(57)【要約】【課題】  本開示の実施形態には、Ｔ細胞療法の改善に関連する方法および組成物が含まれる。【解決手段】  本開示の実施形態には、Ｔ細胞療法の改善に関連する方法および組成物が含まれる。特定の実施形態において、遺伝子組換えＥ０８αβ共受容体がＣＤ８＋Ｔ細胞において発現すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞療法が増強される。ある特定の実施形態において、遺伝子組換えＥ０８αβ共受容体がＣＤ４＋Ｔ細胞において発現すると、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、養子移入のための細胞傷害性細胞機能を有するようになる。具体的な実施形態において、ＴＣＲを発現し、かつＥ０８αβ共受容体を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞が、養子移入において利用される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体のための免疫エフェクター細胞療法を増強する方法であって、下記の細胞：
外因性のＣＤ８αβ共受容体を発現し、かつ任意に１つまたは複数の外因性の操作された抗原受容体を発現するＣＤ８＋細胞、および
外因性のＣＤ８αβ共受容体と１つまたは複数の外因性の操作された抗原受容体とを発現するＣＤ４＋細胞
の一方または両方の効果的な量を当該個体に与える工程を含む方法。
【請求項２】
前記操作された抗原受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの両方である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、またはそれらの両方が前記個体に関して自家である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、またはそれらの両方が前記個体に関して同種である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記外因性の操作された抗原受容体と、前記外因性のＣＤ８αβ共受容体とが、同じベクターから細胞において発現する、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ベクターが、前記外因性の操作された抗原受容体と、前記外因性のＣＤ８αβ共受容体とを別々に発現する１つまたは複数の発現構築物を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記外因性の操作された抗原受容体を発現する前記発現構築物と、前記外因性のＣＤ８αβ共受容体を発現する前記発現構築物とが、２ＡエレメントまたはＩＲＥＳエレメントによって隔てられる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記外因性の操作された抗原受容体と、前記外因性のＣＤ８αβ共受容体とが、異なるベクターから細胞において発現する、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ベクターがウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍抗原が、サバイビン、ＰＲＡＭＥ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ鎖または軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ  ｖＩＩＩ、ガン胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体ｃｃ２、ＩＬ−１１受容体Ｒａ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ルイスＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａｌ、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−ａ、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＨＥＲ２、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４ｖ６およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
効果的な量の前記ＣＤ４＋Ｔ細胞、前記ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそれらの混合物を前記個体に与える工程をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
さらなるガン療法を前記個体に施す工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞傷害性エフェクター細胞機能と、ヘルパー機能とを有するＣＤ４＋Ｔ細胞を作製する方法であって、当該ＣＤ４＋Ｔ細胞を外因性のＣＤ８αβ共受容体および外因性の操作された抗原受容体によりトランスフェクションする工程を含む方法。
【請求項１６】
前記操作された抗原受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの両方である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記外因性の操作された抗原受容体と、前記外因性のＣＤ８αβ共受容体とが、同じベクターから細胞において発現する、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ベクターが、前記外因性の操作された抗原受容体と、前記外因性のＣＤ８αβ共受容体とを別々に発現する１つまたは複数の発現構築物を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記外因性の操作された抗原受容体を発現する前記発現構築物と、前記外因性のＣＤ８αβ共受容体を発現する前記発現構築物とが、２ＡエレメントまたはＩＲＥＳエレメントによって隔てられる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記外因性の操作された抗原受容体と、前記外因性のＣＤ８αβ共受容体とが、異なるベクターから細胞において発現する、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記ベクターがウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記腫瘍抗原が、サバイビン、ＰＲＡＭＥ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ鎖または軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ  ｖＩＩＩ、ガン胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体ｃｃ２、ＩＬ−１１受容体Ｒａ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ルイスＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａｌ、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−ａ、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＨＥＲ２、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４ｖ６およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
効果的な量の前記ＣＤ４＋Ｔ細胞を前記個体に対して、その必要性のある個体に対して与える工程をさらに含む、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記個体がガンを有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
外因性のＣＤ８αβ共受容体、外因性の操作された抗原受容体、またはそれらの両方を発現する効果的な量のＣＤ８＋Ｔ細胞が前記個体に与えられる、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
さらなるガン療法を前記個体に施す工程をさらに含む、請求項２５、２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性を増強する方法であって、当該ＣＤ８＋Ｔ細胞を外因性のＣＤ８αβ共受容体によりトランスフェクションする工程を含む方法。
【請求項３０】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞がまた、外因性の操作された抗原受容体を発現する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記操作された抗原受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの両方である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記外因性の操作された抗原受容体と、前記外因性のＣＤ８αβ共受容体とが、同じベクターから細胞において発現する、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ベクターが、前記外因性の操作された抗原受容体と、前記外因性のＣＤ８αβ共受容体とを別々に発現する１つまたは複数の発現構築物を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記外因性の操作された抗原受容体を発現する前記発現構築物と、前記外因性のＣＤ８αβ共受容体を発現する前記発現構築物とが、２ＡエレメントまたはＩＲＥＳエレメントによって隔てられる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記外因性の操作された抗原受容体と、前記外因性のＣＤ８αβ共受容体とが、異なるベクターから細胞において発現する、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記ベクターがウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記腫瘍抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ鎖または軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ  ｖＩＩＩ、ガン胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体ｃｃ２、ＩＬ−１１受容体Ｒａ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ルイスＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａｌ、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−ａ、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＨＥＲ２、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４ｖ６およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
効果的な量の前記ＣＤ８＋Ｔ細胞を前記個体に対して、その必要性のある個体に対して与える工程をさらに含む、請求項２９〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
効果的な量のＣＤ４＋Ｔ細胞を前記個体に対して、その必要性のある個体に対して与える工程をさらに含む、請求項２９〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、外因性のＣＤ８αβ共受容体、外因性の操作された抗原受容体、またはそれらの両方を発現するように操作される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記個体がガンを有する、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
さらなるガン療法を前記個体に施す工程をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＣＤ８αβ共受容体を遺伝子組換えにより発現するＣＤ４＋Ｔ細胞を含む組成物。
【請求項４６】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞がまた、１つまたは複数の外因性の操作された抗原受容体を遺伝子組換えにより発現する、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記操作された抗原受容体が、ＴＣＲ、ＣＡＲ、またはそれらの両方である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
ＣＤ８＋Ｔ細胞をさらに含む、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＣＤ８αβ共受容体、１つまたは複数の外因性の操作された抗原受容体、あるいはそれらの両方を遺伝子組換えにより発現する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
ＣＤ８αβ共受容体と、任意に１つまたは複数の外因性の操作された抗原受容体とを遺伝子組換えにより発現するＣＤ８＋Ｔ細胞を含む組成物。
【請求項５１】
前記操作された抗原受容体が、ＴＣＲ、ＣＡＲ、またはそれらの両方である、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
ＣＤ４＋Ｔ細胞をさらに含む、請求項５０または５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＤ８αβ共受容体、１つまたは複数の外因性の操作された抗原受容体、あるいはそれらの両方を遺伝子組換えにより発現する、請求項５２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮特許出願第６２／６５９，９７１号（２０１９年４月１９日出願；これはその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）の優先権を主張する。
本開示の様々な実施形態が少なくとも、免疫学、細胞生物学、生物学、分子生物学、細胞療法、およびガン医学を少なくとも含む医学の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液学的悪性腫瘍（例えば、多発性骨髄腫など）のためのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）操作養子Ｔ細胞療法が有望な結果をもたらしている１。しかしながら、腫瘍関連の自己抗原を標的とするほとんどのＴＣＲが、自家レパートリーから単離されたものであり、低い機能的アビディティーを有する；これは、高親和性ＴＣＲを有するＴ細胞の大部分が胸腺選択の期間中に排除され、生き残ったクローンが、自己免疫疾患を回避するために末梢での微調整を受けるからである２、３。この適度な結合親和性により、ＴＣＲ遺伝子組換えＴ細胞が悪性細胞表面での低レベルの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識する能力が制限されることがある。この制限を克服するための戦略には、同種レパートリーからの高親和性ＴＣＲの単離４、または高親和性の合成ＴＣＲの作製および選択５、６が含まれる。そのような戦略は好成績をもたらし得る１、５、６が、潜在的には致死的であるオフターゲット影響を伴う深刻な望ましくない交差反応性を生じさせ得る７〜９。したがって、本発明者らは現在、代替アプローチについて研究を行っている。ＴＡＡに由来するエピトープを標的とするほとんどのＴＣＲがＨＬＡクラスＩ制限であり、生理学的条件のもとでは、ＣＤ８αβ共受容体が、ＨＬＡクラスＩ制限ＴＣＲを発現するＴ細胞の機能的アビディティーを増大させている１０、１１。ＣＤ８  Ｔ細胞においては、内因性共受容体の利用可能性が制限されることで、その完全かつ持続した活性化が、導入されたＴＣＲと内因性ＣＤ８との間でのコピー数の不均衡のために妨げられることがある。ウイルスベクターにより操作されたＴ細胞は超生理学的なコピー数の導入された導入遺伝子を発現し１２、一方で、ＣＤ８共受容体が生理学的レベルで発現される。遺伝子組換えＴＣＲと一緒でのＣＤ８αβ共受容体の強制発現により、全体的なＴＣＲ＋Ｔ細胞：標的細胞の相互作用が増大させられ、その結果、増大した抗腫瘍機能がもたらされることが、本明細書中において示される。
【０００３】
ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との間での相互作用が、効果的な免疫応答を調整するために極めて重要である１３。したがって、遺伝子組換えのＨＬＡクラスＩ制限ＴＣＲを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ８αβ共受容体の発現を強制することの結果が明らかにされた。ＣＤ４＋Ｔ細胞はウイルス感染症に対する抗原特異的免疫に多面的に寄与しており、長期腫瘍抑制の開始および維持において不可欠である１４。例えば、骨髄移植後の感染を処置するためのサイトメガロウイルス特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの注入はウイルス血症を抑制しており、しかし、追加のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞が存在する場合にのみ、これらの移入されたＣＤ８＋Ｔ細胞が持続する１５。腫瘍が標的となるＴ細胞療法が使用されるとき、類似する重要性が、ＣＤ４＋Ｔ細胞に起因している。例えば、転移性胆管ガン患者からのネオ抗原反応性の腫瘍浸潤リンパ球はほとんどがＣＤ４＋ＴＨ１区画に含まれ、これらの細胞の養子移入は腫瘍の退縮をもたらした１６。ＣＤ１９が標的となるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の抗腫瘍活性の相乗的増強が、定義されたＣＤ４：ＣＤ８比を有するＣＡＲ  Ｔ細胞を使用してバーキットリンパ腫異種移植マウスモデルにおいて報告されており１７、一方で、最終製造物における１：１のＣＤ４：ＣＤ８  ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞比によるリンパ腫患者のための臨床試験では、ＣＤ４＋サブセットおよびＣＤ８＋サブセットの両方のＴ細胞の拡大および持続が伴って、高い腫瘍応答率がもたらされ１８、このことは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方の腫瘍特異的Ｔ細胞が悪性腫瘍抑制のために最適であることを示していた。
【０００４】
これらの結果は、（１）ＴＣＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能がＣＤ８共受容体の増大した利用可能性により増強され得ること、および（２）ＣＤ８αβと、遺伝子組換えのＭＨＣクラスＩ制限ＴＡＡ特異的ＴＣＲとの両方が強制発現させられるＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＴＨ細胞のヘルパー機能を維持しながら、多機能なハイブリッド型の細胞傷害性エフェクター細胞に再プログラミングされることを示している。これらのハイブリッド細胞は、ＴＣＲ−ペプチド−ＭＨＣ複合体の増大した安定性と、ＴＣＲシグナル伝達とに伴って、インビトロおよびインビボにおける増強された抗腫瘍機能を、軽減された機能的消耗および改善された発現とともに有する。
【０００５】
したがって、本開示は、共受容体に依存しているＴＣＲ遺伝子組換えのＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を増強し、かつ、養子移入のための細胞傷害機能およびヘルパー機能の両方を有するハイブリッドＣＤ４＋Ｔ細胞の使用を可能にするためのアプローチを提供することによって、養子移入の分野における必要性に対処している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｒａｐｏｐｏｒｔ  ＡＰ，Ｓｔａｄｔｍａｕｅｒ  ＥＡ，Ｂｉｎｄｅｒ−Ｓｃｈｏｌｌ  ＧＫ，ｅｔ  ａｌ．ＮＹ−ＥＳＯ−１−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＴＣＲ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｍａ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１５；２１（８）：９１４−９２１
【非特許文献２】Ａｒｂｅｒ  Ｃ，Ｆｅｎｇ  Ｘ，Ａｂｈｙａｎｋａｒ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｒｖｉｖｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｔｕｍｏｒ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５；１２５（１）：１５７−１６８
【非特許文献３】Ｃｈｏ  ＪＨ，Ｓｐｒｅｎｔ  Ｊ．ＴＣＲ  ｔｕｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２０１８；２８３（１）：１２９−１３７
【非特許文献４】Ｌｅｉｓｅｇａｎｇ  Ｍ，Ｗｉｌｄｅ  Ｓ，Ｓｐｒａｎｇｅｒ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．ＭＨＣ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１０；１２０（１１）：３８６９−３８７７
【非特許文献５】Ｌｉ  Ｙ，Ｍｏｙｓｅｙ  Ｒ，Ｍｏｌｌｏｙ  ＰＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｐｉｃｏｍｏｌａｒ  ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５；２３（３）：３４９−３５４
【非特許文献６】Ｒｏｂｂｉｎｓ  ＰＦ，Ｌｉ  ＹＦ，Ｅｌ−Ｇａｍｉｌ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  ａｎｄ  ｄｕａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＴＣＲ  ＣＤＲｓ  ｃａｎ  ｅｎｈａｎｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１８０（９）：６１１６−６１３１
【非特許文献７】Ｌｉｎｅｔｔｅ  ＧＰ，Ｓｔａｄｔｍａｕｅｒ  ＥＡ，Ｍａｕｓ  ＭＶ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｉｔｉｎ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｍａ  ａｎｄ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２（６）：８６３−８７１
【非特許文献８】Ｃａｍｅｒｏｎ  ＢＪ，Ｇｅｒｒｙ  ＡＢ，Ｄｕｋｅｓ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｔｉｔｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＨＬＡ−Ａ１−ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｓ  ａ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＭＡＧＥ  Ａ３−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１３；５（１９７）：１９７ｒａ１０３
【非特許文献９】Ｍｏｒｇａｎ  ＲＡ，Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ  Ｎ，Ａｂａｔｅ−Ｄａｇａ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａｎｔｉ−ＭＡＧＥ−Ａ３  ＴＣＲ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１３；３６（２）：１３３−１５１
【非特許文献１０】Ｃｏｌｅ  ＤＫ，Ｌａｕｇｅｌ  Ｂ，Ｃｌｅｍｅｎｔ  Ｍ，Ｐｒｉｃｅ  ＤＡ，Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ  Ｌ，Ｓｅｗｅｌｌ  ＡＫ．Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ＣＤ８  ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１２；１３７（２）：１３９−１４８
【非特許文献１１】Ｈｅｂｅｉｓｅｎ  Ｍ，Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｊ，Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｒｅ  Ｈｉｇｈ−Ａｖｉｄｉｔｙ，Ｔｕｍｏｒ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ＣＤ８＋Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ＴＣＲ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｏｆｆ−Ｒａｔｅｓ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１５；７５（１０）：１９８３−１９９１
【非特許文献１２】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ＣＤ，Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＤＡ，Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．ｃ−ＭＰＬ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｓ．Ｂｌｏｏｄ．２０１７；１３０（２５）：２７３９−２７４９
【非特許文献１３】Ｏｓｔｒｏｕｍｏｖ  Ｄ，Ｆｅｋｅｔｅ−Ｄｒｉｍｕｓｚ  Ｎ，Ｓａｂｏｒｏｗｓｋｉ  Ｍ，Ｋｕｈｎｅｌ  Ｆ，Ｗｏｌｌｅｒ  Ｎ．ＣＤ４  ａｎｄ  ＣＤ８  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｉｎｔｅｒｐｌａｙ  ｉｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２０１８；７５（４）：６８９−７１３
【非特許文献１４】Ｋｅｎｎｅｄｙ  Ｒ，Ｃｅｌｉｓ  Ｅ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ＣＤ４＋Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２００８；２２２：１２９−１４４
【非特許文献１５】Ｗａｌｔｅｒ  ＥＡ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ＰＤ，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＭＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｏｆ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｄｏｎｏｒ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．１９９５；３３３（１６）：１０３８−１０４４
【非特許文献１６】Ｔｒａｎ  Ｅ，Ｔｕｒｃｏｔｔｅ  Ｓ，Ｇｒｏｓ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ４＋Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４；３４４（６１８４）：６４１−６４５
【非特許文献１７】Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ  Ｄ，Ｈｕｄｅｃｅｋ  Ｍ，Ｋｏｓａｓｉｈ  ＰＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ＣＤ８＋ａｎｄ  ＣＤ４＋ｓｕｂｓｅｔｓ  ｃｏｎｆｅｒ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１６；３０（２）：４９２−５００
【非特許文献１８】Ｔｕｒｔｌｅ  ＣＪ，Ｈａｎａｆｉ  ＬＡ，Ｂｅｒｇｅｒ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｗｉｔｈ  ａ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｒａｔｉｏ  ｏｆ  ＣＤ８＋ａｎｄ  ＣＤ４＋ＣＤ１９−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１６；８（３５５）：３５５ｒａ１１６
【発明の概要】
【０００７】
本開示の実施形態には、細胞療法を必要としている哺乳動物個体のための細胞療法に関連する方法および組成物が含まれる。細胞療法では、医学的状態（例えば、ガンなど）のための治療法として効果的であるように人の手によって操作される細胞が含まれる。細胞療法では、免疫エフェクター細胞、例えば、抗原を標的とする受容体を有するＴ細胞またはＮＫ細胞などが含まれ、受容体は、細胞に対して内因性で、生来である場合があり、または人の手によって操作される場合がある。ある特定の実施形態において、細胞療法の細胞は、細胞の効力を治療のために増強するタンパク質を発現するように改変され、また、特に細胞療法の細胞は、特定の抗原を標的とする受容体（これは細胞に対して生来である、または生来でない）もまた発現する。受容体の標的となる抗原が、具体的な実施形態においてはガン抗原である。受容体は少なくともいくつかの場合にはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であるが、代替となる場合において、受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、または細胞は両方を発現する場合がある。
【０００８】
特定の実施形態において、細胞の効力を治療のために増強するタンパク質は、ＣＤ８−α鎖および／またはＣＤ８−β鎖を含む分化抗原群８（ＣＤ８）である。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞であるか否かに関わらず、ＣＤ８αβを発現するように改変される。ＣＤ８＋Ｔ細胞については、ＣＤ８αβ共受容体の発現レベルがＣＤ８＋Ｔ細胞において増大すると、細胞における生来のＴＣＲが効果的であり得ることが高まり、遺伝子組換えのＣＤ８＋Ｔ細胞における操作されたＴＣＲが効果的であり得ることもまた高まる。ＣＤ４＋Ｔ細胞（これは生来的にはヘルパーＴ細胞である）が、ＣＤ８αβを発現するように改変される場合には、その遺伝子組換え発現により、ＣＤ４＋Ｔ細胞もまた細胞傷害活性を有することが可能になる。
【０００９】
本開示の実施形態には、個体のための免疫エフェクター細胞療法を増強する方法であって、下記細胞の一方または両方の効果的な量を当該個体に与える工程を含む方法が含まれる：外因性のＣＤ８αβ共受容体を発現し、かつ任意に１つまたは複数の外因性の操作された抗原受容体を発現するＣＤ８＋細胞、および外因性のＣＤ８αβ共受容体と１つまたは複数の外因性の操作された抗原受容体とを発現するＣＤ４＋細胞。具体的な場合において、操作された抗原受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの両方である。ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、またはそれらの両方が、個体に関して自家または同種である場合がある。いくつかの場合において、外因性の操作された抗原受容体と、外因性のＣＤ８αβ共受容体とが、同じベクターから細胞において発現し、ベクターは、外因性の操作された抗原受容体と、外因性のＣＤ８αβ共受容体とを別々に発現する１つまたは複数の発現構築物を含む場合がある。具体的な実施形態において、外因性の操作された抗原受容体を発現する発現構築物と、外因性のＣＤ８αβ共受容体を発現する発現構築物とは、２ＡエレメントまたはＩＲＥＳエレメントによって隔てられる。いくつかの場合において、外因性の操作された抗原受容体と、外因性のＣＤ８αβ共受容体とが、異なるベクターから細胞において発現する。いずれの場合においても、ベクターは、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）または非ウイルスベクターであり得る。
【００１０】
上記方法の特定の実施形態において、抗原は腫瘍抗原または病原体抗原である。腫瘍抗原の例には、サバイビン、ＰＲＡＭＥ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ鎖または軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ  ｖＩＩＩ、ガン胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体ｃｃ２、ＩＬ−１１受容体Ｒａ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ルイスＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａｌ、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−ａ、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＨＥＲ２、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４ｖ６およびそれらの組み合わせからなる群から選択される腫瘍抗原が含まれる。
【００１１】
本開示の方法はさらに、効果的な量の上記ＣＤ４＋Ｔ細胞、上記ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそれらの混合物を個体に与える工程を含む場合がある。そのような場合において、方法はさらに、さらなるガン療法を個体に施す工程を含む場合がある。
【００１２】
本開示の実施形態には、細胞傷害性エフェクター細胞機能と、ヘルパー機能とを有するＣＤ４＋Ｔ細胞を作製する方法であって、ＣＤ４＋Ｔ細胞を外因性のＣＤ８αβ共受容体および外因性の操作された抗原受容体によりトランスフェクションする工程を含む方法が含まれる。操作された抗原受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの両方である場合がある。外因性の操作された抗原受容体と、外因性のＣＤ８αβ共受容体とが、同じベクターから細胞において発現する場合があり、または発現しない場合がある。特に、ベクターは、外因性の操作された抗原受容体と、外因性のＣＤ８αβ共受容体とを別々に発現する１つまたは複数の発現構築物を含む。外因性の操作された抗原受容体を発現する発現構築物と、外因性のＣＤ８αβ共受容体を発現する発現構築物とは、２ＡエレメントまたはＩＲＥＳエレメントによって隔てられる場合がある。ベクターには、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）または非ウイルスベクターが含まれる。
【００１３】
抗原は腫瘍抗原または病原体抗原である場合がある。いくつかの場合において、腫瘍抗原は、サバイビン、ＰＲＡＭＥ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ鎖または軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ  ｖＩＩＩ、ガン胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体ｃｃ２、ＩＬ−１１受容体Ｒａ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ルイスＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａｌ、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−ａ、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＨＥＲ２、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４ｖ６およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１４】
本開示の方法はさらに、効果的な量の上記ＣＤ４＋Ｔ細胞を個体に対して、その必要性のある個体（例えば、ガンを有する個体など）に対して与える工程を含む場合がある。外因性のＣＤ８αβ共受容体、外因性の操作された抗原受容体、またはそれらの両方を発現する効果的な量のＣＤ８＋Ｔ細胞が個体に与えられる場合があり、個体はまた、さらなるガン療法を受けている場合がある。
【００１５】
本開示の実施形態には、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性を増強する方法であって、ＣＤ８＋Ｔ細胞を外因性のＣＤ８αβ共受容体によりトランスフェクションする工程を含む方法が含まれる。ＣＤ８＋Ｔ細胞はまた、外因性の操作された抗原受容体、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの両方などを発現する場合がある。外因性の操作された抗原受容体と、外因性のＣＤ８αβ共受容体とは、同じベクターから細胞において発現する。ベクターは、外因性の操作された抗原受容体と、外因性のＣＤ８αβ共受容体とを別々に発現する１つまたは複数の発現構築物を含む場合がある。いくつかの場合において、外因性の操作された抗原受容体を発現する発現構築物と、外因性のＣＤ８αβ共受容体を発現する発現構築物とは、２ＡエレメントまたはＩＲＥＳエレメントによって隔てられる。外因性の操作された抗原受容体と、外因性のＣＤ８αβ共受容体とが、異なるベクターから細胞において発現する場合がある。ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター）または非ウイルスベクターが利用される場合がある。
【００１６】
抗原には、腫瘍抗原または病原体抗原が含まれる。腫瘍抗原には、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ鎖または軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ  ｖＩＩＩ、ガン胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体ｃｃ２、ＩＬ−１１受容体Ｒａ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ルイスＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａｌ、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−ａ、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＨＥＲ２、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４ｖ６およびそれらの組み合わせからなる群から選択される腫瘍抗原が含まれる。上記方法はさらに、効果的な量の上記ＣＤ８＋Ｔ細胞を個体に対して、その必要性のある個体に対して与える工程を含む場合がある。上記方法はさらに、効果的な量のＣＤ４＋Ｔ細胞を個体に対して、その必要性のある個体に対して与える工程を含む場合がある。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、外因性のＣＤ８αβ共受容体、外因性の操作された抗原受容体、またはそれらの両方を発現するように操作される場合がある。個体はガンを有する場合があり、上記方法はさらに、さらなるガン療法を個体に施す工程を含む場合がある。
【００１７】
本開示の様々な実施形態が、ＣＤ８αβ共受容体を遺伝子組換えにより発現するＣＤ４＋Ｔ細胞を含む組成物に関する。ＣＤ４＋Ｔ細胞はまた、１つまたは複数の外因性の操作された抗原受容体（例えば、ＴＣＲ、ＣＡＲ、またはそれらの両方など）を遺伝子組換えにより発現する場合がある。組成物はさらに、ＣＤ８αβ共受容体、１つまたは複数の外因性の操作された抗原受容体、あるいはそれらの両方を遺伝子組換えにより発現するＣＤ８＋Ｔ細胞を含めて、ＣＤ８＋Ｔ細胞をどのような種類であれ含み得る。
【００１８】
本開示の実施形態には、ＣＤ８αβ共受容体と、任意に１つまたは複数の外因性の操作された抗原受容体とを遺伝子組換えにより発現するＣＤ８＋Ｔ細胞を含む組成物が含まれる。操作された抗原受容体は、ＴＣＲ、ＣＡＲ、またはそれらの両方である場合がある。組成物はさらに、ＣＤ８αβ共受容体、１つまたは複数の外因性の操作された抗原受容体、あるいはそれらの両方を遺伝子組換えにより発現するＣＤ４＋Ｔ細胞を含めて、ＣＤ４＋Ｔ細胞をどのような種類であれ含み得る。
【００１９】
本発明の１つの実施形態に関して議論される限定はどれも、本発明のどのような他の実施形態に対しても当てはまる場合があることが特に意図される。さらに、本発明の組成物はどれも、本発明のどのような方法においても使用される場合があり、本発明の方法はどれも、どのような組成物であれ本発明の組成物を製造するために、または利用するために使用される場合がある。実施例において示される１つの実施形態の様々な局面はまた、異なる実施例においてどこか他のところで、または本出願においてどこか他のところで、例えば、発明の概要、実施形態の詳細な説明、請求項、および図の凡例の説明などで議論される実施形態との関連において実行されることがある実施形態でもある。
【００２０】
上記では、本発明の特徴および技術的利点が、下記の詳細な説明がよりよく理解され得るためにかなり広く概説されている。本明細書中における請求項の主題を形成するさらなる特徴および利点が本明細書中下記において記載されるであろう。開示される概念および具体的な実施形態は、本件設計の同じ目的を実施するために他の構成を変更するための、または設計するための基礎として容易に利用され得ることが、当業者によって理解されなければならない。そのような同等な組立ては、添付された請求項において示されるような精神および範囲から逸脱しないこともまた、当業者によって認識されなければならない。さらなる目的および利点と一緒にではあるが、構成および操作方法の両方に関して、本明細書中に開示される設計に特徴的であると考えられる新規な特徴が、添付されている図面に関連して検討されたとき、下記の説明からよりよく理解されるであろう。しかしながら、図面のそれぞれが例示および説明のためだけに提供されており、本開示の限界の定義として意図されないことが、明確に理解されなければならない。本発明のさらなる目的、特徴、局面および利点について、一部が下記の説明において示されるであろうし、一部が下記の説明から明白であろうし、または本発明の実施によって認識される場合がある。本開示の様々な実施形態が、当業者が本発明を実施することを可能にするために十分に詳しく記載されるであろうし、そして、他の実施形態が利用され得ること、および、様々な変化が、本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解されなければならない。したがって、下記の詳細な説明は、限定する意味では解釈されず、本発明の範囲は、添付された請求項によって最もよく定義される。
【００２１】
本開示のより完全な理解のために、次に、添付されている図面と併せて理解される下記の説明が参照される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】ＣＤ４＋Ｔ細胞は、クラスＩ  ＴＣＲおよびＣＤ８αβが形質導入されたとき、ハイブリッド表現型に転換する。
【図１Ｂ】ＣＤ４＋Ｔ細胞は、クラスＩ  ＴＣＲおよびＣＤ８αβが形質導入されたとき、ハイブリッド表現型に転換する。
【図１Ｃ】ＣＤ４＋Ｔ細胞は、クラスＩ  ＴＣＲおよびＣＤ８αβが形質導入されたとき、ハイブリッド表現型に転換する。
【図１Ｄ】ＣＤ４＋Ｔ細胞は、クラスＩ  ＴＣＲおよびＣＤ８αβが形質導入されたとき、ハイブリッド表現型に転換する。
【図１Ｅ】ＣＤ４＋Ｔ細胞は、クラスＩ  ＴＣＲおよびＣＤ８αβが形質導入されたとき、ハイブリッド表現型に転換する。（図１Ａ）レトロウイルスベクターの概略。（図１Ｂ）ＮＴコントロールと比較されるＴＣＲベクターまたはＴ８ベクターに関してのＣＤ４＋Ｔ細胞（赤四角）またはＣＤ８＋Ｔ細胞（黒丸）の形質導入効率、ｎ＝６。ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ８α発現（図１Ｃ）、ＣＤ８β発現（図１Ｄ）およびサバイビンＬＭＬデキストラマー染色（図１Ｅ）の代表的なヒストグラム（上段パネル）、ならびにＭＦＩ概要（下段パネル）、ｎ＝５〜７のドナー。（図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ）ＮＴ：灰色線、ＴＣＲ＋：青色線、Ｔ８＋：緑色線。平均±ＳＤ、ＮＳ：有意でない、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。
【００２３】
【図２】Ｔ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＴＣＲ＋またはＴ８＋のＣＤ８＋Ｔ細胞と類似する機能的アビディティーを呈する。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔ数（ＳＦＵ／１０５個の遺伝子組換え細胞）による、サバイビンのＬＭＬペプチドまたはＰＲＡＭＥのＮＬＴペプチドに対する、遺伝子組換えのサバイビン特異的（ｓ２４、左上；ｓ１６、左下）またはＰＲＡＭＥ特異的（ｐ２８、右上；ｐ１１、右下）なＴＣＲ＋（白棒）またはＴ８＋（黒棒）のＣＤ４＋Ｔ細胞（赤棒）またはＣＤ８＋Ｔ細胞（黒棒）のアビディティー。１つの代表的なドナーからのデータが示される（３つのドナーがそれぞれのＴＣＲについて試験された）。検出限界：黒色点線。
【００２４】
【図３Ａ】ＴＣＲと一緒でのＣＤ８αβの共発現は逐次殺傷能をＣＤ４＋Ｔ細胞に与え、ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を改善する。
【図３Ｂ】ＴＣＲと一緒でのＣＤ８αβの共発現は逐次殺傷能をＣＤ４＋Ｔ細胞に与え、ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を改善する。
【図３Ｃ】ＴＣＲと一緒でのＣＤ８αβの共発現は逐次殺傷能をＣＤ４＋Ｔ細胞に与え、ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を改善する。
【図３Ｄ】ＴＣＲと一緒でのＣＤ８αβの共発現は逐次殺傷能をＣＤ４＋Ｔ細胞に与え、ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を改善する。
【図３Ｅ】ＴＣＲと一緒でのＣＤ８αβの共発現は逐次殺傷能をＣＤ４＋Ｔ細胞に与え、ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を改善する。
【図３Ｆ】ＴＣＲと一緒でのＣＤ８αβの共発現は逐次殺傷能をＣＤ４＋Ｔ細胞に与え、ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を改善する。（図３Ａ）ＮＴ  Ｔ細胞、ＴＣＲ＋またはＴ８＋のＣＤ４＋Ｔ細胞（赤棒）またはＣＤ８＋Ｔ細胞（黒棒）の、ＢＶ１７３白血病細胞（ＨＬＡ−Ａ２＊０２：０１＋サバイビン＋）との共培養；１：５のＥ：Ｔ比、残留ＢＶ１７３細胞を３日目に定量化した、ｎ＝７。（図３Ｂ）ＮＴ  Ｔ細胞、ＴＣＲ＋またはＴ８＋のＣＤ４＋Ｔ細胞（左）またはＣＤ８＋Ｔ細胞（右）の、野生型（ＷＴ）ＢＶ１７３細胞（黒塗り棒）またはβ２−ミクログロブリンノックアウト（Ｂ２Ｍ−ＫＯ）ＢＶ１７３細胞（白抜き棒）との共培養；１：５のＥ：Ｔ比、残留ＢＶ１７３細胞を３日目に定量化した、ｎ＝３。（図３Ｃ）逐次共培養の実験設定。（図３Ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞（左）またはＣＤ８＋Ｔ細胞（右）の逐次共培養。腫瘍細胞の再攻撃（＋）を伴う経時的な腫瘍細胞（上段パネル）およびＴ細胞（下段パネル）の定量化、ｎ＝７。Ｔ細胞拡大：ＴＣＲ＋対Ｔ８＋ＣＤ４：ｐ＜０．０００１；ＴＣＲ＋対Ｔ８＋ＣＤ８：ｐ＝ＮＳ；Ｔ８＋ＣＤ４対ＴＣＲ＋ＣＤ８：ｐ＝０．００２；Ｔ８＋ＣＤ４対ＣＤ８、ｐ＝０．０１５、ｌｏｇ  ＡＵＣでのｔ検定。（図３Ｅ）１回目の腫瘍攻撃の２４時間後（Ｄ１）および３回目の腫瘍攻撃の２４時間後（Ｄ１０）での共培養上清におけるサイトカイン定量化、ｎ＝６。（図３Ｆ）ＨＬＡ−Ａ＊０２＋ドナー由来（上段パネル）またはＨＬＡ−Ａ＊０２−ドナー由来（下段パネル）の、ＮＴ  Ｔ細胞、ＴＣＲ＋またはＴ８＋のＣＤ４＋Ｔ細胞（赤）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（黒）のＴ細胞拡大倍数、ｎ＝３〜４。（図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｅ、図３Ｆ）平均±ＳＤ、ＮＳ：有意でない、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。
【００２５】
【図４Ａ】ＴＣＲ−ＣＤ８αβの共発現は、ＣＤ８＋Ｔ細胞だけの逐次殺傷能を改善し、ＣＤ４＋Ｔ細胞だけを細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞に転換する。
【図４Ｂ】ＴＣＲ−ＣＤ８αβの共発現は、ＣＤ８＋Ｔ細胞だけの逐次殺傷能を改善し、ＣＤ４＋Ｔ細胞だけを細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞に転換する。（図４Ａ）ＴＩＭＩＮＧによるＴ細胞と標的細胞との間における相互作用の動力学の細胞個々での定量化。ｔＳｅｅｋ：エフェクター細胞と標的細胞とが最初に遭遇するまでの時間、ｔＣｏｎｔａｃｔ：エフェクター細胞と標的細胞との間における接合時間、ｔＤｅａｔｈ：最初の接触から標的細胞アポトーシスまでの時間。（図４Ｂ）１つの標的細胞（左側、Ｅ：Ｔが１：１）もしくは２つの標的細胞（右側、Ｅ：Ｔが１：２）を見出すこと（ｔＳｅｅｋ）（上段の列）、標的との安定な接合部を形成すること（ｔＣｏｎｔａｃｔ、中央の列）、または標的を殺傷すること（ｔＤｅａｔｈ）における単一エフェクター細胞の累積発生率。ＴＣＲ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（赤点線）、Ｔ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（赤実線）、ＴＣＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（黒点線）、およびＴ８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（黒実線）。ＮＳ：有意でない、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１、ログランク検定。
【００２６】
【図５Ａ】初期のＴＣＲシグナル伝達事象の分析。
【図５Ｂ】初期のＴＣＲシグナル伝達事象の分析。（図５Ａ）ｐＬｃｋ  Ｙ３９４リン酸化の代表的なＦＡＣＳヒストグラム：ＮＴ  Ｔ細胞（灰色）、ＴＣＲ＋（青色）およびＴ８＋（緑色）のＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞。（図５Ｂ）ＮＴコントロール細胞におけるＭＦＩに対して正規化されるｐＬＣＫ  ＭＦＩの概要。ｎ＝４つのドナー、平均±ＳＤ、ＣＤ４  ＴＣＲ＋対Ｔ８＋：１０４±１１対１７３±３５％、ＣＤ８  ＴＣＲ＋対Ｔ８＋：１０６±７対１２６±１３％、Ｔ８＋ＣＤ８対ＣＤ４：１２６±１３対１７３±３５％。ＮＳ：有意でない、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。
【００２７】
【図６Ａ】遺伝子組換えＣＤ８αβはＴＣＲ遺伝子組換えのＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍機能を増強する。
【図６Ｂ】遺伝子組換えＣＤ８αβはＴＣＲ遺伝子組換えのＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍機能を増強する。
【図６Ｃ】遺伝子組換えＣＤ８αβはＴＣＲ遺伝子組換えのＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍機能を増強する。
【図６Ｄ】遺伝子組換えＣＤ８αβはＴＣＲ遺伝子組換えのＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍機能を増強する。
【図６Ｅ】遺伝子組換えＣＤ８αβはＴＣＲ遺伝子組換えのＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍機能を増強する。（図６Ａ）実験設定。（図６Ｂ、図６Ｄ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（図６Ｂ）またはＣＤ４＋Ｔ細胞（図６Ｄ）により処置されるマウスからのＢＬＩデータの概要。非形質導入（ＮＴ）のコントロールＴ細胞（ｎ＝５、灰色）、ＴＣＲ＋Ｔ細胞（ｎ＝５、青色）、Ｔ８＋Ｔ細胞（ｎ＝５、緑色）。（図６Ｂ）ＣＤ８：ＮＴ対ＴＣＲ＋：ｐ＝０．０００２、ＮＴ対Ｔ８＋：ｐ＜０．０００１、ＴＣＲ＋対Ｔ８＋：ｐ＝０．０１、０日目と比較される２８日目におけるｌｏｇ  ＡＵＣでのｔ検定。（図６Ｄ）ＣＤ４：ＴＣＲ＋対Ｔ８＋：ｐ＝０．００１、０日目と比較される３５日目におけるｌｏｇ  ＡＵＣでのｔ検定。（図６Ｃ、図６Ｅ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（図６Ｃ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（図６Ｅ）についてＢＬＩ（カラースケール：５×１０３〜５×１０４ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒ）によって経時的に画像化される群あたり３匹の代表的マウス。
【発明の詳細な説明】
【００２８】
Ｉ．定義の例
【００２９】
長年にわたる特許法の慣例と一致して、“ａ”および“ａｎ”の単語は、請求項を含めて、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）の単語と併せて本明細書において使用されるときには、“ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ”（１つまたは複数）を意味する。本開示のいくつかの実施形態は、本開示の１つまたは複数の要素、方法工程および／または方法からなる場合があり、あるいは、本開示の１つまたは複数の要素、方法工程および／または方法から本質的になる場合がある。本明細書中に記載される方法または組成物はどれも、開示される、そして、同じような結果または類似する結果を本開示の精神および範囲から逸脱することなく依然として得る実施形態において記載される他の方法または組成物に関して、それらがどのようなものであれ実施され得ることが意図される。請求項における用語“ｏｒ”（または、もしくは、あるいは）の使用は、代替物のみに言及するために明示的に示される場合、または代替物が相互に排他的である場合を除き、“ａｎｄ／ｏｒ”（および／または）を意味するために使用され、だが、開示では、単に代替物および“ａｎｄ／ｏｒ”を示す定義が維持される。本明細書中で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２またはそれ以上を意味することがある。
【００３０】
長年にわたる特許法の慣例と一致して、“ａ”および“ａｎ”の単語は、請求項を含めて、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）の単語と併せて本明細書において使用されるときには、“ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ”（１つまたは複数）を意味する。本開示のいくつかの実施形態は、本開示の１つまたは複数の要素、方法工程および／または方法からなる場合があり、あるいは、本開示の１つまたは複数の要素、方法工程および／または方法から本質的になる場合がある。本明細書中に記載される方法または組成物はどれも、本明細書中に記載される他の方法または組成物に関して、それらがどのようなものであれ実施され得ること、また、種々の実施形態が組み合わせられてもよいことが意図される。
【００３１】
本出願全体を通して、用語「約」は、値を決定するために用いられているデバイスまたは方法についての誤差の標準偏差を当該値が含むことを示すために、細胞生物学および分子生物学の分野におけるその平易かつ通常の意味に従って使用される。
【００３２】
本明細書全体を通して、文脈上別途要求される場合を除き、単語“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”（含む）、単語“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”（含む）および単語“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”（含む）は、明記された工程または要素または一群の工程もしくは要素を含み、しかし、他の工程または要素または一群の工程もしくは要素をどのようなものであれ除外しないことを意味するように理解されるものとする。“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ”（からなる）によって、句“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ”に続くものはどのようなものも含み、かつそれに限定されることが意味される。したがって、句“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ”（からなる）は、列挙された要素が要求され、または必須であること、そして他の要素は存在しなくてもよいことを示している。“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ”（本質的にからなる）によって、この句の後に列挙されるあらゆる要素を含むこと、そして、列挙された要素について開示において指定される活性もしくは作用を妨げない、または列挙された要素について開示において指定される活性もしくは作用に寄与する他の要素に限定されることが意味される。したがって、句“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ”（本質的にからなる）は、列挙された要素が要求され、または必須であること、しかし、列挙されていない他の要素は随意的であり、列挙された要素の活性または作用に影響するか否かに依存して存在する場合がある、または存在しない場合があることを示している。
【００３３】
本明細書全体を通して、“ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ”（１つの実施形態）、“ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ”（１つの実施形態）、“ａ  ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ”（特定の実施形態）、“ａ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ”（関連した実施形態）、“ａ  ｃｅｒｔａｉｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ”（ある特定の実施形態、“ａｎ  ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ”（さらなる実施形態、“ａ  ｆｕｒｔｈｅｒ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ”（さらなる実施形態）、またはそれらの組み合わせに対する言及は、当該実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる様々な場所での前述の語句の出現は必ずしもすべてが、同じ実施形態に言及しているとは限らない。さらに、そのような特定の特徴、構造または特性は、１つまたは複数の実施形態において、どのような様式であれ好適な様式で組み合わされる場合がある。
【００３４】
用語「操作された抗原受容体」は、本明細書中で使用される場合、特定の抗原に結合する、人の手によって作り出されている合成された細胞表面タンパク質を示す。
【００３５】
用語「外因性の」は、細胞に関して本明細書中で使用される場合には、例えば、人の手から組換え工学方法によって細胞に提供される分子を示す。この用語は、自然界に見出される細胞に対して生来である内因性の分子とは区別される。
【００３６】
疾患もしくは状態を「処置する」、または疾患もしくは状態の処置は、１つまたは複数の薬物または治療法（細胞を含む）を患者に施すことを含むことがあるプロトコルを、疾患の少なくとも１つの徴候または症状を緩和しようとして実行することを示す。処置の望ましい効果には、疾患進行の速度を低下させること、疾患状態を改善または軽減すること、少なくとも１つの症状の発症を遅らせること、および寛解または改善された予後が含まれる。緩和は、疾患または状態の徴候または症状が現れる前に、同様にまた、それらが現れた後で、またはそれらの両方で起こり得る。したがって、「処置する」または「処置」は、疾患もしくは望ましくない状態を「防止する」、または疾患もしくは望ましくない状態の「防止」を含む場合がある。加えて、「処置する」または「処置」は１つまたは複数の徴候または症状の完全な緩和を必要とせず、また、治癒を必要とせず、また、患者に対するほんのわずかな効果しか有しないプロトコルを特に含む。
【００３７】
用語「治療的利益」または用語「治療効果的な」は、本出願全体を通して使用される場合、状態の医学的処置に関して対象の安寧を促進するものまたは増強するものを何であれ示す。これには、疾患の１つまたは複数の徴候または症状の頻度または重篤度における低下が含まれ、しかし、それに限定されない。例えば、ガンの処置では、例えば、腫瘍のサイズにおける低下、腫瘍の浸潤性における低下、ガンの成長速度における低下、および／または転移の防止が伴う場合がある。ガンの処置はまた、ガンを有する対象の生存を延長させることを示す場合がある。
【００３８】
「対象」および「患者」および「個体」は、ヒトまたは非ヒト（例えば、霊長類、哺乳動物および脊椎動物など）のどちらも示す。特定の実施形態において、対象は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマおよびウシなどである。
【００３９】
表現「医薬的に許容され得るまたは薬理学的に許容され得る」は、動物（例えば、ヒトなど）に適切なように投与されたとき、有害反応、アレルギー反応または他の不都合な反応を生じさせない分子実体および組成物を示す。抗体またはさらなる有効成分を含む医薬組成物の調製は、本開示に照らして当業者には知られているであろう。そのうえ、動物（例えば、ヒト）への投与のためには、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求されるような無菌性基準、発熱性基準、一般的安全性基準および純度基準を満たさなければならないことが理解されるであろう。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「医薬的に許容され得るキャリア」には、ありとあらゆる水性溶媒（例えば、水、アルコール性／水性の溶液、生理食塩水溶液、非経口用ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム、リンゲルブドウ糖など）、非水性溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、および注射可能な有機エステル、例えば、エチルオレアートなど）、分散媒体、被覆剤、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤または抗真菌剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガス）、等張剤、吸収遅延剤、塩、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑剤、甘味剤、香味矯臭剤、色素、体液補給剤および栄養補給剤、そのような材料、およびそれらの組み合わせが含まれ、これらは、当業者には知られているであろうようなものである。医薬組成物における様々な成分のｐＨおよび正確な濃度は周知のパラメーターに従って調節される。
【００４１】
ＩＩ．一般的な実施形態
【００４２】
本開示の実施形態には、受容体が操作された養子Ｔ細胞療法に関する改善が含まれる。本開示の方法は、有害な影響がその使用によりもたらされ得る高親和性受容体を利用することを必要とすることなく、操作された受容体により、低いアビディティーの抗原を標的とすることができるように治療法の細胞を改変することによって、養子Ｔ細胞療法のための効果的な選択肢についての拡張をもたらす。
【００４３】
Ａ．ＣＤ４＋Ｔ細胞
本開示の方法には、養子移入のためのヘルパー機能と細胞傷害性との両方をＣＤ８αβ鎖の遺伝子組換え発現のときに有するＣＤ４＋Ｔ細胞を作製することが含まれる。具体的な場合において、標的化されたｐＭＨＣクラスＩ複合体を認識し、これと結合する能力を含むＣＤ４＋Ｔ細胞を作製するという目的のためにＣＤ８αβ鎖の表面発現を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を作製する方法がある。
【００４４】
クラスＩエピトープを認識する活性を有する本開示のＣＤ４＋Ｔ細胞が本明細書中において作製される。したがって、本明細書中において包含される方法は、ＣＤ８αβを遺伝子組換えにより発現することの結果として、ＣＤ４＋細胞をクラスＩ制限エピトープに向け直す。クラスＩエピトープを認識することができることに加えて、この細胞はまた、ＴＨ２を発現するその生来的活性に加えて、ＴＨ１サイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、パーフォリンおよび／またはグランザイムＢなど）を発現する活性を有する。
【００４５】
本開示の実施形態には、ＣＤ４＋Ｔ細胞（およびＣＤ８＋Ｔ細胞）が、ＣＤ８αβの遺伝子組換え発現を伴うことなく拡大状態にあるＴ細胞と比較されるような場合を含めて、著しい同胞殺し（ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ）活性を欠くように細胞を変えるＣＤ８αβ遺伝子組換え発現を含む方法および組成物が含まれる。
【００４６】
特定の実施形態において、十分なレベルのＣＤ８αβを発現する遺伝子組換えＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞機能およびＣＤ４＋Ｔ細胞機能の両方を細胞個々のレベルで効果的に有する、クラスＩのｐＭＨＣが標的となる細胞傷害性かつヘルパー型のハイブリッドＴ細胞になる。そのようなものとして、ＣＤ８αβは、アビディティーが低いクラスＩ  ＴＣＲを有するＣＤ４＋Ｔ細胞だけを、インビボ機能が増強された細胞傷害性かつヘルパー型のハイブリッドＴ細胞に再プログラミングする。
【００４７】
本開示の実施形態には、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を有するようにＣＤ４＋Ｔ細胞を再プログラミングすることが含まれる。具体的な実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、細胞傷害性活性に加えてヘルパーＴ細胞活性を含む。したがって、具体的な場合において、ＣＤ４＋Ｔ細胞はハイブリッドおよび多機能性の両方である。具体的な場合において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、遺伝子組換えの外部提供されたＣＤ８共受容体を発現することによってこれらの特性を有するように操作され、そのような細胞はＴＨ１サイトカインおよびＴＨ２サイトカインの両方を産生することができる。細胞はまた、連続キラー活性を含み、抗腫瘍機能を含む。
【００４８】
ＣＤ８共受容体を発現するＣＤ４＋細胞は細胞傷害性を含むことができることが、ＴＣＲおよびＣＡＲを含めて１つまたは複数の外因性の操作された抗原受容体に関して利用される場合がある。
【００４９】
Ｂ．ＣＤ８＋Ｔ細胞
具体的な実施形態において、様々な方法および組成物が、ＣＤ８＋Ｔ細胞における外因性のＣＤ８αβ共受容体を、当該細胞の有効性を増大させるために利用することに関する。具体的な場合において、ＣＤ８＋Ｔ細胞は外因性の操作された抗原受容体（例えば、ＨＬＡクラスＩ制限ＴＣＲなど）を発現し、当該細胞におけるＣＤ８αβ共受容体の共発現により、細胞の機能的アビディティーが改善される。他の場合において、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、内因性ＴＣＲの活性を増強する外因性のＣＤ８αβ共受容体を発現するように改変される。
【００５０】
これらの方法および組成物は、細胞において天然に存在するレベルを越えてＣＤ８αβの細胞表面レベルを増大させることを含めて、少なくともＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ８αβ共受容体の利用可能性を増大させることによってＣＤ８＋Ｔ細胞療法における進歩を可能にする。したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞をあらゆる種類の細胞療法のために利用することにおいて、具体的な実施形態においては、ＣＤ８＋Ｔ細胞が外因性のＣＤ８αβ共受容体を発現する。
【００５１】
実施形態には、ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団の機能を、集団内の当該細胞の少なくとも一部におけるＣＤ８共受容体の利用可能性を増大させることによって増強することが含まれる。本開示の方法は、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞における内因性のＣＤ８共受容体が養子移入用途のためには少なすぎるという制限要因を克服する。したがって、本開示の特定の実施形態においては、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ８共受容体の利用可能性を、ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を増強するために増大する方法がある。
【００５２】
ＣＤ８共受容体は、細胞が人工抗原受容体について遺伝子組換えであるか否かにかかわらず、ＣＤ８＋Ｔ細胞において利用される場合がある。具体的な実施形態において、本開示の方法および組成物は受容体遺伝子組換え（例えば、ＴＣＲおよび／またはＣＡＲ）のＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を増強する。
【００５３】
Ｃ．ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞
本開示の実施形態は、Ｔ細胞を個体のために使用する養子移入に関する改善を包含する。ＣＤ８＋Ｔ細胞を養子移入のために細胞傷害性Ｔ細胞として利用する既知の方法は今や、非生来的な細胞傷害活性を有するＣＤ４＋Ｔ細胞の利用もまた可能にすることによって改善されてきている。本開示の実施形態は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋である低アビディティーのＴＣＲ遺伝子組換えＴ細胞、またはその機能的ハイブリッドを含めて、ＴＣＲ遺伝子組換えＴ細胞を用いる免疫療法のためにＣＤ８共受容体機能を利用することを包含する。
【００５４】
本開示の実施形態は、生来的な、および／または外部から提供されたＴＣＲまたは他の抗原受容体についてのＣＤ８  Ｔ細胞機能がＣＤ８細胞において増強されることを提供する。増強には、外部から提供されたＣＤ８αβの発現をそれぞれ欠くそのようなＴ細胞と比較して、その連続腫瘍殺傷能を増大させることなどの利点が含まれることがある。
【００５５】
特定の実施形態において、十分なレベルのＣＤ８αβ共受容体および外因性の操作された抗原受容体を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞と、十分なレベルのＣＤ８αβ共受容体および任意に外因性の操作された抗原受容体を発現するＣＤ８＋との混合物が、ある特定の方法において利用される。混合物では、ＣＤ４＋Ｔ細胞対ＣＤ８＋Ｔ細胞の特定の比率（例えば、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：２５、１：５０、１：１００、１：５００、１：１０００、１：１０，０００など）が利用され得る。
【００５６】
本明細書中においてどこか他のところで提供される例は、効果的かつ安全なＴＣＲ発現細胞についての必要性に対処している。過剰発現した腫瘍関連自己抗原（ＴＡＡ）を標的とするほとんどの天然に存在するクラスＩ制限ＴＣＲは、宿主における選択および寛容性のためにアビディティーが低く、また、ＣＤ８共受容体に依存性している。ＴＣＲが操作されたＴ細胞による養子Ｔ細胞移入はこのように、ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能に完全に依拠しており、有益なＣＤ４＋Ｔ細胞機能を活用することができない。したがって、本開示は、ＴＡＡ特異的な低アビディティーＴＣＲの発現をＣＤ８αβ共受容体と組み合わせる新規戦略に関するものであり、精製された遺伝子組換えＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の性質が別々に特徴づけられた。ＣＤ８αβ共移入は、ＴＣＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞機能を、その連続腫瘍殺傷能を増大させることによって増強することが明らかにされ、このことは、内因性ＣＤ８共受容体の制限された利用可能性がその機能的潜在能の完全な展開を妨げていることを示していた。操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、細胞個々のレベルでの多機能的な細胞傷害性かつヘルパー型のハイブリッドＴ細胞に効率的に再プログラミングされた：この細胞は、同族のクラスＩ制限腫瘍抗原を発現する細胞を認識して殺し、連続キラーになり、主にＴＨ１サイトカインを産生し、いくつかのＴＨ２サイトカインを保持し、優れた抗腫瘍機能をインビボで示した。したがって、本開示の実施形態は少なくとも、（１）ＴＣＲ遺伝子組換えＣＤ８＋Ｔ細胞の機能の増強、そして（２）ＣＤ８＋Ｔ細胞機能およびＣＤ４＋Ｔ細胞機能の両方が細胞個々のレベルで容易に利用可能である、クラスＩのｐＭＨＣが標的となる細胞傷害性かつヘルパー型のハイブリッドＴ細胞の製造に関する。
【００５７】
ＩＩＩ．組成物の例
【００５８】
本開示は、養子移入において使用するためのＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に関する。本開示のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、少なくともそれらが、少なくとも１つの外部提供されたタンパク質、すなわち、ＣＤ８αβ共受容体を別個に発現するために自然界では見出されない。特定の場合において、ＣＤ８のα鎖およびβ鎖の両方が同じ細胞において発現する。ＣＤ８αβ共受容体は細胞において一過性に発現してもよく、または発現しなくてもよい。ＣＤ８αβ共受容体を遺伝子組換えにより発現するＣＤ８＋細胞は、少なくともＣＤ８αβ共受容体分子のレベルが、ＣＤ８αβ共受容体分子を自然界において生来的に発現する細胞よりも大きいために、ＣＤ８αβ共受容体の生来的な発現を有する自然界におけるＣＤ８＋細胞ではなく、発現レベルにおけるこの違いが、生来のＣＤ８＋Ｔ細胞よりも大きい効力を有する遺伝子組換えＣＤ８＋Ｔ細胞の機能的違いを引き起こしている。
【００５９】
特定の実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ８αβ共受容体を発現することに加えて、１つまたは複数の操作された抗原受容体もまた発現する。１つまたは複数の操作された抗原受容体はどのような種類ものであってもよく、しかし、具体的な場合において、１つまたは複数の操作された抗原受容体はＨＬＡクラスＩ制限のＴＣＲまたはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
【００６０】
Ａ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
いくつかの実施形態において、操作された抗原受容体には、組換えＴＣＲ、および／または天然に存在するＴ細胞からクローニングされるＴＣＲが含まれる。「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」は、可変ａ鎖および可変β鎖（これらはＴＣＲαおよびＴＣＲβとしてもまたそれぞれ知られている）、または可変γ鎖および可変δ鎖（これらはＴＣＲγおよびＴＣＲδとしてもまたそれぞれ知られている）を含有し、かつ、ＭＨＣ受容体に結合している抗原ペプチドに特異的に結合することができる分子を示す。いくつかの実施形態において、ＴＣＲはαβ形態である。
【００６１】
典型的には、αβ形態およびγδ形態で存在するＴＣＲは一般に構造的に類似しており、しかし、それらを発現するＴ細胞は、異なった解剖学的位置または機能を有する場合がある。ＴＣＲを細胞の表面に、または可溶性形態で見出すことができる。一般には、ＴＣＲが、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原を認識することを一般に担うＴ細胞（またはＴリンパ球）の表面に見出される。いくつかの実施形態において、ＴＣＲはまた、定常ドメイン、膜貫通ドメインおよび／または短い細胞質尾部を含有することができる。例えば、いくつかの局面において、ＴＣＲのそれぞれの鎖が、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびＣ末端での短い細胞質尾部を有することができる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、シグナル伝達を媒介することに関与するＣＤ３複合体のインバリアントタンパク質と結合する。別途明記される場合を除き、用語「ＴＣＲ」は、その機能的なＴＣＲフラグメントを包含することが理解されなければならない。この用語はまた、αβ形態またはγδ形態でのＴＣＲを含めて、無傷または全長のＴＣＲを包含する。
【００６２】
したがって、本明細書中における様々な目的のために、ＴＣＲに対する言及は、あらゆるＴＣＲまたは機能的フラグメント、例えば、ＭＨＣ分子において、すなわち、ＭＨＣ−ペプチド複合体において結合した特異的な抗原性ペプチドに結合するＴＣＲの抗原結合部分などを含む。交換可能に使用され得るが、ＴＣＲの「抗原結合部分」または抗原結合フラグメント」は、ＴＣＲの構造ドメインの一部分を含有し、しかし、完全なＴＣＲが結合する抗原（例えば、ＭＨＣ−ペプチド複合体）と結合する分子を示す。いくつかの場合において、抗原結合部分は、特異的なＭＨＣ−ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するために十分であるＴＣＲの可変ドメイン（例えば、ＴＣＲの可変α鎖および可変β鎖など）を含有する（例えば、一般に、この場合、それぞれの鎖が３つの相補性決定領域を含有する）。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖の可変ドメインは結合して、ループ、またはＴＣＲ分子の結合部位を形成することによって抗原認識を与え、ペプチド特異性を決定し、かつペプチド特異性を決定する、免疫グロブリンに類似する相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成する。典型的には、免疫グロブリンと同様に、ＣＤＲはフレームワーク領域（ＦＲ）によって隔てられる。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３は、プロセシングされた抗原を認識することに関わる主たるＣＤＲであり、だが、アルファ鎖のＣＤＲ１はまた、抗原性ペプチドのＮ末端部分と相互作用することが示されており、これに対して、ベータ鎖のＣＤＲ１は抗原性ペプチドのＣ末端部分と相互作用する。ＣＤＲ２は、ＭＨＣ分子を認識すると考えられている。いくつかの実施形態において、β鎖の可変領域は、さらなる超可変性（ＨＶ４）領域を含有することができる。
【００６４】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖は定常ドメインを含む。例えば、免疫グロブリンと同様に、ＴＣＲ鎖（例えば、ａ鎖、β鎖）の細胞外部分は、２つの免疫グロブリンドメイン、Ｎ末端における可変ドメイン（例えば、ＶａまたはＶｐ；典型的にはＫａｂａｔ番号表記（Ｋａｂａｔ他、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、１９９１、第５版）に基づいてアミノ酸１〜１１６）、および細胞膜に隣接する１つの定常ドメイン（例えば、ａ鎖定常ドメインまたはＣａ、典型的にはＫａｂａｔに基づいてアミノ酸１１７〜２５９、β鎖定常ドメインまたはＣｐ、典型的にはＫａｂａｔに基づいてアミノ酸１１７〜２９５）を含有することができる。例えば、いくつかの場合において、２つの鎖によって形成されるＴＣＲの細胞外部分は、２つの膜近位定常ドメインと、ＣＤＲを含有する２つの膜遠位可変ドメインとを含有する。ＴＣＲドメインの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、これにより２つの鎖の間を連結する短い接続配列を含有する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、当該ＴＣＲが２つのジスルフィド結合を定常ドメインにおいて含有するようにさらなるシステイン残基をα鎖およびβ鎖のそれぞれに有する場合がある。
【００６５】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖は膜貫通ドメインを含む場合がある。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは正に帯電している。いくつかの場合において、ＴＣＲ鎖は細胞質尾部を含有する。いくつかの場合において、この構造により、ＴＣＲは、ＣＤ３のような他の分子と結合することが可能となる。例えば、定常ドメインを膜貫通領域とともに含有するＴＣＲはタンパク質を細胞膜内に固定し、ＣＤ３シグナル伝達装置またはＣＤ３シグナル伝達複合体のインバリアントサブユニットと結合することができる。
【００６６】
一般に、ＣＤ３は、哺乳動物では３つの異なった鎖（γ、δおよびε）と、ζ鎖とを有し得る多タンパク質複合体である。例えば、哺乳動物において、複合体は、ＣＤ３γ鎖と、ＣＤ３δ鎖と、２つのＣＤ３ε鎖と、ＣＤ３ζ鎖のホモダイマーとを含有することができる。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖およびＣＤ３ε鎖は、ただ１つの免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーの非常に近縁の細胞表面タンパク質である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖およびＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は負に帯電しており、このことが、これらの鎖が正荷電のＴ細胞受容体鎖と結合することを可能にする特徴である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖およびＣＤ３ε鎖の細胞内尾部はそれぞれが、免疫受容体活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして知られている１つだけの保存されたモチーフを含有しており、これに対して、それぞれのＣＤ３ζ鎖は３つの保存されたモチーフを有する。一般に、ＩＴＡＭはＴＣＲ複合体のシグナル伝達能力に関与している。これらのアクセサリー分子は、負に帯電した膜貫通領域を有しており、ＴＣＲからのシグナルを細胞内に伝播する際に役割を果たしている。ＣＤ３鎖およびζ鎖はＴＣＲと一緒になって、Ｔ細胞受容体複合体として知られているものを形成する。
【００６７】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、αおよびβの２つの鎖（または場合によってはγおよびδ）のヘテロダイマーである場合があり、または単鎖のＴＣＲ構築物である場合がある。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、例えば、ジスルフィド結合（１つまたは複数）などによって連結される２つの別個の鎖（α鎖およびβ鎖、またはγ鎖およびδ鎖）を含有するヘテロダイマーである。いくつかの実施形態において、標的抗原（例えば、ガン抗原）についてのＴＣＲが特定され、細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ＴＣＲをコードする核酸を様々な供給源から、例えば、ＴＣＲの公的に入手可能なＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などによって得ることができる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲが生物学的供給源から、例えば、細胞などから、例えば、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｔ細胞ハイブリドーマまたは他の公的に入手可能な供給源などから得られる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞を、インビボ単離された細胞から得ることができる。いくつかの実施形態において、高親和性のＴ細胞クローンを患者から単離することができ、ＴＣＲを単離することができる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、培養されたＴ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞クローンであることが可能である。いくつかの実施形態において、標的抗原についてのＴＣＲクローンが、ヒト免疫系遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原系、またはＨＬＡ）により操作された遺伝子組換えマウスにおいて作製されている。いくつかの実施形態において、ファージディスプレイが、標的抗原に対するＴＣＲを単離するために使用される。いくつかの実施形態において、ＴＣＲまたはその抗原結合部分はＴＣＲの配列の知識から合成的に作製することができる。
【００６８】
Ｂ．キメラ抗原受容体
いくつかの実施形態において、操作された抗原受容体には、活性化ＣＡＲもしくは刺激性ＣＡＲ、共刺激性ＣＡＲ（国際公開第２０１４／０５５６６８号を参照のこと）、および／または阻害性ＣＡＲを含めて様々なＣＡＲが含まれる。ＣＡＲは一般には、いくつかの局面ではリンカー（１つまたは複数）および／または膜貫通ドメイン（１つまたは複数）を介して１つまたは複数の細胞内シグナル伝達成分に連結される細胞外の抗原（またはリガンド）結合ドメインを含む。そのような分子は典型的には、生来的な抗原受容体を介するシグナル、共刺激性受容体との組合わせでそのような受容体を介するシグナル、および／または共刺激性受容体だけを介するシグナルを模倣するか、または近似する。ＣＡＲは、第１世代、第２世代、または第３もしくはそれ以降の世代である場合がある。
【００６９】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲはベクターによってコードされ、少なくとも下記のドメインを含む：ａ）細胞内シグナル伝達ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、およびｃ）少なくとも１つの抗原結合領域を含む細胞外ドメイン。
【００７０】
本開示のある特定の実施形態は、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、および１つまたは複数のシグナル伝達モチーフを有する細胞外ドメインを含む、免疫原性を低下させるためにヒト化されているＣＡＲ（ｈＣＡＲ）を含めて、抗原特異的ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸を含めた核酸の使用に関する。ある特定の実施形態において、ＣＡＲは、１つまたは複数の抗原の間での共有空間を含むエピトープを認識する場合がある。ある特定の実施形態において、結合領域は、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域、および／またはその抗原結合フラグメントを含むことができる。別の実施形態において、その特異性は、受容体に結合するペプチド（例えば、サイトカイン）に由来する。
【００７１】
ヒトＣＡＲ核酸は、ヒト患者のための細胞免疫療法を増強するために使用されるヒト遺伝子に由来し得ることが意図される。具体的な実施形態において、本開示には、ベクターによってコードされる全長のＣＡＲ  ｃＤＮＡまたはＣＡＲコード領域が含まれる。抗原結合領域または抗原結合ドメインは、特定のヒトモノクローナル抗体、例えば、米国特許第７，１０９，３０４号（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されるヒトモノクローナル抗体などに由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のＶＨ鎖およびＶＬ鎖のフラグメントを含む場合がある。フラグメントはまた、ヒト抗原特異的抗体の異なる抗原結合ドメインのどのような数も可能である。より具体的な実施形態において、フラグメントは、ヒト細胞における発現のためにヒトでのコドン使用頻度について最適化される配列によってコードされる抗原特異的ｓｃＦｖである。
【００７２】
配置は、ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）またはマルチマーなどの多量体型であり得るであろう。マルチマーはおそらくは、軽鎖および重鎖の可変部分をジアボディにクロスペアリング（ｃｒｏｓｓ  ｐａｉｒｉｎｇ）することによって形成される。構築物のヒンジ部分は、完全に削除されることから、最初のシステインが維持されることまで、セリン置換ではなくプロリン置換にすることまで、最初のシステインまで切り詰められることまでの多数の代替を有することができる。Ｆｃ部分は削除される場合があり、または削除されない場合がある。安定である、かつ／または二量体化するタンパク質はどれも、この目的のために役立ち得る。Ｆｃドメインの１つだけ、例えば、ヒト免疫グロブリンからのＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのどちらかが使用され得るであろう。二量体化を改善するために改変されているヒト免疫グロブリンのヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域もまた使用され得るであろう。免疫グロブリンのヒンジ部分だけもまた使用され得るであろう。ＣＤ８アルファの一部分もまた使用され得るであろう。
【００７３】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ核酸は、他の共刺激性受容体（例えば、膜貫通ドメインなど）および１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインなど）をコードする配列を含む。他の共刺激受容体には、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ−４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）の１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。ＣＤ３□によって開始される一次シグナルに加えて、ヒトＣＡＲに挿入されるヒト共刺激受容体によってもたらされるさらなるシグナルが、ＮＫ細胞の完全な活性化のために利用される場合があり、また、養子免疫療法のインビボ持続性および治療的成功を改善することを助け得るであろう。
【００７４】
いくつかの実施形態において、特異性を特定の抗原（またはマーカーもしくはリガンド）について有する、例えば、養子療法によって標的化されることになる特定の細胞タイプにおいて発現する抗原（例えば、ガンマーカー）、および／または抑制反応を誘発するために意図される抗原（例えば、正常または非病的な細胞タイプの表面において発現する抗原など）などについて有するＣＡＲが構築される。したがって、ＣＡＲは典型的にはその細胞外部分において、１つもしくは複数の抗原結合分子、例えば、１つもしくは複数の抗原結合フラグメント、抗原結合ドメインもしくは抗原結合部分など、または１つもしくは複数の抗体可変ドメイン、および／または抗体分子を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲには、抗体分子の抗原結合部分（１つまたは複数）、例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）に由来する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）などが含まれる。
【００７５】
ＣＡＲのある特定の実施形態において、受容体の抗原特異的部分（これは、抗原結合領域を含む細胞外ドメインとして示されることがある）は、腫瘍関連抗原結合ドメインまたは病原体特異的抗原結合ドメインを含む。抗原には、パターン認識受容体によって認識される炭水化物抗原が含まれる。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の細胞表面に発現する限り、どのような種類のものであってもよい。
【００７６】
キメラ受容体をコードするオープンリーディングフレームの配列をゲノムＤＮＡ源もしくはｃＤＮＡ源から得ることができ、または合成することができ（例えば、ＰＣＲを介して）、またはそれらの組み合わせにより得ることができる。ゲノムＤＮＡのサイズおよびイントロンの数に依存して、イントロンがｍＲＮＡを安定化させることが見出されるようにｃＤＮＡまたはその組み合わせを使用することが望ましい場合がある。また、内因性または外因性の非コード領域を、ｍＲＮＡを安定化させるために使用することがさらに好都合である場合がある。
【００７７】
キメラ構築物はネイクドＤＮＡとして、または好適なベクターにおいて免疫細胞に導入され得ることが意図される。ネイクドＤＮＡを使用するエレクトロポレーションによって細胞を安定的にトランスフェクションする様々な方法がこの技術分野では知られている。例えば、米国特許第６，４１０，３１９号を参照のこと。ネイクドＤＮＡは一般には、発現のための適切な配向で発現ベクターに含有されるキメラ受容体をコードするＤＮＡを示す。本開示の多シストロン性モジュール型ベクターはウイルスベクターである場合があり、またはウイルスベクターでない場合があり、例えば、プラスミドなどである場合がある。例示的な実施形態のために、本明細書中で詳述されるベクターはレトロウイルスベクターであるが、他の場合には、ベクターはまたウイルスベクターであり、しかし、その代わりに、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。
【００７８】
どのようなベクターも、キメラ構築物を免疫細胞に導入するために使用することができる。本開示の方法に従った使用のための好適なベクターは免疫細胞において非複製性である場合がある。ウイルスに基づくベクターであって、細胞において維持されるウイルスのコピー数が、細胞の生存能を維持するためには十分に少ないベクターが数多く知られている：例えば、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶまたはＢＰＶに基づくベクターなど。具体的な場合において、ベクターはモロニーマウス白血病ウイルスに基づく。
【００７９】
いくつかの局面において、抗原特異的な結合成分または認識成分が１つまたは複数の膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、当該ＣＡＲの細胞外ドメインに融合される膜貫通ドメインを含む。１つの実施形態において、ＣＡＲにおけるドメインの１つと生来的に関連する膜貫通ドメインが使用される。場合により、膜貫通ドメインは、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに対するそのようなドメインの結合を回避して、受容体複合体の他の構成成分との相互作用を最小限にするために選択され、またはアミノ酸置換によって改変される。
【００８０】
膜貫通ドメインはいくつかの実施形態においては、天然供給源から、または合成供給源からのどちらからでも得られる。供給源が天然である場合、ドメインはいくつかの局面においては、どのような膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質からであれそれらに由来する。膜貫通領域には、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＧＩＴＲ／ＣＤ３５７、ＮＫＧ２ＤおよびＤＡＰの分子に由来する膜貫通領域が含まれる（すなわち、膜貫通領域は、細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＧＩＴＲ／ＣＤ３５７、ＮＫＧ２ＤおよびＤＡＰの分子の膜貫通領域（１つまたは複数）を少なくとも含む）。代替において、膜貫通ドメインはいくつかの実施形態においては合成である。いくつかの局面において、合成された膜貫通ドメインは、主に疎水性の残基（例えば、ロイシンおよびバリンなど）を含む。いくつかの局面において、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンの三つ組が、合成された膜貫通ドメインのそれぞれの末端に見出されるであろう。
【００８１】
ある特定の実施形態において、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ｉＮＫＴ細胞、Ｂ細胞またはＭＳＣ細胞などを遺伝子改変するために本明細書中に開示されるプラットフォーム技術は、（ｉ）エレクトロポレーションデバイス（例えば、ヌクレオフェクター）を使用する、ウイルスによらない遺伝子移入、（ｉｉ）エンドドメイン（例えば、ＣＤ２８／ＣＤ３−ζ、ＣＤ１３７／ＣＤ３−ζまたは他の組み合わせ）を介してシグナル伝達するＣＡＲ、（ｉｉｉ）抗原認識ドメインを細胞表面につなぐ様々な長さの細胞外ドメインを有するＣＡＲ、およびいくつかの場合においては（ｉｖ）ＣＡＲ＋免疫細胞を確実かつ数的に拡大することができるためのＫ５６２由来の人工的な抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含む。
【００８２】
１つのベクターが２つの別個のＣＡＲ分子をコードする場合があり、あるいは、１つのベクターが、少なくとも１つのＣＡＲ分子が２つの非同一の抗原についての特異性を有する１つまたは複数のＣＡＲ分子、例えば、二重特異性ＣＡＲ、二重特異性ＴＣＲまたは二重特異性ＣＡＲ／ＴＣＲなどをコードする場合がある。本開示のベクターによってコードされる抗原受容体、本開示のベクター自体、および本開示のベクターを含む細胞は、人の手によって作り出されたものであり、自然界には存在しない。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、抗原に特異的に結合する細胞外の抗原認識ドメインを含む。ＣＡＲは、特定の組織タイプまたは細胞タイプの抗原を標的とするように特に設計される場合がある。いくつかの実施形態において、抗原は、細胞の表面に発現するタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲはＴＣＲ様ＣＡＲであり、抗原は、ＴＣＲのように主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子との関連で細胞表面において認識されるプロセシングされたペプチド抗原、例えば、細胞内タンパク質のペプチド抗原などである。
【００８４】
Ｃ．抗原
遺伝子操作された抗原受容体によって標的とされる抗原の中には、養子細胞療法によって標的とされることになる疾患、状態または細胞タイプとの関連で発現する抗原がある。このような疾患および状態の中には、固形腫瘍、血液学的ガン、免疫系のガン（例えば、リンパ腫、白血病および／または骨髄腫など、例えば、Ｂ、Ｔおよび骨髄性の白血病、リンパ腫、ならびに多発性骨髄腫など）を含めて様々なガンおよび腫瘍を含めた、増殖性、新生物性および悪性の疾患および障害、同様にまた、自己免疫状態または同種免疫状態がある。いくつかの実施形態において、抗原は、正常な、または標的とならない細胞または組織と比較した場合、疾患または状態の細胞において、例えば、腫瘍細胞または病原性細胞において選択的に発現し、または過剰発現する。他の実施形態において、抗原は正常な細胞において発現し、かつ／または操作された細胞において発現する。いくつかの場合において、抗原は免疫関連障害に関連する。疾患が病原性疾患である場合、抗原は、ウイルス、真菌、原生動物または細菌などの病原体の腫れ（ｔｕｍｏｒ）であろう。
【００８５】
好適な抗原はどれも、用途が本発明の方法において見出され得る。例示的な抗原には、感染性病原体、自己抗原／自身の抗原、腫瘍関連抗原／ガン関連抗原、および腫瘍のネオ抗原からの抗原性分子が含まれるが、これらに限定されない（Ｌｉｎｎｅｍａｎｎ他、２０１５）。特定の局面において、抗原には、サバイビン、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｍｕｃ−１、Ｈｅｒ２、ＣＡ−１２５、ＷＴ−１、Ｍａｇｅ−Ａ３、Ｍａｇｅ−Ａ４、Ｍａｇｅ−Ａ１０、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４、およびＣＥＡが含まれる。特定の局面において、２つ以上の抗原受容体についての抗原には、ＣＤ１９、ＥＢＮＡ、ＷＴ１、ＣＤ１２３、ＮＹ−ＥＳＯ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＵＣ１、ＨＥＲ２、ＣＡ−１２５、ＷＴ１、Ｍａｇｅ−Ａ３、Ｍａｇｅ−Ａ４、Ｍａｇｅ−Ａ１０、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４および／またはＣＥＡが含まれるが、これらに限定されない。これらの抗原についての配列がこの技術分野では知られている：例えば、ＣＤ１９（アクセッション番号ＮＧ＿００７２７５．１）、ＥＢＮＡ（アクセッション番号ＮＧ＿００２３９２．２）、ＷＴ１（アクセッション番号ＮＧ＿００９２７２．１）、ＣＤ１２３（アクセッション番号ＮＣ＿００００２３．１１）、ＮＹ−ＥＳＯ（アクセッション番号ＮＣ＿００００２３．１１）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（アクセッション番号ＮＧ＿００７７２６．３）、ＭＵＣ１（アクセッション番号ＮＧ＿０２９３８３．１）、ＨＥＲ２（アクセッション番号ＮＧ＿００７５０３．１）、ＣＡ−１２５（アクセッション番号ＮＧ＿０５５２５７．１）、ＷＴ１（アクセッション番号ＮＧ＿００９２７２．１）、Ｍａｇｅ−Ａ３（アクセッション番号ＮＧ＿０１３２４４．１）、Ｍａｇｅ−Ａ４（アクセッション番号ＮＧ＿０１３２４５．１）、Ｍａｇｅ−Ａ１０（アクセッション番号ＮＣ＿００００２３．１１）、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４（アクセッション番号ＮＣ＿０００００３．１２）および／またはＣＥＡ（アクセッション番号ＮＣ＿００００１９．１０）。
【００８６】
腫瘍関連抗原は、前立腺、乳房、結腸直腸、肺、膵臓、腎臓、中皮腫、卵巣もしくはメラノーマの様々なガン、または血液学的悪性腫瘍に由来する場合がある。例示的な腫瘍関連抗原または腫瘍細胞由来抗原には、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３およびＭＡＧＥ４（または他のＭＡＧＥ抗原、例えば、国際特許出願公開第９９／４０１８８号に開示されるＭＡＧＥ抗原など）；ＰＲＡＭＥ；サバイビン、ＢＡＧＥ；ＲＡＧＥ、Ｌａｇｅ（これはまた、ＮＹ  ＥＳＯ  １として知られている）；ＳＡＧＥ；ならびにＨＡＧＥまたはＧＡＧＥが含まれる。腫瘍抗原のこれらの限定されない例が、広範囲の様々な腫瘍タイプにおいて、例えば、メラノーマ、肺ガン、肉腫および膀胱ガン、または血液学的悪性腫瘍において発現する。例えば、米国特許第６，５４４，５１８号を参照のこと。前立腺ガンの腫瘍関連抗原には、例えば、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性ホスファターゼ、ＮＫＸ３．１、および前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）が含まれる。
【００８７】
他の腫瘍関連抗原には、Ｐｌｕ−１、ＨＡＳＨ−１、ＨａｓＨ−２、ＣｒｉｐｔｏおよびＣｒｉｐｔｉｎが含まれる。加えて、腫瘍抗原は、多くのガンの処置において有用である自分自身のペプチドホルモン、例えば、完全長のゴナドトロピンホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、すなわち、１０アミノ酸長の短いペプチドなどである場合がある。
【００８８】
腫瘍抗原には、腫瘍関連抗原の発現（例えば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ発現など）によって特徴づけられるガンに由来する腫瘍抗原が含まれる。対象となる腫瘍関連抗原には、系譜特異的な腫瘍抗原、例えば、メラノサイト−メラノーマ系譜抗原のＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼおよびチロシナーゼ関連タンパク質などが含まれる。例示的な腫瘍関連抗原には、下記のいずれか１つもしくは複数に由来する腫瘍抗原、または下記のいずれか１つもしくは複数を含む腫瘍抗原が含まれるが、これらに限定されない：ｐ５３、Ｒａｓ、ｃ−Ｍｙｃ、細胞質セリン／トレオニンキナーゼ（例えば、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−ＲａｆおよびＣ−Ｒａｆ、サイクリン依存性キナーゼ）、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＲＴ−１、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、ＤＡＭ−１０、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７Ｂ、ＮＡ８８−Ａ、ＭＡＲＴ−１、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ−Ｂ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＴＲＫ受容体、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）、ＡＦＰ、−カテニン／ｍ、カスパーゼ−８／ｍ、ＣＥＡ、ＣＤＫ−４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン／ｍ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、７０７−ＡＰ、アネキシンＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ−ａｂｌ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、インターフェロン調節因子４（ＩＲＦ４）、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲ、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達因子１（ＴＡＣＳＴＤ１）ＴＡＣＳＴＤ２、受容体チロシンキナーゼ（例えば、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）（特にＥＧＦＲｖＩＩＩ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ））、細胞質チロシンキナーゼ（例えば、ｓｒｃファミリー、ｓｙｋ−ＺＡＰ７０ファミリー）、インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）、シグナル伝達・転写活性化因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴＳ、およびＳＴＡＴＥ、低酸素誘導因子（例えば、ＨＩＦ−１およびＨＩＦ−２）、核因子−カッパＢ（ＮＦ−Ｂ）、Ｎｏｔｃｈ受容体（例えば、Ｎｏｔｃｈ１〜４）、ｃ−Ｍｅｔ、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）、ＷＮＴ、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）およびその調節サブユニット、ＰＭＳＡ、ＰＲ−３、ＭＤＭ２、メソテリン、腎細胞ガン−５Ｔ４、ＳＭ２２−アルファ、炭酸脱水酵素Ｉ（ＣＡＩ）およびＩＸ（ＣＡＩＸ）（これはＧ２５０としてもまた知られている）、ＳＴＥＡＤ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＧＤ２、プロテイナーゼ３、ｈＴＥＲＴ、肉腫転位ブレークポイント、ＥｐｈＡ２、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２とＥＴＳとの融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリアン、ＰＳＣＡ、ｓＬｅ、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧＬｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧｓＳ、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン（ｌｅｇｕｍａｉｎ）、ＴＩＥ２、Ｐａｇｅ４、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＭＡＤ−ＣＴ−２、ｆｏｓ関連抗原１、ＣＢＸ２、ＣＬＤＮ６、ＳＰＡＮＸ、ＴＰＴＥ、ＡＣＴＬ８、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＳＵＮＣ１、ＬＲＲＮ１およびイディオタイプ。
【００８９】
本明細書中に記載される方法における使用のためにその抗原が意図される例示的な病原性生物には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、Ａ型、Ｂ型およびＣ型インフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ポリオーマウイルス（例えば、ＢＫウイルスおよびＪＣウイルス）、アデノウイルス、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含むブドウ球菌属菌種、および肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を含むストレプトコッカス属菌種が含まれる。当業者によって理解されるであろうように、本明細書中に記載されるような抗原として使用されるためのこれらの病原性微生物および他の病原性微生物に由来するタンパク質、ならびに当該タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、刊行物において、また、公開されているデータベースにおいて、例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（登録商標）およびＴＲＥＭＢＬ（登録商標）などにおいて特定される場合がある。
【００９０】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来する抗原には、ＨＩＶビリオン構造タンパク質（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｐ１７、ｐ２４）、プロテアーゼ、逆転写酵素、またはｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒおよびｖｐｕによってコードされるＨＩＶタンパク質のどれもが含まれる。
【００９１】
単純ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ１およびＨＳＶ２）に由来する抗原には、ＨＳＶ後期遺伝子から発現されるタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。後期の遺伝子群は主に、ビリオン粒子を形成するタンパク質をコードする。そのようなタンパク質には、本明細書中に記載されるような抗原としてそれぞれが使用されるかもしれないが、ウイルスカプシドを形成する５つのタンパク質（ＵＬ）（ＵＬ６、ＵＬ１８、ＵＬ３５、ＵＬ３８および主要キャプシドタンパク質ＵＬ１９）、ＵＬ４５、およびＵＬ２７が含まれる。本明細書中において抗原としての使用のために意図される他の例示的なＨＳＶタンパク質には、ＩＣＰ２７（Ｈ１、Ｈ２）、糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）および糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）の各タンパク質が含まれる。ＨＳＶゲノムは、抗原として使用される可能性があり得るかもしれないタンパク質をそれぞれがコードする少なくとも７４個の遺伝子を含む。
【００９２】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する抗原には、ＣＭＶ構造タンパク質、ウイルス複製の前初期段階および初期段階の期間中に発現するウイルス抗原、糖タンパク質Ｉおよび糖タンパク質ＩＩＩ、カプシドタンパク質、コートタンパク質、下部（ｌｏｗｅｒ）マトリックスタンパク質ｐｐ６５（ｐｐＵＬ８３）、ｐ５２（ｐｐＵＬ４４）、ＩＥ１および１Ｅ２（ＵＬ１２３およびＵＬ１２２）、ＵＬ１２８〜ＵＬ１５０の遺伝子クラスターからのタンパク質産物（Ｒｙｋｍａｎ他、２００６）、エンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、ｇＨ、ｇＮ、ならびにｐｐ１５０が含まれる。当業者によって理解されるであろうように、本明細書中に記載されるような抗原として使用されるためのＣＭＶタンパク質が刊行物において、また、公開されているデータベースにおいて、例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（登録商標）およびＴＲＥＭＢＬ（登録商標）などにおいて特定される場合がある（例えば、Ｂｅｎｎｅｋｏｖ他（２００４）、Ｌｏｅｗｅｎｄｏｒｆ他（２０１０）、Ｍａｒｓｃｈａｌｌ他（２００９）を参照のこと）。
【００９３】
ある特定の実施形態において使用のために意図されるエプスタイン・バン（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｎ）ウイルス（ＥＢＶ）由来の抗原には、ＥＢＶ溶解性タンパク質のｇｐ３５０およびｇｐ１１０、エプスタイン・バン核抗原（ＥＢＮＡ）−１、ＥＢＮＡ−２、ＥＢＮＡ−３Ａ、ＥＢＮＡ−３Ｂ、ＥＢＮＡ−３Ｃ、ＥＢＮＡリーダータンパク質（ＥＢＮＡ−ＬＰ）を含む潜伏周期感染（ｌａｔｅｎｔ  ｃｙｃｌｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の期間中に産生されるＥＢＶタンパク質、ならびに潜在性膜タンパク質（ＬＭＰ）−１、ＬＭＰ−２ＡおよびＬＭＰ−２Ｂが含まれる（例えば、Ｌｏｃｋｅｙ他（２００８）を参照のこと）。
【００９４】
本明細書中における使用のために意図される呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）由来の抗原には、ＲＳＶゲノムによってコードされる１１個のタンパク質のいずれか、またはその抗原性フラグメントが含まれる：ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ（ヌクレオカプシドタンパク質）、Ｍ（マトリックスタンパク質）ＳＨ、ＧおよびＦ（ウイルスコートタンパク質）、Ｍ２（第２のマトリックスタンパク質）、Ｍ２−１（伸長因子）、Ｍ２−２（転写調節）、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにリンタンパク質Ｐ。
【００９５】
使用のために意図される水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）由来の抗原には、ＶＳＶゲノムによってコードされる５つの主要なタンパク質のいずれか、およびその抗原性フラグメントが含まれる：ラージタンパク質（Ｌ）、糖タンパク質（Ｇ）、核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）およびマトリックスタンパク質（Ｍ）（例えば、Ｒｉｅｄｅｒ他（１９９９）を参照のこと）。
【００９６】
ある特定の実施形態において使用のために意図されるインフルエンザウイルス由来の抗原には、血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質のＭ１およびＭ２、ＮＳ１、ＮＳ２（ＮＥＰ）、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ１−Ｆ２、ならびにＰＢ２が含まれる。
【００９７】
例示的なウイルス抗原にはまた、アデノウイルスポリペプチド、アルファウイルスポリペプチド、カリシウイルスポリペプチド（例えば、カリシウイルスカプシド抗原）、コロナウイルスポリペプチド、ジステンパーウイルスポリペプチド、エボラウイルスポリペプチド、エンテロウイルスポリペプチド、フラビウイルスポリペプチド、肝炎ウイルス（ＡＥ）ポリペプチド（Ｂ型肝炎コア抗原もしくは表面抗原、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ１糖タンパク質もしくはＥ２糖タンパク質、コアタンパク質または非構造タンパク質）、ヘルペスウイルスポリペプチド（単純ヘルペスウイルスまたは水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質を含む）、感染性腹膜炎ウイルスポリペプチド、白血病ウイルスポリペプチド、マールブルグウイルスポリペプチド、オルソミクソウイルスポリペプチド、パピローマウイルスポリペプチド、パラインフルエンザウイルスポリペプチド（例えば、血球凝集素ポリペプチドおよびノイラミニダーゼポリペプチド）、パラミクソウイルスポリペプチド、パルボウイルスポリペプチド、ペスチウイルスポリペプチド、ピコルナウイルスポリペプチド（例えば、ポリオウイルスカプシドポリペプチド）、ポックスウイルスポリペプチド（例えば、ワクシニアウイルスポリペプチド）、狂犬病ウイルスポリペプチド（例えば、狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ）、レオウイルスポリペプチド、レトロウイルスポリペプチド、およびロタウイルスポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
ある特定の実施形態において、抗原は細菌抗原である場合がある。ある特定の実施形態において、対象となる細菌抗原は分泌型ポリペプチドである場合がある。他のある特定の実施形態において、細菌抗原には、ポリペプチドの一部分（１つまたは複数）が細菌の外側細胞表面に露出している抗原が含まれる。
【００９９】
使用のために意図される、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含むブドウ球菌属菌種に由来する抗原には、ビルレンス調節因子（例えば、Ａｇｒ系など）、ＳａｒおよびＳａｅ、Ａｒｌ系、Ｓａｒホモログ（Ｒｏｔ、ＭｇｒＡ、ＳａｒＳ、ＳａｒＲ、ＳａｒＴ、ＳａｒＵ、ＳａｒＶ、ＳａｒＸ、ＳａｒＺおよびＴｃａＲ）、Ｓｒｒ系およびＴＲＡＰが含まれる。抗原として役立ち得る他のブドウ球菌タンパク質には、Ｃｌｐタンパク質、ＨｔｒＡ、ＭｓｒＲ、アコニターゼ、ＣｃｐＡ、ＳｖｒＡ、Ｍｓａ、ＣｆｖＡおよびＣｆｖＢが含まれる（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００８、Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｊｏｄｉ  Ｌｉｎｄｓａｙ編）を参照のこと）。黄色ブドウ球菌の２つの種（Ｎ３１５およびＭｕ５０）についてのゲノムが配列決定されており、例えば、ＰＡＴＲＩＣにおいて公開されている（ＰＡＴＲＩＣ：Ｔｈｅ  ＶＢＩ  ＰａｔｈｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓｎｙｄｅｒ他、２００７）。当業者によって理解されるであろうように、抗原として使用されるためのブドウ球菌タンパク質がまた、他の公開されているデータベースにおいて、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（登録商標）およびＴｒＥＭＢＬ（登録商標）などにおいて特定される場合がある。
【０１００】
本明細書中に記載されるある特定の実施形態において使用のために意図される肺炎連鎖球菌由来の抗原には、ニューモリシン、ＰｓｐＡ、コリン結合タンパク質Ａ（ＣｂｐＡ）、ＮａｎＡ、ＮａｎＢ、ＳｐｎＨＬ、ＰａｖＡ、ＬｙｔＡ、Ｐｈｔ、およびピリンタンパク質（ＲｒｇＡ；ＲｒｇＢ；ＲｒｇＣ）が含まれる。肺炎連鎖球菌の抗原性タンパク質もまた、この技術分野では知られており、いくつかの実施形態において抗原として使用される場合がる（例えば、Ｚｙｓｋ他（２０００）を参照のこと）。肺炎連鎖球菌の毒性株の完全なゲノム配列が配列決定されており、また、当業者によって理解されるであろうように、本明細書中における使用のためのＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質もまた、他の公開されているデータベースにおいて、例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（登録商標）およびＴＲＥＭＢＬ（登録商標）などにおいて特定される場合がある。本開示による抗原のための特に興味深いタンパク質には、ビルレンス因子、および肺炎球菌の表面に曝露することが予測されるタンパク質が含まれる（例えば、Ｆｒｏｌｅｔ他（２０１０）を参照のこと）。
【０１０１】
抗原として使用され得る細菌抗原の例には、アクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）ポリペプチド、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ポリペプチド、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）ポリペプチド、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）ポリペプチド、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）ポリペプチド、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）ポリペプチド（例えば、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのＯｓｐＡ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）ポリペプチド、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）ポリペプチド、カプノシトファガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）ポリペプチド、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）ポリペプチド、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ポリペプチド、コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）ポリペプチド、デルマトフィルス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ）ポリペプチド、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）ポリペプチド、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）ポリペプチド、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ポリペプチド、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）ポリペプチド、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ポリペプチド、ヘモバルトネラ（Ｈａｅｍｏｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）ポリペプチド、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリペプチド（例えば、ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの外膜タンパク質）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）ポリペプチド、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）ポリペプチド、Ｌ型細菌ポリペプチド、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）ポリペプチド、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）ポリペプチド、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）ポリペプチド、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）ポリペプチド、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ポリペプチド、ネオリケッチア（Ｎｅｏｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）ポリペプチド、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）ポリペプチド、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）ポリペプチド、ペプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）ポリペプチド、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）ポリペプチド、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）ポリペプチド（すなわち、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのポリペプチド）（本明細書中の説明を参照のこと）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）ポリペプチド、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ポリペプチド、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）ポリペプチド、ロシャリメア（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）ポリペプチド、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ポリペプチド、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ポリペプチド、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ポリペプチド、Ａ群連鎖球菌ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＭタンパク質）、Ｂ群連鎖球菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）ポリペプチド、トレポネマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）ポリペプチド、およびエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）ポリペプチド（例えば、Ｙ  ｐｅｓｔｉｓのＦ１抗原およびＶ抗原）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０２】
真菌抗原の例には、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）ポリペプチド、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ポリペプチド、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）ポリペプチド、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ポリペプチド、バシジオボルス（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）ポリペプチド、ビポラリス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）ポリペプチド、ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）ポリペプチド、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）ポリペプチド、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）ポリペプチド、コニジオボルス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）ポリペプチド、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）ポリペプチド、クルバラリア（Ｃｕｒｖａｌａｒｉａ）ポリペプチド、エピデルモフィトン（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）ポリペプチド、エクソフィアラ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）ポリペプチド、ゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）ポリペプチド、ヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）ポリペプチド、マズレラ（Ｍａｄｕｒｅｌｌａ）ポリペプチド、マラセジア（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）ポリペプチド、ミクロスポルム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）ポリペプチド、モニリエラ（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ）ポリペプチド、モルチエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）ポリペプチド、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）ポリペプチド、ペシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）ポリペプチド、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）ポリペプチド、フィアレモニウム（Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｕｍ）ポリペプチド、フィアロフォラ（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ）ポリペプチド、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）ポリペプチド、シュードアレシェリア（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ）ポリペプチド、シュードミクロドキウム（Ｐｓｅｕｄｏｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ）ポリペプチド、フィチウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）ポリペプチド、リノスポリジウム（Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）ポリペプチド、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）ポリペプチド、スコレコバシジウム（Ｓｃｏｌｅｃｏｂａｓｉｄｉｕｍ）ポリペプチド、スポロトリクス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）ポリペプチド、ステムフィリウム（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ）ポリペプチド、白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）ポリペプチド、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）ポリペプチド、およびキシロヒファ（Ｘｙｌｏｈｙｐｈａ）ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０３】
原生動物寄生虫抗原の例には、バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）ポリペプチド、バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ）ポリペプチド、ベスノイチア（Ｂｅｓｎｏｉｔｉａ）ポリペプチド、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）ポリペプチド、エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）ポリペプチド、エンセファリトゾーン（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ）ポリペプチド、エントアメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）ポリペプチド、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）ポリペプチド、ハモンジア（Ｈａｍｍｏｎｄｉａ）ポリペプチド、ヘパトゾーン（Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ）ポリペプチド、イソスポラ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）ポリペプチド、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）ポリペプチド、微胞子虫（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）ポリペプチド、ネオスポラ（Ｎｅｏｓｐｏｒａ）ポリペプチド、ノセマ（Ｎｏｓｅｍａ）ポリペプチド、ペンタトリコモナス（Ｐｅｎｔａｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）ポリペプチド、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。蠕虫寄生虫抗原の例には、アカントケイロネマ（Ａｃａｎｔｈｏｃｈｅｉｌｏｎｅｍａ）ポリペプチド、アエルロストロンギルス（Ａｅｌｕｒｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）ポリペプチド、アンシロストーマ（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ）ポリペプチド、住血線虫（Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）ポリペプチド、回虫（Ａｓｃａｒｉｓ）ポリペプチド、ブルギア（Ｂｒｕｇｉａ）ポリペプチド、ブノストムム（Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕｍ）ポリペプチド、キャピラリア（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ）ポリペプチド、シャベルチア（Ｃｈａｂｅｒｔｉａ）ポリペプチド、クーペリア（Ｃｏｏｐｅｒｉａ）ポリペプチド、クレノソーマ（Ｃｒｅｎｏｓｏｍａ）ポリペプチド、ジクチオカウルス（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ）ポリペプチド、ジオクトフィメ（Ｄｉｏｃｔｏｐｈｙｍｅ）ポリペプチド、ジペタロネマ（Ｄｉｐｅｔａｌｏｎｅｍａ）ポリペプチド、ジフィロボトリウム（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ）ポリペプチド、ジプリジウム（Ｄｉｐｌｙｄｉｕｍ）ポリペプチド、イヌ糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ）ポリペプチド、ドラクンクルス（Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ）ポリペプチド、蟯虫（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ）ポリペプチド、フィラロイデス（Ｆｉｌａｒｏｉｄｅｓ）ポリペプチド、ヘモンクス（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）ポリペプチド、ラゴキルアスカリス（Ｌａｇｏｃｈｉｌａｓｃａｒｉｓ）ポリペプチド、ロア糸状虫（Ｌｏａ）ポリペプチド、マンソネラ（Ｍａｎｓｏｎｅｌｌａ）ポリペプチド、ミューレリウス（Ｍｕｅｌｌｅｒｉｕｓ）ポリペプチド、ナノフィエツス（Ｎａｎｏｐｈｙｅｔｕｓ）ポリペプチド、アメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ）ポリペプチド、ネマトジルス（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ）ポリペプチド、エソファゴストムム（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ）ポリペプチド、オンコセルカ（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ）ポリペプチド、オピストルキス（Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ）ポリペプチド、オステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）ポリペプチド、パラフィラリア（Ｐａｒａｆｉｌａｒｉａ）ポリペプチド、肺吸虫（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）ポリペプチド、パラアスカリス（Ｐａｒａｓｃａｒｉｓ）ポリペプチド、フィサロプテラ（Ｐｈｙｓａｌｏｐｔｅｒａ）ポリペプチド、プロトストロンギルス（Ｐｒｏｔｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）ポリペプチド、セタリア（Ｓｅｔａｒｉａ）ポリペプチド、スピロセルカ（Ｓｐｉｒｏｃｅｒｃａ）ポリペプチド、スピロメトラ（Ｓｐｉｒｏｍｅｔｒａ）ポリペプチド、ステファノフィラリア（Ｓｔｅｐｈａｎｏｆｉｌａｒｉａ）ポリペプチド、ストロンギロイデス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ）ポリペプチド、円虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）ポリペプチド、テラジア（Ｔｈｅｌａｚｉａ）ポリペプチド、トキサスカリス（Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ）ポリペプチド、トキソカラ（Ｔｏｘｏｃａｒａ）ポリペプチド、旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ）ポリペプチド、毛様線虫（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）ポリペプチド、鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）ポリペプチド、ウンシナリア（Ｕｎｃｉｎａｒｉａ）ポリペプチド、およびウケレリア（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ）ポリペプチド、（例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのスポロゾイト周囲（ＰｆＣＳＰ））、スポロゾイト表面タンパク質２（ＰｆＳＳＰ２）、肝臓状態抗原１のカルボキシル末端（ＰｆＬＳＡ１  ｃ−ｔｅｒｍ）、および輸出タンパク質１（ＰｆＥｘｐ−１）、ニューモシスチス（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）ポリペプチド、サルコシスチス（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ）ポリペプチド、住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）ポリペプチド、タイレリア（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）ポリペプチド、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）ポリペプチド、およびトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０４】
外部寄生虫抗原の例には、ノミ、マダニ（カタダニおよびヒメダニを含む）、ハエ（例えば、ユスリカなど）、蚊、スナバエ、ブユ、ウマバエ、ノサシバエ、メクラアブ、ツェツェバエ、サシバエ、ハエ幼虫症を引き起こすハエおよびヌカカ（ｂｉｔｉｎｇ  ｇｎａｔｓ）、アリ、クモ、シラミ、コダニ、ならびに半翅目昆虫（例えば、トコジラミおよびサシガメなど）からのポリペプチド（抗原、同様にまたアレルゲンを含む）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０５】
Ｄ．ＣＤ８αβ共受容体
具体的な実施形態において、本開示のＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞は外因性のＣＤ８αβ共受容体を発現する。ＣＤ８αβ共受容体は具体的な実施形態においては哺乳動物供給源に由来しており、ヒト、ラットおよびマウスなどに由来する場合がある。
【０１０６】
ＣＤ８α核酸分子の一例がアクセッション番号ＢＣ０２５７１５でＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースにあり、その配列が下記において提供される：
【０１０７】
1 gcgtcatggc cttaccagtg accgccttgc tcctgccgct ggccttgctg ctccacgccg
【０１０８】
61 ccaggccgag ccagttccgg gtgtcgccgc tggatcggac ctggaacctg ggcgagacag
【０１０９】
121 tggagctgaa gtgccaggtg ctgctgtcca acccgacgtc gggctgctcg tggctcttcc
【０１１０】
181 agccgcgcgg cgccgccgcc agtcccacct tcctcctata cctctcccaa aacaagccca
【０１１１】
241 aggcggccga ggggctggac acccagcggt tctcgggcaa gaggttgggg gacaccttcg
【０１１２】
301 tcctcaccct gagcgacttc cgccgagaga acgagggctg ctatttctgc tcggccctga
【０１１３】
361 gcaactccat catgtacttc agccacttcg tgccggtctt cctgccagcg aagcccacca
【０１１４】
421 cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc
【０１１５】
481 tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact
【０１１６】
541 tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt
【０１１７】
601 cactggttat caccctttac tgcaaccaca ggaaccgaag acgtgtttgc aaatgtcccc
【０１１８】
661 ggcctgtggt caaatcggga gacaagccca gcctttcggc gagatacgtc taaccctgtg
【０１１９】
721 caacagccac tacattactt caaactgaga tccttccttt tgagggagca agtccttccc
【０１２０】
781 tttcattttt tccagtcttc ctccctgtgt attcattctc atgattatta ttttagtggg
【０１２１】
841 ggcggggtgg gaaagattac tttttcttta tgtgtttgac gggaaacaaa actaggtaaa
【０１２２】
901 atctacagta caccacaagg gtcacaatac tgttgtgcgc acatcgcggt agggcgtgga
【０１２３】
961 aaggggcagg ccagagctac ccgcagagtt ctcagaatca tgctgagaga gctggaggca
【０１２４】
1021 cccatgccat ctcaacctct tccccgcccg ttttacaaag ggggaggcta aagcccagag
【０１２５】
1081 acagcttgat caaaggcaca cagcaagtca gggttggagc agtagctgga gggaccttgt
【０１２６】
1141 ctcccagctc agggctcttt cctccacacc attcaggtct ttctttccga ggcccctgtc
【０１２７】
1201 tcagggtgag gtgcttgagt ctccaacggc aagggaacaa gtacttcttg atacctggga
【０１２８】
1261 tactgtgccc agagcctcga ggaggtaatg aattaaagaa gagaactgcc tttggcagag
【０１２９】
1321 ttctataatg taaacaatat cagacttttt tttttataat caagcctaaa attgtataga
【０１３０】
1381 cctaaaataa aatgaagtgg tgagcttaac cctggaaaat gaatccctct atctctaaag
【０１３１】
1441 aaaatctctg tgaaacccct atgtggaggc ggaattgctc tcccagccct tgcattgcag
【０１３２】
1501 aggggcccat gaaagaggac aggctacccc tttacaaata gaatttgagc atcagtgagg
【０１３３】
1561 ttaaactaag gccctcttga atctctgaat ttgagataca aacatgttcc tgggatcact
【０１３４】
1621 gatgactttt tatactttgt aaagacaatt gttggagagc ccctcacaca gccctggcct
【０１３５】
1681 ctgctcaact agcagataca gggatgaggc agacctgact ctcttaagga ggctgagagc
【０１３６】
1741 ccaaactgct gtcccaaaca tgcacttcct tgcttaaggt atggtacaag caatgcctgc
【０１３７】
1801 ccattggaga gaaaaaactt aagtagataa ggaaataaga accactcata attcttcacc
【０１３８】
1861 ttaggaataa tctcctgtta atatggtgta cattcttcct gattattttc tacacataca
【０１３９】
1921 tgtaaaatat gtctttcttt tttaaatagg gttgtactat gctgttatga gtggctttaa
【０１４０】
1981 tgaataaaca tttgtagcat cctctttaat gggtaaacag catccgaaaa aaaaaaaaaa
【０１４１】
2041 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
【０１４２】
2101 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
【０１４３】
ＣＤ８αタンパク質分子の一例がアクセッション番号ＡＡＨ２５７１５でＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースにあり、その配列が下記において提供される：
【０１４４】
1 malpvtalll plalllhaar psqfrvspld rtwnlgetve lkcqvllsnp tsgcswlfqp
【０１４５】
61 rgaaasptfl lylsqnkpka aegldtqrfs gkrlgdtfvl tlsdfrrene gcyfcsalsn
【０１４６】
121 simyfshfvp vflpakpttt paprpptpap tiasqplslr peacrpaagg avhtrgldfa
【０１４７】
181 cdiyiwapla gtcgvlllsl vitlycnhrn rrrvckcprp vvksgdkpsl saryv
【０１４８】
ＣＤ８β核酸分子の一例がアクセッション番号ＢＣ１００９１２でＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースにあり、その配列が下記において提供される：
【０１４９】
1 gcgactgtct ccgccgagcc cccggggcca ggtgtcccgg gcgcgccacg atgcggccgc
【０１５０】
61 ggctgtggct cctcttggcc gcgcagctga cagttctcca tggcaactca gtcctccagc
【０１５１】
121 agacccctgc atacataaag gtgcaaacca acaagatggt gatgctgtcc tgcgaggcta
【０１５２】
181 aaatctccct cagtaacatg cgcatctact ggctgagaca gcgccaggca ccgagcagtg
【０１５３】
241 acagtcacca cgagttcctg gccctctggg attccgcaaa agggactatc cacggtgaag
【０１５４】
301 aggtggaaca ggagaagata gctgtgtttc gggatgcaag ccggttcatt ctcaatctca
【０１５５】
361 caagcgtgaa gccggaagac agtggcatct acttctgcat gatcgtcggg agccccgagc
【０１５６】
421 tgaccttcgg gaagggaact cagctgagtg tggttgattt ccttcccacc actgcccagc
【０１５７】
481 ccaccaagaa gtccaccctc aagaagagag tgtgccggtt acccaggcca gagacccaga
【０１５８】
541 agggcctcaa ggggaaggtg tatcaggaac ctttgtcccc caatgcctgc atggatacta
【０１５９】
601 cagcaatact acaacctcac agaagctgct taacccatgg atcctgaaaa cataggcaag
【０１６０】
661 aagcacaggt cctgatgagt ggatctttac tacttttacc agatt
【０１６１】
ＣＤ８βタンパク質分子の一例がアクセッション番号ＡＡＩ００９１３でＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースにあり、その配列が下記において提供される：
【０１６２】
1 mrprlwllla aqltvlhgns vlqqtpayik vqtnkmvmls ceakislsnm riywlrqrqa
【０１６３】
61 pssdshhefl alwdsakgti hgeeveqeki avfrdasrfi lnltsvkped sgiyfcmivg
【０１６４】
121 speltfgkgt qlsvvdflpt taqptkkstl kkrvcrlprp etqkglkgkv yqeplspnac
【０１６５】
181 mdttailqph rsclthgs
【０１６６】
Ｅ．作製のための細胞
ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞は１つまたは複数の個体からのサンプルから選択され得る。サンプルは、処置を受けている個体から得られる場合があり、したがって、処置を受けている個体に関して自家である。他の場合において、サンプルは、細胞による処置を受けている個体とは異なる個体から得られ、したがって、処置を受けている個体に関して同種である。ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞は、治療を必要としている個体を含めて、対象から、特にヒト対象から単離される免疫細胞から選択される場合がある。免疫細胞を、血液、臍帯血、脾臓、胸腺、リンパ節および骨髄（これらに限定されない）を含めて、対象において存在するどのような場所からであっても採取することができる。単離された免疫細胞はそのまま使用される場合があり、または、例えば、凍結することなどによって、一定の期間にわたって貯蔵することができる。
【０１６７】
免疫細胞は、血液（血液バンクまたは臍帯血液バンクによって集められる血液を含む）、脾臓、骨髄、外科的手技の期間中に取り出される組織および／または露出する組織、ならびに生検手技を介して得られる組織（これらに限定されない）を含めて、免疫細胞が存在するどのような組織からであっても富化／精製され得る。免疫細胞が富化される、単離される、および／または精製される組織／臓器が、生体および非生体の両方の対象から単離される場合があり、ただし、非生体の対象は臓器ドナーである。特定の実施形態において、免疫細胞は血液から単離され、例えば、末梢血または臍帯血などから単離される。いくつかの局面において、臍帯血から単離される免疫細胞は、免疫調節能が増強されている。具体的な局面において、免疫細胞は、増強された免疫調節能のために、プールされた血液から、特に、プールされた臍帯血から単離される。プールされた血液は２つ以上の供給源からのものである場合があり、例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはそれ以上の供給源（例えば、ドナー対象）などからのものである場合がある。
【０１６８】
ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞が由来する免疫細胞の集団を、治療を必要としている対象、または疾患に罹患している対象から得ることができる。したがって、これらの細胞は、治療を必要としている対象に対して自家であろう。代替において、免疫細胞の集団をドナーから得ることができ、好ましくは組織適合性一致のドナーから得ることができる。免疫細胞集団を、末梢血、臍帯血、骨髄、脾臓、あるいは、どのような他の臓器／組織であれ、免疫細胞が前記対象またはドナーにおいて存在する他の臓器／組織から採取することができる。免疫細胞は対象および／またはドナーの予備集団から単離することができ、例えば、プールされた臍帯血などから単離することができる。
【０１６９】
免疫細胞の集団が対象とは異なるドナーから得られるとき、得られた細胞が対象に導入され得るという点で、得られた細胞が対象適合性であるならば、ドナーは好ましくは同種である。同種ドナー細胞はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合性である場合があり、またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合性でない場合がある。対象適合性にするために、同種細胞は、免疫原性を低下させるように処置することができる（Ｆａｓｔ他、２００４）。
【０１７０】
Ｆ．作製方法
当業者は、本開示の遺伝子組換え分子の発現のために、ベクターを標準的な組換え技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌ他（１９９６）、これらは両方が参照によって本明細書中に組み込まれる）により構築する能力が十分に備わっているであろう。遺伝子組換え分子は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを含めて、ベクターにおいて、またはベクターに基づいてレシピエント細胞に提供され得る。ウイルスベクターの例には、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルスまたはレトロウイルスが含まれる。非ウイルスベクターの例には、プラスミド、リポソームおよびナノ粒子などが含まれる。具体的な実施形態において、ベクターはレトロウイルス由来である。
【０１７１】
１．調節エレメント
【０１７２】
本開示において有用であるベクターに含められる発現カセットは特に、タンパク質コード配列に機能的に連結される真核生物転写プロモーター、介在配列を含むスプライスシグナル、および転写終結／ポリアデニル化配列を（５’から３’の方向で）含有する。タンパク質コード遺伝子の転写を真核生物細胞において制御するプロモーターおよびエンハンサーは、多数の遺伝子エレメントから構成される場合がある。細胞機構は、それぞれのエレメントによって伝えられる調節情報を集め、統合し、これにより、異なる遺伝子が転写調節の別個の、多くの場合には複雑なパターンを展開することを可能にすることができる。本開示との関連で使用されるプロモーターには、例えば、構成的プロモーター、誘導可能プロモーターおよび組織特異的プロモーターが含まれる。ベクターがガン治療の創出のために利用される場合には、プロモーターが低酸素の条件のもとで効果的であることがある。
【０１７３】
ａ．プロモーター／エンハンサー
【０１７４】
本明細書中において提供される発現構築物は、抗原受容体および他のシストロン遺伝子産物の発現を行わせるためのプロモーターを含む。プロモーターは一般には、ＲＮＡ合成のための開始部位の位置を定めるために機能する配列を含む。これの最もよく知られている例がＴＡＴＡボックスであり、しかし、ＴＡＴＡボックスを欠くいくつかのプロモーター、例えば、哺乳動物のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のためのプロモーター、およびＳＶ４０の後期遺伝子のためのプロモーターなどにおいては、開始部位そのものに重なる離散したエレメントが、開始の場所を定めるために役立つ。さらなるプロモーターエレメントにより、転写開始頻度が調節される。典型的には、これらは開始部位の上流側の領域に位置しており、だが、多くのプロモーターは、機能的エレメントを開始部位の下流側に同様に含有することが示されている。コード配列をプロモーターの「制御下に」するために、転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端が、選定されたプロモーターの「下流側」（すなわち、３’側）に配置される。「上流側」のプロモーターはＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促進させる。
【０１７５】
プロモーターエレメント間の間隔はしばしば柔軟性があり、そのため、エレメントが互いに逆になったとき、または互いに移動したとき、プロモーター機能は保持される。例えば、ｔｋプロモーターにおいては、プロモーターエレメント間の間隔を、活性が低下し始める前に、５０ｂｐ離れるまで増大させることができる。プロモーターに依存して、個々のエレメントが、転写を活性化するために協調的または独立的にそのどちらでも機能し得るようである。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用の調節配列を示す「エンハンサー」と併せて使用される場合があり、または使用されない場合がある。
【０１７６】
プロモーターは、コーディングセグメントおよび／またはエクソンの上流側に位置する５’側の非コード配列を単離することによって得られる場合があるように、核酸配列に生来的に関連するものである場合がある。そのようなプロモーターは、「内因性」であるとして示すことができる。同様に、エンハンサーは、核酸配列の下流側または上流側のどちらにでも位置する、核酸配列に生来的に関連するものである場合がある。代替において、ある種の利点が、コード核酸セグメントを組換えプロモーターまたは異種プロモーター（これは、核酸配列にその天然環境において通常の場合には関連しないプロモーターを示す）の制御下に配置することによって得られるであろう。組換えまたは異種のエンハンサーもまた、核酸配列にその天然環境において通常の場合には関連しないエンハンサーを示す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、ならびにどのような他のウイルスまたは原核生物細胞もしくは真核生物細胞からであっても単離されるプロモーターまたはエンハンサー、ならびに「天然に存在し」ないプロモーターまたはエンハンサー、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント、および／または発現を変化させる変異を含有するプロモーターまたはエンハンサーが含まれる場合がある。例えば、組換えＤＮＡ構築において最も一般に使用されるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースのプロモーター系、およびトリプトファン（ｔｒｐ）のプロモーター系が含まれる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成により作製することに加えて、様々な配列が、本明細書中に開示される組成物に関連して、ＰＣＲ（商標）を含めて組換えクローニング技術および／または核酸増幅技術を使用して作製される場合がある。さらに、核を持たないオルガネラ（例えば、ミトコンドリアおよび葉緑体など）の内部において配列の転写および／または発現を導く制御配列が同様に用いられ得ることが意図される。
【０１７７】
当然のことながら、発現のために選定されるオルガネラ、細胞タイプ、組織、器官または生物におけるＤＮＡセグメントの発現を効果的に導くプロモーターおよび／またはエンハンサーを用いることが重要であろう。分子生物学の分野の当業者は一般に、プロモーター、エンハンサーおよび細胞タイプの様々な組合わせがタンパク質発現のために使用されることを理解している（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）を参照のこと、これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。用いられるプロモーターは、例えば、組換えタンパク質および／または組換えペプチドの大規模産生において好都合であるように、導入されたＤＮＡセグメントの高レベルの発現を導くための適切な条件のもとで構成的、組織特異的、誘導可能、および／または有用である場合がある。プロモーターは異種または内因性である場合がある。
【０１７８】
加えて、どのような組合わせであれプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（例えば、ｅｐｄ．ｉｓｂ−ｓｉｂ．ｃｈ／でのワールドワイドウエブを介する真核生物プロモーターデータベースＥＰＤＢによるもの）もまた、発現を行わせるために使用され得るであろう。Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６の細胞質発現系の使用が、別の可能な実施形態である。真核生物細胞は、適切な細菌ポリメラーゼが送達複合体の一部として、またはさらなる遺伝子発現構築物としてそのどちらかで提供されるならば、ある種の細菌プロモーターからの細胞質転写を支援することができる。
【０１７９】
プロモーターの限定されない例には、初期または後期のウイルスプロモーター、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターまたは後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の初期プロモーターなど；真核生物細胞のプロモーター、例えば、ベータアクチンプロモーター、ＧＡＤＰＨプロモーター、メタロチオネインプロモーターなど；ならびに連鎖状応答エレメントプロモーター、例えば、環状ＡＭＰ応答エレメントプロモーター（ｃｒｅ）、血清応答エレメントプロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）、および最小のＴＡＴＡボックスの近くにある応答エレメントプロモーター（ｔｒｅ）などが含まれる。ヒト成長ホルモンのプロモーター配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）に記載されるヒト成長ホルモン最小プロモーター、アクセッション番号Ｘ０５２４４、ヌクレオチド２８３〜３４１）またはマウス乳腺腫瘍プロモーター（これはＡＴＣＣから入手可能である；カタログ番号ＡＴＣＣ４５００７）を使用することもまた可能である。ある特定の実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶ  ＩＥ、デクチン−１、デクチン−２、ヒトＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８０、ＳＭ２２、ＲＳＶ、ＳＶ４０、Ａｄ  ＭＬＰ、ベータ−アクチン、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩのプロモーターであり、しかしながら、治療遺伝子の発現を行わせるために有用である他のプロモーターはどれも、本開示の実施に適用可能である。
【０１８０】
ある特定の局面において、本開示の方法はまた、エンハンサー配列、すなわち、プロモーターの活性を増大させ、かつ、シスで、しかも、その向きにかかわらず、（標的プロモーターから数キロベースにまで離れた）比較的長い距離にわたってさえ作用する可能性がある核酸配列に関する。しかしながら、エンハンサーは所与のプロモーターのごく近傍でもまた機能することがあるので、エンハンサー機能はそのような長い距離に必ずしも制限されない。
【０１８１】
ｂ．開始シグナルおよび連鎖発現
【０１８２】
特異的な開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳のために、本開示において提供される発現構築物において使用される場合がある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列が含まれる。ＡＴＧ開始コドンを含めて外因性の翻訳制御シグナルが提供される必要がある場合がある。当業者は、このことを決定し、必要なシグナルを提供することが容易にできるであろう。開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために所望のコード配列の読み枠と「インフレーム」でなければならないことが、広く知られている。外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは生来的または合成由来のどちらもが可能である。発現効率が、適切な転写エンハンサーエレメントを含むことによって増強される場合がある。
【０１８３】
ある特定の実施形態において、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用が、多重遺伝子または多シストロン性メッセージを作出するために使用される。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化Ｃａｐに依存する翻訳のリボソームスキャンモデルを迂回し、翻訳を内部部位において開始させることができる。ピコルナウイルス科の２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）から得られる様々なＩＲＥＳエレメントが記載されており、同様に哺乳動物メッセージから得られるＩＲＥＳも記載されている。ＩＲＥＳエレメントを異種のオープンリーディングフレームに連結することができる。多数のオープンリーディングフレームを、それぞれがＩＲＥＳによって隔てられて一緒になるように転写させ、これにより多シストロン性メッセージをもたらすことができる。ＩＲＥＳエレメントによって、それぞれのオープンリーディングフレームが、リボソームにとって、効率的な翻訳のために利用可能である。多数の遺伝子を、１つだけのメッセージを転写するためにただ１つのプロモーター／エンハンサーを使用して効率的に発現させることができる。
【０１８４】
ある特定の２Ａ配列エレメントが、本開示において提供される構築物における遺伝子の連鎖発現または共発現を生じさせるために使用される場合がある。例えば、切断配列が、オープンリーディングフレームを連結して１つのシストロンを形成することによって遺伝子の共発現を行うために使用され得るであろう。１つの例示的な切断配列が、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）もしくはＦ２Ａ（口蹄疫ウイルス２Ａ）または「２Ａ様」配列（例えば、トセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス２Ａ；Ｔ２Ａ）またはブタテッショウウイルス−１（Ｐ２Ａ）である。具体的な実施形態において、１つのベクターでは、多数の２Ａ配列が同一ではなく、だが、代替の実施形態において、同じベクターが２つ以上の同じ２Ａ配列を利用する。２Ａ配列の様々な例が米国特許出願公開第２０１１／００６５７７９号（その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）において提供される。
【０１８５】
自己切断性の２Ａペプチドが利用される実施形態において、２Ａペプチドは、ポリペプチドの「切断」を真核生物細胞における翻訳の期間中に媒介する１８〜２２アミノ酸（ａａ）長のウイルスオリゴペプチドである場合がある。呼称「２Ａ」はウイルスゲノムの特定の領域を示し、種々のウイルス２Ａが一般には、それらが得られたウイルスにちなんで名付けられている。最初に発見された２ＡがＦ２Ａ（口蹄疫ウイルス）であり、その後、Ｅ２Ａ（ウマ鼻炎Ａウイルス）、Ｐ２Ａ（ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ）、およびＴ２Ａ（トセア・アシグナウイルス２Ａ）もまた特定された。２Ａ媒介「自己切断」の機構は、リボソームが２ＡのＣ末端でのグリシル−プロリルペプチド結合の形成をスキップすることであることが発見された。高度に保存された配列ＧＤＶＥＸＮＰＧＰが種々の２ＡによってＣ末端で共有されており、立体障害およびリボソームスキッピングをもたらすために有用である。翻訳のスキップおよび再開が成功すると、２つの「切断された」タンパク質が生じる。２Ａ配列の様々な例が下記の通りである：
【０１８６】
Ｔ２Ａ：（ＧＳＧ）ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号６）
【０１８７】
Ｐ２Ａ：（ＧＳＧ）ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号７）
【０１８８】
Ｅ２Ａ：（ＧＳＧ）ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号８）
【０１８９】
Ｆ２Ａ：（ＧＳＧ）ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号９）
【０１９０】
ｃ．複製起点
【０１９１】
ベクターを宿主細胞において増やすために、ベクターは、１つまたは複数の複製起点部位（これは「ｏｒｉ」と呼ばれることが多い）、例えば、複製が開始される特異的な核酸配列である、上記で記載されるようなＥＢＶのｏｒｉＰに対応する核酸配列、またはプログラミングにおける類似する機能もしくは高まった機能を有する遺伝子操作されたｏｒｉＰを含有する場合がある。代替において、上記で記載されるような他の染色体外複製ウイルスの複製起点、または自律的複製配列（ＡＲＳ）を用いることができる。
【０１９２】
ｄ．選択マーカーおよびスクリーニングマーカー
【０１９３】
いくつかの実施形態において、本開示の構築物を含有する細胞は、マーカーを発現ベクターに含むことによってインビトロまたはインビボにおいて特定される場合がある。そのようなマーカーは、特定可能な変化を細胞に与え、これにより、発現ベクターを含有する細胞の容易な特定を可能にするであろう。一般に、選択マーカーは、選択について可能にする性質を与えるものである。正の選択マーカーは、マーカーの存在がその選択について可能にするものであり、一方、負の選択マーカーは、その存在がその選択を妨げるものである。正の選択マーカーの一例が薬物耐性マーカーである。
【０１９４】
通常、薬物選択マーカーを含むことにより、形質転換体のクローニングおよび特定が助けられる。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ヒグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子が、有用な選択マーカーである。条件の実施に基づく形質転換体の識別について可能にする表現型を与えるマーカーに加えて、基礎が比色分析であるスクリーニングマーカー（例えば、ＧＦＰなど）を含めた他のタイプのマーカーもまた意図される。代替において、負の選択マーカーとしてのスクリーニングマーカー、例えば、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ｔｋ）、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などが利用される場合がある。当業者はまた、免疫学的マーカーを場合によりＦＡＣＳ分析と併せてどのように用いるかを知っているであろう。使用されるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることが可能である限り、重要でないと思われる。選択マーカーおよびスクリーニングマーカーのさらなる例が当業者には広く知られている。
【０１９５】
ｅ．自殺遺伝子
【０１９６】
本開示によって包含されるベクターを収容するために改変されている本開示の細胞は１つまたは複数の自殺遺伝子を含む場合がある。用語「自殺遺伝子」は、本明細書中で使用される場合、プロドラッグまたは他の薬剤が投与されたとき、その宿主細胞を殺す化合物への遺伝子産物の移行をもたらす遺伝子として定義される。使用され得る自殺遺伝子／プロドラッグの組み合わせの例として、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）およびガンシクロビル、アシクロビルまたはＦＩＡＵ；オキシドレダクターゼおよびシクロヘキシミド；シトシンデアミナーゼおよび５−フルオロシトシン；チミジンキナーゼチミジル酸キナーゼ（Ｔｄｋ：：Ｔｍｋ）およびＡＺＴ；ならびにデオキシシチジンキナーゼおよびシトシンアラビノシドが挙げられる。
【０１９７】
大腸菌のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（これは、プロドラッグの６−メチルプリンデオキシリボシドを毒性のプリン６−メチルプリンに変換するいわゆる自殺遺伝子である）が使用される場合がある。プロドラッグ療法とともに使用される自殺遺伝子の他の例として、大腸菌のシトシンデアミナーゼ遺伝子およびＨＳＶのチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。
【０１９８】
例示的な自殺遺伝子には、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＥＧＦＲｖ３、または誘導可能なカスパーゼ９が含まれる。１つの実施形態において、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩの短縮型（ＥＧＦＲｖ３）が、セツキシマブによって除去することができる自殺抗原として使用される場合がある。本開示において使用され得るこの技術分野で知られているさらなる自殺遺伝子には、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、シトクロームｐ４５０酵素（ＣＹＰ）、カルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）、カルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、グアニンリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＲＴＰ）、グリコシダーゼ酵素、メチオニン−α，γ−リアーゼ（ＭＥＴ）、およびチミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）が含まれる。具体的な実施形態において、米国仮特許出願第６２／７６９，４０５号（２０１８年１１月１９日出願）および米国仮特許出願第６２／７７３，３７２号（２０１８年１１月３０日出願）および米国仮特許出願第６２／７９１，４６４号（２０１９年１月１１日出願）（これらのすべてがそれらの全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されるように、細胞膜表面に発現する非分泌性のＴＮＦアルファタンパク質をコードする変異型ＴＮＦ−アルファ自殺遺伝子が利用され、これにより、非分泌性ＴＮＦアルファタンパク質が阻害剤によって、例えば、抗体などによって標的化されることが可能になる。
【０１９９】
ＩＶ．処置方法
【０２００】
いくつかの実施形態において、本開示は、免疫療法を含めて治療のための方法であって、ＣＤ８αβ共受容体を発現するように操作される本開示によって包含される免疫細胞の効果的な量を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、医学的な疾患または障害が、前記細胞をレシピエント個体に移入することによって処置される。本開示のある特定の実施形態において、ガンが、抗原を標的とする細胞集団を移入することによって処置される。本明細書中には、個体においてガンを処置するための、またはガンの進行を遅らせるための方法であって、（１つまたは複数の抗原に対して特異的である）抗原特異的細胞療法の効果的な量を個体に施すことを含む方法が提供される。
【０２０１】
治療を必要としている個体がガンを有する場合において、ガンは血液ガンであることがあり、または固形腫瘍を含むことがある。本処置方法が有用である腫瘍には、あらゆる悪性細胞タイプ、例えば、固形腫瘍または血液学的悪性腫瘍に見出される悪性細胞タイプなどが含まれる。例示的な固形腫瘍には、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭、首、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、メラノーマ、前立腺、皮膚、甲状腺、胆嚢、脾臓、肝臓、骨、子宮内膜、精巣、子宮頸部、食道、前立腺および乳房からなる群から選択される器官または組織の腫瘍が含まれ得るが、これらに限定されない。例示的な血液学的腫瘍には、骨髄の腫瘍、Ｔ細胞またはＢ細胞の悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、芽細胞腫および骨髄腫などの腫瘍が含まれる。本明細書中において提供される方法を使用して処置され得るガンのさらなる例には、肺ガン（小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、肺の腺ガン、および肺の扁平上皮ガンを含む）、腹膜のガン、胃部または胃のガン（胃腸ガンおよび消化管間質ガンを含む）、膵臓ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、乳ガン、結腸ガン、結腸直腸ガン、子宮内膜ガンまたは子宮ガン、唾液腺ガン、腎臓または腎臓部のガン、前立腺ガン、外陰部ガン、甲状腺ガン、様々なタイプの頭頸部ガン、およびメラノーマが含まれるが、これらに限定されない。
【０２０２】
ガンは具体的には下記の組織学的タイプのものである場合があり、だが、それらに限定されない：新生物、悪性；ガン腫；ガン腫、未分化型；巨細胞ガンおよび紡錘細胞ガン；小細胞ガン；乳頭ガン；扁平上皮ガン；リンパ上皮性ガン；基底細胞ガン；毛母ガン（ｐｉｌｏｍａｔｒｉｘ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；移行上皮ガン；乳頭状移行上皮ガン；腺ガン；ガストリノーマ、悪性；胆管ガン；肝細胞ガン；肝細胞ガンと胆管ガンとの混合型；小柱状腺ガン；腺様嚢胞ガン；腺腫性ポリープにおける腺ガン；腺ガン、家族性大腸ポリポーシス；固形ガン；カルチノイド腫瘍、悪性；鰓肺胞（ｂｒａｎｃｈｉｏｌｏ−ａｌｖｅｏｌａｒ）腺ガン；乳頭状腺ガン；嫌色素性ガン；好酸性（ａｃｉｄｏｐｈｉｌ）ガン；好酸性（ｏｘｙｐｈｉｌｉｃ）腺ガン；好塩基性ガン；明細胞腺ガン；顆粒細胞ガン；濾胞腺ガン；乳頭状濾胞腺ガン；非被包性硬化性ガン；副腎皮質ガン；類内膜ガン（ｅｎｄｏｍｅｔｒｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；皮膚付属器ガン；アポクリン腺ガン；皮脂腺ガン；耳垢腺ガン；粘表皮ガン；嚢胞腺ガン；乳頭状嚢胞腺ガン；乳頭状漿液性嚢胞腺ガン；粘液性嚢胞腺ガン；粘液性腺ガン；印環細胞ガン；浸潤性乳管ガン；髄様ガン；小葉ガン；炎症性乳ガン；パジェット病、乳房；腺房細胞ガン；腺扁平上皮ガン；扁平上皮化生を伴う腺ガン；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；アンドロブラストーマ、悪性；セルトリ細胞ガン；ライディッヒ細胞腫、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；パラガングリオーマ、悪性；乳房外パラガングリオーマ、悪性；クロム親和性細胞腫；グロムス血管肉腫；悪性メラノーマ；無色素性メラノーマ；表在拡大型メラノーマ；悪性黒子型メラノーマ；末端黒子型メラノーマ；結節性メラノーマ；巨大色素性母斑における悪性メラノーマ；類上皮細胞メラノーマ；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽細胞腫；ガン肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胎児性ガン；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛ガン；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管周囲細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣細胞腫；星状膠細胞腫；原形質性星状膠細胞腫；原線維性星状膠細胞腫；星状膠芽細胞腫；神経膠芽細胞腫；乏突起膠腫；乏突起膠芽細胞腫；未分化神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原性腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞型、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；他の指定された非ホジキンリンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫；低��性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小非切れ込み核細胞リンパ腫；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；悪性組織球腫；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病：好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；ヘアリー細胞白血病；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；および慢性骨髄芽球性白血病。
【０２０３】
特定の実施形態が白血病の処置方法に関する。白血病は血液または骨髄のガンであり、血液細胞、通常の場合には白色血液細胞（白血球）の異常な増殖（増倍による異常な生成）によって特徴づけられる。白血病は、血液学的新生物と呼ばれる幅広い一群の疾患の一部である。白血病は、広範な疾患を含む幅広い用語である。白血病は臨床的および病理学的にはその急性型および慢性型に分けられる。
【０２０４】
本開示のある特定の実施形態において、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋の遺伝子組換え細胞が、それを必要とする個体に、例えば、ガンを有する個体などに送達される。細胞はその後、個体の免疫システムを増強して、それぞれのガンを攻撃する。場合により、個体には、１回または複数回の細胞が与えられる。個体に２回以上の細胞が与えられる場合、投与間の期間は、個体における伝播のための時間を許すために十分でなければならず、具体的な実施形態において、服用間の期間が、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日またはそれ以上である。
【０２０５】
ある特定の実施形態において、細胞の成長および活性化を促進する増殖因子が、細胞と同時に、または細胞に続いてのどちらでも対象に投与される。免疫細胞増殖因子は、免疫細胞の成長および活性化を促進させる好適な増殖因子がどれも可能である。好適な免疫細胞増殖因子の例には、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−１２が含まれ、これらは単独で使用することができ、あるいは様々な組合わせで、例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−７、ＩＬ−２およびＩＬ−１５、ＩＬ−７およびＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５、ＩＬ−１２およびＩＬ−７、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５、またはＩＬ−１２およびＩＬ２などの組合わせで使用することができる。
【０２０６】
治療効果的な量の細胞を、非経口投与、例えば、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、胸骨内注射もしくは関節内注射、または注入を含めて多くの経路によって投与することができる。
【０２０７】
養子細胞療法において使用するための改変されたＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋細胞の治療効果的な量は、所望の効果を処置が行われている対象において達成するそのような量である。例えば、これは、ガンの発達を阻害するために、またはガンの退行を引き起こすために必要な免疫細胞の量であることが可能である。
【０２０８】
免疫細胞集団は、疾患と矛盾しない治療計画で、例えば、疾患状態を改善するために１日から数日にわたって１回または数回の服用で、あるいは疾患進行を抑制し、疾患再発を防止するために長期間にわたって定期的な服用で投与することができる。配合物において用いられるための正確な服用量は、投与経路、および疾患または障害の重篤度にもまた依存するであろうし、医師の判断およびそれぞれの患者の状況に応じて決定されなければならない。細胞の治療効果的な量は、処置を受けている対象、苦痛の重篤度およびタイプ、ならびに投与様式に依存するであろう。いくつかの実施形態において、ヒト対象の処置において使用され得るであろう服用量は、１ｍ２あたりの免疫細胞が少なくとも３．８×１０４個、少なくとも３．８×１０５個、少なくとも３．８×１０６個、少なくとも３．８×１０７個、少なくとも３．８×１０８個、少なくとも３．８×１０９個、または少なくとも３．８×１０１０個からの範囲である。ある特定の実施形態において、ヒト対象の処置において使用される服用量は、１ｍ２あたりの免疫細胞が約３．８×１０９  個から約３．８×１０１０個までの範囲である。さらなる実施形態において、免疫細胞の治療効果的な量は約５×１０６細胞／ｋｇ体重から約７．５×１０８細胞／ｋｇ体重まで変化させることができ、例えば、体重１ｋｇあたり約２×１０７個の細胞から約５×１０８個の細胞まで、または体重１ｋｇあたり約５×１０７個の細胞から約２×１０８個の細胞まで変化させることができる。免疫細胞の正確な量は、対象の年齢、体重、性別および生理学的状態に基づいて当業者によって容易に決定される。効果的な服用量を、インビトロ試験系または動物モデル試験系から導かれる用量応答曲線から外挿することができる。
【０２０９】
Ｖ．医薬組成物
【０２１０】
本明細書中にはまた、改変されたＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物および配合物が提供される。
【０２１１】
本明細書中に記載されるような医薬組成物および配合物は、所望の純度を有する有効成分（例えば、細胞など）を１つまたは複数の随意的な医薬的に許容され得るキャリア（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２２版、２０１２年）と混合することによって、凍結乾燥配合物または水溶液の形態で調製することができる。医薬的に許容され得るキャリアは一般に、用いられる投薬量および濃度においてレシピエントに対して無毒性であり、医薬的に許容され得るキャリアには、下記のものが含まれるが、それらに限定されない：緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸など；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム塩化物；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベンなど；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンなど；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンなど；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖、二糖および他の炭水化物；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡなど；糖，例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなど；塩形成対イオン、例えば、ナトリウムなど；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など。本明細書中における例示的な医薬的に許容され得るキャリアにはさらに、介在性（ｉｎｓｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ）薬物分散剤、例えば、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）など、例えば、ヒトの可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などが含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含めて、ある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰおよび使用方法が、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号および同第２００６／０１０４９６８号に記載される。１つの局面において、ｓＨＡＳＥＧＰが１つまたは複数のさらなるグリコサミノグリカナーゼ（例えば、コンドロイチナーゼなど）と組み合わされる。
【０２１２】
ＶＩ．併用療法
【０２１３】
ある特定の実施形態において、本実施形態の組成物および方法は、少なくとも１つのさらなる治療法との組合わせでの改変されたＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋のＴ細胞集団を必要とする。さらなる治療法は、放射線療法、手術（例えば、乳腺腫瘤摘出術および乳房切除術）、化学療法、遺伝子療法、ＤＮＡ療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法、免疫療法、骨髄移植、ナノ療法、モノクローナル抗体療法、または前述の組合わせである場合がある。さらなる治療法はアジュバント療法またはネオアジュバント療法の形態である場合がある。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、さらなる治療法は小分子酵素阻害剤または転移抑制剤の投与である。いくつかの実施形態において、さらなる治療法は、副作用制限剤（例えば、処置の副作用の発生および／または重篤度を軽減するために意図される薬剤（例えば、制吐剤など）など）の投与である。いくつかの実施形態において、さらなる治療法は放射線療法である。いくつかの実施形態において、さらなる治療法は手術である。いくつかの実施形態において、さらなる治療法は放射線療法と手術との組合わせである。いくつかの実施形態において、さらなる治療法はガンマ線照射である。いくつかの実施形態において、さらなる治療法は、ＰＢＫ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を標的とする治療、ＨＳＰ９０阻害剤、チューブリン阻害剤、アポトーシス阻害剤、および／または化学予防剤である。さらなる治療法は、この技術分野において知られている化学療法剤の１つまたは複数である場合がある。
【０２１５】
細胞療法が、さらなるガン治療法（例えば、免疫チェックポイント療法など）の前に、その期間中に、その後で、またはそれに対して様々な組合わせで施される場合がある。施すことが、同時から、数分にまで、数日にまで、数週間にまで及ぶ間隔で行われる場合がある。免疫細胞療法がさらなる治療剤とは別に患者に与えられる実施形態においては一般に、有効な期間がそれぞれの送達の時間との間で終了せず、その結果、２つの化合物が依然として、好都合な併用効果を患者に及ぼすことができるであろうになることが保証されるであろう。そのような場合、患者には抗体療法および抗ガン療法が互いに約１２時間〜２４時間または７２時間の範囲内で、より具体的には互いに約６時間〜１２時間の範囲内で与えられ得ることが意図される。いくつかの状況では、処置のための期間を著しく延長することが望ましい場合があり、この場合、数日（２、３、４、５、６または７）から数週間（１、２、３、４、５、６、７または８）までがそれぞれの投与の間において経過する。
【０２１６】
本実施形態の化合物または治療法をどのようなものであれ患者に施すことは、もし存在するならば薬剤の毒性を考慮して、そのような化合物の投与のための一般的プロトコルに従うであろう。したがって、いくつかの実施形態において、併用療法に起因し得る毒性をモニターする工程が存在する。次に、具体的な例が、個体がガンを有する実施形態に関して続く。
【０２１７】
Ａ．化学療法
広範囲の様々な化学療法剤が本実施形態に従って使用される場合がある。用語「化学療法」は、ガンを処置するために薬物を使用することを示す。「化学療法剤」は、ガンの処置において投与される化合物または組成物を暗示するために使用される。これらの薬剤または薬物は、細胞内におけるそれらの活性様式によって、例えば、それらが細胞周期に影響を与えるかどうか、およびどの段階で影響を与えるかによって分類される。代替において、薬剤は、ＤＮＡを直接に架橋し得るか、ＤＮＡ内に挿入し得るか、または核酸合成に影響を与えることによって染色体異常および有糸分裂異常を誘発し得るかに基づいて特徴づけられる場合がある。
【０２１８】
化学療法剤の例には、下記のものが含まれる：アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミドなど；アルキルスルホナート、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなど；アジリジン系化合物、例えば、ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）など；エチレンイミン系化合物およびメチルアメラミン系化合物（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）、例として、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチイレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン類（とりわけ、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン類（例として、合成類似体のトポテカン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（例として、その合成類似体のアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン）；クリプトフィシン類（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（例として、合成類似体のＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）類；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミドおよびウラシルマスタードなど；ニトロソウレア系化合物、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムスチンなど；抗生物質、例えば、エンジイン系抗生物質（例えば、カリケアマイシン、とりわけ、カリケアマイシンガンマＩ１およびカリケアマイシンオメガＩ１）など；ジネミシン、例として、ジネミシンＡ；ビスホスホナート系化合物、例えば、クロドロナートなど；エスペラミシン類；同様にまた、ネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連した色素タンパク質エンジイン系抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、オートラルニシン（ａｕｔｈｒａｒｎｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン類、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クモロミシニス（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（例として、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン類（例えば、マイトマイシンＣなど）、ミコフェノール酸、ノガラルニシン（ｎｏｇａｌａｒｎｙｃｉｎ）、オリボマイシン類、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチンおよびゾルビシン；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、プテロプテリンおよびトリメトレキサートなど；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリンおよびチオグアニンなど；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビンおよびフロクスウリジンなど；アンドロゲン類、例えば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピチオスタノール、メピチオスタンおよびテストラクトンなど；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）、例えば、ミトタンおよびトリロスタンなど；葉酸補充剤、例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）など；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン；エルホルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）；エポチロン類；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシノイド、例えば、メイタンシンおよびアンサミトシン類など；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫポリサッカリド複合体；ラゾキサン；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（とりわけ、Ｔ−２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；白金配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンなど；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロナート；イリノテカン���例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸など；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、ゲムシタビエン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｅｎ）、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、ならびに上記のいずれかの医薬的に許容され得る塩、酸または誘導体。
【０２１９】
Ｂ．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広範囲に使用されている他の要素には、γ線、Ｘ線として一般に知られているもの、および／または放射性同位体の腫瘍細胞への誘導送達が含まれる。他の形態のＤＮＡ損傷要素もまた意図される：例えば、マイクロ波、陽子線照射（米国特許第５，７６０，３９５号および同第４，８７０，２８７号）、およびＵＶ照射など。これらの要素のすべてが、ＤＮＡに対する、ＤＮＡの前駆体に対する、ＤＮＡの複製および修復に対する、また、染色体の組み立ておよび維持に対する広範囲の様々な損傷に影響する可能性が最も高い。Ｘ線についての適用量範囲が、長期間（３週間〜４週間）のための５０レントゲン〜２００レントゲンの１日線量から、２０００レントゲン〜６０００レントゲンの単回線量にまで及ぶ。放射性同位体についての適用量範囲は広範囲にわたって変化し、放射性同位体の半減期、放射される放射線の強度およびタイプ、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
【０２２０】
Ｃ．免疫療法
当業者は、さらなる免疫療法が本実施形態の方法との組合わせまたは併用で使用され得ることを理解するであろう。ガン処置との関連において、免疫療法は一般には、ガン細胞を標的とし、破壊するための免疫エフェクター細胞および免疫エフェクター分子の使用に依拠する。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））がそのような一例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面における何らかのマーカーについて特異的な抗体である場合がある。抗体は単独で、治療のエフェクターとして役立つ場合がある。あるいは、抗体は、実際に細胞殺傷に影響するために他の細胞を動員する場合がある。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）にコンジュゲート化され、標的化剤として役立つ場合がある。代替において、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的のどちらでも相互作用する表面分子を保持するリンパ球である場合がある。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が含まれる。
【０２２１】
抗体−薬物コンジュゲートが、ガン治療剤の開発に対する画期的な取り組みとして現れている。ガンは世界における主要な死因の１つである。抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、細胞殺傷薬物に共有結合により連結されるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含む。この取り組みでは、ＭＡｂの、その抗原標的に対する高い特異性が、非常に強力な細胞毒性薬物と組み合わされ、これにより、高まったレベルの抗原を有する腫瘍細胞にペイロード（薬物）を送達する「武装された」ＭＡｂをもたらしている。薬物の標的化された送達はまた、正常な組織におけるその曝露を最小限にし、これにより、毒性の低下および治療指数の改善をもたらしている。ＦＤＡによる２つのＡＤＣ薬物の承認により、すなわち、２０１１年におけるＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）および２０１３年におけるＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（トラスツズマブエムタンシンまたはＴ−ＤＭ１）の承認により、この取り組みが有効であることが証明された。現在では３０を超えるＡＤＣ薬物候補が、ガン処置のための臨床試験の様々な段階にある。抗体工学およびリンカー−ペイロード最適化がますます成熟しつつあるので、新しいＡＤＣの発見および開発は、この取り組みに対して好適である新しい標的の特定および検証、ならびに標的化用ＭＡｂの作製にますます依存している。ＡＤＣ標的のための２つの判断基準が、腫瘍細胞におけるアップレギュレーションされた／高い発現レベルと、影響を受けない内在化とである。
【０２２２】
免疫療法の１つの局面において、腫瘍細胞は、標的化されやすい何らかのマーカー、すなわち、他の細胞の大部分には存在しない何らかのマーカーを有しなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在しており、これらのどれもが、本実施形態との関連において標的化のために好適であり得る。一般的な腫瘍マーカーには、ＣＤ２０、ガン胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂ、およびｐ１５５が含まれる。免疫療法の１つの代替局面が、抗ガン作用を免疫刺激作用と組み合わせることである。免疫刺激分子もまた存在しており、これらには、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ガンマ−ＩＦＮなど）、ケモカイン（例えば、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８など）、および増殖因子（例えば、ＦＬＴ３リガンドなど）が含まれる。
【０２２３】
現時点で検討中または使用中である免疫療法の例として、免疫アジュバント、例えば、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、ジニトロクロロベンゼンおよび芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号および同第５，７３９，１６９号）；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、βおよびγ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ならびにＴＮＦ；遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２およびｐ５３（米国特許第５，８３０，８８０号および同第５，８４６，９４５号）；およびモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２および抗ｐ１８５（米国特許第５，８２４，３１１号）がある。１つまたは複数の抗ガン療法が本明細書中に記載される抗体療法とともに用いられ得ることが意図される。
【０２２４】
いくつかの実施形態において、免疫療法は免疫チェックポイント阻害剤である場合がある。免疫チェックポイントはシグナル（例えば、共刺激分子）を強めるか、またはシグナルを弱めるかのどちらもある。免疫チェックポイント遮断によって標的とされ得る抑制性の免疫チェックポイントには、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７−Ｈ３（これはＣＤ２７６としてもまた知られている）、Ｂ／Ｔリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４、これはＣＤ１５２としてもまた知られている）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ３）、プログラム死１（ＰＤ−１）、Ｔ細胞の免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）、ならびにＴ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）が含まれる。特に、免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ−１軸および／またはＣＴＬＡ−４を標的とする。
【０２２５】
Ｄ．手術
ガンを有する人のおよそ約６０％が、予防的、診断的または病期分類、治療的および緩和的な手術を含めて、何らかのタイプの手術を受けることになっている。治療的手術は、ガン性組織のすべてまたは一部が物理的に除かれ、切除され、かつ／または破壊される摘出を含み、他の治療法との併用で、例えば、本実施形態の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法および／または代替療法などとの併用で使用される場合がある。腫瘍摘出は、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除くことを示す。腫瘍摘出に加えて、手術による処置には、レーザー手術、凍結手術、電気手術および顕微鏡下手術（モース術）が含まれる。
【０２２６】
ガン性細胞、組織または腫瘍の一部またはすべてを切除すると、空洞が体内に形成される場合がある。処置が、灌流、直接注入、またはさらなる抗ガン療法による当該区域への局所適用によって達成される場合がある。そのような処置が、例えば、１日毎、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎もしくは７日毎に、または１週間毎、２週間毎、３週間毎、４週間毎および５週間毎に、または１か月毎、２か月毎、３か月毎、４か月毎、５か月毎、６か月毎、７か月毎、８か月毎、９か月毎、１０か月毎、１１か月毎もしくは１２か月毎に繰り返される場合がある。これらの処置は同様に、様々な投与量であり得る。
【０２２７】
Ｅ．他の薬剤
他の薬剤が、処置の治療効力を改善するために本実施形態のある特定の局面との組合わせで使用され得ることが意図される。これらのさらなる薬剤には、細胞表面受容体のアップレギュレーションおよびＧＡＰ結合に影響を与える薬剤、細胞増殖抑制剤および分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導剤に対する過剰増殖性細胞の感受性を増大させる薬剤、または他の生物学的薬剤が含まれる。ＧＡＰ結合の数を増加させることによる細胞間シグナル伝達における増大は、隣接する過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増大させるであろう。他の実施形態において、細胞増殖抑制剤または分化剤を、処置の抗過剰増殖効力を改善するために本実施形態のある特定の局面との組合わせで使用することができる。細胞接着の阻害剤が、本実施形態の効力を改善するために意図される。細胞接着阻害剤の例には、フォーカルアドヒージョンキナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンがある。アポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を増大させる他の薬剤（例えば、抗体ｃ２２５など）が、処置効力を改善するために本実施形態のある特定の局面との組合わせで使用され得るであろうことがさらに意図される。
【０２２８】
ＶＩＩ．製造品またはキット
【０２２９】
本発明のＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋細胞、あるいは本発明のＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋細胞が作製され得る細胞を含む製造品またはキットもまた、本明細書中において提供される。製造品またはキットはさらに、個体においてガンを処置するために、またはその進行を遅らせるために、あるいはガンを有する個体の免疫機能を増強するために細胞を使用するための説明書を含む添付文書を含むことができる。本明細書中に記載される抗原特異的細胞のいずれか、またはそれらを作製するための試薬が、製造品またはキットに含められる場合がある。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、バッグおよびシリンジが含まれる。容器は様々な材料から、例えば、ガラス、プラスチック（例えば、ポリ塩化ビニルまたはポリオレフィンなど）または金属合金（例えば、ステンレス鋼またはハステロイなど）などから形成され得る。いくつかの実施形態において、容器は配合物を収容し、容器上の標識、または容器に付随する標識により、使用のための指示が示される場合がある。製造品またはキットはさらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、ニードル、シリンジ、および使用のための説明書を伴う添付文書を含めて、商業的およびユーザーの観点から望ましい他の材料を含む場合がある。いくつかの実施形態において、製造品はさらに、１つまたは複数の別の薬剤（例えば、化学療法剤および抗腫瘍剤）を含む。そのような１つまたは複数の薬剤のための好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、バッグおよびシリンジが含まれる。
【実施例】
【０２３０】
下記の実施例は、本開示の特定の実施形態を明らかにするために含まれる。下記の実施例において開示される技術は、本開示の方法の実施において十分に機能することが本発明者によって見出された技術を表しており、したがって、その実施のための特定の態様を構成するとみなされ得ることが、当業者によって理解されなければならない。しかしながら、当業者は本開示に照らして、多くの変化を、開示される具体的な実施形態において行うことができ、また、多くの変化が依然として、同じような結果または類似する結果を本開示の精神および範囲から逸脱することなくもたらし得ることを理解しなければならない。
【０２３１】
（実施例１）
低アビディティーＴＣＲ遺伝子組換えＴ細胞による免疫療法のためのＣＤ８共受容体機能の利用
遺伝子組換えされたＴＣＲおよびＣＤ８αβの同時形質導入により、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋の両方のＴ細胞の表現型が改変される。自己ＴＣＲレパートリーから単離されたとき、過剰発現した腫瘍関連自己抗原を標的とするほとんどのＴＣＲは、アビディティーが低いことによって特徴づけられ、ＣＤ８共受容体に依存する２、１１。様々なタイプの測定が、ＴＣＲ−ペプチド−ＭＨＣ相互作用を特徴づけるために行われ得る３０。遺伝子組換えされたＣＤ８α鎖およびＣＤ８β鎖が、腫瘍が標的となるＴＣＲを組み込む多シストロン性ベクターから効率的に発現され得るかどうかを調べるために、サバイビン特異的ＴＣＲ（ｓ２４）、ＣＤ８αβおよび選択マーカー（ΔＣＤ２７１）をコードするレトロウイルスベクター（Ｔ８、図１Ａ）を構築し、同様にまた、ＴＣＲ（サバイビンｓ２４およびｓ１６、ＰＲＡＭＥ  ｐ２８およびｐ１１）またはＣＤ８αβを単独でコードするベクターを構築した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の選択されたＴ細胞に対して、ｓ２４−ＴＣＲまたはｓ２４−Ｔ８を用いた形質導入を行い、形質導入効率についての分析を行った。ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の両方が同等によく形質導入を受けた（％ＴＣＲ＋ＣＤ４対ＣＤ８：８２±９対８４±４、ｐ＝ＮＳ；％Ｔ８＋ＣＤ４対ＣＤ８：５２±１０対４５±８％、ｐ＝ＮＳ；ｎ＝６、平均±ＳＤ、図１Ｂ）。しかし、形質導入効率は、ＴＣＲ単独と比較して多シストロン性Ｔ８ベクターに関しては有意に低かった（ＣＤ４  ＴＣＲ＋対Ｔ８＋：ｐ＜０．００１、ＣＤ８  ＴＣＲ＋対Ｔ８＋：ｐ＜０．００１、ｎ＝６、図１Ｂ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞において、ＮＴ細胞、ＴＣＲ＋細胞およびＴ８＋細胞を比較したとき、ＣＤ８αのレベルが変化していなかった（図１Ｃ）。興味深いことに、ＣＤ８βのレベルが、ＴＣＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、Ｔ８＋Ｔ細胞では有意に高かった（ＣＤ８β  ＭＦＩ：６．３±２．７ｘ１０３対１．９±０．６ｘ１０３、ｎ＝７、平均±ＳＤ、ｐ＝０．００８、図１Ｄ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞においては、ＣＤ８αβとの同時形質導入により、ハイブリッド表現型が生じた。Ｔ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ８αの細胞表面レベルが、ＴＣＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に匹敵しており（ＣＤ８α  ＭＦＩ：４．６±１．７ｘ１０３対４．３±１．３ｘ１０３、ｎ＝６、平均±ＳＤ、ｐ＝ＮＳ）（図１Ｃ）、しかし、Ｔ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ８βの細胞表面レベルは、ＴＣＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して有意に低かった（ＣＤ８β  ＭＦＩ：１．０±０．６ｘ１０３対１．９±０．６ｘ１０３、ｎ＝７、平均±ＳＤ、ｐ＝０．００２）。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８αβがＴＣＲと一緒に共発現したとき、標的となるサバイビンエピトープを認識しただけであった（デキストラマーＭＦＩ、ＣＤ４  ＴＣＲ＋対Ｔ８＋：０．１±０．０８ｘ１０３対２．３±２．５ｘ１０３、ｐ＝０．０２；ＣＤ８  ＴＣＲ＋対Ｔ８＋：３．４±０．６ｘ１０３対４．２±２．６ｘ１０３、ｐ＝ＮＳ；ｎ＝５、平均±ＳＤ）（図１Ｅ）。デキストラマー結合が、ＴＣＲ＋Ｔ細胞およびＴ８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞において同等であり、Ｔ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞と、ＴＣＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞との間でもまた同程度であった（デキストラマーＭＦＩ  ２．３±２．５ｘ１０３対３．４��０．６ｘ１０３、ｐ＝ＮＳ）。したがって、ＣＤ８αβおよびクラスＩ制限ＴＣＲの強制発現は、（１）ＣＤ８βの増大した細胞表面レベルを有するＣＤ８＋Ｔ細胞と、（２）ＣＤ８αβ鎖の表面発現、そして、標的となるｐＭＨＣクラスＩ複合体を認識し、これと結合する新規な能力を有する、生来のＣＤ８＋Ｔ細胞に類似するハイブリッド型のＣＤ４＋Ｔ細胞とをもたらした。
【０２３２】
Ｔ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、標的となるクラスＩ制限エピトープについて、ＴＣＲ＋Ｔ細胞またはＴ８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞と類似するアビディティーを有する。選択されたＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ８αβ共発現の影響を明らかにするために、遺伝子組換えＴ細胞のアビディティーを、４つの異なるＴＣＲを使用して、すなわち、サバイビンＥＬＴ／ＬＭＬエピトープを標的とする２つ（ｓ２４およびｓ１６）と、ＰＲＡＭＥ  ＮＬＴエピトープを標的とする２つ（ｐ２８およびｐ１１）とを使用して測定した。すべてのＴＣＲ構築物が、マウスの定常領域を、内因性ＴＣＲ鎖とのクロスペアリングを最小限に抑えるために使用し（図１Ａ）、形質導入効率が調節された２。Ｔ細胞を同族ペプチドの連続希釈物にさらし、生じたＩＦＮγ  ＥＬＩｓｐｏｔ数を計数した。ＣＤ８αβの同時形質導入は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のアビディティーに影響を与えず、しかしながら、ＣＤ８αβの同時形質導入により、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、標的となるクラスＩエピトープをＣＤ８＋Ｔ細胞と類似するアビディティーで認識するように再プログラミングされた（図２）。制限したペプチド濃度において、また、試験された４つすべてのＴＣＲについて、ＩＦＮ−γスポット形成単位（ＳＦＵ）の数字が、ＴＣＲが単独で形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、Ｔ８が形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞では類似していた。したがって、ＣＤ８共移入を、ＣＤ４＋Ｔ細胞をクラスＩ制限エピトープに転向させるための一般的な戦略として使用することができる。
【０２３３】
ＣＤ８αβのＴＣＲとの共発現は逐次殺傷能をＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞に伝える。Ｔ細胞を、サバイビン＋ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１＋ＢＶ１７３白血病細胞と低いＥ：Ｔ比（１：５）で共培養し、ＨＬＡクラスＩ制限の標的細胞殺傷を評価した。予想された通り、ＴＣＲ＋Ｔ細胞およびＴ８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は容易にその標的を殺した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔ８が形質導入されたときに殺傷をもたらしただけであり、しかし、ＴＣＲが単独で形質導入されたときには殺傷をもたらさず、Ｔ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞による殺傷は、ＴＣＲ＋Ｔ細胞またはＴ８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞と同等であった（ＣＤ４：Ｔ８＋対ＴＣＲ＋、ｐ＝０．０００４；Ｔ８＋ＣＤ４対ＴＣＲ＋ＣＤ８またはＴ８＋ＣＤ８、ｐ＝ＮＳ、ｎ＝７）（図３Ａ）。ＴＣＲ＋Ｔ細胞またはＴ８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は野生型を殺しただけであり、しかし、表面のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１が陰性であるＢ２Ｍ−ＫＯ  ＢＶ１７３細胞を殺さなかったので（図３Ｂ）、この細胞傷害性はＨＬＡクラスＩ制限であった。同じ効果が、Ｔ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞により認められた。腫瘍負荷量が多いときには抗腫瘍機能が急速に消耗するであろうかを評価するために、本発明者らは、ＴＣＲ、Ｔ８またはＮＴコントロールが形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を新鮮なサバイビン＋ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１＋ＢＶ１７３白血病細胞により最大で４回、低いＥ：Ｔ比で攻撃した（図３Ｃ）。注目すべきことに、有意に増大した連続腫瘍殺傷能が、ＴＣＲ＋と比較して、Ｔ８＋ＣＤ８＋のＴ細胞については認められた（殺傷数、Ｔ８＋対ＴＣＲ＋：２±１．４対１．３±１．１、ｐ＝０．０４、ｎ＝７、図３Ｄ、右上パネル）。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔ８が形質導入されたときに殺傷をもたらしただけであり、しかし、ＴＣＲが単独で形質導入されたときには殺傷をもたらさず（殺傷数、Ｔ８＋対ＴＣＲ＋：３．３±０．５対０±０、ｐ＜０．０００１、ｎ＝７、図３Ｄ、左上パネル）、Ｔ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、連続殺傷が、Ｔ８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞と同じくらい効率的であった（殺傷数、Ｔ８＋ＣＤ４対ＣＤ８：３．３±０．５対２±１．４、ｐ＝ＮＳ、ｎ＝７）。最後に、ＣＤ８αβの強制発現はまた、改変されたＴ細胞拡大を多数回の腫瘍攻撃にわたってもたらした（図３Ｄ、下段パネル、点線）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大がＣＤ８αβ共移入の後では有意に変化しなかった（ＣＤ８  ＴＣＲ＋対Ｔ８＋：ｐ＝ＮＳ、ｌｏｇ  ＡＵＣでのｔ検定）。しかしながら、Ｔ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、拡大が、ＴＣＲ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞よりも有意に良好であり（ｐ＜０．０００１）、ＴＣＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞よりも有意に良好であり（ｐ＜０．００２）、Ｔ８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞よりも有意に良好であった（ｐ＜０．０２）。
【０２３４】
ＣＤ８αβ共移入によって生じる細胞傷害性表現型をさらに特徴づけるために、サイトカイン産生を、最初に置床した後の２４時間共培養上清（Ｄ１）において、また、３回目の腫瘍攻撃の後の２４時間共培養上清（Ｄ１０）において調べた。サイトカイン産生プロファイルが、Ｔ８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に対して、ＴＣＲ＋Ｔ細胞では有意に変化しなかった。しかしながら、ＣＤ４＋Ｔ細胞へのＣＤ８αβ共移入では、ＴＨ１優勢の細胞傷害性サイトカインパターンが生じた。Ｔ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、パーフォリンまたはグランザイムＢを含めて多数の細胞傷害性サイトカインを、ＴＣＲ＋Ｔ細胞またはＴ８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に匹敵するレベルで分泌した（図３Ｅ）。加えて、Ｔ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のみが、ＩＬ１０などのいくつかのＴＨ２サイトカインを産生した（図３Ｅ）。したがって、細胞傷害性のＣＤ８＋Ｔ細胞機能が、ＴＣＲおよびＣＤ８αβの共移入によって増強され、一方で、ＣＤ８αβの強制発現では、細胞傷害機能がＴＣＲ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に与えられ、その生来のヘルパー機能が保持されている。さらに、ＨＬＡ−Ａ＊０２＋およびＨＬＡ−Ａ＊０２−のドナーにおけるＴ細胞の拡大がすべての構築物に関して同程度であり（図３Ｆ）、このことは、ＣＤ８共移入が、標的に対するＴＣＲ媒介毒性を低レベルの内因性サバイビン発現（これは同胞殺しとも呼ばれる）によって活性化Ｔ細胞において生じさせる可能性を増大させなかったことを示している４。
【０２３５】
ＴＣＲ−ＣＤ８αβの発現は、ＣＤ８＋Ｔ細胞だけの逐次殺傷能を改善し、ＣＤ４＋Ｔ細胞だけを細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞に転換する。ＴＣＲ遺伝子組換えのＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の殺傷動力学に対する遺伝子組換えＣＤ８αβ発現の影響を細胞個々のレベルで評価するために、ハイスループットのナノウエルグリッドでのコマ撮り画像化顕微鏡法を実施した（ＴＩＭＩＮＧ）２２。標的との安定な接合を確立するために必要とされる時間（ｔＳｅｅｋ）、接合の総持続期間（ｔＣｏｎｔａｃｔ）、および最初の接触と腫瘍細胞アポトーシスとの間の時間（ｔＤｅａｔｈ）を９時間にわたって測定した（図４Ａ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、その標的を見つけ、安定な接合を確立することにおいて効率的であった。ＴＣＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、標的を１：１のＥ：Ｔで見つけることにおいて、Ｔ８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞よりも効率的であり（図４Ｂ、上段パネル、ｔＳｅｅｋ、ＣＤ８  ＴＣＲ＋対Ｔ８＋、ｐ＝０．０１）、しかし、同等に安定した接触を確立した（図４Ｂ、中央パネル、ｔＣｏｎｔａｃｔ、ｐ＝ＮＳ）。それらの殺傷能が１：１のＥ：Ｔ（ウエルあたり１個のＴ細胞と１個の標的細胞）において同等であり（図４Ｂ、左下、ｐ＝ＮＳ）、しかしながら、逐次殺傷能が、１：２のＥ：Ｔ（ウエルあたり１個のＴ細胞と２個の標的細胞）では、Ｔ８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞において有意に増強された（図４Ｂ、右下、ｐ＝０．０００２）。予想された通り、ＴＣＲ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、標的を積極的に探し、接触を見つけたという事実にもかかわらず、安定な接合体を形成し、標的細胞を殺すことができなかった（図４Ｂ、ｔＳｅｅｋおよびｔＣｏｎｔａｃｔ、ＣＤ４：ＴＣＲ＋対Ｔ８＋；ｐ＜０．０００１）。しかしながら、Ｔ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は効率的にその標的を殺した。Ｅ：Ｔが１：１において、Ｔ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＴＣＲ＋Ｔ細胞またはＴ８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞と同じくらい効率的にその標的を見つけ、接合し、殺した（図４Ｂ、ｐ＝ＮＳ）。Ｅ：Ｔが１：２においては、Ｔ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、殺傷が、Ｔ８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞と同じくらい効率的であり（図４Ｂ、右下、ｐ＝ＮＳ）、ＴＣＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞よりも良好であった（図４Ｂ、右下、ｐ＜０．０００１）。これらのＴＩＭＩＮＧアッセイ結果から、（１）ＣＤ８＋Ｔ細胞だけにおけるＣＤ８αβ共移入は連続殺傷能を有意に増強すること、そして（２）Ｔ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞個々の標的探索、接合および殺傷動力学が、ＴＣＲ＋Ｔ細胞またはＴ８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に匹敵することが明らかにされる。
【０２３６】
遺伝子組換えＣＤ８αβは初期のＴＣＲシグナル伝達事象を増強する。遺伝子組換えＣＤ８αβが初期のＴＣＲシグナル伝達事象を増強するかどうかを評価するために、本発明者らは、ＢＶ１７３白血病細胞によるＴ細胞の短時間刺激を行った後での活性化Ｙ３９４部位におけるＬｃｋリン酸化を分析した。ＣＤ８αβの共移入は、活性化ｐＬＣＫ  Ｙ３９４レベルを、Ｔ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞と同様に、Ｔ８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞において有意に増大させた（図５Ａおよび図５Ｂ）。このことは、ＣＤ８共受容体の遺伝子組換え発現により、ＴＣＲ−ｐＭＨＣ複合体に対する安定性がもたらされるだけでなく、初期のＴＣＲシグナル伝達事象がＣＤ８＋およびＣＤ４＋の両方のＴ細胞サブセットにおいて増強されることを示している。
【０２３７】
遺伝子組換えＣＤ８αβはＴＣＲ遺伝子組換えのＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍機能を増強する。最後に、遺伝子組換えＴ細胞のインビボ抗腫瘍機能を、ＢＶ１７３．ｆｆＬｕｃ白血病細胞が移植されたＮＳＧマウスを用いる以前に確立された白血病異種移植モデル２において調べた。簡単に記載すると、亜致死的照射を受けたＮＳＧマウスに、ＢＶ１７３．ｆｆＬｕｃ細胞をｉ．ｖ．注入し、その後、ＮＴ、ＴＣＲまたはＴ８の遺伝子組換えのＣＤ８＋またはＣＤ４＋のＴ細胞による３回のＴ細胞注入を行った（図６Ａ）。腫瘍成長をインビボＢＬＩによって測定した。有意な白血病抑制が、ＮＴコントロールと比較して、ＴＣＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞により処置されるマウスにおいて認められ、さらなる増強が、Ｔ８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞により処置されるマウスにおいて認められた（図６Ｂおよび図６Ｃ、ｎ＝５／群、ＮＴ対ＴＣＲ：ｐ＝０．０００２、ＮＴ対Ｔ８：ｐ＜０．０００１、ＴＣＲ対Ｔ８：ｐ＝０．０１、０日目と比較される２８日目のｌｏｇ  ＡＵＣでのｔ検定）。予想された通り、ＮＴコントロールＴ細胞またはＴＣＲ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のどちらもが、白血病増殖を抑制しなかった。対照的に、Ｔ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は３５日目まで白血病の進行を有意に遅らせた（図６Ｄおよび図６Ｅ、ｎ＝５／群、ｐ＝０．００１、０日目と比較される３５日目のｌｏｇ  ＡＵＣでのｔ検定）。したがって、腫瘍が標的となるクラスＩ  ＴＣＲと一緒でのＣＤ８αβの遺伝子組換え発現により、ＣＤ８＋Ｔ細胞機能の増強と、ＣＤ４＋Ｔ細胞への抗腫瘍機能の付与との両方がもたらされる。
【０２３８】
ある特定の実施形態の意義
【０２３９】
ＣＤ８共受容体機能を活用し、腫瘍が標的となるＨＬＡクラスＩ制限ＴＣＲによる養子Ｔ細胞療法を増強することを目指して、本発明者らは、ＴＡＡ特異的ＴＣＲを単独で、またはＣＤ８αβ共受容体との組合わせで発現するように操作される精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞集団およびＣＤ４＋Ｔ細胞集団の性質を調べた。特徴づけが行われた２つの主要な問題が、（１）ＣＤ８＋Ｔ細胞機能が、ＴＣＲおよびＣＤ８αβが形質導入されたとき、共受容体分子の利用可能性を高めることによって増強され得るであろうか、そして（２）ＴＣＲおよびＣＤ８αβの遺伝子組換え共発現が、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、そのＴヘルパー機能を維持しながら、標的となるクラスＩエピトープに転向させ得るであろうかであった。ＣＤ８共移入は、その逐次殺傷能を含めて、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性をインビトロおよびインビボにおいて増強することが明らかにされた。遺伝子組換えＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４およびＣＤ８の共発現、生来のＣＤ８＋Ｔ細胞と類似するアビディティーによる同族抗原の認識を伴うハイブリッド表現型を示し、標的をクラスＩ制限様式で殺した。ハイブリッドＣＤ４＋Ｔ細胞は白血病細胞を連続殺傷アッセイにおいて、また、細胞個々のレベルで容易に殺し、細胞傷害性サイトカインをＴＨサイトカインと同様に産生した。ハイブリッドＣＤ４＋Ｔ細胞はまた、白血病増殖をマウス異種移植において抑制することができた。
【０２４０】
クラスＩ制限ＴＡＡ特異的ＴＣＲの強制発現、かつ養子Ｔ細胞移入は、ある種の固形腫瘍および血液学的悪性腫瘍のための成功した治療戦略である１、２４、２５。ほとんどの自己ＴＡＡ特異的ＴＣＲはアビディティーが低く、ＣＤ８共受容体の存在に依存しており、一方で、ほんのまれに天然に存在するだけである、またはエクスビボ操作された高アビディティーのＴＡＡ特異的ＴＣＲはＣＤ８非依存性である１１、２６、２７。したがって、ほとんどの養子移入プロトコルは、所望のインビボ抗腫瘍機能を生じさせるためにＣＤ８＋Ｔ細胞に頼っている。生理学的には、ヘテロ二量体形態（αβ）でのＣＤ８共受容体が、成熟した末梢Ｔ細胞におけるクラスＩ制限抗原認識およびＴ細胞活性化において主要な役割を果たしている。これら２つの主要な機能は、ＴＣＲ−ｐＭＨＣ複合体を免疫学的接合部において安定化することであり、そして、初期のＴＣＲシグナル伝達事象を脂質ラフトにおけるＬｃｋ  Ｙ３９４リン酸化によって増強することである２８、２９。したがって、遺伝子組換えＴＣＲは、細胞がＣＤ８αβ共受容体分子をその機能のために内因的に利用できるかに依拠している。具体的な実施形態において、遺伝子組換えＴＣＲのコピー数が超生理学的であるため１２、ＣＤ８＋Ｔ細胞における利用可能なＣＤ８分子の数が、ＴＣＲ遺伝子組換えＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫学的接合部形成および抗腫瘍機能についての制限因子であり得ることが本明細書中では意図される。したがって、共受容体過剰発現の機能的結果を、低アビディティーのＴＡＡ特異的ＴＣＲを備えるＣＤ８＋Ｔ細胞において評価し、共受容体過剰発現の機能的結果から、ＴＣＲ−ＣＤ８αβ分子の不均衡が是正されたとき、改善されたＴＣＲ特異的な細胞傷害性、連続殺傷能、およびインビボ抗腫瘍機能が見出された。
【０２４１】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、腫瘍のネオ抗原を標的とするＣＤ４＋ＴＨ１  腫瘍浸潤リンパ球の養子移入によって、またはＣＤ４  Ｔ細胞：ＣＤ８  Ｔ細胞の規定された比率を用いるＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入によって最近明らかにされるように１６、１８、多岐にわたる機能を、感染症およびガンに対する効率的な免疫応答を調整することにおいて発揮しており、ＣＤ８＋Ｔ細胞とのその相互作用が極めて重要である１３、１４。したがって、機能的なＣＤ４＋Ｔ細胞がおそらくは、養子移入のためのＴＣＲ遺伝子組換えＴ細胞産物に組み込まれなければならない。これは、ＣＤ４＋Ｔ細胞は養子移入後における腫瘍抑制およびＣＤ８＋Ｔ細胞の持続に大きく寄与し得るからである。ＣＤ８に依存しないクラスＩ制限ＴＣＲをＣＤ４＋Ｔ細胞において効率的に過剰発現させることができ、これにより、細胞傷害機能およびヘルパー細胞機能の両方と、腫瘍成長を異種移植モデルにおいてインビボで抑制する能力とを有する多機能性のＣＤ４＋Ｔ細胞が生じることが以前に示された２６、２７。したがって、本発明者らは、遺伝子組換えＣＤ８共発現により、低アビディティーのクラスＩ制限ＴＣＲを発現する非応答性のＣＤ４＋Ｔ細胞が、細胞傷害機能およびヘルパー機能の両方を有する多機能性のハイブリッドＴ細胞に再プログラミングされ得るであろうかを評価した。実際、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ８αβ共発現は、細胞個々のレベルでのインビトロにおける連続殺傷能と、インビボにおける白血病抑制とを含めて、養子移入のための特性が増強された多機能な細胞傷害性かつヘルパー型のハイブリッド細胞をもたらした。
【０２４２】
最適なＴＡＡ特異的ＴＣＲを養子Ｔ細胞療法のために選択することは、腫瘍細胞を排除するための最適なアビディティーと、オフターゲット毒性を引き起こす可能性とが紙一重であるため１、２、４、６〜９、困難な課題である。腫瘍関連の様々な自己抗原がガンにおいて過剰発現し、しかし、これらはまた、ある種の正常な健康な組織において低レベルで存在しているので、ＴＣＲアビディティーが高すぎて、ＴＣＲが、細胞表面に提示される非常に低いレベルのｐＭＨＣを認識するならば、標的に対する腫瘍外の毒性が生じる可能性がある。しかしながら、アビディティーが低いＴＡＡ特異的ＴＣＲのＴＣＲ−ｐＭＨＣ相互作用をＣＤ８共受容体の共発現によって安定化するという本開示の戦略では、同胞殺しについての証拠がＴ細胞拡大培養において何ら見られなかったように、ＴＣＲ＋Ｔ細胞全体が、細胞相互作用を標的とするように安全に増強された。
【０２４３】
全体として、ＣＤ８αβ共受容体の遺伝子組換え共発現は、ＴＣＲ遺伝子組換えのＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の機能に対する有益な効果をインビボおよびインビトロにおいて有する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、同時の細胞傷害性エフェクター機能と、保存された生来のヘルパー機能とを伴って、クラスＩ  ＴＣＲと、ＣＤ８とによって多機能なハイブリッドＴ細胞に再プログラミングすることができる。養子Ｔ細胞移入のためのそのようなハイブリッド細胞の使用は、ＣＤ８およびＣＤ４の両方の機能が細胞個々のレベルで容易に利用可能である新規な戦略を表している。
【０２４４】
（実施例２）
材料および方法の例
細胞株。ＢＶ１７３細胞を、Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＤＳＭＺ）から購入した。Ｋ５６２、ＣＥＭ−Ｔ２（ＴＡＰトランスポーター欠損）および２９３Ｔを、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得た。細胞を、１０％または２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）および１％のグルタマックス（Ｇｉｂｃｏ）が補充される完全ＲＰＭＩ１６４０培地またはＩＭＤＭ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で維持した。ベータ−２ミクログロブリンノックアウト（Ｂ２Ｍ−ＫＯ）のＢＶ１７３細胞を、以前に記載されるようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術１を使用して作製した。簡単に記載すると、Ｂ２ＭシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ、５’−ＧＧＣＣＡＣＧＧＡＧＣＧＡＧＡＣＡＵＣＵ−３’（配列番号１）、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）および組換えＣａｓ９タンパク質（ＣＰ０１、ＰＮＡ  Ｂｉｏ）をそれぞれ１μｇ、室温で混合し、０．１５ｘ１０６個のＢＶ１７３細胞のエレクトロポレーション（１０ｍｓの１６００Ｖの３回のパルス、Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のために使用した。エレクトロポレーションした細胞を抗生物質非含有培地において拡大し、ＨＬＡ−Ａ２陰性細胞について９８％超の純度にまでＦＡＣＳ選別した。インビボ異種移植実験のために、ホタルルシフェラーゼを発現するように改変されるＢＶ１７３細胞（ＢＶ１７３．ｆｆＬｕｃ）細胞を以前に記載されるように使用した２。
【０２４５】
健常者ドナーからの血液サンプル。軟膜を、Ｇｕｌｆ  Ｃｏａｓｔ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、米国）において匿名化健常者志願者から得た。
【０２４６】
レトロウイルスベクターおよび上清の作製。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１制限のサバイビンＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬエピトープ（配列番号２）（ｓ２４またはｓ１６）に特異的なＴＣＲを発現するレトロウイルスベクター、およびＨＬＡ−Ａ＊０２：０１制限のＰＲＡＭＥ  ＮＬＴＨＶＬＹＰＶエピトープ（配列番号３）（ｐ１１またはｐ２８）に特異的なＴＣＲを発現するレトロウイルスベクターは以前に記載されている２。２Ａ配列によって隔てられるヒトＣＤ８α鎖（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１７３２）およびＣＤ８βイソ型１鎖（βＭ１、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ１０９６６−１）をコードする遺伝子がＧｅｎｅａｒｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって合成された。それらをＳＦＧレトロウイルスベクター骨格にそのようなものとして、またはｓ２４サバイビン特異的ＴＣＲとの組合わせでのどちらかでクローン化し、これにより、異なる２Ａ配列によって隔てられる４つすべての遺伝子を発現する多シストロン性ベクターを得た（図１）（Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。一過性のレトロウイルス上清を、記載されるように２９３Ｔのトランスフェクションによって調製した３。
【０２４７】
遺伝子組換えＴ細胞の作製。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって密度勾配遠心分離を使用して軟膜から単離した。ポリクローナルなＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞を、マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏｔｅｃｈまたはＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＰＢＭＣから陽性選択し、ＯＫＴ３（ハイブリドーマＣＲＬ−８００１（ＡＴＣＣ）から精製されたもの）および抗ＣＤ２８抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により被覆される非組織培養処理された２４ウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ならびにＩＬ７およびＩＬ１５（それぞれ１０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）において３日間にわたって活性化し、記載されるように形質導入に供した３。細胞を、実験で使用される前にＩＬ７およびＩＬ１５においてレトロウイルス形質導入後の７日間〜１０日間にわたって拡大した。Ｔ細胞を、１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシンおよび１％のＧｌｕｔａｍａｘによる完全な、ＲＰＭＩ１６４０培地およびクリック培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）の１：１の混合物において培養した。
【０２４８】
免疫表現型決定。細胞を、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７１、ＣＤ１９に対するＦＩＴＣコンジュゲート化、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート化、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート化、Ｖ４５０コンジュゲート化またはクロムオレンジ（Ｋｒｏｍｅ  Ｏｒａｎｇｅ）コンジュゲート化の抗体（すべて、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、あるいはＦＩＴＣコンジュゲート化またはＡＰＣコンジュゲート化のマウスＴＣＲβ定常領域（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローン番号Ｈ５７−５９７）、あるいはＰＥコンジュゲート化ＬＭＬサバイビン特異的デキストラマー（Ｉｍｍｕｄｅｘ）により４℃で３０分間にわたって表面染色した。７−ＡＡＤ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、死細胞を除外した。ＬＣＫリン酸化を評価するために、Ｔ細胞をＢＶ１７３細胞（１：１の比）または黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（０．１μｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ、陽性コントロールとして）により３７℃で３０分間にわたって刺激した。間接的な細胞内染色を、抗ヒトホスホ−ＬＣＫ（Ｙ３９４）Ａｂ（クローン＃７５５１０３）および抗マウスＩｇＧ−ＮＬ５５７  Ａｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を製造者の推奨法に従って使用して行った。サンプルを、ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを用いてＦＡＣＳＣａｎｔｏで取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）を用いて分析した。
【０２４９】
ペプチドおよびＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ。サバイビンのＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬペプチド（配列番号２）、そのヘテロクリティック変異体ＬＭＬＧＥＦＬＫＬペプチド（配列番号４）、およびＰＲＡＭＥのＮＬＴＨＶＬＹＰＶペプチド（配列番号５）をＧｅｎｅｍｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓから得た。Ｔ細胞（１０５個）を三連で置床し、同族ペプチドの連続希釈物（１０−４  〜１０−１０Ｍ）を使用するペプチドパルス処理を受けたＣＥＭ−Ｔ２細胞により１：１で、ＢＶ１７３細胞または培地単独とともに刺激した。プレートを３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベーションし、以前に記載されるように発色させた２。スポット形成単位（ＳＦＵ）をＺｅｌｌＮｅｔによって数えた。
【０２５０】
逐次共培養アッセイ。Ｔ細胞とＢＶ１７３細胞とを、外因性サイトカインを伴うことなく、１：５のＥ：Ｔ比で４つの複製ウエルにおいて共培養した。共培養上清を最初の置床の２４時間後に集め、サイトカイン分析のために−８０ｏＣで貯蔵した。３日〜４日の共培養の度に、残存するＴ細胞およびＢＶ１７３細胞をＦＡＣＳおよびＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって計数した。残存するＴ細胞の逐次殺傷能を評価するために、１ｘ１０５個未満の残留腫瘍細胞がウエルあたり残っているならば、新鮮なＢＶ１７３細胞（１ｘ１０６個）を手つかずの複製ウエルに戻した。
【０２５１】
サイトカイン多重アッセイ。共培養上清におけるサイトカイン濃度を、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸヒトＣＤ８＋Ｔ細胞磁気ビーズパネル（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して二連で定量し、Ｌｕｍｉｎｅｘ２００装置（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を用いて分析した。
【０２５２】
ナノウエルグリッドでのコマ撮り画像化顕微鏡法（ＴＩＭＩＮＧ）。ナノウエルアレイの製造および細胞個々の細胞傷害性アッセイを以前に記載されるように行った５、６。簡単に記載すると、ナノウエルアレイを５０ｍｍのガラス底ペトリ皿（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ）に固定した。Ｔ細胞（エフェクター）およびＢＶ１７３細胞（標的）をＰＫＨ６７緑色色素およびＰＫＨ２６赤色色素（２μＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によりそれぞれ標識した。その後、エフェクターおよび標的をナノウエルアレイに順次負荷し（１０６細胞／ｍＬ）、アレイを、アネキシンＶ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するフェノールレッド非含有培地において３７℃／５％ＣＯ２でインキュベーションした。細胞を５分間隔で９時間にわたって、２０倍の０．８ＮＡ対物レンズを使用するＨａｍａｍａｔｓｕデジタル式科学用ＣＭＯＳカメラを取り付けたＡｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を使用してモニターした。画像を、手動追跡と、細胞追跡および細胞区分けのための自社アルゴリズムの実行との組み合わせを使用して処理した７。
【０２５３】
マウス異種移植モデル。メスのＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γｃ−／−（ＮＳＧ）マウス（６〜８週齢）をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、ベイラー医科大学の動物施設に収容した。亜致死的照射（１２０ｃＧｙ）を受けたマウスに、マウスあたり３ｘ１０６個のＢＶ１７３．ｆｆｌｕｃ細胞を４時間後〜６時間後に静脈内（尾静脈）注入した。白血病負荷を、Ｘｅｎｏｇｅｎインビボ画像化システム（ＩＶＩＳ）（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して生物発光画像化（ＢＬＩ）（光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）によってモニターした。腫瘍注入の２４時間後から始まる３回のＴ細胞注入（マウスあたり５ｘ１０６個の遺伝子組換え細胞またはコントロール、２日〜３日の度に）をｉ．ｖ．（尾静脈または眼窩後）に施した。白血病増殖をＢＬＩによって毎週モニターした。
【０２５４】
統計学。データを、記述統計学を使用してまとめた。曲線下面積（ＡＵＣ）を、経時的なＴ細胞頻度および生物発光強度について台形公式を使用して計算した。比較を、連続変数については、どちらであっても適切であるウィルコクソン順位和検定またはｔ検定を使用して群間において行った。正規性の仮定を調べ、対数変換を、正規性を達成するために必要ならば行った。生存率分析を、カプラン・マイヤー法を使用して行った。ウィルコクソン検定を、マウス群間における統計学的有意差を評価するために使用した。ログランク検定を、ＴＩＭＩＮＧアッセイ結果を分析するために使用した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ＳＡＳ９．４、およびＲ３．３．２を統計学的分析のために使用した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意であると見なした。
【０２５５】
研究承認。すべての動物研究がベイラー医科大学のＩＡＣＵＣによって審査され、承認された。
【０２５６】
本実施例のための参考文献は下記の通りである：
【０２５７】
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【０２５８】
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【０２５９】
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【０２６０】
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【０２６１】
５．Ｒｏｍａｉｎ  Ｇ，Ｓｅｎｙｕｋｏｖ  Ｖ，Ｒｅｙ−Ｖｉｌｌａｍｉｚａｒ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｓｅｒｉａｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２４（２２）：３２４１−３２４９．
【０２６２】
６．Ｌｉａｄｉ  Ｉ，Ｓｉｎｇｈ  Ｈ，Ｒｏｍａｉｎ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｍｏｔｉｌｅ  ＣＤ４（＋）Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｃａｎ  Ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅ  ｉｎ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｍｕｌｔｉｋｉｌｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．２０１５；３（５）：４７３−４８２．
【０２６３】
７．Ｍｅｒｏｕａｎｅ  Ａ，Ｒｅｙ−Ｖｉｌｌａｍｉｚａｒ  Ｎ，Ｌｕ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｔｉｍｅ−ｌａｐｓｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｉｎ  ｎａｎｏｗｅｌｌ  ｇｒｉｄｓ（ＴＩＭＩＮＧ）．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１５；３１（１９）：３１８９−３１９７．
（参考文献）
本明細書中の参考文献は、本明細書中に示される細部に対する補足となる例示的な手順細部または他の細部を提供するという程度にまで、それらのどれもが参照によって本明細書中に特に組み込まれる。
【０２６４】
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本開示およびその利点が詳しく説明されているが、様々な変化、置換および変更が、添付された請求項によって規定されるような設計の精神および範囲から逸脱することなく行われ得ることを理解しなければならない。そのうえ、本出願の範囲は、本明細書に記載されるプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法および工程の特定の実施形態に限定されることは意図されない。当業者は本開示から容易に理解するであろうように、本明細書中に記載される対応する実施形態と実質的に同じ機能を果たす、または本明細書中に記載される対応する実施形態と実質的に同じ結果を達成するプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法または工程は、現在存在するものであろうと、または後に開発されるものであろうと、本開示に従って利用される場合がある。したがって、添付された請求項は、そのようなプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法または工程をその範囲内に含むことが意図される。
【図１Ａ−Ｂ】
2021522208.tif 000003
【図１Ｃ−Ｅ】
2021522208.tif 000004
【図２】
2021522208.tif 000005
【図３Ａ−Ｅ】
2021522208.tif 000006
【図３Ｆ】
2021522208.tif 000007
【図４Ａ−Ｂ】
2021522208.tif 000008
【図５Ａ−Ｂ】
2021522208.tif 000009
【図６Ａ−Ｃ】
2021522208.tif 000010
【図６Ｄ−Ｅ】
2021522208.tif 000011
【配列表】
2021522208000001.app
【国際調査報告】
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2021522208.tif 000013
2021522208.tif 000014
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