(57)【要約】  本発明に従い、とりわけ陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法が提供され、ここでこの外側コーティング層は、抗凝固実体を含み、ｉ）固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；ｉｉ）この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；ｉｉｉ）任意に工程ｉ）及びｉｉ）を１回以上繰り返す工程；ｉｖ）この表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；並びに、ｖ）陽イオン性ポリマーの最外層を、抗凝固実体により処理し、これにより抗凝固実体を、陽イオン性ポリマーの最外層へ共有結合させる工程：を含み、ここで、陰イオン性ポリマーは、（ａ）総分子量６５０ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａ；及び、（ｂ）溶液電荷密度＞４μｅｑ／ｇを有することにより特徴付けられ；並びにここで、工程ｉｉ）は、塩濃度０．２５Ｍ〜５．０Ｍで実行される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
外側コーティング層が抗凝固実体を含む、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程；
iv)この表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；並びに
v)陽イオン性ポリマーの最外層を、抗凝固実体により処理し、これにより抗凝固実体を、陽イオン性ポリマーの最外層へ共有結合させる工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられ；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、前記方法。
【請求項２】
前記陰イオン性ポリマーが、デキストラン硫酸である、請求項1記載の固体物体の製造方法。
【請求項３】
前記陰イオン性ポリマーが、総分子量750kDa〜10,000kDa、例えば1,000kDa〜10,000kDaを有することにより特徴付けられる、請求項1又は2記載の固体物体の製造方法。
【請求項４】
前記陰イオン性ポリマーの総分子量が、評価方法Gに従い測定される、請求項1〜3のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項５】
前記陰イオン性ポリマーが、溶液電荷密度＞4μeq/g〜7μeq/g、例えば＞5μeq/g〜7μeq/gを有することにより特徴付けられる、請求項1〜4のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項６】
前記工程ii)が、塩濃度0.25M〜4.0M、例えば0.25M〜3.0Mで実行される、請求項1〜5のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項７】
前記塩が、無機塩である、請求項1〜6のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項８】
前記塩が、無機のナトリウム塩である、請求項7記載の固体物体の製造方法。
【請求項９】
前記塩が、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、及びリン酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項8記載の固体物体の製造方法。
【請求項１０】
前記塩が、塩化ナトリウムである、請求項9記載の固体物体の製造方法。
【請求項１１】
前記工程iii)が、任意ではない、請求項1〜10のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項１２】
前記工程iii)において、工程i)及びii)が、1〜10回、例えば1、2、3、4、5又は6回繰り返される、請求項11記載の固体物体の製造方法。
【請求項１３】
前記工程i)の陽イオン性ポリマーが、工程iv)の陽イオン性ポリマーと同じである、請求項1〜12のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項１４】
前記工程i)の陽イオン性ポリマーが、任意に架橋されている、ポリアミンである、請求項1〜13のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項１５】
前記工程iv)の陽イオン性ポリマーが、任意に架橋されている、ポリアミンである、請求項1〜14のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項１６】
加えて、工程i)の前に前処理工程を含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項１７】
加えて、工程i)と工程ii)の間、工程ii)と工程iii)の間、工程iii)と工程iv)の間、又は工程iv)と工程v)の間に工程を含む、請求項1〜16のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項１８】
前記抗凝固実体が、ヘパリン部分である、請求項1〜17のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項１９】
前記ヘパリン部分が、末端部に結合されたヘパリン部分である、請求項18記載の固体物体の製造方法。
【請求項２０】
前記末端部に結合されたヘパリン部分が、その還元末端を介して連結されている、請求項19記載の固体物体の製造方法。
【請求項２１】
前記抗凝固実体が、完全長ヘパリンである、請求項18記載の固体物体の製造方法。
【請求項２２】
前記抗凝固実体が、リンカーを介して共有結合されている、請求項1〜21のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項２３】
前記リンカーが、第二級アミンを含む、請求項22記載の固体物体の製造方法。
【請求項２４】
前記リンカーが、第二級アミドを含む、請求項22記載の固体物体の製造方法。
【請求項２５】
前記リンカーが、1,2,3-トリアゾールを含む、請求項22記載の固体物体の製造方法。
【請求項２６】
前記リンカーが、チオエーテルを含む、請求項22記載の固体物体の製造方法。
【請求項２７】
前記固体物体が、医療器具、分析装置、分離装置又はメンブレンである、請求項1〜26のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項２８】
前記固体物体が、抗血栓性医療器具である、請求項27記載の固体物体の製造方法。
【請求項２９】
前記固体物体が、体外医療器具である、請求項27記載の固体物体の製造方法。
【請求項３０】
前記固体物体が、体内医療器具である、請求項28記載の固体物体の製造方法。
【請求項３１】
前記体内医療器具が、ステント又はステント-グラフトである、請求項30記載の固体物体の製造方法。
【請求項３２】
前記固体物体が、好適には評価方法Bに従い測定される、ATIIIの結合に関する抗凝固実体活性の、少なくとも1pmol/cm2表面、例えば少なくとも2pmol/cm2表面、少なくとも3pmol/cm2表面、少なくとも4pmol/cm2表面、又は少なくとも5pmol/cm2表面を有する、請求項1〜31のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項３３】
前記固体物体が、好適には評価方法Eに従い測定される血液接触性能の、少なくとも80％残存血小板、例えば少なくとも85％残存血小板、例えば少なくとも90％残存血小板を有する、請求項1〜32のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項３４】
前記固体物体が、好適には評価方法Fに従い測定されるF1+2値の、＜10,000pmol/L、7,500pmol/L未満、5,000pmol/L未満、又は4,000pmol/L未満を有する、請求項1〜33のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項３５】
前記抗凝固実体が、ヘパリン部分であり、並びにこの固体物体が、好適には評価方法Aに従い測定されるヘパリン濃度の、少なくとも1μg/cm2、例えば少なくとも2μg/cm2、少なくとも4μg/cm2、少なくとも5μg/cm2、又は少なくとも6μg/cm2を有する、請求項1〜34のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項３６】
前記固体物体が、pH3以下の等電点(IEP)、pH5以下の曲線の大域的最小点、及びデルタ値、すなわち少なくとも20mVの大域的最小点でのゼータ電位とpH9でのゼータ電位の間の差異により特徴付けられる、好適には評価方法Dに従い測定されるゼータ電位プロファイルを有する、請求項1〜35のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項３７】
前記陰イオン性ポリマーが、-CO2-、-SO3-、-PO3H-及び-PO32-から選択された基を含むポリマーである、請求項1〜36のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項３８】
前記陰イオン性ポリマーが、-SO3-を含むポリマーである、請求項37記載の固体物体の製造方法。
【請求項３９】
前記陰イオン性ポリマーの硫黄含量が、陰イオン性ポリマーの10重量％〜25重量％である、請求項38記載の固体物体の製造方法。
【請求項４０】
外側コーティング層が抗凝固実体を含む、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程；
iv)この表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；並びに
v)陽イオン性ポリマーの最外層を、抗凝固実体により処理し、これにより抗凝固実体を、陽イオン性ポリマーの最外層へ共有結合させる工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、-SO3-基を含むポリマーであり、
この陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)陰イオン性ポリマーの10重量％〜25重量％の硫黄含量を有することにより特徴付けられ；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、前記方法。
【請求項４１】
外側コーティング層が抗凝固実体を含む、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程；
iv)この表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；並びに
v)陽イオン性ポリマーの最外層を、抗凝固実体により処理し、これにより抗凝固実体を、陽イオン性ポリマーの最外層へ共有結合させる工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、総分子量650kDa〜10,000kDaを有することにより特徴付けられ；
この陰イオン性ポリマーは、デキストラン硫酸であり；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、前記方法。
【請求項４２】
前記抗凝固実体が、ヘパリン部分である、請求項40又は41のいずれか記載の固体物体の製造方法。
【請求項４３】
陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体であって、ここで外側コーティング層は、抗凝固実体に共有結合された陽イオン性ポリマーを含む層であり；
並びにここで、陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられる、前記固体物体。
【請求項４４】
前記陰イオン性ポリマーが、総分子量650kDa〜1,000kDaを有することにより特徴付けられる、請求項43記載の固体物体。
【請求項４５】
前記陰イオン性ポリマーが、総分子量1,000kDa〜4,500kDaを有することにより特徴付けられる、請求項43記載の固体物体。
【請求項４６】
前記陰イオン性ポリマーが、総分子量4,500kDa〜7,000kDaを有することにより特徴付けられる、請求項43記載の固体物体。
【請求項４７】
前記陰イオン性ポリマーが、総分子量7,000kDa〜10,000kDaを有することにより特徴付けられる、請求項43記載の固体物体。
【請求項４８】
前記陰イオン性ポリマーが、塩濃度0.25M〜5.0M、例えば0.25M〜4.0M又は0.25M〜3.0Mで、表面に塗布される、請求項43〜47のいずれか一項記載の固体物体。
【請求項４９】
前記陰イオン性ポリマーが、-CO2-、-SO3-、-PO3H-及び-PO32-から選択される基を含むポリマーである、請求項48記載の固体物体。
【請求項５０】
前記陰イオン性ポリマーが、-SO3-基を含むポリマーである、請求項49記載の固体物体。
【請求項５１】
前記陰イオン性ポリマーの硫黄含量が、陰イオン性ポリマーの10重量％〜25重量％である、請求項50記載の固体物体。
【請求項５２】
陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体であって、ここで外側コーティング層が、それに抗凝固実体が共有結合された陽イオン性ポリマーを含む層であり；陰イオン性ポリマーが、-SO3-基を含むポリマーであり、且つここで陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)陰イオン性ポリマーの10重量％〜25重量％の硫黄含量を有することにより特徴付けられる、前記固体物体。
【請求項５３】
外側コーティング層が陽イオン性ポリマーを含む層である、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程；並びに
iv)この表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられ；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、前記方法。
【請求項５４】
外側コーティング層が陽イオン性ポリマーを含む層である、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程；並びに
iv)この表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、-SO3-基を含むポリマーであり、
この陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)陰イオン性ポリマーの10重量％〜25重量％の硫黄含量を有することにより特徴付けられ；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、前記方法。
【請求項５５】
外側コーティング層が陽イオン性ポリマーを含む層である、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程；並びに
iv)この表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、総分子量650kDa〜10,000kDaを有することにより特徴付けられ；
この陰イオン性ポリマーは、デキストラン硫酸であり；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、前記方法。
【請求項５６】
外側コーティング層が、陽イオン性ポリマーを含む層であり：並びにここで陰イオン性ポリマーが、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられる、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体。
【請求項５７】
外側コーティング層が、陽イオン性ポリマーを含む層であり；陰イオン性ポリマーが、-SO3-基を含むポリマーであり、並びにここで陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)陰イオン性ポリマーの10重量％〜25重量％の硫黄含量を有することにより特徴付けられる、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体。
【請求項５８】
外側コーティング層が陰イオン性ポリマーを含む層である、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられ、
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、前記方法。
【請求項５９】
外側コーティング層が陰イオン性ポリマーを含む層である、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、-SO3-基を含むポリマーであり、
この陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)陰イオン性ポリマーの10重量％〜25重量％の硫黄含量を有することにより特徴付けられ、
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、前記方法。
【請求項６０】
外側コーティング層が陰イオン性ポリマーを含む層である、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、総分子量650kDa〜10,000kDaを有することにより特徴付けられ；
この陰イオン性ポリマーは、デキストラン硫酸であり；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、前記方法。
【請求項６１】
外側コーティング層が、陰イオン性ポリマーを含む層であり；並びにここで、陰イオン性ポリマーが、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられる、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体。
【請求項６２】
外側コーティング層が、陰イオン性ポリマーを含む層であり；陰イオン性ポリマーが、-SO3-基を含むポリマーであり、並びにここで陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)陰イオン性ポリマーの10重量％〜25重量％の硫黄含量を有することにより特徴付けられる、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、生物学的実体(entity)を含む表面コーティングを有する固体物体を調製する方法に関する。特に本発明は、ヘパリンなどの抗凝固実体を含む、改善された表面コーティングを調製する方法、並びにそれにより得られる特定の製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
医療器具が体内に植込まれるか又は体液と接触される場合に、数多くの異なる反応が動き出し、その一部は炎症を生じ、且つ一部は器具表面と接触している血液の凝固を生じる。これらの重篤な有害作用を弱めるために、周知の抗凝固化合物ヘパリンが、医療器具が患者の体内へ植込まれる前に、又は患者の体液と接触する時点で、抗血栓効果を提供するために、患者へ長期間全身投与されている。
【０００３】
トロンビンは、いくつかの凝固因子の一つであり、その全ては一緒に作用し、血液と接触している表面に血栓の形成を生じる。アンチトロンビン(アンチトロンビンIIIとしても公知)(“ATIII”)は、最も傑出した凝固インヒビターである。これは、トロンビン及び他の凝固因子の作用を中和し、その結果血液凝固を制限又は限定する。ヘパリンは、アンチトロンビンが凝固因子を阻害する速度を劇的に増強する。ヘパリンコファクターII(“HCII”)は、ヘパリンの存在下でトロンビンを迅速に阻害する別の凝固因子である。
【０００４】
しかし、高投与量のヘパリンによる全身処置は、重篤な副作用に関連することが多く、中でも出血が多くを占める。ヘパリン療法の別の稀であるが重篤な合併症は、血栓形成(静脈及び動脈の両方)へ繋がり得るヘパリン起因性血小板減少症(HIT)と称されるアレルギー反応の進行である。例えば手術時の、高投与量全身性ヘパリン処置はまた、活性化凝固時間(ヘパリン療法のモニタリング及びガイドに使用される)の頻繁なモニタリング、並びに必要に応じた対応する投与量の調節を必要とする。
【０００５】
従って、患者の全身のヘパリン処置の必要性が、不要になるか又は限定され得るような解決策が求められている。これは、ヘパリン及び他の抗凝固薬の抗凝固特性を使用し、医療器具の表面修飾を通じて達成されると考えられた。従って、ヘパリンの層を医療器具の表面に付着させ、それにより表面を抗血栓性とすることを求める、数多くの比較的成功した技術又は余り成功していない技術が、開発されている。長期間の生体活性が必要とされる器具に関して、ヘパリンは、滲出及び分解に対し抵抗性であることが望ましい。
【０００６】
ヘパリンは、糖ユニット上に負帯電した硫酸基及びカルボン酸基を保有する多糖である。従って、ヘパリンのポリ陽イオン性表面へのイオン結合が試みられたが、この表面修飾は、ヘパリンが表面から滲出するので、安定性の欠如に悩まされ、結果的に機能の欠如を生じた。その後、ヘパリンが表面上の基に共有結合されている、様々な表面修飾が調製されている。
【０００７】
医療器具を抗血栓性とすることに関して最も成功している方法の一つは、器具の修飾された表面へのヘパリンフラグメントの共有結合である。全般的方法及びその改善点は、様々な特許文献において説明されている(EP0086186A1、EP0086187A1、EP0495820B1及びUS6,461,665B1を参照し、これらの各々はその全体が引用により本明細書中に組み込まれている)。
【０００８】
これらの文献は、末端アルデヒド基を持つように修飾されたヘパリンを、第一級アミノ基を持つように修飾されている医療器具の表面と反応させることによる、ヘパリン化された表面の調製を説明している。中間体シッフ塩基が形成され、これはインサイチュ還元され、安定した第二級アミンリンカーを形成し、これによりヘパリンを共有結合により固定する。
【０００９】
その活性を維持しながらヘパリンを表面へ共有結合する更なる方法は、WO2010/029189A2、WO2011/110684A1及びWO2012/123384A1に説明されている(その各々はその全体が引用により本明細書中に組み込まれている)。
【００１０】
この抗凝固実体は、固体物体の表面上に直接固定されるのではなくむしろ、典型的には、ポリマー又は複合体の1つ以上の層により処理された表面上に固定される。
【００１１】
EP0086187A1は、それに吸収された複合体により表面修飾された基体(substrate)を説明しており、ここでこの複合体は、第一級アミノ態窒素官能基、並びに第二級及び／又は第三級アミノ官能基を含む高分子陽イオン界面活性剤、並びに2個のアルデヒド基の間に1〜4個の炭素原子を有するジアルデヒドの複合体である。陰イオン性化合物は追加的に、該複合体へ、並びに任意に追加の陽イオン及び陰イオン交互化合物へ結合されてよい。
【００１２】
EP0495820B1は、基体の表面を修飾する方法であって、(a)高平均分子量のポリアミンを吸着させ、且つ該ポリアミンをクロトンアルデヒドで架橋する工程；(b)次に、架橋したポリアミンの表面上に陰イオン性多糖類の層を吸着させる工程；(c)任意に工程(a)及び(b)を1回以上繰り返す工程；並びに、(d)陰イオン性多糖類層の上又は陰イオン性多糖類の最外層の上に、非架橋のポリアミン層を吸着させ、遊離第一級アミノ基を提供する工程：を含む方法を説明している。後続の工程において、遊離第一級アミノ基と反応性の官能基を保有する生物学的活性のある化学実体を、非架橋のポリアミン、例えばヘパリンと結合させることができる。
【００１３】
しかし、特に抗凝固実体の生物活性が維持されるか又は増強されるようなコーティングに関して、ヘパリンなどの抗凝固実体を含む改善された表面コーティングの必要性が依然存在する。そのような改善された表面コーティングは、抗凝固表面から恩恵を受ける医療器具及び他の製品における潜在的有用性がある。
【００１４】
本発明者らは、驚くべきことに、その上に抗凝固実体が固定された表面の性質は、コーティングの特徴、特に生じる抗凝固実体の生物活性に顕著に影響を及ぼすことができることを発見した。特に、抗凝固実体が陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む固体物体の表面上に固定されている場合、陰イオン性ポリマー層(複数可)の塗布の性質及び状態の慎重な調節は、例えばそれが有し得る抗血栓特性を含む、結果として得る固体物体のコーティングの特徴を改善することができる。
【発明の概要】
【００１５】
（発明の概要）
一態様において、本発明は、外側コーティング層が抗凝固実体を含む、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程；
iv)この表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；並びに
v)陽イオン性ポリマーの最外層を、抗凝固実体により処理し、これにより抗凝固実体を、陽イオン性ポリマーの最外層へ共有結合させる工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられ；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、方法を提供する。
【００１６】
更なる態様において、本発明は、外側コーティング層が抗凝固実体を含む、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程；
iv)この表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；並びに
v)陽イオン性ポリマーの最外層を、抗凝固実体により処理し、これにより抗凝固実体を、陽イオン性ポリマーの最外層へ共有結合させる工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、-SO3-基を含むポリマーであり、
この陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)陰イオン性ポリマーの10重量％〜25重量％の硫黄含量を有することにより特徴付けられ；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、方法を提供する。
【００１７】
更なる態様において、本発明は、外側コーティング層が抗凝固実体を含む、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程；
iv)この表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；並びに
v)陽イオン性ポリマーの最外層を、抗凝固実体により処理し、これにより抗凝固実体を、陽イオン性ポリマーの最外層へ共有結合させる工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、総分子量650kDa〜10,000kDaを有することにより特徴付けられ；
この陰イオン性ポリマーは、デキストラン硫酸であり；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
（図面の簡単な説明）
【図１】図1は、単独の二重層を伴う本発明のコーティング例を示す；
【図２】図2は、NaCl濃度0.25M及び1.7Mで、デキストラン硫酸4、5、6及び7によりコーティングされたPVCチューブに関する標準化されたヘパリン活性(HA)を示す；
【図３】図3は、異なる濃度の異なる塩を使用し、デキストラン硫酸5によりコーティングされたPVCチューブに関する標準化されたヘパリン活性(HA)を示す；
【図４】図4は、NaCl濃度1.7Mで、デキストラン硫酸3、4、5、6及び7によりコーティングされたPVCチューブに関するヘパリン濃度(HC)を示す；
【図５】図5は、変動するNaCl濃度で、デキストラン硫酸3、4、5、6及び7によりコーティングされたPVCチューブのヘパリン濃度(HC)を示す；
【図６】図6は、異なる濃度で異なる塩を使用し、デキストラン硫酸5によりコーティングされたPVCチューブのヘパリン濃度(HC)を示す；
【図７】図7は、NaCl濃度1.7Mで、デキストラン硫酸3、4及び5によりコーティングされたPVCチューブのゼータ電位を示す；
【図８】図8は、NaCl濃度1.7Mで、デキストラン硫酸3、6及び7によりコーティングされたPVCチューブのゼータ電位を示す；
【図９】図9は、NaCl濃度0.25Mで、デキストラン硫酸3、4及び5によりコーティングされたPVCチューブのゼータ電位を示す；
【図１０】図10は、NaCl濃度0.25Mで、デキストラン硫酸3、6及び7によりコーティングされたPVCチューブのゼータ電位を示す；
【図１１】図11は、変動するNaCl濃度で、デキストラン硫酸5によりコーティングされたPVCチューブのゼータ電位を示す；
【図１２】図12は、変動するNa2HPO4濃度で、デキストラン硫酸5によりコーティングされたPVCチューブのゼータ電位を示す；
【図１３】図13は、変動するNa2SO4濃度で、デキストラン硫酸5によりコーティングされたPVCチューブのゼータ電位を示す；
【図１４】図14は、NaCl濃度0.25Mで、デキストラン硫酸2、4、5、6及び7によりコーティングされたPVCチューブの残存血小板(％)を示す；
【図１５】図15は、NaCl濃度0.25Mで、デキストラン硫酸2、4、5、6及び7によりコーティングされたPVCチューブに関するF1+2(プロトロンビンフラグメント)を示す；
【図１６】図16は、NaCl濃度1.7Mで、デキストラン硫酸4、5、6及び7によりコーティングされたPVCチューブの残存血小板(preserved platelet)(％)を示す；
【図１７】図17は、NaCl濃度1.7Mで、デキストラン硫酸4、5、6及び7によりコーティングされたPVCチューブに関するF1+2(プロトロンビンフラグメント)を示す；
【図１８】図18は、プレ-及びポスト-温度及び湿度試験での、NaCl濃度0.25Mで、デキストラン硫酸4によりコーティングされたPVCチューブの残存血小板(％)を示す；
【図１９】図19は、プレ-及びポスト-温度及び湿度試験での、NaCl濃度0.25Mで、デキストラン硫酸4によりコーティングされたPVCチューブに関するF1+2(プロトロンビンフラグメント)を示す；
【図２０】図20は、プレ-及びポスト-温度及び湿度試験での、NaCl濃度1.7Mで、デキストラン硫酸4、5及び7によりコーティングされたPVCチューブの残存血小板(％)を示す；
【図２１】図21は、プレ-及びポスト-温度及び湿度試験での、NaCl濃度1.7Mで、デキストラン硫酸4、5及び7によりコーティングされたPVCチューブに関するF1+2(プロトロンビンフラグメント)を示す；
【図２２】図22は、本発明の固体物体の典型的ゼータ電位プロファイルを示す；
【図２３】図23は、ヘパリンの活性五糖配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
（固体物体）
任意の固体物体は、本発明の方法を用いコーティングされる可能性があり得るが、そのようなコーティング及び方法は、医療器具、分析装置、分離装置、及びメンブレンを含む他の産業製品に関して特に有用である。
【００２０】
固体物体は、抗血栓性表面を有することができる。本発明のいくつかの実施態様において、この抗血栓性表面は、抗凝固実体の固定により、凝固反応の直接の薬学的阻害を示すことができる。本発明のいくつかの実施態様において、この抗血栓性表面は、血液と接触した場合に、血栓症、溶血、血小板、白血球、及び補体の活性化などの何らかの明らかに臨床的に著しい有害反応、並びに／又は他の血液関連の有害事象を引き起こすことはない。
【００２１】
当該技術分野において、用語「血液適合性」、「非血栓形成性(non-thrombogenic)」、「抗血栓形成性(anti-thrombogenic)」及び同類のものは、典型的には用語「抗血栓性(thromboresistant)」と同等であると理解され得る。
【００２２】
一実施態様において、固体物体は、医療器具である。固体物体が医療器具である場合、これは好適には抗血栓性医療器具である。従って一実施態様において、固体物体は、抗血栓性医療器具である。この特許出願の目的に関して、用語「医療器具」は、体内又は体外の器具を指すが、より一般には体内医療器具を指す。
【００２３】
体内医療器具は、典型的には治療効果を提供するために、解剖学的構造内で、例えば血管系又は他の体の管腔、空隙もしくは空洞内で使用される器具である。体内器具は、長期間又は一時的に使用されるものであってよい。長期間使用の器具は、例えばステント又はステント-グラフトなどの器具を送達するための即時の外科的手技後に、解剖学的構造中に、部分又は全体が、留置される。一時的又は短期間使用のための器具は、医療用バルーンなどの、治療領域に一過性に挿入されるもの(すなわち、挿入され、その後同じ外科的手技により取り除かれる)を含む。一実施態様において、固体物体は、体内医療器具である。
【００２４】
永久的又は一時的体内医療器具であることができる体内医療器具の例としては、二分岐型ステント、バルーン拡張型ステント、自己拡張型ステント、神経血管ステント及び分流型ステントを含むステント、二分岐型ステント-グラフトを含むステント-グラフト、血管グラフト及び二分岐型グラフトを含むグラフト、介入的診断用及び治療用シースなどの格納式シース、大型及び標準口径の血管内送達シース、止血管理を伴う又は伴わない及びステアリングを伴う又は伴わない動脈導入シース、マイクロイントロデューサーシース、透析アクセスシース、ガイドシース、並びに経皮的シースを含むシース、拡張器、血管閉鎖栓などの閉鎖栓、塞栓フィルター、塞栓除去術用装置、カテーテル、人工血管、血液留置モニタリング装置、人工心臓弁を含む弁、ペースメーカー電極、ガイドワイヤ、心臓用リード線(cardiac leads)、心肺バイパス回路、カニューレ、プラグ、薬物送達装置、バルーン、組織貼付装置、血液ポンプ、パッチ、長期注入ライン又は動脈ラインなどのライン、配置型ワイヤ(placement wires)、連続くも膜下注入のための装置、栄養チューブ、脳室胸膜シャント、脳室心房(VA)シャント、脳室腹腔(VP)シャント、心室心房シャント、門脈体循環シャント及び腹水シャントなどのCNSシャントが挙げられる。
【００２５】
カテーテルの例としては、マイクロカテーテル、中心静脈カテーテル、末梢静脈カテーテル、血液透析カテーテル、植込み可能な静脈カテーテルを含むコーティングされたカテーテルなどのカテーテル、トンネル型静脈カテーテル、心臓もしくは末梢静脈及び動脈の血管造影術、血管形成術、もしくは超音波手技に有用な冠血管カテーテル、分光能もしくは造影能を備えるカテーテル、肝動脈注入カテーテル、CVC(中心静脈カテーテル)、末梢静脈カテーテル、末梢挿管された中心静脈カテーテル(PICライン)、血流に乗る(flow directed)バルーン付き肺動脈カテーテル、完全非経口高栄養用カテーテル、慢性留置カテーテル(例えば、慢性留置消化管カテーテル及び慢性留置尿生殖器カテーテル)、腹膜透析カテーテル、CPBカテーテル(心肺バイパス)、導尿カテーテル及びマイクロカテーテル(例えば、頭蓋内適用のため)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
一実施態様において、固体物体は、ステント、ステント-グラフト、シース、拡張器、閉鎖栓、弁、塞栓フィルター、塞栓除去術用装置、カテーテル、人工血管、血液留置モニタリング装置、弁、ペースメーカー電極、ガイドワイヤ、心臓用リード線、心肺バイパス回路、カニューレ、プラグ、薬物送達装置、バルーン、組織貼付装置、血液ポンプ、パッチ、ライン、配置型ワイヤ、連続くも膜下注入のための装置、栄養チューブ及びシャントからなる群から選択される体内医療器具である。特定の実施態様において、固体物体は、ステント又はステント-グラフトである。
【００２７】
一実施態様において、該体内医療器具は、神経学的適用、末梢適用、心適用、整形外科適用、皮膚適用、又は婦人科適用において使用することができる。一実施態様において、該ステントは、心適用、末梢適用又は神経学的適用において使用することができる。一実施態様において、該ステント-グラフトは、心適用、末梢適用又は神経学的適用において使用することができる。一実施態様において、該シースは、頸動脈適用、腎臓適用、経橈骨適用、経中隔適用、小児科適用又は微小適用において使用することができる。
【００２８】
体外医療器具の例は、血液処置装置、及び輸血装置である。一実施態様において、該体内医療器具は、神経学適用、末梢適用、心適用、整形外科適用、皮膚適用、又は婦人科適用において使用することができる。一実施態様において、体外医療器具は、酸素供給器である。別の実施態様において、体外医療器具は、ウイルス、細菌、敗血症-起因性前炎症性サイトカイン及び毒素の除去が可能なフィルターである。
【００２９】
メンブレンは、例えば、血液透析メンブレンであることができる。
【００３０】
分析装置は、例えば、クロマトグラフィー又は免疫学的アッセイ、反応化学又は触媒などの、分析方法を実行するための、固体支持体であることができる。そのような器具の例は、スライド、ビーズ、ウェルプレート及びメンブレンを含む。
【００３１】
分離装置は、例えば、タンパク質精製、アフィニティクロマトグラフィー又はイオン交換などの分離方法を実行するための固体支持体であることができる。そのような器具の例は、フィルター及びカラムを含む。
【００３２】
この固体物体は、とりわけ、金属、合成もしくは天然の有機もしくは無機のポリマー、セラミック材料、タンパク質-ベースの材料、又は多糖-ベースの材料を含むか又はこれから形成されてよい。
【００３３】
好適な金属は、チタン、ステンレス鋼、高窒素ステンレス鋼、コバルト、クロム、ニッケル、タンタル、ニオブ、金、銀、ロジウム、亜鉛、白金、ルビジウム、銅及びマグネシウムなどの生体適合性金属、並びにそれらの組合せ(合金)を含むが、これらに限定されるものではない。好適な合金は、L-605、MP35N、Elgiloyなどのコバルト-クロム合金、ニッケル-チタン合金(Nitinolなど)を含むチタン合金、タンタル合金、ニオブ合金(例えば、Nb-1％Zr)、及び他のものがある。
【００３４】
一実施態様において、該生体適合性金属は、Nitinolなどのニッケル-チタン合金である。
【００３５】
合成又は天然の有機又は無機のポリマーとして、ポリオレフィン、ポリエステル(例えば、ポリエチレンテレフタレート及びポリブチレンテレフタレート)、ポリエステルエーテル、ポリエステルエラストマーコポリマー(例えば、商品名HYTREL.RTMでDuPont社(ウィルミントン、Del.)から入手可能なものなど)、フッ素-含有ポリマー、塩素-含有ポリマー(例えばポリ塩化ビニル(PVC))、ブロック共重合体エラストマー(例えば、スチレン末端ブロック、及びブタジエン、イソプレン、エチレン/ブチレン、エチレン/プロペンから形成された、中央ブロックを有するそれらのコポリマーなど)、ブロック共重合体(例えば、アクリロニトリル-スチレン及びアクリロニトリル-ブタジエン-スチレンブロック共重合体などのスチレン系ブロック共重合体、又はブロック共重合体が、ポリエステルもしくはポリアミドのハードセグメント及びポリエーテルのソフトセグメントで形成された、特定のブロック共重合体熱可塑性エラストマーであるブロック共重合体)、ポリウレタン、ポリアミド(例えば、ナイロン12、ナイロン11、ナイロン9、ナイロン6/9及びナイロン6/6)、ポリエーテルブロックアミド(例えばPEBAX(登録商標))、ポリエーテルエステルアミド、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリフェニレンスルフィド、ポリフェニレンオキシド、ポリエーテル、シリコーン、ポリカーボネート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ゴム、シリコーンゴム、ポリヒドロキシ酸、ポリアリルアミン、ポリアリルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ(メチル)メタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリ(酢酸ビニル)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリオキシメチレン、ポリカーボネート、フェノール系、アミノ-エポキシ樹脂、セルロース-ベースのプラスチック、及びゴム状プラスチック、生体吸収性(例えば、ポリ(D,L-ラクチド)及びポリグリコリド、及びそれらのコポリマー)、それらの誘導体及びそれらの混合物が挙げられる。これらの材料の組合せは、架橋を伴い及び伴わずに利用することができる。これらのクラスの一部は、熱硬化性ポリマーとして及び熱可塑性ポリマーとしての両方で利用することができる。本明細書において使用される用語「コポリマー」は、2種以上のモノマー、例えば2、3、4、5種など諸々から形成された任意のポリマーを指すように使用されるものである。
【００３６】
フッ素化ポリマー(フッ素-含有ポリマー)は、フルオロポリマー、例えば延伸ポリテトラフルオロエチレン(ePTFE)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)など、フッ素化エチレン-プロピレン(FEP)、ペルフルオロカーボンコポリマー(例えばテトラフルオロエチレンペルフルオロアルキルビニルエーテル(TFE/PAVE)コポリマー、及びテトラフルオロエチレン(TFE)とペルフルオロメチルビニルエーテル(PMVE)のコポリマーなど)、並びにポリマー鎖間の架橋を伴う又は伴わない、先に挙げたものの組合せを含む。
【００３７】
一実施態様において、この固体物体は、ポリエーテル-ブロック-アミド、例えばPEBAX(登録商標)を含む。別の実施態様において、この固体物体は、塩素-含有ポリマー(例えば、PVC)又はフッ素-含有ポリマー(例えば、ePTFE)を含む。
【００３８】
高分子基体は、任意に充填剤及び／又は着色剤と配合されてよい。従って、好適な基体は、着色高分子材料などの、着色材料を含む。
【００３９】
セラミック基体は、シリコーン酸化物、酸化アルミニウム、アルミナ、シリカ、ヒドロキシアパタイト、ガラス、酸化カルシウム、ポリシラノール、及び酸化リンを含んでよいが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
タンパク質-ベースの材料は、シルク及びウールを含む。多糖-ベースの材料は、アガロース及びアルギン酸塩を含む。
【００４１】
（抗凝固実体）
抗凝固実体は、凝固又は塞栓形成を防止又は軽減するために、哺乳動物の血液と相互作用することが可能な実体である。
【００４２】
抗凝固実体とは、ヘパリン部分、デルマタン硫酸部分、デルマタン二硫酸部分、ヒルジン、エプチフィバチド、チロフィバン、ウロキナーゼ、D-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、RGDペプチド-含有化合物、AZX100(HSP20を模倣する細胞ペプチド、Capstone Therapeutics社、米国)、血小板受容体アンタゴニスト、抗-トロンビン抗体、抗-血小板受容体抗体、アスピリン、プロスタグランジンインヒビター、血小板インヒビター(例えば、クロピドグレル、一酸化窒素(NO)、プロスタグランジン及びアブシキシマブ)、抗血小板ペプチド、クマジン(すなわち、4-ヒドロキシクマリンクラスのビタミンKアンタゴニスト、例えばワルファリン)、アルガトロバン、トロンボモジュリン、抗凝固タンパク質、抗凝固酵素(例えば、アピラーゼ)が挙げられる。一実施態様において、抗凝固実体は、ヘパリン部分、デルマタン硫酸部分及びデルマタン二硫酸部分からなる群から選択される。
【００４３】
一実施態様において、抗凝固実体は、グリコサミノグリカンである。一実施態様において、抗凝固実体は、トロンビンインヒビターである。
【００４４】
用語「ヘパリン部分」は、ヘパリン分子、ヘパリン分子のフラグメント、ヘパリン分子の誘導体又はヘパリン分子のアナログを指す。
【００４５】
一実施態様において、抗凝固実体は、ヘパリン部分である。好適には、ヘパリン部分は、完全長ヘパリン(未変性ヘパリン)、ヘパリンのアルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩(例えば、ヘパリンナトリウム(例えば、Hepsal又はPularin)、ヘパリンカリウム(例えば、Clarin)、ヘパリンリチウム、ヘパリンカルシウム(例えば、Calciparine)又はヘパリンマグネシウム(例えば、Cutheparine))、低分子量ヘパリン(例えば、アルデパリンナトリウム、チンザパリン又はダルテパリン)、ヘパラン硫酸、ヘパリノイド、ヘパリン-ベースの化合物、疎水性対イオンを有するヘパリン、第Xa因子のアンチトロンビン-媒介性阻害が可能な合成ヘパリン組成物(例えば、「フォンダパリヌクス」組成物(例えば、GlaxoSmithKline社からのArixtra))、並びに少なくともヘパリン由来の活性五糖配列を含む合成ヘパリン誘導体(例えば、Petitouらの文献、Biochimie, 85(1-2):83-9(2003)参照)からなる群から選択される。追加のヘパリン部分は、例えば、穏やかな亜硝酸分解(US4,613,665A、その全体は引用により本明細書中に組み込まれている)又は過ヨウ素酸酸化(US6,653,457B1、その全体は引用により本明細書中に組み込まれている)、並びにヘパリン部分の活性が保存される当該技術分野において公知の他の修飾反応などにより修飾されたヘパリンを含む。ヘパリン部分はまた、以下に説明するようなリンカー又はスペーサーに結合されたそのような部分も含む。一実施態様において、ヘパリン部分は、完全長ヘパリンである。
【００４６】
低分子量ヘパリンは、例えば、酸化的脱重合、酵素的分解又は脱アミノ切断により調製することができる。
【００４７】
一実施態様において、ヘパリン部分は、ヘパリンフラグメントである。ヘパリンフラグメントは、当該技術分野において公知の技術を使用し生成されてよい。好適には、これらのフラグメントは、未変性のヘパリンの分解(例えば、そのフラグメント化)を含む方法により生成される、未変性のヘパリンのフラグメントである。下記実施例2eに例示したように、ヘパリンフラグメントは、未変性のヘパリンの部分的亜硝酸切断、任意にそれに続くゲルクロマトグラフィーによる分画により生成されてよい。あるいは、ヘパリンフラグメントは、合成により生成されてよい。合成生成は、化学的酵素法及び／又は従来の有機化学法を含んでよい。
【００４８】
ヘパリンの抗凝固活性は、アンチトロンビン(AT)結合する五糖配列(「活性五糖配列」又は「活性配列」；図23参照)によって主に決まる。好適には、ヘパリンフラグメントは、活性五糖配列を含む。
【００４９】
ヘパリンフラグメントは、例えば、長さが5〜30個、例えば5〜20個、例えば5〜18個、例えば5〜17個、例えば5〜10個、例えば6〜10個の糖残基を有してよい。あるいは、ヘパリンフラグメントは、例えば、長さが6〜30個、例えば6〜20個、例えば6〜18個、例えば6〜17個の糖残基を有してよい。
【００５０】
US6,461,665B1(Scholander；引用により本明細書中に組み込まれている)は、固定前にヘパリン処理することによる、表面-固定されたヘパリンの抗-血栓形成活性の改善を開示している。この改善は、ヘパリンを、高温又は高pHで処理することによるか、又はヘパリンを、アミン、アルコール、チオールなどの求核触媒と、又は固定されたアミノ基、ヒドロキシル基もしくはチオール基と接触させることにより、達成される。
【００５１】
本抗凝固実体は、固体物体の表面へ共有結合により固定され、その結果実質的に固体物体から溶出又は滲出しない。以下に説明するように、本抗凝固実体は、様々な方法により、共有結合により固定されることができる。
【００５２】
本抗凝固実体は、陽イオン性ポリマーの最外層に共有結合される。
【００５３】
本抗凝固実体は、好適には、特に抗凝固実体がヘパリン部分である場合に、陽イオン性ポリマーに結合した末端部である。従って一実施態様において、本抗凝固実体は、末端部に結合した抗凝固部分である。特定の実施態様において、本抗凝固実体は、末端部に結合したヘパリン部分である。適用可能な場合、本抗凝固実体は、好ましくはその還元末端を介して連結される。従って一実施態様において、本抗凝固実体は、その還元末端を介して連結される。特定の実施態様において、本抗凝固実体は、その還元末端(時には還元末端のC1位置と称される)を介して連結された末端部に結合したヘパリン部分である。末端部に結合、特に還元性末端部に結合の利点は、抗凝固実体(例えばヘパリン部分)の別の部位への結合と比べ、例えば、アンチトロンビン相互作用部位などの増強された利用可能性のために、抗凝固実体(例えばヘパリン部分)の生物活性が、最大化されることである。
【００５４】
代表的末端部に結合する方法は、EP0086186B1(Larm；その全体は引用により本明細書中に組み込まれている)に説明されており、これはオリゴマー性又はポリマー性有機物質の、第一級アミノ基を含む異なる型の基体への共有結合の方法を開示している。ヘパリンであってよい結合される物質は、ジアゾ化による分解に供され、遊離末端アルデヒド基を有する物質断片を形成する。次にこの物質断片は、そのアルデヒド基により、基体のアミノ基と反応され、シッフ塩基を形成し、これは次に第二級アミンへ転換(還元を介して)される。ヘパリンの末端部に結合、特に還元性末端部に結合(先のEP0086186B1に記載)の利点は、ヘパリン部分の別の部位への結合と比べ、アンチトロンビン相互作用部位の増強された利用可能性のために、ヘパリン部分の生物活性が、最大化されることである。
【００５５】
本抗凝固実体は、リンカーを介して、陽イオン性ポリマーの最外層に共有結合されてよい。従って一実施態様において、本抗凝固実体は、リンカーを介して共有結合される。
【００５６】
一実施態様において、このリンカーは、第二級アミンを含む。ヘパリン部分のポリマーへの第二級アミンを介した共有結合の代表的手順は、EP0086186B1に説明されている。
【００５７】
一実施態様において、リンカーは、第二級アミドを含む。N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)又は1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド(EDC)が関与するアミド化反応を介した、ヘパリン部分のポリマーへの共有結合に関する代表的手順は、WO2012/123384A1(その全体は引用により本明細書中に組み込まれている)に記載されている。
【００５８】
一実施態様において、このリンカーは、1,2,3-トリアゾールを含む。1,2,3-トリアゾール連結を介した、ヘパリン部分のポリマーへの共有結合の代表的手順は、WO2010/029189A2(Carmeda社、その全体は引用により本明細書中に組み込まれている)に説明されている。この文書は、ポリイミンのアジド-又はアルキン-官能基化；アルキン-及びアジド-官能基化されたヘパリン(未変性及び亜硝酸分解されたヘパリンの両方)の調製；並びに、1,2,3-トリアゾールリンカーを介して、誘導体化されたヘパリンを、誘導体化されたポリマーへ、連結する反応を説明している。
【００５９】
一実施態様において、このリンカーは、チオエーテルを含む。チオエーテル連結を介したヘパリン部分のポリマーへの共有結合の代表的手順は、WO2011/110684A1(Carmeda社ら、その全体は引用により本明細書中に組み込まれている)に説明されている。
【００６０】
（陽イオン性ポリマー）
この陽イオン性ポリマーは、直鎖ポリマーであることができるが、より一般には高分岐ポリマーなどの、分岐鎖ポリマーである。一実施態様において、この陽イオン性ポリマーは、分岐した陽イオン性ポリマーである。この陽イオン性ポリマーは、任意に架橋される。一実施態様において、陽イオン性ポリマーは、第一級／第二級アミン基を含む。一実施態様において、陽イオン性ポリマーは、任意に架橋された、ポリアミンである。陽イオン性ポリマー(例えばポリアミン)は、好適には、分子量5kDa〜3,000kDa、例えば5kDa〜2,000kDa、5kDa〜1,500kDa、5kDa〜1,000kDa、5kDa〜800kDa、5kDa〜500kDa、5kDa〜300kDa又は5kDa〜200kDa又は800kDa〜3,000kDaなどを有する。陽イオン性ポリマー(例えばポリアミン)が架橋されている場合、クロトンアルデヒド及び／又はグルタルアルデヒドなどのアルデヒド架橋-リンカーを使用し、架橋されることが適している。一実施態様において、陽イオン性ポリマーは、ポリアルキレンイミン、例えばポリエチレンイミンである。
【００６１】
この陽イオン性ポリマーは、陽イオン性ポリマーの層及び陰イオン性ポリマーの層により、固体物体の表面を交互に処理することにより形成される、陽イオン性ポリマー及び陰イオン性ポリマーの層毎のコーティングの一部を形成する。この二重層は、陽イオン性ポリマー及び陰イオン性ポリマーの一つの層として、本明細書において定義される。層毎のコーティングにおいて、陽イオン性ポリマーは、典型的には、陰イオン性ポリマーの前に塗布され、すなわち固体物体の表面は、典型的には、最初に請求項1)の(工程i)の陽イオン性ポリマーの第一層により処理され、その時点で請求項1)の(工程ii)の陰イオン性ポリマーの第一層が塗布される。必要とされる二重層の数に応じて、請求項1)の(工程iii)の更なる陽イオン性ポリマー及び陰イオン性ポリマーの層が塗布されてよい。陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの最終(これは最初であってもよい)の二重層が完了した場合、その後請求項1)の(工程ivに対応)の陽イオン性ポリマーの層が塗布される。この陽イオン性ポリマーの層(すなわち最外層)は、次に、陽イオン性ポリマーの層に抗凝固実体を共有結合するために、抗凝固実体により処理される。従って陽イオン性ポリマーの外側コーティング層は、抗凝固実体を「含む」と称することができる。層毎のコーティングにおいて、最内層は、陽イオン性ポリマーの層であり、最外層は、それに抗凝固実体が共有結合されている陽イオン性ポリマーの外側コーティング層である(図1参照)。
【００６２】
一実施態様において、工程i)の陽イオン性ポリマーは、任意に架橋された、ポリアミンである。一実施態様において、工程iv)の陽イオン性ポリマーは、任意に架橋された、ポリアミンである。一実施態様において、工程i)の陽イオン性ポリマーは、工程iv)の陽イオン性ポリマーと同じである。
【００６３】
WO2012/123384A1(Gore Enterprise Holdings社ら、その全体は引用により本明細書中に組み込まれている)は、抗凝固実体、特にヘパリンを持つ(bear)複数の高分岐ポリマー分子を含むコーティングを備える器具を開示している。そのような高分岐ポリマー分子は、陽イオン性ポリマーの最外層において利用されてよく、すなわちそのような高分岐ポリマーは、工程iv)の陽イオン性ポリマーとして使用され、次に工程v)において抗凝固実体を持つよう修飾されてよい。
【００６４】
（陰イオン性ポリマー）
本発明に適している陰イオン性ポリマーは、-COOH、-SO3H及び-PO3H2からなる群からの脱プロトン化された官能基を運搬する。従って一実施態様において、陰イオン性ポリマーは、-CO2-、-SO3-、-PO3H-及び-PO32-から選択される基を含むポリマーである。好適には、陰イオン性ポリマーは、-SO3-基を含むポリマーである。より好適には、脱プロトン化された官能基は、-SO3-基からなる陰イオン性ポリマーにより運搬される。
【００６５】
この陰イオン性ポリマーは、陰イオン性グリコサミノグリカン又は多糖が適している。このポリマーの陰イオン性の特徴は、典型的にはポリマー鎖に沿ったカルボキシラート基又は硫酸基から誘導される。従って一実施態様において、陰イオン性ポリマーは、カルボキシラート基又は硫酸基を持つグリコサミノグリカン又は多糖、特にカルボキシラート基及び／又は硫酸基を持つグリコサミノグリカンである。この陰イオン性ポリマーは、分岐又は非分岐であってよい。一実施態様において、陰イオン性ポリマー及び抗凝固実体は、同じではない。
【００６６】
一実施態様において、陰イオン性ポリマーは、任意に架橋されている。
【００６７】
一実施態様において、陰イオン性ポリマーは、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸、ポリ(2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸)、ポリ(2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸-コ-アクリロニトリル)アクリロニトリル、ポリ(アクリル酸)、ポリアネトールスルホン酸、ポリ(4-スチレンスルホン酸ナトリウム)、ポリ(4-スチレンスルホン酸-コ-マレイン酸)、ポリ(硫酸ビニル)、ポリビニルスルホン酸及びそれらの塩からなる群から選択される。好適には、陰イオン性ポリマーは、デキストラン硫酸である。
【００６８】
デキストラン硫酸は、アンヒドログルコースの硫酸化ポリマーである。デキストラン硫酸の硫酸化の程度及び結果的な硫黄含量は、変動することができる。
【００６９】
一部の実施態様において、その硫黄含量は、10重量％〜25重量％であり、例えば硫黄含量は、15重量％〜20重量％である。
【００７０】
一実施態様において、陰イオン性ポリマーは、総分子量750kDa〜10,000kDa、例えば1,000kDa〜10,000kDaを有することにより特徴付けられる。一実施態様において、陰イオン性ポリマーは、総分子量650kDa〜1,000kDa、例えば750kDa〜1,000kDaを有することにより特徴付けられる。一実施態様において、陰イオン性ポリマーは、総分子量1,000kDa〜4,500kDa、例えば2,000kDa〜4,500kDaを有することにより特徴付けられる。一実施態様において、陰イオン性ポリマーは、総分子量4,500kDa〜7,000kDaを有することにより特徴付けられる。一実施態様において、陰イオン性ポリマーは、総分子量7,000kDa〜10,000kDaを有することにより特徴付けられる。好適には、陰イオン性ポリマーの総分子量は、評価方法Gに従い測定される。
【００７１】
一実施態様において、陰イオン性ポリマーは、＞4μeq/g〜7μeq/g、例えば＞5μeq/g〜7μeq/gの溶液電荷密度(solution charge density)を有することにより特徴付けられる。好適には、陰イオン性ポリマーの溶液電荷密度は、評価方法Hに従い測定される。
【００７２】
（陽イオン性及び陰イオン性ポリマーのコーティング二重層(複数可)）
本発明の方法は、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の形成に関与している。先に説明したように、二重層は、陽イオン性ポリマーと陰イオン性ポリマーの一つの層として、本明細書において定義される(図1参照)。
【００７３】
この層状コーティングは、1以上のコーティング二重層、例えば、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上又は10以上のコーティング二重層を含む。2以上のコーティング二重層が塗布される場合、工程i)及びii)が繰り返され、すなわち工程iii)は、任意ではない。本発明の方法の一実施態様において、工程iii)は、任意ではない。この実施態様において、工程iii)は、必要な数のコーティング二重層を達成するのに必要に応じて何回でも、例えば、1回、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回又は9回繰り返される。本発明の方法の一実施態様において、工程iii)での、工程i)及びii)は、1〜10回、例えば1、2、3、4、5又は6回繰り返される。
【００７４】
工程iii)が任意ではない場合(すなわち工程i)及びii)が1回以上繰り返される場合)、各反復の正確な作業条件は、同一である必要はない(例えば、工程ii)で陰イオン性ポリマーによる表面の処理に使用される塩型及び／又は濃度は、各反復において同一である必要はない)。ある実施態様においては、作業条件(例えば、工程ii)で陰イオン性ポリマーによる表面の処理に使用される塩型及び／又は濃度)は、各反復において同一である。
【００７５】
（方法の工程）
本発明は、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法を提供し、ここでこの外側コーティング層は、抗凝固実体を含み：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程；
iv)この表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；並びに
v)陽イオン性ポリマーの最外層を、抗凝固実体により処理し、これにより抗凝固実体を、陽イオン性ポリマーの最外層へ共有結合させる工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられ；並びに
ここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される。
【００７６】
工程i)-v)は、所定の順番で逐次実行されるということ、すなわち工程i)-iv)の各々は、「そして次に」を暗に受けることは注意しなければならない。これは、特定された工程i)-v)の各々の間に実行される1つ以上の追加工程を排除するものではない。従って一実施態様において、本発明の方法は、工程i)と工程ii)の間、工程ii)と工程iii)の間、工程iii)と工程iv)の間、又は工程iv)と工程v)の間に工程を追加的に含む。
【００７７】
例えば、洗浄工程が、特定された方法の工程の間に実行されてよいことは理解されるべきである。
【００７８】
本発明者らは、驚くべきことに、工程ii)の塩濃度(すなわち、陰イオン性ポリマーコーティング層(複数可)が塗布される場合に存在する塩濃度)は、固体物体のコーティングの生じる特徴、特に最終の固体物体の抗血栓特性に影響を及ぼすことを認めた。本発明者らは、工程ii)が0.25M〜5.0Mの塩濃度で実行される場合に、実施例2a及び3aに示されるように、固体物体のコーティングの生じる特徴、特に最終の固体物体の抗血栓特性が、改善され得ることを認めた。
【００７９】
一実施態様において、工程ii)は、0.25M〜4.0M、例えば0.25M〜3.0M、0.5M〜3.0M、1.0M〜3.0M、1.5M〜3.0M、0.25M〜1.5M、0.5M〜1.5M、0.75M〜1.5M又は1.0M〜2.0Mの塩濃度で、特に、1.0M〜3.0M、例えば1.0M〜2.0M又は0.75M〜1.5M又は1.5M〜3.0Mの塩濃度で実行される。
【００８０】
一実施態様において、この塩は、無機塩である。好適には、この塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、バリウム塩及びストロンチウム塩からなる群から選択される。
【００８１】
一実施態様において、この塩は、無機ナトリウム塩である。
【００８２】
一実施態様において、この塩は、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸ナトリウムからなる群から選択される。
【００８３】
一実施態様において、この塩は、塩化ナトリウムである。
【００８４】
一実施態様において、この塩は、塩化ナトリウムではない。
【００８５】
一実施態様において、この塩は、濃度0.25M〜3.0M、例えば0.5M〜3.0M、例えば1.0M〜3.0M、例えば1.5M〜3.0Mの塩化ナトリウムである。
【００８６】
一実施態様において、この塩は、濃度0.25M〜1.5M、例えば0.5M〜1.5M、例えば0.75M〜1.5Mの硫酸ナトリウムである。
【００８７】
一実施態様において、この塩は、濃度0.25M〜3.0M、例えば0.5M〜3.0M、例えば1.0M〜3.0M、例えば1.0M〜2.0Mのリン酸水素ナトリウムである。
【００８８】
一実施態様において、この塩は、濃度0.25M〜3.0M、例えば0.5M〜3.0M、例えば1.0M〜3.0M、例えば1.0M〜2.0Mのリン酸ナトリウムである。
【００８９】
工程i)(陽イオン性ポリマーによる固体物体の表面の処理)の前に、固体物体の表面は、任意に前処理工程に供することができる。
【００９０】
この前処理工程は、後続のコーティングの密着及び表面被覆を改善するための、クリーニング工程であってよい。好適なクリーニング剤は、アルコールなどの溶媒、アルコールと水酸化化合物(例えば水酸化ナトリウム)の水溶液の混合液を含む溶液、水酸化テトラメチルアンモニウム(TMAH)を含む溶液などの水酸化ナトリウム溶液のような高pH溶液、ピラニア(硫酸と過酸化水素の混合物)のような酸性溶液、塩基性ピラニア溶液、並びに硫酸と過マンガン酸カリウムの組合せ、又は様々な型のペルオキソ硫酸もしくはペルオキソ二硫酸溶液(同じくアンモニウム、ナトリウム、及びカリウム塩として)を含む他の酸化剤、或いは空気、アルゴンもしくは窒素大気又はそれらの組合せ中で、固体物体を、プラズマに供することを含む。
【００９１】
従って一実施態様において、本発明の方法は、工程i)の前に前処理工程を追加的に含む。好適には、この前処理工程は、クリーニング工程である。
【００９２】
あるいは、前処理工程は、工程i)-v)の適用前に、ポリマー又は下塗り剤(primer)コーティング層などの物質を、工程i)-v)に従いコーティングされるべき固体物体の表面に上覆いすることに関与し得る。この「予備的」コーティング層は、例えば、コーティングされるべき固体物体の表面を、後続の層状コーティング方法を最適化するために、所望の表面トポグラフィー又はテクスチャを作製するように、「彫刻する(sculpted)」又は修飾することができる。追加のコーティング層はまた、特に加工時にその結着性を維持することを補助し、後続の層状コーティングの密着を改善することもできる。固体物体上のそのような下塗りコーティング層の例は、化学蒸着(CVD)を使用し塗布されるコーティング層である。固体物体上のそのような下塗りコーティング層の別の例は、ポリドパミン又はそのアナログのコーティングである。
【００９３】
一実施態様において、この前処理工程は、固体物体の表面を、ポリオレフィン、ポリイソブチレン、エチレン-α-オレフィンコポリマー、アクリル系ポリマー、アクリル系コポリマー、ポリ塩化ビニル、ポリビニルメチルエーテル、ポリフッ化ビニリデン、ポリ塩化ビニリデン、フルオロポリマー(例えば、延伸ポリテトラフルオロエチレン(ePTFE)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、フッ化エチレン-プロピレン(FEP)、ペルフルオロカーボンコポリマー、例えば、テトラフルオロエチレンペルフルオロアルキルビニルエーテル(TFE/PAVE)コポリマー、テトラフルオロエチレン(TFE)とペルフルオロメチルビニルエーテル(PMVE)のコポリマー、米国特許第8,658,707号(W.L. Gore及び同僚、その全体、並びにそれらの組合せは引用により本明細書中に組み込まれている)に記載されたようなTFEの、アセテート、アルコール、アミン、アミド、スルホネート、官能基及び同類のものを含む機能性モノマーとのコポリマー、ポリアクリロニトリル、ポリビニルケトン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、エチレン-メタクリル酸メチルのコポリマー、アクリロニトリル-スチレンのコポリマー、ABS樹脂、ナイロン12、ナイロン12のブロック共重合体、ポリカプロラクトン、ポリオキシメチレン、ポリエーテル、エポキシ樹脂、ポリウレタン、レーヨン-トリアセテート、セルロース、酢酸セルロース、酪酸セルロース、セロファン、硝酸セルロース、プロピオン酸セルロース、セルロースエーテル、カルボキシメチルセルロース、キチン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-ポリエチレンオキシドのコポリマー、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、シリコーン(例えば、ポリシロキサン又は置換されたポリシロキサン)などの弾性ポリマー、ポリウレタン、熱可塑性エラストマー、エチレン酢酸ビニルコポリマー、ポリオレフィンエラストマー、EPDMゴム、並びにそれらの混合物からなる群から選択される、ポリマーにより処理することを含む。
【００９４】
一実施態様において、本明細書において定義された工程i)-v)からなる、すなわち、固体物体は工程i)-v)から生じるもののほかに追加のコーティング層を有さない、本明細書記載の固体物体の製造方法が、提供される。
【００９５】
本発明の方法に従いコーティングされた固体物体は、滅菌されてよい。好適な滅菌方法は、エチレンオキシド、蒸気過酸化水素、プラズマ相過酸化水素、乾熱、オートクレーブ蒸気滅菌、二酸化塩素滅菌、ガンマ線滅菌又は電子線滅菌を含むが、これらに限定されるものではない。
【００９６】
実施例7に示したように、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体は、上昇した温度及び湿度に供され、且つそれらの抗血栓特性を保持した。上昇した温度及び湿度の条件は、滅菌、特にエチレンオキシド滅菌の過酷な条件を模倣するように作用することができる。こうして、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体は、滅菌に対し安定していることが予想される。
【００９７】
（コーティング特性）
典型的には、このコーティング層は、平均の合計厚さ約10nm〜約1000nm、例えば約10nm〜約800nm、例えば約10mM〜約500nm、約10nm〜約400nm、約10nm〜約300nm、約10nm〜約200nm、又は約10nm〜約100nmを有するであろう。コーティング厚さは、好適なコーティング厚さ分析装置又はゲージを用いるか、深さプロファイリングを伴うX線光電子分光法を用いるか(評価方法J参照)、又は散逸型石英結晶微量天秤(評価方法O参照)を用いることにより、測定することができる。好適には、コーティング厚さは、評価方法Oを用い測定される。
【００９８】
一実施態様において、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体は、好適には評価方法Bに従い測定される、ATIIIの結合に関する抗凝固実体活性(特にヘパリン活性)の少なくとも1pmol/cm2表面、例えば少なくとも2pmol/cm2表面、少なくとも3pmol/cm2表面、少なくとも4pmol/cm2表面、又は少なくとも5pmol/cm2表面を有する。
【００９９】
一実施態様において、固体物体の抗血栓性表面は、好適には評価方法Bに従い測定される、ATIIIの結合に関する抗凝固実体活性(特にヘパリン活性)の少なくとも1pmol/cm2表面、例えば少なくとも2pmol/cm2表面、少なくとも3pmol/cm2表面、少なくとも4pmol/cm2表面、又は少なくとも5pmol/cm2表面を有する。
【０１００】
一実施態様において、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体は、好適には評価方法Mに従い測定される、HCIIの結合に関する抗凝固実体活性(特にヘパリン活性)の少なくとも5pmol/cm2表面、例えば少なくとも12pmol/cm2表面、少なくとも20pmol/cm2表面、少なくとも50pmol/cm2表面を有する。
【０１０１】
一実施態様において、固体物体の抗血栓性表面は、好適には評価方法Mに従い測定される、HCIIの結合に関する抗凝固実体活性(特にヘパリン活性)の少なくとも5pmol/cm2表面、例えば少なくとも12pmol/cm2表面、少なくとも20pmol/cm2表面、少なくとも50pmol/cm2表面を有する。
【０１０２】
一実施態様において、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体は、好適には評価方法Eに従い測定される、血液接触時の性能の少なくとも80％残存血小板、例えば少なくとも85％残存血小板、例えば少なくとも90％残存血小板を有する。
【０１０３】
一実施態様において、固体物体の抗血栓性表面は、好適には評価方法Eに従い測定される、血液接触時の性能の少なくとも80％残存血小板、例えば少なくとも85％残存血小板、例えば少なくとも90％残存血小板を有する。
【０１０４】
一実施態様において、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体は、好適には評価方法Fに従い測定される、F1+2値の＜10,000pmol/L、例えば7,500pmol/L未満、5,000pmol/L未満、又は4,000pmol/L未満を有する。
【０１０５】
一実施態様において、固体物体の抗血栓性表面は、好適には評価方法Fに従い測定される、F1+2値の＜10,000pmol/L、7,500pmol/L未満、5,000pmol/L未満、又は4,000pmol/L未満を有する。
【０１０６】
一実施態様において、抗凝固実体は、ヘパリン部分であり、ここで固体物体は、好適には評価方法Aに従い測定される、ヘパリン濃度の少なくとも1μg/cm2、例えば少なくとも2μg/cm2、少なくとも4μg/cm2、少なくとも5μg/cm2、又は少なくとも6μg/cm2を有する。
【０１０７】
本発明の方法に従いコーティングされた固体物体のゼータ電位プロファイルは、好適には評価方法Dを用いて測定されてよい。本発明の方法に従いコーティングされた固体物体の典型的ゼータ電位プロファイルは、図22に示しており、これは、使用することができる様々なパラメータは、ゼータ電位プロファイル、特にゼータ電位が0mVである特定のpH値に対応する等電点(IEP)(1A)；ゼータ電位(2B)が最小であるpHに対応する曲線の大域的最小点(2A)；並びに、大域的最小点でのゼータ電位(3A)と、pH9でのゼータ電位(3B)の間の差異に対応するデルタ値(Δ)を限定及び定義することを指摘している。
【０１０８】
同様のゼータ(ζ)電位プロファイルが、図7-13において認めることができるように、デキストラン硫酸4−7により、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体に関して得られる(実施例4a及び4b)。従ってゼータ電位プロファイルは、少なくともその好ましい態様において、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体の電位フィンガープリントとして見ることができる。この電位フィンガープリントに従い、好ましくはIEP(1A)は、pH3以下であり、曲線の大域的最小点(2A)は、pH5以下であり、デルタ値、すなわち大域的最小点のゼータ電位(3A)とpH9のゼータ電位(3B)の間の差異は、少なくとも20mVである。これらのパラメータは、好適には評価方法Dに従い測定される。
【０１０９】
本発明の方法に従いコーティングされた固体物体は、好適には、pH3以下の等電点(IEP)を伴うゼータ電位プロファイルを有し、その理由は、ヘパリンの酸性の性質がコーティングされた表面を支配しているからである。対照的に、不活性ポリマー物質は、およそpH4のIEPを有するであろう。酸性基を有する試料の膨潤(swelling)特性は、アルカリ領域に向かって認められる。この膨潤は、剪断面(shear plane)をバルク方向に向けさせ、且つより低い絶対ゼータ電位値(0mVに近い)が得られるはずである。ゼータ電位の高いデルタ値は、例えば評価方法B、M、E又はFに従い評価される場合、高い抗血栓特性に相関している。更に本発明の方法において使用されるより高い塩濃度は、試験した塩とは関わりないアルカリ領域において、より低い絶対ゼータ電位値をもたらし、更にまたアンチトロンビン結合値と相関する。理論により限定されるものではないが、これは、膨潤を受けることができるコーティングにおいて、アンチトロンビンのヘパリン分子へのアクセスの増大により、潜在的に説明することができる。
【０１１０】
（治療的方法）
先に説明したように、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体、特に医療器具は、医学的治療における用途がある。
【０１１１】
本発明の一態様において、ヒト又は動物の体内の組織の治療において使用するための、先に説明した本発明の方法に従いコーティングされた固体物体(特に医療器具)が提供される。治療される組織は、血管、尿道、腸管、鼻腔、神経鞘、椎間領域、骨小腔、食道、子宮内腔、膵管及び胆管、直腸などの、任意の体の窩洞、腔、もしくは中空器官通路(複数可)、並びに血管のグラフト、ステント、プロテーゼ、又は他の種類の医療用インプラントが植込まれたそれらの予め介入された体腔を含む。更に別の本発明の態様において、先に説明したような本発明の方法に従いコーティングされた固体物体(例えば医療器具)は、脳内の動脈瘤を治療するために留置されてよい。
【０１１２】
本明細書記載のコーティングされた固体物体(特に医療器具)は、血管からの塞栓及び血栓などの障害物の除去において、閉塞された身体通路への開存を回復するための拡張器具として、通路又は腔を塞ぐか又は充填するための手段を選択的に送達するための閉塞器具として、並びにカテーテル様の経管腔器具に関するセンタリング機構として、使用することができる。
【０１１３】
一実施態様において、人体の血管内の狭窄又は再狭窄の予防又は治療における使用のために、先に説明したように、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体(特にステント、グラフト又はステント-グラフトなどの医療器具)が、提供される。別の実施態様において、先に配置された溶出する構築物(eluting construct)が失敗した、人体の血管内の狭窄又は再狭窄の予防又は治療における使用のために、先に説明したように本発明の方法に従いコーティングされた固体物体(特にステント、グラフト又はステント-グラフトなどの医療器具)が、提供される。別の実施態様において、先に説明したように、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体(特にステント、グラフト又はステント-グラフトなどの医療器具)は、例えば腎臓透析時に使用されるものなど、動静脈アクセス部位を確立又は維持するために使用することができる。更なる実施態様において、先に説明したように、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体(特にステント、グラフト又はステント-グラフト、例えば血管グラフトなどの医療器具)は、閉塞又は血管狭窄の領域の周りの流れの方向を代えるために使用されてよい。別の実施態様において、先に説明したように、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体(特にステント、グラフト又はステント-グラフトなどの医療器具)は、罹患した血管の領域に開存を回復するため、又は動脈瘤を除外するために留置されてよい。更に別の実施態様において、先に説明したように、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体(特にステント、グラフト又はステント-グラフトなどの医療器具)は、血管形成術後に罹患された血管を強化するために留置されてよい。更に別の実施態様において、先に説明されたように、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体(特にステント、グラフト又はステント-グラフトなどの医療器具)は、バルーン補助式又はコイル補助式の手法を使用し、脳内に留置されてよい。
【０１１４】
一実施態様において、先に説明されたように、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体(特に医療器具)は、末梢動脈の閉塞性疾患の患者における経皮経管的血管形成術(PTA)のために使用され得る。
【０１１５】
本発明の別の態様において、本発明は、先に説明されたように、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体(特に医療器具)を、人体内の該血管へ植込むことを含む、狭窄又は再狭窄を予防又は治療する方法を提供する。
【０１１６】
（発明の更なる実施態様）
本発明の方法に関する先に説明した実施態様及び優先性(preferences)は、以下の実施態様に同等に適用する。
【０１１７】
一実施態様において、外側コーティング層が陽イオン性ポリマーを含む層である、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程；並びに
iv)この表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられ；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、方法が提供される。
【０１１８】
一実施態様において、外側コーティング層が陽イオン性ポリマーを含む層である、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体であって：
ここで、陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられる、固体物体が提供される。
【０１１９】
一実施態様において、外側コーティング層が陰イオン性ポリマーを含む層である、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられ；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、方法が提供される。
【０１２０】
一実施態様において、外側コーティング層が陰イオン性ポリマーを含む層である、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体であって：並びにここで、陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられる、固体物体が提供される。
【０１２１】
一実施態様において、外側コーティング層が抗凝固実体を含む、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程；
iv)この表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；並びに
v)陽イオン性ポリマーの最外層を、抗凝固実体により処理し、これにより抗凝固実体を、陽イオン性ポリマーの最外層へ共有結合させる工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられ；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、方法が提供される。
【０１２２】
一実施態様において、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体であって、ここで外側コーティング層が、それに抗凝固実体が共有結合された陽イオン性ポリマーを含む層であり；並びにここで陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられる、固体物体が提供される。好適には、陰イオン性ポリマーは、塩濃度0.25M〜5.0M、例えば0.25M〜4.0M又は0.25M〜3.0Mで、表面へ塗布される。
【０１２３】
一実施態様において、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体であって、ここで外側コーティング層が、それに抗凝固実体が共有結合された陽イオン性ポリマーを含む層であり；並びにここで陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜1,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられる、固体物体が提供される。好適には、陰イオン性ポリマーは、塩濃度0.25M〜5.0M、例えば0.25M〜4.0M又は0.25M〜3.0Mで、表面へ塗布される。
【０１２４】
一実施態様において、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体であって、ここで外側コーティング層が、それに抗凝固実体が共有結合された陽イオン性ポリマーを含む層であり；並びにここで陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量1,000kDa〜4,500kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられる、固体物体が提供される。好適には、陰イオン性ポリマーは、塩濃度0.25M〜5.0M、例えば0.25M〜4.0M又は0.25M〜3.0Mで、表面へ塗布される。
【０１２５】
一実施態様において、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体であって、ここで外側コーティング層が、それに抗凝固実体が共有結合された陽イオン性ポリマーを含む層であり；並びにここで陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量4,500kDa〜7,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられる、固体物体が提供される。好適には、陰イオン性ポリマーは、塩濃度0.25M〜5.0M、例えば0.25M〜4.0M又は0.25M〜3.0Mで、表面へ塗布される。
【０１２６】
一実施態様において、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体であって、ここで外側コーティング層が、それに抗凝固実体が共有結合された陽イオン性ポリマーを含む層であり；並びにここで陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量7,000kDa〜10,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられる、固体物体が提供される。好適には、陰イオン性ポリマーは、塩濃度0.25M〜5.0M、例えば0.25M〜4.0M又は0.25M〜3.0Mで、表面へ塗布される。
【０１２７】
一実施態様において、外側コーティング層が抗凝固実体を含む、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程；
iv)この表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；並びに
v)陽イオン性ポリマーの最外層を、抗凝固実体により処理し、これにより抗凝固実体を、陽イオン性ポリマーの最外層へ共有結合させる工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、-SO3-基を含むポリマーであり、
この陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)陰イオン性ポリマーの10重量％〜25重量％の硫黄含量を有することにより特徴付けられ；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、方法が提供される。
【０１２８】
一実施態様において、外側コーティング層が抗凝固実体を含む、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程；
iv)この表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；並びに
v)陽イオン性ポリマーの最外層を、抗凝固実体により処理し、これにより抗凝固実体を、陽イオン性ポリマーの最外層へ共有結合させる工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、総分子量650kDa〜10,000kDaを有することにより特徴付けられ；
この陰イオン性ポリマーは、デキストラン硫酸であり；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、方法が提供される。
【０１２９】
一実施態様において、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体であって、ここで外側コーティング層が、それに抗凝固実体が共有結合された陽イオン性ポリマーを含む層であり；陰イオン性ポリマーが、-SO3-基を含むポリマーであり、且つここで陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)陰イオン性ポリマーの10重量％〜25重量％の硫黄含量を有することにより特徴付けられる、固体物体が提供される。
【０１３０】
一実施態様において、外側コーティング層が陽イオン性ポリマーを含む層である、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程；並びに
iv)この表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、-SO3-基を含むポリマーであり、
この陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)陰イオン性ポリマーの10重量％〜25重量％の硫黄含量を有することにより特徴付けられ；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、方法が提供される。
【０１３１】
一実施態様において、外側コーティング層が陽イオン性ポリマーを含む層である、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程；並びに
iv)この表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、総分子量650kDa〜10,000kDaを有することにより特徴付けられ；
この陰イオン性ポリマーは、デキストラン硫酸であり；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、方法が提供される。
【０１３２】
一実施態様において、外側コーティング層が陽イオン性ポリマーを含む層である、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体であって；陰イオン性ポリマーは、-SO3-基を含むポリマーであり、且つここで陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)陰イオン性ポリマーの10重量％〜25重量％の硫黄含量を有することにより特徴付けられる、固体物体が提供される。
【０１３３】
一実施態様において、外側コーティング層が陰イオン性ポリマーを含む層である、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、-SO3-基を含むポリマーであり、
この陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)陰イオン性ポリマーの10重量％〜25重量％の硫黄含量を有することにより特徴付けられ、
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、方法が提供される。
【０１３４】
一実施態様において、外側コーティング層が陰イオン性ポリマーを含む層である、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、総分子量650kDa〜10,000kDaを有することにより特徴付けられ；
この陰イオン性ポリマーは、デキストラン硫酸であり；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、方法が提供される。
【０１３５】
一実施態様において、外側コーティング層が陰イオン性ポリマーを含む層である、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体であって；この陰イオン性ポリマーは、-SO3-基を含むポリマーであり、且つここで陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)陰イオン性ポリマーの10重量％〜25重量％の硫黄含量を有することにより特徴付けられる、固体物体が提供される。
【０１３６】
（発明の条項）
本発明の追加条項：
1.  外側コーティング層が抗凝固実体を含む、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程；
iv)この表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；並びに
v)陽イオン性ポリマーの最外層を、抗凝固実体により処理し、これにより抗凝固実体を、陽イオン性ポリマーの最外層へ共有結合させる工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられ；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、方法。
【０１３７】
2.  前記陰イオン性ポリマーが、デキストラン硫酸である、条項1記載の固体物体の製造方法。
【０１３８】
3.  前記陰イオン性ポリマーが、総分子量750kDa〜10,000kDa、例えば1,000kDa〜10,000kDaを有することにより特徴付けられる、条項1又は条項2記載の固体物体の製造方法。
【０１３９】
4.  前記陰イオン性ポリマーが、溶液電荷密度＞4μeq/g〜7μeq/g、例えば＞5μeq/g〜7μeq/gを有することにより特徴付けられる、条項1〜3のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【０１４０】
5.  前記工程ii)が、塩濃度0.25M〜4.0M、例えば0.25M〜3.0Mで実行される、条項1〜4のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【０１４１】
6.  前記塩が、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、及びリン酸ナトリウムからなる群から選択され、並びに特に塩化ナトリウムである、条項1〜5のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【０１４２】
7.  前記工程i)の陽イオン性ポリマーが、任意に架橋されている、ポリアミンであるか、
及び／又は、工程iv)の陽イオン性ポリマーが、任意に架橋されている、ポリアミンである、条項1〜6のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【０１４３】
8.  前記抗凝固実体が、ヘパリン部分、例えばその還元末端を介して連結されている、末端部に結合されたヘパリン部分である、条項1〜7のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【０１４４】
9.  前記固体物体が、抗血栓性医療器具である、条項1〜8のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【０１４５】
10.  陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体であって、ここで外側コーティング層が、それに抗凝固実体が共有結合された陽イオン性ポリマーを含む層であり；
並びにここで陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられる、固体物体。
【０１４６】
11.  前記陰イオン性ポリマーが、総分子量650kDa〜1,000kDa又は1,000kDa〜4,500kDa又は4,500kDa〜7,000kDa又は7,000kDa〜10,000kDaを有することにより特徴付けられる、条項10記載の固体物体。
【０１４７】
12.  前記陰イオン性ポリマーが、塩濃度0.25M〜5.0M、例えば0.25M〜4.0M又は0.25M〜3.0Mで、表面に塗布される、条項10又は11のいずれか一項記載の固体物体。
【０１４８】
13.  外側コーティング層が陽イオン性ポリマーを含む層である、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程；並びに
iv)この表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられ；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、方法。
【０１４９】
14.  外側コーティング層が陽イオン性ポリマーを含む層である、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体であって、
ここで、陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられる、固体物体。
【０１５０】
15.  外側コーティング層が陰イオン性ポリマーを含む層である、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)固体物体の表面を陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)この表面を陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程：を含み、
ここで、陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられ；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、方法。
【０１５１】
(利点)
少なくとも一部の実施態様において、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体は、以下の長所又は利点の一つ以上を有すると予想される：
・例えば、評価方法C(トルイジンブルー染色試験)又は評価方法I(SEM)を使用し決定されるような、均一な分布を有し、且つ比較的平滑である抗凝固実体のコーティングを、入手し得る：
・例えば、その製造の材料に関わりなく器具の抗血栓特性を改善するために、固体物体の固有の特性を遮蔽するであろう均一なコーティングを、得ることができる；
・例えば、評価方法B又はMを使用し決定されるような、ヘパリン活性などの良好な抗凝固実体活性を伴うコーティングを、入手し得る；
・その共有結合及びその結果としての長い寿命のために、抗凝固実体、例えばヘパリンを滲出しない抗血栓性コーティングを、得ることができる；
・その特性が滅菌(例えば、EOによる)時に保持されるコーティングを、入手し得る；
・層間のイオン性相互作用の可逆的形成の可能性のために、自己修復(self-healing)コーティングを、得ることができる；
・例えば評価方法Nを用いて決定されるような、良好な生体適合性を伴うコーティングを、入手し得る；
・例えば、評価方法E(血小板)及び／又は評価方法F(血液ループ)を用いて決定されるような、抗凝固薬、例えばヘパリンの全身投与の必要性を低下し、且つ抗凝固活性化の可能性を低下し得るコーティングを、得ることができる；
・特定の塗布、例えば心臓血管系塗布において有益であり得る、評価方法Nを用いることにより決定されるような抗炎症特性及び抗血栓性の組合せを有する固体物体を、入手し得る；
・生体分子への良好な結合能を伴う分析又は分離装置を、得ることができる；並びに
・長いヘパリン活性寿命を伴う分析又は分離装置を、得ることができる。
【０１５２】
本発明は、指定された基及び先に列挙された基の実施態様の全ての組合せを包含している。
【０１５３】
（略語）
Ac          アセチル
ABS         アクリロニトリルブタジエンスチレン
ATIII       アンチトロンビンIII
CNS         中枢神経系
CPB         心肺バイパス
CVC         中心静脈カテーテル
CVD         化学蒸着
Da          ダルトン
DI          脱イオン化
EDC         1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド
EO          エチレンオキシド
EPDM        エチレンプロピレンジエンモノマー(M-クラス)
ePTFE       延伸ポリテトラフルオロエチレン
FEP         フッ化エチレン-プロピレン
GPC         ゲル浸透クロマトグラフィー
HCII        ヘパリンコファクターII
HIT         ヘパリン起因性血小板減少症
IEP         等電点
M           モル濃度
MBTH        3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸塩
PAVE        ペルフルオロアルキルビニルエーテル
PES-Na      ポリエチレン硫酸ナトリウム
PTA         経皮経管的血管形成術
PIC         末梢静脈挿入式中心静脈カテーテル
PMVE        ペルフルオロメチルビニルエーテル
PTFE        ポリテトラフルオロエチレン
PUR         ポリウレタン
PVC         ポリ塩化ビニル
RGD         アルギニルグリシルアスパラギン酸
SEM         走査型電子顕微鏡法／電子顕微鏡
SPDP        3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-スクシンイミジル
TFE         テトラフルオロエチレン
TMAH        水酸化テトラメチルアンモニウム
TMB         3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン
VA          脳室心房
VP          脳室腹腔
XPS         X線光電子分光法
【実施例】
【０１５４】
（実施例）
（一般的手順）
(化学物質)
イソプロパノール、リン酸二水素ナトリウム二水和物、硫酸ナトリウム及び塩化ナトリウムは、Sigma Aldrich社及びVWR Chemicals社から入手し、そのまま使用することができる。薬局方品質のヘパリンは、基本的にEP0086186A1に記載されたように、亜硝酸で処理し、実施例において使用した。ポリアミンは、US9,101,696B2に記載されたように供給業者から入手する。デキストラン硫酸は、実施例1の表1に示したような様々な供給業者から購入した。脱イオン(DI)水を、下記実施例において使用した。
【０１５５】
（材料）
PVCチューブは、Flex Tubing Products社から購入した。PURチューブは、NewAge Industries社から購入した。ステンレス鋼クーポン(coupon)は、Helab Mekano AB社から購入した。
【０１５６】
（評価方法）
各方法で評価されるパラメータは、括弧内に記している。
（評価方法A：ヘパリン濃度試験(定量的ヘパリン付着)）
表面に固定されたヘパリンの定量は、ヘパリンの完全分解、それに続く溶液中に放出された反応生成物の比色測定により行うことができる。分解は、ヘパリン表面を、過剰な亜硝酸ナトリウムと、酸性条件下で反応させることにより、達成される。主に二糖である分解生成物は、基本的にSmith R.L.及びGilkerson Eの文献、Anal Biochem 98, 478-480(1979)(その全体は引用により本明細書中に組み込まれている)に記載されたように、MBTH(3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸塩)との反応において比色定量される。
【０１５７】
（評価方法B：ヘパリン活性試験(ATIIIを使用する定量的ヘパリン機能)）
ヘパリンコーティングを含む、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体に関して、器具のヘパリン活性は、Pascheらの文献「変動する流動条件下での固定されたヘパリンへのアンチトロンビンの結合(A binding of antithrombin to immobilized heparin under varying flow conditions)」(Artif. Organs, 15:281-491(1991)、その全体は引用により本明細書中に組み込まれている)及びLarsen M. Lらの文献「トロンビン及び発色性基質H-D-Phe-Pip-Arg-pNA(S-2238)を使用する血漿ヘパリンのアッセイ(Assay of plasma heparin using thrombin and the chromogenic substrate H-D-Phe-Pip-Arg-pNA(S-2238))」(Thromb. Res. 13:285-288(1978)、その全体は引用により本明細書中に組み込まれている)に説明されたように、アンチトロンビンIII(ATIII)に結合するヘパリンの能力(ability)、又は許容量(capacity)を測定することにより、測定することができ、且つ固体物体の抗血栓特性を評価するために使用することができる。ヘパリン表面の全ての利用可能なアンチトロンビン-結合部位を飽和するために、洗浄された試料を、溶液中で、過剰なアンチトロンビンと共にインキュベーションする。非-特異的に吸着されたアンチトロンビンを、塩溶液を用いてすすぐ。引き続き、表面結合したヘパリンに特異的に結合したアンチトロンビンは、高濃度のヘパリン溶液と共にインキュベーションすることにより、放出される。最後に、ヘパリン表面から放出されたアンチトロンビンを、発色性トロンビン基質を基にした、トロンビン阻害アッセイにおいて測定する。これらの結果を、器具の見かけの1平方センチメートル当たりに結合したアンチトロンビンIII(ATIII)のピコモル数として表す(pmol ATIII/cm2固体物体表面)。見かけの固体物体表面積は、複数の被覆された表面を考慮せず、多孔質物質で構成された固体物体の多孔性も考慮しない。固体物体の表面が多孔質である場合、表面積に対する多孔性の作用は、これらの計算に関して考慮されない。例えば、チューブ状グラフトの内側表面を含む、基体物質上に固定されたヘパリンを伴う、円筒形チューブのePTFE血管グラフト(これは多孔質物質で製造される)の見かけの表面積は、2πrL（式中、rは、グラフト内径であり；Lは、軸方向長さであり；及び、πは、円周率である）として、円筒幾何学に関するように計算される。この方法を使用し、ATIII結合活性を持つ任意の抗凝固実体の活性を測定することができる。
【０１５８】
（評価方法C：トルイジンブルー染色試験(ヘパリン分布)）
ヘパリン分布は、トルイジンブルー染色溶液を用いて、評価される。この溶液は、トルイジンブルー200mgを、水1L中に溶解することにより、調製される。試料を、この染色溶液に2分間供し、その後過剰な水ですすぐ。青色／紫色の染色は、負帯電したヘパリン分子が、外側コーティング層に均質に分布していることを指摘している。
【０１５９】
（評価方法D：ゼータ電位測定(表面電荷の指標)）
コーティングの表面電荷の指標としてのゼータ電位は、SurPASS計器上で決定される。この測定は、標準によりKCl又はNaClなどの単純な電解質の1mM溶液である電解質を、表面上を循環させることにより、実行される。発生する流動電位を、測定し、且つゼータ電位を決定するために使用する。コーティングのゼータ電位は、各々、溶液への酸又は塩基の添加により、pH範囲3〜9で決定される。ゼータ電位は、T. Luxbacherの文献「ZETAガイド、流動電位技術の原理(The ZETA guide, Principles of the streaming potential technique)」第1版、Anton Paar社から出版、ISBN 978-3-200-03553-9(その全体は引用により本明細書中に組み込まれている)に説明されたように、下記式1を用いて計算される：
【０１６０】
【数１】
2021514881.tif 000002
【０１６１】
dU/dP＝流動電位、対、差圧の傾き
ΚB＝電解質の伝導度
η＝電解質粘度
ε＝電解質の誘電係数
ε0＝真空誘電率。
【０１６２】
（評価方法E：血液ループ評価試験(血小板喪失の測定)）
血液接触評価は、コーティングされた物体上で行い、その抗血栓特性を評価することができる。固体物体がPVCチューブの小片などのチューブ状の器具である場合に使用され得る手順は、以下である。最初に、コーティングされたチューブの管腔側を、0.15M塩水の1mL/分の流れで15時間洗浄し、完全な湿潤及び何らかの緩く結合した抗凝固実体の除去を確実にし、その結果安定した表面が残る。次に洗浄したチューブを、基本的にAnderssonらの文献(Andersson, J.；Sanchez, J.；Ekdahl, K. N.；Elgue, G.；Nilsson, B.；Larsson, R.、J Biomed Mater Res A, 67(2), 458-466(2003)、その全体は引用により本明細書中に組み込まれている)に従い20rpmで実行される、Chandlerループモデル内でインキュベーションする。新鮮な血液由来の血小板及びループから収集した血液由来の血小板を、細胞計数器においてカウントし、血小板の喪失を測定する。血小板の大きい喪失は、表面の抗血栓性能の悪さを指摘している。反対に、血小板の最少の喪失は、抗血栓性表面を指摘している。
【０１６３】
（評価方法F：血液ループ評価試験(F1+2の測定に関して)）
F1+2(プロトロンビンフラグメント)の決定を、凝固の活性化マーカーとして使用する(すなわち、トロンビンの間接的測定)。F1+2は、トロンビンの形成に正比例し、トロンビン生成の間接測定値として解釈され、且つ固体物体の抗血栓特性の評価に使用することができる。血漿中のF1+2の定量的決定は、標準ELISAキット(酵素結合免疫吸着アッセイ)(Enzygnost F1+2 ELISA、OPBDG03、Siemens社)を使用する、酵素的免疫分析により実行される。試料中のF1+2抗原を、96-ウェルマイクロタイタープレートのコーティングされた表面上に捕獲された抗体に結合させ、その後ペルオキシダーゼをコンジュゲートされた抗-F1+2抗体により検出する。結合されたペルオキシダーゼの量は、特異的基質3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(TMB)の添加により、測定する。この基質の色素原への酵素による転換は、希硫酸の添加により停止する。ウェル中の450nmでの吸光度は、試料中のF1+2の濃度に比例する。試料の濃度は、既知の濃度のF1+2による標準曲線と比較することにより決定する。
【０１６４】
（評価方法G：溶液中のデキストラン硫酸などの陰イオン性ポリマーの分子量）
デキストラン硫酸試料の分子量の決定は、ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)計器上で実行される。デキストラン硫酸試料を、水-ベースの溶離媒体に溶解し、分子量範囲1,000Da〜100,000Da(スーパーロースカラム)又は100,000Da〜2,000,000Da(セファクリルカラム)に適したGPC計器上で分析する。適切な分子量のデキストラン硫酸標準を使用し、検量線の精度を検証する。デキストラン硫酸などのポリマーは、分散系分子であり、すなわち分子量の分布を有し、これは異なる分子量平均により説明することができる。通常報告される値は、重量平均分子量(Mw)である。Odian G.の文献、「重合の原理(Principles of Polymerization)」、第3版、1.4章「分子量」、24頁(これはその全体が引用により本明細書中に組み込まれている)を参照し、これはGPC技術を用いポリマーの分子量を決定する理論を説明している。デキストラン硫酸以外の陰イオン性ポリマーの分子量も、この方法で決定することができる。
【０１６５】
（評価方法H：溶液中のデキストラン硫酸などの陰イオン性ポリマーの溶液電荷密度）
電荷密度の定量的決定は、高分子電解質溶液(0.001M)(ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド(Poly-Dadmac)及びポリエチレン硫酸ナトリウム(PES-Na))の滴定により、Mutek流動電流検出器(Particle Charge Detector)上で行う。試料を、濃度0.06g/Lとなるよう、水中に溶解する(最大粘度は6000mPasが可能である)。全ての試料溶液に関して、pHを3に調節する。1試料溶液につき10mLを、各測定に添加し、引き続き適切な高分子電解質溶液で、1ユニット／3秒の間隔で、滴定する。S. Farrisらの文献、「電導度滴定による高分子電解質多糖の電荷密度の定量：分析化学実験(Charge Density Quantification of Polyelectrolyte Polysaccharides by Conductometric Titration: An Analytical Chemistry Experiment)」、J. Chem. Educ., 89(1)121-124(2012)(その全体は引用により本明細書中に組み込まれている)を参照されたい。デキストラン硫酸以外の陰イオン性ポリマーの溶液電荷密度は、この方法を用いて決定することができる。
【０１６６】
（評価方法I：エネルギー分散型X線分光法を備えた走査型電子顕微鏡(コーティング被覆及び均一性)）
TM3000は、例えば、試料の厚さ、トポグラフィー(表面構造)及び表面被覆に関する情報を得るために使用される、Hitachi社により製造された、卓上走査型電子顕微鏡(SEM)である。卓上SEMは、画像を作製するために電子を使用するので、これにより、従来の光学顕微鏡に比べ、より高い倍率を達成することができる。TM3000はまた、Quantax70も装備している。これは、試料の化学組成を決定するために使用される、エネルギー分散型X線分光計(EDS)である。加えてこれは、試料の異なる一部分の分析を促進するためのアクセサリーとして回転台／傾斜台を備えている。試料は、カーボンテープ(接地としても作用)により、ホルダー上に搭載され、次に試験チャンバー内に配置される。チャンバーを、低圧まで排気し、その後試料の評価を開始することができる。SEM技術は、試料を横切る電子線の走査を基にし、その電子の一部は、反射された後方散乱電子である一方で、その他は二次電子を観察する(execute)。検出器を使用し、反射される後方散乱電子により発生した電流を測定する。この電流を、各ピクセルが試料の位置に対応しているディスプレイ上に造影する。明ピクセルは、多くの電子(高電子密度)が反射された場合に得られ、より暗いピクセルは、少ない電子(低電子密度)が反射された場合に得られる。
【０１６７】
（評価方法J：深さプロファイリングを伴うX線光電子分光法(XPS)(コーティング厚さ)）
X線光電子分光法(XPS又はESCA)は、固体物質の非破壊化学分析を提供する、最も広範に使用される表面特徴決定技術である。試料に、単一エネルギーX線を照射し、試料表面の上端1nm〜10nmから放出される光電子を生じる。電子エネルギー分析装置は、光電子の結合エネルギーを決定する。水素及びヘリウム以外の全ての元素の定性的及び定量的分析は、検出限界〜0.1−0.2原子百分率で、可能である。分析スポットサイズは、10μm〜1.4mmの範囲である。元素及び化学状態のマッピングを使用し、外観(feature)の表面像を作製することも可能である。深さプロファイリングは、表面の上端10nm以内の非破壊分析を得るために角度依存測定を使用するか、又はコーティング深さを通じて、イオンエッチングなどの破壊分析を使用し、可能である。
【０１６８】
（評価方法K：上昇した温度及び湿度試験(滅菌安定性に関する一般モデル)）
本発明の方法に従いコーティングされた固体物体を、通気性のあるポリエチレンパウチ(例えばTyvekパウチ)内に配置する。このパウチを、人工気候室(例えばClimacell)中に、40℃及び相対湿度50％で、1週間配置し、その後真空チャンバー内で2時間乾燥させる。滅菌安定性に関するこの一般モデルを実行した後、コーティングされた物体の抗血栓特性/活性化を、例えば、評価方法E又はFを用いて評価する。
【０１６９】
（評価方法L：エチレンオキシドに対する安定性）
本発明の方法に従いコーティングされた固体物体を、通気性のあるポリエチレンパウチ(例えばTyvekパウチ)内に配置し、且つ50℃及び相対湿度60％での前処理に少なくとも12時間供し、その後圧力366mBar及び50℃でエチレンオキシドに2時間曝露する。次にこのチャンバーを、50℃で少なくとも10時間脱気する。エチレンオキシドによる滅菌は、Synergy Health Ireland社において行うことができる。滅菌後、コーティングされた物体の抗血栓特性/活性化を、例えば、評価方法E又はFを用いて評価する。
【０１７０】
（評価方法M：ヘパリン活性試験(HCIIを使用する定量的ヘパリン機能)）
ヘパリンコーティングを含む本発明の方法に従いコーティングされた固体物体に関して、この器具のヘパリン活性は、Larsen M. Lらの文献「トロンビン及び発色性基質H-D-Phe-Pip-Arg-pNA(S-2238)を使用する血漿ヘパリンアッセイ」(Thromb. Res. 13:285-288(1978)、及びPascheらの文献「変動する流動条件下での固定されたヘパリンへのアンチトロンビンの結合」(Artif. Organs, 15:281-491(1991))に説明されたアッセイを使用し、既知量のヘパリンコファクターII(HCII)に結合するヘパリンの能力又は許容量を測定することにより、WO2009/064372A2(Gore Enterprise Holdings社；その全体は引用により本明細書中に組み込まれている)に記載されているように、ヘパリンコファクターII(HCII)に結合するヘパリンの能力又は許容量を測定することにより、測定することができ、且つ固体物体の抗血栓特性の評価に使用することができる。これらの結果は、固体物体表面の見かけの1平方センチメートル当たりに結合したヘパリンコファクターII(HCII)のピコモル数として表す(pmol HCII/cm2 固体物体表面)。見かけの固体物体表面積は、複数の被覆された表面を考慮せず、多孔質物質で構成された器具の多孔性も考慮しない。器具の表面が多孔質である場合、表面積に対する多孔性の作用は、これらの計算に関して考慮されない。例えば、チューブ状グラフトの内側表面を含む、基体物質上に固定されたヘパリンを伴う、円筒形チューブのePTFE血管グラフト(これは多孔質物質で製造される)の見かけの表面積は、2πrL（式中、rは、グラフト内径であり；Lは、軸方向長さであり；及び、πは、円周率である）として、任意の円筒幾何学に関するように計算される。この方法を使用し、HCII結合活性を持つ任意の抗凝固実体の活性を測定することができる。
【０１７１】
（評価方法N−表面生体適合性）
本発明の方法に従いコーティングされた固体物体の表面の生体適合性は、Lappegard, K. Tの文献、J. Biomed. Mater. Res. Vol. 87, 129-135(2008)(その全体は引用により本明細書中に組み込まれている)に説明されたように評価することができる。炎症反応を評価するために使用することができる手順は、以下のようである。最初に、コーティングされた固体物体を、0.15M塩水溶液で15分間洗浄する。湿ったコーティングされた固体物体を、全血を含むヘパリン処置したPVCチューブ内に配置し、循環ループ中、20rpmで回転させる(代表的手順については、Ekdahl K. N.の文献、Advances in Experimental Medicine and Biology, 735, 257-270(2013)(その全体は引用により本明細書中に組み込まれている)を参照されたい)。インキュベーション後、血液を、3220g、4℃で15分間遠心分離する。その後のサイトカイン分析のために、血漿のアリコートを-70℃で凍結する。血漿試料を、Lappegardらの文献(前記)に説明された方法に従い、マルチプレックスサイトカインアッセイ(Bio-Plex Human Cytokine 27-Plex Panel、Bio-Rad Laboratories社、ハーキュリーズ、CA)を用いて、分析する。
【０１７２】
陰性対照は、いずれの器具も伴わない、ヘパリン処置PVCの空のループである。これは、インキュベーションされた血液が、炎症マーカーを示さないか又は最小量示すことが明らかにされた非-炎症対照を表している。陽性対照は、いずれの器具も伴わない、非-ヘパリン処置PVCの空のループである。これは、かなりの量の炎症マーカーが認められる炎症対照を表している。これらの対照は、実験及び血液の質を確証するために含む。
【０１７３】
（評価方法O−散逸型石英結晶微量天秤(コーティング厚さ)）
Q-センスE4は、散逸型結晶微量天秤(QCM-D)モニタリング計器である。QCM-Dは、分子層の質量及び構造特性の両方に関する測定技術であり、且つ超高感度秤量装置として認められる。
【０１７４】
QCMセンサーは、AT-カット結晶が最も一般的に使用される薄い石英ディスクからなる。石英ディスクは、2本の電極間に配置され、且つ石英結晶に電圧を印加することにより、これはその共鳴周波数で振動させることができる。石英表面の質量の変化は、Sauerbreyの式により関連づけられた振動する結晶の周波数の変化を誘導する(Rodahl, M.らの文献、「気体及び液体環境における周波数及びQ因子測定のための石英結晶微量天秤の設定(Quartz crystal microbalance setup for frequency and Q factor measurements in gaseous and liquid environments)」、Review of scientific environments, 66(7):3924-3930(1995)(その全体は引用により本明細書中に組み込まれている)を参照されたい)。本発明の方法に従いコーティングされた固体物体のコーティング厚さは、乾燥コーティング厚として報告される。
【０１７５】
（評価方法P−ヘパリンフラグメント画分の分子量決定）
ヘパリンフラグメント画分の分子量は、基本的にUSP<209>「低分子量ヘパリンの分子量決定」に従う、連続する2本のSuperdexカラム(S-75及びS-200)からなるシステム上での、分析的ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)により決定される。ピーク位置は、分子量キャリブレーションのための低分子量ヘパリン用第2内部標準(英国立生物学的製剤研究所(NIBSC)、UK)の溶離プロファイルを基に同定され、ここでこの標準の一番小さい遅れたピークは、二糖である。
【０１７６】
（評価方法Q−ヘパリンフラグメント濃度決定）
溶液中の単離されたヘパリンフラグメントの濃度は、ヘパリン標準曲線に関連した、カルバゾールアッセイ(Bitter, T.；Muir, H.M.の文献、Anal.Biochem., (4) 330-334(1962))により、ウロン酸含量を分析することにより、推定される。
【０１７７】
（実施例1：固体物体のコーティング方法(抗凝固実体の外側コーティング層を伴う、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティング)）
（一般的コーティング方法−チューブ）
チューブ(例えば、PVC又はPURチューブ)の断片(section)の管腔表面は、基本的にEP0086186A1、EP0495820B1及びEP0086187A1(それらの全体は引用により本明細書中に組み込まれている)においてLarmらにより説明された方法を用い、陽イオン性ポリマー及び陰イオン性ポリマーの層毎のコーティングによりコーティングされる。
【０１７８】
具体的には、チューブの管腔表面は、最初にイソプロパノール及び酸化剤により清浄にする。コーティング二重層を、陽イオン性ポリマー(ポリアミン、水中0.05g/L)と陰イオン性ポリマー(デキストラン硫酸、水中0.1g/L)を交互に吸着することにより構築する。ポリアミンを、二官能性アルデヒド(クロトンアルデヒド)により架橋する。デキストラン硫酸生材料は、下記実施例の各々において特定されたように変動され、再度下記実施例の各々において特定されたように、様々なナトリウム塩の存在下で変動する濃度で塗布される。このポリアミンと硫酸化された多糖の対毎に、1つの二重層に分類され(called)、すなわち二重層は、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの1つの層として規定され、且つ同じ条件が、各二重層の構築に使用される。チューブの管腔表面は、3つの二重層によりコーティングされる(1つの二重層によりコーティングされた固体物体について図1参照)。最後のポリアミンの最外層を、次に吸着させる。
【０１７９】
その後ヘパリンを、基本的にEP0086186A1及びEP0495820B1(両方の全体は引用により本明細書中に組み込まれている)においてLarmらにより説明されたように、還元的アミノ化により、ポリアミンの最外層に固定される。
【０１８０】
（一般的コーティング方法−スチールクーポン）
任意の固体物体を、チューブに関して先に説明した全般的コーティング方法を用いてコーティングすることができる。スチールクーポンが利用された下記実施例において、クーポンの全表面が、コーティングされた。
【０１８１】
（実施例1.1−1.56において使用したデキストラン硫酸）
評価したデキストラン硫酸は、表1に表示したように、様々な供給業者から購入した。
【０１８２】
表1−実施例において評価したデキストラン硫酸
【表１】
2021514881.tif 000003
*  評価方法Gに従い決定した重量平均分子量(Mw)
**  評価方法Hに従い決定した溶液電荷密度
【０１８３】
（実施例1.1：デキストラン硫酸1及びNaCl濃度0.25Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸1(表1参照)を、NaCl濃度0.25Mで塗布した。
【０１８４】
（実施例1.2：デキストラン硫酸1及びNaCl濃度1.7Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸1(表1参照)を、NaCl濃度1.7Mで塗布した。
【０１８５】
（実施例1.3：デキストラン硫酸2及びNaCl濃度0.25Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸2(表1参照)を、NaCl濃度0.25Mで塗布した。
【０１８６】
（実施例1.4：デキストラン硫酸3及びNaCl濃度0.05Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸3(表1参照)を、NaCl濃度0.05Mで塗布した。
【０１８７】
（実施例1.5：デキストラン硫酸3及びNaCl濃度0.1Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸3(表1参照)を、NaCl濃度0.1Mで塗布した。
【０１８８】
（実施例1.6：デキストラン硫酸3及びNaCl濃度0.25Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸3(表1参照)を、NaCl濃度0.25Mで塗布した。
【０１８９】
（実施例1.7：デキストラン硫酸3及びNaCl濃度1.0Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸3(表1参照)を、NaCl濃度1.0Mで塗布した。
【０１９０】
（実施例1.8：デキストラン硫酸3及びNaCl濃度1.7Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸3(表1参照)を、NaCl濃度1.7Mで塗布した。
【０１９１】
（実施例1.9：デキストラン硫酸3及びNaCl濃度2.6Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸3(表1参照)を、NaCl濃度2.6Mで塗布した。
【０１９２】
（実施例1.10：デキストラン硫酸3及びNaCl濃度3.0Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸3(表1参照)を、NaCl濃度3.0Mで塗布した。
【０１９３】
（実施例1.11：デキストラン硫酸4及びNaCl濃度0.05Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸4(表1参照)を、NaCl濃度0.05Mで塗布した。
【０１９４】
（実施例1.12：デキストラン硫酸4及びNaCl濃度0.1Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸4(表1参照)を、NaCl濃度0.1Mで塗布した。
【０１９５】
（実施例1.13：デキストラン硫酸4及びNaCl濃度0.25Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸4(表1参照)を、NaCl濃度0.25Mで塗布した。
【０１９６】
（実施例1.14：デキストラン硫酸4及びNaCl濃度1.0Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸4(表1参照)を、NaCl濃度1.0Mで塗布した。
【０１９７】
（実施例1.15：デキストラン硫酸4及びNaCl濃度1.7Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸4(表1参照)を、NaCl濃度1.7Mで塗布した。
【０１９８】
（実施例1.16：デキストラン硫酸4及びNaCl濃度3.0Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸4(表1参照)を、NaCl濃度3.0Mで塗布した。
【０１９９】
（実施例1.17：デキストラン硫酸5及びNaCl濃度0.05Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブを、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸5(表1参照)を、NaCl濃度0.05Mで塗布した。
【０２００】
（実施例1.18：デキストラン硫酸5及びNaCl濃度0.25Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸5(表1参照)を、NaCl濃度0.25Mで塗布した。
【０２０１】
（実施例1.19：デキストラン硫酸5及びNaCl濃度0.5Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸5(表1参照)を、NaCl濃度0.5Mで塗布した。
【０２０２】
（実施例1.20：デキストラン硫酸5及びNaCl濃度0.85Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸5(表1参照)を、NaCl濃度0.85Mで塗布した。
【０２０３】
（実施例1.21：デキストラン硫酸5及びNaCl濃度1.0Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸5(表1参照)を、NaCl濃度1.0Mで塗布した。
【０２０４】
（実施例1.22：デキストラン硫酸5及びNaCl濃度1.7Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸5(表1参照)を、NaCl濃度1.7Mで塗布した。
【０２０５】
（実施例1.23：デキストラン硫酸5及びNaCl濃度3.0Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸5(表1参照)を、NaCl濃度3.0Mで塗布した。
【０２０６】
（実施例1.24：デキストラン硫酸6及びNaCl濃度0.05Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸6(表1参照)を、NaCl濃度0.05Mで塗布した。
【０２０７】
(実施例1.25：デキストラン硫酸6及びNaCl濃度0.25Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸6(表1参照)を、NaCl濃度0.25Mで塗布した。
【０２０８】
（実施例1.26：デキストラン硫酸6及びNaCl濃度0.5Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸6(表1参照)を、NaCl濃度0.5Mで塗布した。
【０２０９】
（実施例1.27：デキストラン硫酸6及びNaCl濃度1.7Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸6(表1参照)を、NaCl濃度1.7Mで塗布した。
【０２１０】
（実施例1.28：デキストラン硫酸6及びNaCl濃度3.0Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸6(表1参照)を、NaCl濃度3.0Mで塗布した。
【０２１１】
（実施例1.29：デキストラン硫酸7及びNaCl濃度0.05Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸7(表1参照)を、NaCl濃度0.05Mで塗布した。
【０２１２】
（実施例1.30：デキストラン硫酸7及びNaCl濃度0.1Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸7(表1参照)を、NaCl濃度0.1Mで塗布した。
【０２１３】
（実施例1.31：デキストラン硫酸7及びNaCl濃度0.25Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸7(表1参照)を、NaCl濃度0.25Mで塗布した。
【０２１４】
（実施例1.32：デキストラン硫酸7及びNaCl濃度0.5Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸7(表1参照)を、NaCl濃度0.5Mで塗布した。
【０２１５】
（実施例1.33：デキストラン硫酸7及びNaCl濃度0.85Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸7(表1参照)を、NaCl濃度0.85Mで塗布した。
【０２１６】
（実施例1.34：デキストラン硫酸7及びNaCl濃度1.0Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸7(表1参照)を、NaCl濃度1.0Mで塗布した。
【０２１７】
（実施例1.35：デキストラン硫酸7及びNaCl濃度1.7Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸7(表1参照)を、NaCl濃度1.7Mで塗布した。
【０２１８】
（実施例1.36：デキストラン硫酸7及びNaCl濃度2.6Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸7(表1参照)を、NaCl濃度2.6Mで塗布した。
【０２１９】
（実施例1.37：デキストラン硫酸7及びNaCl濃度3.0Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸7(表1参照)を、NaCl濃度3.0Mで塗布した。
【０２２０】
（実施例1.38：デキストラン硫酸7及びNaCl濃度3.4Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸7(表1参照)を、NaCl濃度3.4Mで塗布した。
【０２２１】
（実施例1.39：デキストラン硫酸5及びNa2HPO4濃度0.05Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸5(表1参照)を、Na2HPO4濃度0.05Mで塗布した。
【０２２２】
（実施例1.40：デキストラン硫酸5及びNa2HPO4濃度0.25Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸5(表1参照)を、Na2HPO4濃度0.25Mで塗布した。
【０２２３】
（実施例1.41：デキストラン硫酸5及びNa2HPO4濃度0.85Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸5(表1参照)を、Na2HPO4濃度0.85Mで塗布した。
【０２２４】
（実施例1.42：デキストラン硫酸5及びNa2HPO4濃度1.7Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸5(表1参照)を、Na2HPO4濃度1.7Mで塗布した。
【０２２５】
（実施例1.43：デキストラン硫酸5及びNa2SO4濃度0.05Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸5(表1参照)を、Na2SO4濃度0.05Mで塗布した。
【０２２６】
（実施例1.44：デキストラン硫酸5及びNa2SO4濃度0.25Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸5(表1参照)を、Na2SO4濃度0.25Mで塗布した。
【０２２７】
（実施例1.45：デキストラン硫酸5及びNa2SO4濃度0.85Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸5(表1参照)を、Na2SO4濃度0.85Mで塗布した。
【０２２８】
(実施例1.46：デキストラン硫酸7及びNa2HPO4濃度0.85Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸7(表1参照)を、Na2HPO4濃度0.85Mで塗布した。
【０２２９】
（実施例1.47：デキストラン硫酸7及びNa2SO4濃度0.85Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸7(表1参照)を、Na2SO4濃度0.85Mで塗布した。
【０２３０】
（実施例1.48：デキストラン硫酸7及びNaCl濃度0.05Mを使用するPURチューブ上のコーティングの調製）
PURチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸7(表1参照)を、NaCl濃度0.05Mで塗布した。
【０２３１】
（実施例1.49：デキストラン硫酸7及びNaCl濃度0.25Mを使用するPURチューブ上のコーティングの調製）
PURチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸7(表1参照)を、NaCl濃度0.25Mで塗布した。
【０２３２】
（実施例1.50：デキストラン硫酸7及びNaCl濃度1.7Mを使用するPURチューブ上のコーティングの調製）
PURチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸7(表1参照)を、NaCl濃度1.7Mで塗布した。
【０２３３】
（実施例1.51:デキストラン硫酸7及びNaCl濃度3.0Mを使用するPURチューブ上のコーティングの調製）
PURチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸7(表1参照)を、NaCl濃度3.0Mで塗布した。
【０２３４】
（実施例1.52：デキストラン硫酸7及びNaCl濃度0.05Mを使用するスチールクーポン上のコーティングの調製）
スチールクーポン(15.0mm×3.35mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸7(表1参照)を、NaCl濃度0.05Mで塗布した。
【０２３５】
（実施例1.53：デキストラン硫酸7及びNaCl濃度0.25Mを使用するスチールクーポン上のコーティングの調製）
スチールクーポン(15.0mm×3.35mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸7(表1参照)を、NaCl濃度0.25Mで塗布した。
【０２３６】
（実施例1.54：デキストラン硫酸7及びNaCl濃度1.7Mを使用するスチールクーポン上のコーティングの調製）
スチールクーポン(15.0mm×3.35mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸7(表1参照)を、NaCl濃度1.7Mで塗布した。
【０２３７】
（実施例1.55：デキストラン硫酸7及びNaCl濃度3.0Mを使用するスチールクーポン上のコーティングの調製）
スチールクーポン(15.0mm×3.35mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸7(表1参照)を、NaCl濃度3.0Mで塗布した。
【０２３８】
（実施例1.56：デキストラン硫酸2及びNaCl濃度1.7Mを使用するPVCチューブ上のコーティングの調製）
PVCチューブ(内径3mm)を、先に説明した一般的方法に従い、コーティングした。デキストラン硫酸2(表1参照)を、NaCl濃度1.7Mで塗布した。
【０２３９】
（実施例2a：変動するNaCl濃度で異なるデキストラン硫酸を使用しコーティングされたPVCチューブの標準化されたヘパリン活性）
変動するNaCl濃度で実施例1.11−1.19、1.21−1.32、1.34−1.38(デキストラン硫酸4、5、6及び7に対応する)に従いコーティングされたPVCチューブのヘパリン活性を、評価方法B(ヘパリン活性試験)において設定したように測定した。
【０２４０】
試験した全てのコーティングされた固体物体は、評価方法Bにより決定した場合に、少なくとも1pmol/cm2のヘパリン活性を示した。下記表2に示したヘパリン活性値は、1.7M NaClでデキストラン硫酸5によりコーティングされたPVCチューブ(実施例1.22)について認められた最高ヘパリン活性値に対し、標準化されている。
【０２４１】
表2−変動するNaCl濃度でデキストラン硫酸4、5、6及び7によりコーティングされたPVCチューブの標準化されたヘパリン活性(％)
【表２】
2021514881.tif 000004
【０２４２】
0.25M及び1.7M NaClで、デキストラン硫酸4、5、6及び7によりコーティングされたPVCチューブの標準化されたヘパリン活性値は、図2に示している。図2から、両方の塩濃度は、許容し得る抗血栓特性を伴うコーティングに繋がるが、デキストラン硫酸層の追加工程におけるより高い塩濃度(1.7M)の使用は、より低い塩濃度(0.25M)の使用よりもより高いヘパリン活性に繋がることを、認めることができる。表2から、0.25M未満の塩濃度の使用は、より低いヘパリン活性を生じたことも認めることができる。最高のヘパリン活性は、電荷密度6μeq/g以上のデキストラン硫酸(デキストラン硫酸4、5、7)を使用し、得られた。
【０２４３】
（実施例2b：変動した濃度での異なる塩により、デキストラン硫酸5を使用しコーティングされたPVCチューブの標準化されたヘパリン活性）
NaCl、Na2HPO4又はNa2SO4を変動する濃度で使用し、実施例1.17、1.18、1.20、1.22及び1.39−1.45(デキストラン硫酸5に対応する)に従いコーティングされたPVCチューブのヘパリン活性を、評価方法B(ヘパリン活性試験)に設定したように測定した。
【０２４４】
試験した全てのコーティングされた固体物体は、少なくとも1pmol/cm2のヘパリン活性を示した。下記表3に示したヘパリン活性値は、1.70M NaClでデキストラン硫酸5によりコーティングされたPVCチューブ(実施例1.22)について認められた最高ヘパリン活性値に対し、標準化されている。
【０２４５】
表3−変動する濃度で異なる塩を使用しコーティングされた(デキストラン硫酸5)PVCチューブの標準化されたヘパリン活性(％)
【表３】
2021514881.tif 000005
*  1.7Mで水中に溶解せず
【０２４６】
表3からの標準化されたヘパリン活性値を、図3に示している。図3から、デキストラン硫酸層の追加工程におけるより高い塩濃度の使用のヘパリン活性に対する有益な作用は、広範な塩により示されることを、認めることができる。最高のヘパリン活性値は、塩化ナトリウムを使用し、得られた。
【０２４７】
（実施例2c：濃度0.85Mで異なる塩により、デキストラン硫酸5及び7を使用しコーティングされたPVCチューブの標準化されたヘパリン活性）
NaCl、Na2HPO4又はNa2SO4を0.85Mで使用し、実施例1.20、1.33、1.41及び1.45−1.47(デキストラン硫酸5及び7に対応する)に従いコーティングされたPVCチューブのヘパリン活性を、評価方法B(ヘパリン活性試験)に設定したように測定した。
【０２４８】
試験した全てのコーティングされた固体物体は、少なくとも1pmol/cm2のヘパリン活性を示した。下記表4に示したヘパリン活性値は、実施例1.22について認められた最高ヘパリン活性値に対し、標準化されている。
【０２４９】
表4−濃度0.85Mで異なる塩を使用しコーティングされた(デキストラン硫酸5及び7)PVCチューブの標準化されたヘパリン活性(％)
【表４】
2021514881.tif 000006
【０２５０】
例えば、NaCl、Na2HPO4及びNa2SO4などの様々な塩の使用は、ヘパリン活性値に有意に影響を及ぼさないことを、認めることができる。塩濃度は、使用される塩とは無関係にヘパリン活性に影響を及ぼすであろう。
【０２５１】
（実施例2d：変動する濃度でNaClにより、デキストラン硫酸7を使用し様々にコーティングされた固体物体の標準化されたヘパリン活性）
変動する濃度のNaClを使用し、実施例1.29、1.31、1.35、1.37、及び1.48−1.55(デキストラン硫酸7に対応する)に従い様々にコーティングされた固体物体のヘパリン活性を、評価方法B(ヘパリン活性試験)に設定したように測定した。
【０２５２】
試験した全てのコーティングされた固体物体は、少なくとも1pmol/cm2のヘパリン活性を示した。下記表5に示したヘパリン活性値は、実施例1.22について認められた最高ヘパリン活性値に対し、標準化されている。
【０２５３】
表5−変動する濃度でNaClにより様々にコーティングされた(デキストラン硫酸7)固体物体の標準化されたヘパリン活性(％)
【表５】
2021514881.tif 000007
【０２５４】
塩濃度は、コーティングされている固体物体の材料とは無関係に、ヘパリン活性に影響を及ぼすことは、表5から明白である。ポリウレタン(PUR)で製造されたチューブ及びスチールクーポンは、変動する塩濃度でデキストラン硫酸7によりコーティングし、生じる標準化されたヘパリン活性値は、明らかな塩依存性が存在することを示している。
【０２５５】
（実施例2e：デキストラン硫酸5及びNaCl濃度1.7Mを使用しヘパリンフラグメント(八糖)によりコーティングされたPVCチューブの標準化されたヘパリン活性）
PVCチューブ(内径3mm)は、デキストラン硫酸5(表1参照)により、NaCl濃度1.7Mで塗布される、先に説明した一般的方法に従い、ヘパリンフラグメント(八糖)によりコーティングした。
【０２５６】
（ヘパリンの脱重合、それに続く分別により調製されたヘパリンフラグメント画分）
主に8つの糖ユニットのサイズのオリゴ糖(八糖)を、未変性ヘパリンの部分的亜硝酸切断、それに続くゲルクロマトグラフィーによる分別により調製した。亜硝酸切断により生成された八糖は、機能性活性配列を含むことができる最も短いフラグメントである(Thunberg L.らの文献、FEBS Letters 117, 203-206(1980))。
【０２５７】
ヘパリンの脱重合：ヘパリンナトリウム10gを、水36ml中に、一晩撹拌することにより溶解した。このヘパリン溶液へNaNO2の0.30gを添加し、溶解させた。この溶液を、4M HClの添加により、pH2.5まで酸性とした。全体の反応時間が室温で2時間経過後、この溶液を、4M NaOHの添加により中和した。
【０２５８】
この分解混合物を、3mlの部分を、カラム(HiLoad 26/600 Superdex 30pg、移動相0.15M NaCl)へ、流量2.5ml/分で適用する、ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)により、分子サイズを基に分離した。収集された画分(3ml)を、基本的にSmith R.L.及びGilkerson Eの文献、Anal Biochem 98, 478-480(1979)に説明されたように、MBTH反応によりアルデヒドについて分析した。八糖の溶離部分を中心とする幅の広いピークを収集した。数回の分取試行からの一緒にしたオリゴ糖溶離画分を、容積18mlまでの蒸発により濃縮し、且つ同じカラム上で再度クロマトグラフィーした。全ての再クロマトグラフィー試行に関して、十-、八-及び六糖フラグメントを表す3種の画分を収集し、プールした。
【０２５９】
収集した画分を、評価方法Pにより分析した。「六」画分は、六糖を表す主要ピーク及び八糖を表すなだらかな部分(shoulder)からなる。「八」画分は、八糖を表す主要ピーク、六糖を表すなだらかな部分、及び十糖を表す小さいなだらかな部分からなる。「十」画分は、十糖を表す主要ピーク、及び八糖を表すなだらかな部分、及び十二糖を表す小さいなだらかな部分からなる。
【０２６０】
ヘパリンフラグメント画分の濃度は、評価方法Qにより決定した(下記表参照)。
【表６】
2021514881.tif 000008
【０２６１】
（八糖の固定）
PVCチューブを、0.05M NaClの84mlにより希釈した、“八”画分16mlによりコーティングし、次にこの八画分を、基本的にLarmらのEP0086186A1及びEP0495820B1(両方ともそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれている)に説明されたように、還元的アミノ化により、ポリアミンの最外層に固定した。
【０２６２】
（ヘパリンフラグメントによりコーティングされたPVCチューブのトルイジン染色による評価）
オリゴ糖コーティングされた表面を、評価方法Cに設定したような、トルイジンブルー染色試験に供した。強い青／紫色が、チューブの管腔表面に認められ、これはヘパリンフラグメントの広範な共有結合を示している。試験したチューブについて得られた均質な染色は、均一なコーティングの形成を指摘している。
【０２６３】
（ヘパリンフラグメントでコーティングされたPVCチューブのヘパリン密度の評価）
表面のヘパリン密度は、評価方法Aにより決定し、結果を下記表に示している。
【０２６４】
（ヘパリンフラグメントでコーティングされたPVCチューブのヘパリン活性の評価）
八糖コーティングされた表面(実施例2e)のヘパリン活性を、評価方法Bにより決定した。下記表に示したヘパリン活性値は、1.70M NaClでデキストラン硫酸5によりコーティングされたPVCチューブ(実施例1.22)について認められた最高のヘパリン活性に対して、標準化されている。
【表７】
2021514881.tif 000009
【０２６５】
八糖コーティング(実施例2e)及びヘパリンコーティング(実施例1.22)のヘパリン密度値は類似しているが、八糖コーティングのAT結合許容量(ヘパリン活性；‘HA’)は、ヘパリンコーティングと比べ、低かった。しかし、これは、溶液中の八糖画分により示された比較的低い抗-FXa活性と考えられることが予想される(データは示さず)。従って八糖フラグメントは、固定後にそれらのAT-結合許容量を実質的に保持しているように見える。
【０２６６】
（実施例3a：変動するNaCl濃度で異なるデキストラン硫酸を使用しコーティングされたPVCチューブのヘパリン濃度）
変動するNaCl濃度で、実施例1.4-1.19、1.21−1.32及び1.34−1.38(デキストラン硫酸3、4、5、6及び7に対応する)に従いコーティングされた固体物体(PVCチューブ)のヘパリン濃度を、評価方法Aに設定したように測定した。
【０２６７】
試験した全てのコーティングされた固体物体は、少なくとも1μg/cm2のヘパリン濃度を示した。ヘパリン濃度値は、下記表6に示した。
【０２６８】
表6−変動するNaCl濃度でデキストラン硫酸3、4、5、6及び7によりコーティングされたPVCチューブのヘパリン濃度(μg/cm2)
【表８】
2021514881.tif 000010
【０２６９】
1.7MのNaClでデキストラン硫酸3、4、5、6及び7によりコーティングされたPVCチューブのヘパリン濃度を、図4に示している。図4から、これらの条件下でデキストラン硫酸層の追加工程において、より高い分子量のデキストラン硫酸を使用すると、より高いヘパリン濃度となる傾向が存在することを、認めることができる。デキストラン硫酸3は、この実施例においては参照デキストラン硫酸である。
【０２７０】
変動するNaCl濃度でデキストラン硫酸3、4、5、6及び7によりコーティングされたPVCチューブのヘパリン濃度を、図5に示している。図5から、デキストラン硫酸層の追加工程において、増大する塩濃度(少なくとも最大1.7M)により、より高いヘパリン濃度となる傾向が存在することを、認めることができる。0.25M未満の塩濃度の使用は、一般により低いヘパリン活性を生じることも認めることができる。デキストラン硫酸3は、この傾向に従わず、且つこれが使用される場合、この工程における塩濃度が増加するにつれて、ヘパリン濃度は低下する。デキストラン硫酸3は、この実施例においては参照デキストラン硫酸である。理論により限定される訳ではないが、本発明者らは、傾向としてのこの差は、デキストラン硫酸3は、デキストラン硫酸4、5、6及び7よりもはるかに低い電荷密度を有するという事実に起因すると考える。
【０２７１】
（実施例3b：変動する濃度の異なる塩で、デキストラン硫酸5を使用しコーティングされたPVCチューブのヘパリン濃度）
実施例1.17、1.18、1.20、1.22及び1.39−1.45(NaCl、Na2HPO4又はNa2SO4を変動する濃度で使用するデキストラン硫酸5に対応する)に従いコーティングされたPVCチューブのヘパリン濃度を、評価方法Aに設定したように測定した。
【０２７２】
試験した全てのコーティングされた固体物体は、少なくとも1μg/cm2のヘパリン濃度を示した。ヘパリン濃度値は、下記表7に示した。
【０２７３】
表7−変動する濃度の異なる塩を使用しコーティングされた(デキストラン硫酸5)PVCチューブのヘパリン濃度(μg/cm2)
【表９】
2021514881.tif 000011
*  Na2SO4は、1.7Mで水中に溶解せず
【０２７４】
表7のヘパリン濃度値は、図6に示している。図6から、デキストラン硫酸5は、広範な異なる塩について、デキストラン硫酸層の追加工程において、増大する塩濃度により、ヘパリン濃度を増大する傾向を明らかにしていることを、認めることができる。
【０２７５】
（実施例3c：濃度0.85Mの異なる塩でデキストラン硫酸5及び7を使用しコーティングされたPVCチューブのヘパリン濃度）
実施例1.20、1.33、1.41、1.45、1.46及び1.47(NaCl、Na2HPO4又はNa2SO4を0.85Mで使用するデキストラン硫酸5及び7に対応する)に従いコーティングされたPVCチューブのヘパリン濃度を、評価方法Aに設定したように測定した。
【０２７６】
試験した全てのコーティングされた固体物体は、少なくとも1μg/cm2のヘパリン濃度を示した。ヘパリン濃度値は、下記表8に示した。
【０２７７】
表8−濃度0.85Mの異なる塩を使用しコーティングされた(デキストラン硫酸5及び7)PVCチューブのヘパリン濃度(μg/cm2)
【表１０】
2021514881.tif 000012
【０２７８】
例えば、NaCl、Na2HPO4及びNa2SO4などの、様々な塩の使用は、ヘパリン濃度値に有意な影響を及ぼさないことを、認めることができる。
【０２７９】
（実施例3d：変動する濃度のNaClでデキストラン硫酸7を使用しコーティングされた様々な固体物体のヘパリン濃度）
変動する濃度のNaClを用い、実施例1.29、1.31、1.35、1.37、及び1.48−1.55(デキストラン硫酸7(12)に対応する)に従いコーティングされた様々な固体物体のヘパリン濃度を、評価方法Aに設定したように測定した。
【０２８０】
試験した全てのコーティングされた固体物体は、少なくとも1μg/cm2のヘパリン濃度を示した。ヘパリン濃度値は、下記表9に示した。
【０２８１】
表9−変動する濃度のNaClでコーティングされた(デキストラン硫酸7)様々な固体物体のヘパリン濃度(μg/cm2)
【表１１】
2021514881.tif 000013
【０２８２】
表9から、塩濃度は、コーティングされる固体物体の材料とは関わりなく、ヘパリン濃度に影響を及ぼすことは明らかである。ポリウレタン(PUR)で製造されたチューブ及びスチールクーポンを、変動する塩濃度で、デキストラン硫酸7によりコーティングし、且つ生じるヘパリン濃度値は、明確な塩依存性が存在することを示している。
【０２８３】
（実施例4a：1.7M及び0.25M NaCl濃度で異なるデキストラン硫酸を使用しコーティングされたPVCチューブのゼータ電位測定）
変動するNaCl濃度で、実施例1.1、1.2、1.3、1.6、1.8、1.13、1.15、1.18、1.22、1.25、1.27、1.31、1.35及び1.56(デキストラン硫酸1、2、3、4、5、6及び7に相当する)に従いコーティングされたPVCチューブの表面電荷を、評価方法Dに設定したように測定した。
【０２８４】
1.7M NaClでデキストラン硫酸1−7によりPVCコーティングされたチューブに関するゼータ電位値を、表10に示している。
【０２８５】
表10−1.7M NaClでデキストラン硫酸1−7によりPVCコーティングされたチューブに関するゼータ電位
【表１２】
2021514881.tif 000014
【０２８６】
デキストラン硫酸1−7は全て、pH3以下のIEPを有する。しかしより低い分子量のデキストラン硫酸(参照例デキストラン硫酸1−3)は、好ましい特徴(すなわち、先に説明した、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体に関する電位フィンガープリント)の全てを満たさない。デキストラン硫酸1及び2は、5よりも高いpHで生じる大域的最小点を有し、デキストラン硫酸3は、20mVよりも低いデルタ値を有する。デキストラン硫酸4−7でコーティングされた本発明の固体物体は、これらの基準を満たしている。
【０２８７】
1.7M NaClで、デキストラン硫酸3、4及び5でPVCコーティングされたチューブ(実施例1.8、1.15及び1.22に相当する)のゼータ電位を、図7に示している。
【０２８８】
1.7M NaClで、デキストラン硫酸3、6及び7でPVCコーティングされたチューブ(実施例1.8、1.27及び1.35に相当する)のゼータ電位を、図8に示している。
【０２８９】
0.25M NaClで、デキストラン硫酸1−7でPVCコーティングされたチューブのゼータ電位値を、表11に示している。
【０２９０】
表11−0.25M NaClで、デキストラン硫酸1−7でPVCコーティングされたチューブのゼータ電位
【表１３】
2021514881.tif 000015
【０２９１】
デキストラン硫酸1−7は全て、pH3以下のIEPを有する。しかしより低い分子量のデキストラン硫酸(参照例デキストラン硫酸1-3)は、好ましい特徴(すなわち、先に説明した、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体に関する電位フィンガープリント)の全てを満たさない。デキストラン硫酸2は、5よりも高いpHで生じる大域的最小点を有し、デキストラン硫酸1及び3は、20mVよりも低いデルタ値を有する。デキストラン硫酸4−7でコーティングされた本発明の固体物体は、これらの基準を満たしている。
【０２９２】
0.25M NaClで、デキストラン硫酸3、4及び5でPVCコーティングされたチューブ(実施例1.6、1.13及び1.18に相当する)のゼータ電位を、図9に示している。
【０２９３】
0.25M NaClで、デキストラン硫酸3、6及び7でPVCコーティングされたチューブ(実施例1.6、1.25及び1.31に相当する)のゼータ電位を、図10に示している。
【０２９４】
（実施例4b：変動する濃度の異なる塩でデキストラン硫酸5を使用しコーティングされたPVCチューブのゼータ電位測定）
NaCl、Na2HPO4又はNa2SO4を変動する濃度で使用し、実施例1.18、1.22、1.39−1.42及び1.44−1.45(全てデキストラン硫酸5)に従いコーティングされたPVCチューブの表面電荷を、評価方法Dに設定したように測定した。
【０２９５】
異なるNaCl濃度でデキストラン硫酸5によりPVCコーティングされたチューブのゼータ電位値を、表12に示す。
【０２９６】
表12−異なるNaCl濃度でデキストラン硫酸5によりPVCコーティングされたチューブのゼータ電位
【表１４】
2021514881.tif 000016
【０２９７】
NaCl濃度0.25M及び1.7Mでデキストラン硫酸5によりPVCコーティングされたチューブ(実施例1.18及び1.22に相当する)に関するゼータ電位プロファイルを、図11に示し、ここで塩のゼータ電位に対する作用は明らかである。好ましい特徴(すなわち、先に説明した、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体に関する電位フィンガープリント)は、NaCl濃度0.25及び1.7Mで満たされる。
【０２９８】
異なるNa2HPO4濃度でデキストラン硫酸5によりPVCコーティングされたチューブのゼータ電位値を、表13に示す。
【０２９９】
表13−異なるNa2HPO4濃度でデキストラン硫酸5によりPVCコーティングされたチューブのゼータ電位
【表１５】
2021514881.tif 000017
【０３００】
Na2HPO4濃度0.25M、0.85M及び1.7Mでデキストラン硫酸5によりPVCコーティングされたチューブ(実施例1.40、1.41及び1.42に相当する)に関するゼータ電位プロファイルを、図12に示し、ここで全ての好ましい特徴(すなわち、先に説明した、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体に関する電位フィンガープリント)は、異なる濃度でのNa2HPO4の使用で満たされることを認めることができる。
【０３０１】
異なるNa2SO4濃度でデキストラン硫酸5によりPVCコーティングされたチューブのゼータ電位値を、表14に示す。
【０３０２】
表14−異なるNa2SO4濃度でデキストラン硫酸5によりPVCコーティングされたチューブのゼータ電位
【表１６】
2021514881.tif 000018
*  1.7Mで水中に溶解せず
**  N/A＝該当なし
【０３０３】
Na2SO4濃度0.25M及び0.85Mでデキストラン硫酸5によりPVCコーティングされたチューブ(実施例1.44及び1.45に相当する)に関するゼータ電位プロファイルを、図13に示し、ここで全ての好ましい特徴(すなわち、先に説明した、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体に関する電位フィンガープリント)は、異なる濃度でのNa2SO4濃度の使用で満たされることを認めることができる。表12、13及び14から、異なる種類の塩を異なる濃度で使用することは、ゼータ電位プロファイルに有意な影響を及ぼさないことは明らかである。異なる塩型に関して塩依存性が存在することも明らかである。
【０３０４】
（実施例5：変動するNaCl濃度で異なるデキストラン硫酸を使用しコーティングされたPVCチューブの血液接触活性化(血小板喪失及びF1+2)）
変動するNaCl濃度で実施例1.1、1.3、1.13、1.18、1.25及び1.31(デキストラン硫酸1、2、4、5、6、及び7に相当する)に従いコーティングされたPVCチューブの血液曝露後に、保存される血小板の割合及びF1+2(プロトロンビンフラグメント)を、各々、評価方法E及びFに設定したように測定した。
【０３０５】
結果を、表15並びに図14及び15(NaCl濃度0.25M)、表16並びに図16及び17(NaCl濃度1.7M)に示している。
【０３０６】
これらの表及び図において認められるように、NaCl濃度0.25M及び1.7Mで、デキストラン硫酸4、5、6及び7により本発明の方法に従いコーティングされた固体物体に関して、有意な血小板喪失(血小板喪失は血栓症を示す)は、認められなかった。これらのコーティングの抗血栓特性は更に、同じデキストラン硫酸について認められた、低いF1+2値(プロトロンビンフラグメント)により確認された。分子量50kDaの同等のデキストラン硫酸1で及び分子量100kDaの同等のデキストラン硫酸2でコーティングされたチューブもまた、デキストラン硫酸4−7でコーティングされた本発明の固体物体と比べ、有意な血栓症及びプロトロンビンフラグメントの高い生成を示した。
【０３０７】
コーティングされないPVCチューブ実施例及び凝血実施例は、この実験において有意な血栓症を示す。
【０３０８】
表15−NaCl濃度0.25Mでデキストラン硫酸1、2、4、5、6及び7でコーティングされたPVCチューブの残存血小板(％)及びF1+2(pmol/L)
【表１７】
2021514881.tif 000019
【０３０９】
表16−NaCl濃度1.7Mでデキストラン硫酸1、4、5、6及び7でコーティングされたPVCチューブの残存血小板(％)及びF1+2(pmol/L) 
【表１８】
2021514881.tif 000020
【０３１０】
（実施例6：変動する塩濃度で異なるデキストラン硫酸を用いコーティングされたPVC及びPURチューブ並びにスチールクーポンのトルイジンブルー染色）
実施例1.1-1.55に従いコーティングされたPVC及びPURチューブ並びにスチールクーポンを、評価方法Cに設定したようなトルイジンブルー染色試験に供した。
【０３１１】
青／紫色が、チューブの管腔表面及びスチールクーポン上に認められ、これは末端部が官能基化されたヘパリンの共有結合を指摘している。本発明の方法に従いコーティングされた試験された固体物体に関して得られた均質な染色は、異なる固体物体上に、塩の異なる濃度で、異なるデキストラン硫酸を使用して得ることができる、均一なコーティング(特に均一なヘパリン分布)の形成を指摘している。
【０３１２】
（実施例7：コーティングされたPVCチューブの血液接触活性化(血小板喪失及びF1+2)−温度及び湿度試験後）
変動するNaCl濃度で、実施例1.13、1.15、1.22及び1.35(デキストラン硫酸4、5、及び7に相当する)に従いコーティングされたPVCチューブを、上昇した温度及び相対湿度に曝露し(評価方法Kに従い40℃、50％RH、1週間)、その後評価方法E(残存血小板)及びF(F1+2)に従い評価した。結果を、表17並びに図18及び19、表18並びに図20及び21に示している。
【０３１３】
これらの表及び図において認められるように、デキストラン硫酸4、5及び7を使用し本発明の方法に従いコーティングされた固体物体に関して、上昇した温度及び湿度への曝露後の残存血小板及びF1+2値において、有意な変化は存在しなかった。同様の結果が、0.25M及び1.7M NaCl濃度で調製した、デキストラン硫酸4、5及び7を用い、本発明の方法に従いコーティングされた固体物体についても得られた。
【０３１４】
これらの結果は、本発明の方法に従い調製されたコーティングされた固体物体の抗血栓特性は、上昇した温度及び湿度としての過酷な条件に曝露されるにもかかわらず、保持されることを明らかにしている。
【０３１５】
表17−0.25M NaCl濃度でデキストラン硫酸4によりコーティングされたPVCチューブの残存血小板(％)及びF1+2(pmol/L)−上昇した温度及び湿度への曝露前及び後
【表１９】
2021514881.tif 000021
【０３１６】
表18−1.7M NaCl濃度でデキストラン硫酸4、5及び7によりコーティングされたPVCチューブの残存血小板(％)及びF1+2(pmol/L)−上昇した温度及び湿度への曝露前及び後
【表２０】
2021514881.tif 000022
【０３１７】
本明細書において言及される全ての特許及び特許出願は、それらの全体が引用により組み込まれている。
【０３１８】
本明細書及び以下の請求項を通じて、状況が別に必要としない限りは、用語「含む(comprise)」、並びに「一つを含む(comprises)」及び「含んでいる(comprising)」などの変形は、言及された整数、工程、整数の群又は工程の群を包含するが、いずれか他の整数、工程、整数の群又は工程の群を除外するものではないことを暗示していることは理解されるであろう。
【図１】
2021514881.tif 000023
【図２】
2021514881.tif 000024
【図３】
2021514881.tif 000025
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2021514881.tif 000029
【図８】
2021514881.tif 000030
【図９】
2021514881.tif 000031
【図１０】
2021514881.tif 000032
【図１１】
2021514881.tif 000033
【図１２】
2021514881.tif 000034
【図１３】
2021514881.tif 000035
【図１４】
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【図１５】
2021514881.tif 000037
【図１６】
2021514881.tif 000038
【図１７】
2021514881.tif 000039
【図１８】
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【図１９】
2021514881.tif 000041
【図２０】
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【図２１】
2021514881.tif 000043
【図２２】
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【図２３】
2021514881.tif 000045
【手続補正書】
【提出日】令和2年11月16日(2020.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外側コーティング層が抗凝固実体を含む、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)該固体物体の表面を該陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)該表面を該陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程；
iv)該表面を該陽イオン性ポリマーにより処理する工程；並びに
v)該陽イオン性ポリマーの最外層を、該抗凝固実体により処理し、これにより該抗凝固実体を、該陽イオン性ポリマーの最外層へ共有結合させる工程：を含み、
ここで、該陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられ；
ここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行され；
ここで、該陰イオン性ポリマーは、-SO3-基を含むポリマーであり；
並びにここで、該陰イオン性ポリマーの硫黄含量が、該陰イオン性ポリマーの10重量％〜25重量％である、前記方法。
【請求項２】
前記陰イオン性ポリマーが、デキストラン硫酸である、請求項1記載の固体物体の製造方法。
【請求項３】
前記陰イオン性ポリマーが、総分子量750kDa〜10,000kDa、例えば1,000kDa〜10,000kDaを有することにより特徴付けられる、請求項1又は2記載の固体物体の製造方法。
【請求項４】
前記工程ii)が、塩濃度0.25M〜4.0M、例えば0.25M〜3.0Mで実行される、請求項1〜3のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項５】
前記塩が、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、及びリン酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項６】
前記塩が、塩化ナトリウムである、請求項5記載の固体物体の製造方法。
【請求項７】
前記工程i)の前記陽イオン性ポリマーが、任意に架橋されている、ポリアミンである、請求項1〜6のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項８】
前記工程iv)の前記陽イオン性ポリマーが、任意に架橋されている、ポリアミンである、請求項1〜7のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項９】
前記抗凝固実体が、ヘパリン部分である、請求項1〜8のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項１０】
前記ヘパリン部分が、末端部に結合されたヘパリン部分である、請求項9記載の固体物体の製造方法。
【請求項１１】
前記末端部に結合されたヘパリン部分が、その還元末端を介して連結されている、請求項10記載の固体物体の製造方法。
【請求項１２】
前記陰イオン性ポリマーが、-CO2-、-PO3H-及び-PO32-から選択された基を含むポリマーである、請求項1〜11のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項１３】
前記陰イオン性ポリマーの硫黄含量が、該陰イオン性ポリマーの15重量％〜20重量％である、請求項1〜12のいずれか一項記載の固体物体の製造方法。
【請求項１４】
外側コーティング層が抗凝固実体を含む、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)該固体物体の表面を該陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)該表面を該陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程；
iv)該表面を該陽イオン性ポリマーにより処理する工程；並びに
v)該陽イオン性ポリマーの最外層を、該抗凝固実体により処理し、これにより該抗凝固実体を、該陽イオン性ポリマーの最外層へ共有結合させる工程：を含み、
ここで、該陰イオン性ポリマーは、-SO3-基を含むポリマーであり、
該陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)該陰イオン性ポリマーの10重量％〜25重量％の硫黄含量を有することにより特徴付けられ；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、前記方法。
【請求項１５】
外側コーティング層が抗凝固実体を含む、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)該固体物体の表面を該陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)該表面を該陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程；
iv)該表面を該陽イオン性ポリマーにより処理する工程；並びに
v)該陽イオン性ポリマーの最外層を、該抗凝固実体により処理し、これにより該抗凝固実体を、該陽イオン性ポリマーの最外層へ共有結合させる工程：を含み、
ここで、該陰イオン性ポリマーは、総分子量650kDa〜10,000kDaを有することにより特徴付けられ；
該陰イオン性ポリマーは、デキストラン硫酸であり；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、前記方法。
【請求項１６】
前記抗凝固実体が、ヘパリン部分である、請求項14又は15のいずれか記載の固体物体の製造方法。
【請求項１７】
陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体であって、ここで外側コーティング層は、抗凝固実体に共有結合された陽イオン性ポリマーを含む層であり；
ここで、該陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)溶液電荷密度＞4μeq/gを有することにより特徴付けられ
ここで、該陰イオン性ポリマーは、-SO3-基を含むポリマーであり；
並びにここで、該陰イオン性ポリマーの硫黄含量が、該陰イオン性ポリマーの10重量％〜25重量％である、前記固体物体。
【請求項１８】
前記陰イオン性ポリマーが、総分子量650kDa〜1,000kDa、1,000kDa〜4,500kDa、4,500kDa〜7,000kDa、又は7,000kDa〜10,000kDaを有することにより特徴付けられる、請求項17記載の固体物体。
【請求項１９】
前記陰イオン性ポリマーが、塩濃度0.25M〜5.0M、例えば0.25M〜4.0M又は0.25M〜3.0Mで、前記表面に塗布される、請求項17又は18記載の固体物体。
【請求項２０】
前記陰イオン性ポリマーが、-CO2-、-PO3H-及び-PO32-から選択される基を含むポリマーである、請求項19記載の固体物体。
【請求項２１】
前記陰イオン性ポリマーの硫黄含量が、該陰イオン性ポリマーの15重量％〜20重量％である、請求項20記載の固体物体。
【請求項２２】
陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体であって、ここで外側コーティング層が、それに抗凝固実体が共有結合された該陽イオン性ポリマーを含む層であり；該陰イオン性ポリマーが、-SO3-基を含むポリマーであり、且つここで該陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)該陰イオン性ポリマーの10重量％〜25重量％の硫黄含量を有することにより特徴付けられる、前記固体物体。
【請求項２３】
外側コーティング層が陽イオン性ポリマーを含む層である、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)該固体物体の表面を該陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)該表面を該陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程；並びに
iv)該表面を該陽イオン性ポリマーにより処理する工程：を含み、
ここで、該陰イオン性ポリマーは、-SO3-基を含むポリマーであり、
該陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)該陰イオン性ポリマーの10重量％〜25重量％の硫黄含量を有することにより特徴付けられ；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、前記方法。
【請求項２４】
外側コーティング層が陽イオン性ポリマーを含む層である、陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)該固体物体の表面を該陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)該表面を該陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程；並びに
iv)該表面を該陽イオン性ポリマーにより処理する工程：を含み、
ここで、該陰イオン性ポリマーは、総分子量650kDa〜10,000kDaを有することにより特徴付けられ；
該陰イオン性ポリマーは、デキストラン硫酸であり；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、前記方法。
【請求項２５】
陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体であって、ここで外側コーティング層が、陽イオン性ポリマーを含む層であり；陰イオン性ポリマーが、-SO3-基を含むポリマーであり、並びにここで該陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)該陰イオン性ポリマーの10重量％〜25重量％の硫黄含量を有することにより特徴付けられる、前記固体物体。
【請求項２６】
外側コーティング層が陰イオン性ポリマーを含む層である、陽イオン性及び該陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)該固体物体の表面を該陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)該表面を該陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程：を含み、
ここで、該陰イオン性ポリマーは、-SO3-基を含むポリマーであり、
該陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)該陰イオン性ポリマーの10重量％〜25重量％の硫黄含量を有することにより特徴付けられ、
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、前記方法。
【請求項２７】
外側コーティング層が陰イオン性ポリマーを含む層である、陽イオン性及び該陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体の製造方法であって：
i)該固体物体の表面を該陽イオン性ポリマーにより処理する工程；
ii)該表面を該陰イオン性ポリマーにより処理する工程；
iii)任意に工程i)及びii)を1回以上繰り返す工程：を含み、
ここで、該陰イオン性ポリマーは、総分子量650kDa〜10,000kDaを有することにより特徴付けられ；
該陰イオン性ポリマーは、デキストラン硫酸であり；
並びにここで、工程ii)は、塩濃度0.25M〜5.0Mで実行される、前記方法。
【請求項２８】
陽イオン性及び陰イオン性ポリマーの層状コーティングを含む表面を有する固体物体であって、ここで外側コーティング層が、陰イオン性ポリマーを含む層であり；該陰イオン性ポリマーが、-SO3-基を含むポリマーであり、並びにここで該陰イオン性ポリマーは、(a)総分子量650kDa〜10,000kDa；及び、(b)該陰イオン性ポリマーの10重量％〜25重量％の硫黄含量を有することにより特徴付けられる、前記固体物体。
【国際調査報告】
2021514881.tif 000046
2021514881.tif 000047