(57)【要約】  本発明は、細菌メタゲノム分析を通して脳卒中を診断する方法に関し、より具体的には、被検体由来のサンプルを用いて細菌メタゲノム分析を行って、特定細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を分析することによって、脳卒中を診断する方法に関する。環境に存在する細菌から分泌される細胞外小胞は、体内に吸収されて、炎症発生に直接的な影響を及ぼすことができ、脳卒中は、症状が現れる前に早期診断が難しくて、効率的な治療が難しいのが現状であるので、本発明による人体由来のサンプルを用いた細菌由来の細胞外小胞のメタゲノム分析を通して脳卒中の原因因子及び発病の危険度をあらかじめ診断することによって、脳卒中の危険群を早期に診断して、適切な管理により発病時期を遅らせたり発病を予防することができ、発病後にも早期診断することができて、脳卒中の発病率を低減し、治療効果を高めることができる。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のステップを含む、脳卒中の診断のための情報提供方法：
（ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出するステップ；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１及び配列番号２のプライマーペアを用いてＰＣＲを行うステップ；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来のサンプルと細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較するステップ。
【請求項２】
前記ステップ（ｃ）で、デフェリバクター門（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ）、ウェルコミクロビウム門（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）、テネリキューテス門（Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ）、シアノバクテリア門（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、ユーリ古細菌門（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）、ＴＭ７、プランクトミケス門（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ＧＮ０２、及びＯＤ１よりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較することを特徴とする、請求項１に記載の脳卒中の診断のための情報提供方法。
【請求項３】
前記ステップ（ｃ）で、ハロバクテリウム綱（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａ）、デフェリバクター綱（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ）、ヴェルコミクロビウム綱（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ）、クロロプラスト（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）、モリクテス綱（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）、エリュシペロトリクス綱（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉ）、メタノバクテリウム綱（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フラボバクテリウム綱（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｉａ）、プランクトミセチア（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｉａ）、ＴＭ７−１、及びＺＢ２よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較することを特徴とする、請求項１に記載の脳卒中の診断のための情報提供方法。
【請求項４】
前記ステップ（ｃ）で、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、デフェリバクター目（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）、ストレプトファイタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）、ロドシクルス目（Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｌｅｓ）、ウェルコミクロビウム目（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、リケッチア目（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ）、パスツレラ目（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ）、 エリュシペロトリクス目（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、レジオネラ目（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｌｅｓ）、及びフラボバクテリウム目（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較することを特徴とする、請求項１に記載の脳卒中の診断のための情報提供方法。
【請求項５】
前記ステップ（ｃ）で、デルマコッカシエ（Ｄｅｒｍａｃｏｃｃａｃｅａｅ）、デフェリバクター科（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、フソバクテリアシエ（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、乳酸桿菌科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、ロドシクラシエ（Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｃｅａｅ）、ウェルコミクロビアシエ（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ）、オキサロバクテラシエ（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ノカルジオイダシエ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ）、プロピオニバクテリアシエ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、パスツレラシエ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、エリシペロトリチャシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）、コリネバクテリアシエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プレボテラ科（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、コマモナダシエ（Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、リケネルラシエ（Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ）、オドリバクテラシエ（Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、マイクロコッカシエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、マイクロバクテリアシエ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、アルカリゲナシエ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ）、メタノバクテリアシエ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、フラボバクテリアシエ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、及びクリオモルファセエ（Ｃｒｙｏｍｏｒｐｈａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較することを特徴とする、請求項１に記載の脳卒中の診断のための情報提供方法。
【請求項６】
前記ステップ（ｃ）で、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、サイクロバクター（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、クロモハロバクター（Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ）、デルマコッカス（Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ジェオトガリコッカス（Ｊｅｏｔｇａｌｉｃｏｃｃｕｓ）、ムシスピリルム（Ｍｕｃｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ｒｃ４−４，フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アッカーマンシア（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）、アドレクルーツィア（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、カテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、コリンセラ（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノブレビバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）、ステレラ（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、ラクノバクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リムノハビタンス（Ｌｉｍｎｏｈａｂｉｔａｎｓ）、ポリヌクレオバクター（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｂａｃｔｅｒ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フルビコラ（Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ）、及びカンジダタスアクイルナ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ａｑｕｉｌｕｎａ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較することを特徴とする、請求項１に記載の脳卒中の診断のための情報提供方法。
【請求項７】
前記被検体サンプルは、血液であることを特徴とする、請求項１に記載の脳卒中の診断のための情報提供方法。
【請求項８】
前記血液は、全血、血清、血しょう、又は血液単核球であることを特徴とする、請求項７に記載の脳卒中の診断のための情報提供方法。
【請求項９】
下記のステップを含む、脳卒中の診断方法：
（ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出するステップ；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１及び配列番号２のプライマーペアを用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うステップ；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来のサンプルと細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較するステップ。
【請求項１０】
前記ステップ（ｃ）で、デフェリバクター門（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ）、ウェルコミクロビウム門（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）、テネリキューテス門（Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ）、シアノバクテリア門（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、ユーリ古細菌門（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）、ＴＭ７、プランクトミケス門（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ＧＮ０２、及びＯＤ１よりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較することを特徴とする、請求項９に記載の脳卒中の診断方法。
【請求項１１】
前記ステップ（ｃ）で、ハロバクテリウム綱（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａ）、デフェリバクター綱（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ）、ヴェルコミクロビウム綱（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ）、クロロプラスト（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）、モリクテス綱（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）、エリュシペロトリクス綱（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉ）、メタノバクテリウム綱（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フラボバクテリウム綱（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｉａ）、プランクトミセチア（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｉａ）、ＴＭ７−１、及びＺＢ２よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較することを特徴とする、請求項９に記載の脳卒中の診断方法。
【請求項１２】
前記ステップ（ｃ）で、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、デフェリバクター目（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）、ストレプトファイタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）、ロドシクルス目（Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｌｅｓ）、ウェルコミクロビウム目（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、リケッチア目（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ）、パスツレラ目（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ）、 エリュシペロトリクス目（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、レジオネラ目（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｌｅｓ）、及びフラボバクテリウム目（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較することを特徴とする、請求項９に記載の脳卒中の診断方法。
【請求項１３】
前記ステップ（ｃ）で、デルマコッカシエ（Ｄｅｒｍａｃｏｃｃａｃｅａｅ）、デフェリバクター科（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、フソバクテリアシエ（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、乳酸桿菌科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、ロドシクラシエ（Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｃｅａｅ）、ウェルコミクロビアシエ（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ）、オキサロバクテラシエ（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ノカルジオイダシエ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ）、プロピオニバクテリアシエ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、パスツレラシエ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、エリシペロトリチャシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）、コリネバクテリアシエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プレボテラ科（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、コマモナダシエ（Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、リケネルラシエ（Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ）、オドリバクテラシエ（Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、マイクロコッカシエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、マイクロバクテリアシエ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、アルカリゲナシエ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ）、メタノバクテリアシエ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、フラボバクテリアシエ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、及びクリオモルファセエ（Ｃｒｙｏｍｏｒｐｈａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較することを特徴とする、請求項９に記載の脳卒中の診断方法。
【請求項１４】
前記ステップ（ｃ）で、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、サイクロバクター（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、クロモハロバクター（Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ）、デルマコッカス（Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ジェオトガリコッカス（Ｊｅｏｔｇａｌｉｃｏｃｃｕｓ）、ムシスピリルム（Ｍｕｃｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ｒｃ４−４，フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アッカーマンシア（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）、アドレクルーツィア（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、カテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、コリンセラ（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノブレビバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）、ステレラ（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、ラクノバクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リムノハビタンス（Ｌｉｍｎｏｈａｂｉｔａｎｓ）、ポリヌクレオバクター（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｂａｃｔｅｒ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フルビコラ（Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ）、及びカンジダタスアクイルナ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ａｑｕｉｌｕｎａ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較することを特徴とする、請求項９に記載の脳卒中の診断方法。
【請求項１５】
前記被検体サンプルは、血液であることを特徴とする、請求項９に記載の脳卒中の診断方法。
【請求項１６】
前記血液は、全血、血清、血しょう、又は血液単核球であることを特徴とする、請求項１５に記載の脳卒中の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌メタゲノム分析を通して脳卒中を診断する方法に関し、より具体的には、被検体由来のサンプルを用いて細菌メタゲノム分析を行って、特定細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を分析することによって、脳卒中を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳卒中は、脳血流の異常により突然誘発された局所的な神経学的欠損症状を総称する言葉である。脳卒中は、症状に対する用語であって、医学的な疾病と称するときには、脳血管障害（ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｃｃｉｄｅｎｔ、簡略にＣＶＡという）という。米国では、ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｔｒｏｋｅという。漢方医学的な表現を借りて、よく中風と呼ばれることがあるが、中風というのは、さらに広義の表現である。脳卒中は、大きく、脳梗塞と脳出血とに分類される。
【０００３】
脳は、人体全体に対して、重量としては体重の約２％占めるが、脳に向かう血流量は、心拍出量の１５％であり、酸素消耗量は、人体全体の酸素消耗量の２０％である。しかも、脳は、エネルギー源としてブドウ糖のみを使用するので、エネルギー供給が少しの間だけ中断されても、容易に壊死が起こる。したがって、脳血流の異常は、脳損傷と密接な関連がある。脳卒中の危険因子は、多様であることが知られているが、不変性の危険因子として、高齢、男性、脳卒中の家族歴、及びアフリカ及びアジア系人種などが知られており、可変性危険因子として、一過性虚血性発作、脳卒中の病歴、高血圧、冠動脈狭窄、糖尿病、喫煙、心筋梗塞、心房細動、鬱血性心不全の病歴、左心室不全、過度なアルコール摂取、血液凝固疾患などが議論される。脳卒中は、死亡率が高く、治療に多くの費用と時間がかかり、治療するとしても、障害を残しやすい疾患である。また、脳卒中は、治療後にも相当数が再発する。したがって、何よりも予防が重要である。
【０００４】
一方、人体に共生する微生物は、１００兆に達してヒト細胞より１０倍多くて、微生物の遺伝子の数は、ヒトの遺伝子の数の１００倍を超えると知られている。微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）は、与えられた生息域に存在する細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、古細菌（ａｒｃｈａｅａ）、真核生物（ｅｕｋａｒｙａ）を含む微生物群集（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）を言い、腸内微生物叢は、ヒトの生理現象に重要な役割をし、人体細胞と相互作用を通じてヒトの健康と疾病に大きい影響を及ぼすと知られている。人体に共生する細菌は、他の細胞への遺伝子、タンパク質などの情報を交換するために、ナノメートルサイズの小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）を分泌する。粘膜は、２００ナノメートル（ｎｍ）サイズ以上の粒子は通過できない物理的な防御膜を形成して、粘膜に共生する細菌である場合には、粘膜を通過しないが、細菌由来の小胞は、サイズが１００ナノメートルサイズ以下であるので、比較的自由に粘膜を通過して人体に吸収される。
【０００５】
環境ゲノミクスとも呼ばれるメタゲノム学は、環境から採取したサンプルから得られたメタゲノム資料に対する分析学といえる。最近、１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ  ｒＲＮＡ）塩基配列を基盤とする方法でヒトの微生物叢の細菌構成をリスト化することが可能になり、１６ＳリボソームＲＮＡの遺伝子である１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）プラットフォームを用いて分析する。しかしながら、脳卒中の発病において、血液などの人体由来物から細菌由来の小胞に存在するメタゲノム分析を通して脳卒中の原因因子を同定し、脳卒中を診断する方法については報告されたことがない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、脳卒中の原因因子及び発病危険度をあらかじめ診断するために、被検体由来のサンプルである血液に存在する細菌由来の細胞外小胞から遺伝子を抽出し、これに対してメタゲノム分析を行い、その結果、脳卒中の原因因子として作用できる細菌由来の細胞外小胞を同定した。そこで、これに基づいて本発明を完成した。
【０００７】
これより、本発明は、細菌由来の細胞外小胞に対するメタゲノム分析を通して脳卒中を診断するための情報提供方法を提供することを目的とする。
【０００８】
しかしながら、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、下記のステップを含む、脳卒中の診断のための情報提供方法を提供する：
（ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出するステップ；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１及び配列番号２のプライマーペアを用いてＰＣＲを行うステップ；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来のサンプルと細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較するステップ。
【００１０】
また、本発明は、下記のステップを含む、脳卒中の診断方法を提供する：
（ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出するステップ；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１及び配列番号２のプライマーペアを用いてＰＣＲを行うステップ；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来のサンプルと細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較するステップ。
【００１１】
また、本発明は、下記のステップを含む、脳卒中の発病危険度の予測方法を提供する：
（ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出するステップ；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１及び配列番号２のプライマーペアを用いてＰＣＲを行うステップ；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来のサンプルと細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較するステップ。
【００１２】
本発明の一具現例において、前記ステップ（ｃ）で、デフェリバクター門（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ）、ウェルコミクロビウム門（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）、テネリキューテス門（Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ）、シアノバクテリア門（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、ユーリ古細菌門（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）、ＴＭ７、プランクトミケス門（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ＧＮ０２、及びＯＤ１よりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較することができる。
【００１３】
本発明の他の具現例において、前記ステップ（ｃ）で、ハロバクテリウム綱（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａ）、デフェリバクター綱（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ）、ヴェルコミクロビウム綱（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ）、クロロプラスト（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）、モリクテス綱（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）、エリュシペロトリクス綱（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉ）、メタノバクテリウム綱（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フラボバクテリウム綱（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｉａ）、及びプランクトミセチア（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｉａ）、ＴＭ７−１、及びＺＢ２よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較することができる。
【００１４】
本発明のさらに他の具現例において、前記ステップ（ｃ）で、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、デフェリバクター目（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）、ストレプトファイタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）、ロドシクルス目（Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｌｅｓ）、ウェルコミクロビウム目（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、リケッチア目（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ）、パスツレラ目（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ）、 エリュシペロトリクス目（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、レジオネラ目（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｌｅｓ）、及びフラボバクテリウム目（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較することができる。
【００１５】
本発明のさらに他の具現例において、前記ステップ（ｃ）で、デルマコッカシエ（Ｄｅｒｍａｃｏｃｃａｃｅａｅ）、デフェリバクター科（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、フソバクテリアシエ（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、乳酸桿菌科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、ロドシクラシエ（Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｃｅａｅ）、ウェルコミクロビアシエ（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ）、オキサロバクテラシエ（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ノカルジオイダシエ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ）、プロピオニバクテリアシエ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、パスツレラシエ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、エリシペロトリチャシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）、コリネバクテリアシエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プレボテラ科（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、コマモナダシエ（Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、リケネルラシエ（Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ）、オドリバクテラシエ（Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、マイクロコッカシエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、マイクロバクテリアシエ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、アルカリゲナシエ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ）、メタノバクテリアシエ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、フラボバクテリアシエ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、及びクリオモルファセエ（Ｃｒｙｏｍｏｒｐｈａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較することができる。
【００１６】
本発明のさらに他の具現例において、前記ステップ（ｃ）で、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、サイクロバクター（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、クロモハロバクター（Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ）、デルマコッカス（Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ジェオトガリコッカス（Ｊｅｏｔｇａｌｉｃｏｃｃｕｓ）、ムシスピリルム（Ｍｕｃｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ｒｃ４−４、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アッカーマンシア（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）、アドレクルーツィア（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、カテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、コリンセラ（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノブレビバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）、ステレラ（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、ラクノバクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リムノハビタンス（Ｌｉｍｎｏｈａｂｉｔａｎｓ）、ポリヌクレオバクター（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｂａｃｔｅｒ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フルビコラ（Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ）、及びカンジダタスアクイルナ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ａｑｕｉｌｕｎａ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較することができる。
【００１７】
本発明のさらに他の具現例において、前記ステップ（ｃ）で、正常ヒト由来のサンプルと比較して、
バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、ユーリ古細菌門（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）、ＴＭ７、プランクトミケス門（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ＧＮ０２、及びＯＤ１よりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来の細胞外小胞、
メタノバクテリウム綱（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フラボバクテリウム綱（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｉａ）、及びプランクトミセチア（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｉａ）、ＴＭ７−１、及びＺＢ２よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来の細胞外小胞、
メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、レジオネラ目（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｌｅｓ）、及びフラボバクテリウム目（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来の細胞外小胞、
プレボテラ科（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、コマモナダシエ（Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、リケネルラシエ（Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ）、オドリバクテラシエ（Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、マイクロコッカシエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、マイクロバクテリアシエ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、アルカリゲナシエ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ）、メタノバクテリアシエ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、フラボバクテリアシエ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、及びクリオモルファセエ（Ｃｒｙｏｍｏｒｐｈａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来の細胞外小胞、又は
プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、コリンセラ（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノブレビバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）、ステレラ（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、ラクノバクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リムノハビタンス（Ｌｉｍｎｏｈａｂｉｔａｎｓ）、ポリヌクレオバクター（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｂａｃｔｅｒ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フルビコラ（Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ）、及びカンジダタスアクイルナ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ａｑｕｉｌｕｎａ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来の細胞外小胞の含有量が増加している場合、脳卒中と診断することができる。
【００１８】
本発明のさらに他の具現例において、前記ステップ（ｃ）で、正常ヒト由来のサンプルと比較して、
デフェリバクター門（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ）、ウェルコミクロビウム門（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）、テネリキューテス門（Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ）、及びシアノバクテリア門（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）よりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来の細胞外小胞、
ハロバクテリウム綱（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａ）、デフェリバクター綱（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ）、ヴェルコミクロビウム綱（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ）、クロロプラスト（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）、モリクテス綱（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）、及びエリュシペロトリクス綱（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉ）よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来の細胞外小胞、
ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、デフェリバクター目（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）、ストレプトファイタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）、ロドシクルス目（Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｌｅｓ）、ウェルコミクロビウム目（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、リケッチア目（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ）、パスツレラ目（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ）、及びエリュシペロトリクス目（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来の細胞外小胞、
デルマコッカシエ（Ｄｅｒｍａｃｏｃｃａｃｅａｅ）、デフェリバクター科（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、フソバクテリアシエ（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、乳酸桿菌科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、ロドシクラシエ（Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｃｅａｅ）、ウェルコミクロビアシエ（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ）、オキサロバクテラシエ（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ノカルジオイダシエ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ）、プロピオニバクテリアシエ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、パスツレラシエ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、エリシペロトリチャシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）、及びコリネバクテリアシエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来の細胞外小胞、又は
ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、サイクロバクター（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、クロモハロバクター（Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ）、デルマコッカス（Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ジェオトガリコッカス（Ｊｅｏｔｇａｌｉｃｏｃｃｕｓ）、ムシスピリルム（Ｍｕｃｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ｒｃ４−４，フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アッカーマンシア（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）、アドレクルーツィア（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、カテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、及びアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来の細胞外小胞の含有量が減少している場合、脳卒中と診断することができる。
【００１９】
本発明のさらに他の具現例において、前記ステップ（ｃ）で、正常ヒト由来のサンプルと比較して、
コリンセラ（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ）及びフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来の小胞の含有量が増加しており、
ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）及びプロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来の小胞の含有量が減少している場合、脳卒中と診断することができる。
【００２０】
本発明のさらに他の具現例において、前記ステップ（ｃ）で、正常ヒト由来のサンプルと比較して、
コリンセラ（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ）及びフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来の小胞の含有量が増加しており、
ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）及びプロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来の小胞の含有量が減少しており；
バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、ユーリ古細菌門（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）、及びプランクトミケス門（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来の細胞外小胞、
メタノバクテリウム綱（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フラボバクテリウム綱（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｉａ）、及びプランクトミセチア（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｉａ）よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来の細胞外小胞、
メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、レジオネラ目（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｌｅｓ）、及びフラボバクテリウム目（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来の細胞外小胞、
プレボテラ科（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、コマモナダシエ（Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、リケネルラシエ（Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ）、オドリバクテラシエ（Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、マイクロコッカシエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、マイクロバクテリアシエ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、アルカリゲナシエ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ）、メタノバクテリアシエ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、フラボバクテリアシエ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、及びクリオモルファセエ（Ｃｒｙｏｍｏｒｐｈａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来の細胞外小胞、又は
プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノブレビバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）、ステレラ（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、ラクノバクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リムノハビタンス（Ｌｉｍｎｏｈａｂｉｔａｎｓ）、ポリヌクレオバクター（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｂａｃｔｅｒ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、フルビコラ（Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ）、及びカンジダタスアクイルナ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ａｑｕｉｌｕｎａ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来の細胞外小胞の含有量が増加している場合、脳卒中と診断することができる。
【００２１】
本発明のさらに他の具現例において、前記ステップ（ｃ）で、正常ヒト由来のサンプルと比較して、
コリンセラ（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ）及びフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来の小胞の含有量が増加しており、
ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）及びプロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来の小胞の含有量が減少しており；
デフェリバクター門（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ）、ウェルコミクロビウム門（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）、テネリキューテス門（Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ）、及びシアノバクテリア門（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）よりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来の細胞外小胞、
ハロバクテリウム綱（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａ）、デフェリバクター綱（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ）、ヴェルコミクロビウム綱（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ）、クロロプラスト（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）、モリクテス綱（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）、及びエリュシペロトリクス綱（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉ）よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来の細胞外小胞、
ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、デフェリバクター目（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）、ストレプトファイタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）、ロドシクルス目（Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｌｅｓ）、ウェルコミクロビウム目（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、リケッチア目（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ）、パスツレラ目（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ）、及びエリュシペロトリクス目（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来の細胞外小胞、
デルマコッカシエ（Ｄｅｒｍａｃｏｃｃａｃｅａｅ）、デフェリバクター科（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、フソバクテリアシエ（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、乳酸桿菌科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、ロドシクラシエ（Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｃｅａｅ）、ウェルコミクロビアシエ（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ）、オキサロバクテラシエ（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ノカルジオイダシエ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ）、プロピオニバクテリアシエ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、パスツレラシエ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、エリシペロトリチャシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）、及びコリネバクテリアシエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来の細胞外小胞、又は
ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、サイクロバクター（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、クロモハロバクター（Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ）、デルマコッカス（Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ジェオトガリコッカス（Ｊｅｏｔｇａｌｉｃｏｃｃｕｓ）、ムシスピリルム（Ｍｕｃｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）、アッカーマンシア（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）、アドレクルーツィア（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、カテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、及びアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来の細胞外小胞の含有量が減少している場合、脳卒中と診断することができる。
【００２２】
本発明のさらに他の具現例において、前記被検体サンプルは、血液でありうる。
【００２３】
本発明のさらに他の具現例において、前記血液は、全血、血清、血しょう、又は血液単核球でありうる。
【発明の効果】
【００２４】
環境に存在する細菌から分泌される細胞外小胞は、体内に吸収されて、炎症の発生に直接的な影響を及ぼすことができ、脳卒中は、症状が現れる前に早期診断が難しくて、効率的な治療が難しいのが現状であるので、本発明による人体由来のサンプルを用いた細菌由来の細胞外小胞のメタゲノム分析を通して脳卒中の原因因子及び発病の危険度をあらかじめ診断することによって、脳卒中の危険群を早期に診断して、適切な管理により発病時期を遅らせたり発病を予防することができ、発病後にも早期診断することができて、脳卒中の発病率を低減し、治療効果を高めることができる。また、脳卒中と診断された患者にとってメタゲノム分析を通して原因因子の露出を避けることによって、疾病の経過を良くしたり、再発を防ぐことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１ａは、マウスに腸内細菌と細菌由来の小胞（ＥＶ）を口腔で投与した後、時間別に細菌と小胞の分布様相を撮影した写真であり、図１ｂは、口腔で投与した後１２時間目に、血液及び様々な臓器を摘出して、細菌と小胞の体内分布様相を評価した図である。
【図２】図２は、脳卒中患者及び正常ヒトの血液から細菌由来の小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来の小胞（ＥＶｓ）の分布を示す結果である。
【図３】図３は、脳卒中患者及び正常ヒトの血液から細菌由来の小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、綱（ｃｌａｓｓ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来の小胞（ＥＶｓ）の分布を示す結果である。
【図４】図４は、脳卒中患者及び正常ヒトの血液から細菌由来の小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、目（ｏｒｄｅｒ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来の小胞（ＥＶｓ）の分布を示す結果である。
【図５】図５は、脳卒中患者及び正常ヒトの血液から細菌由来の小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来の小胞（ＥＶｓ）の分布を示す結果である。
【図６】図６は、脳卒中患者及び正常ヒトの血液から細菌由来の小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、属（ｇｅｎｕｓ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来の小胞（ＥＶｓ）の分布を示す結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、細菌メタゲノム分析を通して脳卒中を診断する方法に関し、本発明者らは、被検体由来のサンプルを用いて細菌由来の細胞外小胞から遺伝子を抽出し、これに対してメタゲノム分析を行い、脳卒中の原因因子として作用できる細菌由来の細胞外小胞を同定した。
【００２７】
これより、本発明は、（ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出するステップ；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１及び配列番号２のプライマーペアを用いてＰＣＲを行うステップ；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来のサンプルと細菌及び古細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較するステップを含む脳卒中を診断するための情報提供方法を提供する。
【００２８】
本発明において使用される用語「脳卒中の診断」とは、患者に対して脳卒中が発病する可能性があるか、脳卒中が発病する可能性が相対的に高いか、又は脳卒中がすでに発病したか否かを判別することを意味する。本発明の方法は、任意の特定患者に対する脳卒中の発病危険度が高い患者にとって特別かつ適切な管理を通じて発病時期を遅らせたり発病しないようにするに用いることができる。また、本発明の方法は、脳卒中を早期に診断して、最も適切な治療方式を選択することによって、治療を決定するために臨床的に用いられる。
【００２９】
本発明において使用される用語「メタゲノム（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ）」とは、「群遺伝子」とも言い、土、動物の腸など孤立した地域内のすべてのウイルス、細菌、カビなどを含む遺伝子の総和を意味するものであって、主に培養にならない微生物を分析するために、シーケンサーを用いて一度に多くの微生物を同定することを説明する遺伝子の概念に使用される。特に、メタゲノムは、一種のゲノム又は遺伝子を言うものではなく、一つの環境単位のすべての種の遺伝子であって、一種の混合遺伝子を言う。これは、オミックス的に生物学が発展する過程で一種を定義するとき、機能的に既存の一種だけでなく、多様な種が互いに相互作用して完全な種を作るという観点から出た用語である。技術的には、迅速な配列分析法を用いて、種に関係なく、すべてのＤＮＡ、ＲＮＡを分析して、一つの環境内でのすべての種を同定し、相互作用、代謝作用を解明する技法の対象である。本発明では、好ましくは血清から分離した細菌由来の細胞外小胞を用いてメタゲノム分析を実施した。
【００３０】
本発明において使用される用語「細菌由来の小胞」とは、細菌及び古細菌から分泌される細胞外小胞を含むが、これに制限されるものではない。
【００３１】
本発明において、前記被検体サンプルは、血液であり得、前記血液は、好ましくは全血、血清、血しょう、又は血液単核球でありうるが、これに制限されるものではない。
【００３２】
本発明の実施例では、前記細菌由来の細胞外小胞に対するメタゲノム分析を実施し、門（ｐｈｙｌｕｍ）、綱（ｃｌａｓｓ）、目（ｏｒｄｅｒ）、科（ｆａｍｉｌｙ）、及び属（ｇｅｎｕｓ）レベルでそれぞれ分析して、実際に脳卒中発生の原因として作用できる細菌由来の小胞を同定した。
【００３３】
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来の血液サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを門レベルで分析した結果、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ，Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ，Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ，Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ，Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ，Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ，ＴＭ７，Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ，ＧＮ０２，及びＯＤ１門細菌由来の細胞外小胞の含有量が、脳卒中患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
【００３４】
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来の血液サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを綱レベルで分析した結果、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａ，Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ，Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ，Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ，Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ，Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉ，Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ，Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｉａ，Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｉａ，ＴＭ７−１，及びＺＢ２綱細菌由来の細胞外小胞の含有量が、脳卒中患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
【００３５】
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来の血液サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを目レベルで分析した結果、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ，Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ，Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｌｅｓ，Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ，Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ，Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ，Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ，Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ，Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｌｅｓ，及びＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ目細菌由来の細胞外小胞の含有量が、脳卒中患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
【００３６】
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来の血液サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを科レベルで分析した結果、Ｄｅｒｍａｃｏｃｃａｃｅａｅ，Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ，Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ，Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｃｅａｅ，Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ，Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ，Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ，Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ，Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ，Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ，Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ，Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ，Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ，Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ，Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，及びＣｒｙｏｍｏｒｐｈａｃｅａｅ科細菌由来の細胞外小胞の含有量が、脳卒中患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
【００３７】
より具体的に、本発明の一実施例では、被検者由来の血液サンプルに存在する小胞に対して細菌メタゲノムを属レベルで分析した結果、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ，Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ，Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ，Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｊｅｏｔｇａｌｉｃｏｃｃｕｓ，Ｍｕｃｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ，ｒｃ４−４，Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｋｏｃｕｒｉａ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ，Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ，Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ，Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ，Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ，Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ，Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ，Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ，Ｌａｃｈｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｌｉｍｎｏｈａｂｉｔａｎｓ，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｂａｃｔｅｒ，Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ，Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ，及びＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ａｑｕｉｌｕｎａ属細菌由来の細胞外小胞の含有量が、脳卒中患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
【００３８】
前記実施例の結果から、前記同定された細菌由来の細胞外小胞の分布変数が脳卒中発生の予測に有用に用いられることを確認した。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明の理解を助けるために好適な実施例を提示する。しかしなが、下記の実施例は、本発明をさらに容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が制限されるものではない。
【００４０】
［実施例１．腸内細菌及び細菌由来の小胞の体内吸収、分布、及び排泄様相の分析］
腸内細菌と細菌由来の小胞が胃腸管を介して全身的に吸収されるかを評価するために、次のような方法で実験を行った。マウスの胃腸に蛍光で標識した腸内細菌と腸内細菌由来の小胞をそれぞれ５０μｇの用量で胃腸管に投与し、０分、５分、３時間、６時間、１２時間後に蛍光を測定した。マウスの全体イメージを観察した結果、図１ａに示されたように、前記細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）である場合には、全身的に吸収されなかったが、細菌由来の小胞（ＥＶ）である場合には、投与５分後に全身的に吸収され、投与３時間後には、膀胱に蛍光が濃く観察されて、小胞が泌尿器系に排泄されることが分かった。また、小胞は、投与１２時間まで体内に存在することが分かった。
【００４１】
腸内細菌と腸内細菌由来の小胞が全身的に吸収された後、様々な臓器に浸潤された様相を評価するために、蛍光で標識した５０μｇの細菌と細菌由来の小胞を前記の方法のように投与した後、１２時間目にマウスから血液（Ｂｌｏｏｄ）、心臓（Ｈｅａｒｔ）、肺（Ｌｕｎｇ）、肝臓（Ｌｉｖｅｒ）、腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）、脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）、脂肪組織（Ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ）、及び筋肉（Ｍｕｓｃｌｅ）を摘出した。前記摘出した組織から蛍光を観察した結果、図１ｂに示されたように、前記腸内細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）は、各臓器に吸収されなかった反面、前記腸内細菌由来の細胞外小胞（ＥＶ）は、血液、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、脂肪組織、及び筋肉に分布することを確認した。
【００４２】
［実施例２．血液から小胞分離及びＤＮＡ抽出］
血液から小胞を分離し、ＤＮＡを抽出するために、まず、１０ｍｌのチューブに血液を入れて遠心分離（３，５００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）を実施して、浮遊物を沈めて、上清のみを回収した後、新しい１０ｍｌのチューブに移した。０．２２μｍのフィルターを用いて前記回収した上清から細菌及び異物を除去した後、セントリプレップチューブ（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒｓ  ５０ｋＤ）に移し、１５００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離して、５０ｋＤより小さい物質を捨てて、１０ｍｌまで濃縮させた。さらに、０．２２μｍのフィルターを用いてバクテリア及び異物を除去した後、Ｔｙｐｅ９０ｔｉローターで１５０，０００×ｇ、４℃で３時間の間超高速遠心分離方法を用いて上清を捨て、固まったペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を生理食塩水（ＰＢＳ）で溶かして、小胞を収得した。
【００４３】
前記方法により血液から分離した小胞１００μｌを１００℃でボイルして、内部のＤＮＡを脂質外に出るようにした後、氷に５分間冷ました。次に、残った浮遊物を除去するために、１０，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上清のみを集めた後、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＤＮＡ量を定量した。以後、前記抽出されたＤＮＡに細菌由来のＤＮＡが存在するかを確認するために、下記表１に示した１６ｓ  ｒＤＮＡ  ｐｒｉｍｅｒでＰＣＲを行って、前記抽出された遺伝子に細菌由来の遺伝子が存在することを確認した。
【００４４】
【表１】
2021514186.tif 000003
【００４５】
［実施例３．血液から抽出したＤＮＡを用いたメタゲノム分析］
前記実施例２の方法で遺伝子を抽出した後、前記表１に示した１６Ｓ  ｒＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲを実施して遺伝子を増幅させ、シーケンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を行った。結果をＳｔａｎｄａｒｄ  Ｆｌｏｗｇｒａｍ  Ｆｏｒｍａｔ（ＳＦＦ）ファイルに出力し、ＧＳ  ＦＬＸ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ２．９）を用いてＳＦＦファイルをｓｅｑｕｅｎｃｅファイル（．ｆａｓｔａ）とｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｓｃｏｒｅファイルに変換した後、リードの信用度評価を確認し、ｗｉｎｄｏｗ（２０ｂｐｓ）平均ｂａｓｅ  ｃａｌｌ  ａｃｃｕｒａｃｙが９９％未満（Ｐｈｒｅｄ  ｓｃｏｒｅ＜２０）である部分を除去した。質が低い部分を除去した後、リードの長さが３００ｂｐｓ以上のもののみを用い（Ｓｉｃｋｌｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．３３）、結果分析のために、Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  Ｕｎｉｔ（ＯＴＵ）は、ＵＣＬＵＳＴとＵＳＥＡＲＣＨを用いてシーケンス類似度によってクラスタリングを行った。具体的に、属（ｇｅｎｕｓ）は９４％、科（ｆａｍｉｌｙ）は９０％、目（ｏｒｄｅｒ）は８５％、綱（ｃｌａｓｓ）は８０％、門（ｐｈｙｌｕｍ）は７５％シーケンス類似度を基準としてクラスタリングし、各ＯＴＵの門、綱、目、科、属レベルの分類を行い、ＢＬＡＳＴＮとＧｒｅｅｎＧｅｎｅｓの１６Ｓ  ＤＮＡシーケンス  データベース（１０８，４５３シーケンス）を用いて９７％以上のシーケンス類似度を有するバクテリアを分析した（ＱＩＩＭＥ）。
【００４６】
［実施例４．血液から分離した細菌由来の小胞メタゲノム分析基盤脳卒中の診断モデル］
前記実施例３の方法で、脳卒中患者１１５人と、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１０９人の血液から小胞を分離した後、メタゲノムシーケンシングを行った。診断モデルの開発は、まず、ｔ検定で二つの群間のｐ値が０．０５以下であり、二つの群間に２倍以上違いが生じる菌株を選定した後、ロジスティック回帰分析（ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）方法で診断的性能指標であるＡＵＣ（ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｃｕｒｖｅ）、敏感度、及び特異度を算出した。
【００４７】
血液内細菌由来の小胞を門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで分析した結果、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ，Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ，Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ，Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ，Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ，Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ，ＴＭ７，Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ，ＧＮ０２，及びＯＤ１門細菌バイオマーカーにて診断モデルを開発したとき、脳卒中に対する診断的性能が有意に示された（表２及び図２参照）。
【００４８】
【表２】
2021514186.tif 000004
【００４９】
血液内細菌由来の小胞を綱（ｃｌａｓｓ）レベルで分析した結果、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａ，Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ，Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ，Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ，Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ，Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉ，Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ，Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｉａ，Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｉａ，ＴＭ７−１，及びＺＢ２綱細菌バイオマーカーにて診断モデルを開発したとき、脳卒中に対する診断的性能が有意に示された（表３及び図３参照）。
【００５０】
【表３】
2021514186.tif 000005
【００５１】
血液内細菌由来の小胞を目（ｏｒｄｅｒ）レベルで分析した結果、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ，Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ，Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｌｅｓ，Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ，Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ，Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ，Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ，Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ，Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｌｅｓ，及びＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ目細菌バイオマーカーにて診断モデルを開発したとき、脳卒中に対する診断的性能が有意に示された（表４及び図４参照）。
【００５２】
【表４】
2021514186.tif 000006
【００５３】
血液内細菌由来の小胞を科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで分析した結果、Ｄｅｒｍａｃｏｃｃａｃｅａｅ，Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ，Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ，Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｃｅａｅ，Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ，Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ，Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ，Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ，Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ，Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ，Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ，Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ，Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ，Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ，Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，及びＣｒｙｏｍｏｒｐｈａｃｅａｅ科細菌バイオマーカーにて診断モデルを開発したとき、脳卒中に対する診断的性能が有意に示された（表５及び図５参照）。
【００５４】
【表５】
2021514186.tif 000007
【００５５】
血液内細菌由来の小胞を属（ｇｅｎｕｓ）レベルで分析した結果、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ，Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ，Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ，Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｊｅｏｔｇａｌｉｃｏｃｃｕｓ，Ｍｕｃｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ，ｒｃ４−４，Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｋｏｃｕｒｉａ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ，Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ，Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ，Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ，Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ，Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ，Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ，Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ，Ｌａｃｈｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｌｉｍｎｏｈａｂｉｔａｎｓ，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｂａｃｔｅｒ，Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ，Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ，及びＣａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ａｑｕｉｌｕｎａ属細菌バイオマーカーにて診断モデルを開発したとき、脳卒中に対する診断的性能が有意に示された（表６及び図６参照）。
【００５６】
【表６】
2021514186.tif 000008
【００５７】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明による細菌メタゲノム分析を通して脳卒中の診断に関する情報を提供する方法は、被検体由来のサンプルを用いて細菌メタゲノム分析を行って、特定細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を分析することによって、脳卒中の発病危険度を予測し、脳卒中を診断するのに用いられる。
【図１ａ】
2021514186.tif 000009
【図１ｂ】
2021514186.tif 000010
【図２】
2021514186.tif 000011
【図３】
2021514186.tif 000012
【図４】
2021514186.tif 000013
【図５】
2021514186.tif 000014
【図６】
2021514186.tif 000015
【配列表】
2021514186000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年9月10日(2020.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のステップを含む、脳卒中の診断のための情報提供方法：
（ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出するステップ；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１及び配列番号２のプライマーペアを用いてＰＣＲを行うステップ；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒト由来のサンプルと細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較するステップ。
【請求項２】
前記ステップ（ｃ）で、デフェリバクター門（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ）、ウェルコミクロビウム門（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）、テネリキューテス門（Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ）、シアノバクテリア門（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、ユーリ古細菌門（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）、ＴＭ７、プランクトミケス門（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ＧＮ０２、及びＯＤ１よりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較することを特徴とする、請求項１に記載の脳卒中の診断のための情報提供方法。
【請求項３】
前記ステップ（ｃ）で、ハロバクテリウム綱（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａ）、デフェリバクター綱（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ）、ヴェルコミクロビウム綱（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ）、クロロプラスト（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）、モリクテス綱（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）、エリュシペロトリクス綱（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉ）、メタノバクテリウム綱（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フラボバクテリウム綱（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｉａ）、プランクトミセチア（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｉａ）、ＴＭ７−１、及びＺＢ２よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較することを特徴とする、請求項１に記載の脳卒中の診断のための情報提供方法。
【請求項４】
前記ステップ（ｃ）で、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、デフェリバクター目（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）、ストレプトファイタ（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）、ロドシクルス目（Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｌｅｓ）、ウェルコミクロビウム目（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、リケッチア目（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ）、パスツレラ目（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ）、 エリュシペロトリクス目（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、レジオネラ目（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｌｅｓ）、及びフラボバクテリウム目（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）よりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較することを特徴とする、請求項１に記載の脳卒中の診断のための情報提供方法。
【請求項５】
前記ステップ（ｃ）で、デルマコッカシエ（Ｄｅｒｍａｃｏｃｃａｃｅａｅ）、デフェリバクター科（Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、フソバクテリアシエ（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、乳酸桿菌科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、ロドシクラシエ（Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｃｅａｅ）、ウェルコミクロビアシエ（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ）、オキサロバクテラシエ（Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、ノカルジオイダシエ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ）、プロピオニバクテリアシエ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、パスツレラシエ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、エリシペロトリチャシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）、コリネバクテリアシエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プレボテラ科（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、コマモナダシエ（Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、リケネルラシエ（Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ）、オドリバクテラシエ（Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、マイクロコッカシエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、マイクロバクテリアシエ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、アルカリゲナシエ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ）、メタノバクテリアシエ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、フラボバクテリアシエ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、及びクリオモルファセエ（Ｃｒｙｏｍｏｒｐｈａｃｅａｅ）よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較することを特徴とする、請求項１に記載の脳卒中の診断のための情報提供方法。
【請求項６】
前記ステップ（ｃ）で、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、サイクロバクター（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、クロモハロバクター（Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ）、デルマコッカス（Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ジェオトガリコッカス（Ｊｅｏｔｇａｌｉｃｏｃｃｕｓ）、ムシスピリルム（Ｍｕｃｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ｒｃ４−４，フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アッカーマンシア（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）、アドレクルーツィア（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、カテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、コリンセラ（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノブレビバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）、ステレラ（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、ラクノバクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リムノハビタンス（Ｌｉｍｎｏｈａｂｉｔａｎｓ）、ポリヌクレオバクター（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｂａｃｔｅｒ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フルビコラ（Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ）、及びカンジダタスアクイルナ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ａｑｕｉｌｕｎａ）よりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を比較することを特徴とする、請求項１に記載の脳卒中の診断のための情報提供方法。
【請求項７】
前記被検体サンプルは、血液であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の脳卒中の診断のための情報提供方法。
【請求項８】
前記血液は、全血、血清、血しょう、又は血液単核球であることを特徴とする、請求項７に記載の脳卒中の診断のための情報提供方法。
【国際調査報告】
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