(57)【要約】  本発明は、バイサイトカイン（ＢＣ）と称されるサイトカインに基づく融合タンパク質が記載され、具体的には、ＩＬ２アゴニスト変異タンパク質をＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）と結合することにより形成され、突然変異によるヒトＩｇＧ１のＦｃ領域およびコネクターペプチドによって連結される。バイサイトカインの構築物中のＩＬ２アゴニスト変異タンパク質およびＩ型ＩＦＮの組み合わせは、これらの分子に驚くべき免疫調節性の特性、および親サイトカインまたはその組み合わせの治療効果よりも優れた治療効果を与えることから、それらを癌の治療において魅力的かつ新規の分子にする。本特許の対象である融合タンパク質を有効成分として含む薬学的組成物もまた記載される。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）に連結したＩＬ２アゴニスト変異タンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項２】
前記ＩＬ２アゴニスト変異タンパク質がリンカーによりＩ型ＩＦＮに結合する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ＩＬ２変異タンパク質が配列番号１に示される配列を有することを特徴とする、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ＩＬ２変異タンパク質が配列番号２に示される配列を有することを特徴とする、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記Ｉ型ＩＦＮが配列番号３に示されるヒトＩＦＮαであることを特徴とする、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
コネクターペプチドに連結した変異ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域からなる前記リンカーを有することを特徴とする、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
配列番号５に示される配列を有する前記リンカーを有することを特徴とする、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
配列番号６に示される配列を有する前記リンカーを有することを特徴とする、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
配列番号７に示される配列を有する前記リンカーを有することを特徴とする、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１１】
配列番号１０に示される配列を有することを特徴とする、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
配列番号１１に示される配列を有することを特徴とする、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１３】
請求項８または９に記載の融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子。
【請求項１４】
１μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌの範囲の濃度での、有効成分として請求項８または９に示される融合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１５】
癌の治療における請求項８または９に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項１６】
腫瘍内投与のための、請求項１０または１１に記載の核酸分子の使用。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーおよび免疫腫瘍学の分野に関し、具体的には、サイトカインに基づく融合タンパク質の開発に関する。特に、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）がインターロイキン２（ＩＬ２）アゴニスト変異タンパク質に結合することにより構成される融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインの使用に関して、癌免疫療法において何十年にも渡り努力がなされてきたが、今のところ大きな結果が得られていない。これらの分子の毒性が高いこと、半減期が低いこと、並びに患者への有効性が低いことにより、その抗腫瘍特性を向上させる革新的な戦略を創造することが必要とされ、それは癌患者のより上質で、より長い生命を意味することになる。サイトカインの機構の中で、治療効果を妨げるものは、調節性Ｔ細胞の誘導であり、腫瘍微小環境における細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の反応を抑制する（Ｏｖｅｎｓ  ａｎｄ  Ｎａｕｇｌｅｒ，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，２０１２，９：４４）。
【０００３】
慣例では、組み合わせが癌の治療におけるサイトカインの治療上の使用を最適化することを目的とした戦略のうちの１つであり、可溶性分子の同時投与またはフソカイン（ｆｕｓｏｋｉｎｅ）ともしばし呼ばれる融合タンパク質の生成のいずれかによる。後者を使用することの利点は、その産生が実行可能であるだけではなく、異なる薬理的特性を有する分子間の化学量論的な関係性を確率する可能性があることである。さらに、いくつかのフソカインは、親サイトカインを個別に投与することと比較して、およびその組み合わせでの使用と比較しても、優れた治療効果を有することが示されている。（Ｓｔａｇｇ  Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，６４：８７９５−８７９９；Ａｃｒｅｓ  Ｂ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，６５：９５３６−９５４６）；米国特許出願公開第２０１１／０１５０８２８号明細書。フソカインの論文で最近報告された治療方法のうちのひとつは、１型ＩＦＮに基づく融合タンパク質およびＴＧＦβ受容体の外部ドメインをコードするｍＲＮＡを腫瘍内投与することであり、それは抗腫瘍効果を示す。ｍＲＮＡの腫瘍内移動技術は、臨床シナリオによく適した非常に用途が広く、再現可能であり、容易であり、かつ順応性のある治療ツールである（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｊｅｕｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１５，４：５）。
【０００４】
抗腫瘍療法に関連する２つのサイトカインは１型インターフェロン：ＩＦＮαおよびＩＬ２であり、癌の治療で所望されるＴヘルパー細胞１型反応パターンの強力な誘導因子である。悪性細胞へのＩＦＮαの直接抗腫瘍作用はすでに報告されている。細胞増殖抑制、抗増殖効果、および細胞外マトリクスプロテアーゼレベルの低下に関連し、侵入および転移のプロセスに関与しており、疾患の予後不良と関係する。その一方で、このサイトカインは、抗原提示細胞の成熟および遊走、αＣＤ８樹状細胞での交差提示の誘導、およびリンパ球の活性化を促進する（Ｃｈｉｋｋａｌａ  ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９０，５０：１１７６−１１８２）。抗原によって媒介される活性化の結果として、ＩＦＮαがミトコンドリア依存性アポトーシスからＴ細胞を保護し、よって規制された方法で、クローン増殖のプロセスに有利となることが記載されている（Ｄｏｎｄｉ  ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００４，１７３（６）：３７４０−３７４７）。
【０００５】
その一方で、サイトカインＩＬ２は、抗原活性化Ｔリンパ球の増殖分化を促進するオートクリン因子である。しかし、エフェクター細胞よりも制御性Ｔ細胞へより高い親和性で結合することから、抗腫瘍効果に悪影響を与えるかたちでそれらの増殖分化を誘導する（Ｃｈａｐｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ，２００７，１７９：４９６９−４９７８）。この分子の治療効果を向上させるための戦略のうちのひとつは、合理的な設計に基づいて変異タンパク質を開発することである。分子免疫学センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）で生成されたＩＬ２アゴニスト変異タンパク質がそうであり、制御性Ｔ細胞で発現した高親和性受容体に結合することができない。ＩＬ２アゴニスト変異タンパク質は、以下アルファなしＩＬ２（ＵＳ９，２０６，２４３  配列番号６）と称される。野生型Ｉｌ２に対して変性することによって、アルファなしＩＬ２は、制御性Ｔ細胞よりも優先的にＮＫおよび記憶ＣＤ８Ｔ細胞にフェクター集団を拡大する。この分子の毒性が、健康な組織において野生型ＩＬ２と比較し低いことも記載されている（Ｃａｒｍｅｎａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１３，１９０：６２３０−６２３８）。
【０００６】
他のＩＬ２のアゴニスト変異体がインビトロ進化（遺伝子工学）から生成されている。ＩＬ２のスーパーカインと名付けられたこの変異体（Ｈ９）は、ＩＬ２受容体のベータ鎖に増加した結合親和性を示し、Ｔリンパ球の強力な増殖分化、独立的にＩＬ２受容体のＣＤ２５アルファ鎖を刺激する。事実、ＩＬ２に対し、増加した細胞傷害性Ｔリンパ球の拡大、インビボでの高い抗腫瘍反応、制限された制御性Ｔ細胞の発現、および低減した毒性を誘発することができることを示している（Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１２，４８：５２９−５３５）。変異体は、以下Ｈ９と称される。
【０００７】
いくつかの論文では、癌の治療におけるＩＬ２とＩＦＮαとの併用投与の相乗効果について提案している。ＩＦＮαとＩＬ２との組み合わせを使用することにより、ＢＲ５５−２ＭＡｂにより誘発された、ＨＴ２９結腸直腸癌腫系に対する抗体依存性細胞傷害活性刺激する能力が、別個に使用したサイトカインのその能力と比較して大幅に増加する（Ｆｌｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，２０００，１２：７５６−７６１）。２０１０年に、Ｋｏｎｊｅｖｉｃらが、臨床病期ＩＶの転移性黒色腫患者から採取した末梢血液試料から、ＩＬ２およびＩＦＮαの両方がＮＫ細胞のインビトロでの活性を増加させることを実証した。ＩＬ２およびＩＦＮαの両方のサイトカインが、ＣＤ１６が多く発現したＮＫ細胞の亜集団においてでさえ、ＮＫ細胞中の受容体を活性化させるＮＫＧ２Ｄの発現を刺激することができる；ＮＫ細胞活性の誘発に関連する両方のサイトカインによるＮＫＧ２Ｄの誘導（Ｋｏｎｊｅｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，２０：４５９−６７）。
【０００８】
その文献では、野生型ＩＬ２とヒトＩＦＮα２ｂとの２つのサイトカインを組み合わせる融合タンパク質の生成を記載した報告がある。この分子中、ＩＬ２は直接ＩＦＮα２ｂに連結し、その抗腫瘍効果は親サイトカインおよびその組み合わせと比較されておらず（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ，１９９９，１２５：７７−８２）、したがってそれらが親サイトカインおよびその組み合わせよりも優れるかどうかのエビデンスはない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１１／０１５０８２８号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｏｖｅｎｓ  ａｎｄ  Ｎａｕｇｌｅｒ，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，２０１２，９：４４
【非特許文献２】Ｓｔａｇｇ  Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，６４：８７９５−８７９９
【非特許文献３】Ａｃｒｅｓ  Ｂ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，６５：９５３６−９５４６
【非特許文献４】Ｖａｎｄｅｒ  Ｊｅｕｇｈｔｅｔａｌ，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１５，４：５
【非特許文献５】Ｃｈｉｋｋａｌａ  ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９０，５０：１１７６−１１８２
【非特許文献６】Ｄｏｎｄｉ  ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００４，１７３（６）：３７４０−３７４７
【非特許文献７】Ｃｈａｐｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ，２００７，１７９：４９６９−４９７８
【非特許文献８】Ｃａｒｍｅｎａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１３，１９０：６２３０−６２３８
【非特許文献９】Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１２，４８：５２９−５３５
【非特許文献１０】Ｆｌｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，２０００，１２：７５６−７６１
【非特許文献１１】Ｋｏｎｊｅｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，２０：４５９−６７
【非特許文献１２】Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ，１９９９，１２５：７７−８２
【非特許文献１３】Ｈｅｚａｒｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００１，７５（２４）：１２１６１−１２１６８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
前述のことを考慮しながら、本願の発明者らは、癌治療のための、いくつかのバイサイトカイン（ＢＣ）と呼ばれる二官能性融合タンパク質を生成した。Ｉ型ＩＦＮをＩＬ２アゴニストと組み合わせる２つの二官能性分子を癌の治療のために得た。それらを得るための開始点は２つの変異タンパク質：アルファなしＩＬ−２またはＨ９およびＩＦＮαを融合することである。Ｆｃγ受容体への限定的な結合を有する免疫グロブリンのＦｃ領域を通じた両方のサイトカインの結合からなるこれらのＢＣのために提案されたものを、以下ではＢＣ２およびＢＣ３とそれぞれ称する。新生児Ｆｃ受容体に結合することができるＦｃ領域の存在により、半減期の時間を増加することができる。これらの組み合わせおよび設計は、このタンパク質型を開発する新規の要素を構成する。得られる分子は、各親サイトカイン（同Ｆｃ領域に結合）の投与後に観察されるものよりも優れた免疫調節性の効果、および驚くべきインビボ抗腫瘍特性を有し、等モルでのこれらの組み合わせに対してでさえ優れる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一実施形態において、本発明の対象は、Ｉ型ＩＦＮにリンカーを通じて結合されたＩＬ２変異タンパク質を含む融合タンパク質である。具体的には、本発明の融合タンパク質の一部であるＩＬ２変異タンパク質の配列が配列番号１および２に記載される。当該融合タンパク質の構成の一部であるＩＦＮはＩＦＮα（配列番号３）である。
【００１３】
ある特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、リンカーが、変異ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、およびコネクターペプチドからなることを特徴とし、その配列は配列番号５に示される。
【００１４】
さらに、本発明に記載される融合タンパク質の配列は配列番号６および７に記載され、それらをコードする核酸配列は配列番号１０および１１にそれぞれ示される。
【００１５】
その他の実施形態において、本発明は、有効成分として配列番号６および７に示される融合タンパク質並びに薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。
【００１６】
その他の実施形態において、本発明の対象は、癌の治療における本明細書に記載される融合タンパク質の使用であり、当該融合タンパク質をコードする核酸分子の腫瘍内投与アプローチを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】ヒトＩＦＮα２ｂの配列。
【図１Ｂ】リンカー断片の配列。
【図２】Ｈ９の配列。
【図３】ＥＬＩＳＡによるＢＣ２ｍおよびＨＥＫ２９３Ｔ細胞の単一対照における一過性発現の評価。
【図４Ａ】ウエスタンブロットによるＢＣ２ｍおよび単一対照の免疫識別：ＩＦＮαに特異的な抗体。
【図４Ｂ】ウエスタンブロットによるＢＣ２ｍおよび単一対照の免疫識別：ＩＬ２に特異的な抗体。
【図５Ａ】トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清で処理されたＭＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞におけるＭＨＣＩ発現の誘導を試験することにより測定される、ＢＣ２ｍおよびＩＦＮα−Ｆｃ対照のＩＦＮα様活性。
【図５Ｂ】トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清で処理されたナイーブ型マウスの脾細胞の培養から得たＴＣＤ８＋リンパ球の拡大を試験することにより測定される、ＢＣ２ｍおよび単一対照Ｆｃ−アルファなしＩＬ２のＩＬ２様活性。
【図６Ａ】ＥＬＩＳＡによる、形質導入された４Ｔ１腫瘍細胞の上清中のＢＣ２ｍおよび単一対照の検出：Ｆｃ領域に特異的。
【図６Ｂ】ＥＬＩＳＡによる、形質導入された４Ｔ１腫瘍細胞の上清中のＢＣ２ｍおよび単一対照の検出：ＦｃおよびＩＬ２領域に特異的。
【図６Ｃ】ＥＬＩＳＡによる、形質導入された４Ｔ１腫瘍細胞の上清中のＢＣ２ｍおよび単一対照の検出：ＦｃおよびＩＦＮα領域に特異的。
【図７】実験の２５日目および２７日目の、形質導入された４Ｔ１腫瘍細胞を使用したＢＣ２ｍの抗腫瘍効果の評価。
【図８】実験の１７日目の、ＢＣ２ｍを腫瘍内投与した４Ｔ１モデルにおける治療効果の評価。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ＢＣの設計
本発明の融合タンパク質は、意図される病理学上のシナリオを考慮して設計される。配列番号１（以前に米国特許第９，２０６，２４３Ｂ２号の配列番号６に開示される）に示されるアルファなしＩＬ−２変異タンパク質と本発明の図１Ａおよび配列番号３に配列が示されるヒトＩＦＮαとの融合によりＢＣ２は形成される。免疫応答に関与する限定される受容体の活性化能力に関連する、Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ変異体を有する変異されたヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（Ｈｅｚａｒｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００１，７５（２４）：１２１６１−１２１６８）、およびリンカー要素からのコネクターペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３。ＩＦＮα分子は、リンカー断片のＮ末端（Ｎｔ）で結合し、アルファなしＩＬ２分子はＣ末端（Ｃｔ）で結合する。当該リンカーの配列は図１Ｂおよび配列番号５に記載される。
【００１９】
ＢＣ３は、配列が図１Ａおよび配列番号３に示されるヒトＩＦＮαが、配列が配列番号２および図２に示される前述のＨ９変異タンパク質に融合することにより形成される。リンカー要素は、変異体Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ、および免疫応答に関与する受容体の限定された活性化能力を有するヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、およびリンカーペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３により構成される。ＩＦＮα分子は、リンカー断片のＮｔで結合し、Ｈ９分子でみられるＣｔで結合する。当該リンカーの配列は図１Ｂおよび配列番号５に記載される。
【００２０】
薬学的組成物
本発明のＢＣ対象は有効成分として見出され、それに好適な異なる薬学的組成物の一部および薬学的に許容される担体を形成する。当該薬学的組成物における有効成分の濃度は、１μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ、好ましくは５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの範囲内である。
【００２１】
薬学的に許容される担体は、食塩溶液、中性リン酸緩衝食塩水および同様の配合物を含むが、それらに限定されない。患者への投与に好適なその他の緩衝剤、分散剤および非中毒性不活性物質が本発明の組成物に含まれる。組成物は投与に好適な溶液であり、通常は無菌であり、所望されない粒子を含まない。
治療上の使用および治療
【００２２】
新規のＢＣのフォーマットは、それを構成するサイトカインのリンカー要素におけるＦｃ領域の存在による。このＦｃ領域はタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーによってその精製を可能にし、異なる経路（皮下、静脈、皮内、筋肉内、腹腔内）によって可溶性タンパク質として投与することを可能にし、また循環するこれらの薬剤の半減期時間を増加させ、したがって治療効果が向上する。このことは、用量をより低くさせ、その結果毒性を低減する。代替的投与経路は腫瘍内であり、他の投与経路よりも毒性が低い。同様に、アルファなしＩＬ２またはＨ９の存在は、現在の臨床シナリオで使用されている野生型ＩＬ２分子よりも毒性を減少させる。
【００２３】
さらに、これらのＢＣについて本発明で使用される投与戦略には、例えば、ｍＲＮＡの腫瘍内投与およびそれらをコードする形質導入粒子などの遺伝子に基づく治療アプローチによる産生物の腫瘍内投与が含まれる。ＢＣ２またはＢＣ３の発現について、腫瘍または浸潤腫瘍細胞の遺伝的改変はこれらが腫瘍微小環境に存在することを保証し、免疫調節作用および腫瘍そのものに直接作用することを可能にする。治療薬をコードする核酸の腫瘍内投与の融通性および高い再現性は、異なる種類の腫瘍を治療する上での好適なプラットフォームである。
【００２４】
不特定の方法でのインサイチュでの強化作用に加え、抗腫瘍反応のこれらの分子の免疫調節特性を考慮すると、多種の癌を有する患者の標的治療との考えられる組み合わせにサポートされる特定の抗原免疫応答の刺激を将来の治療として考慮することができる。
【００２５】
この方法では、前述のＢＣは、現在の癌の治療に使用されているＩ型ＩＦＮおよびＩＬ２個別サイトカインの薬理的作用を強化する新しい治療上のフロントを構成することを目的とする。この効果は、制御性Ｔ細胞上よりも細胞傷害性Ｔ細胞が優先的に拡大することに関係し、それはより効率の良い抗腫瘍免疫応答につながり、よって腫瘍成長を遅らせること、および治療を受ける患者の生存率を高めることにつながる。その上、使用されるＩＬ２の毒性が低いことにより、野生型サイトカインによる治療と比較して成功する確率が高まる。これらの反応すべてが、治療を受ける患者のより平均余命および生活の質を高めることにつながる。
【００２６】
本発明を以下の実施例および図によってさらに詳述する。しかし、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００２７】
実施例
実施例１．設計並びにＢＣおよびサイトカインの単一対照の取得
Ｉ型ＩＦＮおよびＩＬ２アゴニストに基づく免疫調節性および抗腫瘍作用をマウス内でモデリングするために、配列番号８に記載されるＢＣ２ｍを生成した。これは、ペプチドコネクター（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３に結合した変異マウスＩｇＧ１のＦｃ領域からなる配列番号１２に示されるリンカー断片を通じて、配列番号１に記載される、ＩＬ２アゴニストの例である、アルファなしＩＬ２変異タンパク質に融合したマウスＩＦＮα４（配列番号４）であるＩ型ＩＦＮからなる。Ｆｃ領域内のＤ２６５Ａ突然変異は免疫応答に関与する受容体の活性化能を低減する（Ｂｅｃｋｅｒ  Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ（１９９６）ＰＮＡＳ，９３：２７０２−２７０７）。アルファなしＩＬ２変異タンパク質はリンカー断片のＣｔ末端に向かって位置し、ＩＦＮα４は同じ断片のＮｔ末端に位置する。したがって、ＢＣ２ｍは二量体および４価の分子である。
【００２８】
単一対照が、各々が変異マウスＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）のＦｃ領域に融合した親サイトカインを含み、ＢＣ２ｍ構造内で各サイトカインの相対位置を維持する分子として設計される。したがって、単一ＩＦＮα対照では、このサイトカインが上記のＦｃ領域のＮｔに結合し、アルファなしＩＬ２の単一対照では、このサイトカインは上記のＦｃ領域のＣｔに向かって位置する。したがって、ＩＦＮαおよびアルファなしＩＬ２の単一対照は、二量体および２価の分子である。
【００２９】
ＢＣ２ｍ並びに単一対照ＩＦＮα−ＦｃおよびＦｃアルファなしＩＬ２遺伝子は、高次細胞の一過性発現アッセイのために、ｐＬＶ−ＣＭＶ−ＩＲＥＳ−Ｎｅｏ  ｖｅｃｔｏｒでクローンされる。得られた遺伝子構築物はまた、腫瘍細胞腫系の遺伝的改変で使用される形質導入粒子を得るためのトランスファーベクターとして使用される。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中の当該遺伝子の発現はリポフェクタミンを使用して一過性導入によって確認される。上清中の異なる組み換え分子の定量をマウスＦｃ領域に特異的なＥＬＩＳＡによって実施される。
【００３０】
ＢＣ２およびＢＣ３の生成
ＢＣ２およびＢＣ３ヒトＢＣの構築について、ヒトＩＦＮα（配列番号３および図１Ａ）並びにアゴニスト変異タンパク質アルファなしＩＬ２およびＨ９（配列番号１および２にそれぞれ記載される）を使用した。Ｌ２３４Ａ  Ｌ２３５Ａ突然変異および免疫応答に関与する受容体の限定された活性化能を有する変異ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域、並びにリンカーペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３がリンカーとして使用され、当該リンカーは配列番号５および図１Ｂに示される。ＩＦＮα分子は、リンカー断片のＮｔで結合し、アルファなしＩＬ２またはＨ９はＣｔで結合する。
【００３１】
二官能性タンパク質ＢＣ２およびＢＣ３の最終的な設計は配列番号６および７にそれぞれ示される。ＢＣ２およびＢＣ３の遺伝子は高次細胞中での安定した発現のために、トランスファーベクターｐＬＶ−ＣＭＶ−ＩＲＥＳ−Ｎｅｏにてクローンされる。これらの遺伝子の機能性を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のリポフェクタミンを用いて一過性発現アッセイで確認し、組み換え分子はヒトＦｃ領域に特異的なＥＬＩＳＡによって定量される。
【実施例２】
【００３２】
実施例２．ＢＣ２ｍが内在性および機能性タンパク質として発現する
ＢＣ２ｍが構築され単一対照ＩＦＮα−ＦｃおよびＦｃアルファなしＩＬ２が得られると、一過性導入アッセイをＨＥＫ２９３Ｔ細胞で実施し、これらの分子の設計の実行可能性を評価する。７２時間培養した後、上清を除去しマウスＦｃ領域に特異的なＥＬＩＳＡを実施する。そのために、ポリスチレンプレートをマウスＩｇＧ分子に特異的な抗体でコーティングし、各々がＢＣ２ｍおよび単一対照の遺伝子を含む構築物でトランスフェクトされた細胞の上清で培養する。最後に、マウスＩｇＧのＦｃ領域に特異的な抗体を使用して検出を実行する。４９２ｎｍで吸光度の検量線にマウスＩｇＧで補間し、組み換えタンパク質の濃度を定量する。この試験によって、対象となる３種のタンパク質の発現を検出することができ、設計されたフォーマットの機能性を確認する（図３）。
【００３３】
同様に、サイトカインＩＦＮαおよびＩＬ２に特異的なウエスタンブロットアッセイを実施し、ＢＣ２ｍ構築物内のその存在を確認する（図４ＡおよびＢ）。同様に、非還元および還元条件化下での理論上のサイズがそれぞれ２量体で１２０ｋＤａ、単量体で６０ｋＤａに相当する電気泳動移動を有するタンパク質としてＢＣ２ｍが発現されたことが検証された。これらのサイトカインの同定を、対応する単一対照ＩＦＮα−ＦｃおよびＦｃアルファなしＩＬ２で確認し、設計に従った想定したサイズに相当する電気泳動移動が検出された（図４Ａおよび４Ｂ）。
【実施例３】
【００３４】
実施例３．ＢＣ２ｍがサイトカインＩＦＮαおよびＩＬ２に相当する生物活性を維持する
ＩＦＮα４およびアルファなしＩＬ２変異タンパク質の一部分がＢＣ２ｍおよび単一対照の構築物中で活性であるかどうかを判定するために、相当する遺伝子的構築物でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清、および分子の同モル量を使用してインビトロ実験を実施する。トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清をネガティブ対照として使用する。ＩＦＮα様活性の場合、当該上清で処理された２４時間中ＭＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞の表面上のＭＨＣＩの発現の増加をフローサイトメトリーにより評価する。ＢＣ２ｍまたはＩＦＮα−Ｆｃ対照を含有する上清は、ＢＣ２の構築物の中でＩＦＮαの活性機能が維持されることを示すネガティブ対照を使用して得られた結果とは対照的に、処理された腫瘍細胞中にＭＨＣＩの発現を刺激することがでる（図５Ａ ）。
【００３５】
ＢＣ２ｍ中に存在するアルファなしＩＬ２およびＦｃアルファなしＩＬ２対照が生物活性を示すかどうかの判定をするために、ＣＤ８＋リンパ球増殖分化刺激アッセイをナイーブ型マウスからの脾細胞培養を用いて実施する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脾細胞を、ＣＦＳＥ試薬で標識し、ＢＣ２ｍまたはＦｃアルファなしＩＬ２対照を含有するトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清の存在下で７２時間培養する。実験の最後に、増殖分化中のＣＤ８＋Ｔリンパ球の割合を分析する。ネガティブ対照として、トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞と培養された脾細胞を使用し、ＣＤ８＋Ｔリンパ球（Ｐｒ）の増殖比率を、ＢＣ２ｍまたはＦｃアルファなしＩＬ２で処理された脾細胞について増殖分化するＣＤ８＋Ｔ細胞の割合、およびネガティブ対照に相当する値をそれぞれ除することによって計算する。
【００３６】
図５Ｂでは、ＢＣ２およびＦｃアルファなしＩＬ２を含有する上清は、ネガティブ対照と比較して、それぞれ４倍および５倍の脾細胞増殖分化を誘発することができる。これらの結果は、当該融合タンパク質の構築物中に含まれるアルファなしＩＬ２部分が生物学的特性を保持することを論証する。
【実施例４】
【００３７】
実施例４．レンチウイルスの形質導入により遺伝子組換えされた４Ｔ１腫瘍細胞によるＢＣ２ｍの分泌
インビボでのＢＣ２ｍの抗腫瘍活を評価するために、形質導入する腫瘍細胞のアプローチが選択され、４Ｔ１乳房癌腫のモデルとして使用する。細胞をＢＣ２ｍおよび単一対照をコードするレンチウイルス粒子で形質導入する。ネガティブ対照として、空ｐＬＶ−ＣＭＶ−ＩＲＥＳ−Ｎｅｏベクター（モック対照）で形質導入された腫瘍細胞を使用した。形質導入された細胞を、選択された培地（Ｇ−４１８抗生物質を有する）中で１０日間保持し、上清中の組み換え分子の濃度をＥＬＩＳＡによって測定し、マウス免疫グロブリンのＦｃ部分を検出する。ＢＣ２ｍおよび単一対照が、この技術により形質導入された腫瘍細胞の上清中に検出された（図６Ａ）。
【００３８】
さらに、ＢＣ２ｍおよび単一対照中のアルファなしＩＬ２部分およびＩＦＮαの存在がサンドイッチＥＬＩＳＡによって確認された。そのうちの１つに、形質導入された細胞の上清を抗Ｆｃ抗体でコーティングされたプレート上に培養し、ＩＬ２部分が、ＩＬ２に特異的なウサギ抗体および酵素ペルオキシダーゼに共役した抗ウサギ免疫グロブリン抗体を順次加算することで検出された。したがって、Ｆｃ−ＩＬ２部分がＢＣ２ｍおよび単一ＦｃアルファなしＩＬ２対照の構築物に検出された（図６Ｂ）。他のアッセイにおいて、形質導入された細胞の上清を、抗ＩＦＮα抗体でコーティングされたプレート上に培養し、Ｆｃ部分が酵素ペルオキシダーゼに共役したマウスＩｇＧのＦｃ領域に特異的な抗体によって検出された。ＩＦＮα−Ｆｃ部分がＢＣ２ｍおよび単一ＩＦＮα−Ｆｃ対照に検出された（図６Ｃ）。
【実施例５】
【００３９】
実施例５．個別サイトカインＩＦＮα−ＦｃおよびＦｃアルファなしＩＬ２またはそれらの組み合わせよりも優れた抗腫瘍作用をＢＣ２ｍが示す
ＢＣ２ｍの抗腫瘍作用をその対照と比較するために、異なる分子を分泌する４Ｔ１細胞から移植された腫瘍の成長を評価する。処理される５つのグループの動物が考慮される：そのうち３つが４Ｔ１−Ｍｏｃｋ、４Ｔ１−ＩＦＮα−Ｆｃまたは４Ｔ１−Ｆｃ−ｎｏａｌｐｈａＩＬ２細胞を受け、残りの２つグループはアルファなし４Ｔ１−ＩＦＮα−Ｆｃ＋４Ｔ１−ＦｃＩＬ２または４Ｔ１−ＢＣ２ｍ細胞と培養した。合計１０００００個の細胞を皮下投与した。形質導入されたラインが異なるレベルの組み換えタンパク質を発現し、それらは分泌されたタンパク質／合計細胞比が確実に他のグループと同等であるようにするために、いくつかのケースではモック細胞と混合した。
【００４０】
結果を分析するために、フィッシャー直接確率法により、２５日目および２７日目に、４Ｔ１−Ｍｏｃｋグループで見出された最小の腫瘍以下の容積の腫瘍を有する動物の頻度の一対比較法を異なるグループ間で実施した。
【００４１】
図７で観察されるように、２５日目および２７日目の、モック対照グループで観察される最低量以下の腫瘍を有する動物の頻度が、単一個別対照およびそれらの組み合わせと比較して４Ｔ１−ＢＣ２ｍ細胞を受けたグループにて有意に高かった（フィッシャー直接確率法、ｐ＜０．０５）。この現象は４Ｔ１−ＩＦＮα−Ｆｃ＋４Ｔ１−ＦｃアルファなしＩＬ２細胞の組み合わせを受けたグループでは観察されず、評価された頻度は各単独療法で処理されたグループとの比較において差異はなかった（結果は図示されず、フィッシャー直接確率法、ｐ＞０．０５）。
【００４２】
これらの結果は、ＩＦＮαがアルファなしＩＬ２に結合することを示し、強化された抗腫瘍反応を及ぼす質または量的に異なる分子および細胞機構の活性が、サイトカインＩＦＮα−ＦｃおよびＦｃアルファなしＩＬ２の単一対照を同時投与したもの、またはこれらのサイトカインを個別に投与したものから得られたものよりも高くなることから、ＢＣ２ｍの治療的な優勢を指示する。
【実施例６】
【００４３】
実施例６．ＢＣ２ｍの腫瘍内投与が、４Ｔ１モデルの単一対照ＩＦＮα−ＦｃおよびＦｃアルファなしＩＬ２よりも大きい抗腫瘍作用を有する
４Ｔ１細胞をＢＡＬＢ／ｃ免疫適格性マウスに播種させる。１０日後、事前にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清に含有されたＩＦＮα−Ｆｃ、ＦｃアルファなしＩＬ２およびＢＣ２ｍの同モル量を、腫瘍内投与した。追加的グループには、ＩＦＮα−ＦｃおよびＦｃアルファなしＩＬ２を含有する上清の混合物を投与し、単一対照およびＢＣ２ｍに関して確実に各サイトカインが等モルとなるようにする。ネガティブ対照として、トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清を使用する。上清を４日間に渡り毎日投与した。図８に見られるように、実験の１７日目に、ＢＣ２ｍで治療したマウスの１００％においてネガティブ対照グループの平均腫瘍量を下回り、この結果は他の治療グループでは観察されていない。ネガティブ対照グループの平均サイズを下回る腫瘍サイズとなった動物の頻度は、ＩＦＮα−ＦｃまたはＦｃアルファなしＩＬ２の個別治療を受けたどのグループよりもＢＣ２ｍで治療されたグループがより高かった（フィッシャー直接確率法；ｐ＜０．０５）。しかしながら、ネガティブ対照グループの平均腫瘍両を下回る腫瘍量を有する動物の頻度は、ＩＦＮα−ＦｃおよびＦｃアルファなしＩＬ２対照の組み合わせで治療されたグループは、単一対照ＩＦＮα−Ｆｃのそれよりも高かった。対照的に、ＦｃアルファなしＩＬ２対照に関しては、頻度はより高くなく、ＩＦＮαおよびアルファなしＩＬ２サイトカインを同じ分子内で結合する必要があることを指示している。これは、両方の分子の受容体の同時刺激に関連した分子および細胞機構の起こり得る活性に起因し得る。概して、これらの証拠により、腫瘍にＢＣ２ｍを局所的投与することによる治療効果が、親サイトカインに対して、優れていることを支持する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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