(57)【要約】  本発明は、眼及び/若しくは脳に関与するミトコンドリア病を含むミトコンドリア障害並びにミトコンドリア機能不全に伴う眼及び/若しくは脳に影響を及ぼす神経変性状態の処置及び/又は防止において使用するための、miR-181を阻害することが可能な薬剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリア障害の処置及び/又は防止において使用するためのmiR-181の阻害剤。
【請求項２】
阻害性核酸剤、小分子、又はゲノム編集剤である、請求項1に記載の使用するためのmiR-181の阻害剤。
【請求項３】
阻害性核酸剤が、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、アンタゴミア、LNA)、miRNAスポンジ、及び/又はリボザイムからなる群から選択される、請求項2に記載の使用するためのmiR-181の阻害剤。
【請求項４】
miR-181に対して相補的な少なくとも1つの配列を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用するためのmiR-181の阻害剤。
【請求項５】
miR-181の機能及び/又は活性を低減する、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用するためのmiR-181の阻害剤。
【請求項６】
miRNA-181活性を阻害すること、好ましくはmRNA-181標的結合を阻害すること、少なくとも1つの特異的miR-181標的のmRNA-181レベルを上昇させること、ミトコンドリア機能を改善すること、ミトコンドリアの数を増加させること、酸化ストレス及び/又は細胞死を低減すること、細胞の生存を改善することからなる群から選択される少なくとも1つの特性を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用するためのmiR-181の阻害剤。
【請求項７】
前記miR-181が、miR-181前駆体又は成熟miR-181であり、好ましくは前記miR-181が、miR-181a-1、miR-181a-2、miR-181b-1、miR-181b-2、miR-181c、及びmiR-181d又はこれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用するためのmiR-181の阻害剤。
【請求項８】
配列ACAUUCA(配列番号5)を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用するためのmiR-181の阻害剤。
【請求項９】
配列ACAUUCA(配列番号5)を含み且つ配列番号1又は配列番号2又は配列番号3又は配列番号4と少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用するためのmiR-181の阻害剤。
【請求項１０】
18〜21ヌクレオチド長である、請求項1から9のいずれか一項に記載の使用するためのmiR-181の阻害剤。
【請求項１１】
前記miRNAスポンジが、式:
(X1sX2sX3)n1S2(X1sX2sX3)n2
(式中、
X1、X2及びX3は、独立して、
-  好ましくは、バルジを作製するためにヌクレオチド9〜ヌクレオチド12を修飾した、miR-181a及び/又はmiR-181cに相補的なMPS SEQ、
-  好ましくは、バルジを作製するためにヌクレオチド9〜ヌクレオチド12を修飾した、miR-181b及び/又はmiR-181dに相補的なMPS SEQ
から選択され;
X3は存在しても存在しなくてもよく;
ｓは、4〜6ヌクレオチド、好ましくは4ヌクレオチドのスペーサー配列であり;
S2は、好ましくは、制限酵素部位、好ましくはXbal制限酵素に関する部位に相当する4〜6ヌクレオチド、好ましくは6ヌクレオチドの中心のスペーサー配列であり;
n1及びn2は、3、6及び24から、好ましくは3、6及び12の中から独立して選択される数であり、最も好ましくは、nは3であり、n1及びn2は同一であっても異なっていてもよい)
を有する、請求項3から10のいずれか一項に記載の使用するためのmiR-181の阻害剤。
【請求項１２】
前記miRNAスポンジが、式:
(AsB)n1S2(AsB)n2
(式中、
Aは、好ましくは、バルジを作製するためにヌクレオチド9〜ヌクレオチド12を修飾した、miR-181a及び/又はmiR-181cに相補的なMPS SEQであり;
Bは、好ましくは、バルジを作製するためにヌクレオチド9〜ヌクレオチド12を修飾した、miR-181b及び/又はmiR-181dに相補的なMPS SEQであり;
Sは、4〜6ヌクレオチド、好ましくは4ヌクレオチドのスペーサー配列であり;
S2は、好ましくは、制限酵素、好ましくはXbal制限酵素に関する部位に相当する4〜6ヌクレオチド、好ましくは6ヌクレオチドの中心のスペーサー配列であり
n1及びn2は、3、6及び24から、好ましくは3、6及び12の中から独立して選択される数であり、最も好ましくは、nは3であり、n1及びn2は同一であっても異なっていてもよい)
を有する、請求項3から10のいずれか一項に記載の使用するためのmiR-181の阻害剤。
【請求項１３】
X1、X2、X3、Aは、3'TTGTAAGTnln2n3n2ACAGCCACTCA5’(配列番号113)であり、
ここで、IUPAC命名法によれば、
n1=A若しくはC若しくはG
n2=A若しくはC若しくはT
n3=A若しくはG若しくはT
又はX1、X2、X3、Bは、3'TTGTAAGTn'ln'ln'2n'3ACAGCCACCCA5'(配列番号114)であり、
IUPAC命名法によれば、
n'1=C若しくはG若しくはT
n'2=A若しくはG若しくはT
n'3=A若しくはC若しくはT;
又はn1=3及びn2=3;
又はSは、4ヌクレオチドからなり、好ましくはS=tagc;
又はS2は、6ヌクレオチドからなり、好ましくはS2=Tctagaである、請求項11又は12に記載の使用するためのmiR-181の阻害剤。
【請求項１４】
配列が、1つ以上のロックド核酸(LNA)ヌクレオチド及び1つ以上の非ロックドヌクレオチドをさらに含み、非ロックドヌクレオチドの少なくとも1つは化学修飾を含み、好ましくはロックド核酸(LNA)ヌクレオチドは2〜4’メチレン架橋を有し、好ましくは化学修飾は2'O-アルキル又は2’ハロ修飾である、請求項3から10のいずれか一項に記載の使用するためのmiR-181の阻害剤。
【請求項１５】
配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12又は配列番号13から選択される配列からなる、請求項1から14のいずれか一項に記載の使用するためのmiR-181の阻害剤。
【請求項１６】
少なくとも1つの追加の薬剤と共に使用される、請求項1から15のいずれか一項に記載の使用するためのmiR-181の阻害剤。
【請求項１７】
前記少なくとも1つの追加の薬剤が、請求項1から15のいずれか一項に記載のmiR-181の阻害剤である、請求項16に記載の使用するためのmiR-181の阻害剤。
【請求項１８】
前記少なくとも1つの追加の薬剤が、ミトコンドリア生合成を増加させる薬剤、オートファジーをモジュレートする薬剤、アポトーシスを阻害する薬剤、ROSスカベンジャー、ヘテロプラスミーをシフトする薬剤、毒性化合物のスカベンジャー、ヌクレオチドの補充、不足している遺伝子を置き換える薬剤からなる群から選択される、請求項16又は17に記載の使用するためのmiR-181の阻害剤。
【請求項１９】
前記miR-181の阻害剤及び前記少なくとも1つの追加の薬剤が、連続的又は同時に投与される、請求項16から18のいずれか一項に記載の使用するためのmiR-181の阻害剤。
【請求項２０】
請求項1から19のいずれか一項に記載の少なくとも1つのmiR-181の阻害剤並びにミトコンドリア障害の処置及び/又は防止において使用するための薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項２１】
少なくとも1つの追加の薬剤をさらに含み、好ましくは、前記少なくとも1つの追加の薬剤が、請求項1から15のいずれか一項に記載のmiR-181の阻害剤であり、好ましくは、前記少なくとも1つの追加の薬剤が、ミトコンドリア生合成を増加させる薬剤、オートファジーをモジュレートする薬剤、アポトーシスを阻害する薬剤、ROSスカベンジャー、ヘテロプラスミーをシフトする薬剤、毒性化合物のスカベンジャー、ヌクレオチドの補充、不足している遺伝子を置き換える薬剤からなる群から選択される、請求項20に記載の使用するための医薬組成物。
【請求項２２】
それを必要とする対象におけるミトコンドリア障害を処置及び/又は防止する方法であって、請求項1から15のいずれか一項に記載の少なくとも1つのmiR-181の阻害剤又は請求項20又は21に記載の医薬組成物を対象に投与する工程を含む方法。
【請求項２３】
請求項1から15のいずれか一項に記載の少なくとも1つのmiR-181の阻害剤及びプロモーター配列を含むベクターであって、好ましくは、ウイルスベクター、好ましくは、ミトコンドリア障害の処置及び/又は防止において使用するためのアデノ随伴ウイルスベクターである、ベクター。
【請求項２４】
ミトコンドリア病が、一次又は二次ミトコンドリア病である、請求項1から15のいずれか一項に記載の使用するためのmiR-181の阻害剤又は請求項20若しくは21に記載の使用するための医薬組成物又は請求項22に記載の方法又は請求項23に記載の使用するためのベクター。
【請求項２５】
ミトコンドリア病が、眼及び/若しくは脳に関与するミトコンドリア病、ミトコンドリア機能不全に伴う眼及び/若しくは脳に影響を及ぼす神経変性症からなる群から選択される、請求項24に記載の使用するためのmiR-181の阻害剤又は医薬組成物又は方法又はベクター。
【請求項２６】
ミトコンドリア病が、リー症候群、レーバー遺伝性視神経萎縮症(LHON)、ミトコンドリアミオパチー、脳症、乳酸アシドーシス及び脳卒中症候群(MELAS)、赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん(MERRF)、進行性外眼筋麻痺(PEO)、ピアソン症候群、母系遺伝性ミオパチー及び心筋症(MIMyCA)、ケジェール視神経症、ニューロパシー運動失調及び網膜色素変性(NARP)、常染色体優性視神経萎縮症、カーンズセイヤー症候群、フリートライヒ運動失調症、遺伝性痙性対麻痺、シャルコーマリートゥース病、散発性加齢神経変性疾患、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、加齢黄斑変性症(AMD)、糖尿病性網膜症、緑内障、家族性神経変性疾患、家族性PD、家族性AD、ハンチントン病、網膜色素変性症(RP)、シュタルガルト病からなる群から選択される、請求項24又は25に記載の使用するためのmiR-181の阻害剤又は医薬組成物又は方法又はベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、眼及び/若しくは脳に関与するミトコンドリア病を含むミトコンドリア障害並びにミトコンドリア機能不全に伴う眼及び/若しくは脳に影響を及ぼす神経変性状態の処置及び/又は防止において使用するための、miR-181を阻害することが可能な薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ミトコンドリアは様々な細胞プロセスにおいて重要な存在であり、それらの機能不全は、例えば、ミトコンドリア病(MD)の場合には直接的に、又はミトコンドリア機能不全が病因における中心的要因として記載されている(参照:PMID:23567191)パーキンソン病(PD)若しくはアルツハイマー病(AD)を含む一般的な神経変性障害の場合には間接的に、様々なヒト障害の病因の原因となる。
【０００３】
原発性ミトコンドリア病(PMD)は、酸化的リン酸化(OXPHOS)に関与するミトコンドリア又は核にコードされる遺伝子の変異によって引き起こされる障害からなる異種混交の群である。PMDの臨床症状は、単一の組織病変/器官病変から、ミトコンドリア機能不全に特に感受性の高い中枢神経系(CNS)への関与が著しい症候性の多臓器状態までの範囲に及ぶ。PMDとしては、リー症候群、レーバー遺伝性視神経萎縮症(LHON)、ミトコンドリアミオパチー、脳症、乳酸アシドーシス及び脳卒中症候群(MELAS)、ケジェール視神経症(Kjer's optic neuropathy)、ニューロパシー運動失調及び網膜色素変性(NARP)、常染色体優性視神経萎縮症、カーンズセイヤー症候群、赤色ぼろ線維を有するミオクローヌスてんかん(MERRF)症候群が挙げられる。二次ミトコンドリア病(SMD)は、フリートライヒ運動失調症、遺伝性痙性対麻痺、シャルコーマリートゥース病を含む、ミトコンドリア機能に直接的に影響を及ぼす核遺伝子における変異によって引き起こされる疾患の群である。
【０００４】
それぞれの個別の障害は希少なものであるが、集合的には、成人のMDの総有病率は、およそ4300人に1人であると推定され、遺伝性神経疾患の最も有病率が高い群のうちの1つとなっている(Gormanら、2015)。
【０００５】
中枢神経系及び/又は眼に影響を及ぼす神経変性障害はミトコンドリア機能不全に関連していることが多く;前記障害は、散発性又は家族性の性質ものであり:例えば、散発性の加齢神経変性疾患としては、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、加齢黄斑変性症(AMD)、糖尿病性網膜症、緑内障が挙げられる。
【０００６】
家族性の神経変性疾患としては、家族性PD、AD、ハンチントン病、網膜色素変性症(RP)、シュタルガルト病が挙げられる。
【０００７】
ミトコンドリア病(PMDとSMDの両方)は、生化学的及び遺伝学的に異種混交であり、その複雑さによって、これまで有効な処置の開発が妨げられてきた。患者の大多数に対して、治療は、合併症、例えば、糖尿病、心臓病併発、及びてんかんを防止又は処置することのいずれかに限定されている。利用可能な処置は、ミトコンドリア機能不全の特定の態様に対して支持的であるか(一次欠陥(primary defects)を対象としない)又は焦点を当てたものである。したがって、有効な治療は今日まで利用可能ではなく、ミトコンドリア病に罹患した患者を処置することは主要な課題のままである(Lightowlersら、2015;Viscomiら、2015)。近年、ミトコンドリア生合成/動態又はミトコンドリアクリアランス/ミトコンドリア品質管理のいずれかの具体的モジュレーションが、in vitro及びin vivo MDモデルの両方において、可能な治療戦略として試験されてきた(Ceruttiら、2014;Civilettoら、2018;Civilettoら、2015;Johnsonら、2013;Viscomiら、2011)。一部の有望なデータにもかかわらず、後者のアプローチは、結果の不一致をもたらし、様々なMDモデルにわたり有効ではなかった[(Lightowlersら、2015;Viscomiら、2015)に概説されている]。したがって、MDに対する治療戦略として、ミトコンドリア経路のより有効なモジュレーションに対する需要が存在する。
【０００８】
神経変性障害、例えば、PD又はADに対して利用可能な有効な治療は存在しない。ADは、症例の60〜80%を占める、認知症の最も一般的な原因であり、一方、工業先進国におけるPDの有病率は、一般的に、60歳を超えるヒトの1%と推定され、これは、これまでの処置選択肢がほとんど対症的であることを考えると、健康システムに対する重要な負荷となっている(Barnes及びYaffe、2011;de Lau及びBreteler、2006)。
【０００９】
マイクロRNA(miRNA)は、遺伝子発現の根本的な優れた調節因子であり、病因及び病気の進行に関与する複数の分子経路を同時にモジュレートする能力があるので、有望な治療ツールとなっている。miRNAのモジュレーションは、様々な障害を治療する目的で適用されており、特定の場合には前臨床及び臨床段階に到達している(Broderick及びZamore、2011;Christopherら、2016;Janssenら、2013;Lingら、2013)。miRNAは、神経細胞の生存に重要な役割を担っており、蓄積されている証拠では、miRNAに調節される遺伝子ネットワークが変更されてしまうと神経変性障害のリスクが増大することが示されている(Hebert及びDe Strooper、2009)。miR-181ファミリーのメンバーは、3つの別個の染色体に位置する3つの独立した転写一次産物によって生成される。それぞれの転写産物は、全部で6つの前駆体配列に対して2つの前駆体配列を生成する。各前駆体は2つのmiRNA鎖を生成する:全部で10個の成熟miRNA形態:miR-181a-5p、miR-181a-l-3p、miR-181a-2-3p、miR-181b-5p、miR-181b-l-3p、miR-181b-2-3p miR-181c-5p、miR-181c-3p、miR-181d-5p及びmiR-181d-3pについて、ガイド鎖又は5p、及びパッセンジャー鎖又は3p。5p成熟配列は、哺乳動物の組織において最も高い発現レベルを示すものであり(Karaliら、2016)、かなりの度合いの機能的冗長性を示唆する同じ5'「シード」配列を含有する(Henao-Mejiaら、2013;Jiら、2009)。本明細書で使用する場合、6つの成熟5p miRNAは以下のように定義される:miR-181a-l、miR-181a-2、miR-181b-l、miR-181b-2、miR-181c、及びmiR-181d。miR-181a-l及びmiR-181a-2の成熟形態、並びにmiR-181b-l及びmiR-181b-2の成熟形態は、配列が同一であり;miR-181cの成熟形態は、miR-181aと比較して1つのヌクレオチドの差を有し、一方miR-181dの成熟形態は、miR-181bと比較して1つのヌクレオチドの差を有する。miR-181a及びmiR-181b(miR-181a/b)は、脊椎動物において高度に保存されており、脳及び網膜の様々な領域において高度に発現され(Boudreauら、2014;Karaliら、2016)、ミトコンドリア依存性細胞死(Hutchisonら、2013;Ouyangら、2012;Rodriguez-Blazquezら、2015)及びオートファジー(Chengら、2016;He etら、2013;Tekirdagら、2013)に関与する遺伝子を標的とすることが最近報告された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】WO2010/040112
【特許文献２】米国特許第5,013,830号
【特許文献３】米国特許第5,149,797号
【特許文献４】米国特許第5,220,007号
【特許文献５】米国特許第5,256,775号
【特許文献６】米国特許第5,366,878号
【特許文献７】米国特許第5,403,711号
【特許文献８】米国特許第5,491,133号
【特許文献９】米国特許第5,565,350号
【特許文献１０】米国特許第5,623,065号
【特許文献１１】米国特許第5,652,355号
【特許文献１２】米国特許第5,652,356号
【特許文献１３】米国特許第5,700,922号
【特許文献１４】米国特許第5,034,506号
【特許文献１５】米国特許第3,687,808号
【特許文献１６】米国特許第4,469,863号
【特許文献１７】米国特許第4,476,301号
【特許文献１８】米国特許第5,023,243号
【特許文献１９】米国特許第5,177,196号
【特許文献２０】米国特許第5,188,897号
【特許文献２１】米国特許第5,264,423号
【特許文献２２】米国特許第5,276,019号
【特許文献２３】米国特許第5,278,302号
【特許文献２４】米国特許第5,286,717号
【特許文献２５】米国特許第5,321,131号
【特許文献２６】米国特許第5,399,676号
【特許文献２７】米国特許第5,405,939号
【特許文献２８】米国特許第5,453,496号
【特許文献２９】米国特許第5,455,233号
【特許文献３０】米国特許第5,466,677号
【特許文献３１】米国特許第5,476,925号
【特許文献３２】米国特許第5,519,126号
【特許文献３３】米国特許第5,536,821号
【特許文献３４】米国特許第5,541,306号
【特許文献３５】米国特許第5,550,111号
【特許文献３６】米国特許第5,563,253号
【特許文献３７】米国特許第5,571,799号
【特許文献３８】米国特許第5,587,361号
【特許文献３９】米国特許第5,625,050号
【特許文献４０】米国特許第5,166,315号
【特許文献４１】米国特許第5,185,444号
【特許文献４２】米国特許第5,214,134号
【特許文献４３】米国特許第5,216,141号
【特許文献４４】米国特許第5,235,033号
【特許文献４５】米国特許第5,264,562号
【特許文献４６】米国特許第5,264,564号
【特許文献４７】米国特許第5,405,938号
【特許文献４８】米国特許第5,434,257号
【特許文献４９】米国特許第5,470,967号
【特許文献５０】米国特許第5,489,677号
【特許文献５１】米国特許第5,541,307号
【特許文献５２】米国特許第5,561,225号
【特許文献５３】米国特許第5,596,086号
【特許文献５４】米国特許第5,602,240号
【特許文献５５】米国特許第5,610,289号
【特許文献５６】米国特許第5,608,046号
【特許文献５７】米国特許第5,618,704号
【特許文献５８】米国特許第5,623,070号
【特許文献５９】米国特許第5,663,312号
【特許文献６０】米国特許第5,633,360号
【特許文献６１】米国特許第5,677,437号
【特許文献６２】米国特許第5,677,439号
【特許文献６３】米国特許第5,539,082号
【特許文献６４】米国特許第5,714,331号
【特許文献６５】米国特許第5,719,262号
【特許文献６６】米国特許第4,845,205号
【特許文献６７】米国特許第5,130,302号
【特許文献６８】米国特許第5,134,066号
【特許文献６９】米国特許第5,175,273号
【特許文献７０】米国特許第5,367,066号
【特許文献７１】米国特許第5,432,272号
【特許文献７２】米国特許第5,457,187号
【特許文献７３】米国特許第5,459,255号
【特許文献７４】米国特許第5,484,908号
【特許文献７５】米国特許第5,502,177号
【特許文献７６】米国特許第5,525,711号
【特許文献７７】米国特許第5,552,540号
【特許文献７８】米国特許第5,587,469号
【特許文献７９】米国特許第5,596,091号
【特許文献８０】米国特許第5,614,617号
【特許文献８１】米国特許第5,750,692号
【特許文献８２】米国特許第5,681,941号
【特許文献８３】米国特許第4,828,979号
【特許文献８４】米国特許第4,948,882号
【特許文献８５】米国特許第5,218,105号
【特許文献８６】米国特許第5,525,465号
【特許文献８７】米国特許第5,541,313号
【特許文献８８】米国特許第5,545,730号
【特許文献８９】米国特許第5,552,538号
【特許文献９０】米国特許第5,578,717号
【特許文献９１】米国特許第5,580,731号
【特許文献９２】米国特許第5,591,584号
【特許文献９３】米国特許第5,109,124号
【特許文献９４】米国特許第5,118,802号
【特許文献９５】米国特許第5,138,045号
【特許文献９６】米国特許第5,414,077号
【特許文献９７】米国特許第5,486,603号
【特許文献９８】米国特許第5,512,439号
【特許文献９９】米国特許第5,578,718号
【特許文献１００】米国特許第4,587,044号
【特許文献１０１】米国特許第4,605,735号
【特許文献１０２】米国特許第4,667,025号
【特許文献１０３】米国特許第4,762,779号
【特許文献１０４】米国特許第4,789,737号
【特許文献１０５】米国特許第4,824,941号
【特許文献１０６】米国特許第4,835,263号
【特許文献１０７】米国特許第4,876,335号
【特許文献１０８】米国特許第4,904,582号
【特許文献１０９】米国特許第4,958,013号
【特許文献１１０】米国特許第5,082,830号
【特許文献１１１】米国特許第5,112,963号
【特許文献１１２】米国特許第5,214,136号
【特許文献１１３】米国特許第5,245,022号
【特許文献１１４】米国特許第5,254,469号
【特許文献１１５】米国特許第5,258,506号
【特許文献１１６】米国特許第5,262,536号
【特許文献１１７】米国特許第5,272,250号
【特許文献１１８】米国特許第5,292,873号
【特許文献１１９】米国特許第5,317,098号
【特許文献１２０】米国特許第5,371,241号
【特許文献１２１】米国特許第5,391,723号
【特許文献１２２】米国特許第5,416,203号
【特許文献１２３】米国特許第5,451,463号
【特許文献１２４】米国特許第5,510,475号
【特許文献１２５】米国特許第5,512,667号
【特許文献１２６】米国特許第5,514,785号
【特許文献１２７】米国特許第5,565,552号
【特許文献１２８】米国特許第5,567,810号
【特許文献１２９】米国特許第5,574,142号
【特許文献１３０】米国特許第5,585,481号
【特許文献１３１】米国特許第5,587,371号
【特許文献１３２】米国特許第5,595,726号
【特許文献１３３】米国特許第5,597,696号
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【特許文献１４４】US2008/0249039
【特許文献１４５】WO2010/129746
【特許文献１４６】W02010/040112
【特許文献１４７】米国特許第6,268,490号
【特許文献１４８】米国特許第6,734,291号
【特許文献１４９】米国特許第6,770,748号
【特許文献１５０】米国特許第6,794,499号
【特許文献１５１】米国特許第7,034,133号
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【特許文献１５３】米国特許第7,060,809号
【特許文献１５４】米国特許第7,084,125号
【特許文献１５５】米国特許第7,572,582号
【特許文献１５６】付与前の米国公開公報第2010/0267018号
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【特許文献１６１】米国特許第7,067,641号
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【特許文献１６３】WO97/045069
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【特許文献１６５】米国特許出願第2012/0015865号
【特許文献１６６】米国特許出願第2011/0305769号
【特許文献１６７】米国特許出願第2011/0262527号
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【特許文献１６９】米国特許出願第2010/0305198号
【特許文献１７０】米国特許出願第2010/0203112号
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【特許文献１７３】US2010/0004320
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【非特許文献７９】http://www.ensembl.org/index.html
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、眼及び/若しくは脳に関与するミトコンドリア病を含むミトコンドリア障害並びにミトコンドリア機能不全に伴う眼及び/若しくは脳に影響を及ぼす神経変性の処置及び/又は防止のための、miR-181阻害剤に関する。本発明者らは、驚くべきことに、miR-181、特にmiR-181 a及びbが、CNSにおけるミトコンドリア生合成、機能性、及び抗酸化応答に関係する遺伝子を制御することによって、ミトコンドリア機能の包括的調節に関与することを見出し;さらに、本発明者らは、miR-181a/b分子が、ミトコンドリア依存性プログラム細胞死及びオートファジー/マイトファジー関連遺伝子の発現をモジュレートし、同時に且つ精密に、CNSにおけるミトコンドリア経路をモジュレートすることを見出した。
【００１３】
本発明者らは、驚くべきことに、miR-181の阻害が、特に、遺伝子に依存しない治療戦略が非常に望ましいMD、PD及びRPなどの遺伝学的に異種混交の状態に対して特に高い関連性を有して、MD及びミトコンドリア機能不全に伴う神経変性症において神経保護作用を発揮することを実証した。本発明者らは、miR-181a/bが生合成及びクリアランスの優れた協調によりミトコンドリアの代謝回転をモジュレートすることを見出した。本発明者らは、miR-181の阻害が、特に、ミトコンドリアに媒介される細胞死並びにリー症候群、レーバー遺伝性視神経萎縮症(LHON)、ミトコンドリアミオパチー、脳症、乳酸アシドーシス及び脳卒中症候群(MELAS)、赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん(MERRF)、進行性外眼筋麻痺(PEO)、ピアソン症候群、母系遺伝性ミオパチー及び心筋症(MIMyCA)、ケジェール視神経症、ニューロパシー運動失調及び網膜色素変性(NARP)、常染色体優性視神経萎縮症、カーンズセイヤー症候群、赤色ぼろ線維を有するミオクローヌスてんかん(MERRF)症候群を含むPMD;フリートライヒ運動失調症、遺伝性痙性対麻痺、シャルコーマリートゥース病を含むSMDなどの疾患における神経変性症;散発性加齢神経変性疾患、例えば、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、加齢黄斑変性症(AMD)、糖尿病性網膜症、緑内障;家族性PD、AD、ハンチントン病、網膜色素変性症(RP)、シュタルガルト病を含む家族性神経変性疾患を含むミトコンドリア機能不全に関連する中枢神経系及び/又は眼に影響を及ぼす神経変性障害から保護することによって、ミトコンドリア機能不全によって特徴付けられるいくつかの病態に関して有益な効果を発揮することをさらに見出した。
【００１４】
次いで、本発明は、ミトコンドリア障害の処置及び/又は防止において使用するためのmiR-181の阻害剤を提供する。
【００１５】
本発明において、ミトコンドリア障害とミトコンドリア病は同様に使用される。本発明のこの態様によれば、ミトコンドリア障害の処置及び/又は防止は、前記障害の少なくとも1つの症状を緩和するのに有効でありうる。
【００１６】
この障害の根底にある原因を処置する場合、症状の管理も同様に達成することができると考えられる。症状の管理によって、症状の重篤度が維持される場合があり(すなわち、症状の悪化又は進展が制御される)、又はより好ましくは、症状の重篤度が全体的に又は部分的に低減されうることが意図される。
【００１７】
本明細書で使用する場合、「処置(treatment)」(及び「処置する(treat)」又は「処置すること(treating)」などのその文法上の変形)又は「予防(prevention)」(及び「予防する(prevent)」又は「予防すること(preventing)」などのその文法上の変形)は、処置される個体の自然経過を変更することを試みる臨床的介入を指し、予防中又は臨床病理若しくは障害の経過中に実施することができる。処置の望ましい効果としては、以下に限定されないが、疾患又は障害の発症又は再発を防止すること、症状の軽減、疾患又は障害の任意の直接的又は間接的な病理学的帰結の消失、ぶり返しの防止、疾患/障害の進行速度の低下、疾患/障害の状態の改善又は一時的緩和、及び寛解又は予後改善が挙げられる。一部の実施形態では、本発明の阻害剤は、疾患若しくは障害の発症を遅らせるため、又は疾患若しくは障害の進行を緩徐化するために使用される。
【００１８】
好ましくは、前記阻害剤は、阻害性核酸剤、小分子又はゲノム編集剤である。編集剤は、標的化された遺伝子の破壊又は修復を媒介することができる薬剤であり、前記薬剤は、操作されたヌクレアーゼ、例えば、Znフィンガーヌクレアーゼ、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ、又はクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート系である。
【００１９】
好ましくは、阻害性核酸剤は、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、アンタゴミア(antagomir)、LNA)、miRNAスポンジ、及び/又は本明細書において定義されたリボザイムからなる群から選択される。
【００２０】
さらに好ましくは、miR-181の阻害剤は、miR-181に対して相補的な少なくとも1つの配列を含む。好ましくは、miR-181の阻害剤は、ACAUUCA(配列番号5)に対して相補的な少なくとも1つの配列を含むか又はACAUUCA(配列番号5)を含む。好ましくは、前記阻害剤は、miR-181の機能及び/又は活性を低減する。
【００２１】
miR-181の機能及び活性は、当技術分野において公知の、特に本明細書に記載されている任意の方法によって測定することができる。
【００２２】
より好ましくは、前記阻害剤は、miRNA活性を阻害すること、好ましくはmRNA標的結合を阻害すること、少なくとも1つの特異的miR-181標的のmRNAレベルを上昇させること、ミトコンドリア機能を改善すること、ミトコンドリアの数を増加させること、酸化ストレス及び/又は細胞死を低減すること、細胞の生存を改善することからなる群から選択される少なくとも1つの特性を有する。上記特性は、当技術分野において公知の、特に本明細書に記載されている任意の方法によって測定することができる。
【００２３】
好ましくは、前記miR-181は、miR-181前駆体又は成熟miR-181であり、好ましくは前記miR-181は、miR-181a-l、miR-181a-2、miR-181b-l、miR-181b-2、miR-181c、and miR-181d又はこれらの組合せからなる群から選択される。
【００２４】
好ましくは、miR-の阻害剤は、ACAUUCA(配列番号5)の配列を含むか又はACAUUCA(配列番号5)の配列を含み、且つ配列番号1又は配列番号2又は配列番号3又は配列番号4と少なくとも80%の配列同一性を有する。好ましくは、miR-の阻害剤は、配列番号1又は配列番号2又は配列番号3又は配列番号4と少なくとも85%、90%、95%、99%の同一性を有する。
【００２５】
さらに好ましくは、前記阻害剤は、18〜21ヌクレオチド長である。
【００２６】
好ましい実施形態では、前記miR-の阻害剤は、式:
(X1sX2sX3)n1S2(X1sX2sX3)n2
(式中、
X1、X2及びX3は、独立して、
-  好ましくは、バルジを作製するためにヌクレオチド9〜ヌクレオチド12を修飾した、miR-181a及び/又はmiR-181cに相補的なMPS SEQ、
-  好ましくは、バルジを作製するためにヌクレオチド9〜ヌクレオチド12を修飾した、miR-181b及び/又はmiR-181dに相補的なMPS SEQ
から選択され;
X3は存在しても存在しなくてもよく;
sは、4〜6ヌクレオチド、好ましくは4ヌクレオチドのスペーサー配列であり;
S2は、好ましくは、制限酵素部位、好ましくはXbal制限酵素に関する部位に相当する4〜6ヌクレオチド、好ましくは6ヌクレオチドの中心のスペーサー配列であり;
n1及びn2は、3、6及び24から、好ましくは3、6及び12の中から独立して選択される数であり、最も好ましくは、nは3であり、n1及びn2は同一であっても異なっていてもよい)
を有するmiRNAスポンジである。
【００２７】
好ましい実施形態では、前記miRNAスポンジは、式:
(AsB)n1S2(AsB)n2
(式中、
Aは、バルジを作製するためにヌクレオチド9〜ヌクレオチド12を修飾した、miR-181a及び/又はmiR-181cに相補的なMPS SEQであり;
Bは、バルジを作製するためにヌクレオチド9〜ヌクレオチド12を修飾した、miR-181b及び/又はmiR-181dに相補的なMPS SEQであり;
Sは、4〜6ヌクレオチド、好ましくは4ヌクレオチドのスペーサー配列であり;
S2は、好ましくは、制限酵素、好ましくはXbal制限酵素に関する部位に相当する4〜6ヌクレオチド、好ましくは6ヌクレオチドの中心のスペーサー配列であり
n1及びn2は、3、6及び24から、好ましくは3、6及び12の中から独立して選択される数であり、最も好ましくは、nは3であり、n1及びn2は同一であっても異なっていてもよい)
を有する。
【００２８】
好ましくは、X1、X2、X3、Aは、3'TTGTAAGTnln2n3n2ACAGCCACTCA5'(配列番号113)であり、
IUPAC命名法によれば、
n1=A若しくはC若しくはG
n2=A若しくはC若しくはT
n3=A若しくはG若しくはT
又はX1、X2、X3、Bは、3'TTGTAAGTn'ln'ln'2n'3ACAGCCACCCA5'(配列番号114)であり、
IUPAC命名法によれば、
n'1=C若しくはG若しくはT
n'2=A若しくはG若しくはT
n'3=A若しくはC若しくはT;
又はn1=3及びn2=3;
又はSは、4ヌクレオチドからなり、好ましくはS=tagc;
又はS2は、6ヌクレオチドからなり、好ましくはS2=Tctagaである。
【００２９】
好ましくは、阻害剤の配列は、1つ以上のロックド核酸(LNA)ヌクレオチド及び1つ以上の非ロックドヌクレオチドをさらに含み、非ロックドヌクレオチドの少なくとも1つは化学修飾を含み、好ましくはロックド核酸(LNA)ヌクレオチドは2〜4'メチレン架橋を有し、好ましくは化学修飾は2'O-アルキル又は2'ハロ修飾である。
【００３０】
さらに好ましくは、miR-181の前記阻害剤は、少なくとも1つの追加の薬剤と共に使用される。
【００３１】
より好ましくは、前記少なくとも1つの追加の薬剤は、上記で定義されている、本発明のmiR-181の阻害剤である。
【００３２】
次いで、この使用は、miR-181、すなわち、1つ以上のsiRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、アンタゴミア、LNA)、miRNAスポンジ、及び/又は同じであっても異なっていてもよいリボザイムの1つ以上の阻害剤の組合せを指す。
【００３３】
好ましい実施形態では、前記少なくとも1つの追加の薬剤は、ミトコンドリア生合成を増加させる薬剤(すなわち、酸化的リン酸化の増加及び/又は呼吸鎖複合体、例えば、NAD+前駆体(例えば、とりわけニコチンアミドリボシド)、AMPKアゴニスト(例えば、AICAR)、Poly ADPリボースポリメラーゼ(PARP)阻害剤(例えば、とりわけOlaparib(AZD-2281))、Resveratrol、メトホルミン、レチノイン酸の活性欠損における改善をもたらすミトコンドリア生合成を制御する経路を活性化する薬剤)、オートファジーをモジュレートする薬剤、例えば、オートファジーの活性化剤、例えば、mTOR阻害剤(例えば、ラパマイシン)、アポトーシスを阻害する薬剤、ROSスカベンジャー、例えば、リポ酸、ビタミンC及びE、並びにCoQを含む抗酸化化合物、ヘテロプラスミーをシフトする薬剤、毒性化合物のスカベンジャー、N-アセチルシステイン(NAC)、メトロニダゾール、ヌクレオチドの補充、膜透過性遷移孔阻害剤、例えば、シクロスポリンA又はその誘導体、不足している因子を置き換える薬剤、例えば、体内に欠乏しているか若しくは存在しない酵素を置き換える酵素補充療法、又は遺伝子療法、例えば、疾患を処置するための薬剤としての核酸の患者の細胞内への治療的送達から選択されるミトコンドリア機能を改善する薬剤からなる群から選択される。本発明の好ましい追加の薬剤は、本発明の疾患を処置するための薬剤、例えば、LHON疾患の処置のための薬剤:イデベノン、ユビキノンの合成類似体であり、脳におけるミトコンドリアの酸化的代謝を改善する及び酸化ストレスを低減することによって作用する(Lyseng-Williamson、2016;Sanchezら、2016)。ヒドロキソコバラミン、ビタミンB12の合成の注射可能形態、ヒト野生型ミトコンドリアND4遺伝子を含有する組換えAAVベクター血清型2、ヒト野生型ミトコンドリアND1遺伝子を含有する組換えAAVベクター、エラミプレチド、ミトコンドリア膜透過性遷移孔開口ブロッカー。
【００３４】
好ましくは、miR-181の前記阻害剤及び少なくとも1つの追加の薬剤は、連続的に又は同時に投与される。
【００３５】
本発明は、以前の実施形態のいずれか1つにおいて定義されているmiR-181の阻害剤、又はその薬学的に許容される塩、並びにミトコンドリア障害の処置及び/又は防止において使用するための薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物も提供する。
【００３６】
好ましくは、この組成物は、少なくとも1つの追加の薬剤をさらに含み、好ましくは、前記少なくとも1つの追加の薬剤は、上記で定義されているmiR-181の阻害剤であり、好ましくは、前記少なくとも1つの追加の薬剤は、ミトコンドリア生合成を増加させる薬剤、オートファジーをモジュレートする薬剤、アポトーシスを阻害する薬剤、ROSスカベンジャー、ヘテロプラスミーをシフトする薬剤、毒性化合物のスカベンジャー、ヌクレオチドの補充、不足している因子を置き換える薬剤からなる群から選択される。
【００３７】
本発明は、それを必要とする対象におけるミトコンドリア障害を処置する方法であって、上記で定義されている少なくとも1つのmiR-181の阻害剤又は上記で定義されている医薬組成物を対象に投与する工程を含む方法をさらに提供する。
【００３８】
本発明はまた、上記で定義されている少なくとも1つのmiR-181の阻害剤及びプロモーター配列を含むベクターを提供し、好ましくはベクターはウイルスベクター、好ましくは、ミトコンドリア障害の処置及び/又は防止において使用するためのアデノ随伴ウイルスベクターである。好ましくは、ミトコンドリア病は、一次又は二次ミトコンドリア病である。
【００３９】
好ましくは、ミトコンドリア病は、眼及び/若しくは脳に関与するミトコンドリア病、ミトコンドリア機能不全に伴う眼及び/若しくは脳に影響を及ぼす神経変性症からなる群から選択される。
【００４０】
さらに好ましくは、ミトコンドリア病は、リー症候群、レーバー遺伝性視神経萎縮症(LHON)、ミトコンドリアミオパチー、脳症、乳酸アシドーシス及び脳卒中症候群(MELAS)、赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん(MERRF)、進行性外眼筋麻痺(PEO)、ピアソン症候群、母系遺伝性ミオパチー及び心筋症(MIMyCA)、ケジェール視神経症、ニューロパシー運動失調及び網膜色素変性(NARP)、常染色体優性視神経萎縮症、カーンズセイヤー症候群、赤色ぼろ線維を有するミオクローヌスてんかん(MERRF)症候群、フリートライヒ運動失調症、遺伝性痙性対麻痺、シャルコーマリートゥース病、散発性加齢神経変性疾患、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、加齢黄斑変性症(AMD)、糖尿病性網膜症、緑内障、家族性神経変性疾患、家族性PD、AD、ハンチントン病、網膜色素変性症(RP)、シュタルガルト病からなる群から選択される。
【００４１】
本発明は、以下の図面を参照して非限定的例によって記載されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１−１】miR-181a/bはミトコンドリアの生合成及びマイトファジー(mitophagy)をモジュレートする。A)qRT-PCRは、miR-181a/bサイレンシングがSH-SY5Y細胞におけるmiR-181a/bの予測標的の上方調節をもたらすことを確認する。N=3回の独立した実験である。B)miR-181模倣物のトランスフェクションは、WT3'-UTR予測標的配列を含有する構築物のルシフェラーゼ活性を特異的に阻害する。miR-181a/b結合部位における点変異(mut)はルシフェラーゼ抑制を消失させる。データは、陰性模倣物トランスフェクション(破線)に対して正規化されている。N=6回の独立した実験である。
【図１−２】C)qRT-PCRは、miR-181a/b-1+/+動物に対してmiR-181a/b-1-/-動物の眼におけるmiR-181a/b標的の上方調節を明らかにしている。n≧5匹の動物/遺伝子型である。  D)miR-181a/b-1-/-マウスは、miR-181a/b-1+/+マウスに対して増加したmtDNA含有量を示す。N=4匹の動物/遺伝子型である。
【図１−３】E)WB分析(左側パネル)は、miR-181a/b-1+/+(+/+)マウスに対してmiR-181a/b-1-/-(-/-)マウスの眼において増加したレベル(右のパネルに定量化されている)のミトコンドリアタンパク質を明らかにしている。データはp115又はGapdhのいずれかに対して正規化されている。N=3匹の動物/遺伝子型である。+/+及び-/-の試料の全ての比較バンドが、データ提示の明快さのために、接種され、分割を示す同じブロットからのものであることに留意すること。F)ミトコンドリア及び細胞質フラクションに対するWB分析(左側パネル)は、+/+マウスに対して-/-マウスの眼のミトコンドリアフラクションにおいて増加したレベルのp62及びパーキン(右パネルに定量化されている)を示す。データは、ミトコンドリア及び細胞質フラクションそれぞれについてNdufb8又はGapdhdに対して正規化されている。N=3匹の動物/遺伝子型である。*はp<0.05であり、**はp<0.01であり、***はp<0.001であり、片側(A〜C及びE)、及び両側(D)スチューデントt検定である。
【図２−１】miR-181a/bの阻害は、線状皮膚欠損を伴う小眼球症(Microphthalmia with Linear Skin defects)(MLS)メダカ(medakafish)モデルにおいて細胞死に対して対抗する。A)st30メダカ対照胚及びMO注射胚の網膜及び脳の切片におけるTUNELアッセイは、hccs-MO及びcox7b-MO注射胚それぞれと比較して、hccs-MO/miR-181a/b-MO及びcox7b-MO/miR-181a/b-MO注射胚の両方においてアポトーシス細胞の数が減少したことを明らかにしている。スケールバーは20μmである。B)TUNEL陽性細胞数/眼である。各モデルあたりn≧5個の網膜である。
【図２−２】C)カスパーゼアッセイは、hccs-MO及びcox7b-MO注射胚それぞれと比較して、hccs-MO/miR-181a/b-MO及びcox7b-MO/miR-181a/b-MO注射胚において回復されたレベルのカスパーゼ-3及びカスパーゼ-9を示す。各モデルあたりn≧5個の胚である。*はp<0.05であり、**はp<0.01であり、***はP<0.001である。負の二項分布の一般化線形モデルの逸脱分析(Analysis of Deviance for Negative Binomial Generalized Linear Model)(B)であり、事後チューキー分析を伴う一元配置ANOVA(One way ANOVA with post-hoc Tukey analysis)(C)であり、エラーバーはSEMである。
【図３】miR-181a/bの下方調節は、MLSメダカモデルの表現型を改善する。(A〜I)hccs-MO(B)及びcox7b-MO(H)のみを注射した又はmiR-181a/b-MOと同時注射した(C、I)st30メダカ胚の代表的な画像である。miR-181a/b-MOとの同時注射は、hccs-MO胚及びcox7b-MO胚の両方において小眼球症及び小頭症から救出している。(D〜F、J〜L)hccs-MO/miR-181a/b-MO注射胚及びcox7b-MO/miR-181a/b-MO注射胚を、Baf-A1、PD98059又はHA14-1で処理した。Baf-A1処理は、hccs-MO/miR-181a/b-MO注射胚及びcox7b-MO/miR-181a/b-MO注射胚の両方においてmiR-181a/bの下方調節の保護効果に対抗する(D、J)。PD98059処理は、miR-181a/bの下方調節により媒介されたMLS表現型のモジュレーションに干渉しない(E、K)。HA14-1処理は、hccs-MO/miR-181a/b-MOモデルにおけるmiR-181a/bの下方調節の効果に対抗するが、cox7b-MO/miR-181a/b-MO胚では対抗しない(F、L)。スケールバーは100μmである。(M〜N)hccs-MO(M)胚及びcox7b-MO(N)胚の(A〜L)で説明された異なる条件下でMLS表現型を有する又は有さない胚の百分率である。n≧300個の胚/条件であり、**はp<0.01であり、***はp<0.001であり、一般化線形モデルの逸脱分析であり、エラーバーはSEMである。
【図４−１】miR-181a/b-1の不活性化は、LHON症候群のロテノン誘導マウスモデルにおける細胞死からRGCを保護する。A)ロテノン又はDMSOを硝子体内注射したmiR-181a/b-1+/+マウス及びmiR-181a/b-1-/-マウスの網膜における抗NeuN抗体による免疫蛍光分析である。RGCは、注射の1週間後及び2週間後の両方で、対照と比較してmiR-181a/b-1-/-ロテノン注射マウスに保存されている。スケールバーは50μmである。B)注射の1週間後及び2週間後のRGC/mmの数である(%で示されている)。N=10個である。C)サイクル/程度の変化倍率として報告されている視運動トラッキングアッセイ(optokinetic tracking assay)の結果のグラフ表示である。視力は、注射の1週間後及び2週間後の両方で、対照と比較してmiR-181a/b-1-/-ロテノン注射マウスに保存されている。N=10個である。***はp<0.001であり、事後チューキー分析を伴う一元配置ANOVA(B、C)であり、エラーバーはSEMである。
【図４−２】D)ロテノン又はDMSOを硝子体内内注射したmiR-181a/b-1+/+マウス及びmiR-181a/b-1-/-マウスの網膜切片におけるNADHデヒドロゲナーゼ組織化学反応である。注射の1週間後、NADHデヒドロゲナーゼ活性は、miR-181a/b-1+/+ロテノン注射眼のRGC(GCL、破線内の区域)において失われているが、miR-181a/b-1-/-ロテノン注射眼では保存されている。GCLは神経節細胞層であり、INLは内顆粒層であり、ONLは外顆粒層である。スケールバーは50μmである。E)ロテノン又はDMSOのいずれかを注射したmiR-181a/b-1+/+マウス及びmiR-181a/b-1-/-マウスの網膜における、抗CoxIV抗体による免疫蛍光分析は、miR-181a/b-1-/-ロテノン注射眼において保護されているミトコンドリアを示した。スケールバーは10μmである。
【図５】miR-181a/bの枯渇がRGCを保護し、Ndufs4-/-マウスにおける視覚機能を改善する。A〜D)WT、Ndufs4-/-、Ndufs4-/-/miR-181a/b-1-/-及びmiR-181a/b-1-/-マウスの網膜における抗NeuN抗体による免疫蛍光分析である。RGCは、Ndufs4-/-マウスに対してNdufs4-/-/miR-181a/b-1-/-マウスにおいて保存されている。スケールバーは50μmである。E)RGC/mmの数(%)である。N=5個である。F)サイクル/程度の変化倍率として報告されている視運動トラッキングアッセイの結果のグラフ表示である。視力は、Ndufs4-/-マウスに対してNdufs4-/-/miR-181a/b-1-/-マウスにおいて保存されている。N≧8個である。G、H)網膜電図分析は、Ndufs4-/-マウスに対してNdufs4-/-/miR-181a/b-1-/-マウスにおけるb波の改善を明らかにしている。N≧5個である。p値は、E、Fでは事後チューキー分析を伴う一元配置ANOVAにより、Gでは事後分析を伴う2回のANOVA反復測定により計算した。Gのp値は20log cd.s/m2及び明順応点を指す。他の点のp値は添付表S1に報告されており、エラーバーはSEMである。
【図６】miR-181a/bの枯渇は、Nrf1及びPark2の転写レベルを増加し、Ndufs4-/-網膜におけるマイトファジーを増強する。A)q-RT-PCRは、Ndufs4-/-動物に対してNdufs4-/-/miR-181a/b-1-/-動物の眼におけるmiR-181a/bの標的Nrf1及びPark2の上方調節を明らかにしている。N=4匹の動物/遺伝子型である。B)細胞死分析は、NRF1の下方調節が、FCCPで処理したSH-SY5Y細胞のmiR-181a/b媒介保護を消失させることを示している。N=4個である。C)ミトコンドリアフラクションに対するWB分析は、Ndufs4-/-マウスに対してNdufs4-/-/miR-181a/b-1-/-マウスの眼のミトコンドリアフラクションにおいて増強された増加レベルのp62及びパーキン(Dに定量化されている)を示している。データはCsに対して正規化されている。N=3匹の動物/遺伝子型であり、p値は、Bでは事後分析を伴う一元配置ANOVAにより、Dでは片側スチューデントt検定により計算した。エラーバーはSEMである。
【図７】miR-181a/bの枯渇は、Ndufs4-/-マウスのミトコンドリア生合成を増強する。A〜C)電子顕微鏡分析は、ミトコンドリア形態の改善及びNdufs4-/-マウスに対してNdufs4-/-/miR-181a/b-1-/-マウスにおいてミトコンドリア数の増加を示している。スケールバーは1μmである。ミトコンドリアの定量的増加がCにおいて報告されており、ミトコンドリア/RGCの数もp30及びp55において報告されている。N≧2匹の動物/遺伝子型である。D)Ndufs4-/-/miR-181a/b-1-/-マウスは、q-PCRにより測定するとNdufs4-/-マウスに対して増加したmtDNA含有量を示す。N≧4匹の動物/遺伝子型である。E)MRC複合体I、II及びIVの生化学活性は、Ndufs4-/-マウスに対するNdufs4-/-/miR-181a/b-1-/-マウスにおけるクエン酸シンターゼ(CS)活性の百物率により正規化した。N≧3匹の動物/遺伝子型である。p値は両側スチューデントt検定により計算し、エラーバーはSEMである。
【図８】miR-181a/bの阻害は、メダカにおける6-OHDA誘導細胞死からDAニューロンを保護する。A)メダカの脳におけるRNA ISHは、青斑核(矢印)に局在化したDAニューロンにmiR-181a及びmiR-181bの強い発現を示している。スケールバーは100μmである。(B〜D)DAニューロンを可視化するための、st38対照(DMSO処理)の脳(B)、6-OHDA処理対照の脳(C)及び6-OHDA処理miR-181a/b-MO注射メダカの脳(D)に対する抗TH免疫組織化学染色である。6-OHDA処理は、対照においてTH陽性細胞(矢印)の低減をもたらしたが、miR-181a/b注射魚ではもたらさなかった。スケールバーは100μmである。(B'〜D')B〜Dをより強く拡大したものである。スケールバーは40μmである。E)TH陽性細胞数/青斑核(%で示されている)である。N=6個であり、**はp<0.01であり、事後チューキー分析を伴う一元配置ANOVAであり、エラーバーはSEMである。
【図９】miR-181a/b-1の不活性化は6-OHDA誘導PDマウスモデルの表現型を改善する。(A〜C)黒質(SN)に6-OHDAが一側的に注射されたmiR-181a/b-1+/+マウス及びmiR-181a/b-1-/-マウスの脳における抗TH免疫組織化学染色である。(A、B)6-OHDAの注射は、miR-181a/b-1+/+マウスの対照食塩水注射側に対してSNにおいてTH陽性細胞の低減をもたらすが(A)、miR-181a/b-1-/-動物では、DAニューロン(矢印)は6-OHDA誘導死から保護されている(B)。(C、D)miR-181a/b-1+/+マウスの線条体切片では対照食塩水注射側に対して6-OHDAの注射側のTH染色が減少しているが(C)、それに反して、miR-181a/b-1-/-マウスの6-OHDAの注射側と対照側では差がない(D)。スケールバーは1mmである。E)SNのTH陽性細胞数/切片は変化倍率で報告されているが、対照の半球は各マウス遺伝子型で1に相当する。N=6個である。F)L-DOPA誘導回転試験は、miR-181a/b-1+/+6-OHDA注射マウスの挙動及び運動欠損を測定する。miR-181a/b-1-/-6-OHDA注射マウスは、L-DOPAの回転誘導効果に感受性が少ない。正味の反対側回転(反対側-同側回転)を、各時間間隔(T1=0〜600秒、T2=600〜1200秒、T3=1200〜1800秒、T4=1800〜2400秒)で分析した。N=8回である。*はp<0.05であり、***はp<0.001であり、Eでは事後チューキー分析を伴う一元配置ANOVAであり、Fでは反復測定による遺伝子型効果二元配置ANOVAであり、エラーバーはSEMである。
【図１０】miR-181a/b-1のクラスターが、マウスの脳及び眼におけるmiR-181a及びmiR-181b発現の大部分を占めている。A、B)miR-181a/b-1+/+マウス及びmiR-181a/b-1-/-マウスの網膜(A)及び黒質(SN)(B)の切片におけるmiR-181aプローブ及びmiR-181bプローブによるRNAインサイツハイブリダイゼーションである。スケールバーは、(A)では50μmであり、(B)では1mmである。C、D)TaqmanアッセイによるmiR-181a/b-1+/+眼及びmiR-181a/b-1-/-眼並びに脳におけるmiR-181a及びmiR-181bの発現分析である。miR-181a/bクラスター-1の標的欠失は、両方の組織において成熟型のmiR-181a及びmiR-181bの発現レベルに著しい低減をもたらす。n=3個であり、***はp<0.005であり、片側スチューデントt検定であり、エラーバーはSEMである。E)miR-181a/b-1+/+マウス及びmiR-181a/b-1-/-マウスの脳切片のNISSL染色は、対照と比較してmiR-181a/b-1-/-マウスに明確な形態学的な差を示さない。スケールバーは1mmである。ONLは外顆粒層であり、INLは内顆粒層であり、GCLは神経節細胞層である。
【図１１】miR-181a/b-1の欠失は増加したオートファジーフラックス(autophagic flux)をもたらす。A)qRT-PCR分析は、miR-181a/b-1+/+動物に対してmiR-181a/b-1-/-動物の眼におけるmiR-181a/b標的のBcl2、Mcl1、Xiap、Atg5、Erk2及びPark2の増加したレベルを明らかにしている。n≧5匹の動物/遺伝子型である。B)摂食及び絶食条件下の動物の眼のタンパク質抽出物におけるLc3-I/Lc3-II及びp62のWB分析(左側パネル)は、miR-181a/b-1+/+(+/+)マウスに対してmiR-181a/b-1-/-(-/-)マウスにおける両方のタンパク質の減少したレベル(右側パネルに定量化されている)を明らかにしている。n=各遺伝子型及び条件において2匹のマウスである。エラーバーはSEMである。C)qRT-PCR分析は、摂食及び絶食の両方の条件下でmiR-181a/b-1-/-マウスの眼及びmiR-181a/b-1+/+マウスの眼においてSqstm1(p62)及びMap1lc3b(LC3)転写物レベルに変化がないことを明らかにしている。これらのデータは、WB分析により観察されたオートファジーマーカーのLc3-II及びp62の減少したレベルが、miR-181a/b-1-/-眼において増加したオートファジーフラックスに起因することを示している。n=各遺伝子型及び条件において3匹である。**はp<0.01であり、***はp<0.001であり、片側スチューデントt検定である。
【図１２】miR-181a/bのサイレンシングがFCCP誘導細胞死からSH-SY5Y細胞を保護する。細胞死分析は、miR-181a/bサイレンシング(100nM)がFCCP処理からSH-SY5Y細胞を保護することを示している。n=3回の独立した実験である。**はp<0.01であり、両側スチューデントt検定である。エラーバーはSEMである。
【図１３】メダカにおけるmiR-181a/bのノックダウンが、ミトコンドリア機能及びマイトファジーに関与する遺伝子の上方調節をもたらす。ミトコンドリア依存性細胞死(bcl2、mcl1)、マイトファジー(atg5、erk2)、及びミトコンドリア生合成及び機能(cox11、coq10b、prdx3)に関与するmiR-181a/b標的の転写レベル、並びに間接標的ppargc1aの転写レベルを分析するために、miR-181a/b-MOメダカ胚の全体から抽出された全RNAに実施されたqRT-PCRである。n=3個であり、**はp<0.05であり、***はp<0.005であり、片側スチューデントt検定であり、エラーバーはSEMである。
【図１４】miR-181a/bのMO媒介サイレンシング及び薬物投与の後での異常な表現型の非存在である。(A、B)miR-181a/b-MOのみが注射されたメダカ胚(B)は、対照胚(A)と比較して表現型に差を示していない。(C、E)バフィロマイシンA(Baf-Al)(C)、PD98059(D)及びHA14-1(E)は、この研究で使用された濃度では、対照胚に形態学的変更を誘導しない。スケールバーは100μmである。(F)この研究に使用されたバフィロマイシンAの濃度はオートファジーを遮断し  Ic3-I/IIのWB分析によって実証されている。
【図１５】miR-181a/b-1の欠失は、マウスにおいて網膜の形態及び機能に有意な変更を引き起こさない。(A〜J)異なる網膜マーカー[(A、B)杆体にはロドプシン(Rhod)、(C、D)錐体には錐体アレスチン(C-Arr)、(E、F)RGC及び無軸索細胞にはPax6、(G、H)ミュラー細胞にはGS6、(I、J)内網状層のシナプス構造にはSynthaxin(Synt)]の免疫蛍光染色は、対照マウスに対して、miR-181a/b-1-/-マウスの網膜における細胞層構造に異常のないことを明らかにしている。スケールバーは50μmである。K、L)網膜電図分析は、miR-181a/b-1+/+マウス及びmiR-181a/b-1-/-マウスのa-波(K)及びb-波(L)パターンに差がないことを明らかにしており、miR-181a/bの除去は網膜機能不全を引き起こさないことを示している。n=各遺伝子型において10匹である。M)RGC/mmの数(%で示されている)のグラフ表示は、miR-181a/b-1+/+マウス及びmiR-181a/b-1-/-マウスで有意な差を示していない。n=各遺伝子型において10匹である。ONLは外顆粒層であり、OPLは外網状層であり、INLは内顆粒層であり、IPLは内網状層であり、GCLは神経節細胞層である。
【図１６】miR-181a/bの阻害は、AMDのin vitroモデルにおいてリポフスチン(A2E)の蓄積を低減する。A)対照LNA及びLNA-miR-181a/bがトランスフェクトされ、次いでA2Eで処理されたARPE-19細胞の共焦点画像である。自己蛍光分析は、A2E蓄積の量を示し、miR-181a/bの阻害が、対照細胞と比較してA2E蓄積を低減することを示す。B)変化倍率で報告されている対照細胞と比較した、LNA-miR-181a/bトランスフェクト細胞における細胞1個あたりのA2E自己蛍光強度、A2E SPOT強度及びA2E SPOT域の定量化のグラフ表示である。スチューデントt検定であり、p値は、***が<0.001であり、**が<0.005である。
【図１７】miR-181a/bの枯渇は、Abca4-/-マウスにおいてリポフスチン(A2E)の蓄積を低減する。A)Abca4-/-/miR-181a/b-1-/-RPEにおけるmiR-181a/bの標的であるsod1及びcat1転写物のqRT-PCR分析である。B)Abca4-/-網膜切片及びAbca4-/-/miR-181a/b-1-/-網膜切片のRPE及びPOSにおけるリポフスチン蓄積の代表的な画像である。C)RPE及びPOSにおけるリポフスチン自己蛍光の定量化である。エラーバーはSEMである。*はp<0.05であり、**はp<0.01であり、***はP<0.001である。
【図１８】miR-181a/bの低減は、網膜色素変性症のマウスモデルにおいて視覚機能を改善する。p30でのP347S及びP347S/miR-181a/b+/-マウスからのERG応答は、miR-181a/bヘテロ接合性枯渇動物における改善を強調する。N=16匹であり、*はp<0.01であり、***はP<0.001である。[定輝度(cd・s/m2)、明順応=2.4log cd・s/m2]
【図１９】miR-181a/bの低減は、網膜色素変性症のマウスモデルにおいて光受容体マーカー発現を改善する。A)2つの異なる網膜マーカー(緑色)のロドプシン及び錐体アレスチン、並びにDAPI(青色)で染色されたp30でのP347S網膜及びP347S/miR-181a/b+/-網膜の免疫蛍光画像である。B)P347S及びP347S/miR-181a/b+/-のp30でのONL厚さ分析である。C)qRT-PCR分析は、p30において、P347Sマウス網膜に対してP347S/miR-181a/b+/-マウス網膜の主なPRマーカー(ロドプシン、S-オプシン、M-オプシン、Pde6b及び錐体アレスチン)の増加したレベルを明らかにしている。N=3個であり、エラーバーはSEMである。
【図２０】miR-181a/bの低減は、光受容体の外節長さを改善する。P347S/miR-181a/b+/-光受容体は、P347S動物に対して外節(OS)長さの増加を示した。*はp<0.05であり、スチューデントt検定である。エラーバーはSEMである。
【図２１】miR-181a/bの低減は、後期の時点での網膜色素変性症のマウスモデルにおいて視覚機能を改善する。p90でのP347S及びP347S/miR-181a/b+/-マウスからのERG応答は、miR-181a/bヘテロ接合性枯渇動物における改善を強調する。N=24匹であり、***はp<0.001である。
【図２２】miR-181a/bの低減は、網膜色素変性症のマウスモデルにおいて光受容体マーカー発現及び生存を改善する。A)2つの異なる網膜マーカー(緑色)のロドプシン及び錐体アレスチン、並びにDAPI(青色)で染色されたp90でのP347S網膜及びP347S/miR-181a/b+/-網膜の免疫蛍光画像である。B)P347S及びP347S/miR-181a/b+-のp90でのONL厚さ分析であり、ONL厚さの有意な増加を強調している。C)qRT-PCR分析は、p30において、P347Sマウス網膜と比較したP347S/miR-181a/b+/-マウス網膜の主なPRマーカー(ロドプシン、S-オプシン、M-オプシン、Pde6b及び錐体アレスチン)の増加したレベルを明らかにしている。N=3個であり、エラーバーはSEMである。
【図２３】A)WTの眼に対するP347Sの眼のトランスクリプトーム分析の下降制御項である。B)p30でのP347Sと比較したP347S/181a/b+/-眼における幾つかのmiR-181a/b標的(Hprt、Cox11、Erk2、Bcl2、Nrf1、Coq10b、Atg5、Xiap、Pgc1a、Park2、Prdx3)のqRT-PCR分析であり、*はp<0.05であり、**はp<0.01であり、片側スチューデントt検定である。エラーバーはSEMである。
【図２４】miR-181a/bの低減は、P347S網膜において、活性化されたカスパーゼ-3を減少する。A)抗活性カスパーゼ-3抗体(緑色)及びDAPI(青色)で染色されたp30でのP347S及びP347S/miR-181a/b+/-の凍結網膜切片の免疫蛍光画像である。このアッセイは、P347S網膜に対してP347S/miR-181a/b+/-網膜において少ない数のアポトーシス細胞を明らかにしている。B)抗活性カスパーゼ-3陽性細胞のカウントは手作業で実施した。N=5個であり、*はp<0.05であり、スチューデントt検定である。エラーバーはSEMである。
【図２５】miR-181a/bの低減は、P347S網膜においてTUNEL染色を減少する。A)p30でのP347S及びP347S/miR-181a/b+/-の凍結網膜のTUNEL-POD染色である。褐色のスポットは、DNA二本鎖の損傷又は一本鎖の損傷を示している。このアッセイは、P347S/miR-181a/b+/+マウスに対してP347S/miR-181a/b+/-マウスにおいて低減された数のアポトーシス細胞を明らかにしている。B)TUNEL-POD陽性細胞のカウントは手作業で実施した。N=3個であり、*はp<0.05であり、スチューデントt検定である。エラーバーはSEMである。
【図２６】miR-181a/bの低減は、P347S光受容体においてミトコンドリア形態を改善する。A)p30でのWT、P347S及びP347S/miR-181a/b+/-動物の網膜の電子顕微鏡(EM)画像であり、n=2匹の動物/遺伝子型である。p30でのWT、P347S及びP347S/miR-181a/b+/-のPRミトコンドリアのEM画像は、miR-181a/b下方調節動物におけるミトコンドリア表現型の改善を示した。B)ミトコンドリア大直径長さの定量化である。N=2個であり、**はp<0.01であり、スチューデントt検定である。エラーバーはSEMである。
【図２７−１】miR-181a/bの低減は、P347S眼においてミトコンドリアマーカー発現を改善する。A)p30での野生型、P347S及びP347S/miR-181a/b+/-動物の眼からのタンパク質抽出物におけるWB分析により検出されたMfn2のタンパク質レベルであり、D)における定量化のために、データはp115に対して正規化されている。n=2匹の動物/遺伝子型である。エラーバーはSEMである。B)p30での野生型、P347S及びP347S/miR-181a/b+/-動物の眼からのタンパク質抽出物におけるWB分析により検出されたCIサブユニットのNDUFB8、CII SDHB、CIII UQCRC2、CIV MTC01、CV ATP5Aのタンパク質レベルである。D)におけるタンパク質レベルの定量化のために、データはp115に対して正規化されている。n=2匹の動物/遺伝子型である。エラーバーはSEMである。C)p30での野生型、P347S及びP347S/miR-181a/b+/-動物の眼からのタンパク質抽出物におけるWB分析により検出されたクエン酸シンターゼのタンパク質レベルであり、このタンパク質レベルの定量化もD)に示され、データはp115に対して正規化されている。n=4匹の動物/遺伝子型である。
【図２７−２】D)A、B及びCに示されているWBのタンパク質定量化のグラフ表示である。データはp115に対して正規化されている。*はp<0.05であり、**はp<0.01であり、***はp<0.001であり、両側スチューデントt検定である。エラーバーはSEMである。
【図２８】miR-181a/bのスポンジ効率のin vitro実験の確証である。A)AAV2.1-CMV-eGFP-miR-181スポンジマップである。B)AAV2.1-CMV-eGFP-miR-181a/bスポンジ(スポンジ181)がトランスフェクトされてから48時間目のSH-SY5YにおけるmiR-181a/b直接標的転写物(XIAP、NRF1、PRDX3、MCL1、ATG5、SIRT1、BCL2、BCL2、ERK2、PARK2、COX11)のqRT-PCR分析である。miR-181a/b標的の転写物レベルは、対照試料に対してスポンジ181試料において増加している(CTRL=AAV2.1-CMV-eGFPトランスフェクト細胞)。N=3である。このデータは、miR-181スポンジが内因性miR-181a/bを隔絶し、したがって内因性miR-181a/bの直接標的への結合を防止し、活性を阻害することを示している。
【００４３】
配列表の配列の簡潔な記載
miR-181ファミリーメンバーの配列の比較
【００４４】
【化１】
2021522212.tif 000002
【００４５】
miR-181a(配列番号1)
AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU
miR-181b(配列番号2)
AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU
miR-181c(配列番号3)
AACAUUCAAC-CUGUCGGUGAGU
miR-181d(配列番号4)
AACAUUCAUUGUUGUCGGUGGGU
miR-181シード配列(配列番号5)
ACAUUCA LNA A(配列番号6)
CGACAGCGTTGAATGT LNA B(配列番号7)
CGACAGCAATGAATGT
miR-181スポンジ配列:(配列番号8)
【００４６】
【化２】
2021522212.tif 000003
【００４７】
miR-181スポンジの凡例:
太字フォントのmiR-181スポンジ「MBS SEQ A」;下線を付したフォントのmiR-181スポンジ「MBS SEQ B」;スペーサー「1」:イタリック体のtagc;スペーサー「2」又は中央のスペーサー:Tctaga(制限酵素)
【００４８】
miR-181スポンジ配列:配列番号9
【００４９】
【化３】
2021522212.tif 000004
【００５０】
miR-181スポンジ配列:配列番号10  
【００５１】
【化４】
2021522212.tif 000005
【００５２】
miR-181スポンジ配列:配列番号11
【００５３】
【化５】
2021522212.tif 000006
【００５４】
miR-181スポンジ配列:配列番号12
【００５５】
【化６】
2021522212.tif 000007
【００５６】
miR-181スポンジ配列:配列番号13
【００５７】
【化７】
2021522212.tif 000008
【００５８】
AAV2.1 CMV-eGFP-miR-181スポンジ配列(配列番号14)
> [AAV2.1_CMV_eGFP_miR-181スポンジ] - 5838 bp
agcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccagatttaattaaggctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcggaattcgcccttaagctagctagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatcctgcagaagttggtcgtgaggcactgggcaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccaggcggccgccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaataagcttggatccaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtgctgcgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcg
AGATCTTCTAGAACCCACCGACAATGCTGAATGTTTAGCACTCACCGACAATAGTGAATGTTTAGCACCCACCGACAATGCTGAATGTTTAGCACTCACCGACAATAGTGAATGTTTAGCACCCACCGACAATGCTGAATGTTTAGCACTCACCGACAATAGTGAATGTTTCTAGAACCCACCGACAATGCTGAATGTTTAGCACTCACCGACAATAGTGAATGTTTAGCACCCACCGACAATGCTGAATGTTTAGCACTCACCGACAATAGTGAATGTTTAGCACCCACCGACAATGCTGAATGTTTAGCACTCACCGACAATAGTGAATGTTAGATCTgcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggactcgagttaagggcgaattcccgattaggatcttcctagagcatggctacgtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagccttaattaacctaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccccgatagacggtttttcgccctttgacgctggagttcacgttcctcaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggatttttccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttataatttcaggtggcatctttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaatagtggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagtaatggtaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctgcggttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaag
【００５９】
定義
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」及び「核酸分子」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、すなわち、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかを含むために本明細書で使用される。この用語は、分子の一次構造のみを指す。よって、この用語は、三本鎖、二本鎖及び一本鎖DNA、並びに三本鎖、二本鎖及び一本鎖RNAを含む。この用語はまた、メチル化による及び/又はキャッピングによる修飾、並びにポリヌクレオチドの未修飾形態を含む。より詳細には、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」及び「核酸分子」は、ポリデオキシリボヌクレオチド(2-デオキシ-D-リボースを含有する)、ポリリボヌクレオチド(D-リボースを含有する)、プリン又はピリミジンベースのN-又はC-グリコシドである任意の他の種類のポリヌクレオチド、及び非ヌクレオチド骨格を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド(例えば、ペプチド核酸(PNA))及びポリモルホリノ(NeugeneとしてAnti-Virals, Inc.社、Corvallis、Oreg.から市販されている)ポリマー、並びにポリマーが、DNA及びRNAをにおいて見られるような塩基対合及び塩基スタッキングを可能にする立体配置において核酸塩基を含有する場合には、他の合成配列特異的核酸ポリマーを含む。用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」及び「核酸分子」の間の長さでの区別は意図されておらず、これらの用語は交換可能に使用される。よって、これらの用語は、例えば、3'-デオキシ-2',5'-DNA、オリゴデオキシリボヌクレオチドN3'P5'ホスホラミダイト、2'-O-アルキル-置換RNA、二本鎖及び一本鎖DNA、並びに二本鎖及び一本鎖RNA、microRNA、DNA:RNAハイブリッド、並びにPNAとDNA又はRNAの間のハイブリッドを含み、また、公知のタイプの修飾、例えば、当技術分野で公知である標識、メチル化、「キャップ」、類似体での、天然に存在するヌクレオチドのうちの1つ以上の代用 (例えば、2-アミノアデノシン、2-チオチミジン、イノシン、ピロロ-ピリミジン、3-メチルアデノシン、C5-プロピニルシチジン、C5-プロピニルウリジン、C5-ブロモウリジン、C5-フルオロウリジン、C5-ヨードウリジン、C5-メチルシチジン、7-デアザアデノシン、7-デアザグアノシン、8-オキソアデノシン(8-oooadenosine)、8-オキソグアノシン、O(6)-メチルググアニン、及び2-チオシチジン)、ヌクレオチド間の修飾、例えば、無電荷の結合を有するもの(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミダイト、カルバメートなど)、負に帯電した結合を有するもの(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)、及び正に帯電した結合を有するもの(例えば、アミノアルキルホスホラミダイト、アミノアルキルホスホトリエステル)、ペンダント部分を含有するもの、例えば、タンパク質(ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンなど)など、インターカレーターを有するもの(例えば、アクリジン、ソラレンなど)、キレーターを含有するもの(例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など)、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を有するもの(例えば、アルファアノマー核酸など)など、並びにポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの未修飾形態を含む。この用語はまた、ロックド核酸(例えば、2'-酸素原��と4'-炭素原子の間にメチレン架橋を有するリボヌクレオチドを含む)を含む。例えば、(Elayadi及びCorey、2001;Koshkinら、1998;Kurreckら、2002;Obikaら、1998;Orum及びWengel、2001)を参照されたい。
【００６０】
用語「標識」及び「検出可能な標識」は、以下に限定されないが、放射性同位体、蛍光体、化学発光成分、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、発色剤、染料、金属イオン、金属ゾル、リガンド(例えば、ビオチン又はハプテン)などを含む検出可能な分子を指す。用語「蛍光体」は、検出可能な範囲の蛍光を呈すことが可能な基質又はその一部を指す。本発明で使用してもよい標識の特定例としては、以下に限定されないが、フィコエリトリン、Alexa染料、フルオレセイン、YPet、CyPet、Cascadeブルー、アロフィコシアニン、Cy3、Cy5、Cy7、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、Texasレッド、ルミノール、アクリジニウムエステル(acradimum ester)、ビオチン、緑色蛍光タンパク質(GFP)、高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、高感度黄色蛍光タンパク質(EYFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、Dronpa、mCherry、mOrange、mPlum、Venusホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、NADPH、ベータ-ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ウレアーゼ、MRI造影剤(例えば、ガドジアミド、ガドベン酸、ガドペンテト酸、ガドテリドール、ガドホスベセット、ガドベルセタミド、及びガドキセト酸)、及びコンピューター断層撮影(CT)造影剤(例えば、ジアトリゾ酸、メトリゾ酸、ロダミド、ロタラム酸、ロキシタラム酸、イオグリク酸、アセトリゾ酸、ロカルミン酸、メチオダール、ジオドン、メトリザミド、イオヘキソール、ロキサグリン酸、ロパミドール、ロプロミド、ロトロラン、ロベルソル、ロペントール、ロジキサノール、ロメプロール、ロビトリドール、ロキシラン、ロドキサム酸、ロトロキシ酸、ログリカム酸、アジピオドン、ロベンザミン酸、ロパン酸、ロセタミン酸、イポド酸ナトリウム、チロパン酸、イポド酸カルシウム)が挙げられる。
【００６１】
「組換え体」は、核酸分子を説明するために本明細書で使用する場合、組換え体の起源又は操作が、組換え体が本来関連しているポリヌクレオチドのすべて又は一部と関連しないために、ゲノム、RNA、miRNA、cDNA、ウイルス、半合成、又は合成起源のポリヌクレオチドを意味する。
【００６２】
タンパク質又はポリペプチドに関して使用される用語「組換え体」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。一般的に、以下においてさらに説明されるように、目的の遺伝子は、クローニングされ、次いで、形質転換した生物において発現される。
【００６３】
マイクロRNA
本明細書で使用する場合、用語「マイクロRNA」、「miRNA」「成熟マイクロRNA」、及び「成熟miRNA」は、RNA干渉経路を介して(すなわち、RISCとの会合及び次の標的mRNAの分解又は翻訳の阻害を介して)標的ポリヌクレオチド及びポリペプチドの発現レベルを有効に低減する、約19〜約25ヌクレオチド長(約19、約20、約21、約22、約23、約24、及び約25ヌクレオチドを含む)である非コード一本鎖RNA分子を指す。用語「マイクロRNA」は、いずれかの生物(例えば、植物、動物)において見出されてきた内在性miRNAと、RNA干渉を介して標的ポリヌクレオチドの発現を有効に低減する内在性miRNAにおいて見出されたもの以外の、約19〜25ヌクレオチド長の配列を有する一本鎖RNA分子を含む人工のmiRNAの両方を指す。
【００６４】
マイクロRNAを、その標的特性に基づいてファミリーへと群分けし、これは、主に、マイクロRNAの延長したシード領域(miRNAのヌクレオチド2〜8)の同一性に依存する;同じシードファミリーのメンバーは、通常進化的に関連しており、進化的に関連したmiRNAは、通常、同じシードファミリーのメンバーである。しかし、用語「ファミリー」の使用は、(Bartel、2018)に記載されているように、共通の祖先を厳格に示すものではない。
【００６５】
本発明のmiRNAは、miRNAのうちのmiRNA 181ファミリーに属する。
【００６６】
本明細書で定義されているように、miRNA 181は、同じシード配列、すなわち、ACAUUCA(配列番号5)を共有するmiRNAの群である。好ましくは、miRNAの前記群は、miRNAのファミリーとして本明細書で定義される。
【００６７】
miR-181ファミリーのメンバーは、3つの別個の染色体に位置する3つの独立した転写一次産物によって生成される。それぞれの転写産物は、全部で6つの前駆体配列に対して2つの前駆体配列を生成する。各前駆体は2つのmiRNA鎖を生成する:全部で10個の成熟miRNA形態:miR-181a-5p、miR-181a-l-3p、miR-181a-2-3p、miR-181b-5p、miR-181b-l-3p、miR-181b-2-3p miR-181c-5p、miR-181c-3p、miR-181d-5p及びmiR-181d-3pについて、ガイド鎖又は5p、及びパッセンジャー鎖又は3p。5p成熟配列は、哺乳動物の組織において最も高い発現レベルを示すものであり(Karaliら、2016)、かなりの度合いの機能的冗長性を示唆する同じ5'「シード」配列を含有する(Henao-Mejiaら、2013;Jiら、2009)。本明細書で使用する場合、6つの成熟5p miRNAは、以下のように定義されることになる:miR-181a-1、miR-181a-2、miR-181b-l、miR-181b-2、miR-181c、及びmiR-181d。miR-181a-l及びmiR-181a-2の成熟形態、並びにmiR-181b-l及びmiR-181b-2の成熟形態は、配列が同一であり;miR-181cの成熟形態は、miR-181aと比較して1つのヌクレオチドの差を有し、一方miR-181dの成熟形態は、miR-181bと比較して1つのヌクレオチドの差を有する。
【００６８】
「標的部位」は、マイクロRNAによって認識される核酸配列である。単一の標的部位は、典型的には、約6〜約10個のヌクレオチドを有する。典型的には、標的部位は、mRNAの3'UTR内に位置するが、標的部位は、5'UTR又はmRNAのコード領域中に位置されてもよい。
【００６９】
「阻害剤標的部位」は、前記阻害剤核酸に対して相補的なmiRNA 181の成熟配列内の配列である。miRNA 181配列は、前駆体配列又は成熟配列であってもよい。好ましくは、miRNA 181配列は、成熟配列である。
【００７０】
阻害性核酸
阻害性核酸は、阻害性RNA及び阻害性DNAを含み、例えば、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドであってもよい。用語「阻害性核酸」によって、標的核酸(例えば、標的マイクロRNA、例えば、配列番号1、2、3、又は4によって定義されるマイクロRNAのいずれか)に対して相補的であり、且つそれに結合する配列を含有する核酸分子であって、標的の立体障害によって又はその分解によって、標的核酸分子のレベルでの又はその活性(例えば、mRNA標的結合における活性)の低下を媒介する核酸分子を意味する。阻害性核酸の非限定的な例として、干渉RNA、shRNA、siRNA、リボザイム、アンタゴミア、LIMA、miRスポンジ、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。阻害性RANを作製する方法が本明細書に記載される。阻害性核酸を作製するさらなる方法は当技術分野で公知である。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「干渉RNA」は、RNA干渉を媒介することによって遺伝子の発現を阻害又は下方調節することが可能な-直接的又は間接的に(すなわち、変換の際に)-任意の二本鎖又は一本鎖RNAを指す。干渉RNAとしては、以下に限定されないが、低分子干渉RNA(「siRNA」)及び低分子ヘパリンRNA(「shRNA」)が挙げられる。「RNA干渉」は、配列適合性メッセンジャーRNA転写物の選択的分解を指す。
【００７２】
本明細書で使用する場合、「shRNA」(低分子ヘアピンRNA)は、アンチセンス領域、ループ部分及びセンス領域を含むRNA分子を指し、ここで、センス領域は、アンチセンス領域と塩基対合して二重鎖ステムを形成する相補的ヌクレオチドを有する。転写後プロセシングの後に、低分子ヘアピンRNAは、RNase IIIファミリーのメンバーである酵素Dicerによって媒介される切断事象により、低分子干渉RNAに変換される。
【００７３】
「低分子干渉RNA」又は「siRNA」は、本明細書で使用する場合、配列特異的な様式でRNA干渉を媒介することによって遺伝子発現を阻害又は下方調節することが可能な、任意の低分子RNA分子を指す。低分子RNAは、例えば、約18〜21ヌクレオチド長でありうる。
【００７４】
本明細書で使用する場合、「アンタゴミア」は、任意選択で、切断部位における誤対合又は切断を阻害する1つ以上の塩基修飾を有する、特異的マイクロRNA標的に対する相補性を有する低分子合成RNAを指す。
【００７５】
本明細書で使用する場合、表現「転写後プロセシング」は、転写の後に起こり、且つ例えば、酵素Dicer及び/又はDroshaによって媒介されるmRNAプロセシングを指す。本明細書に記載の処置方法において有用な阻害性薬剤としては、配列番号1、2、3若しくは4又はこれらの組合せのマイクロRNA(例えば、成熟マイクロRNA又は前駆体マイクロRNA)のいずれかの発現又は活性を低下させる阻害性核酸分子が挙げられる。
【００７６】
本発明の方法及び組成物において有用な阻害性核酸としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列(EGS)オリゴヌクレオチド、siRNA化合物、一本鎖又は二本鎖RNA干渉(RNAi)化合物、例えば、siRNA化合物、修飾塩基/ロックド核酸(LNA)、アンタゴミア、ペプチド核酸(PNA)、及び他のオリゴマー化合物、又は標的核酸分子の少なくとも一部をハイブリダイズし、且つその機能をモジュレートするオリゴヌクレオチド模倣体が挙げられる。一部の実施形態では、阻害性核酸としては、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド、修飾された結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉RNA(R Ai)、単鎖干渉RA(siR A);マイクロ、緩衝RA (miR A); 小分子RNA(stR A);又は単鎖ヘパリンRNA(shRNA);小分子RNA誘導遺伝子活性化(RNAa);小分子活性化RNA(saRNA)、又はこれらの組合せが挙げられる。例えば、WO2010/040112を参照されたい。
【００７７】
一部の実施形態では、阻害性核酸は、10〜50、13〜50、又は13〜30ヌクレオチド長である。当業者であれば、これが、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、若しくは50ヌクレオチド長、又はその中のいずれかの範囲のアンチセンス部分を有するオリゴヌクレオチドを具体化することを認識するであろう。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、15ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、本発明のアンチセンス又はオリゴヌクレオチド化合物は、12又は13〜30ヌクレオチド長である。当業者であれば、これが、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、若しくは30ヌクレオチド長、又はそれらの中のいずれかの範囲のアンチセンス部分を有する阻害性核酸を具体化することを認識するであろう。
【００７８】
一部の実施形態では、阻害性核酸は、それぞれ少なくとも1つのヌクレオチドからなる、2つ以上の化学的に別個の領域を含有するキメラオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、1つ以上の有益な特性(例えば、ヌクレアーゼ抵抗性の上昇、細胞内への取り込みの増加、標的に対する結合親和性の増大など)を付与する修飾ヌクレオチドの少なくとも1つの領域及びRNA:DNA又はRNA:RNAハイブリッドを切断することが可能な酵素に対する基質である領域を含有する。本発明のキメラ阻害性核酸は、2つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、及び/又は上記のオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造物として形成されうる。このような化合物は、当技術分野において、ハイブリッド又はギャップマーとも称されてきた。このようなハイブリッド構造の調製について教示する代表的な米国特許は、以下に限定されないが、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,013,830号;同第5,149,797号;同第5,220,007号;同第5,256,775号;同第5,366,878号;同第5,403,711号;同第5,491,133号;同第5,565,350号;同第5,623,065号;同第5,652,355号;同第5,652,356号;及び同第5,700,922号を含む。
【００７９】
一部の実施形態では、阻害性核酸は、糖の2'位で修飾された少なくとも1つのヌクレオチド、最も好ましくは、2'-O-アルキル、2'-O-アルキル-O-アルキル又は2'-フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。他の好ましい実施形態では、RNA修飾は、ピリミジンのリボース、塩基性残基、又はRNAの3'末端における反転塩基(inverted base)において2'-フルオロ、2'-アミノ、及び2'-O-メチル修飾を含む。このような修飾は、通常、オリゴヌクレオチド中に組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対する2'-デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いTm(すなわち、より高い標的結合親和性)を有することが示されてきた。
【００８０】
いくつかのヌクレオチド及びヌクレオチド修飾物は、それらが組み込まれるオリゴヌクレオチドが、ネイティブオリゴヌクレオチドよりもヌクレアーゼ消化に対して抵抗性の高いオリゴヌクレオチドを作製することが示されている-修飾されたオリゴは、未修飾オリゴヌクレオチドよりも長時間無傷で生存する。修飾オリゴヌクレオチドの具体例としては、修飾された骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、単鎖アルキル若しくはシクロアルキル糖間結合、又は単鎖ヘテロ原子若しくは複素環式糖間結合を含むものが挙げられる。ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子骨格、特にCH2-NH-O-CH2、CH,〜N(CH3)〜O〜CH2(メチレン(メチルイミノ)又はMMI骨格]、CH2-O-N(CH3)-CH2、CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2及びO-N(CH3)-CH2-CH2骨格としても知られ、ここで、ネイティブのホスホジエステル骨格は、O-P-O-CHとして表される);アミド骨格((De Mesmaekerら、1995)を参照されたい);モルホリノ骨格構造(米国特許第5,034,506を参照されたい);ペプチド核酸(PNA)骨格(ここで、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格は、ポリアミド骨格と置き換えられ、ヌクレオチドは、ポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接的又は間接的に結合している(Nielsenら、1991)を参照のこと))を有するものが最も好ましい。リン含有結合としては、以下に限定されないが、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチルホスホネート及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3'アミノホスホラミデート及びアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、並びに通常の3'-5'結合を有するボラノホスフェート、これらの2'-5'結合類似体、並びにヌクレオチド単位の隣接する対が3'-5'から5'-3'に又は2'-5'から5'-2'に連結している、反転した極性を有するものが挙げられる;米国特許第3,687,808号;同第4,469,863号;同第4,476,301号;同第5,023,243号;同第5,177,196号;同第5,188,897号;同第5,264,423号;同第5,276,019号;同第5,278,302号;同第5,286,717号;同第5,321,131号;同第5,399,676号;同第5,405,939号;同第5,453,496号;同第5,455,233号;同第5,466,677号;同第5,476,925号;同第5,519,126号;同第5,536,821号;同第5,541,306号;同第5,550,111号;同第5,563,253号;同第5,571,799号;同第5,587,361号;及び同第5,625,050号を参照されたい(このそれぞれは参照によって組み込まれる)。モルホリノベースのオリゴマー化合物については(Braasch及びCorey、2002;Heasman、2002;Lacerraら、2000;Nasevicius及びEkker、2000)及び米国特許第5,034,506号に記載されている。シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣体については、(Wangら、2000a)に記載されている。
【００８１】
その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルヌクレオシド間結合又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子ヌクレオシド間結合とアルキルヌクレオシド間結合若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合とが混合したもの(mixed heteroatom and alkyl or cycloalkyl internucleoside linkages)、又は1つ以上の短鎖ヘテロ原子ヌクレオシド間結合若しくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合を有するもの(ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される);シロキサン骨格;スルフィド骨格、スルホキシド骨格及びスルホン骨格;ホルムアセチル骨格及びチオホルムアセチル骨格;メチレンホルムアセチル骨格及びチオホルムアセチル骨格;アルケン含有骨格;スルファメート骨格;メチレンイミノ骨格及びメチレンヒドラジノ骨格;スルホネート骨格及びスルホンアミド骨格;アミド骨格;並びにN、O、S及びCH2の構成要素部分が混合したその他のものが含まれる;米国特許第5,034,506号;同第5,166,315号;同第5,185,444号;同第5,214,134号;同第5,216,141号;同第5,235,033号;同第5,264,562号;同第5,264,564号;同第5,405,938号;同第5,434,257号;同第5,466,677号;同第5,470,967号;同第5,489,677号;同第5,541,307号;同第5,561,225号;同第5,596,086号;同第5,602,240号;同第5,610,289号;同第5,602,240号;同第5,608,046号;同第5,610,289号;同第5,618,704号;同第5,623,070号;同第5,663,312号;同第5,633,360号;同第5,677,437号;及び同第5,677,439号(このそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい)。
【００８２】
1つ以上の置換された糖部分は、例えば、2'位に以下の: OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3 OCH3、OCH3 O(CH2)n CH3、O(CH2)n NH2若しくはO(CH2)nCH3(ここで、nは1〜約10である);CiからCIO低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリル若しくはアラルキル;Cl;Br;CN;CF3;OCF3;O-、S-、若しくはN-アルキル;O-、S-、若しくはN-アルケニル;SOCH3;SO2 CH3;ONO2;NO2;N3;NH2;ヘテロシクロアルキル;ヘテロシクロアルカリル;アミノアルキルアミノ;ポリアルキルアミノ;置換シリル;RNA切断基;レポーター基;インターカレーター;オリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基;又はオリゴヌクレオチド及び類似する特性を有する他の置換基の薬力学特性を改良するための基のうちの少なくとも1つに含まれてもよい。好ましい修飾は、2'-メトキシエトキシ[2'-O-(2-メトキシエチル)](Martin、1995)としても知られる、2'-O-CH2CH2OCH3]を含む。他の好ましい修飾は、2'-メトキシ(2'-O-CH3)、2'-プロポキシ(2'-OCH2 CH2CH3)及び2'-フルオロ(2'-F)を含む。類似する修飾は、オリゴヌクレオチドの他の位置、特に、3'末端のヌクレオチドにおける糖の3'位及び5'末端のヌクレオチドの5'位においてもなされうる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖模倣体を有してもよい。
【００８３】
阻害性核酸はまた、さらに又は代替的に、核酸塩基(当技術分野では単に「塩基」と称されることも多い)の修飾又は置換も含みうる。本明細書で使用する場合、「未修飾」又は「天然の」核酸塩基は、アデニン(A)、グアニン(G)、チミン(T)、シトシン(C)及びウラシル(U)を含む。修飾された核酸塩基としては、天然の核酸において低い頻度又は一過的にのみ見られる核酸塩基、例えば、ヒポキサンチン、6-メチルアデニン、5-Meピリミジン、特に5-メチルシトシン(5-メチル-2'デオキシシトシンとも称され、当技術分野では、5-Me-Cと称されることも多い)、5-ヒドロキシメチルシトシン(HMC)、グリコシルHMC、及びゲントビオシル(gentobiosyl)HMC、並びに合成核酸塩基、例えば、2-アミノアデニン、2-(メチルアミノ)アデニン、2-(イミダゾリルアルキル)アデニン、2-(アミノアルキルアミノ)アデニン又は他のヘテロ置換されたアルキルアデニン、2-チオウラシル、2-チオチミン、5-ブロモウラシル、5-ヒドロキシメチルウラシル、8-アザグアニン、7-デアザグアニン、N6(6-アミノヘキシル)アデニン、及び2,6-ジアミノプリンが挙げられる。Kornberg, A.、DNA Replication、W. H. Freeman & Co.社  San Francisco、1980、75〜77頁;及び(Gebeyehuら、1987)を参照されたい。当技術分野において知られている「普遍的な」塩基、例えば、イノシンも含まれうる。5-Me-C置換は、核酸二重鎖の安定性を0.6〜1.2℃増大することが示されており(Sanghvi, Y. S.、in Crooke, S. T.及びLebleu, B.編、Antisense Research and Applications、CRC Press、Boca Raton、1993、276〜278頁)、現在好ましい塩基置換である。
【００８４】
所与のオリゴヌクレオチドにおける全ての位置が均一に修飾されている必要はなく、実際、2以上の上述の修飾が単一のオリゴヌクレオチド中に又はオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシド内にも組み込まれてもよい。
【００８５】
一部の実施形態では、ヌクレオチド単位の、糖及びヌクレオシド間結合の両方、すなわち骨格は、新規の基で置き換えられる。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このようなオリゴマー化合物の1つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸(PNA)と称される。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖の骨格は、アミド含有骨格、例えば、アミノエチルグリシン骨格で置き換えられる。核酸塩基は保持されており、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接敵又は間接的に結合している。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特許は、以下に限定されないが、その各々が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第5,539,082;同第5,714,331号;及び同第5,719,262号を含む。PNA化合物のさらなる教示は、(Nielsenら、1991)に見出すことができる。
【００８６】
阻害性核酸は、1つ以上の核酸塩基(当技術分野において単に「塩基」称されることも多い)の修飾又は置換を含みうる。本明細書で使用する場合、「非修飾」又は「天然の」核酸塩基は、プリン塩基のアデニン(A)及びグアニン(G)、並びにピリミジン塩基のチミン(T)、シトシン(C)、及びウラシル(U)を含む。修飾核酸塩基は、他の合成及び天然の核酸塩基、例えば、5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6-メチル、及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2-プロピル及び他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン、及び2-チオシトシン、5-ハロウラシル及びシトシン、5-プロピルウラシル及びシトシン、6-アゾウラシル、シトシン及びチミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル及び他の8-置換アデニン及びグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチル及び他の5-置換ウラシル及びシトシン、7-メチルグアニン及び7-メチルアデニン、8-アザグアニン及び8-アザアデニン、7-デアザグアニン、及び7-デアザアデニン、並びに3-デアザグアニン及び3-デアザアデニンを含む。
【００８７】
さらに、核酸塩基は、米国特許第3,687,808号に開示されているもの、「The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering」、858〜859頁、Kroschwitz, J. I.編、John Wiley & Sons、1990に開示されているもの、Englischら、Angewandte Chemie, International Edition、1991、30、613頁によって開示されているもの、及びSanghvi, Y. S.、第15章、Antisense Research and Applications、289〜302頁、Crooke, S.T.及びLebleu, B. ea.、CRC Press、1993によって開示されているものを含む。これら核酸塩基のある種のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大するのに特に有用である。これらは、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、並びにN-2、N-6、及びO-6置換されているプリン(2-アミノプロピルアデニンを含む、5-プロピニルウラシル、及び5-プロピニルシトシン)を含む。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を0.6〜1.2℃増大することが示されており(Sanghvi, Y.S.、Crooke, S.T.  及びLebleu, B.編、Antisense Research and Applications'、CRC Press、Boca Raton、1993、276〜278頁)、現在好ましい塩基置換であり、2'-Oメトキシエチル糖修飾と組み合せた場合にさらにとりわけ好ましい塩基置換である。修飾核酸塩基は、米国特許第3,687,808号、並びに同第4,845,205号;同第5,130,302号;同第5,134,066号;同第5,175,273号;同第5,367,066号;同第5,432,272号;同第5,457,187号;同第5,459,255号;同第5,484,908号;同第5,502,177号;同第5,525,711号;同第5,552,540号;同第5,587,469号;同第5,596,091号;同第5,614,617号;同第5,750,692号、及び同第5,681,941号(そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
【００８８】
一部の実施形態では、阻害性核酸は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布、又は細胞の取込みを増強する、1つ以上の部分又はコンジュゲートに化学的に結合する。このような部分は、以下に限定されないが、コレステロール部分(Letsingerら、1989)、コール酸(Manoharanら、1994)、チオエーテル、例えば、ヘキシル-S-トリチルチオール(Manoharanら、1992;Manoharanら、1993)、チオコレステロール(Oberhauser及びWagner, 1992)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基(Kabanovら、1990;Svinarchukら、1993)、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロール又はトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート(Manoharanら、1995;Sheaら、1990)、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖(Mancharanら、Nucleosides & Nucleotides 14:969〜973頁、1995)、又はアダマンタン酢酸(Manoharanら、1995)、パルミチル部分(Mishraら、1995)、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ-カルボニル-トキシコレステロール部分(Crookeら、1996)などの脂質部分を含む。米国特許第4,828,979号;同第4,948,882号;同第5,218,105号;同第5,525,465号;同第5,541,313号;同第5,545,730号;同第5,552,538号;同第5,578,717号,同第5,580,731号;同第5,580,731号;同第5,591,584号;同第5,109,124号;同第5,118,802号;同第5,138,045号;同第5,414,077号;同第5,486,603号;同第5,512,439号;同第5,578,718号;同第5,608,046号;同第4,587,044号;同第4,605,735号;同第4,667,025号;同第4,762,779号;同第4,789,737号;同第4,824,941号;同第4,835,263号;同第4,876,335号;同第4,904,582号;同第4,958,013号;同第5,082,830号;同第5,112,963号;同第5,214,136号;同第5,082,830号;同第5,112,963号;同第5,214,136号;同第5,245,022号;同第5,254,469号;同第5,258,506号;同第5,262,536号;同第5,272,250号;同第5,292,873号;同第5,317,098号;同第5,371,241号,同第5,391,723号;同第5,416,203号,同第  5,451,463号;同第5,510,475号;同第5,512,667号;同第5,514,785号;同第5,565,552号;同第5,567,810号;同第5,574,142号;同第5,585,481号;同第5,587,371号;同第5,595,726号;同第5,597,696号;同第5,599,923号;同第5,599,928号及び同第5,688,941号(そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる)も参照されたい。
【００８９】
これらの部分又はコンジュゲートは、1級又は2級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合により結合しているコンジュゲート基を含みうる。本発明のコンジュゲート基としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬物動態特性を増強する基、及びオリゴマーの薬力学特性を増強する基が挙げられる。典型的なコンジュゲート基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び染料が挙げられる。本発明の文脈において、薬物動態特性を増強する基としては、取込みを改善し、分解に対する抵抗性を増強し、且つ/又は標的核酸との配列特異的なハイブリダイゼーションを強化する基が挙げられる。本発明の文脈において、薬力学特性を増強する基としては、本発明の化合物の取込み、分布、代謝、又は排泄を改善する基が挙げられる。代表的なコンジュゲート基は、参照により本明細書に組み込まれる、1992年10月23日に出願された国際特許出願第PCT/US92/09196号、及び米国特許第6,287,860号に開示されている。コンジュゲート部分としては、以下に限定されないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル-5-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール若しくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロール若しくはトリエチルアンモニウム、1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-Hホスホネート、ポリアミン若しくはポリエチレングリコール鎖、又はアダマンタン酢酸、パルミチル部分、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分が挙げられる。例えば、米国特許第4,828,979号;同第4,948,882号;同第5,218,105号;同第5,525,465号;同第5,541,313号;同第5,545,730号;同第5,552,538号;同第5,578,717;同第5,580,731号;同第5,580,731号;同第5,591,584号;同第5,109,124号;同第5,118,802号;同第5,138,045号;同第5,414,077号;同第5,486,603号;同第5,512,439号;同第5,578,718号;同第5,608,046号;同第4,587,044号;同第4,605,735号;同第4,667,025号;同第4,762,779号;同第4,789,737号;同第4,824,941号;同第4,835,263号;同第4,876,335号;同第4,904,582号;同第4,958,013号;同第5,082,830号;同第5,112,963号;同第5,214,136号;同第5,082,830号;同第5,112,963号;同第5,214,136号;同第5,245,022号;同第5,254,469号;同第5,258,506号;同第5,262,536号;同第5,272,250号;同第5,292,873号;同第5,317,098号;同第5,371,241号;同第5,391,723号;同第5,416,203号;同第5,451,463号;同第5,510,475号;同第5,512,667号;同第5,514,785号;同第5,565,552号;同第5,567,810号;同第5,574,142号;同第5,585,481号;同第5,587,371号;同第5,595,726号;同第5,597,696号;同第5,599,923号;同第5,599,928号及び同第5,688,941号(そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
【００９０】
本発明の方法において有用な阻害性核酸は、標的miRNAに対して十分に相補的である、すなわち、十分適切に且つ十分な特異性でハイブリダイズして、所望の効果を与える。「相補的」とは、天然に存在する塩基若しくはその類似体又は天然に存在しない塩基若しくはその類似体を含む2つの配列間で、水素結合を介して対合するための能力を指す。例えば、阻害性核酸の一部位における塩基がmiRNAの対応する位置における塩基と水素結合することが可能である場合、その際に、塩基は、その位置において互いに相補的であると考えられる。一部の実施形態では、100%の相補性は必要とされない。一部の実施形態では、100%の相補性が必要とされる。日常的な方法を使用して、十分な特異性で標的配列に結合する阻害性核酸を設計することができる。
【００９１】
ある特定の例示的な標的セグメントの特異的配列が本明細書において示されているが、当業者であれば、これらが例証するための役割を果たし、本発明の範囲内にある特定の実施形態を説明することを認識するであろう。さらなる標的セグメントは、本開示を鑑みて、当業者によって容易に特定可能である。シード配列内に、又はそれに直接隣接して少なくとも5つの連続するヌクレオチドのストレッチを含む5、6、7、8、9、10又はそれより長いヌクレオチド長の標的セグメントは、同様に標的化するのに好適であると考えられる。一部の実施形態では、標的セグメントは、シード配列のうちの1つの5’末端から少なくとも5つの連続したヌクレオチドを含む配列を含む(残りのヌクレオチドは、シード配列の5’末端のすぐ上流から始まり、阻害性核酸が約5〜約30ヌクレオチドを含有するまで継続する、同じRNAの連続的ストレッチである)。一部の実施形態では、標的セグメントは、シード配列の1つの3末端から少なくとも5つの連続したヌクレオチドを含むRNA配列によって表される(残りのヌクレオチドは、標的セグメントの3'末端のすぐ下流から始まり、阻害性核酸が約5〜約30ヌクレオチドを含有するまで継続する、同じmiRNAの連続的ストレッチである)。本明細書において提供される配列を有する当業者は、過度の実験を行うことなく、標的化するためのさらに好ましい領域を特定することができるであろう。一部の実施形態では、阻害性核酸は、標的中に存在する少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25個の連続するヌクレオチドに対して相補的な配列を含有する(例えば、標的miRNA、例えば、成熟若しくは前駆体miR-181、又は標的mRNA)。
【００９２】
1つ以上の標的領域、セグメント又は部位が一旦特定されると、標的に対して十分に相補的である、すなわち、十分適切に且つ十分な特異性でハイブリダイズして(すなわち、他の非標的RNAには実質的に結合しない)、所望の効果を与える、阻害性核酸化合物が選択される。本発明の文脈において、ハイブリダイゼーションは、相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基の間のワトソン-クリック、Hoogsteen又は逆Hoogsteen水素結合でありうる水素結合を意味する。例えば、アデニン及びチミンは、水素結合の形成を介して対合する相補的核酸塩基である。「相補的」は、本明細書で使用する場合、2つのヌクレオチド間で正確に対合するための能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置におけるヌクレオチドがmiRNA分子又はmRNA分子の同じ位置におけるヌクレオチドと水素結合することが可能である場合、その際に、阻害性核酸と、miRNA又はmRNAはその位置において互いに相補的であると考えられる。それぞれの分子内の十分な数の対応する位置が互いに水素結合しうるヌクレオチドによって占有される場合、阻害性核酸と、miRNA又はmRNAは互いに相補的である。よって、「特異的にハイブリダイズすることができる」及び「相補的」は、阻害性核酸と、miRNA標的の間で安定かつ特異的な結合が生じるような相補性又は正確な対合の十分な程度を示すために使用される用語である。例えば、阻害性核酸の1つの位置における塩基が、miRNA又はmRNAの対応する位置における塩基と水素結合することが可能である場合、その際に、塩基は、その位置で互いに相補的であると考えられる。100%の相補性は必要とされない。
【００９３】
当技術分野において、特異的にハイブリダイズ可能であるために、相補的な核酸配列はその標的核酸の配列と100%相補的である必要はないということが理解される。本発明の方法のための相補的核酸配列は、特異的な結合が望ましい条件下で、例えば、in vivoアッセイ又は治療的処置の場合での生理学的条件下で、及びin vitroアッセイの場合では、アッセイが好適なストリンジェンシーの条件下で実施される条件下で、この配列と標的miRNA又はmRNA分子に対する結合が、標的miRNA又はmRNAの正常な機能に干渉して、発現又は活性の損失を引き起こし、且つこの配列の非標的RNA配列に対する非特異的な結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合、特異的にハイブリダイズ可能である。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常は約750mM未満のNaCI及び75mMのクエン酸三ナトリウム、好ましくは約500mM未満のNaCI及び50mMのクエン酸三ナトリウム、より好ましくは約250mM未満のNaCI及び25mMのクエン酸三ナトリウムとなるであろう。低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えば、ホルムアミドの非存在下で達成することができるが、一方、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、少なくとも約35%のホルムアミド、より好ましくは少なくとも約50%のホルムアミドの存在下で達成することができる。ストリンジェントな温度条件は、通常は少なくとも約30℃の温度、より好ましくは少なくとも約37℃の温度、最も好ましくは少なくとも約42℃の温度を含むことになる。ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤の濃度、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、及びキャリアーDNAの包含又は除外などの様々な追加のパラメーターは、当業者に周知である。様々なレベルのストリンジェンシーは、これらの様々な条件を必要に応じて組み合わせることによって達成される。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、30℃で、750mMのNaCl、75mMのクエン酸三ナトリウム、及び1%のSDS中で起こることになる。より好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、37℃で、500mMのNaCl、50mMのクエン酸三ナトリウム、1%のSDS、35%のホルムアミド、及び100pg/mlの変性サケ精子DNA(ssDNA)で起こることになる。最も好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、42℃で、250mMのNaCl、25mMのクエン酸三ナトリウム、1%のSDS、50%のホルムアミド、及び200pg/mlのssDNAで起こることになる。これらの条件の有用なバリエーションは、当業者にとっては容易に理解されるであろう。
【００９４】
ほとんどの適用では、ハイブリダイゼーション後に行われる洗浄工程もストリンジェンシーの点で異なるであろう。洗浄のストリンジェンシー条件は、塩濃度及び温度によって定義することができる。上記のように、洗浄のストリンジェンシーは、塩濃度を低下させるか、又は温度を上昇させることによって高めることができる。例えば、洗浄工程のストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約30mM未満のNaCl及び3mMのクエン酸三ナトリウム、最も好ましくは約15mM未満のNaCl及び1.5mMのクエン酸三ナトリウムとなる。洗浄工程に関するストリンジェントな温度条件は、通常は、少なくとも約25℃の温度、より好ましくは少なくとも約42℃の温度、さらにより好ましくは少なくとも約68℃の温度を含むことになる。好ましい実施形態では、洗浄工程は、25℃で、30mMのNaCl、3mMのクエン酸三ナトリウム、及び0.1%のSDSで行われることになる。より好ましい実施形態では、洗浄工程は、42℃で、15mMのNaCl、1.5mMのクエン酸三ナトリウム、及び0.1%のSDSで行われることになる。より好ましい実施形態では、洗浄工程は、68℃で、15mMのNaCl、1.5mMのクエン酸三ナトリウム、及び0.1%のSDSで行われることになる。これらの条件の追加のバリエーションは、当業者にとっては容易に明らかとなるであろう。ハイブリダイゼーション技法は、当業者に周知であり、例えば、{Benton、1977;Grunstein、1975及びAusubelらにおける(Current Protocols in Molecular Biology、Wiley Interscience社、New York、2001);Berger及びKimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques、1987、Academic Press、New York);及びSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New Yorkに記載されている。
【００９５】
一般的に、本明細書に記載の方法において有用な阻害性核酸は、標的核酸内の標的領域に対して少なくとも80%の配列相補性を有し、例えば、miRNA内の標的領域に対して90%、95%、又は100%の配列相補性を有する。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの20個の核酸塩基のうち18個が相補的であり、したがって、標的領域に特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物は、90パーセントの相補性を表すことになる。標的核酸のある領域に関する阻害性核酸の相補性のパーセントは、ベーシックローカルアライメントサーチツール(basic local alignment search tools)(BLASTプログラム)を使用して日常的に決定することができる(Altschul、1990;Zhang、1997)。miRNA又はmRNAにハイブリダイズする本発明のアンチセンス及び他の化合物は、日常的な実験により特定される。一般的に、阻害性核酸は、それらの標的に対する特異性を保持していなければならず、すなわち、意図される標的(同じファミリーに属するか又は異なるファミリーに属する1つ以上のmiRNAでありうる)以外の転写物に直接結合してはならないか、又は意図される標的以外の転写物の発現レベルに直接的に有意な影響を与えてはならない。
【００９６】
阻害性核酸に関するさらなる開示については、US2010/0317718(アンチセンスオリゴ);US2010/0249052(二本鎖リボ核酸(dsRNA));US2009/0181914及びUS2010/0234451(LNA);US2007/0191294(siRNA analogues);US2008/0249039(modified siRNA);並びにWO2010/129746及びW02010/040112(阻害性核酸)を参照されたい。
【００９７】
アンチセンス
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、標的に結合して、転写、翻訳、又はスプライシングレベルで発現を中断させることによって、DNA又はRNA標的の発現をブロックするように設計される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的マイクロRNA又は標的炎症性マーカーのmRNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするように設計された相補的な核酸配列である。したがって、標的に十分相補的な、すなわち、十分適切に且つ十分な特異性でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが選択され、所望の効果を与える。
【００９８】
修飾された塩基/ロックド核酸(LNA)
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法において使用される阻害性核酸は、1つ以上の修飾された結合又は塩基を含む。修飾された塩基としては、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ペプチド核酸、又はロックド核酸(LNA)分子が挙げられる。
【００９９】
LNAは、熱安定性を増強させる「ロックド」立体構造をもたらすリボース糖部分の2’炭素と4’炭素の間に余分な架橋を含有する修飾されたリボヌクレオチドである。したがって、LNAは、糖-ホスフェート骨格におけるフラノース環が、2'-0、4'-Cメチレン架橋の導入によってN型(C3'-エンド)立体構造を模倣するRNAにおいて化学的にロックされる二環式RNA類似体の1つのクラスを含む。前記修飾によって、ヌクレアーゼ抵抗性及び同族miRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性が増大する。
【０１００】
好ましくは、修飾されたヌクレオチドは、[アルファ]-L-LNAを含むロックド核酸分子である。LNAは、リボース環が2'-酸素と4'-炭素の間のメチレン架橋によって「ロック」されているリボ核酸類似体、すなわち、少なくとも1つのLNA単量体、すなわち、1つの2'-0,4'-C-メチレン-D-リボフラノシルヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを含む。LNA塩基は、標準的なワトソン-クリック塩基対を形成するが、ロックされた立体配置は、塩基対合反応の速度及び安定性を高める(Jepsenら、2004)。LNAは又は、RNAとの塩基対に対して、DNAと比較して高い親和性も有する。これらの特性のために、LNAは、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)及び比較ゲノムハイブリダイゼーションのためのプローブとして、miRNAのためのノックダウンツールとして、さらに標的mRNA又は他のRNA、例えば、本明細書に記載されているmiRNA及びmRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドとして特に有用である。
【０１０１】
LNA分子としては、それぞれの鎖において10〜30、例えば、12〜24、例えば、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30個のヌクレオチドを含む分子であって、一方の鎖が、miRNA又はmRNA中の標的領域に対して実質的に同一な、例えば、少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%、又は100%同一な、例えば、3、2、1、又は0個のミスマッチヌクレオチドを有する分子を上げることができる。LNA分子は、当技術分野で公知の方法を使用して化学的に合成することができる。
【０１０２】
LNA分子は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して設計することができ;いくつかのアルゴリズムが公知であり、(例えばインターネット上で、例えば、exiqon.comで)市販されている。例えば、(Levinら、2006;McTigueら、2004;Youら、2006)を参照されたい。例えば、アンチセンスオリゴを設計するために使用される方法と類似する「ジーンウォーク(gene walk)」法を使用して、LNAの阻害活性を最適化することができる;例えば、標的miRNA又はmRNAの長さに及ぶ10〜30ヌクレオチドの一連のオリゴヌクレオチドを調製して、それに続いて活性に関して試験することができる。
【０１０３】
任意選択で、ギャップ、例えば、5〜10又はそれより多くのヌクレオチドをLNA間に残して、合成及び試験されるオリゴヌクレオチドの数を低減することができる。GC含量は、好ましくは約30〜60%の間である。LNAを設計するための一般的なガイドラインは当技術分野で公知でり;例えば、LNA配列は他のLNA配列と非常にきつく結合することになり、そのため、LNA内で有意な相補性を回避することが好ましい。可能であれば、連続した3つ以上のG又はCの並び、又は4つより多くのLNA残基は回避されるべきである(例えば、極めて短い(例えば約9〜10ntの)オリゴヌクレオチドでは、このようなことは不可能な可能性がある)。一部の実施形態では、LNAは、キシロ-LNAである。
【０１０４】
一部の実施形態では、LNA分子は、miPvNAの特定の領域を標的とするように設計することができる。例えば、特定の機能的領域、例えば、シード配列を含む領域を標的化することができる。あるいは又はさらに、高度に保存された領域、例えば、霊長類(例えばヒト)及びげっ歯類(例えばマウス)などの別々の種に由来する配列をアライメントし、高度な同一性を有する領域を探すことにより同定された領域を標的とすることもできる。同一性パーセントは、ベーシックローカルアライメントサーチツール(BLASTプログラム)(Altschulら、1990;Zhang及びMadden、1997)(Altschulら、J. Mol. Biol. 215:403〜410頁、1990;Zhang及びMadden、Genome Res. 7:649〜656頁、1997)を使用して、例えば、デフォルトパラメーターを使用して、日常的に決定することができる。
【０１０５】
LNAに関する追加の情報については、米国特許第6,268,490号;同第6,734,291号;同第6,770,748号;同第6,794,499号;同第7,034,133号;同第7,053,207号;同第7,060,809号;同第7,084,125号;及び同第7,572,582号;及び付与前の米国公開公報第2010/0267018号;同第2010/0261175号;及び同第2010/0035968号;Koshkinら、Tetrahedron 54:3607〜3630頁、1998;Obikaら、Tetrahedron Lett. 39:5401〜5404頁、1998; Jepsenら、Oligonucleotides 14:130〜146頁、2004; Kauppinenら、Drug Disc. Today 2(3):287〜290頁、2005;及びPontingら、Cell 136(4): 629〜641頁、2009、「Locked nucleic acids」(LNAs)、J Am Chem Soc. 2002年5月29日;124(21):5974〜82頁を参照されたい。「Locked nucleic acid(LNA) recognition of RNA: NMR solution structures of LNA:RNA hybrids". Petersen Ml、Bondensgaard K、Wengel J、Jacobsen JP;Handb Exp Pharmacol. 2006;(173):405〜22頁。「Locked nucleic acid: high-affinity targeting of complementary RNA for RNomics」Kauppinen S1、Vester B、Wengel J.;RNA Biol. 2009年7月〜8月;6(3):321〜3頁. Epub 2009年7月18日。
【０１０６】
「Locked nucleic acid as a novel class of therapeutic agents.」Veedu RN1、Wengel J.Chem Biodivers. 2010年3月;7(3):536〜42頁。doi: 10.1002/cbdv.200900343. 「Locked nucleic acids: promising nucleic acid analogs for therapeutic applications.」Veedu RN1, Wengel J.Curr Opin Mol Ther. 2001年6月;3(3):239〜43頁。;「Locked nucleic acids: a promising molecular family for gene-function analysis and antisense drug development.」 Orum H1, Wengel J.及びここで引用された参照文献。
【０１０７】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、USSN 61/412,862も参照されたい。
【０１０８】
あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸(PNA)を含んでもよく、これは、糖-ホスフェート骨格ではなくペプチドベースの骨格を含有し、例えば、デオキシリボース骨格は、N-(2アミノエチル)-グリシン単位のポリアミド鎖によって置き換えられる(Fabani, M.M.;Abreu-Goodger、C.;Williams、D.; Lyons、P.A.;Torres, A.G.;Smith, K.G.;Enright, A.J.;Gait, M.J.;Vigorito, E. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Res. 2010,38, 4466〜4475頁)。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下に限定されないが、糖修飾、例えば、2'-0-アルキル(例えば、2'-0-メチル, 2'-0-メトキシエチル)、2'-フルオロ、及び4’チオ修飾、及び骨格修飾、例えば、1つ以上のホスホロチオエート、モルホリノ、又はホスホのカルボキシレート結合(例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第6,693,187号及び同第7,067,641号を参照されたい)。一部の実施形態では、好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、2'-0-メトキシエチル「ギャップマー」であり、これは、5’及び3’末端に、中央の少なくとも10個のデオキシリボヌクレオチドと共に2'-0-メトキシエチルに修飾されたリボヌクレオチドを含有する。これらの「ギャップマー」は、RNA標識のRNase H-に依存する分解機序を誘発することが可能である。安定性を増強し且つ有効性を改善するアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の修飾、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第6,838,283号に記載されているものが当技術分野で公知であり、本発明の方法において使用するのに好適である。
【０１０９】
本発明のさらなるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、低分子RNAジッパーを含む。
【０１１０】
マイクロRNAの活性を阻害するのに有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約19〜約25ヌクレオチド長である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟及び/又は前駆体miRNA配列に対して少なくとも部分的に相補的な、例えば、成熟及び/又は前駆体miRNA配列に対して少なくとも約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%配列を含んでもよい。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟及び/又は前駆体miRNA配列に対して実質的に相補的、すなわち、標的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約95%、96%、97%、98%、又は99%相補的であってもよい。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟及び/又は前駆体miRNA配列に対して100%相補的である配列を含む。
【０１１１】
本発明のアンチセンスヌクレオチドは、以下に限定されないが、miR-181a(配列番号1)、miR-181b(配列番号2)、miR-181c(配列番号3)、若しくはmiR-181d(配列番号4)又はこれらの組合せを含む、miR-181の標的配列であってもよい。
【０１１２】
本発明の好ましいアンチセンスヌクレオチドは、配列番号1、又は3の成熟miR-181a配列に対して少なくとも部分的に相補的な、例えば、前記miRNA配列並びに標的miRNA 181a及び/又はmir-181 cに対して少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%相補的な配列を含む、ロックド核酸である。
【０１１３】
本発明のさらに好ましいアンチセンスヌクレオチドは、配列番号2又は4の成熟miR-181a配列に対して少なくとも部分的に相補的な、例えば、前記miRNA配列並びに標的miRNA 181b及び/又はmir-181 dに対して少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%相補的な配列を含む、ロックド核酸である。特に好ましいロックド核酸は、配列番号1、2、3又は4を含み、1つ以上のヌクレオチドにおいて修飾されている。
【０１１４】
本発明の好ましい実施形態は、mir-181a/c及びmiR-181b/dを標的とするLNAの組合せ、特に好ましい実施形態は、本明細書に記載されているLNA A(配列番号6)及びLNA B(配列番号7)の組合せを含む。
【０１１５】
アンタゴミア
一部の実施形態では、アンチセンスは、アンタゴミアである(Krutzfeldt, J.;Rajewsky, N.;Braich, R.;Rajeev, K.G.;Tuschl, T.;Manoharan, M.;Stoffel, M. Silencing of microRNAs in vivo with 'antagomirs'. Nature 2005年、438、685〜689頁)。アンタゴミアは、マイクロRNA(例えば、標的hsa-miR-181)を標的とする化学修飾されたアンチセンスヌクレオチドである。例えば、本明細書に記載の方法において使用するためのアンタゴミアは、約12〜25ヌクレオチド、好ましくは約15〜23ヌクレオチドのmiRNA標的配列にハイブリダイズするのに十分相補的なヌクレオチド配列を含んでもよい。好適には、アンタゴミアは、miRNA配列に少なくとも部分的に相補的な一本鎖の、化学修飾されたリボヌクレオチドであってもよい。アンタゴミアは、1つ以上の修飾ヌクレオチド、例えば、2’-O-メチル糖修飾を含んでもよい。
【０１１６】
一般的に、例えば、3’末端にコレステロール部分を含む。一部の実施形態では、アンタゴミアは、RNaseからの防御、並びに増強された組織及び細胞による取り込みなどの薬理学的特性のための様々な修飾を有する。例えば、アンチセンスオリゴについて上記で議論した修飾に加えて、アンタゴミアは、糖の完全な又は部分的な2'-O-メチル化及び/又はホスホロチオエート骨格のうちの1つ以上を有していてもよい。ホスホロチオエート修飾は、RNase活性に対する防御をもたらし、その親油性は、組織への取り込みの増強に寄与する。一部の実施形態では、アンタゴミアは、6つのホスホロチオエート骨格の修飾を含んでいてもよく;2つのホスホロチオエートは5'末端に位置し、4つは3'末端に位置する。例えば、Krutzfeldtら、Nature 438:685〜689頁、2005;Czech, N. Engl. J. Med. 354: 1194〜1195頁、2006;Robertsonら、Silence 1:10、2010;Marquez及びMcCaffrey、Human Gene Ther. 19(l):27〜38頁、2008;van Rooijら、Circ. Res. 103(9):919〜928頁、2008;及びLiuら、Int. J. Mol. Sci. 9:978〜999頁、2008を参照されたい。
【０１１７】
本発明の方法において有用なアンタゴミアは、それらの長さに関して修飾されてもよく、又は別の方法でアンタゴミアを構成するヌクレオチド数に関して修飾されてもよい。一般的に、アンタゴミアは、最適な機能のために約20〜21ヌクレオチド長さであり、このサイズはほとんどの成熟マイクロRNAのサイズに適合する。アンタゴミアは、それらの標的に対する特異性を保持していなければならず、すなわち、意図される標的以外の転写物に直接結合してはならないか、又は意図される標的以外の転写物の発現レベルに直接的に有意な影響を与えてはならない。
【０１１８】
アンタゴミアは、成熟及び/又は前駆体miRNA配列に対して少なくとも約約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%相補的であってもよい。一部の実施形態では、アンタゴミアは、成熟miRNA配列に対して実質的に相補的、すなわち、標的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約95%、96%、97%、98%、又は99%相補的であってもよい。他の実施形態では、アンタゴミアは、成熟miRNA配列に対して100%相補的である。
【０１１９】
一部の実施形態では、阻害性核酸はロックされており、コレステロール部分を含む(例えば、ロックドアンタゴミア)。
【０１２０】
siRNA
一部の実施形態では、標的miRNA又は標的mRNAに相補的な核酸配列は、干渉RNAであってもよく、このような干渉RNAとしては、以下に限定されないが、低分子干渉RNA(「siRNA」)又は低分子ヘアピンRNA(「shRNA」)が挙げられる。干渉RNAを構築する方法は当技術分野で周知である。例えば、干渉RNAは、2つの別々のオリゴヌクレオチドからアセンブルされてもよく、この場合、一方の鎖はセンス鎖であり、他方はアンチセンス鎖であり、ここで、アンチセンス及びセンス鎖は、自己相補的である(すなわち、それぞれの鎖が、他方の鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む;例えば、アンチセンス鎖及びセンス鎖が二重鎖又は二本鎖構造を形成する場合);アンチセンス鎖は、標的核酸分子又はその部分(すなわち、望ましくない遺伝子)におけるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、標的核酸配列又はその部分に対応するヌクレオチド配列を含む。あるいは、干渉RNAは、単一のオリゴヌクレオチドからアセンブルされ、この場合、自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域は、核酸ベース又は非核酸ベースのリンカーによって連結される。干渉RNAは、二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピン又は非対称ヘアピン二次構造を有し、自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を有するポリヌクレオチドであってもよく、この場合、アンチセンス領域は、別々の標的核酸分子又はその部分におけるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列又はその部分に対応するヌクレオチド配列を有する。干渉は、2つ以上のループ構造並びに自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を含むステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであってもよく、この場合、アンチセンス領域は、標的核酸分子又はその部分におけるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列又はその部分に対応するヌクレオチド配列を有し、且つここで、環状ポリヌクレオチドは、in vivo又はin vitroのいずれかでプロセシングされて、RNA干渉を媒介することが可能な活性siRNAを生じうる。
【０１２１】
一部の実施形態では、干渉RNAをコードする領域は、センス領域、アンチセンス領域及びループ領域を有する自己相補的なRNA分子をコードする。このようなRNA分子は、望ましく発現される場合、「ヘアピン」構造を形成し、本明細書において「shRNA」と称される。ループ領域は、一般的に、約2〜約10ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ループ領域は、約6〜約9ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、センス領域及びアンチセンス領域は、約15〜約20ヌクレオチド長である。転写後プロセシングの後に、低分子ヘアピンRNAは、RNase IIIファミリーのメンバーである酵素Dicerによって媒介される切断事象によってsiRNAへと変換される。次いで、siRNAは、それが相同性を共有する遺伝子の発現を阻害することが可能である。詳細には、Brummelkampら、Science 296:550〜553頁、2002;Leeら、Nature BiotechnoL、20、500〜505頁、2002;Miyagishi及びTaira、Nature Biotechnol. 20:497〜500頁、2002;Paddisonら、Genes & Dev. 16:948〜958頁、2002;Paul、Nature Biotechnol. 20, 505〜508頁、2002;Sui, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、99(6):5515〜5520頁、2002;Yuら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:6047〜6052頁、2002を参照されたい。
【０１２２】
miRNAスポンジ
miRNAスポンジ又はデコイは(Ebertら、Nat Methods. 2007年9月;4(9):721〜6頁 Epub 2007年8月12日。Generation of miRNA sponge constructs. Kluiver, J.、Slezak-Prochazka, I.、Smigielska-Czepiel, K.、Halsema, N.、Kroesen, B.J.、及びAnke van den Berg. Methods - 2012年7月23日。E-pub ahead of print.;F.C. Tay,ら、Using artificial microRNA sponges to achieve microRNA loss-of-function in cancer cells、Adv. Drug Deliv. Rev. (2014))、mRNAにおいて見出されたものを模倣し且つ標的とされるmiRNAに対して相補的な複数の高親和性miRNAアンチセンス結合部位(MBS)を含有するin vivoで発現された転写物であり、これらの転写物は、特異的miRNAを効率的に隔離し、それによって、内在性標的遺伝子への結合を防止することができる。これらの結合部位は、通常、単一の特異的miRNA又は同じシード領域を共有するmiRNAファミリーのメンバーのいずれかを標的とするよう設計された同一部位のタンデムリピートであり;マイクロRNAと標的の間の相互作用は、シード領域(マイクロRNAの2〜8位)における塩基対合に依存すると考えられ、デコイ標的は、マイクロRNAシードファミリーのすべてのメンバーと相互作用するはずである。そうすることで、単一のマイクロRNA配列をブロックすると考えられるアンチセンスオリゴヌクレオチドを阻害するよりもマイクロRNAの機能的クラスを阻害する方がよく、。
【０１２３】
miRNA又はデコイの設計については、例えば、「Ebert MS、Neilson JR、Sharp PA (2007) MicroRNA sponges: competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. Nat Methods 4: 721〜72頁」及び「Kluiver J, Slezak-Prochazka I、Smigielska-Czepiel K、Halsema N, 、Kroesen BJ、van den Berg A (2012) Generation of miRNA sponge constructs. Methods 58: 113〜117頁」に開示されている。
【０１２４】
スポンジ配列は、典型的には、4〜6ヌクレオチド長のスペーサー配列によって分離された複数のmiRNA結合部位(MBS)からなる。MBSは、完全にアンチセンスであるか又は中央の位置にバルジを含有するかのいずれかである。しかし、完全に塩基対合したmiRNAスポンジの相互作用はAgo2に媒介される切断を受けやすく、したがって、4つのヌクレオチド中央のバルジを含有するMBSがより有効であることが報告されている。miRNAスポンジは、すべてのシードファミリーのメンバーを阻害するという利点をもたらし、複数のMBSが導入される場合にも、これらは全miRNAクラスターの阻害のために使用することができる。miRNA阻害の他の手段についての利点を考慮すると、miRNAスポンジは、疾患の処置において使用するための可能性も有する(参照により組み込まれる、Ebert MSら、Nat Methods 2007、Ebert MS 及びSharp PA、RNA 2010、Liu Zら、Int J Mol Sci 2008、Kluiver Jら、Methods 2012、Kluiverら、PLoS One 2012)。
【０１２５】
miRNAスポンジ構築物の設計及びオフターゲット試験は、ウェブに基づくツールのMiRNAsong:microRNA SpONge Generator及びテスターを使用して実施されてもよい。
【０１２６】
好適には、スポンジは、標的miRNAに対して相補的な配列を含む高親和性miRNAアンチセンス結合部位(MBS)、及びバルジ領域、すなわち、MPS配列のヌクレオチド9〜12におけるミスマッチ領域から構成される。好適には、相補性領域は、標的miRNAにたして少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、99%又は100% 同一である。最も好ましくは、相補性領域は、標的miRNAに対して少なくとも80%同一である。好適には、標的miRNA配列に対して相補的な配列は、シード配列、例えば、標的転写物の認識に必須である所与のmiRNA内の配列を含み、「バルジ」領域は前記シード配列の外側にある。各MBS配列(MBS SEQ.)は、成熟標的miRNAと同じ長さである。各MBS SEQ.は、数回、すなわち、6〜24回、好ましくは6〜12回、最も好ましくは6回繰り返される。好適には、MBS SEQ.は、4〜6ヌクレオチド、好ましくは4ヌクレオチドからなる「スペーサー」配列によって互いに分離されている。
【０１２７】
好適には、本発明のmiRNAスポンジは、2つ以上のmiRNA、好ましくは同じファミリー内の2つ以上のmiRNA、あるいは異なるファミリーに由来する2つ以上のmiRNAを標的とする2つ以上のMBS配列を含んでもよい。
【０１２８】
好適には、所与のシード配列に対して相補的なMPB配列を含むmiRNAスポンジは、前記シード配列を有するすべてのmiRNAを阻害する。好適には、miRNAのファミリーは、関連性の高い配列を有するmiRNAを含み、好適には、同じファミリーに由来するmiRNAは、同じシード配列を共有する。
【０１２９】
本発明の阻害剤は、スペーサー配列によって分離された2つのMBS針悦から構成され;好適には、2つのMBS配列は、同一又は異なるmiRNAを標的とすることができる。
【０１３０】
例えば、miRNA阻害剤は、以下の式:
(X1sX2sX3)n1S2(X1sX2sX3)n2
(式中、
X1、X2及びX3は、独立して、
-  好ましくは、バルジを作製するためにヌクレオチド9〜ヌクレオチド12を修飾した、miR-181a及び/又はmiR-181cに相補的なMPS SEQ、 
-  好ましくは、バルジを作製するためにヌクレオチド9〜ヌクレオチド12を修飾した、miR-181b及び/又はmiR-181dに相補的なMPS SEQ
から選択され;
X3は存在しても存在しなくてもよく;
ｓは、4〜6ヌクレオチド、好ましくは4ヌクレオチドのスペーサー配列であり;
S2は、好ましくは、制限酵素部位、好ましくはXbal制限酵素に関する部位に相当する4〜6ヌクレオチド、好ましくは6ヌクレオチドの中心のスペーサー配列であり;
n1及びn2は、3、6及び24から、好ましくは3、6及び12の中から独立して選択される数であり、最も好ましくは、nは3であり、n1及びn2は同一であっても異なっていてもよい)
を有してもよい。
【０１３１】
本発明の好ましいmiRNA阻害剤は、以下の式:
(AsB)n1S2(AsB)n2
(式中、
Aは、好ましくは、バルジを作製するためにヌクレオチド9〜ヌクレオチド12を修飾した、miR-181a及び/又はmiR-181cに相補的なMPS SEQであり;
Bは、好ましくは、バルジを作製するためにヌクレオチド9〜ヌクレオチド12を修飾した、miR-181b及び/又はmiR-181dに相補的なMPS SEQであり;
Sは、4〜6ヌクレオチド、好ましくは4ヌクレオチドのスペーサー配列であり;
S2は、好ましくは、制限酵素部位、好ましくはXbal制限酵素に関する部位に相当する4〜6ヌクレオチド、好ましくは6ヌクレオチドの中心のスペーサー配列であり;
n1及びn2は、3、6及び24から、好ましくは3、6及び12の中から独立して選択される数であり、最も好ましくは、nは3であり、n1及びn2は同一であっても異なっていてもよい)を有するスペーサー配列によって分離された2つのMBS配列から構成される。
【０１３２】
好ましくは、X1、X2、X3、Aは、3'TT GT AAGTVHDH AC AG CC ACT C A5’であり、
ここで、IUPAC命名法によれば、
V=A又はC又はG
H=A又はC又はT
D=A又はG又はT
【０１３３】
より好ましくは、X1、X2、X3、Bは、3'TTGTAAGTBBDHACAGCCACCCA5'であり、
IUPAC命名法によれば、
B=C又はG又はT
D=A又はG又はT
H=A又はC又はT
【０１３４】
さらに好ましくは、n1=3及びn2=3
【０１３５】
好ましくは、Sは、4ヌクレオチドからなり、好ましくはS=tagc。
【０１３６】
さらに好ましくは、S2は、6ヌクレオチドからなり、好ましくはS2=Tctaga
【０１３７】
好適には、一部の実施形態では、miR-181の阻害剤は、化学修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、好適にはLNA、RNA阻害剤、例えば、アンタゴミア、又はmiR-181a及び/若しくはmiR-181b又はこれらの組合せの成熟配列に対して実質的に相補的な配列を含むmiRNAスポンジである。
【０１３８】
本明細書で使用する場合、「実質的に相補的な」は、標的ポリヌクレオチド配列(例えば、成熟又は前駆体miRNA配列)に対して少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%相補的である配列を指す。
【０１３９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、前駆体miRNA配列(pre-miRNA)に対して実質的に相補的な配列を含んでもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、pre-miRNA配列のステム-ループ領域の外側に位置する配列に対して実質的に相補的な配列を含む。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟miRNA配列に対して実質的に相補的である。
【０１４０】
siRNAによってガイドされる標的RNA切断反応は、高度に配列特異的である。一般的に、標的核酸(すなわち、標的miRNA又はmRNAのシード配列を含む標的領域)の一部に同一なヌクレオチド配列を含有するsiRNAが阻害のために好ましい。しかし、siRNAと標的遺伝子の間の100%の配列同一性は、本発明を実践するために必要とされない。よって、本発明は、遺伝子変異、株の多形性、又は進化的分岐によって期待される配列の多様性を許容することができるという利点を有する。例えば、標的配列に対して、挿入、欠失、及び単一点変異を有するsiRNA配列も、阻害に対して有効であることが見出された。あるいは、ヌクレオチド類似体置換又は挿入を有するsiRNAは、阻害にたいして有効でありうる。一般的に、siRNAは、それらの標的に対する特異性を保持しなければならず、すなわち、意図される標的以外の転写物に直接結合してはならないか、又は意図される標的以外の転写物の発現レベルに直接的に有意な影響を与えてはならない。
【０１４１】
miRNA、miRNA模倣体、又はmiRNA阻害剤の「治療有効用量又は治療有効量」は、本明細書に記載されているように投与された場合に、正の治療応答、例えば、特異的miR-181標的のmRNAレベルの上昇、ミトコンドリア機能の改善及び/又はミトコンドリアの数の増加、細胞生存の改善に伴う酸化ストレス及び細胞死の低減をもたらす量が意図される。
【０１４２】
リボザイム
トランス切断する酵素的核酸分子も使用することができ;これらは、ヒト疾患用の治療剤として有望であることが示されている(Usman及びMcSwiggen、Ann. Rep. Med. Chem. 30:285〜294頁、1995;Christoffersen及びMarr、J. Med. Chem. 38:2023〜2037頁、1995)。酵素的核酸分子は、細胞RNAのバックグラウンド中の特異的なmiRNA又はmRNA標的を切断するように設計されていてもよい。このような切断事象により、miRNA又はmRNAは機能しなくなる。
【０１４３】
一般的に、RNA切断活性を有する酵素的核酸は、最初に標的RNAに結合することによって作用する。このような結合は、標的RNAを切断するように作用する分子の酵素的部分の近傍に保持される酵素的核酸の標的結合部分を介して起こる。したがって、酵素的核酸は、最初に標的RNAを認識して、次いで、相補的塩基対形成によりそれと結合し、正しい部位に結合したら、酵素的に作用して標的RNAを切断する。このような標的RNAの戦略的な切断は、その活性を破壊することになる。酵素的核酸が結合し、そのRNA標的が切断された後、酵素的核酸は、そのRNAから放出されて別の標的を探索し、さらに新しい標的に繰り返して結合して切断することができる。
【０１４４】
いくつかのアプローチ、例えば、in vitroでの選択(進化)戦略(Orgel, Proc.R. Soc.London、B 205:435頁、1979)が、ホスホジエステル結合及びアミド結合の切断及びライゲーションなどの様々な反応を触媒することが可能な新たな核酸触媒を得るために使用されてきた(Joyce、Gene、82、83〜87頁、1989; Beaudryら、Science 257、635〜641頁、1992; Joyce、Scientific American 267、90〜97頁、1992; Breakerら、TIBTECH 12:268、1994; Barrelら、Science 2611411〜1418頁、1993; Szostak、TIBS 17、89〜93頁、1993; Kumarら、FASEB J.、9:1183頁、1995; Breaker、Curr.Op.Biotech.、1 :442頁、1996)。触媒活性に最適なリボザイムの開発は、遺伝子発現を調節する目的でRNA切断リボザイムを用いるあらゆる戦略に大いに貢献するであろう。ハンマーヘッド型リボザイムは、例えば、飽和(10mM)濃度のMg2+補因子の存在下で約1分-1の触媒反応速度(kcat)で機能する。人工の「RNAリガーゼ」リボザイムは、約100分-1の速度で対応する自己修飾反応を触媒することが示されている。さらに、DNAで構成される基質結合アームを有する特定の修飾されたハンマーヘッド型リボザイムは、100分-1に近い複数の回転率でRNA切断を触媒することが知られている。
【０１４５】
阻害性核酸の作製及び使用
本明細書に記載の方法を実践するために使用される核酸配列は、RNA、cDNA、ゲノムDNA、ベクター、ウイルス又はそれらのハイブリッドのいずれかにかかわらず、様々な供給源から単離され、遺伝操作され、増幅され、及び/又は組換えによって発現/生成されうる。
【０１４６】
組換え核酸配列は、個々に単離されてもよく、又はクローニングして所望の活性について試験されてもよい。任意の組換え発現系を使用することができ、このような発現系としては、例えば、in vitro、細菌、真菌、哺乳動物、酵母、昆虫、又は植物細胞の発現系が挙げられる。本発明の核酸配列(例えば、本明細書に記載の阻害性核酸又はセンス核酸のいずれか)は、送達用ベクター中に挿入され、ベクター内の転写単位から発現させてもよい。組換えベクターは、DNAプラスミド又はウイルスベクターであってもよい。ベクター構築物の生成は、当技術分野で周知の任意の適切な遺伝子操作技法を使用して達成することができ、このような技術としては、限定されないが、例えば、Sambrookら Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (1989))、Coffinら(Retroviruses. (1997))及び「RNA Viruses: A Practical Approach」(Alan J. Cann編、Oxford University Press、(2000)に記載されているような、標準的なＰＣＲ技法、オリゴヌクレオチド合成、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、及びDNAシーケンシングが挙げられる。
【０１４７】
当業者に認識されるように、本発明の核酸を細胞内に移入するために様々な好適なベクターが利用可能である。核酸を送達するのに適切なベクターの選択、選択された発現ベクターを細胞内に挿入する条件の最適化は、当業者の技術の範囲内であり、過度な実験を必要としない。ウイルスベクターは、パッケージング細胞中で組換えウイルスを生産するための配列を有するヌクレオチド配列を含む。本発明の核酸を発現するウイルスベクターは、以下に限定されないが、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、又はアルファウイルスを含むウイルス骨格をベースとして構築されてもよい。本発明の核酸を発現することが可能な組換えベクター(例えば、ウイルスベクター)は、本明細書に記載されているように送達され、標的細胞(例えば、安定な形質転換体)中で維持されてもよい。例えば、このような組換えベクター(例えば、hsa-miR-155に相補的なアンチセンスオリゴマーの発現をもたらす組換えベクター)は、対象の脳脊髄液に(例えば、注射又は注入)投与することができる(例えば、頭蓋内注射、脳実質内注射、脳室内注射、及び髄腔内注射、例えば、Bergenら、Pharmaceutical Res. 25:983〜998頁、2007を参照されたい)。本明細書に記載の核酸のいずれかを発現させるために使用することができるいくつかの例示的な組換えウイルスベクターも、Bergenら(上掲)によって記載されている。組換えウイルスベクターの追加の例は、当技術分野で公知である。
【０１４８】
本明細書において提供される核酸(例えば、阻害性核酸)は、対象に投与(例えば、対象の脳脊髄液中に注射又は注入)する前に、1つ以上のカチオン性ポリマー(例えば、ポリ-L-リジン及びポリ(エチレンイミン)、カチオン脂質(例えば、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロポン(propone)(DOTAP)、N-メチル-4-(ジオレイル)メチルピリジニウム、及び3P-[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]コレステロール)、及び/又はナノ粒子(例えば、カチオン性ポリブチルシアノアクリレートナノ粒子、シリカナノ粒子、又はポリエチレングリコールベースのナノ粒子)とさらに複合体を形成してもよい。核酸の治療的送達のためのカチオン性ポリマー、カチオン脂質、及びナノ粒子のさらなる例は、当技術分野で公知である。核酸の治療的送達は、ポリエチレンイミン/DNA複合体の髄腔内注射の後に達成されることが示されている(Wangら、Mol. Ther. 12:314〜320頁、2005)。本明細書に記載の核酸の送達方法は、非限定的である。追加の対象への核酸の治療的送達のための方法は、当技術分野で公知である。
【０１４９】
一部の実施形態では、阻害性核酸(例えば、hsa-miR-155を標的とする1つ以上の阻害性核酸)は、全身投与されるか(例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、又は腹腔内に)又はクモ膜下に投与されてもよい(例えば、硬膜外投与)。一部の実施形態では、阻害性核酸は、1つ以上のカチオン脂質と組み合わせて(例えば、それらと複合体を形成して)投与される。1つ以上の阻害性核酸(例えば、本明細書に記載の阻害性核酸のいずれか)を投与するために使用することができるカチオン脂質の非限定的な例としては、リポフェクトアミン、WO97/045069、及び米国特許出願第2012/0021044号、同第2012/0015865号、同第2011/0305769号、同第2011/0262527号、同第2011/0229581号、同第2010/0305198号、同第2010/0203112号、及び同第2010/0104629号(そのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる)に記載のカチオン脂質分子が挙げられる。本発明を実践するために使用される核酸配列は、in vitroで、周知の化学合成技法によって合成することができ、例えば、Adams, J. Am. Chem. Soc. 105:661頁、1983;Belousov、Nucleic Acids Res. 25:3440〜3444頁、1997;Frenkel、Free Radic. Biol. Med. 19:373〜380頁、1995;Blommers、Biochemistry 33:7886〜7896頁、1994;Narang、Meth. Enzymol. 68:90頁、1994;Brown、Meth. Enzymol. 68: 109頁、1979;Beaucage、Tetra. Lett. 22: 1859頁、1981;及び米国特許第4,458,066号に記載されているように合成することもできる。
【０１５０】
本発明の核酸配列は、修飾、例えば、ヌクレオチド修飾を組み込むことなどによって、核酸分解に対して安定化されうる。例えば、本発明の核酸配列は、少なくともヌクレオチド配列の5'又は3' 末端における第1、第2、又は第3のインターヌクレオチド結合にホスホロチオエートを含む。別の例として、核酸配列は、2'で修飾されたヌクレオチド、例えば、2'-デオキシ、2'-デオキシ-2'-フルオロ、2<*>-O-メチル、2<*>-O-メトキシエチル(2<*>-O-MOE)、2<*>-O-アミノプロピル(2<*>-O-AP)、2<*>-O-ジメチルアミノエチル(2<*>-O-DMAOE)、2<*>-O-ジメチルアミノプロピル(2<*>-O-DMAP)、2<*>-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、又は2'-O〜Ｎ-メチルアセトアミド(2'-O〜NMA)を含んでもよい。別の例として、核酸配列は、少なくとも1つの2'-O-メチルで修飾されたヌクレオチドを含んでいてもよく、一部の実施形態では、ヌクレオチドのすべてが、2'-O-メチル修飾を含む。一部の実施形態では、核酸は、「ロック」されており、すなわち、リボース環が2'-O原子と4'-C原子とを接続するメチレン架橋によって「ロック」されている核酸類似体を含む(例えば、Kaupinnenら、Drug Disc. Today 2(3):287〜290頁、2005;Koshkinら、J. Am. Chem. Soc、120(50):13252〜13253頁、1998を参照されたい)。 追加の修飾については、US2010/0004320、US2009/0298916、及びUS2009/0143326(そのそれぞれは参照により組み込まれる)。
【０１５１】
本発明を実践するために使用される核酸を操作するための技法、例えば、サブクローニング、標識プローブ(例えば、クレノーポリメラーゼ、ニックトランスレーション、増幅を使用して標識するランダムプライマー)、シーケンシング、ハイブリダイゼーションなどは、科学文献及び特許文献において十分に記載されており、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning; A Laboratory Manual第3版 (2001);Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編 (John Wiley & Sons, Inc.社、New York 2010);Kriegler、Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990);Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation、Tijssen編 Elsevier、N.Y. (1993)を参照されたい。
【０１５２】
処置方法
配列番号1、2、3又は4つ(例えば、阻害性核酸、例えば、アンタゴミア)のマイクロRNAの1つ以上の(例えば、少なくとも2、3、4、5、又は6種の)レベル又は活性を低下させる少なくとも1種の(例えば、少なくとも2、3、4、5、又は6種の)薬剤(例えば、核酸)を対象に投与する工程を含む、ミトコンドリア障害を処置尾する方法も提供される。
【０１５３】
一部の実施形態では、対象は、miR-181に存在する連続配列に対して相補的な配列(例えば、成熟又は前駆体hsa-miR-181に存在する連続配列)を含む少なくとも1つの阻害性核酸を投与される。非限定的な実施形態では、阻害性核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、siRNA、又はアンタゴミアであってもよい。一部の実施形態では、少なくとも1つの阻害性核酸は、対象の脳脊髄液中に注射される。一部の実施形態では、注射は、頭蓋内注射又は髄腔内注射である。一部の実施形態では、少なくとも1つの阻害性核酸は、1つ以上のカチオン性ポリマー及び/又はカチオン脂質(例えば、本明細書に記載の又は当技術分野で公知のカチオン性ポリマーのいずれか)と複合体を形成する。特異的な標的miRNA(例えば、miR-181)の発現及び/又は活性を低下させるアンタゴミアは、当技術分野で公知の方法を使用して設計することができる(例えば、Krutzfeldら、Nature 438：685〜689頁、2005を参照されたい)。アンタゴミア及び他の種類の阻害性核酸を設計し作製するさらなる例示的な方法が本明細書に記載されている。
【０１５４】
一部の実施形態では、miR-181レベルを低下させる阻害性核酸は、アンタゴミア-181 LNA配列である。標的マイクロRNA分子に対するアンタゴミアを設計する方法は、Obadら、Nature Genetics 43：371〜378頁、2011に記載されている。miR-181のレベル又は発現を低下させる追加の阻害性核酸は、Wormら、Nucleic Acids Res.37:5784〜5792頁、2009、及びMurugaiyanら、J.Immunol.187:2213〜2221頁、2011に記載されている。
【０１５５】
対象に、薬剤(例えば、1つ以上の阻害性核酸)を、少なくとも1回用量(例えば、少なくとも2、3、4、又は5回用量)で投与することができる。薬剤(例えば、1つ以上の阻害性核酸)は、少なくとも1日1回(例えば、1日2回、1日3回、及び1日4回)、少なくとも週1回(例えば、週2回、週3回、週4回)、及び/又は少なくとも月1回、対象に投与することができる。対象は、長期間(例えば、少なくとも1カ月、2カ月、6カ月、1年、2年、3年、4年、又は5年で)処置することができる(例えば、薬剤を定期的に投与することができる)。本明細書で詳細に記載されているように、対象に投与される薬剤の投薬量を、いくつかの生理学的因子を考慮して医師が決定することができ、このような因子としては、以下に限定されないが、対象の性別、対象の質量、対象の年齢、及び他の医療状態の存在が挙げられる。薬剤は、経口、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内に、又は脳脊髄液への注射によって対象に投与することができる。同様に、薬剤は、固体として(例えば、経口投与では)、又は生理学的に許容できる液体担体として(例えば、生理食塩水)、(例えば静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、脳脊髄液(髄腔内)、又は頭蓋内投与では)配合されてもよい。一部の実施形態では、薬剤(例えば、1つ以上の阻害性核酸)は、注射によって投与してもよく、又は所定時間にわたる注入によって投与してもよい。
【０１５６】
ミトコンドリア障害の処置のために対象に投与される薬剤について本文書において説明するが、これらは、あらゆる組合せ(例えば、薬剤又は以下に記載の薬剤のクラスのいずれかの組合せのうちの少なくとも1、2、3、4、又は５つ)で使用することができる。
【０１５７】
本発明の疾患
本発明において処置及び/又は防止される疾患としては、リー症候群、レーバー遺伝性視神経萎縮症(LHON)、ミトコンドリアミオパチー、脳症、乳酸アシドーシス及び脳卒中症候群(MELAS)、赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん(MERRF)、進行性外眼筋麻痺(PEO)、ピアソン症候群、母系遺伝性ミオパチー及び心筋症(MIMyCA)、ケジェール視神経症、ニューロパシー運動失調及び網膜色素変性(NARP)、常染色体優性視神経萎縮症、カーンズセイヤー症候群、赤色ぼろ線維を有するミオクローヌスてんかん(MERRF)症候群を含むPMD;フリートライヒ運動失調症、遺伝性痙性対麻痺、シャルコーマリートゥース病を含むSMDなどの疾患;散発性加齢神経変性疾患、例えば、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、加齢黄斑変性症(AMD)、糖尿病性網膜症、緑内障;家族性PD、AD、ハンチントン病、網膜色素変性症(RP)、シュタルガルト病を含む家族性神経変性疾患を含むミトコンドリア機能不全に関連する中枢神経系及び/又は眼に影響を及ぼす神経変性障害が挙げられる。
【０１５８】
LHONは、中心視野の喪失を導くRGS変性によって特徴付けられるミトコンドリア視神経症の非症候性形態である。これは、典型的には、15〜35歳の間で起こる、最も頻度の高いミトコンドリア疾患のうちの1つである(有病率は1:30000)。他のMDと同様に、LHONは、ミトコンドリアゲノム(mtDNA)によってコードされた複数の遺伝子における点変異によって引き起こされるため、遺伝学的に異種混交性が高いことによって特徴付けられる。LHON患者の約95%では、変異は、複合体IサブユニットをコードするND1、ND4、又はND6遺伝子に位置する(Carelli, 2004 ;Meyerson, 2015)。
【０１５９】
線状皮膚欠損を伴う小眼球症(MLS)症候群は、ヘテロ接合性雌における小眼球症、脳の異常及び皮膚欠損並びに及びヘミ接合性雄の子宮内致死によって特徴付けられるX連鎖性神経発達障害である。この疾患は、複合体IIIの機能性に関与するホロチトクロームc型合成酵素(HCCS)(Bernardら、2003;Indrieriら、2013;Wimplingerら、2006)、及びチトクロームcオキシダーゼのサブユニット7BであるCOX7B(MRC複合体IV)(Indrieriら、2012)等のMRCの主要な存在における変異によるものである。
【０１６０】
ロドプシン遺伝子における変異は、優性及び劣性の網膜色素変性症(RP)の原因であり、全症例の約10%を占める。したがって、優性ロドプシン変異は機能獲得型変異体又はドミナントネガティブ変異体である。いくつかのクラスを定義する:クラスIは、細胞質膜に局在化し、11-シス-レチンアルデヒドに結合して、スペクトル的に活性なロドプシンを形成する能力がある点が野生型(wt)オプシン様である;クラスIIは、タンパク質のフォールディング及び/又は安定性においておそらく欠点を有し、粗面小胞体に異常に蓄積し、wtオプシンのようには細胞質膜に効率的に輸送されず、11-シスレチンアルデヒドに結合してスペクトル的に活性な感光色素を形成することができない;クラスIIIは、トランスデューシンを構成的に活性化する。
【０１６１】
クラスI変異体の中には、カルボキシ末端に近接するプロリン-347に影響を及ぼすものがある。この残基は、公知のすべての視色素で保存されている。この残基に影響を及ぼす6つの異なるミスセンス変異が、RPを有する患者で特定されており、これはプロリン-347がロドプシンのいくつかの生体機能を媒介することを示す。
【０１６２】
送達方法
ある特定の実施形態では、miR-181の阻害剤は、in vivoで、ベクターから発現される。「ベクター」は、目的の核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる対象となる組成物である。多数のベクターが当技術分野で公知であり、以下に限定されないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物を伴うポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含む。よって、用語「ベクター」は、自律複製プラスミド又はウイルスを含む。ウイルスベクターの例としては、以下に限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。発現構築物は、生細胞において複製してもよく、又は合成によって作製してもよい。この出願の目的として、用語「発現構築物」、「発現ベクター」、及び「ベクター」は、一般的な例証の意味で、本発明の適用を実証するために交換可能に使用され、本発明を限定することを意図するものではない。
【０１６３】
一実施形態では、miR-181の阻害剤に関する発現ベクターは、miR-181阻害剤をコードするポリヌクレオチドに「作動可能に連結する」プロモーターを含む。表現「作動可能に連結する」又は「転写制御下で」は、本明細書で使用する場合、プロモーターが、RNAポリメラーゼによる転写の開始及びポリヌクレオチドの発現を制御するためのポリヌクレオチドに関して、正しい位置及び方向にあることを意味する。
【０１６４】
特に好ましいウイルスベクターは、AAVベクター、好適には、AAV9、AAV5及び AAV2ベクター(例えば、AAV2/2、AAV2/8、AAV2/7m8、AAV2/9、AAV2/PhP.B)である。
【０１６５】
本発明の好ましいプロモーターは、ユビキタスプロモーター、例えば、本発明のmiRNAの遍在的発現を駆動するプロモーター、例えば、CMV又はCBAプロモーターである;あるいは、本発明のプロモーターは、細胞又は組織特異的プロモーター、例えば、ニューロン特異的発現のためのa-synプロモーター又は例えば、光受容体特異的発現のためのRHOプロモーターであってもよい。
【０１６６】
非ウイルス送達系は、プラスミド及び合成、通常は正に帯電した材料、例えば、リポソーム、多糖、ポリペプチド、及び参照により本明細書に組み込まれる、D. Ibraheem、A. Elaissari、H. Fessi、Gene therapy and DNA delivery systems、Int. J. Pharm. 459 (2014) 70〜83頁に記載されているもののような人工的ポリマーから構成される複合体である。1つのこのような例は、ジセチルホスフェート-テトラエチレンペンタアミド系ポリカチオンリポソーム(TEPA-PCL)の使用に基づく送達系である。この系を介して、miRNA及びmiRNAスポンジを含む他のヌクレオチドが、マクロピノサイトーシスによって細胞内に送達され、高い効率で細胞質内に放出される。非ウイルス送達系は、低免疫原性及び低毒性の可能性を付与し、それによって、安全性を改良をもたらす際に魅力的である。
【０１６７】
発明の詳細な説明
材料及び方法
動物実験
倫理に関する声明:魚及びマウスに関するすべての研究は、the institutional guidelines for animal researchに従って行われ、the Italian Ministry of Healthによって承認された;動物実験に関する法律に従うDepartment of Public Health、Animal Health、Nutrition及びFood Safety(article 7; D.L. 116/92;プロトコール番号:389/2015-PR)。すべての動物の処置は、前もって、he Institutional Ethics Committee at the Telethon Institute of Genetics and Medicine(Pozzuoli社、Italy)によって検討され且つ承認された。
【０１６８】
細胞株
HeLa及びSH-SY5Y細胞をATCC(CRM-CCL-2, CRL-2266)から入手し、供給業者によって示唆された通り、それぞれ、10%のFBS(SIGMA社)と1%のペニシリン/ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地(GIBCO社)又はダルベッコ改変イーグル培地とNutrient Mixture F-12の1:1混合物を用いて培養中に維持した。
【０１６９】
ルシフェラーゼアッセイ
miR-181a/bを含有するヒト3'UTR配列によって予測された結合部位をPCRによって増幅し、pGL3-tk-ルシフェラーゼベクター中に挿入した。QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene社)を使用して、変異誘発されたmiR-181a/b結合部位を含有する構築物を得た。プライマー配列を表Iにおいて報告する。プラスミドは、HeLa細胞(PolyFect reagent、QJAGEN社)にトランスフェクトした。7時間後、インターフェロン(Polyplus社)を使用して、100nMのmiRIDIAN Negative Mimic又はMimic-miR-181(DHARMACON社)を細胞にトランスフェクトした。24時間後、Dual-Luciferase Reporter Assay(Promega社)を使用して、ルシフェラーゼ活性を定量した。
【０１７０】
【表１】
2021522212.tif 000009
【０１７１】
RNA抽出
全RNA抽出のための組織又は細胞試料をQIAzol Lysis Reagent(QIAGEN社)中で処理した。製造業者の使用説明書に従って、RNeasy抽出キット(QIAGEN社)を使用して、全RNAを抽出した。
【０１７２】
定量的リアルタイムPCR
定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)実験のために、製造業者の使用説明書に従って、QuantiTect Reverse Transcription Kit(QJAGEN社)を使用してcDNAを生成した。qRT-PCR反応のためのプライマーを設計して、2つの異なるエクソンを繋いで、in silicoツール(www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html)を使用してゲノムDNA増幅を回避し、それらの溶融温度(Tm)を予測し且つ自己アニーリング又はプライマーの二量体化の可能性を回避した。Genome Browser(https://genome.ucsc.edu/)又はEnsembl(http://www.ensembl.org/index.html)のBLAT又はBLASTツールを使用して、in silicoで、設計したプライマーの特異性を試験した。(Bustinら、2009)に従って、プライマーを試験した。プライマー配列を表II(表2)において報告する。異なる処置から得たcDNAに関するqRT-PCRにおいて得た定量データをサイクル閾値(Ct)に関して表す。HPRT及びGAPDH遺伝子を実験に関する内在性参照対照として使用した。それぞれインプレートテクニカルトリプリケートで、Ct値を平均した。平均したCtを分析したmRNAと分析における各試料の各参照遺伝子の間のCt値(ΔCt)の差として正規化した。次いで、各試料のΔCt値を対象のΔCt値(ΔΔCt)に関して正規化した。変化を変化倍率として報告した(2-ΔΔCt)。各プレートを二連で実施し、すべての結果を少なくとも3回の独立した生物学的アッセイの平均±SEMとして示す。
【０１７３】
摂食及び絶食条件下の分析では、絶食条件のマウスを12時間の栄養素欠如の後に(例えば、食餌の供給を12時間中止した)に安楽死させ、一方、餌を与えた状態のマウスを12時間の栄養素欠如と1時間の再給餌後に(例えば、食餌の供給を各ケージに戻した)安楽死させた。
【０１７４】
【表２Ａ】
2021522212.tif 000010
【０１７５】
【表２Ｂ】
2021522212.tif 000011
【０１７６】
【表２Ｃ】
2021522212.tif 000012
【０１７７】
SH-SY5Yトランスフェクション及びFCCP処理
SH-SY5Y細胞に、Dharmafect(DHARMACON)を使用して、100nMの陰性対照miRNA阻害剤、並びにmiR-181a及びmiR-181b阻害剤(それぞれ、DHARMACON IH-300552-07-0005及びIH-300554-08-0005)をトランスフェクトした。
miR阻害剤は、内因性マイクロRNA活性を阻害するように設計された合成一本鎖RNA分子である。72時間のトランスフェクションの後、SH-SY5Y細胞を25μMのFCCP(Sigma社、C2920)で処理した。6時間のFCCP処理の後、細胞死をトリパンブルー染色で評価した。
【０１７８】
ARPE細胞のLNA処理
ARPE-19細胞(CRL-2302)に、インターフェロン(Polyplus社)を使用して、80nMのLNA陰性対照miRNA阻害剤、並びにmiR-181a(CGACAGCGTTGAATGT  配列番号6)LNA及びmiR-181b(CGACAGCAATGAATGT  配列番号7)LNA阻害剤(Exiqon社)をトランスフェクトした。48時間のトランスフェクションの後、ARPE-19細胞を100μMのA2E(ACME BIOSCIENCE INC社、受託合成(Customer synthesis)A2E、AB4344)で処理した。6時間のA2E処理の後、細胞自己蛍光を評価した。
【０１７９】
成熟miRNA定量化アッセイ
miR-181a及びmiR-181bの成熟定量化検出のため、本発明者らは、加水分解プローブ(TaqMan、Applied Biosystem社)を使用した。成熟miRNA分析用のcDNAは、製造会社の使用説明書に従って、miRNA特異的プライマーを用いるTaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kitを使用して生成した。異なる処理のTaqMan-cDNAに対するTaqMan-PCR反応により得た定量化データを、サイクル閾値(Ct)で表す。RNA sno234用のTaqManプローブを実験の内因性対照として使用した。Ct値を「定量的リアルタイムPCR」のセクションに記載されているように分析した。各プレートで2回実施し、全ての結果を3回の独立した生物学的反復の平均±SEMで示す。
【０１８０】
RNAのインサイツハイブリダイゼーション(ISH)
マウスの眼又は脳を4%PFA一晩固定し、30%スクロースで凍結保護し、OCTに包埋した。20マイクロメートルの凍結切片を5μg/mLのプロテイナーゼKで15分間処理した。2mg/mLのグリシンで洗浄し、4%PFA/0.2%グルタルアルデヒドで後固定した後、切片を50%ホルムアミド、pH6にするために5×生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液(sodium saline citrate buffer)(SSC)及びクエン酸、1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、500μg/mLの酵母tRNA、並びに50μg/mLのヘパリンでプレハイブリダイズした。miRCURY検出miR-181a及びmiR-181b Locked Nucleic Acidプローブ(Exiqon社)を最終濃度の30nMで使用した。プローブハイブリダイゼーションを42℃で一晩実施した。ハイブリダイズした切片を50%ホルムアミド、2×SSCによりハイブリダイゼーション温度で洗浄した。切片を、1%の遮断試薬(Roche社)及び10%のヒツジ血清を含有するMABT(100mMのマレイン酸、150mMのNaCl及び0.1%のTween20)で1時間遮断し、MABT/1%の遮断試薬中のアルカリホスファターゼ(AP)標識抗ジゴキシゲニン抗体(1:2000、Roche社)と共に4℃で一晩インキュベートした。切片をNBT-BCIP(Roche社)で染色し、Leica DM5000顕微鏡で撮影した。
メダカのISHを記載されたように実施した(Carrellaら、2015年)。
【０１８１】
定量的ミトコンドリアDNA含有量分析
SYBR GreenリアルタイムPCRを、記載されたように(Viscomiら、2009年)、プライマーを使用してCOI遺伝子(mtDNA)及びRNアーゼP(基準核内遺伝子)に実施した。mtDNA相対コピー数を、サイクル閾値(ΔCt)から計算し、mtDNAコピー数/細胞を、2×2-ΔCtとして計算して、それぞれの核内のRNアーゼPの2つのコピーについて説明した。
【０１８２】
タンパク質の単離及びウエスタンブロッティング(WB)
総タンパク質抽出のために組織及び細胞の試料を、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤(Roche社)を有するRIPA緩衝液でホモジナイズした。タンパク質抽出物濃度を、Bio-Radタンパク質アッセイ(Bio-Rad社)を使用して決定した。各試料から合計30μgのタンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲルにロードした。ミトコンドリア及び細胞質の抽出物を、記載されたように(Comitatoら、2014年)、レンズを除いた眼全体から得た。ミトコンドリア及び細胞質フラクションからの30μgのタンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲルにロードした。WBのため、ゲルをニトロセルロースフィルターで電子ブロッティングし、以下の一次抗体:抗p62(Abnova社、クローン2C11、1:1000);抗LC3B(Novus社、1:500);抗Mfn2(Abcam社、ab56889、1:1000);抗クエン酸シンターゼ(Abcam社、ab9660、1:1000);抗p115(Santa Cruz社、sc-48363、1:3000);抗Tim23(Santa Cruz社、sc-13298、1:250);抗Ndufb11(Proteintech社、1:1000);抗Ndufb8(Abcam社、全OXPHOS齧歯類WB抗体カクテルab110413、1:250);抗CoxIV(Cell Signaling社、4844、1:1000);抗パーキン(Cell Signaling社、4211、1:500);抗Gapdh(Santa Cruz社、sc-32233、1:3000)で順次免疫染色した。
目的のタンパク質を、Luminata Crescendo基質(Millipore社)又はSuper Signal West Femto基質(Thermo Scientific)により製造会社のプロトコールに従って可視化して、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウス又は抗ウサギIgG抗体(1:3000、GE Healthcare社)を用いて検出した。WBの画像を、Chemidoc-lt画像化システム(UVP社)を使用して取得し、バンド強度を、ImageJソフトウエアを使用して計算した。各タンパク質染色のシグナルを定量化し、次いで、同じ試料のGAPDH若しくはp115に又はNdufb8(ミトコンドリアフラクション)に対して正規化した(内部正規化)。次いで、これらの正規化された値を対照試料の値と比較した。同じブロットのバンドだけを比較した。これらの3回の異なる生物学的反復の正規化値の平均を、相対変化倍率として報告している。
摂食及び絶食条件下の分析では、絶食条件のマウスを、12時間の栄養素欠如の後に安楽死させ、一方、摂食条件のマウスを、12時間の栄養素欠如及び1時間再給餌の後に安楽死させた。
【０１８３】
メダカ及びモルホリノ
メダカ(Cab系統)を記載されたように保有し、ステージ分類した(Iwamatsu、2004年)。MOの設計、特異性及び阻害効率は以前に記載されていた(Carrellaら、2015年;Indrieriら、2013年;Indrieriら、2012年)。モルホリノオリゴは、RNAの部位を遮断して細胞プロセスを妨害する、先進的ツールである。モルホリノオリゴは、選択された標的部位に特異的に結合して、細胞成分の標的部位へのアクセスを遮断する。この特性を利用して、翻訳を遮断すること、スプライシングを遮断すること、miRNA又はこれらの標的を遮断すること及びリボザイム活性を遮断することができる。モルホリノオリゴは天然の核酸と根本的に異なっており、メチレンモルホリン環が、リボース又はデオキシリボース糖部分に置き換わっており、非イオン性ホスホロジアミデート架橋が、DNA及びRNAの陰イオン性リン酸塩に置き換わっている。各モルホリン環は、対形成するため鎖DNA塩基(A、C、G、T)のうちの1つに適切に位置し、それにより、25塩基モルホリノオリゴが、ワトソンクリック対形成を介してRNAの鎖の相補的25塩基標的部位に強力且つ特異的に結合する。モルホリノオリゴの不変主鎖が酵素に認識されないので、ヌクレアーゼに対して完全に安定している。hccs-MO、cox7b-MO、miR-181a-MO及びmiR-181b-MOs(MO-miR-181a 5'-AACTCACCGACAGCGTTGAATGTTC-3'配列番号111;MO-miR-181b 5'-AACCCACCGACAGCAATGAATGTTG-3'配列番号112)を受精単細胞メダカ胚に、それぞれ0.3mM、0.1mM、0.075mM及び0.075mMの濃度で注射した。
【０１８４】
Tunelアッセイ
ホールマウントTUNELアッセイを、記載されたように(Indrieriら、2013年)、In Situ Cell Death Detection Kit(Roche社)を使用して、st30メダカ胚に実施した。染色した後、胚をBSA/ゼラチンミックスに包埋し、ビブラトームで切片にした。切片をLeica DM-6000顕微鏡で分析し、TUNEL陽性細胞を網膜全体で手作業によりカウントした。
【０１８５】
カスパーゼアッセイ
試料のために20個の胚をst32でコリオン除去(dechorionated)し、液体窒素で少なくとも24時間凍結した。カスパーゼアッセイを、以前に報告されたように(Indrieriら、2013年)、カスパーゼ-3/7-及びカスパーゼ-9-GLOルシフェラーゼ試薬(Promega社)を使用してタンパク質溶解産物に実施した。発光シグナルを各試料のタンパク質濃度に対して正規化した。
【０１８６】
メダカの薬物処理
St24胚をコリオン除去し、50nMのバフィロマイシンA(SIGMA社、B1793)、25μMのPD98059(Cell Signaling社、#9900)又は6μMのHA14-1(SIGMA社、48787)と共に24時間インキュベートした。薬物を、3%DMSO/胚培地で希釈した。PDメダカモデルを、3%DMSO/0.2%アスコルビン酸/胚培地中の500μMの6-OHDA(SIGMA社、H4381)において胚をst32からst38の成長させることによって生成した。培地を1日に2回新しくした。対照胚を、3%DMSO/胚培地で成長させた。
【０１８７】
メダカにおけるドーパミン作動性ニューロンの検出
対照及びmiR-181a/b-MOのDMSO処理又は6-OHDA処理魚を4%PFAに固定した。魚を、10μg/mlのプロテイナーゼKで1時間30分処理し、2mg/mlのグリシンで洗浄し、4%PFAで20分間固定した。次いで胚を0.1%クエン酸ナトリウム/0.1%Trison X-100と共に氷上で10分間インキュベートした。抗TH抗体(Abcam社、ab112、1:500)と共に一晩インキュベートした後、魚をペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギ抗体(1:200、Vector Laboratories社)と共にインキュベートし、続いてジアミノベンジジン染色した(DAB、Sigma社)。胚をBSA/ゼラチンミックスに包埋し、ビブラトームで切片にした。切片をLeica DM-6000顕微鏡で観察し、抗TH陽性細胞を全てのメダカ青斑核で手作業によりカウントした。
【０１８８】
ロテノン注射
ロテノン(SIGMA社、R8875)を、報告されたように(Heitzら、2012年)、最終濃度の5mMで硝子体内注射した。RGCの組織学的分析のため、2か月齢のマウスのmiR-181a/b-1+/+及びmiR-181a/b-1-/-の一方の眼にロテノンを注射し、反対側の眼にDMSO(内部対照)を注射した。視運動試験では、マウスにロテノンの5mM又はDMSOを両側に注射した。
【０１８９】
NADHデヒドロゲナーゼ活性染色
NADHデヒドロゲナーゼ組織化学反応を、僅かな変更を伴って記載されたように実施した{Marella、2010年}。簡潔には、網膜切片をPBSで3回洗浄し、次いで、2mg/mlのニトロブルーテトラゾリウム、0.5mMのNADH、50mMのTris-Cl、pH7.6を含有する溶液において37℃で30分間インキュベートした。スライドをPBSで2回洗浄し、PBS/グリセロール50%を載せた。
【０１９０】
視運動トラッキング
ロテノン注射マウスの視力を、記載されたように(Chaddertonら、2013年)、Optomotorシステム(OptoMotry、Cerebral Mechanics社)を使用して評価した。
【０１９１】
免疫蛍光分析及び免疫組織化学分析
免疫蛍光分析では、マウスの眼を4%PFAで固定し、30%スクロースで凍結保護し、OCTに包埋し、凍結切片にした。切片を、クエン酸ナトリウム緩衝液中で沸騰させることにより又は1%NP40と共に15分間インキュベートすることにより、錐体アレスチン免疫染色のために透過処理した。以下の一次抗体を一晩インキュベートした:抗ロドプシン(Abcam社、ab3267、1:5000);抗錐体アレスチン(Millipore社、1:1000);抗Pax6(Covance社、1:250);抗GS6(Millipore社、1:100);抗Syntaxin(SIGMA社、1:100);抗NeuN(Millipore社、クローンA60、1:400);抗CoxIV(Cell Signaling社、4844、1:400)。次いで切片をAlexa Fluor二次抗体(1:1000、Invitrogen社)と共にインキュベートした。切片をDAPI(Vector Laboratories社)で対比染色した。抗NeuN抗体を使用して染色したRGCを、視神経の周囲域において、それぞれの眼毎に8枚の異なるスライドでカウントした。切片をLSM710 Zeiss共焦点顕微鏡により撮影した。
マウスにおけるドーパミン作動性ニューロンの検出では、マウスに麻酔をかけ、次いで手術の30〜35日後に4%PFAで灌流した。脳を4%PFAで後固定し、ビブラトームで切片にした。中脳の最深部を切片にし、切片を継続的に収集した。浮遊切片をPBS1×/FBS10%/Triton0.1%で20分間、次いでBSA0.1%/FBS10%/PBS1×中Triton0.1%で1時間インキュベートした。抗TH抗体(Abcam社、ab112、1:1000)と共に一晩インキュベートした後、切片をペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギ抗体(1:200、Vector Laboratories社、Burlingame、CA、USA)と共にインキュベートし、続いてジアミノベンジジン染色した(DAB、Sigma社)。SN域を含有する全ての切片を、マウス脳アトラス{Paxinos、2004年}(前項-2.54〜-3.64mm)を使用して選択した。SNの全範囲を網羅する4枚目毎の切片をカウントに使用した。脳切片をLeica DM-6000顕微鏡で観察し、TH陽性細胞を、各動物の6-OHDA注射側及び対照側の両方で手作業によりカウントした。TH陽性細胞をカウントする基準は、焦平面における核の存在であった。SN対緻密層を、マウス脳アトラス{Paxinos、2004年}を使用して注意深く確定し、SNの他のTH陽性領域と前被蓋核域を含まないように特に注意を払った。
【０１９２】
網膜電図(ERG)
マウスを3時間暗所で飼育し、麻酔をかけた。フラッシュ網膜電図(ERG)を、Ganzfeld刺激器(CSO、Costruzione Strumenti Oftalmici社、Florence、Italy)で生成された10ms閃光により誘発し、以前に記載されたように記録した(Bottaら、2016年;Suraceら、2005年)。ERG及びb波閾値を、以下のプロトコールを使用して評価した。眼を、暗順応条件下、-5.2〜+1.3log cd*s/m2(1×10-5.2〜20.0cd*s/m2に対応する)に増加する閃光で刺激した。暗順応条件下でのERG分析では、0.6log単位の間隔で11回の刺激(-5.2〜+1.3log cd*s/m2)により誘発された応答を考慮した。ノイズを最小限にするため、3つのERG応答を-5.2〜0.0log cd*s/m2からの各0.6log単位の刺激で平均化し、一方、1つのERG応答を、高い刺激(0.0〜+1.3log cd*s/m2)と見なした。暗順応条件下で記録されたa波及びb波増幅を、増加光強度(-4〜+1.3log cd*s/m2)の関数としてプロットした。明順応EGRを、50cd/m2の一定背景発光において20.0cd*s/m2で10回の10ms閃光により眼を刺激する暗順応セッションの後に記録した。
【０１９３】
6-OHDA注射及び行動アッセイ
2か月齢の雄マウスのmiR-181a/b-1+/+及びmiR-181a/b-1-/-に麻酔をかけ、ステレオタキシックフレーム(sterotaxic frame)(Kopf Instruments社)に設置した。6-OHDA(2mg/kg、Sigma社)を、NaCl 0.9%/0.01%アスコルビン酸の溶液に溶解し、{Paxinos、2004年}に従ってAP=-3.1;L=±0.8;DV=-4.8、-5.2の座標で右側の黒質に一側的に注射した。ノルアドレナリン作動性系を保護するため{De Leonibus、2007年}、マウスは、麻酔をかけられる15分前にデシプラミン(35mg/kg、i.p.、Sigma社)の注射を受けた。6-OHDA注射の総容量は、0.8μL(DV=-5.2では0.5μL及びDV=-4.8では0.3μL)であった。脳のもう一方の側面に食塩水を注射した。手術した後、動物は、1mlの食塩水を受け、最初の3日間に1mlのスクロース溶液を1日に2回受けて、病巣誘導嚥下困難に関連する過剰な体重減少を防止した。15日後に動物を、病巣の程度の読み取りパラメーターとして、L-DOPAにより誘導された反対側回転について試験した{De Leonibus、2009年}。行動試験を明期で実施した。試験の前に動物を行動空間に少なくとも30分間順化させた。マウスをプレキシガラスシリンダー(直径19cm)に入れ、ベンセラジド(20mg/kg、i.p.、Simga社)を注射し、ビデオで20分間追跡した(AnyMaze、Stoelting社)。この慣らし期間の後、マウスにL-DOPA(24mg/kg、i.p.、Sigma社)を注射し、ビデオで更に40分間追跡した。その場での回転(on spot rotation)は、身体の完全な360°の一回転と定義する。
P347Sマウスは、PMID:8943080に記載されているセリン(P347S)変異にヒトプロリン-347を担持するトランスジェニックマウスである。
【０１９４】
統計分析
動物を実験群及び対照群に無作為に割り当てた。分析から除外されたデータはなかった。行動及び視覚試験を盲検で実施した。実験反復の数は、各図の説明において示した。全ての実験では、図の説明において報告されているように、群間の差の有意性を、事後チューキー分析を伴う一元配置若しくは二元配置ANOVA、片側若しくは両側スチューデントt検定、一般化線形モデルの逸脱分析、又は負の二項分布の一般化線形モデルの逸脱分析により評価した。p<0.05が有意であると見なした。定量化データは、平均±SEMで表し、p<0.05が有意であると見なした。
【実施例】
【０１９５】
(実施例1)
miR-181a/b対照のミトコンドリア代謝回転
本発明者らは、ミトコンドリア生合成の主要レギュレーターであるPPARGC1A及びNRF1(Finck & Kelly、2006年;Wuら、1999年)、ミトコンドリア呼吸鎖(MRC)アセンブリに関与するCOX11及びCOQ10B(Carrら、2002年;Desbatsら、2015年)、及び重要なミトコンドリアROSスカベンジャーであるPRDX3(Wonseyら、2002年)が、生命情報検索(bioinformatic search)(Gennarinoら、2012年)により推定miR-181a/b標的遺伝子であることを確認した。興味深いことに、qRT-PCR分析は、下記に詳細に記載されているように、Dharmaconから購入した阻害剤によるmiR-181a/bのサイレンシングの後に、SH-SY5Yヒト神経芽細胞腫細胞において、上記に記述された全ての転写物のレベルの増加を示した(図1A)。
新たに予測されたmiR-181a/b標的を確証するため、予測されるmiR-181標的部位を含む各ヒト遺伝子(PPARGC1A、NRF1、COX11、COQ10B及びPRDX3)の3'-UTRを、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のコード領域の下流にあるpGL3-TKルシフェラーゼプラスミドにクローンした。次いで、ルシフェラーゼ活性に影響を及ぼすトランスフェクト模倣物miR-181の能力を試験した。分析した遺伝子の3'-UTR配列の存在が、模倣物miR-181(機能を模倣する、miRNA181a及びbに配列が同一である合成二重鎖オリゴヌクレオチドであり、図1B、Dharmaconから購入され、方法のセクションにおいて詳細に記載されている)に応答してルシフェラーゼ活性を阻害した。加えて、各遺伝子の3'-UTRのmiR-181a/b結合部位における点変異は、ルシフェラーゼ抑制を消失させ、これらのmiRNAがNRF1、COX11、COQ10B及びPRDX3遺伝子を直接的及び特異的に標的にすることを実証した(図1B)。PPARGC1Aへの直接的な標的化は確証されず(図1B)、miR-181a/bをサイレンシングした後にqRT-PCRで観察された上方調節(図1A)は、間接的な効果の結果でありうることを示した。
上記の結果に基づいて、本発明者らは、miR-181a/bの下方調節は、ミトコンドリア生合成を刺激することができると推論し、この仮説をin vivoで試験した。哺乳動物では、miR-181a及びmiR-181bは2つのクラスターにまとめられ、即ち、異なるゲノム座(それぞれ、染色体1及2)に局在化するmiR-181a/b-1及びmiR-181a/b-2である。成熟型のmiR-181a-1及びmiR-181a-2、並びに成熟型のmiR-181b-1及びmiR-181b-2は、同一の配列を示す。更に、miR-181a及びmiR-181bは、両方とも同じ「シード(seed)」配列(Jiら、2009年)のACAUUCAを含有し、即ち、標的認識に最も重要な役割を果たすと思われる領域(Bartel、2009年)を含有する。(Henao-Mejiaら、2013年)に記載された、miR-181a/b-1クラスターの標的欠失を持つマウスモデルを選択し、それは前記クラスターが、RNAインサイツハイブリダイゼーション、Taqmanアッセイ、並びにBcl2、Mcl1、Xiap、Atg5、Erk2及びPark2等の幾つかの確証されたmiR-181a/b標的の増加により実証されているように、脳及び網膜の両方における成熟miR-181a/bの発現の大部分を占めているからである{Chengら、2016年;Heら、2013年;Hutchisonら、2013年;Ouyangら、2012年;Rodriguez-Ortizら、2014年;Tekirdagら、2013年)(図7A〜D、9)。
興味深いことに、miR-181a/b-1-/-マウスの眼におけるNrf1、Ppargcla、Cox11、Cog10b及びPrdx3の増加した発現レベルがRT-PCRにより観察され、図1Cに示されている。Nrf1及びPpargc1aの増加レベルは、増強されたミトコンドリア生合成を示している(Finck & Kelly、2006年;Wuら、1999年)。この観察に適合するように、ミトコンドリアDNA(mtDNA)の増加がqRT-PCRによる測定によって検出され、図1Dに示されており、また、miR-181a/b-1-/-マウスの眼におけるウエスタンブロット(WB)による評価によって、MRC複合体サブユニット(Ndufb11及びCox4)、並びに一般的ミトコンドリアマーカー(Mfn2、Tim23及びクエン酸シンターゼ[Cs])のタンパク質レベルの増加が検出され、図1Eに示されている。全体的に、これらのデータは、miR-181a/bの不活性化が、CNSにおいてミトコンドリア生合成を刺激することを実証しており、網羅的なミトコンドリア代謝回転におけるこれら2つのmiRNAの広範な作用を示唆している。本発明者らは、miR-181a/bの不活性化がマウスの眼においてマイトファジーを増強するかを更に調査した。図8Aに示されているように、RT-PCRで測定すると、遺伝子の転写物レベルはmiR-181a/b-1-/-眼において上方調節された。更に、ミトコンドリアフラクションにおけるPark2/パーキン及びオートファジーアダプターSgstm1/p62の増強された動員がウエスタンブロット分析により検出され、図1Fに示されており、miR-181a/b-1-/-眼におけるマイトファジーの増加を示している。一般的なオートファジーを、Sgstm1/p62のレベル及びオートファジーマーカーMap1lc3b/Lc3-IIのレベルを総タンパク質抽出物において評価することによって更に分析した。WBにより、これら2つのタンパク質の減少したレベルが観察され、更なる証拠が、絶食条件(図8B)、対応する転写物レベルに変化がない条件(図8C)において観察され、miR-181a/b-1-/-眼におけるオートファジーフラックス率の増加を示している。
まとめると、これらの結果は、ミトコンドリア生合成及びin vivoでのクリアランスと協調したミトコンドリア代謝回転の調節におけるmiR-181a/bの重要な役割を明らかにしている。
【０１９６】
(実施例2)
miR-181a/b阻害は、細胞死からニューロンを保護し、MLS症候群のin vivoモデルの表現型を改善する。
驚くべきことに、本発明者らは、miR-181a/bの不活性化がミトコンドリア損傷を保護することを見出した。先ず、本発明者らは、miR-181a/bのin vitroにおける下方調節が、酸化的リン酸化(OXPHOS)の強力な脱共役剤であるFCCPからSH-SY5Y細胞を保護するかを試験した。50%の対照細胞がFCCPによる処理の6時間後に死滅したが、miR-181a/bサイレンス細胞は、細胞死までの任意の変化を示さず(図9)、miR-181a/bサイレンシングが、事実、ミトコンドリア損傷から細胞を保護することを実証した。
本発明者らは、希少型のMDである線状皮膚欠損を伴う小眼球症(MLS)症候群の2つの魚モデルにおけるミトコンドリア媒介神経変性のin vivoモデルに対する、miR-181a/bの不活性化の神経保護効果を更に評価した。MLSは、ヘテロ接合性雌おける小眼球症、脳の異常及び皮膚欠損により、並びにヘミ接合性雄の子宮内致死により特徴づけられる神経発達障害である{Indrieri、2016年}。この疾患は、複合体IIIの機能性に関与するホロチトクローム(holocytochrome)c型シンターゼ(HCCS)(Bernardら、2003年;Indrieriら、2013年;Wimplingerら、2006年)及びチトクロームcオキシダーゼのサブユニット7BであるCOX7B(MRC複合体IV)(Indrieriら、2012年)等のMRCの主要な存在における変異に起因する。MLSの2つのメダカ(Oryzias latipes)モデルを、モルホリノ(MO)ベース手法、hccs又はcox7B発現を使用して、ノックダウンにより予め生成した(Indrieriら、2013;Indrieriら、2012年)。両方のモデル(hccs-MO及びcox7b-MO)は、CNSにおける細胞死の増加に起因した重症の小眼症及び小頭症の表現型を示す(Indrieriら、2013年;Indrieriら、2012年)。メダカでは、成熟形態のmiR-181a及びbは、配列同一性(100%)及び特に網膜における発現パターンの両方が哺乳動物の対応物と比較して完全に保存されている(Carrellaら、2015年)。メダカのmiR-181a/bのMO媒介サイレンシングは、ミトコンドリア機能及びオートファジーに関与する大部分の標的のレベルの増加をもたらす(図10)。興味深いことに、いずれかのMLSメダカモデルにおけるmiR-181a/bの下方調節は、図2のTUNEL及びカスパーゼ活性化アッセイにより示されているように、脳及び眼における細胞死に注目すべき低減をもたらした。したがって、miR-181a/bの下方調節は、hccs(図3A〜C、M)及びcox7B(図3G〜I、N)のの両方の(morphant)モルファントの約50%の疾患表現型に完全な救出をもたらし、一方、miR-181a/bのMO媒介サイレンシングは、任意の明白な形態変更を引き起こさなかった(図11A、B)。これらのデータは、miR-181a/bの下方調節がMRC複合体III及びIV欠損モデルの両方の表現型を改善することを実証しており、MLSモデルにおけるmiR-181a/bのサイレンシングの保護効果が遺伝子に依存しないことを示している。
miR-181a/bが眼においてマイトファジー及びオートファジーを調節するので、本発明者らは、前記のプロセスがmiR-181a/bの下方調節により媒介される表現型の改善に関連するか試験した。この目的のため、hccs-MO/miR-181a/b-MO注射胚及びcox7b-MO/miR-181a/b-MO注射胚を、一般的なオートファジー阻害剤であるバフィロマイシA1(Baf-A1)により50nMで処理した。この濃度は、対照胚において任意の明白な形態的異常を誘導することなく、オートファジーを遮断することができる(図11C、F)。興味深いことに、Baf-A1処理は、有意な数の両方のhccs-MO/miR-181a/b-MO胚(図3D、M)及びcox7b-MO/miR-181a/b-MO胚(図3J、N)において、miR-181a/bの下方調節の保護効果を消失させ、オートファジー/マイトファジーの増加がMLSメダカモデルにおける表現型の改善に実質的に寄与していることを示した。
miR-181a/bの下方調節は、図10に示されているように、MAPK/ERKカスケードの主要成分であるerk2のmRNAレベル、並びにBcl2抗アポトーシスファミリーのメンバーであるbcl2及びmcl1のmRNAレベルも増加するので、本発明者らは、後者の2つの経路がMLS表現型の改善に関与しているかについても試験した。したがって、本発明者らは、hccs-MO/miR-181a/b-MO注射胚及びcox7b-MO/miR-181a/b-MO注射胚を、MAPK/ERK経路の選択的阻害剤であるPD98059(Alessiら、1995年)により、又はBcl-2タンパク質の阻害剤であるHA14-1(Wangら、2000年)により処理した。PD98059及びHA14-1を対照胚に任意の形態変更を誘導しない濃度で使用した[(Carrellaら、2015年)及び図11D、E]。PD98059処理は、いずれのMLSモデル(図3E、K、M、N)においても表現型救出の程度に対していかなる効果も有さず、MAPK経路は分析MLSモデルにおけるmiR-181a/bの下方調節により発揮された保護効果に本来関与していないことを示唆している。一方、HA14-1はhccs-MO/miR-181a/b-MO注射胚における表現型救出の程度を有意に低減したが、cox7b-MO/miR-181a/b-MO注射胚では低減しなかった(図3F、L〜N)。
まとめると、これらのデータは、増加したオートファジー/マイトファジーが両方のモデルにおけるMLS表現型の改善に関与することを示唆しており、miR-181a/b下方調節媒介ニューロン保護におけるこの経路の主な役割を示している。更に、増加したレベルのbcl2は、hccs欠損胚のみの改善に役割を果たし、Bcl2媒介アポトーシス経路の寄与は、特定のミトコンドリア欠損に依存して異なりうることを示している。
【０１９７】
(実施例3)
miR-181a/bの阻害は、LHON症候群のマウスモデルの表現型を改善する。
miR-181a/bの阻害の有効性を、レーベル遺伝性視神経症(LHON)の薬物誘導マウスモデルで更に試験した。LHONは、中心視覚の損失をもたらす網膜神経節細胞(RGC)変性により特徴づけられる非症候群型ミトコンドリア視神経症である。LHONは、1:30000人の有病率の最も頻度が高い形態のMDの1つとなっており、発症は15歳から35歳の間に起こる(Carelliら、2004年)。他のMDと同様に、LHONは、ミトコンドリアゲノムによりコードされた複数の遺伝子における点変異によって引き起こされるため、遺伝学的に異種混交性が高いことにより特徴づけられる(Carelliら、2004年;Meyersonら、2015年)。LHONの約95%の患者では、変異はND1、ND4又はND6遺伝子に位置しており、これらは複合体Iサブユニットをコードする(Carelliら、2004年;Meyersonら、2015年)。MRC複合体I阻害剤であるロテノンの硝子体内注射は、RGCの選択的損傷をもたらし、注射を受けたマウスは、信頼性のある薬物誘導LHONモデルと見なされる(Carelliら、2013年)。miR-181a/bの遺伝子不活性化がロテノン誘導LHONに対して保護効果を発揮するかを評価するため、miR-181a/b-1+/+マウス及びmiR-181a/b-1-/-マウスにロテノンを一側的に硝子体内注射した。内部対照として、反対側の眼にDMSOを注射した。以前に報告されていたように(Heitzら、2012年)、ロテノンを注射したmiR-181a/b-1+/+対照マウスは、RGCの数に注目すべき低減を示した(図4A、B)。対照的に、miR-181a/b-1-/-マウスではロテノン注射網膜とDMSO注射網膜に、両方とも注射の1週間及び2週間後でRGCの数に差はなかった(図4A、B)。興味深いことに、ロテノン注射miR-181a/b-1-/-マウスは、ロテノン注射miR-181a/b-1+/+マウスに対して、NADHデヒドロゲナーゼ活性の染色によって実証されたように、RGCにおいてMRC複合体I活性が保護されていることも示した(図4C)。したがって、CoxIV免疫蛍光分析は、miR-181a/b-1の枯渇がロテノン誘発損傷からミトコンドリアネットワークの完全性を保護することを強調した(図4D)。最後に、本発明者らは、視運動応答(OKR)による網膜機能も試験した。この分析では、miR-181a/b-1+/+マウス及びmiR-181a/b-1-/-マウスにロテノン又はDMSOを両側に注射した。興味深いことに、miR-181a/b-1+/+マウスは、ロテノン投与の1週間後から始まって視覚性能に激しい減少を示したが、miR-181a/b-1-/-マウスは、ロテノン誘導毒性から有意に保護された(図4E)。miR-181a/b-1の除去は、をロテノン注射の2週間後であっても視覚機能不全から救出した(図4A、E)。重要なことは、miR-181a/b-1の除去が、それ自体、網膜形態及びRGC数に異常を引き起こさず[代表的な網膜細胞マーカーによる免疫蛍光分析により示されている(図12A〜J、M)]、網膜機能に変更も引き起こさない[網膜電図(ERG)分析により評価されている(図12K〜L)]ことである。まとめると、これらのデータはmiR-181a/bの阻害がLHONの哺乳動物モデルに保護効果を発揮し、したがって、この状態に対する治療戦略となることを示している。
【０１９８】
(実施例4)
miR-181a/bの不活性化はNdufs4-/-マウスモデルにおいてLHON表現型から救出する。
ロテノン注射マウスは信頼性のあるLHONモデルと見なされる(Carelliら、2013年)。しかし、後者は、miR-181a/bの下方調節が保護機能を発揮する機構を精査することが困難である急性モデルである。したがって、本発明者らは、Ndufs4-/-マウスモデル(Kruseら、2008年)を利用して、MDの哺乳動物モデルのおけるmiR-181a/bの不活性化の有効性を更に特徴づけ、確証した。NDUFS4におけるホモ接合性変異は、典型的には患者が3歳になる前に死亡する予後不良により特徴づけられる遺伝性神経変性状態である、リー症候群(LS)の最も重症型のうちの1つの原因である。NDUFS4は、複合体のNADHデヒドロゲナーゼドメインに位置する核DNAコードMRC複合体Iサブユニットであり、触媒活性の原因である(Breuerら、2013年;Stroudら、2016年;Zhuら、2016年)。ホモ接合性Ndufs4不活性化を有するマウスは、LSに類似している重症の脳症を発生し、出生後(P)50〜60日で死をもたらす(Breuerら、2013年;Kruseら、2008年)。加えて、これらのマウスは、P16〜P20から始まるRGC機能不全及びP42後の検出可能なRGCの死滅をもたらすことによって特徴づけられるLHON表現型も示すので(Songら、2017年;Yuら、2015年)、Ndufs4ノックアウト系は、LHONにおいてmiR-181a/bの不活性化の効果を研究する良いモデルである。miR-181a/b-1-/-マウスをNdufs4-/-マウスと交配させることによって、網膜表現型に対するmiR-181a/bの不活性の効果を研究するために、本発明者らはNdufs4-/-/miR-181a/b-1-/-動物を得た。以前に報告されたように(Yuら、2015年)、Ndufs4-/-マウスは、NeuN陽性細胞のカウントにより確認すると、P55でRGCの数に有意な低減を示した(図5A、B、E)。この低減は、Ndufs4-/-/miR-181a/b-1-/-網膜において救出され(図5C、E)、NeuN陽性細胞の数は、WTマウスとmiR-181a/b-1-/-マウスの両方で識別不能であった(図5D、E)。更に、OKR試験は、P25でNdufs4-/-マウスと比較して、Ndufs4-/-/miR-181a/b-1-/-マウスにおいて視力の有意な改善を示し(図5F)、RGC機能不全及び死滅の両方に対してmiR-181a/bの下方調節の顕著な効果を示した。最後に、b波応答が非存在であるNdufs4-/-マウスでは変更されていることが以前に報告されている(Kruseら、2008年;Yuら、2015年)ERG応答も、分析した。Ndufs4-/-マウスに対して、Nduf4-/-/miR-181a/b-1-/-マウスにおけるb波(暗順応及び明順応範囲)の有意な改善が観察され(図5G〜H)、P30での光刺激に対する網膜応答の有意な改善を示した。まとめると、これらの結果は、Nduf4-/-モデルにおいてmiR-181a/bの下方調節がRGCを死滅から保護し、miRNAがRGCの死滅に対する活性を発揮する前に視覚機能を改善することを示している。
miR-181a/b阻害誘導Ndufs4-/-網膜表現型の改善の基礎となる分子機構の洞察を得るため、Ndufs4-/-/miR-181a/b-1-/-マウスにおけるmiR-181a/b標的の発現レベルを分析し、Ndufs4-/-と比較してNrf1及びPark2転写物の有意な増加が観察された(図6A)。前に記述されているように、Park2及びNrf1は、マイトファジー(Narendraら、2008年)及びミトコンドリア生合成(Finck & Kelly、2006年;Wuら、1999年)のそれぞれの制御における重要な存在であり、即ち、WTマウスに対してmiR-181a/b-1-/-マウスにおいて上方調節されていることを本発明者らが示した経路である(図1)。したがって、本発明者らは、これらの経路の活性化がNdufs4-/-/miR-181a/b-1-/-マウスにおいて観察された表現型の改善に有意に寄与すると仮定した。注目すべきは、パーキン及びp62のレベルが、Ndufs4-/-マウスに対して、Ndufs4-/-/miR-181a/b-1-/-マウスのミトコンドリアフラクションにおいて増加し(図6C、D)、miR-181a/bの枯渇に応答して増強されたマイトファジー活性化を示した。電子顕微鏡法(EM)研究は、未消化の物質を含有するオートファゴソーム/リソソームの蓄積の欠如を示し、オートファゴソーム動員又はオートファゴソーム/リソソーム融合のレベルでのマイトファジーブロックの可能性を排除した(図7B)。更に、Nrf1の上方調節に一致して、Ndufs4-/-マウスに対して、Ndufs4-/-/miR-181a/b-1-/-マウスのRGCにおけるP30及びP55の両方でのミトコンドリアの数の増加がEMにより見られた(図7A〜C)。ミトコンドリア生合成の増大も、q-PCRにより測定すると、Ndufs4-/-マウスに対するNdufs4-/-/miR-181a/b-1-/-マウスにおけるmtDNAの数の増加によって確認された(図7D)。興味深いことに、Ndufs4-/-/miR-181a/b-1-/-マウスのRGCにおけるミトコンドリアの数の増加は、Ndufs4-/-マウスに対して増加した数のクリスタ及びより多くの高電子密度マトリックス等の形態構造の注目すべき改善を伴った(図7A、B)。注目すべきは、NRF1の下方調節が、FCCPで処理されたSH-SY5Y細胞におけるmiR-181a/b仲介救出を有意に消失させ、事実、NRF1がmiR-181a/bの下方調節により発揮された神経保護効果に関連していることを示した(図6B)。最後に、MRC複合体I、II及びIVの生化学活性も分析した。後者の分析は、クレブスサイクル酵素のクエン酸シンターゼの活性に対して正規化した、複合体I及びIIの活性の増加、並びに複合体IV活性の類似した傾向を、P30でNdufs4-/-マウスと比較したNdufs4-/-/miR-181a/b-1-/-マウスにおいて示し(図7E)、miR-181a/bの下方調節が、Ndufs4-/-マウスにおけるMRCの複合体Iの生化学欠損に部分的に対抗できることを示した。まとめると、これらのデータは、miR-181a/bの下方調節が、マイトファジー及びミトコンドリア生合成の同時刺激を主に介して保護効果を発揮し、このことが網膜におけるミトコンドリア代謝回転の増強をもたらし、最終的にミトコンドリア形態及び生化学的表現型の改善をもたらすことを示している。
【０１９９】
(実施例5)
miR-181a/bの阻害は、パーキンソン病の6-OHDA誘導モデルにおいてドーパミン作動性ニューロンを保護する。
miR-181a/bは黒質(SN)及び線条体の有意に発現しており[(Boudreauら、2014年)及び図10B)]、PD患者の脳において上方調節されていることが以前に示された。神経毒の6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)を使用して魚及びマウスに生成されたPDの薬物誘導モデルにおけるmiR-181a/bの不活性化の効果を、評価した。6-OHDAは、魚(Parngら、2007年)及びマウス(Jagmagら、2015年)において黒質線条体ドーパミン作動性(DA)ニューロンの選択的死滅を誘導し、主にPDの運動及び生化学的機能不全を調査するために使用した。脳におけるmiR-181a及びmiR-181bの発現は、メダカにおいて保存されており、硬骨類DAニューロンがクラスター形成している青斑核において強力なシグナルを有する(図8A)。対照メダカの幼生では、6-OHDA処理は、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)免疫染色及びカウントにより示されているように、青斑核において約30%のDAニューロンの損失をもたらした(図8B、C、E)。逆に、[39]に記載されたmiR-181a/bMO(MO-miR-181a 5'-AACTCACCGACAGCGTTGAATGTTC-3'  配列番号111;MO-miR-181b 5'-AACCCACCGACAGCAATGAATGTTG-3'  配列番号112)を注射した動物は、6-OHDA毒性から保護され、未処理対照と比較してTH陽性細胞の数に有意な差を示さなかった(図8B、D、E)。
加えて、6-OHDAの定位固定注射により生成されたネズミPDモデルを分析した。報告されたデータ(Jagmagら、2015年)と適合するように、miR-181a/b-1+/+マウスのSNの6-OHDAの一側注射は、免疫染色及びTH陽性細胞のカウントで示されているように(図9A、C、E)、対照食塩水注射側と比較して、DAニューロン(図9A)及び線条体末端(図9C)の大量破壊をもたらした。興味深いことに、miR-181a/b-1-/-マウスは、6-OHDA注射側におけるDAニューロンの生存が増加していることを示した(図9B、D、E)。
L-DOPAにより誘導された反対側回転は、6-OHDAが一側的に注射された齧歯類における黒質及び線条体DAニューロン変性の読み取りに最も広く使用されている{De Leonibus、2009年}。L-DOPAが注射された6-OHDA処理miR-181a/b-1-/-マウスは、miR-181a/b-1+/+マウスと比較して低い回転行動を示し、したがってmiR-181a/b-1-/-動物における除神経の程度が低減されていることが確認された(図9F)。注目すべきことは、網膜に観察されたことと同様に、miR-181a/b-1の除去が、NISSL染色により示されているように、それ自体、SNに任意の明白な形態的異常を引き起こさなかったことである(図9E)。
まとめると、本発明のデータは、miR-181a/bの下方調節が、メダカ及びマウスにおいて6-OHDA誘導死滅からDAニューロンを保護することによって、PDの前臨床モデルの表現型を改善することを示している。
【０２００】
(実施例6)
加齢黄斑変性におけるmiR-181a/bの阻害
ミトコンドリア機能不全は、複雑な多因子変性疾患である加齢黄斑変性(AMD)を含む幾つかの加齢性疾患の病態生理に関連している。AMDにおける視覚機能障害は、光受容体損傷によってもたらされるが、主要な病原性事象は、網膜色素上皮(RPE)変性に関与する。AMDでは、光受容体外節(POS)代謝回転の生成物であるリポフスチンのRPEへの蓄積が、反応性酸素種(ROS)の産生を介したRPE機能不全及びアポトーシスをもたらす疾患の主な原因であると仮定されてきた。増え続ける証拠は、RPE及び光受容体の両方におけるオートファジー障害及びミトコンドリア機能不全が、酸化ストレスを悪化させ、AMDの病原性に寄与することを示している。本発明者らは、AMD表現型の改善におけるmiR-181a/bの阻害の有効性について試験した。特に、リポフスチン(A2E)が負荷されたARPE-19細胞株(RPE)から構成されるAMDのin vitroモデルを使用した。ARPE-19におけるA2Eの蓄積は、自己蛍光の定量化によって測定することができた。ARPE-19細胞に、miR-181活性を阻害するロックド核酸(Locked nucleic acid)(LNA)オリゴヌクレオチドアンチセンスをトランスフェクトし、対照試料と比較した。トランスフェクトした2日後、対照及びLNA-miR-181トランスフェクト細胞に100μMのA2Eを6時間負荷した(図16A)。miR-181の阻害は、A2Eの自己蛍光を約50%低減し、対照細胞と比較して、リポフスチンの蓄積が減少したことを示唆しており、グラフにおいて定量化した(A2E強度平均、図16B)。更に、miR-181の下方調節は、対照細胞と比較してA2Eのスポット強度及びA2Eのスポット域の減少をもたらし(図16B)、miR-181の阻害が、リポフスチン蓄積に関連する網膜病理の改善をもたらすことを示唆した。
AMDは、大部分が環境因子及び生活習慣因子によって引き起こされるが、AMDのリスクを増強するABCA4における多型等の遺伝因子によっても引き起こされる。ABCA4遺伝子における劣性変異はシュタルガルト病の原因であり、シュタルガルト病はリポフスチン蓄積によって特徴づけられる黄斑変性であり、黄斑変性は、AMDに一般的に見出される状態である。したがって、Abca4-/-マウスモデルは、AND治療戦略を評価する適切なin vivoモデルと見なされる。本発明者は、Abca4-/-マウスとmiR-181a/b-1-/-マウスを交配させて、miR-181a/bの下方調節の効果を試験した。興味深いことに、Abca4-/-/miR-181a/b-1-/-マウスのRPEでは、miR-181a/b標的mRNAのレベルの増加、並びに抗酸化タンパク質をコードするSod1及びCat1のレベルの増加が観察された(図17A)。Abca4-/-マウスは、RPE及び光受容体外節(POS)におけるA2Eの著しい蓄積を示し、網膜疾患の病態生理において主要な役割を果たすと思われる。リポフスチン自己蛍光のレベル(励起:560±40nm、発光:645±75)を網膜の凍結切片(RPEのみ及びPOSのいずれか)において評価した。興味深いことに、5か月齢マウスでの予備データは、Abca4-/-マウスと比較して、Abca4-/-/miR-181a/b-1-/-RPE及びPOSにおけるリポフスチン自己蛍光(AF)の減少を示している(図17B、C)。
【０２０１】
(実施例7)
網膜色素変性におけるmiR-181の阻害
ロドプシン遺伝子における変異は、優性及び劣性網膜色素変性(RP)の原因であり、全症例の約10%を占める。したがって優性ロドプシン変異体は、機能獲得型(gain-of-function)変異体又はドミナントネガティブ変異体である。幾つかのクラスが定義されている。
-  クラスIは、細胞質膜に局在化し、11-シス-レチンアルデヒドと結合してスペクトル的に活性なロドプシンを形成する能力がある点が野生型(wt)ロドプシン様であり、毛様体標的化シグナルのVXPXに影響を与える変異がシナプスを含む誤った場所に局在化しており、シナプス小胞融合を阻害する又はトランスデューシンを異常に活性化することがある。
-  クラスIIは、タンパク質のフォールディング及び/又は安定性においておそらく欠点を有し、粗面小胞体に異常に蓄積し、細胞質膜に効率的に輸送されず、11-シス-レチンアルデヒドと結合してスペクトル的に活性な感光色素を形成することができない。
-  クラスIIIは、トランスデューシンを構成的に活性化する。
クラスI変異体の中には、カルボキシル末端に近接するプロリン-347に影響を及ぼすものがある。この残基は、全ての既知の視色素で保存されている。この残基に影響を及ぼす6個の異なるミスセンス変異が、RPの患者で確認されており、これはプロリン-347がロドプシンの一部の重要な機能を媒介していることを示す。
セリンへのヒトプロリン-347(P347S)変異を担持するトランスジェニックマウス(参照PMID:8943080)は、光受容体変性を発生する。1か月齢(P30)では、光受容体層は既に顕著に低減され、3か月齢(P90)では、光受容体細胞体の僅かに1つの列がP347S網膜に存在する。一致して、網膜電図(ERG)応答は、P30で顕著な低減、P90で殆どヌル(null)であるという結果をもたらす。
本発明者らは、P347Sトランスジェニック動物をmiR-181a/b-1ヘテロ接合性動物と交配させた。P347Sトランスジェニックマウスの網膜を、同腹仔のP347S/miR-181a/b+/-マウスの網膜と比較した。マウスを、ERG試験によりP30及びP90において、並びに組織学的及び分子分析により特徴づけた。
P30でP347S網膜と比較したP347S/miR-181a/b+/-網膜のERG応答(b波)は、図18に示されているように有意に高い(N=16個)。錐体機能に起因する明順応応答は、あまり増加を示していない。したがって、杆体(ロドプシン、Rhod)及び錐体(C-アレスチン、C-arr)のそれぞれの2つの主要マーカーによる免疫蛍光(IF)染色は、外顆粒層(ONL)厚さが差を示さなかったにもかかわらず(図19B)、増加したレベルのロドプシン染色を示し、C-アレスチン染色には差を示さなかった(図19A)。ロドプシン、同様に他の光受容体マーカーのレベルの増加は、qRT-PCR分析によっても確認され、図19Cに報告された。更に、P30において、本発明者らは、外節(OS)長さにも改善を観察し、図20に示されているグラフに定量化した。
P90において、P347S/miR-181a/b+/-動物のERG応答は、P347S動物と比較して、依然として有意に高い結果をもたらしている(図21)。Rhod及びC-arrによるIF染色は、P90で両方のマーカーの増加レベルを示し(図22)、組織化学的切片は、P347S/miR-181a/b+/-ONLが2つ以上の列の光受容体細胞体から構成されていることを明らかにしており、P347SONLと比較した差が図22Bのグラフに報告されている。ロドプシン及びC-アレスチン、同様に他の光受容体マーカーのレベルの増加は、qRT-PCR分析によっても分析され、図22Cに報告された。
P347Sマウスモデルにおいて、miR-181a/bがどのようにミトコンドリア関連経路を調節しうるかを示すデータに加えて、ミトコンドリア関連遺伝子及び経路の強力な下方調節が存在することを明らかにしたP347Sマウスモデルのトランスクリプトームデータ(図23A)は、本発明者らが、miR-181a/b-1ゲノムクラスターのヘテロ接合性欠失を持つP347Sマウスにおいてミトコンドリア表現型を分析することを促した。
miR-181a/bの下方調節がどのようにP347Sマウスの網膜表現型を改善するかを理解するため、本発明者らは、miR-181a/b確証標的が、P347Sモデルと比較してP347S/miR-181a/b+/-マウスの網膜においてどのように上方調節されかを検証した。分子分析は、以下のmiR-181a/b確証標的のqRT-PCRにより実施した(図23B):ミトコンドリア生合成に関与するPpargc1a及びNrf1;ミトコンドリア呼吸鎖の成分であるCox11及びCoq10b;抗酸化機能を有するタンパク質をコードするPrdx3、オートファジー/マイトファジー経路の調節に関与するErk2、Atg5及びPark2;ミトコンドリア媒介細胞死の調節に重要な役割を果たすXiap;抗アポトーシス及び生存促進(pro-survival)遺伝子であるBcl2及びMcl1。本発明者らは、Atg5を除いて全ての標的:Cox11、Erk2、Mcl1、Bcl2、Nrf1、Coq10b、Xiap、Ppargc1a、Park2及びPrdx3の上方調節を見出した。これら全てのデータを合わせると、上記のmiR-181a/b標的遺伝子の上方調節がP347S/miR-181a/b+/-マウスにおいて観察されたPR保護に原則的に寄与しうることが示唆される。
P347SマウスにおけるmiR-181a/bクラスター1の枯渇により発揮される保護効果への更なる洞察を得るため、本発明者らは、細胞死アッセイを実施した。以前に示されたように、miR-181a/bは多数の抗アポトーシス及び生存促進遺伝子を標的にする。最初に、P347S及びP347S/miR-181a/b+/-マウスにおける抗活性カスパーゼ3について凍結網膜に免疫蛍光を実施した(図24A)。カスパーゼ-3は、外因性(デスリガンド(death ligand))及び内因性(ミトコンドリア)経路の両方によりアポトーシス細胞において活性化される。このタンパク質は、不活性酵素前駆体として存在し、タンパク質分解プロセシングを受けて、アポトーシス経路に大きな役割を果たす活性酵素を産生する。免疫蛍光アッセイ及びその定量化により明らかなように(図24B)、P347S/miR-181a/b+/-マウスモデルには、抗活性カスパーゼ-3陽性細胞の有意な低減があり、miR-181a/bの下方調節が確かに細胞をアポトーシスから保護することを示している。更に、本発明者らは、細胞死の追加のマーカー、TUNEL-PODアッセイを使用してデータを確認した。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端標識法(TUNEL)は、3'-ヒドロキシル末端を標識することによりDNA断片化を検出する方法である。細胞死の顕著な特徴はDNAの分解である。DNA切断は、二本鎖及び一本鎖DNA切断(ニック)を生じることがある。両方のタイプの切断は、酵素反応により修飾ヌクレオチド(例えば、ビオチン-dUTP、フルオレセイン-dUTP)で遊離3'-OH末端を標識することによって検出することができる。酵素末端デオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)は、一本及び二本鎖DNAの3'-末端へのデオキシリボヌクレオチドの鋳型依存性重合を触媒する。この技術を使用して、全てのタイプの細胞死を機構と無関係に検出することが可能である。死滅細胞が暗灰色で標識され、矢印で示されている図25Aに示されており、図25Bに定量化されているように、P347Sマウスに対してP347S/miR-181a/b+/-マウスの網膜において死滅細胞の強い低減がある。
これら全てのデータを合わせると、miR-181a/bクラスター1の枯渇が、P347Sマウスにおいて細胞を死滅から保護することが示される。
トランスクリプトームデータ(図23A)によると、透過電子顕微鏡法(TEM)は、P347Sマウスモデルにおいて、より小さく、断片化されたミトコンドリアにより特徴づけられるミトコンドリア表現型を明かにした(図26A)。
TEM分析により、P347S/miR-181+/-マウスの網膜は、P347S/miR-181+/+マウスと比較してより良好な構造を示した。P347S/miR-181+/+マウスのOSは完全に破壊されており、一方、P347S/miR-181+/-動物では、OS及びISの両方が、より良好に組織化され、パッケージングされている(図26A)。更に、2つのモデルのミトコンドリア形態の差は著しい。P347Sの網膜では、ミトコンドリアは断片化されており、非常に小さい。逆に、P347S/miR-181+/-動物では、ミトコンドリアは、より伸長されており、より良好な形態を有し(図26A、図26Bのグラフに定量化されている)、ミトコンドリア機能性におけるmiR-181の関与を示す全ての先行データと一致している。
ミトコンドリア関連表現型の改善をWBで更に調査した。本発明者らは、ミトコンドリア外膜に位置するGTPアーゼであるMfn2(マイトフュージン)のタンパク質レベルを分析した(図27A)。Mfn2は、ミトコンドリア融合に関与するタンパク質である。細胞内では、ミトコンドリアは、絶えず変化している動的状態(ever-changing dynamic state)で、常に伸長及び分化(それぞれ、融合及び分裂)しながら存在している。分裂は、機能不全ミトコンドリアを分離する役割を果たし、一方、融合は、マトリックス代謝産物と無傷のmtDNAとの平衡を助けることが示されている。ある特定の損傷ミトコンドリアを他の健康なミトコンドリアと融合させて、損傷を受けたミトコンドリアの救出を試みることができる。これら2つの事象のバランスは、ミトコンドリア恒常性、細胞安定性及び細胞生存にとって必須であると考えられる。特定のミトコンドリアでは、融合は、Mfn2を含む3つの異なるGTPアーゼにより媒介される。WB分析は、P347Sマウスと比較してP347S/miR-181a/b+/-マウスにおいてMfn2タンパク質レベルが増加している傾向を明らかにした。P347S/miR-181a/b+/+マウスのマウス網膜においてTEMで可視化したミトコンドリア形態の改善に、Mfn2の上方調節が関係しうると推測したくなる。本発明者らは、OXPHOS BLOTを実施してMRCも分析した(図27B)。この手順は、ウエスタンブロットに依存しており、5つのミトコンドリア鎖複合体の特定の抗原に対する抗体が同時に使用される。WTマウスの眼に対して、P347Sマウスモデルにおいてこれらのタンパク質の下方調節が観察された。
P347S/miR-181a/b+/-モデルでは、タンパク質レベルの有意な救出が検出された。加えて、クエン酸回路(クレブス回路)の第1ステップに関与する酵素である、一般的なミトコンドリアマーカーのクエン酸シンターゼ(Cs)に対してタンパク質レベルの上方調節が見出された(図27C)。このタンパク質は、ミトコンドリアマトリックスに位置し、P347S眼に対してP347S/miR-181a/b+/-眼におけるミトコンドリア質量の増加の指標を提供することができる。データは図27Dのグラフに定量化されている。
【０２０２】
(実施例8)
miR-181スポンジ効率のin vitro実験の確証
サイトメガロウイルス(CMV)構成的プロモーターの制御下でmiR-181阻害用の「スポンジ」構築物を発現するAAVベクター(血清型2)(上記のmiR-181スポンジ配列を参照のこと)を、生成した(AAV.CMV.miR-181.スポンジ)。AAV2血清型は、マウス及び非ヒト霊長類を含む幾つかの種に硝子体投与されると、RGCを効率的に伝達することが既に報告されている(Koilkondaら、2014年a;Koilkondaら、2014年b;Kwongら、2015年;Tshilengeら、2016年)。このAAV血清型は、網膜疾患の遺伝子療法に関与している研究者に一般的に使用されている(Bottaら、2016年;Maguireら、2009年;Maguireら、2008年;Mussolinoら、2011年)。miRNAスポンジは、miRNAを内因性標的から隔絶しうる直列型反復miRNAアンチセンス配列(miRNA結合部位(MBS))を有するRNA分子であり、in vivoで長期miRNA機能喪失型を達成する貴重なツールである(Ebert & Sharp、2010年)。miRNAスポンジは、動物モデルへの適用が成功している(Ebert & Sharp、2010年;Tayら、2015年)。スポンジ設計は、(Ebertら、2007年;Gentnerら、2009年;Kluiverら、2012年)に従って実施した。簡潔には、本発明者らは、miRNA181aに対して6MBSアンチセンス及びmiRNA181bに対して6MBSアンチセンスを設計し、miR-181a又はb配列の9〜12位に中央ミスマッチ(「バルジ」)を有した。バルジは9〜12位のヌクレオチドを変えて塩基対形成(G-Uのゆらぎを含む)の機会を低減することによって作り出した。2つのMBSは4nt配列(「スペーサー」)により隔てられる。スポンジオリゴヌクレオチド二重鎖(二本鎖)を、miRNA結合スポンジ配列がGFPレポーター遺伝子の3'UTRに挿入された発現カセットを含有するベクターにクローンした(Karaliら、2011年)。
AAV2.1-CMV-eGFP-miR-181スポンジ(スポンジ181)がトランスフェクトされてから48時間目のSH-SY5Y細胞におけるmiR-181a/b直接標的転写物(XIAP、NRF1、PRDX3、MCL1、ATG5、SIRT1、BCL2、BCL2、ERK2、PARK2、COX11)のqRT-PCR分析である。miR-181a/b標的の転写物レベルは、対照試料と比較してスポンジ181試料において増加している(CTRL=AAV2.1-CMV-eGFPトランスフェクト細胞、N=3個)(図28)。このデータは、miR-181スポンジが内因性miR-181を隔絶し、したがって内因性miR-181a/bの直接標的への結合を防止し、活性を阻害することを示している。
miR-181a/bによりモジュレートされる経路の1つは、Bcl-2タンパク質ファミリーが主要な調節の役割を有するミトコンドリア依存性細胞死である。このタンパク質ファミリーは、ミトコンドリア外膜透過性(MOMP)、ミトコンドリア膜透過性遷移孔(PTP)と呼ばれる内膜チャンネルの形成、並びにチトクロームc及び他のアポトーシストリガー(trigger)の放出を制御する(Rasola & Bernardi、2007年;Tait & Green、2010年)。一次性MDの病原性へのアポトーシスの寄与は一義的に確立されていないが、抗アポトーシスBcl-2タンパク質のレベルの増加は、細胞生存を延長する及び疾患進行を遅延する有効な戦略となりうる。注目すべきことに、Bcl-2ファミリータンパク質のBcl-xLの過剰発現又はシクロスポリンA(CsA)処理のいずれかにおるMOMP及びPTPの阻害は、細胞死の増加に対抗し、hccs欠乏MLSメダカモデルの表現型を改善した(Indrieriら、2013年)。ミトコンドリア機能不全に関連する疾患におけるミトコンドリア依存性細胞死の重要性も、ウルリッヒ型先天性筋ジストロフィー及びベスレムミオパチーを有する患者(Merliniら、2008)、並びにPDの動物モデル(Tamburrinoら、2015年)のCsA治療の肯定的な効果によって実証されている。本明細書で、本発明者らは、miR-181a/bの阻害が、Bcl-2及びMcl-1等のBcl-2ファミリーのレベルの増加をもたらし、試験した両方のMLSモデルにおいて表現型を救出することを示している。更に、Bcl-2タンパク質の強力な阻害剤であるHA14-1(Wangら、2000年b)は、hccs欠損モデルにおいてMLS表現型のmiR-181a/b媒介改善を有意に消失させるが、cox7b欠損モデルでは消失させない。これらのデータは、単一経路、例えば、ミトコンドリア依存性細胞死及びそのモジュレーションが、基礎となる遺伝子欠損に応じて、高度に関連する形態のMDに異なった効果を有しうることを示している。更に、この観察は、2つ以上の経路に同時に作用することが、遺伝子的に異種混交のMDを治療するより有効な戦略となるという本発明者らの仮説を強固なものにする。
オートファジー及びマイトファジーの増加は、PDを含む異なる神経変性疾患に保護効果を発揮することが示されている(Decressacら、2013年;Martinez-Vicente、2017年)。留意すべきことには、早期発生型家族性形態のPDにおける変異された2つの遺伝子産物、即ち、パーキン及びPINK1は、オートファジー経路を介した損傷ミトコンドリアのクリアランスに関与している(Geislerら、2010年;Vives-Bauzaら、2010年)。更に、オートファジーを活性化するmTOR阻害剤のラパマイシンによる処理は、最も重症形態のMDのうちの1つであるリー症候群のモデルであるNdufs4-/-マウスにおいて、神経変性進行及び致死性転帰の両方を有意に遅延した(Johnsonら、2013年)。本明細書で、本発明者らは、miR-181a/bの下方調節がCNSにおけるオートファジー及びマイトファジーの増加をもたらすことを示している。これらのデータと一致して、hccs/miR-181a/b-MO胚及びcox7B/miR-181a/b-MO胚の両方における一般的オートファジーの阻害は、MLS表現型に対するmiR-181a/b下方調節の神経保護効果を低減し、オートファジー/マイトファジーの増加が両方のモデルにおける表現型の救出に有意に寄与することを示している。
機能不全ミトコンドリアの除去はアポトーシスのリスクを制限するが、適切な代償的ミトコンドリア生合成を伴わないマイトファジーの制御不能活性化は、更なるミトコンドリア機能不全に寄与し、ミトコンドリア質量の欠損、エネルギー崩壊及び細胞死をもたらすことがある(Villanueva Pazら、2016年;Zhuら、2013年)。更に、増強されたミトコンドリア生合成は、それ自体、MDにおいて保護的でありうる。ミトコンドリアDNA含有量及びミトコンドリア生合成の変動性は、事実、LHONの非顕在性担体への不完全な浸透率に関連し(Giordanoら、2014年)、増加した生合成は、異なるin vitro及びin vivoMDモデルの表現型を改善することが見出された(Komen & Thorburn、2014年)。しかし、ミトコンドリア生合成を誘発する化合物(ベザフィブレート、レスベラトロール及びAICARを含む)を使用して得た一部の相違した及び矛盾する結果(Komen & Thorburn、2014年)は、患者においてミトコンドリア機能を増加するために、ミトコンドリア生合成のモジュレーションを有効に利用する、追加の研究が必要であることを明確に示している。マイトファジーとミトコンドリア生合成との厳密なバランスは、ミトコンドリア機能不全により特徴づけられる疾患における細胞生存度を決定する重要な側面として現れている(Zhuら、2013年)。本明細書で、本発明者らは、miR-181a/bが両方のプロセスを同時に制御しうることを示している。miR-181a/bの不活性化に続いて観察されるマイトファジーの増加に付随して、本発明者らは、幾つかのミトコンドリアタンパク質及びmtDNAのレベルの増加を観察し、増強されたミトコンドリア生合成を示した。したがって、miR-181a/b枯渇動物は、ロテノン誘導LHONモデルにおいて増強されたMRC複合体I活性及び保存されたミトコンドリア完全性を示した。まとめると、本発明者らは、miR-181a/bがミトコンドリア代謝回転の新規コントローラー(controller)となり、この活性が神経保護に主要な役割を果たしうることを実証している。
MDは、遺伝子的に異種混交の障害の群である。それぞれの個別の障害は希少なものであるが、集合的には、成人MDの総有病率は、およそ4300人に1人であることが推定され、遺伝性神経疾患の最も有病率が高い群のうちの1つとなっている(Gormanら、2015年)。この研究において、本発明者らは、miR-181a/bの下方調節が複数のMDモデルにおいて神経保護効果を発揮することを実証している。本発明者らの結果は、遺伝子に依存しない治療戦略が極めて望ましいLHON等の遺伝子的に異種混交の状態にとって、特に興味深いものである。更に、PDのin vivoモデルにおいて本発明者らが生成した原理証明データは、この疾患の新しい可能な治療標的としてmiR-181a/bを強調している。
miR-181a/b-1-/-マウスは、正常な寿命を示し(Henao-Mejiaら、2013年)、脳及び眼に明白な異常を示さず、このことがCNSにおけるこれら2つのmiRNAの下方調節の安全性に初期の支持を提供することに留意するべきである。一次又は二次ミトコンドリア機能不全に関連する多数の希少及び一般的な神経変性障害は、総体として公衆衛生に対する重要な負担となっているが、CNSにおけるmiR-181a/bのモジュレーションは、これらの神経変性障害の治療における有望な戦略となる。
【０２０３】
［参考文献］
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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