(57)【要約】  本開示は、Ｓｔｅｅｌ症候群の齧歯類モデルに関する。本明細書では、Ｓｔｅｅｌ症候群を引き起こすヒトの突然変異に相当する、齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子内に突然変異を保有する遺伝子組み換え齧歯類動物が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子組み換え齧歯類であって、そのゲノムが齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子内に突然変異を含み、前記突然変異が、ヒトＣＯＬ２７Ａ１タンパク質のアミノ酸位置６９７（Ｇ６９７Ｒ）においてＧｌｙからＡｒｇへの置換をもたらす、ヒトＣＯＬ２７Ａ１遺伝子内の突然変異に相当する、齧歯類。
【請求項２】
前記齧歯類がマウスまたはラットである、請求項１に記載の齧歯類。
【請求項３】
前記齧歯類がマウスであり、前記マウスの前記内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子内の前記突然変異が、前記ヒトＣＯＬ２７Ａ１タンパク質におけるアミノ酸位置６９７に対応するマウスＣｏｌ２７ａ１タンパク質内のアミノ酸位置におけるＧｌｙからＡｒｇへの置換をもたらす、請求項１に記載の齧歯類。
【請求項４】
前記マウスＣｏｌ２７ａ１タンパク質における前記アミノ酸位置が、位置６８２である、請求項３に記載の齧歯類。
【請求項５】
前記齧歯類がラットであり、前記ラットの前記内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子内の前記突然変異が、前記ヒトＣＯＬ２７Ａ１タンパク質におけるアミノ酸位置６９７に対応するラットＣｏｌ２７ａ１タンパク質内のアミノ酸位置におけるＧｌｙからＡｒｇへの置換をもたらす、請求項１に記載の齧歯類。
【請求項６】
前記ラットＣｏｌ２７ａ１タンパク質における前記アミノ酸位置が、位置６９１である、請求項５に記載の齧歯類。
【請求項７】
前記齧歯類が、齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子内の前記突然変異に対してホモ接合型である、請求項１に記載の齧歯類。
【請求項８】
前記齧歯類が、Ｓｔｅｅｌ症候群に関連する一つ以上の異常を呈する、請求項７に記載の齧歯類。
【請求項９】
前記異常が、野生型齧歯類動物と比較して、前記脊柱における重度の胸椎後弯、低体長、短い長骨、低骨塩量（ＢＭＣ）、異常な頭蓋骨形状、および低体重からなる群から選択される、請求項８に記載の齧歯類。
【請求項１０】
齧歯類の単離された細胞または組織であって、そのゲノムが齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子内の突然変異を含み、前記突然変異が、ヒトＣＯＬ２７Ａ１タンパク質のＧ６９７Ｒ置換をもたらすヒトＣＯＬ２７Ａ１遺伝子の突然変異に相当する、単離細胞または組織。
【請求項１１】
前記齧歯類がマウスまたはラットである、請求項１０に記載の単離された細胞または組織。
【請求項１２】
単離された齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞であって、そのゲノムが齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子内に突然変異を含み、前記突然変異が、ヒトＣＯＬ２７Ａ１タンパク質のＧ６９７Ｒ置換をもたらすヒトＣＯＬ２７Ａ１遺伝子内の突然変異に相当する、単離された齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞。
【請求項１３】
前記ＥＳ細胞がマウスＥＳ細胞またはラットＥＳ細胞である、請求項１２に記載の単離されたＥＳ細胞。
【請求項１４】
Ｃｏｌ２７ａ１突然変異齧歯類を作製する方法であって、
改変された齧歯類ゲノムが、齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子内に、ヒトＣＯＬ２７Ａ１タンパク質内のＧ６９７Ｒ置換をもたらすヒトＣＯＬ２７Ａ１遺伝子内の突然変異に相当する突然変異を含むように、齧歯類のゲノムを改変することと、
前記改変されたゲノムを含むＣｏｌ２７ａ１突然変異齧歯類を作製することと、を含む、方法。
【請求項１５】
前記齧歯類ゲノムが、
（ａ）標的核酸を齧歯類ＥＳ細胞のゲノムへと導入して、齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子内に前記突然変異を含むゲノムを有する、変異齧歯類ＥＳ細胞を得ることと、
（ｂ）（ａ）の前記突然変異齧歯類ＥＳ細胞を使用して、Ｃｏｌ２７ａ１突然変異齧歯類を作製することと、を含むプロセスによって改変される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記齧歯類がマウスまたはラットである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
標的核酸構築物であって、
齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子座において齧歯類Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子へと組み込まれ、前記齧歯類Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子座においてヌクレオチド配列と相同の５’ヌクレオチド配列および３’ヌクレオチド配列に隣接する核酸配列を含み、前記核酸配列の前記齧歯類Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子への組み込みが、ヒトＣＯＬ２７Ａ１タンパク質においてＧ６９７Ｒ置換をもたらすヒトＣＯＬ２７Ａ１遺伝子内の突然変異に相当する、前記齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子内の突然変異をもたらす、核酸構築物。
【請求項１８】
前記齧歯類がマウスまたはラットである、請求項１７に記載の標的核酸。
【請求項１９】
Ｓｔｅｅｌ症候群の治療のための治療剤を特定する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の齧歯類に薬剤を投与することと、
（ｂ）前記薬剤が、Ｓｔｅｅｌ症候群に関連する一つ以上の異常に効果を有するかどうかを判定するために一つ以上のアッセイを実施することと、
（ｃ）前記薬剤がＳｔｅｅｌ症候群に関連する前記一つ以上の異常に対する治療効果を有する場合に、前記薬剤を治療剤として特定することと、を含む、方法。
【請求項２０】
前記薬剤が、出生時または出生直後に前記齧歯類に投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記齧歯類がラットまたはマウスである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
Ｓｔｅｅｌ症候群の齧歯類モデルとしての請求項１に記載の齧歯類の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示はヒト疾患の動物モデルに関する。より具体的には、本開示は、Ｓｔｅｅｌ症候群の齧歯類モデルに関する。Ｓｔｅｅｌ症候群を引き起こすヒトの突然変異に相当する、齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子内の突然変異を保有し、かつＳｔｅｅｌ症候群を有するヒトにおいて観察された特徴を再現する遺伝子組み換え齧歯類動物が本明細書に開示されている。
【０００２】
配列表の参照による組み込み
２０１９年５月２１日に作製され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出された３５９９２ＰＣＴ＿１０４３３ＷＯ０１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇという名称の７５ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイル形式の配列表が、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
特許、特許出願、公開特許出願、アクセッション番号、技術論文および学術論文を含む様々な公表文献が、本明細書に引用される。これらの引用された公表文献の各々は、本文書内にその全体が、すべての目的のために、参照により組み込まれる。
【０００４】
Ｓｔｅｅｌ症候群（ＭＩＭ番号６１５１５５）は、１９９３年に、プエルトリコ出身のヒスパニック系小児２３人に認められた整形外科症候群として、Ｓｔｅｅｌらによって初めて公表された（非特許文献１）。主な臨床的特徴には、両側股関節および橈骨頭の先天性脱臼、低身長、手根骨癒合、側彎症、足の異常、軽度の醜形特徴などが挙げられる。
【０００５】
ＳＴＬＳ患者の臨床的および遺伝的評価では、他のよく特徴付けられた骨格異形成および結合組織障害とは異なる明確な遺伝的症候群を示した。ＳＴＬＳに特有の特徴に対する一般的な分子病因を特定する試みは、Ｇｏｎｚａｇａ−Ｊａｕｒｅｇｕｉらが、２０１５年に、ＣＯＬ２７Ａ１  ｐ．Ｇｌｙ６９７Ａｒｇバリアントがホモ接合型の場合、Ｓｔｅｅｌ症候群の分子的な原因であることを報告し、このミスセンスの変化がプエルトリコ系の個人における創始者バリアントであることを示唆するまでは成功しなかった（非特許文献２）。多民族集団を含む大規模コホートにおけるその後の研究験では、ｐ．Ｇｌｙ６９７Ａｒｇバリアントが他の個人で特定された。報告されたプエルトリコ系Ｓｔｅｅｌ症候群患者の特徴と重なる特徴を呈する骨軟骨異形成表現型と、ＣＯＬ２７Ａ１の新規の希少劣性突然変異とを結びつける追加的な症例が公表されたが、聴力低下および発話遅延などのＳｔｅｅｌ症候群に起因しない追加的な特徴もみられた（非特許文献３、非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｔｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．Ａｍ．７５：２５９−２６４，１９９３
【非特許文献２】Ｇｏｎｚａｇａ−Ｊａｕｒｅｇｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２３：３４２−３４６，２０１５
【非特許文献３】Ｇａｒｉｂａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  Ａ．２０１７；１７３（５）：１２５７−１２６３
【非特許文献４】Ｋｏｔａｂａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｇｅｎｅｔ．２０１７；９２（３）：３２３−３２６
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、Ｓｔｅｅｌ症候群の齧歯類モデルに関する。より具体的には、本開示は、ヒトにおけるＳｔｅｅｌ症候群を引き起こすヒトＣＯＬ２７Ａ１遺伝子内の突然変異に相当する、齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子の突然変異を保有する遺伝子組み換え齧歯類動物（例えば、マウスまたはラット）を提供するものである。
【０００８】
一部の実施形態では、遺伝子組み換え齧歯類が本明細書に開示されており、そのゲノムは齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子の突然変異を含み、この突然変異は、ヒトＣＯＬ２７Ａ１タンパク質のアミノ酸位置６９７（Ｇ６９７Ｒ）でＧｌｙからＡｒｇへの置換をもたらすヒトＣＯＬ２７Ａ１遺伝子の突然変異に相当する。
【０００９】
一部の実施形態では、齧歯類はマウスまたはラットである。ある特定の実施形態では、齧歯類はマウスであり、マウスの内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子の突然変異は、マウスＣｏｌ２７ａ１タンパク質のアミノ酸位置６８２でＧｌｙからＡｒｇへの置換をもたらす。他の実施形態では、齧歯類はラットであり、ラットの内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子の突然変異は、ラットＣｏｌ２７ａ１タンパク質のアミノ酸位置６９１でＧｌｙからＡｒｇへの置換をもたらす。
【００１０】
一部の実施形態では、齧歯類はマウスである。一部の実施形態では、マウスは、Ｃ５７ＢＬ系統、例えば、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａのマウスである。他の実施形態では、マウスは、１２９系統、例えば、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９／ＳｖＪａｅ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２のマウスである。ある特定の実施形態では、マウスは、前述の１２９系統のミックス（すなわち、交雑種）、または前述のＣ５７ＢＬ系統のミックス、またはＣ５７ＢＬ系統および１２９系統のミックスである。一部の実施形態では、マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎおよび１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）の交雑種である。
【００１１】
一部の実施形態では、齧歯類は、齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子内の突然変異に対してヘテロ接合型である。他の実施形態では、齧歯類は、齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子内の突然変異に対してホモ接合型である。
【００１２】
一部の実施形態では、齧歯類は、マウスの内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子内の突然変異（例えば、Ｇ６８２Ｒ）に対してヘテロ接合型である、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系統のマウスである一部の実施形態では、齧歯類は、内在性マウスＣｏｌ２７ａ１遺伝子内の突然変異（例えば、Ｇ６８２Ｒ）に対してホモ接合型である、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎおよび１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）の交雑種のマウスである。
【００１３】
本明細書に開示される齧歯類の動物、特にヒトＣＯＬ２７Ａ１タンパク質においてＧ６９７Ｒの変動をコード化する突然変異に相当する突然変異に対してホモ接合型である齧歯類、または上記突然変異に対してヘテロ接合型であるが野生型齧歯類Ｃｏｌ２７ａ１タンパク質を発現することができない齧歯類は、Ｓｔｅｅｌ症候群に関連する一つ以上の異常を呈する。一部の実施形態では、異常は、野生型齧歯類動物と比較して、生後３週齢での脊柱における重度の胸椎後弯、低体長、短い長骨、低骨塩量（ＢＭＣ）、および低体重からなる群から選択される。
【００１４】
一部の実施形態では、齧歯類の単離された細胞または組織が本明細書に開示されており、そのゲノムは齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子内の突然変異を含み、この突然変異は、ヒトＣＯＬ２７Ａ１タンパク質のＧ６９７Ｒ置換をもたらすヒトＣＯＬ２７Ａ１遺伝子の突然変異に相当する。単離された細胞または組織は、マウスまたはラットのものとすることができる。
【００１５】
一部の実施形態では、単離された齧歯類の胚性幹細胞が本明細書に開示されており、そのゲノムは齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子内の突然変異を含み、この突然変異は、ヒトＣＯＬ２７Ａ１タンパク質のＧ６９７Ｒ置換をもたらすヒトＣＯＬ２７Ａ１遺伝子内の突然変異に相当する。単離された齧歯類胚性幹細胞は、マウスまたはラットの胚性幹細胞とすることができる。
【００１６】
一部の実施形態では、改変された齧歯類ゲノムが、齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子内にヒトＣＯＬ２７Ａ１タンパク質においてＧ６９７Ｒ置換をもたらすヒトＣＯＬ２７Ａ１遺伝子内の突然変異に相当する突然変異を含むように、齧歯類ゲノムを改変することと、改変されたゲノムを含むＣｏｌ２７ａ１変異齧歯類を作製することとを含む、Ｃｏｌ２７ａ１変異齧歯類を作製する方法が本明細書に開示される。一部の実施形態では、齧歯類のゲノムは、標的核酸を齧歯類のＥＳ細胞のゲノムへと導入して、そのゲノムが内因性齧歯類Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子内の突然変異を含む突然変異齧歯類ＥＳ細胞を得ることと、（ａ）の突然変異齧歯類ＥＳ細胞を使用してＣｏｌ２７ａ１突然変異齧歯類を作製することとによって改変される。本方法は、突然変異マウスまたは突然変異ラットを作製するために使用することができる。
【００１７】
一部の実施形態では、齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子座において齧歯類Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子へと組み込まれ、齧歯類Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子座においてヌクレオチド配列と相同の５’ヌクレオチド配列および３’ヌクレオチド配列に隣接する核酸配列を含む標的核酸構築物が本明細書に開示されており、核酸配列の齧歯類Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子への組み込みは、ヒトＣＯＬ２７Ａ１タンパク質においてＧ６９７Ｒ置換をもたらすヒトＣＯＬ２７Ａ１遺伝子内の突然変異に相当する、齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子内の突然変異をもたらす。標的核酸構築物は、マウスまたはラットの内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子座において核酸配列をマウスまたはラットのＣｏｌ２７ａ１遺伝子へと組み込むように設計することができる。
【００１８】
さらなる実施形態では、Ｓｔｅｅｌ症候群の治療のための治療剤を特定する方法が本明細書に開示され、方法は、本明細書に開示される齧歯類に薬剤を投与することと、この薬剤が齧歯類においてＳｔｅｅｌ症候群に関連する一つ以上の異常に対して効果を有するかどうかを判定するために一つ以上のアッセイを実施することと、この薬剤がＳｔｅｅｌ症候群に関連する一つ以上の異常に対して治療効果を有する場合に、この薬剤を治療薬として特定することと、を含む。一部の実施形態では、薬剤は、出生時、または出生後すぐ、例えば、出生後１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２日または１日以内に、齧歯類に投与される。
【００１９】
本特許のファイルは、少なくとも一つのカラーで制作された図面を含む。カラー図面を含む本特許のコピーは、要請および必要料金の支払に伴い特許商標庁から提供されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ヒトＣＯＬ２７Ａ１タンパク質（ラミニンＧドメイン、コラーゲンタンパク質に特有の三重らせんドメイン、および線維状コラーゲンＣ末端ドメイン）のドメイン構造、ならびにｐＧ６９７Ｒ突然変異の場所を描写する。
【図２−１】図２Ａ〜図２Ｄは、Ｃｏｌ２７ａ１ノックイン変異マウスの肉眼的表現型を描写する。（Ａ）ホモ接合型Ｃｏｌ２７ａ１Ｇ６８２Ｒ／Ｇ６８２Ｒマウスは有意な小人症を示し、ヘテロ接合性Ｃｏｌ２７ａ１Ｇ６８２Ｒ／＋マウスは表現型が正常で、３週齢で野生型同腹仔と区別できなかった。（Ｂ）変異体および野生型の背側および横側のμＣｔ画像であり、ホモ接合型の変異マウスは、後弯症、短い鼻先、および丸い頭蓋骨を示している。（Ｃ〜Ｄ）ホモ接合型およびヘテロ接合型のＫＩマウス対野生型同腹仔における、体長、体重、および骨格パラメータ、ならびに骨塩量（ＢＭＣ）および骨密度（ＢＭＤ）の縦断的モニタリング。ホモ接合型Ｃｏｌ２７ａ１Ｇ６８２Ｒ／Ｇ６８２Ｒマウスは、低体重および低ＢＭＣを示す。
【図２−２】図２Ａ〜図２Ｄは、Ｃｏｌ２７ａ１ノックイン変異マウスの肉眼的表現型を描写する。（Ａ）ホモ接合型Ｃｏｌ２７ａ１Ｇ６８２Ｒ／Ｇ６８２Ｒマウスは有意な小人症を示し、ヘテロ接合性Ｃｏｌ２７ａ１Ｇ６８２Ｒ／＋マウスは表現型が正常で、３週齢で野生型同腹仔と区別できなかった。（Ｂ）変異体および野生型の背側および横側のμＣｔ画像であり、ホモ接合型の変異マウスは、後弯症、短い鼻先、および丸い頭蓋骨を示している。（Ｃ〜Ｄ）ホモ接合型およびヘテロ接合型のＫＩマウス対野生型同腹仔における、体長、体重、および骨格パラメータ、ならびに骨塩量（ＢＭＣ）および骨密度（ＢＭＤ）の縦断的モニタリング。ホモ接合型Ｃｏｌ２７ａ１Ｇ６８２Ｒ／Ｇ６８２Ｒマウスは、低体重および低ＢＭＣを示す。
【図３】図３は、Ｃｏｌ２７ａ１  Ｇ６８２Ｒ  ＫＩマウスからの長骨の組織学的分析を示す。ホモ接合型Ｃｏｌ２７ａ１Ｇ６８２Ｒ／Ｇ６８２ＲＫＩマウスは、野生型およびヘテロ接合型ＫＩ同腹仔と比較して、低減され、かつ崩壊した増殖ゾーンを伴う軟骨形成不全を示し、円柱状軟骨細胞が完全に欠損していた。サフラニンＯおよびフォン・コッサ染色の組織化学的比較では、プロテオグリカンの蓄積および石灰化のそれぞれに遺伝子型間で明白な差異は認められなかった。
【図４】図４は、マウスの野生型Ｃｏｌ２７ａ１対立遺伝子にＧ６９７Ｒオルソロガス変異（Ｇ６８２Ｒ）を導入するための例示的な標的化戦略を描写する。
【図５Ａ】図５Ａ〜図５Ｄは、ヒト、マウス、およびラットのＣｏｌ２７ａ１タンパク質配列（それぞれ配列番号２、４、および６）のアラインメントを記載する。ヒトＣＯＬ２７Ａ１のグリシン６９７、マウスＣｏｌ２７ａ１のグリシン６８２、およびラットＣｏｌ２７ａ１のＧｌｙ６９１が強調表示されている（７０８の番号が付けられた位置）。
【図５Ｂ】図５Ａ〜図５Ｄは、ヒト、マウス、およびラットのＣｏｌ２７ａ１タンパク質配列（それぞれ配列番号２、４、および６）のアラインメントを記載する。ヒトＣＯＬ２７Ａ１のグリシン６９７、マウスＣｏｌ２７ａ１のグリシン６８２、およびラットＣｏｌ２７ａ１のＧｌｙ６９１が強調表示されている（７０８の番号が付けられた位置）。
【図５Ｃ】図５Ａ〜図５Ｄは、ヒト、マウス、およびラットのＣｏｌ２７ａ１タンパク質配列（それぞれ配列番号２、４、および６）のアラインメントを記載する。ヒトＣＯＬ２７Ａ１のグリシン６９７、マウスＣｏｌ２７ａ１のグリシン６８２、およびラットＣｏｌ２７ａ１のＧｌｙ６９１が強調表示されている（７０８の番号が付けられた位置）。
【図５Ｄ】図５Ａ〜図５Ｄは、ヒト、マウス、およびラットのＣｏｌ２７ａ１タンパク質配列（それぞれ配列番号２、４、および６）のアラインメントを記載する。ヒトＣＯＬ２７Ａ１のグリシン６９７、マウスＣｏｌ２７ａ１のグリシン６８２、およびラットＣｏｌ２７ａ１のＧｌｙ６９１が強調表示されている（７０８の番号が付けられた位置）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
Ｓｔｅｅｌ症候群の齧歯類動物モデルが本明細書に開示されている。特に、ヒトＣＯＬ２７Ａ１遺伝子内の突然変異（例えば、ヒトにＳｔｅｅｌ症候群を引き起こすｐ．Ｇｌｙ６９７Ａｒｇ）に相当する、齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子内の突然変異を有する齧歯類動物が本明細書に開示されている。本明細書に開示される齧歯類動物は、Ｓｔｅｅｌ症候群を有するヒトにおいて観察される臨床的特徴を再現し、かつＳｔｅｅｌ症候群およびその他の骨障害の治療および／または改善のための治療候補の特定および開発に有用である。
【００２２】
本開示の様々な態様が以下のセクションに詳細に記載される。
ＣＯＬ２７Ａ１
コラーゲンは細胞外マトリックス内に最も豊富に存在するタンパク質であり、また脊椎動物における結合組織の構造および足場形成の主な貢献者である。コラーゲンタンパク質は、様々なファミリーに細分化できるが、すべてが、反復する三重アミノ酸（Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａ）の三重らせんドメインによって特徴付けられる類似の共通した構造を有する（Ｇａｒｉｂａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  Ａ．２０１７；１７３（５）：１２５７−１２６３、Ｇｏｎｚａｇａ−Ｊａｕｒｅｇｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。
【００２３】
コラーゲンタイプＸＸＶＩＩ、アルファ１（ＣＯＬ２７Ａ１）は、線維状コラーゲンファミリーのメンバーである。コラーゲンタイプＸＸＶＩＩは、発達中の軟骨において高発現し、また他の組織ではそれほど発現しない（Ｐａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．２２：３−１４，２００３、Ｂｏｏｔ−Ｈａｎｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３１０６７−７７，２００３、Ｐｌｕｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：１２７９１−１２７９５，２００７、およびＨｊｏｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  ４１：５３５−５４２，２００７）。発現パターンに基づいて、ＣＯＬ２７Ａ１が軟骨石灰化中に重要な役割を果たし、骨構造を形成するために、他の細胞型の導入および血管の侵入のための足場を提供すると想定されている。ゼブラフィッシュおよびマウスは、Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子の潜在的な機能喪失の効果を研究するために利用されてきた。これらの研究は、ＣＯＬ２７Ａ１が骨格系の形成および発達において重要な役割を果たしていることを示唆している（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ４（１２）：１−１０，２００９、Ｐｌｕｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ９４２２，２０１１）。
【００２４】
ヒトＣＯＬ２７Ａ１遺伝子は、９ｑ３２〜３３に位置し、長さが約１５６ｋｂであり、６１個のエクソンから構成され、１８６０のアミノ酸からなるプロペプチドをコード化する。このタンパク質はコラーゲンに特有の構造を有するが、その三重らせんドメインは他のプロアルファコラーゲンタンパク質（１０１２のアミノ酸）と比べて短い（９９０のアミノ酸）。相同のマウス遺伝子は染色体４上に位置し、かつ１８４５のアミノ酸からなるタンパク質をコード化する。Ｃｏｌ２７ａ１は、種間で高度に保存される。例えば、ヒトおよびマウスのＣＯＬ２７Ａ１タンパク質はどちらも、シグナルペプチド、ラミニンＧドメイン（ヒトに対しては１７５残基、マウスに対しては１７８残基）、三重らせんドメイン（ヒトに対しては９９４残基、マウスに対しては９９７残基、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙリピートでは二つの中断が保存されている）、およびＮＣ１ドメインまたはＣ−プロペプチド（ヒトに対しては２３９残基、マウスに対しては２４２残基、８つの特徴的なシステイン残基を含む）を含む。表１（ヒト、マウス、およびラット由来のＣｏｌ２７Ａ１タンパク質の特徴の概要説明）および図５Ａ〜図５Ｄ（ヒト、マウス、およびラットのＣｏｌ２７Ａ１タンパク質配列のアラインメント）参照。
【００２５】
ヒト、マウス、およびラット由来の例示的なＣＯＬ２７Ａ１  ｍＲＮＡおよびタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、以下のアクセッション番号で利用可能であり、また配列表にも配列番号１〜６として記載される。
【００２６】
【表１−１】
2021526019.tif 000002
【００２７】
【表１−２】
2021526019.tif 000003
【００２８】
ヒトＣＯＬ２７Ａ１におけるＳｔｅｅｌ症候群および病原性変異
Ｓｔｅｅｌ症候群（ＭＩＭ番号６１５１５５）は、１９９３年に、プエルトリコ出身のヒスパニック系小児２３人に認められた整形外科症候群として、Ｓｔｅｅｌらによって初めて公表された（Ｓｔｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．Ａｍ．７５：２５９−２６４，１９９３）。主な臨床的特徴には、両側股関節および橈骨頭の先天性脱臼、低身長、手根骨癒合、側彎症、足の異常、軽度の醜形特徴などが挙げられる。先天性股関節脱臼の標準治療は外科的介入であり、一般的に転帰は不良である（Ｇｏｎｚａｇａ−Ｊａｕｒｅｇｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２３：３４２−３４６，２０１５）。
【００２９】
「突然変異」という用語は、遺伝子内の一つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含む。一部の実施形態では、突然変異は、単一ヌクレオチドの置換である。他の実施形態では、突然変異は一つ以上のヌクレオチドの欠失である。一部の実施形態では、遺伝子の突然変異は、コード化されたタンパク質内の一つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換をもたして、変異タンパク質を提供する。一部の実施形態では、遺伝子内の突然変異は、コード化されたタンパク質中のアミノ酸の置換を引き起こす。他の実施形態では、遺伝子内の突然変異は、一つ以上のアミノ酸の欠失を引き起こす。ある特定の実施形態では、遺伝子内の突然変異（例えば、ヌクレオチドの置換）は、ナンセンス突然変異、すなわち、短縮タンパク質をもたらす早期終止コドンの変更コードである。一部の実施形態では、遺伝子内の突然変異、例えば一つ以上のヌクレオチドの付加または欠失は、読み枠のフレームシフトを引き起こし、野生型タンパク質産物と比較して、短縮もしくは伸長された、または異なるアミノ酸配列を有する変異タンパク質をもたらす。また他の実施形態では、遺伝子内の突然変異はまた、例えば、ドナー部位またはアクセプター部位を変化させることによって、スプライシングに影響を及ぼすこともでき、異なるようにスプライシングされたｍＲＮＡ転写物、および結果として異なるタンパク質産物をもたらす。
【００３０】
本開示によると、Ｓｔｅｅｌ症候群を引き起こすヒトＣＯＬ２７Ａ１遺伝子の突然変異は、Ｓｔｅｅｌ症候群と関連し、Ｓｔｅｅｌ症候群を分離する、ヒトＣＯＬ２７Ａ１遺伝子の突然変異である。こうした突然変異は、本明細書では病原性変異とも称される。
【００３１】
ヒトＣＯＬ２７Ａ１の変異は、２０１５年にＧｏｎｚａｇａ−Ｊａｕｒｅｇｕｉらが、全員がＳｔｅｅｌ症候群を有する、２人のきょうだいとその有症のいとこが共有していた、ＣＯＬ２７Ａ１遺伝子中のホモ接合型希少ミスセンスバリアント（エクソン７においてｃ．２０８９Ｇ＞Ｃ、ｐ．Ｇ６９７Ｒ）を特定した時、初めて関連付けた（Ｇｏｎｚａｇａ−Ｊａｕｒｅｇｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２３：３４２−３４６，２０１５）。このバリアントは、母集団データベースにおいてヘテロ接合型の状態が低頻度で以前に報告されており、またヘテロ接合型保因者においては目に見えるいかなる表現型効果も見られないようであった。Ｇｏｎｚａｇａ−Ｊａｕｒｅｇｕｉらは、ＣＯＬ２７Ａ１  ｐ．Ｇｌｙ６９７Ａｒｇバリアントがホモ接合型の場合、Ｓｔｅｅｌ症候群の分子的な原因であると結論付けた。
【００３２】
多民族集団を含む大規模コホートにおけるその後の研究では、ｐ．Ｇｌｙ６９７Ａｒｇバリアントがさらなる個人で特定された（Ｂｅｌｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅＬｉｆｅ  ２０１７；６．ｐｉｉ：ｅ２５０６０）。本明細書の実施例に記載される研究は、複数の影響を有する個人においてこのバリアントのホモ接合性および分離を実証し、バリアント対立遺伝子が、創始者突然変異を表し、かつこれがＳｔｅｅｌ症候群の分子的な原因であることをさらに確認する。
【００３３】
ｐ．Ｇｌｙ６９７Ａｒｇバリアントは、コラーゲンタンパク質の三重らせんドメインに特有のＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａリピートモチーフの一部である高度に保存されたグリシン残基を変化させる置換である。例えば、Ｇｏｎｚａｇａ−Ｊａｕｒｅｇｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（上記）の図３（ｂ）〜（ｃ）を参照されたい。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、Ｇｌｙ６９７Ａｒｇ置換は、骨成長プレートの肥大領域の細胞外マトリックスの中へ分泌された場合に、異常な機能をもたらすタンパク質のミスフォールディングをきたし、ヒト患者および齧歯類マウスモデルで観察される異常な成長表現型をもたらす場合がある。
【００３４】
ヒトにおいてＳｔｅｅｌ症候群を引き起こす突然変異に相当する内在性Ｃｏｌ２７ａ１内の突然変異を有する齧歯類
本明細書で実証されるように、Ｓｔｅｅｌ症候群を引き起こすヒトＣＯＬ２７Ａ１遺伝子内の突然変異に相当する突然変異を、齧歯類における内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子の中へと導入することができ、またこの齧歯類が、Ｓｔｅｅｌ症候群に特徴的な骨格異常などのヒトで観察される特徴を呈するようにする。
【００３５】
一部の実施形態では、ヒトＣＯＬ２７Ａ１遺伝子内の病原性変異は、ミスセンス変異である。一部の実施形態では、ヒトＣＯＬ２７Ａ１遺伝子の病原性変異は、ヒトＣＯＬ２７Ａ１のアミノ酸位置６９７におけるグリシンとアルギニンの置換をもたらす突然変異である。
【００３６】
「相当」とは、齧歯類Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子内の突然変異が、ヒトＣＯＬ２７Ａ１タンパク質におけるアミノ酸位置６９７に対応する齧歯類Ｃｏｌ２７ａ１タンパク質のアミノ酸位置で、ヒトにおけるものと同じミスセンス置換、例えば、グリシンのアルギニンによる置換をもたらすことを意味する。例えば、Ｇｌｙ６９７Ａｒｇヒト突然変異に相当するマウスのＣｏｌ２７ａ１遺伝子内の突然変異は、アクセッション番号ＮＰ＿０７９９６１．３による、マウスのＣｏｌ２７ａ１タンパク質の位置６８２におけるＧｌｙからＡｒｇへの置換をもたらす突然変異であり、またＧｌｙ６９７Ａｒｇヒト突然変異に相当するラットのＣｏｌ２７ａ１遺伝子における突然変異は、アクセッション番号ＮＰ＿１１６２７７．２による、ラットのＣｏｌ２７ａ１タンパク質の位置６９１においてＧｌｙからＡｒｇへの置換をもたらす突然変異である。
【００３７】
ヒトＣＯＬ２７Ａ１タンパク質における所与のアミノ酸位置に対応する齧歯類Ｃｏｌ２７ａ１タンパク質におけるアミノ酸位置を容易に決定することができる。当技術分野では、ヌクレオチド配列のためのＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列のためのＢＬＡＳＴＰ、ギャップ型ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなど、市販のコンピュータプログラムで入手可能なものを含む、様々な配列アラインメントツールが利用可能である。例示的なプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，Ａ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｂ．Ｆ．Ｆ．Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ（ｅｄｓ．）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８、およびＭｉｓｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８に説明されている。例示のために、複数のグローバル配列アラインメントＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用したヒトＣＯＬ２７Ａ１タンパク質（配列番号２）、マウスＣｏｌ２７ａ１タンパク質（配列番号４）、およびラットＣｏｌ２７ａ１（配列番号６）のアラインメントを図５Ａ〜図５Ｄに示した。
【００３８】
一部の実施形態では、ヒトＣＯＬ２７Ａ１遺伝子内の病原性変異に相当する齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子に突然変異を含有する本明細書に開示される齧歯類動物は、この突然変異に対してヘテロ接合型であってもよく、またはホモ接合型であってもよい。
【００３９】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類動物は、野生型齧歯類Ｃｏｌ２７ａ１タンパク質を発現することができない。例えば、齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子の一方のコピーが、ヒトの病原性変異に相当する突然変異を含有し、もう一方のコピーが破壊または削除された齧歯類が提供される。別の方法として、齧歯類動物は、ヒトＣＯＬ２７Ａ１遺伝子内の病原性変異に相当する突然変異に対してホモ接合型であり、結果として、野生型齧歯類Ｃｏｌ２７ａ１タンパク質を発現することができない。
【００４０】
ヒトＣＯＬ２７Ａ１の病原性変異に相当する突然変異を保有し、かつ野生型のＣｏｌ２７ａ１タンパク質を発現することができない結果として、本明細書に提供される齧歯類動物は、Ｓｔｅｅｌ症候群に特徴的なヒトで観察される特徴を呈する。一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類動物は、例えば、以下の骨格異常、すなわち野生型（対照）齧歯類と比較して、３週齢時にみとめられた脊柱における重度の胸椎後弯、低体長、長骨の長さの減少、低骨塩量（ＢＭＣ）、成長プレートの欠陥、および低体重などの、ヒトにおけるＳｔｅｅｌ症候群の特徴である一つ以上の異常を呈する。一部の実施形態では、対象齧歯類動物における頭蓋顔面異常は、鼻先がより短くかつわずかに丸みを帯びたドーム形状の頭蓋骨を含み、これは胚期（例えば、胚期１８．５日目）ほどの早期でも観察することができる。一部の実施形態では、齧歯類の成長プレートの欠陥には、円柱軟骨細胞の欠損および／または崩壊を伴う、増殖ゾーンの正常な構造の喪失が含まれる。上述のパラメータのいずれにおいても、変異齧歯類と野生型齧歯類との間の差異は著しく、すなわち、変異齧歯類動物のパラメータは、野生型齧歯類の同じパラメータと少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、またはそれ以上異なる。
【００４１】
本明細書で提供される齧歯類としては、例えば、マウス、ラット、およびハムスターが挙げられる。一部の実施形態では、齧歯類はマウスまたはラットである。特定の実施形態では、齧歯類はマウスである。
【００４２】
一部の実施形態では、齧歯類は、Ｃ５７ＢＬ系統、例えば、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスである。他の実施形態では、当該齧歯類は、１２９系統、例えば、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９／ＳｖＪａｅ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２からなる群から選択される１２９系統のマウスである（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  １０：８３６、Ａｕｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９（５）：１０２４−１０２８，１０３０，１０３２を参照）。一部の実施形態では、齧歯類は、前述の１２９系統および前述のＣ５７ＢＬ／６系統のミックスのマウスである。ある特定の実施形態では、マウスは、前述の１２９系統のミックス（すなわち、交雑種）、または前述のＣ５７ＢＬ系統のミックス、またはＣ５７ＢＬ系統および１２９系統のミックスである。ある特定の実施形態では、マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６系統および１２９系統のミックスである。特定の実施形態では、マウスはＦ１Ｈ４系統としても知られるＶＧＦ１系統であり、これは、Ｃ５７ＢＬ／６および１２９の交雑種である。特定の実施形態では、マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎおよび１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）の交雑種である。他の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統、例えばＢＡＬＢ／ｃ系統である。一部の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統および前述の別系統のミックスである。
【００４３】
一部の実施形態では、齧歯類はラットである。ある特定の実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉから選択される。他の実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される二つ以上の系統のミックスである。
【００４４】
突然変異を有する齧歯類を作製するためのターゲティングベクターおよび方法
本明細書で提供される齧歯類は、本明細書に開示される方法を使用して作製することができる。例示的な実施形態では、所望の突然変異を含有する齧歯類Ｃｏｌ２７ａ１核酸配列を保有するターゲティングベクターが構築される。ターゲティングベクターは、突然変異含有齧歯類Ｃｏｌ２７ａ１核酸配列に加えて、齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子座において、齧歯類Ｃｏｌ２７Ａ１遺伝子配列に対して好適な長さで、かつ相同な隣接する核酸配列も含むことができ、これにより、突然変異含有齧歯類Ｃｏｌ２７Ａ１核酸配列の、齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子への相同な組み換えおよび組み込みを媒介することができる。
【００４５】
一部の実施形態では、齧歯類Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子突然変異を含む核酸分子（例えば、挿入核酸）がベクター、好ましくはＤＮＡベクターへと挿入される。サイズに応じて、突然変異齧歯類Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子配列を、ｃＤＮＡ源から直接クローニングすることができ、またはＧｅｎＢａｎｋから入手可能な公開されている配列（上記を参照）に基づいてコンピュータにより設計することができる。別の方法として、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリは、齧歯類Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子配列を提供することができる。齧歯類Ｃｏｌ２７Ａ１遺伝子配列は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）から単離、クローニング、および／または移転されてもよい。
【００４６】
一部の実施形態では、挿入核酸は、選択可能なマーカー遺伝子（例えば、米国特許第８，６９７，８５１号、同第８，５１８，３９２号、および同第８，３５４，３８９号（これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）に記載の選択可能なマーカー遺伝子を含有する自己欠失型カセット）も含有し、これらは、部位特異的組み換え部位（例えば、ｌｏｘＰ、Ｆｒｔなど）に隣接する、またはこれらを含むことができる。選択可能なマーカー遺伝子を突然変異に隣接するベクター上に置いて、トランスフェクタントの容易な選択を可能にすることができる。
【００４７】
例示的なターゲティングベクターを図４に示す。
一部の実施形態では、変異齧歯類Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子配列を保有するＢＡＣベクターを、例えば、電気穿孔によって齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞へと導入することができる。マウスＥＳ細胞およびラットＥＳ細胞の両方が、当技術分野で説明されてきた。例えば、米国特許第７，５７６，２５９号、同第７，６５９，４４２号、同第７，２９４，７５４号、および米国特許公開第２００８／００７８０００号（そのすべてが参照により本明細書に組み込まれる）は、マウスＥＳ細胞および遺伝子組み換えマウスを作製するためのＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法について記載しており、また米国特許公開第２０１４／０２３５９３３号および同第２０１４／０３１０８２８号（そのすべてが参照により本明細書に組み込まれる）は、ラットＥＳ細胞および遺伝子組み換えラットを作製する方法について記載しているので参照されたい。
【００４８】
レシピエント細胞における相同な組み換えは、染色体ＤＮＡ内に破断を組み込み部位に導入することによって容易にすることができ、これは特定の組み込みの部位にある特定のヌクレアーゼを標的化することによって達成され得る。標的の遺伝子座においてＤＮＡ配列を識別するＤＮＡ結合タンパク質は、当技術分野で既知である。一部の実施形態では、標的配列中の特定の３−ヌクレオチド配列を認識する亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が利用される。一部の実施形態では、転写活性化様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を、部位特異的なゲノム編集に採用してもよい。他の実施形態では、構成要素（Ｃａｓ９およびｔｒａｃｒＲＮＡ）と標的特異的ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とからなるＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）が利用される。
【００４９】
一部の実施形態では、５’および３’相同アームに隣接する対象の核酸（例えば、導入される突然変異を含有する核酸）を保有するターゲティングベクターは、一つ以上の追加のベクターまたはｍＲＮＡを有する細胞内に導入される。一実施形態では、一つ以上の追化的なベクターまたはｍＲＮＡは、部位特異的ヌクレアーゼ（亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、およびＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない）をコード化するヌクレオチド配列を含有する。
【００５０】
ゲノムに統合された変異遺伝子配列を有するＥＳ細胞を選択することができる。選択後、正のＥＳクローンは、例えば、必要に応じて、自己欠失型カセットを除去するように改変することができる。次に、ゲノム内に組み込まれた突然変異を有するＥＳ細胞を、ドナーＥＳ細胞として、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（例えば、米国特許第７，５７６，２５９号、同第７，６５９，４４２号、同第７，２９４，７５４号、および米国特許公開第２００８／００７８０００号を参照）、または米国特許公開第２０１４／０２３５９３３号および同第２０１４／０３１０８２８号に記載の方法を用いることによって、前桑実期の胚（例えば、８細胞期胚）への注入に使用する。ドナーＥＳ細胞を含む胚を胚盤胞段階までインキュベートし、次に代理母へと移植して、完全にドナーＥＳ細胞に由来するＦ０齧歯類を産生する。突然変異対立遺伝子を有する齧歯類の仔は、突然変異遺伝子配列または選択可能なマーカー遺伝子の存在を検出する対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（上記）を使用して、尾切片から単離されたＤＮＡを遺伝子型解析により識別することができる。
【００５１】
Ｓｔｅｅｌ症候群の齧歯類モデルとしての使用
本明細書で提供される齧歯類により、Ｓｔｅｅｌ症候群の発症の根底にある分子機構がよりよく理解できる。加えて、こうした齧歯類は、Ｓｔｅｅｌ症候群およびその他の骨障害（例えば、成長不全、関節炎、骨粗鬆症、側彎症、前頸部痛など）の予防および治療のための治療剤のスクリーニングおよび開発に使用されてもよい。
【００５２】
一部の実施形態では、候補治療剤の効果は、本明細書に開示される齧歯類、すなわちヒトＣＯＬＡ２７Ａ１遺伝子の病原性変異に相当する齧歯類の内在性Ｃｏｌ２７ａ１遺伝子に突然変異を保有する齧歯類に薬剤を投与することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏで判定される。一部の実施形態では、候補治療剤は、核酸分子、例えば、ＣＯＬ２７Ａ１遺伝子治療薬剤である。
【００５３】
一部の実施形態では、本明細書に記載の齧歯類動物は、一つ以上の候補遺伝子治療薬物のベクター設計を判定および／または最適化するために使用される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の齧歯類動物を使用して、候補薬剤、例えば、遺伝子治療薬物の薬物動態特性が決定される。薬物動態特性としては、非ヒト動物がどのように薬剤を処理して様々な代謝物にするか（または、限定されないが有毒代謝物を含む一つ以上の薬剤代謝物の有無の検出）、薬剤半減期、投与後の薬剤の循環濃度（例えば、薬剤の血清濃度）、抗薬物反応（例えば、抗薬物抗体）、薬剤の吸収および分布、投与経路、薬剤の排泄および／またはクリアランスの経路が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
候補薬剤、例えば、ＣＯＬ２７Ａ１遺伝子治療薬剤は、本明細書に記載される非ヒト動物における評価のために、非経口経路投与および非注射経路投与を含む任意の望ましい投与経路を介して投与されてもよい。非経口経路としては、例えば、静脈内、動脈内、門脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、髄腔内、くも膜下腔内、側脳室内、頭蓋内、胸腔内または注入のその他の経路が挙げられる。非注射経路としては、例えば、経口、経鼻、経皮、肺、直腸、口腔、膣、眼が挙げられる。投与は、連続注入、局所投与、インプラント（ゲル、膜など）からの持続放出、および／または静脈内注射によってもよい。記載した齧歯類動物から得られたサンプルを使用して、投与された薬剤の薬物動態プロファイルを決定するために、様々なアッセイを実施してもよい。
【００５５】
一部の実施形態では、候補薬剤、例えば、遺伝子治療薬剤は、出生時または出生直後、例えば、出生後１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１日以内に、本明細書に記載の齧歯類動物に与えられる。ヒトにおける病原性変異に相当するＣｏｌ２７ａ１突然変異を保有する齧歯類に対して本明細書に記載の異常の発生および／または進行を阻害するための候補薬剤の効果を決定するために、様々な機能的および／または形態学的アッセイまたは分析を、様々な時点で（例えば、０時間、６時間、１日、２日、３日、４日、５日、１０日、１５日、３０日、６０日、９０日、６〜１２か月まで、またはそれ以上）実施することができる。
【００５６】
一部の実施形態では、アッセイの実施は、薬剤を投与された変異保有齧歯類動物と、（ｉ）薬剤を投与されていない変異保有齧歯類動物、（ｉｉ）この突然変異に対するヘテロ接合型の齧歯類、および／またはこの突然変異を有しない齧歯類（すなわち、野生型齧歯類動物）のいずれかとの間の差異を決定することを含む。
【００５７】
本記述は、以下の実施例により、さらに例示されるが、決して限定するものとして解釈されるべきではない。すべての引用参考文献（本出願全体を通して引用される文献参照、発行特許、および公表された特許出願を含む）の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００５８】
（実施例）
実施例１．追加的なＳｔｅｅｌ症候群患者におけるＣＯＬ２７Ａ１（ｐ．Ｇｌｙ６９７Ａｒｇ）バリアントの確認
稀なＣＯＬ２７Ａ１ミスセンスバリアント、ｐ．Ｇｌｙ６９７Ａｒｇは、当初、Ｓｔｅｅｌ症候群を有する単一の家族のホモ接合型である３人のメンバーにみられることが見出され、その後、この疾患の分子的な原因であることが確認された。
【００５９】
１９９３年にＳｔｅｅｌが報告した最初のＳＴＬＳ患者およびそれらの患者の家族の接触可能なメンバーのサンプルを６例から得て、遺伝子型を判定した。この同じｐ．Ｇｌｙ６９７Ａｒｇバリアントについて、患者６例中５例はホモ接合型であることが見出され、これは、これらのプエルトリコ系の家族内で、常染色体劣性遺伝疾患に対するメンデルの予想に従って分離された。さらに、臨床所見に基づいてＳｔｅｅｌ症候群が疑われる追加的なプエルトリコ系の患者４例からのサンプルも、全エクソーム配列決定および標的突然変異試験により解析した。これらの個人は、ＣＯＬ２７Ａ１内のｐ．Ｇｌｙ６９７Ａｒｇバリアントについてホモ接合型であることも見出された。
【００６０】
全体として、合計４０名の患者が、５０年前にＳｔｅｅｌが報告した「プエルトリコ症候群」に対応する臨床所見とともに文献で報告されている。これらのうち１７例が、ＣＯＬ２７Ａ１内のｐ．Ｇｌｙ６９７Ａｒｇバリアントに対してホモ接合型であることが分子学的に確認および報告されており（すべてプエルトリコ系）、この障害に関する創始者効果の仮説が確認された。報告された症例は、また、比較的均一な臨床表現型と一致する遺伝子型と表現型の関連の特異性を実証しており、これらの臨床表現型は、主に低身長、両側性先天性股関節形成異常、手根骨癒合、橈骨頭脱臼、側彎症、足変形、および脊椎奇形を特徴とする。
【００６１】
実施例２．Ｓｔｅｅｌ症候群ｐ．Ｇｌｙ６９７Ａｒｇバリアントのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデリング
Ｃｏｌ２７ａ１変異マウスの生成。ヒトｐ．Ｇｌｙ６９７Ａｒｇバリアントをモデル化するために、ｐ．Ｇｌｙ６８２Ａｒｇ置換（ヒト突然変異にオルソロガス）をもたらすグアニン−シチジン突然変異が、マウスＣｏｌ２７ａ１遺伝子の高度に保存された三重らせんドメインに導入された。突然変異は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集およびＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ法の標準的なプロトコルを使用してマウス遺伝子のエクソン７に導入された（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３；２１（６）：６５２−９、Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７；２５（１）：９１−９）。図４は、標的戦略を図示する。最終的なターゲティングベクターを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス胚性幹細胞へと電気穿孔し、そして下流イントロン内に挿入された自己欠失型カセット内のハイグロマイシン抵抗性を介して選択した。導入された突然変異を保有するマウスが、サンガーの配列決定遺伝子型判定により確認された。標的のカセット欠失ノックインマウスを交配させ、所望の遺伝子型を得た。ヘテロ接合型ノックインマウスを１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ野生型マウスと交配させて異系交配し、ミックスのバックグラウンド系統を作製した。この交雑種の遺伝的背景を有するヘテロ接合型の動物の交配は、離乳齢を超えて生存した生存可能なホモ接合型のＫＩ動物を産生することを可能にした。
【００６２】
成長および骨格の表現型解析。マウスは、指定された時点で体重を記録することにより成長動態をモニタリングし、かつｉｎ  ｖｉｖｏ  μＣＴを上述したように実施し撮像することによって肉眼的骨格表現型の解析を隔週で実施した（Ｄａｓ  ＮＭ，Ｈａｔｓｅｌｌ  Ｓ，Ｎａｎｎｕｒｕ  Ｋ，Ｈｕａｎｇ  Ｌ，Ｗｅｎ  Ｘ，Ｗａｎｇ  Ｌ，Ｗａｎｇ  ＬＨ，Ｉｄｏｎｅ  Ｖ，Ｍｅｇａｎｃｋ  ＪＡ，Ｍｕｒｐｈｙ  Ａ，Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓ  Ａ，Ｘｉｅ  Ｌ．Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｓ  ｉｎ  ａ  Ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１６；１１（２）：ｅ０１５００８５．）。簡潔に述べると、高速度ｉｎ  ｖｉｖｏ  μＣＴスキャナ（Ｑｕａｎｔｕｍ  ＦＸ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、米国、ＭＡ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ）を使用して全身のμＣＴ撮像を実施した。Ｘ線源は、８８μＡの電流、９０ｋＶの電圧に設定した。Ｑｕａｎｔｕｍ  ＦＸシステム内の既存のソフトウェアである、３Ｄ  Ｖｉｅｗｅｒを介してＣＴ撮像を視覚化した。視野（ＦＯＶ）は６０、ボクセルサイズは２４０μｍであった。走査中はマウスを麻酔下に維持した。具体的には、マウスを２．５〜３％のイソフルランと１．５リットル／分の酸素流に２〜３分間維持することによって麻酔を導入し、次いでスキャンプラットフォーム上に位置付けた。スキャンプラットフォームに接続されたノーズコーンを介して、イソフルランの一定の送達を達成した。スキャンプロセス後、マウスを加熱ランプ下で回復させ、それぞれのケージに戻した。
【００６３】
骨ミネラル密度（ＢＭＤ）および骨ミネラル含有量（ＢＭＣ）は、Ａｎａｌｙｚｅソフトウェアパッケージ（ＡｎａｌｙｚｅＤｉｒｅｃｔ，Ｏｖｅｒｌａｎｄ  Ｐａｒｋ，ＫＳ，ＵＳＡ）を使用してμＣＴスキャン画像データから算出した。スキャン後、画像処理ステップを実施した。画像のセグメントは、Ａｎａｌｙｚｅソフトウェアパッケージ（ＡｎａｌｙｚｅＤｉｒｅｃｔ、Ｏｖｅｒｌａｎｄ  Ｐａｒｋ社、米国、ＫＳ）内のＶｏｌｕｍｅ  Ｅｄｉｔツールを使用して半自動で実施した。簡潔に述べると、セグメント化マスク（オブジェクトマップ）は、半自動と手動の技法（オブジェクト抽出、領域拡大、閾値設定ツール）との組み合わせを使用して作成した。次にこれらのセグメント化結果は、必要に応じて手動で修正し、ＲＯＩツールを使用して定量化した。
【００６４】
結果。ホモ接合型（Ｃｏｌ２７ａ１Ｇ６８２Ｒ／Ｇ６８２Ｒ）ＫＩマウスはＰ７の前に重度の致死性を示し、離乳後に生存した仔は数匹のみであった。Ｅ１８．５でのホモ接合型ＫＩ胚の表現型解析では、鼻先が短縮された異常な頭蓋骨形状を示したが、この段階では胚のサイズまたは長さに有意差は認められなかった。さらに、ホモ接合型ＫＩマウスは、気腔の発達が不良で間葉が厚くなった異常な肺を有していた。４匹のホモ接合型ＫＩマウスは離乳齢を超えて生存し、肉眼的な表現型および骨格の変化についてさらに評価に供された。
【００６５】
ヘテロ接合型（Ｃｏｌ２７ａ１Ｇ６８２Ｒ／＋）およびホモ接合型（Ｃｏｌ２７ａ１Ｇ６８２Ｒ／Ｇ６８２Ｒ）のＫＩマウス、ならびに野生型同腹仔のコンピュータ断層撮影（μＣＴ）全身スキャンを実施し、肉眼的な骨格異常および体長の減少を、ヒト患者において観察された低身長表現型の代理として評価した。鼻先から尾部の基部（尾椎骨４、ＣＡ４）までの距離を測定し、ヘテロ接合型、ホモ接合型、および野生型マウスの間で長さの差異を評価した。ホモ接合型の変異マウスは、明らかな重度の小人症を示し、また野生型またはヘテロ接合型の同腹仔と比較して著しく小さかった（図２Ａ）。全体長は著しく短く（図２Ｂ、図２Ｄ）、また長骨がすべて短かった。ホモ接合型ＫＩマウスは、より短い鼻先およびやや丸みを帯びたドーム状の頭蓋骨を含む、明確な頭蓋顔面異常も呈し、胚期の初期にも観察された。評価したホモ接合型ＫＩマウスのすべてにおいて、３週齢で脊柱の解析で重度の胸椎後弯が示され、これは頭蓋骨と頸椎の間の鋭角につながり、胸郭の内向きの湾曲がもたらされた。骨格パラメータの分析により、ホモ接合型変異マウスが、ヘテロ接合型ＫＩマウスおよび野生型マウスと比較して、低い骨塩量（ＢＭＣ）を示すことが明らかになった（図２Ｃ）。ホモ接合型マウスは、野生型の同腹仔と比較して体重が半分であり、６ヶ月のモニタリング期間を通して、その成長曲線は野生型およびヘテロ接合型の同腹仔と比較して著しく低いままであった。ヘテロ接合型マウスは生存可能で、いかなる肉眼的な骨格異常も示さず、骨格パラメータは野生型同腹仔と区別できなかった。ホモ接合型およびヘテロ接合型のＫＩマウスを６カ月間の期間にわたってモニタリングした。加齢は、ヘテロ接合型のマウスでは高齢期に肉眼的または検出可能な骨格異常の発生をもたらさなかった。
【００６６】
ヘテロ接合型（Ｃｏｌ２７ａ１Ｇ６８２Ｒ／＋）ＫＩマウスおよびホモ接合型（Ｃｏｌ２７ａ１Ｇ６８２Ｒ／Ｇ６８２Ｒ）ＫＩマウス、ならびに野生型同腹仔の組織学的分析を実施して、成長プレートの欠陥を評価した。Ｐ１において、ヘテロ接合型（Ｃｏｌ２７ａ１Ｇ６８２Ｒ／＋）ＫＩマウスおよびホモ接合型（Ｃｏｌ２７ａ１Ｇ６８２Ｒ／Ｇ６８２Ｒ）ＫＩマウス、ならびに野生型同腹仔から長骨（大腿骨および脛骨）を収集し、固定し、切片を作製した。その後、標準的なプロトコルに従って、切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、サフラニンＯ、またはフォン・コッサ染色に供した。ホモ接合型ＫＩマウスの大腿および脛骨成長プレートの染色切片は、円柱軟骨細胞の欠損および崩壊を伴う増殖ゾーンの正常な構造の完全な喪失を示した（図３）。サフラニンＯおよびフォン・コッサ染色の組織化学的な比較では、ホモ接合型ＫＩマウスとヘテロ接合型ＫＩマウスおよび野生型マウスとの間で、プロテオグリカンの蓄積および石灰化に明白な差異は示されなかった（図３）。興味深いことに、ヘテロ接合型ＫＩマウスにおける長骨の長さおよび肉眼的形態は、野生型同腹仔と変わらないが、これらのマウスにおける成長プレートの組織学的分析は、成長プレートの増殖ゾーンの長さは維持されるが、軟骨細胞の円柱状配置におけるいくらかの崩壊が観察できる中間表現型を明らかにした（図３）。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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