(57)【要約】  特定の肺炎球菌血清型の１以上の活性化肺炎球菌多糖およびキャリアタンパク質を、キャリアタンパク質のリオスフィアおよび１以上の多糖のリオスフィアの形態で別々に凍結乾燥する、肺炎球菌莢膜多糖タンパク質コンジュゲートを生成するための方法が記載される。所定量のキャリアタンパク質リオスフィアおよび活性化多糖リオスフィアを一緒に混合し、混合物を有機溶媒中で再構成して、多糖キャリアタンパク質コンジュゲートを生成する。それぞれが特定の血清型の多糖を含む複数のコンジュゲートは、ワクチンで使用するためのコンジュゲートの組み合わせを有する多価肺炎球菌免疫原性組成物を生成するために使用できる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャリアタンパク質に共有結合した肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖を含む組成物の製造方法であって、該方法は、
（ａ）肺炎連鎖球菌血清型由来の１以上の活性化肺炎連鎖球菌多糖を含む第１のリオスフィア（ｌｙｏｓｐｈｅｒｅ）組成物、およびキャリアタンパク質を含む第２のリオスフィア組成物を提供し；
（ｂ）ある量の第１のリオスフィア組成物とある量の第２のリオスフィア組成物とを一緒に組み合わせて、キャリアタンパク質に対する１以上の活性化多糖類の所定の比率を有するリオスフィア混合物を提供し；
（ｃ）リオスフィア混合物を有機溶媒中で再構成し、混合して再構成混合物を提供し；そして、
（ｄ）再構成混合物に還元剤を添加して、１以上の肺炎連鎖球菌血清型の多糖にコンジュゲートされたキャリアタンパク質を含むコンジュゲート溶液を生成する、
ことを含む方法。
【請求項２】
第１および第２のリオスフィア組成物が、凍結乾燥および放射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水から選択される昇華乾燥プロセスによって調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１および第２のリオスフィア組成物が、凍結乾燥および放射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水から選択される昇華乾燥プロセスによって調製され、１以上の肺炎連鎖球菌血清型からの活性化肺炎連鎖球菌多糖類を含む第１の水溶液と、キャリアタンパク質および緩衝液を含む第２の水溶液を提供し、
ここで、第１および第２の水溶液は、約０．５％（ｗ／ｖ）以上のスクロースを含み、そして、第１および第２の水溶液を昇華乾燥プロセスに供して、第１および第２のリオスフィア組成物を生成することを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
緩衝液が、５．０〜７．０のｐＨ範囲の、ヒスチジン、コハク酸、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、または酢酸緩衝液である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
緩衝液が、５．０〜７．０のｐＨ範囲のリン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
第１および第２のリオスフィア組成物が、それぞれ６％未満の水分含量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
有機溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
再構成が８分以下で行われ、混合が１２０分以下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
コンジュゲート溶液が、重量対重量基準で約０．６〜約１．５の多糖対キャリアタンパク質の比でキャリアタンパク質にコンジュゲートされた多糖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
コンジュゲート溶液が、溶液中の全多糖の約１５％未満である遊離多糖量を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
１以上の多糖が、血清型１，２，３，４，５，６Ａ，６Ｂ，６Ｃ，６Ｄ，６Ｅ，６Ｇ，６Ｈ，７Ｆ，７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，８，９Ａ，９Ｌ，９Ｎ，９Ｖ，１０Ｆ，１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃ，１１Ｆ，１１Ａ，１１Ｂ，１１Ｃ，１１Ｄ，１１Ｅ，１２Ｆ，１２Ａ，１２Ｂ，１３，１４，１５Ｆ，１５Ａ，１５Ｂ，１５Ｃ，１６Ｆ，１６Ａ，１７Ｆ，１７Ａ，１８Ｆ，１８Ａ，１８Ｂ，１８Ｃ，１９Ｆ，１９Ａ，１９Ｂ，１９Ｃ，２０Ａ，２０Ｂ，２１，２２Ｆ，２２Ａ，２３Ｆ，２３Ａ，２３Ｂ，２４Ｆ，２４Ａ，２４Ｂ，２５Ｆ，２５Ａ，２７，２８Ｆ，２８Ａ，２９，３１，３２Ｆ，３２Ａ，３３Ｆ，３３Ａ，３３Ｂ，３３Ｃ，３３Ｄ，３３Ｅ，３４，３５Ｆ，３５Ａ，３５Ｂ，３５Ｃ，３６，３７，３８，３９，４０，４１Ｆ，４１Ａ，４２，４３，４４，４５，４６，４７Ｆ，４７Ａ，４８，ＣＷＰＳ１，ＣＷＰＳ２およびＣＷＰＳ３からなる群より選択される肺炎連鎖球菌血清型から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
キャリアタンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド、細菌性サイトリシンまたはニューモリシンからなる群より選択される不活化細菌性トキソイドである請求項１記載の方法。
【請求項１３】
不活化細菌性トキソイドがＣＲＭ１９７である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
コンジュゲート溶液が無菌濾過される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
肺炎連鎖球菌多糖が、酸化剤と反応することによって活性化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
２以上のコンジュゲートを含み、各コンジュゲートが、キャリアタンパク質に共有結合した１以上の血清型由来の肺炎連鎖球菌多糖を有する組成物を作製するための方法であって、該方法は；
（ａ）以下のものを提供し
（ｉ）２以上の第１の水溶液であって、各第１の水溶液は、特定の肺炎連鎖球菌血清型の活性化多糖を含み、ここで、多糖類は酸化剤と反応して、活性化された多糖類を提供し、そしてここで、２以上の第１の水溶液は、同じではなく、又は、
（ｉｉ）２以上の第１の水溶液であって、各第１の水溶液は、２以上の肺炎連鎖球菌血清型の活性化多糖類を含み、ここで、多糖類は酸化剤と反応して、活性化された多糖類を提供し、そしてここで、２以上の第１の水溶液は、同じではなく、
（ｂ）各々がキャリアタンパク質および緩衝液を含む、２以上の第２の水溶液を提供し、ここで、２以上の第２の水溶液の量は、少なくとも２以上の第１の水溶液の量に対応し；
（ｃ）２以上の第１の水溶液および２以上の第２の水溶液を、リオスフィアを製造するための昇華乾燥プロセスにおいて別々に乾燥して、２以上の第１のリオスフィア組成物を製造し、それぞれは、乾燥多糖、および２以上の第２のリオスフィア組成物を含み、それぞれは、乾燥キャリアタンパク質を含み；
（ｄ）ある量の第１のリオスフィア組成物とある量の第２のリオスフィア組成物とを独立して組み合わせて、それぞれが所定の比率の活性化多糖対キャリアタンパク質を有する複数のリオスフィア混合物を提供し；
（ｅ）複数のリオスフィア混合物を有機溶媒中で再構成し、そして混合し、複数の再構成混合物を提供し；
（ｆ）複数の再構成混合物に還元剤を添加して、複数のコンジュゲート溶液を生成し；そして
（ｇ）２以上の複数のコンジュゲート溶液を組み合わせ、２以上のコンジュゲートを含む組成物を生成し、各コンジュゲートは、キャリアタンパク質に共有結合した１以上の血清型由来の肺炎連鎖球菌多糖を有する；
ことを含む方法。
【請求項１７】
昇華乾燥プロセスが、凍結乾燥および放射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
第１および第２の水溶液が、約０．５％以上のスクロースを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
有機溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
再構成が８分以下で行われ、混合が１２０分以下で行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
各コンジュゲート溶液が、重量対重量基準で約０．６〜約１．３の多糖対キャリアタンパク質の比でキャリアタンパク質にコンジュゲートされた多糖を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
各コンジュゲート溶液が、溶液中の全多糖の約１５％未満である遊離多糖量を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
緩衝液が、５．０〜７．０のｐＨ範囲の、ヒスチジン、コハク酸、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、または酢酸緩衝液である請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
緩衝液が、５．０〜７．０のｐＨ範囲のリン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液である請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
１以上の多糖が、少なくとも１つの血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｇ、６Ｈ、７Ｆ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ｆ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１１Ｆ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１２Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１３、１４、１５Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１６Ａ、１７Ｆ、１７Ａ、１８Ｆ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ｆ、２２Ａ、２３Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２５Ｆ、２５Ａ、２７、２８Ｆ、２８Ａ、２９、３１、３２Ｆ、３２Ａ、３３Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３４、３５Ｆ、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ｆ、４１Ａ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ｆ、４７Ａ、４８、ＣＷＰＳ１、ＣＷＰＳ２、およびＣＷＰＳ３からなる群より選択される１以上の肺炎連鎖球菌血清型から得られる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
キャリアタンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド、細菌性サイトリシンまたはニューモリシンからなる群より選択される不活化細菌性トキソイドである請求項１６記載の方法。
【請求項２７】
不活化細菌性トキソイドがＣＲＭ１９７である請求項２８に記載の方法。
【請求項２８】
コンジュゲート溶液が無菌濾過される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
キャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌血清型多糖１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆを含有する多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製造方法であって、該方法は、
（ａ）２３のキャリアタンパク質リオスフィア組成物および２３の活性化多糖リオスフィア組成物を提供し、ここで、各々が、１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆから選択される肺炎連鎖球菌血清型由来の乾燥活性化多糖類を含み、ここで、２３の活性化多糖類リオスフィア組成物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖類を含まず、
（ｂ）２３のキャリアタンパク質リオスフィア組成物の各々および２３の活性化多糖リオスフィア組成物の各々を別々に組み合わせて、各々が所定の比率の活性化多糖対キャリアタンパク質を有する２３のリオスフィア混合物を提供し、ここで、２３のリオスフィア混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｃ）２３のリオスフィア混合物の各々を有機溶媒で別々に再構成し、混合して複数の再構成混合物を生成し、ここで、２３の再構成混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｄ）２３の再構成混合物の各々に還元剤を添加して、２３のコンジュゲート溶液を生成し、各々は、特定の肺炎連鎖球菌血清型の多糖にコンジュゲートされたキャリアタンパク質を含み、ここで、２３のコンジュゲート溶液のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；そして
（ｅ）２３のコンジュゲート溶液を組み合わせて、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌血清型多糖１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆを含有する多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを提供する、
ことを含む方法。
【請求項３０】
キャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌血清型多糖１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆを含有する多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製造方法であって、該方法は、
（ａ）１５のキャリアタンパク質リオスフィア組成物および１５の活性化多糖リオスフィア組成物を提供し、ここで、各々は、１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆから選択される肺炎連鎖球菌血清型由来の乾燥活性化多糖を含み、ここで、１５の活性化多糖リオスフィア組成物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｂ）１５のキャリアタンパク質リオスフィア組成物の各々と１５の活性化多糖類リオスフィア組成物の各々とを別々に組み合わせて、各々が所定の比の活性化多糖類対キャリアタンパク質を有する１５のリオスフィア混合物を提供し、ここで、１５のリオスフィア混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖類を含まず；
（ｃ）１５のリオスフィア混合物の各々を有機溶媒で別々に再構成し、混合して複数の再構成混合物を生成し、ここで、１５の再構成混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｄ）１５の再構成混合物の各々に還元剤を添加して、１５のコンジュゲート溶液を生成し、各々は、特定の肺炎連鎖球菌血清型の多糖にコンジュゲートされたキャリアタンパク質を含み、ここで、１５のコンジュゲート溶液のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；そして
（ｅ）１５のコンジュゲート溶液を組み合わせて、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌血清型多糖１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆを含有する多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを提供する；
ことを含む、方法。
【請求項３１】
キャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌血清型多糖１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆを含有する多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製造方法であって、該方法は、
（ａ）１３のキャリアタンパク質リオスフィア組成物および１３の活性化多糖リオスフィア組成物を提供し、各々は、１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆから選択される肺炎連鎖球菌血清型由来の乾燥活性化多糖を含み、ここで、１３の活性化多糖類リオスフィア組成物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖類を含まず；
（ｂ）１３のキャリアタンパク質リオスフィア組成物の各々と１３の活性化多糖類リオスフィア組成物の各々とを別々に組み合わせて、各々が所定の比率の活性化多糖類対キャリアタンパク質を有する１３のリオスフィア混合物を提供し、ここで、１３のリオスフィア混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖類を含まず；
（ｃ）１３のリオスフィア混合物の各々を有機溶媒で別々に再構成し、混合して複数の再構成混合物を生成し、ここで、１３の再構成混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖類を含まず；
（ｄ）１３の再構成混合物の各々に還元剤を添加して、１３のコンジュゲート溶液を生成し、各々は、特定の肺炎連鎖球菌血清型の多糖にコンジュゲートされたキャリアタンパク質を含み、ここで、１３のコンジュゲート溶液のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；そして
（ｅ）１３のコンジュゲート溶液を組み合わせて、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌血清型多糖１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆを含有する多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを提供する；
ことを含む方法。
【請求項３２】
キャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌血清型多糖１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆを含有する多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製造方法であって、該方法は、
（ａ）１０のキャリアタンパク質リオスフィア組成物および１０の活性化多糖リオスフィア組成物を提供し、各々は、１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆから選択される肺炎連鎖球菌血清型由来の乾燥活性化多糖を含み、ここで、１０の活性化多糖リオスフィア組成物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｂ）１０のキャリアタンパク質リオスフィア組成物の各々と１０の活性化多糖リオスフィア組成物の各々とを別々に組み合わせて、各々が所定の比率の活性化多糖対キャリアタンパク質を有する１０のリオスフィア混合物を提供し、ここで、１０のリオスフィア混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｃ）１０のリオスフィア混合物の各々を有機溶媒で別々に再構成し、混合して複数の再構成混合物を生成し、ここで、１０の再構成混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖類を含まず；
（ｄ）１０の再構成混合物の各々に還元剤を添加して、１０のコンジュゲート溶液を生成し、各々は、特定の肺炎連鎖球菌血清型の多糖にコンジュゲートされたキャリアタンパク質を含み、ここで、１０のコンジュゲート溶液のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；そして、
（ｅ）１０のコンジュゲート溶液を組み合わせて、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌血清型多糖１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆを含有する多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを提供する；
ことを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の肺炎球菌血清型の１以上の活性化された肺炎球菌多糖およびキャリアタンパク質がキャリアタンパク質のリオスフィア（ｌｙｏｓｐｈｅｒｅ）および１以上の活性化された多糖のリオスフィアの形態で別々に凍結乾燥される、肺炎球菌莢膜多糖キャリアタンパク質コンジュゲートを産生するための方法に関する。所定量のキャリアタンパク質リオスフィアおよび活性化多糖リオスフィアを一緒に混合し、混合物を有機溶媒中で再構成して、多糖キャリアタンパク質コンジュゲートを生成する。各々が特定の血清型の多糖を含む複数のコンジュゲートは、ワクチンに使用するためのコンジュゲートの組み合わせを有する多価肺炎球菌免疫原性組成物を産生するために使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
莢膜をもつ細菌の一例である肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、世界中で深刻な病気の重大な原因となっている。米国疾病対策センター（ＣＤＣ）は１９９７年、米国で毎年、肺炎球菌性髄膜炎３，０００例、肺炎球菌性菌血症５０，０００例、肺炎球菌性中耳炎７，０００，０００例、肺炎球菌性肺炎５００，０００例があると推定している。Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、ＭＭＷＲ  Ｍｏｒｂ  Ｍｏｒｔａｌ  Ｗｋｌｙ  Ｒｅｐ  １９９７，４６（ＲＲ−８）：１−１３を参照のこと。さらに、これらの疾患の合併症は、最大８％の死亡率および２５％の肺炎球菌性髄膜炎を伴う神経学的後遺症を報告している一部の研究では重大となりうる。Ａｒｄｉｔｉら、１９９８、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １０２：１０８７−９７を参照されたい。
【０００３】
長年認可されてきた多価肺炎球菌多糖体ワクチンは、成人、特に高齢者やハイリスク者の肺炎球菌疾患の予防に非常に貴重であることが証明されている。しかしながら、乳児および幼児は、非コンジュゲート型肺炎球菌多糖体に対する反応が不良である。細菌の多糖類はＴ細胞非依存性の免疫原であり、乳児では弱い応答を誘発するかまたは無応答である。細菌多糖免疫原のキャリアタンパク質への化学結合は、乳児における免疫応答をＴ細胞依存性のものに変換する。ジフテリアトキソイド（ＤＴｘ、ＤＴの化学的に解毒されたバージョン）およびＣＲＭ１９７は、それらのアミノ酸配列中にＴ細胞刺激エピトープが存在するため、細菌多糖類免疫原のためのキャリアタンパク質として記載されている。
【０００４】
したがって、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた細菌莢膜多糖を含む多糖−タンパク質結合ワクチンが開発されており、追加のものが開発中である。開発されたコンジュゲートワクチンの例には、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプｂ（Ｈｉｂ）コンジュゲートワクチン（例：ＨＩＢＴＩＴＥＲ登録商標）、および肺炎球菌（例：ＰＲＥＶＮＡＲ登録商標およびＰＲＥＶＮＡＲ１３登録商標）および髄膜炎菌（例：ＭＥＮＪＵＧＡＴＥ登録商標）に対するコンジュゲートワクチンを含む。
【０００５】
多糖抗原をキャリアタンパク質にコンジュゲートさせると、反応混合物が精製され、それにコンジュゲートされたタンパク質を有さない遊離多糖、それにコンジュゲートされた多糖抗原を有さない遊離キャリアタンパク質、および低分子量多糖タンパク質コンジュゲートを除去することができる。遊離多糖、遊離タンパク質、および低分子量コンジュゲートを精製するための様々な方法が当技術分野で知られており、例えば、疎水性クロマトグラフィー、接線限外濾過、ダイアフィルトレーションなどを含む。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ００／３８７１１号、米国特許第６，１４６，９０２号、およびＬｅｉら、２０００、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１０３：２５９−２６４を参照のこと。遊離多糖の量を減少させるための方法には、米国特許第７，７０９，００１号および米国特許出願公開２０１１０２０１７９１号に開示されているような、キャリアタンパク質および多糖の共凍結乾燥をさらに含み、これはまた、特に莢膜多糖１９Ａに関して、キャリアタンパク質と多糖の同時凍結乾燥が、キャリアタンパク質と多糖の個別の凍結乾燥よりも好ましいことを示した。ただし、共凍結乾燥は、個々の製剤と取り扱いが不便なサイクルパラメータを最適化する能力、およびキャリアタンパク質および多糖血清型の供給を希望の溶液サイズで生産する能力を排除する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＵＳ７，７０９，００１号
【特許文献２】ＵＳ２０１１０２０１７９１号
【０００７】
したがって、遊離多糖および低分子量コンジュゲートなどの不純物を含まない安定な多糖タンパク質コンジュゲートを産生する改良された方法が引き続き必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、活性化された肺炎球菌多糖類およびキャリアタンパク質がリオスフィアとして個別にまたは別々に凍結乾燥される、肺炎球菌ワクチンに使用するための多価肺炎球菌多糖類キャリアタンパク質コンジュゲートを製造するための方法を提供する。リオスフィアは所定の比率で混合され得、次いで、有機溶媒中で再構成されて、活性化された多糖およびキャリアタンパク質の再構成された混合物を提供し、次いで、これらは、一緒にコンジュゲートされて、肺炎球菌ワクチンにおいて使用するための多価肺炎球菌多糖キャリアタンパク質コンジュゲートを生成する。多糖類およびキャリアタンパク質のリオスフィアへの別個の乾燥のプロセスは多糖類およびキャリアタンパク質の共凍結乾燥に勝る種々の利点を提供し、これには個々の製剤およびサイクルパラメーターを最適化する能力、簡便な取り扱い、ならびに所望の溶液サイズを有する個々の多糖類およびキャリアタンパク質調製物を産生する能力が含まれるが、これらに限定されない。
【０００９】
本発明は、キャリアタンパク質に共有結合した肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖を含む組成物の製造方法であって、該方法は、
(ａ)肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化肺炎連鎖球菌多糖を含む第１のリオスフィア（ｌｙｏｓｐｈｅｒｅ）組成物、およびキャリアタンパク質を含む第２のリオスフィア組成物を提供し；
（ｂ）ある量の第１のリオスフィア組成物とある量の第２のリオスフィア組成物とを一緒に組み合わせて、キャリアタンパク質に対する活性化多糖類の所定の比率を有するリオスフィア混合物を提供し；
（ｃ）リオスフィア混合物を有機溶媒中で再構成し、混合して再構成混合物を提供し；そして、
（ｄ）再構成混合物に還元剤を添加して、肺炎連鎖球菌血清型多糖にコンジュゲートされたキャリアタンパク質を含むコンジュゲート溶液を生成する、
ことを含む方法、を提供する。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、キャリアタンパク質に共有結合した１以上の肺炎連鎖球菌多糖を含む組成物を作製するための方法を提供し、該方法は：
（ａ）  １以上の肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化肺炎連鎖球菌多糖を含む第１のリオスフィア組成物、およびキャリアタンパク質を含む第２のリオスフィア組成物を提供し；
（ｂ）  ある量の第１のリオスフィア組成物とある量の第２のリオスフィア組成物とを一緒に組み合わせて、キャリアタンパク質に対する１以上の活性化多糖類の所定の比率を有するリオスフィア混合物を提供し；
（ｃ）  リオスフィア混合物を有機溶媒中で再構成し、混合して再構成混合物を提供し；
（ｄ）  再構成混合物に還元剤を添加して、１以上の肺炎連鎖球菌血清型多糖にコンジュゲートされたキャリアタンパク質を含むコンジュゲート溶液を生成する、
ことを含む。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、キャリアタンパク質に共有結合した２以上の肺炎連鎖球菌多糖を含む組成物を作製するための方法を提供し、該方法は：
（ａ）  ２以上の肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化肺炎連鎖球菌多糖を含む第１のリオスフィア組成物、およびキャリアタンパク質を含む第２のリオスフィア組成物を提供し；
（ｂ）  ある量の第１のリオスフィア組成物とある量の第２のリオスフィア組成物とを一緒に組み合わせて、キャリアタンパク質に対する２以上の活性化多糖類の所定の比を有するリオスフィア混合物を提供し；
（ｃ）  リオスフィア混合物を有機溶媒中で再構成し、混合して再構成混合物を提供し；
（ｄ）  再構成混合物に還元剤を添加して、２以上の肺炎連鎖球菌血清型多糖にコンジュゲートされたキャリアタンパク質を含むコンジュゲート溶液を生成する、ことを含む。
【００１２】
本発明の方法のいずれか１つの特定の実施形態において、第１および第２のリオスフィア組成物は、凍結乾燥および放射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水（マイクロ波真空乾燥（ＭＤＶ））から選択される昇華乾燥プロセスによって調製される。
【００１３】
特定の実施形態では、第１および第２のリオスフィア組成物の各々が約６％以下の最終水分含量を有する。特定の実施形態では、第１および第２のリオスフィア組成物の各々が約５％以下の最終水分含量を有する。特定の実施形態では、第１および第２のリオスフィア組成物の各々が約４％以下の最終水分含量を有する。特定の実施形態では、第１および第２のリオスフィア組成物の各々が約３％以下の最終水分含量を有する。特定の実施形態では、第１および第２のリオスフィア組成物の各々が約２％以下の最終水分含量を有する。
【００１４】
特定の実施形態では、第１および第２のリオスフィア組成物が、１つ、２つ、またはそれ以上の肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化肺炎連鎖球菌多糖を含む第１の水溶液と、キャリアタンパク質および緩衝液を含む第２の水溶液とを昇華乾燥させて、第１および第２の乾燥組成物を生成することによって調製され、ここで、第１および第２の水溶液は、約０．５%(ｗ/ｖ)以上のスクロースを含み、そしてここで、昇華乾燥は、凍結乾燥および放射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水から選択される。特定の実施形態において、第１の水溶液は、約４％〜６％のスクロースを含み、第２の水溶液は、約４％〜８％のスクロースを含む。
【００１５】
特定の実施形態では、第１の水溶液は、約６〜９ｍｇ／ｍＬの濃度で多糖を含み、第２の水溶液は約６〜１２ｍｇ／ｍＬの濃度でキャリアタンパク質を含む。特定の実施形態では第１の水溶液は、約６または９ｍｇ／ｍＬの濃度で多糖を含み、第２の水溶液は約６、９、または１２ｍｇ／ｍＬの濃度でキャリアタンパク質を含む。
【００１６】
特定の実施形態では、有機溶媒は非プロトン性溶媒である。特定の実施形態では、非プロトン性溶媒は、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、酢酸エチルアセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトン、またはヘキサメチルリン酸トリアミドである。特定の実施形態では、有機溶媒はＤＭＳＯである。
【００１７】
本方法の特定の実施形態において、工程（ｃ）における再構成は、８分以下で行われる。特定の実施形態では、再構成は６分以下で行われる。特定の実施形態では、再構成が４分以下で行われる。特定の実施形態では、再構成は２分以下で行われる。特定の実施形態では、再構成は約２分で行われる。特定の実施形態において、再構成は、１分以下で行われる。
【００１８】
特定の実施形態では、工程（ｃ）における混合は、１２０分以下で行われる。特定の実施形態では、混合は９０分以下で行われる。特定の実施形態では、混合は６０分以下で行われる。特定の実施形態では、混合は３０分以下で行われる。特定の実施形態では、混合は１０分以下で行われる。
【００１９】
特定の実施形態では、コンジュゲート溶液は重量対重量基準で約０．６〜約１．３の多糖対キャリアタンパク質の比でキャリアタンパク質にコンジュゲートされた多糖を含む。特定の実施形態では、コンジュゲート溶液は重量対重量基準で約０．９〜約１．５の多糖対キャリアタンパク質の比でキャリアタンパク質にコンジュゲートされた多糖を含む。特定の実施形態では、コンジュゲート溶液は重量対重量基準で約０．６〜約１．５の多糖対キャリアタンパク質の比でキャリアタンパク質にコンジュゲートされた多糖を含む。
【００２０】
特定の実施形態では、コンジュゲート溶液は、溶液中の全多糖の約１５％未満である遊離多糖濃度を含む。特定の実施形態において、コンジュゲート溶液は、溶液中の全多糖の約１０％未満である遊離多糖濃度を含む。
【００２１】
特定の実施形態では、コンジュゲートが５（モル／モル）を超えるキャリアタンパク質リジン損失値を有する。
【００２２】
特定の実施形態では、コンジュゲート溶液は、重量対重量基準で約０．６〜約１．３の多糖対キャリアタンパク質の比でキャリアタンパク質にコンジュゲートされた多糖を含み、溶液中の全多糖の約１５％未満である遊離多糖濃度であり、コンジュゲートは５（モル／モル）を超えるキャリアタンパク質リジン損失値を有する。
【００２３】
特定の実施形態では、緩衝液は、５．０〜７．０のｐＨ範囲の、ヒスチジン、コハク酸、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、または酢酸緩衝液である。
【００２４】
特定の実施形態では、緩衝液は、５．０〜７．０のｐＨ範囲のリン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液である。
【００２５】
特定の実施態様において、多糖類は、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｇ、６Ｈ、７Ｆ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ｆ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１１Ｆ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１２Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１３、１４、１５Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１６Ａ、１７Ｆ、１７Ａ、１８Ｆ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ｆ、２２Ａ、２３Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２５Ｆ、２５Ａ、２７、２８Ｆ、２８Ａ、２９、３１、３２Ｆ、３２Ａ、３３Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３４、３５Ｆ、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ｆ、４１Ａ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ｆ、４７Ａ、４８、ＣＷＰＳ１、ＣＷＰＳ２、およびＣＷＰＳ３よりなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型から得られる。
【００２６】
特定の実施形態では、肺炎連鎖球菌多糖類は、酸化剤と反応することによって活性化される。
【００２７】
特定の実施形態では、キャリアタンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド、細菌細胞溶解素またはニューモリシンからなる群より選択される不活化細菌トキソイドである。特定の実施形態では、不活化細菌トキソイドは、ＣＲＭ１９７である。
【００２８】
特定の実施形態では、コンジュゲート溶液は無菌濾過される。
【００２９】
本発明は、キャリアタンパク質に共有結合した１以上の肺炎連鎖球菌多糖を含む組成物の製造方法を提供し、該方法は；
（ａ）（ｉ）１以上の肺炎連鎖球菌血清型からの活性化肺炎連鎖球菌多糖類を含む第１の水溶液、および（ｉｉ）キャリアタンパク質および緩衝液を含む第２の水溶液を提供し；
（ｂ）リオスフィアを製造するための昇華乾燥プロセスにおいて第１の水溶液および第２の水溶液を別々に乾燥して、乾燥した１以上の活性化多糖を含む第１のリオスフィア組成物および乾燥したキャリアタンパク質を含む第２のリオスフィア組成物を製造し；
（ｃ）ある量の第１のリオスフィア組成物とある量の第２のリオスフィア組成物とを一緒に組み合わせて、１以上の活性化多糖対キャリアタンパク質の所定の比率を有するリオスフィア混合物を提供し；
（ｄ）リオスフィア混合物を有機溶媒中で再構成し、混合して再構成された混合物を提供し；そして
（ｅ）再構成された混合物に還元剤を添加して、肺炎連鎖球菌血清型の１以上の活性化多糖にコンジュゲートされたキャリアタンパク質を含むコンジュゲート溶液を生成する、
ことを含む。
【００３０】
この方法の特定の実施形態においては、昇華乾燥プロセスは、凍結乾燥および放射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水から選択される。
【００３１】
特定の実施形態では、第１および第２のリオスフィア組成物の各々が約６％以下の最終水分含量を有する。特定の実施形態では、第１および第２のリオスフィア組成物の各々が約５％以下の最終水分含量を有する。特定の実施形態では、第１および第２のリオスフィア組成物の各々が約４％以下の最終水分含量を有する。特定の実施形態では、第１および第２のリオスフィア組成物の各々が約３％以下の最終水分含量を有する。特定の実施形態では、第１および第２のリオスフィア組成物の各々が約２％以下の最終水分含量を有する。
【００３２】
特定の実施形態では、第１および第２の水溶液が約０．５％以上のスクロースを含む。特定の実施形態において、第１の水溶液は約４％〜６％のスクロースを含み、第２の水溶液は、約４％〜８％のスクロースを含む。
【００３３】
特定の実施形態では、第１の水溶液は約６〜９ｍｇ／ｍＬの濃度で多糖を含み、第２の水溶液は約６〜１２ｍｇ／ｍＬの濃度でキャリアタンパク質を含む。特定の実施形態では第１の水溶液は約６または９ｍｇ／ｍＬの濃度で多糖を含み、第２の水溶液は約６、９、または１２ｍｇ／ｍＬの濃度でキャリアタンパク質を含む。
【００３４】
特定の実施形態では、有機溶媒は非プロトン性溶媒である。特定の実施形態では、非プロトン性溶媒は、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、酢酸エチルアセトニトリル、ジメチルホルムアミド、アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、またはヘキサメチルリン酸トリアミドである。特定の実施形態では、有機溶媒はＤＭＳＯである。
【００３５】
本方法の特定の実施形態において、工程（ｄ）における再構成は、８分以下で行われる。特定の実施形態では、再構成は６分以下で行われる。特定の実施形態では、再構成は４分以下で行われる。特定の実施形態では、再構成は２分以下で行われる。特定の実施形態では、再構成は約２分で行われる。特定の実施形態において、再構成は、１分以下で行われる。
【００３６】
特定の実施形態では、ステップ（ｄ）における混合は、１２０分以下で行われる。特定の実施形態では、混合は９０分以下で行われる。特定の実施形態では、混合は６０分以下で行われる。特定の実施形態では、混合は３０分以下で行われる。特定の実施形態では、混合は１０分以下で行われる。
【００３７】
特定の実施形態では、コンジュゲート溶液は、重量対重量基準で約０．６〜約１．３の多糖対キャリアタンパク質の比でキャリアタンパク質にコンジュゲートされた多糖を含む。特定の実施形態では、コンジュゲート溶液は、重量対重量基準で約０．９〜約１．５の多糖対キャリアタンパク質の比でキャリアタンパク質にコンジュゲートされた多糖を含む。特定の実施形態では、コンジュゲート溶液は、重量対重量基準で約０．６〜約１．５の多糖対キャリアタンパク質の比でキャリアタンパク質にコンジュゲートされた多糖を含む。
【００３８】
特定の実施形態では、コンジュゲート溶液は、溶液中の全多糖の約１５％未満である遊離多糖濃度を含む。特定の実施形態において、コンジュゲート溶液は、溶液中の全多糖の約１０％未満である遊離多糖濃度を含む。
【００３９】
特定の実施形態では、コンジュゲートは、５（モル／モル）を超えるキャリアタンパク質リジン損失値を有する。
【００４０】
特定の実施形態では、各コンジュゲート溶液は、重量対重量基準で約０．６〜約１．３の多糖対キャリアタンパク質の比でキャリアタンパク質にコンジュゲートされた多糖を含み、溶液中の全多糖の約１５％未満である遊離多糖濃度であり、そして、コンジュゲートは、５（モル／モル）を超えるキャリアタンパク質リジン損失値を有する。
【００４１】
特定の実施形態では、緩衝液は、５．０〜７．０のｐＨ範囲のヒスチジン、コハク酸、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、または酢酸緩衝液である。
【００４２】
特定の実施形態では、緩衝液は、５．０〜７．０のｐＨ範囲のリン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液である。
【００４３】
特定の実施態様では、１以上の多糖は、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｇ、６Ｈ、７Ｆ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ｆ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１１Ｆ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１２Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１３、１４、１５Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１６Ａ、１７Ｆ、１７Ａ、１８Ｆ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ｆ、２２Ａ、２３Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２５Ｆ、２５Ａ、２７、２８Ｆ、２８Ａ、２９、３１、３２Ｆ、３２Ａ、３３Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３４、３５Ｆ、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ｆ、４１Ａ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ｆ、４７Ａ、４８、ＣＷＰＳ１、ＣＷＰＳ２、およびＣＷＰＳ３よりなる群から選択される肺炎球菌血清型から得られる。
【００４４】
特定の実施形態では、肺炎連鎖球菌多糖類は、酸化剤と反応することによって活性化される。
【００４５】
特定の実施形態では、キャリアタンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド、細菌細胞溶解素またはニューモリシンからなる群より選択される不活化細菌トキソイドである。特定の実施形態では、不活化細菌トキソイドは、ＣＲＭ１９７である。
【００４６】
特定の実施形態では、コンジュゲート溶液は無菌濾過される。
【００４７】
本発明はさらに、２以上のコンジュゲートを含み、各コンジュゲートがキャリアタンパク質に共有結合した１以上の血清型由来の肺炎連鎖球菌多糖を有する組成物を作製するための方法を提供し、該方法は；
（ａ）（ｉ）２以上の第１の水溶液であって、各第１の水溶液は、特定の肺炎連鎖球菌血清型の活性化多糖類を含み、ここで、多糖類は酸化剤と反応して活性化された多糖類を提供し、そしてここで、２以上の第１の水溶液は同じではなく、または
（ｉｉ）２以上の第１の水溶液であって、各第１の水溶液は、２以上の肺炎連鎖球菌血清型の活性化多糖類を含み、ここで、多糖類は酸化剤と反応して、活性化された多糖類を提供し、そしてここで、２以上の第１の水溶液は同じではなく、
（ｂ）それぞれがキャリアタンパク質および緩衝液を含む２以上の第２の水溶液を提供し、２以上の第２の水溶液の量は、少なくとも２以上の第１の水溶液の量に対応し；
（ｃ）リオスフィアを製造するための昇華乾燥プロセスにおいて、２以上の第１の水溶液および２以上の第２の水溶液を別々に乾燥して２以上の第１のリオスフィア組成物を製造し、それぞれは、乾燥多糖および２以上の第２のリオスフィア組成物を含み、それぞれは、乾燥キャリアタンパク質を含み；
（ｄ）ある量の第１のリオスフィア組成物とある量の第２のリオスフィア組成物とを独立して組み合わせて、それぞれがキャリアタンパク質に対する活性化多糖の所定の比率を有する複数のリオスフィア混合物を提供し；
（ｅ）複数のリオスフィア混合物を有機溶媒中で再構成し、混合して、複数の再構成された混合物を提供し；
（ｆ）複数の再構成された混合物に還元剤を添加して、複数のコンジュゲート溶液を生成し；そして
（ｇ）２以上の複数のコンジュゲート溶液を組み合わせて、２以上のコンジュゲートを含む組成物を生成し、各コンジュゲートは、キャリアタンパク質に共有結合した１以上の血清型からの肺炎連鎖球菌多糖を有する、
ことを含む。
【００４８】
本方法の特定の実施形態では、昇華乾燥プロセスは、凍結乾燥および放射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水から選択される。
【００４９】
特定の実施形態では、第１および第２のリオスフィア組成物の各々は、約６％以下の最終水分含量を有する。特定の実施形態では、第１および第２のリオスフィア組成物の各々は、約５％以下の最終水分含量を有する。特定の実施形態では、第１および第２のリオスフィア組成物の各々は、約４％以下の最終水分含量を有する。特定の実施形態では、第１および第２のリオスフィア組成物の各々は、約３％以下の最終水分含量を有する。特定の実施形態では、第１および第２のリオスフィア組成物の各々は、約２％以下の最終水分含量を有する。
【００５０】
特定の実施形態では、第１および第２の水溶液は、約０．５％以上のスクロースを含む。特定の実施形態において、第１の水溶液は約４％〜６％のスクロースを含み、第２の水溶液は、約４％〜８％のスクロースを含む。
【００５１】
特定の実施形態では、第１の水溶液は約６〜９ｍｇ／ｍＬの濃度で多糖を含み、第２の水溶液は約６〜１２ｍｇ／ｍＬの濃度でキャリアタンパク質を含む。特定の実施形態では、第２の水溶液は、含み、第１の水溶液は、約６または９ｍｇ／ｍＬの濃度で多糖を含み、約６、９または１２ｍｇ／ｍＬの濃度でキャリアタンパク質を含む。
【００５２】
特定の実施形態では、有機溶媒は、非プロトン性溶媒である。特定の実施形態では、非プロトン性溶媒は、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、酢酸エチルアセトニトリル、ジメチルホルムアミド、アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、またはヘキサメチルリン酸トリアミドである。特定の実施形態では、有機溶媒はＤＭＳＯである。
【００５３】
本方法の特定の実施形態では、工程（ｅ）における再構成は、８分以下で行われる。特定の実施形態では、再構成は６分以下で行われる。特定の実施形態では、再構成は４分以下で行われる。特定の実施形態では、再構成は２分以下で行われる。特定の実施形態では、再構成は約２分で行われる。特定の実施形態では、再構成は、１分以下で行われる。
【００５４】
特定の実施形態では、工程（ｅ）における混合は、１２０分以下で行われる。特定の実施形態では、混合は９０分以下で行われる。特定の実施形態では、混合は６０分以下で行われる。特定の実施形態では、混合は３０分以下で行われる。特定の実施形態では、混合は１０分以下で行われる。
【００５５】
特定の実施形態では、各コンジュゲート溶液は、重量対重量基準で約０．６〜約１．３の多糖対キャリアタンパク質の比でキャリアタンパク質にコンジュゲートされた多糖を含む。特定の実施形態では、各コンジュゲート溶液は、重量対重量基準で約０．９〜約１．５の多糖対キャリアタンパク質の比でキャリアタンパク質にコンジュゲートされた多糖を含む。特定の実施形態では、各コンジュゲート溶液は、重量対重量基準で約０．６％〜約１．５の多糖対キャリアタンパク質の比でキャリアタンパク質にコンジュゲートされた多糖を含む。
【００５６】
特定の実施形態では、コンジュゲート溶液は、溶液中の全多糖の約１５％未満である遊離多糖濃度を含む。特定の実施形態において、コンジュゲート溶液は、溶液中の全多糖の約１０％未満である遊離多糖濃度を含む。
【００５７】
特定の実施形態では、コンジュゲートは、５（モル／モル）を超えるキャリアタンパク質リジン損失値を有する。
【００５８】
特定の実施形態では、各コンジュゲート溶液は、重量対重量基準で約０．６〜約１．３の多糖対キャリアタンパク質の比でキャリアタンパク質にコンジュゲートされた多糖を含み、溶液中の全多糖の約１５％未満である遊離多糖濃度であり、コンジュゲートは、５（モル／モル）を超えるキャリアタンパク質リジン損失値を有する。
【００５９】
特定の実施形態では、緩衝液は、５．０〜７．０のｐＨ範囲のヒスチジン、コハク酸、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、または酢酸緩衝液である。
【００６０】
特定の実施形態では、緩衝液は、５．０〜７．０のｐＨ範囲のリン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液である。
【００６１】
特定の実施形態では、多糖は、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｇ、６Ｈ、７Ｆ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ｆ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１１Ｆ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１２Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１３、１４、１５Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１６Ａ、１７Ｆ、１７Ａ、１８Ｆ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ｆ、２２Ａ、２３Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２５Ｆ、２５Ａ、２７、２８Ｆ、２８Ａ、２９、３１、３２Ｆ、３２Ａ、３３Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３４、３５Ｆ、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ｆ、４１Ａ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ｆ、４７Ａ、４８、ＣＷＰＳ１、ＣＷＰＳ２、およびＣＷＰＳ３よりなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型から得られる。
【００６２】
特定の実施形態では、肺炎連鎖球菌多糖類は、酸化剤と反応することによって活性化される。
【００６３】
特定の実施形態では、キャリアタンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド、細菌細胞溶解素またはニューモリシンからなる群より選択される不活化細菌トキソイドである。特定の実施形態では、不活化細菌トキソイドは、ＣＲＭ１９７である。
【００６４】
特定の実施形態では、コンジュゲート溶液は無菌濾過される。
【００６５】
本発明はさらに、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌血清型多糖１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆを含有する多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製造方法を含み：該方法は；
（ａ）２３のキャリアタンパク質リオスフィア組成物および２３の活性化多糖類リオスフィア組成物を提供し、各々は、１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆから選択される肺炎連鎖球菌血清型由来の乾燥活性化多糖類を含み、ここで、２３の活性化多糖類リオスフィア組成物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖類を含まず；
（ｂ）２３のキャリアタンパク質リオスフィア組成物の各々および２３の活性化多糖リオスフィア組成物の各々を別々に組み合わせて、各々が所定の比率の活性化多糖対キャリアタンパク質を有する２３のリオスフィア混合物を提供し、ここで、２３のリオスフィア混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｃ）２３のリオスフィア混合物の各々を有機溶媒で別々に再構成し、混合して複数の再構成混合物を生成し、ここで、２３の再構成混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｄ）２３の再構成混合物の各々に還元剤を添加して、２３のコンジュゲート溶液を生成し、各々は、特定の肺炎連鎖球菌血清型多糖にコンジュゲートされたキャリアタンパク質を含み、ここで、２３のコンジュゲート溶液のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｅ）２３のコンジュゲート溶液を組み合わせて、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌血清型多糖１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに対する多価免疫複合体又はワクチンを提供する、
ことを含む。
【００６６】
本発明はさらに、肺炎連鎖球菌血清型多糖１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに対する多価免疫複合体又はワクチンの製造方法を含み、該方法は、
（ａ）１５のキャリアタンパク質リオスフィア組成物および１５の活性化多糖リオスフィア組成物を提供し、各々は、１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆから選択される肺炎連鎖球菌血清型由来の乾燥活性化多糖を含み、ここで、１５の活性化多糖リオスフィア組成物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｂ）１５のキャリアタンパク質リオスフィア組成物の各々と１５の活性化多糖類リオスフィア組成物の各々とを別々に組み合わせて、各々が所定の比の活性化多糖類対キャリアタンパク質を有する１５のリオスフィア混合物を提供し、ここで、１５のリオスフィア混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖類を含まず；
（ｃ）１５のリオスフィア混合物の各々を有機溶媒で別々に再構成し、混合して複数の再構成混合物を生成し、ここで、１５の再構成混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｄ）１５の再構成混合物の各々に還元剤を添加して、１５のコンジュゲート溶液を生成し、各々は、特定の肺炎連鎖球菌血清型多糖にコンジュゲートされたキャリアタンパク質を含み、ここで、１５のコンジュゲート溶液のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化された多糖を含まず、そして
（ｅ）１５のコンジュゲート溶液を組み合わせて、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌血清型多糖１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆを含有する多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを提供する、
ことを含む。
【００６７】
本発明はさらに、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌血清型多糖１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆを含有する多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製造方法を提供し、該方法は：
（ａ）１３のキャリアタンパク質リオスフィア組成物および１３の活性化多糖リオスフィア組成物を提供し、各々は、１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆから選択される肺炎連鎖球菌血清型由来の乾燥活性化多糖を含み、ここで、１３の活性化多糖リオスフィア組成物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｂ）１３のキャリアタンパク質リオスフィア組成物の各々と１３の活性化多糖類リオスフィア組成物の各々とを別々に組み合わせて、各々が所定の比率の活性化多糖類対キャリアタンパク質を有する１３のリオスフィア混合物を提供し、ここで、１３のリオスフィア混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖類を含まず；
（ｃ）１３のリオスフィア混合物の各々を有機溶媒で別々に再構成し、混合して複数の再構成混合物を生成し、ここで、１３の再構成混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖類を含まず；
（ｄ）１３の再構成混合物の各々に還元剤を添加して、１３のコンジュゲート溶液を生成し、各々は、特定の肺炎連鎖球菌血清型多糖にコンジュゲートされたキャリアタンパク質を含み、ここで、１３のコンジュゲート溶液のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；そして、
（ｅ）１３のコンジュゲート溶液を組み合わせて、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌血清型多糖１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆを含有する多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを提供する、
ことを含む。
【００６８】
本発明はさらに、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌血清型多糖１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆを含有する多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製造方法を提供し、該方法は：
（ａ）１０のキャリアタンパク質リオスフィア組成物および１０の活性化多糖リオスフィア組成物を提供し、各々は、１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆから選択される肺炎連鎖球菌血清型由来の乾燥活性化多糖を含み、ここで、１０の活性化多糖リオスフィア組成物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｂ）１０のキャリアタンパク質リオスフィア組成物の各々と１０の活性化多糖リオスフィア組成物の各々とを別々に組み合わせて、各々が所定の比率の活性化多糖対キャリアタンパク質を有する１０のリオスフィア混合物を提供し、ここで、１０のリオスフィア混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｃ）１０のリオスフィア混合物の各々を有機溶媒で別々に再構成し、混合して複数の再構成混合物を生成し、ここで、１０の再構成混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖類を含まず；
（ｄ）１０の再構成混合物の各々に還元剤を添加して、１０のコンジュゲート溶液を生成し、各々は、特定の肺炎連鎖球菌血清型多糖にコンジュゲートされたキャリアタンパク質を含み、ここで、１０のコンジュゲート溶液のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；そして
（ｅ）１０のコンジュゲート溶液を組み合わせて、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌血清型多糖１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆを含有する多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを提供する、
ことを含む。
【００６９】
特定の実施形態では、第１および第２のリオスフィア組成物の各々は、約６％以下の最終水分含量を有する。特定の実施形態では、第１および第２のリオスフィア組成物の各々は、約５％以下の最終水分含量を有する。特定の実施形態では、第１および第２のリオスフィア組成物の各々は、約４％以下の最終水分含量を有する。特定の実施形態では、第１および第２のリオスフィア組成物の各々は、約３％以下の最終水分含量を有する。特定の実施形態では、第１および第２のリオスフィア組成物の各々は、約２％以下の最終水分含量を有する。
【００７０】
本方法の特定の実施形態では、昇華乾燥プロセスは、キャリアタンパク質を含む各水溶液と、多糖を含む各水溶液とを、リオスフィアビーズの形態で別々に凍結することを含む。
【００７１】
特定の実施形態では、リオスフィアキャリアタンパク質およびリオスフィア多糖組成物は、乾燥多糖およびキャリアタンパク質組成物を生成するために、複数の別個の水性多糖溶液（各水性多糖溶液は上記に列挙された特定の肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化された肺炎連鎖球菌多糖を含む）及び多数の水性キャリアタンパク質溶液（各水性キャリアタンパク質溶液は、キャリアタンパク質および緩衝液を含み）の昇華乾燥によって調製され、ここで、水性キャリアタンパク質溶液の数は少なくとも多糖水溶液の数に対応し、そしてここで、多糖およびキャリアタンパク質水溶液は、それぞれ約０．５％以上のスクロースを含み、そしてここで、昇華乾燥は、凍結乾燥および放射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水から選択される。特定の実施形態において、水性多糖溶液は、各々、約４％〜６％スクロースを含み、水性キャリアタンパク質溶液は、各々、約４％〜８％スクロースを含む。
【００７２】
特定の実施形態では、水性多糖溶液は各々、約６〜９ｍｇ／ｍＬの濃度の多糖を含み、水性キャリアタンパク質溶液は、各々、約６〜１２ｍｇ／ｍＬの濃度のキャリアタンパク質を含む。特定の実施形態では、水性多糖溶液はそれぞれ、約６または９ｍｇ／ｍＬの濃度の多糖を含み、水性キャリアタンパク質溶液はそれぞれ、約６、９、または１２ｍｇ／ｍＬの濃度のキャリアタンパク質を含む。
【００７３】
特定の実施形態では、有機溶媒は非プロトン性溶媒である。特定の実施形態では、非プロトン性溶媒は、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、酢酸エチルアセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトン、またはヘキサメチルリン酸トリアミドである。特定の実施形態では、有機溶媒はＤＭＳＯである。
【００７４】
本方法の特定の実施形態では、工程（ｃ）における再構成は、８分以下で行われる。特定の実施形態では、再構成は６分以下で行われる。特定の実施形態では、再構成は４分以下で行われる。特定の実施形態では、再構成は２分以下で行われる。特定の実施形態では、再構成は約２分で行われる。特定の実施形態において、再構成は、１分以下で行われる。
【００７５】
特定の実施形態では、ステップ（ｃ）における混合は、１２０分以下で行われる。特定の実施形態では、混合は９０分以下で行われる。特定の実施形態では、混合は６０分以下で行われる。特定の実施形態では、混合は３０分以下で行われる。特定の実施形態では、混合は１０分以下で行われる。
【００７６】
特定の実施形態では、各コンジュゲート溶液は、重量対重量基準で約０．６〜約１．３の多糖対キャリアタンパク質の比でキャリアタンパク質にコンジュゲートされた多糖を含む。特定の実施形態では、各コンジュゲート溶液は、重量対重量基準で約０．９〜約１．５の多糖対キャリアタンパク質の比でキャリアタンパク質にコンジュゲートされた多糖を含む。特定の実施形態では、各コンジュゲート溶液は、重量対重量基準で約０．６〜約１．５の多糖対キャリアタンパク質の比でキャリアタンパク質にコンジュゲートされた多糖を含む。
【００７７】
特定の実施形態では、コンジュゲート溶液は、溶液中の全多糖の約１５％未満である遊離多糖濃度を含む。特定の実施形態では、コンジュゲート溶液は、溶液中の全多糖の約１０％未満である遊離多糖濃度を含む。
【００７８】
特定の実施形態では、コンジュゲートは、５（モル／モル）を超えるキャリアタンパク質リジン損失値を有する。
【００７９】
特定の実施形態では、各コンジュゲート溶液は、重量対重量基準で約０．６〜約１．３の多糖対キャリアタンパク質の比でキャリアタンパク質にコンジュゲートされた多糖を含み、溶液中の全多糖の約１５％未満である遊離多糖濃度であり、コンジュゲートは、５（モル／モル）を超えるキャリアタンパク質リジン損失値を有する。
【００８０】
特定の実施形態では、キャリアタンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド、細菌細胞溶解素またはニューモリシンからなる群より選択される不活化細菌トキソイドである。特定の実施形態では、不活化細菌トキソイドは、ＣＲＭ１９７である。
【００８１】
特定の実施形態では、肺炎連鎖球菌多糖類は、酸化剤と反応することによって活性化される。
【００８２】
特定の実施形態では、コンジュゲート溶液は無菌濾過される。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、キャリアタンパク質（Ｐｒ）多糖（Ｐｓ）コンジュゲートを作製するための一般的なスキームを示す。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
Ｉ．定義
本明細書で使用される用語「多糖」（Ｐｓ）は、免疫学的および細菌ワクチン技術分野で一般的に使用される任意の抗原糖要素（または抗原単位）を含むことを意味し、これには、「糖」、「オリゴ糖」、「多糖」、「リポ糖」、「リポオリゴ糖（ＬＯＳ）」、「リポ多糖（ＬＰＳ）」、「グリコレート」、「グリココンジュゲート」などが含まれるが、これらに限定されない。文脈に応じて、Ｐｓは、単数であっても複数であってもよい。
【００８５】
本明細書中で使用される場合、用語「含む」は、本発明の免疫原性組成物と共に使用される場合、アジュバントおよび賦形剤のような任意の他の成分（抗原混合物についての「からなる」という言葉の制限を条件とする）の包含をいう。用語「からなる」は、多価多糖−タンパク質コンジュゲート混合物と共に使用される場合、それらの特定の肺炎連鎖球菌多糖タンパク質コンジュゲートを有し、そして異なる血清型由来の他の肺炎連鎖球菌多糖タンパク質コンジュゲートを有さない混合物をいう。
【００８６】
本明細書中で使用される場合、用語「再構成する」または「再構成」は、乾燥材料に液体を添加して、乾燥材料を溶解させて、その中に溶解された材料の溶液を提供することを指す。しかしながら、再構成によって提供される溶液は、その中に溶解した材料の濃度勾配または層を有する可能性がある。したがって、再構成後、溶液を物理的に撹拌して、再構成された材料の均質な溶液を提供する。
【００８７】
本明細書で使用される「混合」という用語は、振盪、撹拌、揺動、回転などによる溶液の物理的撹拌を指すために使用される。
【００８８】
本明細書で使用する「均質溶液」という用語は、溶液中の成分間に濃度勾配または層が存在しないように、すべての成分が完全に混合された溶液を指す。
【００８９】
本明細書で定義されるように、用語「沈殿」（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、「沈殿」（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）、「粒子形成」、「混濁」、および「凝集」は、互換的に使用され得、多糖−タンパク質コンジュゲートの凝集をもたらす任意の物理的相互作用または化学反応を指すことを意味する。凝集のプロセス（例えば、タンパク質凝集）は、熱、圧力、ｐＨ、撹拌、剪断力、凍結融解、脱水、重金属、フェノール化合物、ケイ素油、変性剤などを含む多数の物理化学的ストレスによって誘導され得る。
【００９０】
本明細書中で使用される場合、「リオスフィア」（Ｌｙｏｓｐｈｅｒｅ）は、例えば、ビーズまたは球または他の形状の形態をとる、凍結乾燥材料の別個の粒子である。リオスフィアは、リオパーティクル球またはリオビーズとも呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、リオスフィア直径は、約２〜約１２ｍｍ、好ましくは２〜８ｍｍ、例えば２．５〜６ｍｍまたは２．５〜５ｍｍである。いくつかの実施形態では、リオスフィアの体積は、約２０〜５５０μＬ、好ましくは２０〜１００μＬ、例えば２０〜５０μＬである。リオスフィアが実質的に球形でない実施形態では、リオスフィアのサイズがより長い寸法とより短い寸法との比であるそのアスペクト比に関して説明することができる。リオスフィアのアスペクト比は、０．５〜２．５、好ましくは０．７５〜２、例えば１〜１．５であり得る。
【００９１】
本明細書中で使用される場合、「免疫原性組成物」は、１以上のキャリアタンパク質にコンジュゲートされた１以上の抗原を含む多価組成物であり得る。本発明の特定の実施形態において、抗原は、カプセル化された細菌由来の糖である。このような組成物において、糖類は、ある種の細菌の表面に似た糖分子の長鎖から構成される。莢膜を有する細菌には、肺炎連鎖球菌、ナイセリア髄膜炎菌およびヘモフィルス・インフルエンザｂ型が含まれるが、これらに限定されない。抗原は、同じ生物由来であっても、異なる生物由来であってもよい。本発明の好ましい実施形態において、抗原は、肺炎連鎖球菌莢膜多糖である。
【００９２】
本明細書中で使用される場合、用語「放射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水」はまた、マイクロ波真空乾燥（ＭＶＤ）をいう。
【００９３】
ＩＩ．プロセス
本発明は、抗肺炎球菌ワクチンとして使用することができる多価肺炎球菌多糖類−タンパク質コンジュゲートを製造するための方法または方法であって、様々な昇華プロセスを使用して肺炎球菌多糖類およびキャリアタンパク質を個別に（または別々に）凍結乾燥した後、低レベルの遊離多糖類（例えば、１５％未満の遊離多糖類）を有するコンジュゲート組成物を形成する条件下、個別に凍結乾燥した多糖類およびキャリアタンパク質を混合する方法またはプロセスを提供する。
【００９４】
本発明は、低レベルの遊離多糖を有する多価肺炎球菌多糖類−タンパク質コンジュゲートを産生するための従来技術の方法に対する改良である。米国特許第７，７０９，００１号および米国特許出願公開２０１１０２０１７９１号に開示されているような従来技術の方法は、多糖類とキャリアタンパク質とを一緒に共凍結乾燥すると、低遊離多糖類（１８％未満）を有するコンジュゲート組成物が得られることが示されたが、個別に凍結乾燥された多糖類とキャリアタンパク質とを組み合わせることによって処方されたコンジュゲート組成物は、米国特許出願公開２０１１０２０１７９１号の表１に示される結果によって示されるように、キャリアタンパク質と多糖類との共凍結乾燥を使用するので、約３１％の遊離多糖類を有する組成物を生じる。
【００９５】
【表１】
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【００９６】
しかし、本発明の発明者らは、米国特許出願公開２０１１０２０１７９１号とは異なり、特定の条件下で、別々に（または個別に）凍結乾燥されたキャリアタンパク質および活性化された多糖をコンジュゲートして、高分子量コンジュゲートを含み、組成物が低レベルの遊離多糖を有する組成物を生成し得ることを発見した。これらの特定の条件は、所定量のキャリアタンパク質リオスフィアと所定量の多糖リオスフィアとを一緒に組み合わせて、リオスフィア混合物を形成し、リオスフィア混合物を有機溶媒中で再構成し、混合してコンジュゲート溶液を提供することを含む。特定の実施形態では、有機溶媒はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。キャリアタンパク質と多糖類リオスフィアを別々に再構成する代わりにこれらのリオスフィア混合物を再構成することは、一方の溶液を他方の溶液に添加することによって、または乾燥材料を溶液に溶解することによって、２つの溶液が組み合わされた場合に典型的に生じる濃度勾配を実質的に低減または排除する。濃度勾配の減少または排除は、高分子量コンジュゲートおよび少量の遊離多糖類（例えば、１５％以下の遊離多糖類）を含む組成物の収率を増加させる。本発明は、個々の製剤およびサイクルパラメーター、便利な取り扱いを最適化する能力、ならびに、所望の溶液サイズを有する個々の多糖およびキャリアタンパク質調製物を産生する能力を含み、これらに限定されない、単一組成物中の多糖およびキャリアタンパク質の共凍結乾燥に対する種々の利点を提供する。
【００９７】
図１は、キャリアータンパク質および多糖類が本明細書中に教示されるように、乾燥したリオスフィアとして混合される、キャリアータンパク質多糖類コンジュゲートを作製するための一般的なスキームを示す。
【００９８】
一般に、精製肺炎球菌莢膜多糖（Ｐｓ）粉末を別々に水に溶解し、血清型１９Ａを除く全ての血清型を０．４５ミクロン濾過する。血清型１９Ａを除く本明細書に開示されるすべての血清型をホモジナイズして、Ｐｓの分子量を減少させる。血清型１８Ｃは、９０℃以上での酸加水分解によってサイズ減少される。血清型１９Ａは、その比較的低い出発サイズのためにサイズが縮小されていない。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数は、血清型特異的標的に制御されて、血清型特異的分子量を達成する。多糖類をそれぞれ０．２２ミクロン濾過し、次いで濃縮し、オープンチャネル（５型）を有する１０ｋＤａ限外濾過膜を用いて限外濾過工程１で水に対してダイアフィルトレーションして、ダイアフィルトレート１を生成する。
【００９９】
次いで、ダイアフィルトレート１を、酢酸ナトリウム緩衝液を用いて血清型特異的温度（４〜２２℃の間）およびｐＨ（４〜５）に調節して、活性化工程の間の多糖サイズの減少を最小限にし得る。多糖類の活性化は、過ヨウ素酸塩の酸化を介して行われる。血清型４については、活性化の前に、溶液を約５０℃およびｐＨ４でインキュベートして、多糖を部分的に脱ケタル化する。多糖類の活性化は、メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始される。添加されるメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は血清型特異的であり、多糖反復単位１モル当たり約０．１〜０．５モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウムの範囲である。メタ過ヨウ素酸ナトリウムの血清型特異的電荷は、多糖活性化の標的レベル（多糖反復単位１モル当たりのアルデヒドモル数）を達成するように選択される。
【０１００】
限外濾過工程２において、全ての血清型について、活性化された多糖をダイアフィルトレーションし、次いで、開放チャネルを有する１０ｋＤａ限外濾過膜を使用する接線流限外濾過によって濃縮して、ダイアフィルトレート２を生成し得る。ダイアフィルトレーションの終わりに、ダイアフィルトレート２を１５ｇＰｓ／Ｌの目標値まで濃縮することができる。好ましくは、全ての血清型についての限外濾過が２〜８℃で行われる。
【０１０１】
次いで、ダイアフィルトレート２を水中で希釈し、スクロースを添加して最終濃度約４〜１２ｍｇ／ｍＬの多糖および０．５％〜６％（ｗ／ｖ）スクロースを作製し、リオスフィアを製造するためのプロセスにおいて昇華的に乾燥させて、６％以下の最終水分含有量を有する乾燥多糖のリオスフィアを生成する。凍結乾燥前に溶液に添加されるスクロースの量は、血清型特異的である。特定の実施形態では、２以上の多糖類を一緒に乾燥させて、乾燥多糖類混合物を生成することができる。
【０１０２】
精製したキャリアタンパク質を、５ｋＤａ接線流限外濾過膜を用いて２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．０緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、次いで０．２２ミクロンフィルターを通して濾過する。濾過した溶液を、最終濃度約６〜１２ｍｇ／ｍＬのキャリアタンパク質および４〜１０％（ｗ／ｖ）スクロースのために、水中でスクロースで希釈し、リオスフィアを製造するプロセスにおいて昇華乾燥させて、６％以下の最終含水率を有する乾燥キャリアタンパク質のリオスフィアを製造する。リオスフィアを製造するための昇華乾燥プロセスは、凍結乾燥または放射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水を含み得る。
【０１０３】
特定の実施形態では、リオスフィアは、約５％以下の最終水分含量を有する。特定の実施形態では、リオスフィアは、約４％以下の最終水分含量を有する。特定の実施形態では、リオスフィアは、約３％以下の最終水分含量を有する。特定の実施形態では、リオスフィアは、約２％以下の最終水分含量を有する。
【０１０４】
乾燥多糖類リオスフィアおよび乾燥多糖類リオスフィアを組み合わせて、多糖類リオスフィアおよびキャリアタンパク質リオスフィアを含むリオスフィア混合物を提供する。多糖類リオスフィアおよびキャリアタンパク質リオスフィアは、血清型特異的最終多糖類濃度および多糖類：キャリアタンパク質比を標的にして組み合わされる。一般に、キャリアタンパク質および多糖は、約０．６〜１．３（ｗ／ｗ）の最終コンジュゲート多糖：キャリアタンパク質比を提供する量で混合される。
【０１０５】
リオスフィア混合物は、有機溶媒、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に再構成または再溶解されて、再構成された混合物を提供する。好ましい実施形態では、有機溶媒は無水であり、特定の実施形態では、無水有機溶媒は無水ＤＭＳＯである。
【０１０６】
特定の実施形態において、再構成後、再構成された混合物は、キャリアタンパク質の均質な溶液および多糖の均質な溶液を提供するために３０分まで混合され得る。しかしながら、特定の実施形態では、混合が１２０分以下、９０分以下、６０分以下、３０分以下、または１０分以下の期間にわたって生じてもよい。特定の実施形態では、５００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）緩衝液が、１．０ｍＭリン酸ナトリウムの最終濃度のために再構成された混合物に添加される。
【０１０７】
コンジュゲーション反応を行うために、水中のシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液を調製し、１．０ｍｅｑのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖類反復単位モル当たりシアノ水素化ホウ素ナトリウム１．０モル）を再構成混合物に添加して、コンジュゲーション溶液を得る。シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液のモル濃度は、コンジュゲーション中の溶液の約０．５％の全水分含量の目標量に基づく。コンジュゲーション溶液を血清型特異的温度で血清型特異的持続時間反応させて、キャリアタンパク質：多糖コンジュゲート中間体を生成させる。
【０１０８】
次に、水素化ホウ素ナトリウムの水溶液を調製し、２．０ｍｅｑの水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位に対して）をコンジュゲーション溶液に添加する。水素化ホウ素ナトリウム溶液のモル濃度は、水素化ホウ素添加後のコンジュゲーション溶液中の約１．０％の総水分含量の目標量に基づく。コンジュゲーション溶液を、周囲温度で３時間反応させて（２時間反応させる血清型７Ｆのような特定の血清型を除く）、キャリアタンパク質：多糖コンジュゲートを生成させる。
【０１０９】
コンジュゲーション反応をクエンチするために、コンジュゲーション溶液を１５０ｍＭ塩化ナトリウム（０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を有する１５０ｍＭ塩化ナトリウム）の溶液に、特定の血清型由来の多糖を含むコンジュゲートについてゆっくりと添加して、コンジュゲーション溶液を２０%(ｖ/ｖ)以下の有機溶媒に希釈工程で希釈して、クエンチされたコンジュゲーション溶液を生成する。特定の実施形態において、温度は、希釈工程の間１５℃以下に維持される。約１時間後、１．５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ ６．０）を２５ｍＭリン酸カリウムの最終濃度まで溶液に添加する。コンジュゲーション性能は、全体的な多糖およびキャリアタンパク質消費、コンジュゲート多糖対キャリアタンパク質比、およびコンジュゲート分子量によって評価され得る。
【０１１０】
限外濾過工程３では、クエンチしたコンジュゲーション溶液を約２．５ｇ／Ｌまで濃縮し、３０ｋＤａ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム中の１５０ｍＭ塩化ナトリウムまたは２５ｍＭリン酸カリウムの約１０ジアボリュームまでに対して２〜８℃で透析濾過して、ダイアフィルトレート３を生成することができる。限外濾過工程３からのダイアフィルトレート３中の多糖類濃度は、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）紫外線多角光散乱屈折率（ＵＶ−ＭＡＬＳ−ＲＩ）によって測定することができる。いくつかの血清型（例えば、血清型１９Ｆ）由来の多糖を含むコンジュゲートについて、ダイアフィルトレート３は、０．２２ミクロンフィルターを通して濾過され、その後、２２℃で約１２０時間インキュベートされる濾液を生成し得る。
【０１１１】
限外濾過工程４では、ダイアフィルトレート３または限外濾過工程３からの濾液を、約２．５ｇ／Ｌの多糖類濃度に濃縮し、３００ｋＤａ接線流限外濾過膜を使用して２〜８℃で１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中の２０ダイアボリュームの１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジンに対してダイアフィルトレーションして、ダイアフィルトレート４を生成することができる。特定の血清型（例えば、血清型７Ｆ）由来の多糖を含むコンジュゲートについては、コンジュゲートが１００ｋＤａ接線流限外濾過膜に対してダイアフィルトレーションされ得；例えば、血清型６Ａ、６Ｂ、および１８Ｃ多糖を含むコンジュゲートは、約３．５ｇ／Ｌに濃縮され、そして３００ｋＤａ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．０３％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０（ｐＨ ７．０）を含む緩衝液に対して、２〜８℃でダイアフィルトレーションされ得、ダイアフィルトレート４を生成する。血清型７Ｆ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆ多糖を含むコンジュゲートは、約２．０ｇ／Ｌに濃縮され、そして、３００ｋＤａの再生セルロース接線流限外濾過膜を使用して、２〜８℃で、１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．０１５%(ｗ/ｖ)ポリソルベート２０、ｐＨ ７．０を含む緩衝液に対してダイアフィルトレーションして、ダイアフィルトレート４を生成し得る。ダイアフィルトレート２中の多糖類濃度は、ＨＰＳＥＣ  ＵＶ−ＭＡＬＳ−ＲＩによって測定することができる。緩衝液は、１０〜５０ｍＭの酢酸塩、リン酸塩、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ、またはヒスチジンのようなアミノ酸緩衝液であり得る。特定の実施形態では、緩衝液は１０ｍＭのＬ−ヒスチジンである。
【０１１２】
限外濾過工程４からのダイアフィルトレート４は、２２ミクロンを通して濾過して第２の濾液を生成する。第２の濾液の多糖類濃度は、ＨＰＳＥＣ  ＵＶ−ＭＡＬＳ−ＲＩによって測定することができる。第２の濾液の多糖類濃度が１．０ｇ／Ｌを超える場合、第２の濾液を、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ ７．０中の追加の１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジンで１．０ｇ／Ｌの多糖類濃度に希釈することができる。これは、一価バルクコンジュゲート中間体（ＭＢＣ）または一価薬物物質を提供する。ＭＢＣはアリコートに分注され、−６０℃〜−８０℃で凍結することができる。
【０１１３】
血清型６Ａ、６Ｂ、および１８Ｃ多糖を含むコンジュゲートについての限外濾過工程４からのダイアフィルトレート４は、二重膜０．５／０．２ミクロンフィルターを通して濾過されて、第２の濾液を生成し得る。第２の濾液の多糖類濃度は、ＨＰＳＥＣ  ＵＶ−ＭＡＬＳ−ＲＩによって測定することができる。第２の濾液の多糖類濃度が１．０ｇ／Ｌを超える場合、第２の濾液を、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０３％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０、ｐＨ７．０中の追加の１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジンで１．０ｇ／Ｌの多糖類濃度に希釈することができる。これは、ＭＢＣまたは一価の薬物物質を提供する。ＭＢＣはアリコートに分注され、−６０℃〜−８０℃で凍結することができる。
【０１１４】
血清型７Ｆ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆ多糖を含むコンジュゲートのためのダイアフィルトレート４は、０．２２ミクロンフィルターを通して濾過されて、第２の濾液を生成し得る。第２の濾液の多糖類濃度は、ＨＰＳＥＣ  ＵＶ−ＭＡＬＳ−ＲＩによって測定することができる。第２の濾液の多糖類濃度が１．０ｇ／Ｌを超える場合、第２の濾液を、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１５%(ｗ/ｖ)ポリソルベート２０、ｐＨ７．０中の追加の１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジンで１．０ｇ／Ｌの多糖類濃度に希釈することができる。これは、ＭＢＣまたは一価の薬物物質を提供する。ＭＢＣはアリコートに分注され、−６０℃〜−８０℃で凍結することができる。
【０１１５】
ＩＩＩ．  多糖類
肺炎連鎖球菌由来の莢膜多糖は、当業者に公知の標準的な技術によって調製され得る。例えば、多糖は細菌から単離することができ、既知の方法（例えば、欧州特許第ＥＰ４９７５２４号およびＥＰ４９７５２５号を参照のこと）によって、ある程度までサイズ化することができ、および特定の実施形態では、ホモジナイザーを使用してまたは化学的加水分解によって、微小流動化が達成される。一実施形態において、各多糖血清型に対応する肺炎連鎖球菌株は、大豆ベースの培地中で増殖される。次いで、個々の多糖を、遠心分離、沈殿、および限外濾過を含む標準的な工程によって精製する。例えば、米国特許出願公開２００８／０２８６８３８号および米国特許第５，８４７，１１２号を参照のこと。多糖類は粘度を低下させるために、および／または後続のコンジュゲート製品の濾過性を改善するために、サイズ化され得る。本発明において、莢膜多糖は、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆ、および３８のうちの１以上から調製される。
【０１１６】
ＩＶ．  キャリアタンパク質
本発明の特定の実施形態において、ＣＲＭ１９７は、キャリアタンパク質として使用される。ＣＲＭ１９７はジフテリア毒素の非毒性変異体（すなわち、トキソイド）である。一実施形態では、それはカザミノ酸および酵母抽出物ベースの培地中で増殖させたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ株Ｃ７（β１９７）の培養物から単離される。別の実施形態では、ＣＲＭ１９７は、米国特許第５，６１４，３８２号に記載された方法に従って組換え的に調製される。典型的には、ＣＲＭ１９７は、限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿、およびイオン交換クロマトグラフィーの組み合わせによって精製される。いくつかの実施形態において、ＣＲＭ１９７は、ＰＦＥＮＥＸ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｐｆｅｎｅｘ  Ｉｎｃ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓにおいて調製される。
【０１１７】
他の適切なキャリアタンパク質としては、さらなる不活化細菌毒素（例えば、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）、ＴＴ（破傷風トキソイド）またはＴＴのフラグメントＣ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド（例えば、国際特許出願公開ＷＯ２００４／０８３２５１に記載されるように）、Ｅｃｏｌｉ  ＬＴ、Ｅｃｏｌｉ  ＳＴ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来の外毒素Ａを含む。外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポリン、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ；国際特許出願公開ＷＯ０２／０９１９９８号参照）、肺炎球菌付着タンパク質（ＰｓａＡ）、Ａ群もしくはＢ群連鎖球菌由来のＣ５Ａペプチダーゼ、または、例えばｄＰＬＹ−ＧＭＢＳ（国際特許出願公開ＷＯ０４／０８１５１５号参照）またはＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥを含むｄＰＬＹ−ｆｏｒｍｏｌ、ＰｈｔＸ、およびＰｈｔＤＥ融合体、ＰｈｔＢＥ融合体（国際特許出願公開ＷＯ０１／９８３３４号およびＷＯ０３／５４００７号参照）などの何らかの方法で解毒されたプライを含むＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタンパク質Ｄ、肺炎球菌ニューモリシン（Ｋｕｏら、１９９５、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６３；  ２７０６−１３）などの細菌外膜タンパク質も使用することができる。他のタンパク質、例えば、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＰＰＤ）、ＰｏｒＢ（Ｎｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来）、ＰＤ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ；例えば、欧州特許第０５９４６１０Ｂ、またはその免疫学的に機能的な等価物を参照のこと）、合成ペプチド（国際特許出願公開ＷＯ９３／１７７１２号およびＷＯ９４／０３２０８号を参照のこと）、百日咳タンパク質（国際特許出願公開ＷＯ９８／５８６６８号および欧州特許ＥＰ０４７１１７７号を参照のこと）、サイトカイン、リンホカイン、成長因子またはホルモン（国際特許出願公開ＷＯ９１／０１１４６を参照のこと）、Ｎ１９タンパク質（Ｂａｒａｌｄｏｉら、２００４、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７２：４８８４−７参照）のような種々の病原体由来抗原（Ｆａｌｕｇｉら、２００１、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１：３８１６−３８２４参照）、鉄取り込みタンパク質（国際特許出願公開ＷＯ０１／７２３３７を参照のこと）、Ｃ．ディフィシルの毒素ＡまたはＢ（国際特許出願公開ＷＯ００／６１７６１を参照のこと）、およびフラジェリン（Ｂｅｎ−Ｙｅｄｉｄｉａら、１９９８、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ６４：９を参照のこと）もまた、キャリアタンパク質として使用され得る。
【０１１８】
ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Ｕｃｈｉｄａら、１９７３、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２１８：３８３８−３８４４）；ＣＲＭ９、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３およびＣＲＭ１０７、ならびに、ＮｉｃｈｏｌｌｓおよびＹｏｕｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔｏｘｉｎｓ、Ｅｄ：Ｆｒａｎｋｅｌ、Ｍａｅｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ、１９９２によって記載されている他のＤＴ突然変異体；Ｇｌｕ−１４８のＡｓｐ、ＧｌｎまたはＳｅｒおよび／またはＡｌａ１５８のＧｌｙへの欠失または突然変異、および、米国特許第４，７０９，０１７号または米国特許第４，９５０，７４０号に開示されている他の突然変異体；残基Ｌｙｓ５１６、Ｌｙｓ５２６、Ｐｈｅ５３０および／またはＬｙｓ５３４の少なくとも１以上の突然変異、ならびに米国特許第５，９１７，０１７号に開示されている他の突然変異、または米国特許第６，４５５，６７３号、または米国特許第５，８４３，７１１号で開示されている断片を使用できる。
【０１１９】
Ｖ．  昇華乾燥
リオスフィアは、例えば、進行波フォーマットでの凍結乾燥または放射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水（マイクロ波真空乾燥）、連続または半連続モードでの噴霧凍結乾燥、真空乾燥、ＲＦ乾燥などによって調製され得る。例えば、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ｆｏｏｄ、およびＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．またはＸｕ＆Ｓｕｎａｄａ、Ｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ（Ｔｏｋｙｏ）５５（１１）：１５４５−５０（２００７）参照のこと。
【０１２０】
リオスフィアは、例えば、液滴の形態（例えば、約２０、５０、１００または２５０マイクロリットル）の１以上の多糖血清型またはキャリアタンパク質を含む水溶液のアリコートを、液滴が無傷のままであるような方法で固体の平坦な表面上に負荷することによって作製され得る。本発明の一実施形態では、表面は、例えば約−１８０℃〜約−１９６℃または約−１８０℃〜約−２７３℃の温度のプレート、例えば金属プレートである。例えば、本発明の一実施形態では、水溶液は、分配チップによって表面上に装填される。本発明の態様において、水溶液は、約３ｍｌ／分〜約７５ｍｌ／分、約５ｍｌ／分〜約７５ｍｌ／分；約３ｍｌ／分〜約６０ｍｌ／分、約２０ｍｌ／分〜約７５ｍｌ／分；および約２０ｍｌ／分〜約６０ｍｌ／分の分配速度で分配される。本発明の一実施形態では、分配される水溶液は２５０マイクロリットルであり、分配速度は約５ｍＬ／分〜約７５ｍＬ／分であり、またはアリコートは１００マイクロリットルであり、分配速度は約３ｍＬ／分〜約６０ｍＬ／分である。本発明の一実施形態では、分配チップと水溶液が分配される表面との間のギャップは、約０．１ｃｍ以上（例えば、約０．５ｃｍまたは０．１ｃｍと１ｃｍとの間、または０．１ｃｍと０．７５ｃｍとの間）である。一旦表面上に置かれると、水溶液は凍結され、次いで凍結乾燥による昇華乾燥に供される。リオスフィアを作製するための方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第５６５６５９７号；国際特許出願公開ＷＯ２０１３０６６７６９号；ＷＯ２０１４０９３２０６号；ＷＯ２０１５０５７５４０号；ＷＯ２０１５０５７５４１号またはＷＯ２０１５０５７５４８号を参照のこと。
【０１２１】
ＶＩ．多糖−タンパク質コンジュゲーション
精製された多糖類は、キャリアタンパク質と反応することができる官能基を導入するために、化学的に活性化される。いったん活性化されると、各莢膜多糖は、本発明の方法に従って、キャリアタンパク質に別々にコンジュゲートされて、グルココンジュゲートを形成する。
【０１２２】
一実施形態では、多糖類の化学的活性化は、米国特許第４，３６５，１７０号；４，６７３，５７４号；および４，９０２，５０６号に記載されている手段によって達成することができる。簡単に述べると、肺炎球菌多糖類を、酸化剤、例えば過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、または過ヨウ素酸などの過ヨウ素酸塩ベースの酸化剤と反応させ、その結果、隣接ヒドロキシル基がランダムに酸化的に切断されて反応性アルデヒド基が生成される。
【０１２３】
酸化された多糖類のタンパク質キャリア上の第一級アミン基（主にリジン残基）への直接アミノ化カップリングは、還元アミノ化によって達成され得る。例えば、コンジュゲーションは、水溶液中でまたはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの有機溶媒中で、実施することができる。例えば、米国特許出願公開２０１５／０２３１２７０Ａ１、ＥＰ０４７１１７７Ｂ１、米国特許出願公開２０１１／０１９５０８６Ａ１を参照されたい。コンジュゲーション反応の終了時に、未反応のアルデヒドは、水素化ホウ素ナトリウムのような強力な還元剤の添加によってキャップされる。
【０１２４】
一実施形態では、多糖類の化学的活性化およびその後のキャリアタンパク質へのコンジュゲーションは、米国特許第４，３６５，１７０号、４，６７３，５７４号および４，９０２，５０６号に記載されている手段によって達成される。簡単に述べると、多糖を過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、または過ヨウ素酸のような過ヨウ素酸塩ベースの酸化剤と反応させて、隣接する水酸基のランダムな酸化開裂を生じさせて、反応性アルデヒド基を生成する。次いで、酸化された多糖のタンパク質キャリア上の第一級アミン基（主にリジン残基）への直接アミノ化カップリングは、還元的アミノ化によって達成され得る。例えば、コンジュゲーションは、活性化多糖およびキャリアタンパク質の混合物を、ニッケルの存在下でシアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤と反応させることによって実施される。コンジュゲーション反応は、水溶液中で、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの有機溶媒中で実施することができる。例えば、米国特許出願公開２０１５／０２３１２７０Ａ１、ＥＰ０４７１１７７ Ｂ１、米国特許出願公開２０１１／０１９５０８６Ａ１を参照されたい。コンジュゲーション反応の終結において、未反応のアルデヒドは、水素化ホウ素ナトリウムのような強力な還元剤の添加によって任意に還元される。
【０１２５】
一実施形態では、製剤化の前に、各肺炎球菌莢膜多糖を肺炎連鎖球菌から個別に精製し、活性化して反応性アルデヒドを形成し、次いでニッケルの存在下でシアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元アミノ化を用いてキャリアタンパク質に共有結合させる。ニッケルは、残留物と錯体を形成し、還元的アミノ化に使用されるシアノ水素化ホウ素ナトリウム還元剤からのシアン化物を妨害する。したがって、ニッケルは、より大きなコンジュゲーション反応効率のために、および遊離シアン化物除去を助けるために、本願の方法において使用され得る。
【０１２６】
遷移金属はシアン化物と安定な錯体を形成することが知られており、シアノ水素化ホウ素ナトリウムによるタンパク質アミノ基およびホルムアルデヒドの還元的メチル化を改善することが知られている。Ｇｉｄｌｅｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９８２，２０３：３３１−３３４；Ｊｅｎｔｏｆｔら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８０，１０６：１８６−１９０を参照のこと。しかしながら、出願人らは驚くべきことに、残留する妨害シアン化物を錯体化することによって、ニッケルの添加は、コンジュゲーションの間のタンパク質の消費を増加させ、そしてより大きく、潜在的なより免疫原性のコンジュゲートの形成をもたらすことを見出した。
【０１２７】
市販のシアノ水素化ホウ素ナトリウム試薬ロットにおける遊離シアン化物レベルの変動は、一貫しないコンジュゲーション性能をもたらし得、分子量および多糖対タンパク質比を含む、変動するコンジュゲート属性を生じる。コンジュゲーション反応へのニッケルの添加は、遊離シアン化物のレベルを減少させ、したがって、ロット間のコンジュゲート一貫性の程度を改善する。
【０１２８】
別の実施形態では、コンジュゲーション方法では、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）による多糖の活性化を使用してシアネートエステルを形成する。活性化された糖は、キャリアタンパク質上のアミノ基に直接結合され得る。
【０１２９】
代替の実施形態において、反応性の均一または不均一基は、シアネートエステルをいくつかの入手可能な態様のいずれかと反応させることにより、活性化された多糖類上に導入されるであろう。例えば、シスタミンまたはシステアミンを使用して、マレイミド活性化キャリアタンパク質（例えば、ＧＭＢＳを使用する）またはハロアセチル化キャリアタンパク質（例えば、ヨードアセチミド［例えば、ヨードアセチミドＨＣｌエチル］またはＮ−スクシンイミジルブロモアセテートもしくはＳＩＡＢ、またはＳＩＡ、またはＳＢＡＰを使用する）との反応後に得られるチオエーテル結合を介してキャリアに結合され得るチオール化多糖を調製し得る。このようなコンジュゲートは、国際特許出願公開ＷＯ９３／１５７６０、ＷＯ９５／０８３４８およびＷＯ９６／２９０９４；ならびにＣｈｕら、１９８３、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４０：２４５−２５６に記載されている。
【０１３０】
他の適切なコンジュゲーション方法は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、および／またはＴＳＴＵを使用する。多くは、国際特許出願公開第ＷＯ９８／４２７２１号に記載されている。コンジュゲーションは、糖の遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応（Ｂｅｔｈｅｌｌら、１９７９、ＪＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：２５７２−４；Ｈｅａｒｎら、１９８１、ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２１８：５０９−１８を参照のこと）、続いてキャリアタンパク質との反応によってカルバメート結合を形成することによって形成され得るカルボニルリンカーを含み得る。この化学は、炭水化物のアノマー末端を還元して第一ヒドロキシル基を形成し、続いて第一ヒドロキシルをＣＤＩと反応させてカルバメート中間体を形成し、続いてタンパク質キャリアアミノ基にカップリングすることからなる。この反応は、糖上の他の第一級ヒドロキシル基の任意の保護／脱保護を必要とし得る。
【実施例】
【０１３１】
以下の実施例は、本発明のさらなる理解を促進することを意図する。
実施例１
肺炎連鎖球菌莢膜多糖類６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆの調製。
肺炎球菌を培養する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｃｈａｓｅ，１９６７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １：５２を参照のこと。肺炎球菌莢膜多糖類を調製する方法も当技術分野で周知である。例えば、欧州特許第ＥＰ０４９７５２４号を参照のこと。肺炎球菌サブタイプの単離物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手可能である。この細菌は、血液寒天培地上でα溶血性を示す、莢膜を有する非運動性のグラム陽性、ランセット形の双球菌と同定される。サブタイプは、特異的抗血清を用いたＱｕｅｌｌｉｎｇ反応に基づいて区別することができる。米国特許第５，８４７，１１２号参照。
【０１３２】
存在する肺炎連鎖球菌血清型の各々を表す細胞バンクは、凍結バイアル中のＭｅｒｃｋ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒａｈｗａｙ、ＮＪ）から得られる。解凍した種培養物を、肺炎連鎖球菌に適切な予め滅菌した増殖培地を含む種発酵槽に移す。培養物を、温度およびｐＨを制御しながら、種発酵槽中で増殖させる。種発酵槽の全容積を、予め滅菌された増殖培地を含有する生産発酵槽に移す。生産発酵は、プロセスの最終的な細胞増殖段階である。温度、ｐＨ、および撹拌速度を制御する。
【０１３３】
発酵プロセスは、不活性化剤の添加によって終了する。不活性化後、溶液は不活性化タンクに移され、そこで制御された温度および撹拌で保持される。遠心分離と濾過の組み合わせを用いて、細胞残屑を除去する。溶液を限外濾過し、ダイアフィルトレーションする。次いで、この溶液を、不純物を除去し、そして多糖を回収する溶媒ベースの分画に供する。
【０１３４】
実施例２
多糖サイズの減少および活性化は、以下のように行われる。
精製肺炎球菌莢膜多糖（Ｐｓ）粉末約６ｇを、注射用水（ＷＦＩ）に溶解して、室温で約４ｇ／Ｌの目標濃度にする。次に、溶液を０．４５ミクロン濾過してバイオ負荷物を減少させる。濾過されたＰｓ溶液のＰｓ濃度は、ＨＰＳＥＣ  ＵＶ−ＭＡＬＳ−ＲＩによって決定される。
【０１３５】
血清型１８Ｃおよび１９Ａを除く本明細書中に開示される全ての血清型について、溶液を約２．５ｇ／Ｌに希釈し、次いで、ＧＥＡ−Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ  Ｐａｎｄａ  ２Ｋホモジナイザーを使用してホモジナイズしてＰｓの分子量を減少させる。血清型１９Ａを除く全ての溶液をホモジナイズして、多糖の分子量を減少させた。血清型１９Ａは、その比較的低い出発サイズのためにサイズが縮小されなかった。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、血清型特異的な標的（１５０〜１０００バール；４〜７回通過）に制御して、血清型特異的な分子量を達成した。サイズ減少多糖を０．２ミクロン濾過し、次いで濃縮し、１０ｋＤａ  ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を用いて水に対してダイアフィルトレーションした。温度は、均質化の間、ホモジナイザーの出口の熱交換器への冷却水供給を用いて制御される。
【０１３６】
血清型１８Ｃ  Ｐｓの分子量を減少させるために、均質化の代わりに酸加水分解を使用する。ろ過した血清型１８Ｃ  Ｐｓ溶液の温度を、ロットＡでは約９６℃、ロットＢでは９０℃に上げる。氷酢酸（１７．４Ｍ）で最終濃度０．２Ｍになるように調整し、ロットＡでは約１８０分間、ロットＢでは１６０分間保持する。１．５Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７．０を、最終濃度０．４６Ｍになるように加え、溶液のｐＨを上げて酸加水分解を停止させ、次いで溶液を室温に冷却する。
【０１３７】
血清型１９Ａは、０．４５ミクロン濾過またはサイズ縮小しない。その比較的小さい出発サイズのために、サイズの縮小は必要とされない。溶解後、血清型１９Ａは、次の段落に記載されるように０．２２ミクロン濾過される。
【０１３８】
次に、各溶液を０．２２ミクロンフィルターを用いて濾過し、限外濾過１工程の前にバイオ負荷物を減少させる。濾過したＰｓを、１０ｋＤａ  ＮＭ  ＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して約１０ｇ／Ｌに濃縮し、次いで、周囲温度で６ダイアボリュームのＷＦＩに対してダイアフィルトレーションし、限外濾過１工程中間体（ＵＦ１−ＦＲ）を生成する。血清型１８Ｃは、１０ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜の代わりに５ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜を使用して、酸加水分解によって生成されるより低い分子量のＰｓを保持することによってＰｓ回収を改善した。ＵＦ１−ＦＲのＰｓ濃度は、ＨＰＳＥＣ  ＵＶ−ＭＡＬＳ−ＲＩによって決定される。ＷＦＩをＵＦ１−ＦＲに添加して、Ｐｓ活性化の前に約１０ｇ／ＬのＰｓ濃度を達成する。
【０１３９】
次いで、２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液を添加して、活性化反応工程のｐＨを制御する。Ｐｓ活性化反応中の酢酸ナトリウム濃度およびｐＨ、ならびに温度は、各血清型について特定の値に制御される（表２）。
【０１４０】
過ヨウ素酸塩活性化は、ＰｎＰｓ反復単位（ＲＵ）１モル当たりの過ヨウ素酸塩のモル数に基づいて、１００ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を溶液に添加することによって開始される。活性化の間、ビシナルジオールは、血清型特異的反応時間にわたって反応性アルデヒドに酸化される。この反応では、活性化生成物（ＡＰ）プロセス中間体を生成した。メタ過ヨウ素酸ナトリウムの仕込み量と反応時間は、各血清型に特異的な値に制御される（表１）。
【０１４１】
【表２】
2021522285.tif 000004
【０１４２】
Ｐｓ活性化後、溶液を６ダイアボリュームの１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ ６．４）に対してダイアフィルトレーションし、続いて、１０ｋＤａ  ＮＭ  ＷＣＯ接線流限外濾過膜を２〜８℃で使用して、追加の６ダイアボリュームのＷＦＩをダイアフィルトレーションする。血清型１８Ｃは、１０ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜の代わりに５ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜を使用して、酸加水分解によって生成されるより低い分子量のＰｓを保持することによってＰｓ回収を改善した。次いで、溶液を濃縮し、限外濾過２工程中間体（ＵＦ２−ＦＲ）を生成する。ＵＦ２−ＦＲのＰｓ濃度は、ＨＰＳＥＣ  ＵＶ−ＭＡＬＳ−ＲＩによって決定される。活性化の程度は、ＵＦ２−ＦＲサンプルをチオセミカルバジドで誘導体化し、次いでＵＶ検出を伴うＨＰＳＥＣによってチオセミカルバゾンを検出することによって決定される。
【０１４３】
実施例３
ＣＲＭ１９７キャリアタンパク質の調製は、以下のように実施され得る。
以前に記載されたようなＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓにおける発現を通して得られた凍結精製ＣＲＭ１９７（国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／１７３８７６号を参照のこと）を、５ｋＤａ  ＷＮＭ  ＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１０ダイアボリュームの２ｍＭリン酸塩、ｐＨ ７．２緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、そして０．２２ミクロン濾過する。特定の実施形態においては、５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ ６．４（５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）が血清型１８Ｃに使用され、ダイアフィルトレーションされた溶液は、１．０〜５．３％（ｗ／ｖ）の最終濃度のスクロースとともに水中で希釈される。以下の表３は、特定の血清型多糖に対するコンジュゲーションのためのＣＲＭ１９７についての代表的なスクロース濃度を提供する。
【０１４４】
実施例４
多糖（Ｐｓ）及びＣＲＭ１９７（Ｐｒ）のリオスフィア産生は、以下のとおりである。
凍結乾燥の前に、ＣＲＭ１９７およびＰｓ溶液を以下に記載するように希釈する。いくつかの実施形態において、ＣＲＭ１９７溶液は、ＷＦＩ、５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ６．４（血清型１８ＣについてはｐＨ ７．０）、およびＷＦＩ中の新たに調製された３０％ｗ／ｖスクロース溶液を使用して、６．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に希釈される。ＵＦ２−ＦＲ  Ｐｓ溶液を、ＷＦＩおよびＷＦＩ中の新しく調製した３０％ｗ／ｖスクロース溶液を使用して、６．０ｍｇ／ｍＬのＰｓ濃度に希釈する。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、ＣＲＭ１９７溶液は、ＷＦＩ、２ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ７．２、およびＷＦＩ中の新たに調製された５０％ｗ／ｖスクロース溶液を使用して、６．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に希釈される。ＵＦ２−ＦＲ  Ｐｓ溶液を、ＷＦＩおよびＷＦＩ中の新たに調製した５０％ｗ／ｖスクロース溶液を使用して、６．０ｍｇ／ｍＬのＰｓ濃度に希釈する。
【０１４６】
血清型特異的スクロースおよびリン酸濃度を使用する（表３）。希釈したＣＲＭ１９７およびＵＦ２−ＦＲ溶液を、次のようにしてリオスフィアに加工する。
【０１４７】
【表３】
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【０１４８】
実施例５
本実施例は、多糖類（Ｐｓ）およびＣＲＭ１９７（Ｐｒ；ＣＲＭ）リオスフィアを製造するための凍結乾燥条件の開発を示す。
血清型６Ａおよび２３Ｆ由来のＣＲＭおよび活性化多糖の個別の溶液を、実施例３および４に記載されるように調製し、この実施例の表に示されるようなＰｓ、ＣＲＭ、およびスクロース濃度を有した。
【０１４９】
改変されたＢｉｏｍｅｋ  ＦＸピペッティングロボット（Ｃｒｙｏｍｅｋ）を使用して、溶液の５０μＬアリコートをＣｒｙｏｍｅｋの平坦な凍結表面上に分配する。ショベル機構を使用して、破損を引き起こすことなく、小さな冷たい容器上にビーズを分配することができる。各異なる溶液のサイクルを完了した後、ビーズを中間貯蔵容器に移し、凍結乾燥機中でまたはマイクロ波真空乾燥によって、昇華乾燥するまで−７０℃に保つ。凍結乾燥機乾燥については、ビーズは、乾燥トレイ中に単層で分配される。キャビネットの圧力、シェルフ温度、サイクルタイムが設定される。ビーズを乾燥させた後、リオスフィアを２〜８℃で保存する。（特定のパラメータについては、例５を参照）
【０１５０】
予備乾燥サイクル（Ｌｙｏ１）は、表４．１に示すように１８時間かかった。カールフィッシャー滴定により測定したリオスフィアの残留水分含量を、表４．２に示す。
【０１５１】
【表４−１】
2021522285.tif 000006
【０１５２】
【表４−２】
2021522285.tif 000007
【０１５３】
結果は、リオスフィア中の高い水分含量を示す。さらに、リオスフィアは、非常に脆く、吸湿性であった。表５．２に示すように、多糖類、タンパク質、およびスクロースの濃度を増加させることによって、固体含有量を増加させた。表５．１に示すように、二次乾燥サイクルを加え、一次乾燥時間を増加させることによって、乾燥サイクルを修正した（Ｌｙｏ２）。
【０１５４】
【表５−１】
2021522285.tif 000008
【０１５５】
【表５−２】
2021522285.tif 000009
【０１５６】
Ｌｙｏ２からの残留水分含量は、改善された乾燥サイクルのためＬｙｏ１からのものよりも有意に低かった。二次乾燥は、全ての氷が昇華した後でさえ、生成物中に依然として存在する結合水分の除去を改善する。二次乾燥は、一次乾燥（１５℃）よりも高い温度（３０℃）を必要とした。
【０１５７】
この時点で、凍結乾燥機の全乾燥サイクル時間は４５時間であった。乾燥サイクル時間（方法：Ｌｙｏ３）をさらに短縮するために、圧力および温度などのいくつかのパラメータを変化させた（表６．１および６．２）。
【０１５８】
【表６−１】
2021522285.tif 000010
【０１５９】
【表６−２】
2021522285.tif 000011
【０１６０】
実施例６
本実施例は、多糖類（Ｐｓ）およびＣＲＭ１９７（Ｐｒ；ＣＲＭ）リオスフィアを製造するための放射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水（マイクロ波真空乾燥（ＭＶＤ））条件の開発を示す。
【０１６１】
ＣＲＭおよび血清型６Ａおよび２３Ｆ由来の活性化多糖の溶液を、実施例３および４に記載されるように調製し、表７．１および７．２に示されるようなＰｓ、ＣＲＭ、およびスクロース濃度を有した。
【０１６２】
改変されたＢｉｏｍｅｋ  ＦＸピペッティングロボット（Ｃｒｙｏｍｅｋ）を使用して、溶液の５０μＬアリコートをＣｒｙｏｍｅｋの平坦な凍結表面上に分配する。ショベル機構を使用して、破損を引き起こすことなく、小さな冷たい容器上にビーズを分配することができる。それぞれ異なる溶液のサイクルを完了した後、ビーズを中間貯蔵容器に移し、凍結乾燥機中でまたはマイクロ波真空乾燥によって、昇華乾燥するまで−７０℃に保つ。マイクロ波乾燥については、ビーズを単層で容器に分配した。出力、圧力、サイクル時間を設定した。ビーズを乾燥させた後、リオスフィアを２〜８℃で保存した。（特定のパラメータについては、例６ を参照する）。
【０１６３】
ビーズを乾燥させるために、２つの異なるＭＶＤサイクルを試験した。両方のサイクルについて、圧力を５０〜６０ｍＴｏｒｒの範囲に維持した。温度はどれだけの電力を加えたかに依存し、２５〜３０℃の範囲に留まった。
【０１６４】
【表７−１】
2021522285.tif 000012
【０１６５】
【表７−２】
2021522285.tif 000013
【０１６６】
ＭＶＤ１サイクルは４時間３０分を要したが、残留水分含量を２％まで減少させるには十分ではなかった。ＭＶＤ２サイクルはより高い電力でより長くかかり、したがって、それは、有意に低い残留水分含量を提供した。
【０１６７】
実施例７
コンジュゲーションの調製において、多糖類（Ｐｓ）リオスフィアとＣＲＭ１９７タンパク質（Ｐｒ）リオスフィアを組み合わせて、Ｐｒに対するＰｓの比（Ｐｓ：Ｐｒ）の特定の比率と最終Ｐｓ濃度を標的として、上記のように無水ＤＭＳＯに溶解されるリオスフィア混合物を提供する。シアノ水素化ホウ素ナトリウムをこのＰｓ：Ｐｒブレンドに添加し、溶液を、適切な反応時間の間、必要なコンジュゲーション温度でインキュベートし、その両方は、ＰｒにコンジュゲートされるＰｓ血清型に特異的である。得られたコンジュゲートサイズのサイズは、Ｐｓ濃度によって有意に影響されることが示されている。
【０１６８】
ＷＦＩ中でシアノ水素化ホウ素ナトリウムの溶液を調製し、この溶液に１．０ｍｅｑのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（Ｐｓ反復単位のモルあたり１．０モルのシアノ水素化ホウ素ナトリウム）を加える。シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液のモル濃度（表８）は、コンジュゲーション中の溶液の約０．５％の総水分含量の目標に基づく。溶液を血清型特異的温度で血清型特異的期間反応させ（表８）、コンジュゲート生成物中間体（ＣＰ）を生成させる。
【０１６９】
ＷＦＩ中で水素化ホウ素ナトリウムの溶液を調製し、２．０ｍｅｑの水素化ホウ素ナトリウム（Ｐｓ反復単位に対して）を溶液に添加する。水素化ホウ素ナトリウム溶液（表２）のモル濃度は、水素化ホウ素添加後の溶液中の約１．０％の総水分含量の目標に基づく。溶液を周囲温度で３時間反応させ（２時間反応させたＶ１１４７ＦＰＢ１４０１を除く）、コンジュゲート生成物クエンチ中間体（ＣＰＱ）を生成させる。
【０１７０】
【表８】
2021522285.tif 000014
【０１７１】
次に、コンジュゲーション溶液を、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（いくつかの実施形態では、コンジュゲートについて０．０２５％ｗ／ｖポリソルベート２０を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム）に溶液をゆっくりと添加することによって、２０％以下（ｖ／ｖ）の無水ＤＭＳＯに希釈する。希釈工程の間、溶液温度を１５℃未満に維持する。約１時間後、１．５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．０）を２５ｍＭリン酸カリウムの最終濃度まで溶液に添加する。コンジュゲーション性能は、全体的なＰｓおよびＣＲＭ１９７消費、コンジュゲートＰｓ対ＣＲＭ１９７比、ならびにコンジュゲート分子量によって評価される。
【０１７２】
コンジュゲーション溶液を約２．５ｇ／Ｌに濃縮し、３０ｋＤａ  ＮＭ  ＷＣＯ接線流限外濾過膜を用いて、２〜８℃で、１０ダイアボリュームの１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＷＬ０００６７１９０中のロットについて）または１５０ｍＭ塩化ナトリウム中の２５ｍＭリン酸カリウム（ＷＬ０００６７１９１中のロットについて）に対してダイアフィルトレーションする。これにより、限外濾過３工程中間体（ＵＦ３−ＦＲ）を生成した。ＵＦ３−ＦＲのＰｓ濃度は、ＨＰＳＥＣ  ＵＶ−ＭＡＬＳ−ＲＩによって決定される。
【０１７３】
いくつかの実施形態における１９Ｆについては、ＵＦ３−ＦＲを０．２２ミクロン濾過し、続いて２２℃で約１２０時間インキュベートする。
【０１７４】
次に、ＵＦ３−ＦＲ溶液を限外濾過４工程で処理する。一部の実施例における限外濾過４工程では、溶液が３００ｋＤａ  ＮＭＷＣＯ  Ｂｉｏｍａｘ  ＰＥＳ接近流超透過膜を用いて、塩化ナトリウム１５０ｍＭ、ｐＨ７．０、２〜８℃で１０ｍＬ−ヒスチジンの２０個のダイアボリュームに対して、約２．５ｇ／ＬのＰｓ濃度に濃縮し、ダイアフィルトレーションされる。血清型７Ｆは、限外濾過４工程のために１００ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜を使用した。使用した血清型６Ａ、６Ｂ、および１８Ｃ  Ｌについて、ＵＦ３−ＦＲ溶液を約３．５ｇ／ｌに濃縮し、３００ｋＤａ  ＮＭ  ＷＣＯ  Ｂｉｏｍａｘ  ＰＥＳ接線流限外濾過膜を使用して、２〜８℃で１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０３％ｗ／ｖＰＳ−２０、ｐＨ７．０中の１０ｍＭ  ｌ−ヒスチジンに対してダイアフィルトレーションする。いくつかの実施形態では、血清型７Ｆ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆ  ＵＦ３−ＦＲ溶液を約２．０ｇ／Ｌに濃縮し、３００ｋＤａ  ＮＭ  ＷＣＯ  ＵｌｔｒａＣｅｌ、再生セルロース、接線流限外濾過膜を使用して、２〜８℃で、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１５％（ｗ／ｖ）ＰＳ−２０、ｐＨ７．０中の１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジンに対してダイアフィルトレーションする。これにより、限外濾過４工程中間体（ＵＦ４−ＦＲ）を生成した。ＵＦ４−ＦＲのＰｓ濃度は、ＨＰＳＥＣ  ＵＶ−ＭＡＬＳ−ＲＩによって決定される。
【０１７５】
ＵＦ４−ＦＲは、ＰＶＤＦフィルターを通して０．２２ミクロン濾過される。濾液のＰｓ濃度は、ＨＰＳＥＣ  ＵＶ−ＭＡＬＳ−ＲＩによって測定する。濾液のＰｓ濃度が１．０ｇ／Ｌより大きい場合、濾液を、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中の追加の１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジンで１．０ｇ／ＬのＰｓ濃度に希釈する。これにより、一価バルクコンジュゲート中間体（ＭＢＣ）を生成した。ＭＢＣをアリコートに分注し、−６０℃〜−８０℃で凍結する。
【０１７６】
血清型６Ａ、６Ｂ、および１８ＣについてのＵＦ４−ＦＲは、二重膜ＰＥＳフィルターを通して０．５／０．２ミクロン濾過される。濾液のＰｓ濃度は、ＨＰＳＥＣ  ＵＶ−ＭＡＬＳ−ＲＩによって測定する。濾液のＰｓ濃度が１．０ｇ／Ｌより大きい場合、濾液を、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０３% w/v PS−２０、ｐＨ ７．０中の追加の１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジンで１．０ｇ／ＬのＰｓ濃度に希釈する。これにより、一価バルクコンジュゲート中間体（ＭＢＣ）を生成した。ＭＢＣをアリコートに分注し、−６０℃〜−８０℃で凍結する。
【０１７７】
血清型７Ｆ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３ＦについてのＵＦ４−ＦＲは、ＰＶＤＦフィルターを通して０．２２ミクロン濾過される。濾液のＰｓ濃度は、ＨＰＳＥＣ  ＵＶ−ＭＡＬＳ−ＲＩによって測定する。濾液のＰｓ濃度が１．０ｇ／Ｌより大きい場合、濾液を、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１５% w/v PS−２０、ｐＨ ７．０中の追加の１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジンで１．０ｇ／ＬのＰｓ濃度に希釈する。これにより、一価バルクコンジュゲート中間体（ＭＢＣ）を生成した。ＭＢＣはアリコートに分注され、−６０℃〜−８０℃で凍結する。
【０１７８】
実施例８
この実施例は、無水ＤＭＳＯ中での還元的アミノ化（Ｐｒ）を使用した、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆ、または３８由来のＰのＣＲＭ１９７（Ｐｒ）へのコンジュゲートのための方法を示す。異なる血清型多糖を、一般的なプロセスフローを使用して、精製ＣＲＭ１９７キャリアタンパク質に個別にコンジュゲートさせる。
【０１７９】
多糖（Ｐｓ）リオスフィアおよびＣＲＭ１９７タンパク質（Ｐｒ）リオスフィアを組み合わせて、Ｐｓ対Ｐｒ(Ｐｓ:Ｐｒ)の特定の比率および最終Ｐｓ濃度を標的にして、上記のように無水ＤＭＳＯに溶解されるリオスフィア混合物を提供する。シアノ水素化ホウ素ナトリウムをこのＰｓ：Ｐｒ再構成混合物に添加し、溶液を、適切な反応時間の間、必要なコンジュゲーション温度でインキュベートし、その両方は、ＰｒにコンジュゲートされるＰｓ血清型に特異的である。得られたコンジュゲートサイズのサイズは、Ｐｓ濃度によって有意に影響されることが示されている。
【０１８０】
水素化ホウ素ナトリウムによる還元
水素化ホウ素ナトリウム（多糖繰り返し単位１モル当たり２モル）を、コンジュゲーション反応および溶液に続いて添加し、２２℃で１時間インキュベートする。溶液を、約４℃で、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２５%(ｗ/ｖ)ポリソルベート２０中に希釈する。次いで、リン酸カリウム緩衝液を添加して、ｐＨを中和する。溶液を濃縮し、１０ｋＤａ  ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウムに対して約４℃でダイアフィルトレーションする。
【０１８１】
最終濾過および生成物貯蔵
次いで、各溶液を濃縮し、３００ｋＤａ  ＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、４℃で１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭヒスチジンに対してダイアフィルトレーションする。保持溶液を０．２２ミクロン濾過する。
【０１８２】
血清型１９Ｆを約５日間インキュベートし、３００ｋＤａ  ＮＭ  ＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭヒスチジンに対して約４℃でダイアフィルトレーションし、０．２２ミクロン濾過する。
【０１８３】
血清型１８Ｃを、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭヒスチジンに対して、約４℃で、３００ｋＤａ  ＮＭ  ＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用してダイアフィルトレーションし、そして０．２２ミクロン濾過する。
【０１８４】
溶液を、追加の１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分配し、≦−６０℃で凍結する。
【０１８５】
実施例９
本実施例は、異なる界面活性剤および安定剤を含む１５価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製剤を示す。
【０１８６】
上記のように調製した肺炎球菌多糖−タンパク質コンジュゲートを、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆを有する１５価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ１５）の製剤に使用する。
【０１８７】
製剤は、先に論じたように、ＤＭＳＯ中での還元アミノ化によって生成された肺炎球菌多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートを使用して調製される。個々の血清型の標的最終濃度を得るために必要とされるバルクコンジュゲートの必要容量は、溶液容量およびバルク多糖類濃度に基づいて計算される。１５のコンジュゲートを、ポリソルベート（ＰＳ）−２０、ＰＳ−８０、またはポロキサマー（Ｐ）１８８とともに、塩化ナトリウム、Ｌ−ヒスチジン、ｐＨ５．８緩衝液から選択される賦形剤と合わせる。
【０１８８】
滅菌した製剤バルクは、そのバルクリン酸アルミニウムアジュバンド（ＡＰＡ）との混合の間、およびそれに続いて、プロピレングリコール（ＰＧ）およびポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）ととともに又はなしで、緩やかに混合される。２つの濃度のコンジュゲートおよびＡＰＡを、種々の製剤において研究する。１つは、８μｇ／ｍＬの血清型６Ｂ多糖、他のすべての血清型について４μｇ／ｍＬの多糖、および２５０μｇ／ｍＬのＡＰＡを含んでいた。他方は、１６μｇ／ｍＬの血清型６Ｂ多糖、全ての他の血清型について８μｇ／ｍＬの多糖、および５００μｇ／ｍＬのＡＰＡを含んでいた。処方されたワクチンは、２〜８℃で保存される。
【０１８９】
ＡＰＡは、ヒドロキシリン酸アルミニウムの水性懸濁液である。ＡＰＡは塩化アルミニウムとリン酸ナトリウムとを１：１の体積比でブレンドし、アルミニウムヒドロキシリン酸塩を沈殿させることによって製造される。ブレンドプロセスの後、材料を高剪断ミキサーでサイズ縮小して、単分散粒度分布を達成する。次いで、生成物を生理食塩水に対してダイアフィルトレーションし、蒸気滅菌する。
【０１９０】
本発明は例示された実施形態を参照して本明細書に記載されるが、本発明はこれに限定されないことが理解されるべきである。当業者の、本明細書の教示へのアクセスは、その範囲内の追加の修正および実施形態を認識するのであろう。したがって、本発明は、本明細書に添付された特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
2021522285.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】令和3年1月7日(2021.1.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャリアタンパク質に共有結合した肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖を含む組成物の製造方法であって、該方法は、
（ａ）１以上の肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化肺炎連鎖球菌多糖を含む第１のリオスフィア（ｌｙｏｓｐｈｅｒｅ）組成物、およびキャリアタンパク質を含む第２のリオスフィア組成物を提供し；
（ｂ）ある量の第１のリオスフィア組成物とある量の第２のリオスフィア組成物とを一緒に組み合わせて、キャリアタンパク質に対する１以上の活性化多糖の所定の比率を有するリオスフィア混合物を提供し；
（ｃ）リオスフィア混合物を有機溶媒中で再構成し、混合して再構成混合物を提供し；そして、
（ｄ）再構成混合物に還元剤を添加して、１以上の肺炎連鎖球菌血清型の多糖にコンジュゲートされたキャリアタンパク質を含むコンジュゲート溶液を生成する、
ことを含む方法。
【請求項２】
第１および第２のリオスフィア組成物が、凍結乾燥および放射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水から選択される昇華乾燥プロセスによって調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１および第２のリオスフィア組成物が、凍結乾燥および放射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水から選択される昇華乾燥プロセスによって調製され、１以上の肺炎連鎖球菌血清型からの活性化肺炎連鎖球菌多糖を含む第１の水溶液と、キャリアタンパク質および緩衝液を含む第２の水溶液を提供し、
ここで、第１および第２の水溶液は、約０．５％（ｗ／ｖ）以上のスクロースを含み、そして、第１および第２の水溶液を昇華乾燥プロセスに供して、第１および第２のリオスフィア組成物を生成することを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
緩衝液が、５．０〜７．０のｐＨ範囲の、ヒスチジン、コハク酸、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、または酢酸緩衝液である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
緩衝液が、５．０〜７．０のｐＨ範囲のリン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
第１および第２のリオスフィア組成物が、６％未満の水分含量を有する、請求項１〜５のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項７】
有機溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である請求項１〜６のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項８】
再構成が８分以下で行われ、混合が１２０分以下で行われる、請求項１〜７のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項９】
コンジュゲート溶液が、重量対重量基準で約０．６〜約１．５の多糖対キャリアタンパク質の比でキャリアタンパク質にコンジュゲートされた多糖を含む、請求項１〜８のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１０】
コンジュゲート溶液が、溶液中の全多糖の約１５％未満である遊離多糖量を含む、請求項１〜９のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１１】
１以上の多糖が、血清型１，２，３，４，５，６Ａ，６Ｂ，６Ｃ，６Ｄ，６Ｅ，６Ｇ，６Ｈ，７Ｆ，７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，８，９Ａ，９Ｌ，９Ｎ，９Ｖ，１０Ｆ，１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃ，１１Ｆ，１１Ａ，１１Ｂ，１１Ｃ，１１Ｄ，１１Ｅ，１２Ｆ，１２Ａ，１２Ｂ，１３，１４，１５Ｆ，１５Ａ，１５Ｂ，１５Ｃ，１６Ｆ，１６Ａ，１７Ｆ，１７Ａ，１８Ｆ，１８Ａ，１８Ｂ，１８Ｃ，１９Ｆ，１９Ａ，１９Ｂ，１９Ｃ，２０Ａ，２０Ｂ，２１，２２Ｆ，２２Ａ，２３Ｆ，２３Ａ，２３Ｂ，２４Ｆ，２４Ａ，２４Ｂ，２５Ｆ，２５Ａ，２７，２８Ｆ，２８Ａ，２９，３１，３２Ｆ，３２Ａ，３３Ｆ，３３Ａ，３３Ｂ，３３Ｃ，３３Ｄ，３３Ｅ，３４，３５Ｆ，３５Ａ，３５Ｂ，３５Ｃ，３６，３７，３８，３９，４０，４１Ｆ，４１Ａ，４２，４３，４４，４５，４６，４７Ｆ，４７Ａ，４８，ＣＷＰＳ１，ＣＷＰＳ２およびＣＷＰＳ３からなる群より選択される肺炎連鎖球菌血清型から得られる、請求項１〜１０のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１２】
キャリアタンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド、細菌性サイトリシンまたはニューモリシンからなる群より選択される不活化細菌性トキソイドである請求項１〜１１のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１３】
不活化細菌性トキソイドがＣＲＭ１９７である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
コンジュゲート溶液が無菌濾過される、請求項１〜１３のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１５】
肺炎連鎖球菌多糖が、酸化剤と反応することによって活性化される、請求項１〜１４のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１６】
２以上のコンジュゲートを含み、各コンジュゲートが、キャリアタンパク質に共有結合した１以上の血清型由来の肺炎連鎖球菌多糖を有する組成物の製造方法であって、該方法は；
（ａ）以下のものを提供し
（ｉ）２以上の第１の水溶液であって、各第１の水溶液は、特定の肺炎連鎖球菌血清型の活性化多糖を含み、ここで、多糖は酸化剤と反応して、活性化された多糖を提供し、そしてここで、２以上の第１の水溶液は、同じではなく、又は
（ｉｉ）２以上の第１の水溶液であって、各第１の水溶液は、２以上の肺炎連鎖球菌血清型の活性化多糖を含み、ここで、多糖は酸化剤と反応して、活性化された多糖を提供し、そしてここで、２以上の第１の水溶液は、同じではなく、
（ｂ）各々がキャリアタンパク質および緩衝液を含む、２以上の第２の水溶液を提供し、ここで、２以上の第２の水溶液の量は、少なくとも２以上の第１の水溶液の量に対応し；
（ｃ）２以上の第１の水溶液および２以上の第２の水溶液を、リオスフィアを製造するための昇華乾燥プロセスにおいて別々に乾燥して、２以上の第１のリオスフィア組成物を製造し、それぞれは、乾燥多糖、および２以上の第２のリオスフィア組成物を含み、それぞれは、乾燥キャリアタンパク質を含み；
（ｄ）ある量の第１のリオスフィア組成物とある量の第２のリオスフィア組成物とを独立して組み合わせて、それぞれが所定の比率の活性化多糖対キャリアタンパク質を有する複数のリオスフィア混合物を提供し；
（ｅ）複数のリオスフィア混合物を有機溶媒中で再構成し、そして混合し、複数の再構成混合物を提供し；
（ｆ）複数の再構成混合物に還元剤を添加して、複数のコンジュゲート溶液を生成し；そして
（ｇ）２以上の複数のコンジュゲート溶液を組み合わせ、２以上のコンジュゲートを含む組成物を生成し、各コンジュゲートは、キャリアタンパク質に共有結合した１以上の血清型由来の肺炎連鎖球菌多糖を有する；
を含む方法。
【請求項１７】
昇華乾燥プロセスが、凍結乾燥および放射エネルギー真空（ＲＥＶ）脱水から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
第１および第２の水溶液が、約０．５％以上のスクロースを含む、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
有機溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である請求項１６〜１８のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２０】
再構成が８分以下で行われ、混合が１２０分以下で行われる、請求項１６〜１９のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２１】
各コンジュゲート溶液が、重量対重量基準で約０．６〜約１．３の多糖対キャリアタンパク質の比でキャリアタンパク質にコンジュゲートされた多糖を含む、請求項１６〜２０のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２２】
各コンジュゲート溶液が、溶液中の全多糖の約１５％未満である遊離多糖量を含む、請求項１６〜２１のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２３】
緩衝液が、５．０〜７．０のｐＨ範囲の、ヒスチジン、コハク酸、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、または酢酸緩衝液である請求項１６〜２２のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２４】
緩衝液が、５．０〜７．０のｐＨ範囲のリン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液である請求項１６〜２２のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２５】
１以上の多糖が、少なくとも１つの血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｇ、６Ｈ、７Ｆ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ｆ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１１Ｆ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１２Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１３、１４、１５Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１６Ａ、１７Ｆ、１７Ａ、１８Ｆ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、２０Ａ、２０Ｂ、２１、２２Ｆ、２２Ａ、２３Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２５Ｆ、２５Ａ、２７、２８Ｆ、２８Ａ、２９、３１、３２Ｆ、３２Ａ、３３Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３３Ｅ、３４、３５Ｆ、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ｆ、４１Ａ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ｆ、４７Ａ、４８、ＣＷＰＳ１、ＣＷＰＳ２、およびＣＷＰＳ３からなる群より選択される１以上の肺炎連鎖球菌血清型から得られる、請求項１６〜２４のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２６】
キャリアタンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド、細菌性サイトリシンまたはニューモリシンからなる群より選択される不活化細菌性トキソイドである請求項１６〜２５のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項２７】
不活化細菌性トキソイドがＣＲＭ１９７である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
コンジュゲート溶液が無菌濾過される、請求項１６〜２７のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２９】
キャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌血清型多糖１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆを含有する多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製造方法であって、該方法は、
（ａ）２３のキャリアタンパク質リオスフィア組成物および２３の活性化多糖リオスフィア組成物を提供し、各々は、１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆから選択される肺炎連鎖球菌血清型由来の乾燥活性化多糖を含み、ここで、２３の活性化多糖リオスフィア組成物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず、
（ｂ）２３のキャリアタンパク質リオスフィア組成物の各々および２３の活性化多糖リオスフィア組成物の各々を別々に組み合わせて、各々が所定の比率の活性化多糖対キャリアタンパク質を有する２３のリオスフィア混合物を提供し、ここで、２３のリオスフィア混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｃ）２３のリオスフィア混合物の各々を有機溶媒で別々に再構成し、混合して複数の再構成混合物を生成し、ここで、２３の再構成混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｄ）２３の再構成混合物の各々に還元剤を添加して、２３のコンジュゲート溶液を生成し、各々は、特定の肺炎連鎖球菌血清型の多糖にコンジュゲートされたキャリアタンパク質を含み、ここで、２３のコンジュゲート溶液のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；そして
（ｅ）２３のコンジュゲート溶液を組み合わせて、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌血清型多糖１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆを含有する多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを提供する、
ことを含む方法。
【請求項３０】
キャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌血清型多糖１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆを含有する多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製造方法であって、該方法は、
（ａ）１５のキャリアタンパク質リオスフィア組成物および１５の活性化多糖リオスフィア組成物を提供し、各々は、１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆから選択される肺炎連鎖球菌血清型由来の乾燥活性化多糖を含み、ここで、１５の活性化多糖リオスフィア組成物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｂ）１５のキャリアタンパク質リオスフィア組成物の各々と１５の活性化多糖リオスフィア組成物の各々とを別々に組み合わせて、各々が所定の比の活性化多糖対キャリアタンパク質を有する１５のリオスフィア混合物を提供し、ここで、１５のリオスフィア混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｃ）１５のリオスフィア混合物の各々を有機溶媒で別々に再構成し、混合して複数の再構成混合物を生成し、ここで、１５の再構成混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｄ）１５の再構成混合物の各々に還元剤を添加して、１５のコンジュゲート溶液を生成し、各々は、特定の肺炎連鎖球菌血清型の多糖にコンジュゲートされたキャリアタンパク質を含み、ここで、１５のコンジュゲート溶液のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；そして
（ｅ）１５のコンジュゲート溶液を組み合わせて、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌血清型多糖１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆを含有する多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを提供する；
ことを含む、方法。
【請求項３１】
キャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌血清型多糖１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆを含有する多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製造方法であって、該方法は、
（ａ）１３のキャリアタンパク質リオスフィア組成物および１３の活性化多糖リオスフィア組成物を提供し、各々は、１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆから選択される肺炎連鎖球菌血清型由来の乾燥活性化多糖を含み、ここで、１３の活性化多糖リオスフィア組成物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｂ）１３のキャリアタンパク質リオスフィア組成物の各々と１３の活性化多糖リオスフィア組成物の各々とを別々に組み合わせて、各々が所定の比率の活性化多糖対キャリアタンパク質を有する１３のリオスフィア混合物を提供し、ここで、１３のリオスフィア混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｃ）１３のリオスフィア混合物の各々を有機溶媒で別々に再構成し、混合して複数の再構成混合物を生成し、ここで、１３の再構成混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｄ）１３の再構成混合物の各々に還元剤を添加して、１３のコンジュゲート溶液を生成し、各々は、特定の肺炎連鎖球菌血清型の多糖にコンジュゲートされたキャリアタンパク質を含み、ここで、１３のコンジュゲート溶液のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；そして
（ｅ）１３のコンジュゲート溶液を組み合わせて、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌血清型多糖１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆを含有する多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを提供する；
ことを含む方法。
【請求項３２】
キャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌血清型多糖１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆを含有する多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製造方法であって、該方法は、
（ａ）１０のキャリアタンパク質リオスフィア組成物および１０の活性化多糖リオスフィア組成物を提供し、各々は、１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆから選択される肺炎連鎖球菌血清型由来の乾燥活性化多糖を含み、そしてここで、１０の活性化多糖リオスフィア組成物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｂ）１０のキャリアタンパク質リオスフィア組成物の各々と１０の活性化多糖リオスフィア組成物の各々とを別々に組み合わせて、各々が所定の比率の活性化多糖対キャリアタンパク質を有する１０のリオスフィア混合物を提供し、ここで、１０のリオスフィア混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｃ）１０のリオスフィア混合物の各々を有機溶媒で別々に再構成し、混合して複数の再構成混合物を生成し、ここで、１０の再構成混合物のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；
（ｄ）１０の再構成混合物の各々に還元剤を添加して、１０のコンジュゲート溶液を生成し、各々は、特定の肺炎連鎖球菌血清型の多糖にコンジュゲートされたキャリアタンパク質を含み、ここで、１０のコンジュゲート溶液のいずれも、同じ肺炎連鎖球菌血清型由来の活性化多糖を含まず；そして、
（ｅ）１０のコンジュゲート溶液を組み合わせて、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌血清型多糖１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆを含有する多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを提供する；
ことを含む、方法。
【国際調査報告】
2021522285.tif 000016