(57)【要約】本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで目的の細胞の代謝特性を決定するための組成物、プロセス、及びキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体培地、栄養エネルギー源、及び５〜２００種の細菌からなる細菌集団を含むシミュレートされた腸内環境であって、前記細菌集団が、前記栄養エネルギー源から、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも３つを産生することができる、前記シミュレートされた腸内環境。
【請求項２】
前記細菌集団が、５〜５０種の細菌からなる、実施形態１に記載のシミュレートされた腸内環境。
【請求項３】
前記細菌集団が、５〜３０種の細菌からなる、実施形態２に記載のシミュレートされた腸内環境。
【請求項４】
前記細菌集団が、５〜２０種の細菌からなる、実施形態３に記載のシミュレートされた腸内環境。
【請求項５】
前記細菌集団が、アナエロスチペス属、バクテロイデス属、バクテロイデス属、ビフィドバクテリウム属、ブラウチア属、クロストリジウム属、コリンセラ属、コプロコッカス属、エスケリキア属、ユーバクテリウム属、フィルミクテス属、ラクトバチルス属、プレボテラ属、ファスコラークトバクテリウム属、ロセブリア属、ルミノコッカス属、セレノモナス属、及び／またはウェルコミクロビウム属に由来する細菌からなる、実施形態１〜４のいずれか１つに記載のシミュレートされた腸内環境。
【請求項６】
前記細菌集団が、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ  ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｎｉｃｉｐｈｉｌｌａ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃｏｌｉ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｒｈａｍｎｏｓｉｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂａｒｉａｔｒｉｃｕｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｏｂｅｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ  ｐｕｌｌｉｃａｅｃｏｒｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｄｏｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｎｏｃｕｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｔｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｍｅｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ  ｉｎｖｉｓｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｙｌｉｎｄｒｏｉｄｅｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｍｕｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｏｐｒｉ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｆａｅｃｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、及び／またはＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａからなる群のうちの、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０またはそれ以上の細菌からなる、実施形態１〜５のいずれか１つに記載のシミュレートされた腸内環境。
【請求項７】
前記細菌集団が、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、ブラウチア属種、Ｂａｒｉａｔｒｉｃｕｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｎｏｃｕｕｍ、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｕｓ、プレボテラ属種、及び／またはＲｏｓｅｂｕｒｉａ  ｆａｅｃｉｓからなる、実施形態１〜６のいずれか１つに記載のシミュレートされた腸内環境。
【請求項８】
前記細菌集団が、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも５つを産生することができる、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のシミュレートされた腸内環境。
【請求項９】
前記細菌集団が、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの全てを産生することができる、実施形態１〜８のいずれか１つに記載のシミュレートされた腸内環境。
【請求項１０】
前記シミュレートされた腸内環境が、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも３つまたは全てを含む、実施形態１〜９のいずれか１つに記載のシミュレートされた腸内環境。
【請求項１１】
前記シミュレートされた腸内環境が、約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭの濃度の酪酸を含んでもよい、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載のシミュレートされた腸内環境。
【請求項１２】
前記シミュレートされた腸内環境が、約２．０ｍＭ〜約７．０ｍＭの濃度のプロピオン酸を含んでもよい、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のシミュレートされた腸内環境。
【請求項１３】
前記シミュレートされた腸内環境が、約０．２ｍＭ〜約２．０ｍＭの濃度の酢酸を含んでもよい、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のシミュレートされた腸内環境。
【請求項１４】
前記シミュレートされた腸内環境が、約０．２ｍＭ〜約２．０ｍＭの濃度の乳酸を含んでもよい、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載のシミュレートされた腸内環境。
【請求項１５】
前記シミュレートされた腸内環境が、約０．０１ｍＭ〜約０．５ｍＭの濃度のギ酸を含んでもよい、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載のシミュレートされた腸内環境。
【請求項１６】
前記シミュレートされた腸内環境が、酪酸、プロピオン酸、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも４つを含み、プロピオン酸もしくは酪酸が最高濃度で存在し、及び／または酢酸、ギ酸もしくは乳酸が最低濃度で存在する、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載のシミュレートされた腸内環境。
【請求項１７】
前記細菌集団が、以下に定義されるａ．〜ｅ．のうちの少なくとも３つを含む、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載のシミュレートされた腸内環境：
ａ．  ブチリシコッカス属、ユーバクテリウム属、アナエロスチペス属、コプロコッカス属、ブチリビブリオ属、ローズブリア属、フェカリバクテリウム属、バリアトリカス属、メガスファエラ属、及び／またはクロストリジウム属のうちの１つまたは複数からの酪酸産生細菌、
ｂ．  フィルミクテス属、ウェルコミクロビウム属、バクテロイデス門、バクテロイデス属、ブラウチア属、プレボテラ属、及び／またはユーバクテリウム属のうちの１つまたは複数からのプロピオン酸産生細菌、
ｃ．  バクテロイデス属、ビフィドバクテリウム属、プレボテラ属、ブラウチア属、セレノモナス属、及び／またはクロストリジウム属のうちの１つまたは複数からの酢酸産生細菌、
ｄ．  ビフィドバクテリウム属、バクテロイデス属、アナエロスチペス属、コプロコッカス属、クロストリジウム属、コリンセラ属、ローズブリア属、及び／またはラクトバチルス属のうちの１つまたは複数からの乳酸産生細菌、
ｅ．  エシェリスキア属、ルミノコッカス属、及び／またはビフィドバクテリウム属からのギ酸産生細菌。
【請求項１８】
ａ．  前記ブチレート産生細菌が、以下の種のいずれかから選択することができ：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｎｏｃｕｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｆａｅｃｉｓ、及び／またはＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ；
ｂ．  前記プロピオン酸産生細菌が、以下の種のいずれかから選択することができ：Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｏｂｅｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ、及び／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ；
ｃ．  前記酢酸産生細菌が、以下の種のいずれかから選択することができ：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、及び／またはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｏｐｒｉ；
ｄ．  前記乳酸生産菌が、以下の種のいずれかから選択することができ：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ及び／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｕｓ；及び／または
ｅ．  前記ギ酸産生細菌が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉであり得る、実施形態１７に記載のシミュレートされた腸内環境。
【請求項１９】
前記細菌集団が、硫酸還元細菌、ムチン分解細菌、硫酸放出細菌、及び／またはメタン産生細菌を含む、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載のシミュレートされた腸内環境。
【請求項２０】
ａ．  前記硫酸還元細菌が、デスルホビブリオ属からのものであり好ましくは前記細菌が、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ種からのものであり；
ｂ．  前記ムチン分解細菌が、アッケルマンシア属からのものであり、好ましくは前記細菌がＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌｉａ種からのものであり；
ｃ．  前記硫酸還元細菌が、アッケルマンシア属からのものであり好ましくは前記細菌が、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌｉａ種からのものであり；
ｄ．  前記メタン産生細菌が、メタノブレビバクター属からのものであり、好ましくは前記細菌が、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉ種からのものである、実施形態１９に記載のシミュレートされた腸内環境。
【請求項２１】
前記細菌集団に存在する細菌の少なくとも９９％が１人または複数の健康なドナーのヒトの腸から単離された共生生物である、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載のシミュレートされた腸内環境。
【請求項２２】
前記細菌集団に存在する細菌の少なくとも９９％が１人または複数の不健康なドナーのヒトの腸から単離された共生生物である、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載のシミュレートされた腸内環境。
【請求項２３】
前記細菌集団におけるバクテロイデス属：フィルミクテス属の比率が３０：６５、３０：７０、３５：６５、または３５：７０である、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載のシミュレートされた腸内環境。
【請求項２４】
前記栄養エネルギー源が単糖類を含む、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載のシミュレートされた腸内環境。
【請求項２５】
安定化されたシミュレートされた腸内環境を作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセスであって、液体培地に５〜２００の種または菌株からなる細菌集団を接種することを含み、前記細菌集団が、前記栄養エネルギー源から、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも３つを産生することができる、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセス。
【請求項２６】
前記細菌集団が、５〜２０の種または菌株からなる、実施形態２５に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセス。
【請求項２７】
前記細菌集団が、実施形態２〜９及び１７〜２３で定義される細菌からなる、実施形態２５または２６に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセス。
【請求項２８】
前記細菌集団が、実施形態８〜１６で定義されるような代謝産物を産生することができる、実施形態２５〜２７のいずれか１つに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセス。
【請求項２９】
前記シミュレートされた腸内環境に前記細菌を逐次的に接種する、実施形態２５〜２８のいずれか１つに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセス。
【請求項３０】
前記細菌種がそれらの増殖特性に基づいて逐次的に添加され、より遅い増殖特性を示す前記細菌種がより速い増殖特性を有する前記細菌種の前に優先的に添加される、実施形態２９に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセス。
【請求項３１】
前記シミュレートされた腸内環境に、少なくとも２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、または１５以上の細菌群を接種する、実施形態２５〜３０のいずれか１つに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセス。
【請求項３２】
前記液体培地がＹＣＦＡである、実施形態２５〜３１のいずれか１つに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセス。
【請求項３３】
目的の細胞の代謝活性を評価するｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセスであって、
ａ．  液体培地、栄養エネルギー源、及び５〜２００種の細菌からなる細菌集団を含む、安定化されたシミュレートされた腸内環境を提供するステップであって、前記細菌集団が、前記栄養エネルギー源から、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも３つを産生することができる、ステップと、
ｂ．  前記目的の細胞を前記シミュレートされた腸内環境に添加するステップと、
ｃ．  前記目的の細胞の添加後に前記シミュレートされた腸内環境の組成を評価するステップと、を含む、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセス。
【請求項３４】
目的の細胞の代謝活性を評価するｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセスであって、
ａ．  液体培地、栄養エネルギー源、及び５〜２００種の細菌からなる細菌集団、及び目的の細胞を含むシミュレートされた腸内環境を提供するステップであって、前記細菌集団が、前記栄養エネルギー源から、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも３つを産生することができる、ステップと、
ｂ．  前記目的の細胞の添加後に前記シミュレートされた腸内環境の組成を評価するステップと、を含む、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセス。
【請求項３５】
前記腸内環境の安定化が達成されるまで、前記シミュレートされた腸内環境を安定化条件下で維持するステップをさらに含む、実施形態３３または３４のいずれか１つに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセス。
【請求項３６】
前記シミュレートされた腸内環境の前記安定化の達成に続いてシミュレートされた腸内環境の試料を抽出することと、その試料の組成の評価を実行することとをさらに含む、実施形態３３〜３５のいずれか１つに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセス。
【請求項３７】
前記安定化が１週間以内に達成される、実施形態３３〜３６のいずれか１つに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセス。
【請求項３８】
前記細菌集団が、実施形態２〜９及び１８〜２３のいずれか１つで定義された細菌からなる、実施形態３３〜３７のいずれか１つに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセス。
【請求項３９】
前記安定化条件が、以下に定義されるａ．〜ｃ．のうちの少なくとも１つ、２つ、または３つを含む、実施形態３３〜３８のいずれか１つに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセス：
ａ．  前記シミュレートされた腸内環境の温度が、約２０℃〜約５０℃の温度に維持される、
ｂ．  前記シミュレートされた腸内環境のｐＨが、５以上のｐＨ〜約７．０以下のｐＨに維持される、
ｃ．  前記シミュレートされた腸内環境が、約１００ｐｐｍ未満の酸素を含む雰囲気で維持される。
【請求項４０】
前記安定化の達成に続いて、前記シミュレートされた腸内環境が、約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭの濃度の酪酸を含んでもよい、実施形態３３〜３９のいずれか１つに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセス。
【請求項４１】
前記安定化の達成に続いて、前記シミュレートされた腸内環境が、約２．０ｍＭ〜約７．０ｍＭの濃度でプロピオン酸を含んでもよい、実施形態３３〜４０のいずれか１つに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセス。
【請求項４２】
前記安定化の達成に続いて、前記シミュレートされた腸内環境が、約０．２ｍＭ〜約２．０ｍＭの濃度の酢酸を含んでもよい、実施形態３３〜４１のいずれか１つに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセス。
【請求項４３】
前記安定化の達成に続いて、前記シミュレートされた腸内環境が、約０．２ｍＭ〜約２．０ｍＭの濃度の乳酸を含んでもよい、実施形態３３〜４２のいずれか１つに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセス。
【請求項４４】
前記安定化の達成に続いて、前記シミュレートされた腸内環境が、約０．０１ｍＭから約０．５ｍＭの濃度でギ酸を含んでもよい、実施形態３３〜４３のいずれか１つに記載ｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセス。
【請求項４５】
前記安定化が３日以内に達成される、実施形態３３〜４４のいずれか１つに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセス。
【請求項４６】
前記目的の細胞の添加後の前記シミュレートされた腸内環境の評価が、メタボロミクス分析、前記目的の細胞の定量化、及び／または前記細菌集団に対する変化の評価のうちの１つまたは複数を含む、実施形態３３〜４５のいずれか１つに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセス。
【請求項４７】
前記シミュレートされた腸内環境に対応する第２のシミュレートされた腸内環境が提供され、前記シミュレートされた腸内環境の安定化を達成するために使用される条件に対応する安定化条件下で維持して、前記第２のシミュレートされた腸内環境の安定化が達成される対照研究をさらに含み、前記第２のシミュレートされた腸内環境の組成が前記シミュレートされた腸内環境と同じ方法で評価され、前記目的の細胞が前記第２のシミュレートされた腸内環境に添加されず、シミュレートされた腸内環境の評価の結果が、前記第２のシミュレートされた腸内環境の評価の結果と比較される、実施形態３３〜４６のいずれか１つに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセス。
【請求項４８】
５〜２００の種または菌株の細菌からなる細菌集団を含むキットであって、前記細菌集団が、栄養エネルギー源から、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも３つを産生することができる、前記キット。
【請求項４９】
実施形態１〜２４のいずれか１つに記載のシミュレートされた腸内環境を調製するための、または実施形態２５〜４７のいずれか１つに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセスを操作するための使用説明書をさらに含む、実施形態４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記細菌集団が凍結乾燥組成物の形態で提供される、実施形態４８〜４９のいずれか１つに記載のキット。
【請求項５１】
前記キットが栄養エネルギー源を含む、実施形態４８〜５０のいずれか１つに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的の細胞の代謝特性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定することを可能にするシミュレートされた腸内環境を提供する。本発明はまた、そのような環境及びシステムを使用するシステム及びそのような環境及びシステムが利用されるプロセスに関する。
【０００２】
ヒトの腸は、子宮内では無菌であると考えられているが、出生直後に母体及び環境の様々な微生物に曝露される。その後、微生物の定着（colonization）及び遷移の動的な期間が生じる。これは、送達形態、環境、食事、及び宿主の遺伝子型等の因子に影響され、これらの因子の全てが、特に幼年期に腸内細菌叢の組成に影響を及ぼす。その後、細菌叢は安定化し、成人のようになる。ヒトの腸内細菌叢は、細菌の２つの主要な門であるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ及びＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓに本質的に属する５００〜１０００種を超える様々な系統型を含む。
【０００３】
ヒトの腸における細菌の定着から生じる共生関係の成功は、多種多様な代謝機能、構造的機能、保護機能、及び他の有益な機能をもたらしている。細菌が定着した腸の代謝活性の増強により、そうでなければ難消化性の食物成分が、宿主に重要な栄養源を提供する副産物の放出によって確実に分解されるようになる。同様に、腸内細菌叢の免疫学的重要性はよく認識されている。
【０００４】
健康の維持におけるこれらの共生関係の重要性を考えると、特定の細胞（例えば、細菌または真菌の細胞）が健康に有益であるか病原性であると考えられるかどうかにかかわらず、マイクロバイオームの活動に対する影響を特定することに大きな関心がある。単純なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで観察された目的の細胞の特性が、はるかに複雑な腸内環境でも付与されることを確認することも重要である。
【０００５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、目的の細胞の影響を調査するために使用できる。動物モデルは、特定の細胞の影響を評価できるようにする便利な方法である。このような研究で使用される動物は、健康であるか、特定の疾患の症状を示すように操作またはチャレンジされ、目的の細胞によって与えられる行動または疾患の変化を観察することができる。さらに、目的の細胞の効果は、他の手段、例えば糞便分析（調査中の細胞の投与がマイクロバイオームの組成に何らかの変化または混乱を引き起こしたかどうかを確認するため）及び／またはメタボロミクス分析（細胞の投与により、消化管または遠位組織のいずれかで代謝産物のプロファイルに変化が生じたかどうかを確認するため）によって判定することもできる。
【０００６】
しかしながら、動物実験の問題点の１つは、無数の複雑な生物学的反応の影響を受ける生物で行われるため、目的の細胞の投与後に観察される生理学的変化が、その投与または他の何らかの理由により必然的に発生することを決定的に決定できるとは限らないことである。
【０００７】
そのような研究の結果と結果の信頼性に影響を与える可能性のある追加の因子には、使用される動物間の遺伝的差異と一貫性のない環境条件が含まれる。これらの差異の影響を最小限に抑えることは可能であるが（例えば、繁殖条件の制御と動物の遺伝子スクリーニングによって、及び／または動物の保管と給餌の一貫性を確保することによって）、これらのステップは、特に複数の部位で実行される場合、研究のコストと複雑さを増す。
【０００８】
動物実験のさらなる問題は、研究設計の開始から意味のあるデータの生成までに取らなければならない多くのステップがあることである。これは、これが数ヶ月ではないにしても数週間かかることを意味する。
【０００９】
動物モデルへの代替アプローチとして、シミュレートされた胃腸内環境を開発する試みがなされてきた。例えば、Ｔｈｅ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ（２０１５）の３０５〜３１７ページに記載されているヒト腸微生物生態系のシミュレーター（ＳＨＩＭＥ（登録商標））は、一連の発酵槽が、胃、小腸、結腸の様々な領域を含む、消化管の様々な領域を模倣するように操作されるヒトの腸のシミュレーターである。
【００１０】
腸を模倣するために、ＳＨＩＭＥ（登録商標）システムの開発者は、消化管の結腸領域を表す各発酵槽に、ヒト対象にできるだけ近い接種材料を含めるように努めた。ｉｎ  ｖｉｖｏの状況を最も正確に反映するために、糞便試料に由来する材料が使用される。しかしながら、「通常の」マイクロバイオームを模倣する目的は単純ではない。少数の対象にわたっても、マイクロバイオームの組成が大幅に異なるためである。単一の対象のマイクロバイオーム組成でさえ、時間の経過と共に大幅に変化する。したがって、細菌組成の複雑さ及び試料間の変化性のために、目的の薬剤の投与後に観察された変化がその投与または微生物接種材料における他の何らかの変化によって引き起こされたと確実に繰り返し結論付けることは困難である。
【００１１】
上述のＴｈｅ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  Ｈｅａｌｔｈの中の章で説明したように、ＳＨＩＭＥ（登録商標）システムで使用される接種材料が単一のドナーから得られるべきか、ドナーのプールから得られるべきかについて議論があり、いずれのアプローチにも利点と欠点がある。
【００１２】
また、その章では、ＳＨＩＭＥ（登録商標）システムにおいて短鎖脂肪酸の産生に関して安定した機能を得るには、２０日ではないにしても少なくとも１５日の適応期間が必要であると報告されている。代謝産物産生の安定性が達成されて初めて、試験物質を接種材料に導入することができる。
【００１３】
ＶｅｎｅｍａによってＴＩＭ−２と呼ばれる腸内細菌叢の別のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル（２０１５，  Ｔｈｅ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ、２９３〜３０４ページ）は、セットアップ時間が短いが、同様にボランティアからの糞便接種物を使用し、そのような試料の調達、ドナー間の変動性、及びそのような接種物内の病原体による安全性の懸念のために問題がある。
【００１４】
ヒトの細菌叢には、少なくとも１０００種類の細菌が含まれていることが知られている（Ｌｏｚｕｐｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  Ｎａｔｕｒｅ  ４８９（７４１５）２２０−２３０）。マイクロバイオームは個人間で大きく異なり、年齢、食事、疾患、環境によって変化し得る。ある対象から経時的に得られた試料は、別の対象から得られた試料よりも類似しており、これは、各人が比較的異なるマイクロバイオームを持っていることを示唆している。ＴＩＭ−２及びＳＨＩＭＥシステムには、ヒトの糞便試料が接種（inoculate）されている。したがって、これらのシステムに接種するために使用される細菌集団は非常に多様な集団であり、これは、例えば、システム間の代謝産物産生に大きな違いをもたらす可能性がある。
【００１５】
したがって、当該技術分野では、上述で概説した従来技術の１つまたは複数の欠点に対処する、より制御されたシミュレートされた胃腸内環境が必要である。
【００１６】
したがって、本発明の第１の態様によれば、液体培地、栄養エネルギー源、及び本質的に５〜２００種の細菌からなる細菌集団を含むシミュレートされた腸内環境が提供され、前記細菌集団は、前記栄養エネルギー源から、酪酸（butyrate）、プロピオン酸（propionate）、コハク酸（succinate）、エタノール、酢酸（acetate）、乳酸（lactate）、及びギ酸（formate）のうちの少なくとも３つを産生することができる。
【００１７】
有利なことに、シミュレートされた腸内環境は、細胞の代謝相互作用を、従来技術のシステムよりも単純で、より制御され、より再現性のある方法で判定することを可能にする。予期せぬことに、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの代謝活性の正確な予測が、そのような評価を行うために必要であると従来考えられていたよりもはるかに少ない種の生物を含むシミュレートされた腸内環境で行うことができることを見出した。当業者は、２００以下の異なる種を含む細菌集団は、何千もの異なる種の細菌を含む糞便試料に由来する材料よりも著しく複雑でなく、より制御されていることを認識するであろう。
【００１８】
実際、以下の実施例に示されるように、本発明者らは、本質的に２００未満の細菌種からなる細菌集団を含むシミュレートされた腸内環境を使用して、目的の細胞の代謝活性に対する貴重な洞察を提供できることを実証した。特に、本質的に２００未満の細菌種からなる細菌集団は、目的の細胞の代謝活性に対する貴重な洞察を提供するのに役立ち得る。本発明の好ましい実施形態では、細菌集団は、本質的に、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上、１５種以上、または１６種以上の細菌からなる。追加的または代替的に、細菌集団は、本質的に、１５０種以下、１２０種以下、１００種以下、９０種以下、８０種以下、７０種以下、６０種以下、５０種以下、４０種以下、３０種以下、２５種以下、または２０種以下の細菌からなる。好ましい実施形態では、細菌集団は、本質的に５〜５０種の細菌からなる。より好ましい実施形態では、細菌集団は、本質的に１０〜３０種の細菌からなる。さらに好ましい実施形態では、細菌集団は、本質的に１０〜２０種の細菌からなる。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態では、細菌集団は、２００種を超える細菌を含まない。好ましい実施形態では、シミュレートされた腸内環境は、ＳＨＩＭＥまたはＴＩＭ−２システムではない。好ましい実施形態では、細菌集団は、ヒトの糞便試料等の糞便試料を接種されない。
【００２０】
シミュレートされた腸内環境は、一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートされた腸内環境であることが理解される。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態では、細菌集団は、本質的に５〜２００の異なる菌株からなる。いくつかの実施形態では、細菌集団は、本質的に、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、または１６以上の菌株からなる。追加的または代替的に、細菌集団は、本質的に、１５０以下、１２０以下、１００以下、９０以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３０以下、または２５以下の菌株からなる。好ましい実施形態では、細菌集団は、本質的に５〜５０の菌株からなる。より好ましい実施形態では、細菌集団は、本質的に１０〜３０の菌株からなる。さらに好ましい実施形態では、細菌集団は、本質的に１０〜２０の菌株からなる。細菌集団は、本質的に５〜５０の菌株からなり得る。より好ましい実施形態では、細菌集団は、本質的に１０〜３０の菌株からなる。さらに好ましい実施形態では、細菌集団は、本質的に１０〜２０の菌株からなる。
【００２２】
細菌集団は：バクテロイデス科、プレボテラ科、リケネラ科、ルミノコッカス科、ベイヨネラ科、及び／またはウェルコミクロビウム科からなる群から選択される科からの１つまたは複数の細菌種を含み得る。細菌集団は、アリスチペス属、アッケルマンシア属、アナエロスチペス属、バクテロイデス属、バクテロイデス属、バリアトリクス（Ｂａｒｉａｔｒｉｃｕｓ）属、ビフィドバクテリウム属、ブラウチア属、ブチリビブリオ属、ブチリシコッカス属、コプロコッカス属、クロストリジウム属、コリンセラ属、ジアリスタ属、デスルホビブリオ属、ドレア属、エスケリキア属、ユーバクテリウム属、フィルミクテス属、フィーカリバクテリウム属、ラクトバチルス属、メガスフェラ属、メタノブレビバクター属、ファスコラークトバクテリウム属、プレボテラ属、ルミノコッカス属、ロセブリア属、セレノモナス属、及び／またはウェルコミクロビウム属からの種を含み得る。
【００２３】
本発明の細菌集団は、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ  ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｎｉｃｉｐｈｉｌｌａ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃｏｌｉ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｒｈａｍｎｏｓｉｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔｒａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂａｒｉａｔｒｉｃｕｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｏｂｅｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ  ｐｕｌｌｉｃａｅｃｏｒｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｄｏｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｎｏｃｕｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ  Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｔｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｍｅｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ  ｉｎｖｉｓｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｙｌｉｎｄｒｏｉｄｅｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｍｕｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｏｐｒｉ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｆａｅｃｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、及び／またはＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａからなる群から選択される１つまたは複数の細菌種を含み得る。
【００２４】
より好ましい実施形態では、細菌集団は、以下の種からなる：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、ブラウチア属種、Ｂａｒｉａｔｒｉｃｕｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｎｏｃｕｕｍ、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｕｓ、プレボテラ属種、及びＲｏｓｅｂｕｒｉａ  ｆａｅｃｉｓ。これらの種を含む細菌集団は、短鎖脂肪酸の全ての主要な代謝経路を包含し、これは、目的の細胞の代謝活性を評価するのに重要であると本発明者らによって特定された。
【００２５】
本明細書で使用されるとき、本発明のシミュレートされた腸内環境内に含まれる細菌集団を記載するために、「本質的にからなる」及び「からなる」という用語は、シミュレートされた腸内環境を、追加の菌株または種を除外するか、またはｄｅ  ｍｉｎｉｍｉｓ、もしくは生物学的に無関係な量の他の菌株または種のみを含む。
【００２６】
腸内細菌叢の主な短鎖脂肪酸生成物には、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸菌、酪酸が含まれる（Ｄｏｕｇｌａｓ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｔｏｎ（２０１６）Ｇｕｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ，７，（３），１８９−２００）。上述のように、細菌集団は栄養エネルギー源から、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも３つを産生することができる。好ましい実施形態では、細菌集団は、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、またはそれら全てを産生することができる。酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、またはそれら全てを産生できる細菌集団は、短鎖脂肪酸の主要な代謝経路を包含する。これにより、細菌集団は、目的の細胞の代謝活性を評価する上で重要であると発明者が特定した腸内環境を正確に模倣することができる。
【００２７】
誤解を避けるために、これは必ずしも酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及び／またはギ酸が細菌集団のメンバーによって直接生産されなければならないことを意味するわけではなく、それらの化合物は間接的に産生されてもよい。例えば、第１の菌株は、栄養エネルギー源から第１の代謝産物（例えば、乳酸またはコハク酸）を産生し得、細菌集団に存在する第２の菌株は、その第１の代謝産物から短鎖脂肪酸（例えば、プロピオン酸、酪酸、酢酸、及び／またはギ酸）を産生し得る。
【００２８】
さらに、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及び／またはギ酸のそれぞれが、シミュレートされた腸内環境で最終生成物として産生され、安定化が達成された後の環境において、これらの化合物のそれぞれの測定可能なレベルがシミュレートされた腸に存在することは必須ではない。例えば、これらの化合物（例えば、コハク酸及び／または酢酸）のうちの１つまたは複数は、細菌集団の１つまたは複数の菌株によって第１の代謝産物として産生され得、次いで、細菌集団のさらなるメンバーによって短鎖脂肪酸（例えば、プロピオン酸、酪酸、酢酸、及び／またはギ酸）に変換され得る。
【００２９】
本発明の実施形態では、シミュレートされた腸内環境は、１つまたは複数の短鎖脂肪酸を含む。好ましい実施形態では、シミュレートされた腸内環境は、酪酸、プロピオン酸、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも３つ、少なくとも４つ、または５つ全てを含む。
【００３０】
これらの成分の一部または全ては、存在する場合、細菌集団によって産生されてもよい。追加的または代替的に、これらの成分の一部または全てを液体培地に直接添加することができる。
【００３１】
例えば、いくつかの実施形態では、酪酸、乳酸及び／またはギ酸は、細菌集団によって産生され得る。追加的または代替的に、プロピオン酸及び／または酢酸を液体培地に直接添加することができる。いくつかの実施形態では、酢酸とプロピオン酸（存在する場合）は、両方とも、液体培地に直接添加され得、そして細菌集団によって産生され得る。
【００３２】
好ましい実施形態では、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つが細菌集団によって産生される。本発明者らは、これが腸内環境を模倣するので、細菌集団によって産生される短鎖脂肪酸を有することが有利であることを見出した。
【００３３】
シミュレートされた腸内環境が酪酸を含む実施形態では、酪酸は、少なくとも約０．５ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２．０ｍＭ、約３．０ｍＭ、約４．０ｍＭ、または約５．０ｍＭの濃度で存在する。追加的または代替的に、酪酸は、約１０．０ｍＭ以下、約８．０ｍＭ以下、約６．０ｍＭ以下、または約５．０ｍＭ以下の濃度で存在し得る。シミュレートされた腸内環境が酪酸を含む好ましい実施形態では、酪酸は、約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭの濃度で存在する。
【００３４】
シミュレートされた腸内環境がプロピオン酸を含む実施形態では、プロピオン酸は、少なくとも約０．５ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２．０ｍＭ、約３．０ｍＭ、約４．０ｍＭまたは約５．０ｍＭの濃度で存在する。追加的または代替的に、プロピオン酸は、約１０．０ｍＭ以下、約８．０ｍＭ以下、約６．０ｍＭ以下、または約５．０ｍＭ以下の濃度で存在し得る。シミュレートされた腸内環境がプロピオン酸を含む好ましい実施形態では、プロピオン酸は、約２．０ｍＭ〜約７．０ｍＭの濃度で存在する。
【００３５】
シミュレートされた腸内環境が酢酸を含む実施形態では、酢酸は、少なくとも約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１．５ｍＭ、または約２．０ｍＭの濃度で存在する。追加的または代替的に、酢酸は、約５．０ｍＭ以下、約４．０ｍＭ以下、約３．０ｍＭ以下、または約２．０ｍＭ以下の濃度で存在し得る。シミュレートされた腸内環境が酢酸を含む好ましい実施形態では、酢酸は、約０．２〜約２．０ｍＭの濃度で存在する。
【００３６】
シミュレートされた腸内環境が乳酸を含む実施形態では、乳酸は、少なくとも約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１．５ｍＭ、または約２．０ｍＭの濃度で存在する。追加的または代替的に、乳酸は、約５．０ｍＭ以下、約４．０ｍＭ以下、約３．０ｍＭ以下、または約２．０ｍＭ以下の濃度で存在し得る。シミュレートされた腸内環境が乳酸を含む好ましい実施形態では、乳酸は、約０．２〜約２．０ｍＭの濃度で存在する。
【００３７】
シミュレートされた腸内環境がギ酸を含む実施形態では、ギ酸は、少なくとも約０．０１ｍＭ、約０．０２ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．１Ｍ、約０．２ｍＭ、または約０．５ｍＭの濃度で存在する。追加的または代替的に、ギ酸は、約２．０ｍＭ以下、約１．５ｍＭ以下、または約１．０ｍＭ以下の濃度で存在し得る。シミュレートされた腸内環境がギ酸を含む好ましい実施形態では、ギ酸は、約０．０１〜約０．５ｍＭの濃度で存在する。
【００３８】
シミュレートされた腸内環境の成分の濃度が本明細書で定量化される場合、これらは、特に明記しない限り、液体培地中の問題の成分のモル量として提供される。これらの化合物を測定するための手段は当該技術分野で周知であり、液体クロマトグラフィー、ＨＰ−ＬＣ、ＬＣ−ＭＳ、及びガスクロマトグラフィーが含まれる。実施例に示されているように、シミュレートされた腸内環境の成分の定量化は、ガスクロマトグラフィーを使用して行うことができる。
【００３９】
シミュレートされた腸内環境が、酪酸、プロピオン酸、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも３つ、少なくとも４つ、または５つ全てを含む実施形態では、プロピオン酸または酪酸が最高濃度で存在し得る。追加的または代替的に、そのような実施形態では、酢酸、ギ酸、または乳酸が最低濃度で存在し得る。
【００４０】
細菌集団の組成に関して、当業者は、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及び／またはギ酸を産生することができる細菌に精通しているであろう。そのような細菌は、細菌集団内に含まれ得る。
【００４１】
酪酸産生細菌が細菌集団に含まれる実施形態では、これらは、以下の中間代謝産物のうちの１つまたは複数を介して酪酸を産生し得る：ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、アセチルＣｏＡ、アセトアセチルＣｏＡ、ブチリルＣｏＡ、リン酸ブチリル。
【００４２】
ヒトの腸内細菌は、３つの異なる経路を介してプロピオン酸を産生することが知られている：１）コハク酸経路；２）アクリレート経路；３）プロパンジオール経路（Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＩＳＭＥ  Ｊ．  ８（６）：１３２３−１３３５）。本発明の特定の実施形態では、細菌集団に含まれる細菌は、１つ、２つ、または３つ全ての経路を介してプロピオン酸を産生することができる。プロピオン酸産生細菌が細菌集団に含まれる場合、これらは、以下の中間代謝産物のうちの１つまたは複数を介してプロピオン酸を産生し得る：ジヒドロキシアセトンリン酸、Ｌ−ラクトアルデヒド、プロパン−１，２−ジオール、プロピオニルＣｏＡ、ＰＥＰ、オキサロ酢酸、コハク酸、スクシニルＣｏＡ、プロピオニルＣｏＡ、ピルビン酸、乳酸、またはラクトイルＣｏＡ。
【００４３】
特定の実施形態では、コハク酸経路を介して産生されるプロピオン酸は、バクテロイデス属、及び／またはプレボテラ属からの細菌によって産生され得る。好ましい実施形態では、コハク酸経路を介して産生されるプロピオン酸は、以下の種のうちのいずれかによって産生され得る：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、及び／またはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｏｐｒｉ。
【００４４】
特定の実施形態では、アクリレート経路を介して産生されるプロピオン酸は、ユーバクテリウム属、アナエロスチペス属、ビフィドバクテリウム属、及び／またはラクトバチルス属からの細菌によって産生され得る。好ましい実施形態では、アクリレート経路を介して産生されるプロピオン酸は、以下の種のいずれかによって産生され得る：Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、及び／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ。
【００４５】
コハク酸産生細菌が細菌集団に含まれる実施形態では、これらは、以下の中間代謝産物のうちの１つまたは複数を介してコハク酸を産生し得る：ホスホエノールピルビン酸、オキサロ酢酸。
【００４６】
特定の実施形態では、プロピオン酸は、プロパンジオール経路は、ブラウチア属及び／またはユーバクテリウム属の細菌によって産生され得る。好ましい実施形態では、プロパンジオール経路を介して産生されるプロピオン酸は、Ｂｌａｕｔｉａ  ｏｂｅｕｍ、及び／またはＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉによって産生され得る。
【００４７】
エタノール産生細菌が細菌集団に含まれる実施形態では、これらは、以下の中間代謝産物のうちの１つまたは複数を介してエタノールを産生し得る：ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、アセチルＣｏＡ、アセトアルデヒド。好ましい実施形態では、細菌集団におけるエタノール産生細菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓである。
【００４８】
酢酸産生細菌が細菌集団に含まれる実施形態では、これらは、以下の中間代謝産物のうちの１つまたは複数を介して酢酸を産生し得る：ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、ギ酸、アセチルＣｏＡ。
【００４９】
乳酸産生細菌が細菌集団に含まれる実施形態では、これらは、以下の中間代謝産物のうちの１つまたは複数を介して乳酸を産生し得る：ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸。
【００５０】
ギ酸産生細菌が細菌集団に含まれる実施形態では、これらは、以下の中間代謝産物のうちの１つまたは複数を介してギ酸を産生し得る：ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸。
【００５１】
いくつかの実施形態では、細菌集団は、ラクノスピラ科及び／またはルミノコッカス科のうちの１つまたは複数からの酪酸産生細菌を含み得る。いくつかの実施形態では、細菌集団は、ブチリシコッカス属、ユーバクテリウム属、アナエロスチペス属、コプロコッカス属、ブチリビブリオ属、ローズブリア属、フェカリバクテリウム属、バリアトリカス属、メガスファエラ属、及び／またはクロストリジウム属のうちの１つまたは複数からの酪酸産生細菌を含み得る。好ましい実施形態では、細菌集団は、以下の種のうちの１つまたは複数の酪酸産生細菌を含み得る：Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ  ｐｕｌｌｉｃａｅｃｏｒｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｍｕｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｔｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｍｅｓ、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｙｌｉｎｄｒｏｉｄｅｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｒｈａｍｎｏｓｉｖｏｒａｎｓ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｎｏｃｕｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｆａｅｃｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｆａｅｃｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、及び／またはＢａｒｉａｔｒｉｃｕｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ。酪酸は、ヒトの腸内環境に存在する主要な短鎖脂肪酸であり、発明者らは、腸内環境を正確にシミュレートするために、酪酸産生種の存在が重要であることを発見した。これらの好ましい細菌種は酪酸を産生することが知られており、したがって腸内環境のシミュレーションに有用である。
【００５２】
より好ましい実施形態では、細菌集団は、以下の種のうちの１つまたは複数からの酪酸産生細菌を含み得る：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｎｏｃｕｕｍ、Ｂａｒｉａｔｒｉｃｕｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｆａｅｃｉｓ、及び／またはＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ。実施例に示されるように  Ｂａｒｉａｔｒｉｃｕｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｎｏｃｕｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｆａｅｃｉｓ、及びＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅを含む細菌集団は、本発明のシミュレートされた腸内環境において酪酸を産生することができる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、細菌集団は、バクテロイデス科、プレボテラ科、リケネラ科、ルミノコッカス科、ベイヨネラ科、及び／またはウェルコミクロビウム科のうちの一つまたは複数からのプロピオン酸産生細菌を含み得る。
【００５４】
いくつかの実施形態では、細菌集団は、フィルミクテス属、ウェルコミクロビウム属、バクテロイデス門、バクテロイデス属、ブラウチア属、プレボテラ属、及び／またはユーバクテリウム属のうちの１つまたは複数からのプロピオン酸産生細菌を含み得る。
【００５５】
いくつかの実施形態では、細菌集団は、以下の種のうちの１つまたは複数からのプロピオン酸産生細菌を含み得る：Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｎｉｃｉｐｈｉｌｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｏｐｒｉ、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ  ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｏｂｅｕｍ、ブラウチア属種、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｔｕｓ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ  ｉｎｖｉｓｕｓ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、及び／またはＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ。
【００５６】
より好ましい実施形態では、細菌集団は、以下の種のうちの１つまたは複数からのプロピオン酸産生細菌を含み得る：Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、ブラウチア種、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｏｐｒｉ、プレボテラ属種、及び／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ。
【００５７】
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｏｐｒｉ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｏｂｅｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ、及び／またはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓは、本発明のシミュレートされた腸内環境で使用できる生物の例である。
【００５８】
いくつかの実施形態では、細菌集団は、バクテロイデス門からの酢酸産生細菌を含み得る。特定の実施形態では、細菌集団は、以下の属のうちの１つまたは複数からの酢酸産生細菌を含み得る：バクテロイデス属、ビフィドバクテリウム属、プレボテラ属、ブラウチア属、セレノモナス属、及び／またはクロストリジウム属。特定の実施形態では、細菌集団は、以下の種のうちの１つまたは複数からの酢酸産生細菌を含み得る：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｏｐｒｉ、プレボテラ属種、Ｂｌａｕｔｉａ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、及び／またはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ。
【００５９】
より好ましい実施形態では、細菌集団は、以下の種のうちの１つまたは複数からの酢酸産生細菌を含み得る：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｏｐｒｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、及び／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ。
【００６０】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、及びＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｏｐｒｉは、本発明のシミュレートされた腸内環境で使用することができる生物の例である。
【００６１】
追加的または代替的に、細菌集団は、以下のうちの１つまたは複数からの乳酸産生細菌を含み得る：ビフィドバクテリウム属、バクテロイデス属、アナエロスチペス属、コプロコッカス属、クロストリジウム属、コリンセラ属、セレノモナス属、ローズブリア属、及び／またはラクトバチルス属。
【００６２】
いくつかの実施形態では、細菌集団は、以下の種のうちの１つまたは複数からの乳酸産生細菌を含み得る：Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃｏｌｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｔｕｓ、Ｂａｒｉａｔｒｉｃｕｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、及び／またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｄｏｌｉｓ。
【００６３】
より好ましい実施形態では、細菌集団は、以下の種のうちの１つまたは複数からの乳酸産生細菌を含み得る：Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｕｓ、及び／またはＢａｒｉａｔｒｉｃｕｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ。
【００６４】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、及び／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｕｓは、本発明のシミュレートされた腸内環境で使用され得る生物の例である。
【００６５】
実施形態では、細菌集団は、エシェリスキア属、ルミノコッカス属、及び／またはビフィドバクテリウム属からのギ酸産生細菌を含み得る。
【００６６】
いくつかの実施形態では、細菌集団は、以下の種のうちの１つまたは複数からのギ酸産生細菌を含み得る：Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、及び／またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍは、本発明のシミュレートされた腸内環境で使用され得る生物の例である。
【００６７】
短鎖脂肪酸産生細菌に加えて、追加の機能を有する生物が細菌集団内に含まれ得る。したがって、本発明の実施形態では、細菌集団は以下を含み得る：
ｉ）アッケルマンシア属からの硫酸放出細菌等の硫酸放出細菌。Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌｉａは、本発明のシミュレートされた腸内環境で使用され得る生物の例である。
ｉｉ）アッケルマンシア属からのムチン分解細菌等のムチン分解細菌。Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌｉａは、本発明のシミュレートされた腸内環境で使用され得る生物の例である。
ｉｉｉ）デスルホビブリオ属からの硫酸還元細菌等の硫酸還元細菌。Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒは、本発明のシミュレートされた腸内環境で使用され得る生物の例である。
ｉｖ）メタノブレビバクター属からのメタン産生細菌等のメタン産生細菌。Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉは、本発明のシミュレートされた腸内環境で使用され得る生物の例である。
ｖ）エシェリキア属からの細菌等のエタノール産生細菌。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉは、本発明のシミュレートされた腸内環境で使用され得る生物の例である。
【００６８】
本発明の実施形態では、本発明のシミュレートされた腸内環境に存在する細菌集団は、主にまたは排他的に、健康なドナーのヒト腸から単離された共生生物である生物を含む。そのような実施形態では、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の細菌集団に存在する細菌種は、健康なドナーのヒトの腸から単離された共生生物である。シミュレートされた腸内環境の細菌集団に対して健康なドナーのヒト腸から単離された共生生物を使用することの利点は、これらの生物がヒト腸内マイクロバイオームのより正確なモデルを提供できることである。共生細菌種を単離するための方法は、当該技術分野でよく知られている。
【００６９】
例えば炎症性腸疾患（ＩＢＤ）等の胃腸障害等の多くの疾患では、細菌叢組成の劇的な変化が記録されている（Ｆｒａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＰＮＡＳ  １０４（３４）：１３７８０−５）。本発明の他の実施形態では、細菌集団は、不健康な及び／または疾患を有するドナー（過敏性腸症候群を有するドナー等）のヒトの腸から単離された共生生物である生物を含む。不健康な及び／または疾患を有するドナーから単離された細菌集団を使用することは、シミュレートされた腸内環境が疾患状態をエミュレートすることを可能にするので、有利である可能性がある。これにより、不健康なヒトの腸内マイクロバイオームをシミュレートする、腸内環境における目的の生物のｉｎ  ｖｉｖｏ代謝活性の正確な予測が可能になる。
【００７０】
本発明の特定の実施形態では、細菌生物は、目的の単一の健康なドナーまたは目的の複数の健康なドナーのヒトの腸から単離され得る。他の実施形態では、細菌生物は、目的の単一の不健康及び／または疾患を有するドナー、または目的の複数の不健康及び／または疾患を有するドナーのヒトの腸から単離することができる。いくつかの実施形態では、細菌種は、少なくとも２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、１１または以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、または１６以上の個別の目的のドナーから単離することができる。
【００７１】
健康なドナーのヒトの腸から単離された共生生物は、細菌の個々の種として、または細菌種の組み合わせとして単離することができる。健康なドナーのヒトの腸から単離された共生生物は、細菌の個々の菌株として、または細菌の菌株の組み合わせとして単離することができる。細菌の個々の種または菌株は、それらの代謝機能または増殖プロファイルに応じて、当該技術分野で周知の方法、例えば、ＮＭＲ、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー質量分析、またはガスクロマトグラフィー質量分析を使用して単離することができる。
【００７２】
細菌の個々の種または菌株、または細菌種または菌株の組み合わせが、目的の健康または不健康なドナーのヒトの腸から単離されると、それらを使用してシミュレートされた腸内環境に接種するか、または細菌を適切な方法を使用して保存することができる−当該技術分野で知られているように、例えば、細菌のグリセロールストックを調製して−８０℃で保存するか、細菌を凍結乾燥することができる。シミュレートされた腸内環境は、健康なドナーのヒトの腸から新たに単離された細菌生物で開始できる。あるいは、シミュレートされた腸内環境は、単離後に凍結乾燥された細菌生物で開始できる。
【００７３】
シミュレートされた腸内環境には、個別の細菌種または細菌種の組み合わせを接種することができる。他の実施形態では、シミュレートされた腸内環境には、個別の菌株または菌株の組み合わせを接種することができる。菌株の組み合わせは、同じ種からの菌株を含むことができ、または異なる種からの菌株を含むことができる。当業者は、シミュレートされた腸内環境に接種するために使用される細菌の特定の種を選択することができる。これにより、シミュレートされた腸内環境をより適切に制御できる。
【００７４】
本発明のシミュレートされた腸内環境は、例えば、小腸、上行結腸、横行結腸、または下行結腸等の、ヒトの胃腸系の異なる区画をシミュレートするために使用することができる。本発明のシミュレートされた腸内環境を使用して、これらの区画のそれぞれに見られる細菌叢をシミュレートすることができる。様々な胃腸区画でヒトの腸内細菌叢をシミュレートするこの能力は、ヒトの腸の様々なコンパートメントで目的の細胞の代謝活性への貴重な洞察を提供できるため、有用である。
【００７５】
本発明の特定の実施形態では、本発明のシミュレートされた腸内環境に存在する細菌集団は、主にまたは排他的に、遺伝子改変された生物ではない生物を含む。そのような実施形態では、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の細菌集団に存在する細菌は、遺伝子改変された生物ではない。
【００７６】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のシミュレートされた腸内環境に存在する細菌集団は、主にまたは排他的に、病原性ではない生物を含む。そのような実施形態では、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の細菌集団に存在する細菌は病原性ではない。
【００７７】
本発明のシミュレートされた腸内環境の１つの利点は、それがバクテロイデス属：フィルミクテス属の比率を確実に制御することを可能にすることである。したがって、本発明の実施形態では、シミュレートされた腸内環境は、バクテロイデス属：フィルミクテス属の比率が５〜５０：５０〜９５、１０〜４５：５５〜９０、１５〜４０：６０〜８５、または２０〜３５：６５〜８０である、細菌集団を含む。好ましい実施形態では、バクテロイデス属：フィルミクテス属の比率は３０〜３５：６５〜７０であり、例えば、３０：６５、３０：７０、３５：６５、または３５：７０である。
【００７８】
いくつかの実施形態では、シミュレートされた腸内環境に存在する細菌集団は、グラム陰性菌とグラム陽性菌の両方を含む。特定の実施形態では、グラム陰性菌対グラム陽性菌の比率は、２０％：８０％、３０％：７０％、４０％：６０％、５０％：５０％、６０％：４０％、７０％：３０％、または８０％：２０％である。好ましい実施形態では、グラム陰性菌対グラム陽性菌の比率は、４０％：６０％、５０％：５０％、または６０％：４０％である。代替的な実施形態では、細菌集団はグラム陰性菌のみを含む。他の実施形態では、細菌集団はグラム陽性菌のみを含む。
【００７９】
液体培地の組成に関して、これは、液体増殖培地を調製するために従来から使用されている材料を含み得る。培地の正確な組成は重要ではない。むしろ、細菌集団の安定化を可能にする任意の培地を使用することができる。
【００８０】
使用できる液体培地の例には、ＹＦＣＡ、ポストゲート培地、調理済み肉ブロス（例、ロバートソンの調理済み肉培地）、ペプトン酵母抽出物グルコースブロス、チオグリコール酸ブロス、溶原性ブロス（ＬＢ）培地、最小塩（Ｍ９）培地、Ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス、ＳＯＢ培地、ＳＯＣ培地、２Ｘ  ＹＴ培地、ＮＺＣＹＭブロス、ＮＺＹＭブロス、ＮＺＭブロス、トリプシン大豆ブロス、及びＳＩＥＭ培地が含まれる。好ましい実施形態では、培地は、ＹＦＣＡ、ポストゲート培地、調理済み肉ブロス（例えば、ロバートソンの調理済み肉培地）、ペプトン酵母抽出物グルコースブロス、チオグリコール酸ブロス、及びＳＩＥＭ培地である。最も好ましくは、培地はＹＣＦＡである。
【００８１】
特定の実施形態では、ＹＦＣＡ培地は、１リットルあたり、カセイン加水分解物１０．０ｇ、酵母抽出物２．５ｇ、炭酸水素ナトリウム４．０ｇ、グルコース２．０ｇ、セロビオース２．０ｇ、可溶性デンプン２．０ｇ、リン酸水素二カリウム０．４５ｇ、リン酸二水素カリウム０．４５ｇ、レサズリン０．００１ｇ、Ｌ−システインＨＣｌ  １．０ｇ、硫酸アンモニウム０．９ｇ、塩化ナトリウム０．９ｇ、硫酸マグネシウム０．０９ｇ、塩化カルシウム０．０９ｇ、ヘミン０．０１ｇ、ＳＣＦＡ  ３．１ｍｌ（酢酸２．０２６ｍｌ／Ｌ、プロピオン酸０．７１５ｍｌ／Ｌ、ｎ−吉草酸０．１１９ｍｌ／Ｌ、イソ吉草酸０．１１９ｍｌ／Ｌ、イソ吉草酸０．１１９ｍｌ／Ｌ）、ビタミン混合物１：１ｍｌ（ビオチン１ｍｇ／１００ｍｌ、シアノコバラミン１ｍｇ／１００ｍｌ、ｐ−アミノ安息香酸３ｍｇ／１００ｍｌ、ピリドキシン１５ｍｇ／１００ｍｌ）、ビタミン混合物２：１ｍｌ（チアミン５ｍｇ／１００ｍｌ、リボフラビン５ｍｇ／１００ｍｌ）、ビタミン混合物３：１ｍｌ（葉酸５ｍｇ／１００ｍｌ）を含む。
【００８２】
追加の成分を液体培地に含んでもよい。これらの目的は、胃腸の状態を模倣することであり得る。いくつかの実施形態では、ムチンは、例えば、液体培地の、約０．００１重量％、約０．００２重量％、または約０．００５重量％〜約０．０５重量％、約０．１重量％、約０．２重量％、約０．５重量％、または約１重量％のレベルで含まれ得る。
【００８３】
細菌集団の生存及び操作のための最適な条件を維持するために、本発明のシミュレートされた腸内環境は、好ましくは、４以上、４．５以上、５以上、５．５以上、または６以上のｐＨを有する。追加的または代替的に、本発明のシミュレートされた腸内環境は、好ましくは、８以下、７．５以下、７．０以下、または６．５以下のｐＨを有する。
【００８４】
追加的または代替的に、本発明のシミュレートされた腸内環境は、好ましくは、嫌気性条件下で、例えば、約５００ｐｐｍ未満、約２００ｐｐｍ未満、１００ｐｐｍ未満、５０ｐｐｍ未満、または約２０ｐｐｍ未満の酸素を含む雰囲気中で保存される。
【００８５】
本発明のシミュレートされた腸内環境内に含まれる栄養エネルギー源は、細菌集団によって（直接的または間接的に）代謝されて、酪酸、プロピオン酸、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも３つを産生することができる任意の化合物を含み得る。
【００８６】
例えば、栄養エネルギー源は、単糖類、二糖類及び／またはオリゴ糖を含む糖を含み得る。本発明の栄養エネルギー源に含まれ得るそのような糖類の好ましい例には、フコース、ラムノース、ヘキソース、ペントースが含まれる。本発明で使用することができるペントース糖類の具体例は、アラビノース、リキソース、リボース、キシロース、リブロース、キシルロース、及びデオキシリボースである。本発明で使用することができるヘキソース糖類の具体例は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、及びタガトースである。本発明の実施形態では、栄養エネルギー源は、液体培地の約２重量％未満、約１重量％未満、約０．５重量％未満、約０．２重量％未満、または０．１重量％未満の量で存在し得る。追加的または代替的に、栄養エネルギー源は、液体培地の約０．００１重量％、約０．００２重量％、約０．００５重量％、約０．０１重量％、０．０２重量％、または０．０５重量％を超える量で存在し得る。
【００８７】
上述したように、本発明のシミュレートされた腸内環境は、有利には、目的の細胞の代謝活性を制御された直接的な方法で評価することを可能にする。
【００８８】
実施例は、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓが本発明のシミュレートされた腸内環境に添加された場合、この株の代謝産物及び特定のＨＤＡＣ阻害効果が細菌コア群集に移されたことを実証している。これは、目的の細胞の代謝活性が、本発明のシミュレートされた腸内環境に首尾よく伝達され得、それにより、目的の細胞の代謝特性が制御された環境で分析されることを可能にすることを実証する。
【００８９】
本発明の別の態様によれば、本発明に従って、上述のように、安定化されたシミュレートされた腸内環境を作製するためのプロセスが提供される。前記プロセスは、液体培地に本質的に５〜２００の種または菌株からなる細菌集団を接種することを含み、前記細菌集団が、前記栄養エネルギー源から、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも３つを産生することができる。好ましい実施形態では、安定化されたシミュレートされた腸内環境を作製するためのプロセスは、本質的に５〜２０種の細菌からなる細菌集団を液体培地に接種することを含む。好ましい実施形態では、菌株は、以下の種から選択される：Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ  ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｎｉｃｉｐｈｉｌｌａ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃｏｌｉ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｒｈａｍｎｏｓｉｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、  Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂａｒｉａｔｒｉｃｕｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｏｂｅｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ  ｐｕｌｌｉｃａｅｃｏｒｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｄｏｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｎｏｃｕｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｔｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｍｅｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ  ｉｎｖｉｓｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｙｌｉｎｄｒｏｉｄｅｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｍｕｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｏｐｒｉ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｆａｅｃｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、及び／またはＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ。
【００９０】
このプロセスは一般にｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセスであると理解されている。
【００９１】
実施例に示されるように、本発明者らは、細菌種がシミュレートされた腸内環境に添加される順序が重要であり得ることを示した。細菌種が接種される順序は、細菌種の感度と増殖プロファイルに基づいて選択される。例えば、どのような状態でも非常によく、非常に速く増殖する細菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ等）を後で接種して、より感受性である、または厳密に嫌気性の細菌（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｆａｅｃｉｓ、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ、及び／またはＢａｒｉａｔｒｉｃｕｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ等）は、より競争力のある細菌種が添加される前に、シミュレートされた腸内環境で確立される。このプロセスは、シミュレートされた腸内環境が単一または少数の細菌種によって支配されるのを防ぎ、本発明の単純化された腸内環境が広範囲の細菌種を含むヒトマイクロバイオームをより正確にシミュレートすることを可能にするので有利である。
【００９２】
細菌種の具体的な増殖速度を計算することは、当該技術分野でよく知られている。例えば、分光光度計を使用して、細菌懸濁液の濁度または光学密度を測定することができ、濁度の増加は、細菌バイオマスの増加を示す。
【００９３】
したがって、特定の実施形態では、シミュレートされた腸内環境に、上述の本発明の細菌種を逐次的に接種する。特に、本発明のシミュレートされた腸内環境を調製するためのプロセスは、５〜２００種の細菌を接種するステップを含み得、細菌種がそれらの増殖特性に基づいて逐次的に添加され、より遅い増殖特性を示す細菌種がより速い増殖特性を有する細菌種の前に優先的に添加される。当業者は、個々の種の増殖特性が、安定化されたシミュレートされた腸内環境で見られる増殖条件下で評価されることを理解するであろう。これは、対照実験で安定化されたシミュレートされた腸内環境での様々な細菌の増殖特性を評価することによって簡単に決定できる。この文脈における「優先的に」はまた、細菌がそれらの増殖特性の順に厳密に添加されなければならないことを意味するものではない。むしろ、それは、より遅い増殖特性を有する細菌の大部分（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）が、より速い成長特性を有する細菌の前に添加されることを意味する。
【００９４】
特定の実施形態では、シミュレートされた腸内環境は、細菌の個々の種で接種される。他の実施形態では、シミュレートされた腸内環境に、少なくとも２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上または１５以上の細菌群が接種される。特定の実施形態では、細菌群は同様の増殖プロファイルを有し、例えば、群内の細菌の種は全て厳密に嫌気性である。好ましい実施形態では、シミュレートされた腸内環境に、少なくとも７つ以上の群の細菌が接種される。
【００９５】
したがって、本発明のさらなる態様によれば、以下のステップを含む、目的の細胞の代謝活性を評価するためのプロセスが提供される：
本明細書に記載の液体培地、本明細書に記載の細菌集団、及び本明細書に記載の栄養エネルギー源を含む安定化されたシミュレートされた腸内環境を提供するステップ、
目的の細胞をシミュレートされた腸内環境に添加するステップ、
目的の細胞の添加後にシミュレートされた腸内環境の組成を評価するステップ。
【００９６】
特定の実施形態では、プロセスは、腸内環境の安定化が達成されるまで、シミュレートされた腸内環境を安定化条件下で維持するステップをさらに含むことができる。
【００９７】
本発明の他の態様では、腸内環境の安定化が達成される前に、目的の細胞の生物をシミュレートされた腸内環境に加えることができる。上で論じたように、細菌集団中の細菌種は、複数の群に逐次的に添加することができる。目的の細胞は、これら群のいずれかに追加できる。好ましい実施形態では、実施例に示されるように、目的の細胞は、シミュレートされた腸内環境への最後の群として添加される。細菌種が厳密に嫌気性であるか、あまりよく増殖しない場合、目的の細胞を、シミュレートされた腸内環境により早く、例えば群２、３、または４で添加することが有利であり得る。
【００９８】
シミュレートされた腸内環境の組成を評価して、目的の細胞の追加後に発生する変化を観察することができる。これらの変化には、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及びギ酸等、シミュレートされた腸内環境によって産生される代謝産物のレベルの増加または減少が含まれ得る。代謝産物を測定するための方法は当該技術分野でよく知られおり、例えば、ＮＭＲ、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー質量分析、またはガスクロマトグラフィー質量分析を使用するものである。実施例に示されているように、目的の細胞への追加は、シミュレートされた腸内環境によって産生される追加の代謝産物をもたらし得る。本発明のプロセスは、目的の生物の代謝活性が、単純化されたシミュレートされた腸内環境において解明されることを可能にする。
【００９９】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、以下のステップを含む、目的の細胞の代謝活性を評価するためのプロセスを提供する：
本明細書に記載の液体培地、本明細書に記載の細菌集団、及び本明細書に記載の栄養エネルギー源、及び目的の細胞を含むシミュレートされた腸内環境を提供するステップ、
目的の細胞の添加後にシミュレートされた腸内環境の組成を評価するステップ。
【０１００】
特定の実施形態では、プロセスは、腸内環境の安定化が達成されるまで、シミュレートされた腸内環境を安定化条件下で維持するステップをさらに含むことができる。
【０１０１】
本発明のプロセスを使用して、代謝活性を調査し、原核細胞または真核細胞を含む任意のタイプの細胞の作用機序を潜在的に解明することができる。本発明の実施形態では、目的の細胞は、細菌細胞、真菌細胞、古細菌細胞、またはウイルスであり得る。目的の細胞は病原性であってもよい。代替的に、目的の細胞が健康に有益であってもよい。そのような実施形態では、本発明は、創薬プロセスの一部としての有用性を有利に見いだす。
【０１０２】
本発明のプロセスは、目的の生物の代謝活性が、単純化されたシミュレートされた腸内環境において解明されることを可能にする。目的の分離された生物は、個別に研究されたときに特定の代謝プロファイルを有する。しかしながら、ヒト腸内マイクロバイオームは、栄養素について競合したり、共生的に働いたりする等、互いに相互作用する何千もの異なる細菌種で構成されている。しかしながら、本発明者らは、シミュレートされた腸内環境でマイクロバイオームを研究する場合、代謝産物である酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及び／またはギ酸が特に重要であることを特定した。
【０１０３】
本発明のプロセスは、腸内環境をシミュレートする制御された環境において、生物の代謝活性を解明することを可能にする。本発明のプロセスは、腸の微生物群集における目的の生物のｉｎ  ｖｉｖｏでの代謝特性の信頼できる予測を可能にする。
【０１０４】
本発明の実施形態では、例えば、ユーザーが特定の基質または目的の第２の細胞を有する細胞の代謝活性を調査したい状況において、本発明のプロセスは、シミュレートされた腸内環境に、基質及び／または第２の目的の細胞を添加するステップを含んでもよい。第２の目的の細胞は、シミュレートされた腸内環境の安定化が達成された後、シミュレートされた腸内環境に添加され得る。
【０１０５】
本発明の実施形態では、本発明のプロセスを使用して、シミュレートされた腸内環境における特定の代謝産物活性について目的の生物をスクリーニングすることができる。この方法で特定の代謝産物活性をスクリーニングすることにより、腸内微生物群集における目的の生物のｉｎ  ｖｉｖｏでの代謝特性の信頼できる予測が可能になる。他の実施形態では、シミュレートされた腸内環境と目的の代謝産物との共インキュベーションは、例えば、二次植物代謝産物を用いて実施することができる。本発明のプロセスは、目的の代謝産物がヒト腸内マイクロバイオームに及ぼす可能性のあるｉｎ  ｖｉｖｏでの効果の信頼できる予測を可能にする。
【０１０６】
基質は、シミュレートされた腸内環境の安定化の達成の前または後に、シミュレートされた腸内環境に添加され得る。基質がサッカリドである場合、それは、細菌集団によって代謝されるサッカリドではなく、及び／または栄養エネルギー源に含まれる糖質ではないことが好ましい。
【０１０７】
当業者によって理解されるように、シミュレートされた腸内環境は、セットアップ時間が最小化され、目的の細胞の代謝特性の分析を可能な限り迅速に開始できるように、可能な限り迅速に安定化を達成することが望ましい。以下の実施例に示されるように、本発明のシミュレートされた腸内環境の安定化は、従来技術の構成よりも著しく迅速に達成することができる。したがって、本発明の実施形態では、安定化は、２週間以内、１０日以内、１週間以内または５日以内、または４日以内、または３日以内、または２日以内、または１日以内で達成される。
【０１０８】
シミュレートされた腸内環境の安定化が達成されるという条件で、任意の安定化条件を採用することができる。本発明の実施形態では、安定化条件は、以下のうちの１つまたは複数を含み得る：
温度制御−シミュレートされた腸内環境の温度は、約２０℃、約２５℃、または約３０℃〜約４０℃、約４５℃、または約５０℃の温度に維持できる。
ｐＨ制御−シミュレートされた腸内環境のｐＨは、４以上、４．５以上、５以上、５．５以上、６以上のｐＨ〜約８以下、７．５以下、７．０以下または６．５以下のｐＨに維持できる。
大気制御−シミュレートされた腸内環境が安定化条件下で維持される環境は嫌気性であり得、例えば、シミュレートされた腸内環境は、約５００ｐｐｍ未満、約２００ｐｐｍ未満、１００ｐｐｍ未満、５０ｐｐｍ未満、または約２０ｐｐｍ未満の酸素を含む雰囲気化で維持できる。
【０１０９】
上で説明したように、シミュレートされた腸内環境は、シミュレートされた腸内環境の安定化が達成されるまで、安定化条件で維持される。本発明の目的のために、安定化は、酪酸、プロピオン酸、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも３つがシミュレートされた腸内環境に存在し、これらの化合物のそれぞれの濃度が、２４時間にわたって２０％変化しない場合に達成されたとみなされる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、シミュレートされた腸内環境は、細菌集団によって産生され、及び／または液体培地に直接添加され得る、酪酸、プロピオン酸、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも３つを含む。安定化する前に、シミュレートされた腸内環境で細菌集団によって産生される、酪酸、プロピオン酸、酢酸、乳酸、及びギ酸等の代謝産物の総レベルは変化する。安定化が達成されると、酪酸、プロピオン酸、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも３つが組成物中の細菌によって産生され、これらの化合物のそれぞれの濃度は、２４時間、１８時間、１２時間、または６時間にわたって２０％変化しない。
【０１１１】
安定化の達成後のシミュレートされた腸内環境が酪酸を含む実施形態では、酪酸は、少なくとも約０．５ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２．０ｍＭ、約３．０ｍＭ、約４．０ｍＭ、または約５．０ｍＭの濃度で存在し得る。追加的または代替的に、酪酸は、約１０．０ｍＭ以下、約８．０ｍＭ以下、約６．０ｍＭ以下、または約５．０ｍＭ以下の濃度で存在し得る。安定化の達成後のシミュレートされた腸内環境が酪酸を含む好ましい実施形態では、酪酸は約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭの濃度で存在する。
【０１１２】
安定化の達成後のシミュレートされた腸内環境がプロピオン酸を含む実施形態では、プロピオン酸は、少なくとも約０．５ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２．０ｍＭ、約３．０ｍＭ、約４．０ｍＭ、または約５．０ｍＭの濃度で存在する。追加的または代替的に、プロピオン酸は、約１０．０ｍＭ以下、約８．０ｍＭ以下、約６．０ｍＭ以下、または約５．０ｍＭ以下の濃度で存在し得る。安定化の達成後のシミュレートされた腸内環境がプロピオン酸を含む好ましい実施形態では、プロピオン酸は約２．０ｍＭ〜約７．０ｍＭの濃度で存在する。
【０１１３】
安定化の達成後のシミュレートされた腸内環境が酢酸を含む実施形態では、酢酸は、少なくとも約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１．５ｍＭ、または約２．０ｍＭの濃度で存在する。追加的または代替的に、酢酸は、約５．０ｍＭ以下、約４．０ｍＭ以下、約３．０ｍＭ以下、または約２．０ｍＭ以下の濃度で存在し得る。安定化の達成後のシミュレートされた腸内環境が酢酸を含む好ましい実施形態では、酢酸は約０．２ｍＭ〜約２．０ｍＭの濃度で存在する。
【０１１４】
安定化の達成後のシミュレートされた腸内環境が乳酸を含む実施形態では、乳酸は、少なくとも約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１．５ｍＭ、または約２．０ｍＭの濃度で存在する。追加的または代替的に、乳酸は、約５．０ｍＭ以下、約４．０ｍＭ以下、約３．０ｍＭ以下、または約２．０ｍＭ以下の濃度で存在し得る。安定化の達成後のシミュレートされた腸内環境が乳酸を含む好ましい実施形態では、乳酸は約０．２ｍＭ〜約２．０ｍＭの濃度で存在する。
【０１１５】
安定化の達成後のシミュレートされた腸内環境がギ酸を含む実施形態では、ギ酸は、少なくとも約０．０１ｍＭ、約０．０２ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．１Ｍ、約０．２ｍＭ、または約０．５ｍＭの濃度で存在する。追加的または代替的に、ギ酸は、約２．０ｍＭ以下、約１．５ｍＭ以下、または約１．０ｍＭ以下の濃度で存在し得る。安定化の達成後のシミュレートされた腸内環境がギ酸を含む好ましい実施形態では、ギ酸は約０．０１ｍＭ〜約０．５ｍＭの濃度で存在する。
【０１１６】
目的の細胞の添加後のシミュレートされた腸内環境の組成の評価は、当業者に知られている技法を使用して実施することができる。本発明の実施形態では、メタボロミクス分析は、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、イソ吉草酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカノエートを含む短鎖脂肪酸及び中鎖脂肪酸の濃度を決定するために実施できる。メタボロミクス分析は、当業者に知られている任意の技法、例えば、ＨＰＬＣを使用して実施することができる。
【０１１７】
追加的または代替的に、シミュレートされた腸内環境の組成の評価は、目的の細胞の数を定量化することを含み得、その結果、ユーザーは、その細胞の増殖速度及び最適な増殖条件を評価することができる。
【０１１８】
細菌集団の変化は、シミュレートされた腸内環境の評価の一部として評価することもできる。例えば、集団の様々なメンバーの割合を評価して、共生細菌を目的の細胞に曝露する効果を予測することができる。そのような評価は、例えば、当業者が精通している技法である１６Ｓメタゲノム配列決定を使用して行うことができる。当業者はまた、そのような配列決定を実行するために使用することができる装置、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑに精通しているであろう。
【０１１９】
組成の評価は、シミュレートされた腸内環境の安定化が達成された後、いつでも実行できる。しかしながら、当業者は、目的の細胞が組成に影響を与えるのに十分な時間を有する時点まで、評価を行うことを延期することが好ましいであろうことを認識するであろう。例えば、組成の評価は、シミュレートされた腸内環境への目的の細胞の添加後、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１８時間、または２４時間で行うことができる。
【０１２０】
その後、後続の評価は、任意選択で定期的（例えば、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１８時間、または２４時間）な間隔で行うことができる。
【０１２１】
シミュレートされた腸内環境の評価は、シミュレートされた腸内環境自体で直接行うことができ（例えば、発酵槽内でシミュレートされた腸内環境を分析することによって）、または本発明の方法は、シミュレートされた腸内環境の試料を抽出するステップと、その試料の評価を実施するステップとを含み得る。
【０１２２】
本発明の実施形態では、プロセスは、シミュレートされた腸内環境に対応する第２のシミュレートされた腸内環境が提供され、シミュレートされた腸内環境の安定化を達成するために使用される条件に対応する安定化条件下で維持して、第２のシミュレートされた腸内環境の安定化が達成される対照研究をさらに含み、第２のシミュレートされた腸内環境の組成がシミュレートされた腸内環境と同じ方法で評価され、目的の細胞が第２のシミュレートされた腸内環境に添加されず、シミュレートされた腸内環境の評価の結果が、第２のシミュレートされた腸内環境の評価の結果と比較される。
【０１２３】
そのような実施形態では、シミュレートされた腸内環境及び第２のシミュレートされた腸内環境は、シミュレートされた腸内環境の共通のストックから取得され得る。代替的に、シミュレートされた腸内環境及び第２のシミュレートされた腸内環境は、別々に調製され得る。
【０１２４】
本発明のプロセスは、制御された条件で細菌集団の維持を可能にする任意の適切な装置で実施することができる。本発明の実施形態では、プロセスは、加熱手段（例えば、磁気ヒーター）、ｐＨセンサー、及び／または温度センサーを含む発酵槽（例えば、ステンレス鋼、プラスチック、またはガラス発酵槽）内で実行される。発酵槽は、液体培地、細菌集団、目的の細胞、基質、添加剤、窒素等の不活性ガス、及び／または酸及び塩基を含むｐＨ調整剤のうちの１つまたは複数の添加を可能にする１つまたは複数の入口を備えていてもよい。追加的または代替的に、発酵槽は、試験のためにシミュレートされた腸内環境の試料、液体流出物、及び／または廃ガスを抽出するための１つまたは複数の出口を備え得る。
【０１２５】
本発明の実施形態では、プロセスは、有利には、連続的に操作される。例えば、液体培地は、細菌集団が制御された条件で維持される装置に連続的または断続的に供給され得る。細菌集団が制御された条件に維持される装置に液体培地が供給される速度は、約０．１ｍｌ／分、０．２ｍｌ／分、０．３ｍｌ／分、約０．４ｍｌ／分、または約０．５ｍｌ／分〜約１ｍｌ／分、２ｍｌ／分、３ｍｌ／分、４ｍｌ／分、または約５ｍｌ／分であり得る。
【０１２６】
追加的または代替的に、試料は、細菌集団が制御された条件に維持されている装置から連続的または断続的に抽出され得る。細菌集団が制御された条件に維持される装置から試料が抽出される速度は、約０．１ｍｌ／分、０．２ｍｌ／分、０．３ｍｌ／分、約０．４ｍｌ／分、または約０．５ｍｌ／分〜約１ｍｌ／分、２ｍｌ／分、３ｍｌ／分、４ｍｌ／分、または約５ｍｌ／分であり得る。
【０１２７】
本発明のさらなる態様では、本明細書に記載の細菌集団と、本明細書に記載のシミュレートされた腸モデルを調製するための使用説明書とを含むキットが提供される。特定の実施形態では、細菌集団は、凍結乾燥組成物の形態で提供され得る。追加的または代替的に、キットは、本明細書に記載の栄養エネルギー源及び／または本明細書に記載の液体培地を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
なし
【実施例】
【０１２９】
実施例１−細菌集団の合理的な設計
細菌集団は、（シミュレートされた胃腸内環境の従来技術で採用されている細菌集団と比較して）単純化され、安定化の迅速な達成を可能にすることを目的として設計された。図１に示されているように、細菌集団は、目的の細胞の代謝活性を評価するために重要であると発明者によって特定された短鎖脂肪酸の全ての主要な代謝経路を包含するように設計された。さらに、集団を構成する細菌は、特定の生物の異常増殖及び増殖の遅い菌株を増殖の速い菌株が打ち負かすことを回避するために選択された。
【０１３０】
実施例２−シミュレートされた腸内環境の安定化
図２に模式的に示す装置を設置した。図示される装置は、シミュレートされた腸内環境（３）がその中に提供されたガラス発酵槽（１）を含む。シミュレートされた腸内環境（３）は、実施例１で設計された細菌集団、液体培地、及びフコース、ラムノース、ヘキソース、及びペントースを含む栄養エネルギー源を含む。
【０１３１】
発酵槽（１）は密封され、嫌気性条件（窒素ブランケット）下で操作される。装置は、連続的に動作するように有利に考案され、したがって、発酵槽（１）は、シミュレートされた腸内環境を一定の体積に維持することを可能にする媒体入口（５）と、ｐＨを制御するための酸及び塩基、ならびに嫌気性環境を維持するための窒素の添加を可能にする制御入口（７）を備えている。センサー入口（９）により、ｐＨ及び温度のセンサーを発酵槽（１）の内部に挿入できる。発酵槽（１）は磁気ヒーター（１１）も備える。
【０１３２】
出口（１３）は、評価のためにシミュレートされた腸内環境の試料の抽出と、排水の除去を可能にする。
【０１３３】
液体培地、細菌集団、及び栄養エネルギー源を発酵槽（１）に添加した後、シミュレートされた腸内環境（３）を安定化条件（ｐＨ６〜６．５、温度３７℃）で５日間維持した。酪酸、プロピオン酸、酢酸、及びギ酸のレベルは、シミュレートされた腸内環境に細菌集団を添加した後、その後２４時間間隔で評価され、これらの評価の結果を図３に示す。示すように、シミュレートされた腸内環境の安定化は、４〜５日後に達成された。これは、従来技術の構成によるものよりもかなり迅速である。
【０１３４】
実施例３−ヒト腸内細菌叢（ＳｉｍＭｉ）の簡略化モデルにおけるＭＲＸ００２９の有効性の評価
Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ株ＭＲｘ００２９は、吉草酸及び中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）のヘキサン酸も産生できる酪酸産生菌株である（図４を参照されたい）。
【０１３５】
確立された細菌群集においてその短鎖脂肪酸ＳＣＦＡ及びＭＣＦＡ産生ならびにＨＤＡＣ活性を維持するＭＲｘ００２９の能力を、本発明のシミュレートされた腸内環境（本明細書ではＳｉｍＭｉと呼ぶ）で試験した。このシステムはＭＲｘ００２９のｉｎ  ｖｉｖｏ代謝特性を予測するために使用した。
【０１３６】
方法
健康なドナーのヒト糞便試料から以前に単離された１６の菌株の安定した群集が、実施例１及び２に記載されるように、ヒト腸内細菌叢のコア代謝機能を模倣するために連続培養で開発された。
【０１３７】
ＳｉｍＭｉ環境の菌株は、以下の種からなる：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、ブラウチア属種、Ｂａｒｉａｔｒｉｃｕｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｎｏｃｕｕｍ、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｕｓ、プレボテラ属種、及びＲｏｓｅｂｕｒｉａ  ｆａｅｃｉｓ。
【０１３８】
ＳｉｍＭｉ環境の細菌種は、主にＳＣＦＡ産生に焦点を当てた幅広い代謝経路をカバーするが、栄養共生、細菌の豊富さ、及び多様性も考慮する。
【０１３９】
細菌群集は７つの群に接種された。
2021521871.tif 000002
【０１４０】
シミュレートされた腸内環境に接種し、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ株ＭＲｘ００２９を接種する前に１時間確立させた。最後の接種後、シミュレートされた細菌環境を２時間放置し、次いで反応容器に０．５ｍＬ／分の流速で清浄な培地をポンプで送る。
【０１４１】
ＭＲＸ００２９を使用した場合と使用しない場合のＳｉｍＭｉ培養物を１３日間培養した。
【０１４２】
細菌上清のＳＣＦＡ及びＭＣＦＡ定量化
２つのコンソーシアムの代謝を１３日間にわたって分析した。細菌の上清からの短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）と中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）は、ＭＳ  Ｏｍｉｃｓ  ＡＰＳ，  Ｄｅｎｍａｒｋによって分析及び定量化された。試料は塩酸を使用して酸性化し、重水素で標識された内部標準を添加した。全ての試料はランダム化された順序で分析された。分析は、四重極検出器（５９９７７Ｂ、Ａｇｉｌｅｎｔ）と組み合わせたガスクロマトグラフ（７８９０Ｂ、Ａｇｉｌｅｎｔ）に取り付けられた高極性カラム（Ｚｅｂｒｏｎ（商標）ＺＢ−ＦＦＡＰ、ＧＣキャップ．  カラム３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）を使用して実行した。システムはＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって制御された。生データは、Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してｎｅｔＣＤＦ形式に変換された後、Ｊｏｈｎｓｅｎ，Ｌ．Ｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ，  １５０３：ｐ．５７−６４に記載されているＰＡＲＡＤＩＳｅソフトウェアを使用してＭａｔｌａｂ  Ｒ２０１４ｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，  Ｉｎｃ．）にインポート及び処理された。
【０１４３】
ＨＤＡＣ活性アッセイ
２つのＳｉｍＭｉ培養（ＭＲＸ００２９を含む及び含まない）の培養の２コンソーシアムからの１２日目の試料のＨＤＡＣ活性を分析した。
【０１４４】
ＭＲＸ００２９を含む及び含まないＳｉｍＭｉ培養物からの無細胞上清（ＣＦＳ）を、ＨＤＡＣ活性分析のために単離した。２つのＳｉｍＭｉ培養物（ＭＲＸ００２９を含む及び含まない）のアリコートを５０００×ｇで５分間遠心分離し、無細胞上清（ＣＦＳ）を、０．２μＭフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＫ）を使用してろ過した後、ＣＦＳの１ｍＬアリコートを、使用するまで−８０℃で保存した。
【０１４５】
細胞培養：ＨＴ−２９ヒト結腸直腸腺癌細胞は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から入手した（１６２〜１７３継代）。細胞は、１０％ＦＢＳ、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、抗真菌剤及び抗生物質（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）を含むダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ）培地中で培養した。コンフルエンスの３日後、細胞をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、５μｇｍｌアポトランスフェリン及び０．２μｇｍｌ亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  ＵＫ）を含む１ｍＬのＤＭＥＭにステップダウンした。実験開始の２４時間前に細胞をステップダウンした。
【０１４６】
ＨＤＡＣアッセイ
ＨＴ−２９細胞を、ＭＲＸ００２９を含む及び含まないＳｉｍＭｉ培養物からの１００μｌのＣＦＳと共に４８時間ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。
【０１４７】
核タンパク質抽出
処理後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ウェルから細胞をこすり取って回収した。細胞を４５０×ｇで５分間遠心分離した。次いで、ＮＸＴＲＡＣＴ  ＮｕＣＬＥＡＲキット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ）を使用して、製造者の使用説明書に従って核抽出を行った。抽出後、核タンパク質を急速凍結し、ＨＤＡＣ活性分析のために−８０℃で保存した。
【０１４８】
総ＨＤＡＣ活性分析
ＨＤＡＣ活性は、ヒストンデアセチラーゼアッセイキット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ）を使用して分析した。アッセイは、１５μＬの抽出ＨＴ−２９核タンパク質を使用して製造者の使用説明書に従って実施した。
【０１４９】
さらに、未処理細胞のＨＴ−２９核タンパク質を抽出し、ＮＸＴＲＡＣＴ  ＮｕＣＬＥＡＲキット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ）で提供されるＨｅＬａ細胞溶解物のタンパク質濃度に対して正規化した。タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＢＣＡ）キットＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，ＵＫ）を使用して決定した。この抽出物の１５ｕＬを、１０％ＣＦＳのインキュベーション後のＨＤＡＣ活性分析に使用して、細胞全体でのＨＤＡＣ阻害を確認した。
【０１５０】
結果
ＳｉｍＭｉ培養物にＭＲｘ００２９を添加すると、培養物に追加の経路が導入される。吉草酸とヘキサン酸は、ＳｉｍＭｉの元のコアコンソーシアムでは産生されなかったが、実行の全期間（１３日間）にわたってＭＲｘ００２９が添加されたＳｉｍＭｉで産生された（図５−７）。
【０１５１】
ＳｉｍＭｉ及びＳｉｍＭｉ＋ＭＲＸ００２９培養物の１２からのアリコートを、ＹＣＦＡをコントロールとして使用して総ＨＤＡＣ阻害について試験した。結果は、ＳｉｍＭｉ＋ＭＲＸ００２９培養物が、ＨＴ−２９細胞全体（ｐ＜０．００１）及びＨＴ−２９細胞溶解物（ｐ＜０．０５）において、標準コンソーシアムよりも強力な総ＨＤＡＣ阻害を有することを示す（図８）。これは、酪酸及び吉草酸を産生する細菌として、ならびに確立された細菌群集内でＨＤＡＣ阻害を刺激することの、ＭＲｘ００２９の生理学的に関連する能力がＳｉｍＭｉ培養で維持されていることを示す。
【０１５２】
Ｍ．  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  ＭＲｘ００２９を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの単純化されたヒト腸内細菌叢コンソーシアムに添加すると、この菌株の代謝産物と特定のＨＤＡＣ阻害効果が細菌コアコミュニティに伝達されることが示された。
【０１５３】
これらの結果は、目的の細胞の有効性に対するコミュニティの影響、及びその逆を示す。これにより、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究を実施しなくても、目的の細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで薬理学的特性にどのような影響を与えるかを評価できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年1月13日(2021.1.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体培地、栄養エネルギー源、及び５〜１５０種の細菌からなる細菌集団を含む、インビトロでのシミュレートされた腸内環境であって、前記細菌集団が、前記栄養エネルギー源から、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも３つを産生することができる、前記インビトロでのシミュレートされた腸内環境。
【請求項２】
前記細菌集団が、５〜５０種の細菌からなる、請求項１に記載のインビトロでのシミュレートされた腸内環境。
【請求項３】
前記細菌集団が、５〜３０種の細菌からなる、請求項２に記載のインビトロでのシミュレートされた腸内環境。
【請求項４】
前記細菌集団が、５〜２０種の細菌からなる、請求項３に記載のインビトロでのシミュレートされた腸内環境。
【請求項５】
前記細菌集団が、アナエロスチペス属、バクテロイデス属、バクテロイデス属、ビフィドバクテリウム属、ブラウチア属、クロストリジウム属、コリンセラ属、コプロコッカス属、エスケリキア属、ユーバクテリウム属、フィルミクテス属、ラクトバチルス属、プレボテラ属、ファスコラークトバクテリウム属、ロセブリア属、ルミノコッカス属、セレノモナス属、及び／またはウェルコミクロビウム属に由来する細菌からなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のインビトロでのシミュレートされた腸内環境。
【請求項６】
前記細菌集団が、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ  ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｎｉｃｉｐｈｉｌｌａ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃｏｌｉ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｒｈａｍｎｏｓｉｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂａｒｉａｔｒｉｃｕｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｏｂｅｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ  ｐｕｌｌｉｃａｅｃｏｒｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｄｏｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｎｏｃｕｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｔｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｍｅｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｕｔａｃｔｕｓ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ  ｉｎｖｉｓｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｙｌｉｎｄｒｏｉｄｅｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｍｕｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｏｐｒｉ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｆａｅｃｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、及び／またはＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａからなる群に由来する、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０またはそれ以上の細菌からなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のインビトロでのシミュレートされた腸内環境。
【請求項７】
前記細菌集団が、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、ブラウチア属種、Ｂａｒｉａｔｒｉｃｕｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｎｏｃｕｕｍ、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｕｓ、プレボテラ属種、及び／またはＲｏｓｅｂｕｒｉａ  ｆａｅｃｉｓからなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のインビトロでのシミュレートされた腸内環境。
【請求項８】
前記細菌集団が、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも５つを産生することができる、請求項１〜７のいずれか１項に記載のインビトロでのシミュレートされた腸内環境。
【請求項９】
前記細菌集団が、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの全てを産生することができる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のインビトロでのシミュレートされた腸内環境。
【請求項１０】
酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも３つまたは全てを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のインビトロでのシミュレートされた腸内環境。
【請求項１１】
酪酸を、任意選択で約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭの濃度で含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のインビトロでのシミュレートされた腸内環境。
【請求項１２】
プロピオン酸を、任意選択で約２．０ｍＭ〜約７．０ｍＭの濃度で含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のインビトロでのシミュレートされた腸内環境。
【請求項１３】
酢酸を、任意選択で約０．２ｍＭ〜約２．０ｍＭの濃度で含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のインビトロでのシミュレートされた腸内環境。
【請求項１４】
乳酸を、任意選択で約０．２ｍＭ〜約２．０ｍＭの濃度で含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のインビトロでのシミュレートされた腸内環境。
【請求項１５】
ギ酸を、任意選択で約０．０１ｍＭ〜約０．５ｍＭの濃度で含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のインビトロでのシミュレートされた腸内環境。
【請求項１６】
酪酸、プロピオン酸、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも４つを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のインビトロでのシミュレートされた腸内環境であって、プロピオン酸もしくは酪酸が最高濃度で存在し、及び／または酢酸、ギ酸もしくは乳酸が最低濃度で存在する、前記インビトロでのシミュレートされた腸内環境。
【請求項１７】
前記細菌集団が、以下に定義されるａ．〜ｅ．のうちの少なくとも３つを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のインビトロでのシミュレートされた腸内環境：
ａ．  ブチリシコッカス属、ユーバクテリウム属、アナエロスチペス属、コプロコッカス属、ブチリビブリオ属、ローズブリア属、フェカリバクテリウム属、バリアトリカス属、メガスファエラ属、及び／またはクロストリジウム属のうちの１つまたは複数に由来する酪酸産生細菌、
ｂ．  フィルミクテス属、ウェルコミクロビウム属、バクテロイデス門、バクテロイデス属、ブラウチア属、プレボテラ属、及び／またはユーバクテリウム属のうちの１つまたは複数に由来するプロピオン酸産生細菌、
ｃ．  バクテロイデス属、ビフィドバクテリウム属、プレボテラ属、ブラウチア属、セレノモナス属、及び／またはクロストリジウム属のうちの１つまたは複数に由来する酢酸産生細菌、
ｄ．  ビフィドバクテリウム属、バクテロイデス属、アナエロスチペス属、コプロコッカス属、クロストリジウム属、コリンセラ属、ローズブリア属、及び／またはラクトバチルス属のうちの１つまたは複数に由来する乳酸産生細菌、
ｅ．  エシェリスキア属、ルミノコッカス属、及び／またはビフィドバクテリウム属に由来するギ酸産生細菌。
【請求項１８】
ａ．  前記ブチレート産生細菌が、以下の種のいずれかから選択され：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｎｏｃｕｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｆａｅｃｉｓ、及び／またはＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ；
ｂ．  前記プロピオン酸産生細菌が、以下の種のいずれかから選択され：Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｈａｄｒｕｓ、Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｏｂｅｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ、及び／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ；
ｃ．  前記酢酸産生細菌が、以下の種のいずれかから選択され：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、及び／またはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｏｐｒｉ；
ｄ．  前記乳酸生産菌が、以下の種のいずれかから選択され：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ及び／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｕｓ；並びに／あるいは
ｅ．  前記ギ酸産生細菌が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、請求項１７に記載のインビトロでのシミュレートされた腸内環境。
【請求項１９】
前記細菌集団が、硫酸還元細菌、ムチン分解細菌、硫酸放出細菌、及び／またはメタン産生細菌を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のインビトロでのシミュレートされた腸内環境。
【請求項２０】
ａ．  前記硫酸還元細菌が、デスルホビブリオ属に由来し、好ましくは前記細菌が、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ種に由来し；
ｂ．  前記ムチン分解細菌が、アッケルマンシア属に由来し、好ましくは前記細菌がＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌｉａ種に由来し；
ｃ．  前記硫酸還元細菌が、アッケルマンシア属に由来し、好ましくは前記細菌が、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌｉａ種に由来し；
ｄ．  前記メタン産生細菌が、メタノブレビバクター属に由来し、好ましくは前記細菌が、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉ種に由来する、請求項１９に記載のインビトロでのシミュレートされた腸内環境。
【請求項２１】
前記細菌集団に存在する細菌の少なくとも９９％が１人または複数の健康なドナーのヒトの腸から単離された共生生物である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のインビトロでのシミュレートされた腸内環境。
【請求項２２】
前記細菌集団に存在する細菌の少なくとも９９％が１人または複数の不健康なドナーのヒトの腸から単離された共生生物である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のインビトロでのシミュレートされた腸内環境。
【請求項２３】
前記細菌集団におけるバクテロイデス属：フィルミクテス属の比率が３０：６５、３０：７０、３５：６５、または３５：７０である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のインビトロでのシミュレートされた腸内環境。
【請求項２４】
前記栄養エネルギー源が単糖類を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のインビトロでのシミュレートされた腸内環境。
【請求項２５】
安定化されたシミュレートされた腸内環境を作製するための、インビトロでのプロセスであって、液体培地に５〜１５０の菌種または菌株からなる細菌集団を接種することを含み、前記細菌集団が、前記栄養エネルギー源から、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも３つを産生することができる、前記インビトロでのプロセス。
【請求項２６】
前記細菌集団が、５〜２０の菌種または菌株からなる、請求項２５に記載のインビトロでのプロセス。
【請求項２７】
前記細菌集団が、請求項２〜９及び１７〜２３で定義される細菌からなる、請求項２５または２６に記載のインビトロでのプロセス。
【請求項２８】
前記細菌集団が、請求項８〜１６で定義される代謝産物を産生することができる、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載のインビトロでのプロセス。
【請求項２９】
前記シミュレートされた腸内環境に前記細菌を逐次的に接種する、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載のインビトロでのプロセス。
【請求項３０】
前記細菌種がそれらの増殖特性に基づいて逐次的に添加され、より遅い増殖特性を示す前記細菌種がより速い増殖特性を有する前記細菌種の前に優先的に添加される、請求項２９に記載のインビトロでのプロセス。
【請求項３１】
前記シミュレートされた腸内環境に、少なくとも２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、または１５以上の細菌群を接種する、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載のインビトロでのプロセス。
【請求項３２】
前記液体培地がＹＣＦＡである、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載のインビトロでのプロセス。
【請求項３３】
目的の細胞の代謝活性を評価するための、インビトロでのプロセスであって、
ａ．  液体培地、栄養エネルギー源、及び５〜１５０種の細菌からなる細菌集団を含む、安定化されたシミュレートされた腸内環境を提供するステップであって、前記細菌集団が、前記栄養エネルギー源から、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも３つを産生することができる、ステップと、
ｂ．  前記目的の細胞を前記シミュレートされた腸内環境に添加するステップと、
ｃ．  前記目的の細胞の添加後に前記シミュレートされた腸内環境の組成を評価するステップと、を含む、前記インビトロでのプロセス。
【請求項３４】
目的の細胞の代謝活性を評価するための、インビトロでのプロセスであって、
ａ．  液体培地、栄養エネルギー源、及び５〜１５０種の細菌からなる細菌集団、及び目的の細胞を含むシミュレートされた腸内環境を提供するステップであって、前記細菌集団が、前記栄養エネルギー源から、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも３つを産生することができる、ステップと、
ｂ．  前記目的の細胞の添加後に前記シミュレートされた腸内環境の組成を評価するステップと、を含む、前記インビトロでのプロセス。
【請求項３５】
前記腸内環境の安定化が達成されるまで、前記シミュレートされた腸内環境を安定化条件下で維持するステップをさらに含む、請求項３３または３４に記載のインビトロでのプロセス。
【請求項３６】
前記シミュレートされた腸内環境の前記安定化の達成に続いてシミュレートされた腸内環境の試料を抽出するステップと、その試料の組成の評価を実行するステップとをさらに含む、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載のインビトロでのプロセス。
【請求項３７】
前記安定化が１週間以内に達成される、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載のインビトロでのプロセス。
【請求項３８】
前記細菌集団が、請求項２〜９及び１８〜２３のいずれか１項で定義された細菌からなる、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載のインビトロでのプロセス。
【請求項３９】
前記安定化条件が、以下に定義されるａ．〜ｃ．のうちの少なくとも１つ、２つ、または３つを含む、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載のインビトロでのプロセス：
ａ．  前記シミュレートされた腸内環境の温度が、約２０℃〜約５０℃の温度に維持される、
ｂ．  前記シミュレートされた腸内環境のｐＨが、５以上のｐＨ〜約７．０以下のｐＨに維持される、
ｃ．  前記シミュレートされた腸内環境が、約１００ｐｐｍ未満の酸素を含む雰囲気で維持される。
【請求項４０】
前記安定化の達成に続いて、前記シミュレートされた腸内環境が、酪酸を、任意選択で約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭの濃度で含む、請求項３３〜３９のいずれか１項に記載のインビトロでのプロセス。
【請求項４１】
前記安定化の達成に続いて、前記シミュレートされた腸内環境が、プロピオン酸を、任意選択で約２．０ｍＭ〜約７．０ｍＭの濃度で含む、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載のインビトロでのプロセス。
【請求項４２】
前記安定化の達成に続いて、前記シミュレートされた腸内環境が、酢酸を、任意選択で約０．２ｍＭ〜約２．０ｍＭの濃度で含む、請求項３３〜４１のいずれか１項に記載のインビトロでのプロセス。
【請求項４３】
前記安定化の達成に続いて、前記シミュレートされた腸内環境が、乳酸を、任意選択で約０．２ｍＭ〜約２．０ｍＭの濃度で含む、請求項３３〜４２のいずれか１項に記載のインビトロでのプロセス。
【請求項４４】
前記安定化の達成に続いて、前記シミュレートされた腸内環境が、ギ酸を、任意選択で約０．０１ｍＭ〜約０．５ｍＭの濃度で含む、請求項３３〜４３のいずれか１項に記載インビトロでのプロセス。
【請求項４５】
前記安定化が３日以内に達成される、請求項３３〜４４のいずれか１項に記載のインビトロでのプロセス。
【請求項４６】
前記目的の細胞の添加後の前記シミュレートされた腸内環境の評価が、メタボロミクス分析、前記目的の細胞の定量化、及び／または前記細菌集団に対する変化の評価のうちの１つまたは複数を含む、請求項３３〜４５のいずれか１項に記載のインビトロでのプロセス。
【請求項４７】
前記シミュレートされた腸内環境に対応する第２のシミュレートされた腸内環境が提供され、前記シミュレートされた腸内環境の安定化を達成するために使用される条件に対応する安定化条件下で維持して、前記第２のシミュレートされた腸内環境の安定化が達成される対照研究をさらに含み、前記第２のシミュレートされた腸内環境の組成が前記シミュレートされた腸内環境と同じ方法で評価され、前記目的の細胞が前記第２のシミュレートされた腸内環境に添加されず、シミュレートされた腸内環境の評価の結果が、前記第２のシミュレートされた腸内環境の評価の結果と比較される、請求項３３〜４６のいずれか１項に記載のインビトロでのプロセス。
【請求項４８】
５〜１５０の菌種または菌株からなる細菌集団を含むキットであって、前記細菌集団が、栄養エネルギー源から、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、エタノール、酢酸、乳酸、及びギ酸のうちの少なくとも３つを産生することができる、前記キット。
【請求項４９】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載のシミュレートされた腸内環境を調製するための、または請求項２５〜４７のいずれか１項に記載のインビトロでのプロセスを操作するための使用説明書をさらに含む、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記細菌集団が凍結乾燥組成物の形態で提供される、請求項４８〜４９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５１】
前記キットが栄養エネルギー源を含む、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載のキット。
【国際調査報告】
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