(57)【要約】  Ｎａｖ１．１機能障害をレスキューするために十分な電位開口型ナトリウムチャネル機能の、抑制性ニューロンに対する選択的な提供が、記載される。抑制性ニューロンにおいて提供されたＮａｖ１．１機能障害をレスキューするために十分な電位開口型ナトリウムチャネル機能は、てんかん、及びより詳細には、ドラベ症候群などの障害を治療するために、使用され得る。
2021521152.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドラベ症候群の治療を必要としている患者においてドラベ症候群を治療する方法であって、治療有効量の少なくとも２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを静脈内投与することを含み、各ウイルスベクターは、
（ｉ）配列番号３からなるエンハンサー；
（ｉｉ）プロモーター；及び
（ｉｉｉ）ヒトＳＣＮ１Ａの断片の発現をもたらすコード配列
を含む発現構築物を含み、
ＡＡＶベクターは、血液脳関門を通過するカプシドと結合しており、
前記コード配列によってコードされるヒトＳＣＮ１Ａ断片は、抑制性ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン内で選択的に発現され、静脈内投与後に、レスキューを必要とする抑制性ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン内のＮａｖ１．１チャネル機能のレスキューをもたらす、方法。
【請求項２】
ウイルスベクターが、配列番号４７及び配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０、又は配列番号５１及び配列番号５２を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ウイルスベクターが、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）配列番号３からなるエンハンサー、（ｉｉ）プロモーター、及び（ｉｉｉ）レスキューを必要とする細胞又は対象内で電位開口型ナトリウムチャネル機能をレスキューするタンパク質をコードするコード配列を含む、発現構築物。
【請求項５】
コード配列が、ＮａｖＳｈｅＰ−Ｄ６０Ｎ、ＮａｖＢｐ、ＮａｖＭｓ、３ｘＨＡ−ＮａｖＳｈｅＰ−Ｄ６０Ｎ、３ｘＨＡ−ＮａｖＢｐ、３ｘＨＡ−ＮａｖＭｓ、Ｈｉｓ−ＮａｖＭｓ、ヒトＳＣＮ１Ａ、マウスＳｃｎ１ａ、ヒトＳＣＮ１Ａ−３ｘＨＡ、及び／又はマウスＳｃｎ１ａ−３ｘＨＡを含む、請求項４に記載の発現構築物。
【請求項６】
プロモーターが、ｍｉｎＢｇｌｏｂｉｎ又はｍｉｎＣＭＶを含む、請求項４に記載の発現構築物。
【請求項７】
発現構築物が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター内にある、請求項４に記載の発現構築物。
【請求項８】
発現構築物が、レポータータンパク質についてのコード配列を含む、請求項４に記載の発現構築物。
【請求項９】
レポータータンパク質が、蛍光レポータータンパク質を含む、請求項８に記載の発現構築物。
【請求項１０】
発現構築物が、スキッピングエレメントを含むか、又はコードする、請求項４に記載の発現構築物。
【請求項１１】
スキッピングエレメントは、２Ａペプチド又は内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項１０に記載の発現構築物。
【請求項１２】
２Ａペプチドが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及び／又はＦ２Ａを含む、請求項１１に記載の発現構築物。
【請求項１３】
構築物が、ＣＮ１３６７、ＣＮ１２４４、ＣＮ１３８９、ＣＮ１３９０、ＣＮ１１８０、ＣＮ１２０３、ＣＮ１４９８、ＣＮ１４９９、ＣＮ１５００、ＣＮ２００１、ＣＮ２００２、ＣＮ２００３、ＣＮ１５０４及びＣＮ１５１２、ＣＮ２００４及びＣＮ２００５、ＣＮ２００６及びＣＮ２００７、又はＣＮ２００８及びＣＮ２００９のエレメントを含む、請求項７に記載の発現構築物。
【請求項１４】
構築物が、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、及び／又は配列番号５２を含む、請求項７に記載の発現構築物。
【請求項１５】
構築物が、配列番号４５及び配列番号４６、配列番号４７及び配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０、又は配列番号５１及び配列番号５２を含む、請求項７に記載の発現構築物。
【請求項１６】
ＡＡＶベクターが、血液脳関門を通過するカプシドに結合している、請求項７に記載の発現構築物。
【請求項１７】
カプシドが、ＰＨＰ．Ｅｂを含む、請求項１６に記載の発現構築物。
【請求項１８】
カプシドが、配列番号５３を含む、請求項１６に記載の発現構築物。
【請求項１９】
カプシドが、配列番号５４又は配列番号５５の挿入物を含むＡＡＶ９カプシドを含む、請求項１６に記載の発現構築物。
【請求項２０】
カプシドが、配列番号５６挿入物を含むＡＡＶ２カプシドを含む、請求項１６に記載の発現構築物。
【請求項２１】
請求項４に記載の発現構築物を含む、組成物。
【請求項２２】
請求項４に記載の発現構築物を含む、細胞。
【請求項２３】
請求項４に記載の発現構築物を含む、非ヒト動物。
【請求項２４】
請求項４に記載の発現構築物を含む、キット。
【請求項２５】
治療有効量の請求項２１に記載の組成物を細胞に投与することを含む、レスキューを必要とする欠損細胞において電位開口型ナトリウムチャネル機能をレスキューする方法。
【請求項２６】
治療有効量の請求項２１に記載の組成物を対象に投与することを含む、レスキューを必要とする対象において電位開口型ナトリウムチャネル機能をレスキューする方法。
【請求項２７】
てんかん、ＳＣＮ１Ａ関連発作障害、単純型熱性発作（ＦＳ）、全般てんかん熱性発作プラス（ＧＥＦＳ＋）、ドラベ症候群（ＤＳ）、全身性強直性間代性発作を伴う難治性小児てんかん（ＩＣＥ−ＧＴＣ）、難治性乳児部分発作、ミオクローヌス性失立てんかん、レノックス・ガストー症候群（ＬＧＳ）、又は点頭てんかんの診断に起因して、対象がレスキューを必要とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
対象が、小児患者である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
対象が、４歳未満である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
対象が、温度誘導性熱性発作試験を受けているトランスジェニックＳｃｎ１ａ＋／−マウスである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
組成物が静脈内投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
組成物が、側脳室若しくは大槽若しくは腰椎空間、又は大後頭孔内へのカニューレを介して、脳脊髄液内に髄腔内投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）天然に存在しないエンハンサー配列、及び
（ｂ）電位開口型ナトリウムチャネル機能をレスキューするタンパク質をコードする核酸
を含む発現構築物であって、
エンハンサー配列が、
（ｉ）配列番号３の配列からなるか
（ｉｉ）直列に並んだ配列番号２の２つ以上のコピーを含むか、
（ｉｉｉ）配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有しかつ介在ニューロン特異的エンハンサー機能を維持する配列を含むか、又は
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、若しくは（ｉｉｉ）の配列にハイブリダイズ可能な配列の相補鎖であって、
試料又は対象への投与後に、エンハンサーは、抑制性ニューロン内で核酸の転写を選択的に促進する、発現構築物。
【請求項３４】
核酸は、ＮａｖＳｈｅＰ−Ｄ６０Ｎ、ＮａｖＢｐ、ＮａｖＭｓ、３ｘＨＡ−ＮａｖＳｈｅＰ−Ｄ６０Ｎ、３ｘＨＡ−ＮａｖＢｐ、３ｘＨＡ−ＮａｖＭｓ、Ｈｉｓ−ＮａｖＭｓ、ヒトＳＣＮ１Ａ、マウスＳｃｎ１ａ、ヒトＳＣＮ１Ａ−３ｘＨＡ、又はマウスＳｃｎ１ａ−３ｘＨＡから選択される、請求項３３に記載の発現構築物。
【請求項３５】
ｍｉｎＢｇｌｏｂｉｎ又はｍｉｎＣＭＶを含むプロモーターを含む、請求項３３に記載の発現構築物。
【請求項３６】
発現構築物が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター内にある、請求項３３に記載の発現構築物。
【請求項３７】
発現構築物が、レポータータンパク質をコードする核酸を含む、請求項３３に記載の発現構築物。
【請求項３８】
レポータータンパク質が、蛍光レポータータンパク質を含む、請求項３７に記載の発現構築物。
【請求項３９】
発現構築物が、スキッピングエレメントを含むか、又はコードする、請求項３３に記載の発現構築物。
【請求項４０】
スキッピングエレメントが、２Ａペプチド又は内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項３９に記載の発現構築物。
【請求項４１】
２Ａペプチドが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及び／又はＦ２Ａを含む、請求項４０に記載の発現構築物。
【請求項４２】
構築物が、ＣＮ１３６７、ＣＮ１２４４、ＣＮ１３８９、ＣＮ１３９０、ＣＮ１１８０、ＣＮ１２０３、ＣＮ１４９８、ＣＮ１４９９、ＣＮ１５００、ＣＮ２００１、ＣＮ２００２、ＣＮ２００３、ＣＮ１５０４及びＣＮ１５１２、ＣＮ２００４及びＣＮ２００５、ＣＮ２００６及びＣＮ２００７、又はＣＮ２００８及びＣＮ２００９のエレメントを含む、請求項３６に記載の発現構築物。
【請求項４３】
構築物が、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、及び／又は配列番号５２を含む、請求項３６に記載の発現構築物。
【請求項４４】
構築物が、配列番号４５及び配列番号４６、配列番号４７及び配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０、又は配列番号５１及び配列番号５２を含む、請求項３６に記載の発現構築物。
【請求項４５】
ＡＡＶベクターが、血液脳関門を通過するカプシドと結合している、請求項３６に記載の発現構築物。
【請求項４６】
カプシドが、ＰＨＰ．Ｅｂを含む、請求項４５に記載の発現構築物。
【請求項４７】
カプシドが、配列番号５３を含む、請求項４５に記載の発現構築物。
【請求項４８】
カプシドが、配列番号５４又は配列番号５５挿入物を含むＡＡＶ９カプシドを含む、請求項４５に記載の発現構築物。
【請求項４９】
カプシドが、配列番号５６挿入物を含むＡＡＶ２カプシドを含む、請求項４５に記載の発現構築物。
【請求項５０】
請求項３３に記載の発現構築物を含む、組成物。
【請求項５１】
請求項３３に記載の発現構築物を含む、細胞。
【請求項５２】
請求項３３に記載の発現構築物を含む、非ヒト動物。
【請求項５３】
請求項３３に記載の発現構築物を含む、キット。
【請求項５４】
治療有効量の請求項５０に記載の組成物を細胞に投与することを含む、レスキューを必要とする欠損細胞において電位開口型ナトリウムチャネル機能をレスキューする方法。
【請求項５５】
治療有効量の請求項５０に記載の組成物を対象に投与することを含む、レスキューを必要とする対象において電位開口型ナトリウムチャネル機能をレスキューする方法。
【請求項５６】
てんかん、ＳＣＮ１Ａ関連発作障害、単純型熱性発作（ＦＳ）、全般てんかん熱性発作プラス（ＧＥＦＳ＋）、ドラベ症候群（ＤＳ）、全身性強直性間代性発作を伴う難治性小児てんかん（ＩＣＥ−ＧＴＣ）、難治性乳児部分発作、ミオクローヌス性失立てんかん、レノックス・ガストー症候群（ＬＧＳ）、又は点頭てんかんの診断に起因して、対象がレスキューを必要とする、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
対象が、小児患者である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
対象が、４歳未満である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
対象が、温度誘導性熱性発作試験を受けているトランスジェニックＳｃｎ１ａ＋／−マウスである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
組成物が、静脈内投与される、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
組成物が、側脳室若しくは大槽若しくは腰椎空間、又は大後頭孔内へのカニューレを介して、脳脊髄液内に髄腔内投与される、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
第１のベクターが、レスキューを必要とする細胞において電位開口型ナトリウムチャネル活性をレスキューするタンパク質のＮ末端部分をコードし、第２のベクターが、前記タンパク質のＣ末端部分をコードする、２つのＡＡＶベクターを含むベクター系であって、前記２つのベクターによってコードされる遺伝子の部分は、相同組換えのための相同性領域を提供して全長Ｎａｖ１．１タンパク質を生成するように重複し、前記第１のベクターは、プロモーター及び配列番号３からなるエンハンサーを含むが、終止シグナル又はポリＡシグナルを含まず、前記第２のベクターは、終止シグナル及びポリＡシグナルを含むが、プロモーター又はエンハンサーを含まない、ベクター系。
【請求項６３】
タンパク質が、ヒトＳＣＮ１Ａを含む、請求項６２に記載のベクター系。
【請求項６４】
相同性領域が、７５〜１０００塩基対である、請求項６２に記載のベクター系。
【請求項６５】
相同性領域が、５５０〜６５０塩基対である、請求項６２に記載のベクター系。
【請求項６６】
ベクターが、抑制性ニューロンにおいてタンパク質を選択的に発現する、請求項６２に記載のベクター系。
【請求項６７】
相同領域に亘るトランススプライシングによって、組換え後に、より効率的な全長タンパク質再構成が駆動されるように、相同性領域が、第１のベクターにおけるスプライシングドナー部位及び第２のベクターにおけるスプライシングアクセプター部位を有するイントロンエレメントをさらに含む、、請求項６２に記載のベクター系。
【請求項６８】
ベクター系が、ＣＮ１５０４、ＣＮ１５１２、ＣＮ２００４、ＣＮ２００５、ＣＮ２００６、ＣＮ２００７、ＣＮ２００８、及び／又はＣＮ２００９のエレメントを含む、請求項６２に記載のベクター系。
【請求項６９】
ベクター系が、ＣＮ１５０４及びＣＮ１５１２、ＣＮ２００４及びＣＮ２００５、ＣＮ２００６及びＣＮ２００７、又はＣＮ２００８及びＣＮ２００９のエレメントを含む、請求項６２に記載のベクター系。
【請求項７０】
ベクター系が、配列番号４５及び配列番号４６、配列番号４７及び配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０、又は配列番号５１及び配列番号５２を含む、請求項６２に記載のベクター系。
【請求項７１】
配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、又は配列番号５２を含む、ウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６２／６５５，０４３号（２０１８年４月９日出願）、同第６２／７４２，８３５号（２０１８年１０月８日出願）及び同第６２／８１０，２８１号（２０１９年２月２５日出願）に対する優先権を主張し、その各々は、本明細書中に完全に記されているのと同様に、本明細書中にその全てが参考として援用される。
【０００２】
連邦支援による研究又は開発についての声明
本発明は、国立衛生研究所による助成金ＲＦ１ＭＨ１１４１２６号の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
開示の分野
本開示は、電位開口型ナトリウムチャネル機能の、レスキュー（レスキュー）を必要とする抑制性ニューロンにおける、選択的なレスキューを記載する。抑制性ニューロンにおけるレスキューされた電位開口型ナトリウムチャネル機能は、てんかんなどの障害、及びより詳細には、ドラベ症候群を治療するために使用され得る。
【背景技術】
【０００４】
早急な治療が必要とされている、多くの神経学的障害が、存在する。そのような障害の１つのクラスは、抑制性ニューロンにおけるＮａｖ１．１ナトリウムチャネルの機能不全に起因して起こる。例えば、てんかん、点頭てんかん、片頭痛及び自閉症スペクトラム障害は、Ｎａｖ１．１ナトリウムチャネルの機能不全に関連する。
【０００５】
てんかんは、２回以上のてんかん性発作を起こす永続的な傾向を脳が示す場合に起こる、神経学的障害である。てんかん性発作は、異常な、過剰な又は同時の神経活動に起因する、脳機能の一時的な崩壊である。その発現には、異常行動、異常感覚、時には意識喪失の期間が、含まれる。
【０００６】
ドラベ症候群（ＤＳ）は、詳細には、乳児期に始まる、稀かつ破局的な形態の難治性てんかんである。最初に、患者は、持続性の発作を起こす。２年目に、さらなるタイプの発作が起こり始め、それとともに発達が低下する。これは、言語及び運動技術の発育不良をもたらす。
【０００７】
ＤＳを患う小児は、１日に複数回の発作を起こしやすい。てんかん性発作は、ＤＳ罹患者において、はるかに高い死亡率をもたらす。ＤＳを罹患すると診断された患者の１０〜１６％が、２歳から４歳までの間に死亡する。さらに、患者は、整形外科的な発達上の問題、成長不良、睡眠及びサーカディアンリズムの障害、並びに慢性感染症を含む、多くの関連症状の危険にさらされている。
【０００８】
特に注意すべきは、ＤＳに罹患する小児は、てんかん重積状態のエピソードを特に起こしやすいことである。てんかん重積状態は、発作が５分間以上続く症状、又は複数回の発作が５分間以内に立て続けに起こり、発作と発作との間に意識を回復することがない症状である。この過酷な症状は、即座の医療介入（多くの場合は入院を含む）を必要とする、救急医療として分類される。３０分間以上続く持続性の痙攣性てんかん重積状態は、致命的になり得、かつ、脳への重い障害をもたらし得る。ＤＳに罹患する小児の頻回の入院は、患者にとってだけでなく家族及び看護者にとっても、明らかに痛ましいものである。ＤＳに罹患する小児は、恒常的な管理を必要とし、そして多回の施設収用を必要とするため、ＤＳの看護費用もまた、高額となる。
【０００９】
現在、ＤＳ患者における発作の症例を減らすために多くの抗痙攣治療が用いられ得るが、このような治療によって得られた結果は、概して乏しく、そしてこれらの治療は、多くの患者において、発作の部分的な停止しかもたらさない。クロバザム及びクロナゼパムなどのこれらの抗痙攣薬の多くは、小児科の患者においては特に急性である、望ましくない副作用を有する。さらに、ある種の抗痙攣薬（特に、ナトリウムチャネルブロッカー類）は、発作を悪化させる。
【００１０】
非病原性ウイルス送達を用いる細胞型又は細胞クラスに特異的な遺伝子送達は、広範な疾患の治療に対し、ますます増える裏付けを示している。特定の遺伝子調節エレメント、例えば特定のプロモーター又はエンハンサーを、送達されるベクターに含めることは、特定の標的細胞型の中での遺伝子発現に特異性を提供するために、有益であった。例えば、Ｄｉｍｉｄｓｃｈｓｔｅｉｎ及び仲間たち（Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９（１２）：１７４３−１７４９，２０１６）は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくウイルス送達遺伝子構築物を開発し、それにより、てんかんの治療において重要な細胞型である終脳内のガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）作動性インターフェロン類における遺伝子の選択的発現をもたらした。この構築物は、５２９塩基対（ｂｐ）のエンハンサー配列（ｍＩ５６ｉ又はｍＤｌｘと呼ぶ）を含んでいた。
【００１１】
ＡＡＶを選択的遺伝子送達系として用いることの１つの重大な欠点は、ＡＡＶの厳格に制限されたパッケージング限界である。これは、長い遺伝子制御エレメントを入れることに対し、特に制限的である。さらに、現存する介在ニューロン特異的ＡＡＶ発現構築物は、特定の適用において弱い発現を、並びに、他のより一般的に使用されるタンパク質よりもずっと耐性の低い導入遺伝子（例えば、治療遺伝子）の発現について、もたらす。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｄｉｍｉｄｓｃｈｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｏｌｌｅａｇｕｅｓ，Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９（１２）：１７４３−１７４９，２０１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、当該分野において、選択細胞型において機能的タンパク質の迅速かつ強力な発現をもたらすことのできる、より短いエンハンサー配列に対する需要が残っている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本開示は、抑制性ニューロン内で選択的に、予期せぬ迅速かつ高レベルのタンパク質発現をもたらす発現構築物を、Ｎａｖ１．１チャネル機能の欠損をレスキューするために提供する。特定の実施形態において、本開示は、ヒトＩ５６ｉエンハンサー及び電位開口型ナトリウムチャネルタンパク質をコードする遺伝子又は欠損したＮａｖ１．１ナトリウムチャネル機能をレスキュー可能なヌクレオチド配列のコンカテマー化したコアを提供する。発現構築物は、抑制性ニューロンにおけるＮａｖ１．１電位開口型ナトリウムチャネル機能不全の機能を逆転させるか、又は改善させるために使用され得る。特定の実施形態において、本開示は、抑制性ニューロンに対し電位開口型ナトリウムチャネルを機能させる遺伝子を選択的に送達することによる、ナトリウムチャネル障害の治療を提供する。これらのエンハンサー及び遺伝子を含むウイルスベクターを投与することにより、抑制性ニューロンにおけるＮａｖ１．１ナトリウムチャネル機能をレスキューするタンパク質又はヌクレオチド配列の、選択的な発現がもたらされる。特定の実施形態において、これらのウイルスベクターにおける治療用電位開口型ナトリウムチャネル遺伝子は、小さくかつ１つのＡＡＶ構築物内に適合する細菌由来のものであってもよく、又は、より大きくかつ他の戦略の中でもとりわけ二重ＡＡＶ構築物送達技術を使用できるヒト由来のものであってもよい。治療可能なＮａｖ１．１ナトリウムチャネル障害としては、てんかん、及びより詳細には、ドラベ症候群（ＤＳ）が挙げられる。例えば、本明細書中に開示されるように、発現構築物の投与は、ＤＳの十分に確立されたインビボマウスモデルにおいて当該疾患を治療する治療有効性をもたらす。
【００１５】
本明細書中で提示される多くの図面は、カラー図面でよりよく理解される。出願人は、図面のカラーバージョンを元の出願の一部と考え、より後の手続きにおいて図面の色イメージを示す権利を保有する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｄ。汎ＧＡＢＡ作動性ウイルスエンハンサーは、ヒト器官型切片培養物において、ファストスパイキング（ｆａｓｔ  ｓｐｉｋｉｎｇ）介在ニューロンを標識する。（図１Ａ）緑色蛍光は、ＣＮ１１８０／ＤＪウイルスベクターを発現する細胞を、７  ＤＩＶ／ＤＰＩ（ＤＩＶ：インビトロの日数、ＤＰＩ：感染後の日数）に同定する。ＣＮ１１８０は、ヒトＤＬＸ（ｈＤＬＸ）Ｉ１２ｂエンハンサー及び最小のベータグロブリンプロモーターの制御下のＳＹＦＰ２発現カセットを含む。ニューロンをパッチクランプし、そして後に赤色チャネルにおいてＡｌｅｘａ  ５９４埋め戻し（ｂａｃｋｆｉｌｌ）を用いて可視化した。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｄ。汎ＧＡＢＡ作動性ウイルスエンハンサーは、ヒト器官型切片培養物において、ファストスパイキング介在ニューロンを標識する。（図１Ｂ）ＹＦＰ蛍光の存在によって分類した、一人のヒトの症例由来のパッチした細胞の形態学は、ＳＹＦＰ２発現細胞が、主に介在ニューロンであることを示唆する。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｄ。汎ＧＡＢＡ作動性ウイルスエンハンサーは、ヒト器官型切片培養物において、ファストスパイキング介在ニューロンを標識する。（図１Ｃ）ＹＳＰ＋ニューロンの電気生理学的パラメータは、これらの細胞が主にファストスパイキング介在ニューロンであることを示唆する。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｄ。汎ＧＡＢＡ作動性ウイルスエンハンサーは、ヒト器官型切片培養物において、ファストスパイキング介在ニューロンを標識する。（図１Ｄ）事後免疫組織化学は、多くのＹＳＰ＋細胞（矢印）が、パルブアルブミン（ＰＶＡＬＢ）を発現することを証明し、このことは、これらの細胞が、ファストスパイキング介在ニューロンの分子特性を有することを示唆する。
【図２】図２は、抑制性ニューロンにおけるタンパク質の標的した発現のための例示的なベクターを示す。ＣＮ１３６７−ｒＡＡＶ２−ｈＩ５６ｉ−ｍｉｎＢｇｌｏｂｉｎ−Ｈｉｓ−ＮａｖＭｓ−Ｐ２Ａ−ＳＹＦＰ２−ＷＰＲＥ３−ＢＧＨｐＡ。符号：ｈＩ５６ｉ−完全長ヒトＤＬＸ  Ｉ５６ｉエンハンサー（配列番号１）；ｍｉｎＢｇｌｏｂｉｎ−最小ベータグロブリンプロモーター；Ｈｉｓ−ＮａｖＭｓ−ヘキサヒスチジンタグ化した、Ｍａｇｎｅｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ由来の電位開口型ナトリウムチャネル；Ｐ２Ａ−自己開裂型ペプチド；ＳＹＦＰ２−超黄色蛍光タンパク質２；ＷＰＲＥ３−ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント３（配列番号１９）；ＢＧＨｐＡ−ウシ成長ホルモンポリＡ配列。
【図３】静脈内（ＩＶ）送達される、ウイルスＣＮ１２４４／ＰＨＰ．ｅＢ．１０１１ゲノムコピー。ＰＨＰ．ｅＢは、血液脳関門を通過する効率的なＡＡＶ移行を可能にし、ＡＡＶベクターの送達を脳全体にわたる様式で可能にする、ＡＡＶ９を指向するカプシドを、コードする。このカプシドは、残基５８６で開始するアミノ酸：ＳＡＱＡがＳＤＧＴＬＡＶＰＦＫＡに変わるように、ＡＡＶとは異なっている。Ｇａｄ２−Ｔ２Ａ−ｎｌｓ−ｍＣｈｅｒｒｙレポーターは、マウス脳内のほぼ全ての抑制性ニューロン類を示し（ここでは、Ｖ１視覚皮質を示す）、そして送達されたＣＮ１２４４／ＰＨＰ．ｅＢウイルスは、前脳抑制性ニューロンにおいて特異的ＳＹＦＰ２レポーター活性を駆動する。
【図４Ａ】図４Ａ、４Ｂ。ＣＮ１２４４対ＣＮ１３８９対ＣＮ１３９０の比較。（図４Ａ）３つの構築物：ＣＮ１２４４、ＣＮ１３８９及びＣＮ１３９０（ＣＮ１２０３  ｓｃＡＡＶ）の模式図。Ｋｅｙ：ｈＩ５６ｉ−完全長ヒトＤｌｘＩ５６ｉエンハンサー（配列番号１）；ｈＩ５６ｉコア−ヒトＤｌｘＩ５６ｉエンハンサーコア（配列番号２）；ｍｉｎＢＧ−最小βグロビンプロモーター；ＳＹＦＰ２−超黄色蛍光タンパク質２；ＷＰＲＥ３−ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント３；ＢＧＨｐＡ−ウシ成長ホルモンポリＡ配列；Ｌ−ＩＴＲ及びＲ−ＩＴＲ−アデノ随伴ウイルス−２（ＡＡＶ２）逆末端リピート（ＩＴＲｓ）。
【図４Ｂ】図４Ａ、４Ｂ。ＣＮ１２４４対ＣＮ１３８９対ＣＮ１３９０の比較。（図４Ｂ）ＡＡＶベクター構築物ＣＮ１２４４、ＣＮ１３８９及びＣＮ１３９０からのＳＹＦＰ２の相対的発現を示すフルオログラフィー画像。
【図５】切片培養物における幼若マウスの皮質及び海馬において、ＣＮ１３９０は、汎ＧＡＢＡ作動性神経集団（これらのＡｉ７５  ｈｅｔ／Ｇａｄ２−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅマウスにおいて赤色蛍光で印をつけられている）についてのレポーター発現の細胞型特異性を保持している。１０ＤＩＶ／１０ＤＰＩ。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｅ。ＣＮ１３９０は、ヒトエキソビボ脳切片において、トランスジーン発現の迅速な発生を示す。（図６Ａ）ＣＮ１３９０／ＰＨＰ．ｅＢによるヒト脳切片形質導入後のウイルス媒介型ＹＦＰ発現の時間経過（左パネル：１ＤＩＶ／１ＤＰＩ；中央パネル：３ＤＩＶ／３ＤＰＩ；右パネル：６ＤＩＶ／６ＤＰＩ）。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｅ。ＣＮ１３９０は、ヒトエキソビボ脳切片において、トランスジーン発現の迅速な発生を示す。（図６Ｂ）図６Ａ，右パネルにおける四角で囲まれた領域の拡大図。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｅ。ＣＮ１３９０は、ヒトエキソビボ脳切片において、トランスジーン発現の迅速な発生を示す。（図６Ｃ）両極化した形態を示す、ウイルス標識された介在ニューロンの高倍率画像。
【図６Ｄ】図６Ａ〜６Ｅ。ＣＮ１３９０は、ヒトエキソビボ脳切片において、トランスジーン発現の迅速な発生を示す。（図６Ｄ）４種の異なるウイルスで標識されたＹＦＰ＋ヒト介在ニューロンからの全細胞記録の例。閾値上の電流注入に対する様々な発射パターンを示した。
【図６Ｅ】図６Ａ〜６Ｅ。ＣＮ１３９０は、ヒトエキソビボ脳切片において、トランスジーン発現の迅速な発生を示す。（図６Ｅ）パッチクランプ記録による、ヒト新皮質介在ニューロン発射パターン及び電気的性質の機能的解析は、ＣＮ１３９０／ＰＨＰ．ｅＢウイルス感染後４０時間の早さで実行可能である。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｆ。Ｓｃｎ１ａ＋／−マウスにおけるＤＳ症候を逆転させるためのＡＡＶベクター試薬。（７Ａ）細菌由来のエピトープタグ化Ｎａｖ遺伝子を送達するためのベクター  （ＮａｖＢａｃｓ）。ここで示すＮａｖ遺伝子は、ＮａｖＭｓ（マグネットコッカス・マリナス（Ｍａｇｎｅｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）由来）、ＮａｖＢｐ（バシラス・シュードフィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）由来）及びＮａｖＳｈｅＰ−Ｄ６０Ｎ（遺伝子操作Ｄ６０Ｎ変異を有するシェワネラ・プトリファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｉｆａｃｉｅｎｓ）由来）である。これらの例は、全て、Ｎ末端  エピトープタグ（ＣＮ１３６７の場合ヘキサヒスチジン、又はＣＮ１４９８，、ＣＮ１４９９及びＣＮ１５００についての３×ＨＡ）を有する。ｈＩ５６ｉは、配列番号１の完全長Ｉ５６ｉエンハンサーをいう；３ｘｈＩ５６ｉＣｏｒｅは、エンハンサーのコンカテマー化したコアをいう（配列番号３）。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｆ。Ｓｃｎ１ａ＋／−マウスにおけるＤＳ症候を逆転させるためのＡＡＶベクター試薬。（７Ｂ）ＮａｖＢａｃベクターからの段階的発現レベル。
【図７Ｃ】図７Ａ〜７Ｆ。Ｓｃｎ１ａ＋／−マウスにおけるＤＳ症候を逆転させるためのＡＡＶベクター試薬。（７Ｃ）いくつかのＰｖａｌｂ介在ニューロンにおけるベクター  ＣＮ１３６７からの弱いが検出可能な発現。
【図７Ｄ】図７Ａ〜７Ｆ。Ｓｃｎ１ａ＋／−マウスにおけるＤＳ症候を逆転させるためのＡＡＶベクター試薬。（７Ｄ）ベクターＣＮ１３６７による発作保護への傾向。
【図７Ｅ】図７Ａ〜７Ｆ。Ｓｃｎ１ａ＋／−マウスにおけるＤＳ症候を逆転させるためのＡＡＶベクター試薬。（７Ｅ）  ベクター１５００は、皮質全体のＰｖａｌｂ＋及びＰｖａｌｂ−介在ニューロンにおける高レベル発現を駆動する。
【図７Ｆ】図７Ａ〜７Ｆ。Ｓｃｎ１ａ＋／−マウスにおけるＤＳ症候を逆転させるためのＡＡＶベクター試薬。（７Ｆ）細胞体及び近位プロセスにおける、ＨＡ−タグ化ＮａｖＢａｃの豊富な産生は、ベクター１４９８及び１５００によってもたらされるが、１４９９によってはもたらされない。
【図８−１】図８。ＡＡＶパッケージ限界を超えるにもかかわらず、完全長ヒトＳＣＮ１Ａタンパク質をコードしそして送達するための、４例の戦略。ヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子（ｈＳＣＮ１Ａ）は、ＡＡＶベクターにおける４．７ｋｂのパッケージ限界を超える、６０３０ｂｐのオープンリーディングフレームを有する。このサイズ限界を克服するための１つのアプローチは、送達のために、２つに割くことである。戦略１及び２は、共トランスフェクトした細胞における完全なオープンリーディングフレーム再構成を可能にするために、２つの別個のＡＡＶベクターゲノム（相同領域は破線で示される）の間の相同性駆動型の組換えを利用する。対照的に、戦略３及び４は、トランススプライシングエレメント（ドットで示される合成イントロン）を追加することにより、オープンリーディングフレーム再構築を潜在的に増加させ、それによって完全長タンパク質発現を増加させる。戦略１及び３は、ＳＹＦＰ−Ｐ２Ａ−及び３ｘＨＡ−タグ化ｈＳＣＮ１Ａタンパク質を利用し、蛍光及び免疫組織化学によってタンパク質の両部分の容易な検出を可能にする。他方で、戦略２及び４は、非タグ化ｈＳＣＮ１Ａタンパク質及び脊椎動物プロモーターを利用して、送達されたトランスジーン及びコードされたタンパク質の免疫原性を確実に低下させる。別の戦略は、ＳＣＮ１Ａタンパク質の異なるセグメント又はサブユニットをそれぞれコードする、多数のベクターを利用する。次いで、タンパク質サブユニットは、天然の発現又は遺伝子操作したシステイン結合ドメイン又は他の結合ドメインを介して発現の後に、自己集合してもよい。
【図８−２】図８。ＡＡＶパッケージ限界を超えるにもかかわらず、完全長ヒトＳＣＮ１Ａタンパク質をコードしそして送達するための、４例の戦略。ヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子（ｈＳＣＮ１Ａ）は、ＡＡＶベクターにおける４．７ｋｂのパッケージ限界を超える、６０３０ｂｐのオープンリーディングフレームを有する。このサイズ限界を克服するための１つのアプローチは、送達のために、２つに割くことである。戦略１及び２は、共トランスフェクトした細胞における完全なオープンリーディングフレーム再構成を可能にするために、２つの別個のＡＡＶベクターゲノム（相同領域は破線で示される）の間の相同性駆動型の組換えを利用する。対照的に、戦略３及び４は、トランススプライシングエレメント（ドットで示される合成イントロン）を追加することにより、オープンリーディングフレーム再構築を潜在的に増加させ、それによって完全長タンパク質発現を増加させる。戦略１及び３は、ＳＹＦＰ−Ｐ２Ａ−及び３ｘＨＡ−タグ化ｈＳＣＮ１Ａタンパク質を利用し、蛍光及び免疫組織化学によってタンパク質の両部分の容易な検出を可能にする。他方で、戦略２及び４は、非タグ化ｈＳＣＮ１Ａタンパク質及び脊椎動物プロモーターを利用して、送達されたトランスジーン及びコードされたタンパク質の免疫原性を確実に低下させる。別の戦略は、ＳＣＮ１Ａタンパク質の異なるセグメント又はサブユニットをそれぞれコードする、多数のベクターを利用する。次いで、タンパク質サブユニットは、天然の発現又は遺伝子操作したシステイン結合ドメイン又は他の結合ドメインを介して発現の後に、自己集合してもよい。
【図９】２部分のＡＡＶウイルスベクター系によって駆動された完全長ヒトＳＣＮ１Ａ発現（上パネル）：２部分のベクター系のモデル。上のベクター（１５０４）は、コンカテマー化した３ｘｈＩ５６ｉＣｏｒｅ（配列番号３）及びすべての抑制性ニューロン（Ｐｖａｌｂ＋抑制性ニューロン及びＰｖａｌｂ−抑制性ニューロンの両方を含む）における発現を駆動するためのプロモーター（ｍｉｎＣＭＶ）エレメントを含む。駆動されたトランスジーンは、Ｐ２ＡタグによってヒトＳＣＮ１ＡのＮ末端領域に結合したＳＹＦＰ２を含み、これは、下のベクター  １５１２に示されるＣ末端領域と相同な６０４ｂｐを含む。下のベクター１５１２はまた、Ｃ末端３ｘＨＡタグ及び３’ＵＴＲ調節配列（ＷＰＲＥ３及びポリＡ部位）をも含む。（下パネル）：両ＡＡＶウイルスベクターを、ＰＨＰ．ｅＢカプシドと共にウイルス粒子内にパッケージし、どちらも、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに静脈内送達させた。２１日後、マウス脳を回収し、固定し、そして抗ＧＦＰ（ＳＹＦＰ２を標的とする）、抗ＨＡ及び抗Ｐｖａｌｂ抗体で免疫蛍光のために処理し、トランスジーン発現細胞及びＰｖａｌｂ＋抑制性ニューロン（ＤＳ症候学において特に重要な細胞）との重ね合わせを検出した。Ｐｖａｌｂ＋抑制性ニューロン及びＰｖａｌｂ−抑制性ニューロンの両方を含む多くの抑制性ニューロンを、Ｎ末端ＳＹＦＰ２＋タグによって高レベルで標識した。これらのＳＳＹＦＰ２＋細胞のいくつかはまた、ＨＡ（これらのＧＦＰ＋ＨＡ＋細胞から発現される完全に無傷（ｉｎｔａｃｔ）なＳＣＮ１Ａタンパク質生成物）をも発現した（矢印）。垂直な矢印は、ヒトＳＣＮ１Ａ  を発現するＰｖａｌｂ＋介在ニューロンを示し、水平な矢印は、ヒトＳＣＮ１Ａ  を発現するＰｖａｌｂ−介在ニューロンを示す。これらのＳＣＮ１Ａ発現細胞は、前脳（新皮質と海馬の両方［ここでは、脳回と記す］）のいたるところに見出され、ここには、多くのてんかんにおいて重要であることが知られており、かつＤＳにおいて機能不全であることが知られている脳の領域が含まれる。
【図１０】図１０．ＣＮ１５００  ｒＡＡＶベクター  は、Ｓｃｎ１ａ＋／−マウスにおいて、熱性発作を実質的に回復させる。熱性発作アッセイを、発作が最初に検出される場所である内部温度として示した（上）。丸は、ＡＡＶで形質導入されていないＳｃｎ１ａ＋／−マウスを表し、ひし形はＣＮ１５００で形質導入された動物を表す。大きなドット及びエラーバーは、各動物群についての平均＋／−ＳＥＭを表す（下）。異なる温度で発作を起こさないままにするという同じデータの傾向が、カプラン−マイヤー曲線を用いて、各群におけるマウスの百分率で示される。
【図１１−１】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−２】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−３】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−４】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−５】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−６】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−７】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−８】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−９】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−１０】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−１１】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−１２】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−１３】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−１４】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−１５】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−１６】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−１７】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−１８】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−１９】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−２０】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−２１】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−２２】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−２３】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−２４】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−２５】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−２６】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−２７】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−２８】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−２９】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−３０】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−３１】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−３２】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−３３】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−３４】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−３５】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−３６】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−３７】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−３８】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−３９】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−４０】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−４１】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−４２】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−４３】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−４４】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−４５】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−４６】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−４７】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−４８】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−４９】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−５０】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−５１】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−５２】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−５３】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−５４】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−５５】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−５６】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【図１１−５７】図１１。本開示を支持する１〜５７の配列例。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
脊椎動物において、電位開口型ナトリウムチャネル（Ｎａｖ）は、アルファサブユニットから構成される大きな中央の孔及びベータサブユニットから構成されていて、この孔の動態及び細胞内分布を調整するより小さい補助サブユニットを含む、ヘテロマータンパク質複合体である。アルファサブユニット９つの異なる遺伝子（ＳＣＮ１Ａ〜ＳＣＮ１１Ａ）のファミリーによってコードされており、ベータサブユニットは、４つの異なる遺伝子（ＳＣＮ１Ｂ〜ＳＣＮ４Ｂ）によってコードされていて、これらの遺伝子メンバーは、細胞特異的及び組織特異的な発現パターンを示す。９つの異なるアルファサブユニット遺伝子のそれぞれは、９つの異なるサブタイプ（Ｎａｖ１．１〜Ｎａｖ１．９）を作る別個のＮａｖチャネル複合体をばら蒔き、これらの９つのＮａｖチャネルは、組織特異的局在及び機能的相違を示す（Ｇｏｌｄｉｎ，（２００１）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ６３：８７１−９４；及びＹｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２３：７５７７−７５８を参照されたい）。
【００１８】
Ｎａｖは、ニューロン機能の中心であり、興奮可能な神経系細胞において作用能力の迅速な上昇を開始させる役割を担っており、そして、Ｎａｖ１．１は、多くの細胞においてこの活性を駆動する。Ｎａｖ１．１チャネルは、ＳＣＮ１Ａアルファサブユニットを含み、ほぼ全てのニューロンで発現されていて、ＧＡＢＡ作動性ニューロンにおいて高レベルである。Ｎａｖ１．２チャネルは、ＳＣＮ２Ａサブユニットを含み、Ｎａｖ１．３チャネルは、ＳＣＮ３Ａサブユニットを含み、Ｎａｖ１．４チャネルは、ＳＣＮ４Ａサブユニットを含み、Ｎａｖ１．５チャネルは、ＳＣＮ５Ａサブユニットを含み、Ｎａｖ１．６チャネルは、ＳＣＮ８Ａサブユニットを含み、Ｎａｖ１．７チャネルは、ＳＣＮ９Ａサブユニットを含み、Ｎａｖ１．８チャネルは、ＳＣＮ１０Ａサブユニットを含み、そして、Ｎａｖ１．９チャネルは、ＳＣＮ１１Ａサブユニットを含む。
【００１９】
治療が緊急で必要とされる、多くの神経学的障害が存在する。このような障害の一つのクラスは、抑制性ニューロンにおけるＮａｖ１．１ナトリウムチャネルの機能不全に起因して起こる。たとえば、以下の障害及び症状が、Ｎａｖ１．１ナトリウムチャネルの機能不全に関連している：てんかん（ドラベ症候群（ＤＳ）、全般てんかん熱性発作プラス（ＧＥＦＳ＋）、境界型ＤＳ、全身性強直性間代性発作を伴う難治性小児てんかん（ＩＣＥＧＴＣ）、原因不明の限局性てんかん及び全身性てんかん、ミオクローヌス性失立てんかん（ドゥース（Ｄｏｏｓｅ）症候群）、レノックス・ガストー症候群、及重度の乳児多巣性てんかん（Ｇａｍｂａｒｄｅｌｌａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ．２００９，５０  Ｓｕｐｐｌ  ５：２０−３））、点頭てんかんとしても知られるウエスト症候群（Ｈａｒｋｉｎ  Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｒａｉｎ，２００７，１３０（３）８４３−８５２）、よくある片頭痛の稀な症例、例えば家族性片麻痺性片頭痛３（ＦＨＭ３）、パナイオトポーロス（Ｐａｎａｙｉｏｔｏｐｏｕｌｏｓ）症候群（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ  Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｈｉｌｄ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００９，２４（４）：５０３−８）、家族性自閉症（Ｗｅｉｓｓ  Ｌ．Ａ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，８（２），１８６−１９４）、散発性自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）（Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２０１１  ４３（６）：５８５−９）、慢性限局性脳炎としても知られるラスムッセン脳炎、又はＣＦＥ（Ｏｈｍｏｒｉ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ，Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ．２００８  ４９（３）：５２１−６）、アルツハイマー病（Ｓｃｈａｒｆｍａｎ  Ｈ．Ｅ．Ｅｐｉｌｅｐｓｙ  Ｃｕｒｒ．２０１２  １２（５）：１７８−１８３）並びに脳虚血−再灌流（Ｙａｏ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｕｒｏｔｏｘ  Ｒｅｓ．２００２；４（１）：６７）。
【００２０】
てんかんの根底にある原因は、皮質回路の興奮−抑制（Ｅ／Ｉ）バランスの欠損から起こると考えられている。前脳ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンは、終脳おける抑制の最初の源であり、てんかんにおけるその重要性を、種々に連なる証拠が示している。ＤＳは、詳細には、主としてＳＣＮ１Ａハプロ不全に起因する重度の小児てんかんである。これは、重度かつ頻繁な（時には日に百回もの）発作が際立っており、発達遅延をもたらし、１６％以下の致死率を有する。ＤＳは、米国及び欧州の両方において、出生の２０，０００分の１近くを冒し、両大陸において１０，０００人以上の人々がＤＳに罹患していると見積もられている（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １３６，ｅ１３１０−ｅ１３１５，２０１５）。電位開口型ナトリウムチャネルＮａｖ１．１のサブユニットを形成する孔をコードする遺伝子であるＳＣＮ１Ａにおけるヘテロ接合性の機能欠失型突然変異は、ＤＳの主な原因である（Ｃａｔｔｅｒａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５８８，１８４９−１８５９，２０１０；Ｃｌａｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．２１，６１５−６２１，２００３；Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｅｐｉｌｅｐｓｙ  Ｒｅｓ．７０  Ｓｕｐｐｌ  １，Ｓ２２３−２３０，２００６；Ｖｅｒｂｅｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｐｉｌｅｐｓｙ  Ｂｅｈａｖ．ＥＢ  ４７，３９−４４，２０１５）。ＤＳの遺伝子モデルは、この疾患の病態生理学を確立した（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４８９，３８５−３９０，２０１２；Ｋａｌｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３，１７９８−１８０８，２０１３；Ｋａｌｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２７，１１０６５−１１０７４，２００７；Ｋａｌｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．７７，１４１−１５４，２０１５；Ｏａｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０６，３９９４−３９９９，２００９；Ｃｈｅａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９，１４６４６−１４６５１，２０１２；Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９，Ｅ３６８−Ｅ３７７，２０１２）。ＤＳのマウスモデルは、Ｓｃｎ１ａのヘテロ接合性欠損に起因する低減したＮａｖ１．１機能を有し、以下を含むＤＳの主要な表現形質を示す：熱性発作，不安及び睡眠負債（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４８９，３８５−３９０，２０１２；Ｋａｌｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３，１７９８−１８０８，２０１３；Ｋａｌｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．７７，１４１−１５４，２０１５；Ｏａｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０６，３９９４−３９９９，２００９；Ｔａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１１，Ｅ３１３９−Ｅ３１４８，２０１４；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．９，１１４２−１１４９，２００６）。
【００２１】
ＤＳは、前脳介在ニューロンの疾患である。包括的なＳｃｎ１ａ欠失は、興奮性ニューロンに対する検出可能な影響がないまま、ナトリウム電流及びＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの興奮能（ｅｘｉｔａｂｉｌｉｔｙ）を低減する（Ｃａｔｔｅｒａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５８８，１８４９−１８５９，２０１０；Ｋａｌｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２７，１１０６５−１１０７４，２００７；Ｃｈｅａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９，１４６４６−１４６５１，２０１２；Ｔａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１１，Ｅ３１３９−Ｅ３１４８，２０１４；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．９，１１４２−１１４９，２００６；Ｏｇｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２７，５９０３−５９１４，２００７；Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  １３８，２２１９−２２３３，２０１５；Ｍｉｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．６５，１−１１，２０１４）。特異的Ｃｒｅ駆動体を用いた前脳又は介在ニューロンにおけるＳｃｎ１ａの条件欠失は、ＤＳの主要な症候を定性的に再生産する一方で、興奮性ニューロン特異的欠失は、検出可能な表現型をもたらさない（Ｃｈｅａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９，１４６４６−１４６５１，２０１２）。加えて、Ｐｖａｌｂ＋又はＳｓｔ＋介在ニューロンクラスにおけるＳｃｎ１ａの標的化した欠失は、（別個に又は組み合わせて）各クラスにおける機能不全がＤＳの多面的な表現型に別個に寄与していることを、Ｐｖａｌｂ＋細胞がより高い効果を発揮することと共に、明らかにした（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  １３８，２２１９−２２３３，２０１５；Ｄｕｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．４９，２１１−２２０，２０１３）。これらのマウスモデルと一貫して、ＤＳを患う患者は、ＧＡＢＡ作動性抑制の低減を示し、経頭蓋刺激試験後にグルタミン酸作動性のニューロン興奮能において変化しない（Ｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ８８，１６５９−１６６５，２０１７）。したがって、マウス及びヒト両方の研究は、ＳＣＮ１Ａにおける病原性機能欠失型突然変異によって起こる前脳介在ニューロンの疾患であることを強く示している。この見識に基づいて、前脳ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンにおけるＮａｖ１．１と同様の特性を持つ機能的電位依存性ナトリウムチャネルの標的導入は、その生理機能のレスキューを介したＤＳ症候を改善するか、又は除去するという仮説が立てられる。電気生理学的かつ表現型的にマウスモデルにおけるＤＳを性質決定するための例示的な方法は、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  １３８（Ｐｔ  ８）：２２１９−３３，２０１５の図１を参照されたい。
【００２２】
非病原性組換え体アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を用いた細胞型特異的又はクラス特異的な遺伝子送達は、広範な疾患の治療法としてますます有望であることを示している。１つ以上のシス作用性ＤＮＡ制御エレメント（例えば、特異的なプロモーター又はエンハンサー）をｒＡＡＶに含めることは、脳内の細胞型又は細胞クラスを含む特定の標的細胞内における発現に特異性を提供するために有益である。例えば、Ｄｉｍｉｄｓｃｈｓｔｅｉｎ及び共同研究者ら（Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９（１２）：１７４３−１７４９，２０１６）は、終脳内におけるＧＡＢＡ作動性介在ニューロンにおいて遺伝子の選択的発現をもたらすｒＡＡＶを開発した。ｒＡＡＶは、胚発生の間に前脳ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンによって天然に発現される、ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓホメオボックス５及び６（Ｄｌｘ５／６）遺伝子由来の５２９塩基対（ｂｐ）のエンハンサー配列（ｍＩ５６ｉ又はｍＤｌｘと呼ぶ）を含む（Ｚｅｒｕｃｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０（２）：７０９−７２１，２０００）。Ｄｉｍｉｄｓｃｈｓｔｅｉｎらによって開発された構築物は、ＡｄｄｇｅｎｅにおいてＩＤ＃８３９００（この構築物においてエンハンサーがｅＧＦＰ発現を駆動する）として入手可能である。さらなるマウス又はヒトＩ５６ｉエンハンサーを働かせて種々のトランスジーンを駆動する構築物もまた、Ａｄｄｇｅｎｅを通して、例えばプラスミドＩＤ＃８３８９９（ＧＣａＭＰ６ｆ発現を駆動する）、８３８９８（ＣｈＲ２−ｍＣｈｅｒｒｙ発現を駆動する）、８３８９５（Ｃｒｅリコンビナーゼ依存型ｅＧＦＰ発現を駆動する）、８９８９７（二シストロン性ｈＭ３Ｄｑ及びｎｌｓ−ｄＴｏｍａｔｏ発現を駆動する）、８３８９６（二シストロン性ｈＭ４Ｄｉ及びｎｌｓ−ｄＴｏｍａｔｏ発現を駆動する）及び８３８９４（ｃｒｅリコンビナーゼ依存型ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を駆動する）を入手可能である。また、米国特許出願公開ＵＳ２０１８／００７８６５８をも参照されたい。さらに、ｍＤｌｘエンハンサーは、かつて、胚発生におけるＤｌｘ５／６発現の通常のパターンと非常に類似したパターンで、レポーター遺伝子を確実に標的するために、使用されてきた（Ｚｅｒｕｃｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２０：７０９−７２１，２０００；Ｓｔｕｈｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ  １２：７５−８５，２００２；Ｓｔｅｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２３：１６７−１７４，２００３；Ｍｏｎｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ．５１：４５５−４５５，２００６；Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３０：１５３２−１５９４，２０１０）。
【００２３】
ｒＡＡＶを選択的遺伝子送達系として用いることの１つの重大な欠点は、ＡＡＶの厳しく制限されたパッケージ限界である。これは詳細には、長い遺伝子制御エレメントを挿入することを制限する。さらに、既存の介在ニューロン特異的ｒＡＡＶ発現構築物は、特定の適用において弱い発現を提供し、そしてトランスジーンの発現（例えば、治療用遺伝子）について、ＧＦＰよりも耐性が低い。したがって、Ｎａｖ１．１機能回復タンパク質の細胞特異的発現（詳細には、抑制性介在ニューロンなどのニューロンにおける発現）を提供することができる、より短いエンハンサー配列であっても、未だ当該分野において必要とされている。また、より強い発現を提供するか、及び／又はレポーターもしくは他の標的遺伝子のより広範な選択をより広範な種類の発現環境において扱う遺伝子エレメントも、必要とされている。
【００２４】
本開示は、電位開口型ナトリウムチャネル機能をレスキューする目的のために抑制性ニューロンにおける高レベルのタンパク質発現をもたらす発現構築物を提供する。このタンパク質発現は、標的化される抑制性ニューロンに選択的であり、かつ、ＤＳの十分に確立したインビボマウスモデル（詳細には、Ｋａｌｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３，１７９８−１８０８，２０１３；及びＯａｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０６，３９９４−３９９９，２００９に記載されている）においてこの疾患を治療する効力をもたらす。このモデルにおいて、マウスは、Ｋａｌｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３，１７９８−１８０８，２０１３；Ｋａｌｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．７７，１４１−１５４，２０１５；及びＯａｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０６，３９９４−３９９９，２００９に記載されているアプローチを用いて、脳波記録法（ＥＥＧ）電極及び筋電図検査（ＥＭＧ）電極を埋め込まれていてもよい。回復の後、動物は、ビデオ、ＥＥＧ及びＥＭＧによって継続的にモニタリングされていてもよい。試験手順の間、マウスの体温は、全身性強直性間代性発作が起こるか、又は深部体温が４２℃に達するまで、０．５℃刻みで上昇し得る。各処理群について、温度に起因する発作感受性についてのカプランマイヤー曲線を作成してもよく、発作発生の平均体温が、コンピューター計算され得る。χ二乗検定は、発作感受性のカプランマイヤープロットと一致し得、そして対応のない両側検定は、発作発生の平均体温間の相違を確認する。
【００２５】
特定の実施形態において、発現構築物は、天然に存在しないエンハンサーエレメント配列を含み、これは、異種コード配列を駆動してＮａｖ１．１関連ナトリウムチャネル障害を駆動するために使用される場合、強力かつ迅速な介在ニューロン特異的発現を示す。特定の実施形態において、天然に存在しないエンハンサーエレメントは、ヒト又はマウスＩ５６ｉエンハンサーの短くしたコア部分（配列番号３）の多数のコピーを含む。実際に、本開示は、任意の種由来のＩ５６ｉエンハンサーのコンカテマー化したコアが抑制性ニューロンにおける機能的タンパク質の選択的発現をもたらす限り、そのコンカテマー化したコアを含み得る。例えば、ゼブラフィッシュＩ５６ｉエンハンサーは、配列番号５に提示されており、そしてゼブラフィッシュＩ５６ｉエンハンサーのコアは、配列番号６として提示される。詳細な実施形態は、天然に存在しないエンハンサーエレメントは、ヒト、マウス又はゼブラフィッシュＩ５６ｉコアの３コピー（例えば、配列番号３及び列番号７に示される）のコンカテマーを含む。さらなる実施形態は、例えば直列に配置される、２ｘ、４ｘ、５ｘ、６ｘ、７ｘ、８ｘ、９ｘ、又は１０ｘコピーの配列番号２又は配列番号６のＩ５６ｉコア配列を含む。詳細な実施形態は、配列番号２及び配列番号６のコンカテマー化したハイブリッドを含み得る（例えば、２−６−２、６−２−６、２−２−６、６−６−２）。
【００２６】
特定の実施形態において、Ｉ５６ｉエンハンサーのコンカテマー化したコアは、電位開口型ナトリウムチャネル機能をレスキューするタンパク質又はヌクレオチド配列の発現を増大するために、大きさを最小化するために使用される。合成３ｘヒトＤＬＸＩ５６ｉコアエンハンサー（３ｘｈＩ５６ｉＣｏｒｅとしても知られる；配列番号３）は、３ｘコンカテマーはエンハンサーの非常に保存的なコアであるにもかかわらず、Ｄｉｍｉｄｓｃｈｓｔｅｉｎら（ＮａｔＮｅｕｒｏｓｃｉ１９（１２）：１７４３−１７４９、２０１６）において報告される元の完全長エンハンサー配列よりも短い。Ｎａｖ１．１ナトリウムチャネル機能をレスキューするタンパク質の発現を駆動する異種発現カセットを構築するために使用される場合、このコンカテマー化したコアエンハンサーは、エンハンサーに結合した積み荷遺伝子のためのより多くの余地を提供し、このことは、遺伝子治療ベクターにおいて非常に望ましい。
【００２７】
コンパクトな大きさのエンハンサーコア、及び一緒に結合してコンカテマー化した多数のコピーは、マウス及びヒトの脳組織のウイルス形質導入後、前脳介在ニューロンにおいて予期せぬ強力なトランスジーンのピーク発現をもたらした（図４Ｂ及び５を参照されたい）。発症はまた、驚くほど迅速でもあり（図６Ａ、６Ｂを参照されたい）、例えばＡｄｄｇｅｎｅプラスミド＃８３９００のエンハンサーと一緒にパッケージされたウイルスと直接比較して、より速くより高い発現をもたらす。発現における増大は、線形状であり、完全長エンハンサー（配列番号１）によって駆動されたレベルを単純に３倍したものではない。したがって、コンカテマー化したＩ５６ｉコアエンハンサーもまた、新規かつ改善されたウイルス（及び他の）ベクターであり、例えばこれは、Ｎａｖ１．１ナトリウムチャネル障害の治療においてよりよい性能を示すことができる本明細書中で記載のベクターである。これらは、詳細には、広範な動物種における新皮質ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンなどの抑制性脳細胞型においてトランスジーンの発現を達成するために有用である。
【００２８】
したがって、本開示は、電位開口型ナトリウムチャネルＮａｖ１．１の機能不全を回復させるか、又は緩和させるために有用な、発現構築物、ベクター及び方法を提供する。特定の実施形態において、本開示は、Ｎａｖ１．１活性障害を有する抑制性介在ニューロンに対して、電位開口型ナトリウムチャネル機能のレスキューを可能にするタンパク質又はヌクレオチド配列を提供する遺伝子を選択的に送達することによる、Ｎａｖ１．１チャネル障害の治療を提供する。
【００２９】
特定の実施形態において、Ｎａｖ１．１が損傷している場合に電位開口型ナトリウムチャネル機能をレスキューするタンパク質をコードする遺伝子は、細菌由来のＮａｖ遺伝子（ＮａｖＢａｃ）である（Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．７，１３１３２，２０１６；Ｓｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８，１４２０５，２０１７；ＤｅＣａｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅＬｉｆｅ  ３，ｅ０４３８７，２０１４）。特定のＮａｖＢａｃｓの例は、ＮａｖＳｈｅＰ、ＮａｖＢｐ及びＮａｖＭｓであり、これらは、３つの別個の細菌種由来の３つのＮａｖタンパク質である。細菌性電位開口型ナトリウムチャネルが興奮できない細胞に対しナトリウム伝導性を付与することができることを示す、代表的な実験プロトコール及びデータについては、Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  １８（７），１３１３２，２０１６、詳細には補遺図８を参照されたい。
【００３０】
ＮａｖＢａｃタンパク質はまた、ＮａｖＳｈｅＰ−Ｄ６０Ｎにおけるのと同様に、突然変異誘発によって、必要に応じて、活性を増大したり、又は変更したりすることができる。さらに、これらのタンパク質は、検出のために、必要に応じて、Ｈｉｓ−ＮａｖＭｓ（Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグを含む）もしくはＮ末端３ｘＨＡタグを含むもの又は他のエピトープタグ又は蛍光タンパク質タグもしくは任意の他のタンパク質タグを含むもののように、タグ又は他の融合タンパク質を組み込むように操作されてもよい。特定の実施形態において、発現構築物は、免疫原性構成要素をコードしない。特定の実施形態において、発現構築物は、免疫原性構成要素を含んだり、又はコードしたりしない。
【００３１】
特定の実施形態において、電位開口型ナトリウムチャネル機能を回復させるタンパク質をコードする遺伝子は、ＳＣＮＡ１をコードする遺伝子である（例えば、ヒトＳＣＮＡ１又はマウスＳｃｎａ１）。
【００３２】
特定の実施形態において、ウイルスベクターの静脈内、後眼窩、脊髄内及び／又は髄腔内投与に基づく治療処置は、標的化した抑制性ニューロン内での選択的発現をもたらす。
【００３３】
特定の実施形態において、翻訳された際に２つのタンパク質：ＳＹＦＰ２（レポーター）及びＮａｖＳｈｅＰ−Ｄ６０Ｎに開裂するトランスジーンＳＹＦＰ２−Ｐ２Ａ−ＮａｖＳｈｅＰ−Ｄ６０Ｎを発現する組換え体ＡＡＶである、ＡＡＶウイルスベクターＣＮ１５００が、本明細書中で提供される。示されるように、ＮａｖＳｈｅＰ−Ｄ６０Ｎ（Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍ．７：１３１３２，２０１６）は、細菌由来の改変型電位開口型ナトリウムチャネルであり、チャネル動態を改善するように改変され、哺乳動物細胞において発現を増大するためにコドン最適化されている。トランスジーン発現レベルは、ＷＰＲＥ３エレメントの付加によって上昇し、転写は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨｐＡ）によって停止される。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最小プロモーターの５’に直接３ｘｈＩ５６ｉＣｏｒｅ合成エンハンサーを介したトランスジーンの発現は高く、そして皮質及び海馬を含む前脳構造において抑制性細胞に限定されている。さらに、治療用トランスジーンＮａｖＳｈｅＰ−Ｄ６０Ｎは、タンパク質発現及び正確なタンパク質局在を検証するために、ＨＡエピトープタグによって標識されてもよい。ＤＳのマウスモデルにおける治療効力は、実証されている。特定の実施形態において、ＨＡエピトープタグは、本明細書中で記載されるＣＮ１５００及び他のベクター設計から取り除かれてもよい。
【００３４】
ヒトＳＣＮＡ１遺伝子は、比較的大きく、そしてＡＡＶよりもより大きな積み荷を受け入れるベクターからの投与によって、又は２−ＡＡＶベクター投与戦略を用いることによって、利益を得ることができる。２つのＡＡＶベクターの間で大きなオープンリーディングフレームを割くために、多数の異なる戦略が利用されてもよい。大きなｈＳＣＮ１Ａオープンリーディングフレームを割くための４つの大きな戦略が、図８に示されるが、さらにいくつか想像することができる。
【００３５】
特定の実施形態において、２−ベクター投与戦略は、２つのベクター間のコード配列を割いてもよい。特定の実施形態において、第１のベクターは、プロモーター及びエンハンサーを含む、タンパク質のＮ末端部分をコードしてもよい。第２のベクターは、タンパク質のＣ末端部分をコードし、そして終止シグナル及びポリＡシグナルを含んでもよい。各ベクターによってコードされるタンパク質の部分は、重複していて、相同性領域を作成する。実施例２、図８戦略１及び図９は、抑制性ニューロンにおけるヒトＳＣＮ１Ａタンパク質の選択的発現を達成する、このような２−ベクター系の例を示す。６０４−塩基対（ｂｐ）の相同性領域は、図９において斜め破線で示される。しかし、当業者に理解されるように、広範な範囲の数の相同なｂｐが選択され得る。特定の実施形態において、相同性のｂｐ領域は、７５ｂｐ未満から１５００ｂｐ未満の範囲にわたる。さらに、種々の他の構成要素及び立体配置が、本明細書中の他の所で単ベクター系と比較してより詳細に記載されるように、２−ベクター系において適切であり得る。可能性のある別の立体配置としては、より効率的なタンパク質の最終的な再構成を行い、そしてより高いレベルのタンパク質発現をもたらす、相同性領域並びにスプライシングドナー部位及びアクセプター部位を提供する合成イントロンエレメントが挙げられる。
【００３６】
さらに、外因性の電位開口型ナトリウムチャネル活性を、活性が欠損している抑制性ニューロンに提供するための、さらなる戦略もまた、使用され得る。例えば、特定の実施形態は、ＳＣＮ１Ａの内因性機能的コピーの発現を増大させる人工転写因子をコードする発現構築物を利用することができる。
【００３７】
特定の実施形態において、発現構築物は、例えばスプライシング及び又は安定性の転写後の正の調節を通して、機能的ＳＣＮ１Ａ  ｍＲＮＡ分子の普及を増大する分子をコードしてもよい。
【００３８】
特定の実施形態において、２つの部分に分離したｈＳＣＮ１Ａ転写物をトランススプライシングすることを介して完全長ｈＳＣＮ１Ａ転写物を回復する戦略が使用され得る。
【００３９】
特定の実施形態において、発現構築物（例えば、ＡＡＶ）は、２つ又は４つの別個のベクターによって送達されるいくつかの（２つ又は４つの）サブユニットＯＲＦとしてｈＳＣＮ１Ａタンパク質を送達することができる。
【００４０】
ここで、本開示の局面は、以下のさらなる選択項目及び詳細によって説明される：（ｉ）発現構築物＆ベクター；（ｉｉ）投与のための組成物（ｉｉｉ）使用方法；（ｉｖ）キットお補備市販の包装；（ｉｖ）例示的実施形態；及び（ｖ）実験的実施例。
【００４１】
（ｉ）発現構築物＆ベクター。本明細書中で開示される発現構築物は、（ｉ）抑制性ニューロン内でのコード配列ｓの選択的発現をもたらす、Ｉ５６ｉエンハンサー配列のコンカテマー化したコア、（ｉｉ）発現されて、レスキューを必要とする細胞において電位開口型ナトリウムチャネル機能をレスキューするタンパク質又はヌクレオチド配列を生じる、コード配列、及び（ｉｉｉ）プロモーターを、含む。発現構築物はまた、必要であるか、又は有益である場合、他の調節エレメントを含んでもよい。特定の実施形態において、発現構築物は、単離されたポリヌクレオチドである。
【００４２】
特定の実施形態において、「エンハンサー」又は「エンハンサーエレメント」は、プロモーターに付随する転写のレベルを増大させ、プロモーター及び転写されるコード配列に対してどちらの方向でも機能し得、そしてプロモーター又は転写されるコード配列から見て上流又は下流に位置し得る、シス作用性配列である。エンハンサーエレメント配列の機能を測定するための、当該分野で認識されている方法及び技術が存在する。例として、Ｉ５６ｉエンハンサーの機能を決定するか、又は測定するための特定の方法が、Ｄｉｍｉｄｓｃｈｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９（１２）：１７４３−１７４９，２０１６）及び米国特許出願公開ＵＳ２０１８／００７８６５８に記載されている。エンハンサー配列の特定の例としては、ヒト完全長Ｉ５６ｉエンハンサー（配列番号１）、ｈＩ５６コア（配列番号２）及び３ｘｈＩ５６ｉコア（配列番号３）、並びにそれらのマウス及びゼブラフィッシュのオルソログが挙げられる。
【００４３】
特定の実施形態において、抑制性ニューロン特異的エンハンサーは、抑制性ニューロンにおいて、独自に又は優先的に使用されるエンハンサーである。抑制性ニューロン特異的エンハンサーは、抑制性ニューロンにおける遺伝子の発現を増大するが、他の細胞型、例えば非抑制性ニューロン又はグリア細胞においては遺伝子の発現に実質的に影響を及ぼさないので、したがって、ニューロン特異的転写活性を有する。いくつかの場合において、他の細胞型において何らかの低レベル発現があることがあるが、そのような発現は、抑制性ニューロンにおけるよりも実質的に低く、例えば、。抑制性ニューロンにおける発現レベルの１％未満又は１％、２％、３％、５％、１０％、１５％又は２０％である。特定の実施形態において、介在ニューロンは、Ｉ５６ｉエンハンサーのコンカテマー化したコアに結合して遺伝子発現を駆動する、正しい組み合わせの転写因子を発現する、唯一の細胞型である。
【００４４】
特定の実施形態において、抑制性ニューロン内における選択的発現は、非抑制性ニューロンの１０％より多くの発現、２０％より多くの発現、３０％より多くの発現、４０％より多くの発現、５０％より多くの発現、６０％より多くの発現、７０％より多くの発現、８０％より多くの発現、９０％より多くの発現、１００％より多くの発現又はそれ以上の発現によって、実証される。特定の実施形態において、抑制性ニューロン内における選択的発現は、抑制性ニューロン内における発現、及び非抑制性ニューロン内における検出可能な発現の非存在によって、実証される。
【００４５】
特定の実施形態において、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン内における選択的発現は、非ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの１０％より多くの発現、２０％より多くの発現、３０％より多くの発現、４０％より多くの発現、５０％より多くの発現、６０％より多くの発現、７０％より多くの発現、８０％より多くの発現、９０％より多くの発現、１００％より多くの発現又はそれ以上の発現によって、実証される。特定の実施形態において、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン内の選択的発現は、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン内における発現及び非ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン内における検出可能な発現の非存在によって、実証される。
【００４６】
特定の実施形態において、抑制性ニューロンの１つのクラスは、図１、７Ｃ、７Ｅ、及び８に関連して記載されるように、Ｐｖａｌｂ発現に基づいて同定可能である。特定の実施形態において、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンは、成体の皮質における遺伝子Ｇａｄ２及びＧａｄ１の発現によって他の細胞型と区別可能であり、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンは、ＧＡＢＡの存在によって、グルタミン酸作動性興奮性ニューロンと区別可能である。成体の線条体において、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンは、遺伝子Ｎｋｘ２．１の発現によって、中型有棘ニューロン（Ｍｅｄｉｕｍ  Ｓｐｉｎｙ  Ｎｅｕｒｏｎ）と区別可能である（例えば、Ｒｕｄｙｅｔａｌ．、ＤｅｖｅｌＮｅｕｒｏｂｉｏ７１、４５−６１（２０１１））：Ｋｅｐｅｃｓ．＆Ｆｉｓｈｅｌｌ、Ｎａｔｕｒｅ．５０５、３１８−３２６（２０１４）。
【００４７】
特定の実施形態において、コード配列又はヌクレオチド配列は、電位開口型ナトリウムチャネル機能をレスキューするタンパク質をコードする。特定の実施形態において、コード配列は、レポータータンパク質をさらにコードする。コード配列が電位開口型ナトリウムチャネル機能及びレポータータンパク質をレスキューするタンパク質又はヌクレオチド配列をコードする場合、自己開裂型ペプチド又は内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列などのスキッピング（ｓｋｉｐｐｉｎｇ）エレメントをさらにコードしてもよい。
【００４８】
電位開口型ナトリウムチャネル機能を回復するタンパク質の例としては、ＮａｖＳｈｅｐ、ＮａｖＳｈｅｐ−Ｄ６０Ｎ、ＮａｖＢｐ、ＮａｖＭｓ、及びｈＳＣＮ１Ａ、並びにそのエピトープタグ化バリアントである３ｘＨＡ−ＮａｖＳｈｅｐ−Ｄ６０Ｎ、３ｘＨＡ−ＮａｖＢｐ、３ｘＨＡ−ＮａｖＭｓ、Ｈｉｓ−ＮａｖＭｓ、及びｈＳＣＮ１Ａ−３ｘＨＡが挙げられる。
【００４９】
電位開口型ナトリウムチャネル機能をレスキューするタンパク質をコードするコード配列の例としては、配列番号９〜１６が挙げられる。
【００５０】
さらに、上に示した通り、外因性電位開口型ナトリウムチャネル活性を、その活性を欠損している抑制性ニューロンに提供するために使用し得る、さらなる戦略が存在する。例えば、特定の実施形態において、ＳＣＮ１Ａ＋／−患者（例えば、ドラベ患者）又は他の電位開口型ナトリウムチャネルが欠損している他の患者において、ＳＣＮ１Ａ（又は他のＳＣＮ＿Ａファミリー遺伝子）の内因性機能的コピーの発現を増加させるために、エンハンサー−ベクター（例えば、ＡＡＶ）は、人工転写因子をコードしてもよい。この人工転写因子は、一般的な転写活性化ドメインに結合した特異的ＤＮＡ結合ドメインを含み得る。ＤＮＡ結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ活性化技術を用いてＣａｓ９関連遺伝子から（Ｃａｓタンパク質がヌクレアーゼ活性を欠失するように遺伝子操作されているＭａｔｈａｒｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６３（６４２４），１８６−１９４に記載のように）、又はＴＡＬＥ転写因子（ＴＦ）などの他の慣用的なＤＮＡセンシングタンパク質から（Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０７（５０），２１６１７−２１６２２）もしくはジンクフィンガーＴＦ（Ｇｅｒｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ，４７（８），２３０９−２３１８）から、遺伝子操作され得る。ＣＲＩＳＰＲ及び他の標的化遺伝子結合（及び任意選択可能に編集）系及び構成要素に関するさらなる情報及び選択肢は、以下に示される。
【００５１】
特定の実施形態において、エンハンサー−ベクターは、機能的ＳＣＮ１Ａ  ｍＲＮＡ分子の、例えば転写後のスプライシング及び他の安定性の正の調節を通して普及を増大し、最終的には機能的電位開口型ナトリウムチャネル活性における増大をもたらす分子をコードし得る。これは、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド分子のＡＡＶ導入により、スプライシングを増大すること（Ｈｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ．９，２５７−２７７）又は潜在的なマイクロＲＮＡの負の調節を防ぐことを通して達成され得る。
【００５２】
特定の実施形態において、２つの部分に分離したｈＳＣＮ１Ａ転写物をスプライシングすることを通して、完全長のｈＳＣＮ１Ａ転写物を復活させるために、戦略が使用され得る。これは、２−ベクター系における強力な合成スプライシングドナー及びスプライシングアクセプターの使用を通して、そして形質導入後の細胞において２つの異なるゲノムの適切な並置を誘発する異なるＩＴＲ（ＩＴＲ２及びＩＴＲ５）の使用を通して、加速され得る（ＭｃＣｌｅｍｅｎｔｓ  ＭＥ，ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．９０（４）：６１１−６２３）。
【００５３】
特定の実施形態において、エンハンサー−ベクター（例えば、ＡＡＶ）は、別個のベクターによって送達されるいくつかの（２つ又は４つの）サブユニットＯＲＦとして、ｈＳＣＮ１Ａタンパク質を送達し得る。Ｎａｖチャネルは、アルファサブユニット内の４つの類似の内部ドメインに起因して、偽４倍内部対称性を示し（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３６３（６４３３），１３０３−１３０８）、これは、このタンパク質が、２つ又は４つの部分で送達されることに適していることを示す。前に示した通り、サブユニットの集合は、天然に起きてもよく、及び／又は遺伝子操作されたシステイン又は他の結合ドメインを含めることによって、容易になってもよい
【００５４】
特定の実施形態において、その内部４ドメインの偽対称性に起因して、ｈＳＣＮ１Ａは、表面ループにおけるブレイクポイントを除いて、機能的にも化学的にも機能的ＮａＶ１．１アルファサブユニットに匹敵する四量体に自己集合可能な、４つの異なるベクター上にコードされる４つの断片で送達され得る。あるいは、１つの断片が、完全にヒト配列からなるＮａＶ１．１アルファサブユニットを思わせるホモ四量体複合体内で自己集合し得る、１つのベクターによって送達されてもよい。どちらの戦略も、電位開口型ナトリウムチャネル活性が欠損しているニューロンにおいて、Ｎａｖ１．１チャネル機能をレスキューする目的で、ヒト非免疫原性生物分子を抑制性細胞に送達し得る。
【００５５】
さらなる戦略は、ｈＳＣＮ１Ａ  ＯＲＦをより小さい（例えば、ＡＡＶ適合性の）大きさ（＜４．７ｋｂ）に短縮するために使用され得る。
【００５６】
レポータータンパク質の例は、ＳＹＦＰ２、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ＰｈｉＹＦＰ及びＺｓＹｅｌｌｏｗ１などの黄色蛍光分子、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲｕｂｙ、Ｊｒｅｄ、及びＡｓＲｅｄ２などの赤色蛍光分子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ａｖＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ、及びｍＡｚａｍｉＧｒｅｅｎなどの緑色蛍光分子、ｍＯｒａｎｇｅ及びｍＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅなどの橙色蛍光分子、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＥＢＦＰ２及びＡｚｕｒｉｔｅなどの青色蛍光分子、Ｃｅｒｕｌｅａｎ及びｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅなどのシアン蛍光分子、ｍＰｌｕｍ及びｍＮｅｐｔｕｎｅなどの遠赤色タンパク質などの、蛍光タンパク質を含む。
【００５７】
ＧＦＰは、２３８アミノ酸（２６．９ｋＤａ）からなり、クラゲであるアエクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）／アエクオレア・アエクオレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ａｅｑｕｏｒｅａ）／アエクオレア・フォルスカレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｆｏｒｓｋａｌｅａ）から最初に単離され、青色光に曝した際に緑色の蛍光を発する。Ａ．ビクトリア由来のＧＦＰは、３９５ｎｍの波長において主要な励起ピークを、４７５ｎｍの波長において副次的な励起ピークを有する。その発行ピークは、５０９ｎｍであり、これは、可視光の低い緑の部分である。ウミシイタケ（ｓｅａ  ｐａｎｓｙ）（レニラ・レニフォルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））由来のＧＦＰは、１つの主要な励起ピークを４９８ｎｍに有する。広範な用途及び研究者の需要の進展に起因して、ＧＦＰの多くの異なる変異体が、遺伝子操作されている。第１の衆生な改善は、１９９５年にＮａｔｕｒｅにおいてＲｏｇｅｒ  Ｔｓｉｅｎによって報告された単点突然変異（Ｓ６５Ｔ）であった。この突然変異は、ＧＦＰの光特性を劇的に改善し、蛍光の増大、光安定性及び発行ピークを５０９ｎｍに保ったままでの主要な励起ピークの４８８ｎｍへのシフトをもたらした。この足場への３７℃折り畳み効率（Ｆ６４Ｌ）点変異の追加は、増強したＧＦＰ（ＥＧＦＰ）をもたらした。ＥＧＦＰは、消滅係数（εと記される）を有し、これは、その９．１３Ｅ−２１ｍ２／分子の光学断面積によっても知られ、また、５５、０００Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）とも引用される。スーパーフォルダー（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ）ＧＦＰは、たとえ折り畳みそこなったペプチド度融合していても、ＧＦＰを迅速に折りたたんで成熟させることを可能にする、一連の突然変異であり、２００６年に報告されている。
【００５８】
緑色蛍光タンパク質の「黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）」は、遺伝子突然変異であり、アエクオレア・ビクトリアに由来する。その励起ピークは、５１４ｎｍであり、その発行ピークは、５２７ｎｍである。
【００５９】
自己開裂型ペプチドの例としては、１つのｍＲＮＡから２つのタンパク質の産生をもたらす２Ａペプチドが挙げられる。２Ａ配列は、短く（例えば、２０アミノ酸）、大きさの制限された構築物においてより利用を可能にする。特定の例としては、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａが挙げられる。特定の実施形態において、発現構築物は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列を含む。ＩＲＥＳは、リボソームに、ｍＲＮＡ分子上の第２の内部部位において翻訳を開始させて、１つのｍＲＮＡから２つのタンパク質の産生をもたらす。
【００６０】
本明細書中で記載されるタンパク質をコードするコード配列は、公に利用可能なデータベース及び刊行物から得られ得る。コード配列は、種々の配列多型、突然変異、及び／又は配列バリアントをさらに含み得、ここで、このような改変は、コードされたタンパク質の機能に影響を及ぼさない。用語「コードする」又は「コードしている」は、ベクター、プラスミド、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの核酸の配列の、タンパク質などの他の分子の合成のための鋳型として寄与する特性をいう。
【００６１】
用語「遺伝子」は、コード配列のみでなく、プロモーター、エンハンサー及び停止領域などの調節領域をも含み得る。この用語は、ｍＲＮＡ転写物からスプライシングされる全てのイントロン及び他のＤＮＡ配列をも、代替のスプライシング部位から生じるバリアントと共に、さらに含み得る。配列はまた、参照配列（単数又は複数）の縮重コドンをも含み得、これは、特性の生物又は細胞型におけるコドン選択性を提供するために導入され得る。
【００６２】
プロモーターは、一般的なプロモーター、組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーター、及び／又は細胞質に特異的なプロモーターを含み得る。プロモーターは、強力なプロモーター、弱いプロモーター、構成的発現プロモーター、及び／又は誘導性プロモーターを含み得る。誘導性プロモーターは、特定の条件、シグナル又は細胞事象に応答して、発現を指示する。例えば、プロモーターは、プロモーターからの転写に影響を及ぼすために、特定のリガンド、低分子、転写因子又はホルモンタンパク質を必要とする、誘導性プロモーターであってもよい。プロモーターの特定の例としては、ｍｉｎＢｇｌｏｂｉｎ、ＣＭＶ、ｍｉｎＣＭＶ、ＳＶ４０最初期プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端リピート（ＬＴＲ）プロモーターが挙げられる。
【００６３】
特定の実施形態において、発現構築物は、ベクター内に提供される。用語ベクターは、発現構築物などの別の核酸分子を移入させるか、又は輸送することができる核酸分子をいう。移入した核酸は、一般に、ベクター核酸分子に結合しており、例えば、ベクター核酸分子内に組み込まれている。ベクターは、細胞内で自主的な複製を指示する配列を含んでもよく、又は宿主細胞ＤＮＡ内への組み込みを可能にする配列を含んでもよい。有用なベクターとしては、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミド又はＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌性人工染色体、及びウイルスベクターが挙げられる。
【００６４】
ウイルスベクターは、広範に使用され、細胞内に非天然核酸分子を移入させそして発現させることを促進する、ウイルス由来核酸エレメントを含む核酸分子をいう。用語アデノ随伴ウイルスベクターは、主にＡＡＶに由来する、構造的かつ機能的な遺伝子エレメント又はその部分を含む、ウイルスベクター又はプラスミドをいう。用語「レトロウイルスベクター」は、主にレトロウイルスに由来する、構造的又は機能的な遺伝子エレメント又はその部分を含む、ウイルスベクター又はプラスミドをいう。用語「レンチウイルスベクター」は、主にレンチウイルスからに由来する、構造的又は機能的な遺伝子エレメント又はその部分を含む、ウイルスベクター又はプラスミドをいう、などである。用語「ハイブリッドベクター」は、一種より多くのウイルス型由来の構造的及び／又は機能的な遺伝子エレメントを含むベクターをいう。
【００６５】
アデノウイルス。「アデノウイルスベクター」は、（ａ）発現構築物のパッケージングを支持しそして（ｂ）センス又はアンチセンス方向で、自身の中にクローニングされているコード配列を発現するために、十分なアデノウイルス配列を含む構築物をいう。組換え体アデノウイルスベクターは、アデノウイルスの遺伝子操作形態を含む。アデノウイルスの遺伝子構成は、３６ｋｂ、直線状、二本鎖ＤＮＡウイルスであることが知られており、アデノウイルスＤＮＡの大きな部分と７ｋｂまでの外来性配列との置換を可能にする。アデノウイルスＤＮＡは、潜在的な遺伝子毒性を有さないエピソーム様式で複製することができるので、レトロウイルスとは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体組み込みをもたらさない。また、アデノウイルスは、構造的に安定であり、膨大な増幅の後に、ゲノム再編成が検出されていない。
【００６６】
アデノウイルスは、特に、中くらいの大きさのゲノム、操作の容易性、高い力価、広い標的細胞範囲及び高い感染性ゆえに、遺伝子移入ベクターとして使用することに適している。このウイルスゲノムの両端は、１００〜２００塩基対の逆方向リピート（ＩＴＲ）を含み、これは、ウイルスＤＮＡ複製及びパッケージングに必要なシスエレメントである。ゲノムの初期（Ｅ）及び後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の発生によって分断された、異なる転写単位を含む。Ｅ１領域（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノム及びいくつかの細胞性遺伝子の転写の調節を担うタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のために、タンパク質の合成をもたらす。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現及び宿主細胞シャットオフに関与している。ウイルスカプシドタンパク質のほとんどを含む後期遺伝子の産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によってなされた１つの一次転写物の重要な処理の後になってからのみ、発現される。ＭＬＰは、感染後期の間には特に効率的であり、このプロモーターから転写された全てのｍＲＮＡは、自身を翻訳のために好ましいｍＲＮＡにする、５’−三連リーダー（ＴＰＬ）配列を有する。
【００６７】
アデノウイルスベクターが複製を欠損しているか、又は少なくとも条件的に欠損している必要性以外に、アデノウイルスベクターの性質は、本明細書中で開示される特定の実施形態の首尾よい実施のために重要ではないと考えられる。アデノウイルスは、４２の異なる公知の血清型又はサブグループＡ〜Ｆのいずれであってもよい。特定の実施形態において、アデノウイルス５型は、かなりの生化学的及び遺伝的情報が既知であり、ベクターとしてアデノウイルスを使用する構築において歴史的に最も使用されてきたヒトアデノウイルスであるがゆえに、サブグループＣのアデノウイルス５型は、特定の実施形態における使用のための条件的複製欠損型アデノウイルスベクターを得るために、好ましい出発物質である。
【００６８】
示されるように、代表的なベクターは、複製欠損であり、アデノウイルスＥ１領域を持たない。したがって，目的の遺伝子をコードしたポリヌクレオチドを、Ｅ１−コード配列が除去されている位置から導入することが、最も便利である。しかし、アデノウイルス、配列内への構築物の挿入の位置は重要ではない。目的の遺伝子をコードしたポリヌクレオチドはまた、Ｅ３置換ベクターにおける欠失したＥ３領域又はヘルパー細胞株もしくはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補う場合のＥ４領域の代わりに挿入されてもよい。
【００６９】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルスであり、アデノウイルス株の夾雑物として発見された。これは、偏在性のウイルスであり（抗体は、ＵＳヒト集団の８５％に存在する）いずれの疾患とも関連付けられていない。これはまた、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスの存在に複製が依存するがゆえに、ディペンドウイルスとしても分類されている。種々の血清型が単離されており、ＡＡＶ−２の血清型は、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３内にカプシド封入されて、直系２０〜２４ｎｍの正十二面体ビリオンを形成する一本鎖直鎖状ＤＮＡを有する、最も性質決定されたＡＡＶである。
【００７０】
ＡＡＶ  ＤＮＡは、４．７キロ塩基長である。これは、２つのオープンリーディングフレームを含み、２つのＩＴＲによって挟まれている。ＡＡＶゲノムには、２つの衆生な遺伝子が存在する：ｒｅｐ及びｃａｐである。Ｒｅｐ遺伝子は、ウイルス複製を担うタンパク質をコードするが、他方でｃａｐは、カプシドタンパク質ＶＰ１−３をコードする。各ＩＴＲは、Ｔ字型のヘアピン構造を形成する。これらの末端リピートは、染色体に組み込まれるための、唯一の必須なＡＡＶのシス構成要素である。したがって、ＡＡＶは、すべてのウイルスコード配列が除去されて、そして送達のための遺伝子のカセットによって置き換えられた、ベクターとして使用され得る。３つのＡＡＶウイルスプロモーターが同定されており、そのマップ位置に従って、ｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と命名されている。ｐ５及びｐ１９からの転写は、ｒｅｐタンパク質の産生をもたらし、そしてｐ４０からの転写物は、カプシドタンパク質を産生する。
【００７１】
ＡＡＶは、素晴らしい安全性プロフィールゆえに、及びゲノムＤＮＡへの組み込みが稀であることゆえに、そしてそのカプシド及びゲノムは選択された細胞集団における発現を可能にするように調整することができるがゆえに、本開示内の使用のために際立っている。ｓｃＡＡＶは、自己相補的ＡＡＶをいう。ｒＡＡＶは、組換え体アデノ随伴ウイルスをいう。
【００７２】
他のウイルスベクターもまた、使用されてもよい。例えば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス及びヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターが、使用されてもよい。これらは、種々の哺乳動物細胞について、いくつかの魅力的な特徴を提供する。
【００７３】
レトロウイルス。レトロウイルスは、遺伝子送達のための一般的なツールである。「レトロウイルス」とは、自身のゲノムＲＮＡを直鎖状の二本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、その後、自身のゲノムＤＮＡを宿主ゲノム内に共有結合的に組み込むＲＮＡウイルスを指す。いったんウイルスが宿主ゲノム内に組み込まれると、「プロウイルス」と呼ばれる。プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型として働き、そして、新規なウイルス粒子を産生するために必要な構造タンパク質及び酵素をコードするＲＮＡ分子の発現を指示する。
【００７４】
特定の実施形態における使用のために好適なレトロウイルスの例としては：モロニ−マウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニ−マウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞（ＭＳＣＶ）及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）及びレンチウイルスが、挙げられる。
【００７５】
「レンチウイルス」は、複雑なレトロウイルスのグループ（又は属）をいう。例示的なウイルスとしては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ１型及びＨＩＶ２型を含む）；ビスナ−マエディウイルス（ＶＭＶ）；ヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。特定の実施形態において、ＨＩＶベースのベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列エレメント）が、使用され得る。
【００７６】
「自己不活性化」（ＳＩＮ）ベクターは、右（３’）ＬＴＲエンハンサー−プロモーター領域（Ｕ３領域として知られる）が（例えば、欠失又は置換によって）改変されて、ウイルス複製の最初の回を乗り越えるウイルス転写を妨げる、複製欠損ベクターをいう。これは、ウイルス複製の間、右（３’）ＬＴＲ  Ｕ３領域は、左（５’）ＬＴＲＵ３領域の鋳型として使用されるため、したがって、ウイルス転写物がＵ３エンハンサー−プロモーターなしでは作成され得ないからである。さらなる実施形態において、３’ＬＴＲは、Ｕ５領域が、例えば典型的ポリ（Ａ）配列と、置き換えられるように改変される。３’ＬＴＲに対する改変、５’ＬＴＲに対する改変又は３’及び５’ＬＴＲの両方に対する改変などの、ＬＴＲに対する改変もまた、特定の実施形態に含まれることに留意するべきである。
【００７７】
特定の実施形態において、ウイルスベクターは、ＴＡＲエレメントを含む。用語「ＴＡＲ」は、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）ＬＴＲのＲ領域に配置される「トランス活性化応答」遺伝子エレメントをいう。このエレメントは、レンチウイルストランスアクチベーター（ｔａｔ）遺伝子エレメントと相互作用し、ウイルス複製を増大する。しかし、このエレメントは、５’ＬＴＲのＵ３領域が異種プロモーターによって置き換えられる実施形態においては、必要ではない。
【００７８】
「Ｒ領域」とは、キャッピング基の始めにて開始し（すなわち、転写の始め）、ポリ（Ａ）尾部の始めの直前にて終わる、レトロウイルスＬＴＲ内の領域をいう。Ｒ領域はまた、Ｕ３領域とＵ５領域とに挟まれることによっても定義される。Ｒ領域は、逆転写の間、ゲノムの一端から他端までの初期ＤＮＡを移動させる役割を果たす。
【００７９】
特定の実施形態において、ウイルスベクター内の異種配列の発現は、転写後調節エレメント、効果的なポリアデニル化部位、及び任意選択可能に、転写終止シグナルをベクターへ組み込むことによって増加する。種々の転写後調節エレメントは、タンパク質での異種核酸、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＰＲＥ）内に存在する転写後調節エレメント（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３８６４）；など（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，９：１７６６）の発現を増加する。特定の実施形態において、ベクターは、ＷＰＲＥ又はＨＰＲＥなどの転写後調節エレメントを含む。特定の実施形態において、ベクターは、ＷＰＲＥ又はＨＰＲＥなどの転写後調節エレメントを欠くか、又は含まない。
【００８０】
異種核酸転写の効果的な末端及びポリアデニル化を指示するエレメントは、異種遺伝子発現を増大し得る。転写終止シグナルは、一般に、ポリアデニル化シグナルの下流で見いだされる。特定の実施形態において、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’に、ポリアデニル化配列を含む。用語「ポリ（Ａ）部位」又は「ポリ（Ａ）配列」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる初期ＲＮＡ転写の終止及びポリアデニル化の両方を指示するＤＮＡ配列を述べる。ポリアデニル化配列は、コード配列の３’末端へのポリ（Ａ）尾部の付加によってｍＲＮＡ安定性を促進し、したがって、増大した転写効率に寄与する。特定の実施形態は、ＢＧＨｐＡ又はＳＶ４０ｐＡを使用し得る。特定の実施形態において、発現構築物の好ましい実施形態は、終止エレメントを含む。これらのエレメントは、転写レベルを増大し、そしてこの構築物から他のプラスミド配列へのリードスルーを最小化することに寄与する。
【００８１】
前述の記載を超えて、広範な好適な発現ベクター型が、当業者には公知である。これらは、一般的な組換え手順のために設計された、市販の発現ベクター（例えば、１つ以上のレポーター遺伝子及び細胞内でのレポーター遺伝子の発現に必要な調節エレメントを含むプラスミド）を含み得る。多くのベクターが、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈなどから市販されており、多くの添付の手引きに記載されている。特定の実施形態において、好適な発現ベクターは、哺乳動物細胞においてコードされた遺伝子の発現を支持可能な任意のプラスミド、コスミド又はファージ構築物（例えば、ｐＵＣ又はＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドシリーズ）を含む。
【００８２】
特定の実施形態は、以下を含む：
【００８３】
【表１】
2021521152.tif 000003
【００８４】
特定の実施形態において、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過するカプシドを有するウイルスベクターが選択される。特定の実施形態において、ＡＡＶは、ＢＢＢを通過するカプシドを含むように改変される。血液脳関門を通過するウイルスカプシドを有するＡＡＶの例としては、ＡＡＶ９（Ｇｏｍｂａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１４；７：８１）、ＡＡＶｒｈ．１０（Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１４；２２（７）：１２９９−１３０９）、ＡＡＶ１Ｒ６，ＡＡＶ１Ｒ７（Ａｌｂｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１８；２６（２）：５１０）、ｒＡＡＶｒｈ．８（Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，前出）、ＡＡＶ−ＢＲ１（Ｍａｒｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１６；８（６）：５９２）、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓ（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１７；２０（８）：１１７２）、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ（Ｄｅｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６；３４（２）：２０４）、及びＡＡＶ‐ＰＰＳ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００９；１５：１２１５）が挙げられる。
【００８５】
ＡＡＶ９は、多くの他の天然に存在する血清型と違って静脈内投与後にＢＢＢを通過する、天然に存在するＡＡＶ血清型である。これは、中枢神経系（ＣＮＳ）の大きな節を変換し、それによって最小限の侵襲性治療を可能にし（Ｎａｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＤｒｕｇｓ．２０１７；３１（４）：３１７）、例えば、上腸間膜動脈（ＳＭＡ）症候群のＡｖｅＸｉｓ（ＡＶＸＳ−１０１，ＮＣＴ０３５０５０９９）による治療及びＣＬＮ３遺伝子関連神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＴ０３７７０５７２）の治療のための、進行中の臨床試験に関連して記載されている。特定の実施形態において、代表的なＡＡＶ９カプシドタンパク質配列は、ＡＡＶ９ＶＰ１カプシドタンパク質配列（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｑ６ＪＣ４０，配列番号５７）を含み得る。
【００８６】
ＡＡＶｒｈ．１０は、リーセス・マカークス（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）から最初に単離され、ヒトにおいて、遺伝子送達適用のために使用される他の一般的な血清型と比較した際に、低い血清要請を示し（Ｓｅｌｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１７；８：４４１）、そして現在、臨床試験ＬＹＳ−ＳＡＦ３０２、ＬＹＳＯＧＥＮＥ及びＮＣＴ０３６１２８６９において評価されている。
【００８７】
キメラＡＡＶベクター（ＡＡＶｒｈ．１０内にＡＡＶ１カプシドドメインを置き換えた）のライブラリーから単離された２つのバリアントであるＡＡＶ１Ｒ６及びＡＡＶ１Ｒ７は、ＢＢＢを通過する能力を保持し、そしてＣＮＳを変換する一方で、肝臓及び血管内皮形質導入の有意な低減を示す。
【００８８】
ｒＡＡＶｒｈ．８，もまた、リーセス・マカークスから単離され、末梢投与後の臨床的重要性の領域で、グリア細胞及び神経細胞型の包括的な形質導入を示し、そしてまた、他のベクターと比較して低減された末梢組織向性を示す。
【００８９】
ＡＡＶ‐ＢＲ１は、無作為ＡＡＶディスプレイペプチドライブラリーのインビボスクリーニングにおいて単離されたＮＲＧＴＥＷＤ（配列番号５３）エピトープを示すＡＡＶ２バリアントである。これは、最小限のオフターゲットな親和性（肝臓を含む）で脳における高いトランスジーン発現を伴う、高い特異性を示す（Ｋｏｒｂｅｌｉｎｅｔａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１６；８（６）：６０９）。
【００９０】
ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓ（Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）は、７マーの配列ＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号５４）をコードする、ＣＲＥＡＴＥ方法によって作成されたＡＡＶ９のバリアントであり、腸神経系においてニューロンを形質導入させ、そして脊髄及び脳幹に侵入するように、末梢感覚求心路を強力に形質導入した。
【００９１】
ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ（Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）は、７−ｍｅｒの配列ＴＬＡＶＰＦＫ（配列番号５５）をコードする、ＣＲＥＡＴＥ方法によって作成されたＡＡＶ９のバリアントである。これは、遺伝子を、ＡＡＶ９より高い効率でＣＮＳ全体に輸送し、多数のＣＮＣ領域を横切って星状細胞及びニューロンの多く形質導入する。
【００９２】
ＡＡＶ−ＰＰＳは、ＤＳＰＡＨＰＳ（配列番号５６）エピトープのＡＡＶ２のカプシドへの挿入によって作成されたＡＡＶバリアントであり、ＡＡＶ２に関して劇的に改善した脳の向性を示す。
【００９３】
特定の実施形態において、投与（例えば、ｉ．ｖ．投与）後に霊長類で抑制性細胞の脳全体への形質導入をもたらすカプシドが選択される。特定の実施形態において、投与後に、Ｓｃｎ１ａの欠失によって影響を受ける組織及び細胞型に広範に広がる形質導入をもたらすカプシドが選択される。
【００９４】
投与のための発現構築物。本開示のベクター（本明細書中で、生理学的に活性な構成要素と呼ぶ）は、ヒト対象又は動物対象への投与に好適な担体と共に処方されてもよい。本明細書中で記載の組成物中の生理学的に活性な構成要素は、中性の形態で遊離塩基として調製されてもよく、又は薬学的に許容可能な塩として調製されてもよい。
【００９５】
薬学的に許容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離のアミノ基によって形成される）を含み、そしてこれは、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機塩、又は、例えば酢酸、シユウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸によって形成される。遊離のカルボキシル基によって形成される塩もまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムもしくは水酸化第二鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、鳥メチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導され得る。
【００９６】
生理学的に活性な構成要素の担体としては、溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、溶液、懸濁液、コロイドなどが挙げられる。このような担体の生理学的に活性な構成要素のための使用は、当該分野で公知である。生理学的に活性な構成要素と不適合である従来の媒体又は薬剤を除いて、本明細書中で記載の組成物とともに使用され得る。
【００９７】
語句「薬学的に許容可能な担体」は、ヒトに投与された際、及び特定の実施形態において静脈内投与された際に、アレルギー反応又は類似の不都合な反応を起こさない担体をいう。
【００９８】
特定の実施形態において、組成物は、静脈内、眼内、硝子体内、非経口、皮下、側脳室内、筋肉内、髄腔内、脊髄内、経口、腹腔内、経口もしくは経鼻吸入、又は１つ以上の細胞、組織もしくは器官への直接注射のために、処方され得る。
【００９９】
組成物は、リポソーム、脂質、脂質複合体、ミクロスフィア、微粒子、ナノスフィア及び／又はナノ粒子を含んでもよい。
【０１００】
リポソームの形成及び使用は、当業者に一般に公知である。リポソームは、改善された血清安定性及び循環半減期を有するように開発されている（例えば、米国特許第５，７４１，５１６号を参照されたい）。さらに、潜在的薬物担体としてのリポソーム及びリポソーム様調製物の種々の方法が、記載されている（例えば、米国特許第５，５６７，４３４号；同第５，５５２，１５７号；同第５，５６５，２１３号；同第５，７３８，８６８号；及び同第５，７９５，５８７号を参照されたい）。
【０１０１】
リポソームは、水性媒体中に分散し、自然発露的に多重膜の同心二重層水泡を形成するリン脂質から形成される（多層小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれ、ＭＬＶは、一般に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する）。ＭＬＶの音波処理により、芯に水溶液を含む２００〜５００オングストロームの範囲の直径を有する小さな小型単層小胞（ＳＵＶ）の形成が起こる。
【０１０２】
リポソームは、細胞膜に類似しており、水溶性物質と油溶性物質の両方に広く好適であり、すなわち、水性空間において、及び二重層自体の中に捕捉し得る。
【０１０３】
リポソームはまた、リポソーム処方物を選択的に改変することにより、活性薬剤の部位特異的送達のためにも使用され得る。特異的標的化が望まれるがゆえに、このために利用可能な方法が確立される。例えば、抗体の結合ドメインは、リポソーム表面に結合して、抗体及びその薬物内容物を、特定の細胞型表面上に位置する特異的な抗原性レセプターに指向させるために使用され得る。炭水化物決定基（細胞−細胞の認識、相互作用及び接着において役割を果たす、糖タンパク質又は糖脂質の細胞表面構成要素）もまた、リポソームを特定の細胞型へ指向させる能力を有する認識部位として使用され得る。
【０１０４】
Ｃｏｕｖｒｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．８４（２）：３２３−３２６，１９７７；Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．５（１）１−２０，１９８８）の教示に加えて、以下の情報が、リポソーム処方物の製造に利用され得る。リン脂質は、水中に分散された際に、脂質対水のモル比に依存して、リポソーム以外の種々の構造を形成し得る。低い比率のリポソームは、好ましい構造である。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度及び二価陽イオンの存在に依存する。リポソームは、イオン性及び極性の物質に対し低い浸透性を示し得るが、高い温度では、その浸透性を著しく変える相転移を起こす。相転移は、ゲル状態として知られる細密な整った構造から、流体状態として知られるまばらかつより整っていない構造への変化を含む。これは、特徴的な相転移温度において起こり、イオン、糖及び薬物に対する浸透性を高める。
【０１０５】
溶質を捕捉する能力は、リポソームの種類によって異なる。例えば、ＭＬＶは、溶質の捕捉において中程度の効率だが、ＳＵＶは、非常に非効率的である。ＳＵＶは、サイズ分布の均一性及び再現性の利点を提供するが、大きさと捕捉効率との間の妥協は、大型単層小胞（ＬＵＶ）によって提供される。これは、エーテル蒸発脱水によって調製され、溶質捕捉の点でＭＬＶよりも３〜４倍効率的である。
【０１０６】
あるいは、本開示は、本開示の生理学的に活性な構成要素の薬学的に許容可能なナノカプセル処方物薬学的に許容可能なナノカプセル処方物を提供する。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再現性のある方法で化合物を封入する（Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｉｎｄ  Ｐｈａｒｍ  ２４（１２）：１１１３−１１２８，１９９８；Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．１５（７）：１０５６−１０６２，１９９８；Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１５（１）：１０７−１１９，１９９８；Ｄｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ  ３（３）：２３３−２６１，１９８７）。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を避けるため、インビボで分解可能なポリマーを用いた超微粒子が設計され得る。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子は、本開示における使用が企図される。このような粒子は、Ｃｏｕｖｒｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ６９（２）：１９９−２０２，１９８０；Ｃｏｕｖｒｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．５（１）１−２０，１９８８；ｚｕｒ  Ｍｕｈｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ，４５（２）：１４９−１５５，１９９８；Ｚａｍｂａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５０（１−３）：３１−４０，１９９８；ａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，１４５，６８４に記載のように製造され得る。
【０１０７】
注射可能な組成物は、滅菌された水溶液又は分散液、並びに、滅菌された注射可能な水溶液又は分散液の即時調製のための滅菌された粉末を含み得る（米国特許第５、４６６、４６８号）。注射を介した送達のために、形態は、シリンジによって送達され得る範囲で滅菌かつ流体である。特定の実施形態において、製造及び保存の条件下で安定であり、任意選択的、１種以上の細菌及び真菌などの微生物の夾雑に対して保存可能な化合物を含む。担体は、溶媒又は分散媒であってもよく、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、これらの公的な混合物、及び／又は植物油であってもよい。レシチンなどのコーティングの使用によって、分散媒の場合に所望の粒子サイズの維持によって、及び／又は界面活性剤の使用によって、適切な流動性が維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌剤及び／又は抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされてもよい。種々の実施形態において、調製物は、等張剤、例えば、糖類又は塩化ナトリウムを含んでもよい。注射可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含めることによって達成され得る。注射可能組成物は、必要に応じて好適に緩衝化され、そして希釈液は、十分な生理食塩水及びグルコースによってまず等張化される。
【０１０８】
分散剤はまた、グリコール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物、及び油の中で調製されてもよい。示されるように、保管及び使用の通常条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐ保存剤を含んでもよい。
【０１０９】
滅菌組成物は、生理学的に活性な構成要素を適切な量の溶媒に他の任意選択可能な成分（例えば、上で挙げたような成分）と共に組み込み、ろ過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液は、種々の滅菌した生理学的に活性な構成要素を、基礎分散媒及び所望の他の成分（例えば、上にあげたような成分）を含む滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、生理学的に活性な構成要素及びあらかじめ濾過滅菌した溶液由来の任意のさらなる所望の成分を含む粉末をもたらす、真空乾燥技術及び凍結乾燥技術であってもよい。
【０１１０】
経口組成物は、液体形態、例えば、溶液、シロップもしくは懸濁液であっても、又は他の好適なビヒクルによって使用前に再構成される製剤として提示されてもよい。このような液体調製物は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素付加した食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンもしくはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステルもしくは分留植物油類）；及び保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）などの薬学的に許容可能な付加物を用いて、従来手段によって調製され得る。組成物は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えば、バレイショデンプンもしくはナトリウムデンプングリコレート）；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容可能な賦形剤を用いて、従来手段で調製された、例えば錠剤又はカプセル剤の形態をとってもよい。錠剤は、当該分野で周知の方法によって、コーティングされてもよい。
【０１１１】
吸入可能組成物は、好適な高圧ガス、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の好適なガスの使用によって、加圧パック又はネブライザーからエアロゾルスプレー調製物の形態で送達されてもよい。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、測定量を送達するバルブを提供することにより、決定され得る。例えば、吸入器又は注入器における使用のためのゼラチンのカプセル及びカートリッジが、本化合物及び好適な粉末ベース（例えば、ラクトース又はデンプン）の粉末混合物を含むように処方され得る。
【０１１２】
組成物はまた、マイクロチップデバイス（米国特許第５、７９７、８９８号）、眼科処方物（Ｂｏｕｒｌａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇ  Ｒｅｔｉｎ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ、１７（１）：３３−５８、１９９８）、経皮マトリックス（米国特許第５、７７０、２１９号及び米国特許第５、７８３、２０８号）及びフィードバック制御された送達（米国特許第５、６９７、８９９号）を含み得る。
【０１１３】
補助活性成分もまた、本組成物中に組み込まれてもよい。
【０１１４】
代表的に、組成物は、少なくとも０．１％の生理学的に活性な構成要素もしくはそれ以上を含み得るが、生理学的に活性な構成要素の百分率は、無論、変動し得、そして簡便に、全組成物の重量及びもしくは容積の、１又は２％と７０％又は８０％と、又はそれ以上又は０．５〜９９％の間であってもいい、重量又は容積を含み得る。通常、生理学的に有用な組成物の各々における生理学的に活性な構成要素の量は、好適な投薬が得られる方法により、本化合物の任意の所与の単位容量で調製され得る。溶解性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品保存期限、並びに他の薬理学的考慮事項の因子は、このような薬学的処方物を調製する当業者によって企図される。したがって、様々な組成物及び投薬が、望ましい場合がある。
【０１１５】
特定の実施形態において、ヒトへの投与のために、組成物は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）又は他国における他の適切な認証機関によって求められる滅菌性、発熱性及びいくつかの安全性及び純度基準を満たしていなければならない。
【０１１６】
使用方法。特定の実施形態において、本明細書中で記載される生理学的に活性な構成要素を含む組成物は対象に投与され、対象における抑制性ニューロン内で電位開口型ナトリウムチャネル機能をレスキューするタンパク質又はヌクレオチド配列の選択的発現をもたらす。特定の実施形態において、電位開口型ナトリウムチャネル機能のレスキューは、Ｎａｖ１．１ナトリウムチャネルの十分な量及び／又は活性を有さない対象の介在ニューロンを、十分な量の外因性電位開口型ナトリウムチャネル及び活性を発現する介在ニューロンに変換して、ニューロン機能を回復しててんかん回路活性を防ぐことを含む。
【０１１７】
特定の実施形態において、レスキューされた電位開口型ナトリウムチャネル機能は、ナトリウムチャネル電流における増大及び／又は生理学的に活性な構成要素によって遺伝子操作された抑制性ニューロンの興奮能の増大の１つ以上によって証明される。特定の実施形態において、レスキューされた電位開口型ナトリウムチャネル機能は、生理学的に活性な構成要素によって遺伝子操作された抑制性ニューロンの電圧脱分極に応答した、ナトリウムチャネル伝導性及び／又はナトリウムチャネル流入の増大の１つ以上によって証明される。増大は、少なくとも１０％の増大、少なくとも２０％の増大、少なくとも３０％の増大、少なくとも４０％の増大、少なくとも５０％の増大、少なくとも６０％の増大、少なくとも７０％の増大、少なくとも８０％の増大、又は少なくとも９０％の増大であり得る。抑制性ニューロンの出力は、電気生理学的方法、例えば多電極アレイ又はパッチクランプを用いて測定され得る。
【０１１８】
特定の実施形態において、抑制性ニューロンは、海馬又は皮質における抑制性介在ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン、汎ＧＡＢＡ作動性ニューロン、又は抑制性ニューロンである。
【０１１９】
特定の実施形態において、レスキューされた電位開口型ナトリウムチャネル機能は、例えばマウスモデルを用いて、前脳介在ニューロンにおけるナトリウム電流依存型迅速スパイキングの増大によって証明される。特定の実施形態において、レスキューされた電位開口型ナトリウムチャネル機能は、本明細書中で記載されるマウスモデルにおける温度誘導性シージング（ｓｅｉｚｉｎｇ）の遅延又は抑制によって証明される。
【０１２０】
詳細な実施形態は、抑制性ニューロンにおいて低減したＮａｖ１．１ナトリウムチャネル機能を有する対象の同定を含む。このような対象は、Ｎａｖ１．１ナトリウムチャネル機能不全に関連する障害の診断に基づいて同定されてもよい。このような障害としては、てんかん、ＳＣＮ１Ａ関連発作障害、単純型熱性発作（ＦＳ）、ＧＥＦＳ＋、ＤＳ、全身性強直性間代性発作を伴う難治性小児てんかん（ＩＣＥ−ＧＴＣ）、難治性乳児部分発作、ミオクローヌス性失立（ｍｙｏｃｌｏｎｉｃ−ａｓｔａｔｉｃ）てんかん、レノックス・ガストー症候群（ＬＧＳ）、及び点頭てんかんが、挙げられる。難治性発作（「制御不能」又は「御しがたい」発作とも呼ばれる）は、従来の治療による正常の医学判定に基づいて十分な程度まで制御することができない発作である。
【０１２１】
ＤＳに関して、詳細には、８０％のＤＳ患者試験は、１Ａ遺伝子突然変異について陽性であるが、ＳＣＮ１Ａ突然変異の非存在は、ＤＳ診断を除外しない。ＤＳは、ＳＣＮ１Ａ（例えば、Ｓ４〜Ｓ６の電圧領域において又は多孔領域において、例えば、部分もしくは完全欠失突然変異、短縮型突然変異、及び／又はミスセンス突然変異）、ＳＣＮ１Ｂ（ナトリウムチャネルβ１サブユニットをコードする）、ＳＣＮ２Ａ、ＳＣＮ３Ａ、ＳＣＮ９Ａ、ＧＡＢＲＧ２（ＧＡＢＡレセプターのγ２サブユニットをコードする）、ＧＡＢＲＤ（ＧＡＢＡレセプターのδサブユニットをコードする）及び／又はＰＣＤＨ１９遺伝子における突然変異に関連している。
【０１２２】
特定の実施形態において、本明細書中で記載される治療を必要とする対象は、診断可能な発作を経験せず、亜臨床放電（脳波を脳波図によって測定する際の、高い割合の発作様活性と呼ぶ）を示す場合がある。これらの発作様放電に関連するてんかん症候群は、ランドウ・クレフナー症候群及び徐波睡眠の間の連続的スパイク波活性（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｓｐｉｋｅ−ｗａｖｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ）を含む。
【０１２３】
特定の実施形態において、患者は、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）などの知的発達障害（ＩＤＤ）を有する場合がある。特定の実施形態において、本開示の方法の患者は、てんかん及びＩＤＤ又はＡＳＤ障害を有する。発作及びてんかんと併発する一般的なＩＤＤ及びＡＳＤとしては、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）、レット症候群（ＲＴＴ）、アンジェルマン症候群、プラダー・ウィリー症候群、口蓋心臓顔面症候群、スミス・レムリ・オピッツ症候群、ニューロリジン突然変異及び「介在ニューロパシー」が挙げられ、これらは、アリスタレス（ａｒｉｓｔａｌｅｓｓ）関連ホメオボックスＸ結合型（ＡＲＸ）及びニューロピリン２（ＮＲＰ２）遺伝子突然変異から生じる。
【０１２４】
本明細書中で記載される方法は、詳細には、小児及び乳児を治療するために、及び乳児又は小児の間に発症する障害を治療するために、有用である。特定の実施形態において、本開示の方法の患者は、新生児、乳児、幼児、未就学児、学童、トゥイーン（ｔｗｅｅｎ）又はテーンエイジャーである。特定の実施形態において、患者は、１８歳以下、１２歳以下、１０歳以下、８歳以下、６歳以下、４歳以下、２歳以下、１歳以下である。特定の実施形態において、患者は、１８歳を超えた成人である。
【０１２５】
特定の実施形態において、本方法は、必要とする患者において、発作又はその症状を軽減又は予防する。特定の実施形態において、本方法は、１種以上の異なる型の発作を軽減又は予防し得る。理想的には、本開示の方法は、発作の完全な防止をもたらす。しかし、本開示はまた、発作の発生数が、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％減少する方法を包括する。
【０１２６】
一般に、発作は、けいれん、反復運動、感覚異常、及びこれらの組み合わせを含み得る。発作は、限局性発作（部分発作とも呼ばれる）と全身性発作とに分類され得る。限局性発作は、脳の片側のみに起こり、他方で全身性発作は、脳の両側に起こる。特異的な型の限局性発作としては、単純限局性発作、複雑限局性発作、及び二次全身性発作が挙げられる。単純限局性発作は、特定の頭葉（例えば、側頭葉、前頭葉、頭頂葉、又は後頭葉）に限定されるか、又は焦点が当たっている場合がある。複雑限局性発作は、一般に、単純限局性発作よりも、１つの半球のより大きな部分に起こるが、一般に、側頭葉又は前頭葉において発生する。限局性発作が、脳の片側（半球）から両側に広がる場合、この発作は、二次全身性発作と呼ばれる。特定の型の全身性発作としては、欠神（小発作とも呼ばれる）、緊張性発作、無緊張性発作、ミオクローヌス性発作、緊張性慢性発作（大発作とも呼ばれる）、及び慢性発作が挙げられる。
【０１２７】
特定の実施形態において、本明細書中で記載される方法は、処置後の患者において、無治療（例えば、治療前）と比較して、又は代替の従来治療による治療と比較して、発作の頻度を下げ、発作の重症度を軽くし、発作の型（例えば、より重症な型からより軽症な型へ）変更し得、又はこれらの組み合わせであり得る、。
【０１２８】
組成物の投与は、任意の適切な経路によるものであってもよい。例えば，特定の実施形態において、投与は、Ｎａｖ１．１ナトリウムチャネル機能不全に関連する研究目的のための、細胞又は組織切片への適用を含んでもよい。
【０１２９】
特定の実施形態において、対象に対する投与は、静脈内，後眼窩，眼内，硝子体内，非経口，皮下，側脳室内，筋肉内，髄腔内，脊髄内，経口，腹腔内，経口，経鼻であっても、又は標的化部位への直接投与であってもよい。送達は、針又はカニューレによって達成されても、又は流体物質を排出する任意の他の技術によって達成されてもよい。投与の方法は、米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，６４１，５１５号及び米国特許第５，３９９，３６３号に記載される様式を含んでもよい。
【０１３０】
医療分野において周知であるように、任意の一対象についての投薬量は、対象の大きさ、表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間及び投与経路、全身状態、及び同時に投与される他の薬物を含む多くの因子に依存する。本開示の化合物の投薬量は、変動し得るが、特定の実施形態において、用量は、本開示の発現構築物の１０５〜１０１０コピーであってもよい。特定の実施形態において、静脈内、脊髄内、後眼窩、側脳室内又は髄腔内投与を受けた患者は、発現構築物の１０６〜１０２２コピーで注入されてもよい。
【０１３１】
治療有効量は、有効量及び／又は治療処置を提供するものを含む。
【０１３２】
「有効量」は、対象において所望の生理学的変化をもたらす組成物の量である。多くの場合、有効量は研究目的で投与される。Ｎａｖ１．１本開示の有効量は、ナトリウムチャネル機能不全に関連する障害に関する動物モデル又はインビトロアッセイにおいて統計的に優位な効果を起こし得る。
【０１３３】
「治療的処置」は、Ｎａｖ１．１ナトリウムチャネル機能不全に関連する障害の症候又は兆候を示す対象に投与される、そして障害の兆候又は症候を軽減するか、又は排除する目的のために対象に投与される治療を含む。治療処置は、障害の存在又は活性、障害の病因、及び／又は障害の副作用を軽減するか、制御するか、又は除去することができる。
【０１３４】
特定の実施形態において、治療有効量の本開示の組成物の投与は、例えば、投与を受ける対象に治療利益を提供するために十分な数の発現構築物の単回投与などの、単回投与で達成されてもよい。あるいは、いくつかの状況において、本組成物の多数回の、連続的な、比較的短期間又は比較的長期間のいずれかで投与を提供することが望ましい場合がある。
【０１３５】
例えば、対象に投与される発現構築物の数は、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、又はそれよりも多い発現構築物／ｍｌであるか、又は、所望の生理学的結果を達成するために必要である場合、単回用量で、又は２以上の投与に分割されてもよい。特定の実施形態において、特定の治療レジメンに所望の効果を達成するため、単独で、又は１つ以上の他の治療薬物と組み合わせて、２つ以上の異なる発現構築物を投与することが望ましい場合がある。
【０１３６】
投与の特定特定の対象のための投薬及びタイミングは、治療する臨床医、研究者又は獣医によって、選択され得る。言い換えると、組成物及び／又は発現構築物の量及び投与時間は、本教示によって利益を受ける当業者の技術範囲内である。
【０１３７】
特定の実施形態において、Ｎａｖ１．１ナトリウムチャネル障害のための治療は、別の治療と組み合わせられてもよい。例えば、発作及びてんかんのための一般的従来治療は、抗てんかん薬及び低炭水化物食（例えば、ケトン食、例えば古典食、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）食、改変アトキンス食、及び低血糖指数治療（ＬＧＩＴ））、静脈内イムノグロブリン、ステロイド、除去食、迷走神経刺激、皮質切除術（ｃｏｒｔｉｃｅｔｏｍｙ）、多回の軟膜下切除（ｓｕｂｐｉａｌ  ｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎｓ）などの非抗てんかん薬治療を含む。
【０１３８】
本明細書中で記載される組成物と組み合わせて使用され得る一般的な抗てんかん性及び抗痙攣性の活性化合物としては、アセタゾラミド、カンナビジオール、カルバマゼピン、クロバザム、クロナゼパム、エスリカルバゼピン酢酸エステル、エトスキシミド、ガバペンチン、ラコサミド、ラモトリギン、レベチラセタム、ニトラゼパム、オキシカルバゼピン、ペラムパネル、ピラセタム、フェノバルビタール、フェニトイン、プレガバリン、プリミドン、レチガビン、ルフィナミド、バルプロ酸ナトリウム、スチリペントール、チアガビン、トピラメート、ビガバトリン、及びゾニサミドが、挙げられる。
【０１３９】
キット及び市販のパッケージ。キット及び市販のパッケージが、本明細書中で記載される発現構築物を含む。発現産物は特定の実施形態に単離され得る。特定の実施形態において、発現産物の構成要素は、互いに単離され得る。特定の実施形態において、発現産物は、ベクター内、ウイルスベクター内、細胞内、組織切片もしくは試料内、及び／又はトランスジェニック動物内であり得る。特定の実施形態において、動物は、発現構築物を含む組成物の投与後にトランスジェニックである。特定の実施形態において、トランスジェニック動物は、動物をＤＳの動物モデルにおける使用のために適切にする遺伝子改変を含む。例えば、マウスなどのトランスジェニック動物は、Ｓｃｎ１ａ＋／−であってもよい。トランスジェニック動物を作製するための詳細な方法は、米国特許第４，７３６，８６６号に記載されている。トランスジェニック動物は、任意の非ヒト哺乳動物であっても、又は鳥類であってもよいが、好ましくは、マウス及び非ヒト霊長類、（ＮＨＰ類）を含む。ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、鶏及び他にはモルモット、ハムスター、アレチネズミ、ラット及びフェレットなどのげっ歯類もまた、含まれる。
【０１４０】
キット又は市販のパッケージの実施形態は、含まれる組成物の、例えば研究における使用及び／又はてんかん及び／又はＤＳなどのＮａｖ１．１ナトリウムチャネル機能不全に関連する障害の治療のための使用に関する指示書をも含む。このようなキットは、１種以上の試薬、制限酵素、ペプチド、治療薬、薬学的化合物、又はシリンジ、注射可能物などの、組成物の送達のための手段をさらに含んでもよい。
【０１４１】
以下の例示的実施形態は、本開示の特定の実施形態を説明するために含まれる。当業者は、本明細書中で開示される特定の実施形態に対して多くの変更がなされ得、そして、本開示の精神及び範囲を逸脱することなく、似ているか、又は類似の結果がなお得られることを、本開示に照らして認識するべきである。
【０１４２】
例示的実施形態。
１．    （ｉ）配列番号２又は配列番号６のコンカテマー化したエンハンサー、（ｉｉ）プロモーター；及び（ｉｉｉ）レスキューを必要とする細胞又は対象において電位開口型ナトリウムチャネル機能をレスキューするタンパク質又は核酸をコードする、コード配列を含む、発現構築物（例えば、単離されたポリヌクレオチド）。
２．    コンカテマーが、配列番号２又は配列番号６の３Ｘコンカテマーを含む、実施形態１の発現構築物。
３．    コンカテマーが、直列に並んだ配列番号２及び配列番号６を含む、実施形態１の発現構築物。
４．    コンカテマーが、配列番号２−配列番号６−配列番号２；配列番号６−配列番号２−配列番号６；配列番号６−配列番号６−配列番号２；配列番号２−配列番号２−配列番号６；配列番号６−配列番号２−配列番号２；又は配列番号２−配列番号６−配列番号６を含む、実施形態３の発現構築物。
５．    （ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び／又は配列番号８、（ｉｉ）プロモーター；及び（ｉｉｉ）レスキューを必要とする細胞又は対象において電位開口型ナトリウムチャネル機能をレスキューするタンパク質又は核酸をコードするコード配列を含む、発現構築物（例えば、単離されたポリヌクレオチド）。
６．    コード配列が、ＮａｖＳｈｅＰ−Ｄ６０Ｎ、ＮａｖＢｐ、ＮａｖＭｓ、３ｘＨＡ−ＮａｖＳｈｅＰ−Ｄ６０Ｎ、３ｘＨＡ−ＮａｖＢｐ、３ｘＨＡ−ＮａｖＭｓ、又はＨｉｓ−ＮａｖＭｓを含むか、又はコードする、実施形態１〜５のいずれかの発現構築物。
７．    コード配列が、ヒトＳＣＮ１Ａ、マウスＳｃｎ１ａ、ヒトＳＣＮ１Ａ−３ｘＨＡ、及び／又はマウスＳｃｎ１ａ−３Ｘｈａ．含むか、又はコードする、実施形態１〜６のいずれかの発現構築物。
８．    コード配列が、内因性ＳＣＮ１Ａの発現を増大する人工転写因子を含むか、又はコードし、人工転写因子は、転写活性化ドメインに結合した標的化ＤＮＡ結合ドメインを含む、実施形態１〜７のいずれかの発現構築物。
９．    コード配列が、スプライシングを増大するか、又はマイクロＲＮＡの負の調節を防ぐ、アンチセンスＲＮＡ分子を含むか、又はコードする、実施形態１〜８のいずれかの発現構築物。
１０．    コード配列が、ＳＣＮ１Ａ発現を上方制御するヌクレオチド配列（例えば、配列番号６６〜１６３）を含むか、又はコードする、実施形態１〜９のいずれかの発現構築物。
１１．    コード配列が、発現後、完全長ＳＣＮ１Ａに集合するＳＣＮ１Ａの１つ以上のセグメントを含むか、又はコードする、及び／又は、実施形態１〜１０のいずれかの発現構築物。
１２．    配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１のＳＣＮ１Ａコード配列を含む、実施形態１１の発現構築物。
１３．    ＳＣＮ１Ａセグメントが、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、及び配列番号６５を含む、実施形態１１の発現構築物。
１４．    プロモーターが、ｍｉｎＢｇｌｏｂｉｎ又はｍｉｎＣＭＶを含む、実施形態１〜１３のいずれかの発現構築物。
１５．    発現構築物が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター内にある、実施形態１〜１４のいずれかの発現構築物。
１６．    発現構築物が、レポータータンパク質についてのコード配列を含む、実施形態１〜１５のいずれかの発現構築物。
１７．    レポータータンパク質が、蛍光レポータータンパク質を含む、実施形態１６の発現構築物。
１８．    発現構築物が、スキッピングエレメントを含むか、又はコードする、実施形態１〜１７のいずれかの発現構築物。
１９．    スキッピングエレメントが、２Ａペプチド又は内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む、実施形態１８の発現構築物。
２０．    ２Ａペプチドが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及び／又はＦ２Ａを含む、実施形態１９の発現構築物。
２１．    構築物が、ＣＮ１３６７、ＣＮ１２４４、ＣＮ１３８９、ＣＮ１３９０、ＣＮ１１８０、ＣＮ１２０３、ＣＮ１４９８、ＣＮ１４９９、ＣＮ１５００、ＣＮ２００１、ＣＮ２００２、ＣＮ２００３、ＣＮ１５０４及びＣＮ１５１２、ＣＮ２００４及びＣＮ２００５、ＣＮ２００６及びＣＮ２００７、ＣＮ２００８及びＣＮ２００９、又はＣＮ２０２６、ＣＮ２０２７、ＣＮ２０２８及びＣＮ２０２９のエレメントを含む、実施形態１〜２０のいずれかの発現構築物。
２２．    構築物が、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、及び／又は配列番号５２を含む、実施形態１〜２１のいずれかの発現構築物。
２３．    構築物が、配列番号４５及び配列番号４６、配列番号４７及び配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０、配列番号５１、及び配列番号５２又はＣＮ２０２６、ＣＮ２０２７、ＣＮ２０２８及びＣＮ２０２９を含む、実施形態１〜２２のいずれかの発現構築物。
２４．    ＡＡＶベクターが、血液脳関門を通過するカプシドに結合している、実施形態１５〜２３のいずれかの発現構築物。
２５．    カプシドが、ＰＨＰ．Ｅｂ．を含む、実施形態２４の発現構築物。
２６．    カプシドが、配列番号５３を含む、実施形態２４又は２５の発現構築物。
２７．    カプシドが、配列番号５４又は配列番号５５挿入物を有するＡＡＶ９カプシドを含む、実施形態２４〜２６のいずれかの発現構築物。
２８．    カプシドが、配列番号５６挿入物を有するＡＡＶ２カプシドを含む、実施形態２４〜２７のいずれかの発現構築物。
２９．    実施形態１〜２８のいずれかの発現構築物を含む、組成物。
３０．    実施形態１〜２８のいずれかの発現構築物を含む、細胞。
３１．    実施形態１〜２８のいずれかの発現構築物を含む、非ヒト動物。
３２．    実施形態１〜２８のいずれかの発現構築物を含む、キット。
３３．    治療有効量の実施形態２９の組成物の細胞への投与を含む、レスキューを必要とする欠損細胞において電位開口型ナトリウムチャネル機能をレスキューする方法。
３４．    治療有効量の実施形態２９の組成物の対象への投与を含む、レスキューを必要とする対象において電位開口型ナトリウムチャネル機能をレスキューする方法。
３５．    レスキューを必要とする対象が、てんかん、ＳＣＮ１Ａ関連発作障害、単純型熱性発作（ＦＳ）、全般てんかん熱性発作プラス（ＧＥＦＳ＋）、ドラベ症候群（ＤＳ）、全身性強直性間代性発作を伴う難治性小児てんかん（ＩＣＥ−ＧＴＣ）、難治性乳児部分発作、ミオクローヌス性失立てんかん、レノックス・ガストー症候群（ＬＧＳ）、又は点頭てんかんの診断に起因する、実施形態３４の方法。
３６．    対象が、小児患者である、実施形態３４又は３５の方法。
３７．    対象が、４歳未満である、実施形態３４〜３６のいずれかの方法。
３８．    対象は、温度誘導性熱性発作試験を受けているトランスジェニックＳｃｎ１ａ＋／−マウスである、実施形態３４、３５、又は３７の方法。
３９．    組成物が、静脈内投与される、実施形態３４〜３８のいずれかの方法。
４０．    組成物が、側脳室若しくは大槽若しくは腰椎空間、又は大後頭孔内へのカニューレを介して、脳脊髄液内に髄腔内投与される、実施形態３４〜３９のいずれかの方法。
４１．    （ａ）天然に存在しないエンハンサー配列；及び
（ｂ）電位開口型ナトリウムチャネル機能をレスキューするタンパク質をコードする核酸又はヌクレオチド配列；
を含む発現構築物であって、
エンハンサー配列が、
（ｉ）配列番号３の配列からなるか；
（ｉｉ）直列に並んだ配列番号２又は配列番号６（例えば、配列番号２−配列番号６−配列番号２；配列番号６−配列番号２−配列番号６；配列番号６−配列番号６−配列番号２；配列番号２−配列番号２−配列番号６；配列番号６−配列番号２−配列番号２；又は配列番号２−配列番号６−配列番号６；配列番号６−配列番号６−配列番号６）の２つ以上のコピーを含むか；
（ｉｉｉ）配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有しかつ介在ニューロン特異的エンハンサー機能を維持する配列を含むか；又は
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）の配列にハイブリダイズ可能な配列の相補鎖であって、
試料又は対象への投与後に、エンハンサーは、抑制性ニューロン内で核酸の転写を選択的に促進する、発現構築物（例えば、単離されたポリヌクレオチド）。
４２．    核酸が、ＮａｖＳｈｅＰ−Ｄ６０Ｎ、ＮａｖＢｐ、ＮａｖＭｓ、３ｘＨＡ−ＮａｖＳｈｅＰ−Ｄ６０Ｎ、３ｘＨＡ−ＮａｖＢｐ、３ｘＨＡ−ＮａｖＭｓ、又はＨｉｓ−ＮａｖＭｓを含むか、又はコードする、実施形態４１の発現構築物。
４３．    核酸が、ヒトＳＣＮ１Ａ、マウスＳｃｎ１ａ、ヒトＳＣＮ１Ａ−３ｘＨＡ、及び／又はマウスＳｃｎ１ａ−３Ｘｈａを含むか、又はコードする、実施形態４１又は４２の発現構築物。
４４．    核酸が、内因性ＳＣＮ１Ａの発現を増大する人工転写因子を含むか、又はコードする、実施形態４１〜４３のいずれかの発現構築物であって、人工転写因子は、転写活性化ドメインに結合した標的化ＤＮＡ結合ドメインを含む、発現構築物。
４５．    核酸が、スプライシングを増大するか、又はマイクロＲＮＡの負の調節を防ぐアンチセンスＲＮＡ分子を含むか、又はコードする、実施形態４１〜４４のいずれかの発現構築物。
４６．    核酸が、ＳＣＮ１Ａ発現を上方制御するヌクレオチド配列（例えば、配列番号６６〜１６３）含むか、又はコードする、実施形態４１〜４５のいずれかの発現構築物。
４７．    核酸が、発現後、完全長ＳＣＮ１Ａに集合するＳＣＮ１Ａの１つ以上のセグメントを含むか、又はコードする、及び／又は、実施形態４１〜４６のいずれかの発現構築物。
４８．    配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１のＳＣＮ１Ａコード配列を含む核酸を含む、実施形態４７の発現構築物。
４９．    ＳＣＮ１Ａセグメントは、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、及び配列番号６５を含む、実施形態４７の発現構築物。
５０．    ｍｉｎＢｇｌｏｂｉｎ又はｍｉｎＣＭＶを含むプロモーターを含む、実施形態４１〜４９のいずれかの発現構築物。
５１．    発現構築物が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター内にある、実施形態４１〜５０のいずれかの発現構築物。
５２．    発現構築物が、レポータータンパク質をコードする核酸を含む、実施形態４１〜５１のいずれかの発現構築物。
５３．    レポータータンパク質は、蛍光レポータータンパク質を含む、実施形態５２の発現構築物。
５４．    発現構築物が、スキッピングエレメントを含むか、又はコードする、実施形態４１〜５３のいずれかの発現構築物。
５５．    スキッピングエレメントが、２Ａペプチド又は内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む、実施形態５４の発現構築物。
５６．    ２Ａペプチドが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及び／又はＦ２Ａを含む、実施形態５５の発現構築物。
５７．    構築物が、ＣＮ１３６７、ＣＮ１２４４、ＣＮ１３８９、ＣＮ１３９０、ＣＮ１１８０、ＣＮ１２０３、ＣＮ１４９８、ＣＮ１４９９、ＣＮ１５００、ＣＮ２００１、ＣＮ２００２、ＣＮ２００３、ＣＮ１５０４及びＣＮ１５１２、ＣＮ２００４及びＣＮ２００５、ＣＮ２００６及びＣＮ２００７、又はＣＮ２００８及びＣＮ２００９のエレメントを含む、実施形態４１〜５６のいずれかの発現構築物。
５８．    構築物が、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、及び／又は配列番号５２を含む、実施形態４１〜５７のいずれかの発現構築物。
５９．    構築物が、配列番号４５及び配列番号４６、配列番号４７及び配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０、又は配列番号５１、及び配列番号５２を含む、実施形態４１〜５８のいずれかの発現構築物。
６０．    ＡＡＶベクターが、血液脳関門を通過するカプシドに結合している、実施形態５１〜５９のいずれかの発現構築物。
６１．    カプシドが、ＰＨＰ．Ｅｂを含む、実施形態６０の発現構築物。
６２．    カプシドが、配列番号５３を含む、実施形態６０又は６１の発現構築物。
６３．    カプシドが、配列番号５４又は配列番号５５挿入物を有するＡＡＶ９カプシドを含む、実施形態６０〜６２のいずれかの発現構築物。
６４．    カプシドが、配列番号５６挿入物を有するＡＡＶ２カプシドを含む、実施形態６０〜６３のいずれかの発現構築物。
６５．    実施形態４１〜６４のいずれかの発現構築物を含む、組成物。
６６．    実施形態４１〜６４のいずれかの発現構築物を含む、細胞。
６７．    実施形態４１〜６４のいずれかの発現構築物を含む、非ヒト動物。
６８．    実施形態４１〜６４のいずれかの発現構築物を含む、キット。
６９．    治療有効量の実施形態６５の組成物の細胞への投与を含む、レスキューを必要とする欠損細胞において電位開口型ナトリウムチャネル機能をレスキューする方法。
７０．    治療有効量の実施形態６５の組成物の対象への投与を含む、レスキューを必要とする対象において電位開口型ナトリウムチャネル機能をレスキューする方法。
７１．    レスキューを必要とする対象が、てんかん、ＳＣＮ１Ａ関連発作障害、単純型熱性発作（ＦＳ）、全般てんかん熱性発作プラス（ＧＥＦＳ＋）、ドラベ症候群（ＤＳ）、全身性強直性間代性発作を伴う難治性小児てんかん（ＩＣＥ−ＧＴＣ）、難治性乳児部分発作、ミオクローヌス性失立てんかん、レノックス・ガストー症候群（ＬＧＳ）、又は点頭てんかん．の診断に起因する、実施形態７０の方法。
７２．    対象が、小児患者である、実施形態７０又は７１のいずれかの方法。
７３．    対象が、４歳未満である、実施形態７０〜７２のいずれかの方法。
７４．    対象は、温度誘導性熱性発作試験を受けているトランスジェニックＳｃｎ１ａ＋／−マウスである、実施形態７０、７１、又は７３のいずれかの方法。
７５．    組成物が、静脈内投与される、実施形態７０〜７４のいずれかの方法。
７６．    組成物が、側脳室若しくは大槽若しくは腰椎空間、又は大後頭孔内へのカニューレを介して、脳脊髄液内に髄腔内投与される、実施形態７０〜７５のいずれかの方法。
７７．    第１のベクターが、レスキューを必要とする細胞において電位開口型ナトリウムチャネル活性をレスキューするタンパク質のＮ末端部分をコードし、第２のベクターが、前記タンパク質のＣ末端部分をコードする、２つのＡＡＶベクターを含むベクター系であって、前記２つのベクターによってコードされる遺伝子の部分は、相同組換えのための相同性領域を提供して全長Ｎａｖ１．１タンパク質を生成するように重複し、前記第１のベクターは、プロモーター及び配列番号３からなるエンハンサーを含むが、終止シグナル又はポリＡシグナルを含まず、前記第２のベクターは、終止シグナル及びポリＡシグナルを含むが、プロモーター又はエンハンサーを含まない、ベクター系。
７８．    タンパク質が、ヒトＳＣＮ１Ａを含む、実施形態７７のベクター系。
７９．    相同性領域が、７５〜１０００塩基対である、実施形態７７又は７８のベクター系。
８０．    相同性領域が、５５０〜６５０塩基対である、実施形態７７又は７８のベクター系。
８１．    ベクターが、抑制性ニューロンにおいてタンパク質を選択的に発現する、実施形態７７〜８０のいずれかのベクター系。
８２．    相同領域に亘るトランススプライシングによって、組換え後に、より効率的な全長タンパク質再構成が駆動されるように、相同性領域が、第１のベクターにおけるスプライシングドナー部位及び第２のベクターにおけるスプライシングアクセプター部位を有するイントロンエレメントをさらに含む、実施形態７７〜８１のいずれかのベクター系。
８３．    ベクター系が、ＣＮ１５０４、ＣＮ１５１２、ＣＮ２００４、ＣＮ２００５、ＣＮ２００６、ＣＮ２００７、ＣＮ２００８、及び／又はＣＮ２００９のエレメントを含む、実施形態７７〜８２のいずれかのベクター系。
８４．    ベクター系が、ＣＮ１５０４及びＣＮ１５１２、ＣＮ２００４及びＣＮ２００５、ＣＮ２００６及びＣＮ２００７、又はＣＮ２００８及びＣＮ２００９のエレメントを含む、実施形態７７〜８３のいずれかのベクター系。
８５．    ベクター系が、配列番号４５及び配列番号４６、配列番号４７及び配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０、又は配列番号５１、及び配列番号５２を含む、実施形態７７〜８４のいずれかのベクター系。
８６．    配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、又は配列番号５２を含む、ウイルスベクター。
８７．    配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び／又は配列番号８、並びに、一般的な転写活性化ドメインに結合した特異的ＤＮＡ結合ドメインを含む人工転写因子をコードするコード配列を含み、人工転写因子は、ＳＣＮ１Ａ（又は他のＳＣＮ＿Ａファミリー遺伝子）の内因性機能的コピーの発現を増大する人工転写因子である、発現構築物。
８８．    配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び／又は配列番号８、並びに、一般的な転写活性化ドメインに結合した特異的ＤＮＡ結合ドメインを含む人工転写因子をコードするコード配列を含み、人工転写因子は、ＳＣＮ１Ａ（又は他のＳＣＮ＿Ａファミリー遺伝子）の内因性機能的コピーの発現を増大する人工転写因子である、発現構築物。
８９．    配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び／又は配列番号８並びにＳＣＮ１Ａ発現のスプライシングを増大するか、及び／又はマイクロＲＮＡの負の調節を防ぐアンチセンスＲＮＡ分子をコードするコード配列を含む、発現構築物。
９０．    配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び／又は配列番号８を含む、一連の発現構築物であって、一連の発現構築物は、ｈＳＣＮ１Ａタンパク質を、２つ又は４つの別個のベクターによって送達される２つ又は４つのサブユニットＯＲＦとして送達する、一連の発現構築物。
９１．    配列番号３の配列を含むエンハンサーを含み、異種誘導性プロモーター及び抑制性ニューロンにおいてＮａｖ１．１チャネル機能を選択的にレスキューするタンパク質をコードする遺伝子又は核酸配列をさらに含む、単離されたポリヌクレオチドであって、エンハンサーおよび異種誘導性プロモーターは、前記遺伝子に作動可能に連結している、単離されたポリヌクレオチド。
９２．    実施形態９１の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
９３．    ベクターがウイルスベクターである、実施形態９２のベクター。
９４．    ウイルスベクターがＡＡＶウイルスベクターである、実施形態９３のベクター。
９５．    実施形態９１の単離されたポリヌクレオチドを含む、ヒト細胞又は非ヒト細胞。
９６．    抑制性ニューロンにおいてＮａｖ１．１チャネル機能をレスキューするタンパク質又は核酸配列の発現を選択的に駆動する、実施形態９２〜９４のいずれかのベクターを含む一連のベクターであって、第２のベクターは、配列番号１、２、４、５、６、７又は８から選択されるエンハンサーを含む、一連のベクター。
９７．    （１）実施形態９２〜９４のいずれかのベクターを提供する工程、（２）前記ベクターを使用してトランスジェニックマウスを作製する工程、及び（３）前記トランスジェニックマウスにおいてレスキューされたＮａｖ１．１チャネル機能を検出する工程を含む、抑制性ニューロンにおいてＮａｖ１．１チャネル機能をレスキューするタンパク質又は核酸配列の発現を選択的に駆動する方法。
９８．    レスキューされたＮａｖ１．１チャネル機能は、抑制性ニューロン内である、実施形態９７の方法。
９９．    配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１内のｈＳＣＮ１Ａ＿断片のコード配列を含む、一連のコード配列。
１００．    ＣＮ２０２６、ＣＮ２０２７、ＣＮ２０２８、及びＣＮ２０２９を含む、一連のベクター。
【実施例】
【０１４３】
実施例１。図１Ａに関して、生きたヒト側頭皮質脳組織を神経外科手術の間に切り出して、てんかん病巣を除去した。この組織を解剖し、３５０ミクロン厚の組織切片にスライスし、Ｔｉｎｇら（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ８（１）：８４０７，２０１８）によって記載される半合成培地を用いて半透膜上で培養した。培養の初日、切片を、精製したウイルスＣＮ１１８０／ＤＪ（これは抑制性ニューロンを標識する）を直接脳切片に適用することにより、精製したウイルスに感染させた。感染７日後、感染細胞のＳＹＦＰ２＋の電気生理学（緑色チャネルにて可視である）を、パッチクランプ記録によって評価した。記録した細胞を、Ａｌｅｘａ  ５９４染料（赤色チャネルにて可視である）によって戻し染色し、その細胞体及び形態学の事後可視化を実施した。
【０１４４】
図１Ｂに関して、パッチクランプ記録を、多重で、ＳＹＦＰ２＋細胞及びＳＹＦＰ２−細胞上において実施した。戻し染色した形態学を、錐体であるか（興奮性ニューロンであることを示す）又は非錐体であるか（抑制性ニューロンであることを示す）について表にした。この解析は、ＳＹＦＰ２＋細胞が、ほとんど抑制性ニューロンの特徴であることを示した。
【０１４５】
図１Ｃに関して、多重で、ＳＹＦＰ２＋細胞及びＳＹＦＰ２−細胞の電気生理学特徴を解析した。これらの解析は、ＳＹＦＰ２−細胞と比較して、ＳＹＦＰ２＋細胞は、より短い活動電位（ＡＰ）半値幅、より大きな発火頻度、より速い脱分極速度、及び注入電流に応答したより速いＡＰ発火速度（ＦＩ勾配）を有することを示した。これらのマトリックスは、全て、ＳＹＦＰ２＋細胞が迅速にスパイキングする介在ニューロンであることを示した。
【０１４６】
図１Ｄに関して、パッチクランプ電気生理学を実施した後、組織を固定し、抗ＧＦＰ抗体及び抗パルブアルブミン抗体で免疫染色した。この解析は、多くのＧＦＰ＋細胞が、パルブアルブミン＋であることを示した。このことは、これらの細胞が、迅速にスパイクする介在ニューロンと一致する分子アイデンティティを有することを示した。
【０１４７】
図３に関して、Ｇａｄ２−Ｔ２Ａ−ｎｌｓ−ｍＣｈｅｒｒｙ  （Ｐｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｎ  ８６：７８３−７９９，  ２０１５）マウスに、ウイルスＣＮ１２４４／ＰＨＰ．ｅＢの１Ｅ１１ゲノムコピーを後眼窩に注入した。３週間後、脳を回収し、３５０ミクロン厚の切片にスライスして、ＳＹＦＰ２及びｍＣｈｅｒｒｙ発現についてウイルス発現細胞及び全ての介在ニューロンを可視化することによって、それぞれ画像化した。
【０１４８】
図４Ａ、４Ｂに関して、成体の野生型マウスに、示されたウイルスの１Ｅ＋１１ゲノムコピーを後眼窩注射した。動物を、３〜４週間維持し、次いで安楽死させ、脳を切除して切片にし、その後、天然蛍光の生組織落射蛍光画像化を行った。露光時間を、トランスジーン発現レベルの直接比較が可能なように合わせた。最初の３つのパネルは、示した構築物のそれぞれについての５００ｍ秒露光であり、４つめのパネルは、ＣＮ１３９０のより短い（５０ｍ秒）露光の画像である。
【０１４９】
図５に関して、皮質／海馬脳切片培養物を、Ｐ５−１０  Ｇａｄ２−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅヘテロ接合性動物；Ａｉ７５ヘテロ接合性動物から調製した。これらの動物は、Ｇａｄ２−発現細胞における核タグ化ｔｄＴｏｍａｔｏトランスジーンのＣｒｅ−媒介型活性化を有し、抑制性ニューロンにおける核の明るい赤色蛍光をもたらした。培養１時間後、ＣＮ１３９０ウイルス懸濁液を切片表面上にピペットで垂らし、脳細胞型に形質導入した。１０  ＤＩＶ／１０ＤＰＩにおいて、天然の蛍光を、緑色及び赤色のチャネルにおいて、Ｎｉｋｏｎ倒立顕微鏡で画像化した。
【０１５０】
Ｉ図６Ａ〜６Ｅに関して、ヒトエキソビボ新皮質脳切片培養物を神経外科手術の生きた標本から調製した（Ｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ８（１）：８４０７，２０１８）。培養１時間後、ＣＮ１３９０ウイルス懸濁液を切片上にピペットで垂らし、脳細胞型に形質導入した。１、３及び６ＤＩＶ／ＤＰＩにおいて、天然のＳＹＦＰ２蛍光を、ａａ  Ｎｉｋｏｎ顕微鏡上で適合した露光時間を用いて画像化した。図６Ａ〜６Ｄは、標的化パッチクランプ記録及び解析のための、ヒト新皮質介在ニューロンの迅速なウイルス遺伝子標識を説明する。種々の培養時間にて、切片を末端パッチクランプ記録分析のために取り出し、標識されたニューロンの発火特徴を解析した。ヒト新皮質介在ニューロン発火パターン及び電気的特徴の、パッチクランプ記録による機能的解析は、ＣＮ１３９０  ｅＢウイルスの感染４０時間後の早さで、実行可能であった。
【０１５１】
図９に関して、上のベクターは、配列番号３のエンハンサー及びプロモーター（ｍｉｎＣＭＶ）エレメントを含み、全ての抑制性ニューロン（Ｐｖａｌｂ＋及びＰｖａｌｂ−の両方の抑制性ニューロンを含む）における発現を駆動した。駆動したトランスジーンは、Ｐ２ＡタグがヒトＳＣＮ１ＡのＮ末端領域に連結したＳＹＦＰ２を含み、これは、下のベクターに含まれるＣ末端領域に対し、６０４ｂｐの相同性を含む。下のベクターはまた、Ｃ末端の３ｘＨＡタグ及び３’ＵＴＲ調節配列（ＷＰＲＥ３及びポリＡ部位）を含む。
【０１５２】
両ＡＡＶウイルスベクターを、ＰＨＰ．ｅＢカプシド内にパッケージし、どちらも１匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスに静脈内送達した。２１日後、マウス脳を回収し、固定し、そして抗ＧＦＰ抗体（ＳＹＦＰ２を標的化している）、抗ＨＡ抗体及び抗Ｐｖａｌｂ抗体によって、免疫蛍光のために処理し、トランスジーン発現細胞及びそのＰｖａｌｂ＋抑制性ニューロン（ＤＳ症候において特に重要性を有する細胞である）との重複を検出した。Ｐｖａｌｂ＋抑制性ニューロン及びＰｖａｌｂ−抑制性ニューロンの両方を含む多くの抑制性ニューロンを、Ｎ末端ＳＹＦＰ２＋タグで高いレベルで標識した。これらのＳＹＦＰ２＋細胞のいくつかもまた、ＨＡを発現することができ、このことは、完全に無傷なＳＣＮ１Ａタンパク質生成物が、これらのＧＦＰ＋ＨＡ＋細胞内で発現されることを示す（矢印）。垂直な矢印は、ヒトＳＣＮ１Ａを発現しているＰｖａｌｂ＋介在ニューロンを表し、水平の矢印は、ヒトＳＣＮ１Ａを発現するＰｖａｌｂ−介在ニューロンを示す。これらのＳＣＮ１Ａ−発現細胞は、ほとんどのてんかんに重要であることが公知であり、かつＤＳにおいて機能不全であることがわかっている脳領域を含む前脳全体に（新皮質と海馬との両方で［ここは歯状回である］）見出される。
【０１５３】
実施例２。ドラベ症候群（ＤＳ）は、薬物抵抗性であり、かつ生命を脅かす形態のてんかんである。これは、代表的に、生後1年で、熱性発作又は温度誘導性発作と共に開始し、この発作は全身性間代性発作、強直間代性発作、及び片側性発作に発展する。これらの発作は、多くの場合、この症候群の第一選択治療である現行の抗てんかん薬に抵抗性である；完全な発作制御は、代表的に、達成されていない。疾患が進むにつれ、罹患した小児のほとんどは、発達遅延、知的障害、運動制及び協調障害、自閉症行動、睡眠障害を含む合併症状に苦しみ、多くは成熟前に亡くなる。
【０１５４】
電位開口型ナトリウムチャネルＮａｖ１．１の孔を形成するサブユニットをコードする遺伝子であるＳＣＮ１Ａにおけるヘテロ接合性機能欠失型突然変異は、ＤＳの最も一般的な原因であり、新生児のほぼ１／１６，０００に発症する。
【０１５５】
Ｓｃｎ１ａのノックアウトによって作製されるマウスモデルは、乳児（Ｐ２１）−てんかん発症、熱性発作に対する高い感受性、運動失調、自発発作、睡眠障害、自閉症行動及び成熟前の死を含むこのてんかんの主要な表現型特徴のいくつかを再現する。発作及びいくつかの合併症は、このマウスにおける介在ニューロン障害から生じる。
【０１５６】
このマウスモデルを使用して、ＤＳについての新規なウイルスベクターの有効性を調査した。ウイルスを、インスリンシリンジを用いて後眼窩注射によって送達し、発作を抑制するその能力を、熱性発作試験を用いて評価した。この試験において、発作が起こるか、又は４２．５℃に達するまで、温度コントローラー及びヒートランプを用いてマウスの体内温度をゆっくりと上昇させた。処理マウス及び対照マウスにおける発作発症の温度を比較し、介入の有効性を決定した。さらなる試験において、自発発作に対する治療の有効性及び早期死亡率を、ビデオ及び脳波記録法モニタリングを用いて評価した。
【０１５７】
ウイルスベクターは、ＣＮ１５００と名付けられた新規なＡＡＶウイルスベクターである。このウイルスベクターは、トランスジーンＳＹＦＰ２−Ｐ２Ａ−ＮａｖＳｈｅＰ−Ｄ６０Ｎを発現して電位開口型ナトリウムチャネルＮａｖ１．１の欠損をレスキューする、組換え体ＡＡＶである。ＮａｖＳｈｅＰ−Ｄ６０Ｎは、哺乳動物細胞において動態及び発現を改善するように改変されている、細菌由来の改変型電位開口型ナトリウムチャネルである。トランスジーン発現レベルは、ＷＰＲＥ３エレメントの付加によって上昇し、転写は、ウシ成長ホルモンポリアデニル配列によって停止する。３ｘｈｉ５６ｉＣｏｒｅ合成エンハンサー（配列番号３）をＣＭＶ最小プロモーターの５’に直接的に介したトランスジーンの発現は、皮質及び海馬を含む前脳構造における抑制性細胞において高く、かつこれらに限定されている。さらに、治療用トランスジーンＮａｖＳｈｅＰ−Ｄ６０Ｎは、正しいタンパク質局在を評価するために、ＨＡエピトープタグで標識されている。
【０１５８】
治療用ＡＡＶ  ウイルスベクターの有効性を試験するために、ＰＨＰ．ｅＢ血清型を用いたＣＮ１５００  パッケージを使用した。出生３５日後のＳｃｎ１ａ＋／−マウスのコホートを、１匹あたり２ｘ１０１１ｖｇ注射するか、又は注射しないままのどちらかにした。ＡＡＶを、後眼窩送達経路を使用して静脈内に導入した。ウイルス投与の２週間後、処理群及び対照群由来の動物を、熱性発作に対する感受性について評価した。前に示した通り、ヒートランプ下で安定的にマウスの体温を２分ごとに０．５℃上昇させ、直腸プローブを用いてマウスの体内温度を測定することにより、熱性発作を評価した。発作を起こしたマウスの体温を記録した。
【０１５９】
新規な治療ベクターＣＮ１５００は、マウス皮質及び海馬の両方のＧＡＢＡ作動性細胞において高く発現したが、熱性発作を経験したＳｃｎ１ａ＋／−マウスの平均体温もまた、３８．７  ℃から４１℃まで上がった。これらのデータは、ＣＮ１５００は、Ｓｃｎ１ａの欠損を実質的にレスキューし得ることを示す。
【０１６０】
実施例２の参考文献は、以下を含む：Ｃａｔｔｅｒａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ５８８：１８４９−１８５９；Ｃｈｅａｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０９：１４６４６−１４６５１；Ｋａｌｕｍｅ（２０１３）Ｒｅｓｐｉｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１８９（２）：３２４−８；Ｋａｌｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２７：１１０６５−１１０７４；Ｋａｌｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １２３：１７９８−１８０８；Ｏａｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０６：３９９４−３９９９。
【０１６１】
配列の記載
本明細書中で記載される核酸を、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２で規定されるように、ヌクレオチド塩基の標準的略号を用いて示す。各核酸配列の１本鎖のみを示すが、相補鎖は、適切である場合に、実施形態に含まれると考えられる。
【０１６２】
配列番号１：ヒト（ｈ）ＤＬＸＩ５６ｉエンハンサーの核酸配列；
配列番号２：ｈＩ５６ｉｃｏｒｅエンハンサーの核酸配列；
配列番号３：３ｘｈＩ５６ｉＣｏｒｅエンハンサーの核酸配列；
配列番号４：マウスＤＬＸＩ５６ｉエンハンサーの核酸配列；
配列番号５：ゼブラフィッシュＤＬＸＩ５６ｉエンハンサーの核酸配列；
配列番号６：ゼブラフィッシュＩ５６ｉｃｏｒｅの核酸配列；
配列番号７：ゼブラフィッシュ３ｘＩ５６ｉｃｏｒｅの核酸配列；
配列番号８：ｈＤＬＸＩ１２ｂエンハンサー；
配列番号９：ＮａｖＳｈｅＰ−Ｄ６０Ｎ，コドン最適化，Ｎ末端３ｘＨＡタグを有する；
配列番号１０：ＮａｖＳｈｅＰ内因性配列；
配列番号１１：ＮａｖＢｐ，内因性配列；
配列番号１２：ＮａｖＢｐ，コドン最適化，Ｎ末端３ｘＨＡタグを有する；
配列番号１３：ＮａｖＭｓ，内因性配列；
配列番号１４：ＮａｖＭｓ，コドン最適化，Ｎ末端３ｘＨＡタグ及びリンカーを有する；
配列番号１５：ＮａｖＭｓ，コドン最適化，Ｎ末端Ｈｉｓタグ及びリンカーを有する；
配列番号１６：ヒトＳＣＮ１Ａ；
配列番号１７：ＳＹＦＰ２；
配列番号１８：Ｐ２ＡＥｎコード配列；
配列番号１９：ＷＰＲＥ３；
配列番号２０：ＢＧＨｐＡ；
配列番号２１：Ｎ末端３ＸＨＡタグ（タンパク質）；
配列番号２２：Ｎ末端３ＸＨＡタグ（ＤＮＡ）；
配列番号２３：ｈＳＣＮ１Ａ２部分発現系のＮ−ｔｅｒｍ；
配列番号２４：ｈＳＣＮ１Ａ２部分発現系のＣ−ｔｅｒｍ，Ｃ末端３ＸＨＡ配列を有する；
配列番号２５：２部分発現系で使用され得る、ｈＳＣＮ１ＡＮｔｅｒｍ及びＣｔｅｒｍの６０４ｂｐ相同性領域；
配列番号２６：ＣＮ１４９８由来のＰ２Ａ翻訳；
配列番号２７：Ｔ２Ａ；
配列番号２８：Ｅ２Ａ；
配列番号２９：Ｆ２Ａ；
配列番号３０：ＭｉｎＢｇｌｏｂｉｎ；
配列番号３１：ｍｉｎＣＭＶ；
配列番号３２：ＡＡＶ９ＰＨＰ．ｅＢカプシド置き換え配列；
配列番号３３：ＣＮ１３６７−Ｌ−ＩＴＲとＲ−ＩＴＲとの間の部分：位置１４２−２９８４；
配列番号３４：ＣＮ１５００−Ｌ−ＩＴＲとＲ−ＩＴＲとの間の部分：位置１４２−２９７６；
配列番号３５：ＣＮ１４９８−Ｌ−ＩＴＲとＲ−ＩＴＲとの間の部分：位置１４２−２９４３；
配列番号３６：ＣＮ１４９９−Ｌ−ＩＴＲとＲ−ＩＴＲとの間の部分：位置１４２−２９４６；
配列番号３７：ＣＮ１２４４−Ｌ−ＩＴＲとＲ−ＩＴＲとの間の部分：位置１４２−２０４２；
配列番号３８：ＣＮ１３８９−Ｌ−ＩＴＲとＲ−ＩＴＲとの間の部分：位置１４２−１８９７；
配列番号３９：ＣＮ１３９０−Ｌ−ＩＴＲとＲ−ＩＴＲとの間の部分：位置１４２−１６６０；
配列番号４０：ＣＮ１２０３−Ｌ−ＩＴＲとＲ−ＩＴＲとの間の部分：位置１８３−２０５２；
配列番号４１：ＣＮ１１８０−Ｌ−ＩＴＲとＲ−ＩＴＲとの間の部分：位置１８３−１８９１；
配列番号４２：ＣＮ２００１−Ｌ−ＩＴＲとＲ−ＩＴＲとの間の部分：位置１４２−２０２３；
配列番号４３：ＣＮ２００２−Ｌ−ＩＴＲとＲ−ＩＴＲとの間の部分：位置１４２−１９９３；
配列番号４４：ＣＮ２００３−Ｌ−ＩＴＲとＲ−ＩＴＲとの間の部分：位置１４２−２０５６；
配列番号４５：ＣＮ１５０４−Ｌ−ＩＴＲとＲ−ＩＴＲとの間の部分：位置１４２−４４８９；
配列番号４６：ＣＮ１５１２−Ｌ−ＩＴＲとＲ−ＩＴＲとの間の部分：位置１４２−４１６５；
配列番号４７：ＣＮ２００４−Ｌ−ＩＴＲとＲ−ＩＴＲとの間の部分：位置１４２−３７９２；
配列番号４８：ＣＮ２００５−Ｌ−ＩＴＲとＲ−ＩＴＲとの間の部分：位置１４２−４１６０；
配列番号４９：ＣＮ２００６−Ｌ−ＩＴＲとＲ−ＩＴＲとの間の部分：位置１４２−４７９０；
配列番号５０：ＣＮ２００７−Ｌ−ＩＴＲとＲ−ＩＴＲとの間の部分：位置１４２−４６７１；
配列番号５１：ＣＮ２００８−Ｌ−ＩＴＲとＲ−ＩＴＲとの間の部分：位置１４２−３９９５；
配列番号５２：ＣＮ２００９−Ｌ−ＩＴＲとＲ−ＩＴＲとの間の部分：位置１４２−４５２５；
配列番号５３：無作為ＡＡＶディスプレイペプチドライブラリーのインビボスクリーニングの間に単離されたエピトープ；
配列番号５４：ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓ７−ｍｅｒの配列；
配列番号５５：ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ７−ｍｅｒの配列；
配列番号５６：ＡＡＶ−ＰＰＳ７−ｍｅｒの配列；
配列番号５７：ＡＡＶ９ＶＰ１カプシドタンパク質配列（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｑ６ＪＣ４０）；
配列番号５８：ＣＮ２０２６−ｒＡＡＶ−３ｘｈＩ５６ｉ（ｃｏｒｅ）−ｍｉｎＢＧ−ｈＳＣＮ１Ａ＿断片１−ＷＰＲＥ３−ＢＧＨｐＡ；
配列番号５９：ＣＮ２０２７−ｒＡＡＶ−３ｘｈＩ５６ｉ（ｃｏｒｅ）−ｍｉｎＢＧ−ｈＳＣＮ１Ａ＿断片２−ＷＰＲＥ３−ＢＧＨｐＡ；
配列番号６０：ＣＮ２０２８−ｒＡＡＶ−３ｘｈＩ５６ｉ（ｃｏｒｅ）−ｍｉｎＢＧ−ｈＳＣＮ１Ａ＿断片３−ＷＰＲＥ３−ＢＧＨｐＡ；
配列番号６１：ＣＮ２０２９−ｒＡＡＶ−３ｘｈＩ５６ｉ（ｃｏｒｅ）−ｍｉｎＢＧ−ｈＳＣＮ１Ａ＿断片４−ＷＰＲＥ３−ＢＧＨｐＡ；
配列番号６２：＞ｈＳＣＮ１Ａ＿断片１＿タンパク質配列；
配列番号６３：ｈＳＣＮ１Ａ＿断片２＿タンパク質配列；
配列番号６４：ｈＳＣＮ１Ａ＿断片３＿タンパク質配列；
配列番号６５：ｈＳＣＮ１Ａ＿断片４＿タンパク質配列；
配列番号６６−１６３：ＳＣＮＡ１の上方制御をもたらすヌクレオチド配列。
【０１６３】
本明細書中で開示されそして参照される配列のバリアントもまた、含まれる。生物学的活性を損なうことなくどのアミノ酸残基が置換され、挿入され、又は欠失され得るかを決定する手引きは、当該分野で周知のＤＮＡＳＴＡＲＴＭソフトウェアなどのコンピュータープログラムを用いて見出すことができる。好ましくは、本明細書中で開示されるタンパク質バリアントにおけるアミノ酸変更は、すなわち、同様に荷電しているか、又は荷電していないアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変更は、その側鎖において関連しているアミノ酸の１つのファミリーの置換を含む。
【０１６４】
ペプチド又はタンパク質において、好適な保存的アミノ酸置換は、当業者に公知であり、一般に、生じる分子の生物学的活性を変えずに行われる。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における１つのアミノ酸置換は、実質的に生物学的活性を変更しないと認識する（例えば、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４）。天然に生じるアミノ酸は、一般に、以下のように、保存的置換ファミリーに分類される：群１：アラニン（Ａｌａ），グリシン（Ｇｌｙ），セリン（Ｓｅｒ），及びトレオニン（Ｔｈｒ）；群２：（酸性）：アスパラギン酸（Ａｓｐ），及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）；群３：（酸性；極性としてもクラス分けされる，負に荷電した残基及びそのアミド）：アスパラギン（Ａｓｎ），グルタミン（Ｇｌｎ），Ａｓｐ，及びＧｌｕ；群４：Ｇｌｎ及びＡｓｎ；群５：（塩基性；極性としてもクラス分けされる，正に荷電した残基）：アルギニン（Ａｒｇ），リシン（Ｌｙｓ），及びヒスチジン（Ｈｉｓ）；群６（大型脂肪族，非極性残基）：イソロイシン（Ｉｌｅ），ロイシン（Ｌｅｕ），メチオニン（Ｍｅｔ），バリン（Ｖａｌ）及びシステイン（Ｃｙｓ）；群７（非荷電極性）：チロシン（Ｔｙｒ），Ｇｌｙ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｃｙｓ，Ｓｅｒ，及びＴｈｒ；群８（大型芳香族委残基）：フェニルアラニン（Ｐｈｅ），トリプトファン（Ｔｒｐ），及びＴｙｒ；群９（非極性）：プロリン（Ｐｒｏ），Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｐｈｅ，Ｍｅｔ，及びＴｒｐ；群１１（脂肪族）：Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，ａｎｄＩｌｅ；群１０（小型脂肪族，非極性又はわずかに極性の残基）：Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｐｒｏ，及びＧｌｙ；並びに群１２（硫黄含有）：Ｍｅｔ及びＣｙｓ。さらなる情報は、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙにおいて見いだされ得る。
【０１６５】
このような変更を行う際に、アミノ酸のヒドロパシー指数が企図される。タンパク質に相互作用性の生物学的機能を付与する際のヒドロパシーアミノ酸指数の重要性は、一般に、当該分野で理解される（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１），１０５−３２）。各アミノ酸は、その疎水性及び荷電特性に基づいて、ヒドロパシー指数が割り当てられている（ＫｙｔｅａｎｄＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。これらの値は、以下である：Ｉｌｅ（＋４．５）；Ｖａｌ（＋４．２）；Ｌｅｕ（＋３．８）；Ｐｈｅ（＋２．８）；Ｃｙｓ（＋２．５）；Ｍｅｔ（＋１．９）；Ａｌａ（＋１．８）；Ｇｌｙ（−０．４）；Ｔｈｒ（−０．７）；Ｓｅｒ（−０．８）；Ｔｒｐ（−０．９）；Ｔｙｒ（−１．３）；Ｐｒｏ（−１．６）；Ｈｉｓ（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；Ｇｌｎ（−３．５）；アスパラギン酸塩（−３．５）；Ａｓｎ（−３．５）；Ｌｙｓ（−３．９）；及びＡｒｇ（−４．５）。
【０１６６】
特定のアミノ酸が、類似のヒドロパシー指数及びスコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、なお類似の生物学的活性を有するタンパク質を生じる。すなわち、なお生物学的官能性等価なタンパク質を得る。このような変更は、ヒドロパシー指数が±２であるアミノ酸の置換が好ましいが、±１以内がより好ましく、±０．５以内はさらにより好ましい。また、類似のアミノ酸の置換は、ヒドロパシー性の基本に基づいて効果的に実施可能であることも当該分野で理解されている。
【０１６７】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳説されるように、以下の親水性値が、アミノ酸残基に割り当てられている：Ａｒｇ（＋３．０）；Ｌｙｓ（＋３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０±１）；グルタミン酸塩（＋３．０±１）；Ｓｅｒ（＋０．３）；Ａｓｎ（＋０．２）；Ｇｌｎ（＋０．２）；Ｇｌｙ（０）；Ｔｈｒ（−０．４）；Ｐｒｏ（−０．５±１）；Ａｌａ（−０．５）；Ｈｉｓ（−０．５）；Ｃｙｓ（−１．０）；Ｍｅｔ（−１．３）；Ｖａｌ（−１．５）；Ｌｅｕ（−１．８）；Ｉｌｅ（−１．８）；Ｔｙｒ（−２．３）；Ｐｈｅ（−２．５）；Ｔｒｐ（−３．４）。アミノ酸は、類似の親水性値を有する別のアミノ酸と置換されて、なお生物学的等価性を、詳細には免疫学的等価性を保つことができることが理解される。このような変化において、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内がより好ましく、±０．５以内がなおより好ましい。
【０１６８】
上で概説したように、アミノ酸の置換は、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、その疎水性、親水性、荷電、大きさなどに基づいてなされ得る。
【０１６９】
他所で示した通り、遺伝子配列のバリアントは、コードしたタンパク質の機能に統計的に有意な度合いで影響しない、コドン最適化バリアント、配列多型、スプライシングバリアント、及び／又は突然変異を含んでもよい。
【０１７０】
本明細書中で開示されるタンパク質、核酸及び遺伝子配列のバリアントはまた、本明細書中で開示されるタンパク質、核酸及び遺伝子配列に対し、少なくとも７０％の配列同一性、８０％の配列同一性、８５％の配列、９０％の配列同一性、９５％の配列同一性、９６％の配列同一性、９７％の配列同一性、９８％の配列同一性、又は９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０１７１】
「％配列同一性」は、配列を比較することによって決定した、２以上の配列間の関係性をいう。当該分野において、「同一性」もまた、タンパク質、核酸、又は遺伝子配列の間の、このような配列の鎖間の適合によって決定される、配列関連性の程度を意味する。「同一性」（しばしば「類似性」とも呼ばれる）は、以下に記載されるものを含む（しかしこれらに限定されない）公知の方法によって容易に計算され得る：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９２）。同一性を決定するための好ましい方法は、試験する配列の間の最良の適合を与えるように設計されている。同一性及び類似性を決定するための方法は、公に利用可能なコンピュータープログラムに体系化されている。配列アラインメント及び同一性百分率の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｓｕｉｔｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて実施され得る。配列の多重アラインメントはまた、Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント方法を用いて実施され得る（デフォルトのパラメータを用いるＨｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ  ＣＡＢＩＯＳ，５，１５１−１５３（１９８９）（ギャップペナルティ＝１０，ギャップ長ペナルティ＝１０）。適切なプログラムはまた、以下が挙げられる：ＧＣＧ  ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒａｍｓ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；及びＦＡＳＴＡ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒ���，Ｎ．Ｙ．。本開示の文脈の範囲内で、配列解析ソフトウェアが使用される場合、解析の結果は、参照したプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解される。本明細書中で使用される場合、「デフォルト値」は、ソフトウェアが最初に初期化された際にソフトウェアと一緒に最初にロードされるパラメータの値の任意のセットを意味する。
【０１７２】
バリアントはまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本明細書中において開示される配列にハイブリダイズし、参照配列と同じ機能を提供する核酸をも含む。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、以下が挙げられる：５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５Ｘデンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン及び２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃一晩のインキュベーションの後、フィルターを０．１ＸＳＳＣで５０℃にて洗浄する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの変更及びシグナル検出は、最初に、ホルムアミド濃度（低いパーセンテージのホルムアミドは、低いストリンジェンシーをもたらす）；塩条件，又は温度の操作を介して達成される。例えば、中程度に高いハイブリダイゼーション条件は、６ＸＳＳＰＥ（２０ＸＳＳＰＥ＝３Ｍ  ＮａＣｌ；０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４；０．０２Ｍ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）及び０．５％  ＳＤＳ、３０％  ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌサケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中で３７℃一晩のインキュベーション；及びその後の５０℃にて１ＸＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳによる洗浄を含む。加えて、より低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの後に、より高い塩濃度での洗浄（例えば、５ＸＳＳＣ）を行ってもよい。上の条件のバリエーションが、ハイブリダイゼーション実験におけるバックグラウンドを抑制するために使用される代替のブロッキング試薬を、入れること及び／又は外すことを通して達成されてもよい。代表的なブロッキング試薬としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、及び市販の独占的処方物が挙げられる。特定のブロッキング試薬を入れることは、適合性の問題ゆえに、上述のハイブリダイゼーション条件の変更を必要とする場合がある。
【０１７３】
特定の実施形態において、遺伝子編集システム、例えば上記のＣＲＩＳＰＲ及びＣａｓ−９（Ｃｓｎｌ及びＣｓｘｌ２としても知られる）の参照は、当業者に理解されるように、さらなる選択肢および開発を組み込むことと解釈されるべきである。例えば、正確なゲノム認識及び結合を可能にする任意の遺伝子編集システムが利用されてもよい。切断及び編集を伴わずにヌクレアーゼが標的化ゲノム結合のために使用される場合、ヌクレアーゼは切断機能性を欠いてもよい。
【０１７４】
Ｃａｓ−９の使用に関連して、Ｃａｓタンパク質の多くの他の選択肢が利用可能であり、使用のために適している。Ｃａｓ−９自体は、コリネバクテリウム、サテレラ、レジオネラ、トレポネーマ、フィリフ・アクター（Ｆｉｌｉｆ  ａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトバシラス、マイコプラズマ、バクテロイド、フラビボラ（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム、スピロヘータ、アゾスピリルム、グルコナセトバクター、ナイセリア、ロゼブリア、パルビバクラム（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス、ニトラチフラクター（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）及びカンピロバクターなどの細菌に由来する、Ｃａｓ９タンパク質の１つ以上の触媒ドメインをいう。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は、例えば、２つの触媒ドメインが、異なる細菌種に由来する、融合タンパク質である。ＤＮＡを結合するために使用できるさらなるＣａｓヌクレアーゼの例としては、Ｃａｓｌ、ＣａｓｌＢ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、ＣａｓｌＯ、Ｃｐｆｌ、Ｃ２ｃ３、Ｃ２ｃ２及びＣ２ｃｌＣｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｐｆｌ、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、ＣｓｘｌＯ、Ｃｓｘｌ６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、並びにＣｓｆ４が挙げられる。
【０１７５】
Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、詳細には、プロトスペーサー隣接モチーフすなわちＰＡＭとして公知の、短い３塩基対認識配列（ＴＴＮ）の手段により、標的部位選択においてさらなる融通性を提供し得る。詳細な実施形態は、遺伝子操作されたＣｐｆ１ｓを利用できる。例えば、ＵＳ２０１８／００３０４２５は、ラクノスピラ科の細菌であるＮＤ２００６及びアシダミノコッカス種ＢＶ３Ｌ６に由来する、標的特異性を改変し、そして改善するように遺伝子操作された、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼについて記載している。
【０１７６】
他のＣｐｆ１バリアントとしては、Ｃｐｆ１ホモログ及びＺｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ  １６３：７５９−７７１に開示されるＣｐｆ１ポリペプチドのオルソログ並びにＵ．Ｓ．２０１６／０２０８２４３に開示されるＣｐｆ１ポリペプチドが挙げられる。他の遺伝子操作されたＣｐｆ１バリアントは、当業者に公知であり、本開示の範囲内に含まれる（例えば、ＷＯ／２０１７／１８４７６８を参照されたい）。
【０１７７】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及びその構成要素に関するさらなる情報は、ＵＳ８６９７３５９、ＵＳ８７７１９４５、ＵＳ８７９５９６５、ＵＳ８８６５４０６、ＵＳ８８７１４４５、ＵＳ８８８９３５６、ＵＳ８８８９４１８、ＵＳ８８９５３０８、ＵＳ８９０６６１６、ＵＳ８９３２８１４、ＵＳ８９４５８３９、ＵＳ８９９３２３３及びＵＳ８９９９６４１及びその関連出願；並びにＷＯ２０１４／０１８４２３、ＷＯ２０１４／０９３５９５、ＷＯ２０１４／０９３６２２、ＷＯ２０１４／０９３６３５、ＷＯ２０１４／０９３６５５、ＷＯ２０１４／０９３６６１、ＷＯ２０１４／０９３６９４、ＷＯ２０１４／０９３７０１、ＷＯ２０１４／０９３７０９、ＷＯ２０１４／０９３７１２、ＷＯ２０１４／０９３７１８、ＷＯ２０１４／１４５５９９、ＷＯ２０１４／２０４７２３、ＷＯ２０１４／２０４７２４、ＷＯ２０１４／２０４７２５、ＷＯ２０１４／２０４７２６、ＷＯ２０１４／２０４７２７、ＷＯ２０１４／２０４７２８、ＷＯ２０１４／２０４７２９、ＷＯ２０１５／０６５９６４、ＷＯ２０１５／０８９３５１、ＷＯ２０１５／０８９３５４、ＷＯ２０１５／０８９３６４、ＷＯ２０１５／０８９４１９、ＷＯ２０１５／０８９４２７、ＷＯ２０１５／０８９４６２、ＷＯ２０１５／０８９４６５、ＷＯ２０１５／０８９４７３及びＷＯ２０１５／０８９４８６、ＷＯ２０１６２０５７１１、ＷＯ２０１７／１０６６５７、ＷＯ２０１７／１２７８０７及びその関連出願に記載されている。
【０１７８】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ開裂ドメインに融合することによって合成され得る。本明細書中で記載される詳細な実施形態は、特異的ＤＮＡ配列に結合するジンクフィンガーを利用し得る。ＤＮＡ結合ドメインは、転写因子に見いだされるものと類似である、３〜６個のジンクフィンガータンパク質を含む。ＤＮＡ開裂ドメインは、例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの触媒ドメインを含む。標的部位開裂配列のどちらかの側における部位について、独自のＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を必要とする二量体として、ＦｏｋＩドメインは、機能する。ＦｏｋＩ開裂部位は、５〜６塩基対のスペーサー配列内を開裂し、２つの逆向きの半分部分に分かれる。
【０１７９】
ＺＦＮに関するさらなる情報及び本開示の教示において有用であるＺＦＮについては、例えば、  米国特許第，５３４，２６１号；同第  ６，６０７，８８２号；同第  ６，７４６，８３８号；同第  ６，７９４，１３６号；同第  ６，８２４，９７８号；同第  ６，８６６，９９７号；同第  ６，９３３，  １１３号；同第  ６，９７９，５３９号；同第  ７，０１３，２１９号；同第  ７，０３０，２１５号；同第  ７，２２０，７１９号；同第  ７，２４１，５７３号；同第  ７，２４１，５７４号；同第  ７，５８５，８４９号；同第  ７，５９５，３７６号；同第  ６，９０３，１８５号；同第  ６，４７９，６２６号；及びＵ．Ｓ．  出願公開第  ２００３／０２３２４１０  号及び同第２００９／０２０３１４０号、並びにＧａｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１２，９（８）：８０５−７；Ｒａｍｉｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２０１２，  ４０（１２）：５５６０−８；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２０１２，２２（７）：１３２７−３３；Ｕｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１０，１１：６３６−６４６；Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５，７７８−７８５（２００７）；Ｂｉｂｉｋｏｖａ，  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００，７６４（２００３）；Ｂｉｂｉｋｏｖａ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６１，１１６９−１１７５（２００２）；Ｗｏｌｆｅ，  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２９，１８３−２１２（２０００）；Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９３，１１５６−１１６０（１９９６）；及びＭｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  ｊｏｕｒｎａｌ  ４，６０９−１６１４（１９８５）を参照されたい。
【０１８０】
詳細な実施形態は、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を遺伝子編集剤として使用し得る。ＴＡＬＥＮは、標的遺伝子配列を結合して標的配列の位置でＤＮＡを切断するために遺伝子操作されている。ＴＡＬＥＮのＴＡＬＥは、キサントモナス細菌によって分泌されるＤＮＡ結合タンパク質である。ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインは、高度に保存的な３３又は３４のアミノ酸リピートを含み、各リピートの１２番目及び１３番目に分岐する残基を有する。これらの２つの位置は、リピート可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれ、特異的なヌクレオチド認識に強い相関性を示す。したがって、標的化特異性は、ＲＶＤにおけるアミノ酸を変更し、非従来的なアミノ酸を組み込むことによって改善され得る。
【０１８１】
ＴＡＬＥＮ融合において使用され得るＤＮＡ開裂ドメインの例は、野生型及びバリアントのＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。ＴＡＬＥＮに関するさらなる情報については、米国特許第８，４４０，４３１号；同第８，４４０，４３２号；同第８，４５０，４７１号；同第８，５８６，３６３号；及び同第８，６９７，８５３号並びにＪｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２０１３，１４（ｌ）：４９−５５；Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ，２０１３，４：１７６２；Ｓｃｈａｒｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２０１３，１３（４）：２９１−３０３；Ｇａｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１２，９（８）：８０５−７；Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９，１４３−１４８（２０１１）；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８６，７５７−７６１（２０１０）；Ｂｏｃｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，１５０９−１５１２（２００９）；及びＭｏｓｃｏｕ，＆Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，１５０１（２００９）を参照されたい。
【０１８２】
詳細な実施形態は、ＭｅｇａＴＡＬを遺伝子編集剤として使用し得る。ＭｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥがメガヌクレアーゼのＤＮＡ開裂ドメインと融合している、稀開裂性（ｒａｒｅ−ｃｌｅａｖｉｎｇ）単鎖ヌクレアーゼ構造を有する。メガヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼとしても公知であり、ＤＮＡ認識機能とヌクレアーゼ機能との両方を同じドメイン内に有する単ペプチド鎖である。ＴＡＬＥＮとは対照的に、ｍｅｇａＴＡＬは、機能的活性のために、単ペプチド鎖の送達のみを必要とする。
【０１８３】
メガヌクレアーゼの例としては、Ｉ−Ｓｃｅｌ、Ｉ−Ｓｃｅｌｌ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−Ｃｅｕｌ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−Ｃｒｅｌ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂｌＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂｌｌＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−Ｔｌｉｌ、Ｉ−Ｐｐｏｌ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、Ｆ−Ｓｃｅｌ、Ｆ−Ｓｃｅｌｌ、Ｆ−Ｓｕｖｌ、Ｆ−Ｔｅｖｌ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−Ａｍａｌ、Ｉ−Ａｎｉｌ、Ｉ−Ｃｈｕｌ、Ｉ−Ｃｍｏｅｌ、Ｉ−Ｃｐａｌ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−Ｃｓｍｌ、Ｉ−Ｃｖｕｌ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−Ｄｄｉｌ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−Ｄｉｒｌ、Ｉ−Ｄｍｏｌ、Ｉ−Ｈｍｕｌ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−Ｌｌａｌ、Ｉ−Ｍｓｏｌ、Ｉ−Ｎａａｌ、Ｉ−Ｎａｎｌ、Ｉ−ＮｃＩＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−Ｎｉｔｌ、Ｉ−Ｎｊａｌ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−Ｐａｋｌ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒｌＰ、１−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−Ｐｏｒｌ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−Ｓｃａｌ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、１−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−Ｓｐｏｍｌ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−Ｔｅｖｌ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ−ＵａｒＡＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎｌＰ、１−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、Ｐｌ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−Ｔｆｕｌ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−Ｔｈｙｌ、ＰＩ−Ｔｌｉｌ、及びＰＩ−ＴＨＩＩが挙げられる。
【０１８４】
本明細書中で記載される詳細な実施形態は、遺伝子編集系を利用して、発現構築物を標的化ゲノム・セーフ・ハーバー（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓａｆｅ  ｈａｒｂｏｒ）内に挿入し得る。ゲノム・セーフ・ハーバー部位を同定するための方法は、Ｓａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０１２）；１２：５１−５８；及びＰａｐａｐｅｔｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１１）Ｊａｎｕａｒｙ；２９（１）：７３−８に記載される。
【０１８５】
特定の実施形態において、発現構築物は、本構築物に関連して記載されていないエレメント、部分又はヌクレオチドを含まない単離されたポリヌクレオチド配列をいう。
【０１８６】
当業者に理解される通り、本明細書中で開示される各々の実施形態は、特定に言及されたエレメント、工程、成分又は構成要素を含んでもよく、本質的にこれらから成ってもよく、又はこれらから成ってもよい。したがって、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、以下を列挙すると解釈されるべきである：「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）、から成る（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）、又はから本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」。移行用語（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｔｅｒｍ）「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、含むことを意味するが、限定するものではなく、特定していないエレメント、工程、成分又は構成要素を、大きな量であったとしても、含めることを可能にする。移行語句（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  ｐｈｒａｓｅ）「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、特定していない全てのエレメント、工程、成分又は構成要素を排除する。移行語句「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、実施形態の範囲を、特定したエレメント、工程、成分又は構成要素、及びこの実施形態に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。Ｓｃｎ１ａ＋／−マウスにおいてベクターが熱性発作を克服する能力を実質的に有意に低下させる物質は、実施例２及び図１０のプロトコールにしたがう。
【０１８７】
別段の指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用される成分の量、分子量などの特性、反応条件などを表す全ての数値は、あらゆる場合に用語「約」によって修飾されていると理解されるものである。したがって、反対の指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲において示される数値パラメータは、概数であり、本発明によって得られることが想定されている所望の特性に依存して変動し得る。最低限、及び特許請求の範囲の均等論の適用を限定することを意図しないが、全ての数値パラメータは、少なくとも、報告された有効桁の数に照らして、及び通常の丸め技術を適用することによって、解釈されるべきである。さらなる明確性が必要である場合、用語「約」は、合理的に本用語に帰する意味を有し、当業者によって、言及された数値又は範囲と組み合わせて使用される場合、すなわち、言及された数値もしくは範囲よりもいくらか多いか、又はいくらか少ないことをいい、言及された数値の±２０％；言及された数値の±１９％；言及された数値の±１８％；言及された数値の±１７％；言及された数値の±１６％；言及された数値の±１５％；言及された数値の±１４％；言及された数値の±１３％；言及された数値の±１２％；言及された数値の±１１％；言及された数値の±１０％；言及された数値の±９％；言及された数値の±８％；言及された数値の±７％；言及された数値の±６％；言及された数値の±５％；言及された数値の±４％；言及された数値の±３％；言及された数値の±２％；又は言及された数値の±１％の範囲内をいう。
【０１８８】
本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータが概算であるにもかかわらず、特定の実施例に示された数値は、可能な限り正確に報告される。しかし、任意の数値は、それぞれの試験測定値において見出される標準偏差から生じる特定の誤差を固有に必ず含む。
【０１８９】
別段の指示があるか、又は明らかに文脈によって矛盾しない限り、本発明を記載する文脈で（特に、以下の特許請求の範囲の文脈で）使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」などの指示物は、単数形と複数形との両方をカバーすると解釈される。本明細書中の値の範囲の列挙は、範囲の中に入る別個の数値のそれぞれを個々に言及する、簡略表記の方法として寄与することが意図される。本明細書中で別段の指示がない限り、それぞれ個々の値は、本明細書中で別個に挙げられていたのと同様に、本明細書中に組み込まれる。本明細書中で記載される全ての方法は、本明細書中で別段の指示があるか、又は明らかに文脈によって矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書中で提示される任意の及び全ての実施例、又は例示的な言葉（例えば、「など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、本発明をよりよく照らすことのみを意図し、別に特許請求しない限り、本発明の範囲の限定を提示しない。本明細書中のいかなる文言も、特許請求されていない全てのエレメントが本発明の実施に必須であることを示すものと解釈されるべきではない。
【０１９０】
本明細書中で開示される本発明の代替のエレメント又は実施形態の分類は、限定として解釈されない。各群のメンバーは、言及されても、個々に特許請求されても、又はその群の他のメンバー又は本明細書中で見出される他のエレメントと任意の組み合わせられてもよい。群の１つ以上のメンバーは、便宜のために及び／又は特許性のために、群に組み入れられてもよく、又は群から取り除かれてもよいことが予期される。何らかのこのような組み入れ又は除外が起こる場合、特許請求の範囲で使用される全てのマーカッシュ群の記載を満たすために修飾されているように、本明細書がこの群を含むとみなされる。
【０１９１】
本発明の特定の実施形態は、本明細書中で記載され、本発明を実施するために本発明者らが知る最もよい様式を含んでいる。もちろん、これらの記載された実施形態の改変が、上述の説明を鑑みて、当業者には明らかとなる。本発明者らは、当業者がこのような改変を適切に用いることを予期しており、本発明者らは、本明細書中で特別に記載されない限り、本発明が実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用可能な法律に従って、特許請求の範囲にあげられた対象物の全ての変更及び均等物を含む。さらに、本明細書中で別段の指示があるか、又は明らかに文脈によって矛盾しない限り、全ての可能なバリエーションにおける上述のエレメントの任意の組み合わせが、本発明によって包含される。
【０１９２】
さらに、多くの参照が、特許、刊行物、雑誌記事及び他の文章に対し、本明細書中を通してなされている（本明細書中の参考文献）。参考文献のそれぞれが、本明細書中に、その参照される教示のために、その全体が参照として個々に組み込まれる。
【０１９３】
最後に、本明細書中で開示される本発明の実施形態は、本発明を説明する目的であると理解される。使用され得る他の改変が、本発明の範囲内である。したがって、例として、限定ではないが、本発明の代替の構成が、本発明の教示に従って利用され得る。したがって、本発明は、正確に示され、記載されたものに限定されない。
【０１９４】
本明細書中に示される詳細は、例示目的であり、そして本発明の好ましい実施形態の考察を説明するためでしかなく、本発明の種々の実施形態の原則的かつ概念的局面の最も有用かつ容易に理解される説明であると信じられるものを示すために提示される。この点で、本発明の構造的詳細を本発明の基本的理解のために必要である以上に詳細に示す意図はなく、図面及び／又は実施例と一緒の本記載は、本発明のいくつかの形態を実際に実現し得る方法を当業者に明らかにする。
【０１９５】
本開示において使用される定義及び説明は、実施例に従って明白かつ明確に改変されない限り、又は意味の適用が何らかの構造的矛盾又は本質的な矛盾を与える場合、何らかの未来の構成を支配することを意味し、そして意図する。用語の構成が矛盾するか、又は本質的に矛盾している場合、定義は、当業者に公知であるＷｅｂｓｔｅｒ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ第３版（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄ．Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｓｍｉｔｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２００４））から採用されるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１１−７】
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【図１１−８】
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【図１１−９】
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【図１１−１０】
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【図１１−１１】
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【図１１−１２】
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【図１１−１３】
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【図１１−１４】
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【図１１−１５】
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【図１１−１６】
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【図１１−１７】
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【図１１−１８】
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【図１１−１９】
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【図１１−２０】
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【図１１−２１】
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【図１１−２２】
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【図１１−２３】
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【図１１−２４】
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【図１１−２５】
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【図１１−２６】
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【図１１−２７】
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【図１１−２８】
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【図１１−２９】
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【図１１−３０】
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【図１１−３１】
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【図１１−３２】
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【図１１−３３】
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【図１１−３４】
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【図１１−３５】
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【図１１−３６】
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【図１１−３７】
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【図１１−３８】
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【図１１−３９】
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【図１１−４０】
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【図１１−４１】
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【図１１−４２】
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【図１１−４３】
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【図１１−４４】
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【図１１−４５】
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【図１１−４６】
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【図１１−４７】
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【図１１−４８】
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【図１１−４９】
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【図１１−５０】
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【図１１−５１】
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【図１１−５２】
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【図１１−５３】
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【図１１−５４】
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【図１１−５５】
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【図１１−５６】
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【図１１−５７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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