(57)【要約】 本発明は、Ｌ−アスコルビン酸に結合して酸化を抑制する一本鎖ＤＮＡアプタマーに関し、前記一本鎖ＤＮＡアプタマーは、１つ以上のステムループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造を有し、前記ステムループ構造におけるステム構造の末端にＣＧ結合を有し、ループ構造の両側の開始部分がＧ又はＣとして互いに対向していることを特徴とする。本発明のアプタマーは、ビタミンＣの酸化防止効果を有し、ビタミンＣに選択的に結合するアプタマーを用いてビタミンＣの還元状態を維持することで、その抗酸化機能を長期間維持するようにして、様々な剤形の機能性化粧品、経口用栄養補助剤及び食品などに用いることができ、ビタミンＣに選択的に結合するアプタマーを用いることで、微量のビタミンＣでも持続的でかつ最大化された抗酸化効果を期待することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アスコルビン酸に結合して酸化を抑制する一本鎖ＤＮＡアプタマーであって、前記一本鎖ＤＮＡアプタマーは、１つ以上のステムループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造を有し、前記ステムループ構造におけるステム構造の末端にＣＧ結合を有し、ループ構造の両側の開始部分がＧ又はＣとして同一の塩基が互いに対向していることを特徴とする、一本鎖ＤＮＡアプタマー。
【請求項２】
前記アプタマーは、前記ステムループ構造におけるステム構造の末端にＣＧ結合を有し、ループ構造の開始部分における１つの塩基がＧ又はＣ塩基からＴに置換された二次構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の一本鎖ＤＮＡアプタマー。
【請求項３】
前記アプタマーは、配列番号１〜２９に記載された塩基配列のうちの１つからなることを特徴とする、請求項１に記載の一本鎖ＤＮＡアプタマー。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のアプタマーを有効成分として含む、抗酸化用組成物。
【請求項５】
ビタミンＣに請求項１〜３のいずれか一項に記載のアプタマーを処理して前記ビタミンＣの酸化を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−アスコルビン酸に特異的に結合するアプタマー及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗酸化物質のうちの代表的な成分の一つであるＬ−アスコルビン酸（Ｌ−Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）（ビタミンＣ、以下、‘ＡＡ’という）は、その遊離基の中性化を通じた抗酸化活性により、医薬、化粧品、食品及び飲料産業で広く使用されている。食品補助剤及び／又は医薬活性成分として使用されるときのＡＡの利点は、産業災害（タイヤ及びゴム工場、化粧品製造工場）で発生し得るＺｎＯＮＰｓの吸入により生じる急性肺細胞酸化過程で、ＡＡを添加した飲用水を供給することで抑制することが報告されている。数十兆ウォン規模に達するこれらの産業では、主要な解決策として、ビタミンＣが共通に使用されることが知られている。
【０００３】
ＡＡは、その抗酸化能力により、本質的に酸化によって容易に分解され得る。ＡＡの酸化に影響を与える主要因子は、温度、ｐＨ、酸素、金属イオン、光及び酵素などである。ＡＡを主成分として使用する産業では、このような酸化分解される特性により、製品の保存期間及び効果の両方に影響を与えるため、当面の問題として長い間認識されてきた。したがって、これらの産業において、ＡＡの酸化的分解に対する理解だけでなく、新しくかつより優れた方法を開発し、発見することに多くの研究と費用が投じられている。
【０００４】
一方、老化を促進する原因は様々であるが、その中でも活性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ：ＲＯＳ）が非常に主要な原因の一つとして受け入れられている。このような活性酸素は、エネルギー代謝過程、免疫反応などで必然的に生成され、外部の有害環境によっても誘発される、避けられない刺激である。活性酸素は、反応性が非常に高いため、体内でＤＮＡの変性、過度の信号伝達の誘発及びタンパク質の変性などをもたらし、健康に有害な影響を累積する一連の反応を引き起こす。しかし、このような有害な反応は、生体内に存在する抗酸化物質（尿酸（ｕｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ビタミンＣ（ｖｉｔ．Ｃ）、ビタミンＥ（ｖｉｔ．Ｅ）など）又は抗酸化酵素（グルタチオンペルオキシダーゼ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、カタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）など）によって精巧にその恒常性を維持するようになっている。しかし、内因性老化による抗酸化システムの老衰及び持続的な有害な刺激による活性酸素の蓄積は、このような均衡を破って健康を害することになり、老化を促進させ、皮膚疾患、皮膚癌、動脈硬化及び血栓のような各種疾病を誘発することもある（Ｌａｕｒｅ  Ｒｉｔｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１，７０５−７２０，２００２；Ｃｕｔｌｅｒ  ＲＧ，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１０５５，９３−１３５，２００５）。
【０００５】
したがって、活性酸素種の形成を抑制するか、または形成された活性酸素種を除去する抗酸化物質への関心が益々増加している。抗酸化物質は、体内に自然に存在するものと、外部から投与されるものとに分類することができ、体内に自然に存在する抗酸化物質としては、スーパーオキシドジスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ、ＳＯＤ）、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）、ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）及びカタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）などの酵素があり、外部から投与されるものとしては、ケンフェロール（ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）、カテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ）及びゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）などのフィトケミカル（ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）；ビタミンＥ、ビタミンＣ及びベータカロチン；及びセレニウムなどのミネラルがある。
【０００６】
太陽光から照射される紫外線Ａ（ＵＶＡ）及び紫外線Ｂ（ＵＶＢ）、公害物質、ストレス、喫煙、飲酒、脂肪性食物などにより発生する遊離基（ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ）と活性酸素（ｏｘｙｇｅｎ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ）などによって細胞が攻撃を受けるが、このような物質から適切な保護が行われない場合、細胞は老化又は死滅することになる。皮膚の場合、このような物質によりコラーゲンやエラスチンなどの物質は、生産が減少したり、変性して、皮膚が弾力を失い、しわが生じる。これを防止するために、ビタミンＡ、Ｃ、Ｅなどの抗酸化物質を含む製剤を皮膚に塗布し、皮膚内に吸収させることによってこのような有害活性物質による酸化を防ぐことが、皮膚の老化を防止するのに重要であることが知られている。しかし、合成ビタミンＣは、空気中で容易に酸化されてしまい、その抗酸化作用がなくなるという問題があるため、保存期間の長い様々な剤形を製造するのに問題がある。
【０００７】
また、還元力が非常に高いビタミンＣは、酸化電位の高い物質に非常に敏感に反応して、ビタミンＣが急速に酸化される。ビタミンＣは、酸化されることによってその効能が損なわれることは、公知の事実である。水は、酸化電位が高いため、ビタミンＣが非常に敏感に反応して急速に酸化される。
【０００８】
したがって、ビタミンＣを含む抗酸化物質の酸化を抑制する新しい方法あるいは物質に対する必要性は、長い間存在してきている。
【０００９】
また、アプタマーを用いて抗酸化物質の酸化を防止することは、既存の方法と比較して、安全でかつ革新的な新しい概念のアプローチであって、これを各種産業に適用して効果を最大化できるように製造可能である。特に、既存のケミカル（Ｃｈｅｍｉｃａｌ）ベースの化粧品、栄養補助剤、食品市場を、ＤＮＡ（ＢＩＯ）ベースの市場に大幅に変化させる起爆剤になるであろう。また、各種産業分野で多様に利用することができる。今後、ＤＮＡ市場の爆発的な増加と革新的なソリューションを提供することが期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】大韓民国公開特許第１０−２０１８−００５４５０８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記の必要性によって案出されたものであって、本発明の目的は、ビタミンＣに特異的に結合して酸化を防止する新規なアプタマーを提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記新規なアプタマーの用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の目的を達成するために、本発明は、Ｌ−アスコルビン酸に結合して酸化を抑制する一本鎖ＤＮＡアプタマーであって、前記一本鎖ＤＮＡアプタマーは、１つ以上のステムループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造を有し、前記ステムループ構造におけるステム構造の末端にＣＧ結合を有し、ループ構造の両側の開始部分がＧ又はＣとして同一の塩基が互いに対向していることを特徴とする一本鎖ＤＮＡアプタマーを提供する。
【００１４】
本発明のアプタマーは、前記ステムループ構造におけるステム構造の末端にＣＧ結合を有し、ループ構造の開始部分における一方向のＧ又はＣ塩基がＴに置換された二次構造を有する一本鎖ＤＮＡアプタマーを提供する。
【００１５】
本発明の実施例において、前記アプタマーは、配列番号１〜２９に記載された塩基配列のうちの１つからなることが好ましく、前記アプタマーは、配列番号１、配列番号４、配列番号５、及び配列番号１７〜２９に記載された塩基配列のうちの１つからなることがより好ましいが、それに限定されない。
【００１６】
また、本発明は、前記本発明のアプタマーを有効成分として含む抗酸化用組成物を提供する。
【００１７】
また、本発明は、ビタミンＣに前記本発明のアプタマーを処理して前記ビタミンＣの酸化を抑制する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明から分かるように、本発明のアプタマーは、ビタミンＣの酸化防止効果を有し、ビタミンＣ（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）に選択的に結合するアプタマーを用いてビタミンＣの還元状態を維持することで、その抗酸化機能を長期間維持するようにして、様々な剤形の機能性化粧品及び経口用栄養補助剤（ｄｉｅｔａｒｙ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）などに用いることができ、ビタミンＣに選択的に結合するアプタマーを用いることで、少量のビタミンＣでも持続的でかつ最大化された抗酸化効果を期待することができ、ビタミンＣ（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）に選択的に結合するアプタマーを用いてビタミンＣなどの生理活性成分の還元状態を維持することで、その抗酸化機能を長期間維持するようにして、様々な健康飲料、抗酸化飲料及び抗酸化食品などに用いることができる。
【００１９】
また、アプタマーを用いて抗酸化物質の酸化を防止することは、既存の方法と比較して、安全でかつ革新的な新しい概念のアプローチであって、これを各種産業に適用して効果を得ることができるように製造可能である。特に、既存のケミカル（Ｃｈｅｍｉｃａｌ）ベースの化粧品、栄養補助剤、食品市場を、ＤＮＡ（ＢＩＯ）ベースの市場に大幅に変化させる起爆剤になるであろう。今後、ＤＮＡ市場の爆発的な増加及び革新的なソリューションを提供することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】一本鎖ＤＮＡライブラリーの分離に用いた１２％ネイティブゲル（ｎａｔｉｖｅ  ｇｅｌ）電気泳動の写真である。青色の四角形で表示されたバンドを切断してクラッシュ・アンド・ソーク法で精製した。
【図２】一本鎖ＤＮＡのアスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）の酸化防止効果の確認のためのＯＰＤＡ測定グラフである。配列番号１、配列番号４、及び配列番号５の一本鎖ＤＮＡで酸化防止効果が観察された。
【図３】選別された一本鎖ＤＮＡのＭＳＴ（Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）測定結果のグラフである。Ｋｄ（結合解離定数）の測定結果、配列番号１、配列番号４、配列番号５の一本鎖ＤＮＡからナノモル（Ｎａｎｏ  ｍｏｌａｒｉｔｙ、ｎＭ）レベルで結合力が確認された。
【図４】Ｍ−ｆｏｌｄプログラムを用いたアプタマーの二次折り畳み構造である。配列番号１、配列番号４、配列番号５のステムループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造であって、ステム（ｓｔｅｍ）構造の末端にＣＧ結合を有し、ループ（ｌｏｏｐ）構造の両側の開始部分がＧ又はＣとして互いに対向している、共通の特徴を有する（赤色の四角形）。
【図５】ステムループ構造を含む任意の配列１３個のＯＰＤＡ測定グラフである。特定のステムループ構造を含む１３個の配列でアスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）の酸化防止効果が観察された。
【図６】酸化防止効果が確認された配列番号１、４、１７、１８のＯＰＤＡ測定比較グラフである。任意の配列で合成した配列番号１７のアプタマー配列が、酸化防止効果が最も大きいものと観察された。
【図７】酸化防止効果が確認された配列番号１７及び１８のＭＳＴ測定結果のグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を非限定的な実施例により詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明を例示するための意図で記載されたものであって、本発明の範囲は、下記の実施例によって制限されるものと解釈されてはならない。
【００２２】
実施例１：一本鎖ＤＮＡライブラリーの作製
ＳＥＬＥＸ法を用いて、Ｌ−アスコルビン酸（Ｌ−Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）に特異的に結合する一本鎖ＤＮＡアプタマーを選別するために、一本鎖ＤＮＡライブラリーを作製した。一本鎖ＤＮＡライブラリー配列は、５’と３’にそれぞれ１５個の特定のプライマー配列を含み、３０個のランダム配列を有するように設計して、計６０個の塩基で構成した。
【００２３】
設計された前記一本鎖ＤＮＡライブラリーは、以下の通りである。
【００２４】
５’−ＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＣ−Ｎ３０−ＧＣＧＣＧＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣ−３’（一本鎖ＤＮＡライブラリー配列；配列番号３０）
【００２５】
合成された前記配列番号３０の塩基配列の単一のオリゴヌクレオチド断片を鋳型として用いて、非対称ＰＣＲ過程で一本鎖ＤＮＡライブラリーを増幅した。非対称ＰＣＲを実施するためにプライマー１及び２を作製した。
【００２６】
前記プライマー１及び２の塩基配列は、以下の通りである。
【００２７】
５’−ＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＣ−３’（プライマー１；配列番号３１）
５’−ＧＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＧＣＧＣ−３’（プライマー２；配列番号３２）
【００２８】
一本鎖ＤＮＡを大量に増幅するために、１０：１の比率でプライマー１とプライマー２を混合して非対称ＰＣＲを実施した。非対称ＰＣＲ反応は、９４℃で５分間反応させた後、９４℃で４０秒、５５℃で４０秒、７２℃で３０秒の条件で４５サイクルを繰り返して実行した後、７２℃で１０分間反応させて増幅した。増幅されたＰＣＲ産物は、２．５％のアガロースゲルに電気泳動し、目視でバンドを先に確認した後、クラッシュ・アンド・ソーク（Ｃｒｕｓｈ  ａｎｄ  Ｓｏａｋ）法で分離した。ＰＣＲ産物は、１２％のネイティブゲル（ｎａｔｉｖｅ  ｇｅｌ）に電気泳動して一本鎖ＤＮＡバンドを切断した後、クラッシュ・アンド・ソークバッファー（Ｃｒｕｓｈ  ａｎｄ  Ｓｏａｋ  ｂｕｆｆｅｒ）（５００ｍＭのＮＨ４ＯＡｃ、０．１％のＳＤＳ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）に溶解させ、エタノール沈殿法によりＤＮＡを精製した（図１）。精製された一本鎖ＤＮＡライブラリーは、９５℃で５分間加熱した後、常温で１０分間折り畳み構造を形成させた後、ＳＥＬＥＸに使用した。
【００２９】
実施例２：Ｌ−アスコルビン酸に特異的に結合するアプタマーの選別のためのＳＥＬＥＸ
Ｌ−アスコルビン酸に特異的に結合して酸化を抑制する一本鎖ＤＮＡアプタマーを選別するために、グラフェンを用いたＳＥＬＥＸ（ｒＧＯ−ＳＥＬＥＸ）技術を活用した。（Ｌｅｅ，Ａ．Ｙ．，Ｈａ，Ｎ．Ｒ．，Ｊｕｎｇ，Ｉ．Ｐ．，Ｋｉｍ，Ｓ．Ｈ．，Ｋｉｍ，Ａ．Ｒ．，＆Ｙｏｏｎ，Ｍ．Ｙ．（２０１７）。Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｓＤＮＡ  ａｐｔａｍｅｒ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｂｅｎｚｙｌｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５３１，１−７．）
【００３０】
以下、グラフェンを活用したＳＥＬＥＸ法は、以下の通りである。
【００３１】
まず、グラフェンと１．５ｍｌのチューブに非特異的に結合する一本鎖ＤＮＡを除去するために２００ｐｍｏｌの一本鎖ＤＮＡライブラリーと４ｍｇ／ｍＬのグラフェンを結合バッファー（Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０）に混合して、３０分間反応させた後、２回の遠心分離で上層液を除去した。残存する一本鎖ＤＮＡとグラフェンの混合物をアスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）で処理して３０分間反応させ、アスコルビン酸に結合した一本鎖ＤＮＡを非対称ＰＣＲ過程により増幅した。増幅された一本鎖ＤＮＡは、１２％のネイティブゲルでクラッシュ・アンド・ソーク（Ｃｒｕｓｈ  ａｎｄ  Ｓｏａｋ）法により分離して、１番目のＳＥＬＥＸ産物として得た。前記の過程を５回繰り返し、５回目のＳＥＬＥＸ産物を鋳型として使用して対称ＰＣＲを実施した。増幅された二本鎖ＤＮＡ断片は、ＮＧＳ（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）技術で配列を分析し、高い頻度数で分析される配列番号１〜１６の１６個の配列を確認した。
【００３２】
実施例３：アスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）の酸化抑制効果の分析
アプタマーによるＬ−アスコルビン酸の酸化防止効果を分析するために、ＯＰＤＡ（Ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）分析法を実施した。Ｌ−アスコルビン酸の酸化された構造であるＤＨＡがＯＰＤＡに結合して蛍光発色が現れる原理を用いて、アプタマーによるアスコルビン酸の酸化防止効果を分析した。（Ｖｉｓｌｉｓｅｌ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｆ．Ｑ．，＆Ｂｕｅｔｔｎｅｒ，Ｇ．Ｒ．（２００７）。Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｓｃｏｒｂａｔｅ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６５（１），３１−３９．）
【００３３】
ＯＰＤＡ分析過程は、以下の通りである。
【００３４】
ＳＥＬＥＸ産物でＮＧＳ技術により分析された配列の頻度数及び折り畳み構造に基づいて１６個の配列を合成した。合成された一本鎖ＤＮＡは、９５℃で５分間加熱し、常温で１０分間反応させて折り畳み構造を形成させた後、１ｕＭの一本鎖ＤＮＡと５ｍＭのアスコルビン酸を混合して３０分間反応させた。その後、過酸化水素水（Ｈ２Ｏ２）を添加して酸化を促進させた後、ＯＰＤＡ蛍光染料を添加して、蛍光の強度を測定した（非特許文献３）。対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、合成された一本鎖ＤＮＡを添加せずに、ビタミンＣのみを添加した試料であって、１６個の配列（配列番号１〜１６）の一本鎖ＤＮＡをそれぞれ処理した試料よりも早く酸化した。１６個の配列のうち、配列番号１、配列番号４、及び配列番号５の３つの一本鎖ＤＮＡでＬ−アスコルビン酸の酸化が防止されることを観察した（図２）。
【００３５】
実施例４：Ｌ−アスコルビン酸とアプタマー配列の結合力の測定
Ｌ−アスコルビン酸に結合するアプタマーの結合力を確認するために、ＭＳＴ（Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法を用いて結合解離定数（Ｋｄ）を測定した。一本鎖ＤＮＡの５’にＣｙ５の蛍光を付着させ、熱勾配条件で結合力によって現れる信号の差を分析して結合の強度を測定した。（Ｅｎｔｚｉａｎ，Ｃ．，＆Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｔ．（２０１６）。Ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ａｐｔａｍｅｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ＭｉｃｒｏＳｃａｌｅ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＭＳＴ）。Ｍｅｔｈｏｄｓ，９７，２７−３４．）
【００３６】
一本鎖ＤＮＡアプタマーの濃度は５ｎＭで固定し、アスコルビン酸の濃度を５０ｕＭから１．５３ｎＭの範囲で濃度勾配をなすように１６個のチューブに挿入した後、１５分間反応させた。反応した一本鎖ＤＮＡとＬ−アスコルビン酸をスキャニング毛細管チューブ（４ｕｌ／チューブ）に吸入させた後、Ｍｎｏｌｉｔｈ  ＮＴ．１１機器を用いて測定した。前記ＯＰＤＡ法で確認された配列番号１、配列番号４、配列番号５のアプタマーは、それぞれ２８０ｎＭ、１４９ｎＭ、６８５ｎＭのＫｄ値で測定され、ナノモル（Ｎａｎｏ  ｍｏｌａｒｉｔｙ、ｎＭ）レベルの結合力を有することが確認された（図３）。
【００３７】
実施例５：ビタミンＣに特異的に結合する一本鎖ＤＮＡアプタマーの構造類似性の分析
結合力が確認された配列番号１、配列番号４、配列番号５の一本鎖ＤＮＡアプタマーの二次構造（Ｓｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を確認するために、Ｍ−ｆｏｌｄプログラムを用いた。配列番号１の場合、２つの形態で二次構造を形成でき、配列番号４及び配列番号５は、それぞれ３つ、２つの形態でステムループ（Ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造を形成できることを確認した。
【００３８】
この３つ（配列番号１、配列番号４、配列番号５）の一本鎖ＤＮＡアプタマーは、ステムループ構造におけるステム構造の末端にＣＧ結合を有し、ループ構造の両側の開始部分がＧ又はＣとして互いに対向している、共通の特徴がある（図４、赤色の四角形）。確認された３つのアプタマーの構造は、−３．６５、−１．６４、−０．８６（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）のギブス自由エネルギー値を有する安定した構造をなしている。
【００３９】
実施例６：１３種の変形配列の酸化防止効果の測定
アプタマーの折り畳み構造の分析を通じて確認された特定の構造配列に基づいて、３２個の塩基配列を有する任意の配列を設計して一本鎖ＤＮＡを合成した。ステムループ構造で１０個の塩基配列を単位体として構成して、５’と３’の両端に１個〜２個ずつ含むように任意の一本鎖ＤＮＡを作製した。計１３種作製した配列番号１７〜２９の一本鎖ＤＮＡの酸化防止効果を、ＯＰＤＡ測定法を通じて確認した（図５）。
【００４０】
１３個の任意の配列は、いずれも、Ｌ−アスコルビン酸に対して酸化防止効果があり、５’と３’の両端にステムループ構造を有する配列番号１７の一本鎖ＤＮＡアプタマーが、計２９種の配列（任意に合成して確認した１３個の配列及びＳＥＬＥＸ過程で選別した１６個の配列）の中で酸化防止効果が最も大きいものと示された（図６）。
【００４１】
実施例７：変形された２つの配列のＫｄの測定及び比較
任意の配列（配列番号１７〜２９）のうち酸化防止効果が大きいと確認された２つの配列に対して、ＭＳＴ（Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）分析でアプタマーの結合力を確認した。ＯＰＤＡ法で確認された配列番号１７と１８の配列は、それぞれ７２９ｎＭと２８９ｎＭのＫｄ値で測定値を得た（図７）。ＯＰＤＡ測定法で確認されたものとは異なり、配列番号１７のＫｄ値が高く測定されるのは、配列番号１７のアプタマーが結合力自体は低いが、−ＯＨ作用基にはさらに特異的に結合するものと考えられる。
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表１は、本発明のアプタマー配列を示した表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021526018.tif 000012
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