(57)【要約】  本発明は、時間相関単一光子計数法を用いた蛍光寿命顕微鏡法に関しており、ここでは、試料（１３）が、パルス光源（２）を用いて蛍光光子の放出のために周期的に励起光パルスによって励起され、ここで、それぞれ２つの順次連続する励起光パルスの間で測定間隔が定められ、検出器（１６）を用いて蛍光光子が検出され、検出された蛍光光子を表す検出器信号（１７）が生成され、該検出器信号（１７）に基づいて、蛍光光子がそれぞれの測定間隔内で検出器（１６）によって検出される検出時間が決定され、該検出時間に基づいてイメージングが行われる。比較的少ない技術的労力で、パイルアップ効果を回避しながら励起光強度を増加させかつ検出器および電子機器タイプの汎用的な使用のために、蛍光寿命顕微鏡法において、それぞれの測定間隔で、予め定められた数の蛍光光子が測定間隔内で検出されたか否かが決定される。すべての検出された光子の検出時間は、複数の画像ピクセルについて共通の第１のデータメモリに集約される。それぞれの測定間隔内で、予め定められた数で検出された蛍光光子のみの検出時間は、同様に複数の画像ピクセルについて共通の第２のデータメモリに集約される。第１のデータメモリに集約された検出時間は、計算ステップにおいて第２のデータメモリに集約された検出時間に組み合わされる。計算ステップの結果は、第３のデータメモリに格納される。さらに、本発明は、そのような蛍光寿命顕微鏡法を実施するための顕微鏡に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
時間相関単一光子計数法を用いた蛍光寿命顕微鏡法であって、
試料（１３）は、パルス光源（２）を用いて蛍光光子の放出のために周期的に励起光パルスによって励起され、
それぞれ２つの順次連続する励起光パルスの間で測定間隔が定められ、
検出器（１６）を用いて蛍光光子が検出され、検出された蛍光光子を表す検出器信号（１７）が生成され、前記検出器信号（１７）に基づいて、蛍光光子がそれぞれの測定間隔内で前記検出器（１６）によって検出される検出時間が決定され、前記検出時間に基づいてイメージングが行われる蛍光寿命顕微鏡法において、
それぞれの測定間隔で、予め定められた数の蛍光光子が前記測定間隔内で検出されたか否かが決定され、
すべての検出された光子の検出時間は、複数の画像ピクセルについて共通の第１のデータメモリに集約され、
それぞれの測定間隔内で、予め定められた数で検出された蛍光光子のみの検出時間は、同様に複数の画像ピクセルについて共通の第２のデータメモリに集約され、
前記第１のデータメモリに集約された検出時間は、計算ステップにおいて前記第２のデータメモリに集約された検出時間に組み合わされ、
前記計算ステップの結果は、第３のデータメモリに格納されることを特徴とする、
蛍光寿命顕微鏡法。
【請求項２】
前記第１のデータメモリに集約された検出時間は、未補正の総ヒストグラムを表す第１のヒストグラムの形態で求められ、前記第２のデータメモリに集約された検出時間は、前記第１のヒストグラムのサブセットを表す第２のヒストグラムの形態で求められ、前記第３のデータメモリに格納された前記計算ステップの結果は、補正された総ヒストグラムを表す第３のヒストグラムの形態で求められる、
請求項１記載の蛍光寿命顕微鏡法。
【請求項３】
補正された総ヒストグラムは、不感時間なしで記録される理想的なヒストグラムを表す、
請求項２記載の蛍光寿命顕微鏡法。
【請求項４】
前記予め定められた数は、１に等しい、
請求項１から３までのいずれか１項記載の蛍光寿命顕微鏡法。
【請求項５】
前記計算ステップにおいて、前記第１のヒストグラムの間隙は、前記第１のヒストグラムの前述の間隙とは異なる検出時間が割り当てられた前記第２のヒストグラムの間隙に組み合わされる、
請求項２から４までのいずれか１項記載の蛍光寿命顕微鏡法。
【請求項６】
前記検出器信号は、検出された蛍光光子ごとにデータワードが挿入されるデータストリームの形態で生成される、
請求項１から５までのいずれか１項記載の蛍光寿命顕微鏡法。
【請求項７】
それぞれの蛍光光子が関連する測定間隔内で検出された予め定められた数の蛍光光子に属するか否かを示すマーカービットは、前記データワードに設けられている、
請求項６記載の蛍光寿命顕微鏡法。
【請求項８】
前記計算ステップでは、非線形最適化法が行われる、
請求項１から７までのいずれか１項記載の蛍光寿命顕微鏡法。
【請求項９】
前記非線形最適化法は、以下の関係式、
Ｍａ（ｔ）・Ｍ１（ｔ−ｔｄ）＝Ｐ０・ｆ（ｔ）・ｆ（ｔ−ｔｄ）
を使用して行われる、
請求項８記載の蛍光寿命顕微鏡法。
【請求項１０】
前記計算ステップでは、前記第３のヒストグラムの反復的改良が行われる、
請求項２から７までのいずれか１項記載の蛍光寿命顕微鏡法。
【請求項１１】
前記反復的改良は、以下の関係式、
ｆ’’（ｔ−ｔｄ）＝［Ｍａ（ｔ）・Ｍ１（ｔ−ｔｄ）］／［Ｐ０・ｆ’（ｔ）］
を使用して行われる、
請求項１０記載の蛍光寿命顕微鏡法。
【請求項１２】
前記計算ステップの結果は、出力機器上で視覚化される、
請求項１から１１までのいずれか１項記載の蛍光寿命顕微鏡法。
【請求項１３】
前記計算ステップの結果は、蛍光寿命を決定するために用いられる、
請求項１から１２までのいずれか１項記載の蛍光寿命顕微鏡法。
【請求項１４】
特に、請求項１から１３までのいずれか１項記載の時間相関単一光子計数法を用いた蛍光寿命顕微鏡法を実施するための顕微鏡（１）であって、
前記顕微鏡（１）は、試料を蛍光光子の放出のための励起光パルスによって励起するように構成された光源（２）を備え、それぞれ２つの順次連続する励起光パルスの間で測定間隔が定められており、
前記顕微鏡（１）は、蛍光光子を検出し、検出された蛍光光子を表す検出器信号（１７）を生成するように構成された検出器（１６）を備え、
前記顕微鏡（１）は、前記検出器信号（１７）に基づいて、蛍光光子がそれぞれの測定間隔内で前記検出器（１６）によって検出される検出時間を決定し、前記検出時間に基づいてイメージングを行うように構成された処理ユニット（１８）を備えている、顕微鏡（１）において、
前記処理ユニット（１８）は、それぞれの測定間隔で、予め定められた数の蛍光光子が前記測定間隔内で検出されたか否かを決定し、
すべての検出された蛍光光子の検出時間は、複数の画像ピクセルについて共通の第１のデータメモリに集約し、
それぞれの測定間隔内で、予め定められた数で検出された蛍光光子のみの検出時間は、同様に複数の画像ピクセルについて共通の第２のデータメモリに集約し、
前記第１のデータメモリに集約された検出時間は、計算ステップにおいて前記第２のデータメモリに集約された検出時間に組み合わせ、
前記計算ステップの結果は、第３のデータメモリに格納するように構成されていることを特徴とする、
顕微鏡（１）。
【請求項１５】
前記顕微鏡は、共焦点走査型顕微鏡または多光子顕微鏡である、
請求項１４記載の顕微鏡（１）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１の上位概念による時間相関単一光子計数法を用いたデータの数値補正のための蛍光寿命顕微鏡法、ならびに請求項１４の上位概念によるそのような方法を実施するための顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光寿命顕微鏡法、略してＦＬＩＭ（「fluorescence lifetime imaging microscopy」）は、蛍光分子の励起状態の異なる寿命の測定に基づくイメージング蛍光顕微鏡法である。測定された寿命に基づけば、例えば、ｐＨ値、温度、イオン濃度、ＦＲＥＴ遷移などの蛍光分子の周辺環境の特性を推論することができる。この場合、ＦＲＥＴとは「フェルスター共鳴エネルギー移動」を表す。
【０００３】
蛍光寿命の決定は、時間領域（「time domain lifetime measurement」）で直接行うか、または周波数領域での代替的方法（「frequency domain lifetime measurement」）で行うことができる。時間領域での決定は、いわゆる時間相関単一光子計数法、略してＴＣＳＰＣ（「time correlated single photon counting」）法によって可能である。この方法では、励起光パルスによる周期的な励起によって開放された光子が個別に検出される。典型的には、励起光パルスと、それに続く検出器によって検出される蛍光信号と、の間の時間が測定される。次いで、そのように検出された蛍光光子は、複数の測定値にわたってヒストグラムに集約される。そのようなヒストグラムでは、測定時間に対する光子数がプロットされている。試料内に存在する蛍光分子に依存して、１つ以上の幾何級数成分を伴う蛍光強度の時間依存性の減少が観察される。
【０００４】
時間測定は、この方法では、通常１ナノ秒未満の分解能で行われる。この時間領域での時間測定の場合、光源、光学系、検出器、および電子機器などの機器コンポーネントによるエラーの影響が重要である。機器によって生じるエラー全体は、装置応答関数、略してＩＲＦ（「instrument response function」）と称される。
【０００５】
この装置応答関数は、最適な記録条件下で測定することができる。検査すべき試料自体の記録のデータから装置応答関数を決定することも一般的である。
【０００６】
記録されたデータの分析は、通常、以下の式、
【数１】
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ただし、Ｎは蛍光成分の数、Ａｎは個々の成分の振幅、τｎは個々の成分の寿命、Ｂはバックグラウンド、およびＩＲＦ（ｔ）は装置応答関数、のモデル関数を使用した非線形最適化法によって行われる。この最適化手法によれば、寿命τｎおよび関連する振幅Ａｎを決定することができる。所定の寿命τｎの精度は、記録された光子の数に強く依存する。例えば、成分の寿命τｎを１０％の測定精度で決定するためには、現時点では数百の光子が必要になる。２つの成分のためには、約１０，０００の光子が必要である。
【０００７】
複数の成分を含む試料を妥当な時間内で検査できるようにするために、通常、すべての画像ピクセルのヒストグラムまたは画像ピクセルの領域のヒストグラムが、１つのヒストグラムに集約される。このヒストグラムは、ここでは総ヒストグラム（「総減衰」）とも称される。最適化法を総ヒストグラムに適用すると、寿命τｎと振幅Ａｎとが十分な精度で提供される。次いで、この結果は通常、最適化法を個々の画像ピクセルに適用する第２のステップで使用される。ここでは、モデル関数の選択された変数だけは、例えば、振幅Ａｎのみまたは成分の寿命τｎのみは十分な精度で決定される必要がある。
【０００８】
上記説明の単一光子計数法に基づく方法の１つの問題は、検出器および電子機器からの組み合わせでは、個々の光子の検出直後の所定の期間にわたり、さらなる光子検出のための再準備が整わないことにある。この期間は、システムの不感時間とも称される。このシステムの不感時間の影響は、試料自体に依存するため、装置応答関数ＩＲＦ（ｔ）では考慮することができない。従来のシステムの典型的な不感時間は約５０〜１００ｎｓの範囲にあるのに対して、今時では、電子機器や検出器における技術的進歩により、数ナノ秒の範囲の不感時間を伴うシステムが開発されている。
【０００９】
不感時間が励起光パルスの周期より大きいシステムでは、通常、励起光パルス後の最初の蛍光光子のみが検出可能である。ヒストグラムでは、より低い時間成分の重み付けがより重くなる。この測定結果の改ざんにつながりかねないより重い重み付けは、専門家の間ではパイルアップ効果とも称される。このようなパイルアップ効果を回避するためには、入射する励起光パルスの強度を低く設定する必要があるが、それによって、相応に長い記録時間がこの方法の適用可能性に著しい制約をもたらすことになる。
【００１０】
数ナノ秒の範囲の不感時間を伴うシステムでも、記録されたデータの改ざんは起こり得る。励起光パルス直後では、分子によって後続時点よりもはるかに多くの光子が送信される。これらの光子の大半は、依然として不感時間内に検出器に入射する。この種のシステムでは、従来の機器と同等の測定誤差のもとで入射する励起光パルスの強度の増加は可能ではあるが、他の顕微鏡法の記録時間を達成するのに十分なレベルではない。
【００１１】
不感時間の影響は、検出器や電子機器に関する十分な並列化により、大幅に低減することができる。ただし、そのような並列化は技術的に複雑であるため、著しい出費に結び付く。したがって、多くの用途のために蛍光寿命顕微鏡を使用する場合には、不感時間の影響を補正することが最も重要である。
【００１２】
複数の文献からは、時間相関単一光子計数法における不感時間の影響を補正するための多くの方法が公知である。それらのすべてには、総ヒストグラムに対するそれらの使用可能性に関する制約または使用可能な検出器タイプもしくは電子機器の選択における制約がある。これらの方法は、３つのグループに、詳細には、検出器からの信号をフィルタリングする方法、ヒストグラムデータを変更する方法、および最適化法自体において変更を行う方法に分けることができる。
【００１３】
適正なデータ分析の態様の他に、ユーザーに対するデータ呈示も重要である。グラフィカルな表示からは、ユーザーは、記録の結果やさらなる所要の活動化について推論することができる。それゆえ、補正された形態での総ヒストグラムの呈示が望ましい。
【００１４】
国際公開第２０１７／２０１９８０号には、順次連続する励起光パルスの間に予め定められた数の光子が検出された励起光パルスの周期のみが考慮される方法が記載されている。この方法は、検出器と電子機器とがいくつかの要件を満たしている場合に、補正された総ヒストグラムの生成のために使用できる。信号幅は、異なる光子に関して大幅に異なるものであってはならず、複数の短く順次連続する光子信号の識別が可能である必要があり、さらに電子機器は、そのようなフィルタリングを可能にするパルス幅に関する評価方法を備えている必要がある。したがって、この方法は、汎用的に使用可能なものではない。
【００１５】
公知文献P.B.Coates, “Pile-up corrections in the measurement of lifetimes”, J. Phys. E: Sci. Instrum. 5, P.148-150 (1972)には、それぞれの検出時間に割り当てられたヒストグラムにおける各間隙が他の間隙に依存することなく変更される方法が記載されている。この変更は、光子の検出の統計の特性に基づいている。この方法は、総ヒストグラムには適用できない。なぜなら、総ヒストグラムは、相応に異なる強度の異なる試料位置でのデータから集約されるからである。集約前の補正は、個々のヒストグラムの光子の数が過度に少ないため失敗する。
【００１６】
公知文献J. G. Walker, “Iterative correction for ‘pile-up’ in single-photon lifetime measurement”, Opt. Comm., P.201, P.271-277 (2002)には、光源の付加的な強度変動を、反復的取り組みで考慮するより改善された方法が記載されている。今日では慣用的なパルスレーザー光源を使用する場合の強度変動は、もはや関連するエラー原因ではなくなっている。ただし、この考察は、総ヒストグラムに集約された異なる画像ピクセルにおける異なる強度の考慮を取り上げるものであってもよい。しかしながら、実際には、この反復的方法は、ここでは強度が過度に異なる可能性があるため、収束しないことが多い。
【００１７】
公知文献M. Patting et.al, Dead-time effects in TCSPC data analysis, Proc. of SPIE Vol.6583, 658307, (2007)には、不感時間の影響を考慮するために、最適化法のモデル関数が適合化される方法が記載されている。この方法は、そこに記載されている簡素化が省かれる場合に、非常に僅かな不感時間を伴うシステムによって生成されたデータにも適用することができる。変更された以下のモデル関数ｆｍ（ｔ）、
【数２】
2021514063.tif 000004
では、上記のモデル関数ｆ（ｔ）に、不感時間内で光子が検出されなかった確率に相応する補正項が乗算される。ただし、Ｐは励起光パルスの数、ｔｄはシステムの不感時間である。この方法は、最適化法により個々の画像ピクセルで探索される変数を決定するのに適しているが、総ヒストグラムへの適用は不可能である。
【００１８】
公知文献M. Patting et.al, Fluorescence decay data analysis correcting for detector pulse pileup at very high count rates, Optical Engineering, 57(3), 031305 (2018)には、最適化法のモデル関数が適合化される方法も記載されている。そこに提案されている補正項は、ポアソン統計から生じる１つのヒストグラム間隙のみにおける補正係数が、当該ヒストグラム間隙の不感時間の影響を特徴付けることを前提とする。ただし、このことは、特に、測定間隔の開始時点の検出時間に割り当てられているヒストグラムの開始が、非常に短い寿命を有する成分によって制される場合には当てはまらない。それに結び付くエラーにより、ユーザーは、当該方法がそれぞれの用途ケースに適しているか否かを検査する必要がある。
【００１９】
国際公開第２０１０／０８９３６３号には、不感時間の影響を考慮するために用いられる最適化法自体における変更が行われる方法が記載されている。この方法は、そこに記載されている形態では、総ヒストグラムに適用することができない。補正された総ヒストグラムの表示は不可能である。
【００２０】
公知文献J. D. Driscoll et.al, Photon counting, censor corrections, and lifetime imaging for improved detection in two-photon microscopy, J Neurophysiol 105: 3106-3113, (2011)には、３．１ｎｓの不感時間を有するシステムでの不感時間の補正が記載されている。ここでは、ヒストグラムのみならず、最適化法の品質基準の計算も補正する２つの方法が提案されている。
【００２１】
前述の２つの方法のうちの最初の方法では、ヒストグラムにおける間隙ごとに、付加的に、光子が検出されなかった励起光パルスの数が決定される。第２の方法では、正確に１つの光子が検出された励起光パルスの数が付加的に決定される。これらの付加的情報により、ポアソン統計に基づいて補正値が決定される。どちらの方法にも、コート法と同じような制約がある。第２の方法では、さらに、既知の寿命を有する試料内の１つの成分のみが、ヒストグラムの減衰特性の開始を制する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明の課題は、比較的少ない技術的労力で、パイルアップ効果を回避しながら励起光強度を増加させかつ検出器および電子機器タイプの汎用的な使用に適していることを可能にする、蛍光寿命顕微鏡法およびならびにそのような方法を実施するように構成された顕微鏡を提供することにある。本発明の付加的な課題は、総ヒストグラムの呈示を補正された形態で可能にするそのような方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
この課題は、本発明により、独立請求項の対象によって解決される。本発明の好適な発展形態は、従属請求項および以下の説明から明らかになる。
【００２４】
本発明は、時間相関単一光子計数法を用いた蛍光寿命顕微鏡法を想定しており、ここでは、試料が、パルス光源を用いて蛍光光子の放出のために周期的に励起光パルスで励起され、ここで、それぞれ２つの順次連続する励起光パルスの間で測定間隔が定められ、検出器を用いて蛍光光子が検出され、検出された蛍光光子を表す検出器信号が生成され、該検出器信号に基づいて、蛍光光子がそれぞれの測定間隔内で検出器によって検出される検出時間が決定され、検出された蛍光光子の検出時間に基づいてイメージングが行われる。
【００２５】
本発明によれば、それぞれの測定間隔で、予め定められた数の蛍光光子が測定間隔内で検出されたか否かが決定される。
【００２６】
複数の画像ピクセルについて、すべての検出された光子の検出時間は、第１のデータメモリ（もしくはデータ領域）に集約される。
【００２７】
同様に複数の画像ピクセルについて、予め定められた数の検出された光子を伴う測定間隔からの光子のみの検出時間は、第２のデータメモリに集約される。
【００２８】
２つのデータメモリにおける情報は、計算ステップにおいて組み合わされ、再びデータメモリに格納される。
【００２９】
最後に述べたデータメモリのデータは、出力機器上で表示され得るか、複数の画像ピクセル内の分子の成分の寿命を決定するために用いることができる。
【００３０】
それぞれ２つの順次連続する励起光パルスの間で定められる測定間隔は、必ずしもこれらの２つのパルス間の時間間隔と同じではない。そのため、この測定間隔は、前述の２つの励起光パルスのうちの最初のパルスの前後の短い時間で開始および終了させることも考えられる。前述の２つの励起光パルスの最初のパルスの前および／または後の時間の典型的な値は、例えば、励起光の平均パルス持続時間の１％〜１０％、またはそれぞれ２つの順次連続する励起光パルスの間の期間である。
【００３１】
測定間隔内で検出された光子の数の決定は、例えば、励起光パルスが検出されたときにリセットされ（例えばゼロに設定され）、光子が検出されるごとに増分されるカウンタを用いて行うことができる。求められた検出時間は、それぞれの光子が測定間隔内でいくつ目の光子であるかを示す情報について補足することができる。代替的に、励起光パルスの識別の際に、付加的なデータワードをデータ情報ストリーム内に挿入することができる。測定間隔内で、予め定められた数の光子が検出されたか否かに関する情報の生成のための対応する動作は、論理回路、任意にプログラミング可能なロジック、またはソフトウェアで行うことができる。
【００３２】
特に簡素な実施形態では、検出された光子の予め定められた数は、１に等しい。
【００３３】
システムの検出電子機器は、データストリームを生成し、ここでは、識別された光子ごとにデータワードが検出時間と共にデータストリームに挿入される。データワードには、マーキングビットが設けられている。このビットは、例えば、励起光パルス後の最初に検出された光子の場合は値１、それ以外の場合は値０を含む。データストリームは、論理回路、任意にプログラミング可能なロジック、またはソフトウェアで処理される。厳密に、２つの順次連続するデータワードがマーキングされている場合、最初のデータワードが発生する測定間隔で、厳密に１つの光子が検出された。
【００３４】
本発明によれば、すべての検出された光子の検出時間は、複数の画像ピクセルについて第１のデータメモリに集約され、予め定められた数の検出された光子を伴う測定間隔からの光子の検出時間は、同様に複数の画像ピクセルについて第２のデータメモリに集約され、これらの２つのデータメモリにおける情報は計算ステップにより組み合わされる。ただし、これらの複数の画像ピクセルは、ここでは、画像のすべてのピクセルだけでなく、画像領域内のピクセルであってもよい。通常の画像フォーマットは、２次元の通常矩形に配置されたピクセルを有し、この場合、例えば１０２４×１０２４個、５１２×５１２個のピクセルが、それぞれｘもしくはｙ方向に設けられている。個々の画像領域（いわゆるＲＯＩ、Region of Interest）は、矩形、正方形、または円形の領域を有し、あるいはユーザーによって任意に定義可能な２次元の形状を有することができる。
【００３５】
検出時間の集約は、検出時間領域に関して検出された光子の頻度をヒストグラムの形態で求める好適な実施形態で行われる。第１のデータメモリ内のヒストグラムは、ここでは、未補正の総ヒストグラムである。次いで、第２のデータメモリ内のヒストグラムは、第１のデータメモリ内の未補正の総ヒストグラムのサブセットを表す。ただし、検出時間の集約は、他の形式で、例えば、検出された光子の頻度に関するモーメントを検出時間に依存して決定することによって行ってもよい。
【００３６】
本発明によれば、２つのデータメモリにおける情報は、計算ステップにより組み合わされる。好適な実施形態では、未補正の総ヒストグラムが決定され、これは以下ではＭａ（ｔ）として表される。付加的に、前述のサブセットは、１つの光子のみが検出された測定間隔からの光子の数を有するヒストグラムＭ１（ｔ）として決定される。ヒストグラムの間隙は、励起光パルス後のそれぞれの検出時間に対応している。求めるべきものは、不感時間のない理想的な機器を用いた記録操作のもとで記録されるはずのヒストグラムｆ（ｔ）である。
【００３７】
時点ｔ前の不感時間内で光子が検出されなかった場合にのみ、時点ｔで光子を検出することができる。それゆえ、総ヒストグラムＭａ（ｔ）において検出時間ｔを伴う間隙については、以下の関係式、
Ｍａ（ｔ）＝Ｐ０（ｔ−ｔｄ，ｔ）・ｆ（ｔ）    （１）
が成り立つ。ただし、ｔｄはシステムの不感時間である。Ｐ０（ａ，ｂ）は、期間ａ〜ｂにおいて光子が検出されなかった確率である。時点ｔ−ｔｄでのＭ１についても以下の類似の関係式、
Ｍ１（ｔ−ｔｄ）＝Ｐ０（ｔ０，ｔ−ｔｄ）・Ｐ０（ｔ，ｔｍ）・ｆ（ｔ−ｔｄ）  （２）
が成り立つ。不感時間の前または後に光子が検出されなかった場合のみ、時点ｔ−ｔｄで厳密に１つの光子を検出することができる。
【００３８】
式（１）および（２）を乗算すると、以下の式、
Ｍａ（ｔ）・Ｍ１（ｔ−ｔｄ）＝Ｐ０（ｔ０，ｔ−ｔｄ）・Ｐ０（ｔ−ｔｄ，ｔ）・Ｐ０（ｔ，ｔｍ）・ｆ（ｔ）・ｆ（ｔ−ｔｄ）    （３）
が得られる。この式（３）は、以下の式、
Ｐ０＝Ｐ０（ｔ０，ｔ−ｔｄ）・Ｐ０（ｔ−ｔｄ，ｔ）・Ｐ０（ｔ，ｔｍ）    （４）
により、以下の式、
Ｍａ（ｔ）・Ｍ１（ｔ−ｔｄ）＝Ｐ０・ｆ（ｔ）・ｆ（ｔ−ｔｄ）    （５）
に簡素化することができる。ここで、Ｐ０は、測定間隔全体において光子が検出されなかった確率である。Ｐ０は、ポアソン分布関数を用いて、検出された光子の総数Ｍａと測定間隔の総数Ｌとから近似的に算出することができる。すなわち、
Ｐ０〜ｅ−Ｍａ／Ｌ    （６）
付加的に、記録の際に光子が検出されなかった測定間隔の数Ｌ０も決定されるならば、正確な決定が可能になる。
Ｐ０＝Ｌ０／Ｌ    （７）
【００３９】
この決定は正確である。なぜなら、検出された光子のない測定間隔における不感時間の影響は、検出された光子のある測定間隔とは対照的に無視できるからである。
【００４０】
補正されたヒストグラムの探索された値ｆ（ｔ）は、ここでは、非線形最適化法を用いて決定される。特に簡素な実施形態では、以下のように、
【数３】
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最小化される二乗平均近似の方法が実行される。二乗平均近似による非線形最適化法の説明は、公知文献D.W. Marquardt, An algorithm for least-squares estimation of nonlinear parameters. J. Soc. Indust. Appl. Math., (1963). 11(2) P.431-441に含まれている。ここでも、当業者には、データの統計的な性質にも影響を与えるさらなる最適化法を使用できることが容易にわかるであろう。
【００４１】
計算ステップによる２つのデータメモリからの情報の組み合わせは、必ずしも最適化法を使用して実施する必要はない。この組み合わせは、例えば、以下の関係式、
ｆ’’（ｔ−ｔｄ）＝［Ｍａ（ｔ）・Ｍ１（ｔ−ｔｄ）］／［Ｐ０・ｆ’（ｔ）］  （９）
のような順次連続する計算ステップによるヒストグラムの反復的改良によって行うこともでき、以下の関係式、
ｆ’（ｔ）＝Ｍ１（ｔ）    （１０）
のような開始値によって行うこともできる。
【００４２】
補正された総ヒストグラムは、ユーザーに、例えばコンピューターのモニタ上で表示することができる。
【００４３】
補正された総ヒストグラムは、より低い励起光強度のもとでのヒストグラムに匹敵する特性を有しているため、蛍光寿命の決定が可能である。
【００４４】
以下では本発明を図面に基づきより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明による顕微鏡の一実施例を表す共焦点走査型顕微鏡を示した図
【図２】問題提示の明確化のために、均一な試料の未補正の総ヒストグラムと不均一な試料の未補正の総ヒストグラムとを示した図
【図３】１つの光子のみが検出された測定間隔からの光子すべてについて、関連する不感時間の影響を伴った総ヒストグラムと、補正された総ヒストグラムと、を示した図
【図４】本方法の好適な実施形態での個々の処理ステップのフローチャート
【図５】好適な実施形態のための顕微鏡の処理ユニット内のサブユニットを示した図
【発明を実施するための形態】
【００４６】
図１に示された共焦点走査型顕微鏡１は、周期的な励起光パルスで光を放出するように構成されたパルスレーザー光源２を有する。図１中に符号３で示された励起光は、ビームスプリッタ４に入射し、このビームスプリッタ４は、励起光３を透過成分５ｔと反射成分５ｒとに分割する。
【００４７】
ビームスプリッタ４を透過した励起光５ｔは、励起ピンホール６を通過し、次いで、ダイクロイックビームスプリッタ７において走査ユニット８の方向に反射される。走査ユニット８は、励起光５ｔを走査レンズ１０の方向に反射するジンバル式走査ミラー９を含む。走査レンズ１０およびチューブレンズ１１を通過した後、励起光５ｔは、顕微鏡対物レンズ１２に到達し、この顕微鏡対物レンズ１２は、励起光５ｔを試料１３上に導く。
【００４８】
励起光５ｔによって照明された試料１３の領域では、蛍光分子が、蛍光１４を放出するために励起される。蛍光１４を形成する蛍光光子は、ダイクロイックビームスプリッタ７から出発した励起光５ｔが試料１３に到達する光路に沿って伝搬され、反対方向にビームスプリッタ７まで戻される。ビームスプリッタ７と検出ピンホール１５とを通過した後、蛍光１４は、次いで、第１の検出器１６に到達する。第１の検出器１６は、受光した蛍光１４を検出器信号１７に変換し、この検出器信号１７は、モニタＭを有する処理ユニット１８に供給される。
【００４９】
走査型顕微鏡１は、受光した蛍光１４を検出器信号に変換する第１の検出器１６に加えて、第２の検出器１９を有しており、この第２の検出器１９は、ビームスプリッタ４によって分岐されたビームパスに配置されている。そのため、第２の検出器１９は、レーザー光源２によって放出された励起光３のうちのビームスプリッタ７によって反射された成分５ｒを受光する。第２の検出器１９は、ビームスプリッタ４において反射された励起光５ｒを励起信号２０に変換し、これを処理ユニット１８に供給する。
【００５０】
冒頭に説明したパイルアップ効果の回避のために、処理ユニット１８は、本発明に従って検出器信号に基づき、例えば２つの順次連続する励起光パルスによって定められた測定間隔内で、予め定められた数の光子が識別されたか否かを決定し、検出されたすべての光子の検出時間をデータメモリに集約し、予め定められた数の検出された光子を伴う測定間隔からの光子のみの検出時間を共通の第２のデータメモリに集約し、２つのデータメモリ内の情報を１つの計算ステップで組み合わせ、この計算ステップの結果をデータメモリに格納するように構成されている。
【００５１】
処理ユニット１８は、さらに、走査ユニット９をそれ自体公知の方法で駆動制御するように構成されている。その他に、処理ユニット１８は、表示装置Ｍ、例えばモニタを有する。
【００５２】
図２は、２つのメモリ内の情報を組み合わせるための計算ステップで解決される問題を明らかにしている。図２は、均一な試料２１の記録からの未補正の総ヒストグラム２２と、不均一な試料２３の記録からの未補正の総ヒストグラム２４と、を示し、ここでは、両ケースにおいて、総励起光強度、すなわち、記録された光子の総数はほぼ同じであるが、不均一な試料２３の画像には、局所的に明らかな強度最大値が存在している。図２による総ヒストグラムの異なる形態からは、総ヒストグラム内の情報のみでは、堅牢な補正を行い得るために不十分であることが明白である。従来技術による多くの方法は、総ヒストグラムに適用することはできない。なぜなら、不感時間の影響は、異なる場所における異なる成分の濃度に依存するからである。図２による例では、特に、均一な試料２１を記録する際にパイルアップ効果が発生しないことが認識できる。なぜなら、このケースでは、個々の各画像ピクセルの励起光強度が（一定して）比較的低いからである。それに対して、不均一な試料２３の記録では、パイルアップ効果が示される。なぜなら、そこでは、それらのピクセルが比較的高い励起光強度を受光し、最後に検出された光子の後の不感時間内に検出器に入射する光子の成分が励起光強度で増加する画像領域が存在しているからである。
【００５３】
図３には、測定間隔始端２６と測定間隔終端２７とを有する測定間隔２５、本発明に従って決定すべき典型的で理想的な総ヒストグラムｆ（ｔ）（参照符号２８）、および非常に高い励起光強度のもとでの未補正の総ヒストグラムＭａ（ｔ）（参照符号２９）が示されている。
【００５４】
さらなるヒストグラムＭ１（ｔ）（参照符号３０）は、１つの光子のみが検出された測定間隔からのそれらの光子のデータのみを含む。ある時点ｔ（参照符号３１）での不感時間ｔｄ（参照符号３３）を伴う不感時間の影響によるＭａ（ｔ）（参照符号２９）の強度低下は、時点ｔ−ｔｄ（参照符号３２）でのＭ１（ｔ）（参照符号３０）の強度増加と常に結び付けられている。
【００５５】
補正された総ヒストグラムｆ（ｔ）は、変数Ｍａ（ｔ）およびＭ１（ｔ）から、例えばさらに上記で提示された関係式（１）〜（８）もしくは関係式（９）および（１０）を使用して求めることができる。
【００５６】
図４には、処理ユニット１８によって実施することができる動作の一連のステップが示されている。まず、検出器信号１７および２０から、識別された光子ごとに検出時間が決定され、この検出時間は、光子の信号１７と励起光パルスの信号２０との間の時間測定を用いて決定される（これは図４では固有の方法ステップとしては示されていない）。ステップ３４では、光子の検出時間を伴う一連のデータワードが生成される。ここで、データワードは、関連する光子が入射する順序で配置されている。後続するステップ３５では、関連する光子の前で他の光子が測定間隔内で検出されなかったデータワードにマーキングがなされる。次いで、ステップ３６では、すべてのデータワードから未補正の総ヒストグラムＭａ（ｔ）が生成される。この総ヒストグラムは、第１のデータメモリに格納される。続いて、ステップ３７では、すべてのマーキングされたデータワードからヒストグラムＭ１（ｔ）が生成され、その後続のデータワードもマーキングされる。このヒストグラムＭ１（ｔ）は、第２のデータメモリに格納される。ステップ３８では、２つのデータメモリのヒストグラムＭａ（ｔ）およびＭ１（ｔ）から、補正された総ヒストグラムｆ（ｔ）が算出される。ここでは、非線形最適化法により、既に上記で導出された以下の式（８）
【数４】
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のように最小化される。ここでは、補正された総ヒストグラムｆ（ｔ）は、さらなるデータメモリに格納される。最後に言及したメモリからのデータはモニタに表示され、蛍光寿命の決定の際に使用される。
【００５７】
図５は、本発明による方法に使用される顕微鏡１の処理ユニット１８の構成部品を示す。時間測定ユニット３９では、検出器信号１７および励起信号２０から識別された光子に関する検出時間を有するデータワードからなるデータストリームが生成される。マーキングユニット４０では、関連する光子が走査間隔の第１の光子として検出されたそれらのデータワードがマーキングされる。第１のヒストグラム生成ユニット４１では、未補正の総ヒストグラムＭａ（ｔ）が算出されて第１のメモリに格納される。第２のヒストグラム生成ユニット４２では、マーキングされたデータワードからヒストグラムＭ１（ｔ）が生成され、それらの後続のデータワードもマーキングされる。このヒストグラムＭ１（ｔ）は、ヒストグラム生成ユニット４２により、図５には示されていない第２のメモリに格納される。計算ユニット４３では、２つのメモリからのデータが結合され、これによって、補正された総ヒストグラムｆ（ｔ）が生じ、それが結果データメモリ４４に格納される。結果データメモリ４４からのデータは、図５には示されていないモニタ上に表示され、蛍光寿命の決定のために使用される。
【００５８】
ヒストグラムＭａ（ｔ）、Ｍ１（ｔ）、およびｆ（ｔ）が記憶される前述のメモリは、例えば、処理ユニット１８の一部である、図には示されていないメモリの別個のメモリ領域として実施されている。ただし、そのような実施形態は、純粋に例示的なものとして理解すべきである。ここで保証されるべきことは、前述のヒストグラムが、上述したような自身の処理のために、それ自体任意の方法で提供されることのみである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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