(57)【要約】  本発明は、ヒトネクチン４を高い親和性および特異性で認識し、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）とのその結合を阻害するモノクローナル抗体を提供する。本発明はさらに、本抗体を含む医薬組成物、ならびに癌免疫療法および診断におけるそれらの使用のための方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネクチン４と結合する単離されたモノクローナル抗体、または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体フラグメントであって、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）とのネクチン４の結合を阻害することができる、単離されたモノクローナル抗体またはその抗体フラグメント。
【請求項２】
前記単離された抗体または抗体フラグメントが、
（ｉ）配列番号３９を含む重鎖（ＨＣ）可変領域の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）および配列番号４０を含む軽鎖（ＬＣ）可変領域の３つのＣＤＲ、または前記抗体もしくはフラグメントの配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体もしくは誘導体、
（ｉｉ）配列番号３５を含む重鎖（ＨＣ）可変領域の３つのＣＤＲおよび配列番号３６を含む軽鎖（ＬＣ）可変領域の３つのＣＤＲ、または前記抗体もしくはフラグメントの配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体もしくは誘導体、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号３７を含む重鎖可変領域の３つのＣＤＲおよび配列番号３８を含む軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、または前記抗体もしくはフラグメントの配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体もしくは誘導体、を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
【請求項３】
ｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１がＳＹＹＩＨ（配列番号２５）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＹＮＥＲＦＫＧ（配列番号２６）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号２７）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＫＡＳＱＳＶＮＮＤＶＡ（配列番号２８）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＹＡＳＮＲＦＴ（配列番号２９）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＱＱＡＹＲＳＰＹＴ（配列番号３０）である、６つのＣＤＲのセット、
ｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１がＡＹＮＩＨ（配列番号９）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＹＩＹＰＮＮＧＧＳＧＹＮＱＫＦＭＮ（配列番号１０）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＦＤＹＤＥＡＷＦＩＹ（配列番号１１）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号１２）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号１３）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＦＱＧＳＧＳＰＹＴ（配列番号１４）である、６つのＣＤＲのセット、および
ｉｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１がＴＹＹＩＨ（配列番号１５）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＮＮＥＫＦＫＶ（配列番号１６）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号１７）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ（配列番号１８）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＹＡＳＮＲＹＴ（配列番号１９）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＱＱＤＹＳＳＰＹＴ（配列番号２０）である、６つのＣＤＲのセット、からなる群から選択されるＣＤＲセットを含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
【請求項４】
配列番号３９、配列番号３５、配列番号３７から選択される重鎖可変領域、または前記重鎖可変領域配列と少なくとも９５％の配列類似性を有する類似体を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
【請求項５】
配列番号４０、配列番号３６、配列番号３８から選択される軽鎖可変配列、または前記軽鎖可変領域配列と少なくとも９５％の配列類似性を有する類似体を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
【請求項６】
重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖が配列番号３９を含み、前記軽鎖が配列番号４０を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
【請求項７】
重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖が配列番号３５を含み、前記軽鎖が配列番号３６を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
【請求項８】
重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖が配列番号３７を含み、前記軽鎖が配列番号３８を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
【請求項９】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナルフラグメントであって、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、単離されたモノクローナルフラグメント。
【請求項１０】
配列番号３２および配列番号３４からなる群から選択される配列、または前記配列と少なくとも９０％の配列類似性を有するその変異体を含む、請求項９に記載の単離されたモノクローナルフラグメント。
【請求項１１】
請求項６、７、または８のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントの変異体であって、前記抗体の鎖と少なくとも９５％の同一性を有する、変異体。
【請求項１２】
前記モノクローナル抗体がヒトネクチン４と１０−９Ｍ〜１０−１０Ｍの親和性で結合する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または抗体フラグメントのＨＣまたはＬＣ配列の少なくとも１つの領域をコードする、ポリヌクレオチド配列。
【請求項１４】
モノクローナル抗体重鎖可変領域をコードし、前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号４５、配列番号４１、配列番号４３からなる群から選択される配列、および前記配列と少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含む、請求項１３に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１５】
モノクローナル抗体軽鎖可変領域をコードし、前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号４６、配列番号４２、配列番号４４、および前記配列と少なくとも９０％の同一性を有するそれらの変異体からなる群から選択される、請求項１３に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、プラスミド。
【請求項１７】
請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含む、細胞。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を産生することができる、細胞。
【請求項１９】
有効成分として、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の少なくとも１つの単離された抗体またはそのフラグメント、および薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、塩、または担体を含む、医薬組成物。
【請求項２０】
前記モノクローナル抗体が細胞毒性部分とコンジュゲートされていない、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記抗体またはそのフラグメントが、
ｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１がＳＹＹＩＨ（配列番号２５）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＹＮＥＲＦＫＧ（配列番号２６）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号２７）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＫＡＳＱＳＶＮＮＤＶＡ（配列番号２８）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＹＡＳＮＲＦＴ（配列番号２９）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＱＱＡＹＲＳＰＹＴ（配列番号３０）である、６つのＣＤＲのセット、
ｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１がＡＹＮＩＨ（配列番号９）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＹＩＹＰＮＮＧＧＳＧＹＮＱＫＦＭＮ（配列番号１０）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＦＤＹＤＥＡＷＦＩＹ（配列番号１１）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号１２）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号１３）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＦＱＧＳＧＳＰＹＴ（配列番号１４）である、６つのＣＤＲのセット、および
ｉｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１がＴＹＹＩＨ（配列番号１５）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＮＮＥＫＦＫＶ（配列番号１６）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号１７）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ（配列番号１８）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＹＡＳＮＲＹＴ（配列番号１９）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＱＱＤＹＳＳＰＹＴ（配列番号２０）である、６つのＣＤＲのセット、からなる群から選択されるＣＤＲセットを含み、
前記抗体が細胞毒性部分、放射性部分、または識別可能な部分に結合されている、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ネクチン４のＴＩＧＩＴとの結合を阻害することによって免疫系を調節することに使用するための、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
癌を治療することに使用するための、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
対象におけるウイルス感染を予防または治療することに使用するための、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
麻疹感染を予防することに使用するための、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２７】
手術、化学療法、放射線療法、および免疫療法から選択される追加の抗癌療法をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記対象に、追加の免疫調節剤、活性化リンパ球細胞、キナーゼ阻害剤、化学療法剤、または任意の他の抗癌剤を投与することをさらに含む、請求項２６または２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記追加の免疫調節剤が免疫チェックポイント分子に対する抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記癌が固形癌である、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記癌が血液癌である、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
治療することが、対象における転移の形成、増殖、または拡散を防止または低減することをもたらす、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、ヒトネクチン４と結合する抗体またはそのフラグメントを投与することを含み、前記抗体またはそのフラグメントがいずれの毒素または抗腫瘍剤ともコンジュゲートされていない、方法。
【請求項３４】
前記抗体またはそのフラグメントが、腫瘍細胞でネクチン４とネクチン１との間の相互作用を阻害する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記投与することが、Ｔ細胞リンパ球および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をさらに投与することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
対象における癌を診断する方法であって、生物学的試料を請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体または抗体フラグメントと接触させることを含む、方法。
【請求項３７】
対象における癌を診断するためのキットであって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗体または抗体フラグメントを含む、キット。
【請求項３８】
ネクチン４と結合することができる細胞外部分を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項３９】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗体または抗体フラグメントを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項４０】
配列番号３２または３４を含む抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内Ｔ細胞またはＮＫ細胞シグナル伝達ドメインを含む、請求項３９に記載のＣＡＲ。
【請求項４１】
請求項３８〜４０のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現するように操作された、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の集団。
【請求項４２】
癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現する少なくとも１つの細胞を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫療法の分野にあり、ヒトタンパク質ネクチン４と結合する抗体およびそのフラグメント、これらの抗体をコードするポリヌクレオチド配列、ならびにこれらの抗体を産生する細胞に関する。本発明はさらに、これらの抗体を含む治療用および診断用組成物、ならびにこれらの抗体を使用して疾患、特に癌を治療および診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫療法は、過去１０年間に癌治療においてなされた最も有望な進歩の１つである。癌免疫療法は、例えば、腫瘍細胞上の抗原に特異的な抗体による、抗原提示細胞と腫瘍細胞との融合による、または抗腫瘍Ｔ細胞の活性化による治療によって抗腫瘍免疫応答を生成および増強するために利用される。患者における腫瘍細胞に対して免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を動員する能力は、これまで不治であると考えられていた癌の種類および転移と戦う治療法を提供する。
【０００３】
Ｔ細胞仲介免疫応答には、免疫応答の程度を制御する共刺激シグナルと共抑制シグナルの間のバランスによって調節される複数の連続したステップが含まれる。免疫チェックポイントと呼ばれる抑制シグナルは、自己寛容の維持および免疫介在性の二次的組織損傷を制限するために重要である。これらのシグナルは、感染または免疫誘発が解消、悪化、または持続するにつれて変化し、これらの変化は免疫応答に影響を及ぼして再形成する。
【０００４】
免疫チェックポイントタンパク質の発現は、腫瘍によって調節され得る。たとえば、癌細胞表面でのプログラム死リガンド−１（ＰＤ−Ｌ１）の上方調節は、ＰＤ−１と結合することを介してＴ細胞を阻害することによって、これらが宿主免疫系を回避することを可能にし、さもなければこれらの腫瘍細胞が攻撃される可能性がある。したがって、免疫チェックポイントは、癌に対する機能的な細胞免疫の活性化に対する重大な障壁を示す。したがって、免疫細胞における抑制性リガンドに特異的な拮抗抗体は、実行可能な抗癌剤と考えられ、それらは癌治療に使用されている（例えば、ニボルマブおよびペンブロリズマブ）。免疫チェックポイント分子に関する別の例は、「ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体」（ＴＩＧＩＴ）である。ＴＩＧＩＴは、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を含む種々の免疫細胞で発現される共抑制分子である。ＴＩＧＩＴは、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ、ＣＤ１５５）と高い親和性で結合する。ＴＩＧＩＴに特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、例えば、ＷＯ２０１６／０２８６５６およびＷＯ２０１７／０３７７０７に開示されている。
【０００５】
ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）は、細胞外マトリックス分子との細胞接着を媒介することに含まれる膜貫通型糖タンパク質である。ＰＶＲは既知の腫瘍抗原であり、治療的介入のための標的である。腫瘍細胞上のＰＶＲの遮断は、腫瘍細胞の生存率を低下させると予想される。ＰＶＲはまた、血管新生および転移において重要な役割を有する。米国特許出願第２００７／００４１９８５、米国特許出願第２００９／０２１５１７５、およびＷＯ２０１７／１４９５３８を含むいくつかの特許出願は、ＰＶＲと特異的に結合する分子および抗体、ならびに癌に対するそれらの使用を開示している。
【０００６】
ネクチン細胞接着分子４（Ｎｅｃｔｉｎ４）は、ポリオウイルス受容体関連４（ＰＶＲＬ４）とも呼ばれ、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、関連する免疫グロブリン様接着分子のネクチンファミリーのメンバーである。ネクチン４は、肺癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌を含む多くの腫瘍における腫瘍関連マーカーである。
【０００７】
Ｃｈａｉｌｔａ−Ｅｉｄらは、２０１６年（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１６；７６：３００３−１３）に複数の前臨床癌モデルにおける非常に強力な治療薬として抗ネクチン４（エンフォルツマブ）抗体薬剤コンジュゲートを開示している。微小管阻害剤ベドチンとコンジュゲートされた抗体は、ヒト、ならびにラットおよびサルのネクチン４と結合し、ネクチン４を発現するいくつかの細胞株および異種移植片の増殖を阻害する。
【０００８】
癌免疫療法でなされた成功にもかかわらず、腫瘍細胞を攻撃する免疫系の細胞を増強するために、追加の取り組み、およびより有効で特異的な薬剤と薬物の組み合わせについていまだ未対処な必要性がある。そのような取り組みの１つには、ＴＩＧＩＴと結合するネクチン４を、特異的モノクローナル抗体によって阻害することが含まれる。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ヒトタンパク質ネクチン４と結合する抗体およびそのフラグメント、これらの抗体をコードするポリヌクレオチド配列、ならびにこれらの抗体を産生する細胞を提供する。本発明は、以前は麻疹ウイルスおよび腫瘍抗原の受容体として知られていたネクチン４が免疫抑制分子ＴＩＧＩＴのリガンドであるという発見に部分的に基づいており、したがって、抗癌免疫におけるＴＩＧＩＴの抑制効果の阻害のための標的として初めて提唱される。本発明はさらに、いくつかの実施形態において、ネクチン４との結合部位を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
【００１０】
本発明は、ヒトネクチン４に特異的である非常に有効なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を提供し、ネクチン４と阻害性受容体ＴＩＧＩＴとの間の相互作用を遮断するだけでなく、この受容体を発現する標的細胞にも直接的な効果を有する。これらの抗体は、ネクチン４に対する結合定数をナノモル以下の範囲で有し、いずれの毒素または抗腫瘍剤ともコンジュゲートされずに、免疫系のＴＩＧＩＴ阻害を逆転させて、腫瘍細胞の排除を直接的に促進する。したがって、本発明の抗体は、例えば癌免疫療法において、標的細胞上のネクチン４と免疫細胞上のＴＩＧＩＴとの間の相互作用の阻害に有用である。さらに、本明細書で説明されるいくつかのインタクト抗体は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）活性を誘発する。ネクチン４は腫瘍細胞で特異的に過剰発現される。ネクチン４に対する本発明の抗体の高い親和性およびＡＤＣＣ活性を伴うＡＤＣＣ活性誘発は、それらを免疫療法の理想的な候補にする。
【００１１】
本発明は、タンパク質ネクチン４を認識し、タンパク質ＴＩＧＩＴとのその結合を防止し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＴ細胞などのリンパ球での抑制活性を阻害する抗体およびそのフラグメントを提供する。本明細書に開示される抗ネクチン４抗体は、癌細胞などの標的細胞上に存在するネクチン４に結合することができる。本発明の抗体およびフラグメントは、相補性決定領域（ＣＤＲ）配列の独自のセット、ヒトネクチン４に対する高い親和性および高い特異性を有することによって特徴付けられ、単独療法および他の抗癌剤との併用として、腫瘍免疫回避と戦うために癌免疫療法で有用である。抗体はまた、ウイルス感染を予防すること、特に麻疹感染の予防において有用である。
【００１２】
本明細書で開示される高親和性抗ネクチン４抗体は、ＴＩＧＩＴ−ネクチン４相互作用を遮断し、Ｔ細胞およびＮＫ細胞活性を回復することが、ここに開示されている。
【００１３】
本発明のモノクローナル抗体のいくつかはまた、ネクチン４とネクチン１との間の相互作用を遮断することができ、ネクチン４を発現する腫瘍の浸潤性を妨害するそれらの能力を示している。さらに、抗ネクチン４ｍＡｂは、ほとんどの標的細胞においてＮＫ細胞の活性化を誘発することができた。有利なことに、本発明による抗ネクチン４ｍＡｂは、標的癌細胞に直接的な効果を有し、ＮＫ細胞および／または毒素を必要とせずにそれらの死滅を誘発する。本発明の抗ネクチン４抗体はＤＮＡＭ１などの共刺激受容体のシグナル伝達に対して遮断効果を有さず、したがって、それらは他の免疫誘導シグナルに対して有害な効果を有さないと予想されることがさらに開示される。
【００１４】
興味深いことに、ヒトとげっ歯類のネクチン４配列間の高い配列類似性にもかかわらず、本発明の抗体のいくつかは、ヒトネクチン４に高度に特異的であり、げっ歯類ネクチン４と結合しない。
【００１５】
本明細書で説明される抗ネクチン４ｍＡｂのいくつかは、腫瘍細胞上のネクチン４を遮断することによって、免疫に依存しない方法で腫瘍細胞の生存率を低下させることができた。いくつかの実施形態では、本明細書で説明されるネクチン４抗体は、いずれの毒性分子ともコンジュゲートされずに、腫瘍細胞上のネクチン１との結合による免疫非依存性干渉を介して、腫瘍細胞の増殖を阻害する。
【００１６】
一態様により、本発明は、単離されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体フラグメントを提供し、ヒトネクチン４と特異的に結合してＴＩＧＩＴとのその結合を阻害する。
【００１７】
本発明はまた、Ｔ細胞リンパ球および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞とともに、癌の治療で使用するため、ヒトネクチン４のヒトＴＩＧＩＴとの結合を阻害することができるｍＡｂまたはその抗体フラグメントを提供する。
【００１８】
いくつかの実施形態によれば、ｍＡｂはいかなる毒素または抗腫瘍剤ともコンジュゲートされていない。
【００１９】
いくつかの実施形態によれば、単離された抗体または抗体フラグメントは６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）配列のセットを含み、
ｉ．配列番号２２を含む重鎖（ＨＣ）可変領域の３つのＣＤＲおよび配列番号２４を含む軽鎖（ＬＣ）可変の３つのＣＤＲ、あるいは当該抗体またはフラグメントの配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体または誘導体、
ｉｉ．配列番号２を含むＨＣ可変領域の３つのＣＤＲおよび配列番号４を含むＬＣ可変の３つのＣＤＲ、あるいは当該抗体またはフラグメントの配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体または誘導体、および
ｉｉｉ．配列番号６を含むＨＣ可変領域の３つのＣＤＲおよび配列番号８を含むＬＣ可変領域の３つのＣＤＲ、あるいは当該抗体またはフラグメントの配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体または誘導体、からなる群から選択される。
【００２０】
いくつかの実施形態によれば、単離された抗体または抗体フラグメントは６つのＣＤＲ配列のセットを含み、
ｉｖ．配列番号３９を含むＨＣ可変領域の３つのＣＤＲおよび配列番号４０を含むＬＣ可変の３つのＣＤＲ、あるいは当該抗体またはフラグメントの配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体または誘導体、
ｖ．配列番号３５を含むＨＣ可変領域の３つのＣＤＲおよび配列番号３６を含むＬＣ可変の３つのＣＤＲ、あるいは当該抗体またはフラグメントの配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体または誘導体、および
ｖｉ．配列番号３７を含むＨＣ可変領域の３つのＣＤＲおよび配列番号３８を含むＬＣ可変領域の３つのＣＤＲ、あるいは当該抗体またはフラグメントの配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体または誘導体抗体、からなる群から選択される。
【００２１】
所与の抗体分子のＣＤＲ配列を決定するために当技術分野で知られているいくつかの方法があるが、標準的な明確な方法はない。抗体の重鎖および軽鎖可変領域からのＣＤＲ配列の決定は当技術分野で知られている任意の方法に従って行うことができ、限定されないが、ＫＡＢＡＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＩＭＧＴとして知られている方法が含まれる。選択されたＣＤＲのセットには、２つ以上の方法で特定される配列を含み得、すなわち、例えば、いくつかのＣＤＲ配列はＫＡＢＡＴを使用して決定され、いくつかはＩＭＧＴを使用する。いくつかの実施形態によれば、ｍＡｂ可変領域のＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴ法を使用して決定される。
【００２２】
いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはフラグメントは、ｈＮｅｃ４．１１（またはネクチン４．１１、またはクローン１１）で示されるモノクローナル抗体のＣＤＲ配列、すなわち、配列番号３９に示される重鎖可変領域に含まれる３つのＣＤＲ配列、および配列番号４０に示される軽鎖可変領域に含まれる３つのＣＤＲ配列を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、配列ＳＹＹＩＨ（配列番号２５）を含む重鎖ＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、配列ＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＹＮＥＲＦＫＧ（配列番号２６）を含む重鎖ＣＤＲ２を含む。いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、配列ＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号２７）を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。
【００２４】
特定の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、（ｉ）配列ＳＹＹＩＨ（配列番号２５）を含むＨＣ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列ＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＹＮＥＲＦＫＧ（配列番号２６）を含むＨＣ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列ＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号２７）を含むＨＣ  ＣＤＲ３を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、配列ＫＡＳＱＳＶＮＮＤＶＡ（配列番号２８）を含む軽鎖ＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、配列ＹＡＳＮＲＦＴ（配列番号２９）を含む軽鎖ＣＤＲ２を含む。いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、配列ＱＱＡＹＲＳＰＹＴ（配列番号３０）を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【００２６】
特定の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、（ｉ）配列ＫＡＳＱＳＶＮＮＤＶＡ（配列番号２８）を含むＬＣ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列ＹＡＳＮＲＦＴ（配列番号２９）を含むＬＣ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列ＱＱＡＹＲＳＰＹＴ（配列番号３０）を含むＨＣ  ＣＤＲ３を含む。
【００２７】
いくつかの特定の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはフラグメントは、配列ＳＹＹＩＨ（配列番号２５）を含む重鎖ＣＤＲ１配列、配列ＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＹＮＥＲＦＫＧ（配列番号２６）を含む重鎖ＣＤＲ２、配列ＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号２７）を含む重鎖ＣＤＲ３、配列ＫＡＳＱＳＶＮＮＤＶＡ（配列番号２８）を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列ＹＡＳＮＲＦＴ（配列番号２９）を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列ＱＱＡＹＲＳＰＹＴ（配列番号３０）を含む軽鎖ＣＤＲ３、あるいは超可変領域（ＨＶＲ）配列における５％以下のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を含むそれらの類似体を含む。
【００２８】
いくつかの特定の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはフラグメントは、
ｉ．配列番号２５で示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
ｉｉ．配列番号２６で示される配列を有する重鎖ＣＤＲ２、
ｉｉｉ．配列番号２７で示される配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｉｖ．配列番号２８で示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
ｖ．配列番号２９で示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、
ｖｉ．配列番号３０で示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、からなる６つのＣＤＲ配列のセットを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、配列番号３９に示される重鎖可変領域、あるいは重鎖可変領域配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体または誘導体を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、配列番号４０に示される軽鎖可変領域、または軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体を含む。
【００３１】
特定の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、配列番号３９で示される配列を有する重鎖可変領域、および配列番号４０で示される配列を有する軽鎖可変領域、あるいは軽鎖および／または重鎖配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体を含む。
【００３２】
本発明はまた、モノクローナル抗体ｈＮｅｃ４．１１が結合するヒトネクチン４タンパク質内のエピトープと高い親和性で結合することができる抗体または抗体フラグメントを包含する。
【００３３】
いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはフラグメントは、ｈＮｅｃ４．０１（またはネクチン４．０１）で示されるモノクローナル抗体のＣＤＲ配列、すなわち、配列番号３５に示される重鎖可変領域に含まれる３つのＣＤＲ配列および配列番号３６に示される軽鎖可変領域に含まれる３つのＣＤＲ配列を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、配列ＡＹＮＩＨ（配列番号９）を含む重鎖ＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、配列ＹＩＹＰＮＮＧＧＳＧＹＮＱＫＦＭＮ（配列番号１０）を含む重鎖ＣＤＲ２を含む。いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、配列ＦＤＹＤＥＡＷＦＩＹ（配列番号１１）を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。
【００３５】
特定の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、（ｉ）配列ＡＹＮＩＨ（配列番号９）を含むＨＣ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列ＹＩＹＰＮＮＧＧＳＧＹＮＱＫＦＭＮ（配列番号：１０を含むＨＣ  ＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列ＦＤＹＤＥＡＷＦＩＹ（配列番号１１）を含むＨＣ  ＣＤＲ３を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、配列ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号１２）を含む軽鎖ＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、配列ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号１３）を含む軽鎖ＣＤＲ２を含む。いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、配列ＦＱＧＳＧＳＰＹＴ（配列番号１４）を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【００３７】
特定の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、（ｉ）配列ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号１２）を含むＬＣ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号１３）を含むＬＣ  ＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列ＦＱＧＳＧＳＰＹＴ（配列番号１４）を含むＨＣ  ＣＤＲ３を含む。
【００３８】
いくつかの特定の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはフラグメントは、配列ＡＹＮＩＨ（配列番号９）を含む重鎖ＣＤＲ１配列、配列ＹＩＹＰＮＮＧＧＳＧＹＮＱＫＦＭＮ（配列番号１０）を含む重鎖ＣＤＲ２、配列ＦＤＹＤＥＡＷＦＩＹ（配列番号１１）を含む重鎖ＣＤＲ３、配列ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号１２）を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号１３）を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列ＦＱＧＳＧＳＰＹＴ（配列番号１４）を含む軽鎖ＣＤＲ３、あるいは超可変領域（ＨＶＲ）配列における５％以下のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を含むその類似体を含む。
【００３９】
いくつかの特定の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはフラグメントは、
ｉ．配列番号９で示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
ｉｉ．配列番号１０で示される配列を有する重鎖ＣＤＲ２、
ｉｉｉ．配列番号１１で示される配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｉｖ．配列番号１２で示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
ｖ．配列番号１３で示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および
ｖｉ．配列番号１４で示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、からなる６つのＣＤＲ配列のセットを含む。
【００４０】
いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、配列番号３５に示される重鎖可変領域、あるいは重鎖可変領域配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体または誘導体を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、配列番号３６に示される軽鎖可変領域、または軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体を含む。
【００４２】
特定の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、配列番号３５で示される配列を有する重鎖可変領域、および配列番号３６で示される配列を有する軽鎖可変領域、あるいは軽鎖および／または重鎖配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体を含む。
【００４３】
本発明はまた、モノクローナル抗体ｈＮｅｃ４．０１が結合するヒトネクチン４タンパク質内のエピトープと高い親和性で結合することができる抗体または抗体フラグメントを包含する。
【００４４】
いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはフラグメントは、ｈＮｅｃ４．０５（またはネクチン４．０５）で示されるモノクローナル抗体のＣＤＲ配列、すなわち、配列番号３７に示される重鎖可変領域に含まれる３つのＣＤＲ配列および配列番号３８に示される軽鎖可変領域に含まれる３つのＣＤＲ配列を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、配列ＴＹＹＩＨ（配列番号１５）を含む重鎖ＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、配列ＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＮＮＥＫＦＫＶ（配列番号１６）を含む重鎖ＣＤＲ２を含む。いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、配列ＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号１７）を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。
【００４６】
特定の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、（ｉ）配列ＴＹＹＩＨ（配列番号１５）を含むＨＣ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列ＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＮＮＥＫＦＫＶ（配列番号１６）を含むＨＣ  ＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列ＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号１７）を含むＨＣ  ＣＤＲ３を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、配列ＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ（配列番号１８）を含む軽鎖ＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、配列ＹＡＳＮＲＹＴ（配列番号１９）を含む軽鎖ＣＤＲ２を含む。いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、配列ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ（配列番号２０）を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【００４８】
特定の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントは、（ｉ）配列ＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ（配列番号１８）を含むＬＣ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列ＹＡＳＮＲＹＴ（配列番号１９）を含むＬＣ  ＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ（配列番号２０）を含むＨＣ  ＣＤＲ３を含む。
【００４９】
いくつかの特定の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはフラグメントは、配列ＴＹＹＩＨ（配列番号１５）を含む重鎖ＣＤＲ１配列、配列ＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＮＮＥＫＦＫＶ（配列番号１６）を含む重鎖ＣＤＲ２、配列ＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号１７）を含む重鎖ＣＤＲ３、配列ＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ（配列番号１８）を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列ＹＡＳＮＲＹＴ（配列番号１９）を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ（配列番号２０）を含む軽鎖ＣＤＲ３、あるいは超可変領域（ＨＶＲ）配列における５％以下のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を含むそれらの類似体を含む。
【００５０】
いくつかの特定の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはフラグメントは、
ｉ．配列番号１５で示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
ｉｉ．配列番号１６で示される配列を有する重鎖ＣＤＲ２、
ｉｉｉ．配列番号１７で示される配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
ｉｖ．配列番号１８で示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
ｖ．配列番号１９で示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および
ｖｉ．配列番号２０で示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、からなる６つのＣＤＲ配列のセットを含む。
【００５１】
いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、配列番号３７に示される重鎖可変領域配列、または重鎖可変領域配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体または誘導体を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、配列番号３８に示される軽鎖可変領域、または軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体を含む。
【００５３】
特定の実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、配列番号３７に示される配列を有する重鎖可変領域、および配列番号３８で示される配列を有する軽鎖可変領域、あるいは軽鎖および／または重鎖配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するその類似体を含む。
【００５４】
本発明はまた、モノクローナル抗体ｈＮｅｃ４．０５が結合するヒトネクチン４タンパク質内のエピトープに高い親和性で結合することができる抗体または抗体フラグメントを包含する。
【００５５】
いくつかの実施形態によれば、単離された抗体またはそのフラグメントは、少なくとも１０−８Ｍの親和性でヒトネクチン４を認識する。他の実施形態によれば、抗体または抗体フラグメントは、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、またはなお高い親和性でヒトネクチン４と結合する。いくつかの実施形態によれば、抗体または抗体フラグメントは、１０−９Ｍ〜１０−１０Ｍの親和性でヒトネクチンと結合する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００５６】
単離されたｍＡｂの類似体および誘導体、ならびに上記のフラグメントもまた、本発明の範囲内である。
【００５７】
いくつかの実施形態によれば、抗体または抗体フラグメント類似体は、参照抗体の配列の超可変領域と少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【００５８】
特定の実施形態によれば、単離された抗体またはそのフラグメントの類似体または誘導体は、参照抗体の配列の可変領域と少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００５９】
いくつかの実施形態によれば、本発明による抗体または抗体フラグメントは、配列番号３９、配列番号３５、または配列番号３７に示される重鎖可変領域、あるいは当該配列と少なくとも９５％の配列類似性を有する類似体を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態によれば、抗体または抗体フラグメントは、配列番号４０、配列番号３６、または配列番号３８に示される軽鎖可変領域、あるいは当該配列と少なくとも９５％の配列類似性を有する類似体を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態によれば、抗体または抗体フラグメントは重鎖および軽鎖を含み、（ｉ）重鎖は配列番号３９を含み、軽鎖は配列番号４０を含み、（ｉｉ）重鎖は配列番号３５を含み、軽鎖は配列番号３６を含み、または（ｉｉｉ）重鎖は配列番号３７を含み、軽鎖は配列番号３８を含む。当該重鎖または軽鎖と少なくとも９５％の配列類似性を有する抗体またはフラグメントの類似体も含まれる。
【００６２】
いくつかの実施形態によれば、類似体は上記の抗体軽鎖または重鎖可変領域と少なくとも９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態によれば、類似体は超可変領域の１つ以上のＣＤＲ配列、すなわち、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０に示されるＣＤＲ配列のいずれか１つに、１つを超えないアミノ酸置換、欠失、または付加を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、アミノ酸置換は保存的置換である。
【００６３】
いくつかの実施形態によれば、抗体または抗体フラグメントは、上記で定められる軽鎖および重鎖領域を有する超可変領域（ＨＶＲ）を含み、１、２、３、４、または５個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加された。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００６４】
いくつかの実施形態によれば、抗体または抗体フラグメントは、上記で定められる軽鎖および重鎖領域を有するＨＶＲを含み、１個のアミノ酸が置換された。いくつかの実施形態によれば、抗体または抗体フラグメントは、上記で定められるＣＤＲを含み、１個のアミノ酸が置換された。
【００６５】
いくつかの実施形態によれば、単離されたモノクローナル抗体または抗体フラグメントはＣＤＲセットを含み、
ｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１がＳＹＹＩＨ（配列番号２５）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＹＮＥＲＦＫＧ（配列番号２６）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号２７）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＫＡＳＱＳＶＮＮＤＶＡ（配列番号２８）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＹＡＳＮＲＦＴ（配列番号２９）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＱＱＡＹＲＳＰＹＴ（配列番号３０）である、６つのＣＤＲのセット、
ｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１がＡＹＮＩＨ（配列番号９）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＹＩＹＰＮＮＧＧＳＧＹＮＱＫＦＭＮ（配列番号１０）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＦＤＹＤＥＡＷＦＩＹ（配列番号１１）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号１２）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号１３）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＦＱＧＳＧＳＰＹＴ（配列番号１４）である、６つのＣＤＲのセット、および
ｉｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１配列がＴＹＹＩＨ（配列番号１５）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＮＮＥＫＦＫＶ（配列番号１６）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号１７）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ（配列番号１８）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＹＡＳＮＲＹＴ（配列番号１９）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＱＱＤＹＳＳＰＹＴ（配列番号２０）である、６つのＣＤＲのセット、からなる群から選択される。
【００６６】
本発明はまた、重鎖および軽鎖を含むモノクローナル抗体およびその結合フラグメントを提供し、当該鎖は重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列のセットを含み、当該セットは、
ｉ．配列番号３９および４０を含むセット、
ｉｉ．配列番号３５および３６を含むセット、および
ｉｉｉ．配列番号３７および３８を含むセット、からなる群から選択される。
【００６７】
いくつかの実施形態によれば、抗体または抗体フラグメントは、ヒトネクチン４がＴ細胞またはＮＫ細胞で発現されるＴＩＧＩＴと結合することを阻害することができる。
【００６８】
特定の実施形態によれば、ｍＡｂは、キメラ抗体および少なくとも抗体の抗原結合部分を含む抗体フラグメントからなる群から選択される。特定の実施形態によれば、抗体はキメラ抗体である。さらに他の実施形態によれば、キメラ抗体はヒト定常領域を含んだ。特定の実施形態によれば、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、ｄＡｂ、単離されたＣＤＲ領域、単鎖可変領域（ｓｃＦＶ）、単鎖抗体（ｓｃａｂ）、「二重特異的抗体」、および「線状抗体」からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００６９】
本明細書で説明される抗体の重鎖および軽鎖可変領域を含む単鎖可変領域（ｓｃＦＶ）もまた、本発明に従って提供される。特定の実施形態によれば、可変領域の間にヒンジ領域がある。
【００７０】
いくつかの実施形態によれば、ｓｃＦＶ配列は、配列番号３２、配列番号３４、または当該配列と少なくとも９０％の配列類似性を有するそれらの類似体で示される。
【００７１】
いくつかの実施形態によれば、抗体は、マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、およびヒトＩｇＧ４からなる群から選択される定常領域配列を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００７２】
いくつかの特定の実施形態によれば、モノクローナル抗体は、キメラモノクローナル抗体である。
【００７３】
いくつかの実施形態によれば、キメラ抗体は、ヒト由来の定常領域を含む。
【００７４】
いくつかの実施形態によれば、キメラ抗体のヒト定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、およびヒトＩｇＧ４からなる群から選択される。
【００７５】
特定の実施形態によれば、抗体はヒトＩｇＧ１である。いくつかの実施形態によれば、本明細書で説明される抗体の可変領域を含むヒトＩｇＧが提供される。
【００７６】
いくつかの実施形態によれば、上記で説明される抗体またはそのフラグメントを含むコンジュゲートが提供される。
【００７７】
いくつかの実施形態によれば、コンジュゲートは担体タンパク質を含む。
【００７８】
ネクチン４と結合することができる細胞外部分（結合ドメイン）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が本発明の別の態様に従って提供される。
【００７９】
いくつかの実施形態によれば、ＣＡＲは、本明細書で説明された提供される抗体またはそのフラグメントのいずれかを含む細胞外部分を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態によれば、ＣＡＲはＣＤＲセットを含むネクチン４結合部位を含み、ＣＤＲセットは、
ｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１がＳＹＹＩＨ（配列番号２５）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＹＮＥＲＦＫＧ（配列番号２６）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号２７）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＫＡＳＱＳＶＮＮＤＶＡ（配列番号２８）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＹＡＳＮＲＦＴ（配列番号２９）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＱＱＡＹＲＳＰＹＴ（配列番号３０）である、６つのＣＤＲのセット、
ｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１がＡＹＮＩＨ（配列番号９）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＹＩＹＰＮＮＧＧＳＧＹＮＱＫＦＭＮ（配列番号１０）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＦＤＹＤＥＡＷＦＩＹ（配列番号１１）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号１２）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ２がＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号１３）であり、ＬＣ  ＣＤＲ３がＦＱＧＳＧＳＰＹＴ（配列番号１４）である、６つのＣＤＲのセット、および
ｉｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１配列がＴＹＹＩＨ（配列番号１５）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＮＮＥＫＦＫＶ（配列番号１６）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号１７）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ（配列番号１８）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＹＡＳＮＲＹＴ（配列番号１９）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＱＱＤＹＳＳＰＹＴ（配列番号２０）である、６つのＣＤＲのセット、からなる群から選択される。
【００８１】
いくつかの実施形態によれば、ＣＡＲは、配列番号３２または３４を含む抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。
【００８２】
一態様によれば、本発明は、ＣＤＲセットを含むネクチン４結合ドメインを含む抗体または抗体フラグメントを含むＣＡＲをコードする単離された核酸分子を提供し、ＣＤＲセットは、
ｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１がＳＹＹＩＨ（配列番号２５）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＹＮＥＲＦＫＧ（配列番号２６）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号２７）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＫＡＳＱＳＶＮＮＤＶＡ（配列番号２８）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＹＡＳＮＲＦＴ（配列番号２９）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＱＱＡＹＲＳＰＹＴ（配列番号３０）である、６つのＣＤＲのセット、
ｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１がＡＹＮＩＨ（配列番号９）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＹＩＹＰＮＮＧＧＳＧＹＮＱＫＦＭＮ（配列番号１０）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＦＤＹＤＥＡＷＦＩＹ（配列番号１１）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号１２）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号１３）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＦＱＧＳＧＳＰＹＴ（配列番号１４）である、６つのＣＤＲのセット、および
ｉｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１配列がＴＹＹＩＨ（配列番号１５）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＮＮＥＫＦＫＶ（配列番号１６）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号１７）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ（配列番号１８）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＹＡＳＮＲＹＴ（配列番号１９）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＱＱＤＹＳＳＰＹＴ（配列番号２０）である、６つのＣＤＲのセット、からなる群から選択される。
【００８３】
いくつかの実施形態によれば、配列番号３１または配列番号３３で示されるポリヌクレオチド配列、あるいは当該配列と少なくとも９５％の類似性を有する類似体を含むベクターが提供される。
【００８４】
いくつかの実施形態によれば、本明細書で説明されるＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞が提供される。
【００８５】
追加の実施形態によれば、本明細書で説明されるＣＡＲを発現するように操作されたＮＫ細胞が提供される。
【００８６】
ヒトネクチン４に対して高い親和性および特異性を有するモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド配列、ならびにこれらのポリヌクレオチド配列を有するベクターおよび宿主細胞が、本発明の別の態様に従って提供される。
【００８７】
いくつかの実施形態によれば、上記の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列が提供される。
【００８８】
いくつかの実施形態によれば、ポリヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号３９の重鎖可変領域および配列番号４０の軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体（本明細書ではｈＮｅｃ４．１１として識別される）、（ｉｉ）配列番号３５の重鎖可変領域および配列番号３６の軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体（本明細書ではｈＮｅｃ４．０１として識別される）、または（ｉｉｉ）配列番号３７の重鎖可変領域および配列番号３８の軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体（本明細書ではｈＮｅｃ４．０５として識別される）と結合するヒトネクチン４タンパク質内のエピトープと結合することができる抗体または抗体フラグメントあるいは鎖をコードする。
【００８９】
いくつかの実施形態によれば、ポリヌクレオチド配列は、配列番号３９および配列番号４０、配列番号３５および配列番号３６、または配列番号３７および配列番号３８からなる群から選択される配列で示される配列を含む抗体または抗体フラグメントあるいは鎖をコードする。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９０】
さらにいくつかの実施形態によれば、本発明によるポリヌクレオチド配列は、
ｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１がＳＹＹＩＨ（配列番号２５）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＹＮＥＲＦＫＧ（配列番号２６）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号２７）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＫＡＳＱＳＶＮＮＤＶＡ（配列番号２８）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＹＡＳＮＲＦＴ（配列番号２９）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＱＱＡＹＲＳＰＹＴ（配列番号３０）である、６つのＣＤＲのセット、
ｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１がＡＹＮＩＨ（配列番号９）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＹＩＹＰＮＮＧＧＳＧＹＮＱＫＦＭＮ（配列番号１０）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＦＤＹＤＥＡＷＦＩＹ（配列番号１１）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号１２）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号１３）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＦＱＧＳＧＳＰＹＴ（配列番号１４）である、６つのＣＤＲのセット、および
ｉｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１配列がＴＹＹＩＨ（配列番号１５）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＮＮＥＫＦＫＶ（配列番号１６）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号１７）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ（配列番号１８）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＹＡＳＮＲＹＴ（配列番号１９）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＱＱＤＹＳＳＰＹＴ（配列番号２０）である、６つのＣＤＲのセット、を含む抗体または抗体フラグメントあるいは鎖をコードする。
【００９１】
各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９２】
いくつかの実施形態によれば、上記で定められるポリヌクレオチド配列は、抗体、少なくとも抗原結合部分を含む抗体フラグメント、および当該抗体または抗体フラグメントを含む抗体コンジュゲートからなる群から選択される分子をコードする。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９３】
いくつかの実施形態によれば、モノクローナル抗体重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２１で示される配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。
【００９４】
いくつかの実施形態によれば、モノクローナル抗体重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１で示される配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。
【００９５】
いくつかの実施形態によれば、モノクローナル抗体重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号５で示される配列、または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。
【００９６】
いくつかの実施形態によれば、モノクローナル抗体軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２３で示される配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。
【００９７】
いくつかの実施形態によれば、モノクローナル抗体軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号３で示される配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。
【００９８】
いくつかの実施形態によれば、モノクローナル抗体軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７で示される配列、または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態によれば、モノクローナル抗体重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号４５で示される配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態によれば、モノクローナル抗体重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号４１で示される配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態によれば、モノクローナル抗体重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号４３に示される配列、または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態によれば、モノクローナル抗体軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号４６に示される配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態によれば、モノクローナル抗体軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号４２に示される配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態によれば、モノクローナル抗体軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号４４に示される配列、または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含む。
【０１０５】
本発明は、いくつかの実施形態によれば、上記に開示された少なくとも１つのポリヌクレオチド配列によってコードされる少なくとも１つの配列を含むポリペプチドを提供する。
【０１０６】
さらなる態様では、本発明は、本発明による少なくとも１つの抗体鎖またはそのフラグメントをコードする核酸分子を含む核酸構築体を提供する。いくつかの実施形態によれば、核酸構築体はプラスミドである。
【０１０７】
いくつかの実施形態によれば、プラスミドは、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、および配列番号４４からなる群から選択される配列に示される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０８】
さらに別の態様では、本発明は、上記で定められる特定のＣＤＲ配列および／または特定の重鎖および軽鎖可変領域を含む抗体または抗体フラグメントを産生することができる細胞を提供する。
【０１０９】
いくつかの実施形態によれば、細胞が提供され、上記で開示される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態によれば、細胞は、
ｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１がＳＹＹＩＨ（配列番号２５）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＹＮＥＲＦＫＧ（配列番号２６）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号２７）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＫＡＳＱＳＶＮＮＤＶＡ（配列番号２８）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＹＡＳＮＲＦＴ（配列番号２９）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＱＱＡＹＲＳＰＹＴ（配列番号３０）である、６つのＣＤＲのセット、
ｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１がＡＹＮＩＨ（配列番号９）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＹＩＹＰＮＮＧＧＳＧＹＮＱＫＦＭＮ（配列番号１０）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＦＤＹＤＥＡＷＦＩＹ（配列番号１１）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号１２）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号１３）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＦＱＧＳＧＳＰＹＴ（配列番号１４）である、６つのＣＤＲのセット、および
ｉｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１配列がＴＹＹＩＨ（配列番号１５）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＮＮＥＫＦＫＶ（配列番号１６）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号１７）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ（配列番号１８）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＹＡＳＮＲＹＴ（配列番号１９）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＱＱＤＹＳＳＰＹＴ（配列番号２０）である、６つのＣＤＲのセット、を含むモノクローナル抗体を産生することができる。
【０１１１】
各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１２】
いくつかの実施形態によれば、細胞はハイブリドーマ細胞においてモノクローナル抗体を産生する。
【０１１３】
本発明による抗体またはそのフラグメントは、細胞毒性部分、放射性部分、または識別可能な部分に結合され得る。
【０１１４】
本発明は、別の態様によれば、有効成分として、ヒトネクチン４を高い親和性および特異性で認識する少なくとも１つの抗体、抗体フラグメント、またはそのコンジュゲート、および任意に少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、塩、または担体を含む医薬組成物を提供し、当該少なくとも１つの抗体または抗体フラグメントはヒトネクチン４のヒトＴＩＧＩＴとの結合を阻害することができる。
【０１１５】
いくつかの実施形態によれば、本医薬組成物はネクチン４に特異的なｍＡｂを含み、ｍＡｂはいかなる毒素または抗腫瘍剤ともコンジュゲートされていない。
【０１１６】
いくつかの実施形態によれば、本医薬組成物は、上記に開示された可変領域およびＣＤＲ配列を有するｈＮｅｃ４．１１、ｈＮｅｃ４．０１、およびｈＮｅｃ４．０５からなる群から選択されるモノクローナル抗体に結合するヒトネクチン４タンパク質内のエピトープと結合することができるモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態によれば、本医薬組成物は、
ｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１が配列番号２５であり、ＨＣ  ＣＤＲ２が配列番号２６であり、ＨＣ  ＣＤＲ３が配列番号２７であり、ＬＣ  ＣＤＲ１が配列番号２８であり、ＬＣ  ＣＤＲ２が配列番号２９であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３が配列番号３０である、６つのＣＤＲのセット、
ｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１が配列番号９であり、ＨＣ  ＣＤＲ２が配列番号１０であり、ＨＣ  ＣＤＲ３が配列番号１１であり、ＬＣ  ＣＤＲ１が配列番号１２であり、ＬＣ  ＣＤＲ２が配列番号１３であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３が配列番号１４である、６つのＣＤＲのセット、または
ｉｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１配列が配列番号１５であり、ＨＣ  ＣＤＲ２が配列番号１６であり、ＨＣ  ＣＤＲ３が配列番号１７であり、ＬＣ  ＣＤＲ１は配列番号１８であり、ＬＣ  ＣＤＲ２が配列番号１９であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３が配列番号２０である、６つのＣＤＲのセット、を含む少なくとも１つのモノクローナル抗体を含む。
【０１１８】
各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１９】
いくつかの実施形態によれば、本医薬組成物は、配列番号３９、配列番号３５、および配列番号３７からなる群から選択される配列を有する重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す
【０１２０】
いくつかの実施形態によれば、本医薬組成物は、配列番号４０、配列番号３６、および配列番号３８からなる群から選択される配列を有する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２１】
特定の実施形態によれば、本医薬組成物は、配列番号３９で示される配列を有する重鎖可変領域および配列番号４０で示される配列を有する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む。
【０１２２】
特定の実施形態によれば、本医薬組成物は、配列番号３５で示される配列を有する重鎖可変領域および配列番号３６で示される配列を有する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む。
【０１２３】
特定の実施形態によれば、本医薬組成物は、配列番号３７で示される配列を有する重鎖可変領域および配列番号３８で示される配列を有する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む。
【０１２４】
また、ＮＫ細胞上に発現されるＴＩＧＩＴとのネクチン４の結合を阻害することによってＮＫ細胞毒性を回復することに使用するため、本発明による少なくとも１つの抗体、抗体フラグメント、または抗体コンジュゲートを含む医薬組成物が提供される。
【０１２５】
いくつかの実施形態によれば、抗体、抗体フラグメント、または抗体コンジュゲートは、Ｔ細胞上に発現されるＴＩＧＩＴとのヒトネクチン４の結合を阻害することができる。
【０１２６】
いくつかの実施形態によれば、本発明による医薬組成物は、癌免疫療法で、または免疫応答を増強することに使用するためのものである。
【０１２７】
いくつかの実施形態によれば、本医薬組成物はさらにＴＩＧＩＴを発現するヒトリンパ球を含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態によれば、ヒトリンパ球は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ細胞）からなる群から選択されるキラー細胞である。
【０１２９】
いくつかの実施形態によれば、キラー細胞は自己または同種異系である。
【０１３０】
いくつかの実施形態によれば、本医薬組成物は、ＴＩＧＩＴを発現する自己または同種異系ＮＫ細胞を含む。
【０１３１】
本発明による組成物によって治療可能な癌は、ネクチン４を発現する任意の癌であり得る。いくつかの実施形態によれば、癌はネクチン４を過剰発現する。本発明のいくつかの実施形態によれば、癌は転移性癌である。いくつかの実施形態によれば、本発明による医薬組成物は、転移の形成または分布を阻害すること、または対象における転移の総数を減少させることに使用するためのものである。
【０１３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、癌は、黒色腫、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌、結腸癌、子宮頸癌、腎臓癌、肺癌、甲状腺癌、前立腺癌、脳癌、腎癌、喉癌、喉頭癌、膀胱癌、肝癌、線維肉腫、子宮内膜細胞癌、神経膠芽細胞腫、肉腫、骨髄性、白血病、およびリンパ腫からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３３】
いくつかの実施形態によれば、癌は固形癌である。いくつかの特定の実施形態によれば、固形癌は、乳癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌、および卵巣癌からなる群から選択される。
【０１３４】
他の実施形態によれば、癌は血液癌である。いくつかの実施形態によれば、本医薬組成物は癌の治療に使用する場合、ヒトリンパ球を伴う。
【０１３５】
いくつかの実施形態によれば、ヒトリンパ球は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞からなる群から選択されるキラー細胞である。
【０１３６】
いくつかの実施形態によれば、キラー細胞は自己または同種異系である。
【０１３７】
いくつかの実施形態によれば、キラー細胞はＮＫ細胞である。
【０１３８】
いくつかの実施形態によれば、本発明による医薬組成物は、ウイルス感染を予防または治療することに使用するためのものである。
【０１３９】
いくつかの実施形態によれば、本医薬組成物は、麻疹ウイルスによる感染を予防する使用のためのものである。
【０１４０】
さらに別の態様によれば、本発明は、上記で定められるモノクローナル抗体または抗体フラグメントを使用することによって、ヒトネクチン４のＴＩＧＩＴとの結合を阻害する方法を提供する。
【０１４１】
さらに別の態様によれば、本発明は癌を治療する方法を提供し、それを必要とする対象に、ネクチン４と結合する抗体またはそのフラグメントを投与することを含み、抗体またはそのフラグメントはいかなる毒素または抗腫瘍剤にもコンジュゲートされていない。
【０１４２】
追加の態様によれば、本発明は、免疫応答を増強するための方法を、それを必要とする対象において提供し、当該対象に上記で定められるモノクローナル抗体、抗体フラグメント、または抗体コンジュゲートの治療有効量を投与することを含む。
【０１４３】
さらに別の態様によれば、本発明は、癌を治療する方法を提供し、それを必要とする対象に、ヒトネクチン４を高い親和性および特異性で認識してそのリガンドＴＩＧＩＴとのその結合を阻害することができる、少なくとも１つの抗体またはその抗体フラグメントを治療有効量含む医薬組成物を投与することを含む。
【０１４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、治療有効量は、対象における腫瘍サイズまたは転移数の減少をもたらす。
【０１４５】
いくつかの実施形態によれば、本方法は、いずれの毒素または抗腫瘍剤ともコンジュゲートされていないｍＡｂを含む医薬組成物を投与することを含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態によれば、癌を治療する方法は、少なくとも１つの追加の抗癌療法を投与または実施することを含む。特定の実施形態によれば、追加の抗癌療法は、手術、化学療法、放射線療法、または免疫療法である。
【０１４７】
いくつかの実施形態によれば、癌を治療する方法は、ヒトネクチン４を高い親和性および特異性で認識するモノクローナル抗体および追加の抗癌剤の投与を含む。いくつかの実施形態によれば、追加の抗癌剤は、免疫調節剤、活性化リンパ球細胞、キナーゼ阻害剤、および化学療法剤からなる群から選択される。
【０１４８】
他の実施形態によれば、追加の免疫調節剤は、ヒトネクチン４以外の抗原と結合する抗体、抗体フラグメント、または抗体コンジュゲートである。
【０１４９】
いくつかの実施形態によれば、追加の免疫調節剤は、免疫チェックポイント分子に対する抗体である。いくつかの実施形態によれば、追加の免疫調節剤は、ヒトプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、ＰＤ−Ｌ１、およびＰＤ−Ｌ２、癌胚性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、ＣＤ１３７、ＯＸ４０（ＣＤ１３４とも呼ばれる）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ、ＣＴＬＡ−４、ＮＫＧ２Ａ、ＧＩＴＲ、ならびにその他のチェックポイント分子またはそれらの組み合わせからなる群から選択される免疫チェックポイント分子に対する抗体である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１５０】
いくつかの実施形態によれば、抗癌剤は、Ｅｒｂｉｔｕｘ、シタラビン、フルダラビン、フルオロウラシル、メルカプトプリン、メトトレキサート、チオグアニン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、カルムスチン、ロムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シスプラチン、カルボプラチン、イホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、チオテパ、ダカルバジン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、エトポシド、テニポシド、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１５１】
いくつかの実施形態によれば、抗癌剤は上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤である。いくつかの実施形態によれば、ＥＧＦＲ阻害剤は、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））、およびネシツムマブ（Ｐｏｒｔｒａｚｚａ（登録商標））からなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、ＥＧＦＲ阻害剤はセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））である。
【０１５２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、対象はヒト対象である。
【０１５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本使用はさらに、免疫共阻害受容体の活性または発現を下方調節する薬剤の使用を含む。
【０１５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、免疫細胞はＴ細胞である。
【０１５５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、免疫共阻害受容体は、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７Ｈ４、ＣＤ９６、ＢＹ５５、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ１０、および２Ｂ４からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１５６】
一態様によれば、本発明は、免疫系の機能および／または活性を調節するための方法を提供し、ネクチン４のＴＩＧＩＴとの結合を本発明による抗体を使用して調節することを含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態によれば、癌を治療する方法は、対象における転移の形成、増殖、または拡散を防止または低減することを含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態によれば、癌を治療する方法は、それを必要とする対象に、ヒトネクチン４のヒトＴＩＧＩＴとの結合を阻害することができるｍＡｂまたはその抗体フラグメントを含む医薬組成物を投与し、さらに当該対象のヒトリンパ球を投与することを含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態によれば、ヒトリンパ球は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞からなる群から選択されるキラー細胞である。
【０１６０】
いくつかの実施形態によれば、キラー細胞は自己または同種異系である。
【０１６１】
いくつかの実施形態によれば、キラー細胞はＮＫ細胞である。
【０１６２】
本発明はまた、ウイルス感染を予防または治療する方法を提供し、対象にヒトネクチン４に特異的な少なくとも１つのｍＡｂ、または少なくとも抗原結合ドメインを含むそのフラグメントを投与することを含み、当該ｍＡｂまたはそのフラグメントはネクチン４のＴＩＧＩＴとの結合を阻害することができる。
【０１６３】
いくつかの実施形態によれば、麻疹ウイルスによる感染を予防する方法が提供され、ヒトネクチン４に特異的なｍＡｂ、または少なくとも抗原結合ドメインを含むそのフラグメントを投与することを含み、当該ｍＡｂまたはそのフラグメントは上皮細胞で発現されるヒトネクチン４との麻疹ウイルスの結合を阻害することができる。いくつかの実施形態によれば、細胞は上皮細胞である。一態様によれば、本発明は、対象における癌または感染性疾患を診断または予後診断する方法を提供し、本方法は、当該対象の生物学的試料におけるネクチン４の発現レベルを、本明細書で説明される少なくとも１つの抗体を使用して決定することを含む。
【０１６４】
さらに別の態様によれば、本発明は癌を治療する方法を提供し、それを必要とする対象に、本明細書で説明されるＣＡＲ分子を含む細胞の治療有効量を投与することを含む。
【０１６５】
本発明はさらに、別の態様によれば、ネクチン４の発現を決定または定量する方法を含み、本方法は生物学的試料を抗体または抗体フラグメントと接触させること、および複合体形成のレベルを測定することを含み、抗体または抗体フラグメントは、
ｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１が配列番号２５であり、ＨＣ  ＣＤＲ２が配列番号２６であり、ＨＣ  ＣＤＲ３が配列番号２７であり、ＬＣ  ＣＤＲ１が配列番号２８であり、ＬＣ  ＣＤＲ２が配列番号２９であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３が配列番号３０である、６つのＣＤＲのセット、
ｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１が配列番号９であり、ＨＣ  ＣＤＲ２が配列番号１０であり、ＨＣ  ＣＤＲ３が配列番号１１であり、ＬＣ  ＣＤＲ１が配列番号１２であり、ＬＣ  ＣＤＲ２が配列番号１３であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３が配列番号１４である、６つのＣＤＲのセット、または
ｉｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１配列が配列番号１５であり、ＨＣ  ＣＤＲ２が配列番号１６であり、ＨＣＣＤＲ３が配列番号１７であり、ＬＣ  ＣＤＲ１が配列番号１８であり、ＬＣ  ＣＤＲ２が配列番号１９であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３が配列番号２０である、６つのＣＤＲのセット、を含む。
【０１６６】
決定および定量する方法は、いくつかの実施形態に従ってインビトロまたはエクスビボで実施され得、またはネクチン４の発現と関連する状態を診断することに使用され得る。本発明による抗体はまた、スクリーニング方法を構成するために使用され得る。例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ならびにＩＨＣまたはＦＡＣＳなどの方法は、本抗体および当技術分野で知られている方法を使用して分泌性または細胞関連ポリペプチドのレベルを測定するために構築することができる。
【０１６７】
いくつかの実施形態によれば、細胞で発現される、または生物学的メディウムに分泌されるネクチン４の存在を検出または定量するための方法は、
ｉ．試料をヒトネクチン４に特異的な抗体または少なくとも抗原結合部分を含むその抗体フラグメントとともにインキュベーションするステップ、
ｉｉ．結合したネクチン４を検出可能なプローブを使用して検出するステップを含む。
【０１６８】
いくつかの実施形態によれば、本方法はさらに、
ｉｉｉ．（ｉｉ）の量を、ネクチン４の既知量を含む参照試料から得られる標準曲線と比較するステップ、および
ｉｖ．試料中のネクチン４の量を標準曲線から計算するステップを含む。
【０１６９】
いくつかの特定の実施形態によれば、試料は体液である。
【０１７０】
いくつかの実施形態によれば、本方法はインビトロまたはエクスビボで実施される。
【０１７１】
生物学的試料におけるネクチン４の発現または存在を測定するためのキットもまた提供され、本発明による少なくとも１つの抗体または抗体フラグメントを含む。いくつかの実施形態によれば、本キットは、
ｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１が配列番号２５であり、ＨＣ  ＣＤＲ２が配列番号２６であり、ＨＣ  ＣＤＲ３が配列番号２７であり、ＬＣ  ＣＤＲ１が配列番号２８であり、ＬＣ  ＣＤＲ２が配列番号２９であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３が配列番号３０である、６つのＣＤＲのセット、
ｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１が配列番号９であり、ＨＣ  ＣＤＲ２が配列番号１０であり、ＨＣ  ＣＤＲ３が配列番号１１であり、ＬＣ  ＣＤＲ１が配列番号１２であり、ＬＣ  ＣＤＲ２が配列番号１３であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３が配列番号１４である、６つのＣＤＲのセット、または
ｉｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１配列が配列番号１５であり、ＨＣ  ＣＤＲ２が配列番号１６であり、ＨＣＣＤＲ３が配列番号１７であり、ＬＣ  ＣＤＲ１が配列番号１８であり、ＬＣ  ＣＤＲ２が配列番号１９であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３が配列番号２０である、６つのＣＤＲのセット、を含む。
【０１７２】
一態様によれば、本発明は癌を検出するためのキットを提供し、診断キットは本明細書で開示される抗体またはその抗体フラグメントを含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態によれば、本発明は免疫関連疾患または増殖性疾患を診断、重症度を評価、または病期分類する方法を提供し、本発明による抗体あるいはそのフラグメントまたはコンジュゲートを使用して、対象に由来する試料におけるネクチン４の発現、濃度、または活性を決定すること、およびネクチン４の発現または活性を、ネクチン４の発現、濃度、または活性の参照量と比較することを含む。当該参照量は、正常な対象から、その疾患の異なる病期にある際に同一対象から採取された試料から得ることができ、または対象の大集団の臨床データから決定される。
【０１７４】
本発明のさらなる実施形態および適用可能性の全範囲は、以下に与えられる詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の精神および範囲内での様々な変更および修正は、この詳細な説明から当業者に明らかになるであろうから、詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、単に例示として与えられているにすぎないことは理解されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】免疫細胞（ＮＫ）および腫瘍細胞でＴＩＧＩＴシグナル伝達に含まれる受容体の模式図。抗ネクチン４Ａｂが示される。
【図２】抗体クローンｈＮｅｃ４．０５およびｈＮｅｃ４．０１は、ＴＩＧＩＴ−ネクチン４相互作用の最も優れた遮断能力を示す。グラフは、ネクチン４でトランスフェクションされたＲＡＪＩバーキットリンパ腫細胞のＦＡＣＳ染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を示す。細胞を０．２μｇの異なるクローン（表示の通り）ともにインキュベーションし、次に３μｇのＴＩＧＩＴ−Ｉｇとインキュベーションし、続いて抗ヒト二次抗体で染色した。
【図３】ネクチン４に対する抗体クローンの結合親和性の定量化。マイクロスケール熱泳動で観察されたフルオロフォア標識ネクチン４−Ｉｇと抗体クローンｈＮｅｃ４．０５およびクローンｈＮｅｃ４．０１の結合。測定は少なくとも３つの独立したタンパク質調製物を用いて繰り返し、結果の平均を示す（±ＳＥＭ）。
【図４】図４Ａ−図4Ｂ。抗体クローンｈＮｅｃ４．０５およびｈＮｅｃ４．０１はＮｅｃｔｉｎ４を遮断し、ＮＫ細胞毒性を増加させる。［３５Ｓ］メチオニン標識した、（４Ａ）ネクチン４でトランスフェクションされたＲＡＪＩバーキットリンパ腫細胞、（４Ｂ）ＬＮＣａｐ前立腺癌細胞（自然発現性ネクチン４）を、コントロール抗体としてのマウスＩｇＧ１または抗ネクチン４抗体ｈＮｅｃ４．０１もしくはｈＮｅｃ４．０５のいずれかの１μｇ／ウェルとともにインキュベーションした。１時間後、細胞にＮＫ細胞を補充し、５時間インキュベーションした。ＮＫ：癌細胞の様々なエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比における平均特異的死滅（±ｓｄ）がプロットされている。＊は、コントロール抗体と比較したｈＮｅｃ４．０１およびｈＮｅｃ４．０５クローンの有意な効果（ｐ＜０．０５）を示す。図は、実施された３回のうちの１回の代表的な実験を示す。同じ効果が、すべて乳癌細胞株であるＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＳＫ−ＢＲ−３、およびＴ４７Ｄ細胞によって決定された。
【図５】図５Ａ−図５Ｃ。抗体クローンはネズミネクチン４と結合しない。（Ａ）ネズミネクチン４（ｍネクチン４として表示）でトランスフェクションされ、市販の抗ネズミネクチン４ｍＡｂ（フローサイトメトリーでは機能しないクローン３５６７０４）によって検出されたＲＡＪＩ細胞のウエスタンブロット。発現を空ベクター（空として表示）を発現するＲＡＪＩ細胞と比較した。ｈＧＡＰＤＨの染色を負荷コントロールとして使用した。（Ｂ〜Ｃ）ネズミネクチン４でトランスフェクションされたＲＡＪＩ細胞のＦＡＣＳ染色（黒色線ヒストグラム）。細胞を０．２μｇの（Ｂ）クローンｈＮｅｃ４．０１または（Ｃ）クローンｈＮｅｃ４．０５によって染色した。
【図６】図６Ａ−図６Ｃ。ネクチン４−ネクチン１相互作用の遮断。（Ａ〜Ｂ）ヒト−ネクチン４でトランスフェクションされたＲＡＪＩ細胞のＦＡＣＳ染色。細胞を１μｇの（Ａ）クローンｈＮｅｃ４．０１、または（Ｂ）クローンｈＮｅｃ４．０５とともにプレインキュベーションし、次に３μｇのネクチン１−Ｉｇとインキュベーションした（黒色線ヒストグラム）。遮断のない染色は灰色線で表す。灰色で塗りつぶされたヒストグラムは、二次抗体のみのバックグラウンドコントロール染色である。（Ｃ）ＡおよびＢのＦＡＣＳ染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値。
【図７】図７Ａ−図７Ｃ。抗ネクチン４ｍＡｂのインビボ効果。（Ａ）空ベクター（ＥＶ）または過剰発現（ＯＥ）ネクチン４のいずれかによってトランスフェクションされた５×１０６個のＲａｊｉ細胞を、単独で（左パネル、ＮＫなし）または１×１０６個のＮＫ細胞とともに（右パネル、ＮＫ）、ＳＣＩＤベージュマウスに皮下移植した。（Ｂ）ネクチン４を過剰発現する５×１０６個のＲａｊｉ細胞を、１×１０６ＮＫ細胞とともにＳＣＩＤベージュマウスに皮下移植した。マウスを７５ｕｇのコントロールＡｂまたは抗ネクチン４クローンｈＮｅｃ４．０５ｍＡｂのいずれかで、週２回腹腔内注入によって処置した。（Ｃ）５×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を、単独、または７×１０５個のＮＫ細胞とともにＳＣＩＤベージュマウスの皮下に移植した。次に、マウスを（Ｂ）と同様に処置した。腫瘍注入後２１日（Ａ）、２７日（Ｂ）、または２３日（Ｃ）に腫瘍を採取して秤量した。すべてのマウス実験群でＮ＝７。（＊）ｐ＜０．０５。
【図８】図８Ａ−図８Ｃ。細胞表面ネクチン−４に結合する抗体クローンｈＮｅｃ４．０５およびｈＮｅｃ４．１１。（Ａ）ヒト細胞株ＭＤＡ−ＭＤ−４５３で発現されたネクチン−４と結合する抗体をＦＡＣＳ分析によって評価した。各クローンについてＡｂ結合（２０〜０．０１ｎＭの範囲）の力価測定後に計算されたＥＣ５０値、および最大結合シグナルが示される。注目すべきことに、同様の結果が、マウスＩｇＧ１ＦｃがヒトＦｃに置換されたＡｂのキメラ型で示された。（Ｂ）カニクイザル（Ｃｙｎｏ）−ネクチン−４によってトランスフェクションされて、Ａと同様に分析されたＣＨＯ細胞に結合する抗体。（Ｃ）ネズミ−ネクチン−４によってトランスフェクションされて、Ａと同様に分析されたＣＨＯ細胞に結合する抗体。ＮＤは、検出されず。
【図９】図９Ａ−図９Ｄ。抗体クローンｈＮｅｃ４．０５およびｈＮｅｃ４．１１は、ネクチン−４のそのリガンドであるＴＩＧＩＴおよびネクチン−１との結合を遮断する。ネクチン−４リガンドの結合を、ＦＡＣＳ分析によって評価した。ヒト−ネクチン−４でトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を、ヒトＴＩＧＩＴ−Ｉｇ（ＡおよびＣ）またはヒトネクチン−１−Ｉｇ（ＢおよびＤ）のいずれかと、共に２０ｕｇ／ｍｌで、抗ネクチン−４クローンであるｈＮｅｃ４．０５（ＡおよびＢ）またはクローンｈＮｅｃ４．１１（ＣおよびＤ）の共に８ｕｇ／ｍｌの添加または無添加でインキュベーションした。抗ネクチン−４抗体による強力な結合阻害がすべての例で示される。残りのシグナルは、抗ネクチン−４Ａｂによる影響を受けないＰＶＲなどのＣＨＯ細胞によって発現される他の受容体と結合するリガンドに起因している可能性がある。
【図１０】図１０Ａ−図１０Ｂ。ヒトＩｇＧ１キメラＡｂクローンｈＮｅｃ４．０５およびｈＮｅｃ４．１１は、腫瘍細胞の存在下でＮＫ細胞の活性化を高める。ヒトＮＫ細胞（エフェクター、Ｅ）を、標的細胞（Ｔ）ＨＴ１３７６（Ａ）およびＭＤＡ−ＭＤ−４５３（Ｂ）とＥ：Ｔ比が２：１でインキュベーションした。インキュベーションは、１２ｕｇ／ｍｌキメラクローンｈＮｅｃ４．０５およびｈＮｅｃ４．１１またはコントロールｈＩｇＧ１の存在下で行った。２時間後、ＮＫ細胞を脱顆粒化および活性化状態について、ＣＤ１０７ａ発現のＦＡＣＳ分析によってアッセイした。コントロールｈＩｇＧ１の存在下でのＮＫ細胞の脱顆粒化を１として設定し、それに応じて誘導倍率を計算した。示されているのは、２〜３回の繰り返しの平均およびそれらの正規化したＳＤである。
【図１１】図１１Ａ−図１１Ｄ。ｈＮｅｃ４．１１によって駆り立てられるＣＡＲ−Ｔは、ネクチン−４を発現する腫瘍細胞の存在下で特異的なＴ細胞の活性化をもたらす。（Ａ）ＣＡＲＴ構築体の概略図。（Ｂ）ジャーカット細胞に、構築体およびＧＦＰをコードするレンチ粒子を形質導入した。形質導入有効性は、ＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析によって判断したときに９９％を超えた。（Ｃ）親ジャーカット細胞またはＣＡＲＴ構築体を発現するジャーカット細胞（ジャーカットｐＨＡＧＥ２．４．１１）を、標的細胞ＨＴ１３７６またはＭＤＡ−ＭＤ−４５３（ＭＤＡ−４５３）と４８時間インキュベーションし、その後、培地を収集し、ジャーカット活性化を評価する方法としてＩＬ−２濃度について試験した。ＩＬ−２の分泌は、ＣＡＲＴ発現によって有意に誘発された（＊＝０．００３、＊＊＝０．０００１４、両側スチューデント検定）。示されているのは、実施された２つの代表的な実験である。（Ｄ）健康なドナーに由来するＰＢＭＣに、ＣＡＲＴ構築体を使用して形質導入した。ＣＡＲＴ  ＰＢＭＣを、Ｅ：Ｔ（Ｘ軸に表示）の範囲にわたってＨＴ１３７６細胞とインキュベーションした。アスタリスクでマークされているところは標的細胞の死滅が有意だった（＊＊＊ｐ＜７×１０−５）。
【発明を実施するための形態】
【０１７６】
本発明は、ヒトネクチン４に特異的である有効なモノクローナル抗体を提供する。本発明はまた、ｍＡｂの治療剤としての製造および使用を提供する。特に、本発明のｍＡｂは、免疫細胞の抗腫瘍殺活性を回復および増強するため、そして診断用試薬として使用され得る。
【０１７７】
以前の刊行物は、ネクチン４を過剰発現する腫瘍細胞に薬剤を標的化するために抗ネクチン４ｍＡｂの使用を示しているが、本発明は、ＮＫ細胞などの免疫細胞の抑制受容体ＴＩＧＩＴとネクチン４との結合を阻害することによって、免疫系を腫瘍細胞に対して直接的に増強するモノクローナル抗体を初めて開示する。
【０１７８】
本発明の抗体は、現在癌の治療について試験されているＴＩＧＩＴに特異的な抗体の欠点を克服する。伝えられるところでは、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴ受容体を発現するすべての免疫細胞を遮断することによって免疫系全体を活性化に対して歪め、潜在的に自己免疫効果を引き起こし得るが、本発明の抗ネクチン４抗体は、腫瘍で過剰発現されることが知られているネクチン４発現細胞のみを標的にする。
【０１７９】
さらに、本発明の抗体のいくつかはまた、潜在的にネクチン４のネクチン１との相互作用を遮断するそれらの能力を介して、腫瘍細胞の免疫非依存的な死滅をもたらし得る。
【０１８０】
本明細書で使用される「抗原」という用語は、抗体形成を誘発することができ、抗体によって特異的に結合されることができる分子または分子の一部を指す。抗原は、１つ以上のエピトープを有し得る。上記で言及される特異的結合は、抗原が高度に選択的な方式で対応する抗体と反応するが、他の抗原によって誘発され得る他の多数の抗体とは反応しないことを示すことを意味する。本発明のいくつかの実施形態による抗原は、ネクチン４タンパク質である。
【０１８１】
「ネクチン４」または「ネクチン細胞接着分子４」という用語は、本明細書で使用されるとき、５１０個のアミノ酸および５５４５４Ｄａの分子量のシングルパスＩ型膜タンパク質を指し、ＰＶＲＬ４、ＬＮＩＲ、ＰＲＲ４、およびＥＤＳＳ１としても知られている。ネクチン４タンパク質には、２つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）Ｃ２型ドメインおよび１つのＩｇ様Ｖ型ドメインが含まれる。それは、経−同種親和性および−異種親和性相互作用を通した細胞接着に含まれる。可溶型はメタロプロテイナーゼＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥによる細胞表面でのタンパク質分解切断によって生成され、分泌型は乳房腫瘍細胞株および乳房腫瘍患者の両方に認められている。本発明による例示的なネクチン４は、ＳｗｉｓｓＰｏｒｔ、ＵｎｉＰｏｒｔ、およびＧｅｎＢａｎｋのシンボルまたは登録番号として、Ｑ９６ＮＹ８−ＮＥＣＴ４＿ＨＵＭＡＮ、Ｑ９６ＮＹ８、Ｂ４ＤＱＷ３、Ｑ９６Ｋ１５、Ｑ９６ＮＹ８−１、Ｑ９６ＮＹ８−２、ＥＮＳＰ０００００３５６９９１、ＮＰ＿１１２１７８．２；ＸＰ＿００５２４５５６５．１、ＸＰ＿０１１５０８３２３．１、ＸＰ＿０１１５０８３２４．１、またはＸＰ＿０１１５０８３２５．１で示される。
【０１８２】
本発明による抗体またはそのフラグメントは、ネクチン４のエピトープと結合する。具体的には、抗体はネクチン４タンパク質配列の外部ドメイン（細胞外部分）内のエピトープと結合する。
【０１８３】
本明細書で使用される「抗原決定基」または「エピトープ」という用語は、特定の抗体と特異的に反応する抗原分子の領域を指す。エピトープに由来するペプチド配列は、単独で、または担体部分と結合して使用され、当技術分野で知られている方法を適用して、動物を免疫して、追加のポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成することができる。エピトープに由来する単離されたペプチドは、抗体を検出する診断方法で使用され得る。
【０１８４】
親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｓｃａｒａｎｏ  Ｓ，Ｍａｓｃｉｎｉ  Ｍ，Ｔｕｒｎｅｒ  ＡＰ，Ｍｉｎｕｎｎｉ  Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｆｏｒ  ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｂａｓｅｄ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ．Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０１０，２５：９５７−６６に記載されている）などの既知の方法を使用して定量化することができ、例えば、解離定数Ｋｄを使用して計算することができ、Ｋｄが低いほど高い親和性を反映することに留意すべきである。
【０１８５】
抗体、または免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によってともに連結された２つの重鎖および２つの軽鎖を含み、各軽鎖はそれぞれの重鎖とジスルフィド結合によって「Ｙ」字型形状で結合される。抗体のタンパク質分解消化は、Ｆｖ（可変フラグメント）およびＦｃ（結晶フラグメント）ドメインを生じる。抗原結合ドメインであるＦａｂには、ポリペプチド配列が変化する領域が含まれる。Ｆ（ａｂ’）２という用語は、ジスルフィド結合によってともに結合された２つのＦａｂ’アームを表す。抗体の中心軸はＦｃフラグメントと呼ばれる。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、いくつかの定常ドメイン（ＣＨ）が続く。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）、およびその他端に定常ドメイン（ＣＬ）を有し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列され、軽鎖定常ドメインは重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列される。軽鎖と重鎖の各対の可変ドメインが抗原結合部位を形成する。軽鎖と重鎖のドメインは同じ全体構造を有し、各ドメインは４つのフレームワーク領域を含み、それらの配列は比較的保存されており、相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）として知られる３つの超可変ドメインによって結合されている。これらのドメインは、抗原結合部位の特異性および親和性に寄与する。
【０１８６】
所与の重鎖または軽鎖可変配列からのＣＤＲの同定または決定は、通常、当技術分野で知られている数少ない方法のうちの１つを使用して行われる。たとえば、このような決定は、Ｋａｂａｔ（ＷｕＴ．Ｔ  ａｎｄ  ＫａｂａｔＥ．Ａ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１９７０；１３２：２１１−５０）およびＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｍ−Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３、２７：５５−７７）に従ってなされる。
【０１８７】
「配列を有するＣＤＲ」という用語または同様な用語が使用されるとき、それはＣＤＲが特定された配列を含むという選択肢、およびＣＤＲが特定された配列からなるという選択肢も含む。
【０１８８】
抗体の抗原特異性は、超可変領域（ＨＶＲ）、つまり、抗原結合部位をともに形成する軽鎖および重鎖の両方の特有のＣＤＲ配列に基づいている。
【０１８９】
重鎖のアイソタイプ（ガンマ、アルファ、デルタ、イプシロン、またはミュー）は、免疫グロブリンクラス（それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ）を決定する。軽鎖は２つのアイソタイプ（カッパ、κまたはラムダ、λ）のいずれかである。両アイソトープはすべての抗体クラスに認められる。
【０１９０】
「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体（全長またはインタクトのモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多価抗体、および所望の生物学的活性、すなわちヒトネクチン４との結合を示すのに十分な長さの抗体フラグメントを含む。
【０１９１】
本発明による抗体または複数の抗体には、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）などのインタクト抗体、ならびにＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントなどのそのタンパク質分解フラグメントが含まれる。単鎖抗体も本発明の範囲内に含まれる。
【０１９２】
抗体フラグメント
「抗体フラグメント」は、インタクト抗体の一部分のみを含み、一般的に、インタクト抗体の抗原結合部位を含み、したがって抗原と結合する能力を保持する。本定義によって包含される抗体フラグメントの例には、（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、およびＣＨ１ドメインを有するＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を有するＦａｂフラグメントであるＦａｂ’フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦｄフラグメント、（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を有するＦｄ’フラグメント、（ｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを有するＦｖフラグメント、（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８９，３４１，５４４−５４６）、（ｖｉｉ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ’フラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｘ）単鎖抗体分子（例えば、単鎖Ｆｖ、ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８８，２４２，４２３−４２６、およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１９８８，８５，５８７９−５８８３）、（ｘ）２つの抗原結合部位を有し、同一ポリペプチド鎖に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と結合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む「二重特異的抗体」（例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，６４４４−６４４８）、（ｘｉ）相補的な軽鎖ポリペプチドとともに抗原結合領域の対を形成するタンデムＦｄセグメントの対（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む「線状抗体」（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１９９５、８、１０５７−１０６２、および米国特許第５，６４１，８７０号）が含まれる。
【０１９３】
様々な技術が抗体フラグメントの生成のために開発されている。伝統的に、これらのフラグメントは、インタクト抗体のタンパク質分解消化を介して派生された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照）。しかし、これらのフラグメントは現在、組換え宿主細胞によって直接的に生成することができる。例えば、抗体フラグメントは、抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを大腸菌から直接的に回収し、化学的に結合してＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１６３−１６７（１９９２））。別の取り組みによれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは組換え宿主細胞培養から直接的に単離することができる。抗体フラグメントの生成のための他の技術は、当業者には明らかであろう。他の実施形態では、選択される抗体は単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。
【０１９４】
単鎖抗体は、抗原結合能力を有し、免疫グロブリン軽鎖および重鎖の可変領域と相同的または類似的であるアミノ酸配列を含む単鎖複合ポリペプチド、すなわち連結されたＶＨ−ＶＬまたは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であることができる。単鎖抗体（米国特許第４，９４６，７７８号）を生成するための技術は、ネクチン４に対する単鎖抗体を生成するために適応することができる。
【０１９５】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、ほとんど均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る自然発生的な変異の可能性以外は同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一抗原に対して向けられる。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対して向けられる。修飾語句「モノクローナル」は、いずれかの特定の方法によって抗体の生成を必要とすると解釈されるべきではない。ｍＡｂは、当業者に知られている方法によって得ることができる。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ１９７５、２５６、４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって生成され得、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号）によって生成され得る。モノクローナル抗体はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ１９９１，３５２，６２４−６２８またはＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９１，２２２：５８１−５９７に記載されている技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【０１９６】
機能的可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）遺伝子の迅速な同定およびクローニングを通したモノクローナル抗体に由来する組換え一価抗原結合分子の設計および開発、ならびに組換え細菌における発現に最適化された合成ＤＮＡ配列の設計およびクローニングは、Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｔ．２０１３、８（６）：１１２５−４８に記載されている。
【０１９７】
本発明のｍＡｂは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＤを含む任意の免疫グロブリンクラスのものであり得る。ｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養することができる。高力価のｍＡｂはインビボ産生によって得ることができ、個々のハイブリドーマからの細胞を未処置の準備したＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入して、高濃度で所望のｍＡｂを含む腹水を生成する。ｍＡｂは、当業者によく知られている方法を使用して、そのような腹水から、または培養上清から精製され得る。
【０１９８】
本発明の抗体の超可変領域と特異的に免疫反応性である抗イディオタイプ抗体もまた含まれる。
【０１９９】
本発明は、軽鎖の３つのＣＤＲおよび重鎖の３つのＣＤＲを含む抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含むモノクローナル抗体または抗体フラグメントを提供し、当該ＡＢＤは、（ｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む重可変鎖および配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽可変鎖（本明細書ではｈＮｅｃ４．１１として識別される）、（ｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重可変鎖および配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽可変鎖（本明細書ではｈＮｅｃ４．０１として識別される）、または（ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重可変鎖および配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽可変鎖（本明細書ではｈＮｅｃ４．０５として識別される）を含むモノクローナルマウス抗体のＡＢＤと少なくとも９０％の配列同一性または類似性を有する。そのような抗体は、抗体ｈＮｅｃ４．１１、ｈＮｅｃ４．０１、またはｈＮｅｃ４．０５の対応するＡＢＤと少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８、少なくとも９９％の配列同一性または類似性、あるいは１００％の配列同一性を有するＡＢＤドメインを有し得る。
【０２００】
配列同一性は、２つの異なる配列間で正確に一致するアミノ酸またはヌクレオチドの量である。配列類似性によって、アミノ酸の保存的置換を同一のアミノ酸として決定することができる。
【０２０１】
本発明はまた、本発明による抗体分子の保存的アミノ酸変異体を提供する。本発明による変異体はまた、コードされたタンパク質の全分子構造を保存するものとして生成され得る。開示されるタンパク質生成物を構成する個々のアミノ酸の特性を考えると、いくつかの合理的な置換が当業者によって認識されるであろう。アミノ酸置換、すなわち「保存的置換」は、例えば、極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または含まれる残基の両親媒性の性質における類似性に基づいてなされ得る。本明細書で使用される「抗体類似体」という用語は、別の抗体から１つ以上の保存的アミノ酸置換によって派生される抗体を指す。
【０２０２】
本明細書で使用される「抗体変異体」という用語は、本発明の抗体を含む任意の分子を指す。例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントが別の化学的実体と結合されている融合タンパク質は、抗体変異体とみなされる。
【０２０３】
抗体の配列の類似体および変異体もまた、本出願の範囲内である。これらには、限定されないが、配列内のアミノ酸の保存的および非保存的な置換、挿入、および欠失が含まれる。そのような改変および得られる抗体類似体または変異体は、それらがヒトネクチン４との抗体の結合を付与する、または改善さえする限り、本発明の範囲内にある。
【０２０４】
当業者に知られているアミノ酸の保存的置換は、本発明の範囲内である。保存的アミノ酸置換には、１つのアミノ酸を同じタイプの官能基または側鎖、例えば、脂肪族、芳香族、正電荷、負電荷を有する別のものによって交換することを含む。これらの置換は、経口生物学的利用能、浸透、および特定の細胞集団への標的化、免疫原性などを増強し得る。当業者は、コードされた配列中の単一のアミノ酸または小さい割合のアミノ酸を変更、追加、または削除する、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失、または付加が、「保存的に改変された変異体」であり、変更が化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらすことを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸をもたらす保存的置換リストは、当技術分野でよく知られている。例えば、当技術分野で知られている１つのリストにより、以下の６つの群は各々、互いが保存的置換であるアミノ酸を含む。
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【０２０５】
変異鎖配列は、特定のプライマーを使用したシークエンシング法によって決定されることが強調されるべきである。同じ配列で使用される異なるシークエンシング法は、技術的な問題および異なるプライマーにより、特に配列末端で、わずかに異なる配列をもたらし得る。したがって、抗ネクチン４可変鎖配列の異なる変異体が本出願に従って特定される。
【０２０６】
本明細書で使用される「抗体の抗原結合部分を有する分子」および「抗原結合フラグメント」という用語は、任意のアイソタイプで任意の動物細胞株または微生物によって生成されるインタクト免疫グロブリン分子だけでなく、その抗原結合反応性画分、限定されないが、例えばＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、その重鎖および／または軽鎖の可変部分、Ｆａｂミニ抗体（例えば、ＷＯ９３／１５２１０、米国特許出願第０８／２５６，７９０号、ＷＯ９６／１３５８３、米国特許出願第０８／８１７，７８８号、ＷＯ９６／３７６２１、米国特許出願第０８／９９９，５５４号を参照）、およびそのような反応性画分を組み込む単鎖抗体、ならびに抗体反応性画分が物理的に挿入されている任意の他のタイプの分子を含むことが意図されている。そのような分子は任意の既知の技術によって提供され得、限定されないが、酵素的切断、ペプチド合成、または組換え技術が含まれる。
【０２０７】
本明細書におけるモノクローナル抗体は特に「キメラ」抗体を含み、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来する、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であり、一方、鎖（複数可）の残りの部分は、別の種に由来する、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、ならびにそれらが所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体のフラグメントにおける対応する配列と同一または相同的である（米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。さらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフト化を実施して、親和性または特異性を含む抗体分子の特定の特性を変更し得る。ＣＤＲグラフトの非限定的な例は、米国特許第５，２２５，５３９号に開示されている。
【０２０８】
キメラ抗体は、ネズミｍＡｂに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなど、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。ヒト抗体（アクセプター抗体と呼ばれる）にほとんど由来する可変領域フレームワーク残基およびマウス抗体（ドナー抗体と呼ばれる）にほとんど由来するＣＤＲを有する抗体は、ヒト化抗体とも呼ばれる。キメラ抗体は主に、適用において免疫原性を低減し、産生における収量を増加するために使用され、例えば、ネズミｍＡｂはハイブリドーマから高い収量を有するが、ヒトにおいて高い免疫原性を有し、そのためヒト／ネズミキメラｍＡｂが使用される。キメラ抗体およびそれらの生成方法は当技術分野で知られている（例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ８６／０１５３３、ＷＯ９７／０２６７１、ＷＯ９０／０７８６１、ＷＯ９２／２２６５３、ならびに米国特許第５，６９３，７６２号、第５，６９３，７６１号、第５，５８５，０８９号、第５，５３０，１０１号、および第５，２２５，５３９号）。
【０２０９】
いくつかの特定の実施形態によれば、モノクローナル抗体は、キメラモノクローナル抗体である。
【０２１０】
いくつかの実施形態によれば、キメラ抗体は、ヒト由来の定常領域を含む。
【０２１１】
いくつかの実施形態によれば、キメラ抗体のヒト定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、およびヒトＩｇＧ４からなる群から選択される。
【０２１２】
特定の実施形態によれば、ヒトネクチン４を認識するキメラモノクローナル抗体が提供され、
ｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１が（配列番号２５）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２が（配列番号２６）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３が（配列番号２７）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１が（配列番号２８）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２が（配列番号２９）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３が（配列番号３０）である、６つのＣＤＲのセット、
ｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１が（配列番号９）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２が（配列番号１０）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３が（配列番号１１）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１が（配列番号１２）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２が（配列番号１３）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３が（配列番号１４）である、６つのＣＤＲのセット、
ｉｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１が（配列番号１５）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２が（配列番号１６）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３が（配列番号１７）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１が（配列番号１８）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２が（配列番号１９）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３が（配列番号２０）である、６つのＣＤＲのセット、を含む。
【０２１３】
一態様によれば、本発明はネクチン４と特異的に結合する抗体フラグメントを含むＣＡＲを提供する。
【０２１４】
いくつかの実施形態によれば、ＣＡＲは、ｉ）ネクチン４と特異的に結合することができる特異的結合物質、ｉｉ）スペーサーまたはヒンジドメイン、ｉｉｉ）ＣＡＲをＴ細胞膜内に固定する膜貫通ドメイン（ＴＭ）、ｉｖ）Ｔ細胞内でシグナルを伝達する細胞内ドメインを含む。
【０２１５】
いくつかの実施形態によれば、ＣＡＲはＣＤＲセットを含み、
ｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１がＳＹＹＩＨ（配列番号２５）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＹＮＥＲＦＫＧ（配列番号２６）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号２７）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＫＡＳＱＳＶＮＮＤＶＡ（配列番号２８）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＹＡＳＮＲＦＴ（配列番号２９）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＱＱＡＹＲＳＰＹＴ（配列番号３０）である、６つのＣＤＲのセット、
ｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１がＡＹＮＩＨ（配列番号９）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＹＩＹＰＮＮＧＧＳＧＹＮＱＫＦＭＮ（配列番号１０）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＦＤＹＤＥＡＷＦＩＹ（配列番号１１）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号１２）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号１３）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＦＱＧＳＧＳＰＹＴ（配列番号１４）である、６つのＣＤＲのセット、および
ｉｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１配列がＴＹＹＩＨ（配列番号１５）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＮＮＥＫＦＫＶ（配列番号１６）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号１７）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ（配列番号１８）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＹＡＳＮＲＹＴ（配列番号１９）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＱＱＤＹＳＳＰＹＴ（配列番号２０）である、６つのＣＤＲのセット、からなる群から選択される。
【０２１６】
一態様によれば、本発明は、ＣＤＲセットを含むネクチン４結合ドメインを含む抗体または抗体フラグメントを含むＣＡＲをコードする単離された核酸分子を提供し、ＣＤＲセットは、
ｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１がＳＹＹＩＨ（配列番号２５）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＹＮＥＲＦＫＧ（配列番号２６）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号２７）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＫＡＳＱＳＶＮＮＤＶＡ（配列番号２８）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＹＡＳＮＲＦＴ（配列番号２９）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＱＱＡＹＲＳＰＹＴ（配列番号３０）である、６つのＣＤＲのセット、
ｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１がＡＹＮＩＨ（配列番号９）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＹＩＹＰＮＮＧＧＳＧＹＮＱＫＦＭＮ（配列番号１０）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＦＤＹＤＥＡＷＦＩＹ（配列番号１１）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号１２）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号１３）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＦＱＧＳＧＳＰＹＴ（配列番号１４）である、６つのＣＤＲのセット、および
ｉｉｉ．ＨＣ  ＣＤＲ１配列がＴＹＹＩＨ（配列番号１５）であり、ＨＣ  ＣＤＲ２がＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＮＮＥＫＦＫＶ（配列番号１６）であり、ＨＣ  ＣＤＲ３がＳＮＰＹＶＭＤＹ（配列番号１７）であり、ＬＣ  ＣＤＲ１がＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ（配列番号１８）であり、ＬＣ  ＣＤＲ２がＹＡＳＮＲＹＴ（配列番号１９）であり、かつＬＣ  ＣＤＲ３がＱＱＤＹＳＳＰＹＴ（配列番号２０）である、６つのＣＤＲのセット、からなる群から選択される。
【０２１７】
いくつかの実施形態によれば、ベクターは、配列番号３１または配列番号３３で示されるポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態によれば、ベクターはウイルスベクターである。特定の実施形態によれば、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
【０２１８】
いくつかの実施形態によれば、本明細書で説明されるＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞が提供される。
【０２１９】
膜貫通ドメインに関して、様々な実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインと結合される膜貫通ドメインを含むように設計することができる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接する１つ以上の追加のアミノ酸、例えば、膜貫通を誘導するタンパク質の細胞外領域と関連する１つ以上のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５個、またはそれ以上のアミノ酸）、および／または膜貫通タンパク質が派生されるタンパク質の細胞内領域と関連する１つ以上の追加のアミノ酸（例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５個、またはそれ以上のアミノ酸）を含むことができる。いくつかの実施形態によれば、膜貫通ドメインはアミノ酸置換によって選択または改変して、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインとのそのようなドメインの結合を回避する、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にすることができる。
【０２２０】
いくつかの実施形態によれば、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、またはゼータ鎖、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２２１】
いくつかの実施形態によれば、ネクチン４結合ドメインを含む抗体または抗体フラグメントは、膜貫通ドメインとヒンジ領域によって結合されている。いくつかの実施形態によれば、ヒンジはヒトタンパク質に由来する。いくつかの実施形態によれば、ヒンジはヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジである。特定の実施形態によれば、ヒンジはＩｇＧ４ヒンジまたはＣＤ８ａヒンジである。
【０２２２】
ＣＡＲの細胞質ドメインまたは領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般に、ＣＡＲが導入されている免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与している。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特定された機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に指示して特定の機能を実施するタンパク質の部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分である、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断された部分を意味する。本発明のＣＡＲで使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および抗原受容体関与後にシグナル伝達を開始するために協調して作用する補助受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変異体および同じ機能的能力を有する任意の組換え配列が含まれる。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲのみを介して生じるシグナルはＴ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次および／または共刺激シグナルも必要とされる。したがって、Ｔ細胞の活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列によって媒介されるということができ、ＴＣＲ（一次細胞内シグナル伝達ドメイン）を介して抗原依存性の一次活性化を開始するものと、抗原非依存的に作用して二次または共刺激シグナル（二次細胞質ドメイン、例えば、共刺激ドメイン）をもたらすものである。
【０２２４】
いくつかの実施形態によれば、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含むように設計される。いくつかの実施形態によれば、２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、リンカー分子によって分離されている。いくつかの実施形態によれば、リンカー分子はグリシン残基である。いくつかの実施形態によれば、リンカーはアラニン残基である。
【０２２５】
いくつかの実施形態によれば、ＣＡＲは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選択されるタンパク質から得られる共刺激ドメインを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２２６】
本発明はまた、ベクターおよび宿主細胞とともに、ＣＡＲをコードする核酸分子に関する。本発明はまた、本発明のＣＡＲを、適切な担体または賦形剤とともにそのようなＣＡＲを含む医薬組成物とともに含む（異種）Ｔ細胞に関する。本発明はまた、本発明のＴ細胞、組成物、およびＣＡＲを組み込んだ自己Ｔ細胞療法（および対応する医学的用途）に関する。
【０２２７】
いくつかの実施形態によれば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現性細胞はさらに第２のＣＡＲを含むことができ、例えば、第２のＣＡＲは、例えば、同じ標的（ネクチン４）または異なる標的に対して異なる抗原結合ドメイン含む。いくつかの実施形態によれば、ＣＡＲ発現性細胞が２つ以上の異なるＣＡＲを含む場合、異なるＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものであることができる。
【０２２８】
いくつかの実施形態によれば、集団中の少なくとも１つの細胞が本明細書で説明される抗ネクチン４ドメインを有するＣＡＲを発現する細胞の集団、および別の物質、例えば、ＣＡＲ発現性細胞の活性を増強する物質を発現する第２の細胞が提供される。
【０２２９】
本発明はまた、本発明のＣＡＲを、適切な担体または賦形剤とともにそのようなＣＡＲを含む医薬組成物とともに含む（異種）ＮＫ細胞に関する。本発明はまた、本発明のＮＫ細胞、組成物、およびＣＡＲを組み込んだ自己ＮＫ細胞療法（および対応する医学的用途）に関する。
【０２３０】
本明細書で使用されるとき、「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、抗原結合ドメイン（例えば、抗体の抗原結合部分（例えば、ｓｃＦＶ））、膜貫通ドメイン、Ｔ細胞またはＮＫ細胞のシグナル伝達および／またはＴ細胞またはＮＫ細胞の活性化ドメインを含む人工的に構築されたハイブリッドポリペプチドを指す。ＣＡＲは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の特異性および反応性を選択された標的にＭＨＣ非拘束性手段で向け直す能力を有しており、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用する。ＭＨＣ非拘束性抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞またはＮＫ細胞に、抗原プロセシングとは無関係に抗原を認識する能力をもたらし、そのため腫瘍エスケープの主メカニズムを回避する。最も一般的には、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ネズミまたはヒト化モノクローナル抗体の可変重領域および軽領域を融合することから派生される単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）で構成される。
【０２３１】
薬理学
医薬品および薬剤の製剤において、活性剤は、好ましくは、１つ以上の薬学的に許容される担体（複数可）および任意にいずれかの他の治療成分とともに利用される。担体（複数可）は、製剤の他の成分と適合性があり、その受容者に対して過度に有害でないという観点において、薬学的に許容されなければならない。活性剤は、上記のように、所望の薬理学的効果を達成するのに有効な量で、そして所望の曝露を達成するのに適切な量で提供される。
【０２３２】
典型的には、抗体の抗原結合部分を含む、またはペプチド模倣物を含有する別のポリペプチドを含む本発明の抗体ならびにそのフラグメントおよびコンジュゲートは、治療使用のために無菌の生理食塩水に懸濁される。あるいは、本医薬組成物は、有効成分（抗体の抗原結合部分を含む分子）の放出を制御するために、または患者の系におけるその存在を延長するために製剤化され得る。多数の適切な薬物送達システムが知られており、例えば、埋め込み可能な薬物放出システム、ヒドロゲル、ヒドロキシメチルセルロース、マイクロカプセル、リポソーム、マイクロエマルジョン、マイクロスフェアなどが含まれる。制御放出調製物は、本発明による分子を複合体化または吸着するためにポリマーの使用を通して調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーには、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）のマトリックス、およびステアリン酸ダイマーとセバリン酸のポリ無水物コポリマーのマトリックスが含まれる。そのようなマトリックスからの本発明による分子、すなわち抗体または抗体フラグメントの放出速度は、分子の分子量、マトリックス内の分子の量、および分散される粒子のサイズに依存する。
【０２３３】
本発明の医薬組成物は、経口、局所、鼻腔内、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、関節内、病変内、腫瘍内、または非経口などの任意の適切な手段によって投与され得る。通常、静脈内（ｉｖ）投与が抗体を送達するために使用される。
【０２３４】
本発明による分子の治療有効量が、とりわけ、投与スケジュール、投与される分子の単位用量、分子が他の治療薬と組み合わせて投与されるか、患者の免疫状態および健康、投与される分子の治療的活性、血液循環におけるその持続性、ならびに治療する医師の判断に依存することは、当業者には明らかであろう。
【０２３５】
本明細書で使用されるとき、「治療有効量」という用語は、哺乳動物における疾患または障害を治療するのに有効である薬剤の量を指す。癌の場合、薬剤の治療有効量は、癌細胞の数を低減し、腫瘍サイズを低減し、末梢器官への癌細胞浸潤を阻害し（すなわち、ある程度遅延させ、好ましくは停止する）、腫瘍転移を阻害し（すなわち、ある程度遅延させ、好ましくは停止する）、腫瘍の成長をある程度阻害し、かつ／または障害と関連する症状の１つ以上をある程度緩和し得る。薬剤が成長を妨げ、かつ／または既存の癌細胞を死滅し得る範囲まで、それは細胞増殖抑制性および／または細胞毒性であり得る。癌治療のため、インビボでの効能は、例えば、生存期間、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）、奏効率（ＲＲ）、奏効期間、および／または生活の質を評価することによって判断することができる。
【０２３６】
本発明による治療にとって修正可能な癌には、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ系悪性腫瘍が含まれる。そのような癌のより具体的な例には、扁平上皮癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌（胃腸癌を含む）、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝腫、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌腫、様々なタイプの頭頸部癌、およびＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中等度／濾胞性ＮＨＬ、中等度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小非切断細胞ＮＨＬ、巨大腫瘤病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、エイズ関連リンパ腫、およびワルデンストレームマクログロブリン血症を含む）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫（脳腫瘍と関連するものなど）、およびメグス症候群と関連する異常な血管増殖が含まれる。好ましくは、癌は、乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、軟組織肉腫、カポシ肉腫、カルシノイド腫、頭頸部癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、および多発性骨髄腫からなる群から選択される。本発明の治療にとって修正可能な癌性状態には、転移性癌が含まれる。
【０２３７】
他の実施形態によれば、本発明による医薬組成物は、ネクチン４の過剰発現を特徴とする癌の治療に使用するためのものである。ネクチン４の過剰発現と関連する癌のタイプは、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）などの既知のデータベースを使用して特定することができる。特定の実施形態によれば、本発明による組成物によって治療可能である癌は、副腎皮質癌（ＡＣＣ）、嫌色素細胞性腎癌（ＫＩＣＨ）、肝臓肝細胞癌（ＬＩＨＣ）、結腸および直腸腺癌（ＣＯＡＤ、ＲＥＡＤ）、膵管腺癌（ＰＡＡＤ）、褐色細胞腫および傍神経節腫（ＰＣＰＧ）、乳頭状腎癌（ＫＩＲＰ）、肺腺癌（ＬＵＡＤ）、頭頸部扁平細胞癌（ＨＮＳＣ）、前立腺腺癌（ＰＲＡＤ）、子宮体子宮内膜癌（ＵＣＥＣ）、子宮頸癌（ＣＥＳＣ）、皮膚黒色腫（ＳＫＣＭ）、中皮腫（ＭＥＳＯ）、尿路上皮膀胱癌（ＢＬＣＡ）、明細胞腎臓癌（ＫＩＲＣ）、肺扁平細胞癌（ＬＵＳＣ）、子宮癌肉腫（ＵＣＳ）、肉腫（ＳＡＲＣ）、卵巣漿液性嚢胞腺癌（ＯＶ）、乳頭状甲状腺癌（ＴＨＣＡ）、多形性神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）、乳癌（ＢＲＣＡ）、低悪性度神経膠腫（ＬＧＧ）、およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣ）からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２３８】
有効成分としての本発明の分子は、よく知られているように、薬学的に許容され、有効成分と適合性のある賦形剤に溶解、分散、または混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。他の適切な担体は当業者によく知られている。さらに、必要に応じて、本組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの少量の補助物質を含むことができる。
【０２３９】
本発明による医薬組成物は、抗新生物組成物とともに投与され得る。
【０２４０】
本明細書で使用される「治療」という用語は、治療的治療および予防的または防止的手段の両方を指す。治療を必要とするものには、すでに障害を有するもの、ならびに障害が防止されるべきものが含まれる。
【０２４１】
「癌」および「癌性」という用語は、一般的に、制御されない細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指す、または説明する。癌の例には、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が含まれる。そのような癌のより具体的な例には、黒色腫、肺、甲状腺、乳房、結腸、前立腺、肝臓、膀胱、腎臓、子宮頸部、膵臓、白血病、リンパ腫、骨髄性、卵巣、子宮、肉腫、胆管、または子宮内膜の癌が含まれる。
【０２４２】
いくつかの実施形態によれば、癌を治療する方法は、本医薬組成物を、少なくとも１つの追加の抗癌剤の投与を含む治療投与計画の一部として投与することを含む。
【０２４３】
いくつかの実施形態によれば、抗癌剤は、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、アスパラギナーゼ、アルキル化剤、抗腫瘍抗生物質、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２４４】
いくつかの実施形態によれば、代謝拮抗剤は、シタラビン、グルダラビン、フルオロウラシル、メルカプトプリン、メトトレキサート、チオグアニン、ゲムシタビン、およびヒドロキシ尿素からなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、有糸分裂阻害剤は、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびビノレルビンからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、トポイソメラーゼ阻害剤は、トポテカンおよびイレノテカンからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、アルキル化剤は、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シスプラチン、カルボプラチン、イフォサミド、メクロレタミン、メルファラン、チオテパ、ダカルバジン、およびプロカルバジンからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、抗腫瘍抗生物質は、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、およびプリカマイシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、トポイソメラーゼＩＩは、エトポシドおよびテニポシドからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２４５】
いくつかの特定の実施形態によれば、追加の抗癌剤は、ベバシズマブ、カルボプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン塩酸塩、ゲムシタビン塩酸塩、トポテカン塩酸塩、チオテパ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２４６】
本発明によるモノクローナル抗体は、少なくとも１つの抗癌剤との併用療法の一部として使用され得る。いくつかの実施形態によれば、追加の抗癌剤は、免疫調節剤、活性化リンパ球細胞、キナーゼ阻害剤、または化学療法剤である。
【０２４７】
いくつかの実施形態によれば、抗癌剤は、作用剤または拮抗剤に関わらず、免疫チェックポイント分子に対する抗体などの免疫調節剤である。
【０２４８】
チェックポイント免疫療法による遮断は、癌治療の刺激的な新しい場であることを証明している。免疫チェックポイント経路は、自己寛容を維持し、生理学的条件下で免疫系による損傷から組織を保護するために協調して機能する一連の共刺激および阻害分子からなる。腫瘍は、特定のチェックポイント経路を利用して免疫系を回避する。したがって、そのような経路の阻害は、有望な抗癌治療戦略として浮上している。
【０２４９】
抗細胞傷害性Ｔリンパ球４（ＣＴＬＡ−４）抗体イピリムマブ（２０１１年に承認）は、癌患者の治療に有益性を示した最初の免疫療法剤だった。抗体は、Ｔ細胞への抗原提示の際に抑制性シグナルを妨害する。抗プログラム細胞死１（ＰＤ−１）抗体ペンブロリズマブ（２０１４年に承認）は、Ｔ細胞によって発現されるＰＤ−１受容体の負の免疫調節シグナル伝達を遮断する。追加の抗ＰＤ−１剤が、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療用に２０１４年に規制当局の承認のために提出された。現在、活発な研究が他の多くの免疫チェックポイント、とりわけ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＮＫＧ２Ａ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ１１２Ｒ、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、ＣＤ１３７、ＯＸ４０（ＣＤ１３４とも呼ばれる）、およびキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）を探求している。
【０２５０】
いくつかの特定の実施形態によれば、免疫調節剤は、ＣＴＬＡ−４を阻害する抗体、抗ヒトプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、ＰＤ−Ｌ１、およびＰＤ−Ｌ２抗体、活性化細胞傷害性リンパ球細胞、リンパ球活性化剤、ＣＥＡＣＡＭに対する抗体、ＴＩＧＩＴに対する抗体、ならびにＲＡＦ／ＭＥＫ経路阻害剤からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの特定の実施形態によれば、追加の免疫調節剤は、ＰＤ−１に対するｍＡｂ、ＰＤ−Ｌ１に対するｍＡｂ、ＰＤ−Ｌ２に対するｍＡｂ、ＣＥＡＣＡＭ１に対するｍＡｂ、ＣＴＬＡ−４に対するｍＡｂ、ＴＩＧＩＴに対するｍＡｂ、ＰＶＲ、インターロイキン２（ＩＬ−２）、またはリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞から選択される。
【０２５１】
他の実施形態によれば、追加の抗癌剤は化学療法剤である。本発明による抗体とともに、または別々に投与することができる化学療法剤は、抗癌活性を示す当技術分野で知られているようないずれかの薬剤を含み得、限定されないが、ミトキサントロン、トポイソメラーゼ阻害剤、紡錘体毒ビンカ類であるビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン（タキソール）、パクリタキセル、ドセタキセル；アルキル化剤系であるメクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、イホスファミド；メトトレキサート、６−メルカプトプリン、５−フルオロウラシル、シタラビン、ゲムシタビン、ポドフィロトキシン系であるエトポシド、イリノテカン、トポテカン、ダカルバジン；抗生物質であるドキソルビシン（アドリアマイシン）、ブレオマイシン、マイトマイシン；ニトロソウレア系であるカルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、無機イオン系であるシスプラチン、カルボプラチン；インターフェロン、アスパラギナーゼ、ホルモン系であるタモキシフェン、リュープロリド、フルタミド、および酢酸メゲストロールが含まれる。
【０２５２】
いくつかの実施形態によれば、化学療法剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体および関連阻害剤、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、抗生物質、Ｌ−アスパラギナーゼ、トポイソメラーゼ阻害剤、インターフェロン、白金配位錯体、アントラセンジオン置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、副腎皮質ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲン、アンドロゲン、抗アンドロゲン、およびゴナドトロピン放出ホルモン類似体から選択される。別の実施形態によれば、化学療法剤は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン（ＬＶ）、イレノテカン、オキサリプラチン、カペシタビン、パクリタキセル、およびドキセタキセルからなる群から選択される。１つ以上の化学療法剤を使用することができる。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、本発明による医薬組成物は、癌の治療に使用するため、または免疫応答の増強に使用するためのものである。
【０２５４】
「免疫応答の増強する」という用語は、免疫系の応答性を増加し、その記憶を誘発または延長することを指す。本発明による医薬組成物は、ワクチン接種時に免疫系を刺激するために使用され得る。したがって、一実施形態では、本医薬組成物は、ワクチン接種を改善するために使用することができる。
【０２５５】
特定の実施形態において、癌は、肺、甲状腺、乳房、結腸、黒色腫、前立腺、肝臓、膀胱、腎、子宮頸部、膵臓、白血病、リンパ腫、骨髄性、卵巣、子宮、肉腫、胆管、および子宮内膜細胞の癌から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２５６】
いくつかの実施形態によれば、本発明による少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントを含む医薬組成物、および追加の免疫調節剤またはキナーゼ阻害剤を含む医薬組成物は、別々の投与によって癌の治療に使用される。
【０２５７】
さらに別の態様によれば、本発明は、癌を治療する方法をそれを必要とする対象において提供し、当該対象に本発明によるモノクローナル抗体または抗体フラグメントの治療有効量を投与することを含む。
【０２５８】
追加の態様によれば、本発明は、ネクチン４過剰発現と関連する疾患を治療するための方法を提供する。
【０２５９】
一態様によれば、本発明は、癌を治療する方法をそれを必要とする対象において提供し、当該対象に本明細書で説明されるＣＡＲ分子を含む複数のＴ細胞の治療有効量を投与することを含む。
【０２６０】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、対象に投与されたときに意図された治療効果を有する抗体フラグメントのモノクローナル抗体の十分な量を指す。治療の最終結果を達成するために必要とされる有効量は、例えば、腫瘍の特定のタイプおよび患者の状態の重症度、ならびに併用がさらに放射線と同時投与されるかを含む多くの要因に依存し得る。本発明の文脈における活性剤の有効量（用量）は、期間にわたって対象における有益な治療応答に影響を及ぼすのに十分なものであるべきであり、限定されないが、腫瘍増殖の阻害、腫瘍増殖速度の低減、腫瘍および転移の成長の防止、ならびに生存率の向上が含まれる。
【０２６１】
本明細書で説明される組成物の毒性および治療効能は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって、例えば、対象化合物についてＩＣ５０（５０％阻害をもたらす濃度）および最大耐量を決定することによって、決定することができる。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒトにおける使用のための投与量の範囲を製剤化するために使用することができる。投与量は、とりわけ、他の関連要因の中でも、使用される投与剤形、選択される投与計画、治療のために使用される薬剤の組成、および利用される投与経路に応じて変化し得る。的確な製剤、投与経路、および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る。治療される状態の重症度および応答性に応じて、投与はまた、徐放性組成物の単回投与であり得、治療過程は、数日から数週間、または治癒に影響が及ぶ、または病状の減少が達成されるまで継続する。投与される組成物の量は、もちろん、治療される対象、病苦の重症度、投与の手段、処方する医師の判断、および他のすべての関連する要因に依存するであろう。
【０２６２】
対象に物質、化合物、または薬剤「を投与する」または「の投与」という用語は、当業者に知られている様々な方法のうちの１つを使用して実行することができる。例えば、化合物または薬剤は、経腸的または非経口的に投与することができる。経腸的は、経口、舌下、または直腸を含む胃腸管を介した投与を指す。非経口投与には、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、眼、舌下、鼻腔内、吸入、脊髄内、脳内、および経皮（例えば、皮膚管を介した吸収による）による投与が含まれる。化合物または薬剤はまた、再充電可能または生体分解性ポリマーデバイスあるいは他のデバイス、例えば、パッチおよびポンプ、あるいは製剤によって適切に導入することができ、化合物または薬剤の持続放出、徐放、または制御放出をもたらす。投与はまた、例えば、１回、複数回、および／または１回以上の延長した期間で実施することができる。いくつかの実施形態では、投与は、自己投与を含む直接投与、および薬物を処方する行為を含む間接投与の両方を含む。例えば、本明細書で使用されるとき、患者に薬剤を自己投与する、または薬剤を別の人によって投与させる医師、および／または患者に薬剤の処方箋を提供する医師は、患者に薬剤を投与している。
【０２６３】
抗体は、一般に、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ患者の体重、一般に約０．５〜約１０ｍｇ／ｋｇ、そしてしばしば約１〜約５ｍｇ／ｋｇの範囲で投与される。これに関連して、少なくとも１２時間、好ましくは少なくとも４日、より好ましくは２１日までの循環半減期を有する抗体を使用することが好ましい。キメラ抗体は、１４〜２１日までの循環半減期を有すると予想される。いくつかの例では、大量の負荷用量を投与した後、治療期間にわたって間欠的な（例えば、毎週）維持用量を投与することが有効であり得る。抗体はまた、徐放性送達システム、ポンプ、および連続注入のための他の既知の送達システムによって送達することができる。
【０２６４】
「約」という用語は、特定の値について許容可能なエラー範囲、たとえば５％または１０％までが想定させるべきであることを意味する。
【０２６５】
診断
本発明はさらに、癌を診断および予後診断するための方法を開示する。
【０２６６】
一態様によれば、本発明は、対象における癌または感染症の診断的および／または予後診断的方法を提供し、本方法は、当該対象の生物学的試料におけるネクチン４の発現レベルを本明細書で説明される少なくとも１つの抗体を使用して決定するステップを含む。
【０２６７】
「生物学的試料」という用語は、診断またはモニタリングアッセイで使用され得る生物から得られる様々な試料タイプを包含する。本用語は、生物学的起源の血液および他の液体試料、生検標本などの固体組織試料、あるいは組織培養またはそれらに由来する細胞およびその子孫を包含する。さらに、本用語は、循環性腫瘍または他の細胞を包含し得る。本用語は、具体的には臨床試料を包含し、さらに細胞培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、尿、羊水、眼試料のための眼房水および硝子体水を含む生物学的液体、ならびに組織試料を含む。本用語はまた、試薬による処理、可溶化、または特定成分の豊富化などの達成後に任意の方法で操作されている試料を包含する。
【０２６８】
ネクチン４の発現レベルの決定は、本明細書で説明される標識された抗ネクチン４抗体によって実施することができる。発現の決定は、例えば、ＥＬＩＳＡによって実施することができる。本発明の方法はさらに、当該発現レベルをコントロールレベルと比較するステップを含むことができる。
【０２６９】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をさらに詳しく示すために提示される。それらは決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２７０】
実験手順
ここで、参考として以下の実施例が実施され、上記の説明とともに、本発明を非限定的な方法で説明する。
【０２７１】
一般に、本明細書で使用される命名法および本発明で利用される実験手順には、分子的、生化学的、微生物学的、免疫学的、および組換えＤＮＡ技術が含まれる。そのような技術は当技術分野でよく知られている。よく知られている手順に言及している他の全般的な参考が、読者の便宜のためにこの文書全体を通して提供される。
【０２７２】
方法
細胞株
使用した細胞株は、ＬＮＣａｐ、ＪＥＧ３、ＭＣＦ−７、ＲＡＪＩ、ＭＤＡ−ＭＤ−４５３、ＨＴ１３７６、およびＣＨＯ細胞だった。いくつかの例では、ＣＨＯ細胞をカニクイザル（Ｃｙｎｏ）またはネズミのネクチン−４によって安定的にトランスフェクションした。細胞は、ＲＡＪＩ細胞を除くすべての細胞について、ＤＭＥＭ中で３７℃、湿度＞９５％、および５％ＣＯ２で増殖させ、１０％熱不活性化ＦＣＳ補充したＲＰＭＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからの培地および血清）中で培養した。
【０２７３】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーは、抗ネズミネクチン４ｍＡｂ（クローン３５６７０４）を使用して実施した。細胞を、細胞１００，０００個あたり０．２μｇのｍＡｂとともに氷上で３０分間インキュベーションした。検出は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と結合した二次ヤギＡｂによって氷上で３０分間実施した。
【０２７４】
いくつかの例では、抗ネクチン−４Ａｂを種々の濃度で使用し、標的細胞とともに氷上で３０分間インキュベーションした。検出は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と結合したマウスまたはヒトＦｃに対する二次抗体によって、氷上で３０分間実施した。
【０２７５】
ヒトＴＩＧＩＴ−Ｉｇまたはヒトネクチン１−Ｉｇの染色では、細胞を細胞１００，０００個あたり３μｇのＴＩＧＩＴ−Ｉｇとともに氷上で１時間インキュベーションした。検出は、二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７抗ヒト（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）によって、氷上で３０分間実施した。遮断実験のため、細胞を１μｇの示された抗体とプレインキュベーションしてからＴＩＧＩＴ−ＩｇまたはヒトＮｅｃｔｉｎ１−Ｉｇ染色した。いくつかの例では、細胞を８ｕｇ／ｍｌの示されたＡｂと、ヒトＴＩＧＩＴ−Ｉｇまたはヒトネクチン−１−Ｉｇ（２０ｕｇ／ｍｌ）とともにインキュベーションした。リガンド結合の検出は、二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７抗ヒトＡｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）によって実施した。
【０２７６】
分析は、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＣｙｔｏｆｌｅｘ  ＢｅｃｍａｎＣｏｕｌｔｅｒフローサイトメーターおよびＦＣＳＥｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して実施した。
【０２７７】
殺アッセイ
標的細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性活性の評価のため、Ｓ３５放出アッセイを記載されたように（Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４（３）：９１３−２２）実施した。ＮＫ細胞を健康なドナーからＥａｓｙＳｅｐヒトＮＫ分離キット（１９０５５  ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）を使用して単離し、ＰＨＡおよびＩＬ−２添加で増殖させた。標的細胞を放射性メチオニン［Ｓ３５］添加したメチオニンフリー培地中で一昼夜インキュベーションした。次に、細胞を洗浄し、ウェルあたり細胞５０００個について１μｇの抗体とともに氷上でインキュベーションした。次に、細胞をＮＫ細胞とともに５時間インキュベーションした。Ｓ３５の放出は、βカウンターＴｏｐＣｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ）で測定した。結果は、（ＣＰＭ（試料）−ＣＰＭ（自発的放出））／（ＣＰＭ（総放出）−ＣＰＭ（自発的放出））×１００で表し、ＣＰＭは１分あたりのカウントを示す。
【０２７８】
ＡＤＣＣアッセイ
ＮＫ細胞を健康なドナーからＥａｓｙＳｅｐヒトＮＫ分離キット（１９０５５  ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）を使用して単離し、ＰＨＡおよびＩＬ−２添加で増殖させた。標的細胞を９６Ｕプレートにウェルあたり細胞２．５×１０４個で加え、Ｅ：Ｔ比が２：１で活性化ＮＫ細胞と共培養した。インキュベーションは、１２ｕｇ／ｍｌキメラクローンｈＮｅｃ４．０５ｈＩｇＧ１およびｈＮｅｃ４．１１ｈＩｇＧ１またはコントロールｈＩｇＧ１の存在下で実施した。２時間後、ＮＫ細胞をそれらのＣＤ１０７ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  カタログ番号３２８６１９）脱顆粒マーカー発現についてＦＡＣＳによって分析した。
【０２７９】
ＣＡＲ−Ｔの生成および機能性アッセイ
ｈＮｅｃ４．１１Ａｂの単鎖は、ＣＤ８ストーク領域にインフレームでクローニングし、ＣＤ２８ＴＭドメイン、４１ＢＢ細胞内ドメイン、およびＣＤ３Ｚｅｔａ鎖の細胞内ドメインが続いた。ＣＡＲ−Ｔ構築体の概略図を図１１Ａに示す。構築体を、プロモーターレンチウイルスベクター（ｐＨＡＧＥ２）を含むｈＥｆ１ａに導入し、続いてＩＲＥＳＧＦＰカセットを導入して形質導入の有効性をモニタリングした。ジャーカット細胞は、構築体をコードするレンチ粒子によって形質導入した。形質導入有効性は９９％を超えていた（図１１Ｂ）。
【０２８０】
親ジャーカット細胞またはＣＡＲ−Ｔ構築体を発現するジャーカット細胞（ジャーカットｐＨＡＧＥ２．４．１１）（ウェルあたり５×１０４個）を、標的細胞ＨＴ１３７６およびＭＤＡ−ＭＤ−４５３とＥ：Ｔ比が１：１で４８時間インキュベーションした。上清を遠心分離後に収集し、ＩＬ−２レベルをＰｅｐｒｏｔｅｃｈのＩＬ−２  ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号９００−Ｔ１２）を製造元のプロトコルに従って使用して測定した。
【０２８１】
健康なドナーに由来するＰＢＭＣは、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）ヒトＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ細胞アクチベーターを製造元のプロトコルに従って使用して、７２時間前活性化した。細胞はｐＨＡＧＥ２．４．１１レンチを使用してＫｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ＪＮら（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｔｈｅｒ．２００９  ｄｏｉ：１０．１０９７／ＣＪＩ．０ｂ０１３ｅ３１８１ａｃ６１３８）に従って形質導入し、発現はＧＦＰレベルによって検証した。ＣＡＲＴ  ＰＢＭＣは、ＨＴ１３７６細胞（２．５×１０４個／ウェル）とともに、様々なＥ：Ｔの範囲によってインキュベーションした。４８時間後、エフェクター細胞を除去し、標的細胞を３回洗浄し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイを製造元のプロトコルに従って使用して生存率を測定した。
【０２８２】
インビボマウス腫瘍モデル
すべての実験は、６〜８週齢のＳＣＩＤベージュ雌マウスを使用して実施した。すべてのマウスは、ヘブライ大学医学部（エルサレムのアインケレム）の特定病原体フリー施設において、ＳＰＦ条件下、通常の明暗サイクル、および２２＋／−２°Ｃで、倫理委員会のガイドラインに従って飼育された。マウスの群はすべて７匹の雌を含んだ（ｎ＝７）。異種移植片は、示された細胞の皮下注入を左脇腹領域に投与することによって作成した。抗ネクチン４クローン．０５抗体およびコントロール抗体（抗マウスＣＤ３、ＩｎＶｉｖｏＭＡｂクローン１７Ａ２）の注入を週に２回腹腔内投与した。マウスは毎日モニタリングした。アッセイ終了の日に（図の凡例を参照）、すべてのマウスを屠殺して、個々の腫瘍重量を記録した。ベースラインにおけるそれらの一般的な健康状態には、種々のマウス群間で差は認められなかった。
【０２８３】
実施例１．抗ネクチン−４ｍＡｂの生成と選択
免疫原（Ｎｅｃ４−Ｆｃ）発現技術は、哺乳類ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に基づいており、最高の品質、安定性、溶解性、および収量をもたらす糖タンパク質の場合に特に選択される方法である。ネクチン−４の外部ドメインおよびヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインの融合タンパク質であるＮｅｃ４−Ｆｃタンパク質を、以下のように組換えによって作成して精製した。
【０２８４】
ヒトネクチン４のコード配列を、ヒトＩｇＧ１のＦｃフラグメントとの融合としてクローニングして、組換えＦｃ−融合タンパク質を生成した。ヒトネクチン４分子の残基３２位から３４９位に及ぶ外部ドメイン（細胞外）部分を使用した。ネクチン４アミノ酸配列の３４９位のＣ末端セリン残基を、ヒトＩｇＧ１の脱グリコシル化Ｆｃ（Ｎ２９７Ａ）の重鎖ヒンジに融合させ、ＣＨ２およびＣＨ３定常領域が続いた。組換えタンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、哺乳類細胞における高レベル発現のためにコドン最適化した。最適化されたＤＮＡ配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ合成サービス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、ＤＮＡフラグメントの５’および３’末端にそれぞれＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限部位に対応する隣接ＤＮＡ配列を追加して作成された。発現ベクターは、最適化されたＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで二重消化した後、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）とのその連結によって構築した。得られた構築体を、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用してＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。４８時間後、トランスフェクションした細胞を５ｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって抗生物質選択を実施した。安定したプールをタンパク質分泌についてＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分析した。上清を収集し、Ｈｉｇｈ−Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＢｉｏＣＡＤ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＰｏｒｏｓ２０プロテインＧカラムによって精製した。得られた融合タンパク質免疫原はネクチン４−Ｆｃと表示される。
【０２８５】
免疫化のために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の免疫原５０μｇを注入し、その後、最初の免疫の１４日後に、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中の免疫原５０μｇを注入した。次に、血清を抗Ｎｅｃ−４−Ｆｃ抗体力価についてＥＬＩＳＡによって分析した。最も高い力価を有するマウスを、ＰＢＳ中の５０μｇの免疫原で追加免疫した。３日後、免疫マウスの脾臓を採取し、赤血球の溶解後、脾臓細胞をＳＰ２／０細胞株と融合させた。可能性のあるハイブリドーマ細胞を、安定したハイブリドーマ細胞株の選択のために、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ）を含む２０％ＲＰＭＩ１６４０培地に播種した。上記の手順を２回繰り返し、ＥＬＩＳＡによって、全部で１０３４ウェルを抗Ｎｅｃ４−Ｆｃ抗体分泌についてスクリーニングした。次に、それらの上清がＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされたＮｅｃ４−Ｆｃとの結合について陽性である３０ウェルを、それらの陽性度について再試験し、並行して、交差反応性試験を無関連のＦｃ融合タンパク質について実施した。これにより、ネクチン−４外部ドメインを特異的に認識する抗体を分泌した１０種のハイブリドーマ細胞株が得られた。ＥＬＩＳＡで特異的シグナルを示したこれらすべての候補を、トランスフェクタント細胞株でネイティブのヒトネクチン−４タンパク質を認識するそれらの能力について試験した。
【０２８６】
ＲＡＪＩバーキットリンパ腫細胞をヒトネクチン４によってトランスフェクションし、ＦＡＣＳによって分析して、示された５つのハイブリドーマクローンの結合を決定した。細胞を異なるクローンとインキュベーションし、次にヒトＴＩＧＩＴ−Ｉｇとインキュベーションして二次抗体で染色した。ＦＡＣＳ染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を図２に示す。示されるように、クローンｈＮｅｃ４．０１（クローン１）およびｈＮｅｃ４．０５（クローン５）によって産生されたモノクローナル抗体は、ＴＩＧＩＴ−Ｎｅｃｔｉｎ４相互作用の最も優れた遮断能力を示した。
【０２８７】
ネクチン４を自然に発現するＪＥＧ３およびＬＮＣａｐ細胞株を使用した同様のアッセイも実施して、同様の結果が得られている。
【０２８８】
５つの抗体が陽性の染色を示した。これらの５つのうち、４つはそれらのＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＭアイソタイプではない）についてさらに選択した。最後に、残りの４つの候補はすべて、生きた細胞の表面に発現されるネイティブのヒトネクチン−４分子に対して強い結合能力を示し、いくつかの無関係な融合タンパク質で繰り返し試験して、ネクチン−４と免疫細胞受容体の他のリガンドとの間の交差反応性がゼロのものについて選択した。しかし、そのうちの２つだけがネクチン−４に対する遮断抗体であることが示された。したがって、２つの安定したクローン細胞株ｈＮｅｃ４．０１およびｈＮｅｃ４．０５が生成されており、ともにアイソタイプカッパＩｇＧ１のものである。次に、大規模なＡｂ産生を実施し、両モノクローナル抗体を、ＧＥ  ＡＫＴＡ  ＰｒｉｍｅＰｌｕｓ液体クロマトグラフィーシステムおよびＨｉＴｒａｐプロテインＧカラムを使用して、無血清培地から数ミリグラムの量で精製した。
【０２８９】
上記と同様に、追加のクローンを特定し、そのうちクローン１１（ｈＮｅｃ４．１１）が最も優れた結合および遮断能力を有していたため、以下に説明するようにｈＮｅｃ４．０５と並行してスクリーニングした。
【０２９０】
上記の試みに基づいて、標的タンパク質であるネクチン−４に非常に類似した免疫原の場合でさえ（それが二量体であり、哺乳類細胞機構によってグリコシル化され、非変性条件下で生成されるという点で）、遮断する抗ネクチン４抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を得る機会は２％（パーミル）未満である。
【０２９１】
実施例２．抗ネクチン−４ｍＡｂのヒトネクチン４との親和性
抗体ｈＮｅｃ４．０１およびｈＮｅｃ４．０５のフルオロフォア標識ヒトネクチン４−Ｉｇ分子との親和性を、マイクロスケール熱泳動アッセイ（Ｗｉｅｎｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１：１００）を使用してさらに決定した。測定は、少なくとも３つの独立したタンパク質調製物で繰り返した。図３に示すように、非常に高い結合親和性が両抗体で認められた。クローンｈＮｅｃ４．０５では、計算されたＫｄは２７２±１５４ｐＭであり、ｈＮｅｃ４．０１クローンでは、計算されたＫｄは１０７±１１５ｐＭだった。
【０２９２】
実施例３．抗ネクチン−４ｍＡｂの配列決定
ネクチン４−ＴＩＧＩＴ結合の最も優れた阻害を示した２つのハイブリドーマクローンであるＮｏ．０．１およびＮｏ．０．５を、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列決定に進めた。
【０２９３】
方法
全ＲＮＡは、ハイブリドーマ細胞からＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号：１５５９６−０２６）の技術マニュアルに従って単離した。次に、全ＲＮＡを、アイソタイプ特異的アンチセンスプライマーまたはユニバーサルプライマーを使用し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号：６１１０Ａ）の技術マニュアルに従って、ｃＤＮＡに逆転写した。ＶＨおよびＶＬの抗体フラグメントをＧｅｎＳｃｒｉｐｔのｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）の標準操作手順（ＳＯＰ）に従って増幅させた。増幅した抗体フラグメントを、標準的なクローニングベクターに別々にクローニングした。コロニーＰＣＲを実施して、正しいサイズのインサートを有するクローンについてスクリーニングを実施した。正しいサイズのインサートを有する５つ以上のコロニーを各フラグメントについてシークエンシングした。異なるクローンの配列を整列させて、これらのクローンのコンセンサス配列が得られた。
【０２９４】
免疫グロブリン可変領域の配列分析のために以下のツールを使用した。
ｉ．ＮＣＢＩヌクレオチドＢＬＡＳＴ、
ｉｉ．ＩＭＧＴ／Ｖ  Ｑｕｅｓｔプログラム、および
ｉｉｉ．ＮＣＢＩＩｇＢＬＡＳＴ。
【０２９５】
得られた配列は次のとおりである。
クローンｈＮｅｃ４．０１：
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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クローンｈＮｅｃ４．０５
【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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クローンｈＮｅｃ４．１１
【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【０２９６】
実施例４．抗ネクチン４ｍＡｂによるネクチン４−ＴＩＧＩＴ相互作用の遮断は、ＮＫ細胞によるヒト細胞株の致死を増強した
抗体クローンｈＮｅｃ４．０５およびｈＮｅｃ４．０１を、ネクチン４とＴＩＧＩＴとの結合の遮断、ＮＫ細胞毒性の阻害について試験した。ネクチン４によってトランスフェクションした［３５Ｓ］メチオニン標識ＲＡＪＩバーキットリンパ腫細胞、およびＬＮＣａＰ前立腺癌細胞（本来的にネクチン４を発現する）を、コントロール抗体としてマウスＩｇＧ１またはマウス抗ヒトネクチン４ｍＡｂであるｈＮｅｃ４．０１もしくはｈＮｅｃ４．０５のいずれかの１μｇ／ウェルとともにインキュベーションした。１時間後、細胞にＮＫ細胞を補充し、５時間インキュベーションした。ＮＫ：癌細胞の種々のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比における平均特異的死滅（±ｓ．ｄ．）を、図４Ａ（ＲＡＪＩ細胞）および図４Ｂ（ＬＮＣａｐ細胞）にプロットする。＊は、コントロール抗体と比較したｈＮｅｃ４．０１およびｈＮｅｃ４．０５クローンの有意な効果（ｐ＜０．０５）を示す。各図は、実施された３回のうち１回の代表的な実験を示す。同じ効果がＭＣＦ−７−乳癌細胞株を使用したときに決定された。
【０２９７】
実施例５．抗ネクチン４抗体の結合の特異性を検証する
ＦＡＣＳ染色を使用して試験し、図５Ａ〜５Ｃに示されるように、ｍＡｂ  ｈＮｅｃ４．０１およびｈＮｅｃ４．０５はヒトネクチン４に特異的であり、ネズミタンパク質と結合しない。ＲＡＪＩ細胞をネズミネクチン４でトランスフェクションした（黒色線ヒストグラム）。最初に、ネズミネクチン４溶解物でトランスフェクションしたＲＡＪＩ細胞を、市販の抗ネズミネクチン４ｍＡｂ（クローン３５６７０４）を用いたウエスタンブロットアッセイに使用して、ネズミネクチン４発現を検証した（Ａ）。次に、細胞を０．２μｇの（Ｂ）クローンｈＮｅｃ４．０１または（Ｃ）クローンｈＮｅｃ４．０５で染色した。ｈＮｅｃ４．０１およびｈＮｅｃ４．０５ｍＡｂはともにマウスＮｅｃｔｉｎ４との結合を示さない。
【０２９８】
実施例６．抗ネクチン４抗体はネクチン４−ネクチン１相互作用を遮断することができる
抗ネクチン４がネクチン４−ネクチン１相互作用を遮断する能力も決定された。ネクチン４でトランスフェクションされたＲＡＪＩ細胞のＦＡＣＳ染色を図６Ａ〜６Ｃに示す。細胞を１μｇの（図６Ａ）クローンｈＮｅｃ４．０１または（図６Ｂ）クローンｈＮｅｃ４．０５とプレインキュベーションし、次に３μｇのネクチン１−Ｉｇ（黒色線）とインキュベーションした。遮断なしの染色は灰色線で示す。灰色で塗りつぶされたヒストグラムは、二次抗体のみのバックグラウンドコントロール染色である。ｍＡｂは、ネクチン４を発現する腫瘍の浸潤性を増加させることが疑われるネクチン４−ネクチン１の相互作用を遮断することができると結論付けられる。
【０２９９】
実施例７．インビボモデル
抗ネクチン４ｍＡｂの有効性は、動物モデルにおいてインビボで決定された。本来的に（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３）または組換えによって（Ｒａｊｉネクチン４ＯＥ）ネクチン４を発現する細胞株をマウスに皮下注入した（マウスあたり細胞５×１０６個）。ＮＫ細胞、Ｂ細胞、およびＴ細胞を欠如するＳＣＩＤベージュマウスを使用した。これらのモデルで腫瘍細胞増殖に対するＮＫ細胞の寄与を試験するため、ヒトＮＫ細胞を１×１０６個で処置群のいくつかに腫瘍細胞とともに注入した。
【０３００】
抗ネクチン４ｍＡｂクローンｈＮｅｃ４．０５、またはコントロールＡｂ（抗マウスＣＤ３、ＩｎＶｉｖｏＭＡｂクローン１７Ａ２）を、腫瘍増殖におけるインビボでのそれらの効果について、直接的に、またはＮＫ細胞とともに試験した。ｍＡｂは、マウスあたり７５μｇで週に２回、腹腔内注入した。腫瘍重量を試験終了時に測定した。図７（Ａ）に示されるように、Ｒａｊｉ細胞におけるネクチン−４の過剰発現（ＯＥ）は、空のベクター（ＥＶ）でトランスフェクションされたそれらの親細胞の増殖と比較して、それらの増殖に影響を及ぼさなかった。それにもかかわらず、ヒトＮＫ細胞の存在下では、ネクチン４のＯＥは腫瘍増殖を増加させ、ＮＫ細胞のＮＫ媒介腫瘍抑制活性に対するネクチン４の負の効果を示唆した。図７Ｂに示されるように、抗ネクチン４Ａｂの添加は、ＮＫ細胞抑制を遮断し、コントロールＡｂ処置動物と比較して腫瘍増殖の低下をもたらした。最後に、図７Ｃに示されるように、これらの効果は、ネクチン４を本来的に発現する細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３）を使用したしたときにも認められた。ＮＫ細胞の非存在下ではＡｂは効果がなかったが、Ａｂは、腫瘍細胞と同時注入されたヒトＮＫ細胞の抗腫瘍効果を有意に増強した。まとめると、これらの実験は、ｈＮｅｃ４．０５ｍＡｂなどの抗ネクチン４抗体が、インビボでＮＫ細胞毒性を増強し、腫瘍増殖阻害をもたらすことができることを示す。
【０３０１】
実施例８．細胞で発現されたヒト、サル、ネズミのネクチン−４との抗ネクチン−４クローンの結合
ヒト細胞株ＭＤＡ−ＭＤ−４５３で発現されたネクチン−４とのネズミ抗ヒトネクチン−４クローンｈＮｅｃ４．０５およびｈＮｅｃ４．１１の結合をＦＡＣＳ分析によって評価した。図８Ａは、各クローについてＡｂ結合の力価測定（２０〜０．０１ｎＭの範囲）後に計算されたＥＣ５０値、および最大結合シグナルを示す。ネズミＩｇＧ１Ｆｃ鎖がヒトＩｇＧ１Ｆｃ鎖に置き換えられたネズミＡｂのキメラ型を試験したとき、同様な値に達した。図８Ｂは、カニクイザル（Ｃｙｎｏ）−ネクチン−４でトランスフェクションされたＣＨＯ細胞との抗体結合を示し、図８Ｃは、マウス−ネクチン−４でトランスフェクションされたＣＨＯ細胞との抗体結合を示す。これらのデータは、ヒト標的に対するＥＣ５０値をナノモル以下の範囲で示し、これは、クローンｈＮｅｃ４．０１およびｈＮｅｃ４．０５について図３に示されているＫｄ値のスケールである。さらに、これらの結果は、サル（カニクイザル）ネクチン−４標的に対するこれら２つのクローンの交差反応性を示し、これらはヒト標的について計算されたものと同様のＥＣ５０値でそれと結合する。これは、Ａｂの前臨床試験にとって重要であり得る。最後に、クローンｈＮｅｃ４．１１はマウスのネクチン−４標的とも交差反応することが示されたが、クローンｈＮｅｃ４．０５では示されなかった。しかし、この場合、計算されたＥＣ５０は、ヒト標的について計算されたものより約１０倍高かった。
【０３０２】
実施例９．抗ネクチン−４クローンによるネクチン−４リガンドの遮断
抗体クローンｈＮｅｃ４．０５およびｈＮｅｃ４．１１は、ネクチン−４とそのリガンドであるＴＩＧＩＴおよびＮｅｃｔｉｎ−１との結合を遮断する。ネクチン−４リガンドの結合をＦＡＣＳ分析によって評価した。ヒト−ネクチン−４でトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を、ヒトＴＩＧＩＴ−Ｉｇ（図９ＡおよびＣ）またはヒトネクチン−１−Ｉｇ（図９ＢおよびＤ）のともに２０ｕｇ／ｍｌのいずれかと、抗−ネクチン−４クローンｈＮｅｃ４．０５（９Ａおよび９Ｂ）またはクローンｈＮｅｃ４．１１（９Ｃおよび９Ｄ）のともに８ｕｇ／ｍｌの添加または無添加でインキュベーションした。抗ネクチン−４抗Ａｂによる強力な結合阻害がすべての場合に示される。残りのシグナルは、抗ネクチン−４抗体の影響を受けないＰＶＲなどのＣＨＯ細胞によって発現される他の受容体とのリガンド結合に起因する可能性がある。これらの結果は、ネクチン−４クローンｈＮｅｃ４．０５およびｈＮｅｃ４．１１が、細胞表面のネクチン−４を介したシグナル伝達を遮断することによって、標的の癌細胞に影響を及ぼし得ることを示唆する。さらに、これらのＡｂは、抑制性リガンドＴＩＧＩＴなどのネクチン−４リガンドを発現するエフェクター細胞にも影響を及ぼし得る。
【０３０３】
実施例１０．ヒトＩｇＧ１キメラＡｂクローンｈＮｅｃ４．０５およびｈＮｅｃ４．１は、腫瘍細胞の存在下でＮＫ細胞の活性化を増強する
図１１では、ＮＫ細胞における脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの相対的な発現レベルが示される。ヒトＮＫ細胞（エフェクター、Ｅ）を、標的細胞（Ｔ）であるＨＴ１３７６（図１０Ａ）およびＭＤＡ−ＭＤ−４５３（図１０Ｂ）とＥ：Ｔ比が２：１でインキュベーションした。インキュベーションは、１２ｕｇ／ｍｌのキメラクローンｈＮｅｃ４．０５ｈＩｇＧ１、ｈＮｅｃ４．１１ｈＩｇＧ１、またはコントロールｈＩｇＧ１の存在下で実施した。２時間後、ＮＫ細胞をそれらの脱顆粒化および活性化状態についてＣＤ１０７ａ発現のＦＡＣＳ分析によってアッセイした。コントロールｈＩｇＧ１の存在下でのＮＫ細胞の脱顆粒化を１として設定し、それに応じて誘導倍率を計算した。示されているのは、２〜３回の繰り返しの平均およびそれらの正規化したＳＤである。これらの結果は、抗腫瘍ＮＫ細胞活性を増強することによるこれらの抗体の抗癌効果を示唆している。ＡＤＣＣ誘導においてクローンｈＮｅｃ４．０５ｈＩｇＧ１を超えるクローンｈＮｅｃ４．１１−ｈＩｇＧ１のわずかな利点が示され、これは図８Ａに示されるように、クローンｈＮｅｃ４．１１のより高い最大結合と一致している。
【０３０４】
実施例１１．ｈＮｅｃ４．１１によって駆り立てられるＣＡＲ−Ｔは、ネクチン−４を発現する腫瘍細胞の存在下で特定のＴ細胞の活性化をもたらす。
ＣＡＲ−Ｔ構築体の概略図を図１１Ａに示す。ＧＦＰ発現によって判断される形質導入有効性は９９％を超えた（図１１Ｂ）。親ジャーカット細胞またはｈＮｅｃ４．１１ベースの単鎖可変領域（ｓｃＦＶ）を含むＣＡＲ−Ｔ構築体を発現するジャーカット細胞（ジャーカットｐＨＡＧＥ２．４．１１）を、標的細胞ＨＴ１３７６およびＭＤＡ−ＭＤ−４５３（ＭＤＡ−４５３）とともにインキュベーションした（図１１Ｃ）。ジャーカット細胞によるＩＬ−２の分泌は、ＣＡＲ−Ｔの発現によって有意に誘発された。次に、ＰＢＭＣにｐＨＡＧＥ２．４．１１レンチ粒子を使用して形質導入した（図１１Ｄ）。ＣＡＲ−Ｔ  ＰＢＭＣを、Ｅ：Ｔの範囲にわたってＨＴ１３７６細胞とともにインキュベーションした。４８時間後、エフェクター細胞を除去し、標的細胞の生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光生物生存率アッセイを使用して評価した。標的細胞の死滅は有意だった。まとめると、これらの結果は、本明細書で説明されるネクチン４抗体に基づくＣＡＲ−Ｔ療法をさらに発展させる可能性を示している。
ＣＡＲ構築体のｓｃＦｖ配列
クローン１１−核酸（配列番号３１）
ＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＡＧＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＡＧＧＴＧＴＧＣＡＴＴＣＡＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＴＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＡＧＴＴＡＣＴＡＴＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＧＡＡＡＴＧＴＴＡＡＴＡＣＴＡＡＧＴＡＴＡＡＴＧＡＧＡＧＧＴＴＴＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＴＣＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＣＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＴＣＧＡＡＣＣＣＣＴＡＴＧＴＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＡＴＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＡＡＡＴＴＣＣＴＧＣＴＴＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＧＡＡＴＡＡＴＧＡＴＧＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＡＡＣＴＧＣＴＴ  ＡＴＧＴＡＴＴＡＴＧＣＡＴＣＣＡＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＡＴＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＴＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＣＡＡＴＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＧＣＴＴＡＴＡＧＧＴＣＴＣＣＧＴＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＴＣＡＡ
クローン１１−アミノ酸（配列番号３２）
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＥＴＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＹＮＥＲＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＮＴＡＨＭＱＬＴＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＳＮＰＹＶＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＶＭＴＱＴＰＫＦＬＬＶＳＡＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＳＶＮＮＤＶＡＷＹＱＱＫＰＧＬＳＰＥＬＬＭＹＹＡＳＮＲＦＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＹＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＩＹＦＣＱＱＡＹＲＳＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＱ
クローン５−核酸（配列番号３３）
ＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＡＧＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＡＧＧＴＧＴＧＣＡＴＴＣＡＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＧＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＴＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＴＧＧＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＧＡＡＡＴＧＴＴＡＡＴＡＣＴＡＡＧＡＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＴＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＴＣＧＡＡＣＣＣＣＴＡＴＧＴＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴ  ＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＴＣＴＡＧＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＡＡＡＴＴＣＣＴＧＣＴＴＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＴＴＡＣＣＡＴＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＧＡＧＴＡＡＴＧＡＴＧＴＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＧＴＣＴＣＣＴＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＴＣＣＡＡＴＣＧＣＴＡＣＡＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＡＴＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＧＡＴＴＡＴＡＧＣＴＣＴＣＣＧＴＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡ
クローン５−アミノ酸（配列番号３４）
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＲＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＩＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＷＩＹＰＧＮＶＮＴＫＮＮＥＫＦＫＶＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＳＮＰＹＶＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＩＶＭＴＱＴＰＫＦＬＬＶＳＡＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＹＡＳＮＲＹＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＹＧＴＤＦＴＦＴＩＳＡＶＱＡＥＤＬＡＶＹＦＣＱＱＤＹＳＳＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
【０３０５】
特定の実施形態の前述の説明は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにするので、他の人は、現在の知識を適用することにより、過度の実験なしに、および一般的な概念から逸脱することなく、このような特定の実施形態の様々な用途に容易に修正および／または適合でき、したがって、そのような適合および変更は、開示された実施形態の均等物の意味および範囲内で理解されるべきであり、そのように意図されている。本明細書で使用される表現または用語は、説明を目的としたものであり、限定を目的としたものではないことを理解されたい。
【図１】
2021522801.tif 000020
【図２】
2021522801.tif 000021
【図３】
2021522801.tif 000022
【図４Ａ】
2021522801.tif 000023
【図４Ｂ】
2021522801.tif 000024
【図５Ａ】
2021522801.tif 000025
【図５Ｂ】
2021522801.tif 000026
【図５Ｃ】
2021522801.tif 000027
【図６Ａ】
2021522801.tif 000028
【図６Ｂ】
2021522801.tif 000029
【図６Ｃ】
2021522801.tif 000030
【図７Ａ】
2021522801.tif 000031
【図７Ｂ】
2021522801.tif 000032
【図７Ｃ】
2021522801.tif 000033
【図８Ａ】
2021522801.tif 000034
【図８Ｂ】
2021522801.tif 000035
【図８Ｃ】
2021522801.tif 000036
【図９Ａ】
2021522801.tif 000037
【図９Ｂ】
2021522801.tif 000038
【図９Ｃ】
2021522801.tif 000039
【図９Ｄ】
2021522801.tif 000040
【図１０Ａ】
2021522801.tif 000041
【図１０Ｂ】
2021522801.tif 000042
【図１１Ａ】
2021522801.tif 000043
【図１１Ｂ】
2021522801.tif 000044
【図１１Ｃ】
2021522801.tif 000045
【図１１Ｄ】
2021522801.tif 000046
【手続補正書】
【提出日】令和3年1月14日(2021.1.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021522801000001.app
【国際調査報告】
2021522801.tif 000047
2021522801.tif 000048
2021522801.tif 000049
2021522801.tif 000050
2021522801.tif 000051