(57)【要約】  本発明は、改変されたブタ流行性下痢ウイルス（PEDV）スパイク（S）タンパク質に関する。さらに、本発明は、前記改変PEDVスパイクタンパク質を含む免疫原性組成物及び前記免疫原性組成物の対象への投与を含む対象を免疫するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（a）及び（b）から成る群から選択されるブタ流行性下痢ウイルス（PEDV）スパイク（S）タンパク質をコードする核酸分子：
（a）少なくとも1つの変異を有する遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質であって、
−アミノ酸900位のロイシン残基がロイシン残基以外のアミノ酸残基によって置換されるもの、及び/又は
−アミノ酸901位のロイシン残基がロイシン残基以外のアミノ酸残基によって置換されるもの、
ここで、当該アミノ酸位の番号付けは、配列番号:2又は配列番号:39の野生型G2a PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列を参照し；
（b）少なくとも1つの変異を有する遺伝子型2b（G2b）PEDV Sタンパク質であって、
−アミノ酸897位のロイシン残基がロイシン残基以外のアミノ酸残基によって置換されるもの、及び/又は
−アミノ酸898位のロイシン残基がロイシン残基以外のアミノ酸残基によって置換されるもの、
ここで、当該アミノ酸位の番号付けは、配列番号:3の野生型G2b PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列を参照する。
【請求項２】
ロイシン残基以外のアミノ酸残基が、アラニン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基及びバリン残基から成る群から選択される、請求項1に記載の核酸分子。
【請求項３】
アミノ酸位の番号付けが、野生型G PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列RSXIEDLLF（配列番号:4）を参照し、RはS1/S2開裂部位の保存されたアルギニン残基であり、かつLLは遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質内のアミノ酸900位及び901位であるか、又はLLは遺伝子型2b（G2b）PEDV Sタンパク質内のアミノ酸897位及び898位である、請求項1又は2に記載の核酸分子。
【請求項４】
アミノ酸配列RSX1IEDX2X3（配列番号:1）を含むブタ流行性下痢ウイルス（PEDV）スパイク（S）タンパク質をコードする核酸分子であって、Rは前記PEDV Sタンパク質のS1/S2開裂部位の保存されたアルギニン残基であり、X1は任意のアミノ酸残基であることができ、かつ
（I）X2はロイシン残基以外のアミノ酸残基であり、かつX3はロイシン残基であるか、又は
（II）X2はロイシン残基であり、かつX3はロイシン残基以外のアミノ酸残基であるか、又は
（III）X2はロイシン残基以外のアミノ酸残基であり、かつX3はロイシン残基以外のアミノ酸残基である、前記核酸分子。
【請求項５】
PEDV Sタンパク質がアミノ酸配列RSXIEDAAF（配列番号:5）を含み、Rは前記PEDV Sタンパク質のS1/S2開裂部位の保存されたアルギニン残基であり、かつAAは遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質内のアミノ酸900位及び901位であるか、又はAAは遺伝子型2b（G2b）PEDV Sタンパク質内のアミノ酸897位及び898位である、請求項1から4のいずれかの項に記載の核酸分子。
【請求項６】
PEDV Sタンパク質がさらにアミノ酸配列X1X2X3FX4KX5X6X7X8（配列番号:6）を含み、
X8は、前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸残基又は前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸位に対して-2位のアミノ酸残基であり、
X2からX5、X7及びX8は任意のアミノ酸であることができ、かつ
（i）X1はチロシン残基以外のアミノ酸残基であり、かつX6はヒスチジン残基であるか、又は
（ii）X1はチロシン残基であり、かつX6はヒスチジン残基以外のアミノ酸残基であるか、又は
（iii）X1はチロシン残基以外のアミノ酸残基であり、かつX6はヒスチジン残基以外のアミノ酸残基である、請求項1から5のいずれかの項に記載の核酸分子。
【請求項７】
（a）G2a PEDV Sタンパク質において、さらに、
−アミノ酸1377位のチロシン残基がチロシン残基以外のアミノ酸残基によって置換され、及び/又は
−アミノ酸1384位のヒスチジン残基がヒスチジン残基以外のアミノ酸残基によって置換されるか、又は
（b）G2b PEDV Sタンパク質において、さらに、
−アミノ酸1374位のチロシン残基がチロシン残基以外のアミノ酸残基によって置換され、及び/又は
−アミノ酸1381位のヒスチジン残基がヒスチジン残基以外のアミノ酸残基によって置換される、請求項1から3、5又は6のいずれかの項に記載の核酸分子。
【請求項８】
−チロシン残基以外のアミノ酸残基が、アラニン残基、グリシン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基及びバリン残基から成る群から選択され、及び/又は
−ヒスチジン残基以外のアミノ酸残基がアルギニン残基である、請求項6又は7に記載の核酸分子。
【請求項９】
PEDV Sタンパク質が以下のタンパク質である、請求項1から8のいずれかの項に記載の核酸分子：
i）（a）配列番号:15、16、17、18、19、20、40のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.1％、少なくとも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、少なくとも99.8％、又は少なくとも99.9％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか若しくは前記アミノ酸配列から成るタンパク質、又は
（b）配列番号:9、10、11、12、13、14のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.1％、少なくとも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、少なくとも99.8％、又は少なくとも99.9％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか若しくは前記アミノ酸配列から成るタンパク質、及び/又は
ii）（a）配列番号:15、16、17、18、19、20、40のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.1％、少なくとも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、少なくとも99.8％、又は少なくとも99.9％配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質、又は
（b）配列番号:9、10、11、12、13、14のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.1％、少なくとも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、少なくとも99.8％、又は少なくとも99.9％配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質。
【請求項１０】
請求項1から9のいずれかの項に記載の核酸分子によってコードされるPEDV（S）タンパク質。
【請求項１１】
PEDV Sタンパク質をコードする前記核酸分子又は当該PEDV Sタンパク質が組換え体である、請求項1から9のいずれかの項に記載の核酸分子又は請求項10に記載のPEDV Sタンパク質。
【請求項１２】
請求項1から9のいずれかの項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１３】
請求項1から9のいずれかの項に記載のPEDV Sタンパク質をコードする核酸分子及び/又は請求項10に記載のPEDV Sタンパク質及び/又は請求項12に記載のベクターを含む、免疫原性組成物。
【請求項１４】
対象に請求項13に記載の免疫原性組成物を投与する工程を含む、当該対象を免疫する方法。
【請求項１５】
仔ブタにおいてPEDV感染により生じる臨床的徴候又は疾患を軽減又は予防する方法であって、当該仔ブタが請求項13に記載の免疫原性組成物が投与されてある雌ブタによって授乳される、前記方法。
【請求項１６】
仔ブタにおいてPEDV感染により生じる死亡率を低下させる方法であって、当該仔ブタが請求項12に記載の免疫原性組成物が投与されてある雌ブタによって授乳される、前記方法。
【請求項１７】
免疫原性組成物が鼻内、粘膜、経口、皮内又は筋肉内投与される、請求項14から16のいずれかの項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（配列表）本出願は37 C.F.R. 1.821-1.825にしたがい配列表を含む。本出願に付随する配列表は参照によりその全体が本明細書に含まれる。
（技術分野）
本発明は改変PEDV（ブタ流行性下痢ウイルス）スパイク（S）タンパク質に関する。当該改変はPEDVワクチンの改善された生産方法をもたらす。さらに、改変スパイクタンパク質を含むワクチンはワクチンとして有効であり、PEDV感染又はチャレンジに対して防御を提供する。10日齢未満の仔ブタにおける高い死亡率（最大100％）のために、当該疾患は、例えば米国養豚業にとって経済的な問題である。
【背景技術】
【０００２】
ブタ流行性下痢ウイルスは、エンベロープをもつプラスセンス一本鎖RNAウイルスであり、ブタで急性下痢、嘔吐及び脱水を引き起こす。3週齢以下のブタでは、PEDV感染後24時間で直ちに臨床的徴候（急性水様下痢、嘔吐及び脱水を含む）が観察され、最大100％の死亡率をもたらす。さらに、PEDV感染動物の腸における肉眼的及び組織学的変化は、小腸の肉眼的な病理学的病巣を引き起こしえる。
PEDVは最初ヨーロッパで識別されたが、多くのアジア諸国（朝鮮、中国、日本、フィリピン及びタイを含む）ではますます問題となってきている。2013年以来、PEDVは米国に現れ、PEDV感染の経済的影響はすでに重大である。したがって、PEDV関連疾患からブタを防御することができるワクチンの開発が継続して希求される。これに関しては、特に粘膜ルート（経口又は鼻内）を介して投与しえる新出現PEDV株に有効なワクチンが希求される。
ただ1つのPEDV血清型が報告されているだけであるが、S遺伝子の系統発生学的研究は、PEDVは2つのグループ（遺伝子グループ1（G1；古典的）及び遺伝子グループ2（G2；野外流行性又は大流行性））に遺伝学的に分類できることを示す。各遺伝子グループはさらにサブグループ（1aおよび1b；2aおよび2b）に分けることができる。G1aにはプロトタイプPEDV株CV777、ワクチン株及び他の細胞培養順応株が含まれ、一方、G1bは新規な変種を含み、前記変種は、最初中国で、後に米国、韓国及びヨーロッパ識別された。G2は全世界の野外単離株を含み、それらはさらに2a及び2bサブグループ（G2a及びG2b）にクラスター化され、それぞれ、アジアにおける以前の局所的な流行発生並びに北米及びアジアにおける最近の大流行発生の要因である。
【０００３】
PEDVは、アルファコロナウイルス（Alphacoronavirus）属のコロナウイルスサブファミリーのメンバーである。PEDVは、約28kbプラスセンスの一本鎖RNAゲノム（5’キャップ及び3’ポリアデニル化テールをもつ）を有するエンベロープをもつウイルスである（Pensaert and De Bouck P. 1978）。当該ゲノムは、5’非翻訳領域（UTR）、3’UTR、及び少なくとも7つのオープンリーディングフレーム（ORF）を有する。前記ORFは、4つの構造タンパク質（スパイク（S）、エンベロープ（E）、膜（M）及びヌクレオキャプシド（N））及び3つの非構造タンパク質（レプリカーゼ1a及び1b並びにORF3）をコードし、これらは、5’-レプリカーゼ（1a/1b）-S-ORF3-E-M-N-3’の順序で当該ゲノム上に並んでいる（Oldham J. 1972；及びBridgen et al. 1993）。
PEDV Sタンパク質はI型糖タンパク質であり、（G2b PEDV）のSタンパク質は1,383のアミノ酸（aa）を含む。当該Sタンパク質は、他のコロナウイルスのSタンパク質とのその相同性に基づいて、S1（例えば1−789 aa）及びS2（例えば790−1,383 aa）ドメインに分割することができる。コロナウイルスのSタンパク質は表面抗原であり、ここで当該表面抗原は、ウイルスの侵入を媒介するために宿主細胞受容体糖タンパク質との相互反応を調節し、かつ天然の宿主で中和抗体の誘発を刺激する役割を果たす。したがって、S糖タンパク質はPEDVに対する有効なワクチンの開発のための主要な標的である。
【０００４】
Maduら（J. Virol., 2009, 3 (15), p. 7411-7421）はSARS（重篤な急性呼吸器症候群）のスパイクタンパク質における2つの単一変異（L803A及びL8-4A）を記載し、当該単一変異の各々が膜融合活性に影響を有することを示す。さらに、Ujike ＆ Taguchi（Viruses, 2015, 7, 1700-1725）は、チロシン依存YXXIシグナルの変異は増強された表面発現を示したことを記載している。Shiratoら（Virus Res., 2011, 161 (2):188-93）は、PEDVのKxHxxモチーフにおけるH1381R変異はスパイクタンパク質の形質膜への輸送をもたらすことを記載する。しかしながら、前記文書のいずれも、スパイクタンパク質内のいずれの改変がPEDVワクチンの生産方法を改善しえるのか、及びスパイクタンパク質内の改変を有するそのような生産ワクチンがなおワクチンとして適切でありかつPEDV感染又はチャレンジに対して防御を提供するのかは開示していない。
上記の技術的問題に対する解決は、特許請求の範囲で特徴づけられる記載及び実施態様によって達成される。
したがって、本発明はその種々の特徴において特許請求の範囲にしたがって実施される。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】PK13細胞における標的タンパク質（PEDV-S2b-wt及びPEDV-S2b-mut）の細胞内局在。上の3つのパネルは、EHV1-PEDV-S2b-wt組換えベクターから送り出されたスパイクタンパク質の発現物は主として細胞質に局在するが、一方、下の3つのパネルに示されるように、EHV1-PEDV-S2b-mutから発現されたPEDV-Sは主として細胞膜内に局在する。
【図２】実施例3に記載されたベクター（CDV-PEDV-spike-MUT（＝CDV-PEDV-spike mut）及びCDV-PEDV-spike-WT（＝CDV-PEDV-spike WT））のVero細胞における増殖の比較。上側の曲線はCDV-PEDV-spike mutに関し、下側の曲線はCDV-PEDV-spike WTに関する。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明の特徴を記載する前に、以下のことが特記されなければならない。本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられるように、単数形“a”、“an”及び“the”は、文脈が明らかにそうでないことを示さないかぎり複数の参照を含む。したがって、“an antigen（抗原）”に対する参照は複数の抗原を含み、“virus（ウイルス）”に対する参照は1つ以上のウイルス及び当業者に公知の前記の同等物に対する参照である、等々である。別に規定されないかぎり、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本発明が属する業界の業者の一人が通常的に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と同様ないずれの方法及び材料又は同等物も本発明の実行又は試験に用いられえるが、好ましい方法、装置及び材料が今や記載される。本明細書で言及される全ての刊行物は、当該刊行物で報告される細胞株、ベクター及び方法論（本発明との関係で用いられる可能性がある）を記載及び開示する目的のために参照によって本明細書に含まれる。前記のいずれも、先発明のために本発明がそのような開示に先行する資格が無いことを容認すると解釈されるべきではない。
本発明は、PEDVスパイクタンパク質のアミノ酸配列における変異は、ベクターベースのPEDVワクチンの生産レベルを増加させるために十分であるという驚くべき発見に基づいている。さらに、動物試験は、そのような改変スパイクタンパク質を有するPEDVベクターベースのワクチンは有効であり、かつPEDV感染又はチャレンジに対する防御を提供するか若しくは防御できることを示した。したがって、本発明は先行技術に固有の問題を解決し、かつ最先端技術における明確な進歩を提供する。
【０００７】
これに関して、本発明は、アミノ酸配列RSX1IEDX2X3（配列番号:1）を含むブタ流行性下痢ウイルス（PEDV）スパイク（S）タンパク質をコードする核酸分子を提供し、
（I）X2はロイシン残基以外のアミノ酸残基であり、かつX3はロイシン残基であるか、又は
（II）X2はロイシン残基であり、かつX3はロイシン残基以外のアミノ酸残基であるか、又は
（III）X2はロイシン残基以外のアミノ酸残基であり、かつX3はロイシン残基以外のアミノ酸残基である。
特に、配列RSX1IEDX2X3（配列番号:1）のRは、配列番号:4、5、21−25及び31−35のいずれかのRも同様に、S1/S2開裂部位のC-末端方向に位置する保存されたアルギニン残基である。前記Rはまた、下文では“PEDV Sタンパク質のS1/S2開裂部位の保存アルギニン残基”と呼称される。より具体的には、前記Rは、前記PEDV Sタンパク質の融合ペプチドにN-末端フランキングするアルギニン残基である。前記融合タンパク質は概して配列SXIEDで開始する。特に、前記融合ペプチドはPEDV Sタンパク質のS2サブユニット内に在る。
【０００８】
配列RSX1IEDX2X3（配列番号:1）はしたがってまた、特に前記PEDV Sタンパク質の融合ドメインの配列であると理解される。
より具体的には、配列RSX1IEDX2X3（配列番号:1）の関係では、並びに配列番号:4、5、21−25及び31−35のいずれかの関係でも同様に、Rは、PEDV Sタンパク質が遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質である場合にはアミノ酸894位の保存アルギニン残基と関係するか、又はRは、PEDV Sタンパク質が遺伝子型2b（G2b）PEDV Sタンパク質である場合にはアミノ酸891位の保存アルギニン残基と関係する。したがって、アミノ酸位に関して、“前記PEDV Sタンパク質のS1/S2開裂部位の保存アルギニン残基”という記述は、“Rは、PEDV Sタンパク質が遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質である場合にはアミノ酸894位のアルギニン残基であり、かつアミノ酸位の番号付けは野生型G2a PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列、好ましくは配列番号:2若しくは配列番号:39のアミノ酸配列を参照するか、又は、Rは、PEDV Sタンパク質が遺伝子型2b（G2b）PEDV Sタンパク質である場合にはアミノ酸891位のアルギニン残基であり、かつアミノ酸位の番号付けは野生型G2a PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列、好ましくは配列番号:3のアミノ酸配列を参照する”と同等であると理解される。
概して、本発明は、アミノ酸配列RSX1IEDX2X3（配列番号:1）を含むブタ流行性下痢ウイルス（PEDV）スパイク（S）タンパク質をコードする核酸分子を提供し、Rは前記PEDV Sタンパク質のS1/S2開裂部位の保存されたアルギニン残基であり、X1は任意のアミノ酸残基であることができ、かつ
（I）X2はロイシン残基以外のアミノ酸残基であり、かつX3はロイシン残基であるか、又は
（II）X2はロイシン残基であり、かつX3はロイシン残基以外のアミノ酸残基であるか、又は
（III）X2はロイシン残基以外のアミノ酸残基であり、かつX3はロイシン残基以外のアミノ酸残基である。
【０００９】
“核酸分子”という用語はポリヌクレオチドを指し、前記ポリヌクレオチドにはDNA分子、RNA分子、cDNA分子又は誘導体が含まれる。当該用語は、二本鎖ポリヌクレオチドと同様に一本鎖ポリヌクレオチドを包含する。好ましくは、当該用語は、一本鎖RNA又は二本鎖cDNAを指す。本発明の核酸は、単離されたポリヌクレオチド（すなわちその天然の環境から単離される）及び遺伝子改変形を包含する。さらにまた、化学的に改変されたポリヌクレオチドもまた含まれ、前記には天然に存在する改変ポリヌクレオチド（例えばグリコシル化若しくはメチル化ポリヌクレオチド）又は人工改変ポリヌクレオチド（例えばビオチン化ポリヌクレオチド）が含まれる。さらに、上記で言及されたスパイクタンパク質は、縮重遺伝暗号のために多数のポリヌクレオチドによってコードされえることは理解されるべきである。さらに、“核酸”及び“ポリヌクレオチド”という用語は互いに取り替え可能であり、任意の核酸を指す。“核酸”及び“ポリヌクレオチド”という用語はまた、具体的には5つの生物学的に存在する塩基（アデニン、グアニン、チミジン、シトシン及びウラシル）以外の塩基を含む核酸を含む。
【００１０】
“PEDV”という用語は当業者には周知である。PEDVはブタ流行性下痢ウイルスを意味し、アルファコロナウイルス属のコロナウイルスサブファミリーのメンバーである。
“スパイク”という用語は、当業者に周知であるPEDVの特異的タンパク質である。スパイクタンパク質は、抗体及び防御性免疫応答の主要な誘発物質である。さらに、スパイクタンパク質は、宿主細胞の細胞受容体と結合することによって、及び宿主細胞とのウイルス-細胞膜融合を媒介することによってもまたPEDVの細胞進入プログラムで主要な役割を果たす。さらに、“PEDV Sタンパク質”という用語は“PEDV S”という略語（PEDVの関係でしばしば用いられる）と同等であることは理解される。
“タンパク質”、“アミノ酸”及び“ポリペプチド”という用語は互いに取り替えて用いることができる。“タンパク質”という用語は、天然に存在するアミノ酸と同様にその誘導体を含むアミノ酸（aa）配列を指す。天然に存在するアミノ酸又は遺伝子コードアミノ酸残基はそれぞれ当業界で周知であり、生化学の標準的教科書に記載されている。アミノ酸配列内では、アミノ酸はペプチド結合によって連結される。さらに、アミノ酸配列の両端は、カルボキシル末端（C-末端）及びアミノ末端（N-末端）に当てはまる。“タンパク質”という用語は、本質的に精製されたタンパク質又は他のタンパク質をその他に含むタンパク質調製物を包含する。さらに、当該用語はまたタンパク質フラグメントにも関連する。さらにまた、前記には化学的に改変されたタンパク質が含まれる。そのような改変は、人工的改変でも天然に存在する改変（例えばリン酸化、グリコシル化、ミリストイル化など）でもよい。
【００１１】
本発明との関係で、“Rは前記PEDV Sタンパク質のS1/S2開裂部位の保存アルギニン残基である”という言い回しは、“Rは前記PEDV Sタンパク質のS1/S2開裂部位のC-末端方向に位置する保存アルギニン残基である”と同等であるか、又は“Rは前記PEDV Sタンパク質の融合ペプチドにN-末端フランキングする保存アルギニン残基である”と同等であるとそれぞれ理解される。“融合ペプチドにN-末端フランキングする”という言い回しは、“融合ペプチド配列にN-末端フランキングする”と同等であると理解される。
配列RSX1IEDX2X3（配列番号:1）は以下の如しと理解されるべきである：
−Rは前記PEDV Sタンパク質のS1/S2開裂部位の保存アルギニン残基であり、
−Sはアミノ酸残基セリンであり、
−X1は20の遺伝子コードアミノ酸残基のいずれかであり、
−Iはイソロイシン残基であり、
−Eはグルタミン酸残基であり、
−Dはアスパラギン酸残基であり、
−X2は変動可能である。X2は2つの条件を有する。X2はロイシン以外のアミノ酸残基であることができ（条件1）、これは、X2はロイシン残基を除いて遺伝子コードアミノ酸残基のいずれでもよいことを意味する。また別に、X2はロイシン残基であることができる（条件2）。
−X3は変動可能である。X3は2つの条件を有する。X3はロイシン以外のアミノ酸残基であることができ（条件1）、これは、X3はロイシン残基を除いて遺伝子コードアミノ酸残基のいずれでもよいことを意味する。また別に、X3はロイシン残基であることができる（条件2）。
【００１２】
したがって、本発明は、以下を含むブタ流行性下痢ウイルス（PEDV）スパイク（S）タンパク質をコードする核酸分子を提供する：
a）アミノ酸配列RSX1IEDLX2（配列番号:21）、Rは前記PEDV Sタンパク質のS1/S2開裂部位の保存アルギニン残基であり、X1は任意のアミノ酸残基であることができ、X2はロイシン残基以外のアミノ酸残基であるか、又は
b）アミノ酸配列RSX1IEDX2L（配列番号:22）、Rは前記PEDV Sタンパク質のS1/S2開裂部位の保存アルギニン残基であり、X1は任意のアミノ酸残基であることができ、X2はロイシン残基以外のアミノ酸残基であるか、又は
c）アミノ酸配列RSX1IEDX2X3（配列番号:1）、Rは前記PEDV Sタンパク質のS1/S2開裂部位の保存アルギニン残基であり、X1は任意のアミノ酸残基であることができ、X2及びX3はロイシン残基以外のアミノ酸残基である。
好ましくは、本発明は、以下を含むブタ流行性下痢ウイルス（PEDV）スパイク（S）タンパク質をコードする核酸分子を提供する：
a）アミノ酸配列RSXIEDLA（配列番号:23）、ここで、Rは前記PEDV Sタンパク質のS1/S2開裂部位の保存アルギニン残基であり、Xは任意のアミノ酸残基であることができるか、又は
b）アミノ酸配列RSXIEDAL（配列番号:24）、ここで、Rは前記PEDV Sタンパク質のS1/S2開裂部位の保存アルギニン残基であり、Xは任意のアミノ酸残基であることができるか、又は
c）アミノ酸配列RSXIEDAA（配列番号:25）、ここで、Rは前記PEDV Sタンパク質のS1/S2開裂部位の保存アルギニン残基であり、Xは任意のアミノ酸残基であることができる。
【００１３】
本発明との関係で記載される、“遺伝子コードアミノ酸残基”という用語は、特に以下から成る群から選択されるアミノ酸残基（カッコ内は一文字コード）を指す：アラニン残基（A）、システイン残基（C）、アスパラギン酸残基（D）、グルタミン酸残基（E）、フェニルアラニン残基（F）、グリシン残基（G）、ヒスチジン残基（H）、イソロイシン残基（I）、リジン残基（K）、ロイシン残基（L）、メチオニン残基（M）、アスパラギン残基（N）、プロリン残基（P）、グルタミン残基（Q）、アルギニン残基（R）、セリン残基（S）、スレオニン残基（T）、バリン残基（V）、トリプトファン残基（W）及びチロシン残基（Y）。
さらに、本発明は、以下の（a）及び（b）から成る群から選択されるブタ流行性下痢ウイルス（PEDV）スパイク（S）タンパク質をコードする核酸分子を提供する：
（a）少なくとも1つの変異を有する遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質であって、
−アミノ酸900位のロイシン残基がロイシン残基の以外のアミノ酸残基によって置換されるもの、及び/又は
−アミノ酸901位のロイシン残基がロイシン残基以外のアミノ酸残基によって置換されるもの、
ここで、当該アミノ酸位の番号付けは、配列番号:2又は配列番号:39の野生型G2a PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列を参照し；
（b）少なくとも1つの変異を有する遺伝子型2b（G2b）PEDV Sタンパク質であって、
−アミノ酸897位のロイシン残基がロイシン残基の以外のアミノ酸残基によって置換されるもの、及び/又は
−アミノ酸898位のロイシン残基がロイシン残基以外のアミノ酸残基によって置換されるもの、
ここで、当該アミノ酸位の番号付けは、配列番号:3の野生型G2b PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列を参照する。
【００１４】
したがって、本発明は、以下の（a）及び（b）から成る群から選択されるブタ流行性下痢ウイルス（PEDV）スパイク（S）タンパク質をコードする核酸分子を提供する：
（a）少なくとも1つの変異を有する遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質であって、
−アミノ酸900位のロイシン残基がロイシン残基の以外のアミノ酸残基によって置換され、かつアミノ酸901位の残基がロイシン残基であるもの、又は
−アミノ酸900位の残基がロイシン残基であり、かつアミノ酸901位の残基がロイシン残基以外のアミノ酸残基によって置換されるもの、又は、
−アミノ酸900位及び901位の残基がロイシン残基の以外のアミノ酸残基によって置換されるもの、
ここで、当該アミノ酸位の番号付けは、配列番号:2又は配列番号:39の野生型G2a PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列を参照し；
（b）少なくとも1つの変異を有する遺伝子型2b（G2b）PEDV Sタンパク質であって、
−アミノ酸897位のロイシン残基がロイシン残基の以外のアミノ酸残基によって置換され、かつアミノ酸898位の残基がロイシン残基であるもの、又は
−アミノ酸897位の残基がロイシン残基であり、かつアミノ酸898位の残基がロイシン残基以外のアミノ酸残基によって置換されるもの、又は、
−アミノ酸897位及び898位の残基がロイシン残基の以外のアミノ酸残基によって置換されるもの、
ここで、当該アミノ酸位の番号付けは、配列番号:3の野生型G2b PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列を参照する。
本明細書で記載されるように、“アミノ酸900位及び901位の残基がロイシン残基以外のアミノ酸残基によって置換される”という言い回しは、“アミノ酸900位及び901位の残基が各々ロイシン残基以外のアミノ酸残基によって置換される”という言い回しと同等であり、“アミノ酸897位及び898位の残基がロイシン残基以外のアミノ酸残基によって置換される”という言い回しは、“アミノ酸897位及び898位の残基が各々ロイシン残基以外のアミノ酸残基によって置換される”という言い回しとそれぞれ同等である。
【００１５】
“遺伝子グループ”という用語はPEDV関係の文献でしばしば用いられる“遺伝子型”という用語と同等であることがさらに理解される。“遺伝子型2a（G2a）”及び“遺伝子型2b（G2b）”という用語は当業者には周知である。S遺伝子の系統発生研究によって、PEDVは、遺伝学的に2つのグループ：遺伝子グループ1（G1；古典的）及び遺伝子グループ2（G2；野外の流行性又は大流行性）に分類されえる。当該遺伝子グループの各々はさらにサブグループ（1a及び1b；2a及び2b）に分割されえる。G2は世界的な野外単離株を含み、さらに2a及び2bサブグループにクラスター化され、それらは、それぞれ、アジアにおける以前の局所的流行発生並びに北米及びアジアにおける最近の大流行発生の要因である。
“アミノ酸位の番号付けは配列番号:2又は配列番号:39の野生型G2a PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列を参照する”及び“アミノ酸位の番号付けは配列番号:3の野生型G2b PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列を参照する”という用語は、アミノ酸位の番号付けは、完全長の野生型G2a PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列（配列番号:2又は配列番号:39）及び野生型G2b PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列（配列番号:3）をそれぞれ参照すると理解されねばならない。したがって、本明細書で言及されるアミノ酸位の番号付けは、野生型G2a PEDV Sタンパク質配列及び野生型G2b PEDV Sタンパク質配列（1388若しくは1386アミノ酸残基又は1383アミノ酸残基をそれぞれ有し、（N-末端）アミノ酸1位にメチオニン残基を含む）との参照による。したがって、本発明の関係で用いられる番号付けは、天然に存在するG2a PEDV Sタンパク質及び野生型G2b PEDV Sタンパク質（それぞれ配列番号:2若しくは配列番号:39及び配列番号:3に示される）に関する。換言すれば、例えば900位のアミノ酸又は残基と参照される場合、それぞれ配列番号:2又は配列番号:39のアミノ酸900と対応するアミノ酸を意味する。しかしながら、これは、本発明のスパイクタンパク質がそれぞれ配列番号:2又は配列番号:39と同一のアミノ酸配列を有することを意味しない。本発明のスパイクタンパク質に対応するアミノ酸は明白に言及されたアミノ酸残基をコードすると述べているだけである。
【００１６】
本発明の核酸分子の別の具体的な特徴では、ロイシン残基以外のアミノ酸残基は、アラニン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基及びバリン残基から成る群から選択される。
本発明の核酸分子の別の具体的な特徴では、ロイシン残基以外のアミノ酸残基は、アラニン残基又はグリシン残基から成る群から選択される。したがって、本発明は特に以下を含むブタ流行性下痢ウイルス（PEDV）スパイク（S）タンパク質をコードする核酸分子を提供する：
a）アミノ酸配列RSXIEDLA（配列番号:23）、又は
b）アミノ酸配列RSXIEDAL（配列番号:24）、又は
c）アミノ酸配列RSXIEDAA（配列番号:25）、又は
d）アミノ酸配列RSXIEDLG（配列番号:31）、又は
e）アミノ酸配列RSXIEDGL（配列番号:32）、又は
f）アミノ酸配列RSXIEDGG（配列番号:33）、又は
g）アミノ酸配列RSXIEDGA（配列番号:34）、又は
h）アミノ酸配列RSXIEDAG（配列番号:35）、
ここで、Rは前記PEDV Sタンパク質のS1/S2開裂部位の保存アルギニン残基であり、かつXは任意のアミノ酸残基であることができる。
【００１７】
本発明の核酸分子の別の具体的な特徴では、前記ロイシン残基以外のアミノ酸残基はアラニン残基である。
本発明の核酸分子の別の具体的な特徴では、アミノ酸位の番号付けは、野生型G PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列RSXIEDLLF（配列番号:4）を参照し、RはS1/S2開裂部位の保存アルギニン残基であり、かつLLは遺伝子型2a（G2a）PEDV S内のアミノ酸900位及び901位であるか、又はLLは遺伝子型2b（G2b）PEDV S内のアミノ酸897位及び898位である。
本発明の核酸分子の別の具体的な特徴では、前記PEDV Sタンパク質はアミノ酸配列RSXIEDAAF（配列番号:5）を含み、ここでRは前記PEDV Sタンパク質のS1/S2開裂部位の保存アルギニン残基であり、かつAAは遺伝子型2a（G2a）PEDV S内のアミノ酸900位及び901位であるか、又はAAは遺伝子型2b（G2b）PEDV S内のアミノ酸897位及び898位である。
【００１８】
本発明の核酸分子の別の具体的な特徴では、PEDV Sタンパク質はアミノ酸配列X1X2X3FX4KX5X6X7X8（配列番号:6）を含み、X8は前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸残基であるか、又は前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸位に対して-2位のアミノ酸残基であり、
X2からX5、X7及びX8は任意のアミノ酸残基であることができ、かつ
（i）X1はチロシン残基以外のアミノ酸残基で、かつX6はヒスチジン残基であるか、又は
（ii）X1はチロシン残基で、かつX6はヒスチジン残基以外のアミノ酸残基であるか、又は
（iii）X1はチロシン残基以外のアミノ酸残基で、かつX6はヒスチジン残基以外のアミノ酸残基である。
好ましくは、本発明との関係では、前記PEDV Sタンパク質が遺伝子型2b（G2b）PEDV Sタンパク質である場合、X8は前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸残基であるか、又は前記PEDV Sタンパク質が遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質である場合、X8は前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸位に対して-2位のアミノ酸残基である。“前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸位に対して-2位のアミノ酸残基”という用語は、具体的には“アミノ酸位n-2のアミノ酸残基、ここでnは前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸残基のアミノ酸位である”と同等であると理解される。したがって、例えば、PEDVタンパク質（例えば遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質）が長さが1388アミノ酸であるアミノ酸配列を有する場合、前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸位に対して-2位のアミノ酸残基は、前記PEDVタンパク質又は遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質のそれぞれアミノ酸1386位のアミノ酸残基である。さらに、本明細書に記載されるように、“X2からX5、X7及びX8は任意のアミノ酸残基であることができる”という言い回しは、特に“X2からX5、X7及びX8の各々が任意のアミノ酸残基であることができる”と同等であると理解される。さらにまた、“X2、X3、X4、X5、X6、X7は任意のアミノ酸残基であることができる”という言い回しは、“X2、X3、X4、X5、X6、X7の各々が任意のアミノ酸残基であることができる”と同等であり、“X1、X2、X3、X4、X6、X7は任意のアミノ酸残基であることができる”は、“X1、X2、X3、X4、X6及びX7の各々が任意のアミノ酸残基であることができる”と同等であり、“X2、X3、X4、X5、X7、X8は任意のアミノ酸残基であることができる”は、“X2、X3、X4、X5、X7及びX8の各々が任意のアミノ酸残基であることができる”とそれぞれ同等である。
有利には、X1X2X3FX4KX5X6X7X8（配列番号:6）に対するスパイクタンパク質の保持シグナル内の前記改変は、スパイクタンパク質の形質膜中への局在をもたらす。
さらにまた、これらの改変はPEDVワクチンの生産方法を改善する。これは特に組換えベクターの安定性に関し、加えて、記載の変異によりPEDVスパイクタンパク質の生物学的活性の妨害のために生産細胞株での組換えベクターのより高力価での増殖を可能にしえる。
【００１９】
さらに、本発明は、アミノ酸配列X1X2X3FX4KX5X6X7X8（配列番号:6）を含むブタ流行性下痢ウイルス（PEDV）スパイク（S）タンパク質をコードする核酸分子を提供し、
X8は前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸残基であるか、又は前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸位に対して-2位のアミノ酸残基であり、
X2からX5、X7及びX8は任意のアミノ酸残基であることができ、
（i）X1はチロシン残基以外のアミノ酸残基で、かつX6はヒスチジン残基であるか、又は
（ii）X1はチロシン残基で、かつX6はヒスチジン残基以外のアミノ酸残基であるか、又は
（iii）X1はチロシン残基以外のアミノ酸残基で、かつX6はヒスチジン残基以外のアミノ酸残基であり、
好ましくはX7は、
−前記PEDV Sタンパク質が遺伝子型2b（G2b）PEDV Sタンパク質である場合、前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸残基であるか、又は、
−前記PEDV Sタンパク質が遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質である場合、前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸位に対して-2位のアミノ酸残基である。
【００２０】
本発明の核酸分子の別の具体的な特徴では、前記PEDV Sタンパク質はさらに以下を含む：
a）アミノ酸配列X1X2X3FX4KX5HX6X7（配列番号:26）、X7は前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸残基であるか、又は前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸位に対して-2位のアミノ酸残基であり、X1はチロシン残基以外のアミノ酸残基であり、X2、X3、X4、X5、X6、X7は任意のアミノ酸残基であることができ、
かつX7は好ましくは、
−前記PEDV Sタンパク質が遺伝子型2b（G2b）PEDV Sタンパク質である場合、前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸残基であるか、又は、
−前記PEDV Sタンパク質が遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質である場合、前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸位に対して-2位のアミノ酸残基であるか、又は
b）アミノ酸配列YX1X2FX3KX4X5HX6X7（配列番号:27）、X7は前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸残基であるか、又は前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸位に対して-2位のアミノ酸残基であり、X5はヒスチジン残基以外のアミノ酸残基であり、X1、X2、X3、X4、X6、X7は任意のアミノ酸残基であることができ、
かつX7は好ましくは、
−前記PEDV Sタンパク質が遺伝子型2b（G2b）PEDV Sタンパク質である場合、前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸残基であるか、又は、
−前記PEDV Sタンパク質が遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質である場合、前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸位に対して-2位のアミノ酸残基であるか、又は、
c）アミノ酸配列X1X2X3FX4KX5X6X7X8（配列番号:6）、X8は前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸残基であるか、又は前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸位に対して-2位のアミノ酸残基であり、X1はチロシン残基以外のアミノ酸残基であり、X6はヒスチジン残基以外のアミノ酸残基であり、X2、X3、X4、X5、X7、X8は任意のアミノ酸残基であることができ、
かつX8は好ましくは、
−前記PEDV Sタンパク質が遺伝子型2b（G2b）PEDV Sタンパク質である場合、前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸残基であるか、又は、
−前記PEDV Sタンパク質が遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質である場合、前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸位に対して-2位のアミノ酸残基である。
【００２１】
本発明の核酸分子の別の具体的な特徴では、前記PEDV Sタンパク質はさらに以下を含む：
a）アミノ酸配列AXXFXKXHXX-COOH（配列番号:28）、又は
b）アミノ酸配列YXXFXKXRXX-COOH（配列番号:29）、又は
c）アミノ酸配列AXXFXKXRXX-COOH（配列番号:30）、
ここで、X-COOHは前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸残基であるか、又は前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸位に対して-2位のアミノ酸残基であり、Xは任意のアミノ酸残基であることができ、
かつX-COOHは好ましくは、
−前記PEDV Sタンパク質が遺伝子型2b（G2b）PEDV Sタンパク質である場合、前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸残基であるか、又は、
−前記PEDV Sタンパク質が遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質である場合、前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸位に対して-2位のアミノ酸残基である。
本発明の核酸分子の別の具体的な特徴では、
（a）前記G2a PEDV Sタンパク質において、さらに
−アミノ酸1377位のチロシン残基はチロシン残基以外のアミノ酸残基によって置換され、及び/又は
−アミノ酸1384位のヒスチジン残基はヒスチジン残基以外のアミノ酸残基によって置換されるか、又は
（b）前記G2b PEDV Sタンパク質において、さらに
−アミノ酸1374位のチロシン残基はチロシン残基以外のアミノ酸残基によって置換され、及び/又は
−アミノ酸1381位のヒスチジン残基はヒスチジン残基以外のアミノ酸残基によって置換される。
上記で規定されるように、本発明との関係で用いられる番号付けは、天然に存在するG2a PEDV Sタンパク質及び野生型G2b PEDV Sタンパク質の配列（それぞれ配列番号:2又は配列番号:39及び配列番号:3に示される）に関連する。
【００２２】
本発明の核酸分子の別の具体的な特徴では、
（a）前記G2a PEDV Sタンパク質において、さらに
−アミノ酸1377位のチロシン残基はチロシン残基以外のアミノ酸残基によって置換され、かつアミノ酸1384位の残基はヒスチジン残基であるか、又は
−アミノ酸1377位の残基はチロシン残基であり、かつアミノ酸1384位のヒスチジン残基はヒスチジン残基以外のアミノ酸残基によって置換されるか、又は
−アミノ酸1377位のチロシン残基はチロシン残基以外のアミノ酸残基によって置換され、かつアミノ酸1384位のヒスチジン残基はヒスチジン残基以外のアミノ酸残基によって置換されるか、又は
（b）前記G2b PEDV Sタンパク質において、さらに
−アミノ酸1374位のチロシン残基はチロシン残基以外のアミノ酸残基によって置換され、かつアミノ酸1381位の残基はヒスチジン残基であるか、又は
−アミノ酸1374位の残基はチロシン残基であり、かつアミノ酸1381位のヒスチジン残基はヒスチジン残基以外のアミノ酸残基によって置換されるか、又は
−アミノ酸1374位のチロシン残基はチロシン残基以外のアミノ酸残基によって置換され、かつアミノ酸1381位のヒスチジン残基はヒスチジン残基以外のアミノ酸残基によって置換される。
本発明の核酸分子の別の具体的な特徴では、
−チロシン残基以外のアミノ酸残基は、アラニン残基、グリシン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基及びバリン残基から成る群から選択され、及び/又は
−ヒスチジン残基以外のアミノ酸残基はアルギニン残基である。
本発明の核酸分子の別の具体的な特徴では、
−チロシン残基以外のアミノ酸残基はアラニン残基であり、及び/又は
−ヒスチジン残基以外のアミノ酸残基はアルギニン残基である。
【００２３】
本発明の核酸分子の別の具体的な特徴では、アミノ酸位の番号付けは、野生型G PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列YXXFXKXH（配列番号:7）を参照し、Y及びHは遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質内のアミノ酸1377位及び1384位であるか、又はY及びHは遺伝子型2b（G2b）PEDV Sタンパク質内のアミノ酸1374位及び1381位である。
本発明の核酸分子の別の具体的な特徴では、核酸分子はアミノ酸配列AXXFXKXR（配列番号:8）をコードする配列を含み、A及びRは遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質内のアミノ酸1377位及び1384位であるか、又はA及びRは遺伝子型2b（G2b）PEDV Sタンパク質内のアミノ酸1374位及び1381位である。
本発明の核酸分子の別の具体的な特徴では、前記PEDV Sタンパク質は、
i）（a）配列番号:15、16、17、18、19、20、40のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.1％、少なくとも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、少なくとも99.8％、又は少なくとも99.9％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか若しくは前記アミノ酸配列から成るか、又は
（b）配列番号:9、10、11、12、13、14のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.1％、少なくとも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、少なくとも99.8％、又は少なくとも99.9％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか若しくは前記アミノ酸配列から成るか、及び/又は
ii）（a）配列番号:15、16、17、18、19、20、40のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.1％、少なくとも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、少なくとも99.8％、又は少なくとも99.9％配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされるか、又は
（b）配列番号:9、10、11、12、13、14のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.1％、少なくとも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、少なくとも99.8％、又は少なくとも99.9％配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。
【００２４】
“同一性”又は“配列同一性”という用語は当業界では公知であり、2つ以上のポリペプチド配列又は2つ以上のポリヌクレオチド配列、すなわち参照配列及び当該参照配列と比較されるべき与えられた配列間の関係を指す。配列同一性は、与えられた配列を参照配列と、これら配列を最適にアラインメントして最高度の配列類似性（そのような配列の一続き間の適合によって決定される）を達成した後で比較することによって決定される。そのようなアラインメントに際して、配列同一性は一位置毎に確認される。例えば、ある特定の位置でヌクレオチド又はアミノ酸残基が同一であるならば、当該配列は当該特定の位置で“同一”である。そのような位置同一性の総数を参照配列のヌクレオチド又は残基総数で割って％配列同一性が得られる。配列同一性は公知の方法によって容易に計算することができる。前記方法には以下に記載された方法が含まれる（ただしそれらに限定されない）：Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York（1988）；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York（1993）；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey（1994）；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press（1987）；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York（1991）；及びCarillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073（1988）（前記文献の教示は参照によって本明細書に含まれる）。配列同一性を決定する好ましい方法は、被検配列間で最大の適合を生じるために設計される。配列同一性を決定する方法は、与えられた配列間の配列同一性を決定する公開コンピュータプログラムで成文化されている。そのようなプログラムの例には以下が含まれる（ただしそれらに限定されない）：GCGプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387（1984））、BLASTP、BLASTN及びFASTA（Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410（1990）。BLASTXプログラムは、NCBI及び他の供給源（BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894；Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410（1990）、前記文献の教示は参照によって本明細書に含まれる）から公開されている。これらのプログラムは、与えられた配列と参照配列との間の高レベルの配列同一性を達成するために規定値ギャップ重を用いて配列を最適にアラインメントする。例示として、参照ヌクレオチド配列に対して例えば少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％の“配列同一性”を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、与えられたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列の各100ヌクレオチドにつき最大15、好ましくは最大10、より好ましくは最大5つの点変異を有するという点を除いて当該参照配列と同一であることが意図される。換言すれば、参照配列に対して少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドでは、参照配列のヌクレオチドの最大15％、好ましくは10％、より好ましくは5％が欠失若しくは別のヌクレオチドで置換されえるか、又は参照配列の総ヌクレオチドの最大15％、好ましくは10％、より好ましくは5％のヌクレオチド数が参照配列に挿入されえる。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5’若しくは3’末端位に又はそれら末端位の間の任意の場所に生じるか、参照配列のヌクレオチド中に個々に又は参照配列内で1つ以上の連続するグループで散在しえる。同様に、参照アミノ酸配列に対して例えば少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％の配列同一性を有するあるアミノ酸配列を有するポリペプチドによって、当該あるポリペプチド配列は、参照アミノ酸配列の各100アミノ酸につき最大15、好ましくは最大10、より好ましくは最大5つのアミノ酸変異を含みえるという点を除いて、当該ポリペプチドのあるアミノ酸配列は参照配列と同一であることが意図される。換言すれば、参照アミノ酸配列と少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％配列同一性を有するあるポリペプチド配列を得るために、参照配列のアミノ酸残基の最大15％、好ましくは最大10％、より好ましくは最大5％が欠失若しくは別のアミノ酸で置換されえるか、又は参照配列のアミノ酸残基総数の最大15％、好ましくは最大10％、より好ましくは最大5％のアミノ酸数が参照配列に挿入されえる。参照配列のこれらの変異は、参照アミノ酸配列のアミノ若しくはカルボキシ末端位に又はそれら末端位の間の任意の場所に生じるか、参照配列の残基中に個々に又は参照配列内で1つ以上の連続するグループで散在しえる。好ましくは、同一ではない残基位は保存的アミノ酸置換では相違する。しかしながら、保存的置換は、配列同一性を決定するときには適合に含まれない。
【００２５】
“同一性”、“配列同一性”及び“パーセント同一性”という用語は本明細書では互換的に用いられる。本発明の目的のためには、2つのアミノ酸配列又は2つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列は最適な比較を目的としてアラインメントされる（例えば、第一のアミノ酸又は核酸の配列に第二のアミノ酸又は核酸配列との最適なアラインメントのためにギャップを導入することができる）。続いて、対応するアミノ酸又はヌクレオチド位のアミノ酸又はヌクレオチド残基が比較される。第一の配列の位置が、第二の配列の対応する位置と同じアミノ酸又はヌクレオチド残基によって占められるとき、当該分子は当該位置で同一である。2つの配列間のパーセント同一性は、当該配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の数/位置の総数（すなわち重なり合う位置）ｘ100）。好ましくは、2つの配列は同じ長さである。
配列比較は、比較される2つの配列の全長にわたって、又は2つの配列のフラグメントにわたって実施されえる。典型的には、比較は、2つの配列の完全長にわたって実施されるであろう。しかしながら、配列同一性は、例えば20、50、100又は前記を超える連続するアミノ酸残基の領域にわたって実施されえる。
【００２６】
種々のコンピュータプログラムが2つの配列間の相同性を決定するために利用可能であるという事実に当業者は気付いているであろう。例えば、配列の比較及び2つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成できる。好ましい実施態様では、2つのアミノ酸又は核酸配列間のパーセント同一性は、NeedlemanとWunsch（Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. (48):444-453（1970））のアルゴリズムを用いて決定され（前記アルゴリズムは、Accelrys GCGソフトウェアパッケージ（http://www.accelrys.com/products/gcg/で入手できる）のGAPプログラムに取り入れられている）、Blosum 62マトリックス又はPAM250マトリックスのどちらか並びに16、14、12、10、8、6又は4のギャップ重及び1、2、3、4、5又は6の長さ重が用いられる。当業者は、これらすべての異なるパラメータはわずかに相違する結果を生じるが、2つの配列の全体的パーセンテージ同一性は異なるアルゴリズムを用いたときに有意には変化しないことを認識するであろう。
本発明のタンパク質配列又は核酸配列はさらに、公開データベースの検索を実施するために“クェリー配列”として用いられ、例えば他のファミリーメンバー又は関連配列を識別することができる。そのような検索は、Altschulら（Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10）のBLASTN及びBLASTPプログラム（バージョン2.0）を用いて実施できる。BLASTタンパク質検索はBLASTPプログラム（スコア＝50、ワード長＝3）を用いて実施され、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を入手することができる。比較目的のためにギャップ有りアラインメントを達成するために、文献（Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402）に記載されているようにGapped BLASTを利用することができる。BLAST及びGapped BLASTプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えばBLASTP及びBLASTN）の既定値パラメータを用いることができる。アメリカ国立生物工学情報センターのホームページ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照されたい。
【００２７】
本明細書で用いられるように、“配列番号:Yの配列と同一”という用語は、“配列番号:Yの長さにわたって配列番号:Yの配列と同一”という用語、又は“配列番号:Yの全長にわたって配列番号:Yの配列と同一”という用語とそれぞれ同等である。この文脈では、“Y”は1から40から選択される任意の整数で、“配列番号:Y”は本明細書で言及される配列番号の任意の番号を表す。
本発明の核酸分子の別の具体的な特徴では、前記PEDV Sタンパク質は、
（a）配列番号:15、16、17、18、19、20、40のいずれかの1つのアミノ酸配列を含むか、又は
（b）配列番号:9、10、11、12、13、14のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。
例示的で非限定的な例では、本発明の核酸分子は、配列番号:36、配列番号:37及び配列番号:38から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
さらに、本発明は、本明細書に記載される核酸分子によってコードされるPEDV（S）タンパク質を提供する。
本発明の核酸分子又はPED Sタンパク質の別の具体的な特徴では、前記PEDV Sタンパク質をコードする核酸分子又はPEDV Sタンパク質は組換え体である。
【００２８】
本明細書で用いられる“組換え体”という用語は、ポリヌクレオチド（DNA分子、RNA分子、cDNA分子又は誘導体を含む）又はポリペプチドで、対応するポリヌクレオチド又はポリペプチドに対して天然では存在しない任意の改変を有するものに関する。例えば、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、人工的に（例えば人間の介入によって）導入される挿入、欠失、倒置、再配置又は点変異を含む場合、それらは“組換え体”と考えられる。したがって、当該ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、天然で随伴する配列（ポリヌクレオチド又はポリペプチド）の全部又は部分を随伴しない。ウイルスに関して用いられる“組換え体”という用語は、当該ウイルスのゲノムの人工的操作によって生産されるウイルスを意味する。“組換えウイルス”という用語は遺伝学的に改変されたウイルスを包含する。
好ましくは、本発明のタンパク質は天然に存在しないタンパク質である。
好ましくは、前記タンパク質は単離されたタンパク質である。
さらに、本発明は本明細書に記載される核酸分子を含むポリヌクレオチドを提供する。
本明細書に記載される核酸分子及びポリヌクレオチドの生産は当業界の技術範囲内であり、とりわけ以下に記載される組換え技術にしたがって実施できる：Sam brook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；Amusable, et al., 2003, Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY；Innis et al. (eds), 1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego；及びErlich (ed), 1994, PCR Technology, Oxford University Press, New York（前記のいずれも参照によって本明細書に含まれる）。
【００２９】
さらに、本発明は、本明細書に記載される核酸分子又は本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
当業界で公知の“ベクター”という用語は、ポリヌクレオチド構築物、典型的にはプラスミド又は細菌人工染色体を指し、宿主細胞に遺伝物質伝達するために用いられる。ベクターは、例えば細菌、ウイルス、ファージ、細菌人工染色体、コスミド、又はプラスミドでありえる。本明細書で用いられるベクターはDNA又はRNAのどちらかを含むか又はそれらを含有しえる。いくつかの実施態様では、ベクターはDNAを含む。いくつかの実施態様では、ベクターは感染性ウイルスである。そのようなウイルスベクターは、細胞培養においても宿主動物においても当該ウイルスベクターの複製について機能を持たない外来遺伝子を保持するように操作されたウイルスゲノムを含有する。本開示の具体的な特徴にしたがえば、ベクターは、多様な特徴のために、例えば単なる遺伝物質の伝達のために、宿主細胞又は有機体のトランスフェクションのために、ワクチン（例えばDNAワクチン）としての使用のために、又は遺伝子発現目的のために用いることができる。遺伝子発現は、遺伝子と呼称される特定のポリヌクレオチド配列によって指令される細胞内におけるタンパク質の生合成を言い表す用語である。具体的な特徴では、ベクターは“発現ベクター”であることができ、発現ベクターは、適切な環境に存在するとき、当該ベクターによって保持される1つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を指令することができるベクターである。
【００３０】
ベクター及びベクター（又は組換え体）の作製及び/又は発現のための使用方法は、以下に開示された方法又は同様な方法による：U.S. Pat. Nos. 4,603,112、4,769,330、5,174,993、5,505,941、5,338,683、5,494,807、4,722,848、5,942,235、5,364,773、5,762,938、5,770,212、5,942,235、382,425、PCT公開WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti,“Applications of pox virus vectors to vaccination: An update”,PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996；Moss,“Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety”,PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996；Smith et al., U.S. Pat. No. 4,745,051（組換えバキュロウイルス）；Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39,“Baculovirus Expression Protocols”（1995 Humana Press Inc.）；Smith et al.,“Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector”, Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165；Pennock et al.,“Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector”, Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406；EPA0 370 573；米国出願No. 920,197（1986年10月16日出願）；EP特許公開No. 265785；U.S. Pat. No. 4,769,331（組換えヘルペスウイルス）；Roizman,“The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors”,PNAS USA 93:11307-11312, October 1996；Andreansky et al.,“The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors”,PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996；Robertson et al.,“Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes”, PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996；Frolov et al.,“Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications,” PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996；Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991；U.S. Pat. Nos. 5,591,439、5,552,143；WO 98/00166；許可米国出願Ser. Nos. 08/675,556及び08/675,566（ともに1996年7月3日出願（組換えアデノウイルス）；Grunhaus et al., 1992,“Adenovirus as cloning vectors”,Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993；Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990；Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434；PCT WO 91/11525；Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993; and McClements et al.,“Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease”, PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996；及びU.S. Pat. Nos. 5,591,639、5,589,466、及び5,580,859、その他にとりわけWO 90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang et al., Nature、及びFurth et al., Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectors。以下もまた参照されたい：WO 98/33510；Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998（レンチウイルス発現系）；Sanford et al., U.S. Pat. No. 4,945,050；Fischbachet al.（Intracel）；WO 90/01543；Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283（1997）、（DNAベクター系）；Szoka et al., U.S. patent No. 4,394,448（生細胞へのDNA挿入方法）；McCormick et al., U.S. Pat. No. 5,677,178（細胞変性ウイルスの使用）；及びU.S. Pat. No. 5,928,913（遺伝子デリバリー用ベクター）；その他に本明細書に引用される他の文書類。
【００３１】
好ましくは、前記ベクターはウイルスベクターである。
“ウイルスベクター”という用語は、当該ベクターの宿主細胞への侵入が具体的な生物学的活性（例えば当該ベクターに保持されるトランスジーンの発現）が生じるように、組換えDNA技術によって操作された遺伝子改変ウイルスを言い表す。具体的な特徴では、トランスジーンは抗原である。ウイルスベクターは、標的細胞、組織又は有機体において複製能力があってもなくてもよい。本明細書で用いられる“viral vector（ウイルスベクター）”という用語は、“virus vector（ウイルスベクター）”と同等である。
ウイルスベクターの生成は、当業界で公知の任意の適切な遺伝子操作技術を用いて達成され、それら技術には以下に関する標準的技術が含まれる（ただしそれらに限定されない）：制限エンドヌクレアーゼ消化、連結、形質転換、プラスミド精製、DNA配列決定、細胞培養のトランスフェクション。前記技術は例えば以下に記載されている：Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989；又はK. Maramorosch and H. Koprowski (Methods in Virology Volume VIII, Academic Press Inc. London, UK, 2014。
ウイルスベクターは任意の公知有機体のゲノムから配列を取り込むことができる。配列はそれらの自然のままの形で取り込まれても、又は所望の活性を得るために任意の態様で改変されてもよい。例えば、配列は挿入、欠失又は置換を含むことができる。
本発明の具体的な特徴では、ベクターは、CDV（イヌジステンパーウイルス）、EHV（ウマヘルペスウイルス）若しくはORFウイルス（パラポックスウイルス）、PRV（仮性狂犬病ウイルス）、CAV（イヌアデノウイルス）、PCMV（ブタサイトメガロウイルス）、又はBoHV-4（ウシヘルペスウイルス-4）である。
本発明のベクターの具体的な特徴では、ベクターはCDV又はEHVである。
【００３２】
さらに、本発明は、本明細書に記載のPEDV Sタンパク質をコードする核酸分子及び/又は本明細書に記載のPEDV Sタンパク質及び/又は本明細書に記載のベクターを含む免疫原性組成物を提供する。
“免疫原性組成物”という用語は、少なくとも1つの抗原（当該免疫原性組成物が投与される宿主で免疫学的応答を誘発する）を含む組成物を指す。そのような免疫学的応答は、本発明の免疫原性組成物に対する細胞性及び/又は抗体媒介免疫応答でありえる。好ましくは、免疫原性組成物は免疫応答を誘発し、より好ましくは、PEDV感染の臨床的徴候の1つ以上に対して防御免疫を付与する。宿主はまた“対象”と記載される。本明細書に記載若しくは言及される宿主又は対象はいずれも仔ブタ、ブタ又は雌ブタである。
通常は、“免疫学的応答”には1つ以上の以下の作用が含まれる（ただしそれらに限定されない）：本発明の免疫原性組成物に含まれる1つの抗原又は複数の抗原に特異的に対抗する抗体、B細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、及び/又は細胞傷害性T細胞、及び/又はガンマ-デルタT細胞の産生又は活性化。好ましくは、宿主は防御性免疫応答又は治療応答を示すであろう。
“防御性免疫学的応答”又は“防御免疫”は、感染宿主が通常示する臨床的徴候の軽減若しくは欠如、より速やかな回復時間及び/又は短縮される感染力持続期間又は感染宿主の組織、体液若しくは分泌物中のより低い病原体力価のいずれかによって明示されるであろう。
新規感染に対する耐性が増強され及び/又は当該疾患の臨床的重篤性が軽減される防御性免疫学的応答を宿主が示す場合、免疫原性組成物は“ワクチン”と表現される。
【００３３】
本発明の免疫原性組成物の別の具体的な特徴では、免疫原性組成物はさらに医薬的に許容できる担体を含む。
“医薬的に許容できる担体”という用語には、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、安定化剤、希釈剤、保存料、抗菌及び抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、アジュバント、免疫刺激剤、及び前記の組合せが含まれる。
“希釈剤”には、水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどが含まれえる。等張剤には、とりわけ塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースが含まれえる。安定化剤にはとりわけアルブミン及びエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩が含まれる。
本発明のある特徴では、医薬的に許容できる担体はリン酸緩衝食塩水である。
好ましくは、免疫原性組成物はさらにシュクロースゼラチン安定化剤を含む。
本発明のある特徴では、医薬的に許容できる担体はキトサンである。
キトサンは、甲殻類（例えばエビ、カニ）、昆虫、及び他の無脊椎動物のキチン由来の天然の脱アセチル化多糖類である。最近、Rauwら（Rauw et al. 2009, Vet Immunol Immunop 134:249-258）は、キトサンはニューカッスル病生ワクチンの細胞性免疫応答を増強し、その防御作用を促進することを示した。さらにWamgら（Wang et al., Arch Virol (2012) 157:1451-1461）は、生弱毒インフルエンザワクチンでの使用についてアジュバントとしてのキトサンの潜在能力を明示する結果を示した。
好ましくは、免疫原性組成物は、さらに1つ以上の他の免疫調節剤（例えばインターロイキン、インターフェロン、又は他のサイトカイン）を含むことができる。本発明の関係で有用なアジュバント及び添加物の量及び濃度は当業者が容易に決定することができる。
【００３４】
いくつかの特徴では、本発明の免疫原性組成物はアジュバントを含む。本明細書で用いられる“アジュバント”には、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム、サポニン、例えばQuil A、QS-21（Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA）、GPI-0100（Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL）、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、水中油中水エマルジョンが含まれえる。エマルジョンは特に以下を基剤にすることができる：形質流動パラフィン油（欧州薬局方タイプ）；イソプレノイド油、例えばスクァラン又はスクァレン；アルケン（特にイソブテン又はデセン）のオリゴマー化から生じる油；直鎖状アルキル基を含む酸又はアルコールのエステル、より具体的には植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ-(カプリレート/カプレート)、グリセリルトリ-(カプリレート/カプレート)又はプロピレングリコールジオレエート；分枝脂肪酸又はアルコールのエステル、特にイソステアリン酸エステル。油はエマルジョンを形成させるために乳化剤と一緒に用いられる。乳化剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、特にソルビタンのエステル、マンニドのエステル（例えばアンヒドロマンニトールオレエート）、グリコールのエステル、ポリグリセロールのエステル、プロピレングリコールのエステル、及びオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸又はヒドロキシステアリン酸のエステル（場合によってエトキシル化される）、並びにポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンコポリマーブロック、具体的にはプルロニック製品、特にL121である。以下を参照されたい：Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, pp51-94, 1995；及びTodd et al., Vaccine 15:564-570, 1997。例示的なアジュバントは、M. Powell and M. Newman編集の著書“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach”, Plenum Press, 1995）の147ページに記載されているSPTエマルジョン及び同書の183ページに記載されているエマルジョンMF59である。
【００３５】
アジュバントの更なる例は、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー並びに無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のコポリマーから選択される化合物である。有利なアジュバント化合物はアクリル酸又はメタクリル酸のポリマーであり、これらは特に糖又はポリアルコールのポリアルケニルエーテルで架橋される。これらの化合物は、カルボマーという用語で知られている（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者はまた米国特許2,909,462号を参照することができる（少なくとも3つのヒドロキシル基（好ましくは8個を超えない）を有し、少なくとも3つのヒドロキシルの水素原子が少なくとも2つの炭素原子を有する不飽和脂肪酸ラジカルによって置き換えられている、ポリヒドロキシル化化合物で架橋されたアクリル酸ポリマーを記載する）。好ましいラジカルは、2から4個の炭素原子を含むもの、例えばビニル、アリル及び他のエチレン系不飽和基である。不飽和ラジカルはそれ自体他の置換基、例えばメチルを含むことができる。カルボポール（BF Goodrich, Ohio, USA）の名称では販売される製品が特に適切である。それらは、アリルシュクロース又はアリルペンタエリトリトールで架橋される。それらの中ではカルボポール974P、934P及び971Pを挙げることができる。カルボポール971の使用がもっとも好ましい。無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のコポリマーではコポリマーEMA（Monsanto）があり、これは無水マレイン酸及びエチレンのコポリマーである。これらのコポリマーの水への溶解は酸溶液を生じ、前記酸溶液は好ましくは生理学的pHに中和されて、免疫原性、免疫学的又はワクチン組成物それ自体がその中に取り込まれるアジュバント溶液を生じるであろう。
【００３６】
更なる適切なアジュバントには多くのアジュバントの中で以下が含まれる（ただしそれらに限定されない）：RIBIアジュバント系（Ribi Inc.）、ブロックコポリマー（CytRx, Atlanta GA）、SAF-M（Chiron, Emeryville CA）、モノホスホリル脂質A、アブリジン脂質-アミンアジュバント、大腸菌（E. coli）由来易熱性エンテロトキシン（組換え体又は他の形態）、コレラトキシン、IMS 131又はムラミルジペプチド、又は天然に存在するか若しくは組換え体のサイトカイン又はそのアナローグ、又は内因性サイトカイン放出刺激剤。
アジュバントは、約100μgから約10mg/用量の量で、好ましくは約100μgから約10mg/用量の量で、より好ましくは約500μgから約5mg/用量の量で、さらに好ましくは約750μgから約2.5mg/用量の量で、もっとも好ましくは約1mg/用量の量で添加できると期待される。また別には、アジュバントは、最終生成物の体積で約0.01から50％の濃度、好ましくは約2％から30％の濃度、より好ましくは約5％から25％の濃度、さらに好ましくは約7％から22％の濃度、もっとも好ましくは10％から20％の濃度で存在しえる。
【００３７】
本発明の免疫原性組成物の別の具体的な特徴では、免疫原性組成物はワクチンである。“ワクチン”という用語は本明細書のどこかで既に記載されている。しかしながら、新規感染に対する耐性が増強され及び/又は疾患の臨床的徴候の重篤度が軽減される防御性免疫学的応答を宿主が示す場合には、当該免疫原性組成物は“ワクチン”と表現される。
さらに、本発明は、本明細書に記載の核酸分子、本明細書に記載のポリヌクレオチド又は本明細書に記載のベクターを含む細胞を提供する。
さらに、本発明は、本明細書に記載のPEDV Sタンパク質をコードする核酸分子及び/又は本明細書に記載のPEDV Sタンパク質を生産する方法を提供し、前記方法は、細胞に本明細書に記載のベクターをトランスフェクトする工程を含む。
さらに、本発明は、対象でPEDV感染を治療及び/又は予防するための免疫原性組成物を調製する、以下の工程を含む方法を提供する：
a．）細胞を本明細書に記載のベクターに感染させる；
b．）前記ベクターを入手する；
c．）医薬的に許容できる担体を添加する。
【００３８】
“入手する”という用語は、抗原の採集、単離、精製及び/又は調合（例えば仕上げ処理、不活化及び/又はブレンド処理）を含む。
“採集”という用語は、トランスフェクトされた細胞又は細胞株から前記ベクターを収集又は回収することを指す。当業界で公知の任意の通常的な方法（例えば任意の分離方法）を用いて、前記ベクターを回収することができる。当業界で周知の方法は、遠心分離又はろ過（例えば一定の孔サイズを有する半透膜を用いる）を含む。
“単離”という用語は前記ベクターの単離工程を含む。前記ベクターを感染細胞又は細胞株から単離する方法は当業者には公知である。それらの方法は物理的及び/又は化学的方法を含み、前記には、凍結融解の繰返し、超音波処理などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
前記ベクターを単離物から“精製”する方法は当業者には公知であり、例えば文献（Protein purification methods - a practical approach（E.L.V. Harris and S. Angel, eds., IRL Press at Oxford University Press））に記載された方法よる。それらの方法には、遠心分離及び/又はろ過、沈澱、サイズ排除（ゲルろ過）クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、共有結合クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどによる分離が含まれるが、ただしそれらに限定されない。ベクターは、精製された純粋な形で入手されるか、又は他の細胞性物質若しくは培養液を含まない又は実質的に含まない形で入手される。前記単離及び/又は精製後に、抗原は、少なくとも80％、好ましくは80％−90％、より好ましくは90％−97％、もっとも好ましくは97％から一切の夾雑物を含まない完全に純粋までの純度を示す。
更なる特徴にしたがえば、本明細書で用いられる“入手する”にはまた、最終調合プロセスの部分として更なる仕上げ処理工程（例えば緩衝剤の添加、不活化、中和工程など）が含まれえる。
【００３９】
好ましくは、細胞は真核細胞株に由来する。
本発明の方法の具体的な特徴では、細胞は、Vero細胞、ST細胞又はBHK-21、Ma104、MDBK、RK13、MDCK若しくはPK15である。
言及される全ての細胞が当業者には公知であり、公的に入手可能である。Vero細胞は、例としてアクセッション番号ATCC CCL-81で米国培養細胞系統保存機関に寄託されている。ST細胞は、例としてアクセッション番号CRL-1746で米国培養細胞系統保存機関に寄託されている。BHK-21細胞は、例としてアクセッション番号ATCC CCL-10で米国培養細胞系統保存機関に寄託されている。MDCK細胞は、例としてアクセッション番号ATCC CCL-34又はATCC CRL-2285で米国培養細胞系統保存機関に寄託されている。
本発明の免疫原性組成物又は方法の別の具体的な特徴では、前記医薬的に許容できる担体は、溶媒、分散媒体、コーティング、安定化剤、希釈剤、保存料、抗菌及び抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、アジュバント、免疫刺激剤、及び前記の組合せから成る群から選択される。
【００４０】
さらに、本発明は対象を免疫する方法を提供し、前記方法はそのような対象に本明細書に記載の免疫原性組成物を投与する工程を含む。
有利には、本発明の免疫原性組成物は安全かつ有効であることが証明されている。
“免疫する”という用語は、免疫されるべき対象に免疫原性組成物を投与し、それによってそのような免疫原性組成物に含まれる抗原に対して免疫学的応答を引き起こすことによる能動免疫を指す。
好ましくは、免疫は、群れにおける特定のPEDV感染の発生の低下、又は特定のPEDV感染により引き起こされるか若しくは感染に付随する臨床的徴候の重篤度の軽減を生じる。
さらに、必要がある対象の本明細書に提供される免疫原性組成物による免疫は、対象のPEDVによる感染の予防をもたらす。さらに好ましいことには、免疫は、PEDV感染に対抗する有効で長期間持続性の免疫学的応答をもたらす。前記期間は、1ヶ月を超えて、好ましくは2ヶ月を超えて、好ましくは3ヶ月を超えて、より好ましくは4ヶ月を超えて、より好ましくは5ヶ月を超えて、より好ましくは6ヵ月を超えて持続するであろうということは理解されよう。免疫は、免疫される全ての対象で有効であるとは限らないことは理解されるべきである。しかしながら、当該用語は、群れにおける対象の有意な部分が効果的に免疫されることを必要とする。
【００４１】
好ましくは、この文脈では群れの対象は、通常的には（すなわち免疫無しでは）、PEDV感染により通常引き起こされるか又はPEDV感染に付随する臨床的徴候を発達させるであろうと想定される。群れの対象が有効に免疫されているか否かは、当業者による更なる骨折りを実施することなく決定できる。好ましくは、免疫されていないか又は本発明の前に入手可能であった免疫原性組成物で免疫されたが、その後で特定のPEDVに感染した対象と比較して、ある群れの対象の少なくとも33％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％及びもっとも好ましくは100％で、臨床的徴候が、発生率又は重篤度において少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、さらに好ましくは少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも40％、さらに好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも60％、さらに好ましくは少なくとも70％、さらに好ましくは少なくとも80％、さらに好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、もっとも好ましくは100％軽減されるならば、当該免疫は有効であろう。
【００４２】
さらに、本発明は、PEDV感染によって引き起こされる臨床的徴候を必要がある対象で治療及び/又は予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載の免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象に投与する工程を含む。
有利には、本発明の免疫原性組成物はPEDV感染によって引き起こされる臨床的徴候を軽減することが証明されてある。
“治療及び/又は予防する”という用語は、群れにおける特定のPEDV感染の発生率の減少又はPEDV感染によって引き起こされるか若しくはPEDV感染に付随する臨床的徴候の重篤度の軽減を指す。したがって、“治療及び/又は予防する”という用語はまた、本明細書で提供される免疫原性組成物の有効量を与えられた対象グループにおいて、そのような免疫原性組成物を与えられなかった対象グループと比較して、群れにおける特定のPEDVの感染対象数の減少（＝特定のPEDV感染の発生率の減少）、又は特定のPEDV感染後のウイルス排泄の減少、又は特定のPEDV感染後の下痢の予防若しくは軽減を指す。
“治療及び/又は予防する”は、概して、その必要があるか又はそのような治療/予防から利益を受ける可能性がある対象又は対象の群れに本発明の免疫原性組成物の有効量を投与することを要する。“治療する”という用語は、対象又は群れの数匹の対象がそのようなPEDVにひとたび感染したとき、かつそのような対象がそのようなPEDV感染によって引き起こされるか若しくはPEDV感染に付随するいくつかの臨床的徴候を示す場合に、有効量の免疫原性組成物を投与することを指す。“予防する”という用語は、PEDVによる対象の何らかの感染の前に又はそのような対象若しくは対象グループ内の対象のいずれもそのようなPEDVによる感染によって引き起こされるか若しくはそのようなPEDV感染に付随する何らかの臨床的徴候を少なくとも示さない場合にそのような対象に投与することを指す。“prophylaxis（予防）”及び“preventing（防止）”は本出願では互換的に用いられる。
【００４３】
本明細書で用いられる“有効量”という用語は、対象において免疫応答を誘引する又は誘引することができる量（ただし抗原の量に限定されない）を指す。そのような有効量は、群れにおける特定のPEDV感染の発生率を減少させるか、又は特定のPEDV感染の臨床的徴候の重篤度を軽減させることができる。
好ましくは、臨床的徴候は、処置されていないか又は本発明の前に利用可能であった免疫原性組成物で処置されているがその後で特定のPEDVに感染した対象と比較して、発生率又は重篤度で少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、さらに好ましくは少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも40％、さらに好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも60％、さらに好ましくは少なくとも70％、さらに好ましくは少なくとも80％、さらに好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、もっとも好ましくは100％軽減される。
本明細書で用いられる“臨床徴候”という用語は、PEDVに由来する対象の感染徴候を指す。そのような臨床徴候の例には、ウイルス負荷、下痢、ウイルス排泄（shedding）、上昇体温、死亡率、腸における肉眼的病巣、抑うつ、体重減、低下する成長速度、減退する食欲が含まれるが、ただしそれらに限定されない。しかしながら、臨床的徴候にはまた、生きている動物から直接観察しえる臨床的徴候も含まれる（ただしそれらに限定されない）。生きている動物から直接観察しえる臨床的徴候の例には、体重減、低下する成長速度、減退食欲、下痢、水様下痢、嘔吐、跛行、無気力、消耗、及び発育不全などが含まれえる。
好ましくは、処置されていないか又は本発明の前に利用可能であった免疫原性組成物で処置されているがその後で特定のPEDVに感染した対象と比較して、治療された対象で発生率又は重篤度が軽減される臨床的徴候は、体重減の軽減、より低いウイルス負荷、下痢の緩和、ウイルス排泄の減少、直腸温度の低下、死亡率の低下、腸における肉眼的病巣の減少、又はこれらの組合せを指す。
本明細書で用いられる“必要がある”又は“必要な”という用語は、投与/処置が、本発明の免疫原性組成物を与えられた対象の健康状態若しくは臨床的徴候における支援若しくは改善、又は健康状態における任意の他の正の医学的効果を伴うことを意味する。
【００４４】
さらに、本発明は、同じ種の非免疫コントロールグループの対象と比較して、下痢を対象で軽減する方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載の免疫原性組成物の治療的に有効な量を対象に投与する工程を含む。
さらに、本発明は、同じ種の非免疫コントロールグループの対象と比較して死亡率を対象で低下させる方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載の免疫原性組成物の治療的に有効な量を対象に投与する工程を含む。
“死亡率を低下させる”という用語は、処置されていない（免疫されていない）が後で特定のPEDVに感染した対象と比較して、死亡率が少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、さらに好ましくは少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも40％、さらに好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも60％、さらに好ましくは少なくとも70％、さらに好ましくは少なくとも80％、さらに好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、もっとも好ましくは100％低下することを意味する。
したがって、臨床的徴候（例えば下痢又は死亡率）を軽減又は予防するために、対象を本発明の免疫原性組成物でワクチン接種できると理解されねばならない。好ましくは、前記対象は仔ブタ、ブタ又は雌ブタである。
さらに、本発明は、PEDVに特異的な抗体の産生を対象において誘発する方法を提供し、前記方法は本明細書に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与する工程を含む。好ましくは、前記対象は仔ブタ、ブタ又は雌ブタである。
さらに、本発明は、PEDVに特異的な抗体の産生を雌ブタにおいて誘発する方法を提供し、前記方法は本明細書に記載の免疫原性組成物を前記雌ブタに投与する工程を含む。
【００４５】
“PEDVに特異的な抗体”という用語は検出可能な抗PEDV抗体を指す。さらに、雌ブタの抗PEDV抗体は本発明のPEDVワクチンによるワクチン接種に応答して発達されてある。“PEDVに特異的な抗体”又は“雌ブタにおけるPEDVに特異的な抗体”という用語はさらにまた、好ましくは少なくとも1：10、より好ましくは1：20を超える、さらに好ましくは1：40を超える、さらに好ましくは1：80を超える、さらに好ましくは1：160を超える、さらに好ましくは1：320を超える、もっとも好ましくは1：640を超える検出可能な抗PEDV抗体力価を有する雌ブタを意味する（ただしこれに限定されない）。好ましくは、当該抗PEDV抗体力価は特異的な抗PEDV免疫アッセイで検出及び定量できる。
有利には、本発明の免疫原性組成物は、雌ブタにおいてPEDVに特異的な抗体の産生を誘発することが示されている。
PEDV特異的抗体の産生をどのように検出するかは当業者には周知である。例えばELISAアッセイによる（ELISAは市場で入手できる）。
さらに、本発明は、非免疫コントロールグループの仔ブタと比較して仔ブタにおいて下痢を軽減させる方法を提供する。前記方法は、本明細書に記載の免疫原性組成物の治療的に有効な量を仔ブタの雌ブタに投与する工程を含み、ここで当該仔ブタは前記雌ブタによって授乳される。本明細書で用いられる“仔ブタの雌ブタ”という用語は、特に“仔ブタの母雌ブタ”又は“仔ブタの養い雌ブタ”とそれぞれ同等であると理解されるべきである。
さらに、本発明は、非免疫コントロールグループの仔ブタと比較して仔ブタの死亡率を低下させる方法を提供する。前記方法は、本明細書に記載の免疫原性組成物の治療的に有効な量を仔ブタの雌ブタに投与する工程を含み、当該仔ブタは前記雌ブタによって授乳される。
【００４６】
さらに、本発明は、PEDV感染によって引き起こされる臨床的徴候又は疾患を仔ブタにおいて軽減又は予防する方法を提供し、仔ブタは本明細書に記載の免疫原性組成物が投与されてある雌ブタによって授乳される。
好ましくは、軽減される臨床的徴候は死亡率である。したがって、本発明はまた、PEDV感染によって引き起こされる死亡率を仔ブタにおいて減少させる方法を提供し、仔ブタは本明細書に記載の免疫原性組成物が投与されてある雌ブタによって授乳される。
さらに、本発明は、PEDV感染によって引き起こされる臨床的徴候又は疾患を仔ブタにおいて軽減又は予防する方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：
−本明細書に記載の免疫原性組成物を雌ブタに投与する工程、及び
−それぞれ、前記仔ブタが前記雌ブタによって授乳されることを許容する工程、又は前記仔ブタが前記雌ブタから乳を飲むことを許容する工程。
有利には、本発明の免疫原性組成物は、妊娠中の雌ブタに投与されるとき、ブタにおける臨床的徴候を軽減することが示されてある。
仔ブタを本発明の免疫原性組成物でワクチン接種する場合、前記仔ブタにおける実際の抗体産生に時間が必要とされることは理解されねばならない。したがって、本発明の別の特徴では、妊娠している雌ブタが本発明の免疫原性組成物でワクチン接種される。前記ワクチン接種は、前記雌ブタでPEDV特異的抗体の産生をもたらす。前記雌ブタの母体由来抗体は続いて新生仔ブタに初乳及び/又は乳を介して受動的に伝達される。
【００４７】
本発明の方法の別の具体的な特徴では、免疫原性組成物が投与される雌ブタは、特に仔ブタを妊娠している雌ブタである。しかしながら、仔ブタは、初乳又は乳を与える任意の雌ブタによって授乳されることがあり得るが、この雌ブタは特に前記免疫原性組成物が投与されている雌ブタであることは理解されるべきである。
別の具体的な特徴では、本発明の方法は以下の工程を含む：
−本明細書に記載の免疫原性組成物を、仔ブタを妊娠している雌ブタに投与する工程、
−前記雌ブタが前記仔ブタを出産することを許容する工程、
−前記仔ブタが前記雌ブタによって授乳されることを許容する工程。
本発明の方法の別の具体的な特徴では、前記方法は、同じ種の非免疫コントロールグループの対象と比較して、以下から成る群から選択される臨床的徴候又は有効性パラメーターの改善をもたらす：体重減の減少、より低いウイルス負荷、下痢の軽減、ウイルス排泄の減少、直腸温度の低下、死亡率の低下、腸における肉眼的病巣の減少、又はこれらの組合せ。
本発明の方法の別の具体的な特徴では、対象は仔ブタ、ブタ又は雌ブタである。
好ましくは、免疫原性組成物は、最初の2ヶ月齢以内、より好ましくは最初の1ヶ月齢以内に対象に投与される。
本発明の方法の別の具体的な特徴では、免疫原性組成物は最初の1ヶ月齢以内に対象に投与される。
したがって、免疫原性組成物は、例示すれば最初の3週齢以内に又は最初の2週齢以内に対象に投与してもよいことは理解されねばならない。
【００４８】
本発明の方法の別の具体的な特徴では、本発明の免疫原性組成物は、妊娠中及び授乳中の雌ブタに投与される。
有利には、本発明の免疫原性組成物は、妊娠中の雌ブタに投与されるとき安全であることが証明されてある。
したがって、以下によってブタをPEDVに対抗してワクチン接種する方法が提供される：本発明のPEDVワクチンを妊娠雌ブタに、分娩前に少なくとも2回、好ましくは分娩前に少なくとも3回、より好ましくは分娩前に2回（“反復用量”）投与する。好ましくは、妊娠雌ブタは本発明のPEDVワクチンで、分娩前に前記ワクチンの一用量で2回ワクチン接種される。しかしながら、ワクチンが雌ブタに2回投与されるとき、最初の投与は分娩前12及び4週間の間、より好ましくは分娩前9及び5週間の間に実施されるべきである。第二の投与は、分娩前8及び1週間の間、より好ましくは分娩前6及び1週間の間に実施されるべきである。
本発明の方法の別の具体的な特徴では、免疫原性組成物は2用量以上投与される。
有利には、本発明の免疫原性組成物は、2用量後にPEDVに特異的な抗体の産生を誘発することが示されてある。
本発明の方法の別の具体的な特徴では、前記免疫原性組成物は2回雌ブタに投与され、最初の投与は分娩前9及び5週間の間、第二の投与は分娩前6及び1週間の間である。
【００４９】
免疫原性組成物は好ましくは局所的に又は全身的に投与される。通常的に用いられる適切な投与ルートは経口又は非経口投与であり、例えば鼻内、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下とともに吸入である。しかしながら、化合物の性質及び作用態様にしたがって、免疫原性組成物は他のルートでも同様に投与されえる。しかしながら、もっとも好ましくは、免疫原性組成物は鼻内又は経口投与される。
本発明の方法の別の具体的な特徴では、本発明の免疫原性組成物は鼻内、粘膜、経口、皮内又は筋肉内投与される。
有利には、本発明の免疫原性組成物は、鼻内投与されるとき有効であることが証明されてある。
本発明の方法の別の具体的な特徴では、本発明の免疫原性組成物は鼻内又は経口投与される。
【００５０】
好ましくは、免疫原性組成物は、1ｘ102から1ｘ109 TCID50/mL、より好ましくは1ｘ103から1ｘ107 TCID50/mL、もっとも好ましくは1ｘ104から1ｘ106 TCID50/mLを含む。
本発明の方法の別の具体的な特徴では、免疫原性組成物は1ｘ103から1ｘ107 TCID50/mLを含む。
“TCID50/mL”という用語は感染性ウイルス力価の程度を指す。具体的には、ミリリットル当たりの組織培養感染用量50（TCID50/mL）は、ウイルス調製物の希釈物を並行して接種した培養細胞の数の50％が感染する当該希釈を示す。
本発明の方法の別の具体的な特徴では、チャレンジ又は感染後2日目からウイルス排泄の減少を生じる。
本発明の方法の別の具体的な特徴では、チャレンジ又は感染後3日目からウイルス排泄の減少を生じる。
本発明の方法の別の具体的な特徴では、チャレンジ又は感染後4日目からウイルス排泄の減少を生じる。
本発明の方法の別の具体的な特徴では、チャレンジ又は感染後5日目からウイルス排泄の減少を生じる。
本発明の方法の別の具体的な特徴では、チャレンジ又は感染後7日目からウイルス排泄の減少を生じる。
本発明の方法の別の具体的な特徴では、チャレンジ又は感染後10日目からウイルス排泄の減少を生じる。
本発明の方法の別の具体的な特徴では、チャレンジ又は感染後5、7又は10日目からウイルス排泄の減少を生じる。
有利には、本発明の免疫原性組成物は、感染又はチャレンジ後ウイルス排泄を減少させることが証明されてある。
【００５１】
“ウイルス排泄の減少”という用語は、ウイルス排泄が、処置されてない（免疫されてない）が後で特定のPEDVに感染した対象と比較して、少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、さらに好ましくは30％、さらに好ましくは少なくとも40％、さらに好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも60％、さらに好ましくは少なくとも70％、さらに好ましくは少なくとも80％、さらに好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、もっとも好ましくは100％減少することを意味する。どのようにウイルス排泄を測定するかは当業者の一般的知識である。
“ウイルス排泄（shedding）”という用語は糞便排出物又は糞便中のPEDV分泌を指す。したがって、ウイルス排泄は、糞便排出物、糞便又は直腸スワブでウイルス力価を試験することによって決定できる。“ウイルス排泄”という用語はさらに、感受性動物（すなわちセンチネル）へのウイルスの伝搬を包含する。ウイルス排泄をどのように測定するかは当業者の一般的知識である（例えばPCR、qPCR又はELISA）。
本発明の方法の別の具体的な特徴では、前記方法は、相同チャレンジに対して防御を増強する。
有利には、本発明の免疫原性組成物は、チャレンジ後に防御性であることが証明されている。
本発明は、医薬の製造のための、本明細書に記載のブタ流行性下痢ウイルス（PEDV）スパイク（S）タンパク質をコードする核酸分子、PEDV（S）タンパク質又は免疫原性組成物の使用を提供する。
本発明はまた、PEDV感染によって引き起こされる臨床的徴候の対象における治療及び/又は予防、又は対象における下痢の軽減のための、本明細書に記載のブタ流行性下痢ウイルス（PEDV）スパイク（S）タンパク質をコードする核酸分子、PEDV（S）タンパク質又は免疫原性組成物の使用を提供する。
【００５２】
配列の概要
以下の配列が本明細書中で本発明において詳述及び開示される：
配列番号:１：RSXIEDXX、
配列番号:2：野生型G2a PEDV Sアミノ酸配列US、
配列番号:3：野生型G2b PEDV Sアミノ酸配列EU、
配列番号:4：RSXIEDLLF、
配列番号:5：RSXIEDAAF、
配列番号:6：XXXFXKXXXX、
配列番号:7：YXXFXKXH、
配列番号:8：AXXFXKXR、
配列番号:9：変異897Aを有するPEDV Sヨーロッパ株遺伝子型2b（G2b）配列、
配列番号:10：アミノ酸898位にAの変異を有するPEDV Sヨーロッパ株遺伝子型2b（G2b）配列、
配列番号:11：変異897A及び898Aを有するPEDV Sヨーロッパ株遺伝子型2b（G2b）配列、
配列番号:12：変異897A並びに1374A及び1381Aを有するPEDV Sヨーロッパ株遺伝子型2b（G2b）配列、
配列番号:13：変異898A並びに1374A及び1381Rを有するPEDV Sヨーロッパ株遺伝子型2b（G2b）配列、
配列番号:14：変異897A、898A並びに1374A及び1381Rを有するPEDV Sヨーロッパ株遺伝子型2b（G2b）配列、
配列番号:15：変異900Aを有するPEDV S US株遺伝子型2a（G2a）配列、
配列番号:16：アミノ酸901位にAの変異を有するPEDV S US株遺伝子型2a（G2a）配列、
配列番号:17：変異900A及び901Aを有するPEDV S US株遺伝子型2a（G2a）配列、
配列番号:18：変異900A並びに1377A及び1384Rを有するPEDV S US株遺伝子型2a（G2a）配列、
配列番号:19：変異901A並びに1377A及び1384Rを有するPEDV S US株遺伝子型2a（G2a）配列、
配列番号:20：変異900A、901A並びに1377A及び1384Rを有するPEDV S US株遺伝子型2a（G2a）配列、
配列番号:21：RSXIEDLX、
配列番号:22：RSXIEDXL、
配列番号:23：RSXIEDLA、
配列番号:24：RSXIEDAL、
配列番号:25：RSXIEDAA、
配列番号:26：XXXFXKXHXX、
配列番号:27：YXXFXKXXXX、
配列番号:28：AXXFXKXHXX、
配列番号:29：YXXFXKXRXX、
配列番号:30：AXXFXKXRXX、
配列番号:31：RSXIEDLG、
配列番号:32：RSXIEDGL、
配列番号:33：RSXIEDGG、
配列番号:34：RSXIEDGA、
配列番号:35：RSXIEDAG、
配列番号:36はPEDVスパイクタンパク質のクローニングカセットを含む（前記カセットは挿入遺伝子のために重複UTR領域を含む）、
配列番号:37（RNA）は配列番号:14のSタンパク質をコードする配列に対応する、
配列番号:38（RNA）は配列番号:37を含む配列に対応する、
配列番号:39：野生型G2a PEDV Sアミノ酸配列、CN、
配列番号:40：変異900A、901A並びに1377A及び1384Rを有するPEDV S CN株遺伝子型2a（G2a）、
配列番号:41−44：プローブ、プライマー、及びウルトラマー配列（表2）。
配列表において、アミノ酸配列は変動可能“X”に等価な記号“Xaa”を用いて3文字コードで提示され、配列表で提供される“残基X”という言い回しは“残基Xaa”と同等である。
【００５３】
項目
以下の項目が本明細書に記載されている：
本発明は以下の項目を提供する：
1．アミノ酸配列RSX1IEDX2X3（配列番号:1）を含むブタ流行性下痢ウイルス（PEDV）スパイク（S）タンパク質をコードする核酸分子であって、
（I）X2がロイシン残基以外のアミノ酸残基であり、かつX3がロイシン残基であるか、又は
（II）X2がロイシン残基であり、かつX3がロイシン残基以外のアミノ酸残基であるか、又は
（III）X2がロイシン残基以外のアミノ酸残基であり、かつX3がロイシン残基以外のアミノ酸残基である、前記核酸分子。
2．−PEDV Sタンパク質が遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質であり、かつアミノ酸位の番号付けが野生型G2a PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列を参照する場合、Rはアミノ酸894位のアルギニン残基であるか、又は
−PEDVタンパク質が遺伝子型2b（G2b）PEDV Sタンパク質であり、かつアミノ酸位の番号付けが野生型G2b PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列を参照する場合、Rはアミノ酸891位のアルギニン残基である、
アミノ酸配列RSX1IEDX2X3（配列番号:1）を含む項目1に記載の核酸分子。
3．−野生型G2a PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列が配列番号:2又は配列番号:39の野生型G2a PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列であり、及び/又は
−当該野生型G2b PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列が配列番号:3の野生型G2b PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列である、
項目2に記載の核酸分子。
4．アミノ酸配列RSX1IEDX2X3（配列番号:1）を含むブタ流行性下痢ウイルス（PEDV）スパイク（S）タンパク質をコードする核酸分子であって、
Rは前記PEDV Sタンパク質のS1/S2開裂部位の保存アルギニン残基であり、X1は任意のアミノ酸残基であることができ、かつ
（I）X2はロイシン残基以外のアミノ酸残基であり、かつX3はロイシン残基であるか、又は
（II）X2はロイシン残基であり、かつX3はロイシン残基以外のアミノ酸残基であるか、又は
（III）X2はロイシン残基以外のアミノ酸残基であり、かつX3はロイシン残基以外のアミノ酸残基である、前記核酸分子。
5．下記（a）及び（b）から成る群から選択されるブタ流行性下痢ウイルス（PEDV）スパイク（S）タンパク質をコードする核酸分子：
（a）少なくとも1つの変異を有する遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質であって、
−アミノ酸900位のロイシン残基がロイシン残基の以外のアミノ酸残基によって置換されるもの、及び/又は
−アミノ酸901位のロイシン残基がロイシン残基以外のアミノ酸残基によって置換されるもの、
ここで、当該アミノ酸位の番号付けは、配列番号:2又は配列番号:39の野生型G2a PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列を参照し；
（b）少なくとも1つの変異を有する遺伝子型2b（G2b）PEDV Sタンパク質であって、
−アミノ酸897位のロイシン残基がロイシン残基の以外のアミノ酸残基によって置換されるもの、及び/又は
−アミノ酸898位のロイシン残基がロイシン残基以外のアミノ酸残基によって置換されるもの、
ここで、当該アミノ酸位の番号付けは、配列番号:3の野生型G2b PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列を参照する。
6．ロイシン残基以外のアミノ酸残基が、アラニン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基及びバリン残基から成る群から選択される、項目1から5のいずれかの項目に記載の核酸分子。
7．ロイシン残基以外のアミノ酸残基がアラニン残基である、項目1から6のいずれかの項目に記載の核酸分子。
8．アミノ酸位の番号付けが、野生型G PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列RSXIEDLLF（配列番号:4）を参照し、Rは前記PEDV Sタンパク質のS1/S2開裂部位の保存アルギニン残基であり、かつLLは遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質内のアミノ酸900位及び901位であるか、又はLLは遺伝子型2b（G2b）PEDV Sタンパク質内のアミノ酸897位及び898位である、項目5又は7のいずれかの項目に記載の核酸分子。
9．アミノ酸位の番号付けが、野生型G PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列RSXIEDLLF（配列番号:4）を参照し、Rはアミノ酸894位のアルギニン残基であり、かつLLは遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質内のアミノ酸900位及び901位であるか、又はRはアミノ酸891位のアルギニン残基であり、かつLLは遺伝子型2b（G2b）PEDV Sタンパク質内のアミノ酸897位及び898位である、項目5から8のいずれかの項目に記載の核酸分子。
10．PEDV Sタンパク質がアミノ酸配列RSXIEDAAF（配列番号:5）を含み、ここでRは前記PEDV Sタンパク質のS1/S2開裂部位の保存アルギニン残基であり、かつAAは遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質内のアミノ酸900位及び901位であるか、又はAAは遺伝子型2b（G2b）PEDV Sタンパク質内のアミノ酸897位及び898位である、項目1から9のいずれかの項目に記載の核酸分子。
11．PEDV Sタンパク質がアミノ酸配列RSXIEDAAF（配列番号:5）を含み、ここでRはアミノ酸894位のアルギニン残基であり、かつAAは遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質内のアミノ酸900位及び901位であるか、又はRはアミノ酸891位のアルギニン残基であり、かつAAは遺伝子型2b（G2b）PEDV Sタンパク質内のアミノ酸897位及び898位である、
項目1から10のいずれかの項目に記載の核酸分子。
12．PEDV Sタンパク質がさらにアミノ酸配列X1X2X3FX4KX5X6X7X8（配列番号:6）を含み、X8は前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸残基であるか、又は前記PEDV Sタンパク質のC-末端アミノ酸位に対して-2位のアミノ酸残基であり、
X2からX5、X7及びX8は任意のアミノ酸残基であることができ、かつ
（i）X1はチロシン残基以外のアミノ酸残基で、かつX6はヒスチジン残基であるか、又は
（ii）X1はチロシン残基で、かつX6はヒスチジン残基以外のアミノ酸残基であるか、又は
（iii）X1はチロシン残基以外のアミノ酸残基で、かつX6はヒスチジン残基以外のアミノ酸残基である、
項目1から11のいずれかの項目に記載の核酸分子。
13．（a）G2a PEDV Sタンパク質において、さらに、
−アミノ酸1377位のチロシン残基がチロシン残基以外のアミノ酸残基によって置換され、及び/又は
−アミノ酸1384位のヒスチジン残基がヒスチジン残基以外のアミノ酸残基によって置換されるか、又は
（b）G2b PEDV Sタンパク質において、さらに、
−アミノ酸1374位のチロシン残基がチロシン残基以外のアミノ酸残基によって置換され、及び/又は
−アミノ酸1381位のヒスチジン残基がヒスチジン残基以外のアミノ酸残基によって置換される、
項目5から13のいずれかの項に記載の核酸分子。
14．−チロシン残基以外のアミノ酸残基が、アラニン残基、グリシン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基及びバリン残基から成る群から選択され、及び/又は
−ヒスチジン残基以外のアミノ酸残基がアルギニン残基である、
項目12から13に記載の核酸分子。
15．−チロシン残基以外のアミノ酸残基がアラニン残基であり、及び/又は
−ヒスチジン残基以外のアミノ酸残基がアルギニン残基である、項目12から14のいずれかの項目に記載の核酸分子。
16．アミノ酸位の番号付けが、野生型G PEDV Sタンパク質のアミノ酸配列YXXFXKXH（配列番号:7）を参照し、Y及びHは遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質内のアミノ酸1377位及び1384位であるか、又はY及びHは遺伝子型2b（G2b）PEDV Sタンパク質内のアミノ酸1374位及び1381位である、項目13から15のいずれかの項目に記載の核酸分子。
17．核酸分子がアミノ酸配列AXXFXKXR（配列番号:8）をコードする配列を含み、A及びRは遺伝子型2a（G2a）PEDV Sタンパク質内のアミノ酸1377位及び1384位であるか、又はA及びRは遺伝子型2b（G2b）PEDV Sタンパク質内のアミノ酸1374位及び1381位である、項目12から16のいずれかの項目に記載の核酸分子。
18．PEDV Sタンパク質が、
i）（a）配列番号:15、16、17、18、19、20、40のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.1％、少なくとも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、少なくとも99.8％、又は少なくとも99.9％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか若しくは前記アミノ酸配列から成るか、又は
（b）配列番号:9、10、11、12、13、14のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.1％、少なくとも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、少なくとも99.8％、又は少なくとも99.9％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか若しくは前記アミノ酸配列から成るか、及び/又は
ii）（a）配列番号:15、16、17、18、19、20、40のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.1％、少なくとも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、少なくとも99.8％、又は少なくとも99.9％配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされるか、又は
（b）配列番号:9、10、11、12、13、14のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.1％、少なくとも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、少なくとも99.8％、又は少なくとも99.9％配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる、
項目1から17のいずれかの項目に記載の核酸分子。
19．前記PEDV Sタンパク質が、
（a）配列番号:15、16、17、18、19、20、40のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか、又は
（b）配列番号:9、10、11、12、13、14のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、
項目1から18のいずれかの項目に記載の核酸分子。
20．項目1から19のいずれかの項目に記載の核酸分子によってコードされるPEDV（S）タンパク質。
21． PEDV Sタンパク質をコードする前記核酸分子又はPEDV Sタンパク質が組換え体である、項目1から19のいずれかの項目に記載の核酸分子又は項目20に記載のPEDV Sタンパク質。
22．項目1から19のいずれかの項目に記載の核酸分子を含むポリヌクレオチド。
23．項目1から19のいずれかの項目に記載の核酸分子又は項目22に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
24．CDV、EHV、ORFウイルス、PRV、CAV、PCMV又はBoHV-4である、項目23に記載のベクター。
25．ベクターがCDV又はEHVである、項目23に記載のベクター。
26．項目1から19のいずれかの項目に記載のPEDV Sタンパク質をコードする核酸分子及び/又は項目20に記載のPEDV Sタンパク質及び/又は項目23から25のいずれかの項目に記載のベクターを含む、免疫原性組成物。
27．免疫原性組成物がさらに医薬的に許容できる担体を含む、項目26に記載の免疫原性組成物。
28．免疫原性組成物がワクチンである、項目26又は27に記載の免疫原性組成物。
29．項目1から19のいずれかの項目に記載の核酸分子、項目22に記載のポリヌクレオチド、又は項目23から25のいずれかの項目に記載のベクターを含む、細胞。
30．項目1から19のいずれかの項目に記載のPEDV Sタンパク質をコードする核酸分子及び/又は項目20に記載のPEDV Sタンパク質を生産する方法であって、細胞に項目23から25のいずれかの項目に記載のベクターをトランスフェクトする工程を含む、前記方法。
31．以下の工程を含む、対象でPEDV感染を治療及び/又は予防するための免疫原性組成物の調製方法：
a．）細胞に項目23から25のいずれかの項目に記載のベクターを感染させる工程；
b．）前記ベクターを入手する工程；及び
c．）医薬的に許容できる担体を添加する工程。
32．Vero細胞、ST細胞又はBHK-21細胞、Ma104細胞、MDBK細胞、RK13細胞、MDCK又はPK15細胞である、項目29に記載の細胞又は項目30若しくは31に記載の方法。
33．医薬的に許容できる担体が、溶媒、分散媒体、コーティング、安定化剤、希釈剤、保存料、抗菌及び抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、アジュバント、免疫刺激剤、並びに前記の組合せから成る群から選択される、項目27に記載の免疫原性組成物または項目31に記載の方法。
34．対象を免疫する方法であって、項目26から28のいずれかの項目に記載の免疫原性組成物を対象に投与する工程を含む、前記方法。
35．免疫原性組成物の治療的に有効な量を対象に投与する工程を含む、対象を免疫する方法で使用される、項目26から28のいずれかの項目に記載の免疫原性組成物。
36．必要がある対象でPEDV感染によって引き起こされる臨床的徴候を治療及び/又は予防する方法であって、項目26から28のいずれかの項目に記載の免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象に投与する工程を含む、前記方法。
37．必要がある対象でPEDV感染によって引き起こされる臨床的徴候を治療及び/又は予防する方法で使用される項目26から28のいずれかの項目に記載の免疫原性組成物であって、項目26から28のいずれかの項目に記載の免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象に投与する工程を含む、前記免疫原性組成物。
38．同じ種の非免疫コントロールグループの対象と比較して死亡率を対象で低下させる方法であって、当該方法が、項目26から28のいずれかの項目に記載の免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象に投与する工程を含む、前記方法。
39．同じ種の非免疫コントロールグループの対象と比較して死亡率を対象で低下させる方法で使用される項目26から28のいずれかの項目に記載の免疫原性組成物であって、前記免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象に投与する工程を含む、前記免疫原性組成物。
40．雌ブタにおいてPEDV特異的抗体の産生を誘発する方法であって、項目26から28のいずれかの項目に記載の免疫原性組成物を雌ブタに投与する工程を含む、前記方法。
41．雌ブタにおいてPEDV特異的抗体の産生を誘発する方法で使用される項目26から28のいずれかの項目に記載の免疫原性組成物であって、前記免疫原性組成物の治療的に有効な量を前記雌ブタに投与する工程を含む、前記免疫原性組成物。
42．非免疫コントロールグループの仔ブタと比較して死亡率を仔ブタにおいて低下させる方法であって項目26から28のいずれかの項目に記載の免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該仔ブタの雌ブタに投与する工程を含み、当該仔ブタが前記雌ブタによって授乳される、前記方法。
43．非免疫コントロールグループの仔ブタと比較して死亡率を仔ブタにおいて低下させる方法で使用される項目26から28のいずれかの項目に記載の免疫原性組成物であって、前記免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該仔ブタの雌ブタに投与する工程を含み、当該仔ブタが前記雌ブタによって授乳される、前記免疫原性組成物。
44．PEDV感染によって引き起こされる臨床的徴候又は疾患を仔ブタにおいて軽減又は予防する方法であって、当該仔ブタが、項目26から28のいずれかの項目に記載の免疫原性組成物を投与されてある雌ブタによって授乳される、前記方法。
45．PEDV感染によって引き起こされる臨床的徴候又は疾患を仔ブタにおいて軽減又は予防する方法で使用される項目26から28のいずれかの項目に記載の免疫原性組成物であって、当該仔ブタが、前記免疫原性組成物を投与されてある雌ブタによって授乳される、前記組成物。
46．以下の工程を含む、PEDV感染によって引き起こされる臨床的徴候又は疾患を仔ブタにおいて軽減又は予防する方法：
−項目26から28のいずれかの項目に記載の免疫原性組成物を雌ブタに投与する工程、及び
−前記仔ブタが前記雌ブタによって授乳されることを許容する工程。
47．PEDV感染によって引き起こされる臨床的徴候又は疾患を仔ブタにおいて軽減又は予防する方法で使用される項目26から28のいずれかの項目に記載の免疫原性組成物であって、
−免疫原性組成物を雌ブタに投与する工程、及び
−仔ブタが前記雌ブタによって授乳されることを許容する工程を含む、前記免疫原性組成物。
48．免疫原性組成物が投与される前記雌ブタが妊娠している、特に前記仔ブタを妊娠している雌ブタである、項目34から47のいずれかの項目に記載の方法。
49．以下の工程を含む、項目34、及び46から48のいずれかの項目に記載の方法：
−項目26から28のいずれかの項目に記載の免疫原性組成物を、仔ブタを妊娠している雌ブタに投与する工程、
−前記雌ブタが前記仔ブタを出産することを許容する工程、
−前記仔ブタが前記雌ブタによって授乳されることを許容する工程。
50．項目36、37、40、44、45、46、47、48又は49のいずれかの項目に記載の方法であって、同じ種の非免疫コントロールグループの対象と比較して、体重減の減少、より低いウイルス負荷、下痢の軽減、ウイルス排泄の減少、直腸温度の低下、死亡率の低下、腸における肉眼病巣の減少、又はこれらの組合せから成る群から選択される臨床的徴候又は有効性パラメーターの改善をもたらす、前記方法。
51．対象が仔ブタ、ブタ又は雌ブタである、項目34から39のいずれかの項目に記載の方法。
52．免疫原性組成物が最初の1ヶ月齢以内の対象に投与される、項目34から39又は51のいずれかの項目に記載の方法。
53．免疫原性組成物が妊娠中及び授乳中の雌ブタに投与される、項目34から52のいずれかの項目に記載の方法。
54．免疫原性組成物が2用量以上投与される、項目34から53のいずれかの項目に記載の方法。
55．免疫原性組成物が2回雌ブタに投与され、最初の投与が分娩前9及び5週間の間、並びに第二の投与が分娩前6及び1週間の間である、項目34から44のいずれかの項目に記載の方法。
56．免疫原性組成物が鼻内、粘膜、経口、皮内又は筋肉内投与される、項目34から55のいずれかの項目に記載の方法。
57記免疫原性組成物が鼻内又は経口投与される、項目34から56のいずれかの項目に記載の方法。
58．当該免疫原性組成物が、特に項目23から25のいずれかの項目に記載のベクターの1ｘ103から1ｘ107 TCID50/mLを含む、項目34から57のいずれかの項目に記載の方法。
59．チャレンジ又は感染後5、7又は10日目にウイルス排泄の減少をもたらす、項目34から5860．のいずれかの項目に記載の方法。
60．当該方法が相同チャレンジに対して防御を増強する、項目34から59のいずれかの項目に記載の方法。
【００５４】
好ましい実施態様の詳細な記載
以下の例は本発明の好ましい材料及び手順を示す。本明細書に記載する方法及び材料と類似又は同等ないずれのものも本発明の実施又は試験で用いられえるが、好ましい方法、装置及び材料が今や記載される。しかしながら、これらの例は単に例示として提供され、それらのいずれも本発明の全体的範囲の限定とみなされるべきでないことは理解されねばならない。
【実施例１】
【００５５】
スパイク改変物の調製
A）組換えCDVベクターによるPEDV-S発現
in vitro実験では、Lederleワクチン株（Lederle；ATCC VR-128）に由来する完全にCDVゲノムをコードする完全なプラスミド（pBR322）をSacIIエンドヌクレアーゼを用いて消化し、続いてP遺伝子及びM遺伝子の間にPEDVスパイク（S）タンパク質コードカセットをクローニングした（配列番号:36を含む配列を生じる）。組換えCDV-PEDV-Sのクローニング及びレスキューに際して、CDV関連蛍光焦点で2b遺伝子型のブタ流行性下痢ウイルススパイクタンパク質の発現を示すことが可能であった。対応するCDVベクターについて、それぞれの結果もまた達成される（すなわち2a遺伝子型配列番号:20のブタ流行性下痢ウイルススパイクタンパク質をコードする配列という点で相違するだけである）。免疫蛍光によって両ベクターについて得られた結果は、全てのCDV感染合胞体で強力なPEDVスパイクタンパク質の発現を示す（データ未提示）。
【００５６】
B）PEDVスパイクを発現するEHVの調製
スパイクタンパク質PEDV-S2b-wt及びPEDV-S2b-mutを発現するEHV1組換え体を作製するために、合成配列配列番号:3及び配列番号:14を用いた。その配列を合成し、移入ベクターpUC19-ORF1/3-PEDV-S2b-wt及びpUC19-ORF1/3-PEDV-S2b-mutにそれぞれサブクローニングした。
RED組換え系（Tischer et al. 2006）を用いるアンパッサン変異誘導によって、PEDV-S2b-wt又はPEDV-S2b-mutの発現カセットをpRacH-SEのorf1/3領域に挿入し、最終的なBAC DNA pRacH-SE-PEDV-S2b-wt及びpRacH-SE-PEDV-S2b-mutを生成した。
RK13細胞に生成したBAC DNAをトランスフェクトし、組換えウイルスrEHV-1をレスキューし、プラーク精製した。挿入領域の高忠実PCRの生成物を配列決定することによって、発現カセットの正確な挿入を確認した。感染細胞のトランスジーンの発現を分析し、間接免疫蛍光アッセイ（IFA）によって確認した（データは示されていない）。さらにまた、構築物のin vitro安定性を確認するために、RK13細胞での20回の細胞継代でウイルスを継代した。
【実施例２】
【００５７】
形質膜におけるスパイクの局在
2b遺伝子型の野生型（天然に存在する）PEDV-Sタンパク質をコードするEHV-1組換えベクター（EHV1-PEDV-S2b-wt）を、変異スパイクタンパク質をコードするEHV-1組換え体（変異はアミノ酸897/ 898 / 1374 / 1381位で（配列番号:14）、EHV1-PEDV-S2b-mutと称される）と比較した。
簡単に記せば、RK13細胞を、6ウェルプレートの1ウェルに2ｘ105細胞の密度で6ウェル細胞培養プレートにプレートした。次の日（播種後24時間）、細胞にEHV1-PEDV-S2b-wt又はEHV1-PEDV-S2b-mutのどちらかを0.01のMOIで感染させた。感染後2日（48時間）で、3％パラホルムアルデヒド溶液を1時間用いて細胞を固定した。固定細胞単層を0.1％のTween20を用いて透過性にし、続いてマウス抗PEDVモノクローナル抗体クローン7D7_G1（Abpro-Labs 2.4.16）（PBSに1：200希釈）を用いて細胞を染色した。1時間後、室温PBSを用いて2回細胞を洗浄した（1000μL/ウェル）。1：500希釈の市販二次抗体（ヤギ抗マウス-FITC（Life Technology cat:A11029 lot:1705900））の750μLを添加し、暗所で（光を遮って）60分間インキュベートした。インキュベーション後、二次抗体溶液を減圧によって吸引し、続いて室温PBSを用いて2回細胞を洗浄した（1000μL/ウェル）。オリンパス倒立蛍光顕微鏡（mod.IX81）を用い、細胞内のPEDVスパイクタンパク質の特異的蛍光を検出するためにFITCフィルターを用いて結果を得た（図1）。EHV1-PEDV-S2b-wt組換えベクターから発現されたスパイクタンパク質は主として細胞質に局在したが、一方、EHV1-PEDV-S2b-mutから発現されたスパイクタンパク質は主として細胞の膜内に局在した。
【実施例３】
【００５８】
Vero細胞の増殖カイネティクス
序：組換えウイルスベクターの効率的増殖はワクチンの効率的生産に関して必須の特色の1つである。イヌジステンパーウイルス（CDV）ワクチンは、Vero細胞（ATCC(商標)CCL-81TM）で非常にしばしばローラーボトル製造系を用いて生産される。我々は、以下の2つのCDV組換え体の増殖カイネティクスを比較した：
（i）配列番号:39（配列番号:20のPEDVスパイクタンパク質をコードする）の挿入物をP遺伝子とM遺伝子の間に有するLederleワクチン株由来のCDV骨格（実施例1参照）、本明細書では“CDV-PEDV-spike-MUT”又は“CDV-PEDV-spike mut”と呼称される、及び
（ii）対応する野生型タンパク質（配列番号:2のPEDVスパイクタンパク質）をコードするそれぞれのベクター、本明細書では“CDV-PEDV-spike-WT”又は“CDV-PEDV-spike wt”と呼称される。
実験セットアップ：ローラーボトル（490cm3）に2ｘ107のVero細胞を播種した。次の日に、CDV-PEDV-spike-MUT又はCDV-PEDV-spike-WTウイルスストックを用いて、ローラーボトル中のVero細胞を0.01のMOIで感染させた。その後7日して、1mLアリコットを各ローラーボトルからトリプリケートでサンプリングした。全てのサンプルを-80℃のフリーザーで分析まで保存した。分析の日に、サンプルを氷上で融解し、ウイルス定量を下記のプロトコルにしたがって実施した：
CDV力価測定プロトコル
材料：
−細胞：96ウェルプレートに24時間前に播種されたVeroDogSLAM BI（6ｘ103細胞/ウェル）
−培養液：MEM（SAFC, SLBX3503）
−希釈用48ウェルプレート
生産：
−希釈のために48ウェルプレートを使用する、
−ウェルを1080μLのMEMで満たす、
−第一の列に各サンプルの120μLをピペットで加える、
−混合プログラム、各サンプルの10-1から10-8の10倍希釈を作成する、
−各希釈のために1つのウェルプレートを使用する、
−予め播種された細胞に希釈物を移す（100μL/ウェル）、
−各サンプルについて8xの複製物を作成する、
−37℃の細胞培養器で3日間インキュベートする、
−細胞で典型的なCDV合胞体形成を検出することによって顕微鏡を用いて読み取る。
結果及び考察：CDV-PEDV-spike-MUT組換え体は、Vero細胞の感染後1、2、3、4、5及び6日目でより高い感染ウイルス力価を示した。さらにまた、両方の組換え体が感染後4日目でピーク上清力価に達したが、CDV-PEDV-spike-MUTは、CDV-PEDV-spike-WT組換え体よりも2倍高い感染力価に達し（図2参照）、CDVベクターの適合に対する当該スパイクの変異の有益さを示した。
無細胞上清のこれらすべてのウイルス力価を測定した。経験的データ（データは示されていない）に基づけば、細胞画分の力価は少なくとも100倍高く、したがって生産セットアップでは（当該生産セットアップではローラー瓶は細胞画分を含んで採集される）、この2つの組換え体間の力価の相違は比例してさらに大きいと期待される。
【実施例４】
【００５９】
ワクチンの動物データ
ワクチン有効性試験
ブタ流行性下痢（PED）は高度に接触伝染性のブタ疾患であり、甚大な経済的影響を有しえる。全ての齢クラスのブタが感染に感受性であるが、重篤な臨床的徴候及び死亡率は主に乳飲み仔ブタで観察される。原因因子は、PEDウイルス（PEDV）（コロナウイルス科のアルファコロナウイルス属で、エンベロープを有する一本鎖プラス鎖RNAウイルス）である。ヨーロッパでは、最初PEDVは1970年代後期にイギリスで出現した。その後、PEDVは、散発的発生を引き起こしながらヨーロッパ全土に拡散した。1990年代後期には、PEDVは、非常に低い血清有病率及び疾患報告が無いことによって証されるようにヨーロッパの養豚場から姿を消した。発生及び地方病的感染はアジアからなお報告された。アジアでは産業化された養豚場の生産性に当該疾患は大きな影響を有する。2005年に始まり、PED症例は再びヨーロッパから報告された。2013年の明白に高病毒性のPEDVの米国への持ち込み後に、中央ヨーロッパ（ドイツ及び近隣の国々を含む）から症例がまた報告された。後者の症例は、関連するが別個のPEDV株（いわゆるS-INDEL株）によって引き起こされた。ドイツでは、2014年5月から症例が報告され、高い罹患率及び種々の致死率を乳飲みブタで示す。
本試験では、配列番号:37の配列（PEDVスパイクタンパク質をコードする）の挿入物をP遺伝子とM遺伝子の間に有するLederleワクチン株由来のCDV骨格（実施例1参照）が、ベクターワクチンとして試験され（以下の本文では“CDV_PEDV-Spikeワクチン”又は“CDV PEDV-Spikeベクターワクチン”とそれぞれ呼ぶ）、6匹の雌ブタ及びそれらの仔が含まれていた。
全ての動物を、S遺伝子を標的とするRT-qPCR及びPEDV特異的抗体によってPEDVについてチェックした。陰性動物だけを試験に登録した。
3つの処置グループ（下記参照）には無作為に割当てられた動物が与えられた：
グループ1（陰性コントロール）：2匹の雌ブタ（#1及び#2と称する）、非ワクチン接種；
グループ2（陽性コントロール）：2匹の雌ブタ（#3及び#4と称する）、非ワクチン接種；
グループ3（CDV_PEDV-Spike）：2匹の雌ブタ（#5及び#6と称する）、CDV_PEDV-Spikeベクターワクチンでワクチン接種。
グループ3の2匹の雌ブタのワクチン接種は以下の計画にしたがって実施され、CDV_PEDV-Spikeワクチンのストック力価は7.94ｘ104 TCID50/mLであった（終末点定量によって規定）：
予想分娩日の9週間前：2匹の雌ブタの各々に4mLのワクチンを鼻内に投与（各鼻孔に2mL）；
予想分娩日の6週間前：2匹の雌ブタの各々に4mLのワクチンを鼻内に投与（各鼻孔に2mL）；
予想分娩日の3週間前：2匹の雌ブタの各々に4mLのそれぞれのワクチンを鼻内に投与（各鼻孔に2mL）し、追加的に2mLを筋肉内に投与。
グループ1の雌ブタが出産した仔ブタ（雌ブタ#1の13匹の仔ブタ及び雌ブタ#2の12匹の仔ブタ）を経口的に疑似接種した。グループ2の雌ブタが出産した仔ブタ（雌ブタ#3の12匹の仔ブタ及び雌ブタ#4の14匹の仔ブタ）及びグループ3の雌ブタが出産した仔ブタ（雌ブタ#5の5匹の仔ブタ及び雌ブタ#6の15匹の仔ブタ）をPEDV野外株（以下の本文では“PEDV EU”と呼称する）により4日齢で経口的にチャレンジした。
グループ2及び3の仔ブタの接種のために、細胞培養適応PEDV EUを用いた。力価は2.15ｘ105 TCID50/mLであった。グループ2及び3の仔ブタに経口的に接種した。この事例では、各仔ブタは、1：10希釈のウイルスストックの1mL（力価2.15ｘ104 TCID50）を2mLの注射器を用いて投与された。
グループ1の仔ブタは、2mL注射器で1mLの細胞培養液を用いて経口的に擬似接種された。
全試験の間、RT-qPCRのために、接種日及び接種後（pi）1から10日目と同様にpi14、17及び20/21日目に直腸スワブ（媒体無しのCPPANプレーンスワブ）を全動物から採取した。細菌学的試験のために、接種前及びチャレンジ後2日の各雌ブタの4匹の仔ブタから追加の直腸スワブを採取した。さらにまた、PEDの指標となる臨床的徴候を確立された標準化累積スコア系（下記参照）を用いて毎日記録した。血液サンプルを接種日及び14及び20/21pi（試験の終わり）又は安楽死の日若しくはそれぞれの動物の死亡時に採取した。
【００６０】
臨床モニタリング
PEDの指標となる臨床徴候を毎日モニタリングするために、確立された累積臨床スコアを用いた（下記の表を参照）。
2021535759.tif 000002
表1：PEDの指標となる臨床的徴候のために累積臨床スコア
【００６１】
サンプル調製及び核酸抽出
直腸スワブを1mLのダルベッコー改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium）に浸漬し、室温で1時間インキュベートした。QIAmpウイルスRNAミニキット（Qiagen）又はNucleoMagVet-KitのどちらかをKingFisher抽出プラットフォームと一緒に用いてウイルスRNAを抽出した。RNAを更なる使用まで-20℃で保存した。
血液サンプルは室温で20分間2031ｘgで遠心分離して血清を得た。生じた血清を小分けして-20℃で保存した。
ウイルス検出
PEDV排泄を検出するために、PEDVのS遺伝子を標的とするRT-qPCR系を以前に記載されたように用いた（Stadler et al., BMC Vet Res. 11:142, 2015）。0から7dpi並びに10及び20/21dpi（チャレンジウイルス接種後日数）で採取したサンプルをPEDVゲノムについて試験した。ゲノムコピー量/μLは社内標準を用いて計算した。
抗体検出
製造業者のマニュアルに従い全ての血清に関して市販の間接ELISA（INgezim PEDV, INGENASA, Madrid, Spain）を実施した。
細菌学
種々の細菌学のために一腹につき4匹の仔ブタの糞便を0及び2dpiに採取した。
統計学
Shapiro-Wilk検定を正規性検定のために用い、マン-ホイットニー順位和検定をソフトウェアパッケージに提供されるように実施した。統計的有意性はSigmaPlotソフトウェアを用いて試験した。
【００６２】
結果
血清中の抗体検出：
CDVグループの全ての仔ブタが、抗体陽性初乳の摂取のためにチャレンジ接種前にELISA（PEDVスパイクタンパク質に対する抗体を検出する）で陽性結果を示したが、一方、陽性及び陰性コントロールグループの全ての動物が明瞭に陰性の結果を示した。
14dpiで、全て（ただし陽性コントロールグループの3匹の仔ブタを除く）が血清転換し、一方、ワクチングループの全ての動物が血清サンプルでなお高い量のPEDV特異的IgGを示した。
試験終了時に、CDVグループ及び陽性コントロールグループの全ての仔ブタがELISAで強い陽性結果を示した。陰性コントロールのいずれの動物も全試験を通して血清転換しなかった。
更なる試験において、母雌ブタのみを鼻内ルートを介して2回ワクチン接種したとき、それぞれの抗体結果が同様に達成されることもまた観察された。
細菌学：
0及び2dpiで採取された糞便スワブは病原性細菌を全く示さなかった。細菌叢は感染時に有意な変化を受けなかった。
臨床的徴候：
陽性コントロールグループ（グループ2）の仔ブタは7日間にわたってPEDVの指標となる臨床的徴候を明瞭に示し、24hpiで嘔吐により始まりその後下痢が続いた。26匹の仔ブタのうち8匹は、重篤な脱水及び6を超える臨床スコア（人道的終点）のために安楽死させねばならなかった。PEDVの指標となる最初の臨床的徴候は36hpiで検出可能であった。
全体として、CDVベクターでワクチン接種されPEDVでチャレンジされた仔ブタ（グループ3）の臨床的徴候は全身的反応に関してより良好であり、（グループ2の仔ブタの31％と比較して）グループ3のブタの20匹のうち2匹のみ（10％）が、重篤な脱水及び6を超える臨床スコアのために安楽死させねばならなかった。
陰性コントロールの動物は全試験を通して健康なままであった。
ウイルスの排泄：
ウイルス排泄における明瞭な相違がチャレンジされたグループ間で検出できた。1dpiで、全てのチャレンジ仔ブタは直腸スワブでウイルスゲノムについて陽性であったが、CDV-PEDVワクチン接種グループの動物は、チャレンジグループの動物よりもゲノムコピー数が有意に低かった（平均CT値26.65）。
さらにまた、次の5日間については、CDVグループの直腸スワブのゲノム負荷は陽性コントロールと全く同様であったが、7dpiに始まってウイルスゲノムの検出可能量はワクチン接種雌ブタによって防御された仔ブタではカットオフレベル以下に下降し、一方、陽性コントロールグループの全ての動物はなおPEDVを排泄した。
PEDVゲノムは陰性コントロールグループのスワブでは全く検出できなかった。
結論すれば、本試験の成果は、CDV PEDV-Spike組換えワクチンでワクチン接種された雌ブタから生まれた仔ブタは、陽性コントロールと比較して臨床的徴候の減少を示し、特に大きな改善が仔ブタの死亡率/致死率に関して観察されるということであった。さらにまた、PEDVチャレンジ後のウイルス排泄は有意に減少した。
なおまた、上記に記載したワクチン有効性試験に対応する動物試験が実施され、この試験では、配列番号:40のPEDVスパイクタンパク質をコードする挿入物をP遺伝子とM遺伝子の間に有するLederleワクチン株由来のCDV骨格（実施例1参照）が2回投与され（分娩5週間前及び分娩2週間前）、より高度に病毒性遺伝子型2a PEDV野外株がチャレンジに用いられる。この組換えワクチンをワクチン接種された雌ブタから生まれた仔ブタは、チャレンジコントロールと比較して減少する死亡率又は臨床的徴候の軽減を示す。
【実施例５】
【００６３】
本動物試験では、配列番号:20のPEDVスパイクタンパク質をコードする挿入物をP遺伝子とM遺伝子の間に有するLederleワクチン株由来のCDV骨格（実施例1及び4を参照）がベクターワクチンとして試験され（以下の本文では“CDV_PEDV-G2aワクチン”又は“CDV PEDV-G2a Spikeベクターワクチン”とそれぞれ呼ぶ）、20匹の雌ブタ及びそれらの仔が含まれていた。
qRT-PCR及びELISAについて陰性とみなされた動物だけを本試験に登録した。
3つの処置グループ（下記参照）には無作為に割当てられた動物が与えられた：
グループ1（厳密な陰性コントロール）：2匹の雌ブタ（1−と4と称する）、非ワクチン接種；
グループ2（チャレンジコントロール）：8匹の雌ブタ（5−12と称する）、非ワクチン接種；
グループ3（CDV_PEDV-G2a-Spike）：8匹の雌ブタ（13−20と称する）、CDV_PEDV-G2a-Spikeベクターワクチンでワクチン接種。
グループ3の8匹の雌ブタのワクチン接種は、試験の分娩5週間前（D0）及び分娩2週間前（D21）に実施し、一方、CDV_PEDV-G2a Spikeワクチンのストック力価は2.57ｘ105 TCID50/mLであった（終末点定量によって規定）。各ワクチン接種で、雌ブタは4mLのワクチンを鼻内に投与された（各鼻孔に2mL）。
グループ1の雌ブタから生まれた仔ブタ（合計41匹の仔ブタ）はチャレンジされなかった（厳密なコントロール）。グループ2の雌ブタから生まれた仔ブタ（合計81匹の仔ブタ）及びグループ3から生まれた仔ブタ（合計83匹の仔ブタ）は、高度に病毒性のPEDV野外株（G2a遺伝子型に属する）を用い2.0ｘ103 TCID50/2mL用量（鼻内に1mL＋経口で1mL）の用量で3−7日齢にて経口的にチャレンジされた。
全試験を通して、直腸スワブを接種前日並びにpi（チャレンジウイルス後）1、3、7及び14日目に採取した。
サンプル調製及び核酸抽出
直腸スワブを収集時に2mLの最少必須培地（MEM）に沈め、処理の前に-70℃で保存した。サンプルを10秒間ヴォルテックスすることによって処理し、続いて4℃にて10分間1,500ｘgで遠心分離した。処理後、100μL/サンプルをウイルス抽出に用い、BS96 Vet 100 BioSprint抽出プラットフォームでBioSprint One-For-All Vet Kit（Qiagen）を用いた。RNAは更なる使用まで-20℃で保存した。
血液サンプルは室温にて10分間1960ｘgで遠心分離して血清を得た。生じた血清をアリコットに分けて-70℃で保存した。
ウイルス検出
PEDV排泄を検出するために、PEDVのS遺伝子を標的とする社内発RT-qPCRシステムを用いた：定量的一工程RT-PCRキット（iTaq Universal One-Step RT-PCR kit; BioRad, cat no. 1725140）をアッセイに用いた。リアルタイムRT-PCRは以下を含む25μLの反応で実施した：2μLの抽出全核酸、0.75μLのプローブ（4μM）、0.5μLの各プライマー（10μM）、12.5μLの2X RT-PCRミックス、0.5μLのiScript逆転写酵素、及び8.25μLのDEPC処理水。プライマー、プローブ及びウルトラマー配列については下記の表2を参照されたい。反応は下記の条件でCFX96リアルタイム検出系（Biorad）を用いて実施した：50℃で30分の最初の逆転写、続いて95℃で5分の最初の変性、95℃で15秒、57℃で30秒のアニーリング及び伸長、を４０サイクル。定量的データを得るために、各反応にPEDVウルトラマー（Integrated DNA Technologies）を組み入れた。凍結乾燥ウルトラマー（4nmol）はDEPCで処理したヌクレアーゼフリー無菌水に再懸濁し、1.0E+10ゲノムコピー/μL（gc/μL）のストック濃度を作成した。ストックウルトラマーから、1.0E+08から1.0E+01の10倍連続希釈をDEPC処理水で作成した。この濃度はキュービットdsDNA HSアッセイによって使用前に確認した。光学データはCFXマネージャーソフトウェアを用いて分析した。各決定について、サイクル閾値（Ct）決定モードのための回帰設定を用いて閾値ラインを自動的に計算した。ベースライン差し引きモードを用いてベースラインを自動的に差し引いた。10未満のベースライン終末値を有する曲線は手動で補正した。
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表2：内部誘導RT-qPCR系で用いられるプローブ（Pr）、プライマー（F/R）及びウルトラマー配列
【００６４】
抗体検出
社内開発CCIFアッセイを用いて、本試験に由来する血清及び乳サンプルを試験した：野生型PEDV単離株（遺伝子グループ2a）を、PEDV増殖培地（MEM＋2.5％HEPES＋0.3％リン酸トリプトースブロス＋0.02％酵母＋10μg/mLトリプシン）で1：100に希釈した。VERO細胞をプレートして2日経過した96ウェルプレートに希釈ウイルス（100μL/ウェル）を接種した。感染の前に、細胞増殖培地をプレートから除去し、プレートを100μLのPEDV増殖培地で2回洗浄した。プレートを37±2℃＋CO2（4−6％）で24時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を廃棄し、プレートを200μL/ウェルの1X PBSで2回洗浄した。固定のために、エタノール（200μL/ウェル）を添加した。プレートを室温で30分間インキュベートして風乾し、使用まで-20℃で保存した。アッセイで使用する前に、プレートを200μL/ウェルの1X PBS（Gibco）で10分間室温にて再水和し、さらに100μL/ウェルの緩衝液（1X PBS＋1％正常ヤギ血清＋0.1％トリトンX）で15分間室温で封鎖した。1：1000希釈のPEDV Mab抗体（Median diagnostics）を含む希釈緩衝液（1X PBS＋5％BSA＋1％正常ヤギ血清＋0.1％トリトンX）で血清サンプルの連続2倍希釈を調製した。希釈サンプル（50μL/ウェル）を当該調製プレートに添加して、37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを1X PBS（200μL/ウェル）で3回洗浄した。続いて、合計50μL/ウェルの希釈二次抗体［Alexa594ヤギ抗マウスIgG（Fisher；1：500希釈）；FITC標識ヤギ抗ブタIgG（BioRad；1：500希釈）；Hoechst 33342（Fisher；1：1000希釈）］を各プレートに添加して37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを1X PBS（200μL/ウェル）で3回洗浄した。蛍光を観察した。Mab3F12が結合したPEDV感染細胞は特異的な赤色を示した。緑色蛍光の同時局在はブタIgGの結合の指標とした。特異的な緑色蛍光が観察される最高希釈がIgG力価と等価であった。
結果
死亡率：
グループ1（厳密なコントロール）では40匹のブタが生存し、グループ2（チャレンジコントロール）では16匹のブタが生存し、グループ3（CDV-PEDV-G2aスパイクワクチン接種）では34匹のブタが生存し、平均死亡率2％（グループ1）、80％（グループ2）及び59％（グループ3）がそれぞれ得られた。
抗体応答：
チャレンジ後の特異的なPEDV抗体応答は、雌ブタの血清及び乳中のCCIF IgG抗体力価の算術平均レベルがグループ2（チャレンジコントロール）の場合よりもCDV-PEDV-G2aスパイクワクチン接種グループで高いことを明示した。これは、ワクチン接種雌ブタは、チャレンジ後の感染仔ブタに由来するウイルスに感染した後で乳及び血清中のIgGレベルをブーストすることによって強力に応答したことを示している。これと比較して、チャレンジコントロールの雌ブタの抗体力価（単にチャレンジされた仔ブタ（及びそれらの糞便）との接触を介してPEDV感染を生じたことによる抗体力価）は有意に低かった。
ウイルスの排泄
チャレンジウイルス接種後3日目に、ワクチン接種及び非ワクチン接種グループでそれぞれ同様な算術平均RNA負荷が検出され、CDV-PED-G2aスパイクワクチン接種グループ及びチャレンジコントロールグループでそれぞれ9.2及び9.8グループ算術平均log10 PEDVゲノムコピーに達した。D48（7dpi）及びD55（14dpi）では、CDV-PEDV-G2aスパイクワクチン接種グループの算術平均log10 PEDVゲノムコピー数はそれぞれ3.2及び2.0 log10であったが、一方、チャレンジコントロールグループではそれぞれ5.5及び3.9 log10であり、7dpi及び14dpiでそれぞれ2.3及び1.9 logの減少を示した。より長い期間の排泄モニタリングは実施しなかったが、チャレンジウイルス接種後7及び14日目に観察されたウイルス排泄動態の傾向は、実施例4で上記に記載した結果と一致してワクチン接種動物における短縮されたウイルス排泄期間を示す。
厳密な陰性コントロールグループのスワブではPEDVゲノムは検出できなかった。
結論すれば、本試験の成果は、CDV PEDV-G2aスパイク組換えワクチンを接種された雌ブタから生まれたか又は授乳された仔ブタはそれぞれ、高度に病毒性のPEDV株でチャレンジされたとき、コントロールグループの仔ブタと比較して死亡率の有意な減少を示すということであった。さらにまた、（出産後の初期数日における移行抗体の伝達を介して）乳からPEDV防御性IgG抗体を得たこれらの仔ブタは、チャレンジ後のウイルス排泄の有意な減少を感染後7及び14日目に示し、これは重要な疫学的パラメーターである。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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