(57)【要約】  本発明は、免疫療法における使用のための、および、とりわけがんワクチン接種における使用のための、高収量の１型分極ｍＲＮＡ負荷樹状細胞を生成する促進方法に関する。
2021527674.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己樹状細胞ワクチンを製造するためのin vitroの方法であって、以下のステップを含む、前記方法：
単離された単球性樹状細胞前駆体を提供すること；
該前駆体を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターロイキン−４（ＩＬ−４）の存在下で約４８〜９６時間培養すること；
成熟したＤＣ集団を形成するための未熟なＤＣｓの成熟に好適な培養条件下で、未熟なＤＣｓを、最後の２４時間、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ｇ）およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）と接触させること；および
成熟ＤＣを抗原コードｍＲＮＡでトランスフェクトすること。
【請求項２】
樹状細胞が、医薬グレードの完全な閉鎖系において分化しおよび成熟する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
単球性樹状細胞前駆体が、培養バッグ中に提供され、とりわけ、細胞培養の開始の際の培養バッグ中の細胞密度が、０．５〜２×１０６細胞／ｍＬの範囲にわたる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＩＦＮ−ｇの濃度が、５００Ｕ／ｍｌと２５００Ｕ／ｍｌとの間である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＭＰＬＡの濃度が、１〜１０μｇ／ｍｌの間である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
トランスフェクションが、エレクトロポレーションによって、とりわけ矩形波パルスを使用して、行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
トランスフェクトされたＤＣｓが、さらに凍結保存培地中に再懸濁され、および、液体窒素容器の気相中で貯蔵される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
抗原が、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、がん−精巣抗原、ミュータノーム由来抗原、（発がん性の）ウイルス抗原、細菌抗原、酵母抗原、寄生虫抗原および真菌抗原からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法によって得られる樹状細胞。
【請求項１０】
成熟した、トランスフェクトされた、および任意には凍結保存された、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法によって得られた樹状細胞を含む、医薬組成物またはワクチン。
【請求項１１】
能動的免疫療法における使用のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法によって得られたトランスフェクトされた樹状細胞。
【請求項１２】
成熟した、ｍＲＮＡをエレクトロポレーションされ、凍結保存され、および解凍された樹状細胞集団であって、該樹状細胞は、ＩＦＮ−ｇおよびＭＰＬＡの存在下で成熟しており、かつ、相対的平均蛍光強度（ｒｅｌＭＦＩ）によって表したとき４００未満のＴ細胞共阻害性リガンドＰＤ−Ｌ１の細胞表面レベルによって特徴づけられる、前記樹状細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、免疫療法における使用のための、および、とりわけがんワクチン接種における使用のための、高収量の１型分極ｍＲＮＡ負荷樹状細胞を生成する加速された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明までの背景
４０年より前の樹状細胞の発見以来、これらの細胞のユニークな生物学的特性の医学応用への橋渡しは、依然として難題である。大半の努力は、ＤＣｓをがんに対するワクチンの形で臨床へ持っていくことに焦点を当てている。これは、腫瘍抗原に対するＴ細胞応答を誘起するＤＣの能力に基づくものであり、無数の前臨床モデルにおいて実証されているとおり、腫瘍発達に対する防護およびさらには確立した腫瘍の根絶につながる。
【０００３】
この効果の根底にあるのは、「４シグナル」コンセプトとしてまとめられてきた一連のユニークな生物学的特性である：（１）主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子への極めて高い量の処理抗原の提示、（２）細胞表面上のＴ細胞共刺激分子の大きなアレイの上方制御、（３）Ｔ細胞応答の適切な分極を駆り立てるサイトカインの放出、および（４）引き出されたＴ細胞エフェクターの組織ホーミングパターンをプログラムする追加のシグナルの提供。抗腫瘍免疫の特定の文脈において、ＤＣｓは、ＤＮＧＲ−１などの特殊化された受容体という手段により死細胞を見つけることができ、これはＭＨＣ Ｉの交差提示および抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞のプライミングに至る。力強くかつ長続きする細胞傷害性Ｔ細胞応答の生成のためにはＣＤ７０の上方制御が必須であるが、Ｔ細胞共刺激分子ＣＤ４０の高い発現は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞増大の大きさをブーストし、増強された腫瘍防護および耐性の免疫への変換を結果としてもたらす。対照的に、Ｔ細胞阻害受容体またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）などのチェックポイントリガンドの発現は、ＤＣｓ表面において最小限になるべきである。
【０００４】
次に、満足な量の生理活性ＩＬ−１２をＴ細胞接触の時に分泌する能力は、ＮＫ細胞エフェクター機能も支持しながら、最適な腫瘍コントロールのために必要な１型分極応答を駆り立てるのに必須である。加えて、ＤＣによって放出されるケモカインのパターンは、どのタイプのＴ細胞がリクルートされるかを決定づけ、すなわち、抗腫瘍免疫の場合には１型分極エフェクターを、Ｔヘルパー（Ｔｈ）２細胞（腫瘍支持の潜在性を持つ）または免疫抑制的な制御性Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇｓ）よりも優先的に好む。
【０００５】
この知識から、理想的なＤＣベースのがんワクチンは、これらの臨界的なパラメータの全ての最大限のコントロールおよび最適化を要することが明らかである。未熟なＤＣｓ（ｉＤＣｓ）はＴ細胞応答を刺激するのにほとんど無効であり、およびＴ細胞寛容を促進さえできるので、正しいＤＣ活性化または成熟状態は、Ｔ細胞の結果を決定するのに必須である。
【０００６】
それ故に、ＤＣ「消耗」の現象も回避しながら、完全に強力な成熟したＤＣｓを生成するための強い活性化刺激を選択することにおいて、周到な考慮は当然必要である。
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドはＤＣ成熟のための最も強いトリガーのうちであり、および、外来性（すなわち、病原体由来）または内在性（組織損傷または細胞死からの危険関連分子）のいずれかであり得る。この知識にもかかわらず、最も使用されている成熟戦略は、最初にJonuleit et al.により記載されたとおり、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を包含する炎症メディエーターの組み合わせに対して単球由来のＤＣｓを曝露することからなる。ＰＧＥ２を加えることの価値は、それがＤＣの収量、成熟、および遊走をさらに増加させることができるという観察にある（Jonuleit et al. 1997）。しかしながら、ＰＧＥ２がＤＣｓの生理活性ＩＬ−１２ｐ７０を分泌する能力を損ない、およびＴヘルパー細胞分極化をＴｈ１よりむしろＴｈ２の発達へとシフトするということもまた示されている（Kalinski et al. 1998）。
【０００７】
その時以来、１型分極応答を誘導するＤＣｓの能力を最大化するために数多くの代替的な戦略が探索されてきた。Mailliard et alは、炎症促進（pro-inflammatory）サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γおよびインターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）の存在下で、ＴＬＲ３アゴニストのポリ（Ｉ：Ｃ）と一緒に、ＤＣｓを成熟させたプロトコルを開発した（ＵＳ７９７２８４７；ＵＳ８６９１５７０）。「標準的な」ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＰＧＥ２で成熟させられたＤＣｓと比較すると、これらのα−１型分極ＤＣｓ（αＤＣ１）は、より高いレベルのＩＬ−１２ｐ７０を生産し、および、メラノーマ関連抗原に対する長命の細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬｓ）のよりロバストな増大を誘導した（Maillard et al. 2004）。これらのαＤＣ１細胞は、既に再発性悪性神経膠腫を持つ患者についての臨床試験に使用されているものの（Okada et al. 2011）、成熟「カクテル」の複雑性は、適正製造規範（ＧＭＰ）を遵守した生産プロセスでの実施の観点から大きな難題を提起する。
【０００８】
より単純な代替策には、ＴＬＲ４リガンドをインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）と組み合わせることが関与する。リポ多糖（ＬＰＳ）は、ＩＬ−１２などの免疫刺激性サイトカインの大規模な生産をトリガーする、ＤＣ成熟のための最も強い生得的な刺激の一つである。しかしながら、ＬＰＳ刺激によるＤＣｓは、その後in vivoでＴ細胞と同族相互作用に従事するとき、さらなるＩＬ−１２放出に対して不応性になる。この「消耗」現象は、ＤＣｓのＩＦＮ−γへの共曝露によってオフセットさせることができ、そこではＴ細胞接触または人工的ＣＤ４０ライゲーションによりトリガーされた際のＩＬ−１２の「第２のバースト」の生産を可能にしている（Paustian et al. 2011）。依然として、ＬＰＳの使用は、その毒性と、ＧＭＰ製剤化が存在しないことに起因して、大スケールの細胞療法応用については課題を生じさせる。ＬＰＳの派生物であるモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）は、しかしながら、免疫刺激特性を保存するものの有意に毒性レベルを減弱させるＬＰＳの酸加水分解の結果として、臨床的使用が認可されている（Boccaccio et al. 1997）。ＭＰＬＡは、現在の大量生産されるワクチンのアジュバント製剤の不可欠な成分である。
【０００９】
ＭＰＬＡ／ＩＦＮ−γ ＤＣｓおよびα−１型分極ＤＣｓの両方が、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＰＧＥ２で成熟させられたＤＣｓと比較すると、ＩＬ−１２ｐ７０、およびエフェクターＴ細胞を引き付けるケモカインの分泌の観点から同等に優れており、かつ、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞プライミング能力の観点からも優れていることが報告されている（Hansen et al. 2013）。ＭＰＬＡ／ＩＦＮ−γ ＤＣ成熟アプローチは、Ten Brinke et alのグループによってさらに探索されており、それによると、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で８日間培養された単球は、培養の最後の２日間の間に成熟ブーストを受けた。採取後、結果としてもたらされたＤＣｓは、ＣＣＲ７リガンドへ向かって遊走する能力を保ちながらも、高い細胞溶解活性を持った抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のプライミングならびに新たな（de novo）Ｔヘルパー１分極化を誘導する能力を発揮した（Ten Brinke et al. 2007；ＷＯ２００７／０７８１９６；ten Brinke et al. 2010）。このＤＣ培養プロトコルは、このセッティングにおけるＤＣ成熟および分化へのヒト血清の有害な影響を示すさらなる研究とともに、可能な臨床実施についてさらに調査されている（Kolanowski et al. 2014）。
【００１０】
適したタイプの成熟刺激の次に、抗原負荷モダリティは、臨床応用可能性の重要な決定要因である。ＤＣｓの免疫原性ペプチドでの受動負荷は、上述した研究における機能試験のために典型的に使用されたとおり、考慮される各候補抗原に対する免疫優性エピトープの従前の知識を暗示し、および、適格患者のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型の観点での特定的な制限を課す。未熟なＤＣｓの高い抗原取り込み能力を有効利用した代替は、腫瘍溶解物とのインキュベーションである。しかしながら、これは満足な量の患者腫瘍材料を要求し、これもやはり、小さい生検または細胞学的試料だけしか通常入手可能でない転移性疾患における実現可能性を制限する。
【００１１】
腫瘍抗原をコードする完全長ｍＲＮＡでＤＣｓを負荷することは、広域な考えられるエピトープの提示を誘導するための洗練されたやり方として今や広く認識されている。これはまた、ＤＣの免疫力を最適化することができるＲＮＡコンストラクトを共導入する機会をも与える（Van Lint et al. 2014）。これは、典型的に細胞のエレクトロポレーションによって達成され、このアプローチの裏側の面は、無視できない細胞の喪失のリスクになり、これによって、満足なワクチン用量を患者へ投与する可能性に支障を来たす（Tuyaerts et al. 2003; Ponsaerts et al. 2003; Bonehill et al. 2004）。
【００１２】
ワクチン生産の面から見た重要な追加の側面は、細胞培養の継続時間である。単球由来のＤＣｓについて、これは伝統的には７〜８日間の範囲にあったところ、培地への新鮮な培地およびサイトカインの繰り返しの添加を暗示していた。これは、要求の厳しいＧＭＰ生産環境の文脈において、消費財ならびにオペレーター介入の観点から、増加したコストとへと転化する。複数のグループが、加速された培養プロトコルを使用して、単球から、完全に機能するＤＣｓを分化させることができるということを実証した（Jarnjak-Jankovic et al. 2007; Dauer et al. 2003; Kvistborg et al. 2009; Massa et al. 2013; Truxova et al. 2014; EP2829600）。
最終的な実用的な考慮は、閉鎖系細胞培養を使用するという選択肢である：これは、ＧＭＰ要件の観点から別の長所を成し、そして生産プロセスを市販の自動化された細胞培養デバイスへと置き換えることができる。
【発明の概要】
【００１３】
これらの考慮を念頭に置いて、臨床グレードのＤＣに基づくがんワクチンの生産のためのプロセスを開発することが本発明のねらいであったところ、本明細書によって初めて、複数の主要な利点を一つの同じ生産方法に再統合させる：加速された培養時間、および、ＧＭＰに適合した１型分極させる成熟カクテルの長所を活かしての、ｍＲＮＡエレクトロポレーションによる抗原負荷との組み合わせ。そのうえ、これは、ＧＭＰ認定されているかまたは医薬グレードである成分の最大限の使用を伴う血清フリー条件において、ＧＭＰに準拠した培養バッグ中で閉鎖培養系を使用して達成することができるということが実証された。
【００１４】
本発明に従う方法のパフォーマンスは、ＴＮＦ−ａおよびＰＧＥ２の組み合わせを用いて成熟させられた単球由来のＤＣｓの広く確立された「標準的な」８日間培養と比較された。この成熟カクテルは当業者に周知であり、および、Jonuleit et alによって記載されたＴＮＦ−ａ、ＰＧＥ２、ＩＬ−１ｂおよびＩＬ−６を含む元々の古典的なモノ−ＤＣ成熟カクテルの単純化されたバージョンである。
【００１５】
重要なことに、および数多くの以前の報告とは対照的に、また現実のワクチン接種のセッティングをそっくり模倣するために、本発明におけるエレクトロポレーションされたＤＣｓを用いた全ての機能アッセイは、操作したての細胞を使用するよりもむしろ、凍結保存および解凍の後に行われた。
標準プロトコルと比較して、本発明の方法は、表現型としても機能的にもより優れたＤＣｓのより高い収量をもたらす。驚くべきことに、我々は、本発明に従い生成されたＤＣｓ上では、古典的なプロトコルで得られたものと比較して強く低減されたＴ細胞抑制性チェックポイントリガンドＰＤ−Ｌ１の発現を見出した。そのうえ、凍結保存されたアリコートの解凍後には古典的なＤＣｓ上では発現がさらに増加したが、本発明の方法を用いて得られた解凍されたＤＣのアリコートの場合は当てはまらなかった。これは、達成し得る限りこの免疫抑制性リガンドの発現を低くするべきところである患者へ実際に注射される細胞に関しては、決定的な観察結果である。
【００１６】
本発明の概要
本発明は、成熟した、好ましくは自己の、臨床グレードの樹状細胞を閉鎖系（１以上の滅菌された接続部（sterile connections）を用いた培養など）において生成するためのin vitroの方法に関し、および、例としてがん患者の、ワクチン接種に好適である。１つの態様において、方法は、本質的に、臨床グレードのサイトカイン、好ましくはＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４、を使用した白血球アフェレーシスから得られた単球の分化による成熟した臨床グレードの樹状細胞の生成（例として閉鎖系における）を含み、これを成熟因子の組み合わせへの、好ましくは、臨床グレードのＩＦＮ−ｇとエンドトキシンの無毒化誘導体ＭＰＬＡへの追加の曝露による、かくして得られたＤＣｓのさらなる成熟と組み合わせている。
【００１７】
約４日間以内の合計のin vitro培養時間（好ましくは約３日間〜約５日間の範囲内の培養）で生産された／生成された成熟した樹状細胞を含む、得られた生産物は、後から、１以上の抗原、とりわけ腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）で負荷される。本発明に従うこの迅速法は白血球アフェレーシス産物から大きな数のＤＣを、好ましくは血清フリー培地を使用した閉鎖系において、生成することが可能である。
【００１８】
１つの態様において、本発明に従う方法は、以下のステップを含む： 
−  患者から単核細胞白血球アフェレーシス産物を得ること、
−  白血球アフェレーシスからの単球の単離、
−  臨床グレードのサイトカインとともに、好ましくは樹状細胞への分化のための好適な量のＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４とともに、単球をインキュベートすること、
−  単球由来の樹状細胞の最終的な成熟のための成熟因子ＭＰＬＡおよびＩＦＮ−ｇの追加、および
−  得られた細胞を回収して、１または複数の抗原またはエピトープをコードする核酸配列、とりわけｍＲＮＡで、それらをトランスフェクトすること。
【００１９】
１つの態様において、単球は、約１〜４、好ましくは１〜３、より好ましくは２〜３日間（１日は２４時間として数える）、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４と接触させられ、その時間の間にＤＣ前駆体が未熟な樹状細胞へと分化する。さらなる態様において、ＩＦＮ−ｇおよびＭＰＬＡの存在下での成熟時間は、１〜３、好ましくは１〜２、より好ましくは約２日（２４時間）かかる。培養条件は、成熟したＤＣ集団を形成するための未熟なＤＣｓの成熟に好適である。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、本明細書中で提供される方法によって得られる、成熟した（およびトランスフェクトされた）樹状細胞または成熟した（およびトランスフェクトされた）樹状細胞の集団を提供する。 
本発明はまた、本発明の方法によって得られた樹状細胞を含む、組成物、キット、臨床グレードのバッグまたはクライオバイアルも提供する。
【００２１】
トランスフェクトされた樹状細胞は、免疫療法のための、とりわけ免疫療法におけるそれらの使用のための、さらにとりわけがんを処置することにおける、組成物を調製するために、殊のほか有用である。ゆえに、本発明はまた、本明細書中で提供される方法によって得られたトランスフェクトされた樹状細胞を対象へ投与することを含む、免疫療法のための方法、腫瘍治療、またはＴ細胞を活性化するための方法も提供する。
【００２２】
図面の簡単な説明
図に特に関連して、示されている委細は一例であり、本発明の異なる態様の例証的な考察を目的とするということに注意すべきである。それらは、本発明の原理および概念的な側面の最も有用で容易な記載であると思われるものを提供するという理由で提示される。この点から、本発明の基本的な理解のために必要なものよりも詳細に本発明の構造的な詳細を示そうとはしていない。図面とともに取り上げた説明は、本発明の複数の形態がいかに実際に具体化され得るかを当業者にとって明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ−１Ｃ】図１．採取の際の４日間培養されたｍｏＤＣｓの特性：（Ａ）デブリを取り除いた後のＣＤ１１ｃ高 ＨＬＡ−ＤＲ高 ＤＣｓのフローサイトメトリーの純度；（Ｂ）サイトスピン調製およびMay-Grunwald Giemsa染色後の光学顕微鏡下での形態；（Ｃ）生存率、および単球のＤＣへの変換率（フローサイトメトリー）（ｎ＝３３）（箱ひげ図は中央値および９５％Ｃ．Ｉ．を示す）；
【図１Ｄ】（Ｄ）代表的なオープンヒストグラム（vs 灰色のバックグラウンド染色）、および、まとめた箱ひげ図（中央値および９５％Ｃ．Ｉ．；ｎ＝３３）、これは相対的ＭＦＩｓ（正の蛍光シグナルの幾何平均の、バックグラウンド蛍光に対する比率）（両方とも生ＣＤ１１ｃ高 ＨＬＡ−ＤＲ高 ＤＣｓの範囲内でゲーティングしたもの）を示す、を包含する、表現型のおよび成熟のマーカーの細胞表面発現。
【図２】図２．４日（4-day）ｍｏＤＣｓと８日（8-day）ｍｏＤＣｓとの間で比較した採取時のＤＣプロファイル（ｎ＝１０）：（Ａ）生存率および単球のＤＣへの変換率（フローサイトメトリー）；（Ｂ）相対的ＭＦＩｓ（正の蛍光シグナルの幾何平均の、バックグラウンド蛍光に対する比率、生ＣＤ１１ｃ高 ＨＬＡ−ＤＲ高 ＤＣｓの範囲内でゲーティングしたもの）として算出された、表現型のおよび成熟のマーカーの細胞表面発現の比較。統計：ウィルコクソンの対応した符号付き順位検定（Wilcoxon matched-pairs signed rank test）。
【００２４】
【図３】図３．採取の際の４日（4-day）ｍｏＤＣにおける成熟プロファイルの誘導へのＭＰＬＡ、ＩＦＮ−γまたはその両方の相対寄与（ｎ＝３）。棒グラフとして示される、ＤＣ成熟マーカーの相対的ＭＦＩｓ。統計：クラスカル・ワリス（Kruskal-Wallis）をダンの多重比較検定（Dunn’s multiple comparisons test）と組み合わせた。
【図４Ａ】図４．ナイーブＴヘルパー分極化能の観点からの、４日（4-day）ｍｏＤＣｓに対するＭＰＬＡおよびＩＦＮ−γのコンビナトリアル効果（２の異なるＤＣドナーおよび３の異なる同種異系Ｔ細胞ドナーでの反復実験からプールされたｎ＝６〜１２のレプリケート）。（Ａ）同種異系ナイーブＴヘルパー細胞分極アッセイについての実験タイムラインの概略。
【図４Ｂ−４Ｃ】（Ｂ）未成熟のまたは完全に成熟した同種異系ＤＣｓとの１４日間の共培養後のＣＤ４＋ Ｔ細胞内の、ＣＤ４＋ Ｔ細胞 ＩＦＮ−γ／ＩＬ−１０サイトカイン生産を示す代表的なドットプロット。（Ｃ）ＤＣに媒介されるナイーブＴヘルパー細胞分極化に対するＭＰＬＡ、ＩＦＮ−γまたは組み合わせの相対寄与：棒グラフは、それぞれ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、およびＩＬ−１７の細胞内発現を示すＣＤ４＋細胞の百分率を表す。
【００２５】
【図５】図５．（Ａ）ビヒクル（ＭＯＣＫ−ＥＰ）またはｅＧＦＰ ｍＲＮＡ（１μｇ ｍＲＮＡ／１０６ ＤＣｓ）のいずれかでＥＰした４日（4-day）ｍｏＤＣｓの、エレクトロポレーション４時間後の生存ＣＤ１１ｃ高 ＨＬＡ−ＤＲ高 ＤＣｓのｅＧＦＰ発現レベルを示す、代表的なドットプロット。（Ｂ）生存ＣＤ１１ｃ高 ＨＬＡ−ＤＲ高 ＤＣｓの百分率および相対的ＭＦＩとして描かれた、時間におけるｅＧＦＰ発現レベルの強度。ＭＯＣＫ−ＥＰ ＤＣｓの幾何平均は、バックグラウンド染色としての役割を果たした。ＥＰの４時間後（ｎ＝９）、解凍直後（ｎ＝９）およびサイトカインの不在下での２４時間後（ｎ＝３）を包含する時点が、アッセイに包含された。（Ｃ）ｅＧＦＰ−ｍＲＮＡでエレクトロポレーションされた後の４日（4-day）ｍｏＤＣｓの生存率（トリパンブルー）および回収百分率（ｎ＝１７）。回収率は、エレクトロポレーション後の生存ＤＣｓ（トリパンブルー）の数をエレクトロポレーション前のもので除算したものとして算出した。（Ｄ）ｅＧＦＰ ｍＲＮＡでのＥＰ後の生存率（トリパンブルー）および回収率の、４日（4-day）および８日（8-day）ｍｏＤＣｓ間の比較（ｎ＝８）。（Ｂ〜Ｃ）統計：クラスカル・ワリス（Kruskal-Wallis）をダンの多重比較検定（Dunn’s multiple comparisons test）と組み合わせた；（Ｄ）ウィルコクソンの対応した符号付き順位検定（Wilcoxon matched-pairs signed rank test）。
【００２６】
【図６Ａ】図６．（Ａ）Luminexアッセイを使用して測定した、凍結保存された４日の（4-day）（ｎ＝５）および８日の（8-day）（ｎ＝２）ｅＧＦＰ ｍＲＮＡ−ＥＰ ＤＣｓの、サイトカインフリー培地中での２４時間のインキュベーション期間後のサイトカインおよびケモカインセクレトーム。統計：独立ｔ検定。
【図６Ｂ−６Ｃ】（Ｂ）同種異系Ｔヘルパー細胞との共培養における凍結保存されたＥＰ−ＤＣｓのタイムライン。（Ｃ）凍結保存および解凍後の、エレクトロポレーションされたＤＣｓのＴ細胞分極化特性（薄い灰色のバー）。ＤＣｓなしの同種異系ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞は、陰性対照としての役割を果たした（白いバー）（２の異なるＤＣドナーおよび１の同種異系Ｔ細胞ドナーでの反復実験からプールされたｎ＝３〜６のレプリケート）。データは、サイトカインを発現するＣＤ４＋ Ｔ細胞の百分率を示す。統計：マン・ホイットニー検定（Mann-Whitney test）。
【００２７】
【図７Ａ】図７．（Ａ）ＨＬＡ−Ａ２−陽性ドナーからのＭＡＣＳ精製ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、示唆されたｍＲＮＡｓでエレクトロポレーションされたかまたはＭＡＲＴ−１からのＡＡＡＧＩＧＩＬＴＶ Ａ２拘束性ペプチドを用いてパルスされた自己４ｄ−ｍｏＤＣｓで、２回刺激した。四量体陽性ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増大を示す代表的なドットプロット。全てのアッセイにおいて使用したＤＣｓは、凍結保存されおよび解凍された。
【図７Ｂ−７Ｃ】（Ｂ）異なるＨＬＡ−Ａ２＋ドナーならびにＤＣなしで、ＭＯＣＫでパルスされたＤＣｓで、ｅＧＦＰ−ｍＲＮＡ−ＥＰ ＤＣｓで、ＭＡＲＴ−１ ｍＲＮＡ−ＥＰ ＤＣｓでおよびＭＡＲＴ−１ペプチドでパルスされたＤＣｓで刺激されたＣＤ８＋ Ｔ細胞を使用して得られたデータの概要（２の異なるＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーでの反復実験からプールされたｎ＝４〜８のレプリケート）。（Ｃ）示唆されたＤＣ条件で示唆されたＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞における細胞内ＩＦＮ−γおよびグランザイムＢのレベル。（Ｂ−Ｃ）統計：クラスカル・ワリス（Kruskal-Wallis）とともにダンの多重比較検定（Dunn’s multiple comparisons test）。
【００２８】
【図８Ａ】図８．（Ａ）ＨＬＡ−Ａ２＋ドナーおよびモデル抗原としてのＭＡＲＴ−１を使用した自己ＤＣ：ＣＤ８ Ｔ細胞の共培養に続く抗原特異的細胞毒性アッセイの外観。２回の週１回のラウンドの、自己４ｄ−ｍｏＤＣでの刺激の後、細胞溶解性ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、Ｔ２標的細胞、無関係のペプチドでパルスされたＴ２標的細胞（インフルエンザペプチド）またはＭＡＲＴ−１ペプチドでパルスされたＴ２標的細胞のいずれかとともに共培養した。ＤＣの対応物は、陰性対照ＤＣｓ（ＭＯＣＫでパルスされたＤＣｓ（図示せず）およびｅＧＦＰ ｍＲＮＡ−ＥＰ ＤＣｓ）、ＭＡＲＴ−１ ｍＲＮＡ−ＥＰ ＤＣｓおよび陽性対照ＤＣｓ（ＭＡＲＴ−１からのＡＡＡＧＩＧＩＬＴＶペプチドを用いてパルスした（図示せず））を包含した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞の細胞溶解活性は、グランザイムＢおよびＩＦＮ−γの分泌と組み合わせられた、脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａおよび活性化マーカーＣＤ１３７の同時の上方制御によって特徴づけられた。
【図８Ｂ】（Ｂ）ＭＡＲＴ−１ペプチド負荷されたＴ２細胞との共培養後のＣＤ１０７ａ／ＣＤ１３７発現を示す代表的なドットプロットでの、示唆されたＤＣ条件で前に刺激されたＣＤ８＋ Ｔ細胞。
【図８Ｃ】（Ｃ）前のＤＣ刺激およびＴ２標的細胞のタイプに従った、自己ＣＤ８＋ Ｔ細胞の細胞傷害性活性（ＣＤ１０７ａ／ＣＤ１３７発現）（２の異なるＨＬＡ−Ａ２−陽性ドナーでの反復実験からプールされたｎ＝４〜８のレプリケート）。統計：二元配置ＡＮＯＶＡとテューキーの多重比較検定（Tukey’s multiple comparisons test）
【００２９】
【図９】図９．異なる時点で決定したときの、８日の（8-day）ＴＮＦ−α／ＰＧＥ２／ＩＬ−１β／ＩＬ−６で成熟させられたｍｏＤＣｓと８日の（8-day）ＴＮＦ−α／ＰＧＥ２で成熟させられたｍｏＤＣｓとの間で比較したＤＣ表現型（ｎ＝３）。関連がある場合はいつでも、時点「採取の際の」、「ＥＰの４時間後」、「解凍直後」および「サイトカインの不在下での２４時間後」がアッセイ中に包含される。（Ａ）採取の際の単球のＤＣへの変換率（トリパンブルー）；（Ｂ）時間における生存率（トリパンブルー）；（Ｃ）相対的ＭＦＩｓ（正の蛍光シグナルの幾何平均の、バックグラウンド蛍光に対する比率、生ＣＤ１１ｃ高 ＨＬＡ−ＤＲ高 ＤＣｓの範囲内でゲーティングしたもの）として算出された、時間における表現型のおよび成熟のマーカーの細胞表面発現の比較を、生ＣＤ１１ｃ高 ＨＬＡ−ＤＲ高 細胞の範囲内のｅＧＦＰ＋細胞の百分率、および相対的ＭＦＩとして描いたもの。バックグラウンド染色としての役割を果たしたＭＯＣＫ−ＥＰ ＤＣｓの幾何平均。統計：棒グラフは９５％Ｃ．Ｉ．を伴う中央値を表す。
【００３０】
【図１０】図１０．４日（4-day）ＭＰＬＡ／ＩＦＮ−γと「古典的な」ｍｏＤＣｓとのプロトコル間で比較した、凍結保存前後のＴ細胞共阻害分子ＰＤ−Ｌ１の発現レベル。表面ＰＤ−Ｌ１発現のレベルは、相対的ＭＦＩ（正の蛍光シグナルの幾何平均の、バックグラウンド蛍光に対する比率、生ＣＤ１１ｃ高 ＨＬＡ−ＤＲ高 ＤＣｓの範囲内でゲーティングしたもの）として算出した。「採取の際の（ｎ＝２）（それぞれ４日目または８日目）」および「解凍直後の（ｎ＝４）」時点を、アッセイに包含した。両方のＤＣ培養において、採取の際に各ドナーを、その後の凍結保存および解凍のために、２つのエレクトロポレーション条件（すなわち、ｅＧＦＰ ｍＲＮＡ−およびＭＡＲＴ−１ ｍＲＮＡ−ＥＰ）にわたって分けた。
【００３１】
【図１１】図１１．ＤＣ生存率を、エレクトロポレーション（または非エレクトロポレーション条件のためのさらなるインキュベーション）の４時間後、ならびに冷凍および解凍後に評価した。短期ＤＣ培養：３日間ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４；２４時間ＭＰＬＡ（２．５μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ（１０００Ｕ／ｍＬ）。採取の際、ＤＣｓを以下のエレクトロポレーションのセッティングに分けた：・エレクトロポレーションなし（非ＥＰ）；・指数パルス（ＥＸＰ−ＥＰ）：３００Ｖ；１５０μＦ；２００μｌ；∞Ω；＋／− ５×１０６ ＤＣｓ／キュベット；・矩形波パルス（ＳＱＷ−ＥＰ）：５００Ｖ；０，５ｍｓ；２００μｌ；１パルス；＋／− ５×１０６ ＤＣｓ／キュベット。  ｅＧＦＰ ｍＲＮＡは、０．５μｇ／１０６細胞で使用した。
【００３２】
【図１２Ａ】図１２．（Ａ）生存率およびｅＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析；
【図１２Ｂ】（Ｂ）生ＤＣｓ（vs 冷凍前）の生存率および有効回収率について評価したときの、凍結保存されたアリコートの解凍後のＤＣｓの安定性。単球由来の ＤＣｓを、２の別々のドナーの白血球アフェレーシスから生成させた。採取の際、以下のセッティングで矩形波パルスを使用して、ＤＣｓを０．５μｇ ｅＧＦＰ ｍＲＮＡ／１０Ｅ６細胞でエレクトロポレーションした：５００Ｖ；１．０ｍｓ；２００μｌ；１パルス；５０×１０６ ＤＣｓ／キュベット。
【００３３】
【図１３−１】図１３．単球由来の樹状細胞を、本発明に記載されたプロトコル（「MIDRIX ＤＣｓ」）またはMassa et al., 2013に記載されたプロトコル(「Massa ＤＣｓ」）のいずれかに従って生成した。ＤＣｓを、それぞれの時点で採取し、およびｅＧＦＰコードｍＲＮＡでエレクトロポレーションした。６の異なるドナーからのデータ。（Ａ）両方のプロトコルで得られた生ＣＤ１１ｃ＋ ＨＬＡ−ＤＲ＋ 樹状細胞の採取の際の生存率および絶対的な細胞収量。
【図１３−２】（Ｂ）単球マーカーＣＤ１４ vs ＤＣ分化マーカーＣＤ８３の発現。（Ｃ）ＤＣ成熟マーカーＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８６およびＣＣＲ７の発現。
【図１３−３】（Ｄ）Ｔ細胞共阻害受容体ＰＤ−Ｌ１の発現。（Ｅ）エレクトロポレーションの４時間後に測定したときの、翻訳されたタンパク質のレベル（ｅＧＦＰシグナル）ならびにエレクトロポレーションされたｅＧＦＰ−ｍＲＮＡの首尾よく成功した翻訳を伴う細胞の割合（ｅＧＦＰ＋ ＤＣｓの百分率）として表された、エレクトロポレーション効率。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明の詳細な説明
これより本発明がさらに記載される。以下の文において、本発明の異なる側面が、より詳細に定義される。そのように定義される各側面は、明らかにそうでないことが示唆されていなければ、あらゆる他の側面（単数または複数）と組み合わせられてもよい。本明細書および添付の請求項中で使用されるとき、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明らかにそうでないことを決定づけていなければ、複数の指示物を包含するものとする。一例として、「化合物（単数）」は、１つの化合物または１つより多い化合物を意味する。本明細書の記載および請求項の全体を通して、単語「含む（comprise）」およびその単語の他の形、「含むこと（comprising）」および「含んでいる（comprises）」などは、包含するが限定されないことを意味し、また、例えば他の追加物、要素、整数、またはステップを除外することは意図しない。明細書中に使用した上記の用語およびその他は、当業者によく理解される。本明細書中に引用された、全ての参照文献、および具体的に言及された教示は、それらの全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
【００３５】
本発明樹状細胞ワクチンの、とりわけ、自己の単球性樹状細胞ワクチンの、製造に関する。とりわけ興味の対象となるのは、本発明の方法を臨床グレードの完全な閉鎖系を使用して行うことができるということである。ガス透過性の培養バッグまたは容器は、閉鎖流路培養系の長所をもたらし、それによって細胞懸濁液は滅菌された接続ポートを介して培養バッグへと加えられ得る。理想的には、全ての細胞収集が、および所望であれば事前選択が、閉鎖流路系の中で執り行われ、これは次いで、バッグの中への細胞の移動のためにガス透過性のバッグへ無菌的に接続される。培養培地は、次いで、滅菌された接続ポートおよび滅菌管系を介して、連続的にバッグを通して灌流されるかまたは定期的にリフレッシュされることができる。ガス透過性のバッグ内の細胞培養は、そうでなければ細胞が当初バッグまたは容器中へと導入されるとき、培地がリフレッシュされるとき、または新たな培地が加えられるときに培養中へと導入され得たかもしれない微生物などの、環境危険因子に晒されることなく、インキュベーターのガス制御された雰囲気中に維持されることができる。
【００３６】
培養期間全体を通じて、培養された細胞の試料は、分析のために、バッグから滅菌接続されたポートを通じて無菌的に引き上げることができる。同様に、ＤＣ培養がすぐに採取できる状態になったとき、細胞を、閉鎖系洗浄および／またはさらなる処理（processing）のために、無菌的に引き上げることができる。閉鎖系は、加えて、空中浮遊粒子数の観点からより低いストリンジェントさを伴うクリーンルーム環境（例としてClass Cクリーンルーム環境）中で細胞培養を実行する可能性を開く。これは、オペレーターのための作業条件の観点から長所を有し、コストを減少させ、そして、細胞分化プロセスを市販の自動化された培養系（例としてCliniMACS Prodigy（登録商標）System, Miltenyi Biotec GmBH, Bergisch Gladbach, Germany）へと簡単に置き換えることができる可能性もまた与える。
【００３７】
ゆえに、本明細書中で使用されるとき、用語「閉鎖系」は、その各々が周囲環境に対して閉鎖されており、かつその各々に要素間の効果的な滅菌接続のための手段が提供されている、要素のアセンブリを指す。１つの態様において、閉鎖系は、白血球アフェレーシス産物を、本明細書中で提供されるとおりの分化および成熟要素と一緒に含む。ＧＭＰ認定されたガス透過性の培養バッグ系の例は、MACS（登録商標）ＧＭＰ細胞培養バッグ（Miltenyi Biotec GmBH, Bergisch Gladbach, Germany）である。本明細書中で使用されるとき、「ＧＭＰ認定された」は、適正製造規範（Good Manufacturing Practice）を意味し、および医薬品製造者がその生産プロセスにおいて満たさなければならない最低限の水準を記載している。欧州医薬品庁（ＥＭＡ）は、例として、これらの標準への準拠を点検するための査察をコーディネートし、欧州連合（ＥＵ）レベルでのＧＭＰ活動を調和させることにおける主要な役割を担っている。
【００３８】
１つの態様において、本発明の方法は、樹状細胞前駆体の集団を単離するおよび／または提供するステップを含む。典型的には、本明細書中で使用される「樹状細胞前駆体」は、（ヒト）末梢血単核球、単球または別の骨髄前駆細胞である。本明細書中で使用されるとき、「単球」は、樹状細胞へと分化する能力を有するＣＤ１４＋単核白血球を指す。単球は、あらゆる哺乳動物からのものであり得るが、しかし好ましくはヒト単球である。単球は、血液、血液画分（例として、白血球（ＷＢＣｓ）、バフィーコート、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）、単核細胞白血球アフェレーシス産物などの、しかしそれらに限定されない、組成物中で、ならびに、単球がさらに富化された組成物中で、提供されおよびインキュベートされることができる。
【００３９】
好ましい態様において、単球は、他の末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）と一緒に、例えば、単核細胞アフェレーシス産物として、提供される。血液および骨髄を包含する様々な起源から、単球および従来の樹状細胞などの、樹状細胞前駆体が富化された細胞集団を単離するための方法は、当該技術分野において知られている。例えば、単球および従来の樹状細胞は、ヘパリン化血液を収集することにより、アフェレーシスもしくは白血球アフェレーシスにより、バフィーコートの調製により、ロゼット、遠心分離、密度勾配遠心分離、細胞の分別溶解（differential lysis）、ろ過、エルトリエーション、蛍光活性化細胞選別または免疫磁気単離により、単離することができる。好ましい態様において、単球は、単核細胞白血球アフェレーシスから単離される。
【００４０】
白血球アフェレーシスの方法は、当該技術分野において知られている。白血球アフェレーシスは、それによって白血球が対象の血液から除去され、その残りが次いで対象へ再び輸血される、という手順である。白血球アフェレーシス産物は、典型的に、ＰＢＭＣｓが富化された血液画分であって、低いレベルの夾雑する赤血球、顆粒球および血小板を持つものである。白血球アフェレーシスを行うための方法および設備は、当該技術分野において周知である。単球性樹状細胞前駆体および／または分化した従来の樹状細胞は、健康な対象から、あるいは、例えばがん患者またはその他の対象であって細胞免疫刺激が有益もしくは望ましいといえる者（すなわち、細菌もしくはウイルス感染症を有する対象等）などの免疫刺激を必要とする対象から、単離することができる。樹状細胞前駆体および／または未熟な樹状細胞はまた、免疫刺激を必要とするＨＬＡ適合した患者への投与のためにＨＬＡ適合した健康な個人から得ることもできる。
【００４１】
１つの態様において、単球は、分化ステップに先立って富化される。単球またはＰＢＭＣｓ等々に対して操作が行われ得、および、例として遠心分離、エルトリエーション、接線流ろ過、Ficoll密度勾配、希釈Ficoll密度勾配遠心分離、希釈Percoll密度勾配遠心分離、抗体パンニング、磁気細胞ソーティング、ポジティブもしくはネガティブ免疫磁気セレクション等を包含する。加えて、ひとたび対象から単離されると、単球（例として、精製された単球、富化された単球、単球を含むＰＢＭＣｓ、等々）は任意に、例として１℃〜３４℃で、ある期間、例としてそれらが対象から単離されてからおよそ１〜９６時間、インキュベートされることができる。
具体的な態様において、単球前駆体は、免疫磁気単離により白血球アフェレーシスから得られる。さらにいっそう具体的には、生存単球ＤＣ前駆体の集団は高度に精製され、例として、単球マーカーＣＤ１４および生存判別染色を使用してフローサイトメトリーにより決定したとき、９０％よりも、９５％よりも、またはさらには９９％よりも純粋である。
【００４２】
ゆえに、本明細書中で開示された方法の第１のステップは、単離された（自己の）単球性ＤＣ前駆体を、とりわけ本明細書中で提供されるとおりの閉鎖系を使用して、提供することを含む。典型的には、細胞培養の開始の際の培養バッグまたは容器中のＤＣ前駆細胞密度は、当該技術分野において知られている方法によって決定したとき、０．５×１０６から２×１０６までの細胞／ｍｌ、好ましくは約１×１０６細胞／ｍｌの範囲にわたる。
【００４３】
単離、精製および／または富化に続いて、ＤＣ前駆体は、樹状細胞への分化に誘導される。ゆえに、さらなる態様において、本発明の方法は、少なくとも顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターロイキン−４（ＩＬ−４）の存在下（分化培地と呼ばれる）での前駆体細胞の培養などの、未熟なＤＣｓを得るための培養および／または分化ステップを含み、および、これは約４８〜９６時間、より具体的には４８〜８４時間、さらにいっそう具体的には８０、７５、７４、７３、７２、７１、７０時間までまたはそれ以下、より具体的には少なくとも４８時間かつ７２時間までである。＋／−４時間または＋／−２時間の差は許容し得、および実用的制約の観点から必然たり得る。特定の態様において、単離されたＤＣ前駆体は、閉鎖系を介して、（血清フリーの）分化培地の入ったガス透過性の培養バッグへと移される。
【００４４】
ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４は、約１００Ｕ／ｍｌから５０００Ｕ／ｍｌまでの各サイトカインの濃度で、好ましくは５００Ｕ／ｍｌから２５００Ｕ／ｍｌまで、より好ましくは５００Ｕ／ｍｌから１５００Ｕ／ｍｌまで、または約５００〜１０００Ｕ／ｍｌで使用することができる。とりわけ、ＧＭ−ＣＳＦは、５００Ｕ／ｍｌと２５００Ｕ／ｍｌとの間の濃度で、好ましくは１０００Ｕ／ｍｌと１５００Ｕ／ｍｌとの間、およびより好ましくは約１０００Ｕ／ｍｌで使用することができる。より具体的には、ＩＬ−４は、５００Ｕ／ｍｌから２５００Ｕ／ｍｌまでの濃度で、好ましくは５００Ｕ／ｍｌから１５００Ｕ／ｍｌまで、より好ましくは５００Ｕ／ｍｌから１０００Ｕ／ｍｌまで、およびさらにいっそう好ましくは約５００Ｕ／ｍｌで使用することができる。
【００４５】
未熟な樹状細胞への単球の分化に続いて、未熟な樹状細胞は、成熟した樹状細胞へと成熟することができる。ゆえに、１つの態様において、本発明の方法は、（分化した）未熟なＤＣｓにインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ｇ）およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）（成熟刺激またはカクテルと呼ぶ）を加えるなどの成熟ステップを含み、およびこれは、少なくとも３０時間まで、好ましくは少なくとも２４時間までである。とりわけ、成熟刺激ＩＦＮ−ｇおよびＭＰＬＡは、採取および／またはトランスフェクション前の細胞培養の最後の２４時間 ＋／−４時間、とりわけ＋／−２時間、培地へと加えられる。
【００４６】
ＩＦＮ−ｇは、５００Ｕ／ｍｌから２０００Ｕ／ｍｌまでの濃度で、好ましくは５００Ｕ／ｍｌから１５００Ｕ／ｍｌまで、さらにいっそう好ましくは５００Ｕ／ｍｌから１０００Ｕ／ｍｌまで、および具体的な態様において、約１０００Ｕ／ｍｌで使用される。ＭＰＬＡは、１μｇ／ｍｌと２０μｇ／ｍｌとの間の濃度で、より具体的には１μｇ／ｍｌと１０μｇ／ｍｌとの間、さらにいっそう具体的には１μｇ／ｍｌと５μｇ／ｍｌとの間で使用される。具体的な態様において、ＭＰＬＡは、約２．５μｇ／ｍｌの濃度で使用される。さらなる態様において、ＩＦＮ−ｇは、医薬グレードまたはＧＭＰ認定された組換えヒトＩＦＮ−ｇである。本明細書中で使用されるとき、「医薬グレード」化合物は、あらゆる活性なまたは不活性な薬物、バイオ医薬品または試薬であって、認められている国もしくは地域の薬局方によってそれについての科学的純度基準（chemical purity standard）が確立されているものを指す。
【００４７】
ゆえに、本発明に従うと、前駆体および／または未熟な樹状細胞は、（少なくとも）上記の因子の組み合わせ、すなわち、分化および／または成熟因子とともに、栽培される。これは、培養培地に因子を加えることによって行うことができる。代替的に、前駆細胞および／または未熟な樹状細胞が中で育てられていた培養培地は、因子を既に含有する培地によって置き換えられる。
【００４８】
さらなる態様において、上述した物質は、該細胞の培養培地に加えられるか、またはそれに加えられる組成物の一部であり得る。該培養培地は、あらゆる好適な種類のものであってよく、すなわち、例としてタンパク質、アミノ酸、または抗生物質のようなあらゆる他の添加物が添加されていてもいなくてもよい。具体的な態様において、培地は、ＧＭＰ条件下で生産され、および使用される。さらにいっそう具体的には、培養培地は、例として血清フリーＧＭＰ CellGro（登録商標）（ＣＧ）培地（CellGenix GmBH, Freiburg, Germany）などの、血清フリーのものである。完全な閉鎖系の態様において、前駆細胞は、本明細書中で提供されるとおりのＤＣ分化培地を含有する培養バッグへと移されることができる。第２のステップで、およびおよそ４８時間（プラスまたはマイナス４時間）後に、成熟刺激ＩＦＮ−ｇおよびＭＰＬＡが、培養バッグ中の培地および細胞に加えられる。
【００４９】
本発明のねらいは、そのうえ、核酸にコードされた腫瘍抗原の効率的な提示と組み合わせた、強いＴｈ１分極能を持つ臨床グレードの樹状細胞（ＤＣｓ）の生産のための「加速された」in vitro細胞分化法を提供することである。典型的に、本発明のＤＣ培養プロトコルは、８日間の「標準的な」プロトコルに代えて、約４日に限られる。
異なるドナーの範囲にわたって評価したとき、ＤＣ生存率および単球のＤＣへの変換率の両方が、本発明の方法では標準的なプロトコルと比較して有意により高い（例として、変換率に関して：本発明の方法：約４５％、標準法：約２５％）。
【００５０】
表現型の上では、本明細書中で提供される方法によって得られた細胞は、以下を包含する、樹状細胞の基本的な特性を見せる：
−  光学顕微鏡によって評価したときの典型的な樹状細胞形態
−  ＤＣ分化マーカーＣＤ１１ｃ、ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）およびＣＤ８３の均一な発現
−  単球マーカーＣＤ１４の均一な下方制御。
【００５１】
ＤＣｓの成熟状態の観点から、これは、特定の細胞表面マーカーの発現を、その中でもＴ細胞共刺激分子を、好ましくはフローサイトメトリー分析によって、測定することによって分析される。その場合において、発現レベルは、一般的に知られている方法によって決定したとき、平均蛍光強度（ＭＦＩｓ）（正の蛍光シグナルの幾何平均の、バックグラウンド蛍光に対する比率）として与えられる。Ｔ細胞共刺激分子は、典型的に成熟マーカーとして評価され、それについてのＤＣｓの表面上での発現は可能な限り高くあるべきである。反対に、最終ＤＣ産物上でＴ細胞共阻害分子の発現を可能な限り低く維持するように努力がなされている。
【００５２】
本発明の方法に従い得られたＤＣｓは以下を実証する：
−  Ｔ細胞共刺激分子（ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８６）の均一な上方制御、および
−  リンパ組織ホーミングケモカイン受容体ＣＣＲ７の均一な発現。
ＣＤ４０、ＣＤ７０およびＣＣＲ７のレベルの中央値は、「古典的な」プロトコルを使用して生成されたＤＣｓが見せるそれらと比較して、統計的有意性を伴ってより高い（両側（two-tailed）ｐ値＜０．０５）。
本発明の１つの態様において、本明細書中で生成されるＤＣｓ上の細胞表面マーカー発現レベルは、ＰＧＥ２およびＴＮＦ−αを成熟刺激として使用してそれによって成熟した樹状細胞が８日後に得られる「古典的な」方法を使用して生成されたＤＣｓのそれと比較される。
【００５３】
例えば、Ｔ細胞共阻害性リガンドＰＤ−Ｌ１については、平均蛍光強度（ｒｅｌＭＦＩ）によって表した細胞表面レベルは（使用した分析方法の記載については、「例」の下の材料および方法のセクションを参照のこと）、４００、３５０、３２０、３１０、３００、２５０、２００未満、とりわけ１５０未満である。加えて、本発明の方法に従い生産されたＤＣｓ上では、エレクトロポレーション、凍結保存および細胞解凍後（すなわち、患者への投与の時の産物の代表となるもの）の表面ＰＤ−Ｌ１発現は、５００、４７０、４５０未満、とりわけ４００未満である。
【００５４】
ゆえに、細胞採取の時（ＤＣ成熟の直後）、本発明の方法に従い生成されたＤＣｓによるＰＤ−Ｌ１の発現レベルは、ＰＧＥ２およびＴＮＦ−ａを成熟刺激として使用してそれによって８日後に成熟した樹状細胞が得られる「古典的な」方法を使用して生成されたＤＣｓによる発現よりも、少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍およびとりわけ少なくとも１０倍、低い（「例」の図１０を参照のこと）。
ゆえに、細胞解凍の時、本発明の方法に従い生成されたＤＣｓによるＰＤ−Ｌ１の発現レベルは、ＰＧＥ２およびＴＮＦ−ａを成熟刺激として使用してそれによって８日後に成熟した樹状細胞が得られる「古典的な」方法を使用して生成されたＤＣｓによる発現よりも、少なくとも４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍およびとりわけ少なくとも１０倍、低い（「例」の図１０を参照のこと）。
【００５５】
機能的には、凍結保存および解凍の後、長期化されたサイトカインフリー培地中のインキュベーションの間に、細胞は、１型分極サイトカイン（ＩＬ−１２、ＩＦＮ−ｇ）ならびに、Ｔｈ１、ＣＤ８およびＮＫ細胞を誘引するケモカインを分泌する能力を保存する。とりわけ本発明の方法に従い生産されたＤＣｓは、上述の「古典的な」方法で得られたＤＣｓと比較して、統計的に有意により高いレベルのＣＸＣＲ３リガンドＣＸＣＬ９（ＭＩＧ３０）およびＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）、ならびにＣＣＲ５リガンドＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１β）およびＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、および、検出不能なほど低いレベルのＣＣＬ１７を、分泌する。１つの態様において、サイトカインまたはケモカインの分泌レベルは、相対的な観点から、すなわち、ＰＧＥ２およびＴＮＦ−ａを成熟刺激として使用してそれによって８日後に成熟した樹状細胞が得られる「古典的な」方法を使用して生成されたＤＣｓによるサイトカインまたはケモカインそれぞれの分泌レベルと比較したときのもので、表される。分泌レベルは、標準的なタンパク質測定法、例としてELISAまたは本明細書中で提供されたLuminex（登録商標）法を使用することによって決定することができる。
【００５６】
例えば、原型的な１型Ｔ細胞分極およびＮＫ細胞支持ケモカインＩＬ−１２については、解凍および上述の条件でのさらなる培養後に樹状細胞上清中に放出されるレベルの範囲は、以下である：
・本発明の方法に従い生産されたＤＣｓについて：５０ｐｇ／ｍｌから２５０ｐｇ／ｍｌまで；とりわけ６０〜２００ｐｇ／ｍｌ；さらにいうととりわけ７０〜１５０ｐｇ／ｍｌ；
・「標準的な」８日間プロトコルに従い生産されたＤＣｓについて：０〜３５ｐｇ／ｍｌであるが、５０ｐｇ／ｍｌ未満。
【００５７】
ケモカインＣＸＣＬ１０（１型分極Ｔ細胞およびＮＫ細胞をリクルートするのに重要）については、解凍および上述の条件でのさらなる培養後に樹状細胞上清中に放出されるレベルの範囲は、以下である：
・本発明の方法に従い生産されたＤＣｓについて：２００ｐｇ／ｍｌから２０００ｐｇ／ｍｌ；とりわけ２５０〜１８００ｐｇ／ｍｌ；さらにいうととりわけ２８０〜１６００ｐｇ／ｍｌ；
・「標準的な」８日間プロトコルに従い生産されたＤＣｓについて：０〜５ｐｇ／ｍｌであるが、１０ｐｇ／ｍｌ未満。
【００５８】
ゆえに、ＣＸＣＬ１０については、本発明の方法に従い生成されたＤＣｓによる分泌レベルは、「古典的な」方法を使用して生成されたＤＣｓによる分泌よりも少なくとも５０倍高い。本発明の方法を用いて得られたＤＣｓの、類似の優位性が、抗がん免疫に要求されるとおりの１型分極炎症性応答を促進する追加のサイトカインおよびケモカイン、その中でもＩＦＮ−ｇ、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５およびＣＸＣＬ９で観察される。
【００５９】
それに対して、ケモカインＣＣＬ１７（制御性Ｔ細胞および２型分極Ｔ細胞（両方とも抗がん免疫応答に有害である）のリクルートに関与する）については、本発明の方法に従い生成されたＤＣｓによる放出は、「古典的な」方法を使用して精製したＤＣｓによる分泌よりも少なくとも３倍低い。
【００６０】
したがって、本発明の方法を用いて得られたＤＣｓは、例として能動的がん免疫療法のために要求されるような高いＩＦＮ−γ分泌によって特徴づけられる１型分極プロファイルへのナイーブＴヘルパー細胞の分化を駆り立てる。 そのうえ、該細胞は、トランスフェクトされたＲＮＡに由来する免疫原性のエピトープを提示することができ、およびその後、既に言及したとおりのＩＦＮ−γおよび細胞傷害性分子グランザイムＢを発現する、自己の、腫瘍抗原特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞の、増大を駆り立てることができる。
【００６１】
さらなる態様において、本発明の方法は、核酸、とりわけＲＮＡ、さらにいうととりわけｍＲＮＡをコードする抗原で、成熟ＤＣｓを負荷するかまたはトランスフェクトすることを含む。本明細書中で使用されるとき、「抗原」は、本発明に限定するものではない。１つの態様において、抗原は、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、がん−精巣抗原、ミュータノーム（mutanome）由来抗原、（発がん性の）ウイルス抗原、細菌抗原、酵母抗原、寄生虫抗原および真菌抗原からなる群から選択される。抗原は対象に対して自己由来とすることができ、および、対象への投与のために抗原を負荷された自己ＤＣワクチンを調製することに使用することができる。対象に対して自己由来であるということは、その抗原（またはその配列）が同じ対象から得られたかまたはそれに由来するという意味である。
【００６２】
非限定例として、抗原は、対象から得られたがん細胞または腫瘍組織からのものであり得る。がん抗原は、抽出物中に存在するか、精製されたか、増幅されたか、in vitroで翻訳された等何であれ、がん細胞、がん細胞もしくは組織の溶解物、がん細胞もしくは組織からの抽出物、がん細胞もしくは組織の精製またはクローン化された要素、トータルＲＮＡもしくはトータルｍＲＮＡ、またはかかる細胞もしくは組織からの選択されたＲＮＡもしくはｍＲＮＡ、として樹状細胞中へと負荷される可能性がある。代替的に、抗原は、病原体からもしくは対象中に存在する病原体感染細胞から、得られるかまたはこれに由来し得る。
【００６３】
用語「核酸」は、一本鎖、二本鎖、および三重のらせん分子、遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離されたＤＮＡ、あらゆる配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーを指す。より具体的には、樹状細胞は、１以上の抗原コードｍＲＮＡでトランスフェクトされている。任意に、および代替的な態様において、成熟期間が完了した後、ＤＣｓは、（例としてトランスフェクションなどの）さらなる取り扱いの前に最初に採取され得、それによって細胞が収集され、遠心分離されおよび／またはサイトカインが洗い出される。
加速された培養プロトコルから考えて、成熟ＤＣｓのトランスフェクションは、単球の単離または前駆体ＤＣｓへの分化刺激の付加の後、約７２〜９６時間で、とりわけ８６時間＋／−４時間で、可能である。
【００６４】
本発明の文脈において、トランスフェクションの方法は、これらに限定されないが、エレクトロポレーション、フォトポレーション、リポフェクショｎクション、ウイルスベクター系、裸の核酸のインキュベーション、または、感染細胞もしくは腫瘍細胞とのＤＣｓの融合を包含する。これらの標準法は、当該技術分野において周知でありかつ実行可能であり、および、抗原コードプラスミド、それらのＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸をＤＣｓ中へと導入する。あらゆる種類の抗原源として使用するための膜フラグメントまたはエキソソームなどの想定され得る元々のＭＨＣ分子との他の抗原性組み合わせもまたあるかも知れない。特定の態様において、成熟ＤＣｓは、エレクトロポレーションによってトランスフェクトされる。指数減衰パルス（Exponential Decay Pulse）、矩形波パルス（Square Wave Pulse）および時定数（Time Constant）などの３つの異なる型のパルスを、エレクトロポレーションのために使用することができる。本発明の具体的な態様において、エレクトロポレーションは、矩形波パルスからなる。トランスフェクションを完了させるために、典型的には１または２のパルスが誘導される。
【００６５】
本発明の１つの態様において、抗原は、樹状細胞のエレクトロポレーションによって、核酸で、好ましくはｍＲＮＡで付加される。好ましくは、樹状細胞は、樹状細胞１０Ｅ６個あたりおよそ０．２５〜４μｇのＲＮＡで、最も好ましくは樹状細胞１０Ｅ６個あたり約１〜３μｇのＲＮＡで、トランスフェクトされる。１つの態様において、百万のＤＣにつき１〜２μｇの抗原ＲＮＡが、トランスフェクションにつき使用される。
【００６６】
本明細書中では、本発明の方法によって得られた細胞が、トランスフェクトされたｍＲＮＡに由来するタンパク質を均一にかつ安定して発現するということが実証された（「例」を参照のこと）。そのうえ、該細胞は、例として能動的がん免疫療法のために要求されるとおり、トランスフェクトされたｍＲＮＡに由来する免疫原性エピトープを提示すること、およびその後、自己由来の、細胞傷害性プロファイルを持つ腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増大を駆り立てることができる。
【００６７】
本発明の文脈において、本明細書中で提供されたとおりの未熟な樹状細胞の、短縮されたインキュベーション時間下での、例としておよそ３日間以内での刺激は、８日間の「古典的な」プロトコルによって調製されたｍＤＣｓと比較して、改善された生存率、機能性および／または免疫刺激作用を持つ成熟した樹状細胞の生成を、結果としてもたらすということが見出された。本明細書中で使用されるとき、用語「免疫刺激作用」は、満足な量の特定のサイトカインおよびケモカイン、とりわけＩＬ−１２およびＣＸＣＬ１０を、生産および／または分泌する、成熟した樹状細胞のまたは成熟した樹状細胞の集団の性能を指し、これは、例としてがんおよび特定の病原体に対する免疫のために要求されるとおり、１型分極エフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞の正しい分化および動員を媒介する。
【００６８】
本発明の１つの態様において、負荷された／トランスフェクトされた樹状細胞は、凍結保護剤を含む組成物中において冷凍することができる。ＤＣｓを冷凍するための多数の凍結保護剤および方法が当業者に知られている。一例として、樹状細胞は、制御された速度の冷凍庫を使用して冷却され、および、凍結保存および貯蔵のために液体窒素容器の気相中に移される。とりわけ、樹状細胞は、１００μＬの体積アリコート中に、２０〜７０×１０６生細胞／ｍＬ、より具体的には約４０〜６０×１０６生細胞／ｍＬ、さらにいっそう具体的には約５０×１０６生細胞／ｍＬの濃度で、好適な凍結保存培地中に再懸濁される。さらなるステップにおいて、解凍された樹状細胞ワクチンは、一般的に解凍後４時間までは、すぐに対象へ投与されることができる状態である。
１つの態様において、本発明は、凍結保存された、成熟したトランスフェクトされた、とりわけエレクトロポレーションされた、本明細書中で提供されたとおりのＤＣｓを、とりわけ、凍結保存に先立って測定すると１００μＬあたり約５×１０６細胞の量で含む、クライオバイアルを提供する。
【００６９】
本発明はさらに、本明細書中で提供された方法に従い調製した凍結保存された生きた樹状細胞を解凍すること、およびそれを対象へ投与することを含む、抗原負荷樹状細胞ワクチンの投与のための方法を提供する。
本発明は、本明細書中で開示した方法によって得られた抗原負荷樹状細胞の、医薬としての、とりわけ医薬または医薬組成物の調製のための使用もまた提供する。本発明は、免疫療法における使用のための、とりわけがんまたは病原体感染の処置または予防のための、本明細書中で記載したとおりのＤＣｓまたは組成物を提供する。
【００７０】
さらなる側面において、本発明は、本発明に従う成熟した樹状細胞および薬学的に許容し得る担体および／または賦形剤を含む医薬組成物を網羅する。さらにまた、本発明は、悪性疾患（がん）、特定の良性疾患（例としてＬＡＭ肺疾患（リンパ脈管筋腫症）、および感染性疾患（例としてウイルス、細菌、細胞内細菌または真菌によって誘発されるからなる群から選択される疾患を処置する方法における使用のための、本発明の成熟した樹状細胞にもまたは成熟した樹状細胞の集団にも関する。さらにまた、本発明は、腫瘍性疾患（がんなど）または感染性疾患を持つ患者を処置するための、有効量の本発明の成熟した樹状細胞を該患者へ投与する、方法にも関する。
【００７１】
本発明の抗原負荷樹状細胞は、疾患の処置または予防におけるワクチンとして、またはＴ細胞の活性化のために、有用である。例えば、抗原負荷樹状細胞は、抗原に対する免疫応答を引き出すために使用されることができる。それらは、病原体感染またはがんなどの、しかしそれらに限定されない、将来の感染または疾患を予防するための（「予防ワクチン接種」）、または、進行中の疾患を処置するための免疫系を活性化させるための（「治療ワクチン接種」）、ワクチンとして使用され得る。本明細書中において調製されるとおりの抗原負荷樹状細胞は、生理学的緩衝液または他の注射可能な液体などの好適な担体とともにワクチンまたは医薬組成物としての使用のために製剤化され得る。ワクチンまたは医薬組成物は、免疫応答を引き出すのに満足な治療有効量で投与される。
【００７２】
本明細書中で使用されるとおりの用語「処置（treatment）」および「処置すること（treating）」は、一般的には、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味し、および、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のあらゆる処置をカバーし、これは以下を包含する：
（１）疾患または症状にかかりやすい可能性があるが未だそれを有すると診断されていない対象において、疾患または症状が起きることを予防すること；
（２）疾患の症状を阻害する、すなわちその発症を停止させること；または
（３）疾患の症状を緩和する、すなわち疾患または症状の退縮を起こさせること。
【００７３】
効果は、完全にもしくは部分的にその疾患または症状を予防するという観点から予防的であり得、および／または、疾患および／もしくは疾患に起因し得る悪影響の部分的なもしくは完全な安定化もしくは治癒という観点から治療的であり得る。加えて、ワクチンは、治癒的なセッティングにおいてその有効性を最大化させるために一次もしくは初期療法に加えて与えられる「アジュバント療法」として、または疾患の制御を最大限にしおよび疾患の再発を遅延させるために、初期療法に続く「維持」もしくは「地固め」療法として、使用されることができる。
【００７４】
本発明の文脈において、用語「がん」は、悪性腫瘍によって誘発されるあらゆる疾患を指す。本明細書中で使用される、用語「感染性疾患」は、病原性ウイルス、病原性細菌、真菌、原生動物、または多細胞寄生虫、を包含する病原性微生物因子から結果としてもたらされる、あらゆる臨床的に明白な疾患を指す。
【００７５】
樹状細胞ワクチンを製剤化するための方法は、当業者に知られている。投与のための好適な製剤は、抗酸化物質、緩衝剤、静菌薬を含有することができる水性等張滅菌注射溶媒、および、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質、および、懸濁剤を包含することができる水性および非水性の滅菌された懸濁液、可溶化剤、増粘剤、安定剤、防腐剤、免疫刺激物質、サイトカインおよびアジュバントを、包含することができる。
【００７６】
樹状細胞組成物／ワクチンは、注射（例として、皮下、皮内、静脈内、リンパ内、関節内、筋肉内、腹腔内）、持続注入によるもの、インプラント等々からの持続放出などの、しかしそれらに限定されない、様々な方法によって投与されることができる。ＤＣワクチンは、特定の間隔で投与されることができる。１つの態様において、ＤＣｓは、２〜４週間間隔で、とりわけ２週間間隔で、投与される。樹状細胞ワクチンは、生理的に許容し得る担体、緩衝液、希釈剤、アジュバント、免疫調節剤、等々、とともに投与されることができる。好ましくは、樹状細胞ワクチンは、それが投与される患者にとって自己由来であるか、または最大限にＨＬＡ適合している。
【００７７】
対象へ投与される細胞の用量は、所望の有益な治療反応を対象において経時的に達成するのに、またはがん細胞の成長を阻害するのに、または感染を阻害するのに有効であり、一方で良好な認容性プロファイル（最小毒性）を維持する、有効量である。これを成し遂げるのに十分適正な量は、「治療有効量」として定義される。用量は、生じる樹状細胞の生物学上および／または臨床上の活性、および任意に患者の状態により、決定されることになる。用量の大きさはまた、具体的な患者における具体的な細胞の投与に付随するあらゆる良くない副作用の存在、性質、および程度によっても決定される。
【００７８】
がん（例として、転移性メラノーマ、前立腺癌、等々）などの疾患の処置または予防において投与する細胞の有効量を決定することにおいて、医師（または治験責任医師）は、ワクチンに包含される標的に対する免疫応答を評価すること（すなわち、免疫モニタリング）を、測定可能パラメータ（標準もしくは免疫関連ＲＥＣＩＳＴ判定基準による放射線学的腫瘍量、腫瘍マーカー、循環腫瘍細胞、血漿循環腫瘍ＤＮＡまたはその他の疾患負荷もしくは疾患活性の代理マーカー）の臨床評価とともに行っていく必要がある。
【００７９】
生物学上および／または臨床上の効果の特定のレベルを達成するために投与するＤＣｓの好ましい用量についての根拠はないことが、当業者に周知である。同様に、明らかな用量規定毒性（ＤＬＴ）は観察されておらず、およびしたがって、最大耐量（ＭＴＤ）は観察されていない。最もごく一般的に投与される用量は、白血球アフェレーシスの１ラウンドから得られたＤＣｓの収量および所望の数のその後のワクチン接種によって決定づけられる。１つの態様において、用量は、ワクチン接種ラウンドあたり５〜１００×１０６ ＤＣｓの範囲内にあり、２〜８回、とりわけ２〜６回、さらにいうととりわけ２〜４回反復される。同様に、注射された細胞の数と毒性との間には関係がない。ＤＣワクチン接種での毒性は通常低く、およびむしろ投与のルート（静脈内ルートでは皮内ルートと比較するとより深刻な副作用）に結びついている。注射は、１、２または３週間の間隔で２、３、４、５または６回反復されてもよく、および、静脈内に、またはリンパ節付近で皮内もしくは皮下注射によって、またはリンパ節中へと直接注射されて、与えられるべきである。ブースター注射は、例として１〜数か月、間を置いてから行われる。
【００８０】
本発明のＤＣｓまたは活性化したＴ細胞による処置のために、生物学的応答調節物質が任意に加えられる。例えば、細胞は任意に、アジュバント、またはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−αもしくはＩＬ−２などのサイトカインを投与される。
本明細書中に記載された特徴の全て（あらゆる付随する請求項、要約および図面を包含する）および／またはそのように開示されたあらゆる方法またはプロセスの全てのステップは、上記側面のいずれかと、いずれの組み合わせで組み合わせられてもよい（かかる特徴および／またはステップの少なくとも一部が相互排他的である組み合わせを除く）。
【００８１】
本発明を、以下の図面、表および例によりさらに記載するが、これらは請求項において定義されるとおりの保護の範囲を限定することは意図しない。例において記載される方法および実験は、匿名ドナーのバフィーコートを出発材料として使用した前臨床開発に主に関する。
【００８２】
例
材料および方法
単球由来の樹状細胞の培養
バフィーコートを、地元の輸血センターから得て、および、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を、Ficoll-paque密度勾配遠心分離（GE Healthcare Life Science, Chicago, Illinois, USA）により単離した。ヒト抗ＣＤ１４免疫磁気マイクロビーズ(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）を製造者のプロトコルに従って使用して、単球を免疫磁気的（immunomagnetically）に精製した。フローサイトメトリーによって分析されたとおり、＞９０％の純度が一貫して得られた（データは図示せず）。
【００８３】
単球が枯渇した画分（末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ））を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Sigma-Aldrich, Missouri, USA）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（Gibco by Life Technologies, California, USA）および１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Sigma-Aldrich, Missouri, USA）を伴うRPMI-GlutaMAX培地（Invitrogen by Life Technologies, California, USA）中で冷凍した。
【００８４】
我々の加速された（すなわち、４日間の）ＤＣ培養プロトコルのために、単球を、３０ｍｌ ＧＭＰ細胞分化バッグ（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）中で、１０００Ｕ／ｍｌ 医薬グレード顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（Leukine (Berlex), Bayer HealthCare Pharmaceuticals, New Jersey, USA）、１０００Ｕ／ｍｌ ＧＭＰ認定された組換えヒトインターロイキン−４（ｈｕＩＬ−４）（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）および１００Ｕ／ｍｌ Ｐ／Ｓ（Gibco by Life Technologies, California, USA）を含有する血清フリーＧＭＰ CellGro（ＣＧ）培地（CellGenix GmBH, Freiburg, Germany）中で２×１０６ 細胞／ｍｌの密度で培養した。３日目に、２．５μｇ／ｍｌ 合成ＭＰＬＡ（Invivogen, California, USA）および１０００Ｕ／ｍｌ 医薬グレードＩＦＮ−γ（Immukine, Boehringer Ingelheim BV, Ingelheim, Germany）を、もう２４ｈ、培養培地に加えた。成熟ＤＣｓ（ｍＤＣｓ）を４日目に採取した。
【００８５】
「古典的な」（８日間の）プロトコルのために、単球をポリスチレン培養フラスコ（Nunc by Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA）中で、より低い濃度の組換えｈｕＩＬ−４（２５０Ｕ／ｍｌ；Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）、および１％のプールされたヒトＡＢ血清（ｈｕＡＢ血清）（Sigma-Aldrich, Missouri, USA）の追加を除いて同じ完全培地中で、１×１０６の密度で培養した。３日目または４日目に、新鮮なＧＭ−ＣＳＦ−およびＩＬ−４−含有培養培地を加えた。６日目に、２０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトＴＮＦ−α（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）および２．５μｇ／ｍｌ 医薬グレードＰＧＥ２（Prostin E2, Pfizer, New York, USA）を、追加の４８ｈ、培養培地に加えた。成熟ＤＣｓを８日目に採取した。
【００８６】
ＤＣ表現型分析
表面染色のために、細胞を最初に洗浄し、および次いでリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Invitrogen by Life Technologies, California, USA）中に再懸濁させることを、ＦｃＲ−ブロッキング試薬（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）および死細胞を染色するための固定可能な生存判別色素eFluor 506（eBioscience by Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA）の組み合わせを用いた４℃での２０分間のインキュベーションに先立って行った。
【００８７】
次に、細胞を、０．５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；０．２５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；および０．０５％ ＮａＮ３（全てSigma-Aldrich, Missouri, USAからのもの）を添加したＰＢＳ（Invitrogen by Life Technologies, California, USA）からなるＦＡＣＳ緩衝液で洗浄することを、４℃で３０分間表面抗体（Ａｂｓ）を加える前に行った。以下の蛍光色素コンジュゲートモノクローナルＡｂｓを使用した：抗ＣＤ４０ ＦＩＴＣ；抗ＨＬＡ−ＡＢＣ ＦＩＴＣ；抗ＣＣＲ７ ＡＰＣ；抗ＣＤ１１ｃ Alexa Fluor 700；抗ＨＬＡ−ＤＲ ＡＰＣ−Ｃｙ７（eBioscience by Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA）；抗ＨＬＡ−Ａ２ ＦＩＴＣ；抗ＤＮＧＲ−１ ＰＥ；抗ＣＤ８６ ＰＥ Texas Red；抗ＣＤ８３ ＰＥ−Ｃｙ７；抗ＰＤ−Ｌ１ Pacific Blue（BD Biosciences, New Jersey, USA）；抗ＣＤ７０ ＰＥ；および抗ＣＤ１４ Pacific Blue（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）。
【００８８】
試料をLSR Fortessa分析フローサイトメーター（BD Biosciences, New Jersey, USA）上で取得し、およびFlowJoソフトウェア（バージョン9.9.4；BD Biosciences, New Jersey, USA）を使用して分析した。表現型および成熟マーカー発現レベルは、相対的蛍光強度（ＭＦＩｓ）（正の蛍光シグナルの幾何平均の、バックグラウンド蛍光に対する比率、生ＣＤ１１ｃ高 ＨＬＡ−ＤＲ高 ＤＣｓの範囲内でゲーティングしたもの）として示される。
【００８９】
Luminexアッセイ
凍結保存された４日の（4-day）および８日の（8-day）単球由来のＤＣｓ（ｍｏＤＣｓ）のアリコートを解凍し、および、１００Ｕ／ｍｌ Ｐ／Ｓ（Gibco by Life Technologies, California, USA）を添加した血清・サイトカインフリーＣＧ培地（CellGenix GmBH, Freiburg, Germany）中で２４ｈの間培養した。ＤＣ培養上清を収集し、および、以下のヒトサイトカインおよびケモカインを包含するようにカスタマイズされたLuminexアッセイ（R&D Systems, Minneapolis, USA）を使用して分析した：ＩＬ−１２ｐ７０；ＩＦＮ−γ；ＩＬ−１０；ＣＣＬ３；ＣＣＬ４；ＣＣＬ５；ＣＸＣＬ９；ＣＸＣＬ１０；ＣＣＬ１７；ＣＣＬ２０；およびＣＸＣＬ１２。Luminexアッセイを、Bio-Plex（Bio-Rad, California, USA）の読取り装置上で分析した。
【００９０】
ＤＣのｍＲＮＡエレクトロポレーション
４日目または８日目にそれぞれ採取後、ＤＣｓをエレクトロポレーションし、およびその後、３．５％ ヒト血清アルブミン（Sanquin, Amsterdam, The Netherlands）；６．２５％ ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）（Grifols, Barcelona, Spain）；および６．２５％ ＤＭＳＯ（Sigma-Aldrich, Missouri, USA）で富化されたPlasma-Lyte A（Baxter, Illinois, USA）中で凍結保存した。ｅＧＦＰ ｍＲＮＡは、ブリュッセル自由大学、K. Thielemans教授のLaboratory of Molecular and Cellular Therapy（ＬＭＣＴ）からご厚意で提供されたｐＳＴ１−ｅＧＦＰ２プラスミドを起源とした。プラスミドは、最初にSapI制限酵素（New England Biolab, Massachusetts, USA）を使用して線状にし、その後、mMESSAGE mMACHINE T17 Ultraキット（Ambion by Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA）を使用してｍＲＮＡへとin vitro転写させた。
【００９１】
ＭＡＲＴ−１ ｍＲＮＡもまた、ＬＭＣＴによって寄付された。ＭＡＲＴ−１のオープンリーディングフレームを、Bonehill et al (2004)によって先行して記載されているとおり、リソソームタンパク質ＤＣ−ＬＡＭＰ１のＨＬＡクラスＩＩ標的配列に融合させた１μｇ ｍＲＮＡ／１０６ ＤＣｓの用量でヌクレアーゼフリー水（Applied Biosystems by Life Technologies, California, USA）中に溶解した３０μｌのｍＲＮＡを添加した１７０μｌの血清フリーＣＧ培地（CellGenix GmBH, Freiburg, Germany）中に４〜１６×１０６ ＤＣｓを再懸濁させ、および４ｍｍギャップキュベット（Bio-Rad, California, USA）へと移した。
【００９２】
以下のパラメータでGene Pulser Xcell Electroporation System（Bio-Rad, California, USA）を使用して、指数波パルスを使用したエレクトロポレーションを行った：容量１５０μＦ；電圧３００Ｖ；抵抗∞Ω。ＥＰの直後に、ＤＣｓを３７℃および５％ＣＯ２で４時間、１０００Ｕ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ（Leukine (Berlex), Bayer HealthCare Pharmaceuticals, New Jersey, USA）、組換えｈｕＩＬ−４（ＤＣ型に依存して１０００Ｕ／ｍｌまたは２５０Ｕ／ｍｌ；Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）および１００Ｕ／ｍｌ Ｐ／Ｓ（Gibco by Technologies, California, USA）を添加したＣＧ培地（CellGenix GmBH, Freiburg, Germany）中で超低接着プレート(Corning, New York, USA）上に、回復のために放置した。ＭＯＣＫ−ＥＰ ＤＣｓを、ｍＲＮＡなしのＣＧ培地（CellGenix GmBH, Freiburg, Germany）中で同じパルスセッティングでエレクトロポレーションした。矩形波パルスエレクトロポレーション（ＳＱＷ−ＥＰ）を使用したエレクトロポレーションを、以下のパラメータで同じエレクトロポレーションシステムを使用して行った：電圧５００Ｖ；０．５ｍｓ；２００μｌ；１パルス；５×１０６または５０×１０６ ＤＣｓ／キュベット。
【００９３】
同種異系Ｔヘルパー細胞分極アッセイ
エレクトロポレーションされおよび凍結保存されたＤＣｓを解凍し、３７℃および５％ＣＯ２で少なくとも１時間、１０％ ｈｕＡＢ血清（Invitrogen by Life Technologies, California, USA）および１００Ｕ／ｍｌ Ｐ／Ｓ（Gibco by Life Technologies, California, USA）を添加した温RPMI-GlutaMAX培地（Invitrogen by Life Technologies, California, USA）中で回復させ、そして刺激物質として使用した。応答物質として、ＣＤ４５ＲＯ陰性Ｔヘルパー細胞を同種異系ＰＢＬｓから、AutoMACSセルセパレータ上のナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞単離キットII（両方ともMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germanyからのもの）を使用して富化させた。ＤＣｓとＴ細胞とを、１０％ ｈｕＡＢ血清（Sigma-Aldrich, Missouri, USA）および１００Ｕ／ｍｌ Ｐ／Ｓ（Gibco by Life Technologies, California, USA）を添加したRPMI-GlutaMAX培地（Invitrogen by Life Technologies, California, USA）中で、１：５のＤＣ：Ｔ細胞比率で１４日間共培養した。１０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトＩＬ−２（R&D Systems, Minneapolis, USA）を、共培養の７日目に加え、および、ＤＣｓを含有しない対照条件については追加で３日目および１０日目に加えた。
【００９４】
同種異系共培養の最後に、５０ｎｇ／ｍｌ ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ）；１μｇ／ｍｌ イオノマイシン（iono）および１０μｇ／ｍｌ ブレフェルジン（ＢＦＡ）（全てSigma-Aldrich, Missouri, USAからのもの）を３７℃および５％ＣＯ２で５時間加え、その後に細胞をフローサイトメトリー染色のために採取した。表面Ｔ細胞マーカーを検出する抗体は、抗ＣＤ３ ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５；抗ＣＤ８ａ ＰＥ−Ｃｙ７（BioLegend, California, USA）；抗ＣＤ４ ＡＰＣ−Ｃｙ７（BD Biosciences, New Jersey, USA）；および抗ＣＤ４５ＲＯ ＰＥ−Ｃｙ７（eBioscience by Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA）を包含した。細胞内（ＩＣ）染色のために、細胞を表面染色後にＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、および、製造者のプロトコルに従ってCytofix/Cytoperm（BD Biosciences, New Jersey, USA）で処置することを、以下のＡｂｓを用いた４℃での３０分間のインキュベーションに先立って行った：抗ＩＬ−４ ＦＩＴＣ（BD Biosciences, New Jersey, USA）；抗ＩＬ−１０ ＰＥ；抗ＩＬ−１７Ａ ＡＰＣ；および抗ＩＦＮ−γ Pacific Blue（eBioscience by Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA）。
【００９５】
抗原特異的な自己ＣＴＬｓの増殖の増大
ＨＬＡ−Ａ２＋ドナーからのバフィーコートを、４日の（4-day）ＭＰＬＡ／ＩＦＮ−γで成熟させられたＤＣｓを生成するために使用し、これらを、採取後に４時間冷凍するか（すなわち、非ＥＰ ＤＣｓ）、または、最初に凍結保存の前にビヒクル（すなわち、ｅＧＦＰ ｍＲＮＡ−ＥＰ ＤＣｓ）もしくは抗原ＭＡＲＴ−１ ｍＲＮＡ（すなわち、ＭＡＲＴ−１ ｍＲＮＡ−ＥＰ ＤＣｓ）のいずれかでエレクトロポレーションするか、のいずれかを行った。ＤＣ培養および操作の詳細については、我々は上の材料および方法のセクションの「単球由来の樹状細胞培養」および「ＤＣのｍＲＮＡエレクトロポレーション」に言及する。
【００９６】
解凍後、非ＥＰ ＤＣｓ；ｅＧＦＰ ｍＲＮＡ−ＥＰ ＤＣｓ；およびＭＡＲＴ−１ ｍＲＮＡ−ＥＰ ＤＣｓを、３７℃および５％ＣＯ２で少なくとも１時間、１０％ ｈｕＡＢ血清（Invitrogen by Life Technologies, California, USA）および１００Ｕ／ｍｌ Ｐ／Ｓ（Gibco by Life Technologies, California, USA）を添加したRPMI-GlutaMAX培地（Invitrogen by Life Technologies, California, USA）中で回復させた。のちに、非ＥＰ ＤＣｓの半分を、１０μＭの、ＭＡＲＴ−１（ＡＡＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号１）（Genscript, New Jersey, USA）からの最適化された、免疫優勢の、ＨＬＡ−Ａ＊２０１拘束性ペプチドを用いてパルスし（Valmori D. et al. 1998）、これは、陽性対照条件としての役割を果たした。非ＥＰ ＤＣｓの半分は、ビヒクルを用いてのみパルスし、および陰性対照条件としての役割を果たした（ＭＯＣＫでパルスされたＤＣｓ）。インキュベーション後、３７℃および５％ＣＯ２で少なくとも１時間、上記と同じ培養培地を使用して、結合されていないペプチドを洗い流した。
【００９７】
ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、凍結保存された自己ＣＤ１４陰性画分から、ポジティブ免疫磁気セレクションキット（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）を使用して精製した。ＤＣｓとＴ細胞とを、１０％ ｈｕＡＢ血清（Invitrogen by Life Technologies, California, USA）および１００Ｕ／ｍｌ Ｐ／Ｓ（Gibco by Life Technologies, California, USA）を添加したRPMI-GlutaMAX培地（Invitrogen by Life Technologies, California, USA）中で、１：１０の比率で１４日間共培養した。２０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトＩＬ−２（R&D Systems, Minneapolis, USA）を３日目および１０日目に加えた。ＤＣｓなしの自己ＣＤ８＋ Ｔ細胞を伴う培養ウェルが、追加の対照として包含された。
【００９８】
共培養の７日目に、自己ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、対応するＤＣｓ（すなわち、ＭＯＣＫでパルスされたＤＣｓ、ｅＧＦＰ ｍＲＮＡ−ＥＰ ＤＣｓ、ＭＡＲＴ−１ ｍＲＮＡ ＤＣｓ、およびＭＡＲＴ−１ペプチドでパルスされたＤＣｓ）で再刺激した。共培養の最後に、細胞を上記のとおりＰＭＡ／iono／brefAとともに５時間インキュベートし、および、ＰＥ−コンジュゲートＡ＊０２：０１／ヒトＭＡＲＴ−１ ＭＨＣ四量体（Sanquin, Amsterdam, The Netherlands）を使用した表面染色および以下のマーカーを使用した細胞内染色のために採取した：抗ＩＦＮ−γ ＦＩＴＣ（BioLegend, California, USA）；および抗グランザイムＢ Pacific Blue（BD Biosciences, New Jersey, USA）。
【００９９】
ＤＣに誘導された抗原特異的細胞溶解活性の評価
エフェクターＴ細胞を、上記のとおりの自己ＤＣ：Ｔ細胞共培養設定の１４日目に採取した。標的細胞は、上記のとおりのＭＡＲＴ−１からの同じペプチド（Genscript, New Jersey, USA）または対照としての配列ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（AnaSpec, California, USA；配列番号２）を持つインフルエンザマトリックスタンパク質からの無関係のＡ２拘束性ペプチド（いずれも１０μｇ／ｍｌで使用）で負荷されたＴＡＰ２欠損Ｔ２細胞からなる。Ｔ２細胞を３時間パルスし、および、結合されていないペプチドを除去するために徹底的に洗浄した。共培養を、モネンシン（Golgistop, BD Biosciences, New Jersey, USA）および抗ＣＤ１０７ａ Pacific Blue Ab（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）の存在下において、１０：１のＥ：Ｔ比で１４時間に設定した。共培養の最後に、細胞を表面抗ＣＤ３、抗ＣＤ８および抗ＣＤ１３７（eBioscience by Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA）で染色した。
【０１００】
統計
統計分析は、GraphPad Prism（バージョン７．０２、GraphPad Software, California, USA）を使用して行った。正規分布を、最初に、ダゴスティーノ・ピアソンのオムニバス正規性検定（D’Agostino-Pearson omnibus normality test）を使用して検定した。正規分布したデータを、２群についての独立（unpaired）もしくは対応のある（paired）ｔ検定、または３以上の群についてのテューキーの多重比較検定（Tukey’s multiple comparisons testing）と組み合わせたＡＮＯＶＡ検定を用いて分析した。非正規分布であるデータについては、ノンパラメトリック検定、すなわち、独立（unpaired）データセットについてはマン・ホイットニー検定（Mann-Witney test）、および対応のある（paired）データセットについてはウィルコクソンの対応した符号付き順位検定（Wilcoxon matched-pairs signed rank test）を２群について、使用した。２よりも多い群については、ノンパラメトリックなクラスカル・ワリス検定（Kruskal-Wallis test）をダンの多重比較検定（Dunn’s multiple comparisons testing）と組み合わせて使用した。統計的有意性のレベルは、以下のアスタリスク符号で記号化した：ｐ値０．０１〜０．０５（＊）、ｐ値０．００１〜０．０１（＊＊）、ｐ値＜０．００１（＊＊＊）およびｐ値＜０．０００１（＊＊＊＊）。
【０１０１】
結果
ＴＬＲ４リガンドとＩＦＮ−γを足し合わせて用いた成熟が関与する短縮された培養プロトコルによって高収量の完全に分化した成熟した樹状細胞を得ることができる
大幅に短縮された単球培養継続時間を、確立された１型分極因子の組み合わせを使用した成熟と一緒に、組み合わせることによってＤＣｓを生成することの実現可能性を、バフィーコートから開始する拡張可能な一連の（extensive series of）小スケール培養を使用して査定した。細胞培養培地、サイトカインおよび閉鎖系容器を、我々のＧＭＰ生産環境への直接的な橋渡しのために選択した。
【０１０２】
オペレーター介入の必要性を低減させるために、我々は、標準的な８日間のＤＣ培養継続時間を４日間の合計期間にまでカットすることを狙った。これは、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４を添加したＧＭＰ準拠の血清フリー培地中の３日間培養と、これに続く採取前の追加の２４時間のＭＰＬＡとＩＦＮ−γとの組み合わせへの曝露からなる。このプロトコルは、９４．６％の純度の中央値 [95% CI: 93.7 - 96.9]を伴うＣＤ１１ｃ高 ＨＬＡ−ＤＲ高 単核細胞集団を結果としてもたらし（図１Ａ）、光学顕微鏡により特徴的な樹状細胞形態を示す（図１Ｂ）。採取の際、単球のＤＣへの変換率の中央値は41.5% [95% CI: 30.7 - 51.7]であり、95.7% [95% CI: 92.7 - 96.4]の生存率中央値（フローサイトメトリーによる）を伴った（図１Ｃ）。
【０１０３】
細胞の表現型は、完全に分化した成熟したＤＣｓのそれと一貫しており、単球マーカーＣＤ１４の著しい下方制御を伴い、これに並行してＣＤ８３の上方制御があり、ならびに、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ抗原提示分子の高いレベルとの組み合わせで、Ｔ細胞共刺激マーカーＣＤ４０、ＣＤ７０、およびＣＤ８６の高い表面発現があった。さらにまた、分子ＤＮＧＲ−１を高いレベルで検出することができたという観察結果は、外来性細胞結合抗原を捕捉しおよび交差提示する潜在性を提案する。成熟ＤＣｓ上でＣＣＲ７が誘導されたところ、これは二次リンパ器官へ遊走する能力を示唆する。ｍｏＤＣｓの大域的な活性化状態の反映として、Ｔ細胞チェックポイント分子ＰＤ−Ｌ１もまた上方制御された（図１Ｄ）。
【０１０４】
４日間ｍｏＤＣ分化プロトコルを、確立された「古典的な」臨床グレード８日間ＤＣ培養と、ワクチン生産に関係する複数の主要なパラメータの観点から比較した。８日（8-day）ｍｏＤＣｓを、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４添加培養培地中で生成させ、および、ＴＮＦ−αおよびＰＧＥ２を加えたことによって最後の２日間成熟させた。最初にJonuleit et al (1997)によって記載された元々の成熟カクテルはＴＮＦ−α、ＰＧＥ２、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６からなるものであったものの、我々およびその他は、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６の欠如が、かくして生成されたＤＣｓの生存率、分化および成熟度への有害作用を有さず（図９）、またＤＣの機能性にも負の影響を有しないということを観察している（Van Driessche et al. 2009）。
【０１０５】
最初に、我々は一貫して、４日（4-day）ｍｏＤＣｓが、採取の際の８日（8-day）ＤＣｓよりも有意に生存性が高く（ｐ値 ０．００１０）、58% [95% CI: 45.1 - 69.1]と比較して96.3% [95% CI: 92.7 - 98]の生存率中央値（フローサイトメトリー）を伴ったことを観察した。４日（4-day）ｍｏＤＣｓは、最も高い単球のＤＣへの変換率の中央値（46.9% [95% CI: 27.2 - 63.2] vs 26.8% [95% CI: 14.1 - 36.2]）もまた生じさせ、統計的有意に達した（ｐ値 ０．０１９５）（図２Ａ）。
【０１０６】
次に、我々は、採取の際の表現型のプロファイルにおける差異を見ていった。４日（4-day）ｍｏＤＣｓは、標準的な８日（8-day）ｍｏＤＣｓよりも有意に高いＣＤ４０、ＣＤ７０およびＨＬＡ−ＡＢＣのレベル（ＭＦＩ）を見せた。予想外なことに、ＰＧＥ２への曝露がなかったにもかかわらず、ＣＣＲ７もまた、ＭＰＬＡ／ＩＦＮ−γで成熟させられた４日（4-day）ｍｏＤＣｓ上でより高いレベルで発現した。それに対して、ＣＤ８６の発現は、８日（8-day）ｍｏＤＣｓにおいてより高い（図２Ｂおよび表１）。ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＤＲおよびＤＮＧＲ−１は、両方のＤＣ培養プロトコルにわたって、統計的有意差を示さなかった。予想外なことに、ＰＤ−Ｌ１発現は、標準的な８日（8-day）のものにおいては４日（4-day）ｍｏＤＣｓと比較して一貫してより高く（平均して４倍）、また、凍結保存されたＤＣアリコートの解凍後にさらに増加さえした（図１０）。
【０１０７】
【表１】
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【０１０８】
これらのデータから、我々は、単球培養継続時間を半分に低減させることが、活性化因子ＭＰＬＡおよびＩＦＮ−γとの組み合わせで、より高い変換収率、より高い細胞生存率を伴って、完全に分化した成熟したＤＣｓを生じさせ、かつ、共刺激分子発現レベルへの有害な影響がない、ということを結論付ける。
【０１０９】
我々の知る限りでは、たった１つの報告が、たった２４〜３６時間の単球からＤＣへの分化期間を伴う加速されたＤＣ分化プロトコルにおける成熟カクテルとしてのＭＰＬＡ ＋ ＩＦＮ−γの統合について記載している（Massa et al. 2013）。しかしながら、ＤＣワクチンの作用の帰結は、該代替ＤＣｓについて評価されていなかった。比較として、単球由来の樹状細胞を、本明細書中で前に記載したプロトコルに従うか（「MIDRIX ＤＣｓ」）、またはMassa et al.によって記載されたalt-2プロトコルに従う（「Massa ＤＣｓ」）かのいずれかで生成した。ＣＤ１４＋単球を、本明細書中で前に記載したとおりバフィーコートから単離した。ＤＣｓを、それぞれの時点で採取し、およびｅＧＦＰコードｍＲＮＡでエレクトロポレーションした。
【０１１０】
データは６の異なるドナーに由来し、および以下の側面が評価された：
（Ａ）両方のプロトコルで得られた生ＣＤ１１ｃ＋ ＨＬＡ−ＤＲ＋ 樹状細胞の採取の際の生存率および絶対的な細胞収量；
（Ｂ）単球マーカーＣＤ１４ vs ＤＣ分化マーカーＣＤ８３の発現；
（Ｃ）ＤＣ成熟マーカーＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８６およびＣＣＲ７の発現；
（Ｄ）Ｔ細胞共阻害受容体ＰＤ−Ｌ１の発現；
（Ｅ）エレクトロポレーションの４時間後に測定したときの、翻訳されたタンパク質のレベル（ｅＧＦＰシグナルの相対的平均蛍光強度）ならびにエレクトロポレーションされたｅＧＦＰ−ｍＲＮＡの首尾よく成功した翻訳を伴う細胞の割合（ｅＧＦＰ＋ ＤＣｓの百分率）として表された、エレクトロポレーション効率。
【０１１１】
図１３において見られるとおり、単球のＤＣｓへの満足な分化を達成するためには、ならびにＴ細胞刺激能力と相関する成熟の満足な表現型特性（phenotypical features）を生成するためには、２４〜３６時間の分化ステップの継続時間は十分ではない。重要なことに、生存ＤＣｓの絶対収量は、Massa et al.によって記載されたプロトコルを使用すると本発明の方法と比較して有意に低く、これはエレクトロポレーションおよび凍結保存でこれらの細胞さらにを処理する可能性を有意に損なうと見受けられており、およびかくしてＤＣワクチンに対する影響を有する。「Massa ＤＣｓ」は、完全長タンパク質をコードするｍＲＮＡでのエレクトロポレーションをより起こしにくく、一方、本発明に従い生成されたＤＣｓは高いエレクトロポレーション効率を示した。
【０１１２】
加えて、「Massa ＤＣｓ」は、単球マーカーＣＤ１４のより少ない下方制御、ＤＣ分化マーカーＣＤ８３のより少ない上方制御、ＤＣ成熟／Ｔ細胞共刺激受容体ＣＤ４０、ＣＤ７０およびＣＤ８６のより低いレベルを見せる。リンパ組織のＴ細胞ゾーン中への遊走に要求されるＣＣＲ７のレベルもまた、Ｄ１ ＤＣｓについてはより上方制御が少ない。さらにいうと、ＰＤ−Ｌ１レベルは、「Massa ＤＣｓ」上でより高い発現の傾向を示した
【０１１３】
短期培養されたＤＣｓに、完全に成熟した表現型および新たな（de novo）Ｔヘルパー１分極化を誘導する能力を付与するにはＭＰＬＡおよびＩＦＮ−γの両方が一緒に必要である
我々は、次に、４日間培養されたｍｏＤＣｓの、ＭＰＬＡ、ＩＦＮ−γまたは組み合わせの表現型成熟状態への、ならびにＴヘルパー分極化能力の面から見た機能的な影響への相対的な寄与を分けて分析した。
我々は、両方の成熟刺激が、Ｔ細胞共刺激分子ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８６の、ならびにＣＤ８３およびＣＣＲ７の表面発現レベルを最大化させるのに要求されるということを見出した（図３）。この効果は、ＨＬＡ−ＤＲまたはＤＮＧＲ−１の発現に関しては観察されず、後者は未熟なＤＣｓに対して相対的に変わらないままであった。注目されるのは、ｍｏＤＣｓ上のＰＤ−Ｌ１誘導が、ＩＦＮ−γ曝露よりもむしろ専らＭＰＬＡによって駆り立てられたという観察結果である。
【０１１４】
機能レベル上で、ナイーブ同種異系ＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌の最大の誘導は、ＭＰＬＡおよびＩＦＮ−γの両方へのＤＣｓの事前の曝露によってのみ達成された。ナイーブＴヘルパー細胞において、ＩＬ−１０生産の限られた量が未熟なＤＣｓによって誘導され、およびこれは、事前のＩＦＮ−γ曝露に関係なく、ＭＰＬＡで事前曝露されたＤＣｓの存在下でさらに抑制された。Ｔヘルパー細胞ＩＬ−４生産は、ＭＰＬＡ／ＩＦＮ−γで成熟させられたＤＣの存在下で小さい増加を示したＩＬ−１７もそうであったように、低いレベルでしか誘導されなかった（図４）。
かくして、短期培養されたｍｏＤＣｓの、ＭＰＬＡおよびＩＦＮ−γの両方一緒での曝露は、完全に成熟した表現型を得ることおよびロバストな新たな（de novo）１型分極Ｔヘルパー細胞応答を誘導する能力をこれらの細胞に授けることに、必要である。
【０１１５】
短期培養されたＤＣｓはエレクトロポレーションへのより優れた回復力を、高いｍＲＮＡ翻訳効率と一緒に発揮する
表現型成熟および１型免疫分極能に加えて、臨床業務において実施可能にするためには、満足なＤＣ量がエレクトロポレーションおよび凍結保存のストレスに続いて回収されるべきである。
我々は最初に、エレクトロポレーションされた抗原コードｍＲＮＡに由来するタンパク質抗原を首尾よくかつ安定して発現させるための、ＭＰＬＡ／ＩＦＮ−γで成熟させられた短期培養されたＤＣｓの能力を評価した。エレクトロポレーション効率についてのマーカーとしてｅＧＦＰコードｍＲＮＡを使用して、エレクトロポレーション４時間後／凍結保存前、細胞解凍直後、およびサイトカインフリー培地中でのさらなるインキュベーションに続く細胞解凍２４時間後の、ｅＧＦＰ発現を見ていった。
【０１１６】
指数パルスによってエレクトロポレーションされたｅＧＦＰ陽性ＤＣｓの百分率の中央値は、凍結保存前の64.8 [95% CI: 55.2 - 87.7]から、解凍直後に80.2 [95% CI: 73.1 - 87.7]まで進化し、および続く２４時間の期間においては依然として安定であり（86.3 [95% CI: 75.2 - 86.4）、その期間にわたって発現強度（ＭＦＩ）に有意な変化はなかった（図５Ａ、Ｂ）。
【０１１７】
４日（4-day）ｍｏＤＣｓにおいて、指数パルスエレクトロポレーションは、生存率（トリパンブルー）の平均１７．３％の減少に至った。エレクトロポレーションに誘導された正味の細胞喪失との組み合わせで、これは百分率の中央値でいう生ＤＣ回収率51.4% [95% CI: 36 - 67%]（エレクトロポレーション後 vs 前の、回収された生細胞）に転化した（図５Ｃ）。別々の一連のドナーを使用して、我々は、エレクトロポレーションに対する回復力の観点から４日（4-day）ＭＰＬＡ／ＩＦＮ−γ ｍｏＤＣｓを標準的な８日（8-day）ｍｏＤＣｓと比較した。我々は、４日（4-day）ＤＣｓが、ＥＰ後の８日（8-day）ＤＣｓよりも有意に生存性が高く（トリパンブルー）、67.3% [95% CI: 18.2 - 93.5] vs 16.5% [95% CI: 2.8 - 57.8]の生存率中央値を伴ったことを観察した。８日（8-day）ｍｏＤＣｓはまた、ｅＧＦＰ ｍＲＮＡ ＥＰ後の正味の細胞喪失も起こしやすく、24.6% [95% CI: 3.7 - 47.5]の平均生細胞回収率を伴い、４日（4-day）ｍｏＤＣｓでの41.5% [95% CI: 12.8 - 83.8]と比較される（図５Ｄ）。
【０１１８】
さらなる試験において、我々は矩形波パルスエレクトロポレーション後の成果を評価した。サイトカイン濃度の範囲にわたって生産されたＤＣｓを使用した小スケールのランを使用して、我々は、矩形波パルスを使用したエレクトロポレーション後および凍結保存後の細胞生存率が、指数パルスプログラムと比較すると一貫してより高かったということを見出した（図１１）。
【０１１９】
矩形波パルスのさらなる評価を、ＧＭＰ環境におけるフルスケールのＤＣ生産ラウンドについて行った。矩形波パルスを使用してエレクトロポレーションされたＤＣｓによるｅＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析は、指数パルスと比較して、％ｅＧＦＰ陽性細胞の観点で劣っていなかった（代表的なデータは図１２Ａに示される）。矩形波パルスによるエレクトロポレーションは、解凍直後のＤＣ回収＞凍結保存されたＤＣｓの８０％、これとともに＞７５％の生存率を、結果としてもたらした（図１２Ｂ）。
矩形波パルスエレクトロポレーションの後で、肉眼で見える細胞集合の形成は観察されなかったところ、これはさらなる細胞取り扱いを大幅に円滑化し、および全体的な細胞回収を改善する（結果は図示せず）。
【０１２０】
エレクトロポレーションおよび凍結保存は、１型分極Ｔ細胞応答を選択的に促進させる短期培養されたＤＣｓの能力を損なわない
エレクトロポレーションおよび凍結保存のストレスに続いても無傷のまま維持されるべきである主要なＤＣの性質は、患者へ投与されたときに１型分極かつ細胞溶解性のＴ細胞を選択的に動員する潜在力である。この機能性の評価を提供するために、我々は、エレクトロポレーションされおよび凍結保存された４日（4-day）ｍｏＤＣｓ vs 標準的な８日（8-day）ＤＣｓの、サイトカインフリー培地中での２４時間のインキュベーション期間に続くサイトカインおよびケモカインセクレトームを評価した（図６Ａ）。我々は、４日（4-day）ｍｏＤＣｓが、依然として生理活性ＩＬ−１２ならびにＩＦＮ−γを分泌することを可能としたということ、一方、８日（8-day）ｍｏＤＣｓによるこれらのサイトカインの生産は、検出限界未満であったということを見出した。両方のＤＣ型の間でＩＬ−１０生産の差異は観察されなかった。
【０１２１】
より印象的なことに、我々は、１型分極Ｔヘルパー細胞、細胞溶解性Ｔ細胞およびＮＫ細胞を誘引することに関与するケモカイン（Colantonio et al. 2002）の高い量を、ＭＰＬＡ／ＩＦＮ−で成熟させられた４日（4-day）ｍｏＤＣｓのみが生産したことを、標準的な８日（8-day）ｍｏＤＣｓからは検出可能な分泌がないこととともに見出した。これは、ＣＸＣＲ３リガンドＣＸＣＬ９（ＭＩＧ３０）およびＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）（Groom et al. 2011）、ならびにＣＣＲ５リガンドＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１β）およびＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）（Samson et al. 1997）の高いレベルを誘導する。ＣＸＣＲ３リガンドＣＸＣＬ１１の分泌（Groom et al. 2011）は、検出限界未満であった。それに対して、Ｔ−ｒｅｇ−およびＴｈ２−動員ケモカインＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）の分泌（Yoshie et al. 2015）は、標準的な８日（8-day）ｍｏＤＣｓで５倍高かった。４日（4-day）ｍｏＤＣｓによるより高いＴｈ１７−およびＴ−ｒｅｇ−誘引ケモカインＣＣＬ２０（Yamazaki et al. 2008）の放出の傾向があり、一方、Ｔ−ｒｅｇ−誘引ＣＸＣＲ４リガンドＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１α）の生産（Colantonio et al. 2002）は、両方のＤＣ培養プロトコルの間で差がなかった（データは図示せず）。
【０１２２】
我々は、エレクトロポレーションおよび凍結保存が、新たな（de novo）Ｔヘルパー１分極化応答を誘導するための４日（4-day）ｍｏＤＣｓの能力を左右するかどうかもまた調査した（図６Ｃ）。同種異系ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞と解凍された４日（4-day）ｍｏＤＣｓとの共培養は、採取したてのエレクトロポレーションされていない４日（4-day）ｍｏＤＣｓを用いて得られたものに匹敵する高いＩＦＮ−γ生産レベルを結果としてもたらした（図４）。ＩＬ−１０生産の誘導は、このセッティングにおいて極めて低く（図６Ｃ）、これは新鮮なＤＣｓを用いて得られた結果と一貫していた（図４）。
【０１２３】
短期培養されたＤＣｓは、細胞溶解活性を持つ腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を効率的にプライミングおよび増大させる
短期培養されたｍｏＤＣｓの、収量、表現型、エレクトロポレーション／凍結保存後の回収、および１型分極Ｔ細胞応答を促進する能力、の観点からの優位性を確立したところで、我々は、次に、エレクトロポレーションされた腫瘍抗原コードｍＲＮＡからの免疫原性エピトープを提示するこれらの細胞の能力を試験した。ここでもやはり、現実の臨床セッティングにおけるＤＣワクチンの実施を反映させるために、我々は全てのアッセイを、新鮮なｍＲＮＡ−ＥＰ ＤＣｓよりもむしろ凍結保存されたものを用いて行った。ＨＬＡ−Ａ２−陽性の健康な血液ドナーにおける四量体を使用してＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を検出する可能性を受けて、ＭＡＲＴ−１／Melan-Aをモデル腫瘍関連抗原として使用した。
【０１２４】
我々は ＭＡＲＴ−１−ｍＲＮＡ−ＥＰ ＤＣｓでの合計２回の週１回の刺激ラウンドが、無関係の抗原（ｅＧＦＰ）で負荷されたＤＣｓでの刺激と比較して、３０倍を超える抗原特異的な（四量体陽性の）ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増大を誘導するのに満足であったということを観察した（中央値0.43% [95% CI: 0.22 - 0.53] vs 13.2% [95% CI: 1.21 - 37.6]）。エレクトロポレーション後の生存率および回収率の観点から、４日（4-day）ｍｏＤＣｓがＭＡＲＴ−１ ｍＲＮＡまたはｅＧＦＰ ｍＲＮＡのいずれでエレクトロポレーションされたかでの差異は観察されなかった（データは図示せず）。ＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増大は、ＭＡＲＴ−１ペプチドでパルスされたＤＣｓ（陽性対照）で得られたのと同じだけの桁の規模であった（中央値 18.9% [95% CI: 5.75 - 28.8]）。これらの結果は、ＭＰＬＡ／ＩＦＮ−γで成熟させられた４日（4-day）ｍｏＤＣｓが、Ａｇ−特異的自己ＣＤ８＋ Ｔ細胞への効率的な提示のために、エレクトロポレーションされたＭＡＲＴ１コードｍＲＮＡから免疫原性エピトープを抽出することができたということを示唆する（図７Ａ〜Ｂ）。
【０１２５】
刺激されたＣＤ８＋ Ｔ細胞のエフェクター潜在性を評価するために、我々は、ＩＦＮ−γおよびグランザイムＢについてのＩＣ染色と四量体検出を組み合わせた。我々は、ＭＡＲＴ−１−ｍＲＮＡ−ＥＰの４日（4-day）ｍｏＤＣｓが、陰性対照条件（すなわち、ＭＯＣＫでパルスされたまたはｅＧＦＰ ｍＲＮＡ−ＥＰ−ＤＣｓでの刺激、またはＤＣｓなし）と比較して、ＩＦＮ−γおよびグランザイムＢ生産抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を最も多数誘導したことを見出した（図７Ｃ）。
【０１２６】
４日（4-day）ｍｏＤＣで刺激されたＣＤ８＋ Ｔ細胞の細胞溶解能をさらに評価するために、我々は、ＴＡＰ欠損のＨＬＡ−Ａ２＋ Ｔ２細胞を、Ａ２拘束性ＭＡＲＴ−１ペプチド vs 無関係の（インフルエンザ）ペプチドで受動負荷させて標的として使用した（実験セットアップは図８Ａに図示される）。以前に記載されたとおり、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ１３７／４−１ＢＢの、細胞溶解性脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａと一緒での二重発現を見ていくフローサイトメトリー分析を、標的エンゲージメントおよび殺活性を検出するために使用した（Bonehill et al. 2009）。我々は、２週間の間に、ＭＡＲＴ−１−ｍＲＮＡ負荷されかつＭＡＲＴ−１ペプチドでパルスされた４日（4-day）ｍｏＤＣｓで刺激されたＣＤ８＋ Ｔ細胞のみが、ＭＡＲＴ−１ペプチドで負荷されたＴ２細胞との接触に続いてＣＤ１３７／ＣＤ１０７ａを上方制御したことを観察した（図８Ｂにおける代表的な点プロット）。このシグナルはドナーのほとんどにおいて検出され、また、無関係の標的（インフルエンザペプチド負荷されたＴ２細胞）のエンゲージメントが細胞溶解性マーカー発現を誘導せず、ＭＯＣＫでパルスされたかまたはｅＧＦＰ−ｍＲＮＡエレクトロポレーションされたＤＣｓでのエフェクターＣＤ８＋ Ｔ細胞の事前の刺激もそうしなかったというように、特異的であった（図８Ｃ）。
【０１２７】
考察
我々の知る限りでは、これは、エレクトロポレーションにより導入された、ＲＮＡにコードされた腫瘍抗原の、効率的な提示と組み合わせた、強いＴｈ１分極能を持つ臨床グレードのＤＣｓの生産を可能にさせる加速されたin vitro細胞分化法を、初めて記載したものである。
【０１２８】
完全に成熟したＤＣｓを生産するための古典的な７〜８日間のin vitro培養を短縮することの実現可能性は、過去に他のグループによって記載されている。しばしば「高速ＤＣｓ（fast-DCs）」と名付けられる、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下での２４時間（Dauer et al. 2003; Kvistborg et al. 2009; Jarnjak-Jankovic et al. 2007）〜７２時間（Truxova et al. 2014）の単球からＤＣへの分化時間の後に、標準的な炎症性サイトカインカクテルＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＰＧＥ２またはＴＬＲリガンドのいずれかを使用した２４時間の成熟期間がこれに続いて（Truxova et al. 2014）得られる細胞は、成熟プロファイルおよび機能性の観点で、古典的な長期間ＤＣ培養と同等に機能を果たした。
【０１２９】
たった１つの報告が、加速されたＤＣ分化プロトコルにおける成熟カクテルとしてのＭＰＬＡ ＋ ＩＦＮ−γの統合を、２４〜３６時間の単球からＤＣへの分化期間の後の４つの異なる成熟戦略を使用した比較実験の一部として記載している（Massa et al. 2013）。古典的なＴＮＦ−α＋ＩＬ−１β＋ＩＬ−６＋ＰＧＥ２のカクテルまたは代替物のＴＮＦ−α＋ＩＬ−１β＋ＩＦＮ−α＋ＩＦＮ−γ＋ポリ（Ｉ：Ｃ）もしくはＴＮＦ−α＋ＩＬ−１β＋ＩＦＮ−γ＋ＣＬ０９７、を用いて成熟させられたＤＣｓと比較して、ＭＰＬＡ＋ＩＦＮ−γで成熟させられたＤＣｓは、共刺激分子発現の最も高いレベルを発現し、およびＩＬ−１２ｐ７０／ＩＬ−１０放出の最も良い比率を生成した。
【０１３０】
Ten Brinke et al (2007; 2010)によって行われた研究もまた、ＭＰＬＡ／ＩＦＮ−γの使用を、６〜７日間の培養時間ではあるが、１型分極の観点から記録した。本発明は、加速された培養プロトコルに適用されたときにも同じようにＭＰＬＡ／ＩＦＮ−γがＤＣｓの完全な成熟を駆り立てることができるということを実証する（図１Ｄ；２Ｂ）。加えて、我々は、両方の剤の組み合わせが、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ７０などの主要なＴ細胞共刺激分子の、ならびにリンパ節ホーミングケモカイン受容体ＣＣＲ７の、最大限の発現を誘導するために必要であることを実証する（図３）。
【０１３１】
これらのうち、ＣＤ４０およびＣＤ７０上方制御は、複雑な炎症性カクテルを用いて成熟させられた８日（8-day）ＤＣｓを使用して得られたものよりも一貫して高かった。両方の分子の満足なレベルは、抗腫瘍免疫応答において必須である：ＣＤ４０は、下流のＣＤ８＋ 細胞傷害性Ｔリンパ球の最適な刺激を可能にさせるＴヘルパー細胞−ＤＣ活性化を円滑化し、一方、ＣＤ７０は、Ｔ−ｒｅｇまたはＴｈ１７ Ｔ細胞分化よりもむしろＴｈ１を駆り立てることにおいて、およびＣＤ８＋ Ｔ細胞にエフェクターおよびメモリー特性を授けるための、基軸となる。したがって、ＣＤ４０／ＣＤ４０ＬおよびＣＤ７０／ＣＤ２７軸の潜在性に入り込むことは、臨床的ながんワクチン応用のためにＤＣ免疫原性を増加させるための戦略として首尾よく有効利用されている。
【０１３２】
我々が驚いたことには、Ｔ細胞共阻害受容体ＰＤ−Ｌ１のより低いレベルを、ＭＰＬＡ／ＩＦＮ−γで成熟させられたＤＣｓ上（vs ＴＮＦ−α／ＰＧＥ２ ＤＣｓ上）で検出した（図２Ｂ）。印象的なことに、採取の際のＰＤ−Ｌ１発現レベルの差異は、凍結保存／解凍後には（図１０）、すなわち、可能な限りこの免疫抑制性リガンドの発現を低くするべきところである患者へ効果的に投与されることになる生物学的製剤では、さらに増加する。２型インターフェロンが数多くの細胞型に対するＰＤ−Ｌ１発現の原型的な誘導物質であるものの（Gato-Canas et al. 2017）、ＰＧＥ２は、免疫抑制能力を持った腫瘍関連骨髄細胞における場合がそうであるとして示されたとおり、骨髄細胞に対するＰＤ−Ｌ１上方制御の力強い原動力として記載されている（Prima et al. 2017）。
【０１３３】
ＤＣ培養プロトコルにおけるＰＧＥ２の使用は、リンパ組織のＴ細胞依存性領域への遊走の効率を最大化する、ＤＣｓ上のＣＣＲ７の最適な発現を誘導するその能力によって通常は動機付けられる。しかしながら、本発明において、４日（4-day）ＭＰＬＡ／ＩＦＮ−γ ＤＣｓは、少なくともＴＮＦ−α／ＰＧＥ２で成熟させられたＤＣｓと同じくらい多くのＣＣＲ７を発現した。我々のＴＮＦ−α／ＰＧＥ２で成熟させられたＤＣｓで見られたＩＬ−１２抑制（図６Ａ）と組み合わせて、全部合わせるとこれらの知見は、次世代のＤＣベースのがんワクチンのための古典的なＤＣ成熟カクテルからの脱却を強く支持する。
【０１３４】
４日の（4-day）ＭＰＬＡ／ＩＦＮ−γで成熟させられたＤＣｓの１型分極免疫応答を支持する能力をさらに確認するのは、凍結保存、解凍およびサイトカインフリー基本培地中のさらなる２４時間の培養の後で放出されるケモカインのプロファイルである（図６Ａ）。８日の（8-day）ＴＮＦ−α／ＰＧＥ２で成熟させられたＤＣｓと比較して、たったの４日の（4-day）ＭＰＬＡ／ＩＦＮ−γで成熟させられたＤＣｓは、Ｔｈ１誘引ケモカインＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、およびＣＸＣＬ１０の高いレベルを分泌した。in vivoで、ＤＣに分泌されるＣＸＣＬ１０とＣＤ４＋ Ｔ細胞上のＣＸＣＲ３受容体発現との間の相互作用は、リンパ節におけるこれらの細胞型の間の安定した接触の形成を確実にすることが示された。この安定した細胞接触は、これらのＣＤ４＋ Ｔ細胞を、高いＩＦＮ−γ生産の潜在的なニッチ中へと置くこととの組み合わせで、さらにＴｈ１分化を促進することができる。加えて、我々の実験は、Ｔ−ｒｅｇおよびＴｈ２−動員ケモカインＣＣＬ１７は、おそらくはＰＧＥ２の事前条件付けの帰結として、圧倒的に８日の（8-day）ＴＮＦ−α／ＰＧＥ２で成熟させられたＤＣｓによって放出されるということを示す。
【０１３５】
統計的有意には達しなかったものの、４日の（4-day）ＭＰＬＡ／ＩＦＮ−γで成熟させられたＤＣｓによるより高いＴｈ１７−およびＴ−ｒｅｇ−誘引ケモカインＣＣＬ２０の放出の傾向もまたあった。ＤＣ成熟刺激における選定がＴｈ１−またはＴｈ２−Ｔ細胞動員プロファイルを定義するという事実は、Lebre et al (2005)によって既に記録されている。彼らの試験では、採取したての成熟ＤＣｓのケモカイン生産が、ＣＤ４０ライゲーションに呼応して評価された。ＬＰＳおよびＩＦＮ−γの存在下で成熟させられたＤＣｓは、圧倒的にＴｈ１誘引ケモカインを放出することが示されたが、他方、成熟カクテル中にＰＧＥ２が存在したときにはＴｈ２関連ケモカインＣＣＬ２２の発現レベルが有意に増加した。我々の知見とは対照的に、Lebre et alの論文では、ＣＣＬ１７の発現パターンはＤＣ型に依存しなかった。
【０１３６】
達成されるＤＣ成熟のレベルに潜在的に影響を及ぼす追加の因子は、使用される培養容器の物理的性質である。本発明の方法によって、臨床的に認定された免疫磁気単離系と互換性がある閉鎖系を構成するガス透過性のバッグの中の細胞を分化および活性化させることが実行可能である。我々の結果は、臨床グレードのバッグ中で生成されたＤＣｓが、下方制御された共刺激分子発現、ケモカインおよびＩＬ−１２分泌を伴う損なわれた成熟プログラムを有するということを示唆した先行研究（Rouas et al. 2010）と相反する。
【０１３７】
驚くべきことに、我々は、これら全ての特徴が我々のＤＣにおいて誘導されており、および、凍結保存、解凍およびサイトカインフリー基本培地中のさらなる培養の後でさえも無傷であるということを示す。類似の研究は、G. Gaudernack et alおよびG. Kvalheim et alのグループらによって行われており（Kyte et al. 2005; Mu et al. 2003）、無傷の免疫原性の性質を持った臨床グレード ＤＣｓを実際にバッグの中で生成することができるというアイディアを補強する。細胞分化バッグ中で培養することはまた、我々の方法を市販の自動化された細胞培養デバイスへと簡単に置き換えることを、我々に可能にさせる。この選択肢は、オペレーター介入のさらなる低減を可能にし、コンタミネーションのリスクを減少させ、および全体的な再現性を増加させる。
【０１３８】
本発明は、抗原でＤＣｓを負荷するやり方としてｍＲＮＡエレクトロポレーションを選択することによって、代替的な培養継続時間および／または成熟プロトコルに着目して先行する報告からさらに自らを差別化する。この技術の長所は、ＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩ提示の両方を最適化するための配列を組み込む選択肢を伴う、腫瘍関連抗原をコードするカスタマイズされた配列または突然変異由来のネオエピトープを含有する配列を合成するという観点からの柔軟性である。また、ＨＬＡ拘束性（HLA-restricted）ペプチドで受動負荷された以前の研究とは対照的に、完全長ＲＮＡでのエレクトロポレーションは、ＨＬＡ型の観点からのいかなる患者事前選択をも課すことなく広域なエピトープの処理（processing）および潜在的な提示を確実にする。
【０１３９】
そのうえ、ＤＣにおける翻訳されたタンパク質の半減期は、ＭＨＣ Ｉ−エピトープ複合体の長期化された生成を確実にし、一方、受動負荷された外来性ペプチドは、表面ＨＬＡ分子に一時的に結合するかまたは内在化によって枯渇するのみである。ｍＲＮＡでエレクトロポレーションされたＤＣｓの、ペプチド負荷ＤＣｓと同じくらいロバストなＴ細胞応答を誘導する能力が、先行して実証されている。ここで我々は、４日間培養された、ＭＰＬＡ／ＩＦＮ−γで成熟させられた、モデル腫瘍関連抗原でエレクトロポレーションされたＤＣｓは、抗腫瘍ツールキット（例としてＩＦＮ−γおよびパーフォリンの高発現）を備えた希少な抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活発な増大を誘導することができるということを示し、これは効率的かつ高度に特異的な細胞傷害性活性に反映される。重要なことに、我々は、現実のワクチン接種のセッティングを反映した凍結保存および解凍後のこの必須のＤＣの性質を評価した。
【０１４０】
要するに、本発明は、４日の（4-day）ＭＰＬＡ／ＩＦＮ−γで成熟させられた単球由来のＤＣｓの、「古典的な」８日の（8-day）ＴＮＦ−α／ＰＧＥ２で成熟させられたＤＣｓに対する、細胞収量、表現型、および１型分極プロファイルの観点からの優位性を実証する。培養時間を低減し、ＧＭＰ準拠の材料および血清フリー培地を閉鎖系で使用して、エレクトロポレーションおよび凍結保存は、細胞溶解性腫瘍由来の抗原に特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導する短期培養されたＭＰＬＡ／ＩＦＮ−γ−ＤＣｓの能力を損なわなかったところ、これは臨床実施にとってのこの生産方法のロバスト性を浮き彫りにする。
【０１４１】
参考文献
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【図１Ａ−１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ−４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ−７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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