(57)【要約】  少なくとも１２個のキャプシドユニットによってカプセル化された核酸オリガミ構造の粒子、それを含む組成物、および標的細胞への核酸の送達のためのその使用が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コアおよびシェルを含む粒子であって、前記コアが、前記シェルによってカプセル化された少なくとも１つの核酸オリガミ構造を含み、前記シェルが、少なくとも１２個のキャプシドユニットを含み、前記キャプシドユニットが、１つ以上のキャプシドタンパク質を含む、粒子。
【請求項２】
前記粒子が、準球形の形状を有する、請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
前記粒子が、正二十面体形状を有する、請求項１〜２に記載の粒子。
【請求項４】
前記粒子の直径が、１０〜２００ナノメートル（ｎｍ）である、請求項１〜３に記載の粒子。
【請求項５】
前記キャプシドユニットが、少なくとも５つのキャプシドタンパク質を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項６】
前記キャプシドユニットの各々が、キャプシドタンパク質の五量体および／または六量体を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項７】
前記キャプシドタンパク質が、人工供給源のもの、または天然供給源からのものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項８】
前記キャプシドタンパク質が、ウイルスタンパク質または変性ウイルスタンパク質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項９】
前記ウイルスタンパク質が、ウイルスファミリーポリオーマウイルス科のウイルスからのものである、請求項８に記載の粒子。
【請求項１０】
前記ウイルスタンパク質が、ＳＶ４０ウイルス、およびヒトポリオーマウイルスからなる群から選択されるウイルスからのものである、請求項８に記載の粒子。
【請求項１１】
前記ヒトポリオーマウイルスが、ＪＣウイルスおよびＢＫウイルスから選択される、請求項１０に記載の粒子。
【請求項１２】
前記キャプシドタンパク質が、ＳＶ４０ウイルスキャプシドタンパク質である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項１３】
前記キャプシドタンパク質が、キャプシドタンパク質ＶＰ１、キャプシドタンパク質ＶＰ２、キャプシドタンパク質ＶＰ３、それらの変性形態、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項１４】
前記キャプシドタンパク質が、ＶＰ１、またはその変性形態である、請求項１〜１３のいずれかに記載の粒子。
【請求項１５】
前記オリガミ構造が、少なくとも７２個のキャプシドユニットによってカプセル化される、請求項１〜１４のいずれかに記載の粒子。
【請求項１６】
前記キャプシドユニットが、５つのＶＰ１分子、５つのＶＰ１分子および１つのＶＰ２分子、５つのＶＰ１分子および１つのＶＰ３分子、ならびに５つのＶＰ１分子および１つのＶＰ２分子または１つのＶＰ３分子からなる群から選択されるウイルスタンパク質分子またはそれらの変性形態の組み合わせを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項１７】
前記オリガミ構造が、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、修飾核酸、合成核酸、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項１８】
核酸分子を標的細胞の中に送達する際に使用するための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項１９】
前記標的細胞が、インビトロ細胞、または組織もしくは生物に収容された細胞から選択される、請求項１８に記載の粒子。
【請求項２０】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の複数の粒子を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸オリガミ構造をカプセル化するウイルスキャプシドユニットの粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスは、ゲノムをパッケージ化し、それをホストに送達する、自己複製分子機械である。多くの場合、球状ウイルスのシェル（またはキャプシド）は、ウイルスゲノムの周りで自己アセンブリする。これは、インビトロでの自己アセンブリシステムを十分に特徴づけているシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の場合である。
【０００３】
ＳＶ４０は、５．２ｋｂの二本鎖（ｄｓ）環状ＤＮＡゲノムを持つ小さな非エンベロープ霊長類ポリオーマウイルスである。ＤＮＡは、細胞のクロマチンと同様のヌクレオソーム構造を持つミニ染色体を形成する。ミニ染色体は、Ｔ＝７ｄの正二十面体格子に配置されている、７２個の基本的なキャプシドサブユニットであるメジャーウイルスタンパク質ＶＰ１の五量体で構成される直径５０ｎｍのキャプシドに囲まれている。ＶＰ１に加えて、マイナーキャプシドタンパク質ＶＰ２またはＶＰ３の単一分子が、各五量体にしっかりと固定されている。キャプシドでは、ＶＰ２およびＶＰ３は、ＶＰ１に対して内部に配置されている。三角分割数Ｔは、異なる正二十面体ウイルスによって異なる場合がある。例えば、ヘルペスウイルスの正二十面体形状は、Ｔ＝１６であるが、アデノウイルスは、Ｔ＝２５を有する。三角分割数が異なると、キャプシドサブユニットの数も異なる。
【０００４】
ＳＶ４０は、その基本的なサブユニットであるＶＰ１キャプシドタンパク質の五量体からインビトロで自己アセンブリし、あらゆる種類の核酸をカプセル化できる。インビトロでアセンブリされたウイルス様ナノ粒子のサイズおよび形状は、カプセル化された核酸の種類および長さに依存する。短い一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡ（≦８１４個のヌクレオチド）上で、ＳＶ４０五量体は、１２個の五量体および単一のＲＮＡ分子で構成される、正二十面体Ｔ＝１の形状を持つ直径２２ｎｍのキャプシドを形成する。ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡが長すぎてＴ＝１の粒子に適合しない場合、五量体は、２２ｎｍの粒子、および正二十面体Ｔ＝３またはＴ＝４の形状のものであると示唆されている直径２９〜４０ｎｍの不均一粒子のストリングを形成する。二本鎖ＤＮＡの単一分子上で、ＳＶ４０は常に、正二十面体Ｔ＝７の形状を持つ７２個の五量体で構成される５０ｎｍの粒子を形成する。ＳＶ４０は、ＶＰ２またはＶＰ３分子を含むＶＰ１五量体からのＤＮＡの周りにインビトロでアセンブリすることも示されている（Ｅｎｏｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０１１  ４２０：１−９）。
【０００５】
経済性、ＳＶ４０様ナノ粒子のインビトロでの調製の容易さ、安全性、および免疫原性の欠如により、それらは、遺伝子送達ベクターとしての医療用途に大きな期待が寄せられている。しかしながら、それらの有用性を妨げる問題が存在する。これらの問題の１つは、核酸のコンパクト性の低さであり、それは、キャプシドの内部空洞の体積に比べて大きな体積を占める。インビトロでのキャプシドアセンブリの分子メカニズムは、タンパク質間相互作用の安定性と、キャプシドの小さな空洞内に核酸を拘束するために必要な作業との間の相互関係に基づく。核酸の柔軟性とコンパクト性は、効果的なカプセル化の重要な要素である。硬いポリマーであり、その長い持続長で知られているｄｓＤＮＡは、パッケージングには不十分な基質であるという強い兆候がある。例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）（Ｄｈａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０１２，４３０（１）：２０−９）またはカウピークロロティックモットルウイルス（ＣＣＭＶ）（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２００６，１２８（８）：２５３８−９）を使用してｄｓＤＮＡ上でアセンブリする場合、固定されたサイズおよび形状を有する明瞭なキャプシドではなく、変形した非天然構造が形成される。これらの構造は、単一の核酸分子に通されたキャプシドの多重線として見られることが多く、核酸のカプセル化が完了していないことを示唆している。ｄｓＤＮＡ上でインビトロでアセンブリしたＳＶ４０では、小角Ｘ線散乱研究により、粒子のコアに電子密度がないことが示され、ＤＮＡがキャプシドの内部空洞から除外され、キャプシドが実質的に空であることが示唆される（Ｓａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１３，４１（３）：１５６９−１５８０）。キャプシドまたは非天然ウイルス構造から押し出されるパッケージ化されていない核酸は、遺伝子送達ベクターとしての有用性を妨げる可能性がある。
【０００６】
それにもかかわらず、自己アセンブリキャプシドのサイズと形状の制御は、より柔軟なｓｓＲＮＡ基質またはｓｓＤＮＡ基質を使用しても簡単ではない。ｓｓＲＮＡ上のＳＶ４０アセンブリは、天然の５０ｎｍのＴ＝７ビリオンサイズの粒子の代わりに、Ｔ＝１のキャプシドまたは多型キャプシドの多重線をもたらす（Ｋｌｅｒ  ａｎｄ  Ｚｌｏｔｎｉｃｋ（ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１３，８（１２）：２７５３−６１）。さらに、クライオ−ＥＭ  ３Ｄ復元は、ＲＮＡがＴ＝１のキャプシドから部分的に押し出されていることを示す（Ｋｌｅｒ  ａｎｄ  Ｚｌｏｔｎｉｃｋ（ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１３，８（１２）：２７５３−６１）。ＣＣＭＶでは、効率的なアセンブリは、ＲＮＡサイズによって制限される（Ｃａｄｅｎａ−Ｎａｖａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０１２，８６（６）：３３１８−２６）。
【０００７】
ウイルスキャプシドの自己アセンブリによってカプセル化できる別の種類のナノ材料は、カルボキシルまたはクエン酸酸性基などのアニオン性リガンドでコーティングされたナノ粒子である（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００５，５（１２）：２０２９−３３；Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．ＡＣＳ  ｎａｎｏ  ２０１３，７（１０）：８４４７−８４５４；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００６，６（４）：６１１−５；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ２０１１，３（１０）：４２７５−８２）。
【０００８】
ナノ粒子のカプセル化は、典型的には、核酸とは異なり、これらの基質が事前にコンパクトであるため、簡単である。ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）による金ナノ粒子のカプセル化の研究は、キャプシド空洞に見合ったサイズと形態のテンプレートがアセンブリ効率を高めることができると示している（Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ＡＣＳ  ｎａｎｏ  ２０１０，４（７）：３８５３−６０；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ２００７，１０４（４）：１３５４−９；Ａｎｉａｇｙｅｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００８，１８（３２）：３７６３−３７７４）。
【０００９】
ナノ粒子を効果的にカプセル化するには、表面電荷密度ならびに他の化学的および物理的表面特性も重要である（Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ＡＣＳ  ｎａｎｏ  ２０１０，４（７）：３８５３−６０；Ｋｕｓｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂ  ２０１５，１１９（５）：１８６９−１８８０）。
【００１０】
ＤＮＡオリガミは、ＤＮＡ自己折り畳みの技術であり、長い一本鎖ＤＮＡ（足場）を事前に設計されたナノメートル構造に折り畳むことを成立させる、ステープルと呼ばれる短い合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドのセットを使用する。ステープルは、足場ＤＮＡの異なる部分を補完し、それによって足場鎖の離れた部分を架橋するように設計されている。この手法は、高精度および高解像度で、２Ｄおよび３Ｄ形状を備えたナノメトリックオブジェクトを操作するためのプラットフォームを提供する。ＤＮＡオリガミ技術は、ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ足場にも適用されている。ＤＮＡオリガミ技術は、デバイス、バイオセンサー、分子機械、およびナノロボットなどの幅広い用途に使用されている。化学物質およびナノ粒子をＤＮＡオリガミ構造の中に搭載する能力は、治療用途に活用される。そのような構造には、化学療法、光線力学療法、および光熱療法のための抗がん剤、感光剤、および金粒子が搭載されている。
【００１１】
ＤＮＡオリガミ技術によって生成された非常にコンパクトな形態の核酸は、ウイルスキャプシドによる大きな核酸分子の完全なカプセル化を可能にし得る。しかしながら、ＤＮＡオリガミの周りのウイルスキャプシドのアセンブリは、難しい場合がある。ＤＮＡオリガミ構造の化学的および物理的表面特性は、これまでアセンブリの基質として機能してきた金ナノ粒子の特性とは異なる。さらに、ＤＮＡオリガミをアセンブリの基質として使用することの固有の特性は、金ナノ粒子と比較して、オリガミ構造が完全な球を容易に形成できないことである。カプセル化されるナノ粒子の形状と天然のキャプシドとの間の不一致は、カプセル化の結果を予測することを困難にするであろう。その結果、この幾何学的な制限は、ＤＮＡオリガミのカプセル化の効率に悪影響を与える可能性がある。
【００１２】
様々な出版物が、核酸の送達のためのウイルス様粒子の使用を対象にしている。米国特許第６，８３０，９２９号は、ＳＶ４０ウイルスおよび偽ウイルスのインビトロ構築を対象にしている。Ｚｌｏｔｎｉｃｋ  Ａ．らによる出版物（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１３，１０４，１５９５−１６０４）は、「Ｔｏ  Ｂｕｉｌｄ  ａ  Ｖｉｒｕｓ  ｏｎ  ａ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ」と題される。Ｈａｎｄａ  Ｈ．ら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１１，４２０，１−９）は、「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＶ４０  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ＶＰ１／２／３  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ」と題される。米国出願公開第ＵＳ２００８／０１３１９２８号は、生理学的条件におけるウイルス粒子様構造、およびそれを形成する方法を対象にしている。Ｍｉｋｋｉｌａら（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２０１４，１４，２１９６−２２００）およびＢｕｒｎｓら（ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．２０１８，７，７６７−７７３）を含む他の出版物は、オリガミ粒子およびウイルスタンパク質を含む物質の組成物を報告している。
【００１３】
大きな核酸分子を完全にカプセル化することができ、そのような核酸分子を細胞に移すために効果的に使用することができる真正なウイルス構造を示す効率的な粒子が、当技術分野で依然として必要とされている。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、その実施形態において、少なくとも１２個のキャプシドユニットによってカプセル化された少なくとも１つの核酸オリガミ構造の粒子、それを含む組成物、およびその使用を提供する。
【００１５】
いくつかの実施形態によれば、本発明の有利な粒子は、非常にコンパクトなオリガミ構造の形態である核酸を効率的かつ完全にカプセル化するそれらの能力により、標的細胞への核酸の効率的な送達を可能にする。本明細書に例示されるように、カプセル化された核酸は、キャプシドユニットで作製されたシェル内に完全にカプセル化および保護され、突出せず、粒子から押し出されない。本明細書で実証されるように、本発明の有利な粒子は、核酸を完全にカプセル化し、ウイルスに完全に類似している正二十面体ウイルス構造を示す。さらに、理論またはメカニズムに拘束されることを望まずに、本明細書の以下で実証されるように、ウイルス構造に非常に類似する有利な粒子は、粒子および核酸が、細胞機構によって認識されるようになっている天然ウイルスと同様に効率的に細胞内で輸送および代謝されるため、遺伝子送達に有効であり、キャプシドは、細胞の酵素反応によって開く場合があり、キャプシドが開いた後、特定の構造が形成されて、核酸カーゴの核への取り込みが促進される。対照的に、ウイルスとの高い類似性を示さない粒子は、核の中に効率的に侵入する可能性が低い。それらは、細胞によって貪食される可能性があるが、最終的には分解性の細胞小器官になるであろう。したがって、本発明の粒子は、遺伝子送達活性の高い可能性を示す。
【００１６】
いくつかの実施形態によれば、ＤＮＡオリガミは、キャプシドアセンブリのための新しいクラスの基質として使用することができることが本明細書に開示される。この目的を達成するために、本明細書に例示されるように、近球形の形態および天然ＳＶ４０キャプシドの内部空洞に最もよく一致する好適な直径に詰められたＳＶ４０キャプシドタンパク質およびＤＮＡオリガミ構造分子が使用された。本明細書で以下にさらに例示されるように、各々が１つ以上のキャプシドタンパク質から作製されたキャプシドユニットを含むシェルを有する粒子は、ＤＮＡオリガミ構造のコアの周りにアセンブリし、それを高効率でカプセル化することができる。いくつかの例示的な実施形態では、得られた粒子のクライオ−ＥＭ構造は、外側のシェルがＴ＝７ｄの正十二面体対称性の規則的なＳＶ４０格子を形成することを実証している。いくつかの実施形態では、クライオ−ＥＭ構造によって実証されるように、粒子のコア内（すなわち、シェルの内側）で、「ハニカム」格子に配置された平行螺旋などのＤＮＡオリガミの構造的特性が同定され得、ＤＮＡオリガミが全体としてキャプシドシェル内にカプセル化されることを示している。
【００１７】
いくつかの例示的な実施形態によれば、本明細書の以下で実証されるように、ＤＮＡオリガミ構造の２つの対向するハニカムの小表面を接続する軸が、正十二面体のキャプシドの三回対称軸からわずかに外れて（例えば、三回対称軸に向かって約−６．８°の傾斜角で）配向されているため、ＤＮＡオリガミ構造およびキャプシドは、ランダムに配向されていない。そのため、有利なことに、ＳＶ４０様粒子は、高い忠実度、効率、および再現性でＤＮＡオリガミの周りに形成され、キャプシドを正確に再現し、２つの格子、ＤＮＡオリガミおよびＳＶ４０キャプシドを互いに対して正確に位置付けることを可能にして、有用で活性な粒子を形成する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡオリガミ構造は、キャプシドに対してランダムに配向されている。
【００１８】
いくつかの実施形態によれば、コアおよびシェルを含む粒子が提供され、該コアが、シェルによってカプセル化された少なくとも１つの核酸オリガミ構造を含み、該シェルが、少なくとも１２個のキャプシドユニットを含み、キャプシドユニットが、１つ以上のキャプシドタンパク質を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態によれば、核酸オリガミ構造は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、任意の形態の一本鎖ＲＮＡ、および任意の形態の二本鎖ＤＮＡ、修飾核酸、合成核酸、またはそれらの任意の組み合わせ、ならびにそれらの多様性であり得る。いくつかの実施形態では、核酸オリガミ構造は、多様な核酸足場またはより小さなオリガミ構造を含み得、各々が、任意選択で、２つ以上の種類の核酸を含み得る。
【００２０】
いくつかの実施形態によれば、粒子のシェルは、準球形の形状を有し得る。いくつかの実施形態によれば、粒子のシェルは、正二十面体形状を有し得る。いくつかの実施形態によれば、粒子は、球形または近球形であり得る。
【００２１】
いくつかの実施形態によれば、粒子の直径は、約１０〜約２００ナノメートル（ｎｍ）であり得る。いくつかの実施形態によれば、該粒子の直径は、約２０ｎｍより大きくてもよい。
【００２２】
いくつかの実施形態によれば、キャプシドユニットは、少なくとも５つのキャプシドタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、キャプシドユニットの各々は、キャプシドタンパク質の五量体および／または六量体を含み得る。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、ウイルスタンパク質である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、ウイルスファミリーポリオーマウイルス科から選択されるウイルスからのものである。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、ヒトポリオーマウイルスからのものである。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、ＳＶ４０ウイルス、ＪＣウイルス、またはＢＫウイルスからなる群から選択されるウイルスからのものである。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、ＳＶ４０ウイルスからのものである。
【００２４】
いくつかの実施形態によれば、キャプシドタンパク質は、キャプシドタンパク質ＶＰ１、キャプシドタンパク質ＶＰ２、キャプシドタンパク質ＶＰ３、またはそれらの任意の組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、ＶＰ１である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、オリガミ構造は、少なくとも７２個のキャプシドユニットによってカプセル化され得る。いくつかの実施形態では、キャプシドユニットは、５つのＶＰ１分子、５つのＶＰ１分子および１つのＶＰ２分子、５つのＶＰ１分子および１つのＶＰ３分子、ならびに５つのＶＰ１分子および１つのＶＰ２分子もしくは１つのＶＰ３分子、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるウイルスタンパク質分子の組み合わせを含み得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、粒子は、核酸分子を標的細胞の中に送達する際に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、標的細胞は、インビトロ細胞、または組織もしくは生物に収容された細胞から選択される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本発明の複数の粒子を含む組成物が提供される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、細胞への核酸の送達のための、コアおよびシェルを含む粒子の使用が提供され、該コアが、シェルによってカプセル化された少なくとも１つの核酸オリガミ構造を含み、該シェルが、少なくとも１２個のキャプシドユニットを含み、キャプシドユニットが、１つ以上のキャプシドタンパク質を含む。
【００２９】
上記の例示的な態様および実施形態に加えて、さらなる態様および実施形態は、図を参照し、以下の詳細な説明を検討することによって明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ−１Ｄ】様々なサイズの近球形のＤＮＡオリガミ構造の電子顕微鏡写真である。図１Ａ−２８７３ヌクレオチド（ｎｔ）の長さの一本鎖ＤＮＡで構築された２５ｎｍのほぼ球形のオリガミ構造、図１Ｂ−５３８６ｎｔの長さの一本鎖ＤＮＡで構築された３０ｎｍのほぼ球形のオリガミ構造、図１Ｃ−７５６０ｎｔの長さの一本鎖ＤＮＡで構築された３５ｎｍのほぼ球形のオリガミ構造、図１Ｄ−２つの半球で構成される４０ｎｍのほぼ球形のオリガミ構造であり、１つは、７５６０ｎｔの長さの一本鎖ＤＮＡで構築され、２つ目は、７２４９ｎｔの一本鎖ＤＮＡで構築されている。
【図２Ａ−２Ｄ】粒子のネガティブ染色透過型電子顕微鏡である。図２Ａ：直径２５ｎｍのほぼ球形のＤＮＡオリガミ構造上にアセンブリしたＶＰ１を含む粒子、図２Ｂ：直径３０ｎｍのほぼ球形のＤＮＡオリガミ構造上にアセンブリしたＶＰ１を含む粒子、図２Ｃ：直径３５ｎｍのほぼ球形のＤＮＡオリガミ構造上にアセンブリしたＶＰ１を含む粒子、図２Ｄ：直径４０ｎｍのほぼ球形のＤＮＡオリガミ構造上にアセンブリしたＶＰ１を含む粒子。すべての画像で、アセンブリ生成物が、背景にある浮遊オリガミ構造および浮遊ＶＰ１五量体とともに観察される。
【図３Ａ】３０ｎｍのほぼ球形のＤＮＡオリガミ構造上にアセンブリした、ＳＶ４０  ＶＰ１で構築された粒子の８つのクライオ−ＥＭの２Ｄ顕微鏡写真である。顕微鏡写真は、特徴的なウイルススパイク（ＶＰ１五量体）を示すシェルおよびコアで構成される、５０ｎｍのＳＶ４０様粒子を示す。コアのうちのいくつかでは、オリガミ構造の折り畳まれたストランドを観察できる（ストライプとして見られる）。
【図３Ｂ】３０ｎｍのほぼ球形のＤＮＡオリガミ構造上にアセンブリしたＳＶ４０様粒子の２Ｄ顕微鏡写真に重ね合わせた野生型ＳＶ４０（ＰＤＢエントリー１ＳＶＡ）のモデルであり、完全な整列を示している。
【図３Ｃ】３０ｎｍのほぼ球形のＤＮＡオリガミ構造上にアセンブリした粒子を類似の粒子のクラスに分類するクライオ−ＥＭ顕微鏡写真の２Ｄ分類であり、各サブクラスは平均して数百の粒子を表す。
【図４Ａ−４Ｂ】蛍光標識された裸の３０ｎｍのオリガミ構造または標識された３０ｎｍのＤＮＡオリガミ構造を含有するＳＶ４０様粒子とインキュベートされたＣＶ−１細胞の共焦点顕微鏡写真である。図４Ａ：蛍光標識された裸の（ウイルスキャプシド内にパッケージされていない）オリガミ構造（構築、対照）で処理されたＣＶ１細胞である。図４Ｂ：ＤＮＡオリガミ構造の周りにインビトロでアセンブリしたウイルスキャプシドとインキュベートされたＣＶ１細胞であり、細胞の中への蛍光標識されたＤＮＡ（矢印でマーク）の取り込みを示している。
【図５Ａ−５Ｅ】３５ｎｍのほぼ球形のＤＮＡオリガミ構造上にアセンブリしたＴ＝７ｄの正二十面体ＳＶ４０様粒子のクライオ−ＥＭおよび３Ｄ再構成である。図５Ａ：上部パネル−ＳＶ４０様粒子の代表的なクライオ−ＥＭ顕微鏡写真であり、５０ｎｍの粒子の均一な集団を示している。スケールバーは、１００ｎｍを表す。挿入図は、縞模様を示すオリガミで満たされた粒子（左）および空の（右）粒子を示している（中央パネルで拡大）。下部パネル−合計４８７７８個の粒子からの２Ｄクラスの平均であり、空の粒子とＤＮＡオリガミで満たされた粒子の両方の存在を示している。    図５Ｂ：７．３Åの解像度での空の粒子の３Ｄ復元（上部パネル−正面図、中央パネル−内部図）、および対応する２６，１１０個の粒子の２Ｄクラス（下部パネル）である。    図５Ｃ：２５Åの解像度でのオリガミで満たされた粒子の３Ｄ復元（上部パネル−正面図、中央パネル−内部図）および対応する１９７８６個の粒子の２Ｄクラス（下部パネル）である。    図５Ｄ：復元された粒子の正二十面体対称性の実証である。正二十面体対称性を示すために、正二十面体は、シェル内の５価の五量体の中心にその頂点を揃えることにより、クライオ−ＥＭで復元されたオリガミで満たされたキャプシドの表面に手動で取り付けられた。５回、３回、および２回の対称軸は、正二十面体の小平面上でそれぞれ五角形、三角形、およびひし形としてマークされる。    図５Ｅ：正二十面体の三角分割数ＴのＣａｓｐａｒおよびＫｌｕｇの計算法の図解である。五角形は、５価の五量体を示す。Ｔは、Ｔ＝ｈ＊＊２＋ｈｋ＋ｋ＊＊２の公式で得られる。Ｔ＝７ｄ、ｈ＝２、およびｋ＝１の場合、ｈは、矢印１および２で表され、Ｋは、矢印１”で表される。復元されたキャプシド上の５価ＶＰ１五量体の局在は、Ｔ＝７ｄに対応する。
【図６Ａ−６Ｂ】ＤＮＡオリガミ上にアセンブリしたＳＶ４０様粒子のクライオ−ＥＭ  ３Ｄ復元の内部図であり、ＤＮＡオリガミが全体としてカプセル化されることを示している。図６Ａ：異なる観察角度で示される３５ｎｍのＤＮＡオリガミ構造の概略図であり、図６Ｂ：ＤＮＡオリガミで満たされたキャプシドの３Ｄ復元の３Ｄ電子密度マップである。ＤＮＡオリガミで満たされたキャプシドの様々な観察角度での図は、図６ＡのＤＮＡオリガミ設計のそれぞれの図に対応する。
【図７Ａ−７Ｃ】キャプシドに整列した正二十面体に関して、カプセル化された３５ｎｍのＤＮＡオリガミの３つの図の立体表現を示すピクトグラム。ＤＮＡオリガミのハニカム小平面は、傾斜した正二十面体の３回対称性に面する（図７Ｂ）。回転すると、２つの対向するハニカム小平面を接続する軸は、破線でマークされたオリガミの螺旋に対して平行に見え、正二十面体の３回対称軸から６．８°外れた位置にある（図７Ａ）。図７Ｃは、図７Ａの回転図を示す。
【図８】安定したＶＰ１／ＤＮＡオリガミ複合体の形成を実証する電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）分析を示すピクトグラムである。３５ｎｍのＤＮＡオリガミは、１つのＤＮＡオリガミ構造あたり４００個の五量体のモル比でＶＰ１五量体と混合した。アセンブリ生成物を０．７％アガロースゲルで分析し、ＥｔＢｒで染色した。Ｍ−サイズマーカー、０−オリガミ構造（五量体なし）、４００−五量体とインキュベートされたオリガミ構造。
【図９】ＤＮＡポリメラーゼの酵素作用への接近性の増加によって実証される、細胞内条件（３７℃および１ｍＭのＭｇ＋）下でのＤＮＡオリガミの展開である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
いくつかの実施形態によれば、少なくとも１２個のキャプシドユニットによってカプセル化された少なくとも１つの核酸オリガミ構造を含む有利な粒子が提供され、キャプシドユニットは、１つ以上のキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、コアおよびシェルを有し、シェルは、キャプシドユニットで作製され、コアは、シェル内にカプセル化された核酸オリガミ構造を含む。複数の粒子を含む組成物、および粒子にカプセル化された核酸を標的細胞に移す／トランスフェクトする／送達するためのその使用がさらに提供される。
【００３２】
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および句が以下に定義される。これらの用語および句は、本明細書の用語または句が、当業者の知識と組み合わせて、本明細書に提示される教示およびガイダンスに照らして当業者によって解釈されるように、説明を目的とするものであり、限定するものではないことを理解されたい。
【００３３】
本明細書で言及される際、「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、および「ヌクレオチド」という用語は、本明細書で交換可能に使用され得る。これらの用語は、別個のフラグメントの形態で、またはより大きな構築物、直鎖もしくは分岐、一本鎖、二本鎖、三本鎖、またはそれらのハイブリッドの成分として、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）のポリマー、およびそれらの変性形態を対象にする。この用語は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドも包含する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡのセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含み得る。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、例えば、これらに限定されないが、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成されたＤＮＡ、組換えＤＮＡ、もしくはそれらのハイブリッド、または例えば、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどのＲＮＡ分子であり得る。各可能性は、別個の実施形態である。これらの用語はさらに、天然に存在する塩基、糖、および共有ヌクレオシド間結合から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびにそれぞれの天然に存在する部分と同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、オリガミ構造の形態である。
【００３４】
オリガミ構造
本明細書で使用される場合、「核酸オリガミ構造」および「オリガミ構造」という用語は、交換可能に使用され得る。これらの用語は、ナノスケールで特定の三次元形状に折り畳まれた核酸分子を指す。オリガミ構造は、当業者に周知であり、本明細書にその全体が組み込まれる、Ｒｏｔｈｅｍｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔｕｒｅ４４０：２９７−３０２に記載されているような分子生物学的技術によって生成することができる。簡単に言えば、核酸の長い鎖（足場）は、「ステープル」ストランドとしても知られる短い核酸ストランドを使用して折り畳まれる。これらのステープルストランドの結合は、長いストランドの立方構造変化につながり、多くのステープルストランドを使用して、特定の折り畳みをもたらすことができる。折り畳みを最適化し、ステープルストランドの結合と除去のために、さらに加熱と冷却を繰り返す。
【００３５】
すでに特定の形状に折り畳まれたオリガミ構造は、商業的に購入することができる。オリガミ構造を販売する会社には、ｔｉｌｉｂｉｔ  ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ、およびＥｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓが含まれるが、これらに限定されない。
【００３６】
いくつかの実施形態では、オリガミ構造は、核酸ストランドを含む。いくつかの実施形態では、オリガミ構造は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、任意の形態の一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを含む）、修飾核酸、合成核酸、それらの任意の組み合わせ、ならびにそれらの多様性からなる群から選択される核酸を含む。各可能性は、別個の実施形態である。いくつかの実施形態では、オリガミ構造は、１つの核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、オリガミ構造は、２つ以上の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、オリガミ構造は、２つ以上の種類の核酸分子の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態では、核酸は、オリガミ構造から直線状ではなく、むしろオリガミ構造にコンパクト化される。いくつかの実施形態では、オリガミ構造は、１つ以上の核酸足場を含むことができ、各足場は、１つ以上の種類の核酸から構成され得る。例えば、足場は、ＲＮＡ分子に連結されたＤＮＡ分子を含むことができる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、オリガミ構造は、１つ以上のより小さなオリガミ構造を含むことができ、各々のより小さなオリガミ構造は、１つ以上の種類の核酸から構成され得る。いくつかの実施形態では、ステープルは、１つ以上の種類の核酸からなる。いくつかの実施形態では、ステープルおよび足場は各々、異なる種類の核酸からなる。
【００３８】
オリガミ構造は、特定の用途に所望の任意の形状をとることができる。いくつかの実施形態では、オリガミ構造の形状は、球、立方体、ピラミッド、円錐、ばね、および球状の形状からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、オリガミ構造は、シェルを満たすか、またはシェルによってカプセル化されるように構成される。いくつかの実施形態では、オリガミ構造は、球形である。いくつかの実施形態では、オリガミ構造は、本質的に球形である。いくつかの実施形態では、オリガミ構造は、ほぼ球形である。いくつかの実施形態では、オリガミ構造は、球形であり、ウイルス様粒子を満たすように構成される。
【００３９】
いくつかの実施形態では、核酸オリガミ構造は、細胞内で展開することが可能である。いくつかの実施形態では、核酸オリガミ構造は、細胞内環境の条件下で展開することが可能である。いくつかの実施形態では、核酸オリガミ構造は、細胞内環境の条件下で展開することができるように設計されている。
【００４０】
いくつかの実施形態では、核酸オリガミ構造は、細胞において発現されることが可能である。いくつかの実施形態では、オリガミ構造の核酸テンプレートは、細胞内で発現されることが可能である。いくつかの実施形態では、核酸オリガミ構造は、それが細胞内で展開された後、細胞内で発現されることが可能である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、核酸オリガミ構造は、それが細胞の中に導入された後、タンパク質キャプシドシェルから放出されると展開することが可能である。いくつかの実施形態では、核酸オリガミ構造は、細胞内環境においてタンパク質キャプシドシェルから放出されると展開することが可能である。いくつかの実施形態では、核酸オリガミ構造は、細胞内環境においてタンパク質キャプシドシェルから放出されたときに展開することができるように設計されている。
【００４２】
いくつかの実施形態では、核酸オリガミ構造のステープルは、オリガミ構造の核酸テンプレートが細胞内に放出されるように、細胞内で解体されることが可能である。いくつかの実施形態では、核酸オリガミ構造のステープルの解体は、温度、塩濃度、マグネシウム濃度、ｐＨなど、またはそれらの任意の組み合わせなどであるがこれらに限定されない細胞間条件の影響を受ける。いくつかの実施形態では、核酸オリガミ構造のステープルは、温度の細胞内条件および／またはマグネシウム濃度の細胞内条件で解体して、オリガミ構造の核酸テンプレートを放出するように設計されている。
【００４３】
いくつかの実施形態では、核酸オリガミ構造のステープルは、ヒドラゾン化学ライゲーションによって接合された１つ以上のオリゴヌクレオチドからなるか、またはそれらから構成され得る。いくつかの実施形態では、核酸オリガミ構造のステープルは、ヒドラゾン化学ライゲーションによって接合された少なくとも２つのオリゴヌクレオチドからなるか、またはそれらから構成され得る。いくつかの実施形態では、核酸オリガミ構造のステープルは、ヒドラゾン化学ライゲーションによって接合された２つのオリゴヌクレオチドからなるか、またはそれらから構成され得る。いくつかの実施形態では、核酸オリガミ構造のステープルは、ヒドラゾン化学ライゲーションによって接合され得る１つ以上の修飾オリゴヌクレオチドからなるか、またはそれらから構成され得る。
【００４４】
いくつかの実施形態では、核酸オリガミ構造のステープルは、ジスルフィド結合によって接合された１つ以上のオリゴヌクレオチドからなるか、またはそれらから構成され得る。いくつかの実施形態では、核酸オリガミ構造のステープルは、ジスルフィド結合によって接合された少なくとも２つのオリゴヌクレオチドからなるか、またはそれらから構成され得る。いくつかの実施形態では、核酸オリガミ構造のステープルは、ジスルフィド結合によって接合された２つのオリゴヌクレオチドからなるか、またはそれらから構成され得る。いくつかの実施形態では、核酸オリガミ構造のステープルは、ジスルフィド結合によって接合され得る１つ以上の修飾オリゴヌクレオチドからなるか、またはそれらから構成され得る。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ステープルは、ヒドラゾン化学ライゲーションによって接合されたオリゴヌクレオチド、ジスルフィド結合によって接合されたオリゴヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせを含み、それからなり、またはそれらを構成し得る。
【００４６】
いくつかの実施形態では、オリガミ構造のステープルは、細胞エンドソームの酸性条件下で分解され、オリガミ構造の核酸テンプレートを放出することが可能である。いくつかの実施形態では、オリガミ構造のステープルは、細胞エンドソームの酸性条件下で分解し、オリガミ構造の核酸テンプレートを放出するように設計されている。
【００４７】
いくつかの実施形態では、オリガミ構造のステープルは、細胞内で還元されて、オリガミ構造の核酸テンプレートを放出することが可能である。いくつかの実施形態では、オリガミ構造のステープルは、細胞内条件下で還元され、オリガミ構造の核酸テンプレートを放出することが可能である。いくつかの実施形態では、オリガミ構造のステープルは、細胞内条件下で還元され、オリガミ構造の核酸テンプレートを放出するように設計されている。
【００４８】
いくつかの実施形態では、オリガミ球（または近球）の直径は、１０〜２００、１０〜１８０、１０〜１６０、１０〜１４０、１０〜１２０、１０〜１００、１０〜８０、１０〜６０、２０〜２００、２０〜１８０、２０〜１６０、２０〜１４０、２０〜１２０、２０〜１００、２０〜８０、または２０〜６０ナノメートル（ｎｍ）である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、オリガミ球の直径は、１０〜２００ｎｍである。いくつかの実施形態では、オリガミ球の直径は、１０、２０、２２、２５、または３０ｎｍより大きい。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、オリガミ球の直径は、２２ｎｍより大きい。いくつかの実施形態では、オリガミ球の直径は、２５ｎｍより大きい。
【００４９】
いくつかの実施形態では、オリガミ構造の中心から外周までの距離は、１０〜２００、１０〜１８０、１０〜１６０、１０〜１４０、１０〜１２０、１０〜１００、１０〜８０、１０〜６０、２０〜２００、２０〜１８０、２０〜１６０、２０〜１４０、２０〜１２０、２０〜１００、２０〜８０、または２０〜６０ナノメートル（ｎｍ）である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、オリガミ構造の中心から外周までの距離は、１０〜２００ｎｍである。いくつかの実施形態では、オリガミ構造の中心から外周までの距離は、１０、２０、２２、２５、または３０ｎｍより大きい。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、オリガミ構造の中心から外周までの距離は、１７ｎｍより大きい。いくつかの実施形態では、オリガミ構造の中心から外周までの距離は、２０ｎｍより大きい。いくつかの実施形態では、オリガミ構造の中心から外周までの距離は、約１７ｎｍである。いくつかの実施形態では、オリガミ構造の中心から外周までの距離は、約２０ｎｍである。いくつかの実施形態では、オリガミ構造の中心から外周までの距離は、約３０ｎｍである。
【００５０】
キャプシドユニットおよびキャプシドタンパク質
本明細書で使用される場合、「キャプシドユニット」または「キャプシドサブユニット」という用語は、１つ以上のキャプシドタンパク質から構成される構造ユニットを指し、「キャプシド」は、ウイルスのタンパク質シェルを指す。いくつかの実施形態では、キャプシドユニットは、キャプソマーである。いくつかの実施形態では、１個以上のキャプシドユニットの組み合わせが、本発明の粒子のシェルを形成する。いくつかの実施形態では、１２個以上のキャプシドユニットの組み合わせが、本発明の粒子のシェルを形成する。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、天然供給源のものである。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、天然のウイルスキャプシドタンパク質との、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列相同性を有する。各可能性は、別個の実施形態である。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、ウイルスファミリーポリオーマウイルス科から選択されるウイルスからのものである。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、ＳＶ４０ウイルスおよび、例えば、ＪＣウイルスまたはＢＫウイルスを含むヒトポリオーマウイルスからなる群から選択されるウイルスのものである。いくつかの実施形態では、ポリオーマウイルス科のウイルスは、メルケル細胞ポリオーマウイルス、トリコジスプラシアスピヌロサポリオーマウイルス、ヒトポリオーマウイルス９、ヒトポリオーマウイルス１２、ニュージャージーポリオーマウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、ＫＩポリオーマウイルス、ＷＵポリオーマウイルス、ヒトポリオーマウイルス６、ヒトポリオーマウイルス７、ＭＷポリオーマウイルス、ＳＴＬポリオーマウイルス、およびリヨンＩＡＲＣポリオーマウイルスからなる群から選択され得る。各可能性は、別個の実施形態である。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、ＳＶ４０ウイルスからのものである。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、変性ＳＶ４０キャプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、人工供給源のものである。いくつかの実施形態では、人工キャプシドタンパク質は、既知のウイルスキャプシドタンパク質の変性または変異形態であり得る。いくつかの実施形態では、人工キャプシドタンパク質は、１つ以上の既知のウイルスキャプシドタンパク質に由来するキメラタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、人工キャプシドタンパク質は、１つ以上のウイルスキャプシドタンパク質からの１つ以上のドメインを含むキメラタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、人工キャプシドタンパク質は、非ウイルス領域またはドメインを含み得、例えば、人工タンパク質は、ウイルス配列またはドメインの代わりに、またはそれに加えて、非ウイルス配列を含み得る。いくつかの実施形態では、人工キャプシドタンパク質は、天然のウイルスキャプシドタンパク質を模倣することが可能な１つ以上の機能的ドメインを含有し得る。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、既知のキャプシドタンパク質の任意の変性形態または変異形態を含み得る。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、ウイルスキャプシドタンパク質の任意の変性形態または変異形態であり得る。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、ＳＶ４０キャプシドタンパク質の変性形態または変異形態であり得る。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、ＳＶ４０キャプシドタンパク質の任意の変性形態または変異形態を含み得る。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、既知のウイルスキャプシドタンパク質の遺伝子操作された形態であり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、様々な供給源の既知のウイルスキャプシドタンパク質の１つ以上のドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の種類のウイルスキャプシドタンパク質の組み合わせが、キャプシドユニットを形成することができる。いくつかの実施形態では、いくつかのキャプシドユニットの組み合わせが、粒子のシェルを形成することができる。いくつかの例示的な実施形態では、粒子のシェルは、少なくとも１２個のキャプシドユニットを含む。いくつかの実施形態では、各キャプシドユニットは、少なくとも１つのウイルスタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、各キャプシドユニットは、少なくとも５つのウイルスタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、キャプシドユニットは、キャプシドタンパク質の五量体である。いくつかの実施形態では、キャプシドユニットは、正十二面体形状を有するシェルを形成する。いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、正十二面体形状を有する。いくつかの実施形態では、正二十面体形状は、１２個の頂点、２回、３回、および５回の対称軸、ならびに正二十面体三角分割数によって画定される特徴的な数の構造単位を有する構造に関し、正二十面体三角分割数は、ＣａｓｐａｒおよびＫｌｕｇのシステム（Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｒ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ．１９６２；２７：１−２４）に従って計算することができる。正二十面体形状は、ＣａｓｐａｒおよびＫｌｕｇのシステム（Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｒ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ．１９６２；２７：１−２４）に基づいて判定することができる。いくつかの実施形態では、正十二面体形状は、中空の準球形構造の形態で配置されたキャプシドユニットに関する。いくつかの実施形態では、正十二面体キャプシドは、Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｚｌｏｔｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｕｓｅｓ  ２０１８，  １０：２５に従って、正十二面体格子に幾何学的欠陥を有するキャプシドを含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、「準球形」という用語は、内部コアの周りに配置された外部シェル表面を有する中空構造を包含するように向けられている。いくつかの実施形態では、準球形は、正十二面体、欠陥のある正十二面体、不完全な正十二面体、完全球、近球、半球、楕円体などのような幾何学的形状を含み得る。
【００５２】
いくつかの実施形態によれば、粒子は、正十二面体形状を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、準球形の形状を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、球形、半球形、または近球形であり得る。
【００５３】
いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、ウイルスタンパク質（ＶＰ）である。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、キャプシドタンパク質ＶＰ１（ＶＰ１）、キャプシドタンパク質ＶＰ２（ＶＰ２）、キャプシドタンパク質ＶＰ３（ＶＰ３）、およびそれらの組み合わせから選択され得る。各可能性は、別個の実施形態である。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、ＶＰ１である。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、それぞれ、ポリオーマウイルス科ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を指す。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、それぞれ、ＪＣ  ＶＰ１、ＪＣ  ＶＰ２、およびＪＣ  ＶＰ３を指す。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、それぞれ、ＢＫ  ＶＰ１、ＢＫ  ＶＰ２、およびＢＫ  ＶＰ３を指す。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、それぞれ、ＳＶ４０  ＶＰ１、ＳＶ４０  ＶＰ２、およびＳＶ４０  ＶＰ３を指す。
【００５８】
いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、ウイルスタンパク質（ＶＰ）、またはその変性形態である。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、キャプシドタンパク質ＶＰ１（ＶＰ１）、および／またはその変性形態、キャプシドタンパク質ＶＰ２（ＶＰ２）および／またはその変性形態、キャプシドタンパク質ＶＰ３（ＶＰ３）、および／またはその変性形態、またはそれらの任意の組み合わせから選択され得る。各可能性は、別個の実施形態である。いくつかの実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の変性形態は、それぞれ、ポリオーマウイルス科ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の変性形態を指す。いくつかの実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の変性形態は、それぞれ、ＪＣ  ＶＰ１、ＪＣ  ＶＰ２、ＪＣ  ＶＰ３の変性形態を指す。いくつかの実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の変性形態は、それぞれ、ＢＫ  ＶＰ１、ＢＫ  ＶＰ２、およびＢＫ  ＶＰ３の変性形態を指す。いくつかの実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の変性形態は、それぞれ、ＳＶ４０  ＶＰ１、ＳＶ４０  ＶＰ２、およびＳＶ４０  ＶＰ３の変性形態を指す。
【００５９】
核酸をキャプシドにカプセル化する方法は、当業者に周知であり、本明細書において以下にも提供される。Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２：ｅ７６５（２００７）およびＳ．Ｋｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＣＳ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ８，２７５３−２７６１（２０１３）などのさらなるテキストを、さらなる指針ついて閲覧することができる。
【００６０】
カプセル化
本明細書で使用される場合、オリガミ構造に関して「カプセル化された」という用語は、その明白な意味で理解されるべきであり、すなわち、オリガミ構造は、完全にキャプシドユニットによって囲まれている。いくつかの実施形態では、オリガミ構造は、キャプシドユニットによって全体に囲まれている。いくつかの実施形態では、オリガミ構造は、キャプシドユニットの外部部分に露出されていない。いくつかの実施形態では、キャプシドユニットは、オリガミ構造が存在する／収容される閉じたコアをカプセル化するシェルを形成する。いくつかの実施形態では、オリガミ核酸は、あまりコンパクトではない形態の同じ核酸よりも完全にカプセル化される。
【００６１】
いくつかの実施形態では、１つのオリガミ構造は、少なくとも１２個のキャプシドユニットによってカプセル化される。いくつかの実施形態では、２つ以上のオリガミ構造は、少なくとも１２個のキャプシドユニットによってカプセル化される。
【００６２】
いくつかの実施形態では、オリガミ構造は、少なくとも１２、３２、４２、７２、９２、１２２、１３２、１６２、２１２、２５２、２７２、２８２、または３１２個のキャプシドユニットのシェルによってカプセル化される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、オリガミ構造は、少なくとも７２個のキャプシドユニットによってカプセル化され得る。いくつかの実施形態では、オリガミ構造は、少なくとも７２個のキャプシド五量体によってカプセル化される。いくつかの実施形態では、シェルのキャプシドユニットは、天然ウイルスキャプシドのキャプシドユニットを作製するキャプシドタンパク質の数または組成において同一または異なる場合がある。いくつかの実施形態では、キャプシドユニットのすべてまたはいくつかのキャプシドタンパク質は、すべてＶＰ１またはその変性／変異形態である。いくつかの実施形態では、キャプシドユニットのすべてまたはいくつかのキャプシドタンパク質は、ＶＰ１およびＶＰ２またはそれらの変性／変異形態である。いくつかの実施形態では、キャプシドユニットのすべてまたはいくつかのキャプシドタンパク質は、ＶＰ１およびＶＰ３またはそれらの変性／変異形態である。いくつかの実施形態では、キャプシドユニットのすべてまたはいくつかのキャプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３またはそれらの変性／変異形態である。いくつかの実施形態では、キャプシドユニットは、少なくとも５つのウイルスタンパク質から構成され得る。いくつかの実施形態では、キャプシドユニットは、ウイルスタンパク質の五量体から構成され得る。いくつかの実施形態では、キャプシドユニットは、ＶＰ１タンパク質の五量体から構成され得る。いくつかの実施形態では、キャプシドユニットは、ＶＰ２および／またはＶＰ３などの１つ以上の追加のウイルスタンパク質を伴い得るＶＰ１タンパク質の五量体から構成され得る。いくつかの実施形態では、キャプシドユニットは、５つのＶＰ１分子、５つのＶＰ１分子および１つのＶＰ２分子、５つのＶＰ１分子および１つのＶＰ３分子、５つのＶＰ１分子および１つのＶＰ２分子または１つのＶＰ３分子、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるウイルスタンパク質分子の組み合わせを含み得る。各可能性は、別個の実施形態である。いくつかの実施形態では、オリガミ構造は、少なくとも３６０個のキャプシドタンパク質によってカプセル化される。いくつかの実施形態では、オリガミ構造は、各五量体がＶＰ１分子およびその変性形態のみからなる少なくとも７２個のＶＰ１五量体、各五量体が１つのＶＰ２分子およびその変性形態を含む少なくとも７２個のＶＰ１五量体、各五量体が１つのＶＰ３分子およびその変性形態を含む７２個のＶＰ１五量体、または各五量体が１つのＶＰ２分子または１つのＶＰ３分子およびその変性形態を含む少なくとも７２個のＶＰ１五量体の任意の組み合わせによってカプセル化される。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本発明の粒子を生成するために混合される、核酸オリガミ構造対キャプシドタンパク質の比は、モル濃度で、少なくとも１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：７５０、１：８００、１：９００、１：１０００、または１：２０００である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、核酸オリガミ構造対キャプシドタンパク質の比は、モル濃度で、少なくとも１：２００である。いくつかの実施形態では、オリガミ構造対キャプシドタンパク質の比は、モル濃度で、１：１００〜１：５０００、１：１００〜１：２０００、１：１００〜１：１０００、１：１００〜１：７５０、１：２００〜１：５０００、１：２００〜１：２０００、１：２００〜１：１０００、または１：２００〜１：７５０である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、本発明の粒子を生成するために混合された、オリガミ構造対キャプシドタンパク質の比は、モル濃度で、１：２００〜１：２０００である。
【００６４】
いくつかの実施形態では、粒子中のオリガミ構造対キャプシドユニットの比は、少なくとも１：１２、１：３２、１：４２、１：７２、１：９２、１：１２２、１：１３２、１：１６２、１：２１２、１：２５２、１：２７２、１：２８２、または１：３１２である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、粒子中の核酸オリガミ構造対キャプシド構造単位の比は、モル濃度で、少なくとも１：１２、１：３２、１：４２、１：７２、１：９２、１：１２２、１：１３２、１：１６２、１：２１２、１：２５２、１：２７２、１：２８２、または１：３１２である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００６５】
いくつかの実施形態では、キャプシドユニットによってカプセル化された少なくとも１つのオリガミ構造を含む粒子は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、カプセル化された核酸を標的細胞に成功裏に移すことが可能であり、その結果、核酸は、標的細胞において発現され得る。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、カプセル化された核酸オリガミ構造を標的細胞に移すことが可能であり、その結果、核酸は、任意選択で、細胞内で展開された後、標的細胞内で発現することができ、発現を可能にする。いくつかの実施形態では、細胞は、インビトロである。いくつかの実施形態では、細胞は、組織または生物に収容されている。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、カプセル化された核酸オリガミ構造をインビボで生物に移すことが可能であり、その結果、核酸は、標的細胞または組織においてインビボで発現され得る。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、非病原性である。いくつかの実施形態では、粒子にカプセル化された核酸は、ウイルス起源ではない。
【００６６】
いくつかの実施形態では、粒子の直径は、２０〜５００、２０〜４００、２０〜３００、２０〜２５０、２０〜２００、２０〜１５０、２０〜１００、３０〜５００、３０〜４００、３０〜３００、３０〜２５０、３０〜２００、３０〜１５０、３０〜１００、４０〜５００、４０〜４００、４０〜３００、４０〜２５０、４０〜２００、４０〜１５０、４０〜１００、５０〜５００、５０〜４００、５０〜３００、５０〜２５０、５０〜２００、５０〜１５０、または５０〜１００ｎｍである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、粒子の直径は、２０〜３００ｎｍである。いくつかの実施形態では、粒子の直径は、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、または６５ｎｍより大きい。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、粒子の直径は、ウイルス様粒子の直径である。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、分子があまりコンパクトではない場合にカプセル化され得るよりも長い核酸分子のカプセル化を可能にする。いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、あまりコンパクトではない核酸分子テンプレートから生成された粒子よりもより安定している。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される粒子は、あまりコンパクトではない核酸分子テンプレートから生成された粒子集団よりもサイズおよび形状がより均一な粒子集団を形成する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１２個のキャプシドユニットによってカプセル化された少なくとも１つのオリガミ構造を含む粒子が提供される。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、あまりコンパクトではない核酸分子テンプレートから生成された粒子とは異なる三角分割数（正十二面体形状）を有する。いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、あまりコンパクトではない核酸分子テンプレートから生成された粒子よりも、天然に存在するウイルスにより類似した正二十面体形状を有する。いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、Ｔ＝１、Ｔ＝３、Ｔ＝４、Ｔ＝７、Ｔ＝９、Ｔ＝１２、Ｔ＝１３、Ｔ＝１６、Ｔ＝２１、Ｔ＝２５、Ｔ＝２７、Ｔ＝２８、またはＴ＝３１の正二十面体形状を有する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００７０】
いくつかの例示的な実施形態では、本発明の粒子は、Ｔ＝７の形状を有する。いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、Ｔ＝７ｄの正十二面体対称性を示す。いくつかの例示的な実施形態では、Ｔ＝７ｄの正二十面体粒子キャプシドは、１２個の５価五量体（例えば、５つの他の五量体に囲まれるＶＰ１五量体）および６０個の六価五量体（例えば、６つの他の五量体に囲まれるＶＰ１五量体）から構成される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、アセンブリしたキャプシドの正二十面体表面格子は、５回、３回、および２回対称軸を含み得る。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡオリガミ構造は、キャプシド形状に関してランダムに位置付けられていない。いくつかの実施形態では、粒子の内部（コア）は、粒子間で均一であり、すなわち、粒子の集団は、実質的に均質である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡオリガミ構造は、キャプシド形状に関してランダムに位置付けられる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、キャプシドシェル内のＤＮＡオリガミ構造のカプセル化効率は、約１％超、約２％超、約３％超、約５％超、約１０％超、約１５％超、約２０％超、約２５％超、約３０％超、約３５％超、約４０％超、約４５％超、約５０％超、約５５％超、約６０％超、約６５％超、約７０超％、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％超、または約９９％超である。各可能性は、別個の実施形態である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、キャプシドシェル内のＤＮＡオリガミ構造のカプセル化効率は、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％である。各可能性は、別個の実施形態である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本発明の粒子にカプセル化された核酸で標的細胞を送達する／感染させる／トランスフェクトするための方法が提供される。いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、粒子にカプセル化された核酸で標的細胞を送達する／感染させる／トランスフェクトする際に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、核酸分子を細胞に送達する際に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、核酸分子を細胞の中に送達する際に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、核酸分子を細胞の細胞質の中に送達する際に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、核酸分子を細胞の核の中に送達する際に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、あまりコンパクトではない核酸分子を含有するＶＬＰ（ウイルス様粒子）と比較して、核酸分子を細胞の中に送達するのに優れている。いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、従来のウイルスベクターと比較して、核酸分子を細胞の中に送達するのに優れている。「より良い送達」および「より良好な送達」という用語は、互換的に使用され、例えば、これらに限定されないが、送達の容易さ、送達の正確さ、粒子の生成の効率および容易さ、標的細胞における核酸の発現の効率、細胞における標的遺伝子の修正または不活性化の効率、細胞核に入る核酸分子の量の増加、細胞細胞質に入る核酸分子の量の増加、より大きな核酸分子を細胞に送達する能力、複数の核酸分子を同じ細胞に送達する能力、任意の種類の核酸分子を、それらの配列に関係なく細胞に送達する能力、複数の種類の核酸分子を同じ細胞に送達する能力、修飾核酸分子を同じ細胞に送達する能力、ウイルス起源の核酸を送達する能力、細胞内の核酸分子からのタンパク質産生の増加などを含む、任意の有利な送達を指すことができる。いくつかの実施形態では、有利な送達は、本発明の粒子の免疫原性の欠如を指す。いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、核酸分子の所望の標的部位への送達／感染／トランスフェクションにおいて使用するためのものである。標的部位は、細胞、組織、器官、微生物などであるがこれらに限定されない任意の標的部位を含み得る。標的部位は、インビボまたはインビトロの標的部位であり得る。
【００７６】
いくつかの実施形態では、細胞は、インビトロである。いくつかの実施形態では、細胞は、インビボである。いくつかの実施形態では、細胞は、インビトロまたはインビボである。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本発明の１つ以上の粒子を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、本発明の複数の粒子を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、粒子および／または粒子のキャプシドユニットにカプセル化された核酸のサイズ、組成、および／または同一性に関して同一または異なり得る複数の粒子を含み得る。
【００７８】
本出願において、特に明記しない限り、本発明の実施形態の特性（１つまたは複数）の状態または関係特性を修正する「実質的に」および「約」などの形容詞は、状態または特徴が、許容範囲内に定義されることを意味すると理解され、それらは、実施形態の動作が意図される用途のための動作に対して受け入れ可能である。特に明記しない限り、明細書および特許請求の範囲における「または」という単語は、排他的なまたはではなく、包括的な「または」であると見なされ、それが結合する項目の少なくとも１つまたは任意の組み合わせを示す。
【００７９】
本出願の説明および特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、および「有する」という動詞の各々、ならびにそれらの同根語は、動詞の目的語または複数の目的語が必ずしも動詞の主語または複数の主語の構成要素、要素、または部分の完全なリストではないことを示すために使用される。
【００８０】
本明細書で使用される他の用語は、当技術分野におけるそれらの周知の意味によって定義されることを意味する。
【００８１】
一般に、本明細書で使用される命名法および本発明で利用される実験手順には、分子的、生化学的、微生物学的、および組換えＤＮＡ技術が含まれる。このような手法は、文献で詳しく説明されている。例えば、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）；”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，”Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）”Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；同第５，１９２，６５９号、および同第５，２７２，０５７号に記載の方法論；”Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙによる”Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），”Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），”Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたく、これらは、すべて参照により組み込まれる。他の一般的な参考文献は、本文書全体で提供されている。
【００８２】
本明細書で使用される場合、値と組み合わされたときの「約」という用語は、参照値のプラスマイナス１０％を指す。例えば、約１０００ナノメートル（ｎｍ）の長さは、１０００ｎｍ±１００ｎｍの長さを指す。
【００８３】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド」への言及は、複数のそのようなポリヌクレオチドを含み、「そのポリペプチド」への言及は、１つ以上のポリペプチドおよび当業者に知られているそれらの同等物などへの言及を含む。特許請求の範囲は、いかなる任意の要素を除外するために起草される場合があることにさらに留意されたい。そのため、この声明は、請求要素の列挙に関連して「単独」、「のみ」などのそのような排他的用語を使用する、または「否定的な」制限を使用するための先行する基礎として役立つことを意図している。
【００８４】
「Ａ、Ｂ、およびＣなどの少なくとも１つ」に類似した伝統的表現法が使用されるそれらの場合には、一般に、そのような構成は、当業者が伝統的表現法を理解するという意味で意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣの少なくとも１つを有するシステム」は、これらに限定されないが、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢを一緒に、ＡおよびＣを一緒に、ＢおよびＣを一緒に、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣを一緒に有するシステムを含むであろう。）。２つ以上の代替用語を提示する事実上いかなる離接語および／または句も、説明、特許請求の範囲、または図面中であろうと、用語のうちの１つ、用語のうちのいずれか、または両方の用語を含む可能性を企図すると理解されるべきであることが当業者によってさらに理解されるであろう。例えば、「ＡまたはＢ」という句は、「Ａ」もしくは「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むと理解されるであろう。
【００８５】
別個の実施形態の文脈で説明される、明確にするための本発明の特定の特性もまた、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、単一の実施形態の文脈で説明される、簡潔にするための本発明の様々な特性もまた、別個にまたは任意の好適なサブコンビネーションで提供され得る。本発明に関連する実施形態のすべての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、どの組み合わせも個別に、かつ明示的に開示されたかのように、本明細書に開示される。さらに、様々な実施形態およびその要素のすべてのサブコンビネーションもまた、本発明によって具体的に包含され、そのようなどのサブコンビネーションも個別に、かつ明示的に本明細書に開示されたかのように、本明細書に開示される。
【００８６】
本発明の追加の目的、利点、および新規の特性は、限定することを意図しない以下の実施例を検討すると、当業者に明らかになるであろう。さらに、上記に描写され、以下の特許請求の範囲のセクションで主張されるような本発明の様々な実施形態および態様の各々は、以下の実施例で実験的裏付けを見出す。
【００８７】
上記に描写され、以下の特許請求の範囲のセクションで主張されるような本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例で実験的裏付けを見出す。
【実施例】
【００８８】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態および態様を説明するのに役立ち、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者は、同一または類似の結果を得ながら、本明細書に開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができることを理解するであろう。
【００８９】
材料および方法
粒子の生成（ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の生成）
インビトロでの粒子の自己アセンブリには、精製されたキャプシドタンパク質および核酸オリガミ構造の使用が必要である。以下の例では、アセンブリ用のＶＰ１五量体の供給源として空のＶＰ１−ＶＬＰを生成した。ＳＶ４０  ＶＰ１は、バキュロウイルス発現ベクター（ＶＰ１  ＵｎｉＰｒｏｔエントリー−Ｐ０３０８７）に感染したＳＦ９細胞で生成した。
【００９０】
ＳＦ９細胞内に形成された空のＶＬＰは、細胞溶解を行うことによって抽出し、ＣｓＣｌ勾配で精製した。ＶＬＰは、インビトロで基本的なＶＰ１五量体キャプシドユニットに解体した。五量体は、最初に５ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．９、５０ｍＭのＮａＣｌ  ２ｍＭのＤＴＴ（解離バッファー）に対して、次に２ｍＭのＥＤＴＡを含む解離バッファーに対して、４℃での透析によってＶＬＰを解離することにより得た。すべての透析ステップは、完全なプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）の存在下で実施した。透析液を２０，０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離して、凝集したタンパク質を沈殿させた。
【００９１】
粒子のアセンブリのために、核酸オリガミ構造を、２×アセンブリバッファー（２５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．２）で分解されたＶＰ１五量体に追加した。キャプシドは、核酸の周りに自発的にアセンブリした。アセンブリ反応に関して、核酸テンプレートは、２５ｎｍの近球形のオリガミ構造に構造化された２８７３ｎｔの長さの一本鎖ＤＮＡ、３０ｎｍの近球形のオリガミ構造に構造化された５３８６ｎｔの長さΦＸ１７４ＶｉｒｉｏｎＤＮＡ、２つの半球から構成される、３５ｎｍの近球形のＤＮＡオリガミ構造および４０ｎｍの近球形のオリガミ構造に構造化された、Ｍ１３ｍｐ１８バクテリオファージ誘導体に基づく、７５６０ｎｔの長さの一本鎖ＤＮＡであり、１つ目は、Ｍ１３ｍｐ１８バクテリオファージ誘導体に基づく７２４９ヌクレオチド長の足場ＤＮＡストランドであり、２つ目は、Ｍ１３ｍｐ１８バクテリオファージに基づく７５６０ヌクレオチド長の足場ＤＮＡ鎖に基づく（すべてのオリガミ構造は、ドイツのガルヒングにあるｔｉｌｉｂｉｔ  ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている）。
【００９２】
オリガミ構造
上で詳述したように、オリガミ構造は、ドイツのガルヒングにあるｔｉｌｉｂｉｔ  ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。同様に、２５個のＣｙ５修飾ステープルを含む５３８６ｎｔのΦＸ１７４ＶｉｒｉｏｎＤＮＡから構成される蛍光標識された３０ｎｍの近球ＤＮＡオリガミを購入した。
【００９３】
ネガティブ染色透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
試料の３μｌの滴をグロー放電グリッド（３００メッシュのＣｕグリッド上のカーボンサポートフィルム、Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｌｔｄ．）に適用した。１０〜２０秒後、余分な液体を濾紙で吸い取った。グリッドを２％酢酸ウラニル染色液とともに３０秒間インキュベートし、吸い取り、空気中で乾燥させた。試料は、１２０ｋＶで動作するＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ１２Ｇ２ＴＷＩＮ  ＴＥＭによって調査し、画像を４Ｋ×４Ｋ  ＦＥＩ  Ｅａｇｌｅ  ＣＣＤカメラによって記録した。
【００９４】
クライオ−ＥＭ
試料調製
単粒子分析では、３０秒のグロー放電処理後に、３μｌのＶＬＰ試料をホーリーカーボングリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ  Ｒ１．２／１．３、Ｍｉｃｒｏ  Ｔｏｏｌｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ）に適用した。Ｖｉｔｒｏｂｏｔ（ＦＥＩ、アイントホーフェン）を使用して、−１８２℃で液体エタンに急速に浸すことにより、グリッドを吸い取り、ガラス化した。
【００９５】
単粒子解析法のためのデータ収集：
試料は、３００ｋＶで動作するＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｆ３０  Ｐｏｌａｒａ顕微鏡（ＦＥＩ、アイントホーフェン）で低線量条件下で画像化した。データセットは、２．３Åの較正されたピクセルサイズのエネルギーフィルター（Ｇａｔａｎ  Ｑｕａｎｔｕｍ  ＧＩＦ）の後ろに取り付けられたＫ２  Ｓｕｍｍｉｔ直接電子検出器カメラでＳｅｒｉａｌＥＭを使用して自動的に収集した。エネルギーフィルターは、ゼロ損失ピークエネルギーから＞±１０ｅＶの電子を除去するように設定した。Ｋ２サミットカメラは、カメラ上で１０電子／ピクセル／秒の線量率でカウントモードで操作した。各動画は、５０の画像フレームに線量分割し、総電子線量は、８０ｅ／Å＾２であった。
【００９６】
単粒子復元
線量分割された画像スタックは、ＭｏｔｉｏｎＣｏｒｒ２、およびＧｃｔｆによって推定されたそれらの焦点ぼけ値を使用して整列させた。整列されたフレームの合計は、さらなる処理に使用し、残りの処理は、ＲＥＬＩＯＮ２．１で行った。４８７７８個の粒子を自動選択し、１００クラスのＲＥＬＩＯＮ２．１を使用して２Ｄ分類に供した。最初の３Ｄ参照は、異なる、選択された２Ｄクラス平均の３２００個の空のキャプシド粒子から調製した。正十二面体対称性（Ｉ１）を課す２６，１１０個の粒子から空のキャプシドの３Ｄ分類および精密化を行った。得られた空のキャプシドマップは、その後、オリガミで満たされたキャプシド（１９７８６個の粒子）の３Ｄ分類および精密化のための初期参照モデルとして使用した。オリガミで満たされたキャプシドの３Ｄ  クライオ−ＥＭマップの復元は、ＲＥＬＩＯＮ３．０で生成されたｄｅ−ｎｏｖｏ３Ｄ初期モデルを使用して確認した。
【００９７】
空のキャプシドの正しい掌性は、ＵＣＳＦキメラプロトコル「Ｆｉｔ  ｉｎ  Ｍａｐ」を使用して相関係数を測定することにより、ＳＶ４０結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＳＶＡ）への適合の質によって評価し、相関係数は、０．９５２であった（反対側の０．９０７とは対照的）。
【００９８】
共焦点顕微鏡アッセイ
ＶＬＰは、２００、４００、７５０のキャプシドタンパク質五量体／ＤＮＡモル比（蛍光標識された３０ｎｍのＤＮＡオリガミ構造−３．７５ｎＭ、１．９ｎＭ、０．９５ｎＭ；ＶＰ１五量体−７５０ｎＭ）を使用して調製した。次に、２５μＬのＶＬＰを３００μＬの無血清培地と混合し、２４枚のマルチウェルプレート内のＣＶ１細胞に１時間重ねた。次に、１ｍｌの血清含有培地をウェルに加えた。蛍光ＤＮＡの細胞内取り込みは、２４時間後に共焦点顕微鏡で視覚化した。
【００９９】
実施例１：ＤＮＡオリガミでのＳＶ４０  ＶＰ１のアセンブリ
粒子の調製には、近球の形態のオリガミ構造ＤＮＡを使用した。２５ｎｍ、３０ｎｍ、３５ｎｍ、および４０ｎｍ（図１Ａ〜Ｄの電子顕微鏡写真に示される）の示された直径のオリガミＤＮＡ構造は、ドイツのガルヒングにあるｔｉｌｉｂｉｔ  ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。さらに、Ｃｙ５蛍光タグで修飾された２５個のステープルを備えた３０ｎｍのＤＮＡオリガミ構造を使用した。すべてのＤＮＡオリガミ構造を粒子（ＶＬＰ）に組み込み、本明細書で説明される実験で使用した。
【０１００】
ＳＶ４０キャプシドタンパク質ＶＰ１の五量体で作製されたキャプシドユニットをオリガミ構造のカプセル化に使用した。ネガティブ染色ＴＥＭ、クライオ−ＥＭ、およびアガロースゲル分析用に、４００：１の五量体／オリガミ構造比（ペンタマー−４μＭ；オリガミ構造−１０ｎｍ）を使用してＶＬＰを調製した。
【０１０１】
実施例２：ウイルス様粒子の形成
ネガティブ染色透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用して、ＶＬＰの形成を確認した。ＶＬＰは、２％酢酸ウラニルでネガティブ染色し、画像化した。２５ｎｍのＤＮＡオリガミ構造上でのＶＰ１のアセンブリは、３６〜３８ｎｍの粒子の形成を引き起こす（図２Ａに示されるように）。直径３０ｎｍのＤＮＡオリガミ構造の周りのＶＰ１のアセンブリは、５０ｎｍの粒子の形成を引き起こす（図２Ｂに示されるように）。
【０１０２】
直径３５ｎｍの近球形のＤＮＡオリガミ構造の周りのＶＰ１のアセンブリは、５０ｎｍの粒子の形成を引き起こす（図２Ｃに示されるように）。
【０１０３】
直径４０ｎｍの近球形のＤＮＡオリガミ構造の周りのＶＰ１のアセンブリは、５６ｎｍの粒子の形成を引き起こす（図２Ｄに示されるように）。
【０１０４】
２５ｎｍおよび４０ｎｍのＤＮＡオリガミ構造の周りのＶＰ１のアセンブリによって得られた粒子は、非天然キャプシドサイズを有する全く新しい形態のＳＶ４０粒子を表し、それぞれＴ＝３または４およびＴ＝１２の形状を示唆している。これらの結果は、正二十面体キャプシド形状に特徴的な三角分割数であるＴが、オリガミ構造のサイズに対応するために調整され得ることを示唆している。したがって、結果は、異なるＤＮＡオリガミサイズに対応する際に多くの柔軟性があることを実証し、隣接する五量体間の結合角での柔軟性を示唆している。
【０１０５】
実施例３：３０ｎｍのほぼ球形のＤＮＡオリガミ構造上にアセンブリしたＳＶ４０様粒子のクライオ−ＥＭ
３０ｎｍの近球形のＤＮＡオリガミ上でＶＰ１アセンブリによって形成された８つの典型的な粒子のクライオ−ＥＭ  ２Ｄ顕微鏡写真を行った。得られた粒子は、サイズおよび形状の点でＳＶ４０と実質的に同一である。粒子は、円周上に特徴的なウイルススパイクを示すシェル（ＶＰ１五量体）およびコアで構成されている。図３Ａに示されるように、コアのうちのいくつかでは、オリガミ構造の折り畳まれたストランドが目に見える（ストライプとして見られる）。天然ウイルスとの類似性を実証するように、野生型ＳＶ４０（ＰＤＢエントリー１ＳＶＡ）の３Ｄモデルは、合成粒子に重ね合わせたとき、完全な整列を示す（図３Ｂ）。クライオ−ＥＭ顕微鏡写真の２Ｄ分類は、粒子を類似した粒子のクラスに分類し、各サブクラスは、平均して数百の粒子を表す。図３Ｃに示されるように、サブタイプはすべて、互いに非常に類似しており、ウイルスの特徴を示している。２Ｄクラスの平均化により、粒子のコアに密度の無秩序な「雲」が生じ、ＤＮＡオリガミ構造がキャプシドの形状に対してランダムに配向していることを示唆している。これは、３０ｎｍのＤＮＡオリガミ構造がＳＶ４０キャプシド空洞よりも小さいことを示唆し、キャプシド内のオリガミ構造にある程度の自由度を残す（以下の、ＤＮＡオリガミ構造の詳細がはっきりと観察される、より大きな３５ｎｍのオリガミ構造をカプセル化する粒子のクラス平均、ならびに図７と比較してもわかるように）。
【０１０６】
実施例４：核酸オリガミの細胞の中への送達
Ｃｙ５タグ付きの３０ｎｍのオリガミＤＮＡで調製した蛍光粒子は、ＣＶ１細胞に添加すると、有意な感染率を示した。結果を図４Ａ〜Ｂに示し、裸のオリガミＤＮＡが提供された細胞は、２４時間後にいかなる蛍光も示さなかった（図４Ａ）。しかしながら、感染後２４時間で見られるように、Ｃｙ５タグ付きのオリガミＤＮＡ上にアセンブリした蛍光粒子が細胞内に見られ、実際に、野生型ＳＶ４０の細胞内輸送経路の目的地のうちの１つであるゴルジで蓄積しているようである。蛍光粒子は、黒い矢印でマークされている（図４Ｂ）。
【０１０７】
したがって、結果は、ＤＮＡカプセル化粒子の効果的な認識および細胞内内在化を実証する。
【０１０８】
実施例５：３５ｎｍのほぼ球形のＤＮＡオリガミ構造上にアセンブリしたＴ＝７ｄの正十二面体ＳＶ４０様粒子のクライオ−ＥＭおよび３Ｄ復元
３５ｎｍの球形ＤＮＡオリガミ構造上にアセンブリしたＳＶ４０  ＶＰ１のクライオ−ＥＭ顕微鏡写真は、サイズ、球形、および特徴的なウイルス五量体が野生型ＳＶ４０に類似している５０ｎｍのウイルス様粒子の存在を示す（図５Ａ、上部パネル）。粒子の混合物は、明らかに、空のウイルス様粒子（ＶＬＰ）およびオリガミで満たされているウイルス様粒子の２つの集団で構成されていた。空の粒子および満たされた粒子の代表的な顕微鏡写真が拡大して示され（図５Ａ、挿入図、中央パネル）、ＤＮＡが左側の粒子のコア内でストライプとして明確に区別され、オリガミ構造の折り畳まれたストランドを表している。粒子の３Ｄモデルを復元するために、１６６６枚の顕微鏡写真から合計４８７７８個の個々の粒子を自動選択した（ＲＥＬＩＯＮ２．１）。粒子は、２Ｄ分類に供し、空のキャプシドクラス平均およびＤＮＡで満たされたキャプシドクラス平均の両方の存在が確認された。（図５Ａ、下部パネル）。
【０１０９】
空の粒子の３Ｄモデルの復元は、７．３Åの解像度でＴ＝７ｄの正二十面体キャプシドを生成する２６１１０個の粒子から計算した（図５Ｂ、正二十面体の三角分割数のＣａｓｐａｒおよびＫｌｕｇの計算法については以下を参照されたい）。
【０１１０】
ＤＮＡオリガミの非対称性により、オリガミで満たされた粒子の３Ｄ復元は、正二十面体対称性を課さずに行った。非対称ＤＮＡオリガミを含有する１９７８６個の粒子の３Ｄ復元は、初期モデルとして空のキャプシド構造を使用して計算し、図５Ｃに約２５Åの解像度で示される。空の粒子の解像度と比較して、構造の解像度が低いのは、おそらく対称性が課されていないためである。対称性の平均化がないにもかかわらず、復元されたオリガミで満たされた粒子のタンパク質シェルは、明らかに正二十面体である（図５Ｃの上部パネル、正二十面体の三角分割数の計算については以下を参照されたい）。シェルの内部には、ＤＮＡオリガミ格子の平行螺旋がはっきりと見える（図５Ｃ、中央パネル）。オリガミで満たされたキャプシドの３Ｄモデルの復元は、ｄｅ−ｎｏｖｏ３Ｄ初期モデルを使用して確認された。
【０１１１】
示されるように、粒子は、ウイルスタイリングのＣａｓｐａｒおよびＫｌｕｇの理論（Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｒ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ．１９６２；２７：１−２４）に従って、Ｔ＝７ｄの正十二面体対称性を明確に示す。最初に、正十二面体キャプシドは、５回、３回、２回の回転軸を持っている（図５Ｄを参照されたい）。正二十面体対称性を示すために、正二十面体は、シェル内の５価の五量体の中心にその頂点を揃えることにより、クライオ−ＥＭで復元されたオリガミで満たされたキャプシドの表面に手動で取り付けられた。５回、３回、２回の対称軸は、それぞれ五角形、三角形、ひし形でマークされる。
【０１１２】
次に、ＳＶ４０  Ｔ＝７ｄの正二十面体キャプシドは、１２個の５価の五量体（他の５つの五量体に囲まれたＶＰ１五量体）および６０個の６価の五量体（他の６つの五量体に囲まれたＶＰ１五量体）で構成される。図５Ｅに示されるように、５価の五量体は、五角形で示される。黒い矢印は、正二十面体の三角分割数（Ｔ）のＣａｓｐａｒおよびＫｌｕｇの計算法を示す。Ｔは、Ｔ＝ｈ＊＊２＋ｈｋ＋ｋ＊＊２の公式で与えられ、整数のすべてのペアに関して、ｈおよびｋは、正二十面体格子上で最も近くに位置付けられた５価の五量体に対する５価の五量体の位置を定義する。Ｔ＝７ｄ、ｈ＝２、およびｋ＝１の場合、ｈは、矢印１および２で表され、Ｋは、矢印１”で表される。ＤＮＡオリガミ上にアセンブリしたキャプシドにおける５価のＶＰ１五量体の局在は、明らかにＴ＝７ｄに対応する（解説は、図５Ｅを参照されたい）。
【０１１３】
したがって、全体として、結果は、オリガミ構造が粒子のタンパク質シェル内にカプセル化され、タンパク質シェルがＴ＝７ｄの正二十面体対称性の規則的なＳＶ４０格子を形成することを明確に示す。
【０１１４】
実施例６：ＤＮＡオリガミが全体としてカプセル化されることを示す、３５ｎｍのＤＮＡオリガミ上にアセンブリしたＳＶ４０様粒子のクライオ−ＥＭ３Ｄ復元の内部図。
３５ｎｍのＤＮＡオリガミ構造の概略図を、図６Ａに異なる観察角度で示す。ＤＮＡオリガミで満たされたキャプシドの３Ｄ復元の３Ｄ電子密度マップの対応する図を、ＤＮＡオリガミの概略設計の異なる図と並べて示す（図６Ｂ）。ＤＮＡオリガミのハニカム格子組織がはっきりと見え（図６Ｂ右上）、ハニカム格子の４５度の内向き傾斜（図６Ｂ左上）、および２つのハニカム平面を接続する縦軸に対して垂直（図６Ｂ右下）および水平（図６Ｂ左下）である軸を中心とした９０度の回転も見られる。復元された粒子の回転した図の各々は、ＤＮＡオリガミの概略設計のそれぞれの図によって予測された特性を正確に描写する。
【０１１５】
したがって、全体として、オリガミ構造のすべての構造的特性である「ハニカム」格子に配置された平行螺旋は、すべての可能な投影で、キャプシド内にはっきりと見え、ＤＮＡオリガミが粒子のタンパク質シェル内に完全にカプセル化されることを示している。
【０１１６】
さらに、図７Ａ〜Ｃに示される結果は、キャプシドが正面から除去された、示された断面図から明らかなように、３５ｎｍのＤＮＡオリガミ構造がキャプシドの形状に対してランダムに位置付けられていないことを実証し、キャプシド格子が回転しているため、正二十面体の３回（図７Ｂ）、２回（図７Ａ）、または５回（図７Ｃ）対称軸のいずれかが描かれている。いずれの場合も、ビューアーは、ＤＮＡオリガミの異なる小平面に面しているようである。例えば、ハニカム小平面は、正二十面体の３回軸からわずかに外れた（６．８°）軸に沿って表示され得る（図７Ａおよび７Ｂ）。
【０１１７】
実施例７：キャプシドタンパク質−核酸オリガミ構造複合体の検出
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）は、タンパク質−核酸複合体の形成の証拠を提供し、五量体−ＤＮＡオリガミの相互作用を観察するために使用する。
【０１１８】
ＥＭＳＡ実験では、３５ｎｍのＤＮＡオリガミ構造をＶＰ１五量体と、１つのＤＮＡオリガミ構造あたり４００個の五量体のモル比で混合した。アセンブリ生成物をアガロースゲルで分析して、移動を確認した。結果を図８に示す。遊離ＤＮＡオリガミは、４ｋｂのｄｓＤＮＡサイズマーカーで移動した。ＶＰ１タンパク質とインキュベートすると、遊離ＤＮＡオリガミバンドが消失し、代わりに移動が遅い、明瞭なバンドが現れた。より高い分子量の新しい明瞭なバンドの出現は、安定した明瞭なＶＰ１／ＤＮＡオリガミ複合体の形成を示唆する。
【０１１９】
実施例８：細胞内条件下でのＤＮＡオリガミの展開
ＤＮＡオリガミの折り畳みは、ＤＮＡポリメラーゼの酵素作用へのアクセス性の向上によって実証されるように、細胞内条件下で可逆的である（図９）。１５℃、２０ｍＭのＭｇ＋では、核酸オリガミ構造は、安定しており、ＤＮＡポリメラーゼの酵素作用にアクセスできない（レーン１、２、および４）。構造は、３７℃および１ｍＭのＭｇ＋で、細胞内条件下で不安定である。不安定な構造であるため、それは、ポリメラーゼによる増幅が可能である（レーン３および５）。
【０１２０】
実施例９：ＶＬＰ形成におけるＶＰ２およびＶＰ３の使用
ＶＰ２およびＶＰ３は、ＶＬＰを形成するときにＶＰ１と組み合わせる場合、ヌクレオチド転移の有効性を高める可能性のある二次キャプシドタンパク質である。大規模なＶＬＰ調製に十分な量のＶＰ２／３を生成するために、それらをＶＰ１と一緒にＳＦ９細胞で発現させる。ＶＰ１＋ＶＰ２およびＶＰ１＋ＶＰ３五量体は、ＶＰ１五量体の調製と同様の方法で抽出および精製する。ＶＰ１＋ＶＰ２五量体およびＶＰ１＋ＶＰ３五量体は、標準的な試験によって決定された特定の比率で混合され、ＶＬＰを含有するＤＮＡオリガミを生成する。次に、ＶＬＰを使用して、哺乳動物細胞に感染させ、ヌクレオチド転移の効率の向上を観察する。
【０１２１】
本発明は、その特定の実施形態と併せて説明されてきたが、多くの代替、修正、および変形が当業者に明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の主旨および広い範囲に含まれるすべてのそのような代替、修正、および変形を包含することが意図されている。
【図１Ａ】
2021522232.tif 000002
【図１Ｂ】
2021522232.tif 000003
【図１Ｃ】
2021522232.tif 000004
【図１Ｄ】
2021522232.tif 000005
【図２Ａ】
2021522232.tif 000006
【図２Ｂ】
2021522232.tif 000007
【図２Ｃ】
2021522232.tif 000008
【図２Ｄ】
2021522232.tif 000009
【図３Ａ】
2021522232.tif 000010
【図３Ｂ】
2021522232.tif 000011
【図３Ｃ】
2021522232.tif 000012
【図４Ａ】
2021522232.tif 000013
【図４Ｂ】
2021522232.tif 000014
【図５Ａ】
2021522232.tif 000015
【図５Ｂ】
2021522232.tif 000016
【図５Ｃ】
2021522232.tif 000017
【図５Ｄ】
2021522232.tif 000018
【図５Ｅ】
2021522232.tif 000019
【図６Ａ】
2021522232.tif 000020
【図６Ｂ】
2021522232.tif 000021
【図７Ａ−７Ｃ】
2021522232.tif 000022
【図８】
2021522232.tif 000023
【図９】
2021522232.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月19日(2019.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コアおよびシェルを含む粒子であって、前記コアが、前記シェルによってカプセル化された少なくとも１つの核酸オリガミ構造を含み、前記シェルが、少なくとも１２個のキャプシドユニットを含み、前記キャプシドユニットが、１つ以上のキャプシドタンパク質を含み、前記粒子が、準球形の形状を有する、粒子。
【請求項２】
前記粒子が、正二面体形状を有する、請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
前記粒子の直径が、１０〜２００ナノメートル（ｎｍ）である、請求項１または２に記載の粒子。
【請求項４】
前記キャプシドユニットが、少なくとも５つのキャプシドタンパク質を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項５】
前記キャプシドユニットの各々が、キャプシドタンパク質の五量体および／または六量体を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項６】
前記キャプシドタンパク質が、人工供給源のもの、または天然供給源からのものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項７】
前記キャプシドタンパク質が、ウイルスタンパク質または変性ウイルスタンパク質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項８】
前記ウイルスタンパク質が、ウイルスファミリーポリオーマウイルス科のウイルスからのものである、請求項７に記載の粒子。
【請求項９】
前記ウイルスタンパク質が、ＳＶ４０ウイルス、およびヒトポリオーマウイルスからなる群から選択されるウイルスからのものである、請求項７に記載の粒子。
【請求項１０】
前記ヒトポリオーマウイルスが、ＪＣウイルスおよびＢＫウイルスから選択される、請求項９に記載の粒子。
【請求項１１】
前記キャプシドタンパク質が、ＳＶ４０ウイルスキャプシドタンパク質である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項１２】
前記キャプシドタンパク質が、キャプシドタンパク質ＶＰ１、キャプシドタンパク質ＶＰ２、キャプシドタンパク質ＶＰ３、それらの変性形態、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項１３】
前記キャプシドタンパク質が、ＶＰ１、またはその変性形態である、請求項１〜１２のいずれかに記載の粒子。
【請求項１４】
前記オリガミ構造が、少なくとも７２個のキャプシドユニットによってカプセル化される、請求項１〜１３のいずれかに記載の粒子。
【請求項１５】
前記キャプシドユニットが、５つのＶＰ１分子、５つのＶＰ１分子および１つのＶＰ２分子、５つのＶＰ１分子および１つのＶＰ３分子、ならびに５ＶＰ１分子および１つのＶＰ２分子または１つのＶＰ３分子からなる群から選択されるウイルスタンパク質分子またはそれらの変性形態の組み合わせを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項１６】
前記オリガミ構造が、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、修飾核酸、合成核酸、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項１７】
核酸分子を標的細胞の中に送達する際に使用するための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項１８】
前記標的細胞が、インビトロ細胞、または組織もしくは生物に収容された細胞から選択される、請求項１７に記載の粒子。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の複数の粒子を含む組成物。
【国際調査報告】
2021522232.tif 000025