(57)【要約】本発明は、人工バイオキソーム粒子であって、選択された細胞源または細胞外源に由来する細胞膜成分を含有し、少なくとも１つの予め定められた活性分子を含む積荷を担持するように設計され、かつ、標的細胞と融合して標的細胞内に積荷を放出するように構成された、該バイオキソーム粒子を提供する。また、本発明は、本発明のバイオキソーム粒子の作製方法、及びそれらを含む組成物を提供する。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工バイオキソーム粒子であって、
選択された細胞源または細胞外源に由来する細胞膜成分を含有し、
少なくとも１つの予め定められた活性分子を含む積荷を担持するように設計され、かつ、
標的細胞と融合して前記標的細胞内に前記積荷を放出するように構成されたことを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項２】
請求項１に記載のバイオキソーム粒子であって、
前記積荷は、少なくとも２つの活性分子を含むことを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項３】
請求項１または２に記載のバイオキソーム粒子であって、
前記積荷は、複数の活性分子を含むことを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のバイオキソーム粒子であって、
前記細胞源または細胞外源は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、幹細胞、免疫系細胞、樹状細胞、外胚葉、ケラチノサイト、消化管（ＧＩ）細胞、口腔細胞、鼻粘膜細胞、神経細胞、網膜細胞、内皮細胞、心臓由来細胞、心筋細胞、周皮細胞、血液細胞、メラニン細胞、実質細胞、肝臓貯蔵細胞、神経幹細胞、膵臓幹細胞、胚性幹細胞、骨髄、皮膚組織、肝臓組織、膵臓組織、生体液、排泄物または外科的摘出組織、乳、唾液、粘液、血漿、尿、糞便、皮脂、出生後臍帯、胎盤、羊膜嚢、腎臓組織、神経組織、副腎組織、粘膜上皮、平滑筋組織、細菌細胞、細菌培養物、微生物全体、馴化培地、羊水、脂肪吸引組織、脂肪吸引副産物、及び植物組織からなる群より選択されることを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のバイオキソーム粒子であって、
前記活性分子は、核酸、ペプチド、アミノ酸、ポリペプチド、ヌクレオシド、成長因子、有機分子、ポリフェノール、ステロイド、脂溶性難溶性薬物、無機分子、抗酸化剤、ホルモン、抗体、ビタミン、サイトカイン、酵素、熱ショックタンパク質、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されることを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項６】
請求項５に記載のバイオキソーム粒子であって、
前記活性分子は、カンナビノイド、カンナビノイド酸、及びエンドカンナビノイドからなる群より選択されることを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項７】
請求項６に記載のバイオキソーム粒子であって、
前記カンナビノイド、前記カンナビノイド酸、または前記エンドカンナビノイドは、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）、カンナビノール酸（ＣＢＮＡ）、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、カンナビノール（ＣＢＮ）、カンナビジオール（ＣＢＤ）、カンナビクロメン（ＣＢＣ）、及びアシルエタノールアミドからなる群より選択されることを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項８】
請求項５に記載のバイオキソーム粒子であって、
前記核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であることを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項９】
請求項８に記載のバイオキソーム粒子であって、
前記核酸はＲＮＡであり、
前記核酸は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンタゴミル、アプタマー、及びリボザイムｍＲＮＡからなる群より選択されることを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のバイオキソーム粒子であって、
前記活性分子は、治療効果を有することを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項１１】
請求項１０に記載のバイオキソーム粒子であって、
前記治療効果は、抗炎症効果、抗線維化効果、抗腫瘍効果、及び神経保護効果からなる群より選択されることを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載のバイオキソーム粒子であって、
前記バイオキソーム粒子は、レドキソームであり、
前記積荷は、少なくとも１つの酸化還元活性フリーラジカル捕捉化合物を含むことを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項１３】
請求項１２に記載のバイオキソーム粒子であって、
フェントン反応複合体阻害剤、ヒドロキシルラジカルトラップ剤、鉄キレート剤、及び脂質ラジカルトラップ剤をさらに含有することを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項１４】
請求項１１または１２に記載のバイオキソーム粒子であって、
ビタミンＥ、テルペノイド、ポリフェノール、フラボノイド、フェノール酸、カンナビノイド、レチノイド、ビタミンＤ、リポ酸、ステロールを含む脂質ラジカル／過酸化物トラップ剤によって、ＬＰＯ鎖反応を阻害することができることを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載のバイオキソーム粒子であって、
前記ラジカルトラップ剤は、アスコルビン酸、一酸化窒素供与体（Ｓ−ニトロソグルタチオン）、またはそれらの誘導体であることを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項１６】
請求項１３に記載のバイオキソーム粒子であって、
前記鉄キレート剤は、デスフェリオキサミン（ＤＦＸ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ルチン、ＥＤＴＡ二ナトリウム、ＥＤＴＡ四ナトリウム、ＥＤＴＡカルシウム二ナトリウム、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはその塩、ヒドロキシエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）またはその塩、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、クエン酸アセチルトリヘキシル、アミノトリメチレンホスホン酸、β−アラニン二酢酸、クエン酸ビスマス、クエン酸、シクロヘキサンジアミン四酢酸、クエン酸ジアンモニウム、シュウ酸ジブチル、シュウ酸ジエチル、シュウ酸ジイソブチル、シュウ酸ジイソプロピル、シュウ酸ジリウム、シュウ酸ジメチル、ＥＤＴＡ二カリウム、シュウ酸二カリウム、シュウ酸ジプロピル、ＥＤＴＡ−銅二ナトリウム、ピロリン酸二ナトリウム、エチドロン酸、ＨＥＤＴＡ、シクロデキストリンメチル、シュウ酸、五カリウム、三リン酸、アミノトリメチレンリン酸五ナトリウム、ペンテト酸五ナトリウム、三リン酸五ナトリウム、ペンテト酸、ジカルボン酸、フィチン酸、クエン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ジヒドロキシエチルグリシン酸ナトリウム、グルセプト酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、シュウ酸ナトリウム、トリメタリン酸ナトリウム、茶−ＥＤＴＡ、テトラヒドロキシプロピルエチレンジアミン、エチドロン酸四カリウム、ピロリン酸四カリウム、エチドロン酸四ナトリウム、ピロリン酸四ナトリウム、ＥＤＴＡ三カリウム、ＥＤＴＡ三ナトリウム、ＨＥＤＴＡ三ナトリウム、ＮＴＡ三ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リンゴ酸、フマル酸、マルトール、サクシマー、ペニシラミン、ジメルカプロール、デフェリプロン、天然タンパク質ベースの鉄キレート剤、メラトニン、シデロホア、亜鉛もしくは銅のカチオン、それらの塩もしくは錯体、メシル酸デスフェリオキサミン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されることを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項１７】
請求項１３に記載のバイオキソーム粒子であって、
前記鉄キレート剤は、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、デトキサミン、デフェロキサミン、デフェリプロン、デフェラシロクス、グルタチオン、金属タンパク質、フェロケル（ビスグリシン酸キレート）、セルロプラスミン、ペニシラミン、クプリゾン、トリエンチン、フェルラ酸、酢酸亜鉛、リポカリン２、及びジメルカプロールからなる群より選択されることを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかに記載のバイオキソーム粒子であって、
長期循環性持続放出バイオキソームであることを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載のバイオキソーム粒子であって、
選択的標的化バイオキソームであることを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれかに記載のバイオキソーム粒子であって、
免疫原性バイオキソームであることを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載のバイオキソーム粒子と、
少なくとも１つの担体と、
を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の組成物であって、
前記組成物は、医薬組成物であり、
前記担体は、薬学的に許容可能な担体であることを特徴とする組成物。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載の組成物であって、
前記組成物は、経口投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、舌下投与、組織内投与、組織に挿入されたインプラントを介した投与、髄腔内投与、筋肉内投与、局所投与、眼内投与、鼻腔内投与、経直腸投与、経膣投与、経肺投与、経粘膜投与、及び経皮投与に適していることを特徴とする組成物。
【請求項２４】
請求項２１に記載の組成物であって、
前記組成物は、薬用化粧品組成物であり、
前記担体は、薬用化粧品的に許容される担体であることを特徴とする組成物。
【請求項２５】
請求項２１に記載の組成物であって、
前記組成物は、食用組成物であり、
前記担体は、食品グレードの担体であることを特徴とする組成物。
【請求項２６】
選択された細胞源または細胞外源に由来する細胞膜成分を含有し、少なくとも１つの活性分子を含む積荷を担持するように設計され、かつ、標的細胞と融合して前記標的細胞内に前記積荷を放出するように構成された複数のバイオキソーム粒子を含む試料の作製方法であって、
（ａ）脂質抽出物を得るために、前記選択された細胞源または細胞外源からの全細胞脂質抽出をマイルドな溶媒系中で行うステップと、
（ｂ）前記脂質抽出物を乾燥させるステップと、
（ｃ）少なくとも１回の超音波処理を行うことによってバイオキソーム粒子の自己集合を誘導するステップと、を含み、
これにより、０．０３〜５μｍの平均粒径を有するバイオキソーム粒子を含む試料が得られることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、
前記バイオキソーム粒子の平均粒径は、０．０５〜３μｍであることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、
前記バイオキソーム粒子の平均粒径は、０．０８〜１．５μｍであることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２６〜２８のいずれかに記載の方法であって、
前記バイオキソーム粒子を含む前記試料は、３．５〜５．５のｐＨを有することを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、
前記バイオキソーム粒子を含む前記試料は、４．５〜５のｐＨを有することを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２６〜３０のいずれかに記載の方法であって、
前記マイルドな溶媒系は、極性溶媒及び非極性溶媒の混合物を含むことを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、
前記極性溶媒は、イソプロパノール、エタノール、ｎ−ブタノール、及び水飽和ｎ−ブタノールからなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項３１または３２に記載の方法であって、
前記非極性溶媒は、ヘキサン、テルペン基由来溶媒、及び超臨界ＣＯ２抽出物から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、
前記非極性溶媒は、ｎ−ヘキサンであることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３３に記載の方法であって、
前記テルペン基由来溶媒は、ｄ−リモネン、ａ−ピネン、及びパラシメンからなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３１〜３４のいずれかに記載の方法であって、
前記極性溶媒は、イソプロパノールであり、
前記非極性溶媒は、ｎ−ヘキサンであることを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項２６〜３６のいずれかに記載の方法であって、
前記溶媒系は、安定剤をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法であって、
前記安定剤は、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）または脂質ラジカルトラップ剤であることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項２６〜３８のいずれかに記載の方法であって、
前記溶媒系は、酸化防止剤、界面活性剤、ビタミンＥ、スクアレン、コレステロール、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項２６〜３９のいずれかに記載の方法であって、
核酸を共沈させるステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、
前記核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であることを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法であって、
前記核酸は、ＲＮＡであることを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項２６〜４２のいずれかに記載の方法であって、
前記全脂質抽出のための前記細胞源または細胞外源は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、幹細胞、免疫系細胞、樹状細胞、外胚葉、ケラチノサイト、消化管（ＧＩ）細胞、口腔細胞、鼻粘膜細胞、神経細胞、網膜細胞、内皮細胞、心臓由来細胞、心筋細胞、周皮細胞、血液細胞、メラニン細胞、実質細胞、肝臓貯蔵細胞、神経幹細胞、膵臓幹細胞、胚性幹細胞、骨髄、皮膚組織、肝臓組織、膵臓組織、出生後臍帯、胎盤、羊膜嚢、腎臓組織、神経組織、副腎組織、粘膜上皮、平滑筋組織、細菌細胞、細菌培養物、微生物全体、馴化培地、羊水、脂肪吸引組織、脂肪吸引副産物、及び植物組織からなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項２６〜４３のいずれかに記載の方法であって、
前記脂質抽出は、細胞馴化培地、凍結乾燥馴化細胞培地、細胞ペレット、凍結細胞、乾燥細胞、洗浄細胞バルク、非付着細胞懸濁液、または付着細胞層から行われることを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法であって、
前記付着細胞層は、（マルチ）フラスコ、ディッシュ、スキャフォールド、ビーズ、及びバイオリアクタから選択される細胞培養プラスチック製品中で増殖させられることを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項２６〜４５のいずれかに記載の方法にしたがって作製された複数のバイオキソーム粒子を含む試料。
【請求項４７】
対象の病状を治療または予防する方法であって、
前記対象に対して請求項２１〜２３のいずれかに記載の組成物を投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法であって、
前記病状は、炎症性疾患、神経学的疾患、感染性疾患、悪性腫瘍、免疫系疾患、及び自己免疫疾患からなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項４９】
対象の皮膚状態を改善する方法であって、
前記対象に対して請求項２１〜２４のいずれかに記載の組成物を投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、
前記組成物が局所的に投与されることを特徴とする方法。
【請求項５１】
請求項１〜２０のいずれかに記載のバイオキソーム粒子の、前記活性分子を標的部位に送達するための担体としての使用。
【請求項５２】
請求項１〜２０のいずれかに記載のバイオキソーム粒子の、薬剤としての使用。
【請求項５３】
請求項１〜２０のいずれかに記載のバイオキソーム粒子の、炎症性疾患、神経学的疾患、感染性疾患、悪性腫瘍、免疫系疾患、または自己免疫疾患の治療への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性生体物質を送達するように設計された新規なバイオキソーム粒子、その作製方法、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
エキソソームは、核酸やタンパク質を運ぶ、天然に存在する分泌された脂質膜微小小胞であり、細胞小器官間や細胞間で核酸やタンパク質を移動させることによって細胞間通信を可能にする。エキソソームは、エンドリソソーム小胞の陥入によって形成され、細胞膜と融合することにより細胞外に放出される。
【０００３】
エキソソームは、ホメオスタシス状態下または疾患の病的状態中に、様々な生理的機能を有する。細胞は、エキソソーム及び微小小胞（ＭＶ）とそれぞれ称されるエンドソーム由来の膜小胞及び細胞膜由来の膜小胞を細胞外環境に放出する。これらを総称した細胞外小胞（ＥＶ）は、膜細胞間で細胞質タンパク質、脂質、及びＲＮＡが移動するための担体として機能することにより、細胞間通信の重要な役割を果たす。
【０００４】
脂質は、脂肪酸、特に多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）に存在する多重二重結合に起因して、ＦＲのための特に貴重な基質である。脂質過酸化（ＬＰＯ）は、開始、増殖、終了の３つの主要ステップからなる連鎖プロセスである。天然細胞膜の主成分は、ＰＵＦＡからなる極性リン脂質（ＰＬ）であるため、天然細胞膜は、酸化ストレスに対して脆弱である。従来、ＬＰＯの酸素ラジカルによるダメージが、膜破壊、変性過程、細胞死をもたらす主要なプロセスと考えられている。
【０００５】
天然のエキソソーム中に遺伝物質やタンパク質が存在することは、エキソソームがそのような生物学的物質のための担体として機能している可能性を示唆する。膜二重層及び水性コアの構造はリポソームの構造と類似しており、これにより、細胞膜を介したそれらの内容物の送達が可能となる。したがって、エキソソームは、様々な生体物質の送達システムとして機能する大きな可能性を有している。エキソソーム及びエキソソームの作製方法についての様々な適用が、特許文献１〜１４に記載されている。
【０００６】
エキソソームは、その膜融合特性及び細胞内標的特性に基づいて、現在使用されている最先端の薬物送達システム（ＤＤＳ）における、下記の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の未解決の問題を解決するためのＤＤＳとして適用することが期待される。（ｉ）細胞外酵素に起因する、裸の遺伝子及び核酸の送達の不安定性。（ｉｉ）ウイルス性ＤＤＳ及びリポソームＤＤＳは、宿主免疫系によって異物として認識され、その結果、それらに対する抗体が生成され、これにより、送達及び安全性が低下する。（ｉｉｉ）活性天然薬物及び治療薬物の大部分は本来疎水性であり、そのため、ＬＰＯの傾向があり、生物学的利用能が低い。上記の（ｉ）〜（ｉｉｉ）はすべて、エキソソーム−ＤＤＳ（薬物送達システム）を実現するために解決するべき主要な課題であり、生産収率、制御担持、安定性、並びに、タンパク質及びＤＮＡを含む組成を改善することが求められている。加えて、現在知られているエキソソーム作製方法は複雑であり、かつ多数のステップを要するため、治療用積荷のための送達担体としてのエキソソームの臨床適用は制限される。したがって、膜完全性、ＬＰＯ連鎖反応に対する安定性、及び治療薬としての使用に必要とされる天然特性を最大限に維持する、エキソソームに触発された人工膜小胞、送達担体、及び研究ツールの大規模生産のための、単純で、ロバストな、かつ費用対効果の高い工業的な方法が依然として求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５、１６５、９３８号明細書
【特許文献２】米国特許第５、４２８、００８号明細書
【特許文献３】米国特許第８、１３８、１４７号明細書
【特許文献４】米国特許第８、５１８、８７９号明細書
【特許文献５】米国特許第９／１１９、９７４号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００４／０００８２５１号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１１／０００３００８号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１１／００１４２５１号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２０１３／００５２６４７号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２０１３／０１４３３１４号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２０１３／０２０９５２８号明細書
【特許文献１２】国際公開第２００９／１０５０４４号
【特許文献１３】国際公開第２０１５／１１０９５７号
【特許文献１４】国際公開第２０１５／１３８８７８号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明の主な目的は、膜完全性を最大限に維持し、かつ、活性生体分子を送達するための担体または複数の工業的用途を有するスタンドアロンの薬剤として使用するように設計されたエキソソーム様人工粒子を工業的規模で作製するための従来技術の方法及びシステムの問題点を解決することである。
【０００９】
本発明は、人工バイオキソーム粒子であって、選択された細胞源または細胞外源に由来する細胞膜成分を含有し、少なくとも１つの予め定められた活性分子を含む積荷（カーゴ）を担持するように設計され、かつ、標的細胞と融合して標的細胞内に積荷を放出するように構成された、該人工バイオキソーム粒子を提供する。
【００１０】
また、本発明は、人工バイオキソーム粒子と、少なくとも１つの担体と、を含む組成物であって、人工バイオキソーム粒子が、選択された細胞源または細胞外源に由来する細胞膜成分を含有し、少なくとも１つの予め定められた活性分子を含む積荷を担持するように設計され、かつ、標的細胞と融合して標的細胞内に積荷を放出するように構成された、該組成物をさらに提供する。
【００１１】
また、本発明は、選択された細胞源または細胞外源に由来する細胞膜成分を含有し、少なくとも１つの活性分子を含む積荷を担持するように設計され、かつ、標的細胞と融合して標的細胞内に積荷を放出するように構成された複数のバイオキソーム粒子を含む試料の作製方法であって、（ａ）脂質抽出物を得るために、選択された細胞源または細胞外源からの全細胞脂質抽出をマイルドな溶媒系中で行うステップと、（ｂ）脂質抽出物を乾燥させるステップと、（ｃ）少なくとも１回の超音波処理を行うことによってバイオキソーム粒子の自己集合を誘導するステップと、を含み、これにより、０．０３〜５μｍの平均粒径を有するバイオキソーム粒子を含む試料が得られる、該方法をさらに提供する。
【００１２】
また、本発明は、対象の病状を治療または予防する方法であって、対象に対して、人工バイオキソーム粒子と、少なくとも１つの担体とを含む組成物を投与するステップを含み、人工バイオキソーム粒子が、選択された細胞源または細胞外源に由来する細胞膜成分を含有し、少なくとも１つの予め定められた活性分子を含む積荷を担持するように設計され、かつ、標的細胞と融合して標的細胞内に積荷を放出するように構成された、該方法をさらに提供する。
【００１３】
また、本発明は、対象の皮膚状態を改善する方法であって、対象に対して、人工バイオキソーム粒子と、少なくとも１つの担体とを含む組成物を投与するステップを含み、人工バイオキソーム粒子が、選択された細胞源または細胞外源に由来する細胞膜成分を含有し、少なくとも１つの予め定められた活性分子を含む積荷を担持するように設計され、かつ、標的細胞と融合して標的細胞内に積荷を放出するように構成された、該方法をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】マルバーン社製の装置で測定したバイオキソーム粒子の粒径分布。（Ａ）分離直後。（Ｂ）分離の１カ月後。
【図２】バイオキソーム粒径分布。（Ａ）ゼータサイザナノ分析装置で測定したバイオキソームの粒径分布。分析装置による測定値は、ヒストグラム上の２つのピークで表される（Ｘ軸は粒径を示す）。（Ｂ）ナノサイト粒径測定装置で検出したバイオキソームの粒径分布。Ｘ軸は粒径をｎｍで示し、Ｙ軸は１ｍｌ当たりの粒子数を示す。左側の図は、同一の試料の３つの測定値を示す。右側の図は、左側の図で実施された３つの測定の平均を示す。
【図３】バイオソームの安定性及び粒径分布。３つの異なる試料から作製したバイオキソームの粒径分布プロフィルを示す。（Ａ）再超音波処理を行わなかった試料。（Ｂ）再超音波処理を行った試料。（Ｃ）凍結乾燥及び超音波処理後の試料。
【図４】ＢｉｏＤｉｐｙ標識バイオキソームのヒト包皮線維芽細胞初代培養（ＨＦＦ）への融合を示す共焦点顕微鏡画像。３つの様々な細胞源から作製したバイオソームと、実験の２４時間前に測定した平均粒径。（Ａ）初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）；ＡＴＣＣ（登録商標）ＰＣＳ−１００−０１０（ＴＭ）  粒径：＞９０％  約１，４ｍｃｎ。（Ｂ）初代ヒト乳腺上皮細胞；ＡＴＣＣ（登録商標）ＰＣＳ−６００−０１０（ＴＭ）。実験の２４時間前に測定した粒径：４０％  約３００ｎｍ；６０％：６００ｎｍ。粒径；実験の２４時間前に測定  １ｍｃｎ。（Ｃ）ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞；ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１６５８；粒径：＞９０％  約７５０ｎｍ。
【図５】付着細胞からバイオキソーム粒子を分離する一般的なスキーム。
【図６】バイオキソーム粒子の起源−標的組織に対する特異性。（Ａ）手順の概略図。（Ｂ）実験データ。
【図７】レドキソーム粒子の模式図。
【図８】２つの互いに異なる濃度のＤＨＡ、及びα−トコフェロールの存在下での、ＰＯＢＮ付加物形成（ＥＰＲスペクトル）を測定することによるレドキソーム粒子の酸化還元感受性。
【図９】（Ａ）レドキソーム粒子からのヒドロキシルラジカル誘発性漏出の動態。（Ｂ）レドキシン粒子からのトリトン誘発性カルセイン漏出。
【図１０】ＲＮＡカプセル化能力。骨髄（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、Ｃ−１２９７４）由来のヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から産生された共抽出ＲＮＡでカプセル化したバイオキソーム、ナノサイト粒径測定装置で行った粒径測定。（Ａ）凍結融解を繰り返す（３回）ことで均一性は失われたが、スペック＜１，５ｍｃｎに留まった。（Ｂ）単回の凍結融解サイクル、及びＣ−凍結融解サイクルなし−の後のＲＮＡ均一カプセル化を、超音波処理／ＲＮＡカプセル化後の新鮮な状態で測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施形態を示す添付図面を参照して、本発明をより詳細に説明する。しかしながら、本発明は、様々な別の形態で実施することができ、本明細書に記載された実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示を徹底的にかつ完全に説明し、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるために提供される。
【００１６】
本発明は、人工バイオキソーム粒子であって、選択された細胞源または細胞外源に由来する細胞膜成分を含有し、少なくとも１つの予め定められた活性分子を含む積荷（カーゴ）を担持するように設計され、かつ、標的細胞と融合して標的細胞内に積荷を放出するように構成されたことを特徴とする人工バイオキソーム粒子を提供する。本明細書で使用するとき、「バイオキソーム（ｂｉｏｘｏｍｅ）」という用語は、これに限定しないが、天然の細胞外小胞（ＥＶ）に類似する、１マイクロメートル（ミクロン）未満の人工ナノ粒子を指す。本発明のバイオキソーム粒子の粒径は、０．０３〜５μｍの範囲である。一実施形態では、バイオキソーム粒子の粒径は、０．１〜０．７μｍ、０．１〜０．５μｍ、０．２〜０．５μｍ、または０．３〜０．５μｍである。別の実施形態では、バイオキソーム粒子の平均粒径は、５μｍ以下、１．５μｍ以下、０．７μｍ以下、０．５μｍ以下、０．３μｍ以下、または０．１５μｍ以下である。一実施形態では、バイオキソーム粒子の平均粒径は、０．５〜１．５μｍである。一実施形態では、バイオキソーム粒子の平均粒径は、０．４〜０．８μｍである。別の実施形態では、バイオキソーム粒子の平均粒径は、０．３〜０．５μｍである。さらに別の実施形態では、作製後の数時間以内に測定した場合、バイオキソーム粒子の平均粒径は０．４〜１．５μｍである。さらに別の実施形態では、作製後に０〜−４°Ｃで貯蔵したバイオキソーム粒子を、作製後の１ヶ月以内に粒径を測定した場合、バイオキソーム粒子の平均粒径は０．８〜５μｍである。
【００１７】
一実施形態では、バイオキソーム粒子は、積荷を担持していない。さらに別の実施形態では、粒子は、少なくとも１つの活性分子を含む積荷を担持している。一実施形態では、積荷は、少なくとも２つの活性分子を含む。別の実施形態では、積荷は、複数の活性分子を含む。本明細書で使用するとき、「活性分子」という用語は、これに限定しないが、シグナル伝達分子、生体分子、遺伝子及び翻訳修飾核酸物質、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、有機分子、無機分子、アミノ酸、ビタミン、ポリフェノール、ステロイド、脂溶性難溶性薬物、血管調節剤、ペプチド、神経伝達物質及びその類似体、ヌクレオシド、タンパク質（これに限定しないが、例えば、成長因子、ホルモン、アプタマー、抗体、サイトカイン、酵素、熱ショックタンパク質）、または生物学的機能を発揮する任意の他の分子を指す。一実施形態では、活性分子は、カンナビノイド、カンナビノイド酸、またはエンドカンナビノイドである。さらに別の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド酸は、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）、カンナビノール酸（ＣＢＮＡ）、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、カンナビノール（ＣＢＮ）、カンナビジオール（ＣＢＤ）、カンナビクロメン（ＣＢＣ）、及びそれらのエンドカンナビノイドまたは類似体からなる群より選択される。一実施形態によれば、核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。さらなる実施形態によれば、核酸はＲＮＡであり、核酸は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンタゴミル、アプタマー、及びリボザイムｍＲＮＡからなる群より選択される。一実施形態によれば、活性分子は治療効果を有する。本明細書で使用するとき、「治療効果」という用語は、これに限定しないが、任意の種類の治療後における、その結果が有用または好ましいと判断される反応を指す。これは、予想していた結果にも、予期外の結果にも、さらには、意図しない結果にも当てはまる。一実施形態では、治療効果は、抗炎症効果、抗線維化効果、抗腫瘍効果、及び神経保護効果からなる群より選択される。炎症、線維症、または過糖症（例えば、糖尿病性腎症）を治療するために選択される積荷の非限定的な例としては、天然由来の遍在するフェノール化合物、例えば、フェルラ酸；天然フェノール、例えば、レスベラトロール、ルチン、ケルセチン、フェノール酸、ビタミン、アリシン；テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）、カンナビノール酸（ＣＢＮＡ）、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、カンナビノール（ＣＢＮ）、カンナビジオール（ＣＢＤ）、カンナビクロメン（ＣＢＣ）、及び／またはそれらの誘導体もしくは合成類似体からなる群より選択されるカンナビノイド；デクスメデトミジン；（α２−ＡＲ）アゴニスト；代謝保護物質、これに限定しないが、例えば、ビルダグチン、プリメリン、メトホルミン、ピリドキサミン、血管調節剤、エピネフリン、ルチン、イソクスプリンが挙げられる。抗腫瘍効果を発揮する積荷の非限定的���例としては、これに限定しないが、化学療法剤、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、クロラムブシル、メルファラン、ネダプラチン、オキサリプラチン、四硝酸トリプラチン、サトラプラチン、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ラジシコール；免疫調節剤、血管新生阻害剤、有糸分裂阻害剤、ヌクレオシド類似体、ＤＮＡ挿入剤、抗老化剤、ジペプチド、エピジェネティック因子及び調節剤、メトホルミン、ラパマイシン、バルプロ酸またはその塩、ワートマニン、ポリアミンスペルミジン、ＨＤＡＣ阻害剤、酪酸ナトリウム、酪酸、サーチュイン活性化剤、レスベラトロール、補酵素ＣｏＱ１０、小ジカルボン酸、アスピリン、サリチル酸、安息香酸、カルニチン類似体、ヒト成長ホルモン、トポイソメラーゼ類似体、抗体、サイトカイン、葉酸代謝拮抗剤、糖鎖阻害剤、ヒト癌化または癌原性転写因子に対する阻害剤オリゴヌクレオチド；あるいは、化学療法剤、免疫調節剤、抗血管新生阻害剤、分裂阻害剤、ヌクレオシド類似体、ＤＮＡ挿入剤、トポイソメラーゼ類似体、抗体、サイトカイン、または葉酸代謝拮抗剤、ヘキソキナーゼ阻害剤、乳酸脱水素酵素阻害剤、ホスホフルクトキナーゼ２またはホスホフルクトキナーゼ２／フルクトース−２，６−ビスホスファターゼ阻害剤、ピルビン酸キナーゼＭ２阻害剤、トランスケトラーゼ阻害剤、ピルビン酸脱水素酵素阻害剤、ピルビン酸脱水素酵素キナーゼ阻害剤、グルコース−６−リン酸脱水素酵素阻害剤、ＧＬＵＴ阻害剤、プロトン輸送阻害剤、モノカルボン酸輸送阻害剤、低酸素誘導因子１α阻害剤、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ阻害剤、グルタミン阻害剤、アスパラギン阻害剤、アルギニン阻害剤、脂肪酸合成酵素阻害剤、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ阻害剤、リンゴ酸ジメチル、リンゴ酸酵素２阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００１８】
本発明の一実施形態では、細胞源または細胞外源は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、幹細胞、免疫系細胞、樹状細胞、外胚葉、ケラチノサイト、消化管（ＧＩ）細胞、口腔細胞、鼻粘膜細胞、神経細胞、網膜細胞、内皮細胞、心臓由来細胞、心筋細胞、周皮細胞、血液細胞、メラニン細胞、実質細胞、肝臓貯蔵細胞、神経幹細胞、膵臓幹細胞、胚性幹細胞、骨髄、皮膚組織、肝臓組織、膵臓組織、出生後臍帯、胎盤、羊膜嚢、腎臓組織、神経組織、副腎組織、粘膜上皮、平滑筋組織、細菌細胞、細菌培養物、真菌、藻類、微生物全体、馴化培地、羊水、脂肪吸引組織、脂肪吸引副産物、糞便試料、及び植物組織からなる群より選択される。
【００１９】
一実施形態では、バイオキソームは、レドキソームである。本明細書で使用するとき、「レドキソーム」という用語は、これに限定しないが、少なくとも１つの酸化還元活性フリーラジカル捕捉化合物を含む積荷を担持するバイオキソーム粒子を指す。一実施形態では、レドキソーム粒子からのパッケージ化された複合体の放出は、ＬＰＯ鎖反応を阻害する。さらに別の実施形態では、レドキソーム粒子からのパッケージ化された複合体の放出は、酸化ストレスの部位で優先的に刺激される。一実施形態では、レドキソームは、これに限定しないが、ビタミンＥ、テルペノイド、ポリフェノール、フラボノイド、フェノール酸、カンナビノイド、レチノイド、ビタミンＤ、リポ酸、ステロールなどの脂質ラジカル／過酸化物トラップ剤によって、ＬＰＯ鎖反応を阻害することができる。一実施形態によれば、レドキソームは、フェントン反応複合体阻害剤、ヒドロキシルラジカルトラップ剤、鉄キレート剤、及び脂質ラジカルトラップ剤をさらに含有する。一実施形態では、ラジカルトラップ剤は、アスコルビン酸、一酸化窒素供与体（Ｓ−ニトロソグルタチオン）、またはそれらの誘導体である。本発明の鉄キレート剤の非限定的な例としては、これに限定しないが、デスフェリオキサミン（ＤＦＸ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ルチン、ＥＤＴＡ二ナトリウム、ＥＤＴＡ四ナトリウム、ＥＤＴＡカルシウム二ナトリウム、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはその塩、ヒドロキシエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）またはその塩、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、クエン酸アセチルトリヘキシル、アミノトリメチレンホスホン酸、β−アラニン二酢酸、クエン酸ビスマス、クエン酸、シクロヘキサンジアミン四酢酸、クエン酸ジアンモニウム、シュウ酸ジブチル、シュウ酸ジエチル、シュウ酸ジイソブチル、シュウ酸ジイソプロピル、シュウ酸ジリウム、シュウ酸ジメチル、ＥＤＴＡ二カリウム、シュウ酸二カリウム、シュウ酸ジプロピル、ＥＤＴＡ−銅二ナトリウム、ピロリン酸二ナトリウム、エチドロン酸、ＨＥＤＴＡ、シクロデキストリンメチル、シュウ酸、五カリウム、三リン酸、アミノトリメチレンリン酸五ナトリウム、ペンテト酸五ナトリウム、三リン酸五ナトリウム、ペンテト酸、ジカルボン酸、フィチン酸、クエン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ジヒドロキシエチルグリシン酸ナトリウム、グルセプト酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、シュウ酸ナトリウム、トリメタリン酸ナトリウム、茶−ＥＤＴＡ、テトラヒドロキシプロピルエチレンジアミン、エチドロン酸四カリウム、ピロリン酸四カリウム、エチドロン酸四ナトリウム、ピロリン酸四ナトリウム、ＥＤＴＡ三カリウム、ＥＤＴＡ三ナトリウム、ＨＥＤＴＡ三ナトリウム、ＮＴＡ三ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リンゴ酸、フマル酸、マルトール、サクシマー、ペニシラミン、ジメルカプロール、デフェリプロン、天然タンパク質ベースの鉄キレート剤、メラトニン、シデロホア、亜鉛もしくは銅のカチオン、それらの塩もしくは錯体、メシル酸デスフェリオキサミン、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。さらに別の実���形態では、鉄キレート剤は、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、デトキサミン、デフェロキサミン、デフェリプロン、デフェラシロクス、グルタチオン、金属タンパク質、フェロケル（ビスグリシン酸キレート）、セルロプラスミン、ペニシラミン、クプリゾン、トリエンチン、フェルラ酸、酢酸亜鉛、リポカリン２、及びジメルカプロールからなる群より選択される。
【００２０】
本発明の一実施形態によれば、レドキソーム粒子の成分は、天然キレート剤、及び承認されたダイエット用の栄養補助食品である。本発明の天然キレート剤として、これに限定しないが、クエン酸、アミノ酸（例えば、カルノシン）、タンパク質、多糖類、核酸、グルタミン酸、ヒスチジン、有機二酸、ポリペプチド、フィトケラチン、ヘモグロビン、クロロフィル、フミン酸、ホスホン酸、またはトランスフェリンが挙げられる。一実施形態では、キレート剤は、フラボンやフラボノイドなどのポリフェノールのグループに属する。一実施形態では、ポリフェノールとしては、これに限定しないが、ルチン、ケルセチン、ルテイン、またはＥＧＣＧが挙げられる。
【００２１】
一実施形態によれば、レドキソーム粒子は、フェノール抗酸化剤などの抗酸化剤を含有する。そのような抗酸化剤としては、例えば、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）（ＩＵＰＡＣ名：２，６−ビス（１，１−ジメチルエチル）−４−メチルフェノール）、ジブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、没食子酸プロピル、硫酸ナトリウム、クエン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、トコフェロール、トコフェロールエステル誘導体、２−メルカプトベンズイミダゾール、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。一実施形態では、使用される抗酸化剤の量は、０．１〜２０％質量％である。さらに別の実施形態では、使用される抗酸化剤の量は、膜投与組成物の全質量に対して、０．５〜１０質量％、０．７〜１０質量％、１〜８質量％、３〜８質量％、２〜５質量％、５〜１０質量％、３〜１０質量％、または２．５〜１０質量％である。一実施形態では、レドキソーム粒子には、ＬＣ−ＰＵＦＡ、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、またはエタノールアミンプラズマロゲンまたはそれらの誘導体がエンリッチされる。さらに別の実施形態では、レドキソーム粒子は、加齢に伴うコラーゲンの断片化を阻害するＤＦＸを送達する。一実施形態では、レドキソーム粒子は、ヒアルロン酸の分解を阻害するアスコルビン酸またはその誘導体を送達し、それによって、コラーゲン及び細胞外マトリックスの損失を遅延させる。本発明の一実施形態では、レドキソーム粒子は、創傷治癒、美容医療、真皮充填処置の補助において有用であり得る。本発明の一実施形態では、レドキソームは、ヒト包皮／皮膚線維芽細胞、ケラチノサイト、脂肪由来幹細胞、及び皮膚マイクロバイオーム細胞に由来する。
【００２２】
本発明の実施形態によれば、バイオキソーム粒子は、積荷または物理的属性にしたがって分類される。一実施形態では、バイオキソーム粒子は、ｐＨ感受性バイオキソームである。一実施形態では、バイオキソーム粒子は、核酸トランスフェクションバイオキソームである。本明細書で使用するとき、「核酸トランスフェクションバイオキソーム」という用語は、これに限定しないが、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節する目的で、バイオキソームによってカプセル化され、標的細胞、組織、器官に送達されるヌクレオチドを指す。本発明の文脈において、「調節する」という用語は、これに限定しないが、内在性の核酸若しくは遺伝子またはそれに対応するタンパク質を増加させること、増強すること、減少させること、または除去することを指す。一実施形態では、このようなカプセル化されたポリヌクレオチドは、天然型または組換え型であってよく、センスまたはアンチセンスの作用機序を用いて、それらの治療活性を発揮する。一実施形態では、核酸トランスフェクションバイオキソームには、合成カチオン性脂質が補充される。別の実施形態では、バイオキソーム粒子は、長期循環性持続放出バイオキソームである。「長期循環性持続放出バイオキソーム」という用語は、バイオキソームのコアポリマー、タンパク質、または多糖類の修飾によって積荷の持続的な送達を提供することにより、血液循環または標的組織における薬物の治療レベルを延長するように設計されたバイオキソームを指す。本発明の長期循環性持続放出バイオキソームは、これに限定しないが、コア−ＰＥＧ共役脂質、アルブミン、ヒアルロン酸、アンカリング金属イオン、またはそれらの任意の組み合わせを添加することにより作製される。コアバイオキソーム膜の親水性修飾は、非修飾バイオキソームと比較して、標的器官または血液におけるバイオキソームの滞留時間を増加させる。循環時間の増加は、ＰＥＧ化粒子の表面における血漿タンパク質の吸収速度の低下に起因する。
【００２３】
一実施形態では、バイオキソーム粒子は、選択的標的化バイオキソームである。本発明の文脈において、「選択的標的化バイオキソーム」という用語は、これに限定しないが、特異的標的化リガンドまたはホーミング部分のために設計されたバイオキソーム粒子を指す。本発明の選択的標的化バイオキソームでは、リガンドまたはホーミング部分としては、これに限定しないが、グリコサミノグリカン、単一特異的または二重特異的抗体、アプタマー、受容体、融合タンパク質、融合ペプチド、またはそれらの合成模倣体、癌標的化葉酸、特異的リン脂質、サイトカイン、成長因子、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００２４】
さらに別の実施形態では、バイオキソーム粒子は、免疫原性バイオキソームである。本発明の文脈において、「免疫原性バイオキソーム」という用語は、病原体細胞培養から誘導されたバイオキソーム粒子、または、共抽出された若しくは外部に埋め込まれた免疫原性部分を有するバイオキソーム粒子を指す。本明細書で使用するとき、「免疫原性」という用語は、これに限定しないが、抗原またはエピトープなどの特定の物質が、ヒト及び他の動物の体内で免疫応答を誘導する能力を指す。換言すれば、免疫原性という用語は、体液性及び／または細胞介在性の免疫応答を誘導する能力を指す。
【００２５】
一実施形態では、本発明のバイオキソーム粒子の膜の少なくとも５０％は、予め定められた細胞培養条件で培養された細胞源から得られた細胞膜から構成される。一実施形態では、互いに異なる細胞源または細胞外源に由来するバイオキソーム粒子は、細胞膜と比較して、脂質組成の相違を示し得る。
【００２６】
本発明は、バイオキソーム粒子と、少なくとも１つの担体とを含む組成物をさらに提供する。一実施形態では、本発明の組成物は医薬組成物であり、担体は薬学的に許容可能な担体である。一実施形態では、本発明の組成物は、経口投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、局所投与、眼内投与、鼻腔内投与（ＣＮＳ送達のための嗅球への直接投与を含む）、経直腸投与、経膣投与、経肺投与、舌下投与、経粘膜投与、組織内投与、超音波ガイド下投与、内視鏡投与、組織に挿入されたインプラントを介した投与、髄腔内投与、及び経皮投与に適している。さらに別の実施形態では、本発明の組成物は薬用化粧品組成物であり、担体は薬用化粧品的に許容される担体である。さらに別の実施形態では、担体は食品グレードの担体である。一実施形態では、本発明の組成物は食用組成物であり、担体は食品グレードの担体である。一実施形態では、本発明の組成物は、賦形剤、安全性検査済みの活性化合物、試薬、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。一実施形態では本発明の組成物中のバイオキソーム粒子の濃度は、全組成物の０．００５％〜８０％である。さらに別の実施形態では、バイオキソーム粒子の濃度は、０．００５％〜２５％である。一実施形態では、バイオキソーム粒子は、適切な賦形剤及び担体とともに製剤化され、細胞バンク目的、細胞治療目的、画像処理目的、または薬物送達目的のために、あるいは、トランスフェクション用の試薬または研究キット用の試薬としてパッケージ化され貯蔵される。バイオキソーム粒子を含む組成物には、これに限定しないが、固体、液体、半固体、凍結保存、冷蔵、または乾燥した、すぐに使用できるものが含まれる。
【００２７】
本発明は、選択された細胞源または細胞外源に由来する細胞膜成分を含有し、少なくとも１つの活性分子を含む積荷を担持するように設計され、かつ、標的細胞と融合して標的細胞内に積荷を放出するように構成された複数のバイオキソーム粒子を含む試料の作製方法であって、（ａ）脂質抽出物を得るために、選択された細胞源または細胞外源からの全細胞脂質抽出をマイルドな溶媒系中で行うステップと、（ｂ）脂質抽出物を乾燥させるステップと、（ｃ）少なくとも１回の超音波処理を行うことによってバイオキソーム粒子の自己集合を誘導するステップと、を含み、これにより、０．０３〜５μｍの平均粒径を有するバイオキソーム粒子を含む試料が得られることを特徴とする方法をさらに提供する。本明細書で使用するとき、「マイルドな溶媒」という用語は、これに限定しないが、ＰＤＥ＞２．５ｍｇ／日、及び濃度限界＞２５０ｐｐｍを有するクラス３またはクラス２のいずれかの溶媒を指す（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｄｒｕｇｓ／ｇｕｉｄａｎｃｅｓ／ｕｃｍ０７３３９５．ｐｄｆ）。
【００２８】
一実施形態では、バイオキソーム粒子の平均粒径は、０．０５〜３μｍである。さらに別の実施形態では、バイオキソーム粒子の平均粒径は、０．０８〜１．５μｍである。さらなる実施形態では、バイオキソーム粒子の平均粒径は、０．１〜０．７μｍ、０．１〜０．５μｍ、０．２〜０．５μｍ、または０．３〜０．５μｍである。別の実施形態では、バイオキソーム粒子の平均粒径は、５μｍ以下、１．５μｍ以下。０．７μｍ以下、０．５μｍ以下、０．３μｍ以下、または０．１５μｍ以下である。一実施形態では、バイオキソーム粒子の平均粒径は、０．５〜１．５μｍである。一実施形態では、バイオキソーム粒子の平均粒径は、０．４〜０．８μｍである。別の実施形態では、バイオキソーム粒子の平均粒径は、０．３〜０．５μｍである。一実施形態では、バイオキソーム粒子を含む試料は、３．５〜５のｐＨを有する。さらに別の実施形態では、バイオキソーム粒子を含む試料は、４．５〜５のｐＨを有する。一実施形態では、溶媒系は、極性溶媒及び非極性溶媒の混合物を含む。一実施形態では、溶媒系に含まれる極性溶媒は、イソプロパノール、エタノール、ｎ−ブタノール、及び水飽和ｎ−ブタノールからなる群より選択される。一実施形態では、溶媒系に含まれる非極性溶媒は、ヘキサン及びテルペン基由来溶媒から選択される。一実施形態では、溶媒系に含まれる非極性溶媒は、ｎ−ヘキサンである。一実施形態では、超臨界二酸化炭素（ｓｃＣＯ２）をマイルドな「グリーン」溶媒として用いた超臨界流体抽出によって、ヘキサンの全部または一部を懸濁させてもよく、これは、ガス状粘度、液体状密度、周囲条件での有機溶媒中よりも約１００倍速い拡散率、及び比較的低温での操作などの多くの有利な特性を有する。テルペン／フラボノイドは、α−ピネン、ｄ−リモネン、リナロール、ユーカリプトール、テルピネオール−４−オール、ｐ−シメン、ボルネオール、デルタ−３−カレン、β−シトステロール、β−ミルセン、β−カリオフィレン、カンフラビンＡ、アピゲニン、ケルセチン、及びプレゴンからさらに選択される。一実施形態では、テルペン基由来溶媒は、ｄ−リモネン、ａ−ピネン、及びパラシメンからなる群より選択される。
【００２９】
一実施形態では、溶媒系に含まれる極性溶媒はイソプロパノールであり、非極性溶媒はｎ−ヘキサンである。さらに別の実施形態では、溶媒は、ヘキサン：イソプロパノールが３：２の低毒性溶媒混合物である。一実施形態では、溶媒系は、安定剤をさらに含む。別の実施形態では、安定剤は、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）である。一実施形態では、溶媒系は、これに限定しないが、抗酸化剤、界面活性剤、安定剤、ビタミンＥ、スクアレン、コレステロール、またはそれらの任意の組み合わせなどの添加剤をさらに含む。一実施形態では、本方法は、核酸を共沈させるステップをさらに含む。一実施形態では、核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。一実施形態では、核酸はＲＮＡである。ＲＮＡ送達は、上述した主要な課題の１つである。一実施形態では、バイオキソームの設計は、親水性ビヒクル中でのキャビテーション超音波処理中に、親水性−疎水性自己集合を介して細胞源または細胞外源から採取した細胞膜を使用して達成される。一実施形態では、バイオキソーム粒子は、超音波処理後の脂質膜分離後に押し出される。一実施形態では、活性分子を含む積荷は親水性であり、超音波処理中または押し出し中に親水性ビヒクルに捕捉される。さらに別の実施形態では、積荷は疎水性積荷であり、溶媒系により抽出前、抽出中、乾燥／溶媒蒸発処理中、超音波処理中、押出中に捕捉される。凍結融解を繰り返すことにより、乾燥後及び超音波処理後の親水性積荷のカプセル化率が改善され得る。カプセル化担持レベルは、各々の特定の治療または研究部位において予め設計された、選択された積荷の感度、安定性、及び所望の担持用量に基づく工学的パラメータの選択の影響を受ける。一実施形態では、活性分子は、安全性が懸念されるウイルス遺伝子ベクター不純物のリスクを伴うことなく、予め定められた濃度でバイオキソームコア中に混ぜ合わされる。一実施形態では、バイオキソーム粒子は、エレクトロポレーションされるか、またはマイクロインジェクションされる。一実施形態では、ＲＮＡまたはＤＮＡは、治療的送達のための核酸物質の完全性を維持するために、任意の適切な保護緩衝液の存在下で、４°Ｃでの穏やかな超音波処理によってバイオキソーム粒子に組み込まれる。本発明の実施形態によれば、本発明の作製方法は、ＬＮＰ及びリポソームの最も知られている工業的特徴に適合する。
【００３０】
一実施形態では、全脂質抽出のための細胞源または細胞外源は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、幹細胞、免疫系細胞、樹状細胞、外胚葉、ケラチノサイト、消化管（ＧＩ）細胞、口腔細胞、鼻粘膜細胞、神経細胞、網膜細胞、内皮細胞、心臓由来細胞、心筋細胞、周皮細胞、血液細胞、メラニン細胞、実質細胞、肝臓貯蔵細胞、神経幹細胞、膵臓幹細胞、胚性幹細胞、骨髄、皮膚組織、肝臓組織、膵臓組織、出生後臍帯、胎盤、羊膜嚢、腎臓組織、神経組織、体液、排泄物または摘出組織、（すなわち、乳、唾液、粘液、血漿、尿、糞便、羊水、皮脂）、副腎組織、粘膜上皮、平滑筋組織、細菌細胞、細菌培養物、微生物全体、馴化培地、羊水、脂肪吸引組織、脂肪吸引副産物、及び植物組織からなる群より選択される。さらに別の態様では、脂質抽出は、細胞馴化培地、凍結乾燥馴化細胞培地、細胞ペレット、凍結細胞、乾燥細胞、洗浄細胞バルク、非付着細胞懸濁液、または付着細胞層から行われる。さらに別の実施形態では、付着細胞層は、（マルチ）フラスコ、ディッシュ、スキャフォールド、ビーズ、及びバイオリアクタから選択される、細胞外マトリックスまたは合成マトリックスでコーティングされたまたはコーティングされていない細胞培養プラスチック製品中で増殖させられる。本発明の一実施形態によれば、膜抽出物は、凍結または／及び噴霧／凍結乾燥によって乾燥させられる。さらに別の態様では、膜抽出物は、蒸発によって乾燥させられる。蒸発は、任意の適切な技術によって行うことができ、そのような技術としては、これに限定しないが、例えば、スピードバック遠心分離機、アルゴン／窒素ブローダウン、スパイラル空気流、及び、制御された温度環境における他の利用可能な溶媒蒸発方法、例えば、マイクロ波またはロータ蒸発器、ソックスレー抽出器、遠心分離蒸発器が挙げられる。さらに別の実施形態では、膜抽出物は、所望の活性分子が充填された緩衝液中でチップ超音波処理器によって超音波処理される。一実施形態では、作製後の数時間以内に粒径を測定した場合、バイオキソーム粒子の平均粒径は０．４〜１．５μｍである。さらに別の実施形態では、作製後に０〜−４°Ｃで貯蔵したバイオキソーム粒子を作製後の１ヶ月以内に粒径を測定した場合、バイオキソーム粒子の平均粒径は０．８〜５μｍである。
【００３１】
一実施形態では、バイオキソーム粒子は、細胞源または細胞外源の膜に由来する。一実施形態では、バイオキソーム粒子は、予め定められた細胞源または細胞外源からオンデマンドで設計される。一実施形態では、細胞源は、自家性である。「自家性」という用語は、ドナーとレシピエントが同一である状況を指す。一実施形態では、細胞源は、非自家性である。一実施形態では、ドナー源は、中胚葉細胞であり、例としては、これに限定しないが、線維芽細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞、分化幹細胞、免疫系細胞、樹状細胞、外胚葉、ケラチノサイト、消化管（ＧＩ）細胞、口腔細胞、鼻粘膜細胞、神経細胞、網膜細胞、内皮細胞、心臓由来細胞、心筋細胞、周皮細胞、または血液細胞が挙げられる。一実施形態では、バイオキソーム粒子の細胞源または細胞外源としては、例えば、間質細胞、ケラチノサイト、メラニン細胞、実質細胞、間葉系幹細胞（系統的にコミットされたまたはコミットされていない前駆細胞）、肝臓貯蔵細胞、神経幹細胞、膵臓幹細胞、胚性幹細胞、骨髄、皮膚組織、肝臓組織、膵臓組織、腎臓組織、神経組織、副腎組織、粘膜上皮、または平滑筋組織が挙げられる。
【００３２】
本発明の方法では、バイオキソーム粒子は、選択された活性分子を担持することができる。一実施形態では、活性分子の担持は、抽出中に実行される。さらに別の実施形態では、活性分子の担持は、乾燥中、抽出前、または抽出後に行われる。一実施形態では、得られたバイオキソーム粒子は、押し出される。
【００３３】
本発明のＨＩＰ抽出システムの利点は、従来のクロロホルム−メタノール脂質抽出法とは対照的に、膜脂質を、最小限のリパーゼ活性で、かつ、プラスチックや細胞培養無菌表面ウェルなど（これに限定しないが、例えば、中空糸、ビーズ、ヌクレオポア、ポリカーボネートフィルタ）のクロロホルム可溶性成分から直接的にまたは該成分上で抽出できることである。例えば、ＨＩＰは、これらの溶媒中で安定しているポリカーボネートからの直接抽出を可能にする。ＨＩＰ抽出は、同一の細胞培養物または組織試料からのＲＮＡまたはタンパク質の共抽出と並行して、細胞または馴化培地からのバイオキソームのコンソレーションに使用することができる。細胞層や細胞ペレット、または凍結乾燥した馴化培地や組織抽出物に対するこのようなプロセスのために、ＨＩＰは、水緩衝液またはＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質安定化溶液（例えば、ＲＮＡｓａｖｅ  ｂｉｏｉｎｄ１．ｃｏｍ、あるいは、トレハロースまたはＲＮＡｓｅ阻害剤含有緩衝剤）の体積当たり約１／４〜１／５を予め混合することができる。水相緩衝液または安定化溶液により、共沈した核酸またはタンパク質抽出物は抽出される。共抽出された核酸またはタンパク質相は、その後、例えば遠心分離または凍結勾配などによって分離される。このようなＲＮＡまたは／及びＤＮＡまたは／及びタンパク質含有相は、バイオキソーム粒子の疎水性相との粒子形成中にさらに分離され、その後、生物学的薬物として、またはバイオマーカー診断用もしくは研究用試薬として使用され得る。
【００３４】
一実施形態では、本発明の方法は、ＧＭＰ及びＧＬＰガイダンスに適合する。一実施形態では、本発明の方法によれば、バイオキソーム粒子は、細胞バイオマス、細胞ペレット、付着細胞層、媒体、またはそれらの任意の組み合わせから採取される。一実施形態では、バイオキソーム粒子は、ＯＥＣＤ承認溶媒抽出法を可能にする単一の低毒性工程によって抽出される。
【００３５】
一実施形態では、細胞源は、より脂溶性の抗酸化物質を発現させるために、培養物中の細胞をマイルドな酸化ストレス、飢餓、放射線、または他のインビトロ改変に曝露することによって、抽出前に改変することができる。一実施形態では、親油性抗酸化剤は、ルチン、スクアレン、トコフェロール、レチノール、葉酸、またはそれらの誘導体である。一実施形態では、脂質溶液成分は、濾過滅菌される。さらに別の実施形態では、脂質溶液成分は、−２０〜−８０°Ｃの温度で窒素またはアルゴン中に保存することができる。
【００３６】
さらなる態様では、溶媒は、界面活性剤をさらに含む。一実施形態では、洗浄剤は、ポロキソマーである。一実施形態では、本発明の方法は、ＨＩＰ溶媒部分を凍結乾燥／蒸発させて、バイオキソーム粒子−核酸複合体を形成するステップ、親水性担体／緩衝液中で超音波処理するステップ、及び／または、任意選択で、所望の粒子サイズ（粒径）に押し出すステップを含む。
【００３７】
本発明はさらに、本発明の方法にしたがって作製された複数のバイオキソーム粒子を含む試料を提供する。
【００３８】
本発明はさらに、対象の病状を治療または予防する方法であって、対象に対して、本発明のバイオキソーム粒子と、少なくとも１つの担体とを含む組成物を投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、組成物は医薬組成物であり、担体は薬学的に許容可能な担体である。一実施形態では、組成物は、経口投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、局所投与、眼内投与、鼻腔内投与、経直腸投与、経膣投与、経肺投与、経粘膜投与、及び経皮投与に適している。さらに別の実施形態では、組成物は薬用化粧品組成物であり、担体は薬用化粧品的に許容される担体である。一実施形態では、病状は、炎症性疾患、神経学的疾患、感染性疾患、悪性腫瘍、免疫系疾患、及び自己免疫疾患からなる群より選択される。疾患の非限定的な例としては、慢性または急性の炎症性皮膚疾患、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、関節炎、炎症性呼吸器疾患、または急性または慢性の傷または損傷などの炎症性疾患；細菌病原体、ウイルス病原体、または寄生虫によって引き起こされる感染症である感染性疾患；炎症性サイトカインの濃度上昇及び／または抗炎症性サイトカインの濃度低下を伴う悪性腫瘍である増殖性疾患；代謝性疾患、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、または糖尿病関連疾患；ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７などの炎症誘発性サイトカインの濃度上昇によって媒介される炎症；これに限定しないが、例えば、ＩＬ−１３、ＩＬ−４、またはＩＬ−１０などの少なくとも１つの抗炎症性サイトカインの濃度上昇によって媒介される炎症；慢性副鼻腔炎（ＣＲＳ）、アレルギー性鼻炎；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；鼻ポリープ（ＮＰ）；血管運動性鼻炎、気道過敏症、嚢胞性線維症；肺線維症；アレルギー性副鼻腔炎、ＩＢＤ；クローン病；潰瘍性大腸炎が挙げられる。
【００３９】
本発明の文脈において、バイオキソーム粒子は、広範囲の美容薬、化粧品、局所投与製剤、これに限定しないが、例えば、ゲル、油、真皮充填剤、エマルジョンなどに組み込むことができる。例えば、バイオキソーム粒子を含有する懸濁液は、局所クリーム、ペースト、軟膏、ゲル、ローションなどとして製剤化し、投与することができる。特定の実施形態では、美容薬としての適用は、局所的処置、「開」処置、または「閉」処置によって行うことができる。「局所的」処置とは、皮膚などの、環境に曝された組織に対する、医薬組成物の直接的な適用を意味する。「開」処置とは、患者の皮膚を切開し、医薬組成物が適用される下層組織を直接可視化することを含む処置である。「閉」処置とは、例えば美容的処置中に真皮充填剤と組み合わせて、または、皮膚領域、傷、しわへの局所的な適用時に、内部標的組織器具を疾患部位に直接挿入する侵襲的処置である。本発明はさらに、対象の皮膚状態を改善する方法であって、本発明のバイオキソーム粒子を含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、本発明は、活性生体分子のための送達担体としてのバイオキソーム粒子の使用をさらに提供する。本発明の活性生体分子は、これに限定しないが、例えば、抗炎症活性、抗老化作用、抗がん活性、代謝活性、または、遺伝的ＤＮＡやＲＮＡの生物活性を有する物質を含む。一実施形態では、活性生体分子は、細胞性サイトカインである。さらに別の実施形態では、活性生体分子は、成長因子である。一実施形態では、活性生体分子は、デオキシリボ核酸またはリボ核酸を含むオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドの長さは、２〜１００ヌクレオチドである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、天然、合成、修飾、または未修飾のものである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ模倣体、抗ｍｉＲ、リボザイム、アプタマー、エキソンスキッピング分子、合成ｍＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。さらに別の実施形態では、バイオキソーム粒子の膜は、標的への積荷の制御放出を提供するように設計される。一実施形態では、酸化ストレス感受性脂質が、バイオキソーム粒子の膜に埋め込まれる。別の実施形態では、バイオキソーム粒子は、金属キレート剤及び抗酸化剤を含有する。一実施形態では、エキソソーム様粒子は、多能性因子を体細胞または幹細胞に導入し、それによって、非ウイルス誘導多能性幹細胞−ｉＰＳＣを得るために使用される。さらに別の実施形態では、バイオキソーム粒子は、細胞を治療するために使用される。本発明のバイオキソーム粒子による細胞の処理は、生理的温度（約３７°Ｃ）で行われる。治療期間は、２分〜７２時間である。本発明はさらに、薬剤として使用するための本発明のバイオキソーム粒子を提供する。
【００４０】
本発明の実施形態では、バイオキソーム粒子の粒径の特性評価のためのＱＣ仕様には、これに限定しないが、粒径、標的組織／細胞への浸透能、無菌状態、並びに、タンパク質及び核酸の不在によって定義される非免疫原性及び安全性が含まれる。粒径分布は、マルバーン社（Ｍａｌｖｅｒｎ）製のナノゼータサイザ（Ｎａｎｏ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）で測定し、ナノゼータサイザソフトウェアによって精緻化した。バイオキソーム粒子集合体のサイズは、一般的に利用可能なダウンサイジング技術を利用して、所望の用途に基づいて操作した。バイオキソーム粒子集合体は、予め選択されたメッシュ寸法を有する膜を通過させる押し出しによってダウンサイジングしてもよい。
【００４１】
本発明の文脈において、バイオキソーム粒子の脂質の特性評価のためのＱＣ仕様として、これに限定しないが、下記の（１）〜（８）が挙げられ、バイオキソーム粒子は、膜脂質の組成及び特徴によって定性化及び定量化される。（１）脂肪酸−ＦＡの不飽和／飽和指数。（２）ＦＡ鎖長特性、（ＧＣ；ＨＰＬＣ分析法）すなわち、長鎖ＬＣ−ポリ不飽和ＦＡ  ＰＵＦＡ／中鎖−ＭＣ。（３）極性（ＩＺＯＮアッセイ）。（４）脂質組成、すなわち、含量％及び／または比、例えば、ＰＬ−リン脂質組成物及び比率ＰＣ−ＰＥ／ＰＩ−ＰＳまたはバイオキソーム膜の様々な脂質グループ間の比率／％、例えば、ＰＬ／ＮＬ（中性脂質）／ＣＬ／ＧＬ／ＴＧ／ＦＦＡ（ＨＰＬＣ、ＴＬＣ、ＬＣ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ、カラムクロマトグラフィーなど）。（５）総脂質（バニリンアッセイなど）。（６）任意選択の機能性脂質及び脂質誘導体の成分、例えば、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、ロイコトリエン、トロムボキサン（ＨＰＬＣ、ＭＳ−ＭＳ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなど）。（７）ヒドロキシなどの代謝産物の指数（ヨウ素アッセイ）。（８）ＲＯＳ媒介酸化。
【００４２】
本発明の文脈において、バイオキソーム粒子を含む最終組成物のためのＱＣ仕様としては、これに限定しないが、粘度及び浸透圧、ｐＨ、バッチ当たりの粒子数、濁度、及び安定性仕様パラメータが挙げられる。アイゾン社（ＩＺＯＮ  Ｌｔｄ．）から提供される粒子測定及び特性評価の方法は、バイオキソーム粒子の作製におけるＱＣにも適用可能である。
【００４３】
本発明の文脈において、バイオキソーム作製能力のＱＣ仕様としては、これに限定しないが、所望のバイオキソーム活性についてのアッセイが挙げられる。例えば、バイオキソーム及びレドキソームベースをベースにした製品のインビトロでの機能的効果を試験するための細胞培養アッセイなどである。機能的効果は、スクラッチアッセイ、細胞毒性アッセイ（例えば、化学療法薬の細胞毒性アッセイ）、ＲＯＳ生成またはヒドロキシ尿素老化誘導アッセイ、炎症ＩＬ１９またはＴＧＦβ誘導アッセイによるＱＣ力価アッセイとしてスクリーニングすることができる。
【００４４】
実施例
【００４５】
実施例１：細胞ペレットからの溶媒による脂質抽出。
【００４６】
以下の細胞試料を培養した：試料１−初代臍帯静脈内皮細胞；正常、ヒト（ＨＵＶＥＣ）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＰＣＳ−１００−０１０（ＴＭ））；試料２−初代乳腺上皮細胞；正常、ヒトＡＴＣＣ（登録商標）ＰＣＳ−６００−０１０（ＴＭ）；試料３−ヒト包皮線維芽細胞ＨＦＦ（初代提供）；試料４−ヒト脂肪由来間葉系幹細胞；（ＡＴＣＣ（登録商標）ＰＣＳ−５００−０１１）。すべての細胞試料を３〜６回継代し、各試料を凍結保存バイアル当たり２×１０６個の細胞で保存し、ペレットを収集し、液体窒素中の凍結保存培地（ＧＩＢＣＯ）に保存した。ペレットをＰＢＳで洗浄し、細胞塊を遠心分離によって濃縮した。細胞濃縮物を、ヘキサン：イソプロパノール（３：２）溶媒及び０．０２％ＢＨＴからなるＨＩＰ溶媒混合物と混合した。ペレットを、１回のボルテックスサイクル当たり２〜４分間、室温で繰り返しボルテックスした。その後、試料を遠心分離し、上清を収集した。収集した上清を、油性残留物が形成されるまで蒸発させた。バイオキソーム粒子をさらに製剤化し、カプセル化した。
【００４７】
実施例２：粒子の形成及び特性評価。
【００４８】
バイオキソーム粒子の形成は、チップ型超音波処理装置（ｖｉｂｒａ−ｃｅｌｌ  Ｓｏｎｉｃ）を使用して行った。試料毎に、３回の超音波処理サイクルを行った。各サイクルは３秒間であり、サイクル間の間隔は１０秒間であった。超音波処理中、試料は、超音波処理によって引き起こされる加熱を防止するために、氷で冷却することによって周囲温度に維持した（ソニケータの温度を６０°Ｃでモニタリングした）。最終生成物のｐＨを測定し、図１（Ａ）に示すように、マルバーン社（Ｍａｌｖｅｒｎ）製のナノサイザー（Ｎａｎｏｓｉｚｅｒ）を使用して粒径を測定した。最終生成物の特性は、ｐＨ４．５〜５、平均粒径０．０５〜１．５μｍのＱＣ仕様に適合した。安定性試験のために、得られた試料を４°Ｃで１ヵ月間保存した（図１（Ｂ））。マルバーン社製のナノサイザーを使用して測定した平均粒径は有意に大きく、バイオキソーム粒子の凝集／混合を示した。
【００４９】
実施例３：バイオキソームの作製を目的とした実験系の確立。
【００５０】
溶媒によって抽出した脂質からバイオキソームを作製するためのプロトコルを、同一細胞源の凍結細胞ペレットまたは新鮮培養物を用いて確立した。プロトコルの確立に使用した細胞は、脂肪組織由来のヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、骨髄細胞、及びＨｅｐＧ２肝細胞株であった。脂質膜を、ヘキサン：イソプロパノール溶媒を用いて抽出し、窒素ガス蒸発または凍結乾燥機で乾燥させた。新鮮な細胞培養物をＨＢＳＳ−ＨＥＰＥＳで培養し、脂質抽出の２時間前に馴化培地を作製した。得られた馴化培地も収集し、脂質及びＲＮＡを抽出し、乾燥させた。細胞ペレットまたは細胞培養物から作製した乾燥脂質試料を、ＨＢＳＳ中で超音波処理して、バイオキソームを作製した。各試料から（ＤＤＷを使用して）抽出したＲＮＡの濃度を、ナノドロップライト（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｌｉｔｅ）分光光度計を使用して測定した。作製されたバイオキソームの粒径及び安定性を、マルバーン・パナリティカル社（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌｔｄ．）製のゼータサイザナノ（ＺｅｔａＳｉｚｅｒ  ｎａｎｏ）粒径分析器とマルバーン・パナリティカル社製のナノサイト（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ）分析器を使用して評価した。ゼータサイザナノ粒径分析器での測定結果は、図２（Ａ）に示すように、８１ｎｍと２６７ｎｍにピークを有する２つの粒径分布を示した。ナノサイト分析器での測定結果は、図２（Ｂ）に示すように、２４８ｎｍの平均粒径を示した。
【００５１】
実施例３：バイオキソームの安定性の試験。
【００５２】
バイオキソームの安定性を試験するために、実施例２に記載した骨髄ｈＭＳＣから超音波処理によって作製したバイオキソームの試料を、バイオキソーム作製後に８つのサブ試料に分割した。試料の各対を、異なる回数の凍結融解サイクル（０〜３サイクル）に曝露した。試料の各対の一方を凍結乾燥させ、他方を−８０°Ｃの冷凍庫に保存した。ナノサイト分析器を使用したバイオキソームの粒径の測定により、凍結融解サイクルの回数に関係なくすべての試料が安定的であることが示されたが、粒子径の均一性は条件依存性であった（図３）。この結果、（凍結乾燥の有無に関わらず）凍結融解サイクルの後に超音波処理ステップを追加すると、図３（Ａ）〜（Ｃ）のバイオキソームの粒子径の均一性が向上することが明らかになった。
【００５３】
実施例４：バイオキソーム融合実験。
【００５４】
活性疎水性化合物を模倣し、バイオキソームの細胞間及び細胞内輸送を可視化するために、バイオキソーム粒子に蛍光脂質バイオマーカー（ＢｉｏＤｉｐｙ（ＴＭ）ＴＲ（Ｄ７５４０）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を組み込んだ。蛍光スフィンゴ脂質に組み込まれたＢｉｏＤｉｐｙ（ＴＭ）及びＮＢＤフルオロフォアは、互いに異なる分光学的特性を有している。ＢｉｏＤｉｐｙ（ＴＭ）ＦＬフルオロフォアは、その高いモル吸光係数と蛍光量子収率に起因して、ＮＢＤよりも大きな蛍光出力を生成する。また、ＢｉｏＤｉｐｙ（ＴＭ）ＦＬフルオロフォアは、ＮＢＤよりも光安定性が高い。ＮＢＤで標識化されたスフィンゴ脂質は、それらのＢｉｏＤｉｐｙ（ＴＭ）ＦＬの場合と比較して、水相を介した移動率が高い。図４は、蛍光バイオキソーム粒子の融合を示す。最終濃度５μＭのＢｉｏＤｉｐｙ（ＴＭ）を、コンフルエントなヒト皮線維芽細胞（ＨＦＦ）細胞の膜に融合させた。蛍光顕微鏡（４０倍の倍率で）及びＣＤＤカメラを使用して蛍光を可視化し、画像を記録した。蛍光バイオキソーム粒子のＨＦＦ細胞への融合を、試料毎に１０〜３５分間追跡した。測定の間、細胞は３７°Ｃに保った。すべてのバイオキソーム作製物（実施例１、試料１〜４）は、１５分以内に標的細胞に融合した（図４（Ａ）〜（Ｃ））。
【００５５】
実施例５：ＨＩＰシステムによる、馴化培地中の付着細胞層からの細胞膜抽出。
【００５６】
抽出ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）細胞及び馴化培地を、図５に示すようにして分離した。ＨＦＦ付着細胞層を、ＨＢＳＳ＋ＨＥＰＥＳで増殖培地から４回洗浄した。その後、緩衝液を除去し、０．０２％ＢＨＴを含むＨＩＰ溶媒系を添加して、マルチフラスコ中の細胞層を被覆した。抽出は、フラスコを周囲温度で２０分間穏やかに振盪することによって行った。フラスコの内容物を５０ｍｌの培養管に移し、アルゴン下で水（３６°Ｃ）を蒸発させたところ、乾燥した油性フィルム状残留物が生成された。
【００５７】
実施例６：膜タンパク質を用いたバイオキソーム粒子の設計。
【００５８】
実施例１にしたがって細胞を播種し、収集した。細胞塊からの脂質及び膜タンパク質の抽出は、ヘキサン：イソプロパノールの１：１の混合物を含むマイルドな溶媒混合物中で行った。抽出後、上清及びペレットを収集し、ＢＳＡ標準物質を用いたＢｒａｄｆｏｒｄ分析により、総タンパク質量を測定した。１５％のタンパク質含量が測定された。ＮａＣｌで洗浄することによって粗抽出物から核酸を除去し、２８０ｎｍでの分光光度計による測定を行った。
【００５９】
実施例６：オリゴヌクレオチドでカプセル化されたエキソソーム様粒子の作製。
【００６０】
実施例１にしたがって細胞を播種し、収集した。細胞塊を、ＨＩＰ（３：２ｖ／ｖ）溶媒系またはヘキサン／エタノール（２：１ｖ／ｖ）溶媒系に溶解させた。室温で３０分間インキュベートした後、さらに溶媒抽出ステップ（それぞれの元の量の約１／４）を行った。次いで、この抽出物を、ベンチ型遠心分離機を使用して３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離すると、水相と溶媒相との間に透明な界面が形成された。オリゴヌクレオチドを、押し出された小胞の水溶液（ｐＨ４、３０％エタノール）に適合する水溶液に可溶化させ、細胞膜のＨＩＰ抽出物に滴下添加した。溶媒相を穏やかにＮ２ブローして、溶媒を除去した。その後、試料をＳｐｅｅｄＶａｃ内に３時間静置し、残留溶媒を蒸発させた。膜−核酸含有容器にＨＢＳＳ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）を満たし、超音波処理した。
【００６１】
実施例７：線維芽細胞由来バイオキソーム粒子の線維芽細胞標的とグリア細胞標的への送達の動態。
【００６２】
ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を、３７°Ｃで１５分間、蛍光Ｃ６−ｎｂｄｅｒｙｔｈｒｏ−セラミドで予め標識した（Ｃ６−ｎｂｄｅｒｙｔｈｒｏ−セラミドの最終濃度は５μＭであった）。培地を廃棄し、その後、皿を氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。抽出のために、細胞を、１ｍｌのヘキサン：イソプロパノール（ＨＩＰ）２：１（ｖ／ｖ）とともに、室温で１５分間、振盪しながらインキュベートした。ＨＩＰを、３つのペトリ皿から１つのガラス管に集めた。ペトリ皿を、１ｍｌのＨＩＰで１回洗浄し、すべての洗浄物をガラス管に添加した。ＨＩＰを、Ｎ２気流下で蒸発させた。３００μｌのＰＢＳ中で再懸濁した後、細胞塊を超音波処理した。ＮＢＤ標識の放出及び組み込みを分析するために、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞及び初代培養グリア細胞を、実験の１日前に、２４ウェル培養皿中の１３ｍｍガラスカバースリップに播種した。ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞から作製したバイオキソーム粒子を細胞に添加し（各ウェルに１０μｌのバイオキソーム懸濁液を添加）、指定された時間間隔でウェルからカバースリップを除去し、非結合のＮＢＤ標識を除去するために洗浄し、Ｚｅｉｓｔ蛍光顕微鏡（４０倍の倍率で）及びＣＤＤカメラを使用して分析した。画像をコンピュータに記録した。この実験の一般的な手順のスキームを図６（Ａ）に示す。
【００６３】
結果：
【００６４】
撮像の結果を図６（Ｂ）に示す。標識されたバイオキソーム粒子による線維芽細胞の有意な標識が、４分以内に観察された。このシグナルは、バイオキソーム粒子を適用した３０分後にさらに強くなった。対照的に、グリア細胞では、３０分後であっても、標識されたバイオキソーム粒子の結合がほとんど見られなかった。これらの結果は、線維芽細胞由来のバイオキソーム粒子が、線維芽細胞標的細胞に対して特異的に標的化されていることを示す。
【００６５】
実施例８：レドキソームの設計。
【００６６】
レドキソーム粒子の模式図を図７に示す。乳酸菌の凍結乾燥細胞を、バイオキソーム抽出源として使用した。トコフェロール及びコレステロール（０．５％）を、安定剤としての１．５％ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）とともに、ヘキサン：イソプロパノール（ＨＩＰ）（３：２ｖ／ｖ）からなる溶媒溶液に溶解させた。脂質二重層膜の安定性／剛性を高めるために、親油性抗酸化剤α−トコフェロール（約３％）、ＤＨＡ（約３％）、コレステロール（１．５％）を剛性安定剤として使用した。溶媒を、窒素気流下で蒸発させ、４°Ｃで２時間凍結乾燥させた。得られた脂質分散液を、チップ型超音波処理装置で、濁りがなくなるまで１０〜２０分間超音波処理した。電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スピントラッピング法を用いて、エキソソーム様粒子中の、鉄誘導酸化ストレスによって生成した脂質由来フリーラジカルを検出した。ニトロンスピントラップａ−（４−ピリジル−１−オキシド）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン（ＰＯＢＮ）を使用して、炭素中心ラジカル付加物を検出した。超音波処理中に、緩衝液に、アスコルビン酸と、ＤＦＸまたはＥＤＴＡとを添加した。細胞培養物選択源からの所望の膜物質の抽出は、選択された脂質−レドキソーム活性試薬（レドキソームセンサーとしてのＤＨＡ／ＥＰＡ、またはレドキソーム安定化剤としてのα−トコフェロール）を溶解したＨＩＰからなる抽出溶媒混合物を用いて行った。ＨＩＰによる脂質抽出は、次の手順で行った：蒸発ステップに続いて、チップ超音波処理により、小胞の所望の直径を達成した。
【００６７】
実施例９：レドキソーム粒子のＥＰＲ−酸化還元感受性。
【００６８】
５０μＭのＤＨＡ及び１００μＭのＤＨＡを、レドキソーム粒子の脂質二重層膜に組み込んだ（図８の２つの中間スペクトル）。炭素中心スピン付加物が観察され、ＤＨＡ濃度が増加するにしたがって、スピン付加物のＥＰＲ信号強度が増加することが観察された（これは、ＤＨＡ用量依存的にＬＲ形成が増加することを示す）。非常に弱い（対照）スペクトルが得られた。図８の一番上側のスペクトルは、ＤＨＡを含まないレドキソーム粒子を示している（基底ＰＯＢＮ付加物の形成を表す）。ＤＨＡ富化エキソソーム様粒子に安定剤であるα−トコフェロールを組み込むと、ＬＲの形成がほとんど基礎レベルまで低下することが観察された。図８の一番下側のスペクトルは、エキソソーム様粒子膜に組み込まれた抗酸化剤によるＬＰＯの阻害を示している。
【００６９】
実施例１０：通常の条件下でのレドキソーム粒子の安定性。
【００７０】
凍結乾燥物質に、１０ｍＭのＴＲＩＳ中の６０ｍＭのカルセインの自己消光濃度をｐＨ８（ＮａＣｌ  １００ｍＭ）で添加し、次いで、ボルテックスによって０．２ｍｌ緩衝液中で再懸濁することによって、カルセイン含有レドキソーム粒子を作製した。カプセル化されていないカルセインを、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用したゲル濾過によって、レドキソーム粒子懸濁液から除去した。３０μｌのレドキソーム懸濁液をカラムに注入し、ｐＨ８（ＮａＣｌ  １５０ｍＭ）の１０ｍＭのＴＲＩＳ中に溶出させ、溶出液の画分を収集した。未処理のレドキソーム粒子及び界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に暴露された最終濃度０．２％のレドキソーム粒子において、励起波長４９０ｎｍ及び発光波長５２０ｎｍでの蛍光分光法によって、蛍光をモニタリングした。
【００７１】
結果：
【００７２】
レドキソーム粒子懸濁液に１００μｍのＨ２Ｏ２を添加した場合には、カルセイン放出の変化は観察されなかった（図９（Ａ））。フェントン反応によってＨ２Ｏ２からヒドロキシルラジカルを生成する触媒として作用する５０μｍのＦｅ２＋を懸濁液に添加した場合には、蛍光の変化率の有意な増加が、ＤＨＡまたはα−トコフェロールを含有するレドキソーム粒子集団で観察されたが、対照集団では観察されなかった。懸濁液にＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した場合には（図９（Ｂ））、レドキソーム粒子に残留しているカルセインがすべて、Ｈ２Ｏ２＋Ｆｅ２＋を添加した場合に観察される速度よりも速い速度で放出された。
【００７３】
実施例１１：脳損傷に対するレドキソームの効果。
【００７４】
脳損傷に対するレドキソームの効果を試験するために、マウス（各群ｎ＝６）を生後８日目に屠殺し、動物試験のヘルシンキコンプライアンスにしたがって、イソフルランとケタミン／ペントバルビタールナトリウムで麻酔した。次いで、新鮮な解剖脳切片を、ＤＭＥＭ＋Ｈｅｐｅｓ中で５０μＭの硫酸第一鉄七水和物（Ｓｉｇｍａ）とともに３７°Ｃで１５分間インキュベートすることによってフェントン反応に供した。このようなエクスビボ誘導酸化ストレスによって、脳切片を、炎症性疾患；虚血性ストレス；ダウン症候群などの他の脳疾患；アテローム性動脈硬化により誘導された冠動脈虚血性変化を模倣したＲＯＳ産生に曝した。ＲＯＳ産生により脳切片からインキュベーション培地中に放出されたＴＢＡＲＳは、約８０〜１００ｎＭ／ｍｇ湿重量から、１２０〜１６０ｎＭ／ｍｇ湿重量まで増加した。レドキソームにカプセル化されていない濃度１μＭのＤＦＸ＋アルファトコフェロール（ｖＥ）による処理は、ＴＢＡＲＳの放出を２０〜３０％低下させた。脳切片を、０．５ｍｃＭのＤＦＸでカプセル化されたｈＡｄＴＭＳＣ−レドキソームと共インキュベートした場合には、ｖＥ−ＴＢＡＲＳの産生は５０〜６０％低下した。
【００７５】
実施例１２：レドキソームのインビトロ効力アッセイ。
【００７６】
ＸＣＬ−１ＤＣＸｐ−ＧＦＰ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＡＣＳ−５００５）由来の神経前駆細胞を、ＲＯＳ誘導性フェントン試薬とともにインキュベートした。細胞／組織損傷の選択マーカーとしてのＬＰＯ測定では、レドキソーム処理の実行可能性を評価するために、ヘキサンイソプロパノール−ＨＩＰ（容量で３／２）抽出物からのアリコートを乾燥させるために蒸発させ、過酸化脂質を微量定量するために、メタノールに溶解させた。アルデヒド脂質過酸化生成物の定量：マロンアルデヒド及び４−ヒドロキシノネナール。インキュベーション培地のアリコート０．５ｍｌに、等量のチオバルビツール酸（５０％酢酸氷中の０．３４％ＴＢＡ）を添加した。水浴中で１０分間煮沸した後、励起波長５３５ｎｍ、発光波長５５３ｎｍの蛍光分光法によってモニタリングすると、バラ色の発光を呈した。適切な標準曲線法を並列に実施した（１，１，３，３−テトラエトキシプロパン、Ｓｉｇｍａ）。インビボ実験後のＬＰＯの組織レベルを測定するために、インビボ実験後に−７０°Ｃで貯蔵された、関連する、脳、肝臓、肺、皮膚、腎臓の凍結組織スライスを氷上で冷たい４°ＣＰＢＳ中で解凍し、組織源に応じて１〜２回洗浄した。０．０１％ｗ／ｖのブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ、Ｓｉｇｍａ）を含有する氷冷１０％ＴＣＡで抽出することによって、組織抽出物を得た。この組織をさらに、高速ホモジナイザーによって氷上で３０秒間均質化し、その後、３５００Ｘｇで１０分間遠心分離した。組織抽出物の上清のアリコートをＬＰＯについて試験し、抽出後に上清に放出されたマロンジアルデヒド生成物として測定した。組織試料では、ＬＰＯは、ＴＢＡ−反応性物質（ＴＢＡＲＳ）／湿重量で表された。
【００７７】
結果：
【００７８】
様々な組織におけるＴＢＡＲＳの基礎濃度は同様であり、ラット脳切片では４０〜５０ｐｍｏｌ／ｇ湿重量、肝臓では６０〜８０ｐｍｏｌ／ｇ湿重量であった。馴化培地へのＬＰＯ放出は、ｉＰＳＣニューロン前駆体におけるフェントン反応（硫酸第一鉄七水和物（Ｓｉｇｍａ）０．１ｍＭ＋０．２ｍＭのＨ２Ｏ２、２０分間）によるＲＯＳ誘導後に、５〜１０倍増加した。硫酸第一鉄七水和物（Ｓｉｇｍａ）を含有する骨髄レドキソームとの共培養により、ＬＰＯ増加は、４０〜８０％阻害された。
【００７９】
コンカナバリンＡによる処理は、肝臓におけるＬＰＯの約２倍の増加を誘導し、５ｍｃＭのＤＦＸ及び５ｍｃＭのα−トコフェロールでカプセル化されたヒト間葉脂肪組織由来のレドキソームによる同時処理は、ＬＰＯを基礎レベルまで低下させた。
【００８０】
実施例１３：ＲＮＡカプセル化及びエレクトロポレーションの実験。
【００８１】
赤血球（ＲＢＣ）：
【００８２】
赤血球（ＲＢＣ）からバイオキソームを作製した。ＲＢＣは、Ｏ型の血液試料から採取することが好ましい。採取されたＲＢＣは、遠心分離機及び白血球除去フィルタ（Ｔｅｒｕｍｏ  Ｊａｐａｎ）を使用して、血漿及び白血球から分離した。バイオキソームの抽出は、上述したようにして行った。エレクトロポレーション実験は、指数関数的プログラムであるＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌエレクトロポレータ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、０．４ｃｍキュベットで１００μＦの固定キャパシタンスで行った。Ｅ９  ＲＢＣから得られたＥ１２バイオキソームを、ＯｐｔｉＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で希釈し、ＡＦ６４７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共役した４μｇデキストランと混合して２００μｌの総量にし、各キュベットに１００μｌのバイオキソームアリコートを添加し、氷上で１５０〜２５０Ｖにて１５分間インキュベートした。凝集体が形成された場合には、バイオキソーム粒子形成時よりも５０％低いエネルギーでの超音波単一パルスを追加することによって、脱凝集を行った。カプセル化の有効性を試験するために、電気穿孔されたバイオキソームを５μｇのラテックスビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに一晩インキュベートした後、デキストラン−ＡＦ６４７のＦＡＣＳ測定を行った。
【００８３】
脂肪組織由来バイオキソーム：
【００８４】
未加工のＲＮＡによりカプセル化された脂肪組織由来のバイオキソームを作製した。ヒト脂肪組織のＥ６細胞培養からＥ８バイオキソームを作製し、６秒間の単一パルス、エネルギー４０％、及び０．５ｍｃｇのＲＮＡ（ＲＮＡの完全性を保持するために）を用いた穏やかな超音波処理によってカプセル化した。得られたＲＮＡカプセル化されたバイオキソームの多分散指数ＰＤＩは、５４８ｎｍであった。ＲＮＡでカプセル化されたバイオキソームをさらに１０倍に希釈し、その後、さらに３０秒間超音波処理すると、平均粒径は４５０ｎｍになった。特に肝臓標的化が望ましい場合、任意選択で、１００ｎｍの粒径に達するように、Ａｖａｎｔ押出機によってさらに押し出される。
【００８５】
実施例１４：ＨＦＦ−ヒト包皮線維芽細胞培養におけるバイオキソーム／ＲＮＡ処理の生物活性。
【００８６】
ＭＴＴ−ａ３−（４，５ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム細胞増殖アッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を実施し、上記のＥ８細胞由来バイオキソーム当たり０．５μｇの内部ＲＮＡを担持した脂肪組織由来バイオキソームの、飢餓ストレス（血清欠乏）後の細胞生存率に対する効果を調べた。簡潔に言えば、１×１０４細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、９０％コンフルエントに達するまで１８〜２４時間培養した。付着後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで、無血清培地を添加した。血清欠乏細胞及び対照細胞（血清１０％）の両方を、２４時間後に採取した。細胞培養上清を廃棄し、２０μｌのＭＴＴ溶液を各ウェルに添加し（０．５ｍｇ／ｍｌ；シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）；ドイツ国ダルムシュタット所在のメルク社（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ））、次いで、細胞をさらに４時間培養した。その後、上清を除去し、２００μｌのＤＭＳＯを各ウェルに、１５分間軽く撹拌しながら添加した。次に、波長４９０ｎｍでの吸光度を、各ウェルについて４回繰り返して検出し、その平均値を計算した。実験の２４時間前に１０％ＤＭＥＭＦＢＳから０％ＦＢＳへのＦＢＳ飢餓を行った。バイオキソームで処理した試料は、生存率がほぼ３０％に低下した無血清試料と比較して、陽性対照（１０％ＦＢＳ）と同様のＨＦＦに対する同じ増殖効果を示した。
【００８７】
実施例１５：ＨＦＫのインビトロでのスクラッチアッセイ。
【００８８】
上述の方法を用いて、初代ヒト包皮ケラチノサイト−ＨＦＦ細胞からバイオキソームを作製した。創傷治癒モデルのインビトロ機能アッセイのための細胞として、ＨＦＫを使用した。１日目に、細胞を初代ストック（Ｐ０〜１）から解凍し、５％ＦＢＳ（エキソソームが枯渇していると証明されることが望ましい）及び１％Ｇｌｕｔａｍａｘを補充した通常培地上でＰ１〜２を培養した。２〜３日目に、継代培養を継続し、実験のためのコンフルエンスに達した。次に、２×１０６／ｃｍ２の密度で直径３μｍの孔を有する直径１．４ｃｍの１２ウェルインサート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）、またはスクラッチアッセイキットプロトコルに応じた６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、または各０．７５ｃｍ×０．９５ｃｍの８チャンバースライド（Ｎｕｎｃ）に分割することによって、１．５％のＦＢＳ上に細胞を再播種した。４日目（継代培養の約１日後）、ＦＢＳは１２時間で０．５％まで減少した。完全なＦＢＳ飢餓は、ガラスパスツールピペット、またはキットフォームテンプレート（Ｃｙｔｏｓｅｌｅｃｔ創傷治癒アッセイ、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、ＣＢＡ−１２０）によって行われたスクラッチとともに一晩実施した。細胞をＦＢＳ５％で４通りまたは３通り処理し、ＦＢＳ飢餓前のすべての調整手順の間、陽性対照として残し、バイオキソームによって未処理の同数のウェルを陰性対照として使用した。飢餓中に放出される活性バイオキソーム／エキソソームの供給源として使用される馴化培地の収集後、ＨＢＳＳ＋Ｈｅｐｅｓで洗浄した後に、バイオキソームを添加した。細胞のカウントは、細胞数対陽性対照のパーセンテージとして行った。
【００８９】
結果：
【００９０】
ＦＢＳ５％添加陽性対照は、２４時間後にスクラッチの完全閉鎖に達した。完全飢餓及びスクラッチストレス下の未処理細胞は、２４時間後に増殖を停止しアポトーシスを起こした。スクラッチの１２時間後、生存細胞をカウントした。１０ｓｕｐ５でのＨＦＦのバイオキソーム処理は、陽性対照の６０〜７５％に達する。ＨＦＦと、４代継体のＨＦＫ由来のＲＮＡとから作製した同じ用量のバイオキソームは、同じ細胞数が得られた。ＨＦＫ  ＲＮＡを添加したＨＦＦバイオキソームは、すべての用量で、２４時間後に、陽性対照と同じ速度でスクラッチを完全に閉鎖した。スクラッチ痕跡は、高用量でＲＮＡなしのＨＦＦと同様に行った、ＨＦＦ  ＲＮＡ有りの１０ｓｕｐ３ＨＦＦバイオキソームでのＨＦＫ  ＲＮＡ無しのＨＦＦバイオキソームにおいて、依然として見られた。
【００９１】
実施例１６：肝線維症インビボモデルにおけるレドキソームの生体内分布及び肝臓保護作用を試験するためのパイロット研究。
【００９２】
任意の肝臓保護治療薬としてのバイオキソームとレドキソームを開発するために、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）誘発性肝臓壊死を病理学的インビボモデルとして選択した。バイオキソームとレドキソームの有効性をインビボで試験するために、研究開始時に、１０〜１１週齢のＳＤラットのｎ＝３６匹を３つの群に分けた（各群は１２匹のラット）。６匹の追加群を、生体内分布のパイロット試験に使用した。対照群を、ＣｏｎＡ注射後にＰＢＳで処置した。そして、バイオキソームとレドキソームの肝臓保護作用を計算し、対照の割合として示した。すべての動物に２０ｍｇ／ｋｇのＣｏｎＡを静脈内注射して肝臓損傷を誘導し、基礎非処置動物と比較した。蛍光標識セラミドＢｉｏＤｉｐｙを有するＥ５ＢｉｏＤｉｐｙの単回用量を、ＣｏｎＡ投与後にＩＶ投与した。炎症部位での脂質過酸化が標的部位での積荷の放出に影響することが知られているという事実のために、ＢｉｏＤｉｐｙセラミドを脂質センサとして選択した。生体内分布試験のラットを、ＣｏｎＡとバイオキソームのＢｉｏＤｉｐｙ注射の８時間後に屠殺した。
【００９３】
結果：
【００９４】
投与の２時間後に、肝臓、腎臓、及び肺において強い蛍光が認められた。肝臓は、バイオキソームＢｉｏＤｉｐｙの主要な標的臓器であった。急性肝障害の機能パラメータをモニタするために、全群において、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血中レベルをＣｏｎＡ注射８時間後に測定した。ＣｏｎＡ対照群のＡＬＴレベルは３００〜１０００ユニット／リットルの範囲であったが、ＡＬＴの基礎レベルは１００ユニット／リットルよりも低かった。肝壊死は、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色で調べた。組織学的試験のために、各動物の肝臓片をトリミングし、段階的エタノール脱水後、１０％緩衝ホルマリン中に２４時間浸漬させることによって固定した。ブロックをさらにパラフィンワックスに包埋した。連続３ｍｍ切片をＨ＆Ｅで染色した。２人の「盲検」病理学者が３つのグレードによって単純化するために評価された病理組織学的スコア：０基本／健康；１軽度−中等度の損傷；３毒性−組織壊死。レドキソーム及びバイオキソーム処置動物の大部分はスコア２で評価され、急性及び慢性の肝臓病理モデルにおけるさらなる用量及び時間依存性に対する肝臓保護の実現可能性が証明された。
【００９５】
実施例１７：様々な細胞から得られたバイオキソーム、ＲＮＡ共単離及び濃縮バイオキソームのＱＣロバスト性及び再現性及びカプセル化効率。
【００９６】
様々な細胞培養物及び出発抽出細胞原料（２Ｅ３〜Ｅ９細胞を形成する）を用いて、幹細胞、細胞系、分化細胞、及び植物細胞起源の培養細胞からバイオキソームを作製した。バイオキソーム粒子の収率は開始細胞数と相関し、Ｅ６−Ｅ１２バイオキソーム粒子によって異なることが分かった。標準的なロータ蒸発法、窒素及びアルゴンガス蒸発法、凍結乾燥法などの様々な工業的乾燥法が用いられた。様々な方法で、同様の収率と粒径分布が得られた。バイオリアクタで培養したＣＤ３発現Ｔリンパ球である、すべての使用済の幹細胞、ＨＦＦ、ＨＦＫ、ＨｅｐＧ２、一次細胞、タバコ細胞、及びＪｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ；クローンＥ６−１）などの付着培養物上で細胞を培養した。関連する積荷が、超音波処理ステップの前に、または必要に応じて押し出し中に、親水性賦形剤緩衝液で添加された。カプセル化効率を改善するために、少なくとも２４時間間隔で３回の凍結融解サイクルを行った。その結果、骨髄幹細胞から作製した場合には、粒径は＜５００ｎｍとなった。図１０（Ａ）は、均一性は低いが、依然としてＱＣ仕様下である粒径データを示している。
【００９７】
溶媒は、医薬品グレード、ＵＳＰグレード、純度＞９０％または分析グレードのものを使用した。バイオキソーム粒子を、収集した液体窒素バンクから抽出し、ＦＢＤ、または／及びＤＭＳＯ含有凍結保存培地、解凍ペレットを除去するために２回洗浄した。バイオキソームの抽出は、新鮮なペレットから、直接抽出によって様々な付着培養細胞層（トリプシンストレスを回避するため）から、幹細胞、間質細胞及び上皮細胞からから、あるいは、初代細胞株、不死化細胞株及び細胞株から、実施した。図１０（Ｂ）に示すように、代表的な均一な粒径を有するＥ９バイオキソーム粒子を、ヒト脂肪組織単離ＭＳＣから得た。ＨＩＰ３：２が最適な溶媒系であることが分かった。これをＲＮＡｓａｖｅまたはＲＮＡｓｅを含まない滅菌水と２：１で使用して、単一ステップでＲＮＡを共沈澱させた。純粋なＲＮＡを収集し、ナノドロップにより濃度を測定することにより純度を確認し、完全性を試験した。バイオキソーム粒子濃度に関連するプロセスによって単離されたＲＮＡの代表的な濃度を、細胞数及び細胞重量毎に標準化した表１に示す。
【００９８】
【表１】
2021521141.tif 000003
【００９９】
追加の洗浄ステップを伴う同様の手順により、馴化培地からバイオキソームを作製した。バイオキソームの収集前に、細胞をＨＢＳＳ＋Ｈｅｐｅｓで洗浄した。ＦＢＳ枯渇条件下では、ＲＮＡが高収率で収集された。
【０１００】
様々な分子が積荷として使用された。そのような分子としては、小分子親水性積荷のモデルとしてのアスコルビン酸、デスフェリオキサミン及びＥＤＴＡ；生物学的分子としてのＲＮＡ及び緑色フルオレセインタンパク質；生物活性脂質試料としてのセラミド、トコフェロール、ドコシェキサエン酸エステル、スフィンゴミエリン及びテルペン、が挙げられる。生体膜修飾及び複合積荷を有する生物活性脂質カプセル化レドキソームの代表的な平均粒径は、一般的には、０．５〜３μｍ（ミクロン）である。
【０１０１】
実施例１８：ＲＮＡカプセル化及びエレクトロポレーションの実験。
【０１０２】
バイオキソームがＲＮＡトランスフェクション及び送達のための実現可能なキャリアであることを証明するために、ヒト赤血球ＲＢＣからバイオキソームを作製した。ＲＢＣは、Ｏ型の血液試料から採取し、次いで遠心分離機と白血球除去フィルタ（Ｔｅｒｕｍｏ  Ｊａｐａｎ）を使用して、血漿及び白血球から分離した。バイオキソームの抽出は、上述したようにして行った。精製オリゴヌクレオチドをバイオキソームに将来的に移すために、有効な陽性対照を用いて、エレクトロポレーションのキャリブレーションを行った。エレクトロポレーション実験は、指数関数的プログラムであるＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌエレクトロポレータ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、０．４ｃｍキュベットで１００μＦの固定キャパシタンスで行った。Ｅ９  ＲＢＣから得られたＥ１２バイオキソームを、ＯｐｔｉＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で希釈し、ＡＦ６４７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共役した４μｇデキストランと混合して２００μｌの総量にし、各キュベットに１００μｌのバイオキソームアリコートを添加し、氷上で１５０〜２５０Ｖにて１５分間インキュベートした。凝集体が形成された場合には、バイオキソーム粒子形成時よりも５０％低いエネルギーでの超音波単一パルスを追加することによって、脱凝集を行った。カプセル化の有効性を試験するために、電気穿孔されたバイオキソームを５μｇのラテックスビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに一晩インキュベートした後、デキストラン−ＡＦ６４７のＦＡＣＳ測定を行った。
【０１０３】
加えて、未加工のＲＮＡによりカプセル化された脂肪組織由来のバイオキソームを作製した。ヒト脂肪組織のＥ６細胞培養からＥ８バイオキソームを作製し、６秒間の単一パルス、エネルギー４０％、及び０．５ｍｃｇのＲＮＡ（ＲＮＡの完全性を保持するために）を用いた穏やかな超音波処理によってカプセル化した。得られたＲＮＡカプセル化されたバイオキソームの多分散指数ＰＤＩは、５４８ｎｍであった。ＲＮＡでカプセル化されたバイオキソームをさらに１０倍に希釈し、その後、さらに３０秒間超音波処理すると、平均粒径は４５０ｎｍになった。特に肝臓標的化が望ましい場合、任意選択で、１００ｎｍの粒径に達するように、Ａｖａｎｔ押出機によってさらに押し出される。プロセスのロバスト性は、同一ステップでの効率的な全ＲＮＡ単離によって検証され、同様のＲＮＡ収率が馴化培地から得られた。
【０１０４】
実施例１９：ＨＦＦ−ヒト包皮線維芽細胞培養上でのバイオキソーム／ＲＮＡ処理の生物活性。
【０１０５】
ＭＴＴ−ａ３−（４，５ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム細胞増殖アッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を実施し、上記のＥ８細胞由来バイオキソーム当たり０．５μｇの内部ＲＮＡを担持した脂肪組織由来バイオキソームの、飢餓ストレス（血清欠乏）後の細胞生存率に対する効果を調べた。１×１０４細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、９０％コンフルエントに達するまで１８〜２４時間培養した。付着後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで、無血清培地を添加した。血清を除去した細胞と対照（血清１０％）細胞の両方を２４時間後に採取した。
細胞培養上清を廃棄し、２０μｌのＭＴＴ溶液を各ウェルに添加し（０．５ｍｇ／ｍｌ；シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）；ドイツ国ダルムシュタット所在のメルク社（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ））、次いで、細胞をさらに４時間培養した。その後、上清を除去し、２００μｌのＤＭＳＯを各ウェルに、１５分間軽く撹拌しながら添加した。次に、波長４９０ｎｍでの吸光度を、各ウェルについて４回繰り返して検出し、その平均値を計算した。実験の２４時間前に１０％ＤＭＥＭＦＢＳから０％ＦＢＳへのＦＢＳ飢餓を行った。バイオキソームで処理した試料は、生存率がほぼ３０％に低下した無血清試料と比較して、陽性対照（１０％ＦＢＳ）と同様のＨＦＦに対する同じ増殖効果を示した。
【０１０６】
実施例２０：安定性概念実証の結果。
【０１０７】
バイオキソームの安定設計の実現可能性を試験するために、骨髄及び他の様々な細胞源由来のバイオキソームを上述したようにして作製し、超音波処理後に、様々な温度で貯蔵した。４°Ｃで、１日、１週間及び１ヵ月間貯蔵した。また、Ｒｅｖｃｏで−７０°Ｃにて貯蔵した。ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  Ｔｒａｃｋｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ＮＳ３００システム（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を使用して、ＥＶの濃度及び粒径分布を定量化した。図３（Ａ）〜（Ｃ）は、粒径の例を示す。粒子濃度は、短期間（１週間未満）の貯蔵では影響を受けず、４°Ｃでの１か月の貯蔵後に凝集することが分かった。−７０°Ｃで凍結した試料は、安定性に影響がなかった。注目すべきは、事前に超音波処理したバイオキソームも、粒径の測定前に繰り返し超音波処理したものと同じレベルで、−７０°Ｃで凍結した後に安定的であった。
【０１０８】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明することを目的としており、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で使用するとき、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が他の意味を明確に示さない限り、複数形も含むことを意図している。本明細書で使用するとき、「含む（comprises、comprising）」という用語は、記載された特徴、整数、ステップ、操作、構成要素、成分、及び／またはそれらの群または組み合わせの存在を明記するが、１以上の他の特徴、整数、ステップ、操作、構成要素、成分、及び／またはそれらの群または組み合わせの存在または追加を排除するものではないことがさらに理解されるであろう。本明細書で使用するとき、「含む（comprises、comprising、includes、including）」または「有する（having）」という用語及びそれらの活用語は、「含む、ただし、これに限定されない」ということを意味する。「からなる（consisting of）」という用語は、「含む、ただし、これに限定されない」ということを意味する。
【０１０９】
本明細書で使用するとき、「及び／または」という用語は、任意の及びすべての可能な組み合わせ、または関連するリストされた項目の１以上、並びに、代替的に解釈される場合（または）の組み合わせの欠如を含む。
【０１１０】
本明細書で使用するとき、「エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）」という用語は、膜由来の微小小胞（マイクロベシクル）を意味し、これは、正常な生理学的条件下及び病理学的条件下の両方において様々な細胞型から分泌されたエキソソーム、微小粒子、放出微小小胞、オンコソーム、エキソソームなどの様々な細胞外小胞を含み、あらゆるサイズの細胞内小胞、植物セクレトームベシクル、微生物叢、及びレトロウイルス様粒子に適用することができる。
【０１１１】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての用語（専門用語、科学用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書で定義されているような用語は、本明細書及び特許請求の範囲の文脈におけるそれらの意味と一致する意味を有するものとして解釈されるべきであり、本明細書で明示的に定義されない限り、理想化されたまたは過度に形式的な意味で解釈されるべきではないことがさらに理解されるであろう。周知の機能または構造は、簡潔性及び／または明確性のために詳細に説明されない場合がある。
【０１１２】
或る要素が、他の要素に対して、「配置される」、「取り付けられる」、「接続される」、「結合される」、「接触する」と称されるとき、その要素が、他の要素に対して、直接的に、「配置される」、「取り付けられる」、「接続される」、「結合される」、「接触する」ようにしてもよいし、あるいは、或る要素と他の要素との間に、別の要素または介在要素が存在してもよいことが理解されるであろう。対照的に、或る要素が、他の要素に対して、直接的に「配置される」、「取り付けられる」、「接続される」、「結合される」、「接触する」と称されるとき、或る要素と他の要素との間には、別の要素または介在要素は存在しない。また、別の要素に「隣接して」配置された構造または要素への言及は、隣接する要素と重なり合う部分や、隣接する要素の下になる部分を有することができることは、当業者であれば理解できるであろう。
【０１１３】
本明細書では、第１、第２などの用語が、様々な要素、構成要素、領域、層、及び／またはセクションを説明するために使用されているが、これらの要素、構成要素、領域、層、及び／またはセクションは、これらの用語によって限定されるべきではないことが理解されるであろう。むしろ、これらの用語は、或る要素、構成要素、領域、層、及び／またはセクションを、別の要素、構成要素、領域、層、及び／またはセクションと区別するためにのみ使用される。
【０１１４】
明確にするために別の実施形態の文脈で説明した本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供してもよい。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で説明した本発明の様々な特徴は、別個に、または任意の適切な部分的な組み合わせで、あるいは、本発明の任意の他の説明された実施形態において適切に提供してもよい。様々な実施形態の文脈で説明した特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしでは動作しない場合を除き、それらの実施形態に必須の特徴とは見なされない。
【０１１５】
「約」という用語を使用する場合は常に、量、時間持続時間などの測定可能な値を指すことを意味し、本開示の方法を実施するのに適した値として、指定された値から±２５％、±２０％、±１０％、±５％、±１％、または±０．１％の変動を包含することを意味する。
【０１１６】
本出願の全体を通じて、本発明の様々な実施形態を範囲形式で示すことがある。範囲形式での記載は単に利便性及び簡潔性のためのであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定と解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲に関する記載は、その範囲内に含まれる個々の数値だけでなく、その範囲内に含まれる可能なすべての部分的な範囲を具体的に開示したものと見なされるべきである。例えば、１から６までという範囲の記載は、１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６まで、・・・、という部分的な範囲、並びに、その範囲内に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５、及び６）を具体的に開示したものと見なされるべきである。このことは、範囲の広さに関係なく適用される。
【０１１７】
本明細書において数値範囲を指定している場合は常に、指定された数値範囲内に含まれるすべての数値（分数または整数）を含むことを意味する。第１の指定数と第２の指定数と「の間の範囲」という表現、及び第１の指定数「から」第２の指定数「までの範囲」という表現は、本明細書では相互交換的に使用されており、第１の指定数及び第２の指定数、並びにこれらの間のすべての分数及び整数を含むことを意味する。
【０１１８】
本明細書で使用するとき、「方法」という用語は、所定の目的を達成するための手法、手段、技術、及び手順を指し、そのようなものとしては、これに限定しないが、化学、薬理学、生物学、生化学、及び医療の分野の当業者に既知の手法、手段、技術、及び手順、またはそれらから当業者が容易に発展させた手法、手段、技術、及び手順が含まれる。
【０１１９】
「患者」または「対象」は、任意の哺乳動物を含むことを意味する。本明細書で使用するとき、「哺乳動物」は、哺乳動物に分類される任意の動物を指し、そのようなものとしては、これに限定しないが、ヒト、実験動物、例えばサル、ラット、マウス、モルモットなど、家畜及び農場動物、並びに、動物園動物、スポーツ動物、またはペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどが挙げられる。
【０１２０】
本明細書に引用されたすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾が存在する場合、定義を含む、本明細書が優先する。加えて、材料、方法、及び実施例は、単なる例示にすぎず、限定を意図するものではない。
【０１２１】
本発明が、図示及び上述した特定の内容に限定されないことは、当業者には理解されるであろう。むしろ、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されており、本明細書に記載された様々な特徴の組み合わせ及び部分的な組み合わせの両方、並びに、上述の説明から当業者が想到し得る様々な改変形態及び変更形態を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年12月9日(2020.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工バイオキソーム粒子であって、
予め定められた細胞源または細胞外源に由来し、マイルドな溶媒系を用いた脂質抽出によって得られた細胞膜成分を含有し、
少なくとも１つの予め定められた活性分子を含む積荷を担持するように設計され、かつ、
標的細胞と融合して前記標的細胞内に前記積荷を放出するように構成されたことを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項２】
請求項１に記載のバイオキソーム粒子であって、
前記積荷は、複数の活性分子を含むことを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項３】
請求項１または２に記載のバイオキソーム粒子であって、
前記細胞源または細胞外源は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、幹細胞、免疫系細胞、樹状細胞、外胚葉、ケラチノサイト、消化管（ＧＩ）細胞、口腔細胞、鼻粘膜細胞、神経細胞、網膜細胞、内皮細胞、心臓由来細胞、心筋細胞、周皮細胞、血液細胞、メラニン細胞、実質細胞、肝臓貯蔵細胞、神経幹細胞、膵臓幹細胞、胚性幹細胞、骨髄、皮膚組織、肝臓組織、膵臓組織、生体液、排泄物または外科的摘出組織、乳、唾液、粘液、血漿、尿、糞便、皮脂、出生後臍帯、胎盤、羊膜嚢、腎臓組織、神経組織、副腎組織、粘膜上皮、平滑筋組織、細菌細胞、細菌培養物、微生物全体、馴化培地、羊水、脂肪吸引組織、脂肪吸引副産物、及び植物組織からなる群より選択されることを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のバイオキソーム粒子であって、
前記活性分子は、核酸、ペプチド、アミノ酸、ポリペプチド、ヌクレオシド、成長因子、有機分子、ポリフェノール、ステロイド、脂溶性難溶性薬物、無機分子、抗酸化剤、ホルモン、抗体、ビタミン、サイトカイン、酵素、熱ショックタンパク質、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されることを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項５】
請求項４に記載のバイオキソーム粒子であって、
前記活性分子は、カンナビノイド、カンナビノイド酸、エンドカンナビノイド、ラパマイシン、及びＣｏＱ１０からなる群より選択されることを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のバイオキソーム粒子であって、
前記活性分子は、治療効果を有することを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のバイオキソーム粒子であって、
前記バイオキソーム粒子は、レドキソームであり、
前記積荷は、少なくとも１つの酸化還元活性フリーラジカル捕捉化合物を含むことを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項８】
請求項７に記載のバイオキソーム粒子であって、
ビタミンＥ、テルペノイド、ポリフェノール、フラボノイド、フェノール酸、カンナビノイド、レチノイド、ビタミンＤ、リポ酸、ステロールを含む脂質ラジカル／過酸化物トラップ剤によって、ＬＰＯ鎖反応を阻害することができることを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項９】
請求項７に記載のバイオキソーム粒子であって、
キレート剤をさらに含み、
前記鉄キレート剤は、デスフェリオキサミン（ＤＦＸ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ルチン、ＥＤＴＡ二ナトリウム、ＥＤＴＡ四ナトリウム、ＥＤＴＡカルシウム二ナトリウム、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはその塩、ヒドロキシエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）またはその塩、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、クエン酸アセチルトリヘキシル、アミノトリメチレンホスホン酸、β−アラニン二酢酸、クエン酸ビスマス、クエン酸、シクロヘキサンジアミン四酢酸、クエン酸ジアンモニウム、シュウ酸ジブチル、シュウ酸ジエチル、シュウ酸ジイソブチル、シュウ酸ジイソプロピル、シュウ酸ジリウム、シュウ酸ジメチル、ＥＤＴＡ二カリウム、シュウ酸二カリウム、シュウ酸ジプロピル、ＥＤＴＡ−銅二ナトリウム、ピロリン酸二ナトリウム、エチドロン酸、ＨＥＤＴＡ、シクロデキストリンメチル、シュウ酸、五カリウム、三リン酸、アミノトリメチレンリン酸五ナトリウム、ペンテト酸五ナトリウム、三リン酸五ナトリウム、ペンテト酸、ジカルボン酸、フィチン酸、クエン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ジヒドロキシエチルグリシン酸ナトリウム、グルセプト酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、シュウ酸ナトリウム、トリメタリン酸ナトリウム、茶−ＥＤＴＡ、テトラヒドロキシプロピルエチレンジアミン、エチドロン酸四カリウム、ピロリン酸四カリウム、エチドロン酸四ナトリウム、ピロリン酸四ナトリウム、ＥＤＴＡ三カリウム、ＥＤＴＡ三ナトリウム、ＨＥＤＴＡ三ナトリウム、ＮＴＡ三ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リンゴ酸、フマル酸、マルトール、サクシマー、ペニシラミン、ジメルカプロール、デフェリプロン、天然タンパク質ベースの鉄キレート剤、メラトニン、シデロホア、亜鉛もしくは銅のカチオン、それらの塩もしくは錯体、メシル酸デスフェリオキサミン、デトキサミン、デフェロキサミン、デフェラシロクス、グルタチオン、金属タンパク質、フェロケル（ビスグリシン酸キレート）、セルロプラスミン、クプリゾン、トリエンチン、フェルラ酸、酢酸亜鉛、リポカリン２、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されることを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のバイオキソーム粒子であって、
長期循環性持続放出バイオキソーム、選択的標的化バイオキソーム、免疫原性バイオキソーム、またはそれらの任意の組み合わせであることを特徴とするバイオキソーム粒子。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のバイオキソーム粒子と、
少なくとも１つの担体と、
を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物であって、
前記組成物は、医薬組成物であり、
前記担体は、薬学的に許容可能な担体であることを特徴とする組成物。
【請求項１３】
請求項１１に記載の組成物であって、
前記組成物は、薬用化粧品組成物であり、
前記担体は、薬用化粧品的に許容される担体であることを特徴とする組成物。
【請求項１４】
請求項１１に記載の組成物であって、
前記組成物は、食用組成物であり、
前記担体は、食品グレードの担体であることを特徴とする組成物。
【請求項１５】
予め定められた細胞源または細胞外源に由来し、マイルドな溶媒系を用いた脂質抽出によって得られた細胞膜成分を含有し、少なくとも１つの活性分子を含む積荷を担持するように設計され、かつ、標的細胞と融合して前記標的細胞内に前記積荷を放出するように構成された複数のバイオキソーム粒子を含む試料の作製方法であって、
（ａ）脂質抽出物を得るために、前記選択された細胞源または細胞外源からの全細胞脂質抽出をマイルドな溶媒系中で行うステップと、
（ｂ）前記脂質抽出物を乾燥させるステップと、
（ｃ）少なくとも１回の超音波処理及び／または押し出しを行うことによってバイオキソーム粒子の自己集合を誘導するステップと、を含み、
これにより、０．０３〜５μｍの平均粒径を有するバイオキソーム粒子を含む試料が得られることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、
前記バイオキソーム粒子の平均粒径は、０．０５〜３μｍであることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の方法であって、
前記バイオキソーム粒子を含む前記試料は、３．５〜５．５のｐＨを有することを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法であって、
前記マイルドな溶媒系は、極性溶媒及び非極性溶媒の混合物を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれかに記載の方法であって、
前記溶媒系は、安定剤をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１５〜１９のいずれかに記載の方法であって、
前記溶媒系は、酸化防止剤、界面活性剤、ビタミンＥ、スクアレン、コレステロール、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１５〜２０のいずれかに記載の方法であって、
核酸を共沈させるステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１５〜２１のいずれかに記載の方法であって、
前記脂質抽出のための前記細胞源または細胞外源は、線維芽細胞、間葉系幹細胞、幹細胞、免疫系細胞、樹状細胞、外胚葉、ケラチノサイト、消化管（ＧＩ）細胞、口腔細胞、鼻粘膜細胞、神経細胞、網膜細胞、内皮細胞、心臓由来細胞、心筋細胞、周皮細胞、血液細胞、メラニン細胞、実質細胞、肝臓貯蔵細胞、神経幹細胞、膵臓幹細胞、胚性幹細胞、骨髄、皮膚組織、肝臓組織、膵臓組織、出生後臍帯、胎盤、羊膜嚢、腎臓組織、神経組織、副腎組織、粘膜上皮、平滑筋組織、細菌細胞、細菌培養物、微生物全体、馴化培地、羊水、脂肪吸引組織、脂肪吸引副産物、及び植物組織からなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１５〜２２のいずれかに記載の方法であって、
前記脂質抽出は、細胞馴化培地、凍結乾燥馴化細胞培地、細胞ペレット、凍結細胞、乾燥細胞、洗浄細胞バルク、非付着細胞懸濁液、または付着細胞層から行われることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１５〜２３のいずれかに記載の方法にしたがって作製された複数のバイオキソーム粒子を含む試料。
【請求項２５】
請求項１２に記載のバイオキソーム粒子の、対象の病状を治療または予防するための医薬品としての使用。
【請求項２６】
請求項１〜１０のいずれかに記載のバイオキソーム粒子の、前記活性分子を標的部位に送達するための担体としての使用。
【請求項２７】
請求項１〜１０のいずれかに記載のバイオキソーム粒子の、薬剤としての使用。
【国際調査報告】
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