(57)【要約】本発明は、サイトカイン変異タンパク質およびサイトカインプロドラッグ、ならびにこれらを製造し、使用するための方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカイン部分、マスキング部分、および担体部分を含むプロドラッグであって、
前記マスキング部分が、前記サイトカイン部分に結合し、前記サイトカイン部分の生物学的活性を阻害し、
前記サイトカイン部分が、前記担体部分に融合され、
前記マスキング部分が、前記サイトカイン部分または前記担体部分に切断可能なペプチドリンカーを介して融合され、ならびに
前記マスキング部分が、前記サイトカイン部分の受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含むものである、前記プロドラッグ。
【請求項２】
前記サイトカイン部分が、野生型ヒトサイトカインまたはその変異タンパク質である、請求項１に記載のプロドラッグ。
【請求項３】
前記サイトカイン部分が、ヒトＩＬ−２アゴニストポリペプチドである、請求項２に記載のプロドラッグ。
【請求項４】
前記ヒトＩＬ−２アゴニストポリペプチドが、配列番号１または配列番号１に対して少なくとも９０％同一性であるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のプロドラッグ。
【請求項５】
前記ヒトＩＬ−２アゴニストポリペプチドが、Ｔ３、Ｋ３５、Ｒ３８、Ｆ４２、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｅ６８、Ｌ７２、Ａ７３、Ｎ８８、Ｃ１２５、およびＱ１２６（配列番号１によるナンバリング）から選択される位置における１つまたはそれ以上の変異を含む、請求項４に記載のプロドラッグ。
【請求項６】
前記ヒトＩＬ−２アゴニストポリペプチドが、配列番号８〜１７、１９〜３３、３６、３７、および３９〜４６から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のプロドラッグ。
【請求項７】
前記マスキング部分が、ヒトＩＬ−２ＲβのＥＣＤまたはその機能的類似体を含む、請求項３〜６のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項８】
前記マスキング部分が、（ｉ）ペプチドリンカーを介して一緒に融合されたヒトＩＬ−２ＲβのＥＣＤまたはその機能的類似体の２コピー、あるいは（ｉｉ）ヒトＩＬ−２ＲγのＥＣＤまたはその機能的類似体にペプチドリンカーを介して融合されたヒトＩＬ−２ＲβのＥＣＤまたはその機能的類似体を含む、請求項７に記載のプロドラッグ。
【請求項９】
前記ヒトＩＬ−２ＲγのＥＣＤまたはその機能的類似体が、配列番号６または配列番号６に対して少なくとも９０％同一性であるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のプロドラッグ。
【請求項１０】
前記ヒトＩＬ−２ＲβのＥＣＤまたはその機能的類似体が、配列番号３、４または５、あるいは配列番号３、４または５に対して少なくとも９０％であるアミノ酸配列を含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項１１】
前記サイトカイン部分が、ヒトＩＬ−１５アゴニストポリペプチドである、請求項２に記載のプロドラッグ。
【請求項１２】
前記ヒトＩＬ−１５アゴニストポリペプチドが、配列番号２または配列番号２に対して少なくとも９０％同一性であるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のプロドラッグ。
【請求項１３】
前記ＩＬ−１５アゴニストポリペプチドが、（ｉ）配列番号７を含むＩＬ−１５Ｒαスシドメイン、または（ｉｉ）配列番号７に対して少なくとも９０％同一性であるアミノ酸配列を含む、請求項１１または１２に記載のプロドラッグ。
【請求項１４】
前記マスキングドメインが、ヒトＩＬ−２ＲβのＥＣＤまたはその機能的類似体、あるいはＩＬ−２Ｒγまたはその機能的類似体を含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項１５】
前記マスキングドメインが、配列番号３、４、５または６、あるいは配列番号３、４、５または６に対して少なくとも９０％同一性であるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のプロドラッグ。
【請求項１６】
第２のエフェクターポリペプチドをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項１７】
前記第２のエフェクターポリペプチドが、（ｉ）１２６位（配列番号１によるナンバリング）における変異を含むヒトＩＬ−２アゴニストポリペプチド、または（ｉｉ）配列番号１２３に対して少なくとも９０％同一性であるアミノ酸配列を含むＣＣＬ１９ポリペプチドである、請求項１６に記載のプロドラッグ。
【請求項１８】
前記サイトカイン部分が、非切断性ペプチドリンカーを介して前記担体部分に融合されている、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項１９】
前記非切断性ペプチドリンカーが、配列番号４７〜５１から選択される、請求項１８に記載のプロドラッグ。
【請求項２０】
前記切断可能なペプチドリンカーが、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、マトリックスメタロペプチダーゼ（ＭＭＰ）２、またはＭＭＰ９の基質配列を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項２１】
前記切断可能なペプチドリンカーが、（ｉ）ｕＰＡおよびＭＭＰ２の両方、（ｉｉ）ｕＰＡおよびＭＭＰ９の両方、または（ｉｉｉ）ｕＰＡ、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９の基質配列を含む、請求項２０に記載のプロドラッグ。
【請求項２２】
前記切断可能なペプチドリンカーが、配列番号１８、３４、３５、３８、５２〜１２１、および２１７から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載のプロドラッグ。
【請求項２３】
前記切断可能なペプチドリンカーが、腫瘍部位またはその周辺環境に局在する１つまたはそれ以上のプロテアーゼによって切断可能であり、前記切断が、前記腫瘍部位またはその周辺環境における前記プロドラッグの活性化を生じるものである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項２４】
前記担体部分が、ＰＥＧ分子、アルブミン、アルブミン断片、抗体Ｆｃドメイン、あるいは抗体またはその抗原結合断片である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項２５】
前記担体部分が、変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）（ＥＵナンバリング）を含む抗体Ｆｃドメインまたは抗体である、請求項２４に記載のプロドラッグ。
【請求項２６】
前記マスキング部分が、切断可能なペプチドリンカーを介して前記サイトカイン部分に融合されている、請求項２４または２５に記載のプロドラッグ。
【請求項２７】
前記担体部分が、ノブ−イントゥ−ホール変異を含む抗体Ｆｃドメインまたは抗体であり、前記サイトカイン部分および前記マスキング部分が、前記抗体Ｆｃドメインの異なるポリペプチド鎖に、または前記抗体の異なる重鎖に融合されている、請求項２４または２５に記載のプロドラッグ。
【請求項２８】
前記サイトカイン部分および前記マスキング部分が、前記Ｆｃドメインの２つの異なるポリペプチド鎖のＣ末端に、または前記抗体の２つの重鎖のＣ末端に融合されている、請求項２７に記載のプロドラッグ。
【請求項２９】
前記サイトカイン部分および前記マスキング部分が、前記Ｆｃドメインの２つの異なるポリペプチド鎖のＮ末端に、または前記抗体の２つの異なる重鎖のＮ末端に融合されている、請求項２７に記載のプロドラッグ。
【請求項３０】
前記ノブ−イントゥ−ホール変異が、前記Ｆｃドメインのポリペプチド鎖または前記抗体の重鎖におけるＴ３６６Ｙ「ノブ」変異、ならびに前記Ｆｃドメインのもう一方のポリペプチドまたは前記抗体のもう一方の重鎖におけるＹ４０７Ｔ「ホール」変異（ＥＵナンバリング）を含む、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項３１】
前記ノブ−イントゥ−ホール変異が、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＹ３４９Ｃおよび／またはＴ３６６Ｗ変異、ならびに「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、および／またはＹ４０７Ｖ変異（ＥＵナンバリング）を含む、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項３２】
前記担体部分が、配列番号１９５〜１９８から選択されるアミノ酸配列、ならびに配列番号１３２〜１３７および１３９から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含む、２つのポリペプチド鎖を含む、抗体Ｆｃドメインである、請求項２４に記載のプロドラッグ。
【請求項３３】
前記担体部分が、グアニルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）、糖鎖抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、糖タンパク質Ａ３３（ｇｐＡ３３）、ムチン１（ＭＵＣ１）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１−Ｒ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒト上皮増殖因子受容体３（ＨＥＲ３）、デルタ様タンパク質３（ＤＬＬ３）、デルタ様タンパク質４（ＤＬＬ４）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ｃ−ＭＥＴ、血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ネクチン−４、Ｌｉｖ−１、糖タンパク質ＮＭＢ（ＧＰＮＭＢ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔｒｏｐ−２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ９）、エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）、前立腺６回膜貫通型上皮抗原１（six transmembrane epithelial antigen of the prostate 1）（ＳＴＥＡＰ１）、葉酸受容体アルファ（ＦＲ−α）、ＳＬＩＴおよびＮＴＲＫ様タンパク質６（ＳＬＩＴＲＫ６）、炭酸脱水酵素ＶＩ（ＣＡ６）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３（ＥＮＰＰ３）、メソテリン、栄養膜（trophoblast）糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ３５２、ＣＤ４７、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）、ＰＤ１、クローディン１８．２、クローディン６、５Ｔ４、ＢＣＭＡ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰアルファ）、メラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、およびＥＰＣＡＭから選択される１つまたはそれ以上の抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項３４】
前記担体部分が、配列番号２０９および配列番号２１０〜２１５のうちの１つをそれぞれ含むアミノ酸配列の２つの重鎖、ならびに配列番号２１６を含むアミノ酸配列の２つの軽鎖を含む抗体である、請求項２４に記載のプロドラッグ。
【請求項３５】
前記担体部分が、配列番号１９１ならびに配列番号１９２、１９３および２０６〜２０８のうちの１つをそれぞれ含むアミノ酸配列の２つの重鎖、ならびに配列番号１８９を含むアミノ酸配列の２つの軽鎖を含む抗体である、請求項２４に記載のプロドラッグ。
【請求項３６】
前記担体部分が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である、請求項２４に記載のプロドラッグ。
【請求項３７】
Ａ７３位における変異を含む、ＩＬ−２変異タンパク質。
【請求項３８】
Ｋ３５Ｎ変異を含む、ＩＬ−２変異タンパク質。
【請求項３９】
配列番号２２〜３３、３６、３７および３９〜４１のうちの１つを含む、ＩＬ−２変異タンパク質。
【請求項４０】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載のプロドラッグまたは請求項３７〜３９のいずれか１項に記載のＩＬ−２変異タンパク質および医薬的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項４１】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載のプロドラッグまたは請求項３７〜３９のいずれか１項に記載のＩＬ−２変異タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項４２】
請求項４１に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項４３】
請求項４２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４４】
ｕＰＡ、ＭＭＰ２、および／またはＭＭＰ９をコードする前記遺伝子が、前記宿主細胞においてノックアウトされている、請求項４３に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載のプロドラッグまたは請求項３７〜３９のいずれか１項に記載のＩＬ−２変異タンパク質の製造方法であって、
請求項４３または４４に記載の宿主細胞を、前記プロドラッグまたはＩＬ−２変異タンパク質の発現を可能にする条件下で培養することであって、前記宿主細胞が哺乳類細胞であり、次いで
前記プロドラッグまたはＩＬ−２変異タンパク質を単離すること
を含む方法。
【請求項４６】
治療または活性化を必要とする患者において癌または感染症を治療するか、または免疫系を活性化するための方法であって、治療上有効な量の請求項４０に記載の医薬組成物を、前記患者に投与することを特徴とする方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法における癌または感染症の治療または免疫系の活性化に使用するためのサイトカインプロドラッグまたはＩＬ−２変異タンパク質。
【請求項４８】
請求項４６に記載の方法における癌または感染症の治療または免疫系の活性化のための薬剤を製造するためのプロドラッグまたはＩＬ−２変異タンパク質の使用。
【請求項４９】
前記患者が、ＨＩＶ感染、あるいは乳癌、肺癌、膵癌、食道癌、甲状腺髄様癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、精巣癌、大腸癌、および胃癌からなる群から選択される癌に罹っている、請求項４６に記載の方法、請求項４７に記載の使用のためのプロドラッグまたはＩＬ−２変異タンパク質、あるいは請求項４８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年３月９日提出の米国仮出願第６２／６４０，９６９号；２０１８年３月１４日提出の米国仮出願第６２／６４３，１０４号；２０１８年３月１７日提出の米国仮出願第６２／６４４，３８４号；２０１８年３月１８日提出の米国仮出願第６２／６４４、５７７号；２０１８年６月５日提出の米国仮出願第６２／６８０，７０７号；および２０１９年２月６日提出の米国仮出願第６２／８０１，６４９号からの優先権を主張する。前記先の出願の内容は、出典明示によりそれらの全体が本明細書に取り込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、リンパ球の産生、生存およびホメオスタシスにおいて中心的な役割を果たしている。これは、１３３個のアミノ酸を有し、その機能に必要な四次構造を形成する４つの逆平行の両親媒性アルファヘリックスからなる（Smith, Science 240:1169-76 (1988); Bazan, Science 257:410-13 (1992)）。
【０００３】
ＩＬ−２は、最大３つの各サブユニットからなるＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）に結合することによってその活性を生じる。α（ＣＤ２５またはＴａｃ抗原）、β（ＣＤ１２２）、およびγ（γｃ、共通のγ鎖、またはＣＤ１３２）サブユニットの結合は、三量体のＩＬ−２への高親和性受容体を生じる（ＫＤ〜０．０１ｎＭ）。βおよびγサブユニットからなる二量体ＩＬ−２受容体は、中間親和性ＩＬ−２Ｒが付与される（ＫＤ〜１ｎＭ）。αサブユニット単独では、単量体の低親和性ＩＬ−２受容体が形成される（ＫＤ〜１０ｎＭ）。例えば、Kim et al., Cytokine Growth Factor Rev. 17:349-66 (2006)を参照のこと。二量体の中間親和性ＩＬ−２受容体は、三量体の高親和性受容体より約１００倍低い親和性でＩＬ−２に結合するが、二量体および三量体ＩＬ−２受容体の両方とも、ＩＬ−２結合によるシグナルを伝達することができる（Minami et al., Annu Rev Immunol. 11:245-68 (1993)）。よって、αサブユニットは、ＩＬ−２に対する受容体の高親和性結合を有しているが、ＩＬ−２シグナル伝達に必要ではないかもしれない。しかしながら、βおよびγサブユニットは、ＩＬ−２シグナル伝達に必須である（Krieg et al., Proc Natl Acad Sci. 107:11906-11 (2010)）。この三量体ＩＬ−２受容体は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞で発現される。Ｔｒｅｇ細胞は、最も高いレベルのＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）をインビボで一貫して発現する（Fontenot et al., Nature Immunol 6:1142-51 (2005)）。前記三量体ＩＬ−２受容体はまた、従来の活性化Ｔ細胞で一時的に誘導される一方、静止期において、これらの細胞は二量体ＩＬ−２受容体のみを発現する。
【０００４】
目的に応じて、ＩＬ−２の変異タンパク質は、ＣＤ２５に対して亢進し、または低下した結合親和性を有するように作成された。ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒ複合体の公開された結晶構造に基づくと、前記変異は、ＣＤ２５に近接することが知られているＩＬ−２またはその近辺の領域に入れられることが多い（Wang et al., Science 310:1159-63 (2005)）。ＩＬ−２残基Ｋ３５、Ｒ３８、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｅ６１、Ｅ６２、Ｋ６４、Ｐ６５、Ｅ６８、Ｖ６９、Ｌ７２、およびＹ１０７は、ＣＤ２５に接触していると考えられている（米国特許第９，７３２，１３４号）。
【０００５】
ＩＬ−２治療の副作用を軽減するために、研究者らは、変異体ＩＬ−２をＣＤ２５に対するその結合親和性を減少させた。例えば、ＷＯ２００８／００３４４７３は、変異Ｒ３８ＷおよびＦ４２Ｋを記載し、ＷＯ２０１２／１０７４１７は、７２位における変異を記載する。米国特許公開第２００３／０１２４６７８号は、ＩＬ−２の血管透過活性を取り除くためにＲ３８Ｗ変異を導入することを記載する。Ｈｅａｔｏｎら（Cancer Res. 53:2597-602 (1993)；米国特許第５，２２９，１０９号）は、２つの変異Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋを導入して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から炎症促進性サイトカインの分泌を有する能力を減少させたＩＬ−２変異タンパク質を得ることを記載する。ＥＰ２６３９２４１Ｂ１は、Ｔｒｅｇ細胞の活性化において内在性ＩＬ−２より少なくとも１０００倍以下の有用性であるＩＬ−２変異タンパク質を記載し、１）Ｒ３８Ｋ、Ｆ４２Ｉ、Ｙ４５Ｎ、Ｅ６２Ｌ、およびＥ６８Ｖ；２）Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｉ、Ｙ４５Ｎ、Ｅ６２Ｌ、およびＥ６８Ｖ；３）Ｒ３８Ｋ、Ｆ４２Ｋ、Ｙ４５Ｒ、Ｅ６２Ｌ、およびＥ６８Ｖ；または４）Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＥ６２Ａから選択される変異を有するＩＬ−２変異タンパク質を記載する。米国特許公開第２０１４／０３２８７９１号は、ＣＤ２５に対して親和性が低下したペグ化ＩＬ−２を記載する。あるＩＬ−２変異タンパク質は、腫瘍抗原を標的とする抗体（例えば、ＣＥＡ、ＦＡＰ、およびＰＤ−Ｌ１など）に抱合されている。例えば、Klein et al., Oncoimmunology 6(3):e1277306 (2017)；Soerensen et al., J Clin Onc. 36:15_suppl (2018)；ＷＯ２０１７／２２０９８９；および米国特許第９，２０６，２６０号を参照のこと。
【０００６】
インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）は、ＩＬ−２に構造類似性を有するサイトカインである。ＩＬ−１５は、ＩＬ−２Ｒβγ受容体に結合し、これによりシグナル伝達し、ウイルス感染後に単核食細胞系および他の免疫細胞によって分泌される。ＩＬ−１５は、ＮＫおよび自然免疫系の他の細胞の増殖を誘導し、ウイルス感染細胞および癌細胞の死滅に関連する。
【０００７】
残念なことに、現在のＩＬ−２およびＩＬ−１５薬物候補の副作用は著しく、前記サイトカインの投薬量が制限される。さらに、Ｔ細胞および他の免疫細胞の活性化は部位特異的ではない。また、ＣＤ２５に対する親和性は顕著に減少しているが、ＩＬ−２変異タンパク質のＰＫシンカーが存在しうる。よって、免疫細胞を活性化し、有効性を有するが、減少した副作用を示す際に部位特異的である改善されたサイトカイン治療を開発する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、サイトカイン部分、マスキング部分、および担体部分を含むプロドラッグであって、前記マスキング部分が、前記サイトカイン部分に結合し、前記サイトカイン部分の生物学的活性を阻害し（例えば、サイトカイン部分が標的細胞におけるその受容体に結合することを阻害し、または前記サイトカイン部分の１つまたはそれ以上の生物学的活性を減少させる）、前記サイトカイン部分が、前記担体部分に融合され、前記マスキング部分が、切断可能なペプチドリンカーを介して前記サイトカイン部分または前記担体部分に融合されているプロドラッグを提供する。ある実施態様において、前記マスキング部分は、前記サイトカイン部分の受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。
【０００９】
ある実施態様において、前記サイトカイン部分は、野生型ヒトサイトカインまたはその変異タンパク質、例えば、ヒトＩＬ−２アゴニストポリペプチド、例えば、配列番号１または配列番号１に対して少なくとも９０％同一性であるアミノ酸配列を含むものである。ある実施態様において、前記ヒトＩＬ−２アゴニストポリペプチドには、Ｔ３、Ｋ３５、Ｒ３８、Ｆ４２、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｅ６８、Ｌ７２、Ａ７３、Ｎ８８、Ｃ１２５、およびＱ１２６（配列番号１によるナンバリング）から選択される位置における１つまたはそれ以上の変異が含まれる。特定の実施態様において、前記ヒトＩＬ−２アゴニストポリペプチドには、配列番号８〜１７、１９〜３３、３６、３７、および３９〜４６から選択されるアミノ酸配列が含まれる。
【００１０】
ある実施態様において、本発明のプロドラッグのマスキング部分は、ヒトＩＬ−２ＲβのＥＣＤまたはその機能的類似体を含む。さらなる実施態様において、前記マスキング部分には、（ｉ）ペプチドリンカーを介して一緒に融合されたヒトＩＬ−２ＲβのＥＣＤまたはその機能的類似体の２コピー、または（ｉｉ）ペプチドリンカーを介してヒトＩＬ−２ＲγのＥＣＤまたはその機能的類似体に融合されたＥＣＤヒトＩＬ−２Ｒβまたはその機能的類似体が含まれる。ある実施態様において、前記ヒトＩＬ−２ＲγのＥＣＤまたはその機能的類似体は、配列番号６または配列番号６に対して少なくとも９０％同一性であるアミノ酸配列を含む。特定の実施態様において、前記ヒトＩＬ−２ＲβのＥＣＤまたはその機能的類似体は、配列番号３、４、または５、あるいは配列番号３、４、または５に対して少なくとも９０％同一性であるアミノ酸配列を含む。
【００１１】
ある実施態様において、本発明のプロドラッグのサイトカイン部分は、ヒトＩＬ−１５アゴニストポリペプチドである。前記ヒトＩＬ−１５アゴニストポリペプチドには、配列番号２または配列番号２に対して少なくとも９０％同一性であるアミノ酸配列が含まれる。ある実施態様において、前記ＩＬ−１５アゴニストポリペプチドには、（ｉ）配列番号７を含むＩＬ−１５Ｒαスシドメインまたは（ｉｉ）配列番号７に対して少なくとも９０％同一性であるアミノ酸配列が含まれるか、またはさらに含まれる。特定の実施態様において、前記ＩＬ−１５マスキングドメインには、ヒトＩＬ−２Ｒβまたはその機能的類似体、あるいはヒトＩＬ−２ＲγのＥＣＤまたは機能的類似体が含まれる。ある実施態様において、前記ＩＬ−１５マスキングドメインには、配列番号３、４、５、または６、あるいは配列番号３、４、５、または６に対して少なくとも９０％同一性であるアミノ酸配列が含まれる
【００１２】
ある実施態様において、前記プロドラッグには、第２のエフェクターポリペプチド、例えば、（ｉ）１２６位（配列番号１によるナンバリング）における変異を含むヒトＩＬ−２アゴニストポリペプチド、または（ｉｉ）配列番号１２３に対して少なくとも９０％同一性であるアミノ酸配列を含むＣＣＬ１９ポリペプチドがさらに含まれる。
【００１３】
本発明のプロドラッグのある実施態様において、前記サイトカイン部分は、非切断性ペプチドリンカー（例えば、配列番号４７〜５１から選択されるもの）を介して前記担体部分に融合されている。
【００１４】
本発明のプロドラッグのある実施態様において、前記マスキング部分を直接または間接に（例えば、前記サイトカイン部分を介して）前記担体部分に結合している切断可能なペプチドリンカーには、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、マトリックスメタロペプチダーゼ（ＭＭＰ）２、またはＭＭＰ９の基質配列が含まれる。さらなる実施態様において、前記切断可能なペプチドリンカーには、（ｉ）ｕＰＡおよびＭＭＰ２の両方、（ｉｉ）ｕＰＡおよびＭＭＰ９の両方、または（ｉｉｉ）ｕＰＡ、ＭＭＰ２、およびＭＭＰ９の配列が含まれる。特定の実施態様において、前記切断可能なペプチドリンカーには、配列番号１８、３４、３５、３８、５２〜１２１、および２１７から選択されるアミノ酸配列が含まれる。ある実施態様において、前記切断可能なペプチドリンカーは、腫瘍部位またはその周辺環境に局在する１つまたはそれ以上のプロテアーゼによって切断可能であり、前記切断は、腫瘍部位またはその周辺環境における前記プロドラッグの活性化を生じる。
【００１５】
本発明のプロドラッグのある実施態様において、前記担体部分は、ＰＥＧ分子、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）またはその断片、抗体Ｆｃドメイン、あるいは抗体またはその抗原結合断片である。特定の実施態様において、前記担体部分は、変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）（ＥＵナンバリング）を含む抗体Ｆｃドメインまたは抗体である。特定の実施態様において、前記担体部分は、ノブ−イントゥ−ホール変異を含む抗体Ｆｃドメインまたは抗体であり、前記サイトカイン部分およびマスキング部分は、前記抗体Ｆｃドメイン異なるポリペプチド鎖または前記抗体の異なる重鎖に融合されている。ある実施態様において、前記サイトカイン部分およびマスキング部分は、前記Ｆｃドメインの２つの異なるポリペプチド鎖のＣ末端または前記抗体の２つの異なる重鎖のＣ末端に融合されている。他の実施態様において、前記サイトカイン部分およびマスキング部分は、前記Ｆｃドメインの２つの異なるポリペプチド鎖のＮ末端または前記抗体の２つの異なる重鎖のＮ末端に融合されている。ある実施態様において、前記ノブ−イントゥ−ホール変異は、前記Ｆｃドメインのポリペプチド鎖または前記抗体の重鎖においてＴ３６６Ｙ「ノブ」変異、ならびに前記Ｆｃドメインの他のポリペプチドまたは前記抗体（ＥＵナンバリング）の他の重鎖においてＹ４０７Ｔ「ホール」変異を含む。ある実施態様において、前記ノブ−イントゥ−ホール変異は、前記「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＹ３４９Ｃおよび／またはＴ３６６Ｗ変異、ならびに前記「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、および／またはＹ４０７Ｖ変異（ＥＵナンバリング）を含む。
【００１６】
特定の実施態様において、前記担体部分は、配列番号１９５〜１９８から選択されるアミノ酸配列および配列番号１３２〜１３７および１３９から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含む２つのポリペプチド鎖を含む抗体Ｆｃドメインである。 
【００１７】
ある実施態様において、前記担体部分は、グアニルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）、糖鎖抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、糖タンパク質Ａ３３（ｇｐＡ３３）、ムチン１（ＭＵＣ１）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１−Ｒ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒト上皮増殖因子受容体３（ＨＥＲ３）、デルタ様タンパク質３（ＤＬＬ３）、デルタ様タンパク質４（ＤＬＬ４）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ｃ−ＭＥＴ、血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ネクチン−４、Ｌｉｖ−１、糖タンパク質ＮＭＢ（ＧＰＮＭＢ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔｒｏｐ−２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ９）、エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）、前立腺６回膜貫通型上皮抗原１（six transmembrane epithelial antigen of the prostate 1）（ＳＴＥＡＰ１）、葉酸受容体アルファ（ＦＲ−α）、ＳＬＩＴおよびＮＴＲＫ様タンパク質６（ＳＬＩＴＲＫ６）、炭酸脱水酵素ＶＩ（ＣＡ６）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ/ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３（ＥＮＰＰ３）、メソテリン、栄養膜（trophoblast）糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ３５２、ＣＤ４７、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）、ＰＤ１、クローディン１８．２、クローディン６、５Ｔ４、ＢＣＭＡ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰアルファ）、（メラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）（ＭＣＳＰ）、およびＥＰＣＡＭから選択される１つまたはそれ以上の抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である。
【００１８】
特定の実施態様において、前記担体部分は、アミノ酸配列が、配列番号２０９、および配列番号２１０〜２１５のうちの１つをそれぞれ含む２つの重鎖、ならびにアミノ酸配列が、配列番号２１６を含む２つの軽鎖を含む、抗体である。ある実施態様において、前記担体部分は、アミノ酸配列が、配列番号１９１、ならびに配列番号１９２、１９３、および２０６〜２０８のうちの１つを含む２つの重鎖、ならびにアミノ酸配列が、配列番号１８９を含む２つの軽鎖を含む、抗体である。
【００１９】
別の態様において、本開示は、Ａ７３位における変異を含むＩＬ−２変異タンパク質、Ｋ３５Ｎ変異を含むＩＬ−２変異タンパク質、ならびに配列番号２３〜３３、３６、３７、および３９〜４１から選択されるアミノ酸配列を含むＩＬ−２変異タンパク質を提供する。新規のＩＬ−２変異タンパク質は、三量体ＩＬ−２受容体への結合の著しい減少を示しうる。
【００２０】
他の態様において、本開示は、本開示のプロドラッグまたはＩＬ−２変異タンパク質および医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物；前記プロドラッグまたはＩＬ−２変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター；ならびに前記ベクターを含む宿主細胞（前記宿主細胞は、原核細胞または真核細胞（例えば、哺乳類細胞など）であってもよい）を提供する。ある実施態様において、前記哺乳類宿主細胞は、ｕＰＡ、ＭＭＰ２、および／またはＭＭＰ９の遺伝子をノックアウトされている（例えば、これらの遺伝子のうちの１つまたはそれ以上のヌル変異を含む）。よって、本開示はまた、前記プロドラッグまたはＩＬ−２変異タンパク質の製造方法であって、前記宿主細胞を、前記プロドラッグまたはＩＬ−２変異タンパク質の発現を可能にする条件下で培養し（前記宿主細胞は、哺乳類細胞である）、次いで前記プロドラッグまたはＩＬ−２変異タンパク質を単離することを含む方法を提供する。
【００２１】
本開示はまた、癌または感染症を治療するか、または活性化を必要とする患者（例えば、ヒト患者）における免疫系を活性化する方法であって、本開示のプロドラッグ、ＩＬ−２変異タンパク質、または医薬組成物の治療上有効な量を前記患者に投与することを特徴とする方法を提供する。前記患者は、例えば、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ感染）、あるいは乳癌、肺癌、膵癌、食道癌、甲状腺髄様癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、精巣癌、大腸癌、および胃癌からなる群から選択される癌に罹っていてもよい。本発明の方法における癌または感染症の治療、あるいは免疫系の活性化において使用するためのサイトカインプロドラッグまたはＩＬ−２変異タンパク質；本発明の方法における癌または感染症を治療するための薬剤または免疫系を活性化するための薬剤の製造のためのプロドラッグまたはＩＬ−２変異タンパク質の使用；ならびに本発明のプロドラッグまたはＩＬ−２変異タンパク質の１回またはそれ以上の投薬単位を含む製品（例えば、キット）もまた、本明細書で提供される。
【００２２】
本発明の他の特徴、対象、および利点は、下記の詳細な説明において明白である。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施態様および態様を示しているが、一例に過ぎず、限定するものではないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の様々な変更と改良が詳細な説明から当業者によって明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、担体タンパク質に融合された変異体ＩＬ−２ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２】図２Ａ〜Ｃは、担体タンパク質に融合されたＩＬ−２変異タンパク質のＣＴＬＬ２に基づく生物学的活性アッセイの結果を示す。図２Ａは、融合タンパク質を記載した表である。図２Ｂは、ＩＬ−２変異タンパク質／Ｆｃ融合タンパク質の結果を示す。図２Ｃは、ＩＬ−２変異タンパク質／ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合タンパク質の結果を示す。
【図３】図３は、抗体に基づくＩＬ−２またはＩＬ−１５プロドラッグを示す模式図。ＩＬ−２またはＩＬ−１５アゴニストポリペプチドは、前記担体抗体の重鎖の１つのＣ末端に、適宜、非切断性ペプチドリンカーを介して融合されている。ＩＬ−２またはＩＬ−１５アンタゴニストポリペプチド（マスキング部分、例えば、ＩＬ−２Ｒβ細胞外ドメイン）は、前記担体抗体のもう一方の重鎖のＣ末端に、切断可能なペプチドリンカーを介して融合されている。
【図４】図４は、ＨＥＫ２９３細胞で発現された５８９Ａ−ＩＬ−２プロドラッグのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。５８９Ａは、ウサギＢ細胞クローニングに由来するクローディン１８．２に対するヒト化抗体である。プロドラッグ試料は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。「活性化」試料は、プロテアーゼで処理されたものであった。前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、非還元条件下で流動した。
【図５】図５は、抗体５８９Ａおよびプロドラッグ５８９Ａ−ＩＬ−２ＥのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を示す。
【図６】図６は、ＣＴＬＬ２に基づく活性化アッセイを用いた５８９Ａ−ＩＬ−２プロドラッグの活性化を示す。ＪＲ１．５５．１：５８９Ａ−ＩＬ−２Ｅ。ＪＲ１．５５．２：５８９−ＩＬ−２Ｆ。ＭＴ：マトリプターゼ（プロテアーゼ）。
【図７】図７ＡおよびＢは、５８９Ａ−ＩＬ−２Ｅ（ＪＲ１．７４．１）プロドラッグの活性化を示す。図７Ａは、ＦＡＣＳ分析によって測定されるように、５８９Ａ−ＩＬ−２Ｅおよびその活性化型（＋ＭＴ）のＨＥＫ２９３細胞（ＩＬ−２ＲαβγまたはＩＬ−２Ｒβγを発現する）への結合を示す。ＭＦＩ：平均蛍光強度。図７Ｂは、１１μｇ／ｍｌのプロドラッグでの全体の結合レベルを示す。
【図８】図８は、ＣＴＬＬ２に基づく活性化アッセイを用いたαＰＤ−Ｌ１−ＩＬ−２Ｂプロドラッグの活性化を示す。ＭＴ：マトリプターゼ。
【図９】図９は、抗体５８９Ａ、高まったＡＤＣＣ機能性を有する５８９Ａ、およびＩＬ−２に融合された高まったＡＤＣＣ機能を有する５８９Ａの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能の分析を示す。
【図１０】図１０は、各マウスにおける腫瘍体積により測定されるように、プロドラッグ５８９Ａ−ＩＬ−２Ｅのインビボ抗癌効果を示す。テセントリク（登録商標）：抗ＰＤ−Ｌ１抗体のアテゾリズマブ。
【図１１】図１１は、各マウスにおける腫瘍体積により測定されるように、プロドラッグ５８９Ａ−ＩＬ−２Ｅのインビボ抗癌効果を示す。これは、図１０に示される実験と同一であった。
【図１２】図１２は、生存率により測定されるように、プロドラッグ５８９Ａ−ＩＬ−２Ｅのインビボ抗癌効果を示す。これは、図１０に示される実験と同一であった。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の詳細な説明
本明細書および特許請求の範囲で用いられるように、単数形「ａ」、「ｏｒ」、および「ｔｈｅ」には、特に文脈から明らかでない限り、複数の対象が含まれる。本明細書の「約」値またはパラメータの対象は、値またはパラメータ自体に対する変動の度合いを含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」についての記載は、「Ｘ」の記載を含む。さらに、一連の数字の前の「約」の使用は、これらの一連の記載された数字の各々の「約」を含む。例えば、「約Ｘ、Ｙ、またはＺ」を示す記載は、「約Ｘ、約Ｙ、または約Ｚ」を記載することが意図される。
【００２５】
用語「抗原結合部分」は、抗原に特異的に結合するポリペプチドまたは相互作用するポリペプチドの一組を意味し、下記に限定されないが、抗体（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体、二重特異性もしくは二特異性抗体、抗イディオタイプ抗体、または二機能性ハイブリッド抗体）またはその抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィドで結合したＦｖ、ｓｃＦｖ、シングルドメイン抗体（ｄＡｂ）、または二特異性抗体）、単鎖抗体、およびＦｃ含有ポリペプチド（例えば、イムノアドヘシン）が含まれる。ある実施態様において、前記抗体には、重鎖アイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ）またはサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のいずれのものも含まれる。ある実施態様において、前記抗体は、軽鎖アイソタイプ（例えば、カッパまたはラムダ）のいずれであってもよい。前記抗体は、ヒト、非ヒト（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、または別の非ヒト動物に由来）、キメラ（例えば、非ヒト可変領域およびヒト定常領域を有する）、またはヒト化（例えば、非ヒトＣＤＲおよびヒトフレームワークおよび定常領域を有する）であってもよい。ある実施態様において、前記抗体は、誘導体化された抗体である。
【００２６】
用語「サイトカインアゴニストポリペプチド」は、野生型サイトカインまたはその類似体を意味する。野生型サイトカインの類似体は、野生型サイトカインと同一の生物学的特異性（例えば、同一の受容体に結合し、同一の標的細胞を活性化する）を有するが、類似体の活性レベルは、野生型サイトカインのものと異なっていてもよい。前記類似体は、例えば、野生型サイトカインの変異タンパク質（すなわち、変異が入ったポリペプチド）であってもよく、野生型サイトカインに対して少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個の変異を含んでいてもよい。
【００２７】
用語「サイトカインアンタゴニスト」または「サイトカインマスク」は、サイトカインに結合し、それにより前記サイトカインが標的細胞の表面上のその受容体に結合し、および／またはそのアンタゴニストまたはマスクに結合しつつその生物学的機能を生じることを阻害する部分（例えば、ポリペプチド）を意味する。サイトカインアンタゴニストまたはマスクの例として、以下に限定されないが、そのサイトカインに接触するサイトカインの天然の受容体の細胞外ドメインに由来するポリペプチドが含まれる。
【００２８】
用語「有効な量」または「治療上有効な量」は、特定の障害、病気、または疾患を治療するために、例えば、１つまたはそれ以上のその症状を軽減し、緩和し、減少させ、および／または遅延させるために十分な化合物または組成物の量を意味する。癌などの疾患に関して、有効な量は、癌の発症または進行を遅延させ（例えば、腫瘍増殖速度を減少させ、および／または癌細胞の末梢器官への腫瘍血管形成、転移、または浸潤を遅延させ、または予防し）、類上皮細胞数を減少し、癌の退縮を引き起こし（例えば、腫瘍を収縮し、または根絶させ）、ならびに／あるいは癌の発症または再発を予防し、または遅延させるために十分な量でありうる。有効な量は、１回またはそれ以上の投与で投与することができる。
【００２９】
用語「機能的類似体」は、対象の分子と同一の生物学的特異性（例えば、同一リガンドへの結合）および／または活性（例えば、標的細胞の活性化または阻害）を有する分子を意味する。
【００３０】
２つのポリペプチド配列に関する用語「融合される」または「融合」は、骨格ペプチド結合による２つのポリペプチド配列の結合を意味する。２つのポリペプチドは、直接、あるいは１個またはそれ以上のアミノ酸の長さであるペプチドリンカーを介して融合されていてもよい。融合ポリペプチドは、２つの融合パートナーの各コーディング配列を、その間にペプチドリンカーのコーディング配列を有するか、または有さずに含むコーディング配列から組み換え技術によって作成されうる。ある実施態様において、融合には、化学的抱合が含まれる。
【００３１】
用語「医薬的に許容される賦形剤」は、組成物中の成分を意味するために用いられる場合、賦形剤が、その対象に過剰で有害な副作用なく、有効活性成分（ＡＰＩ）の生物学的活性に影響を及ぼすことなく、治療対象（ヒト対象を含む）への投与に適することを意味する。
【００３２】
用語「対象」は、哺乳類を意味し、以下に限定されないが、ヒト、ペット（例えば、イヌまたはネコ）、家畜（例えば、ウシまたはウマ）、齧歯類、または霊長類が含まれる。
【００３３】
本明細書で用いられるように、「治療」または「治療する」は、利益的または所望の臨床結果を得るための方法である。利益的または所望の臨床結果には、以下に限定されないが、下記のうちの１つまたはそれ以上が含まれる：疾患から生じる１つまたはそれ以上の症状を軽減し、疾患の程度を減少させ、疾患状態を改善し、疾患を安定にし（例えば、疾患の悪化または進行を抑制し、または遅延させ）、疾患の広がり（例えば、転移）を抑制し、または遅延させ、疾患の再発を抑制し、または遅延させ、疾患の部分的または全体の寛解を供し、疾患を治療するために必要とされる１つまたはそれ以上の他の医薬の用量を減少させ、患者の生活の質を向上させ、ならびに／あるいは生存率を高めること。本開示の方法には、これらの治療態様のうちのいずれか１つまたはそれ以上が含まれる。
【００３４】
本明細書に記載の様々な実施態様の特徴の１つ、いくつか、または全ては、本発明の他の実施態様を形成するために組み合わされてもよいことが理解されるべきである。本明細書で用いられる表題は、構成上のためのもののみであって、下記に記載される事項を限定するものと解釈されるべきではない。
【００３５】
サイトカインプロドラッグ
本開示は、インビボで代謝されて活性なサイトカイン治療薬になるサイトカインプロドラッグを提供する。前記サイトカインプロドラッグは、少ない副作用、優れたインビボＰＫプロファイル（例えば、長期間の半減期）および優れた標的特異性、ならびに以前のサイトカイン治療薬と比較してより高い有効性を有する。本発明のプロドラッグには、担体部分に結合され、サイトカインアンタゴニスト（マスキング部分）によってマスクされた（結合された）サイトカインアゴニストポリペプチド（サイトカイン部分）が含まれる。前記サイトカインアンタゴニストは、例えば、サイトカインの受容体の細胞外ドメインであってもよく、切断可能なリンカー（例えば、切断可能なペプチドリンカー）を介してサイトカイン部分または担体部分に結合されている。前記マスクは、サイトカイン部分に結合しつつその生物学的機能を阻害する。前記プロドラッグは、リンカーが切断し、その結果、サイトカインのマスクがプロドラッグから放出され、それまでマスクされていたサイトカイン部分が曝露され、そのサイトカイン部分を標的細胞上のその受容体への結合を可能にし、標的細胞におけるその生物学的機能を生じることによって患者における標的部位（例えば、腫瘍部位またはその周辺環境）で活性化されうる。ある実施態様において、プロドラッグの担体は、標的部位における抗原に結合する抗体などの抗原結合部分である。
【００３６】
ある実施態様において、本発明のプロドラッグは、担体による標的である体内における標的部位で代謝されて炎症促進性サイトカインとなる炎症促進性サイトカインプロドラッグである。さらなる実施態様において、前記プロドラッグにおける担体は、プロドラッグが患者の腫瘍部位に送達され、サイトカインマスクを担体またはサイトカイン部分に結合させているリンカーの切断により局所（例えば、腫瘍微小環境の内部または近辺）で代謝され、炎症促進性サイトカイン部分を、標的細胞上のその受容体との相互作用に利用できるようにし、標的の免疫細胞を局所的に活性化するような、腫瘍抗原を標的とする抗体である。
【００３７】
下記の記載は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５プロドラッグを例示するが、他のサイトカイン（特に、強力な免疫調節因子であり、強い副作用を有するサイトカイン）のためのプロドラッグもまた、本開示に包含される。これらの他のサイトカインプロドラッグは、ＩＬ−２およびＩＬ−１５プロドラッグについて下記に例示されるものと同一の原理により作成されうる。
【００３８】
Ａ．プロドラッグのサイトカイン部分
ある実施態様において、本発明のプロドラッグには、炎症促進性サイトカインアゴニストポリペプチド、例えば、ＩＬ−２アゴニストポリペプチドまたはＩＬ−１５アゴニストポリペプチドが含まれる。
【００３９】
１．ＩＬ−２アゴニストポリペプチド
ＩＬ−２プロドラッグには、ＩＬ−２アゴニストポリペプチド（サイトカイン部分）、担体（担体部分）、およびＩＬ−２アンタゴニスト（マスキング部分）が含まれうるものであって、前記ＩＬ−２アゴニストポリペプチドは、前記担体に、直接またはリンカー（例えば、切断可能なまたは非切断性ペプチドリンカー）を介して融合され、前記ＩＬ−２アンタゴニストは、前記ＩＬ−２アゴニストポリペプチドまたは前記担体に、切断可能なペプチドリンカーを介して結合されている。本発明のＩＬ−２プロドラッグにおいて、前記ＩＬ−２アゴニストポリペプチドは、野生型ＩＬ−２ポリペプチド、例えば、野生型ヒトＩＬ−２ポリペプチド（配列番号１）、またはＩＬ−２変異タンパク質、例えば、ヒトＩＬ−２に由来するＩＬ−２変異タンパク質であってもよい。前記ＩＬ−２変異タンパク質は、野生型ＩＬ−２と比較して、ＣＤ２５または三量体高親和性ＩＬ−２Ｒに対して顕著に減少した親和性を有しうる。ある実施態様において、ＩＬ−２変異タンパク質は、野生型ＩＬ−２と比較して１００倍、３００倍、５００倍、１，０００倍、または１０，０００倍低い、高親和性ＩＬ−２Ｒに対する結合親和性を有する。特に示されていない限り、本明細書に記載のＩＬ−２およびＩＬ−２変異タンパク質における全ての残基番号は、配列番号１のナンバリングに従うものである。
【００４０】
１の態様において、本開示は、ＩＬ−２プロドラッグにおけるＩＬ−２アゴニストポリペプチドとして用いることができる新規のＩＬ−２変異タンパク質を提供する。新規のＩＬ−２変異タンパク質は、Ａ７３における変異（例えば、Ｔまたは別のアミノ酸残基に対する変異）および／またはＫ３５Ｎ変異を含む。Ａ７３は、ＣＤ２５と相互作用するアミノ酸残基の１つとしてこれまで同定されていない。それゆえ、本発明者らは、この位置における変異の導入（例えば、Ａ７３Ｔ）が、変異Ｒ３８Ｓ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｅ６２Ａを有するＩＬ−２変異タンパク質または変異Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｌ７２Ｇを有するＩＬ−２変異タンパク質の結合親和性と同様に、三量体ＩＬ−２受容体に対するＩＬ−２変異タンパク質の顕著に減少した結合親和性を生じうることに驚いた（下記実施例１を参照のこと）。理論に拘束されることなく、本発明者らは、Ａ７３およびＫ３５がＩＬ−２において可能性のある糖鎖付加部位があり、これらの糖鎖付加部位の変異がＩＬ−２Ｒに対するＩＬ−２変異タンパク質の親和性を調節するものと考える。前記新規の変異タンパク質は、より安全性の高い臨床プロファイルを有し、ＩＬ−２活性を必要とする患者、例えば、活性化された免疫系を必要とする患者（例えば、癌患者およびＡＩＤＳ患者）で用いることができる。新規のＩＬ−２変異タンパク質は、独立した存在として、または（例えば、本発明のプロドラッグにおいて、例えば、担体に融合された）抱合体において用いることができる。
【００４１】
ある実施態様において、本開示の新規のＩＬ−２変異タンパク質は、Ａ７３における変異（例えば、Ａ７３Ｔ）、ならびにＴ３、Ｄ２０、Ｋ３５、Ｒ３８、Ｆ４２、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｅ６８、Ｌ７２、Ｎ８８、Ｎ９０、Ｃ１２５、およびＱ１２６から選択される位置における１つまたはそれ以上の変異を含みうる。ある実施態様において、新規のＩＬ−２変異タンパク質は、Ｒ３８、Ｆ４２、Ｙ４５、およびＡ７３における変異を含む。
【００４２】
ある実施態様において、本発明の新規のＩＬ−２変異タンパク質は、Ｋ３５Ｎ変異、ならびにＴ３、Ｄ２０、Ｒ３８、Ｆ４２、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｅ６８、Ｌ７２、Ａ７３、Ｎ８８、Ｎ９０、Ｃ１２５、およびＱ１２６から選択される位置における１つまたはそれ以上の変異を含みうる。ある実施態様において、新規のＩＬ−２変異タンパク質は、Ａ７３における変異を伴い、または伴わず、変異Ｋ３５Ｎ、ならびにＲ３８、Ｆ４２、およびＹ４５におけるさらなる変異を含む。
【００４３】
ある実施態様において、ＩＬ−２プロドラッグのＩＬ−２アゴニストポリペプチドは、Ｋ３５、Ｒ３８、Ｆ４２、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｅ６８、Ｌ７２、およびＡ７３における１つまたはそれ以上の変異を含みうる。ある実施態様において、前記ＩＬ−２アゴニストポリペプチドは、Ｄ２０、Ｎ８８、Ｎ９０、およびＱ１２６における１つまたはそれ以上の変異をさらに含む。Ｔ３および／またはＣ１２５におけるさらなる変異もまた含まれてもよい。特定の実施態様において、前記ＩＬ−２アゴニストポリペプチドは、配列番号８〜１７、１９〜３３、３６、３７、および３９〜４６から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４４】
ある実施態様において、ＩＬ−２アゴニスト活性の基準レベルを確実にするために、本発明のＩＬ−２プロドラッグは、野生型ＩＬ−２と比較して、二量体中間親和性ＩＬ−２受容体に対して顕著に減少した親和性を生じる変異を含む、第２のＩＬ−２アゴニストポリペプチドをさらに含みうる。例えば、変異Ｔ３Ａ／Ｒ３８Ｓ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｅ６２Ａ／Ｃ１２５Ｓ／Ｑ１２６Ｗ（配列番号３０）を、リンカー（配列番号１３０）またはリンカーなし（配列番号１２９）で有するＩＬ−２変異タンパク質は、ＩＬ−２活性の低いが検出可能なレベルを示す（下記実施例１を参照のこと）。
【００４５】
２．ＩＬ−１５アゴニストポリペプチド
本開示のＩＬ−１５プロドラッグにおいて、前記ＩＬ−１５アゴニストポリペプチドは、野生型ＩＬ−１５ポリペプチド、例えば、野生型ヒトＩＬ−１５ポリペプチド（配列番号２）、あるいは野生型ＩＬ−１５と比較してＩＬ−１５ＲαまたはＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２）に対して減少した親和性を有するＩＬ−１５変異タンパク質、例えば、ヒト野生型ＩＬ−１５に由来するＩＬ−１５変異タンパク質であってもよい。
【００４６】
Ｂ．プロドラッグのマスキング部分
前記サイトカインアンタゴニスト、すなわち、本発明のプロドラッグのマスキング部分は、前記プロドラッグにおけるサイトカイン部分に結合し、前記サイトカイン部分をマスクし、その生物学的機能を阻害するペプチドまたは抗体もしくは抗体断片を含みうる。
【００４７】
一例として、ＩＬ−２およびＩＬ−１５アンタゴニストは、ＩＬ−２またはＩＬ−１５に結合し、ＩＬ−２またはＩＬ−１５部分のその受容体への結合を妨害し、マスクされているが、ＩＬ−２またはＩＬ−１５部分の生物学的活性の減少を生じるペプチドおよび抗体を含みうる。ある実施態様において、前記ＩＬ−２アンタゴニストは、ＩＬ−２ＲβまたはＩＬ−２Ｒγ細胞外ドメインあるいはその機能的類似体（例えば、ヒトＩＬ−２ＲβまたはＩＬ−２Ｒγに由来するもの（例えば、配列番号３〜６のうちの１つ））を含む。ある実施態様において、前記ＩＬ−２アンタゴニストは、ペプチドライブラリーのスクリーニングから同定されたペプチドを含む。ある実施態様において、前記ＩＬ−２アンタゴニストは、ＩＬ−２またはＩＬ−２変異タンパク質のＩＬ−２受容体への結合を阻害する抗体またはその断片を含む。特定の実施態様において、前記ＩＬ−２アンタゴニストは、米国特許第４，４１１，９９３号に開示されるハイブリドーマクローン４Ｅ１２Ｂ２Ｄ１０、４Ｅ１２Ｂ２、および４Ｅ１２から選択される抗体と同一のＣＤＲ配列を有するｓｃＦｖ、Ｆａｂ、または単鎖Ｆａｂを含む。
【００４８】
ヒトＩＬ−２は、ＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２）に比較的低い親和性（ＫＤ〜３μＭ）で結合し、これは、中間親和性受容体ＩＬ−２Ｒβγに対するＩＬ−２の結合親和性より１，０００倍以上弱い（Johnson et al., Eur Cytokine Netw. 5(1):23-34 (1994)）。よって、本発明者らは、ＩＬ−２Ｒβの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）がＩＬ−２変異タンパク質アゴニストポリペプチドと同一の担体分子に融合された場合、ＩＬ−２変異タンパク質アゴニストポリペプチドの細胞に基づく活性が顕著に阻害されることに驚いた（下記実施例４を参照）。
【００４９】
ＩＬ−１５プロドラッグについて、前記マスキング部分は、ＩＬ−２ＲβまたはＩＬ−２Ｒγの細胞外ドメインあるいはその機能的類似体（例えば、配列番号３〜６のうちの１つ）であってもよい。
【００５０】
Ｃ．プロドラッグの担体部分
本発明のプロドラッグの担体部分は、抗原結合部分、または抗原結合部分ではない部分であってもよい。前記担体部分は、サイトカインアゴニストポリペプチドの血清半減期などのＰＫプロファイルを改善させ、体内の標的部位（例えば、腫瘍部位）に対してサイトカインアゴニストポリペプチドの標的としうる。
【００５１】
１．抗原結合担体部位
前記担体部分は、抗体またはその抗原結合断片、またはイムノアドヘシンであってもよい。ある実施態様において、前記抗原結合部位は、２つの重鎖および２つの軽鎖を有する全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ジスルフィド結合Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体、ナノボディ、または単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。ある実施態様において、前記抗原結合部分は、二特異性抗原結合部分であり、２つの異なる抗原または同一抗原上の２つの異なるエピトープに結合することができる。前記抗原結合部分は、さらに強力な相乗的な治療効果を前記サイトカインアゴニストポリペプチドに供しうる。
【００５２】
前記サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）アゴニストポリペプチドおよびそのマスクは、抗原結合部分の軽鎖および／または重鎖のＮ末端またはＣ末端に融合されうる。一例として、前記サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）アゴニストポリペプチドおよびそのマスクは、抗体重鎖またはその抗原結合断片あるいは抗体軽鎖またはその抗原結合断片に融合されうる。ある実施態様において、前記サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）アゴニストポリペプチドは、抗体の重鎖の１つまたは両方のＣ末端に融合され、前記サイトカインのマスクは、サイトカインアゴニストポリペプチドのもう一方の末端に切断可能なペプチドリンカーを介して融合される。ある実施態様において、前記サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）アゴニストポリペプチドは、抗体の重鎖の１つのＣ末端に融合され、前記サイトカインのマスクは、前記抗体のもう一方の重鎖のＣ末端に切断可能なペプチドリンカーを介して融合され、前記２つの重鎖は、２つの異なる重鎖の特異的な対を形成可能にする変異を含む。
【００５３】
ヘテロダイマーを形成するための手法は周知である（例えば、Spies et al., Mol Imm. 67(2)(A):95-106 (2015)を参照のこと）。例えば、プロドラッグにおける２つの重鎖ポリペプチドは、安定なヘテロダイマーを「ノブ−イントゥ−ホール（knobs-into-holes）」変異により形成していてもよい。「ノブ−イントゥ−ホール」変異は、抗体重鎖のヘテロダイマーの形成を容易にするために入れられ、一般に、二特異性抗体を作成するために用いられる（例えば、米国特許第８，６４２，７４５号を参照のこと）。例えば、前記抗体のＦｃドメインは、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｗ変異、ならびに「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、および／またはＹ４０７Ｖ変異を含みうる。さらなるＣＨ３ドメイン間の鎖間ジスルフィド架橋はまた、例えば、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ変異および「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＥ３５６ＣまたはＳ３５４Ｃ変異を導入することによって用いることができる（例えば、Merchant et al., Nature Biotech 16:677-81 (1998)を参照のこと）。他の実施態様において、前記抗体部分は、前記２つのＣＨ３ドメインのうちの１つにおけるＹ３４９Ｃおよび／またはＴ３６６Ｗ変異、ならびにもう一方のＣＨ３ドメインにおけるＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、および／またはＹ４０７Ｖ変異を含みうる。ある実施態様において、前記抗体部分は、前記２つのＣＨ３ドメインのうちの１つにおけるＹ３４９Ｃおよび／またはＴ３６６Ｗ変異、ならびにもう一方のＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ（またはＥ３５６Ｃ）、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、および／またはＹ４０７Ｖ変異を、１つのＣＨ３ドメインにおけるさらなるＹ３４９Ｃ変異およびもう一方のＣＨ３ドメインにおけるさらなるＥ３５６ＣまたはＳ３５４Ｃ変異を含み、鎖間ジスルフィド架橋を形成していてもよい（ナンバリングは常にカバットのＥＵインデックスに従う；カバット；Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）。他のノブ−イントゥ−ホール技術（例えば、ＥＰ１８７０４５９Ａ１に開示のもの）を代わりに、または加えて用いることができる。よって、抗体部分に対するノブ−イントゥ−ホール変異の別の例は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＲ４０９Ｄ／Ｋ３７０Ｅ変異および「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＤ３９９Ｋ／Ｅ３５７Ｋ変異を有することである（ＥＵナンバリング）。
【００５４】
ある実施態様において、前記プロドラッグにおける抗体部分は、そのＦｃドメインにＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）変異を含む。前記ＬＡＬＡ変異は、補体結合および固定ならびにＦｃγ依存性ＡＤＣＣを排除する（例えば、Hezareh et al. J. Virol. 75(24):12161-8 (2001)を参照のこと）。さらなる実施態様において、前記ＬＡＬＡ変異は、ノブ−イントゥ−ホール変異に加えて抗体部分に存在する。
【００５５】
ある実施態様において、前記抗体部分は、ＦｃドメインにおけるＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（「ＹＴＥ」）変異を含む。前記ＹＴＥ変異は、ＩＧＧ１の血清半減期、組織分布、および活性の同時調節を可能にする（Dall'Acqua et al., J Biol Chem. 281: 23514-24 (2006)；およびRobbie et al., Antimicrob Agents Chemother. 57(12):6147-53 (2013)を参照のこと）。さらなる実施態様において、前記ＹＴＥ変異は、ノブ−イントゥ−ホール変異に加えて抗体部分に存在する。特定の実施態様において、前記抗体部分は、ＹＴＥ、ＬＡＬＡ、およびノブ−イントゥ−ホール変異、またはこれらのいずれかの組み合わせを有する。
【００５６】
前記抗原結合部分は、細胞（例えば、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびマクロファージ）の表面における抗原に結合してもよく、あるいはサイトカインに結合してもよい。例えば、前記抗原結合部分は、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４、またはＴＧＦ−ベータに結合してもよく、抗体であってもよい。前記抗体は、免疫細胞を活性化し、その抗癌活性を高める能力を有しうる。
【００５７】
前記抗原結合部分は、腫瘍細胞の表面における抗原に結合しうる。例えば、前記抗原結合部分は、ＦＡＰアルファ、５Ｔ４、Ｔｒｏｐ−２、ＰＤ−Ｌ１、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、クローディン１８．２、ＤＬＬ−３、ＧＣＰ３、または癌胎児抗原（ＣＥＡ）に結合してもよく、抗体であってもよい。前記抗体は、ＡＤＣＣ活性を有していてもよく、あるいは有していなくてもよい。前記抗体はまた、細胞毒性薬にさらに抱合されていてもよい。
【００５８】
ある実施態様において、前記抗原結合部分は、グアニルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）、糖鎖抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、糖タンパク質Ａ３３（ｇｐＡ３３）、ムチン１（ＭＵＣ１）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１−Ｒ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒト上皮増殖因子受容体３（ＨＥＲ３）、デルタ様タンパク質３（ＤＬＬ３）、デルタ様タンパク質４（ＤＬＬ４）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ｃ−ＭＥＴ、血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ネクチン−４、Ｌｉｖ−１、糖タンパク質ＮＭＢ（ＧＰＮＭＢ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔｒｏｐ−２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ９）、エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）、前立腺６回膜貫通型上皮抗原１（six transmembrane epithelial antigen of the prostate 1）（ＳＴＥＡＰ１）、葉酸受容体アルファ（ＦＲ−α）、ＳＬＩＴおよびＮＴＲＫ様タンパク質６（ＳＬＩＴＲＫ６）、炭酸脱水酵素ＶＩ（ＣＡ６）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３（ＥＮＰＰ３）、メソテリン、栄養膜（trophoblast）糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ３５２、ＣＤ４７、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）、クローディン１８．２、クローディン６、ＢＣＭＡ、またはＥＰＣＡＭに結合する。ある実施態様において、前記抗原結合部分は、ＤＬＬ３の上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメインに結合する。ある実施態様において、前記抗原結合部分は、ＤＬＬ３のデルタ／セレート／Ｌａｇ２（ＤＳＬ）様ドメインに結合する。ある実施態様において、前記抗原結合部分は、ＧＰＣ３の３７４番目のアミノ酸の後に位置するエピトープに結合する。ある実施態様において、前記抗原結合部分は、ＧＰＣＣ３のヘパラン硫酸グリカン（heparin sulfate glycan）に結合する。ある実施態様において、前記抗原結合部分は、クローディン１８．２に結合し、クローディン１８．１に結合しない。ある実施態様において、前記抗原結合部分は、クローディン１８．１に、クローディン１８．２より少なくとも１０倍弱い結合親和性で結合する。
【００５９】
典型的な抗原結合部分には、トラスツズマブ、リツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ＧＣ３３（またはこれらのヒト化型）、抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６（またはそのヒト化型）、抗ｄＰＮＡＧ抗体Ｆ５９８、およびこれらの抗原結合断片が含まれる。ある実施態様において、前記抗原結合部分は、トラスツズマブ、リツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、またはパニツムマブ、ＧＣ３３（またはそのヒト化型）、抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６（またはそのヒト化型）、抗ｄＰＮＡＧ抗体Ｆ５９８、またはこれらの断片に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有する。ある実施態様において、前記抗原結合部分は、トラスツズマブ、リツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ＧＣ３３（またはそのヒト化型）、抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６（またはそのヒト化型）、抗ｄＰＮＡＧ抗体Ｆ５９８、またはこれらの断片の抗体重鎖に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有する抗体重鎖を有する。ある実施態様において、前記抗原結合部分は、トラスツズマブ、リツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ＧＣ３３（またはそのヒト化型）、抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６（またはそのヒト化型）、抗ｄＰＮＡＧ抗体Ｆ５９８、またはこれららの断片の抗体軽鎖に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有する抗体軽鎖を有する。前記抗原結合部分は、ＩＬ−２アゴニストポリペプチドに融合されている。ある実施態様において、前記抗原結合部分は、トラスツズマブ、リツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ＧＣ３３、抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６、または抗ｄＰＮＡＧ抗体Ｆ５９８の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００６０】
多くのＣＤＲ描写は、当該技術分野で公知であり、本明細書に含まれる。当業者は、重鎖または軽鎖可変領域の配列に基づいて所定の描写のためのＣＤＲを容易に決定することができる。「カバット」ＣＤＲは、配列可変性に基づくものであり、最も一般的に用いられている（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）。「Ｃｈｏｔｈｉａ」ＣＤＲは、構造ループの位置を示す（Chothia & Lesk, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins, J. Mol. Biol., vol. 196, pp. 901-917 (1987)）。「ＡｂＭ」ＣＤＲは、カバットＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループとの間の中間的な方法を示し、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって用いられる。「コンタクト」ＣＤＲは、利用可能な複雑な結晶構造の解析に基づくものである。これらのＣＤＲの各々に由来する残基を、一般的な抗体ナンバリングスキームを参照にして下記の表１に示す。特に本明細書で特定されていない限り、抗体のアミノ酸番号は、カバット、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、またはコンタクトスキームに関してなされている場合を含み、上記のカバットらに記載のカバットナンバリングスキームを意味する。このナンバリングシステムを用いて、実際の線状のアミノ酸配列は、可変ドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）またはＣＤＲの短縮または前記領域またはＣＤＲへの挿入に相当する少ないか、またはさらなるアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、Ｈ２の残基５２の後の単一のアミノ酸挿入（カバットによる残基５２）および重鎖ＦＲ残基８２の後の挿入された残基（例えば、カバットによる残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）が含まれてもよい。残基のカバットナンバリングは、「標準的な」カバットでナンバリングした配列を有する抗体配列の相同性領域のアラインメントによって所定の抗体について調べられうる。
表１．様々なスキームによるＣＤＲ描写
【表１】
2021515599.tif 000002
【００６１】
ある実施態様において、前記ＣＤＲは「伸長ＣＤＲ」であり、異なるスキームにより開始し、または終結する領域を包含する。例えば、伸長ＣＤＲは、下記のとおりでありうる：Ｌ２４〜Ｌ３６、Ｌ２６〜Ｌ３４、またはＬ２６〜Ｌ３６（ＶＬ−ＣＤＲ１）；Ｌ４６〜Ｌ５２、Ｌ４６〜Ｌ５６、またはＬ５０〜Ｌ５５（ＶＬ−ＣＤＲ２）；Ｌ９１〜Ｌ９７（ＶＬ−ＣＤＲ３）；Ｈ４７〜Ｈ５５、Ｈ４７〜Ｈ６５、Ｈ５０〜Ｈ５５、Ｈ５３〜Ｈ５８、またはＨ５３〜Ｈ６５（ＶＨ−ＣＤＲ２）；および／またはＨ９３〜Ｈ１０２（ＶＨ−ＣＤＲ３）。
【００６２】
ある実施態様において、前記抗原結合部分は、ＨＥＲ２に結合し、配列番号１４８に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖、あるいはこれらの断片、ならびに配列番号１４９に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖、あるいはこれらの断片を含む。ある実施態様において、前記抗原結合ドメインは、配列番号１４８からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号１４９からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
【００６３】
ある実施態様において、前記抗原結合部分は、ＣＤ２０に結合し、配列番号１５０に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖、あるいはこれらの断片、ならびに配列番号１５１に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖、あるいはこれらの断片を含む。ある実施態様において、前記抗原結合ドメインは、配列番号１５０からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号１５１からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
【００６４】
ある実施態様において、前記抗原結合部分は、ＣＤ３０に結合し、配列番号１５２に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖、あるいはこれらの断片、ならびに配列番号１５３に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖、あるいはこれらの断片を含む。ある実施態様において、前記抗原結合ドメインは、配列番号１５２からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号１５３からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
【００６５】
ある実施態様において、前記抗原結合部分は、ＥＧＦＲに結合し、配列番号１５４に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖、あるいはこれらの断片、ならびに配列番号１５５に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖、あるいはこれらの断片を含む。ある実施態様において、前記抗原結合ドメインは、配列番号１５４からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号１５５からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
【００６６】
ある実施態様において、前記抗原結合部分は、ＥＧＦＲに結合し、配列番号１５６に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖、あるいはこれらの断片、ならびに配列番号１５７に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖、あるいはこれらの断片を含む。ある実施態様において、前記抗原結合ドメインは、配列番号１５６からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号１５７からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
【００６７】
ある実施態様において、前記抗原結合部分は、ｃ−ＭＥＴに結合し、配列番号１５８に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖、あるいはこれらの断片、ならびに配列番号１５９に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖、あるいはこれらの断片を含む。ある実施態様において、前記抗原結合ドメインは、配列番号１５８からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号１５９からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
【００６８】
ある実施態様において、前記抗原結合部分は、ＧＰＣ３に結合し、配列番号１６０に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖、あるいはこれらの断片、ならびに配列番号１６１に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖、あるいはこれらの断片を含む。ある実施態様において、前記抗原結合ドメインは、配列番号１６０からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号１６１からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
【００６９】
ある実施態様において、前記抗原結合部分は、クローディン１８．２に結合し、配列番号１６２に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖、あるいはこれらの断片、ならびに配列番号１６３に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖、あるいはこれらの断片を含む。ある実施態様において、前記抗原結合ドメインは、配列番号１６２からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号１６３からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
【００７０】
ある実施態様において、前記抗原結合部分は、ＦＡＰアルファに結合し、配列番号１８０に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖、あるいはこれらの断片、ならびに配列番号１８２に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖、あるいはこれらの断片を含む。ある実施態様において、前記抗原結合ドメインは、配列番号１８０または１８１からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号１８２からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。ある実施態様において、前記抗原結合部分は、ＦＡＰアルファに結合し、配列番号１８３に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、あるいはこれらの断片、ならびに配列番号１８４に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、あるいはこれらの断片を含む。ある実施態様において、前記抗原結合ドメインは、配列番号１８３からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号１８４からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。特定の実施態様において、前記ヒト化ＦＡＰ抗体は、配列番号１８０または１８１で示される軽鎖アミノ酸配列および配列番号１８２で示される重鎖アミノ酸配列を含む。
【００７１】
ある実施態様において、前記抗原結合部分は、癌胎児抗原（ＣＥＡ）に結合し、抗体ＰＲ１Ａ３（米国特許第８，６４２，７４２号）に由来していてもよい。抗ＣＥＡ抗体は、配列番号１７８に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖、あるいはこれらの断片、ならびに配列番号１７９に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖、あるいはこれらの断片を含む。ある実施態様において、前記抗原結合ドメインは、配列番号１７６からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号１７７からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。ある実施態様において、前記ＰＲ１Ａ３抗体は、配列番号１７８で示される軽鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号１７９で示される重鎖可変領域アミノ酸配列を含むヒト化抗体である。
【００７２】
ある実施態様において、前記抗原結合部分は、ＰＤＬ１に結合し、配列番号１８９に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖、あるいはこれらの断片、ならびに配列番号１９０に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖、あるいはこれらの断片を含む。ある実施態様において、前記抗原結合ドメインは、配列番号１８９からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号１９０からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
【００７３】
ある実施態様において、前記抗原結合部分は、５Ｔ４に結合し、配列番号１８７または１８８に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、あるいはこれらの断片、ならびに配列番号１８５または１８６に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、あるいはこれらの断片を含む。ある実施態様において、前記抗原結合ドメインは、配列番号１８７または１８８からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号１８５または１８６からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
【００７４】
ある実施態様において、前記抗原結合部分は、Ｔｒｏｐ−２に結合し、ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ（配列番号１６４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号１６５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、およびＱＱＨＹＩＴＰＬＴ（配列番号１６６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；ならびにＮＹＧＭＮ（配列番号１６７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ（配列番号１６８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、およびＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ（配列番号１６９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。
【００７５】
ある実施態様において、前記抗原結合部分は、メソテリンに結合し、ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号１７０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号１７１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、およびＱＱＷＳＧＹＰＬＴ（配列番号１７２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；ならびにＧＹＴＭＮ（配列番号１７３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧ（配列番号１７４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、およびＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹ（配列番号１７５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。
【００７６】
ある実施態様において、前記抗原結合部分は、１つ、２つ、または３つの抗原結合ドメインを含む。例えば、前記抗原結合部分は、二特異性であり、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、５Ｔ４、ＦＡＰアルファ、Ｔｒｏｐ−２、ＧＰＣ３、ＶＥＧＦＲ２、クローディン１８．２、およびＰＤ−Ｌ１からなる群から選択される２つの異なる抗原に結合する。ある実施態様において、前記二特異性抗原結合部分は、ＨＥＲ２の２つの異なるエピトープに結合する。
【００７７】
２．他の担体部分
他の非抗原結合担体部分が本発明のプロドラッグのために用いられてもよい。例えば、抗体Ｆｃドメイン（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ）、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、アルブミン（例えば、ヒトアルブミン）、またはこれれらの断片、あるいはナノ粒子が用いられうる。
【００７８】
一例として、前記サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）アゴニストポリペプチドおよびそのアンタゴニストは、抗体Ｆｃドメインに融合されて、Ｆｃ融合タンパク質を形成していてもよい。ある実施態様において、前記サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）アゴニストポリペプチドは、前記Ｆｃドメインポリペプチド鎖の１つのＣ末端またはＮ末端に、（直接またはペプチドリンカーを介して）融合され、前記サイトカインマスクは、もう一方のＦｃドメインポリペプチド鎖のＣ末端またはＮ末端に、切断可能なペプチドリンカーを介して融合されており、前記２つのＦｃドメインポリペプチド鎖は、２つの異なるＦｃ鎖の特異的な対を可能にする変異を含有する。ある実施態様において、前記Ｆｃドメインは、上記に記載のホール−イントゥ−ホール変異を含む。さらなる実施態様において、前記Ｆｃドメインはまた、上記に記載のＹＴＥおよび／またはＬＡＬＡ変異を含んでいてもよい。
【００７９】
前記プロドラッグの担体部分は、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）またはその断片を含みうる。アルブミンの典型的な配列が配列番号１２４に示される。ある実施態様において、前記アルブミンまたはアルブミン断片は、ヒト血清アルブミンまたはその断片に対して約８５％またはそれ以上、約９０％またはそれ以上、約９１％またはそれ以上、約９２％またはそれ以上、約９３％またはそれ以上、約９４％またはそれ以上、約９５％またはそれ以上、約９６％またはそれ以上、約９７％またはそれ以上、約９８％またはそれ以上、約９９％またはそれ以上、約９９．５％またはそれ以上、あるいは約９９．８％またはそれ以上の同一性である。
【００８０】
ある実施態様において、前記担体部分は、約１０またはそれ以上、２０またはそれ以上、３０またはそれ以上、４０またはそれ以上、５０またはそれ以上、６０またはそれ以上、７０またはそれ以上、８０またはそれ以上、９０またはそれ以上、１００またはそれ以上、１２０またはそれ以上、１４０またはそれ以上、１６０またはそれ以上、１８０またはそれ以上、２００またはそれ以上、２５０またはそれ以上、３００またはそれ以上、３５０またはそれ以上、４００またはそれ以上、４５０またはそれ以上、５００またはそれ以上、あるいは５５０またはそれ以上のアミノ酸長であるアルブミン断片（例えば、ヒト血清アルブミン断片）を含む。ある実施態様において、前記アルブミン断片は、約１０アミノ酸〜約５８４アミノ酸長（例えば、約１０〜約２０、約２０〜約４０、約４０〜約８０、約８０〜約１６０、約１６０〜約２５０、約２５０〜約３５０、約３５０〜約４５０、または約４５０〜約５５０アミノ酸長など）である。ある実施態様において、前記アルブミン断片は、Ｓｕｄｌｏｗ Ｉドメインまたはその断片、あるいはＳｕｄｌｏｗ ＩＩドメインまたはその断片を含む。
【００８１】
Ｄ．プロドラッグのリンカー構成
前記サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）アゴニストポリペプチドは、前記担体部分に、ペプチドリンカーとともに、またはペプチドリンカーなしで融合されていてもよい。前記ペプチドリンカーは、切断されなくてもよい。ある実施態様において、前記ペプチドリンカーは、配列番号４７〜５１から選択される。特定の実施態様において、前記ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４９）を含む。
【００８２】
前記サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）マスクは、前記サイトカイン部分または前記担体に切断可能なリンカーを介して融合されていてもよい。前記切断可能なリンカーは、１つまたはそれ以上（例えば、２つまたは３つ）の切断可能な部分（ＣＭ）を含有しうる。各ＣＭは、レグマイン、プラスミン、ＴＭＰＲＳＳ−３／４、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＴ１−ＭＭＰ、カテプシン、カスパーゼ、ヒト好中球エラスターゼ、βセクレターゼ、ｕＰＡ、およびＰＳＡから選択される酵素またはプロテアーゼの基質であってもよい。切断可能なリンカーの例として、以下に限定されないが、配列番号１８、３４、３５、３８、５２〜１２１、および２１７から選択されるアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
【００８３】
サイトカインアゴニストポリペプチド、サイトカインマスク、担体、ペプチドリンカー、およびプロドラッグの具体的な非限定的な例は、下記の配列項目で示されている。さらに、本開示のプロドラッグおよび新規のＩＬ−２変異タンパク質は、周知の組み換え技術によって作成されうる。例えば、前記プロドラッグのポリペプチド鎖のためのコーディング配列を含む１つ以上の発現ベクターが哺乳類の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）にトランスフェクトされてもよく、前記細胞は、前記コーディング配列の発現および前記発現されたポリペプチドのプロドラッグ複合体への構築を可能にする条件下で培養される。前記プロドラッグが不活性状態を保つために、ｕＰＡ、ＭＭＰ２、および／またはＭＭＰ９を発現しないか、またはほとんど発現しない宿主細胞が用いられうる。ある実施態様において、前記宿主細胞は、これらのプロテアーゼの遺伝子のヌル変異（ノックアウト）を含有しうる。
【００８４】
医薬組成物
本開示のプロドラッグおよび変異タンパク質（すなわち、有効医薬成分またはＡＰＩ）を含む医薬組成物は、望ましい精製度を有するＡＰＩを、１つまたはそれ以上の任意の医薬的に許容される賦形剤（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition., Osol, A. Ed. (1980)を参照のこと）と凍結乾燥製剤または水溶液の形態で混合することによって調製されうる。医薬的に許容される賦形剤（または担体）は、一般に、用いられる用量と濃度においてレシピエントに非毒性であり、下記に限定されないが：例えば、リン酸、クエン酸、コハク酸、ヒスチジン、酢酸、あるいは別の無機酸もしくは有機酸またはこれらの塩を含む緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基以下）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリデン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；単糖、二糖、および他の糖（ショ糖、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎタンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【００８５】
緩衝液は、特に、安定性がｐＨ依存的である場合、ｐＨを、治療有効性を最適にする範囲に調整するために用いられる。緩衝液は、好ましくは、約５０ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲の濃度で存在する。本発明で用いるのに適当な緩衝剤として、有機酸および無機酸の両方ならびにこれらの塩、例えば、クエン酸、リン酸、コハク酸、酒石酸、フマル酸、グルコン酸、シュウ酸、乳酸、および酢酸が挙げられる。さらに、緩衝液は、ヒスチジンおよびトリメチルアミン塩、例えば、Ｔｒｉｓを含んでいてもよい。
【００８６】
保存剤は、微生物の増殖を防止するために加えられ、典型的に、０．２％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。本発明で用いられるのに適する保存剤として、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；ベンザルコニウムハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、塩化ベンゼトニウム；チメロサール、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾールが挙げられる。
【００８７】
等張化剤（「安定化剤」としても知られる）は、組成物中の液体の浸透圧を調整し、または維持するために存在する。大きな荷電性生体分子（例えば、タンパク質および抗体）とともに用いられる場合、それらは、アミノ酸側鎖の荷電された基と相互作用し、それにより分子内および分子間の相互作用の電位を低下させることができるため、「安定化剤」と呼ばれることもある。等張化剤は、他の成分との相対的な量を考慮して、０．１重量％〜２５重量％、またはより好ましくは、１重量％〜５重量％の量のいずれかで存在することができる。好ましい等張化剤として、多価糖アルコール（polyhydric sugar alcohols）、好ましくは、三価またはそれ以上の糖アルコール、例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトールが挙げられる。
【００８８】
非イオン性界面活性剤または洗浄剤（「湿潤剤」としても公知）は、治療剤を可溶化することを補助し、攪拌によって引き起こされる治療タンパク質の凝集を防ぎ、製剤が活性な治療タンパク質または抗体の変性を生じることなくせん断（shear）表面ストレスに曝露されるために存在する。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在する。
【００８９】
適する非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート（２０、４０、６０、６５、８０など）、ポロクサマー（polyoxamers）（１８４、１８８など）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０など）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０、および６０、グリセロールモノステアレート、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースが含まれる。用いることができる陰イオン洗浄剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、およびスルホン酸ジオクチルナトリウムが含まれる。陽イオン洗浄剤には、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムが含まれる。
【００９０】
医薬担体、賦形剤、または希釈剤の選択は、目的とする投与経路および標準的な医療行為について選択されうる。医薬組成物は、いずれかの適当な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、または可溶化剤をさらに含んでいてもよい。
【００９１】
異なる送達系に応じて異なる組成物／製剤の要件が存在しうる。一例として、本発明に有用な医薬組成物は、ミニポンプを用いて、または粘膜経路により、例えば、吸入または摂取可能な溶液の鼻腔用スプレーまたはエアロゾルとして、あるいは組成物が、例えば、静脈内、筋肉内、または皮下経路による送達のための注射可能な形態により製剤化されている非経口で投与されるために製剤化されてもよい。
【００９２】
ある実施態様において、本開示の医薬組成物は、凍結乾燥されたタンパク質製剤である。他の実施態様において、前記医薬組成物は、水性液体製剤であってもよい。
【００９３】
治療方法
前記サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）プロドラッグは、前記抗原結合ドメインによって結合している抗原により、疾患を治療するために用いることができる。ある実施態様において、前記ＩＬ−２またはＩＬ−１５プロドラッグは、癌を治療するために用いられる。ある実施態様において、前記ＩＬ−２またはＩＬ−１５プロドラッグは、例えば、薬物分子が抗菌薬または抗ウイルス薬である場合、感染症を治療するために用いられる。
【００９４】
ある実施態様において、対象における疾患（例えば、癌、ウイルス感染、または細菌感染）を治療するための方法は、ＩＬ−２またはＩＬ−１５プロドラッグの有効な量を前記対象に投与することを特徴とする。
【００９５】
ある実施態様において、前記癌は、固形癌である。ある実施態様において、前記癌は、血液癌または固形腫瘍である。治療されうる典型的な癌としては、以下に限定されないが、白血病、リンパ腫、腎癌、膀胱癌、尿路癌、子宮頚癌、脳癌、頭頸癌、皮膚癌、子宮癌、精巣癌、食道癌、肝癌、大腸癌、胃癌、扁平上皮癌、前立腺癌、膵癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、胆管細胞癌、乳癌、および卵巣癌が挙げられる。
【００９６】
ある実施態様において、前記サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）プロドラッグは、細菌感染（例えば、敗血症）を治療するために用いられる。ある実施態様において、細菌感染を引き起こす細菌は、薬剤耐性細菌である。ある実施態様において、前記抗原結合部分は、細菌の抗原に結合する。
【００９７】
ある実施態様において、前記サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）プロドラッグは、ウイルス感染を治療するために用いられる。ある実施態様において、ウイルス感染を引き起こすウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）である。ある実施態様において、前記抗原結合部分は、ウイルスの抗原に結合する。
【００９８】
一般に、本発明の医薬組成物の投与用量および投与経路は、標準的な医療行為に従って、対象の大きさおよび状態により決定される。ある実施態様において、医薬組成物は、経口、経皮、吸入、静脈内、動脈内、筋肉内、創傷部位への直接適用、外科手術部位への適用、腹腔内、座薬、皮下、皮内、経皮、噴霧、胸膜内、脳室内、関節内、眼球内、頭蓋内、または脊髄内を含む、いずれかの経路により対象に投与される。ある実施態様において、前記組成物は、静脈内に対象に投与される。
【００９９】
ある実施態様において、医薬組成物の用量は、単回の用量または繰り返し用量である。ある実施態様において、前記用量は、１日あたり１回、１日あたり２回、１日あたり３回、または１日あたり４回もしくはそれ以上で対象に与えられる。ある実施態様において、約１回またはそれ以上（例えば、約２、３、４、５、６、または７回もしくはそれ以上）の用量が１週間で与えられる。ある実施態様において、医薬組成物は、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、３週のうち２週間は１週間に１回、または４週のうち３週間は１週間に１回投与される。ある実施態様において、複数回の用量が、複数日、週、月、または年の間にわたり与えられる。ある実施態様において、治療過程は、約１回またはそれ以上の用量（例えば、約２回、３回、４回、５回、７回、１０回、１５回、または２０回もしくはそれ以上の用量）である。
【０１００】
特に本明細書で定義されていない限り、本開示に関して用いられる科学および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。典型的な方法および物質は、下記に記載されているが、本明細書に記載される方法と物質に類似し、または同等のものもまた、本開示の実施または試験で用いることができる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。一般に、本明細書に記載の細胞組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、合成有機化学、薬および医薬品化学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションに関して用いられる命名法および技術は、当該技術分野で周知であり、一般に用いられている。酵素反応および精製技術は、当該技術分野で一般に実施されるように、または本明細書に記載されるように、製造業者の説明書に従って行われる。さらに、特に文脈により必要とされない限り、単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれるべきである。本明細書および実施態様を通して、用語「有する（have）」および「含む（comprise）」、あるいは「有する（has）」、「有する（having）」、「含む（comprises）」、または「含む（comprising）」などの変化形は、示される整数または整数群を含んでいるが、いずれか他の整数または整数群を排除するものではないことを示すものと理解される。本明細書に記載される発明の態様および変形には、態様および変形「からなる（consisting）」および／または「から必須としてなる（consisting essentially of）」が含まれることが理解される。本明細書に記載される全ての刊行物および他の参考文献は、出典明示よりそれらの全体が本明細書に取り込まれる。多くの文献が本明細書で引用されているが、この引用は、これらの文献のいずれもが一般的な技術常識の一部を形成するということを認めているわけではない。
【０１０１】
典型的な実施態様
本開示のさらなる具体的な実施態様が下記に記載される。これらの実施態様は、本開示に記載の組成物および方法を例示することを意図しており、本開示の範囲を限定するものではない。
１．単離された変異体インターロイキン−２（ＩＬ−２）ポリペプチドであって、７個以下のアミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含み、前記変異の１つが、７３位におけるものである、前記変異体ＩＬ−２ポリペプチド。
２．単離された変異体インターロイキン−２（ＩＬ−２）ポリペプチドであって、７個以下のアミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含み、前記変異の１つが、Ｋ３５Ｎである、前記変異体ＩＬ−２ポリペプチド。
３．単離された変異体インターロイキン−２（ＩＬ−２）ポリペプチドであって、７個以下のアミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含み、前記変異の１つが、Ａ７３Ｔである、前記変異体ＩＬ−２ポリペプチド。
４．さらなるアミノ酸変異をさらに含み、前記変異が、ヒトＩＬ−２の残基４２および４５に相当する位置にあるものである、実施態様１〜３のいずれか１つに記載の変異体インターロイキン−２ポリペプチド。
５．さらなるアミノ酸変異をさらに含み、前記変異が、ヒトＩＬ−２の残基３８、４２、および４５に相当する位置にあるものである、実施態様１〜３のいずれか１つに記載の変異体インターロイキン−２ポリペプチド。
６．さらなるアミノ酸変異をさらに含み、前記変異が、ヒトＩＬ−２の残基３８、４２、４５、および６２に相当する位置にあるものである、実施態様１〜３のいずれか１つに記載の変異体インターロイキン−２ポリペプチド。
７．４２位における変異が、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｉ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、およびＦ４２Ｋの群から選択される、実施態様４〜６のいずれか１つに記載の変異体インターロイキン−２ポリペプチド。
８．４５位における変異が、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、およびＹ４５Ｋの群から選択される、実施態様４〜６のいずれか１つに記載の変異体インターロイキン−２ポリペプチド。
９．３８位における変異が、Ｒ３８Ａ、Ｒ３８Ｋ、およびＲ３８Ｓの群から選択される、実施態様５および６のいずれか１つに記載の変異体インターロイキン−２ポリペプチド。
１０．６２位における変異が、Ｅ６２Ｌ、Ｅ６２Ａ、およびＥ６２Ｉの群から選択される、実施態様６に記載の変異体インターロイキン−２ポリペプチド。
１１．変異Ｔ３ＡおよびＣ１２５Ｓをさらに含む、実施態様１〜１０のいずれか１つに記載の変異体インターロイキン−２ポリペプチド。
１２．実施態様１〜１１のいずれか１つに記載の変異体インターロイキン−２ポリペプチドおよび担体を含むキメラ分子であって、前記変異体ＩＬ−２ポリペプチドが、前記担体に適宜結合していてもよく、前記担体が、ＰＥＧ分子、アルブミン分子、アルブミン断片、ＩｇＧ Ｆｃ、および抗原結合分子から選択される、前記キメラ分子。
１３．前記担体が、抗原結合分子であり、前記抗原結合分子が、抗体または抗体断片である、実施態様１２に記載のキメラ分子。
１４．前記担体が、抗原結合分子であり、前記抗原結合分子が、二特異性抗体である、実施態様１２に記載のキメラ分子。
１５．前記抗原が、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰアルファ）、ＣＥＡ、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、Ｔｒｏｐ−２、ＨＥＲ２、５Ｔ４、メラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲ、およびクローディン１８．２の群から選択される、実施態様１３および１４のいずれかに記載のキメラ分子。
１６．サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）変異タンパク質、前記サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）のマスキング部分またはアンタゴニスト、および切断可能なペプチドリンカーを含む、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）のプロドラッグ（例えば、ＩＬ−２のプロドラッグ）であって、ＩＬ−２アゴニストポリペプチド（Ａ）、マスキング部分（ＭＭ）、および少なくとも１つの切断可能なペプチドリンカーを含み；前記マスキング部分が、ＩＬ−２受容体ベータサブユニット細胞外ドメインまたはその機能的類似体を含む、前記プロドラッグ。
１７．前記ＩＬ−２アンタゴニストまたはマスキング部分（ＭＭ）が、配列番号３に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一性のアミノ酸配列を含む、前記ＩＬ−２受容体ベータサブユニットの細胞外ドメインを含むものである、実施態様１６に記載のプロドラッグ。
１８．前記ＩＬ−２アンタゴニストまたはマスキング部分が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、前記ＩＬ−２受容体ベータサブユニットの細胞外ドメインを含むものである、実施態様１６に記載のプロドラッグ。
１９．前記ＩＬ−２アゴニストポリペプチド（Ａ）が、配列番号１に対して少なくとも９０％同一性のアミノ酸配列を含むか、あるいは前記ＩＬ−１５アゴニストポリペプチド（Ａ）が、配列番号２に対して少なくとも９０％同一性のアミノ酸配列を含む、実施態様１６〜１８のいずれかに記載のプロドラッグ。
２０．前記ＩＬ−２アゴニストポリペプチド（Ａ）が、Ｔ３、Ｋ３５、Ｒ３８、Ｆ４２、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｅ６８、Ｌ７２、Ａ７３、およびＣ１２５から選択される位置における１つまたはそれ以上の変異を含むヒトＩＬ−２の類似体を含み；前記変異が、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＩＬ−２のナンバリングに従って示されるものである、実施態様１６〜１８のいずれかに記載のプロドラッグ。
２１．前記ＩＬ−２アゴニストポリペプチド（Ａ）が、実施態様１〜１１のいずれか１つから選択される変異体ＩＬ−２である、実施態様１６〜１８のいずれかに記載のプロドラッグ。
２２．前記ＩＬ−２アゴニストポリペプチドが、配列番号８〜１７、１９〜３３、３６、３７、および３９〜４６から選択されるアミノ酸配列を含む、実施態様１６〜１８のいずれかに記載のプロドラッグ。
２３．担体（Ｃ）をさらに含み、前記担体が、ＰＥＧ分子、アルブミン、アルブミン断片、Ｆｃ、および抗原結合分子から選択される、実施態様１６〜２２のいずれかに記載のプロドラッグ。
２４．ＩＬ−２（またはＩＬ−１５）活性が腫瘍部位またはその周辺領域で活性化するＩＬ−２（またはＩＬ−１５）のプロドラッグであって：担体に適宜融合されているか、または抱合されているＩＬ−２（またはＩＬ−１５）のアゴニストポリペプチド（ＩＬ−２（またはＩＬ−１５）のアンタゴニストは、前記ＩＬ−２（またはＩＬ−１５）アゴニストポリペプチドのその受容体への結合を阻害するか、または影響を与えるものである）；ならびにＩＬ−２（またはＩＬ−１５）アンタゴニストを前記ＩＬ−２（またはＩＬ−１５）アゴニストポリペプチドまたはその担体に結合する切断可能なペプチドリンカーを含み；前記切断可能なペプチドリンカーが、腫瘍内部またはその周辺環境で見出される１つまたはそれ以上のプロテアーゼによって切断可能であり；ならびに前記担体が、タンパク質、抗体、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーから選択されるものである、前記プロドラッグ。
２５．前記ＩＬ−２またはＩＬ−１５アンタゴニストが、ＩＬ−２受容体ベータサブユニットの細胞外ドメインまたはその機能的類似体を含む、実施態様２４に記載のプロドラッグ。
２６．前記ＩＬ−２またはＩＬ−１５アンタゴニストあるいはマスキング部分（ＭＭ）が、配列番号３に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一性のアミノ酸配列を含む前記ＩＬ−２受容体ベータサブユニットの細胞外ドメインを含むものである、実施態様２４および２５のいずれかに記載のプロドラッグ。
２７．前記ＩＬ−２またはＩＬ−１５アンタゴニストあるいはマスキング部分が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、前記ＩＬ−２受容体ベータサブユニットの細胞外ドメインである、実施態様２４および２５のいずれかに記載のプロドラッグ。
２８．前記ＩＬ−２またはＩＬ−１５アンタゴニストあるいはマスキング部分が、ＩＬ−２受容体ガンマサブユニットまたはその機能的同等物をさらに含む、実施態様２４〜２７のいずれかに記載のプロドラッグ。
２９．前記ＩＬ−２またはＩＬ−１５アンタゴニストあるいはマスキング部分が、第２のＩＬ−２受容体ベータサブユニットまたはその機能的同等物をさらに含む、実施態様２４〜２７のいずれかに記載のプロドラッグ。
３０．前記ＩＬ−２アゴニストポリペプチド（Ａ）が、配列番号１に対して少なくとも９０％同一性のアミノ酸配列を有する、実施態様２４〜２９のいずれかに記載のプロドラッグ。
３１．前記ＩＬ−２アゴニストポリペプチド（Ａ）が、Ｔ３、Ｋ３５、Ｒ３８、Ｆ４２、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｅ６８、Ｌ７２、Ａ７３、およびＣ１２５から選択される位置における１つまたはそれ以上の変異（例えば、Ａ７３における変異およびＫ３５Ｎ変異）を含むヒトＩＬ−２の類似体であり；前記変異が、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＩＬ−２のナンバリングに従って示されるものである、実施態様２４〜２９のいずれかに記載のプロドラッグ。
３２．前記ＩＬ−２アゴニストポリペプチド（Ａ）が、実施態様１〜１１のいずれか１つから選択される変異体ＩＬ−２である、実施態様２４〜２９のいずれかに記載のプロドラッグ。
３３．前記ＩＬ−２アゴニストポリペプチドが、配列番号８〜１７、１９〜３３、３６、３７、および３９〜４６から選択されるアミノ酸配列を含む、実施態様２４〜２９のいずれかに記載のプロドラッグ。
３４．ＩＬ−１５アゴニストポリペプチド（Ａ）、マスキング部分（ＭＭ）、担体（Ｃ）、および少なくとも１つの切断可能なペプチドリンカーを含む、ＩＬ−１５のプロドラッグであって；前記ＩＬ−１５アゴニストポリペプチド（Ａ）が、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一性のアミノ酸配列を含み；前記マスキング部分（ＭＭ）が、ＩＬ−２受容体ベータサブユニット細胞外ドメイン、前記ＩＬ−２受容体ベータサブユニット細胞外ドメインの機能的類似体、ＩＬ−２受容体ガンマサブユニット細胞外ドメインにペプチドリンカーを介して融合されたＩＬ−２受容体ベータサブユニット細胞外ドメイン、および相互に切断可能なペプチドリンカーを介して結合されたＩＬ−２受容体ベータサブユニット細胞外ドメインの二量体から選択され；ならびに前記担体が、アルブミン、アルブミン断片、Ｆｃ、および抗原結合分子から選択されるものである、前記プロドラッグ。
３５．前記ＩＬ−１５のプロドラッグが、ＩＬ−１５受容体アルファサブユニットのスシドメインを含み；前記スシドメインが、配列番号７に対して少なくとも９５％または１００％同一性のアミノ酸配列を含む、実施態様３４に記載のプロドラッグ。
３６．前記ＩＬ−２受容体ベータサブユニット細胞外ドメインが、配列番号３に対して少なくとも９５％または１００％同一性のアミノ酸配列を含む、実施態様３４および３５のいずれか１つに記載のプロドラッグ。
３７．前記ガンマサブユニット細胞外ドメインが、配列番号６に対して少なくとも９５％または１００％同一性のアミノ酸配列を含む、実施態様２８および３４のいずれか１つに記載のプロドラッグ。
３８．前記担体（Ｃ）が、抗原結合分子であり；前記抗原結合分子が、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む抗体である、実施態様２３〜３７のいずれか１つに記載のプロドラッグ。
３９．前記サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）アゴニストポリペプチドが、前記抗体の重鎖の１つのＣ末端に、適宜、ペプチドリンカーを介して、融合され、前記サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）アンタゴニストまたはマスキング部分（ＭＭ）が、第２の重鎖のＣ末端に切断可能なペプチドリンカーを介して融合され；ならびに前記２つの重鎖融合タンパク質が、「ノブ−イントゥ−ホール」変異によりヘテロダイマーを形成している、実施態様３８に記載のプロドラッグ。
４０．前記サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）アゴニストポリペプチドが、前記抗体の重鎖の１つのＮ末端に、適宜、ペプチドリンカーを介して、融合され、前記サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）アンタゴニストまたはマスキング部分（ＭＭ）が、第２の重鎖のＮ末端に切断可能なペプチドリンカーを介して融合され；ならびに前記２つの重鎖融合タンパク質が、「ノブ−イントゥ−ホール」変異によりヘテロダイマーを形成するものである、実施態様３８に記載のプロドラッグ。
４１．前記サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）アゴニストポリペプチドが、前記抗体または抗体断片の重鎖の１つまたは両方のＮ末端に、直接またはペプチドリンカーを介して融合されるか、または抱合され、前記サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）アンタゴニストまたはマスキング部分（ＭＭ）が、前記軽鎖のＮ末端に切断可能なペプチドリンカーを介して融合されて、重鎖融合ポリペプチドおよび軽鎖融合ポリペプチドを形成している、実施態様３８に記載のプロドラッグ。
４２．前記担体が、抗原結合分子であり、前記抗原結合分子が、グアニルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）、糖鎖抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、糖タンパク質Ａ３３（ｇｐＡ３３）、ムチン１（ＭＵＣ１）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１−Ｒ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒト上皮増殖因子受容体３（ＨＥＲ３）、デルタ様タンパク質３（ＤＬＬ３）、デルタ様タンパク質４（ＤＬＬ４）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ｃ−ＭＥＴ、血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ネクチン−４、Ｌｉｖ−１、糖タンパク質ＮＭＢ（ＧＰＮＭＢ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔｒｏｐ−２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ９）、エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）、前立腺６回膜貫通型上皮抗原１（six transmembrane epithelial antigen of the prostate 1）（ＳＴＥＡＰ１）、葉酸受容体アルファ（ＦＲ−α）、ＳＬＩＴおよびＮＴＲＫ様タンパク質６（ＳＬＩＴＲＫ６）、炭酸脱水酵素ＶＩ（ＣＡ６）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ/ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３（ＥＮＰＰ３）、メソテリン、栄養膜（trophoblast）糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ３５２、ＣＤ４７、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）、ＰＤ１、クローディン１８．２、クローディン６、ＦＡＰ−アルファ、５Ｔ４、ＢＣＭＡ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、およびＥＰＣＡＭから選択される１つまたはそれ以上の抗原に結合する、実施態様２３〜４１のいずれかに記載のプロドラッグ。
４３．別のエフェクターポリペプチドをさらに含む、実施態様２３〜４２のいずれか１つに記載のプロドラッグ。
４４．別のエフェクターポリペプチドをさらに含み、前記エフェクターポリペプチドが、１２６位にアミノ酸変異を含む別のＩＬ−２変異タンパク質である、実施態様２３〜４２のいずれか１つに記載のプロドラッグ。
４５．別のエフェクターポリペプチドをさらに含み、前記エフェクターポリペプチドが、配列番号１２３に対して少なくとも９５％同一性のアミノ酸配列を含むＣＣＬ１９ポリペプチドである、実施態様２３〜４２のいずれか１つに記載のプロドラッグ。
４６．前記切断可能なペプチドリンカーが、腫瘍部位またはその周辺環境で見出される１つまたはそれ以上のプロテアーゼによって切断可能である、実施態様１６〜４５のいずれか１つに記載のプロドラッグ。
４７．前記プロドラッグが、腫瘍部位で活性化される、実施態様１６〜４５のいずれか１つに記載のプロドラッグ。
４８．前記切断可能なペプチドリンカーが、ｕＰＡの基質を含む、実施態様１６〜４５のいずれか１つに記載のプロドラッグ。
４９．前記切断可能なペプチドリンカーが、ＭＭＰ２および／またはＭＭＰ９の基質を含む、実施態様１６〜４５のいずれか１つに記載のプロドラッグ。
５０．前記切断可能なペプチドリンカーが、ｕＰＡおよびＭＭＰ２の両方、ｕＰＡおよびＭＭＰ９の両方、あるいはｕＰＡ、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９の基質を含む、実施態様１６〜４５のいずれか１つに記載のプロドラッグ。
５１．前記切断可能なペプチドリンカーが、ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号５２）、ＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号５３）、およびＧＰＬＧＶＲ（配列番号５４）から選択されるアミノ酸配列の酵素基質を含む、実施態様１６〜４５のいずれか１つに記載のプロドラッグ。
５２．前記切断可能なペプチドリンカーが、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号５２）およびＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号５３）の両方の酵素基質を含む、実施態様１６〜４５のいずれか１つに記載のプロドラッグ。
５３．前記切断可能なペプチドリンカーが、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号５２）およびＧＰＬＧＶＲ（配列番号５４）の両方；またはＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号５３）およびＧＰＬＧＶＲ（配列番号５４）の両方の酵素基質を含む、実施態様１６〜４５のいずれか１つに記載のプロドラッグ。
５４．前記切断可能なペプチドリンカーが、配列番号５５〜７８から選択されるアミノ酸配列を含む、実施態様１６〜４５のいずれか１つに記載のプロドラッグ。
５５．実施態様１〜１１のいずれか１つに記載の変異体ＩＬ−２をコードする、ポリヌクレオチド。
５６．実施態様１２〜１５のいずれか１つに記載のキメラ分子、または実施態様１６〜５４のいずれか１つに記載のプロドラッグをコードするポリヌクレオチド。
５７．実施態様５５または５６に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
５８．実施態様５７に記載のベクターでトランスフェクトされた、宿主細胞。
５９．前記宿主細胞が、ｕＰＡ、ＭＭＰ２、および／またはＭＭＰ９をコードする遺伝子をノックアウトされている、実施態様５８に記載の宿主細胞。
６０．実施態様１〜１１のいずれか１つに記載の変異体ＩＬ−２、実施態様１２〜１５のいずれかに記載のキメラ分子、または実施態様１６〜５４のいずれかに記載のプロドラッグの製造方法であって、実施態様５８または５９に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
６１．有効成分として、実施態様１〜１１のいずれか１つに記載の変異体ＩＬ−２または実施態様１６〜５４のいずれか１つに記載のプロドラッグを含む、医薬組成物。
６２．有効成分として、実施態様１２〜１５のいずれか１つに記載のキメラ分子を含む、医薬組成物。
６３．治療を必要とするヒト対象における乳癌、肺癌、膵癌、食道癌、甲状腺髄様癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、精巣癌、大腸癌、直腸癌または胃癌、あるいは感染症の治療方法であって、実施態様６１または６２に記載の医薬組成物を前記ヒト対象に投与することを特徴とする方法。
【０１０２】
本発明がより理解されうるために、下記の実施例が示される。これらの実施例は、例示のみを目的とするものであって、いかなる場合にも本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１０３】
実施例１〜６に記載の実験で使用した材料と方法が下記に記載される。
【０１０４】
ＨＥＫ２９３細胞の一過的トランスフェクション
発現プラスミドを、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）を用いて３ｘ１０６細胞／ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＨＥＫ２９３細胞に２．５〜３μｇ／ｍｌでコトランスフェクトさせた。Ｆｃを基にしたＩＬ−２プロドラッグについて、Ｆｃ−ＩＬ−２変異タンパク質融合ポリペプチドおよびＦｃ−マスキング部分融合ポリペプチドの比率は、１：２の比率であった。抗体を基にしたＩＬ−２プロドラッグについて、ノブ重鎖（ＩＬ−２アゴニストポリペプチドを含む）、ホール重鎖（マスキング部分を含む）、および軽鎖ＤＮＡの比率は、２：１：２のモル比であった。該細胞培養物を、トランスフェクション６日後に、９，０００ｒｐｍにおける４５分間の遠心分離、続いて０．２２μＭの濾過により回収した。
【０１０５】
タンパク質精製
抗体を基にしたＩＬ−２プロドラッグのタンパク質の精製は、１）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー；２）Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、および３）Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓを含む、クロマトグラフィーの３ステップを用いることにより行った。Ｑ ＦＦは、２５ｍＭ Ｔｒｉｓおよび１００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．５）により平衡にした。Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓは、緩衝液Ａ（２０ＭＭ リン酸，３０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ６．２）を用いて平衡にし、緩衝液Ｂ（２０ＭＭ リン酸，０．５Ｍ アルギニン，ｐＨ６．２）による１０ＣＶ直線グラジエントを用いて溶出した。
【０１０６】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析
ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから注文されたＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（７．８ｍｍ ＩＤＸ ３０ｃｍ，５μｍの粒子径）を備えたＨＰＬＣシステムのＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズを用いて行った。１００μｌ以下の試料を載せた。前記カラムを緩衝液（２００ｍＭ Ｋ３ＰＯ４，２５０ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ６．５を含有する）で流動した。流速は０．５ｍｌ／分であった。該カラムは室温で流動した。タンパク質溶出物を２２０ｎｍおよび２８０ｎｍの両方でモニターした。
【０１０７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
１０μｌの培養上澄み液または２０μｇの精製タンパク質試料を、還元剤とともに、または還元剤なしで、Ｂｏｌｔ（登録商標）ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）と混合した。該試料を７０℃で３分間加熱し、次いでＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４−１２％のＢｉｓＴｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に載せた。該ゲルをＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＯＰＳ ＳＤＳ泳動用緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２００ボルトにて４０分間泳動し、クーマシーで染色した。
【０１０８】
タンパク質分解処理
前記プロテアーゼ、ヒトｕ−プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）／ウロキナーゼ （Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）またはヒトマトリプターゼ／ＳＴ１４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を、それぞれ、８１ｎＭおよび２５０ｎＭで前記前駆体分子に加え、３７℃で終夜インキュベートした。
【０１０９】
ＣＴＬＬ２アッセイ
ＣＴＬＬ２細胞は、Ｌ−グルタミン、１０％ ウシ胎児血清、１０％ 非必須アミノ酸、１０％ ピルビン酸ナトリウム、および５５μＭ ベータメルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させた。ＣＴＬＬ２細胞を、培地（１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２を含む）中で５ｘ１０４〜１ｘ１０６細胞／ｍｌにて接着させず、維持した。一般に、細胞を１週間に２回分注した。バイオアッセイのために、継代後４８時間以上で細胞を使用することが最良であった。
【０１１０】
試料は、９６ウェルプレート内で５０μｌ／ウェルにて２ｘ濃度に希釈した。前記ＩＬ−２標準液を、１２ウェルにおいて２０ｎｇ／ｍｌ（２ｘ濃度）から３ｘ連続希釈に滴定した。試料を必要に応じて滴定試験した。ＣＴＬＬ２細胞を、５回洗浄してＩＬ−２を除去し、５０μｌで５０００細胞／ウェルにて撒き、前記試料とともに終夜または少なくとも１８時間培養した。続いて、１００μｌ／ウェルのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、発光を測定した。
【０１１１】
酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ＰＢＳ中で１０μｇ／ｍｌのＩＬ−２タンパク質を９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルで撒種し、４℃で終夜コーティングした。該ウェルを、ＰＢＳで３回洗浄し、１００μｌの２％ ミルク／ＰＢＳで１時間ブロッキングした。次いで、該ウェルをＰＢＳにより３回洗浄し、３倍連続希釈した１００μｌのタンパク質試料を、前記ウェルに加え、室温で１時間のインキュベーションを行った。ＰＢＳで３回洗浄し、１００μｌのＨＲＰ抱合抗ＩｇＧ抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、前記ウェルをＰＢＳにより３回洗浄し、検出試薬を加え、ＯＤ４５０ｎＭを測定した。
【０１１２】
ＦＡＣＳ分析
ＩＬ−２ＲαβγまたはＩＬ−２Ｒβγを発現する安定なＨＥＫ２９３細胞株を培養した。該細胞を非酵素細胞解離溶液で剥離した。細胞をカウントし、細胞密度をＦＡＣＳ洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の３％ ＦＢＳを含有）で約３，０００，０００細胞／ｍｌに調整した。５０μｌの細胞（１５０，０００細胞）を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。一次抗体または目的の抗体を発現する上澄み液を、所定の濃度で前記細胞に加えた。該プレートを氷上で１時間インキュベートした。該プレートをＦＡＣＳ洗浄緩衝液で３回洗浄した。蛍光を抱合させた二次抗体を該細胞（製造元の説明書による濃度）に加えた。該プレートを氷上で１時間インキュベートした。該プレートを再度洗浄した。ＰＩ染色溶液を０．１μｇ／ｍｌで加え、該プレートを氷上で１０分間インキュベートした。該細胞の蛍光をフローサイトメトリー装置で測定した。
【０１１３】
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
クローディン１８．２抗体、ＡＤＣＣが高いクローディン１８．２抗体、およびクローディン１８．２抗体−ＩＬ−２の試料を、ヒトＣＬＤ１８．２またはヒトＣＬＤ１８．１を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞に対してＡＤＣＣを誘導するそれらの能力について分析した。
【０１１４】
ヒト末梢血単核球細胞を増やすために、健常なドナーに由来するヒト血液を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２倍に希釈し、血液細胞をＦｉｃｏｌｌ（リンパ球分離培地１０７７ｇ／ｍｌ，ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カタログ番号Ｊ１５−００４）上で層状にした。末梢血単核球細胞（ＭＮＣ）を間期のものから収集し、洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０培養培地（１０％ 熱不活性化ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミンを補充）中で再懸濁した。
【０１１５】
ＡＤＣＣアッセイを開始するために、標的細胞を蛍光増感リガンド（ＢＡＤＴＡ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ細胞毒性アッセイキットのＤＥＬＦＩＡ ＥｕＴＤＡ細胞毒性試薬，カタログ番号ＡＤ０１１６）で３０分間標識した。ＲＰＭＩ−１０（１０ＭＭ プロベネシド（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｐ８７６１）、１０〜２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１０％ 熱不活性化ウシ胎仔血清を補充）中で広げて洗浄し、前記細胞を１×１０５細胞／ｍｌに調整した。標識した標的細胞、エフェクター細胞（ＭＮＣ）、および上澄み物（１０μｇ／ｍｌの濃度に調整したモノクローナル抗体を含む）を、丸底マイクロタイタープレートに加えた。単離したエフェクター細胞については、１００：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比（５０：１および２５：１についてはデータを示さず）を使用した。３７℃で２時間インキュベートし、アッセイを遠心分離により停止し、２回分の蛍光リガンド放出を時間分解蛍光光度計にてユーロピウム数で測定した。細胞毒性活性の割合は、下記式を用いて算出し：特異的融解％（実験上の放出数−自然発生の放出数）／（最大放出数−自然発生の放出数）Ｘ１００、最大蛍光リガンド放出を、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（０．２５％の最終濃度）を標的細胞に加えることにより調べ、自然発生の放出を抗体およびエフェクター細胞の非存在下で測定した。
【０１１６】
同系腫瘍モデルによるインビボ有効性試験
６週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、１Ｘ１０６個のＣＴ２６／１８．２細胞を皮下注射した。７日後、腫瘍を、デジタルキャリパーを用いて測定し、腫瘍体積を算出した（Ｖ＝（ａｂ２）ｐ／６［式中、ｂは、測定した２つの長さのうちの短い方の値である］）。次に、マウスを、全ての群がほぼ同一の平均腫瘍サイズ（１２７．６ｍｍ３）を示すような治療群に無作為化した。次いで、マウスを、腹腔内注射により１００μｌ中の１０ｍｇ／Ｋｇでのプラセボまたは試験物質で処理した。投薬を７、９、１１、１３、１５、および１８日目に行った。腫瘍を２〜３日ごとに測定し、腫瘍が２０００ｍｍ３に達したらマウスを屠殺した。
【０１１７】
実施例１：変異体ＩＬ−２アゴニストポリペプチドの発現および試験
ヒトＩＬ−２（配列番号１）は、１３３アミノ酸のポリペプチドである。多くの変異体ヒトＩＬ−２アゴニストポリペプチドを融合分子の一部として表し、それらの生物学的活性について試験した（表２）。必要に応じて、対のポリペプチドも示す。
表２．選択された変異体ＩＬ−２アゴニストポリペプチド融合体
【表２】
2021515599.tif 000003
ＳＥＱ：配列番号。ＨＳＡ：ヒト血清アルブミン。Ｎ−ＨＳＡ：担体ＨＳＡはＩＬ−２ポリペプチドのＮ末端に位置する；Ｎ−Ｆｃ：担体ＦｃはＩＬ−２ポリペプチドのＮ末端に位置する。Ｃ−Ｆｃ：担体ＦｃはＩＬ−２ポリペプチドのＣ末端に位置する。
【０１１８】
発現させたＩＬ−２ポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験した（図１）。それらの生物学的活性は、上記に記載されるＣＴＬＬ２細胞に基づく活性化アッセイを用いて試験した。図２Ｂに示されるように、ＩＬ−２変異タンパク質Ｔ３Ａ／Ｃ１２５Ｓ／Ｒ３８Ｓ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ａ７３Ｔ（配列番号１３５）およびＴ３Ａ／Ｃ１２５Ｓ／Ｒ３８Ｓ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｅ６２Ａ（配列番号１３２）を有するＦｃ融合タンパク質は、約６０ｎＭのＥＣ５０である細胞に基づくアッセイにおける同様の活性を示す一方、ＩＬ−２変異タンパク質Ｔ３Ａ／Ｃ１２５Ｓ／Ｋ３５Ｎ／Ｒ３８Ｓ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ａ７３Ｔ（配列番号１３６）を有するＦｃ融合タンパク質は、約１４０ｎＭのＥＣ５０である低い活性を示した。ＩＬ−２変異タンパク質Ｔ３Ａ／Ｃ１２５Ｓ／Ｒ３８Ｓ／Ｆ４２Ｒ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６２Ａ（配列番号１３３）は、約８７ｎＭのＥＣ５０を示した（データ示さず）。ＩＬ−２変異タンパク質Ｔ３Ａ／Ｃ１２５Ｓ／Ｒ３８Ｓ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｅ６２Ａを有するＦｃ融合タンパク質（配列番号１３７）は、ＩＬ−２変異タンパク質と前記Ｆｃとの間にペプチドリンカーを有していないが、約７２ｎＭのＥＣ５０を示した（データ示さず）。図２Ｃは、ＩＬ−２変異タンパク質Ｔ３Ａ／Ｃ１２５Ｓ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｌ７２Ｇ（配列番号１２６）およびＴ３Ａ／Ｃ１２５Ｓ／Ｒ３８Ｓ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｅ６２Ａ（配列番号１２７）を有するヒトアルブミン融合タンパク質が、それぞれ、約７７ｎＭおよび７６ｎＭのＥＣ５０と同様の細胞に基づく活性を有することを示した。
【０１１９】
これらの結果により、ＩＬ−２変異タンパク質へのさらなる変異Ａ７３Ｔの導入がＩＬ−２活性においてＥ６２Ａの変異と同様の効果を示したことが示される。一般に、配列番号１３５、１３２、１２６、および１２７で示されるＩＬ−変異タンパク質は、同様の細胞に基づく活性を示し、これらの活性は、野生型ＩＬ−２の活性より顕著に低かった。このことは、前記変異タンパク質のＩＬ−２Ｒαへの結合の著しい減少または喪失によるものと推定された。変異Ｔ３Ａ／Ｃ１２５Ｓ／Ｒ３８Ｓ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｅ６２Ａを有するＩＬ−２変異タンパク質（配列番号１３２）は、図８（下記も参照のこと）で示されるように、ＩＬ−２Ｒαに対する結合親和性の著しい減少を示した。さらに、Ａ７３ＴおよびＫ３５Ｎのさらなる２つの変異の導入は、このＩＬ−２変異タンパク質の活性をさらに減少させた。
【０１２０】
本発明者らは、１２６位におけるさらなる変異が、ＩＬ−２変異タンパク質Ｔ３Ａ／Ｃ１２５Ｓ／Ｒ３８Ｓ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｅ６２Ａ／Ｑ１２６Ｗ（配列番号１３０）およびＴ３Ａ／Ｃ１２５Ｓ／Ｒ３８Ｓ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｅ６２Ａ／Ｑ１２６Ｗ（リンカーなし）（配列番号１２９）で示されるように、いくらかのＩＬ−２活性をまだ有するが、細胞に基づく活性のさらに顕著に減少したレベルを生じることを見出した（図２Ｃ）。
【０１２１】
実施例２：ＩＬ−２アンタゴニストまたはマスキング部分の設計
ＩＬ−２のプロドラッグ基盤を構築するために、本発明者らは、ヒトＩＬ−２受容体ベータサブユニットおよびガンマサブユニットを用いて、様々なＩＬ−２アンタゴニスト（マスク）を設計した。典型的なマスクの設計を表３に記載し、これらには：
１）Ｆｃ断片のＣ末端に、１つのプロテアーゼ基質ペプチドを含む切断可能なペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＧＧＳ；配列番号１８）を介して融合させた、ＩＬ−２Ｒβサブユニット細胞外ドメインの単一コピー（配列番号１９５）；
２）ＦｃのＣ末端に、２つのプロテアーゼ切断部位を含む切断可能なペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＩＳＳＧＬＬＳＳＧＧＳＧＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨＧＧＧＧＳ；配列番号３８）を介して融合させ、ＩＬ−２Ｒガンマサブユニット細胞外ドメインの１コピーと融合させたＩＬ−２Ｒβサブユニット細胞外ドメインの１コピー（配列番号１９６）；
３）ＦｃのＣ末端に、切断可能なリンカー配列番号３８を融合させた、ＩＬ−２Ｒβサブユニット細胞外ドメインの単一コピー（配列番号１９７）；
４）ＦｃのＣ末端に、切断可能なリンカー配列番号３８を介して融合させた、相互に結合させたＩＬ−２Ｒβサブユニット細胞外ドメインの２コピー（配列番号１９８）
が含まれ、下線はプロテアーゼ基質配列を示す。
表３．ＩＬ−２アンタゴニストまたはマスクの設計
【表３】
2021515599.tif 000004
ＳＥＱ：配列番号。
【０１２２】
これらのマスクポリペプチドで用いられたＦｃ断片は、「ホール」変異Ｙ４０７Ｔを含有した。前記ＩＬ−２変異タンパク質は、「ノブ」変異Ｔ３６６Ｙを含んだＦｃ断片に融合されていた。
【０１２３】
ＩＬ−２プロドラッグの設計を表４に示す。各前記プロドラッグは、ＦｃのＣ末端に融合されたＩＬ−２アゴニストポリペプチド（配列番号１３２、１３３、または１３６）から構成され、Ｆｃ−マスク融合ポリペプチド（配列番号１９５、１９６、１９７、または１９８）のうちの１つで共発現させた。
表４．ＩＬ−２プロドラッグの設計
【表４】
2021515599.tif 000005
【０１２４】
前記プロドラッグを、プロテアーゼ、ヒトｕ−プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）／ウロキナーゼまたはヒトマトリプターゼ／ＳＴ１４で処理した。前記データは、プロテアーゼ処理により、ＣＴＬＬ２アッセイにおいてＩＬ−２機能の活性化が０．５〜２２倍となったことを示す（表４）。これらの結果により、ＩＬ−２Ｒβ細胞外ドメインおよびＩＬ−２Ｒβ細胞外ドメイン二量体の両方が、ＩＬ−２アゴニストポリペプチドのマスクとして機能したことが示された。１つまたは２つの切断可能な部位を有する切断可能なペプチドリンカーは両方とも機能した。本発明者らは、ＩＬ−２Ｒβおよびγサブユニット細胞外ドメインの両方を含むマスクが十分に発現しないことを知見した。
【０１２５】
実施例３：マスキング部分の最適化
プロテアーゼ切断による活性化が高倍率となるＩＬ−２アンタゴニストまたはマスクの改良型を探索するために、ＩＬ−２Ｒβ細胞外ドメインにおける多くの変異を構築した。これらの構築物は、ＨＥＫ２９３細胞においてホモダイマーとして発現され、それらのＩＬ−２との結合親和性を、上記に記載のＥＬＩＳＡ法によって測定し、表５で示す。単一の変異Ｒ１５Ｙ（配列番号１９９）、Ｖ７５Ｑ（配列番号２０２）、またはＶ７５Ｆ（配列番号２０３）を有するＩＬ−２Ｒβ細胞外ドメインは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＩＬ−２に対する結合親和性を完全に喪失した。単一の変異Ｓ６９Ｈ（配列番号２０１）またはＥ１３６Ｑ（配列番号２０４）を有するＩＬ−２Ｒβ細胞外ドメインは、ｐＨ７．４においてＩＬ−２に対する結合親和性を喪失したが、ｐＨ６．４ではＩＬ−２に対して２倍高い結合親和性を示した（表５）。二重変異Ｅ１３６Ｑ／Ｈ１３８Ｒを有するＩＬ−２Ｒβ細胞外ドメイン（配列番号２０５）は、ｐＨ７．４においてＩＬ−２に対して野生型のものと同様の結合親和性を示したが、ｐＨ６．４でのＩＬ−２に対するその結合親和性は２倍まで高くなった（表５）。変異Ｄ６８Ｅを有するＩＬ−２Ｒβ細胞外ドメイン（配列番号２００）は、ｐＨ７．４およびｐＨ６．４の両方においてＩＬ−２に対して２倍高い結合親和性を示した（表５）。
表５．ＩＬ−２Ｒβ変異の設計およびそれらのＩＬ−２に対する結合親和性
【表５】
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「−」：なしか、最小の結合
【０１２６】
実施例４：抗体分子を担体として有するＩＬ−２プロドラッグ
サイトカインポリペプチドを抗体に融合することにより、サイトカインの疾患部位への標的とした送達が可能となる。しかしながら、免疫器官に豊富に存在しうる免疫細胞上に高親和性サイトカイン受容体が存在する場合、サイトカイン受容体への結合について顕著に競合する。この実験において、ＩＬ−２Ｒαに対する結合親和性が顕著に減少したＩＬ−２変異タンパク質を抗体担体に融合させた。この種類の抗体ＩＬ−２プロドラッグは、抗体の標的となる疾患部位で活性化でき、顕著に改善したＰＫプロファイルと極めて高い疾患部位特異性を示しうる。
【０１２７】
クローディン１８．２に対する抗体（５８９Ａ配列）およびＰＤ−Ｌ１に対する抗体（アテゾリズマブ）を、新規のＩＬ−２プロドラッグ基盤の実現可能性を示す例として使用した。抗体に基づくプロドラッグの構造を図３に示す。５８９Ａ−ＩＬ−２−マスク融合分子の異なる組み合わせ設計を表６に記載する。
表６．５８９Ａ−ＩＬ−２プロドラッグの設計
【表６】
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ＨＣ：重鎖。ＬＣ：軽鎖。ＳＥＱ：配列番号。
【０１２８】
５８９Ａ−ＩＬ−２Ａ分子の８０％以上は、細胞中のプロテアーゼまたは細胞培養中に細胞から分泌されたプロテアーゼの存在による可能性により、プロテアーゼ処理なしで切断された（図４）。５８９Ａ−ＩＬ−２Ｂ（非切断性リンカー［（ＧＧＧＧＳ）３］（配列番号４９）を有する）は、前記ヘテロテトラマー抗体の安定な構築を示し、ＣＴＬＬ２アッセイにおいて刺激性活性を示さなかった（図４、表７）。このデータは、ＩＬ−２のアンタゴニストとしてのマスキング部分の有効性を示す。５８９Ａ−ＩＬ−２Ｃ分子は、適切に構築され、ＩＬ−２変異タンパク質の活性において３８倍の阻害を示した（図４および表７）。５８９Ａ−ＩＬ−２Ｅおよび５８９Ａ−ＩＬ−２Ｆ分子は、より安定に構築され、ＩＬ−２変異タンパク質活性において４，０００倍以上の阻害を示した（図４および表７）。マスク変異タンパク質Ｄ６８Ｅのより高い親和性による可能性のため、５８９Ａ−ＩＬ−２Ｅは、作成時に５８９Ａ−ＩＬ２−Ｆより高いプロドラッグ安定性を示した（図４）。
表７．５８９Ａ−ＩＬ−２プロドラッグのＣＴＬＬ２活性
【表７】
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【０１２９】
別の実験において、５８９Ａ−ＩＬ−２Ｅは、プロテアーゼ処理後のＨＥＫ２９３−ＩＬ−２ＲαβγおよびＨＥＫ２９３−ＩＬ−２Ｒβγ細胞株に対する結合で約１０〜２０倍の増加を示した（図６）。さらに、５８９Ａ−ＩＬ−２Ｅは、ＨＥＫ２９３−ＩＬ−２ＲαβγおよびＨＥＫ２９３−ＩＬ−２Ｒβγに対して同様の結合を示し、このことは、前記αサブユニットがＩＬ−２変異タンパク質の結合にあまり貢献せず、変異Ｔ３Ａ／Ｃ１２５Ｓ／Ｒ３８Ｓ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｅ６２Ａを有するＩＬ−２変異タンパク質がＩＬ−２Ｒαに対する結合親和性を著しく減少させたことを示す（図７ＡおよびＢ）。
【０１３０】
抗ＰＤ−Ｌ１−ＩＬ−２プロドラッグの設計を表８に記載する。
表８．抗ＰＤ−Ｌ１−ＩＬ−２プロドラッグの設計
【表８】
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【０１３１】
抗ＰＤ−Ｌ１−ＩＬ−２Ａ分子は、その切断可能なペプチドリンカーにおいて２つの切断部位を有し、細胞培養培地または細胞中のプロテアーゼの存在による可能性のため、ＨＥＫ２９３における発現中のバンドの切断を示した（データ示さず）。抗ＰＤＬ１−ＩＬ−２Ｂは、前記ヘテロテトラマー分子の適切な構築を示し、その精製した試料は、プロテアーゼ切断後に著しい活性を示した（図８）。抗ＰＤ−Ｌ１−ＩＬ−２Ｃ、抗ＰＤ−Ｌ１−ＩＬ−２Ｄ、および抗ＰＤ−Ｌ１−ＩＬ−２Ｅは、適切に構築されず、ＨＣ−ＩＬ−２のホモダイマーを形成し（データ示さず）、ＣＴＬＬ２アッセイにおいてＩＬ−２活性の阻害を示さなかった。これらのデータは、より短い切断リンカーが適切なヘテロテトラマー分子の形成を妨げうることを示す。
【０１３２】
実施例５：５８９Ａ−ＩＬ−２変異タンパク質融合分子のＡＤＣＣ活性
抗クローディン１８．２抗体５８９Ａ、５８９Ａのフコシル化されていない型（ａｆ−５８９Ａ）、およびＩＬ−２変異タンパク質とａｆ−５８９Ａとの融合体を、上記に記載されるように、ＡＤＣＣアッセイにおいてそれらのインビトロ活性を試験した。Ａｆ−５８９Ａは、そのＮ−グリカンにおいてフコースを有しないか、またはほとんど有せず、高まったＡＤＣＣ機能を示した。前記ＩＬ−２変異タンパク質には、変異Ｔ３Ａ／Ｃ１２５Ｓ／Ｒ３８Ｓ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｅ６２Ａが含まれていた（配列番号１０）。前記データは、前記ＩＬ−２変異タンパク質を５８９Ａ抗体にさらに付加することによりそのＡＤＣＣ活性をさらに高めたことを示す（図９）。
【０１３３】
実施例６：５８９Ａ−ＩＬ−２プロドラッグのインビボ有効性
インビボ抗癌効果試験を、５８９Ａ−ＩＬ−２Ｅを抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせて行った。前記プロドラッグおよびＰＤ−Ｌ１抗体の両方を、１０ｍｇ／ｋｇで隔日にて皮下投与した。ヒトクローディン１８．２をトランスフェクトしたＣＴ２６マウス腫瘍細胞を、Ｂａｌｂ／ｃマウスに移植した。腫瘍サイズが約１００ｍｍ３に達したら、前記マウスをそれらの腫瘍サイズに基づいて３つの群に無作為化した。各マウスは、緩衝液のプラセボ（群１）（図１０、左上パネル）、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−Ｌ１抗体（群２）（図１０、右上パネル）、または１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−Ｌ１抗体と１０ｍｇ／ｋｇの５８９Ａ−ＩＬ−２Ｅプロドラッグ（群３）（図１０、下パネル）皮下を受容した。７、９、１１、１３、１５、および１８日目に投薬した。腫瘍サイズおよび体重を、実験期間中モニターした。
【０１３４】
図１０に示されるように、前記プロドラッグおよび抗体の両方による治療群は、プラセボおよびＰＤ−Ｌ１抗体群と比較して、より均一な腫瘍サイズを示した。図１１に示されるように、前記プロドラッグおよびＰＤ−Ｌ１抗体の両方による治療群は、約３５日まで最も遅延した腫瘍増殖を示し、その生存曲線は、４２日目まで交差しなかった（図１２）。治療を１８日目に終了した。理論により拘束されることなく、本発明者らは、ＰＤ−Ｌ１抗体群によるクロスオーバーの可能性のある要因の１つは、マウスが野生型であり、５８９Ａ−ＩＬ−２Ｅに対して産生された抗体が存在する可能性がありうると考慮する。５８９Ａは、ウサギＢ細胞クローニングに由来するヒト化抗体であった。
【０１３５】
上記の非限定的な実施例は、開示される事項のより十分な理解を容易にするために例示することのみに提供されるものである。これらの実施例は、抗体、医薬組成物、または癌、神経変性症、または感染症を治療するための方法および使用に関するものを含む、本明細書に記載の実施態様のいずれかに限定されるものと解釈されるべきではない。
【０１３６】
配列
下記配列において、四角で囲まれた残基は、変異を示す。切断可能なリンカーにおける下線は、プロテアーゼ基質配列を示す。
【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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