(57)【要約】  血漿中のアポリポタンパク質を特異的に吸着でき、血液脳関門を越える薬物、標的送達システムを媒介できる、製薬分野におけるポリペプチド修飾複合体、並びに脳腫瘍及び他の脳疾患を診断及び治療するための製剤の調製におけるその使用である。アミロイドβ（１タイプに関連する）のポリペプチド断片（ＳＰ）が修飾され、修飾された送達システムが血漿タンパク質とタンパク質クラウンを形成した後、修飾された送達システムが血管内皮細胞によるアミロイドβの取り込みを増加させることが示されている。修飾されたリポソーム送達システムは、薬物を病変部位に、より効果的に送達し、薬物の治療効果を著しく改善する。ＳＰが血漿タンパク質を吸着した後、薬物は、血液脳関門を越えて媒介され、及び／又は腫瘍新生血管及び腫瘍細胞を標的にすることができ、その修飾された薬物及び送達システムは、脳腫瘍及び他の脳の疾患を治療する際により良い治療効果が得られる。
2021527033.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳腫瘍及び／又は他の脳疾患の病巣を標的にするために薬物分子、蛍光プローブ又は送達システムを媒介するための調製物の調製におけるアミロイドβ短鎖ペプチドの使用であって、前記アミロイドβ短鎖ペプチドが、血漿中のアポリポタンパク質を特異的に吸着し得るアミロイドβ短鎖ペプチドであり；好ましくは、前記脳腫瘍が、脳転移性腫瘍及び／又は原発性脳腫瘍である、前記使用。
【請求項２】
アミロイドβ短鎖ペプチドが共有結合によってイメージング用物質Ｘに連結されて、脳腫瘍及び他の脳疾患の病巣の追跡に使用されるＳＰ−Ｘが調製され；
好ましくは、前記ＳＰ−Ｘにおいて、Ｘが、蛍光分子フルオレセイン又は近赤外色素分子Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＩＲ８２０、ＩＣＧ、ＤｉＲ、ＤｉＤ、ＤｉＩであり；
より好ましくは、前記脳腫瘍が、脳転移性腫瘍及び／又は原発性脳腫瘍である
ことを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
アミロイドβ短鎖ペプチドが共有結合によって抗腫瘍薬Ｙに連結されて、脳腫瘍及び他の脳疾患の病巣の標的介入に使用されるＳＰ−Ｙが調製され；
好ましくは、前記ＳＰ−Ｙにおいて、Ｙが、ゲフィチニブ、イコチニブ、アンロチニブ、クリゾチニブ、エルロチニブ、オシメルチニブ、アレクチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、アドリアマイシン、エピルビシン、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、９−ニトロセルロースカンプトテシン若しくはビンクリスチン小分子抗腫瘍薬であり；及び／又は
前記ＳＰ−Ｙにおいて、Ｙが、ｐ５３活性化ペプチド又はポリペプチド毒ポリペプチド抗腫瘍薬であり；
より好ましくは、前記脳腫瘍が、脳転移性腫瘍及び／又は原発性脳腫瘍である
ことを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
アミロイドβ短鎖ペプチドが共有結合によってポリエチレングリコール−Ｚに連結されて、ナノメートル送達システムを調製するために使用されるＳＰ−ポリエチレングリコール−Ｚが調製され；
好ましくは、前記ＳＰ−ポリエチレングリコール−Ｚにおいて、Ｚが、リン脂質、ポリ乳酸、乳酸−ｃｏ−グリコール酸若しくはポリカプロラクトンであり；及び／又は
好ましくは、ナノ送達システムが、リポソーム送達システム、ミセル送達システム、ナノディスク送達システム、及びポリマーナノ粒子送達システムの１又は２以上から選択され；
より好ましくは、ＳＰ−ポリエチレングリコール−リン脂質が、前記リポソーム送達システム、前記ミセル送達システム若しくは前記ナノディスク送達システムを調製するために使用され；及び／又はＳＰ−ポリエチレングリコール−ポリ乳酸、ＳＰ−ポリエチレングリコール−乳酸−ｃｏ−グリコール酸、ＳＰ−ポリエチレングリコール−ポリカプロラクトンが、前記ミセル送達システム及び前記ポリマーナノ粒子送達システムを調製するために使用され；
さらに好ましくは、前記リポソーム送達システム、前記ミセル送達システム、前記ナノディスク送達システム又は前記ポリマーナノ粒子送達システムが、脳腫瘍又は他の脳疾患の病巣を追跡するために診断分子を封入するために使用され；好ましくは、前記送達システムに封入された前記診断分子が、５−カルボキシフルオレセイン５−ＦＡＭ又は近赤外色素Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＩＲ８２０、ＩＣＧ、ＤｉＲ、ＤｉＤ、ＤｉＩであり；及び／又は
前記ナノ粒子送達システム、前記リポソーム送達システム、前記ミセル送達システム、前記ポリマーナノ粒子送達システム又は前記ナノディスク送達システムが、脳腫瘍又は他の脳疾患の病巣の標的介入のための抗腫瘍薬を封入するために使用され；好ましくは、前記送達システムに封入された前記薬物が、ゲフィチニブ、イコチニブ、アンロチニブ、クリゾチニブ、エルロチニブ、オシメルチニブ、アレクチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、アドリアマイシン、エピルビシン、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、９−ニトロセルロースカンプトテシン、ビンクリスチン、ｐ５３活性化ペプチド又はポリペプチド毒であり；
さらにより好ましくは、前記脳腫瘍が、脳転移性腫瘍及び／又は原発性脳腫瘍である
ことを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
脳腫瘍及び／又は他の脳疾患の病巣を標的にするために薬物分子、蛍光プローブ又は送達システムを媒介するための調製物を調製するためのアミロイドβ短鎖ペプチドであって、血漿中のアポリポタンパク質を特異的に吸着し得るアミロイドβ短鎖ペプチドであることを特徴とし；好ましくは、前記脳腫瘍が、脳転移性腫瘍及び／又は原発性脳腫瘍である、前記アミロイドβ短鎖ペプチド。
【請求項６】
脳腫瘍及び他の脳疾患の病巣のためのトレーサー分子であって、前記トレーサー分子が、請求項５に記載のアミロイドβ短鎖ペプチドを共有結合によってイメージング用物質Ｘと連結させることによって調製されるＳＰ−Ｘであり；
好ましくは、前記ＳＰ−Ｘにおいて、Ｘが、蛍光分子フルオレセイン又は近赤外色素分子Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＩＲ８２０、ＩＣＧ、ＤｉＲ、ＤｉＤ、ＤｉＩであり；
より好ましくは、前記脳腫瘍が、脳転移性腫瘍及び／又は原発性脳腫瘍であることを特徴とする、前記トレーサー分子。
【請求項７】
脳腫瘍及び他の脳疾患の病巣の標的介入のための薬物であって、前記薬物が、請求項５に記載のアミロイドβ短鎖ペプチドを共有結合によって抗腫瘍薬Ｙと連結させることによって調製されるＳＰ−Ｙであり；
好ましくは、前記ＳＰ−Ｙにおいて、Ｙが、ゲフィチニブ、イコチニブ、アンロチニブ、クリゾチニブ、エルロチニブ、オシメルチニブ、アレクチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、アドリアマイシン、エピルビシン、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、９−ニトロセルロースカンプトテシン若しくはビンクリスチン小分子抗腫瘍薬であり；及び／又は
前記ＳＰ−Ｙにおいて、Ｙが、ｐ５３活性化ペプチド又はポリペプチド毒ポリペプチド抗腫瘍薬であり；
より好ましくは、前記脳腫瘍は、脳転移性腫瘍及び／又は原発性脳腫瘍であることを特徴とする、前記薬物。
【請求項８】
ナノ送達システムであって、請求項５に記載のアミロイドβ短鎖ペプチドをポリエチレングリコール−Ｚと連結することによって調製されるＳＰ−ポリエチレングリコール−Ｚを含み；
好ましくは、前記ＳＰ−ポリエチレングリコール−Ｚにおいて、Ｚが、リン脂質、ポリ乳酸、乳酸−ｃｏ−グリコール酸又はポリカプロラクトンであり；
より好ましくは、前記ナノ送達システムが、リポソーム送達システム、ミセル送達システム、ナノディスク送達システム、及びポリマーナノ粒子送達システムの１又は２以上から選択され；
さらに好ましくは、前記ＳＰ−ポリエチレングリコール−ＺがＳＰ−ポリエチレングリコール−リン脂質である場合、前記ナノ送達システムが、リポソーム送達システム、ミセル送達システム、ナノディスク送達システムの１又は２以上から選択され；前記ＳＰ−ポリエチレングリコール−ＺがＳＰ−ポリエチレングリコール−ポリ乳酸、ＳＰ−ポリエチレングリコール−乳酸−ｃｏ−グリコール酸又はＳＰ−ポリエチレングリコール−ポリカプロラクトンである場合、前記ナノ送達システムが、ミセル送達システム及び／又はポリマーナノ粒子送達システムであり；
さらに好ましくは、前記リポソーム送達システム、ミセル送達システム、ナノディスク送達システム又はポリマーナノ粒子送達システムが、脳腫瘍又は他の脳疾患の病巣を追跡するために診断分子を封入するために使用され；好ましくは、前記送達システムに封入された前記診断分子が、５−カルボキシフルオレセイン５−ＦＡＭ又は近赤外色素Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＩＲ８２０、ＩＣＧ、ＤｉＲ、ＤｉＤ、ＤｉＩであり；及び／又は
さらに好ましくは、前記ナノ粒子送達システム、前記リポソーム送達システム、前記ミセル送達システム、前記ポリマーナノ粒子送達システム又は前記ナノディスク送達システムが、脳腫瘍及び他の脳疾患の病巣の標的介入のための抗腫瘍薬を封入するために使用され；好ましくは、前記送達システムに封入された前記薬物が、ゲフィチニブ、イコチニブ、アンロチニブ、クリゾチニブ、エルロチニブ、オシメルチニブ、アレクチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、アドリアマイシン、エピルビシン、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、９−ニトロセルロースカンプトテシン又はビンクリスチンｐ５３活性化ペプチド又はポリペプチド毒であり；
さらにより好ましくは、前記脳腫瘍が、脳転移性腫瘍及び／又は原発性脳腫瘍であることを特徴とする、前記ナノ送達システム。
【請求項９】
請求項８に記載のナノ送達システムを調製するための方法であって、以下のステップ：
天然のリン脂質、コレステロール、メトキシ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、及びＳＰ−ポリエチレングリコール−Ｚ、モデル薬物又はプローブ分子を計量し、溶媒に溶解させ、フィルムを形成させ、水和させ、膜を通過させ、及びカラムクロマトグラフィーによって遊離プローブ分子又は薬物を除去して、前記ナノ送達システムを作製するステップ；及び／又は
天然のリン脂質、コレステロール、メトキシ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、及びＳＰ−ポリエチレングリコール−Ｚを計量して、溶媒に溶解させ、フィルムを形成させ、水和させ、膜を通過させ、プローブ分子又は薬物を能動的に封入し、及びカラムクロマトグラフィーによって遊離プローブ分子又は薬物を除去して、前記ナノ送達システムを作製するステップ
を含む、前記方法。
【請求項１０】
１）請求項５に記載のアミロイドβ短鎖ペプチド、請求項６に記載のトレーサー分子、請求項７に記載の薬物及び／又は請求項８に記載のナノ送達システム；並びに２）薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする、医薬品組成物。
【請求項１１】
請求項５に記載のアミロイドβ短鎖ペプチド、請求項６に記載のトレーサー分子、請求項７に記載の薬物及び／又は請求項８に記載のナノ送達システムを含むことを特徴とする、診断用調製物。
【請求項１２】
脳疾患を治療するための方法であって、請求項５に記載のアミロイドβ短鎖ペプチド、請求項６に記載のトレーサー分子、請求項７に記載の薬物及び／又は請求項８に記載のナノ送達システムを、それを必要とする対象に投与するステップを含み、
好ましくは、前記脳疾患が、脳腫瘍又は他の脳疾患であり；
より好ましくは、前記脳腫瘍が、脳転移性腫瘍及び／又は原発性脳腫瘍である
ことを特徴とする、前記方法。
【請求項１３】
脳腫瘍及び他の脳疾患の病巣を診断するための方法であって、請求項５に記載のアミロイドβ短鎖ペプチド、請求項６に記載のトレーサー分子、請求項７に記載の薬物及び／又は請求項８に記載のナノ送達システムを、それを必要とする対象に投与するステップを含み、好ましくは、前記脳腫瘍が、脳転移性腫瘍及び／又は原発性脳腫瘍であることを特徴とする、前記方法。
【請求項１４】
脳腫瘍及び他の脳疾患の病巣の標的介入のための方法であって、請求項５に記載のアミロイドβ短鎖ペプチド、請求項６に記載のトレーサー分子、請求項７に記載の薬物及び／又は請求項８に記載のナノ送達システムを、それを必要とする対象に投与するステップを含み、好ましくは、前記脳腫瘍が、脳転移性腫瘍及び／又は原発性脳腫瘍であることを特徴とする、前記方法。
【請求項１５】
請求項５に記載のアミロイドβ短鎖ペプチド、請求項６に記載のトレーサー分子、請求項７に記載の薬物及び／又は請求項８に記載のナノ送達システムを、それを必要とする対象に投与するステップを含むことを特徴とする、薬物媒介方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１８年６月１９日出願の中国特許第ＣＮ２０１８１０６２６６５２．４号明細書の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、薬学の分野に属し、アミロイドβ短鎖ペプチド（ＳＰ）によって媒介される脳標的化送達システム、特に、血漿中のアポリポタンパク質を特異的に吸着し、薬物が血液脳関門を通過するように媒介し得るポリペプチド修飾化合物及び標的化送達システム、並びに脳腫瘍（脳転移及び原発性脳腫瘍を含む）及び他の脳疾患を診断及び治療するための調製物の調製におけるその適用に関する。
【背景技術】
【０００３】
中枢神経系の疾患は人間の健康を深刻に危険にさらす疾患になっているが、関連する新薬の研究の開発進捗は依然として非常に遅いことが先行技術から開示されている。主な理由の１つは、薬物中のほとんどの薬物分子が血液脳関門を通過するのが困難であることであり、血液脳関門を通過し得る薬物又は薬物送達システムを設計することが、現在の薬物研究及び開発の分野における重要及び困難な点の１つである。脳標的化薬物送達システムは、受容体を媒介した方法を主に使用して血液脳関門を通過して脳に到達するが、現在の薬物設計は、血液脳関門上の脳標的化分子と関連する受容体の結合効率に主に焦点を当てており、体液成分の影響が薬物送達システムのインビボ送達の過程でしばしば無視されることが研究から明らかになった。例えば、血漿タンパク質を合わせてタンパク質コロナを形成することは、薬物送達システムの標的化及びインビボ循環時間に大きな影響を与える可能性があり、これは、インビトロで設計された脳標的化薬物送達システムのインビボでの標的化効率の低下をもたらす。真新しい観点から脳標的化薬物送達システムを設計し、血漿タンパク質の吸着と分離、他の細胞の食作用、タンパク質分解、免疫応答などを含むインビボ送達の過程で関連タンパク質又は細胞とのその相互作用を正確に調節し、より効果的な標的化機能を果たす方法は、現在の業界において最新の研究主題である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
先行技術の現在の状況に基づいて、本出願の発明者らは、アミロイドβ短鎖ペプチド（以下ＳＰと呼ぶ）によって媒介される脳標的化送達システムを提供することを意図しており、特に、血漿中のアポリポタンパク質を特異的に吸着し、薬物が血液脳関門を通過するように媒介し得るポリペプチド修飾化合物及び標的化送達システム、並びに脳腫瘍（脳転移及び原発性脳腫瘍を含む）及び他の脳疾患を診断及び治療するための調製物を調製する際のその適用に関する。ポリペプチド修飾標的化送達システムは、血漿中でタンパク質コロナを形成するナノ薬物の成分及び生物活性を調節することによって従来の標的化ナノ薬物の欠陥を克服し、血液脳関門を通過し、血管内皮細胞及び腫瘍細胞を同時に標的にし得るＳＰ−薬物複合体及びＳＰ−修飾ナノ薬物送達システムを構築し、それによって脳腫瘍の標的診断及び治療並びに他の脳疾患の薬物送達を実現する。
【０００５】
本発明の目的は、アミロイドβ短鎖ペプチド（ＳＰ）によって媒介される脳標的化送達システムを提供することであり、特に、血漿中のアポリポタンパク質を特異的に吸着し、薬物が血液脳関門を通過するように媒介し得るポリペプチド修飾化合物及び標的化送達システム、並びに末梢腫瘍、脳腫瘍及び他の脳疾患を診断及び治療するための調製物の調製におけるその適用に関する。ポリペプチド修飾標的化送達システムは、血漿中でタンパク質コロナを形成するナノ薬物の成分及び生物活性を調節することによって従来の標的化ナノ薬物の欠陥を克服し、血液脳関門を通過し、血管内皮細胞及び腫瘍細胞を同時に標的にし得るＳＰ−薬物複合体及びＳＰ−修飾ナノ薬物送達システムを構築し、それによって脳腫瘍（脳転移及び原発性脳腫瘍を含む）の標的診断及び治療並びに他の脳疾患の薬物送達を実現する。
【０００６】
本発明の内容を説明する前に、本明細書で使用される用語は、以下のように定義されている：
用語「ＳＰ」は、アミロイドβ短鎖ペプチドを意味する。
用語「ＰＬＡ」は、ポリ乳酸を意味する。
用語「ＰＬＧＡ」は、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）を意味する。
用語「ＰＣＬ」は、ポリカプロラクトンを意味する。
本発明のＳＰポリペプチドの配列（ＮからＣまで）は、ＮＨ２−ＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭ−ＣＯＮＨ２である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様は、脳腫瘍及び／又は他の脳疾患の病巣を標的にするために薬物分子、蛍光プローブ又は送達システムを媒介するための調製物の調製におけるアミロイドβ短鎖ペプチドの使用であって、アミロイドβ短鎖ペプチドが、血漿中のアポリポタンパク質を特異的に吸着し得るアミロイドβ短鎖ペプチドであり；好ましくは、前記脳腫瘍が、脳転移性腫瘍及び／又は原発性脳腫瘍である、使用を提供する。
【０００８】
アミロイドβ短鎖ペプチドが共有結合によってイメージング用物質Ｘに連結されて、脳腫瘍及び他の脳疾患の病巣の追跡に使用されるＳＰ−Ｘが調製され；
好ましくは、前記ＳＰ−Ｘにおいて、Ｘが、蛍光分子フルオレセイン又は近赤外色素分子Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＩＲ８２０、ＩＣＧ、ＤｉＲ、ＤｉＤ、ＤｉＩであり；
より好ましくは、前記脳腫瘍が、脳転移性腫瘍及び／又は原発性脳腫瘍である、本発明の第１の態様による使用。
【０００９】
アミロイドβ短鎖ペプチドが共有結合によって抗腫瘍薬Ｙに連結されて、脳腫瘍及び他の脳疾患の病巣の標的介入に使用されるＳＰ−Ｙが調製され；
好ましくは、前記ＳＰ−Ｙにおいて、Ｙが、ゲフィチニブ、イコチニブ、アンロチニブ、クリゾチニブ、エルロチニブ、オシメルチニブ、アレクチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、アドリアマイシン、エピルビシン、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、９−ニトロセルロースカンプトテシン又はビンクリスチン小分子抗腫瘍薬であり；及び／又は
前記ＳＰ−Ｙにおいて、Ｙが、ｐ５３活性化ペプチド又はポリペプチド毒ポリペプチド抗腫瘍薬であり；
より好ましくは、前記脳腫瘍は、脳転移性腫瘍及び／又は原発性脳腫瘍である、本発明の第１の態様による使用。
【００１０】
アミロイドβ短鎖ペプチドが共有結合によってポリエチレングリコール−Ｚに連結されて、ナノメートル送達システムを調製するために使用されるＳＰ−ポリエチレングリコール−Ｚが調製され；
好ましくは、前記ＳＰ−ポリエチレングリコール−Ｚにおいて、Ｚが、リン脂質、ポリ乳酸、乳酸−ｃｏ−グリコール酸又はポリカプロラクトンであり；及び／又は
好ましくは、ナノ送達システムが、リポソーム送達システム、ミセル送達システム、ナノディスク送達システム、及びポリマーナノ粒子送達システムの１又は２以上から選択され；
より好ましくは、ＳＰ−ポリエチレングリコール−リン脂質が、リポソーム送達システム、ミセル送達システム又はナノディスク送達システムを調製するために使用され；及び／又はＳＰ−ポリエチレングリコール−ポリ乳酸、ＳＰ−ポリエチレングリコール−乳酸−ｃｏ−グリコール酸、ＳＰ−ポリエチレングリコール−ポリカプロラクトンが、ミセル送達システム及びポリマーナノ粒子送達システムを調製するために使用され；
さらに好ましくは、リポソーム送達システム、ミセル送達システム、ナノディスク送達システム又はポリマーナノ粒子送達システムが、脳腫瘍又は他の脳疾患の病巣を追跡するために診断分子を封入するために使用され；好ましくは、送達システムに封入された診断分子が、５−カルボキシフルオレセイン５−ＦＡＭ又は近赤外色素Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＩＲ８２０、ＩＣＧ、ＤｉＲ、ＤｉＤ、ＤｉＩであり；及び／又は
ナノ粒子送達システム、リポソーム送達システム、ミセル送達システム、ポリマーナノ粒子送達システム又はナノディスク送達システムが、脳腫瘍及び他の脳疾患の病巣の標的介入のための抗腫瘍薬を封入するために使用され；好ましくは、送達システムに封入された薬物が、ゲフィチニブ、イコチニブ、アンロチニブ、クリゾチニブ、エルロチニブ、オシメルチニブ、アレクチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、アドリアマイシン、エピルビシン、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、９−ニトロセルロースカンプトテシン、ビンクリスチン、ｐ５３活性化ペプチド又はポリペプチド毒であり；
さらにより好ましくは、前記脳腫瘍が、脳転移性腫瘍及び／又は原発性脳腫瘍である、本発明の第１の態様による使用。
【００１１】
本発明の第２の態様は、脳腫瘍及び／又は他の脳疾患の病巣を標的にするために薬物分子、蛍光プローブ又は送達システムを媒介するための調製物を調製するためのアミロイドβ短鎖ペプチドであって、アミロイドβ短鎖ペプチドが、血漿中のアポリポタンパク質を特異的に吸着し得るアミロイドβ短鎖ペプチドであり；好ましくは、前記脳腫瘍が、脳転移性腫瘍及び／又は原発性脳腫瘍である、アミロイドβ短鎖ペプチドを提供する。
【００１２】
本発明の第３の態様は、脳腫瘍及び他の脳疾患の病巣のためのトレーサー分子であって、前記トレーサー分子が、請求項５に記載のアミロイドβ短鎖ペプチドを共有結合によってイメージング用物質Ｘと連結させることによって調製されるＳＰ−Ｘであり；
好ましくは、前記ＳＰ−Ｘにおいて、Ｘが、蛍光分子フルオレセイン又は近赤外色素分子Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＩＲ８２０、ＩＣＧ、ＤｉＲ、ＤｉＤ、ＤｉＩであり；
より好ましくは、前記脳腫瘍が、脳転移性腫瘍及び／又は原発性脳腫瘍である、トレーサー分子を提供する。
【００１３】
本発明の第４の態様は、脳腫瘍及び他の脳疾患の病巣の標的介入のための薬物であって、前記薬物が、請求項５に記載のアミロイドβ短鎖ペプチドを共有結合によって抗腫瘍薬Ｙと連結させることによって調製されるＳＰ−Ｙであり；
好ましくは、前記ＳＰ−Ｙにおいて、Ｙが、ゲフィチニブ、イコチニブ、アンロチニブ、クリゾチニブ、エルロチニブ、オシメルチニブ、アレクチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、アドリアマイシン、エピルビシン、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、９−ニトロセルロースカンプトテシン又はビンクリスチン小分子抗腫瘍薬であり；及び／又は
前記ＳＰ−Ｙにおいて、Ｙが、ｐ５３活性化ペプチド又はポリペプチド毒ポリペプチド抗腫瘍薬であり；
より好ましくは、前記脳腫瘍は、脳転移性腫瘍及び／又は原発性脳腫瘍である、薬物を提供する。
【００１４】
本発明の第５の態様は、ナノ送達システムであって、第２の態様のアミロイドβ短鎖ペプチドをポリエチレングリコール−Ｚと連結することによって調製されるＳＰ−ポリエチレングリコール−Ｚを含み；
好ましくは、前記ＳＰ−ポリエチレングリコール−Ｚにおいて、Ｚが、リン脂質、ポリ乳酸、乳酸−ｃｏ−グリコール酸又はポリカプロラクトンであり；
より好ましくは、ナノ送達システムが、リポソーム送達システム、ミセル送達システム、ナノディスク送達システム、及びポリマーナノ粒子送達システムの１又は２以上から選択され；
さらに好ましくは、ＳＰ−ポリエチレングリコール−ＺがＳＰ−ポリエチレングリコール−リン脂質である場合、前記ナノ送達システムが、リポソーム送達システム、ミセル送達システム、ナノディスク送達システムの１又は２以上から選択され；ＳＰ−ポリエチレングリコール−ＺがＳＰ−ポリエチレングリコール−ポリ乳酸、ＳＰ−ポリエチレングリコール−乳酸−ｃｏ−グリコール酸又はＳＰ−ポリエチレングリコール−ポリカプロラクトンである場合、前記ナノ送達システムが、ミセル送達システム及び／又はポリマーナノ粒子送達システムであり；
さらに好ましくは、前記リポソーム送達システム、ミセル送達システム、ナノディスク送達システム又はポリマーナノ粒子送達システムが、脳腫瘍又は他の脳疾患の病巣を追跡するために診断分子を封入するために使用され；好ましくは、送達システムに封入された診断分子が、５−カルボキシフルオレセイン５−ＦＡＭ又は近赤外色素Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＩＲ８２０、ＩＣＧ、ＤｉＲ、ＤｉＤ、ＤｉＩであり；及び／又は
さらに好ましくは、ナノ粒子送達システム、リポソーム送達システム、ミセル送達システム、ポリマーナノ粒子送達システム又はナノディスク送達システムが、脳腫瘍又は他の脳疾患の病巣の標的介入のための抗腫瘍薬を封入するために使用され；好ましくは、送達システムに封入された薬物が、ゲフィチニブ、イコチニブ、アンロチニブ、クリゾチニブ、エルロチニブ、オシメルチニブ、アレクチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、アドリアマイシン、エピルビシン、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、９−ニトロセルロースカンプトテシン、ビンクリスチン、ｐ５３活性化ペプチド又はポリペプチド毒であり；
さらにより好ましくは、前記脳腫瘍が、脳転移性腫瘍及び／又は原発性脳腫瘍である、ナノ送達システムを提供する。
【００１５】
本発明の第６の態様は、第５の態様のナノ送達システムを調製するための方法であって、以下のステップ：
天然のリン脂質、コレステロール、メトキシ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、及びＳＰ−ポリエチレングリコール−Ｚ、モデル薬物又はプローブ分子を計量し、溶媒に溶解させ、フィルムを形成させ、水和させ、膜を通過させ、及びカラムクロマトグラフィーによって遊離プローブ分子又は薬物を除去して、ナノ送達システムを作製するステップ；及び／又は
天然のリン脂質、コレステロール、メトキシ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、及びＳＰ−ポリエチレングリコール−Ｚを計量して、溶媒に溶解させ、フィルムを形成させ、水和させ、膜を通過させ、プローブ分子又は薬物を能動的に封入し、及びカラムクロマトグラフィーによって遊離プローブ分子又は薬物を除去して、ナノ送達システムを作製するステップ
を含む方法を提供する。
【００１６】
本発明の第７の態様は、１）第２の態様に記載のアミロイドβ短鎖ペプチド、第３の態様に記載のトレーサー分子、第４の態様に記載の薬物及び／又は第５の態様に記載のナノ送達システム；並びに２）薬学的に許容される担体を含む医薬品組成物を提供する。
【００１７】
本発明の第８の態様は、第２の態様に記載のアミロイドβ短鎖ペプチド、第３の態様に記載のトレーサー分子、第４の態様に記載の薬及び／又は第５の態様に記載のナノ送達システムを含む診断用調製物を提供する。
【００１８】
本発明の第９の態様は、脳疾患を治療するための方法であって、第２の態様に記載のアミロイドβ短鎖ペプチド、第３の態様に記載のトレーサー分子、第４の態様に記載の薬及び／又は第５の態様に記載のナノ送達システムを、それを必要とする対象に投与するステップを含み、
好ましくは、脳疾患が、脳腫瘍又は他の脳疾患であり；
より好ましくは、前記脳腫瘍が、脳転移性腫瘍及び／又は原発性脳腫瘍である、方法を提供する。
【００１９】
本発明の第１０の態様は、脳腫瘍及び他の脳疾患の病巣を診断するための方法であって、第２の態様に記載のアミロイドβ短鎖ペプチド、第３の態様に記載のトレーサー分子、第４の態様に記載の薬及び／又は第５の態様に記載のナノ送達システムを、それを必要とする対象に投与するステップを含み、好ましくは、前記脳腫瘍が、脳転移性腫瘍及び／又は原発性脳腫瘍である、方法を提供する。
【００２０】
本発明の第１１の態様は、脳腫瘍及び他の脳疾患の病巣の標的介入のための方法であって、第２の態様に記載のアミロイドβ短鎖ペプチド、第３の態様に記載のトレーサー分子、第４の態様に記載の薬及び／又は第５の態様に記載のナノ送達システムを、それを必要とする対象に投与するステップを含み、好ましくは、前記脳腫瘍が、脳転移性腫瘍及び／又は原発性脳腫瘍である、方法を提供する。
【００２１】
本発明の第１２の態様は、第２の態様に記載のアミロイドβ短鎖ペプチド、第３の態様に記載のトレーサー分子、第４の態様に記載の薬物及び／又は第５の態様に記載のナノ送達システムを、それを必要とする対象に投与するステップを含むことを特徴とする薬物媒介方法を提供する。
【００２２】
本発明によれば、分子パートナーとしてのアポリポタンパク質及び末梢への受容体媒介輸送を用いて脳内のアミロイドβのクリアランス機序をシミュレートし、アミロイドβをテンプレートとして使用して、アポリポタンパク質脂質結合ドメインに特異的に結合できる短鎖ペプチド（ＳＰ）を設計する。リポソームの表面上の短鎖ペプチドを修飾することによって、血漿中のアポリポタンパク質を特異的に吸着でき、その生物活性は、インビボの血液循環の過程で維持することができ、次いでアポリポタンパク質は、血液脳関門上の種々の受容体［低密度リポタンパク質関連タンパク質１（ＬＲＰ−１）、スカベンジヤー受容体クラスｂメンバー１（ｓｒｂ１）及び低密度リポソーム関連タンパク質２（ＬＲＰ−２）を含む］と組み合わせて、脳へのリポソーム輸送を媒介することができる。ポリペプチド修飾リポソームは、血漿中でタンパク質コロナを形成するナノ薬物の成分及び生物活性を調節することによって従来の標的化ナノ薬物の欠陥を克服し、血液脳関門を通過し、血管内皮細胞及び腫瘍細胞を同時に標的にし得るＳＰ−薬物複合体及びＳＰ−修飾ナノ薬物送達システムを構築し、それによって脳腫瘍の標的診断及び治療並びに他の脳疾患の薬物送達を実現する。
【００２３】
本発明において、ＳＰは、ポリエチレングリコール−ジステアロイルホスホエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ポリエチレングリコール−ポリ乳酸（ＰＥＧ−ＰＬＡ）、ポリエチレングリコール−乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール−ポリカプロラクトン（ＰＥＧ−ＰＣＬ）及び他の物質に共有結合的に修飾され、ＳＰ短鎖ペプチドが修飾されたリポソーム、ミセル、ナノディスク、ナノ粒子などの送達システムが構築される。
【００２４】
ＳＰ修飾ナノ送達システムは、抗腫瘍薬、例えばゲフィチニブ、イコチニブ、アンロチニブ、クリゾチニブ、エルロチニブ、オシメルチニブ、アレクチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、アドリアマイシン、エピルビシン、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、９−ニトロセルロースカンプトテシン、ビンクリスチン、ｐ５３活性化ペプチド、ハチ毒ペプチド、サソリ毒ペプチドなどを封入することができる。また、これは、蛍光物質、例えばＦＡＭ、近赤外色素Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＩＲ８２０、ＩＣＧ、ＤｉＲ、ＤｉＤ、ＤｉＩなどを封入することができる。
【００２５】
本発明において、ＳＰ修飾薬物又はプローブは、薬物、例えばアドリアマイシン、エピルビシン、ｐ５３活性化ペプチド及びポリペプチド毒を含む、マレイミドヒドラジド誘導体の反応によって形成されるｐＨ感受性ヒドラゾン結合を含み；或いは薬物、例えばゲフィチニブ、イコチニブ、アンロチニブ、クリゾチニブ、エルロチニブ、オシメルチニブ、アレクチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、９−ニトロセルロースカンプトテシン、ビンクリスチン、ｐ５３活性化ペプチド、ポリペプチド毒を含む、３−（２−ピリジンジメルカプト）プロピオン酸誘導体の反応によって形成されるジスルフィド結合を含み；或いはフルオレセイン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＩＣＧ、ＩＲ８２０を含む安定した化学結合を介して蛍光プローブを接続する。
【００２６】
さらに、本発明は、脳腫瘍（脳転移及び原発性脳腫瘍を含む）又は他の脳疾患の病巣を標的にするために薬物分子、蛍光プローブ又は送達システムを媒介するための調製物の調製におけるアミロイドβ短鎖ペプチドの適用であって、アミロイドβ短鎖ペプチドが、血漿中のアポリポタンパク質を特異的に吸着し得るアミロイドβ短鎖ペプチドである、適用（application）を提供する。
【００２７】
アミロイドβ短鎖ペプチド（ＳＰ）は、共有結合によってイメージング用物質Ｘに連結されて、脳腫瘍（脳転移及び原発性脳腫瘍を含む）及び他の脳疾患の病巣の追跡に使用されるＳＰ−Ｘが調製され；前記ＳＰ−Ｘにおいて、Ｘは、蛍光分子フルオレセイン又は近赤外色素分子Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＩＲ８２０、ＩＣＧ、ＤｉＲ、ＤｉＤ、ＤｉＩである。
【００２８】
アミロイドβ短鎖ペプチド（ＳＰ）は、共有結合によって抗腫瘍薬Ｙに連結されて、脳腫瘍（脳転移及び原発性脳腫瘍を含む）及び他の脳疾患の病巣の標的介入に使用されるＳＰ−Ｙが調製され；前記ＳＰ−Ｙにおいて、Ｙは、ゲフィチニブ、イコチニブ、アンロチニブ、クリゾチニブ、エルロチニブ、オシメルチニブ、アレクチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、アドリアマイシン、エピルビシン、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、９−ニトロセルロースカンプトテシン又はビンクリスチン小分子抗腫瘍薬であり；前記ＳＰ−Ｙにおいて、Ｙは、ｐ５３活性化ペプチド又はポリペプチド毒ポリペプチド抗腫瘍薬である。
【００２９】
アミロイドβ短鎖ペプチド（ＳＰ）は、共有結合によってポリエチレングリコール−Ｚに連結されて、ナノメートル送達システムを調製するために使用されるＳＰ−ポリエチレングリコール−Ｚが調製され；前記ＳＰ−ポリエチレングリコール−Ｚにおいて、Ｚは、リン脂質、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）又はポリカプロラクトン（ＰＣＬ）である。
【００３０】
本発明のＳＰ−ポリエチレングリコール−リン脂質は、リポソーム送達システム、ミセル送達システム又はナノディスク送達システムを調製するために使用される。
【００３１】
本発明のＳＰ−ポリエチレングリコール−ポリ乳酸、ＳＰ−ポリエチレングリコール−乳酸−ｃｏ−グリコール酸、ＳＰ−ポリエチレングリコール−ポリカプロラクトンは、ミセル送達システム及びポリマーナノ粒子送達システムを調製するために使用される。
【００３２】
本発明のリポソーム送達システム、ミセル送達システム、ナノディスク送達システム又はポリマーナノ粒子送達システムは、脳腫瘍（脳転移及び原発性脳腫瘍を含む）又は他の脳疾患の病巣を追跡するために診断分子を封入するために使用され；送達システムに封入された診断分子は、５−カルボキシフルオレセイン５−ＦＡＭ又は近赤外色素Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＩＲ８２０、ＩＣＧ、ＤｉＲ、ＤｉＤ、ＤｉＩである。
【００３３】
本発明のナノ粒子送達システム、リポソーム送達システム、ミセル送達システム、ポリマーナノ粒子送達システム又はナノディスク送達システムは、脳腫瘍（脳転移及び原発性脳腫瘍を含む）又は他の脳疾患の病巣の標的介入のための抗腫瘍薬を封入するために使用され；封入された薬物は、ゲフィチニブ、イコチニブ、アンロチニブ、クリゾチニブ、エルロチニブ、オシメルチニブ、アレクチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、アドリアマイシン、エピルビシン、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、９−ニトロセルロースカンプトテシン、ビンクリスチン、ｐ５３活性化ペプチド又はポリペプチド毒である。
【００３４】
より具体的には、本発明は、以下の技術的解決策によって実現される：
１．ＳＰ修飾リポソーム送達システムの調製
ＳＰ含有システインスルフヒドリル及びマレイミド−ＰＥＧ−ＤＳＰＥは、リン酸緩衝液中ｐＨ７．４で反応させる。精製後、生成物を凍結乾燥して、後で使用するためにＳＰ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを調製する。
【００３５】
一定量の天然のリン脂質、コレステロール、メトキシ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ）を、ＳＰ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、モデル薬物又はプローブ分子と一緒に計量し、それらを溶媒に溶解させ、フィルムを形成させ、水和させ、リポソーム押出機によって膜を通過させ、カラムクロマトグラフィーによって遊離プローブ分子又は薬物を除去し、ＳＰポリペプチド修飾リポソームを調製する。その粒径及び表面電位は、動的光散乱粒径分析器によって特徴付けられる。或いは、一定量の天然のリン脂質、コレステロール、メトキシ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ）及びＳＰ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを計量し、溶媒に溶解させ、フィルムを形成させ、水和させ、リポソーム押出機によって膜を通過させ、プローブ分子又は薬物を能動的に封入し、カラムクロマトグラフィーによって遊離プローブ分子又は薬物を除去し、ＳＰポリペプチド修飾リポソームを調製する。その粒径及び表面電位は、動的光散乱粒径分析器によって特徴付けられる。
【００３６】
２．血漿と一緒にインキュベートしてタンパク質コロナを形成した後のＳＰ修飾送達システムの結合活性に対する影響の実験
ＳＰ修飾送達システムを新鮮な血漿としばらくの間インキュベートした後、ＬＲＰ−１受容体に対するその結合活性は、ウェスタンブロット及び放射性標識方法によって検出される。血清とインキュベートしないＳＰ修飾送達システム及び未修飾ＳＰ送達システムは、陰性対照として使用される。
【００３７】
３．血管内皮細胞系による送達システムの取り込みに対するＳＰ修飾の影響の実験
血管内皮細胞（ｂＥＮＤ．３細胞など）によるＳＰ修飾及び未修飾送達システムの取り込みを、血清インキュベーションの前後で比較する。
【００３８】
４．正常なマウスにおいてＢＢＢを通過するＳＰ修飾送達システムの能力の評価
正常なマウス（クンミン、Ｃ５７ＢＬ／６など）に、フルオレセイン担持送達システムを尾静脈から注射し、異なる時点でのマウス脳におけるＳＰ修飾及び未修飾送達システムの蓄積が比較される。
【００３９】
５．正常なラットにおけるＳＰ修飾送達システムの薬物動態評価
正常なＳＤラットに、フルオレセインＤｉＩ標識化ポリペプチド修飾及び未修飾送達システムを尾静脈から注射する。異なる時点で血液を回収し、血漿を分離し、血漿中のＤｉＩの含有量を蛍光によって定量的に検出して、ラットにおけるＳＰ修飾送達システムの薬物動態を評価する。
【００４０】
６．正常なマウスにおけるＳＰ修飾送達システムの免疫原性の評価
脂質Ａを含有するポリペプチド修飾及び未修飾送達システムを調製し、Ｂａｌｂ／ｃマウスに７日に１回４週間、腹腔内注射する。各注射後７日目に血液を眼窩から回収し、後で使用するために血漿を回収し凍結させる。ＥＬＩＳＡを使用して、異なる時点でマウスのＰＥＧ及びＳＰに対するＩｇＧ及びＩｇＭの含有量を検出し、免疫原性を評価する。
【００４１】
７．インビボでのＳＰ修飾送達システムの抗腫瘍効果の評価
ＳＰ修飾送達システム、未修飾ポリペプチド送達システム、遊離薬物及び通常の生理食塩水を、尾静脈を介して同所性Ｕ８７神経膠腫モデルを有するヌードマウスに注射することによって、インビボでのＳＰ修飾送達システムの抗腫瘍効果を、生存期間の中央値、腫瘍組織のアポトーシス及び血管新生密度を指標として評価する。
【００４２】
試験は、ＳＰ媒介薬物又は薬物送達システムが、ＬＲＰ−１発現が高い細胞及び組織を標的にし、生体膜バリアを通過する能力、特に血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する能力があり、脳腫瘍（脳転移及び原発性脳腫瘍を含む）及び他の疾患の標的診断及び治療に使用することができることを示す。
【００４３】
実験は、ＳＰが薬物送達システムの表面上に修飾され、血漿中のアポリポタンパク質と合わせてタンパク質コロナを形成し、血管内皮細胞の取り込みを増大させ；ＳＰが、血液脳関門を越えて薬物を媒介でき、及び／又は同時に腫瘍血管新生及び腫瘍細胞を標的にできることを示す。修飾された薬物及び薬物送達システムは、脳腫瘍（脳転移及び原発性脳腫瘍を含む）及び脳の他の疾患の治療においてより良い治療効果を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】インビトロでのＳＰ修飾リポソーム及び血漿タンパク質の結合同定を示す図である。ＳＰを化学的結合によってリポソームの表面上に修飾してＳＰ−ｓＬｉｐを得て、それをマウス血漿と混合し、３７℃で１時間インキュベートし、次いで高速で遠心分離して、タンパク質コロナを含有するリポソーム沈殿物を得た。Biorad社４％〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離後、リポソームによって吸着された血漿タンパク質成分を、急速な銀染色によって分析した（図１Ａに示すとおり）。メトキシポリエチレングリコール修飾長循環リポソーム（ｓＬｉｐ）と比較すると、４５ＫＤａ（バンド１）、３８ＫＤａ（バンド２）及び２５ＫＤａ（バンド３）におけるＳＰ−ｓＬｉｐによって吸着された血漿タンパク質のバンドは、著しく増加した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ及びウェスタンブロットの結果（図１Ｂに示すとおり）は、３か所の同じ位置に対応するＰＡＧＥ接着剤上で分析し、３つのタンパク質は、マウスからのＡｐｏＪ、ＡｐｏＥ及びＡｐｏＡ１として同定された。ウェスタンブロット半定量方法では、ＳＰ−ｓＬｉｐが、ｓＬｉｐよりも著しく多くの３種のアポリポタンパク質を吸着したことも確認した（図１Ｃ〜Ｅに示すとおり）。
【図２】インビボでの蛍光標識ｓＬｉｐ及びＳＰ−ｓＬｉｐによる血漿機能性アポリポタンパク質の吸着の同定を示す図である。標的の小ペプチドによって修飾されたリポソームが、動物への全身投与後も関連する標的タンパク質を吸着できることを実証するために、本発明者らは、同量のＤｉＩ蛍光標識リポソームをマウスに尾静脈から注射し、次いで１時間後に血液を採取して、血漿中のタンパク質コロナを含有するリポソームを分離した。図２Ａに示すとおり、ウェスタンブロットは、マウスで同じ含有量のリポソームによって吸着された３種のアポリポタンパク質（ＡｐｏＪ、ＡｐｏＥ及びＡｐｏＡ１）の含有量に有意差があったことを示した。この結果は、ＳＰ修飾リポソーム（ＳＰ−ｓＬｉｐ）が、通常のリポソームと比較してマウスの血漿タンパク質中のアポリポタンパク質を急速及び特異的に吸着し得ることを証明している。（図２Ｂ〜Ｄの半定量分析に示す通り）
【図３】血漿タンパク質の吸着後のｓＬｉｐ及びＳＰ−ｓＬｉｐとＬＲＰ−１受容体との結合活性の評価を示す図である。ＳＰ修飾リポソーム（ＳＰ−ｓＬｉｐ）自体は、溶液中の組換えタンパク質ＬＲＰ−１を特異的に吸着することができる（図３Ａに示すとおり）。本発明者らは、ウェスタンブロットによって、ＳＰ−ｓＬｉｐがＡｐｏＥとのプレインキュベーション後でもＬＲＰ−１と結合する能力を保持していることを確認した（図３Ｂ〜Ｃに示すとおり）。図３ＤＥは、ＥＬＩＳＡによって、遊離ＳＰ及び修飾されたリポソーム（ＳＰ−ｓＬｉｐ）の両方が、ＳＰと９６ウェルプレートに固定された抗体との相互作用に関して競合し得るが、ＳＰ−ｓＬｉｐは、血漿インキュベーション後に抗体結合に関して競合する能力を失うことが証明され、これは、リポソームの表面上のＳＰの機能ドメインが、ＡｐｏＥなどの血漿タンパク質と結合した後にブロックされたことを示していた。ＳＰ−ｓＬｉｐの表面に特異的に結合できる、ＡｐｏＥなどのアポリポタンパク質は、ＢＢＢ受容体ＬＲＰ−１に結合する活性を有しており、これは、ＳＰ−ｓＬｉｐを媒介して、ＢＢＢを越えて脳に入る効果的な方法になっている。
【図４】血漿インキュベーションの前後の血管内皮細胞によるリポソームの取り込みを示す図である。ＳＰ修飾リポソーム（ＳＰ−ｓＬｉｐ）を血漿とインキュベートして、タンパク質コロナを形成した後、内皮細胞によるＳＰ−ｓＬｉｐの取り込みは増加した（図４Ａ〜Ｂに示すとおり）。
【図５】マウスにおけるＳＰ修飾リポソームの薬物動態パラメーター及び免疫原性評価を示す図である。ＳＰをリポソームの表面上に修飾し（ＳＰ−ｓＬｉｐ）、これは、インビボでのリポソームの薬物動態パラメーターに影響を与えず（図５Ａに示すとおり）、一般的な長循環リポソームの免疫原性を増加させなかった（血中のＩｇＧ及びＩｇＭを評価指数とした、図５Ｂ〜Ｄに示すとおり）。
【図６】マウスにおけるＳＰ修飾リポソームの脳内侵入効率の評価を示す図である。マウス脳内のフルオレセインのインビボ検出を通して、ＳＰ−ｓＬｉｐ群のＢＢＢを通過する量が、ｓＬｉｐ群のものよりも著しく高いことがわかり、これはＳＰが、血液脳関門を越えて送達システムを媒介し得ることを示した。
【図７】インビボでのアドリアマイシン封入リポソームの抗神経膠腫効果を示す図である。生理食塩水群、ＤＯＸ群、ｓＬｉｐ／ＤＯＸ群及びＳＰ−ｓＬｉｐ／ＤＯＸ群のマウスの生存期間の中央値は、それぞれ２７日、３１日、３３日及び５０日であった。ＳＰ修飾リポソームは、脳同所性腫瘍モデルマウスの生存期間の中央値を大幅に延長し得る。
【図８】腫瘍組織の血管新生に対するアドリアマイシン封入リポソームの効果を示す図である。アドリアマイシンを封入したＳＰ修飾リポソーム（ＳＰ−ｓＬｉｐ／ＤＯＸ）群の腫瘍組織の血管密度は、未修飾群（ｓＬｉｐ／ＤＯＸ）のものよりも著しく低く、ＳＰが送達システムを媒介して腫瘍血管新生を標的にできることを示した。
【図９】神経膠腫細胞のアポトーシスに対するアドリアマイシン担持リポソームの効果を示す図である。アドリアマイシンを封入したＳＰ修飾リポソーム（ＳＰ−ｓＬｉｐ／ＤＯＸ）群の腫瘍組織におけるアポトーシスの数は、未修飾群のものよりも著しく高く、これは、ＳＰが腫瘍細胞を標的にする薬物送達システムを媒介できることを示した。
【図１０】安全性評価を示す図である。ＳＰは、インビトロで培養した神経細胞株ＰＣ１２に対して細胞毒性を示さず（図１０Ａに示すとおり）、アドリアマイシンを封入したＳＰ修飾リポソーム（ＳＰ−ｓＬｉｐ／ＤＯＸ）群のマウス臓器の組織切片に明らかな異常はなく（図１０Ｂに示すとおり）、それは、ＳＰ修飾がリポソーム表面に毒性及び副作用を引き起こさなかったことを示した。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明は、以下の具体な実施例によってさらに説明されるが、これらの実施例は、より詳細及び具体的な説明のためだけのものであるとして理解されるべきであり、いかなる形態においても本発明を限定するものとして理解されるべきではない。
【００４６】
本項では、本発明の試験で使用される材料及び試験方法の一般的な説明をもたらす。本発明の目的を達成するために使用される多くの材料及び操作方法は、当技術分野でよく知られているが、本発明は、ここで可能な限り詳細に説明される。当業者には、文脈の中で、特に指定のない限り、本発明で使用される材料および操作方法が当技術分野でよく知られていることは明らかである。
【実施例１】
【００４７】
リポソームの調製
リポソームｓＬｉｐ／ＤｉＩ及びＳＰ−ｓＬｉｐ／ＤｉＩの調製：
リポソームｓＬｉｐ／ＤｉＩの調製：リポソームを調製するための膜材料：天然のリン脂質（ＨＳＰＣ）：７．８５ｍｇ；コレステロール：３．３５ｍｇ；ｍＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ：２．７８ｍｇ；ＤｉＩ：０．４ｍｇを計量し、それらをＣＨＣｌ３  １０ｍＬに溶解させ、４０℃の水浴に懸濁させてフィルムを形成させ、真空乾燥して有機溶媒を除去し、フィルムを再蒸留水１ｍＬに溶解し、６０℃の水浴中で振盪及び水和させ、４００ｎｍ、２００ｎｍ及び１００ｎｍの孔でリポソーム押出機で押し出してｓＬｉｐ／ＤｉＩを得る。
【００４８】
リポソームＳＰ−ｓＬｉｐ／ＤｉＩの調製：Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ  ５０ｍｇを計量し、それを３７℃でＣＨＣｌ３  ５ｍＬに溶解させてフィルムを形成させ、３０分間真空乾燥させ、それを再蒸留水４ｍＬに溶解させ、３７℃で水和させ、超音波によって大きい粒子を取り出す。ＳＰ−Ｃｙｓタンパク質２６ｍｇを計量し、再蒸留水２ｍＬに溶解させ、上記膜材料の溶液と混合する。容器を再蒸留水１ｍＬで洗浄した後、混合物を混合し、ＥＤＴＡ溶液４０μＬ（５００ｍＭ、ｐＨ８．０）及びＰＢ溶液３ｍＬ（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）を加え、室温で撹拌して６時間反応させ、綿状沈殿がないようにする。蒸留水中の透析を４８時間〜７２時間、８０００〜１００００Ｄａの孔の透析膜を使用して行ない、得られた溶液の凍結乾燥生成物はＳＰ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥである。
【００４９】
リポソームを調製するための膜材料：ＨＳＰＣ：７．８５ｍｇ；コレステロール：３．３５ｍｇ；ｍＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ：１．６７ｍｇ；ＳＰ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ：１．８２ｍｇ； ＤｉＩ：０．４ｍｇを計量し、ＣＨＣｌ３  １０ｍＬに溶解させ、４０℃の水浴に懸濁させてフィルムを形成させ、真空乾燥して有機溶媒を除去し、フィルムを再蒸留水１ｍＬに溶解させ、６０℃の水浴中で振盪及び水和させ、４００ｎｍ、２００ｎｍ及び１００ｎｍの孔でリポソーム押出機で押し出してＳＰ−ＳＬＩＰ／ＤＩＩを得る。
【００５０】
リポソームｓＬｉｐ／ＤＯＸ及びＳＰ−ｓＬｉｐ／ＤＯＸの調製：
リポソームｓＬｉｐ／ＤＯＸの調製：リポソームを調製するための膜材料：ＨＳＰＣ：７．８５ｍｇ；コレステロール：３．３５ｍｇ；ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ：２．７８ｍｇを計量し、それらをＣＨＣｌ３  １０ｍＬに溶解させ、４０℃の水浴に懸濁させてフィルムを形成させ、真空乾燥して有機溶媒を除去し、硫酸アンモニウム溶液１ｍＬ（０．３２Ｍ）に溶解させ、６０℃の水浴中で振盪及び水和させ、４００ｎｍ、２００ｎｍ及び１００ｎｍの孔でリポソーム押出機で押し出し、硫酸アンモニウム溶液によって水和したｓＬｉｐを得る。Ｇ５０溶出カラムによって生理的食塩水溶媒と置き換えた後、アドリアマイシン水溶液を加え、混合し（薬物と脂質の比は１：１０）、コーティングされていないアドリアマイシンをＧ５０クロマトグラフィーカラムによって除去して、ｓＬｉｐ／ＤＯＸを得る。
【００５１】
リポソームＳＰ−ｓＬｉｐ／ＤＯＸの調製：リポソームを調製するための膜材料：ＨＳＰＣ：７．８５ｍｇ；コレステロール：３．３５ｍｇ；ｍＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ：１．６７ｍｇ；ＳＰ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ：１．８２ｍｇを計量し、他のステップは、上記（リポソームｓＬｉｐ／ＤＯＸの調製）と同じであり、ＳＰ−ｓＬｉｐ／ＤＯＸを得る。
【実施例２】
【００５２】
血清中でタンパク質コロナを形成した後のリポソームのＬＲＰ−１受容体との結合活性及び血管内皮細胞による取り込みへの影響
血清中でリポソームによって形成されたタンパク質コロナの特徴：
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血清（抗凝固薬としてプロテアーゼ阻害剤及びＥＤＴＡを含有）をリポソームと１：１の比で混合し、３７℃で１時間インキュベートし、１５０００ｒｐｍで３０分遠心分離し、冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ３０μＬに溶解させた。血清を陽性対照、ＰＢＳを陰性対照として用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ充填緩衝液６μＬ及びβ−メルカプトエタノール３μＬを加え、１０分間煮沸してタンパク質を変性させ、分子量の異なるタンパク質を４〜２０％ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、迅速な銀染色キットで着色させた。ＰＡＧＥ接着剤と対照の同じ位置で明らかに差異のあるバンド（赤い矢印が示すとおり）を切り取り、それらをトリプシンで消化し、０．１％ギ酸溶液に再懸濁した。各バンドのタンパク質成分をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析し、実験結果を図１に示す。
【００５３】
インビボ実験を以下のように実施した：蛍光ＤｉＩで標識した修飾及び未修飾リポソームを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに尾静脈から注射し、１時間後に血液を回収し、血漿を低速で遠心分離した。タンパク質コロナの分離方法は、上記インビトロ実験で説明したとおりであり、インビボで吸着したタンパク質コロナ成分を、図２に示すとおりにＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットによって同定した。
【００５４】
血清インキュベーションの前後のＳＰ−ｓＬｉｐとＬＲＰ−１受容体の結合活性：
ＥＬＩＳＡ方法を使用して、血清インキュベーションの前後のＳＰ−ｓＬｉｐとＳＰ抗体の間の結合活性を検出し、血漿タンパク質相互作用後のＳＰと受容体の間の活性な結合ドメインの変化を判断し、それに吸着されたアポリポタンパク質の活性を検出した。特異的な操作は、以下の通りであった：ＳＰ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ  ０．１μｇをＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加え、室温で終夜放置し、ＰＢＳで３回洗浄し、３％ＢＳＡと一緒に１時間密封し、ＢＳＡ溶液を吸引した。ＳＰ抗体を加え、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、前もって血清又はＰＢＳとインキュベートし勾配に希釈したリポソームを加え、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、対応するセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体を加え、１時間後にＴＭＢ発色溶液と３〜１５分間反応させ、反応を２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止させ、その吸光度値を４５０ｎｍ波長で測定した。実験結果を図３に示す。
【００５５】
血清中にタンパク質コロナを形成した後の血管内皮細胞による取り込みに対するＳＰ−ｓＬｉｐの効果：
血管内皮細胞ｂＥＮＤ３の蘇生：凍結したｂＥＮＤ３細胞を急速に解凍し、それらを培養液で充填済みの遠心分離管に移し、１０００ｒ／分で３分間遠心分離し、上清を廃棄し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培養液を加え、穏やかに均等に吹き、それらを培養皿に滴下し、均等に混合した。細胞の形態及び増殖を顕微鏡下で観察し、インキュベーター内３７℃、５％ＣＯ２及び９５％相対湿度で培養した。
【００５６】
血管内皮細胞ｂＥＮＤ３の培養：ｂＥＮＤ３細胞の増殖、すなわち細胞の数、形状及び付着を観察した。古い培養液を排出し、１０％ＦＢＳを含有する新鮮なＤＭＥＭ培養液を加え、均等に混合し、インキュベーター内３７℃、５％ＣＯ２及び飽和湿度で培養を続け、細胞の増殖を毎日観察し、２〜３日ごとに継代し、細胞は約１０日間対数増殖期に入り、それらをインビトロ細胞実験に使用することができた。
【００５７】
血管内皮細胞ｂＥＮＤ３の継代：培養液を排出し、ＰＢＳで２回洗浄し、０．２５％トリプシンを少量加え、インキュベーターに１分間入れ、次いで培養液２〜３ｍＬを加えて消化を停止させ、細胞懸濁液をいつかの遠心管に等量入れ、遠心分離し、上清を廃棄し、新しい培養液を加え、それを培養皿に移し、インキュベーターに入れて培養した。
【００５８】
血管内皮細胞ｂＥＮＤ３の凍結：細胞実験後、細胞を次の使用のために凍結し、凍結溶液（１０％ＤＭＳＯ及び９０％ウシ胎児血清を含有）を前もって調製し４℃で予冷した。細胞をトリプシンで消化し、予冷した凍結溶液を加え、スポイトで穏やかに吹き、混合した。細胞液１ｍＬを各凍結チューブに加え、密封後に凍結の名称及び日付を記し、−８０℃で終夜放置し、それを液体窒素タンクに保管し、記録に登録した。
【００５９】
適切な密度のＢＥＮＤ３を６ウェルプレートに播種し、細胞インキュベーターに入れ、終夜培養した。フルオレセインＤｉＩ標識リポソーム（血清インキュベートと血清非インキュベート）を、血清を含まないＤＭＥＭ培地で５０倍に希釈し、各ウェルに１ｍＬ加えて細胞と一緒に４時間インキュベートした。培養液を排出し、ＰＢＳで急速に２回洗浄し、細胞をトリプシンで消化し、血清含有培地で消化を停止させ、遠心分離し、ＰＢＳで再度洗浄した。最後に、細胞をＰＢＳ  ３００μＬ中に分散させ、陽性細胞の割合及びＤｉＩを担持したリポソームの蛍光強度（励起波長５５５ｎｍ、発光波長５７０ｎｍ）をフローサイトメトリーによって測定した。実験結果を図４に示す。
【００６０】
インビボでのリポソームの薬物動態パラメーター及び免疫原性に対するＳＰ修飾の効果：
各グループ３匹のＳＤラットに、ｓＬｉｐ／ＤｉＩ及びＳＰ−ｓＬｉｐ／ＤｉＩを尾静脈から注射した。注射の前、注射の５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間及び２４時間後に、それぞれ尾から血液を採取した（ＥＤＴＡ抗凝固）。上清を血液試料から分離し、血漿中のＤｉＩを正常なラット血清で段階的に希釈した。蛍光分光光度計を定量化のために使用し（励起波長５５５ｎｍ、発光波長５７０ｎｍ）、実験結果を図５ａに示す。脂質Ａを担持したｓＬｉｐ及びＳＰ−ｓＬｉｐを、７日に１回Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射し、後で使用するために各注射の７日後に血液を採取した。ＥＬＩＳＡを使用して、異なる時点でマウスで生成されたＰＥＧ及びＳＰに対するＩｇＧ及びＩｇＭの含有量を検出し、実験結果を図５ｂ〜ｃに示す。
【実施例３】
【００６１】
ＳＰ修飾リポソームはＢＢＢを渡ることができる
インビボ実験は、フルオレセインＤｉＩ標識ＳＰ修飾リポソーム（ＳＰ−ｓＬｉｐ／ＤｉＩ）が血液脳関門を通過できることを確認した：
蛍光標識ＳＰ−ｓＬｉｐ／ＤｉＩ（リン脂質含有量が１０ｍｇ／ｍＬ、ＤｉＩ含有量が０．４ｍｇ／ｍＬ）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに尾静脈から注射した（１０μＬ／ｇ）。１時間後、マウスをエーテルで麻酔にかけ、脳組織を取り出し、それを４％パラホルムアルデヒドで２４時間固定し、３０％スクロースで脱水し、ＯＣＴで包埋し、凍結し、切断した。核をＤＡＰＩによって染色し、血管をＣＤ３１抗体によって標識し、それを顕微鏡下で観察及び撮影し、フルオレセインＤｉＩ標識メトキシリポソームを対照として同じ手順で処理し、実験結果を図６に示す。
【実施例４】
【００６２】
インビボでのアドリアマイシン封入ＳＰ−ｓＬｉｐの薬力学的実験
同所性腫瘍モデルマウスの生存期間の中央値：
ヌードマウスにおける神経膠腫モデルの樹立：対数増殖期のＵ８７細胞を取り、細胞を消化及びカウントし、それらを適切な量のＰＢＳ緩衝液で懸濁し、６×１０５個の細胞（ＰＢＳ緩衝液５μＬに分散されている）を各ヌードマウスに播種した。実験前にヌードマウスを７％抱水クロラールで麻酔にかけ、脳定位装置で固定し、懸濁した細胞を線条体に播種した（すなわち大泉門の前方０．６ｍｍ、右１．８ｍｍ、深さ３ｍｍ）。手術後のヌードマウスの状態を定期的に観察した。
【００６３】
同所性脳腫瘍モデルのヌードマウスをランダムに４グループに分け（ｎ＝１３）、それらの体重を、それぞれ７、９、１１、１３、及び１５日目に記録した。生理食塩水２００μＬ、アドリアマイシン、ｓＬｉｐ／ＤＯＸ及びＳＰ−ｓＬｉｐ／ＤＯＸを、尾静脈に注射し、アドリアマイシンの単回注射用量は２ｍｇ／ｋｇであり、モデルヌードマウスの生存期間を記録した。実験の結果を図７に示す。
【００６４】
腫瘍細胞の血管形成及びアポトーシスに対するアドリアマイシンカプセル封入ＳＰ−ｓＬｉｐの阻害効果：
投与後１８日目に、同所性神経膠腫モデルマウスを、抱水クロラールで麻酔にかけ、脳組織を分離し、パラホルムアルデヒドで固定し、脱水し、パラフィンに包埋させた。ＣＤ３１抗体の免疫蛍光染色を使用して、血管新生に対する阻害効果を観察及び検出した。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ｄＵＴＰニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）を使用して腫瘍細胞のアポトーシス度を検出し、共焦点蛍光顕微鏡を使用して観察及び写真撮影をした。実験の結果を図８及び９に示す。
【００６５】
安全性評価：勾配濃度のＳＰを神経細胞株ＰＣ１２と共培養して、インビトロでその細胞毒性を評価した。同時に、同所性腫瘍の薬力学的試験におけるマウスの心臓、肝臓、脾臓、肺及び腎臓組織を解剖し、４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液で固定し、パラフィン包埋切片を作製し、ＨＥで染色し、顕微鏡下で観察及び撮影した。実験の結果を図１０に示す。
【００６６】
本発明はある程度まで記載されているが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく種々の条件を適切に変更できることは明らかである。本発明は、記載された実施形態に限定されないが、記載された各要素の同等の置換を含む、特許請求の範囲に属することを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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