(57)【要約】種々の疾患状態に関連する、脂肪色素からの自家蛍光シグナルを測定するためのシステムおよび方法が開示される。この方法は、疾患状態にあるときに前記脂肪色素を含む組織を励起光源に曝露することを含みうる。脂肪色素は、７００ｎｍと１２００ｎｍの間の波長に、自家蛍光スペクトルの少なくとも一部を有しうる。上記方法は、７００ｎｍと１２００ｎｍの間の１またはそれを超える波長で、組織をイメージングすることも含みうる。上記疾患状態は、非アルコール性脂肪肝疾患および／またはリソソーム蓄積症の少なくとも１つを含みうる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患状態にあるときに脂肪色素を含む組織を励起光源に曝露することであって、ここで前記脂肪色素は、７００ｎｍと１２００ｎｍの間の波長に、自家蛍光スペクトルの少なくとも一部を有すること；および
７００ｎｍと１２００ｎｍの間の１またはそれを超える波長で、組織をイメージングすること
を含む、方法。
【請求項２】
前記励起光源が、波長４００ｎｍと８５０ｎｍの間の１またはそれを超える波長の励起光を放射する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記励起光源が、６００ｎｍと８５０ｎｍの間の１またはそれを超える波長の励起光を放射する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記組織をイメージングすることが、８５０ｎｍと９００ｎｍの間の１またはそれを超える波長で、前記組織をイメージングすることを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
クエンチャーを前記脂肪色素に付与することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記クエンチャーが、イメージングされた前記自家蛍光スペクトルの波長よりも短い波長における、前記脂肪色素の自家蛍光強度を減少させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記クエンチャーが、４００ｎｍと８００ｎｍの間の波長において、前記脂肪色素の自家蛍光強度を減少させる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記クエンチャーが、ズダンブラックＢを含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記励起光源が、前記イメージングされた自家蛍光の波長よりも長い１またはそれを超える波長の励起光を放射する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記励起光源が、１０００ｎｍと２０００ｎｍの間の１またはそれを超える波長の励起光を放射する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記脂肪色素が、リポフスチン、セロイド、および／またはリポフスチン様脂肪色素である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出された自家蛍光強度の少なくとも一部を強度閾値と比較して、前記組織が前記疾患状態にあるかどうかを決定することをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記強度閾値が、臨床的に正常な組織のベースライン自家蛍光強度である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記強度閾値が、評価した組織の事前に取得した自家蛍光強度である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
患者についての進行状態を決定することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記疾患状態が、非アルコール性脂肪肝疾患および／またはリソソーム蓄積症の疾患状態である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記イメージングした組織に関連するシグナルをディスプレイに出力することをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記イメージングした組織に関連するシグナルをコンピューティングデバイスに出力することをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
シリコン検出器を使用して、前記組織をイメージングすることをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ヒ化インジウムガリウム検出器、ゲルマニウム検出器、またはテルル化カドミウム水銀検出器を使用して、前記組織をイメージングすることをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記イメージングした組織を用いて１またはそれを超える自家蛍光パラメータを識別すること；および前記１またはそれを超える自家蛍光パラメータを非一時的なコンピュータ可読媒体に保存して、前記疾患状態の前記進行および／または退行を経時的にモニタすることをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
疾患状態にあるときに脂肪色素を含む組織を励起光源に曝露すること、ここで前記脂肪色素は、７００ｎｍと２０００ｎｍの間の波長に、自家蛍光スペクトルの少なくとも一部を有し、前記疾患状態は、非アルコール性脂肪肝疾患および／またはリソソーム蓄積症の少なくとも１つの疾患状態であること；
７００ｎｍと２０００ｎｍの間の１またはそれを超える波長で、前記組織をイメージングすること；および
前記イメージングした組織を強度閾値と比較して、前記組織が非アルコール性脂肪肝疾患および／またはリソソーム蓄積症の前記疾患状態にあるかどうかを決定すること
を含む、方法。
【請求項２３】
前記強度閾値が、臨床的に正常な組織のベースライン自家蛍光強度である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記強度閾値が、評価した組織の事前に取得した自家蛍光強度である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記脂肪色素が、７００ｎｍと１２００ｎｍの間の波長に、自家蛍光スペクトルの少なくとも一部を有する、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記組織をイメージングすることが、８５０ｎｍと９００ｎｍの間の１またはそれを超える波長で、前記組織をイメージングすることを含む、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
クエンチャーを前記脂肪色素に付与することをさらに含む、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記クエンチャーが、イメージングされた前記自家蛍光スペクトルの波長よりも短い波長における、前記脂肪色素の自家蛍光強度を減少させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記クエンチャーが、４００と８００ｎｍの間の波長において、前記脂肪色素の自家蛍光強度を減少させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記クエンチャーが、ズダンブラックＢを含む、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記励起光源が、４００ｎｍと８５０ｎｍの間の１またはそれを超える波長の励起光を放射する請求項２２〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記励起光源が、６００ｎｍと８５０ｎｍの間の１またはそれを超える波長の励起光を放射する、請求項２２〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記励起光源が、イメージングされた前記自家蛍光の波長よりも長い１またはそれを超える波長の励起光を放射する、請求項２２〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記励起光源が、１０００ｎｍと２０００ｎｍの間の１またはそれを超える波長の励起光を放射する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記脂肪色素が、リポフスチン、セロイド、および／またはリポフスチン様脂肪色素である、請求項２２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記イメージングした組織に関連するシグナルをディスプレイに出力することをさらに含む、請求項２２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記イメージングした組織に関連するシグナルをコンピューティングデバイスに出力することをさらに含む、請求項２２〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
シリコン検出器を使用して、前記組織をイメージングすることをさらに含む、請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
ＩｎＧａＡｓ検出器、ゲルマニウム検出器、またはＭＣＴ検出器を使用して、前記組織をイメージングすることをさらに含む、請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
患者についての進行状態を決定することをさらに含む、請求項２２〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記進行状態が、前記イメージングした組織の前記自家蛍光スペクトルの少なくとも一部と、前記強度閾値との間の違いに基づく、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記イメージングした組織を用いて１またはそれを超える自家蛍光パラメータを識別すること；および前記１またはそれを超える自家蛍光パラメータを非一時的なコンピュータ可読媒体に保存して、前記疾患状態の前記進行および／または退行を経時的にモニタすることをさらに含む、請求項２１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
４００ｎｍと８５０ｎｍの間の１またはそれを超える波長の励起光を放射する励起光源；
検出器でイメージングしようとする組織の脂肪色素から発せられる、７００ｎｍと１２００ｎｍの間またはそれと等しい波長の自家蛍光シグナルを検出するように構成されている検出器；および
前記検出器からの前記検出された自家蛍光シグナルを受信するコンピューティングデバイスであって、リアルタイムでイメージングされる組織の疾患状態を連続的に決定するように構成されているコンピューティングデバイス、
を含む、医療用イメージングデバイス。
【請求項４４】
前記励起光源が、６００ｎｍと８５０ｎｍの間の１またはそれを超える波長の励起光を放射する、請求項４３に記載の医療用イメージングデバイス。
【請求項４５】
前記検出器が、８５０ｎｍと９００ｎｍの間の１またはそれを超える波長の自家蛍光シグナルを検出する、請求項４３〜４４のいずれか１項に記載の医療用イメージングデバイス。
【請求項４６】
前記コンピューティングデバイスが、前記検出された自家蛍光シグナルを強度閾値と比較して、前記疾患状態を決定する、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の医療用イメージングデバイス。
【請求項４７】
前記強度閾値が、前記医療用イメージングデバイスのメモリに保存された、事前に取得した対象の自家蛍光強度である、請求項４６に記載の医療用イメージングデバイス。
【請求項４８】
前記コンピューティングデバイスが、前記検出された自家蛍光シグナルを周囲組織の強度と比較して、前記疾患状態を決定するように構成されている、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の医療用イメージングデバイス。
【請求項４９】
前記コンピューティングデバイスが、前記疾患状態の進行状態を決定するように構成されている、請求項４３〜４８のいずれか１項に記載の医療用イメージングデバイス。
【請求項５０】
前記コンピューティングデバイスが、前記検出された自家蛍光シグナルの強度および／または範囲に、少なくとも部分的に、基づいて、前記進行状態を決定するように構成されている、請求項４９に記載の医療用イメージングデバイス。
【請求項５１】
前記コンピューティングデバイスが、前記決定された疾患状態、進行状態、および検出された自家蛍光シグナルをディスプレイに出力するように構成されている、請求項４９に記載の医療用イメージングデバイス。
【請求項５２】
前記医療用イメージングデバイスが、介在組織を通して解剖学的構造をイメージングするように構成されている、請求項４３〜５１のいずれか１項に記載の医療用イメージングデバイス。
【請求項５３】
前記医療用イメージングデバイスが、内視鏡、ファイバースコープ、カテーテル、腹腔鏡装置、および直視下手術イメージング装置の少なくとも１つである、請求項４３〜５２のいずれか１項に記載の医療用イメージングデバイス。
【請求項５４】
前記コンピューティングデバイスが、前記検出された自家蛍光シグナルを用いて１またはそれを超える自家蛍光パラメータを識別し；かつ前記１またはそれを超える自家蛍光パラメータを非一時的なコンピュータ可読媒体に保存して、前記疾患状態の前記進行および／または退行を経時的にモニタするように構成されている、請求項４３〜５３のいずれか１項に記載の医療用イメージングデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づいて、２０１８年４月９日出願の米国仮出願第６２／６５４，６６５号の利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
蓄積脂肪色素に関連する疾患状態を検出するためのシステムおよび方法が開示される。
【背景技術】
【０００３】
背景
現在のｉｎ  ｖｉｖｏイメージングテクノロジーは、高解像度、望ましい透過深さ、および感受性を同時に提供することができず、このことが疾患識別のための幅広い採用の妨げとなっている。例えば、高解像度で高感度のイメージングは、１細胞の可視光イメージング技術にそのまま利用できる。しかしながら、動物全体やその組織をイメージングする場合には、表面下組織の特徴に関する解像度および感受性は、周囲組織による光の散乱および吸収によって、著しく低下する。従来型ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングテクノロジーの別の主要な制約は、種々の状態を検出するために使用される蛍光発光波長として用いられるのと同じ波長における、組織の強いバックグラウンド自家蛍光である。この自家蛍光発光波長の重なりは、疾患検出を妨げうる。このような１つの例において、可視および近赤外線波長による伝統的な蛍光イメージングは、正常な細胞および組織に起因するバックグラウンド自家蛍光シグナルに対する低いコントラストの影響を受ける。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
要旨
いくつかの実施形態において、近赤外線（ＮＩＲ、ｎｅａｒ  ｉｎｆｒａｒｅｄ）および短波長赤外線（ＳＷＩＲ、ｓｈｏｒｔｗａｖｅ  ｉｎｆｒａｒｅｄ）スペクトル領域における自家蛍光によるイメージングに関連する方法およびシステムが開示される。
【０００５】
ある特定の実施形態において、方法は、疾患状態にあるときに前記脂肪色素を含む組織を励起光源に曝露することを含む。脂肪色素は、７００ｎｍと１２００ｎｍの間の波長に、自家蛍光スペクトルの少なくとも一部を有していてもよい。前記方法は、７００ｎｍと１２００ｎｍの間の１またはそれを超える波長で、組織をイメージングすることも含んでいてもよい。
【０００６】
ある特定の実施形態によれば、方法は、疾患状態にあるときに脂肪色素を含む組織を励起光源に曝露することを含む。前記脂肪色素は、７００ｎｍと２０００ｎｍの間の波長に自家蛍光スペクトルの少なくとも一部を有していてもよい。さらに、前記疾患状態は、非アルコール性脂肪肝疾患および／またはリソソーム蓄積症の少なくとも１つを含んでいてもよい。前記方法は、また、波長７００ｎｍと２０００ｎｍの間の１またはそれを超える波長で、組織をイメージングすること、およびイメージングした組織を強度閾値と比較して、組織が非アルコール性脂肪肝疾患および／またはリソソーム蓄積症の疾患状態であるかどうかを決定することを含んでいてもよい。
【０００７】
ある特定の実施形態において、医療用イメージングデバイスは、４００ｎｍと８５０ｎｍの間の１またはそれを超える波長の励起光を放射する励起光源と、検出器でイメージングしようとする組織の脂肪色素から放射される、７００ｎｍと１２００ｎｍの間またはそれと等しい波長の自家蛍光シグナルを検出するように構成されている検出器と、前記検出器からの検出された自家蛍光シグナルを受信するコンピューティングデバイスとを含んでいてもよい。前記コンピューティングデバイスは、リアルタイムでイメージングされる組織の疾患状態を連続的に決定するように構成されていてもよい。
【０００８】
上記の概念、および以下で議論するその他の概念は、本開示はこの点で限定されないので、任意の適切な組み合わせに構成してもよいことを理解すべきである。さらに、以下に示す種々の非限定的な実施形態を添付の図面と共に考慮することで、本開示の他の利点および新たな特徴が明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
添付の図面は、一定の尺度で描写することを意図していない。これらの図面において、種々の図に描かれた同一またはほぼ同一の各要素は、同様の数字で示されていることがある。明確にする目的で、全ての図において、全ての要素に名前が付されていないことがある。
【００１０】
【図１】図１Ａは、いくつかの実施形態による、励起波長と、対応する発光波長のグラフである。図１Ｂは、いくつかの実施形態における、多光子励起光源の励起波長と、対応する発光波長のグラフである。
【００１１】
【図２】図２は、一実施形態における、励起ユニット、伝達ユニット、および対応する検出ユニットの概略説明図である。
【００１２】
【図３】図３は、一実施形態における、励起ユニット、伝達ユニット、および対応する検出ユニットの概略説明図である。
【００１３】
【図４】図４は、疾患の進行および／または退行を経時的に追跡するための方法の例示的なフローチャートである。
【００１４】
【図５】図５Ａは、非アルコール性脂肪肝疾患マウスモデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで検出された、肝臓および泌尿生殖器の解剖所見の近赤外線／短波長赤外線自家発光イメージである。図５Ｂは、図５Ａに示されたマウスモデルにおける、切除した肝組織の近赤外線／短波長赤外線自家発光イメージである。図５Ｃは、肝硬変マウスモデルに由来する肝組織中の細胞の近赤外線／短波長赤外線自家発光イメージである。
【００１５】
【図６】図６Ａは、Ｃｙ５励起および発光チャンネルを用いた、ズダンブラックＢ染色していない肝硬変肝組織の自家発光イメージである。図６Ｂは、近赤外線／短波長赤外線チャンネルを用いた、図６Ａに示した、ズダンブラックＢ染色をしていない肝硬変肝組織の自家発光イメージである。
【００１６】
【図７】図７Ａは、Ｃｙ５チャンネルを用いた、ズダンブラックＢ染色した肝硬変肝組織の自家発光イメージである。図７Ｂは、近赤外線／短波長赤外線チャンネルを用いた、図７Ａに示した、ズダンブラックＢ染色した肝硬変肝組織の自家発光イメージである。
【００１７】
【図８】図８は、顕微鏡用フィルタキューブセッティング用の、例示的な励起および発光波長の図である。
【００１８】
【図９】図９は、ズダンブラックＢの吸収スペクトルである。
【００１９】
【図１０】図１０Ａは、肝硬変のマウスモデルに由来する、ズダンブラックＢで染色した肝硬変肝組織（パラホルムアルデヒド固定およびパラフィン包埋）を可視光で照明および検出したイメージであり、リポフスチン／セロイドのエリアが黒で示されている。図１０Ｂは、図１０Ａに示したものと同一の組織切片の、リポフスチン／セロイドに関連するズダンブラックＢ陽性エリアのＮＩＲ／ＳＷＩＲ自家蛍光を示すイメージである。
【００２０】
【図１１】図１１Ａは、コントロール食（ＣＤ）を１２週間摂食させた（これは非アルコール性脂肪肝疾患を誘発しない）マウスモデルの自家発光イメージである。図１１Ｂは、コリン欠乏Ｌ−アミノ酸制限高脂肪食（ＣＤＡＨＦＤ）を１２週間摂食させて非アルコール性脂肪肝疾患を誘発させたマウスモデルの自家発光イメージである。
【００２１】
【図１２】図１２は、それぞれＣＤ、ＣＤＡＨＦＤを、それぞれ３週間、６週間、９週間、および１２週間与えたマウスモデルの、ｅｘ  ｖｉｖｏイメージングした肝臓の代表的なイメージである。
【００２２】
【図１３】図１３Ａは、示された期間にわたりＣＤを与えたマウスのｅｘ  ｖｉｖｏ肝における近赤外線／短波長赤外線自家蛍光の定量（カウント毎ミリ秒で示す）を、ＣＤＡＨＦＤを与えたマウスと比較したグラフである。図１３Ｂは、各時点において、ｅｘ  ｖｉｖｏ肝における強度を、コントロールの平均信号強度に対する、パーセントで表した増加量で数値化したグラフである。
【００２３】
【図１４】図１４は、げっ歯動物肝（ＣＣｌ４／ＯＯ）におけるＣＣｌ４誘発性線維症の非侵襲性ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング中に測定した自家蛍光強度を、オリーブオイル（ＯＯ）のみのコントロールおよび無処置コントロールと比較したグラフである。
【００２４】
【図１５】図１５は、げっ歯動物肝におけるＣＣｌ４誘発性線維症のｅｘ  ｖｉｖｏイメージング中に測定した自家蛍光強度のグラフである。
【００２５】
【図１６】図１６は、総胆管結紮（ＣＢＤＬ、Ｃｏｍｍｏｎ  Ｂｉｌｅ  Ｄｕｃｔ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ）の４週間後の、未処置の健常マウス（ＳＣ）と線維症マウスの非侵襲的ｉｎ  ｖｉｖｏ肝臓自家蛍光強度を比較したグラフである。
【００２６】
【図１７】図１７は、総胆管結紮（ＣＢＤＬ）の４週間後の、未処置の健常マウス（ＳＣ）と線維症マウスのｅｘ  ｖｉｖｏ肝自家蛍光強度を比較したグラフである。
【００２７】
【図１８】図１８は、自家蛍光顕微鏡法を用いて、コントロールマウスおよびＣＣｌ４処置マウス由来の肝組織切片中に認められた、自家蛍光が測定された範囲（パーセント範囲）のグラフである。
【００２８】
【図１９】図１９Ａは、ＣＣｌ４誘発性線維症マウス由来の、Ｆ４／８０染色した肝組織の５μｍ切片の、明視野自家発光イメージの複合画像である。図１９Ｂは、ＣＣｌ４誘発性線維症マウス由来の、ズダンブラックＢ染色した肝組織の５μｍ切片の、明視野自家発光イメージの複合画像である。図１９Ｃは、ＣＣｌ４誘発性線維症マウス由来の、ナイルブルー硫酸塩で染色した肝組織の５μｍ切片の、明視野自家発光イメージの複合画像である。図１９Ｄは、ＣＣｌ４誘発性線維症マウス由来の、ＰＡＳ−Ｄ染色した肝組織の５μｍ切片の、明視野自家発光イメージの複合画像である。図１９Ｅは、コントロールマウス由来の、ＰＡＳ−Ｄ染色した肝組織の５μｍ切片の、明視野自家発光イメージの複合画像である。
【００２９】
【図２０】図２０は、ＣＣｌ４誘発性線維症の退行のイメージングに用いられる処置方法および試験方法の概略図である。
【００３０】
【図２１】図２１は、ＣＣｌ４誘発性線維症の退行後の、非侵襲的にｉｎ  ｖｉｖｏで測定した自家蛍光強度を、健常組織と、線維症組織と、線維症組織とで比較したグラフである。
【００３１】
【図２２】図２２は、ＣＣｌ４誘発性線維症の退行後の、ｅｘ  ｖｉｖｏで測定した自家蛍光強度を、健常組織と、線維症組織と、線維症組織とで比較したグラフである。
【００３２】
【図２３】図２３は、ＣＣｌ４誘発性線維症の退行後の、健常組織、線維症組織、および線維症組織由来の肝組織片において、自家蛍光が測定された範囲をパーセントで比較したグラフである
【００３３】
【図２４】図２４は、ムコリピドーシスＩＶ型のホモ接合型Ｍｃｏｌｎ１ノックアウトマウスモデルのｉｎ  ｖｉｖｏとｅｘ  ｖｉｖｏで測定した自家蛍光シグナルを、種々の組織においてコントロールと比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
詳細な説明
発明者らは、近赤外線（ＮＩＲ、ｎｅａｒ  ｉｎｆｒａｒｅｄ）および短波長赤外線（ＳＷＩＲ、ｓｈｏｒｔｗａｖｅ  ｉｎｆｒａｒｅｄ）スペクトル領域における自家蛍光によるイメージングに関連する、種々の疾患状態のコントラストおよび検出を改善する上でのメリットを認識した。具体的には、理論に拘束されることを望むものではないが、ＮＩＲ／ＳＷＩＲスペクトルのイメージング波長が長くなると光散乱プロセス抑制されうるため、このようなＮＩＲ／ＳＷＩＲスペクトルの範囲内において、物質（例えば、組織）を透過してイメージを映し出す光の透過率が最大化されうる。さらに、可視光領域とは異なり、ＮＩＲ／ＳＷＩＲ領域（ｒｅｇｉｍｅ）に含まれる健常組織からのバックグラウンド自家蛍光は（特に皮膚や筋肉において）非常に少ない。このように、バックグラウンド自家蛍光シグナルが抑制されているため、対応する疾患組織からの自家蛍光シグナルとのコントラストが改善されうる。
【００３５】
上記に加え、発明者らは、観察した種々の疾患組織から検出した自家蛍光シグナルが、蓄積した脂肪色素からの自家蛍光に由来している可能性を認識した。特に、発明者らは、ＮＩＲ／ＳＷＩＲ波長領域において、脂肪色素（例えば、リポフスチン、セロイド、またはリポフスチン様脂肪色素などの非分解性の酸化細胞内物質）からの自家蛍光シグナルを観察した。これらの脂肪色素は、詳細は後述するが、特定の疾患状態に関連しうる。上記の点に鑑み、発明者らは、これらの脂肪色素の蓄積および／または存在に関連する疾患状態を正確に検出するための、自家蛍光イメージング方法およびシステムの最適化が可能であることを見出した。よって、本明細書で開示されるシステムおよび方法は、病的な生物学的構造と非病的な生物学的構造とを容易に識別する能力を改善しうる。
【００３６】
理論に拘束されることを望むものではないが、オートファジーが亢進すると、組織中に脂肪色素（例えば、リポフスチン、セロイド、および／またはリポフスチン様脂肪色素などの酸化細胞内物質）が蓄積しうる。例えば、いくつかのケースでは、リソソームに運ばれた基質（例えば、分子、オルガネラなど）が増加した結果として脂肪色素の蓄積が起こり、リソソームは運ばれてくる基質の増加に耐えられず、結果として、正常な場合には部分的に分解されうる物質の酸化および／または架橋が増加する（例えば、リポフスチン、セロイド、および／またはリポフスチン様脂肪色素の増加）。その結果、いくつかのケースでは、オートファジーの増加およびこれに関連するリポフスチン、セロイド、および／またはリポフスチン様脂肪色素の増加が、細胞ストレスの増加、エネルギー産生の低下、そして最終的に、細胞死を引き起こす。これらの脂肪色素の自家蛍光が強まるため、脂肪色素量の変化と密接な関係にある疾患状態が、後述するように、それに対応する検出された自家蛍光シグナルの変化によって検出されうる。例えば、酸化ストレスの結果として、病理学的状態に対する応答として、または有毒な化合物の存在に応答して、中枢神経系または肝組織中へのリポフスチン、セロイド、および／またはリポフスチン様脂肪色素などの細胞内酸化物質の蓄積が見られうる。リポフスチン、セロイド、および／またはリポフスチン様脂肪色素は、ハンチントン病、パーキンソン病、およびアルツハイマー病を含む神経変性疾患につながることがある、細胞内分解経路とも関連しうる。以下にさらに詳述するように、神経変性疾患の神経セロイドリポフスチン症ファミリーと同様に、脂肪色素の蓄積は、先天性代謝異常であるリソソーム蓄積症とも関連しうる。
【００３７】
上記の点に鑑み、本明細書に記載されたシステムおよび方法には、疾患状態にあるときに脂肪色素量の増加を示す組織の自家蛍光イメージングが含まれる。したがって、自家蛍光シグナルを示す脂肪色素のために、検出される自家蛍光強度の変化は、関連する疾患状態に相関しうる。さらに、ある特定の実施形態によれば、脂肪色素は、脂肪色素に起因する（例えば、組織における）関連する疾患状態の累積量に相関する自家蛍光シグナルを示しうる。例えば、組織に存在する脂肪色素の量は、組織における関連する疾患状態の重篤度および／または程度と直接相関しうる。
【００３８】
ある特定の実施形態において、本明細書で論じられる脂肪色素は、概して、一般的な切れ目のない膜に囲まれた、自家蛍光色素および脂質成分からなる顆粒として理解されうる。いくつかのケースでは、脂肪色素は、酸化細胞内物質としても知られる脂質酸化産物でありうる。いくつかのケースでは、脂肪色素は、細胞内経路マクロオートファジーの破綻、ならびに膜損傷、ミトコンドリア損傷、またはリソソーム損傷の前兆でありうる。いくつかの実施形態によれば、脂肪色素は、タンパク質残基および／または脂質を含みうる。
【００３９】
いくつかの実施形態によれば、脂肪色素という用語は、リポフスチン、セロイド、および／またはリポフスチン様脂肪色素などの相対的に非分解性の酸化細胞内物質を指してもよい。リポフスチンは、長い間老化の研究に関係するものであったため、いくつかのケースでは、「加齢性色素」および／または「消耗性色素」と呼ばれることがある。リポフスチンは、退行性変化している有糸分裂後細胞（例えば、ニューロン、心筋細胞、肝臓，および網膜色素上皮細胞）中に見いだされうる。セロイドは、一般に、老化ではなく、むしろ疾患と関連しているリポフスチン様色素という広いカテゴリーに相当するものと理解されうる。セロイドは、種々の細胞、例えば、これらに限定されないが、脳、肝臓，膵臓、精巣、精嚢、および前立腺の細胞中に見いだされうる。セロイドの存在は、種々の病理学的状態、例えば、これらに限定されないが、腫瘍（例えば、前立腺腺癌、および／または口蓋の癌腫）、アテローム性動脈硬化、栄養失調、毒性傷害、および網膜変性における診断パラメータとして利用されうる。
【００４０】
当業者が一般に理解するように、本明細書で用いられる場合、脂肪色素、リポフスチン、セロイド、および／または他の類似の用語は、場合により、互換的に用いられうる。例えば、これらの用語は、生理化学的および組織化学的性質が類似する同じ細胞物質を指すために、しばしば互換的に用いられる。しかしながら、根底にある病因・病態生理学的メカニズムに基づいて、セロイドをリポフスチンと区別する場合がある。
【００４１】
上記の点に鑑み、脂肪色素（例えば、セロイドおよび／またはリポフスチン）量の増加および／または変化に関連しうる疾患状態は、それに対応して増加および／または変化する自家蛍光シグナル強度に基づいて検出されうる。検出されうる適切な疾患状態としては、これらに限定されないが、癌性または癌関連組織；肝硬変組織；線維症瘢痕組織；放射線処置組織；炎症組織；老化（例えば、生理学的に老化した組織または病態生理学的に老化した組織）；ストレスを受けた組織；血管または組織のアテローム硬化病変およびプラーク；神経変性疾患患部組織、例えばアルツハイマー病、アルツハイマープラーク、パーキンソン病；血管造影（例えば、眼の血管造影、および以下の識別の適用、すなわち急性後部多発性小板状色素上皮症、浸出型加齢性黄斑変性症、網膜色素上皮の出血性剥離、網膜出血、網膜新生血管、網膜色素上皮の漿液性剥離、ベーチェット病（ベーチェット症候群）、脈絡膜メラノーシスなどにおける血管造影）；重症虚血肢、糖尿病黄斑浮腫、ドルーゼン分離、黄斑分離、傍矢状髄膜腫、内頸静脈における術後血栓症の予測、腹壁ヘルニア修復における創傷合併症の予測、サイコイドーシス、強膜炎および後部強膜炎、センチネルリンパ節マッピング、脊髄硬膜動静脈瘻、フォークト・小柳・原田病、ならびに他の適切な血管造影を使用する機会；（例えば肝毒性の結果として起こる）壊死性炎症に起因する肝線維症または肝硬変；ならびに、関心のある他の適用可能な疾患組織状態、異常組織状態、または他の組織状態、があげられる。
【００４２】
上記の疾患状態の他、ここに開示されるシステムおよび方法は、１またはそれを超える以下の疾患状態を検出するために使用しうる。例えば、脂肪色素の自家蛍光は、非アルコール性脂肪肝疾患を検出するために使用しうる。脂肪色素の蓄積は、リソソーム蓄積症およびリソソーム関連オルガネラ（これらは先天性代謝異常（例えば、チェディアック・東症候群、ヘルマンスキー・パドラック症候群、グリッセリ症候群、およびウィスコット・アルドリッチ症候）である）と関連しうる。ある特定の実施形態において、脂肪色素の蓄積は、神経変性疾患の神経セロイドリポフスチン症ファミリー（例えば、バッテン病）と関連しうる。他の疾患状態としては、スフィンゴリピドージス、ティ・サックス病、ニーマン・ピック病、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症（例えば、サンフィリポ症候群）、早老症（ハッチンソン・ギルフォード病としても知られている）、ウイルス性肝炎、肝臓の壊死性炎症性疾患、栄養失調、特定の栄養の欠乏症（例えば、コリン欠乏症、ビタミンＥ欠乏症、ビタミンＤ欠乏症）があげられる。脂肪色素と関連しうる、ある特定の疾患状態としては、リソソーム酵素の阻害剤、ホルモン投与、薬物誘発性副作用、および／または長期間のアルコール摂取による毒性があげられる。いくつかのケースでは、脂肪色素の蓄積は、アテローム性動脈硬化（例えば、プラークを生じさせる脳卒中および／または脳梗塞）、酸化ストレス（例えば、高酸素症、低酸素症）、筋ジストロフィー（例えば、酸化ストレスによるデュシェンヌ型筋ジストロフィー）、脳の出血または脳梗塞部位、および／または（例えば、１２／１５−リポキシゲナーゼノックアウトモデルに見られる）亢進したオートファジーに関連する疾患、などの疾患状態と関連しうる。
【００４３】
ＮＩＲ／ＳＷＩＲ自家蛍光ベースの技術を用いて脂肪色素の存在を検出する方法は、組織（例えば、動物モデルの祖岸）の疾患状態に関する情報をリアルタイムに取得できるため、魅力的でありうる。検出されるシグナルは、組織にもともと備わっている特性であるため、自家蛍光技術はサンプル処理も必要としない。よって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法は、リアルタイム生細胞分析のための非破壊的な技術として実行してもよく、また、サンプルの摘出を必要としないｉｎ  ｖｉｖｏで実施することもできる。したがって、本方法およびシステムは、ヒト患者および／または動物モデルを含むあらゆる適切な対象のイメージングのために使用しうる。これらの方法は、どのような疾患状態が、脂肪色素（脂肪色素には、リポフスチン、セロイド、および／または他の類似のリポフスチン様色素などの酸化細胞内物質が含まれうる）の存在に由来する自家蛍光を用いて検出しうるかについてのよりよい理解、ならびに改善された手術のシステムおよび方法をもたらしうる。さらに、本明細書に記載された方法およびシステムは、異常または罹患した組織と、健常な組織とを識別するために使用できる。よって、本明細書に記載されたシステムおよび方法は、疾患メカニズムの研究を加速し、および／または診断もしくは予後の医療技術およびツールとして役立ちうる。なお、サンプルを摘出することなく疾患状態を検出するための方法が説明されているが、本開示は上記したものに限定されず、外科手術手順が行われている間に、および／または切除した組織に対してイメージングが行われる実施形態もまた意図されていることは言うまでもない。
【００４４】
上述のように、いくつかの実施形態において、イメージングされている脂肪色素は、少なくとも部分的にはＮＩＲ／ＳＷＩＲスペクトルの外側にあるピーク自家蛍光および吸収スペクトルを示しうる。しかしながら、これらの脂肪色素の自家蛍光スペクトルは、少なくとも部分的にはＮＩＲ／ＳＷＩＲスペクトル内まで伸びる裾を含みうる。このような実施形態において、対応するイメージングまたは診断デバイスは、脂肪色素の吸収スペクトルの範囲内かつＮＩＲ／ＳＷＩＲスペクトルの外側の電磁放射線を放射する励起光源を含んでいてもよい。このデバイスは、ＮＩＲ／ＳＷＩＲスペクトル内に位置するスペクトルの範囲内の、蛍光コンポーネントから放射される蛍光を検出する検出器も含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、可視スペクトルの範囲内で励起し、ＮＩＲ／ＳＷＩＲスペクトル内で検出することが可能である。いくつかのケースでは、ＮＩＲスペクトルの範囲内で励起し、ＮＩＲ／ＳＷＩＲスペクトル内で検出することが可能である。
【００４５】
別の実施形態において、発明者らは、ＮＩＲ／ＳＷＩＲスペクトルなどの特定のスペクトル内で脂肪色素をイメージングすることで、周囲組織に関係する他の自家蛍光シグナルを減少させ、および／または実質的に除去しうることを認識した。よって、脂肪色素の自家蛍光スペクトルの強度と対応する周囲組織の自家蛍光の強度の比は、自家蛍光スペクトルの裾部分において、脂肪色素の蛍光発光波長のピークにおける比を上回りうる。したがって、このような実施形態において、対応するデバイスは、蛍光コンポーネントの吸収スペクトルの範囲内の電磁放射線を放射する励起光源と、蛍光スペクトルの裾部分の範囲内の電磁放射線を検出する検出器を含んでいてもよい。
【００４６】
さらに別の実施形態において、発明者らは、ＮＩＲ／ＳＷＩＲスペクトル領域において、健常組織（例えば、脂肪色素または対応する強い自家蛍光がほとんどまたは全くない）と比べて増強された脂肪色素の自家蛍光シグナルを、疾患状態および／または患者の状態を識別するために使用しうることを認識した。よって、いくつかの実施形態において、疾患状態にあるときにこれらのスペクトル領域内で強い自家蛍光がない脂肪色素を含む組織を、第１のスペクトル領域内で組織の自家蛍光の励起光源に曝露してもよい。組織の自家蛍光シグナルは、次いで別の第２のスペクトル領域内の電磁放射線に感受性のある検出器を使用して検出およびイメージングする。いくつかの例において、励起光源は、ＮＩＲスペクトル領域内の電磁放射線を放射し、検出器は、ＳＷＩＲスペクトル領域内の電磁放射線に対して感受性がある。しかしながら、励起および自家蛍光検出の両方について、本開示は上記したものに限定されず、それらとは違う、異なるスペクトル範囲もまた意図される。
【００４７】
ある特定の実施形態において、標的とする疾患コンポーネントは、標的とする疾患コンポーネントを取り囲む組織と比べて、より弱い自家蛍光強度を示しうる。例えば、いくつかのケースでは、標的とする疾患コンポーネント（例えば、腫瘍）を取り囲む組織は、ある特定の疾患状態（例えば、肝毒性の結果として起こる肝硬変）の存在に起因する、対応する強い自家蛍光シグナルを有しうる。よって、標的とする疾患コンポーネント自体は、周囲組織と比べて、存在しないまたは減少した自家蛍光強度（すなわち、ネガティブ自家蛍光コントラスト）に基づいて検出されうる。
【００４８】
上記の点に鑑み、いくつかの実施形態において、デバイスは、組織（この組織は脂肪色素を含んでいても、含んでいなくてもよい）を脂肪色素の吸収スペクトルの範囲内の電磁放射線に曝露するように構成および配置された励起光源を含んでいてもよい。励起光源は、脂肪色素の吸収スペクトルの、特定の帯域内の電磁放射線（例えば、励起光）を放射しうる。あるいは、本開示は上記したものに限定されず、励起光源は脂肪色素の吸収スペクトル全体にわたる電磁放射線を放射してもよい。これにかかわらず、いくつかの実施形態において、励起光源は、６００ｎｍ、６５０ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、８５０ｎｍ、９００ｎｍ、または他の任意の適切な波長よりも長いまたはそれと等しい波長を含む電磁放射線を放射しうる。さらに、励起光源は、１０００ｎｍ、９００ｎｍ、８５０ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、および／または他の任意の適切な波長よりも短いまたはそれと等しい波長を含む吸収スペクトルの範囲内の電磁放射線を放射しうる。上記波長領域の組み合わせも意図され、この組み合わせには、例えば、６００ｎｍと９００ｎｍの間もしくはそれと等しい、６５０ｎｍと９００ｎｍの間もしくはそれと等しい、６５０ｎｍと８５０ｎｍの間もしくはそれと等しい、および／または他の任意の適切な波長領域が含まれる。ＮＩＲ波長領域の放射線を放射する励起光源は、例えば、可視波長にわたる励起光について組織浸透深さが改善されることを含む、いくつかの利点をもたらしうる。よって、いくつかの実施形態において、励起光源は、６５０ｎｍと９００ｎｍの間またはそれと等しい波長の電磁放射線（例えば、励起光）を放射しうる。さらに、いくつかの実施形態において、対象の肝臓をイメージングする場合、胆嚢および胃腸管など、他の周辺の生物学的構造の自家発光を励起することを避けるために、８００ｎｍと８５０ｎｍの間またはそれを含む領域（例えば、８０８ｎｍを含む）の電磁放射線を放射する励起光源を用いることが望ましいことがありうる。上記にかかわらず、肝臓は、他の励起波長によっても同様にイメージングされうる。以上、特定の波長領域および波長の組み合わせを示したが、本開示は上記したものに限定されず、励起波長について、他の波長（上記よりも長い波長も短い波長も含まれる）もまた意図されることを理解すべきである。
【００４９】
上記の波長領域によって、組織透過性の改善を実現しうる。しかしながら、切開手術手順、ならびに内視鏡手順、カテーテル手順、および腹腔鏡手順などのいくつかの実施形態において、透過深さが浅い、より短い波長を使用することも許容されうる。したがって、さらに別の実施形態において、励起光源は、４００ｎｍと８５０ｎｍの間の１またはそれを超える波長の電磁放射線を放射しうる。例えば、ある特定の実施形態において、励起光源は、４００ｎｍよりも長いまたはそれと等しい、４５０ｎｍよりも長いまたはそれと等しい、５００ｎｍよりも長いまたはそれと等しい、または５５０ｎｍよりも長いまたはそれと等しい波長のうちの１またはそれを超える波長の励起光を放射しうる。いくつかの実施形態によれば、励起光源は、８５０ｎｍよりも短いまたはそれと等しい、６００ｎｍよりも短いまたはそれと等しい、５５０ｎｍよりも短いまたはそれと等しい、５００ｎｍよりも短いまたはそれと等しい、または４５０ｎｍよりも短いまたはそれと等しい波長のうちの１またはそれを超える波長の励起光を放射しうる。上記の波長の範囲の組み合わせも意図され、例えば、４００ｎｍと６００ｎｍの間もしくはそれと等しい、または４５０ｎｍと５５０ｎｍの間もしくはそれと等しい電磁放射線を放射する励起光源があげられる。
【００５０】
上記のことに鑑み、発明者らは、ある特定の実施形態において、本開示は上記したものに限定されず、本明細書に記載された蓄積脂肪色素に関連する疾患状態を識別および検出するためのシステムが、カテーテル、内視鏡、腹腔鏡、光ファイバー装置、切開手術手順のためのハンドヘルドシステム、オーバーヘッドマウント型イメージングシステム、テーブルマウント型システム、および／または他の適切なフォームファクターを含む、任意の数の異なるフォームファクター中で実現されうることを認識した。
【００５１】
観察される自家蛍光の光源としての脂肪色素の識別に基づいて、発明者らは、いくつかの適用において、多光子励起法の使用が望ましいことを認識した。具体的には、そのような方法を使用することによって、入射する励起光によって励起される領域の特異性が改善されうるとともに、より長い波長を使用することによる透過深さが改善されうる。よって、いくつかの実施形態において、励起光源は、付随する検出器が感受性を示すイメージング波長よりも長い波長の励起光を放射しうる。例えば、いくつかの実施形態において、電磁放射線に感受性を示す検出器を、疾患状態にあるときに脂肪色素を含有する組織をイメージングするために使用することができ、そのイメージは、ある発光波長領域（例えば、８５０と１２００ｎｍの間）で取得される。いくつかのケースでは、励起光源によって放射される励起光の波長は、対応するイメージング波長（例えば、１３００ｎｍ、１４００ｎｍ、１５００ｎｍなど）よりも長い波長領域でありうる。ある特定の実施形態によれば、励起光源は、１０００と２０００ｎｍの間の波長、ならびに他の任意の適切な波長領域の励起光を放射する。同様に、検出器は、８５０ｎｍと１０００ｎｍの間、８５０ｎｍと９００ｎｍの間もしくはそれと等しい波長、および／または他の任意の適切な波長領域で自家蛍光シグナルをイメージングしうる。
【００５２】
１つの実施形態において、デバイスは、脂肪色素の自家蛍光スペクトルの裾部分の一部を検出するための検出器を含む。この裾部分は特定の適用に応じて、任意の波長の範囲に対応しうるが、１つの実施形態において、裾部分は、約７００ｎｍ、８００ｎｍ、８５０ｎｍ、９００ｎｍ、１０００ｎｍ、１１００ｎｍ、１２００ｎｍ、１３００ｎｍ、１４００ｎｍ、１５００ｎｍ、１６００ｎｍ、１７００ｎｍ、１８００ｎｍ、１９００ｎｍよりも長いもしくはそれと等しい波長、および／または他の任意の適切な波長を含む。同様に、裾部分は、約２０００ｎｍ、１６００ｎｍ、１５００ｎｍ、１４００ｎｍ、１３００ｎｍ、１２００ｎｍ、１１００ｎｍ、１０００ｎｍ、９００ｎｍ、８００ｎｍよりも短いもしくはそれと等しい波長、および／または他の任意の適切な波長を含みうる。上記の蛍光スペクトルの裾部分の波長領域の組み合わせ、および対応する検出器が感受性を示す波長領域の組み合わせも意図される。例えば、検出器、ならびに付随する任意のフィルタおよび他の光学要素は、７００ｎｍと２０００ｎｍの間、８５０ｎｍと１１００ｎｍの間、ならびに８５０ｎｍと９００ｎｍの間の波長の電磁放射線の裾部分を検出するように構成および配置されていてもよい。当然ながら、本開示は上記したものに限定されず、スペクトルの裾部分およびそれを測定するために用いる検出器は、上記の範囲よりも波長が短いものも長いものも意図される。上記の範囲は、健常組織および疾患組織の自家蛍光シグナルを測定するためにも同様に適用されうる。
【００５３】
本明細書に記載された任意の範囲の電磁放射線に感受性のある任意の検出器が、本開示のデバイスおよび方法に使用しうることを理解すべきである。しかしながら、１つの実施形態において、イメージングおよび／または診断デバイスに用いる検出器は、ＩｎＧａＡｓ（ヒ化インジウムガリウム）検出器、ゲルマニウム検出器、ＭＣＴ（テルル化カドミウム水銀）検出器、ボロメータ、および／または関心のある電磁波波長領域に感受性のある、任意の他の適切な検出器でありうる。さらに、発明者らは、特定された脂肪色素が、以前に理解していたよりも長い波長で、比較的強い自家蛍光シグナル強度を示すことを認識した。したがって、いくつかの実施形態において、上記の検出器よりも短い波長で運用できる、より典型的な検出器を使用しうる。例えば、１つの実施形態において、約６００ｎｍと約９００ｎｍの間の波長の電磁放射線を検出することができる、シリコンベースの検出器を使用しうる。しかしながら、本開示は上記したものに限定されず、検出器はこれらのタイプの検出器のみに限定されるものではなく、いくつかの例において、検出器は、上記の波長領域内であってもよい波長領域、および／または上記領域の外側まで伸びていてもよい波長領域をカバーする検出器の組み合わせであってもよい。本明細書に記載された検出器は、高量子収量外因性マーカーで得たシグナルと同等のレベルで、低量子収量自家蛍光シグナルを検出しうる。いくつかのケースでは、低量子収量自家蛍光の検出は、生物組織および／または細胞に対してより破壊性が低く、かつ、生物組織および／または細胞との反応がより少ない、より低いエネルギーのＮＩＲ励起によって行われる。
【００５４】
上記の実施形態において、脂肪色素コンポーネントの自家蛍光スペクトルの対応するピーク発光波長は、蛍光コンポーネントの裾部分よりも短い波長であってもよい。例えば、いくつかの実施形態において、蛍光コンポーネントのピーク波長は、関心のある特定の脂肪色素に応じて、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍよりも短いまたはそれと等しい波長、または他の任意の適切な波長でありうる。
【００５５】
蛍光および自家蛍光スペクトルは、典型的には、１またはそれを超えるピーク蛍光強度を含む。これらの強度は、周囲波長における蛍光スペクトルの強度よりも強い局所的および／または全体的ピークのいずれかでありうる。さらに、スペクトルは連続的でありピークはある波長領域に及ぶであろうが、ピークは、一般的に、最大蛍光強度が計測された波長を基準にして記述される。さらに、蛍光スペクトルは、単に見えないほどに小さな検出可能なシグナルで、全ての波長にわたって連続的であるという主張がありうるが、この適用の目的のために、特定の蛍光コンポーネントおよび／または組織について、測定された蛍光および／または自家蛍光強度が０．０１％、０．１％、１％よりも小さいまたはそれと等しい波長、または他の適切な最大ピーク強度（％）よりも小さいまたはそれと等しい波長、および／またはその強度が測定された蛍光シグナルのバックグラウンドノイズを超えない波長は、蛍光および／または自家蛍光スペクトル波長領域の範囲内であるとみなされず、スペクトルの裾部分ももちろん同様である。
【００５６】
上記に加えて、いくつかの実施形態において、スペクトルの裾部分は、スペクトルの全体的ピークから除かれたスペクトルの部分に相当するものとして説明されうる。また、いくつかの実施形態において、スペクトルの裾部分は、全体的ピークよりも長い波長における蛍光スペクトルの範囲のパーセンテージと比較して説明されうる。例えば、いくつかの実施形態において、蛍光スペクトルの裾部分は、１％、５％、１０％、２０％よりも大きいまたはそれと等しい、または蛍光スペクトルの範囲の他の任意の適切なパーセンテージでありうる。同様に、スペクトルピークの位置に応じて、蛍光スペクトルの裾部分は、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％よりも小さいまたはそれと等しい、または蛍光スペクトルの範囲の他の任意の適切なパーセンテージでありうる。例えば、蛍光スペクトルの範囲の約１％と４０％の間である蛍光および／または自家蛍光スペクトルの裾部分を含む、上記したものの組み合わせも意図される。
【００５７】
開示される方法およびデバイスの所望の適用に応じて、検出器によって取得した自家蛍光シグナルを表示すること、および／またはさらに処理すること、のいずれかが望ましいことがある。よって、１つの実施形態において、検出器は、以下に詳述するように、さらなる評価のために、検出された自家蛍光シグナルをコンピューティングデバイスに出力してもよい。上記に加えて、または上記に代えて、検出器は、検出された自家蛍光シグナルを、モニタまたはプリンタなどの付属のディスプレイに出力してもよい。本開示は上記に限定されず、このディスプレイは、イメージングまたは診断デバイスとは分離していてもよく、イメージングまたは診断デバイスと一体化していてもよい。
【００５８】
自家蛍光シグナルがコンピューティングデバイスに出力される実施形態において、受信した情報に対して、１またはそれを超える操作が行われうる。例えば、いくつかの実施形態において、コンピューティングデバイスは、後で処理するために、情報を付属のメモリに保存してもよく、ならびに／または情報を、サーバー、システムに接続された別のコンピューティングデバイスに伝達してもよく、ならびに／または情報のさらなる処理、保存、および／もしくは他のハンドリングのために、情報を、離れた場所にあるコンピューティングデバイスに伝達してもよい。いずれのケースにおいても、いくつかの実施形態において、組織および／または対象の状態を決定するために、受信したシグナルを処理することが望ましいであろう。例えば、検出器の視野（ＦＯＶ、Ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  Ｖｉｅｗ）は、検出器が向けられた組織からの自家蛍光シグナルを取得する複数のピクセルを含みうる。各ピクセル、またはピクセルのグループについての検出された自家蛍光シグナルの強度は、閾値強度と比較されてもよい。この閾値強度に合致した、またはこの閾値強度を超えたピクセルは、特定の疾患状態または対象症状を示すものとして識別されうる。あるいは、特定の疾患状態を決定するために、個別のピクセルの自家蛍光強度の比を、周囲組織の自家蛍光強度と比較して決定してもよい。
【００５９】
上記の実施形態において、複数のピクセルの検出された蛍光および／または自家蛍光強度を閾値強度と比較するコンピューティングデバイスは、閾値強度に合致した、または閾値強度を超えた１またはそれを超えるピクセルを組織状態および／または対象症状に割り当てうる。この組織状態または症状は、次いで、ディスプレイに表示され（例えば、イメージングした組織の組織状態を描写するイメージ）、コンピューティングデバイスのメモリ内に保存され、別のコンピューティングデバイスに伝達され、診断結果（すなわち、対象症状があるかないか）として出力され、および／または任意の他の適切な様式で使用されてもよい。
【００６０】
特定の種類の組織状態および対象症状が本明細書で論じられているが、本明細書で開示されるシステムおよび方法は、任意の適切な種類の対象症状および／または組織状態に適用しうることを理解すべきである。例えば、ある特定の実施形態によれば、検出された自家蛍光強度の少なくとも一部を強度閾値と比較して、組織が、非アルコール性脂肪肝疾患、肝硬変、リソソーム蓄積症、または他の疾患状態などの、疾患状態にあるかどうかを決定しうる。ある特定の実施形態において、強度閾値は、臨床的に決定された、疾患組織の自家蛍光強度と対比した正常組織の自家蛍光強度に基づくベースライン自家蛍光強度閾値でありうる。あるいは、別の実施形態において、自家蛍光強度閾値は、評価した組織の事前に取得した自家蛍光強度に基づきうる。例えば、事前に取得した自家蛍光強度は、特定の患者の事前のイメージングセッション中に取得し、特定のデバイスのメモリに保存した自家蛍光強度値でありうる。
【００６１】
さらに別の実施形態において、本明細書に記載された方法は、患者についての進行状態を決定することを含みうる。上記したように、いくつかのケースでは、検出された自家蛍光シグナルの少なくとも一部（すなわち、イメージングした視野の少なくとも一部の自家蛍光強度）を強度閾値と比較して、組織が疾患状態にあるかどうかを決定しうる。いくつかの実施形態において、イメージングした組織の検出された自家蛍光強度の少なくとも一部が、強度閾値よりも強く、疾患状態が確証された場合、患者についての進行状態も決定されうる。いくつかのケースでは、患者についての進行状態は、自家蛍光強度と閾値強度との間の差異、および／または閾値強度よりも強い検出された自家蛍光シグナルが全体にわたって検出される範囲のいずれかに基づいて決定しうる。例えば、検出された自家蛍光シグナルに関するより広い範囲および／またはより高い強度は、検出された疾患の異なる進行状態に関連しうる。１つの実施形態において、進行状態は、異なる進行状態に関連する多数の自家蛍光強度および／または範囲閾値を用いて決定してもよく、検出された自家蛍光シグナルをこれらの閾値と比較して特定の進行状態を識別してもよい。あるいは、別の実施形態において、自家蛍光シグナルは、特定の疾患状態と関連する自家蛍光および／または範囲閾値に対するパーセンテージおよび／または差異として決定してもよい。非限定的な例として、イメージングした組織の検出された自家蛍光強度が強度および／または範囲閾値よりも１０％高い場合、このパーセンテージの相異に関連する進行状態は、検出された自家蛍光シグナルが閾値強度に対してさらに高い強度および／または範囲を示した場合よりも、より低リスクの進行状態に相当しうる。
【００６２】
患者についての進行状態を決定する方法は、患者における疾患状態をモニタして、処置および／または治療が必要かどうかを決定するために有用でありうる。例えば、患者の進行状態に基づいて、疾患の存在の可能性、疾患重篤度、ありうる処置および／または薬物療法、ならびに経過観察の頻度（例えば、３か月、６か月ごとなど）を決定しうる。さらに、本開示の方法は比較的非侵襲的な特質および特異性を有するため、本明細書に記載された方法は、疾患の診断または予後に関連するエラー（例えば、サンプルエラー）のリスクを低減し、侵襲的手順の必要性を低減し、患者における治療前検査と処置におけるオプションの両方を改善しうる。
【００６３】
上記の点に鑑み、患者の進行状態は、識別された疾患状態のステージまたは程度の決定を可能にするために使用しうる、および／または処置のコースを（例えば、医師に）推奨するために使用しうる。例えば、デバイスのコントローラーは、検出された自家蛍光シグナルと保存された自家蛍光強度閾値および／または範囲閾値とを比較し、特定の疾患状態と進行状態の両方を決定しうる。コントローラーは、次いで、識別された疾患状態および／または進行状態を、推奨された処置のコースと共に、出力しうる。１つのこのような実施形態において、特定の疾患状態および進行状態に応じて、推奨される処置のコースとしては、処置オプション、生検または他の診断手順の推奨、モニタリングの頻度（例えば、３か月、６か月ごと、などのモニタリング）、および／または任意の他の適切な処置オプション、があげられうる。さらに、コントローラー、または他の付属のコンピューティングデバイスは、疾患状態に関連する特定の自家蛍光パラメータ、例えば上記の強度、空間的位置および／または分布、カバーされる範囲および／または割合、並びに疾患状態に関連する他の適切なパラメータなど、を識別しうる。これらのパラメータを、これらのパラメータを経時的にモニタリングするために、任意の適切な非一時的なコンピュータ可読媒体に保存して、疾患状態の進行および／または退行もまた経時的に追跡してもよい。このようなモニタリングは、疾患の進行および／または退行の速度を経時的に決定すること、患者が処置に対して反応しているかどうかを決定すること、処置が認可されているかどうかを決定すること、および／または異なる処置を使用すべきかどうかを決定することに関して、医師に有益でありうる。
【００６４】
上記に加えて、いくつかの実施形態において強度閾値化を使用しうるが、本開示は上記したものに限定されず、他の実施形態において、本開示のシステムおよび方法は、強度閾値化せずに、例えば、より高いコントラストのイメージを簡便に提供するために使用しうることに注目すべきである。
【００６５】
本明細書に記載された種々のデバイスおよび方法は、任意の適切な種類の組織、および任意の数の異なる適用に使用しうることを理解すべきである。例えば、イメージングおよび／または診断デバイスは、目的物内の組織および／または組織自体の両方を蛍光コンポーネントの励起光源に曝露し、次いで目的物からの蛍光および／または自家蛍光シグナルを検出するように構築および配置されていてもよい。しかしながら、デバイスの特定の用途に応じて、目的物は、多くの異なる表面および／または構造に相当しうる。１つのこのような実施形態において、目的物は、対象の身体であり、イメージングおよび／または診断デバイスは、対象の全身を一度に、および／または対象の身体のサブパート（すなわち、胴体、腹腔、腕、手、指、脚、頭、またはそれらの下位部分）を非侵襲性イメージングおよび／または検出する。あるいは、目的物は、癌性腫瘍の摘出中に露出されている組織など、手術中の対象のサージカルベッドでありうる。さらに別の実施形態において、目的物は、組織の切除片（例えば、残存する何らかの癌関連細胞を検出するためにイメージングされる腫瘍周辺部を含む、切除された腫瘍）。なお、本開示はここで開示されたこれらの適用のみに限定されず、イメージングおよび／または診断デバイスの他の特定の適用もまた意図されていることは言うまでもない。
【００６６】
ある特定の実施形態によれば、本明細書に記載された方法は、脂肪色素を選択的に標的にするクエンチャーの付与を含みうる。いくつかのケースでは、脂肪色素（例えば、リポフスチンおよび／またはセロイド）の自家蛍光強度が特定の波長領域において低下するように、クエンチャーを付与して前記脂肪色素の自家蛍光をクエンチしてもよい。本開示は上記したものに限定されず、特定の実施形態に応じて、クエンチャーは、所望の波長領域において、前記脂肪色素の自家蛍光強度を、少なくとも４０％、３０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および／または他の適切なパーセンテージだけ低下させてもよい。
【００６７】
クエンチャーは、任意の適切な波長領域（例えば、付属の検出器でイメージングしている蛍光シグナルと関連する波長領域よりも短い波長を含む）にわたって、脂肪色素の自家蛍光強度をクエンチしうる。１つのこのような実施形態において、クエンチャーは、脂肪色素の自家蛍光を、可視領域では低下させ、検出器がイメージングするＮＩＲ／ＳＷＩＲ領域では低下させなくてもよい。例えば、クエンチャーは、８００ｎｍ、７５０ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、および／または他の適切な波長領域よりも短いまたはそれと等しい波長で、脂肪色素の自家蛍光シグナル強度をクエンチしうる。同様に、クエンチャーは、３７５ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ波長、６００ｎｍ、および／または他の適切な波長領域よりも長いまたはそれと等しい波長で、自家蛍光シグナル強度をクエンチしうる。上記した領域の組み合わせが意図され、例えば、約３７５ｎｍと８００ｎｍの間、６００ｎｍと８００ｎｍの間またはそれと等しい波長、および／または任意の他の適切な波長領域で、観察される自家蛍光強度を低下させるクエンチャーが含まれる。
【００６８】
所望の脂肪色素を標的にすることができる、任意の適切な種類のクエンチャーを使用しうることを理解すべきである。しかしながら、１つの実施形態において、クエンチャーの例としては、ズダンブラックＢがあげられうる。理論に拘束されることを望むものではないが、ズダンブラックＢは、およそ８００ｎｍまでの電磁放射線を吸収し、リポフスチンおよび／またはセロイドの自家蛍光を、ほぼこの波長までクエンチするために使用しうる。ある特定の実施形態によれば、約８００ｎｍまでの波長をクエンチャー（例えば、ズダンブラックＢ）でクエンチした後でもなお、ＮＩＲ／ＳＷＩＲ自家蛍光は、約８００ｎｍよりも長い波長で検出されうる。脂肪色素からの自家蛍光をクエンチすることによって、いくつかの実施形態において、他の蛍光プローブ（例えば蛍光標識抗体など）を、約４００ｎｍから約８００ｎｍまでの波長の可視領域で発光する組織に付与してもよく、次いで、組織に付与して他の組織構造を蛍光ラベルしてもよい。これによって、脂肪色素の自家蛍光イメージング（例えば、８００ｎｍまたはそれよりも長い波長で）を可能にしたままで、これらの他のプローブの蛍光イメージングを、約４００ｎｍ〜８００ｎｍの波長で利用することが可能になりうる。
【００６９】
本明細書で用いられる場合、用語「近赤外線（ＮＩＲ）」は、約７５０ｎｍと１０００ｎｍの間の電磁波波長を指す。また、本明細書で用いられる場合、用語「短波長赤外線（ＳＷＩＲ）」は、約１０００ｎｍと２０００ｎｍの間の電磁波波長を指す。
【００７０】
ここで、図に目を移すと、いくつかの非限定的な実施形態が、さらに詳細に説明されている。しかしながら、本開示は、本明細書に記載されたそれらの特定の実施形態のみに限定されるものではないことを理解すべきである。むしろ、本開示はこれらに限定されず、開示されている種々のコンポーネント、特徴、および方法は、任意の適切な組み合わせに編成しうる。
【００７１】
図１Ａは、それぞれに異なる可視スペクトル領域、近赤外線スペクトル領域、および短波長赤外線スペクトル領域に対応する、異なる波長領域を示す。図１Ａは、８５０ｎｍ未満の励起波長または波長領域に対する組織の曝露と、それに対応する８５０ｎｍまたはそれより長波長で起こる自家蛍光発光も示す。図１Ｂは、ある特定の実施形態による、２光子励起光源の励起波長と、それに対応する発光波長のグラフを示す。図１Ｂは、２光子励起光源の励起波長に対する組織の曝露を示す。２光子励起光源は、対象とする発光波長（単数または複数）よりも長い波長の励起光を放射してもよく、１０００と２０００ｎｍの間またはそれと等しい波長でありうる。図示した実施形態において、対応する自家蛍光発光は、１０００ｎｍで起こる。図には励起および発光波長が別々に描かれているが、励起および発光波長は１つの波長領域に相当することもあることを理解すべきである。また、前に説明したように、波長領域は、図中に具体的に示したもの以外の波長に対応することもありうる。
【００７２】
図２は、イメージングおよび／または診断システム２を示す。このシステムは、励起ユニット４、伝達ユニット６、および検出ユニット８を含む。以下にさらに説明するように、励起ユニットおよび伝達ユニットは、目的物１０の部分または下位部分（例えば、対象の身体、対象の身体の下位部分、サージカルベッド、および／または切除した組織）を、励起波長または波長領域に曝露する。特定の適用に応じて、この励起波長は、目的物自体の組織の自家蛍光についての励起波長でありうる。目的物を励起波長に曝露した後、検出ユニットは、次いで、励起波長に応答して目的物から放射される自家蛍光シグナルを、検出および処理する。これらのユニットの要素および相互関係、ならびに目的物を、以下にさらに詳述する。
【００７３】
図解された実施形態において、励起ユニット４は、励起光源１４に電力を供給する電源１２を含む。励起光源は、予想される脂肪色素（脂肪色素は目的物１０の組織に含まれる）の吸収スペクトルの範囲内の、あるいは場合によりその外側まで伸びる、任意の所望の波長領域を放射しうる。任意の適切な種類の励起光源を使用することができ、限定するものではないが、レーザー、発光ダイオード、ハロゲンベースの発光体、または所望のスペクトル帯域内の電磁放射線の任意の他の適切な光源があげられる。励起光源は、任意の適切な光学的結合１６（限定するものではないが、例えば、光ファイバー束、ライトパイプ、平面導光体、光学的に透明な光路、または励起光源を伝導ユニットに結合する任意の他の適切な手段）を介して、伝達ユニット６に光学的に結合されている。ある特定の実施形態によれば、光ファイバー束は、励起光源からの励起光をガイドする。特定の結合に関わらず、図示した実施形態において、光学的結合は、励起光源からの電磁放射線を、励起フィルタ１８またはフィルタのセットに伝送する。ある特定の実施形態において、励起フィルタ（ｆｉｌｅｒ）は、望ましくない励起波長を遮断する。所望の励起波長および用いる光源の種類に応じて、フィルタは、所望のスペクトル内の電磁放射線を提供するための、ローパスフィルタおよび／またはハイパスフィルタの組み合わせであってもよい。例えば、フィルタは、所望の蛍光スペクトル波長よりも高いおよび／または低い電磁波波長、または他の望ましくない励起波長を排除しうる。いくつかの実施形態において、次いで、目的物の全域に励起光が広がるのを助長するために、放射された電磁放射線をディフーザに通してもよい。
【００７４】
目的物が励起光源に曝露されると、組織自体に含まれるコンポーネント（例えば、上記の脂肪色素）が自家蛍光し、所定の蛍光スペクトル内の電磁放射線を、構成および配置された検出ユニット８に向けて放射する。図示した実施形態において、検出ユニットは、イメージングされる目的物の対応する部分からの強度シグナルをイメージングおよび／または検出する複数のピクセルを含む光学結合検出器２６上に、目的物１０を適切にイメージングするための対物レンズ２２を含む。目的物と検出器の間の光路沿いのどこかに、反射した励起光が検出器で検出されることを防ぐために、１またはそれを超えるフィルタ２４を配置してもよい。検出器は、任意の適切な電磁波波長に感受性がありうるが、いくつかの実施形態において、検出器は、例えば、これに限定されないが、例えば短波長赤外線スペクトル範囲（例えば、１０００〜２０００ｎｍ）を含む、本明細書に記載された波長領域に感受性でありうる。
【００７５】
自家蛍光シグナルが検出器２６によって検出されると、検出器は、シグナルをプロセッサ２８に出力しうる。プロセッサは、次いで、前に説明したように、情報を適切に処理し、検出されたシグナルが特定の組織状態および／または対象症状に関連するかどうかを決定してもよい。この情報は、ピクセルごとに、取得した１つのイメージについて決定してもよく、および／または手術手順のイメージング中に行われるであろうように、リアルタイムで連続的に決定してもよい。処理した情報は、次いで、イメージとしてディスプレイ３０に表示されてもよく、および／または後で閲覧および／または使用するために、メモリ３２に保存してもよい。
【００７６】
図３は、図２に示したものと類似した、別のシステムを示す。しかしながら、図示した実施形態において、デバイスは、所望の励起波長領域を、イメージングしようとする目的物１０に向けて反射するダイクロイックミラー３４を含む、変形した伝達ユニット６を含む。これに続く自家蛍光シグナルは、ダイクロイックミラーを通過し、かつ、検出器２６によって（前に説明したように）検出および処理されるように、対物レンズ２２を通過し、かつダイクロイックミラーの通過帯域内である、蛍光波長領域を含む。
【００７７】
上記の実施形態において、励起ユニット、伝達ユニット、および検出ユニットは、それぞれ既に説明されている。しかしながら、本開示は上記したものに限定されず、これらの各種ユニットは、１つの一体型システムにまとめられてもよく、別々のコンポーネントとして提供してもよい。
【００７８】
図４は、上記のシステムを使用して実行しうる方法の１つの実施形態を示す。図示した実施形態において、１またはそれを超える生物学的構造の自家蛍光イメージングが実現されうる。このイメージングの間に、疾患状態に関連する１またはそれを超える自家蛍光パラメータが識別されうる。本開示はこの様式に限定されず、任意の適切な方法、測定基準、または他の適切な基準を用いて行いうる。例えば、最大または平均シグナル強度、閾値シグナル強度よりも高いイメージの視野のパーセント範囲、解剖学的位置、閾値シグナル強度よりも高いシグナルの空間的分布、および／または任意の他の適切なパラメータが、イメージングシステムのプロセッサによって識別されうる。特定の測定基準に関わらず、１またはそれを超える自家蛍光パラメータは、イメージングデバイスのメモリ内、対応するコンピューティングデバイスのメモリ内、および／または離れた場所にあるコンピューティングデバイスのメモリ内に保存されうる。１またはそれを超える自家蛍光パラメータは、適切な期間にわたる１またはそれを超える自家蛍光パラメータの対応する値を含む、データセット中に保存されうる。本開示はいかなる特定の期間にも限定されず、時間は、特定の種類の疾患状態に応じて、日、週、月、および／または年のオーダーでありうる。どの場合でも、１またはそれを超える自家蛍光パラメータの経時的な値を含むデータセットは、特定の疾患状態の経時的な進行および／または退行をモニタするために使用しうる。
【００７９】
理論に拘束されることを望むものではないが、自家蛍光シグナルは、疾患状態に応じて、疾患状態の進行および退行の両方に対して、経時的に様々に変化する。例えば、ここで開示したように、ある特定の疾患状態は、脂肪色素に関連する自家蛍光のイメージングによって検出されうる。しかしながら、この脂肪色素が組織内でどこに、どのように位置しているかに応じて、経時的な脂肪色素の自家蛍光は異なる。例えば、脂肪色素（例えば、リポフスチン）が、疾患の退行中に組織から容易に排除されうるマクロファージ内に主に位置している疾患状態において、対応する自家蛍光シグナルは経時的に減少しうるが、これは疾患の退行に相関しうる。しかしながら、リポフスチンが疾患の退行中排除されない組織内に存在する疾患状態では、そうではなく、疾患の退行中に減少しない自家蛍光シグナルになることがあり、また、そうではなく、疾患の退行中に実質的に一定のままの自家蛍光シグナルになることがある。このような実施形態において、自家蛍光シグナルは、イメージングしている生物学的構造に起きた累積的なストレスおよび／または損傷を代表するものでありうる。いずれのケースにおいても、自家蛍光イメージングは、特定の脂肪色素の組織内への沈着が、どこで、どのように起こるかに応じた種々の疾患状態の、退行および／または進行を追跡するために有用でありうる。
【００８０】
上記の点に鑑み、いくつかの実施形態において、および特定の疾患状態に応じて、例えば、範囲の増大、最大または平均自家蛍光強度の増加、および／または類似の種類の測定基準などの自家蛍光パラメータの変化は、経時的に進行している特定の疾患状態を意味しうる。同様に、例えば、範囲の減少、最大または平均自家蛍光強度の低下、および／または類似の種類の測定基準などの自家蛍光パラメータの変化は、経時的に退行している特定の疾患状態を意味しうる。よって、保存された経時的な１またはそれを超える自家蛍光パラメータに対応するデータセットは、医療用または非医療用の、医師が使用する任意の適切な出力デバイス（例えば、モニタ、プリンタ、または他の類似の種類のディスプレイ方法が含まれる）に出力されうる。この出力に基づいて、医師は、予後、処置オプション、および患者または対象に関する処置への対応に関して、ここに開示された方法およびシステムに基づく、より多くの情報を得た上での決定を行いうる。
【００８１】
上述のように、本明細書に記載されたシステムおよび方法は、リアルタイム生細胞分析に用いられうるデバイス中で実現されうる。さらに、ある特定の実施形態において、前記のデバイスは、切開手術および／またはサンプル摘出のいずれも必要とせずに、種々の疾患状態のｉｎ  ｖｉｖｏイメージングおよび検出を実施しうるように構築されていてもよい。例えば、種々の励起ユニット、伝達ユニット、および検出ユニットは、適切な励起波長およびイメージング波長で組織をイメージングし、十分な量の組織を透過し、対象の皮膚などの介在組織の下にある関心のある解剖学的構造をイメージングするように構築および配置されているデバイス内に組み込まれていてもよい。例えば、ある特定の実施形態において、本開示のシステムのイメージング深さをより深くするために、約６００ｎｍよりも長い波長を使用してもよい。しかしながら、本開示は上記したものに限定されず、切開手術の間および／または切除したサンプルに使用するデバイスに本明細書に記載されたシステムおよび方法が組み込まれた実施形態もまた意図されることを理解すべきである。
【００８２】
いくつかのケースでは、上記の医療用イメージングデバイスは、組織が１またはそれを超える疾患状態にあるかどうかを決定するために使用しうる。くり返しになるが、ありうる疾患状態（これに限定されないが、非アルコール性脂肪肝疾患および／またはリソソーム蓄積症が含まれる）は、上に示されている。例えば、システムは、疾患状態にあるときに脂肪色素（例えば、リポフスチン、セロイド、および／またはリポフスチン様脂肪色素）を含む組織をイメージングするために使用しうる。さらに、イメージングした組織からの自家蛍光シグナルを強度閾値と比較して、組織が疾患状態にあるかどうかを決定しうるように構成されていてもよい。いくつかの実施形態において、デバイスは、さらに患者についての進行状態を決定するように構成されている。すでに説明したように、進行状態は、自家蛍光強度の大きさおよび／または自家蛍光シグナルが全体にわたって観察される範囲に基づいて決定されうる。
【００８３】
上記した本明細書に記載された技術の実施形態および例は、任意の多数の手段で実現することができる。例えば、前記実施形態は、ハードウェア、ソフトウェア、またはそれらの組み合わせによって実現できる。ソフトウェアで実現される場合、ソフトウェアコードは、任意の適したプロセッサまたはプロセッサの集まり（１台のコンピューティングデバイスに備えられていても、多数のコンピューティングデバイスに分散されていてもよい）で実行されうる。このようなプロセッサは、集積回路コンポーネント（例えば、この技術分野で、ＣＰＵチップ、ＧＰＵチップ、マイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、またはコプロセッサという名前で知られている、市販の集積回路コンポーネントが含まれる）内に１またはそれを超えるプロセッサを含む、集積回路として実現されうる。あるいは、プロセッサは、ＡＳＩＣなどのカスタム回路構成、またはプログラマブルロジックデバイスを設定することで得られるセミカスタム回路構成内に実現されうる。さらなる代替手段として、プロセッサは、市販、セミカスタム、またはカスタムの、より大きな回路または半導体デバイスの一部でありうる。特定の例として、いくつかの市販のマイクロプロセッサは、多数のコアの１つまたはそのサブセットがプロセッサを構成するように、多数のコアを有する。前記に関わらず、プロセッサは、任意の適切な回路構成を用いて実現されうる。
【００８４】
さらに、コンピューティングデバイスは、多数の形態、例えば、ラックマウント型コンピュータ、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、またはタブレットコンピュータなどのいずれとしても具現化されうることを理解すべきである。また、コンピューティングデバイスは、一般的にはコンピューティングデバイスとはみなされないが適切な処理能力を有するデバイス、例えば、パーソナルデジタルアシスタント（ＰＤＡ）、スマートホン、または任意の他の適切な携帯型もしくは固定型電子デバイスなどとしても具現化されうる。
【００８５】
また、コンピューティングデバイスは、１またはそれを超える入力デバイスおよび出力デバイスを有していてもよい。これらのデバイスは、他にもあるが、特に、ユーザーインターフェースを提供するために使用することができる。ユーザーインターフェースを提供するために使用することができる出力デバイスとしては、例えば、出力の視覚的プレゼンテーションのためのプリンタまたはディスプレイスクリーン、出力の聴覚的プレゼンテーションのためのスピーカーまたは他の音響発生デバイスがあげられる。ユーザーインターフェースとして使用することができる入力デバイスとしては、例えば、キーボード、ならびにマウス、タッチパッド、およびデジタイズタブレットなどのポインティングデバイスがあげられる。別の例として、コンピューティングデバイスは、音声認識または他の聴覚的フォーマットを通じて、入力情報を受信してもよい。
【００８６】
このようなコンピューティングデバイスは、任意の適した形態の１またはそれを超えるネットワーク（例えば、ローカルエリアネットワークまたはワイドエリアネットワーク（例えば、エンタープライズネットワークまたはインターネットなど）が含まれる）によって相互に接続されていてもよい。このようなネットワークは、任意の適した技術に基づいていてもよく、任意の適したプロトコルにしたがって動作してもよく、また、無線ネットワーク、有線ネットワーク、または光ファイバーネットワークを含んでいてもよい。
【００８７】
また、本明細書で概説した種々の方法およびプロセスは、種々のオペレーティングシステムまたはプラットフォームのいずれか１つを採用した１またはそれを超えるプロセッサで実行することができるソフトウェアとしてコード化されていてもよい。また、このようなソフトウェアは、多数の適したプログラム言語および／またはプログラミングもしくはスクリプティングツールのいずれかを用いて記述されていてもよく、また、フレームワークまたは仮想機械で実行される実行可能な機械語コードまたは中間コードとしてコンパイルされていてもよい。
【００８８】
この点で、ここで開示された実施形態は、１またはそれを超えるコンピュータまたは他のプロセッサで実行した場合に、上記の種々の実施形態を実現する方法を実行する１またはそれを超えるプログラムがコード化された、コンピュータ可読記憶媒体（または多数のコンピュータ可読媒体）（例えば、コンピュータメモリ、１またはそれを超えるフロッピー（登録商標）ディスク、コンパクトディスク、光学ディスク、デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）、磁気テープ、フラッシュメモリ、フィールドプログラマブルゲートアレイまたは他の半導体デバイス内の回路構成、または他の有形コンピュータ記憶媒体）として具現化されうる。上記の例から明らかなように、コンピュータ可読記憶媒体は、非一時的な形態でコンピュータが実行可能な命令を提供するために十分な時間、情報を保持することが可能である。このようなコンピュータ可読記憶媒体または媒体は移動が可能であり、それらに保存された（１または複数の）プログラムを１またはそれを超える他のコンピュータまたは他のプロセッサに読み込み、上記の本実施形態の種々の態様を実行することが可能である。本明細書で用いられる場合、用語「コンピュータ可読記憶媒体」は、製作品（すなわち、製作品の物品）または機械とみなされうる非一時的なコンピュータ可読媒体のみを包含する。  代替的にまたは追加的に、開示された方法は、コンピュータ可読記憶媒体以外の、伝播シグナルなどのコンピュータ可読媒体として具現化されうる。
【００８９】
本明細書で用いられる場合、用語「プログラム」または「ソフトウェア」は、一般的な意味で、コンピューティングデバイスまたは他のプロセッサをプログラムして、上記した本開示の種々の態様を実行するために採用することができる、任意の種類のコンピュータコードまたはコンピュータが実行可能な命令のセットを指す。また、本実施形態の１態様によれば、実行された場合に本開示の方法を実行する１またはそれを超えるコンピュータプログラムは、１つのコンピュータまたはプロセッサに存在する必要はなく、多くの異なるコンピュータまたはプロセッサの間にモジュールの形で分配され、本開示の種々の態様を実行してもよい。
【００９０】
コンピュータが実行可能な命令は、プログラムモジュールなどの多くの形式で、１またはそれを超えるコンピュータまたは他のデバイスによって実行されうる。一般的に、プログラムモジュールには、特定のタスクを実行するか、または特定の抽象データ型を実現する、ルーチン、プログラム、オブジェクト、コンポーネント、データ構造などが含まれる。典型的には、プログラムモジュールの機能は、種々の実施形態で要求されるように、結合してもよく、または分配してもよい。
【実施例】
【００９１】
実施例：ＮＩＲ／ＳＷＩＲ自家蛍光
以下の実施例は、ＮＩＲ／ＳＷＩＲ自家蛍光の検出を示す。この検出方法は、関心のある領域をＮＩＲ励起光源の入射光束で照射すること、組織からの蛍光をＮＩＲ／ＳＷＩＲ検出器で検知すること、および相対的に高い蛍光シグナルに基づいて関心のある領域内の異常な組織の存在を判定すること、含んでいた。具体的には、図５Ａは、コリン欠乏Ｌ−アミノ酸制限高脂肪食（ＣＤＡＨＦＤ）を１２週間与えられた非アルコール性脂肪肝疾患マウスモデルの肝臓（一番上の矢印）、および泌尿生殖器解剖所見（下の２つの矢印）における、ｉｎ  ｖｉｖｏのＮＩＲ／ＳＷＩＲ自家蛍光を示す。図５Ｂは、図５Ａに示したマウスモデルの、切除した肝臓で検出されたＮＩＲ／ＳＷＩＲ自家蛍光を示す。図５Ｃは、ＣＣｌ４と５％エタノールの経口投与を８週間受けた肝硬変マウスモデルからの肝組織（ホルムアルデヒド固定およびパラフィン包埋）の５μｍスライドにおいて、顕微鏡法により検出されたＮＩＲ／ＳＷＩＲ自家蛍光細胞を示す。
実施例：ＮＩＲ／ＳＷＩＲ自家蛍光を用いた脂肪色素の検出
【００９２】
以下の実施例は、染色した組織および未染色の組織における、ＮＩＲ／ＳＷＩＲ自家蛍光による脂肪色素の検出を示す。ほとんどの健常組織のＮＩＲおよびＳＷＩＲ波長領域における自家蛍光は非常に小さい。しかしながら、脂肪色素（例えば、リポフスチンおよび／またはセロイド）は、ＮＩＲ光およびＳＷＩＲ光を放出することができ、特定の疾患症状があるときにＮＩＲ／ＳＷＩＲ自家蛍光シグナルが上昇し、疾患に関連したコントラストのあるイメージをもたらす。例えば、図６Ａおよび６Ｂは、図８（各顕微鏡用フィルタキューブセッティングについての励起および発光波長の図解を示す）に示すＣｙ５チャンネルおよびＮＩＲ／ＳＷＩＲチャンネルに対応する波長における、肝硬変肝組織の、顕微鏡法による空間分解発光検出を示す。図８において、各チャンネルについて、励起波長を左側のバンドで表し、発光波長を右側のバンドで表す。同様に、図７Ａおよび７Ｂは、ズダンブラックＢ染色した肝硬変肝組織（パラホルムアルデヒド固定およびパラフィン包埋）の、リポフスチン／セロイドの可視波長の発光を吸収によってクエンチした、顕微鏡法による空間分解発光検出を示す。未染色の切片について、自家蛍光は、Ｃｙ５およびＮＩＲ／ＳＷＩＲチャンネル（ならびにＣｙ３−ＴＲＩＴＣチャンネル、図示せず）において検出可能であったが、染色した切片については、ＮＩＲ／ＳＷＩＲチャンネルにおいてのみ検出可能であった。未染色の組織において観察可能な自家蛍光がみられ、およびズダンブラックＢ染色した組織において検出可能な自家蛍光が見られないという同様の挙動は、ＤＡＰＩ−ＢＦＰ、ＧＦＰ、およびＣｙ３−ＴＲＩＴＣチャンネルに対応する波長においても観察された。理論に拘束されることを望むものではないが、自家蛍光シグナルがクエンチしていないサンプルでのみ検出されたことは、ズダンブラックＢはリポフスチン／セロイドを標的としてクエンチするので、観察された自家蛍光の原因がリポフスチン／セロイドであると考えられることを示す。
【００９３】
図９は、ズダンブラックＢの吸収スペクトルを示す。図に示されているように、このクエンチャーは、およそ８００ｎｍまでの可視光を吸収し、これがリポフスチンの発光をクエンチするが、これはＮＩＲ／ＳＷＩＲ領域の波長を有する光を透過するメカニズムである。よって、図６Ａ〜図７Ｂに示すように、ズダンブラックＢは、染色した切片についても、ＮＩＲ／ＳＷＩＲ波長領域でのシグナルの検出を可能にする。
【００９４】
図１０Ａは、ＣＣｌ４および５％エタノールの食餌を８週間与えることにより肝硬変を誘発させた、肝硬変マウスモデルからの肝硬変肝組織（パラホルムアルデヒド固定およびパラフィン包埋）を示す。組織は、ズダンブラックＢで染色した。可視照明および検出において、図１０Ａにおけるリポフスチンの範囲は、濃灰色／黒色色素によって示される。図１０Ｂは、同一の組織片が、８０８ｎｍ励起およびＮＩＲ／ＳＷＩＲ検出により、ズダンブラックＢ陽性エリアで自家蛍光を示したことを示す。これは、望まれるＮＩＲ／ＳＷＩＲ波長領域において自家蛍光シグナルを検出しながらも、可視波長領域でリポフスチンをクエンチすることができることを示す。
【００９５】
上記の実施例において、ズダンブラックＢ染色は、慣習的に非パラフィン包埋組織で行われ、そのときズダンブラックＢは脂肪／脂質も同じように染色するので、全く異なる染色パターンを示すことが認められる。脂肪／脂質はパラフィン包埋のプロセスで失われるため、ズダンブラックＢは、パラフィン包埋工程に対して頑健性のある、リポフスチンに特異的になる。
実施例：非アルコール性脂肪肝疾患の検出
【００９６】
以下の実施例は、疾患動物モデルにおける、リポフスチン／セロイドに起因するＮＩＲ／ＳＷＩＲ自家蛍光シグナルの観察を示す。非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）マウスモデルの肝臓と、肝硬変マウスモデルの肝臓の両方に、ｉｎ  ｖｉｖｏシグナル検出に十分な強いＮＩＲ／ＳＷＩＲ自家蛍光シグナルが見られた。例えば、マウスは、コントロール食（ＣＤ）、またはコリン欠乏Ｌ−アミノ酸制限高脂肪食（ＣＤＡＨＦＤ）（非アルコール性脂肪肝疾患を誘導することを意味する）のいずれかを、１２週間与えられた。図１１Ａおよび１１Ｂに示すように、ＣＤを給餌されたマウスは、肝臓におけるシグナル強度に基づいて、ＣＤＡＨＦＤを給餌されたマウスと明確に識別することが可能である（矢印で示す）。図１１Ａおよび１１Ｂは、雄性生殖器系のＮＩＲ／ＳＷＩＲ自家蛍光が同時に存在することも示す。図１２は、それぞれの食餌（上：ＣＤ、下：ＣＤＡＨＦＤ）を、３週間、６週間、９週間、および１２週間与えられたマウスのｅｘ  ｖｉｖｏ肝の代表的なイメージを示す。図１３Ａに示すように、ＣＤ給餌マウス（ｎ＝２４）の肝臓は、平均１２．５カウント毎ミリ秒（ｃｐｍｓ）のＮＩＲ／ＳＷＩＲ自家蛍光を示したのに対し、ＣＤＡＨＦＤ給餌マウスでは、３週間、６週間、９週間、および１２週間のＣＤＡＨＦＤ給餌で、それぞれ、平均でほぼ１８、２０、２４、および２９ｃｐｍｓであった（各時点につき、ｎ＝６）。ｅｘ  ｖｉｖｏ肝の蛍光強度の同じ定量を、各時点において、コントロールの平均強度に対するシグナルの増加量のパーセントで表し、図１３Ｂに示す。
実施例：ＣＣｌ４誘発性線維症のリアルタイム非侵襲性イメージング
【００９７】
異なる疾患メカニズムの２種類の進行性肝線維症モデルにおける自家蛍光を検討した。
【００９８】
１番目のモデルは、肝臓毒素誘発肝線維症であった。このモデルにおいて、投与された四塩化炭素（ＣＣｌ４）はフリーラジカルに代謝され、それが反応性酸素種に伝播する。実験の間、野生型Ｃ３Ｈｆ／Ｓｅｄマウスの３つの群に、５％エタノールの飲料水を適宜与えると共に、ＣＣｌ４を、オリーブオイルで、それぞれ３週間、６週間、および８週間にわたり、週３回、経口強制給餌によって投与した。同齢のコントロールに、オリーブオイルを経口強制給餌によって投与し、５％エタノール飲料水を与えた。
【００９９】
２番目のモデルは、門脈線維症を引き起こすことが知られている閉塞性胆汁うっ滞に基づくものであった。総胆管結紮（ＣＢＤＬ）術を行い、総胆管を二重結紮し、続発性胆汁性肝硬変を生じさせた。この処置の４週間後（この時点で肝硬変が生じていることが知られている）にマウスを屠殺した。
【０１００】
各疾患モデルおよび群の肝臓自家蛍光を、８０８ｎｍ励起によって、無傷の、剃毛した皮膚を通してｉｎ  ｖｉｖｏでイメージングし、また、切除した肝臓全体をｅｘ  ｖｉｖｏでイメージングし、その後、パラフィン包埋肝組織片のイメージングを行った。
【０１０１】
ＣＣｌ４処置マウスの肝臓自家蛍光シグナルは、測定した全ての時点において、同齢のコントロールマウスと明確に識別が可能であった。ＩｎＧａＡｓカメラを８５０ｎｍロングパス検出で用いて、肝臓からの自家蛍光は、覚醒自由行動下マウスにおける９．１７フレーム毎秒（ｆｐｓ）のリアルタイムイメージングのために十分な強度を有していた。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏで検出された肝臓自家蛍光シグナルの強度は、コントロールマウスに比べて、およそ２倍に強まっていた（ＣＣｌ４投与後３週間：ｐ＜０．００１６、ＣＣｌ４投与後６週間：ｐ＜０．００６９）（図１４参照）。ｅｘ  ｖｉｖｏ自家蛍光の定量により、肝臓自家蛍光は、同齢のコントロールに比べて、有意に増加することが示唆され、処置群とコントロール群の間のシグナル比は、３週間群と６週間群について、それぞれ１．８（ｐ＜２．４×１０−４）と２．２（ｐ＜９．６×１０−５）であった（図１５参照）。
【０１０２】
図１６および１７に示すように、ＣＢＤＬ線維症モデルにおける肝臓自家蛍光（それぞれ、ｉｎ  ｖｉｖｏとｅｘ  ｖｉｖｏ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏ測定の定量とｅｘ  ｖｉｖｏ測定の定量のいずれにおいても、ＣＢＤＬ処置を受けていない同齢のコントロールマウスと比較して、平均でほんのわずかに上昇していた（Ｐｉｎ  ｖｉｖｏ＜０．０１０、Ｐｅｘ  ｖｉｖｏ＜０．０１８）。さらに、ＣＢＤＬマウスにおける絶対的な肝臓自家蛍光シグナルは、上記のＣＣｌ４マウスモデルの場合よりも、著しく弱かった。理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＣｌ４モデルに比べて、線維症の発症においてＣＢＤＬマウスが受ける酸化ストレスは弱く、また、筋線維芽細胞の主な発生源に違いがある。これらの結果から、酸化損傷経路は、肝臓疾患の進行に伴う自家蛍光増強の因子であることを示唆している可能性があり、また形成に酸化が関係している自家蛍光色素（例えば、脂肪色素であるリポフスチンまたはセロイド）を指し示している可能性がある。さらに、ＣＢＤＬ処置マウスおよびＣＣｌ４処置マウスの両者において、胆管および胆嚢は、イメージング波長において自家蛍光しないことが認められたので、疾患に関連するＮＩＲ／ＳＷＩＲ自家蛍光シグナル源として、胆汁（すなわち、ビリベルジン／ビリルビン）の自家蛍光コンポーネントは除外された。
【０１０３】
自家蛍光シグナルを、ＣＣｌ４モデルおよびＣＢＤＬモデルからの肝組織サンプルで、顕微鏡法によってさらに検討した。疾患関連自家蛍光シグナルは、未染色のパラフィン包埋において検出しうることが認められた。この知見により、血液のコンポーネント（例えば、ポルフィリン）（一般的に、パラフィン包埋操作の間に洗い流される）は、シグナル源として除外された。ＣＣｌ４処置マウスの全ての群において、同齢のコントロールと比較して、自家蛍光のパーセント範囲が著しく増加していることが認められ（処置後６週までに約１５倍の増加）、これは線維症と相関しており、シリウスレッド染色によって確証された。具体的には、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングとｅｘ  ｖｉｖｏイメージングのどちらとも整合して、同齢のコントロールと比較して、３週間処置したマススと６週間処置したマウスとの間に、著しい違いがあった（Ｐ３週間＜３．８×１０−３、Ｐ６週間＜４．０×１０−３）。全肝臓イメージングと同様に、ＣＢＤＬ組織サンプルは、標準食コントロールマウスと比較して、小さいが有意に大きいパーセント範囲を示し（ｐ＜０．０１１）、これもまた、ＣＣｌ４サンプルに比べて著しく弱かった。
実施例：リポフスチン自家蛍光
【０１０４】
検出された自家蛍光シグナルの起源を決定するために、ＣＣｌ４モデルからのｅｘ  ｖｉｖｏ肝切片の組織学的染色を行った。脱パラフィン化し、さらに様々な種類のマウントメディアを用いたマウント手順を経た後も、実質的にクエンチングなしで、自家蛍光シグナルは残っており、また、脱パラフィン化し、染色し、マウントした組織で検出されたことで、ロバストなシグナルであることが示された。図１８は、コントロールとＣＣｌ４処置組織切片において観察された自家蛍光のパーセント範囲のグラフを示す。ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色およびＣＣｌ４誘発性肝硬変の病因に基づき、組織をマクロファージマーカーＦ４／８０、活性化肝臓星細胞（ＨＳＣ）マーカー、α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）、および細胆管反応マーカーＣＫ１９のために染色した。シグナルは、α−ＳＭＡまたはＣＫ１９と関係がなかった。しかしながら、図１９Ａに示すように、シグナルは、Ｆ４／８０と高い共局在を示した。イメージ中に観察された淡褐色の外観は、セロイドマクロファージを示唆しており、これはα−ＳＭＡ−Ｆ４／８０二重染色においてさらに顕著であり、これにより、α−ＳＭＡ陽性細胞とではなく、Ｆ４／８０細胞マーカーと共局在することが裏づけられた。セロイドマクロファージは、肝臓傷害および肝線維症と関連することが知られている。そこで、組織の自家蛍光応答を、リポフスチン／セロイド脂肪色素のための既知の３種類の染色（ズダンブラックＢ（ＳＢＢ）、ナイルブルーＡ硫酸塩（ＮＢＳ）、およびジアスターゼ消化過ヨウ素酸シッフ反応（ＰＡＳ−Ｄ））について検討した（図１９Ｂ〜１９Ｅ参照）。ＮＩＲ／ＳＷＩＲ自家蛍光は、図に示すとおり、組織のＳＢＢ陽性、ＮＢＳ陽性、およびＰＡＳ−Ｄ陽性の陽性部位と強い相関があった。また、自家蛍光シグナルを、ＮＢＳ−染色組織のアセトンによる脱染色と、それに続くＳＢＢによる再染色によってさらに試験したところ、再染色した組織の自家蛍光シグナルは、通常のリポフスチン染色の位置と重なっていた。よって、理論に拘束されることを望むものではないが、観察された酸化ストレス関連自家蛍光は、リポフスチン／セロイドに起因しうる可能性が高い。
実施例：ＣＣｌ４肝損傷の退行の非侵襲的追跡
【０１０５】
疾患の進行に関連するシグナルを測定する能力は、診断および疾患のステージ分類に実用上影響を与える。同様に、疾患の退行を測定する方法が望まれるであろう。賦活化された肝臓星細胞（ＨＳＣ）およびマクロファージについての、ＣＣｌ４処置を中止した後の可逆性を追跡するＩｎ  ｖｉｖｏ研究により、関連する自家蛍光が、同じように退行した可能性が示唆された。これらの研究は、賦活化されたＨＳＣは、不活性状態に逆戻りするのに加えて、アポトーシスによって排除されるが、マクロファージは、線維化反応の細胞コンポーネントとマトリックスコンポーネントの両者を消散させる役割を果たすことを示す。そこで、ＣＣｌ４処置を中止し、ＣＣｌ４肝損傷から回復させることによる、線維症の退行に応答した自家蛍光シグナルの挙動を検討した。具体的には、図２０に示すように、ＣＣｌ４を、オリーブオイルで、経口強制給餌によって、週３回、３週間投与し、続いてオリーブオイルのみを投与して５週間回復させた。この群と、図に同様に示されているように、ＣＣｌ４処置を全部で３週間受けたマウス、または８週間受けたマウス（上側に示す）を、オリーブオイルのみを投与された同齢のコントロールと共に比較した。全てのマウスは、検討が続いている間、５％エタノールの飲料水を適宜与えられた。
【０１０６】
自家蛍光強度は、ＣＣｌ４処置を３週間または８週間続けたマウスと比べて、肝線維症が退行しているマウスの方が有意に低く（Ｐｉｎ  ｖｉｖｏ＜７．３×１０−６、Ｐｅｘ  ｖｉｖｏ＜２．０×１０−１０）、これにより、ｉｎ  ｖｉｖｏとｅｘ  ｖｉｖｏの両者において、疾患の退行に伴う自家蛍光シグナルの逆戻りが実証された（それぞれ、図２１と２２参照）。退行群におけるＩｎ  ｖｉｖｏ自家蛍光は、図２１に示すように、オリーブオイルのみを与えられたマウスに近く、これは、比較的低レベルである自家蛍光が、上にかぶさっている組織によって減弱化および散乱されるためである可能性がありうる。しかしながら、図２２に示すように、肝線維症が退行しているマウス、またはＣＣｌ４による肝傷害を受けているマウスは、コントロール群と比べて、ｅｘ  ｖｉｖｏ自家蛍光が有意に高かった。
【０１０７】
退行モデルとＣＣｌ４処置８週間の未染色のパラフィン包埋肝組織片は、自家蛍光顕微鏡法において、上記のｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ測定と同様の傾向が見られた。退行群の自家蛍光シグナルは、ＣＣｌ４処置を３週間だけ、または８週間受けたマウスよりも低かったが、線維化していないコントロールのレベルまで完全には減少していなかった（図２３参照）。ＣＣｌ４中止後の肝線維症の退行は、シリウスレッド染色によって裏づけられ、これにより、ＣＣｌ４処置を続けたマウスに比べて、コラーゲンが著しく減少していることが示された。ＰＡＳ／ＤおよびＳＢＢを用いたリポフスチンの染色も、同様に、ＮＩＲ／ＳＷＩＲ自家蛍光イメージで見られた観察結果と類似するものであった。Ｈ＆Ｅ染色によっても、ＣＣｌ４処置３週間に比べて、退行モデルにおいて、リポフスチン誘発自家蛍光源であるセロイドマクロファージ数が減少していることが示された。Ｆ４／８０染色により、文献から予測されうるように、線維症関連マクロファージの減少が示された。合わせて考えると、これらの結果から、リポフスチン自家蛍光のＮＩＲ／ＳＷＩＲイメージングによって、ＣＣｌ４誘発性肝傷害の進行と退行の両方を追跡するための定量的な様式が提供されうることが示唆される。
実施例：リポフスチン自家蛍光による早期ＮＡＦＬＤの検出
【０１０８】
自家蛍光に関する、ＣＣｌ４誘発性線維症とＣＢＤＬ誘発性線維症との間の顕著な相異は、それぞれの病因・病態生理に関連する可能性があり、ＣＣｌ４の場合、リポフスチン形成の主要な促進因子である酸化ストレスへの依存度が高い。理論に拘束されることを望むものではないが、酸化ストレスは、同様に、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）において、重要な病態生理学的役割を果たしており、これが慢性肝疾患（ＣＬＤ）の主な要因の１つである。そこで、本開示のイメージング技術を、ＮＡＦＬＤマウスモデルの検討に用いた。
【０１０９】
食餌性ＮＡＦＬＤモデルを検討した。このモデルでは、マウスは、コントロール食（ＣＤ）またはコリン欠乏Ｌ−アミノ酸制限高脂肪食（ＣＤＡＨＦＤ）のいずれかを、３、６、９、１２、または１５週間（ｎ＝６〜８マウス／群）与えられた。ＣＤＡＨＦＤは、９〜１２週間の給餌後、線維症の累積を伴う早期非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を誘発する。各食餌期間の終わりに、肝臓の自家発光をイメージングし、すぐにｅｘ  ｖｉｖｏイメージングのために肝組織を切除し、次いで組織を処理した。
【０１１０】
ＣＤマウスと比較して、ＣＤＡＨＦＤマウスにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングとｅｘ  ｖｉｖｏイメージングのいずれについても、ＮＩＲ／ＳＷＩＲ自家蛍光は、より高いレベルで検出可能であった。９週間の給餌後、ｉｎ  ｖｉｖｏ自家蛍光とｅｘ  ｖｉｖｏ自家蛍光の平均シグナル強度は、同齢のコントロールよりも、それぞれ１．２倍と１．６倍高かった（Ｐｉｎ  ｖｉｖｏ＜０．０１７、Ｐｅｘ  ｖｉｖｏ＜３．８×１０−５）。１５週間の給餌までに、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの平均シグナル強度は、コントロールに対して、それぞれ１．８倍および２．８倍まで増加した（Ｐｉｎ  ｖｉｖｏ＜２．２×１０−４、Ｐｅｘ  ｖｉｖｏ＜５．１×１０−６）。各イメージング時点におけるシグナルの定量によって、自家蛍光が、経時的かつ（Ｈ＆Ｅ染色で示されるように）疾患の進行と共に、一様に増加することが示された。免疫化学的に染色したＣＤＡＨＦＤ肝臓は、ＰＡＳ／Ｄ、Ｆ４／８０との間で良好な相関を示し、ＳＢＢ染色は、ＣＣｌ４線維症モデルにおける知見と同様に、自家蛍光色素と相関を示した。さらに、各食餌群およびコントロール群からの肝切片の組織学的観察によって、ＣＤマウスは病理学的に正常な肝臓を有するが、ＣＤＡＨＦＤマウスは、３週以降、重篤な脂肪症が認められ、給餌１２週間で脂肪性肝炎および線維症の初期兆候（ＨＥおよびシリウスレッド染色に基づく）を示すことが確かめられた。予想されたとおり、自家蛍光シグナルの全体量、ならびにそれぞれの染色の起こり方は、ＣＣｌ４モデルよりも低かった。
【０１１１】
ＣＣｌ４線維症モデルを用いた退行実験と同様に、ＮＡＦＬＤモデルマウスの退行群を検討した。具体的には、ＣＤＡＨＦＤ食を９週間与えた後、食餌をＣＤに切り替えてさらに６週間給餌した。この期間の後、脂肪症の正常化が起こると期待された。これは、組織学的に、脂肪症の退行による実験において、また、これらのマウスの肝臓における炎症の風船様腫大が存在しないことによって実証された。しかしながら、この後、対応するｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏレベルでのＮＩＲ／ＳＷＩＲシグナルの減衰は起こらなかった。理論に拘束されることを望むものではないが、このことは、ＮＡＦＬＤにおけるリポフスチンの肝細胞局在によって説明できる可能性がある。リポフスチンは、ＣＣｌ４モデルにおけるセロイドマクロファージとは異なり、ひとたび傷害誘発処置を止めればすぐに消失するというわけではない。よって、測定されたシグナルは、この実質性肝疾患中の肝実質が受けた（酸化）ストレスの累積量を反映している可能性がある。
実施例：ＩＲ／ＩＧＦＲノックアウトリポジストロフィーモデルにおける進行性ＮＡＦＬＤ所見
【０１１２】
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、ヒトのリポジストロフィーおよびげっ歯動物リポジストロフィーモデルの所見でもある。全身性リポジストロフィーに罹患したヒトにおいて、ＮＡＦＬＤは、ＮＡＳＨおよび肝硬変に進行することが多く、その時には肝臓移植が必要になる。インスリン受容体（ＩＲ）およびインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦＲ）の脂肪特異的ノックアウト（ＫＯ）で観察されるげっ歯動物リポジストロフィーモデルは、低レプチンレベル、インスリン抵抗性、高脂血症、および脂肪肝疾患を含めて、ヒト全身性リポジストロフィーと類似している。このＫＯマウスは、肝臓肥大（肝臓重量が、体重の２５％に至る）を伴う、糖尿病、高脂血症、および進行性脂肪肝疾患を発症し、５２週齢までに、炎症、線維症、および高度異型肝結節に加えて、肝臓に球状変性の組織学的エビデンスが認められる。そこで、進行性ＮＡＦＬＤの全スペクトルを説明できる可能性があり、かつ、ヒトのＮＡＦＬＤの病理を反映している可能性がある、ＩＲ／ＩＧＦＲ−ＫＯマウスモデルにおける自家蛍光を検討した。
【０１１３】
５２週齢野生型マウスおよびＩＲ／ＩＧＦＲ−ＫＯマウスの、Ｈ＆Ｅ染色した肝組織を、８０８ｎｍで励起してイメージングした。同齢の野生型マウスに対して、ＫＯマウスは、ＮＩＲ／ＳＷＩＲ領域で高レベルの自家蛍光を示した。重篤な線維症もシリウスレッド染色によって確認された。自家蛍光シグナルは、ＣＣｌ４およびＣＤＡＨＦＤの実験と同様の方法で、野生型の肝組織（ｎ＝４）およびＫＯマウスの肝組織（ｎ＝５）のパラフィン包埋サンプル中のパーセント範囲で定量した。ＫＯマウスにおいて、シリウスレッドのパーセント範囲のみならず、自家蛍光シグナルのパーセント範囲も１２倍増加した（ｐ＜０．０００９）。リポフスチン／脂肪色素の蓄積物は、上記の２つのマウスモデルで用いたものと同じセットの染色を用いて裏づけられ、染色されたマーカーと、観察された自家蛍光シグナルの精緻な重なりが示された。
【０１１４】
ＩＲ／ＩＧＦＲ−ＫＯマウスにおける肝細胞球状変性は、進行性ＮＡＦＬＤであることを示しており、１２週齢までに、反応性酸素種および脂質過酸化のレベルが上昇し、これが、５２週齢になったときの高い自家蛍光シグナルの原因でありうる。さらに、このモデルは、５２週までに、炎症および線維症のｍＲＮＡマーカーを発現し、それによって重篤な間質性線維症（４ステージ中のステージ３）を呈する。よって、リポジストロフィーモデルは、ＮＡＦＬＤの進行に伴う自家発光の上昇が脂肪色素分子に起因し、この脂肪色素分子がＮＡＦＬＤの進行に伴う肝細胞傷害によって蓄積することを裏づけている。ＣＤＡＨＦＤ実験と同様に、リポフスチンの蓄積物は、斑点状構造を持ち、肝細胞中に局在しており、ＣＣｌ４モデルにおける線維症関連セロイドマクロファージとは対照的である。理論に拘束されることを望むものではないが、このモデルの結果は、脂肪色素染色に加えて、食餌誘発性ＮＡＦＬＤ中の増強されたシグナルが、実際に、疾患の進行の結果として起こるということを証明するのに役立つ。
実施例：ヒトの臨床的なＮＡＦＬ、ＮＡＳＨ、および肝硬変の検出方法としてのリポフスチン定量
【０１１５】
本開示の方法の潜在的な特異性を評価するために、ヒトの組織サンプルについてＮＩＲ／ＳＷＩＲ自家蛍光イメージングを行った。具体的には、生検した肝臓サンプルを脂肪症、風船様腫大、腺房内および門脈炎症、ならびに線維症の程度（構造的再構築の程度を含む）に基づいて等級分けした。多様な病歴およびステージのＮＡＦＬ、ＮＡＳＨ、および臨床的に診断された代償性肝硬変を有する１５名の患者から得た、未染色の生検肝組織のイメージを取得した。マウスの実験と同じ閾値法を用いて自家蛍光シグナルのパーセント範囲を決定することによって、組織サンプル中の自家蛍光を定量した。サンプルを等級分けおよびステージ分けし、次いでＮＡＳＨと、種々のステージの肝硬変に分けた。
【０１１６】
マクロファージ（クッパ−細胞）中にはいくつかのシグナルが存在するが、大半のシグナルは肝細胞中の斑点状構造から生じる。自家蛍光シグナルの分布および構造は、比較的正常な患者の組織（ここで、リポフスチンは比較的通常の加齢過程の一部として蓄積する）における分布および構造に従っているように見えた。幼年者の正常組織（２〜３歳、ｎ＝２）は、ＮＩＲ／ＳＷＩＲ波長において自家蛍光シグナルを示さなかったが、２０歳では、肝臓中のリポフスチンの蓄積物は定量可能であった。疾患肝組織に差異が認められ、疾患ステージに関連していた。例えば、硬変肝と診断された患者において、全リポフスチンシグナルは、正常肝組織およびＮＡＦＬＤ（ステージ１の線維症）と比べて著しく減少していた。これは、肝実質構造の再構築と、中隔肥厚を伴う重篤な線維症の蓄積物の再構築の両者に起因すると考えられる。リポフスチンの染色は、マウスモデルの結果に従い、ＣＤ６８がマクロファージの分布と頻度を示し、ＰＡＳ／ＤおよびＳＢＢは、リポフスチンおよび脂肪色素と相関を示した。
実施例：自家蛍光に基づくムコリピドーシスＩＶ型の検出
【０１１７】
自家蛍光イメージングを用いて、ムコリピドーシスＩＶ型（リソソーム蓄積障害のサブタイプである）のホモ接合型Ｍｃｏｌｎ１ノックアウトマウスを評価した。病理学的に正常な野生型およびヘテロ接合型Ｍｃｏｌｎ１ノックアウトマウスの自家蛍光イメージングも、コントロールとする目的で行った。脳の自家蛍光イメージングは、各群について、皮膚を除去した無傷の頭蓋骨を通して行った。脳のｉｎ  ｖｉｖｏ自家蛍光イメージングの後、続いて、肝臓、脾臓、心臓、脳、腎臓、および眼のｅｘ  ｖｉｖｏ自家蛍光イメージングを行った。図２４に示すように、ホモ接合型Ｍｃｏｌｎ１ノックアウト群について、自家蛍光シグナルの上昇は、脳のｉｎ  ｖｉｖｏで観察され、また、コントロール群に比べてリポフスチン蓄積が増加していると予想される構造におけるｅｘ  ｖｉｖｏイメージングでも観察された。具体的には、肝臓、心臓、脳、および腎臓において、自家蛍光シグナルの上昇が認められ、本開示の方法の、リソソーム蓄積障害の結果として生じるリポフスチン蓄積を検出する能力が裏づけられた。
実施例：リソソーム蓄積症
【０１１８】
ＮＩＲ／ＳＷＩＲ自家蛍光は、二次的な上方制御されたマクロオートファジー（増加しつつある（神経変性）疾患（例えば、ハンチントン病、パーキンソン病、およびアルツハイマー病など）につながりうる、主要な細胞内分解経路）を伴う、１２／１５−リポキシゲナーゼノックアウトマウスの脳でも検出された。これらの結果に基づき、リソソーム蓄積症（リソソーム蓄積症は、（神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）ファミリーの神経変性障害、またはムコリピドーシスのサブグループのように）酵素の欠乏、不足、または機能不全をもたらす先天性代謝異常であり、体内の種々の細胞中に不適切なリソソームの蓄積を引き起こす）に関連するリポフスチン様色素の蓄積も検出できうると考えられる
【０１１９】
本技術を種々の実施形態および実施例と共に説明したが、本技術をそれらの実施形態または実施例に限定することを意図するものではない。むしろ、本技術は、当業者が理解するであろうように、種々の代替物、改変物、および均等物を含む。したがって、上記の説明および図面は例示にすぎない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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