(57)【要約】  治療的有効量の、野生型または無傷のγ１３４．５タンパク質発現を伴わずに、γ１３４．５タンパク質のＣ末端部分（例として、アミノ酸残基１４７〜２６３）のみを発現する組換え単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）を、対象へ投与することにより、がんを有する対象を処置するための方法が提供される。本発明の組換えＨＳＶ−１は、免疫活性化を引き起こし、がん細胞中で選択的に複製され、インターフェロンによるクリアランスに抵抗する。
2021527072.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを有する対象を処置するための方法であって、治療的有効量の、野生型または無傷のγ１３４．５タンパク質発現を伴わずに、γ１３４．５タンパク質のＣ末端部分のみを発現する組換え単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）を対象へ投与し、それによって対象のがんを処置することを含む、前記方法。
【請求項２】
γ１３４．５タンパク質のＣ末端部分が、配列番号２からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組換えＨＳＶ−１が、１以上の非必須の遺伝子またはそのフラグメントの欠失をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
非必須の遺伝子が、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ９．５、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬＩ２、ＵＬ１３、ＵＬＩ４、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２３、ＵＬ２４、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４３．５、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５３、ＵＬ５５、Ｕｓ１、Ｕｓ１．５、Ｕｓ２、Ｕｓ３、Ｕｓ４、Ｕｓ５、Ｕｓ７、Ｕｓ８、Ｕｓ８．５、Ｕｓ９、Ｕｓ１０、Ｕｓ１１、Ｕｓ１２、およびＩＣＰ０から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
組換えＨＳＶ−１が、
がん治療のための、治療用タンパク質、酵素、抗体または核酸を発現する１以上の遺伝子での１以上の非必須の遺伝子の置換をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
非必須の遺伝子が、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ９．５、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬＩ２、ＵＬ１３、ＵＬＩ４、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２３、ＵＬ２４、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４３．５、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５３、ＵＬ５５、Ｕｓ１、Ｕｓ１．５、Ｕｓ２、Ｕｓ３、Ｕｓ４、Ｕｓ５、Ｕｓ７、Ｕｓ８、Ｕｓ８．５、Ｕｓ９、Ｕｓ１０、Ｕｓ１１、Ｕｓ１２、およびＩＣＰ０から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
治療用タンパク質が、インターフェロンアルファ、インターロイキン−２、および顆粒球−コロニー刺激因子から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
抗体が、抗プログラム細胞死タンパク質１抗体、抗チェックポイントＴ−リンパ球関連タンパク質４抗体、抗ＯＸ４０抗体、および抗ＣＤ４０抗体から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
がんが、固形腫瘍を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
がんが、乳房、肝臓、皮膚、脳、肺、および結腸がんから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
有効量の、がんの処置のために有用な第２の治療剤を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
緒言
本出願は、２０１８年６月８日に出願された米国仮特許出願第６２／６８２，２０２号に対する優先権の利益を主張し、この内容は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号ＡＩ１１２７５５の下の政府の支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）は、がん免疫治療にとって魅力的な薬剤である（Peters & Rabkin (2015) Mol. Ther. Oncolytics 2:15010; Chiocca & Rabkin (2014) Cancer Immunol. Res. 2:295-300）。感染すると、ＨＳＶ−１は逐次的な遺伝子発現、ＤＮＡ複製、組み立て、および退出を経て、腫瘍細胞破壊がもたらされる。これは、適応抗腫瘍免疫を活性化する、危険シグナルとネオ抗原の放出を伴う。一連の腫瘍溶解性ＨＳＶは、様々な開発段階にある（Peters & Rabkin (2015) Mol. Ther. Oncolytics 2:15010）。最も臨床的に進んでいる薬剤は、進行性黒色腫の処置のためにＦＤＡによって承認されたタリモジェンラヘルパレプベック（Ｔ−ＶＥＣ）である（Andtbacka, et al. (2015) J. Clin. Oncol. 33:2780-88）。腫瘍溶解性ＨＳＶの追加の例は、臨床試験を経た、または臨床試験中のＧ２０７、１７１６、およびΔＧ４７である（Markert, et al. (2000) Gene Ther. 7:867-74; Rampling, et al. (2000) Gene Ther. 357:525-6; Streby, et al. (2017) Clin. Cancer Res. 23:3566-74; Fukuhara, et al. (2016) Cancer Sci. 107:1373-79）。バックボーンの設計は異なるものの、これらの腫瘍溶解性ＨＳＶウイルスは、病原性因子をコードするγ１３４．５遺伝子をもともと欠失している。
【０００４】
ＨＳＶ  γ１３４．５は、大きなアミノ末端ドメイン（ａａ１〜１４６）およびカルボキシル末端ドメインを含有する。感染細胞において、ＨＳＶ−１は、翻訳開始因子２α（ｅＩＦ−２α）のリン酸化によってタンパク質合成をシャットオフする、二本鎖ＲＮＡ依存性キナーゼ（ＰＫＲ）を活性化する。そのため、γ１３４．５タンパク質はタンパク質ホスファターゼ１（ＰＰ１）をリダイレクト（redirect）して、ｅｌＦ−２αを脱リン酸化する。注目すべきことに、γ１３４．５−ＰＰ相互作用の部位特異的断絶は、ウイルスの病原性を無効にする。ＨＳＶ  γ１３４．５はまた、糖タンパク質プロセシングとウイルスの拡散に影響を与えることも報告されている。加えて、証拠は、γ１３４．５タンパク質が追加の機能を有することを示唆している。これらには、オートファジーの阻害、ＴＡＮＫ結合キナーゼ１によるＩＦＮ誘導、およびトール様受容体による樹状細胞成熟および核退出の加速が含まれる。γ１３４．５タンパク質は核と細胞質の間を往復するが、宿主細胞とのその正確な相互作用は未だ不明である。
【０００５】
いくつかの株の証拠は、γ１３４．５遺伝子の欠失を有するＨＳＶ−１突然変異体が抗腫瘍活性を発揮することを実証している。これは、免疫不全および免疫応答性前臨床モデルにおいて、神経膠腫、結腸、卵巣、乳房、肝臓、および黒色腫を含む腫瘍について示されている（Mineta, et al. (1995) Nat. Med. 1:938-43; Toda, et al. (1998) Hum. Gene Ther. 9:2177-85; Chambers, et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1411-15; Randazzo, et al. (1995) Virology 211:94-101; Thomas & Fraser (2003) Mol. Ther. 8:543-51; Coukos, et al. (2000) Clin. Cancer Res. 6:3342-53; Braidwood, et al. (2014) J. Hepatocell. Carcinoma 1:149-61; Wang, et al. (2016) Gene Ther. 23:135-43; WO 2017/013419 A1; US 2017/0319638 A1; US 7,223,593）。しかしながら、治療成果は大きく異なる。根本的なイベントは複雑であるが、ウイルス−宿主相互作用の性質が決定要因のようである。腫瘍細胞におけるマイトジェン活性化プロテインキナーゼまたはＲＡＳ癌遺伝子の活性化はＰＫＲを阻害し、それによってウイルス複製を可能にすることが示唆されている。他方、刺激されたインターフェロン遺伝子（ＳＴＩＮＧ）の遺伝的または後成的抑制は、それがＩ型ＩＦＮ産生を媒介するため、腫瘍破壊のためにγ１３４．５ヌル突然変異体をライセンス（license）することが報告されている。したがって、腫瘍細胞における活発なＰＫＲ、ＳＴＩＮＧ、またはＩＦＮ産生は、γ１３４．５遺伝子を欠く腫瘍溶解性ＨＳＶの有効性を軽減すると考えられている。
【０００６】
腫瘍を直接破壊するための弱毒化された複製能力のあるウイルスの使用における主な制限は、がん細胞を含む多くの細胞型における成長の低下であり続けている。腫瘍溶解の最初の波にもかかわらず、宿主防御は、新生物細胞の集団全体を根絶するのに十分に長い期間、ウイルスベクターが首尾よく複製することを制限する。さらに、複製が改善された腫瘍溶解性ウイルスのバックボーンは、抗腫瘍免疫に必要な先天性免疫準備刺激をしばしば弱めることがある。そのため、生き残ったがん細胞は増殖するか、患者に対するそれらの締め付け（strangle-hold）を再確立する。よって、必要なのは、がん細胞を溶解し、全身性の抗腫瘍応答を有効に活性化するウイルス抗腫瘍剤である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の概要
本発明は、治療的有効量の、野生型または無傷のγ１３４．５タンパク質発現を伴わずに、γ１３４．５タンパク質のＣ末端部分、例として、配列番号２からなるタンパク質のみを発現する組換え単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）を、対象へ投与し、それによって対象のがんを処置することによる、がんを有する対象を処置するための方法を提供する。いくつかの態様において、組換えＨＳＶ−１は、１以上の非必須遺伝子、例として、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ９．５、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬＩ２、ＵＬ１３、ＵＬＩ４、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２３、ＵＬ２４、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４３．５、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５３、ＵＬ５５、Ｕｓ１、Ｕｓ１．５、Ｕｓ２、Ｕｓ３、Ｕｓ４、Ｕｓ５、Ｕｓ７、Ｕｓ８、Ｕｓ８．５、Ｕｓ９、Ｕｓ１０、Ｕｓ１１、Ｕｓ１２、およびＩＣＰ０、またはそのフラグメントの欠失をさらに含む。他の態様において、組換えＨＳＶ−１は、がん治療のための治療用タンパク質（例として、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、および顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ））、酵素、抗体（例として、抗プログラム細胞死タンパク質１抗体（抗ＰＤ１）、抗チェックポイントＴ−リンパ球関連タンパク質４抗体（抗ＣＴＬＡ４）、抗ＯＸ４０（抗ＣＤ１３４）抗体、および抗ＣＤ４０抗体）または核酸を発現する１以上の遺伝子での１以上の非必須遺伝子の置換をさらに含み、ここで非必須遺伝子は、ＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ９．５、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬＩ２、ＵＬ１３、ＵＬＩ４、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２３、ＵＬ２４、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４３．５、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５１、ＵＬ５３、ＵＬ５５、Ｕｓ１、Ｕｓ１．５、Ｕｓ２、Ｕｓ３、Ｕｓ４、Ｕｓ５、Ｕｓ７、Ｕｓ８、Ｕｓ８．５、Ｕｓ９、Ｕｓ１０、Ｕｓ１１、Ｕｓ１２、およびＩＣＰ０から選択される。なおさらなる態様において、がんは、固形腫瘍であり、任意に、乳房、肺、肝臓、皮膚（黒色腫）、脳、および結腸がんから選択されるがんである。組換えＨＳＶ−１の投与に加えて、方法は、有効量の、がんの処置のために有用な第２の治療剤の投与をさらに含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
図面の簡単な説明
【図１】図１は、ΔＮ１４６が局所の腫瘍成長を減少させることを実証するデータを提供する。４Ｔ１細胞をマウスの皮下に移植した（−７日目）。形成された腫瘍を、１日目、３日目、および６日目に、ＰＢＳ中に懸濁したＰＢＳ、Δγ１３４．５、ΔＮ１４６、またはＥＵｓ１１とともに注射した。腫瘍サイズを、２４日目まで定期的に（ｘ軸）測定した（各群ｎ＝６）。平均腫瘍体積は、ｙ軸で経時的に示される。星印は、ノンパラメトリック分析による統計的有意性を示す。示される結果は、３つの独立した実験のうちの１つからのものである。選択された群間の差を、両側スチューデントのｔ検定により統計学的に評価した（＊＊、Ｐ＜０．０１）。
【０００９】
【図２】図２は、ΔＮ１４６が転移を減少させることを実証するデータを提供する。４Ｔ１細胞をマウスの皮下に移植した（−７日目）。形成された腫瘍を、１日目、３日目、および６日目に、ＰＢＳ中に懸濁したＰＢＳ、Δγ１３４．５、ΔＮ１４６、またはＥＵｓ１１とともに注射した。処置の開始後２４日目にマウスを屠殺し、肺を収集し、ホルマリン中に固定した。肺転移の数を光学顕微鏡下で計測し、定量した。示される結果は、３つの独立した実験のうちの１つからのものである。選択された群間の差を、両側スチューデントのｔ検定により統計学的に評価した（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１）。
【００１０】
【図３】図３は、４Ｔ１腫瘍におけるウイルス成長を実証するデータを提供する。ＰＢＳ中に懸濁したＰＢＳ、Δγ１３４．５、ΔＮ１４６、またはＥＵｓ１１で処置した腫瘍を９日目に収集し、腫瘍中に存在する感染性ウイルスをプラークアッセイにより定量した（ｎ＝６）。示される結果は、３重の試料を有する３つの実験からのものである。選択された群間の差を、両側スチューデントのｔ検定により統計学的に評価した（＊＊、Ｐ＜０．０１）。
【００１１】
【図４】図４は、in vitroにおけるΔＮ１４６およびＥＵｓ１１の比較分析を示す。ＩＦＮ−α１およびＣｘｃｌ９の発現におけるウイルスの効果を分析した。４Ｔ１細胞を、モック感染、またはΔＮ１４６もしくはＥＵｓ１１で感染させた（５ｐｆｕ／細胞）。感染の６時間後、ＲＮＡ試料を定量ポリメラーゼ連鎖反応により分析した。データは、標準偏差を有する３重の試料の３つの実験の代表的なものである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の詳細な説明
ウイルス複製のための最適な細胞内環境は、細胞膜へのウイルスの付着により起こり始める事象を通じて進行する。単純ヘルペスウイルスの細胞膜受容体（単数または複数）への結合に、細胞における生化学的、生理学的、および形態学的変化に関連する事象のカスケードが続く。感受性細胞における感染に続いて、溶解的複製は、時間的に調整された一連の遺伝子転写によって調節される。ウイルスの宿主細胞膜への結合は、最初期（immediate-early）（ＩＥまたはα）遺伝子（ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、およびＩＣＰ４７）を活性化し、それは、転写される次の群の遺伝子である、初期（β）遺伝子の産生を可能にするトランス活性化因子である。最初期遺伝子産物の発現に、初期および次いで後期（γ）遺伝子によってコードされるタンパク質の発現が続く。野生型ウイルスにおける遺伝子活性化とウイルス複製のカスケード全体は約１８〜２４時間かかり、不可逆的に細胞死をもたらす。本発明の組換えＨＳＶ突然変異体は、γ１３４．５ヌルウイルスのタンパク質合成シャットオフ表現型を回避し、抗腫瘍免疫を媒介するＳＴＩＮＧ（インターフェロン刺激遺伝子）を活性化し、標的化されたγ１３４．５欠失を有するより堅牢なＨＳＶバリアントを作成する。
【００１３】
γ１３４．５のＣ末端半分（ΔＮ１４６）を発現する組換えＨＳＶ−１が、γ１３４．５ヌル突然変異体（Δγ１３４．５）に対して不応性である悪性細胞において堅牢に複製し、溶解することが今や発見された。感染細胞において、Δγ１３４．５ではなくΔＮ１４６が翻訳開始因子ｅＩＦ２αのリン酸化を妨げ、ウイルスタンパク質合成を確実にする。注目すべきことに、ΔＮ１４６はまた、腫瘍に対する免疫を準備刺激することが知られている免疫因子であるＳＴＩＮＧのγ１３４．５阻害ドメインが除去されているので、インターフェロン調節因子３とＩＦＮ応答を活性化する。しかしながら、Δγ１３４．５とは異なり、ΔＮ１４６はＩＦＮ−α／βに曝露されると適切に複製する。これは、γ１３４．５のＣ末端側半分に関連する活性に起因する。ＥＵｓ１１は適切に複製するが、インターフェロン調節ＩＲＦ３を不活性化する。よって、その複製は免疫阻害を犠牲にしてもたらされる。マウス４Ｔ１腫瘍モデルにおいては、ΔＮ１４６はΔγ１３４．５よりもより効果的に腫瘍成長と転移を減少させる。腫瘍成長の減少は同等である一方で、ΔＮ１４６は、ＥＵｓ１１よりもより効果的に転移を減少させる。これは、局所の腫瘍におけるウイルス複製、ＩＦＮ誘導およびＴ細胞浸潤と一致する。ΔＮ１４６は正常組織においては検出できず、in vivoでは無毒性である。よって、ＨＳＶ−１の選択的な編集は、ウイルス−細胞相互作用を変化させ、ユニークな抗新生物プラットフォーム、つまり、腫瘍選択性、免疫刺激、ＩＦＮによるクリアランスに対する耐性をもたらす。したがって、本発明は、野生型または無傷のγ１３４．５タンパク質発現を伴わずに、γ１３４．５タンパク質のＣ末端半分のみを発現する組換えＨＳＶ−１ウイルス、およびがんの処置におけるその使用である。
【００１４】
当技術分野において知られているように、γ１３４．５は、実験モデルにおいて末梢組織におけるウイルス複製および末梢神経系への浸透を促進するＨＳＶタンパク質である（Whitley, et al. (1993) J. Clin. Invest. 91:2837-43; Perng, et al. (1996) J. Virol. 70:2883-93; Mao & Rosenthal (2003) J. Virol. 77:3409-3417）。加えて、それは中枢神経系におけるＨＳＶ感染と複製を促進する（Chou, et al. (1990) Science 250:1262-66; MacLean, et al. (1991) J. Gen. Virol. 72:631-39）。ＨＳＶ  γ１３４．５は、タンパク質ホスファターゼ１αに結合する大きなアミノ末端ドメイン（ａａ１〜１４６）とカルボキシル末端ドメイン（ａａ１４７〜２６３）を含むことが知られている（He, et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:20737-43）。野生型γ１３４．５のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＨＳＶ−１株１７の完全なゲノムを提供するＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＣ＿００１８０６．１；ＨＳＶ−１株Ｆの完全なゲノムを提供するＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＧＵ７３４７７１．１；ＨＳＶ−１株Ｈ１２９の完全なゲノムを提供するＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＧＵ７３４７７２．１で入手可能である。例証として、野生型または無傷のγ１３４．５はアミノ酸配列：
ＭＡＲＲＲＲＨＲＧＰＲＲＰＲＰＰＧＰＴＧＡＶＰＴＡＱＳＱＶＴＳＴＰＮＳＥＰＡＶＲＳＡＰＡＡＡＰＰＰＰＰＡＳＧＰＰＰＳＣＳＬＬＬＲＱＷＬＨＶＰＥＳＡＳＤＤＤＤＤＤＤＷＰＤＳＰＰＰＥＰＡＰＥＡＲＰＴＡＡＡＰＲＰＲＳＰＰＰＧＡＧＰＧＧＧＡＮＰＳＨＰＰＳＲＰＦＲＬＰＰＲＬＡＬＲＬＲＶＴＡＥＨＬＡＲＬＲＬＲＲＡＧＧＥＧＡＰＥＰＰＡＴＰＡＴＰＡＴＰＡＴＰＡＴＰＡＲＶＲＦＳＰＨＶＲＶＲＨＬＶＶＷＡＳＡＡＲＬＡＲＲＧＳＷＡＲＥＲＡＤＲＡＲＦＲＲＲＶＡＥＡＥＡＶＩＧＰＣＬＧＰＥＡＲＡＲＡＬＡＲＧＡＧＰＡＮＳＶ（配列番号１）
を有する。
【００１５】
本明細書に使用されるとき、「組換えＨＳＶ−１」は、野生型または無傷のγ１３４．５タンパク質発現を伴わずに、γ１３４．５タンパク質のＣ末端部分または半分のみを発現する、操作されたまたは改変されたヒト単純ヘルペスウイルス１を指す。本明細書に使用されるとき、γ１３４．５タンパク質のＣ末端部分または半分は、抗腫瘍活性を保持または増大させるγ１３４．５タンパク質またはそのバリアントの以下のアミノ酸残基：
ＲＬＲＲＡＧＧＥＧＡＰＥＰＰＡＴＰＡＴＰＡＴＰＡＴＰＡＴＰＡＲＶＲＦＳＰＨＶＲＶＲＨＬＶＶＷＡＳＡＡＲＬＡＲＲＧＳＷＡＲＥＲＡＤＲＡＲＦＲＲＲＶＡＥＡＥＡＶＩＧＰＣＬＧＰＥＡＲＡＲＡＬＡＲＧＡＧＰＡＮＳＶ（配列番号２）
を指す。
【００１６】
本発明の組換えＨＳＶ−１のいくつかの側面において、内在性γ１３４．５遺伝子は、γ１３４．５遺伝子の両方のコピーが、γ１３４．５タンパク質のＣ末端部分のみを発現するように改変されている。本発明の組換えＨＳＶ−１の他の側面において、γ１３４．５遺伝子の両方の内在性コピーは、欠失しており、γ１３４．５タンパク質のＣ末端部分をコードする核酸はＨＳＶ−ｌゲノム中の１以上の別々の場所、例として、非必須遺伝子中に挿入されている。この点において、ＨＳＶ−１ゲノムは、野生型γ３４．５遺伝子は、非機能的であるが、組換えＨＳＶ−１は哺乳動物の腫瘍細胞に未だ感染、複製、および溶解し得るように改変されている。
【００１７】
γ１３４．５タンパク質のＣ末端部分の発現は、γ１３４．５タンパク質プロモーター、別の内在性ＨＳＶ−１プロモーター、またはウイルスもしくは細胞起源の異種もしくは外来性プロモーターにより駆動され得る。本発明において使用の例示のプロモーターは、限定せずに、単純ヘルペスウイルス最初期プロモーターα２７、α４、α０、α２２、およびα４７；ＩＣＰ８（またはＵＬ２９）、チミジンキナーゼ（ｔｋまたはＵＬ２３）、ＩＣＰ６（ＵＬ３９）からの単純ヘルペスウイルス初期プロモーターまたはいずれかのＤＮＡ複製遺伝子；または後期プロモーター、例として、Ｕｓ１１プロモーターを含む。
【００１８】
いくつかの態様において、組換えＨＳＶ−１は、ＨＳＶ−１の１以上の非必須の遺伝子の欠失をさらに含む。非必須遺伝子は、必須の遺伝子と区別され、その不在においてウイルスは複製されない。非必須遺伝子は、有益な遺伝子であってもよく、その場合、そのような有益な遺伝子の置換は、野生型ウイルスのそれよりもはるかに遅い速度で複製するウイルスをもたらす。ＨＳＶ−１の代表的な非必須の遺伝子は、これらに限定されないが、ＵＬ領域におけるＵＬ２、ＵＬ３、ＵＬ４、ＵＬ９．５、ＵＬ１０、ＵＬ１１、ＵＬ１２、ＵＬ１３、ＵＬＩ４、ＵＬ２０、ＵＬ２１、ＵＬ２３、ＵＬ２４、ＵＬ３９、ＵＬ４０、ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４３．５、ＵＬ４４、ＵＬ４５、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ５０、ＵＬ５ｌ、ＵＬ５３、およびＵＬ５５；Ｕｓ領域におけるＵｓ１、Ｕｓ１．５、Ｕｓ２、Ｕｓ３、Ｕｓ４、Ｕｓ５、Ｕｓ７、Ｕｓ８、Ｕｓ８．５、Ｕｓ９、Ｕｓ１０、Ｕｓ１１およびＵｓ１２；および逆方向反復領域におけるＩＣＰ０を含む。
【００１９】
代替の態様において、１以上の非必須の遺伝子は、治療用タンパク質、酵素、抗体、核酸をコードするおよび発現することができる１以上の核酸（例として、該タンパク質、酵素、抗体、またはマイクロＲＮＡ、リボザイム等をコードする核酸）、またはがん治療のための同種のもので置き換えられる。治療用タンパク質は、がんの処置に治療的利益を有する機能的タンパク質（すなわち、酵素または抗体以外）を指す。好適な治療用タンパク質の例は、これらに限定されないが、ｒｓＣＤ４０Ｌ（Eliopoulos et al. (2000) Mol. Cell. Biol. 20:5503-5515）；Ｆａｓリガンド（Sharma et al. (2000) Pharmacol. Ther. 88:333-347）；ＴＲＡＩＬ（Golstein (1997) Curr. Biol. 7:R750-753）；ＴＮＦ（Baker & Reddy (1996) Oncogene 12:1-9; Theys, et al. (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65:4295-4300; Lammertyn, et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:1808-1813）；黒色腫、乳房癌、結腸直腸癌、膠芽腫、神経芽細胞腫、および前立腺癌の処置のためのＧＭ−ＣＳＦ（例として、Eubank, et al. (2009) Cancer Res. 69(5):2133-40を参照のこと）；卵巣癌および固形腫瘍の処置のためのＩＦＮα（例として、Goto, et al. (1996) Br. J. Cancer 74:546-54を参照のこと）；神経芽細胞腫および卵巣癌の処置のためのＩＬ−２（例として、Minor, et al. (2017) Gynecol. Oncol. Rep. 22:43-44を参照のこと）；および乳房癌、膀胱癌、卵巣癌の処置のためのＧ−ＣＳＦ（例として、Omura, et al. (1996) Proc. Annu. Meet Am. Soc. Clin. Oncol. 15:A755を参照のこと）を含む。
【００２０】
治療用酵素は、がんの処置において治療的利益を有する酵素を指す。治療用酵素の具体的な使用は、非毒性のプロドラッグを腫瘍に対して細胞傷害性である毒性薬物に変換することができる酵素を含む。好適な治療用酵素−プロドラッグペアの例は、これらに限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）＋ガンシクロビル（ＧＣＶ）（Moolten (1986) Cancer Res. 46:5276-5281）；ＨＳＶ−ＴＫ＋Ａ−５０２１（１’Ｓ，２’Ｒ）−９｛［１’，２’−ビス（ヒドロキシメチル）シクロプロパ−１’−イル］メチル｝グアニン（Hasegawa, et al. (2000) Cancer Gene Ther. 7:557-562）；西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）＋インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）（Greco, et al. (2000) Cancer Gene Ther. 7:1414-1420）；細菌酵素カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）＋４−（［２−クロロエチル］［２−メシルオキシエチル］アミノ）ベンゾイル−Ｌ−グルタミン酸（ＣＭＤＡ）または＋４−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヨードエチル）アミノ］フェノキシカルボニルＬ−グルタミン酸（ＺＤ２７６７Ｐ）（Spooner, et al. (2000) Cancer Gene Ther. 7:1348-1356; Webley, et al. (2001) Br. J. Cancer 84:1671-1676）；ヒトシトクロムＰ４５０  ＣＹＰＩＡ２＋アセトアミノフェン（Thatcher, et al. (2000) Cancer Gene Ther. 7:521-525）；ウサギシトクロムＰ４５０  ４Ｂｌ（ＣＹＰ４Ｂｌ）＋４−イポメアノール（４−ＩＭ）（Mohr, et al. (2000) Cancer Gene Ther. 7:1008-1014; Heuser, et al. (2000) Cancer Gene Ther. 7:806-12）；ラットシトクロムＰ４５０  ４Ｂｌ（ＣＹＰ２Ｂｌ）＋イホスファミド（ＩＦＯ）などのオキサホスホリン（Kammertoens, et al. (2000) Cancer Gene Ther. 7:629-636）；大腸菌ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）＋ＣＢ１９５４（Djeha, et al. (2000) Cancer Gene Ther. 7: 721-731; Djeha, et al. (2001) Mol. Ther. 3:233-240）；大腸菌シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、大腸菌ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＵＰＲＴ）＋５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）（Kammertoens, et al. (2000) Cancer Gene Ther. 7:629-636; Block, et al. (2000) Cancer Gene Ther. 7:438-445; Bentires-Alj, et al. (2000) Cancer Gene Ther. 7:20-6）；シトクロムＰ４５０酵素＋シクロホスファミド（ＣＰＡ）（Huang, et al. (2000) Cancer Gene Ther. 7:1034-42; Kan, et al. (2001) Cancer Gene Ther. 8:473-82）；ウサギカルボキシルエステラーゼ＋７−エチル−１０−［４−（１−ピペリジノ）−１−ピペリジノ］カルボニルオキシカンプトテシン（ＣＰＴ−ＩＩ）（Meck, et al. (2001) Cancer Res. 61:5083-89）；マッシュルームチロシナーゼ＋ビス−（２−クロロエチル）アミノ−４−ヒドロキシフェニルアミノメエタノン２８（Jordan, et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:1549-58）；大腸菌β−ガラクトシダーゼ＋ｌ−クロロメチル−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンズ［ｅ］インドール（ＣＣ−１０６５）または＋１−（１’−クロロエチル）−５−ヒドロキシ−ｌ，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンズ［ｅ］インドール（Tietze, et al. (2001) Chembiochem. 2:758-765）；カルボキシペプチダーゼＧ２の突然変異体（ＣＰＧ２、グルタマートカルボキシペプチダーゼ＋４−［ビス（２−ヨードエチル）アミノ］フェニルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸または＋３−フルオロ−４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］ベンゾイル−Ｌ−グルタミン酸または＋３，５−ジフルオロ−４−［ビス（２−ヨードエチル）アミノ］ベンゾイル���Ｌ−グルタミン酸（Friedlos, et al. (2002) Cancer Res. 62:1724-1729）を含む。
【００２１】
治療用抗体は、がんの処置において治療的利益を有する抗体を指す。好適な治療用抗体の例は、これらに限定されないが、（膀胱がんおよび乳房がん、ＮＳＣＬＣ、および小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）の処置のための）アテゾリズマブ；（膀胱がんおよびメルケル細胞癌（ＭＣＣ）の処置のための）アベルマブ；（膀胱がんおよびＮＳＣＬＣの処置のための）デュルバルマブ；（膀胱がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肝臓がん、ＮＳＣＬＣ、転移性のＳＣＬＣ、ホジキンリンパ腫、および黒色腫の処置のための）ニボルマブ；（膀胱がん、子宮頸部がん、結腸直腸がん、食道がん、肝臓がん、ＮＳＣＬＣ、ホジキンリンパ腫、黒色腫、およびＭＣＣの処置のための）ペンブロリズマブ；（膠芽腫、子宮頸部がん、結腸直腸がん、腎臓がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、および卵巣がんの処置のための）ベバシズマブ；（神経芽細胞腫の処置のための）ジヌツキシマブ；（乳房がんの処置のための）ペルツズマブ；（乳房がんおよび食道がんの処置のための）トラスツズマブ；（結腸直腸がんの処置のための）セツキシマブ；（結腸直腸がんの処置のための）パニツムマブ；（結腸直腸がんおよび食道がんの処置のための）ラムシルマブ；（慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の処置のための）アレムツズマブ；（急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の処置のための）ブリナツモマブ；（ＣＬＬおよび非ホジキンリンパ腫の処置のための）オビヌツズマブ；（ＣＬＬの処置のための）オファツムマブ；（ＣＬＬおよび非ホジキンリンパ腫の処置のための）リツキシマブ；（ＮＳＣＬＣの処置のための）ネシツムマブ；（黒色腫、膵臓がん、前立腺癌および黒色腫の処置のための）イピリムマブ；（多発性骨髄腫の処置のための）ダラツムマブ；（多発性骨髄腫の処置のための）エロツズマブ；（骨がんの処置のための）デノスマブ；（骨がんの処置のための）オララツムマブ（Olaratumumab）；（メルケル細胞癌（ＭＣＣ）の処置のための）セミプリマブ；ＭＥＤＩ０５６２；ＧＳＫ３１７４９９８；ＰＦ−０４５１８６００；ＣＰ−８７０，８９３；ダセツズムマブ（dacetuzumumab）；ＡＤＣ−１０１３；および（胃または胃食道がんの処置のための）ラムシルマブを含む。
【００２２】
組換えウイルスを調製する方法は、当該技術分野において知られている。手短に言えば、組換えＨＳＶを構築するために、目的の遺伝子を、トランスファープラスミドにクローニングする。このプラスミドを次いで、（ＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子で置き換えられている標的遺伝子を有する）ＨＳＶ−ｌゲノムＤＮＡでウサギ皮膚細胞に共トランスフェクトする。組換えウイルスの子孫を選択し、１００μｇのブロモデオキシウリジン／ｍｌおよび２％ウシ胎仔血清を含む混合物１９９Ｖ補充物を含む培地中で、１４３ＴＫ突然変異体細胞でプラーク精製する。次に、チミジンキナーゼ遺伝子を、ＨＡＴ培地中での、子孫ウイルスＤＮＡとチミジンキナーゼ遺伝子をコードするプラスミドとの共トランスフェクションにより、回復する。ウイルスストックの調製および感染力の力価測定は、Ｖｅｒｏ細胞で行った。
【００２３】
本明細書で例証されるように、野生型または無傷のγ１３４．５タンパク質発現を伴わずに、γ１３４．５タンパク質のＣ末端部分のみを発現する組換えＨＳＶ−１は、免疫活性化を誘発し、γ１３４．５ヌル突然変異体（Δγ１３４．５）に対して不応性である悪性細胞において堅牢に複製し、溶解する。したがって、本発明は、治療的有効量の、野生型または無傷のγ１３４．５タンパク質発現を伴わずに、γ１３４．５タンパク質のＣ末端部分（とりわけ、配列番号２）のみを発現する組換えＨＳＶ−１を、対象、例としてヒトへ投与し、それによって対象のがんを処置することによる、がんを有する対象を処置するための方法を提供する。組換えＨＳＶ−１は、単独の抗がん治療として、または放射線および／または化学治療などの治療的有効量の、第２の抗がん剤と併せて投与され得る。さらに、本方法はまた、本発明の組換えＨＳＶ−１の所望される組織への標的化された投与に好適な標的特異的部分（例として、抗体または細胞マーカー）の使用を含み得る。
【００２４】
本明細書に使用されるとき、用語「処置する」、「処置すること」、「処置」等は、それに関連する疾患または状態および／または症状を排除すること、減少させること、緩和すること、逆転させること、および／または改善すること、この場合において、がんを処置することを指す。本明細書に記載の方法に従って処置され得る固形および非固形腫瘍は、扁平上皮細胞癌を含む、膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頸部のがん；甲状腺を含む癌および皮膚の癌；急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性および慢性骨髄性白血病および前骨髄球性白血病を含む白血病；Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、およびバーキットリンパ腫を含むリンパ腫；線維肉腫および横紋筋肉腫；黒色腫；および神経芽細胞腫、星状細胞腫および神経膠腫を含む。ある態様において、本明細書に記載の方法に従って処置されるがんは、固形腫瘍である。他の態様において、がんは、乳房、肝臓、肺、皮膚（黒色腫）、脳、および結腸がんから選択される。
【００２５】
もっとも除外されていないが、疾患または状態を処置することは、それに関連する疾患、状態、または症状が、完全に排除されることを要求されず、急性または慢性兆候、症状および／または機能不全の処置を含む。「処置する」、「処置すること」、「処置」等は、「予防的処置」を含んでもよく、これは、疾患または状態の再発症、または疾患または状態の再発はしていないが、そのリスクがある、またはその可能性がある対象において、疾患または状態の再発症する可能性、またはすでに制御された疾患または状態の再発の可能性を減少させることを指す。したがって、「処置」はまた、ぶり返しの予防または段階的予防も含む。用語「処置する」および同義語は、そのような処置を必要とする個体に、治療的有効量の本発明の組換えＨＳＶ−１を投与することを企図する。処置は、例えば症状を抑制するために、症候的に適応することができる。処置は、短期間に実施し得、中期的に適応し得、または例えば維持的治療の文脈において長期処置であり得る。
【００２６】
本明細書に使用されるとき、用語「治療的有効量」または「有効な用量」は、投与された場合、それを必要とする個体に、目的の状態または疾患の処置のために、活性成分（単数または複数）を効果的に送達するのに十分である活性成分（単数または複数）の量を指す。がんまたは他の増殖障害の場合において、薬剤の治療的有効量は、望ましくない細胞増殖を減少させ得る（すなわち、ある程度遅延、および好ましくは停止し得る）；がん細胞の数を減少させ得る；腫瘍サイズを減少させ得る；末梢器官へのがん細胞浸潤を阻害し得る（すなわち、ある程度遅延、および好ましくは停止し得る）；腫瘍転移を阻害し得る（すなわち、ある程度遅延、および好ましくは停止し得る）；腫瘍成長をある程度阻害し得る；および／またはがんに関連する１以上の症状をある程度緩和し得る。投与された活性成分（単数または複数）が成長を防止し、および／または既存のがん細胞を死滅させる程度まで、それは細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性であり得る。
【００２７】
そのまま用いられ得る本発明の組換えＨＳＶ−１は、生キャリア細胞を介して、または薬学的に許容し得る賦形剤を含有する医薬組成物に製剤化されて提供される。本明細書に提供される医薬組成物は、固体または液体形態での静脈内投与のために、または静脈内注射のために、特別に製剤化され得る。最適な医薬組成物は、例えば、所期の投与のルート、送達フォーマット、および所望される投薬量に応じて当業者により決定され得る。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (19th edition, 1995)を参照のこと。
【００２８】
組換えＨＳＶ−１は、注射可能な製剤などの従来の全身性剤形に組み込まれ得る。剤形はまた、必要な生理学的に許容し得る担体材料、賦形剤、潤滑剤、緩衝剤、界面活性剤、抗細菌剤、増量剤（マンニトールなど）、抗酸化剤（アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム）または同種のものを含んでもよい。
【００２９】
医薬組成物中の主な担体または賦形剤は、水性または非水性のいずれかの性質であってもよい。例えば、好適な担体または賦形剤は、注射のための水、生理学的な生理食塩水溶液または人工脳脊髄液であってもよく、非経口投与のための組成物に一般的な他の材料で補充されてもよい。血清アルブミンと混合された中性緩衝生理食塩水または生理食塩水は、さらなる例示のビヒクルである。医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み得、それらは、ソルビトールまたはその適切な代替物をさらに含んでもよい。本発明の医薬組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥ケーキまたは水性溶液の形態の最適な製剤（Remington's Pharmaceutical Sciences, Id.）と混合することによって保管のために調製されてもよい。さらに、組換えＨＳＶ−１は、スクロースなどの適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として製剤化されてもよい。
【００３０】
本発明の組換えＨＳＶ−１または医薬組成物の投与ルートは、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内のルートによる注射；持続放出システムによる、または移植デバイスによるものが含まれる。組成物は、ボーラス注射によって、または注入によって継続的に、または移植デバイスによって投与されてもよい。組成物はまた、膜、スポンジ、または所望の分子が吸収またはカプセル化された別の適切な材料の移植を介して局所的に投与することができる。移植デバイスが使用される場合、デバイスは、任意の適切な組織または器官に移植されてもよく、所望の分子の送達は、拡散、徐放性ボーラス、または連続投与を介してもよい。
【００３１】
本発明の組成物は、非経口的に送達され得る。非経口投与が企図される場合、本発明で使用するための治療用組成物は、薬学的に許容し得るビヒクル中に所望の活性成分（単数または複数）を含む、パイロジェンフリーの非経口的に許容し得る水性溶液の形態であってもよい。非経口注射のための具体的に好適なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、活性成分（単数または複数）はその中に滅菌の等張溶液として製剤化され、適切に保存されている。調製物は、活性成分（単数または複数）の制御または持続放出を提供し得る、注射可能なミクロスフェア、生体侵食性粒子、高分子化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸など）、ビーズまたはリポソームなどの薬剤とともに所望の活性成分（単数または複数）の製剤を含み得、それは次いでデポ注射を介して送達されてもよい。ヒアルロン酸を含む製剤は、循環の持続期間を助長する効果を有する。移植可能な薬物送達デバイスは、所望の活性成分（単数または複数）を導入するために用いられてもよい。
【００３２】
本発明はまた、本発明の組換えＨＳＶ−１およびがんの処置に有用な１以上の第２の治療剤を、それを必要とする個体に投与することにより、がんを処置するための方法を含む。組換えＨＳＶ−１および第２の治療剤は、同時にまたは連続して投与され得る。加えて、組換えＨＳＶ−１および第２の治療剤は、単一の組成物または２つの別々の組成物から投与され得る。
【００３３】
第２の治療剤は、その所望される治療的効果を提供するための量で投与される。各第２の治療剤についての有効な投薬量範囲は、当該技術分野において知られており、第２の治療剤は、かかる確立された範囲内でそれを必要とする個体に投与される。
【００３４】
いくつかの態様において、第２の治療剤は、抗体である。好適な抗体は、これらに限定されないが、アテゾリズマブ；アベルマブ；デュルバルマブ；ニボルマブ（抗ＰＤ１）；ペンブロリズマブ（抗ＰＤ１）；ベバシズマブ；ジヌツキシマブ；ペルツズマブ；トラスツズマブ；セツキシマブ；パニツムマブ；ラムシルマブ；アレムツズマブ；ブリナツモマブ；オビヌツズマブ；オファツムマブ；リツキシマブ；ネシツムマブ；イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ４）；ダラツムマブ；エロツズマブ；デノスマブ；オララツムマブ（Olaratumumab）；セミプリマブ；ＭＥＤＩ０５６２（抗ＯＸ４０）、ＧＳＫ３１７４９９８（抗ＯＸ４０）、ＰＦ−０４５１８６００（抗ＯＸ４０）、ＣＰ−８７０，８９３（抗ＣＤ４０）、ダセツズマブ（抗ＣＤ４０）、ＡＤＣ−１０１３（抗ＣＤ４０）、およびラムシルマブを含む。
【００３５】
他の態様において、第２の治療剤は、化学治療剤、放射線治療剤、抗血管新生剤、アポトーシス誘導剤、抗チューブリン薬または腫瘍標的化化学治療剤、放射線治療剤、抗血管新生剤、アポトーシス誘導剤または抗チューブリン薬を含む。例示の第２の治療剤は、これらに限定されないが、アンギオスタチン、エンドスタチン、バスクロスタチン、カンスタチンおよびマスピンなどの抗血管新生剤、およびコルヒチン、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、コンブレタスタチンまたはそれらの誘導体またはプロドラッグなどの抗チューブリン薬を含む。第２の治療剤の他の例は、これらに限定されないが、アルキル化剤、ナイトロジェンマスタード、シクロホスファミド、トロホスファミド、クロラムブシル、ニトロソ尿素、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、スルホン酸アルキル、ブスルファン、トレオスルファン、トリアゼン、植物性アルカロイド、ビンカアルカロイド（ビネリシチン（vineristine）、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、タキソイド、ＤＮＡトポイソメラーゼインヒビター、エピポドフィリン（epipodophyllin）、９−アミノカンプトテシン、カンプトテシン、クリスナトール、マイトマイシン、マイトマイシンＣ、代謝拮抗薬、葉酸代謝拮抗薬、ＤＨＦＲインヒビター、トリメトレキサート、ＩＭＰデヒドロゲナーゼインヒビター、ミコフェノール酸、チアゾフリン、リバビリン、ＥＩＣＡＲ、リボヌクレオチドレダクターゼインヒビター、ヒドロキシ尿素、デフェロキサミン、ピリミジン類似体、ウラシル類似体、フロクスウリジン、ドキシフルリジン、ラチトレキセド（ratitrexed）、シトシン類似体、シタラビン（ａｒａ  Ｃ）、シトシンアラビノシド、フルダラビン、プリン類似体、メルカプトプリン、チオグアニン、ＤＮＡ代謝拮抗薬、３−ＨＰ、２’−デオキシ−５−フルオロウリジン、５−ＨＰ、アルファ−ＴＧＤＲ、アフィジコリングリシナート、ａｒａ−Ｃ、５−アザ−２’デオキシシチジン、ベータ−ＴＧＤＲ、シクロシチジン、グアナゾール（イノシングリコジアルデヒド）、マセベシン（macebecin）ＩＩ、ピラゾロイミダゾール、ホルモン治療、受容体アンタゴニスト、抗エストロゲン、タモキシフェン、ラロキシフェン、メゲストロール、ＬＨＲＨアゴニスト、ゴセレリン、リュープロリドアセタート、抗アンドロゲン薬、フルタミド、ビカルタミド、レチノイド／デルトイド（deltoid）、シス−レチノイン酸、ビタミンＡ誘導体、オールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ−ＩＶ）、ビタミンＤ３類似体、ＣＢ１０９３、ＩＣＨ１０６０、光線力学的治療、ベルテポルフィン、ＢＰＤ−ＭＡ、フタロシアニン、光増感剤Ｐｃ４、デメトキシ−ヒポクレリンＡ（２ＢＡ−２−ＤＭＨＡ）、サイトカイン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子、血管新生インヒビター、アンギオスタチン（プラスミノーゲンフラグメント）、抗血管新生抗トロンビンＵＩ、アンジオザイム、ＡＢＴ−６２７、Ｂａｙ  １２−９５６６、ベネフィン、ＢＭＳ−２７５２９１、軟骨由来インヒビター（ＣＤＩ）、ＣＤ５９補体フラグメント、ＣＥＰ−７０５５、Ｃｏｌ  ３、コンブレタスタチンＡ−４、エンドスタチン（コラーゲンＸＶＩＩＩフラグメント）、フィブロネクチンフラグメント、Ｇｒｏ−ベータ、ハロフギノン、ヘパリナーゼ、ヘパリンヘキササッカライドフラグメント、ＨＭＶ８３３、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ＩＭ−８６２、インターフェロン誘導性タンパク質、インターロイキン−１２、クリングル５（プラスミノーゲンフラグメント）、マリマスタット、メタロプロテイナーゼインヒビター（ＵＭＰ）、２−メトキシエストラジオール、ＭＭＩ２７０（ＣＧＳ  ２７０２３Ａ）、ネオバスタット、ＮＭ−３、パンゼム（panzem）、ＰＩ−８８、胎盤リボヌクレアーゼインヒビター、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター、血小板因子−４（ＰＦ４）、プリノマスタット、プロラクチン１６１、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、レチノイド、ソリマスタット（Solimastat）、スクアラミン、ＳＳ３３０４、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＳＵ１１２４８、テトラヒドロコルチゾール−Ｓ、テトラチオモリブダート、サリドマイド、トロンボスポンジン−ｌ（ＴＳＰ−ｌ）、ＴＮＰ−４７０、形質転換成長因子−ベータ、バスキュロスタチン、バソスタチン（カルレティキュリンフラグメント）、ＺＤ６１２６、ＺＤ６４７４、ファメシルトランスフェラーゼインヒビター（ＦＴＩ）、ビスホスホナート、抗有糸分裂剤、アロコルヒチン、ハリコンドリンＢ、コルヒチン、コルヒチン誘導体、ドルスタチン１０、マイタンシン、リゾキシン、チオコルヒチン、トリチルシステイン、イソプレニル化インヒビター、ドーパミン作動性神経毒、細胞周期インヒビター、スタウロスポリン、アクチノマイシン、アクチノマイシンＤ、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ブレオマイシンＡ２、ブレオマイシンＢ２、ペプロマイシン、アントラサイクリン、アドリアマイシン、エピルビシン、ピラルビシン（pirarnbicin）、ゾルビシン、ミトキサントロン、ＭＤＲインヒビター、ベラパミル、Ｃａ２１Ａ  ＴＰａｓｅインヒビター、およびタプシガルジンを含む。
【００３６】
以下の非限定例は、本発明をさらに例証するために提供される。
【実施例】
【００３７】
例１：材料および方法
細胞およびウイルス。Ｖｅｒｏ、ＨＴ−２９、ＳＷ４８０、Ｃ３２、Ａ３７５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、４Ｔ１、ＨｅｐＧ２およびＡ５４９細胞をAmerican Type Culture Collectionから得た。Ｖｅｒｏ、ＳＷ４８０、Ｃ３２、Ａ３７５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＡ５４９細胞を、１０％ウシ胎児血清で補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。ＨＴ−２９、４Ｔ１およびＨｅｐＧ２細胞を、１０％ウシ胎児血清で補充したＲＰＭＩ１６４０中で増殖させた。ＨＳＶ−１（Ｆ）は、この研究（Ejercito, et al. (1968) J. Gen. Virol. 2:357-364）において用いられているプロトタイプＨＳＶ−１株である。組換えウイルスΔγ１３４．５において、γ１３４．５遺伝子のコーディング領域から１−ｋｂフラグメントを欠失させた（Chou, et al. (1990) Science 250:1262-1266）。ΔＮ１４６においては、アミノ酸１〜１４６をコードするγ１３４．５遺伝子の配列を欠失させた（Ma, et al. (2012) J. Virol. 86:2188-2196）。ＥＵｓ１１においては、γ１３４．５遺伝子を欠失させたが、α−４７プロモーターにより駆動されるＵｓ１１遺伝子を有した（Liu, et al. (2018) J. Virol. 92）。ウイルスストックの調製および感染力の力価測定を、これまでに記載されるように行った（Ma, et al. (2012) J. Virol. 86:2188-2196）。
【００３８】
ウイルス感染。ウイルス感染を、示される感染の多重度において行った（Verpooten, et al. (2009) J. Biol. Chem. 284:1097-1105）。細胞を次いで回収し、免疫ブロット、リアルタイムＰＣＲ分析またはウイルス成長分析のために処理した（Ma, et al. (2012) J. Virol. 86:2188-96; Wu, et al. (2016) J. Virol. 90:10414-22）。細胞生存率を製造者のプロトコルに従って、CELLTITER-GLO（登録商標）Luminescent Cell Viability Assay（Promega）により決定した。インターフェロンアッセイについて、２０時間、ＶｅｒｏおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をヒトインターフェロン−α（Sigma）で未処置または処置し、４Ｔ１細胞をマウスインターフェロン−α（Sigma）で処置した。細胞を、次いでウイルスで感染させ、ウイルスの収量を感染の４８時間後に決定した。
【００３９】
免疫ブロット分析およびＥＬＩＳＡ。細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、氷上で、氷冷緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．０％Triton（商標）Ｘ−１００、およびプロテアーゼインヒビターカクテル）で溶解した。遠心分離後、上清を崩壊緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー、１０％グリセロール、および１００ｎＭ  β−メルカプトエタノール）と混合し、煮沸した。試料を次いで変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動に供し、ニトロセルロース膜に転写し、ｇＣ（Jing, et al. (2004) J. Virol. 78:7653-66）、γ１３４．５（Cheng, et al. (2002) J. Virol. 76:9434-45）、ＩＣＰ２７（Virusys Inc.）、ＩＣＰ０（Santa Cruz）、ｅＩＦ−２α（Cell Signaling Technology, Inc.）、リン酸化されたｅＩＦ−２α（Cell Signaling Technology, Inc.）、ＩＲＦ３（Cell Signaling Technology, Inc.）、リン酸化されたＩＲＦ３（Cell Signaling Technology, Inc.）およびβ−アクチン（Sigma）に対する抗体と反応させた。膜をＰＢＳ中でリンスし、西洋ワサビペルオキシダーゼと抱合されたロバ抗ウサギまたは抗マウス免疫グロブリンのいずれかと反応させ、増強された化学発光ウェスタンブロット検出システムキット（Amersham Pharmacia Biotechnology, Inc.）で現像した。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行うために、細胞培養の上清を収集し、製造者（R&D Systems）の指示に従って、ＩＦＮ−αおよびＣｘｃｌ９を分析した。
【００４０】
トランスクリプトーム分析。４Ｔ１細胞の単層をモック感染、またはウイルス（５ｐｆｕ／細胞）で感染させた。感染の６時間後、RNase plus mini kit（Qiagen）を用いて細胞からＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅ  Ｉ（New England BioLabs）で処置した。二重のＲＮＡ試料を、シカゴにあるイリノイ大学のゲノム調査のためのセンターによって、Clariom（商標）S Affymetrix arrayを用いて処理した。Clariom（商標）S Mouse Arrayから生成された生データを、パッケージOligoを用いてＲ中で処理した。各ＣＥＬファイルからの特色強度値を、デフォルト設定のRobust Multi-array Average（ＲＭＡ）を用いて正規化された発現値に変換した。すべての陽性および陰性対照プローブをAffymetrix report genes（ＲＰＴＲ）と一緒に、下流分析を実施する前に除去した。ＰＣＡ（主成分分析）プロットを、何らかのバッチ効果を確認するために生成した。遺伝子発現変動分析をlimmaパッケージを用いて実施した。有意に発現した遺伝子を、＜０．０５の調整済みｐ値でフィルターした。ヒートマップを、Ｒパッケージ「pheatmap」v1.0.8を用いて一次データ（正規化された発現値）から生産した。
【００４１】
定量リアルタイムＰＣＲアッセイ。細胞をモック感染、またはウイルスで感染させた。感染の６時間後、RNase plus mini kit（Qiagen）を用いて細胞から全ＲＮＡを回収し、ＤＮａｓｅ  Ｉ消化（New England BioLabs）に供した。ｃＤＮＡをhigh capacity cDNA reverse transcription kit（Applied Biosystems）を用いて合成した。定量リアルタイムＰＣＲを、ABI SYBR（登録商標）green master mix（Applied Biosystems）を用いてApplied Biosystems ABI Prism 7900HT装置を用いて実施した。遺伝子発現レベルを内在対照１８Ｓ  ｒＲＮＡに対して正規化した。相対的な遺伝子発現を２−ΔΔＣＴ法（Schmittgen & Livak (2008) Nat. Protoc. 3:1101-8）により決定した。各遺伝子についてのプライマーをqPrimerDepotデータベースの推奨に従って選択した。プライマー配列を表１に提供する。
【表１】
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【００４２】
マウス研究。５週齢のマウスＢＡＬＢ／ｃマウスをHarlan Sprague Dawley Inc.から購入し、バイオセーフティーレベル２の封じ込めにおいて、特定の病原体フリーの状態下で飼育した。すべての動物を含む実験手順は、シカゴにあるイリノイ大学のthe institutional animal care and use committeeにより承認を受けた。６週齢において、０．１ｍｌのＰＢＳに懸濁した１ｘ１０５の生存能力のある４Ｔ１細胞をマウスの右脇腹の皮下に接種した（−７日目）。８日後に腫瘍がおよそ１００ｍｍ３の体積に達すると、１日目、３日目および６日目のΔγ１３４．５、ΔＮ１４６またはＰＢＳの腫瘍内注射のために、マウスを無作為に３つの群に分けた。０．１ｍｌの体積中、合計１ｘ１０７ＰＦＵのウイルスまたはＰＢＳを、各腫瘍にゆっくりと注射した。腫瘍成長を、デジタル測径器で２つの垂直な腫瘍直径を測定することにより１日おきにモニタリングした。以下の式：体積＝（長さ×幅×高さ）／２を用いて腫瘍体積を計算した。腫瘍接種の２４日後、マウスをＣＯ２吸入により安楽死させた。
【００４３】
組織分析。最後の腫瘍内注射後の選択される日に、各処置群から６匹のマウスを屠殺し、腫瘍、肺、肝臓、脾臓および血液を収集した。ウイルスのロードを測定するために、試料を細かく刻み、均質化し、ビーズビートし（bead-beat）、３回凍結融解し、ＤＭＥＭ中で超音波処理した。遠心分離後、腫瘍上清をプラークアッセイに使用した。肺、肝臓、脾臓および血液からの上清は定量リアルタイムＰＣＲアッセイに用いた。手短に言えば、上清を１％ＳＤＳ、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、および１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する緩衝液に懸濁した。３７℃でのプロテイナーゼＫ（５０μｇ／ｍｌ）とのインキュベーション後、ウイルスＤＮＡを抽出し、ＨＳＶ−１  ｇＤ特異的プライマー：ＴＡＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＧＣＴＴＧ（配列番号２１）およびＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＡＣＴＴＧＴＴＧＴＡ（配列番号２２）を用いて、リアルタイムＰＣＲにより定量した。
【００４４】
転移形成アッセイについて、マウスから肺を取り出し、ホルマリン中で固定化した。肺転移の数を光学顕微鏡下で計測することにより定量した。
【００４５】
免疫組織化学分析。組織切片を処理し、ＨＳＶ−１抗原をＨＳＶ−１に対する抗体（Dako）により検出した。ＣＤ４（Cell Signaling Technology, Inc.）およびＣＤ８（Cell Signaling Technology, Inc.）抗体を製造者のプロトコルに従って使用した。色素原としてビオチン化抗ウサギ免疫グロブリン二次抗体、アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ、ならびに０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および０．０２５％Ｈ２Ｏ２中３，３’−ジアミノベンジジンテトラ塩酸塩（０．０４％）（Ventana Medical Systems, Tucson, AZ）の添加の前に、試料を一次抗体とインキュベートした。
【００４６】
例２：腫瘍細胞におけるΔＮ１４６突然変異体複製
アミノ酸１４７〜２６３のみを含むＨＳＶ  γ１３４．５突然変異体（ΔＮ１４６）は、正常な細胞または組織中のウイルスの成長を実質的に損なわせることが示されている（Ma, et al. (2012) J. Virol. 86:2188-2196; Ma, et al (2017) Sci. Rep. 7:41461; Pan, et al (2018) J. Virol. 92:e01015-18）。悪性細胞中のこの突然変異体の活性を決定するために、ウイルスの複製を評価した。この分析は、４Ｔ１（マウス乳房癌）細胞において、野生−＋型ＨＳＶ−１が１ｘ１０７ｐｆｕ／ｍｌまで増幅した一方で、γ１３４．５ヌル突然変異体（Δγ１３４．５）は、１ｘ１０３ｐｆｕ／ｍｌにのみ達したことを示す。しかしながら、ΔＮ１４６は、１ｘ１０６ｐｆｕ／ｍｌまで成長し、堅牢な複製を示した。同様の傾向は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト乳房腺癌）細胞においても観察され、ΔＮ１４６は、Δγ１３４．５よりも１００倍増幅した。その上、これらの表現型は、ヒトＨＴ２９（結腸）、ＳＷ４８０（結腸）、ＨｅｐＧ２（肝臓）、Ｃ３２（黒色腫）、Ａ３７５（黒色腫）およびＡ５４９（肺）を含む広範な他の腫瘍細胞において再現された。
【００４７】
続いて、ウイルス成長の速度論を調査した。ＨＳＶ−１は、感染が進行するにつれて、４Ｔ１細胞野生型中で着実に成長し、感染の７２時間後、力価は、１ｘ１０７ｐｆｕ／ｍｌまで増加した。ΔＮ１４６は、わずかに低いレベルではあるが、１ｘ１０６ｐｆｕまで複製され、Δγ１３４．５はほとんど複製されず、感染全体で１ｘ１０３ｐｆｕ／ｍｌの力価であった。同様の傾向はＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞で観察され、ΔＮ１４６はΔγ１３４．５よりも１００倍複製された。ウイルスの細胞溶解活性を評価するために、細胞の生存率を測定した。この分析は、野生型ウイルスと同様に、ΔＮ１４６が７２時間までに４Ｔ１細胞のほとんど９５％を溶解し、反応速度がわずかに遅れたのに対し、Δγ１３４．５はおよそ４０％の細胞を破壊したことを示した。このような効果は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞においても反映された。総合すると、これらの結果は、ΔＮ１４６がγ１３４．５ヌル突然変異体よりもより効果的に腫瘍細胞内で複製され、腫瘍細胞を溶解することを示す。
【００４８】
例３：γ１３４．５のＣ末端部分の発現はｅＩＦ２αリン酸化を阻害する
ＨＳＶ感染は、α、β、およびγ遺伝子の逐次的な発現を伴って、一時的な様式で進行する。ウイルスＤＮＡ複製の開始は、γ１３４．５の非存在下でタンパク質合成の停止を引き起こす（Chou & Roizman (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3266-70）。代表的なタンパク質ＩＣＰ２７（αタンパク質）およびｇＣ（γタンパク質）の発現はウイルスＤＮＡ複製に依存しているので、ΔＮ１４６の影響を評価するために、これらのタンパク質の発現を測定した。細胞をモック感染またはＨＳＶ−１、Δγ１３４．５、またはΔＮ１４６ウイルスに感染させ、感染の１２時間後、試料をウェスタンブロット分析に供した。この分析は、野生型ウイルスが、感染した４Ｔ１およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞においてＩＣＰ２７とｇＣの両方を発現したことを示した。もっともΔγ１３４．５はＩＣＰ２７を発現したが、４Ｔ１またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のいずれにおいてｇＣはほとんど検出できなかった。これらの同じ条件下で、ΔＮ１４６は野生型ＨＳＶ−１と同等のレベルのＩＣＰ２７およびｇＣを発現し、これは、ウイルスのＤＮＡ複製によって開始される翻訳停止をブロックする能力を示す。
【００４９】
ｅＩＦ２αのリン酸化はタンパク質合成と結びついているので、ストレスキナーゼＰＫＲ、ＰＥＲＫまたはＧＣＮ２によるｅＩＦ２αのリン酸化を４Ｔ１およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞においてモニタリングした。この分析は、ｅＩＦ２αの発現がモック感染した、またはウイルスに感染した腫瘍細胞で同等であることを示した。興味深いことに、リン酸化されたｅＩＦ２αは、おそらく発癌性ストレスに起因して、モック感染細胞中に存在していた。もっとも野生型ＨＳＶ−１はｅＩＦ２αリン酸化を排除したが、Δγ１３４．５はそれを悪化させ、ΔＮ１４６は４Ｔ１およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞におけるｅＩＦ２αリン酸化を完全に無効にした。したがって、γ１３４．５のＣ末端部分にまたがる領域は、腫瘍細胞におけるｅＩＦ２αリン酸化を阻害するのに充分であった。
【００５０】
例４：ΔＮ１４６は、腫瘍細胞におけるインターフェロン応答を刺激する
ウイルス感染に対する腫瘍細胞応答を評価するために、４Ｔ１細胞におけるトランスクリプトーム分析を行った。多様な細胞経路における多数の遺伝子が、モック感染およびウイルスに感染した４Ｔ１細胞において差次的に発現したことが観察された。注目すべきことに、先天性免疫経路における多くの遺伝子は、ΔＮ１４６に応答して明確に上方調節された。試験された４６の遺伝子のうち、ほとんどは、モック感染または野生型ウイルスに感染した細胞において変化しないままか、わずかに発現した。しかしながら、それらは、程度は異なるものの、Δγ１３４．５に感染した細胞で上方調節された。注目すべきことに、遺伝子誘導はΔＮ１４６に感染した細胞でより顕著であり、これは、ΔＮ１４６が炎症応答を刺激する傾向があることを示している。
【００５１】
これらの結果を確認するために、選択されたサイトカインおよびインターフェロン刺激遺伝子の発現を、リアルタイムＰＣＲによって決定した。予想どおり、野生型ウイルスはＩＦＮ−α１、ＩＦＩＴ１、Ｃｃｌ５、およびＣｘｃｌ９の発現をほとんど引き起こさなかった一方で、Δγ１３４．５またはΔＮ１４６はこれらの遺伝子を急激に誘導した。これは、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるサイトカイン産生のレベルによって裏付けられた。分子的な基盤を検討するために、免疫応答を活性化するインターフェロン調節因子（ＩＲＦ３）を分析した。ＩＲＦ３は、モック感染または野生型ＨＳＶ−１に感染した４Ｔ１細胞においてリン酸化されていなかった。対照的に、それは、Δγ１３４．５またはΔＮ１４６に感染した細胞においてリン酸化され始めた。これは、ＩＣＰ０およびＩＣＰ２７の正常な発現によって示されるように、ウイルス感染力の違いに起因するものではなかった。これらの結果は複数の実験で確認され、表現型はヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞においても見られた。Δγ１３４．５と同様に、ΔＮ１４６は悪性細胞の感染時に免疫刺激性であると結論付けられた。
【００５２】
例５：ΔＮ１４６はＩＦＮに耐性である
Ｉ型ＩＦＮは、腫瘍に対する免疫を準備刺激するために必要である。他方、それは抗ウイルス応答を媒介する。ΔＮ１４６がＩＦＮによるクリアランスに不応であるかどうかを決定するために、ウイルス成長を調べた。概念を実証するものとして、ＩＦＮに対するウイルス応答は、ＩＦＮ−α／β遺伝子を欠くＶｅｒｏ細胞で最初に決定された。ＩＦＮ−αによる処置はＨＳＶ−１（Ｆ）の複製にほとんど影響を与えなかったが、Δγ１３４．５の複製を大幅に、およそ１０００倍低減させた。しかしながら、ＩＦＮ−αはΔＮ１４６の複製を適度に減少させただけであった。さらにまた、４Ｔ１およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞で試験した場合、同様の傾向が観察された。ＩＦＮ−αは一般にウイルス複製を低減させる一方で、野生型ＨＳＶ−１またはΔＮ１４６への効果は小さかった。実際、ΔＮ１４６は、外因性ＩＦＮ−αの存在下で、Δγ１３４．５よりも５００〜１０００倍一貫して複製した。よって、γ１３４．５のアミノ酸１４７〜２６３は、ＩＦＮに対するウイルス耐性を付与するのに充分である。
【００５３】
例６：ΔＮ１４６はin vivoで原発腫瘍成長および転移を低減させる
実施例２〜５に提示された結果に照らして、複製および炎症を活性化するΔＮ１４６の能力は、in vivoで腫瘍破壊を増大させると仮定された。これを実証するために、自発的に転移する攻撃的な４Ｔ１乳がんが選択され、プロセスはヒト乳腺腫瘍に似ていた。比較のために、Δγ１３４．５もまたＨＳＶ１７１６に類似していた（Rampling, et al. (2000) Gene Ther. 7:859-866; Streby, et al. (2017) Clin. Cancer Res. 23:3566-3574）。加えて、組換えＨＳＶ  ＥＵｓ１１（Liu, et al. (2018) J. Virol. 92）はタリモジェンラヘルパレプベックの腫瘍溶解性バックボーンと構造的に同等であるため（Liu、et al. (2003) GeneTher. 10: 292-303）、このウイルスが含まれる。マウスの脇腹の皮下に確立された腫瘍に、１、３、および６日目にＰＢＳ、Δγ１３４．５、ΔＮ１４６、またはＥＵｓ１１（１ｘ１０７ｐｆｕ）を３回注射した。次いで、腫瘍サイズをモニタリングした。図１に例証するように、ＰＢＳで処置された対照腫瘍は期間にわたり速い速度で成長した。γ１３４．５ヌルウイルスによる処置は、局所腫瘍成長をわずかに低減させた。しかしながら、ΔＮ１４６またはＥＵｓ１１での腫瘍内接種は、腫瘍成長を著しく遅らせ、処置が進むにつれて腫瘍サイズの低減はより明らかになった。２４日目に、ΔＮ１４６およびＥＵｓ１１は、モック対照またはΔγ１３４．５と比較して腫瘍サイズをほぼ４５％低減させた。ゆえに、ＥＵｓ１１に匹敵する一方で、ΔＮ１４６はΔγ１３４．５と比較した場合に原発腫瘍に対して優れた活性を示した。
【００５４】
転移に対するウイルスの影響を評価するために、肺腫瘍形成を２４日目に分析した。図２は、顕微鏡分析によって測定されるように、肺転移が対照マウスにおいて容易に検出可能であり、動物あたり平均２５個の結節を有することを示す。Δγ１３４．５またはＥＵｓ１１による処置は発生率を低減させ、動物あたり平均１５個の結節を有した。注目すべきことに、ΔＮ１４６は、転移性のバーデン（burden）をさらに低減させ、平均１０個の結節を有した。これらの結果は、Δγ１３４．５ウイルスが肺転移を低減させることを示す；しかしながら、ΔＮ１４６は、より顕著な効果を発揮した。
【００５５】
例７：ΔＮ１４６は原発腫瘍において複製するが正常組織においては複製しない
ウイルスの複製を評価するために、９日目に収集された原発腫瘍中のウイルス収量を決定した。この分析は、プラークアッセイによって測定されるように、Δγ１３４．５が１ｘ１０２ｐｆｕ／ｇ腫瘍組織の平均力価で複製されることを示した（図３）。他方、ＥＵｓ１１は７ｘ１０３ｐｆｕ／ｇ腫瘍組織の平均力価で成長した。同様に、ΔＮ１４６は５ｘ１０３ｐｆｕ／ｇ腫瘍組織の平均力価で成長した。明らかなように、ＥＵｓ１１と同様に、ΔＮ１４６はΔγ１３４．５よりも５０倍多く複製された。これを踏まえると、ウイルス抗原は腫瘍床の薄片で検出され、ΔＮ１４６およびＥＵｓ１１はΔγ１３４．５よりも広範囲に広がった。これは、腫瘍組織の壊死の程度と相関していた。
【００５６】
ウイルスが正常組織に広がるかどうかを測定するために、Δγ１３４．５、ΔＮ１４６、およびＥＵｓ１１が肺、血液、肝臓、および脾臓に存在するかどうかをｑＰＣＲアッセイによって決定した。この分析は、９日目にこれらの組織でウイルスが検出可能でなかったことを示したが、それらは腫瘍中で容易に見出された。これらの結果は、Δγ１３４．５またはＥＵｓ１１の結果と同様に、ΔＮ１４６の複製がin vivoで腫瘍組織に限定されることを示す。
【００５７】
ウイルス複製が実際に腫瘍において活発に生じることを確認するために、４Ｔ１原発腫瘍の三重の治療を実施し、７、９、および１５日目のウイルス収量を測定した。この分析は、プラークアッセイにより、７日目にウイルスが約２ｘ１０２ｐｆｕ／ｇ腫瘍組織で検出可能であったことを示した。処置が進むにつれて、Δγ１３４．５の量は最初は変化しないままであり、次いで１５日目までに１ｘ１０ｐｆｕ／ｇ腫瘍組織に減少した。しかしながら、これらの同じ条件下で、ΔＮ１４６のレベルは９日目に１ｘ１０４ｐｆｕ／ｇ腫瘍組織に増大し、それに続いて１５日目までに１ｘ１０３ｐｆｕ／ｇ腫瘍組織に減少した。ＥＵｓ１１は同様の成長パターンを示した。したがって、Δγ１３４．５とは異なり、ΔＮ１４６およびＥＵｓ１１はin vivoにおいて腫瘍内で複製することができる。
【００５８】
実施例８：ΔＮ１４６はＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の原発腫瘍への浸潤を誘導する
先の証拠は、γ１３４．５の欠失を伴う腫瘍溶解性ＨＳＶが全身性抗腫瘍免疫を活性化することを示唆している（Thomas & Fraser (2003) Mol. Ther. 8:543-51; Toda, et al. (1999) Hum. Gene Ther. 10:385-93）。腫瘍内ウイルス注射は局所腫瘍成長と転移形成の両方を低減したので、適応免疫の誘導が存在したかどうかが決定された。そのため、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は免疫組織化学分析によって評価された。２４日目に収集された原発腫瘍を薄片にし、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の存在について染色した。モック感染腫瘍において、いくらかのＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞（＜４％）が検出可能であった。しかしながら、Δγ１３４．５で処置された腫瘍においては、ＣＤ４＋Ｔ細胞は１２％に、ＣＤ８＋Ｔ細胞は７％に上昇した。同様に、ΔＮ１４６はＣＤ４＋細胞の１５％およびＣＤ８＋Ｔ細胞の８％を占めた。ＥＵｓ１１は免疫細胞浸潤を引き起こしたが、観察された効果はＣＤ４＋（１０％）とＣＤ８＋Ｔ細胞（５％）の両方で低減した。これらの結果は、Δγ１３４．５と同様に、ΔＮ１４６がＴ細胞浸潤を誘導するのに対し、ＥＵｓ１１はこのプロセスを弱めるように見えることを示す。
【００５９】
例９：ΔＮ１４６とＥＵｓ１１は腫瘍細胞と差次的に相互作用する
ΔＮ１４６とＥＵｓ１１が腫瘍細胞と差次的に相互作用するかどうかを決定するために、in vitro分析を実施した。図４に示すように、ΔＮ１４６感染はＩＦＮ−α１およびｃｘｃｌ９遺伝子の転写を刺激した。対照的に、ＥＵｓ１１は遺伝子発現を抑制した。これは、ＥＬＩＳＡによって測定されたサイトカイン産生のレベルと一致していた。一貫して、ΔＮ１４６はＩＲＦ３のリン酸化を刺激した一方で、ＥＵｓ１１は刺激せず、これは、ＥＵｓ１１がウイルス感染時の免疫抑制を媒介することを示唆する。
【００６０】
腫瘍細胞を破壊するウイルスの能力を評価するために、細胞生存率を測定した。この分析は、ＥＵＳ１１と同様に、ΔＮ１４６は７２時間までに４Ｔ１細胞のほとんど９５％を溶解したことを示した。よって、ΔＮ１４６とＥＵｓ１１の両方が腫瘍細胞を効果的に溶解した。さらに、ＩＦＮ処理の有無にかかわらず４Ｔ１細胞におけるウイルス複製は決定された。この分析は、ＩＦＮ−αの非存在下で、ΔＮ１４６とＥＵｓ１１の両方が効果的に複製され、力価が約１ｘ１０６ｐｆｕ／ｍｌに達することを示した。外因性ＩＦＮ−αの添加は、ΔＮ１４６およびＥＵｓ１１のウイルス複製を適度に低減させ、力価は５ｘ１０４ｐｆｕ／ｍｌであり、これはＩ型ＩＦＮに対して同等に耐性であることを示唆する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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