(57)【要約】  本発明は、５'キャップ化合物、特にそのような５'キャップ化合物によるＲＮＡの安定化に関し、そのような５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡを含む医薬組成物などの組成物および細胞、ならびに本発明による組成物または細胞を使用して目的のペプチドまたはタンパク質を生成する方法を提供する。さらに、本発明は、治療法で使用するため、特にタンパク質補充療法、ゲノム操作、遺伝的再プログラミング、および免疫療法によって疾患または障害を治療する方法；細胞内のＲＮＡの安定性を高める方法；細胞におけるＲＮＡの発現を増加させる方法；ならびにＲＮＡに５'キャップ構造を提供する方法において使用するためのＲＮＡ、組成物、または細胞を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2021515577.tif 000019
式（Ｉ）
［式中、Ｒ１は、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリール、および置換されていてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、および置換されていてもよいアルコキシからなる群より独立して選択されるか、またはＲ２とＲ３が一緒になってＯ−Ｘ−Ｏ［Ｘは、置換されていてもよいＣＨ２、置換されていてもよいＣＨ２ＣＨ２、置換されていてもよいＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、置換されていてもよいＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）、および置換されていてもよいＣ（ＣＨ３）２からなる群より選択される］を形成するか、またはＲ２は、Ｒ２が結合している環の４'位の水素原子と結合して−Ｏ−ＣＨ２−または−ＣＨ２−Ｏ−を形成し；
Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、およびＢＨ３からなる群より独立して選択され；
Ｒ５は、Ｓ、Ｓｅ、およびＢＨ３からなる群より選択され；
Ｒ７は、２〜９個の塩基を有するモノヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであり；
Ｒ８は、Ｈ、ハロ、または置換されていてもよいアルコキシであり；
ｎは１、２、または３であり；ならびに
Ｂはプリンまたはピリミジン塩基部分である］
による５'キャップ構造を有する５'キャップ化合物。
【請求項２】
Ｒ１が、置換されていてもよいＣ１−４アルキル、置換されていてもよいＣ２−４アルケニル、および置換されていてもよいアリールからなる群より選択される、請求項１に記載の５'キャップ化合物。
【請求項３】
Ｒ２およびＲ３が、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、および２−メトキシエトキシからなる群より独立して選択される、請求項１または２に記載の５'キャップ化合物。
【請求項４】
Ｒ２が、Ｈ、Ｆ、メトキシ、エトキシ、プロポキシおよび２−メトキシエトキシからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の５'キャップ化合物。
【請求項５】
Ｒ８が、Ｈ、Ｆ、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、および２−メトキシエトキシからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の５'キャップ化合物。
【請求項６】
Ｂが、天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基部分またはそれらの修飾形態である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の５'キャップ化合物。
【請求項７】
Ｂが、グアニン、アデニン、シトシン、チミン、ウラシル、およびそれらの修飾形態からなる群より、好ましくはグアニン、アデニン、シトシン、ウラシル、およびそれらの修飾形態からなる群より、より好ましくはグアニン、アデニン、シトシン、およびそれらの修飾形態からなる群より、より好ましくはグアニン、アデニン、およびそれらの修飾形態からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の５'キャップ化合物。
【請求項８】
前記修飾されたプリンまたはピリミジン塩基部分が、１つ以上のアルキル基、好ましくは１つ以上のＣ１−４アルキル基、より好ましくは１つ以上のメチル基で修飾されている、請求項７に記載の５'キャップ化合物。
【請求項９】
前記修飾されたプリンまたはピリミジン塩基部分が、Ｎ７−アルキル−グアニン、Ｎ６−アルキル−アデニン、５−アルキルシ−トシン、５−アルキル−ウラシル、およびＮ（１）−アルキル−ウラシルからなる群より、好ましくはＮ７−Ｃ１−４アルキル−グアニン、Ｎ６−Ｃ１−４アルキル−アデニン、５−Ｃ１−４アルキル−シトシン、５−Ｃ１−４アルキル−ウラシル、およびＮ（１）−Ｃ１−４アルキル−ウラシルからなる群より、より好ましくはＮ７−メチル−グアニン、Ｎ６−メチル−アデニン、５−メチル−シトシン、５−メチル−ウラシル、およびＮ（１）−メチル−ウラシルからなる群より選択される、請求項７または８に記載の５'キャップ化合物。
【請求項１０】
前記天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基部分が、ＧまたはＡ、好ましくはＧである、請求項６〜９のいずれか一項に記載の５'キャップ化合物。
【請求項１１】
ＢがＧまたはＡ、好ましくはＧである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の５'キャップ化合物。
【請求項１２】
Ｒ７が、２、３、４、５、または６個の塩基を有するモノヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の５'キャップ化合物。
【請求項１３】
Ｒ７が、その５'末端を介してＲ８が結合している環に結合している、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の５'キャップ化合物。
【請求項１４】
Ｒ７がリボモノヌクレオチドまたはリボオリゴヌクレオチドである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の５'キャップ化合物。
【請求項１５】
Ｒ７が、２'位に遊離ＯＨ基を有するリボヌクレオチドである、請求項１４に記載の５'キャップ化合物。
【請求項１６】
Ｒ７がリボオリゴヌクレオチドであり、前記リボオリゴヌクレオチドの３'末端のリボース部分および前記リボオリゴヌクレオチドの５'末端のリボース部分の両方が２'位に遊離ＯＨ基を有する、請求項１４に記載の５'キャップ化合物。
【請求項１７】
Ｒ７がリボオリゴヌクレオチドであり、少なくとも前記リボオリゴヌクレオチドの５'末端のリボースの２'位のＯＨ基が、Ｈ、ハロ、および置換されていてもよいアルコキシからなる群より選択される置換基で置換されており、ならびに前記リボオリゴヌクレオチドの３'末端のリボースが２'位に遊離ＯＨ基を有する、請求項１４に記載の５'キャップ化合物。
【請求項１８】
前記モノヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとＲ７が結合している前記環との間のヌクレオチド間結合が、ホスフェート、ホスホロチオエート、ボラノホスフェート、イミドホスフェート、アルキレンホスフェート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダイト、および非ヌクレオチドリンカーからなる群より選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の５'キャップ化合物。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの間のヌクレオチド間結合（１つまたは複数）が、ホスフェート、ホスホロチオエート、ボラノホスフェート、イミドホスフェート、アルキレンホスフェート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダイト、および非ヌクレオチドリンカーからなる群より選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の５'キャップ化合物。
【請求項２０】
前記置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学的配置が、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の５'キャップ化合物。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の５'キャップ化合物を含む組成物またはキット。
【請求項２２】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡ。
【請求項２３】
請求項２２に記載のＲＮＡを含む組成物または細胞。
【請求項２４】
前記ＲＮＡが、目的のペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２２に記載のＲＮＡまたは請求項２３に記載の組成物もしくは細胞。
【請求項２５】
請求項２４に記載のＲＮＡ、組成物または細胞を使用する工程を含む、目的のペプチドまたはタンパク質を生成する方法。
【請求項２６】
請求項２４に記載のＲＮＡ、組成物または細胞を個体に投与する工程を含む、前記個体において目的のペプチドまたはタンパク質を発現する方法。
【請求項２７】
治療法で使用するための、請求項２４に記載のＲＮＡ、組成物または細胞。
【請求項２８】
請求項２４に記載のＲＮＡ、組成物または細胞を対象に投与する工程を含む、前記対象における疾患または障害を治療する方法。
【請求項２９】
対象における疾患または障害を治療する方法で使用するための、請求項２４に記載のＲＮＡ、組成物または細胞。
【請求項３０】
疾患または障害の治療が、タンパク質補充療法、ゲノム操作、遺伝的再プログラミング、および免疫療法からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法、または請求項２９に記載の使用のためのＲＮＡ、組成物もしくは細胞。
【請求項３１】
前記ＲＮＡ、組成物または細胞が、最大で１日１回、好ましくは最大で２日に１回、好ましくは最大で３日に１回、または最大で４日に１回、前記対象に投与される、請求項２８もしくは３０に記載の方法、または請求項２９もしくは３０に記載の使用のためのＲＮＡ、組成物もしくは細胞。
【請求項３２】
前記ＲＮＡ、組成物または細胞が慢性患者または長期患者に、例えば少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、少なくとも５年間、または少なくとも１０年間、例えば最大２週間、最大３週間、最大４週間、最大１ヶ月間、最大２ヶ月間、最大３ヶ月間、最大４ヶ月間、最大５ヶ月間、最大６ヶ月間、最大１２ヶ月間、最大２年間、最大３年間、最大４年間、最大５年間、最大１０年間まで、または前記患者の全生涯などの長期間にわたって投与される、請求項２８、３０もしくは３１に記載の方法、または請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の使用のためのＲＮＡ、組成物もしくは細胞。
【請求項３３】
細胞におけるＲＮＡの安定性を高めるおよび／または細胞におけるＲＮＡの発現を増加させる方法であって、
‐前記ＲＮＡに請求項１〜２０のいずれか一項で定義された式（Ｉ）による構造を提供すること；および
‐式（Ｉ）による構造で修飾された前記ＲＮＡを前記細胞に移入すること
を含む方法。
【請求項３４】
前記ＲＮＡに式（Ｉ）による構造を提供する工程が、２'‐Ｏ‐リボースメチルトランスフェラーゼの非存在下で行われる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＲＮＡに５'キャップ構造を提供する方法であって、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の５'キャップ化合物の存在下で鋳型核酸を使用して転写反応を行うことを含む方法。
【請求項３６】
前記鋳型核酸がＤＮＡである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記転写反応がインビトロで行われる、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記転写反応が、Ｔ３、Ｔ７およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼからなる群より選択されるＲＮＡポリメラーゼを使用して行われる、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＲＮＡが、目的のペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
２'‐Ｏ‐リボースメチルトランスフェラーゼの非存在下で行われる、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の方法によって得られるＲＮＡ。
【請求項４２】
前記目的のペプチドまたはタンパク質が、エリスロポエチンなどのサイトカイン；インテグリンなどの接着分子；免疫グロブリン；免疫学的に活性な化合物、例えば抗原、例えば腫瘍関連抗原、病原体関連抗原（ウイルス抗原、例えばインフルエンザウイルス（インフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、または呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）の１つ以上の抗原など）、アレルゲン、または自己抗原；バソプレシン、インスリンまたは成長ホルモンなどのホルモン；ＶＥＧＦＡなどの成長因子；単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）、ヘキソサミニダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、プソイドコリンエステラーゼ、膵酵素、およびラクターゼなどの酵素；成長因子受容体などの受容体；α１−アンチトリプシンなどのプロテアーゼ阻害剤；ＢＡＸなどのアポトーシス調節因子；ＦＯＸＰ３などの転写因子；ｐ５３などの腫瘍抑制タンパク質；サーファクタントタンパク質などの構造タンパク質；ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、またはＮＡＮＯＧなどの再プログラミング因子；クラスタ化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピート‐ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）などのゲノム操作タンパク質；ならびにフィブリノゲンなどの血液タンパク質からなる群より選択される、請求項２４に記載のＲＮＡ、組成物もしくは細胞、請求項２５に記載の目的のペプチドもしくはタンパク質を生成する方法、請求項２６に記載の目的のペプチドまたはタンパク質を発現する方法、請求項２７および２９〜３１のいずれか一項に記載の使用のためのＲＮＡ、組成物もしくは細胞、請求項２８、３０および３１のいずれか一項に記載の疾患もしくは障害を治療する方法、請求項３８もしくは３９に記載の方法、または請求項３９に記載の方法によって得られる請求項４１に記載のＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５'キャップ化合物、特にトリヌクレオチドまたはより高級のホモログに関し、５'キャップ化合物は、第１のヌクレオチドと第２のヌクレオチドの間のリン酸架橋中に少なくとも１つのホスホロチオエート、ホスホロセレノエートおよび／またはボラノホスフェート部分を含み、第２のヌクレオチドはその２'位でブロックされている。特に、本発明は、特にワクチン接種の状況などの目的のペプチドまたはタンパク質を発現するためにＲＮＡを使用する状況における、そのような５'キャップ化合物によるＲＮＡの安定化に関し、そのような５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡを含む医薬組成物などの組成物および細胞、ならびに本発明による組成物または細胞を使用して目的のペプチドまたはタンパク質を生成する方法を提供する。さらに、本発明は、治療法で使用するため、特にタンパク質補充療法、ゲノム操作、遺伝的再プログラミング、または免疫療法によって疾患または障害を治療する方法；細胞内のＲＮＡの安定性を高める方法；細胞におけるＲＮＡの発現を増加させる方法；およびＲＮＡに５'キャップ構造を提供する方法において使用するためのＲＮＡ、組成物、または細胞を提供する。
【背景技術】
【０００２】
核酸にコードされた治療薬という概念は、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６５−１４６８）が、インビトロ転写された（ＩＶＴ）ｍＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）のマウス骨格筋への直接筋肉内注射が、注射された筋肉でコードされたタンパク質の発現をもたらすことを示した１９９０年に着想された。この所見は、治療法、特に免疫療法における核酸の適用可能性をさらに調べるためのこの分野における重要な動機となった。最初は、感染性病原体に対するＤＮＡベースのワクチンが研究された（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５６６４−５６６７；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２：１８４７−１８５１；Ｕｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４９；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：４１５６−４１６０）。さらに、腫瘍に対する遺伝子治療における核酸の適用可能性、および特異的抗腫瘍免疫の誘導のための核酸の適用可能性が研究されている（Ｃｏｎｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１１６４−１１６８；Ｃｏｎｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：５９−６５；Ｓｐｏｏｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：１７３−１８０；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：４０７−４１８）。
【０００３】
核酸に基づく治療法は多くの利点を示す。例えば、核酸ベースの治療薬の製造は簡単で、比較的コストがかからず、ＤＮＡベースの治療薬は長期間の保存に対して安定である。しかし、特にＤＮＡベースの治療薬は、抗ＤＮＡ抗体の誘導（Ｇｉｌｋｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１３９８−１４０２）および導入遺伝子の宿主ゲノムへの潜在的な組み込みなどの種々の潜在的な安全性リスクを示す。これは、細胞遺伝子の不活性化、導入遺伝子の制御不能な長期的発現、または腫瘍形成につながる可能性があり、したがって、ｅｒｂ−Ｂ２（Ｂａｒｇｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：２２６−２３０）およびｐ５３（Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：４８５５−４８７８）などの腫瘍形成能を有する腫瘍関連抗原には一般に適用されない。
【０００４】
ＲＮＡの使用は、ＤＮＡベースの治療薬の潜在的なリスクを回避する魅力的な代替策を提供する。ＲＮＡに基づく治療法の利点の一部は、一過性の発現および非形質転換特性である。さらに、ＲＮＡは、導入遺伝子が発現されるために核内に輸送される必要がなく、さらには、宿主ゲノムに組み込まれることができない。
【０００５】
ＩＶＴ  ＲＮＡによる治療法のために２つの異なる戦略が追求されており、どちらも様々な動物モデルで試験されて成功を収めている。ＲＮＡは、種々の経路によって患者に直接注入するか（Ｈｏｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１−７）、またはインビトロで従来のトランスフェクション法を用いて樹状細胞にＩＶＴ−ＲＮＡをトランスフェクトし、その後トランスフェクトされた樹状細胞を患者に投与する（Ｈｅｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：５５０８−５５１４）。ＲＮＡをトランスフェクトされた樹状細胞による免疫は、インビトロおよびインビボで抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導することが示されている（Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：２１２７−２１３３；Ｈｅｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：４０９−４１７）。さらに、実験動物のリンパ節への裸のＲＮＡの直接注入（結節内注入）は、おそらくマクロピノサイトーシスと呼ばれる過程によって、主に未成熟樹状細胞による前記ＲＮＡの取り込みをもたらすことが示されている（ドイツ特許第１０  ２００８  ０６１  ５２２．６号参照）。ＲＮＡが翻訳され、発現されたタンパク質が抗原提示細胞の表面上のＭＨＣ分子に提示されて免疫応答を誘発すると想定されている。
【０００６】
ＲＮＡに基づく治療法の主たる難点は、インビボでのＲＮＡの不安定性である。５'末端からの長鎖ＲＮＡの分解は、ｍ７ＧＤＰをＲＮＡ鎖から切断する、いわゆる「デキャッピング」酵素Ｄｃｐ２によって細胞内で誘導される。したがって、切断は、ＲＮＡキャップのαリン酸基とβリン酸基の間で起こると想定されている。
【０００７】
真核生物のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、５'末端に特定の構造、いわゆるキャップ構造を担持する。これは、ＲＮＡの最初に転写されたヌクレオチド、通常グアノシンに、５'−５'三リン酸架橋を介して付加されるＮ７−メチル化グアノシン部分からなる。したがって、この構造はしばしばｍ７ＧｐｐｐＧと称される。ｍ７ＧｐｐｐＧ構造は、中でも特にｍＲＮＡからコードされたタンパク質への翻訳に必要である。
【０００８】
高等真核生物における細胞ｍＲＮＡは、ｍ７Ｇｐｐｐ部分の後の最初のヌクレオチドの２'−０位でのメチル化によって５'末端でさらに修飾されている。この構造はキャップ１（非メチル化形態のキャップ０に対して）と呼ばれる。この修飾は４０年以上前に記述されたが、その機能は最近までよく理解されないままであった。２０１０年に、キャップの２'−０メチル化により、ＩＦＩＴタンパク質、特にＩＦＩＴ１などのキャップ０構造を認識するタンパク質による認識が回避されることが初めて報告された。ＩＦＩＴ１のキャップ０  ｍＲＮＡへの結合は、キャップ結合翻訳開始ｅＩＦ４Ｅの結合を損ない、翻訳効率の低下をもたらす。
【０００９】
合成ｍＲＮＡは、通常、ファージＲＮＡポリメラーゼ（主にＴ７またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）を使用して、適切なＤＮＡ鋳型（例えば線状化プラスミドＤＮＡ）からインビトロ転写によって生成される。キャップされたｍＲＮＡは、過剰のキャップジヌクレオチド、例えばｍ７ＧｐｐｐＧを反応に添加することによるインビトロ転写によって得ることができる。しかし、キャップジヌクレオチドｍ７ＧｐｐｐＧは、インビトロ転写中に２つの方向に組み込まれることができ、その一方だけが機能性であると報告された。そのため、ｍ７グアノシンの２'または３'位のいずれかでの修飾のために逆方向に組み込まれることができない抗リバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）が開発された。その結果、ウサギ網状赤血球溶解物および樹状細胞において、ＡＲＣＡでキャップされたｍＲＮＡは、ｍ７ＧｐｐｐＧでキャップされたＲＮＡと比較して優れた翻訳効率を示すことが実証された。
【００１０】
過去１０年間に、デキャッピング酵素に対してｍＲＮＡを安定化し、ｅＩＦ４Ｅに対する親和性を高めることによって翻訳効率を増強するために、ＡＲＣＡはさらに修飾された。修飾には、リン酸架橋中の架橋酸素および非架橋酸素での様々な置換、リン酸基伸長、およびグアノシン修飾が含まれる。この課題は、デキャッピング酵素Ｄｃｐ１−Ｄｃｐ２に対して不活性であるキャップ類似体が必ずしも開始因子の良好な基質であるとは限らず、結果として不十分にしか翻訳されないという事実によって複雑になる。しかし、βリン酸塩（ベータ−Ｓ−ＡＲＣＡまたはβ−Ｓ−ＡＲＣＡ）でのホスホロチオエート修飾キャップ類似体の使用は、ＡＲＣＡまたはｍ７ＧｐｐｐＧと比較して、例えば樹状細胞における増加した翻訳効率および延長した半減期の両方を有するｍＲＮＡをもたらした。β−Ｓ−ＡＲＣＡは、硫黄修飾によるＰ立体中心の導入により、ＨＰＬＣでの溶出パターンに基づいてＤ１およびＤ２と称される２つのジアステレオマーの混合物として合成される。興味深いことに、ジアステレオマーは、特に酵素的切断（Ｄｃｐ２切断など）に対する抵抗性および／またはｅＩＦ４Ｅへの結合に関して、異なる生物学的性質を有することが示された。過去にはｍ７ＧｐｐｐＧが一般的に使用されたが、ＡＲＣＡキャップｍＲＮＡはますます前臨床試験へ、そしてまた現在、臨床試験へと進みつつある。
【００１１】
キャップジヌクレオチドの２'−Ｏ位の修飾はファージＲＮＡポリメラーゼによる取り込みを阻害するので（ＡＲＣＡで好都合に使用されるように）、キャップ０構造だけがキャップジヌクレオチドを使用してインビトロで共転写的に付加されることができる。インビトロ転写されたＲＮＡのキャッピングは、例えばワクシニアウイルスからの対応する酵素を使用して転写後に達成することもできる。ここでは、キャップ１構造を得ることができる。しかし、その場合、合成工程は２段階、すなわち転写とそれに続くキャッピングからなり、より時間と労力を要するものになる。さらに、ＲＮＡの５'配列こそが、酵素によるキャッピング効率に強い影響を及ぼす。また、この方法は、酵素の特異性のために非修飾キャップに限定される。したがって、上記のような有益な修飾（例えばホスホロチオエート置換）のいずれも、この方法では組み込むことができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ドイツ特許第１０  ２００８  ０６１  ５２２．６号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６５−１４６８
【非特許文献２】Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５６６４−５６６７
【非特許文献３】Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２：１８４７−１８５１
【非特許文献４】Ｕｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４９
【非特許文献５】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：４１５６−４１６０
【非特許文献６】Ｃｏｎｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１１６４−１１６８
【非特許文献７】Ｃｏｒｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：５９−６５
【非特許文献８】Ｓｐｏｏｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：１７３−１８０
【非特許文献９】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：４０７−４１８
【非特許文献１０】Ｇｉｌｋｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１３９８−１４０２
【非特許文献１１】Ｂａｒｇｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：２２６−２３０
【非特許文献１２】Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：４８５５−４８７８
【非特許文献１３】Ｈｏｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１−７
【非特許文献１４】Ｈｅｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：５５０８−５５１４
【非特許文献１５】Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：２１２７−２１３３
【非特許文献１６】Ｈｅｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：４０９−４１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
要するに、ＲＮＡは特に臨床応用に適する。しかし、治療法におけるＲＮＡの使用は、特に細胞質におけるＲＮＡの短い半減期、および／またはＩＦＩＴタンパク質、特にＩＦＩＴ１などのキャップ０構造を認識するタンパク質によるＲＮＡの認識（それによりｅＩＦ４ＥへのＲＮＡの結合が損なわれる）によって主に制限され、これらの両方が低いおよび／または不十分なタンパク質発現をもたらす。したがって、ＲＮＡ療法のためには、細胞におけるＲＮＡの安定性および／またはＲＮＡ発現を増加させることが特に重要である。そこで、ＲＮＡ療法に特に適したＲＮＡを提供すること、すなわち特に細胞中でＲＮＡを安定化するおよび／またはＲＮＡ発現を増加させる手段を提供することが本発明の目的である。この技術的問題は、特許請求の範囲の主題により本発明に従って解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
第１の態様では、本発明は、式（Ｉ）：
【化１】
2021515577.tif 000002
式（Ｉ）
［式中、Ｒ１は、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリール、および置換されていてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、および置換されていてもよいアルコキシからなる群より独立して選択されるか、またはＲ２とＲ３が一緒になってＯ−Ｘ−Ｏ［Ｘは、置換されていてもよいＣＨ２、置換されていてもよいＣＨ２ＣＨ２、置換されていてもよいＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、置換されていてもよいＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）、および置換されていてもよいＣ（ＣＨ３）２からなる群より選択される］を形成するか、またはＲ２は、Ｒ２が結合している環の４'位の水素原子と結合して−Ｏ−ＣＨ２−または−ＣＨ２−Ｏ−を形成し；
Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、およびＢＨ３からなる群より独立して選択され；
Ｒ５は、Ｓ、Ｓｅ、およびＢＨ３からなる群より選択され；
Ｒ７は、２〜９個の塩基を有するモノヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであり；
Ｒ８は、Ｈ、ハロ、または置換されていてもよいアルコキシであり；
ｎは１、２、または３であり；ならびに
Ｂはプリンまたはピリミジン塩基部分である］
による５'キャップ構造を有する５'キャップ化合物を提供する。
【００１６】
第２の態様では、本発明は、第１の態様の５'キャップ化合物を含む組成物またはキットを提供する。そのようなキットまたは組成物は、本発明の５'キャップ構造を有するＲＮＡを提供するために使用され得る。
【００１７】
第３の態様では、本発明は、第１の態様の５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡを提供する。
【００１８】
第４の態様では、本発明は、第３の態様のＲＮＡを含む組成物または細胞を提供する。
【００１９】
本発明の第３および第４の態様の特に好ましい実施形態では、ＲＮＡは、目的のペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
【００２０】
第５の態様では、本発明は、第３の態様の特に好ましい実施形態のＲＮＡまたは第４の態様の特に好ましい実施形態の組成物もしくは細胞を使用する工程を含む、目的のペプチドまたはタンパク質を生成する方法を提供する。
【００２１】
第６の態様では、本発明は、第３の態様の特に好ましい実施形態のＲＮＡまたは第４の態様の特に好ましい実施形態の組成物もしくは細胞を個体に投与する工程を含む、前記個体において目的のペプチドまたはタンパク質を発現する方法を提供する。
【００２２】
第７の態様では、本発明は、治療法において使用するための、第３の態様の特に好ましい実施形態のＲＮＡまたは第４の態様の特に好ましい実施形態の組成物もしくは細胞を提供する。
【００２３】
第８の態様では、本発明は、第３の態様の特に好ましい実施形態のＲＮＡまたは第４の態様の特に好ましい実施形態の組成物もしくは細胞を対象に投与する工程を含む、前記対象における疾患または障害を治療する方法を提供する。疾患または障害の治療は、好ましくはタンパク質補充療法、ゲノム操作、遺伝的再プログラミング、および免疫療法からなる群より選択される。
【００２４】
第９の態様では、本発明は、対象における疾患または障害を治療する方法で使用するための、第３の態様の特に好ましい実施形態のＲＮＡまたは第４の態様の特に好ましい実施形態の組成物もしくは細胞を提供する。疾患または障害の治療は、好ましくはタンパク質補充療法、ゲノム操作、遺伝的再プログラミング、および免疫療法からなる群より選択される。
【００２５】
第１０の態様では、本発明は、細胞（未成熟抗原提示細胞など）におけるＲＮＡの安定性を高めるおよび／または細胞（未成熟抗原提示細胞など）におけるＲＮＡの発現を増加させる方法を提供し、前記方法は、第１の態様で定義された式（Ｉ）による構造を有する前記ＲＮＡを提供すること；および式（Ｉ）による構造で修飾された前記ＲＮＡを細胞に移入することを含む。
【００２６】
第１１の態様では、本発明は、５'キャップ構造を有するＲＮＡを提供する方法を提供し、前記方法は、第１の態様の５'キャップ化合物の存在下で鋳型核酸を使用して転写反応を行うことを含む。
【００２７】
さらなる態様では、本発明は以下を提供する：
−個体において免疫応答を誘発する方法であって、第３の態様の好ましい実施形態のＲＮＡまたは第４の態様の好ましい実施形態の組成物（好ましくはワクチン組成物の形態）もしくは細胞（好ましくは未成熟抗原提示細胞）を前記個体に投与する工程を含む方法；一実施形態では、この方法は、インフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、または呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）などのウイルスに対する免疫応答を誘発するためのものである；
−抗原提示細胞の表面に目的の抗原を提示するＭＨＣ分子の一部を増加させる方法であって、前記目的の抗原またはその抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、第１の態様で定義された式（Ｉ）による構造で修飾されているＲＮＡを提供すること；および式（Ｉ）による構造で修飾された前記ＲＮＡを未成熟抗原提示細胞に移入することを含む方法；一実施形態では、目的の抗原は、ウイルス（インフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶなど）の抗原またはその抗原ペプチドである；
−免疫エフェクタ細胞を刺激および／または活性化する方法であって、目的の抗原またはその抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、第１の態様で定義された式（Ｉ）による構造で修飾されたＲＮＡを提供すること；式（Ｉ）による構造で修飾された前記ＲＮＡを未成熟抗原提示細胞に移入すること；および抗原提示細胞を免疫エフェクタ細胞と接触させることを含む方法；一実施形態では、目的の抗原は、ウイルス（インフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶなど）の抗原またはその抗原ペプチドである；
−個体において免疫応答を誘導する方法であって、目的の抗原またはその抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、第１の態様で定義された式（Ｉ）による構造で修飾されたＲＮＡを提供すること；および式（Ｉ）による構造で修飾された前記ＲＮＡを前記個体に投与することを含む方法；一実施形態では、目的の抗原は、ウイルス（インフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶなど）の抗原またはその抗原ペプチドである；ならびに
−個体において免疫応答を誘導する方法であって、目的の抗原またはその抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、第１の態様で定義された式（Ｉ）による構造で修飾されたＲＮＡを提供すること；式（Ｉ）による構造で修飾された前記ＲＮＡを未成熟な抗原提示細胞に移入すること；および抗原提示細胞を前記個体に投与することを含む方法；一実施形態では、目的の抗原は、ウイルス（インフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶなど）の抗原またはその抗原ペプチドである。
【００２８】
本発明のさらなる態様ならびに利点および新規の特徴は、任意で付属の図面と併せて以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の例示的な５'キャップ化合物、ｍ２７，２'−ＯＧｐｐＳｐｍ２'−ＯＧｐＧ（以下「化合物１」；ＯＲ＝ＯＣＨ３）の合成のためのＰ−イミダゾリド前駆体（Ｉｍ−ｐｍ２'−ＯＧｐＧ）の合成。
【図２】化合物１（ｍ２７，２'−ＯＧｐｐＳｐｍ２'−ＯＧｐＧ；ＯＲ＝ＯＣＨ３）の合成（Ａ）およびＨＲＭＳスペクトル（Ｂ）。
【図３】異なる５'キャップ類似体で共転写的にキャップされたＲＮＡの翻訳可能性の比較。Ｄ１  β−Ｓ−ＡＲＣＡ：β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマー；Ｄ２  β−Ｓ−ＡＲＣＡ；β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマー；Ｄ１化合物１；化合物１のＤ１ジアステレオマー；Ｄ２化合物１；化合物１のＤ２ジアステレオマー。それぞれのキャップ構造を含むルシフェラーゼＲＮＡをｈｉＤＣにエレクトロポレーションした。ルシフェラーゼ活性を７２時間にわたって記録した。
【図４】異なる５'キャップ類似体で修飾されたＲＮＡのインビボ翻訳。Ｄ１／Ｄ２  β−Ｓ−ＡＲＣＡ  ＲＮＡ：β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１またはＤ２ジアステレオマーのいずれかを使用してＩＶＴによってＲＮＡを調製した；Ｄ１／Ｄ２化合物１  ＲＮＡ：化合物１のＤ１またはＤ２ジアステレオマーのいずれかを使用してＩＶＴによってＲＮＡを調製した；酵素的キャップ０／キャップ１  ＲＮＡ：キャップ類似体の非存在下でＩＶＴによってＲＮＡを調製し、次に２番目の工程では、ワクシニアキャッピング酵素単独を使用して（酵素的キャップ０  ＲＮＡ）またはメチルトランスフェラーゼと共にワクシニアキャッピング酵素を使用して（酵素的キャップ１  ＲＮＡ）、酵素的にキャップした。図４は、投与後６時間（Ａ）、２４時間（Ｂ）または４８時間（Ｃ）のルシフェラーゼシグナルを示す。
【図５】キャップ０構造（Ａ）またはキャップ１構造（Ｂ）を有する異なる５'キャップ類似体で修飾されたマウスエリスロポエチン（ｍＥＰＯ）ＲＮＡのインビボ翻訳。ＡＲＣＡ  Ｇ：ＡＲＣＡ  Ｇで共転写的にキャップされたＲＮＡ；Ｄ１：β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーで共転写的にキャップされたＲＮＡ；Ｅキャップ０：キャップ０構造を提供する酵素的にキャップされたＲＮＡ；ＡＲＣＡ  Ｇ＋Ｅキャップ１：ＡＲＣＡ  Ｇで共転写的にキャップされ、次にキャップ１構造を提供するワクシニアキャッピング酵素およびワクシニアメチルトランスフェラーゼを使用して酵素的にキャップされたＲＮＡ；Ｄ１＋Ｅキャップ１：β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーで共転写的にキャップされ、次にキャップ１構造を提供するワクシニアキャッピング酵素およびワクシニアメチルトランスフェラーゼを使用して酵素的にキャップされたＲＮＡ；Ｅキャップ１：キャップ１構造を提供する酵素的にキャップされたＲＮＡ。１−メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）を含むｍＥＰＯ  ｍＲＮＡ（３μｇ）をＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）で製剤化し、マウスに腹腔内注射した。図５は、注射後６時間、２４時間、４８時間または７２時間のマウスの血漿中のＥＰＯレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明をさらに以下でより詳細に説明するが、本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００３１】
以下において、本発明の要素をより詳細に説明する。これらの要素を特定の実施形態と共に列挙するが、それらは、追加の実施形態を創製するために任意の方法および任意の数で組み合わせてもよいことが理解されるべきである。様々に説明される例および好ましい実施形態は、本発明を明確に記述される実施形態のみに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明確に記述される実施形態を任意の数の開示される要素および／または好ましい要素と組み合わせた実施形態を支持し、包含すると理解されるべきである。さらに、本出願において記述されるすべての要素の任意の並び替えおよび組合せは、文脈上特に指示されない限り、本出願の説明によって開示されていると見なされるべきである。例えば、ある好ましい実施形態ではＲ１がメチルであり、別の好ましい実施形態ではＲ５がＳである場合、ある好ましい実施形態では、Ｒ１はメチルであり、Ｒ５はＳである。同様に、ある好ましい実施形態ではＲ７が＊ｐｍ２'−ＯＧｐＮであり、別の好ましい実施形態ではＲ８がＯＣＨ３である場合、ある好ましい実施形態では、Ｒ７は＊ｐｍ２'−ＯＧｐＮであり、Ｒ８はＯＣＨ３である。
【００３２】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、「Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）」，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ  Ｈ．Ｋｏｅｌｂｌ，Ｅｄｓ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，ＣＨ−４０１０  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）に記載されているように定義される。
【００３３】
本発明の実施は、特に指示されない限り、当技術分野の文献（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  １９８９参照）で説明されている化学、生化学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる。
【００３４】
本明細書および以下の特許請求の範囲全体を通して、文脈上特に必要とされない限り、「含む」という語および「含むこと」などの変形は、記述されるメンバー、整数もしくは工程またはメンバー、整数もしくは工程の群の包含を意味するが、いかなる他のメンバー、整数もしくは工程またはメンバー、整数もしくは工程の群の除外も意味しないと理解される。「から本質的になる」という用語は、本質的に重要な他のメンバー、整数、または工程を除外することを意味する。「含む」という用語は、「から本質的になる」という用語を包含し、次に、「からなる」という用語を包含する。したがって、本出願における各出現ごとに、「含む」という用語は、「から本質的になる」または「からなる」という用語で置き換えられてもよい。同様に、本出願における各出現ごとに、「から本質的になる」という用語は、「からなる」という用語で置き換えられてもよい。
【００３５】
本発明の説明に関連して（特に特許請求の範囲に関連して）使用される「１つの」および「その」という用語および類似の言及は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に属するそれぞれ別々の値を個別に言及することの簡略方法として機能することが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、各個別の値は、本明細書で個別に列挙されているかのごとくに本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的言語（例えば「など」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、特許請求される本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施に不可欠な、特許請求されていない要素を指示すると解釈されるべきではない。
【００３６】
本明細書の本文全体を通していくつかの資料を引用する。本明細書で引用される資料（すべての特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、指示書等を含む）の各々は、上記または下記のいずれでも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明のためにそのような開示に先行する権利を有さないことの承認と解釈されるべきではない。
【００３７】
本発明によれば、「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、それらの組合せ、およびそれらの修飾形態を含む。この用語には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え生産された分子、および化学的に合成された分子が含まれる。本発明によれば、核酸は、一本鎖または二本鎖の線状または共有結合閉環分子として存在し得る。本発明によれば、核酸は単離することができる。「単離された核酸」という用語は、本発明によれば、核酸が、（ｉ）例えばＤＮＡについてはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってもしくはＲＮＡについてはインビトロ転写（例えばＲＮＡポリメラーゼを使用して）によって、インビトロで増幅された、（ｉｉ）クローニングによって組換え生産された、（ｉｉｉ）例えば切断およびゲル電気泳動による分離によって精製された、または（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。
【００３８】
本発明の文脈において、「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボヌクレオチド残基を含み、好ましくは完全にまたは実質的にデオキシリボヌクレオチド残基からなる分子に関する。「デオキシリボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２'位のヒドロキシル基を欠くヌクレオチドに関する。「ＤＮＡ」という用語は、部分的または完全に精製されたＤＮＡ、本質的に純粋なＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および組換え生成されたＤＮＡなどの単離されたＤＮＡを含み、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然に存在するＤＮＡとは異なる修飾されたＤＮＡを含む。そのような改変は、例えばＤＮＡの末端（一方もしくは両方）または内部への、例えばＤＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおける非ヌクレオチド物質の付加を含み得る。ＤＮＡ分子中のヌクレオチドはまた、非天然のヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドなどの非標準のヌクレオチドも含み得る。これらの変更されたＤＮＡは、類似体または天然に存在するＤＮＡの類似体と称され得る。
【００３９】
本発明の文脈において、「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチド残基を含み、好ましくは完全にまたは実質的にリボヌクレオチド残基からなる分子に関する。「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。「ＲＮＡ」という用語は、部分的または完全に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、および組換えで生成されたＲＮＡを含み、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる修飾されたＲＮＡを含む。そのような改変は、例えばＲＮＡの末端（一方もしくは両方）または内部への、例えばＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおける非ヌクレオチド物質の付加を含み得る。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非天然のヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドなどの非標準のヌクレオチドも含み得る。これらの改変／修飾ヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドの類似体と称され得、そのような改変／修飾ヌクレオチドを含む対応するＲＮＡ（すなわち改変／修飾ＲＮＡ）は、天然に存在するＲＮＡの類似体と称され得る。分子中のリボヌクレオチド残基の含量が、分子中のヌクレオチド残基の総数に基づき、少なくとも４０％（例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）である場合、分子は「実質的にリボヌクレオシド残基からなる」。分子中のヌクレオチド残基の総数は、すべてのヌクレオチド残基（ヌクレオチド残基が標準（すなわち天然に存在する）ヌクレオチド残基であるかその類似体であるかに関わらず）の合計である。本発明の文脈において、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、本発明の５'キャップ化合物で修飾されており、好ましくは、以下に記載されるように、ＲＮＡをさらに安定化するために１つ以上のさらなる修飾を含む。
【００４０】
本発明によれば、ＲＮＡは、少なくとも２０、好ましくは少なくとも５０、特に少なくとも１００ヌクレオチド、例えば１００〜１５，０００、より好ましくは５０〜１０，０００、より好ましくは１００〜５，０００、特に２００〜１，０００ヌクレオチドの長さを有する。ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）は、好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも１５０、特に少なくとも２００ヌクレオチド、例えば１００〜１５，０００、より好ましくは５０〜１０，０００、より好ましくは１００〜５，０００、特に２００〜１，０００ヌクレオチドの長さを有する。
【００４１】
本発明によれば、「ＲＮＡ」は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、および阻害性ＲＮＡを含み、好ましくはｍＲＮＡである。
【００４２】
本発明によれば、「ｄｓＲＮＡ」は二本鎖ＲＮＡを意味し、２つの部分的または完全に相補的な鎖を有するＲＮＡである。
【００４３】
本発明によれば、「ｍＲＮＡ」という用語は「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡ鋳型を使用することによって生成され得、ペプチドまたはタンパク質をコードし得る「転写物」に関する。典型的には、ｍＲＮＡは、５'ＵＴＲ、ペプチド／タンパク質コード領域、および３'ＵＴＲを含む。本発明の文脈において、ｍＲＮＡは、好ましくはＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写（ＩＶＴ）によって生成される。上記のように、インビトロ転写の方法は当業者に公知であり、様々なインビトロ転写キットが市販されている。
【００４４】
ｍＲＮＡは一本鎖であるが、ｍＲＮＡの一部が折りたたまれ、それ自体と対合して二重らせんを形成することを可能にする自己相補的な配列を含み得る。
【００４５】
ｍＲＮＡは、細胞内およびインビトロで限られた半減期しか有さない。したがって、本発明によれば、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率は、必要に応じて変更し得る。例えば、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡの安定化作用を有するおよび／または翻訳効率を増加させる１つ以上の修飾によって安定化され、その翻訳が増加し得る。そのような修飾は、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０３６３６６号に記載されている。本発明によるｍＲＮＡの発現を増加させるために、コード領域内、すなわち発現されるペプチドまたはタンパク質をコードする配列内で、好ましくは発現されるペプチドまたはタンパク質の配列を変化させずに、例えばＧＣ含量を増加させてｍＲＮＡの安定性を高め、コドン最適化を実施し、したがって細胞中での翻訳を増強するようにｍＲＮＡを修飾し得る。
【００４６】
ＲＮＡは、細胞から単離することができ、ＤＮＡ鋳型から作製することができ、または当技術分野で公知の方法を使用して化学的に合成することができる。好ましい実施形態では、ＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型からインビトロで合成される。１つの特に好ましい実施形態では、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって生成される。インビトロ転写の方法論は当業者に公知である；例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  １９８９参照。さらに、様々なインビトロ転写キットが、例えばＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔＡｉｄ（商標）Ｔ７キット、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７キット、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ（登録商標）など）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．（ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７キット、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７  ＡＲＣＡ  ｍＲＮＡキットなど）、Ｐｒｏｍｅｇａ（ＲｉｂｏＭＡＸ（商標）、ＨｅＬａＳｃｒｉｂｅ（登録商標）、Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ（登録商標）システムなど）、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＳＰ６またはＴ７転写キットなど）、およびＥｐｉｃｅｎｔｒｅ（ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ（商標）など）から市販されている。１つの特に好ましい実施形態では、ＲＮＡは、インビトロ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ  ＲＮＡ）である。修飾されたＲＮＡを提供するために、対応する修飾されたヌクレオチド、例えば修飾された天然に存在するヌクレオチド、非天然に存在するヌクレオチドおよび／または修飾された非天然に存在するヌクレオチドを合成（好ましくはインビトロ転写）中に組み込むことができ、または転写後にＲＮＡで修飾を行うおよび／またはＲＮＡに修飾を付加することができる。
【００４７】
本発明によるＲＮＡは、少なくとも本発明の５'キャップ化合物で修飾されている。
【００４８】
好ましい実施形態では、本発明によるＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質、好ましくは薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を含み、特に細胞または対象に移入された場合に、前記ペプチドまたはタンパク質を発現することができる。したがって、本発明によるＲＮＡは、好ましくは、ペプチドまたはタンパク質をコードする、好ましくは薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域（オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））を含む。これに関して、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、開始コドンで始まり、終止コドンで終わる、連続する一続きのコドンである。
【００４９】
本発明によれば、「薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質」という用語は、ペプチドまたはタンパク質の発現が、例えば疾患または障害の症状を改善するのに有益である個体の治療に使用できるペプチドまたはタンパク質を意味する。好ましくは、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、治癒的または緩和的特性を有し、疾患または障害の１つ以上の症状を改善する、緩和する、軽減する、逆転させる、発症を遅延させるまたは重症度を軽減するために投与され得る。好ましくは、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、治療有効量で個体に投与された場合に、個体の状態または病状に対してプラスのまたは有利な効果を及ぼす。薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、予防的特性を有することができ、疾患または障害の発症を遅延させるため、またはそのような疾患または障害の重症度を軽減するために使用され得る。「薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質」という用語は、タンパク質またはポリペプチド全体を含み、その薬学的に活性な断片も指すことができる。この用語はまた、ペプチドまたはタンパク質の薬学的に活性な類似体を含み得る。
【００５０】
薬学的に活性なペプチドおよびタンパク質の特定の例には、サイトカイン、接着分子（特にインテグリン）、免疫グロブリン（例えば抗体）、免疫学的に活性な化合物（例えば抗原）、ホルモン、成長因子、プロテアーゼ阻害剤（例えばα１−アンチトリプシン）、酵素（例えば単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）、ヘキソサミニダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、プソイドコリンエステラーゼ、膵酵素、およびラクターゼ）、受容体（例えば成長因子受容体）、アポトーシス調節因子、転写因子、腫瘍抑制タンパク質、構造タンパク質、再プログラミング因子、ゲノム操作タンパク質、および血液タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
本発明によれば、「サイトカイン」という用語は、約５〜２０ｋＤａの分子量を有し、細胞シグナル伝達（例えばパラクリン、内分泌、および／またはオートクリンシグナル伝達）に関与するタンパク質に関する。特に、サイトカインは、放出された場合、放出された場所周辺の細胞の挙動に影響を及ぼす。サイトカインの例には、リンホカイン、インターロイキン、ケモカイン、インターフェロン、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が含まれる。本出願によれば、サイトカインはホルモンまたは成長因子を含まない。サイトカインは、（ｉ）通常、ホルモンよりもはるかに多様な濃度で作用し、および（ｉｉ）一般に広範囲の細胞によって作られる（ほぼすべての有核細胞がサイトカインを産生できる）という点でホルモンとは異なる。インターフェロンは通常、抗ウイルス活性、抗増殖活性、および免疫調節活性を特徴とする。インターフェロンは、調節される細胞表面のインターフェロン受容体に結合することによって細胞内の遺伝子の転写を変化させ、調節するタンパク質であり、それにより細胞内のウイルス複製を防止する。インターフェロンは２つのタイプに分類することができる。ＩＦＮ−γは唯一のＩＩ型インターフェロンである；他はすべてＩ型インターフェロンである。Ｉ型とＩＩ型のインターフェロンは、遺伝子構造（ＩＩ型インターフェロン遺伝子は３つのエクソンを有し、Ｉ型は１つのエクソンを有する）、染色体位置（ヒトでは、ＩＩ型は１２番染色体に位置し、Ｉ型インターフェロン遺伝子は９番染色体に連鎖し、その上に存在する）、およびそれらが産生される組織の種類（Ｉ型インターフェロンは遍在的に合成され、ＩＩ型はリンパ球によって合成される）が異なる。Ｉ型インターフェロンは細胞受容体への結合を互いに競合的に阻害するが、ＩＩ型インターフェロンは異なる受容体を有する。本発明によれば、「インターフェロン」または「ＩＦＮ」という用語は、好ましくはＩ型インターフェロン、特にインターフェロンαおよびインターフェロンβに関する。サイトカインの特定の例には、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球‐マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、インターフェロンベータ（ＩＦＮβ）、インターフェロンガンマ（ＩＮＦγ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、およびインターロイキン１１（ＩＬ−１１）が含まれる。本発明によれば、「ホルモン」という用語は、腺によって産生されるシグナル伝達分子のクラスに関し、シグナル伝達は通常、（ｉ）特定の組織におけるホルモンの合成；（ｉｉ）貯蔵および分泌；（ｉｉｉ）その標的へのホルモンの輸送；（ｉｖ）受容体によるホルモンの結合；（ｖ）シグナルの中継と増幅；ならびに（ｖｉ）ホルモンの分解の工程を含む。ホルモンは、（１）通常、あまり多様でない濃度で作用し、および（２）一般に特定の種類の細胞によって作られるという点でサイトカインとは異なる。ホルモンの特定の例には、インスリン、バソプレシン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺ホルモン、成長ホルモン（ヒト成長ホルモンまたはウシソマトトロピンなど）、オキシトシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、グルカゴン、ソマトスタチン、コレシストキニン、ガストリン、レプチン、カテコールアミン、ゴナドトロピン、栄養ホルモン、およびドーパミンが含まれる。一実施形態では、「ホルモン」は、ペプチドまたはタンパク質ホルモン、例えばインスリン、バソプレシン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺ホルモン、成長ホルモン（ヒト成長ホルモンまたはウシソマトトロピンなど）、オキシトシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、グルカゴン、ソマトスタチン、コレシストキニン、ガストリン、およびレプチンである。
【００５２】
本発明によれば、「接着分子」という用語は、細胞の表面に位置し、細胞と他の細胞または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）との結合に関与するタンパク質に関する。接着分子は、典型的には膜貫通型受容体であり、カルシウム非依存性（例えばインテグリン、免疫グロブリンスーパーファミリー、リンパ球ホーミング受容体）とカルシウム依存性（カドヘリンおよびセレクチン）に分類することができる。接着分子の特定の例は、インテグリン、リンパ球ホーミング受容体、セレクチン（例えばＰ−セレクチン）、およびアドレシンである。
【００５３】
インテグリンはシグナル伝達にも関与する。特に、リガンド結合時に、インテグリンは細胞シグナル伝達経路、例えば受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）などの膜貫通タンパク質キナーゼの経路を調節する。そのような調節は、細胞の成長、分裂、生存、もしくは分化、またはアポトーシスをもたらすことができる。インテグリンの特定の例には、α１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α５β１、α６β１、α７β１、αＬβ２、αＭβ２、αＩＩｂβ３、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ５、αＶβ６、αＶβ８、およびα６β４が含まれる。
【００５４】
本発明によれば、「免疫グロブリン」または「免疫グロブリンスーパーファミリー」という用語は、細胞の認識、結合、および／または接着過程に関与する分子を指す。このスーパーファミリーに属する分子は、免疫グロブリンドメインまたは免疫グロブリンフォールドとして知られる領域を含むという特徴を共有する。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーには、抗体（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、共受容体（例えばＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９）、抗原受容体アクセサリー分子（例えばＣＤ−３γ、ＣＤ３−δ、ＣＤ−３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ）、共刺激または阻害性分子（例えばＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６）、およびその他（例えばＣＤ１４７、ＣＤ９０、ＣＤ７）が含まれる。
【００５５】
本発明によれば、「免疫学的に活性な化合物」という用語は、好ましくは免疫細胞の成熟を誘導および／もしくは抑制する、サイトカイン生合成を誘導および／もしくは抑制する、ならびに／またはＢ細胞による抗体産生を刺激することにより体液性免疫を変化させることによって、免疫応答を変化させる任意の化合物に関する。免疫学的に活性な化合物は、抗ウイルスおよび抗腫瘍活性を含むがこれらに限定されない強力な免疫刺激活性を有し、また免疫応答の他の局面を下方制御する、例えば免疫応答をＴＨ２免疫応答からシフトさせることもでき、これは広範囲のＴＨ２媒介性疾患を治療するのに有用である。免疫学的に活性な化合物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。免疫学的に活性な化合物の特定の例には、インターロイキン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球‐マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン、インテグリン、アドレシン、セレクチン、ホーミング受容体、および抗原、特に腫瘍関連抗原、病原体関連抗原（細菌、寄生生物、またはウイルス抗原（インフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶまたはＲＳＶ）の１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０）の抗原）、アレルゲン、および自己抗原が含まれる。
【００５６】
本発明によれば、「自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ）」または「自己抗原（ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎ）」という用語は、対象の体内に由来し（すなわち自己抗原は「自家抗原」とも呼ばれ得る）、この身体の正常な部分に対する異常に激しい免疫応答を生じさせる抗原を指す。自己抗原に対するそのような激しい免疫反応は、「自己免疫疾患」の原因であり得る。
【００５７】
本発明によれば、「アレルゲン」という用語は、対象の体外に由来し（すなわちアレルゲンは「異種抗原」とも呼ばれ得る）、対象の免疫系が、さもなければ対象に無害である認識された脅威を撃退する異常に激しい免疫応答を生じさせる、抗原の一種を指す。「アレルギー」とは、アレルゲンに対するそのような激しい免疫反応によって引き起こされる疾患である。アレルゲンは通常、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）応答を介してアトピー性個体におけるＩ型過敏反応を刺激することができる抗原である。アレルゲンの特定の例には、落花生タンパク質（例えばＡｒａ  ｈ  ２．０２）、オボアルブミン、草花粉タンパク質（例えばＰｈｌ  ｐ  ５）、およびイエダニのタンパク質（例えばＤｅｒ  ｐ  ２）に由来するアレルゲンが含まれる。
【００５８】
本発明によれば、「成長因子」という用語は、細胞の成長、増殖、治癒、および／または細胞分化を刺激することができる分子を指す。典型的には、成長因子は細胞間のシグナル伝達分子として機能する。「成長因子」という用語は、その標的細胞の表面上の特異的受容体に結合する特定のサイトカインおよびホルモンを含む。成長因子の例には、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＶＥＧＦＡなどの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子、エフリン、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ニューレグリン、ニューロトロフィン（例えば脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ））、胎盤成長因子（ＰＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、レナラーゼ（ＲＮＬＳ）（抗アポトーシス生存因子）、Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング増殖因子（トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β））、および腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）が含まれる。一実施形態では、「成長因子」は、ペプチドまたはタンパク質成長因子である。
【００５９】
本発明によれば、「酵素」という用語は、化学反応を加速する高分子生物学的触媒を指す。任意の触媒と同様に、酵素はそれらが触媒する反応で消費されず、前記反応の平衡を変化させない。他の多くの触媒とは異なり、酵素ははるかに特異的である。一実施形態では、酵素は、対象のホメオスタシスに不可欠であり、例えば酵素の機能不全（特に、突然変異、欠失または産生低下のいずれかによって引き起こされ得る活性低下）は疾患をもたらす。酵素の例には、コレステロールの生合成または分解の酵素、ステロイド生成酵素、キナーゼ、ヌクレアーゼ、ホスホジエステラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、デヒドロゲナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、アロマターゼ、シトクロム、アデニル酸またはグアニル酸シクラーゼ、およびノイラミニダーゼ、例えば組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）、ヘキソサミニダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、プソイドコリンエステラーゼ、膵酵素（例えばアミラーゼ、リパーゼ、およびプロテアーゼまたはそれらの混合物（パンクレリパーゼなど））、ならびにラクターゼが含まれる。
【００６０】
本発明によれば、「受容体」という用語は、細胞の外部からシグナル（特にリガンドと呼ばれる化学シグナル）を受け取るタンパク質分子を指す。受容体へのシグナル（例えばリガンド）の結合は、細胞のある種の応答、例えばキナーゼの細胞内活性化を引き起こす。受容体には、膜貫通型受容体（イオンチャネル連結型（イオンチャネル型）受容体、Ｇタンパク質結合（代謝型）受容体、および酵素結合受容体など）ならびに細胞内受容体（細胞質受容体および核内受容体など）が含まれる。受容体の特定の例には、ステロイドホルモン受容体、成長因子受容体、およびＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）などのペプチド受容体（すなわちそのリガンドがペプチドである受容体）が含まれる。「成長因子受容体」という用語は、成長因子に結合する受容体を指す。成長因子受容体は、細胞の分化と増殖のためのシグナル伝達カスケードの最初の段階である。成長因子受容体は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＭＡＰキナーゼ、およびＰＩ３キナーゼ経路を使用し得る。
【００６１】
本発明によれば、「プロテアーゼ阻害剤」という用語は、プロテアーゼの機能を阻害する分子、特にペプチドまたはタンパク質を指す。プロテアーゼ阻害剤は、阻害されるプロテアーゼによって（例えばアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、メタロプロテアーゼ阻害剤、セリンプロテアーゼ阻害剤、トレオニンプロテアーゼ阻害剤、トリプシン阻害剤）またはそれらの作用機構によって（例えばセルピンなどの自殺阻害剤）分類することができる。プロテアーゼ阻害剤の特定の例には、α１−アンチトリプシン、アプロチニン、およびベスタチンなどのセルピンが含まれる。
【００６２】
本発明によれば、「アポトーシス調節因子」という用語は、アポトーシスを調節する、すなわちアポトーシスを活性化するかまたは阻害する分子、特にペプチドまたはタンパク質を指す。アポトーシス調節因子は、ミトコンドリア機能を調節するものとカスパーゼを調節するものの２つの大きなクラスに分類できる。最初のクラスには、ミトコンドリア膜電位の損失および／またはサイトゾルへのシトクロムＣなどのアポトーシス促進性タンパク質の放出を防ぐことによってミトコンドリアの完全性を維持するように働くタンパク質（例えばＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ｘＬ）が含まれる。また、シトクロムＣの放出を促進するアポトーシス促進性タンパク質（例えばＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＩＭ）もこの最初のクラスに属する。２番目のクラスには、アポトーシスタンパク質の阻害剤（例えばＸＩＡＰ）またはカスパーゼの活性化をブロックするＦＬＩＰなどのタンパク質が含まれる。アポトーシス調節因子の特定の例は、ＢＡＸ、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ｘＬ、ＢＡＫ、ＢＩＭ、ＸＩＡＰ、およびＦＬＩＰ、特にＢＡＸである。
【００６３】
本発明によれば、「転写因子」という用語は、特に特定のＤＮＡ配列に結合することによって、ＤＮＡからメッセンジャーＲＮＡへの遺伝情報の転写の速度を調節するタンパク質に関する。転写因子は、生涯を通じて細胞分裂、細胞増殖、および細胞死を調節し、胚発生中の細胞移動および組織化を調節し、ならびに／またはホルモンなどの細胞外からのシグナルに応答して調節し得る。転写因子は、通常は転写因子によって調節される遺伝子に隣接する、特定のＤＮＡ配列に結合する少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを含む。転写因子の特定の例には、肝細胞核因子、ＭＥＣＰ２、インスリンプロモータ因子１、ＦＯＸＰ２、ＦＯＸＰ３、ＳＴＡＴタンパク質ファミリー、ｐ５３、ＨＯＸタンパク質ファミリー、およびＳＯＸ２などのＳＯＸタンパク質が含まれる。
【００６４】
本発明によれば、「腫瘍抑制タンパク質」という用語は、細胞を癌への経路の一段階から保護する分子、特にペプチドまたはタンパク質に関する。腫瘍抑制タンパク質（通常、対応する腫瘍抑制遺伝子によってコードされる）は、細胞周期の調節に対する減弱化もしくは抑制作用を示し、および／またはアポトーシスを促進する。その機能は以下の１つ以上であり得る：細胞周期の継続に不可欠な遺伝子の抑制；ＤＮＡ損傷への細胞周期の連結（損傷したＤＮＡが細胞内に存在する限り、細胞分裂は起こらないはずである）；損傷したＤＮＡを修復できない場合、アポトーシスの開始；転移抑制（例えば腫瘍細胞の分散を防ぎ、接触阻害の喪失をブロックし、および転移を阻害する）；ならびにＤＮＡ修復。腫瘍抑制タンパク質の特定の例には、ｐ５３、ホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、ＳＷＩ／ＳＮＦ（ＳＷＩｔｃｈ／ショ糖非発酵性）、フォンヒッペル‐リンダウ腫瘍抑制因子（ｐＶＨＬ）、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）、ＣＤ９５、腫瘍原性抑制５（ＳＴ５）、腫瘍原性抑制５（ＳＴ５）、腫瘍原性抑制１４（ＳＴ１４）、およびＹｉｐｐｅｅ様３（ＹＰＥＬ３）が含まれる。
【００６５】
本発明によれば、「構造タンパク質」という用語は、さもなければ流動性の生物学的成分に堅さと剛性を与えるタンパク質を指す。構造タンパク質は、大部分が線維状（コラーゲンおよびエラスチンなど）であるが、球状（アクチンおよびチューブリンなど）の場合もある。通常、球状タンパク質はモノマーとして可溶性であるが、重合して、例えば細胞骨格を構成し得る長い線維を形成する。他の構造タンパク質は、機械力を生成することができるモータタンパク質（ミオシン、キネシン、およびダイニンなど）、ならびにサーファクタントタンパク質である。構造タンパク質の特定の例には、コラーゲン、フィブロイン、フィブリノゲン、サーファクタントタンパク質Ａ、サーファクタントタンパク質Ｂ、サーファクタントタンパク質Ｃ、サーファクタントタンパク質Ｄ、エラスチン、チューブリン、アクチン、およびミオシンが含まれる。
【００６６】
本発明によれば、「再プログラミング因子」または「再プログラミング転写因子」という用語は、任意でさらなる再プログラミング因子などのさらなる作用物質と共に体細胞で発現された場合、幹細胞特性、特に多能性を有する細胞への前記体細胞の再プログラミングまたは脱分化をもたらす分子、特にペプチドまたはタンパク質に関する。再プログラミング因子の特定の例には、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、およびＮＡＮＯＧが含まれる。
【００６７】
本発明によれば、「ゲノム操作タンパク質」という用語は、ＤＮＡを対象のゲノムに挿入する、ゲノムから欠失させるまたは置換することができるタンパク質に関する。ゲノム操作タンパク質の特定の例には、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスタ化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピート‐ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）が含まれる。
【００６８】
本発明によれば、「血液タンパク質」という用語は、対象の血漿、特に健常対象の血漿中に存在するペプチドまたはタンパク質に関する。血液タンパク質は、輸送（例えばアルブミン、トランスフェリン）、酵素活性（例えばトロンビンまたはセルロプラスミン）、血液凝固（例えばフィブリノゲン）、病原体に対する防御（例えば補体成分および免疫グロブリン）、プロテアーゼ阻害剤（例えばα１‐アンチトリプシン）などの多様な機能を有する。血液タンパク質の特定の例には、トロンビン、血清アルブミン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、インスリン、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、プロテインＣ、フォンビルブラント因子、アンチトロンビンＩＩＩ、グルコセレブロシダーゼ、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）、修飾第ＶＩＩＩ因子、および抗凝固因子が含まれる。
【００６９】
本発明によれば、「タンパク質補充療法」という用語は、健常対象と比較して患者において活性が低下しているペプチドまたはタンパク質を補充または置換する医学的治療に関する。活性低下（患者の体内にペプチドまたはタンパク質が存在しない場合であり得るゼロ活性を含む）は、（ｉ）ペプチドもしくはタンパク質の発現減少（すなわちペプチドもしくはタンパク質は十分に機能性であるが、その量が減少している）または（ｉｉ）発現されたペプチドもしくはタンパク質のアミノ酸配列における１つ以上の突然変異の存在（すなわちペプチドまたはタンパク質は十分に機能性ではない）の結果であり得る。例えば、ペプチドまたはタンパク質のこの活性低下は、ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子が、（ｉ）前記遺伝子の発現が低下もしくはサイレンシングし、それによりペプチドまたはタンパク質（まだ十分に機能性であり得る）の量の減少をもたらすおよび／または（ｉｉ）前記遺伝子によってコードされるペプチドもしくはタンパク質のアミノ酸配列が１つ以上の突然変異を含み、それにより十分に機能性ではない（もしくは非機能性の）ペプチドもしくはタンパク質をもたらすような方法で１つ以上の突然変異を含むことの結果であり得る。患者におけるペプチドまたはタンパク質の活性低下によって引き起こされる疾患または障害は、例えばペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡ（特に本発明のＲＮＡ）をそのような疾患または障害を有する患者に投与することにより、ペプチドまたはタンパク質を置換または補充すること（タンパク質補充療法）によって治療され得る。ペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、患者にとって自家であっても異種であってもよい。しかし、患者におけるペプチドまたはタンパク質の活性低下が１つ以上の突然変異に起因する（すなわち十分に機能性でない（または非機能性の）ペプチドまたはタンパク質をもたらす）場合、ペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、患者にとって異種であること、特にペプチドまたはタンパク質をその天然（すなわち非変異）形態で発現する（同じ種の）健常対象から得られることが好ましい。例えば、そのようなタンパク質補充療法は、（ｉ）前記ペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡ（特に本発明のＲＮＡ）（前記ヌクレオチド配列は、好ましくは異種であり、健常対象から得られ得る）または（ｉｉ）そのようなＲＮＡを含む組成物、例えば医薬組成物を患者に投与する工程、あるいは（ａ）前記ペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡ（特に本発明のＲＮＡ）（前記ヌクレオチド配列は、好ましくは異種であり、健常対象から得られ得る）を細胞に移入する工程（前記細胞は患者にとって自家であり得る）および（ｂ）前記トランスフェクトされた細胞を患者に投与する工程を含み得る。代替法（ｉ）では、ＲＮＡは、好ましくは細胞（例えば単球、マクロファージ、もしくは樹状細胞などの抗原提示細胞、または他の細胞）に取り込まれ、ペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列の翻訳産物が形成されて（および任意で翻訳後に修飾されて）、前記ペプチドまたはタンパク質を生成する。代替法（ｉｉ）では、トランスフェクトされた細胞の患者への投与後に、トランスフェクト細胞は、好ましくはペプチドまたはタンパク質を発現する。
【００７０】
「ゲノム操作」という用語は、好ましくはゲノム操作タンパク質を使用することによって、ＤＮＡを対象のゲノムに挿入する、ゲノムから欠失させるまたは置換する過程に関する。ゲノム操作タンパク質の特定の例には、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスタ化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピート‐ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）が含まれる。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「遺伝的再プログラミング」とは、細胞の遺伝的プログラムの再設定を指す。再プログラミングされた細胞は、好ましくは多能性を示す。
【００７２】
一実施形態では、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、疾患関連ペプチドまたはタンパク質であり、すなわち疾患または障害と因果関係がある。
【００７３】
例えば、疾患または障害は、ペプチドまたはタンパク質の活性低下によって引き起こされ得る。活性低下は、（ｉ）ペプチドもしくはタンパク質の発現減少（すなわちペプチドもしくはタンパク質は十分に機能性であるが、その量が減少している）または（ｉｉ）発現されたペプチドもしくはタンパク質のアミノ酸配列における１つ以上の突然変異の存在（すなわちペプチドもしくはタンパク質が十分に機能性ではない）の結果であり得る。例えば、ペプチドまたはタンパク質のこの活性低下は、ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子が、（ｉ）前記遺伝子の発現が低下もしくはサイレンシングし、それによりペプチドまたはタンパク質（まだ十分に機能性であり得る）の量の減少をもたらすおよび／または（ｉｉ）前記遺伝子によってコードされるペプチドもしくはタンパク質のアミノ酸配列が１つ以上の突然変異を含み、それにより十分に機能性ではない（または非機能性の）ペプチドもしくはタンパク質をもたらすような方法で１つ以上の突然変異を含むことの結果であり得る。患者におけるペプチドまたはタンパク質の活性低下によって引き起こされるそのような疾患または障害は、例えばペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡ（特に本発明のＲＮＡ）をそのような疾患または障害を有する患者に投与することにより、ペプチドまたはタンパク質を置換または補充すること（タンパク質補充療法）によって治療され得る。ペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、患者にとって自家であっても異種であってもよい。しかし、患者におけるペプチドまたはタンパク質の活性低下が１つ以上の突然変異に起因する（すなわち十分に機能性ではない（または非機能性の）ペプチドまたはタンパク質をもたらす）場合、ペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、異種であること、特にペプチドまたはタンパク質をその天然（すなわち非変異）形態で発現する（同じ種の）健常対象から得られることが好ましい。例えば、そのようなタンパク質補充療法は、（ｉ）前記ペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡ（特に本発明のＲＮＡ）（前記ヌクレオチド配列は、好ましくは異種であり、健常対象から得られ得る）または（ｉｉ）そのようなＲＮＡを含む組成物、例えば医薬組成物を患者に投与する工程、あるいは（ａ）前記ペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡ（特に本発明のＲＮＡ）（前記ヌクレオチド配列は、好ましくは異種であり、健常対象から得られ得る）を細胞に移入する工程（前記細胞は患者にとって自家であり得る）および（ｂ）前記トランスフェクトされた細胞を患者に投与する工程を含み得る。代替法（ｉ）では、ＲＮＡは、好ましくは細胞（例えば単球、マクロファージ、もしくは樹状細胞などの抗原提示細胞、または他の細胞）に取り込まれ、ペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列の翻訳産物が形成されて（および任意で翻訳後に修飾されて）、前記ペプチドまたはタンパク質を生成する。代替法（ｉｉ）では、トランスフェクトされた細胞の患者への投与後に、トランスフェクト細胞は、好ましくはペプチドまたはタンパク質を発現する。
【００７４】
あるいは、患者におけるペプチドまたはタンパク質の活性低下によって引き起こされるそのような疾患または障害は、ゲノム操作を使用することによって、例えばそのような疾患または障害を有する患者においてペプチドまたはタンパク質をコードする（すなわち十分に機能性ではない（または非機能性の）ペプチドまたはタンパク質をもたらす）ＤＮＡ配列を、ペプチドまたはタンパク質をその天然（すなわち非変異）形態でコードするＤＮＡ配列で置換することによって治療され得る。例えば、そのようなゲノム操作療法は、患者に、（ｉ）ゲノム操作タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡ（特に本発明のＲＮＡ）および（ｉｉ）ペプチドまたはタンパク質をその天然（すなわち非変異）形態でコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡを投与する工程を含み得る。投与後、好ましくは、ゲノム操作タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡおよびペプチドまたはタンパク質をその天然（すなわち非変異）形態でコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡは、細胞（特に疾患細胞）に取り込まれ、ゲノム操作タンパク質をコードするヌクレオチド配列の翻訳産物が形成されて（および任意で翻訳後修飾されて）、ゲノム操作タンパク質を生成し、ゲノム操作タンパク質は、ペプチドまたはタンパク質をその天然（すなわち非変異）形態でコードするＤＮＡと共に、細胞のゲノム内の変異ＤＮＡ配列を、ペプチドまたはタンパク質をその天然（すなわち非変異）形態でコードするＤＮＡ配列で置換するように働く。
【００７５】
さらなる代替法では、患者におけるペプチドまたはタンパク質の活性低下によって引き起こされるそのような疾患または障害は、遺伝的再プログラミングを使用することによって、例えばそのような疾患または障害を有する患者の体細胞（特に自己体細胞）を再プログラミングし、前記再プログラミングされた細胞を患者に投与することによって治療され得る。この治療アプローチは、所望のペプチドまたはタンパク質（例えばインスリンなどのホルモン）を産生する細胞の枯渇または消失を引き起こす疾患または障害を有する患者において特に有益であり得る。例えば、そのような遺伝的再プログラミング療法は、（ａ）１つ以上の再プログラミング因子をコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡ（特に本発明のＲＮＡ）を体細胞に導入する工程；（ｂ）幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程；および（ｃ）幹細胞特性を有する細胞を患者に投与する工程を含み得る。好ましい実施形態では、体細胞は患者にとって自家である。投与後、幹細胞特性を有する細胞は、好ましくは所望のペプチドまたはタンパク質を発現する細胞に分化する。
【００７６】
一実施形態では、疾患関連ペプチドまたはタンパク質などの薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、好ましくはエリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターロイキン４（ＩＬ−２）、およびインターロイキン１０（ＩＬ−１１）からなる群より選択されるサイトカイン、より好ましくはＥＰＯである。サイトカインの活性低下によって引き起こされる疾患もしくは障害、あるいはサイトカインの量の増加が（ｉ）疾患もしくは障害の１つ以上の症状を改善、緩和、軽減もしくは逆転させる、および／または（ｉｉ）疾患もしくは障害の発症を遅らせる、および／または（ｉｉｉ）疾患もしくは障害の重症度を軽減する、疾患または障害は、本明細書に記載されるような対応するタンパク質補充療法（例えばサイトカインを置換または補充することによる）、本明細書に記載されるような対応するゲノム操作療法、および／または本明細書に記載されるような遺伝的再プログラミング療法によって治療され得る。そのような疾患もしくは障害を有するかまたはそのような疾患もしくは障害を発症するリスクがある患者は、それに応じて治療することができる。
【００７７】
一実施形態では、疾患関連ペプチドまたはタンパク質などの薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、接着分子、特にインテグリンである。接着分子の活性低下によって引き起こされる疾患もしくは障害、あるいは接着分子の量の増加が（ｉ）疾患もしくは障害の１つ以上の症状を改善、緩和、軽減もしくは逆転させる、および／または（ｉｉ）疾患もしくは障害の発症を遅らせる、および／または（ｉｉｉ）疾患もしくは障害の重症度を軽減する、疾患または障害は、本明細書に記載されるような対応するタンパク質補充療法（例えば接着分子を置換または補充することによる）、本明細書に記載されるような対応するゲノム操作療法、および／または本明細書に記載されるような遺伝的再プログラミングによって治療され得る。そのような疾患もしくは障害を有するかまたはそのような疾患もしくは障害を発症するリスクがある患者は、それに応じて治療することができる。
【００７８】
一実施形態では、疾患関連ペプチドまたはタンパク質などの薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、ホルモン、特にバソプレシン、インスリンまたは成長ホルモンである。ホルモンの活性低下によって引き起こされる疾患もしくは障害、あるいはホルモンの量の増加が（ｉ）疾患もしくは障害の１つ以上の症状を改善、緩和、軽減もしくは逆転させる、および／または（ｉｉ）疾患もしくは障害の発症を遅らせる、および／または（ｉｉｉ）疾患もしくは障害の重症度を軽減する、疾患または障害は、本明細書に記載されるような対応するタンパク質補充療法（例えばホルモンを置換または補充することによる）、本明細書に記載されるような対応するゲノム操作療法、および／または本明細書に記載されるような遺伝的再プログラミング療法によって治療され得る。そのような疾患もしくは障害を有するかまたはそのような疾患もしくは障害を発症するリスクがある患者は、それに応じて治療することができる。
【００７９】
一実施形態では、疾患関連ペプチドまたはタンパク質などの薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、成長因子、特にＶＥＧＦＡである。成長因子の活性低下によって引き起こされる疾患もしくは障害、あるいは成長因子の量の増加が（ｉ）疾患もしくは障害の１つ以上の症状を改善、緩和、軽減もしくは逆転させる、および／または（ｉｉ）疾患もしくは障害の発症を遅らせる、および／または（ｉｉｉ）疾患もしくは障害の重症度を軽減する、疾患または障害は、本明細書に記載されるような対応するタンパク質補充療法（例えば成長因子を置換または補充することによる）、本明細書に記載されるような対応するゲノム操作療法、および／または本明細書に記載されるような遺伝的再プログラミング療法によって治療され得る。そのような疾患もしくは障害を有するかまたはそのような疾患もしくは障害を発症するリスクがある患者は、それに応じて治療することができる。
【００８０】
一実施形態では、疾患関連ペプチドまたはタンパク質などの薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、好ましくは単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）、ヘキソサミニダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、プソイドコリンエステラーゼ、膵酵素、およびラクターゼからなる群より選択される酵素である。酵素の活性低下によって引き起こされる疾患もしくは障害、あるいは酵素の量の増加が（ｉ）疾患もしくは障害の１つ以上の症状を改善、緩和、軽減もしくは逆転させる、および／または（ｉｉ）疾患もしくは障害の発症を遅らせる、および／または（ｉｉｉ）疾患もしくは障害の重症度を軽減する、疾患または障害は、本明細書に記載されるような対応するタンパク質補充療法（例えば酵素を置換または補充することによる）、本明細書に記載されるような対応するゲノム操作療法、および／または本明細書に記載されるような遺伝的再プログラミング療法によって治療され得る。そのような疾患もしくは障害を有するかまたはそのような疾患もしくは障害を発症するリスクがある患者は、それに応じて治療することができる。
【００８１】
一実施形態では、疾患関連ペプチドまたはタンパク質などの薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、受容体、特に成長因子受容体である。受容体の活性低下によって引き起こされる疾患もしくは障害、あるいは受容体の量の増加が（ｉ）疾患もしくは障害の１つ以上の症状を改善、緩和、軽減もしくは逆転させる、および／または（ｉｉ）疾患もしくは障害の発症を遅らせる、および／または（ｉｉｉ）疾患もしくは障害の重症度を軽減する、疾患または障害は、本明細書に記載されるような対応するタンパク質補充療法（例えば受容体を置換または補充することによる）、本明細書に記載されるような対応するゲノム操作療法、および／または本明細書に記載されるような遺伝的再プログラミング療法によって治療され得る。そのような疾患もしくは障害を有するかまたはそのような疾患もしくは障害を発症するリスクがある患者は、それに応じて治療することができる。
【００８２】
一実施形態では、疾患関連ペプチドまたはタンパク質などの薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、アポトーシス調節因子、特にＢＡＸである。アポトーシス調節因子の活性低下によって引き起こされる疾患もしくは障害、あるいはアポトーシス調節因子の量の増加が（ｉ）疾患もしくは障害の１つ以上の症状を改善、緩和、軽減もしくは逆転させる、および／または（ｉｉ）疾患もしくは障害の発症を遅らせる、および／または（ｉｉｉ）疾患もしくは障害の重症度を軽減する、疾患または障害は、本明細書に記載されるような対応するタンパク質補充療法（例えばアポトーシス調節因子を置換または補充することによる）、本明細書に記載されるような対応するゲノム操作療法、および／または本明細書に記載されるような遺伝的再プログラミング療法によって治療され得る。そのような疾患もしくは障害を有するかまたはそのような疾患もしくは障害を発症するリスクがある患者は、それに応じて治療することができる。
【００８３】
一実施形態では、疾患関連ペプチドまたはタンパク質などの薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、腫瘍抑制タンパク質、特にｐ５３である。腫瘍抑制タンパク質の活性低下によって引き起こされる疾患もしくは障害、あるいは腫瘍抑制タンパク質の量の増加が（ｉ）疾患もしくは障害の１つ以上の症状を改善、緩和、軽減もしくは逆転させる、および／または（ｉｉ）疾患もしくは障害の発症を遅らせる、および／または（ｉｉｉ）疾患もしくは障害の重症度を軽減する、疾患または障害は、本明細書に記載されるような対応するタンパク質補充療法（例えば腫瘍抑制タンパク質を置換または補充することによる）、本明細書に記載されるような対応するゲノム操作療法、および／または本明細書に記載されるような遺伝的再プログラミング療法によって治療され得る。そのような疾患もしくは障害を有するかまたはそのような疾患もしくは障害を発症するリスクがある患者は、それに応じて治療することができる。
【００８４】
一実施形態では、疾患関連ペプチドまたはタンパク質などの薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、構造タンパク質、特にサーファクタントタンパク質Ｂである。構造タンパク質の活性低下によって引き起こされる疾患もしくは障害、あるいは構造タンパク質の量の増加が（ｉ）疾患もしくは障害の１つ以上の症状を改善、緩和、軽減もしくは逆転させる、および／または（ｉｉ）疾患もしくは障害の発症を遅らせる、および／または（ｉｉｉ）疾患もしくは障害の重症度を軽減する、疾患または障害は、本明細書に記載されるような対応するタンパク質補充療法（例えば構造タンパク質を置換または補充することによる）、本明細書に記載されるような対応するゲノム操作療法、および／または本明細書に記載されるような遺伝的再プログラミング療法によって治療され得る。そのような疾患もしくは障害を有するかまたはそのような疾患もしくは障害を発症するリスクがある患者は、それに応じて治療することができる。
【００８５】
一実施形態では、疾患関連ペプチドまたはタンパク質などの薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、転写因子、特にＦＯＸＰ３である。転写因子の活性低下によって引き起こされる疾患もしくは障害、あるいは転写因子の量の増加が（ｉ）疾患もしくは障害の１つ以上の症状を改善、緩和、軽減もしくは逆転させる、および／または（ｉｉ）疾患もしくは障害の発症を遅らせる、および／または（ｉｉｉ）疾患もしくは障害の重症度を軽減する、疾患または障害は、本明細書に記載されるような対応するタンパク質補充療法（例えば転写因子を置換または補充することによる）、本明細書に記載されるような対応するゲノム操作療法、および／または本明細書に記載されるような遺伝的再プログラミング療法によって治療され得る。そのような疾患もしくは障害を有するかまたはそのような疾患もしくは障害を発症するリスクがある患者は、それに応じて治療することができる。
【００８６】
一実施形態では、疾患関連ペプチドまたはタンパク質などの薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、再プログラミング因子、例えばＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８およびＮＡＮＯＧである。再プログラミング因子の活性低下によって引き起こされる疾患もしくは障害、あるいは再プログラミング因子の量の増加が（ｉ）疾患もしくは障害の１つ以上の症状を改善、緩和、軽減もしくは逆転させる、および／または（ｉｉ）疾患もしくは障害の発症を遅らせる、および／または（ｉｉｉ）疾患もしくは障害の重症度を軽減する、疾患または障害は、本明細書に記載されるような対応するタンパク質補充療法（例えば再プログラミング因子を置換または補充することによる）、本明細書に記載されるような対応するゲノム操作療法、および／または本明細書に記載されるような遺伝的再プログラミング療法によって治療され得る。そのような疾患もしくは障害を有するかまたはそのような疾患もしくは障害を発症するリスクがある患者は、それに応じて治療することができる。
【００８７】
一実施形態では、疾患関連ペプチドまたはタンパク質などの薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、ゲノム操作タンパク質、特にクラスタ化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピート‐ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）である。ゲノム操作タンパク質の活性低下によって引き起こされる疾患もしくは障害、あるいはゲノム操作タンパク質の量の増加が（ｉ）疾患もしくは障害の１つ以上の症状を改善、緩和、軽減もしくは逆転させる、および／または（ｉｉ）疾患もしくは障害の発症を遅らせる、および／または（ｉｉｉ）疾患もしくは障害の重症度を軽減する、疾患または障害は、本明細書に記載されるような対応するタンパク質補充療法（例えばゲノム操作タンパク質を置換または補充することによる）、本明細書に記載されるような対応するゲノム操作療法、および／または本明細書に記載されるような遺伝的再プログラミング療法によって治療され得る。そのような疾患もしくは障害を有するかまたはそのような疾患もしくは障害を発症するリスクがある患者は、それに応じて治療することができる。
【００８８】
一実施形態では、疾患関連ペプチドまたはタンパク質などの薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、血液タンパク質、特にフィブリノゲンまたはα１−アンチトリプシンである。血液タンパク質の活性低下によって引き起こされる疾患もしくは障害、あるいは血液タンパク質の量の増加が（ｉ）疾患もしくは障害の１つ以上の症状を改善、緩和、軽減もしくは逆転させる、および／または（ｉｉ）疾患もしくは障害の発症を遅らせる、および／または（ｉｉｉ）疾患もしくは障害の重症度を軽減する、疾患または障害は、本明細書に記載されるような対応するタンパク質補充療法（例えば血液タンパク質を置換または補充することによる）、本明細書に記載されるような対応するゲノム操作療法、および／または本明細書に記載されるような遺伝的再プログラミング療法によって治療され得る。そのような疾患もしくは障害を有するかまたはそのような疾患もしくは障害を発症するリスクがある患者は、それに応じて治療することができる。
【００８９】
一実施形態では、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、免疫グロブリン、特に抗体である。免疫グロブリンの活性低下によって引き起こされる疾患もしくは障害、あるいは免疫グロブリンの量の増加が（ｉ）疾患もしくは障害の１つ以上の症状を改善、緩和、軽減もしくは逆転させる、および／または（ｉｉ）疾患もしくは障害の発症を遅らせる、および／または（ｉｉｉ）疾患もしくは障害の重症度を軽減する、疾患または障害は、本明細書に記載されるような対応するタンパク質補充療法（例えば免疫グロブリンを置換または補充することによる）、本明細書に記載されるような対応するゲノム操作療法、および／または本明細書に記載されるような遺伝的再プログラミング療法によって治療され得る。そのような疾患もしくは障害を有するかまたはそのような疾患もしくは障害を発症するリスクがある患者は、それに応じて治療することができる。
【００９０】
一実施形態では、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、免疫学的に活性な化合物、特に疾患関連抗原などの抗原である。したがって、疾患関連ペプチドまたはタンパク質の別の例は、疾患関連抗原、すなわち障害または疾患に特徴的であり、通常の条件下、すなわち健常個体では、限られた数の器官および／もしくは組織で、または特定の発生段階で特異的に発現され（例えば、疾患関連抗原は、通常の条件下では生命維持に不可欠ではない組織、生殖器官、例えば精巣、栄養膜組織、例えば胎盤、または生殖系列細胞において特異的に発現され得る）、ならびに１つ以上の疾患組織で発現または異常発現される抗原である。これに関連して、「限られた数」は、好ましくは３以下、より好ましくは２以下または１を意味する。疾患関連抗原の特定の例は、腫瘍関連抗原、病原体関連抗原（例えばウイルス（インフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶまたはＲＳＶなど）の抗原）およびアレルゲンである。腫瘍関連抗原を特徴とする疾患または障害は、前記疾患または障害を有するか、または発症するリスクがある患者において前記疾患関連抗原に対する免疫応答を誘発することによって治療され得る。例えば、それぞれ、疾患関連抗原が腫瘍関連抗原である場合、免疫療法は癌免疫療法と見なされ得る；疾患関連抗原が病原体関連抗原（例えばウイルス（インフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶなど）の抗原）である場合、免疫療法は病原体免疫療法と見なされ得る；および疾患関連抗原がアレルゲンである場合、免疫療法はアレルギー寛容誘導療法と見なされ得る。したがって、本発明のＲＮＡは、悪性疾患もしくは感染症に対して個体をワクチン接種する疾患関連抗原を生成するために使用され得るか、またはアレルギー寛容をもたらすアレルゲンを生成するために使用され得る。
【００９１】
「免疫療法」という用語は、好ましくは特異的免疫反応および／または免疫エフェクタ機能（１つまたは複数）を含む治療に関する。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「脱分化」とは、形態または機能の特殊化の喪失を指す。細胞では、脱分化はより拘束されていない細胞をもたらす。本明細書で使用される場合、「拘束された」という用語は、特定の機能に永続的に拘束されていると見なされる細胞を指す。拘束された細胞は、「最終分化細胞」とも称される。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「分化」とは、特定の形態または機能に対する細胞の適応を指す。細胞では、分化はより拘束された細胞をもたらす。
【００９４】
「分化細胞」とは、より特殊化した形態または機能への漸進的な発生変化を受けた成熟細胞である。細胞分化は、細胞が、明らかに特殊化した細胞型に成熟するときに経る過程である。分化細胞は独特な特性を有し、特定の機能を果たし、より分化していない対応する細胞よりも分裂する可能性が低い。
【００９５】
「未分化」細胞、例えば未成熟細胞、胚細胞、または原始細胞は、典型的には非特異的な外観を有し、複数の非特異的な活動を行い得るが、分化細胞が典型的に果たす機能を、皆無ではないにせよ、十分に果たすことができない。
【００９６】
「体細胞」とは、ありとあらゆる分化細胞を指し、幹細胞、生殖細胞、または配偶子を含まない。好ましくは、本明細書で使用される「体細胞」は、最終分化細胞を指す。
【００９７】
「幹細胞」は、自己複製する能力、未分化状態にとどまる能力、および分化する能力を有する細胞である。幹細胞は、少なくともそれが天然に存在する動物の寿命の間は、無制限に分裂することができる。幹細胞は最終分化しておらず、分化経路の最終段階ではない。幹細胞が分裂する場合、各娘細胞は、幹細胞のままであるか、または最終分化につながる経路に入ることができる。
【００９８】
「幹細胞特性を有する細胞」という用語は、本明細書では、幹細胞ではない分化した体細胞に由来するが、幹細胞、特に胚性幹細胞に典型的な１つ以上の特徴を示す細胞を表すために使用される。そのような特徴には、緻密なコロニー、高い核対細胞質比および顕著な核小体などの胚性幹細胞形態、正常な核型、テロメラーゼ活性の発現、胚性幹細胞に特徴的な細胞表面マーカの発現、ならびに／または胚性幹細胞に特徴的な遺伝子の発現が含まれる。胚性幹細胞に特徴的な細胞表面マーカは、発生段階特異的胎児性抗原３（ＳＳＥＡ−３）、ＳＳＥＡ−４、腫瘍関連抗原１−６０（ＴＲＡ−１−６０）、ＴＲＡ−１−８１、およびＴＲＡ−２−４９／６Ｅからなる群より選択される。胚性幹細胞に特徴的な遺伝子は、例えば内因性ＯＣＴ４、内因性ＮＡＮＯＧ、増殖分化因子３（ＧＤＦ３）、発現抑制１（ＲＥＸ１）、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）、胚細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、発生多能性関連２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４、およびテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）からなる群より選択される。一実施形態では、幹細胞に典型的な１つ以上の特徴には、多能性が含まれる。一実施形態では、幹細胞特性を有する細胞は、多能性状態を示す。一実施形態では、幹細胞特性を有する細胞は、３つの一次胚葉すべての高度派生物に分化する発生能を有する。一実施形態では、一次胚葉は内胚葉であり、高度派生物は腸様上皮組織である。さらなる実施形態では、一次胚葉は中胚葉であり、高度派生物は横紋筋および／または軟骨である。なおさらなる実施形態では、一次胚葉は外胚葉であり、高度派生物は神経組織および／または表皮組織である。１つの好ましい実施形態では、幹細胞特性を有する細胞は、目的のペプチドまたはタンパク質を発現する細胞に分化する発生能を有する。本発明によれば、一般に、「幹細胞特性を有する細胞」、「幹細胞の性質を有する細胞」、「再プログラミングされた細胞」および「脱分化された細胞」という用語または類似の用語は、同様の意味を有し、本明細書では互換的に使用される。
【００９９】
一実施形態では、ＲＮＡ、特に細胞で発現されるべきペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を含むＲＮＡは、一本鎖自己複製ＲＮＡである。一実施形態では、自己複製ＲＮＡは、プラスセンスの一本鎖ＲＮＡである。一実施形態では、自己複製ＲＮＡは、ウイルスＲＮＡまたはウイルスＲＮＡに由来するＲＮＡである。一実施形態では、自己複製ＲＮＡは、アルファウイルスゲノムＲＮＡであるか、またはアルファウイルスゲノムＲＮＡに由来する。一実施形態では、自己複製ＲＮＡは、ウイルス遺伝子発現ベクターである。一実施形態では、ウイルスはセムリキ森林ウイルスである。一実施形態では、自己複製ＲＮＡは１つ以上の導入遺伝子を含み、前記導入遺伝子は、一実施形態では、ＲＮＡがウイルスＲＮＡである場合、構造タンパク質をコードするウイルス配列などのウイルス配列を部分的または完全に置換し得る。
【０１００】
「ヌクレオシド」（本明細書では「Ｎ」と略す）という用語は、リン酸基のないヌクレオチドと考えることができる化合物に関する。ヌクレオシドは糖（例えばリボースまたはデオキシリボース）に結合した核酸塩基であるが、ヌクレオチドはヌクレオシドと１つ以上のリン酸基からなる。ヌクレオシドの例には、シチジン、ウリジン、プソイドウリジン、アデノシン、およびグアノシンが含まれる。
【０１０１】
通常天然に存在する核酸を構成する５つの標準的なヌクレオシドは、ウリジン、アデノシン、チミジン、シチジンおよびグアノシンである。５つのヌクレオシドは一般に、それぞれその１文字コードＵ、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧに略される。ただし、チミジンは、ウリジンに見出されるリボフラノース環ではなく２'‐デオキシリボフラノース部分を含むため、より一般的には「ｄＴ」（「ｄ」は「デオキシ」を表す）と表記される。これは、チミジンがリボ核酸（ＲＮＡ）ではなくデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に見出されるためである。逆に、ウリジンはＤＮＡではなくＲＮＡに見出される。残りの３つのヌクレオシドは、ＲＮＡとＤＮＡの両方に見出され得る。ＲＮＡでは、それらはＡ、ＣおよびＧとして表され、ＤＮＡでは、ｄＡ、ｄＣおよびｄＧとして表される。
【０１０２】
修飾されたプリン（ＡもしくはＧ）またはピリミジン（Ｃ、Ｔ、もしくはＵ）塩基部分は、好ましくは１つ以上のアルキル基、より好ましくは１つ以上のＣ１−４アルキル基、さらにより好ましくは１つ以上のメチル基で修飾されている。修飾されたプリンまたはピリミジン塩基部分の特定の例には、Ｎ７−アルキル−グアニン、Ｎ６−アルキル−アデニン、５−アルキル−シトシン、５−アルキル−ウラシル、およびＮ（１）−アルキル−ウラシル、例えばＮ７−Ｃ１−４アルキル−グアニン、Ｎ６−Ｃ１−４アルキル−アデニン、５−Ｃ１−４アルキル−シトシン、５−Ｃ１−４アルキル−ウラシル、およびＮ（１）−Ｃ１−４アルキル−ウラシル、好ましくはＮ７−メチル−グアニン、Ｎ６−メチル−アデニン、５−メチル−シトシン、５−メチル−ウラシル、およびＮ（１）−メチル−ウラシルが含まれる。
【０１０３】
本明細書で使用される「インビトロ転写」または「ＩＶＴ」という用語は、転写（すなわちＲＮＡの生成）が無細胞的に行われることを意味する。つまり、ＩＶＴは、生存／培養細胞を使用するのではなく、細胞から抽出された転写機構（例えば細胞溶解物またはＲＮＡポリメラーゼ（好ましくはＴ７、Ｔ３もしくはＳＰ６ポリメラーゼ）を含むその単離された成分）を使用する。
【０１０４】
本発明による修飾されたＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）に関連して「修飾」という用語は、前記ＲＮＡ中に天然には存在しないＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の任意の修飾を含む。特に、修飾という用語は、本発明の５'キャップ構造を有するＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）を提供することに関する。例えば、本発明の５'キャップ構造を有するＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）を提供することは、本発明の５'キャップ化合物の存在下でのＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって達成され得、この場合前記５'キャップ構造は生成されたＲＮＡ鎖に共転写的に組み込まれ、またはＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、例えばインビトロ転写によって生成され得、５'キャップ構造はキャッピング酵素、例えばワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して転写後にＲＮＡに付加され得る。
【０１０５】
ＲＮＡ（好ましくは、ｍＲＮＡ）は、例えばその安定性を高める、および／または免疫原性を減少させる、および／または細胞傷害性を減少させるために、さらなる修飾を含み得る。例えば、本発明の５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのさらなる修飾は、天然に存在するポリ（Ａ）尾部の伸長もしくは切断、５'もしくは３'非翻訳領域（ＵＴＲ）の改変、例えば前記ＲＮＡのコード領域に関連しないＵＴＲの導入、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドの合成ヌクレオチドによる置換、および／またはコドン最適化（例えばＲＮＡのＧＣ含量を変化させる、好ましくは増加させるため）であり得る。
【０１０６】
マスクされていないポリＡ配列を有するＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、マスクされたポリＡ配列を有するＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）よりも効率的に翻訳される。「ポリ（Ａ）尾部」または「ポリＡ配列」という用語は、典型的にはＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）分子の３'末端に位置するアデノシン（特にアデニリル）（Ａ）残基の配列に関し、「マスクされていないポリＡ配列」は、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）分子の３'末端のポリＡ配列がポリＡ配列のＡで終了し、ポリＡ配列の３'末端、すなわち下流に位置するＡ以外のヌクレオチドが後続していないことを意味する。さらに、約１２０ヌクレオチドの長さを有する長いポリＡ配列は、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の最適な転写物安定性および翻訳効率をもたらす。
【０１０７】
したがって、本発明によるＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡの安定性および／または発現を増加させるために、好ましくは１０〜５００、より好ましくは３０〜３００、さらにより好ましくは６５〜２００、特に１００〜１５０個のアデノシン（特にアデニリル）残基の長さを有するポリＡ配列と共に存在するようにＲＮＡを修飾し得る。特に好ましい実施形態では、ポリＡ配列は約１２０個のアデノシン（特にアデニリル）残基の長さを有する。本発明によるＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡの安定性および／または発現をさらに増加させるために、ポリＡ配列を脱マスク化することができる。
【０１０８】
さらに、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）分子の３'非翻訳領域への３'ＵＴＲの組み込みは、翻訳効率の向上をもたらし得る。そのような３'ＵＴＲの２つ以上を組み込むことによって（好ましくは頭−尾方向に配置される；Ｈｏｌｔｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０８，４００９−４０１７（２００６）参照）、相乗作用が達成され得る。３'ＵＴＲは、それらが導入されるＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）に対して自家または異種であり得る。特定の一実施形態では、３'ＵＴＲは、α２−グロビン、α１−グロビン、またはβ−グロビン、好ましくはβ−グロビン、より好ましくはヒトβ−グロビンの遺伝子またはｍＲＮＡなどのグロビン遺伝子またはｍＲＮＡに由来する。例えば、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、既存の３'ＵＴＲをα２−グロビン、α１−グロビン、β−グロビン、好ましくはβ−グロビン、より好ましくはヒトβ−グロビンなどのグロビン遺伝子に由来する１コピー以上、好ましくは２コピーの３'ＵＴＲで置換するまたはこれを挿入することによって修飾し得る。
【０１０９】
本発明によるＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、その安定性を高める、および／または免疫原性を減少させる、および／または細胞傷害性を減少させるために、修飾されたリボヌクレオチドを有し得る。例えば、一実施形態では、本発明によるＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）において、シチジンを５−メチルシチジンで部分的または完全に、好ましくは完全に置換する。あるいはまたはさらに、一実施形態では、本発明によるＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）において、ウリジンをプソイドウリジンまたはＮ（１）−メチルプソイドウリジンまたは５−メチルウリジンで部分的または完全に、好ましくは完全に置換する。プソイドウリジン（ウリジンを部分的または完全に、好ましくは完全に置換する）によって修飾されたＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、本明細書では「Ψ修飾された」と称され、「ｍ１Ψ修飾された」という用語は、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）がＮ（１）−メチルプソイドウリジン（ウリジンを部分的または完全に、好ましくは完全に置換する）を含むことを意味する。さらに、「ｍ５Ｕ修飾された」という用語は、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）が５−メチルウリジン（ウリジンを部分的または完全に、好ましくは完全に置換する）を含むことを意味する。本発明のそのようなΨまたはｍ１Ψまたはｍ５Ｕ修飾されたＲＮＡは、通常、それらの非修飾形態と比較して低下した免疫原性を示し、したがって、免疫応答の誘導を回避または最小化すべき用途（例えば本明細書に記載されるようなタンパク質補充療法、ゲノム操作療法、および遺伝的再プログラミング療法）において好ましい。
【０１１０】
上記の修飾の組合せ、すなわちポリＡ配列の組み込み、ポリＡ配列の脱マスク化、１つ以上の３'ＵＴＲの組み込み、および１つ以上の天然に存在するヌクレオチドの合成ヌクレオチドによる置換（例えばシチジンの５−メチルシチジンによる置換および／またはウリジンのプソイドウリジン（Ψ）もしくはＮ（１）‐メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）もしくは５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）による置換）は、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の安定性に相乗効果を及ぼし、翻訳効率を高める。したがって、好ましい実施形態では、本発明によるＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、本発明の５'キャップ化合物で修飾されるだけでなく、上記の３つの修飾の組合せ、すなわち（ｉ）ポリＡ配列の組み込み、ポリＡ配列の脱マスク化；（ｉｉ）１つ以上の３'ＵＴＲの組み込み；および（ｉｉｉ）１つ以上の天然に存在するヌクレオチドの合成ヌクレオチドによる置換（例えばシチジンの５−メチルシチジンによる置換および／またはウリジンのプソイドウリジン（Ψ）もしくはＮ（１）‐メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）もしくは５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）による置換）も含む。任意で、本発明のＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）のコドンを、例えばＲＮＡのＧＣ含量を増加させるため、および／または目的のペプチドもしくはタンパク質が発現されるべき細胞（もしくは対象）においてまれなコドンを、前記細胞（もしくは対象）において同義の頻度の高いコドンであるコドンによって置換するために、さらに最適化し得る。
【０１１１】
本明細書で使用される「ＲＮＡポリメラーゼ」という用語は、一次転写物ＲＮＡを生成するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを指す。本発明によるＩＶＴ  ＲＮＡを生成するのに適したＲＮＡポリメラーゼの例には、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼが含まれる。好ましいＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである。
【０１１２】
「従来の５'キャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５'末端に見出されるキャップ構造を指し、一般に、その三リン酸部分を介してｍＲＮＡの次のヌクレオチドの５'末端に接続されているグアノシン５'−三リン酸（Ｇｐｐｐ）からなる（すなわちグアノシンは５'‐５'三リン酸結合を介してｍＲＮＡの残りの部分に接続されている）。グアノシンは、Ｎ７位でメチル化され得る（キャップ構造ｍ７Ｇｐｐｐをもたらす）。
【０１１３】
本出願によれば、「キャップ０」という用語は、構造「ｍ７ＧｐｐｐＮ」を意味し、Ｎは、２'位にＯＨ部分を担持する任意のヌクレオシドである。本出願によれば、「キャップ１」という用語は、構造「ｍ７ＧｐｐｐＮｍ」を意味し、Ｎｍは、２'位にＯＣＨ３部分を担持する任意のヌクレオシドである。本出願によれば、「キャップ２」という用語は、構造「ｍ７ＧｐｐｐＮｍＮｍ」を意味し、各Ｎｍは、独立して、２'位にＯＣＨ３部分を担持する任意のヌクレオシドである。
【０１１４】
本発明の文脈において、「本発明の５'キャップ構造」という用語は、従来の５'キャップの構造に類似するが、好ましくはインビボまたは細胞内で、これに結合した場合、ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）を安定化するおよび／またはＲＮＡ発現（特にｍＲＮＡ発現）を増加させる能力を有するように修飾された５'キャップ類似体である。細胞は、本発明のＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）でトランスフェクトすることができる任意の細胞であってよく、好ましくは対象から得られた細胞、例えば幹細胞（例えば間葉系幹細胞（ＭＳＣ））または樹状細胞（例えば未成熟樹状細胞）などの抗原提示細胞（例えば未成熟抗原提示細胞）である。好ましくは、本発明の５'キャップ構造は、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＩＩａ）のいずれか１つの構造「１−（Ｎ７−（Ｒ１）−グアニン−９−イル）−ペントース−５−イル−（ホスホロチオエート結合）−Ｎ（Ｒ８）−」を少なくとも含む（すなわち、５'キャップ構造の最初のグアニンは、Ｎ７位においてＲ１で置換されており、Ｎ９位で置換基Ｒ２およびＲ３を担持するペントースのＣ１'に接続されており、ホスホロチオエート結合は構造−Ｏ−Ｐ（Ｏ−）（Ｒ４）−Ｏ−Ｐ（Ｏ−）（Ｒ５）−Ｏ［−Ｐ（Ｏ−）（Ｒ６）−Ｏ］ｎを有し、ならびにＮは、塩基Ｂを担持し、２'位においてＲ８で置換されている任意のヌクレオシドである）。さらに、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＩＩａ）のいずれか１つのＲ７が、少なくともリボオリゴヌクレオチドの５'末端にあるリボースの２'位のＯＨ基がＨ、ハロ、および置換されていてもよいアルコキシからなる群より選択される置換基Ｒ８'で置換されており、ならびにリボオリゴヌクレオチドの３'末端のリボースが２'位に遊離ＯＨ基を有するリボオリゴヌクレオチドである場合、本発明の５'キャップ構造は、好ましくは、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＩＩａ）のいずれか１つの構造「１−（Ｎ７−（Ｒ１）−グアニン−９−イル）−ペントース−５−イル−（ホスホロチオエート結合）−Ｎ（Ｒ８）−」に加えて、２'位においてＲ８'で置換された任意のヌクレオシドも含む（リボオリゴヌクレオチドが複数のＮ（Ｒ８'）部分を含む場合は、Ｎ（Ｒ８）部分とＮ（Ｒ８'）部分の間のヌクレオチド間結合、およびＮ（Ｒ８'）部分の各対の間のヌクレオチド間結合と共に）。例えば、本発明の５'キャップ構造を提供するために、Ｒ７が式［ｐＮ（Ｒ８'）］２ｐＮのリボオリゴヌクレオチドである（すなわちリボオリゴヌクレオチドの３'末端のヌクレオシドのみが２'位に遊離ＯＨ基を有し、他の２つのヌクレオシドは２'位においてＲ８'で置換されている）式（Ｉ）の５'キャップ化合物を使用する場合、本発明の５'キャップ構造は、少なくとも構造「１−（Ｎ７−（Ｒ１）−グアニン−９−イル）−ペントース−５−イル−（ホスホ���チオエート結合）−Ｎ（Ｒ８）−［ｐＮ（Ｒ８'）］２」を含む。
【０１１５】
本出願によれば、「５'キャップされたＲＮＡ」という用語は、その５'末端にキャップ構造を含むＲＮＡを意味する。
【０１１６】
本出願の文脈において、「本発明の５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡ」という用語は、その５'末端に本発明の５'キャップ構造を含むＲＮＡを意味する。同様に、「本発明の５'キャップ化合物で修飾されたｍＲＮＡ」という用語は、その５'末端に本発明の５'キャップ構造を含むｍＲＮＡを意味する。したがって、好ましい実施形態では、本発明の５'キャップ化合物で修飾されたそのようなＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）は、その５'末端に、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＩＩａ）のいずれか１つの構造「１−（Ｎ７−（Ｒ１）−グアニン−９−イル）−ペントース−５−イル−（ホスホロチオエート結合）−Ｎ（Ｒ８）−」）を少なくとも含む（すなわち、５'キャップ構造の最初のグアニンは、Ｎ７位においてＲ１で置換されており、Ｎ９位で置換基Ｒ２およびＲ３を担持するペントースのＣ１'に接続されており、ホスホロチオエート結合は構造−Ｏ−Ｐ（Ｏ−）（Ｒ４）−Ｏ−Ｐ（Ｏ−）（Ｒ５）−Ｏ−［−Ｐ（Ｏ−）（Ｒ６）−Ｏ］ｎを有し、ならびにＮは、塩基Ｂを有し、２'位においてＲ８で置換されている任意のヌクレオシドである）。さらに、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＩＩａ）のいずれか１つのＲ７が、少なくともリボオリゴヌクレオチドの５'末端にあるリボースの２'位のＯＨ基がＨ、ハロ、および置換されていてもよいアルコキシからなる群より選択される置換基Ｒ８'で置換されており、ならびにリボオリゴヌクレオチドの３'末端のリボースが２'位に遊離ＯＨ基を有するリボオリゴヌクレオチドである場合、本発明の５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）は、好ましくは、その５'末端に、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＩＩａ）のいずれか１つの構造「１−（Ｎ７−（Ｒ１）−グアニン−９−イル）−ペントース−５−イル−（ホスホロチオエート結合）−Ｎ（Ｒ８）−」に加えて、２'位においてＲ８'で置換された任意のヌクレオシドも含む（リボオリゴヌクレオチドが複数のＮ（Ｒ８'）部分を含む場合は、Ｎ（Ｒ８）部分とＮ（Ｒ８'）部分の間のヌクレオチド間結合、およびＮ（Ｒ８'）部分の各対の間のヌクレオチド間結合と共に）。例えば、ＲＮＡを、Ｒ７が式［ｐＮ（Ｒ８'）］２ｐＮのリボオリゴヌクレオチドである（すなわちリボオリゴヌクレオチドの３'末端のヌクレオシドのみが２'位に遊離ＯＨ基を有し、他の２つのヌクレオシドは２'位においてＲ８'で置換されている）式（Ｉ）の本発明の５'キャップ化合物で修飾する場合、修飾されたＲＮＡは、その５'末端に、少なくとも構造「１−（Ｎ７−（Ｒ１）−グアニン−９−イル）−ペントース−５−イル−（ホスホロチオエート結合）−Ｎ（Ｒ８）−［ｐＮ（Ｒ８'）］２」を含む。
【０１１７】
「ＲＮＡ発現を増加させる」という用語は、好ましくは本発明の５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡと関連して、好ましくはキャップ０構造を認識するタンパク質、例えばＩＦＩＴタンパク質（特にＩＦＩＴ１）によるＲＮＡの認識を減少させる、さらには阻害することを意味する。
【０１１８】
本発明によれば、ペプチドまたはタンパク質の一部または断片は、好ましくは、それが由来するペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つの機能特性を有する。そのような機能特性は、薬理学的活性、他のペプチドまたはタンパク質との相互作用、酵素活性、抗体との相互作用、および核酸の選択的結合を含む。例えば、ペプチドまたはタンパク質の薬理学的に活性な断片は、その断片が由来するペプチドまたはタンパク質の薬理学的活性の少なくとも１つを有する。ペプチドまたはタンパク質の一部または断片は、好ましくは、ペプチドまたはタンパク質の少なくとも６、特に少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０または少なくとも５０個の連続するアミノ酸の配列を含む。ペプチドまたはタンパク質の一部または断片は、好ましくは、ペプチドまたはタンパク質の最大８、特に最大１０、最大１２、最大１５、最大２０、最大３０または最大５５個の連続するアミノ酸の配列を含む。
【０１１９】
本発明によれば、ペプチドまたはタンパク質の類似体は、それが由来する前記ペプチドまたはタンパク質の修飾形態であり、前記ペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つの機能特性を有する。例えば、ペプチドまたはタンパク質の薬理学的に活性な類似体は、その類似体が由来するペプチドまたはタンパク質の薬理学的活性の少なくとも１つを有する。そのような修飾には、任意の化学修飾が含まれ、ならびに炭水化物、脂質および／またはタンパク質もしくはペプチドなどのタンパク質またはペプチドに関連する任意の分子の単一または複数の置換、欠失および／または付加が含まれる。一実施形態では、タンパク質またはペプチドの「類似体」には、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、パルミトイル化、ミリストイル化、イソプレニル化、脂質化、アルキル化、誘導体化、保護基／ブロッキング基の導入、タンパク質分解切断、または抗体もしくは別の細胞リガンドへの結合から生じる修飾形態が含まれる。「類似体」という用語はまた、前記タンパク質およびペプチドのすべての機能的な化学的等価物に及ぶ。
【０１２０】
本発明の文脈において、「ワクチン組成物」という用語は、ＲＮＡを含む抗原製剤に関する。ワクチン組成物は、１つ以上の抗原に対する個体の体液性および／または細胞性免疫系を刺激するために個体に投与される。これに関連して、ＲＮＡは、抗原、前記抗原を含むタンパク質もしくはペプチド、または抗原ペプチドをコードし得る。本発明の文脈におけるワクチン組成物は、１つ以上のアジュバントおよび／または賦形剤をさらに含んでもよく、抗原に対する防御および／または治療的免疫反応を誘発するために、任意の適切な経路で個体に適用される。
【０１２１】
本発明による「抗原」は、免疫応答を誘発する任意の物質および／または免疫応答もしくは細胞応答などの免疫機構が向けられる任意の物質を包含する。これには、特にＭＨＣ分子に関連して提示される場合、抗原が抗原ペプチドにプロセシングされ、免疫応答または免疫機構が１つ以上の抗原ペプチドに向けられる状況も含まれる。特に、「抗原」は、抗体またはＴリンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応する任意の物質、好ましくはペプチドまたはタンパク質に関する。本発明によれば、「抗原」という用語は、Ｔ細胞エピトープなどの少なくとも１つのエピトープを含有する任意の分子を含む。好ましくは、本発明の文脈における抗原は、任意でプロセシング後に、好ましくは抗原（抗原を発現する細胞を含む）に特異的な免疫反応を誘導する分子である。
【０１２２】
本発明によれば、免疫応答の候補である任意の適切な抗原を使用することができ、免疫応答は体液性および細胞性免疫応答の両方であり得る。本発明のいくつかの実施形態の文脈において、抗原は、ＭＨＣ分子に関連して、好ましくは細胞、好ましくは抗原提示細胞によって提示され、抗原に対する免疫応答をもたらす。抗原は、好ましくは、天然に存在する抗原に対応するまたは由来する生成物である。そのような天然に存在する抗原は、アレルゲン、ウイルス（例えばインフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶ）、細菌、真菌、寄生生物ならびに他の感染性因子および病原体を含んでもよく、もしくはそれらに由来してもよく、または抗原は腫瘍抗原であってもよい。本発明によれば、抗原は、天然に存在する生成物、例えばウイルスタンパク質（例えばインフルエンザウイルスＡ型、インフルエンザウイルスＢ型、もしくはインフルエンザウイルスＣ型のタンパク質、例えばインフルエンザウイルス型Ａ、インフルエンザウイルスＢ型、もしくはインフルエンザウイルスＣ型からのＰＢ１、ＰＢ１−Ｆ２、ＰＢ２、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、もしくはＮＥＰ／ＮＳ２）、またはその一部に対応し得る。
【０１２３】
好ましい実施形態では、抗原は、腫瘍抗原、すなわち細胞質、細胞表面または細胞核に由来し得る腫瘍細胞の一部、特に主として細胞内にまたは腫瘍細胞の表面抗原として生じるものである。例えば、腫瘍抗原には、癌胎児性抗原、α１−フェトプロテイン、イソフェリチン、および胎児性スルホグリコプロテイン、α２−Ｈ−フェロプロテインおよびγ−フェトプロテイン、ならびに様々なウイルス腫瘍抗原が含まれる。本発明によれば、腫瘍抗原は、好ましくは、型および／または発現レベルに関して腫瘍または癌および腫瘍細胞または癌細胞に特徴的な任意の抗原を含む。別の実施形態では、抗原は、病原体関連抗原、すなわち病原体に由来する抗原、例えばウイルス（インフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶなど）、細菌、単細胞生物、または寄生生物に由来する抗原、例えばウイルスリボ核タンパク質またはコートタンパク質などのウイルス抗原である。特に、抗原は、特にＴ細胞受容体の活性の調節を介して、調節、特に免疫系の細胞、好ましくはＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球の活性化をもたらすＭＨＣ分子によって提示されるべきである。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、抗原は腫瘍抗原であり、本発明は、そのような腫瘍抗原を発現し、好ましくはクラスＩ  ＭＨＣと共にそのような腫瘍抗原を提示する腫瘍細胞に対する抗腫瘍ＣＴＬ応答の刺激を含む。
【０１２５】
「免疫原性」という用語は、免疫反応を誘導する抗原の相対的有効性に関する。
【０１２６】
「病原体」という用語は、病原性微生物に関し、ウイルス、細菌、真菌、単細胞生物、および寄生生物を含む。病原性ウイルスの例は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス（例えばインフルエンザウイルスＡ型、インフルエンザウイルスＢ型、またはインフルエンザウイルスＣ型）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ＨＢＶ、ＨＣＶ、パピローマウイルス、およびヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、例えばＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＳＶ、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、パピローマウイルス、およびＨＴＬＶ、好ましくはインフルエンザウイルス、ＣＭＶ、またはＲＳＶである。単細胞生物には、マラリア原虫、トリパノソーマ、アメーバなどが含まれる。
【０１２７】
したがって、別の好ましい実施形態では、抗原は、１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のウイルス抗原、すなわちウイルスの１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の抗原であり、ウイルスは、好ましくはインフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶである。したがって、この実施形態では、本発明は、好ましくは前記ウイルスに対する免疫応答を誘発することを含む。１つ以上のウイルス抗原は、好ましくはインフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、またはインフルエンザＣ型からのＰＢ１、ＰＢ１−Ｆ２、ＰＢ２、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、およびＮＥＰ／ＮＳ２からなる群より選択される。
【０１２８】
本発明で使用し得る腫瘍抗原の例は、ｐ５３、ＡＲＴ−４、ＢＡＧＥ、ｓｓ‐カテニン／ｍ、Ｂｃｒ−ａｂＬ  ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、クローディン−１２、ｃ−ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ−Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇａｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＰＶ−Ｅ６、ＨＡＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ−Ａ、好ましくはＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、またはＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｂ、ＭＡＧＥ−Ｃ、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１、−２、−３、ＮＡ８８−Ａ、ＮＦ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＢＲ−１、ｐ１９０マイナーＢＣＲ−ａｂＬ、Ｐｌａｃ−１、Ｐｍ１／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１またはＳＡＲＴ−３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥおよびＷＴ、好ましくはＷＴ−１である。
【０１２９】
本発明による「抗原の一部または断片」または「抗原ペプチド」は、好ましくは抗原の不完全な形態であり、抗原に対する、または抗原の発現および好ましくは抗原の提示を特徴とする細胞に対する免疫応答を誘発することができる。
【０１３０】
これに関連して、本発明はまた、本明細書では「抗原ペプチド」とも称される、抗原に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを利用する。「抗原ペプチド」または「抗原に由来する抗原ペプチド」とは、抗原の断片またはペプチドのアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含むオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。抗原ペプチドは、任意の長さであり得る。
【０１３１】
好ましくは、抗原ペプチドは、免疫応答、好ましくは抗原に対する、または抗原の発現および好ましくは抗原の提示を特徴とする細胞に対する細胞応答を刺激することができる。好ましくは、抗原ペプチドは、クラスＩ  ＭＨＣと共に抗原を提示することを特徴とする細胞に対する細胞応答を刺激することができ、好ましくは抗原応答性ＣＴＬを刺激することができる。好ましくは、本発明によれば、抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ提示ペプチドであるか、またはＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ提示ペプチドを生成するようにプロセシングされ得る。好ましくは、抗原ペプチドは、抗原の断片のアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含む。好ましくは、抗原の前記断片は、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ提示ペプチドである。好ましくは、本発明による抗原ペプチドは、そのような断片のアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含み、そのような断片、すなわち抗原に由来するＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ提示ペプチドを生成するようにプロセシングされ得る。
【０１３２】
抗原ペプチドが直接、すなわちプロセシングされずに、特に切断されずに提示される場合、抗原ペプチドは、ＭＨＣ分子、特にクラスＩ  ＭＨＣ分子への結合に適した長さを有し、好ましくは７〜２０アミノ酸長、より好ましくは７〜１２アミノ酸長、より好ましくは８〜１１アミノ酸長、特に９または１０アミノ酸長である。好ましくは、直接提示される抗原ペプチドの配列は、抗原のアミノ酸配列に由来する、すなわちその配列は抗原の断片と実質的に対応し、好ましくは完全に同一である。
【０１３３】
抗原ペプチドがプロセシング後、特に切断後に提示される場合、プロセシングによって生成されるペプチドは、ＭＨＣ分子、特にクラスＩ  ＭＨＣ分子への結合に適した長さを有し、好ましくは７〜２０アミノ酸長、より好ましくは７〜１２アミノ酸長、より好ましくは８〜１１アミノ酸長、特に９または１０アミノ酸長である。好ましくは、プロセシング後に提示されるペプチドの配列は、抗原のアミノ酸配列に由来する、すなわちその配列は、抗原の断片に実質的に対応し、好ましくは完全に同一である。したがって、一実施形態では本発明による抗原ペプチドは、抗原の断片に実質的に対応し、好ましくは完全に同一であり、抗原ペプチドのプロセシング後に提示ペプチドを構成する、７〜２０アミノ酸長、より好ましくは７〜１２アミノ酸長、より好ましくは８〜１１アミノ酸長、特に９または１０アミノ酸の配列を含む。しかしながら、抗原ペプチドはまた、上記で述べた配列よりもさらに一層長い抗原の断片に実質的に対応し、好ましくは完全に同一である配列も含み得る。一実施形態では、抗原ペプチドは、抗原の配列全体を含み得る。
【０１３４】
クラスＩ  ＭＨＣによって提示されるペプチドの配列に実質的に対応するアミノ酸配列を有するペプチドは、クラスＩ  ＭＨＣによって提示されるペプチドのＴＣＲ認識またはＭＨＣへのペプチド結合に必須ではない１つ以上の残基において異なり得る。そのような実質的に対応するペプチドはまた、抗原応答性ＣＴＬを刺激することができる。ＴＣＲ認識には影響を及ぼさないが、ＭＨＣへの結合の安定性を改善する残基において提示ペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するペプチドは、抗原ペプチドの免疫原性を改善することができ、本明細書では「最適化ペプチド」と称され得る。これらの残基のいずれが、ＭＨＣまたはＴＣＲのどちらかへの結合に影響を及ぼす可能性がより高いとかについての既存の知識を使用して、実質的に対応するペプチドの設計への合理的なアプローチを採用し得る。機能的である得られたペプチドは、抗原ペプチドとして企図される。
【０１３５】
一実施形態では、抗原提示細胞のＭＨＣなどのＭＨＣに関連して提示される場合の抗原ペプチドは、Ｔ細胞受容体によって認識される。Ｔ細胞受容体によって認識される場合、抗原ペプチドは、適切な共刺激シグナルの存在下で、抗原ペプチドを特異的に認識するＴ細胞受容体を担持するＴ細胞のクローン拡大を誘導することが可能であり得る。好ましくは、抗原ペプチドは、特にＭＨＣ分子に関連して提示される場合、免疫応答、好ましくはそれらが由来する抗原に対する、または抗原の発現および好ましくは抗原の提示を特徴とする細胞に対する細胞応答を刺激することができる。
【０１３６】
「エピトープ」という用語は、抗原などの分子中の抗原決定基、すなわち免疫系によって認識される、例えば、特にＭＨＣ分子に関連して提示された場合にＴ細胞によって認識される分子の一部または断片を指す。タンパク質のエピトープは、好ましくは前記タンパク質の連続または不連続部分を含み、好ましくは５〜１００、好ましくは５〜５０、より好ましくは８〜３０、最も好ましくは１０〜２５アミノ酸長であり、例えばエピトープは、好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長であり得る。本発明の文脈におけるエピトープは、Ｔ細胞エピトープであることが特に好ましい。
【０１３７】
「エピトープ」、「Ｔ細胞エピトープ」、「抗原の断片」、「免疫原性ペプチド」および「抗原ペプチド」などの用語は、本明細書では互換的に使用され、好ましくは抗原に対する、または抗原を発現するかもしくは含み、好ましくは抗原を提示する細胞に対する免疫応答を誘発することができる抗原の不完全な形態に関する。好ましくは、これらの用語は、抗原の免疫原性部分に関する。好ましくは、抗原の免疫原性部分は、特にＭＨＣ分子に関連して提示された場合、Ｔ細胞受容体によって認識される（すなわち特異的に結合される）抗原の一部である。特定の好ましい免疫原性部分は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合する。
【０１３８】
「標的」という用語は、細胞性免疫応答などの免疫応答の標的である細胞または組織などの作用物質を意味する。標的には、抗原または抗原エピトープ、すなわち抗原に由来するペプチド断片を提示する細胞が含まれる。一実施形態では、標的細胞は、抗原を発現し、好ましくは前記抗原をクラスＩ  ＭＨＣと共に提示する細胞である。
【０１３９】
「部分」という用語は画分を指す。アミノ酸配列またはタンパク質などの特定の構造に関して、その「部分」という用語は、前記構造の連続または不連続な画分を表し得る。
【０１４０】
「一部」および「断片」という用語は、本明細書では互換的に使用され、連続する要素を指す。例えば、アミノ酸配列またはタンパク質などの構造の一部は、前記構造の連続する要素を指す。
【０１４１】
「抗原プロセシング」は、抗原の断片であるプロセシング産物への前記抗原の分解（例えばタンパク質のペプチドへの分解）、ならびに細胞による、好ましくは抗原提示細胞による特定のＴ細胞への提示のためのＭＨＣ分子とこれらの断片の１つ以上との会合（例えば結合による）を指す。
【０１４２】
「抗原応答性ＣＴＬ」とは、抗原提示細胞の表面にクラスＩ  ＭＨＣと共に提示される、抗原または前記抗原に由来するペプチドに応答性であるＣＤ８＋Ｔ細胞を意味する。
【０１４３】
本発明によれば、ＣＴＬ応答性には、持続的なカルシウム流入、細胞分裂、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生、ＣＤ４４およびＣＤ６９などの活性化マーカの上方制御、ならびに腫瘍抗原を発現する標的細胞の特異的細胞溶解性死滅が含まれ得る。ＣＴＬ応答性はまた、ＣＴＬ応答性を正確に示す人工レポータを使用して決定し得る。
【０１４４】
「免疫応答」および「免疫反応」という用語は、本明細書ではそれらの従来の意味で互換的に使用され、抗原に対する統合された身体応答を指し、好ましくは細胞性免疫応答、体液性免疫応答、またはその両方を指す。本発明によれば、抗原、細胞または組織などの作用物質に関する「への免疫応答」または「に対する免疫応答」という用語は、作用物質に対して向けられる細胞応答などの免疫応答に関する。免疫応答は、１つ以上の抗原に対する抗体の発現および、インビトロでの様々な増殖またはサイトカイン産生試験で検出され得る、抗原特異的Ｔリンパ球、好ましくはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球、より好ましくはＣＤ８＋Ｔリンパ球の拡大からなる群より選択される１つ以上の反応を含み得る。
【０１４５】
本発明の文脈における「免疫応答を誘導する」および「免疫応答を誘発する」という用語ならびに類似の用語は、免疫応答の誘導、好ましくは細胞性免疫応答、体液性免疫応答、またはその両方の誘導を指す。免疫応答は、保護的／防御的／予防的および／または治療的であり得る。免疫応答は、任意の免疫原または抗原または抗原ペプチド、好ましくは腫瘍関連抗原または病原体関連抗原（例えばウイルス（インフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶまたはＲＳＶなど）の抗原）に対して向けられ得る。この文脈における「誘導する」は、誘導前に特定の抗原または病原体に対する免疫応答が存在しなかったことを意味し得るが、同時に、誘導前に特定の抗原または病原体に対するある程度の免疫応答が存在し、誘導後に前記免疫応答が増強されることも意味し得る。したがって、この文脈における「免疫応答を誘導する」には、「免疫応答を増強する」ことも含まれる。好ましくは、個体において免疫応答を誘導した後、前記個体は感染症または癌性疾患などの疾患の発症から保護され、または免疫応答を誘導することによって疾患状態が改善される。
【０１４６】
「細胞性免疫応答」、「細胞応答」、「細胞媒介性免疫」または類似の用語は、抗原の発現および／またはクラスＩもしくはクラスＩＩ  ＭＨＣと共に抗原を提示することを特徴とする細胞に向けられた細胞応答を含むことが意図されている。細胞応答は、「ヘルパー」または「キラー」のいずれかとして働くＴ細胞またはＴリンパ球と呼ばれる細胞に関連する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とも称される）は、免疫応答を調節することによって中心的な役割を果たし、キラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＴＬとも称される）は、疾患細胞などの細胞を死滅させる。
【０１４７】
「体液性免疫応答」という用語は、作用物質および生物に応答して抗体が産生され、最終的にそれらを中和および／または排除する、生存生物における過程を指す。抗体応答の特異性は、単一特異性の抗原に結合する膜結合型受容体を介してＴおよび／またはＢ細胞によって媒介される。適切な抗原の結合および様々な他の活性化シグナルの受け取り後、Ｂリンパ球が分裂し、記憶Ｂ細胞および抗体分泌形質細胞クローンを産生し、それぞれが、その抗原受容体によって認識されたのと同一の抗原エピトープを認識する抗体を産生する。記憶Ｂリンパ球は、その後それらの特異的抗原によって活性化されるまで休眠状態のままである。これらのリンパ球は記憶の細胞基盤を提供し、特異的抗原に再暴露されたときに抗体応答の増大を生じさせる。
【０１４８】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗原上のエピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。特に、「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質を指す。「抗体」という用語には、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および前記のいずれかの組合せが含まれる。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成される。可変領域および定常領域は、本明細書ではそれぞれ可変ドメインおよび定常ドメインとも称される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が間に組み入れられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域にさらに細分化することができる。各ＶＨおよびＶＬは、次の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。ＶＨのＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と称され、ＶＬのＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と称される。重および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は重鎖定常領域（ＣＨ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含み、ＣＨは、定常ドメインＣＨ１、ヒンジ領域、ならびに定常ドメインＣＨ２およびＣＨ３（以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置されている：ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）にさらに細分化することができる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクタ細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。抗体は、天然源または組換え供給源に由来する無傷の免疫グロブリンであり得、無傷の免疫グロブリンの免疫活性部分であり得る。抗体は、典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体を含む様々な形態で存在し得る。
【０１４９】
「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質、好ましくは抗体またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）などの抗原受容体に関する。免疫グロブリンは、特徴的な免疫グロブリン（Ｉｇ）フォールドを有する構造ドメイン、すなわち免疫グロブリンドメインを特徴とする。この用語は、膜結合免疫グロブリンおよび可溶性免疫グロブリンを包含する。膜結合免疫グロブリンは、表面免疫グロブリンまたは膜免疫グロブリンとも称され、一般にＢＣＲの一部である。可溶性免疫グロブリンは一般に抗体と称される。免疫グロブリンは一般に、いくつかの鎖、典型的にはジスルフィド結合を介して連結された２本の同一の重鎖と２本の同一の軽鎖を含む。これらの鎖は、主に、ＶＬ（可変軽鎖）ドメイン、ＣＬ（定常軽鎖）ドメイン、ＶＨ（可変重鎖）ドメイン、ならびにＣＨ（定常重鎖）ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４などの免疫グロブリンドメインで構成される。哺乳動物免疫グロブリン重鎖には５つの種類、すなわちα、δ、ε、γおよびμがあり、これらは抗体の異なるクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭを構成する。可溶性免疫グロブリンの重鎖とは対照的に、膜または表面免疫グロブリンの重鎖は、そのカルボキシ末端に膜貫通ドメインと短い細胞質ドメインを含む。哺乳動物には、２種類の軽鎖、すなわちラムダとカッパがある。免疫グロブリン鎖は可変領域と定常領域を含む。定常領域は、免疫グロブリンの異なるアイソタイプ内で本質的に保存されており、可変部分は高度に多様であり、抗原認識を担う。
【０１５０】
「ワクチン接種」および「免疫化」という用語は、治療または予防上の理由で個体を治療する過程を表し、本明細書に記載されているように、１つ以上の免疫原または抗原またはその誘導体を、特にそれをコードするＲＮＡの形態で個体に投与し、前記１つ以上の免疫原もしくは抗原に対する、または前記１つ以上の免疫原もしくは抗原の提示を特徴とする細胞に対する免疫応答を刺激する手順に関する。
【０１５１】
「抗原の提示を特徴とする細胞」または「抗原を提示する細胞」または「抗原提示細胞の表面に抗原を提示するＭＨＣ分子」または類似の表現は、疾患細胞、特に腫瘍細胞、またはＭＨＣ分子、好ましくはＭＨＣクラスＩおよび／もしくはＭＨＣクラスＩＩ分子、最も好ましくはＭＨＣクラスＩ分子に関連して、直接またはプロセシング後に、抗原もしくは抗原ペプチドを提示する抗原提示細胞などの細胞を意味する。
【０１５２】
本発明の文脈において、「保護する」、「予防する」、「予防的」、「防御的」または「保護的」などの用語は、対象における疾患の発症および／または伝播の予防または治療またはその両方、特に個体が疾患を発症する可能性を最小限に抑えるまたは疾患の発症を遅らせることに関する。例えば、疾患のリスクがある人は、疾患を予防する治療法の候補となる。本明細書に記載の作用物質（例えばＲＮＡ）または組成物（医薬組成物、例えばワクチン組成物など）の予防的投与は、レシピエントを疾患の発症から、例えば病原体（例えばインフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶもしくはＲＳＶなどのウイルス）による感染、または既存の腫瘍の播種もしくは転移から保護することができる。本明細書に記載の作用物質（例えばＲＮＡ）または組成物（医薬組成物など）の治療的投与は、疾患の進行／成長の阻害をもたらし得る。これは、好ましくは疾患の排除につながる、疾患の進行／成長の減速、特に疾患の進行の中断を含む。
【０１５３】
「アジュバント」という用語は、抗原、抗原ペプチド、または前記抗原もしくは抗原ペプチドをコードする核酸（ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなど）と組み合わせて個体に投与された場合に、免疫応答を延長または増強または加速する化合物に関する。本発明の文脈において、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、任意のアジュバントと共に投与され得る。アジュバントは、抗原の表面の増加、体内での抗原の保持の延長、抗原放出の遅延、マクロファージへの抗原の標的化、抗原の取り込みの増加、抗原プロセシングの増強、サイトカイン放出の刺激、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞などの免疫細胞の刺激と活性化、および免疫細胞の非特異的活性化を含む１つ以上の機構によってその生物学的活性を発揮すると想定されている。例えば、ＤＣの成熟を可能にする化合物、例えばリポ多糖またはＣＤ４０リガンドは、適切なアジュバントのクラスを形成する。一般に、「危険シグナル」の種類の免疫系に影響を及ぼす作用物質（ＬＰＳ、ＧＰ９６、ｄｓＲＮＡなど）またはＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインは、制御された方法で免疫応答が強化されるおよび／または影響を受けることを可能にするアジュバントとして使用できる。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（Ｋｒｉｅｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６−５４９）もまた、この状況で任意に使用することができる。さらなる種類のアジュバントには、油エマルジョン（例えばフロイントアジュバント）、無機化合物（ミョウバンなど）、細菌産物（百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）毒素など）、リポソーム、免疫刺激複合体、サイトカイン（例えばモノカイン、リンホカイン、インターロイキンまたはケモカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＴ−α、または成長因子、例えばｈＧＨ）、リポペプチド（例えばＰａｍ３Ｃｙｓ）が含まれる。一実施形態における本発明のＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）が免疫刺激剤をコードすることができ、前記ＲＮＡによってコードされる前記免疫刺激剤が一次免疫刺激剤として作用する場合、しかしながら、比較的少量のＣｐＧ  ＤＮＡしか必要としない（ＣｐＧ  ＤＮＡのみによる免疫刺激と比較して）。アジュバントの例は、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ  ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）である。ＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）、ＤＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ；国際公開第９６／３３７３９号）、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、およびＱＳ−Ｌ１（Ｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ  ７：１７８−１８６）などのサポニン、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、ビタミンＥ、モンタニド、ミョウバン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ならびにスクアレンおよび／またはトコフェロールなどの生物学的に分解可能な油から調製される様々な油中水型エマルジョン。特に好ましいアジュバントは、サイトカイン、例えばモノカイン、リンホカイン、インターロイキンまたはケモカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ���４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＴ−α、成長因子、例えばｈＧＨ、またはＰａｍ３Ｃｙｓなどのリポペプチドであり、これらはすべて、本発明の医薬組成物中で、または本発明のＲＮＡが治療法に使用される場合に、アジュバントとしての使用に適する。
【０１５４】
「増加する」、「増強する」または「延長する」などの用語は、好ましくは、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約１００％の増加、増強、または延長に関する。これらの用語は、ゼロまたは測定不能もしくは検出不能なレベルから、ゼロより高いレベルまたは測定可能もしくは検出可能なレベルへの増加、増強、または延長にも関連し得る。
【０１５５】
「減少する」、「低減する」または「阻害する」などの用語は、好ましくは５％以上、１０％以上、２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上のレベルの全体的な減少を生じさせる能力に関する。これには、完全なまたは本質的に完全な減少、すなわちゼロまたは本質的にゼロへの減少も含まれる。
【０１５６】
「移入する」、「トランスフェクトする」または「細胞に導入する」などの用語は、本明細書では互換的に使用され、核酸、特に外因性または異種核酸、好ましくはＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）の細胞への導入に関する。本発明によれば、細胞は、器官、組織および／または生物の一部を形成することができる。核酸、特に外因性または異種核酸、好ましくはＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）の細胞への導入は、インビボまたはインビトロで行うことができる。
【０１５７】
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、その細胞表面にＭＨＣ分子と会合した抗原、特にタンパク質抗原のペプチド断片を表示する細胞である。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用してこの複合体を認識し得る。抗原提示細胞は抗原をプロセシングし、Ｔ細胞に提示する。抗原提示細胞には、単球／マクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞（ＤＣ）が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、本発明によるＡＰＣは、哺乳動物、好ましくはヒト、マウス、またはラットである。
【０１５８】
ノンプロフェッショナル抗原提示細胞は、ナイーブＴ細胞との相互作用に必要なＭＨＣクラスＩＩタンパク質を構成的には発現しない；これらは、ＩＦＮγなどの特定のサイトカインによってノンプロフェッショナル抗原提示細胞が刺激されたときにのみ発現される。
【０１５９】
プロフェッショナル抗原提示細胞は、食作用または受容体媒介エンドサイトーシスのいずれかによって抗原を内在化し、次いでクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に結合した抗原の断片をその膜上に表示することにおいて非常に効率的である。Ｔ細胞は、抗原提示細胞の膜上の抗原−クラスＩＩ  ＭＨＣ分子複合体を認識し、それと相互作用する。次に、さらなる共刺激シグナルが抗原提示細胞によって生成され、Ｔ細胞の活性化をもたらす。共刺激分子の発現は、プロフェッショナル抗原提示細胞の決定的な特徴である。
【０１６０】
プロフェッショナル抗原提示細胞の主な種類は、最も広範囲の抗原提示を有し、おそらく最も重要な抗原提示細胞である樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および特定の活性化上皮細胞である。
【０１６１】
樹状細胞（ＤＣ）は、末梢組織中で捕捉された抗原を、ＭＨＣクラスＩＩおよびＩの両方の抗原提示経路を介してＴ細胞に提示する白血球集団である。樹状細胞は免疫応答の強力な誘導因子であり、これらの細胞の活性化が免疫誘導の重要な工程であることは周知である。
【０１６２】
樹状細胞は、好都合には「未成熟」細胞および「成熟」細胞として分類され、これらは、よく特徴付けられた２つの表現型を区別する簡単な方法として使用することができる。しかしながら、この命名法は、分化のすべての可能な中間段階を除外すると解釈されるべきではない。
【０１６３】
未成熟樹状細胞は、Ｆｃγ受容体およびマンノース受容体の高発現と相関する、抗原の取り込みおよびプロセシングの高い能力を有する抗原提示細胞として特徴付けられる。成熟表現型は、典型的には、これらのマーカの発現はより低いが、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ、接着分子（例えばＣＤ５４およびＣＤ１１）ならびに共刺激分子（例えばＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１  ＢＢ）などのＴ細胞活性化に関与する細胞表面分子の発現が高いことを特徴とする。
【０１６４】
樹状細胞の成熟は、そのような抗原提示樹状細胞がＴ細胞プライミングを引き起こす樹状細胞活性化の状態と称され、一方、未成熟樹状細胞による提示は寛容をもたらす。樹状細胞の成熟は、主に、先天性受容体によって検出される微生物特徴を有する生体分子（細菌ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、エンドトキシンなど）、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＦＮ）、ＣＤ４０Ｌによる樹状細胞表面のＣＤ４０の連結、およびストレスによる細胞死を受けている細胞から放出される物質によって引き起こされる。樹状細胞は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および腫瘍壊死因子αなどのサイトカインと共にインビトロで骨髄細胞を培養することによって得ることができる。
【０１６５】
本発明の文脈における「免疫反応性細胞」または「エフェクタ細胞」という用語は、免疫反応中にエフェクタ機能を発揮する細胞に関する。「免疫反応性細胞」は、好ましくは、抗原、または抗原もしくは抗原に由来する抗原ペプチドの発現および／もしくは提示を特徴とし、免疫応答を媒介する細胞に結合することができる。例えば、そのような細胞は、サイトカインおよび／またはケモカインを分泌し、微生物を死滅させ、抗体を分泌し、感染細胞または癌性細胞を認識し、任意でそのような細胞を排除する。例えば、免疫反応性細胞には、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤性Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、および樹状細胞が含まれる。好ましくは、本発明の文脈において、「免疫反応性細胞」は、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０１６６】
好ましくは、「免疫反応性細胞」は、特に抗原提示細胞または腫瘍細胞などの疾患細胞の表面などのＭＨＣ分子に関連して提示される場合、ある程度の特異性で抗原または抗原に由来する抗原ペプチドを認識する。好ましくは、前記認識は、抗原または前記抗原に由来する抗原ペプチドを認識する細胞が応答性または反応性であることを可能にする。細胞が、ＭＨＣクラスＩＩ分子に関連して抗原または抗原に由来する抗原ペプチドを認識する受容体を担持するヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）である場合、そのような応答性または反応性は、サイトカインの放出ならびに／またはＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）および／もしくはＢ細胞の活性化を含み得る。細胞がＣＴＬである場合、そのような応答性または反応性は、例えばアポトーシスまたはパーフォリン媒介細胞溶解を介した、ＭＨＣクラスＩ分子に関連して提示される細胞、すなわちクラスＩ  ＭＨＣと共に抗原を提示することを特徴とする細胞の除去を含み得る。本発明によれば、ＣＴＬ応答性には、持続的なカルシウム流入、細胞分裂、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生、ＣＤ４４およびＣＤ６９などの活性化マーカの上方制御、ならびに抗原を発現する標的細胞の特異的細胞溶解性死滅が含まれ得る。ＣＴＬ応答性はまた、ＣＴＬ応答性を正確に示す人工レポータを使用して決定し得る。抗原または抗原に由来する抗原ペプチドを認識し、応答性または反応性であるそのようなＣＴＬは、本明細書では「抗原応答性ＣＴＬ」とも称される。細胞がＢ細胞である場合、そのような応答性は免疫グロブリンの放出を含み得る。
【０１６７】
「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は、様々な細胞性免疫反応に関与する胸腺由来細胞に関し、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）および細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を含む。
【０１６８】
Ｔ細胞は、リンパ球として公知の白血球の群に属し、細胞性免疫において中心的な役割を果たす。これらは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれるこれらの細胞表面上の特別な受容体の存在によって、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞などの他の種類のリンパ球と区別することができる。胸腺は、Ｔ細胞の成熟に関与する主要な器官である。それぞれ別個の機能を有する、Ｔ細胞のいくつかの異なるサブセットが発見されている。
【０１６９】
Ｔヘルパー細胞は、数ある機能の中でも特に、Ｂ細胞の形質細胞への成熟ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫学的過程において他の白血球を補助する。これらの細胞は、その表面にＣＤ４タンパク質を発現するため、ＣＤ４＋Ｔ細胞としても知られる。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原と共に提示されたときに活性化される。ひとたび活性化されると、これらは速やかに分裂し、能動免疫応答を調節または補助する、サイトカインと呼ばれる小さなタンパク質を分泌する。
【０１７０】
細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶反応にも関与する。これらの細胞は、その表面にＣＤ８糖タンパク質を発現するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られる。これらの細胞は、身体のほぼあらゆる細胞の表面上に存在する、ＭＨＣクラスＩに関連する抗原に結合することによってその標的を認識する。
【０１７１】
Ｔ細胞の大部分は、いくつかのタンパク質の複合体として存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。実際のＴ細胞受容体は、独立したＴ細胞受容体アルファおよびベータ（ＴＣＲαおよびＴＣＲβ）遺伝子から生成され、α−およびβ−ＴＣＲ鎖と呼ばれる２本の別々のペプチド鎖からなる。γδ  Ｔ細胞（ガンマデルタＴ細胞）は、その表面に異なるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞の小さなサブセットである。しかし、γδ  Ｔ細胞では、ＴＣＲは１本のγ鎖と１本のδ鎖で構成される。このＴ細胞の群は、αβ  Ｔ細胞よりもはるかにまれである（全Ｔ細胞の２％）。
【０１７２】
Ｔ細胞受容体の構造は、抗体の腕の軽および重鎖の組合せとして定義される領域である、免疫グロブリンＦａｂ断片に非常に類似する。ＴＣＲのそれぞれの鎖は免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、１つのＮ末端免疫グロブリン（Ｉｇ）可変（Ｖ）ドメイン、１つのＩｇ定常（Ｃ）ドメイン、膜貫通／細胞膜貫通領域、およびＣ末端に短い細胞質尾部を有する。ＴＣＲ  α鎖とβ鎖の両方の可変ドメインは３つの超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するが、β鎖の可変領域は、通常は抗原と接触せず、したがってＣＤＲとは見なされない追加の超可変性（ＨＶ４）を有する。ＣＤＲ３は、プロセシングされた抗原の認識を担う主要なＣＤＲであるが、α鎖のＣＤＲ１も抗原性ペプチドのＮ末端部分と相互作用することが示されており、一方β鎖のＣＤＲ１はペプチドのＣ末端部分と相互作用する。ＣＤＲ２はＭＨＣを認識すると考えられている。β鎖のＣＤＲ４は、抗原認識には関与しないと考えられているが、スーパー抗原と相互作用することが示されている。ＴＣＲドメインの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成する短い連結配列からなり、これが２本の鎖の間にリンクを形成している。
【０１７３】
「末梢血単核細胞」または「ＰＢＭＣ」という用語は、円形の核を有する末梢血細胞に関する。これらの細胞はリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）と単球からなるが、赤血球と血小板は核を有さず、顆粒球（好中球、好塩基球、および好酸球）は多葉核を有する。これらの細胞は、フィコールと勾配遠心分離を使用して全血から抽出することができ、これにより、血液が血漿の最上層、続いてＰＢＭＣの層ならびに多形核細胞（好中球および好酸球など）と赤血球の最下層画分に分離される。
【０１７４】
「主要組織適合遺伝子複合体」という用語および「ＭＨＣ」という略語は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、すべての脊椎動物で生じる遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質または分子は、免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞または疾患細胞との間のシグナル伝達に重要であり、ＭＨＣタンパク質または分子はペプチドに結合し、Ｔ細胞受容体による認識のためにそれらを提示する。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、細胞の表面に発現され、Ｔ細胞に対して自己抗原（細胞自体からのペプチド断片）と非自己抗原（例えば侵入微生物の断片）の両方を表示する。
【０１７５】
ＭＨＣ領域は、クラスＩ、クラスＩＩ、およびクラスＩＩＩの３つのサブグループに分けられる。ＭＨＣクラスＩタンパク質は、α鎖およびβ２ミクログロブリン（１５番染色体によってコードされるＭＨＣの一部ではない）を含む。それらは、抗原断片を細胞傷害性Ｔ細胞に提示する。ほとんどの免疫系細胞、特に抗原提示細胞では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質はαとβ鎖を含み、抗原断片をＴヘルパー細胞に提示する。ＭＨＣクラスＩＩＩ領域は、補体成分およびサイトカインをコードするものなどの他の免疫成分をコードする。
【０１７６】
ヒトでは、細胞表面の抗原提示タンパク質をコードするＭＨＣ領域の遺伝子は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子と称される。しかし、ＭＨＣという略語は、しばしばＨＬＡ遺伝子産物を指すために使用される。ＨＬＡ遺伝子には、９つのいわゆる古典的ＭＨＣ遺伝子：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１が含まれる。
【０１７７】
免疫療法または免疫応答に関する本発明のすべての態様の１つの好ましい実施形態では、ＭＨＣ分子はＨＬＡ分子である。
【０１７８】
本発明の文脈において「免疫エフェクタ機能」または「エフェクタ機能」という用語は、例えば細胞の死滅をもたらす免疫系の成分によって媒介される任意の機能を含む。好ましくは、本発明の文脈における免疫エフェクタ機能は、Ｔ細胞媒介性エフェクタ機能である。そのような機能は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）の場合は、Ｔ細胞受容体によるＭＨＣクラスＩＩ分子に関連した抗原または抗原由来の抗原ペプチドの認識、サイトカインの放出、ならびに／またはＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）および／もしくはＢ細胞の活性化を含み、ＣＴＬの場合は、Ｔ細胞受容体によるＭＨＣクラスＩ分子に関連した抗原または抗原由来の抗原ペプチドの認識、例えばアポトーシスまたはパーフォリン媒介性細胞溶解を介した、ＭＨＣクラスＩ分子に関連して提示された細胞の除去、すなわちクラスＩ  ＭＨＣと共に抗原を提示することを特徴とする細胞の除去、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生、ならびに抗原を発現する標的細胞の特異的細胞溶解性死滅を含む。
【０１７９】
本発明の文脈における「免疫エフェクタ細胞」という用語は、免疫反応中にエフェクタ機能を発揮する細胞に関する。「免疫エフェクタ細胞」は、好ましくは、抗原または抗原の提示を特徴とし、免疫応答を媒介する細胞に結合することができる。例えば、そのような細胞は、サイトカインおよび／またはケモカインを分泌し、微生物を死滅させ、抗体を分泌し、感染細胞または癌性細胞を認識し、任意でそのような細胞を排除する。例えば、免疫エフェクタ細胞には、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤性Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、および樹状細胞が含まれる。好ましくは、本発明の文脈において、「免疫エフェクタ細胞」は、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０１８０】
好ましくは、「免疫エフェクタ細胞」は、特に抗原提示細胞または疾患細胞などの疾患細胞の表面などのＭＨＣ分子に関連して提示される場合、ある程度の特異性で抗原または前記抗原に由来する抗原ペプチドを認識する。好ましくは、前記認識は、抗原または前記抗原に由来する抗原ペプチドを認識する細胞が応答性であることを可能にする。細胞が、ＭＨＣクラスＩＩ分子に関連して抗原または前記抗原に由来する抗原ペプチドを認識する受容体を担持するヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）である場合、そのような応答性は、サイトカインの放出ならびに／またはＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）および／もしくはＢ細胞の活性化を含み得る。細胞がＣＴＬである場合、そのような応答性は、例えばアポトーシスまたはパーフォリン媒介性細胞溶解を介した、ＭＨＣクラスＩ分子に関連して提示される細胞、すなわちクラスＩ  ＭＨＣと共に抗原を提示することを特徴とする細胞の除去を含み得る。抗原または前記抗原に由来する抗原ペプチドを認識し、応答性であるそのようなＣＴＬは、本明細書では「抗原応答性ＣＴＬ」とも称される。細胞がＢ細胞である場合、そのような応答性は免疫グロブリンの放出を含み得る。
【０１８１】
「半減期」という用語は、分子の活性、量、または数の半分を除去するのに必要な期間に関する。本発明の文脈において、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の半減期は、前記ＲＮＡの安定性の指標である。ＲＮＡの半減期は、ＲＮＡの「発現の持続期間」に影響を及ぼし得る。長い半減期を有するＲＮＡは長期間発現されると予想することができる。
【０１８２】
言うまでもなく、本発明に従ってＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を低下させることが望ましい場合、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を高める上記の要素の機能を妨げるようにＲＮＡを修飾することが可能である。
【０１８３】
「患者」、「個体」、「対象」、または「動物」という用語は互換的に使用され、脊椎動物に関する。例えば、本発明の文脈における脊椎動物は、哺乳動物、鳥（例えば家禽）、爬虫類、両生類、硬骨魚、および軟骨魚、特に上記のいずれかの飼いならされた動物ならびに動物園の動物などの捕らわれている動物であり、好ましくは哺乳動物である。例えば、本発明の文脈における哺乳動物には、ヒト、非ヒト霊長動物、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマなどの飼いならされた哺乳動物、マウス、ラット、ウサギ、モルモットなどの実験動物、および動物園の動物などの捕らわれている動物が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「動物」という用語にはヒトも含まれる。「対象」という用語は、疾患、好ましくは本明細書に記載の疾患を有する患者、すなわち動物、好ましくはヒトも含み得る。
【０１８４】
本発明によれば、「慢性患者」または「長期患者」という用語は、慢性疾患または障害を有する患者を指す。「慢性疾患または障害」は、持続性であるおよび／またはその作用（例えば症状）が少なくとも３週間、例えば少なくとも４週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、少なくとも５年間、または少なくとも１０年間、例えば最大４週間、最大１ヶ月間、最大２ヶ月間、最大３ヶ月間、最大４ヶ月間、最大５ヶ月間、最大６ヶ月間、最大１２ヶ月間、最大２年間、最大３年間、最大４年間、最大５年間、最大１０年間、または患者の生涯にわたって持続する疾患または障害である。
【０１８５】
本発明によれば、「腫瘍」または「腫瘍疾患」という用語は、細胞（新生細胞または腫瘍細胞と呼ばれる）の異常な増殖によって形成される腫脹または病変を指す。「腫瘍細胞」とは、急速で制御されない細胞増殖によって成長し、新たな成長を開始させた刺激が停止した後も成長し続ける異常細胞を意味する。腫瘍は、構造機構および正常組織との機能的協調の部分的または完全な欠如を示し、通常は良性、前悪性または悪性のいずれかであり得る明確な組織塊を形成する。
【０１８６】
好ましくは、本発明による腫瘍疾患は癌疾患、すなわち悪性疾患であり、腫瘍細胞は癌細胞である。好ましくは、腫瘍疾患は、抗原、すなわち腫瘍抗原が発現されるかまたは異常発現される細胞を特徴とする。好ましくは、腫瘍疾患または腫瘍細胞は、クラスＩ  ＭＨＣと共に腫瘍抗原を提示することを特徴とする。
【０１８７】
「異常発現」とは、本発明によれば、健常個体の状態と比較して、発現が変化している、好ましくは増加していることを意味する。発現の増加は、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％の増加を指す。一実施形態では、発現は疾患組織でのみ認められ、健常組織での発現は抑制される。
【０１８８】
本発明による腫瘍疾患は癌であり、本発明による「癌」という用語には、白血病、セミノーマ、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、副腎癌、甲状腺癌、血液癌、皮膚癌、脳の癌、子宮頸癌、腸癌、肝臓癌、結腸癌、胃癌、腸癌、頭頸部癌、消化器癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵臓癌、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌、および肺癌、ならびにそれらの転移が含まれる。それらの例は、肺癌腫、乳房癌腫、前立腺癌腫、結腸癌腫、腎細胞癌腫、子宮頸癌腫、または上記の癌型もしくは腫瘍の転移である。本発明による「癌」という用語は癌転移も含む。
【０１８９】
一実施形態では、本発明によるＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードする（修飾）ＲＮＡ、特に（修飾）ｍＲＮＡである。本発明によれば、「ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡが、適切な環境、好ましくは細胞内に存在する場合、翻訳過程の間にペプチドまたはタンパク質を産生する、すなわち発現するようにアミノ酸のアセンブリに指令できることを意味する。好ましくは、本発明によるＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）は、ペプチドまたはタンパク質の翻訳を可能にする細胞翻訳機構と相互作用することができる。
【０１９０】
「コードする」は、定義されたヌクレオチドの配列または定義されたアミノ酸の配列のいずれかを有する、生物学的過程における他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として機能する、核酸中の特定のヌクレオチド配列の固有の特性を指す。したがって、核酸の発現（翻訳および任意で転写）が細胞または他の生体系でタンパク質を産生する場合、核酸はタンパク質をコードする。
【０１９１】
「発現」という用語は、本発明に従ってその最も一般的な意味で使用され、例えば転写および／または翻訳によるＲＮＡおよび／またはペプチドもしくはタンパク質の産生を含む。ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、特にペプチドまたはタンパク質の産生に関する。これはまた、核酸の部分的発現も含む。さらに、発現は一過性または安定であり得る。
【０１９２】
本発明の文脈において、「転写」という用語は、ＤＮＡ配列の遺伝暗号がＲＮＡに転写される過程に関する。その後、ＲＮＡはタンパク質に翻訳され得る。本発明によれば、「転写」という用語は「インビトロ転写」を含み、「インビトロ転写」という用語は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが、好ましくは適切な細胞抽出物を使用して、無細胞系においてインビトロで合成される過程に関する。好ましくは、クローニングベクターが転写物の生成に適用される。これらのクローニングベクターは、一般に転写ベクターと称され、本発明によれば「ベクター」という用語に包含される。本発明によれば、本発明で使用されるＲＮＡは、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって得られ得る。転写を制御するためのプロモータは、任意のＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモータであり得る。ＲＮＡポリメラーゼの特定の例は、Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼである。好ましくは、本発明によるインビトロ転写は、Ｔ７またはＳＰ６プロモータによって制御される。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することによって得られ得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得られ得る。
【０１９３】
ｃＤＮＡ含有ベクター鋳型は、転写後に、任意で異なるペプチドもしくはタンパク質を発現することができる異なるＲＮＡ分子の集団をもたらす異なるｃＤＮＡ挿入物を担持するベクターを含み得、または転写後にのみ、１つのペプチドもしくはタンパク質のみを発現することができる１つのＲＮＡ種の集団をもたらす唯一の種のｃＤＮＡ挿入物を担持するベクターを含み得る。したがって、単一のペプチドまたはタンパク質のみを発現できるＲＮＡを生成すること、またはＲＮＡライブラリおよび複数のペプチドもしくはタンパク質を発現できる全細胞ＲＮＡなどの異なるＲＮＡの組成物、例えばペプチドまたはタンパク質の組成物を生成することが可能である。本発明は、そのようなすべてのＲＮＡの細胞への導入を想定する。
【０１９４】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、プラスミドベクター、コスミドベクター、λファージなどのファージベクター、アデノウイルスもしくはバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、または細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）もしくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体ベクターを含む、当業者に公知の任意のベクターを含む。前記ベクターには、発現ベクターおよびクローニングベクターが含まれる。発現ベクターは、プラスミドおよびウイルスベクターを含み、一般に、所望のコード配列および特定の宿主生物（例えば細菌、酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物）またはインビトロ発現系における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な適切なＤＮＡ配列を含む。クローニングベクターは一般に、特定の所望のＤＮＡ断片を操作および増幅するために使用され、所望のＤＮＡ断片の発現に必要な機能的配列を欠いていてもよい。
【０１９５】
ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸は、多くの種類のベクターにクローニングすることができる。しかしながら、本発明は、特定のベクターに限定されると解釈されるべきではない。代わりに、本発明は、容易に入手可能であり、当技術分野で周知の非常に多くのベクターを包含すると解釈されるべきである。特定の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、細菌ベクター、および哺乳動物細胞ベクターからなる群より選択される。多くのそのような系が市販されており、広く入手可能である。
【０１９６】
ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は当技術分野で周知である。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、ウイルスはヘルパー依存性アデノウイルス（ＨＤ−Ａｄ）である。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能性の複製起点、プロモータ配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つ以上の選択可能なマーカを含む。
【０１９７】
分子生物学の当業者は、一般に、タンパク質発現のためにプロモータ、エンハンサ、および細胞型の組合せを使用する方法を知っている。使用されるプロモータは、構成的、組織特異的、誘導性であり得、および／または適切な条件下でペプチドもしくはタンパク質をコードする導入された核酸セグメントの高レベル発現を指令するのに有用であり得る。プロモータは、異種または内因性であり得る。本発明に従って使用され得る構成的プロモータ配列には、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ配列、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモータ、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモータ、モロニーウイルスプロモータ、トリ白血病ウイルスプロモータ、エプスタインバーウイルス前初期プロモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモータ、ならびにアクチンプロモータ、ミオシンプロモータ、ヘモグロビンプロモータ、および筋肉クレアチンプロモータなどの、しかしこれらに限定されないヒト遺伝子プロモータが含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明は、構成的プロモータの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモータもまた、本発明の一部として企図される。本発明における誘導性プロモータの使用は、そのような発現が所望される場合にプロモータが作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現をオンにする、または発現が所望されない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモータの例には、メタロチオネインプロモータ、グルココルチコイドプロモータ、プロゲステロンプロモータ、およびテトラサイクリンプロモータが含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明は、組織特異的プロモータの使用を含み、このプロモータは所望の組織においてのみ活性である。組織特異的プロモータは当技術分野で周知であり、ＨＥＲ−２プロモータおよびＰＳＡ関連プロモータ配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９８】
ペプチドまたはタンパク質の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、選択マーカ遺伝子またはレポータ遺伝子またはその両方を含むこともでき、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させようとする細胞集団からの発現細胞の同定および選択を容易にし得る。他の実施形態では、選択マーカは別個のＤＮＡ片上に担持されてもよく、同時トランスフェクション手順において使用され得る。選択マーカとレポータ遺伝子の両方に、細胞での発現を可能にする適切な調節配列を隣接させ得る。有用な選択マーカは当技術分野で公知であり、例えばｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。レポータ遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を同定するため、および調節配列の機能性を評価するために使用される。容易にアッセイ可能なタンパク質をコードするレポータ遺伝子は、当技術分野で周知である。一般に、レポータ遺伝子は、レシピエントの生物または組織に存在しないかまたは発現されない遺伝子であり、その発現がいくつかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によって明らかにされるタンパク質をコードする遺伝子である。レポータ遺伝子の発現は、核酸がレシピエント細胞に導入された後の適切な時点でアッセイされる。適切なレポータ遺伝子には、ルシフェラーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子が含まれ得る。
【０１９９】
ベクターは、当技術分野における任意の方法によって細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的手段によって細胞に移入することができる。核酸を宿主細胞に導入する物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を作製する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）参照。
【０２００】
目的の核酸を細胞に導入する生物学的方法には、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するための最も広く使用される方法になっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。
【０２０１】
核酸を細胞に導入する化学的手段には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームなどの脂質ベースの系が含まれる。インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして使用するための好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち人工膜小胞）である。そのような系の調製および使用は、当技術分野で周知である。
【０２０２】
外因性核酸を細胞に導入する、または細胞内のペプチドもしくはタンパク質の細胞レベルを増加させるために使用される方法に関わりなく、細胞におけるペプチドまたはタンパク質またはそのコード核酸の存在および／または量を確認するために、様々なアッセイを実施し得る。そのようなアッセイには、例えばサザンブロット法、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ、ならびに例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）によって特定のペプチドの存在または非存在を検出するためのアッセイが含まれる。
【０２０３】
「細胞」という用語は、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）でトランスフェクトすることができる任意の細胞を意味し、トランスフェクトされるＲＮＡは、好ましくは外因性または異種ＲＮＡである。細胞は任意の対象から得ることができ、一実施形態では、障害または疾患を有する患者から得られ得る。細胞が障害または疾患を有する患者から得られる場合、細胞は、導入されるＲＮＡと相同であるが、活性が低下したペプチドまたはタンパク質をもたらす遺伝物質を含み得る。活性低下は、（ｉ）ペプチドもしくはタンパク質の発現減少（すなわちペプチドもしくはタンパク質は十分に機能性であるが、その量が減少している）または（ｉｉ）発現されたペプチドもしくはタンパク質のアミノ酸配列における１つ以上の突然変異の存在（すなわちペプチドもしくはタンパク質が十分に機能性ではない）の結果であり得る。例えば、活性が低下したペプチドまたはタンパク質をもたらすそのような相同な遺伝物質は、（ｉ）１つ以上の突然変異を含む前記遺伝子の発現が低下もしくはサイレンシングし、それにより減少した量の十分に機能性であるペプチドもしくはタンパク質をもたらす、および／または（ｉｉ）前記遺伝子によってコードされるペプチドもしくはタンパク質のアミノ酸配列が１つ以上の突然変異を含み、それにより十分に機能性ではない（もしくは非機能性の）ペプチドもしくはタンパク質をもたらすような方法で１つ以上の突然変異を含む遺伝子であり得る。
【０２０４】
十分に機能性のペプチドまたはタンパク質が、細胞または患者において発現されるが、細胞または患者の機能を維持するには量が低すぎる場合（例えば細胞が含まれる患者における疾患または障害の発症につながる）、前記ペプチドまたはタンパク質を置換または補充する療法（タンパク質補充療法）は有益であろう。そのようなタンパク質補充療法は、前記ペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡ（またはそのようなＲＮＡを含む医薬組成物などの組成物）を患者に投与する工程、あるいは（ａ）前記ペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡを細胞（患者から得られ得る）に移入し、（ｂ）前記トランスフェクトされた細胞を患者に投与する工程を含み得る。
【０２０５】
患者におけるペプチドまたはタンパク質の活性低下（したがって、疾患または障害の発症）が、前記ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列における１つ以上の突然変異の存在に起因する（すなわちペプチドまたはタンパク質が十分に機能性ではない）場合、ゲノム操作療法は有益であろう。そのようなゲノム操作療法は、患者に、（ｉ）ゲノム操作タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡ（特に本発明のＲＮＡ）および（ｉｉ）ペプチドまたはタンパク質をその天然（すなわち非変異）形態でコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡを投与する工程を含み得る。
【０２０６】
あるいは、遺伝的再プログラミング療法は、特に所望のペプチドまたはタンパク質（例えばインスリンなどのホルモン）を産生する細胞の枯渇または消失を引き起こす疾患または障害を有する患者に有益である。例えば、そのような遺伝的再プログラミング療法は、（ａ）１つ以上の再プログラミング因子をコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡ（特に本発明のＲＮＡ）を体細胞に導入する工程；（ｂ）幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程；および（ｃ）幹細胞特性を有する細胞を患者に投与する工程を含み得る。好ましい実施形態では、体細胞は患者にとって自家である。
【０２０７】
本発明による「翻訳」という用語は、ｍＲＮＡの鎖が、ペプチドまたはポリペプチドを作製するようにアミノ酸の配列のアセンブリを指令する、細胞のリボソームにおける過程に関する。翻訳は、インビボ（例えば細胞、組織、もしくは生物において）またはインビトロ（例えば無細胞系を使用して）で実施され得る。
【０２０８】
本発明に従って核酸と機能的に連結され得る発現制御配列または調節配列は、核酸に関して同種または異種であり得る。コード配列および調節配列は、コード配列の転写または翻訳が調節配列の制御下または影響下にあるように一緒に共有結合されている場合、「機能的に」連結されている。調節配列とコード配列との機能的連結によって、コード配列が機能的タンパク質に翻訳される場合、調節配列の誘導は、コード配列のリーディングフレームシフトまたはコード配列が所望のタンパク質もしくはペプチドに翻訳されないことを生じさせずに、コード配列の転写をもたらす。
【０２０９】
「発現制御配列」または「調節配列」という用語は、本発明によれば、核酸の転写または誘導されたＲＮＡの翻訳を制御する、プロモータ、リボソーム結合配列および他の制御エレメントを含む。本発明の特定の実施形態では、調節配列を制御することができる。調節配列の正確な構造は種または細胞型に応じて異なり得るが、一般に、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などの転写または翻訳の開始に関与する５'非転写ならびに５'および３'非翻訳配列を含む。特に、５'非転写調節配列は、機能的に結合した遺伝子の転写制御のためのプロモータ配列を含有するプロモータ領域を含む。調節配列は、エンハンサ配列または上流活性化配列も含み得る。
【０２１０】
本発明によれば、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）などの核酸は、インビトロでまたは対象内に存在し得る細胞に取り込まれるかまたは導入される、すなわちトランスフェクトまたは形質導入されると、前記ペプチドまたはタンパク質の発現をもたらすことが好ましい。細胞は、コードされたペプチドまたはタンパク質を細胞内で（例えば細胞質および／または核内で）発現してもよく、コードされたペプチドまたはタンパク質を分泌してもよく、またはそれを表面に発現してもよい。
【０２１１】
本発明によれば、「発現する核酸」および「コードする核酸」などの用語または類似の用語は、本明細書では互換的に使用され、特定のペプチドまたはポリペプチドに関して、核酸が、適切な環境、好ましくは細胞内に存在する場合、発現されて前記ペプチドまたはポリペプチドを生成できることを意味する。
【０２１２】
本発明によれば、ＲＮＡは、例えば腹腔内、筋肉内、もしくは皮内へのＲＮＡの投与、または細胞が未成熟な抗原提示細胞である場合は、リンパ系（リンパ節など）へのＲＮＡの投与によって、インビトロまたはインビボのいずれかで細胞に移入されるべきである。本発明によれば、ＲＮＡを細胞に移入するのに適した任意の技術を使用して、ＲＮＡを細胞に導入し得る。好ましくは、ＲＮＡは標準的な技術によって細胞にトランスフェクトされる。そのような技術には、核酸のリン酸カルシウム沈殿物のトランスフェクション、ＤＥＡＥに関連する核酸のトランスフェクション、目的の核酸を担持するウイルスによるトランスフェクションまたは感染、エレクトロポレーション、リポフェクション、およびマイクロインジェクションが含まれる。本発明によれば、核酸の投与は、裸の核酸として、または投与試薬と組み合わせて達成される。好ましくは、核酸の投与は裸の核酸の形態である。好ましくは、ＲＮＡは、ＲＮアーゼ阻害剤などの安定化物質と組み合わせて投与される。特に好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡおよび／または組成物は、裸のＲＮＡとして、好ましくは腹腔内、筋肉内に、結節内注射または経皮投与によって投与される。抗原提示細胞（未成熟抗原提示細胞など）、好ましくは樹状細胞（未成熟樹状細胞など）の場合、特に未成熟樹状細胞などの未成熟抗原提示細胞はマクロピノサイトーシスによって裸のＲＮＡを取り込むことができるため、従来のトランスフェクション技術は、裸のＲＮＡを前記細胞に導入するために絶対に必要とは限らない。好ましくは、目的のペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡの細胞への導入は、細胞内での前記目的のペプチドまたはタンパク質の発現をもたらす。特定の実施形態では、核酸を特定の細胞に標的化することが好ましい。そのような実施形態では、細胞への核酸の投与に適用される担体（例えばレトロウイルスまたはリポソーム）は、標的分子を示す。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質または標的細胞上の受容体のリガンドに特異的な抗体などの分子を、核酸担体に組み込み得るかまたはそれに結合し得る。核酸がリポソームによって投与される場合、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質を、標的化および／または取り込みを可能にするためにリポソーム製剤に組み込み得る。そのようなタンパク質は、特定の細胞型、内在化されるタンパク質に対する抗体、細胞内の位置を標的とするタンパク質などに特異的なカプシドタンパク質またはその断片を包含する。
【０２１３】
本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、ペプチド結合によって共有結合で連結された２個以上、好ましくは３個以上、好ましくは４個以上、好ましくは６個以上、好ましくは８個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１３個以上、好ましくは１６個以上、好ましくは２１個以上、および好ましくは８、１０、２０、３０、４０または５０個、特に１００個までのアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」という用語は、選択的に、大きなペプチド、好ましくは１００個を超えるアミノ酸残基を有するペプチドを指すが、一般に「ペプチド」と「タンパク質」という用語は同義語であり、本明細書では互換的に使用される。
【０２１４】
「免疫学的に活性な化合物」という用語は、好ましくは免疫細胞の成熟を誘導および／もしくは抑制する、サイトカイン生合成を誘導および／もしくは抑制する、ならびに／またはＢ細胞による抗体産生を刺激することにより体液性免疫を変化させることによって、免疫応答を変化させる任意の化合物に関する。免疫学的に活性な化合物は、抗ウイルスおよび抗腫瘍活性を含むがこれらに限定されない強力な免疫刺激活性を有し、また免疫応答の他の局面を下方制御する、例えば免疫応答をＴＨ２免疫応答からシフトさせることもでき、これは広範囲のＴＨ２媒介性疾患を治療するのに有用である。免疫学的に活性な化合物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。
【０２１５】
一実施形態では、特に抗原（疾患関連抗原）が関与するまたはそれを発現する疾患を有する哺乳動物を治療することを所望する場合、疾患関連抗原などの抗原をコードするＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）を哺乳動物に投与する。ＲＮＡは、好ましくは哺乳動物の抗原提示細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞または他の細胞）に取り込まれる。ＲＮＡの抗原性翻訳産物が形成され、その産物がＴ細胞による認識のために細胞の表面に表示される。一実施形態では、抗原またはその任意のプロセシングによって生成された産物は、それらの活性化をもたらすＴ細胞受容体を介したＴ細胞による認識のためにＭＨＣ分子に関連して細胞表面に表示される。
【０２１６】
「目的の抗原を提示するＭＨＣ分子の部分」という用語は、細胞表面のＭＨＣ分子の総量に対して、特定の抗原または前記抗原由来の抗原ペプチドが負荷されている、すなわち結合している、抗原提示細胞の表面上のＭＨＣ分子の画分を指す。好ましい実施形態では、本発明の５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡは、ＲＮＡが移入された抗原提示細胞の表面上に目的の抗原を提示するＭＨＣ分子の部分を増加させることができる。これは、本発明の５'キャップ化合物の５'キャップ構造を担持しないＲＮＡ、特に、従来のＲＮＡキャップを担持するＲＮＡとの比較においてである。
【０２１７】
本発明によれば、「疾患」、「障害」、および「状態」という用語は、本明細書では互換的に使用され、感染症（すなわち病原体によって引き起こされる疾患）、腫瘍疾患、および望ましくない炎症を含む任意の病的状態を指す。
【０２１８】
「リスクがある」とは、一般集団と比較して疾患を発症する可能性が通常よりも高いと同定された個体、すなわち患者を意味する。さらに、疾患を有していたか、または現在有している個体は、引き続き疾患を発症する可能性があるため、疾患を発症するリスクが高い対象である。
【０２１９】
「インビボ」という用語は、対象における状況に関する。
【０２２０】
「自己」という用語は、同じ対象に由来するものを表すために使用される。例えば、「自己細胞」とは、同じ対象に由来する細胞を指す。そのような手順は、さもなければ拒絶反応をもたらす免疫学的障壁を克服するため、有利である。
【０２２１】
「異種」という用語は、複数の異なる要素からなるものを表すために使用される。一例として、ある個体の骨髄を異なる個体に移入することは、異種移植を構成する。異種遺伝子は、対象以外の供給源に由来する遺伝子である。
【０２２２】
本明細書で使用される「非ヌクレオチドリンカー」という用語は、リン酸塩またはリン酸塩誘導体（ホスホロチオエート、ボラノホスフェート、イミドホスフェート、アルキレンホスフェート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、ホスホトリエステル、またはホスホロアミダイトなど）ではない２つのヌクレオシドの任意のリンカーを意味する。好ましくは、非ヌクレオチドリンカーは、ペプチド、アミン、脂肪族炭化水素（例えばアルキル）、または芳香族炭化水素であり、炭化水素は、任意に、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、尿素、またはチオ尿素を含むがこれらに限定されない１つ以上の官能基を含んでもよい。そのような非ヌクレオチドリンカーの特定の例には、アルキルリンカーが含まれるが、これに限定されない。アルキルリンカーは、分岐または非分岐、環状または非環状、置換または非置換、飽和または不飽和、キラル、アキラルまたはラセミ混合物であってよい。アルキルリンカーは、２〜１８個の炭素原子、例えば３〜９個の炭素原子を有することができる。いくつかのアルキルリンカーは、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、尿素、およびチオエーテルを含むがこれらに限定されない１つ以上の官能基を含む。そのようなアルキルリンカーには、１−プロパノール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２，３−プロパントリオール、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ポリエチレングリコールリンカー（例えば［−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−］ｃ、（ｃ＝１、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９））、メチルリンカー、エチルリンカー、プロピルリンカー、ブチルリンカー、またはヘキシルリンカーが含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、非ヌクレオチドリンカーは、式ＨＯ−（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ２）ｐ−ＯＨ［式中、ｏおよびｐは、独立して、１〜６、例えば１〜４、または１〜３の整数である］のグリセロールまたはグリセロールホモログである。いくつかの他の実施形態では、非ヌクレオチドリンカーは、式ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＮＨＣ（ＯＭＣＨ２）ｍ−ＯＨ［式中、各ｍは、独立して、０〜１０、例えば０〜６、２〜６、または２〜４の整数である］を有するものなどの１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの誘導体である。
【０２２３】
「アルキル」という用語は、飽和直鎖または分岐炭化水素のモノラジカルを指す。好ましくは、アルキル基は、１〜２０個の炭素原子、例えば１〜１２個または１〜１０個の炭素原子、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の炭素原子、より好ましくは１〜８個の炭素原子、例えば１〜６個または１〜４個の炭素原子を含む。例示的なアルキル基には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル（例えばｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、ペンチル（例えばｎ−ペンチル、イソペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ネオペンチル）、１，２−ジメチルプロピル、イソアミル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、２，２−ジメチルブチル、ｎ−ヘプチル、イソヘプチル、ｎ−オクチル、２−エチルヘキシル、ｎ−ノニル、ｎ−デシルなどが含まれる。「置換アルキル」とは、アルキル基の１個以上（例えば１個からアルキル基に結合した水素原子の最大数まで、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大１０個まで、例えば１〜５個、１〜４個、または１〜３個、または１もしくは２個）の水素原子が、水素以外の置換基で置換されている（複数の水素原子が置換されている場合、置換基は同じでも異なっていてもよい）ことを意味する。好ましくは、水素以外の置換基は、本明細書で指定されるような第１レベルの置換基、第２レベルの置換基、または第３レベルの置換基、例えばハロゲンまたは置換されていてもよいアリールである。置換アルキルの例には、トリフルオロメチル、２，２，２−トリクロロエチル、アリールアルキル（「アラルキル」とも呼ばれる、例えばベンジル、クロロ（フェニル）メチル、４−メチルフェニルメチル、（２，４−ジメチルフェニル）メチル、ｏ−フルオロフェニルメチル、２−フェニルプロピル、２−、３−、もしくは４−カルボキシフェニルアルキル）、またはヘテロアリールアルキル（「ヘテロアラルキル」とも呼ばれる）が含まれる。
【０２２４】
「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する不飽和の直鎖または分岐炭化水素のモノラジカルを指す。一般に、アルケニル基の炭素−炭素二重結合の最大数は、アルケニル基の炭素原子の数を２で割ることによって計算される整数に等しく、アルケニル基の炭素原子の数が奇数である場合は、除算の結果を次の整数に切り捨てる。例えば、９個の炭素原子を有するアルケニル基の場合、炭素−炭素二重結合の最大数は４である。好ましくは、アルケニル基は、１〜４個、すなわち１、２、３、または４個の炭素−炭素二重結合を有する。好ましくは、アルケニル基は、２〜２０個の炭素原子、例えば２〜１２個または２〜１０個の炭素原子、すなわち２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の炭素原子、より好ましくは２〜８個の炭素原子、例えば２〜６個の炭素原子または２〜４個の炭素原子を含む。したがって、好ましい実施形態では、アルケニル基は、２〜１０個の炭素原子および１、２、３、４、もしくは５個の炭素−炭素二重結合を含み、より好ましくは２〜８個の炭素原子および１、２、３、もしくは４個の炭素−炭素二重結合、例えば２〜６個の炭素原子および１、２、もしくは３個の炭素−炭素二重結合、または２〜４個の炭素原子および１もしくは２個の炭素−炭素二重結合を含む。炭素−炭素二重結合（１つまたは複数）は、シス（Ｚ）またはトランス（Ｅ）配置であり得る。例示的なアルケニル基には、エテニル（すなわちビニル）、１−プロペニル、２−プロペニル（すなわちアリル）、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニル、１−ヘプテニル、２−ヘプテニル、３−ヘプテニル、４−ヘプテニル、５−ヘプテニル、６−ヘプテニル、１−オクテニル、２−オクテニル、３−オクテニル、４−オクテニル、５−オクテニル、６−オクテニル、７−オクテニル、１−ノネニル、２−ノネニル、３−ノネニル、４−ノネニル、５−ノネニル、６−ノネニル、７−ノネニル、８−ノネニル、１−デセニル、２−デセニル、３−デセニル、４−デセニル、５−デセニル、６−デセニル、７−デセニル、８−デセニル、９−デセニルなどが含まれる。アルケニル基が窒素原子に結合している場合、二重結合は窒素原子に対してアルファではあり得ない。「置換アルケニル」とは、アルケニル基の１個以上（例えば１個からアルケニル基に結合した水素原子の最大数まで、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大１０個まで、例えば１〜５個、１〜４個、または１〜３個、または１もしくは２個）の水素原子が、水素以外の置換基で置換されている（複数の水素原子が置換されている場合、置換基は同じでも異なっていてもよい）ことを意味する。好ましくは、水素以外の置換基は、本明細書で指定されるような第１レベルの置換基、第２レベルの置換基、または第３レベルの置換基、例えばハロゲンまたは置換されていてもよいアリールである。置換アルケニルの一例は、スチリル（すなわち２−フェニルビニル）である。
【０２２５】
「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの炭素‐炭素三重結合を有する不飽和の直鎖または分岐炭化水素のモノラジカルを指す。一般に、アルキニル基の炭素−炭素三重結合の最大数は、アルキニル基の炭素原子の数を２で割ることによって計算される整数に等しく、アルキニル基の炭素原子の数が奇数である場合は、除算の結果を次の整数に切り捨てる。例えば、９個の炭素原子を有するアルキニル基の場合、炭素−炭素三重結合の最大数は４である。好ましくは、アルキニル基は、１〜４個、すなわち１、２、３、または４個、より好ましくは１もしくは２個の炭素−炭素三重結合を有する。好ましくは、アルキニル基は、２〜２０個の炭素原子、例えば２〜１２個または２〜１０個の炭素原子、すなわち２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の炭素原子、より好ましくは２〜８個の炭素原子、例えば２〜６個の炭素原子または２〜４個の炭素原子を含む。したがって、好ましい実施形態では、アルキニル基は、２〜１０個の炭素原子および１、２、３、４、もしくは５個（好ましくは１、２、もしくは３個）の炭素−炭素三重結合を含み、より好ましくは２〜８個の炭素原子および１、２、３、もしくは４個（好ましくは１もしくは２個）の炭素−炭素三重結合、例えば２〜６個の炭素原子および１、２、もしくは３個の炭素−炭素三重結合、または２〜４炭素原子および１もしくは２個の炭素−炭素三重結合を含む。例示的なアルキニル基には、エチニル、１−プロピニル（すなわち−Ｃ≡ＣＣＨ３）、２−プロピニル（すなわち−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨまたはプロパルギル）、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニル、１−ヘプチニル、２−ヘプチニル、３−ヘプチニル、４−ヘプチニル、５−ヘプチニル、６−ヘプチニル、１−オクチニル、２−オクチニル、３−オクチニル、４−オクチニル、５−オクチニル、６−オクチニル、７−オクチニル、１−ノニリル、２−ノニニル、３−ノニニル、４−ノニニル、５−ノニニル、６−ノニニル、７−ノニニル、８−ノニニル、１−デシニル、２−デシニル、３−デシニル、４−デシニル、５−デシニル、６−デシニル、７−デシニル、８−デシニル、９−デシニルなどが含まれる。アルキニル基が窒素原子に結合している場合、三重結合は窒素原子に対してアルファではあり得ない。「置換アルキニル」とは、アルキニル基の１個以上（例えば１個からアルキニル基に結合した水素原子の最大数まで、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大１０個まで、例えば１〜５個、１〜４個、または１〜３個、または１もしくは２個）の水素原子が、水素以外の置換基で置換されている（複数の水素原子が置換されている場合、置換基は同じでも異なっていてもよい）ことを意味する。好ましくは、水素以外の置換基は、本明細書で指定されるような第１レベルの置換基、第２レベルの置換基、または第３レベルの置換基、例えばハロゲンまたは置換されていてもよいアリールである。
【０２２６】
「アリール」または「芳香環」という用語は、芳香族環状炭化水素のモノラジカルを指す。好ましくは、アリール基は、１個の環（例えばフェニル）または２つ以上の縮合環（例えばナフチル）に配置され得る３〜１４個（例えば５〜１０個、例えば５、６、または１０個）の炭素原子を含む。例示的なアリール基には、シクロプロペニリウム、シクロペンタジエニル、フェニル、インデニル、ナフチル、アズレニル、フルオレニル、アントリル、およびフェナントリルが含まれる。好ましくは、「アリール」は、６個の炭素原子を含む単環式環または１０個の炭素原子を含む芳香族二環式環系を指す。好ましい例は、フェニルおよびナフチルである。「置換アリール」とは、アリール基の１個以上（例えば１個からアリール基に結合した水素原子の最大数まで、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大１０個まで、例えば１〜５個、１〜４個、または１〜３個、または１もしくは２個）の水素原子が、水素以外の置換基で置換されている（複数の水素原子が置換されている場合、置換基は同じでも異なっていてもよい）ことを意味する。好ましくは、水素以外の置換基は、本明細書で指定されるような第１レベルの置換基、第２レベルの置換基、または第３レベルの置換基、例えばハロゲン、−ＣＮ、ニトロ、−ＯＲ１１（例えば−ＯＨ）、−ＳＲ１１（例えば−ＳＨ）、−Ｎ（Ｒ１２）（Ｒ１３）（例えば−ＮＨ２）、＝Ｚ（例えば＝Ｏ、＝Ｓ、または＝ＮＨ）、アルキル（例えばＣ１−６アルキル）、アルケニル（例えばＣ２−６アルケニル）、およびアルキニル（例えばＣ２−６アルキニル）である。置換アリールの例には、ビフェニル、２−フルオロフェニル、アニリニル、３−ニトロフェニル、４−ヒドロキシフェニル、メトキシフェニル（すなわち２−、３−、または４−メトキシフェニル）、および４−エトキシフェニルが含まれる。
【０２２７】
「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香環」という用語は、アリール基の１個以上の炭素原子がＯ、Ｓ、またはＮのヘテロ原子で置換されてている、上記で定義されたアリール基を意味する。好ましくは、ヘテロアリールは、１、２、または３個の炭素原子が、Ｏ、Ｎ、またはＳの同じまたは異なるヘテロ原子で置換されている５または６員芳香族単環式環を指す。あるいは、１、２、３、４、または５個の炭素原子がＯ、Ｎ、またはＳの同じまたは異なるヘテロ原子で置換されている芳香族二環式または三環式環系を意味する。好ましくは、ヘテロアリール基の各環において、Ｏ原子の最大数は１であり、Ｓ原子の最大数は１であり、ＯおよびＳ原子の最大総数は２である。例示的なヘテロアリール基には、フラニル、チエニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾチエニル、１Ｈ−インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、インドオキサジニル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾジアジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、ベンゾトリアジニル、ピリダジニル、フェノキサジニル、チアゾロピリジニル、ピロロチアゾリル、フェノチアジニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、ピロリジニル、インドリジニル、インダゾリル、プリニル、キノリジニル、フタラジニル、ナフチリジニル、シンノリニル、プテリジニル、カルバゾリル、フェナントリジニル、アクリジニル、ペリミジニル、フェナントロリニル、およびフェナジニルが含まれる。例示的な５または６員ヘテロアリール基には、フラニル、チエニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、ピロリル、イミダゾリル（例えば２−イミダゾリル）、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル（例えば４−ピリジル）、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、およびピリダジニルが含まれる。「置換ヘテロアリール」とは、ヘテロアリール基の１個以上（例えば１個からヘテロアリール基に結合した水素原子の最大数まで、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大１０個まで、例えば１〜５個、１〜４個、または１〜３個、または１もしくは２個）の水素原子が、水素以外の置換基で置換されている（複数の水素原子が置換されている場合、置換基は同じでも異なっていてもよい）ことを意味する。好ましくは、水素以外の置換基は、本明細書で指定されるような第１レベルの置換基、第２レベルの置換基、または第３レベルの置換基、例えばハロゲン、−ＣＮ、ニトロ、−ＯＲ１１（例えば−ＯＨ）、−ＳＲ１１（例えば−ＳＨ）、−Ｎ（Ｒ１２）（Ｒ１３）（例えば−ＮＨ２）、＝Ｚ（例えば＝Ｏ、＝Ｓ、または＝ＮＨ）、アルキル（例えばＣ１−６アルキル）、アルケニル（例えばＣ２−６アルケニル）、およびアルキニル（例えばＣ２−６アルキニル）である。置換ヘテロアリールの例には、３−フェニルピロリル、２，３'−ビフリル、４−メチルピリジル、２−、または３−エチルインドリルが含まれる。
【０２２８】
「シクロアルキル」または「脂環式」という用語は、好ましくは３〜１４個の炭素原子、例えば３〜１０個の炭素原子、すなわち３、４、５、６、７、８、９、または１０個の炭素原子、より好ましくは３〜７個の炭素原子を有する「アルキル」および「アルケニル」の環状非芳香族型を表す。一実施形態では、シクロアルキル基は、１個、２個、またはそれ以上（好ましくは１または２個）の二重結合を有する。例示的なシクロアルキル基には、シクロプロピル、シクロプロペニル、シクロブチル、シクロブテニル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロヘプテニル、シクロオクチル、シクロオクテニル、シクロノニル、シクロノネニル、シクロデシル、シクロデセニル、およびアダマンチルが含まれる。「シクロアルキル」という用語は、その二環式および三環式型も含むことが意図されている。二環式環が形成される場合、それぞれの環が２個の隣接する炭素原子で互いに結合されていることが好ましいが、あるいは２個の環は同じ炭素原子によって結合されている、すなわちそれらはスピロ環系を形成するかまたは「架橋」環系を形成する。シクロアルキルの好ましい例には、Ｃ３−Ｃ８−シクロアルキル、特にシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、シクロオクチル、スピロ［３，３］ヘプチル、スピロ［３，４］オクチル、スピロ［４，３］オクチル、スピロ［４，５］デカニル、ビシクロ［４．１．０］ヘプチル、ビシクロ［３．２．０］ヘプチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル（すなわちノルボルニル）、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［５．１．０］オクチル、ビシクロ［４．２．０］オクチル、ビシクロ［４．３．０］ノニル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル（すなわちテトラリニル）、およびビシクロ［４．４．０］デカニル（すなわちデカリニル）が含まれる。「置換シクロアルキル」とは、シクロアルキル基の１個以上（例えば１個からシクロアルキル基に結合した水素原子の最大数まで、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大１０個まで、例えば１〜５個、１〜４個、または１〜３個、または１もしくは２個）の水素原子が、水素以外の置換基で置換されている（複数の水素原子が置換されている場合、置換基は同じでも異なっていてもよい）ことを意味する。好ましくは、水素以外の置換基は、本明細書で指定されるような第１レベルの置換基、第２レベルの置換基、または第３レベルの置換基、例えばハロゲン、−ＣＮ、ニトロ、−ＯＲ１１（例えば−ＯＨ）、−ＳＲ１１（例えば−ＳＨ）、−Ｎ（Ｒ１２）（Ｒ１３）（例えば−ＮＨ２）、＝Ｚ（例えば＝Ｏ、＝Ｓ、または＝ＮＨ）、アルキル（例えばＣ１−６アルキル）、アルケニル（例えばＣ２−６アルケニル）、およびアルキニル（例えばＣ２−６アルキニル）である。置換シクロアルキルの例には、オキソシクロヘキシル、オキソシクロペンチル、フルオロシクロヘキシル、およびオキソシクロヘキセニルが含まれる。
【０２２９】
「ヘテロシクリル」または「複素環」という用語は、シクロアルキル基の１、２、３、または４個の炭素原子が酸素、窒素、ケイ素、セレン、リン、または硫黄、好ましくはＯ、Ｓ、またはＮのヘテロ原子で置換されている、上記で定義されたシクロアルキル基を意味する。ヘテロシクリル基は、好ましくは３〜１０個、例えば３、４、５、６、または７個の環原子を含む１または２個の環を有する。好ましくは、ヘテロシクリル基の各環において、Ｏ原子の最大数は１であり、Ｓ原子の最大数は１であり、ＯおよびＳ原子の最大総数は２である。「ヘテロシクリル」という用語はまた、上記のヘテロアリール基の部分的または完全に水素化された形態（例えばジヒドロ、テトラヒドロまたはペルヒドロ形態）を包含することが意図されている。例示的なヘテロシクリル基には、モルホリニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、ピペリジニル（ピペリジルとも呼ばれる）、ピペラジニル、ジおよびテトラヒドロフラニル、ジおよびテトラヒドロチエニル、ジおよびテトラヒドロピラニル、ウロトロピニル、ラクトン、ラクタム、環状イミド、および環状無水物が含まれる。「置換ヘテロシクリル」とは、ヘテロシクリル基の１個以上（例えば１個からヘテロシクリル基に結合した水素原子の最大数まで、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大１０個まで、例えば１〜５個、１〜４個、または１〜３個、または１もしくは２個）の水素原子が、水素以外の置換基で置換されている（複数の水素原子が置換されている場合、置換基は同じでも異なっていてもよい）ことを意味する。好ましくは、水素以外の置換基は、本明細書で指定されるような第１レベルの置換基、第２レベルの置換基、または第３レベルの置換基、例えばハロゲン、−ＣＮ、ニトロ、−ＯＲ１１（例えば−ＯＨ）、−ＳＲ１１（例えば−ＳＨ）、−Ｎ（Ｒ１２）（Ｒ１３）（例えば−ＮＨ２）、＝Ｚ（例えば＝Ｏ、＝Ｓ、または＝ＮＨ）、アルキル（例えばＣ１−６アルキル）、アルケニル（例えばＣ２−６アルケニル）、およびアルキニル（例えばＣ２−６アルキニル）である。
【０２３０】
炭化水素の文脈において使用される「芳香族」という用語は、分子全体が芳香族でなければならないことを意味する。例えば、単環式アリールが（部分的または完全に）水素化される場合、得られる水素化環状構造は、本発明の目的のためにシクロアルキルとして分類される。同様に、二環式または多環式アリール（ナフチルなど）が水素化される場合、得られる水素化二環式または多環式構造（１，２−ジヒドロナフチルなど）は、本発明の目的のためにシクロアルキルとして分類される（１，２−ジヒドロナフチルにおけるように、１個の環がまだ芳香族である場合でも）。本出願内では、ヘテロアリールとヘテロシクリルとの間で同様の区別がなされる。例えば、インドリニル、すなわちインドリルのジヒドロ変異体は、二環式構造の１個の環のみが芳香族であり、環原子の１つがヘテロ原子であるため、本発明の目的のためにヘテロシクリルとして分類される。
【０２３１】
「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード、好ましくはフルオロを意味する。「ヒドロキシ」という用語は、ＯＨを意味する。「アルコキシ」という用語は、アルキルが上記で定義されたとおりであるＯ−アルキルを意味し、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ペントキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、およびデシルオキシを含む。「置換アルコキシ」という用語は、Ｏ−（置換アルキル）を意味し、置換アルキルは上記で定義されたとおりであり、２−メトキシエトキシを含む。「ニトロ」という用語は、ＮＯ２を意味する。「シアノ」という用語は、−ＣＮ基を意味する。「イソシアノ」という用語は、−ＮＣ基を意味する。「シアナト」という用語は、−ＯＣＮ基を意味する。「イソシアナト」という用語は、−ＮＣＯ基を意味する。「チオシアナト」という用語は、−ＳＣＮ基を意味する。「イソチオシアナト」という用語は、−ＮＣＳ基を意味する。「アジド」という用語は、Ｎ３を意味する。
【０２３２】
「アミノ」という用語は、非置換アミノ（すなわち−ＮＨ２基）および置換アミノ（すなわち１個または２個の水素原子が水素以外の基で置換されている一置換または二置換アミノ）を含む。したがって、「アミノ」という用語は、−Ｎ（Ｒ１２）（Ｒ１３）基を意味し、ここで、Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれの場合に、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルからなる群より独立して選択され、またはＲ１２およびＲ１３は、それらが結合している窒素原子と一緒になって−Ｎ＝ＣＲ１５Ｒ１６基を形成してもよく、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリル基はそれぞれ、１個以上（例えば１個から、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリル基に結合した水素原子の最大数まで、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大１０個まで、例えば１〜５個、１〜４個、または１〜３個、または１もしくは２個）の独立して選択されるＲ３０で置換されていてもよく、Ｒ１５およびＲ１６は、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、および−ＮＨｙＲ２０２−ｙからなる群より独立して選択されるか、またはＲ１５およびＲ１６は、それらが結合している原子と一緒になって１個以上（例えば１個から環に結合した水素原子の最大数まで、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大１０個まで、例えば１〜５個、１〜４個、または１〜３個、または１もしくは２個）の独立して選択されるＲ３０で置換されていてもよい環を形成し、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリル基はそれぞれ、１個以上（例えば１個から、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリル基に結合した水素原子の最大数まで、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大１０個まで、例えば１〜５個、１〜４個、または１〜３個、または１もしくは２個）の独立して選択されるＲ３０で置換されていてもよく、ｙは０から２までの整数であり、Ｒ２０は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルからなる群より選択され、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリル基はそれぞれ、１個以上（例えば１個から、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリル基に結合した水素原子の最大数まで、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大１０個まで、例えば１〜５個、１〜４個、または１〜３個、または１もしくは２個）の独立して選択されるＲ３０で置換されていてもよく、ならびにＲ３０は、第１（または第２または第３）レベルの置換基である。
【０２３３】
「イミノ」という用語は、−Ｎ（Ｒ１４）−基を意味し、ここで、窒素原子の両方の自由原子価が他の１つの原子（例えばＣ）に結合して二重結合（例えばＣ＝Ｎ（Ｒ１４））を生成してもよく、または異なる原子（例えば、２つのＣ原子）に結合して２つの単結合（例えばＣ−Ｎ（Ｒ１４）−Ｃ）を生成してもよい。いずれの場合も、Ｒ１４は、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルからなる群より選択され、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリル基はそれぞれ、１個以上（例えば１個から、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリル基に結合した水素原子の最大数まで、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大１０個まで、例えば１〜５個、１〜４個、または１〜３個、または１もしくは２個）の独立して選択されるＲ３０で置換されていてもよく、ならびにＲ３０は、第１（または第２または第３）レベルの置換基である。
【０２３４】
「置換されていてもよい」という用語は、１個以上（例えば１個から、１つの部分に結合した水素原子の最大数まで、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大１０個まで、例えば１〜５個、１〜４個、または１〜３個、または１もしくは２個）の水素原子が、水素とは異なる基／置換基（すなわち第１レベルの置換基）、例えばアルキル（好ましくはＣ１−６アルキル）、アルケニル（好ましくはＣ２−６アルケニル）、アルキニル（好ましくはＣ２−６アルキニル）、アリール（好ましくは３〜１４員アリール）、ヘテロアリール（好ましくは３〜１４員ヘテロアリール）、シクロアルキル（好ましくは３〜１４員シクロアルキル）、ヘテロシクリル（好ましくは３〜１４員ヘテロシクリル）、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＮＣＯ、−ＣＮＯ、−ＳＣＮ，−ＮＣＳ、−Ｎ３、−ＮＯ２、−ＯＲ７１、−Ｎ（Ｒ７２）（Ｒ７３）、−ＯＮ（Ｒ７２）（Ｒ７３）、−Ｎ＋（−Ｏ−）（Ｒ７２）（Ｒ７３）、−Ｓ（Ｏ）０−２Ｒ７１（すなわち−ＳＲ７１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７１、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７１）、−Ｓ（Ｏ）０−２ＯＲ７１（例えば−Ｓ（Ｏ）１−２ＯＲ７１）、−ＯＳ（Ｏ）０−２ＯＲ７１（例えば−ＯＳ（Ｏ）１−２ＯＲ７１）、−Ｓ（Ｏ）０−２Ｎ（Ｒ７２）（Ｒ７３）（例えば−Ｓ（Ｏ）１−２Ｎ（Ｒ７２）（Ｒ７３））、−ＯＳ（Ｏ）０−２Ｎ（Ｒ７２）（Ｒ７３）（例えば−ＯＳ（Ｏ）１−２Ｎ（Ｒ７２）（Ｒ７３））、−Ｎ（Ｒ７１）Ｓ（Ｏ）０−２Ｒ７１（例えば−Ｎ（Ｒ７１）Ｓ（Ｏ）１−２Ｒ７１）、−ＮＲ７１Ｓ（Ｏ）０−２ＯＲ７１（例えば−ＮＲ７１Ｓ（Ｏ）１−２ＯＲ７１）、−ＮＲ７１Ｓ（Ｏ）０−２Ｎ（Ｒ７２）（Ｒ７３）（例えば−ＮＲ７１Ｓ（Ｏ）１−２Ｎ（Ｒ７２）（Ｒ７３））、−Ｃ（＝Ｚ１）Ｒ７１、−Ｃ（＝Ｚ１）Ｚ１Ｒ７１、−Ｚ１Ｃ（＝Ｚ１）Ｒ７１、および−Ｚ１Ｃ（＝Ｚ１）Ｚ１Ｒ７１で置換されていてもよく、ならびに／あるいはシクロアルキルまたはヘテロシクリル基の同じ炭素原子に結合している任意の２個の第１レベルの置換基が一緒になって＝Ｚ１を形成してもよいことを示し、ここで、第１レベルの置換基のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクリル基はそれぞれ、それ自体が、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、３〜１４員アリール、３〜１４員ヘテロアリール、３〜１４員シクロアルキル、３〜１４員ヘテロシクリル、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＮＣＯ、−ＣＮＯ、−ＳＣＮ、−ＮＣＳ、−Ｎ３、−ＮＯ２、−ＯＲ８１、−Ｎ（Ｒ８２）（Ｒ８３）、−ＯＮ（Ｒ８２）（Ｒ８３）、−Ｎ＋（−Ｏ−）（Ｒ８２）（Ｒ８３）、−Ｓ（Ｏ）０−２Ｒ８１（すなわち−ＳＲ８１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８１、または−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８１）、−Ｓ（Ｏ）０−２ＯＲ８１（例えば−Ｓ（Ｏ）１−２ＯＲ８１）、−ＯＳ（Ｏ）０−２Ｒ８１（例えば−ＯＳ（Ｏ）１−２Ｒ８１）、−ＯＳ（Ｏ）０−２ＯＲ８１（例えば−ＯＳ（Ｏ）１−２ＯＲ８１）、−Ｓ（Ｏ）０−２Ｎ（Ｒ８２）（Ｒ８３）（例えば−Ｓ（Ｏ）１−２Ｎ（Ｒ８２）（Ｒ８３））、−ＯＳ（Ｏ）０−２Ｎ（Ｒ８２）（Ｒ８３）（例えば−ＯＳ（Ｏ）１−２Ｎ（Ｒ８２）（Ｒ８３））、−Ｎ（Ｒ８１）Ｓ（Ｏ）０−２Ｒ８１（例えば−Ｎ（Ｒ８１）Ｓ（Ｏ）１−２Ｒ８１）、−ＮＲ８１Ｓ（Ｏ）０−２ＯＲ８１（例えば−ＮＲ８１Ｓ（Ｏ）１−２ＯＲ８１）、−ＮＲ８１Ｓ（Ｏ）０−２Ｎ（Ｒ８２）（Ｒ８３）（例えば−ＮＲ８１Ｓ（Ｏ）１−２Ｎ（Ｒ８２）（Ｒ８３））、−Ｃ（＝Ｚ２）Ｒ８１、−Ｃ（＝Ｚ２）Ｚ２Ｒ８１、−Ｚ２Ｃ（＝Ｚ２）Ｒ８１、および−Ｚ２Ｃ（＝Ｚ２）Ｚ２Ｒ８１からなる群より選択される１個以上（例えば１、２または３個）の置換基（すなわち第２レベルの置換基）で置換されていてもよく、ならびに／あるいはシクロアルキルまたはヘテロシクリル基の同じ炭素原子に結合している２個の第２レベルの置換基が一緒になって＝Ｚ２を形成してもよく、ここで、第２レベルの置換基のＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、３〜１４員アリール、３〜１４員ヘテロアリール、３〜１４員シクロアルキル、３〜１４員ヘテロシクリル基はそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＮＣＯ、−ＣＮＯ、−ＳＣＮ、−ＮＣＳ、−Ｎ３、−ＮＯ２、−ＯＨ、−Ｏ（Ｃ１−３アルキル）、−ＯＣＦ３、−Ｓ（Ｃ１−３アルキル）、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−３アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−３アルキル）２、−ＮＨＳ（Ｏ）２（Ｃ１−３アルキル）、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−３アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−３アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−ＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−３アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−３アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−３アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨｚ−２（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨｚ−２（Ｃ１−３アルキル）ｚ、および−Ｎ（Ｃ１−３アルキル）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚからなる群より独立して選択される１個以上（例えば１、２または３個）の置換基（すなわち第３レベルの置換基）で置換されていてもよく、ここで、ｚは０、１、または２であり、Ｃ１−３アルキルはメチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルであり、ならびに／あるいはシクロアルキルまたはヘテロシクリル基の同じ炭素原子に結合している任意の２個の第３レベルの置換基は、一緒になって＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＨ、または＝Ｎ（Ｃ１−３アルキル）を形成してもよく；
ここで、
Ｒ７１、Ｒ７２、およびＲ７３は、−Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、３〜７員シクロアルキル、５または６員アリール、５または６員ヘテロアリール、および３〜７員ヘテロシクリルからなる群より独立して選択され、ここで、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、３〜７員シクロアルキル、５または６員アリール、５または６員ヘテロアリール、および３〜７員ヘテロシクリル基はそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＮＣＯ、−ＣＮＯ、−ＳＣＮ、−ＮＣＳ、−Ｎ３、−ＮＯ２、−ＯＨ、−Ｏ（Ｃ１−３アルキル）、−ＯＣＦ３、−Ｓ（Ｃ１−３アルキル）、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−３アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−３アルキル）２、−ＮＨＳ（Ｏ）２（Ｃ１−３アルキル）、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−３アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−３アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−ＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−３アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−３アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−３アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨｚ−２（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨｚ−２（Ｃ１−３アルキル）ｚ、および−Ｎ（Ｃ１−３アルキル）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚからなる群より選択される１、２または３個の置換基で置換されていてもよく、ここで、ｚは０、１、または２であり、Ｃ１−３アルキルはメチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルであり、
あるいは、Ｒ７２およびＲ７３は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、Ｃ１−３アルキル、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＮＣＯ、−ＣＮＯ、−ＳＣＮ、−ＮＣＳ、−Ｎ３、−ＮＯ２、−ＯＨ、−Ｏ（Ｃ１−３アルキル）、−ＯＣＦ３、−Ｓ（Ｃ１−３アルキル）、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−３アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−３アルキル）２、−ＮＨＳ（Ｏ）２（Ｃ１−３アルキル）、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−３アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−３アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−ＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−３アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−３アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−３アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨｚ−２（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨｚ−２（Ｃ１−３アルキル）ｚ、および−Ｎ（Ｃ１−３アルキル）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚからなる群より選択される１、２または３個の置換基で置換されていてもよい５または６員環を形成してもよく、ここで、ｚは０、１、または２であり、Ｃ１−３アルキルはメチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルであり；
Ｒ８１、Ｒ８２、およびＲ８３は、−Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ２−４アルキニル、３〜６員シクロアルキル、５または６員アリール、５または６員ヘテロアリール、および３〜６員ヘテロシクリルからなる群より独立して選択され、ここで、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ２−４アルキニル、３〜６員シクロアルキル、５または６員アリール、５または６員ヘテロアリール、および３〜６員ヘテロシクリル基はそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＮＣＯ、−ＣＮＯ、−ＳＣＮ、−ＮＣＳ、−Ｎ３、−ＮＯ２、−ＯＨ、−Ｏ（Ｃ１−３アルキル）、−ＯＣＦ３、−Ｓ（Ｃ１−３アルキル）、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−３アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−３アルキル）２、−ＮＨＳ（Ｏ）２（Ｃ１−３アルキル）、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−３アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−３アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−ＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−３アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−３アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−３アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨｚ−２（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨｚ−２（Ｃ１−３アルキル）ｚ、および−Ｎ（Ｃ１−３アルキル）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚからなる群より選択される１、２または３個の置換基で置換されていてもよく、ここで、ｚは０、１、または２であり、Ｃ１−３アルキルはメチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルであり、
あるいは、Ｒ８２およびＲ８３は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、Ｃ１−３アルキル、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＮＣＯ、−ＣＮＯ、−ＳＣＮ、−ＮＣＳ、−Ｎ３、−ＮＯ２、−ＯＨ、−Ｏ（Ｃ１−３アルキル）、−ＯＣＦ３、−Ｓ（Ｃ１−３アルキル）、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−３アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−３アルキル）２、−ＮＨＳ（Ｏ）２（Ｃ１−３アルキル）、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−３アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−３アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−ＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−３アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−３アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−３アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨｚ−２（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨｚ−２（Ｃ１−３アルキル）ｚ、および−Ｎ（Ｃ１−３アルキル）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚからなる群より選択される１、２または３個の置換基で置換されていてもよい５または６員環を形成してもよく、ここで、ｚは０、１、または２であり、Ｃ１−３アルキルはメチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルであり；
Ｚ１およびＺ２は、Ｏ、Ｓ、およびＮ（Ｒ８４）から独立して選択され、ここで、Ｒ８４は、−ＨまたはＣ１−３アルキルである。
【０２３５】
典型的な第１レベルの置換基は、好ましくは、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、３〜１４員（５または６員など）アリール、３〜１４員（５または６員）ヘテロアリール、３〜１４員（３〜７員など）シクロアルキル、３〜１４員（３〜７員など）ヘテロシクリル、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＮＣＯ、−ＣＮＯ、−ＳＣＮ、−ＮＣＳ、−Ｎ３、−ＮＯ２、−ＯＲ７１、−Ｎ（Ｒ７２）（Ｒ７３）、−Ｓ（Ｏ）０−２Ｒ７１、−Ｓ（Ｏ）０−２ＯＲ７１、−ＯＳ（Ｏ）０−２Ｒ７１、−ＯＳ（Ｏ）０−２ＯＲ７１、−Ｓ（Ｏ）０−２Ｎ（Ｒ７２）（Ｒ７３）、−ＯＳ（Ｏ）０−２Ｎ（Ｒ７２）（Ｒ７３）、−Ｎ（Ｒ７１）Ｓ（Ｏ）０−２Ｒ７１、−ＮＲ７１Ｓ（Ｏ）０−２ＯＲ７１、−Ｃ（＝Ｚ１）Ｒ７１、−Ｃ（＝Ｚ１）Ｚ１Ｒ７１、−Ｚ１Ｃ（＝Ｚ１）Ｒ７１、および−Ｚ１Ｃ（＝Ｚ１）Ｚ１Ｒ７１、例えばＣ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ２−４アルキニル、５または６員アリール、５または６員ヘテロアリール、３〜７員シクロアルキル、３〜７員ヘテロシクリル、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＮＣＯ、−ＣＮＯ、−ＳＣＮ、−ＮＣＳ、−Ｎ３、−ＮＯ２、−ＯＨ、−Ｏ（Ｃ１−３アルキル）、−Ｓ（Ｃ１−３アルキル）、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−３アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−３アルキル）２、−ＮＨＳ（Ｏ）２（Ｃ１−３アルキル）、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−３アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−３アルキル）、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨｚ−２（Ｃ１−３アルキル）ｚ、および−Ｎ（Ｃ１−３アルキル）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚからなる群より選択され、ここで、ｚは０、１、または２であり、Ｃ１−３アルキルはメチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルであり；Ｚ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮ（ＣＨ３）から独立して選択され；ならびにＲ７１、Ｒ７２、およびＲ７３は、上記で定義されたとおりであるか、または好ましくは、−Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ２−４アルキニル、５または６員シクロアルキル、５または６員アリール、５または６員ヘテロアリール、および５または６員ヘテロシクリルからなる群より独立して選択され、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリル基はそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＮＣＯ、−ＣＮＯ、−ＳＣＮ、−ＮＣＳ、−Ｎ３、−ＮＯ２、−ＯＨ、−Ｏ（Ｃ１−３アルキル）、−ＯＣＦ３、−Ｓ（Ｃ１−３アルキル）、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−３アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−３アルキル）２、−ＮＨＳ（Ｏ）２（Ｃ１−３アルキル）、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−３アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−３アルキル）、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨｚ−２（Ｃ１−３アルキル）ｚ、および−Ｎ（Ｃ１−３アルキル）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚから選択される１、２または３個の置換基で置換されていてもよく、ここで、ｚは０、１、または２であり、Ｃ１−３アルキルはメチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルであり；あるいは、Ｒ７２およびＲ７３は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、Ｃ１−３アルキル、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＮＣＯ、−ＣＮＯ、−ＳＣＮ、−ＮＣＳ、−Ｎ３、−ＮＯ２、−ＯＨ、−Ｏ（Ｃ１−３アルキル）、−ＯＣＦ３、−Ｓ（Ｃ１−３アルキル）、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−３アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−３アルキル）２、−ＮＨＳ（Ｏ）２（Ｃ１−３アルキル）、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−３アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−３アルキル）、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨｚ−２（Ｃ１−３アルキル）ｚ、および−Ｎ（Ｃ１−３アルキル）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚからなる群より選択される１、２または３個の置換基で置換されていてもよい５または６員環を形成してもよく、ここで、ｚは０、１、または２であり、Ｃ１−３アルキルはメチル、エチル、プロピル、またはイソプロピルである。
【０２３６】
典型的な第２レベルの置換基は、好ましくは、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ２−４アルキニル、５員または６員アリール、５員または６員ヘテロアリール、５員または６員シクロアルキル、５員または６員のヘテロシクリル、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＮＣＯ、−ＣＮＯ、−ＳＣＮ、−ＮＣＳ、−Ｎ３、−ＮＯ２、−ＯＨ、−Ｏ（Ｃ１−３アルキル）、−ＯＣＦ３、−Ｓ（Ｃ１−３アルキル）、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−３アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−３アルキル）２、−ＮＨＳ（Ｏ）２（Ｃ１−３アルキル）、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ１−３アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−３アルキル）、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨｚ−２（Ｃ１−３アルキル）ｚ、および−Ｎ（Ｃ１−３アルキル）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２−ｚ（Ｃ１−３アルキル）ｚからなる群より選択され、ここで、ｚは０、１、または２であり、Ｃ１−３アルキルはメチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルである。特に好ましい第２レベルの置換基には、４−モルホリニル、ホモモルホリニル、４−ピペリジニル、ホモピペリジニル（すなわちアゼパニル、特に４−アゼパニル）、４−ピペラジニル、ホモピペラジニル（すなわちジアゼパニル、特に２，４‐ジアゼパニル）、Ｎ‐メチル−ピペラジン−４−イル、Ｎ−メチル−ホモピペラジニル、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２−ｚ（ＣＨ３）ｚ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２−ｚ（ＣＨ３）ｚ、−ＣＦ３、および−ＯＣＦ３が含まれる。
【０２３７】
典型的な第３レベルの置換基は、好ましくは、フェニル、フラニル、ピロリル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、前記の基の部分的および完全に水素化された形態、モルホリノ、Ｃ１−３アルキル、ハロゲン、−ＮＣ、−ＮＣＯ、−ＣＮＯ、−ＳＣＮ、−ＮＣＳ、−Ｎ３、−ＣＦ３、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＨ３、−ＮＨ２−ｚ（ＣＨ３）ｚ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ３からなる群より選択され、ここで、ｚは０、１、または２である。
【０２３８】
本明細書で使用される「任意の」または「任意に」という用語は、続いて記述される事象、状況、または状態が起こってもよくまたは起こらなくてもよいこと、およびその記述が、前記事象、状況、または状態が起こる場合と起こらない場合を含むことを意味する。
【０２３９】
「異性体」は、同じ分子式を有するが、構造が異なる化合物（「構造異性体」）、または官能基および／もしくは原子の幾何学的配置が異なる化合物（「立体異性体」）である。「鏡像異性体」は、重ね合わせることができない互いの鏡像である一対の立体異性体である。「ラセミ混合物」または「ラセミ化合物」は、一対の等量の鏡像異性体を含み、接頭辞（±）で表される。「ジアステレオマー」は、鏡像異性体ではない立体異性体である。「互変異性体」は、純粋な場合でも自発的に相互変換する、同じ化学物質の構造異性体である。
【０２４０】
本発明の５'キャップ化合物または本発明の５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡは、同位体標識され得る、すなわち１つ以上の原子が、同じ数のプロトンを有するが中性子の数が異なる対応する原子によって置換される。例えば、水素原子は重水素原子で置換され得る。本発明の５'キャップ化合物または本発明の５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡにおいて使用できる例示的な同位体には、重水素、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、３２Ｓ、３６Ｃｌ、および１２５Ｉが含まれる。「同位体濃縮された」という用語は、同位体の発生が自然の存在率を超えていることを意味する。同位体標識された本発明の５'キャップ化合物、または本出願のそのような同位体標識された５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡは、インビトロ転写中に対応する同位体標識されたヌクレオチドを使用することによって、または転写後にそのような対応する同位体標識されたヌクレオチドを付加することによって生成できる。
【０２４１】
「置換基Ｒ５を含むＰ原子の立体化学的配置は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する」という表現は、置換基Ｒ５を含み、キラル中心を有し、したがって２つの立体化学的配置のいずれかで存在することができるリン原子が、主に１つの所望の立体化学的配置、すなわちβ−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置で存在することを意味する。β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子に関して場合により、これは（Ｒ）配置または（Ｓ）配置のいずれかであり得る。好ましくは、目的の基の５０％より多くが所望の立体化学的配置を有し、好ましくは目的の基の少なくとも７５％が所望の立体化学的配置を有し、より好ましくは目的の基の少なくとも９０％が所望の立体化学的配置を有し、さらにより好ましくは目的の基の少なくとも９５％が所望の立体化学的配置を有し、最も好ましくは目的の基の少なくとも９９％が所望の立体化学的配置を有する。
【０２４２】
ベータ−Ｓ−ＡＲＣＡ（β−Ｓ−ＡＲＣＡ）のＤ１ジアステレオマーは、以下の構造：
【化２】
2021515577.tif 000003
を有する。
【０２４３】
「ベータ−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマー」または「β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）」は、ベータ−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマー（β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２））と比較して、ＨＰＬＣカラムで最初に溶出し、したがってより短い保持時間を示すβ−Ｓ−ＡＲＣＡのジアステレオマーである。ＨＰＬＣは、好ましくは分析ＨＰＬＣである。一実施形態では、、好ましくは５μｍ、４．６×２５０ｍｍの形式のＳｕｐｅｌｃｏｓｉｌ  ＬＣ−１８−Ｔ  ＲＰカラムを分離に使用し、それにより１．３ｍｌ／分の流速を適用することができる。一実施形態では、酢酸アンモニウム中のメタノールの勾配、例えば１５分以内で０．０５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝５．９中のメタノールの０〜２５％直線勾配を使用する。ＵＶ検出（ＶＷＤ）は２６０ｎｍで実施でき、蛍光検出（ＦＬＤ）は２８０ｎｍでの励起および３３７ｎｍでの検出で実施できる。
【０２４４】
対象物に関連して本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、対象物が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、自然界の供給源から単離することができ、実験室で人によって意図的に改変されていないタンパク質、アミノ酸または核酸は、天然に存在する。
【０２４５】
本発明は、好ましくは免疫細胞において、より好ましくは未成熟免疫細胞において、さらにより好ましくは未成熟抗原提示細胞において、最も好ましくは未成熟樹状細胞において、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡの安定性および／または発現を増加させるための前記ＲＮＡの修飾に関する。本発明に記載される修飾されたＲＮＡは、ＲＮＡワクチン接種に特に有用である。
５'キャップ化合物
【０２４６】
第１の態様では、本出願は、式（Ｉ）：
【化３】
2021515577.tif 000004
式（Ｉ）
［式中、Ｒ１は、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリール、および置換されていてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、および置換されていてもよいアルコキシからなる群より独立して選択されるか、またはＲ２とＲ３が一緒になってＯ−Ｘ−Ｏ［Ｘは、置換されていてもよいＣＨ２、置換されていてもよいＣＨ２ＣＨ２、置換されていてもよいＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、置換されていてもよいＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）、および置換されていてもよいＣ（ＣＨ３）２からなる群より選択される］を形成するか、またはＲ２は、Ｒ２が結合している環の４'位の水素原子と結合して−Ｏ−ＣＨ２−または−ＣＨ２−Ｏ−を形成し；
Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、およびＢＨ３からなる群より独立して選択され；
Ｒ５は、Ｓ、Ｓｅ、およびＢＨ３からなる群より選択され；
Ｒ７は、２、３、４、５、６、７、８、または９個（２、３、４、５、または６個など）の塩基を有するモノヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであり；
Ｒ８は、Ｈ、ハロ、または置換されていてもよいアルコキシであり；
ｎは１、２、または３であり；ならびに
Ｂはプリンまたはピリミジン塩基部分である］
による５'キャップ構造を有する５'キャップ化合物を提供する。
【０２４７】
一実施形態では、５'キャップ化合物は、式（Ｉａ）：
【化４】
2021515577.tif 000005
式（Ｉａ）
［式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、ｎ、およびＢは、上記または下記で定義されるとおりであり、Ｒ１は、５'キャップ化合物が前記５'キャップ化合物を含むＲＮＡの翻訳を阻害しないように選択される］
を有する。式（Ｉａ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、Ｒ１は、キャップされたＲＮＡ、特にキャップされたＲＮＡの５'キャップ構造が、好ましくはインビボおよびインビトロで、翻訳開始機構によって認識されるように、好ましくはキャップされたＲＮＡ、特にキャップされたＲＮＡの５'キャップ構造が真核生物の翻訳開始機構によって認識されるように選択される。例えば、当業者は、キャップされたＲＮＡまたはキャップされたＲＮＡの５'キャップ構造が真核生物翻訳開始機構によって認識されるかどうかを、前記キャップされたＲＮＡまたは前記５'キャップ構造に対する真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅの親和性を測定することによって決定し得る。
【０２４８】
式（Ｉａ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、Ｒ１は、置換されていてもよいＣ１−Ｃ４アルキル（例えば、いずれも置換されていてもよい、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ベンジル、フェニルエチル、およびナフチルメチル）、置換されていてもよいＣ２−Ｃ４アルケニル（例えば、いずれも置換されていてもよい、エテニル、プロペニル、またはブテニル）、ならびに置換されていてもよいアリールからなる群より選択される。式（Ｉａ）の５'キャップ化合物の好ましい実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび置換されていてもよいアリールからなる群より選択される。式（Ｉａ）の５'キャップ化合物の好ましい実施形態では、Ｒ１は、メチル、エチル、置換されていてもよいベンジル、置換されていてもよいフェニルエチル、および置換されていてもよいナフチルメチルからなる群より選択される。式（Ｉａ）の５'キャップ化合物の好ましい実施形態では、Ｒ１はメチルまたはエチル、より好ましくはメチルである。
【０２４９】
一実施形態では、５'キャップ化合物は、式（Ｉｂ）：
【化５】
2021515577.tif 000006
式（Ｉｂ）
［式中、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、ｎ、およびＢは、上記（特に式（Ｉ）および（Ｉａ）の１つ以上に関して）または下記で定義されるとおりであり、Ｒ２およびＲ３の配置は、５'キャップ化合物が１つの方向でのみＲＮＡ鎖に組み込まれ得る配置である］
を有する。Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５，ＲＮＡ  Ｊ．１：９５７−９６７）は、インビトロ転写中に、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼが転写の開始のために７−メチルグアノシン単位を使用し、それによりキャップを有する転写物の約４０〜５０％がキャップジヌクレオチドを逆方向に有する（すなわち最初の反応産物はＧｐｐｐｍ７ＧｐＮである）ことを明らかにした。正しい方向のキャップ構造を含むＲＮＡと比較して、逆方向のキャップ構造を含むＲＮＡ（リバースキャップを有するＲＮＡとも呼ばれる）は、コードされたタンパク質の翻訳に関して機能性ではない。したがって、キャップを正しい方向に組み込むこと、すなわちｍ７ＧｐｐｐＧｐＮなどに本質的に対応するキャップ構造を有するＲＮＡが得られることが望ましい。キャップジヌクレオチドの逆方向組み込みは、メチル化グアノシン単位の２'−ＯＨ基または３'−ＯＨ基のいずれかの置換によって阻害されることが示されている（Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；ＲＮＡ  Ｊ．７：１４８６−１４９５；Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２４：１６１−１６４）。そのような「抗リバースキャップ類似体」、すなわちＡＲＣＡの存在下で合成されるＲＮＡは、従来の５'キャップｍ７ＧｐｐｐＧの存在下でインビトロで転写されたＲＮＡよりも効率的に翻訳される。さらに、Ｋｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９，１３１：６３６４−６３６５）は、ロックト核酸（ＬＮＡ）修飾ジヌクレオチドｍＲＮＡキャップ類似体も、ＲＮＡ鎖に逆方向で組み込まれないことを見出した。
【０２５０】
その結果、式（Ｉｂ）の５'キャップ化合物の好ましい実施形態では、Ｒ１は、真核生物翻訳開始機構が本発明の５'キャップ化合物でキャップされたＲＮＡを認識することができるように選択され、Ｒ２およびＲ３の少なくとも一方（または両方）は、５'キャップ化合物がＲＮＡ鎖に逆方向で組み込まれることができないように選択される。
【０２５１】
式（Ｉｂ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、および２−メトキシエトキシからなる群より独立して選択される。式（Ｉｂ）の５'キャップ化合物の好ましい実施形態では、Ｒ２およびＲ３の一方はＯＨであり、他方はＯＨではない。式（Ｉｂ）の５'キャップ化合物の別の好ましい実施形態では、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つはＯＨではない。例えば、式（Ｉｂ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、および２−メトキシエトキシからなる群より、好ましくはＨ、Ｆ、メトキシ、エトキシ、およびプロポキシからなる群より選択される。
【０２５２】
上記の式（Ｉｂ）の５'キャップ化合物の実施形態のいずれか１つにおいて、置換基Ｒ２およびＲ３を含む環構造は、リボースの立体化学的配置を有し得る。この実施形態では、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つがＯＨではないことが好ましい。
【０２５３】
上記実施形態のものにおいて、Ｒ２（またはＲ３）がＯＨではない場合、Ｒ２（またはＲ３）は、好ましくはＨ、ハロ、および置換されていてもよいＣ１−Ｃ１０アルコキシからなる群より、より好ましくはＨ、Ｆ、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、および２−メトキシエトキシからなる群より、より好ましくはＨ、Ｆ、メトキシ、エトキシ、およびプロポキシからなる群より選択される。より好ましくは、それはメトキシである。
【０２５４】
式（Ｉｂ）の５'キャップ化合物の好ましい実施形態では、特に置換基Ｒ２およびＲ３を含む環構造がリボースの立体化学的配置を有する場合、Ｒ２はＯＨであり、Ｒ３はメトキシであるか、またはＲ２はメトキシであり、Ｒ３はＯＨである。
【０２５５】
式（Ｉｂ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、Ｒ２およびＲ３は一緒になってＯ−Ｘ−Ｏを形成し、ＸはＣＨ２およびＣ（ＣＨ３）２からなる群より選択され、これらは両方とも置換されていてもよい。
【０２５６】
式（Ｉｂ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、置換基Ｒ２およびＲ３を含む環構造の立体化学的配置は、リボースの立体化学的配置に対応しない。例えば、置換基Ｒ２およびＲ３を含む環構造の立体化学的配置は、特に前記環構造の立体化学的配置がアラビノースの立体化学的配置に対応する場合、アラビノース、キシロース、またはリキソースの立体化学的配置に対応し得る。これらの実施形態では、Ｒ２およびＲ３は両方ともＯＨであることが好ましい。しかしながら、これらの実施形態では、Ｒ２およびＲ３が上記で指定されたように選択されることも可能である。
【０２５７】
一実施形態では、５'キャップ化合物は、式（Ｉｃ）：
【化６】
2021515577.tif 000007
式（Ｉｃ）
［式中、、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、ｎ、およびＢは、上記（特に式（Ｉ）、（Ｉａ）、および（Ｉｂ）の１つ以上に関して）または下記で定義されるとおりであり、Ｒ５はＳまたはＳｅ、好ましくはＳである］
を有する。式（Ｉｃ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、Ｒ５はＳまたはＳｅ、好ましくはＳであり、ｎは１または２である。式（Ｉｃ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、Ｒ５はＳであり、ｎは１または２、好ましくは１である。式（Ｉｃ）の５'キャップ化合物の上記実施形態のいずれにおいても、Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓｅ、およびＳからなる群より、より好ましくはＯおよびＳからなる群より独立して選択されることが好ましい。ｎが２または３である上記実施形態のいずれにおいても、Ｒ６は、各［Ｒ６ＰＯ２］部分について独立して選択され得ることが理解されるべきである。例えば、ｎが２である場合、５'キャップ化合物は２つの［Ｒ６ＰＯ２］部分を含み、２つのＲ６残基は同じであってもよく（例えば両方の［Ｒ６ＰＯ２］部分のＲ６はＯである）、または異なっていてもよい（例えば一方の［Ｒ６ＰＯ２］部分のＲ６はＯであり、他方の［Ｒ６ＰＯ２］部分のＲ６はＳである）。式（Ｉｃ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、Ｒ５はＳまたはＳｅ、好ましくはＳであり、ｎは１または２、好ましくは１であり、Ｒ４およびＲ６は、ＯおよびＳからなる群より独立して選択され、より好ましくはＲ４およびＲ６はＯである。式（Ｉｃ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、Ｒ５はＳであり、ｎは１または２、好ましくは１であり、Ｒ４およびＲ６はＯである。
【０２５８】
式（Ｉｃ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学的配置は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する。
【０２５９】
一実施形態では、５'キャップ化合物は、式（Ｉｄ）：
【化７】
2021515577.tif 000008
式（Ｉｄ）
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、ｎ、およびＢは、上記（特に式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、および（Ｉｃ）の１つ以上に関して）または下記で定義されるとおりであり、Ｒ７は、その５'末端を介してＲ８が結合している環に結合している］
を有する。式（Ｉｄ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、Ｒ７は、リボモノヌクレオチドまたはリボオリゴヌクレオチドである。式（Ｉｄ）の５'キャップ化合物の１つの好ましい実施形態では、Ｒ７は、２'位に遊離ＯＨ基を有するリボヌクレオチドである。式（Ｉｄ）の５'キャップ化合物の別の好ましい実施形態では、Ｒ７は、リボオリゴヌクレオチドの３'末端のリボース部分およびリボオリゴヌクレオチドの５'末端のリボース部分の両方が２'位に遊離ＯＨ基を有するリボオリゴヌクレオチドである。式（Ｉｄ）の５'キャップ化合物の別の好ましい実施形態では、Ｒ７は、少なくともリボオリゴヌクレオチドの５'末端のリボースの２'位のＯＨ基がＨ、ハロ、および置換されていてもよいアルコキシ（Ｈ、Ｆ、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、または２−メトキシエトキシ、好ましくはＨ、Ｆ、メトキシ、エトキシ、またはプロポキシ、最も好ましくはメトキシなど）からなる群より選択される置換基で置換されており、リボオリゴヌクレオチドの３'末端のリボースが２'位に遊離ＯＨ基を有するリボオリゴヌクレオチドである。式（Ｉｄ）の上記実施形態のいずれにおいても、モノヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとＲ７が結合している環との間のヌクレオチド間結合は、ホスフェート、ホスホロチオエート、ボラノホスフェート、イミドホスフェート、アルキレンホスフェート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダイト、および非ヌクレオチドリンカーからなる群より、好ましくはホスフェート、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエートからなる群より選択されることが好ましい（一実施形態では、モノヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとＲ７が結合している環との間のヌクレオチド間結合はホスフェートである）。Ｒ７がオリゴヌクレオチド、特にリボオリゴヌクレオチドである式（Ｉｄ）の上記実施形態のいずれにおいても、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの間のヌクレオチド間結合（１つまたは複数）は、ホスフェート、ホスホロチオエート、ボラノホスフェート、イミドホスフェート、アルキレンホスフェート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダイト、および非ヌクレオチドリンカーからなる群より、好ましくはホスフェート、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエートからなる群より選択されることが好ましい（一実施形態では、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの間のヌクレオチド間結合（１つまたは複数）はホスフェートである）。式（Ｉｄ）の５'−キャップ化合物の一実施形態では、Ｒ７は＊［ｐＮ（Ｒ８'）］ａ［ｐＮ］ｂであり、＊は、Ｒ７が結合している環へのＲ７の結合点を示し；各Ｎ（Ｒ８'）は、２'位においてＲ８'（Ｈ、ハロ、および置換されていてもよいアルコキシからなる群より、好ましくはＨ、Ｆ、メトキシ、エトキシ、プロポキシおよび２−メトキシエトキシからなる群より、より好ましくはＨ、Ｆ、メトキシ、エトキシおよびプロポキシからなる群より選択され、最も好ましくはメトキシである）で置換されたヌクレオシド（好ましくはアデノシン、グアノシン、ウリジン、５−メチルウリジン、またはシチジン）であり；各Ｎ���、２'位に遊離ＯＨ基を有するリボヌクレオシド（好ましくはアデノシン、グアノシン、ウリジン、５−メチルウリジン、またはシチジン）であり；各ｐはホスフェート部分であり；ａは０、１、２、３、４、５、６、７、または８であり；ｂは１、２、３、４、５、６、７、８、または９であり；ならびにａ＋ｂは１、２、３、４、５、６、７、８、または９である（好ましくは、ａは０、１、または２であり；ｂは１、２、３、４、５、または６であり；ａ＋ｂは１、２、３、４、５、または６である）。式（Ｉｄ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、Ｒ７は＊ｐＧｐＮまたは＊ｐＧであり、Ｎはアデノシン、グアノシン、ウリジン、５−メチルウリジン、またはシチジンであり、＊は、Ｒ７が結合している環へのＲ７の結合点を示す。式（Ｉｄ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、Ｒ７は＊ｐｍ２'−ＯＧｐＮであり、Ｎはアデノシン、グアノシン、ウリジン、５−メチルウリジン、またはシチジンであり、＊は、Ｒ７が結合している環へのＲ７の結合点を示す。
【０２６０】
一実施形態では、５'キャップ化合物は、式（Ｉｅ）：
【化８】
2021515577.tif 000009
式（Ｉｅ）
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびｎは、上記（特に式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、および（Ｉｄ）の１つ以上に関して）または下記で定義されるとおりであり、Ｂは、天然に存在するプリンもしくはピリミジン塩基部分またはその修飾形態である］
を有する。式（Ｉｅ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、Ｂは、グアニン、アデニン、シトシン、チミン、ウラシル、およびそれらの修飾形態からなる群より、好ましくはグアニン、アデニン、シトシン、ウラシル、およびそれらの修飾形態からなる群より、より好ましくはグアニン、アデニン、シトシン、およびそれらの修飾形態からなる群より、より好ましくはグアニン、アデニン、およびそれらの修飾形態からなる群より選択される。式（Ｉｅ）の５'−キャップ化合物の一実施形態では、修飾されたプリンまたはピリミジン塩基部分は、１つ以上のアルキル基、好ましくは１つ以上のＣ１−４アルキル基、より好ましくは１つ以上のメチル基で修飾されている。式（Ｉｅ）の５'キャップ化合物の好ましい実施形態では、修飾されたプリンまたはピリミジン塩基部分は、Ｎ７−アルキル−グアニン、Ｎ６−アルキル−アデニン、５−アルキル−シトシン、５−アルキル−ウラシル、およびＮ（１）−アルキル−ウラシルからなる群より、好ましくはＮ７−Ｃ１−４アルキル−グアニン、Ｎ６−Ｃ１−４アルキル−アデニン、５−Ｃ１−４アルキル−シトシン、５−Ｃ１−４アルキル−ウラシル、およびＮ（１）−Ｃ１−４アルキル−ウラシルからなる群より、より好ましくはＮ７−メチル−グアニン、Ｎ６−メチル−アデニン、５−メチル−シトシン、５−メチル−ウラシル、およびＮ（１）−メチル−ウラシルからなる群より選択される。式（Ｉｅ）の５'キャップ化合物の好ましい実施形態では、天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基部分は、ＧまたはＡ、好ましくはＧである。式（Ｉｅ）の５'キャップ化合物のより好ましい実施形態では、ＢはＧまたはＡ、好ましくはＧである。
【０２６１】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、および（Ｉｅ）のいずれか１つの５'キャップ化合物の上記実施形態のいずれにおいても、Ｒ８は、Ｈ、Ｆ、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、および２−メトキシエトキシからなる群より、より好ましくはＨ、Ｆ、メトキシ、エトキシ、およびプロポキシからなる群より選択されることが好ましい。最も好ましくは、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、および（Ｉｅ）のいずれか１つの５'キャップ化合物の上記実施形態のいずれにおいても、Ｒ８はメトキシである。
【０２６２】
一実施形態では、５'キャップ化合物は、式（ＩＩ）：  
【化９】
2021515577.tif 000010
式（ＩＩ）
［式中、Ｒ１は、置換されていてもよいＣ１−Ｃ４アルキルおよび置換されていてもよいアリールからなる群より選択され；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、および２−メトキシエトキシからなる群より独立して選択され；
Ｒ４およびＲ６は、ＯおよびＳからなる群より独立して選択され；
Ｒ５はＳまたはＳｅであり；
Ｒ７は、２、３、４、５、または６個（２または３個など）の塩基を有するリボモノヌクレオチドまたはリボオリゴヌクレオチドであり；
Ｒ８は、Ｈ、Ｆ、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、および２−メトキシエトキシからなる群より選択され；
ｎは１、２、または３であり；ならびに
Ｂはプリンまたはピリミジン塩基部分である］
を有する。
【０２６３】
一実施形態では、５'キャップ化合物は、式（ＩＩａ）：
【化１０】
2021515577.tif 000011
式（ＩＩａ）
［式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、ｎ、およびＢは、上記（特に式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、および（ＩＩ）の１つ以上に関して）または下記で定義されるとおりであり、Ｒ１は、メチル、エチル、ベンジル、フェニルエチル、およびナフチルメチルからなる群より、より好ましくはメチルおよびエチルからなる群より選択される］
を有する。式（ＩＩａ）の５'キャップ化合物の好ましい実施形態では、Ｒ１はメチルまたはエチル、より好ましくはメチルである。
【０２６４】
一実施形態では、５'キャップ化合物は、式（ＩＩｂ）：
【化１１】
2021515577.tif 000012
式（ＩＩｂ）
［式中、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、ｎ、およびＢは、上記（特に式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩ）および（ＩＩａ）の１つ以上に関して）または下記で定義されるとおりであり、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つはＯＨでない］
を有する。式（ＩＩｂ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、Ｒ２およびＲ３の一方はＯＨであり、他方はＯＨではない。式（ＩＩｂ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、置換基Ｒ２およびＲ３を含む環構造は、リボースの立体化学的配置を有する。この実施形態では、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つがＯＨではないことが好ましい。上記実施形態のものにおいて、Ｒ２（またはＲ３）がＯＨではない場合、Ｒ２（またはＲ３）は、Ｈ、Ｆ、メトキシ、エトキシ、およびプロポキシからなる群より選択されることが好ましい。より好ましくは、それはメトキシである。
【０２６５】
式（ＩＩｂ）の５'キャップ化合物の好ましい実施形態では、特に置換基Ｒ２およびＲ３を含む環構造がリボースの立体化学的配置を有する場合、Ｒ２はＯＨであり、Ｒ３はメトキシであるか、またはＲ２はメトキシであり、Ｒ３はＯＨである。
【０２６６】
式（ＩＩｂ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、置換基Ｒ２およびＲ３を含む環構造の立体化学的配置は、リボースの立体化学的配置に対応しない。例えば、置換基Ｒ２およびＲ３を含む環構造の立体化学的配置は、特に前記環構造の立体化学的配置がアラビノースの立体化学的配置に対応する場合、アラビノース、キシロース、またはリキソースの立体化学的配置に対応し得る。これらの実施形態では、Ｒ２およびＲ３は両方ともＯＨであることが好ましい。しかしながら、これらの実施形態では、Ｒ２およびＲ３が上記で指定されたように選択されることも可能である。
【０２６７】
一実施形態では、５'キャップ化合物は、式（ＩＩｃ）：
【化１２】
2021515577.tif 000013
式（ＩＩｃ）
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、ｎ、およびＢは、上記（特に式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、および（ＩＩｂ）の１つ以上に関して）または下記で定義されるとおりである］
を有する。式（ＩＩｃ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、ｎは１または２である。ｎが２または３である上記実施形態のいずれにおいても、Ｒ６は、各［Ｒ６ＰＯ２］部分について独立して選択され得ることが理解されるべきである。例えば、ｎが２である場合、５'キャップ化合物は２つの［Ｒ６ＰＯ２］部分を含み、２つのＲ６残基は同じであってもよく（例えば両方の［Ｒ６ＰＯ２］部分のＲ６はＯである）、または異なっていてもよい（例えば一方の［Ｒ６ＰＯ２］部分のＲ６はＯであり、他方の［Ｒ６ＰＯ２］部分のＲ６はＳである）。式（ＩＩｃ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、Ｒ４およびＲ６はＯである。式（ＩＩｃ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、ｎは１または２、好ましくは１であり、Ｒ４およびＲ６はＯである。
【０２６８】
一実施形態では、５'キャップ化合物は、式（ＩＩｄ）：
【化１３】
2021515577.tif 000014
式（ＩＩｄ）
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、ｎ、およびＢは、上記（特に式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、および（ＩＩｃ）の１つ以上に関して）または下記で定義されるとおりであり、Ｒ７は、その５'末端を介してＲ８が結合している環に結合している］
を有する。式（ＩＩｄ）の５'キャップ化合物の１つの好ましい実施形態では、Ｒ７は、２'位に遊離ＯＨ基を有するリボヌクレオチドである。式（ＩＩｄ）の５'キャップ化合物の別の好ましい実施形態では、Ｒ７は、リボオリゴヌクレオチドの３'末端のリボース部分およびリボオリゴヌクレオチドの５'末端のリボース部分の両方が２'位に遊離のＯＨ基を有するリボオリゴヌクレオチドである。式（ＩＩｄ）の５'キャップ化合物の別の好ましい実施形態では、Ｒ７は、少なくともリボオリゴヌクレオチドの５'末端のリボースの２'位のＯＨ基がＨ、ハロ、および置換されていてもよいアルコキシ（Ｈ、Ｆ、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、または２−メトキシエトキシ、好ましくはＨ、Ｆ、メトキシ、エトキシ、またはプロポキシ、最も好ましくはメトキシなど）からなる群より選択される置換基で置換されており、リボオリゴヌクレオチドの３'末端のリボースが２'位に遊離ＯＨ基を有する、リボオリゴヌクレオチドである。式（ＩＩｄ）の上記実施形態のいずれにおいても、モノヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとＲ７が結合している環との間のヌクレオチド間結合は、ホスフェート、ホスホロチオエート、ボラノホスフェート、イミドホスフェート、アルキレンホスフェート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダイト、および非ヌクレオチドリンカーからなる群より選択されることが好ましく、より好ましくは、モノヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとＲ７が結合している環との間のヌクレオチド間結合はホスフェートである。Ｒ７がオリゴヌクレオチド、特にリボオリゴヌクレオチドである式（ＩＩｄ）の上記実施形態のいずれにおいても、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの間のヌクレオチド間結合（１つまたは複数）は、ホスフェート、ホスホロチオエート、ボラノホスフェート、イミドホスフェート、アルキレンホスフェート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダイト、および非ヌクレオチドリンカーからなる群より選択されることが好ましく、より好ましくはオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの間のヌクレオチド間結合（１つまたは複数）はホスフェートである。式（ＩＩｄ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、Ｒ７は＊［ｐＮ（Ｒ８'）］ａ［ｐＮ］ｂであり、＊は、Ｒ７が結合している環へのＲ７の結合点を示し；各Ｎ（Ｒ８'）は、２'位においてＲ８'（Ｈ、ハロ、および置換されていてもよいアルコキシからなる群より、好ましくはＨ、Ｆ、メトキシ、エトキシ、プロポキシおよび２−メトキシエトキシからなる群より、より好ましくはＨ、Ｆ、メトキシ、エトキシおよびプロポキシからなる群より選択され、最も好ましくはメトキシである）で置換されたヌクレオシド（好ましくはアデノシン、グアノシン、ウリジン、５−メチルウリジン、またはシチジン）であり；各Ｎは、２'位に遊離ＯＨ基を有するリボヌクレオシド（好ましくはアデノシン、グアノシン、ウリジン、５−メチルウリジン、またはシチジン）であり；各ｐはホスフェート部分であり；ａは０、１、２、３、４、５、６、７、または８であり；ｂは１、２、３、４、５、６、７、８、または９であり；ならび���ａ＋ｂは１、２、３、４、５、６、７、８、または９である（好ましくは、ａは０、１、または２であり；ｂは１、２、３、４、５、または６であり；ａ＋ｂは１、２、３、４、５、または６である）。式（ＩＩｄ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、Ｒ７は＊ｐＧｐＮまたは＊ｐＧであり、Ｎはアデノシン、グアノシン、ウリジン、５−メチルウリジン、またはシチジンであり、＊は、Ｒ７が結合している環へのＲ７の結合点を示す。式（ＩＩｄ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、Ｒ７は＊ｐｍ２'−ＯＧｐＮであり、Ｎはアデノシン、グアノシン、ウリジン、５−メチルウリジン、またはシチジンであり、＊は、Ｒ７が結合している環へのＲ７の結合点を示す。
【０２６９】
一実施形態では、５'キャップ化合物は、式（ＩＩｅ）：
【化１４】
2021515577.tif 000015
式（ＩＩｅ）
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびｎは、上記（特に式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、および（ＩＩｄ）の１つ以上に関して）または下記で定義されるとおりであり、Ｂは、天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基部分またはその修飾形態である］
を有する。式（ＩＩｅ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、Ｂは、グアニン、アデニン、シトシン、チミン、ウラシル、およびそれらの修飾形態からなる群より、好ましくはグアニン、アデニン、シトシン、ウラシル、およびそれらの修飾形態からなる群より、より好ましくはグアニン、アデニン、シトシン、およびそれらの修飾形態からなる群より、より好ましくはグアニン、アデニン、およびそれらの修飾形態からなる群より選択される。式（ＩＩｅ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、修飾されたプリンまたはピリミジン塩基部分は、１つ以上のアルキル基、好ましくは１つ以上のＣ１−４アルキル基、より好ましくは１つ以上のメチル基で修飾されている。式（ＩＩｅ）の５'キャップ化合物の好ましい実施形態では、修飾されたプリンまたはピリミジン塩基部分は、Ｎ７−アルキル−グアニン、Ｎ６−アルキル−アデニン、５−アルキル−シトシン、５−アルキル−ウラシル、およびＮ（１）−アルキル−ウラシルからなる群より、好ましくはＮ７−Ｃ１−４アルキル−グアニン、Ｎ６−Ｃ１−４アルキル−アデニン、５−Ｃ１−４アルキル−シトシン、５−Ｃ１−４アルキル−ウラシル、およびＮ（１）−Ｃ１−４アルキル−ウラシルからなる群より、より好ましくはＮ７−メチル−グアニン、Ｎ６−メチル−アデニン、５−メチル−シトシン、５−メチル−ウラシル、およびＮ（１）−メチル−ウラシルからなる群より選択される。式（ＩＩｅ）の５'キャップ化合物の好ましい実施形態では、天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基部分は、ＧまたはＡ、好ましくはＧである。式（ＩＩｅ）の５'キャップ化合物のより好ましい実施形態では、ＢはＧまたはＡ、好ましくはＧである。
【０２７０】
式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、および（ＩＩｅ）のいずれか１つの５'キャップ化合物の上記実施形態のいずれにおいても、Ｒ８は、Ｈ、Ｆ、メトキシ、エトキシ、およびプロポキシからなる群より選択されることが好ましい。最も好ましくは、式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、および（ＩＩｅ）のいずれか１つの５'キャップ化合物の上記実施形態のいずれにおいても、Ｒ８はメトキシである。
【０２７１】
一実施形態では、５'キャップ化合物は、式（ＩＩＩ）：
【化１５】
2021515577.tif 000016
式（ＩＩＩ）
［式中、Ｒ１は、メチル、エチル、ベンジル、フェニルエチル、またはナフチルメチル、より好ましくはメチルまたはエチルであり；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、およびメトキシからなる群より独立して選択され、好ましくは、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つはＯＨではなく；
Ｒ７は、その５'末端を介してＲ８が結合している環に結合したリボモノヌクレオチド、リボジヌクレオチドまたはリボトリヌクレオチドであり、リボモノヌクレオチド、リボジヌクレオチドまたはリボトリヌクレオチドとＲ７が結合している環との間のヌクレオチド間結合は、ホスフェート、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエートからなる群より選択され、Ｒ７がリボジヌクレオチドまたはリボトリヌクレオチドである場合、リボジヌクレオチドまたはリボトリヌクレオチド中のヌクレオチドの間のヌクレオチド間結合（１つまたは複数）は、ホスフェート、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエートからなる群より選択され；
Ｒ８は、Ｈ、Ｆ、およびメトキシからなる群より選択され；
ｎは１または２であり；ならびに
Ｂは、グアニン、アデニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群より、好ましくはグアニン、アデニン、シトシン、およびウラシルからなる群より、より好ましくはグアニン、アデニン、およびシトシンからなる群より、より好ましくはグアニンおよびアデニンからなる群より選択される］
を有する。
【０２７２】
一実施形態では、５'キャップ化合物は、式（ＩＩＩａ）：
【化１６】
2021515577.tif 000017
式（ＩＩＩａ）
［式中、Ｒ１はメチルまたはエチルであり；Ｒ２およびＲ３の一方はＯＣＨ３であり、他方はＯＨであり（例えばＲ２はＯＣＨ３であり、Ｒ３はＯＨであるか、Ｒ２はＯＨであり、Ｒ３はＯＣＨ３である）；Ｒ８はメトキシであり；ｎは１であり；リボモノヌクレオチド、リボジヌクレオチドまたはリボトリヌクレオチドとＲ７が結合している環との間のヌクレオチド間結合は、ホスフェートまたはホスホロチオエート、好ましくはホスフェートであり、Ｒ７がリボジヌクレオチドまたはリボトリヌクレオチドである場合、リボジヌクレオチドまたはリボトリヌクレオチド中のヌクレオチドの間のヌクレオチド間結合（１つまたは複数）は、ホスフェートまたはホスホロチオエート、好ましくはホスフェートであり；ならびにＢはグアニンまたはアデニン、好ましくはグアニンである］
を有する。式（ＩＩＩａ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、Ｒ７は、２'位に遊離ＯＨ基を有するリボモノヌクレオチドである。式（ＩＩＩａ）の５'キャップ化合物の別の好ましい実施形態では、Ｒ７は、リボジヌクレオチドまたはリボトリヌクレオチドの３'末端のリボース部分およびリボジヌクレオチドまたはリボトリヌクレオチドの５'末端のリボース部分の両方が２'位に遊離のＯＨ基を有するリボジヌクレオチドまたはリボトリヌクレオチドである。式（ＩＩＩａ）の５'キャップ化合物の別の好ましい実施形態では、Ｒ７は、少なくともリボジヌクレオチドまたはリボトリヌクレオチドの５'末端のリボースの２'位のＯＨ基がＨ、Ｆ、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、および２−メトキシエトキシからなる群より選択される置換基で置換されており（好ましくはＨ、Ｆ、メトキシ、エトキシ、およびプロポキシからなる群より選択される置換基で置換されており、最も好ましくは前記置換基はメトキシである）、リボジヌクレオチドまたはリボトリヌクレオチドの３'末端のリボースが２'位に遊離ＯＨ基を有する、リボジヌクレオチドまたはリボトリヌクレオチドである。式（ＩＩＩａ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、Ｒ７は＊ｐＧｐＮまたは＊ｐＧであり、Ｎはアデノシン、グアノシン、ウリジン、５−メチルウリジン、またはシチジンであり、＊は、Ｒ７が結合している環へのＲ７の結合点を示す。式（ＩＩＩａ）の５'キャップ化合物の一実施形態では、Ｒ７は＊ｐｍ２'−ＯＧｐＮであり、Ｎはアデノシン、グアノシン、ウリジン、５−メチルウリジン、またはシチジンであり、＊は、Ｒ７が結合している環へのＲ７の結合点を示す。
【０２７３】
本発明の５'キャップ化合物は、標準的な手順を使用して、市販の化合物（（ｐＮ）２−４など）から出発して合成することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、活性化系（例えば２，２'−ジチオジピリジン／トリフェニルホスフィンな；図１およびＭｕｋａｉｙａｍａ  ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  １９７１（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．４４，２２８４（１９７１）参照）の存在下でイミダゾールと反応させることによって対応するＰ−イミダゾリド誘導体に変換することができる。修飾されたリン酸架橋を有するヌクレオチドサブユニット（例えばｍ２７，２'−ＯＭｅＧＤＰβＳ）は、Ｋｏｗａｌｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００８（ＲＮＡ  １４，１１１９−１１３１（２００８））に記載されているように合成し得る。次に、２つの前駆体を結合して、本発明の最終的な５'キャップ化合物を生成し得る；例えば図２参照。ジアステレオ異性体は、ＲＰ  ＨＰＬＣ（例えばＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ａｍｉｄｅ  ＲＰ  Ｃ１６カラムを使用して）によって分離し得る。
【０２７４】
好ましくは、本発明の５'キャップ化合物を対応する５'キャップＲＮＡを調製するために使用した場合、５'キャップ構造は、５'キャップＲＮＡを細胞に移入したときＲＮＡの安定性を増加させる、キャップ０構造を認識するタンパク質、例えばＩＦＩＴタンパク質（特にＩＦＩＴ１）によるＲＮＡの認識を低下もしくは阻害する、ＲＮＡの翻訳効率を高める、ＲＮＡの翻訳を延長させる、ＲＮＡの総タンパク質発現を増加させる、および／またはＲＮＡが抗原をコードするヌクレオチド配列を含む場合、５'キャップ構造のない同じＲＮＡと比較して前記抗原に対する免疫応答を増加させることができる。ＲＮＡが抗原をコードするヌクレオチド配列を含む場合、細胞は、未成熟樹状細胞などの未成熟抗原提示細胞であることが好ましい。当業者は、例えば、５'キャップ構造のみが異なる２つのＲＮＡを、例えばインビトロ転写によって生成することにより、５'キャップＲＮＡの５'キャップ構造が上記の機能を発揮できるかどうかを容易に決定することができ、ここで、ＲＮＡの１つは、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＩＩａ）のいずれか１つによる５'キャップ構造を担持し、他方のＲＮＡ（参照ＲＮＡ）は、（ｉ）５'キャップ構造を含まない、（ｉｉ）従来のｍＲＮＡ  ５'キャップ、すなわちメチル−７−グアノシンキャップを担持する、または（ｉｉｉ）式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＩＩａ）のいずれか１つによる５'キャップ構造の機能を比較するべき任意の他のキャップを担持する。例えば、参照ＲＮＡは、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマーに対応する５'キャップ構造を担持し得る。５'キャップＲＮＡの５'キャップ構造は、修飾されたＲＮＡを細胞に移入したとき、ＲＮＡの安定性を増加させる、キャップ０構造を認識するタンパク質、例えばＩＦＩＴタンパク質（特にＩＦＩＴ１）によるＲＮＡの認識を低下もしくは阻害する、ＲＮＡの翻訳効率を高める、ＲＮＡの翻訳を延長させる、ＲＮＡの総タンパク質発現を増加させる、および／またはＲＮＡが抗原をコードするヌクレオチド配列を含む場合、従来のｍＲＮＡ  ５'キャップを有する同じＲＮＡなどの参照ＲＮＡと比較して前記抗原に対する免疫応答を増加させることができる。
【０２７５】
好ましくは、本発明の５'キャップ化合物（特に式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＩＩａ）のいずれか１つによる５'キャップ化合物）で修飾されたＲＮＡの安定性および翻訳効率は、必要に応じてさらに修飾され得る。例えば、ＲＮＡは、ＲＮＡの安定化作用および／または翻訳効率増加作用を有する１つ以上の修飾によって安定化され、その翻訳が増加し得る。そのような修飾は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２００７／０３６３６６号に記載されている。
【０２７６】
例えば、マスクされていないポリＡ配列（マスクされていないポリＡ尾部）を有するＲＮＡは、マスクされたポリＡ配列を有するＲＮＡよりも効率的に翻訳される。「ポリ（Ａ）尾部」という用語は、典型的にはＲＮＡ分子の３'末端に位置するアデニル（Ａ）残基の配列に関し、「マスクされていないポリＡ配列」は、ＲＮＡ分子の３'末端のポリＡ配列がポリＡ配列のＡで終了し、ポリＡ配列の３'末端、すなわち下流に位置するＡ以外のヌクレオチドが後続していないことを意味する。さらに、約１２０ヌクレオチドの長いポリＡ配列は、最適な転写物安定性および翻訳効率をもたらす。
【０２７７】
したがって、本発明の５'キャップ化合物（特に式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＩＩａ）のいずれか１つによる５'キャップ化合物）で修飾されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、１０〜５００ヌクレオチドの長さ、好ましくは３０〜３００ヌクレオチドの長さ、より好ましくは６５〜２００ヌクレオチドの長さ、より好ましくは１００〜１５０ヌクレオチドの長さ、例えば１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０ヌクレオチド、好ましくは１２０ヌクレオチドの長さを有するポリＡ尾部をさらに含み得る。好ましくは、前記ポリＡ配列は、マスクされていないポリＡ配列である。したがって、好ましくは、本発明の５'キャップ化合物（特に式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＩＩａ）のいずれか１つによる５'キャップ化合物）で修飾されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、１０〜５００ヌクレオチドの長さ、好ましくは３０〜３００ヌクレオチドの長さ、より好ましくは６５〜２００ヌクレオチドの長さ、より好ましくは１００〜１５０ヌクレオチドの長さ、例えば１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０ヌクレオチド、好ましくは１２０ヌクレオチドの長さを有するマスクされていないポリＡ尾部を含む。
【０２７８】
さらに、３'非翻訳領域（ＵＴＲ）をＲＮＡ分子の３'非翻訳領域に組み込むと、翻訳効率の向上をもたらすことができる。そのような３'ＵＴＲの２つ以上を組み込むことによって相乗作用が達成され得る。３'ＵＴＲは、それらが導入されるＲＮＡに対して自家または異種であり得、例えばβ‐グロビンｍＲＮＡの３'ＵＴＲであり得る。したがって、好ましくは、本発明の５'キャップ化合物（特に式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＩＩａ）のいずれか１つによる５'キャップ化合物）で修飾されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、β‐グロビン遺伝子、好ましくはヒトβ‐グロビン遺伝子の３'非翻訳領域（３'ＵＴＲ）の１コピー以上、好ましくは２コピーをさらに含み得る。
【０２７９】
さらに、プソイドウリジンまたはＮ（１）−メチルプソイドウリジンまたは５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）によるウリジンの置換は、Ψまたはｍ１Ψまたはｍ５Ｕ修飾ＲＮＡを生じさせ、このように修飾されたＲＮＡの免疫原性を低下させ得る。したがって、好ましくは、本発明の５'キャップ化合物（特に式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＩＩａ）のいずれか１つによる５'キャップ化合物）で修飾されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡにおいて、プソイドウリジンまたはＮ（１）−メチルプソイドウリジンまたは５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）は、部分的または完全に、好ましくは完全に、ウリジンを置換する。すなわち、１つの好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡは、Ψもしくはｍ１Ψもしくはｍ５Ｕ修飾されているかまたはそれらの任意の組合せ（例えば、Ψおよびｍ１Ψ修飾もしくはΨおよびｍ５Ｕ修飾もしくはｍ１Ψおよびｍ５Ｕ修飾もしくはΨおよびｍ１Ψおよびｍ５Ｕ修飾）である。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ中の１つ以上のウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、３−メチルウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−アザウリジン、６−アザウリジン、２−チオ−５−アザウリジン、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオプソイドウリジン、２−チオプソイドウリジン、５−ヒドロキシウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリルウリジン、５−ハロウリジン（例えば５−ヨードウリジンまたは５−ブロモウリジン）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチルウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチルプソイドウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル‐ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル‐ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチルウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、１−エチルプソイドウリジン、５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニルウリジン、１−プロピニルプソイドウリジン、５−タウリノメチルウリジン（τｍ５Ｕ）、１−タウリノメチルプソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオプソイドウリジン、５−メチル−２−チオウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオプソイドウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４−チオ−１−メチルプソイドウリジン、３−メチルプソイドウリジン（ｍ３Ψ）、２−チオ−１−メチルプソイドウリジン、１−メチル−１−デアザプソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザプソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチルジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオジヒドロウリジン、２−チオジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオウリジン、４−メトキシプソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオプソイドウリジン、Ｎ１−メチルプソイドウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオウリジン、２'−Ｏ−メチルウリジン（Ｕｍ）、５，２'−Ｏ−ジメチルウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２'−Ｏ−メチルプソイドウリジン（Ψｍ）、２−チオ−２'−Ｏ−メチルウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２'−Ｏ−メチルウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２'−Ｏ−メチルウ���ジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２'−Ｏ−メチルウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２'−Ｏ−ジメチルウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２'−Ｏ−メチルウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオウリジン、デオキシチミジン、２'−Ｆ−アラウリジン、２'−Ｆ−ウリジン、２'−ＯＨ−アラウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、および５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）ウリジン、または当技術分野で公知の任意の他の修飾ウリジンのいずれか１つ以上であり得る。
【０２８１】
本発明の５'キャップ化合物（特に式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＩＩａ）のいずれか１つによる５'キャップ化合物）で修飾されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、上記の修飾の組合せ、すなわち以下の修飾：ポリＡ配列の組み込み、ポリＡ配列の脱マスク化、１つ以上の３'ＵＴＲの組み込み、およびプソイドウリジンもしくはＮ（１）−メチルプソイドウリジンもしくは５−メチルウリジンよるウリジンの置換、またはそれらの組合せの少なくとも２つ（例えば少なくとも３つまたは４つすべて）によって修飾されていることが特に好ましい。
【０２８２】
特に好ましい実施形態では、本発明の５'キャップ化合物（特に式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＩＩａ）のいずれか１つによる５'キャップ化合物）で修飾されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、例えば、エリスロポエチンなどのサイトカイン；インテグリンなどの接着分子；免疫グロブリン；免疫学的に活性な化合物、例えば抗原、例えば腫瘍関連抗原、病原体関連抗原（例えばウイルスの１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の抗原、例えばインフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶの１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の抗原）、アレルゲン、または自己抗原；バソプレシン、インスリンまたは成長ホルモンなどのホルモン；ＶＥＧＦＡなどの成長因子；単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）、ヘキソサミニダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、プソイドコリンエステラーゼ、膵酵素、またはラクターゼなどの酵素；成長因子受容体などの受容体；α１−アンチトリプシンなどのプロテアーゼ阻害剤；ＢＡＸなどのアポトーシス調節因子；ＦＯＸＰ３などの転写因子；ｐ５３などの腫瘍抑制タンパク質；サーファクタントタンパク質などの構造タンパク質；ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、またはＮＡＮＯＧなどの再プログラミング因子；クラスタ化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピート‐ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）などのゲノム操作タンパク質；ならびにフィブリノゲンなどの血液タンパク質からなる群より選択される、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質をコードする。例えば、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、免疫原、抗原または抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質であり得、ペプチドまたはタンパク質は、発現後にプロセシングされて、前記免疫原、抗原または抗原ペプチドを提供し得る。あるいは、ペプチドまたはタンパク質自体が免疫原、抗原または抗原ペプチドであってもよい。
組成物およびキット
【０２８３】
さらなる態様では、本発明は、本発明の５'キャップ化合物を含む組成物またはキットを提供する。そのような組成物またはキットは、本発明の５'キャップ構造を有するＲＮＡを提供するため、および／または、例えば本明細書に開示される対応する方法において、ＲＮＡの安定性を高めるために使用され得る。この態様の一実施形態では、キットは、インビトロ転写反応で典型的に使用される試薬（例えばＮＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、１つ以上の緩衝液、および／もしくはＤＮＡ鋳型）ならびに／または使用説明書をさらに含み得る。
【０２８４】
さらなる態様では、本発明は、本発明の５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）を含む組成物、好ましくは医薬組成物（本発明のＲＮＡを含むこのような組成物は、本明細書では本発明のＲＮＡ組成物とも称される）を提供する。この態様の組成物、特に医薬組成物は、本発明の５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）を、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含み得る。一実施形態では、医薬組成物は、本発明の５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤および１つ以上の追加／補足の活性化合物を含む。
【０２８５】
さらなる態様では、本出願は、治療法で使用するための、本明細書で指定される医薬組成物を提供する。
【０２８６】
例えば、特に本発明の５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡがペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む実施形態では、本発明の医薬組成物は、タンパク質補充療法、ゲノム操作療法、ゲノム再プログラミング療法、または免疫療法において使用され得る。
【０２８７】
本発明のＲＮＡまたは医薬組成物のタンパク質補充療法の例示的な用途には、ペプチドまたはタンパク質の活性低下によって引き起こされる状態、障害または疾患、例えば貧血（補充タンパク質：例えばエリスロポエチン）、糖尿病（補充タンパク質：例えばバソプレシン）、先天性肺疾患（補充タンパク質：例えばサーファクタントタンパク質Ｂ）、喘息（補充タンパク質：例えばＦＯＸＰ３）、心筋梗塞（補充タンパク質：例えばＶＥＧＦＡ）、黒色腫（補充タンパク質：例えばＢＡＸ）、自己免疫性糖尿病（補充タンパク質：例えばＩＬ−４）、自己免疫性心筋炎（補充タンパク質：例えばＩＬ−１０）、炎症（補充タンパク質：例えばＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ−１）、シアリル‐ルイスＸ（ＳＬｅＸ）、およびＩＬ−１０））、第ＶＩＩ因子欠損症（補充タンパク質：例えば第ＶＩＩａ因子）、血友病Ａ（補充タンパク質：例えば第ＶＩＩＩ因子）、血友病Ｂ（補充タンパク質：例えば第ＩＸ因子）、第Ｘ因子欠損症（補充タンパク質：例えば第Ｘ因子）、第ＸＩ因子欠損症（補充タンパク質：例えば第ＸＩ因子）、第ＸＩＩＩ因子欠損症（補充タンパク質：例えば第ＸＩＩＩ因子）、フォン・ヴィレブランド病（補充タンパク質：例えばフォン・ヴォレブランド因子）、プロテインＣ欠乏症（補充タンパク質：例えばプロテインＣ）、アンチトロンビン欠乏症（補充タンパク質：例えばアンチトロンビンＩＩＩ）、フィブリノゲン欠乏症（補充タンパク質：例えばフィブリノゲン）、遺伝性血管浮腫（補充タンパク質：例えばＣ１エステラーゼ阻害剤）、α１−ＰＩ欠乏症（補充タンパク質：例えばα−１プロテイナーゼ阻害剤）、ゴーシェ病（補充タンパク質：例えばグルコセレブロシダーゼ）、ムコ多糖症Ｉ（補充タンパク質：例えばα−Ｌ−イズロニダーゼ）、ムコ多糖症ＩＩ（補充タンパク質：例えばイズロン酸スルファターゼ）、ムコ多糖症ＶＩ（補充タンパク質：例えばＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ）、ムコ多糖症ＩＶＡ（補充タンパク質：例えばＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ）、ムコ多糖症ＩＩＩＡ（補充タンパク質：例えばヘパラン硫酸スルファターゼ）、ファブリー病（補充タンパク質：例えばα−ガラクトシダーゼＡ）、ポンペ病（補充タンパク質：例えばα−グルコシダーゼ）、ニーマン・ピック病Ｂ型（補充タンパク質：例えば酸性スフィンゴミエリナーゼ）、α−マンノシドーシス（補充タンパク質：例えばα−マンノシダーゼ）、異染性白質ジストロフィ（補充タンパク質：例えばアリールスルファターゼＡ）、ＬＡＬ欠損症（補充タンパク質：例えばリソソーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ））、スクラーゼイソマルターゼ欠損症（補充タンパク質：例えばスクロースイソマルターゼ）、ＡＤＡ欠損症（補充タンパク質：例えばアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ））、原発性ＩＧＦ−１欠損症（補充タンパク質：例えばインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１））、低ホスファターゼ血症（補充タンパク質：例えばアルカリホスファターゼ）、急性間欠性ポルフィリン症（補充タンパク質：例えばポルフォビリノーゲンデアミナーゼ）の治療（予防的治療を含む）が含まれる。
【０２８８】
本発明のＲＮＡまたは医薬組成物のゲノム操作療法の例示的な用途には、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症（Ｘ−ＳＣＩＤ）（インターロイキン２受容体共通γ鎖（ＩＬ−２Ｒγ）をコードするＤＮＡによる矯正）、色素性乾皮症（天然、すなわち非変異ＤＮＡによる矯正）、ならびにタンパク質補充療法の例示的な用途に関して上記で指定された状態、障害および疾患からなる群より選択される状態、障害または疾患の治療（予防的治療を含む）が含まれる。本発明のＲＮＡまたは医薬組成物のさらなるゲノム操作療法には、例えばＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳを利用するゲノム編集が含まれる。
【０２８９】
本発明のＲＮＡまたは医薬組成物の遺伝的再プログラミング療法の例示的な用途には、タンパク質補充療法の例示的な用途および／またはゲノム操作療法の例示的な用途に関して上記で指定された状態、障害および疾患のいずれかの治療（予防的治療を含む）が含まれる。
【０２９０】
本発明の医薬組成物の例示的な免疫療法用途には、感染症（例えばウイルス（インフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶなど）、細菌、真菌または他の微生物などの病原体によって引き起こされるもの）；望ましくない炎症（免疫障害など）；および癌からなる群より選択される状態、障害または疾患の治療（予防的治療を含む）が含まれる。
【０２９１】
癌（医学用語：悪性新生物）は、細胞の群が制御されない成長（通常の限界を超えた分裂）、浸潤（隣接組織への侵入と破壊）、および時には転移（リンパまたは血液を介した身体の他の場所への広がり）を示す疾患のクラスである。癌のこれらの３つの悪性特性は、自己制限されており、浸潤も転移もしない良性腫瘍から癌を区別する。ほとんどの癌は腫瘍、すなわち、細胞（新生細胞または腫瘍細胞と呼ばれる）の異常な成長によって形成される腫脹または病変を形成するが、白血病のようないくつかは腫脹または病変を形成しない。本発明による「癌」という用語には、白血病、セミノーマ、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、副腎癌、甲状腺癌、血液癌、皮膚癌、脳の癌、子宮頸癌、腸癌、肝臓癌、結腸癌、胃癌、腸癌、頭頸部癌、消化器癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵臓癌、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌、および肺癌、ならびにそれらの転移が含まれる。それらの例は、肺癌腫、乳房癌腫、前立腺癌腫、結腸癌腫、腎細胞癌腫、子宮頸癌腫、または上記の癌型もしくは腫瘍の転移である。本発明による癌という用語は、癌転移も含む。
【０２９２】
本発明のＲＮＡおよび医薬組成物で治療可能な癌の例には、悪性黒色腫、すべての種類の癌腫（結腸癌腫、腎細胞癌腫、膀胱癌腫、前立腺癌腫、非小細胞および小細胞肺癌腫など）、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、神経膠腫などが含まれる。
【０２９３】
悪性黒色腫は深刻な種類の皮膚癌である。これは、メラノサイトと呼ばれる色素細胞の制御されない成長に起因する。
【０２９４】
本発明によれば、「癌腫」は、上皮細胞に由来する悪性腫瘍である。この群は、乳癌、前立腺癌、肺癌および結腸癌の最も一般的な形態を含む、最も一般的な癌である。
【０２９５】
リンパ腫および白血病は、造血（血液形成）細胞に由来する悪性腫瘍である。
【０２９６】
肉腫は、胚性中胚葉から発生する多くの組織の１つにおける形質転換細胞から生じる癌である。したがって、肉腫には、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、および造血組織の腫瘍が含まれる。
【０２９７】
芽球性腫瘍または芽細胞腫は、未成熟または胚組織に類似する腫瘍（通常は悪性）である。これらの腫瘍の多くは小児において最も一般的である。
【０２９８】
神経膠腫は、脳または脊椎から始まる腫瘍の一種である。グリア細胞から発生するため、グリオーマと呼ばれる。神経膠腫の最も一般的な部位は脳である。
【０２９９】
「転移」とは、癌細胞がその元の部位から身体の別の部位に広がることを意味する。転移の形成は非常に複雑な過程であり、原発性腫瘍からの悪性細胞の分離、細胞外マトリックスの侵襲、内皮基底膜の貫通による体腔および血管への進入、次いで血液によって輸送された後、標的器官の浸潤に依存する。最後に、標的部位における新しい腫瘍、すなわち二次性腫瘍または転移性腫瘍の成長は、血管新生に依存する。腫瘍転移は、腫瘍細胞または成分が残存し、転移能を発現し得るため、しばしば原発性腫瘍の除去後にも起こる。一実施形態では、本発明による「転移」という用語は、原発性腫瘍および所属リンパ節系から離れた転移に関する「遠隔転移」に関する。
【０３００】
例示的な免疫障害には、自己免疫疾患（例えば真性糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症および乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、敗血症および敗血症性ショック、炎症性腸疾患、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病逆転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、糸球体腎炎、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、および間質性肺線維症）、移植片対宿主病、移植の症例、ならびにアトピー性アレルギーなどのアレルギーが含まれるが、これらに限定されない。
【０３０１】
例示的なウイルスには、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン‐バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えばＣＭＶ５）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）（例えばＨＨＶ６、７または８）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）（例えばＢＨＶ４）、ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）（例えばＥＨＶ２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）５、水痘‐帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、麻疹ウイルス、パポバウイルス（ＪＣおよびＢＫ）、肝炎ウイルス（例えばＨＢＶまたはＨＣＶ）、粘液腫ウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、ポリオーマウイルス、インフルエンザウイルス（例えばインフルエンザウイルスＡ型、インフルエンザウイルスＢ型、またはインフルエンザウイルスＣ型）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、パピローマウイルス、ワクシニアウイルスおよび伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）などのポックスウイルス、ならびにリッサウイルスが含まれるが、これらに限定されない。そのようなウイルスは、アポトーシス阻害剤を発現してもよく、発現しなくてもよい。ウイルス感染によって引き起こされる例示的な疾患には、水痘、サイトメガロウイルス感染、性器ヘルペス、Ｂ型およびＣ型肝炎、インフルエンザ、帯状疱疹、および狂犬病が含まれるが、これらに限定されない。
【０３０２】
例示的な細菌には、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、エンテロバクター種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（例えばＦ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７）、Ａ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ａ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、リステリア菌（ｌｉｓｔｅｒｉａ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ボレリア属菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）およびリケッチア属菌（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）が含まれるが、これらに限定されない。細菌感染によって引き起こされる例示的な疾患には、炭疽、コレラ、ジフテリア、食中毒、ハンセン病、髄膜炎、消化性潰瘍疾患、肺炎、敗血症、敗血症性ショック、梅毒、破傷風、結核、腸チフス、尿路感染症、ライム病およびロッキー山紅斑熱が含まれるが、これらに限定されない。
【０３０３】
本発明のＲＮＡまたは医薬組成物で治療可能な感染症の特定の例には、ウイルス感染症、例えばＡＩＤＳ（ＨＩＶ）、Ａ型、Ｂ型またはＣ型肝炎、ヘルペス、帯状疱疹（水痘）、風疹（風疹ウイルス）、黄熱、デング熱；フラビウイルスによって引き起こされる感染症；インフルエンザ；ＲＳＶによって引き起こされる感染症；ＣＭＶによって引き起こされる感染症；出血性感染症（マールブルグウイルスまたはエボラウイルス）；細菌感染症（レジオネラ症（レジオネラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ））など）、胃潰瘍（ヘリコバクター）、コレラ（ビブリオ菌）、大腸菌、ブドウ球菌、サルモネラ菌または連鎖球菌（破傷風）による感染症；原虫病原体による感染症、例えばマラリア、睡眠病、リーシュマニア症、トキソプラズマ症、すなわちプラスモディウム属菌（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、トリパノソーマ属菌（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、リーシュマニア属菌（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）およびトキソプラズマ属菌（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）による感染症；あるいは、例えばクリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマチディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）またはカンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）によって引き起こされる真菌感染症が含まれる。
【０３０４】
特に医薬組成物（例えばワクチン組成物）の形態での、本発明による投与のために、ＲＮＡは、裸のＲＮＡであり得るか、または担体、例えばリポソームもしくは遺伝子導入のための他の粒子に組み込まれてもよく、好ましくは裸のＲＮＡの形態である。
【０３０５】
本発明の５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）または本発明の医薬組成物は、単独で、または本発明のＲＮＡもしくは医薬組成物の投与の前、投与と同時もしくは投与後に投与することができる１つ以上の追加／補足の活性化合物と組み合わせて使用することができる。そのような１つ以上の追加／補足の活性化合物には、免疫抑制剤（例えば、免疫応答の誘導を回避または最小化する必要がある用途（例えば本明細書に記載されるようなタンパク質補充療法、ゲノム操作療法、および遺伝的再プログラミング療法において）、ペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えばプラスミド）（特にゲノム操作療法において、例えば、前記ヌクレオチド配列が、例えば患者のゲノム内の対応する変異ヌクレオチド配列を置換するために、患者のゲノムに挿入されるべきである場合）、細胞分化のための化合物（例えば、特に遺伝的再プログラミング療法において、幹細胞特性を有する細胞の、ペプチドまたはタンパク質（特に薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質）を発現する細胞への分化を誘導する化合物）、癌患者のための化学療法薬（例えばゲムシタビン、エトポホス、シスプラチン、カルボプラチン）、抗ウイルス剤、抗寄生生物剤、抗菌剤、免疫療法剤（例えば抗原またはその断片（特にその免疫原性断片））、ならびにアジュバントが含まれ、本発明のＲＮＡと同時に投与される場合、本発明の医薬組成物中に存在してもよい。
【０３０６】
特にワクチン組成物の場合、１つまたは複数の追加／補足の活性化合物は、免疫療法剤、好ましくは標的化された、すなわち特異的な免疫反応を誘導または達成する免疫療法剤を含み得る。したがって、一実施形態では、本発明のＲＮＡおよび医薬組成物は、免疫療法剤、好ましくは標的化された、すなわち特異的な免疫反応を誘導または達成する免疫療法剤と併せて使用することができる。そのような免疫療法剤には、治療用抗体などの疾患関連抗原に対する作用物質、または疾患関連抗もしくは疾患関連抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導する作用物質が含まれる。有用な免疫療法剤には、疾患関連抗原または疾患関連抗原を発現する細胞に対するＢ細胞またはＴ細胞応答を誘導するタンパク質またはペプチドが含まれる。これらのタンパク質またはペプチドは、疾患関連抗原の配列またはその１つ以上の断片に本質的に対応するかまたは同一である配列を含み得る。一実施形態では、タンパク質またはペプチドは、疾患関連抗原に由来するＭＨＣ提示ペプチドの配列を含む。タンパク質またはペプチドを投与する代わりに、タンパク質またはペプチドをコードする核酸、好ましくはｍＲＮＡなどのＲＮＡを投与することも可能である。タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡは、本発明の５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）であり得る。あるいはまたはさらに、タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡは、本発明の医薬組成物の投与と同時に（この場合、ＲＮＡは本発明の医薬組成物の一部を形成し得る）および／または投与前におよび／または投与後に投与し得る、本発明によらない異なるＲＮＡであってもよい。したがって、本発明の医薬組成物は遺伝子ワクチン接種において使用され得、抗原またはその断片をコードする適切な核酸分子（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を個体に導入することによって免疫応答が刺激される。
【０３０７】
一実施形態では、疾患関連抗原は腫瘍関連抗原である。この実施形態では、本発明の５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）および本発明の医薬組成物は、癌または癌転移の治療に有用であり得る。好ましくは、罹患器官または組織は、疾患関連抗原を発現する癌細胞などの疾患細胞を特徴とし、および／または疾患関連抗原とそれらの表面との会合を特徴とする。無傷または実質的に無傷の腫瘍関連抗原またはそれらの断片、例えばＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩペプチドまたはそのような抗原もしくは断片をコードする核酸、特にｍＲＮＡによる免疫化は、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩタイプの応答を誘発し、したがって、癌細胞および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞を溶解することができるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球などのＴ細胞を刺激することを可能にする。そのような免疫化はまた、腫瘍関連抗原に対する抗体の産生をもたらす体液性免疫応答（Ｂ細胞応答）を誘発し得る。さらに、樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）にＭＨＣクラスＩ提示ペプチドを直接、またはインビトロで腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドをコードする核酸でのトランスフェクションによって負荷して、患者に投与することができる。
【０３０８】
本発明によれば、腫瘍関連抗原は、好ましくは、種類および／または発現レベルに関して、腫瘍または癌および腫瘍細胞または癌細胞に特徴的な任意の抗原を含む。一実施形態では、「腫瘍関連抗原」という用語は、正常条件下、すなわち健常個体では、限られた数の器官および／もしくは組織で、または特定の発生段階で特異的に発現されるタンパク質に関し、例えば腫瘍関連抗原は、正常条件下では胃組織、好ましくは胃粘膜、生殖器官、例えば精巣、栄養膜組織、例えば胎盤、または生殖系列細胞で特異的に発現され得、および１つ以上の腫瘍または癌組織で発現または異常発現される。これに関連して、「限られた数」は、好ましくは３以下、より好ましくは２以下または１を意味する。本発明の文脈における腫瘍関連抗原には、例えば分化抗原、好ましくは細胞型特異的分化抗原、すなわち正常条件下では特定の分化段階で特定の細胞型において特異的に発現されるタンパク質、癌／精巣抗原、すなわち正常条件下では精巣で、および時に胎盤で特異的に発現されるタンパク質、ならびに生殖系列特異的抗原が含まれる。本発明の文脈において、腫瘍関連抗原は、好ましくは癌細胞の細胞表面と関連しており、好ましくは正常組織では発現されないかまたはまれにしか発現されない。好ましくは、腫瘍関連抗原または腫瘍関連抗原の異常発現は、癌細胞を同定する。本発明の文脈において、個体、例えば癌疾患に罹患している患者の癌細胞によって発現される腫瘍関連抗原は、好ましくは前記個体の自己タンパク質である。好ましい実施形態では、本発明の文脈における腫瘍関連抗原は、正常条件下では、必須ではない組織もしくは器官、すなわち免疫系によって損傷された場合でも個体の死をもたらさない組織もしくは器官において、または免疫系がアクセスできないもしくはほとんどアクセスできない身体の器官または構造において、特異的に発現される。一実施形態では、腫瘍関連抗原のアミノ酸配列は、正常組織で発現される腫瘍関連抗原と癌組織で発現される腫瘍関連抗原との間で同一である。好ましくは、腫瘍関連抗原は、それが発現される癌細胞によってＭＨＣ分子に関連して提示される。
【０３０９】
腫瘍免疫療法、特に腫瘍ワクチン接種における標的構造体として本発明によって企図される腫瘍関連抗原の基準を理想的に満たす分化抗原の例は、ＣＬＤＮ６およびＣＬＤＮ１８．２などのクローディンファミリーの細胞表面タンパク質である。これらの分化抗原は様々な起源の腫瘍で発現され、それらの選択的発現（毒性関連の正常組織では発現されない）および形質膜への局在化により、抗体媒介性癌免疫療法に関連する標的構造体として特に適する。
【０３１０】
本発明において有用であり得る抗原の特定の例は、ｐ５３およびＷＴ−１を含む、本明細書で明示的に指定されるものである。
【０３１１】
本発明によるＲＮＡまたは医薬組成物は、一般に「薬学的に許容される量」および「薬学的に許容される製剤」で適用される。「薬学的に許容される」という用語は、医薬組成物の活性成分（１つまたは複数）の作用と相互作用しない物質の非毒性を指す。
【０３１２】
「治療有効量」は、単独でまたはさらなる投薬量と組み合わせて、所望の反応または所望の効果をもたらす量に関する。特定の疾患または特定の状態の治療法の場合、所望の反応は、疾患の進行の阻害に関する。これは、疾患の進行の減速、特に疾患の進行の中断を含む。疾患または状態の治療法の所望の反応はまた、疾患または状態の発生の遅延または発生の阻害であり得る。本発明による組成物の有効量は、状態または疾患、疾患の重症度、患者の年齢、生理学的状態、身長および体重を含む患者の個々のパラメータ、治療期間、任意で付随する治療法の種類、特定の投与経路、および同様の因子に依存する。患者の反応が初期用量では不十分である場合、より高い用量（またはより局所的な投与経路によって達成され得るより高い有効用量）を適用し得る。一般に、治療のためまたはヒトにおける免疫反応の誘導もしくは増加のためには、好ましくは１ｎｇ〜７００μｇ、１ｎｇ〜５００μｇ、１ｎｇ〜３００μｇ、１ｎｇ〜２００μｇ、または１ｎｇ〜１００μｇの範囲のＲＮＡの用量を製剤化し、投与する。
【０３１３】
本発明によれば、ＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）の投与は、裸の核酸として、または１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて達成される。好ましくは、核酸の投与は裸の核酸の形態である。好ましくは、ＲＮＡは、ＲＮアーゼ阻害剤などの安定化物質と組み合わせて投与される。本発明はまた、長期間の持続的発現を可能にするための細胞への核酸の反復導入も想定する。しかしながら、本発明の５'キャップ構造および任意で他の安定化修飾の存在により、本発明のＲＮＡは、好ましくは、本発明の５'キャップ構造を含まないＲＮＡよりも少ない頻度で投与できるという利点を示す。したがって、本発明のＲＮＡを使用することは、例えばタンパク質補充療法に関して、所望の効果（例えば患者の機能を維持する（例えば患者のホメオスタシスを維持する）のに十分な量の所望のペプチドまたはタンパク質の発現）を達成するために、本発明のＲＮＡ（または医薬組成物）のより少ない投与（注射など）しか必要としない。したがって、一実施形態では、本発明のＲＮＡ（本発明のＲＮＡ組成物または医薬組成物など）は、患者に（例えば腹腔内、筋肉内、または皮内注射などの注射によって）、最大で１日１回（すなわち２回の投与間の期間は、少なくとも２４時間、例えば少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、もしくは少なくとも４２時間である）、好ましくは最大で２日に１回（すなわち２回の投与間の期間は、少なくとも４８時間、例えば少なくとも５４時間、少なくとも６０時間、もしくは少なくとも６６時間である）、好ましくは最大で３日に１回（すなわち２回の投与間の期間は、少なくとも７２時間、例えば少なくとも７８時間、少なくとも８４時間、もしくは少なくとも９０時間である）、または最大で４日に１回（すなわち２回の投与間の期間は、少なくとも９６時間、例えば少なくとも１０２時間、少なくとも１０８時間、もしくは少なくとも１１４時間である）、投与される。したがって、本発明は、慢性患者および／または長期患者、例えば長期間にわたって治療される患者、例えば本発明のＲＮＡ（本発明のＲＮＡ組成物または医薬組成物など）を長期間にわたって投与される患者に特に有益であり、ここで、長期間は、好ましくは少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、少なくとも５年間、または少なくとも１０年間、例えば最大２週間、最大３週間、最大４週間、最大１ヶ月間、最大２ヶ月間、最大３ヶ月間、最大４ヶ月間、最大５ヶ月間、最大６ヶ月間、最大１２ヶ月間、最大２年間、最大３年間、最大４年間、最大５年間、最大１０年間まで、または患者の全生涯である。したがって、一実施形態では、本発明のＲＮＡ（本発明のＲＮＡ組成物または医薬組成物など）は、慢性患者または長期患者に（例えば腹腔内、筋肉内、または皮内注射などの注射によって）、長期間、特に少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少な���とも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、少なくとも５年間、または少なくとも１０年間、例えば最大２週間、最大３週間、最大４週間、最大１ヶ月間、最大２ヶ月間、最大３ヶ月間、最大４ヶ月間、最大５ヶ月間、最大６ヶ月間、最大１２ヶ月間、最大２年間、最大３年間、最大４年間、最大５年間、最大１０年間まで、または慢性もしくは長期患者の全生涯にわたって、最大で１日１回（すなわち２回の投与間の期間は、少なくとも２４時間、例えば少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、もしくは少なくとも４２時間である）、好ましくは最大で２日に１回（すなわち２回の投与間の期間は、少なくとも４８時間、例えば少なくとも５４時間、少なくとも６０時間、もしくは少なくとも６６時間である）、好ましくは最大で３日に１回（すなわち２回の投与間の期間は、少なくとも７２時間、例えば少なくとも７８時間、少なくとも８４時間、もしくは少なくとも９０時間である）、または最大で４日に１回（すなわち２回の投与間の期間は、少なくとも９６時間、例えば少なくとも１０２時間、少なくとも１０８時間、もしくは少なくとも１１４時間である）、投与される。
【０３１４】
例えばＲＮＡと複合体を形成するか、またはＲＮＡが封入もしくはカプセル化された小胞を形成することによって、ＲＮＡが結合できる任意の賦形剤（特に担体）で細胞をトランスフェクトして、裸のＲＮＡと比較してＲＮＡの安定性を高めることができる。本発明に従って有用な賦形剤（特に担体）には、例えばカチオン性脂質、リポソーム、特にカチオン性リポソーム、およびミセルなどの脂質含有担体、ならびにナノ粒子が含まれる。カチオン性脂質は、負に帯電した核酸と複合体を形成し得る。任意のカチオン性脂質を本発明に従って使用し得る。さらに、細胞を個体から採取し、本発明のＲＮＡまたは医薬組成物でトランスフェクトすることができ、トランスフェクトされた細胞を個体に挿入することができる。
【０３１５】
好ましくは、ペプチドまたはポリペプチドをコードするＲＮＡの細胞、特にインビボで存在する細胞への導入は、細胞内での前記ペプチドまたはポリペプチドの発現をもたらす。特定の実施形態では、核酸を特定の細胞に標的化することが好ましい。そのような実施形態では、細胞への核酸の投与に適用される担体（例えばレトロウイルスまたはリポソーム）は、標的分子を示す。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質または標的細胞上の受容体のリガンドに特異的な抗体などの分子を、核酸担体に組み込み得るかまたはそれに結合し得る。核酸がリポソームによって投与される場合、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質を、標的化および／または取り込みを可能にするためにリポソーム製剤に組み込み得る。そのようなタンパク質は、特定の細胞型、内在化されるタンパク質に対する抗体、細胞内の位置を標的とするタンパク質などに特異的であるカプシドタンパク質またはその断片を包含する。
【０３１６】
本開示の特定の実施形態では、本明細書に記載されるキャップされたＲＮＡは、ＲＮＡリポプレックス粒子中に存在し得る。本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子およびＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物は、非経口投与後、特に静脈内投与後の、本明細書に記載のキャップされたＲＮＡの標的組織への送達に有用である。ＲＮＡリポプレックス粒子は、脂質のエタノール溶液を水または適切な水相に注入することによって得られるリポソームを使用して調製し得る。一実施形態では、水相は酸性ｐＨを有する。一実施形態では、水相は、例えば約５ｍＭの量の酢酸を含む。一実施形態では、リポソームおよびＲＮＡリポプレックス粒子は、少なくとも１つのカチオン性脂質および少なくとも１つのさらなる脂質を含む。一実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質は、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）および／または１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む。一実施形態では、少なくとも１つのさらなる脂質は、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）および／または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む。一実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質は、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）を含み、少なくとも１つのさらなる脂質は、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。一実施形態では、リポソームおよびＲＮＡリポプレックス粒子は、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）および１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。リポソームは、リポソームをＲＮＡと混合することによってＲＮＡリポプレックス粒子を調製するために使用され得る。特定の脾臓標的化ＲＮＡリポプレックス粒子は、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１３／１４３６８３号に記載されている。正味の負電荷を有するＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓組織または脾臓細胞、例えば抗原提示細胞、特に樹状細胞を選択的に標的とするために使用し得ることが見出された。したがって、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が起こる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓においてＲＮＡを発現するために使用され得る。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、肺および／または肝臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現は、起こらないかまたは本質的に起こらない。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓内のプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が起こる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、そのような抗原提示細胞においてＲＮＡを発現するために使用され得る。一実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞および／またはマクロファージである。
【０３１７】
本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、活性薬剤ではない（例えば、使用される量／濃度で治療効果を示さない治療的に不活性な成分である）医薬組成物中のすべての物質、例えば、すべて好ましくは薬学的に許容される、塩、担体、結合剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、分散剤、防腐剤、乳化剤、緩衝剤、湿潤剤、着香剤、着色剤、安定剤（ＲＮアーゼ阻害剤など）または抗酸化剤を示すことが意図されている。
【０３１８】
「薬学的に許容される塩」は、例えば、塩酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、炭酸またはリン酸などの薬学的に許容される酸を使用することによって形成され得る酸付加塩を含む。さらに、適切な薬学的に許容される塩は、アルカリ金属塩（例えばナトリウムまたはカリウム塩）；アルカリ土類金属塩（例えばカルシウムまたはマグネシウム塩）；アンモニウム（ＮＨ４＋）；ならびに適切な有機配位子で形成される塩（例えばハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、アルキルスルホン酸塩およびアリールスルホン酸塩などの対アニオンを使用して形成される第四級アンモニウムおよびアミンカチオン）を含み得る。薬学的に許容される塩の例示的な例には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩（ａｌｇｉｎａｔｅ）、アルギン酸塩（ａｒｇｉｎａｔｅ）、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物、酪酸塩、エデト酸カルシウム、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、クラブラン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸、二塩酸塩、ドデシル硫酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストール酸塩、エシル酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、ガラクチン酸塩、ガラクツロン酸塩、グルセプチン酸塩、グルコヘプトン酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イソ酪酸塩、イソチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メタンスルホン酸塩、メチル硫酸塩、粘液酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩）、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、フタル酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、スベレート、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオジド、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６６，ｐｐ．１−１９（１９７７）参照）。薬学的に許容されない塩は、薬学的に許容される塩を調製するために使用されてもよく、本発明に含まれる。
【０３１９】
本発明による組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合性であるありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。「薬学的に許容される担体」は、固体、半固体、液体、またはそれらの組合せの形態であり得る。
【０３２０】
薬学的に許容される担体には、滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌水溶液または分散液、滅菌非水性溶液または分散液、および滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な薬剤のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で公知である。従来の媒体または薬剤が活性薬剤と不適合である場合を除き、本発明の医薬組成物におけるその使用が企図される。注射用製剤の例示的な薬学的に許容される担体には、水、等張緩衝生理食塩水（例えばリンガー液または乳酸加リンガー液）、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール）、ポリアルキレングリコール（例えばプロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール）、水素化ナフタレン、および、特に生体適合性ラクチドポリマー（例えばラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマー）が含まれる。
【０３２１】
薬学的に許容される抗酸化剤の例には、以下が含まれる：（１）水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど；および（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など。
【０３２２】
本発明の医薬組成物での使用に適する緩衝剤には、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸、および塩中のリン酸が含まれる。
【０３２３】
本発明の医薬組成物での使用に適する防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン、ソルビン酸、およびチメロサールなどの様々な抗菌剤および抗真菌剤が含まれる。微生物の存在の防止はまた、滅菌手順（例えば滅菌濾過、特に滅菌精密濾過）によって確保され得る。
【０３２４】
本発明の医薬組成物は、任意の経路によって、好ましくは非経口的に個体に投与され得る。本明細書で使用される「非経口投与」および「非経口的に投与される」という表現は、経腸投与以外の投与方法を意味する（本明細書で使用される「経腸投与」および「経腸的に投与される」は、投与された薬物が胃および／または腸によって取り込まれることを意味する）。非経口投与は通常、注射および／または注入によるものであり、限定されることなく、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、骨内、眼窩内、心臓内、結節内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、脳内、脳室内、くも膜下、脊髄内、硬膜外、胸骨内、および局所投与を含む。免疫療法以外の用途（例えばタンパク質補充療法、ゲノム操作療法、または遺伝的再プログラミング療法）については、本発明の医薬組成物は、腹腔内、筋肉内、または皮内投与されることが好ましい。免疫治療用途では、本発明の医薬組成物は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、リンパ内、皮内または結節内、より好ましくは皮内または結節内に、例えば結節内注射によって、投与されることが好ましい。
【０３２５】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知の様々な方法によって投与することができる。当業者に理解されるように、投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて異なる。
【０３２６】
活性薬剤（すなわち本発明のＲＮＡおよび任意で１つ以上の追加／補足の活性化合物）は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤などの、急速な放出から化合物を保護する担体で調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法は、一般に当業者に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８参照。
【０３２７】
特定の投与経路によって活性薬剤（すなわち本発明のＲＮＡおよび任意で１つ以上の追加／補足の活性化合物）を投与するには、活性薬剤の不活性化を防止するおよび／または翻訳される活性薬剤（特に本発明のＲＮＡ）の有効性を高めるための物質で活性薬剤をコーティングするか、または化合物を前記物質と同時投与することが必要であり得る。例えば、活性剤薬は、適切な担体、例えば脂質含有担体（特にカチオン性脂質）、リポソーム（水中油中水型ＣＧＦエマルジョン、および従来のリポソーム（Ｓｔｒｅｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７：２７（１９８４））、特にカチオン性リポソーム）、ミセル、ＲＮＡが封入またはカプセル化されているナノ粒子、または希釈剤中で個体に投与され得る。薬学的に許容される希釈剤には、生理食塩水および緩衝水溶液が含まれる。
【０３２８】
医薬組成物は、典型的には、製造および保管の条件下で無菌および安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高薬物濃度に適した他の規則的構造物として製剤化することができる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルを含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを医薬組成物に含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。
【０３２９】
一般に、分散液は、基本的な分散媒と上記に列挙したものの中から必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに活性薬剤を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、あらかじめ滅菌濾過された活性薬剤の溶液から活性薬剤の粉末と任意のさらなる所望の成分を生じる、減圧乾燥および凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ、ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）である。
【０３３０】
投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば治療応答）を提供するように調整される。例えば、単一のボーラスを投与し得るか、いくつかの分割用量を経時的に投与し得るか、または治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例的に減少または増加させ得る。投与を容易にし、投薬量を均一にするために、医薬組成物を単位剤形に製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、治療される個体の単位用量として適した物理的に別個の単位を指す；各単位は、必要な医薬担体と共同して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性薬剤を含む。本発明の単位剤形の仕様は、（ａ）活性薬剤の独特の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体の感受性の治療のためにそのような活性薬剤を調合する技術分野に固有の制限によって決定され、これらに直接依存する。医薬組成物（単一剤形など）を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性薬剤の量（特にＲＮＡの量）は、治療される個体および特定の投与様式に応じて異なる。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性薬剤の量は、一般に、治療効果をもたらす組成物の量である。
【０３３１】
一般に、１００％（医薬製剤／組成物について）のうちで、活性薬剤の量（特に、医薬製剤／組成物中に存在する場合は任意で１つ以上の追加／補足の活性化合物と共に、本発明のＲＮＡの量）は、約０．０１％〜約９９％、好ましくは約０．１％〜約７０％、最も好ましくは約１％〜約３０％の範囲であり、残りは、好ましくは１つ以上の薬学的に許容される賦形剤で構成される。
【０３３２】
単位剤形中の、および／または個体に投与されるかもしくは治療法に使用される場合の、活性薬剤、例えば本発明のＲＮＡの量は、単位あたり、投与あたり、または治療あたり約０．００１ｍｇ〜約１０００ｍｇ（例えば約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇ、例えば約１ｍｇ〜約５０ｍｇ）の範囲であり得る。特定の実施形態では、そのような活性薬剤の適切な量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（約０．２ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇなど）、または約０．１ｍｇ／ｍ２〜約４００ｍｇ／ｍ２（約０．３ｍｇ／ｍ２〜約３５０ｍｇ／ｍ２または約１ｍｇ／ｍ２〜約２００ｍｇ／ｍ２など）の量を含む、個体の質量または体表面積を使用して計算され得る。
【０３３３】
選択される投与経路に関わりなく、適切な水和形態で使用され得る活性薬剤（すなわちＲＮＡおよび任意で１つ以上の追加／補足の活性化合物）、ならびに／または本発明の医薬組成物は、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に許容される剤形に製剤化される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，「Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａｌｌｅｎ，Ｌｏｙｄ  Ｖ．，Ｊｒ．，２２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１２；Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」，７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９参照）。
【０３３４】
本発明の医薬組成物中の活性薬剤の実際の投与量レベルは、患者に対する毒性を伴わずに、特定の患者、組成物、および投与様式について所望の治療応答を達成するのに有効な活性薬剤の量が得られるように変化させ得る。選択される投与量レベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の活性薬剤の排泄速度、治療期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康および過去の病歴、ならびに医療分野で周知の同様の因子を含む、様々な薬物動態因子に依存する。
【０３３５】
当技術分野における通常の技術を有する医師または獣医は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師または獣医は、医薬組成物中で使用される活性薬剤の用量を、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加することができる。一般に、本発明の医薬組成物の適切な１日用量は、治療効果を生じるのに有効な最低用量である活性薬剤の量である。そのような有効用量は、一般に上記の因子に依存する。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下などの非経口投与であることが好ましく、好ましくは標的部位の近位に投与される。投与は腫瘍内であってもよい。所望する場合、医薬組成物の有効１日用量は、任意に単位剤形で、１日を通して適切な間隔で別々に投与される２、３、４、５、６またはそれ以上の分割用量として投与され得る。本発明の活性薬剤（特にＲＮＡ）を単独で投与することは可能であるが、活性薬剤を医薬製剤／組成物として投与することが好ましい。
【０３３６】
一実施形態では、本発明のＲＮＡまたは医薬組成物は、毒性副作用を低減するために、注入、好ましくは２４時間を超えるなどの長期間にわたる緩やかな持続注入によって投与され得る。投与はまた、２〜２４時間、例えば２〜１２時間の期間にわたる持続注入によって行われてもよい。そのようなレジメンは、必要に応じて、例えば６ヶ月または１２ヶ月後に、１回以上繰り返してもよい。
【０３３７】
本発明の医薬組成物は、注射による、例えばボーラス注射または持続注入による非経口投与用に製剤化することができる。注射用の製剤は、単位剤形（例えば小ビン、複数回用量の容器）で、および防腐剤を添加して提供することができる。本発明の医薬組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態をとることができ、懸濁剤、安定剤、または分散剤などの製剤化剤を含むことができる。あるいは、薬剤は、使用前に適切なビヒクル（例えば発熱物質を含まない滅菌水）で構成するための粉末形態であり得る。典型的には、静脈内投与用の医薬組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、医薬組成物はまた、可溶化剤および注射部位の痛みを和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬を含むことができる。一般に、成分は、別々にまたは単位剤形中で一緒に混合されて、例えば活性薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密閉容器中の凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給される。医薬組成物が注入によって投与される場合、無菌の医薬品グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルで投薬することができる。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合することができるように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０３３８】
医薬組成物は、当技術分野で公知の医療機器を用いて投与することができる。例えば、好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号；米国特許第５，３８３，８５１号；米国特許第５，３１２，３３５号；米国特許第５，０６４，４１３号；米国特許第４，９４１，８８０号；米国特許第４，７９０，８２４号；または米国特許第４，５９６，５５６号に開示されている装置などの無針皮下注射装置で投与することができる。本発明において有用な周知のインプラントおよびモジュールの例には、以下に記載されているものが含まれる：制御された速度で薬剤を投与するための埋め込み型マイクロインフュージョンポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を通して薬剤を投与するための治療装置を開示する米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で薬剤を送達するための薬剤注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号；持続的薬物送達のための可変流量埋め込み型注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号；マルチチャンバ区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号；および浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４７５，１９６号。
【０３３９】
他の多くのそのようなインプラント、送達システム、およびモジュールは、当業者に公知である。特定の実施形態では、本発明のＲＮＡまたは医薬組成物は、インビボでの適切な分布を確実にするように製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高度に親水性の化合物を排除する。本発明のＲＮＡまたは医薬組成物がＢＢＢを通過することを確実にするために（所望される場合）、それらは、例えばリポソーム中に製剤化することができる。リポソームを製造する方法については、例えば米国特許第４，５２２，８１１号；米国特許第５，３７４，５４８号；および米国特許第５，３９９，３３１号参照。リポソームは、特定の細胞または器官に選択的に輸送される１つ以上の部分を含んでもよく、したがって標的薬物送達を増強する（例えばＶ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５参照）。例示的な標的化部分には、葉酸またはビオチン（例えばＬｏｗ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，４１６，０１６号参照）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０）；およびサーファクタントタンパク質Ａ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）が含まれる。
【０３４０】
本発明の一実施形態では、本発明のＲＮＡはリポソーム中に製剤化される。より好ましい実施形態では、リポソームは標的化部分を含む。最も好ましい実施形態では、リポソーム中のＲＮＡは、ボーラス注射によって所望の領域の近位の部位に送達される。そのようなリポソームベースの組成物は、容易に注射可能な程度に流動性であるべきであり、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されるべきである。
【０３４１】
治療のための「治療有効量」は、完全または部分的であり得る客観的応答によって測定され得る。完全奏効（ＣＲ）は、状態、障害または疾患の臨床的、放射線学的または他の証拠がないことと定義される。部分奏効（ＰＲ）は、５０％を超える疾患の減少から生じる。進行までの時間の中央値は、客観的応答の持続性を特徴付ける尺度である。
【０３４２】
治療のための「治療有効量」はまた、例えば適切な動物モデル系および／または当業者に公知のインビトロアッセイを使用することによって、状態、障害または疾患の進行を安定させるその能力によって測定され得る。活性薬剤（特に本発明のＲＮＡ）の治療有効量は、単独でまたはさらなる用量と共に、所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患または特定の状態の治療の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の経過の阻害に関する。これは、疾患の進行を遅くすること、特に疾患の進行を妨げるまたは逆転させることを含む。疾患または状態の治療における所望の反応はまた、前記疾患または前記状態の発症の遅延または発症の防止であり得る。したがって、活性薬剤の治療有効量は、個体における状態、障害もしくは疾患、または状態、障害もしくは疾患の症状、または状態、障害もしくは疾患に対する素因を治療、治癒、緩和、軽減、改変、矯正、改善、好転するまたは影響を及ぼすことができる。当業者は、治療される疾患、障害または状態、疾患、障害または状態の重症度、治療される個体のパラメータ（年齢、生理学的状態、サイズおよび体重を含む）、治療期間、付随する治療法の種類（存在する場合）、特定の投与経路、および同様の因子に基づいてそのような量を決定することができる。したがって、本明細書に記載の活性薬剤の投与される用量は、様々なそのようなパラメータに依存し得る。個体／患者の反応が初期用量では不十分である場合、より高い用量（または異なる、より局所的な投与経路によって達成される実質的により高い用量）を使用し得る。
【０３４３】
本発明の医薬組成物は、上記で論じた抗原などの少なくとも１つの抗原またはその断片（特にその免疫原性断片）をコードする本発明のＲＮＡを含むワクチン製剤の形態を取り得る。
【０３４４】
本発明の医薬組成物はまた、所望する場合、活性薬剤（すなわちＲＮＡおよび任意に１つ以上の追加／補足の活性化合物）を含有する１つ以上の単位剤形を含み得るパック、キットまたは投薬装置で提供され得る。パックは、例えばブリスタパックなどの金属またはプラスチックホイルを含むことができる。パック、キット、または投薬装置には、投与のための指示書を添付することができる。
【０３４５】
１つ以上の追加／補足の活性化合物は、抗ＣＴＬ−Ａ４もしくは抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤＬ１などの免疫調節剤、または抗ＣＤ２５抗体もしくはシクロホスファミドなどの抗制御性Ｔ細胞試薬を含み得る。
【０３４６】
本発明の医薬組成物は、１つ以上のアジュバントなどの補足的免疫増強物質と共に投与してもよく、その有効性をさらに高め、好ましくは免疫刺激の相乗作用を達成するための１つ以上の免疫増強物質を含み得る。
【０３４７】
「アジュバント」という用語は、抗原、抗原ペプチド、または前記抗原もしくは抗原ペプチドをコードする核酸（ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなど）と組み合わせて個体に投与された場合に、免疫応答を延長または増強または加速する化合物に関する。本発明の文脈において、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、任意のアジュバントと共に投与され得る。アジュバントは、抗原の表面の増加、体内での抗原の保持の延長、抗原放出の遅延、マクロファージへの抗原の標的化、抗原の取り込みの増加、抗原プロセシングの増強、サイトカイン放出の刺激、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞などの免疫細胞の刺激と活性化、および免疫細胞の非特異的活性化を含む１つ以上の機構によってその生物学的活性を発揮すると想定されている。例えば、ＤＣの成熟を可能にする化合物、例えばリポ多糖またはＣＤ４０リガンドは、適切なアジュバントのクラスを形成する。一般に、「危険シグナル」の種類の免疫系に影響を及ぼす作用物質（ＬＰＳ、ＧＰ９６、ｄｓＲＮＡなど）またはＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインは、制御された方法で免疫応答が強化されるおよび／または影響を受けることを可能にするアジュバントとして使用できる。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（Ｋｒｉｅｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６−５４９）もまた、この状況で任意に使用することができる。さらなる種類のアジュバントには、油エマルジョン（例えばフロイントアジュバント）、無機化合物（ミョウバンなど）、細菌産物（百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）毒素など）、リポソーム、免疫刺激複合体、サイトカイン（例えばモノカイン、リンホカイン、インターロイキンまたはケモカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＴ−α、または成長因子、例えばｈＧＨ）、リポペプチド（例えばＰａｍ３Ｃｙｓ）が含まれる。一実施形態における本発明のＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）が免疫刺激剤をコードすることができ、前記ＲＮＡによってコードされる前記免疫刺激剤が一次免疫刺激剤として作用する場合、しかしながら、比較的少量のＣｐＧ  ＤＮＡしか必要としない（ＣｐＧ  ＤＮＡのみによる免疫刺激と比較して）。アジュバントの例は、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ  ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）である。ＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）、ＤＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ；国際公開第９６／３３７３９号）、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、およびＱＳ−Ｌ１（Ｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ  ７：１７８−１８６）などのサポニン、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、ビタミンＥ、モンタニド、ミョウバン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ならびにスクアレンおよび／またはトコフェロールなどの生物学的に分解可能な油から調製される様々な油中水型エマルジョン。特に好ましいアジュバントは、サイトカイン、例えばモノカイン、リンホカイン、インターロイキンまたはケモカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ���４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＴ−α、成長因子、例えばｈＧＨ、またはＰａｍ３Ｃｙｓなどのリポペプチドであり、これらはすべて、本発明の医薬組成物中で、または本発明のＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）が治療法に使用される場合に、アジュバントとしての使用に適する。
【０３４８】
治療は、自宅、医院、診療所、病院の外来診療部門、または病院で提供され得る。治療は一般に医療監督下で開始されるため、医療関係者は治療の効果を注意深く観察し、必要な調整を行うことができる。治療期間は、患者の年齢および状態、ならびに患者が治療にどのように応答するかに依存する。
【０３４９】
状態、障害または疾患を発症するリスクが高い人は、状態、障害または疾患の症状を抑制するまたは遅延させるための予防的治療を受けてもよい。
【０３５０】
「治療」という用語は当業者に公知であり、状態、障害もしくは疾患、状態、障害もしくは疾患の症状、または状態、障害もしくは疾患に対する素因を治療、治癒、緩和、軽減、改変、矯正、改善、好転する、影響を及ぼすまたは予防することを目的とした（例えば、個体における腫瘍のサイズまたは腫瘍の数の減少を含む、疾患を予防もしくは排除する；個体の疾患を停止するもしくは遅延させる；個体における新たな疾患の発症を阻害するもしくは遅延させる；現在疾患を有するもしくは以前に疾患を有していた個体における症状および／もしくは再発の頻度もしくは重症度を低下させる；ならびに／または個体の寿命を延長する、すなわち増加させるために）、本明細書に記載の活性薬剤（例えばｍＲＮＡなどのＲＮＡもしくはｍＲＮＡなどのＲＮＡを含む医薬組成物）の適用もしくは投与（例えば前記活性薬剤を含む医薬組成物）、または本明細書に記載の活性薬剤（例えばｍＲＮＡなどのＲＮＡもしくはｍＲＮＡなどのＲＮＡを含む医薬組成物）の個体／患者に対する手順もしくは適用もしくは投与（例えば前記活性薬剤を含む医薬組成物）、または状態、障害もしくは疾患、または状態、障害もしくは疾患の症状、または状態、障害もしくは疾患に対する素因を有する個体から単離された細胞、細胞培養物、細胞株、試料、組織もしくは器官に対する手順が含まれる。特に、「疾患の治療」という用語は、疾患またはその症状の治癒、持続期間の短縮、改善、予防、進行もしくは悪化の減速もしくは阻害、または発症の予防もしくは遅延を含む。したがって、「治療」という用語は、状態、障害もしくは疾患、または状態、障害もしくは疾患の症状の予防的治療を含むことができる。活性薬剤は、治療に使用される場合、本発明のＲＮＡおよび本明細書に記載の１つ以上の追加／補足の活性化合物を含み、小分子、ペプチド、ペプチド模倣物、ポリペプチド／タンパク質、抗体、ＤＮＡまたはｄｓＲＮＡなどの他のポリヌクレオチド、細胞、ウイルス、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る他の治療活性化合物を含むが、これらに限定されない。
【０３５１】
好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、ｄｓＲＮＡを実質的に含まず、好ましくはｄｓＲＮＡおよびＤＮＡを実質的に含まない。
【０３５２】
本出願の５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡを含むＲＮＡ製剤、特に医薬組成物、特に本出願の５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡを含む医薬組成物と共に本明細書で使用される「ｄｓＲＮＡを実質的に含まない」という用語は、ＲＮＡ製剤または医薬組成物中のｄｓＲＮＡの量が、個体に投与されたときに前記ＲＮＡ製剤または医薬組成物が前記個体において望ましくない応答（炎症性サイトカイン（例えばＩＦＮ‐α）の望ましくない誘導および／または本発明のＲＮＡからのタンパク質合成の阻害をもたらすエフェクタ酵素の望ましくない活性化など）を実質的に誘導しない量であることを意味する。好ましくは、「ｄｓＲＮＡを実質的に含まない」および「望ましくない応答を実質的に誘導しない」という用語は、個体に投与されたとき、前記ＲＮＡ製剤または医薬組成物が、投与後少なくとも１０時間（例えば少なくとも１２時間、少なくとも１４時間、少なくとも１６時間、少なくとも１８時間、少なくとも２０時間、少なくとも２２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも４２時間、少なくとも４８時間、少なくとも５４時間、少なくとも６０時間、少なくとも６６時間、少なくとも７２時間、少なくとも７８時間、少なくとも８４時間、少なくとも９０時間、または少なくとも９６時間）、ＲＮＡのペプチドまたはタンパク質への翻訳をもたらすことを意味する。例えば、ＲＮＡ製剤または医薬組成物中のｄｓＲＮＡの含有量は、前記ＲＮＡ製剤または医薬組成物の総重量に基づき、最大で５重量％（好ましくは最大で４重量％、最大で３重量％、最大で２重量％、最大で１重量％、最大で０．５重量％、最大で０．１重量％、最大で０．０５重量％、最大で０．０１重量％、最大で０．００５重量％、最大で０．００１重量％）であり得る。
【０３５３】
本出願の５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡを含むＲＮＡ製剤、特に医薬組成物、特に本出願の５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡを含む医薬組成物と共に本明細書で使用される「ＤＮＡを実質的に含まない」という用語は、ＲＮＡ製剤または医薬組成物中のＤＮＡの量が、前記ＲＮＡ製剤または医薬組成物の総重量に基づき、最大で５重量％（好ましくは最大で４重量％、最大で３重量％、最大で２重量％、最大で１重量％、最大で０．５重量％、最大で０．１重量％、最大で０．０５重量％、最大で０．０１重量％、最大で０．００５重量％、最大で０．００１重量％）であり得ることを意味する。
【０３５４】
本出願の５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡを含むＲＮＡ製剤、特に医薬組成物、特に本出願の５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡを含む医薬組成物と共に本明細書で使用される「ｄｓＲＮＡおよびＤＮＡを実質的に含まない」という用語は、前記ＲＮＡ製剤または医薬組成物が、上記で指定されたｄｓＲＮＡを実質的に含まず（例えば、翻訳は投与後少なくとも１０時間続き、および／またはｄｓＲＮＡ含有量は最大で５重量％である）、ならびに上記で指定されたＤＮＡを実質的に含まない（例えば、ＤＮＡ含有量は最大で５重量％である）ことを意味する。
【０３５５】
一実施形態では、本発明の医薬組成物はワクチン組成物である。
【０３５６】
本発明のワクチン組成物は、特定の用途（すなわちワクチン接種）のための本発明の医薬組成物と見なされ得る。したがって、本発明の医薬組成物に関連して上述した特徴および実施形態の１つ以上（例えば投与経路；他の成分の存在（１つ以上の医薬的に許容される担体、賦形剤、および／または希釈剤および／またはアジュバントおよび／または１つ以上の追加／補足の活性化合物）；活性薬剤（１つまたは複数）の量；薬学的に許容される塩など）は、本発明のワクチン組成物にも適用され得る。
【０３５７】
好ましい実施形態では、前記ワクチン組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、および／または希釈剤をさらに含む。前記ワクチン組成物は、個体における免疫反応を増強および／または支持することができる化合物または物質をさらに含み得る。例えば、本発明のワクチン組成物は、上記のアジュバントまたはサイトカイン、例えばインターロイキン１２（ＩＬ−１２）、顆粒球‐マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはインターロイキン１８（ＩＬ−１８）をさらに含み得る。さらに、本発明によるワクチン組成物は、ＲＮアーゼ阻害剤などのＲＮＡ安定化物質、薬学的に許容される塩もしくは緩衝液、防腐剤（塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン、もしくはチメロサールなど）、湿潤剤、乳化剤、および／またはさらなる薬物もしくは活性薬剤をさらに含み得る。
【０３５８】
特に好ましい実施形態では、ＲＮＡは、本発明によるワクチン組成物中に裸のＲＮＡの形態で存在する。
【０３５９】
本発明のワクチン組成物は、非経口投与用に、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、リンパ内、皮内または結節内投与用に、より好ましくは結節内注射などの皮内または結節内投与用に製剤化されることが特に好ましい。本発明のワクチン組成物は、最も好ましくは、リンパ管および／または脾臓への注射のために、リンパ節、好ましくは鼠径リンパ節への注射用に製剤化される。
【０３６０】
好ましくは、ワクチン組成物は、レシピエント、すなわちワクチン接種される個体の血液と等張である水溶液または非水溶液の形態である。例えば、リンガー液、等張塩化ナトリウム溶液、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用し得る。特に、ワクチン組成物は、好ましくは無菌であり、上記で指定されたＲＮＡを治療有効量で含む。
【０３６１】
好ましい実施形態では、ワクチン組成物は、ｄｓＲＮＡを実質的に含まず、好ましくはｄｓＲＮＡおよびＤＮＡを実質的に含まない。
【０３６２】
細胞
さらなる態様では、本発明は、本出願の５'キャップ化合物で修飾されたＲＮＡを含む細胞を提供し、ＲＮＡは、好ましくはペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明のＲＮＡがペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む細胞のこの好ましい実施形態では、細胞は、例えば本明細書に記載のペプチドまたはタンパク質を生成するための対応する方法において、前記ペプチドまたはタンパク質を生成するため、または、例えば本明細書に記載のペプチドまたはタンパク質を発現させるための対応する方法において、前記細胞を個体に投与することによって個体において前記ペプチドまたはタンパク質を発現させるために使用することができる。
【０３６３】
好ましい実施形態では、細胞は、未成熟抗原提示細胞などの抗原提示細胞であり、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、および樹状細胞からなる群より選択され得る。
【０３６４】
特に好ましい実施形態では、本発明による細胞は上記の医薬組成物に製剤化され、前記医薬組成物は、好ましくは薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質などのペプチドまたはタンパク質を発現するのに適する。代替的な実施形態では、本発明による細胞は上記の医薬組成物に製剤化され、前記医薬組成物は、好ましくは個体に投与したときに免疫応答を誘発するのに適しており、免疫応答は、好ましくは、本発明の未成熟抗原提示細胞に存在するＲＮＡによってコードされるタンパク質もしくはペプチド、またはＲＮＡによってコードされるタンパク質またはペプチドで構成される抗原および／もしくは免疫原に向けられる。したがって、本発明は、本発明の第３の態様による未成熟抗原提示細胞を含む医薬組成物を提供する。
【０３６５】
方法および使用
一態様では、本発明は、ＲＮＡに５'キャップ構造を提供する方法を提供し、前記方法は、第１の態様の５'キャップ化合物の存在下で鋳型核酸を使用して転写反応を行うことを含む。一実施形態では、鋳型核酸はＤＮＡである。転写反応は、インビボまたはインビトロで行われ得るが、好ましくはインビトロで行われる。一実施形態では、転写反応は、Ｔ３、Ｔ７およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼからなる群より選択されるＲＮＡポリメラーゼを使用して行われる。ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み得、ペプチドまたはタンパク質は、好ましくは本明細書に記載されるような薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質である。一実施形態では、この方法は、２'‐Ｏ‐リボースメチルトランスフェラーゼの非存在下で行われる。代替的実施形態では、この方法は、２'‐Ｏ‐リボースメチルトランスフェラーゼの存在下で行われる。
【０３６６】
別の態様では、本発明は、細胞におけるＲＮＡの安定性を高めるおよび／または細胞におけるＲＮＡの発現を増加させる方法を提供し、前記方法は、前記ＲＮＡに第１の態様で定義された式（Ｉ）による構造を提供すること；および式（Ｉ）による構造で修飾された前記ＲＮＡを細胞に移入することを含む。好ましくは、前記細胞は、好ましくは単球、マクロファージ、グリア細胞、Ｂ細胞、および樹状細胞からなる群より選択される、未成熟抗原提示細胞などの抗原提示細胞である。未成熟な抗原提示細胞におけるＲＮＡの安定性を評価するために、当業者は、試験されたＲＮＡの存在を検出し得るか、または、例えばリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用することによって、前記ＲＮＡの導入後の特定の時点の後に細胞内のＲＮＡの量を定量化し得る。細胞におけるＲＮＡの発現は、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質、好ましくはｄ２ＥＧＦＰなどのマーカタンパク質をコードするＲＮＡを使用して決定し得るが、当業者に公知の他の任意のマーカタンパク質であってもよく、ＲＮＡの導入後の特定の時点で前記マーカタンパク質の発現を決定し得る。一実施形態では、前記ＲＮＡに式（Ｉ）による構造を提供する工程は、２'‐Ｏ‐リボースメチルトランスフェラーゼの非存在下で行われる。代替的実施形態では、この方法は、２'‐Ｏ‐リボースメチルトランスフェラーゼの存在下で行われる。
【０３６７】
さらなる態様では、本発明は、本発明のＲＮＡ、ＲＮＡ組成物または細胞を使用する工程を含む、目的のペプチドまたはタンパク質を生成する方法を提供し、それぞれの場合に、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、好ましくは、エリスロポエチンなどのサイトカイン；インテグリンなどの接着分子；免疫グロブリン；免疫学的に活性な化合物、例えば抗原、例えば腫瘍関連抗原、病原体関連抗原（例えばウイルスの１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の抗原、例えばインフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶの１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の抗原）、アレルゲン、または自己抗原；バソプレシン、インスリンまたは成長ホルモンなどのホルモン；ＶＥＧＦＡなどの成長因子；単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）、ヘキソサミニダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、プソイドコリンエステラーゼ、膵酵素、またはラクターゼなどの酵素；成長因子受容体などの受容体；α１−アンチトリプシンなどのプロテアーゼ阻害剤；ＢＡＸなどのアポトーシス調節因子；ＦＯＸＰ３などの転写因子；ｐ５３などの腫瘍抑制タンパク質；サーファクタントタンパク質などの構造タンパク質；ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、またはＮＡＮＯＧなどの再プログラミング因子；クラスタ化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピート‐ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）などのゲノム操作タンパク質；ならびにフィブリノゲンなどの血液タンパク質からなる群より選択される、薬学的に活性なタンパク質である。ＲＮＡまたはＲＮＡ組成物を使用する方法の実施形態では、方法は、前記ＲＮＡまたはＲＮＡ組成物を細胞に移入する工程を含み得る。これに関して、ＲＮＡを細胞に移入するのに適した任意の技術を使用し得る。好ましくは、ＲＮＡは、本明細書に記載されるような標準的な技術、例えばリン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、またはマイクロインジェクションによって細胞にトランスフェクトされる。細胞は、ＲＮＡでトランスフェクトできる任意の細胞であってよく、好ましくは未成熟抗原提示細胞などの抗原提示細胞であり、より好ましくはマクロファージ、単球、Ｂ細胞、および樹状細胞からなる群より選択される。目的のペプチドまたはタンパク質を生成する方法は、インビボまたはインビトロで行われ得るが、好ましくはインビトロで行われる。
【０３６８】
さらなる態様では、本発明は、本発明のＲＮＡ、ＲＮＡ組成物または細胞を個体に投与する工程を含む、前記個体においてペプチドまたはタンパク質を発現する方法を提供し、それぞれの場合に、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、好ましくは、エリスロポエチンなどのサイトカイン；インテグリンなどの接着分子；免疫グロブリン；免疫学的に活性な化合物、例えば抗原、例えば腫瘍関連抗原、病原体関連抗原（例えばウイルスの１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の抗原、例えばインフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶの１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の抗原）、アレルゲン、または自己抗原；バソプレシン、インスリンまたは成長ホルモンなどのホルモン；ＶＥＧＦＡなどの成長因子；単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）、ヘキソサミニダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、プソイドコリンエステラーゼ、膵酵素、またはラクターゼなどの酵素；成長因子受容体などの受容体；α１−アンチトリプシンなどのプロテアーゼ阻害剤；ＢＡＸなどのアポトーシス調節因子；ＦＯＸＰ３などの転写因子；ｐ５３などの腫瘍抑制タンパク質；サーファクタントタンパク質などの構造タンパク質；ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、またはＮＡＮＯＧなどの再プログラミング因子；クラスタ化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピート‐ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）などのゲノム操作タンパク質；ならびにフィブリノゲンなどの血液タンパク質からなる群より選択される、薬学的に活性なタンパク質である。本発明のＲＮＡ、ＲＮＡ組成物または細胞は、任意の経路、例えば本発明の医薬組成物に関して上述したものによって投与され得る。
【０３６９】
さらなる態様では、本発明は、（ｉ）治療法で使用するため、特に対象における疾患または障害を治療する方法で使用するための本発明のＲＮＡ、ＲＮＡ組成物、または細胞；（ｉｉ）本発明のＲＮＡ、ＲＮＡ組成物、または細胞を対象に投与する工程を含む、前記対象における疾患または障害を治療する方法；および（ｉｉｉ）対象における疾患または障害を治療するための薬剤を調製するための本発明のＲＮＡ、ＲＮＡ組成物、または細胞の使用を提供し、ここで、（ｉ）〜（ｉｉｉ）のそれぞれにおいて、ＲＮＡは、好ましくは疾患関連ペプチドまたはタンパク質であるペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。これらの（ｉ）〜（ｉｉｉ）の態様の一実施形態では、疾患または障害の治療は、本明細書に記載されるタンパク質補充療法、ゲノム操作、遺伝的再プログラミング、および免疫療法からなる群より選択される。好ましくは、ペプチドまたはタンパク質は、薬学的に活性なタンパク質であり、より好ましくは、エリスロポエチンなどのサイトカイン；インテグリンなどの接着分子；免疫グロブリン；免疫学的に活性な化合物、例えば抗原、例えば腫瘍関連抗原、病原体関連抗原（例えばウイルスの１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の抗原、例えばインフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶの１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の抗原）、アレルゲン、または自己抗原；バソプレシン、インスリンまたは成長ホルモンなどのホルモン；ＶＥＧＦＡなどの成長因子；単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）、ヘキソサミニダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、プソイドコリンエステラーゼ、膵酵素、またはラクターゼなどの酵素；成長因子受容体などの受容体；α１−アンチトリプシンなどのプロテアーゼ阻害剤；ＢＡＸなどのアポトーシス調節因子；ＦＯＸＰ３などの転写因子；ｐ５３などの腫瘍抑制タンパク質；サーファクタントタンパク質などの構造タンパク質；ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、またはＮＡＮＯＧなどの再プログラミング因子；クラスタ化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピート‐ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）などのゲノム操作タンパク質；ならびにフィブリノゲンなどの血液タンパク質からなる群より選択される。一実施形態では、疾患または障害は、本明細書に開示される疾患および障害、例えばタンパク質補充療法、ゲノム操作療法、遺伝的再プログラミング療法、および／または免疫療法に関して本明細書に記載される例示的な疾患および障害から選択される。本発明のＲＮＡ、ＲＮＡ組成物または細胞は、任意の経路および／または任意のレジメンもしくは量で、例えば本発明の医薬組成物に関して上述した経路および／またはレジメンおよび／または量で投与し得る。一実施形態では、本発明のＲＮＡ、ＲＮＡ組成物または細胞は、対象に（例えば腹腔内、筋肉内、または皮内注射などの注射によって）、最大で１日１回、好ましくは最大で２日に１回、好ましくは最大で３日に１回、または最大で４日に１回投与される。一実施形態では、本発���のＲＮＡ、ＲＮＡ組成物または細胞は、慢性患者または長期患者に（例えば腹腔内、筋肉内、または皮内注射などの注射によって）、長期間、特に少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、少なくとも５年間、または少なくとも１０年間、例えば最大２週間、最大３週間、最大４週間、最大１ヶ月間、最大２ヶ月間、最大３ヶ月間、最大４ヶ月間、最大５ヶ月間、最大６ヶ月間、最大１２ヶ月間、最大２年間、最大３年間、最大４年間、最大５年間、最大１０年間まで、または患者の全生涯にわたって投与される。一実施形態では、本発明のＲＮＡ（本発明のＲＮＡ組成物または医薬組成物など）は、慢性患者または長期患者に（例えば腹腔内、筋肉内、または皮内注射などの注射によって）、長期間、すなわち少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、少なくとも５年間、または少なくとも１０年間、例えば最大２週間、最大３週間、最大４週間、最大１ヶ月間、最大２ヶ月間、最大３ヶ月間、最大４ヶ月間、最大５ヶ月間、最大６ヶ月間、最大１２ヶ月間、最大２年間、最大３年間、最大４年間、最大５年間、最大１０年間まで、または患者の全生涯にわたって、最大で１日１回（すなわち２回の投与間の期間は、少なくとも２４時間、例えば少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、もしくは少なくとも４２時間である）、好ましくは最大で２日に１回（すなわち２回の投与間の期間は、少なくとも４８時間、例えば少なくとも５４時間、少なくとも６０時間、もしくは少なくとも６６時間である）、好ましくは最大で３日に１回（すなわち２回の投与間の期間は、少なくとも７２時間、例えば少なくとも７８時間、少なくとも８４時間、もしくは少なくとも９０時間である）、または最大で４日に１回（すなわち２回の投与間の期間は、少なくとも９６時間、例えば少なくとも１０２時間、少なくとも１０８時間、もしくは少なくとも１１４時間である）、投与される。
【０３７０】
さらなる態様では、本発明は以下を提供する：
（Ｉ）第２の態様のワクチン組成物または第３の態様の未成熟抗原提示細胞を個体に投与する工程を含む、前記個体において免疫応答を誘発する方法が提供される。好ましくは、前記免疫応答は、本発明のワクチン組成物または未成熟抗原提示細胞に含まれるＲＮＡによってコードされるタンパク質またはペプチドに対して特異的に向けられるか、または前記タンパク質またはペプチドに含まれる抗原に対して特異的に向けられる。前記免疫応答は、治療的および／または防御的であり得る。前記ワクチン組成物および前記未成熟抗原提示細胞、好ましくは未成熟樹状細胞は、本発明の第２の態様について上記で指定されたように非経口的に、好ましくは結節内注射、好ましくは鼠径リンパ節への注射によって投与されることが特に好ましい。一実施形態では、方法は、インフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶなどのウイルスに対する免疫応答を誘発するためのものである。
【０３７１】
（ＩＩ）抗原提示細胞の表面に目的の抗原（例えばインフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶなどのウイルスの抗原）を提示するＭＨＣ分子の部分を増加させる方法が提供され、前記方法は、前記目的の抗原（例えばインフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶなどのウイルスの抗原）またはその抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、第１の態様で定義された式（Ｉ）による構造で修飾されたＲＮＡを提供すること；および式（Ｉ）による構造で修飾された前記ＲＮＡを未成熟抗原提示細胞に移入することを含む。一実施形態では、目的の抗原（例えばインフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶなどのウイルスの抗原）またはその抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、式（Ｉ）による構造で修飾されたＲＮＡを提供する工程は、２'‐Ｏ‐リボースメチルトランスフェラーゼの非存在下で行われる。代替的実施形態では、前記工程は、２'‐Ｏ‐リボースメチルトランスフェラーゼの存在下で行われる。理論に拘束されるものではないが、本発明の５'キャップ化合物でＲＮＡを修飾することは、特に未成熟抗原提示細胞、例えば未成熟樹状細胞内で、前記ＲＮＡの安定性および／または発現を増加させると想定される。この増加した安定性および／または発現は、前記ＲＮＡによってコードされるタンパク質またはペプチドの蓄積をもたらす。前記タンパク質またはペプチドは、抗原または抗原ペプチドを含み得る。したがって、前記タンパク質のプロセシング後、抗原または抗原ペプチドは、抗原提示細胞の表面上のＭＨＣ分子に負荷され得る。あるいは、前記タンパク質またはペプチドは、それ自体が抗原または抗原ペプチドであってもよく、プロセシングなしでＭＨＣ分子に負荷されてもよい。本発明の５'キャップ化合物で修飾された抗原または抗原ペプチドを含む特定のタンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡは、従来の５'キャップ構造を有する同じＲＮＡと比較した場合、好ましくはＡＲＣＡ  ５'キャップ構造を有する同じＲＮＡなどの参照ＲＮＡと比較した場合、前記ＲＮＡによってコードされるタンパク質またはペプチドに由来するペプチドを提示する抗原提示細胞の細胞表面上のＭＨＣ分子の部分／画分を増加させると想定される。抗原提示細胞の表面に特定の抗原を提示するＭＨＣ分子の密度は、前記特定の抗原に特異的な誘導される免疫応答の強さを決定するので、抗原提示細胞に導入された、抗原をコードするＲＮＡの安定性を高めることは、前記特定の抗原に対する免疫応答の増加をもたらすと想定される。
【０３７２】
（ＩＩＩ）免疫エフェクタ細胞を刺激および／または活性化する方法が提供され、前記方法は、目的の抗原（例えばインフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶなどのウイルスの抗原）またはその抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、第１の態様で定義された式（Ｉ）による構造で修飾されたＲＮＡを提供すること；式（Ｉ）による構造で修飾された前記ＲＮＡを未成熟抗原提示細胞に移入すること；および抗原提示細胞を免疫エフェクタ細胞と接触させることを含む。好ましくは、前記免疫エフェクタ細胞は、抗原特異的に活性化および／または刺激される。好ましくは、この方法によって、抗原特異的エフェクタ細胞、好ましくはＴ細胞の量が増加する。好ましくは、未成熟抗原提示細胞は未成熟樹状細胞である。一実施形態では、目的の抗原（例えばインフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶなどのウイルスの抗原）またはその抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、式（Ｉ）による構造で修飾されたＲＮＡを提供する工程は、２'‐Ｏ‐リボースメチルトランスフェラーゼの非存在下で行われる。代替的実施形態では、前記工程は、２'‐Ｏ‐リボースメチルトランスフェラーゼの存在下で行われる。好ましい実施形態では、免疫エフェクタ細胞は、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。一実施形態では、前記ＲＮＡを未成熟抗原提示細胞に移入する工程は、上述したリポフェクション、エレクトロポレーション、またはマイクロインジェクションなどの当業者に公知の任意の核酸導入方法、例えばトランスフェクション法によってインビトロで行われる。別の実施形態では、前記ＲＮＡを未成熟抗原提示細胞に移入する工程は、例えばＲＮＡを個体に投与することによって、好ましくは非経口投与によって、好ましくはリンパ内投与によって、好ましくはリンパ節（１つまたは複数）への注射、すなわちリンパ節内注射によって、リンパ管への注射によって、または脾臓への注射によってインビボで行われる。好ましくは、前記投与は、好ましくはリンパ節（１つまたは複数）内で未成熟樹状細胞によって取り込まれるＲＮＡのリンパ節内注射による。投与されるＲＮＡは、好ましくは裸のＲＮＡの形態である。一実施形態では、抗原提示細胞を免疫エフェクタ細胞と接触させる工程は、例えば組織培養皿においてインビトロで行われる。別の実施形態では、抗原提示細胞を免疫エフェクタ細胞と接触させる工程は、インビボで行われる。この実施形態では、ＲＮＡを未成熟抗原提示細胞に移入する工程は、上記のようにインビトロまたはインビボで行われ得る。ＲＮＡがインビトロで移入された抗原提示細胞をインビボで免疫エフェクタ細胞と接触させるために、抗原提示細胞は、好ましくは非経口投与によって、例えば静脈内、筋肉内、皮下、リンパ節内、リンパ内、または腹腔内注射によって、好ましくはリンパ管、脾臓、および／またはリンパ節（１つまたは複数）、好ましくは鼠径リンパ節（１つまたは複数）への注射などのリンパ系への注射によって個体に投与される。一実施形態では、方法は、ＲＮＡを未成熟���原提示細胞に移入した後および抗原提示細胞を免疫エフェクタ細胞と接触させる前に、未成熟抗原提示細胞を成熟抗原提示細胞に分化させる工程をさらに含み得る。分化工程は、インビトロまたはインビボで行われ得る。例えば、ＲＮＡを未成熟抗原提示細胞、好ましくは未成熟樹状細胞に移入することができ、未成熟抗原提示細胞をインビトロで分化させ、分化した成熟抗原提示細胞、好ましくは成熟樹状細胞を上記のようにインビトロまたはインビボで、好ましくはインビボで免疫エフェクタ細胞と接触させる。ＲＮＡがインビトロで移入される未成熟抗原提示細胞は、個体、例えば免疫化される患者から単離し得るか、または造血幹細胞から分化させ得る。
【０３７３】
免疫エフェクタ細胞、特にＴ細胞の刺激および／または活性化は、典型的には免疫エフェクタ細胞の増殖、細胞傷害反応性、および／またはサイトカイン分泌に関連する。したがって、当業者は、免疫エフェクタ細胞が刺激および／または活性化されるかどうかを、典型的にはＴ細胞を使用して実施される簡単なインビトロ試験によって決定し得る。そのようなＴ細胞は、Ｔ細胞ハイブリドーマなどの形質転換されたＴ細胞株、またはげっ歯動物、例えばマウスもしくはラットなどの哺乳動物から単離されたＴ細胞によって提供され得る。適切なＴ細胞ハイブリドーマは市販されているか、または公知の方法によって作製され得る。Ｔ細胞は、公知の方法で哺乳動物から単離され得る（Ｓｈｉｍｏｎｋｅｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：３０３−３１６参照）。Ｔ細胞の活性化および／または刺激を試験するための適切な実験設定を以下の工程（１）〜（４）で説明する。Ｔ細胞は、試験し得るおよびＴ細胞の活性化またはＴ細胞活性の調節を示す適切なマーカを発現する。マウスＴ細胞ハイブリドーマＤＯ１１．１０は、活性化するとインターロイキン−２（ＩＬ−２）を発現するので、前記ハイブリドーマをこの目的に使用し得る。Ｔ細胞の活性化／刺激を確認するために、または組成物が前記Ｔ細胞ハイブリドーマの活性を調節することができるかどうかを判定するために、ＩＬ−２濃度を測定し得る。この試験は以下の工程によって実施される：（１）Ｔ細胞ハイブリドーマからまたは哺乳動物からの単離によってＴ細胞を提供する、（２）増殖を可能にする条件下でＴ細胞を培養する、（３）増殖中のＴ細胞を、抗原またはそれをコードする核酸と接触させた抗原提示細胞と接触させる、および（４）Ｔ細胞をマーカについて、例えばＩＬ−２産生について試験する。試験に使用される細胞は、増殖を可能にする条件下で培養される。例えば、ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞ハイブリドーマは、完全培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンおよび５ｘ１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ  １６４０）において３７℃および５％ＣＯ２で適切に培養されるＴ細胞活性化シグナルは、適切な抗原ペプチドが負荷された抗原提示細胞によって提供される。
【０３７４】
あるいは、Ｔ細胞活性の調節は、抗原特異的Ｔ細胞の変化または増殖を決定することによって確認してもよく、これは、例えば公知の放射性標識法によって測定し得る。例えば、標識されたヌクレオチドを試験培地に添加し得る。そのような標識ヌクレオチドのＤＮＡへの組み込みは、Ｔ細胞増殖の指標としての役割を果たし得る。この試験は、Ｔ細胞ハイブリドーマのようなその増殖のために抗原提示を必要としないＴ細胞には適用されない。この試験は、哺乳動物から単離された非形質転換Ｔ細胞の場合にＴ細胞活性の調節を決定するために有用である。
【０３７５】
（ＩＶ）個体において免疫応答を誘導する方法が提供され、前記方法は、目的の抗原（例えばインフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶなどのウイルスの抗原）またはその抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、第１の態様で定義された式（Ｉ）による構造で修飾されたＲＮＡを提供すること；および式（Ｉ）による構造で修飾された前記ＲＮＡを前記個体に投与することを含む。一実施形態では、ＲＮＡは、リンパ節内注射によって投与されるか、または皮内投与される。目的の抗原は、任意の抗原（例えばインフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶなどのウイルスの抗原）であり得、好ましくは上記で定義されたとおりである。好ましい実施形態では、前記ＲＮＡは、好ましくは非経口投与によって、例えば静脈内、筋肉内、皮下、リンパ節内、皮内、リンパ内、または腹腔内注射によって、好ましくはリンパ管（１つまたは複数）、脾臓、および／またはリンパ節（１つまたは複数）、好ましくは鼠径リンパ節（１つまたは複数）への注射などのリンパ系への注射によって、裸のＲＮＡの形態で投与される。好ましくは、投与されたＲＮＡは、個体の未成熟樹状細胞によって取り込まれる。好ましくは、免疫応答は防御的および／または治療的であり、例えば癌性疾患または感染症などの疾患を治療および／または予防するために有用である。一実施形態では、目的の抗原（例えばインフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶなどのウイルスの抗原）またはその抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、式（Ｉ）による構造で修飾されたＲＮＡを提供する工程は、２'‐Ｏ‐リボースメチルトランスフェラーゼの非存在下で行われる。代替的実施形態では、前記工程は、２'‐Ｏ‐リボースメチルトランスフェラーゼの存在下で行われる。
【０３７６】
（Ｖ）個体において免疫応答を誘導する方法が提供され、前記方法は、目的の抗原（例えばインフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶなどのウイルスの抗原）またはその抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、第１の態様で定義された式（Ｉ）による構造で修飾されたＲＮＡを提供すること；式（Ｉ）による構造で修飾された前記ＲＮＡを未成熟抗原提示細胞に移入すること；および抗原提示細胞を前記個体に投与することを含む。一実施形態では、目的の抗原（例えばインフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶ、またはＲＳＶなどのウイルスの抗原）またはその抗原ペプチドを含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、式（Ｉ）による構造で修飾されたＲＮＡを提供する工程は、２'‐Ｏ‐リボースメチルトランスフェラーゼの非存在下で行われる。代替的実施形態では、前記工程は、２'‐Ｏ‐リボースメチルトランスフェラーゼの存在下で行われる。本発明のこの態様では、ＲＮＡは、上述したように当業者に公知の任意の核酸導入法、例えばリポフェクション、エレクトロポレーション、またはマイクロインジェクションなどのトランスフェクションによってインビトロで未成熟抗原提示細胞に移入される。好ましくは、未成熟抗原提示細胞は未成熟樹状細胞である。ＲＮＡがインビトロで移入される未成熟抗原提示細胞は、個体、例えば免疫化される患者から単離し得るか、または造血幹細胞から分化させ得、造血幹細胞は個体から単離し得る。未成熟抗原提示細胞または造血幹細胞は、白血球除去によって個体から単離し得る。好ましくは、未成熟抗原提示細胞は未成熟樹状細胞である。好ましくは、未成熟抗原提示細胞は、免疫化される個体から単離され、ＲＮＡは、前記単離した細胞に移入され、細胞は、好ましくは非経口投与によって、例えば静脈内、筋肉内、皮下、リンパ節内、リンパ内、または腹腔内注射、好ましくはリンパ管（１つまたは複数）、脾臓および／またはリンパ節（１つまたは複数）、好ましくは鼠径リンパ節（１つまたは複数）への注射などのリンパ系への注射によって前記個体に戻される。
【０３７７】
標的疾患に対するワクチン接種への適合性を含む、免疫反応を誘発する能力は、インビボ試験によって容易に決定され得る。例えば、組成物、例えばワクチン組成物または医薬組成物を実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギなどの哺乳動物に投与し、組成物の投与前および組成物の投与後の所定の時点で、例えば投与の１、２、３、４、５、６、７、および８週間後に前記動物から血液試料を採取し得る。血液試料から血清を生成し、投与／免疫化後に生じた抗体の発生を決定し得る。例えば、抗体の濃度を測定し得る。さらに、Ｔ細胞を哺乳動物の血液および／またはリンパ系から単離し、それを、免疫化に使用される抗原に対する反応性に関して試験し得る。当業者に公知の任意の読み出しシステムを使用してよく、例えば増殖アッセイ、サイトカイン分泌アッセイ、細胞傷害活性を試験するアッセイ、またはテトラマー解析などを使用し得る。さらに、免疫反応性の増加は、上記のように、抗原特異的Ｔ細胞の数、それらの潜在的細胞傷害能、またはそれらのサイトカイン分泌パターンを測定することによっても決定され得る。
【０３７８】
本出願の実施例に示されるように、本発明者らは、驚くべきことに、本発明の５'キャップ化合物を使用することによって、β−Ｓ−ＡＲＣＡキャップ１構造を１工程でＲＮＡに組み込み、それによりチオ置換のプラスの作用を、キャップ１を規定する２'−Ｏ−メチル化と組み合わせることがことが可能であることを見出した。
【０３７９】
本発明を、本発明の好ましい実施形態を例示する以下の実施例によって説明するが、特許請求の範囲で定義される本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。添付の特許請求の範囲に含まれない実施例は、比較目的でのみ提供される。
【実施例】
【０３８０】
略語
ｈ：時間（１または複数）
ｍＭ：ミリモル（１０−３ｍｏｌ／ｌ）
ＮＴＰ：ヌクレオシド三リン酸
【実施例１】
【０３８１】
キャップ類似体の合成
【０３８２】
共転写的にキャップされたインビトロ転写ｍＲＮＡを得るために、図２（ＯＲ＝ＯＣＨ３）に示す本発明の５'キャップ化合物（化合物１、式（Ｉ）の化合物）を設計した。化合物１は、５'−５'三リン酸架橋のβ位にホスホロチオエート置換、逆方向への組み込みを回避するための末端２'−Ｏメチル化、キャップ１構造を反映する内部２'−Ｏメチル化、およびファージＲＮＡポリメラーゼによる組み込みを可能にする追加のグアノシン部分を含む。修飾されたキャップトリヌクレオチドの合成および使用法を以下で説明する。
【０３８３】
本発明の５'キャップ化合物および他のキャップ類似体は、標準的な手順を使用して（ｐＮ）２−４などの市販のオリゴヌクレオチドから出発して合成することができる。ｍ２７，２−ＯＧｐｐＳｐｍ２'−ＯＧｐＧ（化合物１）については、市販の５'−リン酸化２'−Ｏ−メチル化ジグアノシン５'，３'−ジヌクレオチド（ｐｍ２'−ＯＧｐＧ）を入手し、さらに処理することなく出発物質として使用した。ジヌクレオチドを、３当量の２，２'−ジチオジピリジン／トリフェニルホスフィン活性化系の存在下でＤＭＦ中１０当量のイミダゾールと反応させることによって対応するＰ−イミダゾリド誘導体（Ｉｍ−ｐｍ２'−ＯＧｐＧ）に変換した（図１；Ｍｕｋａｉｙａｍａ  ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  １９７１参照）。ヌクレオチドサブユニットである２'−Ｏ−メチルグアノシン５'−Ｏ−（２−チオジホスフェート）（ｍ２７，２'−ＯＭｅＧＤＰβＳ）は、先に記述されているように（Ｋｏｗａｌｓｋａ  ｅｔ  ａｌ  ２００８）合成した。次に、ｍ２７，２'−ＯＭｅＧＤＰβＳとＰ−イミダゾリドＩｍ−ｐｍ２'−ＯＧｐＧを、過剰（８当量）のＺｎＣｌ２の存在下にＤＭＦ中で、２つのジアステレオ異性体（Ｄ１およびＤ２、ＲＰ  ＨＰＬＣカラムからの溶出順序に従って命名した）の混合物としてのキャップ類似体（ｍ２７，２−ＯＧｐｐＳｐｍ２'−ＯＧｐＧ、ＨＰＬＣ収率３８％；図２）にカップリングした。ジアステレオ異性体を、ＲＰ  ＨＰＬＣ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ａｍｉｄｅ  ＲＰ  Ｃ１６カラム）によって純粋なジアステレオ異性体Ｄ１およびＤ２に分離した。
分光データ：
ｍ２７，２'−ＯＧｐｐＳｐ２'−ＯＧｐＧ（化合物１）
【０３８４】
（Ｄ１）：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ９．０７（ｓ，１Ｈ）、８．１６（ｓ，１Ｈ）、８．０７（ｓ，１Ｈ）、５．９７（ｄ，Ｊ＝２．２４Ｈｚ，１Ｈ）、５．８７（ｄ，Ｊ＝５．９８Ｈｚ，１Ｈ）、５．８２（ｄ，Ｊ＝５．４８Ｈｚ，１Ｈ）、４．８５−５．００（ｍ，１Ｈ）、４．７４−４．８７（ｍ，２Ｈ，ＨＤＯの信号と部分的にオーバーラップ）、４．６１（ｔ，Ｊ＝５．３５Ｈｚ，１Ｈ）、４．５１（ｔ，Ｊ＝４．３６Ｈｚ，２Ｈ）、４．１２−４．４８（ｍ，９Ｈ）、４．０７（ｓ，３Ｈ）、３．５８（ｓ，３Ｈ）、３．４３（ｓ，３Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ  ３０．９３（ｔ，Ｊ＝２６．９Ｈｚ，１  Ｐ）−０．５９（ｂｒ．ｓ．，１  Ｐ）−１１．９４（ｄ，Ｊ＝２６．９Ｈｚ，１  Ｐ）−１２．０８（ｄ，Ｊ＝２６．９Ｈｚ，１  Ｐ）；
（Ｄ２）：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ  ９．０８（ｓ，１Ｈ）、８．１６（ｓ，１Ｈ）、８．１０（ｓ，１Ｈ）、５．８９（ｄ，Ｊ＝２．４９Ｈｚ，１Ｈ）、５．８７（ｄ，Ｊ＝５．９８Ｈｚ，１Ｈ）、５．８２（ｄ，Ｊ＝５．９８Ｈｚ，１Ｈ）、４．９７（ｍ，１Ｈ）、４．５８−４．５５（〜ｔ，１Ｈ）４．８５−４．７３（ｍ，２Ｈ，ＨＤＯの信号とオーバーラップ）、４．５４−４．４７（ｍ，２Ｈ）、４．１３−４．４６（ｍ，９Ｈ）、４．０７（ｓ，３Ｈ）、３．５７（ｓ，３Ｈ）、３．４４（ｓ，３Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ３０．４０（ｄｔ，Ｊ＝２６．９Ｈｚ，１  Ｐ）−０．６０（ｂｒ．ｓ．，１  Ｐ）−１１．９８（ｄ，Ｊ＝２６．９Ｈｚ，１  Ｐ）−１２．４３−１２．０６（ｄ，Ｊ＝２６．９Ｈｚ，１  Ｐ）
ＨＲＭＳ  Ｃ３３Ｈ４４Ｎ１５Ｏ２４Ｐ４Ｓ−［Ｍ−Ｈ］−の計算値ｍ／ｚ  １１９０．１３６０、実測値  １１９０．１３９３６
【実施例２】
【０３８５】
キャップ類似体を使用したインビトロ転写によるキャップされたｍＲＮＡのインビトロ合成
【０３８６】
インビトロ転写中の異なるキャップ類似体の組み込みには、通常のβ−Ｓ−ＡＲＣＡジヌクレオチドキャップの組み込みと同じプロトコルを使用することができる。ここに示す実施例では、３ｍＭのキャップ類似体と７．５ｍＭのＮＴＰを転写反応に添加した。化合物１のジアステレオマー（Ｄ１／Ｄ２）の１つまたはβ−Ｓ−ＡＲＣＡのジアステレオマー（Ｄ１／Ｄ２）の１つで生成されたＲＮＡの収量（反応容量１ｍｌあたりのｍｇ  ＲＮＡ）と完全性を以下の表に示す。
【表１】
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【実施例３】
【０３８７】
細胞培養物中の異なるキャップ付きｍＲＮＡからのタンパク質発現
【０３８８】
キャップ類似体組み込みの機能的アッセイとして、および得られたキャップ構造の翻訳可能性の試験として、ルシフェラーゼレポータをコードする異なるキャップ付きｍＲＮＡをヒト未成熟樹状細胞（ｈｉＤＣ）にトランスフェクトした。そのために、Ｋｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５３４，３９６−４０１（２０１６）に記載されているように、ウェルあたり７００  ｎｇのキャップされたＲＮＡをリポソームで製剤化し、５Ｅ０４  ｈｉＤＣを含む９６ウェルに添加した。その後、レポータ活性を７２時間にわたって記録した。結果を図３に示す。
【０３８９】
化合物１のＤ１またはＤ２ジアステレオマーで共転写的にキャップされたｍＲＮＡは機能的であり、対応するβ−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１またはＤ２ジアステレオマーでキャップされたｍＲＮＡと同等のレベルでｈｉＤＣに翻訳され、本発明による式（Ｉ）の化合物に関しても、β−Ｓ−ＡＲＣＡ修飾の利点は依然として有効であることを示した（図３）。
【実施例４】
【０３９０】
式（Ｉ）の５'キャップ化合物で修飾されたｍＲＮＡは、ｍＲＮＡの安定性および翻訳効率の改善とＩＦＩＴ１による免疫応答の回避を組み合わせる
【０３９１】
上記のように、ルシフェラーゼｍＲＮＡを化合物１のＤ１もしくはＤ２ジアステレオマー、または対応するβ−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１もしくはＤ２ジアステレオマーで共転写的にキャップした。さらに、ＮＥＢワクシニアキャッピング酵素キット（酵素的キャップ０／キャップ１  ＲＮＡ）を使用して、三リン酸Ｌｕｃ  ｍＲＮＡ（すなわちキャップ類似体の非存在下で転写された）を酵素的にキャップした。酵素的キャップ０構造を得るために、ワクシニアキャッピング酵素をそのまま使用し、酵素的キャップ１構造については、ワクシニアメチルトランスフェラーゼも添加した。その後、二本鎖ＲＮＡの量を減少させるまたは除去するために、得られたキャップ付きｍＲＮＡ調製物を精製した。さらに、以前の実験で分析に干渉することが示されている、共転写的にキャップされたｍＲＮＡ調製物中に存在する少量のキャップされていないＲＮＡを、酵素的にキャップ０（ジヌクレオチドでキャップされたｍＲＮＡの場合）またはキャップ１構造（トリヌクレオチドでキャップされたｍＲＮＡの場合）に変換した。次に、得られたｍＲＮＡ調製物をＦ１２で製剤化し、Ｂａｌｂ／ｃマウスに静脈内投与した。マウスあたり１０μｇ  ＲＮＡの用量で、１群あたり５匹のマウスを試験した。ルシフェラーゼ発現の強度と動態を、適用後６時間、２４時間、および４８時間の生物発光インビボイメージングによって観測した。
【０３９２】
この設定では、β‐Ｓ置換は、存在したとしても、β‐Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）および（Ｄ２）キャップ０  ＲＮＡと比較して、酵素的にキャップされたキャップ０  ＲＮＡの同様の発現プロフィールによって観察されるように、わずかな影響しか及ぼさず、インビボ発現を駆動する主な因子は、キャップ１構造の２'−Ｏ−メチル化である。したがって、酵素的にキャップされたキャップ１  ｍＲＮＡ調製物は、測定したいずれの時点でも最も高いタンパク質発現をもたらす。しかし、化合物１でキャップされたＲＮＡは、適用の２０時間後に同様のタンパク質レベルを示し、その他の時点ではわずかにより低いレベル（すべてのキャップ０  ＲＮＡと比較して常により高いレベル）を示す。したがって、本発明の５'キャップ化合物は、チオ置換のプラスの作用とキャップ１を規定する２'−Ｏ−メチル化とを組み合わせる、β−Ｓ−ＡＲＣＡキャップ１構造のＲＮＡへの組み込みを可能にする。
【実施例５】
【０３９３】
インビボでの異なるキャップ付きｍＲＮＡからのタンパク質発現
【０３９４】
上記のように、１−メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）を含むマウスエリスロポエチン（ｍＥＰＯ）ｍＲＮＡを、ＡＲＣＡ  Ｇまたはβ−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマー（Ｄ１と称する）で共転写的にキャップした。さらに、ＮＥＢワクシニアキャッピング酵素キット（酵素的キャップ０／キャップ１  ＲＮＡ）を使用して、三リン酸ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡ（すなわちキャップ類似体の非存在下で転写された）を酵素的にキャップした。酵素的キャップ０構造（Ｅキャップ０と称する）を得るために、ＲＮＡトリホスファターゼおよびグアニリルトランスフェラーゼ活性を有するワクシニアキャッピング酵素をそのまま使用し、酵素的キャップ１構造（Ｅキャップ１と称する）については、２'−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するワクシニアメチルトランスフェラーゼも添加した。その後、二本鎖ＲＮＡの量を減少させるまたは除去するために、得られた異なるキャップ付きｍＲＮＡ調製物を精製した。さらに、以前の実験で分析に干渉することが示されている、共転写的にキャップされたｍＲＮＡ調製物中に存在する少量のキャップされていないＲＮＡを、酵素的にキャップ０構造に変換し、次いでキャップ１構造に変換した。Ｄ１構造を使用したｍＲＮＡの調製において、酵素での処理後に得られた生成物をＤ１＋Ｅキャップ１と称し、ＡＲＣＡ  Ｇの場合は、酵素での処理後に得られた生成物をＡＲＣＡ  Ｇ＋Ｅキャップ１と称した。次にｍＲＮＡ調製物をＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）で製剤化し、Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射した。マウスあたり３μｇ  ＲＮＡの用量で、１群あたり５匹のマウスを試験した。適用後６時間、２４時間、４８時間および７２時間に収集した血漿中で、ｍＥＰＯ  ｍＲＮＡの翻訳をＥＬＩＳＡによって観測した。
【０３９５】
図５から分かるように、ＲＮＡにおける本発明のキャップ１構造の存在は、特に注射の２４時間後に、キャップ０構造を有するＲＮＡと比較して、ｍＥＰＯのはるかに高い発現レベルをもたらす。さらに、図５は、本発明のキャップ１構造を含むＲＮＡを使用することによって、少なくとも７２時間、高いｍＥＰＯ血漿レベルを維持することが可能であることを示す。したがって、この実施例は、ペプチドまたはタンパク質の高い発現レベルを維持するために、ペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡを少なくとも１日２回投与する必要がないことを明らかにする。むしろ、本発明を使用することによって、ペプチドまたはタンパク質の高い発現レベルを維持しながら、ＲＮＡを最大で１日１回、好ましくは最大で２日に１回、好ましくは最大で３日に１回、または最大で４日に１回投与することが可能である。これは、投与（例えば注射）の回数を有意に減らすことができるという患者にとっての利点を有し、これは、慢性または長期患者などの長期間にわたって治療（例えば医薬組成物）を受ける患者に関して特に有益である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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