(57)【要約】  本発明は、宿主細胞タンパク質(HCP)から組換えポリペプチドを精製する方法であって、(a)組換えポリペプチド及びHCPを含む溶液を、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体にアプライするステップ、(b)スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体を、カプリル酸塩及びアルギニンを含む洗浄バッファーで洗浄するステップ、並びに(c)組換えポリペプチドを、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体から溶出するステップを含み、組換えポリペプチドが、抗ICOS抗体又はその抗原結合性フラグメントである、方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞タンパク質(HCP)から組換えポリペプチドを精製する方法であって、(a)前記組換えポリペプチド及びHCPを含む溶液を、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体にアプライするステップ、(b)前記スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体を、カプリル酸塩及びアルギニンを含む洗浄バッファーで洗浄するステップ、並びに(c)前記組換えポリペプチドを、前記スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体から溶出するステップを含み、前記組換えポリペプチドが、抗ICOS抗体又はその抗原結合性フラグメントである、方法。
【請求項２】
前記洗浄バッファーが、約50mMを上回るカプリル酸塩及び約0.5Mを上回るアルギニンを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記抗ICOS抗体が、配列番号1に記載されるCDRH1、配列番号2に記載されるCDRH2、配列番号3に記載されるCDRH3、配列番号4に記載されるCDRL1、配列番号5に記載されるCDRL2、及び/若しくは配列番号6に記載されるCDRL3、又はそれぞれのCDRの直接的な等価物のうちの1つ以上を含み、直接的な等価物が、前記CDRに2個以下のアミノ酸置換を有する、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記抗ICOS抗体が、配列番号7に記載されるアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び/又は配列番号8に記載されるアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むVLドメインを含み、前記抗ICOS抗体が、ヒトICOSに特異的に結合する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗ICOS抗体が、ICOSアゴニストである、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記カプリル酸塩が、カプリル酸ナトリウムである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記洗浄バッファーが、約75mM〜約300mMのカプリル酸塩を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記洗浄バッファーが、約0.75M〜約1.5Mのアルギニンを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記HCPが、哺乳動物細胞に由来する、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記HCPが、ホスホリパーゼB様2タンパク質である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記洗浄バッファーのpHが、pH7〜pH9である、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記洗浄バッファーのpHが、pH7.5〜pH8.5である、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗ICOS抗体が、モノクローナル抗体(mAb)である、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗ICOS抗体が、IgG1又はIgG4である、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗ICOS抗体が、IgG4である、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記スーパー抗原が、プロテインA、プロテインG、及びプロテインLからなる群から選択される、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ(c)の後に、HCPの量が、産物1mg当たり約200ng未満のHCPである、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ホスホリパーゼB様2タンパク質から抗ICOS抗体又はその抗原結合性フラグメントを精製する方法であって、(a)前記抗ICOS抗体又はその抗原結合性フラグメント及びホスホリパーゼB様2タンパク質を含む溶液を、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体にアプライするステップ、(b)前記スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体を、約100mMのカプリル酸塩及び約1.1Mのアルギニンを含む洗浄バッファーで洗浄するステップ、並びに(c)前記抗ICOS抗体又はその抗原結合性フラグメントを、前記スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体から溶出するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質精製の分野に関し、具体的には、固体支持体に固定化されたスーパー抗原、例えば、プロテインA、プロテインG、又はプロテインLを使用した、抗ICOS抗体の精製に関する。具体的には、本発明は、洗浄バッファー成分、及び洗浄バッファーを使用して洗浄ステップ中に宿主細胞混入物を除去し、所望されるタンパク質産物の損失を最小限に抑える方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗腫瘍T細胞機能を増強させ、T細胞増殖を誘導することは、がん処置の強力かつ新しいアプローチである。3つの免疫腫瘍学抗体(例えば、免疫モジュレーター)が、現在、市販されている。抗CTLA-4(YERVOY/イピリムマブ)は、T細胞プライミングの時点で免疫応答を増大させると考えられており、抗PD-1抗体(OPDIVO/ニボルマブ及びKEYTRUDA/ペンブロリズマブ)は、局所腫瘍微小環境において、すでにプライミング及び活性化されている腫瘍特異的T細胞において阻害性チェックポイントを解放することによって機能すると考えられている。
【０００３】
ICOSは、CD28/CTLA-4-Igスーパーファミリーに対する構造的及び機能的関連を有する、共刺激性T細胞受容体である(Hutloff, et al., "ICOS is an inducible T-cell co-stimulator structurally and functionally related to CD28", Nature, 397: 263-266 (1999))。ICOSの活性化は、ICOS-L(B7RP-1/B7-H2)による結合を通じて生じる。B7-1又はB7-2(CD28及びCTLA4のリガンド)のいずれも、ICOSに結合することもそれを活性化することもない。しかしながら、ICOS-Lは、CD28及びCTLA-4の両方に、弱く結合することが示されている(Yao S et al., "B7-H2 is a costimulatory ligand for CD28 in human", Immunity, 34(5); 729-40 (2011))。ICOSの発現は、T細胞に制限されているとみられる。ICOSの発現レベルは、異なるT細胞サブセット間及びT細胞活性化状態において、変動する。ICOSの発現は、休止中のTH17、濾胞性ヘルパーT(TFH)、及び制御性T(Treg)細胞で示されているが、しかしながら、CD28とは異なり、ナイーブTH1及びTH2エフェクターT細胞集団には高度に発現されない(Paulos CM et al., "The inducible costimulator (ICOS) is critical for the development of human Th17 cells", Sci Transl Med, 2(55); 55ra78 (2010))。ICOSの発現は、CD4+及びCD8+エフェクターT細胞において、TCR結合を通じた活性化の後に、高度に誘導される(Wakamatsu E, et al., "Convergent and divergent effects of costimulatory molecules in conventional and regulatory CD4+ T cells", Proc Natal Acad Sci USA, 110(3); 1023-8 (2013))。ICOS受容体を通じた共刺激シグナル伝達は、同時のTCR活性化シグナルを受容するT細胞においてのみ生じる(Sharpe AH and Freeman GJ. "The B7-CD28 Superfamily", Nat. Rev Immunol, 2(2); 116-26 (2002))。活性化された抗原特異的T細胞において、ICOSは、IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-4、IL-13、及びその他のものを含む、TH1及びTH2の両方のサイトカインの産生を調節する。ICOSはまた、CD28よりも低い程度ではあるが、エフェクターT細胞増殖を刺激する(Sharpe AH and Freeman GJ. "The B7-CD28 Superfamily", Nat. Rev Immunol, 2(2); 116-26 (2002))。
【０００４】
CD4+及びCD8+エフェクターT細胞上のICOSの活性化が、抗腫瘍能を有するという考えを支持する文献が増えている。ICOS-L-Fc融合タンパク質は、SA-1(肉腫)、Meth A(線維肉腫)、EMT6(乳房)、及びP815(肥満細胞腫)、及びEL-4(形質細胞腫)同系腫瘍を有するマウスにおいて、腫瘍成長の遅延及び完全な腫瘍根絶を引き起こしたが、一方で、免疫原性が低いことが知られているB16-F10(黒色腫)腫瘍モデルでは、活性は観察されなかった(Ara G et al., "Potent activity of soluble B7RP-1-Fc in therapy of murine tumors in syngeneic hosts", Int. J Cancer, 103(4); 501-7 (2003))。ICOS-L-Fcの抗腫瘍活性は、活性が、ヌードマウスにおいて成長させた腫瘍では完全に失われたため、インタクトな免疫応答に依存性であった。ICOS-L-Fcで処置したマウスに由来する腫瘍の分析により、処置に応答して腫瘍におけるCD4+及びCD8+ T細胞の浸潤の有意な増加が示され、これらのモデルにおけるICOS-L-Fcの免疫刺激作用が裏付けられた。
【０００５】
ICOS-/-及びICOS-L-/-マウスを使用した別の報告では、B16/Bl6黒色腫同系腫瘍モデルにおいて、抗CTLA4抗体の抗腫瘍活性を媒介することにおけるICOSシグナル伝達の要件が示された(Fu T et al., "The ICOS/ICOSL pathway is required for optimal antitumor responses mediated by anti-CTLA-4 therapy", Cancer Res, 71(16); 5445-54 (2011))。ICOS又はICOS-Lが欠如しているマウスは、抗CTLA4抗体処置の後に、野生型マウスと比較して、生存率が有意に減少した。別の研究では、B16/Bl6腫瘍細胞に、組換えマウスICOS-Lを過剰発現するように形質導入が行われた。これらの腫瘍は、抗CTLA4処置に対して、対照タンパク質を形質導入したB16/Bl6腫瘍細胞よりも有意に感受性が高いことが見出された(Allison J et al., "Combination immunotherapy for the treatment of cancer"、WO2011/041613 A2 (2009))。これらの研究は、単独及び他の免疫調節性抗体との組合せでのICOSアゴニストの抗腫瘍能の証拠を提供する。
【０００６】
抗CTLA4抗体で処置した患者から、抗腫瘍免疫応答を媒介することにおけるICOS+エフェクターT細胞の有望な役割を示すデータも出てきている。イピリムマブ処置の後に、循環及び腫瘍浸潤CD4+ICOS+及びCD8+ICOS+ T細胞の絶対数が増加した、転移性黒色腫(Giacomo AMD et al., "Long-term survival and immunological parameters in metastatic melanoma patients who respond to ipilimumab 10 mg/kg within an expanded access program", Cancer Immunol Immunother., 62(6); 1021-8 (2013))、尿路上皮(Carthon BC et al., "Preoperative CTLA-4 blockade: Tolerability and immune monitoring in the setting of a presurgical clinical trial" Clin Cancer Res., 16(10); 2861-71 (2010))、乳房(Vonderheide RH et al., "Tremelimumab in combination with exemestane in patients with advanced breast cancer and treatment-associated modulation of inducible costimulator expression on patient T cells", Clin Cancer Res., 16(13); 3485-94 (2010))、及び前立腺がんを有する患者は、増加がほとんど観察されなかったか又はまったく観察されなかった患者よりも、処置関連の予後が有意に良好であった。重要なことに、イピリムマブは、ICOS+ Tエフェクター:Tregの比を変化させ、処置前にはTregsが豊富であったのを逆転させ、処置後にはTregsに対してTエフェクターが有意に豊富となることが示された(Liakou CI et al., "CTLA-4 blockade increases IFN-gamma producing CD4+ICOShi cells to shift the ratio of effector to regulatory T cells in cancer patients", Proc Natl Acad Sci USA. 105(39); 14987-92 (2008))及び(Vonderheide RH et al., Clin Cancer Res., 16(13); 3485-94 (2010))。したがって、ICOS陽性Tエフェクター細胞は、アゴニストICOS抗体でのこの細胞集団の活性化の潜在的有益性を指摘する、イピリムマブ応答の陽性予測バイオマーカーである。このように、がんの処置における追加のT細胞増殖誘導分子、例えば、抗ICOS抗体に対する必要性が存在する。
【０００７】
いくつかの事例において、抗体、例えば、抗ICOS抗体の精製は、宿主細胞タンパク質(HCP)混入物の除去を伴い得る。FDAにより、「プロセス関連の」混入物として分類されている宿主細胞タンパク質(HCP)混入物は、バイオ医薬品の下流プロセシングにおいて、十分に低いレベルまで除去しなければならない。HCPの適切なクリアランスは、典型的な下流プロセシング中、いくつかのモノクローナル抗体(mAb)産物では特に困難であり得る。mAb下流プロセスの大半は、「プラットフォーム」アプローチを利用し、典型的なmAb下流プラットフォームは、プロテインA親和性クロマトグラフィー捕捉に続き、1〜3回の非親和性ポリッシングステップからなる。プロテインA親和性捕捉ステップは、プラットフォームの主力であり、HCPクリアランスの大半を提供する。後続のポリッシングステップは、一般に、イオン交換、疎水性相互作用、又は多様式のクロマトグラフィーである。
【０００８】
多数のmAb産物について、HCP濃度は、第1のポリッシングクロマトグラフィーステップの後、十分に低い。しかしながら、特にさらなるHCPを除去するために第2のポリッシングクロマトグラフィーステップが実装される、多くのmAbが存在し、これは、重大なプロセス開発の労力を必要とし得、さらなるプロセスの複雑性をもたらす。これまでの研究により、mAb産物分子との誘因性相互作用を有するHCP混入物の部分集団が特定されている(Levy et al., (2014) Biotechnol. Bioeng. 111(5):904-912; Aboulaich et al., (2014) Biotechnol. Prog. 30(5):1114-1124)。プロテインAステップによるクリアランスから逃れるHCPの大半は、共溶出又はプロテインAリガンド若しくはベースマトリックスへの吸収よりも、産物の会合に起因する。除去が困難であるHCPの集団は、細胞培養物中に存在する多様なHCP集団と比較して、比較的小さく、異なるmAb産物で類似である。
【０００９】
困難なHCP混入物の集団は、大部分が、すべてのmAb産物で同一であるが、HCP-mAb相互作用の程度の変動が、プロテインAステップでの総HCPクリアランスに有意に影響を及ぼし得、mAb産物のアミノ酸配列に対する非常にわずかな変化が、プロテインA及びポリッシングステップにおけるHCP-mAb相互作用に影響を及ぼし得る。HCP-mAbの会合の可能性に明白な影響を有するプロテインAカラムにロードされたHCPの集団は、細胞齢、回収手段、及び条件によって影響を受け得、異なる宿主細胞株間で観察されている違いは小さい。産物の会合に加えて、ほとんどのプロテインA樹脂について、ベースマトリックスに結合し、産物とともに共溶出される、低いレベルのHCP混入物が存在する。制御された細孔のガラス樹脂は、ベースマトリックスに結合したはるかに高レベルのHCPを有する。
【００１０】
1つの特定の洗浄液添加剤であるカプリル酸ナトリウムが、HCP-mAbの会合を破壊し、プロテインA溶出液中低いHCP濃度をもたらすことに最も成功しているものの1つとして、これまでに特定されている。カプリル酸ナトリウム(オクタン酸ナトリウムとしても知られている)は、マウスにおいて非毒性であることが見出された炭素数8の飽和脂肪酸であり、臨界ミセル濃度はおよそ360mMである。これまでの研究では、50mMのカプリル酸ナトリウム(Aboulaich et al., (2014) Biotechnol. Prog. 30(5):1114-1124)、NaCl及びpHの変動を伴う40mMのカプリル酸ナトリウム(Chollangi et al., (2015) Biotechnol. Bioeng. 112(11):2292-2304)、及び最大80mMのカプリル酸ナトリウム(Herzer et al., (2015) Biotechnol. Bioeng. 112(7):1417-1428)が、HCPクリアランスを向上させるために使用されており、NaClを伴う高pHの50mMのカプリル酸ナトリウム(Bee et al., (2015) Biotechnol. Prog. 31(5):1360-1369)が、総HCPクリアランス及びタンパク質分解性HCP混入物の除去の両方のために使用されていた。最大100mMのカプリル酸ナトリウムを含有するプロテインA洗浄液に関する特許出願が、これまでに出願されている(WO2014/141150、WO2014/186350)。加えて、カプリル酸は、プロテインA捕捉ステップの前及び後の非クロマトグラフィープロセスにおける宿主細胞タンパク質混入物の沈降のために使用されている(Brodsky et al., (2012) Biotechnol. Bioeng. 109(10): 2589-2598、Zheng et al., (2015) Biotechnol. Prog. 31(6):1515-1525、Herzer et al., (2015) Biotechnol. Bioeng. 112(7):1417-1428)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
タンパク質、特に、抗ICOS抗体を、宿主細胞タンパク質から精製する、改善された方法を提供することが、当該技術分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一態様において、本発明は、宿主細胞タンパク質(HCP)から組換えポリペプチドを精製する方法であって、(a)組換えポリペプチド及びHCPを含む溶液を、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体にアプライするステップ、(b)スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体を、カプリル酸塩及びアルギニンを含む洗浄バッファーで洗浄するステップ、並びに(c)組換えポリペプチドを、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体から溶出するステップを含み、組換えポリペプチドが、抗ICOS抗体又はその抗原結合性フラグメントである、方法を提供する。
【００１３】
一実施形態において、洗浄バッファーは、約50mMを上回るカプリル酸塩及び約0.5Mを上回るアルギニンを含む。
【００１４】
別の実施形態において、抗ICOS抗体は、配列番号1に記載されるCDRH1、配列番号2に記載されるCDRH2、配列番号3に記載されるCDRH3、配列番号4に記載されるCDRL1、配列番号5に記載されるCDRL2、及び/若しくは配列番号6に記載されるCDRL3、又はそれぞれのCDRの直接的な等価物のうちの1つ以上を含み、直接的な等価物は、前記CDRに2個以下のアミノ酸置換を有する。
【００１５】
別の実施形態において、抗ICOS抗体は、配列番号7に記載されるアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むVHドメイン、及び/又は配列番号8に記載されるアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むVLドメインを含み、この抗ICOS抗体は、ヒトICOSに特異的に結合する。
【００１６】
なおも別の実施形態において、抗ICOS抗体は、ICOSアゴニストである。別の実施形態において、カプリル酸塩は、カプリル酸ナトリウムである。
【００１７】
さらに別の実施形態において、洗浄バッファーは、約75mM〜約300mMのカプリル酸塩を含む。
【００１８】
別の実施形態において、洗浄バッファーは、約0.75M〜約1.5Mのアルギニンを含む。
【００１９】
別の実施形態において、HCPは、哺乳動物細胞に由来する。一実施形態において、HCPは、ホスホリパーゼB様2タンパク質である。
【００２０】
別の実施形態において、洗浄バッファーのpHは、pH7〜pH9である。一実施形態において、洗浄バッファーのpHは、pH7.5〜pH8.5である。
【００２１】
一実施形態において、抗ICOS抗体は、モノクローナル抗体(mAb)である。
【００２２】
一実施形態において、抗ICOS抗体は、IgG1又はIgG4である。一実施形態において、抗ICOS抗体は、IgG4である。
【００２３】
別の実施形態において、スーパー抗原は、プロテインA、プロテインG、及びプロテインLからなる群から選択される。
【００２４】
一実施形態において、組換えポリペプチドを、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体から溶出するステップの後に、HCPの量は、産物1mg当たり約200ng未満のHCPである。
【００２５】
別の態様において、ホスホリパーゼB様2タンパク質から抗ICOS抗体又はその抗原結合性フラグメントを精製する方法であって、(a)抗ICOS抗体又はその抗原結合性フラグメント及びホスホリパーゼB様2タンパク質を含む溶液を、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体にアプライするステップ、(b)スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体を、約100mMのカプリル酸塩及び約1.1Mのアルギニンを含む洗浄バッファーで洗浄するステップ、並びに(c)抗ICOS抗体又はその抗原結合性フラグメントを、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体から溶出するステップを含む、方法が、提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】mAb1をモデルとして使用し、洗浄液中のカプリル酸ナトリウムの濃度を変動させた場合のプロテインA溶出液における収率パーセント(三角形、▲)及びHCP濃度(四角形、■)を示す図である。
【図２】洗浄バッファー中、5つの濃度のカプリル酸ナトリウムについて、溶出画分、ストリップ画分、及び洗浄液画分中のロードされたmAb1のパーセントを示す図である。
【図３】異なるカプリル酸ナトリウム濃度の溶液における、MabSelect SuRe樹脂へのmAb1の吸着について、ラングミュア等温式への当てはめを示す図である。
【図４】100mM及び250mMのカプリル酸ナトリウムの洗浄バッファーを用いた場合の、5つのmAbのプロテインA溶出液HCP濃度を示す図である。
【図５】変動するpHで、異なる濃度のカプリル酸ナトリウム及びアルギニンを含有する洗浄バッファーを用いた場合の、mAb2のプロテインA溶出液HCP濃度を示す図である。注記:すべての洗浄バッファーは、300mMの酢酸ナトリウムを含有する。
【図６】変動するpHで、異なる濃度のカプリル酸ナトリウム及びアルギニンを含有する洗浄バッファーを用いた場合の、2つの異なるmAb1供給流のプロテインA溶出液中のHCP濃度を示す図である。注記:すべての洗浄バッファーは、300mM酢酸ナトリウムを含有する。
【図７】変動するpHで、異なる濃度のカプリル酸ナトリウム及びアルギニンを含有する洗浄バッファーを用いた場合の、mAb5供給流のプロテインA溶出液PLBL2濃度を示す図である。
【図８】変動するpHで、異なる濃度のカプリル酸ナトリウム及びアルギニンを含有する洗浄バッファーを用いた場合の、mAb5供給流のプロテインA溶出液HCP濃度を示す図である。
【図９】変動するpHで、異なる濃度のカプリル酸ナトリウム及びアルギニンを含有する洗浄バッファーを用いた場合の、mAb5供給流のプロテインAステップ収率を示す図である。
【図１０】カプリル酸ナトリウム及びアルギニン又はリジンを含有する洗浄液について、mAb3プロテインA溶出液におけるカテプシンL活性を示す図である。
【図１１】モノクローナル抗体プロセス中間体の抗体フラグメント化パーセントを示す図である。
【図１２】カプリル酸塩のみの洗浄バッファーと対比して、カプリル酸塩に加えてアルギニンの洗浄バッファーを用いた場合のHCP濃度を示す図である。
【図１３】25℃で最大10日間保持したモノクローナル抗体バルク原薬の抗体フラグメント化パーセントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、又は生物学的系に限定されるものではなく、当然ながら、変動し得ることが理解されるべきである。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のものにすぎず、制限することを意図するものではないこともまた、理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」は、文脈により別途明確に指示されない限り、複数形の参照物を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド」への言及は、2つ以上のポリペプチドの組合せなどを含む。
【００２８】
「含む(comprising)」という用語は、「含む(including)」又は「からなる(consisting)」を包含し、例えば、Xを「含む」組成物は、排他的にXからなる場合もあり、又は何らかの追加、例えば、X+Yを含む場合もある。「から本質的になる」という用語は、特徴の範囲を、指定された材料又はステップ、及び特許請求される特徴の基本的特性に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。「からなる」という用語は、いかなる追加の構成要素の存在も排除する。
【００２９】
測定可能な値、例えば、量、時間的な期間などに言及する場合に本明細書において使用される「約」は、指定された値からの±5%、±1%、及び±0.1%を含む、±20%又は±10%の変動を包含することを意味し、そのような変動は、開示される方法を実施するのに適している。
【００３０】
別途定義されない限り、本明細書に使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似又はそれと同等のいずれの方法及び材料も、本発明の試験の実施に使用することができるが、好ましい材料及び方法が、本明細書に記載されている。本発明を説明し、特許請求するに当たり、以下の用語が使用される。
【００３１】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書において、アミノ酸残基のポリマーを指して互換可能に使用される。ポリペプチドは、天然起源(組織由来)のもの、原核生物細胞若しくは真核生物細胞調製物由来の組換え発現若しくは天然発現のもの、又は合成方法により化学的に産生されたものであり得る。これらの用語は、1つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸に類似の様式で機能する、化学化合物を指す。非天然の残基は、科学文献及び特許文献において十分に記載されており、天然のアミノ酸残基の模倣体として有用ないくつかの例示的な非天然の構成及びガイドラインが、以下に記載される。芳香族アミノ酸の模倣体は、例えば、D-又はL-ナフィルアラニン(naphylalanine);D-又はL-フェニルグリシン;D-又はL-2チエネイルアラニン(thieneylalanine);D-又はL-1、-2,3-、又は4-ピレネイルアラニン(pyreneylalanine);D-又はL-3チエネイルアラニン;D-又はL-(2-ピリジニル)-アラニン;D-又はL-(3-ピリジニル)-アラニン;D-又はL-(2-ピラジニル)-アラニン;D-又はL-(4-イソプロピル)-フェニルグリシン:D-(トリフルオロメチル)-フェニルグリシン;D-(トリフルオロメチル)-フェニルアラニン:D-p-フルオロ-フェニルアラニン;D-又はL-p-ビフェニルフェニルアラニン;K-又はL-p-メトキシ-ビフェニルフェニルアラニン:D-又はL-2-インドール(アルキル)アラニン;並びにD-又はL-アルキルアイニン(alkylainine)によって置き換えることによって生成することができ、ここで、アルキルは、置換又は非置換メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソ-ブチル、sec-イソチル(isotyl)、イソ-ペンチル、又は非酸性アミノ酸であり得る。非天然のアミノ酸の芳香環としては、例えば、チアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンズイミダゾリル、ナフチル、フラニル
、ピロリル、及びピリジル芳香環が挙げられる。
【００３２】
「ペプチド」は、本明細書において使用される場合、本明細書において具体的に例示されるペプチドの保存的変更であるペプチドを含む。「保存的変更」は、本明細書において使用される場合、アミノ酸残基の、別の生物学的に類似の残基との置換えを表す。保存的変更の例としては、1つの疎水性残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシン、若しくはメチオニンと別のものとの置換、又は1つの極性残基と別のものとの置換、例えば、アルギニンとリジンとの置換、グルタミン酸とアスパラギン酸との置換、若しくはグルタミンとアスパラギンとの置換などが挙げられるが、これらに限定されない。互いに置換することができる中性の親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、及びスレオニンが挙げられる。
【００３３】
「保存的変更」はまた、非置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することも含むが、ただし、置換ポリペプチドに対して産生された抗体が非置換ポリペプチドとも免疫反応することを条件とする。そのような保存的置換は、本明細書に記載されるタンパク質クラスの定義の範囲内である。
【００３４】
「カチオン性」は、本明細書において使用される場合、pH7.4において正味の正電荷を有する任意のペプチドを指す。ペプチドの生物学的活性は、当業者に公知であり、本明細書に記載される、標準的な方法によって決定することができる。
【００３５】
「組換え（体）」は、タンパク質に関して使用される場合、タンパク質が、異種性の核酸若しくはタンパク質の導入によって、又は天然の核酸若しくはタンパク質の変更によって改変されていることを示す。
【００３６】
本明細書において使用される場合、「治療用タンパク質」は、哺乳動物に投与して、例えば、研究者又は医師により求められている、組織、系、動物、又はヒトの生物学的又は医学的応答を誘起することができる、任意のタンパク質及び/又はポリペプチドを指す。治療用タンパク質は、1つを上回る生物学的又は医学的応答を誘起し得る。さらに、「治療有効量」という用語は、そのような量を受容していない対応する対象と比較して、限定されないが、疾患、障害、若しくは副作用の治癒、予防、若しくは緩和、又は疾患若しくは障害の進行速度の減少をもたらす、任意の量を意味する。この用語はまた、正常な生理学的機能の増強に有効な量、並びに患者において第2の医薬剤の治療効果を増強又は補助する生理学的機能を引き起こすのに有効な量を、その範囲内に含む。
【００３７】
本明細書において特定されるすべての「アミノ酸」残基は、天然のL-立体配置にある。標準的なポリペプチドの命名法に従い、アミノ酸残基の省略形は、以下の表に示される通りである。
【００３８】
【表１−１】
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【００３９】
すべてのアミノ酸残基配列は、本明細書において、左から右への配向が、慣例的なアミノ末端からカルボキシ末端への方向にあるという定則によって表されることに留意されたい。
【００４０】
精製方法
一態様において、本発明は、宿主細胞タンパク質(HCP)から組換えポリペプチドを精製する方法であって、(a)組換えポリペプチド及びHCPを含む溶液を、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体にアプライするステップ、(b)スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体を、カプリル酸塩及びアルギニンを含む洗浄バッファーで洗浄するステップ、並びに(c)組換えポリペプチドを、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体から溶出するステップを含む、方法を対象とする。
【００４１】
一態様において、本発明は、宿主細胞タンパク質(HCP)から組換えポリペプチドを精製する方法であって、(a)組換えポリペプチド及びHCPを含む溶液を、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体にアプライするステップ、(b)スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体を、約50mMを上回るカプリル酸塩及び約0.5Mを上回るアルギニンを含む洗浄バッファーで洗浄するステップ、並びに(c)組換えポリペプチドを、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体から溶出するステップを含む、方法を対象とする。
【００４２】
一態様において、本発明は、宿主細胞タンパク質(HCP)から組換えポリペプチドを精製する方法であって、(a)組換えポリペプチド及びHCPを含む溶液を、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体にアプライするステップ、(b)スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体を、250mMを上回る濃度でカプリル酸塩を含む洗浄バッファーで洗浄するステップ、並びに(c)組換えポリペプチドを、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体から溶出するステップを含む、方法を対象とする。
【００４３】
一態様において、本発明は、宿主細胞タンパク質(HCP)から組換えポリペプチドを精製する方法であって、(a)組換えポリペプチド及びHCPを含む溶液を、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体にアプライするステップ、(b)スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体を、約150mM〜約850mMのカプリル酸塩を含む洗浄バッファーで洗浄するステップ、並びに(c)組換えポリペプチドを、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体から溶出するステップを含む、方法を対象とする。
【００４４】
別の態様において、本発明は、宿主細胞タンパク質(HCP)から組換えポリペプチドを精製する方法であって、(a)組換えポリペプチド及びHCPを含む溶液を、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体にアプライするステップ、(b1)スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体を、カプリル酸塩を含む第1の洗浄バッファーで洗浄するステップ、(b2)スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体を、アルギニンを含む第2の洗浄バッファーで洗浄するステップ、並びに(c)組換えポリペプチドを、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体から溶出するステップを含む、方法を対象とする。
【００４５】
別の態様において、本発明は、宿主細胞タンパク質(HCP)から組換えポリペプチドを精製する方法であって、(a)組換えポリペプチド及びHCPを含む溶液を、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体にアプライするステップ、(b1)スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体を、アルギニンを含む第1の洗浄バッファーで洗浄するステップ、(b2)スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体を、カプリル酸塩を含む第2の洗浄バッファーで洗浄するステップ、並びに(c)組換えポリペプチドを、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体から溶出するステップを含む、方法を対象とする。
【００４６】
ステップ(a)において溶液をスーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体にアプライ(又はローディング)した後、組換えポリペプチドは、固体支持体に固定化されたスーパー抗原に吸着される。HCP混入物は、次いで、吸着された組換えポリペプチドを含有する固定化されたスーパー抗原を、本明細書に記載される洗浄バッファーと接触させることによって、除去することができる。
【００４７】
「スーパー抗原」は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーと、これらのタンパク質の標的リガンド結合部位とは異なる部位で相互作用する、一般的なリガンドを指す。ブドウ球菌(Staphylococcal)エンテロトキシンは、T細胞受容体と相互作用するスーパー抗原の例である。抗体に結合するスーパー抗原としては、IgG定常領域に結合するプロテインG(Bjorck and Kronvall (1984) J. Immunol., 133:969)、IgG定常領域及びVHドメインに結合するプロテインA(Forsgren and Sjoquist, (1966) J. Immunol., 97:822)、並びにVLドメインに結合するプロテインL(Bjorck, (1988) J. Immunol., 140:1194)が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、一実施形態において、スーパー抗原は、プロテインA、プロテインG、及びプロテインLからなる群から選択される。
【００４８】
本明細書において使用される場合、用語「プロテインA」は、その天然源(例えば、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)の細胞壁)から回収されたプロテインA、合成で(例えば、ペプチド合成又は組換え技法により)産生されたプロテインA、及びCH2/CH3領域を有するタンパク質に結合する能力を保持するそのバリアントを包含する。プロテインAは、例えば、Repligen又はPharmaciaから市販で購入することができる。
【００４９】
本明細書において使用される場合、「親和性クロマトグラフィー」は、クロマトグラフィー分離を達成するために、生体分子の一般的な特性、例えば、等電点、疎水性、又はサイズではなく、生体分子間の特定の可逆的相互作用を利用する、クロマトグラフィー方法である。「プロテインA親和性クロマトグラフィー」又は「プロテインAクロマトグラフィー」は、免疫グロブリン分子のFc部分に対するプロテインAのIgG結合性ドメインの親和性を利用する、特定の親和性クロマトグラフィー方法を指す。このFc部分は、ヒト又は動物免疫グロブリン定常ドメインCH2及びCH3、又はこれらに実質的に類似の免疫グロブリンドメインを含む。実際には、プロテインAクロマトグラフィーは、固体支持体に固定化されたプロテインAを使用することを含む。Gagnon, Protein A Affinity Chromatography, Purification Tools for Monoclonal Antibodies, pp. 155-198, Validated Biosystems, (1996)を参照されたい。プロテインG及びプロテインLもまた、親和性クロマトグラフィーに使用することができる。固体支持体は、プロテインAが接着する非水性マトリックス(例えば、カラム、樹脂、マトリックス、ビーズ、ゲルなど)である。そのような支持体としては、アガロース、セファロース、ガラス、シリカ、ポリスチレン、コロジオンチャコール、砂、ポリメタクリレート、架橋ポリ(スチレン-ジビニルベンゼン)、及びアガロースとデキストランの表面エクステンダー、並びに任意の他の好適な材料が挙げられる。そのような材料は、当該技術分野において周知である。任意の好適な方法を使用して、スーパー抗原を固体支持体に固定化することができる。タンパク質を好適な固体支持体に固定する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ostrove, in Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology, (1990) 182: 357-371を参照されたい。そのような固体支持体は、固定化されたプロテインA又はプロテインLを有するもの及び有さないものが、多数の市販供給業者、例えば、Vector Laboratory (Burlingame, Calif.)、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Calif.)、BioRad (Hercules, Calif.)、Amersham Biosciences (part of GE Healthcare, Uppsala, Sweden)、及びMillipore (Billerica, Mass.)から容易に入手可能である。
【００５０】
本明細書に記載される方法は、1つ以上のさらなる精製ステップ、例えば、1つ以上のさらなるクロマトグラフィーステップを含み得る。一実施形態において、1つ以上のさらなるクロマトグラフィーステップは、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、及び混合モードクロマトグラフィーからなる群から選択され、特に、アニオン交換クロマトグラフィーである。
【００５１】
一実施形態において、本方法は、本明細書に記載される方法のステップ(c)によって産生される溶出液を濾過するステップをさらに含む。
【００５２】
一実施形態において、本方法は、ステップ(c)の後に、以下のステップをさらに含む:(d)回収されたタンパク質を含有する溶液を、30mMの酢酸、100mMのHClで約pH3.5に滴定するステップ、(e)ステップ(d)の溶液を、約30〜約60分間、約pH3.5に保つステップ、及び(f)ステップ(e)の溶液のpHを、1Mのトリスで約pH7.5に調節するステップ。一実施形態において、本方法は、ステップ(f)によって得られた溶液を濾過するステップをさらに含む。
【００５３】
一実施形態において、ステップ(a)においてカラムにアプライされる組換えタンパク質の量(すなわち、ロード比)は、35mg/ml以下、例えば、30mg/ml以下、20mg/ml以下、15mg/ml以下、又は10mg/ml以下である。「ロード比」が、樹脂1ミリリットル(ml)当たりのタンパク質(例えば、モノクローナル抗体)のミリグラム(mg)数を指すことが理解される。
【００５４】
洗浄バッファー
「バッファー」は、その酸-塩基共役成分の作用によってpHの変化に抵抗する緩衝溶液である。「平衡バッファー」は、クロマトグラフィーの固相を調製するために使用される溶液を指す。「ローディングバッファー」は、固相(すなわち、クロマトグラフィーマトリックス)にタンパク質及び混入物の混合物をロードするために使用される溶液を指す。平衡バッファー及びローディングバッファーは、同じであってもよい。「洗浄バッファー」は、ローディングが完了した後に、残留する混入物を固相から除去するために使用される溶液を指す。「溶出バッファー」は、クロマトグラフィーマトリックスから標的タンパク質を取り出すために使用される。
【００５５】
「塩」は、酸及び塩基の相互作用によって形成される化合物である。
【００５６】
本発明の一態様において、洗浄バッファーは、脂肪族カルボン酸塩を含む。脂肪族カルボン酸塩は、直鎖又は分岐鎖のいずれかであり得る。ある特定の実施形態において、脂肪族カルボン酸塩は、脂肪族カルボン酸若しくはその塩であるか、又は脂肪族カルボン酸塩の供給源が、脂肪族カルボン酸若しくはその塩である。ある特定の実施形態において、脂肪族カルボン酸塩は、直鎖であり、メタン酸(ギ酸)、エタン酸(酢酸)、プロパン酸(プロピオン酸)、ブタン酸(酪酸)、ペンタン酸(吉相酸)、ヘキサン酸(カプロン酸)、ヘプタン酸(エナント酸)、オクタン酸(カプリル酸)、ノナン酸(ペラルゴン酸)、デカン酸(カプリン酸)、ウンデカン酸(ウンデシル酸)、ドデカン酸(ラウリン酸)、トリデカン酸(トリデシル酸)、テトラデカン酸(ミリスチン酸)、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸(パルミチン酸)、ヘプタデカン酸(マルガリン酸)、オクタデカン酸(ステアリン酸)、及びイコサン酸(アラキドン酸)、又はこれらの任意の塩からなる群から選択される。したがって、脂肪族カルボン酸塩は、長さが1〜20炭素の炭素骨格を含み得る。一実施形態において、脂肪族カルボン酸塩は、6〜12炭素骨格を含む。一実施形態において、脂肪族カルボン酸塩は、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、カプリル酸塩、デカン酸塩、及びドデカン酸塩からなる群から選択される。さらなる実施形態において、脂肪族カルボン酸塩は、カプリル酸塩である。
【００５７】
一実施形態において、脂肪族カルボン酸塩の供給源は、脂肪族カルボン酸、脂肪族カルボン酸のナトリウム塩、脂肪族カルボン酸のカリウム塩、及び脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩からなる群から選択される。一実施形態において、脂肪族カルボン酸塩の供給源は、脂肪族カルボン酸のナトリウム塩である。さらなる実施形態において、洗浄バッファーは、カプリル酸ナトリウム、デカン酸ナトリウム、又はドデカン酸ナトリウム、特に、カプリル酸ナトリウムを含む。
【００５８】
一実施形態において、洗浄バッファーは、約50mMを上回るカプリル酸塩を含む。一実施形態において、洗浄バッファーは、約200mMを上回るカプリル酸塩を含む。一実施形態において、洗浄バッファーは、約250mMを上回るカプリル酸塩を含む。さらなる実施形態において、洗浄バッファーは、少なくとも約50mMのカプリル酸塩、例えば、少なくとも約75mM、約100mM、約150mM、約200mM、約250mM、又は約300mMのカプリル酸塩を含む。一実施形態において、洗浄バッファーは、約850mM未満のカプリル酸塩、例えば、約800mM未満、約750mM未満、約700mM未満、約650mM未満、約600mM未満、約550mM未満、約500mM未満、約450mM未満、約400mM未満、約350mM未満、約300mM未満のカプリル酸塩を含む。別の実施形態において、洗浄バッファーは、約100mM、約125mM、約150mM、約175mM、約200mM、又は約250mMのカプリル酸塩を含む。
【００５９】
一実施形態において、洗浄バッファーは、約50mMを上回るカプリル酸ナトリウムを含む。一実施形態において、洗浄バッファーは、約200mMを上回るカプリル酸ナトリウムを含む。一実施形態において、洗浄バッファーは、約250mMを上回るカプリル酸ナトリウムを含む。さらなる実施形態において、洗浄バッファーは、少なくとも約50mMのカプリル酸ナトリウム、例えば、少なくとも約75mM、約100mM、約150mM、約200mM、約250mM、又は約300mMのカプリル酸ナトリウムを含む。一実施形態において、洗浄バッファーは、約850mM未満のカプリル酸ナトリウム、例えば、約800mM未満、約750mM未満、約700mM未満、約650mM未満、約600mM未満、約550mM未満、約500mM未満、約450mM未満、約400mM未満、約350mM未満、約300mM未満のカプリル酸ナトリウムを含む。別の実施形態において、洗浄バッファーは、約100mM、約125mM、約150mM、約175mM、約200mM、又は約250mMのカプリル酸ナトリウムを含む。
【００６０】
一実施形態において、洗浄バッファーは、約50mM〜約750mMのカプリル酸塩、約50mM〜約500mMのカプリル酸塩、約75mM〜約400mMのカプリル酸塩、約75mM〜約350mMのカプリル酸塩、約75mM〜約300mMのカプリル酸塩、約75mM〜約200mMのカプリル酸塩、約250mMを上回って約750mMまでのカプリル酸塩、約250mMを上回って約500mMまでのカプリル酸塩、約250mMを上回って約400mMまでのカプリル酸塩、約250mMを上回って約350mMまでのカプリル酸塩、又は約250mMを上回って約300mMまでのカプリル酸塩を含む。
【００６１】
一実施形態において、洗浄バッファーは、約50mM〜約750mMのカプリル酸ナトリウム、約50mM〜約500mMのカプリル酸ナトリウム、約75mM〜約400mMのカプリル酸ナトリウム、約75mM〜約350mMのカプリル酸ナトリウム、約75mM〜約300mMのカプリル酸ナトリウム、約75mM〜約200mMのカプリル酸ナトリウム、約250mMを上回って約750mMまでのカプリル酸ナトリウム、約250mMを上回って約500mMまでのカプリル酸ナトリウム、約250mMを上回って約400mMまでのカプリル酸ナトリウム、約250mMを上回って約350mMまでのカプリル酸ナトリウム、又は約250mMを上回って約300mMまでのカプリル酸ナトリウムを含む。
【００６２】
一実施形態において、洗浄バッファーは、有機酸、有機酸の共役塩基のアルカリ金属塩又はアンモニウム塩、及び有機塩基を含む。一実施形態において、洗浄バッファーは、NaClを添加せずに作製される。
【００６３】
一実施形態において、有機酸の共役塩基は、有機酸の共役塩基のナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩である。一実施形態において、有機酸は、酢酸であり、酢酸の共役塩基は、ナトリウム塩(すなわち、酢酸ナトリウム)である。
【００６４】
一実施形態において、洗浄バッファーは、約1mM〜約500mMの酢酸をさらに含む。一実施形態において、洗浄バッファーは、約45mMの酢酸を含む。一実施形態において、洗浄バッファーは、約1mM〜約500mMのトリス塩基をさらに含む。一実施形態において、洗浄バッファーは、約55mMのトリス塩基を含む。一実施形態において、洗浄バッファーは、約1mM〜約500mMの酢酸ナトリウムをさらに含む。一実施形態において、洗浄バッファーは、約300mMの酢酸ナトリウムを含む。
【００６５】
一実施形態において、洗浄バッファーのpHは、約pH7〜約pH9、例えば、約pH7.5〜約pH8.5である。
【００６６】
一実施形態において、洗浄バッファーは、約0.25M〜約1.5Mのアルギニンを含む。さらなる実施形態において、洗浄バッファーは、約0.25M〜約2Mのアルギニンを含む。さらなる実施形態において、洗浄バッファーは、約0.5M〜約2Mのアルギニンを含む。なおも別の実施形態において、洗浄バッファーは、約0.75M〜約1.5Mのアルギニンを含む。さらなる実施形態において、洗浄バッファーは、約1M、約1.1M、約1.2M、約1.3M、約1.4M、約1.5M、約1.6M、約1.7M、約1.8M、約1.9M、又は約2Mのアルギニンを含む。一実施形態において、洗浄バッファーは、約0.5M〜約2Mのアルギニン、特に、約0.75M〜約2Mのアルギニンを含む。さらなる実施形態において、洗浄バッファーは、約1Mを上回るアルギニンを含む。
【００６７】
「アルギニン」への参照は、天然のアミノ酸を指すだけでなく、アルギニン誘導体又はその塩、例えば、アルギニンHCl、アセチルアルギニン、アグマチン、アルギニン酸、N-アルファ-ブチロイル-L-アルギニン、又はN-アルファ-ピバロイルアルギニンも包含することが、理解される。
【００６８】
或いは、アルギニンは、最初の洗浄バッファーに含まれてもよい(すなわち、同時に使用されてもよい)。したがって、一態様において、本発明は、宿主細胞タンパク質(HCP)から組換えポリペプチドを精製する方法であって、(a)組換えポリペプチド及びHCPを含む溶液を、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体にアプライするステップ、(b)スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体を、約100mM〜約850mMのカプリル酸塩及び約0.25M〜約1.5Mのアルギニンを含む洗浄バッファーで洗浄するステップ、並びに(c)組換えポリペプチドを、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体から溶出するステップを含む、方法を提供する。本明細書に記載される実施例において示されるように、カプリル酸塩及びアルギニンの組合せを含むスーパー抗原クロマトグラフィー洗浄液は、特に、除去することが特に困難な2つの宿主細胞タンパク質であるPLBL2及びカテプシンLの除去に関して、宿主細胞タンパク質クリアランスの改善という予期されない相乗効果を有した。
【００６９】
一実施形態において、洗浄バッファーは、約100mM〜約750mMのカプリル酸塩、約100mM〜約500mMのカプリル酸塩、約100mM〜約400mMのカプリル酸塩、約100mM〜約350mMのカプリル酸塩、若しくは約100mM〜約300mMのカプリル酸塩、及び/又は約0.25M〜約2Mのアルギニン、約0.5M〜約1.5Mのアルギニン、若しくは約0.5M〜約1Mのアルギニンを含む。
【００７０】
一実施形態において、洗浄バッファーは、約100mM〜約750mMのカプリル酸ナトリウム、約100mM〜約500mMのカプリル酸ナトリウム、約100mM〜約400mMのカプリル酸ナトリウム、約100mM〜約350mMのカプリル酸ナトリウム、若しくは約100mM〜約300mMのカプリル酸ナトリウム、及び/又は約0.25M〜約2Mのアルギニン、約0.5M〜約1.5Mのアルギニン、若しくは約0.5M〜約1Mのアルギニンを含む。
【００７１】
一実施形態において、洗浄バッファーは、約0.5M〜約2Mのアルギニン及び約50mM〜約750mMのカプリル酸ナトリウム、約0.5M〜約1.5Mのアルギニン及び約50mM〜約500mMのカプリル酸ナトリウム、又は約0.5M〜約1.5Mのアルギニン及び約50mM〜約250mMのカプリル酸ナトリウムを含む。
【００７２】
一実施形態において、洗浄バッファーは、約0.5M〜約1Mのリジン、例えば、約0.75Mリジンをさらに含む。この実施形態において、リジンは、最初の洗浄バッファーに含まれる(すなわち、同時に使用される)。代替的な実施形態において、リジンは、別個の洗浄バッファーに含まれる(すなわち、逐次的に使用される)。本明細書に提供される実施例において示されるように、リジンの添加により、溶出体積の低減が成功したことが示された。
【００７３】
組換えポリペプチド
本明細書において使用される「結合性タンパク質」という用語は、抗原に結合することができる抗体及び他のタンパク質コンストラクト、例えば、ドメインを指す。
【００７４】
「抗体」という用語は、本明細書において、免疫グロブリン様ドメイン(例えば、IgG、IgM、IgA、IgD、又はIgE)を有する分子を指して最も広義において使用され、これには、モノクローナル抗体、組換え抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体を含む多重特異性抗体、及びヘテロコンジュゲート抗体、単一可変ドメイン(例えば、VH、VHH、VL、ドメイン抗体(dAb(商標)))、抗原結合性抗体フラグメント、Fab、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合Fv、一本鎖Fv、ジスルフィド結合scFv、ダイアボディ、TANDABS(商標)など、並びに前述のもののいずれかの改変バージョンが含まれる。
【００７５】
代替的な抗体形式としては、抗原結合性タンパク質の1つ以上のCDRを、好適な非免疫グロブリンタンパク質足場又は骨格に配置することが可能な代替的な足場、例えば、アフィボディ、SpA足場、LDL受容体クラスAドメイン、アビマー、又はEGFドメインが挙げられる。
【００７６】
一実施形態において、ポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチドである。一実施形態において、抗原結合性ポリペプチドは、抗体、抗体フラグメント、免疫グロブリン単一可変ドメイン(dAb)、mAbdAb、Fab、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、閉構造多重特異性抗体、ジスルフィド結合scFv、ダイアボディ、又は可溶性受容体からなる群から選択される。さらなる実施形態において、抗原結合性タンパク質は、抗体、例えば、モノクローナル抗体(mAb)である。組換えポリペプチド、産物分子、及びmAbという用語は、本明細書において互換可能に使用される。抗体は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はドメイン抗体であり得る。
【００７７】
Fv、Fc、Fd、Fab、又はF(ab)2という用語は、それらの標準的な意味で使用される(例えば、Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)を参照されたい)。
【００７８】
「キメラ抗体」は、ドナー抗体に由来する天然に存在する可変領域(軽鎖及び重鎖)を、アクセプター抗体に由来する軽鎖及び重鎖定常領域とともに含む、操作抗体の一種を指す。
【００７９】
「ヒト化抗体」は、そのCDRが非ヒトドナー免疫グロブリンに由来し、分子の残りの免疫グロブリンに由来する部分が、1つ(又はそれ以上の)ヒト免疫グロブリンに由来する、操作抗体の一種を指す。加えて、フレームワーク支持残基は、結合親和性を保存するように変更されていてもよい(例えば、Queen et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10032, Hodgson et al., (1991) Bio/Technology, 9:421を参照されたい)。好適なヒトアクセプター抗体は、従来的なデータベース、例えば、KABAT.RTM.データベース、Los Alamosデータベース、及びSwiss Proteinデータベースから、ドナー抗体のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列に対する相同性によって選択されるものであり得る。ドナー抗体のフレームワーク領域に対する相同性(アミノ酸に基づく)によって特徴付けられるヒト抗体は、ドナーCDRの挿入のための重鎖定常領域及び/又は重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに好適であり得る。軽鎖定常領域又は可変フレームワーク領域を供与することができる好適なアクセプター抗体は、類似の様式で選択することができる。アクセプター抗体の重鎖及び軽鎖は、同じアクセプター抗体を起源とする必要はないことに留意されたい。先行技術では、そのようなヒト化抗体を産生するいくつかの手段が記載されており、例えば、EP-A-0239400及びEP-A-054951を参照されたい。
【００８０】
「ドナー抗体」という用語は、変更された免疫グロブリンコーディング領域を提供し、その結果ドナー抗体の特徴的な抗原特異性及び中和活性を有する変更された抗体が発現されるように、抗体の可変領域、CDR、又は他の機能性フラグメント、又はその類似体のアミノ酸配列を、第1の免疫グロブリンパートナーに供与する、抗体(モノクローナル及び/又は組換え)を指す。「アクセプター抗体」という用語は、その重鎖及び/若しくはその軽鎖フレームワーク領域、並びに/又はその重鎖及び/若しくは軽鎖定常領域をコードするアミノ酸配列のすべて(又は任意の部分であるが、いくつかの実施形態ではすべて)を、第1の免疫グロブリンパートナーに供与する、ドナー抗体とは異種である抗体(モノクローナル及び/又は組換え)を指す。ある特定の実施形態では、ヒト抗体は、アクセプター抗体である。
【００８１】
「CDR」は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の超可変領域である、抗体の相補性決定領域アミノ酸配列として定義される。例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)を参照されたい。免疫グロブリンの可変部分には、3つの重鎖及び3つの軽鎖CDR(又はCDR領域)がある。したがって、本明細書において使用される「CDR」は、3つすべての重鎖CDR、又は3つすべての軽鎖CDR(又は適切な場合には、すべての重鎖及びすべての軽鎖CDRの両方)を指す。抗体の構造及びタンパク質フォールディングは、他の残基が、抗原結合性領域の一部であると考えられることを意味し得、当業者によりそのように理解されるであろう(例えば、Chothia et al., (1989) Nature 342:877-883を参照されたい)。
【００８２】
「VH」及び「VL」という用語は、本明細書において、それぞれ、抗原結合性タンパク質の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を指して使用される。
【００８３】
本明細書全体を通じて、可変ドメイン配列及び全長抗体配列におけるアミノ酸残基は、Kabatの番号付け慣例に従って番号付けされている。同様に、実施例において使用される「CDR」、「CDRL1」、「CDRL2」、「CDRL3」、「CDRH1」、「CDRH2」、「CDRH3」という用語は、Kabatの番号付け慣例に従う。さらなる情報については、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1991)を参照されたい。
【００８４】
当業者には、可変ドメイン配列及び全長抗体配列におけるアミノ酸残基の代替的な番号付け慣例が存在することが明らかである。CDR配列の代替的な番号付け慣例、例えば、Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883に記載されるものも存在する。抗体の構造及びタンパク質フォールディングは、他の残基が、CDR配列の一部と考えられることを意味し得、当業者によりそのように理解されるであろう。
【００８５】
当業者に利用可能なCDR配列の他の番号付け慣例としては、「AbM」(University of Bath)及び「contact」(University College London)の方法が挙げられる。Kabat、Chothia、AbM、及びcontact方法のうちの少なくとも2つを使用して最小オーバーラッピング領域を決定して、「最小結合ユニット」を得ることができる。最小結合ユニットは、CDRの一部分であり得る。
【００８６】
クエリー核酸配列と対象核酸配列との間の「同一性パーセント」は、割合として表される「同一性」値であり、これは、ペアワイズのBLASTNアライメントを行った後に、対象核酸配列が、クエリー核酸配列との100%クエリーカバレッジを有する場合に、BLASTNアルゴリズムによって計算される。クエリー核酸配列と対象核酸配列との間のそのようなペアワイズのBLASTNアライメントは、National Center for Biotechnology Instituteのウェブサイトで利用可能なBLASTNアルゴリズムのデフォルト設定を、低複雑性領域のフィルターをオフにして使用することにより、行われる。
【００８７】
クエリーアミノ酸配列と対象アミノ酸配列との間の「同一性パーセント」は、割合として表される「同一性」値であり、これは、ペアワイズのBLASTPアライメントを行った後に、対象アミノ酸配列が、クエリーアミノ酸配列との100%のクエリーカバレッジを有する場合に、BLASTPアルゴリズムによって計算される。クエリーアミノ酸配列と対象アミノ酸配列との間のそのようなペアワイズのBLASTPアライメントは、National Center for Biotechnology Instituteのウェブサイトで利用可能なBLASTPアルゴリズムのデフォルト設定を、低複雑性領域のフィルターをオフにして使用することにより、行われる。
【００８８】
クエリー配列は、対象配列と100%同一であってもよく、又はそれは、同一性%が、100%未満となるように、対象配列と比較して、最大である特定の整数個までのアミノ酸若しくはヌクレオチド変更を含んでもよい。例えば、クエリー配列は、対象配列に対して少なくとも50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98、又は99%同一である。そのような変更としては、少なくとも1つのアミノ酸欠失、置換(保存的置換及び非保存的置換を含む)、又は挿入が挙げられ、ここで、この変更は、クエリー配列のアミノ末端若しくはカルボキシ末端の位置、又はそれらの末端位置の間の任意の場所に生じてもよく、クエリー配列のアミノ酸又はヌクレオチド間に個別に散在していてもよく、又はクエリー配列内の1つ以上の連続した群に生じてもよい。
【００８９】
同一性%は、CDRを含む、クエリー配列の長さ全体にわたって決定され得る。或いは、同一性%は、CDRを除外してもよく、例えば、CDRは、対象配列に対して100%同一であり、同一性%の変動は、クエリー配列の残りの部分に存在し、そのため、CDR配列は固定/インタクトである。
【００９０】
本明細書において使用される場合、「ドメイン」という用語は、タンパク質の残りの部分とは独立した三次構造を有する、フォールディングされたタンパク質構造を指す。一般に、ドメインは、タンパク質の別個の機能的特性を担い、多くの場合には、タンパク質及び/又はドメインの残りの部分の機能の消失なしに、付加、除去、又は他のタンパク質へ移動され得る。「抗体単一可変ドメイン」は、抗体可変ドメインの特徴的な配列を含む、フォールディングされたポリペプチドドメインである。したがって、それには、完全な抗体可変ドメイン及び改変された可変ドメイン、例えば、1つ以上のループが、抗体可変ドメインに特徴的ではない配列によって置き換えられているもの、或いはトランケートされているか、又はN末端若しくはC末端伸長を含む、抗体可変ドメイン、並びに少なくとも全長ドメインの結合活性及び特異性を保持する可変ドメインのフォールディングされたフラグメントが含まれる。
【００９１】
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という語句は、異なるV領域又はドメインから独立して抗原又はエピトープに特異的に結合する、抗体可変ドメイン(VH、VHH、VL)を指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の領域又はドメインが、単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合に必要とされない場合(すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインが、追加の可変ドメインから独立して抗原に結合する場合)、他の異なる可変領域又は可変ドメインを有する形式(例えば、ホモ又はヘテロ多量体)で存在してもよい。「ドメイン抗体」又は「dAb」は、この用語が本明細書において使用される場合、抗原に結合することができる「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであり得るが、他の種、例えば、げっ歯類(例えば、WO 00/29004に開示されるように)、コモリザメ(nurse shark)、及びラクダ科動物VHH dAb(ナノボディ)に由来する単一抗体可変ドメインも含む。ラクダ科動物VHHは、天然に軽鎖が欠如している重鎖抗体を産生する、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、及びグアナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。そのようなVHHドメインは、当該技術分野において利用可能な標準的な技法に従ってヒト化することができ、そのようなドメインは、依然として、本発明による「ドメイン抗体」であると考えられる。本明細書において使用される場合、「VH」は、ラクダ科動物VHHドメインを含む。NARVは、コモリザメを含む軟骨魚類において特定された別の種類の免疫グロブリン単一可変ドメインである。これらのドメインはまた、新規な抗原受容体可変領域(V(NAR)又はNARVと略されることが多い)としても知られている。さらなる詳細については、Mol. Immunol. (2006) 44, 656-665及びUS2005/0043519を参照されたい。
【００９２】
「mAbdAb」及び「dAbmAb」という用語は、本明細書において、モノクローナル抗体及び少なくとも1つの単一ドメイン抗体を含む抗原結合性タンパク質を指して、使用される。これら2つの用語は、互換可能に使用することができ、本明細書において使用される場合、同じ意味を有することが意図される。
【００９３】
多くの場合、宿主細胞タンパク質からの組換えポリペプチドの精製は、組換えポリペプチドのフラグメント化をもたらす。出願者らは、本明細書に記載される精製方法を用いた場合に、組換えポリペプチドのフラグメント化の量が、有意に低減されることを見出した。一実施形態において、溶出される組換えポリペプチドは、約10%未満、約9%未満、約8%未満、約7%未満、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、又は約1%未満のフラグメント化された組換えポリペプチドを含む。別の実施形態において、組換えポリペプチドは、抗体であり、溶出される抗体は、約10%未満、約9%未満、約8%未満、約7%未満、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、又は約1%未満のフラグメント化された抗体を含む。
【００９４】
ICOS抗体
本明細書において使用される場合、「ICOS」は、任意の誘導性T細胞共刺激タンパク質を意味する。ICOS(誘導性T細胞共刺激因子)の別称としては、AILIM、CD278、CVID1、JTT-1若しくはJTT-2、MGC39850、又は8F4が挙げられる。ICOSは、活性化されたT細胞上に発現される、CD28スーパーファミリーの共刺激分子である。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、CD28及びCTLA-4細胞表面受容体ファミリーに属する。これは、ホモ二量体を形成し、細胞-細胞シグナル伝達、免疫応答、及び細胞増殖の調節において重要な役割を果たす。ヒトICOS(アイソフォーム2)(アクセッション番号:UniProtKB-Q9Y6W8-2)のアミノ酸配列は、配列番号9として以下に示される。
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【００９５】
ヒトICOS(アイソフォーム1)(アクセッション番号:UniProtKB-Q9Y6W8-1)のアミノ酸配列は、配列番号10として以下に示される。
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【００９６】
ICOSの活性化は、ICOS-L(B7RP-1/B7-H2)による結合を通じて生じる。B7-1又はB7-2(CD28及びCTLA4のリガンド)のいずれも、ICOSに結合することもそれを活性化することもない。しかしながら、ICOS-Lは、CD28及びCTLA-4の両方に、弱く結合することが示されている(Yao S et al., "B7-H2 is a costimulatory ligand for CD28 in human", Immunity, 34(5); 729-40 (2011))。ICOSの発現は、T細胞に制限されているとみられる。ICOSの発現レベルは、異なるT細胞サブセット間及びT細胞活性化状態において、変動する。ICOSの発現は、休止中のTH17細胞、濾胞性ヘルパーT(TFH)細胞、及び制御性T(Treg)細胞上で示されているが、しかしながら、CD28とは異なり、ナイーブTH1及びTH2エフェクターT細胞集団上では高度に発現されない(Paulos CM et al., "The inducible costimulator (ICOS) is critical for the development of human Th17 cells", Sci Transl Med, 2(55); 55ra78 (2010))。ICOSの発現は、CD4+及びCD8+エフェクターT細胞上で、TCR結合を通じた活性化の後に、高度に誘導される(Wakamatsu E, et al., "Convergent and divergent effects of costimulatory molecules in conventional and regulatory CD4+ T cells", Proc Natal Acad Sci USA, 110(3); 1023-8 (2013))。ICOS受容体を通じた共刺激シグナル伝達は、同時のTCR活性化シグナルを受容するT細胞においてのみ生じる(Sharpe AH and Freeman GJ. "The B7-CD28 Superfamily", Nat. Rev Immunol, 2(2); 116-26 (2002))。活性化された抗原特異的T細胞において、ICOSは、IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-4、IL-13、及びその他のものを含む、TH1及びTH2の両方のサイトカインの産生を調節する。ICOSはまた、CD28よりも低い程度ではあるが、エフェクターT細胞増殖を刺激する(Sharpe AH and Freeman GJ. "The B7-CD28 Superfamily", Nat. Rev Immunol, 2(2); 116-26 (2002))。ICOSに対する抗体及び疾患の処置において使用する方法は、例えば、WO 2012/131004、US20110243929、US20160304610、及びUS20160215059に記載されている。US20160215059は、参照により本明細書に組み込まれる。US20160304610に記載される例示的な抗体には、37A10S71が含まれる。37A10S713の重鎖、軽鎖、及びCDRの配列は、配列番号11〜18として以下に再現されている。
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【００９７】
本明細書において使用される「ICOS結合性タンパク質」という用語は、ICOSに結合することができる抗体及び他のタンパク質コンストラクト、例えば、ドメインを指す。いくつかの事例において、ICOSは、ヒトICOSである。「ICOS結合性タンパク質」という用語は、「ICOS抗原結合性タンパク質」と互換可能に使用することができる。したがって、当該技術分野において理解されているように、抗ICOS抗体及び/又はICOS抗原結合性タンパク質は、ICOS結合性タンパク質と考えられるであろう。本明細書において使用される場合、「抗原結合性タンパク質」は、抗原、例えば、ICOSに結合する、本明細書に記載される抗体、ドメイン、及び他のコンストラクトを含むがこれらに限定されない、任意のタンパク質である。本明細書において使用される場合、ICOS結合性タンパク質の「抗原結合性部分」は、抗原結合性抗体フラグメントを含むがこれに限定されない、ICOSに結合することができるICOS結合性タンパク質の任意の部分を含み得る。
【００９８】
一実施形態において、本発明のICOS抗体は、以下のCDRのうちのいずれか1つ又は組合せを含む。
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【００９９】
いくつかの実施形態において、本発明の抗ICOS抗体は、配列番号7に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、重鎖可変領域を含む。好適には、本発明のICOS結合性タンパク質は、配列番号7に対して約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有する、重鎖可変領域を含み得る。
【０１００】
ヒト化重鎖(VH)可変領域(H2):
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【０１０１】
本発明の一実施形態において、ICOS抗体は、配列番号8に記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域において、CDRL1(配列番号4)、CDRL2(配列番号5)、及びCDRL3(配列番号6)を含む。配列番号8に記載されるヒト化軽鎖可変領域を含む本発明のICOS結合性タンパク質は、「L5」と表記される。したがって、配列番号7の重鎖可変領域及び配列番号8の軽鎖可変領域を含む本発明のICOS結合性タンパク質は、本明細書において、H2L5と表記され得る。本明細書の実施例において、mAb5は、配列番号7の重鎖可変領域及び配列番号8の軽鎖可変領域を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、本発明のICOS結合性タンパク質は、配列番号8に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。好適には、本発明のICOS結合性タンパク質は、配列番号8に対して約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含み得る。
【０１０３】
ヒト化軽鎖(VL)可変領域(L5)
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【０１０４】
CDR又は最小結合単位は、少なくとも1つのアミノ酸置換、欠失、又は付加によって改変され得、ここで、バリアントの抗原結合性タンパク質は、改変されていないタンパク質、例えば、配列番号7及び配列番号8を含む抗体の生物学的特徴を実質的に保持する。
【０１０５】
CDR H1、H2、H3、L1、L2、L3のそれぞれが、単独で、又は任意の他のCDRと任意の順列若しくは組合せで組み合わせて、改変され得ることが理解される。一実施形態において、CDRは、最大3個のアミノ酸、例えば、1又は2個のアミノ酸、例えば、1個のアミノ酸の置換、欠失、又は付加によって改変される。典型的には、改変は、例えば、以下の表1に示されるような、置換、特に、保存的置換である。
【０１０６】
【表１−２】
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【０１０７】
抗体のサブクラスは、部分的に、二次エフェクター機能、例えば、補体活性化又はFc受容体(FcR)結合、及び抗体依存性細胞毒性(ADCC)を決定する(Huber, et al., Nature 229(5284): 419-20 (1971)、Brunhouse, et al., Mol Immunol 16(11): 907-17 (1979))。特定の用途に最適な抗体の種類を特定するに当たり、抗体のエフェクター機能が考慮され得る。例えば、hIgG1抗体は、比較的長い半減期を有し、補体への結合に非常に有効であり、FcγRI及びFcγRIIの両方に結合する。対照的に、ヒトIgG4抗体は、半減期が短く、補体に結合せず、FcRに対して低い親和性を有する。IgG4のFc領域におけるセリン228のプロリンとの置換(S228P)は、hIgG4で観察される不均一さを低減させ、血清半減期を延長させる(Kabat, et al., "Sequences of proteins of immunological interest" 5.sup.th Edition (1991)、Angal, et al., Mol Immunol 30(1): 105-8 (1993))。ロイシン235をグルタミン酸と置き換える第2の変異(L235E)により、残りのFcR結合及び補体結合活性が排除される(Alegre, et al., J Immunol 148(11): 3461-8 (1992))。結果として得られる両方の変異を有する抗体は、IgG4PEと称される。hIgG4アミノ酸の番号付けは、EU番号付け参考文献から得られた: Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969). PMID: 5257969。本発明の一実施形態において、ICOS抗体は、IgG4アイソタイプである。一実施形態において、ICOS抗体は、置換S228P及びL235Eを含むIgG4 Fc領域を含み、表記IgG4PEを有し得る。本明細書の実施例において、mAb5は、変異S228P及びL235Eを含むIgG4 Fc領域を含む。
【０１０８】
本明細書において使用される場合、「ICOS-L」及び「ICOSリガンド」は、互換可能に使用され、ヒトICOSの膜結合型の天然のリガンドを指す。ICOSリガンドは、ヒトにおいてはICOSLG遺伝子によってコードされる、タンパク質である。ICOSLGはまた、CD275(分化のクラスター275)とも表記される。ICOS-Lの別称としては、B7RP-1及びB7-H2が挙げられる。
【０１０９】
宿主細胞タンパク質
「混入物」は、スーパー抗原クロマトグラフィーの前のロードサンプル中、又はスーパー抗原クロマトグラフィーの後の溶出液中に存在する、任意の外来又は望ましくない分子を指す。「プロセス混入物」が存在する場合がある。これらは、目的のタンパク質が産生されるプロセスの結果として存在する混入物である。例えば、これらには、宿主細胞タンパク質(HCP)、RNA、及びDNAが含まれる。「HCP」は、細胞内及び/又は分泌タンパク質を含め、細胞培養又は発酵中に宿主細胞によって産生される、目的のタンパク質とは無関係のタンパク質を指す。宿主細胞タンパク質の例は、プロテアーゼであり、これは、精製中及び精製後に依然として存在する場合、目的のタンパク質に損傷を引き起こし得る。例えば、プロテアーゼが、目的のタンパク質を含むサンプル中に残っている場合、これは、もともとは存在していなかった、産物関連の物質又は混入物を生じる可能性がある。プロテアーゼの存在は、精製プロセス中、及び/又は最終製剤において、経時的に目的のタンパク質の減衰、例えば、フラグメント化を引き起こし得る。
【０１１０】
一実施形態において、宿主細胞タンパク質は、哺乳動物細胞又は細菌細胞から産生される/それに由来する。さらなる実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト又はげっ歯類(例えば、ハムスター若しくはマウス)細胞から選択される。なおもさらなる実施形態において、ヒト細胞は、HEK細胞であり、ハムスター細胞は、CHO細胞であり、又はマウス細胞は、NS0細胞である。
【０１１１】
ある特定の実施形態において、宿主細胞は、CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、K562細胞、BHK細胞、PER.C6細胞、及びHEK細胞からなる群から選択される(すなわち、宿主細胞タンパク質は、これらの宿主細胞に由来する)。或いは、宿主細胞は、大腸菌(E. coli)(例えば、W3110、BL21)、枯草菌(B. subtilis)、及び/又は他の好適な細菌からなる群から選択される細菌細胞、真核細胞、例えば、真菌又は酵母細胞(例えば、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、アスペルギルス種(Aspergillus sp.)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)、アカパンカビ(Neurospora crassa))であり得る。
【０１１２】
「溶液」は、細胞培養培地、例えば、細胞培養供給液（feedstream）であり得る。供給液は、濾過され得る。溶液は、清澄化未処理ブロス(Clarified Unprocessed Broth)(CUB)(又は清澄化発酵ブロス/上清)であり得る。CUBはまた、任意の細胞及び/又は細胞残屑が清澄化によって除去された、細胞培養上清としても知られている。溶液は、タンパク質を発現する細胞の溶解調製物であり得る(例えば、溶液は、溶解物である)。
【０１１３】
プロセス混入物にはまた、細胞を成長させるため又は目的のタンパク質の発現を確実にするために使用される成分、例えば、溶媒(例えば、酵母細胞を培養するために使用されるメタノール)、抗生物質、メトトレキサート(MTX)、培地成分、凝集剤なども含まれる。また、前のステップ中にサンプル中に浸出するスーパー抗原固相の一部である分子、例えば、プロテインA、プロテインG、又はプロテインLも含まれる。
【０１１４】
混入物には、「産物関連バリアント」も含まれ、これには、活性を保持するが構造が異なるタンパク質、及び構造の違いが原因で活性を失ったタンパク質が含まれる。これらの産物関連バリアントとしては、例えば、高分子量種(HMWs)、低分子量種(LMWs)、凝集タンパク質、前駆体、分解タンパク質、ミスフォールドタンパク質、低ジスルフィド結合タンパク質、フラグメント、及び脱アミド化種が挙げられる。
【０１１５】
洗浄ステップが成功したかどうかを確認するために、溶出液中のこれらの混入物のうちのいずれか1つの存在を、測定することができる。例えば、本発明者らは、産物1mg当たりのHCPのng数として表されるHCPのレベルの低減を示した(実施例を参照されたい)。或いは、検出されたHCPは、ng/mgと同等である「百万分率」若しくは「ppm」として表してもよく、又はpg/mgと同等である「ppb」(「十億分率」)として表してもよい。
【０１１６】
一実施形態において、ステップ(c)の後に、HCPの量は、産物1mg当たり約200ng(すなわち、ng/mg)未満のHCP、約150ng/mg未満、約100ng/mg未満、約50ng/mg未満、又は約20ng/mg未満である。
【０１１７】
低減はまた、脂肪族カルボン酸塩を用いない対照洗浄ステップと比較して、及び/又は精製前の溶液(例えば、清澄化未処理ブロス)と比較して、示すことができる。
【０１１８】
一実施形態において、ステップ(c)の後に、以前に公開された100mMのカプリル酸塩の洗浄液(例えば、WO2014/141150を参照されたい)と比較したHCPの相対低減係数は、約2倍〜約50倍である。したがって、一実施形態において、ステップ(c)の後に、100mMのカプリル酸塩から本質的になる洗浄バッファーと比較したHCPの相対低減係数は、約2倍〜約50倍である。さらなる実施形態において、相対低減係数は、少なくとも約2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、又は50倍である。疑念を回避するため、「100mMのカプリル酸塩から本質的になる洗浄バッファー」への言及は、100mMのカプリル酸塩の洗浄液の基本的特徴に実質的に影響を及ぼさない追加の成分、例えば、緩衝塩及び/又は酢酸ナトリウムの存在を排除するものではない。
【０１１９】
一実施形態において、溶出液からの目的のタンパク質の回収は、本発明の洗浄ステップの後に、100%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、70%、60%、50%、又はそれ未満であり、100%〜50%の範囲内のいずれの離散値、又はこの範囲内の離散値の任意の対によって定義されるいずれの部分範囲も含む。一実施形態において、溶出液からの目的のタンパク質の回収は、70%を上回る、例えば、75%を上回る、80%を上回る、85%を上回る、90%を上回る、95%を上回る、又は99%を上回る。溶出液における回収パーセント(%)は、溶出液中の目的のタンパク質の量を、以下の式に従って、カラムにアプライされた目的のタンパク質の量に占める割合として決定することによって、計算される。
回収割合=溶出液中の産物の量÷カラムにアプライされた産物の量×100
【０１２０】
溶出液中に存在する混入物(すなわち、宿主細胞タンパク質)の量は、ELISA、OCTET、又は上述の混入物のうちの1つ以上のレベルを決定する他の方法によって決定することができる。本明細書に記載される実施例において、ELISA方法を使用して、サンプル中のHCPのレベルを決定する。
【０１２１】
一実施形態において、宿主細胞タンパク質は、PLBL2(ホスホリパーゼB様2タンパク質)及び/又はカテプシンLから選択される。
【０１２２】
一実施形態において、宿主細胞タンパク質は、PLBL2である。したがって、本発明の一態様において、ホスホリパーゼB様2タンパク質(PLBL2)から組換えポリペプチドを精製する方法であって、(a)組換えポリペプチド及びPLBL2を含む溶液を、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体にアプライするステップ、(b)スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体を、約150mM〜約850mMのカプリル酸塩を含む洗浄バッファーで洗浄するステップ、並びに(c)組換えポリペプチドを、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体から溶出するステップを含む、方法が、提供される。
【０１２３】
本発明の別の態様において、ホスホリパーゼB様2タンパク質(PLBL2)から組換えポリペプチドを精製する方法であって、(a)組換えポリペプチド及びPLBL2を含む溶液を、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体にアプライするステップ、(b)スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体を、約55mM〜約850mMのカプリル酸塩及び約0.25M〜約1.5Mのアルギニンを含む洗浄バッファーで洗浄するステップ、並びに(c)組換えポリペプチドを、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体から溶出するステップを含む、方法が、提供される。
【０１２４】
本発明の別の態様において、ホスホリパーゼB様2タンパク質(PLBL2)から組換えポリペプチドを精製する方法であって、(a)組換えポリペプチド及びPLBL2を含む溶液を、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体にアプライするステップ、(b)スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体を、約100mMのカプリル酸塩及び約1.1Mのアルギニンを含む洗浄バッファーで洗浄するステップ、並びに(c)組換えポリペプチドを、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体から溶出するステップを含む、方法が、提供される。
【０１２５】
PLBL2は、産物分子への明白な結合に起因して、抗体、特に、mAb5(実施例を参照されたい)の下流プロセシング中に除去することが困難である、HCP混入物であることが見出されている。したがって、一実施形態において、組換えポリペプチドは、抗体、例えば、IgG抗体、特に、IgG4抗体である。PLBL2の量は、当該技術分野において公知の方法を使用して、例えば、ELISA、例えば、実施例に記載されるか又はWO2015/038884に開示されるPLBL2特異的ELISAによって、測定することができる。
【０１２６】
カテプシンLプロテアーゼは、CHO細胞培養中に産生され、これは、抗体、例えば、mAb3産物分子を分解し得る可能性がある(実施例を参照されたい)。したがって、一実施形態において、組換えポリペプチドは、抗体、例えば、IgG抗体、特に、IgG1抗体である。
【０１２７】
一実施形態において、宿主細胞タンパク質は、カテプシンLである。この実施形態において、カテプシンLからの組換えポリペプチドの精製は、ステップ(c)の溶出液におけるカテプシンL活性の低減によって測定することができる(例えば、PromoKine PK-CA577-K142による)。
【０１２８】
本発明の一態様において、カテプシンLから組換えポリペプチドを精製する方法であって、(a)組換えポリペプチド及びカテプシンLを含む溶液を、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体にアプライするステップ、(b)スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体を、約150mM〜約850mMのカプリル酸塩を含む洗浄バッファーで洗浄するステップ、並びに(c)組換えポリペプチドを、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体から溶出するステップを含む、方法が、提供される。
【０１２９】
本発明の別の態様において、カテプシンLから組換えポリペプチドを精製する方法であって、(a)組換えポリペプチド及びカテプシンLを含む溶液を、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体にアプライするステップ、(b)スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体を、約55mM〜約850mMのカプリル酸塩及び約0.25M〜約1.5Mのアルギニンを含む洗浄バッファーで洗浄するステップ、並びに(c)組換えポリペプチドを、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体から溶出するステップを含む、方法が、提供される。
【０１３０】
本発明の別の態様において、カテプシンLから組換えポリペプチドを精製する方法であって、(a)組換えポリペプチド及びカテプシンLを含む溶液を、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体にアプライするステップ、(b)スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体を、約150mMのカプリル酸塩及び約1.1Mのアルギニンを含む洗浄バッファーで洗浄するステップ、並びに(c)組換えポリペプチドを、スーパー抗原クロマトグラフィー固体支持体から溶出するステップを含む、方法が、提供される。
【０１３１】
本発明の一態様において、本明細書において定義される精製方法のうちのいずれか1つによって得られる精製された組換えポリペプチドが、提供される。
【０１３２】
本発明は、これより、以下の非限定的な実施例を参照して説明される。
【０１３３】
ポリソルベート分解
ポリソルベート、例えば、ポリソルベート20及びポリソルベート80は、最終的な製剤製品中のタンパク質医薬を安定させるために広く使用されている非イオン性界面活性剤である。ポリソルベートは、医薬製品中の残留酵素によって分解され得、これは、製品の最終的な貯蔵寿命に影響を及ぼし得る。理論により束縛されるものではないが、本明細書に記載される方法は、最終製品中の残留宿主細胞タンパク質の量を低減することによって、分解されるポリソルベートの量を低減する。一実施形態において、分解されるポリソルベートの量は、約50%未満、約40%未満、約30%未満、約20%未満、約10%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、又は約1%未満である。
【実施例】
【０１３４】
[実施例1]
プロテインA洗浄液中のpH及びカプリル酸ナトリウム濃度のスクリーニング及び最適化
序説
本明細書に記載される研究において、プロテインA洗浄液を、すべてのmAb産物について、2カラムのプロセス(プロテインAに続いてアニオン交換)で十分なHCP除去を達成するように最適化した。既存のプラットフォームプロセスは、多くの場合、求められるHCPレベルを達成するためには第2のポリッシングステップが必要である。クロマトグラフィーステップを排除することにより、プロセスが単純化され、より迅速なプロセス開発が可能となり、設備適合のリスクを軽減することができる。洗浄液最適化の戦略は、HCP-mAbの相互作用を破壊することによって、HCPクリアランスを改善することであった。様々な洗浄液添加剤及び洗浄液pHを、スクリーニングした後、プロテインAプロセスの総HCP除去について最適化した。
【０１３５】
材料及び方法
n-オクタン酸ナトリウム、氷酢酸、酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、ベンジルアルコール、及びtrizma塩基を、Sigma-Aldrich Chemical Co.(St. Louis, MO)から購入した。Millipore Milli-Q(登録商標)システムを使用してさらに精製した水を使用して、溶液を作製した。すべてのpH調節は、3Mのトリス塩基又は3Mの酢酸のいずれかを使用して行った。
【０１３６】
mAb産生のためのチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞培養
清澄化未処理ブロス(CUB)は、いくつかのGSK mAb産物、例えば、mAb1(IgG1、pI=8.7、MW=149kDa)、mAb2(IgG1、pI=8.3、MW=149kDa)、mAb3(IgG1、pI=7.9、MW=149kDa)、mAb4(IgG1、pI=8.6、MW=148kDa)、又はmAb5(IgG4、pI=7.1、MW=145kDa)のうちの1つを含有していた。mAb5は、配列番号7の重鎖可変領域及び配列番号8の軽鎖可変領域を含み、変異S228P及びL235Eを含むIgG4 Fc領域を含む。この研究において使用したすべてのmAbは、類似の方法を使用して産生及び採取した。例えば、mAb1は、2リットルの反応容器に、mAb1を発現するDG44細胞を、1.23〜1.24MM/mLの生存細胞数及び約93.8%の生存率で播種することによって調製した。培養物を、次いで、約34℃、pH約6.9、及び6g/Lのグルコースで、16日間維持した。撹拌速度は、約300rpmで維持した。培養後に、非清澄化細胞及びmAbを含む培養流体に、10,000gで20分間、バッチ遠心分離を行った。培養流体を、次いで、Nalgeneからの0.45μM及び0.2μMのSFCAフィルターを通して吸引濾過した。
【０１３７】
プロテインA精製
GE Healthcareから入手したMabSelect SuRe(商標)(MSS)プロテインA樹脂を、0.5cm径のカラムに、25cmの最終ベッド高まで充填した。樹脂は、重力沈降後に、AKTA Avant 25を使用して、475cm/時間の線形流動速度で、2時間、0.4MのNaCl中に流動充填した。2MのNaClを100μL注入することによって充填品質を評価して、非対称性が、1.0±0.2であり、1メートル当たり少なくとも1000プレートであることを確認した。すべてのプロテインA実験は、樹脂1mL当たり35mgのmAbというロード比を使用し、すべてのプロセス流動速度は、300cm/時間の線形速度と同等であった。プロテインAクロマトグラフィーの方法及びバッファーを、表2に記載する。
【０１３８】
【表２】
2021515764.tif 000011
【０１３９】
洗浄液最適化
これまでに研究により、多数の除去が困難なHCP混入物は、mAbと直接的に会合していることが示されており(Levy et al., (2014) Biotechnol. Bioeng. 111(5):904-912、Aboulaich et al., (2014) Biotechnol. Prog. 30(5):1114-1124)、HCP-mAbの相互作用を破壊する溶液条件により、プロテインA洗浄ステップ中のHCPクリアランスの改善がもたらされる可能性が高く、この研究において、様々な洗浄溶液を、この目的でスクリーニングし、最適化した。具体的には、様々なpHで、異なる濃度のカプリル酸ナトリウムを含有する洗浄溶液を、サンプルロード後に使用して、溶出の前にプロテインAに吸着されたmAbからのHCPのクリアランスを行った。それぞれの洗浄液のHCP除去の有効性を評価及び定量するために、以下のELISA方法の節に記載されるように、社内でHCP ELISAを開発した。カプリル酸ナトリウムは、プロテインA洗浄液において使用されると、強力なHCPクリアランスを提供することがこれまでに見出されている。しかしながら、これまでの研究は、100mM未満のカプリル酸ナトリウム濃度及びpH7.5に限定されていたため、初期スコーピング研究の後に、濃度及びpHの範囲にわたるカプリル酸ナトリウムのプロテインA洗浄液の挙動を特徴付けるための球状中心複合計画研究(spherical central composite design study)を行った。これらの計画を、以下の表3及び4に示す。統計学的モデリングは、以下の統計学的分析方法の節に従って完了した。
【０１４０】
分析
プロテインA収率
プロテインA収率は、Nanodrop 2000c(Thermo Scientific)を使用して溶出液中のmAb濃度を測定することによって決定した。それぞれの溶出液サンプルについて3回のNanodrop読取りを平均して、タンパク質濃度を決定し、プロテインA溶出液中の総mAb含量は、mAb濃度に溶出液体積(クロマトグラムから決定)を乗じることによって計算した。ロード中のmAb濃度は、Agilent 1100シリーズHPLCにおいて、POROS(登録商標)A 20μMのカラムを使用して、決定した。分析用プロテインAでのそれぞれのCUBサンプルの未加工データを、それぞれの特定のmAbについて濃度が判明している標準物と比較して、力価を計算した。総ロード体積に、測定された力価を乗じて、ロードされたmAbの総質量を計算し、収率は、溶出液中の総mAbをロード中の総mAbで除すことによって計算した。
【０１４１】
宿主細胞タンパク質(HCP)濃度の測定:HCP ELISA
CHO由来製品サンプル中の免疫原性HCPの総量を定量するために、HCP ELISAを使用した宿主細胞タンパク質分析を、社内で開発した(Mihara et al., (2015) J. Pharm. Sci. 104: 3991-3996)。このHCP ELISAは、特注のヤギ抗CHO HCPポリクローナル抗体及びCHO由来製品にわたる多製品用途の社内で産生したHCP参照標準物を使用して、開発した。
【０１４２】
統計学的分析
HCPクリアランス及び収率に関して洗浄性能を分析するために、スコーピング実験及び中心複合計画試験を行った。係数は、いずれも、-1、1単位のスケールでスケーリングし、一般的な線形モデルをデータに当てはめた。別個のモデルを、それぞれの応答に当てはめた。最終的なモデルを選択した後、残差に対するモデル仮定を評価し、適宜、変換を行った。すべてのモデル項は、5%有意水準に対して評価し、すべての二次因子項を含む全モデルで開始し、変数減少法(backwards elimination)を行った。
【０１４３】
MabSelect SuRe平衡等温線測定
MabSelect SuRe(商標)樹脂を、DI水中にバッファー交換して、約50%のスラリーを生成した。スラリーを、ResiQuotに添加し、家庭用真空ラインで乾燥させ、20.8μLの樹脂プラグを、96ディープウェルプレートに分配した。別個の96ウェルプレートにおいて、100、250、及び500mMのカプリル酸ナトリウムを有する、0〜10mg/mLのタンパク質溶液を生成した。それぞれの溶液のタンパク質濃度を測定した後、1mLを、それぞれの樹脂プラグに添加した。樹脂-タンパク質混合物を、撹拌により一晩平衡化した。UV 96ウェルプレート中に直接濾過することによって樹脂を除去し、最終濃度を測定した。吸着されたタンパク質濃度qを、以下の等式を用いて計算した。
【０１４４】
【数１】
2021515764.tif 000012
【０１４５】
結果及び考察
この節において提示される結果は、高濃度のカプリル酸ナトリウム(＞100mM)により、プロテインAクロマトグラフィー中に、これまでに公開されているカプリル酸ナトリウムに基づくプロテインA洗浄バッファーよりも、有意に多くの宿主細胞タンパク質(HCP)が除去されることを示す。これは、比較的高いHCPレベルを有するいくつかのmAbをモデルとして使用して実証され、統計学的実験計画によって確認された。試験したmAbのCUB(プロテインAロード)は、106〜107ng/mgのHCP濃度を有した。
【０１４６】
この研究の一次目標は、プロテインAクロマトグラフィーステップにわたって、洗浄バッファーのカプリル酸ナトリウム濃度及びpHのHCPクリアランスに対する影響を評価することであった。主要な目的は、二重にあった。第1には、カプリル酸ナトリウム濃度及びpHのすべての研究範囲にわたり、HCPに対する影響を理解することであった。スコーピング計画を使用して、両方のパラメーターの範囲全体を検討した(表3)。最大カプリル酸ナトリウム濃度は、1Mであり、pH範囲は、7〜9であった。第2の目的は、許容可能なステップ収率を維持しながら、HCPクリアランスに関して、カプリル酸ナトリウム濃度及びpHを最適化することであった。球状中心複合計画(CCD、表4)を、この最適化に使用した。スコーピング研究及びCCD研究のいずれも、mAb1をモデルmAbとして使用した。これらの初期研究から得られた知見を、さらなるmAbで試験した。スコーピング及びCCDの両方から得られた結果を、以下に提示する。
【０１４７】
【表３】
2021515764.tif 000013
【０１４８】
【表４】
2021515764.tif 000014
【０１４９】
CCD研究により得られた結果を、表5に提示する。全体として、プロテインA洗浄バッファーのpHは、HCPクリアランスに対する影響は最小限であった。500mM又は750mMのカプリル酸ナトリウムを含有する洗浄液は、試験した全pH範囲にわたって、ほぼ同一のHCPレベルを有した。統計学的分析を、方法の節に記載されるように行った。簡単に述べると、別個のモデルを、それぞれの応答(収率及びHCP)に当てはめ、モデル項を、F検定を使用して、5%有意水準に対して評価した。F検定により、洗浄液のpHが、HCP濃度に統計学的に有意な作用を有さなかったことが確認された。同様の分析により、pHが、収率パーセントに関して、有意な因子ではなかったことが確認された。
【０１５０】
【表５】
2021515764.tif 000015
【０１５１】
CCD結果の統計学的分析により、カプリル酸ナトリウム濃度が、HCPクリアランス及び収率パーセントの両方に関して、線形項及び二次項の両方で重要な因子であることが確認された。HCP濃度(ng/mg)は、カプリル酸ナトリウム濃度を、0から1Mへと増加させた場合に、2桁低減された(図1-収率パーセント(三角形、▲)及びHCP濃度(四角形、■))。しかしながら、カプリル酸ナトリウム濃度が250mMを上回って増加すると、収率は、90%超から70%に低下する(図1)。250mMを上回るカプリル酸ナトリウムのステップ収率のこの大幅な減少は、カプリル酸塩ミセルの形成に起因し得る。プロテインA洗浄バッファー中のカプリル酸塩の臨界ミセル濃度(CMC)は、実験により、340mMであることが判明した。カプリル酸ナトリウムの濃度を、250mMから500mMへと増加させた場合、収率に15%の低減があり、HCPには2.8%の減少のみがあった。これは、カプリル酸ナトリウムの遊離形態はHCP除去の活性形態であるが、CMCを上回るいずれの濃度でも、カプリル酸塩ミセルが収率低下を引き起こすため、収穫逓減を示すことを示し得る。
【０１５２】
[実施例2]
収率低下及び可能性のある軽減戦略の検討
CMCを上回る場合の収率パーセントの減少は、カプリル酸塩の遊離形態ではなく、カプリル酸塩ミセルが、プロテインAステップにわたり収率を低減させ得ることを示唆する。収率低下の性質を決定するために、様々なカプリル酸ナトリウム洗浄液を使用したプロテインAプロセスの溶出液、ストリップ、及び洗浄液画分において、mAb濃度を測定した(図2)。この結果は、高いカプリル酸ナトリウム濃度における収率低下は、洗浄ステップ中の脱離に起因していたことを示す。
【０１５３】
高カプリル酸ナトリウム洗浄中の収率低下をさらに特徴付けるために、平衡結合等温線を測定して、高カプリル酸ナトリウム濃度におけるmAbの能力の低下を決定した(図3)。これまでに公開されている100mMのカプリル酸ナトリウムを含有するカプリル酸塩洗浄液は、ラングミュアの等温線を用いて当てはめた場合、57g/Lの最大結合能を有した。吸着等温線は、250mMのカプリル酸ナトリウムでは類似であったが、500mMのカプリル酸ナトリウムでは、ラングミュアの等温線は、適合が不良であった。この結果により、高濃度のカプリル酸ナトリウム洗浄液が、プロテインA樹脂の結合能を減少させ、収率低下を引き起こすことが確認される。
【０１５４】
収率低下の原因を決定した後、収率低下を低減する方法を検討した。検討した2つの戦略は、洗浄液体積の減少及びロード比の減少であった。250mMのカプリル酸ナトリウムの洗浄液を、4、6、及び8CVで試験した。洗浄の長さを、8から4CVに減少させることにより、収率に2%の増加のみが得られ(表6)、HCP濃度は、31.0から35.8ng/mgに増加しただけであった。これにより、高カプリル酸ナトリウム洗浄液は、初期スコーピング研究及びCCD研究中に試験したものよりも小さな体積で許容可能なHCPレベルを達成することができることが示され、また、洗浄体積を小さくしても、高カプリル酸ナトリウム濃度による結合能の減少を補うわけではないことも示された。
【０１５５】
【表６】
2021515764.tif 000016
【０１５６】
プロテインA捕捉中のロード比の減少もまた、高濃度カプリル酸ナトリウム洗浄中の収率低下の軽減策として検討した(表7)。ロード比を、30mg/mlから10mg/mlに減少させると、収率は、250mM及び500mMのカプリル酸ナトリウムの洗浄液について、それぞれ、4.7%及び7.7%増加した。ロード比は、プロテインA溶出液中のHCP濃度に及ぼす影響が最小限であった。
【０１５７】
【表７】
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【０１５８】
[実施例3]
さらなるmAbによる改善された洗浄性能
前述のプロテインA洗浄液最適化研究は、mAb1のみをモデル産物として使用して完了した。CCD研究により、pHは、HCP除去に関して、重要な因子ではなかったことが確認された。統計学的分析及び後続の収率検討により、カプリル酸ナトリウム濃度は、最大400mMまでが最適であることが示された。250mMのカプリル酸ナトリウムの洗浄液のHCP除去が、これまでに開発された100mMのカプリル酸ナトリウムの洗浄液よりも改善されていることを確認するために、この節ではさらなるmAbを研究した。5つのmAbについて、プロテインA溶出液中のHCP濃度を、100又は250mMのいずれかのカプリル酸ナトリウムを含有する洗浄液で比較した(図4)。1つのmAb(mAb3)は、HCPレベルがより高い高細胞密度のプロセス、及び研究した他の分子と同程度である標準的なプロセスという2つの別個の上流プロセスを起源とした。
【０１５９】
mAb2を除き、ここで試験したすべてのmAbが、250mMのカプリル酸ナトリウムの洗浄液を使用した場合に、プロテインA溶出液中、100ng/mg未満であった。ほとんどの事例では、HCP濃度は、単純に洗浄液中のカプリル酸ナトリウム濃度を増加させることによって、およそ1桁改善された。加えて、これらのmAbは、高いカプリル酸ナトリウム濃度で許容可能なステップ収率及び産物の品質を有した。
【０１６０】
[実施例4]
カプリル酸ナトリウムに基づくプロテインA洗浄液へのアルギニンの添加
アミノ酸であるアルギニンは、脂肪酸であるカプリル酸ナトリウムと比較して、非常に異なる物理化学的特性を有する。これらの2つの添加剤間での構造の違いが、直交的なHCP除去機序をもたらし得る、すなわち、アルギニン及びカプリル酸塩の混合物が、単一の成分のみを含有する洗浄液よりも良好なHCP除去を有し得るという仮説を立てた。以下の研究を完了し、カプリル酸塩/アルギニン混合物について、総HCP除去及び特定のHCP除去の両方を評価した。
【０１６１】
カプリル酸塩/アルギニンプロテインA洗浄バッファーを用いた総HCPクリアランス
カプリル酸ナトリウム及びアルギニンの組合せを含有するプロテインA洗浄バッファーを、mAb1及びmAb2を用いて試験した。mAb2の結果を、図5に提示する。100mMのカプリル酸ナトリウム又は750mMのアルギニンのみを含有するプロテインA洗浄バッファーでは、700〜1300ng/mgのHCP濃度が得られた。カプリル酸ナトリウムの濃度を250mMに増加させることにより、上記で考察した「高カプリル酸ナトリウム」の結果と一致して、HCPクリアランスの大幅な改善が得られた。250mMのカプリル酸ナトリウムを含有するpH8.5の洗浄液では、プロテインA溶出液中、273ng/mgのHCPがもたらされた。カプリル酸塩に基づくプロテインA洗浄液へのアルギニンの添加により、HCP除去がさらに改善され、pH7.5又は8.5のいずれでも、750mMのアルギニンを有する250mMのカプリル酸ナトリウムでは、それぞれ、209及び144ng/mgのHCP濃度がもたらされた。
【０１６２】
同様のカプリル酸塩/アルギニン研究を、mAb1を用いて完了した。mAb1は、「標準的な」流加培養バイオリアクター及び高細胞密度プロセスの2つの別個の上流プロセスを起源とした。高細胞密度プロセスでは、高い産物力価及びHCP濃度が得られた。これは、「最悪の場合」の供給材料として、この研究に含めた。結果を、図6に提示する。
【０１６３】
全体としては、mAb1の結果は、図5において提示されたmAb2の知見と類似である。標準的なmAb1供給液及び高密度材料の両方について、カプリル酸ナトリウムを100から250mMに増加させることによって、HCPクリアランスの改善がみられた。加えて、500mMのアルギニンは、いずれのカプリル酸ナトリウムのみの洗浄液よりも良好なHCPクリアランスを有した。しかしながら、カプリル酸ナトリウム及びアルギニンの両方を有する洗浄液は、混合物として、又は逐次的な洗浄液のアプライによってのいずれでも、いずれかの成分個別よりも改善されたHCPクリアランスを示した。250mMのカプリル酸ナトリウム及び750mMのアルギニンを含有するpH8.5の洗浄液が、もっとも良好な性能であった。高カプリル酸ナトリウム及びアルギニンのこの組合せは、高密度及び標準的なmAb1について、それぞれ、113及び67ng/mgのプロテインA溶出液をもたらした。
【０１６４】
[実施例5]
PLBL2を除去するためのカプリル酸塩/アルギニンのプロテインA洗浄液
PLBL2は、産物分子への明白な結合に起因して、IgG4であるmAb5の下流プロセシング中に除去することが困難である、特定のHCP混入物である。mAb5は、配列番号7の重鎖可変領域及び配列番号8の軽鎖可変領域を含み、変異S228P及びL235Eを含むIgG4 Fc領域を含む。この特定のHCP混入物は、下流プロセシング中にIgG4産物に結合することがこれまでに見出されている。PLBL2はまた、HCP ELISA分析中に、「希釈の非線形性(dilutional non-linearity)」を引き起こす。高カプリル酸ナトリウム濃度及び/又はアルギニンを含有するプロテインA洗浄液を、mAb5のプロテインAステップ中のPLBL2除去に関して試験した。
【０１６５】
洗浄液を、最大で750mMのカプリル酸ナトリウム濃度、7.5及び8.5のpH、並びに最大で1Mのアルギニン濃度で試験した。それぞれのプロテインA洗浄液試験について、総PLBL2濃度(図7、PLBL2特異的ELISAを使用して測定)を、総HCP(図8)及びステップ収率(図9)とともに報告した。
【０１６６】
PLBL2濃度は、異なる試験洗浄液について、ほぼ1から600ng/mgで変動した。アルギニンを含有せず、100mM未満のカプリル酸ナトリウムを含有する洗浄液は、性能がもっとも悪く、およそ600ng/mgのPLBL2を有するプロテインA溶出液をもたらした。カプリル酸ナトリウム濃度を250mMに増加させることにより、PLBL2は、約100ng/mgまで低減され、250mMを上回るカプリル酸ナトリウム濃度は、PLBL2を約50ng/mgまで減少させ続けたが、収率低下ももたらした。総HCPもまた、カプリル酸ナトリウムを増加させることにより、概して減少した。
【０１６７】
アルギニンを含有するプロテインA洗浄液は、PLBL2クリアランスという点ではもっとも成功し、総HCPの良好な除去も示した。カプリル酸ナトリウムなしの1000mMのアルギニンでは、約10ng/mgのPLBL2及び62ng/mgのHCPがもたらされた。高濃度のアルギニンは、有意な収率低下を引き起こさなかった。
【０１６８】
カプリル酸ナトリウム及びアルギニンの組合せは、mAb5に関してもっとも有効な洗浄液であった。具体的には、pH7.5又は8.5で、1Mのアルギニンと組み合わせた250mMのカプリル酸ナトリウムは、2〜3ng/mgのPLBL2及び約20〜30ng/mgのHCPをもたらし、同時に、約90%のステップ収率を維持した。1Mのアルギニン及び100mMのカプリル酸ナトリウムを含有する洗浄液もまた成功したが、わずかに高いPLBL2及びHCP濃度をもたらした。
【０１６９】
[実施例6]
カテプシンL活性低減のためのカプリル酸塩/アルギニン洗浄液
カプリル酸ナトリウム及びアルギニンを含有するプロテインA洗浄液を、mAb3を用いてカテプシンLクリアランス能力について試験した。カテプシンLプロテアーゼは、CHO細胞培養中に産生され、これは、mAb3産物分子を分解し得る可能性がある。カテプシンLは、プロテインAプロセス中に、mAb3から除去されないことが示されている。100mMのカプリル酸ナトリウム、250mMのカプリル酸ナトリウム、100mMのカプリル酸ナトリウムと1000mMのアルギニン、及び100mMのカプリル酸ナトリウムと750mMのリジンを含有する洗浄液を、試験した。
【０１７０】
この具体的な産物について、250mMのカプリル酸ナトリウムを含有する洗浄液では、予期しないプロテインA溶出挙動がもたらされ、通常は約2カラム体積で完了する低いpHでの溶出が、10カラム体積を超えて拡大された。加えて、mAb3のプロテインA溶出液は、250mMのカプリル酸ナトリウムの洗浄液を試験した場合、非常に高い凝集物(SECによって測定される)を有していた。この挙動は、高カプリル酸ナトリウム洗浄液を用いて試験したいずれの他の産物でも観察されなかった。
【０１７１】
アルギニン又はリジンを含有するプロテインA洗浄液は、250mMのカプリル酸ナトリウム単独で観察された拡大溶出挙動を有さなかった。3つの異なる洗浄液(100mMのカプリル酸塩(「プラットフォームmsss溶出液」)、250mMのカプリル酸塩と1Mのアルギニン(「cap/arg msss溶出液」)、250mMのカプリル酸塩、750mMのリジン(「cap/lys msss溶出液」))について、プロテインA溶出液において測定したカテプシンL活性を、図10に報告し、プロテインA溶出体積を、表8に列挙する。測定された活性は、100mMのカプリル酸ナトリウム、1000mMのアルギニンの洗浄液では有意に減少し、後続の安定性研究により、フラグメント化が、この洗浄液を使用して調製した材料については、100mMのカプリル酸ナトリウムの洗浄液と比較して、減少したことが示された。アルギニンではなく、750mMのリジンの添加は、大きな溶出体積の減少に成功したが、カテプシンL活性を有意に減少させることはなかった。カプリル酸ナトリウム及び1000mMのアルギニンの組合せにより、カテプシンL及び総HCPクリアランスの改善がもたらされ、同時に、妥当な溶出体積及び許容可能な産物品質属性が維持される。
【０１７２】
【表８】
2021515764.tif 000018
【０１７３】
[実施例7]
HCPを除去するためのカプリル酸塩/アルギニンのプロテインA洗浄液
カプリル酸ナトリウム及びアルギニンを含有するプロテインA洗浄液を、mAb3を用いてHCPクリアランス能力について試験した。洗浄バッファーの濃度及び結果として得られるHCPの濃度を、以下の表9に概説する。アルギニン/カプリル酸塩の洗浄液を、mAb3について、カプリル酸塩のみの洗浄液と比較した。
【０１７４】
150mMのカプリル酸塩の洗浄液は、100mMのカプリル酸塩の洗浄液よりも有意に高いHCPクリアランスをもたらす。1.1Mのアルギニン及び150mMのカプリル酸塩の組合せは、さらに、HCPクリアランスを、有意な係数で改善する。プロテインAステップ中のHCPのクリアランスの改善により、カプリル酸塩のみのプロセスでは必要とされる最終ポリッシングクロマトグラフィーステップの除去が可能となった。
【０１７５】
【表９】
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【０１７６】
[実施例8]
mAb3フラグメント化の減少
カプリル酸ナトリウム及びアルギニンを含有する洗浄液を用いたmAb3のプロテインA精製を、精製中の抗体のフラグメント化について試験した。100mMのカプリル酸塩の洗浄液を含有する3バッチの洗浄バッファー、及び150Mのカプリル酸塩に加えて1.1Mのアルギニンを含有する2バッチの洗浄バッファーを含め、データ(図11〜13)を生成した。
【０１７７】
図11は、下流プロセス全体を通じた抗体フラグメント化パーセント(SEC HPLCを用いて測定)を示す。図12は、プロセスを通じたHCP濃度を示す。カプリル酸塩/アルギニンのバッチは、プロセス中の有意な抗体フラグメント化の形成を有さないが、一方で、カプリル酸塩のみのバッチは、3回目のポリッシングステップ(カプリル酸塩/アルギニンの洗浄液では必要ない)の後に、有意な抗体フラグメント化の発生を有する。
【０１７８】
加えて、両方のプロセス(カプリル酸塩のみ及びカプリル酸塩＋アルギニン)によって産生されたバルク原薬の安定性を、比較した。カプリル酸塩＋アルギニンプロセスにより得られたバルク原薬は、摂氏25度で10日以内に抗体フラグメント化を生じなかったし、カプリル酸塩のみのプロセスにより得られたバルク原薬は、摂氏25度で10日間の間に有意な抗体フラグメント化を生じる(図13)。
【０１７９】
洗浄バッファーにおけるカプリル酸塩及びアルギニンの組合せは、カテプシンLのクリアランスの改善に起因して、下流プロセス全体を通じて抗体フラグメント化の発生を有意に減少させる。
【０１８０】
結論
プロテインAステップにわたるHCPクリアランスは、HCP-mAb相互作用を最小限に抑えるように洗浄バッファーを改変することによって最適化された。初期スクリーニング研究により、プロテインA洗浄バッファーの7〜9で変動するpHは、HCPクリアランスにもステップ収率にも、有意に影響を及ぼさないと結論付けられた。カプリル酸ナトリウム濃度は、ステップ収率及びHCP除去の両方に強い影響を有する。非常に高いカプリル酸ナトリウム濃度(CMCを上回る)では、HCPクリアランスは最適であるが、ステップ収率が非常に低い。この研究では、250mMのカプリル酸ナトリウムを含有するプロテインA洗浄液を利用することにより、許容可能なステップ収率を維持しながら、これまでに使用されていた100mMのカプリル酸ナトリウムの洗浄液と比較して、HCPクリアランスの大幅な改善が得られることが見出された。この研究ではまた、250mMのカプリル酸ナトリウム及び500〜1000mMのアルギニンの組合せを含有するプロテインA洗浄液が、カプリル酸ナトリウムのみを含有する洗浄液と比較して、高いHCPクリアランスを有することも見出された。カプリル酸ナトリウム及びアルギニンを含有するプロテインA洗浄液は、それぞれ、mAb3及びmAb5からの、2つの特に困難なHCP混入物であるカテプシンL及びPLBL2の除去に成功することが見出された。
【０１８１】
本明細書に記載される実施形態は、本発明のすべての態様に適用され得ることが理解される。さらに、本明細書において引用された、特許及び特許出願を含むがこれらに限定されない、すべての刊行物は、全内容が記載される場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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