(57)【要約】  本発明は、抗体医薬品の技術分野に関し、特に抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片に関し、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片の医薬組成物及びそれらの応用を含む。本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片は、有意な抗腫瘍効果を有し、ヒトＣＤ４７タンパク質との親和力が高く、細胞表面ＣＤ４７へのＳＩＲＰａの結合能力を阻害でき、且つ有意な赤血球凝集活性無し、抗腫瘍薬の調製に適用できる。【選択図】図１
2021535743.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、
（１）前記重鎖可変領域は、
（ａ１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２及び３で示されるアミノ酸配列、
（ａ２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、２及び１１で示されるアミノ酸配列、
（ａ３）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、５及び６で示されるアミノ酸配列、
（ａ４）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、８及び９で示されるアミノ酸配列、
（ａ５）（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）又は（ａ４）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲからなる群から選ばれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
（２）前記軽鎖可変領域は、
（ａ６）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１３及び１４で示されるアミノ酸配列、
（ａ７）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、１６及び１７で示されるアミノ酸配列、
（ａ８）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、１９及び２０で示されるアミノ酸配列、
（ａ９）（ａ６）、（ａ７）又は（ａ８）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲからなる群から選ばれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２及び３、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２及び３で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲである重鎖可変領域、並びに、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１３及び１４、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１３及び１４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲである軽鎖可変領域、
前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、２及び１１、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、２及び１１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲである重鎖可変領域、並びに、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１３及び１４、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１３及び１４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲである軽鎖可変領域、
前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、５及び６、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、５及び６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲである重鎖可変領域、並びに、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はがそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、１６及び１７、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、１６及び１７で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲである軽鎖可変領域、又は
前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、８及び９又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、８及び９で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲ的重鎖可変領域、及び前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、１９及び２０又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、１９及び２０で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲ的軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗ＣＤ４７抗体及その抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗体は、マウスモノクローナル抗体、ヒト／マウスキメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１又は２に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
（１）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、
（ｂ１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７で示されるアミノ酸配列、
（ｂ２）（ｂ１）に示されるアミノ酸配列に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、（ｂ１）に示されるアミノ酸配列と同じ又は類似する機能を持つアミノ酸配列、
（ｂ３）（ｂ１）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列から選ばれ、
（２）前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、
（ｂ４）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８で示されるアミノ酸配列、
（ｂ５）（ｂ４）に示されるアミノ酸配列に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、（ｂ４）に示されるアミノ酸配列と同じ又は類似する機能を持つアミノ酸配列、
（ｂ６）（ｂ４）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノアミノ酸配列から選ばれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
前記抗体は、さらに、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はその変異体の重鎖定常領域、マウス由来のｋ鎖又はその変異体の軽鎖定常領域を含む、請求項４に記載のＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に対して少なくと８５％の同一性と有するアミノ酸配列であり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に対して少なくとも８５％の同一性を有するとともに、また、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、且つＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、また、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
前記抗ＣＤ４７抗体は、ヒト化抗体であり、
（１）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、
（ｃ１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１で示されるアミノ酸配列、
（ｃ２）（ｃ１）に示されるアミノ酸配列に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、（ｃ１）に示されるアミノ酸配列と同じ又は類似する機能を持つアミノ酸配列、
（ｃ３）（ｃ１）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列から選ばれ、
（２）前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、
（ｃ４）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４で示されるアミノ酸配列、
（ｃ５）（ｃ４）に示されるアミノ酸配列に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、（ｃ４）に示されるアミノ酸配列と同じ又は類似する機能を持つアミノ酸配列、
（ｃ６）（ｃ４）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列から選ばれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に対して少なくとも８５％の同一性を有し、また、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０に対して少なくとも８５％の同一性を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３と同じ機能を持つアミノ酸配列、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１に対して少なくとも８５％の同一性を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項７に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
分離された核酸であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片をコードする、核酸。
【請求項１０】
（１）前記重鎖可変領域アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７で示され、
（２）前記軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０で示される、請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１２】
宿主細胞であって、請求項１１に記載の発現ベクターで形質転換され、前記宿主細胞は、原核細胞及び真核細胞から選ばれ、哺乳動物の細胞が好ましい、宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を製造する方法であって、請求項１２に記載の宿主細胞に抗体を発現させ、宿主細胞から前記抗体を分離するステップを含む、方法。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片、又は請求項１４の医薬組成物の、ＣＤ４７活性を阻害する医薬品の調製における応用。
【請求項１６】
ＣＤ４７活性を阻害する医薬品は、白血病、リンパがん、乳がん、肺がん、胃がん、大腸がん、食管がん、卵巣がん、子宮頸がん、腎臓がん、膀胱がん、膵臓がん、グリオマ及び／又はメラノーマの治療に適用される、請求項１５に記載の応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体医薬技術分野に関し、特に抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物及びそれらの応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ４７タンパク質は、整合素相関蛋白（ＩＡＰ）と称され、ＩｇＧスーパ―家族である五つ回膜貫通型糖タンパク質に属し、異なる組織細胞に広く発現される。ＣＤ４７抗体は、リガンドとするＴＳＰ−１又はＳＩＲＰαと結合し、細胞移動、粘附、アポトーシス、軸索伸長、細胞因子の発生及びＴ細胞活化、を含む異なる細胞機能をコントロールすることができ、ＳＩＲＰαは、典型的な免疫受体チロシン抑制剤配列（ＩＴＩＭ）を含有する膜貫通蛋白であり、主に髄系造血細胞膜表面、例えば、マクロファージ、細胞、樹状細胞などに発現される。ＣＤ４７はＳＩＲＰαと結合した後、ＩＴＩＭｓのリン酸化をもたらすため、ＳＨＰ−１／ＳＨＰ−２を生成し、さらに、マクロファージ突触でのミオシンＩＩＡの累積を抑制し、最終的にマクロファージ細胞のマクロファージ機能を抑制する。
【０００３】
腫瘍細胞の「免疫エスケープ」は、腫瘍の発生、進展及び薬剤耐性の主要なメカニズムと考えられる。腫瘍細胞は、ＣＤ４７分子の高発現により、マクロファージ細胞表面のＳＩＲＰαと互いに作用させ、マクロファージ細胞の食作用を顕著に抑制し、マクロファージ細胞によって取り込まれることを回避される。ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの結合を阻害すれば、腫瘍細胞による免疫抑制又は免疫耐性を除去でき、腫瘍細胞を有効に殺すことができる。これは、ＣＤ４７の腫瘍免疫タゲット治療に極めて有力な理論な根拠を提供している。
近年、国内外で、ＣＤ４７／ＳＩＲＰαシグナルシグナル伝達経路の各種治療法に多くの研究を行っており、例えば、ＣＤ４７抗体、抗ＳＩＲＰα抗体、組み換えＳＩＲＰαタンパク質、二重特異性抗体である。そのうち、ＣＤ４７阻害性抗体は、最も希望の持つ腫瘍治療案と考えられる。ヒトＣＤ４７ブロッキングモノクローナル抗体の有効性は、複数の前臨床モデルにおいて証実されている。例えば、リンパ癌、膀胱癌、結大腸癌、膠芽腫、乳癌、急性リンパ白血病及び急性骨髄性白血病などがある。
さらに、赤血球、血小板にもＣＤ４７分子が発現され、抗体がＣＤ４７とＳＩＲＰαとの互い作用を阻害すると、これらの細胞が「食しないで」というシグナルの保護を失なってしまい、さらにマクロファージ細胞によって取り込まれる。従って、ＣＤ４７抗体の副作用を回避する必要があり、例えば、血小板の分解、赤血球の凝集、赤血球の低下、貧血なども抗ＣＤ４７抗体を応用すれば考慮すべき点である。
従って、優れた抗腫瘍活性を有し、且つ顕著な赤血球凝集活性を有しない抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する必要がある。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の一側面では、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域は、重鎖可変領域の相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖可変領域の相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）及び／又は重鎖可変領域の相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含有し、前記軽鎖可変領域は、軽鎖可変領域の相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖可変領域の相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）及び／又は軽鎖可変領域の相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含有する抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０００５】
実施形態において、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、
【０００６】
（１）前記重鎖可変領域は、
（ａ１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２及び３で示されるアミノ酸配列、
（ａ２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、２及び１１で示されるアミノ酸配列、
（ａ３）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、５及び６で示されるアミノ酸配列、
（ａ４）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、８及び９で示されるアミノ酸配列、並びに
（ａ５）（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）又は（ａ４）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲからなる群から選ばれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
（２）前記軽鎖可変領域は、
（ａ６）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１３、及び１４で示されるアミノ酸配列、
（ａ７）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、１６、及び１７で示されるアミノ酸配列、
（ａ８）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、１９、及び２０で示されるアミノ酸配列、
（ａ９）（ａ６）、（ａ７）又は（ａ８）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲからなる群から選ばれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
【０００７】
具体的な実施形態において、本発明は、抗ＣＤ４７抗体又は抗原結合断片であって、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２及び３、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２及び３で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲである重鎖可変領域、並びに、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１３、及び１４またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１３、及び１４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲである軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ４７抗体又は抗原結合断片を提供する。
具体的な実施形態において、本発明は、抗ＣＤ４７抗体又は抗原結合断片であって、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、２及び１１、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１０、２及び１１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲである重鎖可変領域、並びに、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１３、及び１４またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１３、及び１４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲである軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ４７抗体又は抗原結合断片を提供する。
具体的な実施形態において、本発明は、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、５及び６又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、５、及び６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲである重鎖可変領域、並びに、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、１６、及び１７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、１６、及び１７で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲである軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する。
具体的な実施形態において、本発明は、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、８及び９又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、８、及び９で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲである重鎖可変領域、並びに、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、１９、及び２０またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、１９、及び２０で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するＣＤＲである軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片は、マウス抗体又はその抗原結合断片、キメラ抗体又はその抗原結合断片、或いはヒト化抗体又はその抗原結合断片である。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、
（１）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、
（ｂ１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７で示されるアミノ酸配列、
（ｂ２）（ｂ１）に示されるアミノ酸配列に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、（ｂ１）に示されるアミノ酸配列と同じ又は類似する機能を持つアミノ酸配列、並びに
（ｂ３）（ｂ１）に示されるアミノ酸配列対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列から選ばれ、
（２）前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、
（ｂ４）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８で示されるアミノ酸配列、
（ｂ５）（ｂ４）に示されるアミノ酸配列に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、（ｂ４）に示されるアミノ酸配列と同じ又は類似する機能を持つアミノ酸配列、
（ｂ６）（ｂ４）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノアミノ酸配列から選ばれる、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０００８】
幾つかの具体的な実施形態において、本発明は、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明は、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に対して少なくと８５％の同一性と有するアミノ酸配列である、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明は、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明は、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７び機能と同じであるアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明は、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明は、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に対して少なくとも８５％の同一性を有し、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２及び３で示されるアミノ酸配列であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に対して少なくとも８５％の同一性を有し、且つ前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１３及び１４で示されるアミノ酸配列である、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する。
具体的な実施形態において、本発明は、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に対して少なくとも８５％の同一性を有し、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、５及び６で示されるアミノ酸配列であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に対して少なくとも８５％の同一性を有し、且つ前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、１６及び１７で示されるアミノ酸配列である、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明は、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に対して少なくとも８５％の同一性を有し、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、８及び９で示されるアミノ酸配列であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６に対して少なくとも８５％の同一性を有し、且つ前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、１９及び２０で示されるアミノ酸配列である、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明は、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７と同じ機能を持つアミノ酸配列、又ははＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７に対して少なくとも８５％の同一性を有し、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２及び１１で示されるアミノ酸配列であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に対して少なくとも８５％の同一性を有し、且つ前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１３及び１４で示されるアミノ酸配列である、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明は、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に対して少なくとも８５％の同一性を有し、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、８及び９で示されるアミノ酸配列であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と同じ機能を持つアミノ酸配列、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８に対して少なくとも８５％の同一性を有し、且つ前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、１９及び２０で示されるアミノ酸配列である、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７抗体は、マウス抗体であり、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はその変異体を含有する重鎖可変領域、及びマウス由来ｋ鎖又はその変異体である軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
幾つかの好ましい実施形態において、本発明のマウス抗ＣＤ４７抗体は、マウスＩｇＧ１又はＩｇＧ２又はその変異体の重鎖定常領域、マウス由来ｋ鎖及びその変異体の軽鎖可変領域をさらに含有する。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明は、ヒト化抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、
（１）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、
（ｃ１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１で示されるアミノ酸配列、
（ｃ２）（ｃ１）に示されるアミノ酸配列に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、（ｃ１）で示されるアミノ酸配列と同じ又は類似する機能を持つアミノ酸配列、及び
（ｃ３）（ｃ１）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列から選ばれ、
（２）前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、
（ｃ４）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４で示されるアミノ酸配列、
（ｃ５）上記の（ｃ４）に示されるアミノ酸配列に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、（ｃ４）で示されるアミノ酸配列と同じ又は類似する機能を持つアミノ酸配列、及び
（ｃ６）（ｃ４）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列から選ばれる、ヒト化抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明は、ヒト化抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であるヒト化抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明は、ヒト化抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であるヒト化抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明は、ヒト化抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、且つＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、且つＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４と同じ機能を持つアミノ酸配列、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であるヒト化抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明は、ヒト化抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に対して少なくとも８５％の同一性を有し、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、２及び１１で示されるアミノ酸配列であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２に対して少なくとも８５％の同一性を有し、且つ前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１３及び１４で示されるアミノ酸配列であるヒト化抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明は、ヒト化抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０に対して少なくとも８５％の同一性を有し、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、５及び６で示されるアミノ酸配列であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３に対して少なくとも８５％の同一性を有し、且つ前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、１６及び１７で示されるアミノ酸配列であるヒト化抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明は、ヒト化抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１に対して少なくとも８５％の同一性を有し、且つ前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、８及び９で示されるアミノ酸配列であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４に１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠如又は付加され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４と同じ機能を持つアミノ酸配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４に対して少なくとも８５％の同一性を有し、且つ前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、１９及び２０で示されるアミノ酸配列であるヒト化抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する。
いくつの実施形態において、本発明は、ヒト化抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖は、ヒト化ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はその変異体の重鎖可変領域を含み、前記軽鎖は、ヒト化ｋ鎖、λ鎖又はその変異体の軽鎖定常領域を含むヒト化抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する。
本発明の一つの好ましい実施形態において、前記マウスＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片は、さらに、マウスｋ鎖、λ鎖又はその変異体の軽鎖定常領域を含み、及び／又はマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はその変異体の重鎖定常領域を含む。
【０００９】
本発明の一つのの好ましい実施形態において、前記キメラ抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片の抗体軽鎖は、さらに、マウスｋ鎖、λ鎖又はその突然変異配列の軽鎖定常領域を含む。前記キメラ抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片の抗体重鎖は、さらに、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４又はその突然変異配列の重鎖定常領域を含み、好ましくは、ヒトＩｇＧ１或いはＩｇＧ２重鎖可変領域、又はアミノ酸の突然変異後にＡＤＣＣ（抗体依存性の細胞媒介性細胞毒作用）毒性を顕著に低減させるＩｇＧ４定常領域を含む。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明のヒト化抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片は、さらに、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はその変異体の重鎖定常領域、及びヒトｋ鎖、λ鎖又はその変異体の軽鎖定常領域を含む。幾つかの好ましい実施形態において、本発明のヒト化抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片は、さらに、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はその変異体の重鎖定常領域、及びヒトｋ鎖又はその変異体の軽鎖定常領域を含む。
幾つかの実施形態において、本発明は、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ又はＦ（ａｂ）２である抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を提供する。
本発明の他の側面では、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片をコードする、分離された核酸を提供する。
幾つかの具体的な実施形態において、本発明に係る分離された核酸では、重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７で示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０で示される。
一つの具体的な実施形態において、本発明に係る分離された核酸では、重鎖可変領域のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５で示され、軽鎖定常領域のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８で示される。
一つの具体的な実施形態において、本発明の分離された核酸では、重鎖可変領域のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０をコードするヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６で示され、軽鎖定常領域のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９で示される。
一つの具体的な実施形態において、本発明の分離された核酸では、重鎖可変領域のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１をコードするヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７で示され、軽鎖定常領域のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０で示される。
本発明の他の側面では、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を発現させる発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、本発明の分離された核酸分子を含む。
発明の他の側面では、上記の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
いくつの実施形態において、本発明の宿主細胞は、原核細胞及び真核細胞から選ばられる。いくつの実施形態において、前記宿主細胞はバクテリアであり、好ましくは、大腸菌である。他の好ましい実施形態において、前記宿主細胞は、哺乳動物の細胞である。
本発明の他の側面で、前記宿主細胞に抗体を発現させ、宿主細胞から前記抗体を分離するステップを含む、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片を製造する方法を提供する。
本発明の他の側面で、本発明のヒト化抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。いくつの実施形態において、本発明は、本発明のヒト化抗ＣＤ４７抗体及びその抗原結合断片を含み、さらに、他の活性成分、例えば、他の抗体、標的薬などを含む医薬組成物を提供する。いくつの実施形態において、前記薬学的に許容される担体は、酸化防止剤、ポリペプチド、タンパク質、親水性プライマー、アミノ酸、糖、キレート剤、アルジトール、イオン表面活化剤から選択される。具体的な実施形態において、前記薬学的に許容される担体は、緩衝溶液である。他の具体的な実施形態において、前記薬学的に許容される担体は、リポソームである。
本発明のヒト化抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片は、経口或いは非経口的に投与されるように、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と混合されて医薬製剤として製造される。医薬の投与経路は、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、脳内、眼内、気管内、皮下、鼻腔内投与である。前記製剤は、任意の経路で投与されることができ。例えば、点滴注射又はボーラス注入、上皮又は皮膚粘膜（例ば、口腔粘膜又は直腸など）を介して吸収する経路で投与できる。医薬の投与は、全身的又は局部的である。前記製剤は、当分野で知られている方法で製造でき、且つ医薬品分野で通常の使用の担体、希釈剤又は賦形剤を含む。
本発明の他の側面では、その必要がある対象に本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片又は本発明の医薬組成物を投与することを含むＣＤ４７活性を阻害する方法を提供する。
本発明の他の側面では、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片又は本発明の医薬組成物の、ＣＤ４７活性阻害薬の調製における応用を提供する。いくつの実施形態において、前記ＣＤ４７活性阻害薬は、白血病、リンパ腫、乳癌、肺癌、胃癌、大腸癌、食管癌、卵巣癌、子宮頸癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌、神経膠腫及び／又は黒色腫の治療に用いられる。いくつの実施形態において、本発明は、上記抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片又は本発明の医薬組成物の抗腫瘍薬物への製造における応用を提供する。好ましくは、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、乳癌、肺癌、胃癌、大腸癌、食管癌、卵巣癌、子宮頸癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌、神経膠腫、及び／又は黒色腫から選択される。
本発明で提供される抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片は、顕著な抗腫瘍作用を有し、顕著に腫瘍の増長を抑制し、顕著な赤血球凝集活性を具有していなく、ヒト化抗体免疫原性が大きく低減され、ヒト免疫系が外因性モノクローナル抗体への拒絶反応を効果的に消除し、各種の腫瘍疾患を治療するための薬物の調製に用いられ、幅広い市場見通しがある。
【００１０】
定義
特に定義されていない限り、本明細書で使用される科学及び技術的用語の意味は、当業者にとって通常に理解されるものである。本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、タンパク質、オリゴヌクレオチドやポリヌクレオチド、及びハイブリダイゼーションで使用される命名及び技術は、本分野で通常知られる応用である。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチドの合成、組織培養、及び形質転換（電気穿孔、リポソームトランスフェクション）では、標準技術を使用している。酵素反応および精製技術は、製造元の取り扱い説明書、当分野で通常使用されるか又は本明細書に記載されている方法に従って行う。前記技術及び方法は、通常本分野でよく知られ且つ本明細書に引用及び討論される複数の総合で比較的具体な文献に記載のように使用される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、コールド・スプリング・ハーバー（ニューヨーク州、１９８９））。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学及び医学及び薬学的化学で使用される命名、実験室の方法及び技術は、本分野でよく知られて通常で使用されるものである。
本発明において、「少なくとも８０％の同一性」という用語とは、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を意味する。本発明において、「少なくとも８５％配列同一性」という用語とは、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を意味する。いくつの好ましい実施形態において、本発明に記載の配列同一性は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％を意味する。２つの配列の間の配列比較及び同一性パーセントの測定は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｓｔｕｔｕｔｅウェブサイトでのＢＬＡＳＴＮ／ＢＬＡＳＴＰ演算法により行う。
抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域は、３次元空間で互いに対応する位置で並べて抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合される抗原の３次元表面に相補させ、且つそれぞれの重鎖及び軽鎖の３つの超可変領域はいずれも「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と称される。各ドメインへのアミノ酸の割合は、Ｋａｂａｔ《免疫学的に趣味のあるタンパク質の配列》（国立健康研究所、ベセスダ（メリーランド州）（１９８７及び１９９１））又はＣｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａなど、Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７８−８８３（１９８９）によって定義される。
本発明に記載の「抗原結合断片」は、抗原結合活性のＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片及びヒトＣＤ４７結合のＦｖ断片、ｓｃＦｖ断片を有する。Ｆｖ断片は、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有するが、定常領域がなくなり、全部の抗原結合部位の最小の抗体断片を有する。一般的には、Ｆｖ抗体は、さらにＶＨとＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーを含み、且つ抗原結合に必要とする構造を形成できる。異なるリンカーによって２つの抗体可変領域を１つのポリペプチドとして連結され、一本鎖抗体又は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と称される。
本発明に記載の抗体とは、免疫グロブリン又はその免疫活性部分であり、即ち、特異的結合抗原（免疫反応を起こさせる）の抗原結合部位の分子である。「特異的結合」とは、抗体と抗原の１つ又は複数のエピトープを反応させるが、他のポリペプチドと反応させないか又は低い親和性（Ｋｄ＞１０−６）で他のポリペプチドと結合させることを意味する。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、一本鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びＦａｂライブラリを含むが、これらに限定されない。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）とは、単一の抗体産生細胞株に由来するクローンから得られた抗体であり、前記細胞株は、真核、原核、又はバクテリオファージの細胞株に限定されない。モノクローナル抗体又は抗原結合断片は、ハイブリドーマ技術、組み換え技術、バクテリオファージの表示技術、及び合成技術、例えば、ＣＤＲ  ｇｒａｆｔｉｎｇ又はその他の従来技術により組み換えることにより得られることができる。
本発明の「マウス抗体」は、当分野の知識および技術に従って作製されたヒトＣＤ４７に対するモノクローナル抗体である。作製中、被験者にＣＤ４７抗原を注射し、次に、所望の配列または機能的特徴を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離する。
本発明に記載の「キメラ抗体」とは、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合させることにより形成される抗体であり、マウス抗体によって誘発される免疫応答反応を低減させることができる。キメラ抗体を確立するには、マウス由来の特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを確立し、次いでマウスハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子をクローン化し、さらに、必要に応じてヒト抗体の定常領域遺伝子をクロ―ン化し、マウス可変領域遺伝子をヒト定常領域遺伝子と連結してキメラ遺伝子を形成し、ヒトベクターに挿入し、最後に、キメラ抗体分子を真核生物系又は原核生物系で発現させる。
【００１１】
本発明に記載の「ヒト化抗体」は、ＣＤＲ移植抗体とも称され、マウスのＣＤＲ配列をヒトの抗体フレームワーク領域（ＦＲ）で産生された抗体に移植する。このようなフレームワーク領域配列は、公共のＤＮＡデータベース又は開示されている参考文献から得られ、例えば、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）  ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ、又は免疫球タンパク質雑誌、２００１ＩＳＢＮ０１２４４１３５１から取得される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ヒト化抗ＣＤ４７抗体とサルＣＤ４７の結合活性アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の結果である。
【図２】図２は、ヒト化抗ＣＤ４７抗体とヒトＣＤ４７との結合活性アッセイ（ＥＬＩＳＡ）結果である。
【図３】図３は、ヒト化抗ＣＤ４７抗体と細胞表面ヒトＣＤ４７との結合活性アッセイ（ＥＬＩＳＡ）結果である。
【図４】図４は、赤血球凝集実験の結果であり、ここで、ＲＢＣ：陽性対照、ＰＢＳ：空白対照である。
【図５】図５は、ＦＡＣＳによりヒト化抗ＣＤ４７抗体の阻断活性を測定する実験結果である
【図６】図６は、ヒト化抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ３４−３９−ＰＥによるヒト胃癌ＮＵＧＣ−４移植腫瘍モデルの抗腫瘍試験結果である。
【図７】図７は、ヒト化抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ２６Ｔ−３１−ＰＥによるヒト胃癌ＮＵＧＣ−４移植腫瘍モデルの抗腫瘍試験結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、代表的な実施例は、本発明の保護範囲を制限するのではなく、本発明をよりよく説明するために使用される。以下の実施例で指定された条件なしの実験方法は、通常、一般的な条件に従って、例えば、コールドスプリングハーバーの抗体技術実験マニュアル、分子クローニングマニュアルなど、又は、原料や製品の製造元が推奨する条件に従って行う。実施例で使用された材料、試薬、特に説明されていない限り、すべて市販されている。
【００１４】
実施例１  抗原タンパク質及び陽性対照抗体の作製
【００１５】
１．抗原タンパク質及び陽性対照抗体の発現ベクターの構築
（１）抗原タンパク質の発現ベクターの構築
全長のＣＤ４７タンパク質をコードする遺伝子断片を合成し、アミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１で示されるように設計し、次いで、真核細胞発現プラスミドｐＴａｒｇｅＴにクローン化し、発現プラスミドｐＴａｒｇｅＴ―ＣＤ４７を得た。
ヒトＣＤ４７タンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列とｈＩｇＧ１−Ｆｃ又はｈｉｓタグアミノ酸配列を融合し、アミノ酸配列をそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３で示されるように設計した。上記アミノ酸配列のコドン最適化後、タグ付きＣＤ４７タンパク質細胞外領域遺伝子断片ＣＤ４７―ｈＦｃ、ＣＤ４７―ｈｉｓを合成し、それぞれ真核細胞発現プラスミドｐＨＲにクローン化し、発現プラスミドｐＨＲ−ＣＤ４７―ｈＦｃ、ｐＨＲ−ＣＤ４７―ｈｉｓを得た。
ヒトＣＤ４７タンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列とｍＩｇＧ１−Ｆｃアミノ酸配列を融合し、アミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４で示されるように設計した。上記アミノ酸配列のコドン最適化後、完全な発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＴＰＡ−ＣＤ４７−ｍＩｇＧ１−Ｆｃを合成した。
ＳＩＲＰαの配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５で示され、前記配列のコドン最適化後、完全な発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）−  ＳＩＲＰα−ｍｙｃ−Ｈｉｓを合成した。
【００１６】
（２）陽性対照抗体の発現ベクターの構築
特許出願ＷＯ２０１３／１１９７１４に開示された抗体ＡＢ６．１２−ＩｇＧ４Ｐ（本明細書は、ＡＢ０６．１２−４Ｐ）は、陽性対照抗体として、ＡＢ０６．１２−４Ｐのアミノ酸配列は、以下の通りであり、即ち
ＡＢ０６．１２−４Ｐ重鎖可変領域：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、
ＡＢ０６．１２−４Ｐ軽鎖可変領域：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７。
前記抗体配列に対応するアミノ酸配列に人工的コドン最適化を行い、陽性対照抗体ＡＢ０６．１２−４Ｐの重鎖及び軽鎖アミノ酸配列発現プラスミド  ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＳＨＣ０２５−ｈＧ４、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＨＣ０２５−ｈｋを得た。その重鎖遺伝子断片をＩｇＧ軽鎖定常領域を含有する真核細胞発現プラスミドｐＨＲにクローン化し、ＡＢ０６．１２−４Ｐの重鎖真核細胞発現プラスミドｐＨＲ−ＳＨＣ０２５−ｈＧ４−４ＰＥを得た。その軽鎖発現プラスミドは、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＳＨＣ０２５−ｈｋである。
【００１７】
２、抗原タンパク質及び陽性対照抗体の発現及び精製
（１）抗原タンパク質の安定したトランスジェニック細胞株の構築
真核細胞発現プラスミドｐＴａｒｇｅＴ−ＣＤ４７は、電圧１６０Ｖ、１５ｍｓｅｃのスクエアパルスのエレクトロポレーションによってＣＨＯ―Ｋ１細胞（中国化学院上海細胞生物学研究所）にトランスフェクトされ、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータにセットされて培養された。２４時間後、５００ｕｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含有する培地を使用して加圧培養を行った。１６日後、ＦＡＣＳによりｐｏｏｌ陽性率を検出し、プラスミドのエレクトロポレーション後の細胞をプレーティングし（細胞密度１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、１００ｕｌ／ウェル）、ＰＥ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ４７抗体（ＢＤ、５５６０４６）を使用して細胞とともにインキュベートし、フローサイトメーター（ＢＤ、ＦＡＣＳＪａｚｚ）を使用して５８５ｎｍの波長で平均値を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄを使用してデータ分析を行い、陽性細胞株をサブクローン化し、ＣＤ４７分子を高レベルで発現するクローン化されたＣＨＯ−Ｋ１細胞株を選択し、ＣＨＯ−Ｋ１−Ｅ５と称された。
（２）タグ付き抗原タンパク質及び陽性対照抗体の発現
１Ｌ細胞培養フラスコに密度が０．５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの２９３Ｆ細胞を播種し、新鮮な予備加熱されたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３の発現培地を加え、播種後に総体積が２５０ｍＬになり、３７℃、８％ＣＯ２、加湿ＣＯ２インキュベーターに入れ、一晩培養した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地８．５ｍＬを採取し、１ｍｇ／ｍｌのＰＥＩ溶液５００μｌを加え、均一に混合した。トランスフェクションを待つプラスミド２５０μｇを採取してＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地８．５ｍｌを加え、均一に混合し、ここで、タグ付き抗原タンパク質発現用プラスミドｐＨＲ−ＣＤ４７−ｈＦｃ、ｐＨＲ−ＣＤ４７−ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＴＰＡ−ＣＤ４７−ｍＩｇＧ１−Ｆｃ、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＳＩＲＰα−ｍｙｃ−Ｈｉｓをそれぞれトランスフェクトし、陽性対照抗体ＡＢ０６．１２−４Ｐ重鎖プラスミドｐＨＲ−ＳＨＣ０２５−ｈＧ４−４ＰＥと軽鎖プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＳＨＣ０２５−ｈｋが共にトランスフェクションされた。ＰＥＩとＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地の混合溶液をプラスミドに加え、均一に混合し、次いで細胞培養物を加え、３７℃、８％ＣＯ２、加湿ＣＯ２インキュベータに入れて培養した。細胞トランスフェクション後の１日目及び３日目に、細胞に栄養を追加し、各瓶あたりグルタミン２．５ｍｌ（母液の濃度２００ｍＭ）及びグルコース５ｍｌ（母液の濃度１８０ｇ／Ｌ）を加えた。細胞生存率を６５％〜７５％までに低減させると、細胞上清を収集する。細胞培養物を１５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、上清を収集し、さらに８０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心し、上清を収集した。
（３）アフィニティークロマトグラフィー用カラムによる精製
ＡＫＴＡ（ＧＥ、ＡＫＴＡ  ｐｕｒｅ−１５０）を使用してタンパク質の性質により異なるアフィニティークロマトグラフィー用カラムを選択して精製した（異なるタンパク質に適用されるアフィニティークロマトグラフィー用カラムは表１に示す。）。具体的には、精製手順は、以下の通りである。
【００１８】
【表１】
2021535743.tif 000003
洗浄：装置及びパイプラインを超純水で２ｍｉｎ洗浄し、流速１０ｍＬ／ｍｉｎ、クロマトグラフィーシステムを０．１Ｍ  ＮａＯＨでを洗浄した。
カラムの接続：クロマトグラフィーカラムをクロマトグラフィー装置に接続し、超純水で５ｍｉｎ洗浄し、次いで０．１Ｍ  ＮａＯＨで３０ｍｉｎ洗浄し、保持時間５ｍｉｎである。
平衡：２０ｍＭ  ＰＢ＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．２で５ＣＶ（カラム容量）平衡化した。
ローディング：細胞培養上清をサンプリングし、保持時間５ｍｉｎである。
再平衡：２０ｍＭ  ＰＢ＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．２で５ＣＶ平衡化した。
溶出：５０ｍＭ酢酸、ｐＨ＝３．４で溶出し、保持時間５ｍｉｎである。ＵＶ２８０〜５０ｍＡｕ程度で収集を開始し、５０ｍＡｕ程度に低下するまでに収集を停止した。１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ９．０でサンプルのｐＨを７．０に調整した。
再平衡：２０ｍＭ  ＰＢ＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．２で３ＣＶ平衡化し、保持時間５ｍｉｎである。
オンライン洗浄：０．１Ｍ  ＮａＯＨで３０ｍｉｎ洗浄し、保持時間５ｍｉｎである。
洗浄及び保管：精製水で１０ｍｉｎ洗浄した後、２０％アルコールで２ＣＶ洗浄した。
【００１９】
実施例２  モノクローナル抗体の作製
１、ハイブリドーマモノクローナルの作製
（１）動物免疫
異なるタグを付く抗ＣＤ４７抗原タンパク質をアジュバントとともに免疫する方法によりＳＪＬ実験用マウスを免疫し、初期で抗原５０ｕｇを使用し、後期で２５ｕｇ抗原を使用して免疫させた。
免疫アジュバントは、Ｑｕｉｃｋ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｍｏｕｓｅ５Ｗ（北京博奥龍免疫技術有限公司）又はＴｉｔｅｒ  Ｍａｘ（Ｓｉｇｍａ）とＣｐＧ（金斯瑞生物技術有限合成）／Ａｌｕｍ（ｔｈｅｒｍｏ）とのアジュバント間隔であってもよい。異なるタグを付くＣＤ４７抗原タンパク質のサンプルをアジュバント溶液に一滴ずつ加え、滴下しながらボルテックスして完全に混合し、アジュバントの用量は、明細書を参照して選択された。十分に混合して油中水型エマルジョンを形成した後、ＳＪＬマウスを免疫させた。
高レベル発現ＣＤ４７の分析に使用される細胞系、例えば、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ及びＣＨＯ−Ｋ１−Ｅ５は、マウスの免疫にも使用された。培養されているヒト急性リンパ球性白血病細胞（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ）及び実施例１では得られるＣＨＯ−Ｋ１−Ｅ５陽性単一細胞をトリプシン消化により処理し、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、細胞ペレットをＰＢＳで再懸濁し、サンプリングではセルカウンターでカウントし、残ったサンプルは、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心され、上清を捨て、細胞ペレットをＰＢＳで再懸濁し、適量のＰＢＳを追加し、１ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞懸濁液を得た。実験群のマウスは、各匹あたり１ｘ１０７ｃｅｌｌｓで免疫した。
免疫形態は、表２に示した。
【表２】
2021535743.tif 000004
【００２０】
（２）ハイブリドーマの融合
脾臓細胞の取得及び作製：追加免疫されたマウスを犠牲にし、７５％のアルコール中に浸した。脾臓を解剖し取り出し、乳棒で研磨した後、細胞篩でろ過した後、単一細胞懸濁液を調製した。脾臓細胞の懸濁液を２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、上清を捨てた。赤血球溶解液２ｍｌを加え、室温で赤血球２ｍｉｎを溶解し、２０ｍｌになるまでにＰＢＳを加え、１５００ｒｐｍで７ｍｉｎ遠心した後、上清を捨て、再懸濁して生細胞数をカウントした。培養瓶中でのＳｐ２／０細胞を収集し、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心した後、上清を捨て、再懸濁して生細胞数をカウントした。脾臓細胞：Ｓｐ２／０細胞＝１：１の割合で細胞を混合し、１５００ｒｐｍで７ｍｉｎ遠心した後上清を捨てた。エレクトロポレーションバッファー２０ｍＬで細胞を再懸濁し、１５００ｒｐｍで７ｍｉｎ遠心した。上清を捨て、１回繰り返した。細胞濃度が２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度になるように、それぞれ適量なエレクトロポレーションバッファーで細胞を再懸濁した。電気穿孔融合用タンクに細胞懸濁液９ｍＬを加えて融合させた。融合後、細胞懸濁液を２０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０完全培地１５ｍＬに移し、室温で２０ｍｉｎ放置した。融合細胞を１×ＨＡＴ、１×ＢＩＯＭＹＣ３、２０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ  １６４０培地で再懸濁した。細胞量は約４×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルになるように、細胞懸濁液を１００μｌ／ウェルで若干の９６ウェルプレートに加え、３７℃インキュベーターに入れて培養した。５日後、ＲＰＭＩ  １６４０完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＡＴ、１×ＢＩＯＭＹＣ−３を含有する）を１００μＬ／ウェルで追加した。
【００２１】
（３）ハイブリドーマおよびサブクローンの上清のスクリーニング
一週間融合後、細胞上清を取り出し、ＣＤ４７−ｈｉｓタンパク質または細胞表面のＣＤ４７に結合できるハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡでスクリーニングし、ＣＤ４７−ｈｉｓを使用してｈＦｃおよびｍＦｃの代わりにＣＤ４７に対する抗体をスクリーニングした。次に、ハイブリドーマ上清がＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用を阻害する能力をＥＬＩＳＡで分析した。ＥＬＩＳＡプレートにＳＩＲＰα−ｍｙｃ−ｈｉｓをコーティングし、組換えヒトタンパク質ＣＤ４７−ｈＦｃとハイブリドーマ上清の混合物を加え、２ｈインキュベートし、ＨＲＰ標記抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異性抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を加え、１ｈインキュベートし、マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍにおける吸光値を検出した。スクリーニングにより得られた結合能力及び阻害能力を有するハイブリドーマ親クローンを拡張培養し、結合活性及び阻害活性の再測定を行い、結合及び阻害能力を有するハイブリドーマ陽性クロ―を再度スクリーニングして得られた。
限定希釈法により、陽性細胞株に対してサブクローンを行い、一週間培養した後、ＥＬＩＳＡでサブクローン上清とＣＤ４７分子の結合活性、及びＣＤ４７−ＳＩＲＰαの互い作用を阻害する活性を検出し、３種の二重陽性細胞株を得り、それぞれＳＨＣ０２５−２６、ＳＨＣ０２５−３４、ＳＨＣ０２５−５８と記載された。
【００２２】
２、サブタイプの同定
モウス抗体サブタイプ同定用キットＳＢＡ  Ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｒｍ−Ｃ５７ＢＬ／６−ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、型番：５３００−０５Ｂ）の取り扱い説明書を参照して、抗体のサブタイプ同定を行い、結果は表３に示した。
【表３】
2021535743.tif 000005
【００２３】
３、モノクローナル抗体の作製
サブクローン上清の活性分析の結果により示すように、モノクローナル抗体の親クローンＳＨＣ０２５−２６、ＳＨＣ０２５−３４、ＳＨＣ０２５−５８を特定し、拡大培養した。培養条件は、１０％ウシ胎児血清、１ｘ  ＮＡＥＥ、１ｘピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリンストレプトマイシン二重抗体を含む１６４０培地では、細胞のセルコンフルエンスが８０％を超える場合には、細胞を継代培養して増殖させ、培養物が約５０ｍｌに達したときに上清を収集し、抗体を精製した。得られた抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により純度が良好であることが確認された。
【００２４】
４、モノクローナル抗体シーケンシング
サブクローンによる陽性ハイブリドーマ細胞を拡大培養し、適量な細胞を採取し、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、７４１３４）キットの説明書に従って、全ＲＮＡを抽出し、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｃｒｉｐｔ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ、６１１０Ａ）逆転写キットにより、ｃＤＮＡ第一鎖を合成した。
マウス抗体サブタイプの可変領域に従って特異的プライマー（５’端には真核生物発現ベクターとの相同組換えのホモロジーアームを含む）を設計し、テンプレートとしてｃＤＮＡを使用して、抗体可変領域遺伝子のPCR増幅を実行し、マウス抗体の軽鎖および重鎖可変領域の遺伝子断片を取得し、プライマーを設計し（文献：１．Ａｎｋｅ  Ｋｒｅｂｂｅｒ、Ｓｕｓａｎｎｅ  Ｂｏｒｎｈａｕｓｅｒ、Ｊｏｒｇ  Ｂｕｒｍｅｓｔｅｒ  ｅｔａｌ．Ｒｅｌｉａｂｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ａｎｄ  ｓｐｌｅｅｎ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ａ  ｒｅｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｓｙｓｔｅｍ。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９７、２０１：３５-５５．２．
2021535743.tif 000006
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｓ  ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｃｅｌｌ−ｌｉｎｅ  ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｉｏｎ、２００８、７８：１０７１-１０７８を参照）で、ＤＮＡシーケンスを実行し、ＤＮＡ配列を取得し、シーケンス結果は表４に示した。
【表４】
2021535743.tif 000007
【００２５】
実施例４  キメラ抗体の構築
精製後（精製手順は実施例１を参照）のマウス抗体軽鎖及び重鎖可変領域遺伝子断片は、それぞれ、ヒト抗体軽鎖または重鎖定常領域を含む線形化された真核生物発現プラスミドで大腸菌ＤＨ５α感受性細胞に同時形質転換し、対応する抗生物質を含む寒天プレートの表面に混合物を均一に塗布し、３７℃の恒温インキュベーターで一晩インキュベートした後、それぞれいくつの単菌落を選び、ＤＮＡシーケンス用にいくつかの単一コロニーを選択し、正しい配列のキメラ抗体は、それぞれＳＨＣ０２５−２６ＣＨＩ、ＳＨＣ０２５−３４ＣＨＩ、ＳＨＣ０２５−５８ＣＨＩと記載された。
相応する抗生物質を含有する２×ＹＴ液体培地に正しい配列の陽性クロ−ンを播種し、３７℃で、１２時間以上振とうして培養し、次いで菌体を収集してプラスミドの抽出を行い、キメラ抗体の軽鎖及び重鎖発現用プラスミドを得、核酸定量分析装置によりプラスミドの濃度及び純度を検出した。
キメラ抗体をＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトし、発現させて精製して大量の抗体を取得し、純度検出、活性分析及び親和性の検出を行った。
シーケンスにより、ＳＨＣ０２５−２６の重鎖ＣＤＲの１１８番目、及びＳＨＣ０２５−５８の軽鎖ＣＤＲの５６番目はそれぞれ１つのシステインを含み、ＣＤＲ領域のシステインは、発現する際に抗体分子上の他のシステインとランダムにペアになり、酸化されてジスルフィド架橋を形成し、抗体の純度に大きく影響した。この問題を解決するために、ＳＨＣ０２５−２６ＣＨＩ、ＳＨＣ０２５−５８ＣＨＩアミノ酸配列を以下のように変更し、ＳＨＣ０２５−２６ＣＨＩ重鎖のＣ１１８をＴに突然変異し、ＳＨＣ０２５−２６ＣＨＩ−Ｔと記載され、ＳＨＣ０２５−５８ＣＨＩ軽鎖のＣ５６をＡに突然変異させ、ＳＨＣ０２５−５８ＣＨＩ−Ａと記載され、部位特異的突然変異誘発導入法により突然変異遺伝子を構築した。キメラ抗体配列決定の結果は、表５に示した。
【表５】
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【００２６】
実施例５  ヒト化抗体の構築及び生産
キメラ抗体の活性分析、親和性ＫＤ値などに従って、ＳＨＣ０２５−３４ＣＨＩ、ＳＨＣ０２５−５８ＣＨＩ−Ａ、ＳＨＣ０２５−２６ＣＨＩ−Ｔを選択して抗体のヒト化を実行した。
抗体のヒト化とは、まず、免疫遺伝子データベース（ＩＭＧＴ）におけるマウス抗体配列と比較し、ＳＨＣ０２５−３４ＣＨＩ、ＳＨＣ０２５−５８ＣＨＩ−Ａ、ＳＨＣ０２５−２６ＣＨＩ−Ｔ抗体の可変領域のマウス起源を確認し、相同性を比較し、ＳＨＣ０２５−３４ＣＨＩ、ＳＨＣ０２５−５８ＣＨＩ−Ａ、ＳＨＣ０２５−２６ＣＨＩ−Ｔ抗体の重鎖可変領域配列のＦＲ領域は、それぞれマウス抗体由来遺伝子ＩＧＨＶ１−８＊０１、ＩＧＨＶ３−２１＊０４及びＩＧＨＶ１−２＊０２と最も類似した。抗体軽鎖可変領域ＦＲ配列は、マウス抗体ＩＧＫＶ３−１１＊０１、ＩＧＫＶ１−５＊０１及びＩＧＫＶ４−１＊０１と最も類似した。ＳＨＣ０２５−３４ＣＨＩ／ＳＨＣ０２５−５８ＣＨＩ−Ａ抗体フレームワーク領域配列ＦＲ１−ＦＲ３をテンプレートとして、ＳＨＣ０２５−３４ＣＨＩ／ＳＨＣ０２５−５８ＣＨＩ−ＡのＦＲ１−ＦＲ３配列の替りにヒトフレームワーク領域ライブラリで３Ｄ構造が類似するが、免疫原性が低い全なヒトフレームワークを探し、重鎖／軽鎖全長配列に対して３Ｄ構築を行い、元の抗体重鎖／軽鎖配列との構造比較分析を行い、抗原性及び３Ｄ構造類似性を総合に考慮すると、最終的にＳＨＣ０２５−３４ＣＨＩの６つのヒト化重鎖可変領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、４９、５０、５１、５２、５３）、４つのヒト化軽鎖可変領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４、５５、５６、５７を参照）、ＳＨＣ０２５−５８ＣＨＩ−Ａの６つのヒト化軽鎖可変領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８、５９、６０、６１、６２、６３を参照）及び５つのヒト化軽鎖可変領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４、６５、６６、６７、６８を参照）を選択して最適化を行った。ＳＨＣ０２５−３４ＣＨＩ／ＳＨＣ０２５−５８ＣＨＩ−Ａのヒト化抗体非ＣＤＲ領域配列は、９５％以上ヒト化された。ＳＨＣ０２５−２６ＣＨＩ−Ｔ重及び軽鎖の可変領域配列を使用し、タンパク質データバンクで構造アラインメント分析を行い、最も類似するＦＲ１−ＦＲ３配列を選択してマウス配列を置き換え、構造シミュレーションで抗体構造の安定性に重要な役割を果たすアミノ酸部位をマウス由来アミノ酸残基に逆変異させた。最終的にＳＨＣ０２５−２６ＣＨＩ−Ｔの４つのヒト化重鎖可変領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９、７０、７１、７２を参照）及び２つのヒト化軽鎖可変領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３、７４を参照）を取得した。
以上に設計されたヒト化抗体軽鎖及び重鎖可変領域アミノ酸配列は、対応するヌクレオチド配列に逆転写され、隣接するフラグメント間に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドフラグメントを生成し、Ｏｖｅｒｌａｐ  ＰＣＲによりオリゴヌクレオチドフラグメントをアニーリングさせて連結され、さらに特異的プライマー（５’の末端には真核生物発現ベクターとの相同組換えのための相同アーム配列を含む）を使用して完全な軽鎖および重鎖可変領域ヌクレオチドフラグメントを増幅し、精製された軽鎖可変領域ヌクレオチドフラグメントおよびＩｇＧ４軽鎖定常領域を含む線形化された真核生物発現プラスミド大腸菌ＤＨ５α感受性細胞に同時形質転換し、精製された重鎖可変領域ヌクレオチドフラグメントＳ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ突然変異ＩｇＧ４重鎖定常領域を含有する真核細胞発現プラスミドを大腸菌ＤＨ５α感受性細胞に同時形質転換し、それぞれ転化プラスミドを形質転換した感受性細胞を、対応する抗生物質の寒天プレート表面に均一に塗布し、３７℃、恒温インキュベータで一晩培養した後、若干の単一コロニーを選択してＤＮＡシーケンスを実行した。
相応する抗生物質を含有する２×ＹＴ液体培地に正しい配列の陽性クロ−ンを播種し、３７℃で、１２時間以上振とうして培養し、次いで菌体を収集してプラスミドの抽出を行い、ヒト化抗体軽鎖及び重鎖発現プラスミドを得、核酸定量分析装置によりプラスミドの濃度及び純度を検出した。
プラスミドをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトし、発現させて精製し、大量の抗体を得、純度検出、活性分析及び親和性の検出を行った。
純度、活性及び親和性がいずれもよいヒト化抗体を選択し、Ｈｕ２６Ｔ−３１−ＰＥ、Ｈｕ３４−３９−ＰＥ、Ｈｕ５８Ａ−１４−ＰＥと記載し、それらの配列を表６に示した。ヒト化抗体の由来源は表７に示した。
【表６】
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【表７】
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【００２７】
実施例６  サルＣＤ４７への結合活性の測定（ＥＬＩＳＡ）
タンパク質ベースのＥｌｉｓａにより抗体の結合活性を分析した。カニクイザルＣＤ４７−Ｈｉｓ（０．１μｇ／ウェル、ＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＤ７−Ｃ５２Ｈ１−５０ｕｇ）を９６ウェルマイクロプレートをコーティングした。本発明で提供される抗ＣＤ４７抗体は、一次抗体として２μｇ／ｍＬから開始し、５倍階段希釈してマイクロプレートに加え、合計８つの濃度であり、濃度は、それぞれ２０００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、１６ｎｇ／ｍＬ、３．２ｎｇ／ｍＬ、０．６４ｎｇ／ｍＬ、０．１２８ｎｇ／ｍＬ、０ｎｇ／ｍＬであり、３７℃で１．５ｈインキュベートし、陽性対照抗体はＡＢ０６．１２−４Ｐである。二次抗体としてＡｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９−０３５−００３、１：１００００）を使用し、発色液ＴＭＢ（３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジン）を追加し、終了後、マイクロプレートリーダー（ｔｈｅｒｍｏ、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＦＣ）によりＯＤ４５０値を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄを使用してＥＣ５０を生成し、その結果を図１に示した。
実験結果より、本発明で提供されるヒト化抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ２６Ｔ−３１−ＰＥ、Ｈｕ３４−３９−ＰＥ、Ｈｕ５８Ａ−１４−ＰＥは、いずれも、カニクイザルＣＤ４７と結合する能力を有し、且つ結合能力が陽性対照抗体ＡＢ０６．１２−４Ｐと相当することが分かった。
実施例７  ヒトＣＤ４７への結合活性の測定（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡにより結合活性を分析した。ヒトＣＤ４７−Ｈｉｓタンパク質（０．１ｕｇ／ウェル、実施例１、２で得られたもの）を９６ウェルマイクロプレートにコーティングし、３７℃で２ｈインキュベートした。１ｘＰＢＳＴで３回洗浄した後、５％スキルミルクで４℃一晩ブロックした。１ｘＰＢＳＴで３回洗浄した後、本発明で提供される抗ＣＤ４７抗体は、一次抗体として２μｇ／ｍＬから開始し、５倍階段希釈してマイクロプレートに加え、合計８つの濃度であり、濃度は、それぞれ２０００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、１６ｎｇ／ｍＬ、３．２ｎｇ／ｍＬ、０．６４ｎｇ／ｍＬ、０．１２８ｎｇ／ｍＬ、０ｎｇ／ｍＬであり、３７℃で１．５ｈインキュベートし、陽性対照抗体はＡＢ０６．１２−４Ｐであり、１ｘＰＢＳＴで５回洗浄した後、二次抗体としてＡｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９−０３５−００３、１：１００００）を使用し、３７℃で４０ｍｉｎインキュベートした。１ｘＰＢＳＴで５回洗浄した後、発色溶液ＴＭＢを加え、終了終了後、マイクロプレートリーダー（ｔｈｅｒｍｏ、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＦＣ）によりＯＤ４５０値を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄを使用したＥＣ５０を生成し、結果を図２に示した。
実験結果より、本発明で提供されるヒト化抗ＣＤ４７抗体体Ｈｕ２６Ｔ−３１−ＰＥ、Ｈｕ３４−３９−ＰＥ、Ｈｕ５８Ａ−１４−ＰＥはいずれもヒトＣＤ４７と結合する能力を有し、且つ結合能力が陽性対照抗体ＡＢ０６．１２−４Ｐに相当することが分かった。
【００２８】
実施例８  細胞表面へのＣＤ４７の結合の測定（ＥＬＩＳＡ）
細胞ベースのＥｌｉｓａにより抗体の結合活性を分析した。ＣＨＯ−Ｋ１−Ｅ５細胞を各ウェルあたり１ｘ１０５ｃｅｌｌｓプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養し、２日目に４％パラホルムアルデヒドで固定した後、スキルミルクで１ｈブロックした。プレートを１ｘＰＢＳで軽く洗浄した。本発明で提供される抗ＣＤ４７抗体は、一次抗体として２μｇ／ｍＬから開始し、５倍階段希釈してマイクロプレートに加え、合計８つの濃度であり、濃度は、それぞれ２０００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、１６ｎｇ／ｍＬ、３．２ｎｇ／ｍＬ、０．６４ｎｇ／ｍＬ、０．１２８ｎｇ／ｍＬ、０ｎｇ／ｍＬであり、３７℃で１．５ｈインキュベートし、陽性対照抗体はＡＢ０６．１２−４Ｐである。二次抗体としてＡｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９−０３５−００３、１：１００００）を使用し、発色液ＴＭＢを加入し、終了後、マイクロプレートリーダー（ｔｈｅｒｍｏ、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＦＣ）によりＯＤ４５０値を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄを使用してＥＣ５０を生成し、結果を図３に示した。
実験結果より、本発明で提供されるヒト化抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ２６Ｔ−３１−ＰＥ、Ｈｕ３４−３９−ＰＥ、Ｈｕ５８Ａ−１４−ＰＥはいずれもヒトＣＤ４７と結合する能力を有し、且つ結合能力が陽性対照抗体ＡＢ０６．１２−４Ｐに相当することが分かった。
【００２９】
実施例９  ヒトＣＤ４７タンパク質への親和性の測定
Ｆｏｒｔｅｂｉｏ  Ｏｃｔｅｔを使用して実施例１、２で得られたヒト化抗ＣＤ４７抗体の抗原ＣＤ４７（１９−１３６）−ｈＦＣに結合する親和性を測定した。まず、抗原ＣＤ４７（１９−１３６）−ｈＦｃをビオチン化して標識し、次に１０ｋＤの限外濾過チューブを使用してＰＢＳ遠心限外濾過を行い、３〜４回脱塩し、Ｎａｎｏｄｒｏｐによりビオチン標識後の抗原ＣＤ４７−ｈＦｃ−Ｂｉｏｔｉｎの実際のの濃度を測定した。ＣＤ４７−ｈＦｃ−ＢｉｏｔｉｎをＳＤバッファー（０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０＋０．１％ＢＳＡ溶液）で濃度５ｕｇ／ｍｌに希釈し、前記ヒト化抗ＣＤ４７抗体は、濃度が１０ｕｇ／ｍｌ、２．５ｕｇ／ｍｌ、０．６２５ｕｇ／ｍｌ、０ｕｇ／ｍｌになるようにＳＤバッファーで４倍濃度階段希釈され、ＳＡセンサーを選択してその抗原を固定化し、ｆｏｒｔｅｂｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６のプロトコールに従って親和性測定を行い、具体的なパラメータ及び実験結果は、表８に示した。
【表８】
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実験結果より、陽性対照抗体よりも、Ｈｕ２６Ｔ−３１−ＰＥはヒトＣＤ４７タンパク質への結合がより高い親和性を有することを示した。
【００３０】
実施例１０  赤血球凝集試験
血液５ｍＬを採取してＰＢＳ  ４０ｍＬを加え、２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ軽く遠心し、上清を捨て、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳで赤血球を再懸濁し、赤血球のヘマトクリット値に応じて２％の赤血球懸濁液を調製した。分析される抗体は、初期濃度が１〜２０ｕＭであり、２倍階段希釈し、合計２４つの濃度勾配である。丸底の９６ウェルプレートに異なる濃度の抗体５０μＬに加え、上記の２％赤血球懸濁液５０ｕｌを加え、均一に混合し、室温で放置した。２時間後、凝集があるか否かを観察した。ウサギポリクローナル抗体ＲＢＣ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、１０９−４１３９）を血球凝集の発生の陽性対照として使用し、その結果を図４に示した。図４に示すように、９６ウェルプレートに左から右に添加した抗体（ウサギポリクローナル抗体ＲＢＣ抗体、ＡＢ０６．１２−４Ｐ抗体及び本発明の被験抗体）の濃度を２０ｕＭから２倍勾配で順次に希釈し、ここで、ＲＢＣは陽性対照群（ウサギポリクローナル抗体ＲＢＣ抗体を使用し、赤血球の凝集を有意に引き起こす）を表し、ＰＢＳは、空白対象群を表した。ウェルにおいて、赤血球は、小さな丸い点を現れ、きちんとしたエッジは細胞の凝集がないことを示し、わずかに不規則なエッジは少量の赤血球の凝集を示しわずかに不規則なエッジは少量の赤血球の凝集を示し、薄片状で、穴の底を覆っていると、ほとんどの赤血球が凝集していることを示した。
実験より、特許出願ＷＯ２０１１／１４３６２４に開示された抗ＣＤ４７抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４は、抗ＣＤ４７抗体の一般的な望ましくない現象である、同じ濃度範囲内のほとんどの赤血球の有意な凝集を引き起こし得ることを示した。しかし、同じ条件下で、実験結果より、本発明のＨｕ２６Ｔ−３１−ＰＥ、Ｈｕ３４−３９−ＰＥ、Ｈｕ５８Ａ−１４−ＰＥは、いずれも赤血球凝集を引き起こさないことを示し、本発明の抗体は、抗体Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４よりもこの点で明らかに優れた。
【００３１】
実施例１１    ＦＡＣＳによるＣＤ４７阻害活性の測定の実験
ＦＡＣＳを使用し、本発明で提供される抗ＣＤ４７抗体が細胞表面ＣＤ４７へのＳＩＲＰａの結合を阻害する能力を検出した。
ＣＤ４７の由来源としてＣＨＯ−Ｋ１−Ｅ５陽性細胞株を使用し、階段希釈された抗ＣＤ４７抗体の存在下で、ＣＤ４７とＳＩＲＰａとの結合能を観察すした。二次抗体として、ＰＥ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４０５２０３、１：２００）を使用し、ＳＩＲＰａ−Ｂｉｏｔｉｎの変化をモニタリングした。ＡＢ０６．１２−４Ｐは、ＳＩＲＰａが細胞表面ＣＤ４７に結合することを阻害する陽性対照である。フローサイトメーター（ＢＤ、ＦＡＣＳＪａｚｚ）により５８５ｎｍの波長における平均値を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄを使用してＩＣ５０を生成し、結果を図５に示した。
実験結果より、阻害活性は、順次にＨｕ２６Ｔ−３１−ＰＥ≧Ｈｕ３４−３９−ＰＥ≧ＡＢ０６．１２−Ｐ＞Ｈｕ５８Ａ−１４−ＰＥであることを分かった。
【００３２】
実施例１２  ヒト胃癌ＮＵＧＣ−４移植腫瘍モデルの抗腫瘍試験
１、実験材料
（１）実験細胞及び動物
ＮＵＧＣ−４ヒト胃癌細胞は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から購入され、
ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウス、雌性、５〜８週齢、体重１８〜２０ｇ、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．、Ｌｔｄから購入された。、  
（２）被験品及び対照品
対照品Ｉｓｏｔｙｐｅ  ＩｇＧ４（カタログ番号ＡＢ１７００９１）は、Ｚｈｏｎｇｍｅｉ  Ｇｕａｎｋｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．Ｌｔｄから購入され、陰性対照品として、使用された。
試験前に、本発明のヒト化抗ＣＤ４７抗体は、ＰＢＳで０．６ｍｇ／ｍＬ及び０．３ｍｇ／ｍＬの２つの濃度に調製され、Ｉｓｏｔｙｐｅ  ＩｇＧ４及びＡＢ  ０６．１２−４Ｐは、０．６ｍｇ／ｍＬに調製された。
（３）実験方法
１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン及び１００μｇ／ｍＬ  ロコマイシンを含有するＲＭＰＩ１６４０培地を使用し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータにてＮＵＧＣ−４ヒト胃癌細胞を培養した。週１回１×ＥＤＴＡ溶液２ｍＬで消化して継代させた。細胞の飽和度が８０％〜９０％になると、細胞を収集し、カウントし、播種した。５×１０６個の細胞を含むＰＢＳをＭａｔｒｉｇｅｌ１００ｕＬと混合し（最終体積２００μＬ）、マウスの右後ろに播種し、播種細胞数は、５×１０６ｃｅｌｌｓ／匹である。腫瘍が体積１５０〜２００ｍｍ３に成長したら、群分けを開始し、週３回腹腔内投与し、バーニアキャリパーを使用して腫瘍の直径を週３回測定し、腫瘍体積を計算し、腫瘍体積の計算式は、Ｖ＝０．５ａ×ｂ２であり、ここで、ａ及びｂはそれぞれ腫瘍の長軽及び短径を示した。抗体の抗腫瘍効果は、相対的腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）によって評価された。相対的腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）の計算式は、Ｔ／Ｃ％＝ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ×１００％（ＴＲＴＶ：治療群ＲＴＶ、ＣＲＴＶ：陰性対照群ＲＴＶ）である。ＲＴＶ＝Ｖ２１／Ｖ０、ここで、Ｖ０は、群分けで投与される時に（即ち、ｄ０）測定された腫瘍体積であり、Ｖ２１は、投与の２１日目に測定された腫瘍体積である。投与群び溶媒群の最終日（２１日目）の腫瘍体積をＴ−ｔｅｓｔにより分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで実行した。結果は、表９に示した。
【表９】
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実験結果より、本発明で提供される抗体は、ヒト胃癌ＮＵＧＣ−４細胞をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス移植腫瘍モデルに播種して有意な抗腫瘍効果を有することを示した。用量３ｍｇ／ｋｇのＨｕ２６Ｔ−３１−ＰＥ及びＨｕ３４−３９−ＰＥは、６ｍｇ／ｋｇの対照抗体ＡＢ０６．１２−４Ｐと同様の腫瘍阻害効果を有するが、用量６ｍｇ／ｋｇのＨｕ２６Ｔ−３１−ＰＥ及びＨｕ３４−３９−ＰＥの腫瘍阻害効果は、６ｍｇ／ｋｇの対照抗体ＡＢ０６．１２−４Ｐよりも優れた。投与中止から１週間後、６ｍｇ／ｋｇの対照抗体群では、腫瘍の再発が発生した。しかしながら、Ｈｕ２６Ｔ−３１−ＰＥ及びＨｕ３４−３９−ＰＥ群では再発が発生しなかった（図６、図７）。本発明で提供される抗ＣＤ４７抗体は、予想外に、腫瘍増殖に対してより有意な阻害効果を有することを示した。
【００３３】
以上の実施例は、本発明で提供される抗ＣＤ４７抗体が有意な抗腫瘍効果を有し、腫瘍増殖を有意に阻害できることを証明し、その抗体は、抗腫瘍薬における調製に適用でき、予測可能な市場見通しを有することを示唆している。
【００３４】
以上、本発明を詳しく説明しているが、当業者は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明に様々な修正および変更を加えることができることを理解すべきである。本発明の権利範囲は、上記の詳細な説明に限定されるものではなく、請求項に属するべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年4月7日(2021.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片であって、
（１）前記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、５及び６で示され、
（２）前記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、１６及び１７で示される、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
前記抗体は、マウスモノクローナル抗体、ヒト／マウスキメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗体は、さらに、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はその変異体の重鎖定常領域、マウス由来のｋ鎖又はその変異体の軽鎖定常領域を含む、請求項１に記載のＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２であり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５である、
、請求項１に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３である、請求項１に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
分離された核酸であって、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片をコードする、核酸。
【請求項７】
（１）前記重鎖可変領域アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６で示され、
（２）前記軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９で示される、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合断片、又は請求項８の医薬組成物の、ＣＤ４７活性を阻害する医薬品の調製における応用。
【請求項１０】
ＣＤ４７活性を阻害する医薬品は、白血病、リンパがん、乳がん、肺がん、胃がん、大腸がん、食管がん、卵巣がん、子宮頸がん、腎臓がん、膀胱がん、膵臓がん、グリオマ及び／又はメラノーマの治療に適用される、請求項９に記載の応用。
【国際調査報告】
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