステム及び方法が提供される。エレクトロポレーション装置は、細胞及びカーゴのエレクトロポレーションチャンバーへの通過を可能にする第１入力、並びにエレクトロポレーションチャンバーからのエレクトロポレートされた細胞の通過を可能にする第１出力を含む。
2021535738.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞にカーゴをエレクトロポレートする方法であって、
前記細胞を前記カーゴとともにエレクトロポレーションチャンバー内を流すことと、
複数の電気パルスを前記エレクトロポレーションチャンバー内の前記細胞に適用することと、
を含み、ここで前記エレクトロポレーションチャンバーが、
第１電極；
第２電極；
前記細胞及び前記カーゴの前記エレクトロポレーションチャンバーへの通過を可能にする第１入力；
前記エレクトロポレーションチャンバーからのエレクトロポレートされた細胞の通過を可能にする第１出力；及び
前記細胞及び前記カーゴが流れるための前記第１電極と前記第２電極との間のそこで規定された経路を有する流体チャネル領域
を含み、ここで前記細胞が、エレクトロポレーション培地に懸濁され、約１×１０６個の細胞／ｍｌ〜約５００×１０６個の細胞／ｍｌの細胞密度を有し；
ここで
（ｉ）各電気パルスが指数関数的な吐出波形又は方形波形の形態を有し；
（ｉｉ）前記複数の電気パルスが約０．３ｋＶ／ｃｍ〜約３ｋＶ／ｃｍの電界強度で適用され；
（ｉｉｉ）前記電界強度が約１５Ｖ〜約１００Ｖの電圧で適用され；
（ｉｖ）各電気パルス間の持続時間が約０．１秒〜約１０秒であり；且つ
（ｖ）各電気パルスが約１０μｓ〜約１０，０００μｓのパルス幅を有する、
方法。
【請求項２】
前記流れが段階的様式で実施され、ここで前記エレクトロポレーションチャンバーの総体積の約半分以上の流量が、前記エレクトロポレーションチャンバー内に、指定された時間間隔でポンピングされ、且つ前記細胞及び前記カーゴの流速が、約０．１ｍｌ／分〜約１５ｍｌ／分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、前記エレクトロポレーションチャンバー内の均一な又は実質的に均一な電界に曝露される、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数のパルスが、２パルス〜１０パルスである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、哺乳動物細胞又は非哺乳動物細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物細胞が、ＮＫ細胞、ＥＣ−７細胞、Ｔ細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞、樹状細胞、胚細胞、幹細胞、上皮細胞、リンパ球、マクロファージ、配偶子細胞、及び線維芽細胞からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＮＫ細胞が、ｈａＮＫ細胞、初代ＮＫ細胞、又は活性化ＮＫ細胞であり；前記Ｔ細胞が、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞であり；且つ前記幹細胞が、ＡＤ−ＭＳＣ細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記非哺乳動物細胞が、細菌細胞又は酵母細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記カーゴが、核酸である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸が、ＲＮＡ又はＤＮＡである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＥＣ−７細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞、樹状細胞、及び幹細胞であり；且つ
（ｉ）前記電界強度が約２０Ｖ〜約５０Ｖの電圧で適用され；
（ｉｉ）前記パルス幅が約２０μｓ〜約７００μｓであり；且つ
（ｉｉｉ）前記エレクトロポレーション培地中の前記細胞の細胞密度が約５×１０６個の細胞／ｍｌ〜約３００×１０６個の細胞／ｍｌである、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記カーゴが、ＤＮＡであり、且つ前記エレクトロポレートされた細胞が、ＥＣ−７細胞であり、少なくとも７０％の生存率及び少なくとも９０％の効率を伴う、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記カーゴが、ＤＮＡであり、且つ前記エレクトロポレートされた細胞が、ＣＨＯ−Ｓ細胞であり、少なくとも約７０％の生存率及び少なくとも約８５％の効率を伴う、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記カーゴが、ＲＮＡであり、且つ前記エレクトロポレートされた細胞が、Ｔ細胞であり、少なくとも約８０％の生存率及び少なくとも約９０％の効率を伴う、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記カーゴが、ＲＮＡ又はＤＮＡであり、且つ前記エレクトロポレートされた細胞が、ＮＫ細胞であり、少なくとも約８０％の生存率及び少なくとも約８０％の効率を伴う、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記カーゴが、ＲＮＡであり、且つ前記エレクトロポレートされた細胞が、樹状細胞であり、少なくとも約８０％の生存率及び少なくとも約８０％の効率を伴う、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記カーゴが、ＤＮＡであり、且つ前記エレクトロポレートされた細胞が、幹細胞であり、少なくとも約７０％の生存率及び少なくとも約８０％の効率を伴う、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記エレクトロポレーション培地が、１ｍＳ／ｍ〜約２０ｍＳ／ｍのコンダクタンス及び約５０ｍＯｓｍ／ｌ〜約３００ｍＯｓｍ／ｌの容積モル浸透圧濃度を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記エレクトロポレーション培地が、１つ以上の塩、単糖及び緩衝剤を含み、ここで前記塩が、金属ハロゲン化物塩、リン酸塩、金属硫酸塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１入力が、前記第１電極、前記第２電極、又は前記流体チャネル領域において存在し、且つ前記第１出力が、前記第１電極、前記第２電極、又は前記流体チャネル領域において存在する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１入力と前記第１出力の双方が、前記第１電極において存在するか、又は前記第１入力と前記第１出力の双方が、前記第２電極において存在する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記エレクトロポレーションチャンバーが、前記エレクトロポレーションチャンバーへの前記細胞及び前記カーゴの通過をさらに可能にする第１外部入力、並びに前記エレクトロポレーションチャンバーからの前記エレクトロポレートされた細胞の通過をさらに可能にする第１外部出力をさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１電極が、第１材料によって囲まれ、且つ前記第２電極が、第２材料によって囲まれる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１外部入力が、前記第１材料で存在し、且つ前記第１外部出力が、前記第２材料で存在するか、又は前記第１外部入力が、前記第２材料で存在し、且つ前記第１外部出力が、前記第１材料で存在する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１外部入力と前記第１外部出力の双方が、前記第１材料で存在するか、又は前記第１外部入力と前記第１外部出力の双方が、前記第２材料で存在する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記エレクトロポレーションチャンバーの幅が、約０．０１ｍｍ〜約１０ｍｍである、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記経路が、直線状、曲線状、分岐状、又はそれらの組み合わせである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記経路が、前記第１電極及び前記第２電極に対して水平である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記エレクトロポレーションチャンバー内の前記細胞が、前記エレクトロポレーションチャンバーの長さに沿う前記経路内を側方に流れる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１電極と前記第２電極の各々が、固体電極又はメッシュ電極である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１電極、前記第２電極、又は双方が、複数の固体金属プレートを含み、ここで各固体金属プレートが、独立した電界強度を適用するため、形成される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
細胞にカーゴをエレクトロポレートするための装置であって、
１つ以上のエレクトロポレーションチャンバーであって、各エレクトロポレーションチャンバーが
第１電極；
第２電極；
前記細胞及び前記カーゴの前記エレクトロポレーションチャンバーへの通過を可能にする第１入力；
前記エレクトロポレーションチャンバーからのエレクトロポレートされた細胞の通過を可能にする第１出力；及び
前記細胞及び前記カーゴが流れるための前記第１電極と前記第２電極との間のそこで規定された経路を有する流体チャネル領域
を含むエレクトロポレーションチャンバーを含む、装置。
【請求項３３】
前記第１入力が、前記第１電極、前記第２電極、又は前記流体チャネル領域において存在し、且つ前記第１出力が、前記第１電極、前記第２電極、又は前記流体チャネル領域において存在する、請求項３２に記載の装置。
【請求項３４】
前記第１入力と前記第１出力の双方が、前記第１電極において存在するか、又は前記第１入力と前記第１出力の双方が、前記第２電極において存在する、請求項３２に記載の装置。
【請求項３５】
前記エレクトロポレーションチャンバーが、前記細胞及び前記カーゴの前記エレクトロポレーションチャンバーへの通過をさらに可能にする第１外部入力、並びに前記エレクトロポレーションチャンバーからの前記エレクトロポレートされた細胞の通過をさらに可能にする第１外部出力をさらに含む、請求項３２〜３３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３６】
前記第１電極が、第１材料によって囲まれ、且つ前記第２電極が、第２材料によって囲まれる、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３７】
前記第１外部入力が、前記第１材料で存在し、且つ前記第１外部出力が、前記第２材料で存在するか、又は前記第１外部入力が、前記第２材料で存在し、且つ前記第１外部出力が、前記第１材料で存在する、請求項３６に記載の装置。
【請求項３８】
前記第１外部入力と前記第１外部出力の双方が、前記第１材料で存在するか、又は前記第１外部入力と前記第１外部出力の双方が、前記第２材料で存在する、請求項３６に記載の装置。
【請求項３９】
前記エレクトロポレーションチャンバーの幅が、約０．０１ｍｍ〜約１０ｍｍである、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４０】
前記第１電極と前記第２電極の各々が、ステンレス鋼、ポリイミド、貴金属、グループ４の金属、導電材料、又はシリコンから形成される、請求項３２〜３９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４１】
前記第１電極と前記第２電極の各々が、固体電極又はメッシュ電極である、請求項３２〜４０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４２】
前記第１電極、前記第２電極、又は双方が、複数の固体金属プレートを含み、ここで各固体金属プレートが、独立した電界強度を適用するため、形成される、請求項３２〜４１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４３】
前記経路が、直線状、曲線状、分岐状、又はそれらの組み合わせである、請求項３２〜４２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４４】
前記経路が、前記第１電極及び前記第２電極に対して水平である、請求項３２〜４３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４５】
前記エレクトロポレーションチャンバーの長さが、約５ｍｍ〜約１００ｍｍであり、且つ前記エレクトロポレーションチャンバーの高さが、約２００μｍ〜約１０００μｍである、請求項３２〜４４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４６】
２つ以上のエレクトロポレーションチャンバーが存在するとき、前記エレクトロポレーションチャンバーが順次接続される、請求項３２〜４５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４７】
前記エレクトロポレーションチャンバーの少なくとも１つに連結された電力供給を、前記エレクトロポレーションチャンバーの前記少なくとも１つに複数の電気パルスを提供するため、さらに含む、請求項３２〜４６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４８】
前記電力供給が、電力変換装置、及び前記電力変換装置と前記エレクトロポレーションチャンバーの前記少なくとも１つとの間に連結されたパルス回路を含む、請求項４７に記載の装置。
【請求項４９】
前記パルス回路が、少なくとも１つのスイッチング素子を含み、且つ前記装置が、前記エレクトロポレーションチャンバーの前記少なくとも１つ向けの、前記電力変換装置からのＤＣ電圧を前記電気パルスに変換するための前記少なくとも１つのスイッチング素子を制御するため、前記少なくとも１つのスイッチング素子に連結された制御回路をさらに含む、請求項４７に記載の装置。
【請求項５０】
前記制御回路が、前記エレクトロポレーションチャンバーの前記少なくとも１つ向けの、前記ＤＣ電力信号を電気パルスに変換するための前記少なくとも１つのスイッチング素子に対して制御信号を生成するために形成されたパルス発生器を含む、請求項４９に記載の装置。
【請求項５１】
前記電力供給が、１つ以上のスイッチング素子を含み、且つ前記制御回路が、前記１つ以上のスイッチング素子を制御するための前記電力供給に連結されたコントローラを含む、請求項４９又は５０に記載の装置。
【請求項５２】
（ｉ）各電気パルスが指数関数的な吐出波形又は方形波形の形態を有し；
（ｉｉ）前記複数の電気パルスが約０．３ｋＶ／ｃｍ〜約３ｋＶ／ｃｍの電界強度で適用され；
（ｉｉｉ）前記電界強度が約１５Ｖ〜約１００Ｖの電圧で適用され；
（ｉｖ）各電気パルス間の持続時間が約０．１秒〜約１０秒であり；且つ／又は
（ｖ）各電気パルスが約１０μｓ〜約１０，０００μｓのパルス幅を有する、
請求項４７〜５１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５３】
細胞トランスフェクション用のキットであって、
請求項３２〜４６のいずれか一項に記載の細胞をエレクトロポレートするための前記装置；
トランスフェクション対象の前記細胞及び前記カーゴを含有するための第１容器、
前記エレクトロポレートされた細胞を含有するための第２容器；
前記第１容器及び前記第２容器を、細胞をエレクトロポレートするための前記装置に流体接続するためのチューブ、並びに
任意選択的には、トランスフェクション対象の前記細胞、エレクトロポレーション培地、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される試薬
を含むキット。
【請求項５４】
前記第１容器及び前記チューブの第１部分を含む第１パッケージ；
細胞をエレクトロポレートするための前記装置及び前記チューブの第２部分を含む第２パッケージ；並びに
前記第２容器及び前記チューブの第３部分を含む第３パッケージ
をさらに含む、請求項５３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］  
関連出願の相互参照
本願は、２０１９年７月９日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４１０５５号から３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§３６５（ｃ）の下で優先権を主張し、その全内容は本明細書で参照により援用される。
【０００２】
発明の分野は、トランスフェクションシステム及び方法、特にエレクトロポレーションシステム及び方法に関する。
［背景技術］
背景説明は、本明細書に提示される方法及び技術を理解する場合に有用であるかもしれない情報を含む。本明細書に提供される情報のいずれかが先行技術であるか又は本明細書に提示される主題に関連すること又は明示的に若しくは暗示的に参照される任意の刊行物が先行技術であることは承認ではない。
【０００３】
核酸を細胞に導入し、遺伝子組換え細胞を作製するため、トランスフェクションが使用されることがある。細胞をトランスフェクトするため、光穿孔（ｏｐｔｏｐｅｒｆｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウムを利用するポリマーに基づく方法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ウイルス形質導入、及び脂質媒介法（例えば、リポソーム−ＤＮＡ複合体を使用する）を含む、様々な物理的、化学的及びウイルス的方法が存在する。
【０００４】
エレクトロポレーションは、制御された直流（ＤＣ）の電気パルスを細胞に比較的短い持続時間で適用することを含む。電気パルスは、細胞膜の規則正しい構造の可逆的分解を引き起こす膜電位を誘導し、膜中の孔の形成をもたらすと考えられる。次に、目的の分子は、典型的には数ミリ秒内〜数秒内、孔が閉じるまで、孔を通じて細胞に進入し得る。孔形成は、様々なパラメータ、特に、ギャップ幅（例えば平行電極プレート間の距離）、電気パルス波の形状、電界強度、温度、及び電気パルス長を調節することにより制御され得る。
【０００５】
エレクトロポレーションは、一般に実験室規模で（例えば、約０．５ｍＬの能力を有する小型キュベットを用いて）使用されるが、かかる実験室に基づく技術は、効率低下及び高コストであることから、大規模な臨床グレードの作製に適しない。他のトランスフェクション法、例えばリポフェクタミン２０００（商標）を用いる脂質に基づく技術もまた頻用されるが、高コストが理由で同様の欠点を有する。加えて、脂質に基づく方法は、臨床対象のいくつかの細胞型、例えばｈａＮＫなどのＮＫ細胞の場合、十分に機能しない。ＮＫ細胞は、例えば、初代ＮＫ細胞を遺伝的に操作することで、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ−非特許文献１を参照）を発現するか又は自己分泌成長刺激用サイトカイン（非特許文献２を参照）を発現するため、ｍＲＮＡ及びエレクトロポレーションを用いてトランスフェクトされている。大規模トランスフェクション（例えば１ｍＬより大きい反応サイズ）向けにＭａｘｃｙｔｅなどの市販品が存在する一方で、これら製品はまた、高価であり、且つ／又はハイスループット性能が欠如している。同様に、これらの市販品は、ＮＫ細胞をトランスフェクトするのに最適でなく、低い収率及び／又は低い細胞生存率に伴う問題をもたらすことが多い。典型的なエレクトロポレーション速度（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｒａｔｅｓ）は、約１０〜２０％の細胞生存率とともに、２〜５％のＤＮＡトランスフェクション効率をもたらすことがある。
【０００６】
通常の技術の場合、図１Ａに示される通り、エレクトロポレーションは、２つの平行プレート電極を用いて実施される。この配置では、細胞は、典型的には２つの平行プレート間を流れる。しかし、電界は不均一であり、（ａ）で示されるチャンバーの中央にある細胞は、より均一な電界を受ける一方で、（ｂ）で示される電極近傍の細胞は、不均一な電界を受け、特に電極の境界に生じる電場活動電位を受ける。他の技術では、図１Ｂに示される通り、マイクロメッシュ電極の平行プレートが利用され（非特許文献３）、ここで細胞は、上位マイクロメッシュ電極及び下位マイクロメッシュ電極を通過する。チャンバーの中央（ａ）及びチャンバーの境界近傍（ｂ）における細胞の類似軌道によって示される通り、この技術が２つの平行電極プレートの間を通過するよりも均一な電界を提供する一方で、チャンバーの幅又は上位マイクロメッシュ電極と下位マイクロメッシュ電極との間の距離は制限され、低いトランスフェクション効率をもたらす。図１Ａ及び図１Ｂで示される配置では、約１〜１．３ｋＶ／ｃｍ（例えば、平行プレートにおいて２００Ｖ／２ｍｍ、平行マイクロメッシュ電極において４０Ｖ／４００ｕｍ）の電界強度が利用される。
【０００７】
他の態様では、単細胞エレクトロポレーションチップがトランスフェクション向けに使用されている。この技術では、シリコンチップは、複数の線形チャネルを含んでもよく、各チャネルはチャネルの反対側に配置された対向電極を有する。細胞は、チャネルを通過し、電界に曝露される。このタイプの技術の場合、約７９％の細胞生存率とともに約６８％のＤＮＡトランスフェクション効率が達成されている。
［先行技術文献］
［特許文献］
［特許文献１］米国特許出願公開第２０１７／００３７３５７号明細書
［非特許文献］
［非特許文献１］Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ．（２００９）３３：１２５５−９
［非特許文献２］Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ（２００８）１０：２６５−７４
［非特許文献３］Ｓｅｌｍｅｃｚｉ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｌａｒｇｅ  ｖｏｌｕｍｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ  ｓｃａｌｅ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌｏｗ  ｉｎ  ａ  ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｈｉｐ，”Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，１３：３８３−３９２（２０１１）
［非特許文献４］Ｍｏｆｆｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０１７）８：３８９
［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
たとえ様々なトランスフェクションシステム及び方法が哺乳動物細胞用に存在するとはいえ、かかる技術は１つ以上の不利益を被る。したがって、特にハイスループットな大規模製造プロセス向けに、改善されたエレクトロポレーションシステム及び方法を提供することが依然として求められている。
［課題を解決するための手段］
本明細書に提示される技術は、細胞、例えば哺乳動物細胞及び非哺乳動物細胞のエレクトロポレーションのための、例えば大規模な連続製造プロセス向けの様々なデバイス、システム、及び方法を対象とする。特に、第１出力からオフセット距離だけ隔てられた第１入力を含むエレクトロポレーション装置を用いる、細胞のエレクトロポレーションのためのシステム及び方法は、高い効率及び生存率を提供し得る。
【０００８】
いくつかの態様では、細胞にカーゴをエレクトロポレートする方法が提供される。この方法は、細胞をカーゴとともにエレクトロポレーションチャンバーに流すことを含む。エレクトロポレーションチャンバーは、第１電極、第２電極、細胞及びカーゴのエレクトロポレーションチャンバーへの通過を可能にする第１入力、エレクトロポレーションチャンバーからのエレクトロポレートされた細胞の通過を可能にする第１出力、並びに細胞及びカーゴが流れるための第１電極と第２電極との間のそこで規定された経路を有する流体チャネル領域を含む。さらに、細胞は、エレクトロポレーション培地に懸濁され、約１×１０６個の細胞／ｍｌ〜約５００×１０６個の細胞／ｍｌの細胞密度を有してもよい。この方法は、複数の電気パルスをエレクトロポレーションチャンバー内の細胞に適用することをさらに含み、ここで（ｉ）各電気パルスは指数関数的な吐出波形又は方形波形を有し、（ｉｉ）複数の電気パルスは約０．３ｋＶ／ｃｍ〜約３ｋＶ／ｃｍの電界強度で適用され；（ｉｉｉ）電界強度は約１５Ｖ〜約１００Ｖの電圧で適用され；（ｉｖ）各電気パルス間の持続時間は約０．１秒〜約１０秒であり；且つ（ｖ）各電気パルスは約１０μｓ〜約１０，０００μｓのパルス幅を有する。
【０００９】
別の態様では、細胞にカーゴをエレクトロポレートするための装置が提供される。該装置は、１つ以上のエレクトロポレーションチャンバーを含む。各エレクトロポレーションチャンバーは、第１電極、第２電極、細胞及びカーゴのエレクトロポレーションチャンバーへの通過を可能にする第１入力、エレクトロポレーションチャンバーからのエレクトロポレートされた細胞の通過を可能にする第１出力、並びに細胞及びカーゴが流れるための第１電極と第２電極との間のそこで規定された経路を有する流体チャネル領域を含む。
【００１０】
別の態様では、細胞トランスフェクション用のキットが提供される。キットは、本明細書に記載のようなエレクトロポレーション用の装置、トランスフェクション対象の細胞及びカーゴを含有するための第１容器、エレクトロポレートされた細胞を含有するための第２容器、細胞をエレクトロポレートするための装置に第１容器及び第２容器を流体連絡するためのチューブ、並びに任意選択的には、試薬、例えばトランスフェクション対象の細胞、エレクトロポレーション培地、又はそれらの組み合わせを含む。
【００１１】
本明細書に記載の主題の様々な対象、特徴、態様及び利点は、数字が構成要素を表しているような添付の図面とともに、好ましい実施形態の以下の詳細な説明からより明白になるであろう。
［図面の簡単な説明］
［図１Ａ−１Ｂ］平行プレート電極（図１Ａ中に示される通り）及び入力と出力との間にオフセットを有しないマイクロメッシュ電極（図１Ｂ中に示される通り）を含む通常のエレクトロポレーション装置を示す。
【００１２】
［図２Ａ−２Ｂ］本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うエレクトロポレーション用の装置の態様を示す。
【００１３】
［図２Ｃ］本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う第１電極及び第２電極の態様を示す。
【００１４】
［図２Ｄ］本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う、本明細書に記載のようなエレクトロポレーション装置内での細胞に対して電気パルスを生成し、提供するための装置のブロック図である。
【００１５】
［図２Ｅ］本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う本明細書に記載のようなエレクトロポレーション装置内での細胞に対して電気パルスを生成し、提供するためのさらなる装置のブロック図である。
【００１６】
［図３Ａ−３Ｄ］本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う、エレクトロポレーション装置を含むエレクトロポレーション用の装置の態様を示す。図３Ａは、入力・出力チャンバーオフセットエレクトロポレーション装置の構造の図面を示す。図３Ｂは、入力・出力チャンバーオフセットエレクトロポレーション装置の電界の図面を示す。図３Ｃは、入力・出力チャンバーオフセットエレクトロポレーション装置を通じた細胞移動距離の関数としての電界強度を示す。図３Ｄは、本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うエレクトロポレーション装置の代替的配置を示す。
【００１７】
［図３Ｅ−３Ｇ］本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うエレクトロポレーションチャンバー内の経路の態様を示す。
【００１８】
［図３Ｈ−３Ｊ］本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うエレクトロポレーション装置の代替的配置を示す。
【００１９】
［図３Ｋ−３Ｌ］本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う、細胞を選別するためのマイクロ流体チャンバー例を図示する。
【００２０】
［図３Ｍ−３Ｓ］本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うマイクロ流体チャンバー内のポストの幾何学的形状及びポジショニングの様々な態様を示す図面である。
【００２１】
［図３Ｔ］本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う、緩衝液を変更するためのマイクロ流体チャンバー例を図示する。
【００２２】
［図３Ｕ］本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う、細胞選別用の１つのチャンバー及び緩衝液変更用のもう１つのチャンバーといった２つの分かれたチャンバーを有するマイクロ流体チャンバー例を図示する。
【００２３】
［図３Ｖ−３Ｗ］本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うエレクトロポレーション装置の代替的配置を示す。
【００２４】
［図３Ｘ］本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うエレクトロポレーション装置を含むエレクトロポレーションシステムのモジュラー配置を示す。
【００２５】
［図４］本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う、チャンバーオフセットエレクトロポレーション装置に関連するパラメータの表を示す。
【００２６】
［図５］本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う、チャンバーオフセットエレクトロポレーション装置を通流する細胞に適用されてもよい流体フロー波形（ポンプ）及び電気波形（刺激）の例を示す。
【００２７】
［図６］本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う、チャンバーオフセットエレクトロポレーション装置での使用に適した異なる材料で形成されたマイクロメッシュの様々な例を示す。
【００２８】
［図７Ａ−７Ｅ］本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、ｈａＮＫ細胞及び対応するパラメータにおけるエレクトロポレーション実験の結果を示す。
【００２９】
［図８Ａ−８Ｄ］本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、ｈａＮＫ細胞及び対応するパラメータにおけるエレクトロポレーション実験のさらなる結果を示す。
【００３０】
［図９Ａ−９Ｄ］本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、ＥＣ７細胞及び対応するパラメータにおけるエレクトロポレーション実験の結果を示す。
【００３１】
［図１０Ａ−１０Ｅ］本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、ＥＣ７細胞及び対応するパラメータにおけるエレクトロポレーション実験のさらなる結果を示す。
【００３２】
［図１１Ａ−１１Ｃ］エレクトロポレートされたＥＣ７細胞の顕微鏡画像を示す。
【００３３】
［図１２Ａ−１２Ｂ］本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、トランスフェクトされたＥＣ７細胞のさらなる結果を示す。
【００３４】
［図１３Ａ−１３Ｄ］本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、異なる細胞株における様々なトランスフェクション効率を示す。
【００３５】
［図１４Ａ−１４Ｅ］本明細書に記載のようなＰｂＡＥを使用する、ｍＲＮＡをＴ細胞に導入するためのトランスフェクション実験の結果を示す。
【００３６】
［図１５Ａ−１５Ｂ］本明細書に記載の通り、エレクトロポレーションの存在下及び不在下でのｍＲＮＡをＴ細胞に導入するためのトランスフェクション実験の結果を示す。
【００３７】
［図１６Ａ−１６Ｄ］本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤ−ＭＳＣ）及び対応するパラメータにおけるトランスフェクション実験の結果を示す。
［発明を実施するための形態］
細胞、例えば哺乳動物細胞（例えば、ＮＫ細胞、ＥＣ−７細胞、Ｔ細胞など）及び非哺乳動物細胞のエレクトロポレーションのためのシステム及び方法が、高い効率及び生存率を提供する対応するエレクトロポレーションプロトコルとともに提供される。いくつかの態様では、エレクトロポレーションプロトコルは、複数の電気パルス、段階的な流体フロー、低い伝導率及び低い容積モル浸透圧濃度のエレクトロポレーション緩衝液、比較的中程度の容量、並びに／又は比較的中程度の時定数を細胞に施すことを含む。
【００３８】
様々な態様では、哺乳動物細胞にカーゴをエレクトロポレートするための装置が提供される。該装置は、１つ以上のエレクトロポレーションチャンバー含み得、ここで各エレクトロポレーションチャンバーは、第１電極、第２電極、及び第１電極と第２電極との間のそこで規定された経路を有する流体チャネル領域を含む。第１電極と第２電極の各々は、固体電極又はメッシュ電極、例えばマイクロメッシュ電極であり得る。該装置はまた、細胞及びカーゴのエレクトロポレーションチャンバーへの通過を可能にする第１入力、及びエレクトロポレーションチャンバーからのエレクトロポレートされた細胞の通過を可能にする第１出力を含む。本明細書で用いられるとき、「エレクトロポレートされた細胞」は、トランスフェクト細胞、死細胞、及び非トランスフェクト細胞を含む。いくつかの実施形態では、第１入力と第１出力は、オフセット距離だけ隔てられ得る。第１電極は、第１材料によって囲まれ得、また第２電極は、第２材料によって囲まれ得、それらは同じであっても又は異なってもよい。
【００３９】
例えば、図２Ａは、エレクトロポレーション装置７００ａを含む、細胞にカーゴをエレクトロポレートするための例示的な装置を図示する。エレクトロポレーション装置７００ａは、例えばここで互いに直線上にあることが示される第１電極７４０（１）及び第２電極７４０（２）といった２つの電極を含むエレクトロポレーションチャンバー７２０を含む。エレクトロポレーション装置７００ａは、細胞及びカーゴのエレクトロポレーションチャンバー７２０への通過を可能にする第１入力７１０及びエレクトロポレーションチャンバー７２０からのエレクトロポレートされた細胞の通過を可能にする第１出力７３０をさらに含む。第１入力７１０と第１出力７３０は、エレクトロポレーションチャンバー７２０を通じた細胞の流れを側方に促進するため、オフセット距離（ｄ）だけ隔てられてもよい。流体チャネル領域７２５は、エレクトロポレーションチャンバー７２０内に存在し、流体チャネル領域７２５は、細胞及びカーゴが流れるための第１電極７４０（１）と第２電極７４０（２）との間のそこで規定された経路７３５を含む。図示されないが、経路７３５は、細胞及びカーゴの経路７３５への通過を可能にするための第１入力に対応する経路入口、並びに経路７３５からのエレクトロポレートされた細胞の通過を可能にするための第１出力７３０に対応する経路出口を有してもよい。
【００４０】
任意の実施形態では、第１入力は、第１電極、第２電極、又は流体チャネル領域に存在するか又は規定されてもよい。加えて、第１出力は、第１電極、第２電極、又は流体チャネル領域に存在するか又は規定されてもよい。第１入力と第１出力の双方は、第１電極又は第２電極のいずれかに存在し得る。例えば、図２Ａに示される通り、第１入力７１０と第１出力７３０の双方は、第２電極７４０（２）に存在する。或いは、第１入力は第１電極に存在してもよく、且つ第１出力は第２電極に存在してもよい、又は第１入力は第２電極に存在してもよく、且つ第１出力は第１電極に存在してもよい。本明細書では、流体チャネル領域の場合、第１入力、第１出力、又は双方が例えば流体チャネル領域の側壁に存在してもよいと考えられる。
【００４１】
図２Ｂにさらに図示される通り、エレクトロポレーション装置７００ｂ内で、第１電極７４０（１）の上位表面７０６は、第１材料７１５（１）によって囲まれるか又はそれに接続されてもよく、第２電極７４０（２）の下位表面７１１は、第２材料７１５（２）によって囲まれるか又はそれに接続されてもよい。例えば、第１材料及び第２材料は、エレクトロポレーション装置の内部チャンバー内、特に平行的な第１電極及び第２電極の間のエレクトロポレーションチャンバー内に細胞を含有するため、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）アクリル、ポリエチレン、ポリプロピレン、又はアクリルガラスなどの非多孔度質材料であってもよい。追加的に又は代替的に、エレクトロポレーション装置７００ｂは、細胞及びカーゴのエレクトロポレーションチャンバー７２０への通過をさらに可能にするための第１外部入力７５０、並びにエレクトロポレーションチャンバー７２０からのエレクトロポレートされた細胞の通過をさらに可能にするための第１外部出力７６０をさらに含んでもよい。第１外部入力は、第１材料で存在し得るか又は規定され得、且つ第１外部出力は、第２材料で存在し得るか又は規定され得る。或いは、第１外部入力は、第２材料で存在し得るか又は規定され得、且つ第１外部出力は、第１材料で存在し得るか又は規定され得る。さらなる実施形態では、第１外部入力と第１外部出力の双方は、第１材料又は第２材料で存在し得るか又は規定され得る。例えば、図２Ｂに図示される通り、第１外部入力７５０と第１外部出力７６０の双方は、第２材料７１５（２）で存在するか又は規定され、矢印はエレクトロポレーション装置を通る細胞及びカーゴの流れ方向及びエレクトロポレーション装置を出るエレクトロポレートされた細胞を示す。図２Ａ及び図２Ｂに示され、且つ符号のないその他の開口部又は孔は、当業者によって公知のように、エレクトロポレーション装置の様々な構成要素を、例えばスクリュー及び／又はプラグを介して接続するための開口部を表す。
【００４２】
第１電極と第２電極の各々は、固体電極、例えば固体プレート電極、又は多孔度を有するメッシュ電極、例えばマイクロメッシュ電極であってもよい。一実施形態では、第１電極と第２電極の双方は、固体電極、例えば固体プレート電極である。任意の実施形態では、第１電極、第２電極、又は双方が固体電極であるとき、第１電極、第２電極、又は双方は、複数又は一連の固体金属プレートを含む。例えば、図２Ｃに図示される通り、第１電極７４１（１）及び第２電極（７４１）（２）は、複数の固体金属プレート７４５を含む。各固体金属プレート７４５は、特定の電界パターンを作るように独立した電界を印加するために形成されてもよい。第１電極及び第２電極が形成されてもよい好適な材料として、限定はされないが、ステンレス鋼、ポリイミド、シリコン、貴金属、グループ４の金属、導電材料、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適な貴金属の例として、限定はされないが、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、パラジウム（Ｐｄ）、銀（Ａｇ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）、白金（Ｐｔ）、及び金（Ａｕ）が挙げられる。グループ４の金属の例として、チタン（Ｔｉ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、ハフニウム（Ｈｆ）及びラザホージウム（Ｒｆ）が挙げられる。好適な導電材料の例として、限定はされないが、酸化インジウム錫（ＩＴＯ）、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及び導電性ポリマー、例えばポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）ポリスチレンスルホン酸（ＰＥＤＯＴ：ＰＳＳ）が挙げられる。
【００４３】
任意の実施形態では、本明細書に開示されるエレクトロポレーション装置のいずれか１つは、本明細書に記載のエレクトロポレーションパラメータを伴うエレクトロポレーションプロセス中、細胞に電気パルスを供するための構成要素を含んでもよい。例えば、図２Ｄは、本明細書に説明される通り、細胞に対して電気パルスを生成し、提供するための装置８５２を図示する。具体的には、図２Ｄに示される通り、装置８５２は、電力供給８５４及び電力供給８５４に連結された制御回路８５８を含む。電力供給８５４は、エレクトロポレーション装置８６０（例えば、本明細書に開示されるエレクトロポレーション装置例のいずれか１つ）に電気パルスを提供する。
【００４４】
図２Ｄの例では、電力供給８５４は、電源８５６、電源８５６に連結された電力変換装置８６２、及び電力変換装置８６２とエレクトロポレーション装置８６０との間で連結されたパルス回路８６４を含む。電力変換装置８６２は、例えば電源８５６によって提供される電力のタイプに応じて、ＤＣ−ＤＣ電力変換回路及び／又はＡＣ−ＤＣ電力変換回路を含んでもよい。例えば、電力変換装置８６２は、電源８５６（例えば、１つ以上のバッテリー）からＤＣ電力を受信し、調節されたＤＣ電圧をパルス回路８６４に出力してもよい。かかる例では、電力変換装置８６２は、任意の好適な変換トポロジーを有するＤＣ−ＤＣ電力変換回路（例えば、バック、ブーストなど）を含んでもよい。他の例では、電力変換装置８６２は、電源８５６（例えば、ＡＣメイン）からＡＣ電力を受信してもよい。かかる例では、電力変換装置８６２は、任意の好適な変換トポロジーを有するＡＣ−ＤＣ電力変換回路（例えば、ＡＣ−ＤＣ整流器、ＰＦＣブーストなど）を含んでもよい。
【００４５】
図２Ｄのパルス回路８６４は、電力変換装置８６２からＤＣ電圧を受信し、エレクトロポレーション装置８６０向けにＤＣ電圧をＤＣ電気パルスに変換する。例えば、パルス回路８６４は、電力変換装置８６２からのＤＣ電圧を読み取り、電気パルスを生成するための１つ以上のスイッチング素子（図示せず）を含んでもよい。他の例では、パルス回路８６４は、エレクトロポレーション装置８６０向けに電気パルスを生成するための他の好適な回路を含んでもよい。
【００４６】
図２Ｄに示される通り、制御回路８５８は、コントローラ８６６及びコントローラ８６６に連結されたパルス発生器８６８を含む。コントローラ８６６は、電力変換装置８６２の出力パラメータ（例えば出力電圧）を表すフィードバック信号８７０を受信し、フィードバック信号８７０に基づいて電力変換装置８６２内の１つ以上のスイッチング素子（図示せず）を制御するため、電力変換装置８６２向けに１つ以上の制御信号８７２を生成する。例えば、コントローラ８６６は、規定値（例えば、電気パルスの所望される振幅）に電力変換装置の出力電圧を調節するため、電力変換装置のスイッチング素子を制御してもよい。いくつかの例では、コントローラ８６６は、フィードバック信号８７０及び／又は本明細書に開示される他の信号に基づいて、出力電圧を低下又は増加させてもよい。
【００４７】
加えて、また図２Ｄに示される通り、コントローラ８６６は、パルス発生器８６８向けに信号８７４を生成してもよく、パルス発生器８６８は、コントローラ８６６からの受信された信号に基づき、電気パルスを生成するためのパルス回路８６４向けに１つ以上の制御信号８７６を生成してもよい。例えば、信号８７４は、電気パルスの生成を開始させるため、パルス発生器８６８を指令する開始及び／又は停止信号であってもよい。いくつかの例では、パルス発生器８６８は、コントローラ８６６からの受信された信号に基づき、電気パルスの周波数、パルス幅、デューティ比などを調節してもよい。
【００４８】
いくつかの例では、制御回路８５８は、電力変換装置８６２及び／又はパルス発生器８６８を制御するための１つ以上の追加的な信号を受信してもよい。例えば、また図２Ｄに示される通り、制御回路８５８内のパルス発生器８６８は、任意選択的には１つ以上の信号８７８ａを受信してもよい。信号８７８ａは、パルス回路８６４、エレクトロポレーション装置８６０などからのフィードバック信号であり、電気パルスを生成するためのパルス回路８６４を制御するために使用されてもよい。加えて、また図２Ｄに示される通り、制御回路８５８内のコントローラ８６６は、任意選択的には、パルス回路８６４、エレクトロポレーション装置８６０などからのフィードバック信号を表す１つ以上の信号８８０、及び／又はユーザーインターフェースからのユーザが規定した指令を表す１つ以上の信号８８２を受信してもよい。かかる例では、信号８８０及び／又は信号８８２は、パルス回路８６４及び／又は電力変換装置８６２を制御し、パルスタイミングを監視するなどのため、使用されてもよい。いくつかの例では、装置８５２は、エレクトロポレーション装置８６０に関連するチップ電圧及び／又はチップ電流を監視するための１つ以上の検出器（図示せず）を含んでもよい。かかる例では、パルス発生器８６８及び／又はコントローラ８６６は、検知されたチップ電圧及び／又は検知されたチップ電流を信号８７８ａ、８８０を介して受信し、次いで検知されたチップ電圧及び／又は電流に基づいてパルス回路８６４及び／又は電力変換装置８６２を制御してもよい。
【００４９】
制御回路８５８はまた、制御目的で、１つ以上の追加的な信号を生成してもよい。例えば、コントローラ８６６は、任意選択的には、エレクトロポレーション装置の他の構成要素、及び／又はエレクトロポレーション装置外部の構成要素向けに１つ以上の信号８８４を生成してもよい。かかる例では、信号８８４は、ユーザーインターフェースに供されるユーザフィードバック、装置内の液体ポンプ、蠕動ポンプ、ピンチバルブのモーター（例えば、ステッピングモーター）を制御するための制御信号などを表してもよい。加えて、パルス回路８６４は、任意選択的には、エレクトロポレーション装置の他の構成要素、及び／又はエレクトロポレーション装置外部の構成要素向けに１つ以上の信号８７８ｂを生成してもよい。例えば、パルス回路は、検出器が電圧及び電流の監視を開始するように指令するため、検出器向けに信号８７８ｂを生成してもよい。
【００５０】
図２Ｅは、本明細書に説明される通り、細胞に対して電気パルスを生成し、提供するための別の例の装置８８６を図示する。図示のように、装置８８６は、エレクトロポレーション装置８６０に連結された電力供給８８８及び電力供給８８８を制御するための制御回路８９０を含む。図２Ｅの電力供給８８８及び制御回路８９０は、図２Ｄの電力供給８５４及び制御回路８５８に類似するが、追加的な構成要素を含む。例えば、電力供給８８８は、図２Ｄの電源８５６、電力変換装置８６２及びパルス回路８６４とともに、電源８５６と電力変換装置８６２との間に連結されたフィルター８９２を含む。フィルター８９２は、電源８５６からの電気信号を平滑化するためのコンデンサー、インダクタなどの１つ以上の構成要素（図示せず）を含んでもよい。
【００５１】
加えて、また図２Ｅに示される通り、制御回路８９０は、図２Ｄのコントローラ８６６及びパルス発生器８６８とともに、パルス発生器８６８に連結された１つ以上のゲートドライバ８９４を含む。図２Ｅの例では、ゲートドライバ８９４は、パルス発生器８６８から信号を受信し、パルス回路８６４内の１つ以上のスイッチング素子（例えばＭＯＳＦＥＴ）を制御するための１つ以上のパルス幅変調（ＰＷＭ）制御信号８９６を生成する。加えて、制御回路８９０は、図２Ｄで参照される様々な信号のいずれか１つ以上を受信及び／又は生成してもよい。例えば、コントローラ８６６は、フィードバック信号８７０を受信し、上で説明されるように、電力変換装置８６２内の１つ以上のスイッチング素子（例えばＭＯＳＦＥＴ）を制御するための制御信号８７２を生成してもよい。
【００５２】
本明細書に開示される制御回路は、ハードウェア構成要素及び／又は本明細書に開示される機能を含む様々な機能を実施するためのプログラム化されたソフトウェア構成要素を含んでもよい。例えば、図２Ｄ及び２Ｅの制御回路８５８、８９０のいずれか１つは、（本明細書に説明される）電力供給８５４、８８８のパラメータ、エレクトロポレーション装置８６０に関連するパラメータなどを監視するための１つ以上のセンサーを含んでもよい。パラメータは、電力供給８５４、８８８及び／又はエレクトロポレーション装置８６０に関連する電気パラメータ、エレクトロポレーション装置８６０に関連する流体パラメータなどを含んでもよい。かかる例では、制御回路８５８、８９０は、パラメータに基づき、電力供給８５４、８８８、及び／又は装置８５２、８８６の他の構成要素（例えば、液体ポンプなど）を制御してもよい。本明細書では、本明細書に記載の電力供給８５４、８８８のいずれか１つ及び制御回路８５８、８９０のいずれか１つが、電気パルス及び以下にさらに説明されるようなエレクトロポレーションパラメータ、例えば、波形、電界強度、電圧、各電気パルス間の持続時間、パルス幅、各電気パルスの持続時間などを提供し得ると考えられる。例えば、制御回路８５８、８９０のいずれか１つは、以下：（ｉ）各電気パルスは指数関数的な吐出波形又は方形波形の形態を有し；（ｉｉ）複数の電気パルスが約０．３ｋＶ／ｃｍ〜約３ｋＶ／ｃｍの電界強度で適用され；（ｉｉｉ）電界強度は約１５Ｖ〜約１００Ｖの電圧で適用され；（ｉｖ）各電気パルス間の持続時間は約０．１秒〜約１０秒であり；且つ（ｖ）各電気パルスは約１０μｓ〜約１０，０００μｓのパルス幅を有することの１つ以上を提供し得る。
【００５３】
いくつかの実施形態では、第１電極は上位マイクロメッシュ電極であってもよく、且つ第２電極は下位マイクロメッシュ電極であってもよい。かかる実施形態では、エレクトロポレーションチャンバーは、上位マイクロメッシュ電極、下位マイクロメッシュ電極、並びに細胞及びカーゴが流れるための上位マイクロメッシュ電極と下位マイクロメッシュ電極との間の規定された経路を含んでもよい。上位マイクロメッシュ電極と下位マイクロメッシュ電極の各々は、例えばエレクトロポレーションチャンバー内又は外のいずれかへのマイクロメッシュ電極の細胞の通過を可能にするため、多孔度を有する。例えば、上位マイクロメッシュ電極と下位マイクロメッシュ電極の各々は、約３０％〜約５０％の開口領域といった多孔度を有し得る。上位マイクロメッシュ電極及び下位マイクロメッシュ電極の孔開口部の幅は、約７０μｍ〜約１４０μｍであり得る。上位マイクロメッシュ電極は第１材料によって囲まれ得、また下位マイクロメッシュ電極は第２材料によって囲まれ得る。第１材料は、細胞のエレクトロポレーションチャンバーへの通過を可能にする第１入力を含み、第２材料は、エレクトロポレーションチャンバーからのエレクトロポレートされた細胞の通過を可能にする第１出力を含む。追加的に又は代替的に、細胞及び／又はカーゴが上位マイクロメッシュ電極の孔を通って移動し、エレクトロポレーションチャンバーに入るのではなく、上位マイクロメッシュ電極は、任意選択的には、細胞及び／又はカーゴのエレクトロポレーションチャンバーへの通過を可能にするための第２入力を含んでもよい。第２入力は、第１材料における第１入力と実質的に整列されてもよい。追加的に又は代替的に、エレクトロポレートされた細胞が下位マイクロメッシュ電極の孔を通って移動し、エレクトロポレーションチャンバーを出るのではなく、下位マイクロメッシュ電極は、エレクトロポレーションチャンバーから外部へのエレクトロポレーションの通過を可能にするための第２出力を含んでもよい。第２出力は、第２材料における第１出力と実質的に整列されてもよい。
【００５４】
例えば、図３Ａは、細胞にカーゴをエレクトロポレートするための例示的な装置を図示し、それはマイクロメッシュ電極を含むＩＯＣＯエレクトロポレーション装置２００を含む。ＩＯＣＯエレクトロポレーション装置２００は、上位マイクロメッシュ電極２４０（１）及び下位マイクロメッシュ電極２４０（２）といった、互いに整列した状態でここに示される２つのマイクロメッシュ電極を含む。上位マイクロメッシュ電極２４０（１）の上位表面は、第１材料によって囲まれてもよく、下位マイクロメッシュ電極２４０（２）の下位表面は、第２材料によって囲まれてもよい。例えば、第１材料及び第２材料は、エレクトロポレーション装置の内部チャンバー内、特に２つの平行マイクロメッシュ電極間のチャンバー２２０内に細胞を含有するため、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）アクリル、ポリエチレン、ポリプロピレンなどの非多孔質材料であってもよい。第１入力２１０は、上位マイクロメッシュ電極２４０（１）上（ＰＤＭＳを有しない領域）に形成され、且つ第１出力２３０は、下位マイクロメッシュ電極２４０（２）上（ＰＤＭＳを有しない領域）に形成される。したがって、この例では、上位マイクロメッシュ電極２４０（１）及び下位マイクロメッシュ電極２４０（２）は、細胞の流れをチャンバーの側方距離に沿って方向づけるため、第１材料（上位ＰＤＭＳ層）及び第２材料（下位ＰＤＭＳ層）によって囲まれた、エレクトロポレーションチャンバー２２０の長さに及ぶ。第１材料（上位ＰＤＭＳ層）における開口部（第１入力２１０）及び第２材料（下位ＰＤＭＳ層）における開口部（第１出力２３０）は、細胞の流れの、エレクトロポレーションチャンバー２２０の側方通過を容易にするため、オフセット距離（ｄ）だけ隔てられる。
【００５５】
任意の実施形態では、上記のようなエレクトロポレーションチャンバーは、限定はされないが、円形、卵円形、方形、矩形、又は多角形を含むいずれかの所望される形状を有してもよい。
【００５６】
任意の実施形態では、エレクトロポレーションチャンバー幅（ｗ）は、約０．０１ｍｍ〜約１５ｍｍ、０．０１ｍｍ〜約１０ｍｍ、０．０１ｍｍ〜約７．５ｍｍ、０．０１ｍｍ〜約５ｍｍ、約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍ、約０．１ｍｍ〜約１５ｍｍ、０．１ｍｍ〜約１０ｍｍ、０．１ｍｍ〜約７．５ｍｍ、約０．１ｍｍ〜約５ｍｍ、約１ｍｍ〜約１５ｍｍ、約１ｍｍ〜約１０ｍｍ、約１ｍｍ〜約７．５ｍｍ、約１ｍｍ〜約５ｍｍ、約２ｍｍ〜約１０ｍｍ、約２ｍｍ〜約５ｍｍ、約０．０１ｍｍ〜約４ｍｍ、約０．１ｍｍ〜約４ｍｍ、約１ｍｍ〜約４ｍｍ、約０．０１ｍｍ〜約２ｍｍ、約０．０５ｍｍ〜約１ｍｍ、約０．１ｍｍ〜約０．５ｍｍ、又は約０．２ｍｍ〜約０．４ｍｍの範囲であってもよい。いくつかの態様では、チャンバー幅（ｗ）は、約０．３ｍｍ又は約４ｍｍである。
【００５７】
いくつかの態様では、第１入力と第１出力との間のオフセット距離（ｄ）は、約０．１ｃｍ〜約１０ｃｍ、約０．１ｃｍ〜約５ｃｍ、約０．１ｃｍ〜約４ｃｍ、約１ｃｍ〜約３ｃｍの範囲であってもよい。いくつかの態様では、オフセット距離（ｄ）は、約２ｃｍである。いくつかの態様では、入力と出力との間に重複がない。
【００５８】
第１入力及び／又は第２入力は、エレクトロポレーションチャンバーと流体連絡され、エレクトロポレーションチャンバーは、第１出力及び／又は第２出力と流体連絡される。入力、出力、及びエレクトロポレーションチャンバーは、加えて、エレクトロポレーションチャンバーを通る細胞の流れを制御するため、１つ以上の弁、レギュレーター、ポンプ、又は任意の他のマイクロ流体部品を含んでもよい。
【００５９】
いくつかの態様では、第１入力と第１出力の双方は、第１入力と第１出力との間で好適なオフセット距離が維持される条件で、上位マイクロメッシュ電極上の第１材料に位置づけられてもよい。追加的に又は代替的に、第２入力と第２出力の双方は、上位マイクロメッシュ電極に存在してもよい。他の態様では、第１入力と第１出力の双方は、第１入力と第１出力との間で好適なオフセット距離が維持される条件で、下位マイクロメッシュ電極上の第２材料に位置づけられてもよい。追加的に又は代替的に、第２入力と第２出力の双方は、下位マイクロメッシュ電極に存在してもよい。
【００６０】
いくつかの実施形態では、細胞は、第１入力に入り、第１の方向に流れてもよい。一旦第１電極又は第２電極を通過すると、細胞の流れは、方向を変え、第１の方向に垂直な又は実質的に垂直な方向の、エレクトロポレーションチャンバーの長さに沿う経路内を側方に流れ得る。一旦第１出力に達すると、細胞の流れは、方向を再び変え、第１の方向に平行な第２の方向にエレクトロポレーションチャンバーから放出し得る。
【００６１】
いくつかの態様では、平行な第１電極及び第２電極の間に、約０．３ｋＶ／ｃｍ〜約３ｋＶ／ｃｍの範囲内の電界を生成するのに好適な電圧が印加される。典型的な電界は、ｈａＮＫＳに対して約１〜１．３ｋＶ／ｃｍ（例えば、４０Ｖ／３００ｕｍ）、またＥＣ−７細胞に対して約０．３〜１ｋＶ／ｃｍの範囲である。いくつかの態様では、電圧は、約１０Ｖ、約２０Ｖ、約３０Ｖ、約４０Ｖ、約５０Ｖ、約７５Ｖ、約１００Ｖ、若しくは約２００Ｖ、又はそれらの中の任意の好適な範囲、又はそれ以上であってもよい。
【００６２】
いくつかの態様では、第１入力、第２入力、第１出力及び第２出力の直径は、ほぼ同じであってもよい。他の態様では、第１入力の直径は、第１出力の直径よりも大きくてもよいか若しくは小さくてもよく、且つ／又は第２入力の直径は、第２出力の直径よりも大きくてもよいか若しくは小さくてもよい。例えば、第１入力の直径及び／又は第２入力の直径は、約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍ、約１ｍｍ〜約７ｍｍ、約３ｍｍ〜約５ｍｍの範囲であってもよいか、又は約４ｍｍであってもよい。第１出力の直径及び／又は第２出力の直径は、約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍ、約１ｍｍ〜約７ｍｍ、約３ｍｍ〜約５ｍｍの範囲であってもよいか、又は約４ｍｍであってもよい。
【００６３】
任意の実施形態では、エレクトロポレーションチャンバーの長さ（ｌ）は、約２ｍｍ〜約１００ｍｍ、約２ｍｍ〜約８０ｍｍ、約２ｍｍ〜約６０ｍｍ、約２ｍｍ〜約４０ｍｍ、約２ｍｍ〜約２０ｍｍ、約５ｍｍ〜約１００ｍｍ、約５ｍｍ〜約８０ｍｍ、約５ｍｍ〜約６０ｍｍ、約５ｍｍ〜約４０ｍｍ、約５ｍｍ〜約２０ｍｍ、約５ｍｍ〜約１５ｍｍ、約８ｍｍ〜約１２ｍｍの範囲であってもよいか、又は約１０ｍｍであってもよい。
【００６４】
任意の実施形態では、エレクトロポレーションチャンバーの高さ（ｈ）は、約１００μｍ〜約１０００μｍ、約１００μｍ〜約７５０μｍ、約１００μｍ〜約５００μｍ、約１００μｍ〜約３００μｍ、約１００μｍ〜約２００μｍ、約２００μｍ〜約１０００μｍ、約２００μｍ〜約７５０μｍ、約２００μｍ〜約５００μｍ、又は約２００μｍ〜約３００μｍの範囲であってもよい。いくつかの態様では、チャンバー高さ（ｈ）は、約２８４μｍである。
【００６５】
任意の実施形態では、幅（ｗ）に対する長さ（ｌ）の比（ｌ／ｗ）は、約１〜約５０、約１〜約４０、約１〜約２０又は約１〜約１０であり得る。
【００６６】
任意の実施形態では、一旦細胞がエレクトロポレーションチャンバーに入ると、細胞はエレクトロポレーションチャンバーを出るまで、均一電界に曝露される。例えば、図３Ｂは、ＩＯＣＯエレクトロポレーション装置２００における電界の図面である。位置（１）は、入力（第１入力２１０）における細胞を指し、位置（２）は、エレクトロポレーションチャンバー内の細胞を指し、位置（３）は、出力（第１出力２３０）における細胞を指す。
【００６７】
図３Ｃは、ＩＯＣＯエレクトロポレーション装置２００を通じた細胞移動距離に対する電界強度のプロットである。位置（１）で示される入力（第１入力２１０）における細胞は、マイクロメッシュ電極を通過してエレクトロポレーションチャンバーに入るまで電界に曝露されない。位置（２）で示されるエレクトロポレーションチャンバー内で、細胞は均一な（最大強度の）電界を受ける一方で、チャンバーの長さに沿って移動する。一旦位置（３）で示される出力（第１出力２３０）に入ると、細胞は電界に曝露されない。
【００６８】
図３Ｄは、エレクトロポレーション装置３１０−３３０を含む、本明細書で提示されるエレクトロポレーション装置の代替的な配置を示す。この実施形態では、細胞は、上位メッシュと下位メッシュとの間に直線状（水平）流路を有するのでなく、上位メッシュと下位メッシュとの間に曲線状又は円形状（水平）流路をとってもよい。直線状流路と曲線状流路の各々は、上位及び下位メッシュの少なくとも１つの表面によって規定された平面に対して平行に伸びる少なくとも１つのセグメントを含んでもよい。
【００６９】
この例では、エレクトロポレーション装置の様々な層３１０−３３０が図３Ｄに示される。固体外部プレート３１０（１）及び３１０（２）（例えば、プラスチック、金属、又は任意の他の好適な材料）は、該装置を囲む。接着層又は他の好適な材料（例えば、両側テープ、感圧性接着材料など）３２０（１）（第１材料）は、上位固体外部プレート３１０（１）と上位メッシュ３３０（１）との間に設けられ、接着層又は他の好適な材料（例えば、両側テープ、感圧性接着層など）３２０（２）（第２材料）は、下位外部プレート３１０（２）と下位メッシュ３３０（２）との間に設けられる。細胞及びカーゴが通流してもよい曲線状チャネル又は曲線状経路３３５を含む別の接着層（例えば、感圧性接着材料又は両側テープなど）（３４０）は、上位メッシュ３３０（１）と下位メッシュ３３０（２）との間に位置づけられる。流体は、エレクトロポレーション装置３１０−３３０を通じて、シリンジ３５０により駆動されてもよい。エレクトロポレーション装置３１０−３３０はまた、エレクトロポレーターパルサー３６０と面してもよい。任意の実施形態では、エレクトロポレーション装置３１０−３３０は、細胞が連続的様式で装置を通流する、連続エレクトロポレーション装置であってもよい。
【００７０】
細胞及びカーゴがエレクトロポレーションチャンバーを通流する経路は、エレクトロポレーションチャンバー内、例えば、第１電極（例えば、固体電極又は上位マイクロメッシュ電極）と第２電極（例えば、固体電極又は下位マイクロメッシュ電極）との間の上記のような流体チャネル領域内で規定される。第１電極（例えば、固体電極又は上位マイクロメッシュ電極）及び第２電極（例えば、固体電極又は下位マイクロメッシュ電極）の少なくとも１つに平行である少なくとも１つの水平フローセグメントを含むという条件で、任意の好適な経路が本明細書に提供される実施形態によって検討されることは理解される。水平フローセグメントは、上位及び下位マイクロメッシュ電極の間に伸びる経路の長さの１／１０、１／４、１／２、３／４、７／８、又は９／１０のいずれかよりも長く又は短く形成してもよい。場合によっては、該経路は、直線状、曲線状、分岐状、回り道状、蛇行状、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。曲線状経路の例として、限定はされないが、円形状経路、らせん状経路、円錐状経路、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例えば、図３Ｂに図示される通り、矢印が細胞の流れを図示する場合、経路は直線状である。図２Ａ、図２Ｂ、図３Ｄ及び図３Ｅに図示される通り、矢印が細胞の流れを図示する場合、経路は曲線状である。図３Ｆに図示される通り、矢印が細胞の流れを図示する場合、経路は、直線状であり、方向における１つ以上の変化又はスイッチバックを伴ってもよい。図３Ｇに図示される通り、経路は、円形状であり、且つ１つ以上の分枝を有してもよい。図３Ｅ〜図３Ｇに示される通り、経路は、第１入力に対応してもよい又は第１入力と実質的に整列されてもよい入口３８０（平面外）、及び第１出力に対応してもよい又は第１出力と実質的に整列されてもよい１つ以上の出口３９０（平面内）を含んでもよい。経路の長さは、エレクトロポレーションプロセスの特定の特徴に応じて、調節、例えば短縮又は延長されてもよい。
【００７１】
任意の実施形態では、本明細書に記載のエレクトロポレーション装置は、細胞の流れをサンプルチューブからエレクトロポレーション装置のエレクトロポレーションチャンバーへ生成し、装置を通流し、収集管に至るための手段を含んでもよい。例えば、図３Ｈに図示される通り、流れ生成手段５２０は、例えばチューブを介して、トランスフェクション対象の細胞及び／又はカーゴを含有するサンプルチューブ５１０及びエレクトロポレーション装置５３０と流体連絡される。流れ生成手段５２０は、サンプルチューブ５１０からのチューブを通り、エレクトロポレーション装置５３０を通り、そして収集管５５０内に至る、細胞及び／又はカーゴの流れを生成し得る。図示されていないが、エアフィルター装置は、サンプルチューブ５１０、収集管５５０、又は双方の内容物と流体連絡されてもよい。流れ生成手段は、任意の好適なポンプ、例えば蠕動ポンプ又はシリンジポンプであってもよい。本明細書では、２つ以上の流れ生成手段５２０がエレクトロポレーション装置内に存在してもよいと考えられる。例えば、１つ以上の流れ生成手段５２０は、サンプルチューブ５１０とエレクトロポレーション装置５３０との間に流体連絡されて存在してもよく、また１つ以上の流れ生成手段５２０は、収集管５５０とエレクトロポレーション装置５３０との間に流体連絡されて存在してもよい。追加的に又は代替的に、エレクトロポレーション装置５３０及び／又は流れ生成手段５２０はまた、例えばエレクトロポレーターパルサーを含むコントローラ５４０と面してもよい。
【００７２】
任意の実施形態では、本明細書に記載のエレクトロポレーション装置はまた、必要に応じてプライミング緩衝液を送達するための、エレクトロポレーション装置と流体連絡されたプライミング緩衝液チューブを含んでもよい。好適なプライミング緩衝液の例として、限定はされないが、蒸留水、脱イオン水、等張性緩衝液、及びそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、図３Ｉに図示される通り、プライミング緩衝液チューブ５６０は、エレクトロポレーション装置５３０と流体連絡される。弁５７０は、プライミング緩衝液を流れ生成手段５２０を介してエレクトロポレーション装置５３０に送達するため、開かれてもよい、又は弁５７０は、送達を停止するため、閉じられてもよい。弁５７５は、細胞及び／又はカーゴを流れ生成手段５２０を介してエレクトロポレーション装置５３０に送達するため、開かれてもよい、又は弁５７５は、送達を停止するため、閉じられてもよい。いくつかの実施形態では、弁５７０及び７５７の双方は、細胞及びプライミング緩衝液を送達するため、開かれてもよい。いくつかの実施形態では、最初にプライミング緩衝液が送達され、続いて細胞及び／又はカーゴが送達されてもよい。
【００７３】
任意の実施形態では、本明細書に記載のエレクトロポレーション装置はまた、細胞を、エレクトロポレーション装置のエレクトロポレーションチャンバーに入る前に選別するための第１のマイクロ流体デバイスを含んでもよい。例えば、図３Ｊに図示される通り、第１のマイクロ流体デバイス５８０は、エレクトロポレーション装置５３０、トランスフェクション対象の細胞を含有するサンプルチューブ５１０、及び任意選択的には緩衝液選別チューブ５７７と流体連絡され得る。流れ生成手段５２０は、サンプルチューブ５１０からの細胞及び／又は選別チューブ５７７からの緩衝液の、エレクトロポレーション装置５３０を通り、収集管５５０に至るような流れを生成し得る。第１のマイクロ流体デバイス５８０は、サンプルチューブ５１０からエレクトロポレーション装置５３０にかけて、例えば細胞のサイズに基づいて、細胞を予備選別する能力がある。追加的に又は代替的に、第１のマイクロ流体デバイス５８０は、サンプルチューブ５１０からの細胞の緩衝液変更を達成させる能力がある。流れ５９０は、選別除去され、且つエレクトロポレーション装置５３０に送達されない細胞を含有し、廃棄物の流れであり得るか、又は異なるパラメータを用いる別のエレクトロポレーション装置に送達され得るかのいずれかである。追加的に又は代替的に、第２のマイクロ流体デバイス５８５が、エレクトロポレーション装置５３０及び収集管５５０と流体連絡され得る。第２のマイクロ流体デバイス５８５は、収集管５５０における収集前に、例えばエレクトロポレートされた細胞のサイズに基づいて、エレクトロポレートされた細胞を選別する能力がある。流れ５９５は、選別除去され、且つ収集管５５０に送達されないエレクトロポレートされた細胞を含有する。
【００７４】
２つのマイクロ流体デバイスが図３Ｊに示されているが、本明細書では、例えば、エレクトロポレーションチャンバーに入る前に細胞を選別するため、又はエレクトロポレーションチャンバーを出るエレクトロポレートされた細胞を選別するため、１つのマイクロ流体デバイスのみがエレクトロポレーション装置内に存在してもよいと考えられる。
【００７５】
図３Ｋは、マイクロ流体デバイス例（例えば、マイクロ流体デバイス５８０、マイクロ流体デバイス５８５）の図面である。この例において、細胞１００（例えば、トランスフェクション対象の細胞、エレクトロポレートされた細胞、トランスフェクト細胞）を含む溶液は、チャンバー１０５に入力機構１１０で入る。細胞は丸で図示される。細胞は、ここで勾配を有する複数のラインに沿って分布される矩形構造で示される、ポスト１１５のマトリックスを含むチャンバー１０５を通過する。細胞がチャンバー内の対角線上に配向されたポスト列の間を通過するとき、細胞は第２出力機構１２２に向けて側方に偏向される。チャンバーの一部の側面図が図３Ｌに示され、ここでチャンバーは、床１６０を有し、任意選択的には天井１５０を有し、それらはポスト１１５と同じ材料又は異なる材料で作られてもよい。細胞（黒丸）は、ポストのマトリックスを通流することが示される。ポスト列がさらに曲線状に配列されてもよく、結果的に細胞がチャンバーの側面に向けて誘導されることにもなると理解される。
【００７６】
この例では、チャンバー用に２つの出力機構が示される。第１出力機構１２０（２つ以上のマイクロ流体デバイスが存在するとき、第３出力機構とも称され得る）を介してチャンバーを出る溶液は、細胞が枯渇している一方で、第２出力機構１２２（２つ以上のマイクロ流体デバイスが存在するとき、第４出力機構とも称され得る）を介してチャンバーを出る溶液は、細胞が濃縮されている。任意の実施形態では、第２出力機構は、エレクトロポレーションチャンバーと、例えば第１入力と流体連絡され得る。枯渇は、出力機構１２０を介してチャンバーを出る溶液中の細胞の濃度が、入力機構１１０でチャンバーに入る溶液中の細胞の濃度と比べて５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下している状態を指す。濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）又は濃縮（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）は、出力機構１２２を介してチャンバーを出る溶液中の細胞の濃度が、入力機構１１０でチャンバーに入る溶液中の細胞の濃度と比べて５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％又はそれ以上増加している状態を指す。出力機構１２２に誘導される細胞の場合、チャンバーの偏向点１３０は、存在する細胞が出力機構１２２（且つ出力機構１２０でない）に送られるように位置づけられる必要がある。一般に、出力機構１２２は、出力機構１２０よりも大きい断面積を有するように形成される。一般に、出力機構は、本明細書に記載の流速での流体フローにとって十分に大きい断面積を有することで、細胞又はデバイスを損傷すると思われる高い圧力をもたらさない。
【００７７】
いくつかの実施形態では、出力機構１２０の幅は、出力機構１２２の幅よりも大きい。例えば、出力機構１２０の幅は、出力機構１２２の１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍の幅である。他の実施形態では、出力機構の断面積の合計は、入力機構の断面積の合計以上であってもよい。
【００７８】
いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、標準ポンプ又はシリンジなどのマイクロ流体デバイスへの接続を可能にすることで、細胞を含む溶液がデバイスを通流するように形成される。溶液のデバイスの通流に影響し得るパラメータは、チャンバー１０５の寸法、ポスト１１５の平面内及び平面外の寸法、列内のポストの間隔（ｄｘ）、ポストの回転（Φ）、ポスト列間の距離（ｄｙ）、入力機構の直径、及び出力機構の直径を含む（下の図３Ｍ〜図３Ｑを参照）。いくつかの実施形態では、これらパラメータの寸法は、デバイスを通過する溶液の流れを駆動するシリンジ又は標準ポンプ（例えば、蠕動ポンプ、ダイアフラムポンプ、シリンジポンプ、ローブポンプなど）の手動操作からの適用圧力に適合するように選択される。種々の圧力は、圧力によりマイクロ流体デバイス又は細胞が損傷しないという条件で許容される。
【００７９】
一般に、細胞は、連続的に（特定経路内に一度に）又は複数で（複数の経路内に流れる複数の細胞で）マイクロ流体デバイスに流れてもよい。
【００８０】
図３Ｍは、チャンバー１０５の断面のトップダウンビューの図面であり、ここで断面は各々、７ポストの２列を含む。細胞の流れは、経路（ｐ）に沿って示される。この図面は、マイクロ流体デバイスのチャンバーの断面内でのポスト１１５の位置決めを示す。一般に、ポストは、空間間隔（ｄｘ）で角度（θ）によって規定されるような勾配を有するラインに沿って整列され、固定的であっても又は変動的であってもよいが、変動はポスト間の経路（ｐ）からの細胞の回避をもたらさないという条件である。
【００８１】
いくつかの実施形態では、チャンバーの幅は、１ｍｍ、２．５ｍｍ、５ｍｍ、７．５ｍｍ、１０ｍｍ、１２．５ｍｍ、１５ｍｍ、１７．５ｍｍ、２０ｍｍ、３０ｍｍ、４０ｍｍ、５０ｍｍ、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意のサイズである。各径路（ｐ）の幅により、流線の特性が制御される。例えば、１、２、４、８、１２、１６、３２など、又はそれらの間の任意の範囲といったいくつもの経路が、チャンバーの幅に応じて利用されてもよい。他の実施形態では、チャンバーを通る流体の流速は、１ｍＬ／時間、２ｍＬ／時間、３ｍＬ／時間、４ｍＬ／時間、５ｍＬ／時間、６ｍＬ／時間、７ｍＬ／時間、８ｍＬ／時間、９ｍＬ／時間、１０ｍＬ／時間、１５ｍＬ／時間、２０ｍＬ／時間、２５ｍＬ／時間、３０ｍＬ／時間、４０ｍＬ／時間、５０ｍＬ／時間などであってもよい。チャンバーは、望ましくは矩形であるが、さらに円形状、半円形状、Ｖ形状、又は任意の他の適切な形状であってもよい。
【００８２】
角度（θ）は、０勾配を有する水平軸とポストが分布される勾配を有するラインとの間の角度である（この例では、角度は負の勾配の尺度（ｔａｎ（θ）＝ポスト列のΔｙ／Δｘ））を提供する。この例では、ポストの各列が対角線上に配列されることから、ポストが正又は負の勾配を有してもよいことは理解される。ここで、対角線が、チャンバーに対して平行又は垂直でない任意の配向性、例えば、時計回り又は反時計回りで、１°〜８９°の間、９１°〜１７９°の間、１８１°〜２６９°の間、又は２７１°〜３５９°の間の角度を包含してもよいことは理解される。他の例示的な角度範囲は、１°〜１０°、１１°〜２０°、２１°〜３０°、３１°〜４０°、４１°〜５０°、５１°〜６０°、６１°〜７０°、７１°〜８０°、８１°〜９０°、９１°〜１００°、１０１°〜１１０°、１１１°〜１２０°、１２１°〜１３０°、１３１°〜１４０°、１４１°〜１５０°、１５１°〜１６０°、１６１°〜１７０°、又は１７１°〜１８０°であってもよい。
【００８３】
一般に、複数のポスト列がチャンバー内に存在し、各列は、角度（θ）で規定される場合と同じ勾配又は実質的に同じ勾配を有する。細胞１００がマイクロ流体デバイスのチャンバー１０５に入るとき、細胞は、チャンバー１０５の側面に向けて側方性に、チャンバーの側面に達するまで、ポスト１１５間の複数の経路（ｐ）を通流する。細胞を濃縮する場合、細胞は一般にポスト列を横断しないばかりか、細胞は典型的には特定経路（ｐ）に沿って移動する。次に、細胞は、出力機構１２２を介してマイクロ流体チャンバーを出る。他の実施形態では、ポストは、チャンバー１０５の長さに沿って曲線状の構成要素を有してもよい。
【００８４】
本明細書で用いられるとき、用語「ポスト」は、関連する平面寸法、平面外寸法、回転角、及び形状を有するチャンバー内部の構造物を指す。平面内寸法は、ポストの長さ（ｌ）及び幅（ｗ）を指してもよい一方で、平面外寸法は、ポストの高さ（ｈ）を指してもよい。傾き角又は回転角（Φ）は、チャンバーに対するポストの回転を指す。
【００８５】
形状は、ポストの三次元的特徴づけ、例えば、円柱状、円錐体、錐体、立方又は立方状などを指す。一般に、ポストは、その軸（平面外寸法）がそれに付く表面に対して垂直であるように位置づけられる。いくつかの実施形態では、チャンバー内のすべてのポストは同じ寸法である。他の実施形態では、ポストの寸法は、例えばポストの高さ（ｈ）に沿って測定される位置に応じた空間の関数として変化する。一般に、ポストは、任意の形状であってもよく、本明細書に提示される特定の幾何学的形状に制限されない。ポスト形状は、軸の長さ（ｌ）及び幅（ｗ）に加えて、軸の長さに沿って、例えば反復する一定間隔又は反復する可変間隔で位置する、屈曲に伴う複数の半径（ｒ４〜ｒ１２）によって表される図３Ｒに示される通り、任意であってもよい。いくつもの異なる形状は、複数の半径によって説明されてもよい。加えて、図３Ｒ及び図３Ｓを参照すると、ポストの１つ以上の側面は、直線の形状であってもよい。したがって、ポストは、曲線及び／又は直線からなる任意の好適な形状を有してもよい。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ポストは、勾配を有するラインに沿う間隔（ｄｘ）で配列され、ここで間隔は規則的に隔てられるか又は固定される。例えば、ポストは、濃縮対象の細胞のサイズに応じて、例えば、５μｍごと、１０μｍごと、１５μｍごと、２０μｍごと、２５μｍごと、３０μｍごと、３５μｍごと、４０μｍごと、４５μｍごと、５０μｍごと、５５μｍごと、６０μｍごと、６５μｍごと、７０μｍごと、７５μｍごと、８５μｍごと、９０μｍごと、９５μｍごと、１００μｍごと（これら範囲の間の任意の値を含む）に配置されてもよい。
【００８７】
他の実施形態では、ポストは、間隔が固定されないばかりか、いずれか２つの連続するポスト間で変動するように、勾配を有するラインに沿って分布される。任意の間隔（ｄｘ）は、細胞が経路（ｐ）を回避することを防ぐのに十分に小さいという条件で許容される。例えば、可変間隔の場合、第１のポストが特定位置に配置されてもよく、第２のポストが第１のポストから５μｍに配置されてもよく、第３のポストが第２のポストから４ｕｍに配置されてもよい。間隔は、細胞のサイズに基づいて選択され得る。
【００８８】
いくつかの実施形態では、間隔は、特定タイプの細胞の濃縮を可能にする一方で、より小さい細胞が出力機構１２０を介して出ることを可能にする程度に十分に大きいように選択され得る。例えば、血液サンプルは、比較的小さいサイズの複数の異なる細胞型、例えば、赤血球、好中球（例えば、直径が１２〜１４μｍ）、好酸球（例えば、直径が１２〜１７μｍ）、好塩基球（例えば、直径が１４〜１６μｍ）、リンパ球（例えば、直径が１０〜１４μｍ）、及び単球（例えば、直径が２０μｍ）を含んでもよい。ヒト身体内の他のタイプの細胞は、はるかにより大きく、例えば直径が４０〜１００μｍの範囲又はそれ以上である。かかる場合、赤血球及び白血球の通過を可能にする一方で、より大きい細胞（例えば、正常細胞、腫瘍細胞など）を濃縮するため、ポストは隔てられてもよい。ポストの配置（スペーシング）は、単離されている細胞のタイプに基づいて決定される。異なるシース流対サンプル流の比は、サイズに基づく選別性能に影響し得る。
【００８９】
各ポストは、平面内寸法とも称される関連の長さ（ｌ）、幅（ｗ）、及び平面外寸法とも称される高さ（ｈ）を有する（図３Ｎも参照）。いくつかの実施形態では、ポストの幅は、５μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、５０μｍ、５５μｍ、６０μｍ、６５μｍ、７０μｍ、７５μｍ、８５μｍ、９０μｍ、９５μｍ、１００μｍなど、又はそれらの間の任意の値であってもよい。ポストの長さは、５μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、５０μｍ、５５μｍ、６０μｍ、６５μｍ、７０μｍ、７５μｍ、８５μｍ、９０μｍ、９５μｍ、１００μｍなど、又はそれらの間の任意の値であってもよい。一般に、ポストは、（トップダウンの配向性からの観点として、また寸法ｗ及びｌに関連して）任意の形状、例えば限定はされないが、円形状、卵円、四角、矩形などであってもよい。
【００９０】
本明細書に提示される例では、ポストは、卵円又は四角形状を有する。いくつかの実施形態では、ポストの長さは、ポストの幅よりも１．１〜１０倍大きい；ポストの幅よりも１．１〜５倍大きい；ポストの幅よりも２〜４倍大きい；ポストの幅よりも３〜４倍大きい；又はポストの幅よりも２〜３倍大きい。いくつかの実施形態では、長さ及び幅は、２０対１、１８対１、１６対１、１４対１、１２対１、１０対１、９対１、８対１、７対１、６対１、５対１、４対１、３対１、２対１、１．１対１、又はより小さい若しくはより大きい比のいずれかよりも大きい若しくは小さい比を有してもよい。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ポストの断面は、ポストと、ポストが高さ（ｈ）とともに延びる元の壁に対して平行である平面との交わりによって規定されてもよい。断面は、長さ（ｌ）方向と幅（ｗ）方向の一方又は双方に対称的であってもよい。
【００９２】
さらに他の実施形態では、マトリックスにおける各ポストの長さ及び幅は同じである。さらに他の実施形態では、ポストが円形状である場合、マトリックスにおける各ポストの半径は同じである。
【００９３】
さらなる特徴として、ポストの回転角（Φ）、ポストの高さ又は平面外寸法、列間のスペーシング（ｄｙ）、及び列のオフセット（ｘｏ）が挙げられ、それらは図３Ｎ〜図３Ｑにおいて、また本願全体を通じて、さらに詳細に説明される。本明細書で用いられるとき、用語「回転角」は、チャンバー内のその位置に対するポストの回転の度合いを指す。いくつかの実施形態では、ポストは、その幅よりも大きい長さを有する。この実施形態では、０の回転角は、ポストの長さがチャンバーの側面に垂直な軸と整列されることを意味する。異なる回転角を記述するため、ポストは時計回り又は反時計回りの方向に回転されてもよい。例として、図３Ｍ〜図Ｑにおけるポストは、これらの図に示されるポストの幾何学的形状に達するように、反時計回りの動きで約３５°回転される。
【００９４】
図３Ｎを参照すると、各ポストは、細胞が上方経路内を流れる（例えば、ポストの頂上を超えて異なる経路に至る）ことにより経路（ｐ）から逃れることを阻止するためにポストが十分に高いことに関連する高さ（ｈ）又は平面外寸法を有する。例えば、いくつかの実施形態では、ポストは、チャンバーの床１６０及びチャンバーの天井１５０と接触状態にあるなど、マイクロ流体チャンバーの高さに及ぶことになる。他の実施形態では、ポストの高さ又は平面外寸法は、マイクロ流体デバイスの全高さの一部分に及んでもよい。例えば、ポストは、１μｍ、３μｍ、５μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、５０μｍ、５５μｍ、６０μｍ、６５μｍ、７０μｍ、７５μｍ、８５μｍ、９０μｍ、９５μｍ、１００μｍなど、又はそれらの間の任意の値の高さを有してもよい。
【００９５】
図３Ｏを参照すると、各ポストは、トップダウンビューから示される通り、関連する回転角（Φ）又は傾きを有する。本例では、ポストの回転は、ポストの長さがチャンバーの側面に垂直な第１軸と整列され、且つポストの幅がチャンバーの側面に平行な第２軸と整列されるような配向を基にして、ポストを、所望される回転に達するまで、反時計回り方向に、例えば本例では反時計回りに約３５°回転させることにより、決定される。経路（ｐ）への細胞の通流を容易にする任意の回転角が利用されてもよく、すべてのかかる回転角が本明細書で検討される。いくつかの実施形態では、回転角は、１°〜１７９°の間、１°〜８９°の間、５°〜８５°の間、１０°〜８０°の間、１５°〜７５°の間、２０°〜７０°の間、２５°〜６５°の間、３０°〜６０°の間、３５°〜５５°の間、４０°〜５０°の間、３０°〜４０°の間、３２°〜３８°の間、３４°〜３６°の間、又は３５°である。他の実施形態では、回転角は、９１°〜１７９°の間、９５°〜１７５°の間、１００°〜１７０°の間、１０５°〜１６５°の間、１１０°〜１６０°の間、１１５°〜１５５°の間、１２０°〜１５０°の間、１２５°〜１４５°の間、１３０°〜１４０°の間、又は１３５°であってもよい。
【００９６】
先に示された通り、ポストは、負の勾配を有するラインに沿って分布される。細胞をこのラインに沿って方向づけることにより、経路（ｐ）を通流する細胞は、チャンバーの側面に向かって側方に誘導される一方で、細胞が最初に懸濁された溶液は、ある様式で（例えば、ほぼ水平に又は水平に）流れ、出力機構１２０を介してマイクロ流体チャンバーを出ることができる。
【００９７】
図３Ｐを参照すると、さらに他の実施形態では、ポスト列は間隔（ｄｙ）で隔てられる。いくつかの実施形態では、ポストは垂直なラインに沿って間隔（ｄｙ）で配列され、ここで間隔は規則的に隔てられるか又は固定される。例えば、ポストは、濃縮対象の細胞のサイズに応じて、５μｍごと、１０μｍごと、１５μｍごと、２０μｍごと、２５μｍごと、３０μｍごと、３５μｍごと、４０μｍごと、４５μｍごと、５０μｍごと、５５μｍごと、６０μｍごと、６５μｍごと、７０μｍごと、７５μｍごと、８５μｍごと、９０μｍごと、９５μｍごと、１００μｍごとなど（それらの間の任意の値を含む）に配置されてもよい。
【００９８】
他の実施形態では、ポストは、間隔（ｄｙ）が固定されない代わりに、いずれか２つの連続するポスト列の間で変動するように、垂直なラインに沿って分布される。例えば、第１のポスト列は特定位置に配置されてもよく、第２のポスト列は第１のポスト列から５μｍに配置されてもよく、第３のポスト列は第２のポスト列から４ｕｍに配置されてもよいなど、垂直なラインに対して整列される。間隔（ｄｙ）は、濃縮対象の細胞のサイズに基づいて選択され得る。任意の間隔（ｄｙ）は、マイクロ流体デバイスを損傷し得るような高い圧力を必要とせず、チャンバーへの溶液の通流を可能にするほどに間隔が十分に広いという条件で、許容される。いくつかの実施形態では、連続するポスト列は、ゼロオフセット（ｘｏ）を有してもよい。
【００９９】
図３Ｑを参照すると、連続するポスト列は、間隔（ｄｘ）に対してオフセット（ｘｏ）を有してもよい。例えば、列（ｒ）は、（例えばデカルト座標系ｘ、ｙを用いて）特定位置に確定されてもよい。（ｒ＋１）番目の列は、ある量（ｘｏ）だけ右側に変位されてもよい。（ｒ＋２）番目の列は、ある量（２ｘｏ）だけ右側に変位されてもよい。（ｒ＋３）番目の列は、ある量（３ｘｏ）だけ右側に変位されてもよく、以下同様で、間隔（ｄｘ）に至るまで変位されてもよい。オフセットは、各々の連続する列が一定量だけ同じ方向に変位されるように、固定された様式で設けられてもよい。或いは、オフセットは、各々の連続する列が可変量（最大で（ｄｘ）の量）だけ同じ方向に変位されるように、可変的な様式で設けられてもよい。他の実施形態では、オフセットは、列（ｒ）に対して、（ｒ＋１）番目の列がある方向に固定された又は可変的なオフセットを有し、且つ（ｒ＋２）番目の列がその逆方向に固定された又は可変的なオフセットを有する（例えば、あるオフセットが右側であり、且つ次のオフセットが左側である）ように、交互方向に適用されてもよい。
【０１００】
ポストは、任意の好適な材料、例えば、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）、ガラス、プラスチック、エラストマー、シリコンなどで作成されてもよい。ＰＤＭＳは、一般にサブミクロンの解像度（例えば、０．１μｍ未満の特徴）を有するように製作され得る。いくつかの実施形態では、チャンバー１０５及び／又はポスト１１５は、ＰＤＭＳで作成されてもよい。他の実施形態では、チャンバーはガラス及び／又はシリコン及び／又はプラスチックで製作されてもよく、ポストはＰＤＭＳを用いて製作されてもよい（例えば、チャンバーの底面は、ガラス又はシリコンであってもよく、チャンバーの最上部は、ガラス又はプラスチックであってもよい）。本明細書に記載のようなチャンバー及びポストを製作するため、当該技術分野で周知のリソグラフィーが利用されてもよい。本明細書に示されるマイクロ流体デバイスを構築するため、ＰＤＭＳと類似の特性を有する材料がさらに使用されてもよい。
【０１０１】
加えて、具体的な実施形態は、弁（例えば、入力機構とチャンバーとの間、チャンバーと出力機構との間、出力機構と別の入力機構又は別のチャンバーとの間など）、ポンプ及びミキサーを含む、いくつかの追加的特徴を含んでもよい。いくつかの実施形態では、弁は、キュレーション中、ＰＤＭＳ中に配置されてもよい。
【０１０２】
マイクロ流体デバイスを製作するため、種々の技術を利用することができる。マイクロ流体デバイスは、以下の材料：ポリ（メチルメタクリル酸）（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、シリコーン（例えば、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ））、シリコン、及びそれらの組み合わせの１つ以上から形成されてもよい。その他の材料は、当該技術分野で周知である。
【０１０３】
本明細書で参照される材料を用いて、ポストを有するチャンバー及びマイクロ流体デバイスを製作するための方法は、当該技術分野で公知でもあり、限定はされないが、エンボス加工、レーザーマイクロマシニング、ミリング、成形（例えば、熱可塑性射出成形、又は圧縮成形）、フォトリソグラフィ（例えば、光造形法又はＸ線フォトリソグラフィ）、シリコンマイクロマシニング、ウェット又はドライケミカルエッチングなどが挙げられる。
【０１０４】
フォトリソグラフィ、続いてウェット（ＫＯＨ）又はドライエッチング（フッ素又は他の反応性ガスによる反応性イオンエッチング）を用いるシリコン製造技術は、ガラス材料向けに利用可能である。例えば、ガラスマスターは、通常のフォトリソグラフィによって形成可能であり、プラスチック又はＰＤＭＳに基づくデバイスを作製するための成形技術におけるマスター鋳型として役立つ。
【０１０５】
マイクロ流体デバイスは、例えば、接着剤、クランプ、熱、溶剤などにより、共に連結された１つ以上の層内に製作されてもよい。或いは、マイクロ流体デバイスは、例えば光造形法又は他の三次元製造技術を用いて、単一ピースとして製作されてもよい。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、細胞の変形能に起因し、ギャップ距離は、濃縮対象の細胞のサイズ（例えば直径）と比べて約５μｍ以下であるように選択されてもよい。他の実施形態では、ギャップ距離は、選別対象の細胞のサイズ（例えば直径）と比べて約５μｍ以上であるように選択されてもよい。変形可能な細胞と同じ又は類似する直径を有する強固な細胞又は微粒子の場合、ギャップ距離は、同じ直径の変形可能な細胞におけるギャップ距離と比べて異なってもよい（例えば、強固な細胞の場合、より大きい）。
【０１０７】
図３Ｔは、別の例のマイクロ流体細胞濃縮装置の図面である。この例において、細胞１００を含む第１溶液は、第１入力機構１１０でチャンバー１０５に入る。細胞は丸で図示される。細胞は、ここで勾配を有するラインに沿って分布される矩形構造として示される、ポスト１１５のマトリックスを含む、チャンバー１０５を通過する。細胞がチャンバー内の対角線上に方向づけられたポスト列の間を通るとき、細胞はチャンバーの側面に向けて側方に偏向される。図３Ｌと同様、チャンバーは、ポスト１１５と同じ材料又は異なる材料であってもよい、床１６０（図示せず）及び任意選択的な天井１５０を有する。
【０１０８】
この例では、第２入力機構１１２がこのシステム内に存在する。第２溶液（例えば、第１入力機構１１０を通じてチャンバーに入る第１溶液と異なる緩衝液）、例えば緩衝液チューブ５７７からの緩衝液は、第２入力機構１１２を通じてチャンバーに入る。いくつかの実施形態では、第１溶液及び第２溶液は、実質的に混合せず、それ故、チャンバーの上位領域１５５は、第１溶液を含み、第２溶液を有するとしてもほんのわずかしか有しない一方で、チャンバーの下位領域１６５は、第２溶液を含み、第１溶液を有するとしてもほんのわずかしか有しない。したがって、細胞が側方に偏向され、出力機構１２２を通じてチャンバーを出るとき、出力機構１２２を介してチャンバーを出る溶液は、第２溶液の緩衝液中に存在する。
【０１０９】
いくつかの態様では、緩衝液変更は、図３Ｕに示される通り、カスケード設計において順次行われてもよい。この例では、細胞１００を含む第１溶液は、第１入力機構１１０（１）で第１チャンバー１０５（１）に入る。細胞は丸で図示される。細胞は、ここで勾配を有するラインに沿って分布される矩形構造として示される、ポスト１１５（１）のマトリックスを含む、チャンバー１０５（１）を通過する。細胞がチャンバー内の対角線上に方向づけられたポスト列の間を通るとき、細胞は側方に偏向される。図３Ｌと同様、チャンバーは、ポスト１１５と同じ材料又は異なる材料であってもよい、床（１６０）（図示せず）及び任意選択的な天井（１５０）を有する。（濃縮された）細胞は、第２入力機構１１２がシステムの入力である場合、入力機構１１０（２）に流れる出力１２２（１）を通じてチャンバーを出る。
【０１１０】
第２溶液（例えば緩衝液）は、第１入力機構１１０（１）を通じてチャンバーに入る第１溶液と異なり、第２入力機構（１１２）を通じてチャンバーに入る。いくつかの実施形態では、第１溶液及び第２溶液は、実質的に混合せず、それ故、チャンバーの上位領域（１５５）は、第１溶液を含み、第２溶液を有するとしてもほんのわずかしか有しない一方で、チャンバーの下位領域（１６５）は、第２溶液を含み、第１溶液を有するとしてもほんのわずかしか有しない。細胞（濃縮され、且つ入力機構１１２からの緩衝液中に存在する）は、出力機構１２２（２）を通じてチャンバー１０５（２）を出る。
【０１１１】
他の態様では、緩衝液変更は、並行して行われてもよい。例えば、流路は、サンプルが複数のチャンバー内に流れるように分割されてもよく、ここで各チャンバーは、緩衝液用の入力機構を含む。この配置の場合、細胞が同じ緩衝液中で濃縮されるように、同じ緩衝液が平行チャンバーの各々に供されてもよい。或いは、例えば異なる下流アッセイにおいて、細胞が異なる緩衝液中で濃縮されるように、異なる緩衝液が平行チャンバーの各々に供されてもよい。
【０１１２】
一般に、入力機構は、シリンジポンプにより、又はシリンジの手動押下げにより駆動され得る。いくつかの態様では、複数の入力において、各入力を自動的に駆動するため、１つ以上のシリンジポンプが使用され得る。他の態様では、複数の入力において、各入力を手動で駆動するため、１つ以上のシリンジの手動押下げが使用され得る。
【０１１３】
任意の実施形態では、異なるエレクトロポレーション効果を提供する能力があるエレクトロポレーション装置が本明細書に記載される。例えば、図３Ｖに図示される通り、３つの電極６４０（１）、６４０（２）、６４０（３）を有するエレクトロポレーション装置６００が提供される。エレクトロポレーション装置６００は、細胞及びカーゴが移動するための２つの経路、電極６４０（１）と電極６４０（２）との間の第１経路及び電極６４０（２）と電極６４０（３）との間の第２経路を含み、ここで矢印は細胞の流れを示す。細胞は、入口６２０でエレクトロポレーションチャンバーに入り、出口６３０を介して出ることができる。図示されていないが、本明細書では、２つ以上の出口が存在してもよく、例えば各出口が異なるタイプの細胞を収集し得ると考えられる。異なる電極ギャップ長（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４）が、エレクトロポレーション装置６００内に存在する。異なる電極ギャップ長及び異なる経路は、異なる容量をもたらし；それ故、各経路内を移動する細胞において、異なる電界強度及びエレクトロポレーション効果が達成され得る。例えば、Ｌ２をＬ４よりも大きくすることができ、かかる例では、第１経路内の容量（Ｃ１）を第２経路内の容量（Ｃ２）よりも大きくすることができる（Ｃ１＞Ｃ２）。任意の実施形態では、細胞（同じ又は異なるタイプ）は、例えば上記のマイクロ流体デバイスを用いて予備選別及び／又は選択されてから、第１経路又は第２経路に進入してもよい。
【０１１４】
本明細書では、本明細書に記載のエレクトロポレーション装置が、所望される長さ及び形状の経路を提供するため、互いに流体連絡（例えば、接続、積層）されてもよいカートリッジとして存在し得ることも検討される。例えば、図３Ｗに図示される通り、カートリッジ４１０の各々は、第１電極４４０（１）及び第２電極４４０（２）を含むエレクトロポレーションチャンバーを含み、ここでカートリッジは順次積層されてもよく、矢印はカートリッジを通る細胞の流れを示す。例えば、最上位カートリッジ４１０の出口は、中間カートリッジ４１０の入口と流体連絡され、中間カートリッジ４１０の出口は、最下位カートリッジ４１０の入口と流体連絡される。
【０１１５】
さらなる実施形態では、本明細書に記載のエレクトロポレーション装置を含むモジュラーシステムが提供される。例えば、図３Ｘに図示される通り、モジュラーシステム８００は、第１モジュール８０５、第２モジュール８１５、及び第３モジュール８２５といった互いに流体連絡又は接続するように形成された３つのモジュールを含む。第１モジュール８０５は、トランスフェクション対象の細胞及び／又はカーゴを含有するための第１容器８０７（例えばサンプルチューブ）、並びに第１容器８０７を第２モジュール８１５と流体接続するためのチューブ８１０を含む。第１モジュール８０５はまた、任意選択的には、エアフィルター装置８０９及びエアフィルター装置８０９を第１容器８０７に流体接続するためのチューブ８１０を含んでもよい。第２モジュール８１５は、エレクトロポレーション装置８２０及びエレクトロポレーション装置を第１モジュール８０５、例えば第１容器８０７、及び第３モジュール８２５に流体接続するためのチューブ８１０、並びに本明細書に記載のような流れ生成手段（例えば蠕動ポンプ）をエレクトロポレーション装置８２０及び第１モジュール８０５、例えば第１容器８０７に流体接続するためのチューブ８１０を含む。第３モジュール８２５は、エレクトロポレートされた細胞を回収するための第２容器８３０（例えば収集管）、並びに第２容器８３０を第２モジュール８１５、例えばエレクトロポレーション装置８２０に流体接続するためのチューブ８１０を含む。第３モジュール８２５はまた、任意選択的には、エアフィルター装置８０９とエアフィルター装置８０９を第２容器８３０に流体接続するためのチューブ８１０とを含んでもよい。任意選択的には、コネクター８５０、例えばルアーロックは、モジュールを共に、例えば、第１モジュール８０５を第２モジュール８１５と、そして第２モジュール８１５を第３モジュール８２５と接続してもよい。本明細書では、第１モジュール８０５、第２モジュール８１５、及び第３モジュール８２５の各々が、別々にパッケージング及び滅菌されてもよいと考えられる。
【０１１６】
本明細書に記載のエレクトロポレーション装置は、図１Ｂに示される配置など、メッシュに基づくエレクトロポレーション装置を上回る利点をいくつか有する。まず、エレクトロポレーションチャンバーの第１入力から第１出力にかけて測定されるとき、エレクトロポレーションチャンバーを通じた移動距離が増加し、電界における対応する増加をもたらすことはない。したがって、細胞は、厳密に直線の流路内よりも長い期間、均一な電界に曝露され、それにより改善されたエレクトロポレーション効率がもたらされ、生存率における対応する低下を伴わない。
【０１１７】
上位メッシュ電極と下位メッシュ電極との間のエレクトロポレーションチャンバー幅（ｗ）が図１Ｂにおいて増加し、より長い移動距離をもたらし得るが、より大きいエレクトロポレーションチャンバー幅はより大きいインピーダンスを有することになり、好適な電界を生成するため、より高い電圧が印加される必要があろう。加えて、より大きい電圧は、細胞生存率に対して有害な影響を有する可能性が高くなる。さらに、平行プレート電極の配置においては、図１Ａなどの場合、電界分布は均一でなくなる。
【０１１８】
したがって、実施形態によると、本明細書に記載のエレクトロポレーション装置は、オフセット入力・出力の設計によって、より短い電極対を有することができ、それによりエレクトロポレーションチャンバーの長さが伸び、電極対距離が増加しない。
【０１１９】
図４は、本明細書に記載のようなエレクトロポレーション装置と先行技術におけるエレクトロポレーション装置との間の差異を例示する表を提示する。かかる差異として、限定はされないが、（１）入力・出力オフセット距離の存在、（２）ＢＴＸ及びＲＰＭＩなどの市販のエレクトロポレーション培地の代わりに、低コンダクタンスで低い容積モル浸透圧濃度のエレクトロポレーション培地の使用、（３）一連の電気パルスで適用される指数関数的な吐出波形、及び（４）段階的な流体フロースキーム、が挙げられる。
【０１２０】
図３Ａ〜図３Ｃにおける例では、ステンレス鋼のマイクロメッシュ電極が利用される一方で、該電極は任意の特定の材料に制限されず、任意の好適な材料で形成されてもよい。例えば、図６に示される通り、好適な材料は、シリコン及びポリイミドを含む。好適なマイクロメッシュ電極を形成するため、シリコン及びポリイミドが使用されてもよいが、かかる材料は、典型的には当該技術分野で公知の微細加工プロトコルを用いてクリーンルーム設備内で加工される。それに対し、ステンレス鋼のマイクロメッシュ電極は、セットアップが容易であり、専用の設備、例えばクリーンルームを必要としない。
【０１２１】
マイクロメッシュが細胞の通過を可能にする孔を有し（例えば、マイクロメッシュ孔は細胞よりも大きい）、且つマイクロメッシュ孔が孔開口部周囲の電極パターニングに適合するという条件で、任意の好適な材料が使用されてもよいことは理解される。
【０１２２】
〔エレクトロポレーション方法及びパラメータ〕
細胞にカーゴをエレクトロポレートする方法が、例えば上記のようなエレクトロポレーション装置とともに本明細書に提供される。この方法は、細胞をカーゴとともにエレクトロポレーションチャンバーに流すことを含み得る。エレクトロポレーションチャンバーは、第１電極（例えば固体電極）、第２電極（例えば固体電極）、及び第１電極と第２電極との間のそこで規定された経路を有する流体チャネル領域（すべてが本明細書に記載の通り）を含む。該装置はまた、本明細書に記載のように細胞及びカーゴのエレクトロポレーションチャンバーへの通過を可能にする第１入力と、本明細書に記載のようにエレクトロポレーションチャンバーからのエレクトロポレートされた細胞の通過を可能にする第１出力とを含む。いくつかの実施形態では、第１入力と第１出力は、オフセット距離だけ隔てられ得る。細胞は、エレクトロポレーション培地に懸濁され得る。第１電極は、本明細書に記載のように第１材料によって囲まれ得、第２電極は、本明細書に記載のように第２材料によって囲まれ得、それらは同じであっても又は異なってもよい。第１材料及び第２材料はまた、本明細書に記載のように第１外部入力と、本明細書に記載のように第１外部出力とを含んでもよい。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションチャンバーは、本明細書に記載のように上位マイクロメッシュ電極、本明細書に記載のように下位マイクロメッシュ電極、並びに本明細書に記載のように細胞及びカーゴが流れるための上位マイクロメッシュ電極と下位マイクロメッシュ電極との間の規定された経路を含む。上位マイクロメッシュ電極と下位マイクロメッシュ電極の各々は、本明細書に記載のように多孔度を有する。加えて、上位マイクロメッシュ電極は、本明細書に記載のように第１材料によって囲まれ得る。第１材料は、細胞のエレクトロポレーションチャンバーへの通過を可能にする、本明細書に記載のように第１入力を含み得る。下位マイクロメッシュ電極は、第２材料によって囲まれ得る。第２材料は、エレクトロポレーションチャンバーからのエレクトロポレートされた細胞の通過を可能にする、本明細書に記載のように第１出力を含み得る。第１入力と第１出力は、本明細書に記載のようにオフセット距離だけ隔てられる。細胞は、エレクトロポレーション培地に懸濁され得る。任意選択的には、上位マイクロメッシュ電極は、本明細書に記載のように第２入力をさらに含んでもよく、且つ／又は下位マイクロメッシュ電極は、本明細書に記載のように第２出力をさらに含んでもよい。
【０１２４】
任意の実施形態では、細胞及びカーゴのフローは、段階的様式で実施されてもよい。例えば、エレクトロポレーションチャンバーの総体積の約半分以上の流量が、指定された時間間隔でエレクトロポレーションチャンバー内にポンピングされ得る。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションチャンバーの総体積にほぼ等しい流量が、エレクトロポレーションチャンバー内にポンピングされ得る。図５は、一連の電気パルス（刺激）の例及び段階的な流体フロースキーム（ポンプ）の例を示す。段階的な流体フロースキームの場合、チャンバー体積は約２２μＬである。秒ごとに、１１μＬがエレクトロポレーションチャンバー内にポンピングされ、流量の半分が置き換わる。これは、所望量の細胞を処理するのに要する期間、反復されてもよい。
【０１２５】
追加的に又は代替的に、任意の好適な時間間隔が、段階的な流体フロースキームに適する任意の量とともに用いられてもよい。例えば、時間間隔は、約０．１秒〜約１０秒、約０．５秒〜約５秒、約１秒〜約２秒、若しくはそれらの間の任意の時間の範囲であってもよい、又はより長い間隔を含んでもよい。いくつかの態様では、時間の関数としてのエレクトロポレーションチャンバー内にポンピングされる流体の量は、入力チャンバーの体積の４分の３、エレクトロポレーションチャンバーの体積の２分の１、エレクトロポレーションチャンバーの体積の４分の１、エレクトロポレーションチャンバーの体積の８分の１、又はそれ以下であってもよい。細胞及びカーゴの任意の好適な流速が、本明細書に記載のパラメータとともに使用可能である。例えば、エレクトロポレーション培地中の細胞及びカーゴの流速は、約０．１ｍｌ／分以上、約０．５ｍｌ／分以上、約１ｍｌ／分以上、約２．５ｍｌ／分以上、約５ｍｌ／分以上、約７．５ｍｌ／分以上、約１０ｍｌ／分以上、約１２．５ｍｌ／分以上、若しくは約１５ｍｌ／分以上、又は約０．１ｍｌ／分〜約１５ｍｌ／分、約０．５ｍｌ／分〜約１５ｍｌ／分、約１ｍｌ／分〜約１５ｍｌ／分、約１ｍｌ／分〜約１２．５ｍｌ／分、約１ｍｌ／分〜約１０ｍｌ／分、約１ｍｌ／分〜約７．５ｍｌ／分、約１ｍｌ／分〜約５ｍｌ／分、若しくは約１ｍｌ／分〜約２．５ｍｌ／分であってもよい。
【０１２６】
任意の実施形態では、細胞は、エレクトロポレーションチャンバー内の均一な又は実質的に均一な電界に曝露される。複数の電気パルスがエレクトロポレーションチャンバー内の細胞に適用され得、ここで各電気パルスは同じか又は異なる。いくつかの実施形態では、直流（ＤＣ）電気パルスが適用される。追加的に又は代替的に、交流（ＡＣ）電気パルスが適用される。任意の実施形態では、各パルスは、指数関数的な吐出波形又は方形波形の形態を有し得る。任意の実施形態では、複数の電気パルスは、指数関数的な吐出波形又は方形波形の双方を含み得る。
【０１２７】
一連の電気パルスの場合、所与の強度の電界を生成するため、１００ｍｓ〜５０００ｍｓごと（例えば、１００ｍｓごと、２５０ｍｓごと、５００ｍｓごと、１０００ｍｓごと、２０００ｍｓごと、３０００ｍｓごとなど）に電圧が電極に印加され得る。これは、所望量の細胞を処理するのに要する期間、反復されてもよい。したがって、態様が連続流と称されてもよい一方で、連続流が段階的な流体フロースキームを含み、流体が既定の時間間隔に応じてエレクトロポレーションチャンバー内に連続的にポンピングされることは理解される。
【０１２８】
追加的に又は代替的に、電気パルス間の任意の好適な持続時間は、エレクトロポレーションチャンバー内の細胞に対する電気パルスの任意の好適な持続時間とともに用いられてもよい。例えば、各パルス間の持続時間は、約０．１秒〜約１５秒、約０．１秒〜約１０秒、約０．１秒〜約５秒、約０．２秒〜約１秒、約０．４秒〜約０．６秒、又はそれらの間の任意の時間の範囲であってもよく、より長い間隔を含んでもよい。いくつかの態様では、電気パルスの持続時間は、約１０ｍｓ〜約１０ｓ、約１０ｍｓ〜約５ｓ、約１０ｍｓ〜約１ｓ、約１０ｍｓ〜約５００ｍｓ、約１０ｍｓ〜約２５０ｍｓ、約５０ｍｓ〜約１５０ｍｓ、約７５ｍｓ〜約１２５ｍｓ、約１００ｍｓ〜約１０ｓ、約１００ｍｓ〜約５、約１００ｍｓ〜約１ｓ、約１００ｍｓ〜約５００ｍｓ、約１００ｍｓ〜約２５０ｍｓの範囲、又はそれらの間の任意の範囲であってもよい。
【０１２９】
好適なパルス数及びパルス間の間隔に関して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のパルスが、単一のパルスよりも望ましい結果を提供してもよい。したがって、パルスは、２〜１０パルス、２〜６パルス、６〜８パルス、又は２〜３パルスの範囲であってもよいと考えられる。最も典型的には、パルスは、後続するパルスと、比較的短い間隔、典型的には０．５秒〜１５秒の間だけ隔てられるが、場合によってはより長い間隔が用いられてよい。
【０１３０】
任意の実施形態では、約０．１ｋＶ／ｃｍ〜約５ｋＶ／ｃｍ、約０．１ｋＶ／ｃｍ〜約３ｋＶ／ｃｍ、約０．１ｋＶ／ｃｍ〜約２ｋＶ／ｃｍ、約０．１ｋＶ／ｃｍ〜約１ｋＶ／ｃｍ、約０．１ｋＶ／ｃｍ〜約０．５ｋＶ／ｃｍ、約０．３ｋＶ／ｃｍ〜約５ｋＶ／ｃｍ、約０．３ｋＶ／ｃｍ〜約３ｋＶ／ｃｍ、約０．３ｋＶ／ｃｍ〜約２ｋＶ／ｃｍ、約０．３ｋＶ／ｃｍ〜約１ｋＶ／ｃｍ、約０．３ｋＶ／ｃｍ〜約０．５ｋＶ／ｃｍ、約０．５ｋＶ／ｃｍ〜約３ｋＶ／ｃｍ、約０．５ｋＶ／ｃｍ〜約２ｋＶ／ｃｍ、約０．５ｋＶ／ｃｍ〜約１ｋＶ／ｃｍ、約０．８ｋＶ／ｃｍ〜約３ｋＶ／ｃｍ、約０．８ｋＶ／ｃｍ〜約２ｋＶ／ｃｍ、約０．８ｋＶ／ｃｍ〜約１ｋＶ／ｃｍ、約１ｋＶ／ｃｍ〜約３ｋＶ／ｃｍ、又は約１ｋＶ／ｃｍ〜約２ｋＶ／ｃｍの電界強度を生成するのに適した電圧で、複数の電気パルスが適用されてもよい。好適な電圧は、約１０Ｖ、約１５Ｖ、約２０Ｖ、約３０Ｖ、約４０Ｖ、約５０Ｖ、約７５Ｖ、約１００Ｖ、又は約２００Ｖ、又は約１０Ｖ〜約２００Ｖ、約１０Ｖ〜約１００Ｖ、約１０Ｖ〜約７５Ｖ、約１０Ｖ〜約５０、約１０Ｖ〜約４０Ｖ、約１０Ｖ〜約３０Ｖ、約１５Ｖ〜約２００Ｖ、約１５Ｖ〜約１００Ｖ、約１５Ｖ〜約７５Ｖ、約１５Ｖ〜約５０、約１５Ｖ〜約４０Ｖ、約１５Ｖ〜約３０Ｖ、約２０Ｖ〜約５０、約２０Ｖ〜約４０Ｖ、約２０Ｖ〜約３０Ｖ、約３０Ｖ〜約５０Ｖ、約３０Ｖ〜約４０Ｖ、又はそれらの中の任意の好適な範囲であってもよい。
【０１３１】
追加的に又は代替的に、各電気パルスは、約１０μｓ以上、約５０μｓ以上、約７５μｓ以上、約１００μｓ以上、約２５０μｓ以上、約５００μｓ以上、約７５０μｓ以上、約１，０００μｓ以上、約５，０００μｓ以上、若しくは約１０，０００μｓ；又は約１０μｓ〜約１０，０００μｓ、約１０μｓ〜約５，０００μｓ、約１０μｓ〜約１，０００μｓ、約１０μｓ〜約７５０μｓ、約１０μｓ〜約５００μｓ、約１０μｓ〜約２５０μｓ、約１０μｓ〜約１００μｓ、約１０μｓ〜約５０μｓ、約１００μｓ〜約１０００μｓ、約１００μｓ〜約７５０μｓ、約１００μｓ〜約５００μｓ、約１００μｓ〜約２５０μｓ、約２５０μｓ〜約１０００μｓ、約２５０μｓ〜約７５０μｓ、約２５０μｓ〜約５００μｓ、約５００μｓ〜約１０００μｓ、若しくは約５００μｓ〜約７５０μｓのパルス幅を有し得る。
【０１３２】
任意の好適な細胞、例えば、哺乳動物細胞、非哺乳動物細胞、又は双方は、カーゴがトランスフェクトされてもよい。好適な哺乳動物細胞の例として、限定はされないが、ＮＫ細胞（例えば、ｈａＮＫ細胞、初代ＮＫ細胞、活性化（ａＮＫ）細胞）、ＥＣ−７細胞（アデノウイルスを産生するために修飾されたＨＥＫ２９３細胞の誘導体）、Ｔ細胞（例えば、初代ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞）、ＣＨＯ−Ｓ細胞、樹状細胞、胚細胞、幹細胞（例えば、脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤ−ＭＳＣ））、上皮細胞、リンパ球、マクロファージ、配偶子細胞、及び線維芽細胞が挙げられる。好適な非哺乳動物細胞の例として、限定はされないが、細菌細胞、及び酵母細胞が挙げられる。任意の好適なカーゴ、例えば核酸が使用されてもよい。核酸は、ＲＮＡ（例えば、合成ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、インビトロ転写ＲＮＡ、ＧＦＰ−ｍＲＮＡなど）及び／又はＤＮＡ（例えば、合成ＤＮＡ、ＧＦＰ−ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡなど）であってもよい。特に、ＮＫ細胞、ＥＣ−７細胞（アデノウイルスを産生するために修飾されたＨＥＫ２９３細胞の誘導体）及びＴ細胞は、本明細書に記載のエレクトロポレーション装置を用いて、ＲＮＡ（例えば、合成ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、インビトロ転写ＲＮＡ、ＧＦＰ−ｍＲＮＡなど）及び／又はＤＮＡ（例えば、合成ＤＮＡ、ＧＦＰ−ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡなど）がトランスフェクトされ得る。さらに、本明細書では、体外受精を実施するため、本明細書に記載のエレクトロポレーション装置が使用可能であると考えられる。例えば、卵及び精子は、卵の受精を達成するため、本明細書に記載のようなエレクトロポレーション装置を通流することが可能である。
【０１３３】
さらに検討される態様では、細胞がトランスフェクトされる場合の培地又はエレクトロポレーション緩衝液は、任意選択的には１つ以上の栄養分を含有する低い伝導率及び低い容積モル浸透圧濃度の培地である。任意の実施形態では、エレクトロポレーション培地は、約０．０５ｍＳ／ｍ以上、約１ｍＳ／ｍ以上、約５ｍＳ／ｍ以上、約１０ｍＳ／ｍ以上、約１５ｍＳ／ｍ以上、約ｍＳ／ｍ以上、約２５ｍＳ／ｍ以上、約３０ｍＳ／ｍ以上、約５０ｍＳ／ｍ以上、約１００ｍＳ／ｍ以上、約１５０ｍＳ／ｍ以上、若しくは約２００ｍＳ／ｍ以上；又は約０．０５ｍＳ／ｍ〜約２００ｍＳ／ｍ；約１ｍＳ／ｍ〜約３０ｍＳ／ｍ、約１ｍＳ／ｍ〜約２０ｍＳ／ｍ、約１ｍＳ／ｍ〜約１０ｍＳ／ｍ、約１ｍＳ／ｍ〜約５ｍＳ／ｍ、約３ｍＳ／ｍ〜約３０ｍＳ／ｍ、約５ｍＳ／ｍ〜約２０ｍＳ／ｍ、若しくは約５ｍＳ／ｍ〜約１５ｍＳ／ｍのコンダクタンスを有し得る。追加的に又は代替的に、エレクトロポレーション培地は、約５０ｍＯｓｍ／ｌ以上、約１００ｍＯｓｍ／ｌ以上、約１５０ｍＯｓｍ／ｌ以上、約２００ｍＯｓｍ／ｌ以上、約２５０ｍＯｓｍ／ｌ以上、約３００ｍＯｓｍ／ｌ以上、約３５０ｍＯｓｍ／ｌ以上、若しくは約４００ｍＯｓｍ／ｌ；又は約５０ｍＯｓｍ／ｌ〜約４００ｍＯｓｍ／ｌ、約５０ｍＯｓｍ／ｌ〜約３００ｍＯｓｍ／ｌ、約５０ｍＯｓｍ／ｌ〜約２００ｍＯｓｍ／ｌ、約１００ｍＯｓｍ／ｌ〜約４００ｍＯｓｍ／ｌ、約１００ｍＯｓｍ／ｌ〜約３００ｍＯｓｍ／ｌ、約２００ｍＯｓｍ／ｌ〜約４００ｍＯｓｍ／ｌ、約２００ｍＯｓｍ／ｌ〜約３００ｍＯｓｍ／ｌ、約２５０ｍＯｓｍ／ｌ〜約４００ｍＯｓｍ／ｌ、若しくは約２５０ｍＯｓｍ／ｌ〜約３００ｍＯｓｍ／ｌの容積モル浸透圧濃度を有してもよい。
【０１３４】
任意の実施形態では、エレクトロポレーション培地は、１つ以上の塩、糖、及び緩衝剤を含んでもよい。好適な塩として、限定はされないが、金属ハロゲン化物塩、リン酸塩、金属硫酸塩、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適な金属ハロゲン化物塩の例として、限定はされないが、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化クロム（ＣｒＣｌ３）、臭化カリウム（ＫＢｒ）、臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、臭化マグネシウム（ＭｇＢｒ２）、フッ化マグネシウム（ＭｇＦ２）、ヨウ化マグネシウム（ＭｇＩ２）、臭化リチウム（ＬｉＢｒ）、ヨウ化カリウム（ＫＩ）、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）、及びヨウ化リチウム（ＬｉＩ）が挙げられる。好適なリン酸塩の例として、限定はされないが、リン酸一ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、リン酸二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、リン酸三ナトリウム（Ｎａ３ＰＯ４）、リン酸一マグネシウム（Ｍｇ（Ｈ２ＰＯ４）２）、リン酸二マグネシウム（ＭｇＨＰＯ４）、リン酸三マグネシウム（Ｍｇ３（ＰＯ４）２、リン酸一カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、リン酸二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、リン酸三カリウム（Ｋ３ＰＯ４）、リン酸一カルシウム（Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２）、リン酸二カルシウム（ＣａＨＰＯ４）、リン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２）、及びリン酸クロム（ＣｒＰＯ４）が挙げられる。好適な金属硫酸塩の例として、限定はされないが、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、硫酸カリウム（Ｋ２ＳＯ４）、硫酸カルシウム（ＣａＳＯ４）、及び硫酸クロム（Ｃｒ２（ＳＯ４）３）が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つ以上の塩は、塩化カリウム、塩化マグネシウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、及びそれらの組み合わせであってもよい。
【０１３５】
好適な糖の例として、単糖、二糖、又はそれらの組み合わせが挙げられる。好適な単糖として、限定はされないが、グルコース、フルクトース、及びガラクトースが挙げられる。好適な二糖として、限定はされないが、グルコース、フルクトース、及びガラクトースのうちの２つから形成される二糖が挙げられる。例えば、好適な二糖は、スクロース、ラクトース、麦芽糖、トレハロース、又はそれらの組み合わせであり得る。好適な緩衝剤の例として、限定はされないが、ヘペス、トリス（ヒドロキシメチル）、及びＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）が挙げられる。
【０１３６】
任意の実施形態では、１つ以上の塩の各々は、約０．１ｍＭ〜約２００ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約８０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約６０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約４０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、又は約１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度でエレクトロポレーション培地中に存在してもよい。例えば、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、及びＭｇＳＯ４などの塩は、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度でエレクトロポレーション培地中に存在し得る。糖は、約２０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約２００ｍＭ、又は約４０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度でエレクトロポレーション培地中に存在してもよい。緩衝剤は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、又は約１５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度でエレクトロポレーション培地中に存在してもよい。
【０１３７】
他の好適な培地として、限定はされないが、表１に示される通り、Ｃｗ１００（０．１１Ｓ／ｍ、０．１２ｏｓｍ／ｌ）又はＣｗ２４０が挙げられる。市販のエレクトロポレーション培地が利用されてもよいが、準最適であることが示された。かかる市販の培地は、ヘペスの存在下又は不在下で、ＲＰＭＩ（１．３７Ｓ／ｍ、０．２８ｏｓｍ／ｌ）、ＢＴＸ（８ｍＳ／ｍ、０．２７ｏｓｍ／ｌ）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、希釈されたＰＢＳ、又はＰＢＳを含む。培地は、一般に導電性培地であり、さらに滅菌されてもよい。
【０１３８】
【表１】
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【０１３９】
任意の実施形態では、エレクトロポレーションにおける細胞は、約１×１０６個の細胞／ｍｌ以上、約１０×１０６個の細胞／ｍｌ以上、約５０×１０６個の細胞／ｍｌ以上、約１００×１０６個の細胞／ｍｌ以上、約１５０×１０６個の細胞／ｍｌ以上、約２００×１０６個の細胞／ｍｌ以上、約２５０×１０６個の細胞／ｍｌ以上、約３００×１０６個の細胞／ｍｌ以上、約４００×１０６個の細胞／ｍｌ以上、若しくは約５００×１０６個の細胞／ｍｌ；又は約１×１０６個の細胞／ｍｌ〜約３００×１０６個の細胞／ｍｌ、約１×１０６個の細胞／ｍｌ〜約２５０×１０６個の細胞／ｍｌ、約１×１０６個の細胞／ｍｌ〜約２００×１０６個の細胞／ｍｌ、約１×１０６個の細胞／ｍｌ〜約１５０×１０６個の細胞／ｍｌ、約１×１０６個の細胞／ｍｌ〜約１００×１０６個の細胞／ｍｌ、約１×１０６個の細胞／ｍｌ〜約５０×１０６個の細胞／ｍｌ、約１×１０６個の細胞／ｍｌ〜約３００×１０６個の細胞／ｍｌ、約１×１０６個の細胞／ｍｌ〜約２５０×１０６個の細胞／ｍｌ、約１０×１０６個の細胞／ｍｌ〜約２００×１０６個の細胞／ｍｌ、約１０×１０６個の細胞／ｍｌ〜約１５０×１０６個の細胞／ｍｌ、約１０×１０６個の細胞／ｍｌ〜約１００×１０６個の細胞／ｍｌ、約１０×１０６個の細胞／ｍｌ〜約５０×１０６個の細胞／ｍｌ、約１００×１０６個の細胞／ｍｌ〜約３００×１０６個の細胞／ｍｌ、約１００×１０６個の細胞／ｍｌ〜約２５０×１０６個の細胞／ｍｌ、約１００×１０６個の細胞／ｍｌ〜約２００×１０６個の細胞／ｍｌ、若しくは約１００×１０６個の細胞／ｍｌ〜約１５０×１０６個の細胞／ｍｌの細胞密度でエレクトロポレーション培地中に存在してもよい。
【０１４０】
好適な容量に関しては、容量は約１μＦ〜約１５０μＦの範囲であってもよいと考えられる。いくつかの実施形態では、容量は、約１〜１００μＦ、約５〜約７５μＦ、約５〜約５０μＦ、約１０〜約４０μＦ、又は約１０〜約３０μＦ、又は約１０〜約２５μＦの範囲であってもよい。他の実施形態では、容量は約１０μＦである。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、複数の電気パルスは、対応する短い時定数とともに利用されてもよい。いくつかの態様では、３０ミリ秒未満、２０ミリ秒未満、１０ミリ秒未満、又は５ミリ秒未満の時定数が使用されてもよい。他の態様では、時定数は、約０．５〜３０ミリ秒、約１〜２０ミリ秒、及び約５〜１５ミリ秒；又は約１０ミリ秒の範囲であってもよい。
【０１４２】
いくつかの態様では、エレクトロポレーション用の電界強度は、約０．３〜３ｋＶ／ｃｍの間である。より低い電界強度（例えば、約０．５〜１ｋＶ／ｃｍ）がＥＣ−７細胞に適することが見出された一方で、より高い電界強度（例えば、約１〜３ｋＶ／ｃｍ）がｈａｎｋ細胞に適することが見出された。一般に、約０．１〜約５ｋＶ／ｃｍの範囲のエレクトロポレーション用の電界強度が本明細書で検討される。電圧は、好適な電界強度を生成するように選択されてもよい。
【０１４３】
一般に、インピーダンス（Ｒｐ）は、約２００Ω〜無限大、又はそれ以外の場合、約２００Ω〜最大約１ｋの範囲であってもよい。
【０１４４】
エレクトロポレーション反応に添加されるカーゴ、例えば細胞内に輸送されるべき材料の濃度は、約５０μｇ／ｍｌ以上、約１００μｇ／ｍｌ以上、約２００μｇ／ｍｌ以上、約３００μｇ／ｍｌ以上、約４００μｇ／ｍｌ以上、又は約５００μｇ／ｍｌ以上；約５０μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ〜約４００μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ〜約３００μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ〜約２００μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ〜約４００μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ〜約３００μｇ／ｍｌ、又は約１００μｇ／ｍｌ〜約２００μｇ／ｍｌの濃度を有する。いくつかの態様では、ＧＦＰ−ｍＲＮＡ又はＧＦＰ−ＤＮＡが、約５０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、１００〜３００μｇ／ｍｌ、５０〜１００μｇ／ｍｌの濃度で、エレクトロポレーション培地に添加された一方で、他の実施形態では、デキストラン５００ｋが、約５０μｇ／ｍｌの濃度で、エレクトロポレーション反応に添加された。
【０１４５】
いくつかの態様では、単一のチャンバー装置内で、４×１０７個の細胞／ｍｌ（１３．２ｍＬ（５．２８×１０８個の細胞））で最大７．３３ｕＬ／ｓが３０分以内に達成可能である。３０分以内に２０×１０９個の細胞を達成するため、細胞密度を４倍増加させてもよく、且つ／又は複数のエレクトロポレーションチャンバーを用いて並行処理が実施されてもよい。
【０１４６】
いくつかの態様とさらには下に提供される例では、エレクトロポレーションのエレクトロニクス及びパラメータは、ＮＫ細胞（例えば、ｈａＮＫ細胞、初代ＮＫ細胞、活性化（ａＮＫ）細胞）、ＥＣ７細胞、樹状細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞、Ｔ細胞（例えば、初代ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞）、及び幹細胞（例えば、ＡＤ−ＭＳＣ細胞）のエレクトロポレーション専用に設計され得る。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、該細胞は、ＮＫ細胞（例えば、ｈａＮＫ細胞、初代ＮＫ細胞、活性化（ａＮＫ）細胞）、ＥＣ７細胞、樹状細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞、Ｔ細胞（例えば、初代ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞）、及び幹細胞（ＡＤ−ＭＳＣ細胞）の１つ以上であり、エレクトロポレーションパラメータの１つ以上は、次の通りである：（ｉ）電界強度は、約２０Ｖ〜約５０Ｖの電圧で適用され；（ｉｉ）パルス幅は約１０μｓ〜約７５０μｓであり；且つ（ｉｉｉ）エレクトロポレーション培地中の細胞の細胞密度は、約５×１０６個の細胞／ｍｌ〜約３００×１０６個の細胞／ｍｌである。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、細胞はＥＣ−７細胞であり、カーゴはＤＮＡであり、且つエレクトロポレーションパラメータの１つ以上は次の通りである：（ｉ）電界強度は、約２０Ｖ〜約５０Ｖ、約２０Ｖ〜４０Ｖ、又は約２０Ｖ〜約３０Ｖの電圧で適用され；（ｉｉ）パルス幅は、約１０μｓ〜約１００μｓ、１０μｓ〜約７５μｓ、又は１０μｓ〜約５０μｓであり；（ｉｉｉ）パルス数は、２〜６又は２〜３であり、且つ（ｉｖ）エレクトロポレーション培地中の細胞の細胞密度は、約１０×１０６個の細胞／ｍｌ〜約２５０×１０６個の細胞／ｍｌ、約１０×１０６個の細胞／ｍｌ〜約１００×１０６個の細胞／ｍｌ、又は約５０×１０６個の細胞／ｍｌ〜約１００×１０６個の細胞／ｍｌである。追加的に又は代替的に、ＤＮＡカーゴがエレクトロポレートされたＥＣ−７細胞は、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９５％のトランスフェクション効率とともに、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％の生存率を有し得る。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、細胞はＣＨＯ−Ｓ細胞であり、カーゴはＤＮＡであり、且つエレクトロポレーションパラメータの１つ以上は次の通りである：（ｉ）電界強度は、約２０Ｖ〜約５０Ｖ、又は約３０Ｖ〜５０Ｖ、約４０Ｖ〜約５０Ｖの電圧で適用され；（ｉｉ）パルス幅は、約１００μｓ〜約７５０μｓ、約２５０μｓ〜約７５０μｓ、又は約５００μｓ〜約７５０μｓであり；（ｉｉｉ）パルス数は、２〜６又は２〜３であり、且つ（ｉｖ）エレクトロポレーション培地中の細胞の細胞密度は、約５０×１０６個の細胞／ｍｌ〜約２５０×１０６個の細胞／ｍｌ、約５０×１０６個の細胞／ｍｌ〜約１２５×１０６個の細胞／ｍｌ、又は約５０×１０６個の細胞／ｍｌ〜約１００×１０６個の細胞／ｍｌである。追加的に又は代替的に、ＤＮＡカーゴがエレクトロポレートされたＣＨＯ−Ｓ細胞は、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％のトランスフェクション効率とともに、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％の生存率を有し得る。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、細胞はＴ細胞（例えば、初代ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞）であり、カーゴはＤＮＡ又はＲＮＡであり、且つエレクトロポレーションパラメータの１つ以上は次の通りである：（ｉ）電界強度は、約２０Ｖ〜約５０Ｖ、又は約３０Ｖ〜５０Ｖ、約４０Ｖ〜約５０Ｖの電圧で適用され；（ｉｉ）パルス幅は、約１００μｓ〜約７５０μｓ、約１００μｓ〜約５００μｓ、又は約２００μｓ〜約４００μｓであり；（ｉｉｉ）パルス数は、２〜１０又は２〜６であり、且つ（ｉｖ）エレクトロポレーション培地中の細胞の細胞密度は、約１０×１０６個の細胞／ｍｌ〜約３００×１０６個の細胞／ｍｌ、約２０×１０６個の細胞／ｍｌ〜約２５０×１０６個の細胞／ｍｌ、又は約１０×１０６個の細胞／ｍｌ〜約２００×１０６個の細胞／ｍｌである。追加的に又は代替的に、ＤＮＡ又はＲＮＡカーゴがエレクトロポレートされたＴ細胞（例えば、初代ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞）は、少なくとも約２０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９９％のトランスフェクション効率とともに、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％の生存率を有し得る。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、細胞はＮＫ細胞（例えば、ｈａＮＫ細胞、初代ＮＫ細胞、活性化（ａＮＫ）細胞）であり、カーゴはＤＮＡ又はＲＮＡであり、且つエレクトロポレーションパラメータの１つ以上は次の通りである：（ｉ）電界強度は、約２０Ｖ〜約５０Ｖ、又は約３０Ｖ〜５０Ｖ、約４０Ｖ〜約５０Ｖの電圧で適用され；（ｉｉ）パルス幅は、約１００μｓ〜約７５０μｓ、約２００μｓ〜約７５０μｓ、又は約２００μｓ〜約６００μｓであり；（ｉｉｉ）パルス数は、２〜６又は２〜３であり、且つ（ｉｖ）エレクトロポレーション培地中の細胞の細胞密度は、約１０×１０６個の細胞／ｍｌ〜約３００×１０６個の細胞／ｍｌ、約１０×１０６個の細胞／ｍｌ〜約２５０×１０６個の細胞／ｍｌ、又は約１０×１０６個の細胞／ｍｌ〜約１００×１０６個の細胞／ｍｌである。追加的に又は代替的に、ＤＮＡ又はＲＮＡカーゴがエレクトロポレートされたＮＫ細胞（例えば、ｈａＮＫ細胞、初代ＮＫ細胞、活性化（ａＮＫ）細胞）は、少なくとも約１０％、少なくとも約５０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％のトランスフェクション効率とともに、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％の生存率を有し得る。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、細胞は樹状細胞であり、カーゴはＤＮＡ又はＲＮＡであり、且つエレクトロポレーションパラメータの１つ以上は次の通りである：（ｉ）電界強度は、約２０Ｖ〜約５０Ｖ、又は約３０Ｖ〜５０Ｖ、約３０Ｖ〜約４０Ｖの電圧で適用され；（ｉｉ）パルス幅は、約１００μｓ〜約７５０μｓ、約１００μｓ〜約５００μｓ、又は約２００μｓ〜約４００μｓであり；（ｉｉｉ）パルス数は、２〜１０又は６〜８あり、且つ（ｉｖ）エレクトロポレーション培地中の細胞の細胞密度は、約１０×１０６個の細胞／ｍｌ〜約１００×１０６個の細胞／ｍｌ、約１０×１０６個の細胞／ｍｌ〜約５０×１０６個の細胞／ｍｌ、又は約１０×１０６個の細胞／ｍｌ〜約２５×１０６個の細胞／ｍｌである。追加的に又は代替的に、ＤＮＡ又はＲＮＡカーゴがエレクトロポレートされた樹状細胞は、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％のトランスフェクション効率とともに、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％の生存率を有し得る。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、細胞は幹細胞（例えば、ＡＤ−ＭＳＣ細胞）であり、カーゴはＤＮＡであり、且つエレクトロポレーションパラメータの１つ以上は次の通りである：（ｉ）電界強度は、約２０Ｖ〜約５０Ｖ、又は約３０Ｖ〜５０Ｖ、約３０Ｖ〜約４０Ｖの電圧で適用され；（ｉｉ）パルス幅は、約５０μｓ〜約２５０μｓ、約５０μｓ〜約１００μｓ、又は約１００μｓ〜約２００μｓであり；（ｉｉｉ）パルス数は、２〜１０又は６〜８であり、且つ（ｉｖ）エレクトロポレーション培地中の細胞の細胞密度は、約１０×１０６個の細胞／ｍｌ〜約１００×１０６個の細胞／ｍｌ、約１０×１０６個の細胞／ｍｌ〜約５０×１０６個の細胞／ｍｌ、又は約１０×１０６個の細胞／ｍｌ〜約２５×１０６個の細胞／ｍｌである。追加的に又は代替的に、ＤＮＡカーゴがエレクトロポレートされた幹細胞（例えば、ＡＤ−ＭＳＣ細胞）は、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％のトランスフェクション効率とともに、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％の生存率を有し得る。
【０１５４】
本明細書に記載の方法は、一過性トランスフェクション又は安定なトランスフェクションに適用することができる。用語「一過性トランスフェクション」は、限られた期間だけ細胞内に存在し、ゲノムに組み込まれない核酸の導入又はトランスフェクションを指す。用語「安定なトランスフェクション」は、トランスフェクトされた核酸の核ゲノムへの組込み、又は細胞内の染色体外の複製エピソームとしてのトランスフェクトされたプラスミドの維持を通じて目的の遺伝子の永久発現をもたらすトランスフェクションを指す。
【０１５５】
任意の実施形態では、本明細書に記載の方法は、例えば本明細書に記載のようなマイクロ流体デバイスを使用する、第１細胞選別ステップ及び／又は第２細胞選別ステップをさらに含んでもよい。第１細胞選別ステップは、圧力を加えて、細胞を含む第１溶液の、本明細書に記載のような複数のポスト列を含む本明細書に記載のようなマイクロ流体チャンバーの通流を引き起こし、細胞をポスト列によりチャンバーの側面に偏向させ、本明細書に記載のような第１出力機構を出る溶液から細胞を枯渇させ、本明細書に記載のような第２出力機構を出る溶液中で細胞を濃縮することにより、細胞をエレクトロポレーションチャンバーへの導入前に選別することができる。第２出力機構を出る細胞は、カーゴとともにエレクトロポレーションチャンバー内に導入され得る。第２細胞選別ステップは、圧力を加えて、エレクトロポレートされた細胞を含む第４溶液の、本明細書に記載のような複数のポスト列を含む本明細書に記載のようなマイクロ流体チャンバーの通流を引き起こし、エレクトロポレートされた細胞をポスト列によりチャンバーの側面に偏向させ、本明細書に記載のような第３出力機構を出る溶液からエレクトロポレートされた細胞を枯渇させ、本明細書に記載のような第４出力機構を出る溶液中でエレクトロポレートされた細胞を濃縮することにより、エレクトロポレートされた細胞を、エレクトロポレーションチャンバーを出てから選別することができる。
【０１５６】
本明細書に提供される技術及び方法は、ワークフローの一部として種々のデバイス又はプラットフォームに組み込まれてもよい。例えば、本明細書に記載のようなエレクトロポレーション装置は、例えばカートリッジ形態で自動化デバイスに組み込むことができ、ここでエレクトロポレーションは、細胞に対する１つ以上の他の自動化プロセスと併せて実施され得る。例えば、自動化エレクトロポレーションは、特許文献１（その全体が参照により援用される）に記載のような自動化された細胞培養及び収集と併せて実施され得る。
【０１５７】
他の態様では、インビボトランスフェクションの方法が提供され、ここで上記方法は実施され、例えば等張性緩衝液と混合されたトランスフェクト細胞は、疾患又は障害を治療するため、患者に投与されてもよい。疾患の例として、限定はされないが、ミトコンドリア障害、心機能不全、心不全、自閉症、糖尿病、及び聴覚消失が挙げられる。本明細書では、本明細書に記載のエレクトロポレーション装置が、薬剤又は製剤の送達に寄与する、例えば糖尿病を治療するためのインスリン又は薬剤の送達に寄与するため、対象の標的組織への適用に適応されてもよいことも考えられる。例えば、エレクトロポレーション用の電極が皮膚表面に適用されてもよい、又は針状電極対が皮下に施されてもよい。本明細書では、エレクトロポレーション装置及び方法が、アデノウイルス産生、タンパク質の生成、細胞免疫療法、又は再生医療に対して使用されてもよいことも考えられる。
【０１５８】
本明細書では、キットも提供される。例えば、キットは、本明細書に記載のようなエレクトロポレーション装置、トランスフェクション対象の細胞及びカーゴを含有するための第１容器、エレクトロポレートされた細胞を含有するための第２容器、第１容器及び第２容器をエレクトロポレーション装置に流体接続するためのチューブ、並びに任意選択的には好適な試薬を含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットは、例えば第１容器及びチューブの第１部分を含有する第１モジュール（例えば、第１モジュール８０５）を含む第１パッケージを含んでもよい。キットは、例えばエレクトロポレーション装置及びチューブの第２部分を含有する第２モジュール（例えば、第２モジュール８１５）を含む隔てられた第２パッケージをさらに含んでもよい。キットはまた、例えば第２容器及びチューブの第３部分を含有する第３モジュール（例えば、第３モジュール８２５）を含む隔てられた第３パッケージを含んでもよい。任意選択的には、試薬は、隔てられた第４パッケージ内に存在してもよい。第１，第２、第３、及び第４パッケージは、滅菌されてもよい。好適な試薬として、限定はされないが、本明細書に記載のようなトランスフェクション対象の細胞、本明細書に記載のようなエレクトロポレーション培地、及びそれらの組み合わせが挙げられる。追加的に又は代替的に、キットは、エレクトロポレーションチップ、接続チューブ、装置、エレクトロポレーション用ツール、エレクトロポレーション緩衝液、添加物、試薬、及びそれらの組み合わせをさらに含んでもよい。
［実施例］
〔実施例１．ｈａＮＫ細胞のトランスフェクション〕
いくつかの態様では、ｈａＮＫ細胞のエレクトロポレーションのための条件を下の表２に示す。
【０１５９】
【表２】
2021535738.tif 000004
【０１６０】
図７Ａ〜図Ｅは、エレクトロポレーション反応の実験結果を示す。図７Ａは、種々の実験条件とともに様々な効率及び生存率を示す。特に、ＩＯＣＯエレクトロポレーション装置を用いての１．５ｋｖ／ｃｍ、Ｒｐ１ｋ、１０ｕＦの条件により、ｈａＮＫ細胞へのＧＦＰ−ｍＲＮＡのエレクトロポレーションについて、７０％超の生存率で８０％超の効率が得られた。「ｒｅｇ」という名称は、元のマイクロメッシュを指す一方で、「オフセット」は、オフセットマイクロメッシュ（ｏｆｆｓｅｔ  ｍｉｃｒｏｍｅｓｈ）を指す。図７Ｂは、ｈａｎｋ細胞にエレクトロポレートされているＧＦＰ−ｍＲＮＡの顕微鏡画像を示す。図７Ｃ及び７Ｄは、細胞選別の結果を示し、ここで図７Ｃは生細胞を示し、図７Ｄはエレクトロポレートされた細胞を示す。図７Ｅは、細胞選別結果に対応するヒストグラムを示し、対照細胞及びＧＦＰがエレクトロポレートされた細胞を示す。
【０１６１】
図８Ａ〜図８Ｄは、様々なエレクトロポレーション実験条件下での別の実験結果のセットを示し、ＧＦＰ−ｍＲＮＡのｈａＮＫへのエレクトロポレーションで、５０％超の効率及び７０％超の生存率が得られた。図８Ｂ及び図８Ｃは、細胞選別の結果を示し、ここで図８Ｂは生細胞を示し、図８Ｃはエレクトロポレートされた細胞を示す。図８Ｄは、細胞選別結果に対応するヒストグラムを示し、対照細胞及びＧＦＰがエレクトロポレートされた細胞を示す。ＧＦＰの発現は、生細胞内で計数した（ヨウ化プロピジウム陰性、ＰＩ−）。ＣＴＬは対照実験を表す。
【０１６２】
〔実施例２．ＥＣ７細胞のトランスフェクション〕
ＥＣ７細胞のエレクトロポレーションにおける典型的条件を下の表３に示す。
【０１６３】
【表３】
2021535738.tif 000005
【０１６４】
図９Ａ〜図９Ｄは、ＥＣ−７細胞におけるエレクトロポレーション反応の実験結果である。図９Ａは、種々の実験条件とともに様々な効率及び生存率を示す。特に、ＩＯＣＯエレクトロポレーション装置を用いての１ｋｖ／ｃｍ、Ｒｐ２００、１０ｕＦの条件により、ＥＣ−７細胞へのＧＦＰ−ＤＮＡのエレクトロポレーションで、約９０％超の効率及び約５０％超の生存率が得られた。図９Ｂ〜図９Ｃは、細胞選別の結果を示し、ここで図９Ｂは生細胞を示し、図９Ｃはエレクトロポレートされた細胞を示す。図９Ｄは、細胞選別結果に対応するヒストグラムであり、対照細胞及びＧＦＰがエレクトロポレートされた細胞を示す。
【０１６５】
図１０Ａ〜図１０Ｅは、様々なエレクトロポレーション実験条件下でのＥＣ−７細胞における追加的な実験結果のセットを示す。図１０Ｂ、図１０Ｃ、及び図１０Ｄは、細胞選別の結果を示し、ここで図１０Ｂは生細胞を示し、図１０Ｃ及び図１０Ｄはエレクトロポレートされた生細胞を示す。図１０Ｅは、細胞選別結果に対応するヒストグラムとともに、対照細胞及びＧＦＰがエレクトロポレートされた細胞を示す。ＧＦＰの発現は、生細胞内で計数した（ヨウ化プロピジウム陰性、ＰＩ−）。ＣＴＬは対照実験を表す。
【０１６６】
図１１Ａ〜図１１Ｃは、図３Ａ〜図Ｃのエレクトロポレーション装置・オフセットチャンバーを用いてＥＣ−７細胞へ巧みにエレクトロポレートされたＧＦＰ−ＤＮＡの画像を示す。
【０１６７】
図１１Ａは、エレクトロポレーションの２０時間後に得たものであり、ＧＦＰ−ＤＮＡ及びＧＦＰ−ＡＤ５（ＡＤ５ウイルス産生をコードするＤＮＡ）のＥＣ−７細胞へのエレクトロポレーションを示す。図１１Ｂは、エレクトロポレーションの４４時間後に得たものであり、ＧＦＰ−ＤＮＡ及びＤＮＡシャトルベクターのＥＣ−７細胞へのエレクトロポレーションを示す。図１１Ｃは、エレクトロポレーションの６日後に得たものであり、マイクロメッシュ対キュベットでのエレクトロポレーション結果の比較を示す。
【０１６８】
本明細書中に提示される実施形態によると、図１１Ｃは、ＥＣ７細胞におけるＡＤ５ウイルス産生の早期段階中でのコメット形成も示す。この一連の画像では、細胞は、クラスター、又は「コメット」状プラークを形成し、各細胞はより円形状になる。
【０１６９】
これら一連の画像によって示される通り、ＥＣ−７細胞は、蛍光タグ化ウイルスＤＮＡ（ＡＤ５ウイルス産生用）を巧みにエレクトロポレートし、ウイルス産生を開始させることができ、本明細書に提供される技術及びシステムが（例えば、ウイルスワクチンにおける使用及びウイルスタンパク質の産生を意図した）アデノウイルス産生に適することが示された。
【０１７０】
図１２Ａ及び１２Ｂは、本明細書に記載の方法及びデバイスを用いてＥＣ７細胞をトランスフェクトすることのさらなる結果を示す。図１２Ａは、カーゴの量がエレクトロポレーション実行間で変動した場合のエレクトロポレーションパラメータの表を示す。図１２Ｂでは、エレクトロポレーションの６日後の画像を示す。エレクトロポレーションの１４日後までに、約７０〜８０％の効率が認められた。トランスフェクション後、複数の「コメット」状クラスターが認められた。約１７００〜１８００万個の細胞／分を、約２４０ｍＳ／ｍのコンダクタンスを有する、エレクトロポレーション緩衝液ｃｗ１００中、約４０ｍ／ｍｌの細胞濃度で、ＥＣ７細胞にトランスフェクトしてもよい。
【０１７１】
〔実施例３．様々な細胞型のエレクトロポレーション〕
他の態様では、種々の異なる細胞型をトランスフェクトするため、本明細書に提供される方法及びシステムを使用してもよい。例えば、本明細書に提供される方法及びシステムにより、最大１０８個又はそれ以上の細胞をトランスフェクトすることができる。ＥＣ７細胞、ｈａＮＫ細胞、ＣＨＯ細胞、及びＴ細胞をトランスフェクトするため、本明細書に提供される方法及びシステムを使用してもよい。例えば、０．６ｍｌ／分の流速及び４×１０７個の細胞／ｍｌの細胞濃度を用いてＥＣ７細胞をトランスフェクトするため、本明細書に提示される方法及び技術を使用してもよい。別の例では、０．３６ｍｌ／分の流速及び３×１０７個の細胞／ｍｌの細胞濃度を用いてｈａＮＫ細胞をトランスフェクトするため、本明細書に提示される方法及び技術を使用してもよい。さらに別の例では、０．４５ｍｌ／分の流速及び２．５×１０７個の細胞／ｍｌの細胞濃度を用いてＣＨＯ細胞をトランスフェクトするため、本明細書に提供される方法及び技術を使用してもよい。Ｔ細胞の場合、０．４４ｍｌ／分の流速及び約２×１０７個の細胞／ｍｌの細胞濃度でＴ細胞をトランスフェクトするため、本明細書に提示される方法及び技術を使用してもよい。これらの条件は、最適な条件を達成するため、さらに変化させてもよい。
【０１７２】
図１３Ａ〜図１３Ｄは、本明細書に記載の方法及びデバイスを使用しての、これらの異なる細胞株における様々なトランスフェクション効率を示す。図１３Ａは、（ＧＦＰ  ｍＲＮＡをトランスフェクトした）ｈａＮＫ細胞における、９０％超の細胞生存率で９５％超のトランスフェクション効率を示す。最大１．２７億個の細胞／分をトランスフェクトした。図１３Ｂは、（ＧＦＰ  ｐｍａｘ  ＤＮＡをトランスフェクトした）ＣＨＯ細胞における、５０％超の細胞生存率で９０％超のトランスフェクション効率を示す。最大１５００万個の細胞／分をトランスフェクトした。図１３Ｃは、（ＧＦＰアデノウイルスＤＮＡをトランスフェクトした）ＥＣ７細胞における、５０％超の細胞生存率で９５％超のトランスフェクション効率を示す。最大２０００万個又はそれ以上の細胞／分をトランスフェクトした。図１３Ｄは、（ＧＦＰ  ｍＲＮＡをトランスフェクトした）Ｔ細胞における、８０％超の細胞生存率で９０％超のトランスフェクション効率を示す。最大８８０万個の細胞／分をトランスフェクトした。
【０１７３】
〔実施例４．初代Ｔ細胞のトランスフェクション〕
他の態様では、ポリ（β−アミノエステル）に付着されたｍＲＮＡを初代Ｔ細胞にエレクトロポレートするため、本明細書に提示される方法及びシステムを使用している。特定のポリ（β−アミノエステル）ポリマーは、有効なＲＮＡトランスフェクション剤として作用することが示されている。
【０１７４】
ｍＲＮＡをＴ細胞に送達するため、ＲＮＡ及びポリ（β−アミノエステル）ポリマーを含むナノ粒子を使用している（例えば、非特許文献４を参照）。例えば、いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）に基づくシェルを用いて作出してもよい。ナノ粒子を適切な標的に標的化するため、標的分子（例えば、抗体の結合ドメイン）をＰＧＡ分子に付着させてもよい。例えば、ナノ粒子をＴ細胞に標的化するため、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８結合ドメインをＰＧＡ分子に付着させてもよい。標的化のため、ＰＧＡ又は任意の他の好適な陰性荷電分子を使用してもよい。特異的標的化又はカチオン膜の会合により、ナノ粒子の取り込みが生じることがある。
【０１７５】
ナノ粒子の内部は、ｍＲＮＡ及びポリ（β−アミノエステル）などの担体分子を含んでもよい。一旦ナノ粒子が細胞内に取り込まれると、ｍＲＮＡは、ナノ粒子の分解により、浸透圧膨張により、又はいくつかの他の好適なプロセスにより、細胞内に放出され、ｍＲＮＡはその各々のタンパク質に転写される。場合によっては、ｍＲＮＡ分解を低減するため、合成ｍＲＮＡを使用してもよい。
【０１７６】
本明細書に提供される方法は、例えば、ｍＲＮＡ及びポリ（β−アミノエステル）（ＰｂＡＥ）担体を用いるか、又はｍＲＮＡ及びポリ（β−アミノエステル）担体をカプセル封入しているナノ粒子を用いることによって、ｍＲＮＡを細胞にトランスフェクトするため、使用してもよい。図１４Ａ〜図１４Ｅは、（遊離ｍＲＮＡでなく、エレクトロポレーションを用いない）ｍＲＮＡと複合体を形成したＰｂＡＥを用いるＴ細胞トランスフェクションを示す。図１３Ａは、本明細書に提供される技術による使用に適したポリ（β−アミノエステル）の構造を示す。図１４Ｂは、ＰｂＡＥを用いてｍＲＮＡをトランスフェクトしたＴ細胞の、フローサイトメトリーを用いた細胞選別結果を示す。図１４Ｃは、ｍＲＮＡ対担体分子の様々な比に基づき、生細胞に対して正規化した結果を示すグラフである。図１４Ｄ及び１４Ｅは、刺激Ｔ細胞（図１４Ｄ）及び非刺激Ｔ細胞（図１４Ｅ）におけるＧＦＰ−ｍＲＮＡトランスフェクションについての様々な条件下での細胞生存率の結果を示す。これらの実験では、ＰｂＡＥ：ＲＮＡの比が６０：１であることで、高レベルの生細胞がもたらされた一方で、高いＧＦＰ送達速度が得られた。
【０１７７】
図１５Ａ及び１５Ｂは、対照細胞（エレクトロポレーションなし）及びエレクトロポレートされた細胞を用いる、Ｔ細胞へのＧＦＰ  ｍＲＮＡトランスフェクションを示す。特に、図１５Ａは、対照細胞（エレクトロポレーションなし）を示し、ここでは主にバックグラウンド蛍光が観察される。図１５Ｂは、エレクトロポレートされた細胞を示し、ヒストグラムによって示されるように、細胞の大部分においてＧＦＰ−ｍＲＮＡが検出される。
【０１７８】
〔実施例５．脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤ−ＭＳＣ）のトランスフェクション〕
脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤ−ＭＳＣ）を、約１×１０５百万個／ミリリットルの密度で剥離し、収集した。細胞をＰＢＳ及びエレクトロポレーション緩衝液で洗浄し、３３０万個の細胞／ミリリットルの密度でエレクトロポレーション緩衝液に懸濁した。各条件では、０．１ミリリットルの最終細胞密度での３０μｇのＤＮＡをエレクトロポレートした。エレクトロポレーション条件は次の通りである：パルス幅＝１００ｕｓ、パルス期間＝３４０ｍｓ、電界強度は下の表４に示すように０．９から１．６ｋＶ／ｃｍにかけて変化する。
【０１７９】
【表４】
2021535738.tif 000006
【０１８０】
エレクトロポレーション後、細胞を３０×１０３個の細胞／ｃｍ２の密度で播種した。エレクトロポレーションの２４時間後、ＧＦＰ発現効率をフローサイトメトリーで検証した。結果を図１６Ａ〜１６Ｄに示す。図１６Ａ〜１６Ｃの各々における１〜８のｘ軸値は、表４に示すような電界強度に対応し、「ＣＴＬ」は、エレクトロポレーションを伴わない対照に対応する。図１６Ａは、エレクトロポレーションの２４時間後の細胞生存率を示す。電界強度が低下すると、生細胞が増加する。図１６Ｂは、エレクトロポレーションの２４時間後、細胞トランスフェクション効率の測定において、フローサイトメトリーによって読み取ったＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の発現を示す。電界が強くなると、より高いパーセントの生細胞がＧＦＰを発現した。図１６Ｃは、ＧＦＰ蛍光の中央値を示し、それはフローサイトメトリー測定においてＧＦＰがいかに高輝度であったかを表す。電界が強くなると、より高輝度のＧＦＰが測定された。結果は、１．１〜１．３ｋｖ／ｃｍ間の電界強度が生存率及び効率の中で最高の性能を示すことがあることを示唆した。この生存率が、真の全生存率を反映するような付着細胞と上清の双方を含むことに注意されたし。図１６Ｄは、ＭＳＣトランスフェクション結果の写真である。左側の写真は、ＭＳＣの形態学を示し、右側の画像は、同じ光場における蛍光画像であり、細胞の大部分が緑色蛍光タンパク質（緑色）を発現することを示す。
【０１８１】
〔実施例６．ＥＣ−７細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞、初代ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞、ｈａＮＫ細胞、初代ＮＫ細胞、活性化ＮＫ細胞、樹状細胞、ＡＤ−ＭＳＣ細胞のトランスフェクション〕
図２Ａに表す装置と類似する装置内で、下の表５中に示すエレクトロポレーションパラメータを用いて、ＥＣ−７細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞、初代ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞、ｈａＮＫ細胞、初代ＮＫ細胞、活性化ＮＫ細胞、樹状細胞、ＡＤ−ＭＳＣ細胞をエレクトロポレートした。
【０１８２】
【表５】
2021535738.tif 000007
【０１８３】
表５で使用したエレクトロポレーション培地（「Ｅｌｅｃｔｒｏ培地」）１及び２の組成物を下の表６及び７に示す。
【０１８４】
【表６】
2021535738.tif 000008
【０１８５】
【表７】
2021535738.tif 000009
【０１８６】
所与のパラメータに従い、表５における細胞をエレクトロポレートした結果を下の表８に提示する。
【０１８７】
【表８】
2021535738.tif 000010
【０１８８】
【表９】
2021535738.tif 000011
【０１８９】
いくつかの実施形態では、特定の実施形態を説明し、主張するために用いられる成分の量、濃度、反応条件などの特性などを表す数は、いくつかの例では用語「約」で修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書及び添付の特許請求の範囲中で示される数値パラメータは、特定の実施形態によって得られるように求められた所望される特性に応じて変化し得る近似である。いくつかの実施形態では、数値パラメータは、報告された有効数字の数に照らして、また通常の丸め技法を適用することにより解釈される必要がある。いくつかの実施形態の広い範囲を示している数値範囲及びパラメータが近似であるにもかかわらず、具体例の中で示される数値は、実行可能な程度に正確に報告される。いくつかの実施形態の中で提示される数値は、必然的にそれら各々の試験測定値中に見出される標準偏差に起因する特定の誤差を含有してもよい。
【０１９０】
本明細書の説明において、また後述する特許請求の範囲全体を通じて使用される通り、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」の意味は、文脈が明確にそうでない旨を表さない限り、複数の参照対象を含む。さらに、本明細書の説明において使用される通り、「ｉｎ」の意味は、文脈が明確にそうでない旨を表さない限り、「ｉｎ」及び「ｏｎ」を含む。文脈がそうでない旨を表さない限り、本明細書に示されるすべての範囲は、それらのエンドポイントを包含するものとして解釈される必要があり、また制限のない範囲は、商業的に実際的な値を含むように解釈される必要がある。同様に、すべての値リストは、文脈がそうでない旨を表さない限り、中間値を包含するものとして考察される必要がある。
【０１９１】
既に本明細書で記載された修飾以外の多くのさらなる修飾が本明細書の発明概念から逸脱しない条件で可能であることも、当業者にとって明白である必要がある。さらに、本明細書及び特許請求の範囲の双方を解釈する場合、すべての用語は、文脈に合致する最も広い可能な様式で解釈される必要がある。特に、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、非排他的様式で要素、構成要素、若しくはステップを指し、参照される要素、構成要素、若しくはステップが、明確に参照されていない他の要素、構成要素、若しくはステップとともに存在するか、又は利用されるか、又は組み合わされてもよいことを示すように解釈される必要がある。本明細書の特許請求の範囲が、Ａ、Ｂ、Ｃ．．．及びＮからなる群から選択されるもの少なくとも１つを指す場合、テキストは、その群から、Ａ＋Ｎ、又はＢ＋Ｎなどでなく、１つの要素のみを必要とするものとして解釈される必要がある。
［符号の説明］
１００  細胞
１０５  チャンバー
１１０  第１入力機構
１１２  第２入力機構
１１５  ポスト
１２０  第１出力機構
１２２  第２出力機構
１３０  偏向点
１５０  天井
１５５  上位領域
１６０  床
１６５  下位領域
２００  ＩＯＣＯエレクトロポレーション装置
２１０  第１入力
２２０  エレクトロポレーションチャンバー
２３０  第１出力
２４０（１）  下位マイクロメッシュ電極
２４０（２）  上位マイクロメッシュ電極
３１０  外部プレート
３１０−３３０  ：エレクトロポレーション装置
３３０（１）  上位メッシュ
３３０（２）  下位メッシュ
３３５  曲線状経路
３５０  シリンジ
３６０  エレクトロポレーターパルサー
３８０  入口
３９０  出口
４１０  カートリッジ
４４０（１）  第１電極
４４０（２）  第２電極
５１０  サンプルチューブ
５２０  生成手段
５３０  エレクトロポレーション装置
５４０  コントローラ
５５０  収集管
５６０  プライミング緩衝液チューブ
５７０  弁
５７５  弁
５７７  緩衝液選別チューブ
５８０  第１のマイクロ流体デバイス
５８５  第２のマイクロ流体デバイス
６００  エレクトロポレーション装置
６２０  入口
６３０  出口
６４０  電極
７００ａ  エレクトロポレーション装置
７００ｂ  エレクトロポレーション装置
７０６  上位表面
７１０  第１入力
７１１  下位表面
７１５（１）  第１材料
７１５（２）  第２材料
７２０  エレクトロポレーションチャンバー
７２５  流体チャネル領域
７３０  第１出力
７３５  経路
７４０（１）  第１電極
７４０（２）  第２電極
７４１（１）  第１電極
７４１（２）  第２電極
７４５  固体金属プレート
７５０  第１外部入力
７６０  第１外部出力
８００  モジュラーシステム
８０５  第１モジュール
８０７  第１容器
８０９  エアフィルター装置
８１０  チューブ
８１５  第２モジュール
８２０  エレクトロポレーション装置
８２５  第３モジュール
８３０  第２容器
８５０  コネクター
８５２  装置
８５４  電力供給
８５６  電源
８５８  制御回路
８６０  エレクトロポレーション装置
８６２  電力変換装置
８６４  パルス回路
８６６  コントローラ
８６８  パルス発生器
８７０  フィードバック信号
８７２  制御信号
８７４  信号
８７６  制御信号
８７８ａ信号
８７８ｂ信号
８８０  信号
８８２  信号
８８４  信号
８８６  装置
８８８  電力供給
８９０  制御回路
８９２  フィルター
８９４  ゲートドライバ
８９６  制御信号
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１Ａ】平行プレート電極（図１Ａ中に示される通り）及び入力と出力との間にオフセットを有しないマイクロメッシュ電極（図１Ｂ中に示される通り）を含む通常のエレクトロポレーション装置を示す。
【図１Ｂ】平行プレート電極（図１Ａ中に示される通り）及び入力と出力との間にオフセットを有しないマイクロメッシュ電極（図１Ｂ中に示される通り）を含む通常のエレクトロポレーション装置を示す。
【図２Ａ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うエレクトロポレーション用の装置の態様を示す。
【図２Ｂ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うエレクトロポレーション用の装置の態様を示す。
【図２Ｃ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う第１電極及び第２電極の態様を示す。
【図２Ｄ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う、本明細書に記載のようなエレクトロポレーション装置内での細胞に対して電気パルスを生成し、提供するための装置のブロック図である。
【図２Ｅ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う本明細書に記載のようなエレクトロポレーション装置内での細胞に対して電気パルスを生成し、提供するためのさらなる装置のブロック図である。
【図３Ａ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う、エレクトロポレーション装置を含むエレクトロポレーション用の装置の態様を示す。図３Ａは、入力・出力チャンバーオフセットエレクトロポレーション装置の構造の図面を示す。
【図３Ｂ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う、エレクトロポレーション装置を含むエレクトロポレーション用の装置の態様を示す。図３Ｂは、入力・出力チャンバーオフセットエレクトロポレーション装置の電界の図面を示す。
【図３Ｃ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う、エレクトロポレーション装置を含むエレクトロポレーション用の装置の態様を示す。図３Ｃは、入力・出力チャンバーオフセットエレクトロポレーション装置を通じた細胞移動距離の関数としての電界強度を示す。
【図３Ｄ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う、エレクトロポレーション装置を含むエレクトロポレーション用の装置の態様を示す。図３Ｄは、本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うエレクトロポレーション装置の代替的配置を示す。
【図３Ｅ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うエレクトロポレーションチャンバー内の経路の態様を示す。
【図３Ｆ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うエレクトロポレーションチャンバー内の経路の態様を示す。
【図３Ｇ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うエレクトロポレーションチャンバー内の経路の態様を示す。
【図３Ｈ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うエレクトロポレーション装置の代替的配置を示す。
【図３Ｉ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うエレクトロポレーション装置の代替的配置を示す。
【図３Ｊ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うエレクトロポレーション装置の代替的配置を示す。
【図３Ｋ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う、細胞を選別するためのマイクロ流体チャンバー例を図示する。
【図３Ｌ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う、細胞を選別するためのマイクロ流体チャンバー例を図示する。
【図３Ｍ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うマイクロ流体チャンバー内のポストの幾何学的形状及びポジショニングの様々な態様を示す図面である。
【図３Ｎ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うマイクロ流体チャンバー内のポストの幾何学的形状及びポジショニングの様々な態様を示す図面である。
【図３Ｏ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うマイクロ流体チャンバー内のポストの幾何学的形状及びポジショニングの様々な態様を示す図面である。
【図３Ｐ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うマイクロ流体チャンバー内のポストの幾何学的形状及びポジショニングの様々な態様を示す図面である。
【図３Ｑ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うマイクロ流体チャンバー内のポストの幾何学的形状及びポジショニングの様々な態様を示す図面である。
【図３Ｒ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うマイクロ流体チャンバー内のポストの幾何学的形状及びポジショニングの様々な態様を示す図面である。
【図３Ｓ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うマイクロ流体チャンバー内のポストの幾何学的形状及びポジショニングの様々な態様を示す図面である。
【図３Ｔ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う、緩衝液を変更するためのマイクロ流体チャンバー例を図示する。
【図３Ｕ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う、細胞選別用の１つのチャンバー及び緩衝液変更用のもう１つのチャンバーといった２つの分かれたチャンバーを有するマイクロ流体チャンバー例を図示する。
【図３Ｖ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うエレクトロポレーション装置の代替的配置を示す。
【図３Ｗ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うエレクトロポレーション装置の代替的配置を示す。
【図３Ｘ】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従うエレクトロポレーション装置を含むエレクトロポレーションシステムのモジュラー配置を示す。
【図４】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う、チャンバーオフセットエレクトロポレーション装置に関連するパラメータの表を示す。
【図５】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う、チャンバーオフセットエレクトロポレーション装置を通流する細胞に適用されてもよい流体フロー波形（ポンプ）及び電気波形（刺激）の例を示す。
【図６】本明細書に提供されるいくつかの実施形態に従う、チャンバーオフセットエレクトロポレーション装置での使用に適した異なる材料で形成されたマイクロメッシュの様々な例を示す。
【図７Ａ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、ｈａＮＫ細胞及び対応するパラメータにおけるエレクトロポレーション実験の結果を示す。
【図７Ｂ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、ｈａＮＫ細胞及び対応するパラメータにおけるエレクトロポレーション実験の結果を示す。
【図７Ｃ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、ｈａＮＫ細胞及び対応するパラメータにおけるエレクトロポレーション実験の結果を示す。
【図７Ｄ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、ｈａＮＫ細胞及び対応するパラメータにおけるエレクトロポレーション実験の結果を示す。
【図７Ｅ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、ｈａＮＫ細胞及び対応するパラメータにおけるエレクトロポレーション実験の結果を示す。
【図８Ａ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、ｈａＮＫ細胞及び対応するパラメータにおけるエレクトロポレーション実験のさらなる結果を示す。
【図８Ｂ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、ｈａＮＫ細胞及び対応するパラメータにおけるエレクトロポレーション実験のさらなる結果を示す。
【図８Ｃ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、ｈａＮＫ細胞及び対応するパラメータにおけるエレクトロポレーション実験のさらなる結果を示す。
【図８Ｄ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、ｈａＮＫ細胞及び対応するパラメータにおけるエレクトロポレーション実験のさらなる結果を示す。
【図９Ａ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、ＥＣ７細胞及び対応するパラメータにおけるエレクトロポレーション実験の結果を示す。
【図９Ｂ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、ＥＣ７細胞及び対応するパラメータにおけるエレクトロポレーション実験の結果を示す。
【図９Ｃ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、ＥＣ７細胞及び対応するパラメータにおけるエレクトロポレーション実験の結果を示す。
【図９Ｄ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、ＥＣ７細胞及び対応するパラメータにおけるエレクトロポレーション実験の結果を示す。
【図１０Ａ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、ＥＣ７細胞及び対応するパラメータにおけるエレクトロポレーション実験のさらなる結果を示す。
【図１０Ｂ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、ＥＣ７細胞及び対応するパラメータにおけるエレクトロポレーション実験のさらなる結果を示す。
【図１０Ｃ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、ＥＣ７細胞及び対応するパラメータにおけるエレクトロポレーション実験のさらなる結果を示す。
【図１０Ｄ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、ＥＣ７細胞及び対応するパラメータにおけるエレクトロポレーション実験のさらなる結果を示す。
【図１０Ｅ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、ＥＣ７細胞及び対応するパラメータにおけるエレクトロポレーション実験のさらなる結果を示す。
【図１１Ａ】エレクトロポレートされたＥＣ７細胞の顕微鏡画像を示す。
【図１１Ｂ】エレクトロポレートされたＥＣ７細胞の顕微鏡画像を示す。
【図１１Ｃ】エレクトロポレートされたＥＣ７細胞の顕微鏡画像を示す。
【図１２Ａ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、トランスフェクトされたＥＣ７細胞のさらなる結果を示す。
【図１２Ｂ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、トランスフェクトされたＥＣ７細胞のさらなる結果を示す。
【図１３Ａ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、異なる細胞株における様々なトランスフェクション効率を示す。
【図１３Ｂ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、異なる細胞株における様々なトランスフェクション効率を示す。
【図１３Ｃ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、異なる細胞株における様々なトランスフェクション効率を示す。
【図１３Ｄ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、異なる細胞株における様々なトランスフェクション効率を示す。
【図１４Ａ】本明細書に記載のようなＰｂＡＥを使用する、ｍＲＮＡをＴ細胞に導入するためのトランスフェクション実験の結果を示す。
【図１４Ｂ】本明細書に記載のようなＰｂＡＥを使用する、ｍＲＮＡをＴ細胞に導入するためのトランスフェクション実験の結果を示す。
【図１４Ｃ】本明細書に記載のようなＰｂＡＥを使用する、ｍＲＮＡをＴ細胞に導入するためのトランスフェクション実験の結果を示す。
【図１４Ｄ】本明細書に記載のようなＰｂＡＥを使用する、ｍＲＮＡをＴ細胞に導入するためのトランスフェクション実験の結果を示す。
【図１４Ｅ】本明細書に記載のようなＰｂＡＥを使用する、ｍＲＮＡをＴ細胞に導入するためのトランスフェクション実験の結果を示す。
【図１５Ａ】本明細書に記載の通り、エレクトロポレーションの存在下及び不在下でのｍＲＮＡをＴ細胞に導入するためのトランスフェクション実験の結果を示す。
【図１５Ｂ】本明細書に記載の通り、エレクトロポレーションの存在下及び不在下でのｍＲＮＡをＴ細胞に導入するためのトランスフェクション実験の結果を示す。
【図１６Ａ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤ−ＭＳＣ）及び対応するパラメータにおけるトランスフェクション実験の結果を示す。
【図１６Ｂ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤ−ＭＳＣ）及び対応するパラメータにおけるトランスフェクション実験の結果を示す。
【図１６Ｃ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤ−ＭＳＣ）及び対応するパラメータにおけるトランスフェクション実験の結果を示す。
【図１６Ｄ】本明細書に記載の方法及びデバイスを使用する、脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤ−ＭＳＣ）及び対応するパラメータにおけるトランスフェクション実験の結果を示す。
【図１Ａ】
2021535738.tif 000012
【図１Ｂ】
2021535738.tif 000013
【図２Ａ】
2021535738.tif 000014
【図２Ｂ】
2021535738.tif 000015
【図２Ｃ】
2021535738.tif 000016
【図２Ｄ】
2021535738.tif 000017
【図２Ｅ】
2021535738.tif 000018
【図３Ａ】
2021535738.tif 000019
【図３Ｂ】
2021535738.tif 000020
【図３Ｃ】
2021535738.tif 000021
【図３Ｄ】
2021535738.tif 000022
【図３Ｅ】
2021535738.tif 000023
【図３Ｆ】
2021535738.tif 000024
【図３Ｇ】
2021535738.tif 000025
【図３Ｈ】
2021535738.tif 000026
【図３Ｉ】
2021535738.tif 000027
【図３Ｊ】
2021535738.tif 000028
【図３Ｋ】
2021535738.tif 000029
【図３Ｌ】
2021535738.tif 000030
【図３Ｍ】
2021535738.tif 000031
【図３Ｎ】
2021535738.tif 000032
【図３Ｏ】
2021535738.tif 000033
【図３Ｐ】
2021535738.tif 000034
【図３Ｑ】
2021535738.tif 000035
【図３Ｒ】
2021535738.tif 000036
【図３Ｓ】
2021535738.tif 000037
【図３Ｔ】
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【図３Ｕ】
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【図３Ｖ】
2021535738.tif 000040
【図３Ｗ】
2021535738.tif 000041
【図３Ｘ】
2021535738.tif 000042
【図４】
2021535738.tif 000043
【図５】
2021535738.tif 000044
【図６】
2021535738.tif 000045
【図７Ａ】
2021535738.tif 000046
【図７Ｂ】
2021535738.tif 000047
【図７Ｃ】
2021535738.tif 000048
【図７Ｄ】
2021535738.tif 000049
【図７Ｅ】
2021535738.tif 000050
【図８Ａ】
2021535738.tif 000051
【図８Ｂ】
2021535738.tif 000052
【図８Ｃ】
2021535738.tif 000053
【図８Ｄ】
2021535738.tif 000054
【図９Ａ】
2021535738.tif 000055
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
2021535738.tif 000057
【図９Ｄ】
2021535738.tif 000058
【図１０Ａ】
2021535738.tif 000059
【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
2021535738.tif 000062
【図１０Ｅ】
2021535738.tif 000063
【図１１Ａ】
2021535738.tif 000064
【図１１Ｂ】
2021535738.tif 000065
【図１１Ｃ】
2021535738.tif 000066
【図１２Ａ】
2021535738.tif 000067
【図１２Ｂ】
2021535738.tif 000068
【図１３Ａ】
2021535738.tif 000069
【図１３Ｂ】
2021535738.tif 000070
【図１３Ｃ】
2021535738.tif 000071
【図１３Ｄ】
2021535738.tif 000072
【図１４Ａ】
2021535738.tif 000073
【図１４Ｂ】
2021535738.tif 000074
【図１４Ｃ】
2021535738.tif 000075
【図１４Ｄ】
2021535738.tif 000076
【図１４Ｅ】
2021535738.tif 000077
【図１５Ａ】
2021535738.tif 000078
【図１５Ｂ】
2021535738.tif 000079
【図１６Ａ】
2021535738.tif 000080
【図１６Ｂ】
2021535738.tif 000081
【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
2021535738.tif 000083
【手続補正書】
【提出日】令和3年3月10日(2021.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞にカーゴをエレクトロポレートする方法であって、
前記細胞を前記カーゴとともにエレクトロポレーションチャンバー内を流すことと、
複数の電気パルスを前記エレクトロポレーションチャンバー内の前記細胞に適用することと、
を含み、ここで前記エレクトロポレーションチャンバーが、
第１電極；
第２電極；
前記細胞及び前記カーゴの前記エレクトロポレーションチャンバーへの通過を可能にする第１入力；
前記エレクトロポレーションチャンバーからのエレクトロポレートされた細胞の通過を可能にする第１出力；及び
前記細胞及び前記カーゴが流れるための前記第１電極と前記第２電極との間のそこで規定された経路を有する流体チャネル領域
を含み、ここで前記細胞が、エレクトロポレーション培地に懸濁され、約１×１０６個の細胞／ｍｌ〜約５００×１０６個の細胞／ｍｌの細胞密度を有し；
ここで
（ｉ）各電気パルスが指数関数的な吐出波形又は方形波形の形態を有し；
（ｉｉ）前記複数の電気パルスが約０．３ｋＶ／ｃｍ〜約３ｋＶ／ｃｍの電界強度で適用され；
（ｉｉｉ）前記電界強度が約１５Ｖ〜約１００Ｖの電圧で適用され；
（ｉｖ）各電気パルス間の持続時間が約０．１秒〜約１０秒であり；且つ
（ｖ）各電気パルスが約１０μｓ〜約１０，０００μｓのパルス幅を有する、
方法。
【請求項２】
以下：
（ｉ）前記流れが段階的様式で実施され、ここで前記エレクトロポレーションチャンバーの総体積の約半分以上の流量が、前記エレクトロポレーションチャンバー内に、指定された時間間隔でポンピングされ、且つ前記細胞及び前記カーゴの流速が、約０．１ｍｌ／分〜約１５ｍｌ／分であること；
（ｉｉ）前記細胞が前記エレクトロポレーションチャンバー内の均一な又は実質的に均一な電界に曝露されること；並びに
（ｉｉｉ）前記複数のパルスが２パルス〜１０パルスであること
の１つ以上が満たされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、哺乳動物細胞又は非哺乳動物細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＥＣ−７細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞、樹状細胞、及び幹細胞であり；且つ
（ｉ）前記電界強度が約２０Ｖ〜約５０Ｖの電圧で適用され；
（ｉｉ）前記パルス幅が約２０μｓ〜約７００μｓであり；且つ
（ｉｉｉ）前記エレクトロポレーション培地中の前記細胞の細胞密度が約５×１０６個の細胞／ｍｌ〜約３００×１０６個の細胞／ｍｌである、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
以下：
（ｉ）前記カーゴが、ＤＮＡであり、且つ前記エレクトロポレートされた細胞が、ＥＣ−７細胞であり、少なくとも７０％の生存率及び少なくとも９０％の効率を伴うこと；
（ｉｉ）前記カーゴが、ＤＮＡであり、且つ前記エレクトロポレートされた細胞が、ＣＨＯ−Ｓ細胞であり、少なくとも約７０％の生存率及び少なくとも約８５％の効率を伴うこと；
（ｉｉｉ）前記カーゴが、ＲＮＡであり、且つ前記エレクトロポレートされた細胞が、Ｔ細胞であり、少なくとも約８０％の生存率及び少なくとも約９０％の効率を伴うこと；
（ｉｖ）前記カーゴが、ＲＮＡ又はＤＮＡであり、且つ前記エレクトロポレートされた細胞が、ＮＫ細胞であり、少なくとも約８０％の生存率及び少なくとも約８０％の効率を伴うこと；
（ｖ）前記カーゴが、ＲＮＡであり、且つ前記エレクトロポレートされた細胞が、樹状細胞であり、少なくとも約８０％の生存率及び少なくとも約８０％の効率を伴うこと；及び
（ｖｉ）前記カーゴが、ＤＮＡであり、且つ前記エレクトロポレートされた細胞が、幹細胞であり、少なくとも約７０％の生存率及び少なくとも約８０％の効率を伴うこと、
の１つ以上が満たされる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記エレクトロポレーション培地が、１ｍＳ／ｍ〜約２０ｍＳ／ｍのコンダクタンス及び約５０ｍＯｓｍ／ｌ〜約３００ｍＯｓｍ／ｌの容積モル浸透圧濃度を有し、且つ／又は前記エレクトロポレーション培地が、１つ以上の塩、単糖及び緩衝剤を含み、ここで前記塩が、金属ハロゲン化物塩、リン酸塩、金属硫酸塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１入力が、前記第１電極、前記第２電極、又は前記流体チャネル領域において存在し、且つ前記第１出力が、前記第１電極、前記第２電極、又は前記流体チャネル領域において存在する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記エレクトロポレーションチャンバーが、前記エレクトロポレーションチャンバーへの前記細胞及び前記カーゴの通過をさらに可能にする第１外部入力、並びに前記エレクトロポレーションチャンバーからの前記エレクトロポレートされた細胞の通過をさらに可能にする第１外部出力をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１電極が、第１材料によって囲まれ、且つ前記第２電極が、第２材料によって囲まれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記経路が、直線状、曲線状、分岐状、又はそれらの組み合わせであり；前記経路が、前記第１電極及び前記第２電極に対して水平であり；且つ前記エレクトロポレーションチャンバー内の前記細胞が、前記エレクトロポレーションチャンバーの長さに沿う前記経路内を側方に流れる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１電極及び前記第２電極の各々が、固体電極、メッシュ電極であるか、又は複数の固体金属プレートを含み、ここで各固体金属プレートが、独立した電界強度を適用するため、形成される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞にカーゴをエレクトロポレートするための装置であって、
１つ以上のエレクトロポレーションチャンバーであって、各エレクトロポレーションチャンバーが
第１電極；
第２電極；
前記細胞及び前記カーゴの前記エレクトロポレーションチャンバーへの通過を可能にする第１入力；
前記エレクトロポレーションチャンバーからのエレクトロポレートされた細胞の通過を可能にする第１出力；及び
前記細胞及び前記カーゴが流れるための前記第１電極と前記第２電極との間のそこで規定された経路を有する流体チャネル領域
を含むエレクトロポレーションチャンバーを含む、装置。
【請求項１３】
前記第１入力が、前記第１電極、前記第２電極、又は前記流体チャネル領域において存在し、且つ前記第１出力が、前記第１電極、前記第２電極、又は前記流体チャネル領域において存在する、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記エレクトロポレーションチャンバーが、前記細胞及び前記カーゴの前記エレクトロポレーションチャンバーへの通過をさらに可能にする第１外部入力、並びに前記エレクトロポレーションチャンバーからの前記エレクトロポレートされた細胞の通過をさらに可能にする第１外部出力をさらに含む、請求項１２又は１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記第１電極が、第１材料によって囲まれ、且つ前記第２電極が、第２材料によって囲まれる、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１６】
以下：
（ｉ）前記第１電極及び前記第２電極の各々が、固体電極、メッシュ電極であるか、又は複数の固体金属プレートを含み、ここで各固体金属プレートが、独立した電界強度を適用するため、形成されること；
（ｉｉ）前記経路が、直線状、曲線状、分岐状、又はそれらの組み合わせであり；且つ前記経路が、前記第１電極及び前記第２電極に対して水平であること；並びに
（ｉｉｉ）前記エレクトロポレーションチャンバーの長さが、約５ｍｍ〜約１００ｍｍであり、且つ前記エレクトロポレーションチャンバーの高さが、約２００μｍ〜約１０００μｍであること、
の１つ以上が満たされる、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１７】
前記エレクトロポレーションチャンバーの少なくとも１つに連結された電力供給を、前記エレクトロポレーションチャンバーの前記少なくとも１つに複数の電気パルスを提供するため、さらに含み、ここで前記電力供給が、電力変換装置、及び前記電力変換装置と前記エレクトロポレーションチャンバーの前記少なくとも１つとの間に連結されたパルス回路を含み、ここで前記パルス回路が、少なくとも１つのスイッチング素子を含み、且つ前記装置が、前記エレクトロポレーションチャンバーの前記少なくとも１つ向けの、前記電力変換装置からのＤＣ電圧を前記電気パルスに変換するための前記少なくとも１つのスイッチング素子を制御するため、前記少なくとも１つのスイッチング素子に連結された制御回路をさらに含む、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１８】
前記制御回路が、前記エレクトロポレーションチャンバーの前記少なくとも１つ向けの、前記ＤＣ電力信号を電気パルスに変換するための前記少なくとも１つのスイッチング素子に対して制御信号を生成するために形成されたパルス発生器を含み、且つ／又は前記電力供給が、１つ以上のスイッチング素子を含み、且つ前記制御回路が、前記１つ以上のスイッチング素子を制御するための前記電力供給に連結されたコントローラを含む、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
（ｉ）各電気パルスが指数関数的な吐出波形又は方形波形の形態を有し；
（ｉｉ）前記複数の電気パルスが約０．３ｋＶ／ｃｍ〜約３ｋＶ／ｃｍの電界強度で適用され；
（ｉｉｉ）前記電界強度が約１５Ｖ〜約１００Ｖの電圧で適用され；
（ｉｖ）各電気パルス間の持続時間が約０．１秒〜約１０秒であり；且つ／又は
（ｖ）各電気パルスが約１０μｓ〜約１０，０００μｓのパルス幅を有する、
請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２０】
前記エレクトロポレーションチャンバーがエレクトロポレーション培地をさらに含み、ここで前記エレクトロポレーション培地が、１つ以上の塩、単糖及び緩衝剤を含み、ここで前記塩が、金属ハロゲン化物塩、リン酸塩、金属硫酸塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、且つ／又は前記エレクトロポレーション培地が、１ｍＳ／ｍ〜約２０ｍＳ／ｍのコンダクタンス及び約５０ｍＯｓｍ／ｌ〜約３００ｍＯｓｍ／ｌの容積モル浸透圧濃度を有する、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２１】
１つ以上の塩、単糖及び緩衝剤を含むエレクトロポレーション培地であって、前記塩が、金属ハロゲン化物塩、リン酸塩、金属硫酸塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、エレクトロポレーション培地。
【請求項２２】
前記１つ以上の塩の各々が、前記エレクトロポレーション培地中に約０．１ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度で存在し、前記単糖が、前記エレクトロポレーション培地中に約２０ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度で存在し、且つ前記緩衝剤が、前記エレクトロポレーション培地中に約１ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で存在し、且つ／又は前記エレクトロポレーション培地が、１ｍＳ／ｍ〜約２０ｍＳ／ｍのコンダクタンス及び約５０ｍＯｓｍ／ｌ〜約３００ｍＯｓｍ／ｌの容積モル浸透圧濃度を有する、請求項２１に記載のエレクトロポレーション培地。
【請求項２３】
前記金属ハロゲン化物塩が、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化クロム（ＣｒＣｌ３）、臭化カリウム（ＫＢｒ）、臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、臭化マグネシウム（ＭｇＢｒ２）、フッ化マグネシウム（ＭｇＦ２）、ヨウ化マグネシウム（ＭｇＩ２）、臭化リチウム（ＬｉＢｒ）、ヨウ化カリウム（ＫＩ）、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）、ヨウ化リチウム（ＬｉＩ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され；
前記リン酸塩が、リン酸一ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、リン酸二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、リン酸三ナトリウム（Ｎａ３ＰＯ４）、リン酸一マグネシウム（Ｍｇ（Ｈ２ＰＯ４）２）、リン酸二マグネシウム（ＭｇＨＰＯ４）、リン酸三マグネシウム（Ｍｇ３（ＰＯ４）２、リン酸一カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、リン酸二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、リン酸三カリウム（Ｋ３ＰＯ４）、リン酸一カルシウム（Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２）、リン酸二カルシウム（ＣａＨＰＯ４）、リン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２）、リン酸クロム（ＣｒＰＯ４）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され；
前記金属硫酸塩が、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、硫酸カリウム（Ｋ２ＳＯ４）、硫酸カルシウム（ＣａＳＯ４）、硫酸クロム（Ｃｒ２（ＳＯ４）３）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され；
前記単糖が、グルコース、フルクトース、ガラクトース、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され；且つ
前記緩衝剤が、ヘペス、トリス（ヒドロキシメチル）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、
請求項２１又は２２に記載のエレクトロポレーション培地。
【国際調査報告】
2021535738.tif 000084
2021535738.tif 000085
2021535738.tif 000086