(57)【要約】開示されるものは、運動中の粒子のカメラレスで高スループットの３次元撮像のための方法、デバイス、システム、および用途である。いくつかの側面では、システムは、粒子が進行経路に沿って移動することを可能にするための、粒子運動デバイスと、粒子が、移動している間、複数の時点において粒子の複数の区分にわたって走査する、粒子の進行経路の領域内に光の非対称照明面積を生成するための、光学照明システムと、粒子運動デバイスと光学的にインターフェースをとられ、進行経路内での運動の間に、粒子の体積に対応する粒子の異なる部分と関連付けられる、光学信号データを取得する、光学検出システムと、光学検出システムによって取得される光学信号データを処理し、粒子の３Ｄ特徴を示す情報を含むデータを生成するための、データ処理ユニットとを含む。
2021514062.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
移動する粒子の３次元（３Ｄ）撮像のためのシステムであって、
粒子が進行経路に沿って第１の方向に移動することを可能にするための基板を含む粒子運動デバイスと、
前記粒子が、移動している間、複数の時点において前記粒子の複数の区分にわたって走査する、粒子の前記進行経路の領域内に光の非対称照明面積を生成する光学照明システムであって、前記光の非対称照明面積は、照明の他の寸法より薄い照明の１つの寸法を備え、照明面のような形状を形成し、前記光学照明システムは、光ビームを異なる角度に方向転換することによって、前記光の非対称照明面積を粒子運動の前記進行経路に指向させるように前記光ビームを修正するための光方向転換デバイスに光学的に結合される光ビームを生成するための光源を含む、光学照明システムと、
光学検出システムであって、前記光学検出システムは、前記粒子運動デバイスと光学的にインターフェースをとられ、前記進行経路内での運動の間に、粒子の体積に対応する前記粒子の異なる部分と関連付けられる光学信号データを取得するように動作可能であり、前記光学検出システムは、１つ以上の光検出器と、前記粒子運動デバイスと前記１つ以上の光検出器との間に位置付けられる空間フィルタとを含み、前記空間フィルタは、前記粒子の走査される区分にわたる前記光の非対称照明面積の一部が、前記空間フィルタを通して通過し、前記１つ以上の光検出器によって検出されることを選択的に可能にするための複数の開口を含む、光学検出システムと、
前記光学検出システムと通信するデータ処理ユニットであって、前記データ処理ユニットは、プロセッサを含み、前記プロセッサは、光学検出システムによって取得される前記光学信号データを処理し、前記粒子の３Ｄ特徴を示す情報を含むデータを生成するように構成される、データ処理ユニットと
を備える、システム。
【請求項２】
前記光の非対称照明面積は、前記光の非対称照明面積の第１の走査が、前記第１の方向と、第２の方向とを備える第１の平面を形成するように、前記進行経路の領域において、前記第１の方向に対して垂直な第２の方向に指向され、前記光学検出システムの画像面は、前記光の非対称照明面積の第２の走査が、前記第１の平面と平行な第２の平面を形成し、第３の方向に沿って前記第１の平面からある距離だけ変動されるように、前記第１の方向および前記第２の方向に対して垂直な第３の方向に沿って配列される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記光学照明システムは、前記粒子が、前記第１の方向に移動している間、第１の時点において、前記第１の平面内の前記粒子の第１の区分を走査し、第２の時点において、前記第２の平面内の前記粒子の第２の区分を走査し、それによって、前記粒子に空間的にマッピングされる時間信号を生成するように構成される、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記空間フィルタの開口は、各開口が、前記光の非対称照明面積をフィルタリングし、前記粒子のボクセルに対応するように構成されるように、前記第２の方向に沿って位置付けられる、請求項２に記載のシステム。
【請求項５】
前記データ処理ユニットは、ボクセル毎に前記粒子の３Ｄ画像を生成するように動作可能である、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記粒子の３Ｄ画像データは、３つの軸における少なくとも１μｍの空間分解能と、前記３つの軸における約２０μｍの視野とを含む、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
前記粒子運動デバイスは、粒子フローセルを含み、前記粒子フローセルは、前記基板上に形成されるチャネルを含み、前記粒子を含有する流体が前記進行経路として前記チャネルを通して流動することを可能にする、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記チャネル内の前記粒子の流率は、少なくとも０．２ｍ  ｓ−１であり、前記システムは、１秒あたり５００個の粒子のスループットで前記粒子のデータを生成するように動作可能である、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記粒子は、前記基板に固定され、前記粒子運動デバイスは、前記粒子が、前記進行経路に沿って移動され、その上で前記光の非対称照明面積が走査される前記領域の中にもたらされるように、前記基板を前記光学照明システムおよび前記光学検出システムに対して移動させるための位置付けシステムを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記空間フィルタの複数の開口は、あるパターンで配列され、前記あるパターンの各開口は、前記第１の方向に沿って離間され、前記あるパターンの別の開口に対して前記第１の方向に垂直な第２の方向に沿ってその位置が変動する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記光方向転換デバイスは、音響光学偏向器（ＡＯＤ）を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記ＡＯＤは、前記データ処理ユニットによって、少なくとも１００ｋＨｚの速度で周期的角度変化を発生させるようにプログラム可能である、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記光方向転換デバイスは、走査ミラーの多重化アレイおよび／または走査格子の多重化アレイを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記光方向転換デバイスは、円筒形レンズと、レンズと、プリズムと、空間フィルタとから成る群から選択された１つ以上の受動光学構成要素と光学的に結合され、前記進行経路上に前記方向転換された光を成形する、請求項１１−１３のいずれかに記載のシステム。
【請求項１５】
前記１つ以上の光検出器は、光電子増倍管を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１６】
前記光学検出システムはさらに、前記光方向転換デバイスと光学的に結合される対物レンズを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１７】
前記光学検出システムは、前記空間フィルタに光学的に結合される対物レンズを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１８】
前記光学検出システムはさらに、前記光を前記空間フィルタから外に、複数の光検出器に向かって指向するための１つ以上の導光体要素を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１９】
前記光学検出システムはさらに、細胞によって放射または散乱される光の２つ以上の帯域またはタイプに基づいて、２つ以上の対応する信号を発生させるための２つ以上の光検出器を含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記粒子は、生細胞を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２１】
移動する粒子の３次元（３Ｄ）撮像のための方法であって、
粒子を第１の方向に沿って移動させることと、
前記粒子が、移動している間に、個々の光の非対称照明面積を対応する領域に指向することによって、前記粒子の複数の区分を区分毎に走査することと、
運動中の前記粒子の走査される区分にわたって前記光の非対称照明面積の一部を空間的にフィルタリングし、空間フィルタを通した前記粒子の体積に対応するある光学信号が検出されることを可能にすることと、
空間的にフィルタリングされた光学信号を検出し、検出の時点にマッピングされた３次元の個々のボクセルを取得することと
を含む、方法。
【請求項２２】
光源から生成される光ビームを前記個々の光の非対称照明面積に修正することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記粒子の複数の区分を走査することは、前記光ビームを異なる角度に方向転換することと、前記方向転換された光ビームを前記光の非対称照明面積に成形することとを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
第１の個々の光の非対称照明面積は、前記第１の個々の光の非対称照明面積の第１の走査が、前記第１の方向と、前記第２の方向とを備える第１の平面を形成するように、前記粒子の進行経路において、前記第１の方向に対して垂直な第２の方向に指向され、前記検出することのための画像面は、第２の個々の光の非対称照明面積の第２の走査が、前記第１の平面と平行な第２の平面を形成し、前記第３の方向に沿って前記第１の平面からある距離だけ変動されるように、前記第１の方向および前記第２の方向に対して垂直な第３の方向に沿って配列される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記光学信号を処理し、前記粒子の３Ｄ特徴を示す情報を含むデータを生成することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
ボクセル毎の構築に基づいて、前記生成されたデータから前記粒子の３Ｄ画像を生成することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記粒子のデータは、３つの軸における少なくとも１μｍの空間分解能と、前記３つの軸における２０μｍの視野とを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記粒子のデータは、１秒あたり５００個の粒子のスループットで生成される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記粒子は、粒子フローセルによって移動され、前記粒子フローセルは、基板上に形成されるチャネルを含み、前記粒子を含有する流体を前記第１の方向に沿って前記チャネルを通して流動させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記粒子は、前記基板に固定され、前記基板は、前記粒子が、前記第１の方向に沿って前記基板上を移動するように、位置付けシステムによって移動される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記粒子は、生細胞を含む、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本特許文書は、２０１８年２月１６日に出願され、「ＳＹＳＴＥＭＳ，  ＤＥＶＩＣＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＴＨＲＥＥ−ＤＩＭＥＮＳＩＯＮＡＬ  ＩＭＡＧＩＮＧ  ＦＬＯＷ  ＣＹＴＯＭＥＴＲＹ」と題された、米国仮特許出願第６２／７１０，５７６号の優先権および利益を主張する。前述の特許出願の内容全体は、参照することによって本特許文書の開示の一部として組み込まれる。
【０００２】
（連邦政府による資金提供を受けた研究開発）
本発明は、認可番号ＤＡ０４５４６０の下で国立衛生研究所（ＮＩＨ）による政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明の下である権利を有する。
【０００３】
本特許文書は、フローサイトメトリのための技法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００４】
フローサイトメトリは、生細胞等の粒子を、それらが流体を通して流動するにつれて検出および分析するための技法である。例えば、フローサイトメータデバイスが、細胞および／または生化学的分子または分子塊の物理的および生化学的性質を、それらが逐次的な様式で照会されるにつれて、それらの光学、電気、音響、および／または磁気応答に基づいて特性評価するために使用されることができる。典型的には、フローサイトメトリは、粒子を照会するために外部光源を使用し、そこから、前方散乱、側面散乱、および蛍光等の入力光と粒子との間の１つ以上の相互作用によって引き起こされる、光学信号が、検出される。フローサイトメトリによって測定される性質は、粒子の相対サイズ、粒状度、および／または蛍光強度を含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
開示されるものは、３次元撮像フローサイトメトリ（３Ｄ−ＩＦＣ）に関する、方法、デバイス、システム、および用途である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
いくつかの側面では、移動する粒子の３次元（３Ｄ）撮像のためのシステムは、粒子が進行経路に沿って第１の方向に移動することを可能にするための基板を含む、粒子運動デバイスと、粒子が、移動している間、複数の時点において粒子の複数の区分にわたって走査する、粒子の進行経路の領域内に光の非対称照明面積を生成するための、光学照明システムであって、光の非対称照明面積は、照明の他の寸法より薄い照明の１つの寸法を含み、照明面のような形状を形成し、光ビームを異なる角度に方向転換することによって、光の非対称照明面積を粒子運動の進行経路に指向させるように光ビームを修正するための、光方向転換デバイスに光学的に結合される、光ビームを生成するための光源を含む、光学照明システムと、粒子運動デバイスと光学的にインターフェースをとられ、進行経路内での運動の間に、粒子の体積に対応する粒子の異なる部分と関連付けられる、光学信号データを取得するように動作可能である、光学検出システムであって、１つ以上の光検出器と、粒子運動デバイスと１つ以上の光検出器との間に位置付けられる、空間フィルタとを含み、空間フィルタは、粒子の走査される区分にわたる光の非対称照明面積の一部が、空間フィルタを通して通過し、１つ以上の光検出器によって検出されることを選択的に可能にするための、複数の開口を含む、光学検出システムと、光学検出システムと通信する、データ処理ユニットであって、光学検出システムによって取得される光学信号データを処理し、粒子の３Ｄ特徴を示す情報を含むデータを生成するように構成される、プロセッサを含む、データ処理ユニットとを含む。
【０００７】
いくつかの側面では、移動する粒子の３次元（３Ｄ）撮像のための方法は、粒子を第１の方向に沿って移動させるステップと、粒子が、移動している間に、個々の光の非対称照明面積を対応する領域に指向することによって、粒子の複数の区分を区分毎に走査するステップと、運動中の粒子の走査される区分にわたって光の非対称照明面積の一部を空間的にフィルタリングし、空間フィルタを通した粒子の体積に対応するある光学信号が検出されることを可能にするステップと、空間的にフィルタリングされた光学信号を検出し、検出の時点にマッピングされた３次元の個々のボクセルを取得するステップとを含む。
【０００８】
本特許文書および添付の付属において説明される主題は、以下の特徴のうちの１つ以上のものを提供する、具体的な方法で実装され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａは、本技術による、３次元撮像フローサイトメトリ（３Ｄ−ＩＦＣ）システムの例示的実施形態のブロック図を示す。
【００１０】
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａに示される３Ｄ−ＩＦＣシステムのデータ処理システムの例示的実施形態のブロック図を示す。
【００１１】
【図１Ｃ】図１Ｃは、本技術による、３Ｄ−ＩＦＣシステムの例示的実施形態の略図を示す。
【００１２】
【図１Ｄ】図１Ｄは、図１Ｃの略図からの、物体面において流動する細胞、および画像面に位置付けられた空間フィルタを描写する図を示す。
【００１３】
【図２】図２は、時間領域信号と空間光強度を含む空間情報との間の関係の原理を図示する略図を示す。
【００１４】
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、いくつかの例示的実施形態による、例示的３Ｄ−ＩＦＣシステムからの時間領域信号のデータプロットを示す。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、いくつかの例示的実施形態による、例示的３Ｄ−ＩＦＣシステムからの時間領域信号のデータプロットを示す。
【００１５】
【図４】図４Ａ−４Ｉは、いくつかの例示的実施形態による、例示的３Ｄ−ＩＦＣシステムによって捕捉された２Ｄおよび３Ｄ画像のデータプロットを図示する。
【００１６】
【図５Ａ】図５Ａは、本技術による、３Ｄ−ＩＦＣシステムの例示的実施形態の略図を示す。
【００１７】
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａの略図からの、物体面に沿って流動する細胞、および画像面に位置付けられた空間フィルタを描写する図を示す。
【００１８】
【図５Ｃ】図５Ｃは、例示的３Ｄ−ＩＦＣシステムのデータ処理システムによって生成された、３Ｄ再構築空間の実施例を示す。
【００１９】
【図５Ｄ】図５Ｄ−５Ｆは、いくつかの例示的実施形態による、時間から３Ｄ空間へのマッピングを実証する、例示的３Ｄ−ＩＦＣシステムの例示的出力を示す。
【図５Ｅ】図５Ｄ−５Ｆは、いくつかの例示的実施形態による、時間から３Ｄ空間へのマッピングを実証する、例示的３Ｄ−ＩＦＣシステムの例示的出力を示す。
【図５Ｆ】図５Ｄ−５Ｆは、いくつかの例示的実施形態による、時間から３Ｄ空間へのマッピングを実証する、例示的３Ｄ−ＩＦＣシステムの例示的出力を示す。
【００２０】
【図６Ａ】図６Ａ−６Ｃは、いくつかの例示的実施形態による、１μｍ蛍光ビーズで結合された、ＣＦＳＥで染色されたＨＥＫ−２９３細胞を使用する、例示的３Ｄ−ＩＦＣシステムからの画像およびデータプロットを示す。
【図６Ｂ】図６Ａ−６Ｃは、いくつかの例示的実施形態による、１μｍ蛍光ビーズで結合された、ＣＦＳＥで染色されたＨＥＫ−２９３細胞を使用する、例示的３Ｄ−ＩＦＣシステムからの画像およびデータプロットを示す。
【図６Ｃ】図６Ａ−６Ｃは、いくつかの例示的実施形態による、１μｍ蛍光ビーズで結合された、ＣＦＳＥで染色されたＨＥＫ−２９３細胞を使用する、例示的３Ｄ−ＩＦＣシステムからの画像およびデータプロットを示す。
【００２１】
【図７Ａ】図７Ａおよび７Ｂは、いくつかの例示的実施形態による、例示的３Ｄ−ＩＦＣシステムによって撮像された、蛍光γＨ２ＡＸ病巣の画像およびデータプロットを示す。
【図７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、いくつかの例示的実施形態による、例示的３Ｄ−ＩＦＣシステムによって撮像された、蛍光γＨ２ＡＸ病巣の画像およびデータプロットを示す。
【００２２】
【図８Ａ】図８Ａ−８Ｄは、いくつかの例示的実施形態による、例示的３Ｄ−ＩＦＣシステムによって決定された白血球細胞の形態を描写する、画像およびデータプロットを図示する。
【図８Ｂ】図８Ａ−８Ｄは、いくつかの例示的実施形態による、例示的３Ｄ−ＩＦＣシステムによって決定された白血球細胞の形態を描写する、画像およびデータプロットを図示する。
【図８Ｃ】図８Ａ−８Ｄは、いくつかの例示的実施形態による、例示的３Ｄ−ＩＦＣシステムによって決定された白血球細胞の形態を描写する、画像およびデータプロットを図示する。
【図８Ｄ】図８Ａ−８Ｄは、いくつかの例示的実施形態による、例示的３Ｄ−ＩＦＣシステムによって決定された白血球細胞の形態を描写する、画像およびデータプロットを図示する。
【００２３】
【図９】図９は、いくつかの例示的実施形態による、例示的３Ｄ−ＩＦＣシステム内で使用される、微小流体システムの実施例を示す。
【００２４】
【図１０】図１０は、いくつかの例示的実施形態による、空間フィルタ設計のための実施例の略図を示す。
【００２５】
【図１１】図１１は、本技術による、３Ｄ−ＩＦＣシステムの例示的実施形態の略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
生物学の中心的課題は、個体群における不均質な個々の表現型を、それらが観察される個体群の挙動に順応する程度、または疾患に至らせる例外または健康に対する脅威となる能力として突出する程度を理解するために、その遺伝子型に相関させることである。光学顕微鏡は、生物学的試料の形態および分子組成を研究するための基礎的方法であるが、フローサイトメトリは、多数の生物医学的用途における定量的な高スループットの単一細胞特性評価のための至適基準である。従来の撮像フローサイトメトリ（ＩＦＣ）は、光学撮像のいくつかの側面をフローサイトメトリと融合する技法である。例えば、ＩＦＣは、実験条件の変化に起因する摂動を伴わずに、細胞の大きな個体群における個々の細胞からアンサンブル平均測定値およびハイコンテントの空間メトリックを同時に生成することができる。さらに、既存のＩＦＣシステムの重要な限界は、光学検出方法および算出アルゴリズムが使用されているかどうかにかかわらず、２Ｄ細胞画像のみが、取得され得ることである。３Ｄ断層撮影の不在は、物体の閉塞、焦点深度によるぶれ、ｚ軸空間分解能の喪失、および２Ｄ画像の中への３Ｄ細胞の投影に起因するアーチファクトをもたらす。例えば、２Ｄ顕微鏡撮像の場合、蛍光プローブが、細胞の中心で観察される場合、その場所（例えば、膜、細胞基質、細胞核）は、不明瞭である。撮像面に対する細胞の配向に依存する２Ｄ撮像と比較して、内在化測定、プローブ共限局化、およびスポット計数等の用途の範囲に関して、３Ｄ画像は、より完全かつ正確な細胞および細胞小器官の形態の表現型化、および核酸およびタンパク質の局在化を提供し、生物学的洞察を支援する。したがって、流動している単一細胞に関する迅速かつ継続的な３Ｄ画像の入手の必要性が存在する。
【００２７】
蛍光顕微鏡を使用する継続的なミリ秒未満の時間分解能の要求は、殆ど充足されていないままである。流動している細胞を撮像することは、細胞の大きい個体群に関する高スループットの形態、転座、および細胞シグナリング分析を迅速に実施し得る。単点フローサイトメトリと比較して、３次元撮像フローサイトメトリ（３Ｄ−ＩＦＣ）は、高スループットの希少細胞検出および不均質現象の研究のために有用であり得る、蛍光および／または散乱光の３Ｄ空間分布に関するハイコンテント情報を提供する。
【００２８】
開示されるものは、運動中の粒子のカメラレスで高スループットの３次元撮像のための方法、デバイス、システム、および用途である。いくつかの側面では、例えば、３次元撮像フローサイトメトリ（３Ｄ−ＩＦＣ）システムが、光シート蛍光顕微鏡の構成に配列され、これは、信号が、例えば、空間フィルタを通して垂直方向に検出される間、単一平面内の試料を一度に照明する。例えば、３Ｄ−ＩＦＣシステムは、ｚ方向に高速走査を提供する、音響光学偏向器を含むことができる。例えば、３Ｄ−ＩＦＣシステムは、各信号チャネル内の空間フィルタを通過した蛍光光学信号を検出するための単一要素光検出器を含むことができ、３Ｄ画像が、時間領域検出器の出力から再構築される。３Ｄ−ＩＦＣシステムは、検出器が、細胞内の個々の点を一度に検出することが可能であるように、走査光シート、細胞の流動運動、および空間フィルタを統合し、これは、１対１の基準における空間から時間へのマッピング、いわゆる、空間から時間への変換を可能にする。
【００２９】
移動する粒子の３次元撮像のためのシステム、方法、およびデバイスの開示される実施形態のいくつかのものが、主に、撮像フローサイトメトリに関して下層概念の理解を促進するように、本明細書で説明されるが、開示される実施形態はまた、他の手段またはモダリティによる移動する粒子のための技法およびシステムも含み、他の用途のためにも使用され得ることを理解されたい。
【００３０】
本開示されるシステム、方法、およびデバイスは、細胞／粒子／物体が、（例えば、流動、摺動、落下、または他の機構によって）高速で走査している「光シート」と称される光学照明面積によって画定される光学照会区域を通して進行するとき、運動中の物体（例えば、細胞、粒子、または他の物体）の３Ｄ特徴をボクセル毎に、検出器の出力において時間信号にマッピングすることが可能である。いくつかの実施形態では、開示されるシステム、方法、およびデバイスは、光学信号のみが、具体的な体積（例えば、点体積）から、かつ具体的な時間において発生され、検出器に到達することを可能にする、光学検出器の正面に設置される、空間フィルタ／マスクを含む。具体的な体積または具体的な時点から外れている信号が、空間マスクによって遮断される。
【００３１】
図１Ａは、本技術による、１００と標識される、移動する粒子の３次元撮像のためのシステムの例示的実施形態のブロック図を示す。システム１００は、粒子運動システム１１０と、粒子運動システム１１０とインターフェースをとられる、走査光シート照明システム１２０と、粒子運動システム１１０とインターフェースをとられる、光学検出システム１３０と、光学検出システム１３０および／または走査光シート照明システム１３０と通信する、データ処理システム１４０とを含む。いくつかの実装では、システム１００は、空間と時間との間の流動している試料に関する光学的に検出される情報を変換し、変換された情報から３次元画像を構築することによって、単点検出器として動作する。例えば、光を試料の単一の点上に集束させる代わりに、照明システム１２０は、試料が、粒子運動システム１１０によって運動するにつれて、光を２Ｄ平面に沿って集束させる一方、光学検出システム１３０は、光のある部分のみが通過することを可能にし、ある点信号が検出器に進入することを制限するパターンを有する空間フィルタマップに基づいて、平面状に照明される試料の周囲の３次元空間から個々の光点を検出する。本光学機械技法は、物体が運動している間、平面状の光シートの光学的に選別された１次元の点を走査しながら、３次元の物体上に２次元の光（例えば、平面状の「光シート」）を構造化する。システム１００は、粒子、細胞、または他の移動する物体の３Ｄ細胞断層撮影画像を迅速な流率（例えば、１０ｃｍ／秒）で生成し、高スループット３Ｄ撮像を可能にすることが可能である。
【００３２】
システム１００のいくつかの実施形態では、粒子運動デバイス１００は、粒子が進行経路に沿って第１の方向（例えば、運動方向）に移動することを可能にする、基板を含む。走査光シート照明システム１２０は、粒子が、移動している間、複数の時点において粒子の複数の区分にわたって走査する、粒子の進行経路の領域内に光シートを生成するように構成される。生成された走査光シートは、照明の他の寸法より薄い照明の１つの寸法を含み、照明面のような形状を形成する、光の非対称照明面積である。走査光シート照明システム１２０は、光ビームを異なる角度に方向転換することによって、光シートを粒子運動の進行経路に指向させるように光ビームを修正するための、光方向転換デバイスに光学的に結合される、光ビームを生成するための光源（例えば、レーザ）を含む。光学検出システム１３０は、粒子運動デバイス１１０と光学的にインターフェースをとられ、進行経路内での運動の間に粒子の体積に対応する粒子の異なる部分と関連付けられる、光学信号データを取得するように動作可能である。光学検出システム１３０は、１つ以上の光検出器と、粒子運動デバイス１１０と１つ以上の光検出器との間に位置付けられる、空間フィルタとを含み、空間フィルタは、粒子の走査される区分にわたる光の非対称照明面積の一部が空間フィルタを通して通過し、１つ以上の光検出器によって検出されることを選択的に可能にするための、１つ以上の開口を含む。データ処理ユニット１４０は、光学検出システム１３０と（いくつかの実施形態では、走査光シート照明システム１２０と）と通信し、光学検出システム１３０によって取得された光学信号データを処理し、粒子の３Ｄ特徴を示す情報を含むデータを生成するように構成される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、そのような関連する実施形態では時として「フローセル」と称される、粒子運動システム１１０は、流動試料（例えば、粒子、生細胞、または他の物体）を含有する流体サンプルを搬送するための流体チャネルを有する、基板を含む。いくつかの実施形態では、粒子フローセルシステムは、流体チャネル内で微細流に閉じ込められたサンプル流体を生成するための、流動集束システムを含む。いくつかの実施形態では、フローセルの流体チャネルは、光透過性であり、透明な光学経路を可能にするように照会領域内に構成される。流動試料を含有する流体は、光学データが単一粒子または単一細胞を含む粒子毎に撮像システム１２０によって取得される、流体チャネル内の照会面積を通して流動方向に沿って流動する。
【００３４】
さらに、いくつかの実施形態では、粒子運動システム１１０は、１つ以上の粒子、細胞（または照会のための他の物体）が固定される、基板を含み、基板は、粒子、細胞等が、その上で走査光シートが照明され、そこから粒子、細胞等における、および／またはそれを通したそのような光が検出可能である照会領域の中にもたらされるように、走査光シート照明システム１２０および光学検出システム１３０に対して移動される。そのような実施形態では、粒子運動システム１１０は、その上に固定された粒子が進行経路に沿って移動され、光シートが走査される領域の中にもたらされるように基板を移動させるための、移動ステージ（例えば、モータまたは他の駆動デバイスによって駆動される）を含む、デバイス位置付けシステムを含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、走査光シート照明システム１２０は、粒子運動システム１１０の流体チャネル内で流動する粒子上への照明のための光シートとして構造化されるであろう光を発生させるための、光源を含む。いくつかの実施形態では、光源は、レーザを含む、および／またはいくつかの実施形態では、光源は、高輝度ＬＥＤまたはスーパールミネセントダイオードを含む。照明システム１２０は、光源によって発生された光ビームを異なる角度に方向転換するためのデバイスを含み、これは、高速（例えば、少なくとも１００ｋＨｚ〜１ＭＨｚの範囲）で周期的角度変化を発生させるようにプログラムされ得る。光ビーム方向転換デバイスは、受動光学構成要素（例えば、円筒形レンズ、またはレンズ、プリズム、または空間フィルタのような他の光学構成要素等）と光学的に結合され、方向転換された光を成形し、運動している粒子の光学区画化を可能にする、構造化された光シート照明を生成することができる。例えば、照明システム１２０は、粒子上に粒子の薄いスライスまたは細い線、例えば、走査光シートを一度に照明するように動作可能である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、例えば、光方向転換デバイスは、音響光学偏向器（ＡＯＤ）デバイスを含む。例えば、ＡＯＤは、ＡＯＤが、ビームの部分を喪失することなくビームのエネルギーを移動させる、高光学効率を伴う、光ビームの角度の制御可能な高速変化を提供することができる。ＡＯＤは、高速および高効率で光を確実に方向転換するが、波長に敏感であり、種々の波長の複数の光ビームがシステム１００の実装において採用されるべきいくつかの用途に関しては最適ではない場合がある。
【００３７】
ＡＯＤに加えて、またはその代替として、例えば、いくつかの実施形態では、光方向転換デバイスは、波長に限定されない走査ミラーの多重化アレイおよび／または走査格子の多重化アレイを含むことができる。例えば、走査ミラーのような個々の光学構成要素は、約２０ｋＨｚの走査速度を提供するであろうが、走査ミラーの多重化アレイは、高速、例えば、２００ｋＨｚを提供するように構成されることができる。
【００３８】
いくつかの実装では、光学検出システム１３０は、粒子、細胞等の進行経路のものに対して直交する任意の角度で、例えば、光学的に透明な経路を有する粒子フローセルの流体チャネルに対して法線方向等の角度で設置されることができる。いくつかの実施形態では、光学検出システム１３０は、光検出器と、光検出器の画像面に位置付けられ、粒子の具体的な位置からの光が光検出器による検出のために通過することを選択的に可能にする、空間フィルタとを含む。光学検出システム１３０は、（ａ）粒子の流動運動と、（ｂ）走査光シート照明と、（ｃ）粒子の全ての位置から順次にタイミングが調節された様式で光強度（例えば、蛍光と、散乱とを含む）を検出するように空間的にマッピングされたフィルタとの組み合わせに基づいて、３Ｄ物体の１Ｄ光学データ点を随時検出するように動作可能である。したがって、光学検出システム１３０の光検出器によって記録される時間領域信号は、空間から時間への１対１の関係を有する。いくつかの実装では、光学検出システム１３０は、蛍光および散乱光を集光および検出するための光学フィルタを含む。例えば、光学検出システム１３０は、蛍光および／または散乱光の複数のチャネルを検出するための、複数の光検出器を含むことができる。
【００３９】
いくつかの実施形態では、空間フィルタは、表面上にあるパターンで配列される複数の開口（開口部またはスリット）を有する、表面を含む。いくつかの実施形態では、スリットは、粒子運動の第１の方向、および第１のものに対して垂直な第２の方向に沿って離間され、隣接するスリットの位置は、パターンの別のスリットに対して第２の方向に沿って変動する。いくつかの実施例では、開口は、例えば、限定ではないが、正方形、長方形、台形、三角形等を含む、他の幾何学形状および形状、または楕円形、円形等を含む、他の湾曲形状に構成されることができる。種々の実施形態では、開口のサイズは、検出可能な光学信号から構築されるべき画像データの所望の分解能に基づいて選択されることができる。例えば、開口の直径または長さは、画像面上に指向される光の拡大強度×所望の分解能から決定されることができる。一実施例では、所望の分解能が、１μｍであり、検出モジュール１７０の対物レンズが、２０倍である場合、スリットは、２０μｍの直径を有するように構成されるであろう。同様に、例えば、所望の分解能が、０．５μｍであり、検出モジュール１７０の対物レンズが、５０倍である場合、スリットは、２５μｍの直径を有するように構成されるであろう。いくつかの実装では、例えば、（粒子サイズに対して）比較的により小さい開口は、事実上、検出される光がデルタ関数として処理されることを可能にする。
【００４０】
データ処理システム１４０は、検出される光学信号データを処理し、そこから粒子、細胞等の３Ｄ画像または密度分布が構築され得る、粒子、細胞等の３次元特徴を示すデータ（例えば、データセット）を生成するように構成される。例えば、データは、共焦点顕微鏡等の従来の３Ｄ撮像モダリティから取得される３Ｄ画像と幾分異なる、３Ｄ空間内の光学密度分布を表し得る。いくつかの実施形態では、データ処理システム１４０は、光学検出システム１３０と通信する、データ配信ユニットを含む。データ処理システム１４０は、光学検出システム１３０において捕捉された検出光学信号データから粒子毎に３Ｄ画像を再構築するための、プロセッサと、メモリと（データ処理ユニット）を含むことができる。いくつかの実装では、例えば、画像再構築アルゴリズムが、照明および検出プロトコルの仕様を含み、走査光シート照明システム１２０および光学検出システム１３０に適宜コマンドする、データ処理ユニット上に常駐する。いくつかの実施形態では、データ処理システム１４０は、画像データを処理し、粒子と関連付けられる性質を決定するための、画像処理ユニットを含む。
【００４１】
図１Ｂは、例示的システム１００のデータ処理システム１４０の例示的実施形態のブロック図を示す。種々の実装では、データ処理システム１４０は、例えば、デスクトップまたはラップトップコンピュータを含む、１つ以上のパーソナルコンピューティングデバイス、クラウド内にサーバおよび／またはデータベースを含む、インターネットを介してアクセス可能なコンピュータシステムまたは通信ネットワーク（「クラウド」と称される）内の１つ以上のコンピューティングデバイス、および／またはスマートフォン、タブレット、またはスマートウォッチまたはスマートグラスを含む、ウェアラブルコンピュータデバイス等の１つ以上のモバイルコンピューティングデバイス上で具現化される。データ処理システム１４０は、データを処理するための、プロセッサと、プロセッサと通信し、データを記憶および／またはバッファリングする、メモリとを含む。例えば、プロセッサは、中央処理ユニット（ＣＰＵ）またはマイクロコントローラユニット（ＭＣＵ）を含むことができる。いくつかの実装では、プロセッサは、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）またはグラフィック処理ユニット（ＧＰＵ）を含むことができる。例えば、メモリは、プロセッサによって実行されると、例えば、情報、コマンド、および／またはデータを受信する、システム１００等からの情報およびデータを処理する、および処理された情報／データをアクチュエータまたは外部ディスプレイ等の別のデバイスに伝送または提供する等の種々の動作を実施するためのデータ処理システム１４０を構成する、プロセッサ実行可能コードを含み、記憶することができる。データ処理システム１４０の種々の機能をサポートするために、メモリは、命令、ソフトウェア、値、画像、およびプロセッサによって処理または参照される他のデータ等の情報およびデータを記憶することができる。例えば、種々のタイプのランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）デバイス、読取専用メモリ（ＲＯＭ）デバイス、フラッシュメモリデバイス、および他の好適な記憶媒体が、メモリの記憶機能を実装するために使用されることができる。いくつかの実装では、データ処理システム１４０は、プロセッサおよび／またはメモリを他のモジュール、ユニット、またはデバイスにインターフェースをとらせるための、入力／出力（Ｉ／Ｏ）ユニットを含む。いくつかの実施形態では、モバイルコンピューティングデバイス等に関して、データ処理システム１４０は、例えば、伝送機（Ｔｘ）または伝送機／受信機（Ｔｘ／Ｒｘ）ユニット等の無線通信ユニットを含む。例えば、そのような実施形態では、Ｉ／Ｏユニットは、プロセッサおよびメモリを無線通信ユニットとインターフェースをとらせ、例えば、クラウド内の１つ以上のコンピュータとユーザデバイスとの間等の、データ処理システム１４０と他のデバイスとの通信において使用され得る、例えば、典型的なデータ通信規格と互換性のある種々のタイプの無線インターフェースを利用することができる。データ通信規格は、限定ではないが、Ｂｌｕｅｔｏｏｒｈ、Ｂｌｕｅｔｏｏｒｈ  ｌｏｗ  ｅｎｅｒｇｙ（ＢＬＥ）、Ｚｉｇｂｅｅ（登録商標）、ＩＥＥＥ８０２．１１、無線ローカルエリアネッ��ワーク（ＷＬＡＮ）、無線パーソナルエリアネットワーク（ＷＰＡＮ）、無線広域ネットワーク（ＷＷＡＮ）、ＷｉＭＡＸ、ＩＥＥＥ８０２．１６（世界規模相互運用マイクロ波アクセス（ＷｉＭＡＸ））、３Ｇ／４Ｇ／ＬＴＥ／５Ｇセルラー通信方式、およびパラレルインターフェースを含む。いくつかの実装では、データ処理システム１４０は、Ｉ／Ｏユニットを介した有線接続を使用して他のデバイスとインターフェースをとることができる。データ処理システム１４０はまた、他の外部インターフェース、データ記憶装置源、および／または視覚またはオーディオ表示デバイス等とインターフェースをとり、プロセッサによって処理され得る、メモリ内に記憶され得る、またはディスプレイデバイスまたは外部デバイスの出力ユニット上に展示され得る、データおよび情報を読み出し、転送することができる。
【００４２】
図１Ｃは、システム１００のいくつかの実施形態による、３Ｄ−ＩＦＣシステム１５０の例示的実施形態の略図を示す。略図に示されるように、３Ｄ−ＩＦＣシステム１５０は、光シート照明モジュール１６０および検出器モジュール１７０にインターフェースをとられる、流動試料（例えば、粒子、生細胞等）を含有する流体サンプルを搬送するための流体チャネルを含む、粒子フローセル１５１を含む。光シート照明モジュール１６０は、光源１６９（例えば、４８８ｎｍレーザ等のレーザ）を伴う光学照明経路内に配列される、円筒形レンズ１６１および対物レンズ（ＯＬ）１６３に光学的に結合される、音響光学偏向器（ＡＯＤ）１６５を含む。例えば、円筒形レンズ１６１は、ＡＯＤ１６５の後に設置され、光を１方向に集束させ（例えば、レーザビーム焦点を作製し）、走査光シートを形成する。ＡＯＤは、周波数毎に異なる角度に偏向された１次ビームを生成し、したがって、経時的に走査を発生させる。検出器モジュール１７０は、流動システム１５１とインターフェースをとられる対物レンズ１７２と光学光検出器１７９（例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ））との間の光学検出経路内に配列される、空間フィルタ（ＳＰ）１７１を含み、流動物体（例えば、細胞、粒子等）から光学信号データを捕捉する。いくつかの実装では、光学信号データの特定の光スペクトル領域または複数の光スペクトル領域が、検出器モジュール１７０によって検出される。したがって、図１Ｃに示されるもののようないくつかの実施形態では、例えば、検出器モジュール１７０は、分割された光学経路内で帯域通過フィルタ（ＢＰ）１７５および光検出器１７９（例えば、ＰＭＴ）に光学的に結合されるダイクロイックミラー（ＤＭ）１７３に光学的に結合される、空間フィルタ１７１を含む。例えば、照明は、検出に対して垂直に行われることができる。空間フィルタ１７１は、画像面に設置される。いくつかの実施形態では、３Ｄ−ＩＦＣシステム１５０は、光をシステムの別のコンポーネントの指定される場所に集束させる、および／または指向するためのレンズまたは導光体を含む。いくつかの実装では、例えば、ＰＭＴ信号が、例えば、チャネルデジタル記録デバイスあたりで１秒あたり１００メガサンプル（ＭＳ／秒）で収集される。
【００４３】
いくつかの例示的実施形態では、３Ｄ−ＩＦＣシステム１５０は、信号が、垂直方向に検出される間、単一平面内の流動試料を一度に照明する、光シート蛍光顕微鏡の構成に配列される。音響光学偏向器（ＡＯＤ）１６５は、ｚ方向の高速走査を提供することができる。ＰＭＴ  １７９等の単一要素光検出器が、各チャネル内の空間フィルタ１７１を通過した蛍光を検出し、画像が、時間領域検出器の出力から再構築される。走査光シート、細胞の流動運動、および空間フィルタを組み合わせて、検出器は、細胞内の個々の点のみを一度に検出することができ、これは、空間から時間への変換を可能にする。
【００４４】
図１Ｄは、物体面に沿って流動する例示的流動試料（例えば、細胞）、および画像面に位置付けられる空間フィルタ１７１を描写する図を示す。いくつかの実施形態では、空間フィルタ１７１は、あるパターン、例えば、スリットに配列される複数の開口（開口部）を有する、表面を含み、パターンの各開口は、ｙ軸に沿った各開口が、ｘ軸に沿った異なる位置にあるように、（流動方向に対して平行な）ｙ軸に沿って離間され、パターンの別の開口に対して（流動方向に対して垂直な）ｘ軸に沿ってその位置が変動する。図１Ｄに示される例示的空間フィルタ１７１では、開口は、約２０μｍの直径を伴う丸みを帯びた形状（例えば、楕円形または円形）を有する、スリットを含む。
【００４５】
略図に示されるように、平面状の光シートは、ｘｙ平面内に作成され、光の幅は、ｙ軸（粒子の流動方向）に沿って画定され、ｘ軸は、光の重量（照明の方向）である。本略図では、ｚ軸は、ＡＯＤ１６５によって制御される、走査軸である。いくつかの実装では、光シートの厚さ（ｚ軸）は、約１μｍである。細胞の光学点走査は、細胞が、チャネル内で運動している間、ｙ軸に沿って実行され、ｘ軸走査は、空間フィルタマップ１７１によって遂行される。本実施例では、光シート照明モジュール１６０によって生成される光シートは、０．６μｍのウエスト（ｚ方向）と、ｙ方向の２５０μｍの長さとを有し、ｚ方向に走査する。空間フィルタは、１つのものが別のものの直後にあるような方法で離間されて位置付けられる、１０個の２０μｍ（ｘ方向）×１０μｍ（ｙ方向）のスリットを有する。
【００４６】
図２Ａ−２Ｄは、時間領域信号（右）と３Ｄ空間内に立方体として描写される空間情報（左）との間の関係を図示する、略図を示し、空間光強度を示す。図２Ａは、３Ｄ−ＩＦＣからの時間領域信号の実施例を示し、（実施例では球体のような）３Ｄ物体の光強度を表し、各時点は、３Ｄ空間内の具体的なボクセルに対応する。図２Ｂは、３Ｄ物体全体のｘｙ平面投影を表す信号の範囲の実施例を示す。図２Ｃは、強調されるような各区分が、３Ｄ空間の１つのｙｚ平面スライスの光強度を表す実施例を示す。これらの実施例では、各区分の持続時間は、物体が物体面内で２０μｍ進行する時間であり、これは、画像が空間フィルタに沿って１つのスリットから別のものに通過する時間に等しい。図２Ｄは、強調されるような１つの単一ピークが、光シ−トが１つの走査周期を実施する、ｚ方向の１行の光強度を表す、実施例を示す。
【００４７】
以下の方程式は、システム１００の実施形態のいくつかの側面を説明するために使用され得る。例えば、音響光学偏向器（ＡＯＤ）内の音響トランスデューサに送信される音響周波数が、正弦波状に変化しているとき、光シートのｚ方向内の位置ｆ（ｔ）は、以下のように説明され得る。
【化１】
2021514062.tif 000003
【００４８】
例えば、音響周波数が、鋸歯波状に変化している場合、ｆ（ｔ）は、以下のように説明され得る。
【化２】
2021514062.tif 000004
式中、Ｔは、走査周期であり、ｖ１は、ｚ方向の走査速度であり、ｚ０は、光シートのｚ方向のウエストである。
【００４９】
光シート照明Ｉ（ｘ，ｙ，ｚ，ｔ）は、以下のように記述され得る。
【化３】
2021514062.tif 000005
【００５０】
空間フィルタの特性関数Ｆ（ｘ，ｙ）は、以下のように設計される。
【化４】
2021514062.tif 000006
式中、ｘ＝１，２，．．．，Ｎは、空間フィルタ上のスリットの数であり、Ｌは、スリットのｙ方向の長さである。
【００５１】
測定されるＰＭＴ信号Ｓ（ｔ）は、以下のように表現され得る。
【化５】
2021514062.tif 000007
式中、Ｍは、検出システムの拡大係数であり、Ｃｅｌｌ（ｘ，ｙ，ｚ）は、３Ｄ細胞蛍光強度プロファイルである。
【００５２】
本例示的アプローチは、３Ｄ細胞画像を時間領域光強度に１対１の基準でマッピングする。
【００５３】
システム１００の例示的実施形態の実装が、生細胞等の生物学的サンプルの特徴を撮像および特性評価するために使用され得る。例えば、単一の細胞が、フローセルキュベットの内側で０．１ｍ／秒の速度で流動する懸濁液中で撮像され得る。本明細書に説明される例示的実装では、撮像されているいくつかの単一細胞サンプルは、その細胞膜に結合される１μｍ蛍光ビーズを伴う、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  ＣＦＳＥで染色されている、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む。
【００５４】
図３Ａおよび３Ｂは、例示的３Ｄ−ＩＦＣシステム１５０からの時間領域信号のデータプロットの実施例を示す。物体、すなわち、その細胞膜に結合される１μｍ蛍光ビーズを伴う、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  ＣＦＳＥで染色されているＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、０．１ｍ／秒の速度で流動している場合がある。データプロットは、図３Ａの１つのチャネル（例えば、５２０／４０ｎｍ帯域通過型）、および図３Ｂの別のチャネル（例えば、６５０ｎｍロングパス型）のＰＭＴからの時間領域データ出力を示す。検出される範囲は、細胞の２Ｄ画像を再構築するために使用され得る。図３Ａおよび３Ｂのデータプロットは、３Ｄ−ＩＦＣシステム１５０を用いて捉えられる実施例として、細胞の時間領域信号群を示す。これらの例示的実装では、光シートは、ｚ方向に２５μｍの範囲内で２００ｋＨｚで走査していた。
【００５５】
図４Ａ−４Ｉは、例示的３Ｄ−ＩＦＣシステム１５０によって捕捉された、その細胞膜に結合される１μｍ蛍光ビーズを伴う、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  ＣＦＳＥで染色されているＨＥＫ２９３Ｔ細胞の２Ｄ画像および３Ｄ画像の例示的データプロットを示す。図４Ａ−４Ｃでは、データプロットは、それぞれ、例示的３Ｄ−ＩＦＣシステム１５０によって捕捉および再構築された、緑色チャネル（４０１）、赤色チャネル（４０２）、およびオーバーレイ（４０３）の画像データを示す、２Ｄ画像を示す。これらのデータプロットでは、スケールバーは、５μｍを表す。図４Ｄ−４Ｆでは、データプロットは、例示的３Ｄ−ＩＦＣシステム１５０によって生成される、緑色チャネル（４０４）、赤色チャネル（４０５）、および融合物（４０６）の３Ｄ再構築画像データを示す、３Ｄ再構築画像を示す。これらのデータプロットでは、立方体ケージは、２０μｍ×２０μｍ×２０μｍの空間を表す。図４Ｇ−４Ｉは、３Ｄ画像に関する緑色チャネル（斜視図４０７−４１１）、赤色チャネル（斜視図４１２−４１７）、およびオーバーレイ（斜視図４１８−４２３）において３Ｄに撮像された細胞の６つの異なる２Ｄ斜視図を示す。３Ｄ再構築画像によって示されるように、異なる視野角からの２Ｄ斜視図は、異なる特徴を保有する。
【００５６】
図４Ａ−４Ｉに示される３Ｄ画像は、これらが細胞膜上の４つの蛍光ビーズであることを実証するが、２Ｄ画像は、ビーズの数に関して曖昧な情報を含有する。流動システムでは、物体の配向を制御することは殆ど可能ではなく、そのため、１つのみの視点を有する２Ｄ画像を捕捉することは、特に、相対場所が重要であるとき、検出誤差を発生させ得る。生物学的試料は、本質的に３次元であるため、３Ｄ画像を捕捉することは、サンプルに関する完全な情報を提供する。
【００５７】
例示的３Ｄ−ＩＦＣシステム１５０を実装および／または加工するための例示的方法が、説明される。上記に説明される例示的実装では、ガウスエネルギー分布を伴う楕円形ビーム形状を有する、コリメートされ、集束され、次いで、拡張され、１．２μｍ（ｚ方向）×２５０μｍ（ｙ方向）の面積を照明する、１００ｍＷの４８８ｎｍレーザ（Ｔｏｐｔｉｃａ製ｉＢｅａｍ−ＳＭＡＲＴ）が、使用された。モジュール式の掃引周波数型ＲＦ電力源（Ｉｓｏｍｅｔ製）によって駆動される、ＡＯＤ（Ｉｓｏｍｅｔ製）が、使用され、異なる時間において異なる出力角度を伴う偏向されたレーザビームを生成し、したがって、レーザビームをｚ方向に走査した。円筒形レンズおよび１０倍／０．２５対物レンズが、使用され、光シートを形成した。サンプルからの蛍光放射が、１０倍／０．２５対物レンズ（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ製）を通して集光され、各チャネルにおいて１つのＰＭＴ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ製）によって検出された。ＰＭＴの読出値が、ＰＣＩＥ  ＤＡＱカード（Ａｄｖａｎｔｅｃｈ製）によって記録された。
【００５８】
空間フィルタの加工は、以下の技法を含むことができる。空間フィルタの設計は、ＡｕｔｏＣＡＤにおいて描画され、１インチあたり２０，０００ドット（ｄｐｉ）で透明マスクに印刷された。ネガ型フォトレジスト（ＮＲ９−１５００ＰＹ、Ｆｕｔｕｒｒｅｘ，  Ｉｎｃ．製）の層が、６インチガラスウエハ上で１分あたり３，０００回転（ｒｐｍ）で回転された。ウエハは、１５０℃で３分間にわたってホットプレート上で加熱され、次いで、透過性マスクを通してＵＶ光（ＥＶＧ６２０ＮＴ、ＥＶ  Ｇｒｏｕｐ製）に暴露された。ＵＶ暴露の後、ウエハは、ＲＤ６（Ｆｕｔｕｒｒｅｘ，  Ｉｎｃ．製）内での１２秒間にわたる現像の前に、１００℃でさらなる３分間にわたって焼成された。３００ｎｍの厚さのアルミニウムのフィルムが、ガラスウエハ上にスパッタされた。金属リフトオフの後、空間フィルタのパターンが、形成され、ガラスウエハが、１２ｍｍ×１２ｍｍの部片にダイカットされた。フローサイトメータシステム内に空間フィルタを保持することに役立つように、１０個の２０μｍ×１０μｍのスリットを有する空間フィルタが、３Ｄ印刷法によって加工された、サンプルホルダに搭載された。
【００５９】
細胞サンプルの調製は、以下の技法を含むことができる。ＨＥＫ２９３Ｔヒト胎児腎臓細胞サンプルが、培養培地（ＤＭＥＭ、１０％のウシ胎仔血清、１％のペニシリンストレプトマイシン）を用いて、１０ｃｍのペトリ皿内で９０％の密集度に培養された。１．０μｍ蛍光ビーズ（Ｅｘ／Ｅｍ：４８８／６４５ｎｍ、Ｔ８８８３、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ製）の原液からの１００倍の希釈後、１００μＬの希釈された溶液が、１０ｍＬの新鮮細胞培養培地と混合され、細胞培養プレートに添加された。１０時間にわたる連続培養の後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、採集され、４％のパラホルムアルデヒドによって定着され、１倍のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄および再懸濁された。定着後、細胞は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  ＣＦＳＥ細胞増殖キット（Ｅｘ／Ｅｍ：４９２／５１７ｎｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ製）を用いて染色された。全ての撮像実験の前に、懸濁液が、ＰＢＳ中で２００個の細胞／μＬの濃度まで希釈された。
【００６０】
開示される３Ｄ−ＩＦＣシステムおよび方法の例示的用途は、以下を含むことができる。
【００６１】
ＤＮＡ損傷：電離放射線または細胞毒性化学薬品が、二重鎖切断（ＤＳＢ）を形成する、ＤＮＡ損傷を引き起こすと、リン酸化タンパク質ガンマＨ２ＡＸ病巣が、１：１の様式でＤＳＢを迅速に形成し、表す。ガンマＨ２ＡＸに対して作られた抗体を用いて、フローサイトメトリおよび免疫蛍光顕微鏡によるガンマＨ２ＡＸの検出および可視化は、ＤＮＡ損傷、関連するＤＮＡ損傷タンパク質、およびＤＮＡ修復を評価する。２Ｄ撮像技法および手動定量化が、多くの研究者によって広く使用されるが、２Ｄ画像からの病巣の計数は、極めて多くの労力を要するだけではなく、病巣の数が大きく、重複が１つの視点内で生じるときには信頼性を欠くものでもある。高スループットで３Ｄ空間分解能を取得することは、２Ｄ技法と比較すると、ガンマＨ２ＡＸの数、面積、および密度の分析に関して有意に優れている。本明細書に説明される３Ｄ−ＩＦＣシステム１５０の例示的実施形態は、例えば、ガンマＨ２ＡＺ病巣の定量化に好適である、高スループットのサイトメトリック器具を提供することができる。
【００６２】
ＦＩＳＨ：蛍光インサイツハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）は、染色体上の具体的なＤＮＡ配列の存在または不在を効率的に検出および限局化し、疾患診断および予後の査定において高い正確度を達成することができる。ＦＩＳＨ信号分析は、典型的には、２Ｄ顕微鏡画像上で行われる。しかしながら、２つのプローブされたＦＩＳＨ信号が、転座が深度方向に存在する投影画像面内で重複されるときに、検出誤差が、生じ得る。初期または微妙な疾患に関して、少数の異常細胞を検出することは、診断上の差異を作製し得、本種類の検出誤差は、重大であり得る。本明細書に説明される３Ｄ−ＩＦＣシステム１５０の例示的実施形態は、ＦＩＳＨ信号の３Ｄ可視化に好適であり得、一部の臨床症例に関する分析の全体的な正確度を改良し得る。
【００６３】
内在化／エンドサイトーシス：例えば、（１）食細胞の病原体および細胞破片の認識、結合、内在化、および排除、（２）細胞抗体の取り込みおよび提示、（３）細胞エキソソームおよび他のナノ粒子の取り込み、（４）細胞の薬剤取り込みおよび処理等の多くの細胞プロセスが、内在化を測定することによって評価される。２Ｄの広視野顕微鏡画像または撮像サイトメトリック画像のいずれも、相対的場所に関して不完全な情報を提供するにすぎない。例えば、２Ｄ顕微鏡画像からでは、粒子が、細胞のちょうど中心に着座している状態で観察される場合、粒子が細胞膜上にある（セルの上にある）かどうか、または粒子が細胞質の内側にあるかどうか、またはさらに細胞核の中にあるかどうかを区別することは殆ど可能ではない。代わりに、人々は、複数の焦点面において画像を捉え、本タイプの問題を解決する。本明細書に説明される３Ｄ−ＩＦＣシステム１５０の例示的実施形態は、これらの内在化研究のための継続的な高スループット分析を実施することができる。
【００６４】
カメラレスで高スループットの３Ｄ−ＩＦＣシステム、方法、およびデバイスのさらなる実施形態および実装が、流動している単一細胞の３Ｄ蛍光および暗視野画像を捕捉する光学区分化顕微鏡に基づいて、細胞のような物体を撮像するために説明される。開示されるカメラレスで高スループット３Ｄ−ＩＦＣシステムおよび方法は、１秒あたり約５００個の細胞のスループットで流動している単一細胞の３Ｄ蛍光および無標識側方散乱画像を共捕捉する能力を提供する。
【００６５】
例えば、いくつかの例示的実装では、高スループット３Ｄ−ＩＦＣシステムは、光シート走査照明技法および空間から時間への変換検出技法を利用し、カメラを用いることなく単一要素光検出器の読出値からの蛍光および無標識３Ｄ細胞画像の再構築を可能にする。例示的実装では、光電子増倍管（ＰＭＴ）の速度および感受性の利点を使用して、例示的３Ｄ−ＩＦＣシステムは、複数の走査技法を使用し、フローサイトメトリアーキテクチャ内に空間情報を追加する。３Ｄ撮像が、第１の（ｚ）軸を横断したレーザ走査、第２の（ｙ）軸を横断した流動による細胞の平行移動、および第３の（ｘ）軸に沿って配列される複数のピンホールの使用によって達成され、セルあたり６０，０００個のボクセルから蛍光および無標識情報を生成し得る。時間から空間に精密にマッピングすることによって、１つの時点における光検出器の読出値は、３Ｄ空間内の１つのボクセルに対応する。下記に説明される例示的結果は、１秒あたり約５００個の細胞のスループットに対応する、０．２ｍ  ｓ−１の速度で流動している単一セルの蛍光および９０度無標識側方散乱（ＳＳＣ）撮像の３Ｄ−ＩＦＣを例証する。
【００６６】
図５Ａは、システム１００のいくつかの実施形態による、５５０と標識される、３Ｄ−ＩＦＣシステムの別の例示的実施形態を示す。略図に示されるように、３Ｄ−ＩＦＣシステム５５０は、３Ｄ  ＩＦＣシステム５５０の光シート照明モジュール５６０および検出器モジュール５７０にインターフェースをとられる、流動試料（例えば、粒子、生細胞等）を含有する流体サンプルを搬送するための流体チャネルを含む、流動システム５５１を含む。光シート照明モジュール５６０は、光源５６９（例えば、レーザ）を伴う光学照明経路内に配列される、円筒形レンズ（ＣＬ）５６１および照明対物レンズ（ＩＯ）５６３（例えば、５０倍／０．５５照明対物レンズ）に光学的に結合される、音響光学偏向器（ＡＯＤ）５６５を含む。円筒形レンズ５６１は、ＡＯＤ５６５の後に設置され、光を１方向に集束させ（例えば、レーザビーム焦点を作製し）、走査光シートを形成する。例えば、いくつかの実施形態では、光シート照明モジュール５６０は、円筒形レンズ５６１とＡＯＤ５６５との間にミラー要素５６４を含み、照明モジュール５６０の構成要素の種々の位置配列を可能にしながら、光学経路を留保し、光を流動サンプル上に送達する。いくつかの実装では、ＡＯＤ５６５は、周波数毎に異なる角度に偏向された１次ビームを生成し、したがって、経時的に走査を発生させる。いくつかの実装では、流体サンプルは、図９に関してさらに議論される、正方形断面の石英フローセルに進入する前に、シースによって２Ｄで流体力学的に集束される。
【００６７】
検出器モジュール５７０は、流動システム５５１とインターフェースをとられる検出器対物レンズ（ＤＯ）５７２（例えば、１０倍／０．２８検出対物レンズ）と光学光検出器５７９との間の光学検出経路内に配列される、空間フィルタ（ＳＰ）５７１を含み、流動物体（例えば、細胞、粒子等）から光学信号データを捕捉する。空間フィルタ５７１は、光検出器５７９の画像面に設置される。例えば、光検出器５７９は、検出器モジュール５７０が光学信号データの特定の光スペクトル領域または複数の光スペクトル領域を検出するように、１つ以上の光検出器（例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）等）を含むように構成されることができる。図５Ａに示されるように、いくつかの実施形態では、例えば、検出器モジュール５７０は、分割された光学経路内で対応する光検出器５７９（例えば、ＰＭＴ）に光学的に結合される１つ以上のダイクロイックミラー（ＤＭ）５７３に光学的に結合される、空間フィルタ５７１を含む。いくつかの実施形態では、システム５５０は、１つ以上のダイクロイックミラー（ＤＭ）５７３が、光検出器５７９を伴う分割された光学経路内で対応する帯域通過フィルタ（ＢＰ）１７５に光学的に結合されるように構成される。図５Ａの略図に示されるように、例えば、流動試料の照明は、検出配向に対して垂直であるように構成される。いくつかの実施形態では、３Ｄ−ＩＦＣシステム５５０は、光をシステムの別のコンポーネントの指定される場所に集束させる、および／または指向するためのレンズまたは導光体を含む。
【００６８】
３Ｄ−ＩＦＣシステム５５０は、デジタイザ（ＤＩＧ）５８０、例えば、検出器モジュール５７０の例示的ＰＭＴの出力信号をデジタル的に処理する、１２５ＭＳ  ｓ−１デジタイザとインターフェースをとられる処理ユニット（例えば、プロセッサと、メモリとを備える）を含む、データ処理システム１４０の例示的実施形態を含む。
【００６９】
３Ｄ−ＩＦＣシステム５５０の例示的実装では、懸濁細胞が、図９にさらに詳細に示される、正方形の断面を伴う石英フローセル内に、２Ｄの流体力学的に集束される単一ファイルを形成し得る。図５Ａの実施例では、例えば、回折限定されたビームウエストと、２００〜４００μｍの高さとを伴う、フローセル５５１上の光シート（ｘｙ平面）が、レーザの励起によって形成され、非常に高率（例えば、２００ｋＨｚ）でｚ方向に走査する。例えば、粒子または細胞が、０．２ｍ  ｓ−１で光学照会全体を通して流動しているとき、ピクセル化される視野は、図５Ｃに示されるように、Ｘ×Ｙ×Ｚ個のボクセルを伴う３Ｄ空間によって表される。
【００７０】
図５Ｂは、物体面に沿って流動する、例示的流動試料（例えば、細胞）の光学照会面積、および画像面に位置付けられる、空間フィルタ５７１を描写する図を示す。空間フィルタ５７１は、あるパターンに配列される複数の開口を有する、表面を含み、パターンの各開口は、（流動方向に対して平行な）ｙ軸に沿って離間され、パターンの別の開口に対して（流動方向に対して垂直な）ｘ軸に沿ってその位置が変動する。図５Ｂの略図に示されるように、Ｈは、光シートの高さを表し、θは、流動（ｙ軸）と垂直線との間の傾斜角を表す。照明光シートは、水平に伝搬し、ｚ軸に走査し、サンプルは、ｙ軸に流動し、ｘは、直交軸である。
【００７１】
画像面における空間フィルタは、ピンホールを使用し、ｘ軸を横断してライン走査を生成する。例えば、空間フィルタ上のピンホールアレイが、流動流に対して傾斜角θに整合され、そのため、ピンホールアレイもまた、ｘ方向に沿って進む。このように、各ピンホールは、明確に異なるｘ指数を伴うボクセルからの光が、ＰＭＴ検出器まで通過することを可能にする（例えば、本例示的マスクの詳細が、本開示において後に議論される）。撮像プロセスは、流動する細胞が、空間フィルタの第１のピンホールに出現すると、開始する。第１の光シート走査周期の間（例えば、５μｓ）、ｘ１ｙ１指数を伴うボクセルＺ１−Ｚの光強度が、収集される。細胞が、下流にｙにおいて次の位置ｘ１ｙ２まで流動するにつれて、対応するＺ１−Ｚボクセルが、生成される。これは、ｘ１における２Ｄのｙｚスライス全体が撮像されると、細胞がピンホール１を完全に通過するまで繰り返される。細胞は、ｙ方向（例えば、流動方向）にさらに下流に進行するにつれて、続くピンホールに到達し、ｘ２からｘＸにおけるｙｚスライスが、記録される。例えば、図５Ｃを参照されたい。
【００７２】
図５Ｃは、３Ｄ  ＩＦＣシステム５５０のデータ処理システムによって生成される、３Ｄ再構築空間の実施例を示す。処理するステップから、例えば、Ｘ軸上の分解能が、ピンホール（例えば、ｘ方向のピクセル化された視野）の数によって決定され、Ｙ軸の分解能が、２つのスリット（例えば、ｙ方向のピクセル化された視野）の間の距離によって決定され、Ｚ軸の分解能が、光シート走査範囲（例えば、ｚ方向のピクセル化された視野）によって決定される。
【００７３】
図５Ｄ−５Ｆは、３Ｄ−ＩＦＣシステム５５０の例示的出力を示す。システム５５０の例示的実装では、検出される時間領域マルチパラメトリック信号（例えば、多色蛍光ＦＬ１およびＦＬ２および側方散乱ＳＳＣの光強度）が、ＡＯＤドライバの調整電圧の基準出力と同期化され、これは、検出されたボクセルのｚ位置を示す。例えば、２００ｋＨｚの走査率において、ｚ軸内の１次元（１Ｄ）の強度プロファイルが、５μｓの時間周期内の時間領域信号から回収される（例えば、図５Ｄ参照）。細胞のピンホール間での進行の約１００μｓの間に、約２０周期のレーザ走査が、実施され、ｙｚ面の２Ｄ画像アレイが、ＰＭＴ読出値から回収される（例えば、図５Ｅ参照）。細胞が、照会面積全体を通して進行するにつれて、多量の２Ｄのｙｚ平面画像が、回収され、最終的な３Ｄ画像が、ボクセルのｘ位置を示す序数のピンホール番号を用いて再構築される。図５Ｆに示される実施例では、１０個のピンホール空間フィルタが、１秒あたり５００個の細胞のスループットに対応する、１０個の２Ｄのｙｚ平面画像および１ｍｓの信号長を生成する。例示的システム５５０において使用されるＰＭＴおよびデジタイザの帯域幅は、例えば、それぞれ、１５０ＭＨｚおよび１２５ＭＨｚであり、本実装では、３Ｄ細胞画像あたり６０，０００個のボクセルのスループットをサポートする。２０μｍ×２０μｍ×２０μｍの３Ｄ空間内の各３Ｄ細胞画像が、３Ｄ画像分析および定量測定のために１００×１００×１００個のピクセルに再度サイズ決めされる。
【００７４】
空間から時間への変換による画像再構築のために各細胞の速度を測定するために、ピンホールの上流および下流のスリットの対が、光学空間フィルタに追加される（図１０参照）。検出区域を通して移動する細胞の測定される率、および光シート走査率の既知の周波数は、３Ｄ−ＩＦＣ画像内の各ボクセルが、明確に異なる時間領域値を有し、全てのボクセルが、単一要素ＰＭＴから随時慎重に捕捉され得ることを確実にする。３Ｄ細胞画像が、次いで、時間領域信号から再構築される。
【００７５】
図５Ｄは、ｚ軸内に１Ｄ光強度プロファイルを生成する、１つの光シート走査周期を描写する。１つの時点のＰＭＴ電圧読出値は、ｚ軸内の１つのボクセルの光強度に対応する。
【００７６】
図５Ｅは、物体が、ｙ軸に沿って進行する間、複数の走査が、１つのピンホール走査周期内でｙｚ平面内に２Ｄプロファイルを生成することを描写する。点線によって分離される各区分は、２Ｄ画像スタック内の１つの行の光強度に対応する。
【００７７】
図５Ｆは、物体が、空間フィルタ網羅面積を通して完全に通過するときを描写し、時間領域信号は、ｘｙｚ空間内の３Ｄプロファイルの完全な情報を含有する。各区分は、１つの２Ｄ画像スライスに対応する。図５Ｆの略図では、ＡＯＤは、ＡＯＤドライバの調整電圧を指し、ＦＬ１は、蛍光検出チャネル１のＰＭＴ読出値を指し、ＦＬ２は、蛍光検出チャネル２のＰＭＴ読出値を指し、ＳＳＣは、側方散乱光検出チャネルのＰＭＴ読出値を指す。
【００７８】
３Ｄ−ＩＦＣシステム５５０の細胞撮像能力を実証するために、例えば、懸濁された単一細胞が、０．２ｍ  ｓ−１の流動速度で撮像された。システム５５０の例示的実装は、２色の蛍光と、無標識の暗視野（側方散乱）の３Ｄ画像とを含む、哺乳類細胞の例示的画像データを生成した。例示的実装に関して、ＨＥＫ２９３細胞が、細胞間カルボキシフルオセイン色素（ＣＦＳＥ）で染色され、無作為の数の１μｍ蛍光カルボキシレート修飾ポリスチレンビーズで結合された。
【００７９】
図６Ａ−６Ｃは、１μｍ蛍光ビーズで結合されたＣＦＳＥで染色されたＨＥＫ−２９３細胞を使用する、３Ｄ−ＩＦＣシステム５５０の例示的実装からの画像およびデータプロットを示す。図６Ａは、回収された２Ｄのｙｚ−平面画像、およびＣＦＳＥ蛍光、ビーズ、およびＳＳＣのまとめられた、３Ｄに表面レンダリングされた図（最下段）の実施例を描写する。図６Ｂは、ビーズで結合された細胞の３Ｄ画像およびヒストグラム検出事象の実施例を描写する。３Ｄ空間内の相対位置関係は、３Ｄ−ＩＦＣにおける粒子の計数が、細胞配向とは無関係であることを示す。４つのビーズで結合される細胞の実施例では、具体的な視点内の閉塞が、２Ｄ画像を用いた粒子計数に関する誤差の原因となる可能性が高い。図６Ｃは、３ＤのＳＳＣ画像の強度ベースの処理の実施例を描写する。図６Ｃの左の列は、図７Ａに示される細胞の３ＤのＳＳＣ画像の強度ヒストグラムを示す。Ｐ（ｘ，ｙ，ｚ）は、３Ｄ蛍光画像を使用して決定される１μｍサイズのビーズの位置であり、各ビーズの位置の±１μｍの面積内において、３ＤのＳＳＣ画像内の局所的な強度ピークが、見出され得る。図６Ｃでは、スケールバーは、５μｍを表す。例示的実装では、流動速度は、０．２ｍ／秒であった。ＣＦＳＥは、Ｅｘ／Ｅｍ：４８８／５１７の細胞間カルボキシフルオセイン色素であり、ビーズは、Ｅｘ／Ｅｍ：４８８／６４５のカルボキシレート修飾蛍光ミクロスフェアであり、ＳＳＣは、９０度側方散乱であった。
【００８０】
図６Ｂを参照すると、２Ｄのビーズ画像が、重複していたが、３Ｄ−ＩＦＣは、再構築された３Ｄ画像から厳密な数の粒子を分解し、これは、いくつかの局在化および共局在化する特徴にとって重要であることに留意されたい。流動システムでは、細胞およびそれらの内部構造が、無作為に配向され、結果として、２Ｄ画像が、好ましくない視点からのものになり得る。さらに、開示される３Ｄ−ＩＦＣシステムを使用して、複数の視点が、３Ｄ−ＩＦＣ細胞断層撮影を介して達成され得、これは、改良された相対位置関係およびスポット計数結果を提供し得、これは、機械のビジョンおよび人間の視覚化の両方にとって有利である。側方散乱暗視野撮像モードを使用して、例えば、３Ｄ−ＩＦＣシステム５５０は、散乱光の３Ｄ空間分布を発生させた。物体が、可視光によって照明されるとき、屈折率の変動が、光を散乱させ、散乱領域のサイズおよび屈折率分布は、散乱光の分布を決定するであろう。３ＤのＳＳＣ画像は、流体（ＰＢＳ、ｎは、約１．３３５）、細胞（ｎは、約１．３〜１．６）、およびポリスチレンビーズ（ｎは、約１．６）の間のそれらの屈折率（ｎ）変動の空間分布を表す。図６Ｃに示されるように、強度ベースで低域フィルタリングされたＳＳＣ画像が、細胞体積を示し、高域フィルタリングされたＳＳＣ画像が、ビーズの蛍光画像と相関する。
【００８１】
開示される３Ｄ−ＩＦＣシステムは、従来の撮像流動システムによって実践的には取得不可能な情報を取得することが可能である。例として、以下を参照されたい。電離放射線または細胞毒性化学薬品が、二重鎖切断（ＤＳＢ）の形態のＤＮＡ損傷を引き起こすと、リン酸化タンパク質ガンマＨ２ＡＸ（γＨ２ＡＸ）が、１：１の様式でＤＳＢに病巣を形成する。抗γＨ２ＡＸ免疫標識によって、病巣は、ＤＮＡ損傷およびＤＮＡ修復のための能力を反映する。２Ｄ撮像技法および手動定量化は、今日使用されているが、２Ｄ画像からの病巣の計数は、多くの労力を要し、視点依存に起因して信頼性を欠くものである。３Ｄ−ＩＦＣシステムの病巣計数を評価するために、ＣＭＫ３細胞内の免疫標識されたγＨ２ＡＸ病巣（例えば、多形性膠芽腫細胞株）が、６Ｇｙのガンマ照射の後、撮像され得る。代表的な細胞画像が、図７Ａおよび７Ｂに示される。本例示的データは、γＨ２ＡＸ病巣の数が、蛍光強度に関連せず、したがって、従来のフローサイトメトリのメトリックを用いた強度ベースの測定値が、ＤＮＡ損傷を不十分に反映することを示す。対照的に、３Ｄ−ＩＦＣシステム５５０は、γＨ２ＡＸの陽性の病巣の数の正確かつ迅速な分析を生成することが可能であった。
【００８２】
図７Ａおよび７Ｂは、３Ｄ−ＩＦＣシステム５５０によって撮像された蛍光γＨ２ＡＸ病巣の例示的結果を描写する、画像およびデータプロットを示す。図７Ａは、ＣＦＳＥで染色された照射によって損傷された神経膠芽腫ＣＭＫ３細胞およびγＨ２ＡＸ抗体結合ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５の代表的な３Ｄ画像を示し、それらの２色蛍光の２Ｄのｙｚ平面は、ｘ＝１０μｍにおける画像スライスを融合した。３Ｄ画像の高品質は、３Ｄ−ＩＦＣが、ＤＮＡ損傷病巣関連の研究に好適であることを示す。図７Ｂは、散乱プロット内のマーキングされた領域（ｉ）−（ｉｖ）内の細胞の画像とともに、γＨ２ＡＸ強度および病巣数における９１７の検出事象の散乱プロットの実施例を示す。データは、病巣数が、標識されたγＨ２ＡＸからの蛍光強度とは無関係であり、したがって、従来のフローサイトメトリのメトリックを用いた強度ベースの測定値が、ＤＮＡ損傷の程度を評価することは不可能であることを示す。画像では、スケールバーは、５μｍを表す。例示的実装の間の流動速度は、０．２ｍ／秒であった。ＣＦＳＥ、すなわち、細胞間カルボキシフルオセイン色素に関して、Ｅｘ／Ｅｍは、４８８／５１７であり、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、すなわち、ＤＮＡ損傷抗体結合色素に関して、Ｅｘ／Ｅｍは、４９０／６７７であった。
【００８３】
末梢血白血球の形態は、急性および長期的な評価のための重要な臨床診断および予後測定である。３Ｄ−ＩＦＣシステム５５０の例示的実装が、そのような末梢血白血球の形態を実証するために行われた。
【００８４】
図８Ａ−８Ｄは、３Ｄ−ＩＦＣシステム５５０によって決定される白血球細胞の形態を描写する画像およびデータプロットを示す。図８Ａは、白血球の代表的な２Ｄ透過画像（左の列）および３Ｄ画像を示す。図８Ｂは、図８Ａに示される第１の細胞のＳＳＣ信号の強度ヒストグラム、およびオルソスライスビューおよびボリュームビューにおけるその３Ｄプロファイルの実施例を示す。３ＤのＳＳＣ画像に基づく細胞体積推定が、蛍光体積に合致する。図８Ｃは、ＣＦＳＥ（ＦＬ１）体積およびＳＳＣベースの推定される細胞体積における５８９の検出事象の散乱プロットを示す。図８Ｄは、ＳＳＣベースの推定される細胞体積およびＳＳＣ強度から計算される細胞直径の散乱プロットを示す。これらの図では、スケールバーは、５μｍを表す。例示的実装のための流動速度は、０．２ｍ／秒であった。
【００８５】
図８Ａは、３つの撮像モード、すなわち、２Ｄ透過画像（例えば、３Ｄ−ＩＦＣパラメータ）、３Ｄ蛍光、側方散乱画像における、白血球の代表的な３Ｄ−ＩＦＣ撮像を示す。白血球ＳＳＣ信号は、細胞核の粒状度を示すだけではなく、低強度（低屈折率）でのＳＳＣ撮像から取得される細胞容積測定を提供することも行う。ここで、従来の流動ＳＳＣ強度信号が、細胞核の寄与によって支配されるのに対し、３ＤのＳＳＣ信号の２つ以上の強度帯域は、細胞基質および細胞核等の、それらの対応する屈折率を反映する２つ以上の画像を発生させるために使用され得る。図８Ｂおよび８Ｃに示されるように、３ＤのＳＳＣ画像が、透過および蛍光の結果と合致する、細胞体積を生成するために使用されることができる。
【００８６】
３Ｄ−ＩＦＣシステム５５０の例示的実装において使用され、結果を取得および生成するための材料および方法に関するさらなる情報が、下記に説明される。
【００８７】
いくつかの実施形態では、粒子運動システム１１０（例えば、粒子フローセル実施形態）は、懸濁細胞を光学照会面積に継続的に導入し得る、図９に示されるもののような微小流体システムを含むことができる。マイクロチャネルの断面内の細胞の位置が、ｘ、ｙ、およびｚ方向全ての光学視野と整合されるため、細胞に関する再現可能かつ安定した流動速度が、細胞を正方形の断面の中心に厳密に集束させることによって取得される。シリンジポンプによって注入されるサンプル中の懸濁細胞が、単一流の中に流体力学的に集束される。シース流動が、流動する細胞をｘおよびｚ方向の両方に閉じ込めるために使用される。液体流量計とともに空気圧ポンプが、使用され、安定したシース流動を提供する。シース流動とサンプル流動との接合部において、管類端部が、対称的な流動を保つために特にテーパ状になっている。サンプルとシースとの間の流率比は、１００：１になるように厳密に制御され、高速および光学視野内での粒子流動を確実にする。
【００８８】
図９は、例示的３Ｄ−ＩＦＣシステム５５０の例示的粒子フローセル５５１のために使用される、微小流体システム９００の実施例を示す。図９は、テーパ状の管類とインターフェースをとられる例示的微小流体システム９００の略図と、写真とを含む。略図に示されるように、流体中に懸濁される粒子または細胞が、チャネルを通して、本実施例では、２５０μｍ×２５０μｍの断面寸法と、２０ｍｍの長さとを有する、例示的石英フローセルに流動することができる。
【００８９】
システム１００のいくつかの例示的実施形態では、光学システムは、単一の平面内の試料を一度に照明する一方、信号が、垂直の（ｚ）方向に検出される、（図１Ｃまたは図５Ａに示されるもののような）光シート蛍光顕微鏡の構成に配列される。３Ｄ−ＩＦＣシステム５５０の例示的実装では、ガウスエネルギー分布を伴う円形ビーム形状を有し、コリメートされ、拡張され、次いで、集束され、０．６μｍ（ｚ方向）×２５０μｍ（ｙ方向）の面積を照明する、１，０００ｍＷの４８８ｎｍレーザ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ製）が、使用された。円筒形レンズおよび５０倍／０．５５対物レンズ（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ製）が、使用され、光シートを形成した。音響光学偏向器（ＡＯＤ）が、光学システム内に構成され、ｚ方向に高速走査（例えば、本実装では、２００ｋＨｚ）を生成する。
【００９０】
単一ピクセル光検出器が、各チャネル内の空間フィルタを通過した蛍光または散乱光を検出することができ、画像が、時間領域の出力から再構築される。例えば、空間フィルタ５７９に関して、ピンホールが、垂直に配列された。図５Ｂに示されるように、流動（ｙ）方向は、傾斜され、角度θを作成し、これは、ｘ方向の視野Ｄｘ、ｙ方向の視野Ｄｙ、およびピンホールの数Ｘによって決定され、
【化６】
2021514062.tif 000008
である。また、ｚ方向の照明光シートが、細胞サイズより大きい範囲にわたって、かつはるかにより高い、典型的には、ｙ方向の細胞進行速度より２０倍を超える高い速度で走査するため、細胞が１つのピンホールを通過すると、１つのｙｚ平面画像スライスの光強度が、記録され、細胞が、次のピンホールを通過すると、別のｙｚ平面画像スタックが、入手される。例えば、走査光シート、細胞の流動運動、および空間フィルタを組み合わせて、検出器は、細胞内の個々のボクセルの蛍光のみを一度に検出し、これは、１対１の時間から空間へのマッピングを可能にする。本概念は、以下の方程式によって数学的にモデル化されることができる。測定されるＰＭＴ信号Ｓ（ｔ）は、以下のように表現されることができる。
【化７】
2021514062.tif 000009
式中、Ｃ（ｘ，ｙ，ｚ）は、３Ｄ細胞蛍光または散乱光強度プロファイルであり、Ｉ（ｚ，ｔ）は、光シート照明であり、Ｆ（ｘ，ｙ）は、空間フィルタの特性関数であり、ｖＣは、細胞流動速度であり、Ｍは、検出システムの拡大係数である。
【００９１】
ＡＯＤ内の音響トランスデューサに送信される音響周波数は、ビームを偏向させ、異なるｚ位置に照明を作成するように変動され得る。音響周波数の継続的な変化を生成する調整電圧は、正弦波、三角形等の波形の種々のタイプによって発生されることができる。効率的な大部分のレーザ出力に関して、調整電圧は、鋸歯状に変化しているように設定され、そのため、光シートのｚ方向の位置ｚ０（ｔ）は、以下のように説明されることができる。
【化８】
2021514062.tif 000010
式中、Ｔは、光シート照明走査周期であり、ｖｉは、ｚ方向の走査速度である。
【００９２】
円筒形レンズを使用することによって、レーザは、発散され、２００〜４００μｍのｙ方向の高さを伴う光シートを形成する。走査光シート照明Ｉ（ｚ，ｔ）は、ガウスビームとして以下のように説明されることができる。
【化９】
2021514062.tif 000011
【００９３】
ＰＭＴ信号読出値をオーバーサンプリングするステップを用いて、ｚ方向の空間分解能が、回折限定される。ガウスビームウエストが、０．７３μｍと測定され、より単純な計算のためにデルタ関数として以下のように近似された。
【化１０】
2021514062.tif 000012
【００９４】
空間フィルタの２つの実施例が、図１０に示される。
【００９５】
図１０は、空間フィルタ設計に関する実施例の略図を示す。空間フィルタの２つの実施例が、画像面に設置された。１０μｍ×２００μｍの寸法を伴う上部の２つおよび底部の２つの長いスリットは、速度検出のためのものである。空間フィルタ上の他のピンホールは、それぞれ、ｘ方向の２μｍおよび１μｍのボクセルサイズを伴う３Ｄ画像捕捉のための、１０μｍ×２０μｍ（左）および１０μｍ×１０μｍ（右）である。ピンホールの配列は、レーザビームウエストに整合する。
【００９６】
速度検出のために使用されるスリットの問題はさておき、空間フィルタの特性関数Ｆ（ｘ，ｙ）は、以下のように設計される。
【化１１】
2021514062.tif 000013
式中、ｑ＝１，２，…，Ｎは、空間フィルタ上のピンホールの数である。検出対物レンズのＮＡ、細胞流動速度、および信号のサンプリングレートとともに、ピンホールのサイズは、ｘおよびｙ方向の空間分解能を決定する。
【００９７】
例示的実装では、空間フィルタは、電子ビームリソグラフィを使用して加工され、暗転面積は、２５０ｎｍの厚さを伴うクロムから作製される。
【００９８】
上記の近似を用いて、ｙｑ＋１−ｙｑが、細胞サイズ（直径）より大きいとき、細胞突出部が、ｊ番目のピンホールと重複される。
【化１２】
2021514062.tif 000014
【００９９】
１０倍／０．２８検出対物レンズを使用し、細胞が、被写界深度内に存在すると想定して、複数のｚにおける例示的システムＰＳＦは、考慮されなかった。ＰＭＴ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ製）によって検出された光強度信号は、初めに、ＤＣ〜１５０ＭＨｚの帯域幅を伴う増幅器（Ｈａｍａｍａｔｓｕ製）によって増幅され、次いで、チャネルあたり１２５ＭＳ／秒の最大サンプリングレートを伴うデジタイザ（ＡＤＶＡＮＴＥＣＨ製）によってデジタル化された。
【０１００】
その結果、本例示的アプローチは、３Ｄ細胞画像を時間領域光強度に１対１の基準でマッピングする。３Ｄ画像構築アルゴリズムは、上記の方程式に従ってＭＡＴＬＡＢ（登録商標）で記述された。細胞の流動速度ｖＣのわずかな相違に起因して、各細胞の３Ｄ画像の原サイズは、わずかに異なり得る。例示的実装では、原３Ｄ画像は、次いで、１００×１００×１００個のピクセルに再度サイズ決めされた。３Ｄ画像バッチ処理が、画像Ｊ内で実施された。
【０１０１】
図１１は、３Ｄ−ＩＦＣシステム５５０のいくつかの実施形態による、１１５０と標識される、３Ｄ−ＩＦＣシステムの別の例示的実施形態を示す。３Ｄ−ＩＦＣシステム１１５０は、例えば、２Ｄ透過撮像モードを提供する、付加的な検出経路を含む。略図に示されるように、陰影を付けられた部分（略図の右下部分）は、透過画像検出の構成要素を描写し、これは、（例えば、５０μｍ×２ｍｍの寸法を伴う）単一のスリットを有する、透過検出のための空間フィルタ１１７１、および検出対物レンズ（ＤＯ）５７２（例えば、５０倍／０．５５検出対物レンズ）、およびデータ処理システム（例えば、ＤＩＧ５８０）とデータ通信する、光検出器１１７２（例えば、ＰＭＴ、すなわち、光電子増倍管）を含む。
【０１０２】
細胞を調製するための例示的方法が、下記に説明される。
【０１０３】
蛍光ビーズを伴う細胞。いくつかの例示的実装では、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ−２９３）細胞が、完全培養培地（ＤＭＥＭ、１０％のウシ胎仔血清、１％のペニシリンストレプトマイシン）を用いて、１０ｃｍのペトリ皿内で９０％の密集度に培養された。１．０μｍ蛍光ビーズ（Ｅｘ／Ｅｍ：４８８／６４５ｎｍ、例えば、Ｔ８８８３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）の原液（固形分２％）からの１００倍の希釈後、１００μＬの希釈された溶液が、１０ｍＬの新鮮細胞培養培地と混合され、細胞培養プレートに添加された。１０時間にわたる連続培養の後、ＨＥＫ−２９３細胞は、採集され、２０μＭの作用濃度におけるＣｅｌｌＴｒａｃｅ  ＣＦＳＥ細胞増殖キット（Ｅｘ／Ｅｍ：４９２／５１７ｎｍ、例えば、Ｃ３４５５４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）で染色された。染色プロセス後、細胞は、４％のパラホルムアルデヒドによって定着され、１倍のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄および再懸濁された。全ての撮像実験の前に、細胞懸濁液が、ＰＢＳ中で１，０００個の細胞／μＬの濃度まで希釈された。
【０１０４】
ＣＦＳＥ染色。いくつかの例示的実装では、ＨＥＫ−２９３細胞は、完全培養培地を用いて、１０ｃｍのペトリ皿内で９８％の密集度に培養され得、次いで、採集され、１倍のＰＢＳ中で１×１０６個の細胞／ｍＬの濃度まで再懸濁された。ＣＦＳＥ細胞増殖キット（Ｅｘ／Ｅｍ４９２／５１７ｎｍ、例えば、Ｃ３４５５４、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ製）が、２０μＭの作用濃度における細胞懸濁液に添加された。３７℃で３０分間にわたって細胞をインキュベートするステップの後、新鮮培養培地（ＤＭＥＭ）が、使用され、染色プロセスを急冷し、ＨＥＫ−２９３細胞は、１倍のＰＢＳによって洗浄され、４％のパラホルムアルデヒドによって定着された。定着された細胞は、１倍のＰＳＳ中で洗浄され、再懸濁された。プロトコルもまた、適用され、ＣＭＫ３細胞およびヒトの血液白血球を染色した。
【０１０５】
ＣＭＫ３細胞照射治療および免疫染色。いくつかの例示的実装では、ヒト神経膠芽腫ＣＭＫ３細胞が、培養プレート内で完全培養培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２、２％のＢ２７サンプリメント、１％のペニシリンストレプトマイシン、１％のＧｌｕｔａｍａｘ、１００μｇ／ＬのＥＧＦ、１００μｇ／ＬのＦＧＦ、０．２４％のヘパリン）を用いて培養された。細胞は、採集され、１倍のＰＳＢ中で１×１０６個の細胞／ｍＬの濃度まで再懸濁され、次いで、ＣＦＳＥで染色された。ＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）を誘発するために、ＣＭＫ３細胞は、セシウム源照射器による６Ｇｙの照射で処置される。処置された細胞は、１倍のＰＳＢで一度洗浄され、照射後３０分で１％のパラホルムアルデヒドを用いて定着された。定着された細胞は、ＰＢＳで２回洗浄された。次いで、７０％のエタノールが、細胞に添加され、細胞は、１時間にわたって氷の上でインキュベートされた。エタノール処置の後、細胞は、ＰＢＳで２回洗浄され、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００の中で室温において１０分間にわたってインキュベートされた。次いで、細胞は、ＰＢＳで一度洗浄され、ＰＢＳ中で、５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の中で３０分間にわたって室温において振動器上でインキュベートされた。細胞は、次いで、ＰＢＳで一度洗浄され、抗ホスホヒストンＨ２Ａ中でインキュベートされた。Ｘ（Ｓｅｒ１３９）抗体、すなわち、１：３００に希釈されたクローンＪＢＷ３０１が、氷の上で振動器上で１時間にわたってインキュベートされた。一次抗体処置後、細胞は、５％のＢＳＡで２回洗浄され、１：１００に希釈されたＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５抗マウスＩｇＧ１抗体中で氷の上で振動器の上で１時間にわたってインキュベートされた。最後に、染色された細胞は、５％のＢＳＡで２回洗浄され、ＭｉｌｌｉＱ水中で１：３に希釈された安定化定着緩衝液中で再懸濁された。全ての撮像実験の前に、細胞は、ＰＳＢ中で５００個の細胞／μＬの濃度まで希釈された。
【０１０６】
白血球の分離および染色。いくつかの例示的実装では、新鮮なヒトの全血が、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｂｌｏｏｄ  ＢａｎｋからＥＤＴＡ管内に採集された。全血中の赤血球が、初めに、ＲＢＣ溶解バッファ（００−４３００−５４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）によって溶解され、白血球群が、溶解プロセスの後、ソフト遠心分離機によって採集された。採集された白血球は、次いで、１倍のＰＢＳ中で洗浄され、１ｘ１０６個の細胞／ｍＬの濃度まで再懸濁された。再懸濁された白血球は、ＣＦＳＥで染色された。染色プロセスの後、細胞は、４％のパラホルムアルデヒドによって定着され、１倍のＰＢＳ中で洗浄され、再懸濁された。全ての撮像実験前に、細胞懸濁液は、ＰＢＳ中で５００個の細胞／μＬの濃度まで希釈された。
【０１０７】
例示的データによって実証されるように、開示される３Ｄ−ＩＦＣシステムは、高スループットの３Ｄ画像捕捉および分析への先例のないアクセスを提供することが可能である。３Ｄ−ＩＦＣシステム５５０の例示的実装は、０．２ｍ  ｓ−１の細胞流動速度、３軸における１μｍの空間分解能、全軸における２０μｍの視野、および１秒あたり５００個の細胞のスループットを特徴とした。いくつかの実施形態は、空間分解能、空間フィルタの変更を通した視野および３Ｄ画像捕捉率、およびより高い流率の使用を直接向上させるような柔軟性を有する。２Ｄの透過画像と結合される、その情報に富む３Ｄ暗視野（側方散乱）画像検出は、無標識アッセイの可能性をもたらす。
【０１０８】
開示されるシステム、方法、およびデバイスの例示的用途は、限定ではないが、Ｔ細胞のエフェクタ細胞および記憶細胞への非対称分割、Ｂ細胞の分泌経路、表現型創薬、タンパク質または受容体の転座、細胞小器官の形成または輸送の追跡、および３Ｄ配向および極性が重要である、染色体構造異常、および他の用途を含む。いくつかの実装では、開示されるシステム、方法、およびデバイスは、画像ベースのソート機能性と統合されることができる。
【０１０９】
実施例
【０１１０】
本技術によるいくつかの実施形態（実施例Ａ１）では、３次元撮像フローサイトメトリシステムは、粒子流動システムと、粒子流動システムとインターフェースをとられる、走査光シート照明システムと、粒子流動システムとインターフェースをとられる、光学検出システムと、光学検出システムおよび／または走査光シート照明システムと通信する、データ処理システムとを含む。粒子流動システムは、粒子を含有する流体サンプルを搬送する、透明な光学経路を伴う、流体チャネルと、流体チャネル内の微細流に閉じ込められたサンプル流体を生成するための、流動集束システムとを含む。走査光シート照明システムは、流体チャネル内を流動する粒子を照明するための、光源と、高速で周期的な角度変化を発生させるようにプログラム可能である、照明ビームを異なる角度に方向転換するためのデバイスと、粒子の薄いスライスまたは細い線等の粒子の照明される区分の一度の光学走査を可能にする、構造化された光シート照明を生成するための、円筒形レンズおよび／または他の光学構成要素とを含む。光学検出システムは、１つ以上の光検出器と、１つ以上の光検出器の画像面に位置付けられ、粒子の具体的な位置からの光が１つ以上の光検出器を通して通過し、それによって検出されることを選択的に可能にする、空間フィルタとを含む。データ処理システムは、検出されるデータを処理し、粒子の３次元の構築された画像を生成するように構成される。
【０１１１】
実施例Ａ２は、光学検出システムが、蛍光および／または散乱光を集光および検出するように動作可能である、実施例Ａ１またはＡ３−Ａ７のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１１２】
実施例Ａ３は、光学検出システムが、流体チャネルが光学的に透明な経路を有する任意の角度に設置されるように構成される、実施例Ａ１−Ａ２またはＡ４−Ａ７のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１１３】
実施例Ａ４は、光学検出システムが、１つ以上の光検出器によって記録される時間領域信号が、空間から時間への１対１の関係を有するように、（ａ）粒子の流動運動と、（ｂ）走査光シート照明と、（ｃ）粒子の全ての位置から順次にタイミングが調節された様式で光強度（例えば、蛍光と、散乱とを含む）を検出するように空間的にマッピングされたフィルタとの組み合わせに基づいて、３Ｄ物体の１Ｄ光学データ点を随時検出するように動作可能である、実施例Ａ１−Ａ３またはＡ５−Ａ７のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１１４】
実施例Ａ５は、データ処理システムが、光学検出システムと通信するデータ配信ユニットを含む、実施例Ａ１−Ａ４またはＡ６−Ａ７のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１１５】
実施例Ａ６は、データ処理システムが、照明および検出プロトコルの仕様を含み、走査光シート照明システムおよび光学検出システムに適宜コマンドする、画像再構築アルゴリズムを含む、実施例Ａ１−Ａ５またはＡ７のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１１６】
実施例Ａ７は、データ処理システムが、画像データを処理し、粒子と関連付けられる性質を決定するための、画像処理ユニットを含む、実施例Ａ１−Ａ６のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１１７】
本技術によるいくつかの実施形態（実施例Ｂ１）では、フローサイトメトリシステムにおける３次元撮像のための光学撮像システムは、流動チャネル内で流動する粒子を照明するための、光源と、流動チャネルの領域の上方に構成される、１つ以上のレンズと、光学光検出器および光源の光学経路内に構成され、ｚ方向の高速走査を提供する、音響光学偏向器と、光源が、信号が垂直方向に検出される間、単一平面内の流動チャネル内で流動する粒子を一度に照明するように構成される、各チャネル内の空間フィルタを通過した蛍光を検出するための、単一要素光検出器とを含む。
【０１１８】
実施例Ｂ２は、システムが、光検出器が粒子内の個々の点を一度に検出し、それによって、空間から時間への変換を可能にするように、光学信号データを取得し、走査された光シートと、粒子の流動運動と、空間フィルタとの組み合わせに基づいて、時間領域検出器の出力から画像を再構築するように構成される、実施例Ｂ１に記載の光学撮像システムを含む。
【０１１９】
実施例Ｂ３は、光源が、レーザを含む、実施例Ｂ１に記載の光学撮像システムを含む。
【０１２０】
本技術によるいくつかの実施形態（実施例Ｂ４）では、３次元撮像フローサイトメトリシステムは、基板と、生細胞を含む粒子をチャネルの流動方向に沿って流動させるように動作可能である、基板上に形成されるチャネルと、粒子流動デバイスとインターフェースをとられ、チャネルを通した流動の間に粒子と関連付けられる画像データを３次元で取得するように動作可能である、撮像システムと、撮像システムと通信する、データ処理および制御ユニットであって、撮像システムによって取得された画像データを処理し、処理された画像データから細胞と関連付けられる１つ以上の性質を決定するように構成される、プロセッサを含み、その中の撮像システムは、信号が、垂直方向に検出される間、単一平面内の試料を一度に照明する、光シート蛍光顕微鏡の構成に構成される、データ処理および制御ユニットとを含むように構造化される、粒子流動デバイスを含む。
【０１２１】
実施例Ｂ５は、撮像システムが、実施例Ｂ１−Ｂ３のいずれかに記載の光学撮像システムを含む、実施例Ｂ４に記載の３次元撮像フローサイトメトリシステムを含む。
【０１２２】
実施例Ｂ６は、撮像システムが、粒子流動デバイスの領域に入力光を提供するための、１つ以上の光源と、入力光によって照明された粒子から画像データを捕捉するための、光学光検出器とを含む、実施例Ｂ４に記載の３次元撮像フローサイトメトリシステムを含む。
【０１２３】
実施例Ｂ７は、光学光検出器が、空間フィルタ、放射フィルタ、および光電子増倍管に光学的に結合される、顕微鏡の対物レンズを含む、実施例Ｂ６に記載の３次元撮像フローサイトメトリシステムを含む。
【０１２４】
実施例Ｂ８は、光学光検出器がさらに、入力光を第１の領域に指向する、細胞によって放射または散乱される光を光学光検出器の光学要素に指向する、または両方を行うための、１つ以上の導光体要素を含む、実施例Ｂ７に記載の３次元撮像フローサイトメトリシステムを含む。
【０１２５】
実施例Ｂ９は、導光体要素が、ダイクロイックミラーを含む、実施例Ｂ８に記載の３次元撮像フローサイトメトリシステムを含む。
【０１２６】
実施例Ｂ１０は、光学光検出器が、２つ以上の光電子増倍管を含み、細胞によって放射または散乱される光の２つ以上の帯域またはタイプに基づいて２つ以上の対応する信号を発生させる、実施例Ｂ８に記載の３次元撮像フローサイトメトリシステムを含む。
【０１２７】
本技術によるいくつかの実施形態（実施例Ｃ１）では、３次元（３Ｄ）撮像フローサイトメトリシステムは、基板と、流体中の粒子がチャネルの流動方向に沿って流動することを可能にするための基板上に形成される、チャネルとを含む、粒子流動デバイスと、粒子が、チャネル内で流動方向に沿って流動している間、流体中の粒子の複数の区分にわたって１つの区分を一度に走査する、光の２次元（２Ｄ）シートを生成するための、光学照明システムであって、光源を含み、光シート発生ユニットに光学的に結合され、光ビームをチャネルに指向される光の２Ｄシートに修正する、光ビームを生成し、光シート発生ユニットは、光ビームを異なる角度に方向転換するための、光方向転換デバイスと、チャネルを伴う光学経路内の光方向転換デバイスの後に設置される、円筒形レンズとを含む、光学照明システムと、粒子流動デバイスとインターフェースをとられ、チャネルを通した流動の間に粒子と関連付けられる、３次元の光学信号データを取得するように動作可能である、光学検出システムであって、１つ以上の光検出器と、１つ以上の光検出器の画像面に位置付けられる、空間フィルタとを含み、空間フィルタは、粒子の走査される区分にわたる、光の２Ｄシートの一部が、空間フィルタを通して通過し、１つ以上の光検出器によって検出されることを選択的に可能にするための、複数の開口を含む、光学検出システムと、光学検出システムおよび光学照明システムと通信する、データ処理ユニットであって、光学検出システムによって取得される光学信号データを処理し、それから粒子の３Ｄ画像が構築され得る画像データを生成するように構成される、プロセッサを含む、データ処理ユニットとを含む。
【０１２８】
実施例Ｃ２は、光の２Ｄシートが、光の２Ｄシートの第１の走査が、流動方向と、第２の方向とを備える、第１の平面を形成するように、チャネルにおいて、流動方向に対して垂直な第２の方向に指向され、光学検出システムの画像面が、光の２Ｄシートの第２の走査が、第１の平面と平行な第２の平面を形成し、第３の方向に沿って第１の平面からある距離だけ変動されるように、流動方向および第２の方向に対して垂直な第３の方向に沿って配列される、実施例Ｃ１またはＣ３−Ｃ１５のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１２９】
実施例Ｃ３は、光学照明システムが、粒子が、流動方向に流動している間、第１の時点において、第１の平面内の粒子の第１の区分を走査し、第２の時点において、第２の平面内の粒子の第２の区分を走査するように構成され、それによって、粒子に空間的にマッピングされる時間信号を生成する、実施例Ｃ２に記載のシステムを含む。
【０１３０】
実施例Ｃ４は、空間フィルタの開口が、各開口が、光の２Ｄシートをフィルタリングし、粒子のボクセルに対応するように構成されるように、第２の方向に沿って位置付けられる、実施例Ｃ２に記載のシステムを含む。
【０１３１】
実施例Ｃ５は、データ処理ユニットが、ボクセル毎に粒子の３Ｄ画像を生成するように動作可能である、実施例Ｃ１−Ｃ４またはＣ６−Ｃ１５のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１３２】
実施例Ｃ６は、粒子の画像データが、３つの軸における、少なくとも１μｍの空間分解能と、３つの軸における約２０μｍの視野とを含む、実施例Ｃ１−Ｃ５またはＣ７−Ｃ１５のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１３３】
実施例Ｃ７は、チャネル内の粒子の流率が、少なくとも０．２ｍ  ｓ−１であり、システムが、１秒あたり５００個の粒子のスループットで粒子の画像データを生成するように動作可能である、実施例Ｃ１−Ｃ６またはＣ８−Ｃ１５のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１３４】
実施例Ｃ８は、空間フィルタの複数の開口が、あるパターンで配列され、パターンの各開口は、流動方向に沿って均一に離間され、パターンの別の開口に対して流動方向に対して垂直な第２の方向に沿ってその位置が変動する、実施例Ｃ１−Ｃ７またはＣ９−Ｃ１５のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１３５】
実施例Ｃ９は、光方向転換デバイスが、音響光学偏向器（ＡＯＤ）を含む、実施例Ｃ１−Ｃ８またはＣ１０−Ｃ１５のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１３６】
実施例Ｃ１０は、光シート発生ユニットが、データ処理ユニットによって、少なくとも２００ｋＨｚの速度の周期的角度変化を発生させるようにプログラム可能である、実施例Ｃ１−Ｃ９またはＣ１１−Ｃ１５のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１３７】
実施例Ｃ１１は、１つ以上の光検出器が、光電子増倍管を含む、実施例Ｃ１−Ｃ１０またはＣ１２−Ｃ１５のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１３８】
実施例Ｃ１２は、光学検出システムが、空間フィルタ、および空間フィルタと光検出器との間に光学的に結合される、放射フィルタに光学的に結合される、対物レンズを含む、実施例Ｃ１−Ｃ１１またはＣ１３−Ｃ１５のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１３９】
実施例Ｃ１３は、光学検出システムがさらに、光を空間フィルタから外に、複数の光検出器に向かって指向するための、１つ以上の導光体要素を含む、実施例Ｃ１２に記載のシステムを含む。
【０１４０】
実施例Ｃ１４は、光学検出システムが、２つ以上の光電子増倍管を含み、細胞によって放射または散乱される光の２つ以上の帯域またはタイプに基づいて２つ以上の対応する信号を発生させる、実施例Ｃ１３に記載のシステムを含む。
【０１４１】
実施例Ｃ１５は、粒子が、生細胞を含む、実施例Ｃ１−Ｃ１４のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１４２】
本技術によるいくつかの実施形態（実施例Ｃ１６）では、移動する粒子の３次元（３Ｄ）撮像のための方法は、粒子をチャネルを通して第１の方向に沿って移動させるステップと、粒子が、チャネルを通して移動している間に、個々の光の２次元の（２Ｄ）シートをチャネルの対応する領域に指向することによって、粒子の複数の区分を区分毎に走査するステップと、粒子の走査される区分にわたって光の２Ｄシートの一部を空間的にフィルタリングし、空間フィルタを通したある光学点信号が検出されることを可能にするステップと、検出の時点にマッピングされた３次元の個々のボクセルに対応する、空間的にフィルタリングされた光学点信号を検出するステップと、光学点信号を処理し、粒子の画像データを生成するステップとを含む。
【０１４３】
実施例Ｃ１７は、光源から生成される光ビームを個々の光の２Ｄシートに修正するステップを含む、実施例Ｃ１６またはＣ１８−Ｃ２４のいずれかに記載の方法を含む。
【０１４４】
実施例Ｃ１８は、粒子の複数の区分を走査するステップが、方向転換された光ビームを光の２Ｄシートに修正する円筒形レンズを通して光ビームを異なる角度に方向転換するステップを含む、実施例Ｃ１７の方法を含む。
【０１４５】
実施例Ｃ１９は、第１の個々の光の２Ｄシートが、光の２Ｄシートの第１の走査が、第１の方向と、第２の方向とを備える、第１の平面を形成するように、チャネルにおいて、第１の方向に対して垂直な第２の方向に指向され、検出するステップのための画像面が、第２の個々の光の２Ｄシートの第２の走査が、第１の平面と平行な第２の平面を形成し、第３の方向に沿って第１の平面からある距離だけ変動されるように、第１の方向および第２の方向に対して垂直な第３の方向に沿って配列される、実施例Ｃ１６−Ｃ１８またはＣ２０−Ｃ２４のいずれかに記載の方法を含む。
【０１４６】
実施例Ｃ２０は、ボクセル毎の構築に基づいて、生成された画像データから粒子の３Ｄ画像を生成するステップを含む、実施例Ｃ１６−Ｃ１９またはＣ２１−Ｃ２４のいずれかに記載の方法を含む。
【０１４７】
実施例Ｃ２１は、粒子の画像データが、３つの軸における少なくとも１μｍの空間分解能と、３つの軸における２０μｍの視野とを含む、実施例Ｃ１６−Ｃ２０またはＣ２２−Ｃ２４のいずれかに記載の方法を含む。
【０１４８】
実施例Ｃ２２は、粒子の画像データが、１秒あたり５００個の粒子のスループットで生成される、実施例Ｃ１６−Ｃ２１またはＣ２２−Ｃ２４のいずれかに記載の方法を含む。
【０１４９】
実施例Ｃ２３は、粒子が、生細胞を含む、実施例Ｃ１６−Ｃ２２またはＣ２４のいずれかに記載の方法を含む。
【０１５０】
実施例Ｃ２４は、実施例Ｃ１−Ｃ１５のいずれかに記載のシステム上に実装される、実施例Ｃ１６−Ｃ２３のいずれかに記載の方法を含む。
【０１５１】
本技術によるいくつかの実施形態（実施例Ｄ１）では、移動する粒子の３次元（３Ｄ）撮像のためのシステムは、粒子が進行経路に沿って第１の方向に移動することを可能にするための基板を含む、粒子運動デバイスと、粒子が、移動している間、複数の時点において粒子の複数の区分にわたって走査する、粒子の進行経路の領域内に光の非対称照明面積を生成するための、光学照明システムであって、光の非対称照明面積は、照明の他の寸法より薄い照明の１つの寸法を備え、照明面のような形状を形成し、光ビームを異なる角度に方向転換することによって、光の非対称照明面積を粒子運動の進行経路に指向させるように光ビームを修正するための、光方向転換デバイスに光学的に結合される、光ビームを生成するための光源を含む、光学照明システムと、粒子運動デバイスと光学的にインターフェースをとられ、進行経路内での運動の間に、粒子の体積に対応する粒子の異なる部分と関連付けられる、光学信号データを取得するように動作可能である、光学検出システムであって、１つ以上の光検出器と、粒子運動デバイスと１つ以上の光検出器との間に位置付けられる、空間フィルタとを含み、空間フィルタは、粒子の走査される区分にわたる光の非対称照明面積の一部が、空間フィルタを通して通過し、１つ以上の光検出器によって検出されることを選択的に可能にするための、複数の開口を含む、光学検出システムと、光学検出システムと通信する、データ処理ユニットであって、光学検出システムによって取得される光学信号データを処理し、粒子の３Ｄ特徴を示す情報を含むデータを生成するように構成される、プロセッサを含む、データ処理ユニットとを含む。
【０１５２】
実施例Ｄ２は、光の非対称照明面積が、光の非対称照明面積の第１の走査が、第１の方向と、第２の方向とを備える、第１の平面を形成するように、進行経路の領域において、第１の方向に対して垂直な第２の方向に指向され、光学検出システムの画像面は、光の非対称照明面積の第２の走査が、第１の平面と平行な第２の平面を形成し、第３の方向に沿って第１の平面からある距離だけ変動されるように、第１の方向および第２の方向に対して垂直な第３の方向に沿って配列される、実施例Ｄ１またはＤ３−Ｄ２０のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１５３】
実施例Ｄ３は、光学照明システムが、粒子が、第１の方向に移動している間、第１の時点において、第１の平面内の粒子の第１の区分を走査し、第２の時点において、第２の平面内の粒子の第２の区分を走査し、それによって、粒子に空間的にマッピングされる時間信号を生成するように構成される、実施例Ｄ２またはＤ４に記載のシステムを含む。
【０１５４】
実施例Ｄ４は、空間フィルタの開口が、各開口が、光の非対称照明面積をフィルタリングし、粒子のボクセルに対応するように構成されるように、第２の方向に沿って位置付けられる、実施例Ｄ２またはＤ３に記載のシステムを含む。
【０１５５】
実施例Ｄ５は、データ処理ユニットが、ボクセル毎に粒子の３Ｄ画像を生成するように動作可能である、実施例Ｄ１−Ｄ４またはＤ６−Ｄ２０のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１５６】
実施例Ｄ６は、粒子の３Ｄ画像データが、３つの軸における、少なくとも１μｍの空間分解能と、３つの軸における約２０μｍの視野とを含む、実施例Ｄ５に記載のシステムを含む。
【０１５７】
実施例Ｄ７は、粒子運動デバイスが、基板上に形成される、チャネルを含み、粒子を含有する流体が、進行経路としてチャネルを通して流動することを可能にする、粒子フローセルを含む、実施例Ｄ１−Ｄ６またはＤ８−Ｄ２０のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１５８】
実施例Ｄ８は、チャネル内の粒子の流率が、少なくとも０．２ｍ  ｓ−１であり、システムは、１秒あたり５００個の粒子のスループットで粒子のデータを生成するように動作可能である、実施例Ｄ７に記載のシステムを含む。
【０１５９】
実施例Ｄ９は、粒子が、基板に固定され、粒子運動デバイスは、粒子が、進行経路に沿って移動され、その上で光の非対称照明面積が走査される領域の中にもたらされるように、基板を光学照明システムおよび光学検出システムに対して移動させるための、位置付けシステムを含む、実施例Ｄ１−Ｄ８またはＤ１０−Ｄ２０のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１６０】
実施例Ｄ１０は、空間フィルタの複数の開口が、あるパターンで配列され、パターンの各開口は、第１の方向に沿って離間され、パターンの別の開口に対して第１の方向に垂直な第２の方向に沿ってその位置が変動する、実施例Ｄ１−Ｄ９またはＤ１１−Ｄ２０実施例のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１６１】
実施例Ｄ１１は、光方向転換デバイスが、音響光学偏向器（ＡＯＤ）を含む、実施例Ｄ１−Ｄ１０またはＤ１２−Ｄ２０のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１６２】
実施例Ｄ１２は、ＡＯＤが、データ処理ユニットによって、少なくとも１００ｋＨｚの速度で周期的角度変化を発生させるようにプログラム可能である、実施例Ｄ１１に記載のシステムを含む。
【０１６３】
実施例Ｄ１３は、光方向転換デバイスが、走査ミラーの多重化アレイおよび／または走査格子の多重化アレイを含む、実施例Ｄ１−Ｄ１２またはＤ１４−Ｄ２０のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１６４】
実施例Ｄ１４は、光方向転換デバイスが、円筒形レンズと、レンズと、プリズムと、空間フィルタとから成る群から選択され、進行経路上に方向転換された光を成形する、１つ以上の受動光学構成要素と光学的に結合される、実施例Ｄ１−Ｄ１３またはＤ１５−Ｄ２０のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１６５】
実施例Ｄ１５は、１つ以上の光検出器が、光電子増倍管を含む、実施例Ｄ１−Ｄ１４またはＤ１６−Ｄ２０のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１６６】
実施例Ｄ１６は、光学検出システムがさらに、光方向転換デバイスと光学的に結合される、対物レンズを含む、実施例Ｄ１−Ｄ１５またはＤ１７−Ｄ２０のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１６７】
実施例Ｄ１７は、光学検出システムが、空間フィルタに光学的に結合される、対物レンズを含む、実施例Ｄ１−Ｄ１６またはＤ１８−Ｄ２０のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１６８】
実施例Ｄ１８は、光学検出システムがさらに、光を空間フィルタから外に、複数の光検出器に向かって指向するための、１つ以上の導光体要素を含む、実施例Ｄ１−Ｄ１７またはＤ１９−Ｄ２０のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１６９】
実施例Ｄ１９は、光学検出システムがさらに、細胞によって放射または散乱される光の２つ以上の帯域またはタイプに基づいて、２つ以上の対応する信号を発生させるための、２つ以上の光検出器を含む、実施例Ｄ１８に記載のシステムを含む。
【０１７０】
実施例Ｄ２０は、粒子が、生細胞を含む、実施例Ｄ１−Ｄ１９のいずれかに記載のシステムを含む。
【０１７１】
本技術によるいくつかの実施形態（実施例Ｄ２１）では、移動する粒子の３次元（３Ｄ）撮像のための方法は、粒子を第１の方向に沿って移動させるステップと、粒子が、移動している間に、個々の光の非対称照明面積を対応する領域に指向することによって、粒子の複数の区分を区分毎に走査するステップと、運動中の粒子の走査される区分にわたって光の非対称照明面積の一部を空間的にフィルタリングし、空間フィルタを通した粒子の体積に対応するある光学信号が検出されることを可能にするステップと、空間的にフィルタリングされた光学信号を検出し、検出の時点にマッピングされた３次元の個々のボクセルを取得するステップとを含む。
【０１７２】
実施例Ｄ２２は、光源から生成される光ビームを個々の光の非対称照明面積に修正するステップを含む、実施例Ｄ２１またはＤ２３−Ｄ３２のいずれかに記載の方法を含む。
【０１７３】
実施例Ｄ２３は、粒子の複数の区分を走査するステップが、光ビームを異なる角度に方向転換するステップと、方向転換された光ビームを光の非対称照明面積に成形するステップとを含む、実施例Ｄ２１−Ｄ２２またはＤ２４−Ｄ３２のいずれかに記載の方法を含む。
【０１７４】
実施例Ｄ２４は、第１の個々の光の非対称照明面積が、第１の個々の光の非対称照明面積の第１の走査が、第１の方向と、第２の方向とを備える、第１の平面を形成するように、粒子の進行経路において、第１の方向に対して垂直な第２の方向に指向され、検出するステップのための画像面が、第２の個々の光の非対称照明面積の第２の走査が、第１の平面と平行な第２の平面を形成し、第３の方向に沿って第１の平面からある距離だけ変動されるように、第１の方向および第２の方向に対して垂直な第３の方向に沿って配列される、実施例Ｄ２１−Ｄ２３またはＤ２５−Ｄ３２のいずれかに記載の方法を含む。
【０１７５】
実施例Ｄ２５は、光学信号を処理し、粒子の３Ｄ特徴を示す情報を含むデータを生成するステップをさらに含む、実施例Ｄ２１−Ｄ２４またはＤ２６−Ｄ３２のいずれかに記載の方法を含む。
【０１７６】
実施例Ｄ２６は、ボクセル毎の構築に基づいて、生成されたデータから粒子の３Ｄ画像を生成するステップを含む、実施例Ｄ２１−Ｄ２５またはＤ２７−Ｄ３２のいずれかに記載の方法を含む。
【０１７７】
実施例Ｄ２７は、粒子のデータが、３つの軸における少なくとも１μｍの空間分解能と、３つの軸における２０μｍの視野とを含む、実施例Ｄ２１−Ｄ２６またはＤ２８−Ｄ３２のいずれかに記載の方法を含む。
【０１７８】
実施例Ｄ２８は、粒子のデータが、１秒あたり５００個の粒子のスループットで生成される、実施例Ｄ２１−Ｄ２７またはＤ２９−Ｄ３２のいずれかに記載の方法を含む。
【０１７９】
実施例Ｄ２９は、粒子が、基板上に形成されるチャネルを含み、粒子を含有する流体を、第１の方向に沿ってチャネルを通して流動させる、粒子フローセルによって移動される、実施例Ｄ２１−Ｄ２８またはＤ３０−Ｄ３２のいずれかに記載の方法を含む。
【０１８０】
実施例Ｄ３０は、粒子が、基板に固定され、基板は、粒子が、第１の方向に沿って基板上を移動するように、位置付けシステムによって移動される、実施例Ｄ２１−Ｄ２９またはＤ３１−Ｄ３２のいずれかに記載の方法を含む。
【０１８１】
実施例Ｄ３１は、粒子が、生細胞を含む、実施例Ｄ２１−Ｄ３０またはＤ３２のいずれかに記載の方法を含む。
【０１８２】
実施例Ｄ３２は、実施例Ｄ１−Ｄ２０のいずれかのシステム上に実装される、実施例Ｄ２１−Ｄ３１のいずれかに記載の方法を含む。
【０１８３】
本特許文書および添付の付属において説明される主題および機能動作の実装は、本明細書およびそれらの構造的均等物において、またはそれらのうちの１つ以上のものの組み合わせにおいて開示される構造を含む、種々のシステム、デジタル電子回路内、またはコンピュータソフトウェア、ファームウェア、またはハードウェア内に実装されることができる。本明細書内に説明される主題の実装は、１つ以上のコンピュータプログラム製品、すなわち、データ処理装置の動作による実行のための、またはそれを制御するための有形かつ非一過性のコンピュータ可読媒体上にエンコードされるコンピュータプログラム命令の１つ以上のモジュールとして実装されることができる。コンピュータ可読媒体は、機械可読記憶デバイス、機械可読ストレージ基板、メモリデバイス、機械可読伝搬信号に影響を及ぼす物質の組成、またはそれらのうちの１つ以上のものの組み合わせであり得る。用語「データ処理ユニット」または「データ処理装置」は、実施例として、プログラム可能なプロセッサ、コンピュータ、または複数のプロセッサまたはコンピュータを含む、データを処理するための装置、デバイス、および機械の全てを包含する。装置は、ハードウェアに加えて、当該コンピュータプログラムのための実行環境を作成するコード、例えば、プロセッサファームウェア、プロトコルスタック、データベース管理システム、オペレーティングシステム、またはそれらのうちの１つ以上のものの組み合わせを成す、コードを含むことができる。
【０１８４】
コンピュータプログラム（プログラム、ソフトウェア、ソフトウェアアプリケーション、スクリプトまたはコードとしても公知である）は、コンパイル型またはインタープリタ型言語を含む、任意の形態のプログラム言語で記述され得、これは、独立型プログラムとして、またはモジュール、コンポーネント、サブルーチン、またはコンピューティング環境内での使用に好適な他のユニットとしてを含む、任意の形態で展開されることができる。コンピュータプログラムは、必ずしもファイルシステム内のファイルに対応するわけではない。プログラムは、他のプログラムまたはデータを保持するファイルの一部（例えば、マークアップ言語文書内に記憶される１つ以上のスクリプト）の中、当該プログラム専用の単一ファイルの中、または複数の連携ファイル（例えば、１つ以上のモジュール、サブプログラム、またはコードの一部を記憶するファイル）の中に記憶されることができる。コンピュータプログラムは、１台のコンピュータ上、または１カ所に位置する、または複数の敷地に横断して分散され、通信ネットワークによって相互接続される、複数台のコンピュータ上で実行されるように展開されることができる。
【０１８５】
本明細書に説明されるプロセスおよび論理フローは、入力データを動作させ、出力を発生させることによって１つ以上のコンピュータプログラムを実行し、機能を実施する、１つ以上のプログラム可能なプロセッサによって実施されることができる。プロセスおよび論理フローはまた、特殊目的論理回路、例えば、ＦＰＧＡ（フィールドプログラマブルゲートアレイ）またはＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）によって実施されることができ、装置もまた、それらとして実装されることができる。
【０１８６】
コンピュータプログラムの実行に好適なプロセッサは、実施例として、汎用マイクロプロセッサおよび特殊目的マイクロプロセッサの両方と、任意の種類のデジタルコンピュータの任意の１つ以上のプロセッサとを含む。概して、プロセッサは、読取専用メモリまたはランダムアクセスメモリまたは両方から命令およびデータを受信するであろう。コンピュータの不可欠な要素は、命令を実施するためのプロセッサ、および命令およびデータを記憶するための、１つ以上のメモリデバイスである。概して、コンピュータはまた、データを受信する、またはデータを伝達する、または両方のために、データを記憶するための１つ以上の大容量記憶デバイス、例えば、磁気、光磁気ディスク、または光ディスクを含む、またはそれに動作可能に結合されるであろう。しかしながら、コンピュータは、そのようなデバイスを有する必要はない。コンピュータプログラム命令およびデータを記憶するために好適なコンピュータ可読媒体は、実施例として、半導体メモリデバイス、例えば、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、およびフラッシュメモリデバイスを含む、あらゆる形態の不揮発性メモリ、媒体、およびメモリデバイスを含む。プロセッサおよびメモリは、特殊目的論理回路によって補完される、またはその中に組み込まれることができる。
【０１８７】
本明細書で使用されるような用語「約」は、量または濃度および同等物等の測定可能な値を指すとき、規定される量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらに０．１％の変動を包含することを意味する。
【０１８８】
図面とともに、本明細書は、「例示的な（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）」が、「実施例（ｅｘａｍｐｌｅ）」を意味する場合、例示的にすぎないものとして見なされることが意図される。本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別様に示さない限り、同様に、複数形を含むことを意図する。加えて、「または（ｏｒ）」の使用は、文脈が明確に別様に示さない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を含むことを意図する。
【０１８９】
本特許文書および添付の付属は、多くの詳細を含有するが、これらは、請求され得るもののいかなる発明の範囲上の限定としてではなく、むしろ、特定の発明の特定の実施形態に特有であり得る特徴の説明として解釈されるべきである。本特許文書および添付の付属において、別個の実施形態の文脈で説明されるある特徴もまた、単一の実施形態に組み合わせて実装されることができる。逆に、単一の実施形態の文脈で説明される種々の特徴もまた、複数の実施形態において別個に、または任意の好適な部分的組み合わせで実装されることができる。また、特徴が、ある組み合わせにおいて作用するものとして上記に説明され、さらに、そのようなものとして最初に請求され得るが、請求される組み合わせからの１つ以上の特徴が、ある場合では、その組み合わせから削除されることができ、請求される組み合わせは、副次的組み合わせまたは副次的組み合わせの変形例を対象とし得る。
【０１９０】
同様に、動作は、図面内に特定の順序に描写されるが、これは、望ましい結果を達成するために、そのような動作が示される特定の順序または順次順序で実施されること、または図示される動作の全てが実施されることを要求するものとして理解されるべきではない。また、本特許文書および添付の付属に説明される実施形態における種々のシステムコンポーネントの分離は、全ての実施形態においてそのような分離を要求するものとして理解されるべきではない。
【０１９１】
いくつかの実装および実施例のみが、説明され、他の実装、拡張、および変形例が、本特許文書および添付の付属に説明および図示されるものに基づいて成され得る。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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