(57)【要約】  本発明は、生物活性核酸を細胞内に導入可能な新しい構造の核酸複合体、これを含む疾病の治療又は診断用組成物及びこれを用いた標的遺伝子発現調節方法に関し、より詳細には、エンドソーム脱出を助ける物質を含む生物活性核酸とキャリアペプチド核酸が相補的に結合した核酸複合体、これを含む疾病の治療又は診断用組成物、標的遺伝子発現調節用組成物及びこれを用いた標的遺伝子発現調節方法に関する。  本発明の構造式（１）による生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸を含む核酸複合体は、生物活性核酸の安全性を高め、生物活性核酸の自己凝集（ｓｅｌｆ−ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）などによる沈殿などの損失を減少させることができ、細胞内生物活性核酸の伝達効率を高め、標的遺伝子の発現を容易に調節することができる。また、前記核酸複合体はエンドソーム脱出を助ける物質を含むことによって、細胞内在化によって細胞内部に浸透した核酸複合体が細胞質で効果的に活性を表すようにするのに有用である。【選択図】  図１Ａ
2021515589.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（１）の構造を有する核酸複合体：
構造式（１）
［ｍＡ≡ｍＣ（＋）］
前記構造式（１）において、
Ａは、目的とする遺伝子と結合可能な配列又は目的とする遺伝子配列を有する生物活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であり、
Ｃは、生物活性核酸と結合可能なキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であり、
‘≡’は、生物活性核酸とキャリアペプチド核酸間の相補的な結合を意味し、
‘ｍ’は、生物活性核酸とキャリアペプチド核酸のエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ）を助ける物質を意味し、
Ａで表される生物活性核酸は全体的に負電荷又は中性を有し、
Ｃ（＋）は、キャリアペプチド核酸が全体的に正電荷を有するということを意味し、
キャリアペプチド核酸は、キャリアペプチド核酸が全体的に正電荷を帯びるように修飾されたペプチド核酸単量体を一つ以上含む。
【請求項２】
前記生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸は、それぞれの５’末端及び／又は３’末端にエンドソーム脱出を助ける物質が結合していることを特徴とする、請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項３】
前記エンドソーム脱出を助ける物質は、ペプチド、脂質ナノ物質（ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、接合体ナノ物質（ｐｏｌｙｐｌｅｘ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、高分子ナノ球（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ）、無機物ナノ物質（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、陽イオン脂質ナノ物質（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、陽イオン高分子（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ）及びｐＨ感応性高分子（ｐＨ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項２に記載の核酸複合体。
【請求項４】
前記ペプチドは、ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（配列番号８５）、ＧＬＦＤＩＩＫＫＩＡＥＳＦ（配列番号８６）及びヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）（１０）からなる群から選ばれ、
前記脂質ナノ物質（ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、脂質（Ｌｉｐｉｄ）、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）、パルミチン酸セチル（ｃｅｔｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、ポロキサマー１８（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８）、Ｔｗｅｅｎ  ８５、トリステアリングリセリド（ｔｒｉｓｔｅａｒｉｎ  ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）及びＴｗｅｅｎ  ８０からなる群から選ばれ、
前記接合体ナノ物質（ｐｏｌｙｐｌｅｘ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、ポリ（アミドアミン）（ｐｏｌｙ（ａｍｉｄｏａｍｉｎｅ））又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）であり、
前記高分子ナノ球（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ）は、ポリカプロラクトン（ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ））、ポリ乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ）、ポリグリコール酸（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）、ポリ（ｄ、ｌ−ラクチド）（ｐｏｌｙ（ｄ、ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ））、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）及びＰＬＧＡ−ポリエチレングリコール（ＰＬＧＡ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）からなる群から選ばれ、
前記無機物ナノ物質（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、ＷＯ３及びＷＯ２．９からなる群から選ばれ、
前記陽イオン脂質ナノ物質（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、１−（アミノエチル）イミノビス［Ｎ−（オレイックイルシステイニル−１−アミノ−エチル）プロピオンアミド］（１−（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｂｉｓ［Ｎ−（ｏｌｅｉｃｙｌｃｙｓｔｅｉｎｙｌ−１−ａｍｉｎｏ−ｅｔｈｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｅ］）、ＰＴＡのＮ−アルキル化誘導体（Ｎ−ａｌｋｙｌａｔｅｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ＰＴＡ）及び３，５−ジドデシルオキシベンズアミジン（３，５−ｄｉｄｏｄｅｃｙｌｏｘｙｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ）からなる群から選ばれ、
前記陽イオン高分子（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ）は、ビニルピロリドン−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリル酸共重合体ジエチル硫酸塩（ｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ  ａｃｉｄ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｄｉｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｐｈａｔｅ）、ポリイソブチレン（ｐｏｌｙｉｓｏｂｕｔｙｌｅｎｅ）及びポリ（Ｎ−ビニルカルバゾール）（ｐｏｌｙ（Ｎ−ｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ））からなる群から選ばれ、
前記ｐＨ感応性高分子（ｐＨ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）は、ポリ酸（ｐｏｌｙａｃｉｄｓ）、ポリ（アクリル酸）（ｐｏｌｙ（ａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ））、ポリ（メタクリル酸）（ｐｏｌｙ（ｍｅｔｈａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ））及び加水分解されたポリアクリルアミド（ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項３に記載の核酸複合体。
【請求項５】
前記生物活性核酸とキャリアペプチド核酸はそれぞれ、２〜５０個の核酸単量体を含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項６】
前記生物活性核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ及び修飾されたペプチド核酸からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項７】
前記キャリアペプチド核酸は、前記生物活性核酸に対して塩基配列の一部或いは全部が相補的な配列で構成されることを特徴とする、請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項８】
前記一部が相補的な配列で構成されるキャリアペプチド核酸は、一つ以上のユニバーザル塩基を含むことを特徴とする、請求項７に記載の核酸複合体。
【請求項９】
全体的に正電荷を有することを特徴とする、請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項１０】
前記キャリアペプチド核酸は、全体的に正電荷を有するように１個以上のガンマ−又はアルファ−バックボーン修飾ペプチド核酸単量体を含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項１１】
前記ガンマ−或いはアルファ−バックボーン修飾ペプチド核酸単量体は、電気的陽性を有するように、リシン（Ｌｙｓｉｎｅ）、アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、ジアミノ酪酸（Ｄｉａｍｉｎｏ  ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）、オルニチン（Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）及びアミノ酸類似体からなる群から選ばれる一つ以上の正電荷を有するアミノ酸をバックボーンに含むことを特徴とする、請求項１０に記載の核酸複合体。
【請求項１２】
前記ガンマ−或いはアルファ−バックボーン修飾ペプチド核酸単量体は、負電荷を有するアミノ酸であるグルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、アスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ）又はアミノ酸類似体をバックボーンに含むことを特徴とする、請求項１０に記載の核酸複合体。
【請求項１３】
前記ペプチド核酸単量体は、正電荷を有するアミノ酸を有する単量体が負電荷を有するアミノ酸を有する単量体に比べてより多く含まれ、全体的なキャリアペプチド核酸の電荷が陽性になることを特徴とする、請求項１０に記載の核酸複合体。
【請求項１４】
疎水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、親水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、標的抗原特異的抗体、アプタマー、クエンチャー、蛍光マーカー及び発光マーカーからなる群から選ばれる一つ以上の物質が、生物活性核酸及び／又はキャリアペプチド核酸に結合していることを特徴とする、請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項１５】
前記疎水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、親水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、標的抗原特異的抗体、アプタマー、クエンチャー、蛍光マーカー及び発光マーカーからなる群から選ばれる一つ以上の物質と生物活性核酸及び／又はキャリアペプチド核酸の結合は、単純共有結合又はリンカーで媒介した共有結合であることを特徴とする、請求項１４に記載の核酸複合体。
【請求項１６】
前記生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸は、それぞれの核酸の５’−方向性及び３’−方向性によって平行（ｐａｒａｌｌｅｌ）又は逆平行（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ）に結合していることを特徴とする、請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項１７】
前記生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸の結合力は、生物活性核酸と生物活性核酸の目的とする遺伝子との結合力よりも低いことを特徴とする、請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項１８】
前記生物活性核酸とキャリアペプチド核酸とが平行結合（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）又は部分特異結合（ｐａｒｔｉａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）することを特徴とする、請求項１７に記載の核酸複合体。
【請求項１９】
前記キャリアペプチド核酸がリンカー、ユニバーザル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）及び生物活性核酸の対応する塩基と相補的でない塩基を有するペプチド核酸塩基からなる群から選ばれるいずれか一つ以上のペプチド核酸塩基を含むことを特徴とする、請求項１７に記載の核酸複合体。
【請求項２０】
前記ユニバーザル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）は、アデニン（ａｄｅｎｉｎｅ）、グアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）、シトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ）、チミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）、ウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）などの天然塩基と選択性無しで結合し、相補的な結合力よりも低い結合力を有する塩基であり、イノシンＰＮＡ（ｉｎｏｓｉｎｅ  ＰＮＡ）、インドールＰＮＡ（ｉｎｄｏｌｅ  ＰＮＡ）、ニトロインドールＰＮＡ（ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ＰＮＡ）及び無塩基ＰＮＡ（ａｂａｓｉｃ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項１９に記載の核酸複合体。
【請求項２１】
前記生物活性核酸とキャリアペプチド核酸との結合力調節によって、生物活性核酸とキャリアペプチド核酸との分離時点又は生物活性核酸と生物活性核酸の目的とする遺伝子との結合時点の調節が可能であることを特徴とする、請求項１７に記載の核酸複合体。
【請求項２２】
前記核酸複合体の粒子は５ｎｍ〜３００ｎｍのサイズを有することを特徴とする、請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項２３】
前記核酸複合体の粒子サイズは、核酸複合体の電荷バランスを調節することによって調節されることを特徴とする、請求項２２に記載の核酸複合体。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の核酸複合体を含む疾病の診断用組成物。
【請求項２５】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の核酸複合体を含む疾病の予防又は治療用組成物。
【請求項２６】
前記疾病は、癌、炎症性疾患、老人性黄斑変性、糖尿病性網膜症、慢性閉塞性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＯＰＤ）、希少疾患及び重症疾患、心血管疾患、代謝性疾患又は皮膚疾患であることを特徴とする、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記核酸複合体内に含まれた生物活性核酸が結合する標的遺伝子は、ＶＥＧＦ、ＰＤ−Ｌ１、アンドロゲン受容体、クラステリン、ＴＧＦβＲ２、ＥＲＢＢ３、ＡＢＣＢ１及びＰＤＥ４Ｂからなる群から選ばれるいずれか一つ以上であり、前記疾病は癌であることを特徴とする、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記癌は乳癌、前立腺癌又は肺癌であることを特徴とする、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記核酸複合体内に含まれた生物活性核酸が結合する標的遺伝子は、ＶＥＧＦであり、前記疾病は、老人性黄斑変性又は糖尿病性網膜症であることを特徴とする、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３０】
前記核酸複合体内に含まれた生物活性核酸が結合する標的遺伝子は、ＰＤＥ４Ｂであり、前記疾病は、慢性閉塞性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＯＰＤ）であることを特徴とする、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３１】
前記核酸複合体内に含まれた生物活性核酸が結合する標的遺伝子は、ＴＬＲ２、Ｓｍａｄ３、ＩＦＩ１６、ＴＬＲ６及びＴＩＥＧ１からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であり、前記疾病は、皮膚疾患であることを特徴とする、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３２】
前記皮膚疾患は、乾癬、色素沈着関連皮膚疾患、アトピー皮膚炎、皮膚損傷又はケロイド（怪我後肥大症）であることを特徴とする、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
水性溶液、クリーム、ゲル、ペースト、ローション及び軟膏から選ばれるいずれか一つの剤形を有することを特徴とする、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の核酸複合体を含む標的遺伝子発現調節用組成物。
【請求項３５】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の核酸複合体を用いることを特徴とする標的遺伝子発現調節方法。
【請求項３６】
（ａ）エンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ）を助ける物質を含む生物活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）とキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）を結合させて複合体を形成する段階；及び
（ｂ）前記複合体を細胞、細菌、かび、寄生虫などに接触させて生物体及び細胞内に導入する段階を含むことを特徴とする、請求項３５に記載の標的遺伝子発現調節方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物活性核酸を細胞内に導入可能な新しい構造の核酸複合体、これを含む疾病の治療又は診断用組成物及びこれを用いた標的遺伝子発現調節方法に関し、より詳細には、エンドソーム脱出を助ける物質を含み、生物活性核酸とキャリアペプチド核酸が相補的に結合した核酸複合体、これを含む疾病の治療又は診断用組成物、標的遺伝子発現調節用組成物及びこれを用いた標的遺伝子発現調節方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝統的に、新しい薬剤を探索する際には、コンピュータ研究を用いた様々な化合物をスクリーニングすることを基本とし、スクリーニングされた化合物の大多数はタンパク質を標的にする。
【０００３】
伝統的な薬剤と違い、核酸薬剤は標的特異的伝令ＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ，ｍＲＮＡ）の発現を抑制するので、タンパク質を標的にする既存薬剤で治療が不可能だった研究領域を扱うことが可能になった（Ｋｏｌｅ  Ｒ．等，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１２；１１；１２５−１４０．，Ｗｉｌｓｏｎ  Ｃ．等，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．２００６；１０：６０７−６１４．）。
【０００４】
オリゴ核酸（Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）ベースの遺伝子発現調節の優れた効果及び様々な用途にもかかわらず、核酸に基づく治療剤を開発するには克服すべき妨害物が多数存在する。例えば、オリゴ核酸は核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）などによる損傷の危険があり、オリゴ核酸の電気的性質（電荷）と大きさによって受動拡散（ｐａｓｓｉｖｅ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）による細胞膜透過が不可能な点などがある。これらの問題点を解消するために、核酸の修飾を用いて生物学的安定性を確保しようとする努力が続いており、修飾された人工核酸（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）の場合、生物学的な活性の損失無しで標的核酸との親和性を高めることが可能になった。
【０００５】
修飾された人工核酸の一種であるペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ，ＰＮＡ）は、（２−アミノエチル）−グリシンペプチドバックボーン（（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｇｌｙｃｉｎｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）が導入された人工核酸であり、相補的な塩基配列を有するＲＮＡ及びＤＮＡに強く結合する性質を持っている。特に、前記ペプチド核酸は核酸分解酵素に対して抵抗性があり、生物学的安定性が高いので、様々なオリゴ核酸に基づく治療剤関連研究が行われている。しかし、前記ペプチド核酸は電気的中性を有する特性から、細胞内導入が難しい短所がある（Ｊｏｅｒｇｅｎｓｅｎ  Ｍ．等，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ２０１１，２１；２９−３７．）。
【０００６】
薬剤としての性能及び長所から、核酸を用いた様々な臨床試験が進行されており、増加する核酸ベース治療剤の用途にもかかわらず、細胞内導入のための運搬体の使用は極めて制限的である。例えば、ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、陽性リポソーム（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）及びポリマーナノ粒子（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）を使用するオリゴ核酸に基づく薬剤の細胞又は組織内への運搬戦略（方法）を用いた臨床試験が進行されているが、大多数の場合、運搬システムを含まず、主に、非経口的な方法である筋肉注射、眼球（ｏｃｕｌａｒ）投与、皮下注射などの投与経路（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｒｏｕｔｅ）で核酸を直接導入している。
【０００７】
また、オリゴ核酸自体の細胞膜透過能力は非常に低く、特に、ＤＮＡ又はＲＮＡは負電荷を帯びているので、細胞の疎水性リン脂質二重膜を通過できず、単純拡散による細胞内伝達が難しい。レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）或いはＡＡＶ（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）などのウイルス運搬体の使用は、オリゴ核酸の細胞内導入を可能にするが、意図しない免疫活性と発癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）の組換え可能性などの危険性がある（Ｃｏｕｔｏ  Ｌ．Ｂ．等，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１０，５；５３４−５４２．）。
【０００８】
このような理由から、細胞毒性が少なく、免疫活性が低い非ウイルス性オリゴ核酸に基づく核酸運搬体開発の重要性が一層増大しており、その結果として、正電荷性脂質（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ）、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ、安定した核酸脂質粒子（ｓｔａｂｌｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｐｉｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅ，ＳＮＡＬＰ）、ポリマー及び細胞−透過粒子（ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を用いた細胞導入手法が開発されている（Ｚｈｉ  Ｄ．等，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２０１３，２４；４８７−５１９．，Ｂｕｙｅｎｓ  Ｋ．等，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１２，１５８；３６２−７０．，ＲＯＳＳＩ，Ｊ．Ｊ．等，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００６，１３：５８３−５８４．，Ｙｏｕｓｅｆｉ  Ａ．等，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１３，１７０；２０９−１８．，Ｔｒａｂｕｌｏ  Ｓ．等，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．２０１３，１９；２８９５−９２３．）。
【０００９】
このような核酸伝達手法は機能性残基を直接的な結合によって持っており、複合体形成のための段階を含み、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）構造のエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ）効率及び生体毒性などの問題点があり、オリゴ核酸導入機能の向上と製造手順及び副作用に関連した問題点の解消が必要である。
【００１０】
一方、一般に、生物活性核酸は、膜受容体細胞内在化（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）によるエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）という細胞小器官の形成によって細胞内に流入する。効果的な生物活性核酸の発現及び治療のためには、エンドソーム内部の生物活性核酸がエンドソームを脱出して核に移動したり或いは細胞質でその機能を担うようにする必要がある。したがって、エンドソームから細胞質に脱出する過程、“エンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ）”が必須である（Ｄ．Ｗ．Ｐａｃｋ，Ａ．Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｐｕｎ，Ｐ．Ｓ．Ｓｔａｙｔｏｎ，“Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．，４，５８１−５９３，２００５）。
【００１１】
これと関連して、本発明者らは、生物活性核酸と全体的に正電荷を有するように修飾されたキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）とが相補的に結合した核酸複合体において細胞透過性（ｃｅｌｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）が驚くほど向上し、これを用いて標的遺伝子の発現を非常に効率的に調節できることを確認し、このような細胞毒性が低く、生物活性核酸の細胞透過性及び遺伝子発現調節能力が向上した新しい構造体に対する特許を出願したことがある（ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６）。
【００１２】
その後、持続した研究から、前記のような構造体にエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ）を助ける物質が結合する場合、前記構造体に含まれた生物活性核酸の細胞内での活性が顕著に向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
この背景技術に記載の前記情報は単に本発明の背景に関する理解を向上させるためのものであり、したがって、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者に既に周知である先行技術を形成する情報を含まなくてもよい。
【発明の概要】
【００１４】
本発明の目的は、エンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ）を助ける物質を含む生物活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）と全体的に正電荷を有するように修飾されたキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）とが相補的に結合した核酸複合体及びこれを含む疾病の診断又は治療用組成物を提供することにある。
【００１５】
本発明の他の目的は、前記核酸複合体を含む標的遺伝子発現調節用組成物及び前記核酸複合体を用いた標的遺伝子発現調節方法を提供することにある。
【００１６】
前記目的を達成するために、下記構造式（１）の構造を有する核酸複合体を提供する。
構造式（１）
［ｍＡ≡ｍＣ（＋）］
前記構造式（１）において、
Ａは、目的とする遺伝子と結合可能な配列又は目的とする遺伝子配列を有する生物活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であり、
Ｃは、生物活性核酸と結合可能なキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であり、
‘≡’は、生物活性核酸とキャリアペプチド核酸間の相補的な結合を意味し、
‘ｍ’は、生物活性核酸とキャリアペプチド核酸のエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ）を助ける物質を意味し、
Ａで表される生物活性核酸は、全体的に負電荷又は中性を有し、
Ｃ（＋）は、キャリアペプチド核酸が全体的に正電荷を有するということを意味し、
キャリアペプチド核酸は、キャリアペプチド核酸が全体的に正電荷を帯びるように修飾されたペプチド核酸単量体を一つ以上含む。
【００１７】
本発明はまた、前記構造式（１）の核酸複合体を含む疾病の診断用組成物及び疾病の予防又は治療用組成物を提供する。
【００１８】
本発明はまた、前記構造式（１）の核酸複合体を投与する段階を含む疾病の予防又は治療方法を提供する。
【００１９】
本発明はまた、疾病の予防又は治療のための前記構造式（１）の核酸複合体の用途を提供する。
【００２０】
本発明はまた、疾病の予防又は治療用薬剤の製造のための前記構造式（１）の核酸複合体の使用を提供する。
【００２１】
本発明はまた、前記構造式（１）の核酸複合体を含む標的遺伝子発現調節用組成物及び標的遺伝子発現調節方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
図１Ａ〜１Ｅは、ＶＥＧＦ特異的生物活性ペプチド核酸を含む構造式（１）による核酸複合体を用いて、ヒト由来子宮癌細胞株における細胞内に浸透した核酸複合体が細胞質に効果的に出ることを確認した結果、ヒト由来乳癌細胞株と肺癌細胞株の細胞生存率変化、及びＶＥＧＦとその下位経路タンパク質の発現の抑制及び細胞死誘導を確認した結果を示す図である。
（Ａ）ＨｅＬａで核酸複合体の細胞透過性及びエンドソーム脱出の変化、
（Ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞生存率の変化、
（Ｃ）Ａ５４９細胞生存率の変化、
（Ｄ）ＶＥＧＦ及び下位経路タンパク質の発現変化、
（Ｅ）ＶＥＧＦ抑制による細胞死誘導分析。
【００２３】
図２Ａ〜２Ｇは、ＶＥＧＦ特異的生物活性ペプチド核酸を含む構造式（１）による核酸複合体を用いて、ヒト乳癌細胞株が移植されたマウスにおける腫瘍成長抑制効能を立証した結果を示す図である。
（Ａ）生体内動物テストデザイン（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｉｍａｌ  ｔｅｓｔ  ｄｅｓｉｇｎ）の図式化、
（Ｂ）マウスの体重変化、
（Ｃ）腫瘍体積の変化、
（Ｄ）腫瘍重さの変化、
（Ｅ）腫瘍の外観変化、
（Ｆ）肝毒性指標の変化、
（Ｇ）ＶＥＧＦ及び下位経路タンパク質の発現変化。
【００２４】
図３は、ＰＤ−Ｌ１特異的生物活性ペプチド核酸を含む構造式（１）による核酸複合体を用いて、ヒト由来乳癌細胞株が移植されたマウスにおける腫瘍成長抑制効能を立証した結果を示す図である。
【００２５】
図４は、アンドロゲン受容体（Ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）特異的生物活性ペプチド核酸を含む構造式（１）による核酸複合体を用いて、ヒト由来前立腺癌細胞株でアンドロゲン受容体とその下位経路タンパク質発現が抑制されることを確認した図である。
（Ａ）生物活性ペプチド核酸（配列番号１２又は配列番号１３）とキャリアペプチド核酸（配列番号１６〜配列番号１９又は配列番号２４〜配列番号２７）とからなる複合体を使用した場合、
（Ｂ）生物活性ペプチド核酸（配列番号１４又は配列番号１５）とキャリアペプチド核酸（配列番号２０〜配列番号２３又は配列番号２８〜配列番号３１）とからなる複合体を使用した場合。
【００２６】
図５Ａ〜５Ｃは、クラステリン（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ）特異的生物活性ペプチド核酸を含む構造式（１）による核酸複合体を用いて、ヒト前立腺癌の細胞生存率変化及びクラステリンに関連した経路タンパク質の発現の抑制を確認した図である。
（Ａ）生物活性ペプチド核酸（配列番号３２又は配列番号３３）とキャリアペプチド核酸（配列番号３６〜配列番号３９又は配列番号４４〜配列番号４７）とからなる複合体を使用した場合、ＰＣ−３細胞生存率の変化、
（Ｂ）生物活性ペプチド核酸（配列番号３４又は配列番号３５）とキャリアペプチド核酸（配列番号４０〜配列番号４３又は配列番号４８〜配列番号５１）とからなる複合体を使用した場合、ＰＣ−３細胞生存率の変化、
（Ｃ）クラステリン及び関連経路タンパク質の発現変化、
（１）生物活性ペプチド核酸（配列番号３２又は配列番号３３）とキャリアペプチド核酸（配列番号３６〜配列番号３９又は配列番号４４内配列番号４７）とからなる複合体を使用した場合、
（２）生物活性ペプチド核酸（配列番号３４又は配列番号３５）とキャリアペプチド核酸（配列番号３６〜配列番号３９又は配列番号４４〜配列番号４７）とからなる複合体を使用した場合。
【００２７】
図６Ａ〜６Ｆは、ＶＥＧＦ特異的生物活性ペプチド核酸を含む構造式（１）による核酸複合体を用いて、ヒト由来網膜色素上皮細胞株の細胞生存率変化及びＶＥＧＦとその下位経路タンパク質の発現の抑制及び硝子体内注射及び眼球点眼液を用いたネズミの網膜における血管の生成が抑制されることを確認した図である。
（Ａ）ＡＲＰＥ−１９細胞生存率の変化、
（Ｂ）ＶＥＧＦ及び下位経路タンパク質の発現変化、
（Ｃ）生物活性ペプチド核酸（配列番号２）とキャリアペプチド核酸（配列番号８）とからなる複合体を使用した場合、硝子体内注射をして１週後にネズミの網膜で血管生成の確認、
（Ｄ）及び（Ｅ）生物活性ペプチド核酸（配列番号２）とキャリアペプチド核酸（配列番号６又は配列番号８）とからなる複合体を使用した場合、硝子体内注射を用いたネズミの網膜で血管生成の確認、
（Ｆ）生物活性ペプチド核酸（配列番号２）とキャリアペプチド核酸（配列番号８）とからなる複合体を使用した場合、眼球点眼液を用いたネズミの網膜で血管生成の確認。
【００２８】
図７は、ＰＤＥ４Ｂ特異的生物活性ペプチド核酸を含む構造式（１）による核酸複合体を用いて、ヒト由来呼吸器上皮細胞及びヒト由来肺癌細胞株でＰＤＥ４Ｂと炎症関連タンパク質発現が抑制されることを確認した図である。
（Ａ）生物活性ペプチド核酸（配列番号５２又は配列番号５５）とキャリアペプチド核酸（配列番号５６〜配列番号６３）とからなる複合体を使用した場合、ＮＣＩ−Ｈ２９２でＰＤＥ４Ｂ及び炎症タンパク質の発現確認、
（Ｂ）生物活性ペプチド核酸（配列番号５２又は配列番号５５）とキャリアペプチド核酸（配列番号５６〜配列番号６３）とからなる複合体を使用した場合、Ａ５４９でＰＤＥ４Ｂ及び炎症タンパク質の発現確認。
【００２９】
図８Ａ〜８Ｆは、ＴＬＲ２特異的生物活性ペプチド核酸を含む構造式（１）による核酸複合体を用いて、アトピーに関連したＴＬＲ２の発現を抑制することを確認した図である。
（Ａ）生物活性ペプチド核酸（配列番号６４又は配列番号６５）とキャリアペプチド核酸（配列番号６７〜配列番号７１）とからなる複合体を使用した場合、ＨａＣａＴでの細胞生存率の変化、
（Ｂ）生物活性ペプチド核酸（配列番号６４又は配列番号６５）とキャリアペプチド核酸（配列番号６６〜配列番号７１）とからなる複合体を使用した場合、ＨａＣａＴでのＴＬＲ２及び下位遺伝子のタンパク質の抑制、
（Ｃ）生物活性ペプチド核酸（配列番号６５）とキャリアペプチド核酸（配列番号６７又は配列番号７０）とからなる複合体を使用した場合、薬効評価動物でのアトピー皮膚炎表現型の変化、
（Ｄ）薬効評価動物の血清内ＩｇＥ及びＴＡＲＣ濃度変化、
（Ｅ）薬効評価動物のＨ＆Ｅを用いたアトピー表現型の変化、
（Ｆ）薬効評価動物における免疫染色を用いた組織での炎症マーカーの変化。
【００３０】
図９Ａ〜９Ｂは、Ｓｍａｄ３特異的生物活性ペプチド核酸を含む構造式（１）による核酸複合体を用いて、皮膚再生に関連したＳｍａｄ３の発現を抑制することを確認した図である。
（Ａ）生物活性ペプチド核酸（配列番号７３）とキャリアペプチド核酸（配列番号７５又は配列番号７７〜配列番号７８）とからなる複合体を使用した場合、ＨａＣａＴでの怪我後回復能力分析、
（Ｂ）生物活性ペプチド核酸（配列番号７２又は配列番号７３）とキャリアペプチド核酸（配列番号７４〜配列番号７８）とからなる複合体を使用した場合、ＨａＣａＴでのＳｍａｄ３遺伝子のタンパク質の抑制。
【００３１】
図１０Ａ〜１０Ｂは、ＴＩＥＧ１特異的生物活性ペプチド核酸を含む構造式（１）による核酸複合体を用いて、怪我後肥大症に関連したＴＩＥＧ１の発現を抑制することを確認した図である。
（Ａ）生物活性ペプチド核酸（配列番号７９又は配列番号８０）とキャリアペプチド核酸（配列番号８１〜配列番号８４）とからなる複合体を使用した場合、ＫＥＬ−ＦＩＢでの細胞生存率変化、
（Ｂ）生物活性ペプチド核酸（配列番号７９又は配列番号８０）とキャリアペプチド核酸（配列番号８１〜配列番号８４）とからなる複合体を使用した場合、ＫＥＬ−ＦＩＢでのＴＩＥＧ１遺伝子及び下位遺伝子のタンパク質の変化。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
特に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野に周知されており、通常用いられるものである。
【００３３】
本発明の一実施例において、エンドソーム脱出を助ける物質を含む生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸が相補的に結合した核酸複合体を用いて、細胞内生物活性核酸の伝達効率を高め、標的遺伝子発現を容易に調節できることを確認した。
【００３４】
したがって、本発明は一観点において、下記構造式（１）の構造を有する核酸複合体に関する。
構造式（１）
［ｍＡ≡ｍＣ（＋）］
前記構造式（１）において、
Ａは、目的とする遺伝子と結合可能な配列又は目的とする遺伝子配列を有する生物活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であり、
Ｃは、生物活性核酸と結合可能なキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であり、
‘≡’は生物活性核酸とキャリアペプチド核酸間の相補的な結合を意味し、
‘ｍ’は、生物活性核酸とキャリアペプチド核酸のエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ）を助ける物質を意味し、
Ａで表される生物活性核酸は全体的に負電荷又は中性を有し、
Ｃ（＋）は、キャリアペプチド核酸が全体的に正電荷を有するということを意味し、
キャリアペプチド核酸は、キャリアペプチド核酸が全体的に正電荷を帯びるように修飾されたペプチド核酸単量体を一つ以上含む。
【００３５】
本発明において、“生物活性核酸”は、発現を減少させようとする目的とする標的遺伝子と結合できる相補的な配列、特に当該目的とする標的遺伝子のｍＲＮＡに結合できる相補的な配列を有するか、発現させようとする標的遺伝子の発現を促進する配列を含む核酸を含む核酸であり、当該遺伝子の発現を抑制又は促進するなどの遺伝子発現調節に関与する核酸を意味し、発現を減少又は増加させようとする標的遺伝子に相補的な配列を有する核酸であるか、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な配列の核酸であり得る。
【００３６】
特に、本発明における“生物活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）”は、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）又は生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で標的遺伝子及びこれを含む塩基配列と結合して当該遺伝子の固有機能（例えば、転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）発現又はタンパク質発現）を活性化又は阻害させたり、或いはｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇ）を調節（例えば、エクソンスキッピング（ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ））するなどの機能を果たすことを特徴とし得る。前記塩基配列は、遺伝子調節部位（ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又は遺伝子部位（ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又はスプライシング調節部位（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であることを特徴とし得る。前記遺伝子調節部位は、プロモーター、転写エンハンサー、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、ウイルスパッケージング配列、及び選択マーカーから選択されることを特徴とし得る。前記遺伝子部位はエクソン又はイントロンであり得、前記遺伝子部位は遺伝子の転写開始部位の１０、５、３、１ｋｂ又は５００、３００、２００ｂｐ内に、例えば、開始部位の上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）又は下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）に存在できる。また、前記スプライシング調節部位は、エクソンスキッピング、 隠されたスプライシング（ｃｒｙｐｔｉｃ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ）、擬似スプライス部位活性化（ｐｓｅｕｄｏ−ｓｐｌｉｃｅ  ｓｉｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、イントロン保持（ｉｎｔｒｏｎ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）、選択的スプライシングディレギュレーション（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）関連配列を含むことができる。
【００３７】
本発明において“キャリアペプチド核酸”は、生物活性核酸と一部或いは全部の塩基が相補的に結合して機能性を付与する核酸を意味し、本発明で用いられるキャリアペプチド核酸は、ペプチド核酸（ＰＮＡ：Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）だけでなく、これと類似な修飾された核酸を使用することもでき、ペプチド核酸が好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３８】
本発明において、前記生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸は、それぞれの核酸の５’末端及び／又は３’末端にエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ）を助ける物質が結合していることを特徴とし、好ましくは、前記生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸のそれぞれの５’末端にエンドソーム脱出を助ける物質が結合した形態が用いられ得る。
【００３９】
前記生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸とエンドソーム脱出を助ける物質は共有結合で連結されることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００４０】
本発明において、“エンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ）を助ける物質”は、エンドソーム内部の浸透圧を増加させたり、エンドソームの膜を不安定化させる方法によって生物活性核酸のエンドソームで脱出を助けることを特徴とし得る。生物活性核酸がより効率的で迅速に核や細胞質に移動して標的遺伝子に出会って作用するように助けることを意味する（Ｄ．Ｗ．Ｐａｃｋ，Ａ．Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｐｕｎ，Ｐ．Ｓ．Ｓｔａｙｔｏｎ，“Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．，４，５８１−５９３（２００５））。
【００４１】
前記エンドソーム脱出を助ける物質は、生物活性核酸又はキャリアペプチド核酸と５’末端又は３’末端にリンカー媒介の連結方法で結合することを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【００４２】
本発明において、前記エンドソーム脱出を助ける物質は、ペプチド、脂質ナノ物質（ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、接合体ナノ物質（ｐｏｌｙｐｌｅｘ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、高分子ナノ球（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ）、無機物ナノ物質（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、陽イオン脂質ナノ物質（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、陽イオン高分子（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ）及びｐＨ感応性高分子（ｐＨ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とし得る。
【００４３】
好ましい一例として、本発明において、前記ペプチドは、ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（配列番号８５）、ＧＬＦＤＩＩＫＫＩＡＥＳＦ（配列番号８６）及びヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）（１０）からなる群から選ばれることを特徴とし得る。
【００４４】
好ましい一例として、本発明において、前記脂質ナノ物質（ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、脂質（Ｌｉｐｉｄ）、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）、パルミチン酸セチル（ｃｅｔｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、ポロキサマー１８（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８）、Ｔｗｅｅｎ  ８５、トリステアリングリセリド（ｔｒｉｓｔｅａｒｉｎ  ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）及びＴｗｅｅｎ  ８０からなる群から選ばれることを特徴とし、
前記接合体ナノ物質（ｐｏｌｙｐｌｅｘ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、ポリ（アミドアミン）（ｐｏｌｙ（ａｍｉｄｏａｍｉｎｅ））又はＰＥＩ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）であることを特徴とし、
前記高分子ナノ球（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ）は、ポリカプロラクトン（ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ））、ポリ乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ）、ポリグリコール酸（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）、ポリ（ｄ，ｌ−ラクチド）（ｐｏｌｙ（ｄ，ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ））、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）及びＰＬＧＡ−ポリエチレングリコール（ＰＬＧＡ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）からなる群から選ばれることを特徴とし、
前記無機物ナノ物質（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）はＦｅ２Ｏ３Ｆｅ３Ｏ４、ＷＯ３及びＷＯ２．９からなる群から選ばれることを特徴とする。
【００４５】
本発明において、前記陽イオン脂質ナノ物質（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、１−（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｂｉｓ［Ｎ−（ｏｌｅｉｃｙｌｃｙｓｔｅｉｎｙｌ−１−ａｍｉｎｏ−ｅｔｈｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｅ］、ＰＴＡのＮ−アルキル化誘導体（Ｎ−ａｌｋｙｌａｔｅｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ＰＴＡ）及び３，５−ジドデシルオキシベンズアミジン（３，５−ｄｉｄｏｄｅｃｙｌｏｘｙｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ）からなる群から選ばれることを特徴とし得る。
【００４６】
また、好ましい一例として、本発明において、前記陽イオン高分子（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ）は、ビニルピロリドン−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリル酸共重合体ジエチル硫酸塩（ｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ  ａｃｉｄ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｄｉｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｐｈａｔｅ）、ポリイソブチレン（ｐｏｌｙｉｓｏｂｕｔｙｌｅｎｅ）及びポリ（Ｎ−ビニルカルバゾール）（ｐｏｌｙ（Ｎ−ｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ））から構成される群から選ばれることを特徴とし、
前記ｐＨ感応性高分子（ｐＨ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）は、ポリ酸（ｐｏｌｙａｃｉｄｓ）、ポリ（アクリル酸）（ｐｏｌｙ（ａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ））、ポリ（メタクリル酸）（ｐｏｌｙ（ｍｅｔｈａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ））及び加水分解されたポリアクリルアミド（ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）からなる群から選ばれることを特徴とし得る。
【００４７】
本発明において、前記生物活性核酸とキャリアペプチド核酸はそれぞれ２〜５０個、好ましくは５〜３０個、より一層好ましくは１０〜２５個、最も好ましくは１５〜１７個の核酸単量体を含むことを特徴とし得る。
【００４８】
前記生物活性核酸は天然（ｎａｔｕｒａｌ）核酸塩基及び／又は修飾された核酸単量体からなっていることを特徴とし得る。
【００４９】
本発明において、前記生物活性核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾された核酸であるＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＭＯ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＧＮＡ（ｇｌｙｃｏｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＴＮＡ（ｔｈｒｅｏｓｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）及びＤＮＡｚｙｍｅからなる群から選ばれることを特徴とし、好ましくはＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾された核酸であるＰＮＡ、ＰＭＯ、ＬＮＡ、ＧＮＡ及びＴＮＡからなる群から選ばれることを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【００５０】
本発明において、前記生物活性核酸に使用された単量体がＰＮＡの場合、生物活性ペプチド核酸といい、他の単量体が使用された場合にも同じ方式で呼ぶ。
【００５１】
本発明において、前記キャリアペプチド核酸は、前記生物活性核酸と塩基配列の一部或いは全部が相補的な配列で構成されることを特徴とし得る。特に、キャリアペプチド核酸は、ユニバーザル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）を一つ以上含むことができ、キャリアペプチド核酸の全てがユニバーザル塩基からなってもよい。
【００５２】
本発明において、前記生物活性核酸とキャリアペプチド核酸は、ホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）、２’０−メチル（２’０−ｍｅｔｈｙｌ）、２’メトキシ−エチル（２’  ｍｅｔｈｏｘｙ−ｅｔｈｙｌ）、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、メチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）及びホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）から構成される群から選ばれるいずれか一つ以上の官能基をさらに含むことを特徴とし得る。
【００５３】
本発明において、前記生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸のそれぞれは、電気的特性が全体的に、正電荷（陽性）、負電荷（陰性）又は中性電荷を有することを特徴とする複合体であり得る。
【００５４】
前記電気的特性の表現において、“全体的に”との意味は、個別塩基の電気的特性ではなく全体的な生物活性核酸又はキャリアペプチド核酸のそれぞれの電荷が外部から見て全体的な電気的特性であることを意味し、例えば、生物活性核酸内の一部単量体が陽性を有しても、陰性を有する単量体の個数が相対的に多く存在する場合には、生物活性核酸は“全体的に”電気的特性からして負電荷を有するものであり、キャリアペプチド核酸内の一部塩基及び／又はバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）が陰性を有しても、陽性を有する塩基及び／又はバックボーンの個数が相対的に多く存在する場合には、キャリアペプチド核酸は“全体的に”電気的特性からして正電荷を有するものである。
【００５５】
このような観点で、本発明の構造式（１）の構造を有する核酸複合体は、全体的に正電荷を有することを特徴とし得る。前記構造式（１）による核酸複合体において、好ましくは前記生物活性核酸は全体的に電気的特性からして負電荷又は中性の特性を有し、前記キャリアペプチド核酸は全体的に電気的特性からして正電荷特性を有することを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【００５６】
本発明において、前記生物活性核酸とキャリアペプチド核酸の電気的特性の付与は、修飾されたペプチド核酸単量体を使用することができ、修飾されたペプチド核酸単量体は、正電荷を有するキャリアペプチド核酸として、リシン（Ｌｙｓｉｎｅ，Ｌｙｓ，Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ａｒｇ，Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，Ｈｉｓ，Ｈ）、ジアミノ酪酸（Ｄｉａｍｉｎｏ  ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ，ＤＡＢ）、オルニチン（Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ，Ｏｒｎ）及びアミノ酸類似体からなる群から選ばれるいずれか一つ以上の正電荷のアミノ酸を含み、負電荷を有するキャリアペプチド核酸として、負電荷のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ，Ｇｌｕ，Ｅ）又はアミノ酸類似体の負電荷のアミノ酸を含むことを特徴とし得る。
【００５７】
本発明において、前記キャリアペプチド核酸は全体的に正電荷を有するように１個以上のガンマ−又はアルファ−バックボーン修飾ペプチド核酸単量体を含むことを特徴とし得る。
【００５８】
前記ガンマ−或いはアルファ−バックボーン修飾ペプチド核酸単量体は、電気的陽性を有するように、リシン（Ｌｙｓｉｎｅ，Ｌｙｓ，Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ａｒｇ，Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，Ｈｉｓ，Ｈ）、ジアミノ酪酸（Ｄｉａｍｉｎｏ  ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ，ＤＡＢ）、オルニチン（Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ，Ｏｒｎ）及びアミノ酸類似体からなる群から選ばれるいずれか一つ以上の正電荷を有するアミノ酸をバックボーンに含むことを特徴とし得る。
【００５９】
本発明において、電荷付与のためのペプチド核酸単量体の修飾は、前記バックボーン修飾の他にも、ヌクレオ塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）が修飾されたペプチド核酸単量体を使用することができる。好ましくは、電気的陽性を有するようにアミン、トリアゾール、イミダゾール残基をヌクレオ塩基に含んだり、或いは電気的陰性を有するようにカルボン酸を塩基に含むことを特徴とし得る。
【００６０】
本発明において、前記キャリアペプチド核酸の修飾ペプチド核酸単量体は、負電荷をバックボーン或いはヌクレオ塩基にさらに含んでもよいが、修飾ペプチド核酸単量体は、正電荷を有する単量体が負電荷を有する単量体に比べて多く含まれ、全体的にキャリアペプチド核酸の電荷が陽性になることが好ましい。
【００６１】
好ましくは、本発明に係る前記構造式（１）の核酸複合体は、全体的に陽の電荷を有することを特徴とする。
【００６２】
本発明に係る前記構造式（１）の核酸複合体において、疎水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、親水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、標的抗原特異的抗体、アプタマー又は蛍光／発光マーカーなどからなる群から選ばれる一つ以上の物質が生物活性核酸及び／又はキャリアペプチド核酸に結合していることを特徴とし、好ましくは、前記疎水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、親水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、標的抗原特異的抗体、アプタマー及びイメージングのための蛍光／発光マーカーなどからなる群から選ばれる一つ以上の物質は、前記キャリアペプチド核酸に結合したものであり得る。
【００６３】
本発明において前記疎水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、親水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、標的抗原特異的抗体、アプタマー、クエンチャー、蛍光マーカー及び発光マーカーからなる群から選ばれる一つ以上の物質と生物活性核酸及び／又はキャリアペプチド核酸の結合は、単純共有結合又はリンカーで媒介した共有結合であることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない（表１参照）。好ましくは、前記核酸運搬体に結合した細胞透過、溶解度、安定性、運搬及びイメージング関連物質（例えば、疎水性残基など）は、標的遺伝子の発現を調節する生物活性核酸と独立して存在する。
【００６４】
本発明において、前記生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸の相補的な結合形態は、大きく、逆平行結合（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）と平行結合（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）の形態を有することを特徴とし得る。前記相補的な結合形態は、生物活性核酸の目的配列（生物活性核酸と相補的な配列）の存在下で分離される構造を有する。
【００６５】
前記逆平行結合と平行結合は、ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＰＮＡの結合方式において、５’−方向性と３’−方向性によって決定される。逆平行結合は一般的なＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＰＮＡの結合方式であり、本発明に係る構造式（１）の核酸複合体を取り上げて説明すると、生物活性核酸は５’から３’方向に、キャリアペプチド核酸は３’から５’方向に互いに結合する形態を意味する。平行結合は逆平行結合に比べては結合力が多少劣る形態であり、生物活性核酸とキャリアペプチド核酸の両方とも５’から３’方向に又は３’から５’方向に互いに結合する形態を意味する。
【００６６】
本発明に係る構造式（１）の核酸複合体において、好ましくは前記生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸の結合力は、生物活性核酸と生物活性核酸の目的とする遺伝子、特に目的遺伝子のｍＲＮＡとの結合力よりも低いことを特徴とし得る。前記結合力は、融解温度、ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ又はＴｍによって決定される。
【００６７】
前記生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸の結合力（融解温度、ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，Ｔｍ）を生物活性核酸と生物活性核酸の目的とする遺伝子、特に目的遺伝子のｍＲＮＡとの結合力よりも低くするための具体的な方法は、例えば、前記生物活性核酸とキャリアペプチド核酸が平行結合（Ｐａｒａｌｌｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）又は部分特異結合（Ｐａｒｔｉａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）することを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
【００６８】
他の例として、前記キャリアペプチド核酸がリンカー、ユニバーザル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）及び生物活性核酸の対応する塩基と相補的でない塩基を有するペプチド核酸塩基から構成された群から選ばれる一つ以上のペプチド核酸塩基を有することを特徴とし得るが、これに限定されるものではない（表１参照）。
【００６９】
本発明において、前記ユニバーザル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）は、アデニン（ａｄｅｎｉｎｅ）、グアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）、シトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ）、チミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）、ウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）などの天然塩基と選択性無しで結合し、相補的な結合力よりも低い結合力を有する塩基としてイノシンＰＮＡ（ｉｎｏｓｉｎｅ  ＰＮＡ）、インドールＰＮＡ（ｉｎｄｏｌｅ  ＰＮＡ）、ニトロインドールＰＮＡ（ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ＰＮＡ）及び無塩基（ａｂａｓｉｃ）からなる群から選ばれる一つ以上を使用でき、好ましくはイノシンＰＮＡを使用することを特徴とし得る。
【００７０】
【表１】
2021515589.tif 000003
【００７１】
前記表１で、Ｎは核酸の塩基（ＡＴＧＣ）で、＊はアンチセンス核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）配列と相補的でない配列で、＄はユニバーザル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）で、＝はリンカーであり、５’−、３’−は核酸（塩基）の方向性を表す。
【００７２】
本発明において、前記核酸複合体の機能調節のための核酸の結合形態と電気的性質組合せを提供し、前記核酸の結合形態と電気的性質組合せで粒子サイズ及び作用時点を調節し、細胞透過性、溶解度及び特異度を向上させることを特徴とし得る。
【００７３】
本発明において、前記生物活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸の結合力調節により、目的遺伝子の存在下で、生物活性ペプチド核酸が目的配列と結合する時点（生物活性核酸の目的配列への置換される時点、標的特異的分離及び結合時点）などの調節が可能である。
【００７４】
本発明に係る構造式（１）の核酸複合体において、生物活性核酸の目的遺伝子への置換（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）時点、標的特異的分離及び結合（ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ｂｉｎｄ）時点の調節は、複合体の非特異結合のためのキャリアペプチド核酸の非特異塩基、ユニバーザル塩基及びリンカーの有無、個数及び位置によって調節が可能であることを特徴とし得る。前記ペプチド複合体の相補的な結合の形態である平行（ｐａｒａｌｌｅｌ）又は逆平行（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ）形態の結合などと前記条件の組合せによって調節が可能であることを特徴とし得る。
【００７５】
本発明において、前記構造式（１）の核酸複合体の粒子は５ｎｍ〜３００ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜８０ｎｍ、最も好ましくは１５ｎｍ〜７０ｎｍの大きさを有することを特徴とし得る。
【００７６】
本発明において、前記核酸複合体の粒子サイズは、生物活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸の電荷バランス（ｃｈａｒｇｅ  ｂａｌａｎｃｅ）を調節することによって調節されることを特徴とし得る。具体的には、キャリアペプチド核酸の正電荷が増加すると粒子のサイズが小さくなるが、キャリアペプチド核酸の正電荷が一定レベルを超えると粒子のサイズが大きくなる特徴を有する。また、粒子サイズを決定する他の重要な要素として、複合体をなす生物活性ペプチド核酸電荷による全般的なキャリアペプチド核酸との適切な電荷バランスによって粒子サイズが決定される。
【００７７】
本発明に係るキャリアペプチド核酸の陽電荷は、１個〜７個（陽電荷を有する単量体が１個〜７個含まれることを意味する。）、好ましくは２個〜５個、最も好ましくは２個〜３個であり、生物活性核酸の電荷は電荷バランスのネットチャージ（ｎｅｔ  ｃｈａｒｇｅ）が負電荷０個〜５個、好ましくは０個〜３個である。
【００７８】
本発明において、前記構造式（１）の核酸複合体は、生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸が適切な条件で混成化されることによって製造され得る。
【００７９】
本発明の“混成化”は、相補的な一本鎖核酸二本鎖核酸を形成することを意味する。混成化は、２本の核酸鎖間の相補性が完全な場合（ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ）に起こったり又は一部の不整合（ｍｉｓｍａｔｃｈ）塩基が存在しても起こることができる。混成化に必要な相補性の程度は混成化条件によって変わり、特に結合温度によって調節可能である。
【００８０】
本発明において、前記生物活性核酸又はキャリアペプチド核酸の両末端には、レポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）とレポーター蛍光を消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）可能なクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が結合できる。前記レポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）はＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、ＨＥＸ（２’，４’，５’，７’，−ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏ−６−ｃａｒｂｏｘｙ−４，７−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）及びＣＹ５から構成される群から選ばれる一つ以上であり得、好ましくは、ＣＹ５を使用する。前記クエンチャーはＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２及びＤａｂｃｙｌから構成される群から選ばれるいずれか一つ以上であり得るが、これに限定されるものではない。
【００８１】
本発明は、他の観点において、前記構造式（１）の構造を有する核酸複合体を含む疾病の診断用組成物に関する。
【００８２】
本発明は、さらに他の観点において、前記構造式（１）の構造を有する核酸複合体を含む疾病の予防又は治療用組成物に関する。
【００８３】
本発明は、さらに他の観点において、前記構造式（１）の構造を有する核酸複合体を予防又は治療が必要な患者に投与することを特徴とする疾病の予防又は治療方法に関する。
【００８４】
本発明はさらに他の観点において、疾病の予防又は治療のための前記構造式（１）の構造を有する核酸複合体の用途に関する。
【００８５】
本発明はさらに他の観点において、疾病の予防又は治療用薬剤の製造のための前記構造式（１）の構造を有する核酸複合体の使用に関する。
【００８６】
本発明の“標的遺伝子”は、活性、抑制又は標識しようとする核酸配列（塩基配列）を意味し、用語“標的核酸”と同一のものであり、本明細書で同じ意味で使われる。
【００８７】
前記標的遺伝子を含む標的核酸（塩基配列）が生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）又は生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で前記複合体と接触（結合）すると、キャリアペプチド核酸から生物活性核酸が分離され、生物学的活性を示す。
【００８８】
本発明において、前記構造式（１）の構造を有する核酸複合体を用いて診断又は予防、治療できる疾病は、前記核酸複合体内の生物活性核酸が結合する標的遺伝子によって決定され、好ましくは癌又は腫瘍であるが、これに限定されるものではない。
【００８９】
本発明において、用語“治療用組成物”は、“医薬（薬剤学的、薬学的）組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）”と同じ意味で使用でき、本発明の生物活性核酸及び前記核酸と結合するキャリアペプチド核酸を含む核酸複合体を有効成分として含む。
【００９０】
本発明の治療用組成物は、標準医薬実施によって経口又は非経口投与剤形の形態で剤形化できる。それらの剤形は、有効成分の他に薬学的に許容される担体、賦形剤、補助剤又は希釈剤などの添加物を含有してもよい。
【００９１】
用語“薬学的に許容される（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）”とは、化合物の生物学的活性と物性を損傷させない特性を意味する。
【００９２】
用語“担体（ｃａｒｒｉｅｒ）”とは、細胞又は組織内への複合体の付加を容易にする化合物と定義される。例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、生物体の細胞又は組織内への多くの有機化合物の投入を容易にする通常の担体である。
【００９３】
用語“希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）”とは、対象化合物の生物学的活性形態を安定化させるだけでなく、化合物を溶解させる水で希釈される化合物と定義される。バッファー溶液に溶解されている塩は、当該分野で希釈剤として用いられる。通常用いられるバッファー溶液は、リン酸塩バッファー食塩水であり、これはヒト溶液の塩状態を摸倣しているためである。バッファー塩は低い濃度で溶液のｐＨを制御できるので、バッファー希釈剤が化合物の生物学的活性を変形することは稀である。
【００９４】
ここに使用された複合体を含有する化合物は、ヒト患者に、それ単独で又は併用療法（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）のように他の活性成分と併用して又は適当な担体や賦形剤と共に混合された医薬組成物として投与できる。
【００９５】
本発明における使用に適した医薬組成物には、活性成分がそれらの意図した目的を達成するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。より具体的に、治療的有効量は、治療される客体の生存を延長したり、疾患の症状を防止、軽減又は緩和させるのに有効な化合物の量を意味する。治療的有効量の決定は、特に、ここに提供された詳細な開示内容の側面において、通常の技術者の能力範囲内にある。
【００９６】
本発明で用いられる用語“予防”は、前記複合体又はその医薬的に許容可能な塩を含む医薬組成物の投与（又は塗布）によって抗癌活性を示し、癌の増殖を抑制又は遅延させる全ての行為を意味する。また、本発明で用いられる用語“治療”とは、前記複合体又はその医薬的に許容可能な塩を含む医薬組成物の投与（又は塗布）によって癌疾患の症状が好転又は完治する全ての行為を意味する。
【００９７】
本発明において、前記核酸複合体を含む組成物で予防又は治療できる疾病は、腫瘍又は癌、炎症性疾患、老人性黄斑変性、糖尿病性網膜症、希少疾患及び重症疾患、心血管疾患、代謝性疾患又は皮膚疾患などがあるが、これに限定されるものではない。
【００９８】
本発明において、前記核酸複合体を含む疾病の予防又は治療用組成物が治療できる疾病は、核酸複合体内に含まれた生物活性核酸が結合する標的遺伝子によって決定される。前記生物活性核酸が結合する標的遺伝子の例には、癌治療のための標的遺伝子は、ＶＥＧＦ、アンドロゲン受容体、クラステリン（Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ）、ＴＧＦβＲ２、ＥＲＢＢ３、ＡＢＣＢ１、及びＰＤ−Ｌ１などがあり、炎症疾患を標的にする遺伝子はＰＤＥ４Ｂ又はＰｅｌｌｉｎｏ−１であり、希少疾患及び重症疾患を標的とする遺伝子は、ＳＭＮ２、ＡｐｏＢ−１００、ＩＣＡＭ−１、ＡｐｏＣＩＩＩ、ＴＴＲ、ＨＴＴ、ＧＨｒ、ＳＯＤ１、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＫＫ、ｍｉＲ−２１、ＴＭＰＲＳＳ６、ＦＭＲ１又はＣｏｎｎｅｘｉｎ  ２６である。心血管疾患を標的とする遺伝子は、Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ、Ａｐｏ（ａ）、ＡｐｏＣＩＩＩ又はＡＧＴであり、代謝性疾患を標的とする遺伝子はＧＣＧＲ、ＡＮＧＰＴＬ３、ｍｉＲ−１０３／１０７又はＤＧＡＴ２である。皮膚疾患を標的とする遺伝子はＩＦＩ１６、ＴＬＲ６又はＴＩＥＧ１を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００９９】
本発明において、前記治療用組成物は、それらの単独或いは以下に説明するような薬剤学的に許容される担体又は賦形剤と共に、公知の方法で非経口又は経口投与用剤形に製剤化できる。このような剤形の具体的な例としては、注射剤、軟質カプセル剤、硬質カプセル剤、錠剤、シロップ剤などの経口剤又は外用剤を挙げることができる。
【０１００】
好ましくは、前記核酸複合体を含む治療用組成物は、非経口投与用剤形に製造して使用できる。適切な非経口投与用剤形には、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射又は胸部内注射用などに適切な注射液又は凍結乾燥剤形を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【０１０１】
本発明において、前記核酸複合体を含む組成物は、皮膚伝達（ｓｋｉｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）経路を通じて投与され得る。皮膚伝達のための剤形は、水性溶液、クリーム及び軟膏などから選択され得るが、これに限定されず、皮膚伝達のために当該技術の分野に公知のいずれの形態の剤形も利用可能である。
【０１０２】
非経口投与用剤形に製剤化するために、本発明に係る複合体を含み、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のいずれか１成分又は２以上の成分を混合して使用することができ、必要によって、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤をさらに添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形に製剤化してもよい。特に、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）された形態の剤形に製剤化して提供することが好ましい。凍結乾燥剤形の製造のために、本発明の属する技術分野における通常の方法を用いることができ、凍結乾燥のための安定化剤が追加されてもよい。さらに、当該分野における適正な方法で又はレミングトン薬学の科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）に開示の方法を用いて各疾病にしたがって又は成分にしたがって好ましく製剤化できる。
【０１０３】
また、本発明に係る治療用組成物は、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、軟膏剤、シロップ剤、点眼液などのような経口投与剤形に剤形化できるが、このとき、薬学的に許容される一つ以上の賦形剤が添加され得る。
【０１０４】
本発明において、前記核酸複合体を含む組成物は、癌の予防又は治療用組成物であることを特徴とし得る。治療可能な腫瘍又は癌は、特に制限されず、固形癌及び血液癌のいずれをも含む。好ましくは、乳癌、前立腺癌又は肺癌であることを特徴とし得る。
【０１０５】
好ましくは、本発明に係る癌治療のための核酸複合体内に含まれた生物活性核酸が結合する標的遺伝子は、ＶＥＧＦ、ＰＤ−Ｌ１、アンドロゲン受容体、クラステリン、ＴＧＦβＲ２、ＥＲＢＢ３、ＡＢＣＢ１、及びＰＤＥ４Ｂから構成された群から選ばれるいずれか一つ以上を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【０１０６】
本発明において、前記構造式（１）の構造を有する核酸複合体を含む癌の予防又は治療用組成物は、配列番号１〜配列番号３で表されるＶＥＧＦ特異的生物活性ペプチド核酸又は配列番号１０で表されるＰＤ−Ｌ１特異的生物活性ペプチド核酸及びこれに相補的なキャリアペプチド核酸を含む。前記キャリアペプチド核酸は、好ましくは配列番号４〜配列番号９（ＶＥＧＦ）又は配列番号１１（ＰＤ−Ｌ１）の配列を有することができ、前記配列の一部がユニバーザル塩基に置換されて用いられてもよい。
【０１０７】
本発明において、前記構造式（１）の構造を有する核酸複合体を含む癌の予防又は治療用組成物は、配列番号１２〜配列番号１５で表されるアンドロゲン受容体特異的生物活性ペプチド核酸及びこれに相補的なキャリアペプチド核酸を含む。前記キャリアペプチド核酸は、好ましくは、配列番号１６〜配列番号３１の配列を有することができ、前記配列の一部がユニバーザル塩基に置換されて用いられてもよい。
【０１０８】
本発明において、前記構造式（１）の構造を有する核酸複合体を含む癌の予防又は治療用組成物は、配列番号３２〜配列番号３５で表されるクラステリン特異的生物活性ペプチド核酸及びこれに相補的なキャリアペプチド核酸を含む。前記キャリアペプチド核酸は、好ましくは、配列番号３６〜配列番号５１の配列を有することができ、前記配列の一部がユニバーザル塩基に置換されて用いられてもよい。
【０１０９】
本発明において、前記構造式（１）の構造を有する核酸複合体を含む組成物は、老人性黄斑変性（Ａｇｅｄ  Ｍａｃｕｌａｒ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）又は糖尿病性網膜症の予防又は治療用組成物であることを特徴とし得る。本発明に係る老人性黄斑変性又は糖尿病性網膜症の予防又は治療のための核酸複合体内に含まれた生物活性核酸が結合する標的遺伝子はＶＥＧＦを挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【０１１０】
前記老人性黄斑変性又は糖尿病性網膜症の予防又は治療用組成物は、配列番号１〜配列番号３で表されるＶＥＧＦ特異的生物活性ペプチド核酸及びこれに相補的なキャリアペプチド核酸を含む。キャリアペプチド核酸は、好ましくは、配列番号４〜配列番号９の配列を有することができ、前記配列の一部がユニバーザル塩基に置換されて用いられてもよい。
【０１１１】
前記老人性黄斑変性又は糖尿病性網膜症の予防又は治療用組成物は、水性溶液、注射剤、目薬又は点眼液から選ばれるいずれか一つの剤形を有することを特徴とし得る。
【０１１２】
本発明において、前記核酸複合体を含む組成物は、慢性閉塞性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＯＰＤ）の予防又は治療用組成物であることを特徴とし得る。前記核酸複合体内に含まれた生物活性核酸が結合する標的遺伝子はＰＤＥ４Ｂであるが、これに制限されるものではない。
【０１１３】
前記ＣＯＰＤの予防又は治療用組成物は配列番号５２〜５５で表されるＰＤＥ４Ｂ特異的生物活性ペプチド核酸及びこれに相補的なキャリアペプチド核酸を含む。キャリアペプチド核酸は、好ましくは、配列番号５６〜６３の配列を有することができ、前記配列の一部がユニバーザル塩基に置換されて用いられてもよい。
【０１１４】
本発明において、前記核酸複合体を含む組成物は、皮膚疾患の予防又は治療用組成物であることを特徴とし得る。前記核酸複合体内に含まれた生物活性核酸が結合する標的遺伝子は、ＴＬＲ２、Ｓｍａｄ３、ＩＦＩ１６及びＴＩＥＧ１から構成された群から選ばれるいずれか一つ以上を挙げることができるが、これに限定されるものではない。前記皮膚疾患は、乾癬、色素沈着関連皮膚疾患又はアトピー皮膚炎、皮膚損傷又はケロイド（ｋｅｌｏｉｄｓ；怪我後肥大症）などがあるが、これに限定されるものではない。
【０１１５】
好ましくは、本発明はアトピー皮膚炎（Ａｔｏｐｉｃ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）治療用組成物を提供する。本発明に係るアトピー治療用組成物は、配列番号６４又は配列番号６５で表されるＴＬＲ２特異的生物活性ペプチド核酸及びこれに相補的なキャリアペプチド核酸を含む。前記キャリアペプチド核酸は、好ましくは、配列番号６６〜配列番号７１の配列を有することができ、前記配列の一部がユニバーザル塩基に置換されて用いられてもよい。
【０１１６】
本発明はまた、皮膚損傷治療用組成物を提供する。前記治療用組成物は、皮膚創傷治療（ｓｋｉｎ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ）を含む皮膚再生（ｓｋｉｎ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）のためのものであるが、これに制限されるものではない。本発明に係る皮膚損傷治療用組成物は、配列番号７２又は７３で表されるＳｍａｄ３特異的生物活性ペプチド核酸及びこれに相補的なキャリアペプチド核酸を含む。前記キャリアペプチド核酸は、好ましくは、配列番号７４〜７８の配列を有することができ、前記配列の一部がユニバーザル塩基に置換されて用いられてもよい。
【０１１７】
本発明はまた、ケロイド治療用組成物を提供する。本発明に係るケロイド治療用組成物は、配列番号７９又は８０で表されるＴＩＥＧ１特異的生物活性ペプチド核酸及びこれに相補的なキャリアペプチド核酸を含む。前記キャリアペプチド核酸は、好ましくは、配列番号８１〜８４の配列を有することができ、前記配列の一部がユニバーザル塩基に置換されて用いられてもよい。
【０１１８】
前記皮膚疾患の予防又は治療用組成物は、水性溶液、クリーム、ゲル、ペースト、ローション又は軟膏などの剤形に製造できるが、これに限定されるものではない。
【０１１９】
本発明において、前記核酸複合体を含む組成物は、炎症性疾患の予防又は治療用組成物であることを特徴とし得る。前記核酸複合体内に含まれた生物活性核酸が結合する標的遺伝子は、ＰＤＥ４Ｂ又はＰｅｌｌｉｎｏ−１であり得るが、これに限定されるものではない。
【０１２０】
本発明において、前記核酸複合体を含む組成物は、希少疾患及び重症疾患の予防又は治療用組成物であることを特徴とし得る。前記核酸複合体内に含まれた生物活性核酸が結合する標的遺伝子は、ＳＭＮ２、ＡｐｏＢ−１００、ＩＣＡＭ−１、ＡｐｏＣＩＩＩ、ＴＴＲ、ＨＴＴ、ＧＨｒ、ＳＯＤ１、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＫＫ、ｍｉＲ−２１、ＴＭＰＲＳＳ６又はＣｏｎｎｅｘｉｎ  ２６を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【０１２１】
好ましくは、本発明に係る希少疾患及び重症疾患は難聴であり、核酸複合体内に含まれた生物活性核酸が結合する標的遺伝子はＣｏｎｎｅｘｉｎ  ２６であり得る。
【０１２２】
本発明において、前記複合体は、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）などの伝達体を用いて投与（又は塗布）しもてよい。前記リポソームは、リンパ組織のような特定組織に対して前記複合体を標的化したり、或いは感染細胞に対して選択的に標的化することに役立てることができ、また、前記複合体が含まれた組成物の半減期を増加させることに役立てることができる。リポソームにはエマルジョン、フォーム（ｆｏａｍ）、マイセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）、不溶性単層、液晶、リン脂質分散物、ラメラ層（ｌａｍｅｌｌａｒ  ｌａｙｅｒ）などがある。このような製剤において、送達される前記複合体は、単独で又は特定細胞を対象に、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体のようなリンパ細胞のうち優勢な受容体に結合する分子と共に又はその他治療組成物と共に、リポソームの一部として混入させる。したがって、本発明の所定複合体で充填又は塗布されて（ｄｅｃｏｒａｔｅｄ）前記複合体組成物を送達するリポソームは、リンパ細胞の前記部位に指向され得る。
【０１２３】
本発明によって使用するためのリポソームは一般に、中性及び負電荷リン脂質及びコレステロールなどのステロールをはじめとする標準ベシクル（ｖｅｓｉｃｌｅ）−形成脂質から形成される。一般に、例えば、血流中のリポソームの安定性、酸不安定性（ａｃｉｄ  ｌａｂｉｌｉｔｙ）及びリポソームのサイズなどを考慮して脂質を選択する。リポソーム製造には様々な方法を用いることができる。例えば、文献［Ｓｚｏｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９：４６７，１９８０）、及び米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号及び第５，０１９，３６９号］に記載のような方法を用いることができる。
【０１２４】
本発明は一態様において、複合体又は複合体を含む組成物を個体に投与（又は塗布）して疾病を治療し抑制（又は緩和）する方法を提供する。
【０１２５】
本発明に係る複合体を用いて治療可能な疾患は、使用される生物活性核酸の特性によって決定され、特に制限されない。
【０１２６】
好ましい本発明に係る複合体を用いて治療可能な疾患の例には、癌、黄斑変性などの異常血管増殖疾患、皮膚疾患、炎症疾患、自己免疫疾患などがあるが、これに制限されない。
【０１２７】
本発明に係る複合体を含む組成物は、癌疾患を治療するために又は癌疾患の症状を抑制（又は緩和）するために医薬として効果的な量で投与（又は塗布）できる。色素沈着関連皮膚疾患の種類、患者の年齢、体重、症状の特性及び程度、現在治療法の種類、治療回数、投与（塗布）形態及び経路などの様々な要因によって変更可能であり、当該分野における専門家によって容易に決定され得る。本発明の組成物は、上述した薬理学的又は生理学的成分を共に投与（塗布）したり順次に投与（塗布）でき、また、追加の従来の治療剤と併用して投与（塗布）でき、従来の治療剤とは順次に又は同時に投与（塗布）できる。このような投与（塗布）は、単一又は多重投与（塗布）であり得る。
【０１２８】
本発明で、“個体”は、本発明に係る複合体を投与（塗布）して軽減、抑制又は治療可能な状態又は疾患を病んでいたり或いはその危険がある哺乳動物を意味し、好ましくはヒトを意味する。
【０１２９】
また、本発明の化合物の人体に対する投与量（塗布量）は、患者の年齢、体重、性別、投与（塗布）形態、健康状態及び疾患程度によって変わってもよく、体重が７０ｋｇである成人患者を基準にする時、一般に０．００１〜１，０００ｍｇ／日であり、好ましくは０．０１〜５００ｍｇ／日であり、医師又は薬剤師の判断によって一定時間間隔で１日１回又は数回分割投与（塗布）してもよい。
【０１３０】
本発明の方法で使用される任意の複合体又はこれを含む混合物に対する治療的有効量は、細胞培養分析から初期に測定され得る。例えば、線量（ｄｏｓｅ）は細胞培養で決定されたＩＣ５０（ｈａｌｆ  ｍａｘｉｍａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）又はＥＣ５０（ｈａｌｆ  ｍａｘｉｍａｌ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を含む循環濃度範囲を得るために動物モデルから計算され得る。かかる情報は、ヒトにおける有用な線量をより正確に決定するために用いることができる。
【０１３１】
ここに記載されている複合体又はこれを含む混合物の毒性と治療効率性は、例えば、ＬＤ５０（群集の５０％に対する致死量）、ＥＤ５０（群集の５０％に対して治療効果を有する線量）、ＩＣ５０（群集の５０％に対して治療抑制効果を有する線量）を決定するために、細胞培養又は実験動物における標準製薬過程によって算定され得る。毒性と治療効果間の線量比が治療指数であり、これはＬＤ５０とＥＤ５０（又は、ＩＣ５０）間の比率として表現され得る。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養分析から得られたデータは、ヒトに使用する線量の範囲を算定するために用いることができる。当該化合物の投与量（ｄｏｓａｇｅ）又は塗布量は、好ましくは、毒性がないか或いは殆どない状態でＥＤ５０（又は、ＩＣ５０）を含む循環濃度の範囲内にある。
【０１３２】
本発明はさらに他の観点において、前記複合体を含む癌又は腫瘍診断用キットに関する。
【０１３３】
本発明において癌又は腫瘍診断のための検体試料は、ヒトを含む動物の特定組織又は器官から由来し得る。前記組織の代表例には、皮膚、筋肉又は神経組織が含まれる。前記器官の代表例には、目、脳、肺、肝、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、小腸、皐丸、卵巣、子宮、直腸、神経系、腺及び内部血管が含まれる。
【０１３４】
前記検体試料は、生物学的根源から出たいかなる細胞、組織、流体液（ｆｌｕｉｄ）、又は本発明によってよく分析され得るいかなる他の媒質（ｍｅｄｉｕｍ）も含み、これはヒト、動物、ヒト又は動物の消費のために製造された飲食から得た試料が含まれる。また、分析される生物試料は、体液試料を含み、これは喀痰、血液、血清、血漿、リンパ、母乳、小便、糞便、眼球流液、唾液、精液、脳抽出物（例えば、脳粉砕物）、脊髓液、虫垂、脾臓及び扁桃腺組織抽出物が含まれるが、これに限定されるものではない。
【０１３５】
本発明のキットは、バッファー、ＤＮＡ重合酵素助因子及びデオキシリボヌクレオチド−５−トリリン酸塩のような標的増幅ＰＣＲ反応（例えば、ＰＣＲ反応）を実施するのに必要な試薬を選択的に含むことができる。また、前記キットは、様々なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、バッファー及び試薬、及びＤＮＡ重合酵素活性を抑制する抗体を含むことができる。なお、前記キットは、特定反応で使用される試薬の最適量は、本明細書に開示の事項を習得した通常の技術者によって容易に決定され得る。典型的に、前記キットは、前述した構成成分を含む別個の包装又はコンパートメント（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）として作製可能である。
【０１３６】
本発明において、前記キャリアペプチド核酸は生物活性核酸と相補的に水素結合して前記核酸を細胞内に運搬でき、前記生物活性核酸は標的遺伝子と結合して標的遺伝子の発現を調節することを特徴とし得る。
【０１３７】
したがって、本発明はさらに他の観点において、前記構造式（１）の構造を有する核酸複合体を含む標的遺伝子発現調節用組成物に関する。
【０１３８】
本発明はさらに他の観点において、前記構造式（１）の構造を有する核酸複合体を用いることを特徴とする標的遺伝子発現調節方法に関する。
【０１３９】
本発明において、前記標的遺伝子発現調節方法は、（ａ）エンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ）を助ける物質を含む生物活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）とキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）を結合させて複合体を形成する段階；及び（ｂ）前記複合体を標的細胞に接触させて細胞内に導入する段階を含むことを特徴とし得る。
【０１４０】
本発明において、前記標的細胞は、前述した癌又は腫瘍由来細胞であるが、これに限定されない。本発明において、前記（ｂ）段階で複合体が細胞内に導入されて移動した後、生物活性核酸は相補的な塩基配列を有する標的核酸と結合し、キャリアペプチド核酸と分離されることを特徴とし、前記生物活性核酸は標的遺伝子と結合して標的遺伝子の発現を調節することを特徴とし得る。
【０１４１】
本発明によれば、前記複合体は、標的核酸（標的配列）が不在する場合、生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸が相補的な結合を維持するのに対し、生物活性核酸の塩基配列と相補性をなす標的核酸が存在する場合には、“生物活性核酸の目的配列への置換（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）”、“標的特異的分離及び結合（ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ｂｉｎｄ）”方法により、生物活性核酸がキャリアペプチド核酸から分離されて標的核酸と結合する。前記分離及び結合の時点は、生物活性核酸のキャリアペプチド核酸と標的核酸の塩基配列の相補性に基づくそれぞれの核酸（塩基）間の水素結合力の調節によって調節可能であることを特徴とし得る。
【０１４２】
したがって、本発明の好ましい具現例によれば、標的特異的分離及び結合方法は；ｉ）相補的な結合のうち一部が異なる配列（ｐａｒｔｉａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を持つキャリアペプチド核酸構造によって“単一塩基配列変異（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）”、或いは“生物活性核酸よりも短い配列”を有するように作製したり、ｉｉ）キャリアペプチド核酸の一部配列をユニバーザル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）に置き換えたり、ｉｉｉ）キャリアペプチド核酸の一部配列をリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）に置き換えたり、ｖｉ）生物活性核酸に平行（ｐａｒａｌｌｅｌ）に結合するキャリアペプチド核酸構造を有するようにし、標的核酸と生物活性核酸との結合力よりもキャリアペプチド核酸と生物活性核酸との結合力が相対的に低く作製される方式として具現でき、該方法は２以上の組合せで利用可能であり、平行結合（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）方式を用いることが好ましい。
【０１４３】
前記ユニバーザル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）は、アデニン（ａｄｅｎｉｎｅ）、グアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）、シトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ）、チミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）、ウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）などの天然塩基と選択性無しに結合し、相補的な結合力よりも低い結合力を有する塩基として、イノシンＰＮＡ（ｉｎｏｓｉｎｅ  ＰＮＡ）、インドールＰＮＡ（ｉｎｄｏｌｅ  ＰＮＡ）、ニトロインドールＰＮＡ（ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ＰＮＡ）及び無塩基（ａｂａｓｉｃ）から構成された群から選ばれる一つ以上を使用でき、好ましくは、イノシンＰＮＡを使用することを特徴とし得る。
【０１４４】
前記生物活性核酸とキャリアペプチド核酸との結合力調節によって生物活性核酸とキャリアペプチド核酸の分離時点及び生物活性核酸と生物活性核酸の目的とする遺伝子との結合時点を調節できる長所がある。
【０１４５】
本発明において、構造式（１）の構造を有する核酸複合体においてエンドソーム脱出を助ける物質を含まない構造式［Ａ≡Ｃ（＋）］の構造を有する核酸複合体を用いて、その効能を検証した。ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６を参照できる。
【０１４６】
本発明に係るキャリアペプチド核酸（すなわち、修飾されたキャリアペプチド核酸）は、修飾されなかった従来のネイキッドペプチド核酸（ｎａｋｅｄ−ＰＮＡ）の自己凝集（ｓｅｌｆ−ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）性質などによる沈殿問題を解消しており、細胞透過性、溶解度の増加及び細胞内拡散効果を増進させることができる。
【０１４７】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものとして解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【０１４８】
実施例１：構造式（１）の構造を有する新規複合体を用いたヒト由来乳癌細胞及び肺癌細胞における血管内皮成長因子の抑制による抗癌薬理効果確認
【０１４９】
多くの癌細胞で高い発現が確認される血管内皮成長因子であるＶＥＧＦは、癌細胞で細胞血管増殖を誘導するものと知られており、これに対する新規複合体を用いてＶＥＧＦを抑制し、抗癌薬理効果を確認した。
【０１５０】
血管内皮細胞成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）は、血管、リンパ管の発生と恒常性に関与し、神経細胞にも重要な効果を有する。このようなＶＥＧＦは、腫瘍及び目における疾病に関連した新血管生成の重要な媒介因子として知られた。また、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡは、調査した大多数のヒトの腫瘍によって過発現した（Ｂｅｒｋｍａｎなど、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．，９１：１５３−１５９（１９９３））。癌はそれ自身の成長のために栄養分の供給と老廃物を排出する通路として新しい毛細血管を必要とし、このために癌細胞と癌の基質細胞はＶＥＧＦを継続的に分泌し、分泌されたＶＥＧＦは組織を通して拡散され、血管内皮細胞の移動を促進する（Ｆｅｒｒａｒａ．Ｎ．等，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，２：７９５−８０３，（２００２））。癌細胞によって誘導された新生血管は周囲細胞の助けを受けないので、正常に形成された毛細血管に比べて不完全であるという特徴がある。ＶＥＧＦは受容体であるＶＥＧＦＲ１、２、３に結合するが、ＶＥＧＦＲ２を通じて内皮細胞の増殖、移動、透過性を誘導する信号を伝達する（Ｚｅｎｇ  Ｈ．等，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：２６９６９−２６９７６（２００１））。したがって、ＶＥＧＦをターゲットする薬物を用いて新生血管形成を制御することによって、癌細胞の増殖及び新生血管形成関連疾患を治療することができる。
【０１５１】
実施例１−１．細胞培養
【０１５２】
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）から入手したヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、ヒト肺癌細胞（Ａ５４９）及びヒト子宮癌細胞（ＨｅＬａ）をＤＭＥＭ培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、ウェルジン、韓国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１５３】
実施例１−２．核酸複合体の細胞内導入、細胞透過性及びエンドソーム脱出の変化確認
【０１５４】
血管内皮成長因子を抑制するための新規複合体は、血管成長の必須遺伝子であるＶＥＧＦ  ｍＲＮＡと相補的な配列（配列番号１〜配列番号３）の生物活性ペプチド核酸を作製し、エンドソーム脱出を助ける物質が含まれた生物活性ペプチド核酸と相補的なキャリアペプチド核酸（配列番号４〜配列番号９）を作製した後、同量を混成化して複合体を作製した（表２参照）。生物学的活性を有するペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸が結合している複合体の処理方法は、ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６に開示の通りである。
【０１５５】
【表２】
2021515589.tif 000004
【０１５６】
実施例１−１で培養された細胞を８ウェルプレートにウェル当たり５×１０３ｃｅｌｌｓを培養し、複合体処理して２４、４８、７２、９６時間間隔で培養した後、処理時間経過後アクリジンオレンジ染色（Ａｃｒｉｄｉｎｅ  ｏｒａｎｇｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）の方法で核酸複合体の細胞透過性及びエンドソーム脱出の変化を確認した。
【０１５７】
本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表３の通りである。
【０１５８】
【表３】
2021515589.tif 000005
【０１５９】
図１Ａに示すように、ヒト由来子宮癌細胞株で、エンドソーム脱出残基（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ  ｍｏｉｅｔｙ）を添加するによって、添加していない核酸複合体に比べて早く細胞質に出ることを確認した。
【０１６０】
実施例１−３．ヒト由来乳癌細胞と肺癌細胞株における細胞生存率分析
【０１６１】
新規複合体の血管内皮成長因子抑制程度を分析するために、実施例１−１で培養された細胞を９６−ウェルプレートにウェル当たり６×１０３ｃｅｌｌｓを培養し、複合体処理して２４、４８、７２、９６時間間隔で培養した後、処理時間経過後に、ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６に開示の実験条件で細胞生存率を確認した。
【０１６２】
本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表４の通りである。
【０１６３】
【表４】
2021515589.tif 000006
【０１６４】
その結果、図１Ｂ及び図１Ｃに示すように、新規複合体を用いた血管内皮成長因子抑制によって細胞生存率が抑制されることが、ヒト由来乳癌細胞と肺癌細胞で確認された。
【０１６５】
実施例１−４．ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）で遺伝子発現の分析
【０１６６】
新規複合体の血管内皮成長因子抑制程度を分析するために、実施例１−１で培養された細胞を６−ウェルプレートにウェル当たり１×１０５ｃｅｌｌｓを培養し、複合体処理して２４、４８、７２、９６時間間隔で培養した後、処理時間経過後に、抗ＶＥＧＦ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、米国）、抗ｐ−Ａｋｔ１（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、米国）を用いて、ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６に開示の条件でタンパク質発現を分析した。
【０１６７】
本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表５の通りである。
【０１６８】
【表５】
2021515589.tif 000007
【０１６９】
図１Ｄに示すように、血管内皮成長因子であるＶＥＧＦと下位遺伝子であるｐ−Ａｋｔ１のタンパク質発現が抑制されることが確認できた。
【０１７０】
実施例１−５．流細胞分析機（ＦＡＣＳ）を用いた細胞死の分析
【０１７１】
新規複合体の血管内皮成長因子抑制を用いた細胞死を分析するために、実施例１−１で培養された細胞を６−ウェルプレートにウェル当たり１×１０５ｃｅｌｌｓを培養し、複合体処理後７２時間培養して細胞を収集した後、ＦＩＴＣアネキシンＶアポトーシス検出用キット（ＢＤ、米国）のアネキシンＶ結合バッファー５００μＬによく溶解させた後、ＦＩＴＣアネキシンＶとよう化プロピジウム染色液をそれぞれ５μＬ処理し、流細胞分析機専用チューブに移して利用し、処理時間経過後にＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏII（ＢＤ、米国）で分析した。
【０１７２】
本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表６の通りである。
【０１７３】
【表６】
2021515589.tif 000008
【０１７４】
その結果、生物活性ペプチド核酸と結合するキャリアペプチド核酸のチャージ（Ｃｈａｒｇｅ）又は長さの異なる複合体を分析した結果、それぞれ０．６〜３．１％の細胞死が誘導されることが確認された（図１Ｅ）。
【０１７５】
実施例２：血管内皮成長因子を標的遺伝子とする生物活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸候補物質複合体を用いた抗癌薬剤評価
【０１７６】
下記表７の構造で製造されたＶＥＧＦを標的遺伝子とする生物活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む候補物質複合体を用いて、ヒト由来乳癌腫瘍細胞株及び腫瘍細胞を移植した動物モデルにおいて標的遺伝子の発現抑制による腫瘍の抑制と、癌細胞の表面で発現して続けて癌細胞の増殖を誘導するＰＤ−Ｌ１を標的とする生物活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む新規複合体とＶＥＧＦを標的遺伝子とする候補物質複合体を共に組み合わせて処理したときの癌細胞成長抑制の有無を分析する。
【０１７７】
【表７】
2021515589.tif 000009
【０１７８】
実施例２−１．ヒト由来乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）が移植されたマウスにおける生物活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸候補物質複合体の尾静脈投与による抗癌薬効評価
【０１７９】
抗癌薬効の評価のために特定病原体不在（ＳＰＦ）ＢＡＬＢ／Ｃ系統及び雌ヌードマウス（Ｎａｒａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ、韓国）を用いてヒト由来乳癌細胞を培養し、５週齢の雌ヌードマウスに移植のために、培養されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株を３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調節した後、調節された細胞培養液をマウス当たり０．３ｍｌ（９×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）ずつ右側の肩胛部と胸壁との間の腋窩部位の皮下に注入した。生物活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸候補物質複合体を陰性対照物質（１ｍｇ／ｋｇ 、２ｍｇ／ｋｇ）とサンプル  １、２、３、４（１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ）として調製されたものをマウス当たり０．１ｍｌずつ２回／週（日数（ｄａｙｓ）０、３、７、１０、１４、１７）で尾静脈投与した。全ての動物に対して、注射開始時及び試験期間中に、投与直前の一般症状観察及び体重測定をした。癌細胞移植後、群別平均腫瘍サイズが３７．７ｍｍ３到達した時から２１日目まで総１０回、個体別にバーニアキャリパー（Ｖｅｒｎｉｅｒ  ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて３方向を測定した後、長さ（ｌｅｎｇｔｈ）×幅（ｗｉｄｔｈ）×高さ（ｈｅｉｇｈｔ）／２の計算式により計算した。薬物投与開始２１日目に眼窩静脈からヘパリンチューブを用いて採血（５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離、上澄液である血漿だけを分離してバイアルに分注して−７０℃に保管）した後、ＣＯ２ガスでマウスを安楽死させた後、腫瘍を分離して化学天秤（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂａｌａｎｃｅ）に重さを測定し、腫瘍組織は写真撮影した。
【０１８０】
実施例２−２．ヒト由来乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）が移植されたマウスにおける血液を用いた肝毒性指標物質分析
【０１８１】
抗癌薬効の評価を行ったマウスの採血を用いて採血した血液中の血漿を分離してアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）とアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）分析キット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、米国）分析溶液に適切な希釈比率に希釈して、ウェル当たり２０μＬになるように入れ、また、血漿中のアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）とアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の量を定量するように助ける標準物質も共に準備して入れた後、分析キット内の方法に従って反応溶液（分析溶液を含む酵素及び染色試薬混合物）を製造し、ウェル当たり総１００μＬとなるように入れてよく混ぜた後、５７０ｎｍでＯＤをスペクトロフォトメータで測定した。
【０１８２】
実施例２−３．ヒト由来乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）が移植されたマウスにおける腫瘍組織を用いたＶＥＧＦ及び下位遺伝子タンパク質発現分析
【０１８３】
抗癌薬効の評価を行ったマウスの腫瘍組織を用いて、任意に各グループの２個の組織に対してＲＩＰＡバッファー１００μｌを入れて均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）を行い、タンパク質を分離した後、抗ＶＥＧＦ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、米国）、抗ＶＥＧＦＲ１抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、米国）、抗ＶＥＧＦＲ２抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、米国）、抗ｐ−Ａｋｔ１抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、米国）、抗ｐ−Ａｋｔ１抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、米国）、抗Ｂｃｌ２抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、米国）、抗Ｓｕｒｖｉｖｉｎ抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、米国）、抗ＣｙｃｌｉｎＤ  １抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、米国）を用いて、ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６に開示の条件でタンパク質発現を分析した。ヒト由来乳癌細胞株が移植されたマウスにおける尾静脈投与による動物実験から、投与翌日から最終日まで、陰性対照物質と比較して全てのサンプル投与群において試験期間中に特異な一般症状及び統計的に有意な体重減少は観察されなかった（図２Ｂ）。また、腫瘍サイズの場合は、最終日（ｄａｙ２１）結果を見ると、陰性対照物質１ｍｇ／ｋｇ投与群と比較して、サンプル１、２、３、４の１ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ、１８．４％（ｐ＜０．０１）、２６．０％（ｐ＜０．００１）、１７．５％（ｐ＜０．０１）、２３．９％（ｐ＜０．００１）、陰性対照物質２ｍｇ／ｋｇ投与群と比較してサンプル１、２、３、４の２ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ、３０．１％（ｐ＜０．００１）、４１．４％（ｐ＜０．００１）、３２．６％（ｐ＜０．００１）、３６．４％（ｐ＜０．００１）の腫瘍成長抑制効果が見られ、最終日の腫瘍重さの場合は、薬物投与開始後２１日目にＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を切除してその重さを測定した結果、陰性対照物質１ｍｇ／ｋｇ投与群と比較してサンプル１、２、３、４の１ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ、２０．３％（ｐ＜０．０１）、２８．６％（ｐ＜０．００１）、１９．０％（ｐ＜０．０１）、２６．４％（ｐ＜０．００１）、陰性対照物質２ｍｇ／ｋｇ投与群と比較してサンプル１、２、３、４の２ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれ、３３．３％（ｐ＜０．００１）、４３．４％（ｐ＜０．００１）、３５．２％（ｐ＜０．００１）、３８．９％（ｐ＜０．００１）の腫瘍重さ減少があったことが確認できた（図２Ｃ〜図２Ｅ）。最後に、抗癌薬効評価で用いられたマウスから採血して肝毒性指標物質を比較した結果、全ての投与グループで特異的に肝毒性は確認されなかった（図２Ｆ）。また、ＶＥＧＦをはじめとする下位遺伝子の発現が、新規複合体を処理した群で効果的に抑制されることが確認できた（図２Ｇ）。
【０１８４】
実施例３：ヒト由来乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）が移植されたマウスにおける腫瘍組織を用いたＰＤ−Ｌ１抑制
【０１８５】
多くの癌細胞遺伝子の表面で発現するＰＤ−Ｌ１のため、Ｔ細胞のＰＤ−１と結合して免疫細胞による死滅が誘導されず、続けて癌細胞の増殖を誘導することが知られており、よって、高発現を示すヒト由来乳癌細胞が移植されたマウスの腫瘍組織において、ＰＤ−Ｌ１を標的とする新規複合体を用いてＰＤ−Ｌ１を抑制し、免疫抗癌効果を確認した。
【０１８６】
【表８】
2021515589.tif 000010
【０１８７】
実施例３−１．ヒト由来乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）が移植されたマウスにおける生物活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸候補物質複合体の尾静脈投与によるＰＤ−Ｌ１のタンパク質発現分析
【０１８８】
実施例２−３と同じ方法で抗癌薬効の評価を行ったマウスの腫瘍組織からタンパク質を分離し、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（Ａｂｃａｍ、英国）を用いてタンパク質発現を確認した。
【０１８９】
実施例３−２．ヒト由来乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）が移植されたマウスにおける生物活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸候補物質複合体の尾静脈投与による組織での免疫抗癌評価
【０１９０】
実施例２−１と同じ方法で抗癌薬効の評価を行ったマウスの腫瘍組織を生検して４％ホルマリン溶液に１日間固定し、固定した組織をパラフィン包埋し、５μｍにセクションしてスライドガラスにマウンティングした。マウンティングした組職を０．５％ＢＳＡ溶液に１時間ブロッキングし、ＰＤ−Ｌ１に対する１次抗体溶液を処理して１日間処理した。その後、１次抗体溶液を除去し、１Ｘ  ＰＢＳで洗浄した後に２次抗体溶液を処理し、常温で２時間処理してＤＡＢ染色により分析した。
【０１９１】
本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表９の通りである。
【０１９２】
【表９】
2021515589.tif 000011
【０１９３】
その結果、図３に示すように、マウスの腫瘍組織でＰＤ−Ｌ１を処理したグループでタンパク質発現が減少すること、及び組織でＰＤ−Ｌ１の発現が抑制されることが確認できた。
【０１９４】
実施例４：新規複合体を用いたヒト由来前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体の抑制による抗癌効果の確認
【０１９５】
前立腺の正常な発達と保存はアンドロゲン受容体（ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＡＲ）による男性ホルモンのアンドロゲン（ａｎｄｒｏｇｅｎ）の役割に依存し、アンドロゲンによって細胞が死滅したり、新しい細胞に代替されるなど、アンドロゲン受容体の調節によってバランスが保たれると知られている。しかし、テストステロン又はＤＨＴ（修飾テストステロン）が存在するとき、アンドロゲン受容体の発現が増加してバランスが崩れ、結局としてこれは癌を誘発すると知られている。前立腺癌細胞株にＤＨＴによって誘導されたアンドロゲン受容体を抑制し、ヒト由来前立腺癌における抗癌効果を確認した。
【０１９６】
実施例４−１．細胞培養
【０１９７】
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）から入手したヒト前立腺癌細胞（ＬＮＣａｐ）をＲＰＭＩ１６４０（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＡＴＣＣ、米国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１９８】
実施例４−２．生物活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体の細胞内導入
【０１９９】
アンドロゲン受容体を抑制するための新規複合体は、前立腺細胞の成長と均衡に必須遺伝子であるアンドロゲン受容体ｍＲＮＡと相補的な配列（配列番号１２〜配列番号１５）の生物活性ペプチド核酸を作製し、エンドソーム脱出を助ける物質が含まれた生物活性ペプチド核酸と相補的なキャリアペプチド核酸（配列番号１６〜配列番号３１）を作製した後、同量を混成化して複合体を作製した（表１０参照）。生物学的活性を有するペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸が結合している複合体の処理方法は、ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６に開示の通りである。
【０２００】
【表１０】
2021515589.tif 000012
【０２０１】
実施例４−３．ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）で遺伝子発現の分析
【０２０２】
新規複合体のアンドロゲン受容体抑制程度を分析するために、実施例４−１で培養された細胞を６−ウェルプレートにウェル当たり１×１０５ｃｅｌｌｓを培養し、ＤＨＴ（修飾テストステロン）を処理してアンドロゲン受容体の発現を増加させた４時間後、複合体処理して７２、９６、１２０、１４４、１６８時間間隔で培養し、処理時間経過後に、抗アンドロゲン受容体抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、米国）、抗ｐ−Ａｋｔ１（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、米国）を用いて、ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６に開示の条件でタンパク質発現を分析した。
【０２０３】
本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表１１の通りである。
【０２０４】
【表１１】
2021515589.tif 000013
【０２０５】
その結果、図４に示すように、ＤＨＴによって発現が増加したアンドロゲン受容体と下位遺伝子であるｐ−Ａｋｔ１のタンパク質発現が抑制されることが確認された。
【０２０６】
実施例５：新規複合体を用いたヒト由来前立腺癌細胞におけるクラステリンの抑制による抗癌効果の確認
【０２０７】
クラステリン（Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ）は、アポリポタンパク質Ｊ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｊ）とも呼ばれる全ての哺乳類の体液に存在する二量性糖タンパク質であり、いままで研究されたほぼ全種類の細胞で誘導及び発現し、精子成熟、脂質運送、組織再構成、細胞膜再利用、細胞−細胞又は細胞−細胞下層間の相互作用、及び細胞死などの様々な正常の生物学的過程に関与するものと知られている。ヒトの種々の悪性腫瘍の発生と進行過程に関与するクラステリンの強力な腫瘍形成能力に関して報告されており、クラステリンが細胞死を調節するＢａｘの発現を抑制して癌細胞成長を増進し、癌細胞の抵抗性にも関与することが知られている。ヒト由来前立腺癌で過発現するクラステリンを抑制することにより、抗癌効果があるかどうか確認した。
【０２０８】
実施例５−１．細胞培養
【０２０９】
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）から入手したヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３）をＦ１２Ｋ培養培地（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２  Ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ、米国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０２１０】
実施例５−２．生物活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体の細胞内導入
【０２１１】
クラステリンを抑制するための新規複合体は、血管成長の必須遺伝子であるＶＥＧＦ  ｍＲＮＡと相補的な配列（配列番号３２〜配列番号３５）の生物活性ペプチド核酸を作製し、エンドソーム脱出を助ける物質が含まれた生物活性ペプチド核酸と相補的なキャリアペプチド核酸（配列番号３６〜配列番号５１）を作製した後、同量を混成化して複合体を作製した（表１２参照）。生物学的活性を有するペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸が結合している複合体の処理方法は、ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６に開示の通りである。
【０２１２】
【表１２】
2021515589.tif 000014
【０２１３】
実施例５−３．ヒト由来前立腺癌細胞株における細胞生存率分析
【０２１４】
新規複合体の血管内皮成長因子抑制程度を分析するために、実施例５−１で培養された細胞を９６−ウェルプレートにウェル当たり６×１０３ｃｅｌｌｓを培養し、複合体処理して２４、４８、７２、９６、１２０時間間隔で培養した後、処理時間経過後に、ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６に開示の実験条件で細胞生存率を確認した。
【０２１５】
本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表１３の通りである。
【０２１６】
【表１３】
2021515589.tif 000015
【０２１７】
その結果、図５Ａ及び図５Ｂに示すように、新規複合体を用いたクラステリン抑制によって細胞生存率が抑制されることがヒト由来前立腺癌細胞から確認された。
【０２１８】
実施例５−４．ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）で遺伝子発現の分析
【０２１９】
新規複合体のクラステリン抑制程度を分析するために、実施例５−１で培養された細胞を６−ウェルプレートにウェル当たり１×１０５ｃｅｌｌｓを培養し、複合体処理して２４、４８、７２、９６，１２０時間間隔で培養した後、処理時間経過後に、抗クラステリン（ａｂｃａｍ、英国）、抗Ｂａｘ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、米国）を用いて、ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６に開示の条件でタンパク質発現を分析した。
【０２２０】
本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表１４の通りである。
【０２２１】
【表１４】
2021515589.tif 000016
【０２２２】
その結果、図５Ｃに示すように、癌抵抗性及び誘導遺伝子であるクラステリンと調節遺伝子であるＢａｘのタンパク質発現が抑制されることが確認された。
【０２２３】
実施例６：新規複合体を用いたヒト由来網膜色素上皮細胞における血管内皮成長因子の抑制確認
【０２２４】
老人性黄斑変性の原因として知られた黄斑における血管内皮成長因子であるＶＥＧＦに対する新規複合体をヒト由来網膜色素上皮細胞に処理し、血管生成を抑制するかどうか確認した。
【０２２５】
実施例６−１．細胞培養
【０２２６】
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）から入手したヒト網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）をＤＭＥＭ−Ｆ１２培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２，Ｇｉｂｃｏ、米国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０２２７】
実施例６−２．生物活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体の細胞内導入
【０２２８】
血管内皮成長因子を抑制するための新規複合体は、血管成長の必須遺伝子であるＶＥＧＦ  ｍＲＮＡと相補的な配列（配列番号１〜配列番号３）の生物活性ペプチド核酸を作製し、エンドソーム脱出を助ける物質が含まれた生物活性ペプチド核酸と相補的なキャリアペプチド核酸（配列番号４〜配列番号９）を作製した後、同量を混成化して複合体を作製した（表２参照）。生物学的活性を有するペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸が結合している複合体の処理方法は、ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６に開示の通りである。
【０２２９】
実施例６−３．ヒト由来網膜色素上皮細胞生存率分析
【０２３０】
新規複合体の血管内皮成長因子抑制程度を分析するために、実施例６−１で培養された細胞を９６−ウェルプレートにウェル当たり６×１０３ｃｅｌｌｓを培養し、複合体処理して２４、４８、７２、９６、１２０時間間隔で培養した後、処理時間経過後に、ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６に開示の実験条件で細胞生存率を確認した。
【０２３１】
本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表１５の通りである。
【０２３２】
【表１５】
2021515589.tif 000017
【０２３３】
その結果、図６Ａに示すように、新規複合体を用いた血管内皮成長因子抑制によって細胞生存率が抑制されることが、ヒト由来網膜色素上皮細胞から確認された。
【０２３４】
実施例６−４．ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）で遺伝子発現の分析
【０２３５】
新規複合体の血管内皮成長因子抑制程度を分析するために、実施例６−１で培養された細胞を６−ウェルプレートにウェル当たり１×１０５ｃｅｌｌｓを培養し、複合体処理して２４、４８、７２、９６、１２０時間間隔で培養した後、処理時間経過後に、抗ＶＥＧＦ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、米国）、抗ｐ−Ａｋｔ１（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、米国）を用いてタンパク質発現を分析した。前記表１５の核酸複合体の組合せを用いた。図６Ｂに示すように、血管内皮成長因子であるＶＥＧＦと下位遺伝子であるｐ−Ａｋｔ１のタンパク質発現が抑制されることが確認された。
【０２３６】
実施例６−５．硝子体内注射（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ）を用いたマウスの網膜における血管生成抑制分析
【０２３７】
新規複合体の血管内皮成長因子抑制程度をマウスの網膜で確認するために妊娠したマウス（ナラバイオテック、韓国）から生まれたばかりのＰ０とＰ１６のマウスに新規複合体を３０μｇ／ｋｇで直接硝子体内注射し、１週経過後に陰性対照群と比較した。まず、マウスの網膜を分離する前に、ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ（ｓｉｇｍａ、米国）２５０ｍｇ／ｍｌで目の後に注射後、網膜を分離して蛍光顕微鏡で分析した。
【０２３８】
本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表１６の通りである。
【０２３９】
【表１６】
2021515589.tif 000018
【０２４０】
その結果、それぞれ、図６Ｃ、図６Ｄ及び図６Ｅに示すように、新規複合体を用いた血管内皮成長因子抑制によってマウスの網膜における血管生成が効率的に抑制されることが確認できた。
【０２４１】
実施例６−６．眼球点眼液（ｅｙｅ  ｄｒｏｐｓ）を用いたマウスの網膜における血管生成抑制分析
【０２４２】
新規複合体の血管内皮成長因子抑制程度は、マウスの網膜で眼球点眼液を用いて血管生成が抑制されるかどうか確認するために、妊娠したマウス（ナラバイオテック、韓国）から生まれたばかりのＰ１４のマウスに新規複合体を眼球点眼液を用いて３０μｇ／ｋｇで網膜に１日に１回５日間処理した後、陰性対照群と共に比較した。まず、マウスの網膜を分離する前に、ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ（ｓｉｇｍａ、米国）２５０ｍｇ／ｍｌで目の後に注射後、網膜を分離して蛍光顕微鏡で分析した。
【０２４３】
配列番号２及び配列番号８で表される核酸複合体であるｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＰＮＡ  ｄｕｐｌｅｘを用いた。その結果、図６Ｆに示すように、眼球点眼液を用いた新規複合体による血管内皮成長因子抑制によってマウスの網膜における血管生成が効率的に抑制されることが確認できた。
【０２４４】
実施例７：新規複合体を用いてヒト由来呼吸器上皮細胞及び肺癌細胞におけるＰＤＥ４Ｂの抑制確認
【０２４５】
慢性閉塞性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＯＰＤ）は、気道の慢性炎症と肺実質破壊で肺機能が減少した疾病状態を指し、疾病は主に、喫煙歴のある中年以上で発生するが、慢性炎症の人からも発病する。呼吸困難によって身体的活動や日常生活に障害がある他、憂うつ、不安のような精神的問題も伴い、入院と死亡を増加させる主要疾病として知られている。このＣＯＰＤの治療剤としてＰＤＥ４抑制剤が用いられたが、その副作用によって現在は用いられていない。近年、ＰＤＥ４ファミリのうちＰＤＥ４Ｂを抑制したとき、ｃＡＭＰの分解を抑制して抗炎症効果を示すことが知られ、新規複合体を用いてＰＤＥ４Ｂを抑制し、ＣＯＰＤの治療効果を確認した。
【０２４６】
実施例７−１．細胞培養
【０２４７】
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）から入手したヒト呼吸器上皮細胞（ＮＣＩ−Ｈ２９２）をＲＰＭＩ１６４０（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＡＴＣＣ、米国）において、ヒト肺癌細胞（Ａ５４９）は、Ｆ１２Ｋ培養培地（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２  Ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ、米国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０２４８】
実施例７−２．生物活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体の細胞内導入
【０２４９】
ＰＤＥ４Ｂを抑制するための新規複合体は、炎症を起こす重要物質であるｃＡＭＰの分解に関連したＰＤＥ４Ｂ  ｍＲＮＡと相補的な配列（配列番号５２〜配列番号５５）の生物活性ペプチド核酸を作製し、エンドソーム脱出を助ける物質が含まれた生物活性ペプチド核酸と相補的なキャリアペプチド核酸（配列番号５６〜配列番号６３）を作製した後、同量を混成化して複合体を作製した（表１７参照）。生物学的活性を有するペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸が結合している複合体の処理方法は、ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６に開示の通りである。
【０２５０】
【表１７】
2021515589.tif 000019
【０２５１】
実施例７−３．ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）で遺伝子発現の分析
【０２５２】
新規複合体のＰＤＥ４Ｂ抑制程度を分析するために、実施例７−１で培養された細胞を６−ウェルプレートにウェル当たり１×１０５ｃｅｌｌｓを培養し、複合体処理して４時間後に、ヒト由来呼吸器上皮細胞にはＣＳＥ（ｓｉｇｍａ、米国）を、ヒト由来肺癌細胞にはＬＰＳ（ｓｉｇｍａ、米国）を処理して発病モデルを作った後、７２、９６、１２０時間間隔で培養し、処理時間経過後に、抗ＰＤＥ４Ｂ抗体（ａｂｃａｍ、英国）、抗ＩＬ−６（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、米国）、ＴＮＦ−α（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、米国）を用いて、ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６に開示の条件でタンパク質発現を分析した。
【０２５３】
本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表１８の通りである。
【０２５４】
【表１８】
2021515589.tif 000020
【０２５５】
その結果、図７に示すように、ＣＳＥとＬＰＳによって発現が増加したＰＤＥ４ＢとＣＯＰＤによる代表的な炎症マーカーであるＩＬ−６とＴＮＦ−αのタンパク質発現が抑制されることが確認された。
【０２５６】
実施例８：新規複合体を用いてアトピー性皮膚炎（Ａｔｏｐｉｃ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）でＴＬＲ２の抑制確認
【０２５７】
核酸複合体のアトピー皮膚炎治療効果の分析のために、標的遺伝子としてＴＬＲ２（Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ２）を使用した。アレルギー誘発物質や細菌が皮膚に浸透する時に発現する遺伝子であるＴＬＲ２は、アトピー皮膚炎患者では過発現しており、皮膚内炎症性サイトカインによる炎症増加によってアトピー皮膚炎を悪化させる。このため、アトピー皮膚炎において主要標的になると予測されている。
【０２５８】
実施例８−１．細胞培養
【０２５９】
ＣＬＳ（ＣＬＳ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、ドイツ）から入手したヒト角質細胞（ＨａＣａＴ）を、ＤＭＥＭ培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ，ウェルジン、韓国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。アトピー皮膚炎様細胞モデルを作るためにイエダニ抽出液５ｎｇ／ｍＬとＤＮＣＢ（２−ｄｉｎｉｔｒｏｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ）５μＭを処理して１日間培養した。
【０２６０】
実施例８−２．生物活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体の細胞内導入
【０２６１】
ＴＬＲ２を抑制するための新規複合体は、ＴＬＲ２ｍＲＮＡと相補的な配列（配列番号６４〜配列番号６５）の生物活性ペプチド核酸を作製し、エンドソーム脱出を助ける物質が含まれた生物活性ペプチド核酸と相補的なキャリアペプチド核酸（配列番号６６〜配列番号７１）を作製した後、同量を混成化して複合体を作製した（表１９参照）。生物学的活性を有するペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸が結合している複合体の処理方法は、ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６に開示の通りである。
【０２６２】
【表１９】
2021515589.tif 000021
【０２６３】
実施例８−３．ヒト由来角質細胞株で細胞生存率変化
【０２６４】
新規複合体のＴＬＲ２抑制程度を分析するために、実施例８−１で培養された細胞を９６−ウェルプレートにウェル当たり６×１０３ｃｅｌｌｓを培養し、複合体処理して２４、４８、７２時間間隔で培養した後、処理時間経過後に、ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６に開示の実験条件で細胞生存率を確認した。
【０２６５】
その結果、図８Ａに示すように、新規複合体を用いたＴＬＲ２抑制によって細胞生存率が抑制されることが、ヒト由来角質細胞から確認された。
【０２６６】
実施例８−４．ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）で遺伝子発現の分析
【０２６７】
新規複合体のＴＬＲ２抑制程度を分析するために、実施例８−１で培養された細胞を６−ウェルプレートにウェル当たり１×１０５ｃｅｌｌｓを培養し、複合体を処理して２４、４８、７２時間間隔で培養した後、処理時間経過後に、抗ＴＬＲ２抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、米国）、抗ｐ−ＮＦ−ｋＢ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、米国）、ＭｙＤ８８（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、米国）、ＴＡＲＣ（ａｂｃａｍ、英国）を用いて、ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６に開示の条件でタンパク質発現を分析した。
【０２６８】
本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表２０の通りである。
【０２６９】
【表２０】
2021515589.tif 000022
【０２７０】
その結果、図８Ｂに示すように、ＴＬＲ２及び下位経路遺伝子の発現が、処理された核酸複合体によって抑制されることを確認した。
【０２７１】
実施例８−５．イエダニ抽出物及びＤＮＣＢを用いたアトピー皮膚炎誘導動物モデルにおけるアトピー皮膚炎表現型効果分析
【０２７２】
ＮＣ／Ｎｇａマウスの背中を除毛し、ＡＤクリーム（イエダニ抽出物クリーム、Ｂｉｏｓｔｉｒ、日本）を１００ｍｇずつ１週に２回で総３週間塗布して、イエダニによるアトピー皮膚炎誘発動物モデルを構築した。また、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの背中を除毛し、１週に２回で総３週間５０μＭのＤＮＣＢを塗布して、新居症候群によるアトピー皮膚炎誘発動物モデルを構築した。１週間に総３回クリーム剤形の核酸複合体を処理し、アトピー皮膚炎動物モデル表現型を写真で分析し、背中部位の育毛程度をＩｍａｇｅ  Ｊで測定した。
【０２７３】
本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表２１の通りである。
【０２７４】
【表２１】
2021515589.tif 000023
【０２７５】
その結果、アトピー皮膚炎表現型が新規核酸複合体を処理したグループで減少することを確認した（図８Ｃ）。
【０２７６】
実施例８−６．血清内ＩｇＥ及びＴＡＲＣ濃度変化分析
【０２７７】
実施例８−５の条件で行った動物実験において最終実験終了日に、マウス血液を眼窩静脈を通じて収集し、常温で２時間以上放置した後、遠心分離機（１４，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）を用いて血清を収集した。収集した血清をＩｇＥ  ＥＬＩＳＡキット（ゴマバイオテック、韓国）及びＴＡＲＣ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、米国）で提供する実験方法に従って血清内ＩｇＥ及びＴＡＲＣの濃度を測定した。
【０２７８】
前記表２１の核酸複合体の組合せを用いた。その結果、アトピー皮膚炎を誘導した対照群に比べて、新規核酸複合体を処理したグループでＩｇＥ及びＴＡＲＣの濃度が陰性対照群と類似のレベルに減少したことが確認できた（図８Ｄ）。
【０２７９】
実施例８−７．Ｈ＆Ｅ染色でアトピー誘導動物モデルにおける表現型分析
【０２８０】
実施例８−５の条件で実験を行い、最終実験終了日にマウスの耳組織を生検して４％ホルマリン溶液に１日間固定し、固定した組織をパラフィン包埋して５μｍにセクションし、スライドガラスにマウンティングした。マウンティングした組職をヘマトキシリン：エオイン染色溶液に一定時間染色し、１Ｘ  ＰＢＳで水洗した後、顕微鏡で分析した。
【０２８１】
前記表２１の核酸複合体の組合せを用いた。その結果、乾癬を誘導した対照群に比べて新規核酸複合体を処理したグループで皮膚の表皮（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）の異常増殖が減少したことが確認できた（図８Ｅ）。
【０２８２】
実施例８−８．免疫染色でアトピー誘導動物モデルにおける組織内炎症性マーカー分析
【０２８３】
実施例８−５の条件で実験を行い、最終実験終了日にマウスの背中組織を生検して４％ホルマリン溶液に１日間固定し、固定した組織をパラフィン包埋して５μｍにセクションし、スライドガラスにマウンティングした。マウンティングした組職を０．５％ＢＳＡ溶液に１時間ブロッキングし、ＣＤ３に対する１次抗体溶液を処理して１日間処理した。その後、１次抗体溶液を除去し、１Ｘ  ＰＢＳで洗浄した後に２次抗体溶液を処理し、常温で２時間処理してＤＡＢ染色により分析した。
【０２８４】
前記表２１の核酸複合体の組合せを用いた。その結果、組織内炎症性マーカーであるＣＤ３が、アトピー誘導した対照群に比べて新規核酸複合体を処理したグループで減少することを確認した（図８Ｆ）。
【０２８５】
実施例９：新規複合体を用いて皮膚再生（ｓｋｉｎ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）でＳｍａｄ３の抑制確認
【０２８６】
核酸複合体の皮膚再生効果分析のために、標的遺伝子としてＳｍａｄ３を使用した。Ｓｍａｄ３は、怪我した皮膚で過発現するタンパク質であり、皮膚再生において主要標的になると予測されている。
【０２８７】
実施例９−１．細胞培養
【０２８８】
ＣＬＳ（ＣＬＳ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、ドイツ）から入手したヒト角質細胞（ＨａＣａＴ）を、ＤＭＥＭ培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ，ウェルジン、韓国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０２８９】
実施例９−２．生物活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体の細胞内導入
【０２９０】
Ｓｍａｄ３を抑制するための新規複合体は、怪我した部位で過発現するＳｍａｄ３ｍＲＮＡと相補的な配列（配列番号７２又は配列番号７３）の生物活性ペプチド核酸を作製し、エンドソーム脱出を助ける物質が含まれた生物活性ペプチド核酸と相補的なキャリアペプチド核酸（配列番号７４〜配列番号７８）を作製した後、同量を混成化して複合体を作製した（表２２参照）。生物学的活性を有するペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸が結合している複合体の処理方法は、ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６に開示の通りである。
【０２９１】
【表２２】
2021515589.tif 000024
【０２９２】
実施例９−３．怪我後回復能力分析（Ｗｏｕｎｄｓ−Ｈｅａｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）を用いた細胞移動性分析
【０２９３】
新規複合体のＳｍａｄ３抑制程度を分析するために、実施例９−１で培養された細胞を２４−ウェルプレートにウェル当たり１×１０４ｃｅｌｌｓを培養し、複合体を処理して２４、４８時間間隔で培養した後、処理時間経過後に、ヒト由来角質細胞株において人為的に怪我させた部分から細胞移動性に対する効果を確認した。
【０２９４】
本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表２３の通りである。
【０２９５】
【表２３】
2021515589.tif 000025
【０２９６】
その結果、図９Ａに示すように、新規複合体によって細胞の移動性が向上することを確認した。
【０２９７】
実施例９−４．ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）で遺伝子発現の分析
【０２９８】
新規複合体のＳｍａｄ３抑制程度を分析するために、実施例９−１で培養された細胞を６−ウェルプレートにウェル当たり１×１０５ｃｅｌｌｓを培養し、複合体を処理して２４、４８、７２時間間隔で培養した後、処理時間経過後に、抗ｐ−ｓｍａｄ３抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、米国）を用いて、ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６に開示の条件でタンパク質発現を分析した。
【０２９９】
本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表２４の通りである。
【０３００】
【表２４】
2021515589.tif 000026
【０３０１】
その結果、図９Ｂに示すように、新規複合体によってヒト由来角質細胞株においてｓｍａｄ３の発現が減少することが確認できた。
【０３０２】
実施例１０：新規複合体を用いてケロイドでＴＩＥＧ１の抑制確認
【０３０３】
新規核酸複合体の怪我後肥大症（ケロイド、ｋｅｌｏｉｄｓ）治療効果分析のために標的遺伝子としてＴＩＥＧ１を使用した。ＴＩＥＧ１は、ケロイド患者の皮膚組織で過発現するタンパク質であり、ケロイド治療において主要標的になると予測されている。
【０３０４】
実施例１０−１．細胞培養
【０３０５】
ヒトケロイド線維芽細胞細胞（ＫＥＬ  ＦＩＢ）を、ＤＭＥＭ培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ，ウェルジン、韓国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０３０６】
実施例１０−２．生物活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体の細胞内導入
【０３０７】
ＴＩＥＧ１を抑制するための新規複合体は、怪我後肥大症部位で過発現するＴＩＥＧ１ｍＲＮＡと相補的な配列（配列番号７９又は配列番号８０）の生物活性ペプチド核酸を作製し、エンドソーム脱出を助ける物質が含まれた生物活性ペプチド核酸と相補的なキャリアペプチド核酸（配列番号８１〜配列番号８４）を作製した後、同量を混成化して複合体を作製した（表２５参照）。生物学的活性を有するペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸が結合している複合体の処理方法は、ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６に開示の通りである。
【０３０８】
【表２５】
2021515589.tif 000027
【０３０９】
実施例１０−３．ヒト由来ケロイド線維芽細胞で細胞生存率分析
【０３１０】
新規複合体のＴＩＥＧ１抑制程度を分析するために、実施例１０−１で培養された細胞を９６−ウェルプレートにウェル当たり６×１０３ｃｅｌｌｓを培養し、複合体処理して２４、４８、７２、９６時間間隔で培養した後、処理時間経過後に、ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６に開示の実験条件で細胞生存率を確認した。
【０３１１】
配列番号７９及び配列番号８１〜配列番号８４の核酸複合体（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＰＮＡ）と配列番号８０及び配列番号８１〜配列番号８４の核酸複合体（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＰＮＡ）を用いた。その結果、図１０Ａに示すように、新規複合体を用いたＴＩＥＧ１抑制によって細胞生存率が抑制されることが、ヒト由来ケロイド線維芽細胞から確認された。
【０３１２】
実施例１０−４．ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）で遺伝子発現の分析
【０３１３】
新規複合体のＴＩＥＧ１抑制程度を分析するために、実施例１０−１で培養された細胞を６−ウェルプレートにウェル当たり１×１０５ｃｅｌｌｓを培養し、複合体を処理して２４、４８、７２時間間隔で培養した後、処理時間経過後に、抗ＴＩＥＧ１抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、米国）、抗ｐ−ｓｍａｄ２（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、米国）、抗ｓｍａｄ７（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、米国）を用いて、ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６に開示の条件でタンパク質発現を分析した。
【０３１４】
本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表２６の通りである。
【０３１５】
【表２６】
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【０３１６】
その結果、図１０Ｂに示すように、新規複合体によってヒト由来線維芽細胞株においてＴＩＥＧ１の発現及び下位遺伝子が減少及び増加することが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０３１７】
本発明の構造式（１）による生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸を含む核酸複合体は、生物活性核酸の安全性を高め、生物活性核酸の自己凝集（ｓｅｌｆ−ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）などによる沈殿などの損失を減少させることができ、細胞内生物活性核酸の伝達効率を高め、標的遺伝子の発現を容易に調節することができる。
【０３１８】
特に、本発明に係る核酸複合体における生物活性核酸とキャリアペプチド核酸との結合は、生物活性核酸の標的遺伝子の塩基配列存在下でのみ分離されるため、前記生物活性核酸の単独細胞内導入に比べて、標的遺伝子に対する選択性及び特異度が高く、生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸間の様々な構造組合せによって結合力を調節して複合体を製造できるので、生物活性核酸の細胞内又は細胞外で作用時点の調節が可能であるという長所がある。
【０３１９】
また、前記核酸複合体はエンドソーム脱出を助ける物質を含むので、細胞内在化によって細胞内部に浸透した核酸複合体が細胞質で効果的に活性を表すようにするのに有用である。
【０３２０】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施態様であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されるものでない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項及びそれらの等価物によって定義されるといえよう。
【図１Ａ】
2021515589.tif 000029
【図１Ｂ】
2021515589.tif 000030
【図１Ｃ】
2021515589.tif 000031
【図１Ｄ】
2021515589.tif 000032
【図１Ｅ】
2021515589.tif 000033
【図２Ａ】
2021515589.tif 000034
【図２Ｂ】
2021515589.tif 000035
【図２Ｃ】
2021515589.tif 000036
【図２Ｄ】
2021515589.tif 000037
【図２Ｅ】
2021515589.tif 000038
【図２Ｆ】
2021515589.tif 000039
【図２Ｇ】
2021515589.tif 000040
【図３】
2021515589.tif 000041
【図４】
2021515589.tif 000042
【図５Ａ】
2021515589.tif 000043
【図５Ｂ】
2021515589.tif 000044
【図５Ｃ】
2021515589.tif 000045
【図６Ａ】
2021515589.tif 000046
【図６Ｂ】
2021515589.tif 000047
【図６Ｃ】
2021515589.tif 000048
【図６Ｄ】
2021515589.tif 000049
【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
2021515589.tif 000051
【図７】
2021515589.tif 000052
【図８Ａ】
2021515589.tif 000053
【図８Ｂ】
2021515589.tif 000054
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
2021515589.tif 000057
【図８Ｆ】
2021515589.tif 000058
【図９Ａ】
2021515589.tif 000059
【図９Ｂ】
2021515589.tif 000060
【図１０Ａ】
2021515589.tif 000061
【図１０Ｂ】
2021515589.tif 000062
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年10月12日(2020.10.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７７】
【表７】
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【国際調査報告】
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