(57)【要約】本発明は、試験試料中のクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）を検出するための方法及び組成物を提供する。試料中のそれの有無は、２３Ｓリボソーム遺伝子または遺伝子転写物に結合するプライマー及び／またはプローブ及びまたはモレキュラービーコンを使用する核酸ベースの試験方法により決定される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セット２０、セット２４、セット４７、セット５１、セット７４、及びセット７８からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットを含む、組成物。
【請求項２】
プローブをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記プローブが、標識ポリヌクレオチドである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号９７のヌクレオチド５〜３４、配列番号９８のヌクレオチド５〜３１、配列番号９９のヌクレオチド３〜３１、配列番号１００のヌクレオチド５〜３０、配列番号１０１のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０３のヌクレオチド５〜２６、配列番号１０４のヌクレオチド４〜２７、配列番号１０５のヌクレオチド７〜３０、配列番号１０６のヌクレオチド５〜２７、配列番号１０７のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０８のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０９のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１０のヌクレオチド６〜３０、配列番号１１１のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１２のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１３のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１４のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１５のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１６のヌクレオチド４〜２８、配列番号１１７のヌクレオチド５〜３０、配列番号１１８のヌクレオチド８〜２８、配列番号１１９のヌクレオチド８〜３０、配列番号１２０のヌクレオチド８〜２９、配列番号１２１のヌクレオチド４〜３３、配列番号１２２のヌクレオチド７〜３４、配列番号１２３のヌクレオチド９〜３４、配列番号１２４のヌクレオチド８〜３４、配列番号１２５のヌクレオチド６〜２８、配列番号１２６のヌクレオチド７〜２８、配列番号１２７のヌクレオチド３〜２７、配列番号１２８のヌクレオチド７〜３２、配列番号１２９のヌクレオチド４〜２７、及び配列番号１３０のヌクレオチド６〜２７からなる群より選択される配列を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記プローブが、フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンである、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記モレキュラービーコンが、配列番号９７のヌクレオチド５〜３４、配列番号９８のヌクレオチド５〜３１、配列番号９９のヌクレオチド３〜３１、配列番号１００のヌクレオチド５〜３０、配列番号１０１のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０３のヌクレオチド５〜２６、配列番号１０４のヌクレオチド４〜２７、配列番号１０５のヌクレオチド７〜３０、配列番号１０６のヌクレオチド５〜２７、配列番号１０７のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０８のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０９のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１０のヌクレオチド６〜３０、配列番号１１１のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１２のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１３のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１４のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１５のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１６のヌクレオチド４〜２８、配列番号１１７のヌクレオチド５〜３０、配列番号１１８のヌクレオチド８〜２８、配列番号１１９のヌクレオチド８〜３０、配列番号１２０のヌクレオチド８〜２９、配列番号１２１のヌクレオチド４〜３３、配列番号１２２のヌクレオチド７〜３４、配列番号１２３のヌクレオチド９〜３４、配列番号１２４のヌクレオチド８〜３４、配列番号１２５のヌクレオチド６〜２８、配列番号１２６のヌクレオチド７〜２８、配列番号１２７のヌクレオチド３〜２７、配列番号１２８のヌクレオチド７〜３２、配列番号１２９のヌクレオチド４〜２７、及び配列番号１３０のヌクレオチド６〜２７からなる群より選択される配列を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記モレキュラービーコンが、配列番号９７〜１０１及び１０３〜１３０からなる群より選択される配列を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号１１５からなる、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含む、モレキュラービーコンであって、前記ポリヌクレオチドが、配列番号９７のヌクレオチド５〜３４、配列番号９８のヌクレオチド５〜３１、配列番号９９のヌクレオチド３〜３１、配列番号１００のヌクレオチド５〜３０、配列番号１０１のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０３のヌクレオチド５〜２６、配列番号１０４のヌクレオチド４〜２７、配列番号１０５のヌクレオチド７〜３０、配列番号１０６のヌクレオチド５〜２７、配列番号１０７のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０８のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０９のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１０のヌクレオチド６〜３０、配列番号１１１のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１２のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１３のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１４のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１５のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１６のヌクレオチド４〜２８、配列番号１１７のヌクレオチド５〜３０、配列番号１１８のヌクレオチド８〜２８、配列番号１１９のヌクレオチド８〜３０、配列番号１２０のヌクレオチド８〜２９、配列番号１２１のヌクレオチド４〜３３、配列番号１２２のヌクレオチド７〜３４、配列番号１２３のヌクレオチド９〜３４、配列番号１２４のヌクレオチド８〜３４、配列番号１２５のヌクレオチド６〜２８、配列番号１２６のヌクレオチド７〜２８、配列番号１２７のヌクレオチド３〜２７、配列番号１２８のヌクレオチド７〜３２、配列番号１２９のヌクレオチド４〜２７、及び配列番号１３０のヌクレオチド６〜２７からなる群より選択される配列を含む、前記モレキュラービーコン。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号９７〜１０１及び１０３〜１３０からなる群より選択される配列を含む、請求項９に記載のモレキュラービーコン。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号１１５からなる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記フルオロフォアが、ＦＡＭであり、前記クエンチャーが、ＢＨＱ１である、請求項９に記載のモレキュラービーコン。
【請求項１３】
試験試料中のクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の検出方法であって、前記方法が、
（ａ）前記試験試料から核酸を抽出すること、
（ｂ）ステップ（ａ）で抽出された前記核酸を、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ及び配列特異的プライマーセットを含む反応混合物と反応させることにより、標的配列を増幅することであって、前記配列特異的プライマーセットが、セット２０、セット２４、セット４７、セット５１、セット７４、及びセット７８からなる群より選択される、前記増幅すること、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）の増幅産物の有無を検出することであって、前記増幅産物の存在が、前記試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を示す、前記検出すること、を含む、前記方法。
【請求項１４】
前記標的配列のステップ（ｂ）の前記増幅が、約６０℃〜約６７℃で１５分未満実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記増幅ステップが、１０分未満実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記反応混合物が、逆転写酵素をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記増幅産物の有無の検出が、標識に結合しているポリヌクレオチドを含むプローブと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号９７のヌクレオチド５〜３４、配列番号９８のヌクレオチド５〜３１、配列番号９９のヌクレオチド３〜３１、配列番号１００のヌクレオチド５〜３０、配列番号１０１のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０３のヌクレオチド５〜２６、配列番号１０４のヌクレオチド４〜２７、配列番号１０５のヌクレオチド７〜３０、配列番号１０６のヌクレオチド５〜２７、配列番号１０７のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０８のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０９のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１０のヌクレオチド６〜３０、配列番号１１１のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１２のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１３のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１４のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１５のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１６のヌクレオチド４〜２８、配列番号１１７のヌクレオチド５〜３０、配列番号１１８のヌクレオチド８〜２８、配列番号１１９のヌクレオチド８〜３０、配列番号１２０のヌクレオチド８〜２９、配列番号１２１のヌクレオチド４〜３３、配列番号１２２のヌクレオチド７〜３４、配列番号１２３のヌクレオチド９〜３４、配列番号１２４のヌクレオチド８〜３４、配列番号１２５のヌクレオチド６〜２８、配列番号１２６のヌクレオチド７〜２８、配列番号１２７のヌクレオチド３〜２７、配列番号１２８のヌクレオチド７〜３２、配列番号１２９のヌクレオチド４〜２７、及び配列番号１３０のヌクレオチド６〜２７からなる群より選択される配列を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号９７〜１０１及び１０３〜１３０からなる群より選択される配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記標識ポリヌクレオチドの前記配列が、配列番号１１５である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
クラミジア・トラコマチスが、１００ＩＦＵ／ｍＬ以下の濃度で前記試験試料中に存在する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
クラミジア・トラコマチスが、５ＩＦＵ／ｍｌ以下の濃度で前記試験試料中に存在し、前記増幅ステップが、１５分未満実施される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
クラミジア・トラコマチスが、１０ＩＦＵ／ｍｌ以下の濃度で前記試験試料中に存在し、前記増幅ステップが、６分未満実施される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の組成物を含む、キット。
【請求項２５】
鎖置換ポリメラーゼをさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンをさらに含み、前記ポリヌクレオチドが、配列番号９７〜１０１及び１０３〜１３０からなる群より選択される配列からなる、請求項２４に記載のキット。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１１５からなる、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
試験試料中のクラミジア・トラコマチスの検出方法であって、前記方法が、
（ａ）前記試験試料から核酸を抽出すること、
（ｂ）ステップ（ａ）で抽出された前記核酸を、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼならびにセット２０及びセット２４からなる群より選択される配列特異的ＬＡＭＰプライマーセットを含む反応混合物と１０分未満反応させることにより、標的配列を増幅すること、ならびに
（ｃ）ステップ（ｂ）の増幅産物の有無を検出することであって、前記増幅産物の存在が、前記試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を示す、前記検出すること、を含む、前記方法。
【請求項２９】
前記増幅産物の有無の検出が、配列番号９７のヌクレオチド５〜３４、配列番号９８のヌクレオチド５〜３１、配列番号９９のヌクレオチド３〜３１、配列番号１００のヌクレオチド５〜３０、配列番号１０１のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０３のヌクレオチド５〜２６、配列番号１０４のヌクレオチド４〜２７、配列番号１０５のヌクレオチド７〜３０、配列番号１０６のヌクレオチド５〜２７、配列番号１０７のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０８のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０９のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１０のヌクレオチド６〜３０、配列番号１１１のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１２のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１３のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１４のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１５のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１６のヌクレオチド４〜２８、配列番号１１７のヌクレオチド５〜３０、配列番号１１８のヌクレオチド８〜２８、配列番号１１９のヌクレオチド８〜３０、配列番号１２０のヌクレオチド８〜２９、配列番号１２１のヌクレオチド４〜３３、配列番号１２２のヌクレオチド７〜３４、配列番号１２３のヌクレオチド９〜３４、配列番号１２４のヌクレオチド８〜３４、配列番号１２５のヌクレオチド６〜２８、配列番号１２６のヌクレオチド７〜２８、配列番号１２７のヌクレオチド３〜２７、配列番号１２８のヌクレオチド７〜３２、配列番号１２９のヌクレオチド４〜２７、及び配列番号１３０のヌクレオチド６〜２７からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むモレキュラービーコンと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記増幅産物の有無の検出が、配列番号９７〜１０１及び１０３〜１３０からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むモレキュラービーコンと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
セット１〜セット８１からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットを含む、組成物。
【請求項３２】
プローブをさらに含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記プローブが、標識を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記プローブが、標識ポリヌクレオチドである、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号９７のヌクレオチド５〜３４、配列番号９８のヌクレオチド５〜３１、配列番号９９のヌクレオチド３〜３１、配列番号１００のヌクレオチド５〜３０、配列番号１０１のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０２のヌクレオチド６〜３０、配列番号１０３のヌクレオチド５〜２６、配列番号１０４のヌクレオチド４〜２７、配列番号１０５のヌクレオチド７〜３０、配列番号１０６のヌクレオチド５〜２７、配列番号１０７のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０８のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０９のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１０のヌクレオチド６〜３０、配列番号１１１のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１２のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１３のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１４のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１５のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１６のヌクレオチド４〜２８、及び配列番号１１７のヌクレオチド５〜３０、配列番号１１８のヌクレオチド８〜２８、配列番号１１９のヌクレオチド８〜３０、配列番号１２０のヌクレオチド８〜２９、配列番号１２１のヌクレオチド４〜３３、配列番号１２２のヌクレオチド７〜３４、配列番号１２３のヌクレオチド９〜３４、配列番号１２４のヌクレオチド８〜３４、配列番号１２５のヌクレオチド６〜２８、配列番号１２６のヌクレオチド７〜２８、配列番号１２７のヌクレオチド３〜２７、配列番号１２８のヌクレオチド７〜３２、配列番号１２９のヌクレオチド４〜２７、配列番号１３０のヌクレオチド６〜２７、及び配列番号１３１のヌクレオチド８〜２９からなる群より選択される配列を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号９７〜１３１からなる群より選択される配列を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３７】
前記標識が、フルオロフォアである、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３８】
前記フルオロフォアが、前記ポリヌクレオチドの末端に共有結合している、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
配列番号１０３のヌクレオチド５〜２６、配列番号１０４のヌクレオチド４〜２７、配列番号１０５のヌクレオチド７〜３０、配列番号１０７のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０８のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０９のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１１のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１４のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１５のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１６のヌクレオチド４〜２８、配列番号１１７のヌクレオチド５〜３０、配列番号１１８のヌクレオチド８〜２８、配列番号１１９のヌクレオチド８〜３０、配列番号１２３のヌクレオチド９〜３４、配列番号１２４のヌクレオチド８〜３４、配列番号１２８のヌクレオチド７〜３２、及び配列番号１２９のヌクレオチド４〜２７からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット１２、セット１４〜２７、セット３９、セット４１〜５４、セット６６、及びセット６８〜８１からなる群より選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項４０】
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２８、及び配列番号１２９からなる群より選択される配列を含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記標識ポリヌクレオチドの前記配列が、配列番号１１５であり、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット２０、セット２４、セット４７、セット５１、セット７４、及びセット７８からなる群より選択される、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
ポリヌクレオチドの前記セットが、セット２０またはセット２４である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
配列番号９７のヌクレオチド５〜３４、配列番号９８のヌクレオチド５〜３１、配列番号９９のヌクレオチド３〜３１、配列番号１００のヌクレオチド５〜３０、配列番号１０１のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０６のヌクレオチド５〜２７、配列番号１１０のヌクレオチド６〜３０、配列番号１１２のヌクレオチド６〜２９、配列番号１２０のヌクレオチド８〜２９、配列番号１２１のヌクレオチド４〜３３、及び配列番号１２２のヌクレオチド７〜３４からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット１２〜２７、セット３９〜５４、及びセット６６〜８１からなる群より選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項４４】
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１２０、配列番号１２１、及び配列番号１２２からなる群より選択される配列を含む、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
配列番号１２５のヌクレオチド６〜２８及び配列番号１２６のヌクレオチド７〜２８からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット１２、セット１４〜１８、セット２０、セット２４、セット２７、セット３９、セット４１〜４５、セット４７、セット５１、セット５４、セット６６、セット６８〜７２、セット７４、セット７８、及びセット８１からなる群より選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項４６】
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号１２５及び配列番号１２６からなる群より選択される配列を含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
配列番号１１３のヌクレオチド８〜３１及び配列番号１２７のヌクレオチド３〜２７からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット１４〜２７、セット４１〜５４、及びセット６８〜８１からなる群より選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項４８】
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号１１３及び配列番号１２７からなる群より選択される配列を含む、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
配列番号１３０のヌクレオチド６〜２７を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット１２〜２０、セット２２〜２７、セット３９〜４７、セット４９〜５４、セット６６〜７４、及びセット７６〜８１からなる群より選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項５０】
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号１３０を含む、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
配列番号１０２のヌクレオチド６〜３０及び配列番号１３１のヌクレオチド８〜２９からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドをさらに含み、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット１３、セット４０、及びセット６７からなる群より選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項５２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１０２及び配列番号１３１からなる群より選択される配列を含む、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記プローブが、フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンである、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記モレキュラービーコンが、配列番号９７のヌクレオチド５〜３４、配列番号９８のヌクレオチド５〜３１、配列番号９９のヌクレオチド３〜３１、配列番号１００のヌクレオチド５〜３０、配列番号１０１のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０２のヌクレオチド６〜３０、配列番号１０３のヌクレオチド５〜２６、配列番号１０４のヌクレオチド４〜２７、配列番号１０５のヌクレオチド７〜３０、配列番号１０６のヌクレオチド５〜２７、配列番号１０７のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０８のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０９のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１０のヌクレオチド６〜３０、配列番号１１１のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１２のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１３のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１４のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１５のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１６のヌクレオチド４〜２８、配列番号１１７のヌクレオチド５〜３０、配列番号１１８のヌクレオチド８〜２８、配列番号１１９のヌクレオチド８〜３０、配列番号１２０のヌクレオチド８〜２９、配列番号１２１のヌクレオチド４〜３３、配列番号１２２のヌクレオチド７〜３４、配列番号１２３のヌクレオチド９〜３４、配列番号１２４のヌクレオチド８〜３４、配列番号１２５のヌクレオチド６〜２８、配列番号１２６のヌクレオチド７〜２８、配列番号１２７のヌクレオチド３〜２７、配列番号１２８のヌクレオチド７〜３２、配列番号１２９のヌクレオチド４〜２７、及び配列番号１３０のヌクレオチド６〜２７からなる群より選択される配列を含む、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記モレキュラービーコンが、配列番号９７〜配列番号１３０からなる群より選択される配列を含む、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号１１５からなる、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含む、モレキュラービーコンであって、前記ポリヌクレオチドが、配列番号９７のヌクレオチド５〜３４、配列番号９８のヌクレオチド５〜３１、配列番号９９のヌクレオチド３〜３１、配列番号１００のヌクレオチド５〜３０、配列番号１０１のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０２のヌクレオチド６〜３０、配列番号１０３のヌクレオチド５〜２６、配列番号１０４のヌクレオチド４〜２７、配列番号１０５のヌクレオチド７〜３０、配列番号１０６のヌクレオチド５〜２７、配列番号１０７のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０８のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０９のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１０のヌクレオチド６〜３０、配列番号１１１のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１２のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１３のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１４のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１５のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１６のヌクレオチド４〜２８、配列番号１１７のヌクレオチド５〜３０、配列番号１１８のヌクレオチド８〜２８、配列番号１１９のヌクレオチド８〜３０、及び配列番号１２０のヌクレオチド８〜２９からなる群より選択される配列を含む、前記モレキュラービーコン。
【請求項５８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号９９〜配列番号１２０からなる群より選択される配列を含む、請求項５７に記載のモレキュラービーコン。
【請求項５９】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号９９〜配列番号１２０からなる群より選択される配列からなる、請求項５８に記載のモレキュラービーコン。
【請求項６０】
前記フルオロフォアが、ＦＡＭであり、前記クエンチャーが、ＢＨＱ１である、請求項５７に記載のモレキュラービーコン。
【請求項６１】
前記フルオロフォアが、ＡＴＴＯ５６５またはＡｌｅｘａ５９４であり、前記クエンチャーが、ＢＨＱ１またはＢＨＱ２である、請求項５７に記載のモレキュラービーコン。
【請求項６２】
試験試料中のクラミジア・トラコマチスの検出方法であって、前記方法が、
（ａ）前記試験試料から核酸を抽出すること、
（ｂ）ステップ（ａ）で抽出された核酸を、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ及び配列特異的プライマーセットを含む反応混合物と反応させることにより、標的配列を増幅することであって、前記配列特異的プライマーセットが、セット１〜セット８１からなる群より選択される、前記増幅すること、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）の増幅産物の有無を検出することであって、前記増幅産物の存在が、前記試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を示す、前記検出すること、を含む、前記方法。
【請求項６３】
前記標的配列のステップ（ｂ）の前記増幅が、約６０℃〜約６７℃で３０分未満実施される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記増幅ステップが、１５分未満実施される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記増幅ステップが、１０分未満実施される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記増幅ステップが、６分未満実施される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記反応混合物が、逆転写酵素をさらに含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
前記増幅産物の有無の検出が、標識に結合しているポリヌクレオチドを含むプローブと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６９】
前記標識が、フルオロフォアである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記フルオロフォアが、前記ポリヌクレオチドの末端に共有結合している、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号９７のヌクレオチド５〜３４、配列番号９８のヌクレオチド５〜３１、配列番号９９のヌクレオチド３〜３１、配列番号１００のヌクレオチド５〜３０、配列番号１０１のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０２のヌクレオチド６〜３０、配列番号１０３のヌクレオチド５〜２６、配列番号１０４のヌクレオチド４〜２７、配列番号１０５のヌクレオチド７〜３０、配列番号１０６のヌクレオチド５〜２７、配列番号１０７のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０８のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０９のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１０のヌクレオチド６〜３０、配列番号１１１のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１２のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１３のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１４のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１５のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１６のヌクレオチド４〜２８、配列番号１１７のヌクレオチド５〜３０、配列番号１１８のヌクレオチド８〜２８、配列番号１１９のヌクレオチド８〜３０、配列番号１２０のヌクレオチド８〜２９、配列番号１２１のヌクレオチド４〜３３、配列番号１２２のヌクレオチド７〜３４、配列番号１２３のヌクレオチド９〜３４、配列番号１２４のヌクレオチド８〜３４、配列番号１２５のヌクレオチド６〜２８、配列番号１２６のヌクレオチド７〜２８、配列番号１２７のヌクレオチド３〜２７、配列番号１２８のヌクレオチド７〜３２、配列番号１２９のヌクレオチド４〜２７、配列番号１３０のヌクレオチド６〜２７、及び配列番号１３１のヌクレオチド８〜２９からなる群より選択される配列を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号９７〜１３０からなる群より選択される配列を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号１０３のヌクレオチド５〜２６、配列番号１０４のヌクレオチド４〜２７、配列番号１０５のヌクレオチド７〜３０、配列番号１０７のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０８のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０９のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１１のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１４のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１５のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１６のヌクレオチド４〜２８、配列番号１１７のヌクレオチド５〜３０、配列番号１１８のヌクレオチド８〜２８、配列番号１１９のヌクレオチド８〜３０、配列番号１２３のヌクレオチド９〜３４、配列番号１２４のヌクレオチド８〜３４、配列番号１２８のヌクレオチド７〜３２、及び配列番号１２９のヌクレオチド４〜２７からなる群より選択される配列を含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット１２、セット１４〜２７、セット３９、セット４１〜５４、セット６６、及びセット６８〜８１からなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７４】
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２８、及び配列番号１２９からなる群より選択される配列を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記標識ポリヌクレオチドの前記配列が、配列番号１１５であり、前記配列特異的プライマーセットが、セット２０、セット２４、セット４７、セット５１、セット７４、及びセット７８からなる群より選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記配列特異的プライマーセットが、セット２０またはセット２４である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号９７のヌクレオチド５〜３４、配列番号９８のヌクレオチド５〜３１、配列番号９９のヌクレオチド３〜３１、配列番号１００のヌクレオチド５〜３０、配列番号１０１のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０６のヌクレオチド５〜２７、配列番号１１０のヌクレオチド６〜３０、配列番号１１２のヌクレオチド６〜２９、配列番号１２０のヌクレオチド８〜２９、配列番号１２１のヌクレオチド４〜３３、及び配列番号１２２のヌクレオチド７〜３４からなる群より選択される配列を含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット１２〜２７、セット３９〜５４、及びセット６６〜８１からなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７８】
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１２０、配列番号１２１、及び配列番号１２２からなる群より選択される配列を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号１２５のヌクレオチド６〜２８及び配列番号１２６のヌクレオチド７〜２８からなる群より選択される配列を含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット１２、セット１４〜１８、セット２０、セット２４、セット２７、セット３９、セット４１〜４５、セット４７、セット５１、セット５４、セット６６、セット６８〜７２、セット７４、セット７８、及びセット８１からなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項８０】
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号１２５及び配列番号１２６からなる群より選択される配列を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号１１３のヌクレオチド８〜３１及び配列番号１２７のヌクレオチド３〜２７からなる群より選択される配列を含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット１４〜２７、セット４１〜５４、及びセット６８〜８１からなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項８２】
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号１１３及び配列番号１２７からなる群より選択される配列を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号１３０のヌクレオチド６〜２７を含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット１２〜２０、セット２２〜２７、セット３９〜４７、セット４９〜５４、セット６６〜７４、及びセット７６〜８１からなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項８４】
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号１３０を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記標識ポリヌクレオチドが、配列番号１０２のヌクレオチド６〜３０及び配列番号１３１のヌクレオチド８〜２９からなる群より選択される配列を含み、配列特異的プライマーセットが、セット１３、セット４０、及びセット６７からなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項８６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１０２及び配列番号１３１からなる群より選択される配列を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
クラミジア・トラコマチスが、１００ＩＦＵ／ｍＬ以下の濃度で前記試験試料中に存在する、請求項６２に記載の方法。
【請求項８８】
クラミジア・トラコマチスが、５０ＩＦＵ／ｍＬ以下の濃度で前記試験試料中に存在する、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
クラミジア・トラコマチスが、５ＩＦＵ／ｍＬ以下の濃度で前記試験試料中に存在する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
クラミジア・トラコマチスが、２ＩＦＵ／ｍＬ以下の濃度で前記試験試料中に存在する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
クラミジア・トラコマチスが、５ＩＦＵ／ｍｌ以下の濃度で前記試験試料中に存在し、前記増幅ステップが、１５分未満実施される、請求項８７に記載の方法。
【請求項９２】
クラミジア・トラコマチスが、１０ＩＦＵ／ｍｌ以下の濃度で前記試験試料中に存在し、前記増幅ステップが、６分未満実施される、請求項８７に記載の方法。
【請求項９３】
請求項３１に記載の組成物を含む、キット。
【請求項９４】
鎖置換ポリメラーゼをさらに含む、請求項９３に記載のキット。
【請求項９５】
フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンをさらに含み、前記ポリヌクレオチドが、配列番号９７のヌクレオチド５〜３４、配列番号９８のヌクレオチド５〜３１、配列番号９９のヌクレオチド３〜３１、配列番号１００のヌクレオチド５〜３０、配列番号１０１のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０２のヌクレオチド６〜３０、配列番号１０３のヌクレオチド５〜２６、配列番号１０４のヌクレオチド４〜２７、配列番号１０５のヌクレオチド７〜３０、配列番号１０６のヌクレオチド５〜２７、配列番号１０７のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０８のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０９のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１０のヌクレオチド６〜３０、配列番号１１１のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１２のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１３のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１４のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１５のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１６のヌクレオチド４〜２８、配列番号１１７のヌクレオチド５〜３０、配列番号１１８のヌクレオチド８〜２８、配列番号１１９のヌクレオチド８〜３０、配列番号１２０のヌクレオチド８〜２９、配列番号１２１のヌクレオチド４〜３３、配列番号１２２のヌクレオチド７〜３４、配列番号１２３のヌクレオチド９〜３４、配列番号１２４のヌクレオチド８〜３４、配列番号１２５のヌクレオチド６〜２８、配列番号１２６のヌクレオチド７〜２８、配列番号１２７のヌクレオチド３〜２７、配列番号１２８のヌクレオチド７〜３２、配列番号１２９のヌクレオチド４〜２７、配列番号１３０のヌクレオチド６〜２７、及び配列番号１３１のヌクレオチド８〜２９からなる群より選択される配列を含む、請求項９４に記載のキット。
【請求項９６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号９７〜配列番号１３１からなる群より選択される配列を含む、請求項９５に記載のキット。
【請求項９７】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号９７〜配列番号１３１からなる群より選択される配列からなる、請求項９６に記載のキット。
【請求項９８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１１５からなり、ポリヌクレオチドの前記セットが、セット２０またはセット２４である、請求項９７に記載のキット。
【請求項９９】
試験試料中のクラミジア・トラコマチスの検出方法であって、前記方法が、
（ａ）前記試験試料から核酸を抽出すること、
（ｂ）ステップ（ａ）で抽出された前記核酸を、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ及び配列特異的ＬＡＭＰプライマーセットを含む反応混合物と１０分未満反応させることにより、標的配列を増幅すること、ならびに
（ｃ）ステップ（ｂ）の増幅産物の有無を検出することであって、前記増幅産物の存在が、前記試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を示す、前記検出すること、を含む、前記方法。
【請求項１００】
クラミジア・トラコマチスが、１００ＩＦＵ／ｍＬ以下の濃度で前記試験試料中に存在する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
クラミジア・トラコマチスが、１０ＩＦＵ／ｍＬ以下の濃度で前記試験試料中に存在する、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記増幅ステップが、ステップ（ａ）で抽出された前記核酸を、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ及び配列特異的プライマーセットを含む反応混合物と反応させることを含み、前記配列特異的プライマーセットが、セット１〜セット８１からなる群より選択される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
前記増幅産物の有無の検出が、配列番号９７〜配列番号１３１からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むモレキュラービーコンと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記増幅産物の有無の検出が、配列番号９９〜配列番号１２０からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むモレキュラービーコンと、前記増幅産物をハイブリダイズさせることを含む、請求項１０２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１８年５月９日に出願された米国仮出願第６２／６６９，２３６号及び２０１８年５月１０日に出願された米国非仮出願第１５／９７６，７３３号の利益を主張し、これらの開示は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−ウェブを介して提出されており且つ全体が本明細書で参照により組み込まれる配列表を含有する。２０１９年５月８日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、ＴＳＭ−０４５ＷＯ＿ＣＲＦ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと名付けられ、サイズが、２９，９３７バイトである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、分子生物学及び核酸化学の分野に関する。本発明は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）などの病原体を検出するための方法及び試薬を提供し、従って、医学的診断及び予測の分野にも関連する。特に、本発明は、クラミジア・トラコマチスを増幅及び検出するためのポリヌクレオチド及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
性感染症（ＳＴＩ）のための迅速で手頃なサンプルイン−アンサーアウトのポイントオブケア（ＰＯＣ）診断プラットフォームの開発に対する差し迫ったニーズがある。毎年世界中で１５〜４９歳の男性及び女性において、著しい罹患率及び死亡率を引き起こす治療可能なＳＴＩ、すなわち、ナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（ＮＧ）、クラミジア・トラコマチス（ＣＴ）、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）（ＴＶ）、及び梅毒によるものの４億９，９００万人を超える新規患者が発生すると、世界保健機関（ＷＨＯ）は推定する。サハラ以南のアフリカの女性における未処置の淋菌及びクラミジア感染症は、不妊症の介入を求める女性における不妊症の最大８５％の原因に関係があるとされている。
【０００５】
Ｃ．トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）は、米国で最も一般的な性感染症の原因である。クラミジアは、男性に尿道炎を、女性に骨盤内炎症性疾患、子宮外妊娠、及び不妊症を引き起こし得る。無症候性感染症は、男性及び女性で共に一般的であり、これは、疾患の蔓延を防ぐスクリーニングを必要とする（ＣＤＣにより推奨される）。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】各プライマーセットから生成されたアンプリコンに結合することが可能な標識ポリヌクレオチド配列またはモレキュラービーコンを特定する。
【発明の概要】
【０００７】
概要
本発明は、一部の実施形態では、セット１〜セット８１からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットを含む組成物を包含する。一部の実施形態では、組成物はさらに、プローブを含む。一部の実施形態では、プローブは、標識を含む。一部の実施形態では、プローブは、標識ポリヌクレオチドである。好ましい実施態様では、標識は、好ましくは、ポリヌクレオチドの末端に共有結合しているフルオロフォアである。特に好ましい実施形態では、プローブまたはポリヌクレオチドは、フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンである。一実施形態では、フルオロフォアは、ＦＡＭであり、クエンチャーは、ＢＨＱ１である。代替の実施態様では、フルオロフォアは、ＡＴＴＯ５６５またはＡｌｅｘａ５９４であり、クエンチャーは、ＢＨＱ１またはＢＨＱ２である。
【０００８】
一部の実施態様では、組成物は、配列番号９７のヌクレオチド５〜３４、配列番号９８のヌクレオチド５〜３１、配列番号９９のヌクレオチド３〜３１、配列番号１００のヌクレオチド５〜３０、配列番号１０１のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０２のヌクレオチド６〜３０、配列番号１０３のヌクレオチド５〜２６、配列番号１０４のヌクレオチド４〜２７、配列番号１０５のヌクレオチド７〜３０、配列番号１０６のヌクレオチド５〜２７、配列番号１０７のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０８のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０９のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１０のヌクレオチド６〜３０、配列番号１１１のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１２のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１３のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１４のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１５のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１６のヌクレオチド４〜２８、及び配列番号１１７のヌクレオチド５〜３０、配列番号１１８のヌクレオチド８〜２８、配列番号１１９のヌクレオチド８〜３０、配列番号１２０のヌクレオチド８〜２９、配列番号１２１のヌクレオチド４〜３３、配列番号１２２のヌクレオチド７〜３４、配列番号１２３のヌクレオチド９〜３４、配列番号１２４のヌクレオチド８〜３４、配列番号１２５のヌクレオチド６〜２８、配列番号１２６のヌクレオチド７〜２８、配列番号１２７のヌクレオチド３〜２７、配列番号１２８のヌクレオチド７〜３２、配列番号１２９のヌクレオチド４〜２７、配列番号１３０のヌクレオチド６〜２７、及び配列番号１３１のヌクレオチド８〜２９からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドを含む。さらなる実施態様では、標識ポリヌクレオチドは、配列番号９７〜１３１からなる群より選択される配列を含み得る。特定の実施態様では、標識ポリヌクレオチドの配列は、配列番号９７〜１３１からなる群より選択される。他の実施形態では、標識ポリヌクレオチドの配列は、配列番号９７〜１３１からなる群より選択される。
【０００９】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのセットは、セット１２、セット１４〜２７、セット３９、セット４１〜５４、セット６６、及びセット６８〜８１からなる群より選択され、組成物は、配列番号１０３のヌクレオチド５〜２６、配列番号１０４のヌクレオチド４〜２７、配列番号１０５のヌクレオチド７〜３０、配列番号１０７のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０８のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０９のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１１のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１４のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１５のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１６のヌクレオチド４〜２８、配列番号１１７のヌクレオチド５〜３０、配列番号１１８のヌクレオチド８〜２８、配列番号１１９のヌクレオチド８〜３０、配列番号１２３のヌクレオチド９〜３４、配列番号１２４のヌクレオチド８〜３４、配列番号１２８のヌクレオチド７〜３２、及び配列番号１２９のヌクレオチド４〜２７からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドを含む。一部の実施態様では、標識ポリヌクレオチドは、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２８、及び配列番号１２９からなる群より選択される配列を含む。一部の実施態様では、標識ポリヌクレオチドの配列は、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２８、及び配列番号１２９である。好ましい実施態様では、標識ポリヌクレオチドの配列は、配列番号１１５であり、ポリヌクレオチドのセットは、セット２０、セット２４、セット４７、セット５１、セット７４、及びセット７８からなる群より選択される。さらにより好ましくは、ポリヌクレオチドのセットは、セット２０またはセット２４である。
【００１０】
さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチドのセットは、セット１２〜２７、セット３９〜５４、及びセット６６〜８１からなる群より選択され、組成物は、配列番号９７のヌクレオチド５〜３４、配列番号９８のヌクレオチド５〜３１、配列番号９９のヌクレオチド３〜３１、配列番号１００のヌクレオチド５〜３０、配列番号１０１のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０６のヌクレオチド５〜２７、配列番号１１０のヌクレオチド６〜３０、配列番号１１２のヌクレオチド６〜２９、配列番号１２０のヌクレオチド８〜２９、配列番号１２１のヌクレオチド４〜３３、及び配列番号１２２のヌクレオチド７〜３４からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドを含む。より詳細には、標識ポリヌクレオチドは、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１２０、配列番号１２１、及び配列番号１２２からなる群より選択される配列を含み得る。特定の実施態様では、標識ポリヌクレオチドの配列は、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１２０、配列番号１２１、及び配列番号１２２からなる群より選択される。
【００１１】
一実施態様では、ポリヌクレオチドのセットは、セット１２、セット１４〜１８、セット２０、セット２４、セット２７、セット３９、セット４１〜４５、セット４７、セット５１、セット５４、セット６６、セット６８〜７２、セット７４、セット７８、及びセット８１からなる群より選択され、組成物は、配列番号１２５のヌクレオチド６〜２８、及び配列番号１２６のヌクレオチド７〜２８からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドを含む。特定の実施態様では、標識ポリヌクレオチドは、配列番号１２５及び配列番号１２６からなる群より選択される配列を含む。一部の実施形態では、標識ポリヌクレオチドの配列は、配列番号１２５または配列番号１２６である。
【００１２】
別の実施態様では、ポリヌクレオチドのセットは、セット１４〜２７、セット４１〜５４、及びセット６８〜８１からなる群より選択され、組成物は、配列番号１１３のヌクレオチド８〜３１、及び配列番号１２７のヌクレオチド３〜２７からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標識ポリヌクレオチドは、配列番号１１３及び配列番号１２７からなる群より選択される配列を含む。他の実施形態では、標識ポリヌクレオチドの配列は、配列番号１１３または配列番号１２７である。
【００１３】
さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチドのセットは、セット１２〜２０、セット２２〜２７、セット３９〜４７、セット４９〜５４、セット６６〜７４、及びセット７６〜８１からなる群より選択され、組成物は、配列番号１３０のヌクレオチド６〜２７を含む標識ポリヌクレオチドを含む。一部の実施態様では、標識ポリヌクレオチドは、配列番号１３０を含む。他の実施形態では、標識ポリヌクレオチドの配列は、配列番号１３０である。
【００１４】
一実施態様では、ポリヌクレオチドのセットは、セット１３、セット４０、及びセット６７からなる群より選択され、組成物は、配列番号１０２のヌクレオチド６〜３０、及び配列番号１３１のヌクレオチド８〜２９からなる群より選択される配列を含む標識ポリヌクレオチドを含む。そのような実施形態では、標識ポリヌクレオチドは、配列番号１０２及び配列番号１３１からなる群より選択される配列を含み得る。別の実施形態では、標識ポリヌクレオチドの配列は、配列番号１０２または配列番号１３１である。
【００１５】
本発明の別の態様は、フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンを提供し、ポリヌクレオチドが、配列番号９７のヌクレオチド５〜３４、配列番号９８のヌクレオチド５〜３１、配列番号９９のヌクレオチド３〜３１、配列番号１００のヌクレオチド５〜３０、配列番号１０１のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０２のヌクレオチド６〜３０、配列番号１０３のヌクレオチド５〜２６、配列番号１０４のヌクレオチド４〜２７、配列番号１０５のヌクレオチド７〜３０、配列番号１０６のヌクレオチド５〜２７、配列番号１０７のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０８のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０９のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１０のヌクレオチド６〜３０、配列番号１１１のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１２のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１３のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１４のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１５のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１６のヌクレオチド４〜２８、配列番号１１７のヌクレオチド５〜３０、配列番号１１８のヌクレオチド８〜２８、配列番号１１９のヌクレオチド８〜３０、及び配列番号１２０のヌクレオチド８〜２９からなる群より選択される配列を含む。
【００１６】
本発明のさらに別の態様は、試験試料中のクラミジア・トラコマチスを検出する方法を提供し、方法は、（ａ）試験試料から核酸を抽出すること、（ｂ）鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ及び配列特異的プライマーセットを含む反応混合物と、ステップ（ａ）で抽出された核酸を反応させることにより、標的配列を増幅すること（該配列特異的プライマーセットが、セット１〜セット８１からなる群より選択される）、ならびに、（ｃ）ステップ（ｂ）の増幅産物の有無を検出すること（該増幅産物の存在が、試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を示す）を含む。一実施形態では、標的配列のステップ（ｂ）の増幅は、約６０℃〜約６７℃で３０分未満実施される。好ましくは、増幅ステップは、１５分未満、１０分未満、または６分未満実施される。一部の実施態様では、反応混合物はさらに、逆転写酵素を含む。一部の実施態様では、クラミジア・トラコマチスは、１００ＩＦＵ／ｍＬ以下、５０ＩＦＵ／ｍＬ以下、５ＩＦＵ／ｍＬ以下、または２ＩＦＵ／ｍＬ以下の濃度で試験試料中に存在する。一実施態様では、クラミジア・トラコマチスは、５ＩＦＵ／ｍｌ以下の濃度で試験試料中に存在し、増幅ステップは、１５分未満実施される。別の実施態様では、クラミジア・トラコマチスは、１０ＩＦＵ／ｍｌ以下の濃度で試験試料中に存在し、増幅ステップは、６分未満実施される。
【００１７】
特定の実施形態では、増幅産物の有無の検出は、標識に結合しているポリヌクレオチドを含むプローブと、増幅産物をハイブリダイズさせることを含む。好ましい実施態様では、標識は、好ましくは、ポリヌクレオチドの末端に共有結合しているフルオロフォアである。特に好ましい実施形態では、プローブまたはポリヌクレオチドは、フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンである。一実施形態では、フルオロフォアは、ＦＡＭであり、クエンチャーは、ＢＨＱ１である。代替の実施態様では、フルオロフォアは、ＡＴＴＯ５６５またはＡｌｅｘａ５９４であり、クエンチャーは、ＢＨＱ１またはＢＨＱ２である。本方法は、本明細書に記載の、プライマーセット及び標識ポリヌクレオチドの任意の組み合わせ、例えば、モレキュラービーコン、を使用して実施することができる。図１は、各プライマーセットから得られたアンプリコンに結合することが可能であり、それ故、試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を検出するのに有用である標識ポリヌクレオチド配列、またはモレキュラービーコンを特定する。
【００１８】
本発明のさらに別の態様は、セット１〜セット８１からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットを含む組成物を含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットはさらに、鎖置換ポリメラーゼ、及び任意に逆転写酵素を含む。特定の実施形態では、キットは、フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含むモレキュラービーコンを含み、ポリヌクレオチドが、配列番号９７のヌクレオチド５〜３４、配列番号９８のヌクレオチド５〜３１、配列番号９９のヌクレオチド３〜３１、配列番号１００のヌクレオチド５〜３０、配列番号１０１のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０２のヌクレオチド６〜３０、配列番号１０３のヌクレオチド５〜２６、配列番号１０４のヌクレオチド４〜２７、配列番号１０５のヌクレオチド７〜３０、配列番号１０６のヌクレオチド５〜２７、配列番号１０７のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０８のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０９のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１０のヌクレオチド６〜３０、配列番号１１１のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１２のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１３のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１４のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１５のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１６のヌクレオチド４〜２８、配列番号１１７のヌクレオチド５〜３０、配列番号１１８のヌクレオチド８〜２８、配列番号１１９のヌクレオチド８〜３０、配列番号１２０のヌクレオチド８〜２９、配列番号１２１のヌクレオチド４〜３３、配列番号１２２のヌクレオチド７〜３４、配列番号１２３のヌクレオチド９〜３４、配列番号１２４のヌクレオチド８〜３４、配列番号１２５のヌクレオチド６〜２８、配列番号１２６のヌクレオチド７〜２８、配列番号１２７のヌクレオチド３〜２７、配列番号１２８のヌクレオチド７〜３２、配列番号１２９のヌクレオチド４〜２７、配列番号１３０のヌクレオチド６〜２７、及び配列番号１３１のヌクレオチド８〜２９からなる群より選択される配列を含む。モレキュラービーコンのポリヌクレオチド配列は、配列番号９７〜配列番号１３１からなる群より選択される配列を含み得る。一部の実施形態では、モレキュラービーコンのポリヌクレオチド配列は、配列番号９７〜配列番号１３１からなる群より選択される配列からなる。一実施形態では、モレキュラービーコンのポリヌクレオチド配列は、配列番号１１５からなり、ポリヌクレオチドのセットは、セット２０またはセット２４である。
【００１９】
本発明のさらに別の態様は、試験試料中のクラミジア・トラコマチスを検出する方法を提供し、方法は、（ａ）試験試料から核酸を抽出すること、（ｂ）鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ及び配列特異的ＬＡＭＰプライマーセットを含む反応混合物と、ステップ（ａ）で抽出された核酸を１０分未満反応させることにより、標的配列を増幅すること、ならびに、（ｃ）ステップ（ｂ）の増幅産物の有無を検出すること、を含み、該増幅産物の存在が、試験試料中のクラミジア・トラコマチスの存在を示す。一部の実施態様では、クラミジア・トラコマチスは、１００ＩＦＵ／ｍＬ以下、５０ＩＦＵ／ｍＬ以下、５ＩＦＵ／ｍＬ以下、または２ＩＦＵ／ｍＬ以下の濃度で試験試料中に存在する。特定の実施態様では、増幅ステップは、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ及び配列特異的プライマーセットを含む反応混合物と、ステップ（ａ）で抽出された核酸を反応させること、を含み、該配列特異的プライマーセットが、セット１〜セット８１からなる群より選択される。そのような実施態様では、増幅産物の有無の検出は、配列番号９７〜配列番号１３１からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むモレキュラービーコンと、増幅産物をハイブリダイズさせることを含み得る。一部の実施態様では、増幅産物の有無の検出は、配列番号９９〜配列番号１２０からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含むモレキュラービーコンと、増幅産物をハイブリダイズさせることを含む。
【００２０】
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、試験試料は、クラミジア・トラコマチスに加えて、１つ以上の他の微生物を含み、クラミジア・トラコマチス由来の標的配列が１つ以上の他の微生物由来のポリヌクレオチド配列よりも優先的に増幅される。
【００２１】
一部の実施形態では、本発明は、配列番号１〜９６のいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％同一の核酸配列、及び試験試料中のクラミジア・トラコマチスを検出する、それらの核酸配列の使用方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号９９のヌクレオチド３〜３１、配列番号１００のヌクレオチド５〜３０、配列番号１０１のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０２のヌクレオチド６〜３０、配列番号１０３のヌクレオチド５〜２６、配列番号１０４のヌクレオチド４〜２７、配列番号１０５のヌクレオチド７〜３０、配列番号１０６のヌクレオチド５〜２７、配列番号１０７のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０８のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０９のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１０のヌクレオチド６〜３０、配列番号１１１のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１２のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１３のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１４のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１５のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１６のヌクレオチド４〜２８、及び配列番号１１７のヌクレオチド５〜３０からなる群のうちのいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％同一の核酸配列、ならびに試験試料中のクラミジア・トラコマチスを検出する、それらの核酸配列の使用方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
詳細な説明
低濃度の種（試料中の数個の分子または微生物まで）の検出は、医学における課題である。本発明は、クラミジア・トラコマチスの選択的検出に関する。特に、核酸増幅、特に、ＲＴ−ＬＡＭＰ、を利用する新しい検出方策、及びモレキュラービーコン検出に基づいて、クラミジア感染症は、本明細書に記載の方法及び試薬を使用して診断することができる。標的領域としてＲＮＡ（リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）またはメッセンジャーＲＮＡのいずれか）を使用すると、Ｃ．トラコマチスゲノム毎の標的の複数のコピーが提供される。従って、これにより、ゲノム毎の複数のコピーで存在する場合であっても、ゲノムＤＮＡを標的とする手法と比較して、本明細書に記載のアプローチを利用する試料中のＣ．トラコマチスの検出が容易になる。加えて、本明細書に記載のモレキュラービーコン検出試薬は、さらなる特異性を提供し、ほとんどの場合、オフターゲット増幅ＤＮＡに結合することができず、それにより、例えば、偽陽性の出現を最小限に抑える。この特異性は、とりわけ、以下に提供される実施例４に示される。本発明の他の多くの特徴も、本明細書に記載される。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「核酸」は、非標準ヌクレオチドを含有するＤＮＡ及びＲＮＡを含む、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含む。「核酸」は、少なくとも１つのポリヌクレオチド（「核酸鎖」）を含有する。「核酸」は、一本鎖または二本鎖であってよい。「核酸」という用語は、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）巨大分子及びリボ核酸（ＲＮＡ）巨大分子を構成するヌクレオチド及びヌクレオシドを指す。最も一般的な核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）である。さらに、本発明が、とりわけ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、及びスレオース核酸（ＴＮＡ）などの人工ヌクレオチドを含有する生物学的配列に使用することができることを理解すべきである。好ましくは、人工ヌクレオチドは、［アルファ］−Ｌ−ＬＮＡを含むロックされた核酸分子である。ＬＮＡは、リボース環が、少なくとも１つのＬＮＡモノマーを含有する２’−酸素及び４’−炭素間のメチレンブリッジ、すなわち、オリゴヌクレオチド、つまり、１つの２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシルヌクレオチド、により「ロック」されるリボ核酸アナログを含む。ＬＮＡ塩基は、標準的なワトソン−クリック塩基対を形成するが、ロックされた構成により、塩基対反応の速度及び安定性が向上する（Ｊｅｐｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４，１３０−１４６（２００４））。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び／またはそれらのアナログを含有する２つ以上のヌクレオチド、例えば、修飾骨格（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）もしくはホスホロチオエート）または修飾塩基を含有するもの、を含有するポリマー鎖を指す。「ポリヌクレオチド」は、プライマー、オリゴヌクレオチド、核酸鎖などを含む。ポリヌクレオチドは、標準または非標準ヌクレオチドを含有してもよい。従って、用語は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組み換え核酸、分岐核酸、プラスミド、ベクター、プローブ、プライマーなどを含む。通常は、ポリヌクレオチドは、鎖の一端に５’リン酸を含有し（「５’末端」）、他端に３’ヒドロキシル基を含有する（「３’末端」）。ポリヌクレオチドのほとんどの５’ヌクレオチドは、本明細書では、ポリヌクレオチドの「５’末端ヌクレオチド」と呼ばれてもよい。ポリヌクレオチドのほとんどの３’ヌクレオチドは、本明細書では、ポリヌクレオチドの「３’末端ヌクレオチド」と呼ばれてもよい。本発明の核酸は、ＲＮＡの形態をとる場合、５’キャップを有しても、有さなくてもよい。
【００２５】
ＬＡＭＰは、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼまたは他の鎖置換ポリメラーゼにより実施される自動サイクル鎖置換ＤＮＡ合成に依存する核酸増幅法である。増幅産物は、標的のいくつかの反復配列を有するステムループ構造であり、複数のループを有する。本方法の主なメリットは、ＤＮＡテンプレートの変性が必要とされないので、ＬＡＭＰ反応が（６０〜６７℃の範囲の）等温条件下で実施することができることである。ＬＡＭＰは、標的配列内の６つの異なるハイブリダイゼーション部位を認識する１つの酵素及び４種のプライマーのみを必要とする。２つの追加プライマーを追加することにより、反応を促進することができる。本方法は、大量の増幅産物を生成して、反応混合物の濁度または蛍光の視覚的判断による検出などの、より容易な検出をもたらす。
【００２６】
簡単に言うと、反応は、一対の『ループ形成』プライマー（順方向及び逆方向内側プライマー、それぞれ、ＦＩＰ及びＢＩＰ）のアニーリング及び伸長、続いて、一対の隣接プライマーのアニーリング及び伸長（Ｆ３及びＢ３）により開始される。これらのプライマーの伸長は、ループ形成要素の鎖置換をもたらし、これは、折りたたまれて、末端ヘアピンループ構造を形成する。これらのキー構造が出現すると、増幅プロセスは、自立的になり、反応混合物中のヌクレオチドの全て（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰ）が増幅ＤＮＡに組み込まれるまで、一定の温度で（ＰＣＲのような周期的ではなく）連続的及び指数関数的に進行する。任意に、反応を加速するプライマーのさらなる対が含まれる可能性がある。ループプライマーと呼ばれるこれらのプライマーは、内部プライマーのダンベル型産物の非内部プライマー結合末端ループにハイブリダイズする。
【００２７】
本明細書で使用される「プライマー」という用語は、核酸鎖（テンプレート）に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下、すなわち、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの重合剤の存在下、ならびに好適な温度及びｐＨに置かれる場合に、合成の開始点として作用することが可能なオリゴヌクレオチドを指す。
【００２８】
ＬＡＭＰは、多くの場合、最速のリアルタイムＰＣＲ試験に相当する３０分未満の反応時間で、ＰＣＲよりも高い感度及び特異性での標的ＤＮＡ配列の増幅を可能にする。増幅される標的配列は通常、長さが２００〜３００塩基対（ｂｐ）であり、反応は、増幅プロセス中に、同時にいくつかのプライマーが、この配列の１２０ｂｐ〜１６０ｂｐを認識することに依存する。この高レベルのストリンジェンシーにより、増幅が非常に特異的になり、その結果、反応における増幅ＤＮＡの出現は、標的配列全体が最初に存在した場合にのみ生じる。
【００２９】
ＬＡＭＰの応用はさらに、逆転写酵素（ＲＴ）の追加によるＲＮＡ分子の検出を含むように拡張されている。ＲＮＡ検出を含むことにより、ＬＡＭＰを適用することができる標的のタイプも拡張され、ＲＮＡベースのウイルス、重要な調節非コードＲＮＡ（ｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、及び特定の疾患または生理学的状態と関連しているＲＮＡ分子をさらに標的とする能力を追加する。ＲＮＡを検出する能力は、例えば、高度に発現され、安定した、及び／または豊富なメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）標的を選択する際に、アッセイ感度を向上させる可能性も有する。増幅のこの予備段階は、ＲＮＡ分子の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）への逆転写を含む。次に、ｃＤＮＡは、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼのテンプレートとして機能する。熱安定性ＲＴ酵素の使用（すなわち、ＮＥＢ  ＲＴｘ）により、反応が単一の温度及び１ステップの単一混合反応で完了することが可能になる。
【００３０】
本明細書で使用される「標的配列」は、本明細書で提供されるポリヌクレオチドのうちの１つ以上を使用して増幅されるか、検出されるか、または増幅及び検出されるクラミジア・トラコマチスまたはその補体の核酸配列を意味する。さらに、標的配列という用語は場合により、二本鎖核酸配列を指すこともあるが、当業者らは、標的配列が、一本鎖、例えば、ＲＮＡでもあり得ることを理解するであろう。特定の生物に多少特異的である標的配列が選択されてもよい。例えば、標的配列は、属全体、複数の属、種もしくは亜種、血清群、栄養要求型、血清型、株、分離株、または生物の他のサブセットに特異的であってよい。
【００３１】
本明細書に記載のプライマー／プローブ組成物及び方法の速度、特異性、及び感度は、いくつかの態様から生じる。本発明による組成物及び方法で使用される例示的なプライマーは、以下を含む。
【００３２】
（表１）プライマー配列
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2021522818.tif 000004
2021522818.tif 000005
【００３３】
ＬＡＭＰ増幅産物の検出は、様々な方法で達成することができる。好ましい実施形態では、産物の検出は、蛍光標識プローブをプライマー混合物に添加することにより行われる。本明細書で使用される「プローブ」という用語は、標的配列と相補的または実質的に相補的な部分（複数可）を含む一本鎖核酸分子を指す。特定の実施態様では、蛍光標識プローブは、モレキュラービーコンである。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「モレキュラービーコン」は、溶液中の特定の核酸の存在を報告するように設計された一本鎖ヘアピン型オリゴヌクレオチドプローブを指す。モレキュラービーコンは、４つの構成要素：ステム、ヘアピンループ、端に標識されたフルオロフォア、及び反対端に標識されたクエンチャーからなる（Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：４９−５３）。ヘアピン様ビーコンが標的に結合していない場合、フルオロフォア及びクエンチャーは、互いに近くにあり、蛍光は、抑制される。相補的な標的ヌクレオチド配列の存在下では、ビーコンのステムは、標的にハイブリダイズするように開いている。これにより、フルオロフォア及びクエンチャーが分離されて、フルオロフォアが蛍光を発することが可能になる。あるいは、モレキュラービーコンは、端に標識されたドナーの近くで発光するフルオロフォアも含む。「波長シフトモレキュラービーコン」は、フルオロフォアがより強く発光することを可能にするさらなるハーベスターフルオロフォアを組み込む。モレキュラービーコンの現在の概説は、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ，４８（５）：８５６−８７０；Ｃｉｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ３９３（１）：１２５−３５；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ３７３（４）：４５７−６１；及びＣａｄｙ，２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５５４：３６７−７９を含む。
【００３５】
一実施態様では、モレキュラービーコンは、フルオロフォア、クエンチャー、及びポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドが、配列番号９７のヌクレオチド５〜３４、配列番号９８のヌクレオチド５〜３１、配列番号９９のヌクレオチド３〜３１、配列番号１００のヌクレオチド５〜３０、配列番号１０１のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０２のヌクレオチド６〜３０、配列番号１０３のヌクレオチド５〜２６、配列番号１０４のヌクレオチド４〜２７、配列番号１０５のヌクレオチド７〜３０、配列番号１０６のヌクレオチド５〜２７、配列番号１０７のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０８のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０９のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１０のヌクレオチド６〜３０、配列番号１１１のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１２のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１３のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１４のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１５のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１６のヌクレオチド４〜２８、配列番号１１７のヌクレオチド５〜３０、配列番号１１８のヌクレオチド８〜２８、配列番号１１９のヌクレオチド８〜３０、及び配列番号１２０のヌクレオチド８〜２９からなる群より選択される配列を含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号９９〜配列番号１２０からなる群より選択される配列を含む。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号９９〜配列番号１２０からなる群より選択される配列からなる。上記の配列を有するポリヌクレオチドは、１つ以上の非天然ヌクレオシドまたは結合、例えば、とりわけ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、及びトレオース核酸（ＴＮＡ）を含み得る。一部の実施形態では、モレキュラービーコンのポリヌクレオチドは、１〜６つのロックされた核酸を含む。好ましい実施形態では、モレキュラービーコンのポリヌクレオチドは、３つのロックされた核酸を含む。別の好ましい実施形態では、モレキュラービーコンのポリヌクレオチドは、４つのロックされた核酸を含む。
【００３６】
モレキュラービーコンは、好ましくは、配列特異的ＬＡＭＰプライマーのセットも含む組成物で使用される。一実施態様では、モレキュラービーコンは、配列番号９７のヌクレオチド５〜３４、配列番号９８のヌクレオチド５〜３１、配列番号９９のヌクレオチド３〜３１、配列番号１００のヌクレオチド５〜３０、配列番号１０１のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０２のヌクレオチド６〜３０、配列番号１０３のヌクレオチド５〜２６、配列番号１０４のヌクレオチド４〜２７、配列番号１０５のヌクレオチド７〜３０、配列番号１０６のヌクレオチド５〜２７、配列番号１０７のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０８のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０９のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１０のヌクレオチド６〜３０、配列番号１１１のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１２のヌクレオチド６〜２９、配列番号１１３のヌクレオチド８〜３１、配列番号１１４のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１５のヌクレオチド５〜２９、配列番号１１６のヌクレオチド４〜２８、配列番号１１７のヌクレオチド５〜３０、配列番号１１８のヌクレオチド８〜２８、配列番号１１９のヌクレオチド８〜３０、配列番号１２０のヌクレオチド８〜２９、配列番号１２１のヌクレオチド４〜３３、配列番号１２２のヌクレオチド７〜３４、配列番号１２３のヌクレオチド９〜３４、配列番号１２４のヌクレオチド８〜３４、配列番号１２５のヌクレオチド６〜２８、配列番号１２６のヌクレオチド７〜２８、配列番号１２７のヌクレオチド３〜２７、配列番号１２８のヌクレオチド７〜３２、配列番号１２９のヌクレオチド４〜２７、及び配列番号１３０のヌクレオチド６〜２７からなる群より選択される配列を含む。そのような実施態様では、モレキュラービーコンは、配列番号９７〜配列番号１３０からなる群より選択される配列を含み得る。より好ましくは、モレキュラービーコンのポリヌクレオチド配列は、配列番号９７〜配列番号１３０からなる群より選択される配列からなる。特に好ましい実施態様では、モレキュラービーコンのポリヌクレオチド配列は、配列番号１１５である。
【００３７】
セット１２〜２７、セット３９〜５４、及びセット６６〜８１からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットを含む組成物に含まれる場合、モレキュラービーコンは、好ましくは、配列番号９７のヌクレオチド５〜３４、配列番号９８のヌクレオチド５〜３１、配列番号９９のヌクレオチド３〜３１、配列番号１００のヌクレオチド５〜３０、配列番号１０１のヌクレオチド６〜２９、配列番号１０６のヌクレオチド５〜２７、配列番号１１０のヌクレオチド６〜３０、配列番号１１２のヌクレオチド６〜２９、配列番号１２０のヌクレオチド８〜２９、配列番号１２１のヌクレオチド４〜３３、及び配列番号１２２のヌクレオチド７〜３４からなる群より選択される配列を含む。より詳細には、モレキュラービーコンは、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１２０、配列番号１２１、及び配列番号１２２からなる群より選択される配列を含み得る。特定の実施態様では、モレキュラービーコンのポリヌクレオチド配列は、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１２０、配列番号１２１、及び配列番号１２２からなる群より選択される。
【００３８】
セット１２、セット１４〜１８、セット２０、セット２４、セット２７、セット３９、セット４１〜４５、セット４７、セット５１、セット５４、セット６６、セット６８〜７２、セット７４、セット７８、及びセット８１からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットを含む組成物に含まれる場合、モレキュラービーコンは、好ましくは、配列番号１２５のヌクレオチド６〜２８、及び配列番号１２６のヌクレオチド７〜２８からなる群より選択される配列を含む。特定の実施態様では、モレキュラービーコンは、配列番号１２５及び配列番号１２６からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含み得る。一部の実施形態では、モレキュラービーコンのポリヌクレオチド配列は、配列番号１２５または配列番号１２６である。
【００３９】
セット１４〜２７、セット４１〜５４、及びセット６８〜８１からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットと組み合わせて使用される場合、モレキュラービーコンは、好ましくは、配列番号１１３のヌクレオチド８〜３１及び配列番号１２７のヌクレオチド３〜２７からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、モレキュラービーコンの標識ポリヌクレオチドは、配列番号１１３及び配列番号１２７からなる群より選択される配列を含む。他の実施形態では、モレキュラービーコンのポリヌクレオチド配列は、配列番号１１３または配列番号１２７である。
【００４０】
セット１２〜２０、セット２２〜２７、セット３９〜４７、セット４９〜５４、セット６６〜７４、及びセット７６〜８１からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットを含む組成物に含まれる場合、モレキュラービーコンは、好ましくは、配列番号１３０のヌクレオチド６〜２７を含む。一部の実施態様では、モレキュラービーコンは、配列番号１３０を含む。他の実施形態では、モレキュラービーコンのポリヌクレオチド配列は、配列番号１３０である。
【００４１】
セット１３、セット４０、及びセット６７からなる群より選択されるポリヌクレオチドのセットと組み合わせて使用される場合、モレキュラービーコンは、好ましくは、配列番号１０２のヌクレオチド６〜３０及び配列番号１３１のヌクレオチド８〜２９からなる群より選択される配列を含む。そのような実施形態では、モレキュラービーコンは、配列番号１０２及び配列番号１３１からなる群より選択される配列を含み得る。別の実施形態では、モレキュラービーコンのポリヌクレオチド配列は、配列番号１０２または配列番号１３１である。
【００４２】
本明細書で使用される「標識」という用語は、検出することが可能な、任意に、定量化することが可能な、特性または特徴を有する分子または部分を意味する。標識は、例えば（且つ限定されないが）放射性同位元素、フルオロフォア、化学発光団、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子などと同様に、直接的に検出することができるか、または、例えば、特定の結合メンバーと同様に、間接的に検出され得る。直接的に検出可能な標識は、標識の検出及び／または定量化を可能にするために、例えば、基質、トリガー試薬、消光部分、光などの追加の構成要素を必要とし得ることが理解されるであろう。間接的に検出可能な標識は、使用される場合、通常、「コンジュゲート」と組み合わせて使用される。コンジュゲートは通常、直接的に検出可能な標識に結合または連結されている特定の結合メンバーである。コンジュゲートを合成するためのカップリング化学は、当該技術分野で周知であり、例えば、特定の結合メンバーの特定の結合性または標識の検出可能な特性を破壊しない任意の化学的手段及び／または物理的手段を含み得る。本明細書で使用される場合、「特異的結合メンバー」は、結合対のメンバー、すなわち、分子の一方が、例えば、化学的または物理的手段を介して、他方の分子に特異的に結合する２つの異なる分子、を意味する。抗原及び抗体特異的結合対に加えて、他の特異的結合対は、アビジン及びビオチン；ハプテン及びハプテンに特異的な抗体；相補的ヌクレオチド配列；酵素補因子または基質及び酵素；などが含まれるが、これらに限定されることは意図されない。
【００４３】
モレキュラービーコンは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸のみで構成することができるか、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）コンジュゲートで構成することができる。フルオロフォアは、任意の蛍光有機色素または単一量子ドットであり得る。消光部分は、望ましくは、フルオロフォアの発光を消光する。フルオロフォアの発光を消光する任意の好適な消光部分を使用することができる。フルオロフォアは、当該技術分野で既知の任意の蛍光マーカー／色素であり得る。好適な蛍光マーカーの例としては、Ｆａｍ、Ｈｅｘ、Ｔｅｔ、Ｊｏｅ、Ｒｏｘ、Ｔａｍｒａ、Ｍａｘ、Ｅｄａｎｓ、Ｃｙ５などのＣｙ色素、フルオレセイン、クマリン、エオシン、ローダミン、Ｂｏｄｉｐｙ、Ａｌｅｘａ、Ｃａｓｃａｄｅブルー、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ、ルシファーイエロー、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、及びＡＴＴＯ色素のファミリーが挙げられるが、これらに限定されない。クエンチャーは、当該技術分野で既知の任意のクエンチャーであり得る。クエンチャーの例としては、Ｄａｂｃｙｌ、Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、ＥｌｌｅＱｕｅｎｃｈｅｒ、Ｔａｍｒａ、ＢＨＱ、及びＱＳＹが挙げられるが、これらに限定されない（それらの全ては、登録商標である）。当業者は、プローブを設計する場合、色素／クエンチャーのどの組み合わせが適切であるかを知っているであろう。例示的な実施形態では、フルオレセイン（ＦＡＭ）は、Ｂｌａｃｋｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）（ＢＨＱ（商標））（Ｎｏｖａｔｏ、カリフォルニア州）と組み合わせて使用される。次に、モレキュラービーコンの増幅産物への結合を、直接視覚的に評価することができる。あるいは、感度を向上させるために、蛍光レベルを分光法で測定することができる。
【００４４】
Ａｂｉｎｇｄｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ（英国；ｗｗｗ．ａｂｉｎｇｄｏｎｈｅａｌｔｈ．ｃｏｍ）、Ａｔｔｏｓｔａｒ（米国ミネソタ州；ｗｗｗ．ａｔｔｏｓｔａｒ．ｃｏｍ）、Ｂｉｏｌｅｇｉｏ（オランダ；ｗｗｗ．ｂｉｏｌｅｇｉｏ．ｃｏｍ）、Ｂｉｏｍｅｒｓ．ｎｅｔ（ドイツ；ｗｗｗ．ｂｉｏｍｅｒｓ．ｎｅｔ）、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国カリフォルニア州；ｗｗｗ．ｂｉｏｓｅａｒｃｈｔｅｃｈ．ｃｏｍ）、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（ベルギー；ｗｗｗ．ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ．ｃｏｍ）、Ｇｅｎｅ  Ｌｉｎｋ（米国ニューヨーク州；ｗｗｗ．ｇｅｎｅｌｉｎｋ．ｃｏｍ）、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国アイオワ州；ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ）、Ｉｓｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（オランダ；ｗｗｗ．ｉｓｏｇｅｎ−ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ（米国テキサス州；ｗｗｗ．ｏｌｉｇｏｓ．ｃｏｍ）、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ（ドイツ；ｗｗｗ．ｅｕｒｏｆｉｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｅｕ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国テキサス州；ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（米国マサチューセッツ州；ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．ｃｏｍ）、ＴＩＢ  ＭＯＬＢＩＯＬ（ドイツ；ｗｗｗ．ｔｉｂ−ｍｏｌｂｉｏｌ．ｄｅ）、ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国カリフォルニア州；ｗｗｗ．ｔｒｉｌｉｎｋｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ）を含む様々な商用サプライヤーが、標準及びカスタムモレキュラービーコンを製造する。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）製のＳｅｎｔｉｎｅｌ（商標）モレキュラービーコン対立遺伝子識別キットならびにＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ  ＳＡ（ベルギー、ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ．ｃｏｍ）及びＩｓｏｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＢＶ（オランダ、ｉｓｏｇｅｎ．ｃｏｍ）製の種々のキットなどのモレキュラービーコンを利用する様々なキットも市販されている。
【００４５】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーは、任意に、当該技術分野で既知の本質的にあらゆる手法を使用して調製される。特定の実施形態では、例えば、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーは、例えば、参照により組み込まれるＢｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．２２（２０）：１８５９−１８６２で記載される固相ホスホルアミダイトトリエステル法、または例えば、参照により組み込まれるＮｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８に記載される自動合成を使用する当該技術分野で既知の別の合成手法によるものを含む、本質的にあらゆる核酸合成法を使用して化学的に合成される。自動オリゴヌクレオチド合成のための多種多様な装置が市販されている。マルチヌクレオチド合成アプローチ（例えば、トリヌクレオチド合成など）も任意に利用される。さらに、本明細書に記載のプライマー核酸は、任意に、種々の修飾を含む。さらに説明するために、プライマーはまた、任意に、例えば、参照により組み込まれる１９９９年１２月１４日に発行された米国特許第６，００１，６１１号に記載される増幅反応の特異性を改善するように修飾される。プライマー及びプローブはまた、本明細書に記載されるか、または別途当該技術分野で知られる種々の他の修飾を用いて合成することができる。
【００４６】
さらに、本質的にあらゆる核酸（及び、標準であれ非標準であれ、実質上あらゆる標識核酸）は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、及び他の多くのものなどの様々な商用供給元のいずれかにカスタムまたは標準で注文することができる。
【００４７】
試験試料は一般に、クラミジア感染症と疑われる対象、通常は、哺乳動物対象、より一般的には、ヒト対象、に由来するか、またはそれらから単離される。例示的な試料または標本としては、血液、血漿、血清、尿、滑液、精液、精漿、前立腺液、膣液、頸管粘液、子宮液、頸管擦過物、羊水、肛門擦過物、粘液、痰、組織などが挙げられる。例えば、擦過、静脈穿刺、スワビング、生検、または当該技術分野で既知の他の手法を含む、これらの試料を取得するための本質的にあらゆる手法が任意に利用される。
【００４８】
本明細書で使用される「試験試料」という用語は、標的配列を含有すると疑われるか、または潜在的に含有する生物または生体液から採取された試料を意味する。試験試料は、任意の生物学的供給源、例えば、組織、血液、唾液、痰、粘液、汗、尿、尿道スワブ、頸管スワブ、膣スワブ、泌尿生殖器または肛門スワブ、結膜スワブ、眼レンズ液、脳脊髄液、乳、腹水、滑液、腹腔液、羊水、発酵ブロス、細胞培養物、化学反応混合物などから採取することができる。試験試料は、（ｉ）供給元から入手されるものとしてすぐに、または（ｉｉ）前処理後に試料の特性を改変するために使用することができる。従って、試験試料は、例えば、血液から血漿または血清を調製すること、細胞またはウイルス粒子を破壊すること、固体材料から液体を調製すること、粘性流体を希釈すること、液体を濾過すること、液体を蒸留すること、液体を濃縮すること、干渉成分の不活化、試薬の添加、核酸の精製などにより、使用前に前処理することができる。
【００４９】
有利なことに、本発明は、尿試料などの臨床試料中のクラミジア・トラコマチスの信頼できる迅速な検出を可能にする。
【００５０】
さらに、説明するために、本明細書に記載の標的核酸を分析する前に、それらの核酸は、異なる成分の複雑な混合物を通常含む試料から精製または単離されてもよい。収集された試料中の細胞は通常、細胞の内容物を放出するために溶解される。例えば、特定の試料中のＣ．トラコマチス及び他の細胞は、それらを種々の酵素、化学物質と接触させることにより溶解させることができ、及び／または、例えば、細菌の細胞壁を分解する当該技術分野で既知の他のアプローチにより溶解させることができる。一部の実施形態では、核酸は、細胞溶解物において直接分析される。他の実施形態では、核酸はさらに、検出の前に細胞溶解物から精製または抽出される。本質的にあらゆる核酸抽出方法は、本発明の方法で利用される試料中の核酸を精製するために、使用することができる。核酸を精製するために使用することができる例示的な手法としては、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、固体支持体に固定化されたプローブへのハイブリダイゼーション、液液抽出（例えば、フェノール−クロロホルム抽出など）、沈殿（例えば、エタノールなどを使用する）、濾紙を用いる抽出、ミセル形成試薬（例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミドなど）を用いる抽出、固定化されたインターカレーション色素（例えば、臭化エチジウム、アクリジンなど）への結合、シリカゲルもしくは二原子土への吸着、カオトロピック条件下での磁性ガラス粒子もしくは有機シラン粒子への吸着、及び／または同類のものが挙げられる。試料処理はまた、例えば、米国特許第５，１５５，０１８号、同第６，３８３，３９３号、及び同第５，２３４，８０９号（これらはそれぞれ、参照により組み込まれる）に記載される。
【００５１】
試験試料は、任意に、増幅効率及び／または定性的精度及び／または定量的精度を改善するために、当業者が既知の任意の手法に従って処理及び／または精製されていることがある。従って、試料は、精製、単離、または化学合成により得られたかどうかに関わらず、排他的または本質的に核酸（複数可）からなってもよい。試験試料からＤＮＡなどの核酸を単離または精製したい当業者は、例えば、頸管擦過物のＤＮＡを単離または精製するための手段を利用可能である（例えば、ＱＩＡａｍｐ−ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ−Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ、ヒルデン）。
【実施例】
【００５２】
実施例１：標的の選択及びプライマープローブの設計
細菌細胞におけるリボソーム遺伝子の構成的且つ高レベルの発現を考慮して、これらの遺伝子、特に、１６Ｓ及び２３Ｓ遺伝子を増幅アッセイの標的として選択した。
【００５３】
Ｃ．トラコマチスの複数の血清型、クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びクラミジア・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）などの密接に関連する種、ならびに尿または膣液に一般に見られる他の種の１６Ｓ及び２３Ｓ遺伝子配列をＮＣＢＩデータベースから取得した。Ｃｌｕｓｔａｌ  ｏｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：５３９）を使用して、配列をアラインし、Ｃ．トラコマチス種に固有の特定の塩基を有する領域を特定した。ＬＡＭＰデザイナー（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ）を使用して、ループ媒介増幅プライマーを設計した。特異性を高めるために、増幅産物を標的とするモレキュラービーコンまたはプローブを手動でまたはビーコンデザイナー（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ）を使用して設計した。さらに、ヒトゲノム及びＮＣＢＩヌクレオチドデータベースに対してＢＬＡＳＴを使用して、設計されたプライマーセット及びビーコンを特異性について分析した。種々のプライマーセット及びプローブを設計し、反応速度についてスクリーニングした。
【００５４】
本発明のプライマーセットは、表２にまとめられ、これは、少なくとも、フォワードインナープライマー（ＦＩＰ）及びバックワードインナープライマー（ＢＩＰ）を含む。さらに、プライマーセットは通常、フォワードアウタープライマー（Ｆ３）、バックワードアウタープライマー（Ｂ３）、フォワードループプライマー（ＬＦ）、及びバックワードループプライマー（ＬＢ）から選択される少なくとも２つの追加のプライマーも含む。
【００５５】
（表２）ＬＡＭＰプライマーセット
2021522818.tif 000006
2021522818.tif 000007
【００５６】
実施例２：増幅反応動態
２つの異なる濃度（１０３ＩＦＵ／ｍＬ及び１０ＩＦＵ／ｍＬ）の滴定されたＣ．トラコマチス（Ｚ０５４株、Ｄ−ＵＷ３（Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ）またはＡＴＣＣ血清型Ｄ株ＶＲ−８８５）を用いて、陰性尿マトリックスをスパイクした。標準的な抽出方法を使用して、核酸を抽出し、表２に記載されるＬＡＭＰプライマーセットを使用して、試料を増幅した。増幅産物の検出のために、ＹｏＰｒｏ（商標）色素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；緑色蛍光カルボシアニン核酸染色）を使用した。この例では、２５μｌの反応物は、４．８ｍＭまたは６ｍＭのＭｇＣｌ２、１．４ｍＭまたは１．６ｍＭのｄＮＴＰ、２００ｎＭのＹＯ−ＰＲＯ−１色素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、プライマー（存在する場合、０．２μＭのＦ３及びＢ３；１．６μＭのＦＩＰ及びＢＩＰ；存在する場合、０．４〜０．８μＭのＬＦ及びＬＢ）、８または１２単位のＢｓｔ２ポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、７．５単位のＲＴｘ  Ｗａｒｍｓｔａｒｔ（逆転写酵素；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ならびに抽出された核酸（テンプレートとして）または水（テンプレートなしの対照として）が補充された１Ｘの等温増幅緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有していた。反応物を６３°または６５℃でインキュベートし、ＲｏｃｈｅリアルタイムＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ９６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、反応動態を監視した。
【００５７】
この例は、このプライマーのセット及びループ媒介増幅法の使用により、高速増幅動態を達成することを示す。結果は、表３にまとめられ、陽性になるまでの時間（Ｔｐ）を機器で計算した。ＮＴは、未試験の濃度を示す。結果は、陽性になるまでの時間で分類される（ＮＴは、「未試験」を意味し、「コールなし（ｎｏ  ｃａｌｌ）」は、増幅が全く検出されなかったことを示す）。
【００５８】
（表３）陽性色素検出までの時間
2021522818.tif 000008
【００５９】
実施例３：アッセイ動態に対するビーコン設計位置の影響
上記のプライマーセットの一部及びインターカレーション色素を含有する増幅反応物は、水もしくは陰性尿抽出物、またはアッセイ時間のカットオフウィンドウの可変間隔内の、時間の０％〜７５％の範囲の頻度で、テンプレートとしてＣ．ニューモニエ（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）もしくはＣ．シタッシ（Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ）などの密接に関連する種のＤＮＡ（表４）を使用する場合、増幅産物の検出をもたらした。結果は、陽性になるまでの時間で分類される（「コールなし」は、増幅が全く検出されなかったことを示す）。
【００６０】
（表４）交差反応性−色素検出
2021522818.tif 000009
【００６１】
特異性を高めるために、Ｃ．トラコマチス標的のシグナルのみが確実に検出されるように、これらのプライマーセットに沿って、モレキュラービーコンを設計した（表５に示された配列）。標的特異的蛍光検出を提供するために含まれた５’フルオロフォア／３’クエンチャー修飾（６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）及びＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １（ＢＨＱ１））を用いて、各モレキュラービーコンプローブを設計した。
【００６２】
（表５）プローブ配列
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【００６３】
２つの異なる濃度（１０３ＩＦＵ／ｍＬ及び１０ＩＦＵ／ｍＬ）の滴定されたＣ．トラコマチス（Ｚ０５４株、Ｄ−ＵＷ３（Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ）またはＡＴＣＣ血清型Ｄ株ＶＲ−８８５）を用いて、陰性尿マトリックスをスパイクした。標準的な抽出方法を使用して、核酸を抽出し、ＬＡＭＰプライマーセット（表２で）を使用して、試料を増幅し、モレキュラービーコン（表４で）の１つを増幅産物の検出のために使用した。この例では、２５μｌの反応物は、４．８ｍＭまたは６ｍＭのＭｇＣｌ２、１．４ｍＭまたは１．６ｍＭのｄＮＴＰ、２００ｎＭのモレキュラービーコン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、プライマー（存在する場合、０．２μＭのＦ３及びＢ３；１．６μＭまたは２μＭのＦＩＰ及びＢＩＰ；存在する場合、０．４〜０．８μＭのＬＦ及びＬＢ）、８または１２単位のＢｓｔ２ポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、７．５単位のＲＴｘ  Ｗａｒｍｓｔａｒｔ（逆転写酵素；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ならびに抽出された核酸（テンプレートとして）または水（テンプレートなしの対照として）が補充された１Ｘの等温増幅緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有していた。反応物を６３℃でインキュベートし、ＲｏｃｈｅリアルタイムＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ９６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、反応動態を監視した。各プライマー−プローブの組み合わせが陽性になるまでの時間は、表６に示される。結果は、以下の通り、反応開始から、陽性になるまでの時間（Ｔｐ）で分類される：「ＮＴ」は、この組み合わせが未試験であったことを示し、「コールなし」は、増幅が全く検出されなかったことを示す。
【００６４】
（表６）陽性プローブ検出までの時間
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【００６５】
検出にモレキュラービーコンを使用すると、反応Ｔｐがわずかに増加したが、アッセイの特異性が大幅に向上し、妥当なトレードオフが得られ、４５分の試験期間内に水試料または近縁の種のＤＮＡにおいて増幅は全く観察されなかった（実施例４、表７を参照のこと）。
【００６６】
実施例４：特異性試験
滴定されたＣ．トラコマチスまたは性感染症と一般に関連する生物（例えば、ナイセリア・ゴノレエ）もしくはＣ．トラコマチスに密接に関連する種（Ｃ．ニューモニア（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）もしくはＣ．シタッシ）を用いて、陰性尿マトリックスをスパイクした。細菌ストックをＰＢＳで連続希釈した後、尿マトリックスに所望の濃度で添加した。上記の実施例３に記載の方法に従って、ＬＡＭＰプライマー及びモレキュラービーコンプローブを含有するＲＴ−ＬＡＭＰ反応におけるテンプレートとして、試験種の対応する抽出された核酸またはＤＮＡを使用した。ＮＴは、未試験の反応を示す。
【００６７】
（表７）交差反応性−プローブ検出
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【００６８】
この実施例は、ＣＴ２３Ｓアッセイ及びその反応製剤が、非常に特異的に設計され、密接に関連する生物及び性感染症に一般に関連する生物の配列との交差反応性を制限することができることを示す。
【００６９】
実施例５：感度試験
示されたプライマーセット／モレキュラービーコンの組み合わせの感度を評価するために、ＲＮＡ分子標準を種々の濃度に希釈した（表８）。標準を、ＰＢＳ中０．１ｍｇ／ｍＬのポリＡキャリアＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）で連続希釈し、ＲＴＬＡＭＰ反応における増幅のためのテンプレートとして使用した。反応の最終濃度は、４０、８、または４コピー／ｕＬであった。反応条件は、上記の実施例３に記載されたものと同等であった。増幅シグナルは、４コピー／ｕＬという低い濃度で得られた（表８を参照のこと）。
【００７０】
（表８）ＬＡＭＰ及びモレキュラービーコンによる感度
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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