(57)【要約】本発明は、オリゴヌクレオチドの生成のための方法に関する。本発明の方法は、増幅、制限処理及びアフィニティー精製の組合せを使用して、高品質オリゴヌクレオチドを生成する。本発明は、本発明の方法において使用するための核酸前駆体、本発明の方法において使用するための前記核酸前駆体を含む固相支持体及びキットにさらに関係する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の配列を有する１つ又は複数の一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する方法であって、
ａ）第１鎖と、任意選択で、第１鎖と相補的である第２鎖を含む少なくとも１つの一本鎖又は二本鎖核酸前駆体を提供するステップであって、第１鎖が、以下の要素：
（１）第１のプライマー結合部位、
（２）第１のエンドヌクレアーゼ認識部位、
（３）目的の配列、
（４）第２のエンドヌクレアーゼ認識部位、及び
（５）第２のプライマー結合部位
を５’から３’方向に含み、
第１のエンドヌクレアーゼ認識部位が、二本鎖形成後に、第１のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ上流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計され、
第２のエンドヌクレアーゼ認識部位が、二本鎖形成後に、第２のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ下流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計されている、ステップと、
ｂ）第１のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第１のプライマー及び第２のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第２のプライマーを使用して、タグを含む増幅された二本鎖核酸前駆体を生成することで、増幅法によって、ステップａ）の前駆体を増幅するステップであって、第２のプライマーが、第１のプライマーには存在しない親和性タグを含む、ステップと、
ｃ）ステップｂ）において得られた増幅された二本鎖前駆体を、第１及び第２のエンドヌクレアーゼで消化して、目的の配列のすぐ上流及び下流の糖−リン酸骨格が切断されており、タグから、目的の配列と相補的である配列を含めて目的の配列と相補的である配列までの間の無傷の糖−リン酸骨格を有する増幅された二本鎖核酸前駆体を生成するステップと、
ｄ）増幅された二本鎖核酸前駆体を、タグ付き相補的第２鎖の親和性捕捉によって固相支持体に固定化するステップと、
ｅ）増幅された二本鎖前駆体を変性させ、それによって目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを放出するステップと、
ｆ）固相支持体を除去して、目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを得るステップと
を含む方法。
【請求項２】
ステップｃ）及びステップｄ）が逆転される、又はステップｄ）及びステップｅ）が逆転される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一本鎖オリゴヌクレオチドを精製するステップｇ）をさらに含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｅ）における変性が、化学的変性を含み、好ましくは、化学的変性が、強塩基の添加によって、好ましくは、約０．５〜１．５Ｍの濃度のアルカリ水酸化物の添加によってｐＨを高めることによるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
核酸前駆体が、約２０〜２００ヌクレオチドからなり、好ましくは、核酸前駆体が、配列番号１〜配列番号９７８からなる群から選択される配列を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
目的の配列が、所定のゲノム配列に対して少なくとも部分的に相補的である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
生成されたオリゴヌクレオチドが、マルチプレックスＯＬＡアッセイにおいて使用するのに適しており、好ましくは、生成されたオリゴヌクレオチドが、少なくとも３００−プレックスＯＬＡアッセイにおいて使用するのに適している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
生成されたオリゴヌクレオチドが、マルチプレックスオリゴヌクレオチドベースの増幅アッセイにおいて使用するのに適しており、好ましくは、生成されたオリゴヌクレオチドが、少なくとも３００−プレックスオリゴヌクレオチドベースの増幅アッセイにおいて使用するのに適している、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
生成されたオリゴヌクレオチドが、マルチプレックス捕捉ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用するのに適しており、好ましくは、生成されたオリゴヌクレオチドが、少なくとも３００−プレックス捕捉ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用するのに適している、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
核酸前駆体が、一本鎖核酸前駆体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｂ）における増幅法が、等温増幅法であり、好ましくは、等温増幅法が、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）又はヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
第１及び第２のエンドヌクレアーゼが、２つの異なる酵素である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップｃ）における第１のエンドヌクレアーゼが、
ｉ）第１のＤＮＡ鎖、又は
ｉｉ）第１及び第２のＤＮＡ鎖
を切断する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップｂ）から得られた増幅された二本鎖前駆体が、ステップｄ）において固相支持体に結合する前に精製される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
タグがビオチンであり、固相支持体が、ストレプトアビジンを含み、好ましくは、固相支持体がビーズであり、より好ましくは、ビーズが磁性ビーズである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ステップａ）において、別個の、目的の配列を有する２つ又はそれより多い核酸前駆体が提供され、好ましくは、核酸前駆体の配列が、配列番号１〜配列番号９７８からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
第１のプライマーが、第１のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、第２のプライマーが、第２のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングできる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
目的の配列が、第１及び第２のエンドヌクレアーゼ認識部位又はその逆相補体を含まない、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
第１鎖と、任意選択で、第１鎖と相補的である第２鎖を含む一本鎖又は二本鎖核酸前駆体であって、第１鎖が、以下の要素：
（１）第１のプライマー結合部位、
（２）第１のエンドヌクレアーゼ認識部位、
（３）目的の配列、
（４）第２のエンドヌクレアーゼ認識部位、及び
（５）第２のプライマー結合配列
を５’から３’方向に含み、
好ましくは、第１のプライマーが、第１のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、第２のプライマーが、第２のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、
好ましくは、目的の配列が、第１及び第２のエンドヌクレアーゼ認識部位又はその逆相補体を含まず、
第１のエンドヌクレアーゼ認識部位が、二本鎖形成後に、第１のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ上流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計され、
第２のエンドヌクレアーゼ認識部位が、二本鎖形成後に、第２のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ下流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計されている、一本鎖又は二本鎖核酸前駆体。
【請求項２０】
前駆体が、第２鎖の５’末端に位置する親和性タグをさらに含み、好ましくは、親和性タグが、第２鎖の５’末端にのみある、請求項１９に記載の二本鎖核酸前駆体。
【請求項２１】
親和性捕捉によって固相支持体に結合された請求項２０に記載の二本鎖核酸前駆体を含む固相支持体。
【請求項２２】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法において使用するためのキットオブパーツであって、
第２のエンドヌクレアーゼと、任意選択で、第１のエンドヌクレアーゼを含む容器、
増幅ステップｂ）において使用するための酵素を、任意選択で、第１の及び／又はタグ付き第２のプライマーと組み合わせて含む容器、
アフィニティー精製のための固相支持体を含む容器、及び任意選択で
変性のための化学物質を含む容器
を含む、キットオブパーツ。
【請求項２３】
１つ又は複数の一本鎖オリゴヌクレオチドの生成のための、請求項１９若しくは請求項２０に記載の核酸前駆体又は請求項２２に記載のキットオブパーツの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学及びバイオテクノロジーの分野に関する。特に、本発明は、中でも、核酸検出、例えば、核酸の（ハイスループット）検出、標的化された変動検出並びに標的化された及び／又はプログラム可能なゲノム編集の分野において使用するのに適しているオリゴヌクレオチド、より特に、標的化するオリゴヌクレオチド又は核酸プローブの生成に関する。
【０００２】
本発明は、核酸及び／又は核酸変動のハイスループット検出の分野において特に有用である。
【背景技術】
【０００３】
形質、対立遺伝子及びシーケンシングに関する情報を得るための先進技術の発達のために遺伝情報のほぼ指数関数的な増大が利用可能になるにつれ、サンプル、多くの場合には、複数のサンプルを迅速な、並行であることが多い様式で試験するための効率的な、信頼できる、拡張可能なアッセイがますます必要となっている。特に、一塩基多型（ＳＮＰ）は、生物の遺伝子構造に関する価値ある情報を含有し、その検出は、多くの関心、及び革新的な活動を誘引している分野である。
【０００４】
既知配列の核酸の解析のために使用される主な方法の１つは、２つのプローブを標的配列にアニーリングさせ、プローブが標的配列に隣接してハイブリダイズされる場合には、プローブをライゲーションすることに基づいている。成功したライゲーション事象の検出は、次いで、サンプル中の標的配列の存在を示す。オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）は、このような一塩基多型の検出に適しているとわかっており、いくつかの特許出願及び科学論文において長年にわたって多数の変法で記載されてきた技術である。
【０００５】
ＯＬＡ−原理（オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ）は、中でも、米国特許第４，９８８，６１７号（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら）に記載されている。この刊行物は、既知のあり得る突然変異又は多型を有する既知核酸配列の一定領域において核酸配列を決定する方法を開示する。突然変異を検出するために、オリゴヌクレオチドは、決定されるべき配列のすぐ隣に接するセグメントにアニーリングするように選択される。選択されたオリゴヌクレオチドプローブの１つは、末端領域を有し、末端領域ヌクレオチドのうち１つは、既知核酸配列中の対応する位置の正常又は突然変異ヌクレオチドのいずれかに対して相補的である。２つのプローブが正しく塩基対結合され、互いにすぐ隣に接して位置する場合に、２つのプローブを共有結合によって接続するリガーゼが提供される。連結されたプローブの存在、不在又は量は、既知配列及び／又は突然変異の存在の指標である。ＯＬＡベースの技術のその他のバリアントは、とりわけ、Ｎｉｌｓｓｏｎら、Ｈｕｍａｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ、２００２年、１９号、４１０〜４１５頁；Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４年、２６５巻：２０８５〜２０８８頁；米国特許第５，８７６，９２４号；国際公開第９８／０４７４５号；国際公開第９８／０４７４６号；米国特許第６，２２１，６０３号；米国特許第５，５２１，０６５号；米国特許第５，９６２，２２３号；欧州特許第１８５４９４号；米国特許第６，０２７，８８９号；米国特許第４，９８８，６１７号；欧州特許第２４６８６４号；米国特許第６，１５６，１７８号；欧州特許第７４５１４０号；欧州特許第９６４７０４号；国際公開第０３／０５４５１１号；米国特許出願公開第２００３／０１１９００４号；米国特許出願公開第２００３／１９０６４６号；欧州特許第１３１３８８０号；米国特許出願公開第２００３／００３２０１６号；欧州特許第９１２７６１号；欧州特許第９５６３５９号；米国特許出願公開第２００３／１０８９１３号；欧州特許第１２５５８７１号；欧州特許第１１９４７７０号；欧州特許第１２５２３３４号；国際公開第９６／１５２７１号；国際公開第９７／４５５５９号；米国特許出願公開第２００３／０１１９００４号；米国特許第５，４７０，７０５号；国際公開第０１／５７２６９号；国際公開第０３／００６６７７号；国際公開第０１／０６１０３３号；国際公開第２００４／０７６６９２号；国際公開第２００６／０７６０１７号；国際公開第２０１２／０１９１８７号；国際公開第２０１２／０２１７４９号；国際公開第２０１３／１０６８０７号；国際公開第２０１５／１５４０２８号；国際公開第２０１５／０１４９６２号及び国際公開第２０１３／００９１７５号に開示されてきた。
【０００６】
ＯＬＡ技術におけるさらなる進歩は、ＫｅｙＧｅｎｅ、オランダ、ヴァーヘニンゲンによって報告されている。国際公開第２００４／１１１２７１号、国際公開第２００５／０２１７９４号、国際公開第２００５／１１８８４７号及び国際公開第０３／０５２１４２号において、彼らは、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイの信頼性を改善するいくつかの方法及びプローブ設計を記載している。これらの出願は、達成され得るマルチプレックスレベルの大幅な改善をさらに開示する。また「ＳＮＰＷａｖｅ：  ａ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、ｖａｎ  Ｅｉｊｋ  ＭＪら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４年；３２巻（４号）：ｅ４７）には、この分野において行われた改善が記載されている。
【０００７】
Ｊａｎｉｔｚ編  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｗｉｌｅｙ  ＶＣＨ、２００８年に記載され、Ｒｏｃｈｅ（ＧＳ  ＦＬＸ及び関連システム）及びｌｌｌｕｍｉｎａ（ゲノムアナライザー及び関連システム）によって提供されるプラットフォームにおいて市場で入手可能であるような次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術が登場すると、ＯＬＡアッセイを検出プラットフォームとしてシーケンシングに適合させる必要性が生じた。その分野における改善は、とりわけ、Ｋｅｙｇｅｎｅ  ＮＶの国際公開第２００７１００２４３号に記載されている。国際公開第２００７１００２４３号では、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイの結果への次世代シーケンシング技術の適用が記載されている。信頼性及び正確性の点からだけではなく、経済的促進要因も理由となり、規模を増大することによって費用をさらに低減するため、この分野ではさらなる改善が依然として必要とされている。
【０００８】
例えば、高品質オリゴヌクレオチドプローブの経済的な製造に対する継続的な必要性がある。このような高品質オリゴヌクレオチドは、中でも、マルチプレックス反応、例えば、上記で本明細書において記載されたようなマルチプレックスＯＬＡアッセイにおいて使用するのに適している。ＯＬＡアッセイは、通常、各標的を特定するために３つの特異的プローブを必要とする。高度のマルチプレックス化では、必要なオリゴヌクレオチドの数及び量は、それらが、通常、個別に合成及び精製されるので極めて高価である可能性が高い。Ｐｏｒｒｅｃａは、２００７年にはこの問題にすでに対処しており（Ｐｏｒｒｅｃａら、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｓｅｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｘｏｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ−４、９３１〜９３６頁（２００７年））、核酸の標的化された増幅のための方法において使用するための固体表面で並行して合成される複数のオリゴヌクレオチドプローブ（１００マー）を増幅する方法を開示した。Ｐｏｒｒｅｃａらは、各々、標的化アームとのその接合部でニッキング制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有する配列と隣接している、ヒトゲノム中の７０ｎｔの連続タンパク質コード配列を含むプローブのＰＣＲ増幅を使用する方法を記載した。アンプリコンは、ＲＥを使用して消化され、カラム精製され、アクリルアミドゲルで分離され、予測される一本鎖７０ｎｔ種に対応するバンドから回収され、精製された。論文によれば、このプロセスは、２００μＬで２．５ｎＭのオリゴヌクレオチド、すなわち、０．５ｐＭｏｌの量の、２０μＬで１２５ｎＭのオリゴヌクレオチド、すなわち、２．５ｐＭｏｌの量への増幅をもたらす。言い換えれば、５倍の増幅が報告された。
【０００９】
本発明者らは、プローブ増幅のためにＰｏｒｒｅｃａの方法を修正し、９０ｎｔの平均長（８５〜９３ｎｔ）を有する９つのプローブ前駆体の比較的多量の投入材料（０．５ｐｍｏｌ）を使用する場合に同様の結果、すなわち、４．５の増幅係数を見出した。このような収量は、ＯＬＡなどのハイスループットの標的化されたヌクレオチド検出の使用にとっては満足いくものではない。さらに、３プレックスアッセイ（３つの異なる標的配列におけるＳＮＰ検出に適しており、９つの異なるプローブ配列を必要とする）は、比較的クリーンな増幅産物をもたらしたが、プローブ数を３２６プレックスアッセイ（９７８の異なるプローブ配列）に増大した結果、ＰＣＲ増幅アーチファクトのために収量及び配列組成を妨害し得るヘテロ二本鎖形成による可能性があるバックグラウンドバンドが生じた。
【００１０】
したがって、例えば、アレイで少量で合成された、プールされたオリゴヌクレオチドのモル量及び／又は収量を、その配列組成を変更せずに、プール中の各オリゴの相対存在量を大幅に乱すことなく増大する方法が、当技術分野では依然として必要である。数千サンプルのハイスループット解析のため高度マルチプレックス化アッセイの開発を可能にするのに十分な量及び質でのこれらのオリゴヌクレオチドの生成が必要である。
【００１１】
本発明者らは、ここで、高収量をもたらす、すなわち、ハイスループット検出法に適した３２６プレックスアッセイについてでさえ、精製後に５００倍の増幅係数をもたらす改善されたオリゴヌクレオチド増幅法を見出した。本明細書に記載される説明、図面及び種々の実施形態を通して、本発明をさらに詳細に示す。引用されたすべての参考文献は、本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【００１２】
第１の態様において、本発明は、目的の配列を有する１つ又は複数の一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する方法であって、
ａ）第１鎖と、任意選択で、第１鎖と相補的である第２鎖を含む少なくとも１つの一本鎖又は二本鎖核酸前駆体を提供するステップであって、第１鎖は、以下の要素：
（１）第１のプライマー結合部位、
（２）第１のエンドヌクレアーゼ認識部位、
（３）目的の配列、
（４）第２のエンドヌクレアーゼ認識部位、及び
（５）第２のプライマー結合部位
を５’から３’方向に含み、
第１のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第１のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ上流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計され、
第２のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第２のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ下流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計されている、ステップと、
ｂ）第１のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第１のプライマー及び第２のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第２のプライマーを使用する増幅法によって、ステップａ）の前駆体を増幅するステップと、
ｃ）ステップｂ）において得られた増幅された二本鎖前駆体を、第１及び第２のエンドヌクレアーゼで消化して、目的の配列のすぐ上流及び下流の糖−リン酸骨格が切断された増幅された二本鎖核酸前駆体を生成するステップと、
ｅ）増幅された二本鎖前駆体を変性させ、それによって目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを放出するステップと
を含む方法に関する。
【００１３】
好ましくは、第１のプライマーは、第１のプライマー結合部位（より詳細には、第２鎖の第１のプライマー結合部位内に含まれるプライマー結合配列）のみと選択的にアニーリングでき、第２のプライマーは、第２のプライマー結合部位（より詳細には、第１鎖の第２のプライマー結合部位内に含まれるプライマー結合配列）のみと選択的にアニーリングできる。任意選択で、第１のプライマーは、第１及び第２のプライマー結合部位の両方とアニーリングでき、第２のプライマーは、第１及び第２のプライマー結合部位の両方とアニーリングできるという意味で、第１及び第２のプライマーは、同一である場合も、同様である場合もある。任意選択で、このプライマーは、第１及び第２のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングできる。
【００１４】
好ましくは、目的の配列は、第１及び／又は第２のエンドヌクレアーゼ認識部位又はその逆相補体を含まない。
【００１５】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、目的の配列と相補的である配列を含むオリゴヌクレオチドを、目的の配列を含む第１鎖から、又は第１鎖の残部から分離するために１つ又は複数のステップをさらに含む。好ましくは、これは、少なくとも目的の配列と相補的である配列を含む第２鎖又は第２鎖の残部を固定化するステップｄ）を
ｉ）増幅ステップｂ）と消化ステップｃ）の間に、
ｉｉ）消化ステップｃ）と変性ステップｅ）の間に、又は、
ｉｉｉ）変性ステップｅ）の後に
追加することによって達成される。
【００１６】
好ましくは、この固定化ステップは、固相支持体で目的の配列と相補的である配列を含む第２鎖又はその一部を親和性捕捉することを含む。これは、目的の配列と相補的である配列を含む第２鎖に全体として、又はその一部にタグをつけることを必要とし得る。第２鎖に全体としてタグをつけることは、本発明の方法のステップｂ）において、親和性タグを含む第２のプライマーを使用して達成され得る。親和性タグは、少なくとも第２のプライマーに存在し得る。親和性タグが第１のプライマー及び第２のプライマー両方に存在する場合もあるということは本明細書においてさらに理解される。或いは、親和性タグは、第２のプライマーにのみ存在する、すなわち、第１のプライマーには存在しない。第１及び第２のプライマーを使用して、タグを含む増幅された二本鎖核酸前駆体を生成する。或いは、ステップｂ）において使用される第２のプライマーは、増幅に先立って固相支持体に存在する場合もあり、ステップｂ）における増幅は、固相支持体で実施され、第２鎖を介して固相支持体に付着されたアンプリコンをもたらす。目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを得るために、目的の配列の逆相補体を含む第２鎖又はその一部を除去するさらなるステップが、本発明の方法に追加される。前記除去ステップは、好ましくは、上記で定義されるような選択肢ｉ）若しくはｉｉ）において変性ステップの後に、又は上記で定義されるような選択肢ｉｉｉ）において固定化ステップの後に追加される。好ましくは、この実施形態内で、前駆体又は方法は、本発明の方法のステップｃ）において定義されるような増幅された二本鎖前駆体を消化することが、目的の配列まで、目的の配列を含めてタグの間の第２鎖の糖−リン酸骨格を無傷で維持するように設計される。
【００１７】
好ましくは、本発明の方法は、一本鎖オリゴヌクレオチドを精製するステップｇ）をさらに含む。
【００１８】
好ましい実施形態では、ステップｅ）における変性は、化学的変性を含み、好ましくは、化学的変性は、強塩基の添加によって、好ましくは、約０．５〜１．５Ｍの濃度のアルカリ水酸化物の添加によってｐＨを高めることによるものである。
【００１９】
好ましくは、核酸前駆体は、約２０〜２００ヌクレオチドからなり、好ましくは、核酸前駆体は、配列番号１〜配列番号９７８からなる群から選択される配列を有する。
【００２０】
好ましくは、目的の配列は、所定のゲノム配列と少なくとも部分的に相補的であり、好ましくは、生成したオリゴヌクレオチドは、マルチプレックスＯＬＡアッセイにおいて使用するのに適しており、より好ましくは、生成されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも３００プレックスＯＬＡアッセイにおいて使用するのに適している。
【００２１】
好ましくは、核酸前駆体は、一本鎖核酸前駆体である。
【００２２】
好ましい実施形態では、ステップｂ）における増幅法は、等温増幅法であり、好ましくは、等温増幅法は、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）又はヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）である。
【００２３】
好ましくは、ステップｃ）における第１及び第２のエンドヌクレアーゼは、２つの異なる酵素である。
【００２４】
好ましくは、ステップｃ）における第１のエンドヌクレアーゼは、ｉ）第１のＤＮＡ鎖又はｉｉ）第１及び第２のＤＮＡ鎖を切断する。
【００２５】
好ましい実施形態では、ステップｂ）から得られた増幅された二本鎖前駆体は、ステップｄ）において固相支持体と結合する前に精製される。
【００２６】
好ましくは、第２鎖又はその一部を親和性捕捉するためのタグは、ビオチンであり、固相支持体は、ストレプトアビジンを含み、好ましくは、固相支持体は、ビーズであり、より好ましくは、ビーズは、磁性ビーズである。
【００２７】
好ましくは、ステップａ）では、別個の、目的の配列を有する２つ又はそれより多い核酸前駆体が提供され、好ましくは、核酸前駆体の配列は、配列番号１〜配列番号９７８からなる群から選択される。
【００２８】
第２の態様において、本発明は、第１鎖と、任意選択で、第１鎖と相補的である第２鎖とを含む一本鎖又は二本鎖核酸前駆体に関し、第１鎖は、以下の要素：
（１）第１のプライマー結合部位、
（２）第１のエンドヌクレアーゼ認識部位、
（３）目的の配列、
（４）第２のエンドヌクレアーゼ認識部位、及び、
（５）第２のプライマー結合部位
を５’から３’方向に含み、
第１のプライマーは、第１のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、第２のプライマーは、第２のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、
目的の配列は、第１及び第２のエンドヌクレアーゼ認識部位又はその逆相補体を含まず、
第１のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第１のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ上流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計され、
第２のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第２のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ下流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計されている。
【００２９】
好ましくは、前駆体は、第２鎖の５’末端に位置する親和性タグをさらに含み、好ましくは、親和性タグは、第１鎖の５’末端に位置せず、好ましくは、親和性タグは、第２鎖の５’末端にのみ位置する。
【００３０】
第３の態様では、本発明は、親和性捕捉によって固相支持体に結合された本明細書において定義されるような二本鎖核酸前駆体に関する。
【００３１】
第４の態様では、本発明は、
第２のエンドヌクレアーゼと、任意選択で、第１のエンドヌクレアーゼとを含む容器と、
第１の態様の方法の増幅ステップｂ）において使用するための酵素を、任意選択で、第１の及び／又はタグ付き第２のプライマーと組み合わせて含む容器と、
アフィニティー精製のための固相支持体を含む容器と、任意選択で、
変性のための化学物質を含む容器と
を含む、本発明の方法において使用するためのキットオブパーツに関係する。
【００３２】
第５の態様では、本発明は、１つ又は複数の一本鎖オリゴヌクレオチドの生成のための本明細書において定義されるような核酸前駆体又は本明細書において定義されるようなキットオブパーツの使用に関する。
【００３３】
定義
本発明の方法、組成物、使用及びその他の態様に関する種々の用語は、本明細書及び特許請求の範囲を通して使用される。このような用語には、特に断りのない限り、本発明が関係する技術分野におけるその通常の意味が与えられるべきである。他の具体的に定義される用語は、本明細書において提供される定義と一致する方法で解釈されるべきである。本明細書において記載されるものと同様又は等価の任意の方法及び材料が、本発明の試験のための実施において使用され得るが、好ましい材料及び方法は、本明細書に記載されている。
【００３４】
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に別に示さない限り、複数形を含む。したがって、例えば、「１つの細胞」への言及は、２つ又はそれより多い細胞の組み合わせなどを含む。
【００３５】
「及び／又は」という用語は、記載された場合のうち１つ又は複数が、単独で、又は記載された場合のうちの少なくとも１つと、最大の記載された場合のすべてと組み合わせて、生じ得る状況を指す。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、小さな変動を記載及び説明するために使用される。例えば、この用語は、±（＋又は−）１０％以下、例えば、±５％以下、±４％以下、±３％以下、±２％以下、±１％以下、±０．５％以下、±０．１％以下又は±０．０５％以下を指す場合がある。さらに、量、割合及びその他の数値は、本明細書において範囲形式で示されることがある。このような範囲形式は、便宜及び簡潔性のために使用されるということは理解されるべきであり、範囲の限界として明確に指定された数値を含むが、その範囲内に包含されるすべての個々の数値又は部分範囲も、各数値及び部分範囲が明確に指定されるかのように含むと柔軟に理解されなければならない。例えば、約１〜約２００の範囲中の割合は、約１及び約２００の明確に列挙された限界を含むが、約２、約３及び約４などの個々の割合並びに約１０〜約５０、約２０〜約１００などの部分範囲なども含むと理解されなければならない。
【００３７】
「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、包括的であり、上限のないものであり、排他的ではないと解釈される。具体的には、この用語及びその変動は、指定の特性、ステップ又は構成成分が含まれることを意味する。これらの用語は、他の特性、ステップ又は構成成分の存在を排除すると解釈されてはならない。
【００３８】
「構築物」又は「核酸構築物」又は「ベクター」：これは、組換えＤＮＡ技術の使用から得られた、多くは、構築物に含まれたＤＮＡ領域の宿主細胞における発現を目的として外因性ＤＮＡを宿主細胞に送達するために使用される、人工の核酸分子を指す。構築物のベクター骨格は、例えば、（キメラ）遺伝子が組み込まれる、又は適した転写調節配列（例えば、（誘導）プロモーター）がすでに存在する場合には、所望のヌクレオチド配列（例えば、コード配列）のみが転写調節配列の下流に組み込まれるプラスミドであり得る。ベクターは、例えば、選択マーカー、多重クローニング部位などといった分子クローニングにおけるその使用を促進するためのさらなる遺伝要素を含み得る。
【００３９】
「配列」又は「ヌクレオチド配列」：これは、核酸の、又は核酸内のヌクレオチドの順序を指す。言い換えれば、核酸中のヌクレオチドの任意の順序は、配列又はヌクレオチド配列と呼ばれる場合もある。
【００４０】
「相同性」、「配列同一性」などの用語は、本明細書において同義的に使用される。配列同一性は、配列を比較することによって決定されるような、２つ若しくはそれより多いアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列又は２つ若しくはそれより多い核酸（ポリヌクレオチド）配列間の関係として本明細書において定義される。当技術分野で、「同一性」とはまた、場合によっては、このような配列のストリング間のマッチによって決定されるようなアミノ酸又は核酸配列間の配列関連性の程度を意味する。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、あるポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換の、第２のポリペプチド配列に対する比較によって決定される。
【００４１】
「相補性」という用語は、十分に相補的な鎖（以下に本明細書において定義される、例えば、第２鎖）に対する配列の配列同一性として本明細書において定義される。例えば、１００％相補的である（又は十分に相補的である）配列は、相補鎖と１００％の配列同一性を有すると本明細書において理解され、例えば、８０％相補的である配列は、（十分に）相補的な鎖に対して８０％の配列同一性を有すると本明細書において理解される。
【００４２】
「同一性」及び「類似性」は、公知の方法によって容易に算出され得る。「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つの配列の長さに応じて、グローバル又はローカルアラインメントアルゴリズムを使用する２つのペプチド又は２つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定され得る。類似の長さの配列は、好ましくは、長さ全体にわたって最適に配列をアラインするグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈ）を使用してアラインされ、一方で、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）を使用してアラインされる。配列は、それらが（例えば、デフォルトパラメータを使用してプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって最適にアラインされた場合に）少なくともある特定の最小パーセンテージの配列同一性（以下に定義されるような）を共有する場合に、「実質的に同一である」又は「本質的に類似している」と呼ばれることがある。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して、２つの配列をその長さ全体（全長）にわたってアラインして、マッチ数を最大化し、ギャップ数を最小化する。グローバルアラインメントは、２つの配列が類似の長さを有する場合に配列同一性を決定するために適宜使用される。一般に、ギャップ生成ペナルティー＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）であり、ギャップ伸長ペナルティー＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）である、ギャップデフォルトパラメータが使用される。ヌクレオチドについては、使用されるデフォルトスコアリングマトリックスは、ｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質については、デフォルトスコアリングマトリックスは、Ｂｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２年、ＰＮＡＳ  ８９巻、９１５〜９１９頁）。配列アラインメント及び配列同一性パーセンテージのスコアは、コンピュータプログラム、例えば、米国、９２１２１−３７５２カリフォルニア州、サンディエゴ、スクラントンロード（Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ）９６８５から入手可能なＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージ、バージョン１０．３を使用して、又はオープンソースソフトウェア、例えば、ＥｍｂｏｓｓＷＩＮバージョン２．１０．０中のプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用する）若しくは「ｗａｔｅｒ」（ローカルＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用する）を、上記のギャップと同一パラメータを使用して、若しくはデフォルト設定（「ｎｅｅｄｌｅ」及び「ｗａｔｅｒ」両方について、並びにタンパク質及びＤＮＡアラインメント両方について、デフォルトギャップ開始ペナルティーは１０．０であり、デフォルトギャップ伸長ペナルティーは０．５であり、タンパク質のデフォルトスコアリングマトリックスはＢｌｏｓｕｍ６２であり、ＤＮＡのものはＤＮＡＦｕｌｌである）を使用して、決定され得る。配列が、実質的に異なる全体の長さを有する場合には、ローカルアラインメント、例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するもの���好ましい。
【００４３】
或いは、類似性又は同一性パーセンテージは、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどといったアルゴリズムを使用して公開データベースに対して検索することによって決定され得る。したがって、本発明の核酸及びタンパク質配列は、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を同定するために、公開データベースに対して検索を実施するための「クエリー配列」としてさらに使用され得る。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５巻：４０３〜１０頁のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して実施され得る。本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索が、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施され得る。本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索が、ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施され得る。比較目的でギャップありアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７年）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻（１７号）：３３８９〜３４０２頁に記載されるように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）のデフォルトパラメータが使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／の国立バイオテクノロジー情報センターのホームページを参照のこと。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「選択的にハイブリダイズする（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」、「選択的にハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ）」という用語及び類似の用語は、互いに少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、さらにより好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％又はより好ましくは、少なくとも９９％相同なヌクレオチド配列が、通常、互いにハイブリダイズされたままである、ハイブリダイゼーション及び洗浄の状態を説明することが意図される。すなわち、このようなハイブリダイズする配列は、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、さらにより好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％又はより好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を共有し得る。
【００４５】
このようなハイブリダイゼーション条件の好ましい、限定されない例として、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーションと、それに続く、約５０℃での、好ましくは、約５５℃での、好ましくは、約６０℃での、さらにより好ましくは、約６５℃での１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での１回又は複数回の洗浄がある。
【００４６】
高度にストリンジェントな条件として、例えば、５×ＳＳＣ／５×デンハート液／１．０％  ＳＤＳ中約６８℃でのハイブリダイゼーション及び室温での０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中での洗浄が挙げられる。或いは、洗浄は、４２℃で実施され得る。
【００４７】
当業者ならば、ストリンジェントな及び高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件にどの条件を適用するかを承知するであろう。このような条件に関する追加のガイダンスは、当技術分野では、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ  （２００１年）  「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （第３版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９５年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．）において容易に入手可能である。
【００４８】
もちろん、ポリＡ配列（ｍＲＮＡの３’末端ポリ（Ａ）トラクトなど）と、又はＴ（又はＵ）残基の相補的ストレッチとのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、このようなポリヌクレオチドが、ポリ（Ａ）ストレッチ又はその相補体を含有する任意の核酸分子（例えば、実際に、任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）とハイブリダイズするであろうことから、本発明の核酸の一部と特異的にハイブリダイズするために使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。
【００４９】
同様に、「標的配列」は、例えば、変更が、導入されるべきである、又は検出されるべきである、標的化されるべきである核酸内のヌクレオチドの順序を表すためである。例えば、標的配列は、ＤＮＡ二本鎖の第１鎖によって含まれるヌクレオチドの順序である。
【００５０】
「エンドヌクレアーゼ」とは、二本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の鎖を、その認識部位への結合の際に加水分解する酵素である。エンドヌクレアーゼは、部位特異的エンドヌクレアーゼとして本明細書において理解されるべきである。制限エンドヌクレアーゼは、二本鎖の両鎖を同時に加水分解して、ＤＮＡに二本鎖切断を導入するエンドヌクレアーゼとして理解されるべきである。「ニッキング」エンドヌクレアーゼとは、二本鎖のうち一方の鎖のみを加水分解して、切断されたのではなく「ニッキングされた」ＤＮＡ分子を生成するエンドヌクレアーゼである。
【００５１】
プライマー結合部位は、二本鎖形成の際に、プライマー配列が選択的にハイブリダイズできるプライマー結合配列を含む部位として本明細書において定義される。したがって、プライマー結合配列は、好ましくは、一本鎖ＤＮＡ配列である。
【００５２】
エンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成されると、エンドヌクレアーゼが、ＤＮＡの少なくとも一方の鎖と結合でき、その後、ハイブリダイズできる特定の配列を含むと本明細書において定義される。エンドヌクレアーゼによって認識される特定の配列は、二本鎖ＤＮＡの第１鎖中又は第２鎖中に位置し得る。エンドヌクレアーゼによって作製される二本鎖又は一本鎖切断は、エンドヌクレアーゼ認識部位内に位置し得る。好ましくは、切断は、エンドヌクレアーゼ認識配列に直接隣接して位置する場合も、エンドヌクレアーゼ認識配列の下流の１つ若しくは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５若しくは１６）塩基上流に位置する場合もある。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、本発明の方法の好ましい実施形態の模式図を示す図である。ＰＢＳ１は、第１のプライマー結合部位であり、ＰＢＳ２は、第２のプライマー結合部位であり、ＥＳ１は、第１のエンドヌクレアーゼ認識部位であり、ＥＳ２は、第２のエンドヌクレアーゼ認識部位である。リバースプライマーは、タグ（黒色丸）を含み得る。固相支持体（大きな丸）は、タグ付きの、増幅された、ニッキングされた核酸前駆体を捕捉し得る。
【図２Ａ】図２は、本発明の２つの例示された核酸前駆体を示す図である。Ａ）第１のエンドヌクレアーゼ認識部位は、第１のプライマー結合部位内に（部分的に又は完全に）含まれる場合があり、第２のエンドヌクレアーゼ認識部位は、第２のプライマー結合部位内に（部分的に又は完全に）含まれる場合がある。Ｂ）要素が５つの別個の要素である核酸前駆体。略語及び記号は、図１について示されたとおりである。矢印は、プライマーであり、リバースプライマーは、タグ（黒色丸）を含み得る。
【図２Ｂ】図２は、本発明の２つの例示された核酸前駆体を示す図である。Ａ）第１のエンドヌクレアーゼ認識部位は、第１のプライマー結合部位内に（部分的に又は完全に）含まれる場合があり、第２のエンドヌクレアーゼ認識部位は、第２のプライマー結合部位内に（部分的に又は完全に）含まれる場合がある。Ｂ）要素が５つの別個の要素である核酸前駆体。略語及び記号は、図１について示されたとおりである。矢印は、プライマーであり、リバースプライマーは、タグ（黒色丸）を含み得る。
【図３Ａ】本発明の例示された核酸前駆体を示す図である。プライマー結合部位（ＰＢＳ）は、エンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ、黒色）と重複する場合がある。さらに、プライマー結合部位は、ユニバーサル部分（黒色及び白色）及び可変部分（灰色）を含み得る。Ａ）プライマー結合部位のユニバーサル部分及び可変部分と相補的であるプライマー対を使用する増幅は、核酸前駆体の特定のサブセットの増幅を可能にする。Ｂ）ユニバーサル部分とのみ相補的であるプライマー対を使用する増幅は、核酸前駆体の完全なプールの増幅を可能にする。略語及び記号は、図１及び２について示されたとおりである。
【図３Ｂ】本発明の例示された核酸前駆体を示す図である。プライマー結合部位（ＰＢＳ）は、エンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ、黒色）と重複する場合がある。さらに、プライマー結合部位は、ユニバーサル部分（黒色及び白色）及び可変部分（灰色）を含み得る。Ａ）プライマー結合部位のユニバーサル部分及び可変部分と相補的であるプライマー対を使用する増幅は、核酸前駆体の特定のサブセットの増幅を可能にする。Ｂ）ユニバーサル部分とのみ相補的であるプライマー対を使用する増幅は、核酸前駆体の完全なプールの増幅を可能にする。略語及び記号は、図１及び２について示されたとおりである。
【図４Ａ】図４は、本発明の例示された核酸前駆体を示す図である。核酸前駆体は、５つの別個の要素を含み得る。プライマー結合部位は、ユニバーサル部分（白色）及び可変部分（灰色）を含み得る。Ａ）プライマー結合部位のユニバーサル部分及び可変部分と相補的であるプライマー対を使用する増幅は、核酸前駆体の特定のサブセットの増幅を可能にする。Ｂ）ユニバーサル部分（白色）のみと相補的であるプライマー対を使用する増幅は、核酸前駆体の完全なプールの増幅を可能にする。略語及び記号は、図１及び２について示されたとおりである。
【図４Ｂ】図４は、本発明の例示された核酸前駆体を示す図である。核酸前駆体は、５つの別個の要素を含み得る。プライマー結合部位は、ユニバーサル部分（白色）及び可変部分（灰色）を含み得る。Ａ）プライマー結合部位のユニバーサル部分及び可変部分と相補的であるプライマー対を使用する増幅は、核酸前駆体の特定のサブセットの増幅を可能にする。Ｂ）ユニバーサル部分（白色）のみと相補的であるプライマー対を使用する増幅は、核酸前駆体の完全なプールの増幅を可能にする。略語及び記号は、図１及び２について示されたとおりである。
【図５Ａ】図５は、本発明の例示された核酸前駆体を示す図である。プライマー結合部位（ＰＢＳ）は、エンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ、黒色）と重複する場合がある。プライマー結合部位は、可変部分（灰色）及びユニバーサル部分（黒色及び白色）を含み得る。Ａ）可変部分及びＥＳとのみ十分に相補的であるプライマー対を使用する増幅は、核酸前駆体の特定のサブセットの増幅を可能にする。Ｂ）ユニバーサル部分（白色）のみと相補的であるプライマー対を使用する増幅は、核酸前駆体の完全なプールの増幅を可能にする。略語及び記号は、図１及び２について示されたとおりである。
【図５Ｂ】図５は、本発明の例示された核酸前駆体を示す図である。プライマー結合部位（ＰＢＳ）は、エンドヌクレアーゼ認識部位（ＥＳ、黒色）と重複する場合がある。プライマー結合部位は、可変部分（灰色）及びユニバーサル部分（黒色及び白色）を含み得る。Ａ）可変部分及びＥＳとのみ十分に相補的であるプライマー対を使用する増幅は、核酸前駆体の特定のサブセットの増幅を可能にする。Ｂ）ユニバーサル部分（白色）のみと相補的であるプライマー対を使用する増幅は、核酸前駆体の完全なプールの増幅を可能にする。略語及び記号は、図１及び２について示されたとおりである。
【図６Ａ】図６は、本発明の例示された核酸前駆体を示す図である。核酸前駆体は、５つの別個の要素を含み得る。プライマー結合部位は、可変部分（灰色）及びユニバーサル部分（白色）を含み得る。Ａ）可変部分とのみ十分に相補的であるプライマー対を使用する増幅は、核酸前駆体の特定のサブセットの増幅を可能にする。Ｂ）ユニバーサル部分（白色）のみと相補的であるプライマー対を使用する増幅は、核酸前駆体の完全なプールの増幅を可能にする。略語及び記号は、図１及び２について示されたとおりである。
【図６Ｂ】図６は、本発明の例示された核酸前駆体を示す図である。核酸前駆体は、５つの別個の要素を含み得る。プライマー結合部位は、可変部分（灰色）及びユニバーサル部分（白色）を含み得る。Ａ）可変部分とのみ十分に相補的であるプライマー対を使用する増幅は、核酸前駆体の特定のサブセットの増幅を可能にする。Ｂ）ユニバーサル部分（白色）のみと相補的であるプライマー対を使用する増幅は、核酸前駆体の完全なプールの増幅を可能にする。略語及び記号は、図１及び２について示されたとおりである。
【図７】図７は、結果Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ  Ｄ１０００（Ａｇｉｌｅｎｔ）を示す図である。２００μＬの総未精製ＰＣＲサンプルのうちの１μＬを調べ、５０μＬの総（精製）ＲＰＡサンプルのうち１μＬを調べた。
【図８】図８は、結果Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ  Ｄ１０００を示す図である。１０２ｂｐの明確な可視二本鎖増幅産物が検出され（合計１００μＬのうち１μＬを調べた）、これは増幅されたプローブ前駆体であると予測された。サイズの相違は、Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎシステムの不正確なサイズ分類による可能性が極めて高い。
【図９】図９は、ビオチンを用いる精製、結果Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡキット（４０μＬの総１／４希釈されたサンプルのうち１μＬを調べた）。回収されたＤＮＡは、予測された一本鎖５５〜６３ｎｔプローブに対応していた。サイズの相違は、アレイシステムの不正確なサイズ分類による可能性が極めて高い。
【図１０】図１０は、比較実験の結果Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ａｇｉｌｅｎｔを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
第１の態様において、本発明は、目的の配列を有する１つ又は複数の一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する方法であって、
ａ）第１鎖と、任意選択で、第１鎖と相補的である第２鎖を含む少なくとも１つの一本鎖−又は二本鎖核酸前駆体を提供するステップであって、第１鎖は、以下の要素：
（１）第１のプライマー結合部位、
（２）第１のエンドヌクレアーゼ認識部位、
（３）目的の配列、
（４）第２のエンドヌクレアーゼ認識部位、及び
（５）第２のプライマー結合部位
を５’から３’方向に含み、
第１のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第１のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ上流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計され、
第２のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第２のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ下流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計されている、ステップと、
ｂ）第１のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第１のプライマー及び第２のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第２のプライマーを使用する増幅法によって、ステップａ）の前駆体を増幅するステップと、
ｃ）ステップｂ）において得られた増幅された二本鎖前駆体を、第１及び第２のエンドヌクレアーゼで消化して、目的の配列のすぐ上流及び下流の糖−リン酸骨格が切断された増幅された二本鎖核酸前駆体を生成するステップと、
ｅ）増幅された二本鎖前駆体を変性させ、それによって目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを放出するステップと
を含む方法に関係する。
【００５５】
本発明の方法に、追加のステップ、例えば、得られた生成物の追加の精製ステップ又は（長期又は短期）貯蔵又は任意のその他の適した追加の方法ステップが含まれてもよい。
【００５６】
第１鎖は、目的の配列を含む。したがって、第１鎖は、目的の配列を含む、核酸前駆体の、又は本発明の方法のステップｂ）によってそれから増幅された核酸の鎖として本明細書において理解されるべきである。第２鎖は、目的の配列と相補的である配列を含む。第２鎖は、第１鎖と相補的である、核酸前駆体の、又は本発明の方法のステップｂ）によってそれから増幅された核酸の鎖として本明細書において理解されるべきである。
【００５７】
第１鎖の第１のプライマー結合部位は、第１のプライマー結合配列の逆相補体を含み、その結果、相補鎖（また、第２鎖として本明細書において示される）が、この第１のプライマー結合部位内に、第１のプライマーが選択的にアニーリングできる第１のプライマー結合配列を含むと、本明細書において理解されるべきである。第１鎖の第２のプライマー結合部位は、第１鎖中に、第２のプライマーが選択的にアニーリングできる第２のプライマー結合配列を含むとさらに理解されるべきである。好ましくは、第１のプライマーは、第１のプライマー結合配列のみと選択的にアニーリングでき、第２のプライマーは、第２のプライマー結合配列のみと選択的にアニーリングできる。任意選択で、第１及び第２のプライマーは、第１及び第２のプライマー結合部位の両方とアニーリングできるという意味で、第１及び第２のプライマーは、同一である場合も、同様である場合もある。任意選択で、（第１及び第２の）プライマーは、第１及び第２のプライマー結合部位の両方のみと選択的にアニーリングできる。
【００５８】
好ましくは、目的の配列は、第１及び／又は第２のエンドヌクレアーゼ認識部位又はその逆相補体を含まない。
【００５９】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、目的の配列と相補的である配列を含むオリゴヌクレオチドを、目的の配列を含む第１鎖から、又は第１鎖の残部から分離するために１つ又は複数のステップをさらに含む。好ましくは、これは、目的の配列と相補的である配列を含む第２鎖、又は第２鎖の残部を固定化するステップｄ）を、
ｉ）増幅ステップｂ）と消化ステップｃ）の間に、
ｉｉ）消化ステップｃ）と変性ステップｅ）の間に、又は、
ｉｉｉ）変性ステップｅ）の後に
追加することによって達成される。
【００６０】
好ましくは、この固定化ステップは、固相支持体で目的の配列と相補的である配列を含む第２鎖又はその一部を親和性捕捉することを含む。これは、目的の配列と相補的である配列を含む第２鎖に全体として、又はその一部にタグをつけることを必要とし得る。第２鎖に全体としてタグをつけることは、本発明の方法のステップｂ）において、親和性タグを含む第２のプライマーを使用して、タグを含む増幅された二本鎖核酸前駆体を生成することで達成できる。
【００６１】
親和性タグは、少なくとも第２のプライマーに存在し得る。親和性タグは、第１のプライマー及び第２のプライマーの両方に存在し得るということは本明細書においてさらに理解される。或いは、親和性タグは、第１のプライマーに存在しない、例えば、親和性タグは、第２のプライマーにのみ存在する。
【００６２】
別の実施形態では、ステップｂ）において使用される第２のプライマーは、増幅の前に、本明細書において明記されたように固相支持体に存在する場合があり、ステップｂ）における増幅は、固相支持体で実施され、第２鎖を介して固相支持体に付着されたアンプリコンをもたらす。この実施形態内で、増幅のための第１のプライマーは、固相支持体とは別個に提供され得る、例えば、溶液中に存在する場合があり、第２のプライマーは、例えば、共有結合連結によって固相支持体に連結され得る、又は本明細書においてさらに詳述されるように親和性捕捉によって固定化され得る。
【００６３】
目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを得るために、目的の配列の逆相補体を含む第２鎖又はその一部を除去するさらなるステップが、本発明の方法に追加される。前記除去ステップは、好ましくは、上記で定義されるような選択肢ｉ）若しくはｉｉ）において変性ステップの後に、又は上記で定義されるような選択肢ｉｉｉ）において固定化ステップの後に追加される。好ましくは、この実施形態内で、前駆体又は方法は、本発明の方法のステップｃ）において定義されるような増幅された二本鎖前駆体を消化することが、目的の配列まで、及び目的の配列を含めてタグの間の第２鎖の糖−リン酸骨格を無傷で維持するように設計される。
【００６４】
したがって、本発明の方法の好ましい実施形態は、
ａ）第１鎖と、任意選択で、第１鎖と相補的である第２鎖を含む少なくとも１つの一本鎖又は二本鎖核酸前駆体を提供するステップであって、第１鎖は、以下の要素：
（１）第１のプライマー結合部位、
（２）第１のエンドヌクレアーゼ認識部位、
（３）目的の配列、
（４）第２のエンドヌクレアーゼ認識部位、及び、
（５）第２のプライマー結合部位
を５’から３’方向に含み、
第１のプライマーは、第１のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、第２のプライマーは、第２のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、
目的の配列は、第１及び第２のエンドヌクレアーゼ認識部位又はその逆相補体を含まず、
第１のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第１のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ上流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計され、
第２のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第２のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ下流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計されている、ステップと、
ｂ）第１のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第１のプライマー及び第２のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第２のプライマーを使用して、タグを含む増幅された二本鎖核酸前駆体を生成することで、増幅法によって、ステップａ）の前駆体を増幅するステップであって、少なくとも第２のプライマーは、親和性タグを含む、ステップと（好ましくは、親和性タグは、第１のプライマーに存在しない）、
ｃ）ステップｂ）において得られた増幅された二本鎖前駆体を、第１のエンドヌクレアーゼで、及び第２のエンドヌクレアーゼで消化して、目的の配列のすぐ上流及び下流の糖−リン酸骨格が切断されており、タグから、目的の配列と相補的である配列を含めて目的の配列と相補的である配列までの間の無傷の糖−リン酸骨格を有する増幅された二本鎖核酸前駆体を生成するステップと、
ｄ）増幅された二本鎖核酸前駆体を、タグ付き相補的第２鎖の親和性捕捉によって固相支持体に固定化するステップと、
ｅ）増幅された二本鎖前駆体を変性させ、それによって目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを放出するステップと、
ｆ）固相支持体を除去して、目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを得るステップと
を含む。
【００６５】
本発明の好ましい実施形態の模式図は、図１に表されている。当業者ならば、本発明の方法は、上記で詳述されたようなステップを含み得ることは理解されよう。しかし、ステップが上記で明記された順序で実施されることは本発明にとって必須ではない。好ましい実施形態では、ステップｃ）及びステップｄ）は、逆転される。代替実施形態では、ステップｄ）及びステップｅ）は、逆転される。
【００６６】
したがって、本発明の好ましい実施形態では、方法は、上記で明記された（及び以下にさらに詳述される）ステップを以下の順序で含み得る：
ｉ）ステップａ）、ステップｂ）、ステップｃ）、ステップｄ）、ステップｅ）及びステップｆ）、又は
ｉｉ）ステップａ）、ステップｂ）、ステップｄ）、ステップｃ）、ステップｅ）及びステップｆ）、又は
ｉｉｉ）ステップａ）、ステップｂ）、ステップｃ）、ステップｅ）、ステップｄ）及びステップｆ）。
【００６７】
したがって、任意選択で、本発明の方法は、以下の引き続くステップを含み得る：
ａ）第１鎖と、任意選択で、第１鎖と相補的である第２鎖を含む少なくとも１つの一本鎖−又は二本鎖核酸前駆体を提供するステップであって、第１鎖は、以下の要素：
（１）第１のプライマー結合部位、
（２）第１のエンドヌクレアーゼ認識部位、
（３）目的の配列、
（４）第２のエンドヌクレアーゼ認識部位、及び
（５）第２のプライマー結合部位
を５’から３’方向に含み、
第１のプライマーは、第１のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、第２のプライマーは、第２のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、
目的の配列は、第１及び第２のエンドヌクレアーゼ認識部位又はその逆相補体を含まず、
第１のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第１のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ上流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計され、
第２のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第２のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ下流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計されている、ステップと、
ｂ）第１のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第１のプライマー及び第２のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第２のプライマーを使用して、タグを含む増幅された二本鎖核酸前駆体を生成することで、増幅法によって、前駆体を増幅するステップであって、第２のプライマーは、親和性タグを含み、好ましくは、親和性タグは、第１のプライマーに存在しない、ステップと、
ｄ）増幅された二本鎖核酸前駆体を、タグ付き相補的第２鎖の親和性捕捉によって固相支持体に固定化するステップと、
ｃ）増幅された二本鎖前駆体を、第１のエンドヌクレアーゼで、及び第２のエンドヌクレアーゼで消化して、目的の配列のすぐ上流及び下流の糖−リン酸骨格が切断されており、タグから、目的の配列と相補的である配列を含めて目的の配列と相補的である配列までの間の無傷の糖−リン酸骨格を有する増幅された二本鎖核酸前駆体を生成するステップと、
ｅ）増幅された二本鎖前駆体を変性させ、それによって目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを放出するステップと、
ｆ）固相支持体を除去して、目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを得るステップ。
【００６８】
さらに、本発明の方法は、以下の後続ステップを含み得る：
ａ）第１鎖と、任意選択で、第１鎖と相補的である第２鎖を含む少なくとも１つの一本鎖又は二本鎖核酸前駆体を提供するステップであって、第１鎖は、以下の要素：
（１）第１のプライマー結合部位、
（２）第１のエンドヌクレアーゼ認識部位、
（３）目的の配列、
（４）第２のエンドヌクレアーゼ認識部位、及び、
（５）第２のプライマー結合部位
を５’から３’方向に含み、
第１のプライマーは、第１のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、第２のプライマーは、第２のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、
目的の配列は、第１及び第２のエンドヌクレアーゼ認識部位又はその逆相補体を含まず、
第１のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第１のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ上流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計され、
第２のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第２のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ下流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計されている、ステップと、
ｂ）第１のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第１のプライマー及び第２のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第２のプライマーを使用して、タグを含む増幅された二本鎖核酸前駆体を生成することで、増幅法によって、前駆体を増幅するステップであって、第２のプライマーは、親和性タグを含み、好ましくは、親和性タグは、第１のプライマーに存在しない、ステップと、
ｃ）増幅された二本鎖前駆体を、第１のエンドヌクレアーゼで、及び第２のエンドヌクレアーゼで消化して、目的の配列のすぐ上流及び下流の糖−リン酸骨格が切断されており、タグから、目的の配列と相補的である配列を含めて目的の配列と相補的である配列までの間の無傷の糖−リン酸骨格を有する増幅された二本鎖核酸前駆体を生成するステップと、
ｅ）増幅された二本鎖前駆体を変性させ、それによって目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを放出するステップと、
ｄ）変性された増幅された二本鎖核酸前駆体のタグ付き相補的第２鎖を、親和性捕捉によって固相支持体に固定化するステップと、
ｆ）固相支持体を除去して、目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを得るステップ。
【００６９】
追加の精製ステップが、例えば、ステップａ）とステップｂ）の間に、及び／又はステップｂ）とステップｃ）の間に、及び／又はステップｃ）とステップｄ）の間に、及び／又はステップｄ）とステップｅ）の間に、及び／又はステップｅ）とステップｆ）の間に、及び／又はステップｄ）とステップｃ）の間に、及び／又はステップｅ）とステップｄ）の間に、及び／又はステップｂ）とステップｄ）の間に、及び／又はステップｃ）とステップｅ）の間に、及び／又はステップｄ）とステップｆ）の間に、及び／又はステップｆ）の後に含まれてもよい。
【００７０】
或いは、方法は、上記で定義されるような以下のステップからなり得る
ｉ）ステップａ）、ステップｂ）、ステップｃ）、ステップｄ）、ステップｅ）及びステップｆ）、又は
ｉｉ）ステップａ）、ステップｂ）、ステップｄ）、ステップｃ）、ステップｅ）及びステップｆ）、又は
ｉｉｉ）ステップａ）、ステップｂ）、ステップｃ）、ステップｅ）、ステップｄ）及びステップｆ）。
【００７１】
ステップｂ）における増幅が、上記で詳述されるように固相支持体で実施される場合には、方法は、上記で明記された（及び以下にされに詳述される）ステップを以下の順序で含み得る：ステップａ）、ステップｂ）、ステップｃ）、ステップｅ）及びステップｆ）。言い換えれば、本発明の方法は、以下の連続ステップを含み得る：
ａ）第１鎖と、任意選択で、第１鎖と相補的である第２鎖を含む少なくとも１つの一本鎖又は二本鎖核酸前駆体を提供するステップであって、第１鎖は、以下の要素：
（１）第１のプライマー結合部位、
（２）第１のエンドヌクレアーゼ認識部位、
（３）目的の配列、
（４）第２のエンドヌクレアーゼ認識部位、及び
（５）第２のプライマー結合部位
を５’から３’方向に含み、
第１のプライマーは、第１のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、第２のプライマーは、第２のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき、
目的の配列は、第１及び第２のエンドヌクレアーゼ認識部位又はその逆相補体を含まず、
第１のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第１のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ上流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計され、
第２のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第２のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ下流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計されている、ステップと、
ｂ）第１のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第１のプライマー及び第２のプライマー結合部位にハイブリダイズ可能な第２のプライマーを使用して、タグを含む増幅された二本鎖核酸前駆体を生成することで、増幅法によって、ステップａ）の前駆体を増幅するステップであって、第２のプライマーは、固相支持体に連結されている、ステップと、
ｃ）ステップｂ）において得られた増幅された二本鎖前駆体を、第１のエンドヌクレアーゼで、及び第２のエンドヌクレアーゼで消化して、目的の配列のすぐ上流及び下流の糖−リン酸骨格が切断されており、タグから、目的の配列と相補的である配列を含めて目的の配列と相補的である配列までの間の無傷の糖−リン酸骨格を有する増幅された二本鎖核酸前駆体を生成するステップと、
ｅ）増幅された二本鎖前駆体を変性させ、それによって目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを放出するステップと、及び任意選択で、
ｆ）固相支持体を除去して、目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを得るステップ。
【００７２】
１つ又は複数の追加の精製ステップが、例えば、ステップａ）とステップｂ）の間に、及び／又はステップｂ）とステップｃ）の間に、及び／又はステップｃ）とステップｅ）の間に、及び／又はステップｅ）とステップｆ）の間に、及び／又はステップｆ）の後ろに含まれてもよい。或いは、増幅が固相支持体で適用されるこの実施形態内では、方法は、この実施形態において上記で定義されるような以下のステップからなり得る：ステップａ）、ステップｂ）、ステップｃ）、ステップｅ）及びステップｆ）。目的の配列は、本発明の方法のステップａ）において提供される核酸前駆体内にすでに含まれているので、本発明の方法はまた、目的の配列を有する１つ又は複数の一本鎖オリゴヌクレオチドの増幅の方法と考えられ得る。
【００７３】
本発明を以下により詳細に説明する：
目的の配列を有するオリゴヌクレオチド
第１の態様では、本発明は、目的の配列を有する１つ又は複数の一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する方法に関係する。一本鎖オリゴヌクレオチドは、短い一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子として本明細書において定義される。好ましい実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ分子である。方法は、任意選択で、異なる配列、例えば、本発明の方法のステップａ）において出発材料として、さらに本明細書において「核酸前駆体」の下で定義されるような、これらの任意選択で異なる配列を含む複数の前駆体オリゴヌクレオチドの初期プールを使用する、目的の異なる配列を有する多数のオリゴヌクレオチドのプールされた生成（すなわち、単一容器における生成）に特に適している。
【００７４】
好ましい実施形態では、生成された一本鎖オリゴヌクレオチド又は一本鎖オリゴヌクレオチドのプールは、約２０〜２００ヌクレオチド、好ましくは、約３０〜１８０ヌクレオチド、約４０〜１６０ヌクレオチド、約５０〜１４０ヌクレオチド、約６０〜１２０ヌクレオチド、約７０〜１１０ヌクレオチド、約７５〜１００ヌクレオチド、約７５〜９５ヌクレオチド又は約８０〜９０ヌクレオチドからなる、又は各々からなる。これらのヌクレオチドは、好ましくは、連続ヌクレオチドであるということは理解されるべきである。
【００７５】
好ましくは、生成したオリゴヌクレオチド又は一本鎖オリゴヌクレオチドのプールは、少なくとも約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５若しくは２００ヌクレオチドからなる、又は各々からなる、及び／又は２００、１９５、１９０、１８５、１８０、１７５、１７０、１６５、１６０、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５若しくは２０を超えるヌクレオチドを有さない。
【００７６】
本明細書においてさらに詳述される本発明の例示された実施形態では、核酸前駆体は、配列番号１〜配列番号９７８からなる群から選択される配列を有し、好ましくは、配列は、配列番号１〜３２６からなる群、配列番号３２７〜６５２からなる群及び／又は配列番号６５３〜９７８からなる群から選択される。最も好ましくは、核酸前駆体は、配列番号６５３〜９７８からなる群から選択される配列を有する。この実施形態において出発材料として使用される核酸前駆体のプールは、配列番号１〜配列番号９７８によって表されるこれらの９７８種の核酸前駆体のプールを含む、又はからなる。
【００７７】
生成されるべき一本鎖オリゴヌクレオチド又は一本鎖オリゴヌクレオチドのプールは、目的の配列を含み得る、若しくはからなり得る、又は各々含み得る、若しくはからなり得る。好ましくは、本発明の方法によって生成される一本鎖オリゴヌクレオチド又は一本鎖オリゴヌクレオチドのプールは、目的の配列からなる、又は各々からなる。特に好ましい目的の配列として、例えば、増幅のためのプライマーとして、ライゲーション、ハイブリダイゼーション若しくは（溶液中での）捕捉のためのプローブとして、又はアダプターとして、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として使用され得る配列がある。
【００７８】
プライマー又はプライマーオリゴヌクレオチドとして使用するための目的の配列は、増幅されるべき所定の標的配列と少なくとも部分的に相補的である配列、例えば、所定の（ゲノム）ＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列及び／又は無細胞ＤＮＡ配列を含み得る。このような配列は、相補的標的配列と本明細書において命名される。好ましくは、前記相補的標的配列は、所定の標的配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９８％又は９９％相補的である。最も好ましくは、相補的標的配列は、所定の標的配列に対して十分に相補的である（１００％）。好ましくは、このような相補的標的配列は、約１８、１９、２０、２１、２２、２３ヌクレオチド長のストレッチである。任意選択で、プライマーとして使用するための目的の配列は、さらなる機能的要素、例えば、（１つ若しくは複数の）その後の増幅及び／又はシーケンシングステップのための１つ若しくは複数のプライマー結合部位及び／又は例えば、サンプル追跡若しくは分子インデックス化のための１つ若しくは複数のバーコード付け配列（任意選択で、国際公開第２０１６／２０１１４２号に記載されるような、中断されたバーコード）及び／又は１つ若しくは複数の縮重ヌクレオチドを含む。プライマーは、３’末端に相補的標的配列及び１つ又は複数の機能的要素、好ましくは、上記で示されたような機能的要素を含むテールを含むプライマーとして本明細書において理解されるテイルドプライマーであり得る。或いは、プライマーは、米国特許出願公開第２００８／０３０５４７８号、米国特許出願公開第２０１０／０２２７３２０号、米国特許出願公開第２０１６／００６８９０３号に記載されるようなオメガプライマーであり得る。このようなオメガプライマーは、通常、プライマーの３’及び５’両末端に、標的と結合しない、その後、モノプレックスＰＣＲの誘導セクションとして使用され得るループ（通常、１２〜５０ヌクレオチド長のストレッチ）によってわけられている２つの相補的標的配列を含む（通常、それぞれ、６〜６０ヌクレオチド長のストレッチ及び１０〜１００ヌクレオチド長のストレッチ）。
【００７９】
本発明の方法は、例えば、マルチプレックスＰＣＲなどのマルチプレックスオリゴヌクレオチドベースの増幅において使用され得るプライマーオリゴヌクレオチドの定義されたプールの生成に特に適している。このようなプライマープールは、一緒に、特定の標的配列を増幅するのに適しているプライマー対を含み得る、又はからなり得る。任意選択で、対の両プライマーは、標的特異的であり、これは、プライマーの少なくとも一部は、ある特定の遺伝子又はその一部であり得る増幅されるべき特異的配列と相補的である配列として含まれると本明細書において理解されるべきである。或いは、対の一方のプライマーは、特定の標的配列に対して特異的ではない配列、例えば、アダプター中の所定の配列とアニーリング可能であり得る、いわゆる、共通プライマーであるのに対し、対のもう一方のプライマーは標的特異的である。任意選択で、対の両プライマーは、共通プライマーである。対のプライマーがテイルドプライマーである場合には、テールは、共通プライマーの対を用いるその後のテールＰＣＲのためのユニバーサル配列を含み得る。
【００８０】
生成されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０−、２０、４０−、６０−、８０−、１００−、１２０−、１４０−、１６０−、１８０−、２００−、２２０−、２４０−、２６０−、２８０−、３００−、３２０−、３２６−、３４０−、３６０、３８０−、４００−、４２０−、４４０−、４６０−、４８０−、５００−、６００−、７００−、８００−、９００−、１，０００−、２，０００−、３，０００−、４，０００−、５，０００−、６，０００−、７，０００−、８，０００−、９，０００−、１０，０００−、２０，０００−、３０，０００−、４０，０００−、５０，０００−、６０，０００−、７０，０００、８０，０００−、９０，０００−、１００，０００−、２００，０００−、３００，０００−、４００，０００−又は５００，０００−プレックスＰＣＲアッセイにおいてプライマーとして使用するのに適している。ｎ−プレックスＰＣＲアッセイは、ｎ種の異なる標的配列の増幅をもたらす単一反応容器におけるＰＣＲ反応として本明細書において理解されるべきである。本発明の方法によって生成されたプライマーはまた、合成によるシーケンシングのために、又はクローニングのために使用され得る。
【００８１】
本発明の方法において生成されたオリゴヌクレオチドはまた、プローブとして使用するのに特に適している。したがって、目的の配列は、プローブ配列からなり得る、又は含み得る。プローブ又はプローブオリゴヌクレオチドは、プローブ中の配列と相補的であるヌクレオチド配列、すなわち、標的配列の存在を検出するために使用される（単独で、又は１つ若しくは複数の他のプローブと組み合わせて）オリゴヌクレオチドとして本明細書において理解される。このようなプローブ配列は、したがって、上記で定義されたような相補的標的配列を含み、１つ若しくは複数のプライマー結合部位及び／又は１つ若しくは複数のバーコード配列をさらに含み得る。プローブは、タグ（標識）、例えば、親和性リガンド又は放射活性若しくは蛍光タグをさらに含み得る。本発明の方法によって生成されたオリゴヌクレオチドプローブは、中でも、核酸検出の分野、例えば、ハイブリダイゼーションによる核酸の（ハイスループット）検出又は核酸の（溶液中での）捕捉（ハイブリダイゼーション捕捉プローブ）、標的化される変動検出及び標的化される及び／又はプログラム可能なゲノム編集の分野において使用するのに特に適している。本発明の方法は、例えば、マルチプレックスＯＬＡにおいて使用され得るプローブオリゴヌクレオチドの定義されたプールの生成にとって特に適している。
【００８２】
プローブは、別のプローブと一緒に、例えば、ＳＮＰ又はインデル検出において使用され得るＯＬＡプローブであり得る。例えば、国際公開第２００７／１００２４３号に記載されるように、第１及び第２のプローブのハイブリダイゼーションのための２つの標的配列は、プローブが結合の際に直接ライゲーションされ得るように互いに隣接して位置しており、又はこれらの２つの標的配列は、隣接せず、間にギャップを残し、その結果、ギャップファイリング（Ａｋｈｕｎｏｖら、Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２００９年８月；１１９巻（３号）：５０７〜５１７頁）又はギャップライゲーション（例えば、国際公開第００／７７２６０号に記載されるような適した第３のオリゴヌクレオチドを使用する）が必要とされる。さらに、本発明の方法によって生成されるようなプローブはまた、南京錠プローブ（例えば、Ｎｉｌｓｓｏｎら  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９４年９月３０巻；２６５巻（５１８１号）：２０８５〜２０８８頁に記載されるような）、分子反転プローブ（例えば、Ｈａｒｄｅｎｂｏｌら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００３年６月；２１巻（６号）：６７３−６７８頁に記載されるような）又はコネクタ反転プローブ（例えば、Ａｋｈｒａｓら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２００７年；２巻（９号）：ｅ９１５に記載されるような）である場合もあり、これらはすべて、一般に、標的と相補的である２つのセグメント（各々一般に、約２０ヌクレオチド長）を含み、これらのセクションがリンカー（例えば、４０ヌクレオチド長リンカー）によって接続されている一本鎖核酸分子である。核酸分子は、標的配列とのハイブリダイゼーション及びライゲーション（任意選択で、ギャップファイリング後）の際に環状になる。リンカー配列中の機能の存在は、増幅及びその後の検出を可能にし得る。
【００８３】
本明細書において定義されるような１つ若しくは複数のプライマーを使用して増幅される、及び／又は本明細書において定義されるような１つ若しくは複数のプローブを使用して検出されるべき特に好ましい所定の標的配列として、遺伝子変動、例えば、多型を含有する、表す、又はそれと関連するヌクレオチド配列、すなわち、多型部位を有するゲノム配列がある。多型という用語は、本明細書において、集団における２つ又はそれより多い遺伝子的に決定された代替配列又は対立遺伝子の出現を指す。プローブ、相補的標的配列が、好ましくは、多型部位のこれらの２つ又はそれより多い遺伝子的に決定された代替配列のうち１つのみと（少なくとも部分的に）相補的である。プライマーの場合には、相補的標的配列は、好ましくは、このような多型部位に隣接する（例えば、上流又は下流の）遺伝的に決定された配列と（少なくとも部分的に）相補的である。
【００８４】
多型部位は、ＳＮＰなど、１塩基対ほどに小さいものであり得る。多型として、制限断片長多型を、変動数のタンデムリピート（ＶＮＴＲ’ｓ）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、単純反復配列及びＡｌｕなどの挿入要素が挙げられる。プローブの場合には、相補的標的配列は、２つ又はそれより多い遺伝的に決定された代替ＳＮＰ対立遺伝子配列のうち１つのみと（少なくとも部分的に）相補的である。より好ましくは、ライゲーションプローブの場合には、相補的標的配列の５’又は３’末端のヌクレオチドは、代替（ＳＮＰ）対立遺伝子のうち１つのみと相補的である。
【００８５】
好ましい実施形態では、生成されたオリゴヌクレオチドは、ＯＬＡアッセイにおいて使用するのに適している。本発明の方法は、高品質一本鎖オリゴヌクレオチドの生成をもたらす。このようなオリゴヌクレオチドは、マルチプレックス化アッセイ、例えば、それだけには限らないが、マルチプレックスオリゴヌクレオチドベースの増幅（例えば、マルチプレックスＰＣＲ）、マルチプレックス捕捉ハイブリダイゼーション、ＭＬＰＡ及びマルチプレックスＯＬＡアッセイにおいて特に有用である。好ましくは、生成されたオリゴヌクレオチドは、例えば、米国特許第４，９８８，６１７号、Ｎｉｌｓｓｏｎら（前掲）、米国特許第５，８７６，９２４号、国際公開第９８／０４７４５号国際公開第９８／０４７４６号、米国特許第６，２２１，６０３号、米国特許第５，５２１，０６５号、米国特許第５，９６２，２２３号、欧州特許第１８５４９４号、米国特許第６，０２７，８８９号、米国特許第４，９８８，６１７号、欧州特許第２４６８６４号、米国特許第６，１５６，１７８号、欧州特許第７４５１４０号、欧州特許第９６４７０４号、国際公開第０３／０５４５１１号、米国特許出願公開第２００３／０１１９００４号、米国特許出願公開第２００３／１９０６４６号、欧州特許第１３１３８８０号、米国特許出願公開第２００３／００３２０１６号、欧州特許第９１２７６１号、欧州特許第９５６３５９号、米国特許出願公開第２００３／１０８９１３号、欧州特許第１２５５８７１号、欧州特許第１１９４７７０号、欧州特許第１２５２３３４号、国際出願第９６／１５２７１号、国際出願第９７／４５５５９号、米国特許出願公開第２００３／０１１９００４号、米国特許第５，４７０，７０５号、国際公開第２００４／１１１２７１号、国際公開第２００５／０２１７９４号、国際公開第２００５／１１８８４７号、国際公開第０３／０５２１４２号、ｖａｎ  Ｅｉｊｋ  ＭＪ（前掲）、国際公開第２００７／１００２４３号、国際公開第０１／５７２６９号、国際公開第０３／００６６７７号、国際公開第０１／０６１０３３号、国際公開第２００４／０７６６９２号、国際公開第２００６／０７６０１７号、国際公開第２０１２／０１９１８７号、国際公開第２０１２／０２１７４９号、国際公開第２０１３／１０６８０７号、国際公開第２０１５／１５４０２８号、国際公開第２０１５／０１４９６２号及び国際公開第２０１３／００９１７５号に記載されるように、ＯＬＡマルチプレックスアッセイにおいて使用するのに適している。
【００８６】
さらに好ましい実施形態では、生成されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０−、２０−、４０−、６０−、８０−、１００−、１２０−、１４０−、１６０−、１８０−、２００−、２２０−、２４０−、２６０−、２８０、３００−、３２０−、３２６−、３４０−、３６０−、３８０−、４００−、４２０−、４４０−、４６０−、４８０−、５００−、６００−、７００−、８００−、９００−、１，０００、２，０００−、３，０００−、４，０００−、５，０００−、６，０００−、７，０００−、８，０００−、９，０００−、１０，０００−、２０，０００−、３０，０００−、４０，０００−、５０，０００−、６０，０００−、７０，０００−、８０，０００−、９０，０００−、１００，０００−、２００，０００−、３００，０００−、４００，０００−又は５００，０００−プレックスＯＬＡアッセイにおいてプローブとして使用するのに適している。好ましくは、生成されたオリゴは、少なくとも３００−プレックスＯＬＡアッセイにおいて、さらにより好ましくは、少なくとも３２６−プレックスＯＬＡアッセイにおいて使用するのに適している。
【００８７】
本発明の方法によって生成されたオリゴヌクレオチドはまた、一本鎖アダプターとして、又は部分的に、若しくは完全に二本鎖のアダプター（それだけには限らないが、Ｙ型アダプターなど）の調製のために使用され得る。部分的に又は完全に二本鎖のアダプターは、２つの部分的又は完全に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって形成され得る。アダプターとして使用するためのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、機能的要素、例えば、それだけには限らないが、（１つ若しくは複数の）増幅ステップ及び／又はシーケンシングのための１つ若しくは複数のプライマー結合部位及び／又は例えば、サンプル追跡若しくは分子インデックス化のための１つ若しくは複数のバーコード付け配列（任意選択で国際公開第２０１６／２０１１４２号に記載されるような、中断されたバーコード）及び／又は１つ若しくは複数の縮重ヌクレオチドを含む。
【００８８】
核酸前駆体
本発明の方法の第１のステップは、第１鎖と、任意選択で、第１鎖と相補的である第２鎖を含む少なくとも１つの一本鎖又は二本鎖核酸前駆体を提供することである。核酸前駆体は、好ましくは、ＤＮＡ分子である。
【００８９】
したがって、本発明の方法において使用するための核酸前駆体は、第１鎖を含む一本鎖核酸前駆体であり得る。或いは、本発明において使用するための核酸前駆体は、第１鎖と、第１鎖と相補的である第２鎖とを含む二本鎖核酸前駆体であり得る。核酸前駆体の任意選択の第２鎖は、好ましくは、第１鎖に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９８％又は９９％相補的である。最も好ましくは、任意選択の第２鎖は、第１鎖に対してその全長にわたって十分に相補的（１００％）である。
【００９０】
好ましくは、核酸前駆体は、一本鎖核酸前駆体であり、最も好ましくは、核酸前駆体は、一本鎖ＤＮＡ核酸前駆体である。
【００９１】
核酸前駆体の長さは、少なくとも約５０、６０、７０、８０又は９０ヌクレオチド、好ましくは、最大で約５００、４５０、４００、３５０又は３００ヌクレオチド、例えば、５０から５００、５０から４００、５０から３５０、５０から３００、８０から５００、８０から４００、８０から３５０、８０から３００の間の長さのヌクレオチドである。
【００９２】
第１鎖は、好ましくは、以下の５つの要素：
（１）第１のプライマー結合部位、
（２）第１のエンドヌクレアーゼ認識部位、
（３）目的の配列、
（４）第２のエンドヌクレアーゼ認識部位、及び
（５）第２のプライマー結合部位
を５’から３’方向に含む、又はからなる。
【００９３】
これらの５つの要素は、５つの別個の要素であり得る（図２Ｂに例示されるように）、又は１つ若しくは複数の要素が部分的若しくは完全に重複している場合もある（図２Ａ）。例えば、第１のエンドヌクレアーゼ認識部位は、第１のプライマー結合配列の逆相補体配列内に部分的若しくは完全に含まれ得る、及び／又は第２のエンドヌクレアーゼ認識部位は、第２のプライマー結合配列内に部分的若しくは完全に含まれ得る。したがって、同一配列が、プライマー結合配列並びにエンドヌクレアーゼ認識部位として機能し得る（図２Ａ）。
【００９４】
したがって、第１鎖は、第１のプライマー結合部位（第１のプライマー結合配列の逆相補体配列を有し、二本鎖形成されると、相補鎖は、第１のプライマーがアニーリングできる第１のプライマー結合配列を含む）及び第２のプライマー結合部位（第２のプライマーがアニーリングできる第２のプライマー結合配列を有する）を含む。第１鎖の二本鎖形成の際（第１鎖と、相補的第２鎖を得るため）、第１のプライマーは、第１のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングでき（例えば、ハイブリダイズでき）、第２のプライマーは、第２のプライマー結合部位とのみ選択的にアニーリングできる（例えば、ハイブリダイズできる）。別の言い方をすると、第１のプライマーは、第１のプライマー結合部位を除いて、核酸前駆体及び／又はその相補体とアニーリングしない。同様に、第２のプライマーは、第２のプライマー結合部位を除いて、核酸前駆体及び／又はその相補体とアニーリングしない。任意選択で、第１及び第２のプライマーは、それらが、第１及び第２のプライマー結合部位の両方とアニーリングするという意味で、同一である場合も、同様である場合もある。さらに、第１及び第２のプライマー結合部位の配列は、同一である場合もある。言い換えれば、第１のプライマー結合配列は、第２のプライマー結合配列と同一である場合もある。
【００９５】
核酸前駆体は、上記で定義されるような目的の配列を含む。さらに好ましい実施形態では、２つ又はそれより多い核酸前駆体のプールが提供される。好ましくは、プールは、少なくとも２、３、４、５、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、９７８、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１３００、１４００、１５００、２０００、３０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００、０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、１，１００，０００、１，２００，０００、１，３００，０００、１，４００，０００又は１，５００，０００の核酸前駆体を含む。
【００９６】
核酸前駆体のこのプールの核酸配列は、プールの核酸前駆体のすべて又は一部の間で異なり得る。これらの核酸前駆体は、（１つ又は複数の）プライマー結合部位及び／又は（１つ又は複数の）エンドヌクレアーゼ認識部位中の目的の配列のヌクレオチド配列において異なり得る。核酸前駆体のプールは、少なくとも２、３、４、５，１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、９７８、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１３００、１４００、１５００又は２０００、３０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００、０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、１，１００，０００、１，２００，０００、１，３００，０００、１，４００，０００又は１，５００，０００の固有の配列を含み得る。少なくとも２つの固有の配列を含む核酸前駆体のプールは、その全長にわたって同一のヌクレオチド配列を有さない、すなわち、そのヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヌクレオチド位置で異なっている少なくとも２つの核酸前駆体を含むプールとして本明細書において理解されるべきである。
【００９７】
好ましい実施形態では、核酸前駆体の最初のプールは、約２％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％又は１００％の固有の配列を含有し得る。核酸前駆体の最初のプールは、増幅ステップの前の核酸前駆体のプールとして本明細書において理解される。より好ましくは、核酸前駆体の最初のプールは、約７５％又は１００％の固有の配列を含有でき、それによって、約７５％の固有の配列を含有するプールが最も好ましい。このようなプールは、通常、（マルチプレックス）ＯＬＡアッセイのためのプローブの生成のためのプールであり、好ましくは、各ＳＮＰのために、２つの別個の対立遺伝子プローブ及び１つの遺伝子座プローブが使用され、これらのプローブは、等モル量の対立遺伝子及び遺伝子座プローブをもたらすために、第１の対立遺伝子プローブ１：第２の対立遺伝子プローブ２：遺伝子座プローブが１：１：２の比でライゲーションアッセイにおいて存在する。したがって、好ましい実施形態では、核酸前駆体の最初のプールは、約１：１：２の比の固有の配列を含有し得る。或いは、核酸前駆体の最初のプールは、約１：１の比で固有の配列を含有し得る（マルチプレックスオリゴヌクレオチドベースの増幅、又は隣接する（ａｂｕｔｔｉｎｇ）、隣接する（ａｄｊａｃｅｎｔ）若しくはより遠位に置かれた遺伝子座に特異的なプローブのみを使用するＯＬＡアッセイにおいて使用するためのオリゴヌクレオチド生成のために）。
【００９８】
好ましくは、核酸前駆体の固有の配列は、配列番号１〜配列番号９７８からなる群から選択される。さらに、少なくとも１つの配列は、配列番号１〜３２６からなる群から選択され得る、１つの配列は、配列番号３２７〜６５２からなる群から選択され得る。及び／又は１つの配列は、配列番号６５３〜９７８からなる群から選択され得る。
【００９９】
各核酸前駆体の第１のプライマー結合部位の配列は、プール内でオリゴヌクレオチド前駆体の各々について同一であり得る。さらに又は或いは、プール中の各オリゴヌクレオチド前駆体の第２のプライマー結合部位の配列は、プール内の核酸前駆体の各々について同一であり得る。さらに又は或いは、プール中の各オリゴヌクレオチド前駆体の第１のエンドヌクレアーゼ認識部位は、プール内の核酸前駆体の各々について同一であり得る。さらに又は或いは、プール中の各オリゴヌクレオチド前駆体の第２のエンドヌクレアーゼ認識部位は、プール内の核酸前駆体の各々について同一であり得る。本明細書において早期に示されたように、任意選択の実施形態では、第１及び第２のプライマー並びにプライマー結合部位は、同一である場合もあり、第１のプライマーがまた、第２のプライマー結合部位とアニーリングすることができ、逆もまた同様であり、核酸前駆体の増幅を可能にするような方法で高度に類似している場合もある。本発明の方法において使用される第１及び第２のエンドヌクレアーゼが、制限酵素である任意選択の実施形態では、第１及び第２のエンドヌクレアーゼ認識部位は、逆相補体配向であるが、互いに同一であり得る。言い換えれば、この実施形態内で、第１鎖内の第１のエンドヌクレアーゼ認識部位のヌクレオチド配列は、第１鎖中の第２のエンドヌクレアーゼ認識部位のヌクレオチド配列の逆相補体である。
【０１００】
任意選択で、プールの核酸前駆体は、１つ又は複数の特定のプライマー対の選択に応じてオリゴヌクレオチドの特定のサブセットの生成を可能にする方法で設計される。例えば、プール内の核酸前駆体の特定のサブセットは、特定のプライマー結合部位組合せを含み得る。好ましくは、これらのプライマー結合部位組合せは、これらのプライマー結合配列の５’末端（プライマー結合部位の可変部分と本明細書において命名される）で少なくとも２、３、４、５、６つ又はそれより多いヌクレオチドで異なり、その３’末端に対応する（ワトソン−クリック）１、２、３、４、５、６つ又はそれより多いヌクレオチドを有するプライマーを有する特定のサブセットの増幅を可能にする１つ又は複数のプライマー結合配列を含む。
【０１０１】
例えば、核酸前駆体の２つの異なるサブセットの第１及び／又は第２のプライマー結合部位は、ユニバーサル部分（２つのサブセットについてヌクレオチド配列が等しい）と可変部分（２つのサブセットについてヌクレオチド配列が異なる）を含む。好ましくは、このユニバーサル部分は、少なくとも１８ヌクレオチドを有し、可変部分は、１、２、３、４又はそれより多いヌクレオチド長さを有する。可変部分は、プライマー結合配列の５’末端部分に位置し、ユニバーサル部分は、プライマー結合配列の３’末端部分に位置する（２つの例示された実施形態については図３及び図４を参照のこと）。このような核酸前駆体の増幅の際、３’末端に選択的ヌクレオチドを有する（プライマー結合配列の可変部分と相補的であり、それとアニーリング可能である）１つ又は複数のプライマーが使用され得る。このような選択的ヌクレオチドの有無は、前駆体のどのサブセットが、又は任意選択ですべてのサブセットが増幅されるかを決定する。例えば、選択的ヌクレオチドを有さないプライマー（＋０／＋０）、すなわち、プライマー結合配列の１８ヌクレオチド長のユニバーサル部分のみと相補的である配列を含むプライマーを使用することによって、両サブセットの一緒の増幅が可能となる。例えば、プライマー結合配列のユニバーサル部分と相補的である１８ヌクレオチド長ヌクレオチドと隣接する、両プライマー対の（＋２／＋２）、又は対のプライマーの一方で（＋０／＋２又は２／＋０）３’末端に２つの選択的ヌクレオチドを含むプライマー対を使用することによって、サブセットのいずれか一方の増幅が可能となる。したがって、この特定の例では、プライマーの２つの選択的ヌクレオチドは、プライマー結合部位のユニバーサル部分の１８ヌクレオチドと直接隣接して位置する可変部分の２つのヌクレオチドと相補的である。
【０１０２】
したがって、第１及び第２のプライマー結合配列のそれぞれユニバーサル部分とのみアニーリングするプライマー対は、すべてのサブセットの増幅、すなわち、核酸前駆体の完全な最初のプールの増幅を可能にする。
【０１０３】
対照的に、プライマー結合配列の可変部分と（部分的に又は完全に）アニーリングし、任意選択で、プライマー結合配列のユニバーサル部分とも（部分的に又は完全に）アニーリングする少なくとも１つのプライマーを含むプライマー対は、１つ又は複数のサブセットの増幅を可能にする。このプライマー対の第２のプライマーは、他のプライマー結合配列のユニバーサル部分のみとアニーリングし得る、又は他のプライマー結合配列の可変部分と（部分的に又は完全に）アニーリングし、任意選択で、他のプライマー結合配列のユニバーサル部分とも（部分的に又は完全に）アニーリングし得ることは本明細書において理解される。
【０１０４】
好ましい実施形態では、プライマー結合配列のユニバーサル部分は、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は少なくとも２４ヌクレオチドを含む。さらに、プライマー結合配列の可変部分は、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は少なくとも１０ヌクレオチドを含む。
【０１０５】
さらに又は或いは、核酸前駆体は、本明細書において詳述されるような可変部分及びユニバーサル部分を有するプライマー結合部位を含むことができ、プライマーは、例えば、可変部分のみと結合して、増幅を可能にし得る。この実施形態では、可変部分は、好ましくは、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は少なくとも２４ヌクレオチドを含み得る。プライマーが効率的にアニーリングするのに十分なこのような比較的長い可変部分はまた、それ自体が別個のプライマー結合部位であると考えてもよい。別の言い方をすると、プールの核酸前駆体は、したがって、第１及び第２のプライマー結合部位の隣に、１つ又は２つの追加のプライマー結合部位を含み得る（例示された実施形態については、図５及び６を参照のこと）。より特には、プールの核酸前駆体（の第１鎖）は、第１のプライマー結合配列の逆相補体の上流若しくは５’末端に第３のプライマー結合配列の逆相補体を含み得る、及び／又は第２のプライマー結合配列の下流若しくは３’末端に第４のプライマー結合配列を含み得る。プール内の核酸前駆体は、特定のサブセットが、特定の第１及び第２のプライマー結合部位組合せを含み、一方で、この特定のサブセットを含むより大きなサブセットが、特定の第３及び第４のプライマー結合部位組合せを含むように設計され得る。第１、第２、第３及び第４のプライマー結合部位のうち少なくとも１つは、本明細書において詳述されるような可変部分及びユニバーサル部分をやはり含むことができ、それによって、可変部分の修飾及び特定のプライマー対の使用によって特定のサブセットの増幅が可能となることは本明細書においてさらに理解される。
【０１０６】
さらに、前駆体の第１鎖内のプライマー結合部位の可変部分は、第１のエンドヌクレアーゼが、第１のプライマー結合部位の可変部分の下流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断し、及び／又は第２のエンドヌクレアーゼが、第２のプライマー結合部位の可変部分の上流の第１鎖のＤＮＡを切断するように、第１のエンドヌクレアーゼ認識部位の下流及び／又は第２のエンドヌクレアーゼ認識部位の上流であり得る（図３及び５に例示される）。
【０１０７】
本発明の方法において使用するための核酸前駆体は、第１のエンドヌクレアーゼ認識部位及び第２のエンドヌクレアーゼ認識部位をさらに含む。
【０１０８】
核酸前駆体は、二本鎖形成後に、第１のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ上流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計された第１のエンドヌクレアーゼ認識部位を含む。「目的の配列のすぐ上流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断する」という表現は、糖−リン酸骨格が、目的の配列の５’−ヌクレオチドと前記５’−ヌクレオチドの上流である（又は５’側の）第１のヌクレオチドの間で切断されることを意味する。結果として、目的の配列の５’末端ヌクレオチド及び前記５’−ヌクレオチドの下流（又は３’側の）配列は、もはや、第１のプライマー結合部位及び第１のエンドヌクレアーゼ認識部位の逆相補体を含むＤＮＡ鎖の一部ではない。
【０１０９】
核酸前駆体は、二本鎖形成後に、第２のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ下流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計される第２のエンドヌクレアーゼ認識部位を含む。「目的の配列のすぐ下流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断する」という表現は、糖−リン酸骨格が、目的の配列の３’−ヌクレオチドと前記３’−ヌクレオチドの下流である（又は３’側の）第１のヌクレオチドの間で切断されることを意味する。結果として、目的の配列の３’−ヌクレオチド及び前記３’−ヌクレオチドの上流の配列は、もはや、第２のプライマー結合部位及び第２のエンドヌクレアーゼ認識部位を含むＤＮＡ鎖の一部ではない。したがって、二本鎖形成された前駆体の第１のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識する第１のエンドヌクレアーゼは、目的の配列のすぐ上流のＤＮＡを切断する。同様に、二本鎖形成された前駆体の第２のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識する第２のエンドヌクレアーゼは、目的の配列のすぐ下流のＤＮＡを切断する。
【０１１０】
本明細書において詳述されるように、エンドヌクレアーゼは、目的の配列のすぐ上流（第１のエンドヌクレアーゼ）又はすぐ下流（第２のエンドヌクレアーゼ）のいずれかの第１鎖の糖−リン酸骨格を切断する。これは、当技術分野で公知の、いわゆる「アウトサイドカッター」を使用することによって達成され得る。このようなアウトサイドカッターは、エンドヌクレアーゼ認識部位内の第１及び／又は第２のエンドヌクレアーゼ認識配列それぞれに直接隣接する第１鎖の糖−リン酸骨格を切断し得る。或いは、アウトサイドカッターは、前記酵素の認識配列から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６ヌクレオチド離れた糖−リン酸骨格を切断し得る。例えば、第１のエンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ認識配列から１０ヌクレオチド離れた箇所で切断する場合には、エンドヌクレアーゼ認識配列と目的の配列の間に１０ヌクレオチドが存在する。本明細書に示されるように、エンドヌクレアーゼ認識配列と目的の配列の間に位置するこれらのヌクレオチドは、第１及び／又は第２のプライマー結合部位の一部である場合があり、任意選択で、第１及び／又は第２のプライマー結合部位の可変部分を構成し得る。第１のエンドヌクレアーゼ及び／又は第２のエンドヌクレアーゼは、ニッキングエンドヌクレアーゼ又は制限エンドヌクレアーゼであり得る。好ましくは、目的の配列は、本発明の方法の消化ステップ後に目的の配列が無傷のままであるように設計され、本発明の方法において使用されるエンドヌクレアーゼはそのように選択される。
【０１１１】
少なくとも目的の配列の逆相補体を含む第２鎖又はその残部が、少なくとも目的の配列を含む第１鎖又はその残部から分離される場合には、本発明の方法は、増幅された二本鎖前駆体の第２鎖にタグをつけることを含む。本明細書においてさらに詳述されるように、このタグは、好ましくは、増幅された二本鎖前駆体の第２鎖の５’末端に位置し、増幅ステップにおいてタグ付きプライマーを使用することによって導入され得る。この実施形態内で、前駆体又は方法は、好ましくは、本発明の方法における増幅された二本鎖前駆体の消化の際に、タグから目的の配列の逆相補体まで、及び目的の配列の逆相補体を含めて第２鎖の糖−リン酸骨格が無傷のままであるように設計される。さらに、第２鎖の糖−リン酸骨格は、目的の配列の相補的な配列の３’で切断され得る。したがって、目的の配列と相補的である配列は切断されないことが好ましい。しかし、目的の配列と相補的である配列の糖−リン酸骨格が、その３’末端近くで切断され得る、例えば、糖リン酸骨格が、目的の配列と相補的である配列の３’末端の最後の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド前で切断され得ることが本発明内で考慮される。
【０１１２】
タグから目的の配列の逆相補体まで、及び目的の配列の逆相補体を含めて第２鎖の糖−リン酸骨格を無傷のままにする前駆体のあり得る設計は、目的の配列のすぐ下流の第１鎖のみをニッキングするような配向で、ニッキングエンドヌクレアーゼによって認識されるように設計された第２の制限認識部位の選択である。前記ニッキングエンドヌクレアーゼは、次いで、本発明の方法の消化ステップにおいて第２のエンドヌクレアーゼとして使用されるべきである。
【０１１３】
例えば、第１のエンドヌクレアーゼが、その認識配列ＧＧＡＴＣから４塩基離れ箇所で一本鎖切断を触媒可能な（すなわち、５’…ＧＧＡＴＣＮＮＮＮ：Ｎ…３’）Ｎｔ．ＡｌｗＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）である場合には、第１のエンドヌクレアーゼ認識部位は、目的の配列の５’−ヌクレオチドにすぐ隣接するＧＧＡＴＣＮＮＮＮを含む又はからなる（５’から３’方向に）。例えば、第２のエンドヌクレアーゼが、ＣＡＴＴＧＣの５’末端にすぐ隣接する一本鎖切断を触媒する（すなわち、５’…ＮＮ：ＣＡＴＴＧＣ…３’）Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）である場合には、第２のＲＥ認識部位は、ＣＡＴＴＧＣを含む又はからなり（５’から３’方向に）、目的の配列の３’−ヌクレオチドにすぐ隣接する。
【０１１４】
タグから目的の配列の逆相補体まで、及び目的の配列の逆相補体を含めて第２鎖の糖−リン酸骨格を無傷のままにする方法のあり得る設計は、エンドヌクレアーゼによって切断できない化学特性を有する第２のプライマー選択である。このような化学特性は、当技術分野で公知であり、それだけには限らないが、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、メチル化（例えば、Ｎ６−メチルアデノシン又はｍＡ、５−メチルシトシン又はｍＣ、５−ヒドロキシメチルシトシン又はｈｍＣ）及びロックド核酸（ＬＮＡ）に基づく化学特性から選択され得る。この特定の実施形態内で、第２のエンドヌクレアーゼは、目的の配列の３’末端ヌクレオチドと第２のエンドヌクレアーゼ認識部位の５’末端ヌクレオチドの間の第１鎖及び目的の配列の逆相補体の５’末端ヌクレオチドと第２のエンドヌクレアーゼ認識部位の３’末端ヌクレオチドの間の第２鎖又はこの位置の第２鎖５’の任意の位置を切断可能である制限エンドヌクレアーゼであり得る。第２のプライマーは、生成されたアンプリコンの第２鎖が、選択された第２の（制限）エンドヌクレアーゼによる切断に対して不活性であるように設計されなくてはならない。これは、第２の（制限）エンドヌクレアーゼが普通切断する位置で第２鎖でエンドヌクレアーゼ耐性の化学特性を有するアンプリコンをもたらす修飾された第２のプライマーを使用することによって企図され得る。
【０１１５】
増幅
本発明の方法は、第１のプライマー及び第２のプライマーを使用することで増幅法によって、本明細書において定義されるような核酸前駆体を増幅するステップを含む。核酸前駆体の増幅は、好ましくは、核酸前駆体の存在量（ａｂｕｎｄａｎｃｙ）の少なくとも１００倍、好ましくは、少なくとも５００、１０００又はさらには少なくとも５０００倍の増大をもたらす。本発明の方法における増幅ステップは、（増幅された）二本鎖核酸前駆体の生成をもたらす。
【０１１６】
ポリメラーゼ連鎖反応並びに等温増幅法など、任意の増幅法が、本発明の方法において使用するのに適したものであり得る。核酸前駆体がＰＣＲを使用して増幅される場合には、ＰＣＲの間の誤取り込み数を低減するために、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼの使用が好ましい。
【０１１７】
好ましくは、増幅法は、等温増幅法である。ループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）及びリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）など、いくつかの等温増幅法が、当技術分野で公知であり、本明細書に記載される本発明は、単一等温増幅法に限定されない。好ましい等温増幅法として、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）又はヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）がある。
【０１１８】
ヘリカーゼ依存性増幅は、ヘリカーゼの二本鎖ＤＮＡ巻き戻し活性を利用して、鎖を分離し、プライマーアニーリング及び鎖置換ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を可能にする。ＨＤＡは、当技術分野で周知である。例えば、ＨＤＡ方法は、米国特許第９０７４２４８号に記載されるような以下のステップを含み得る：
適したバッファー、核酸前駆体、第１及び第２のプライマー、ヘリカーゼ及びデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を組み合わせるステップ、
好ましくは、プライマーの融解温度の下、約５摂氏度からプライマーの融解温度の上、約３摂氏度の間である温度で反応混合物をインキュベートするステップ、
増幅された鋳型核酸を得るステップ。
【０１１９】
特に好ましい増幅法として、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）がある。ＲＰＡは、当技術分野で周知であり、例えば、Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇら（２００８年）、国際公開第２００３／０７２８０５号、国際公開第２００５／１１８８５３号、国際公開第２００７／０９６７０２号、国際公開第２００８／０３５２０５号、国際公開第２０１０／１３５３１０号、国際公開第２０１０／１４１９４０号、国際公開第２０１１／０３８１９７号、国際公開第２０１２／１３８９８９号に記載されるように、及び／又はＴｗｉｓｔＤＸ製のＴｗｉｓｔＡｍｐ  Ｂａｓｉｃキットを製造条件に従って使用して実施され得る。
【０１２０】
手短には、本明細書において定義されるような（１つ又は複数の）核酸前駆体を、ＲＰＡが起こるのに適したバッファー中で、第１及び第２のプライマー並びに少なくとも３種の酵素、すなわち、少なくともリコンビナーゼ、ポリメラーゼ及び一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）と接触させる。好ましくは、（１つ又は複数の）核酸前駆体を、第１及び第２のプライマーを接触させ、その後、酵素を添加する。ＰＲＡの一例は、以下に詳細に概説されている。しかし本発明は決して、以下に詳述されるＲＰＡ反応に制限されず、当業者ならば、このプロトコールへの変法は、本発明の範囲内であるということは理解している。
【０１２１】
例えば、２．４μＬの第１のプライマー（１０μＭ）、２．４μＬの第２のプライマー（１０μＭ）及び０．０１〜０．０５ｐｍｏｌの核酸前駆体を、Ｈ２Ｏ中で混合して、１８μＬの総容量とする。その後、バッファーを添加してもよく、特に、ＲＰＡの酵素が凍結乾燥状態にある場合には、例えば、２９．５μＬの再水和バッファーを１８μＬの上記で示される総容量に添加してもよく、バッファーは、以下の組成を有し得る：
０〜６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、例えば、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ
５０〜１５０ｍＭ  酢酸カリウム、例えば、１００ｍＭ  酢酸カリウム
０．３〜７．５ｗ／ｖポリエチレングリコール、例えば、５．４６％ｗ／ｖ  ＰＥＧ  ３５ｋＤａ。
【０１２２】
任意選択で、再水和溶液（バッファー、プライマー及び（１つ又は複数の）核酸前駆体を含む）をボルテックス処理し、短時間遠心沈殿する。その後、４７．５μＬの総容量の再水和溶液を、好ましくは、以下の構成成分を含む基本ＲＰＡ凍結乾燥反応ペレットに移す（示された濃度は、凍結乾燥前と同じ又は復元後と同じである）：
少なくとも１種のリコンビナーゼ（例えば、１００〜３５０ｎｇ／μＬ  ｕｖｓＸリコンビナーゼ、例えば、２６０ｎｇ／μＬ、好ましくは、バクテリオファージＴ６  ＵｖｓＸリコンビナーゼ）、
少なくとも１種の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（１５０〜８００ｎｇ／μＬ  ｇｐ３２、例えば、２５４ｎｇ／μＬ、好ましくは、バクテリオファージＲｂ６９  ｇｐ３２）、
少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、３０〜１５０ｎｇ／μＬ  バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｐｏｌ  Ｉ（Ｂｓｕ）ポリメラーゼ又はＳ．オーレウス（ａｕｒｅｕｓ）Ｐｏｌ  Ｉ大フラグメント（Ｓａｕポリメラーゼ）、例えば、９０ｎｇ／μＬ）、
ｄＮＴＰ又はｄＮＴＰ及びｄｄＮＴＰ混合物（１５０〜４００μＭ  ｄＮＴＰ、例えば、２４０μＭ）、
クラウディング剤（例えば、任意選択で、２．５％〜７．５％重量／容量のトレハロース、例えば、５．７％ｗ／ｖのトレハロースと組み合わせた、ポリエチレングリコール、好ましくは、１．５〜５％ｗ／ｖ  ＰＥＧ  ３５ｋＤａ、例えば、２．２８％ｗ／ｖ  ＰＥＧ  ３５ｋＤａ）、
バッファー（例えば、０〜６０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー、例えば、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ）、
還元剤（例えば、１〜１０ｍＭ  ＤＴＴ、例えば、５ｍＭ  ＤＴＴ）、
ＡＴＰ又はＡＴＰ類似体（例えば、１．５〜３．５ｍＭ  ＡＴＰ、例えば、２．５ｍＭ  ＡＴＰ）、
任意選択で、少なくとも１種のリコンビナーゼローディングタンパク質（例えば、５０〜２００ｎｇ／μＬ  ｕｖｓＹ、好ましくは、バクテリオファージＲｂ６９  ｕｖｓＹ、例えば、８８ｎｇ  バクテリオファージＲｂ６９  ｕｖｓＹ）、
ホスホクレアチン（例えば、２０〜７５ｍＭ、例えば、５０ｍＭホスホクレアチン）、
クレアチンキナーゼ（例えば、１０〜２００ｎｇ／μＬ、例えば、１００ｎｇ／μＬ）。
【０１２３】
反応混合物は、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（ｅｘｏＩＩＩ）、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｆｏ）又は８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）いずれかの５０〜２００ｎｇ／μＬをさらに含み得る。
【０１２４】
ＲＰＡ反応を開始するために、反応混合物に、マグネシウムを添加してもよい、例えば、酢酸マグネシウムを、８〜１６ｍＭの反応混合物中の最終濃度に添加してもよい（例えば、上記の例示された４７．５μＬの反応容量に、２μＬの２８０ｍＭ酢酸マグネシウムを添加してもよい）。任意選択で、酢酸マグネシウムは、反応混合物にすでに存在している、すなわち、その後添加されないが、上記で定義される再水和溶液の他の成分と一緒に（１つ又は複数の）核酸前駆体と接触させる。反応物を、所望の程度の増幅が達成されるまでインキュベートする。オリゴヌクレオチド前駆体を、上記で示されたようなこれらの酵素、プライマー及びバッファー構成成分と接触させた後、混合物を、好ましくは、約３７℃（好ましくは、２５℃から４２℃の間）で約１時間インキュベートする。好ましくは、ＲＰＡは、少なくとも１００倍、好ましくは、少なくとも２００、３００又はさらには少なくとも４００倍、例えば、約５００倍の核酸前駆体の増幅をもたらす。
【０１２５】
ＲＰＡのための他のプロトコールは、核酸前駆体の増幅に同等に適している。より特には、それだけには限らないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲｅｃＡ又は任意の門由来の任意の相同体タンパク質又はタンパク質複合体（例えば、Ｒａｄ５１）若しくはＲｅｃＴ若しくはＲｅｃＯ又はＵｖｘ、例えば、Ａｅｈ１  Ｕｖｘ、Ｔ４  ＵｖｓＸ、Ｔ６  ＵｖｓＸ及びｂ６９  Ｕｖｘなどの他のリコンビナーゼが使用され得る。ポリメラーゼは、真核生物又は原核生物ポリメラーゼであり得る。原核生物のポリメラーゼとして、少なくとも、大腸菌ｐｏｌ  Ｉ、大腸菌ｐｏｌ  ＩＩ、大腸菌ｐｏｌ  ＩＩＩ、大腸菌ｐｏｌ  ＩＶ及び大腸菌ｐｏｌＶが挙げられる。真核細胞ポリメラーゼとして、例えば、ｐｏｌ−、ｐｏｌ−β、ｐｏｌ−δ及びｐｏｌ−εからなる群から選択される多タンパク質ポリメラーゼ複合体が挙げられる。適したポリメラーゼは、大腸菌ＰｏｌＶ又は他の種の相同体ポリメラーゼであり得る。さらなる適した一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）は、大腸菌ｇｐ３２又はＡｅｈ１  ｇｐ３２、Ｔ４  ｇｐ３２、Ｒｂ６９  ｇｐ３２であり得る。使用されるべき適した酵素濃度は、２０μＭリコンビナーゼ、約１〜１０μＭ  ＳＳＢ及び約１〜２μＭポリメラーゼである。さらなる任意選択のクラウディング剤（ポリエチレングリコール及び／又はトレハロースとは別の）として、それだけには限らないが、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、フィコール、デキストラン、ＰＶＰ及びアルブミンがある。好ましい実施形態では、クラウディング剤は、２００，０００ダルトン未満の分子量を有する。さらに、クラウディング剤は、約０．５％〜約１５％の容量に対する重量（ｗ／ｖ）の量で存在し得る。
【０１２６】
核酸前駆体の増幅のために使用されるプライマーは、例えば、ＲＰＡ又はＰＣＲを使用する増幅のためのプライマー伸長を可能にするような程度に核酸前駆体とアニーリングする。特に、第１のプライマーは、第１のプライマー結合配列と（のみ）アニーリングし、第２のプライマーは、第２のプライマー結合配列と（のみ）アニーリングする。
【０１２７】
好ましい実施形態では、第１のプライマーは、第１のプライマー結合配列と十分に相補的であり、第２のプライマーは、第２のプライマー結合配列と十分に相補的である。本明細書において定義されるような可変部分を有するプライマー結合部位の場合には、プライマーは、プライマー結合配列のユニバーサル部分及び任意選択で、プライマー結合配列の可変部分の部分とのみ十分に相補的であり得る。或いは、プライマーは、プライマー結合配列の可変部分及び任意選択で、プライマー結合配列のユニバーサル部分の部分とのみと十分に相補的であり得る。同様に、プライマーは、プライマー結合配列の可変部分と部分的に相補的であり得、プライマー結合配列のユニバーサル部分と部分的に相補的であり得る。
【０１２８】
さらに、第１及び／又は第２のプライマーは、プライマー結合配列と相補的である配列の５’に存在する追加の配列をさらに含み得る。好ましくは、前記追加の配列は、相補的配列の５’の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１５の追加のヌクレオチドからなり得る。上記で本明細書に示されるように、第１鎖は、核酸前駆体の、又は本発明の方法のステップｂ）において得られたアンプリコンのいずれかの目的の配列を含む鎖であると本明細書において理解されるべきである。同様に、第２鎖は、第１鎖と相補的である、核酸前駆体の、又は本発明の方法のステップｂ）において得られたアンプリコンの鎖として本明細書において理解されるべきである。当業者には理解されるであろうが、本明細書に示されるように第１及び第２のプライマーが、その５’末端に追加のヌクレオチドを含む場合には、本発明の方法のステップｂ）において得られたアンプリコンの鎖は、核酸前駆体のそれぞれの鎖よりも長いであろう。
【０１２９】
第１のプライマー及び／又は第２のプライマーの長さは、好ましくは、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドである。第１のプライマー及び第２のプライマーは、同一又は異なる長さを有し得る。好ましい実施形態では、第１のプライマーの長さは、好ましくは、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５，２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドであり、第２のプライマーの長さは、好ましくは、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５，２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドである。好ましくは、第１及び第２のプライマーは、それらが、それぞれ、第１及び第２のプライマー結合配列の少なくとも１８の連続ヌクレオチドと相補的であるように設計される。
【０１３０】
本明細書において詳述されるように、第２のプライマーは、５’末端でヌクレオチドにコンジュゲートされた親和性タグを含み得る。ヌクレオチドの５’末端にコンジュゲートされ得る任意の親和性タグは、本発明の好ましい実施形態において使用するのに適しており、目的の配列の逆相補体を含む第２鎖又はその一部は、目的の配列を含む第１鎖又はその一部から分離される。
【０１３１】
５’末端コンジュゲートタグの代替として、親和性タグが、第２のプライマーの配列内に内部に位置し得る。例えば、第２のプライマーは、１つ又は複数のビオチン修飾チミジン残基を含み得る。
【０１３２】
「親和性タグ」という用語は、本明細書で使用される場合、親和性タグが付着している分子を、親和性タグを含有しない他の分子から分離するために使用され得る部分を指す。ある特定の場合には、「親和性タグ」は、「捕捉物質」と結合でき、これでは、親和性タグが捕捉物質と特異的に結合し、それによって、親和性タグが付着している分子の、親和性タグを含有しない他の分子からの分離を容易にする。親和性タグの例として、６−ヒスタミニルプリン（例えば、Ｍｉｎ及びＶｅｒｄｉｎｅ、１９９６年  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４巻：３８０６〜３８１頁に記載されるような）、ポリＴ相補体を有する固相支持体に付着可能なポリＡテールなどのポリヌクレオチドテール又は固相支持体上の例えば、ストレプトアビジン若しくはアビジンに付着可能なビオチンが挙げられ、ビオチンが最も好ましい。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「ビオチン」という用語は、ビオチン又はビオチン類似体、例えば、デュアルビオチン、デスチオビオチン、ＰＣ−ビオチン、オキシビオチン、２’−イミノビオチン、ジアミノビオチン、ビオチンスルホキシド、ビオチンアジド、ビオサイチンなどを含む親和性物質を指す。好ましくは、ビオチン部分は、ストレプトアビジンに少なくとも１０−８Ｍの親和性で結合する。ビオチン親和性物質はまた、リンカー、例えば、−ＬＣ−ビオチン、−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン、−ＳＬＣ−ビオチン又は−ＰＥＧｎ−ビオチン（式中、ｎは３〜１２である）を含み得る。
【０１３４】
好ましい本発明の方法では、第２のプライマーは、親和性タグを含む、
親和性タグは、少なくとも第２のプライマーに存在し得る。親和性タグは、第１のプライマー及び第２のプライマーの両方に存在し得るということは本明細書においてさらに理解される。或いは、親和性タグは、第１のプライマーに存在しない、例えば、第２のプライマーにのみ存在する。
【０１３５】
核酸前駆体の増幅は、したがって、少なくとも１つのタグを含む増幅された二本鎖核酸前駆体をもたらし、タグは、第１鎖と相補的である配列を含む鎖にある。増幅された二本鎖核酸前駆体はまた、第１鎖に、好ましくは、第１鎖の５’末端にタグをさらに含み得る。第１鎖のタグ及び第２鎖のタグは、同一のタグである場合も、異なるタグである場合もある。限定されない例として、第１鎖及び第２鎖のタグは、ビオチンであり得る。
【０１３６】
好ましい実施形態では、核酸前駆体の増幅は、第１鎖と相補的である配列を含む鎖にのみタグを含む増幅された二本鎖核酸前駆体をもたらす。特に、第１鎖と相補的である配列を含む鎖は、５’末端にタグを含む。最も好ましくは、相補鎖は、５’末端にビオチンを含む。
【０１３７】
或いは、例えば、第２のプライマーが、１つ又は複数のビオチン修飾チミジン残基を含む場合には、ビオチン部分は、内部に、例えば、相補鎖の配列内に存在し得る。
【０１３８】
好ましくは、増幅された二本鎖前駆体は、精製され、その後、固相支持体に結合する。好ましくは、精製は、増幅された、タグ付けされた前駆体の、（未使用の）タグ付けされた第２のプライマーからの分離をもたらす。二本鎖前駆体の精製は、増幅された核酸生成物を精製ための当技術分野で公知の任意の方法を使用して実施され得る。好ましい精製方法として、それだけには限らないが、カラム精製（例えば、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製カラム）及びアガロース又はアクリルアミドゲルでの分離が挙げられる。
【０１３９】
消化
本発明の方法は、増幅された二本鎖前駆体を、第１のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識する第１の制限又はニッキングエンドヌクレアーゼで、及び第２のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識するニッキングエンドヌクレアーゼで消化するステップを含む。第１及び第２のエンドヌクレアーゼでの消化は、目的の配列のすぐ上流及び下流の糖−リン酸骨格の切断を有する増幅された二本鎖核酸前駆体の生成をもたらす。
【０１４０】
第１のエンドヌクレアーゼ認識部位に結合する第１のエンドヌクレアーゼは、いずれか両方の糖−リン酸骨格（制限エンドヌクレアーゼである）を切断する、又は２つの糖−リン酸骨格のうち一方のみを切断する（ニッキングエンドヌクレアーゼである）。第１のエンドヌクレアーゼがニッキングエンドヌクレアーゼである場合には、第１のエンドヌクレアーゼ認識部位は、ニッキングエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ上流の第１鎖を切断するように配向される。
【０１４１】
本明細書に示されるように、第１のエンドヌクレアーゼ認識部位に結合する第１のエンドヌクレアーゼは、好ましくは、例えば、上記で詳述されるようなエンドヌクレアーゼ認識配列にすぐ（直接）隣接する、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６ヌクレオチド離れた糖リン酸骨格を切断するアウトサイドカッターである。このような酵素の例として、「ＩＩＳ型制限酵素」である。第１のエンドヌクレアーゼは、少なくとも目的の配列のすぐ上流（５’）の糖−リン酸骨格を切断する。したがって、第１のエンドヌクレアーゼは、ｉ）第１のＤＮＡ鎖又はｉｉ）第１及び第２のＤＮＡ鎖を切断する。
【０１４２】
したがって、第１のエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡの両鎖を切断するアウトサイドカッター、すなわち、制限エンドヌクレアーゼ又はＤＮＡの一方の鎖のみを切断する、すなわち、ニッキングエンドヌクレアーゼであり得る。両方の例において、第１のエンドヌクレアーゼ認識部位は、エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ認識部位の３’の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するのを可能にする配向で、アウトサイドカッターが部位を結合するように設計される。より好ましくは、第１のエンドヌクレアーゼ認識部位は、エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ認識部位の３’の、目的の配列のすぐ上流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するのを可能にする配向で、アウトサイドカッターが部位を結合するように設計される。
【０１４３】
第１のエンドヌクレアーゼとして使用するのに適したエンドヌクレアーゼの限定されない例を以下に示す。
【０１４４】
ＤＮＡの両鎖を切断するエンドヌクレアーゼの限定されない例は、第１のエンドヌクレアーゼとして使用するのに適しており、以下がある：ＭｎｌＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＩＭｕｔＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＭｂｏＩＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓαＩ、ＢｔｓＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＡｓｕＨＰＩ、Ｂｓｅ１Ｉ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＭＩＩ、ＢｓｅＮＩ、ＢｓｒＳＩ、ＢｓｔＦ５Ｉ、Ｈｉｎ４ＩＩ、ＴｓｃＡＩ、ＴｓｅＦＩ、ＴｓｐＤＴＩ、ＴｓｐＧＷＩ、ＡｐｙＰＩ、Ｂｃｅ８３Ｉ、ＢｆｉＩ、ＢｆｕＩ、ＢｍｕＩ、ＢｓａＭＩ、ＢｓｂＩ、ＢｓｃＣＩ、Ｂｓｅ３ＤＩ、ＢｓｅＭＩ、ＢｓｕＩ、ＣｃｈＩＩ、ＣｃｈＩＩＩ、ＣｄｐＩ、ＣｊｅＮＩＩＩ、ＣｓｔＭＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、ＧｓｕＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＰｃｔＩ、ＰｌａＤＩ、ＰｓｐＰＲＩ、ＲｄｅＧＢＩＩ、ＲｌｅＡＩ、ＳｄｅＡＩ、ＴａｑＩＩ、ＴｓｏＩ、Ｔｔｈ１１１ＩＩ、ＷｖｉＩ、ＡｑｕＩＩ、ＡｑｕＩＶ、ＤｒａＲＩ、ＭａｑＩ、ＰｓｐＯＭＩＩ、ＲｃｅＩ、ＲｐａＢ５Ｉ、ＲｐａＢＩ、ＲｐａＩ、ＳｓｔＥ３７Ｉ及びＲｄｅＧＢＩＩＩ。
【０１４５】
第１のエンドヌクレアーゼとして使用するための好ましいニッキングエンドヌクレアーゼは、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ及びＮｔ．ＢｓｐＱＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）からなる群から選択され得る。特に好ましい第１のエンドヌクレアーゼとして、Ｎｔ．ＡｌｗＩがある。
【０１４６】
当業者は、第１のエンドヌクレアーゼを選択する方法及びエンドヌクレアーゼが、少なくとも目的の配列の５’ヌクレオチドのすぐ上流の糖−リン酸骨格を切断することを確実にするように第１のエンドヌクレアーゼ認識部位を設計する方法を理解している。
【０１４７】
増幅された二本鎖前駆体は、第２のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識する第２のエンドヌクレアーゼ（第２のエンドヌクレアーゼ）でさらに消化される。第２のエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡの両鎖を切断するアウトサイドカッター、すなわち、制限エンドヌクレアーゼ又はＤＮＡの一方の鎖のみを切断する、すなわち、ニッキングエンドヌクレアーゼであり得る。両方の例において、第２のエンドヌクレアーゼ認識部位は、エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ認識部位の５’の、目的の配列の最後のヌクレオチドの後のすぐ３’の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断することを可能にする配向で、アウトサイドカッターが部位を結合するように設計される。したがって、第２のエンドヌクレアーゼ認識部位は、エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ認識部位の５’の、目的の配列のすぐ下流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断することを可能にする配向の部位を、アウトサイドカッターが結合するように設計される。
【０１４８】
本明細書に示されるように、第２のエンドヌクレアーゼ認識部位に結合する第２のエンドヌクレアーゼは、好ましくは、上記で詳述されるようなエンドヌクレアーゼ認識配列にすぐ（直接）隣接する、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６ヌクレオチド上流の糖−リン酸骨格を切断するアウトサイドカッターである。第２のエンドヌクレアーゼが、制限エンドヌクレアーゼである場合には、第１のエンドヌクレアーゼとして使用するのに適したＤＮＡの両鎖を切断するのに適したエンドヌクレアーゼとして、上記で本明細書に示されるような同一リストから選択され得る。
【０１４９】
本明細書に示されるように、特定の実施形態では、第２のエンドヌクレアーゼ認識部位を認識し、結合する第２のエンドヌクレアーゼは、ニッキングエンドヌクレアーゼである、すなわち、エンドヌクレアーゼは、目的の配列の（末端）３’ヌクレオチドのすぐ下流の、二本鎖ＤＮＡの第１鎖のみを切断することが好ましい。
【０１５０】
第２のエンドヌクレアーゼとして使用するのに適したニッキングエンドヌクレアーゼは、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、ＡｓｐＣＮＩ、ＢｓｃＧＩ、ＢｓｐＮＣＩ、ＦｉｎＩ、ＴｓｕＩ、ＵｂａＦ１１Ｉ、ＢｓｐＧＩ、ＤｒｄＩＩ、Ｐｆｌ１１０８Ｉ、ＵｂａＰＩ、ＥｃｏＨＩ、ＵｎｂＩ又はＶｐａｃ１１ＡＩからなる群から選択され得る。特に好ましい第２のエンドヌクレアーゼは、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩである。
【０１５１】
増幅された核酸前駆体の制限及び／又はニッキングは、（増幅された）前駆体を、（１種又は複数の）酵素と、適したバッファー中、適した温度で、製造業者の使用説明書に従って接触させることによって実施される。第１及び第２のエンドヌクレアーゼは、同時に添加されてもよい。或いは、前駆体は、第１の（又は第２の）エンドヌクレアーゼと接触されてもよく、任意選択で、前駆体は、精製され、その後、第２の（又は第１の）エンドヌクレアーゼが適当なバッファー中で添加される。第１及び第２のエンドヌクレアーゼを使用する制限処理後、制限処理された前駆体は精製され得る。
【０１５２】
固定化
本発明の方法の好ましい実施形態では、増幅された二本鎖核酸前駆体の第２鎖は、捕捉物質と接触される親和性タグを含み、前記捕捉物質は、好ましくは、固相支持体に含まれる。適した捕捉物質は、親和性タグに応じて変わる。例えば、核酸が、ビオチンタグを含む場合には、捕捉物質は、例えば、ストレプトアビジン又はアビジンであり得る。さらなるあり得るタグは、Ｈｉｓ−タグ、ＤＮＰ（２，４−ジニトロフェニル−）又はジゴキシゲニン（ＤＩＧ）であり得、捕捉物質は、それぞれ、抗Ｈｉｓ抗体、抗ＤＮＰ抗体又は抗ＤＩＧ抗体であり得る。同様に、親和性タグが、ポリヌクレオチドテールを含む場合には、捕捉物質は、その相補性配列であり得る。
【０１５３】
固相支持体又はゲルは、捕捉物質を含み得る。好ましくは、捕捉物質は、固相支持体に存在する。親和性タグの捕捉物質への結合は、したがって、増幅されたタグ付けされた二本鎖核酸前駆体の固定化及び／又はタグ付けされた一本鎖オリゴヌクレオチドの固相支持体への固定化をもたらし得る。タグ付けされた核酸の固定化に適している任意の固相支持体が、本発明の方法において使用するのに適している。
【０１５４】
内部又は外部表面を有する固相支持体は、粒子、粉末、シート、ビーズ、フィルター、平坦基板、チューブ、トンネル、チャネル、金属粒子などを含む任意の適した形式であり得る。支持体は、多孔性であってもよく、これは、核酸前駆体の固定化が起こるための内部表面を提供し得る。好ましい材料は、タグ付けされた核酸前駆体と捕捉物質の間の相互作用に干渉しない。適した材料として、それだけには限らないが、神、ガラス、セラミック、金属、メタロイド、ポルアクリロイルモルホリン（ｐｏｌａｃｒｙｌｏｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ）、種々のプラスチック及びプラスチックコポリマー、例えば、ナイロン（商標）、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリスチレン、ポリスチレン／ラテックス、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテトラフタレート）、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、シリコン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース及びコントロールドポアガラス（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州、フェアフィールド）、エアロゲルなど及び親和性カラム（例えば、ＨＰＬＣカラム）において使用するのに適していると一般に知られている任意の材料を挙げることができる。
【０１５５】
固相支持体は、個別に、又はグループで同定可能であるビーズ（又は適した表面を有するその他の小さい物体）の形態であり得る。好ましくは、固相支持体はまた、その磁性特性に従って分離可能であり得る。したがって、本発明の好ましい実施形態では、親和性タグはビオチンであり、又は含み、固相支持体は、ストレプトアビジンを含む。好ましくは、固相支持体はビーズであり、より好ましくは、ビーズは、磁性ビーズである。特に好ましい固相支持体は、ＤｙｎａＢｅａｄｓ（登録商標）などである。
【０１５６】
特に好ましい実施形態では、固定化は、機能付与された（常）磁性粒子（又はビーズ）とともにインキュベートすることによって実施でき、粒子は、その表面が本明細書において定義されるような第２のプライマーのタグの結合パートナーを含む点で機能付与される。このようなタグがビオチンである場合には、粒子は、ストレプトアビジンで機能付与され得る。粒子（又はビーズ）は、好ましくは、直径約１〜５μｍであり、以下の特徴のうち１つ又は複数を含む：カルボン酸ビーズに基づく親水性ビーズ表面、直径約１．０５μｍ、等電点ｐＨ５．２、中電荷（−３５ｍＶ（ｐＨ７で）、鉄含量（フェライト）約２６％（３７％）及び低凝集。
【０１５７】
変性
本発明の好ましい実施形態では、増幅された、好ましくは、消化された二本鎖核酸前駆体は、変性される、例えば、第１鎖は第２の相補鎖から分離される。当業者は、二本鎖ＤＮＡを変性する種々の方法に精通している。このような方法として、それだけには限らないが、熱及び／又は化学物質に対する二本鎖ＤＮＡの曝露を挙げることができる。好ましくは、本発明の方法における変性は、化学的変性を含む。ＤＮＡを変性するための好ましい化学物質として、例えば、ホルムアミド、グアニジン、サリチル酸ナトリウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、プロピレングリコール、尿素又はアルカリ剤がある。好ましくは、化学的変性は、強塩基の添加によってｐＨを高めることによるものである。好ましくは、強塩基は、アルカリ水酸化物である。特に、ｐＨを高めるための適した強塩基（又はその組合せ）は、好ましくは、ＮａＯＨ、ＬｉＯＨ、ＫＯＨ、ＲｂＯＨ、ＣｓＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）２、Ｃａ（ＯＨ）２、Ｓｒ（ＯＨ）２及びＢａ（ＯＨ）２からなる群から選択され得る。最も好ましくは、本発明の方法において二本鎖核酸前駆体を変性するための強塩基は、アルカリ水酸化物ＮａＯＨである。
【０１５８】
強塩基は、好ましくは、約０．５〜１．５Ｍの、好ましくは、約０．７〜１．２Ｍの最終濃度で添加され得る、又は好ましくは、最終濃度は、約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１若しくは１．２Ｍである。最も好ましくは、最終濃度は、約１Ｍである。
【０１５９】
二本鎖前駆体は、強塩基とともに約１〜３０分間、好ましくは、５〜１５分間インキュベートされ得る、又は好ましくは、二本鎖前駆体は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５間インキュベートされる。最も好ましくは、二本鎖前駆体は、強塩基とともに約１０分間インキュベートされ得る。
【０１６０】
二本鎖前駆体を変性した後、反応物を中和するために酸を添加してもよい。この中和反応は、以下で記載されるように固相支持体が一本鎖オリゴヌクレオチドから分離される前後に実施され得る。好ましくは、中和反応は、分離後に実施される。任意の酸が、中和するのに適している可能性がある。好ましくは、酸は、ＨＣｌ、ＨＩ、ＨＢｒ、ＨＣｌＯ４、ＨＮＯ３又はＨ２ＳＯ４などの強酸であり、ＨＣｌは、最も好ましい。
【０１６１】
強酸は、好ましくは、約０．５〜１．５Ｍ又は約０．７〜１．２Ｍの最終濃度で添加される、又は好ましくは、最終濃度は、約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１又は１．２Ｍである。最も好ましくは、最終濃度は、約１Ｍである。好ましくは、酸は、変性のために使用された塩基と等モル量で添加され、それによって、完全中和をもたらす。
【０１６２】
分離
目的の配列の逆相補体を含む第２鎖又はその一部が、目的の配列を含む第１鎖又はその一部から分離される本発明の好ましい方法は、固相支持体を除去して、目的の配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを得るステップを含む。
【０１６３】
固相支持体は、捕捉物質を含む。本発明の方法では、捕捉物質（例えば、ストレプトアビジン）は、親和性タグ（例えば、ビオチン）を捕捉しており、親和性タグは、好ましくは、核酸前駆体の相補（第２の）鎖にカップリングされている。したがって、固相支持体を一本鎖オリゴヌクレオチドから分離することはまた、（タグ付き）相補鎖を一本鎖オリゴヌクレオチドから分離することを伴う。
【０１６４】
固相支持体を、一本鎖オリゴヌクレオチドから分離することは、当技術分野で公知任意の従来法を使用して行うことができ、方法は、使用される固相支持体の種類に応じて変わる。例えば、固相支持体が小粒子を含む場合には、これらの粒子を遠心沈殿してもよく、好ましくは、オリゴヌクレオチドを含む上清を別のバイアルに移してもよい。
【０１６５】
固相支持体が、磁性又は常磁性ビーズを含む場合には、固相支持体を、磁性分離によって、例えば、固相支持体のすぐ近くに磁石を配置することによって除去してもよい。
【０１６６】
精製
固相支持体を除去した後に得られる一本鎖オリゴヌクレオチドを、任意選択で、さらに精製してもよい。したがって、本発明の好ましい実施形態では、方法は、一本鎖オリゴヌクレオチドを精製するステップｇ）をさらに含む。
【０１６７】
精製は、当技術分野で公知の任意の従来のオリゴヌクレオチド精製法を使用して行うことができる。好ましい精製法として、アフィニティー精製、例えば、（ミニ−）カラム精製がある。しかし、他の精製法、例えば、アガロース又はアクリルアミドゲルでの分離は、一本鎖オリゴヌクレオチドを精製するのに同等に適している可能性がある。
【０１６８】
標識化
本発明の方法において得られる一本鎖オリゴヌクレオチドは、その後、標識化され得る。例えば、生成された一本鎖オリゴヌクレオチドは、フルオロフォア、ハプテン、親和性リガンド、又は放射活性部分を用いて標識化され得る。或いは、生成された一本鎖オリゴヌクレオチドは標識化されない。
【０１６９】
本発明は、本明細書において詳述されるように、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの生成に特に適している。それにもかかわらず、方法はまた、例えば、ゲノム編集アプローチ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓガイドＲＮＡ（例えば、Ｍａｌｉら、２０１３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０巻（１０号）：９５７〜６３頁及びＣｏｎｇら２０１３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３９巻（９１２１号）：８１９〜２３頁に記載されるような）において使用するためのＲＮＡ分子の生成ももたらし得る。例えば、ＲＮＡ分子の生成のために、本発明の方法は、以下のとおりに改変されてもよい：本明細書において詳述されるような方法のステップａ）は、以下の要素を５’から３’方向に含む少なくとも１つの（一本鎖又は二本鎖）核酸前駆体を含む：（１）第１のプライマー結合部位、（２）目的の配列及び（３）第２のプライマー結合部位。目的の配列は、ＲＮＡをコードする配列を含む場合があり、転写ＲＮＡのプロモーター、好ましくは、Ｔ７プロモーターをさらに含み得る。好ましくは、プロモーターは、目的の配列に作動可能に連結されている。ステップｂ）において（任意選択で、タグ付きではない）二本鎖オリゴヌクレオチドを得た後に、任意選択で、第２のプライマーは、タグを含まない。ＲＮＡは、当技術分野で公知の従来法を使用して、例えば、Ｔ７プロモーターを使用して（及びＭｇ２＋を補因子として有する）二本鎖ＤＮＡから転写され得る。
【０１７０】
本発明のさらなる態様
第２の態様において、本発明は、第１鎖を含む核酸前駆体に関係し、第１鎖は、以下の要素：
（１）第１のプライマー結合部位、
（２）第１のエンドヌクレアーゼ認識部位、
（３）目的の配列、
（４）第２のエンドヌクレアーゼ認識部位、及び
（５）第２のプライマー結合部位
を５’から３’方向に含む。
【０１７１】
好ましくは、第１のプライマーは、本発明の第１の態様においてさらに詳述されるような第１のプライマー結合配列とのみ選択的にアニーリングでき、第２のプライマーは、本発明の第１の態様においてさらに詳述されるような第２のプライマー結合配列とのみ選択的にアニーリングできる。任意選択で、第１及び第２のプライマー並びに第１及び第２のプライマー結合部位は、第１のプライマーが第２のプライマー結合配列とアニーリングし、逆もまた同様であり、核酸前駆体の増幅を可能にするというような方法で、同一又は同様である。
【０１７２】
好ましくは、第１のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後に、第１のエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ上流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計されている。
【０１７３】
好ましくは、第２のエンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖形成後、ニッキングエンドヌクレアーゼが、目的の配列のすぐ下流の第１鎖の糖−リン酸骨格を切断するように設計されている。
【０１７４】
好ましくは、前駆体は、目的の配列の糖−リン酸骨格（すなわち、目的の配列の５’ヌクレオチドから目的の配列の３’ヌクレオチド）は、本発明の方法において使用される第１及び第２のエンドヌクレアーゼによって切断されないように設計される。
【０１７５】
好ましくは、目的の配列は、第１及び第２のエンドヌクレアーゼ認識部位又はその逆相補体を含まない。
【０１７６】
核酸前駆体は、一本鎖又は二本鎖核酸前駆体であり得る。核酸前駆体が二本鎖である場合には、前駆体は、第１鎖と相補的である第２鎖を含む。前駆体は、上記で本明細書において詳述されるようにさらに特定される。最も好ましい実施形態では、核酸前駆体は、配列番号１〜９７８からなる群から選択される配列を有する。
【０１７７】
核酸前駆体は、二本鎖であり得る。さらに好ましい実施形態では、二本鎖核酸前駆体は、親和性タグを含む。
【０１７８】
好ましくは、親和性タグは、第２鎖の５’末端に位置する。例えば、相補鎖の５’ヌクレオチドは、ビオチンタグ又はポリヌクレオチドテールを含み得る。好ましくは、相補鎖は、第２鎖の５’末端にビオチンタグを含む、すなわち、５’末端でビオチン化される。ビオチン部分は、当技術分野で公知の任意の従来法を使用して５’ヌクレオチドにコンジュゲートされてもよい。
【０１７９】
或いは、親和性タグは、内部に、相補配列内に位置する。好ましくは、このような内部親和性タグは、第２のエンドヌクレアーゼ認識部位の５’で第２鎖（すなわち、第１鎖のエンドヌクレアーゼ認識部位に対する逆相補体である配列の５’）に位置する。より好ましくは、このような内部親和性タグは、第２のプライマー結合部位で第２鎖に（すなわち、第１鎖の第２のプライマー結合配列に対する逆相補体である配列に）位置する。このような内部親和性タグの好ましい例として、ビオチン修飾チミジン残基がある。
【０１８０】
好ましくは、二本鎖核酸前駆体は、第１鎖の３’末端及び／又は５’末端に親和性タグを含まない。好ましくは、二本鎖核酸前駆体は、第２鎖の５’末端にのみ親和性タグを含む。
【０１８１】
第３の態様では、本発明は、上記で本明細書において定義されるような二本鎖核酸前駆体を含む固相支持体に関する。固相支持体は、上記で詳述したようにさらに特定される。好ましくは、二本鎖核酸前駆体は、固相支持体に親和性捕捉によって結合される。二本鎖核酸前駆体の第１鎖及び第２鎖は、十分に無傷の糖−リン酸骨格を有し得る。或いは、前駆体の第１鎖は、リン酸ジエステル結合の少なくとも１つの又は２つの切断を含む場合があり、前駆体の第２鎖は、十分に無傷の糖−リン酸骨格を有する場合があり、又は或いは、前駆体の第１鎖は、リン酸ジエステル結合の少なくとも１つの又は２つの切断を含む場合があり、前駆体の第２鎖は、リン酸ジエステル結合の最大で１つの切断を有する。
【０１８２】
さらなる実施形態では、固相支持体は、一本鎖第２鎖、すなわち、上記で本明細書において定義されるような第１鎖と相補的である鎖を含む。
【０１８３】
第４の態様では、本発明は、本発明の方法において使用するための要素を含有するキットに関係する。このようなキットは、中に１つ又は複数の容器、例えば、チューブ又はバイアルを受け取るための運搬装置を含み得る。
【０１８４】
好ましくは、キットは、以下のうち少なくとも１つを含む：
上記で本明細書において定義されるような、第２の（ニッキング）エンドヌクレアーゼと、任意選択で、第１のエンドヌクレアーゼを含む容器（１）、
上記で本明細書において定義されるような増幅ステップにおいて使用するための酵素を含む容器（２）、
上記で本明細書において定義されるようなアフィニティー精製のための固相支持体を含む容器（３）、及び
上記で本明細書において定義されるような変性のための化学物質を含む容器（４）。
【０１８５】
好ましい実施形態では、キットは、容器（１）及び（２）又は（１）及び（３）又は（１）及び（４）を含む。別の好ましい実施形態では、キットは、容器（２）及び（３）又は（２）及び（４）又は（３）及び（４）を含む。別の好ましい実施形態では、キットは、容器（１）、（２）及び（３）又は（１）、（２）及び（４）又は（１）、（３）及び（４）を含む。別の好ましい実施形態では、キットは、容器（２）、（３）及び（４）又は（１）、（２）、（３）及び（４）を含む。最も好ましい実施形態では、キットは、容器（１）、（２）、（３）及び任意選択で、容器（４）を含む。
【０１８６】
さらに好ましい実施形態では、キットは、上記で本明細書において定義されるような第１の及び／又はタグ付き第２のプライマーを含む容器（５）を上記で定義されるようにさらに含む。或いは、第１の及び／又は第２のタグ付きプライマーは、増幅ステップにおいて使用するための酵素を含む容器（２）の範囲内に含まれ得る。
【０１８７】
試薬は、凍結乾燥形で、又は適当なバッファー中で存在し得る。キットはまた、本発明を実施するのに必要な任意の他の構成成分、例えば、バッファー、ピペット、マイクロタイタープレート及び書面の使用説明書も含有し得る。本発明のキットのこのような他の構成成分は、当業者に公知である。
【０１８８】
第５の態様では、本発明は、１つ又は複数の一本鎖オリゴヌクレオチドの生成のための、本明細書において定義されるような核酸前駆体又は本明細書において定義されるようなキットオブパーツの使用に関係する。生成された一本鎖オリゴヌクレオチドは、上記で本明細書において定義されるような目的の配列からなり得る、又は含み得る。
【０１８９】
第６の態様では、本発明は、１つ又は複数の一本鎖オリゴヌクレオチドの増幅のための、本明細書において定義されるような核酸前駆体又は本明細書において定義されるようなキットオブパーツの使用に関する。生成された一本鎖オリゴヌクレオチドは、上記で本明細書において定義されるような目的の配列からなり得る、又は含み得る。
【実施例】
【０１９０】
ＰＣＲ増幅、アンプリコンニッキング、アクリルアミドゲル分離によるニッキングされたアンプリコンの精製及びその後のプローブを放出するための熱変性を含む方法を使用する、９プローブ前駆体のマルチプレックスのプローブ増幅での最初の実験は、満足のいくプローブ収量をもたらさなかった。この問題は、アクリルアミドゲル分離の代わりにビオチンビーズ精製を、熱変性の代わりに化学的変性と組み合わせて使用して克服した。しかし、マルチプレックスレベルが３９１２プローブに増大すると、低収量及びヘテロ二本鎖形成を再度もたらした（実施例１を参照のこと）。これらの問題は、ＰＣＲの代わりに等温増幅法を、アンプリコン精製のためのビオチンビーズ及びプローブ放出のための化学的変性を使用することと一緒に使用することによって克服した。ヘテロ二本鎖形成を伴わず、高収量をもたらすこの増幅法は、実施例２及び３において詳細に記載されている。
【０１９１】
実施例１．高マルチプレックスプローブのＰＣＲ及びＲＰＡの比較
プローブ前駆体
３９１２プローブ前駆体（平均長９０ｎｔ）（９７８の固有の配列；配列番号１〜９７８を含む）を、ＬＣ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製のプログラム可能なマイクロアレイで合成した。凍結乾燥（ｌｙｐｈｏｌｉｓｅｄ）サンプルに、２５μＬのヌクレアーゼ不含水を添加し、濃度０．０６４ｐｍｏｌ／μＬを作製した。
【０１９２】
プローブ前駆体の処理
ＰＣＲ：
ＰＣＲ増幅を、０．０５ｐｍｏｌのマルチプレックスプローブ前駆体（総量）、２００μＭのｄＮＴＰ’、４μＭのＦ−プライマー（配列番号９７９）、４μＭのＲ−ビオチンプライマー（配列番号９８０）（非ビオチン化プライマーの配列は、配列番号９８１で示されている）、１×クローニングされたＰｆｕ反応バッファー＿ＡＤ（Ａｇｉｌｅｎｔ）中の１０ユニットのクローニングされたＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ＿ＡＤを含有する２００μＬの総容量で実施した。以下のＰＣＲプログラムを使用した：９５℃で５分と、それに続く、９５℃で３０秒、５５℃で２分、７２℃で８分の２０サイクルと、それに続く、７２℃で１０分。
【０１９３】
ＲＰＡ：
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を、ＴｗｉｓｔＤＸ製のＴｗｉｓｔＡｍｐ  Ｂａｓｉｃキット（注文番号ＴＡＢＡＳ０１ＫＩＴ）を使用して実施した。０．０５ｐｍｏｌのマルチプレックスプローブ前駆体（総量）、７００ｎＭのＦ−プライマー（配列番号９７９）、７００ｎＭのＲ−ビオチンプライマー（配列番号９８０）及び２９．５μＬの再水和バッファーを含有する反応ミックスを調製した。反応混合物にＭＱを添加し、４７．５μＬの最終容量とした。２μＬの２８０ｍＭ  ＭｇＡｃを添加して、反応を開始した後、混合物を３８℃で４０分間インキュベートした。
【０１９４】
ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製カラムを、製造業者のプロトコールに従って用い、溶出のために５０μＬのＥＢバッファーを使用して、サンプルを精製した。
【０１９５】
結果：
それぞれＰＣＲ及びＲＰＡによって生成されたアンプリコンの品質及びサイズをＡｇｉｌｅｎｔ  Ｄ１０００スクリーンテープを備えたＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎで調べた（図７）。ＰＣＲは、低い特定のアンプリコン収量（ＲＰＡと比較して）をもたらし、これは、ヘテロ二本鎖形成による可能性が高い。
【０１９６】
実施例２．プローブ増幅及び精製の方法
プローブ前駆体
３９１２プローブ前駆体（平均長９０ｎｔ）（９７８の固有の配列；配列番号１〜９７８を含む）を、ＬＣ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製のプログラム可能マイクロアレイで合成した。凍結乾燥サンプルに、２５μＬのヌクレアーゼ不含水を添加し、濃度０．０６４ｐｍｏｌ／μＬを作製した。
【０１９７】
プローブ前駆体の処理
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を、ＴｗｉｓｔＤＸ製のＴｗｉｓｔＡｍｐ  Ｂａｓｉｃキット（注文番号ＴＡＢＡＳ０１ＫＩＴ）を使用して実施した。０．０１ｐｍｏｌのマルチプレックスプローブ前駆体（総量）、７００ｎＭのＦ−プライマー（配列番号９７９）、７００ｎＭのＲ−ビオチンプライマー（配列番号９８０）及び２９．５μＬの再水和バッファーを含有する単一ＲＰＡ反応ミックスを調製した。反応混合物にＭＱを添加し、４７．５μＬの最終容量とした。この反応ミックスを、凍結乾燥Ｂａｓｉｃ反応物に添加した。２μＬの２８０ｍＭ  ＭｇＡｃを添加して、反応を開始した後、混合物を３８℃で４０分間インキュベートした。
【０１９８】
８つの別個のＲＰＡ反応を実施し、プールした。アンプリコンを、２つのＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製カラムを製造業者のプロトコールに従って使用して、溶出のためにカラムあたり５０μＬのＥＢバッファー、すなわち、合計１００μＬのＥＢバッファーを使用して精製した。
【０１９９】
アンプリコンの品質及びサイズを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｄ１０００スクリーンテープを備えたＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎで調べた（図８）。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＱｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＢＲアッセイキット（カタログ番号Ｑ３２８５０）を用いて濃度を測定した（表１）。総収量は、約８μｇのアンプリコンである。
【０２００】
【表１】
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【０２０１】
一本鎖５５〜６３ｎｔ標的化プローブのニッキング
（８５〜９３ｎｔ．）プローブ前駆体の隣接する配列は、標的化アームとの接合部でニッキング制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有していた。
【０２０２】
２つのニッキング反応を、以下のとおりに実施した：５０μＬのカラム精製されたＲＰＡ反応物、１０μＬの１０×Ｃｕｔ−Ｓｍａｒｔバッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、５μＬのＮｔ．ＡｌｗＩ（１０Ｕ／μＬ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）及び３５μＬのＭＱを混合し、３７℃で２時間インキュベートした。このステップの後、５μＬのＮｂＢｓｒＤＩ（１０Ｕ／μＬ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、６５℃で２時間インキュベートし、８０℃で２０分の不活性化ステップを続けた。
【０２０３】
２つの反応のニッキングされたＲＰＡ生成物をプールし、２つのＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製カラムを製造業者のプロトコールに従って用いて精製し、カラムあたり８０μＬ（合計１６０μＬ）のＥＢバッファー中で溶出を行った。
【０２０４】
ビオチンを用いる精製
ＱＩＡｑｕｉｃｋ精製したニッキングされたＲＰＡ生成物の固定化のために、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃ１（カタログ番号６５００２）を、製造業者のプロトコールに従って使用した。１６０μＬのＱＩＡｑｕｉｃｋ精製した生成物を、５３．３μＬの３つのアリコートにわけた。これらのアリコートの各々に、２００μＬの量のビーズを添加した。製造業者のプロトコールに従って、インキュベーションを実施し、洗浄を実施した。最終ステップにおいて、ビーズを、アリコートあたり２０μＬのＥＢバッファーに再懸濁した。
【０２０５】
一本鎖５５〜６３ｎｔ．標的化プローブの放出
上記で得られた３つのアリコートの各々を、化学的変性に供した。化学的変性を実施するために、ＮａＯＨを０．９Ｍの最終濃度まで添加した。混合物を、室温で１０分間インキュベートし、次いで、磁石の上に置いた。上清を取り、添加されたＮａＯＨと当モル量でＨＣｌを添加することによって中和した。
【０２０６】
３つのアリコートの上清をプールし、ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ製のｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（カタログ番号Ｄ７０１０）を、製造業者のプロトコールに従って用いて精製した。４０μＬのＥＢ（Ｑｉａｇｅｎ）中で溶出を行った。
【０２０７】
陽性対照と匹敵する長さ（５４〜６８ｎｔ）の注文したプローブセットを使用し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡキットを用いてＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒで、プローブの品質及びサイズを調べた（図９）。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＱｕｂｉｔ  ｓｓＤＮＡアッセイキット（カタログ番号Ｑ１０２１２）を用いて濃度を測定した（表２）。
【０２０８】
【表２】
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【０２０９】
結果
本プローブ増幅法は、極めて少量の投入材料（０．０１ｐｍｏｌ）を用いて達成された高い正味のプローブ収量（５５０のプローブ収量の正味の増大倍数）をもたらした。この方法は、ヘテロ二本鎖分子を作出することなく高マルチプレックスレベルでのオリゴヌクレオチドの増幅を可能にする。精製のためのビオチンビーズの使用は、極めて迅速で、容易な方法を与えた。さらに、増幅されたオリゴヌクレオチドの放出のための化学的変性及び中和は、極めて効率的であるが、変性及び放出のために熱を使用すると、検出可能な量の生成物を得られない。
【０２１０】
実施例３．パラメータ変動
比較実験のセットでは、実施例２において詳細に記載された方法を、その時点で１つのパラメータを変更しながら実施した。実験は以下のとおりに設計した：
１．実施例２において詳述されたとおりであるが、実施例２において行われたような５μＬ（各５０ユニット）の代わりに、２．５μＬの各ニッキング酵素（各１２．５ユニット）を用いる方法（図１０「２つのニッキング酵素」）。
２．ニッキング酵素Ｎｔ．ＡｌｗＩが、同容量及び１のもとに示されているようなユニットのＡｌｗＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と置き換えられている、実施例２において詳述されたとおりの方法（図１０：「１つの制限酵素及び１つのニッキング酵素」）。
【０２１１】
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡキットを用いてＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒで、プローブの品質及びサイズを調べた（図１０）。第１のニッキング酵素を、制限酵素と置き換えることによって、匹敵する収量がもたらされた。
【０２１２】
当業者ならば、本明細書において明記された実験は、プローブとして使用するためのオリゴヌクレオチドに関するが、同一プロトコールが、異なる使用のために意図されるオリゴヌクレオチドにも当てはまるということは理解している。
【０２１３】
実施例４．増幅されたオリゴヌクレオチドプローブ検証
実施例２において詳述されたような方法を使用することで生成された３９１２オリゴヌクレオチドプローブは、ＯＬＡアッセイにおいて、トウモロコシゲノム（トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ））において各々２つの対立遺伝子を有する３２６の異なるＳＮＰを検出するように設計された（すなわち、３２６−プレックス）。実施例２において生成されたようなプローブを、Ｆ２トウモロコシマッピング集団から調製された５つの異なるトウモロコシゲノムＤＮＡサンプルを遺伝子型同定するためのＯＬＡアッセイにおいてそれらを試験することによって検証した。より特には、２連の５つの異なるトウモロコシゲノムＤＮＡサンプルの各々の間で遺伝子型判定を比較することによって、これらのプローブを使用するＯＬＡアッセイの再現性を試験した。さらに、これらの５つの異なるサンプル内の遺伝子型判定を、プローブが、３２６の遺伝子座のＳＮＰ対立遺伝子を検出するための３２６−プレックスプローブを含む既存の１０５６−プレックスＯＬＡアッセイの個別に合成されたプローブ（ＩＤＴ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって置き換えられている、同一ＯＬＡアッセイ及び同一の５つの異なるトウモロコシゲノムＤＮＡサンプルを使用する遺伝子型判定に対して比較することによって、これらのプローブを使用するＯＬＡアッセイを検証した。
【０２１４】
オリゴヌクレオチドプローブ（５’−３’配向）は、遺伝子座の既知配列に基づく、３２６の遺伝子座の各々についてＳＮＰ対立遺伝子を識別するために選択された一般的な手順を使用して設計した。ＰＣＲプライマー結合領域、遺伝子座及び対立遺伝子識別子を含めた。より特には、第１のプライマー結合配列の逆相補体（１６ヌクレオチドの長さを有する）を、対立遺伝子特異的プローブの５’末端に位置させ、第２のプライマー結合配列（１８ヌクレオチドの長さを有する）を、遺伝子座特異的プローブの３’末端に位置させる。第１のプライマー結合配列の３’末端に隣接して、以下の要素がある（５’から３’方向に）：１３ヌクレオチドのユニバーサル配列、４塩基対立遺伝子識別子が位置する、第１の標的特異的配列。第２のプライマー配列の５’末端に隣接して、以下の要素がある（３’から５’方向に）：１４ヌクレオチドのユニバーサル配列、８塩基遺伝子座識別子が位置する、第２の標的特異的配列。
【０２１５】
以下、ＯＬＡアッセイの手順を、実施例２において調製されたようなプローブを使用して記載する。ライゲーション反応における１μＬの実施例２において生成されたような３２６−プレックスプローブミックス（遺伝子座あたり３．４ｎＭ；合計１．１２μＭ）が、１μＬのＩＤＴから注文され、その後リン酸化された１０５６−プレックスプローブミックス（遺伝子座あたり０．４ｎＭ；合計０．４μＭ）によって置き換えられている全手順が、個別に合成されたプローブに対して同一に実施される。
【０２１６】
ＯＬＡアッセイ手順
ライゲーション反応物を、以下のとおりに調製した：５μＬ中の１００〜２００ｎｇのゲノムＤＮＡを、１μｌの１０×Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼバッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ  ｐＨ７．６、２５０ｍＭ  ＫＡｃ、１００ｍＭ  ＭｇＡｃ、１０ｍＭ  ＮＡＤ、１００ｍＭジチオトレイトール、１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）、４ユニットのＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、１μｌの実施例２において生成されたような３２６−プレックスプローブミックス（遺伝子座あたり３．４ｎＭ；合計１．１２μＭ）又は１μＬのＬＣ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから注文され、その後リン酸化された１０５６−プレックスプローブミックス（遺伝子座あたり０．４ｎＭ；合計０．４μＭ）及びＭｉｌｌｉＱ水と組み合わせて、合計１０μｌにした。ライゲーション反応を、ゲノムＤＮＡサンプルあたり４連で設定した。反応混合物を、９４℃で１分間及び３０秒間インキュベートし、６０℃まで３０秒あたり１．０℃の温度低下を続け、６０℃でおよそ１８時間インキュベーションを続けた。反応物は、さらなる使用まで４℃で維持した。ライゲーション反応物を、ＭｉｌｌｉＱ水で４×希釈した。
【０２１７】
第１及び第２の増幅プライマーを使用してライゲーション産物の増幅を実施した。第１の増幅プライマーは、その３’末端に、第１のプライマー結合配列とのアニーリングのための配列（１６ヌクレオチド）、その５’末端に位置するＰ７配列及びこれらの要素の間に５塩基サンプル識別子を含むように設計されている。第２のプライマーは、その３’末端に第２のプライマー結合配列とのアニーリングのための配列（１８ヌクレオチド）、その５’末端に位置するＰ５配列及びこれらの要素の間に６塩基プレート識別子を含むように設計されている。
【０２１８】
ライゲーション産物の増幅を、以下の反応混合物：１０μｌの４×希釈されたライゲーション反応物、０．０５μＭ（最終濃度）の各プライマー（第１及び第２の増幅プライマー）、２０μＬのＰｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＦＬＸマスターミックス（Ｂｉｏｋｅ）及び合計４０μｌまでのＭｉｌｌｉＱ水中で実施した。各ライゲーション産物は、３回増幅され、５つの異なるゲノムＤＮＡサンプルあたり、合計６０のＰＣＲ反応を実施した。サーモサイクリングプロファイルを、金又は銀ブロックを備えたＰＥ９７００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．）で以下の条件を使用して実施した：ステップ１：プレＰＣＲインキュベーション：９８℃で３０秒。ステップ２：変性：９８℃で１０秒；アニーリング：６５℃で１５秒。伸長：７２℃で１５秒。総サイクル数は、２９であった。ステップ３：伸長：７２℃で５分。反応物は、さらなる使用まで４℃で維持した。合計６０のＰＣＲ反応の増幅産物をプールし（６０×４０μｌ）、２つのＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、カラムあたり１５μｌ、合計３０μＬのＭｉＩｌｉＱ水に溶出した。
【０２１９】
Ｓａｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ製のＰｉｐｐｉｎ  Ｐｒｅｐを用いてアンプリコンの精製を行った。４×９００ｎｇを３％カセット及びマーカーＣを使用してオーバーフローなしで精製した。１７０ｂｐ〜２３０ｂｐまでの範囲を溶出した。溶出された生成物をＭｉｎｅｌｕｔｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、１５μＬに溶出した。
【０２２０】
アンプリコンのシーケンシングを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑナノランを使用して実施した。得られたシーケンシングデータを、脱マルチプレックス化し、リードを、使用されたサンプルの各々に割り当てた。効率的な遺伝子型判定に必要な十分なゲノムカバレッジのためにゲノムＤＮＡのサンプルあたり２つの４連のデータをプールし、さらに処理し、シングレットとみなし、その結果、ゲノムＤＮＡのサンプルあたり２連の結果が得られた。
【０２２１】
結果
合計５サンプル（５×３２６＝１６３０遺伝子型の理論的合計数を含む）について、合計１４５２遺伝子型が判定され、９９．８％の２連の間の再現性があった、すなわち、実施例２において生成されたプローブを用いる３２６−プレックスアッセイを使用して判定された遺伝子型のうち９９．８％が、２連の間で同一である。個別に合成されたプローブを使用した場合には、合計１４５２遺伝子型が判定され、これは、実施例２において生成されたプローブを使用して判定された遺伝子型に対して９７．５％同一であった。
【０２２２】
【表３】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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