(57)【要約】【課題】  乳癌の早期予測のため、処置応答、再発および予後のモニタリングのための方法を提供する。【解決手段】  本発明は、乳癌の早期予測のため、処置応答、再発および予後をモニタリングするための新規エピジェネティックバイオマーカーのセットを開示する。遺伝子の異常なメチル化は、乳癌患者由来の腫瘍組織および血漿サンプルにおいて検出され得るが、正常な健常個体では検出されない。本開示は、本明細書中で使用されるプライマーおよびプローブも開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌の検出を必要とするヒト被験体におけるメチル化状態を検出するための方法であって、前記方法は、（ａ）生物学的サンプルを提供する工程、および（ｂ）標的ＤＮＡ配列ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１またはそれらのフラグメントにおけるエピジェネティックバイオマーカーのメチル化状態をアッセイする工程を含み、コントロールのメチル化状況を基準として、前記ヒト被験体の前記ＤＮＡ配列に過剰メチル化が存在することが、乳癌を示す、方法。
【請求項２】
ヒト被験体における、乳癌の素因もしくは罹患を検出するためまたは乳癌の処置応答、予後もしくは再発を予測するための方法であって、前記方法は、（ａ）生物学的サンプルを提供する工程、および（ｂ）標的ＤＮＡ配列ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１またはそれらのフラグメントにおけるエピジェネティックバイオマーカーのメチル化状態をアッセイする工程を含み、コントロールのメチル化状況を基準として、前記ヒト被験体の前記ＤＮＡ配列に過剰メチル化が存在することが、前記乳癌の素因もしくは罹患、処置応答不良、予後不良または再発を示す、方法。
【請求項３】
前記サンプル中の前記標的ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１  ＤＮＡ配列またはそれらのフラグメントならびにコントロールＤＮＡ配列のメチル化レベルをアッセイするために、ＧＣＭ２メチル化特異的プローブおよびＩＴＰＲＩＰＬ１メチル化特異的プローブを使用する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）標的ＤＮＡ配列ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１またはそれらのフラグメントを含む生物学的サンプルを提供する工程、（ｂ）ＧＣＭ２メチル化特異的プローブおよびＩＴＰＲＩＰＬ１メチル化特異的プローブを用いて、前記サンプル中の前記標的ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１  ＤＮＡ配列またはそれらのフラグメントならびにコントロールＤＮＡ配列のメチル化レベルをアッセイする工程、（ｃ）コントロールＤＮＡ配列に対する、前記標的ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１  ＤＮＡ配列またはそれらのフラグメントの相対的なメチル化状態を計測して、過剰メチル化されたＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１の存在を検出する工程、および（ｄ）前記ヒト被験体の前記標的ＤＮＡ配列ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１  ＤＮＡ配列またはそれらのフラグメントが、前記被験体におけるコントロールＤＮＡ配列のメチル化と比べて過剰メチル化されているとき、前記被験体を、乳癌処置を必要とすると特定する工程を含む、方法。
【請求項５】
（ａ）標的ＤＮＡ配列ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１またはそれらのフラグメントを含む生物学的サンプルを提供する工程、（ｂ）ＧＣＭ２メチル化特異的プローブおよびＩＴＰＲＩＰＬ１メチル化特異的プローブを用いて、前記サンプル中の前記標的ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１  ＤＮＡ配列またはそれらのフラグメントならびにコントロールＤＮＡ配列のメチル化レベルをアッセイする工程、（ｃ）コントロールＤＮＡ配列に対する、前記標的ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１  ＤＮＡ配列またはそれらのフラグメントの相対的なメチル化状態を計測して、過剰メチル化されたＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１の存在を検出する工程、および（ｄ）前記ヒト被験体の前記標的ＤＮＡ配列ＧＣＭ２およびＩＴＲＰＩＰＬ１が、前記被験体におけるコントロールＤＮＡ配列のメチル化状況と比べて過剰メチル化されているとき、前記被験体を、乳癌の素因もしくは罹患、処置応答不良または予後不良もしくは再発を有すると特定する工程を含む、方法。
【請求項６】
前記生物学的サンプルが、組織、細胞、血液、尿、血清または血漿である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡ配列ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１またはそれらのフラグメントにおけるメチル化が、前記コントロールのメチル化より約６４％高い、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡ配列ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１またはそれらのフラグメントにおけるメチル化が、前記コントロールのメチル化よりそれぞれ約６９％および約８０％高い、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ヒト被験体における前記標的ＤＮＡ配列のメチル化が、コントロールにおけるメチル化より少なくとも０．５倍高いとき、前記過剰メチル化が示唆される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ヒト被験体における前記標的ＤＮＡ配列のメチル化が、コントロールにおけるメチル化より少なくとも２倍高いとき、前記過剰メチル化が示唆される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ＧＣＭ２メチル化特異的プローブが、配列番号１５に対して少なくとも８５％の相同性を有する配列を有し、ＩＴＰＲＩＰＬ１メチル化特異的プローブが、配列番号１６に対して少なくとも８５％の相同性を有する配列を有する、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記ＧＣＭ２メチル化特異的プローブが、配列番号１５の配列を有し、ＩＴＰＲＩＰＬ１メチル化特異的プローブが、配列番号１６の配列を有する、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
コントロールＤＮＡ配列に対する、前記標的ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１  ＤＮＡ配列またはそれらのフラグメントの相対的なメチル化状態の基準が、ＧＣＭ２の場合、約５４％より高い感度および約１００％の特異度を有し、ＩＴＰＲＩＰＬ１の場合、約７９％より高い感度および約９６％より高い特異度を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
以下の１つ以上の標的ＤＮＡ配列またはそれらの組み合わせのいずれか：Ｃ１ｏｒｆ１１４またはそのフラグメント、ＺＮＦ１７７またはそのフラグメントおよびＣ８ｏｒｆ４７またはそのフラグメントのメチル化レベルをアッセイする工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ＲＫＬ００１のメチル化レベルがさらにアッセイされる、請求項１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
以下の１つ以上の標的ＤＮＡ配列またはそれらの組み合わせのいずれか：Ｃ１ｏｒｆ１１４またはそのフラグメント、ＺＮＦ１７７またはそのフラグメントおよびＣ８ｏｒｆ４７またはそのフラグメントのメチル化レベルをアッセイするために、Ｃ１ｏｒｆ１１４メチル化特異的プローブ、ＺＮＦ１７７メチル化特異的プローブもしくはＣ８ｏｒｆ４７メチル化特異的プローブまたはそれらの組み合わせのいずれかをさらに使用する、請求項１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
標的であるＣ１ｏｒｆ１１４、ＺＮＦ１７７およびＣ８ｏｒｆ４７またはそれらのフラグメントのメチル化特異的プローブが、それぞれ配列番号１７、１８および１４に対して少なくとも８５％の相同性を有する配列を有する、請求項１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
標的であるＣ１ｏｒｆ１１４またはそのフラグメント、ＺＮＦ１７７またはそのフラグメントおよびＣ８ｏｒｆ４７またはそのフラグメントの前記メチル化特異的プローブが、それぞれ配列番号１７、１８および１４の配列を有する、請求項１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
コントロールＤＮＡ配列に対する、前記標的Ｃ１ｏｒｆ１１４、ＺＮＦ１７７および／もしくはＣ８ｏｒｆ４７  ＤＮＡ配列またはそれらのフラグメントの相対的なメチル化状態の基準が、それぞれ、Ｃ１ｏｒｆ１１４の場合、約７５％より高い感度および約７６％の特異度、ならびにＺＮＦ１７７の場合、約６２％より高い感度および約８２％の特異度を有する、請求項１６または１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
コントロールＤＮＡ配列に対する、標的であるＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１またはそれらのフラグメント；標的であるＧＣＭ２、ＩＴＰＲＩＰＬ１およびＣ１ｏｒｆ１１４またはそれらのフラグメント；ならびにＧＣＭ２、ＩＴＰＲＩＰＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４およびＺＮＦ１７７またはそれらのフラグメントの組み合わせの相対的なメチル化状態の基準が、それぞれ、約８７％より高い感度および約９６％の特異度、約９５％より高い感度および約７２％の特異度、約８７％より高い感度および約９６％の特異度を有する、請求項１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記基準が、加重和スコアの解析によって前記特異度および感度を計測する工程をさらに含む、請求項１３、１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
標的であるＧＣＭ２、ＩＴＰＲＩＰＬ１およびＣ１ｏｒｆ１１４もしくはそれらのフラグメントまたは標的であるＧＣＭ２、ＩＴＰＲＩＰＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４およびＺＮＦ１７７もしくはそれらのフラグメントの組み合わせの相対的なメチル化状態の基準が、それぞれ、約８７％より高い感度および約９６％の特異度、ならびに約９１％より高い感度および約９６％の特異度を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＲＫＬ００１のメチル化レベルをアッセイするために、ＲＫＬ００１メチル化特異的プローブをさらに使用する、請求項１５のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
ＲＫＬ００１メチル化特異的プローブが、配列番号１３に対して少なくとも８５％の相同性を有する配列を有する、請求項２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
ＲＫＬ００１メチル化特異的プローブが、配列番号１３の相同性を有する配列を有する、請求項２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記メチル化状態が、ポリメラーゼ連鎖反応によって検出される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
配列番号１４〜１８からなる群より選択される配列を有するプローブ。
【請求項２８】
配列番号１〜１３からなる群より選択される配列を有するプライマー。
【請求項２９】
乳癌の検出を必要とするヒト被験体におけるメチル化状態を検出するため、あるいはヒト被験体における乳癌の素因もしくは罹患を検出するためまたは乳癌の処置応答、予後もしくは再発を予測するためのキットであって、前記キットは、標的ＤＮＡ配列ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１またはそれらのフラグメントにおけるエピジェネティックバイオマーカーのメチル化状態をアッセイするための、配列番号５〜８の配列を有するプライマーまたは配列番号１５および１６の配列を有するプローブを含む、キット。
【請求項３０】
標的ＤＮＡ配列ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１もしくはそれらのフラグメントにおけるエピジェネティックバイオマーカーのメチル化状態をアッセイするために、配列番号９〜１２および１〜４の配列を有する１つ以上のプライマーならびに／または配列番号１７、１８、１２および１３の配列を有する１つ以上のプローブを、１つ以上の標的ＤＮＡ配列Ｃ１ｏｒｆ１１４またはそのフラグメント、ＺＮＦ１７７またはそのフラグメント、Ｃ８ｏｒｆ４７またはそのフラグメントおよびＲＫＬ００１４またはそれらの組み合わせのいずれかと組み合わせて、さらに含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
重亜硫酸ナトリウム、ならびに標的遺伝子全体を増幅するためのアダプター、ならびに請求項１〜２３のいずれかに示されたような標的ＤＮＡ配列におけるエピジェネティックバイオマーカーのＤＮＡ領域からの少なくとも１つのシトシンの変換されたメチル化配列およびまたは変換された非メチル化配列の存在を定量するためのポリヌクレオチド（例えば、検出可能に標識されたポリヌクレオチド）をさらに含む、請求項２９または３０に記載のキット。
【請求項３２】
標的配列全体または遺伝子の増幅のためのメチル化感知制限酵素をさらに含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記方法が、乳癌の検出を必要とするヒト被験体におけるメチル化状態を検出する、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、乳癌のリスクもしくは感受性ならびに／または乳癌の予後および悪性度を予測するための遺伝子バイオマーカーに関する。特に、本発明は、遺伝子バイオマーカーのメチル化に基づいて、乳癌を検出し、乳癌のリスクもしくは乳癌の感受性ならびに／または乳癌の予後および悪性度を予測する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌は、身体の他の部分に浸潤するかまたは広がる可能性のある、異常な細胞成長を伴う疾患の一群であり、世界の死因第一位である。
【０００３】
メチル化ＤＮＡは、ほとんどの腫瘍タイプの組織における有望なバイオマーカーの１クラスとして研究されている。多くの場合において、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼは、遺伝子発現のエピジェネティックな制御として、シトシン−リン酸−グアニン（ＣｐＧ）アイランド部位のＤＮＡにメチル基を付加する。
米国特許出願公開第２００８／０３１１５７０（Ａ１Ａ）号明細書は、癌をスクリーニングするための方法を提供しており、その方法は、以下の工程を含む：（１）試験検体を提供する工程；（２）その試験検体のゲノムＤＮＡ内の少なくとも１つの標的遺伝子におけるＣｐＧ配列のメチル化状況を検出する工程であって、その標的遺伝子は、ＳＯＸ１、ＰＡＸ１、ＬＭＸ１Ａ、ＮＫＸ６−１、ＷＴ１およびＯＮＥＣＵＴ１からなる、工程；および（３）その標的遺伝子におけるメチル化状況の有無に基づいて、その検体に癌または癌性の病理学的変化が存在するかを判定する工程。国際公開第２０１６／０７１４７７（Ａ１）号パンフレットは、ｓｈｏｘ２遺伝子におけるＣｐＧメチル化を解析することによる、処置に対する癌患者の応答の評価に関する。欧州特許第２８２８４０５（Ｂ１）号明細書は、血液または血漿および便における複数の遺伝子マーカーを評価することによって直腸結腸新形成を検出するための方法を提供している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００８／０３１１５７０（Ａ１Ａ）号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１６／０７１４７７（Ａ１）号パンフレット
【特許文献３】欧州特許第２８２８４０５（Ｂ１）号明細書
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、乳癌の早期予測のため、処置応答、再発および予後をモニタリングするための新規エピジェネティックバイオマーカーのセットを開示する。遺伝子の異常なメチル化は、癌患者由来の腫瘍組織および血漿サンプルにおいて検出され得るが、正常な健常個体では検出されない。本開示は、本明細書中で使用されるプライマーおよびプローブも開示する。
【０００６】
１つの実施形態において、本開示は、乳癌の検出を必要とするヒト被験体におけるメチル化状態を検出するための方法を開示し、その方法は、（ａ）生物学的サンプルを提供する工程、および（ｂ）標的ＤＮＡ配列ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１またはそれらのフラグメントにおけるエピジェネティックバイオマーカーのメチル化状態をアッセイする工程を含み、コントロールのメチル化状況を基準として、そのヒト被験体の上記ＤＮＡ配列に過剰メチル化が存在することが、乳癌を示す。
【０００７】
１つの実施形態において、本開示は、ヒト被験体における、乳癌の素因もしくは罹患を検出するためまたは乳癌の処置応答、予後もしくは再発を予測するための方法を開示し、その方法は、（ａ）生物学的サンプルを提供する工程、および（ｂ）標的ＤＮＡ配列ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１またはそれらのフラグメントにおけるエピジェネティックバイオマーカーのメチル化状態をアッセイする工程を含み、コントロールのメチル化状況を基準として、そのヒト被験体の上記ＤＮＡ配列に過剰メチル化が存在することが、乳癌の素因もしくは罹患、処置応答不良、予後不良または再発を示す。
【０００８】
いくつかの実施形態では、サンプル中の標的ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１  ＤＮＡ配列またはそれらのフラグメントならびにコントロールＤＮＡ配列のメチル化レベルをアッセイするために、ＧＣＭ２メチル化特異的プローブおよびＩＴＰＲＩＰＬ１メチル化特異的プローブを使用する。
【０００９】
１つの実施形態において、本開示は、（ａ）標的ＤＮＡ配列ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１またはそれらのフラグメントを含む生物学的サンプルを提供する工程、（ｂ）ＧＣＭ２メチル化特異的プローブおよびＩＴＰＲＩＰＬ１メチル化特異的プローブを用いて、前記サンプル中の上記標的ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１  ＤＮＡ配列またはそれらのフラグメントならびにコントロールＤＮＡ配列のメチル化レベルをアッセイする工程、（ｃ）コントロールＤＮＡ配列に対する、標的ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１  ＤＮＡ配列またはそれらのフラグメントの相対的なメチル化状態を計測して、過剰メチル化されたＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１の存在を検出する工程、および（ｄ）上記ヒト被験体の標的ＤＮＡ配列ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１  ＤＮＡ配列またはそれらのフラグメントが、前記被験体におけるコントロールＤＮＡ配列のメチル化と比べて過剰メチル化されているとき、その被験体を、乳癌処置を必要とすると特定する工程を含む、方法を提供する。この方法は、乳癌の検出を必要とするヒト被験体におけるメチル化状態を検出し得る。
【００１０】
１つの実施形態において、本開示は、（ａ）標的ＤＮＡ配列ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１またはそれらのフラグメントを含む生物学的サンプルを提供する工程、（ｂ）ＧＣＭ２メチル化特異的プローブおよびＩＴＰＲＩＰＬ１メチル化特異的プローブを用いて、上記サンプル中の標的ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１  ＤＮＡ配列またはそれらのフラグメントならびにコントロールＤＮＡ配列のメチル化レベルをアッセイする工程、（ｃ）コントロールＤＮＡ配列に対する、標的ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１  ＤＮＡ配列またはそれらのフラグメントの相対的なメチル化状態を計測して、過剰メチル化されたＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１の存在を検出する工程、および（ｄ）上記ヒト被験体の標的ＤＮＡ配列ＧＣＭ２およびＩＴＲＰＩＰＬ１が、前記被験体におけるコントロールＤＮＡ配列のメチル化状況と比べて過剰メチル化されているとき、その被験体を、乳癌の素因もしくは罹患、処置応答不良または予後不良または再発を有すると特定する工程を含む、方法を提供する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、上記生物学的サンプルは、組織、細胞、血液、尿、血清または血漿である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、コントロールのメチル化よりも約６４％高い、本明細書中に記載されるＤＮＡ配列ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１またはそれらのフラグメントにおけるメチル化は、乳癌を示唆する。さらなる実施形態において、コントロールのメチル化よりも約６９％高い、上記ＤＮＡ配列ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１またはそれらのフラグメントにおけるメチル化は、乳癌を示唆する。さらなる実施形態において、コントロールのメチル化よりもそれぞれ約６９％および約８０％高い、上記ＤＮＡ配列ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１またはフラグメントにおけるメチル化は、乳癌を示唆する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される過剰メチル化は、ヒト被験体における上記標的ＤＮＡ配列のメチル化が、コントロールにおけるメチル化よりも少なくとも０．５倍、１倍、２倍または３倍高いとき、示唆される。１つの実施形態において、過剰メチル化は、ヒト被験体における上記標的ＤＮＡ配列のメチル化が、コントロールにおけるメチル化より少なくとも２倍高いとき、示唆される。
【００１４】
メチル化アッセイにおいて使用されるプローブのある特定の実施形態は、配列番号１３〜１８からなる群より選択される配列に対して約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれより高いパーセントの相同性を有する。いくつかの実施形態において、ＧＣＭ２メチル化特異的プローブは、配列番号１５に対して少なくとも８５％の相同性を有する配列を有し、ＩＴＰＲＩＰＬ１メチル化特異的プローブは、配列番号１６に対して少なくとも８５％の相同性を有する配列を有する。いくつかの実施形態において、ＧＣＭ２メチル化特異的プローブは、配列番号１５の配列を有し、ＩＴＰＲＩＰＬ１メチル化特異的プローブは、配列番号１６の配列を有する。
【００１５】
さらなる実施形態において、本開示の方法は、以下の１つ以上の標的ＤＮＡ配列またはそれらの組み合わせのいずれか：Ｃ１ｏｒｆ１１４またはそのフラグメント、ＺＮＦ１７７またはそのフラグメントおよびＣ８ｏｒｆ４７またはそのフラグメントのメチル化レベルをアッセイする工程をさらに含む。さらに、ＲＫＬ００１のメチル化レベルが、さらにアッセイされる。
【００１６】
いくつかの実施形態において、Ｃ１ｏｒｆ１１４メチル化特異的プローブ、ＺＮＦ１７７メチル化特異的プローブもしくはＣ８ｏｒｆ４７メチル化特異的プローブまたはそれらの組み合わせのいずれかが、以下の１つ以上の標的ＤＮＡ配列またはそれらの組み合わせのいずれか：Ｃ１ｏｒｆ１１４またはそのフラグメント、ＺＮＦ１７７またはそのフラグメントおよびＣ８ｏｒｆ４７またはそのフラグメントのメチル化レベルをアッセイするためにさらに使用される。さらに、標的であるＣ１ｏｒｆ１１４、ＺＮＦ１７７およびＣ８ｏｒｆ４７またはそれらのフラグメントのメチル化特異的プローブは、それぞれ配列番号１７、１８および１４に対して少なくとも８５％の相同性を有する配列を有する。さらなる実施形態において、標的であるＣ１ｏｒｆ１１４またはそのフラグメント、ＺＮＦ１７７またはそのフラグメントおよびＣ８ｏｒｆ４７またはそのフラグメントのメチル化特異的プローブは、それぞれ配列番号１７、１８および１４の配列を有する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、コントロールＤＮＡ配列に対する、標的Ｃ１ｏｒｆ１１４、ＺＮＦ１７７および／もしくはＣ８ｏｒｆ４７  ＤＮＡ配列またはそれらのフラグメントの相対的なメチル化状態の基準は、それぞれ、Ｃ１ｏｒｆ１１４の場合、約７５％より高い感度および約７６％の特異度を有し、ＺＮＦ１７７の場合、約６２％より高い感度および約８２％の特異度を有する。いくつかの実施形態において、標的であるＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１またはそれらのフラグメント；標的であるＧＣＭ２、ＩＴＰＲＩＰＬ１およびＣ１ｏｒｆ１１４またはそれらのフラグメント；ならびにＧＣＭ２、ＩＴＰＲＩＰＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４およびＺＮＦ１７７またはそれらのフラグメントの組み合わせの相対的なメチル化状態の基準は、それぞれ、コントロールＤＮＡ配列に対して、約８７％より高い感度および約９６％の特異度、約９５％より高い感度および約７２％の特異度、約８７％より高い感度および約９６％の特異度を有する。さらなる実施形態において、その基準は、加重和スコアの解析によって特異度および感度を計測する工程をさらに含む。いくつかのさらなる実施形態において、標的であるＧＣＭ２、ＩＴＰＲＩＰＬ１およびＣ１ｏｒｆ１１４もしくはそれらのフラグメントまたは標的であるＧＣＭ２、ＩＴＰＲＩＰＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４およびＺＮＦ１７７もしくはそれらのフラグメントの組み合わせの相対的なメチル化状態の基準は、それぞれ、約８７％より高い感度および約９６％の特異度、ならびに約９１％より高い感度および約９６％の特異度を有する。
【００１８】
さらなる実施形態において、ＲＫＬ００１のメチル化レベルをアッセイするために、ＲＫＬ００１メチル化特異的プローブをさらに使用する。好ましくは、ＲＫＬ００１メチル化特異的プローブは、配列番号１３に対して少なくとも８５％の相同性を有する配列を有する。より好ましくは、ＲＫＬ００１メチル化特異的プローブは、配列番号１３の相同性を有する配列を有する。
【００１９】
いくつかの実施形態において、メチル化状態は、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸配列決定（例えば、バイサルファイトシークエンスまたはパイロシークエンス）、バイサルファイト変換、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量に基づく分離、標的捕捉またはマイクロアレイによって検出される。特定の実施形態において、メチル化状態は、ポリメラーゼ連鎖反応によって検出される。
【００２０】
ポリメラーゼ連鎖反応において使用されるプライマーのある特定の実施形態は、配列番号１〜１２からなる群より選択される配列に対して約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれより高いパーセントの相同性を有する。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ配列ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１またはそれらのフラグメントのメチル化状態を検出または計測するために、配列番号５〜８の配列を有するプライマーまたは配列番号１５および１６の配列を有するプローブを使用する。
【００２１】
本開示は、本明細書中に記載されるような標的ＤＮＡ配列におけるエピジェネティックバイオマーカーのメチル化プロファイルを検出するためおよび／または特徴付けるためのキットも提供する。そのキットは、重亜硫酸ナトリウム、ならびに標的遺伝子全体を増幅するためのアダプター、ならびに本明細書中に記載されるような標的ＤＮＡ配列におけるエピジェネティックバイオマーカーのＤＮＡ領域からの少なくとも１つのシトシンの変換されたメチル化配列およびまたは変換された非メチル化配列の存在を定量するためのポリヌクレオチド（例えば、検出可能に標識されたポリヌクレオチド）をさらに含み得る。さらに、そのキットは、標的配列全体または遺伝子を増幅するためのメチル化感知制限酵素（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ）をさらに含み得る。
【００２２】
１つの実施形態において、上記キットは、標的ＤＮＡ配列ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１もしくはそれらのフラグメントにおけるエピジェネティックバイオマーカーのメチル化状態をアッセイするために、配列番号９〜１２および１〜４の配列を有する１つ以上のプライマーならびに／または配列番号１７、１８、１２および１３の配列を有する１つ以上のプローブを、１つ以上の標的ＤＮＡ配列Ｃ１ｏｒｆ１１４またはそのフラグメント、ＺＮＦ１７７またはそのフラグメント、Ｃ８ｏｒｆ４７またはそのフラグメントおよびＲＫＬ００１４またはそれらの組み合わせのいずれかと組み合わせて、さらに含む。
【００２３】
１つの実施形態において、上記キットは、１つ以上の標的ＤＮＡ配列Ｃ１ｏｒｆ１１４またはそのフラグメント、ＺＮＦ１７７またはそのフラグメント、Ｃ８ｏｒｆ４７またはそのフラグメントおよびＲＫＬ００１４またはそれらの組み合わせのいずれかとともに、標的ＤＮＡ配列ＧＣＭ２またはそのフラグメントおよびＩＴＰＲＩＰＬ１またはそのフラグメントにおけるエピジェネティックバイオマーカーのメチル化プロファイルを検出するためおよび／または特徴付けるために使用され得る。そのキットは、標的ＤＮＡ配列のメチル化状態を検出または計測するための、配列番号９〜１２および１〜４の配列を有する１つ以上のプライマーならびに／または配列番号１７、１８、１２および１３の配列を有する１つ以上のプローブをさらに含む。
【００２４】
さらなる実施形態において、上記キットは、標的配列全体または遺伝子を増幅するためのメチル化感知制限酵素をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１Ａ〜Ｆは、それぞれ、腫瘍組織と隣接する正常組織との間の、標的核酸、ならびに遺伝子のプロモーター、エキソンおよび遺伝子本体領域のメチル化状態の差異についてのヒートマップを示している（Ａ：ＲＫＬ００１；Ｂ：Ｃ８ｏｒｆ４７；Ｃ：ＧＣＭ２；Ｄ：Ｃ１ｏｒｆ１１４；Ｅ：ＩＴＰＲＩＰＬ１；Ｆ：ＺＮＦ１７７）。
【００２６】
【図２】図２は、健常被験体および乳癌患者の血漿サンプル中の標的遺伝子のエピジェネティックバイオマーカーのメチル化状態の早期検出の差異を示している。
【００２７】
【図３】図３は、乳癌患者および健常被験体における標的遺伝子のエピジェネティックバイオマーカーのメチル化状態の早期検出を示している、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析を示している。ＧＩ：ＧＣＭ２、ＩＴＰＲＩＰＬ１；ＧＩＣ：ＧＣＭ２、ＩＴＰＲＩＰＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４；ＧＩＣＺ：ＧＣＭ２、ＩＴＰＲＩＰＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４、ＺＮＦ１７７；Ｇ（ａ＊）Ｉ（ｂ＊）Ｃ（ｃ＊）Ｚ（ｄ＊）：加重和スコアの解析後のＧＣＭ２＋ＩＴＰＲＩＰＬ１＋Ｃ１ｏｒｆ１１４＋ＺＮＦ１７７。
【００２８】
【図４】図４Ａ〜Ｃは、手術前および手術後の乳癌患者における標的遺伝子Ｃ１ｏｒｆ１１４（Ａ）、ＣＡ−１５３（Ｂ）およびＣＥＡ（Ｃ）のエピジェネティックバイオマーカーのメチル化状態による処置応答を示している。
【００２９】
【図５】図５は、ＩＴＰＲＩＰＬ１遺伝子のメチル化状態のカプラン・マイヤー曲線に基づいた、乳癌患者における予後不良を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、本明細書中に記載される特定の材料および方法に限定されないと理解される。本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を説明するための目的のものであって、添付の請求項によってのみ限定される本発明の範囲を限定する意図はないことも理解されるべきである。
【００３１】
本明細書および添付の請求項において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が別段明確に規定されていない限り、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「バイオマーカー（ａ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）」に対する言及は、２つ以上のバイオマーカーの混合物などを含む。
【００３２】
用語「ＡＵＣ」は、本明細書中で使用されるとき、曲線下面積の省略形である。特に、この用語は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積のことを指す。ＲＯＣ曲線は、診断検査の考えられる種々のカットポイントに対する偽陽性率に対して真陽性率をプロットしたものである。ＲＯＣ曲線は、選択されたカットポイントに応じて感度と特異度との間にトレードオフを示す（感度が上昇すると、特異度が低下する）。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、診断検査の精度に対する尺度である（面積が大きいほど好ましく、１が最善であり、無作為検査であれば、ＲＯＣ曲線は対角線上に乗ることになり、０．５という面積を有する；参照として、Ｊ．Ｐ．Ｅｇａｎ．Ｓｉｇｎａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ＲＯＣ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７５）。
【００３３】
用語「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された組織、細胞または体液のサンプルのことを指し、それらとしては、例えば、血液、バフィーコート、血漿、血清、血液細胞（例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣＳ）、杆状球、好中球、後骨髄球、単球またはＴ細胞）、糞便、尿、骨髄、胆汁、髄液、リンパ液、皮膚サンプル、皮膚、気道、腸管および尿生殖器の外分泌物、涙液、唾液、乳、器官、生検材料、ならびにインビトロ細胞培養物の構成物のサンプル（培養液中での細胞および組織、例えば、組換え細胞の成長に由来する条件培地、ならびに細胞構成要素が挙げられるがこれらに限定されない）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３４】
用語「バイオマーカー」とは、コントロール被験体（例えば、陰性診断を受けたまたは検出不可能な癌を有する人物、正常または健常な被験体）から採取された同等のサンプルと比較される、ヒト癌を有する患者から採取されたサンプル中に存在する核酸分子のことを指す。バイオマーカーは、検出および／または定量され得る、核酸、核酸のフラグメント、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであり得る。バイオマーカーには、遺伝子由来のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
【００３５】
用語「ＣｐＧアイランド」は、本明細書中で使用されるとき、あるゲノムにおける一続きのＤＮＡであって、そのゲノムの残りと比べてＧＣリッチなＤＮＡのことを指す。数百塩基対、時として数千塩基対にも及ぶこれらの領域のＧＣ含有量は、通常、５０％以上である。これらの領域は、遺伝子の５’末端の印となることが多い。
【００３６】
バイオマーカーの「コントロール量」は、ある検査量のバイオマーカーに対して比較される任意の量または量の範囲であり得る。
【００３７】
本明細書中で使用されるとき、癌の「早期検出」という用語は、転移前に癌の可能性を発見することを指す。好ましくは、この用語は、サンプル組織または細胞の形態学的変化が観察される前に癌の可能性を発見することを指す。
【００３８】
本明細書中で使用されるとき、用語「検出する（ｄｅｔｅｃｔ）」、「検出する（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）」または「検出」は、発見するもしくは見分けるといった一般的な行為、または検出可能に標識された組成物の特異的観察を説明し得る。
【００３９】
用語「遺伝子」とは、ポリペプチド、前駆体またはＲＮＡ（例えば、非コードＲＮＡ、例えば、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、スプライコソームＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）の生成に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列のことを指す。ポリペプチドまたは非コードＲＮＡは、完全長またはフラグメントのポリペプチドの所望の活性または機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、免疫原性など）が保持される限り、その完全長のコード配列またはコード配列の任意の部分によってコードされ得る。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳制御配列（例えば、リボソーム結合部位および配列内リボソーム進入部位）、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界領域、複製起点、マトリックス付着部位および遺伝子座調節領域を含むこともあるし、それらを除外することもある。この用語は、構造遺伝子のコード領域、およびその遺伝子の長さが完全長ｍＲＮＡに対応するような、コード領域の５’末端と３’末端の両方においていずれかの末端の約１ｋｂ以上の距離にわたってコード領域に隣接して位置する配列も包含する。用語「遺伝子」はさらに、遺伝子のｃＤＮＡの形態とゲノムの形態の両方を含む。
【００４０】
本明細書中で使用されるとき、用語「相同性」とは、第２の配列とある配列同一性の程度を共有するが、その配列が第２の配列と同一ではない、第１の配列を指す。例えば、ある変異遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、その変異遺伝子の配列と相同であるが、同一ではない。いくつかの実施形態において、２つの配列間の相同性の程度は、適切なストリンジェントな条件下においてそれらの間の相同組換えを可能にするのに十分な程度である。
【００４１】
核酸配列同一性およびアミノ酸配列同一性を測定する手法は、ある遺伝子に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれらの配列を第２のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列も、この形式で決定され、比較され得る。一般に、同一性とは、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の、それぞれ厳密なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の一致のことを指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの同一性パーセントを決定することによって比較され得る。２つの配列の同一性パーセントは、核酸配列かアミノ酸配列かを問わず、アラインメントされた２つの配列の間の厳密なマッチの数を、短い方の配列の長さで除算し、それに１００を乗算した値である。
【００４２】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度は、相同領域間で安定な二重鎖の形成を可能にする条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションの後、一本鎖特異的ヌクレアーゼで消化し、そして消化されたフラグメントのサイズ測定によって測定され得る。２つの核酸配列または２つのポリペプチド配列は、それらの配列が、上記方法を用いて決定されたそれらの分子の定義された長さにわたって、少なくとも約７０％〜７５％、好ましくは、８０％〜８２％、より好ましくは、８５％〜９０％、さらにより好ましくは、９２％、なおもより好ましくは、９５％、最も好ましくは、９８％の配列同一性を示すとき、互いに実質的に相同である。本明細書中で使用されるとき、実質的に相同とは、特定のＤＮＡ配列またはポリペプチド配列と完全な同一性を示す配列のことも指す。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、その特定の系に対して定義されるストリンジェントな条件下での、サザンハイブリダイゼーション実験において特定され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと。
【００４３】
本明細書中で使用されるとき、用語「予測」とは、ある患者がある薬物または薬物セットに対して好ましくまたは好ましくなく応答する可能性のことを指し、それらの応答の程度のことも指す。したがって、処置予測因子は、予後と無関係な、特定の処置に対する個々の患者の応答に関する変数である。
【００４４】
用語「メチル化」は、本明細書中で使用されるとき、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素の作用によってメチル基が、ある核酸の領域、例えば、ゲノムＤＮＡにおけるシトシン塩基に付加されて存在することを指す。
【００４５】
核酸分子の「メチル化状況」、「メチル化プロファイル」または「メチル化状態」という用語は、その核酸分子における１つ以上のメチル化ヌクレオチド塩基の有無のことを指す。例えば、メチル化シトシンを含む核酸分子は、メチル化されているとみなされる（すなわち、その核酸分子のメチル化状況は、メチル化されている）。いかなるメチル化ヌクレオチドも含まない核酸分子は、メチル化されていないとみなされる。
【００４６】
用語「過剰メチル化」とは、正常なコントロールＤＮＡサンプル内の対応するＣｐＧジヌクレオチドに見られる、核酸分子におけるメチル化ヌクレオチド塩基の量と比べて、ある試験ＤＮＡサンプルのＤＮＡ配列内の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドにおける核酸分子にメチル化ヌクレオチド塩基が多く存在することに対応する平均的なメチル化状況のことを指す。
【００４７】
用語「低メチル化」とは、正常なコントロールＤＮＡサンプル内の対応するＣｐＧジヌクレオチドに見られる、核酸分子におけるメチル化ヌクレオチド塩基の量と比べて、ある試験ＤＮＡサンプルのＤＮＡ配列内の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドにおける核酸分子にメチル化ヌクレオチド塩基が少なく存在することに対応する平均的なメチル化状況のことを指す。
【００４８】
用語「被験体」とは、ヒトのことを指す。
【００４９】
用語「感受性」とは、組織がある特定の外部刺激に対して特別な方法で反応するようにさせ、ゆえに、その個体を、ある特定の疾患に対して通常よりも感受性にさせる傾向がある、体質または身体の状態のことを指す。
【００５０】
用語「標的部位」または「標的配列」とは、結合にとって十分な条件が存在する場合に、ある結合分子が結合する核酸の一部を定義する核酸配列のことを指す。
【００５１】
用語「リスク」とは、ある特定の期間中（例えば、次の１０年以内）に、または被験体の生存期間中に、疾患に罹る確率の推定値のことを指す。
【００５２】
用語「予後」は、本明細書中で使用されるとき、一般に、臨床の状態または疾患の確度の高い経過および結果の予測のことを指す。患者の予後は、通常、ある疾患の好ましいもしくは好ましくない経過または結果を示すその疾患の因子または症状を評価することによってなされる。
【００５３】
用語「重量和スコア」とは、異なる目的物の重要性を強調するために個別に重み付けされた、すべての目的物を含むスコアによって評価される、可能性のあるあらゆる選択肢のことを指す。
【００５４】
癌は、細胞増殖と細胞死との均衡が調節不全に至る、遺伝子の１つ以上の変異または修飾に起因する細胞の異常な成長を特徴とする。癌などの多くの疾患プロセスでは、遺伝子プロモーターのＣｐＧアイランドが、異常な過剰メチル化を獲得し、その結果、細胞分裂後に娘細胞に受け継がれ得る転写サイレンシングが生じる。癌におけるＤＮＡメチル化に起因するサイレンシングは、通常、タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターに存在するＣｐＧアイランド内の複数のＣｐＧ部位において生じる。ＤＮＡメチル化の変化は、癌発生の重要な構成要素として認識されている。ＤＮＡメチル化のプロファイリングは、他の癌検出よりも高い臨床的感度およびより広いダイナミックレンジを提供する。したがって、本開示は、乳癌の早期予測のため、処置応答および予後または再発をモニタリングするための方法およびキットを提供する。
【００５５】
本開示では、生物学的サンプル中の標的ＤＮＡ配列ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１またはそれらのフラグメントのメチル化状態を計測することにより、ヒト被験体において乳癌を検出する、または乳癌の素因もしくは罹患を検出する、または乳癌の処置応答、予後もしくは再発を予測する。さらなる実施形態において、生物学的サンプル中の標的ＤＮＡ配列Ｃ１ｏｒｆ１１４、ＺＮＦ１７７および／またはＣ８ｏｒｆ４７またはそれらのフラグメントのメチル化状態を計測することにより、ヒト被験体において乳癌を検出する、または乳癌の素因もしくは罹患を検出する、または乳癌の処置応答、予後もしくは再発を予測する。さらなる実施形態では、ヒト１９番染色体における核酸配列ＲＫＬ００１のメチル化状態をさらに計測する。
【００５６】
ＧＣＭ２遺伝子は、神経細胞とグリア細胞の判定のバイナリースイッチとして作用すると考えられているグリア細胞欠損ホモログ２をコードする。ＧＣＭタンパク質および哺乳動物ＧＣＭホモログは、ＤＮＡ結合活性を有する、保存されたＮ末端ＧＣＭモチーフを含む。ＧＣＭ２配列およびその機能は、当該分野で公知であり、例えば、ウェブサイト：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＧＣＭ２に記載されている。
【００５７】
ＩＴＰＲＩＰＬ１遺伝子は、イノシトール１，４，５−三リン酸レセプター相互作用タンパク質様１からコードする。ＩＴＰＲＩＰＬ１配列およびその機能は、当該分野で公知であり、例えば、ウェブサイト：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＩＴＰＲＩＰＬ１に記載されている。
【００５８】
ＺＮＦ１７７は、ジンクフィンガータンパク質１７７をコードする。ＺＮＦ１７７配列およびその機能は、当該分野で公知であり、例えば、ウェブサイト：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＺＮＦ１７７に記載されている。
【００５９】
Ｃ８ｏｒｆ４７は、グルタミン酸リッチタンパク質５をコードする。Ｃ８ｏｒｆ４７配列およびその機能は、当該分野で公知であり、例えば、ウェブサイト：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＥＲＩＣＨ５に記載されている。
【００６０】
ＲＫＬ００１は、１９番染色体における核酸配列であり、以下の配列を有する：ＣＧＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＴＣＴＡＴＴＣＣＴＧＴＣＧＣＴＧＣＧＣＣＣＣＧＣＣＴＴＧＣＣＧＧＣＴＧＣＧＴＧＴＣＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＣＧＣＧＣＴＧＧＣＴＣＣＣＣＧＴＣＣＧＴＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＴＴＧＣＴＧＴＣＣＴＧＧＧＣＡＧＧＣＣＧＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＡＡＡＡＡＡＣＡ（配列番号１９）。
【００６１】
いくつかの実施形態において、メチル化は、シトシンメチル化部位を含む。いくつかの場合において、シトシンメチル化は、５−メチルシトシン（５−ｍＣｙｔ）および５−ヒドロキシメチルシトシンを含む。いくつかの場合において、シトシンメチル化部位は、ＣｐＧジヌクレオチドモチーフに存在する。他の場合において、シトシンメチル化部位は、ＣＨＧまたはＣＨＨモチーフに存在し、そこでは、アデニン、シトシンまたはチミンである。いくつかの場合において、１つ以上のＣｐＧジヌクレオチドモチーフまたはＣｐＧ部位は、ＣｐＧジヌクレオチドが豊富な短いＤＮＡ配列であるＣｐＧアイランドを形成する。いくつかの場合において、ＣｐＧアイランドは、通常、約０．２〜約１ｋｂ長であるが、必ずしもそうではない。いくつかの場合において、メチル化は、ＣｐＧアイランドのメチル化を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態において、メチル化状態は、メチル化特異的酵素による消化；バイサルファイトシークエンス；プロモーターメチル化、ＣｐＧアイランドメチル化、ＭＳＰ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔおよびＭｓ−ＳＮｕＰＥから選択される解析；ならびに増幅ＤＮＡの検出に頼る他の方法によって解析される。用語「ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔＴＭ」とは、蛍光に基づくリアルタイムＰＣＲ法のことを指す。ＭｅｔｈｙｌＬｉｇｈｔは、Ｅａｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：２３０２−２３０６，１９９９に説明されており、これは参照により本明細書中に援用される。
【００６３】
用語「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ」アッセイとは、増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーするまたは増幅プライマーによってカバーされるメチル化特異的ブロッキングプローブ（本明細書中ではブロッカーとも称される）によって核酸サンプルのメチル化特異的選択的増幅が可能になるアッセイのことを指す。
【００６４】
用語「Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ」とは、メチル化感受性一本鎖ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）のことを指す。ＭｓＳＮｕＰＥは、Ｇｏｎｚａｌｇｏ  ＆  Ｊｏｎｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２５２９−２５３１，１９９７に記載されており、これは参照により本明細書中に援用される。
【００６５】
用語「ＭＳＰ」とは、メチル化特異的ＰＣＲのことを指す。ＭＳＰは、Ｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：９８２１−９８２６，１９９６および米国特許第５，７８６，１４６号に記載されており、これらの各々は参照により本明細書中に援用される。
【００６６】
ＤＮＡのバイサルファイト修飾は、ＣｐＧメチル化状態を評価する方法である。５−メチルシトシンは、真核細胞のＤＮＡにおいて最も高頻度の共有結合性の塩基修飾である。しかしながら、５−メチルシトシンは、シトシンと同じ塩基対形成挙動を示すので、５−メチルシトシンの位置は、配列決定法またはハイブリダイゼーション法によって直接特定できない。さらに、５−メチルシトシンが有するエピジェネティックな情報は、例えばＰＣＲ増幅中に、完全に失われる。バイサルファイトシークエンスは、５−メチルシトシンの存在についてＤＮＡを解析するための方法であり、この方法は、バイサルファイトとシトシンとの特異的反応に基づき、それによって、その後のアルカリ加水分解時にシトシンが、その塩基対形成挙動がチミンに対応するウラシルに変換される。しかしながら、５−メチルシトシンは、上述の条件下でも修飾されないまま残る。したがって、元のＤＮＡは、当初はそのハイブリダイゼーション挙動によってシトシンと区別できなかったメチルシトシンが、分子生物学的手法、例えば、増幅およびハイブリダイゼーションまたは配列決定によって、唯一の残っているシトシンとして検出できるように変換される。
【００６７】
１つの実施形態において、メチル化状態は、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸配列決定（例えば、バイサルファイトシークエンスまたはパイロシークエンス）、バイサルファイト変換、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量に基づく分離、標的捕捉またはマイクロアレイによって検出される。１つの実施形態において、メチル化状態は、プライマーを用いて標的遺伝子のメチル化ＣｐＧを増幅することによって検出される。さらなる実施形態において、メチル化の検出は、ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ、定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ＱＭＳＰ）、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質を用いたＰＣＲ、または定量的ＰＣＲによって行われる。
【００６８】
本開示の１つの実施形態において、本明細書中に記載される遺伝子のメチル化ＣｐＧを増幅し得るプライマーが、使用され得る。それらのプライマーは、それらの遺伝子のメチル化ＣｐＧにハイブリダイズする領域に少なくとも１つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含む。詳細には、それらの遺伝子のメチル化ＣｐＧを増幅するためのプライマーは、以下の配列からなる群より選択される配列に対して約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれより高いパーセントの相同性を有する配列を含む。
【表１】
2021522814.tif 000002
【００６９】
本明細書中に記載される遺伝子のメチル化ＣｐＧとハイブリダイズすることができるプローブが使用され得る。それらの遺伝子のメチル化ＣｐＧとハイブリダイズすることができるプローブは、それらの遺伝子のメチル化ＣｐＧにハイブリダイズする領域に少なくとも１つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含む。詳細には、プローブは、以下の配列からなる群より選択される配列に対して約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれより高いパーセントの相同性を有する配列を含み得る。
【表２】
2021522814.tif 000003
【００７０】
１つの実施形態において、標的遺伝子のメチル化状態の検出は、標的遺伝子の正常状態を基準とした、それらの遺伝子における過剰メチル化の存在を含む。
【００７１】
いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、乳癌を有すると疑われる患者由来または検出されるべき被験体由来の組織、細胞、血液、尿、血清または血漿である。
【００７２】
本明細書中で使用されるとき、用語「癌を有すると疑われる患者」とは、初期診断を受けた（例えば、ＣＴスキャンが塊を示しているか、またはバイオマーカーのレベルが高い）が、癌のステージまたは癌を示すメチル化遺伝子の有無が不明である個体のことを指す。この用語はさらに、かつて癌を有した人々（例えば、寛解状態の個体）も含む。
【００７３】
いくつかの実施形態において、状態を正確に予測する検出検査は、アッセイの感度、アッセイの特異度または受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）として計測される。ＲＯＣ曲線下面積が大きいほど、例えば、検査の予測値が正確であるかまたは説得力がある。
【００７４】
１つの実施形態において、加重和スコアは、指標として核酸配列および遺伝子におけるメチル化状態を測定するために計測される。加重和モデル（ＷＳＭ）は、いくつかの決定基準に関していくつかの選択肢を評価するための最もよく知られた最も単純な多基準意思決定分析（ＭＣＤＡ）／多基準意思決定法である。本開示によると、加重和スコアの解析によって、ＧＣＭ２、ＩＴＰＲＩＰＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４およびＺＮＦ１７７の組み合わせが、コントロールと比べて約９１％より高い感度および約９６％より高い特異度を示すことが示される。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示されるバイオマーカーの１つ以上が、異なるサンプルにおいて少なくともｐ＜０．０５の統計的有意差を示す。これらのバイオマーカーを使用する検出検査は、少なくとも０．９のＡＵＣを示し得る。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるＤＮＡ配列におけるエピジェネティックバイオマーカーの過剰メチル化状態は、予後「不良」、あるいは被験体がある薬物もしくは薬物セットに対して好ましくなく応答し、癌の進行および／または１つ以上の治療薬不応性に至る可能性と相関する。いくつかの場合において、予後「不良」とは、被験体がある薬物または薬物セットに対して応答せず、癌が進行する可能性のことを指す。いくつかの場合において、予後「不良」とは、５年未満から１ヶ月未満という被験体の生存期間のことを指す。いくつかの場合において、予後「不良」とは、処置した場合の被験体の生存期間が５年未満から１ヶ月未満である被験体の生存期間のことを指す。いくつかの場合において、予後「不良」とは、さらに、被験体が１つ以上の薬物に対して不応性の癌を発症する可能性のことを指す。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書中に記載される標的ＤＮＡ配列１９のメチル化プロファイルを検出するためおよび／または特徴付けるためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、標的ＤＮＡ配列は、ＧＣＭ２およびＩＴＰＲＩＰＬ１；ＧＣＭ２、ＩＴＰＲＩＰＬ１およびＣ１ｏｒｆ１１４；ＧＣＭ２、ＩＴＰＲＩＰＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４およびＺＮＦ１７７；ＧＣＭ２、ＩＴＰＲＩＰＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４、ＺＮＦ１７７およびＲＫＬ１００１；ならびにＧＣＭ２、ＩＴＰＲＩＰＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４およびＺＮＦ１７７、ＲＫＬ１００１およびＣ８ｏｒｆ４７からなる群より選択される組み合わせを含む。
【００７８】
いくつかの場合において、上記キットは、１つ以上の標的遺伝子のメチル化状態／レベルを検出または計測する複数のプライマーまたはプローブを含む。そのようなキットは、いくつかの場合において、本明細書中に記載されるメチル化バイオマーカー配列の少なくとも１つにハイブリダイズする少なくとも１つのポリヌクレオチドおよび遺伝子メチル化を検出するための少なくとも１つの試薬を含む。メチル化を検出するための試薬としては、例えば、重硫酸ナトリウム、マーカー配列がメチル化されていない場合にマーカー配列の生成物である配列にハイブリダイズするようにデザインされたポリヌクレオチド（例えば、少なくとも１つのＣ−Ｕ変換を含む）、および／またはメチル化感受性制限酵素もしくはメチル化依存性制限酵素が挙げられる。いくつかの場合において、上記キットは、アッセイでの使用に適合されたアッセイ装置の形態として固体支持体を提供する。いくつかの場合において、上記キットはさらに、必要に応じてキット内のポリヌクレオチド、例えばプローブに連結された検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態において、上記キットはさらに、本明細書中に記載されるような加重和スコアを得るためのプロセス装置を含む。
【００７９】
必要に応じて、増幅された部分にハイブリダイズすることができる１つ以上の検出可能に標識されたポリペプチドも、上記キットに含められる。いくつかの実施形態において、上記キットは、本明細書中に記載される標的ＤＮＡ配列を増幅するのに十分なプライマーを含み、必要に応じて、増幅された各ＤＮＡ領域またはその一部にハイブリダイズすることができる検出可能に標識されたポリヌクレオチドを含む。上記キットはさらに、メチル化依存性制限酵素もしくはメチル化感受性制限酵素および／または重亜硫酸ナトリウムを含み得る。
【００８０】
いくつかの実施形態において、上記キットは、重亜硫酸ナトリウム、標的遺伝子全体を増幅するためのプライマーおよびアダプター、ならびに本明細書中に記載されるエピジェネティックバイオマーカーのＤＮＡ領域からの少なくとも１つのシトシンの変換されたメチル化配列およびまたは変換された非メチル化配列の存在を定量するためのポリヌクレオチド（例えば、検出可能に標識されたポリヌクレオチド）を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態において、上記キットは、メチル化感知制限酵素、標的遺伝子全体を増幅するためのプライマーおよびアダプター、ならびに本明細書中に記載されるエピジェネティックマーカーのＤＮＡ領域の少なくとも一部のコピー数を定量するためのポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、上記キットは、メチル化結合部分、および本明細書中に記載されるマーカーのＤＮＡ領域の少なくとも一部のコピー数を定量するための１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
【００８２】
本明細書中に記載され、特許請求される本発明は、多くの特性および実施形態を有し、それらには、この詳細な開示に示されたものまたはこの詳細な開示に記載または言及されたものが含まれるが、これらに限定されない。すべてを網羅することは意図されておらず、本明細書中に記載され、特許請求される本発明は、この詳細な開示において特定された特徴または実施形態に限定されるものではなく、例示目的でのみ含められているのであって、限定目的で含められているのではない。当業者は、多くの構成要素およびパラメータが、ある特定の程度で変更もしくは修正されることがあること、または本発明の範囲から逸脱することなく、公知の均等物の代わりに用いられることがあることを容易に認識するだろう。そのような修正および均等物は、個別に示されているかのように本明細書中に援用されることが認識されるべきである。本発明はまた、本明細書で言及されたまたは示された工程、特徴、組成物および化合物のすべてを個別にまたは集合的に含み、また、前記工程または特徴のいずれか２つ以上の任意のおよびすべての組み合わせを含む。
【００８３】
本明細書中で参照されたまたは述べられたすべての特許、刊行物、科学論文、ウェブサイトならびに他の文書および資料は、本発明が属する分野の当業者の熟練度を示すものであり、そのような参照された文書および資料の各々は、その全体が個別に参照により援用されているか、またはその全体が本明細書中に示されているのと同一程度に、参照により援用される。出願人は、そのような特許、刊行物、科学論文、ウェブサイト、電子的に入手可能な情報および他の参照された資料または文書からのあらゆる資料および情報を本明細書に物理的に組み込む権利を留保する。本明細書中の任意の出願、特許および刊行物への言及は、それらが、有効な先行技術を構成するという、または世界のどの国においても共通の一般的な知識の一部を形成するという自認もしくは任意の形態の示唆ではなく、また、そのような自認もしくは示唆として解釈されるべきでない。
【００８４】
本明細書中に記載された具体的な方法および組成物は、好ましい実施形態の代表であり、例示的なものであって、本発明の範囲に対する限定として意図されたものではない。本明細書を考慮すると、当業者には、他の目的、態様および実施形態が考えつくだろう。それらの他の目的、態様および実施形態は、請求項の範囲によって定義される本発明の趣旨の範囲内に包含される。本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、本明細書中に開示された本発明に様々な置き換えおよび修正がなされ得ることは、当業者には容易に明らかであろう。適切に本明細書中に例示的に記載された本発明は、本質的なものとして本明細書中に具体的に開示されていない任意のエレメントまたは制限がなくても実施され得る。したがって、例えば、本明細書中の各例、本発明の実施形態または実施例において、用語「〜を含む」、「〜から本質的になる」および「〜からなる」のうちのいずれかは、本明細書においてその他の２つの用語のどちらかに置き換えられてもよい。また、用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などは、限定なしに広く解釈されるべきである。適切に本明細書中に例示的に記載された方法およびプロセスは、異なる工程順序で実施されてもよく、それらは、必ずしも本明細書中または請求項に示される工程順序に限定されるものではない。また、本明細書中および添付の請求項で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数形の参照を含む。いかなる状況下においても、本特許は、本明細書中に具体的に開示される特定の例または実施形態または方法に限定されると解釈されてはならない。いかなる状況下においても、任意の審査官または特許商標庁の他の任意の役人もしくは職員による声明が、出願人による応答書において明確に、かつ条件なしまたは留保なしで明示的に採用されない限り、そのような声明によって本特許が限定されると解釈されてはならない。さらに、タイトル、見出しなどは、本文書の読者の理解度を高めるために提供されているものであって、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書中で言及される本発明の態様、実施形態または構成要素のいずれの例も、非限定的であるとみなされるべきである。
【００８５】
用いられた用語および表現は、説明の用語として使用されており、限定の用語として使用されておらず、そのような用語および表現の使用には、示され、記載された特徴またはその一部の均等物を排除する意図はなく、特許請求される本発明の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。したがって、本発明を、好ましい実施形態および自由選択の特徴によって具体的に開示してきたが、本明細書中に開示された概念の修正および変更は、当業者に頼ってよく、そのような修正および変更は、添付の請求項によって定義される本発明の範囲内にあるとみなされることが理解されるだろう。
【００８６】
本明細書中では本発明を広く一般的に説明してきた。その一般的な開示に含まれるより狭い種および亜属の分類の各々も、本発明の一部を成す。これは、削除された資料が本明細書中に具体的に記載されているかを問わず、属から任意の主題を取り除いた但し書きまたは否定的な制限を伴う本発明の一般的な説明を含む。
【００８７】
他の実施形態は、以下の請求項の範囲内である。さらに、本発明の特徴または態様が、マーカッシュ群で記載されている場合、当業者は、本発明が、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループでも記載されていることを認識するだろう。
【００８８】
さらなる詳述なしに、当業者は、前述の説明に基づいて本発明を最大限に利用できると考えられる。ゆえに以下の例は、単なる例証的なものとして解釈されるべきであり、決して本発明の範囲の限定として解釈されるべきでない。
【００８９】
例示的な実施形態を用いて本開示を説明してきたが、当業者には様々な変更および修正が浮かぶことがある。本開示は、添付の請求項の範囲内に含まれるようなそのような変更および修正を包含すると意図されている。
【実施例】
【００９０】
実施例１  乳癌組織における標的核酸および遺伝子のメチル化状態
【００９１】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ４５０Ｋアレイに基づくデータに対するβ値を、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋから生成した。正常組織のβ値が０．１５未満であり；△β値（腫瘍の値から正常組織の値を減じた値）が０．３より高いとき、標的核酸および遺伝子を選択した。ＧＣＭ２、ＩＴＰＲＩＰＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４およびＺＮＦ１７７、ＲＫＬ１００１およびＣ８ｏｒｆ４７の△β値は、０．３よりかなり高い。
【表３】
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β値（Ｔ）、腫瘍組織のメチル化レベル；
青色で標識された＞０．３のβ値（Ｔ）は、他の癌に対するバイオマーカーとして計算される。
【００９２】
図１は、腫瘍組織と隣接する正常組織との間の、標的核酸および遺伝子のメチル化状態（β値）の差異を示している（ｎ＝９７）。色が濃いほど、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ４５０Ｋアレイに基づくデータによると組織のメチル化状態がより高いことを示す。
実施例２  乳癌組織および正常組織における標的核酸と遺伝子との間のメチル化状態の差異の検出
【００９３】
乳癌患者のうち同じ患者由来の原発腫瘍と隣接する乳房組織のマッチドペアからゲノムＤＮＡを抽出した後、バイサルファイト変換を行った。乳房腫瘍組織および隣接する正常組織におけるＤＮＡメチル化解析の検出において、メチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑＭＳＰ）を使用した。ＡＣＴＢ遺伝子を参照遺伝子として使用した。ＡＣＴＢ遺伝子のメチル化レベルを基準とした標的遺伝子のメチル化レベルが、対にされた正常な乳房組織サンプルと比べて乳房腫瘍において少なくとも２倍高かったとき、標的を過剰メチル化されているとみなした。隣接する正常組織と比べたとき、乳房腫瘍においてＧＣＭ２、ＩＴＰＲＩＰＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４およびＺＮＦ１７７、ＲＫＬ１００１およびＣ８ｏｒｆ４７のすべての過剰メチル化率が、６４％より高かった。
【表４】
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実施例３  健常被験体および乳癌患者の血漿サンプル中の標的遺伝子のエピジェネティックバイオマーカーのメチル化状態の早期検出
【００９４】
循環無細胞ＤＮＡを血漿から抽出した。簡潔には、１０ｍＬの末梢血から直ちに３．５ｍＬの血漿を単離した。２４人の乳癌患者および２５人の健常被験体から得た血漿から循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を抽出した後、ｃｆＤＮＡをバイサルファイト変換によって行った。ｃｆＤＮＡメチル化解析に、プローブベースのメチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑＭＳＰ）を用いた。ＧＣＭ２、ＩＴＰＲＩＰＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４およびＺＮＦ１７７による早期予測は、９１．７％の感度および９６．０％の特異度（ＡＵＣ：０．９５４）を示した。
【表５】
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【００９５】
図２は、健常被験体および乳癌患者の血漿サンプル中の標的遺伝子のエピジェネティックバイオマーカーのメチル化状態の早期検出の差異を示している。さらに、図３に示されているような受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析は、乳癌患者および健常被験体における標的遺伝子のエピジェネティックバイオマーカーのメチル化状態の早期検出を示した。
実施例４  乳癌患者における標的遺伝子のエピジェネティックバイオマーカーのメチル化状態によってモニターされる処置応答
【００９６】
乳癌患者の血漿由来のｃｆＤＮＡを、プローブベースのメチル化特異的リアルタイムＰＣＲ（ｑＭＳＰ）によって解析した。ＣＡ−１５３およびＣＥＡ腫瘍マーカーは、現在、臨床で使用されている癌バイオマーカーであり、これらを比較マーカーとして使用した。結果は、エピジェネティックバイオマーカーのメチル化状態が、医学的な手術処置に対して感度よく応答し得ることを示した。図４に示されているように、手術前および手術後の乳癌患者における標的遺伝子のエピジェネティックバイオマーカーのメチル化状態による処置応答。
実施例５  乳癌患者における標的遺伝子のエピジェネティックバイオマーカーのメチル化状態による予後予測
【００９７】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ４５０Ｋアレイに基づくデータおよび追跡調査情報を、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋから生成した。全生存曲線を、カプラン・マイヤー法を用いて計算し、ＳＰＳＳソフトウェア（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）によってログランク検定およびウィルコクソン検定を用いて比較を行った。図５に示されているカプラン・マイヤー曲線は、ＩＴＰＲＩＰＬ１遺伝子のメチル化状態が、乳癌患者における予後不良を有したことを示している。ＧＣＭ２、ＩＴＰＲＩＰＬ１、Ｃ１ｏｒｆ１１４、ＺＮＦ１７７、Ｃ８ｏｒｆ４７および／もしくはＲＫＬ１００１ならびに／またはそれらの組み合わせのいずれかの全生存曲線も、カプラン・マイヤー法を用いて計算した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2021522814.tif 000016
【図４Ｃ】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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