(57)【要約】  バイカレインおよびスクテラレインを合成する微生物、その製造方法およびその使用を提供する。宿主細胞の異種代謝経路を遺伝子工学によって改造することにより、バイカレインおよびスクテラレインを高収量で生産する工学菌株を獲得した。前記工学菌株でバイカレインおよびスクテラレインを生産するプロセスをさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）フラボノイド６−ヒドロキシラーゼおよびシトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼを発現する遺伝子、並びにクリシンまたはアピゲニンを合成する遺伝子を宿主細胞に導入することと；
（２）フェニルアラニンおよび／またはチロシンを含む培養系中で前記宿主細胞を培養し、バイカレインまたはスクテラレインを生産することと、
を含むことを特徴とする、バイカレインおよびスクテラレインの生産方法。
【請求項２】
前記クリシンまたはアピゲニンを合成する遺伝子は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、４−クマル酸ＣｏＡリガーゼ、カルコンシンターゼ、カルコンイソメラーゼおよびフラボンシンターゼＩを発現する遺伝子を含む；好ましくは、宿主細胞に導入される時、前記フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、４−クマル酸ＣｏＡリガーゼ、カルコンシンターゼ、カルコンイソメラーゼおよびフラボンシンターゼＩを発現する遺伝子は、同一の発現ベクターに存在することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（１）フラボノイド６−ヒドロキシラーゼおよびシトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼを発現する遺伝子を宿主細胞に導入し、組換え宿主細胞を獲得することと；
（２）クリシンまたはアピゲニンを含む培養系中で前記組換え宿主細胞を培養し、バイカレインまたはスクテラレインを生産することと、
を含むことを特徴とする、バイカレインおよびスクテラレインの生産方法。
【請求項４】
フラボノイド６−ヒドロキシラーゼおよびシトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼでクリシンまたはアピゲニンを触媒することにより、クリシンまたはアピゲニンの構造にヒドロキシ基を１つ付加し、バイカレインまたはスクテラレインを形成することを特徴とする、クリシンまたはアピゲニンをバイカレインまたはスクテラレインに転換する方法。
【請求項５】
前記フラボノイド６−ヒドロキシラーゼは、Ｎ末端の（１−１０）〜（２０−３０）位のアミノ酸が切断された変異型フラボノイド６−ヒドロキシラーゼである；好ましくは、Ｎ末端の（２−５）〜（２２−２８）位のアミノ酸が切断された変異型フラボノイド６−ヒドロキシラーゼであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記フラボノイド６−ヒドロキシラーゼは、ポリペプチドタグと融合され、前記ポリペプチドタグは、仔牛血清１７ヒドロキシラーゼのＮ末端の８アミノ酸ポリペプチド、低分子ユビキチン様修飾因子、マルトース結合タンパク質、シトクロムＰ４５０  ２Ｂ１ファミリー可溶性タンパク質、またはそれらの組み合わせからなる群から選ばれる；好ましくは、マルトース結合タンパク質またはシトクロムＰ４５０  ２Ｂ１ファミリー可溶性タンパク質、またはそれらの組み合わせである；好ましくは、前記ポリペプチドタグはＮ末端に位置することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼは、Ｎ末端の（１−２０）〜（６０−８５）位のアミノ酸が切断された変異型シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼである；好ましくは、Ｎ末端の（２−１０）〜（６５−８０）位のアミノ酸が切断された突然変異型シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼである；より好ましくは、Ｎ末端の（２−５）〜（７０−７５）位のアミノ酸が切断された突然変異型シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記宿主細胞は、原核細胞または真核細胞を含む；好ましくは、前記原核細胞は、大腸菌細胞、枯草菌細胞を含む；前記真核細胞は、酵母細胞を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
フラボノイド６−ヒドロキシラーゼおよびシトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼを発現する外因性遺伝子を含むことを特徴とする、組換え宿主細胞。
【請求項１０】
クリシンまたはアピゲニンを合成する外因性遺伝子をさらに含み、前記クリシンまたはアピゲニンを合成する遺伝子は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、４−クマル酸ＣｏＡリガーゼ、カルコンシンターゼ、カルコンイソメラーゼおよびフラボンシンターゼＩを発現する遺伝子を含む；好ましくは、前記フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、４−クマル酸ＣｏＡリガーゼ、カルコンシンターゼ、カルコンイソメラーゼおよびフラボンシンターゼＩを発現する遺伝子は、同一の発現ベクターで宿主細胞に導入されることを特徴とする、請求項９に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１】
前記フラボノイド６−ヒドロキシラーゼは、Ｎ末端の（１−１０）〜（２０−３０）位のアミノ酸が切断された変異型フラボノイド６−ヒドロキシラーゼである；好ましくは、Ｎ末端の（２−５）〜（２２−２８）位のアミノ酸が切断された変異型フラボノイド６−ヒドロキシラーゼであることを特徴とする、請求項９〜１０のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
【請求項１２】
前記フラボノイド６−ヒドロキシラーゼは、ポリペプチドタグと融合され、前記ポリペプチドタグは、仔牛血清１７ヒドロキシラーゼのＮ末端の８アミノ酸ポリペプチド、低分子ユビキチン様修飾因子、マルトース結合タンパク質、シトクロムＰ４５０  ２Ｂ１ファミリー可溶性タンパク質、またはそれらの組み合わせからなる群から選ばれる；好ましくは、マルトース結合タンパク質またはシトクロムＰ４５０  ２Ｂ１ファミリー可溶性タンパク質、またはそれらの組み合わせである；好ましくは、前記ポリペプチドタグはＮ末端に位置することを特徴とする、請求項９〜１０のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
【請求項１３】
前記シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼは、Ｎ末端の（１−２０）〜（６０−８５）位のアミノ酸が切断された変異型シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼである；好ましくは、Ｎ末端の（２−１０）〜（６５−８０）位のアミノ酸が切断された突然変異型シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼである；より好ましくは、Ｎ末端の（２−５）〜（７０−７５）位のアミノ酸が切断された突然変異型シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼであることを特徴とする、請求項９〜１０のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれかに記載の組換え宿主細胞の、バイカレインおよびスクテラレインを生産するための使用。
【請求項１５】
フラボノイド６−ヒドロキシラーゼおよびシトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼを発現する遺伝子を宿主細胞に導入し、組換え菌株を獲得することを含む；好ましくは、クリシンまたはアピゲニンを合成する遺伝子を導入することをさらに含むことを特徴とする、バイカレインおよびスクテラレインを生産するための宿主細胞の製造方法。
【請求項１６】
バイカレインおよびスクテラレインを生産するためのキットであって、請求項９〜１３のいずれかに記載の組換え宿主細胞を含むキット。
【請求項１７】
野生型フラボノイド６−ヒドロキシラーゼに相応するものであって、Ｎ末端の（１−１０）〜（２０−３０）位のアミノ酸が切断され、好ましくはＮ末端の（２−５）〜（２２−２８）位のアミノ酸が切断され、好ましくは配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する変異型フラボノイド６−ヒドロキシラーゼ。
【請求項１８】
野生型シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼに相応するものであって、Ｎ末端の（１−２０）〜（６０−８５）位のアミノ酸が切断され、好ましくはＮ末端の（２−１０）〜（６５−８０）位のアミノ酸が切断され、より好ましくはＮ末端の（２−５）〜（７０−７５）位のアミノ酸が切断され、好ましくは配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する変異型シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼ。
【請求項１９】
請求項１７に記載の変異型フラボノイド６−ヒドロキシラーゼと、それと融合するポリペプチドタグとを含み、前記ポリペプチドタグは、８ＲＰ、Ｓｕｍｏ、ＭＢＰ、２Ｂ１からなる群から選ばれ、好ましくはＭＢＰまたは２Ｂ１であることを特徴とする、融合ポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１７に記載の変異型フラボノイド６−ヒドロキシラーゼ；または
請求項１８に記載の変異型シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼ；または
請求項１９または２０に記載の融合ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項２１に記載のいずれかのポリヌクレオチド；或いは
請求項１７に記載の変異型フラボノイド６−ヒドロキシラーゼ若しくは請求項１９に記載の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、請求項１８に記載の変異型シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼをコードするポリヌクレオチドと、
を含む発現構築物。
【請求項２３】
請求項１７に記載の変異型フラボノイド６−ヒドロキシラーゼ若しくは請求項１９に記載の融合ポリペプチド、並びに請求項１８に記載の変異型シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼの、クリシンまたはアピゲニンの構造にヒドロキシ基を１つ付加してバイカレインまたはスクテラレインを形成するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学および医薬の技術分野に関し、具体的には、バイカレインおよびスクテラレインを合成する微生物、その製造方法およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
コガネバナ（Scutellaria Baicalensis Georgi）は中国で有名な伝統薬物であり、シソ科植物である；漢方薬のオウゴンは植物のコガネバナの乾燥した根であり、薬用の歴史が長く、風熱や湿熱などの多数の病気の治療に有用である。エゾムカシヨモギはキク科植物の短茎ヒホウ（Erigeron breviscapus）の乾燥した全草であり、性質が寒くて味が苦く、抗炎症、鎮痛、血行促進、うっ血除去、風邪払い、湿邪除去などの効能を有する。オウゴンおよびエゾムカシヨモギのエキスは長い間、漢方薬製剤に広く使用されており、「銀黄錠」、「双黄連経口液」や「蘭岑経口液」などの主要原料はいずれもオウゴンエキスであり、漢方薬の「清開霊」の主要な活性成分はバイカレインであり、抗炎症、下痢と肝疾患と腫瘍を予防・治療する効能を有する；通常のエゾムカシヨモギ剤形として、ブレビスカピン錠やブレビスカピン経口液などがあり、それらは生体内で、主にそれらのアグリコンであるスクテラレインの形態で代謝・吸収される。従って、バイカレインおよびスクテラレインは両方共、新薬開発においてある程度の価値がある。
【０００３】
バイカレインおよびスクテラレインは、類似な構造を持つ２つの重要なフラボノイド化合物である。バイカレインの分子式はＣ１５Ｈ１０Ｏ５で、分子量は２７０．２４であるが、スクテラレインの分子量はＣ１５Ｈ１０Ｏ６で、分子量は２８６．２４である。それらの構造は図１に示す。
【０００４】
現在、ほとんどの植物由来天然物と同様に、バイカレインおよびスクテラレインは主に化学合成と有機溶媒抽出の２つの方法で製造される。有機溶媒抽出は主に、オウゴンやエゾムカシヨモギ、ハンシレンなど薬用植物に組織抽出をするが、このプロセスには大量の有機溶媒が必要であり、しかも後段の分離工程が煩雑である問題や、産業化のコストが高い問題などもある。最も重要なのは、この方法が植物の成長の遅さや薬用資源の破壊などの難題に悩まされているということである。バイカレインおよびスクテラレインは化学合成によっても大量に獲得できるが、原料には桂皮酸またはその誘導体や、オキシフェノールなどの化学物質が関わっているため、医薬品や食品などの分野における使用はある程度制限されている。さらに、合成プロセスには、有毒な試薬や高価な化学触媒を使用するなどの問題も関わっている。
【０００５】
合成生物学は、理性的な設計に基づいて、標準化された生物学的要素を統合および組み立てて、性能に優れた人工生命システムを構築するものである。合成生物学が誕生すると、その構想と設計は産業用微生物技術の開発に大きな影響を与え、それにより、微生物技術は医薬品、バイオ燃料、ファインケミカルの開発と生産プロセスにおいてより大きな役割を果たす。
【０００６】
本分野では、多数の天然物の合成要素を組み立てることにより、微生物による異種合成を実現した。しかしながら、本発明にかかるバイカレインおよびスクテラレインの２つの活性フラボノイド化合物について、微生物による異種合成に成功した報告は未だに無い。従って、バイカレインおよびスクテラレインを異種合成できる微生物株を構築することが切望されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、バイカレインおよびスクテラレインを合成する微生物、その製造方法およびその使用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第一は、（１）フラボノイド６−ヒドロキシラーゼ（Ｆ６Ｈ）およびシトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼ（ＣＰＲ）を発現する遺伝子、並びにクリシンまたはアピゲニンを合成する遺伝子を宿主細胞に導入することと；（２）フェニルアラニンおよび／またはチロシンを含む培養系中で前記宿主細胞を培養し、バイカレインまたはスクテラレインを生産することと、を含むバイカレインおよびスクテラレインの生産方法を提供する。
【０００９】
一つの好ましい例において、前記クリシンまたはアピゲニンを合成する遺伝子は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（phenylalanine ammonia-lyase、ＰＡＬ）、４−クマル酸ＣｏＡリガーゼ（4-coumarate：CoA ligase、４ＣＬ）、カルコンシンターゼ（chalcone synthase、ＣＨＳ）、カルコンイソメラーゼ（chalcone isomerase、ＣＨＩ）およびフラボンシンターゼＩ（flavone synthase I、ＦＮＳＩ）を発現する遺伝子を含む；好ましくは、宿主細胞に導入される時、前記フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、４−クマル酸ＣｏＡリガーゼ、カルコンシンターゼ、カルコンイソメラーゼおよびフラボンシンターゼＩを発現する遺伝子は、同一の発現ベクターに存在する。
【００１０】
もう一つの好ましい例において、前記フラボノイド６−ヒドロキシラーゼは、コガネバナ（Scutellaria baicalensis）から由来のものであり、そのホモログ（他の種から由来の相同遺伝子またはポリペプチド）も含む；前記ＣＰＲは、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）から由来のものであり、そのホモログも含む。
【００１１】
もう一つの好ましい例において、前記ＰＡＬは、イワベンケイ（Rhodotorula toruloides）から由来のものであり、そのホモログも含む；前記４ＣＬは、パセリ（Petroselium crispum）から由来のものであり、そのホモログも含む；前記ＣＨＳは、ペチュニア（Petunia X hybrida）から由来のものであり、そのホモログも含む；前記ＣＨＩは、アルファルファ（Medicago sativa）から由来のものであり、そのホモログも含む；前記ＦＮＳＩは、パセリ（Petroselium crispum）から由来のものであり、そのホモログも含む。
【００１２】
本発明のもう一つは、（１）フラボノイド６−ヒドロキシラーゼ（Ｆ６Ｈ）およびシトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼ（ＣＰＲ）を発現する遺伝子を宿主細胞に導入し、組換え宿主細胞を獲得することと；（２）クリシンまたはアピゲニンを含む培養系中で前記組換え宿主細胞を培養し、バイカレインまたはスクテラレインを生産することと、を含むバイカレインおよびスクテラレインの生産方法を提供する。
【００１３】
本発明のもう一つは、フラボノイド６−ヒドロキシラーゼおよびシトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼでクリシンまたはアピゲニンを触媒することにより、クリシンまたはアピゲニンの構造にヒドロキシ基を１つ付加し、バイカレインまたはスクテラレインを形成するという、クリシンまたはアピゲニンをバイカレインまたはスクテラレインに転換する方法を提供する。
【００１４】
一つの好ましい例において、前記フラボノイド６−ヒドロキシラーゼ（Ｆ６Ｈ）は、Ｎ末端の（１−１０）〜（２０−３０）位のアミノ酸が切断された変異型フラボノイド６−ヒドロキシラーゼである；好ましくは、Ｎ末端の（２−５）〜（２２−２８）位のアミノ酸が切断された変異型フラボノイド６−ヒドロキシラーゼである。
【００１５】
もう一つの好ましい例において、前記フラボノイド６−ヒドロキシラーゼは、ポリペプチドタグと融合され、前記ポリペプチドタグは、仔牛血清１７ヒドロキシラーゼのＮ末端の８アミノ酸ポリペプチド（８ＲＰ）、低分子ユビキチン様修飾因子（Ｓｕｍｏ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、シトクロムＰ４５０  ２Ｂ１ファミリー可溶性タンパク質（２Ｂ１）、またはそれらの組み合わせからなる群から選ばれる；好ましくは、マルトース結合タンパク質またはシトクロムＰ４５０  ２Ｂ１ファミリー可溶性タンパク質、またはそれらの組み合わせである；好ましくは、前記ポリペプチドタグはＮ末端に位置する。
【００１６】
もう一つの好ましい例において、前記シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼ（ＣＰＲ）は、Ｎ末端の（１−２０）〜（６０−８５）位のアミノ酸が切断された変異型シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼである；好ましくは、Ｎ末端の（２−１０）〜（６５−８０）位のアミノ酸が切断された突然変異型シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼである；より好ましくは、Ｎ末端の（２−５）〜（７０−７５）位のアミノ酸が切断された突然変異型シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼである。
【００１７】
もう一つの好ましい例において、前記宿主細胞は、原核細胞または真核細胞を含む；好ましくは、前記原核細胞は、大腸菌細胞、枯草菌細胞を含む；前記真核細胞は、酵母細胞を含む。
【００１８】
本発明のもう一つは、フラボノイド６−ヒドロキシラーゼおよびシトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼを発現する外因性遺伝子を含む組換え宿主細胞を提供する。
【００１９】
もう一つの好ましい例において、前記組換え宿主細胞はさらに、クリシンまたはアピゲニンを合成する外因性遺伝子を含む。
【００２０】
もう一つの好ましい例において、前記ポリペプチドタグは、シングルコピーまたは２〜１０コピー（３、４、５、６、８コピーなど）の直列配列構造である。
【００２１】
本発明のもう一つは、前記のいずれかの組換え宿主細胞の、バイカレインおよびスクテラレインを生産するための使用を提供する。
【００２２】
一つの好ましい例において、クリシンまたはアピゲニンを合成する遺伝子が細胞内に存在しない菌株は、外因的に添加されるクリシンまたはアピゲニンを基質として、バイカレインおよびスクテラレインを生産するために使用される；クリシンまたはアピゲニンを合成する遺伝子が細胞内に存在する菌株は、フェニルアラニンおよび／またはチロシンが外因的に添加された培養条件下で、バイカレインおよびスクテラレインを生産するために使用される。
【００２３】
本発明のもう一つは、フラボノイド６−ヒドロキシラーゼおよびシトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼを発現する遺伝子を宿主細胞に導入し、組換え菌株を獲得することを含む；好ましくは、クリシンまたはアピゲニンを合成する遺伝子を導入することをさらに含む、バイカレインおよびスクテラレインを生産するための宿主細胞の製造方法を提供する。
【００２４】
本発明のもう一つは、バイカレインおよびスクテラレインを生産するためのキットであって、前記のいずれかの組換え宿主細胞を含むキットを提供する。
【００２５】
もう一つの好ましい例において、前記キットはさらに、宿主細胞培地や、取扱説明書などを含む。
【００２６】
本発明のもう一つは、野生型フラボノイド６−ヒドロキシラーゼ（Ｆ６Ｈ）に相応するものであって、Ｎ末端の（１−１０）〜（２０−３０）位のアミノ酸が切断され、好ましくはＮ末端の（２−５）〜（２２−２８）位のアミノ酸が切断され、好ましくは配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する変異型フラボノイド６−ヒドロキシラーゼを提供する。
【００２７】
本発明のもう一つは、野生型シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼに相応するものであって、Ｎ末端の（１−２０）〜（６０−８５）位のアミノ酸が切断され、好ましくはＮ末端の（２−１０）〜（６５−８０）位のアミノ酸が切断され、より好ましくはＮ末端の（２−５）〜（７０−７５）位のアミノ酸が切断され、好ましくは配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する変異型シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼを提供する。
【００２８】
本発明のもう一つは、前記のいずれかの変異型フラボノイド６−ヒドロキシラーゼと、それと融合するポリペプチドタグとを含む融合ポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドタグは、８ＲＰ、Ｓｕｍｏ、ＭＢＰ、２Ｂ１からなる群から選ばれ、好ましくはＭＢＰまたは２Ｂ１である。
【００２９】
一つの好ましい例において、前記融合ポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する。
【００３０】
本発明のもう一つは、前記変異型フラボノイド６−ヒドロキシラーゼ；または前記変異型シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼ；または前記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００３１】
本発明のもう一つは、前記のいずれかのポリヌクレオチド；或いは前記のいずれかの変異型フラボノイド６−ヒドロキシラーゼ若しくは前記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、前記変異型シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼをコードするポリヌクレオチドとを含む発現構築物を提供する。
【００３２】
もう一つの好ましい例において、前記発現構築物はさらに、前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結されるプロモーターおよびターミネーターを含む。
【００３３】
本発明のもう一つは、前記変異型フラボノイド６−ヒドロキシラーゼ若しくは前記融合ポリペプチド、並びに変異型シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼの、クリシンまたはアピゲニンの構造にヒドロキシ基を１つ付加してバイカレインまたはスクテラレインを形成するための使用を提供する。
【００３４】
本発明の他の面は、本文の開示内容により、当業者にとって自明である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１はバイカレインおよびスクテラレインの構造式である。
【図２】図２はバイカレインおよびスクテラレインの生合成経路である。
【図３】図３はプラスミドｐＹＨ６６の構築の概念図である。
【図４】図４はプラスミドｐＹＨ５７の構築の概念図である。
【図５】図５は工学菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＹＨ５７−ｐＹＨ６６および標準試料であるバイカレインのＨＰＬＣ検出スペクトルである。ただし、ｉは空白対照としてのＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＤｕｅｔ−１−ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１発酵液を示す；ｉｉはＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＹＨ５７−ｐＹＨ６６にフェニルアラニンが添加された発酵液を示す；ｉｉｉはバイカレインの標準試料を示す。
【図６】図６は工学菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＹＨ５７−ｐＹＨ６６で生産されるバイカレインの質量分析スペクトルである。
【図７】図７は工学菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＹＨ５７−ｐＹＨ６６および標準試料であるスクテラレインのＨＰＬＣ検出スペクトルである。ただし、ｉは空白対照としてのＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＤｕｅｔ−１−ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１発酵液を示す；ｉｉはＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＹＨ５７−ｐＹＨ６６にチロシンが添加された発酵液を示す；ｉｉｉはスクテラレインの標準試料を示す。
【図８】図８は工学菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＹＨ５７−ｐＹＨ６６で生産されるスクテラレインの質量分析スペクトルである。
【図９】図９はＳｂＦ６Ｈ和ＡｔＣＰＲ変異体でクリシンを触媒して、バイカレインを生成する。    Ａ、構築されたプラスミドにおける肝心な要素の概念図；    Ｂ、組換え大腸菌でクリシンを触媒して、バイカレインを生成する転換率；    Ｃ、組換え大腸菌で触媒される反応液のＨＰＬＣによる解析。ただし、Ｃｈｒはクリシンを示し、Ｂａｉはバイカレインを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明者らは、微生物によるバイカレインおよびスクテラレインの異種合成、並びに生物学的に生産されるバイカレインおよびスクテラレインの生成量の向上に着目して詳しく研究したところ、宿主細胞の異種代謝経路を遺伝子工学によって改造することにより、バイカレインおよびスクテラレインを高収量で生産する工学菌株を獲得した。
【００３７】
本文に用いられるように、前記「Ｎ末端の（１−１０）〜（２０−３０）位のアミノ酸」とは、Ｎ末端からの１−１０番目のうちのいずれか１つのアミノ酸から始まり、Ｎ末端からの２０−３０番目のうちのいずれか１つのアミノ酸で終わることを指す。
【００３８】
本文に用いられるように、前記「Ｎ末端の（２−５）〜（２２−２８）位」とは、Ｎ末端からの２−５番目のうちのいずれか１つのアミノ酸から始まり、Ｎ末端からの２２−２８番目のうちのいずれか１つのアミノ酸で終わることを指す。
【００３９】
本文に用いられるように、前記「Ｎ末端の（１−２０）〜（６０−８５）位」とは、Ｎ末端からの１−２０番目のうちのいずれか１つのアミノ酸から始まり、Ｎ末端からの６０−８５番目のうちのいずれか１つのアミノ酸で終わることを指す。
【００４０】
本文に用いられるように、前記「Ｎ末端の（２−１０）〜（６５−８０）位」とは、Ｎ末端からの２−１０番目のうちのいずれか１つのアミノ酸から始まり、Ｎ末端からの６５−８０番目のうちのいずれか１つのアミノ酸で終わることを指す。
【００４１】
本文に用いられるように、前記「Ｎ末端の（２−５）〜（７０−７５）位」とは、Ｎ末端からの２−５番目のうちのいずれか１つのアミノ酸から始まり、Ｎ末端からの７０−７５番目のうちのいずれか１つのアミノ酸で終わることを指す。
【００４２】
本文に用いられるように、「外因的」または「異種的」とは、異なる由来の２本または複数本の核酸または蛋白質配列の間の関係を指す。
【００４３】
本文に用いられるように、前記「作動可能に連結（接続）される」または「操作可能に連結（接続）される」とは、２つまたは複数の核酸領域または核酸配列の機能的な空間配置を指す。例えば、プロモーター領域を、核酸配列の転写が該プロモーター領域によって導かれるように、標的遺伝子の核酸配列に対して特定の位置に配置することにより、プロモーター領域は、該核酸配列と「作動可能に連結される」ことになる。
【００４４】
本文に用いられるように、前記「発現構築物」とは、１つまたは複数の遺伝子発現カセットを含んでもよい所望の核酸コード配列を含む組換えＤＮＡ分子を指す。前記「構築物」は通常、発現ベクターに含まれる。
【００４５】
本文に用いられるように、前記ＰＡＬ、４ＣＬ、ＣＨＳ、ＣＨＩおよびＦＮＳＩタンパク質は、発現系中でクリシンまたはアピゲニンの合成経路を形成するタンパク質である。
【００４６】
本文に用いられるように、前記Ｆ６ＨおよびＣＰＲタンパク質は、発現系中でクリシンまたはアピゲニンを転換して、バイカレインまたはスクテラレインを生成するタンパク質である。
【００４７】
野生型の上記タンパク質または遺伝子はいずれも、本分野で同定されたものであるため、公的なルートで入手および調製することができる。本発明の好ましい形態として、ＰＡＬは、イワベンケイ（Rhodotorula toruloides）から由来のものであり、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ３３８８３．１で表される配列を有する；４ＣＬは、パセリ（Petroselium crispum）から由来のものであり、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＫＦ７６５７８０．１で表される配列を有する；ＣＨＳは、ペチュニア（Petunia X hybrida）から由来のものであり、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＫＦ７６５７８１．１で表される配列を有する；ＣＨＩは、アルファルファ（Medicago sativa）から由来のものであり、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＫＦ７６５７８２．１で表される配列を有する；ＦＮＳＩは、パセリ（Petroselium crispum）から由来のものであり、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｑ７ＸＺＱ８．１で表される配列を有する。
【００４８】
野生型のＦ６ＨおよびＣＰＲも、本分野で同定されたものである。本発明の好ましい形態として、Ｆ６Ｈはコガネバナ（Scutellaria baicalensis）から由来のものであり、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＳＷ２１０５０．１で表される配列を有する。本発明の好ましい形態として、ＣＰＲはシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）から由来のものであり、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿８４９４７２．２で表される配列を有する。
【００４９】
本発明者らの発見によれば、宿主細胞でバイカレインおよびスクテラレインを生産するプロセスにおいて、野生型のＦ６Ｈを利用すると、微量の産物しか生成できず、大規模生産を実現できないので、反応に関与する複数のタンパク質を改造して大量にスクリーニング・解析したところ、いくつかの好ましい改造案を獲得し、微生物、特に大腸菌のような原核発現系によるバイカレインおよびスクテラレインの生成量を極めて顕著に向上した。
【００５０】
よって、本発明の好ましい形態として、野生型Ｆ６Ｈに相応するものであって、Ｎ末端の（１−１０）〜（２０−３０）位のアミノ酸が切断され、好ましくはＮ末端の（２−５）〜（２２−２８）位のアミノ酸が切断され、より好ましくはＮ末端の２−２５位のアミノ酸が切断された変異型Ｆ６Ｈを提供する。
【００５１】
本発明の好ましい形態として、前記Ｆ６Ｈまたは変異型Ｆ６Ｈを含む融合ポリペプチドであって、Ｆ６Ｈまたはいずれかの変異型Ｆ６Ｈと、それと融合するポリペプチドタグとを含む融合ポリペプチドをさらに提供し、前記ポリペプチドタグは、８ＲＰ、Ｓｕｍｏ、ＭＢＰ、２Ｂ１、またはそれらの組み合わせからなる群から選ばれ、好ましくはＭＢＰまたは２Ｂ１である。前記ポリペプチドタグと前記Ｆ６Ｈまたは変異型Ｆ６Ｈの間には、連結ペプチドが含まれてもよいが、含まれなくてもよく、前記連結ペプチドは両者の生物学的活性に影響を及ばない。
【００５２】
本発明の好ましい形態として、野生型ＣＰＲに相応するものであって、Ｎ末端の（１−２０）〜（６０−８５）位のアミノ酸が切断され、好ましくはＮ末端の（２−１０）〜（６５−８０）位のアミノ酸が切断され、より好ましくはＮ末端の（２−５）〜（７０−７５）位のアミノ酸が切断された変異型ＣＰＲを提供する。
【００５３】
前記の好ましいタンパク質（前記野生型のタンパク質も、変異型のタンパク質も含む）の上で、本発明はさらに、それらの生物学的活性が保存された断片、誘導体および類似物を含む。それらのタンパク質の断片、誘導体または類似物は、若干（通常は１〜５０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは例えば１〜１０個、１〜５個、１〜３個または１〜２個）のアミノ酸が欠失、挿入、および／または置換されたもの、並びにＣ末端および／またはＮ末端に１個または複数（例えば１００個以内、８０個以内、５０個以内、２０個以内、好ましくは１０個以内、より好ましくは５個以内）のアミノ酸が付加または欠失されたものであってもよい。例えば、本分野において、特性が接近するまたは類似するアミノ酸で置換する場合、普通はタンパク質の機能を変化させない。また、例えば、Ｃ末端および／またはＮ末端に１つまたは複数のアミノ酸を付加または欠失しても、普通はタンパク質の機能を変化させない。しかし、前記変異型タンパク質の場合、その更なる変化形態では、いずれも前記のようにＮ末端において切断された。
【００５４】
前記の好ましいタンパク質（前記野生型のタンパク質も、変異型のタンパク質も含む）の上で、本発明はさらに、それらの類似物を含む。これらの類似物と天然タンパク質の差異は、アミノ酸配列での差異であってもよく、配列に影響しない修飾形態での差異であってもよく、またはその両方であってもよい。これらのタンパク質は天然または誘導の遺伝的変異体を含む。誘導変異体は各種の技術で、例えば放射線または変異剤への曝露によるランダム突然変異誘発で獲得することができ、さらに部位特異的突然変異誘発法または他の既知の分子生物学的技術で獲得することもできる。類似物はさらに、天然L-アミノ酸と異なる残基（例えばD-アミノ酸）を有する類似物、および天然に存在しないまたは合成されるアミノ酸（例えばβ、γ-アミノ酸）を有する類似物を含む。本発明にかかるタンパク質は、上記で挙げられた代表的なタンパク質に制限されないことは、理解されるべきである。
【００５５】
前記の好ましいタンパク質（前記野生型のタンパク質も、変異型のタンパク質も含む）の上で、本発明はさらに、前記タンパク質と相同性が高く（例えば、挙げられた具体的なタンパク質の配列との相同性が７０％またはそれ以上であり；好ましくは、相同性が８０％またはそれ以上であり；より好ましくは、相同性が９０％またはそれ以上であり、例えば相同性が９５％、９８％または９９％であり）、且つ相応のポリペプチドと同様な機能を持つタンパク質を含む。
【００５６】
本発明では、特定の種から由来のタンパク質または遺伝子が挙げられた。本発明では特定の種から由来のタンパク質または遺伝子が好ましく研究されたが、他の種から由来の、前記タンパク質または遺伝子と高い相同性を有する（例えば６０％以上、例えば７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、ひいては９８％の配列相同性を有する）他のタンパク質または遺伝子も、本発明で考えられる範囲内に入ることは、理解されるべきである。
【００５７】
本発明はさらに、本発明で提供される本発明にかかるタンパク質またはその保存的変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に関する。本発明にかかるポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態であってもよい。ＤＮＡ形態はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは人工合成したＤＮＡを含む。ＤＮＡは一本鎖または二本鎖であってもよい。ＤＮＡはコード鎖または非コード鎖であってもよい。本発明にかかる変異体成熟タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、成熟タンパク質しかコードしないコード配列と、成熟タンパク質のコード配列および各種の付加的なコード配列と、成熟タンパク質のコード配列（および各種の付加的なコード配列）および非コード配列と、を含む。
【００５８】
本発明はさらに、前記遺伝子の配列に対して、コドンを最適化することで、例えば宿主細胞の好みに応じてコドンを最適化することで形成されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００５９】
本発明はさらに、外因的に導入されたＦ６Ｈ（特に前記変異型Ｆ６Ｈまたは融合ポリペプチド）およびＣＰＲ（特に前記変異型Ｆ６Ｈまたは融合ポリペプチド）の発現遺伝子を含み、バイカレインおよびスクテラレインを高収量で生産する工学菌株を構築した。該組換え菌株を培養し、且つ培養系にクリシンまたはアピゲニンを添加することで、バイカレインまたはスクテラレインを生産することができる。
【００６０】
本発明はさらに、外因的に導入されたＦ６Ｈ（特に前記変異型Ｆ６Ｈまたは融合ポリペプチド）およびＣＰＲ（特に前記変異型Ｆ６Ｈまたは融合ポリペプチド）の発現遺伝子と、クリシンまたはアピゲニンを合成する遺伝子とを含み、バイカレインおよびスクテラレインを高収量で生産する他の工学菌株を構築した。前記クリシンまたはアピゲニンを合成する遺伝子は、ＰＡＬ、４ＣＬ、ＣＨＳ、ＣＨＩおよびＦＮＳＩタンパク質を発現する遺伝子を含む。
【００６１】
本発明にかかる菌株は安定性が良好で、バイオリアクターにおけるバイカレインまたはスクテラレインの大規模な培養および生産を実現できる。本発明に好ましい菌株は、バイカレインまたはスクテラレインの収率が非常に高い。
【００６２】
本発明において、大腸菌でバイカレインまたはスクテラレインを生産することにより、バイカレインまたはスクテラレインのより経済的で、より便利な製造を実現できる。
【００６３】
本発明はさらに、バイカレインまたはスクテラレインを生産する工学菌株のキットを提供する。さらに、大腸菌培地、バイカレインまたはスクテラレインを分離または検出する試薬、取扱説明書などを含んでもよい。
【００６４】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いるもので、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例に特に具体的な条件を説明しない実験方法は、例えばＪ．サムブルックら著、分子クローニング： 実験マニュアル、第三版、科学出版社、２００２に記載される条件、或いはメーカーの薦めの条件で行われる。
【００６５】
実験材料
ＡｘｙＰｒｅｐ全ＲＮＡミニプレップ精製キット、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ゲル抽出キット、プラスミド抽出キットはいずれも、アメリカのＡｘｙｇｅｎ社の製品である；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）ポリメラーゼキット、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用高正確性ポリメラーゼのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼはいずれも、日本ＴＡＫＡＲＡ社の製品である；制限エンドヌクレアーゼはいずれもＮＥＢ社の製品である。
【００６６】
大腸菌ＤＨ１０Ｂは遺伝子クローニングに適用され、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株はタンパク質発現およびバイカレイン、スクテラレインの生産に適用される。ｐＥＴ２８ａ、ｐＥＤＤｕｅｔ−１、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１ベクターは、代謝経路遺伝子の組み立てに適用される。
【００６７】
標準試料化合物であるバイカレインおよびスクテラレインは、上海源葉生物科技社から購入される。他の試薬は、中国製の分析級またはクロマトグラフ級の試薬であり、国薬集団化学試剤社から購入される。
【００６８】
ＰＣＲはArktik Thermal Cycler （Thermo Fisher Scientific社）で行われる；恒温培養はＺＸＧＰ−Ａ２０５０恒温インキュベーターおよびＺＷＹ−２１１Ｇ恒温振とう培養機で行われる；遠心は５４１８Ｒ高速冷却遠心機および５４１８小型遠心機（Eppendorf社）で行われる。真空濃縮は、Concentrator plus濃縮機（Eppendorf社）で行われる；ＯＤ６００はUV-1200紫外可視分光光度計（上海マパダインスツルメンツ社）で計測される。ロータリーエバポレーターシステムは、IKA RV 10デジタルロータリーエバポレーター（ＩＫＡ）と、MZ 2C NT化学ダイヤフラムポンプと、CVC3000真空コントローラー（vacuubrand社）とからなる。高速液体クロマトグラフィーは、Dionex UltiMate 3000液体クロマトグラフィーシステム（Thermo Fisher Scientific社）で行われる。
【００６９】
液体クロマトグラフィーの検出条件は、下記の通りである：Ａ相：０．１％ギ酸・水、Ｂ相：アセトニトリル；分離条件：０〜２０分間は２０％Ｂ相−５５％Ｂ相、２０〜２２分間は５５％Ｂ相−１００％Ｂ相、２２〜２７分間は１００％Ｂ相、２７〜３５分間は１００％Ｂ相−２０％Ｂ相、３５〜４０分間は２０％Ｂ相；検出波長：３４０  ｎｍ、カラム温度：３０ｏＣ。クロマトグラフィーカラム：Thermo syncronis C18逆相カラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ）。
【実施例１】
【００７０】
ポリペプチドおよびその配列の最適化
【００７１】
１、Ｆ６Ｈポリペプチド配列の最適化改造
コガネバナ（Scutellaria baicalensis）から由来のＦ６Ｈ（ＳｂＦ６Ｈ）は、長さが５１７ａａ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＳＷ２１０５０．１）であり、具体的な配列が下記のようである（配列番号１）：
［配１］
2021535757.tif 000002
【００７２】
改造１：本発明者らは、配列番号１に対して、その２−２５位のアミノ酸を取り除き、Ｎ末端にＭおよびＡという２つのアミノ酸を付加することでその配列を改造し、改良したＦ６Ｈ変異体ｔｒＦ６Ｈを獲得し、その具体的な配列が下記のようである（配列番号２）：
［配２］
2021535757.tif 000003
【００７３】
改造２：本発明者らは、配列番号１に対して、その２−２５位のアミノ酸を取り除き、Ｎ末端に８ＲＰのアミノ酸配列を付加することでその配列を改造し、改良したＦ６Ｈ変異体８ＲＰｔｒＦ６Ｈを獲得し、その具体的な配列が下記のようである（配列番号３）：
［配３］
2021535757.tif 000004
【００７４】
改造３：本発明者らは、配列番号１に対して、その２−２５位のアミノ酸を取り除き、Ｎ末端にＳｕｍｏのアミノ酸配列を付加することでその配列を改造し、改良したＦ６Ｈ変異体ＳｕｍｏｔｒＦ６Ｈを獲得し、その具体的な配列が下記のようである（配列番号４）：
［配４］
2021535757.tif 000005
【００７５】
改造４：本発明者らは、配列番号１に対して、その２−２５位のアミノ酸を取り除き、Ｎ末端にＭＢＰのアミノ酸配列を付加することでその配列を改造し、改良したＦ６Ｈ変異体ＭＢＰｔｒＦ６Ｈを獲得し、その具体的な配列が下記のようである（配列番号５）：
［配５］
2021535757.tif 000006
【００７６】
改造５：本発明者らは、配列番号１に対して、その２−２５位のアミノ酸を取り除き、Ｎ末端に２Ｂ１のアミノ酸配列を付加することでその配列を改造し、改良したＦ６Ｈ変異体２Ｂ１ｔｒＦ６Ｈを獲得し、その具体的な配列が下記のようである（配列番号６）：
［配６］
2021535757.tif 000007
【００７７】
２、ＣＰＲの最適化改造
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）から由来のＣＰＲ（ＡｔＣＰＲ）は、配列の長さが７１２ａａ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿８４９４７２．２）であり、具体的には下記のものである（配列番号７）：
［配７］
2021535757.tif 000008
【００７８】
本発明者らは、配列番号１に対して、その２−７２位のアミノ酸を削除することでその配列を改造し、改良したＡｔＣＰＲ変異体ｔｒＡｔＣＰＲを獲得し、具体的には下記のものである（配列番号８）：
［配８］
2021535757.tif 000009
【実施例２】
【００７９】
新型Ｆ６Ｈ変異体を含む組換えプラスミドの構築
ｐＥＴＤｕｅｔ−１を出発プラスミドとして、ＡｔＣＰＲをワンショットクローニング方法でＮｄｅＩとＸｈｏＩ部位にライゲートし、プラスミドｐＹＨ４５を得た。
【００８０】
ｐＥＴＤｕｅｔ−１を出発プラスミドとして、ｔｒＡｔＣＰＲをワンショットクローニング方法でＮｄｅＩとＸｈｏＩ部位にライゲートし、プラスミドｐＹＨ４６を得た。
【００８１】
さらに、コドン最適化されたＦ６Ｈのコード遺伝子配列をジェンスクリプトにより合成し、ｐＵＣ１９ベクターにライゲートし、ｐＵＣ１９−Ｆ６Ｈを得た。Ｆ６Ｈ−Ｆ／Ｒをプライマーとして、ｐＵＣ１９−Ｆ６Ｈを鋳型として、５０μＬの反応系（PrimeSTAR Max Premix、２５μＬ；両方のプライマーの最終濃度０．２〜０．３μＭ；ｐＵＣ１９−Ｆ６Ｈ  ０．２ｕＬ；残りの体積は滅菌蒸留水で補足した）ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ反応条件は、９８℃で２分間初期変性し、そして９８℃で１０ｓ変性し、５５℃で１５ｓアニーリングし、７２℃で２０ｓ伸長し、２５サイクルであり、アガロースゲル電気泳動で検出したところ、増幅で約１．５ｋｂの断片を獲得し、精製後、Ｎｃｏ  ＩとＢａｍＨ  Ｉによる二重酵素切断で消化した。消化した断片を同じ酵素で消化したｐＹＨ４６にライゲートし、ライゲーション産物によって大腸菌ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞を形質転換し、プラスミドを抽出し、構築の時に導入された制限酵素切断部位の二重酵素切断および遺伝子シーケンシングによって検証したところ、組換えプラスミドｐＹＨ５９を得た。同様に、消化した断片をｐＹＨ４５にライゲートし、組換えプラスミドｐＹＨ５９を得た。
【００８２】
ｔｒＦ６Ｈ−Ｆ／Ｆ６Ｈ−Ｒをプライマーとして、ｐＵＣ１９−ｔｒＦ６Ｈを鋳型として、ＰＣＲ増幅を行って得られた産物を、ワンショットクローニング方法でｐＹＨ４６におけるＮｄｅＩとＢａｍＨ  Ｉ部位にライゲートし、プラスミドｐＹＨ５８を得た。
【００８３】
ｐＵＣ１９−ｔｒＦ６Ｈを鋳型として、８ＲＰ−ｔｒＦ６Ｈ−Ｆ／Ｆ６Ｈ−Ｒをプライマーとして増幅した産物を、ワンショットクローニング方法でｐＹＨ４６におけるＮｄｅＩとＢａｍＨ  Ｉ部位にライゲートし、ｐＹＨ６０を得た。
【００８４】
ｐＥＴＳｕｍｏ（Invitrogen社から購入）を鋳型として、Ｓｕｍｏ−Ｆ／Ｓｕｍｏ−ｔｒＦ６Ｈ−Ｒをプライマーとして、Ｓｕｍｏ配列を含むＤＮＡ断片を得、ｐＵＣ１９−ｔｒＦ６Ｈを鋳型として、Ｓｕｍｏ−ｔｒＦ６Ｈ−Ｆ／  Ｆ６Ｈ−Ｒをプライマーとして増幅し、ｔｒＦ６ＨＤＮＡ断片を含むものを得た。前記の２つのＤＮＡ断片を鋳型として、Ｓｕｍｏ−Ｆ／Ｆ６Ｈ−Ｒをプライマーとして融合ＰＣＲした産物を、ワンショットクローニング方法でｐＹＨ４６におけるＮｄｅＩとＢａｍＨ  Ｉ部位にライゲートし、ｐＹＨ６１を得た。
【００８５】
ｐＭＡＬ−ｃ５ｘ（Invitrogen社から購入）を鋳型として、ＭＢＰ−Ｆ／ＭＢＰ−ｔｒＦ６Ｈ−Ｒをプライマーとして、ＰＣＲ増幅を行い、ＭＢＰ配列を含むＤＮＡ断片を得、ｐＵＣ１９−ｔｒＦ６Ｈを鋳型として、ＭＢＰ−ｔｒＦ６Ｈ−Ｆ／Ｆ６Ｈ−Ｒをプライマーとして増幅し、ｔｒＦ６Ｈを含むＤＮＡ断片を得、前記で得られた２つのＤＮＡ断片を鋳型として、ＭＢＰ−Ｆ／Ｆ６Ｈ−Ｒをプライマーとして融合ＰＣＲした産物を、ワンショットクローニング方法でｐＹＨ４６におけるＮｄｅＩとＢａｍＨ  Ｉ部位にライゲートし、ｐＹＨ６２を得た。
【００８６】
ｐＵＣ１９−ｔｒＦ６Ｈを鋳型として、２Ｂ１−Ｆ／Ｆ６Ｈ−Ｒをプライマーとして増幅した産物を、ワンショットクローニング方法でｐＹＨ４６におけるＮｄｅＩとＢａｍＨ  Ｉ部位にライゲートし、ｐＹＨ６３を得た。
【００８７】
ｔｒＦ６Ｈ−Ｆ／Ｆ６Ｈ−Ｒをプライマーとして、ｐＵＣ１９−ｔｒＦ６Ｈを鋳型として、ＰＣＲ増幅を行って得られた産物を、ワンショットクローニング方法でｐＹＨ４５におけるＮｄｅＩとＢａｍＨ  Ｉ部位にライゲートし、プラスミドｐＹＨ６４を得た。
【００８８】
ｐＭＡＬ−ｃ５ｘを鋳型として、ＭＢＰ−Ｆ／ＭＢＰ−ｔｒＦ６Ｈ−Ｒをプライマーとして、ＰＣＲ増幅を行い、ＭＢＰ配列を含むＤＮＡ断片を得、ｐＵＣ１９−ｔｒＦ６Ｈを鋳型として、ＭＢＰ−ｔｒＦ６Ｈ−Ｆ／Ｆ６Ｈ−Ｒをプライマーとして増幅し、ｔｒＦ６Ｈを含むＤＮＡ断片を得、前記で得られた２つのＤＮＡ断片を鋳型として、ＭＢＰ−Ｆ／Ｆ６Ｈ−Ｒをプライマーとして融合ＰＣＲした産物を、ワンショットクローニング方法でｐＹＨ４５におけるＮｄｅＩとＢａｍＨ  Ｉ部位にライゲートし、ｐＹＨ６５を得た。
【００８９】
ｐＵＣ１９−2B1trF6Hを鋳型として、２Ｂ１−Ｆ／Ｆ６Ｈ−Ｒをプライマーとして増幅した産物を、ワンショットクローニング方法でｐＹＨ４５におけるＮｄｅＩとＢａｍＨ  Ｉ部位にライゲートし、ｐＹＨ６６を得た。プラスミドｐＹＨ６６の構築の概念図は図３に示す。
【００９０】
前記構築プロセスに適用されたプライマーは表１に示す。構築されたプラスミドにおける肝心な要素の概念図は図９Ａに示す。
【表１】
2021535757.tif 000010
【実施例３】
【００９１】
ＰＡＬ、４ＣＬ、ＣＨＳ、ＣＨＩおよびＦＮＳＩを発現する組換えプラスミドの構築
イワベンケイ（Rhodotorula toruloides）から由来のＰＡＬ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ３３８８３．１）、パセリ（Petroselium crispum）から由来の４ＣＬ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＫＦ７６５７８０．１）、ペチュニア（Petunia X hybrida）から由来のＣＨＳ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＫＦ７６５７８１．１）、アルファルファ（Medicago sativa）から由来のＣＨＩ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＫＦ７６５７８２．１）、パセリ（Petroselium crispum）から由来のＦＮＳＩ遺伝子（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｑ７ＸＺＱ８．１）をジェンスクリプトにより合成し、ｐＥＴ２８ａベクターに構築し、ｐＥＴ２８−ＰＡＬ、ｐＥＴ２８−４ＣＬ、ｐＥＴ２８−ＣＨＳ、ｐＥＴ２８ａ−ＣＨＩ、ｐＥＴ２８ａ−ＦＮＳＩを得た。
【００９２】
表２のプライマーを合成した。ｐＥＴ２８−４ＣＬを鋳型として、４ＣＬ−Ｆ−ＮｃｏＩ／４ＣＬ−Ｒ−ＢａｍＨＩをプライマーとして得られたＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩで二重酵素切断されたｐＣＤＦＤｕｅｔ−１にライゲートし、ｐＹＨ４０を得た。
【００９３】
ｐＥＴ２８−ＣＨＳを鋳型として、ＣＨＳ−Ｆ−ＮｄｅＩ／ＣＨＳ−Ｒ−ＸｈｏＩをプライマーとして得られたＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩで二重酵素切断されたｐＹＨ４０にライゲートし、ｐＹＨ５０を得た。
【００９４】
ｐＥＴ２８ａ−ＣＨＩを鋳型として、Ｔ７ＣＨＩ−Ｆ−ＸｈｏＩ／ＣＨＩ−Ｒ−ＡｖｒＩＩをプライマーとして得られたＰＣＲ産物を、ｐＹＨ５０にライゲートし、ｐＹＨ５１を得た。
【００９５】
ｐＥＴ２８−ＰＡＬを鋳型として、Ｔ７ＰＡＬ−Ｆ−ＢａｍＨ  Ｉ／ＰＡＬ−Ｒ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩをプライマーとして得られたＰＣＲ産物を、ＢａｍＨ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで二重酵素切断した後、同様に二重酵素切断されたｐＹＨ５１にライゲートし、プラスミドｐＹＨ５５を得た。
【００９６】
ｐＥＴ２８ａ−ＦＮＳＩを鋳型として、ＦＮＳＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｆ／ＦＮＳＩ−ＮｏｔＩ−Ｒをプライマーとして得られたＰＣＲ産物を、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ／Ｎｏｔ  Ｉで二重酵素切断した後、同様に二重酵素切断されたｐＹＨ５５にライゲートし、最終ベクターｐＹＨ５７を得た。プラスミドｐＹＨ５７の構築の概念図は図４に示す。
【表２】
2021535757.tif 000011
【実施例４】
【００９７】
バイカレインおよびスクテラレインを合成する菌株の構築および機能の検証
バイカレインおよびスクテラレインを生合成する概念図は図１に示す。
【００９８】
組換えプラスミドｐＹＨ６６およびｐＹＨ５７によって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を共形質転換し、工学菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＹＨ５７−ｐＹＨ６６を得た。
【００９９】
ＬＢ固体培地（スペクチノマイシン８０μｇ／ｍＬ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ）で３７℃で一晩培養した。単一クローンを２ｍＬのＬＢ液体培地（スペクチノマイシン８０μｇ／ｍＬ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ）に掻き取り、一晩培養した菌液を新たな１０ｍＬのＭＯＰＳ液体耐性培地に転移接種し、３７℃、２５０ｒ／ｍｉｎでＯＤ６００＝０．５〜０．６になるまで培養し、水浴で温度を１６℃程度まで低下させてから、誘導剤ＩＰＴＧを最終濃度が１ｍＭになるまで添加し、滅菌したフェニルアラニンまたはチロシンを異なる濃度で添加し、２２℃に転移して低温で誘導培養し、シェーカー回転数が２２０ｒ／ｍｉｎの条件で引き続き４８ｈ培養した。外因性遺伝子がライゲートされないｐＥＴＤｕｅｔ−１およびｐＣＤＦＤｕｅｔ−１空プラスミドを携えるＢＬ２１（ＤＥ３）組換え菌株を空白対照として、前記と同様に培養した。
【０１００】
それと共に、表２に記載の各組換えプラスミドのそれぞれによって大腸菌を形質転換し、培養し、それぞれの産物の生成状況を検出した。
【０１０１】
培養後、組換えプラスミドによって形質転換された各組換え菌株が化合物を発現する状況を検出し、表３に示す。
【表３】
2021535757.tif 000012
【０１０２】
本発明にかかる各組換え菌株で標的化合物を成功に合成できたことは検証された。
【０１０３】
工学菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＹＨ５７−ｐＹＨ６６および標準試料であるバイカレインのＨＰＬＣ検出スペクトルは図５に示す。工学菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＹＨ５７−ｐＹＨ６６で生産されるバイカレインの質量分析スペクトルは図６に示す。
【０１０４】
工学菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＹＨ５７−ｐＹＨ６６および標準試料であるスクテラレインのＨＰＬＣ検出スペクトルは図７に示す。工学菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＹＨ５７−ｐＹＨ６６で生産されるスクテラレインの質量分析スペクトルは図８に示す。
【実施例５】
【０１０５】
クリシンを基質とする生産
ｐＹＨ５８〜ｐＹＨ６６という６つの組換えプラスミドによって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を形質転換し、工学菌株を獲得し、ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＹＨ５８〜ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＹＨ６６と名づけた。
【０１０６】
ＬＢ固体培地（アンピシリン１００μｇ／ｍＬ）で３７℃で一晩培養した。単一クローンを２ｍＬのＬＢ液体培地（アンピシリン１００μｇ／ｍＬ）に掻き取り、一晩培養した菌液を新たな２０ｍＬのＭＯＰＳ液体耐性培地に転移接種し、３７℃、２５０ｒ／ｍｉｎでＯＤ６００＝０．５〜０．６になるまで培養し、水浴で温度を１６℃程度まで低下させてから、誘導剤ＩＰＴＧを最終濃度が１ｍＭになるまで添加し、シェーカー回転数が２２０ｒ／ｍｉｎで、温度が２２℃の条件で引き続き１２ｈ培養した。前記発酵液を合わせ、６０００ｒｐｍ、４℃、１０分間の条件で遠心し、上澄を取り除き、菌体を収集した。反応バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．４、０．１％Ｔｒｉｘｔｏｎ）でＯＤ６００＝３０になるまで再懸濁させた。各組換え細菌の再懸濁液を１ｍＬ取り、それに５μＬのクリシン（２５ｍＭ）と２．５μＬのＮＡＤＰＨ（１００ｍＭ）を添加し、引き続き３７℃で８時間反応させた。反応終了後、反応液に１０μＬのＨＣｌ（６Ｍ）と１ｍＬの酢酸エチルを加えて３回抽出し、有機相を濃縮して得られた残留物を２００μＬのメタノールで溶解させてから、１０μＬを取ってＨＰＬＣ解析をした。
【０１０７】
各組換え大腸菌でクリシンを触媒して、バイカレインを生成する転換率は図９Ｂに示す。
【０１０８】
各組換え大腸菌で触媒した反応液のＨＰＬＣ解析結果は図９Ｃに示す。
【０１０９】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の前記開示内容を読み終わった後、当業者は本発明に各種の変動や修正をすることができるが、それらの均等の様態も同様に本願の特許請求の範囲に含まれることは、理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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