(57)【要約】  本発明は、Ｘ連鎖性高ＩｇＭ症候群（Ｘ−ＨＩＧＭ）を治療、抑制または緩和するための治療法の恩恵を受け得る対象として特定または選択された対象において、Ｘ−ＨＩＧＭを治療、抑制または緩和するための組成物、システムおよび方法を開示する。本発明のシステムは、内在性ＣＤ４０ＬＧ遺伝子座の改変を行うために共送達できるように構成されたヌクレアーゼとベクタードナーコンストラクトを含む。
2021521850.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞においてCD40LG遺伝子を編集する方法であって、
（ｉ）ガイドRNA（gRNA）をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する工程、および
（ii）鋳型ポリヌクレオチドを前記細胞に導入する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記gRNAが、配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記gRNAが、配列番号１２のヌクレオチド配列を有する核酸を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
gRNAをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する前記工程が、該gRNAをコードするポリヌクレオチドとCAS9タンパク質とを含むリボ核タンパク質（RNP）に前記細胞を接触させることを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記CAS9タンパク質と前記gRNAをコードするポリヌクレオチドの比率が、０．１：１〜１：１０である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記CAS9タンパク質と前記gRNAをコードするポリヌクレオチドの比率が、１：１〜１：５である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記CAS9タンパク質と前記gRNAをコードするポリヌクレオチドの比率が、約１：１．２である、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記鋳型ポリヌクレオチドが、CD40LG遺伝子の少なくとも一部またはその相補鎖をコードしている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記鋳型ポリヌクレオチドが、野生型CD40LG遺伝子の少なくとも一部またはその相補鎖をコードしている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記鋳型ポリヌクレオチドが、CD40LG遺伝子の少なくとも約１ｋｂを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記鋳型ポリヌクレオチドが、配列番号１５のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する核酸を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記鋳型ポリヌクレオチドが、配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記鋳型ポリヌクレオチドがウイルスベクターに含まれている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ベクターが、自己相補型AAV（scAAV）ベクターである、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｉ）が、工程（ii）の前に実施される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｉ）と工程（ii）が、同時に実施される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｉ）および／または工程（ii）が、ヌクレオフェクションを実施することを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヌクレオフェクションの実施が、ロンザ社製のシステムの使用を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記システムが、方形波パルスの使用を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞をＩＬ−６に接触させる工程をさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＩＬ−６の濃度が、約２０ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｍｇ／ｍｌまたは２０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＩＬ−６の濃度が、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌである、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＩＬ−６の濃度が、約１００ｍｇ／ｍｌまたは１００ｍｇ／ｍｌである、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞がＳＦＥＭ II培地中でインキュベートされる、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が細胞集団を構成し、該細胞集団の濃度が、約１×１０５個／ｍｌ〜約１×１０６個／ｍｌまたは１×１０５個／ｍｌ〜１×１０６個／ｍｌである、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞集団の濃度が、約１×１０５個／ｍｌ〜約５×１０５個／ｍｌまたは１×１０５個／ｍｌ〜５×１０５個／ｍｌである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞集団の濃度が、約２．５×１０５個／ｍｌまたは２．５×１０５個／ｍｌである、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
工程（ｉ）および工程（ii）の後に、前記細胞集団を希釈する工程をさらに含む、請求項２６〜２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞集団の希釈が、工程（ｉ）および工程（ii）を実施した約１６時間後または１６時間後に行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞集団が、約250,000個／ｍｌまたは250,000個／ｍｌに希釈される、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
幹細胞因子（SCF）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（Flt-3）、トロンボポエチン（TPO）、トロンボポエチン（TPO）受容体アゴニスト、UM171またはstemregenin（SR1）に前記細胞を接触させる工程をさらに含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記TPO受容体アゴニストがエルトロンボパグを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
工程（ｉ）および／または工程（ii）が、前記細胞をHDM2タンパク質に接触させることを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記HDM2タンパク質の濃度が、約１ｎＭ〜約５０ｎＭまたは１ｎＭ〜５０ｎＭである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記HDM2タンパク質の濃度が、約６．２５ｎＭ〜約２５ｎＭまたは６．２５ｎＭ〜２５ｎＭである、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
少なくともMOI 1000の前記AAVまたは少なくともMOI 約1000の前記AAVに前記細胞を接触させる、請求項１４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
少なくともMOI 2500の前記AAVまたは少なくともMOI 約2500の前記AAVに前記細胞を接触させる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも１００μｇ／ｍｌの前記RNPまたは少なくとも約１００μｇ／ｍｌの前記RNPに前記細胞を接触させる、請求項４〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
少なくとも２００μｇ／ｍｌの前記RNPまたは少なくとも約２００μｇ／ｍｌの前記RNPに前記細胞を接触させる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
工程（ｉ）および／または工程（ii）が、約1,000,000個の細胞と２０μｌのヌクレオフェクション反応液を接触させること、または1,000,000個の細胞と２０μｌのヌクレオフェクション反応液を接触させることを含み、
該ヌクレオフェクション反応液が、前記gRNAおよび／または前記鋳型ポリヌクレオチドを含む、
請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ヌクレオフェクション反応が、約１ｍｌまたは１ｍｌの量で行われる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞が初代細胞である、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞が造血幹細胞（HSC）である、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞がＴ細胞またはＢ細胞である、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞が、エクスビボの細胞である、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記CD40LG遺伝子が、配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
CD40LG遺伝子の相同組換え修復（HDR）用核酸であって、
CD40LG遺伝子の少なくとも一部をコードする第１の配列；
１つ以上のガイドRNA切断部位をコードする第２の配列；および
１つ以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第３の配列
を含む核酸。
【請求項５２】
前記CD40LG遺伝子の少なくとも一部が、配列番号１３に示される核酸配列の少なくとも一部を含む、請求項５１に記載の核酸。
【請求項５３】
前記CD40LG遺伝子の少なくとも一部が、CD40LG遺伝子の少なくとも１ｋｂまたは少なくとも約１ｋｂを含む、請求項５１または５２に記載の核酸。
【請求項５４】
第２の配列が、配列番号１２に示される核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項５５】
第２の配列が、配列番号１２に示される核酸配列を含む、請求項５１〜５４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項５６】
前記１つ以上のヌクレアーゼ結合部位が、フォワードTALEN（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）結合部位およびリバースTALEN結合部位を含む、請求項５１〜５５のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項５７】
前記１つ以上の核酸結合部位が、clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）関連タンパク質９（Cas9）結合部位である、請求項５１〜５６のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項５８】
１つ以上のエンハンサーエレメントをさらに含む、請求項５１〜５７のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項５９】
相同アーム配列をさらに含む、請求項５１〜５８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項６０】
プロモーターをコードする核酸配列をさらに含む、請求項５１〜５９のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項６１】
細胞におけるCD40Lタンパク質の発現に対する相同組換え修復（HDR）促進用ベクターであって、請求項５１〜６０のいずれか１項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項６２】
アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）である、請求項６１に記載のベクター。
【請求項６３】
自己相補型AAV（scAAV）ベクターである、請求項６１または６２に記載のベクター。
【請求項６４】
請求項５１〜６０のいずれか１項に記載の核酸を含む細胞。
【請求項６５】
ヒト細胞である、請求項６４に記載の細胞。
【請求項６６】
初代細胞である、請求項６４または６５に記載の細胞。
【請求項６７】
自家細胞である、請求項６４〜６６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６８】
Ｔ細胞である、請求項６４〜６７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６９】
造血幹細胞（HSC）である、請求項６４〜６８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７０】
ＣＤ３４＋である、請求項６４〜６９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７１】
エクスビボの細胞である、請求項６４〜７０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７２】
細胞におけるCD40Lタンパク質の発現に対する相同組換え修復（HDR）促進用システムであって、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載のベクターと、ヌクレアーゼをコードする核酸とを含むシステム。
【請求項７３】
前記ヌクレアーゼがTALENヌクレアーゼである、請求項７２に記載のシステム。
【請求項７４】
前記ヌクレアーゼがCasヌクレアーゼである、請求項７２に記載のシステム。
【請求項７５】
前記ベクターおよび前記核酸が、前記細胞に共送達されるように構成されている、請求項７２〜７４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７６】
前記細胞への共送達によって、内在性CD40LG遺伝子座が改変される、請求項７５に記載のシステム。
【請求項７７】
前記細胞がヒト初代造血細胞である、請求項７２〜７６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７８】
CD40LG遺伝子の相同組換え修復（HDR）の促進を必要とする対象において、CD40LG遺伝子の相同組換え修復（HDR）を促進する方法であって、
請求項６４〜７１のいずれか１項に記載の細胞または請求項６１〜６３のいずれか１項に記載のベクターを前記対象に投与する工程；および
ヌクレアーゼを前記対象に投与する工程
を含む方法。
【請求項７９】
前記ヌクレアーゼがTALENヌクレアーゼである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ヌクレアーゼがCasヌクレアーゼである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記ヌクレアーゼが、前記細胞または前記ベクターとともに前記対象に共投与される、請求項７８〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記細胞が前記対象から得られたものであり、該細胞が、請求項５１〜６０のいずれか１項に記載の核酸の導入により遺伝子組換えされている、請求項７８〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記投与が養子細胞移入によって行われる、請求項７８〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記細胞がヒト細胞である、請求項７８〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記細胞が初代細胞である、請求項７８〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記細胞が自家細胞である、請求項７８〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記細胞がＴ細胞である、請求項７８〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記細胞が造血幹細胞（HSC）である、請求項７８〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記細胞がＣＤ３４＋である、請求項７８〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記対象が雄性である、請求項７８〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記対象がＸ連鎖性高ＩｇＭ症候群（X-HIGM）に罹患している、請求項７８〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
Ｘ連鎖性高ＩｇＭ症候群（X-HIGM）またはX-HIGMに伴う症状の治療、抑制または緩和を必要とする対象において、Ｘ連鎖性高ＩｇＭ症候群（X-HIGM）またはX-HIGMに伴う症状を治療、抑制または緩和する方法であって、
請求項６４〜７１のいずれか１項に記載の細胞または請求項６１〜６３のいずれか１項に記載のベクターを前記対象に投与する工程；
ヌクレアーゼを前記対象に投与する工程；
任意で、X-HIGMまたはX-HIGMに伴う症状に対する治療の恩恵を受け得る対象として前記対象を特定する工程；および／または
任意で、前記対象において、X-HIGMの進行の改善またはX-HIGMに伴う症状の改善を測定する工程
を含む方法。
【請求項９３】
前記ヌクレアーゼがTALENヌクレアーゼである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記ヌクレアーゼがCRISPR／Casヌクレアーゼである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
前記ヌクレアーゼが、前記細胞または前記ベクターとともに前記対象に共投与される、請求項９２〜９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
前記細胞が前記対象から得られたものであり、該細胞が、請求項５１〜６０のいずれか１項に記載の核酸の導入により遺伝子組換えされている、請求項９２〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記投与が養子細胞移入によって行われる、請求項９２〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
前記細胞がヒト細胞である、請求項９２〜９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
前記細胞が初代細胞である、請求項９２〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
前記細胞が自家細胞である、請求項９２〜９９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記細胞がＴ細胞である、請求項９２〜１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記細胞が造血幹細胞（HSC）である、請求項９２〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記細胞がＣＤ３４＋である、請求項９２〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記対象が雄性である、請求項９２〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記方法によって細菌感染症または日和見感染症が抑制される、請求項９２〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記方法によって間欠性好中球減少症が抑制される、請求項９２〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2019年4月27日に出願された「Ｘ連鎖性高ＩｇＭ症候群のゲノム編集治療」という名称の米国仮特許出願第62/663485号の優先権を主張するものであり、この出願は参照によりその全体が本明細書に明示的に援用される。
【０００２】
配列表の参照
本願は電子形式の配列表とともに出願されたものである。この配列表は、SCRI192WOSEQLISTのファイル名で2019年4月16日に作成された約101kbのファイルとして提供されたものである。この電子形式の配列表に記載の情報は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００３】
本明細書による開示の態様は、概して、エンドヌクレアーゼに基づく遺伝子編集システムおよび遺伝子編集方法に関連する。より具体的には、本発明の実施形態は、遺伝子を効率的に相同組換え修復できるように構成された核酸およびベクター、ならびにＸ連鎖性高ＩｇＭ症候群などの遺伝子欠損を修復する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｘ連鎖性高ＩｇＭ症候群（X-HIGM）は、CD40LG遺伝子の不活性化変異によって引き起こされる劣性原発性免疫不全症である。X-HIGMの患者は、クラススイッチを起こしたメモリーＢ細胞および免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＡおよび免疫グロブリンＥ（IgG、IgAおよびIgE）が欠損しており、このことから、日和見感染を繰り返し起こしやすい（Allen, R.C., et al., Science, 1993. 259(5097): p. 990-993; Aruffo, A., et al., Cell, 1993. 72(2): p. 291-300; Korthauer, U., et al., Nature, 1993. 361(6412): p. 539; Winkelstein, J.A., et al., Medicine, 2003. 82(6): p. 373-384）。X-HIGMは、現在、γグロブリン置換療法または同種骨髄移植による治療が行われている。しかしながら、これらの治療法はいずれも合併症を起こすことがあり、骨髄移植は治療に有効であるが、適切なドナーを見つけることのできない患者が多く存在する（de la Morena, M.T., et al., J Allergy Clin Immunol, 2017. 139(4): p. 1282-1292）。
【０００５】
エンドヌクレアーゼを使用したシステムは、生物医学研究の重要な遺伝子編集ツールとして急速な発展を遂げ、遺伝子破壊および／または遺伝子ターゲティングにおいて使用できることが、様々な培養細胞およびモデル生物系において実証されている。
【０００６】
エンドヌクレアーゼを使用した遺伝子編集システムによって、かつてない精度、効率および柔軟性で科学者らの手によりゲノムを編集することが可能となっている。エンドヌクレアーゼを使用した遺伝子編集アプローチとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、メガヌクレアーゼ（MegaTALなど）またはCRISPR/Cas9を含むシステムがあるが、これらに限定されない。Ｘ連鎖性高ＩｇＭ症候群を抑制および／または治療するためのさらなるアプローチが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書で提供される実施形態のいくつかは、Ｘ連鎖性高ＩｇＭ症候群のゲノム編集治療用のシステム、方法および組成物に関する。いくつかの実施形態は、細胞においてCD40LG遺伝子を編集する方法であって、（ｉ）ガイドRNA（gRNA）をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する工程、および（ii）鋳型ポリヌクレオチドを前記細胞に導入する工程を含む方法を含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を有する核酸を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、gRNAをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する前記工程は、該gRNAをコードするポリヌクレオチドとCAS9タンパク質とを含むリボ核タンパク質（RNP）に前記細胞を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、前記CAS9タンパク質と前記gRNAをコードするポリヌクレオチドの比率は、０．１：１〜１：１０である。いくつかの実施形態において、前記CAS9タンパク質と前記gRNAをコードするポリヌクレオチドの比率は、１：１〜１：５である。いくつかの実施形態において、前記CAS9タンパク質と前記gRNAをコードするポリヌクレオチドの比率は、約１：１．２である。
【０００９】
いくつかの実施形態において、前記鋳型ポリヌクレオチドは、CD40LG遺伝子の少なくとも一部またはその相補鎖をコードしている。いくつかの実施形態において、前記鋳型ポリヌクレオチドは、野生型CD40LG遺伝子の少なくとも一部またはその相補鎖をコードしている。いくつかの実施形態において、前記鋳型ポリヌクレオチドは、CD40LG遺伝子の少なくとも約１ｋｂを含む。いくつかの実施形態において、前記鋳型ポリヌクレオチドは、配列番号１５のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記鋳型ポリヌクレオチドは、配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、前記鋳型ポリヌクレオチドはウイルスベクターに含まれる。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは自己相補型AAV（scAAV）ベクターである。
【００１１】
いくつかの実施形態において、工程（ｉ）は、工程（ii）の前に実施される。いくつかの実施形態において、工程（ｉ）と工程（ii）は、同時に実施される。いくつかの実施形態において、工程（ｉ）および／または工程（ii）は、ヌクレオフェクションを実施することを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオフェクションの実施は、ロンザ社製のシステムの使用を含む。いくつかの実施形態において、前記システムは、方形波パルスの使用を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態は、前記細胞をIL-6に接触させることを含む。いくつかの実施形態において、前記IL-6の濃度は、約20ng/ml〜約500mg/mlまたは20ng/ml〜500mg/mlである。いくつかの実施形態において、前記IL-6の濃度は、約50ng/ml〜約150mg/mlまたは50ng/ml〜150mg/mlである。いくつかの実施形態において、前記IL-6の濃度は、約100mg/mlまたは100mg/mlである。
【００１３】
いくつかの実施形態において、前記細胞は、SFEM II培地中でインキュベートされる。
【００１４】
いくつかの実施形態において、前記細胞は細胞集団を構成し、該細胞集団の濃度は、約1×105個/ml〜約1×106個/mlまたは1×105個/ml〜1×106個/mlである。いくつかの実施形態において、前記細胞集団の濃度は、約1×105個/ml〜約5×105個/mlまたは1×105個/ml〜5×105個/mlである。いくつかの実施形態において、前記細胞集団の濃度は、約2.5×105個/mlまたは2.5×105個/mlである。
【００１５】
いくつかの実施形態は、工程（ｉ）および工程（ii）の後に、前記細胞集団を希釈する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞集団の希釈は、工程（ｉ）および工程（ii）を実施した約１６時間後または１６時間後に行われる。いくつかの実施形態において、前記細胞集団は、約250,000個/mlまたは250,000個/mlに希釈される。
【００１６】
いくつかの実施形態は、幹細胞因子（SCF）、FMS様チロシンキナーゼ３（Flt-3）、トロンボポエチン（TPO）、トロンボポエチン（TPO）受容体アゴニスト、UM171またはstemregenin（SR1）に前記細胞を接触させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記TPO受容体アゴニストはエルトロンボパグを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、工程（ｉ）および／または工程（ii）は、前記細胞をHDM2タンパク質に接触させることを含む。いくつかの実施形態において、前記HDM2タンパク質の濃度は、約1nM〜約50nMまたは1nM〜50nMである。いくつかの実施形態において、前記HDM2タンパク質の濃度は、約6.25nM〜約25nMまたは6.25nM〜25nMである。
【００１８】
いくつかの実施形態において、少なくともMOI 1000の前記AAVまたは少なくともMOI 約1000の前記AAVに前記細胞を接触させる。いくつかの実施形態において、少なくともMOI 2500の前記AAVまたは少なくともMOI 約2500の前記AAVに前記細胞を接触させる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、少なくとも100μg/mlの前記RNPまたは少なくとも約100μg/mlの前記RNPに前記細胞を接触させる。いくつかの実施形態において、少なくとも200μg/mlの前記RNPまたは少なくとも約200μg/mlの前記RNPに前記細胞を接触させる。
【００２０】
いくつかの実施形態において、工程（ｉ）および／または工程（ii）は、約1,000,000個の細胞と20μlのヌクレオフェクション反応液を接触させること、または1,000,000個の細胞と20μlのヌクレオフェクション反応液を接触させることを含み、該ヌクレオフェクション反応液は、前記gRNAおよび／または前記鋳型ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオフェクション反応は、約１mlまたは１mlの量で行われる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、前記細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（HSC）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞またはＢ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD34+細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はエクスビボの細胞である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、前記CD40LG遺伝子は、配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する。
【００２３】
いくつかの実施形態は、CD40LG遺伝子の相同組換え修復（HDR）用の核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、CD40LG遺伝子をコードする第１の配列；１つ以上のガイドRNA切断部位をコードする第２の配列；および１つ以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第３の配列を含む。いくつかの実施形態において、前記CD40LG遺伝子は、配列番号１３に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の配列は、配列番号１２に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のヌクレアーゼ結合部位は、フォワードTALEN（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）結合部位およびリバースTALEN結合部位を含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の核酸結合部位は、clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR）関連タンパク質９（Cas9）結合部位である。いくつかの実施形態において、前記核酸は１つ以上のエンハンサーエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は相同アーム配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、プロモーターをコードする核酸配列をさらに含む。
【００２４】
本明細書で提供する実施形態のいくつかは、細胞におけるCD40Lタンパク質の発現に対するHDR促進用ベクターに関する。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、CD40LG遺伝子をコードする第１の配列；１つ以上のガイドRNA切断部位をコードする第２の配列；および１つ以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第３の配列を含む。いくつかの実施形態において、前記CD40LG遺伝子は、配列番号１３に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の配列は、配列番号１２に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のヌクレアーゼ結合部位は、フォワードTALEN（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）結合部位およびリバースTALEN結合部位を含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の核酸結合部位は、clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR）関連タンパク質９（Cas9）結合部位である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは１つ以上のエンハンサーエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは自己相補型AAV（scAAV）ベクターである。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（HSC）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD34+HSCである。
【００２５】
本明細書で提供するいくつかの実施形態は、細胞におけるCD40Lタンパク質の発現に対するHDR促進用システムに関する。いくつかの実施形態において、前記システムは、本明細書に記載のベクターと、ヌクレアーゼをコードする核酸とを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはTALENヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはCasヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ベクターおよび前記核酸は、前記細胞に共送達されるように構成されている。いくつかの実施形態において、前記細胞への共送達によって、内在性CD40LG遺伝子座が改変される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト造血細胞である。
【００２６】
本明細書で提供するいくつかの実施形態は、CD40L発現細胞に関する。いくつかの実施形態において、前記細胞は、CD40LG遺伝子をコードする第１の配列；プロモーターをコードする第２の配列；１つ以上のガイドRNA切断部位をコードする第３の配列；および１つ以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第４の配列を含む核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記核酸はベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態において、前記ベクターはAAVである。いくつかの実施形態において、前記AAVはscAAVである。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はHSCである。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD34+HSCである。
【００２７】
本明細書で提供するいくつかの実施形態は、CD40LG遺伝子の相同組換え修復（HDR）の促進を必要とする対象において、CD40LG遺伝子の相同組換え修復（HDR）を促進する方法に関する。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の細胞または本明細書に記載のベクターを前記対象に投与する工程、およびヌクレアーゼを前記対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはTALENヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはCasヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、前記細胞または前記ベクターとともに前記対象に共投与される。いくつかの実施形態において、前記細胞は、前記対象から得られたものであり、本明細書に記載の核酸または本明細書に記載のベクターを導入することによって遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入によって行われる。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はHSCである。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD34+HSCである。いくつかの実施形態において、前記対象は雄性である。いくつかの実施形態において、前記対象はＸ連鎖性高ＩｇＭ症候群（X-HIGM）に罹患している。
【００２８】
本明細書で提供される実施形態のいくつかは、Ｘ連鎖性高ＩｇＭ症候群（X-HIGM）またはX-HIGMに伴う症状の治療、抑制または緩和を必要とする対象において、Ｘ連鎖性高ＩｇＭ症候群（X-HIGM）またはX-HIGMに伴う症状を治療、抑制または緩和する方法に関する。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の細胞または本明細書に記載のベクターを前記対象に投与する工程、およびヌクレアーゼを前記対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、X-HIGMまたはX-HIGMに伴う症状の治療の恩恵を受け得る対象として前記対象を特定する工程、および／または任意で、前記対象において、X-HIGMの進行の改善もしくはX-HIGMに伴う症状の改善を測定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはTALENヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはCRISPR/Casヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、前記細胞または前記ベクターとともに前記対象に共投与される。いくつかの実施形態において、前記細胞は、前記対象から得られたものであり、本明細書に記載の核酸または本明細書に記載のベクターを導入することによって遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入によって行われる。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はHSCである。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD34+HSCである。いくつかの実施形態において、前記対象は雄性である。いくつかの実施形態において、前記方法によって細菌感染症または日和見感染症が抑制される。いくつかの実施形態において、前記方法によって間欠性好中球減少症が抑制される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】CD40LG遺伝子の変異によって、IgMは正常値または高値を示すが、IgGが低値となり、IgEとIgAが欠損することを説明する概略図である。Ｘ連鎖性高ＩｇＭ症候群（X-HIGM）の患者は、細菌性感染症／日和見感染症および間欠性好中球減少症に罹患する。
【００３０】
【図２】エキソンおよび翻訳開始部位に対してリボ核タンパク質（RNP）の認識部位を示したヒトCD40LG遺伝子座と、プロモーターレスCD40L cDNAとキメラ3’UTRを含むAAVドナー鋳型を示す。影を付けた破線は、CD40LGの相同領域の位置を示す。TALENのヌクレアーゼ部位およびCRISPRのヌクレアーゼ部位と、1KbのCD40LG相同アームを含むAAV6ドナー鋳型も示す。標的化コンストラクトは、これらのヌクレアーゼによって切断されないように5’UTRに欠失を含む。CD40LG遺伝子座は、造血幹細胞（HSC）においてサイレントであるため、MNDプロモーターによって、遺伝子編集に関する追跡が可能となる。
【００３１】
【図３】CD34+細胞の編集プロトコルの方法の一実施形態の概略図である。成人ドナーにおいて動員した末梢血単核細胞（PBMC）から濃縮された凍結保存CD34+細胞を解凍し、無血清幹細胞増殖培地［トロンボポエチン、幹細胞因子およびFLT3リガンド（PeproTech）をいずれも100ng/mlの濃度で添加したCellGenix GMP SCGM培地（CellGenix Inc.）］に1×106個/mlの密度で播種した。後述するように、IL-3（60ng/ml）またはIL-6（100ng/ml）を培地に加えた。CD34+細胞は、培地中で37℃で４８時間培養することによってあらじめ刺激した後、Neon Transfection Systemを使用してエレクトロポレーションを行った。400μLの培地を入れた24ウェルプレートに細胞を分注し、MOI 1000〜5000にてドナー鋳型AAVを加えた。エレクトロポレーションおよびAAVによる形質導入の２４時間後、AAV含有培地を除去し、新鮮な幹細胞増殖培地で置換した。遺伝子編集の２日後および５日後に、細胞の生存能力およびGFPの発現を分析した。
【００３２】
【図４Ａ−４Ｂ】CD34+造血幹細胞のCD40LG遺伝子座にGFPレポーターを導入した効率的な編集の結果を示す。図４Ａは、編集の２日後および５日後に、mock条件、MOI 1000のAAVのみの条件、および50μg/mlのTALENまたは100μg/mlのRNPとMOI 1000のAAVの条件で、生存能力（左欄）およびGFP発現（右欄）をそれぞれゲーティングした代表的なフローサイトメトリープロットを示す。図４Ｂは、細胞の生存能力および GFPの割合（%）を示す。編集の２日後に前方散乱および側方散乱から測定した生存能力（左）と、編集の５日後にフローサイトメトリーで測定した編集細胞のパーセンテージ（GFP+の割合（%））（右）を各棒グラフに示す。データは平均値±SEMとして示す（４人の個別のドナーを使用したN=9での反復実験）。
【００３３】
【図５】MND.GFPレポーター（配列番号１４）のオンターゲットな組み込みの確認を示した棒グラフを示す。棒グラフは、CD34+ドナーにおいてMND.GFPレポーターを使用した場合のddPCRまたはFACSで測定した編集率を示す。IL-6を含む培地中で細胞を増殖させ、MOI 2500のMND.GFP AAV6と200μg/mlのRNPで処理した。データは平均値±SEMとして示す（２人の異なるドナーを使用したN=2での反復実験）。
【００３４】
【図６】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃおよび図６Ｄは、NSGマウスの移植に使用した細胞に対するメチルセルロース培地でのコロニー形成単位アッセイの結果を示した棒グラフを示す。図６Ａは、メチルセルロース培地に500個のmock細胞またはAAV+RNPで処理した細胞を播種してから１４日後に種類別に計数した総コロニー数を示す。図６Ｂは、コロニーの種類ごとのGFP+総コロニー数を示す。図６Ｃは、コロニーの種類ごとのGFP+細胞のパーセンテージを示す。図６Ｄは、FACSで測定したHDRで編集された細胞のパーセンテージを示す。
【００３５】
【図７】図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄ、図７Ｅおよび図７Ｆは、IL-3を加えた培地およびIL-6を加えた培地を比較した代表的な結果を示す。60ng/mlのIL-3（図７Ａ）または100ng/mlのIL-6（図７Ｂ）を含む培地中で増殖させ、RNPとAAVで処置してから２４時間後の細胞を代表的なFACSプロットに示す。上段は、左から右に順に、前方散乱／側方散乱により測定した細胞の生存能力、CD34+CD38-染色、およびCD133+CD90+（LT-HSC）染色を示す。下段は、左から右に順に、すべての生細胞におけるGFP発現、CD34+CD38-生細胞におけるGFP発現、およびCD34+CD38-CD133+CD90+細胞におけるGFP発現を示す。図７Ｃは、前方散乱／側方散乱により測定した編集の４８時間後の細胞の生存能力を示した棒グラフを示す。MOI 1KのAAVで処理した細胞は、100ng/mlのRNPをエレクトロポレーションし、MOI 2.5KのAAVで処理した細胞は、200μg/mlのRNPをエレクトロポレーションした。データは平均値±SEMとして示す。図７Ｄは、編集の５日後にGFP+の割合（%）により測定したHDRで編集された細胞のパーセンテージを示す。データは平均値±SEMとして示す。図７Ｅは、編集の４８時間後に、CD34+CD38-CD133+CD90+を染色した細胞のパーセンテージを示す。CD34+CD38-CD133+CD90+染色では、ドナーによって顕著に結果が異なったため、mockに対するfold change平均値±SEMとしてデータを示した。図７Ｆは、編集の４８時間後におけるCD34+CD38-CD133+CD90+細胞におけるGFP+のパーセンテージを示す（N=３人のドナー、３回の反復実験）。
【００３６】
【図８】ヒトのコドンに最適化されたCD40L cDNAを挟んで両側に位置する1kbの同一の相同アーム、WPRE3エレメントおよび合成ポリアデニル化配列を含むAAVドナー鋳型を示した概略図を示す。
【００３７】
【図９Ａ−９Ｂ】編集細胞における標的化されたcDNAの組み込みの結果を示す。図９Ａは、編集の４８時間後にフローサイトメトリー（FSC/SSCによる生細胞のゲーティング）で測定した、mock処理細胞、AAVのみで処理した細胞またはAAV+RNPで処理した細胞の生存能力を示した棒グラフを示す。データは平均値±SEMとして示す。図９Ｂは、ddPCRで測定したCD34+ドナーにおける編集率を示す。データは平均値±SEMとして示す（N=２人のドナー、３回の反復実験）。
【００３８】
【図１０Ａ−１０Ｂ】NSGマウスへのインプット移植を示した棒グラフを示す。図１０Ａは、NSGマウスへの生着実験から得た細胞のサブセットをインビトロで維持して編集の２日後（かつ移植の１日後）に測定した細胞の生存能力を示す。図１０Ｂは、生着実験から得た細胞をインビトロで維持して測定したHDR率（５日目に測定した GFP+の割合（%））を示す。データはすべて平均値±SEMとして示した。
【００３９】
【図１１】NSGマウスの骨髄および脾臓から採取した細胞のゲーティング方法の一例を示す。リンパ球集団および顆粒球集団は、大きさ（前方散乱）および顆粒度（側方散乱）に基づいて区別した。次に、これらの主要な２つの集団を、細胞の種類ごとに特異的な表面マーカーの発現による定義に基づいて、別々の細胞系列に分割した。各種の細胞におけるGFPの発現を示している。脾臓試料では、顆粒球集団およびCD34+/CD38-集団は分析しなかった。
【００４０】
【図１２】図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅは、NSGマウスの骨髄に編集細胞を生着させた結果を示す。図１２Ａおよび図１２Ｂは、図１１に示す一連のゲーティング方法を使用して、移植の１６週間後にNSGマウスの骨髄から採取した細胞を分析した代表的なフローサイトメトリープロットを示す。図１２Ａは、未処理細胞を移植したマウスから採取された骨髄を示す。図１２Ｂは、MOI 2.5KのAAV+200μg/mlのRNPで処理した細胞を移植したマウスから採取した骨髄を示す。上段は、左から右に順に、hCD45:mCD45キメリズム、CD45でゲーティングしたヒトCD33+、CD19+染色およびCD34+染色を示す。下段は、左から右に順に、hCD45+細胞、CD33+細胞、CD19+細胞およびCD34+細胞におけるGFPの発現を示す。図１２Ｃは、mock細胞、MOI 1KのAAV+100μg/mlのRNPで処理した細胞、またはMOI 2.5KのAAV+200μg/mlのRNPで処理した細胞を移植したNSGマウスの骨髄に生着した総hCD45+細胞を示す。各ドットは個々のマウスを示す。平均値±SEMをグラフに示す。図１２Ｄは、hCD45+集団全体におけるHDR編集細胞（GFP+）の割合（%）を示す。各ドットは個々のマウスを示し、平均値±SEMをグラフに示す。図１２Ｅは、hCD45+集団全体におけるCD33+細胞とCD19+細胞の比率を示す。データは平均値±SEMとして示す。有意性は二元配置分散分析で測定した。
【００４１】
【図１３】図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃ、図１３Ｄ、図１３Ｅ、図１３Ｆ、図１３Ｇは、NSGマウスにおける編集細胞の生着に対する低分子の影響を示した結果を示す。図１３Ａは、前方散乱／側方散乱により測定した編集の４８時間後の細胞の生存能力を示した棒グラフを示す。データは平均値±SEMとして示す。図１３Ｂは、編集の４８時間後のLT-HSCのパーセンテージを平均値±SEMで示す。N=２人のドナー、３回の反復実験。図１３Ｃは、UM171およびSR1を含む培地中で増殖させ、AAVとRNPで処理したCD34+細胞を移植してから１６週間後のNSGマウスの骨髄から採取した細胞の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。図１３Ｄは、mock細胞または編集した（MOI 2.5KのAAVと200μg/mlのRNPで処理した）細胞を移植した１２〜１６週間後のNSGマウスの骨髄における総hCD45+細胞の生着を示す。移植前に、グラフに示した低分子の様々な組み合わせを含む培地中で細胞を増殖させた。各ドットは個々のマウスを示し、平均値±SEMを示す。図１３Ｅは、NSGマウスの骨髄から回収したhCD45+細胞におけるHDR編集率（GFP+の割合（%））を示す。平均値±SEMをグラフに示す。図１３Ｆは、骨髄から回収した総hCD45+細胞中のCD33+細胞またはCD19+細胞のパーセンテージを示す。データは平均値±SEMとして示す。有意性は二元配置分散分析で測定した。図１３Ｇは、NSGマウスの骨髄から回収したCD19+細胞、CD33+細胞およびCD34+細胞におけるHDR編集率（GFP+の割合（%））を示す。有意性は対応のあるｔ検定で測定した。
【００４２】
【図１４】図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄは、NSGマウスの脾臓に編集細胞を生着させた結果を示す。図１４Ａおよび図１４Ｂは、移植の１６週間後にNSGマウスの脾臓から採取した細胞を分析した代表的なフローサイトメトリープロットを示す。図１４Ａのフローサイトメトリープロットは、mock処理細胞を移植したマウスから得た結果である。上段は、左から右に順に、hCD45:mCD45キメリズム、ヒトCD33+染色およびヒトCD19+染色を示す。下段のプロットは、左から右に順に、hCD45+細胞、CD33+細胞およびCD19+細胞におけるGFPの発現を示す。図１４Ｂのフローサイトメトリープロットは、MOI 2.5KのAAV+200μg/mlのRNPで処理した細胞を移植したマウスから得た結果を示す。図１４Ｃは、mock細胞、MOI 1KのAAV+100μg/mlのRNPで処理した細胞、またはMOI 2.5KのAAV+200μg/mlのRNPで処理した細胞を移植したNSGマウスの脾臓に生着した総hCD45+細胞を示す。各ドットは個々のマウスを示す。平均値±SEMをグラフに示す。図１４Ｄは、hCD45+集団全体におけるHDR編集細胞の割合（%）を示す。平均値±SEMをグラフに示す。
【００４３】
【図１５】図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、図１５Ｄ、図１５Ｅは、低分子であるUM171およびSR1のインビトロでの効果を示す。図１５Ａおよび図１５Ｂは、UM171およびSR1の存在下（図１５Ｂ）またはこれらの非存在下で（図１５Ａ）細胞を増殖させ、LT-HSCを編集してから４８時間後に染色およびGFP発現を分析した代表的なフローサイトメトリープロットを示す。上段のプロットは、左から順に、すべての生細胞をゲーティングしたCD34+CD38-集団、およびCD34+/CD38-集団中のCD133+CD90+細胞を示し、プロット上の数は前方散乱／側方散乱により測定した生細胞を示す。ヒストグラムは、生細胞におけるGFPhighを示す。下段のプロットは、左から順に、すべての生細胞、CD34+CD38-細胞およびCD34+CD38-CD133+CD90+細胞におけるGFPhigh細胞を示したヒストグラムである。図１５Ｃは、グラフに示した群のバルク集団における編集の４８時間後のGFPの発現を平均値±SEMで示す。図１５Ｄは、LT-HSCとして染色された細胞における編集の４８時間後のGFPの発現を示す。図１５Ｅは、編集の５日後にGFPの発現により測定したHDR編集率を示す。データは平均値±SEMとして示す。
【００４４】
【図１６】図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃ、図１６Ｄ、図１６Ｅ、図１６Ｆ、図１６Ｇは、編集された細胞の生着に対するエルトロンボパグの影響を示す。図１６Ａは、3μg/mlのエルトロンボパグの存在下または非存在下で増殖させ、mock処理またはMOI 1KのAAV+100μg/mlのRNPで処理した細胞における、編集の４８時間後の細胞の生存能力を示した棒グラフを示す。データは平均値±SEMを示す。図１６Ｂは、編集の５日後にFACSで測定したHDR率（GFP+の割合（%））を示す。データは平均値±SEMを示す。図１６Ｃは、編集の４８時間後のLT-HSCのパーセンテージを平均値±SEMで示す。図１６Ｄは、細胞移植の１２週間後のNSGマウスの骨髄におけるヒトCD45細胞の生着を示す。各ドットは個々のマウスを示し、平均値を示す。図１６Ｅは、NSGマウスの骨髄から採取したヒト細胞におけるHDR率（GFP+の割合（%））を示す。図１６Ｆは、細胞移植の１２週間後のNSGマウスの脾臓におけるhCD45+細胞の生着を示す。図１６Ｇは、NSGマウスの脾臓から採取したヒト細胞におけるHDR率（GFP+の割合（%））を示す。
【００４５】
【図１７Ａ−１７Ｂ】編集細胞の生着に対する編集後の培養時間の影響を示す。編集の１日後、２日後または４日後にCD34+細胞をマウスに移植した。図１７Ａは、細胞移植の１２週間後のNSGマウスの骨髄におけるヒトCD45細胞の生着を示す。各ドットは個々のマウスを示し、平均値を示す。図１７Ｂは、NSGマウスの骨髄から採取したヒト細胞におけるHDR率（GFP+の割合（%））を示す。
【００４６】
【図１８】CD34+細胞を４８時間または７２時間にわたり前刺激した場合の、NSGW41レシピエントマウスの骨髄から回収された全ヒト細胞に対する効果の比較を示す。
【００４７】
【図１９】CD34+細胞を４８時間または７２時間にわたり前刺激した場合の、W41マウスの骨髄における編集細胞（GFP+）の生着に対する効果の比較を示す。
【００４８】
【図２０】CD34+細胞を４８時間または７２時間にわたり前刺激した場合の、W41マウスの脾臓における全ヒト細胞の生着に対する効果の比較を示す。
【００４９】
【図２１】CD34+細胞を４８時間または７２時間にわたり前刺激した場合の、NSGW41マウスの脾臓における編集細胞（GFP+）の生着に対する効果の比較を示す。
【００５０】
【図２２】プロトコルＡおよびプロトコルＢを使用して樹立したインビボの実証研究の設計の概略図を示す。
【００５１】
【図２３】プロトコルＡ（丸印）またはプロトコルＢ（正方形）を使用して培養したCD34+細胞を移植したNSGW41マウスの骨髄から回収したhCD45+細胞のパーセンテージの比較を示す。
【００５２】
【図２４】プロトコルＡ（丸印）またはプロトコルＢ（正方形）を使用して培養したCD34+細胞を移植したNSGW41マウスの骨髄から回収した全hCD45+細胞中のGFP+細胞のパーセンテージの比較を示す。
【００５３】
【図２５】プロトコルＡ（丸印）またはプロトコルＢ（正方形）を使用して培養したCD34+細胞を生着させたNSGW41マウスの骨髄から回収したヒトCD45+細胞中のCD19+細胞のパーセンテージの比較を示す。
【００５４】
【図２６】プロトコルＡ（丸印）またはプロトコルＢ（正方形）を使用して培養したCD34+細胞を移植したNSGW41マウスの骨髄から回収したヒトCD19+細胞中のGFP+細胞のパーセンテージの比較を示す。
【００５５】
【図２７】プロトコルＡ（丸印）またはプロトコルＢ（正方形）を使用して培養したCD34+細胞を生着させたNSGW41マウスの骨髄から回収したヒトCD45+細胞中のCD33+細胞のパーセンテージの比較を示す。
【００５６】
【図２８】プロトコルＡ（丸印）またはプロトコルＢ（正方形）を使用して培養したCD34+細胞を生着させたNSGW41マウスの骨髄から回収したヒトCD33+細胞中のGFP+細胞のパーセンテージの比較を示す。
【００５７】
【図２９】移植の１６週間後にNSGW41マウスの骨髄から採取した細胞の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。上パネルは、mock未処理細胞を移植したマウスから採取した骨髄を示す。上段は、左から右に順に、hCD45:mCD45キメリズム、ヒトCD45をゲーティングしたCD33+細胞、およびCD19+染色を示す。下段は、左から右に順に、hCD45+細胞におけるGFP発現、CD33+細胞におけるGFP発現、およびCD19+細胞におけるGFP発現を示す。下パネルは、AAVとRNPで処理した細胞を移植したマウスから採取した骨髄を示す。上段は、左から右に順に、hCD45:mCD45キメリズム、ヒトCD45をゲーティングしたCD33+細胞、およびCD19+染色を示す。下段は、左から右に順に、hCD45+細胞におけるGFP発現、CD33+細胞におけるGFP発現、およびCD19+細胞におけるGFP発現を示す。GFP+ヒト細胞はすべての造血細胞系に存在し、CD40L遺伝子座をHDR編集したヒトHSCが長期間にわたり生着を持続したことと一致していた。
【００５８】
【図３０】プロトコルＡ（丸印）またはプロトコルＢ（正方形）を使用して培養したCD34+細胞を移植したNSGW41マウスの脾臓から回収したヒトCD45+細胞のパーセンテージの比較を示す。
【００５９】
【図３１】プロトコルＡ（丸印）またはプロトコルＢ（正方形）を使用して培養したCD34+細胞を移植したNSGW41マウスの脾臓から回収したヒトCD45+細胞中のGFP+細胞のパーセンテージの比較を示す。
【００６０】
【図３２】ロンザ社のシステム上で様々なヌクレオフェクションプログラムを使用した場合と、NEONシステム上でエレクトロポレーションを行った場合の細胞の生存能力の比較を示す。１人のCD34+細胞ドナーから得たデータを棒グラフに示す。
【００６１】
【図３３】ロンザ社のシステム上で様々なヌクレオフェクションプログラムを使用した場合と、NEONシステム上でエレクトロポレーションを行った場合の細胞のHDR率（%）（GFPの発現）の比較を示す。１人のCD34+細胞ドナーから得たデータを棒グラフに示す。
【００６２】
【図３４】プロトコルＡ（丸印）またはプロトコルＢ（正方形）を使用して培養したCD34+細胞を移植したNSGW41マウスの脾臓から回収したヒトCD45+細胞中のCD19+細胞のパーセンテージの比較を示す。
【００６３】
【図３５】プロトコルＡ（丸印）またはプロトコルＢ（正方形）を使用して培養したCD34+細胞を移植したNSGW41マウスの脾臓から回収したヒトCD19+細胞中のGFP+細胞のパーセンテージの比較を示す。
【００６４】
【図３６】プロトコルＡ（丸印）またはプロトコルＢ（正方形）を使用して培養したCD34+細胞を移植したNSGW41マウスの脾臓から回収したヒトCD45+細胞中のCD33+細胞のパーセンテージの比較を示す。
【００６５】
【図３７】プロトコルＡ（丸印）またはプロトコルＢ（正方形）を使用して培養したCD34+細胞を移植したNSGW41マウスの脾臓から回収したヒトCD33+細胞中のGFP+細胞のパーセンテージの比較を示す。
【００６６】
【図３８】移植の１６週間後にNSGW41マウスの脾臓から採取した細胞の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。上パネルは、mock未処理細胞を移植したマウスから採取した脾臓を示す。上段は、左から右に順に、hCD45:mCD45キメリズム、ヒトCD45をゲーティングしたCD33+細胞、およびCD19+染色を示す。下段は、左から右に順に、hCD45+細胞におけるGFP発現、CD33+細胞におけるGFP発現、およびCD19+細胞におけるGFP発現を示す。下パネルは、AAVとRNPで処理した細胞を移植したマウスから採取した脾臓を示す。上段は、左から右に順に、hCD45:mCD45キメリズム、ヒトCD45をゲーティングしたCD33+細胞、およびCD19+染色を示す。下段は、左から右に順に、hCD45+細胞におけるGFP発現、CD33+細胞におけるGFP発現、およびCD19+細胞におけるGFP発現を示す。GFP+ヒト細胞はすべての造血細胞系に存在し、CD40L遺伝子座をHDR編集したヒトHSCからこれらの細胞が派生したことと一致していた。
【００６７】
【図３９】プロトコルＡ（丸印）またはプロトコルＢ（正方形）を使用して培養したCD34+細胞を移植したNSGW41マウスの骨髄から回収したヒトCD45+細胞中のCD34+CD38low細胞のパーセンテージの比較を示す。
【００６８】
【図４０】プロトコルＡ（丸印）またはプロトコルＢ（正方形）を使用して培養したCD34+細胞を移植したNSGW41マウスの骨髄から回収したヒトCD34+CD38lowCD45+細胞中のGFP+細胞のパーセンテージの比較を示す。
【００６９】
【図４１】mock細胞または編集細胞を移植したNSGW41マウスから回収した全ヒトCD45+細胞をCD34+でゲーティングした代表的なフローサイトメトリー分析を示す。
【００７０】
【図４２】組換えHDM2のヌクレオフェクションによるHDR率の改善を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
以下の詳細な説明において、本明細書の一部を構成する添付の図面を参照しながら本発明を説明する。別段の記載がない限り、図面中の類似の記号は、通常、類似の構成要素を示す。詳細な説明、図面および請求項に記載の実施形態は例示を目的としたものであり、本発明をなんら限定するものではない。本明細書に記載の主題の要旨や範囲から逸脱することなく、その他の実施形態を採用してもよく、その他の変更を加えてもよい。本明細書に概説され、図面に示された本開示の態様は、様々な構成で配置、置換、合体、分離および設計することができることは容易に理解され、このような態様はいずれも明示的に本明細書に包含される。
【００７２】
用語の定義
以下の説明において、様々な用語を広い意味で使用する。本発明の実施形態の理解を容易にするため、用語の定義を以下に記載する。別段の記載がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。たとえば、Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)；Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989)を参照されたい。本発明の開示を目的として以下の用語を以下のように定義する。
【００７３】
本明細書において、「a」および「an」という冠詞は、これらの冠詞の文法上の目的語となる１つまたは複数の（たとえば少なくとも１つの）ものを指すために使用される。たとえば、「an element」は１つのエレメントまたは複数のエレメントを意味する。
【００７４】
「約」は、特定の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、大きさ、量、重量または長さが、対照としての数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、大きさ、量、重量または長さと比較して、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％の範囲で変動することを意味する。
【００７５】
本明細書において、請求項の移行句、本体部を問わず、「含む（comprise(s)）」および「含んでいる（comprising）」という用語は、オープンエンドの意味を有するものと解釈される。すなわち、これらの用語は、「少なくとも有する」または「少なくとも含んでいる」という表現と同義であると解釈される。「含む」という用語が方法に関わる文脈で用いられる場合、当該方法が、明記された工程を少なくとも含み、さらに別の工程を含んでもよいことを意味する。また、「含む」という用語が化合物、組成物または装置に関わる文脈で用いられる場合、当該化合物、当該組成物または当該装置が、明記された特徴または構成要素を少なくとも含み、さらに別の特徴または構成要素を含んでもよいことを意味する。
【００７６】
本明細書において「対象」または「患者」は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、処置、観察または実験の対象となる動物が挙げられるが、これに限定されない。「動物」には、変温脊椎動物、温血脊椎動物、および魚類、甲殻類、爬虫類などの無脊椎動物、特に哺乳動物が含まれる。「哺乳動物」には、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、霊長動物（サル、チンパンジー、類人猿など）、特にヒトが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。
【００７７】
本明細書で開示するいくつかの実施形態は、本発明を必要とする対象または患者の選択に関する。いくつかの実施形態において、疾患に伴う症状の治療、緩和、抑制、進行もしくは改善を必要とする患者、または根治治療を必要とする患者が選択される。いくつかの実施形態において、Ｘ連鎖性高ＩｇＭ症候群（X-HIGM）の症状を有する患者、X-HIGMと診断された患者、またはX-HIGMを有する疑いのある患者が選択される。このような本発明を必要とする対象または患者の特定または選択は、臨床的評価および／または診断的評価により行うことができる。
【００７８】
Ｘ連鎖性高ＩｇＭ症候群（X-HIGM）は、CD40LG遺伝子の変異によって、CD40のシグナル伝達が欠損していることを特徴とする原発性免疫不全障害を指す。細胞表面分子CD40は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーであり、免疫細胞、造血細胞、血管細胞、上皮細胞などにおいて広く発現されており、様々な種類の腫瘍細胞でも発現される。CD40自体は、内因性キナーゼやその他のシグナル伝達活性を持っていないが、細胞の種類および微小環境に応じて遺伝子発現を様々に変化させる複雑な一連の下流アダプター分子を介して多様な作用を仲介する。CD40は、新規がん療法の標的となる可能性があり、間接的な免疫活性化作用とCD40発現腫瘍に対する直接的な細胞傷害作用を介して、腫瘍の退縮を仲介しうると考えられる。
【００７９】
CD40は、Ｂリンパ球、樹状細胞および単球に発現され、これにより細胞性免疫および液性免疫の極めて重要な制御因子として機能することが知られている（Grewal and Flavell, Annu Rev Immunol., 16:111 (1998); van Kooten and Banchereau, J Leukoc Biol., 67:2 (2000)）。
【００８０】
さらに、CD40は、内皮細胞、線維芽細胞、造血前駆細胞、血小板、基底膜上皮細胞などの、その他の多くの非免疫細胞の表面上でも発現される（Grewal and Flavell, Annu Rev Immunol., 16:111 (1998); van Kooten and Banchereau, J Leukoc Biol., 67:2 (2000); Young et al., Immunol Today, 9:502 (1998); Quezada et al., Annu Rev Immunol., 22:307 (2004)）。CD154としても知られているCD40リガンド（CD40L）は、CD40に対する主要なリガンドであり、主に活性化Ｔリンパ球および血小板により発現される（van Kooten and Banchereau, J Leukoc Biol., 67:2 (2000); Armitage et al., Nature, 357:80 (1992)）。また、アテローム性動脈硬化症、移植片拒絶、凝固、感染症の抑制および自己免疫は、いずれもCD40とCD40Lの相互作用によって制御される（Grewal and Flavell, Annu Rev Immunol., 16:111 (1998); van Kooten and Banchereau, J Leukoc Biol., 67:2 (2000)）。
【００８１】
「共刺激分子」は、Ｔ細胞の表面上のＴ細胞抗原受容体（TCR）が結合したMHC−ペプチド複合体とともに作用した場合に、共刺激作用により、該ペプチドに結合したＴ細胞を活性化させる単一の分子または複数の分子の組み合わせを包含する。
【００８２】
本明細書において、「治療」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、対象、特にX-HIGMに罹患している対象に見られる疾患、障害または生理状態に応じてなされる介入が挙げられるが、これに限定されない。治療の目的としては、症状の緩和または予防；疾患、障害または病態の進行または悪化の遅延または阻止；疾患、障害または病態の根治的治療；および疾患、障害または病態の寛解のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、「治療」は、基礎疾患の治療、基礎疾患に伴う症状の治療の両方を指す。たとえば、いくつかの実施形態において、治療により、疾患に伴う症状の軽減、緩和、改善もしくは除去および／または疾患の根治が得られる。
【００８３】
本明細書で述べる「養子細胞療法」または「養子細胞移入」は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、細胞の移入を指し、最も一般的には、免疫系細胞を同じ患者に戻したり、新たなレシピエント（宿主）に移入したりすることによって、免疫機能および免疫特性を移入する処置が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、養子細胞療法または養子細胞移入は、対象におけるCD40LG遺伝子の相同組換え修復を促進させるための細胞を投与することを含む。
【００８４】
本明細書において「相同組換え修復（HDR）」は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、DNAの二本鎖切断（DSB）の修復時などに細胞内で起こるDNA修復が挙げられるが、これに限定されない。HDRには、ヌクレオチド配列の相同性が必要であり、ドナーポリヌクレオチドを利用して、二本鎖切断（DSB）（たとえば、標的DNA配列内のDSB）が生じた配列の修復が行われる。ドナーポリヌクレオチドが修復に適した鋳型として機能するためには、通常、二本鎖切断部位の両側の配列と配列相同性を有する必要がある。HDRにより、たとえば、ドナーポリヌクレオチドからDNA標的配列へと遺伝子情報が伝達される。ドナーポリヌクレオチド配列がDNA標的配列と異なり、HDRによって、ドナーポリヌクレオチドの全体またはその一部がDNA標的配列に組み込まれた場合には、DNA標的配列が変更される（たとえば、挿入、欠失、変異が起こる）。いくつかの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドの全体、その一部またはそのコピーが、DNA標的配列部位に組み込まれる。
【００８５】
本明細書において「核酸」または「核酸分子」は、ポリヌクレオチドを指し、たとえば、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により得られる断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより得られる断片などが挙げられる。核酸分子は、天然のヌクレオチドモノマー（DNA、RNAなど）、または天然のヌクレオチドの類似体（たとえば、天然のヌクレオチドのエナンチオマー）からなるモノマー、またはこれらの組み合わせから構成されていてもよい。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分に修飾を有していてもよい。糖部分の修飾としては、たとえば、ハロゲン、アルキル基、アミンまたはアジド基による１つ以上のヒドロキシル基の置換が挙げられ、糖部分はエーテル化またはエステル化されていてもよい。さらに、糖部分全体が、立体構造的に類似の構造や電子的に類似の構造と置換されていてもよく、このような構造として、たとえば、アザ糖または炭素環式糖類似体が挙げられる。修飾塩基部分としては、アルキル化プリン、アルキル化ピリミジン、アシル化プリン、アシル化ピリミジン、およびその他の公知の複素環置換基が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはこれと似た結合により連結することができる。ホスホジエステル結合と似た結合としては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロセレノエート結合、ホスホロジセレノエート結合、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）結合、ホスホロアニリデート（phosphoranilidate）結合およびホスホロアミデート結合が挙げられる。「核酸分子」は、いわゆる「ペプチド核酸」も包含し、これは、ポリアミド主鎖に付加された天然の核酸塩基または修飾核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。本明細書において各核酸配列は、配列番号で記載されている場合があり、本発明の用途全体を通して記載されており、補遺Ｉに含まれている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のヌクレオチド配列は、配列番号１〜９および１２〜２７のうちのいずれか１つの配列と、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の同一性を有する。
【００８６】
本明細書において、「融合」または「融合した」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、第１の核酸の３’末端のコード配列と第２の核酸の５’末端のコード配列とがインフレームになるように、第１の核酸と第２の核酸がリン酸ジエステル結合で連結されている状態が挙げられるが、これに限定されない。さらに、「融合」または「融合した」という用語は、第１のポリペプチドのＣ末端が、ペプチド結合により第２のポリペプチドに連結されている状態も指しうる。それゆえ、本明細書において、「融合した」核酸またはペプチド（あるいは核酸またはペプチドの「融合」）は、分子の配置を指すものであり、２つの分子を連結させるという行為を必ずしも伴うものではない。たとえば、第１の核酸と第２の核酸との融合により、（第１の核酸がコードする）第１のポリペプチド配列と（第２の核酸がコードする）第２のポリペプチド配列とが融合した１つのポリペプチドをコードすることができる。いくつかの実施形態において、融合した核酸を含む分子は「融合核酸」と称される。
【００８７】
本明細書において、「バリアント」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、参照配列としてのポリヌクレオチド（またはポリペプチド）と実質的に類似した配列を有するポリヌクレオチド（またはポリペプチド）が挙げられるが、これに限定されない。ポリヌクレオチドの場合、バリアントは、参照配列としてのポリヌクレオチドと比較して、５’末端、３’末端および／または配列内の１つ以上の位置に１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、付加を有しうるポリヌクレオチドである。バリアントの配列と参照配列であるポリヌクレオチドの配列の間の類似性および／または相違性は、当技術分野で知られている慣用の手法、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびハイブリダイゼーション法を用いて検出することができる。また、バリアントポリヌクレオチドには、たとえば、部位特異的突然変異導入により作製されたポリヌクレオチドなどの合成的に創出されたポリヌクレオチドも包含される。一般に、DNA（ただしこれに限定されない）などのポリヌクレオチドのバリアントと参照配列であるポリヌクレオチドとの配列同一性は、当業者に公知の配列アラインメントプログラムで決定した場合、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数値であってもよい。ポリペプチドの場合、バリアントは、参照配列としてのポリペプチドと比較して、１つ以上のアミノ酸の欠失、置換または付加を有していてもよい。バリアントの配列と参照配列であるポリペプチドの配列の間の類似性および／または相違性は、当技術分野で知られている慣用の手法、たとえば、ウエスタンブロットを用いて検出することができる。一般に、ポリペプチドのバリアントと参照配列であるポリペプチドとの配列同一性は、当業者に公知の配列アラインメントプログラムで決定した場合、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数値であってもよい。
【００８８】
「調節エレメント」は、コアプロモーターの活性を調節するヌクレオチド配列である。たとえば、調節エレメントは、特定の細胞、組織または細胞小器官において、転写を可能とする細胞因子と特異的または選択的に結合するヌクレオチド配列を含んでいてもよい。このような調節エレメントは、通常、「細胞特異的」、「組織特異的」または「細胞小器官特異的」に発現される遺伝子と関連している。いくつかの実施形態において、細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子の編集用システムであって、CRISPRガイドRNAをコードする第１の核酸配列；Cas9タンパク質をコードする第２の核酸配列；第１のアデノウイルスタンパク質をコードする第３の核酸配列；および第２のアデノウイルスタンパク質をコードする第４の核酸配列を含み、前記CRISPRガイドRNAが、細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的であること、および第１の核酸配列がベクター中に含まれていることを特徴とするシステムを提供する。いくつかの実施形態において、第１の核酸配列、第２の核酸配列、第３の核酸配列および第４の核酸配列は、ヒト細胞などの真核細胞において作動可能な調節エレメントに連結されている。
【００８９】
本明細書において、「作動可能に連結されている」という用語は、調節エレメントと遺伝子またはそのコード領域との間の結合について述べるために使用される。通常、遺伝子の発現は、たとえば、構成的プロモーター、誘導型プロモーター、組織特異的調節エレメント、エンハンサーなどの（ただしこれらに限定されない）１つ以上の調節エレメントの制御下に置かれている。遺伝子またはコード領域は、調節エレメントと「作動可能に連結されている」、「作動可能に連結されている」、または「作動可能な関係にある」と表現されるが、これは、遺伝子またはコード領域が調節エレメントによる制御または影響を受けることを意味する。たとえば、プロモーターの作用によって、コード配列の転写または発現が起こる場合、このプロモーターは該コード配列に作動可能に連結されている。
【００９０】
本明細書において、「上流」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、ポリヌクレオチド上の特定の位置の５’位側、およびポリペプチド上の特定の位置のＮ末端側が挙げられるが、これらに限定されない。また、本明細書において、「下流」は、ヌクレオチド上の特定の位置の３’位側、およびポリペプチド上の特定の位置のＣ末端側を意味する。
【００９１】
本明細書において「コンストラクト」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、１つまたは複数の特定のヌクレオチド配列を発現させるために作製された組換え核酸、または別の組換えヌクレオチド配列の構築に使用される組換え核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を誘導するヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、遺伝子の５’末端側の非コード領域内において、構造遺伝子の転写開始点の近傍に位置する。プロモーター内の、転写開始において機能する配列エレメントは、コンセンサスヌクレオチド配列により特徴付けられることが多い。このようなプロモーターエレメントとして、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化特異的エレメント（DSE；McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)；この文献は引用によりその全体が本明細書に援用される）、サイクリックAMP応答エレメント（CRE）、血清反応エレメント（SRE；Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990)；この文献は引用によりその全体が本明細書に援用される）、グルココルチコイド応答エレメント（GRE）、およびその他の転写因子結合部位、たとえば、CRE/ATF（O’Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992)）、AP2（Ye et al., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994)）、SP1、cAMP応答エレメント結合タンパク質（CREB;Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)）および八量体因子（全般的な事項に関しては、Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987)およびLemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)を参照されたい；これらの文献はいずれも引用によりその全体が本明細書に援用される）が挙げられる。本明細書において、プロモーターは、構成的に活性なプロモーター、抑制型プロモーター、誘導型プロモーターのいずれであってもよい。プロモーターが誘導型プロモーターである場合、転写率は誘導剤に応答して上昇する。これに対して、プロモーターが構成的プロモーターである場合、転写率は誘導剤による制御を受けない。抑制型プロモーターも公知である。いくつかの実施形態において、調節エレメントは非翻訳領域であってもよい。いくつかの実施形態において、非翻訳領域は５’末端側の非翻訳領域である。いくつかの実施形態において、非翻訳領域は３’末端側の非翻訳領域である。いくつかの実施形態において、５’末端側の非翻訳領域または３’末端側の非翻訳領域が使用される。いくつかの実施形態において、５’末端側の非翻訳領域と３’末端側の非翻訳領域の両方が使用される。当業者であれば、本発明の実施形態における「非翻訳領域」の意味を理解できるであろう。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプロモーターは、MNDプロモーターであってもよい。MNDプロモーターは、負の制御領域が欠失しており、dl587revプライマー結合部位が置換された脊髄増殖性肉腫ウイルスのエンハンサーから名付けられたものであり、改変されたMoMulv LTRのU3領域と脊髄増殖性肉腫ウイルスのエンハンサーを含む、ガンマレトロウイルスの合成プロモーターである。
【００９３】
本明細書において、「エンハンサー」は、転写開始点に対する距離または方向性に関係なく転写効率を調節できる調節エレメントの１種を指す。
【００９４】
本明細書において「トランスフェクション」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、宿主細胞と本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターとを接触させることなどによって該宿主細胞に核酸を導入することが挙げられるが、これに限定されない。本明細書において「一過性トランスフェクション」は、一過性にトランスフェクトされた宿主細胞のゲノムに外来核酸が通常組み込まれないような方法を利用して、１つまたは複数の外来核酸を宿主細胞に導入することを指す。いくつかの実施形態において、前記核酸はRNAである。いくつかの実施形態において、前記核酸はDNAである。いくつかの実施形態において、前記核酸がRNAである場合、該RNAは、一過性にトランスフェクトされた細胞のゲノムに通常組み込まれることはない。いくつかの実施形態において、前記核酸がDNAである場合、該DNAは、一過性にトランスフェクトされた細胞のゲノムに組み込まれることがある。
【００９５】
本明細書において「ベクター」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、宿主細胞に遺伝物質を伝達するために使用されるポリヌクレオチドコンストラクト、通常、プラスミドまたはウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターとしては、たとえばウイルス、プラスミド、コスミドまたはファージを挙げることができる。本発明において使用されるベクターは、DNAで構成されていてもよく、RNAで構成されていてもよい。いくつかの実施形態において、ベクターはDNAで構成されている。「発現ベクター」とは、適切な環境下に置かれた場合に、該発現ベクター内に組み込まれた１つ以上の遺伝子によってコードされたタンパク質の発現を誘導することができるベクターである。ベクターは自律複製能を有することが好ましい。一般に、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子および転写ターミネーターを含む。遺伝子の発現は、通常、プロモーターの制御下に置かれており、遺伝子は該プロモーターと「作動可能に連結されている」と表現される。
【００９６】
本明細書において「ＡＡＶシステム」または「ＡＡＶ発現システム」という用語は、本明細書を参照すれば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、少なくとも１つの転写物をコードする核酸を発現させるための核酸が、１つ以上のＡＡＶベクターに組み込まれているシステムが挙げられるが、これに限定されない。本明細書において、「活性依存的発現」（およびこの用語を語根とする派生語）とは、核酸を含む細胞の特定の活性の変化により（たとえば細胞の脱分極により）、誘導される核酸の発現を指す。いくつかの実施形態において、細胞は神経細胞であり、刺激を受けて神経細胞が脱分極することにより、「活性依存的に」核酸の発現が誘導される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、配列番号１５、１６または１７に示される配列を含む。
【００９７】
本明細書に記載の「宿主細胞」という用語は、本明細書を参照すれば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、本発明の実施形態に記載のCas9 mRNA/AAVガイドRNAが導入される細胞、および本明細書に記載のシステムとともに提供される細胞が挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞は、原核細胞であってもよく、真核細胞であってもよい。原核細胞である宿主細胞としては、大腸菌、窒素固定細菌、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・アルバス（Staphylococcus albus）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、炭疽菌（Bacillus anthracis）、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・チューリゲンシス（Bacillus thuringiensis）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、マイコプラズマ、および／またはシアノバクテリアが挙げられるが、これらに限定されない。真核細胞である宿主細胞としては、原生動物細胞、真菌細胞、藻類細胞、植物細胞、昆虫細胞、両生類細胞、鳥類細胞および哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、細胞の少なくとも１つの標的遺伝子を編集するシステムであって、該細胞が真核細胞であることを特徴とするシステムを提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は形質転換細胞ではない。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代リンパ球である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、初代リンパ球、ＣＤ３４＋幹細胞、肝細胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細胞、筋細胞または腸細胞である。
【００９８】
「原核」細胞は真の核を持たない。原核細胞としては、細菌（たとえば、シアノバクテリア、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、窒素固定細菌、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、ビフィズス菌（Bifidobacterium）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、炭疽菌（Bacillus anthrax）、破傷風菌（Clostridium tetani）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、スタフィロコッカス・ニューモニエ（Staphylococcus pneumoniae）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）および／もしくは大腸菌）ならびに／または古細菌（たとえば、クレン古細菌（Crenarchaeota）、ユリ古細菌（Euryarchaeota）および／もしくはコル古細菌（Korarchaeota））が挙げられる。本明細書に記載のCas9タンパク質は、原核細胞に由来するタンパク質である。
【００９９】
「真核」細胞としては、藻類細胞、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（Ｔ細胞など）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
本明細書に記載の「前駆Ｔ細胞」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、胸腺へと遊走して、前駆Ｔ細胞になることができ、Ｔ細胞受容体を発現していないリンパ球系前駆細胞が挙げられるが、これに限定されない。すべてのＴ細胞は、骨髄中の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞由来の造血前駆細胞（リンパ球系前駆細胞）は、胸腺に定着して細胞分裂により拡大増殖し、未成熟な胸腺細胞の大集団を形成する。ごく初期の胸腺細胞はＣＤ４もＣＤ８も発現せず、したがって、ダブルネガティブ（ＣＤ４−ＣＤ８−）細胞に分類される。これらはその発達が進むにつれてダブルポジティブ（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）胸腺細胞となり、最終的にシングルポジティブ（ＣＤ４＋ＣＤ８−またはＣＤ４−ＣＤ８＋）胸腺細胞に成熟して、その後、胸腺から末梢組織へ移出される。
【０１０１】
本明細書に記載の「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、マクロファージ、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞などの骨髄系細胞、またはリンパ系細胞（たとえば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞など）に分化することができる前駆細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ＨＳＣは３種の幹細胞を含む異種細胞集団であり、これら３種の幹細胞は血液中のリンパ系子孫細胞と骨髄系子孫細胞の割合（Ｌ／Ｍ）によって区別される。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される細胞はＨＳＣ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代リンパ球またはＣＤ３４＋幹細胞である。
【０１０２】
本明細書において、「自家」は、幹細胞のドナーとレシピエントとが同じであることを指し、たとえば、患者または対象が幹細胞の提供者であることを指す。
【０１０３】
本明細書に記載の「初代ヒト細胞」は、その由来臓器の組織または血球から直接培養された細胞を指す。初代ヒト細胞は、不死化細胞株と比べて、インビボにおける複製能が優れている。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される細胞は初代ヒト細胞である。
【０１０４】
本明細書に記載の「共送達」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、インビトロ、インビボを問わず、２つ以上の別個の化学物質が送達されることが挙げられるが、これに限定されない。共送達は、別個の薬剤が同時に送達されること；別個の薬剤が混合物として同時に送達されること；および１種の薬剤が送達された後に、単一または複数の第２の薬剤が送達されることを指す。いずれの場合も、共送達される薬剤が共同して作用することが意図される。いくつかの実施形態において、共送達には、たとえば、目的のmRNAとＡＡＶベクターの送達が含まれる。
【０１０５】
本明細書に記載の「エンドヌクレアーゼ」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、ポリヌクレオチド鎖のホスホジエステル結合を切断する酵素が挙げられるが、これに限定されない。前記ポリヌクレオチドは、二本鎖DNA（dsDNA）、一本鎖DNA（ssDNA）、RNA、DNAとRNAの二本鎖ハイブリッド、合成DNA（たとえば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ以外の塩基を含むもの）のいずれであってもよい。エンドヌクレアーゼは、対称的な位置でポリヌクレオチドを切断して「平滑」末端を生じるものや、少しずれた位置でポリヌクレオチドを切断して突出末端を生じるものがあり、この突出部位は「粘着末端」とも呼ばれる。本明細書に記載の方法および組成物は、エンドヌクレアーゼにより生じた切断部位に対して使用してもよい。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、該システムは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、メガヌクレアーゼ（MegaTALなど）、CRISPR／Cas9などのエンドヌクレアーゼをコードする核酸；またはCas9、TALEN、MegaTALなどのエンドヌクレアーゼの特定のドメインもしくはその１つ以上の部分を含む融合タンパク質をコードする核酸をさらに提供することができる。ただし、これらの例には限定されず、その他のエンドヌクレアーゼ、その他のエンドヌクレアーゼを含む前記システムおよび方法の実施形態、ならびにこれらの例示的な実施形態を変更または改良したものを、過度な実験を行うことなく実施することができる。
【０１０６】
本明細書に記載の「転写活性化因子様（TAL）エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、ヌクレアーゼドメインに融合したTALエフェクタードメインを含むヌクレアーゼが挙げられるが、これに限定されない。TALエフェクターのDNA結合ドメインは、所望の標的と結合するように遺伝子組換えし、ヌクレアーゼドメイン（たとえばFoklヌクレアーゼドメインなど）と融合させてもよい。このような方法により、TALエフェクタードメインとヌクレアーゼの融合タンパク質を作製することができる。本明細書に記載の方法およびシステムは、TALエフェクターヌクレアーゼにより生じた切断部位に対して使用してもよい。本明細書で提供されるシステムの実施形態のいくつかにおいて、該システムは、TALENヌクレアーゼ、またはTALENヌクレアーゼをコードするベクターもしくは核酸をさらに含んでいてもよい。本明細書で提供される方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、TALENヌクレアーゼなどのヌクレアーゼを提供することをさらに含んでいてもよい。
【０１０７】
MegaTALは、DNAを標的とする２種の酵素を組み合わせて誘導されたものである。メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼとも呼ばれる）は、DNA認識能とヌクレアーゼ機能を同一ドメインに併せ持つことを特徴とする単鎖ペプチドである。本明細書で提供されるシステムの実施形態のいくつかにおいて、該システムは、MegaTALヌクレアーゼ、またはMegaTALヌクレアーゼをコードするベクターもしくは核酸をさらに含んでいてもよい。本明細書で提供される方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、MegaTALヌクレアーゼ、またはMegaTALヌクレアーゼをコードするベクターもしくは核酸を提供することをさらに含んでいてもよい。
【０１０８】
CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）は、短い反復塩基配列を含む原核生物のDNAセグメントである。各反復配列の後ろには、過去に遭遇した細菌ウイルスやプラスミドに由来する短い「スペーサーDNA」セグメントが組み込まれている。
【０１０９】
Cas9（CRISPR関連タンパク質９）は、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）などの微生物が持つ獲得免疫機構であるCRISPRに関連するRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ酵素である。化膿レンサ球菌は、Cas9を利用して、侵入してきたバクテリオファージDNAやプラスミドDNAなどの外来性DNAを記憶し、同じ外来性DNAが再侵入してくると、それを解読して切断する。Cas9は、外来性DNAを巻き戻して、ガイドRNAに存在する２０ｂｐのスペーサー領域との相補性を確認することによって、外来性DNAを解読する。DNA基質がガイドRNAと相補的であれば、Cas9は侵入してきたDNAを切断する。
【０１１０】
本明細書で述べるCRISPR/Casシステムは、遺伝子編集（特定の遺伝子配列の付加、破壊または変更）や遺伝子制御に使用される。Cas9タンパク質またはその誘導体もしくは断片と適切なガイドRNAを細胞に送達することによって、生物のゲノムを所望の位置で切断することができる。CRISPRを用いて、特定の集団全体のゲノムを改変することができるRNA誘導型遺伝子を構築することが可能である。CRISPR/Cas9システムの基本的なコンポーネントは、標的遺伝子、ガイドRNAおよびCas9エンドヌクレアーゼまたはその誘導体もしくは断片を含む。CRISPR/Cas9を使用して遺伝子編集を行う際の重要な点の１つとして、様々な種類の細胞にガイドRNAを効率よく送達できるシステムが必要であることが挙げられる。このようなシステムは、たとえば、核酸としてインビトロで作製されたガイドRNA（インビトロ転写または化学合成により作製されたガイドRNA）を送達することを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ガイドRNAをコードする核酸は、２’Ｏ−メチル塩基などの修飾塩基の組み込みによりヌクレアーゼ耐性が付与されている核酸である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のCRISPR/Cas9システムでは、Cas9ヌクレアーゼまたはその誘導体もしくは機能性断片をコードするポリヌクレオチド（たとえば、Cas9含有mRNAベクターに含まれる２０残基長の核酸配列）に、所望の長さのポリ（Ｔ）テールまたはポリ（Ａ）テールが付加されており、このポリヌクレオチドは本明細書に記載の教示に従って調製されるが、このようなCRISPR/Cas9システムは、たとえば、１以上の修飾塩基（たとえば本明細書に記載の１以上の修飾塩基）を含むガイドRNAとともに提供される。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、化学的に修飾されたガイドRNAを使用することが意図される。化学的に修飾されたガイドRNAは、ヒト初代細胞においてCRISPR-Casゲノム編集を実施する際に使用されている（Hendel, A. et al., Nat Biotechnol. 2015 Sep; 33(9):985-9）。ガイドRNAの化学的修飾には、ヌクレアーゼ耐性を付与する改変が含まれていてもよい。ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼであってもよく、エキソヌクレアーゼであってもよい。化学的修飾のいくつかとしては、２’−フルオロ、２’Ｏ−メチル、ホスホロチオエートジチオール３’−３’末端結合、２−アミノ−ｄＡ、５−メチル−ｄＣ、Ｃ−５プロピニル−Ｃ、Ｃ−５プロピニル−Ｕ、モルホリノなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明はこれらの例示に限定されず、その他の化学修飾、これらの典型的な化学修飾の別法および変法も本発明に含まれる。
【０１１２】
本明細書に記載の実施形態において有用な典型的なガイドRNAは、本明細書に記載の１つ以上の修飾塩基を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記ガイドRNAは、配列番号１２に示される配列を含む。さらに、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを使用することによって、広範な初代細胞に形質導入を行うことができるため、ガイドRNAを発現させる重要なシステムではAAVベクターを使用しているAAVベクターは、感染症を引き起こさず、ゲノムに組み込まれないことが知られている。したがって、AAVベクターは、安全かつ有効に使用できるという利点がある。
【０１１３】
「エキソヌクレアーゼ」は、ポリヌクレオチド鎖の末端からホスホジエステル結合を切断する酵素を指し、この酵素は、加水分解反応を利用して３’末端または５’末端からホスホジエステル結合を切断する。ポリヌクレオチドは、二本鎖DNA（dsDNA）、一本鎖DNA（ssDNA）、RNA、DNAとRNAの二本鎖ハイブリッド、合成DNA（たとえば、A、C、G、T以外の塩基を含むもの）のいずれであってもよい。「５’エキソヌクレアーゼ」は、５’末端からホスホジエステル結合を切断するエキソヌクレアーゼを指す。「３’エキソヌクレアーゼ」は、３’末端からホスホジエステル結合を切断するエキソヌクレアーゼを指す。エキソヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼによって切断されたポリヌクレオチド鎖の末端からホスホジエステル結合を切断してもよく、あるいは、剪断（たとえば、微細針に通過させる操作、加熱、超音波処理、ミニビーズを用いた破砕、または噴霧化）、放射線照射、紫外線照射、活性酸素暴露、化学的加水分解、化学療法剤の使用などのその他の化学的方法または物理的方法によって切断されたポリヌクレオチド鎖の末端からホスホジエステル結合を切断してもよい。エキソヌクレアーゼは、平滑末端または粘着末端からホスホジエステル結合を切断してもよい。３’−エキソヌクレアーゼとして、大腸菌エキソヌクレアーゼＩおよび大腸菌エキソヌクレアーゼIIIの２種が一般的に使用されており、これらのエキソヌクレアーゼは、一本鎖を３’末端から分解するエキソヌクレアーゼ活性を有する。３’−エキソヌクレアーゼとしては他にも、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（NDK）類であるNDK1（NM23-H1）、NDK5、NDK7およびNDK8（Yoon J-H, et al., Characterization of the 3’ to 5’ exonuclease activity found in human nucleoside diphosphate kinase 1 (NDK1) and several of its homologues. (Biochemistry 2005:44(48):15774-15786.)；WRN（Ahn, B., et al., Regulation of WRN helicase activity in human base excision repair. J. Biol. Chem. 2004, 279:53465-53474)；ならびにThree prime repair exonuclease 2（Trex2）（Mazur, D. J., Perrino, F. W., Excision of 3’ termini by the Trex1 and TREX2 3’→5’ exonucleases. Characterization of the recombinant proteins. J. Biol. Chem. 2001, 276:17022-17029；これらの文献はいずれも引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）が挙げられる。５’−３’エキソヌクレアーゼとして、大腸菌エキソヌクレアーゼVIIおよびＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼの２種が一般的に使用されており、一本鎖を分解するエキソヌクレアーゼ活性が５％保持されている。エキソヌクレアーゼは、大腸菌などの原核生物に由来するエキソヌクレアーゼであってもよく、あるいは酵母、線虫、マウス、ヒトなどの真核生物に由来するエキソヌクレアーゼであってもよい。本明細書で提供されるシステムの実施形態のいくつかにおいて、該システムは、エキソヌクレアーゼ、またはエキソヌクレアーゼをコードするベクターもしくは核酸をさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼはTrex2である。本明細書で提供される方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、Trex2などのエキソヌクレアーゼ、またはエキソヌクレアーゼをコードするベクターもしくは核酸を提供することをさらに含んでいてもよい。
【０１１４】
本明細書に記載の「ガイド」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、ヌクレアーゼを部位特異的に標的核酸配列に誘導する任意のポリヌクレオチドが挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、前記ガイドは、RNA、DNA、またはRNAとDNAの組み合わせを含む。本明細書に記載の実施形態において有用な典型的なガイドRNAを、配列番号１２に示される配列に提供するが、このガイドRNAは、本明細書に記載の１つ以上の修飾塩基を含んでいてもよい。
【０１１５】
「ゲノム領域」とは、宿主細胞のゲノムを構成する染色体のセグメントであって、標的核酸配列部位の両側に存在するセグメント、また該標的部位の一部を含むセグメントのことである。ドナーポリヌクレオチドの相同アームは、対応するゲノム領域との間で相同組換えが起こるよう十分な相同性を有する。いくつかの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドの相同アームは、標的部位を挟んで両側に隣接して存在するゲノム領域と顕著な配列相同性を有する。また、標的部位から離れた位置にあるゲノム領域と十分な相同性を有するような相同アームを設計することも可能である。
【０１１６】
本明細書に記載の「非相同末端結合（NHEJ）」とは、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、ドナーポリヌクレオチドを必要とせずに、DNA中の二本鎖切断部位の末端同士が直接連結されることにより二本鎖切断（DSB）が修復されることが挙げられるが、これに限定されない。NHEJは、修復鋳型を使用せずにDNAの修復を行うことが可能な、細胞に備わったDNA修復経路である。ドナーポリヌクレオチドを使用せずに行われるNHEJでは、多くの場合、二本鎖切断（DSB）が生じた部位にヌクレオチドのランダムな挿入や欠失が起こる。
【０１１７】
本明細書において、「切断部位」は、第１のポリペプチドとシスの位置関係にある第２のポリペプチドの分離を仲介する配列を指す。したがって、簡潔に言えば、本明細書において、「切断」、「切断部位」などは、１つのポリヌクレオチドによりコードされ、シスの位置関係にある２つのポリペプチドの分離を指す。したがって、「切断」および「切断部位」は、タンパク質分解部位およびタンパク質分解を意味するということもできるが、必ずしもこれらには限られず、たとえばリボソームスキッピングなどのポリペプチドの分離を仲介するその他の機構を指すこともある。切断は、様々な方法によって開始することができ、たとえば、ホスホジエステル結合を酵素的加水分解または化学的加水分解することによって開始することができるが、切断を開始する方法はこれらに限定されない。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、別個の２本の一本鎖が切断された結果として生じる。二本鎖DNA、RNAまたはDNA／RNAハイブリッドが切断されると、平滑末端または突出末端が生じうる。
【０１１８】
「相補的」とは、相補的配列が、参照配列としてのポリヌクレオチド配列の全体またはその１つ以上の部分と相同であることを指す。たとえば、ヌクレオチド配列「CATTAG」は、参照配列CATTAG」と一致し、別の参照配列「GTAATC」に相補的である。
【０１１９】
本明細書において「標識」は、検出可能な分子を表す。好適な標識の多くは、ポリペプチドを含むものである。それゆえ、本明細書において、「標識核酸」は、標識をコードする核酸を指す。いくつかの実施形態において、AAVベクターシステムは標識ポリヌクレオチドを含む。したがって、いくつかの実施形態において、プロモーター（MNDプロモーターなど）が標識ポリヌクレオチドと作動可能に連結されていることから、本明細書に記載のAAVベクターはレポーターを含むように構成されている。本明細書に記載の実施形態において好適な標識としては、Aequoria victoria GFP、Renilla muelleri GFP、Renilla reniformis GFP、Renilla ptilosarcus GFPなどの緑色蛍光タンパク質（GFP）、青色蛍光タンパク質（BFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、および橙色蛍光タンパク質（OFP）が挙げられるが、これらに限定されない。その他のレポーター遺伝子としては、ネオマイシン、ホスホロトランスフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、アミノグリコシド、ホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢ、キサンチングアニンホスホリボシル（トランスフェラーゼ）、ルシフェラーゼ（たとえば、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼなど）、DHFR／メトトレキサート、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、turbo、およびtagRFP、ならびにこれらのレポーター遺伝子の核標的型が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、たとえば活発な細胞での標識の産生が所望される場合は、目的のポリペプチド自体に標識が含まれる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるAAVコンストラクトは、MNDプロモーター駆動性のGFPカセットを含み、MNDプロモーター駆動性のGFPカセットにより、AAVの形質導入効率を追跡することができる。
【０１２０】
本明細書に記載の「遺伝子発現」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、遺伝子産物の生合成が挙げられるが、これに限定されない。たとえば、構造遺伝子の場合、遺伝子発現は、構造遺伝子のmRNAへの転写、およびmRNAから１つ以上のポリペプチドへの翻訳を含む。
【０１２１】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基で構成されるポリマーであり、天然由来のものおよび合成されたものを含む。約１０アミノ酸残基未満のポリペプチドは、一般に「ペプチド」と呼ばれる。ポリペプチドはタンパク質と見なすこともできる。
【０１２２】
「タンパク質」は、１つ以上のポリペプチド鎖を含む巨大分子である。タンパク質は、糖鎖基などの非ペプチド成分をさらに含んでいてもよい。タンパク質への糖鎖やその他の非ペプチド性置換基の付加は、該タンパク質を産生する細胞によって行われてもよく、付加される糖鎖やその他の非ペプチド性置換基の種類は細胞の種類によって異なる。本明細書において、タンパク質は、そのアミノ酸主鎖構造によって定義されるものであり、糖鎖基などの置換基は特に規定されないが、このような置換基がタンパク質中に含まれていてもよい。いくつかの実施形態において、細胞の少なくとも１つの標的遺伝子を編集するシステムが提供され、該システムは、CRISPRガイドRNAをコードする第１の核酸配列；Cas9タンパク質をコードする第２の核酸配列；第１のアデノウイルスタンパク質をコードする第３の核酸配列；および第２のアデノウイルスタンパク質をコードする第４の核酸配列を含み、前記CRISPRガイドRNAが、細胞における少なくとも１つの標的遺伝子と相補的であること、ならびに第１の核酸配列がベクターに含まれていることを特徴とする。本明細書において各アミノ酸配列は、配列番号で記載されている場合があり、本発明の用途全体を通して記載されており、補遺Ｉに含まれている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸配列は、配列番号１０または配列番号１１の配列と、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の同一性を有する。
【０１２３】
本明細書で使用されている実質的に複数形および／または単数形の用語は、当業者であれば、本明細書の記載および／または用途に適するように、複数形の用語を単数のものとして、かつ／または単数形の用語を複数のものとして解釈することができる。本発明を明確なものとするために、様々な単数形／複数形の用語が意図的に使い分けられている。
【０１２４】
当業者であれば、本明細書に記載の用語、特に添付の請求項（たとえば添付の請求項の本体部）に記載の用語は、通常、「オープンエンドな」用語であることを理解できるであろう（たとえば、「含んでいる（including）」という用語は、「含んでいるが、これらに限定されない」と解釈されるべきであり、「有する（having）」という用語は、「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「含む（include）」という用語は「含むが、これらに限定されない」と解釈されるべきである）。さらに、特定の数が請求項に記載されている場合、前述のような意図も請求項に明確に記載されており、特定の数が記載されていない場合はそのような意図も存在しないことも、当業者であれば理解できるであろう。具体的に説明をすれば、たとえば、後述の特許請求の範囲では、請求項を定義するために、「少なくとも１つ」や「１つ以上」といった前置きが記載されている場合がある。しかしながら、このような前置きが記載されているからといって、不定冠詞「１つ（ａまたはａｎ）」を使用して構成要素が記載された請求項を、１つのみの構成要素を含む実施形態に限定すべきではなく、たとえ同じ請求項内に「１つ以上」または「少なくとも１つ」といった前置きと「１つ（ａまたはａｎ）」といった不定冠詞とが含まれていたとしても、１つのみの構成要素を含む実施形態に限定すべきではない（たとえば、「１つ（ａおよび／またはａｎ）」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味すると解釈すべきである）。これは、定冠詞を使用して記載された請求項でも同じである。また、請求項に特定の数が明確に記載されていたとしても、「少なくとも」記載されたその数であるということを当業者であれば理解するであろう（たとえば、修飾語を伴わない「２つ」という記載は、「少なくとも２つ」または「２つ以上」を意味する）。さらに、「Ａ、ＢおよびＣのうちの少なくとも１つ」といった慣用語句が使用されている場合、通常、そのような語句は、当業者がその語句を通常理解する意味で記載されている（たとえば「Ａ、ＢおよびＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみを有するシステム、Ｂのみを有するシステム、Ｃのみを有するシステム、ＡとＢを有するシステム、ＡとＣを有するシステム、ＢとＣを有するシステム、ならびに／またはＡ、ＢおよびＣを有するシステムなどを包含するが、これらに限定されない）。また、「Ａ、ＢまたはＣのうちの少なくとも１つ」といった慣用語句が使用されている場合、通常、そのような語句は、当業者がその語句を通常理解する意味で記載されている（たとえば「Ａ、ＢまたはＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみを有するシステム、Ｂのみを有するシステム、Ｃのみを有するシステム、ＡとＢを有するシステム、ＡとＣを有するシステム、ＢとＣを有するシステム、ならびに／またはＡ、ＢおよびＣを有するシステムなどを包含するが、これらに限定されない）。さらに、２つ以上の選択肢を表すための選言的用語および／または選言的語句は、明細書、特許請求の範囲または図面のいずれにおいても、記載された用語のうちの１つ、記載された用語のいずれか、または記載された用語の両方を含む場合があると当業者であれば理��するであろう。たとえば「ＡまたはＢ」という表現は、「ＡまたはＢ」または「ＡおよびＢ」を含む場合がある。
【０１２５】
Ｘ連鎖性高ＩｇＭ症候群
Ｘ連鎖性高免疫グロブリンＭ（IgM）症候群（X-HIGM）は、CD40LGに変異を有するヒトに発症し、感染症の再発、正常または高値を示すIgM濃度、血清中免疫グロブリンＧ、ＡおよびＥ（IgG、IgAおよびIgE）の低下、メモリーＢ細胞数の減少、クラススイッチを起こしたメモリーＢ細胞の欠損を特徴とする（図１）。CD40Lの機能の再構成により適切な造血細胞系列へと誘導する遺伝子療法は、X-HIGM患者に対する治療法を顕著に改善できると考えられる。
【０１２６】
興味深いことに、女性のX-HIGM保因者についての研究では、CD40LG遺伝子のＸ連鎖性の不活性化はランダムかつ非常に不均一であり、何人かの保因者では、Ｔ細胞の５〜１０％のみにしか非変異CD40Lの発現が認められないことが示されている。さらに、Ｔ細胞の５％のみにしか非変異CD40Lの発現が認められない女性のX-HIGM保因者は、高ＩｇＭ症候群に特徴的な症状を呈した。Ｔ細胞の１２％ほどにしか非変異CD40Lの発現が認められない女性の保因者では症状は現れない。これらのことから、免疫機能の低下を伴わない非変異CD40Lの発現の閾値は５〜１２％である可能性が示唆された。したがって、遺伝子療法によって遺伝子発現が修正された細胞の割合が比較的低かったとしても、臨床的有用性があると考えられる（Hollenbaugh, D., et al., The Journal of clinical investigation, 1994. 94(2): p. 616-622; de Saint Basile, G., et al., European journal of immunology, 1999. 29(1): p. 367-373）。
【０１２７】
CD40とCD40リガンド（CD40L）による共刺激シグナルは、抗原認識の際のＢ細胞とＴ細胞のクロストークにおいて極めて重要な役割を果たしている（Banchereau, J., et al., Annual review of immunology, 1994. 12(1): p. 881-926; Foy, T.M., et al., Annual review of immunology, 1996. 14(1): p. 591-617; Elgueta, R., et al., Immunol Rev, 2009. 229(1): p. 152-72）。CD40Lは、主に活性化Ｔ細胞に発現されるが、炎症状態では、樹状細胞やマクロファージなどのその他の免疫細胞においても発現され、これに対して、CD40は、Ｂ細胞に構成的に発現される（Schonbeck, U. and P. Libby, The CD40/CD154 receptor/ligand dyad. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS, 2001. 58(1): p. 4-43; van Kooten, C. and J. Banchereau, Current opinion in immunology, 1997. 9(3): p. 330-337）。CD40LによるCD40の活性化は、Ｂ細胞の発達段階に必須であり、Ｂ細胞の増殖を促進し、免疫グロブリンのクラススイッチングおよび体細胞超変異の極めて重要なチェックポイントとして作用する（Clark, E.A. and J.A. Ledbetter, Nature, 1994. 367(6462): p. 425; Bishop, G.A. and B.S. Hostager, Cytokine & growth factor reviews, 2003. 14(3-4): p. 297-309; Crotty, S., Nature Reviews Immunology, 2015. 15(3): p. 185;Kawabe, T., et al., Immunity, 1994. 1(3): p. 167-178）。
【０１２８】
X-HIGM治療用の遺伝子療法を開発する過去の試みでは、Cd40l-/-マウスの骨髄造血幹細胞（HSC）にCD40L cDNA発現カセットを送達するため、γ−レトロウイルスが使用された。しかし、この方法では、マウスの大部分においてＴ細胞のリンパ球増殖性疾患が起こったことから、CD40Lの内因性転写制御では、安全性を考慮する重要性があることが示唆された（Sacco, M.G., et al., Cancer gene therapy, 2000. 7(10): p. 1299; Brown, M.P., et al., Nature medicine, 1998. 4(11): p. 1253）。
【０１２９】
過去の研究では、初代ヒトＴ細胞の内在性プロモーターの下流にCD40Lのコード配列を直接送達する遺伝子編集アプローチが検討された（Hubbard, N., et al., Blood, 2016. 127(21): p. 2513-22）。このアプローチは、CD40LG特異的TALEヌクレアーゼ（TALEN）を使用した相同組換え修復（HDR）に基づく方法であり、血清型６型アデノ随伴ウイルス（AAV6）を使用して、CD40LG相同アームを含むCD40L cDNAが送達された。遺伝子編集されたＴ細胞におけるCD40Lの発現動態は、遺伝子編集されていないＴ細胞における内因性CD40Lタンパク質の発現動態を反映していた。さらに、遺伝子編集によって、CD40Lの発現と、X-HIGM患者のインビトロでのＴ細胞の機能が回復した。Hubbardにより報告されたこの方法は、Ｔ細胞療法として有望であったものの、造血幹細胞・前駆細胞（HSPC）を使用した遺伝子編集アプローチの将来的なX-HIGM根治的治療としての臨床への移行はなされていない。
【０１３０】
CD34+HSPCにおいてHDRを利用した遺伝子編集は、Ｔ細胞よりも実施が困難であった（Sather, B.D., et al., Sci Transl Med, 2015. 7(307): p. 307ra156）。さらに、免疫不全ヒト化マウスへの遺伝子編集HSPCの生着は、未編集細胞よりも不良である（De Ravin, S.S., et al., Nat Biotechnol, 2016. 34(4): p. 424-9; Dever, D.P., et al., Nature, 2016. 539(7629): p. 384-389; De Ravin, S.S., et al., Sci Transl Med, 2017. 9(372): p. eaah3480; Hoban, M.D., et al., Blood, 2015. 125(17): p. 2597-604）。特に、G-CSFで動員した末梢血由来HSPC（細胞の由来源として臨床的意義がより高い）を使用した場合、高率で維持された遺伝子編集細胞の検出は困難であった。
【０１３１】
したがって、本明細書で提供するいくつかの実施形態は、ゲノム編集治療アプローチを使用して、X-HIGMを治療、緩和、抑制または改善することに関する。いくつかの実施形態において、内在性プロモーターおよび内在性エンハンサーの制御下のインタクトなCD40LG cDNAをHSPCに導入するシステムおよびそのための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムおよび方法によって、CD40Lの免疫学的欠陥および機能的欠陥を回復させることができ、根治療法を提供することができる。
【０１３２】
いくつかの実施形態は、たとえば、CD34+造血幹細胞における相同組換え修復に基づいた遺伝子編集アプローチに関し、この方法では、CD40LをコードするcDNAが、内在性プロモーターの制御下に置かれる。ヒト末梢血幹細胞の最大３０％において、CD40Lのコード配列またはコントロールGFPのコード配列がオンターゲットで組み込まれる。遺伝子編集細胞の生着能力を評価するため、GFP発現CD34+細胞を免疫不全マウスに移植した。移植したこのヒト細胞は、マウス骨髄から回収した細胞において相当な割合を占め、そのうちの１．５％が所望とする遺伝子編集を含んでいた。回収した遺伝子編集細胞は、骨髄系細胞、Ｂ細胞、CD34+細胞などの様々な細胞系列の細胞を含んでいた。このエクスビボ遺伝子編集プロトコルにおいて、低分子の添加を行ったところ、ヒト細胞の生着が増加したが、所望とする遺伝子編集細胞を含む生着細胞のパーセンテージへの影響は見られなかった。これらの知見から、ヒト造血幹細胞においてCD40LG遺伝子座の遺伝子編集が可能であることが実証された。
【０１３３】
さらに、本明細書における開示は、ヒト末梢血由来HSPCにおけるCD40LG遺伝子座の効率的な編集、遺伝子編集されたヒト末梢血由来HSPCの効率的な培養、および遺伝子編集された多能性幹細胞の免疫不全マウスへの生着のための方法、システムおよび組成物に関する。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、ヒト造血幹細胞（HSC）においてAAVを使用したHDRの効率は、Cas9 RNPとTALENの２つのヌクレアーゼプラットフォーム間で示される。RNPガイドRNA（gRNA）は、Cas9による切断が、TALENの標的の15bp内を標的とするように設計し、同じドナー鋳型を使用してこれらのヌクレアーゼを比較した。CD40LGプロモーターは、HSCにおいて活性を示さないため、両側に1kbのCD40LG相同領域を含むMNDプロモーター−GFP発現カセットを送達できるようにAAV6ドナーを設計した（図２）（Challita, P.-M., et al., Journal of virology, 1995. 69(2): p. 748-755）。標的化コンストラクト内のCD40LG相同アームは、TALEN結合部位およびCas9 gRNA結合部位が欠失しているため、これらのヌクレアーゼによって切断されない。
【０１３５】
いくつかの実施形態は、成体から動員したＣＤ３４＋細胞を用いて、TALEN mRNAまたはCas9/gRNAリボ核タンパク質複合体（RNP）と、プロモーター駆動性蛍光マーカーの標的組み込み用ＡＡＶドナーとを共送達する方法に関する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法により、複数のドナーで効果的な相同組換え修復率が得られ、TALENでは、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくはそれ以上、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の効率で相同組換え修復が達成され、RNPでは、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくはそれ以上、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の効率で相同組換え修復が達成される。いくつかの実施形態において、RNP/AAV共送達を用いた場合に、細胞の生存能力が最も高くなる。いくつかの実施形態において、遺伝子編集したＨＳＣは、コロニー形成単位アッセイにおいて多系統に分化できる能力を保持する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムにより、免疫不全マウスにおいて長期的な生着と分化能が提供される。いくつかの実施形態において、CD40LG cDNAを有するAAVベクターにより、CD40LG欠損細胞での発現が回復する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムおよび方法は、患者の前記疾患または該疾患に伴う症状の治療的な修正がなされる。
【０１３６】
相同組換え修復
相同組換え修復（HDR）は、相同性を有する核酸（たとえば姉妹染色分体または外来核酸）を用いて、DNAの損傷を修復するプロセスを指す。正常細胞において、HDRは、一般に、切断の認識、切断の安定化、切除、一本鎖DNAの安定化、DNAクロスオーバー中間体の形成、クロスオーバー中間体の分解、連結などの一連の工程を伴う。本明細書で述べるように、HDRを利用して、ゲノム中の標的配列を変更して変異を正常に修正（たとえば修復または編集）することができる。特定の理論に縛られることを望むものではないが、ドナー鋳型または鋳型核酸を用いることにより、HDRによる標的配列の変更が起こると考えられる。たとえば、ドナー鋳型または鋳型核酸により、標的部位を変更することができる。
【０１３７】
本明細書における実施形態のいくつかは、Ｘ連鎖性高ＩｇＭ症候群（X-HIGM）に関わる遺伝子の相同組換え修復方法および該遺伝子の相同組換え修復システムに関する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子はCD40LG遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記方法は、ヒト造血細胞におけるCD40LG遺伝子の相同組換え修復（HDR）を含む。いくつかの実施形態において、前記方法およびシステムは、ヌクレアーゼを用いたCD40LG遺伝子のHDRを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼを用いたHDRは、TALENをベースとするヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼを用いるHDRは、CRISPR/Casをベースとするヌクレアーゼを含む。
【０１３８】
TALEN
転写活性化因子様（TAL）エフェクターDNA修飾酵素（TALEN）は、特定のDNA配列を切断するよう作製することができる制限酵素である。TALENは、TALエフェクタードメインとDNA切断ドメインとを融合することにより作製される。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、CD40LG TALENを用いた標的化に使用されるCD40LG遺伝子座は、ＡＡＶドナーと共送達される。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、CD40LG TALENフォワード配列は、配列番号１０および配列番号２１に示される配列である。いくつかの実施形態において、CD40LG TALENリバース配列は、配列番号１１および配列番号２２に示される配列である。いくつかの実施形態において、フォワード配列および／またはリバース配列は、配列番号１０、２１、１１および２２のいずれかに示される配列と、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の同一性を有する。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、AAVドナーは、MNDプロモーターの制御下にGFPカセットを含む。いくつかの実施形態において、AAVドナーは、MNDプロモーター駆動性のGFPカセットを挟んで両側に隣接して存在する１ｋｂの相同アームを有する（配列番号１４）。いくつかの実施形態において、AAVドナーは、配列番号１４および１５に示すように、TALENおよびガイド配列による切断を防ぐため１つ以上のヌクレオチド変異を含む。いくつかの実施形態において、MNDプロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号１４または配列番号１５の配列と、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の同一性を有する。
【０１４２】
本明細書で提供する実施形態のいくつかは、CD40LG遺伝子（配列番号１３）の相同組換え修復（HDR）において使用されるTALENヌクレアーゼに関する。いくつかの実施形態において、TALENは、CD40LG遺伝子のTALEN結合部位に結合する。いくつかの実施形態において、CD40LG TALENは、天然のCD40LG配列（配列番号１３）に結合する。いくつかの実施形態において、CD40LG遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１３の配列と、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の同一性を有する。
【０１４３】
CD40LG TALENによる標的化に使用されるCD40LG遺伝子座は、５’末端から３’末端の方向に、上流の相同アーム（配列番号１８）；ガイドRNA（配列番号１２）を含むエキソン１（配列番号２６）；T-for（TALENフォワード結合部位；配列番号２３）；切断部位（配列番号２５）；T-rev（TALENリバース結合部位；配列番号２４）；エキソン２（配列番号２７）；および下流の相同アーム（配列番号１９）を含む。いくつかの実施形態において、前記コンポーネント（上流の相同アーム、エキソン１、ガイドRNA、T-for、切断部位、T-rev、エキソン、および下流の相同アームのうちの１つ以上を含む）のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列は、それぞれに対応する配列番号（配列番号１８、配列番号２６、配列番号１２、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２４、配列番号２７および配列番号１９）に示される配列と、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の同一性を有する。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、CD40LG TALENを用いた標的化に使用されるCD40LG遺伝子座は、AAVドナーと共送達される。いくつかの実施形態において、CD40LG TALENフォワード配列は、配列番号１０に示される配列である。いくつかの実施形態において、CD40LG TALENリバース配列は、配列番号１１に示される配列である。いくつかの実施形態において、AAVドナーは、MNDプロモーターの制御下にGFPカセットを含む。いくつかの実施形態において、AAVドナーは、MNDプロモーター駆動性のGFPカセットを挟んで両側に隣接して存在する１ｋｂの相同アームを有する（配列番号１４）。いくつかの実施形態において、AAVドナーは、配列番号１４および１５に示すように、TALENおよびガイド配列による切断を防ぐため１つ以上のヌクレオチド変異を含む。
【０１４５】
CRISPR/Cas
本明細書における実施形態のいくつかは、目的遺伝子の相同組換え修復（HDR）に使用されるCasヌクレアーゼに関する。いくつかの実施形態において、前記CasヌクレアーゼはCas9ヌクレアーゼである。Cas9は、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）などの微生物が持つ獲得免疫機構であるCRISPR（Clustered Regularly Interspersed Palindromic Repeats）に関連するRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ酵素である。化膿レンサ球菌は、Cas9を利用して、侵入してきたバクテリオファージDNAやプラスミドDNAなどの外来性DNAを記憶し、同じ外来性DNAが再侵入してくると、それを解読して切断する。Cas9は、外来性DNAを巻き戻して、ガイドRNAに存在する２０ｂｐのスペーサー領域と相補的かどうかを確認することによって、外来性DNAを解読する。DNA基質がガイドRNAと相補的であれば、Cas9は侵入してきたDNAを切断する。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、Casヌクレアーゼは、単鎖ガイドRNAとともに複合体を形成し、リボ核タンパク質複合体（RNP）として送達される。いくつかの実施形態において、CRISPRガイド配列は配列番号１２に示される配列である。いくつかの実施形態において、RNPはAAVドナーと共送達される。いくつかの実施形態において、AAVドナーは自己相補型AAV（scAAV）である。いくつかの実施形態において、AAVドナーは、MNDプロモーターの制御下にあるGFPカセットを含み、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）部位は欠失している。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、前記核酸は、配列番号１２によってコードされる単鎖ガイドRNA（sgRNA）などの、単鎖ガイドRNA（sgRNA）を含む。いくつかの実施形態において、前記sgRNAをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２の配列と、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の同一性を有する。
【０１４８】
細胞
本明細書における実施形態のいくつかは、細胞の内在性CD40LG遺伝子座を改変するための、TALENヌクレアーゼやCasヌクレアーゼなどのヌクレアーゼと、AAVドナー鋳型との共送達に関する。いくつかの実施形態において、前記細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記細胞は形質転換細胞ではない。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代リンパ球である。いくつかの実施形態において、前記細胞はリンパ球前駆細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト造血細胞である。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、前記細胞は、細胞内在性のCD40LG遺伝子座を改変するために、TALENヌクレアーゼやCasヌクレアーゼなどのヌクレアーゼとAAVドナーの共送達により形質転換される。いくつかの実施形態において、細胞のCD40LG遺伝子を編集する方法が提供され、該方法は、該細胞の少なくとも１つの標的遺伝子と相補的な、TALENガイドRNAやCRISPRガイドRNAなどのガイドRNAをコードする第１の核酸配列を含む第１のベクターを細胞に導入する工程；およびTALENヌクレアーゼやCasヌクレアーゼなどのヌクレアーゼ、またはその誘導体もしくは断片をコードする第２の核酸配列を前記細胞に導入する工程を含む。いくつかの実施形態において、前記方法により作製された細胞を提供する。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の１つ以上の核酸組成物を前記細胞に提供する工程を含み、この核酸組成物は、配列番号１〜２７のうちの１つ以上に示される配列または配列番号１〜２７のうちの１つ以上によってコードされる配列であり、たとえば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６および／または２７のいずれか１つに示される配列またはこれらの配列番号のいずれか１つによってコードされる配列と、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の同一性を有する配列である。
【０１５０】
治療方法
本明細書におけるいくつかの実施形態は、CD40LG遺伝子の相同組換え修復（HDR）の促進を必要とする対象において、CD40LG遺伝子の相同組換え修復（HDR）を促進する方法に関する。いくつかの実施形態において、前記方法は、CD40LG遺伝子の相同組換え修復（HDR）の促進を必要とする対象を選択または特定することを含む。CD40LG遺伝子の相同組換え修復（HDR）の促進を必要とする対象として選択または特定される対象は、X-HIGMの症状を呈する対象、またはX-HIGMと診断された対象である。このような判定は、臨床検査または診断検査により行うことができる。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、前記方法は、CD40LG遺伝子の相同組換え修復（HDR）の促進を必要とする対象に対して、処理した細胞を用いた養子細胞療法または養子細胞移入を行うことを含む。いくつかの実施形態において、養子細胞療法または養子細胞移入は、対象におけるCD40LG遺伝子の相同組換え修復を促進させるための細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、CD40LG遺伝子の相同組換え修復（HDR）の促進を必要とする対象から細胞を採取することを含む。いくつかの実施形態において、CD40LG遺伝子の相同組換え修復（HDR）の促進を必要とする対象から採取する細胞は初代ヒト造血細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、細胞の内在性のCD40LG遺伝子座を改変するための、TALENヌクレアーゼやCasヌクレアーゼなどのヌクレアーゼとAAVドナーの共送達により形質転換される。いくつかの実施形態において、前記方法は前記形質転換細胞を拡大培養する工程を含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、細胞内のCD40LG遺伝子座が改変された形質転換細胞を選択する工程を含む。いくつかの実施形態において、前記形質転換細胞は患者に投与される。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、患者への前記形質転換細胞の投与は、該患者への自家細胞の投与を含む。いくつかの実施形態において、患者への前記形質転換細胞の投与によって、X-HIGMの症状が治療、抑制または緩和される。いくつかの実施形態において、患者への前記形質転換細胞の投与によって、X-HIGMが治療される。いくつかの実施形態において、前記方法によって、前記方法によって細菌感染症または日和見感染症が抑制される。いくつかの実施形態において、前記方法によって間欠性好中球減少症が抑制される。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、処理した細胞は組成物として投与される。いくつかの実施形態において、前記細胞の投与量は、1×104個、2×104個、3×104個、4×104個、5×104個、6×104個、7×104個、8×104個、9×104個、1×105個、2×105個、3×105個、4×105個、5×105個、6×105個、7×105個、8×105個、9×105個、1×106個、2×106個、3×106個、4×106個、5×106個、6×106個、7×106個、8×106個、9×106個、1×107個、2×107個、3×107個、4×107個、5×107個、6×107個、7×107個、8×107個、9×107個、1×108個、2×108個、3×108個、4×108個、5×108個、6×108個、7×108個、8×108個、9×108個、1×109個もしくはそれ以上、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の数である。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、処理した細胞の対象への投与は、障害の症状または該障害を治療するために用いられる別の治療法と組み合せた併用療法として行われる。いくつかの実施形態において、別の治療法としては、免疫グロブリン療法、抗生物質療法、抗菌療法、骨髄刺激療法（顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）療法など）、骨髄移植療法、コルチコステロイド療法または輸血療法が挙げられる。
【０１５５】
医薬組成物
本明細書で提供されるシステムまたは方法で調製された細胞は、CD40LG遺伝子座の標的化相同組換え修復を目的として、かつ治療適用または予防適用を目的として、たとえばX-HIGMを治療、抑制または緩和することを目的として、患者に直接投与することができる。いくつかの実施形態において、前記細胞は、本明細書で提供されるシステムにより調製される。いくつかの実施形態において、前記細胞を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、X-HIGMを治療、予防、緩和もしくは抑制する方法、またはX-HIGMに伴う状態もしくは症状を緩和する方法において使用することができる。
【０１５６】
前記細胞を含む前記組成物は、適切な任意の方法で投与され、また、いくつかの実施形態においては、薬学的に許容される担体とともに投与される。当業者であれば、前記細胞を含む前記組成物に応じて好適な投与方法を利用することができ、そのような投与方法を熟知しているであろう。また、前記組成物の種類によっては、２つ以上の投与経路を使用できる場合もあるが、特定の経路が別の経路よりも即時性および有効性に優れている場合が多い。
【０１５７】
薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物およびその組成物の投与方法などに応じて選択される。したがって、医薬組成物の好適な製剤として、幅広い種類の製剤が挙げられる（たとえば、Remington’s Pharmaceutical Sciencesを参照されたい）。
【０１５８】
静脈内経路、筋肉内経路、皮内経路および／または皮下経路などの非経口投与に適した製剤としては、水性の滅菌等張注射液剤および／または非水性の滅菌等張注射液剤が挙げられ、該注射液剤は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤および／または投与対象のレシピエントの血液と等張にするための溶質を含んでいてもよい。さらに、水性の滅菌懸濁剤および／または非水性の滅菌懸濁剤も例として挙げることができ、該滅菌懸濁剤は、懸濁化剤、可溶化剤、粘稠化剤、安定剤および／または保存剤を含んでいてもよい。本明細書により開示された組成物は、たとえば、点滴静注投与、経口投与、局所投与、腹腔内投与、膀胱内投与または髄腔内投与することができる。前記組成物の製剤は、アンプルやバイアルなどの、単一用量または複数用量の密閉容器に入れて提供することができる。注射用の液剤および懸濁剤は、上記した種類の滅菌された散剤、顆粒剤および／または錠剤から調製することもできる。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、非経口投与経路、皮下投与経路、関節腔内投与経路、気管支内投与経路、腹腔内投与経路、関節包内投与経路、軟骨内投与経路、腔内投与経路、体腔内投与経路、小脳内投与経路、脳室内投与経路、結腸内投与経路、頸管内投与経路、胃内投与経路、肝内投与経路、心筋内投与経路、骨内投与経路、骨盤内投与経路、心膜内投与経路、腹膜内投与経路、胸膜内投与経路、前立腺内投与経路、肺内投与経路、直腸内投与経路、腎内投与経路、網膜内投与経路、脊髄内投与経路、滑液包投与経路、胸腔内投与経路、子宮内投与経路、膀胱内投与経路、病巣内投与経路、ボーラス投与、経膣投与経路、直腸投与経路、頬側投与経路、舌下投与経路、鼻腔内投与経路または経皮投与経路の１つ以上が企図される。いくつかの実施形態において、投与される組成物は、前記経路の１つ以上を介した送達用に製剤化することができる。
【０１６０】
細胞においてCD40LG遺伝子を編集する特定の方法
本明細書で提供される方法および組成物の実施形態のいくつかは、細胞においてCD40LG遺伝子を編集する方法を含む。そのような実施形態のいくつかは、（ｉ）ガイドRNA（gRNA）をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入するか、あるいはTALENをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する工程；および（ii）鋳型ポリヌクレオチドを前記細胞に導入する工程を含む。いくつかの実施形態において、前記CD40LG遺伝子は、配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％の同一性を有する核酸を含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、gRNAをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する前記工程は、該gRNAをコードするポリヌクレオチドとCAS9タンパク質とを含むリボ核タンパク質（RNP）に前記細胞を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、前記RNPは、前記CAS9タンパク質と前記gRNAをコードするポリヌクレオチドを、０．１：１〜１：１０の比率、１：１〜１：５の比率、または約１：１．２の比率で含む。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、前記鋳型ポリヌクレオチドは、CD40LG遺伝子の少なくとも一部またはその相補鎖をコードしている。いくつかの実施形態において、前記鋳型ポリヌクレオチドは、野生型CD40LG遺伝子の少なくとも一部またはその相補鎖をコードしている。いくつかの実施形態において、前記鋳型ポリヌクレオチドは、CD40LG遺伝子の少なくとも１kbまたは少なくとも約１kbを含む。いくつかの実施形態において、前記鋳型ポリヌクレオチドは、配列番号１５のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記鋳型ポリヌクレオチドは、配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、前記鋳型ポリヌクレオチドはウイルスベクターに含まれる。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは自己相補型AAV（scAAV）ベクターである。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、工程（ｉ）は、工程（ii）の前に実施される。いくつかの実施形態において、工程（ｉ）と工程（ii）は、同時に実施される。いくつかの実施形態において、工程（ｉ）および／または工程（ii）は、ヌクレオフェクションを実施することを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオフェクションの実施は、ロンザ社製のシステムの使用を含む。いくつかの実施形態において、前記システムは、方形波パルスの使用を含む。
【０１６６】
いくつかの実施形態は、前記細胞をIL-6に接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記IL-6の濃度は、約20ng/ml〜約500mg/mlもしくは20ng/ml〜500mg/ml、約50ng/ml〜約150mg/mlもしくは50ng/ml〜150mg/ml、または約100mg/mlもしくは100mg/mlである。いくつかの実施形態において、前記IL-6の濃度は、少なくとも1ng/mlもしくは少なくとも約1ng/ml、少なくとも10ng/mlもしくは少なくとも約10ng/ml、少なくとも50ng/mlもしくは少なくとも約50ng/ml、少なくとも100ng/mlもしくは少なくとも約100ng/ml、少なくとも200ng/mlもしくは少なくとも約200ng/ml、少なくとも500ng/mlもしくは少なくとも約500ng/ml、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度である。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、前記細胞は、Serum-Free Expansion Medium II（SFEMII）培地中でインキュベートされる。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、前記細胞は細胞集団を構成し、該細胞集団の濃度は、約1×105個/ml〜約1×106個/mlもしくは1×105個/ml〜1×106個/ml、約1×105個/ml〜約5×105個/mlもしくは1×105個/ml〜5×105個/ml、または約2.5×105個/mlもしくは2.5×105個/mlである。いくつかの実施形態において、前記細胞集団の密度は、2,000,000個/ml未満もしくは約2,000,000個/ml未満、1,000,000個/ml未満もしくは約1,000,000個/ml未満、500,000個/ml未満もしくは約500,000個/ml未満、250,000個/ml未満もしくは約250,000個/ml未満、100,000個/ml未満もしくは約100,000個/ml未満、50,000個/ml未満もしくは約50,000個/ml未満、10,000個/ml未満もしくは約10,000個/ml未満、1000個/ml未満もしくは約1000個/ml未満、またはこれらの密度のいずれか２つによって定義される範囲内の密度である。
【０１６９】
いくつかの実施形態は、工程（ｉ）および工程（ii）の後に、前記細胞集団を希釈する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞集団の希釈は、工程（ｉ）および工程（ii）を実施した約１６時間後または１６時間後に行われる。いくつかの実施形態において、前記細胞集団は、約250,000個/mlまたは250,000個/mlに希釈される。いくつかの実施形態において、前記細胞集団は、2,000,000個/ml未満もしくは約2,000,000個/ml未満、1,000,000個/ml未満もしくは約1,000,000個/ml未満、500,000個/ml未満もしくは約500,000個/ml未満、250,000個/ml未満もしくは約250,000個/ml未満、100,000個/ml未満もしくは約100,000個/ml未満、50,000個/ml未満もしくは約50,000個/ml未満、10,000個/ml未満もしくは約10,000個/ml未満、1000個/ml未満もしくは約1000個/ml未満、またはこれらの密度のいずれか２つによって定義される範囲内の密度に希釈される。
【０１７０】
いくつかの実施形態は、幹細胞因子（SCF）、FMS様チロシンキナーゼ３（Flt-3）、トロンボポエチン（TPO）、トロンボポエチン（TPO）受容体アゴニスト、UM171またはstemregenin（SR1）に前記細胞を接触させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記TPO受容体アゴニストはエルトロンボパグを含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、工程（ｉ）および／または工程（ii）は、前記細胞をHDM2タンパク質に接触させることを含む。いくつかの実施形態において、前記HDM2タンパク質の濃度は、約1 nM〜約50nMもしくは1 nM〜50nM、または約6.25nM〜約25nMもしくは6.25nM〜25nMである。いくつかの実施形態において、前記HDM2タンパク質の濃度は、少なくとも1nMもしくは少なくとも約1nM、少なくとも10nMもしくは少なくとも約10nM、少なくとも20nMもしくは少なくとも約20nM、少なくとも30nMもしくは少なくとも約30nM、少なくとも40nMもしくは少なくとも約40nM、少なくとも50nMもしくは少なくとも約50nM、少なくとも100nMもしくは少なくとも約100nM、少なくとも200nMもしくは少なくとも約200nM、少なくとも500nMもしくは少なくとも約500nM、少なくとも1000nMもしくは少なくとも約1000nM、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度である。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、少なくともMOI 1000もしくは少なくともMOI 約1000の前記AAV、または少なくともMOI 2500もしくは少なくともMOI 約2500の前記AAVに前記細胞を接触させる。いくつかの実施形態において、少なくともMOI 10もしくは少なくともMOI 約10、少なくともMOI 100もしくは少なくともMOI 約100、少なくともMOI 200もしくは少なくともMOI 約200、少なくともMOI 500もしくは少なくともMOI 約500、少なくともMOI 1000もしくは少なくともMOI 約1000、少なくともMOI 2000もしくは少なくともMOI 約2000、少なくともMOI 5000もしくは少なくともMOI 約5000、少なくともMOI 10000もしくは少なくともMOI 約10000、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の量もしくは濃度のAAVに、前記細胞または前記細胞の細胞集団を接触させる。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、少なくとも100μg/mlもしくは少なくとも約100μg/mlの前記RNP、または少なくとも200μg/mlもしくは少なくとも約200μg/mlの前記RNPに前記細胞を接触させる。いくつかの実施形態において、少なくとも1μg/mlもしくは少なくとも約1μg/ml、少なくとも10μg/mlもしくは少なくとも約10μg/ml、少なくとも100μg/mlもしくは少なくとも約100μg/ml、少なくとも200μg/mlもしくは少なくとも約200μg/ml、少なくとも500μg/mlもしくは少なくとも約500μg/ml、少なくとも1000μg/mlもしくは少なくとも約1000μg/ml、またはこれらの濃度のいずれか２つによって定義される範囲内の濃度の前記RNPに前記細胞を接触させる。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、工程（ｉ）および／または工程（ii）は、約1,000,000個の細胞と20μlのヌクレオフェクション反応液を接触させること、または1,000,000個の細胞と20μlのヌクレオフェクション反応液を接触させることを含み、該ヌクレオフェクション反応液は、前記gRNAおよび／または前記鋳型ポリヌクレオチドを含む。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオフェクション反応は、10μlもしくは約10μl、50μlもしくは約50μl、100μlもしくは約100μl、200μlもしくは約200μl、500μlもしくは約500μl、1000μlもしくは約1000μl、1500μlもしくは約1500μl、2000μlもしくは約2000μl、50000μlもしくは約50000μl、またはこれらの量のいずれか２つによって定義される範囲内の量で行われる。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、前記細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（HSC）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞またはＢ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD34+細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はエクスビボの細胞である。
【実施例】
【０１７７】
実験方法
非肥満糖尿病（NOD）scidγ（NSG）マウスは、ジャクソン研究所から購入した。すべての動物実験は、Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care（AAALAC）による基準に従って実施し、Seattle Children’s Research Instituteの動物実験委員会（IACUC）によって承認された。リン酸緩衝生理食塩水で１：１希釈したBUSULFEX（Henry Schein Inc.）を25mg/kgまたは35mg/kgの用量で使用して、６〜１０週齢のマウスを処置した。２４時間後、リン酸緩衝生理食塩水に懸濁した2×106個のmock造血幹細胞または遺伝子編集造血幹細胞を、眼窩後方への注射により送達した。移植の１２〜１６週間後に、マウスを安楽死させ、大腿骨および脾臓へのヒト細胞の生着を分析した。
【０１７８】
CD34+造血幹／前駆細胞のエクスビボ培養
成人ドナーから動員したPBMCから濃縮した凍結保存CD34+細胞は、Fred Hutchinson Cancer Research CenterのCore Center for Excellence in Hematologyから入手した。この細胞を解凍し、無血清幹細胞増殖培地［トロンボポエチン、幹細胞因子およびFLT3リガンド（PeproTech）をいずれも100ng/mlの濃度で添加したCellGenix GMP SCGM培地（CellGenix Inc.）］に1×106個/mlの密度で播種した。後述するように、IL-3（60ng/ml）またはIL-6（100ng/ml）を培地に加えた。実験全体を通して、1μMのStemRegenin 1（STEMCELL Technologies）、35nMのUM171（ApexBio）および3μg/mlのエルトロンボパグ（Selleckchem）の各低分子を、使用した幹細胞増殖培地に加えた。
【０１７９】
CD34+造血幹／前駆細胞の遺伝子編集
サイトカインを添加した幹細胞増殖培地中でCD34+細胞を37℃で４８時間インキュベートすることによってあらかじめ刺激し、Neon Transfection Systemと10μlのチップ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用してエレクトロポレーションを行った。400μLの培地を入れた24ウェルプレートに細胞を分注し、MOI 1000〜5000にてドナー鋳型AAVを加えた。エレクトロポレーションおよびAAVによる形質導入の２４時間後、AAV含有培地を除去し、新鮮な幹細胞増殖培地で置換した。遺伝子編集の２日後および５日後に、細胞の生存能力およびGFPの発現を分析した。また、遺伝子編集の２４時間後または４８時間後に、幹細胞表現型（CD34+CD38-CD90+CD133+）の分析を行った。マウスへの生着実験へのスケールアップでは、細胞とヌクレアーゼの濃度を変えずに100μLのNeonチップを使用してエレクトロポレーションを行ったこと以外は、同じ遺伝子編集条件を使用した。AAVを含む培地4mLを入れた6ウェルプレートに細胞を分注した。２４時間後、細胞を回収し、PBSで２回洗浄してから注射に使用した。
【０１８０】
AAVのストック液は、過去の報告に従って作製した（Khan, I.F., R.K. Hirata, and D.W. Russell, Nat Protoc, 2011. 6(4): p. 482-501）。AAVベクタープラスミド、血清型ヘルパープラスミドおよびアデノウイルスヘルパープラスミド（HgT1-adeno）をHEK293Ｔ細胞にトランスフェクトした。４８時間後に細胞を回収し、凍結と融解を３回繰り返して細胞を溶解した。その後、溶解物をベンゾナーゼで処理し、イオジキサノール密度勾配で精製した。逆方向末端反復配列（ITR）に特異的なプライマーおよびプローブを使用してAAVゲノムのqPCRを行うことにより、ウイルスストック液の力価を測定した（Aurnhammer, C., et al., Hum Gene Ther Methods, 2012. 23(1): p. 18-28）。
【０１８１】
組換えAAVベクター
プラスミドはいずれも、Hubbardら（Hubbard, N., et al., Blood, 2016. 127(21): p. 2513-22）によって過去に報告されたものを改良して使用した。pAAV.MND.GFP.WPREレポーターコンストラクトを作製するため、MNDを付加したレトロウイルスのプロモーターを、過去に報告されているpAAV CD40LG[GFP.WPRE]プラスミドに挿入した（配列番号１６）。
【０１８２】
pAAV.CD40L.cDNA.WPRE3ドナー鋳型（配列番号１５）は、コドン最適化されたCD40Lを挟んで両側に位置する1kbの相同領域、切断型ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント３（WPRE3）、別の上流配列エレメントを含むシミアンウイルス40後期ポリアデニル化シグナルを含むように設計した（Choi, J.-H., et al., Molecular brain, 2014. 7(1): p. 17）。CD40L.cDNA.WPRE3.synPolyAの全長を遺伝子合成（GeneArt）し、CD40LG遺伝子座を挟んで両側に位置する２つの1kbの相同領域とともに、Infusion cloning（クロンテック）によりpAAVバックボーンにクローニングした。
【０１８３】
統計分析は、GraphPad Prism7（GraphPad、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して行った。多重比較は、一元配置分散分析を使用してｐ値を算出することにより行った。特段の記載がない限り、２群の比較は、対応のない両側ｔ検定を使用してｐ値を算出することにより行った。棒グラフはいずれも平均値の±SEMを示す。
【０１８４】
エレクトロポレーションはすべてNeon Transfection System（サーモサイエンティフィック）を使用して行った。エレクトロポレーションの前に、細胞を回収し、PBSで洗浄した。Cas9 RNP（総反応液量1mlあたりのCas9タンパク質の量：100μgもしくは200μg）またはmRNA（総反応液量1mlあたりのCD40L TALENの量：各50μg）の添加後に、細胞の最終濃度が2.5×107個/mlとなるように、細胞をNeonバッファーTに再懸濁する。各ヌクレアーゼと混合した後、10μLのNeonチップ１本あたり2.5×105個の細胞を使用してエレクトロポレーションを行った（1400V、20ms、単回パルス）。
【０１８５】
マウスへの生着試験へのスケールアップでは、各試薬の濃度はすべて同一とし、１回のエレクトロポレーションあたりの総量を10倍に増やし、100μLのNeonチップを使用した。したがって、Cas9 RNP（100μg/mlもしくは200μg/ml）またはmRNA（CD40L TALEN、各50μg/ml）と2.5×106個の細胞を混合し、100μLのNeonチップを使用してエレクトロポレーションを行った。各条件に対して100μLでの反応を複数回行った。
【０１８６】
コロニー形成単位
メチルセルロースベースのMethoCult H4034 Optimum培地（STEMCELL Technologies）にMock HSPCまたは遺伝子編集したHSPCを加え、ボルテックスすることによって激しく混合した。混合後に、500個の細胞を含むメチルセルロースベースの培地1.1mlを、35mmのグリッド付きディッシュに分注した。細胞を37℃で１４日間インキュベート後、メーカーの添付文書（STEMCELL Technologies）に従って、コロニーを分類し、計数した。EVOS fl倒立顕微鏡（AMG）を使用して、GFP発現コロニーを計数した。
【０１８７】
DNeasy Blood&Tissue kit（Qiagen）を使用して、造血幹細胞・前駆細胞（HSPC）からゲノムDNAを単離した。CD40LG遺伝子座における編集率を評価するため、AAVインサート内で結合するフォワードプライマーと、相同領域外のCD40LG遺伝子座で結合するリバースプライマーとを用いて、「イン−アウト」ドロップレットデジタルPCRを行った。同等のサイズ（1.3 kb）のActB遺伝子コントロールアンプリコン（配列番号１７）を作製し、コントロールとして使用した。いずれのアンプリコン用プローブもFAMで標識し、別々のウェルで反応を行った。各HDR反応およびコントロール反応は、別々のウェルにおいて二連で行った。PCR反応は、QX200 Droplet Generator（バイオ・ラッド）を用いてドロップレットに分割して行った。増幅は、UTP非含有のプローブ用ddPCR Supermix（バイオ・ラッド）、900nMのプライマー、250nMのプローブ、50ngのゲノムDNAおよび１%DMSOを用いて行った。ドロップレットの解析は、QX200 Droplet Digital PCR System（バイオ・ラッド）を用いて行い、QuantaSoftソフトウェア（バイオ・ラッド）で解析した。CD40LGはＸ染色体上に存在するため、男性ドナー細胞からの編集率は、CD40LG/ActB陽性ドロップレット（コピー／μl）の比率に２を掛けて算出した。
【０１８８】
フローサイトメトリー分析は、LSR IIフローサイトメーター（BDバイオサイエンス）で行い、データは、FlowJoソフトウェア（Tree Star）を使用して分析した。骨髄内および脾臓内の様々な造血細胞系における編集細胞の生着を評価するため、ヒトCD45-eFluor450（クローンHI30、eBioscience）、マウスCD45-APC（クローン30-F11、eBioscience）、CD33-PE（クローンWM53、BDバイオサイエンス）、およびCD19-Pe/Cy7（クローンHIB19、eBioscience）の各蛍光色素標識抗体で細胞を染色した（詳細なゲーティング方法については図１１を参照されたい）。さらに、造血幹細胞の表現型を評価するため、CD34-APCCy7（クローン581、BioLegend）、CD38-PerCPCy5.5（クローンHIT2、BDバイオサイエンス）、CD90-APC（クローン5E10、BDバイオサイエンス）、およびCD133-PE（クローンAC133、ミルテニーバイオテク）の各蛍光色素標識抗体で細胞を染色した。
【０１８９】
mRNAの合成
pEVL CD40LG.TALEN（配列番号２１および２２）コンストラクトは、BsaIを使用して線状化した。メーカーのプロトコルに従って、T7 mScriptスタンダードmRNA製造系（Cellscript）を使用して、インビトロ転写および５’−キャップ形成を行った。線状化した鋳型をインビトロにおいて非修飾mRNA転写産物に転写し、提供された酵素を使用してキャップ−１ mRNA構造（２’−Ｏメチルトランスフェラーゼ）でキャップした（５’−７−メチルグアニレートキャップ）。NucleoSpin RNA Clean-upキット（Machery Nagel）を使用して、最終的な精製を行った。
【０１９０】
ヌクレアーゼの設計
CD40LG TALENは、pUC57バックボーンではなく、pEVLバックボーン（配列番号２０）にクローニングしたこと以外は、Hubbardらによって過去に報告されたものと同一のものであった（Hubbard, N., et al., Blood, 2016. 127(21): p. 2513-22; Grier, A.E., et al., Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2016. 5）。
【０１９１】
CRISPR sgRNA（配列番号１２）は、CD40LG TALENペアによって生成される二本鎖切断（DSB）部位に可能な限り近い二本鎖切断（DSB）を生成するように設計し、これら２種のヌクレアーゼプラットフォーム間の比較において偏りが生じないようにした。合成sgRNA（5’ - AAAGUUGAAAUGGUAUCUUC - 3’、配列番号２８）は、Synthego（カリフォルニア州プレザントン）から購入し、２’−Ｏ−メチル類似体と、５’末端および３’末端の３つの末端ヌクレオチド間の３’ホスホロチオエートヌクレオチド結合で化学的に修飾した。Cas9 RNPは、エレクトロポレーションを行う直前に、Cas9タンパク質（Integrated DNA Technologies）とsgRNAを１：１．２のモル比で15分間インキュベートすることによって作製した。
【０１９２】
実施例１−CD34+造血幹細胞におけるCD40LG標的化HDR
この実施例では、CD34+造血幹細胞のCD40LG遺伝子座にGFPレポーターを導入する方法を実証する。本実施例で述べるシステム、方法および組成物の態様は、健常ドナーから濃縮した血中動員CD34+細胞の編集効率の向上に関し、サイトカインを使用した前刺激条件、最適な細胞密度、エレクトロポレーション条件、およびAAVとヌクレアーゼの送達の相対的タイミングを含む（図３）。ヌクレアーゼとAAVの共送達を行う前に、凍結CD34+細胞を解凍し、４８時間培養した。AAV6ドナー鋳型とTALENヌクレアーゼまたはRNPヌクレアーゼとを共送達した２日後に、細胞を単離し、送達を分析した（図３）。mock処理細胞と比較して、細胞の生存能力は20%しか低下していなかった（図４Ａ）。遺伝子編集の５日後には、組み込まれなかったAAVからの発現を示す、AAVのみを使用したコントロールにおけるGFPのバックグラウンド発現はほぼゼロまで低下した（図４Ａ）。これと同時に、AAVとTALEN（AAV/TALEN）で処理した細胞の約20%、およびAAV/RNPで処理した細胞の約30%は、高いMFIでGFPを発現し、HDRが示された（図４Ｂ）。MND.GFPレポーター鋳型のシームレスなオンターゲットの組み込みは、AAV/RNPで処理した細胞をドロップレットデジタルPCR（ddPCR）で分析することによって確認した（図５）。また、メチルセルロース培地を用いたコロニー形成単位（CFU）アッセイで測定したところ、AAV/RNPで処理した細胞は、mock処理した細胞と比べて、総コロニー数またはコロニーの種類の点で差がなかった（図６Ａおよび図６Ｂ）。さらに、HDRで編集したコロニーのパーセンテージは、コロニーの種類に応じて変化することはなく、フローサイトメトリーで検出したGFP+コロニーのパーセンテージと同様である（図６Ｃ、図６Ｃ、図６Ｄ）。RNPは、TALENと比べて生存能力およびHDR率が増加したことから、以降の実験はすべてRNPヌクレアーゼを使用して行った。
【０１９３】
実施例２−造血幹細胞におけるHDRでのサイトカイン条件
この実施例では、造血幹細胞におけるHDRにおいてサイトカイン応答を調節する方法を実証する。CD34+細胞のエクスビボ培養に使用される２種のサイトカインカクテルを試験した。これらのカクテルはいずれも100ng/mlの幹細胞因子（SCF）、FMS様チロシンキナーゼ３（Flt-3）およびトロンボポエチン（TPO）を含んでおり、これらのカクテルに、60ng/mlのインターロイキン３（IL-3）または100ng/mlのインターロイキン６（IL-6）を加えて細胞の拡大増殖を促進した。IL-3を含む培地中で培養した細胞は、編集の４８時間後に高い生存能力を示し（図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄ）、バルク集団中のHDR率が高かった（図７Ｅ）。一方、LT-HSC集団（CD34+、CD38-、CD90+およびCD133+）をIL-6とともに培養した場合、IL-3で処理した細胞の２倍の数が回収された。さらに、LT-HSC集団において、IL-6の存在下で培養した場合、GFPを発現した細胞の割合は、IL-3の存在下で培養した場合と比べてわずかに高かった。さらに、AAV用量を細胞１個あたりウイルス粒子2500個まで増加させ、かつRNPの用量を200μg/mlまで増加して、バルク細胞集団をIL-6の存在下で培養したところ、堅牢なHDR率が達成された。
【０１９４】
実施例３−内在性プロモーターによって制御されるCD40L cDNAの挿入
この実施例では、内在性CD40LGプロモーターの下流にCD40L cDNAを効率的に組み込む方法を実証する。また、この実施例では、治療目的での、内在性プロモーター駆動性のCD40L cDNAの発現を実証する。内在性プロモーターの下流に導入されたCD40L cDNAで編集したＴ細胞は、編集されていない細胞と同等のCD40Lの表面発現を示す（Hubbard, N., et al., Blood, 2016. 127(21): p. 2513-22）。造血幹細胞を編集するため、コドン最適化されたCD40L cDNAを挟んで両側に位置する1kbの同一の相同アーム、WPRE3エレメントおよび合成ポリアデニル化配列を含むAAVドナー鋳型（配列番号１５）を設計した（図８）（Choi, J.-H., et al., Molecular brain, 2014. 7(1): p. 17）。ddPCRで測定したところ、細胞の約25%において標的化されたcDNAの組み込みが観察された（図９Ａおよび図９Ｂ）。したがって、内在性CD40LGプロモーターの下流へのCD40L cDNAの導入に成功した。
【０１９５】
実施例４−NOD-scid-IL2RγNULLマウスにおける編集細胞の生着
この実施例では、NSGマウスの骨髄に編集細胞を生着させる方法を実証する。CD34+細胞に堅牢な編集を行った後、NOD-scid-IL2RγNULL（NSG）マウスに移植し、編集された細胞の長期的な再増殖能を測定した。これらの細胞は、MND.GFPレポーターコンストラクトを使用して編集し、これによって、編集された細胞の表現型が容易に追跡でき、かつ測定できるようにした。これを達成するため、「高用量」（MOI 2.5KのAAVと200μg/ml RNP）または「低用量」（MOI 1KのAAVと100μg/ml RNP）で編集試薬を使用した。インビボ実験へのスケールアップでは、小スケールの実験と比べて、HDR率は同程度であったものの、編集後の細胞の生存能力が向上した（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。培養時間を短縮するため、AAVおよびRNPを送達してから２４時間後に編集細胞をNSGマウスに移植した。移植の１２〜１６週間後に各マウスから骨髄および脾臓を採取し、HDR編集されたヒト細胞の有無を分析した（図１１）。
【０１９６】
MOI 1KのAAVと100μg/mlのRNPで処理した細胞は、骨髄におけるhCD45の平均生着率が47.7%であったが、これに対して未処理細胞では59%であった（図１２Ｃ）。一方、MOI 2.5KのAAVと200μg/mlのRNPで処理した細胞は、未処理CD34+細胞（59%）と比べてhCD45の生着率が顕著に低かった（16.2%）。高用量のAAVとRNPで編集したヒト細胞の1.4%でGFPの発現が検出されたことから、マウスに投与されたこの細胞は、長期的な再増殖可能なHDR編集造血幹細胞であったことが示された。これに対して、低用量のAAVとRNPで処理した細胞では、マウスから回収した細胞のわずか5.0×10-3%のみがGFPを発現した（図１２Ｄ）。これら２つの細胞集団間の移植時におけるHDR率は、低用量で処理した細胞で4.9%であったのに対して、高用量で処理した細胞で26.8%であり（図１０Ａおよび図１０Ｂ）、このHDR率の差を考慮すると、骨髄中で生存を維持した編集細胞のパーセンテージがほぼ3-logの差であることは注目すべきことであった。
【０１９７】
AAVとRNPで処理した細胞の表現型は、未処理のコントロール細胞の表現型と類似していた。AAVとRNPで処理した細胞を投与したマウスと、未処理の細胞を投与したマウスでは、CD33+、CD19+およびCD34+の割合は、顕著に異なってはいなかった（図１２Ｅ）。さらに、CD33+集団、CD19+集団およびCD34+集団のそれぞれにおいて、編集されたGFP+細胞が占める割合は同程度であった（図１２Ａ、図１２Ｂおよび図１３Ｇ）。この結果は、遺伝子編集によって造血細胞の分化能が破壊されておらず、真のLT-HSCが編集されていることが示唆された。
【０１９８】
さらに、脾臓においても、同様のhCD45細胞生着パターンおよびGFP発現パターンが認められた。低用量の編集細胞を移植したマウスは、非処理細胞を投与したマウスと比べて、脾臓hCD45+細胞のパーセンテージの低下が最も低かった（27.4%対36%）（図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ）。高用量の編集細胞を移植したマウスの脾臓に占めるhCD45+細胞の割合は13.1%であった。高用量の編集細胞を投与したマウスにおいて、GFP発現画分は、hCD45+細胞の0.9%を占めたのに対して、低用量の編集細胞を投与したマウスでは、hCD45+細胞におけるGFPの陽性率はわずか0.03%であった（図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ）。
【０１９９】
実施例５−編集された細胞の生着に対する低分子の効果
この実施例では、NSGマウスにおける編集細胞の生着に対する低分子の影響を実証する。編集された細胞は、最長で移植１６週間後のNSGマウスにおいて検出された。さらに、この実施例では、移植可能な編集されたLT-HSCの数をさらに増加させる方法を実証する。エクスビボにおけるLT-HSCの自己複製を促進する低分子を培養系に導入した（Fares, I., et al., Science, 2014. 345(6203): p. 1509-12; Sun, H., et al., Stem Cell Res, 2012. 9(2): p. 77-86）。自己複製の誘導によって、細胞が細胞周期（G期またはS2期）を経てHDRを起こすため有用であり、かつ自己複製した幹細胞が、骨髄に生着する能力を維持して、長期間にわたり生存を維持したという２つの点で利点があった。
【０２００】
低分子であるUM171およびSR-1は、造血幹細胞の自己複製を増加させ、これらの低分子の組み合わせは、近年、HDR編集された細胞の生着を補助するために使用されている（Schiroli, G., et al., Sci Transl Med, 2017. 9(411); Bak, R.O. and M.H. Porteus, Cell Rep, 2017. 20(3): p. 750-756; Bak, R.O., et al., Elife, 2017, 6; Fares I., et al., (2013) Blood 122:798）。編集細胞の編集率および生着に対するこれらの低分子の効果を分析した。UM171およびSR-1を培地に添加すると、編集後の細胞の生存能力がわずかに上昇したが、バルク集団またはLT-HSCとして染色された細胞において、HDR率に対する有意な効果は認められなかった（図１３Ａならびに図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、図１５Ｄ、図１５Ｅ）。特に、編集の４８時間後にLT-HSCとして染色された細胞のパーセンテージは、低分子の添加によって２倍以上になった（図１３Ｂ）。以上のデータを合わせると、本明細書に記載の培養系の実施形態のいくつかにおいて、UM171およびSR-1の添加により、サイトカインのみを添加した場合よりも、HSCの幹細胞性がより良好に維持されたが、HDR率に対する影響は認められなかったということが実証された。
【０２０１】
別の低分子であるエルトロンボパグは、CD34+/CD38-細胞の拡大増殖を促すことができる（Sun, H., et al., Stem Cell Res, 2012. 9(2): p. 77-86）。無形成性貧血治療用の承認薬であるエルトロンボパグは、TPO受容体であるc-mplのアゴニストである。エルトロンボパグを添加することによって、生存能力に有意な影響を与えることなく、編集細胞のパーセンテージが約5%増加した（図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃ、図１６Ｄ、図１６Ｅ、図１６Ｆ、図１６Ｇ）。また、エルトロンボパグの添加により、LT-HSCとして染色される細胞のパーセンテージがわずかに増加した。
【０２０２】
NSGマウスにおける編集細胞の生着能に対するこれらの低分子の影響を試験した。AAVとRNPで処理した細胞では、UM171およびSR-1の添加により、骨髄におけるhCD45細胞の全体的な生着が、16.2%から25.4%へとわずかに増加した（図１３Ｄ）。これら２種の低分子を添加した場合と添加しなかった場合のGFP+ヒト細胞のパーセンテージは同等であった（図１３Ｅ）。また、骨髄のヒト細胞中のCD33+骨髄系細胞およびCD19+Ｂ細胞のパーセンテージに有意差はなく、編集された細胞は、両方の集団においてほぼ同じ割合で検出された（図１３Ｆおよび図１３Ｇ）。さらに、UM171およびSR-1の存在下では、編集の２日後や４日後ではなく、編集の１日後に細胞を移植した場合に、骨髄中の編集細胞のパーセンテージが最も高くなった（図１７Ａ、図１７Ｂ）。
【０２０３】
エルトロンボパグを培地に添加した場合、骨髄または脾臓におけるhCD45細胞の全体的な生着に影響は認められなかった（図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃ、図１６Ｄ、図１６Ｅ、図１６Ｆ、図１６Ｇ）。しかし、低用量のAAV+RNPで細胞を処理した場合、骨髄と脾臓のいずれでもGFP+細胞のパーセンテージがわずかに増加した。これに対して、高用量のAAVとRNPをUM171およびSR1とともに使用した場合、エルトロンボパグを添加しても、編集細胞のパーセンテージに上昇は認められなかった（図１３Ｅ）。エルトロンボパグによるHDR率の上昇は、ベースラインのHDR率が低い場合にのみ、インビボで検出可能である可能性が考えられた。以上のデータを合わせると、エルトロンボパグは、hCD45+細胞の生着またはLT-HSCの編集率に有意な影響を与えなかったことが実証された。さらに、低分子であるUM171とSR1の組み合わせは、造血幹細胞におけるHDR率を上昇させなかったが、NSGマウスに移植した場合のhCD45+細胞の全体的な生着率を上昇させた。
【０２０４】
実施例６−インビボでの生着能力に対する前刺激時間の効果
HDR編集された動員ヒトCD34+細胞のインビボにおける生着能力に対する前刺激時間の延長の効果を試験した。TPO、SCF、FLT3LおよびIL6（各100ng/ml）を添加し、35nM UM171および1μM SR1を加えたSCGM培地中において、成人由来の動員ヒトCD34+細胞を1×106個/mlの濃度で４８時間または７２時間培養した。次に、Neon systemを使用して200μg/mlのRNPを培養細胞にエレクトロポレーションし、GFPレポーターカセットを含むrAAV6標的化ベクターをMOI 1Kで形質導入した。２４時間後、形質導入細胞をNSGW41レシピエントマウスに移植した。移植の前日に12.5mg/kgのブスルファンをマウスに注射し、移植の１６週間後にマウスを屠殺した。
【０２０５】
骨髄および脾臓における生着したヒト細胞の総数は、サイトカインで７２時間にわたり前刺激したCD34+細胞と比べて、サイトカインで４８時間にわたり前刺激したCD34+細胞の方が相対的に低かった（図１８および図２０）。しかし、編集された細胞（GFP+）の生着は、前刺激を長くすると相対的に高くなった（図１９および図２１）。
【０２０６】
実施例７−培養プロトコルの比較
CD34+細胞を培養するための２つの異なるプロトコル（プロトコルＡまたはプロトコルＢ）を試験した。表１および図２２は、HDRを用いた遺伝子編集用の動員CD34+HSCを培養するための各プロトコルの条件の概略を示す。
【表１】
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【０２０７】
プロトコルＡでは、TPO、SCF、FLT3LおよびIL6（各100ng/ml）を添加し、35nM UM171および1μM SR1を加えたSCGM培地中において、動員ヒトCD34+細胞を1×106個/mlの濃度で４８時間培養した後、ロンザ社のシステムを使用して、200μg/mlのRNPをヌクレオフェクションした。次に、MOI 1KのAAV標的化ベクターで細胞を形質導入した。プロトコルＢでは、前記と同じ添加物を含むSFEM II培地中でCD34+細胞を培養した。前刺激における細胞密度は2.50×105個/mlとした。４８時間の前刺激後、ロンザ社のシステムを使用して200μg/mlのRNPを細胞にヌクレオフェクションし、1×106個/mlの密度で播種し、MOI 2.5KのAAVを形質導入した。翌日、W41マウスに細胞を移植した。細胞移植の前日に12.5mg/kgのブスルファンをマウスに注射した。
【０２０８】
実施例１〜５では、プロトコルＡを使用し、Neon electroporation systemを使用してエレクトロポレーションを行った。ロンザ社のシステム上で様々なヌクレオフェクションプログラムを使用した場合と、Neon systemによりエレクトロポレーションを行った場合の細胞の生存能力を比較した（図３２）。成人由来の動員ヒトCD34+細胞をSCGM培地中で培養し、Neonシステムまたはロンザ社の装置によりmockトランスフェクションまたはRNP（200μg/ml）のトランスフェクションを行った。さらに、ロンザ社のシステム上で様々なヌクレオフェクションプログラムを使用した場合と、Neon systemによりエレクトロポレーションを行った場合のHDR率（%）（GFPの発現）を比較した（図３３）。成人由来の動員ヒトCD34+細胞をSCGM培地中で培養し、Neonシステムまたはロンザ社のヌクレオフェクションを使用して、RNP（200μg/ml）のエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後、AAV標的化ベクターを形質導入した。５日目に、GFPの発現によりHDR率を測定した。CM149を使用した場合に最適な生存能力とHDR率が得られたため、インビボ研究での最適化にCM149を使用した。様々な条件から、ロンザ社のシステムとエレクトロポレーションプログラムCM149を使用した場合に、CD34+細胞の生存能力とHDR率が増加したことが特定された（図３２および図３３）。長期にわたり生着したHDR編集GFP+細胞の平均数の増加は、ヌクレアーゼの送達にロンザ社のnucleofectorシステムを使用したことによるものだと見られた。
【０２０９】
以下、プロトコルＡまたはプロトコルＢを使用してCD34+細胞を培養し、ロンザ社のヌクレオフェクションシステムを使用してトランスフェクトを行った。
【０２１０】
骨髄から回収された細胞に関して、プロトコルＡまたはプロトコルＢを使用して培養したCD34+細胞を移植したNSGW41マウスの骨髄から回収したhCD45+細胞のパーセンテージを測定し（図２３）、回収した全hCD45+細胞中のGFP+細胞のパーセンテージを測定した（図２４）。さらに、ヒトCD45+細胞中のCD19+細胞のパーセンテージを測定し（図２５）、ヒトCD19+細胞中のGFP+細胞のパーセンテージを測定した（図２６）。プロトコルＡまたはプロトコルＢを使用して培養したCD34+細胞を生着させたNSGW41マウスの骨髄から回収したヒトCD45+細胞中のCD33+細胞のパーセンテージを測定し（図２７）、ヒトCD33+細胞中のGFP+細胞のパーセンテージを測定した（図２８）。移植の１６週間後にNSGW41マウスの骨髄から採取した細胞の代表的なフローサイトメトリープロットを図２９に示す。
【０２１１】
脾臓から回収された細胞に関して、プロトコルＡまたはプロトコルＢを使用して培養したCD34+細胞を移植したNSGW41マウスの脾臓から回収したヒトCD45+細胞のパーセンテージを測定し（図３０）、回収したヒトCD45+細胞中のGFP+細胞のパーセンテージを測定した（図３１）。プロトコルＡまたはプロトコルＢを使用して培養したCD34+細胞を移植したNSGW41マウスの脾臓から回収したヒトCD45+細胞中のCD19+細胞のパーセンテージを測定し（図３４）、ヒトCD19+細胞中のGFP+細胞のパーセンテージを測定した（図３５）。プロトコルＡまたはプロトコルＢを使用して培養したCD34+細胞を移植したNSGW41マウスの脾臓から回収したヒトCD45+細胞中のCD33+細胞のパーセンテージを測定し（図３６）、ヒトCD33+細胞中のGFP+細胞のパーセンテージを測定した（図３７）。移植の１６週間後にNSGW41マウスの脾臓から採取した細胞の代表的なフローサイトメトリープロットを図３８に示す。
【０２１２】
プロトコルＡまたはプロトコルＢを使用して培養したCD34+細胞を移植したNSGW41マウスの骨髄から回収したヒトCD45+細胞中のCD34+CD38low細胞のパーセンテージを測定し（図３９）、ヒトCD34+CD38lowCD45+細胞中のGFP+細胞のパーセンテージを測定した（図４０）。mock細胞または編集細胞を移植したNSGW41マウスから回収した全ヒトCD45+細胞をCD34+でゲーティングした代表的なフローサイトメトリー分析を図４１に示す。この試験では、移植の１６週間後のNSGW41マウスから骨髄細胞を採取し、LT-HSC（長期間にわたり再増殖する造血幹細胞）の有無を分析した。LT-HSCは、CD38マーカーの低発現およびCD34マーカーの発現により特徴付けられる。さらに、LT-HSCを分析して、この集団内に編集細胞が存在していることを示すGFP+細胞の有無を調べた。長期にわたり再増殖するこのHSC集団内にGFP+細胞が存在していたことから、ヒトHSCのCD40L遺伝子座におけるHDR編集が維持されていることが示された。
【０２１３】
先の研究と比較して、いずれのプロトコルによってもHDR編集された（GFP+）細胞の生着が増加した（図２４、図３１）。すべてのNSGレシピエントマウスは、骨髄および脾臓において、骨髄系集団およびＢ細胞集団の両方に、生着したHDR編集ヒト細胞を保持していた（図２５、図２７、図３４、図３６）。これらの細胞系列の比率は、mock編集されたヒトCD34+細胞のレシピエントでの比率と同等であった。これらのデータは、分化多能性HSCの編集と一致しており、HDR編集された幹細胞の分化能が編集後も損なわれていなかったことを示していた。HDR編集された（GFP+）細胞は、すべての細胞系列（Ｂ細胞系および骨髄系）に存在し、mock細胞と同等の比率であった（図２６、図２８、図３５、図３７、図３８）。特に、（CD38lowCD34+の発現により定義される）骨髄中に生着したヒトCD45+造血幹細胞（HSC）のパーセンテージは、mock HDR編集されたレシピエントにおけるパーセンテージと同等であった（図３９）。GFP+細胞はこの集団に存在し、インビボで長期にわたり生存を維持することができるHSCが編集されたことと一致していた（図４０、 図４１）。これらの研究において観察された生着したHDR編集HSCの割合は、CD40Lが欠損している患者から得た自家HSCの編集により臨床的有用性を提供できると予測されたレベルと一致していた。これらの知見を合わせると、このアプローチで患者を治療することによって、患者に臨床的有用性を提供できることが示された。
【０２１４】
実施例８−HDM2タンパク質との共送達
HDM2は、p53/TP53のユビキチン化を仲介するE3ユビキチンタンパク質リガーゼであり、ユビキチン化されたp53/TP53のプロテアソームによる分解を引き起こす。AAVおよびRNPとともにHDM2タンパク質を共送達した際の、CD34+細胞において観察されるHDR率に対する効果を試験した。プロトコルＢを使用して、成人由来の動員ヒトCD34+細胞を４８時間培養した後、HDM2（6.25nM〜25 nM）の存在下または非存在下でRNPをヌクレオフェクションした。AAVは、MOI 1Kで添加した。HDR率は、５日目のGFPの発現で評価した。
【０２１５】
驚くべきことに、HDM2タンパク質を共トランスフェクトした細胞におけるHDR率は、RNPおよびAAVベクターのみで処理したものよりも高かった（最大で３倍）（図４２）。これらのデータから、HDM2を利用して、CD34+細胞におけるCD40L遺伝子座のHDR編集率を向上させることができ、前述の方法とHDM2を併用することによって、長期にわたって生存可能なHSCのHDR率を向上できることが示された。
【０２１６】
本発明の説明、特定の実施形態およびデータは、単に例示を目的として提示されているものであり、本開示の様々な実施形態を限定することを意図するものではない。本明細書に記載の説明およびデータに基づき、本開示の範囲を逸脱することなく様々な変更および改良が可能であることは当業者には明らかである。したがって、そのような変更および改良も、本開示の様々な実施形態の一部と見なされる。
【図１】
2021521850.tif 000004
【図２】
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【図３】
2021521850.tif 000006
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
2021521850.tif 000009
【図６Ａ】
2021521850.tif 000010
【図６Ｂ】
2021521850.tif 000011
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
2021521850.tif 000014
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ−７Ｄ】
2021521850.tif 000016
【図７Ｅ−７Ｆ】
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【図８】
2021521850.tif 000018
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
2021521850.tif 000020
【図１０Ａ】
2021521850.tif 000021
【図１０Ｂ】
2021521850.tif 000022
【図１１】
2021521850.tif 000023
【図１２Ａ】
2021521850.tif 000024
【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
2021521850.tif 000029
【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年1月22日(2021.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１】
2021521850.tif 000079
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
2021521850.tif 000082
【図４Ｂ】
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【図５】
2021521850.tif 000084
【図６Ａ−６Ｂ】
2021521850.tif 000085
【図６Ｃ−６Ｄ】
2021521850.tif 000086
【図７Ａ−７Ｂ】
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【図７Ｃ−７Ｄ】
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【図７Ｅ−７Ｆ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ−１２Ｂ】
2021521850.tif 000096
【図１２Ｃ−１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ−１３Ｃ】
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【図１３Ｄ−１３Ｅ】
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【図１３Ｆ−１３Ｇ】
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【図１４Ａ−１４Ｂ】
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【図１４Ｃ−１４Ｄ】
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【図１５Ａ−１５Ｂ】
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【図１５Ｃ−１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ−１６Ｃ】
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【図１６Ｄ−１６Ｅ】
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【図１６Ｆ−１６Ｇ】
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【図１７Ａ−１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
2021521850.tif 000127
【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
2021521850.tif 000131
【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【国際調査報告】
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