(57)【要約】  高度に精製されたステビオール配糖体、特にステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３、及びレバウジオシドＡＭを調製する方法が記載される。本方法は、様々な出発組成物を標的ステビオール配糖体に変換するために酵素調製物及び組換え微生物を利用することを包含する。高度に精製されたレバウジオシドは、あらゆる飲料、菓子類、ベーカリー製品、クッキー、及びチューインガム等の食用及びチュアブル組成物における、ノンカロリー甘味料、フレーバー増強剤、甘味増強剤、及び消泡剤として有用である。
2021527622.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式を有するレバウジオシドＡＭ：
【化１】
2021527622.tif 000020
【請求項２】
高度に精製された、請求項１に記載のレバウジオシドＡＭを産生する方法であって、
ａ．少なくとも１つの炭素原子を有する有機化合物を含む出発組成物を提供するステップと、
ｂ．酵素調製物、細胞又は微生物からなる群から選択される生体触媒を提供するステップであって、前記生体触媒が、前記出発組成物をレバウジオシドＡＭに変換することができる少なくとも１種の酵素を含む上記ステップと、
ｃ．前記生体触媒を、前記出発組成物を含む培地と接触させて、レバウジオシドＡＭを含む培地を製造するステップ
とを含む上記方法。
【請求項３】
ｄ．レバウジオシドＡＭを培地から分離して、高度に精製されたレバウジオシドＡＭ組成物を得るステップを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
出発組成物が、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３、他のステビオール配糖体、ポリオール、炭水化物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
微生物が、大腸菌（ｅ．ｃｏｌｉ）、サッカロミセス属種（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、アスペルギルス属種（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ピキア属種（ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、バチルス属種（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、及びヤロウィア属種（ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．）からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
酵素が、ステビオール生合成酵素、ＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰグルコースリサイクリング酵素、メバロン酸（ＭＶＡ）経路酵素、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−リン酸経路（ＭＥＰ／ＤＯＸＰ）酵素、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、コパリル二リン酸シンターゼ、カウレンシンターゼ、カウレンオキシダーゼ、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）、ステビオールシンセターゼ、デオキシキシルロース５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）、Ｄ−１−デオキシキシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＣＭＳ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＣＭＫ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＭＣＳ）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸シンターゼ（ＨＤＳ）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸レダクターゼ（ＨＤＲ）、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、切断型ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ９１Ｄ２、ＥＵＧＴ１１、ＵＧＴＳｌ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、又は８５％超のアミノ酸配列同一性、８６％超のアミノ酸配列同一性、８７％超のアミノ酸配列同一性、８８％超のアミノ酸配列同一性、８９％超のアミノ酸配列同一性、９０％超のアミノ酸配列同一性、９１％超のアミノ酸配列同一性、９２％超のアミノ酸配列同一性、９３％超のアミノ酸配列同一性、９４％超のアミノ酸配列同一性、９５％超のアミノ酸配列同一性、９６％超のアミノ酸配列同一性、９７％超のアミノ酸配列同一性、９８％超のアミノ酸配列同一性、９９％超のアミノ酸配列同一性を有するそれらの突然変異体；及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
高度に精製されたレバウジオシドＡＭ組成物中のレバウジオシドＡＭ含有量が、乾燥重量に基づいて約９５重量％よりも多い、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載のレバウジオシドＡＭを含む消費製品であって、食品、飲料、医薬組成物、タバコ製品、栄養組成物、口腔衛生組成物、及び化粧品組成物からなる群から選択される、上記消費製品。
【請求項９】
炭水化物、ポリオール、アミノ酸及びそれらの対応する塩、ポリアミノ酸及びそれらの対応する塩、糖酸及びそれらの対応する塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機酸塩及び有機塩基塩を包含する有機塩、無機塩、苦味化合物、カフェイン、香味剤及び香味成分、収斂化合物、タンパク質又はタンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの添加剤を更に含む、請求項８に記載の消費製品。
【請求項１０】
サポニン、抗酸化物質、食物繊維供給源、脂肪酸、ビタミン、グルコサミン、ミネラル、防腐剤、水和剤、プロバイオティクス、プレバイオティクス、体重管理剤、骨粗鬆症管理剤、フィトエストロゲン、長鎖一級脂肪族飽和アルコール、フィトステロール及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの機能性成分を更に含む、請求項８に記載の消費製品。
【請求項１１】
レバウジオシドＡ、レバウジオシドＡ２、レバウジオシドＡ３、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＣ２、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＤ２、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＦ２、レバウジオシドＦ３、レバウジオシドＧ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＩ２、レバウジオシドＩ３、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＫ２、レバウジオシドＫＡ、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＭ２、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ、レバウジオシドＯ２、レバウジオシドＱ、レバウジオシドＱ２、レバウジオシドＱ３、レバウジオシドＲ、レバウジオシドＳ、レバウジオシドＴ、レバウジオシドＴ１、レバウジオシドＵ、レバウジオシドＵ２、レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＷ２、レバウジオシドＷ３、レバウジオシドＹ、レバウジオシドＺ１、レバウジオシドＺ２、ダルコシドＡ、ダルコシドＣ、ルブソシド、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオシド、ステビオシドＡ、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、ステビオシドＤ、ステビオシドＥ、ステビオシドＥ２、ステビオシドＦ、ＮＳＦ−０２、モグロシドＶ、Ｌｕｏ  Ｈａｎ  Ｇｕｏ、アルロース、Ｄ−アロース、Ｄ−タガトース、エリスリトール、ブラゼイン、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン、グリチルリチン酸及びその塩、ソーマチン、ペリラルチン、ペルナンズルシン、ムクロジオシド類、バイユノシド、フロミソシド−Ｉ、ジメチル−ヘキサヒドロフルオレン−ジカルボン酸、アブルソシド類、ペリアンドリン、カルノシフロシド類、シクロカリオシド、プテロカリオシド類、ポリポドシドＡ、ブラジリン、ヘルナンズルチン、フィロズルチン、グリシフィリン、フロリジン、トリロバチン、ジヒドロフラボノール、ジヒドロケルセチン−３−アセタート、ネオアスティリビン、トランス−シンナムアルデヒド、モナチン及びその塩、セリゲインＡ、ヘマトキシリン、モネリン、オスラジン、プテロカリオシドＡ、プテロカリオシドＢ、マビンリン、ペンタジン、ミラクリン、クルクリン、ネオクリン、クロロゲン酸、シナリン、シアメノシド、スクラロース、カリウムアセスルファム、アスパルテーム、アリテーム、サッカリン、シクラマート、ネオテーム、ズルチン、スオサン、アドバンテーム、ギムネミン酸、ホズルシン、ジジフィン、ラクチゾール、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、スレオニン、プロリン、セリン、リシン、トリプトファン、マルチトール、マンニトール、ソルビトール、ラクチトール、キシリトール、イノシトール、イソマルト、プロピレングリコール、グリセロール、トレイトール、ガラクチトール、水素化イソマルツロース、還元イソマルト−オリゴ糖類、還元キシロ−オリゴ糖類、還元ゲンチオ−オリゴ糖類、還元マルトースシロップ、還元グルコースシロップ、水素化デンプン加水分解物類、ポリグリシトール類、糖アルコール類、Ｌ−糖類、Ｌ−ソルボース、Ｌ−アラビノース、トレハロース、ガラクトース、ラムノース��様々なシクロデキストリン類、環状オリゴ糖類、様々な種類のマルトデキストリン類、デキストラン、スクロース、グルコース、リブロース、フルクトース、トレオース、キシロース、リキソース、アルトロース、マンノース、イドース、ラクトース、マルトース、転化糖、イソトレハロース、ネオトレハロース、イソマルツロース、エリトロース、デオキシリボース、グロース、タロース、エリトルロース、キシルロース、セロビオース、アミロペクチン、グルコサミン、マンノサミン、グルクロン酸、グルコン酸、グルコノ−ラクトン、アベクオース、ガラクトサミン、テンサイオリゴ糖類、イソマルト−オリゴ糖類（イソマルトース、イソマルトトリオース、パノース等）、キシロ−オリゴ糖類（キシロトリオース、キシロビオース等）、キシロ末端オリゴ糖類、ゲンチオ−オリゴ糖類（ゲンチオビオース、ゲンチオトリオース、ゲンチオテトラオース等）、ニゲロ−オリゴ糖類、パラチノースオリゴ糖類、フルクトオリゴ糖類（ケストース、ニストース等）、マルトテトラオール、マルトトリオール、マルト−オリゴ糖類（マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース等）、デンプン、イヌリン、イヌロ−オリゴ糖類、ラクツロース、メリビオース、ラフィノース、高フルクトースコーンシロップ類等の異性化液糖類、カップリングシュガー類、大豆オリゴ糖類、Ｄ−プシコース、Ｄ−リボース、Ｌ−グルコース、Ｌ−フコース、Ｄ−ツラノース、Ｄ−ロイクロースからなる群から選択される化合物を更に含む、請求項８に記載の消費製品。
【請求項１２】
消費製品のフレーバーを改変する方法であって、
ａ．消費製品を提供するステップ、
ｂ．請求項１に記載のレバウジオシドＡＭを含む、改変特性を備えたフレーバーを添加するステップであって、レバウジオシドＡＭは、前記改変特性を備えたフレーバーの検出閾値以下の濃度で前記消費製品中に存在する上記ステップ
を含む方法。
【請求項１３】
フレーバーを改変するステップが、消費製品の甘味を増強することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
飲料又は食品の気泡を抑制する方法であって、
ａ．飲料又は食品を提供するステップ、
ｂ．請求項１に記載のレバウジオシドＡＭを含む消泡剤を添加するステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高度に精製されたステビオール配糖体組成物を包含する、ステビオール配糖体を含む組成物を調製する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
高強度甘味料は、スクロースの甘味レベルよりも何倍も高い甘味レベルを有している。それらは本質的にノンカロリーであり、食物及び飲料を包含するダイエット及び減カロリー製品において一般的に使用されている。高強度甘味料は血糖反応を引き起こさないため、糖尿病患者及び炭水化物の摂取量の制御に関心のある他の人々を対象とした製品における使用に適している。
【０００３】
ステビオール配糖体は、南アメリカの特定の地域に自生するキク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）（キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ））の多年生低木であるステビア・レバウディアナ・ベルトーニ（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔｏｎｉ）の葉に見出される一群の化合物である。それらは、Ｃ１３及びＣ１９の位置における炭水化物残基の存在によって異なる単一の塩基であるステビオールによって構造的に特徴付けられる。それらはステビアの葉に蓄積し、総乾燥重量の約１０％〜２０％を構成している。乾燥重量ベースで、ステビアの葉に見出される４つの主要な配糖体は一般に、ステビオシド（９．１％）、レバウジオシドＡ（３．８％）、レバウジオシドＣ（０．６〜１．０％）、及びダルコシドＡ（０．３％）を包含する。他の既知のステビオール配糖体は、レバウジオシドＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＭ、ステビオールビオシド及びルブソシドを包含する。
ステビア・レバウディアナからステビオール配糖体を調製する方法は既知であるが、これらの方法の多くは、商業的に使用するのには適していない。
したがって、高度に精製されたステビオール配糖体組成物を包含する、ステビオール配糖体を含む組成物を調製するためのシンプル、効率的、且つ経済的な方法に対するニーズが依然として存在する。
【０００４】
発明の概要
本発明は、有機基質を含む出発組成物を微生物細胞及び／又は酵素調製物と接触させ、それにより標的ステビオール配糖体を含む組成物を生成することにより、標的ステビオール配糖体を含む組成物を調製する方法を提供する。
出発組成物は少なくとも１つの炭素原子を含むあらゆる有機化合物でありうる。一態様では、出発組成物はステビオール配糖体、ポリオール又は糖アルコール、様々な炭水化物からなる群から選択される。
【０００５】
標的ステビオール配糖体は、あらゆるステビオール配糖体でありうる。一態様において、標的ステビオール配糖体は、ステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３、レバウジオシドＡＭ、又は合成ステビオール配糖体である。
一態様では、標的ステビオール配糖体は、レバウジオシドＡＭである。
いくつかの好ましい態様では、出発組成物を標的ステビオール配糖体に変換することができる、１種若しくは２種以上の酵素を含む酵素調製物、又は１種若しくは２種以上の酵素を含む微生物細胞が使用される。酵素は細胞の表面及び／又は内部に位置しうる。酵素調製物は、全細胞懸濁液、粗溶解物、又は精製酵素（単数又は複数）の形で提供されうる。酵素調製物は、遊離形態であるか、又は無機若しくは有機材料で作製された固体支持体に固定化されうる。
【０００６】
いくつかの態様において、微生物細胞は、出発組成物を標的ステビオール配糖体に変換するために必要な酵素及びそれをコードする遺伝子を含む。したがって、本発明はまた、有機基質を含む出発組成物を、出発組成物を標的ステビオール配糖体に変換することができる少なくとも１種の酵素を含む微生物細胞と接触させ、それにより少なくとも１種の標的ステビオール配糖体を含む培地を生成することにより、標的ステビオール配糖体を含む組成物を調製する方法も提供する。
【０００７】
出発組成物を標的ステビオール配糖体に変換するために必要な酵素は、ステビオール生合成酵素、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、及び／又はＵＤＰリサイクリング酵素を包含する。
一態様では、ステビオール生合成酵素は、メバロン酸（ＭＶＡ）経路酵素を包含する。
別の態様では、ステビオール生合成酵素は、非メバロン酸２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−リン酸経路（ＭＥＰ／ＤＯＸＰ）酵素を包含する。
【０００８】
一態様では、ステビオール生合成酵素は、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、コパリル二リン酸シンターゼ、カウレンシンターゼ、カウレンオキシダーゼ、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）、ステビオールシンセターゼ、デオキシキシルロース５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）、Ｄ−１−デオキシキシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＣＭＳ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＣＭＫ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＭＣＳ）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸シンターゼ（ＨＤＳ）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸還元酵素（ＨＤＲ）、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、切断型ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼなどを包含する群から選択される。
【０００９】
ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオール及び／又はステビオール配糖体基質に少なくとも１つのグルコース単位を付加して、標的ステビオール配糖体を提供することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼでありうる。
以下で使用されるように、用語「ＳｕＳｙ＿ＡＴ」は、他に特定されない限り、例１に記載されているアミノ酸配列「配列番号１」を有するスクロースシンターゼを指す。
以下で使用されるように、用語「ＵＧＴＳｌ２」は、他に特定されない限り、例１に記載されているアミノ酸配列「配列番号２」を有するＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼを指す。
【００１０】
以下で使用されるように、用語「ＵＧＴ７６Ｇ１」は、他に特定されない限り、例１に記載されているアミノ酸配列「配列番号３」を有するＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼを指す。
一態様において、ステビオール生合成酵素及びＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、微生物細胞において産生される。微生物細胞は、例えば、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ヤロウィア属種（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．）等であってよい。別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼが合成される。
【００１１】
一態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ９１Ｄ２、ＵＧＴＳｌ２、ＥＵＧＴ１１、及びこれらのポリペプチドに対して実質的な（８５％超、８６％超、８７％超、８８％超、８９％超、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超）アミノ酸配列同一性を有するＵＧＴ、並びにこれらのＵＧＴをコードする単離された核酸分子を包含する群から選択される。
【００１２】
一態様では、ステビオール生合成酵素、ＵＧＴ及びＵＤＰ−グルコースリサイクリング系は、１つの微生物（微生物細胞）中に存在する。微生物は、例えば、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ヤロウィア属種（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．）であってよい。
【００１３】
一態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオール又はＣ１３に−ＯＨ官能基を有するあらゆる出発ステビオール配糖体に少なくとも１つのグルコース単位を付加して、Ｃ１３に−Ｏ−グルコースベータグルコピラノシドグリコシド結合を有する標的ステビオール配糖体を与えることができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ８５Ｃ２、又はＵＧＴ８５Ｃ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００１４】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオール又はＣ１９に−ＣＯＯＨ官能基を有するあらゆる出発ステビオール配糖体に少なくとも１つのグルコース単位を付加して、Ｃ１９に−ＣＯＯ−グルコースベータグルコピラノシドグリコシド結合を有する標的ステビオール配糖体を与えることができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７４Ｇ１、又はＵＧＴ７４Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００１５】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、あらゆる出発ステビオール配糖体のＣ１９にある既存のグルコースに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、新たに生成されたグリコシド結合（単数又は複数）において少なくとも１つのベータ１→２グルコピラノシドグリコシド結合（単数又は複数）を有する少なくとも１つの追加のグルコースを有する標的ステビオール配糖体を与えることができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴＳｌ２、又はＵＧＴＳｌ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＥＵＧＴ１１、又はＥＵＧＴ１１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。更に別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２、又はＵＧＴ９１Ｄ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００１６】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、あらゆる出発ステビオール配糖体のＣ１９にある既存のグルコースに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、新たに生成された結合のグリコシド結合（単数又は複数）において少なくとも１つのベータ１→３グルコピラノシドグリコシド結合（単数又は複数）を有する少なくとも１つの追加のグルコースを有する標的ステビオール配糖体を与えることができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１、又はＵＧＴ７６Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００１７】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、あらゆる出発ステビオール配糖体のＣ１３にある既存のグルコースに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、新たに生成されたグリコシド結合（単数又は複数）において少なくとも１つのベータ１→２グルコピラノシドグリコシド結合（単数又は複数）を有する少なくとも１つの追加のグルコースを有する標的ステビオール配糖体を与えることができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴＳｌ２、又はＵＧＴＳｌ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＥＵＧＴ１１、又はＥＵＧＴ１１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。更に別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２、又はＵＧＴ９１Ｄ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００１８】
一態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオールモノシドを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様において、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ８５Ｃ２、又はＵＧＴ８５Ｃ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴ、又はＵＧＴ８５Ｃ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００１９】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオールモノシドＡを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７４Ｇ１、又はＵＧＴ７４Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールモノシドＡに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオールモノシドＢを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１、又はＵＧＴ７６Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００２０】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールモノシドＡに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオールビオシドＡを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴＳｌ２、又はＵＧＴＳｌ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＥＵＧＴ１１、又はＥＵＧＴ１１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。更に別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２、又はＵＧＴ９１Ｄ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００２１】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールモノシドＡに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ルブソシドを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ８５Ｃ２、又はＵＧＴ８５Ｃ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００２２】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールモノシドに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ルブソシドを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７４Ｇ１、又はＵＧＴ７４Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールモノシドに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオールビオシドを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールビオシドＢに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオシドＢを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ８５Ｃ２、又はＵＧＴ８５Ｃ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００２３】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールビオシドＢに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオシドＣを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴＳｌ２、又はＵＧＴＳｌ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＥＵＧＴ１１、又はＥＵＧＴ１１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。更に別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２、又はＵＧＴ９１Ｄ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００２４】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールビオシドＡに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオシドＡを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ８５Ｃ２、又はＵＧＴ８５Ｃ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールビオシドＡに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオシドＣを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１、又はＵＧＴ７６Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００２５】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ルブソシドに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオシドＢを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１、又はＵＧＴ７６Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００２６】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ルブソシドに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）を生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴＳｌ２、又はＵＧＴＳｌ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＥＵＧＴ１１、又はＥＵＧＴ１１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。更に別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２、又はＵＧＴ９１Ｄ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ルブソシドに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオシドを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。
【００２７】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールビオシドに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオシドを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７４Ｇ１、又はＵＧＴ７４Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００２８】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオシドＢに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、レバウジオシドＥ３を生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴＳｌ２、又はＵＧＴＳｌ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＥＵＧＴ１１、又はＥＵＧＴ１１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。更に別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２、又はＵＧＴ９１Ｄ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００２９】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオシドＢに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、レバウジオシドＥ２を生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）に少なくとも１つのグルコース単位を付加して、レバウジオシドＥ３を生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１、又はＵＧＴ７６Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）に少なくとも１つのグルコース単位を付加して、レバウジオシドＥを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。
【００３０】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオシドＣに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、レバウジオシドＥ３を生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ８５Ｃ２、又はＵＧＴ８５Ｃ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００３１】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオシドに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、レバウジオシドＥ２を生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１、又はＵＧＴ７６Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００３２】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオシドに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、レバウジオシドＥを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴＳｌ２、又はＵＧＴＳｌ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＥＵＧＴ１１、又はＥＵＧＴ１１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。更に別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２、又はＵＧＴ９１Ｄ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、レバウジオシドＥ３に少なくとも１つのグルコース単位を付加して、レバウジオシドＡＭを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。
【００３３】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、レバウジオシドＥ２に少なくとも１つのグルコース単位を付加して、レバウジオシドＡＭを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴＳｌ２、又はＵＧＴＳｌ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＥＵＧＴ１１、又はＥＵＧＴ１１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。更に別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２、又はＵＧＴ９１Ｄ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００３４】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、レバウジオシドＥに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、レバウジオシドＡＭを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１、又はＵＧＴ７６Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００３５】
任意に、本発明の方法は、出発組成物上に２つ以上のＵＧＴを使用して、出発組成物よりも２つ以上多いグルコース単位を有する標的ステビオール配糖体（単数又は複数）を与えることを更に含む。特定の態様において、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴＳｌ２、ＥＵＧＴ１１及び／若しくはＵＧＴ９１Ｄ２、又はＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴＳｌ２、ＥＵＧＴ１１及び／若しくはＵＧＴ９１Ｄ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有し、出発組成物に２つ以上のグルコース単位を付加して、出発組成物よりも２つ以上多いグルコース単位を有するステビオール配糖体（単数又は複数）を与えることができるあらゆるＵＧＴ、又はそれらのあらゆる組み合わせである。
【００３６】
一態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオシドに全体として２つのグルコース単位を付加して、レバウジオシドＡＭを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様において、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴＳｌ２、ＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ９１Ｄ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、又はＵＧＴＳｌ２、ＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ９１Ｄ２、ＵＧＴ７６Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するあらゆるＵＧＴ、又はそれらのあらゆる組み合わせから選択される。別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴＳｌ２及びＵＧＴ７６Ｇ１である。
【００３７】
任意に、本発明の方法は、ＵＤＰをリサイクルしてＵＤＰ−グルコースを提供することを更に含む。一態様では、本方法は、触媒量のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−グルコースを使用して、ステビオール及び／又はステビオール配糖体基質の標的ステビオール配糖体へのバイオトランスフォーメーションが行われるように、リサイクリング触媒及びリサイクリング基質を提供することによってＵＤＰをリサイクルすることを含む。
一態様では、リサイクリング触媒は、スクロースシンターゼＳｕＳｙ＿Ａｔ、又はＳｕＳｙ＿Ａｔと８５％超のアミノ酸配列同一性を有するスクロースシンターゼである。
一態様では、リサイクリング基質はスクロースである。
【００３８】
任意に、本発明の方法は、レシピエント標的ステビオール配糖体分子を修飾するための糖ドナーとしてオリゴ糖又は多糖を使用するトランスグリコシダーゼの使用を更に含む。非限定的な例は、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）、フルクトフラノシダーゼ、アミラーゼ、サッカラーゼ、グルコスクラーゼ、ベータ−ｈ−フルクトシダーゼ、ベータ−フルクトシダーゼ、スクラーゼ、フルクトシリンベルターゼ、アルカリ性インベルターゼ、酸性インベルターゼ、フルクトフラノシダーゼを包含する。いくつかの態様では、グルコース及び、フルクトース、キシロース、ラムノース、アラビノース、デオキシグルコース、ガラクトースを包含するがこれらに限定されないグルコース以外の糖（単数又は複数）が、レシピエント標的ステビオール配糖体に転移される。一態様では、レシピエントステビオール配糖体は、レバウジオシドＡＭである。
【００３９】
任意に、本発明の方法は、標的ステビオール配糖体を培地から分離して、高度に精製された標的ステビオール配糖体組成物を得ることを更に含む。標的ステビオール配糖体は、例えば、結晶化、膜による分離、遠心分離、抽出、クロマトグラフィー分離、又はそのような方法の組み合わせ等の少なくとも１つの適切な方法によって分離されうる。
一態様では、標的ステビオール配糖体は、微生物内で産生されうる。別の態様では、標的ステビオール配糖体は、培地中に分泌されうる。別の一態様では、放出されたステビオール配糖体は、培地から連続的に除去されうる。更に別の態様では、標的ステビオール配糖体は、変換反応の完了後に分離される。
【００４０】
一態様では、分離は、無水ベースで約８０重量％を超える標的ステビオール配糖体を含む組成物、すなわち、高度に精製されたステビオール配糖体組成物を生成する。別の態様において、分離は、約９０重量％を超える標的ステビオール配糖体を含む組成物を生成する。特定の態様では、組成物は、約９５重量％を超える標的ステビオール配糖体を含む。他の態様では、組成物は、約９９重量％を超える標的ステビオール配糖体を含む。
標的ステビオール配糖体は、水和物、溶媒和物、無水物、又はそれらの組み合わせを含む、あらゆる多形又は無定形の形態でありうる。
【００４１】
精製された標的ステビオール配糖体は、甘味料、フレーバー調整剤、改変特性を備えたフレーバー及び／又は消泡剤として消費製品において使用されうる。適切な消費製品は、食品、飲料、医薬組成物、タバコ製品、栄養組成物、口腔衛生組成物、及び化粧品組成物を包含するが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、レバウジオシドＡＭの化学構造を示している。
【図２】図２は、ステビオールからレバウジオシドＡＭ及び様々なステビオール配糖体を生成する経路を示している。
【図３】図３は、酵素ＵＧＴＳｌ２及びＵＧＴ７６Ｇ１を使用したステビオシドからのレバウジオシドＡＭの生体触媒生成、及びスクロースシンターゼＳｕＳｙ＿Ａｔを介したＵＤＰからＵＤＰ−グルコースへの付随するリサイクルを示している。
【図４】図４は、酵素ＵＧＴ７６Ｇ１を使用したレバウジオシドＥからのレバウシオシドＡＭの生体触媒生成、及びスクロースシンターゼＳｕＳｙ＿Ａｔを介したＵＤＰからＵＤＰ−グルコースへの付随するリサイクルを示している。
【図５】図５は、ステビオシドのＨＰＬＣクロマトグラムを示している。２５．９９２分の保持時間のピークはステビオシドに対応している。
【図６】図６は、ステビオシドからのレバウジオシドＡＭの生体触媒生成の生成物のＨＰＬＣクロマトグラムを示している。１０．６３６分の保持時間のピークは、レバウジオシドＡＭに対応している。
【図７】図７は、レバウジオシドＥのＨＰＬＣクロマトグラムを示している。１０．８３５分の保持時間のピークは、レバウジオシドＥに対応している。
【図８】図８は、レバウジオシドＥからのレバウジオシドＡＭの生体触媒生成の生成物のＨＰＬＣクロマトグラムを示している。１０．９３６分及び１１．４４２分の保持時間のピークは、レバウジオシドＥ及びレバウジオシドＡＭにそれぞれ対応している。
【図９】図９は、メタノール結晶化による精製後のレバウジオシドＡＭのＨＰＬＣクロマトグラムを示している。１０．３３６分の保持時間のピークは、レバウジオシドＡＭに対応している。
【図１０】図１０は、レバウジオシドＡＭ（５００ＭＨｚ、ピリジン−ｄ５）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示している。
【図１１】図１１は、レバウジオシドＡＭ（５００ＭＨｚ、ピリジン−ｄ５）のＨＳＱＣスペクトルを示している。
【図１２】図１２は、レバウジオシドＡＭ（５００ＭＨｚ、ピリジン−ｄ５）のＨ，Ｈ  ＣＯＺＹスペクトルを示している。
【図１３】図１３は、レバウジオシドＡＭ（５００ＭＨｚ、ピリジン−ｄ５）のＨＭＢＣスペクトルを示している。
【図１４】図１４は、レバウジオシドＡＭ（５００ＭＨｚ、ピリジン−ｄ５）のＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹスペクトルを示している。
【図１５ａ】図１５ａ及び図１５ｂは、レバウジオシドＡＭのＬＣクロマトグラムとマススペクトルをそれぞれ示している。
【図１５ｂ】図１５ａ及び図１５ｂは、レバウジオシドＡＭのＬＣクロマトグラムとマススペクトルをそれぞれ示している。
【００４３】
詳細な説明
本発明は、有機基質を含む出発組成物を微生物細胞及び／又は酵素調製物と接触させ、それにより標的ステビオール配糖体を含む組成物を生成することにより、標的ステビオール配糖体を含む組成物を調製する方法を提供する。
【００４４】
本発明の一つの目的は、標的ステビオール配糖体、特にステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３、レバウジオシドＡＭ、又は合成ステビオール配糖体を様々な出発組成物から調製するための効率的な生体触媒法を提供することである。
本明細書で使用される場合、略語「ｒｅｂ」は「レバウジオシド」を指す。両方の用語は同じ意味を持ち、互換的に使用されてよい。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「生体触媒」又は「生体触媒作用」は、有機化合物に対する単一又は複数段階の化学変換が可能な、天然又は遺伝子改変された生体触媒、例えば酵素、又は１種若しくは２種以上の酵素を含む微生物を包含する細胞の使用を指す。生体触媒プロセスは、発酵、生合成、生物変換、及びバイオトランスフォーメーションプロセスを包含する。単離された酵素及び全細胞生体触媒法の両方が当技術分野において知られている。生体触媒タンパク質酵素は、天然に存在するタンパク質又は組換えタンパク質でありうる。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「ステビオール配糖体（単数又は複数）」という用語は、天然に存在するステビオール配糖体を包含するがこれらに限定されない、ステビオールの配糖体、例えばステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３、レバウジオシドＡＭ、合成ステビオール配糖体、例えば、酵素的にグルコシル化されたステビオール配糖体及びそれらの組み合わせを指す。
【００４７】
出発組成物
本明細書で使用される場合、「出発組成物」は、少なくとも１つの炭素原子を含む１種又は２種以上の有機化合物を含むあらゆる組成物（一般的には水溶液）を指す。
一態様では、出発組成物はステビオール、ステビオール配糖体、ポリオール、及び様々な炭水化物からなる群から選択される。
【００４８】
出発組成物のステビオール配糖体は、ステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３、又はステビア・レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）植物で生じるステビオールの他の配糖体、合成ステビオール配糖体、例えば酵素的にグルコシル化されたステビオール配糖体及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
一態様では、出発組成物はステビオールである。
別の態様において、出発組成物のステビオール配糖体は、ステビオールモノシドである。
更に別の態様では、出発組成物のステビオール配糖体は、ステビオールモノシドＡである。
【００４９】
更に別の態様では、出発組成物のステビオール配糖体は、ルブソシドである。
更に別の態様において、出発組成物のステビオール配糖体は、ステビオールビオシドである。
更に別の態様では、出発組成物のステビオール配糖体は、ステビオールビオシドＡである。
更に別の態様では、出発組成物のステビオール配糖体は、ステビオールビオシドＢである。
【００５０】
更に別の態様では、出発組成物のステビオール配糖体は、ステビオシドである。
更に別の態様では、出発組成物のステビオール配糖体は、レバウジオシドＫＡとしても知られるステビオシドＡである。
更に別の態様では、出発組成物のステビオール配糖体は、ステビオシドＢである。
更に別の態様では、出発組成物のステビオール配糖体は、ステビオシドＣである。
【００５１】
別の態様において、出発組成物のステビオール配糖体は、レバウジオシドＥである。
別の態様において、出発組成物のステビオール配糖体は、レバウジオシドＥ２である。
別の態様において、出発組成物のステビオール配糖体は、レバウジオシドＥ３である。
【００５２】
「ポリオール」という用語は、２つ以上のヒドロキシル基を含む分子を指す。ポリオールは、２、３、及び４個のヒドロキシル基をそれぞれ含むジオール、トリオール、又はテトラオールであってよい。ポリオールはまた、それぞれ５、６、又は７個のヒドロキシル基を含むペンタオール、ヘキサオール、ヘプタオール等の４つを超えるヒドロキシル基を含んでよい。更に、ポリオールはまた、糖アルコール、多価アルコール、又は炭水化物の還元形態である多価アルコールであってよく、ここで、カルボニル基（アルデヒド又はケトン、還元糖）は一級又は二級ヒドロキシル基に還元されている。ポリオールの例は、エリスリトール、マルチトール、マンニトール、ソルビトール、ラクチトール、キシリトール、イノシトール、イソマルト、プロピレングリコール、グリセロール、トレイトール、ガラクチトール、水素化イソマルツロース、還元イソマルト−オリゴ糖類、還元キシロ−オリゴ糖類、還元ゲンチオ−オリゴ糖類、還元マルチトールシロップ、還元グルコースシロップ、水素化デンプン加水分解物類、ポリグリシトール類、及び糖アルコール類、又は還元可能なあらゆるその他の炭水化物を包含するが、これらに限定されない。
【００５３】
「炭水化物」という用語は、ｎが３〜３０である一般式（ＣＨ２Ｏ）ｎの、複数のヒドロキシル基で置換されたアルデヒド又はケトン化合物、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーを指す。加えて、本発明の炭水化物は、１つ又は２つ以上の位置で置換又は脱酸素化されうる。本明細書で使用される炭水化物は、未修飾炭水化物、炭水化物誘導体、置換炭水化物、及び修飾炭水化物を包含する。本明細書で使用される場合、「炭水化物誘導体」、「置換炭水化物」、及び「修飾炭水化物」という句は同義的である。修飾炭水化物とは、少なくとも１つの原子が付加、除去、又は置換されている、又はそれらが組み合わされたあらゆる炭水化物を意味する。したがって、炭水化物誘導体又は置換炭水化物は、置換及び非置換の単糖、二糖、オリゴ糖、及び多糖を包含する。炭水化物誘導体又は置換炭水化物は、任意に、炭水化物誘導体又は置換炭水化物が、甘味料組成物の甘味を改善するように機能することを条件として、あらゆる対応するＣ位置で脱酸素化、及び／又は水素、ハロゲン、ハロアルキル、カルボキシル、アシル、アシルオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル誘導体、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホ、メルカプト、イミノ、スルホニル、スルフェニル、スルフィニル、スルファモイル、カルボアルコキシ、カルボキサミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホリル、ホスフィノ、チオエステル、チオエーテル、オキシミノ、ヒドラジノ、カルバミル、ホスホ、ホスホナート、又はあらゆる他の存立可能な官能基等の１つ又は２つ以上の部分で置換されうる。
【００５４】
本発明に従って使用されてよい炭水化物の例は、タガトース、トレハロース、ガラクトース、ラムノース、様々なシクロデキストリン類、環状オリゴ糖類、様々な種類のマルトデキストリン類、デキストラン、スクロース、グルコース、リブロース、フルクトース、トレオース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、マンノース、イドース、ラクトース、マルトース、転化糖、イソトレハロース、ネオトレハロース、イソマルツロース、エリトロース、デオキシリボース、グロース、イドース、タロース、エリトルロース、キシルロース、プシコース、ツラノース、セロビオース、アミロペクチン、グルコサミン、マンノサミン、フコース、グルクロン酸、グルコン酸、グルコノ−ラクトン、アベクオース、ガラクトサミン、テンサイオリゴ糖類、イソマルト−オリゴ糖類（イソマルトース、イソマルトトリオース、パノース等）、キシロ−オリゴ糖類（キシロトリオース、キシロビオース等）、キシロ末端オリゴ糖類、ゲンチオ−オリゴ糖類（ゲンチオビオース、ゲンチオトリオース、ゲンチオテトラオース等）、ソルボース、ニゲロ−オリゴ糖類、パラチノースオリゴ糖類、フルクトオリゴ糖類（ケストース、ニストース等）、マルトテトラオール、マルトトリオール、マルト−オリゴ糖類（マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース等）、デンプン、イヌリン、イヌロ−オリゴ糖類、ラクツロース、メリビオース、ラフィノース、リボース、高フルクトースコーンシロップ類等の異性化液糖類、カップリングシュガー類、及び大豆オリゴ糖類を包含するが、これらに限定されない。更に、本明細書で使用される炭水化物は、Ｄ配置又はＬ配置のいずれかであってよい。
【００５５】
出発組成物は合成又は精製（部分的又は完全に）、市販又は調製されたものであってよい。
一態様では、出発組成物はグリセロールである。
別の態様では、出発組成物はグルコースである。
更に別の態様では、出発組成物はスクロースである。
【００５６】
更に別の態様において、出発組成物はデンプンである。
別の態様では、出発組成物はマルトデキストリンである。
更に別の態様では、出発組成物はセルロースである。
【００５７】
更に別の態様では、出発組成物はアミロースである。
出発組成物の有機化合物（単数又は複数）は、本明細書に記載されているように、標的ステビオール配糖体（単数又は複数）の生成のための基質（単数又は複数）として働く。
【００５８】
標的ステビオール配糖体
本方法の標的ステビオール配糖体は、本明細書に開示される方法によって調製されうるあらゆるステビオール配糖体でありうる。一態様において、標的ステビオール配糖体は、ステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３、レバウジオシドＡＭ又はステビア・レバウディアナ植物で生じるステビオールの他の配糖体、合成ステビオール配糖体、例えば酵素的にグルコシル化されたステビオール配糖体及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００５９】
一態様では、標的ステビオール配糖体は、ステビオールモノシドである。
別の態様では、標的ステビオール配糖体は、ステビオールモノシドＡである。
別の態様では、標的ステビオール配糖体は、ステビオールビオシドである。
別の態様では、標的ステビオール配糖体は、ステビオールビオシドＡである。
別の態様では、標的ステビオール配糖体は、ステビオールビオシドＢである。
別の態様では、標的ステビオール配糖体は、ルブソシドである。
別の態様では、標的ステビオール配糖体は、ステビオシドである。
一態様では、標的ステビオール配糖体は、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）である。
別の態様では、標的ステビオール配糖体は、ステビオシドＢである。
【００６０】
別の態様では、標的ステビオール配糖体は、ステビオシドＣである。
別の態様では、標的ステビオール配糖体は、レバウジオシドＥである。
別の態様では、標的ステビオール配糖体は、レバウジオシドＥ２である。
別の態様では、標的ステビオール配糖体は、レバウジオシドＥ３である。
別の態様では、標的ステビオール配糖体は、レバウジオシドＡＭである。
【００６１】
標的ステビオール配糖体は、水和物、溶媒和物、無水物、又はそれらの組み合わせを包含するあらゆる多形又は無定形の形態でありうる。
一態様において、本発明は、ステビオールモノシドの生成のための生体触媒プロセスである。
一態様において、本発明は、ステビオールモノシドＡの生成のための生体触媒プロセスである。
一態様において、本発明は、ステビオールビオシドの生成のための生体触媒プロセスである。
一態様において、本発明は、ステビオールビオシドＡの生成のための生体触媒プロセスである。
【００６２】
一態様において、本発明は、ステビオールビオシドＢの生成のための生体触媒プロセスである。
一態様において、本発明は、ルブソシドの生成のための生体触媒プロセスである。
一態様において、本発明は、ステビオシドの生成のための生体触媒プロセスである。
一態様において、本発明は、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）の生成のための生体触媒プロセスである。
一態様において、本発明は、ステビオシドＢの生成のための生体触媒プロセスである。
【００６３】
一態様において、本発明は、ステビオシドＣの生成のための生体触媒プロセスである。
一態様において、本発明は、レバウジオシドＥの生成のための生体触媒プロセスである。
一態様において、本発明は、レバウジオシドＥ２の生成のための生体触媒プロセスである。
一態様において、本発明は、レバウジオシドＥ３の生成のための生体触媒プロセスである。
【００６４】
一態様において、本発明は、レバウジオシドＡＭの生成のための生体触媒プロセスである。
特定の態様において、本発明は、ステビオシド及びＵＤＰ−グルコースを含む出発組成物からレバウジオシドＡＭを生成するための生体触媒プロセスを提供する。
別の特定の態様において、本発明は、レバウジオシドＥ及びＵＤＰ−グルコースを含む出発組成物からレバウジオシドＡＭを生成するための生体触媒プロセスを提供する。
任意に、本発明の方法は、標的ステビオール配糖体を培地から分離して、高度に精製された標的ステビオール配糖体組成物を得ることを更に含む。標的ステビオール配糖体は、例えば、結晶化、膜による分離、遠心分離、抽出、クロマトグラフィー分離、又はそのような方法の組み合わせ等のあらゆる適切な方法によって分離されうる。
【００６５】
特定の態様では、本明細書に記載の方法は、高度に精製された標的ステビオール配糖体組成物をもたらす。本明細書で使用される「高度に精製された」という用語は、無水（乾燥）ベースで約８０重量％を超える標的ステビオール配糖体を有する組成物を指す。一態様では、高度に精製された標的ステビオール配糖体組成物は、無水（乾燥）ベースで約９０重量％を超える標的ステビオール配糖体、例えば、乾燥重量に基づいて約９１％を超える、約９２％を超える、約９３％を超える、約９４％を超える、約９５％を超える、約９６％を超える、約９７％を超える、約９８％を超える、又は約９９％を超える標的ステビオール配糖体含有量を含む。
【００６６】
一態様では、標的ステビオール配糖体がｒｅｂ  ＡＭである場合、本明細書に記載の方法により、乾燥重量に基づいて約９０重量％を超えるｒｅｂ  ＡＭ含有量を有する組成物が得られる。別の特定の態様では、標的ステビオール配糖体がｒｅｂ  ＡＭである場合、本明細書に記載の方法により、乾燥重量に基づいて約９５重量％を超えるｒｅｂ  ＡＭ含有量を含む組成物が得られる。
【００６７】
微生物及び酵素調製物
本発明の一態様では、微生物（微生物細胞）及び／又は酵素調製物を、出発組成物を含む培地と接触させて、標的ステビオール配糖体を産生する。
酵素は、全細胞懸濁液、粗溶解物、精製酵素、又はそれらの組み合わせの形で提供されうる。一態様では、生体触媒は、出発組成物を標的ステビオール配糖体に変換することができる精製された酵素である。別の態様では、生体触媒は、出発組成物を標的ステビオール配糖体に変換することができる少なくとも１種の酵素を含む粗溶解物である。更に別の態様では、生体触媒は、出発組成物を標的ステビオール配糖体に変換することができる少なくとも１種の酵素を含む全細胞懸濁液である。
【００６８】
別の態様では、生体触媒は、出発組成物を標的ステビオール配糖体に変換することができる酵素（単数又は複数）を含む１種又は２種以上の微生物細胞である。酵素は、細胞の表面、細胞の内部、又は細胞の表面と細胞の内部の両方に位置しうる。
出発組成物を標的ステビオール配糖体に変換するための適切な酵素は、ステビオール生合成酵素及びＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）を包含するが、これらに限定されない。任意に、それはＵＤＰリサイクリング酵素（単数又は複数）を包含してよい。
一態様では、ステビオール生合成酵素は、メバロン酸（ＭＶＡ）経路酵素を包含する。
別の態様では、ステビオール生合成酵素は、非メバロン酸２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−リン酸経路（ＭＥＰ／ＤＯＸＰ）酵素を包含する。
【００６９】
一態様では、ステビオール生合成酵素は、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、コパリル二リン酸シンターゼ、カウレンシンターゼ、カウレンオキシダーゼ、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）、ステビオールシンセターゼ、デオキシキシルロース５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）、Ｄ−１−デオキシキシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＣＭＳ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＣＭＫ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＭＣＳ）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸シンターゼ（ＨＤＳ）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸還元酵素（ＨＤＲ）、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、切断型ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ等を包含する群から選択される。
ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオール及び／又はステビオール配糖体基質に少なくとも１つのグルコース単位を付加して、標的ステビオール配糖体を提供することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼでありうる。
【００７０】
一態様において、ステビオール生合成酵素及びＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、微生物細胞において産生される。微生物細胞は、例えば、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ヤロウィア属種（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．）等であってよい。別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼが合成される。
【００７１】
一態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ９１Ｄ２、ＵＧＴＳｌ２、ＥＵＧＴ１１、及びこれらのポリペプチドに対して実質的な（８５％超、８６％超、８７％超、８８％超、８９％超、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超）アミノ酸配列同一性を有するＵＧＴ、並びにこれらのＵＧＴをコードする単離された核酸分子を包含する群から選択される。
【００７２】
一態様では、ステビオール生合成酵素、ＵＧＴ及びＵＤＰ−グルコースリサイクリング系は、１つの微生物（微生物細胞）中に存在する。微生物は、例えば、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ヤロウィア属種（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．）であってよい。
【００７３】
一態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオール又はＣ１３に−ＯＨ官能基を有するあらゆる出発ステビオール配糖体に少なくとも１つのグルコース単位を付加して、Ｃ１３に−Ｏ−グルコースベータグルコピラノシドグリコシド結合を有する標的ステビオール配糖体を与えることができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ８５Ｃ２、又はＵＧＴ８５Ｃ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００７４】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオール又はＣ１９に−ＣＯＯＨ官能基を有するあらゆる出発ステビオール配糖体に少なくとも１つのグルコース単位を付加して、Ｃ１９に−ＣＯＯ−グルコースベータグルコピラノシドグリコシド結合を有する標的ステビオール配糖体を与えることができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７４Ｇ１、又はＵＧＴ７４Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００７５】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、あらゆる出発ステビオール配糖体のＣ１９にある既存のグルコースに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、新たに生成されたグリコシド結合（単数又は複数）において少なくとも１つのベータ１→２グルコピラノシドグリコシド結合（単数又は複数）を有する少なくとも１つの追加のグルコースを有する標的ステビオール配糖体を与えることができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴＳｌ２、又はＵＧＴＳｌ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＥＵＧＴ１１、又はＥＵＧＴ１１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。更に別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２、又はＵＧＴ９１Ｄ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００７６】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、あらゆる出発ステビオール配糖体のＣ１９にある既存のグルコースに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、新たに生成された結合のグリコシド結合（単数又は複数）において少なくとも１つのベータ１→３グルコピラノシドグリコシド結合（単数又は複数）を有する少なくとも１つの追加のグルコースを有する標的ステビオール配糖体を与えることができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１、又はＵＧＴ７６Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００７７】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、あらゆる出発ステビオール配糖体のＣ１３にある既存のグルコースに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、新たに生成されたグリコシド結合（単数又は複数）において少なくとも１つのベータ１→２グルコピラノシドグリコシド結合（単数又は複数）を有する少なくとも１つの追加のグルコースを有する標的ステビオール配糖体を与えることができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴＳｌ２、又はＵＧＴＳｌ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＥＵＧＴ１１、又はＥＵＧＴ１１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。更に別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２、又はＵＧＴ９１Ｄ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００７８】
一態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオールモノシドを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様において、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ８５Ｃ２、又はＵＧＴ８５Ｃ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴ、又はＵＧＴ８５Ｃ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００７９】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオールモノシドＡを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７４Ｇ１、又はＵＧＴ７４Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００８０】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールモノシドＡに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオールモノシドＢを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１、又はＵＧＴ７６Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００８１】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールモノシドＡに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオールビオシドＡを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴＳｌ２、又はＵＧＴＳｌ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＥＵＧＴ１１、又はＥＵＧＴ１１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。更に別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２、又はＵＧＴ９１Ｄ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールモノシドＡに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ルブソシドを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ８５Ｃ２、又はＵＧＴ８５Ｃ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００８２】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールモノシドに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ルブソシドを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７４Ｇ１、又はＵＧＴ７４Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールモノシドに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオールビオシドを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。
【００８３】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールビオシドＢに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオシドＢを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ８５Ｃ２、又はＵＧＴ８５Ｃ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールビオシドＢに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオシドＣを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴＳｌ２、又はＵＧＴＳｌ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＥＵＧＴ１１、又はＥＵＧＴ１１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。更に別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２、又はＵＧＴ９１Ｄ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００８４】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールビオシドＡに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオシドＡを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ８５Ｃ２、又はＵＧＴ８５Ｃ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールビオシドＡに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオシドＣを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１、又はＵＧＴ７６Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００８５】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ルブソシドに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオシドＢを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１、又はＵＧＴ７６Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００８６】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ルブソシドに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）を生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴＳｌ２、又はＵＧＴＳｌ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＥＵＧＴ１１、又はＥＵＧＴ１１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。更に別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２、又はＵＧＴ９１Ｄ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ルブソシドに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオシドを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。
【００８７】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオールビオシドに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、ステビオシドを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７４Ｇ１、又はＵＧＴ７４Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００８８】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオシドＢに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、レバウジオシドＥ３を生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴＳｌ２、又はＵＧＴＳｌ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＥＵＧＴ１１、又はＥＵＧＴ１１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。更に別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２、又はＵＧＴ９１Ｄ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオシドＢに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、レバウジオシドＥ２を生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。
【００８９】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）に少なくとも１つのグルコース単位を付加して、レバウジオシドＥ３を生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１、又はＵＧＴ７６Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）に少なくとも１つのグルコース単位を付加して、レバウジオシドＥを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。
【００９０】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオシドＣに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、レバウジオシドＥ３を生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ８５Ｃ２、又はＵＧＴ８５Ｃ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００９１】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオシドに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、レバウジオシドＥ２を生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１、又はＵＧＴ７６Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００９２】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオシドに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、レバウジオシドＥを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴＳｌ２、又はＵＧＴＳｌ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＥＵＧＴ１１、又はＥＵＧＴ１１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。更に別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２、又はＵＧＴ９１Ｄ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、レバウジオシドＥ３に少なくとも１つのグルコース単位を付加して、レバウジオシドＡＭを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。
【００９３】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、レバウジオシドＥ２に少なくとも１つのグルコース単位を付加して、レバウジオシドＡＭを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴＳｌ２、又はＵＧＴＳｌ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＥＵＧＴ１１、又はＥＵＧＴ１１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。更に別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２、又はＵＧＴ９１Ｄ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００９４】
別の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、レバウジオシドＥに少なくとも１つのグルコース単位を付加して、レバウジオシドＡＭを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１、又はＵＧＴ７６Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するＵＧＴである。
【００９５】
任意に、本発明の方法は、出発組成物に対して２種以上のＵＧＴを使用して、出発組成物よりも２つ以上多いグルコース単位を有する標的ステビオール配糖体（単数又は複数）を与えることを更に含む。特定の態様において、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴＳｌ２、ＥＵＧＴ１１及び／若しくはＵＧＴ９１Ｄ２、又はＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴＳｌ２、ＥＵＧＴ１１及び／若しくはＵＧＴ９１Ｄ２と８５％超のアミノ酸配列同一性を有し、出発組成物に２つ以上のグルコース単位を付加して、出発組成物よりも２つ以上多いグルコース単位を有するステビオール配糖体（単数又は複数）を与えることができるあらゆるＵＧＴ、又はそれらのあらゆる組み合わせである。
【００９６】
一態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオシドに全体として２つのグルコース単位を付加して、レバウジオシドＡＭを生成することができるあらゆるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼである。特定の態様において、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴＳｌ２、ＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ９１Ｄ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、又はＵＧＴＳｌ２、ＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ９１Ｄ２、ＵＧＴ７６Ｇ１と８５％超のアミノ酸配列同一性を有するあらゆるＵＧＴ、又はそれらのあらゆる組み合わせから選択される。別の特定の態様では、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴＳｌ２及びＵＧＴ７６Ｇ１である。
【００９７】
任意に、本発明の方法は、ＵＤＰをリサイクルしてＵＤＰ−グルコースを提供することを更に含む。一態様では、本方法は、触媒量のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−グルコースを使用して、ステビオール及び／又はステビオール配糖体基質の標的ステビオール配糖体へのバイオトランスフォーメーションが行われるように、リサイクリング触媒及びリサイクリング基質を提供することによってＵＤＰをリサイクルすることを含む。ＵＤＰリサイクリング酵素は、スクロースシンターゼＳｕＳｙ＿Ａｔ又はＳｕＳｙ＿Ａｔと８５％超のアミノ酸配列同一性を有するスクロースシンターゼでありえ、リサイクリング基質はスクロースでありうる。
【００９８】
任意に、本発明の方法は、レシピエント標的ステビオール配糖体分子を修飾するための糖ドナーとしてオリゴ糖又は多糖を使用するトランスグリコシダーゼの使用を更に含む。非限定的な例は、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）、フルクトフラノシダーゼ、アミラーゼ、サッカラーゼ、グルコスクラーゼ、ベータ−ｈ−フルクトシダーゼ、ベータ−フルクトシダーゼ、スクラーゼ、フルクトシリンベルターゼ、アルカリ性インベルターゼ、酸性インベルターゼ、フルクトフラノシダーゼを包含する。いくつかの態様では、グルコース及び、フルクトース、キシロース、ラムノース、アラビノース、デオキシグルコース、ガラクトースを包含するがこれらに限定されないグルコース以外の糖（単数又は複数）が、レシピエント標的ステビオール配糖体に転移される。一態様では、レシピエントステビオール配糖体は、レバウジオシドＡＭである。
【００９９】
別の態様において、出発組成物ステビオール配糖体に少なくとも１つのグルコース単位を付加することができるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、以下のＧｅｎＩｎｆｏ識別子番号のリストから、好ましくは表１及び表２に示されている群から選択されるＵＧＴと８５％超のアミノ酸配列同一性を有する。
【表１−１】
2021527622.tif 000003
【表１−２】
2021527622.tif 000004
【表１−３】
2021527622.tif 000005
【表２−１】
2021527622.tif 000006
【表２−２】
2021527622.tif 000007
【表２−３】
2021527622.tif 000008
【表３】
2021527622.tif 000009
【０１００】
本発明の一態様は、酵素、すなわち出発組成物を標的ステビオール配糖体に変換することができる酵素を含む微生物細胞である。したがって、本方法のいくつかの態様は、微生物を、出発組成物を含む培地と接触させて、少なくとも１つの標的ステビオール配糖体を含む培地を得ることを包含する。
微生物は、出発組成物を標的ステビオール配糖体（単数又は複数）に変換するために必要な酵素（単数又は複数）を保有するあらゆる微生物でありうる。これらの酵素は、微生物のゲノム内にコードされている。
適切な微生物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ヤロウイア属種（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．）等を包含するが、これらに限定されない。
一態様では、微生物は、出発組成物と接触される際に遊離している。
【０１０１】
別の態様では、微生物は、出発組成物と接触される際に固定化されている。例えば、微生物は、無機又は有機材料で作製された固体支持体に固定化されてよい。微生物を固定化するのに適した固体支持体の非限定的な例は、誘導体化されたセルロース又はガラス、セラミクス、金属酸化物又は膜を包含する。微生物は、例えば、共有結合、吸着、架橋、捕捉又はカプセル化によって、固体支持体に固定化されてよい。
更に別の態様では、出発組成物を標的ステビオール配糖体に変換することのできる酵素は、微生物から反応培地中に分泌される。
標的ステビオール配糖体は、任意に精製される。反応培地からの標的ステビオール配糖体の精製は、高度に精製された標的ステビオール配糖体組成物を得るための少なくとも１つの適切な方法によって達成されうる。適切な方法は、結晶化、膜による分離、遠心分離、抽出（液相又は固相）、クロマトグラフィー分離、ＨＰＬＣ（調製又は分析）、又はそのような方法の組み合わせを包含する。
【０１０２】
使用
特に本発明に従って得られる高度に精製された標的配糖体（単数又は複数）、特にステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭは「そのまま」、又は他の甘味料、フレーバー、食品成分及びそれらの組み合わせと組み合わせて使用されうる。
【０１０３】
フレーバーの非限定的な例は、ライム、レモン、オレンジ、フルーツ、バナナ、ブドウ、ナシ、パイナップル、マンゴー、ベリー、ビターアーモンド、コーラ、シナモン、砂糖、綿菓子、バニラ、及びそれらの組み合わせを包含するが、これらに限定されない。
他の食品成分の非限定的な例は、酸味料、有機酸及びアミノ酸、着色剤、充填剤、加工デンプン、ガム、テクスチャライザー、防腐剤、カフェイン、抗酸化物質、乳化剤、安定剤、増粘剤、ゲル化剤及びそれらの組み合わせを包含するが、これらに限定されない。
【０１０４】
特に本発明に従って得られる高度に精製された標的配糖体（単数又は複数）、特にステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭは、水和物、溶媒和物、無水物、アモルファス形態、及びそれらの組み合わせを包含するが、これらに限定されない様々な多形形態で調製されうる。
【０１０５】
特に本発明に従って得られる高度に精製された標的配糖体（単数又は複数）、特に、ステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭは、食品、飲料、医薬組成物、化粧品、チューインガム、卓上製品、シリアル、乳製品、練り歯磨き及び他の口腔組成物等に高甘味度天然甘味料として組み込まれてよい。
【０１０６】
本発明に従って得られる高度に精製された標的配糖体（単数又は複数）、特にステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／若しくはレバウジオシドＡＭは、唯一の甘味料として甘味料化合物として使用されてよく、又は、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＡ２、レバウジオシドＡ３、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＣ２、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＤ２、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＦ２、レバウジオシドＦ３、レバウジオシドＧ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＩ２、レバウジオシドＩ３、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＫ２、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＭ２、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ、レバウジオシドＯ２、レバウジオシドＱ、レバウジオシドＱ２、レバウジオシドＱ３、レバウジオシドＲ、レバウジオシドＳ、レバウジオシドＴ、レバウジオシドＴ１、レバウジオシドＵ、レバウジオシドＵ２、レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＷ２、レバウジオシドＷ３、レバウジオシドＹ、レバウジオシドＺ１、レバウジオシドＺ２、ダルコシドＡ、ダルコシドＣ、ステビオシドＤ、ステビオシドＥ、ステビオシドＥ２、ステビオシドＦ、モグロシド類、ブラゼイン、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン、グリシルリジン酸及びその塩、タウマチン、ペリラルチン、ペルナンズルチン、ムクロジオシド類、バイユノシド、フロミソシド−Ｉ、ジメチル−ヘキサヒドロフルオレン−ジカルボン酸、アブルソシド類、ペリアンドリン、カルノシフロシド類、シクロカリオシド、プテロカリオシド類、ポリポドシドＡ、ブラジリン、ヘルナンズルチン、フィロズルチン、グリシフィリン、フロリジン、トリロバチン、ジヒドロフラボノール、ジヒドロケルセチン−３−アセタート、ネオアスティリビン、トランス−シンナムアルデヒド、モナチン及びその塩、セリゲインＡ、ヘマトキシリン、モネリン、オスラジン、プテロカリオシドＡ、プテロカリオシドＢ、マビンリン、ペンタジン、ミラクリン、クルクリン、ネオクリン、クロロゲン酸、シナリン、Ｌｕｏ  Ｈａｎ  Ｇｕｏ甘味料、モグロシドＶ、シアメノシド及びそれらの組み合わせ等の少なくとも１つの天然に存在する高強度甘味料と一緒に使用されてよい。
【０１０７】
特定の態様において、ステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭは、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＡ２、レバウジオシドＡ３、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＣ２、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＤ２、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＦ２、レバウジオシドＦ３、レバウジオシドＧ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＩ２、レバウジオシドＩ３、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＫ２、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＭ２、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ、レバウジオシドＯ２、レバウジオシドＱ、レバウジオシドＱ２、レバウジオシドＱ３、レバウジオシドＲ、レバウジオシドＳ、レバウジオシドＴ、レバウジオシドＴ１、レバウジオシドＵ、レバウジオシドＵ２、レバウジオシドＶ、レバウジオシドＷ、レバウジオシドＷ２、レバウジオシドＷ３、レバウジオシドＹ、レバウジオシドＺ１、レバウジオシドＺ２、ダルコシドＡ、ダルコシドＣ、ステビオシドＤ、ステビオシドＥ、ステビオシドＥ２、ステビオシドＦ、ＮＳＦ−０２、モグロシドＶ、Ｌｕｏ  Ｈａｎ  Ｇｕｏ、アルロース、アロース、Ｄ−タガトース、エリスリトール及びそれらの組み合わせからなる群から選択される化合物を含む甘味料組成物において使用されうる。
【０１０８】
高度に精製された標的配糖体（単数又は複数）、特にステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭはまた、スクラロース、アセスルファムカリウム、アスパルテーム、アリテーム、サッカリン、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン、シクラマート、ネオテーム、ズルチン、スオサン、アドバンテーム、それらの塩、及びそれらの組み合わせ等の合成高強度甘味料と組み合わせて使用されてよい。
【０１０９】
更に、高度に精製された標的ステビオール配糖体（単数又は複数）、特にステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭは、ギムネマ酸、ホズルシン、ジジフィン、ラクチゾール等の天然甘味料抑制剤と組み合わせて使用されうる。ステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭはまた、様々な旨み味覚増強剤と組み合わされてよい。ステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭは、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、スレオニン、プロリン、セリン、グルタマート、リシン、トリプトファン及びそれらの組み合わせ等の旨味性及び甘味性アミノ酸と混合されうる。
【０１１０】
高度に精製された標的ステビオール配糖体（単数又は複数）、特にステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭは、炭水化物、ポリオール、アミノ酸及びそれらの対応する塩、ポリアミノ酸及びそれらの対応する塩、糖酸及びそれらの対応する塩、ヌクレオチド、有機酸、無機酸、有機酸塩及び有機塩基塩を包含する有機塩、無機塩、苦味化合物、香味剤及び香味剤成分、収斂性化合物、タンパク質又はタンパク質加水分解物、界面活性剤、乳化剤、フラボノイド、アルコール、ポリマー及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ又は２つ以上の添加剤と組み合わせて使用されうる。
【０１１１】
高度に精製された標的ステビオール配糖体（単数又は複数）、特にステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭは、ポリオール又は糖アルコールと組み合わせられてよい。「ポリオール」という用語は、２つ以上のヒドロキシル基を含む分子を指す。ポリオールは、２、３、及び４個のヒドロキシル基をそれぞれ含むジオール、トリオール、又はテトラオールであってよい。ポリオールはまた、それぞれ５、６、又は７個のヒドロキシル基を含むペンタオール、ヘキサオール、ヘプタオール等の４つを超えるヒドロキシル基を含んでよい。更に、ポリオールはまた、糖アルコール、多価アルコール、又は炭水化物の還元形態である多価アルコールであってよく、ここで、カルボニル基（アルデヒド又はケトン、還元糖）は一級又は二級ヒドロキシル基に還元されている。ポリオールの例は、エリスリトール、マルチトール、マンニトール、ソルビトール、ラクチトール、キシリトール、イノシトール、イソマルト、プロピレングリコール、グリセロール、トレイトール、ガラクチトール、水素化イソマルツロース、還元イソマルト−オリゴ糖類、還元キシロ−オリゴ糖類、還元ゲンチオ−オリゴ糖類、還元マルトースシロップ、還元グルコースシロップ、水素化デンプン加水分解物類、ポリグリシトール類、及び糖アルコール類、又は甘味料組成物の味に悪影響を及ぼさない還元可能なあらゆるその他の炭水化物を包含するが、これらに限定されない。
【０１１２】
高度に精製された標的ステビオール配糖体（単数又は複数）、特にステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭは、例えば、Ｄ−タガトース、Ｌ−糖類、Ｌ−ソルボース、Ｌ−アラビノース及びそれらの組み合わせ等の低カロリー甘味料と組み合わせられてよい。
【０１１３】
高度に精製された標的ステビオール配糖体（単数又は複数）、特にステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭはまた、様々な炭水化物と組み合わせられてよい。「炭水化物」という用語は、一般に、ｎが３〜３０である一般式（ＣＨ２Ｏ）ｎの、複数のヒドロキシル基で置換されたアルデヒド又はケトン化合物、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーを指す。加えて、本発明の炭水化物は、１つ又は２つ以上の位置で置換又は脱酸素化されうる。本明細書で使用される炭水化物は、未修飾炭水化物、炭水化物誘導体、置換炭水化物、及び修飾炭水化物を包含する。本明細書で使用される場合、「炭水化物誘導体」、「置換炭水化物」、及び「修飾炭水化物」という句は同義的である。修飾炭水化物とは、少なくとも１つの原子が付加、除去、又は置換されている、又はそれらが組み合わされたあらゆる炭水化物を意味する。したがって、炭水化物誘導体又は置換炭水化物は、置換及び非置換の単糖、二糖、オリゴ糖、及び多糖を包含する。炭水化物誘導体又は置換炭水化物は、任意に、炭水化物誘導体又は置換炭水化物が、甘味料組成物の甘味を改善するように機能することを条件として、あらゆる対応するＣ位置で脱酸素化、及び／又は水素、ハロゲン、ハロアルキル、カルボキシル、アシル、アシルオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル誘導体、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホ、メルカプト、イミノ、スルホニル、スルフェニル、スルフィニル、スルファモイル、カルボアルコキシ、カルボキサミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホリル、ホスフィノ、チオエステル、チオエーテル、オキシミノ、ヒドラジノ、カルバミル、ホスホ、ホスホナート、又はあらゆる他の存立可能な官能基等の１つ又は２つ以上の部分で置換されうる。
【０１１４】
本発明に従って使用されてよい炭水化物の例は、プシコース、ツラノース、アロース、タガトース、トレハロース、ガラクトース、ラムノース、様々なシクロデキストリン類、環状オリゴ糖類、様々な種類のマルトデキストリン類、デキストラン、スクロース、グルコース、リブロース、フルクトース、トレオース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、マンノース、イドース、ラクトース、マルトース、転化糖、イソトレハロース、ネオトレハロース、イソマルツロース、エリトロース、デオキシリボース、グロース、イドース、タロース、エリトルロース、キシルロース、プシコース、ツラノース、セロビオース、アミロペクチン、グルコサミン、マンノサミン、フコース、グルクロン酸、グルコン酸、グルコノ−ラクトン、アベクオース、ガラクトサミン、テンサイオリゴ糖類、イソマルト−オリゴ糖類（イソマルトース、イソマルトトリオース、パノース等）、キシロ−オリゴ糖類（キシロトリオース、キシロビオース等）、キシロ末端オリゴ糖類、ゲンチオ−オリゴ糖類（ゲンチオビオース、ゲンチオトリオース、ゲンチオテトラオース等）、ソルボース、ニゲロ−オリゴ糖類、パラチノースオリゴ糖類、フルクトオリゴ糖類（ケストース、ニストース等）、マルトテトラオール、マルトトリオール、マルト−オリゴ糖類（マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース等）、デンプン、イヌリン、イヌロ−オリゴ糖類、ラクツロース、メリビオース、ラフィノース、リボース、高フルクトースコーンシロップ類等の異性化液糖類、カップリングシュガー類、及び大豆オリゴ糖類を包含するが、これらに限定されない。更に、本明細書で使用される炭水化物は、Ｄ配置又はＬ配置のいずれかであってよい。
【０１１５】
特に本発明に従って得られる高度に精製された標的ステビオール配糖体（単数又は複数）、特にステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭは、様々な生理活性物質又は機能性成分と組み合わせて使用されうる。機能性成分は一般にカロテノイド、食物繊維、脂肪酸、サポニン、抗酸化物質、栄養補助食品、フラボノイド、イソチオシアナート、フェノール、植物ステロール及びスタノール（フィトステロール及びフィトスタノール）；ポリオール；プレバイオティクス、プロバイオティクス；フィトエストロゲン；大豆タンパク質；硫化物／チオール；アミノ酸；タンパク質；ビタミン；及びミネラル等のカテゴリーに分類される。機能性成分はまた、心血管、コレステロール低下、抗炎症等の健康上の利益に基づいて分類されてよい。例示的な機能性成分は、ＷＯ２０１３／０９６４２０に提供されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
特に本発明に従って得られる高度に精製された標的ステビオール配糖体（単数又は複数）、特にステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭは、ゼロカロリー、低カロリー又は糖尿病用飲料及び味覚特性が改善された食品を製造するために、高強度甘味料として適用されてよい。また、それは飲料、食品、医薬品、及び砂糖を使用できない他の製品において使用されてよい。更に、高度に精製された標的ステビオール配糖体、特にステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭは、飲料、食品、及び人間が消費する他の製品の甘味料としてだけでなく、特性が改善された動物飼料及び家畜飼料にも使用されうる。
【０１１７】
特に本発明に従って得られる高度に精製された標的ステビオール配糖体（単数又は複数）、特にステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭは、ゼロカロリー、低カロリー又は糖尿病用飲料及び変更されたフレーバーを有する食品を製造するために、フレーバー調整剤として適用されてよい。フレーバー改変剤、又は改変特性を備えたフレーバー（ＦＭＰ）として使用される場合、高度に精製された標的ステビオール配糖体は、フレーバー調整剤又はＦＭＰの検出レベル未満で消費製品において使用される。フレーバー調整剤又はＦＭＰは、それ自体の検出可能な味又はフレーバーを消費製品に付与しないが、代わりに、消費者による消費製品中の他の成分の味及び／又はフレーバーの検出を改変するのに役立つ。味覚及びフレーバー改変の一例は、甘味増強であり、ここで、フレーバー調整剤又はＦＭＰ自体は消費製品の甘味に寄与しないが、消費者が味わう甘味の品質を増強する。
【０１１８】
高度に精製された標的ステビオール配糖体（単数又は複数）、特にステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭが、フレーバー改変剤又は改変特性を備えたフレーバーとして使用されてよい消費製品の例は、ウォッカ、ワイン、ビール、リキュール、日本酒等のアルコール飲料；天然ジュース；清涼飲料；炭酸ソフトドリンク；ダイエットドリンク；ゼロカロリードリンク；低カロリー飲料及び食品；ヨーグルトドリンク；インスタントジュース；インスタントコーヒー；粉末タイプのインスタント飲料；缶詰；シロップ；豆醤；醤油；お酢；ドレッシング；マヨネーズ；ケチャップ；カレー；スープ；インスタントブイヨン；醤油粉；粉末酢；ビスケットタイプ；米菓；クラッカー；パン；チョコレート；カラメル；キャンディー；チューインガム；ゼリー；プリン；保存された果物及び野菜；フレッシュクリーム；ジャム；マーマレード；フラワーペースト；粉ミルク；アイスクリーム；シャーベット；瓶詰め野菜及び果物；缶詰ゆで豆；甘口ソースで煮た肉及び食品；農業野菜食品；シーフード；ハム；ソーセージ；魚肉ハム；魚肉ソーセージ；魚肉ペースト；魚のフライ製品；乾燥シーフード製品；冷凍食品；保存海藻；保存肉；タバコ；医薬品；及びその他多数を包含するが、これらに限定されない。基本的に、それは無制限の用途を有しうる。
【０１１９】
特に本発明に従って得られる高度に精製された標的ステビオール配糖体（単数又は複数）、特にステビオールモノシド、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭは、ゼロカロリー、低カロリー、又は糖尿病用飲料及び食品を製造するために、消泡剤として適用されてよい。
【０１２０】
高度に精製された標的ステビオール配糖体（単数又は複数）、特にステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭが、甘味料化合物として使用されてよい消費製品の例は、ウォッカ、ワイン、ビール、リキュール、日本酒等のアルコール飲料；天然ジュース；清涼飲料；炭酸ソフトドリンク；ダイエットドリンク；ゼロカロリードリンク；低カロリー飲料及び食品；ヨーグルトドリンク；インスタントジュース；インスタントコーヒー；粉末タイプのインスタント飲料；缶詰；シロップ；豆醤；醤油；お酢；ドレッシング；マヨネーズ；ケチャップ；カレー；スープ；インスタントブイヨン；醤油粉；粉末酢；ビスケットタイプ；米菓；クラッカー；パン；チョコレート；カラメル；キャンディー；チューインガム；ゼリー；プリン；保存された果物及び野菜；フレッシュクリーム；ジャム；マーマレード；フラワーペースト；粉ミルク；アイスクリーム；シャーベット；瓶詰め野菜及び果物；缶詰ゆで豆；甘口ソースで煮た肉及び食品；農業野菜食品；シーフード；ハム；ソーセージ；魚肉ハム；魚肉ソーセージ；魚肉ペースト；魚のフライ製品；乾燥シーフード製品；冷凍食品；保存海藻；保存肉；タバコ；医薬品；及びその他多数を包含するが、これらに限定されない。基本的に、それは無制限の用途を有しうる。
食品、飲料、医薬品、化粧品、卓上製品、及びチューインガム等の製品の製造の際には、混合、混練、溶解、浸酸、浸透、浸透、散布、噴霧、注入及び他の方法等の従来的な方法が使用されてよい。
【０１２１】
更に、本発明で得られる高度に精製された標的ステビオール配糖体（単数又は複数）、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭは、乾燥又は液体の形態で使用されてよい。
【０１２２】
高度に精製された標的ステビオール配糖体は、食品の熱処理の前又は後に加えられうる。高度に精製された標的ステビオール配糖体、特にステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭの量は、使用の目的に依存する。上記のように、それは単独で又は他の化合物と組み合わせて添加されうる。
【０１２３】
本発明はまた、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３、及び／又はレバウジオシドＡＭを使用する飲料における甘味増強にも向けられている。したがって、本発明は、甘味料及びステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３、及び／又はレバウジオシドＡＭを甘味増強剤として含む飲料を提供し、ここで、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭは、それぞれの甘味認識閾値以下の濃度で存在する。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「甘味増強剤」という用語は、飲料等の組成物中の甘味の知覚を増強又は強化することができる化合物を指す。「甘味増強剤（ｓｗｅｅｔｎｅｓｓ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）」という用語は、「甘味感強化剤（ｓｗｅｅｔ  ｔａｓｔｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒ）」、「甘味強化剤（ｓｗｅｅｔｎｅｓｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒ）」、「甘味増幅剤（ｓｗｅｅｔｎｅｓｓ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）」、及び「甘味増感剤（ｓｗｅｅｔｎｅｓｓ  ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｒ）」という用語と同義である。
【０１２５】
本明細書で一般的に使用される「甘味認識閾値濃度」という用語は、人間の味覚によって知覚できる甘味化合物の既知の最低濃度であり、典型的には約１．０％のスクロース当量（１．０％ＳＥ）である。一般に、甘味増強剤は、所与の甘味増強剤の甘味認識閾値濃度以下で存在する場合、それ自体でいかなる顕著な甘味を提供することなく、甘味料の甘味を増強又は強化してよい；しかしながら、甘味増強剤は、それらの甘味認識閾値濃度を超える濃度では、それ自体、甘味を提供してよい。甘味認識閾値濃度は、特定の増強剤に固有であり、飲料マトリクスに基づいて変化しうる。甘味認識閾値濃度は、所与の飲料マトリクスにおいて１．０％より多いスクロース当量が検出されるまで、所与の増強剤の濃度を増加させる味覚試験によって容易に決定されうる。約１．０％のスクロース当量を提供する濃度が甘味認識閾値とみなされる。
【０１２６】
いくつかの態様において、甘味料は、例えば、約１．０重量％、約１．５重量％、約２．０重量％、約２．５重量％、約３．０重量％、約３．５重量％、約４．０重量％、約４．５重量％、約５．０重量％、約５．５重量％、約６．０重量％、約６．５重量％、約７．０重量％、約７．５重量％、約８．０重量％、約８．５重量％、約９．０重量％、約９．５重量％、約１０．０重量％、約１０．５重量％、約１１．０重量％、約１１．５重量％、又は約１２．０重量％等の約０．５重量％から約１２重量％の量で飲料中に存在する。
【０１２７】
特定の態様では、甘味料は、例えば、約２重量％から約８重量％、約３重量％から約７重量％、又は約４重量％から約６重量％等の約０．５重量％から約１０重量％の量で飲料中に存在する。特定の態様では、甘味料は、約０．５重量％から約８重量％の量で飲料中に存在する。特定の態様では、甘味料は、約２重量％から約８重量％の量で飲料中に存在する。
【０１２８】
一態様では、甘味料は、従来的なカロリーの甘味料である。適切な甘味料は、スクロース、フルクトース、グルコース、高フルクトースコーンシロップ及び高フルクトーススターチシロップを包含するが、これらに限定されない。
別の態様では、甘味料はエリスリトールである。
【０１２９】
更に別の態様では、甘味料は希少糖である。適切な希少糖は、Ｄ−アロース、Ｄ−プシコース、Ｄ−リボース、Ｄ−タガトース、Ｌ−グルコース、Ｌ−フコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−ツラノース、Ｄ−ロイクロース及びそれらの組み合わせを包含するが、これらに限定されない。
甘味料は、単独で、又は他の甘味料と組み合わせて使用されうることが企図されている。
一態様では、希少糖はＤ−アロースである。より特定の態様では、Ｄ−アロースは、飲料中に、例えば、約２重量％から約８重量％等の約０．５重量％から約１０重量％の量で存在する。
【０１３０】
別の態様では、希少糖はＤ−プシコースである。より特定の態様では、Ｄ−プシコースは、飲料中に、例えば、約２重量％から約８重量％等の約０．５重量％から約１０重量％の量で存在する。
更に別の態様では、希少糖はＤ−リボースである。より特定の態様では、Ｄ−リボースは、飲料中に、例えば、約２重量％から約８重量％等の約０．５重量％から約１０重量％の量で存在する。
更に別の態様では、希少糖はＤ−タガトースである。より特定の態様では、Ｄ−タガトースは、飲料中に、例えば、約２重量％から約８重量％等の約０．５重量％から約１０重量％の量で存在する。
【０１３１】
更なる態様において、希少糖はＬ−グルコースである。より特定の態様では、Ｌ−グルコースは、飲料中に、例えば、約２重量％から約８重量％等の約０．５重量％から約１０重量％の量で存在する。
一態様では、希少糖はＬ−フコースである。より特定の態様では、Ｌ−フコースは、飲料中に、例えば、約２重量％から約８重量％等の約０．５重量％から約１０重量％の量で存在する。
別の態様において、希少糖はＬ−アラビノースである。より特定の態様では、Ｌ−アラビノースは、飲料中に、例えば、約２重量％から約８重量％等の約０．５重量％から約１０重量％の量で存在する。
【０１３２】
更に別の態様では、希少糖はＤ−ツラノースである。より特定の態様では、Ｄ−ツラノースは、飲料中に、例えば、約２重量％から約８重量％等の約０．５重量％から約１０重量％の量で存在する。
更に別の態様では、希少糖はＤ−ロイクロースである。より特定の態様では、Ｄ−ロイクロースは、飲料中に、例えば、約２重量％から約８重量％等の約０．５重量％から約１０重量％の量で存在する。
甘味認識閾値以下の濃度での甘味増強剤の添加は、あらゆる甘味増強剤の非存在下における対応する飲料と比較して、甘味料及び甘味増強剤を含む飲料の検出されるスクロース当量を増加させる。更に、甘味料は、甘味料の非存在下における同じ濃度の少なくとも１つの甘味増強剤を含む溶液の検出可能な甘味よりも多い量だけ増加されうる。
【０１３３】
したがって、本発明はまた、甘味料を含む飲料を提供すること、並びにステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭ又はそれらの組み合わせから選択される甘味増強剤を添加することを含む、甘味料を含む飲料の甘味を増強するための方法も提供し、ここで、ステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭは、甘味認識閾値以下の濃度で存在する。
【０１３４】
甘味認識閾値以下の濃度におけるステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭの甘味料を含む飲料への添加は、例えば、約１．０％、約１．５％、約２．０％、約２．５％、約３．０％、約３．５％、約４．０％、約４．５％又は約５．０％等の約１．０％から約５．０％の検出されるスクロース当量を増加させてよい。
【０１３５】
以下の例は、高度に精製された標的ステビオール配糖体（単数又は複数）、特にステビオールモノシドＡ、ステビオールビオシド、ステビオールビオシドＡ、ステビオールビオシドＢ、ルブソシド、ステビオシド、ステビオシドＡ（レバウジオシドＫＡ）、ステビオシドＢ、ステビオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＥ２、レバウジオシドＥ３及び／又はレバウジオシドＡＭの調製のための本発明の好ましい態様を示している。例に記載された材料、比率、条件、及び手順は例示に過ぎず、本発明はそれらに限定されないことが理解されよう。
【０１３６】
例
（例１）
生体触媒プロセスで使用される改変酵素のタンパク質配列
配列番号１：
＞ＳｕＳｙ＿Ａｔ、バリアントＰＭ１−５４−２−Ｅ０５（改変スクロースシンターゼ；ＷＴ遺伝子の供給源：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ））
【数１】
2021527622.tif 000010
配列番号２：
＞ＵＧＴＳｌ２バリアント０２３４（改変グルコシルトランスフェラーゼ；ＷＴ遺伝子の供給源：トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））
【数２】
2021527622.tif 000011
配列番号３：
＞ＵＧＴ７６Ｇ１バリアント００４２（改変グルコシルトランスフェラーゼ；ＷＴ遺伝子の供給源：ステビア・レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ））
【数３】
2021527622.tif 000012
【０１３７】
（例２）
配列番号１のＳｕＳｙ＿Ａｔバリアントの発現及び調合
配列番号１のＳｕＳｙ＿Ａｔバリアントをコードする遺伝子（例１）を発現ベクターｐＬＥ１Ａ１７（ｐＲＳＦ−１ｂの派生物、Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。得られたプラスミドを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。
【０１３８】
カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を添加したＺＹＭ５０５培地（Ｆ．  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｓｔｕｄｉｅｒ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４１  （２００５）  ２０７−２３４）中、３７℃で細胞を培養した。遺伝子の発現を対数期にＩＰＴＧ（０．２ｍＭ）によって誘導し、３０℃、２００ｒｐｍで１６〜１８時間行なった。
遠心分離（３２２０×ｇ、２０分、４℃）によって細胞を収集し、細胞溶解バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０；２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＤＮＡヌクレアーゼ２０Ｕ／ｍＬ、リゾチーム０．５ｍｇ／ｍＬ）で２００の光学密度となるように再懸濁した（６００ｎｍ（ＯＤ６００）で測定）。次に細胞を超音波処理によって破壊し、粗抽出物を遠心分離（１８０００×ｇ、４０分、４℃）によって細胞破片から分離した。上清を０．２μｍフィルターで濾過滅菌し、蒸留水で５０：５０に希釈して、酵素活性調製物を得た。
【０１３９】
ＳｕＳｙ＿Ａｔの酵素活性調製物について、単位活性は次のように定義される：１ｍＵのＳｕＳｙ＿Ａｔは、１ｎｍｏｌのスクロースを１分でフルクトースに変換する。アッセイの反応条件は、３０℃、５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．０、ｔ０で４００ｍＭのスクロース、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び１５ｍＭウリジン二リン酸（ＵＤＰ）である。
【０１４０】
（例３）
配列番号２のＵＧＴＳｌ２バリアントの発現及び調合
配列番号２のＵＧＴＳｌ２バリアントをコードする遺伝子（例１）を発現ベクターｐＬＥ１Ａ１７（ｐＲＳＦ−１ｂの派生物、Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。得られたプラスミドを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。
カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を添加したＺＹＭ５０５培地（Ｆ．  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｓｔｕｄｉｅｒ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４１  （２００５）  ２０７−２３４）中、３７℃で細胞を培養した。遺伝子の発現を対数期にＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）によって誘導し、３０℃、２００ｒｐｍで１６〜１８時間行なった。
【０１４１】
遠心分離（３２２０×ｇ、２０分、４℃）によって細胞を収集し、細胞溶解バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０；２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＤＮＡヌクレアーゼ２０Ｕ／ｍＬ、リゾチーム０．５ｍｇ／ｍＬ）で２００の光学密度となるように再懸濁した（６００ｎｍ（ＯＤ６００）で測定）。次に細胞を超音波処理によって破壊し、粗抽出物を遠心分離（１８０００×ｇ、４０分、４℃）によって細胞破片から分離した。上清を０．２μｍフィルターで濾過滅菌し、１Ｍスクロース溶液で５０：５０に希釈して、酵素活性調製物を得た。
【０１４２】
ＵＧＴＳｌ２の酵素活性調製物について、単位活性は次のように定義される：１ｍＵのＵＧＴＳｌ２は、１ｎｍｏｌのレバウジオシドＡ（Ｒｅｂ  Ａ）を１分でレバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）に変換する。アッセイの反応条件は、３０℃、５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．０、ｔ０で１０ｍＭのＲｅｂ  Ａ、５００ｍＭスクロース、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭウリジン二リン酸（ＵＤＰ）及び３Ｕ／ｍＬのＳｕＳｙ＿Ａｔである。
【０１４３】
（例４）
配列番号３のＵＧＴ７６Ｇ１バリアントの発現及び調合
配列番号３のＵＧＴ７６Ｇ１バリアントをコードする遺伝子（例１）を発現ベクターｐＬＥ１Ａ１７（ｐＲＳＦ−１ｂの派生物、Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。得られたプラスミドを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。
カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を添加したＺＹＭ５０５培地（Ｆ．  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｓｔｕｄｉｅｒ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４１  （２００５）  ２０７−２３４）中、３７℃で細胞を培養した。遺伝子の発現を対数期にＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）によって誘導し、３０℃、２００ｒｐｍで１６〜１８時間行なった。
【０１４４】
遠心分離（３２２０×ｇ、２０分、４℃）によって細胞を収集し、細胞溶解バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０；２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＤＮＡヌクレアーゼ２０Ｕ／ｍＬ、リゾチーム０．５ｍｇ／ｍＬ）で２００の光学密度となるように再懸濁した（６００ｎｍ（ＯＤ６００）で測定）。次に細胞を超音波処理によって破壊し、粗抽出物を遠心分離（１８０００×ｇ、４０分、４℃）によって細胞破片から分離した。上清を０．２μｍフィルターで濾過滅菌し、１Ｍスクロース溶液で５０：５０に希釈して、酵素活性調製物を得た。
ＵＧＴ７６Ｇ１の酵素活性調製物について、単位活性は次のように定義される：１ｍＵのＵＧＴ７６Ｇ１は、１ｎｍｏｌのレバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）を１分でレバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）に変換する。アッセイの反応条件は、３０℃、５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．０、ｔ０で１０ｍＭのＲｅｂ  Ａ、５００ｍＭスクロース、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭウリジン二リン酸（ＵＤＰ）及び３Ｕ／ｍＬのＳｕＳｙ＿Ａｔである。
【０１４５】
（例５）
ＵＧＴＳｌ２、ＳｕＳｙ＿Ａｔ及びＵＧＴ７６Ｇ１を同時に加える、ワンポット反応におけるステビオシドからのレバウジオシドＡＭの合成
３つの酵素：ＵＧＴＳｌ２（配列番号２のバリアント）、ＳｕＳｙ＿Ａｔ−（配列番号１のバリアント）及びＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号３のバリアント）（例１、２、３、及び４を参照）を利用して、レバウジオシドＡＭ（ｒｅｂ  Ａｍ）をワンポット反応（図３）でステビオシドから直接合成した。最終反応溶液は、１０５Ｕ／ＬのＵＧＴＳｌ２、４０５Ｕ／ＬのＳｕＳｙ＿Ａｔ、３Ｕ／ＬのＵＧＴ７６Ｇ１、５ｍＭのステビオシド、０．２５ｍＭのウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、１Ｍのスクロース、４ｍＭのＭｇＣｌ２、及びリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．６）を含んでいた。まず、２０７ｍＬの蒸留水を０．２４ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０３ｇのスクロース、９．９ｍＬの１．５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．６）、及び１５ｇのステビオシドと混合した。成分を溶解させた後、温度を４５℃に調整し、ＵＧＴＳｌ２、ＳｕＳｙ＿Ａｔ、ＵＧＴ７６Ｇ１、及び３９ｍｇのＵＤＰを加えた。反応混合物を４５℃のシェーカーで２４時間インキュベートした。８時間目と１８時間目に追加のＵＤＰを３９ｍｇ加えた。いくつかの時点において、ｒｅｂ  ＡＭ、ｒｅｂ  Ｅ、ステビオシド、ｒｅｂ  Ｍ、ｒｅｂ  Ｂ、ステビオールビオシド、及びｒｅｂ  Ｉの含有量をＨＰＬＣで分析した。
【０１４６】
分析のために、１７％のＨ３ＰＯ４を使用して反応混合物をｐＨ５．５に調整し、それから１０分間煮沸することによってバイオトランスフォーメーション試料を不活性化した。得られた試料を濾過し、濾液を１０倍に希釈し、ＨＰＬＣ分析の試料として使用した。ＨＰＬＣアッセイは、ポンプ、カラムサーモスタット、オートサンプラー、バックグラウンド補正が可能なＵＶ検出器、及びデータ収集システムで構成されるＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ  １２００  ＨＰＬＣシステム上で実行した。分析対象物はＡｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  ＳＢ−Ｃ１８、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、２．７μｍ、４０℃を使用して分離した。移動相は２つのプレミックスから成る：
−  ７５％の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．６）と２５％のアセトニトリルを含むプレミックス１、及び
−  ６８％の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．６）と３２％のアセトニトリルを含むプレミックス２。
【０１４７】
溶出グラジエントはプレミックス１で開始し、１２．５分において５０％までプレミックス２に変更し、１３分において１００％までプレミックス２に変更した。総実行時間は４５分であった。カラム温度は４０℃に維持した。注入量は５μＬであった。レバウジオシド種は２１０ｎｍのＵＶによって検出された。
【０１４８】
表３は、各時点について、同定されたレバウジオシド種へのステビオシドの変換を示している（面積の割合）。２４時間後におけるステビオシドと反応混合物のクロマトグラムが、それぞれ図５と図６に示されている。当業者は、保持時間が溶媒及び／又は機器の変更により、時として変化しうることを理解するであろう。
【表４】
2021527622.tif 000013
【０１４９】
（例６）
ＳｕＳｙ＿ＡｔとＵＧＴ７６Ｇ１の同時ワンポット反応におけるレバウジオシドＥからのレバウジオシドＡＭの合成
２つの酵素：ＳｕＳｙ＿Ａｔ−（配列番号１のバリアント）及びＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号３のバリアント）（例１、２、及び４を参照）を利用して、レバウジオシドＥ（ｒｅｂ  Ｅ）からレバウジオシドＡＭ（ｒｅｂ  ＡＭ）をワンポット反応（図４）で直接合成した。最終反応溶液は、４０５Ｕ／ＬのＳｕＳｙ＿Ａｔ、３Ｕ／ＬのＵＧＴ７６Ｇ１、５ｍＭのｒｅｂ  Ｅ、０．２５ｍＭのウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、１Ｍのスクロース、４ｍＭのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、及びリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．６）を含んでいた。まず、３７ｍＬの蒸留水を４０．３ｍｇのＭｇＣｌ２、１７．１２ｇのスクロース、１．６５ｍＬの１．５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．６）、５．０４ｇのｒｅｂ  Ｅと混合した。成分を溶解させた後、温度を４５℃に調整し、ＳｕＳｙ＿Ａｔ、ＵＧＴ７６Ｇ１、及び６．５ｍｇのＵＤＰを加えた。反応混合物を４５℃のシェーカーで２４時間インキュベートした。８時間目と１８時間目に追加のＵＤＰを６．５ｍｇ加えた。いくつかの時点において、ｒｅｂ  ＡＭ、ｒｅｂ  Ｅ、ステビオシド、ｒｅｂ  Ａ、ｒｅｂ  Ｍ、ｒｅｂ  Ｂ、及びステビオールビオシドの含有量をＨＰＬＣで分析した。
【０１５０】
分析のために、１７％のＨ３ＰＯ４を使用して反応混合物をｐＨ５．５に調整し、それから１０分間煮沸することによってバイオトランスフォーメーション試料を不活性化した。得られた試料を濾過し、濾液を１０倍に希釈し、ＨＰＬＣ分析の試料として使用した。ＨＰＬＣアッセイは、ポンプ、カラムサーモスタット、オートサンプラー、バックグラウンド補正が可能なＵＶ検出器、及びデータ収集システムで構成されるＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ  １２００  ＨＰＬＣシステム上で実行した。分析対象物はＡｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  ＳＢ−Ｃ１８、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、２．７μｍ、４０℃を使用して分離した。移動相は２つのプレミックスから成る：
−  ７５％の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．６）と２５％のアセトニトリルを含むプレミックス１、及び
−  ６８％の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．６）と３２％のアセトニトリルを含むプレミックス２。
【０１５１】
溶出グラジエントはプレミックス１で開始し、１２．５分において５０％までプレミックス２に変更し、１３分において１００％までプレミックス２に変更した。総実行時間は４５分であった。カラム温度は４０℃に維持した。注入量は５μＬであった。レバウジオシド種は２１０ｎｍのＵＶによって検出された。
【０１５２】
表４は、各時点について、同定されたレバウジオシド種へのｒｅｂ  Ｅの変換を示している（面積の割合）。２４時間後におけるｒｅｂ  Ｅと反応混合物のクロマトグラムが、それぞれ図７と図８に示されている。当業者は、保持時間が溶媒及び／又は機器の変更により、時として変化しうることを理解するであろう。
【表５】
2021527622.tif 000014
【０１５３】
（例７）
レバウジオシドＡＭの精製
２４時間後、例５の反応混合物をＨ３ＰＯ４でｐＨをｐＨ５．５に調整することによって不活性化し、次いで１０分間煮沸した。煮沸させた後、反応混合物を濾過し、ＲＯ水で５％の固形分に希釈した。希釈した溶液を、ＹＷＤ０３マクロポーラス吸着樹脂（Ｃａｎｇｚｈｏｕ  Ｙｕａｎｗｅｉ、中国）を充填した１Ｌカラムに通した。吸着したステビオール配糖体を５Ｌの７０％エタノールで溶出させた。得られた溶出液を乾固するまで蒸発させて、１６ｇの乾燥粉末を取得し、これを８０ｍＬの７０％メタノールに溶解させた。溶液を２０℃で３日間、結晶化させた。結晶を濾過により分離し、真空オーブン中、８０℃で１８時間乾燥させて、ＨＰＬＣアッセイによる測定で純度９５．９２％の純粋なｒｅｂ  ＡＭ結晶１０．４ｇを得た。図９にｒｅｂ  ＡＭのクロマトグラムが示されている。当業者は、保持時間が溶媒及び／又は機器の変更により、時として変化しうることを理解するであろう。
【０１５４】
（例８）
レバウジオシドＡＭの構造解明
ＮＭＲ実験は、ピリジン−ｄ５に溶解した試料を用いて、Ｂｒｕｋｅｒ  ５００ＭＨｚ分光計上で行った。試料からのシグナルに加えて、δＣ  １２３．５、１３５．５、１４９．９ｐｐｍ及びδＨ  ７．１９、７．５５、８．７１ｐｐｍにおいてピリジン−ｄ５からのシグナルが観察された。
【０１５５】
ピリジン−ｄ５中のレバウジオシドＡＭの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、試料の優れた品質を明らかにしている（図１０を参照）。ＨＳＱＣ（図１１を参照）は、糖領域にエキソメチレン基が存在し、Ｈ，Ｈ−ＣＯＳＹにおいて観察可能なＣ−１５への長距離カップリングを伴うことを示している（図１２）。四級炭素（Ｃ−１３、Ｃ−１６、及びＣ−１９）の他の深磁場シグナルがＨＭＢＣによって検出される（図１３）。ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ、及びＨ，Ｈ−ＣＯＳＹにおけるシグナルの相関は、以下のアグリコン構造を持つステビオール配糖体の存在を明らかにしている：
【化１】
2021527622.tif 000015
【０１５６】
ＨＳＱＣシグナルとＨＭＢＣシグナルの相関は、５つのアノマーシグナルを明らかにしている。約８Ｈｚのアノマープロトンの結合定数とそれらの糖結合の幅広いシグナルは、これら５つの糖のβ−Ｄ−グルコピラノシドとしての同定を可能とする。
ＨＳＱＣ及びＨＭＢＣと組み合わせたアノマープロトンの観察は、糖結合及びアグリコンとの相関を明らかにしている。糖配列の割り当ては、ＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹ（図１４）とＨＳＱＣの組み合わせを用いて確認された。
【０１５７】
上記のＮＭＲ実験を適用して、プロトンと炭素の化学シフト、主な結合定数、及び主なＨＭＢＣ相関を割り当てた（表５を参照）。
【表６−１】
2021527622.tif 000016
【表６−２】
2021527622.tif 000017
【表６−３】
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【０１５８】
全てのＮＭＲデータの相関は、以下の化学構造で示されるように、ステビオールアグリコンに結合した５つのβ−Ｄ−グルコピラノースを持つレバウジオシドＡＭを指し示している：
【化２】
2021527622.tif 000019
【０１５９】
レバウジオシドＡＭの化学式はＣ５０Ｈ８０Ｏ２８であり、これは計算上のモノアイソトピック分子量１１２８．５に対応する。ＬＣＭＳ分析については、レバウジオシドＡＭをメタノールに溶解し、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｎｅｘｅｒａ  ２０２０  ＵＦＬＣ  ＬＣＭＳ装置をＣｏｒｔｅｃｓ  ＵＰＬＣ  Ｃ１８  １．６μｍ、５０×２．１ｍｍカラム上で用いて分析した。観察された１１２７．３のＬＣＭＳ（ネガティブＥＳＩモード）の結果（それぞれ図１５ａ及び図１５ｂを参照）は、レバウジオシドＡＭと一致しており、イオン（Ｍ−Ｈ）−に対応している。
【図１】
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【図２】
2021527622.tif 000022
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2021527622.tif 000027
【図８】
2021527622.tif 000028
【図９】
2021527622.tif 000029
【図１０】
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【図１１】
2021527622.tif 000031
【図１２】
2021527622.tif 000032
【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【国際調査報告】
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