(57)【要約】  対象のインビトロ尿試料中のマイコバクテリアに関連する抗原の検出のための抗体であって、前記抗原が、ＭａｎＬＡＭ（マンノースキャップ型リポアラビノマンナン）を含み、前記抗体が、前記尿由来の前記ＭａｎＬＡＭ分子に特異的に結合し、前記抗体が、３ｘ１０−８Ｍ以下のＫＤの親和性で前記ＭａｎＬＡＭに結合し、前記抗体が、イノシトールリン酸でキャップされていないまたはキャップされているＬＡＭ分子に、１０−３Ｍ以上のＫＤの親和性で結合する抗体、およびその使用のための抗体。【選択図】図１Ａ、１Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のインビトロ尿試料中のマイコバクテリアに関連する抗原の検出のための抗体であって、前記抗原が、ＭａｎＬＡＭ（マンノースキャップ型リポアラビノマンナン）を含み、前記抗体が、前記尿由来の前記ＭａｎＬＡＭ分子に特異的に結合し、前記抗体が、３ｘ１０−８Ｍ以下のＫＤを有する親和性で前記ＭａｎＬＡＭに結合し、かつ前記抗体が、１０−３Ｍ以上のＫＤの親和性でイノシトールリン酸でキャップされていないまたはキャップされているＬＡＭ分子に結合する、抗体。
【請求項２】
前記ＭａｎＬＡＭが、ＭＴＸキャップ型ＭａｎＬＡＭを含み、マンノシドキャップが５−デオキシ−５−メチルチオ−キシロ部分の結合によりさらに修飾されることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記ＭＴＸキャップ型ＭａｎＬＡＭが、アルファ１−４結合メチルキシロース残基でさらに置換される２つのアルファ１−２−Ｍａｎｐ結合残基を特徴とするＭＴＸ−Ｍａｎ２キャップ型ＭａｎＬＡＭを含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、Ｍａｎｐの特徴を含む前記ＭａｎＬＡＭのエピトープに結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、グリカン７、グリカン８、グリカン９、グリカン１０、およびグリカン１１からなる群より選択されるモチーフを備えることを特徴とする前記ＭａｎＬＡＭのエピトープに結合する、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
前記エピトープが、ＭＴＸ−ジマンノース部分を備えることをさらに特徴とする、請求項４または５に記載の抗体。
【請求項７】
対象由来の尿試料を用いて前記対象中の成長が遅いマイコバクテリアの存在を検出するために好適な、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）またはウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）に関連する抗原を検出するために好適な、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体が、前記対象の尿中の急速成長マイコバクテリア由来のマーカーと交差反応しない、請求項７または８に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム・アブセサス（Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、またはマイコバクテリウム・ケロネー（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）に関連するマーカーと交差反応しない、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、マイコバクテリウム・ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、およびマイコバクテリウム・アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）からなる群より選択される成長が遅いマイコバクテリアに関連するマーカーに対し少なくとも１０倍低い反応性を示す、請求項７〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体が、非マイコバクテリア細菌種の検出に比べて少なくとも１５００倍大きな反応性で前記結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）またはウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）に関連する前記抗原を検出する、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１３】
前記非マイコバクテリウム細菌種が、ゴルドニア・ブロンキアリス（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌｉｓ）、ノカルジア・アステロイデス菌種（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドコッカス菌種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）,ツカムレラ・パウロメタボルム（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ  ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌｕｍ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、コリネバクテリウム・ウレアリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、腐性ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、プロテウス・ミラビリス  （Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、エンテロコッカス・フィカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、またはトラコーマ病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の１種または複数を含む、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗原を検出するためのサンドイッチイムノアッセイにおいて捕捉抗体としての使用に好適な、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗原を検出するためのサンドイッチイムノアッセイにおいて検出抗体としての使用に好適な、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１６】
対象中の病原性マイコバクテリアの存在を差次的に検出するための方法であって、前記対象の尿と請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体を接触させること；前記尿中の抗原への前記抗体の結合を検出すること；前記抗体が３ｘ１０−８Ｍ以下のＫＤを有する親和性で前記尿中の前記抗原に特異的に結合する場合、前記ＭａｎＬＡＭ分子を特徴とする前記病原性マイコバクテリアが前記対象の身体中に存在すると決定することを含む、方法。
【請求項１７】
前記抗体が、非病原性マイコバクテリアの抗原に対するよりも少なくとも３倍大きいシグナルで前記尿中の前記病原性マイコバクテリアの抗原に結合する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記尿に第１の抗体を適用して前記抗原に結合させること；および前記尿に第２の抗体を適用して第２の抗原に結合させることをさらに含み、前記第１の抗体は、請求項１〜１７のいずれか１項に記載されるように特徴付けられ、前記第２の抗体は、前記第１の抗体と同じ抗原には結合せず、かつ前記第１と第２の抗原は、前記ＭａｎＬＡＭ分子を含み、前記第１と第２の抗体の片方は、捕捉抗体でありかつ前記第１と第２の抗体のもう一方は、イムノアッセイにおける検出抗体である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の抗体が、３ｘ１０−５Ｍ以下のＫＤを有する親和性で前記ＭａｎＬＡＭ分子のポリアラビノース構造に結合することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体が、ａｒａ４および／またはａｒａ６に特異的に結合する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＭｏＡｂ１、１３Ｈ３、２７Ｄ２およびＡ１９４−０１抗体からなる群より選択される抗体と前記尿を接触させるステップを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
サンドイッチイムノアッセイにおいて前記ＭｏＡｂ１、１３Ｈ３、２７Ｄ２またはＡ１９４−１抗体の複数の組み合わせと前記尿を接触させるステップを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
サンドイッチイムノアッセイにおいて前記ＭｏＡｂ１およびＡ１９４−１抗体の組み合わせと前記尿を接触させるステップを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象の分類のための好適な参照標準診断を用いて結核でない対象由来の試料に比較して結核に罹患している対象由来の試料の中央値シグナル間で３倍またはそれより大きい倍率変化を達成するために好適な第２の抗体を有する試料に前記ＭｏＡｂ１抗体を適用することを含む、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記参照標準診断が、対象を分類するためのマイコバクテリア培養物またはＰＣＲベース法に基づく、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
好適な比較標準アッセイを用いて結核でない対象由来の試料に比較して結核に罹患している少なくとも２０％多い対象を検出するために試料に前記ＭｏＡｂ１抗体を適用することを含み、前記好適な比較標準アッセイが、前記アリーアＬＦ−ＬＡＭを含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２７】
結核でない対象由来の尿試料中の検出されたＭａｎＬＡＭ抗原特異的サンドイッチイムノアッセイシグナルが、集団中の少なくとも７０％の前記試料について１１ｐｇＭａｎＬＡＭ／ｍｌ未満である、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記シグナルが、前記集団中の少なくとも８０％の試料について検出限界より小さい、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記シグナルが、前記集団中の少なくとも９０％の試料について検出限界より小さい、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記シグナルが、前記集団中の少なくとも９５％の試料について検出限界より小さい、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記シグナルが、前記集団中の少なくとも９７％の試料について検出限界より小さい、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
結核の対象由来の尿試料中の前記検出ＭａｎＬＡＭ抗原特異的サンドイッチイムノアッセイシグナルが、集団中の少なくとも４０％の前記試料について１１ｐｇＭａｎＬＡＭ／ｍｌを超える、請求項２１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記シグナルが、前記集団中の少なくとも５０％の前記試料について前記検出限界を超える、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記シグナルが、前記集団中の少なくとも６０％の前記試料について前記検出限界を超える、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記シグナルが、前記集団中の少なくとも７５％の前記試料について前記検出限界を超える、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記シグナルが、前記集団中の少なくとも９０％の前記試料について前記検出限界を超える、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＨＩＶウイルスの非存在下で前記対象中のＴＢ病原性マイコバクテリアを検出することをさらに含む、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体の前記抗原への結合に基づくイムノアッセイのＡＵＣ（曲線下面積）が、少なくとも０．７０である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＡＵＣが、少なくとも０．８０である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＡＵＣが、少なくとも０．８５である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＡＵＣが、少なくとも０．９０である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＡＵＣが、少なくとも０．９５である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＡＵＣが、少なくとも０．９８である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
の前記第１と第２の抗体の片方が捕捉抗体でありかつ前記第１と第２の抗体のもう一方が検出抗体であるイムノアッセイにおいて、対象由来のインビトロ尿試料中のマイコバクテリアに関連する抗原を検出するために前記第１の抗体として前記ＭｏＡｂ１抗体または前記１３Ｈ３抗体、および第２の抗体として前記Ａ１９４−０１抗体または前記２７Ｄ２抗体の組み合わせを適用することを含む、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記検出が、イムノアッセイを用いて実施され、前記組み合わせが、前記アリーアＬＦ−ＬＡＭ検査より少なくとも２０％高い臨床的感度を有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記対象の身体中の前記病原性マイコバクテリアの存在に従い結核の前記対象を診断することをさらに含む、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記診断が、前記対象中の活動性結核感染の存在を検出することをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記病原性マイコバクテリアの存在に従い結核に対する前記対象の治療の有効性をモニターすることをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
臨床的感度をさらに高めるために前記イムノアッセイでの検出の前に前記試料中のＭａｎＬＡＭを含む前記抗原を濃縮することをさらに含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗原を濃縮することが、前記試料に磁気ビーズまたは限外濾過を適用することを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記対象中の病原性マイコバクテリアの存在と前記対象中の非病原性マイコバクテリアの存在を鑑別することをさらに含む、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記対象の環境由来の混入細菌の存在下で前記対象中の病原性マイコバクテリアの存在を特異的に検出することをさらに含む、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記混入細菌が、ゴルドニア・ブロンキアリス（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌｉｓ）、ノカルジア・アステロイデス菌種（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドコッカス菌種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）,ツカムレラ・パウロメタボルム（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ  ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌｕｍ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、コリネバクテリウム・ウレアリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、腐性ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、プロテウス・ミラビリス  （Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、エンテロコッカス・フィカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、トラコーマ病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、または非結核性抗酸菌（Ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の１種または複数を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記抗体を接触させることの前に前記尿を加熱することをさらに含む、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体または抗体の組み合わせおよび対象の尿試料中のマイコバクテリウム関連抗原の検出のためのその使用方法、特に、このような抗体または抗体の組み合わせおよび病原性マイコバクテリウムと細菌種を高精度で識別できる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
結核（ＴＢ）は、第１級の感染症の殺し屋である。２０１６年には、１０４０万人の人がＴＢを発病し、１７０万人がこの疾患で死亡しており、このことが、この疾患を世界中の主要な死亡の９番目の原因および感染病原体が引き起こす主要な原因にしている（世界保健機関２０１７）。ＴＢはまた、ＨＩＶを抱えて生きる人（ＰＬＨＩＶ）の死亡率の最も多い原因でもあり、２０１６年に３７４，０００人が死亡したと推定されている（世界保健機関２０１７）。ＰＬＨＩＶの人では、ＨＩＶでない人よりＴＢ発症のリスクが約３０倍大きいと推定されている（Ｇｅｔａｈｕｎ  ＆  Ｆｏｒｄ  ２０１６）。ＴＢによる死亡のほとんどは、早期診断で防止できたはずであるが、しかし、ＴＢは多くの場合、診断されないままになっている。世界全体では、推定発生症例と報告ＴＢ症例の間に、推定で４１０万件の症例の相違があった（世界保健機関２０１７）。この相違は、ＴＢが蔓延している低中所得国（ＬＭＩＣ）における典型的な一次診療環境に好適な確立された検査および正確、安価で迅速な試験の制約に起因する。
【０００３】
従来の診断法は、遅い（喀痰培養）または感度が悪い（喀痰スメア顕微鏡）。最近の技術、例えば、塩基配列決定またはＸｐｅｒｔ（登録商標）ＭＴＢ／ＲＩＦリアルタイムＰＣＲ検査は、より利用しやすくなってきたが、専用設備を必要とし、高価であるか、または別の理由で、ＴＢと接触するリスクの最も高いＬＭＩＣの集団の多くにとって利用し難い（Ｐａｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。既存のＴＢ診断法の制約は、ＰＬＨＩＶの人にとっては、この集団での未治療ＴＢに関連する高い死亡率のため、特に深刻である。加えて、ほとんどの検査は喀痰試料の分析に基づくが、多くのＴＢのＰＬＨＩＶの人は、肺外結核ＴＢ（約２５％）であるか、またはその他の理由で喀痰試料を生成できない。Ｘｐｅｒｔ臨床性能試験（Ｓｔｅｉｎｇａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）のメタアナリシスは、ＨＩＶ陽性患者の統合感度がＨＩＶ陰性患者に比べて低いことを示した（９９％対８６％）。この結果は、スメア陽性喀痰に比べてスメア陰性喀痰でのＸｐｅｒｔ検査の低い統合感度（６７％対９８％）と合わせたＨＩＶ陽性患者中のスメア陰性のより高い比率により、少なくとも部分的に説明された。一引用研究では、Ｘｐｅｒｔは、ＨＩＶ陽性患者におけるスメア陰性ＴＢについて検出感度が４３％に過ぎなかった（Ｌａｗｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。最近開発されたＸｐｅｒｔ  Ｕｌｔｒａの感度は、ＨＩＶ患者でのＸｐｅｒｔの感度より優れており、改善された感度は、特異性の低下の犠牲により達成された（Ｄｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）。
【０００４】
全てのＴＢ患者の早期発見と治療は、ＷＨＯの世界結核終息戦略および３番目の持続可能な開発目標（Ｕｐｌｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）に適合する要件の重要な要素であるが、これを達成することは、患者が最初に治療を求める地域ヘルスポストまたは医院などの環境で活動性結核を診断するための新規高感度ポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）手法を必要とするであろう。治療判断を素早く告知できる正確なＰＯＣ検査の欠如は、ケアカスケードの初期段階での顕著な患者喪失に繋がり、これは罹患率および死亡率の増加をもたらす（Ｃａｚａｂｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）。従って、ＷＨＯは、「ＴＢを検出するためのバイオマーカーに基く、非喀痰ベースの迅速な検査」を、優先度の高い目標製品プロファイル（ＴＰＰ）レポートにおいて重要な未充足ニーズとして記載している（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ２０１４）。
【０００５】
活動性結核の患者の血清または尿中に存在するマイコバクテリア抗原の特定には大きな関心が示されている。これらの抗原は、喀痰試料の採取の必要がなく、かつイムノアッセイベース迅速検査形式で開発し得る診断検査のための潜在的標的である。結核菌（Ｍｔｂ）細胞壁リポ多糖類で病原性因子である、リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）は、ＴＢのための診断バイオマーカーとして最も注目を集めている。ＬＡＭは、バイオマーカーとして多くの魅力的な特徴を有する：細菌由来である、Ｍｔｂの細胞壁中の豊富に存在する、熱安定性がある、およびＭｔｂに特有の構造エピトープを有する。ＬＡＭは多くのＴＢ患者の尿中で見つけることができるという多くの証拠があり（Ｓａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）ならびに初期段階の調査は、それが喀痰中（Ｐｅｒｅｉｒａ  Ａｒｉａｓ−Ｂｏｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）および血液中（Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１７；Ｓａｄａ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）で見つかる場合もあるということを示唆する。
【０００６】
１９９０年に喀痰中での（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）、１９９２年に血液中での（Ｓａｄａ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）および１９９７年に尿中での（Ｓｖｅｎｓｏｎ  １９９７）ＬＡＭの最初の報告以来、診断標的としてのＬＡＭの魅力的な特徴は、四半世紀にわたり、市販ＥＬＩＳＡおよび迅速（ラテラルフロー）検査の開発を含むＬＡＭベース診断法に対する研究に刺激を与えた。ＴＢの臨床診断のためにＡｂｂｏｔｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから最近上市された唯一のＬＡＭ検査である、Ａｌｅｒｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ＴＢ  ＬＡＭ（登録商標）検査（ＬＦ−ＬＡＭ）は、ウサギポリクローナル抗体を用いる尿中のＬＡＭを測定するためのラテラルフロー検査である。別の検査である、喀痰中のＬＡＭを測定するための大塚製薬からのＥＬＩＳＡ検査は最近、ヨーロッパでの使用のためのＣＥマークを受けたが、ＴＢ薬物試験での治療に対する応答を評価するツールとして使用されているに過ぎない（Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１８）。
【０００７】
尿中のＬＡＭを測定するためのキットの導入およびそれらの性能を評価する多数の臨床試験後の初期の大きな興奮にも関わらず、これらの検査の採用は限定的であった。採用が少ない大きな理由は、発生ＴＢ症例のスペクトルを介した試験の相対的に低い臨床的感度であった。ＰＬＨＩＶでのＴＢを診断するアリーアＬＦ−ＬＡＭ検査を評価する研究の総合的なメタアナリシスは、検査が、限られた診断精度：３０３７人の患者において、９２％の統合特異性で、ＨＩＶ＋症例でのＴＢ診断に対し４４％統合感度、であることを明らかにした（世界保健機関２０１５）。 この分析は、ＣＤ４カウント≦１００細胞／μｌで、ＴＢ症状を有するＨＩＶ／ＡＩＤＳを抱えて生きる免疫無防備状態の人々（ＰＬＨＩＶ）においてＴＢを診断するためのアリーアＬＦ−ＬＡＭの使用に対する極めて限られたＷＨＯ推奨のベースとなった（世界保健機関２０１５）。その低い感度にもかかわらず、アリーアＬＦ−ＬＡＭによる検査とその後の即時治療は、ＨＩＶ＋１０カ所のアフリカの病院の入院患者における、大きな、実用的ランダム化並行群多施設試験での８週死亡率を有意に減少させることが示された（Ｐｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）が、これまで、中央アフリカ共和国とジンバブエのみが、診断検査でアリーアＬＦ−ＬＡＭを組み込む方法に関するガイドラインを有し、ＬＭＩＣの取り込みは極めて限られていた（ＭＳＦ  ＆  Ｓｔｏｐ−ＴＢ  Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ  ２０１７）。
【０００８】
ＬＦ−ＬＡＭ検査および以前のＥＬＩＳＡ検査で実施された多数の試験にもかかわらず、ＬＡＭ検査の臨床性能を改善する道があるかどうかを理解するのに不可欠な、ＴＢバイオマーカーとしての尿中ＬＡＭについての多くの未解決の疑問が存在する。最も重要なのは、ＬＦ−ＬＡＭ陰性ＴＢ患者−特にＨＩＶ−患者および高いＣＤ４カウントを有するＨＩＶ＋患者の尿中ＬＡＭレベルが、単に、低すぎて現在の検査で測定できないが、改善された検出限界を有する検査により測定可能であるのかどうかがわからないことである。第２に、尿中の最も重要でＭｔｂに特有なＬＡＭエピトープの利用可能性と存在量が十分に理解されていないことである。
【発明の概要】
【０００９】
尿中のマイコバクテリアリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）の測定に基づく結核（ＴＢ）のための現在の診断検査は、低中所得国における使用のために、低コストおよび使いやすさなどの多くの望ましい特性を有するが、感度が不十分である。しかし、より高い精度を有する（すなわち、より高い臨床的感度を有する）尿ベース検査は、明らかに望ましいであろう。
【００１０】
本発明は、抗体または抗体の組み合わせおよび対象の尿試料中のマイコバクテリウム関連抗原の検出のためのその使用方法を提供することにより、背景技術のこれらの欠点を克服する。抗体または抗体の組み合わせおよび方法は、高精度で病原性マイコバクテリウムと他の細菌種を識別できる。
【００１１】
少なくともいくつかの実施形態では、対象のインビトロ尿試料中のマイコバクテリアに関連する抗原の検出のための抗体が提供され、上記抗原は、ＭａｎＬＡＭ（マンノースキャップ型リポアラビノマンナン）を含み、上記抗体は、上記尿由来の上記ＭａｎＬＡＭ分子に特異的に結合し、上記抗体は、３ｘ１０−８Ｍ以下のＫＤの親和性で上記ＭａｎＬＡＭに結合し、上記抗体は、イノシトールリン酸でキャップされていないまたはキャップされているＬＡＭ分子に、１０−３Ｍ以上のＫＤの親和性で結合する。
【００１２】
任意選択で、ＭａｎＬＡＭは、ＭＴＸキャップ型ＭａｎＬＡＭを含み、マンノシドキャップが５−デオキシ−５−メチルチオ−キシロ部分の結合によりさらに修飾されることを特徴とする。
【００１３】
任意選択で、ＭＴＸキャップ型ＭａｎＬＡＭは、アルファ１−４結合メチルキシロース残基でさらに置換される２つのアルファ１−２−Ｍａｎｐ結合残基を特徴とするＭＴＸ−Ｍａｎ２キャップ型ＭａｎＬＡＭを含む。
【００１４】
任意選択で、抗体は、Ｍａｎｐの特徴を含む上記ＭａｎＬＡＭのエピトープに結合する。
【００１５】
任意選択で、抗体は、グリカン７、グリカン８、グリカン９、グリカン１０、およびグリカン１１からなる群より選択されるモチーフを特徴とする上記ＭａｎＬＡＭのエピトープに結合する。
【００１６】
任意選択で、エピトープは、ＭＴＸ−ジマンノース部分を備えることをさらに特徴とする。
【００１７】
任意選択で、抗体は、対象由来の尿試料を用いて対象中の成長が遅いマイコバクテリアの存在を検出するのに好適である。
【００１８】
任意選択で、抗体は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）またはウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）に関連する抗原を検出するのに好適である。
【００１９】
少なくともいくつかの実施形態では、抗体は、病原性マイコバクテリアに関連する抗原を特異的に検出して、このような細菌に関連するマーカーを他の型の細菌から識別できる。
【００２０】
任意選択で、抗体は、対象の尿中の急速成長マイコバクテリア由来のマーカーと交差反応しない。
【００２１】
任意選択で、抗体は、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム・アブセサス（Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）またはマイコバクテリウム・ケロネー（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）に関連するマーカーと交差反応しない。
【００２２】
任意選択で、抗体は、マイコバクテリウム・ゴルドナエ、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、およびマイコバクテリウム・アビウムからなる群より選択される成長が遅いマイコバクテリアに関連するマーカーに対し少なくとも１０倍低い反応性を示す。
【００２３】
任意選択で、抗体は、非マイコバクテリア細菌種の検出に比べて、上記結核菌またはウシ型結核菌に関連する抗原を少なくとも１５００倍大きな反応性で検出する。
【００２４】
任意選択で、非マイコバクテリウム細菌種は、ゴルドニア・ブロンキアリス（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌｉｓ）、ノカルジア・アステロイデス菌種（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ツカムレラ・パウロメタボルム（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ  ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌｕｍ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、コリネバクテリウム・ウレアリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、腐性ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、プロテウス・ミラビリス  （Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、エンテロコッカス・フィカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、またはトラコーマ病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の１種または複数を含む。
【００２５】
少なくともいくつかの実施形態では、抗体は、好ましくはイムノアッセイで使用される、複数の抗体または抗体の組み合わせを含み得る。より好ましくは、イムノアッセイはサンドイッチイムノアッセイであり、１個の抗体が抗原を「捕捉」し、一方、第２の抗体が、捕捉された抗体の存在を検出する。各抗体は、抗原上の異なるエピトープに結合して、抗原からの相互の競合を回避する。検出抗体は、抗原に対し、捕捉抗体より低い親和性を有し得る。
【００２６】
少なくともいくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、抗原検出のためのサンドイッチイムノアッセイにおいて捕捉抗体としての使用に適する。
【００２７】
任意選択で、抗体は、抗原検出のためのサンドイッチイムノアッセイにおいて検出抗体としての使用に適する。
【００２８】
少なくともいくつかの実施形態では、対象中の病原性マイコバクテリアの存在を差次的に検出するための方法が提供され、方法は、上記請求項のいずれか１項に記載の抗体を対象の尿と接触させること；尿中の上記抗原に対する抗体の結合を検出すること；上記抗体が３ｘ１０−８Ｍ以下のＫＤの親和性で尿中の上記抗原に特異的に結合する場合には、上記ＭａｎＬＡＭ分子を特徴とする上記病原性マイコバクテリアが対象の身体中に存在すると決定することを含む。
【００２９】
任意選択で、抗体は、非病原性マイコバクテリアの抗原に対する場合よりも少なくとも３倍大きいシグナルで尿中の上記病原性マイコバクテリアの抗原に結合する。
【００３０】
任意選択で、方法は、第１の抗体を尿に適用して上記抗原に結合させること、および第２の抗体を尿に適用して、第２の抗原に結合させることをさらに含み、上記第１の抗体は、上記請求項のいずれか１項の記載を特徴とし、上記第２の抗体は、第１の抗体と同じ抗原には結合せず、第１と第２の抗原は、上記ＭａｎＬＡＭ分子を含み、上記第１と第２の抗体の片方は捕捉抗体であり、上記第１と第２の抗体のもう一方はイムノアッセイにおける検出抗体である。
【００３１】
任意選択で、第２の抗体は、３ｘ１０−５Ｍ以下のＫＤの親和性での上記ＭａｎＬＡＭ分子のポリアラビノース構造体への結合を特徴とする。
【００３２】
任意選択で、抗体は、ａｒａ４および／またはａｒａ６に特異的に結合する。
【００３３】
任意選択で、方法は、尿をＭｏＡｂ１、１３Ｈ３、２７Ｄ２およびＡ１９４−０１抗体からなる群より選択される抗体と接触させることをさらに含む。ＭｏＡｂ１抗体は、米国特許第９５１２２０６号に記載されている。この特許は、本明細書で完全に記載されるかのように、特許請求の範囲を裏付けるのに必要な程度に、参照により組み込まれる。Ａ１９４−０１抗体は、米国特許出願公開第２０１７０１６０５８号に記載されている。この特許は、本明細書で完全に記載されるかのように、特許請求の範囲を裏付けるのに必要な程度に、参照により組み込まれる。
【００３４】
任意選択で、方法は、サンドイッチイムノアッセイにおいて、尿をＭｏＡｂ１、１３Ｈ３、２７Ｄ２またはＡ１９４−１抗体の内の複数の組み合わせと接触させることをさらに含む。
【００３５】
任意選択で、方法は、サンドイッチイムノアッセイにおいて、尿をＭｏＡｂ１およびＡ１９４−１抗体の組み合わせと接触させることをさらに含む。
【００３６】
任意選択で、方法は、ＭｏＡｂ１抗体を好適な第２の抗体と共に試料に適用して、対象の分類のための好適な参照標準診断を用いて結核でない対象由来の試料に比較して結核に罹患している対象由来の試料の中央値シグナル間で、３倍またはそれより大きい倍率変化を達成することをさらに含む。
【００３７】
任意選択で、参照標準診断は、対象を分類するために、マイコバクテリア培養法またはＰＣＲベース法を基準にする。
【００３８】
任意選択で、方法は、ＭｏＡｂ１抗体を試料に適用して、好適な比較標準アッセイを用いて、結核でない対象由来の試料に比較して、結核に罹患している少なくとも２０％多い対象を検出することをさらに含み、上記好適な比較標準アッセイは、アリーアＬＦ−ＬＡＭを含む。
【００３９】
任意選択で、結核でない対象由来の尿試料中の検出されるＭａｎＬＡＭ抗原特異的サンドイッチイムノアッセイシグナルは、集団中の少なくとも７０％の試料に対し、１１ｐｇＭａｎＬＡＭ／ｍｌ未満である。
【００４０】
任意選択で、シグナルは、集団中の少なくとも８０％の試料に対し、検出限界より小さい。
【００４１】
任意選択で、シグナルは、集団中の少なくとも９０％の試料に対し、検出限界より小さい。
【００４２】
任意選択で、シグナルは、集団中の少なくとも９５％の試料に対し、検出限界より小さい。
【００４３】
任意選択で、シグナルは、集団中の少なくとも９７％の試料に対し、検出限界より小さい。
【００４４】
任意選択で、結核の対象由来の尿試料中の検出されるＭａｎＬＡＭ抗原特異的サンドイッチイムノアッセイシグナルは、集団中の少なくとも４０％の試料に対し、１１ｐｇＭａｎＬＡＭ／ｍｌを超える。
【００４５】
任意選択で、シグナルは、集団中の少なくとも５０％の試料に対し、検出限界より大きい。
【００４６】
任意選択で、シグナルは、集団中の少なくとも６０％の試料に対し、検出限界より大きい。
【００４７】
任意選択で、シグナルは、集団中の少なくとも７５％の試料に対し、検出限界より大きい。
【００４８】
任意選択で、シグナルは、集団中の少なくとも９０％の試料に対し、検出限界より大きい。
【００４９】
任意選択で、方法は、ＨＩＶウイルスの非存在下で対象中のＴＢ病原性マイコバクテリアを検出することをさらに含む。
【００５０】
任意選択で、結核を罹患している対象対結核のない対照の二項診断分類に対する、上記抗体の上記抗原への結合に基づくイムノアッセイのＡＵＣ（曲線下面積）は、少なくとも０．７０である。
【００５１】
任意選択で、ＡＵＣは少なくとも０．８０である。
【００５２】
任意選択で、ＡＵＣは少なくとも０．８５である。
【００５３】
任意選択で、ＡＵＣは少なくとも０．９０である。
【００５４】
任意選択で、ＡＵＣは少なくとも０．９５である。
【００５５】
任意選択で、ＡＵＣは少なくとも０．９８である。
【００５６】
任意選択で、方法は、ＭｏＡｂ１抗体または１３Ｈ３抗体の第１の抗体としての組み合わせ、およびＡ１９４−０１抗体または２７Ｄ２抗体の第２の抗体としての組み合わせを適用して、イムノアッセイにおいて対象由来のインビトロ尿試料中のマイコバクテリアに関連する抗原を検出することをさらに含み、このイムノアッセイでは、第１と第２の抗体の片方は、捕捉抗体であり、第１と第２の抗体のもう一方は、検出抗体である。
【００５７】
任意選択で、検出は、イムノアッセイを用いて実施され、組み合わせは、アリーアＬＦ−ＬＡＭ検査より、少なくとも２０％高い臨床的感度を有する。
【００５８】
任意選択で、方法は、対象の身体中の上記病原性マイコバクテリアの存在に従って結核の対象を診断することをさらに含む。
【００５９】
任意選択で、診断は、対象中の活動性結核感染の存在を検出することをさらに含む。
【００６０】
任意選択で、方法は、上記病原性マイコバクテリアの存在に従って結核に対する対象の治療の有効性をモニターすることをさらに含む。
【００６１】
任意選択で、方法は、臨床的感度をさらに高めるために、イムノアッセイでの検出の前に、試料中のＭａｎＬＡＭを含む上記抗原を濃縮することをさらに含む。
【００６２】
任意選択で、上記抗原の濃縮は、磁気ビーズまたは限外濾過を試料に適用することを含む。
【００６３】
任意選択で、方法は、対象中の病原性マイコバクテリアの存在と、対象中の非病原性マイコバクテリアの存在を鑑別することをさらに含む。
【００６４】
任意選択で、方法は、対象の環境由来の混入細菌の存在下で、対象中の病原性マイコバクテリアの存在を特異的に検出することをさらに含む。
【００６５】
任意選択で、混入細菌は、ゴルドニア・ブロンキアリス（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌｉｓ）、ノカルジア・アステロイデス菌種（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ツカムレラ・パウロメタボルム（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ  ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌｕｍ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、コリネバクテリウム・ウレアリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、腐性ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、プロテウス・ミラビリス  （Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、エンテロコッカス・フィカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、トラコーマ病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、または非結核性抗酸菌（Ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の１種または複数を含む。
【００６６】
任意選択で、方法は、上記抗体と接触させる前に、尿を加熱することをさらに含む。
【００６７】
少なくともいくつかの実施形態では、対象のＨＩＶ状態は、対象が病原性マイコバクテリアに感染しているかどうかを決定する抗体の組み合わせおよび方法の能力に対し、大きな影響を与えない。リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）を含む抗原は、ＨＩＶ陽性およびＨＩＶ陰性結核（ＴＢ）対象の尿中で検出可能である。
【００６８】
単に例示を目的として、以降で添付の図面を参照しながら本発明を説明する。ここで、詳細な図面への具体的言及と共に、示された詳細事項は、一例として本発明の好ましい実施形態の説明を記述することのみを目的とするものであり、本発明の原理と概念的側面の最も有用で容易に理解される説明であると考えられる内容を提供するために呈示されていることが強調される。その際、本発明の基本的理解に必要である以上に詳細には本発明の構造的詳細を示す試みは行わなかったが、図で行われた説明により、本発明のいくつかの形態を実際に実施し得る方法が当業者に明らかにされている。図面は次の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、ＬＡＭを検出する抗体対を特定するための選別結果を示す。（Ａ）スクリーニングおよび測定のために使用されるサンドイッチイムノアッセイの模式図。（Ｂ）捕捉（行）および検出（列）抗体のそれぞれの対での組み合わせの、１０ｎｇ／ｍＬの培養Ｍｔｂ由来の精製ＬＡＭ（左ヒートマップ）およびＴＢ陽性、ＨＩＶ陽性個体由来の尿中のＬＡＭ（右ヒートマップ）を検出する能力を示す。ヒートマップは、シグナル対ブランク（Ｓ／Ｂ）比を示す。尿中ＬＡＭヒートマップ中の値は、２人の個体由来の尿試料に対する最大値を表す。抗体名は、グリカンアレイへの結合により決定された、それらが標的とするＬＡＭエピトープを基準に色分けされており、エピトープは、捕捉抗体名の隣に列記されている（エピトープマッピング結果の詳細については、図２Ｂおよび図７を参照）。精製ＬＡＭおよびＴＢ陽性、ＨＩＶ陽性個体由来の尿中のＬＡＭと高い反応性を示す抗体の組み合わせは、赤色ボックスで示されている。（Ｃ）ヒートマップ中に列挙された種々のエピトープを示すＬＡＭの模式図である。図１Ｄ〜１Ｅは、抗体エピトープマッピングに使用した６１種のオリゴ糖構造体の構造を示す。選択オリゴ糖（Ｇｌｙ１６、Ｇｌｙ２２、およびＧｌｙ４４）は、さらに、ウサギモノクローナル抗体の開発に使用された。凡例は、図１Ｆに示されている。
【図２】図２Ａは、捕捉抗体としてのＭｏＡｂ１を検出抗体としてのＡ１９４−０１と組み合わせた、最高性能の抗ＬＡＭ抗体に対する、ＬＡＭ濃度の関数としてのイムノアッセイシグナルを示す。点は、ブランク試料（ｎ＝１０）および７種のレベルのＬＡＭ（ｎ＝４／レベル）を試験した場合の、測定イムノアッセイシグナルを示す。実線は、データに対する４ＰＬフィットを示す。破線は、１．３７５のＳ／Ｂ比および両対に対するフィッティング曲線から計算した関連ＬＡＭ検出限界（ＬＯＤ）を与えるシグナルを示す。図２Ｂは、グリカンアレイを用いたエピトープマッピングの結果を示す。オリゴ糖構造体を選択するための、０．０３９μｇ／ｍＬの濃度でのモノクローナル抗体の反応性。暗緑色領域は、強力結合を表し、白色領域は、結合がないか、または低い結合を表す。図は、少なくとも１種の抗体に対しバックグラウンドを超える反応性が示された、全てのグリカンを含む。列１中の命名は、図１Ｄ〜１Ｅによる。
【図３】図３Ａは、Ａ１９４−０１検出抗体と対にした５種の捕捉抗体に対し、全ての試験した尿試料（表の列）の測定ＬＡＭ濃度を示すヒートマップである。試料は、ドナーのＴＢおよびＨＩＶ状態によりグループ分けされる。表の最下段の行は、比較のための、各試料のアリーアＬＦ−ＬＡＭ試験グレードを示す（陽性アリーアＬＦ−ＬＡＭ試験結果の試料のみを色付けしている）。（Ｂ）図３ＡのＭｏＡｂ１捕捉抗体／Ａ１９４−０１検出抗体対を用いたサンドイッチイムノアッセイの結果を、散布図形式で再プロットする。このプロットは、各尿試料に対して測定したシグナル対ブランク（Ｓ／Ｂ）比（左軸）およびＬＡＭ濃度（右軸）を、ドナーのＴＢおよびＨＩＶ状態の関数として示す。オレンジ色の点線は、アッセイ閾値（Ｓ／Ｂ＝１．３７５）を示す。濃度値は、アッセイ閾値を超える点についてのみ意味がある。点は、同じ試料のアリーアＬＦ−ＬＡＭ試験の結果により着色される。検出抗体としてのＡ１９４−０１と組み合わせた他の３種の捕捉抗体の散布図は、図３Ｃで見つけることができる。図３Ｃは、各尿試料に対して測定したシグナル対ブランク（Ｓ／Ｂ）比（左軸）およびＬＡＭ濃度（右軸）を、ドナーのＴＢおよびＨＩＶ状態の関数として示す。各プロットは、Ａ１９４−０１検出抗体と対をなす捕捉抗体パネル中の３種の捕捉抗体の１種に対する結果を示す。オレンジ色の点線は、アッセイ閾値（Ｓ／Ｂ＝１．３７５）を示す。濃度値は、アッセイ閾値を超える点についてのみ意味がある。点は、同じ試料のアリーアＬＦ−ＬＡＭ試験の結果により着色される。
【図４】ＭｏＡｂ１捕捉抗体／Ａ１９４−０１検出抗体の組み合わせを用いた、ＴＢ＋ＨＩＶ＋患者由来の４組の尿試料に対する測定ＬＡＭ濃度のプロットを示す。右バーは、試料が前処理無しで試験された場合の測定濃度であった。暗色バーは、試料が試験前に熱処理（８５℃で１０分間）された場合の結果を示す。
【図５】図５ＡおよびＢは、（ｂ）ＨＩＶ状態およびＣＤ４カウント（μＬ当たりの細胞数）および（Ｃ）アリーアＬＦ−ＬＡＭ試験として分けて示した、ＴＢ＋対象のアッセイシグナルを示す。アスタリスクは、最も左の条件からの有意差を示した（マン・ホイットニー検定、ｐ＜０．０５）。
【図６】プロットは、Ａ１９４−０１検出抗体と対をなす各候補捕捉抗体に対して観察された臨床的感度および特異性を示す（９５％信頼区間と共に）。このプロットはまた、２つの異なる使用症例シナリオ：（ｉ）ＴＢの確定検出／診断（紫色の記号）または（ｉｉ）ＴＢのためのさらなる確証試験を受けるべき患者を特定するための優先順位づけ（緑色の記号）、に対して使用されるＰＯＣ  ＴＢ試験のための目標製品プロファイル（ＴＰＰ）要件資料中でＷＨＯにより設定された、最小（三角形）および最適（菱形）標的感度および特異性要件を示す。アッセイの性能を表すマーカーは理想的には、使用症例に対するに要件を表すマーカーの上側で、かつ左側になるはずである（関心領域が強調される）。９５％ウィルソンの信頼区間が示される。
【図７】グリカンアレイを用いたエピトープマッピングの結果を示す。６種の異なる抗体濃度のモノクローナル抗体の、図１Ｄ〜１Ｆ由来の全６１種の構造体ならびに３つのネガティブコントロールスポット（ＢＳＡ２回、および緩衝液）および１つのポジティブコントロールスポット（ＬＳ）に対する反応性を示す。
【図８】微生物学的および複合参照基準に対する試験下の抗体とアリーアＬＦ−ＬＡＭの間の感度および特異性のフォレストプロットならびに差異を示す。（Ａ）分析のために２変量ランダム効果モデルを用いて合算した全コホート、（Ｂ）別々に３つのコホートについて、および（Ｃ）３つのＣＤ４層中の２変量ランダム効果モデルを用いた統合解析について。＊２変量ランダム効果を用いる解析に基づく感度および特異性推定値は、アスタリスクで示される。ＭＲＳは微生物学的参照基準、ＣＲＳは複合参照基準、ΔＳｎは感度差異、ΔＳｐは特異性差異、ＨＩＶはヒト免疫不全ウイルス、およびＣＩは信頼区間を意味する。
【図９】ベン図。（Ａ）全ての微生物学的に確証されたＴＢ診断法（ｎ＝１４１）、および（Ｂ）ＣＤ４≦１００細胞／μｌ（ｎ＝７４）の患者において微生物学的に確認されたＴＢ診断法の比率。これは、コホート２について入院の２４時間以内に得られた試料に対して、尿試験下の抗体測定、尿アリーアＬＦ−ＬＡＭ、尿Ｘｐｅｒｔ、喀痰Ｘｐｅｒｔまたは喀痰スメア顕微鏡試験を個別に実施することにより、作製され得る。ベン図の下の表は、試験方法毎の診断収率を示す。「上記方法で見逃されたＴＢ症例」は、患者入院中にいずれかの時点で収集されたいずれかの試験体に対する陽性マイコバクテリア培養により作製されたもの、および／または最初の２４時間後に収集されたいずれかの試験体に対するＸｐｅｒｔ試験に基づいて行われた診断を含む。ベン図内に挿入された数値は、所与のアッセイ（単一または複数）により診断されたＴＢ症例の数を表す。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
（少なくともいくつかの実施形態の記述）
対象の尿中の病原性マイコバクテリアに関連する抗原の検出のためのＬＡＭアッセイは、極めて望ましく、なぜならこのような試験は、難易度の高い医学的、臨床的条件下であっても安価で、実施が容易であるからである。本発明は、少なくともいくつかの実施形態では、種々のＬＡＭエピトープを標的とする抗体を用いるＬＡＭのための高感度イムノアッセイを提供するための、改善されたアッセイ試薬および方法に関する。
【００７１】
種々の手法を用いて開発され、かつ種々のＬＡＭモチーフを標的とする、全体で８種のＬＡＭ用の候補抗体を、評価した。これらの抗体を、サンドイッチフォーマットでＬＡＭに対する最良の分析感度をもたらす抗体対を特定するためにスクリーニングした。最良の候補対を次いで、一次診療施設でＴＢの臨床症状を示すＨＩＶ＋およびＨＩＶ−の成人由来の７５種の尿試料のレトロスペクティブ症例対照研究において評価した。候補対の交差反応性も、非ＴＢ細菌と微生物の可能な干渉について評価した。
【００７２】
何らかの限定を受けることを望むものではないが、本発明の一態様は、全試料セットを通して、イムノアッセイフォーマットで、優れた感度［９３％（ＣＩ：８０％〜９７％）］および特異性［９７％（ＣＩ：８５％〜１００％）］を示した抗体対に関する（図５）。重要なことに、アッセイは、分析をＨＩＶ−対象に限定した場合でも、高感度［８０％（ＣＩ：５５％〜９３％）］を示した。対照的に、ＬＡＭに対する市販のアリーアＬＦ−ＬＡＭストリップ検査は、全体感度３３％（ＣＩ：２０％〜４８％）およびＨＩＶ−亜集団に対してわずか１３％（ＣＩ：４％〜３８％）の感度を示した。選択対は、メチルチオ−ｄ−キシロース（ＭＴＸ）構造を標的とする捕捉抗体を使用した。これは、ＴＢを引き起こすマイコバクテリア由来のＬＡＭに比較的特異的であり、交差反応性は、急成長マイコバクテリアまたはＬＡＭ産生非マイコバクテリア放線菌類、その他の一般的尿路感染症または潜在的交差反応細に対し観察されなかった（表２Ａ）。別のＴＢ特異性の小さい捕捉抗体はより高い分析感度を与えたが、臨床的特異性は劣ったので、この特異性は重要であるように見える。
【００７３】
実施例１−尿中の病原性マイコバクテリアに関連する抗原の検出のためのＬＡＭベースアッセイ
この実施例は、病原性マイコバクテリアに関連する尿中の１種または複数の抗原の検出のためのＬＡＭベースアッセイの実例に関する。
【００７４】
材料および方法
抗体およびコントロール材料
Ｍｔｂ株Ａｏｙａｍａ−Ｂ由来の精製ＬＡＭを、Ｎａｃａｌａｉ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）から得た。スメグマ菌由来のホスホイノシトールキャップ型ＬＡＭ（ＰＩＬＡＭ）ならびにＭｔｂおよびウシ型結核菌の不活性全細胞ライセートを、Ｂｉｏｄｅｆｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＢＥＩ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＵＳＡ）から得た。交差反応性試験のために、多くの異なる細菌および真菌株の生ホールセルストックを、凍結乾燥細胞またはグリセロール中の凍結細胞懸濁液のバイアルとしてＡＴＣＣから得た。凍結乾燥細胞を、０．５ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に懸濁した。その後、ストック細胞懸濁液を同じ緩衝液中で系列希釈して、試験試料を生成した。
【００７５】
多くの既存のモノクローナルおよびポリクローナル抗ＬＡＭ抗体を、Ｄｒ．Ａｂｅ  Ｐｉｎｔｅｒ／Ｒｕｔｇｅｒｓ（Ａ１９４−０１）を含む共同研究の大学および民間のグループから快く提供を受けた（Ｃｈｏｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１８；Ｋａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２；米国特許出願公開第２０１７０１６０５８号）。市販の抗ＬＡＭウサギポリクローナル抗体（Ｖｉｒｏ  Ｐｏｌｙ）を、Ｖｉｒｏｓｔａｔ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ＵＳＡ）から購入した。
【００７６】
ＭｏＡｂ１、ＭｏＡｂ２、ＭｏＡｂ３は、ＢＣＧで免疫し、ＭａｎＬＡＭに対しパニングしたニワトリ（ＭｏＡｂ２）およびウサギ（ＭｏＡｂ１およびＭｏＡｂ３）から生成したｓｃＦｖライブラリーのファージディスプレイにより大塚製薬で単離された組換え抗体である（米国特許第９５１２２０６号）。可変領域配列を合成し、それらを標準的ＩｇＧ１ベクターに挿入し、プラスミドをＥｘｐｉ２９３細胞に遺伝子導入することにより、これらの抗体を発現させた。
【００７７】
加えて、２つの組換えウサギモノクローナル抗体（１３Ｈ３および２７Ｄ２）およびウサギポリクローナル抗体（Ｉｍｍ  Ｐｏｌｙ）を、新しく産生した。モノクローナル抗体を、ウシ血清アルブミン（Ｄｒ．Ｔｏｄｄ  Ｌｏｗａｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌｂｅｒｔａにより提供された）に結合した合成ＬＡＭオリゴ糖フラグメントを免疫原として用いて生成した。手短に説明すると、ウサギを６５μｇのＢＳＡ−Ａｒａ６（ＩＤ４４）、６５μｇのＢＳＡ−Ａｒａ７（ＩＤ１６）および６５μｇのＢＳＡ−Ａｒａ２２（ＩＤ２２）で免役し、７日目と１４日目に同じ混合物で追加免役した（オリゴ糖構造の記載については図１Ｄ参照）。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を２８日目に収集し、９６ウェルプレートで培養した。上清を、ＬＡＭに対する結合およびＢＳＡに対する低交差反応性について間接ＥＬＩＳＡにより試験した。所望の活性を有するウェル由来の抗体遺伝子を、クローニングし、ＨＥＫ２９３細胞中で発現させ、間接ＥＬＩＳＡで試験して、精製ＬＡＭおよび熱殺菌したＭｔｂ  Ｈ３７Ｒａに対する最大の反応性を有する抗体（１３Ｈ３および２７Ｄ２）を特定した。ポリクローナル抗体（Ｉｍｍ  Ｐｏｌｙ）を、ウサギを２５０μｇの精製ＬＡＭ、２００μｇの熱殺菌Ｍｔｂ  Ｈ３７Ｒａおよびフロイント不完全アジュバント（ＩＣＦＡ）の混合物で免疫し２８、４７および６７日目に同じ免疫原で追加免役することにより、産生した。７６日目に収集した血清を、プロテインＡカラムによる親和性クロマトグラフィーにより精製した。
【００７８】
１３Ｈ３は、次の翻訳可変領域配列を有する：
１３Ｈ３重鎖（下線の配列は、定常領域の開始を示す）：
ＭＥＴＧＬＲＷＬＬＬＶＡＶＬＫＧＶＱＣＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＡＳＧＳＤＩＦＴＹＹＭＮＷＶＲＱＡＲＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＮＴＧＧＳＡＷＹＳＳＷＡＫＧＲＦＴＩＳＲＴＳＴＴＶＴＬＫＭＴＳＰＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＡＩＧＧＧＡＡＧＧＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＯＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰ
１３Ｈ３カッパ鎖（下線の配列は、定常領域の開始を示す）：
ＭＤＴＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＴＦＡＩＶＭＴＱＴＰＳＳＫＳＶＰＶＧＤＴＶＴＩＮＣＱＡＳＥＳＶＡＮＮＮＤＬＡＷＹＱＱＫＰＧＨＳＰＫＬＬＩＹＦＡＳＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＦＧＴＱＦＴＬＴＩＳＧＡＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＴＧＹＫＧＦＮＴＤＧＭＡＦＧＧＧＴＥＶＷＫＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡ
【００７９】
２７Ｄ２は、次の翻訳可変領域配列を有する：１１Ｈ３／１１Ｋ２
２７Ｄ２重鎖（下線の配列は、定常領域の開始を示す）：
ＭＥＴＧＬＲＷＬＬＬＶＡＶＬＫＧＶＱＣＱＳＶＥＥＦＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＲＫＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＩＩＴＤＳＧＳＴＹＹＡＳＷＶＮＧＲＦＴＩＳＫＴＳＴＴＶＴＬＫＩＴＳＰＳＴＥＤＴＡＴＹＦＣＧＫＤＤＹＩＹＧＤＬＷＧＳＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰ
２７Ｄ２カッパ鎖（下線の配列は、定常領域の開始を示す）：
ＭＤＴＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＴＦＡＱＶＬＴＱＴＰＡＳＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＳＣＱＳＳＱＳＶＹＮＮＮＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＬＫＱＬＩＹＡＡＳＳＬＡＳＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＤＬＥＣＤＤＡＡＴＹＹＣＱＧＧＹＴＴＨＡＲＡＦＧＧＧＴＥＶＷＫＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡ
【００８０】
全ての抗体を、それらの結合部位により認識されるオリゴ糖エピトープを特定するために分析した。エピトープ特定を、（Ｃｈｏｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１８）に記載の一連の多様な６１種のオリゴ糖構造を示すグリカンアレイに対する抗体の結合を測定することにより実施した。一連の構造を、図１Ｄ〜１Ｆに示す。手短に説明すると、オリゴ糖フラグメントを、以前記載したように（Ｇａｄｉｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．２００３；Ｊｏｅ  ｅｔ  ａｌ．２００６；Ｊｏｅ  ｅｔ  ａｌ．２００７；Ｓａｈｌｏｕｌ  ＆  Ｌｏｗａｒｙ  ２０１５）合成し、ＢＳＡに結合させ、マイクロアレイを生成するために使用した。段階希釈した抗体を、スライド上で、３７℃で３０分間インキュベートし、洗浄後、蛍光標識二次抗種抗体で４０分間染色した。蛍光シグナルを、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂスキャナー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＵＳＡ）を用いて測定し、各スポットの強度を、ＰｒｏＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ６．１を用いて定量化した。
【００８１】
ＬＡＭイムノアッセイ
多重化サンドイッチイムノアッセイフォーマット（図１Ａ）および電気化学発光（ＥＣＬ）検出を用いたＬＡＭのイムノアッセイを、市販の計測装置とＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ．（ＭＳＤ）のマルチウェルプレート消耗品を使って実施した（Ｄｅｂａｄ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。アッセイを、ＭＳＤ  Ｕ−ＰＬＥＸ（登録商標）の９６ウェルプレートで実施した。プレートの各ウェルの底部には、一体型のスクリーン印刷カーボンインク電極上に固定された結合試薬の１０プレックスアレイが存在する。１０種の結合試薬はそれぞれ、一連の１０個の自社開発のリンカーの１個に結合する。Ｕ−ＰＬＥＸアッセイでは、異なる捕捉試薬を異なるリンカーに結合する。プレート中の捕捉試薬のアレイを、捕捉抗体−リンカー複合体の混合物をウェルに添加し、リンカーにそれらの相補的なアレイ要素（または「スポット」）上に自己集合させることにより、必要に応じ形成する。抗ＬＡＭ抗体のアレイを用いて、単一多重測定における複数の捕捉抗体の性能を比較した。
【００８２】
抗体を、Ｕ−ＰＬＥＸ添付文書中の手順によるアッセイで使用するために作製した。捕捉試薬を、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でビオチン化し、ビオチン−ストレプトアビジン結合を介してＵ−ＰＬＥＸリンカー結合した。検出抗体を、ＭＳＤスルホ−タグ（商標）ＥＣＬ標識で標識した。捕捉抗体アレイを作製するために、最大１０個の抗体−リンカー複合体を、Ｕ−ＰＬＥＸ  Ｓｔｏｐ  Ｂｕｆｆｅｒ中で、抗体当たり２．９μｇ／ｍＬの濃度で混合し、５０μＬのこの混合物を、Ｕ−ＰＬＥＸプレートの各ウェルに加えた。プレートを、振盪を加えながら１時間インキュベートして、抗体アレイを形成させ、その後、洗浄した。プレートを直ぐに使用するか、または必要になるまで乾燥ポーチに入れて４℃で貯蔵した。
【００８３】
特に指示がない限り、アッセイは、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）または他の非特異的抗体結合からの非特異的シグナルを防ぐためにブロッキング成分を含むＭＳＤの市販の希釈剤を用いて、次のプロトコルに従って実施した。捕捉抗体アレイを、上述のようにＵ−ＰＬＥＸプレート中で予備形成した。ＭＳＤ希釈剤２２（２５μＬ）を、Ｕ−ＰＬＥＸプレートの各ウェル中で２５μＬの試料と混合し、混合物を、浸透しながら室温で１時間インキュベートして、試料中のＬＡＭをウェル中の捕捉抗体アレイに結合させた。非結合試料を除去するためにウェルを洗浄後、２μｇ／ｍＬのスルホ−タグ標識検出抗体（カゼインを補充したＭＳＤ希釈剤３中の）の２５μＬを加え、追加の１時間にわたり、震盪しながらインキュベートし、イムノアッセイサンドイッチを完成した。非結合検出抗体を除去するためにウェルを洗浄後、ウェルを、１５０ｕＬの２ｘＭＳＤリードバッファＴ細胞で満たし、ＥＣＬを、ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｓ６００ＥＣＬプレートリーダーで測定した。プレートリーダーは、ＭＳＤプレート中の電極に電圧を加えて、結合検出抗体からのＥＣＬを誘導し、冷却ＣＣＤカメラを用いて、各アレイスポットからの発光を定量化する（Ｄｅｂａｄ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。抗体対のスクリーニングの間、捕捉抗体と検出抗体Ａ１９４−０１、２７Ｄ２、１３Ｈ３、ＭｏＡｂ１、ＭｏＡｂ２、ＭｏＡｂ３、Ｉｍｍ  Ｐｏｌｙ、Ｖｉｒｏ  Ｐｏｌｙの全ての可能な組み合わせを、ＭｔＢ培養由来の精製ＬＡＭおよびＴＢ＋／ＨＩＶ＋個体由来の尿を用いて評価した（図１Ｂ）。より詳細なアッセイ評価を、捕捉抗体（ＭｏＡｂ１、１３Ｈ３、２７Ｄ２、ＭｏＡｂ３）およびＡ１９４−０１または２７Ｄ２検出抗体のアレイを組み合わせた特殊なパネルで実施した（図３Ａ）。
【００８４】
ＬＡＭ定量化
ＬＡＭ濃度を計算するために、精製ＬＡＭ（ＭＳＤ希釈剤１００中で希釈）を用いて８点較正曲線を各アッセイプレート中で二重に実施した。ＥＣＬシグナルのＬＡＭ濃度に対する関連性を４−パラメーターロジステック（４−ＰＬ）関数にフィッティングした。試験試料のＬＡＭ濃度を、ＥＣＬシグナルを４−ＰＬフィッティングにバックフィッティングすることにより計算した。代表的較正曲線を、図２Ａに示す。
【００８５】
尿試料作製
全ての抗ＬＡＭ抗体を不活化するために、試料を、分析の前に８５℃で１０分間の熱処理により前処理した。
【００８６】
試料収集および診断検査
このレトロスペクティブ症例対照試験のために、合計７５個の尿試料をＦＩＮＤ（Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）バイオバンクから選択した。これらの試料は、バングラデシュ（ｎ＝５）、ペルー（ｎ＝１９）、南アフリカ（ｎ＝１５）およびベトナム（ｎ＝３６）の一次診療施設にて試料収集時点でＴＢの臨床症状を示しているが、ＴＢ治療を受けていない、成人由来の試験で以前に収集された。患者登録の前に、施設内倫理委員会により承認され、患者インフォームドコンセントを得たが、個人を特定できる情報は、ＦＩＮＤまたは研究者に利用可能でなかった。
【００８７】
ＦＩＮＤは、試料の収集および処理用に規格化されたプロトコルを使用する。手短に説明すると、尿を、患者との最初の接触時に収集し、同日に処理して一定分量を分割採取し、凍結（−８０℃）した（通常４時間以内）。ＷＨＯにより事前に選定されたＩＶＤを、ＨＩＶ血清学的試験およびＣＤ４カウントに使用した。患者分類で使用するために、喀痰試料（通常、最初の２４時間で２回）も全参加者について同様に収集し、混入物を除去し、液体培養（ＭＧＩＴ，ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＵＳＡ）および固体培養（Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ−Ｊｅｎｓｅｎ  ｍｅｄｉａ）を用いて最大で６回培養した。培養物中のＭｔｂ錯体の存在を、Ｚｉｅｈｌ−Ｎｅｅｌｓｏｎ  ｏｒ  Ａｕｒａｍｉｎｅ−Ｏ蛍光顕微鏡により確認し、迅速種決定アッセイ（Ｃａｐｉｌｉａ  ＴＢ  ｔｅｓｔ，ＴＡＵＮＳ，Ｊａｐａｎ、のような）または分子法を用いて、抗酸性桿菌、ＭＰＴ６４抗原検出を確認した。
【００８８】
患者の分類および複合参照基準
患者を、別に記載のように（Ｂｒｏｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）、臨床的および検査所見に基づき複合参照基準を用いて分類した。ＴＢ陽性（ＴＢ＋）は、少なくとも１つの陽性培養物を有する患者であった。全てのＴＢ＋患者は、陽性顕微鏡結果を有した。全ての喀痰試料でスメア陰性および４つ以上の培養物陰性であった参加者、および結核治療なしに症状回復および２ヶ月追跡調査来診で陰性喀痰培養物結果を示した参加者を、ＴＢ−に分類した。被験者を、ＨＩＶ迅速検査でＨＩＶ＋またはＨＩＶ−としてさらに分類した（表３Ａ、下記参照）。
【００８９】
ＬＡＭの迅速検査
尿試料を、製造業者の説明書に従って実施されるアリーアＬＦ−ＬＡＭ検査を用いて試験した。ストリップを３人の異なる技術者により独立に読み取り、技術者たちは製造業者により提供された参照カードと試験ラインの強度を比較し、結果を等級分類した。文書化のために、全てのストリップをスキャンした。
【００９０】
結果
抗体生成および選択
サンドイッチイムノアッセイでの使用におそらく有用な抗体対を特定するために、既存の抗体ライブラリーを、全ての可能な捕捉および検出抗体対の組み合わせで試験した（Ａ１９４−０１、２７Ｄ２、１３Ｈ３、ＭｏＡｂ１、ＭｏＡｂ２、ＭｏＡｂ３、Ｉｍｍ  Ｐｏｌｙ、Ｖｉｒｏ  Ｐｏｌｙ）。その後、各対を試験して、ブランク試料に対するそのバックグラウンドシグナル、培養したＭｔｂ由来の精製ＬＡＭに対するその特異的シグナル、および高レベルのＬＡＭを含むと知られる（アリーアＬＦ−ＬＡＭ検査での陽性に基づいて）２人のＴＢ陽性ＨＩＶ陽性ヒト被験者由来の尿中ＬＡＭに対するその特異的シグナルを評価した。試料を保存するために、各検査ウェルは、捕捉抗体のアレイを有したが、単一検出抗体を用いて発色させた。このマルチプレクシング手法は、単一ウェルで最大１０対の捕捉および検出抗体を同時に評価することを可能にした。
【００９１】
図１Ｂは、各抗体対で得られたシグナル対ブランク（Ｓ／Ｂ）の比を示すヒートマップである。図はまた、グリカンアレイを用いて特徴付けされる、異なるＬＡＭエピトープ（図１Ｃ）に対する特異性に基づいて、抗体をグループ分けおよび色分けする（（Ｃｈｏｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１８）および図２Ｂ）。多くの抗体対は、精製ＬＡＭに対し高い反応性を示したが、尿中ＬＡＭの検出では比較的劣っていた。特に、２種の抗体（Ａ１９４−０１および２７Ｄ２）のみが、尿中のＬＡＭの検出用の検出抗体として有用であった。Ａ１９４−０１抗体は、２種の内でより感度が高く、患者尿中で２〜５倍高いシグナルを生成した。これらの抗体の両方は、ＬＡＭのアラビナンドメイン中の直鎖テトラアラビノシド（Ａｒａ４）または分岐部ヘキサアラビノシド（Ａｒａ６）構造を標的とする。２７Ｄ２のＡｒａ６に対する特異性は、所定のＬＡＭエピトープに対する特異性を有する抗体の開発のための免疫原としての、ＢＳＡに結合された合成ＬＡＭグリカンフラグメントの有用性を立証した。驚くべきことに、１種の抗体（ＭｏＡｂ２）は、培養Ｍｔｂ由来の精製ＬＡＭを測定するための検出抗体として使用した場合に、極めて高いシグナルをもたらしたが、尿中ＬＡＭの測定の場合ではもたらさなかった。グリカンアレイ試験は、この抗体が、ＭｔＢに対し比較的特異的な、ＬＡＭエピトープ、ジ−もしくはトリ−マンノシドキャップ（Ｍａｎ２またはＭａｎ３）を標的にすることを示した（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．２０１１；Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。単一の仮説に限定することを望むものではないが、ＭＴＸのないＭａｎｐ（Ｍａｎ１、Ｍａｎ２、Ｍａｎ３）キャップは、尿中で安定でない可能性がある。理由は、例えば、それらは、分解され（例えば、酵素または別の機構により）、従って、これらのエピトープは、ほとんどの尿試料中で利用できないためである。
【００９２】
培養物および尿由来のＬＡＭに対する相対反応性の差異も、捕捉抗体について観察された。分岐部Ａｒａ４およびＡｒａ６構造（Ａ１９４−０１、２７Ｄ２、１３Ｈ３）、Ｍａｎ２またはＭａｎ３キャップ（ＭｏＡｂ３およびＭｏＡｂ２）およびＭａｎ２またはＭａｎ３を標的とする抗体を含む、ほぼ全ての捕捉抗体は、検出抗体としてＡ１９４−０１と組み合わせた場合、培養Ｍｔｂ由来の精製ＬＡＭに対し、高いシグナルをもたらした。検出抗体としてのその挙動と一致して、ＭｏＡｂ２（これは主にＭａｎ２およびＭａｎ３キャップを標的とする）は捕捉抗体として使用される場合、それは、尿中ＬＡＭに対し、シグナルを生成しないか、または極めて低いシグナルを生成した。Ｍａｎｐ−ＭＴＸを標的とするＭｏＡｂ１は、ＴＢ＋／ＨＩＶ−個体由来の尿で最も高いシグナルを生成した。単一の仮説に限定されることを望むものではないが、ＭＴＸモチーフはＭａｎｐを分解から保護し、患者尿中にこれらのエピトープの存在をもたらす可能性がある。その結果、ＭｏＡｂ１は、魅力的で、極めて反応性の高い、特異的捕捉抗体である。これらの結合試薬の臨床的潜在力を効率的に比較するため、および尿中のＬＡＭ構造体の存在量の理解を高めるために、８組の対を開発し、一連のエピトープ特異性を含む４種の捕捉抗体（１３Ｈ３、２７Ｄ２、ＭｏＡｂ１、ＭｏＡｂ３）および２種の検出抗体（Ａ１９４−０１および２７Ｄ２）の多重パネルを用いて評価した。
【００９３】
分析アッセイ性能
図２Ａは、最高性能の抗体対（捕捉抗体としてのＭｏＡｂ１と検出抗体としてのＡ１９４−０１の組み合わせ）に対して８種のレベルの精製ＬＡＭを用いて作成した較正曲線を示す。曲線は、アッセイシグナルをＬＡＭ濃度の関数としてプロットする。ブランク（ＬＡＭなし）試料に対するプレート内変動係数（ＣＶ）は、Ａ１９４−０１検出抗体と組み合わせた４種全ての捕捉抗体について≦１５％であった（表１Ａ）。
【表１】
2021521462.tif 000003
【００９４】
表１Ａは、Ａ１９４−０１検出抗体と組み合わせた場合の、４種の異なる抗ＬＡＭ捕捉抗体の分析性能をまとめる。この結果は、図２Ａに記載の８点較正曲線から測定した。最初の２つのデータ列は、ブランク試料についての平均シグナルおよびＣＶを示す（ｎ＝１４）。３つめの列は、ブランクシグナルより１．３７５倍高い検出閾値を上回るシグナルを与える較正標準についての平均ＣＶを示す（ＬＡＭ濃度当たり４回の反復実験による）。最後の列は、較正曲線に対し最良の４−ＰＬフィッティングにバックフィッティングすることにより計算した、検出閾値に等しいシグナルを与えることが予測されるＬＡＭ濃度によるＬＯＤの推定値を示す。
【００９５】
これらの結果に基づいて、ブランク（Ｓ／Ｂ＝１．３７５）を３７．５％上回るシグナルを、シグナル閾値と定義した。この閾値は、全てのアッセイについて、ブランクシグナルを２．５標準偏差上回る。ブランクシグナルに対するＣＶは、システムの電子ノイズ（±３０カウント）により支配された；ブランクシグナルを上回ってシグナルが増大するに伴い、ＣＶがかなり減少した。平均して、この閾値を上回るＬＡＭレベルに対するＣＶは、１２対全てについて、３〜４％であった。表１Ａおよび図２Ａはまた、シグナル閾値に基づく検出限界（ＬＯＤ）も提供する。ＭｏＡｂ１捕捉抗体によりもたらされるより高いシグナル対バックグラウンド比率により、この捕捉抗体は、精製ＬＡＭ標準物質および１１ｐｇ／ｍｌのＬＯＤのより高感度の検出をもたらした。検出抗体として使用した場合、２７Ｄ２は、Ａ１９４−０１を用いて得られた結果と高く相関した結果をもたらした（データは示さず）が、より低いシグナルおよびより高い検出限界をもたらす傾向があった。この２種の抗体の高い相関および類似のエピトープ特異性のため、分析は、より高感度のＡ１９４−０１検出抗体を用いて得た結果に注力される。しかし、２７Ｄ２は、検出器側でＡ１９４−０１の代替として使用できる。
【００９６】
試料作製
アッセイで試験する前に、尿試料を、試料中に存在し得る全ての抗ＬＡＭ抗体を不活化するために、８５℃で１０分間熱処理した。シグナルは通常熱処理により変化しないか、またはわずかに増加したのみであったので、抗体の干渉がこれらの試料中に存在するという証拠はほとんど見つからなかった（図４）。しかし、熱処理はＬＡＭ検出に対し何らかの悪い影響を有するように見えなかったので、その後の実験でも熱処理ステップを保持することが決定された。
【００９７】
アッセイ性能に対するマトリックス効果を評価するために、次の実験を実施した：（ｉ）臨床的尿試料中に添加したＬＡＭが、合成標準物質希釈剤中のＬＡＭ較正標準を用いて生成した較正曲線（図２Ａでのような）と比較して、予測した測定ＬＡＭレベルを与えることを示すための、添加回収率（ｓｐｉｋｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ）実験および（ｉｉ）尿試料中の測定レベルが、尿の標準物質希釈剤中への希釈に伴い直線的に減少することを示すための、希釈直線性（ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｌｉｎｅａｒｉｔｙ）実験。添加および希釈実験について、平均回収率は、２７Ｄ２を除く全ての捕捉抗体に対し、８０％〜１２０％の受け入れられる範囲であった（表１Ｂ）。２７Ｄ２は、一貫して低添加回収率を有し、それが、試料の加熱により修正できなかった、ある程度のマトリックス干渉を受けやすい可能性があることを示している。
【表２】
2021521462.tif 000004
【００９８】
表１Ｂは、Ａ１９４−０１検出抗体と対形成した場合の４種の捕捉抗体のそれぞれについての添加回収率および希釈直線性を示す。添加回収率は、理論的予測値に対する、尿試料中に添加された精製ＬＡＭの測定ＬＡＭ濃度である。各記載は、試料中に添加された３種のＬＡＭ濃度（３００、３，０００および３０，０００ｐｇ／ｍｌ）に対する平均回収率である。希釈時の回収は、未希釈試料（未希釈試料中のＬＡＭレベルは約１，０００〜約２００，０００ｐｇ／ｍｌの範囲である）中の測定尿中ＬＡＭに基づく予測値に対する希釈したＬＡＭ陽性尿試料の測定ＬＡＭ濃度である。各値は、１：２〜１：１６の４種の希釈範囲についての平均回収率である。この表はまた、全ての試験試料の平均値も示す。
【００９９】
交差反応性
ＬＡＭアッセイを、尿試料中に存在する可能性がある１０種の異なるマイコバクテリウム種および２０種の異なる非マイコバクテリア微生物のパネルに対する交差反応性について行った。表２Ａは、Ａ１９４−０１検出抗体と対形成した場合の各捕捉抗体で測定したシグナル対ブランク比を与える。
【表３】
2021521462.tif 000005
【０１００】
表２Ａは、一連の微生物についてのＬＡＭアッセイの交差反応性を示す。結果を、Ａ１９４−０１検出抗体と対形成した場合の示した４種の捕捉抗体に対して与える。記載シグナル対ブランク（Ｓ／Ｂ）比を、ＡＴＣＣまたはＢＥＩから得たストック調製物の１：１０，０００希釈（マイコバクテリア試料）または１：１００希釈（非マイコバクテリア試料）で測定した。データを、記載希釈で少なくとも１種の捕捉抗体に対しアッセイ閾値（１．３７５）より大きいＳ／Ｂ比を与える微生物に対してのみ示した。
【０１０１】
全てのアッセイについて、この閾値を基準にして検出不能交差反応性を有する微生物を、表の最下段に列記する。全ての試験した調製物は、ＭｔＢおよびウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）（死滅させた全細胞ライセート）およびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）（細胞ライセートから精製したＰＩＬＡＭ）を除いて、全生細胞であった。ＮＤ（検出不能）は、（ｉ）測定Ｓ／Ｂ比率が１．３７５より小さい、または（ｉｉ）特異的捕捉抗体スポット上のシグナルが他のスポット上のシグナルに比べて低すぎる（＜０．２％）ので交差反応性を正確に測定できない、ことを示す。成長が遅いマイコバクテリアを、アスタリスク＊で示す。
【０１０２】
試験した最大の濃度（ストックＡＴＣＣまたはＢＥＩ材料の１：１００希釈）で、４種の非マイコバクテリア種のみが、少なくとも１種の捕捉抗体に対して、アッセイ閾値の１．３７５より大きいＳ／Ｂ値をもたらした（ノカルジア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ゴルドニア・ブロンキアリス（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌｉｓ）（Ｔｓｕｋａｍｕｒａ）、ロドコッカス菌種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ツカムレラ・パウロメタボルム（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ  ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌｕｍ））。これらの４種の種の交差反応性の強度は、異なる捕捉抗体間でかなり変動した。２７Ｄ２およびＭｏＡｂ３は、４種全ての種に対し最強の交差反応性を示した。１３Ｈ３もまた、４種の種と交差反応したが、１〜２桁小さいシグナルを有した。ＭｏＡｂ１は、試験した濃度で最良の区別をもたらし、いずれの非マイコバクテリア種に対しても測定できる交差反応性を示さなかった。
【０１０３】
予想通り、全ての捕捉抗体は、ＴＢを引き起こすマイコバクテリア種Ｍｔｂおよびウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）に対して強力なシグナルをもたらした；これらの細菌性調製物の１：１，０００希釈物の試験は、アッセイの飽和レベルを上回るシグナルを与えた。しかし、大きな差異が、この希釈で試験したマイコバクテリア種に対する異なる捕捉抗体の交差反応性において観察された。ＭｏＡｂ１を除く全ての捕捉抗体は、急成長マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）およびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）種に対し極めて高い交差反応性を与え、１：１０００希釈で飽和シグナルをもたらした。対照的に、ＭｏＡｂ１が捕捉抗体として使用された場合、これらの２種の種に対する交差反応性は、他の捕捉抗体より少なくとも３桁低く、検出限界より低かった。マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）を除いて、ＭｏＡｂ１はまた、他のマイコバクテリウム種に対してより低い交差反応性を有する傾向があったが、これらの種に対するシグナルはより低い傾向を示し、かつ捕捉抗体間の差異はより小さい傾向を示した。全体として、捕捉ＭｏＡｂ１／検出Ａ１９４−０１の組み合わせは優れた特異性を示し、全ての非マイコバクテリア微生物に対して交差反応性がなく、急速成長マイコバクテリアに対して交差反応性がなく、成長が遅い非結核性抗酸菌に対して低レベルの交差反応性のみを有する（Ｍｔｂに比べて少なくとも１０倍低い反応性）。
【０１０４】
臨床試料の試験
表３Ａは、試験集団の特性を示す。
【表４】
2021521462.tif 000006
【０１０５】
表３Ａは、ＴＢおよびＨＩＶ状態で分けて示した試験集団の特性を示す。ＮＡは、指定された特性に対する情報が試験被験者について入手できなかったことを示す。ＣＤ４細胞カウントは、ＴＢ／ＨＩＶ＋被験者についてのみ入手できた。
【０１０６】
試料は、ＴＢ臨床試料のＦＩＮＤ（Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）リポジトリ由来であり、地理的位置（アジア、アフリカおよび南アメリカ）の範囲を含むように、かつＴＢおよびＨＩＶ状態の異なる組み合わせを含むように選択した。ＣＤ４カウントはほとんどのＴＢ＋／ＨＩＶ＋被験者について入手でき、アリーアＬＦ−ＬＡＭ検査から最も利益を得る可能性が高い免疫無防備状態の患者を特定するためのＷＨＯアルゴリズムで使用される１００細胞／ｕＬの閾値を上回るおよび下回る被験者を含んだ。アリーア検査の臨床性能の臨床試験に従い、この尿試料のパネルに対するアリーア検査の感度は、ＨＩＶ＋被験者で４４％（１１／２５）であったが、ＨＩＶ−被験者では１３％（２／１５）に過ぎなかった。
【０１０７】
図３Ａは、ＴＢおよびＨＩＶ状態の関数としての完全試料セットについての測定ＬＡＭ濃度のヒートマップを示す。ヒートマップは、Ａ１９４−０１を検出抗体として使用した場合の４種の捕捉抗体で測定した濃度を比較する。全ての捕捉は、ＨＩＶ＋／ＴＢ＋被験者由来のほとんどの尿試料中でＬＡＭの測定可能な濃度を示したが、ＭｏＡｂ１および１３Ｈ３のみが、かなりの比率のＨＩＶ−／ＴＢ＋被験者由来の尿中でＬＡＭを検出した。これらの２種のうち、１３Ｈ３が多くのＴＢ−被験者由来の尿中のＬＡＭまたはＬＡＭ関連構造を検出したので、ＭｏＡｂ１のみが、ＴＢ＋およびＴＢ−被験者の良好な区別をもたらした。ＭｏＡｂ１および他の３種の捕捉抗体（１３Ｈ３、２７Ｄ２、ＭｏＡｂ３）についての性能の差異を、図３Ｂおよび３Ｃの散布図でより明確に示す。定性的には、ＴＢ＋ドナー由来の試料に対する１３Ｈ３およびＭｏＡｂ１由来のシグナルは、アッセイ閾値から十分に分離していた。しかし、これらの２種の抗体のＴＢ−試料に伴う挙動は、かなり異なっていた。１３Ｈ３は、ＴＢ−試料に対し広いシグナル分布を与えた。対照的に、さらにＴＢ特異的なＭｏＡｂ１捕捉抗体を使いるＴＢ−試料に対するシグナルは、ブランクシグナルの近くで密に詰まっており、ＴＢ−試料に対する最高のシグナルは約１．８のＳ／Ｂ値を有し、全ての他の試料は、１１ｐｇ／ｍｌのＬＯＤより小さいシグナルを生成する。アリーアＬＦ−ＬＡＭ検査結果による色分けは、アリーア検査で検出可能なＬＡＭシグナルは、ＭｏＡｂ１捕捉抗体を用いたイムノアッセイの検出限界を１〜２桁上回ること、およびイムノアッセイで検出できるＴＢ＋被験者由来の多数の試料が存在したが、アリーア検査ではそうではなく、捕捉ＭｏＡｂ１／検出剤Ａ１９４−０１ベースのイムノアッセイの感度の劇的な増大をもたらしたことを示す。
【０１０８】
表４は、試験試料セットに対するＬＡＭアッセイの測定感度および特異性を示す。ＴＢ−とＴＢ＋群のアッセイシグナル間の分離の指標として、表４はまた、受診者動作特性曲線（ＲＯＣ）曲線分析からの曲線下面積（ＡＵＣ）値を与える。
【表５】
2021521462.tif 000007
【０１０９】
表４は、同じ試料セットでのアリーアＬＦ−ＬＡＭに比較して、４種の捕捉抗体（Ａｂ）および検出抗体としてのＡ１９４−０１の選択パネルを用いるＬＡＭアッセイの精度を示す。この表は、それぞれ４種の捕捉抗体に対する測定感度（正確に分類されたＴＢ＋試料／ＴＢ＋試料の合計数）および特異性（正確に分類されたＴＢ−試料／ＴＢ−試料の合計数）を与える。値を、完全試料セット（全）またはＨＩＶ−およびＨＩＶ＋被験者由来試料のサブセットについて計算した。この比率に対する９５％信頼区間（ＣＩ）を、ウィルソン法を用いて計算した。この表はまた、ブートストラッピングにより決定された信頼限界を含むＲＯＣ分析からのＡＵＣ値も与える。比較のために、下部の３行は、同じ試料セットに対するアリーアＬＦ−ＬＡＭ検査による類似の性能測定基準を示す。
【０１１０】
ＴＢ＋試料（ＨＩＶ−被験者由来の試料を含む）に対する高いシグナルおよびＴＢ−試料に対するＬＯＤより低いシグナルの密接な分布の組み合わせに起因して、ＭｏＡｂ１捕捉抗体を用いるアッセイに対するＡＵＣ値［０．９８（０．９５〜１．００）］は、他の捕捉抗体に対するＡＵＣよりかなり良好であった。ＨＩＶ−試料のみを試験すると、ＭｏＡｂ１［０．９５（０．８７〜１．００）］と１３Ｈ３［０．６０（０．４０〜０．８０）］の間の差異は、さらに大きかった。
【０１１１】
ＡＵＣの差異は、１３Ｈ３［全体感度＝７０％（５５％〜８２％、２８／４０）、特異性＝８６％（７１％〜９４％）；２１０ｐｇ／ｍｌのカットオフで３０／３５）］に比較して、ＭｏＡｂ１［全体感度＝９３％（８０％〜９７％；３７／４０）、特異性＝９７％（８５％〜１００％；１１ｐｇ／ｍｌのカットオフで３４／３５）］を用いるアッセイのより高い観察精度に反映された。ＭｏＡｂ１捕捉抗体を用いるアッセイは、高い特異性を維持しつつ、アリーアＬＦ−ＬＡＭアッセイ［全体感度＝３３％（２０％〜４８％、１３／４０）、特異性＝１００％（９０％〜１００％；３５／３５）］より約３倍高い感度であった。ＭｏＡｂ１捕捉抗体を用いるアッセイは、ＴＢ＋／ＨＩＶ＋試料の特定において完璧であった［ＭｏＡｂ１感度＝１００％（８７％〜１００％）；２５／２５］。
【０１１２】
図５は、アッセイシグナル（ＭｏＡｂ１捕捉抗体およびＡ１９４−０１検出抗体を用いたアッセイについて）とＣＤ４カウントおよびアリーアＬＦ−ＬＡＭ試験結果との関連性を示す。強く免疫抑制された（ＣＤ４＜１００細胞／μｌ）ＨＩＶ＋被験者は、ＨＩＶ−被験者より有意に高いレベルのＬＡＭを有した（図５Ｂ）。１００細胞／μＬより大きいＣＤ４カウントのＨＩＶ＋被験者とＨＩＶ−被験者の間で有意な差異が存在しなかったため、増大したＬＡＭレベルは、免疫抑制と相関するように見えた。図３Ｂからの定性的イメージを裏付けて、図５Ａは、高アリーアＬＦ−ＬＡＭグレードが極めて高いアッセイシグナルと関連することを示す。この図はまた、イムノアッセイによる低いが検出可能なシグナルを有するが、アリーア検査では検出されない、かなりの数のＴＢ＋被験者を強調する。
【０１１３】
ＭｏＡｂ１捕捉抗体の特異性に対する追加の裏付け
ＭｏＡｂ１／Ａ１９４−０１抗体対の観察された感度および特異性は優れていたが、ＴＢ＋／ＨＩＶ−被験者で観察されたシグナルは、低く、アッセイ閾値近傍である傾向を示し、ＴＢ＋／ＨＩＶ−被験者由来の尿は、中央Ｓ／Ｂ値は２．１にすぎなかった。追加の実験は、これらのシグナルが、非特異的アッセイバックグラウンドの変動の結果ではなく、特異的結合イベントの結果を反映するより大きな信頼性を生じさせることであった。
【０１１４】
第１セットの実験では、尿試料中のＬＡＭの濃縮が、アッセイシグナルにおける対応する増大を生じたことが確認された。表２Ｂは、低レベルのＬＡＭを有する７種の尿試料を、１０ｋＤの分画分子量を有する遠心限外濾過装置（Ａｍｉｃｏｎ）を用いてそれらの元の体積の１／５に濃縮する効果を示す。
【表６】
2021521462.tif 000008
【０１１５】
表２Ｂは、検出可能でないＬＡＭ（ＴＢ−ＨＩＶ−被験者由来）または低レベルの検出可能なＬＡＭ（ＴＢ＋ＨＩＶ−およびＴＢ＋ＨＩＶ＋被験者）を有する尿試料を、ＭｏＡｂ１−Ａ１９４−０１抗体対を用いてＬＡＭについてアッセイした後の結果を示す。試料を、濃縮なし（１Ｘ試料）または１０ｋＤカットオフを有する遠心限外濾過装置を用いて５倍に濃縮（５Ｘ濃縮）後に測定した。試料の予備処理ステップ（８５℃、１０分）を、濃縮前に実施した。「ＮＤ」は、アッセイシグナルがアッセイの検出閾値未満であったことを示す。比率の列は、５Ｘ濃縮物対１Ｘ試料中のＬＡＭの測定濃度の比率を与える。
【０１１６】
試料の濃縮は、測定されるＬＡＭ濃度の３．２倍〜４．９倍の増大をもたらし、これは、予測した理論値の５倍増大に近づく。対照的に、検出不能なＬＡＭレベルを有するＴＢ−ドナー由来の試料が、同じ濃縮工程を経た場合、レベルは検出不能のままであり、従って、陰性尿の単純な濃縮は、この効果を生成するのに十分ではなかった。類似の実験を、１００ｋＤカットオフを有する装置を用いてＬＡＭ陽性試料のサブセットで実施し、凡そ９０％のＬＡＭが濾液中に通過したことを明らかにした（データは示さず）。この結果は、測定された種が１０〜１００ｋＤの分子量であり、ＭｔＢ由来のＬＡＭの分子量を特徴付ける以前の調査と一致することを示す（Ｖｅｎｉｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。
【０１１７】
加えて、尿試料からＬＡＭを枯渇させるために固定化ＭｏＡｂ１を使用し得ることが確認された。枯渇実験を、抗体の大きい表面積を得るためにビオチン標識ＭｏＡｂ１でコートしたＭＳＤの大型スポットストレプトアビジンプレートで実施した。熱処理試料をこれらのウェル中でインキュベートした（振盪しながら室温で１時間）後、ＬＡＭアッセイプレートに試料を移し、残存するＬＡＭレベルを測定した。表３Ｂに示すように、この枯渇プロトコルを、広範囲のＬＡＭレベルを有するＴＢ＋被験者由来の１０種の尿試料に適用することは、枯渇を実施しなかった試料に比べて、５６％のＬＡＭレベルの中央値の増加（ＩＱＲ：４７％〜６１％）をもたらした。
【表７】
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【０１１８】
表３Ｂは、一連のＬＡＭレベル（ＴＢ＋／ＨＩＶ−被験者およびＴＢ＋／ＨＩＶ＋被験者の両方由来）を有する熱処理尿試料を、ビオチン標識したＭｏＡｂ１でコートしたＭＳＤ大型スポットストレプトアビジンプレートのウェル中で室温下１時間、振盪しながらインキュベートして、試料からのＬＡＭの枯渇を試みた後の結果を示す。コントロールとして、試料を、抗体でコートしていないウェル中でもインキュベートした（「シャム」条件）。その後、検出抗体としてＡ１９４−０１を用いるマルチプレックスＬＡＭアッセイにより、枯渇試料中の、ならびに非枯渇試料中のＬＡＭレベルを測定した。報告ＬＡＭ濃度は、非枯渇試料についてである。この表はまた、ＭｏＡｂ１を用いて、またはシャム条件を用いて枯渇させた試料について測定されたＬＡＭ濃度のパーセント減少率（％枯渇）も記載している。
【０１１９】
枯渇プロトコルが抗体の非存在下で実施されたシャム条件は、ＬＡＭレベルの中央減少値２％（ＩＱＲ：１％〜３％）を与えたに過ぎなかったので、枯渇ステップでのＭｏＡｂ１の存在は必要であった。
【０１２０】
考察
この症例対照研究は、フェムトモル（ｆＭ）の範囲でＬＯＤを有する高感度ＥＣＬイムノアッセイを使用してＨＩＶ−／ＴＢ＋およびＨＩＶ＋／ＴＢ＋患者の尿中でＬＡＭが検出可能かどうかを決定しようとした。研究は、多重化フォーマットを採用して、異なる特異性の複数の抗体の同時評価を可能にし、どのように抗体特異性が臨床性能に影響するかを特徴付けた。
【０１２１】
最高性能のモノクローナル抗体対（捕捉ＭｏＡｂ１／検出器Ａ１９４−０１）を用いたＥＣＬアッセイの結果は、推定ＴＢを有する４つの国からのよく特徴付けられた患者由来の７５種の尿試料の小さいセットにおいて、結核症例検出に対し、アリーアＬＦ−ＬＡＭに比較して、ほぼ３倍高い感度および統計的に識別不能な特異性を示した。全てのＨＩＶ＋およびかなりの割合のＨＩＶ−患者は、１１ｐｇ／ｍｌ（０．６ｐＭ）のアッセイ検出限界を超える検出可能なＬＡＭ濃度を有した。このアッセイの検出限界は、アリーアＬＦ−ＬＡＭ検査のカットオフより２５〜５０倍低かった。アリーアＬＦ−ＬＡＭ検査は、２５０〜５００ｐｇ／ｍｌの範囲にあり（Ｎａｋｉｙｉｎｇｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１４；Ｓａｖｏｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）、より低いＬＡＭ濃度を有するＴＢ患者を検出できない。この結果は、ＬＡＭ検出の分析感度の向上は、ＴＢ診断のための臨床的感度の向上に直接つながることを示唆する。
【０１２２】
イムノアッセイに対するほぼ完全な特異性での診断感度の向上のための重要な要素は、ＴＢ患者の尿中に存在する性質の異なるＬＡＭエピトープに対する結合特異性を有する明確なモノクローナル抗体のユニーク対の特定であった。異なる起源由来の一連の抗ＬＡＭ抗体のそれぞれの可能な対での組み合わせのスクリーニングでは、多くの対が、Ｍｔｂ培養物由来の精製ＬＡＭを検出できることが見出されたが、一部のみが患者尿中のＬＡＭまたはＬＡＭ関連構造の検出について良好な感度を示した。検出抗体の選択は、尿中のＬＡＭの高感度検出にとって特に重要であるように思われ、検出抗体として他の候補よりかなり良好な性能をもたらす２種の抗体（Ａ１９４−０１および、より低い程度で２７Ｄ２）が特定された。これらの抗体のエピトープマッピングは、これらの抗体の両方が、直鎖Ａｒａ４および分岐部Ａｒａ６（ヘキサＡｒａｆ）モチーフの両方を含むＬＡＭのアラビナンドメインを標的とすることを示し、これらの構造がＴＢ患者の尿中に比較的豊富であることを示している。Ａ１９４−０１の抗体工学研究は、単量体Ｆａｂ構造への変換が結合活性の大きな損失を生じることを示し（Ｐｉｎｔｅｒ  ２０１７）、ＬＡＭ分子内の完全ＩｇＧの２つのアラビナンモチーフへの多価性の結合が結合に重要であり得ることを示唆している。多価性の結合を介して結合力を増大させる能力は、次に、この抗体の検出抗体としてのユニークな有用性に関与し得る。
【０１２３】
ほとんどの候補抗体が尿中ＬＡＭ検出用の捕捉抗体として適度に良好に機能したので、最適捕捉抗体の選択は、主として、抗体特異性により推進される。直鎖Ａｒａ４および分岐部Ａｒａ６モチーフの両方を標的とする抗体（Ａ１９４−０１、Ｉｍｍ  ２７Ｄ２）は、Ａ１９４−０１と対形成した場合、全て、少なくともいくつかの尿試料中のＬＡＭを検出できた。このアラビナン特異的捕捉抗体セットのうち、１３Ｈ３は、ＴＢ＋被験者由来の尿に対し最も高いシグナルを有する傾向があったが、ブランクシグナルを上回る高いシグナルを与えるいくつかのＴＢ−試料で比較的低特異性（８６％）を示した。１３Ｈ３／Ａ１９４−０１対を用いてＬＡＭアッセイを開発することは可能であるが、この結果は、非ＴＢ特異的アラビナンエピトープを標的とする抗体のみを用いる尿中ＬＡＭアッセイの性能が、非ＴＢマイコバクテリア（ＮＴＢ）または放線菌目の関連微生物などの他の起源由来の尿中ＬＡＭとの交差反応性により制限され得ることを示唆する。特に、Ａｒａ６構造は、ＭｔＢ  ＬＡＭに特有ではなく、交差反応性研究は、１３Ｈ３／Ａ１９４−０１対は、非マイコバクテリア放線菌類ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ゴルドニア属（Ｇｏｒｏｎｉａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）およびツカムレラ属（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）（これらは全て、Ａｒａ６構造を有するＬＡＭを産生することが既知である）と交差反応することを確認した（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．２０１１；Ｂｒｉｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。アリーアＬＦ−ＬＡＭ検査および以前の市販のＥＬＩＳＡ検査で使用されるポリクローナル抗体は、類似の制限を有する可能性がある。古い市販のＥＬＩＳＡ検査であるクリアビューＴＢ検査を、分析前に尿を濃縮することにより改善する試みは、感度は顕著に改善され得ることを明らかにしたが、特異性が対応して低下することも明らかにした（Ｓａｖｏｌａｉｎｅｎ  ２０１３）。同様に、アリーアＬＦ−ＬＡＭ検査から擬陽性の結果を減らす必要性は、２０１４年に検査の参照カードをより高いアッセイカットオフの方向に改訂するように製造業者を導き、これは、特異性を高めたが、感度を低下させた。さらに、アリーアＬＦ−ＬＡＭ検査の口腔内在住アクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）およびノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）に対する交差反応性はおそらく、アッセイが喀痰中のＬＡＭ検出に十分に特異的でない理由であろう（Ｄｈｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。また、アリーアＬＦ−ＬＡＭ検査は、プレートウオッシャーの配管中のバイオフルムなどのＬＡＭの環境要因からの交差反応性を受けやすいことも明らかになり、非ＴＢ特異的抗体を使う場合の抗体特異性の重要性ならびに環境干渉物質に対する保護の必要性の両方を強調する。
【０１２４】
比較的非特異的ＬＡＭエピトープを標的とする１３Ｈ３のような抗体に加えて、Ｍａｎ２およびＭａｎ３モチーフ（ＭｏＡｂ２）、ならびにＭＴＸ−Ｍａｎ２およびＭＴＸ−Ｍａｎ３モチーフ（ＭｏＡｂ１）などの、よりＴＢ特異的構造を標的とする捕捉抗体を評価した。どちらもＭｔＢ培養物由来の精製ＬＡＭに対し強力なシグナルをもたらしたが、ＭｏＡｂ１のみがＴＢ患者由来の尿試料中のＬＡＭを検出し、尿中ＬＡＭ中のいずれかのＭａｎ２またはＭａｎ３キャップモチーフの大部分は、ＭＴＸ修飾として存在する必要があることを示している。驚くべきことに、試験は、ＭｏＡｂ１のＡ１９４−０１検出抗体との対形成が、１３Ｈ３／Ａ１９４−０１対と同様なＴＢ＋群中の類似の反応性をもたらすが、ＭｏＡｂ１捕捉抗体は、高い臨床的特異性を達成できたことを示した。異なる抗体対の観察臨床的感度および特異性の図表による比較で示されるように（図６）、ＭｏＡｂ１／Ａ１９４−０１対は、最良の全体臨床的感度（９３％）および特異性（９７％）をもたらした。高い全体感度は、ＴＢ＋ＨＩＶ−被験者由来の尿中ＬＡＭ検出についての、この対の優れた感度をほぼ反映した（８０％）。図６はまた、この対の観察性能と、ＰＯＣ  ＴＢ検査のためのＷＨＯ精度目標とを比較し、このアッセイが、追跡調査ＴＢ試験、ならびに診断で使用するより厳密な要件に対し患者を特定するための優先順位づけに使用するＰＯＣ  ＴＢ検査の目標基準値に適合する可能性があるという励ましを与える。
【０１２５】
単一の仮説に限定されるのを望むものではないが、ＭｏＡｂ１／Ａ１９４−０１対の交差反応性試験の結果により裏付けられるように、ＭｏＡｂ１捕捉抗体のエピトープ特異性は、同時に臨床的特異性を維持しつつ高感度検出をもたらすその能力に関与する。尿路感染症に関与する最も一般的な微生物に対し交差反応性がないことが観察され、また、１３Ｈ３を採用するアッセイと対照的に、ＬＡＭ産生非マイコバクテリア放線菌類ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ゴルドニア属（Ｇｏｒｏｎｉａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）およびツカムレラ属（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）に対する検出可能な交差反応性は観察されなかった。ＭｏＡｂ１捕捉はまた、ＴＢ産生マイコバクテリア（ＭｔＢおよびウシ型結核菌）の、他のほとんどのマイコバクテリア種からのより良好な区別を提供した。特に、急成長マイコバクテリアのマイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム・アブセサス（Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）およびマイコバクテリウム・ケロネー（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）との検出可能な交差反応性は、観察されなかった。これらのマイコバクテリアは、あったとしてもごくわずかなＭＴＸ修飾を有するＬＡＭを産生する（Ｊｏｅ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。対照的に、１３Ｈ３捕捉は、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）およびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）の試験濃度に対し、飽和または飽和に近いシグナルを生成した。ＭｏＡｂ１に対する低レベルの交差反応性が、成長が遅いＮＴＭのマイコバクテリウム・ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）およびカンサシ菌（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）で観察されたが、これらの種で観察されたシグナルは、ＴＢを引き起こす株で測定されたものよりかなり低かった。また、この対は、アリーアＬＦ−ＬＡＭ検査でシグナルを生成したプレートウオッシャーからの未知の環境的ＬＡＭ様混入物の影響を受けないことも明らかになった。ＭｏＡｂ１抗体のＴＢ特異性はまた、Ｏｔｓｕｋａにより開発された喀痰中のＬＡＭ検出用のＥＬＩＳＡでも採用されており、これは、アリーアＬＦ−ＬＡＭ検査とは対照的に、蔓延する口腔放線菌類種により産生されるＬＡＭと交差反応しない（Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１８）。
【０１２６】
ＬＡＭは、ＭｏＡｂ１／Ａ１９４−０１抗体対を用いて、ほぼ全てのＨＩＶ陽性およびＨＩＶ陰性患者で検出可能であったが、試験は、低ＣＤ４カウントのＨＩＶ陽性患者でＬＡＭ濃度が増大するという以前の知見を確認した。≦１００細胞／μｌの低ＣＤ４カウントを有するＴＢ／ＨＩＶ同時感染患者由来の試料は、有意により高いＬＡＭ濃度であり、選択した試料は、＞１０ｎｇ／ｍｌのＬＡＭを有した。＞１００細胞／μｌの高いＣＤ４カウントを有するＴＢ／ＨＩＶ同時感染患者およびＴＢ／ＨＩＶ陰性免疫正常者由来試料中の濃度は、１１〜１０００ｐｇ／ｍｌの範囲およびそれより低い範囲であった（図５および図３Ｂ）。この効果は、アリーアＬＦ−ＬＡＭを用いた大きなコホート試験からよく知られている（Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。腎臓ＴＢ感染症は、低ＣＤ４カウントを有するＴＢ／ＨＩＶ同時感染患者における高いＬＡＭ濃度に対する説明として提案されてきた（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．２０１５；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。この試験の免疫正常およびＨＩＶ陰性患者の根底にあるＬＡＭ抗原尿をもたらす機序は、不明確なままである。ＬＡＭが感染肺胞マクロファージから活発に分泌されていることを示唆するいくつかの証拠が存在する（Ｓｔｒｏｈｍｅｉｅｒ  ＆  Ｆｅｎｔｏｎ  １９９９）。このような活発なプロセスは、インビボでのＴＢの生存に好都合な可能性があるＬＡＭの重要な免疫調節特性と一致するであろう（Ｌａｗｎ  ２０１２）。このプロセスはまた、血流中に無細胞のＬＡＭまたはＬＡＭフラグメントを生じ、これは、糸球体濾過を介して尿中におそらく通過できるであろう。血清中のＬＡＭレベルおよび尿中レベルとのそれらの相関の調査は、現在進行中である。
【０１２７】
知見の要約
アッセイの向上した性能は、全ＨＩＶ陽性の免疫正常患者中の、しかし、おそらくＨＩＶ陰性の場合でも、その免疫正常患者中のＴＢ診断およびスクリーニングのための高められたＬＡＭ検出アッセイの開発が十分に実施可能であることを示す。しかし、低ピコモルあるいはフェムトモル範囲のＬＯＤおよび極めて特異的な抗体によるアッセイが必要である。開発されたアッセイは、高感度で、検査室設定で有用なツールを提供し得るが、これは、検査室施設および訓練されたスタッフを利用できない低および中所得設定において典型的な一次診療環境で使用されるポイント・オブ・ケア検査用としては設計されていない。いくつかの最も高感度のラテラルフローアッセイは、低ｐＭ範囲に達する；例えば、最近開発されたマラリア抗原検出アッセイは、２．５ｐＭ  ＨＲＰ−２（＝８０ｐｇ／ｍｌ）のＬＯＤを報告し、これは、必要とされる分析感度に近い（Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）。他の研究は、抗原濃縮ステップを提案したが、アッセイの複雑さおよびコストが課題であろう。ＦＩＮＤおよびパートナーは、この試験からの知見を簡単かつ高感度のＰＯＣ検出プラットフォームに移すことを計画している。
【０１２８】
実施例２−抗体を用いて実施したエピトープマッピング
ＭｏＡｂ１、ＭｏＡｂ２およびＭｏＡｂ３を用いてエピトープマッピングを実施した。
表５は、抗体の説明である。
【表８】
2021521462.tif 000010
【０１２９】
２．材料および方法
３種の抗体（ＭｏＡｂ１、ＭｏＡｂ２、ＭｏＡｂ３）を、それらの結合部位により認識されるオリゴ糖エピトープを特定するために分析した。エピトープ特定を、一連の多様な６１種のオリゴ糖構造を示すグリカンアレイに対する抗体の結合を測定することにより実施した（図１Ｄ〜１Ｆ）。手短に説明すると、オリゴ糖フラグメントを、以前記載したように合成した（Ｊｏｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ５−ｄｅｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ−ｘｙｌｏｆｕｒａｎｏｓｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｉｎ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｉｐｏａｒａｂｉｎｏｍａｎｎａｎ．Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｌｉｎｋａｇｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２８，５０５９−５０７２（２００６）；Ｇａｄｉｋｏｔａ，Ｒ．Ｒ．，Ｃａｌｌａｍ，Ｃ．Ｓ．，Ａｐｐｅｌｍｅｌｋ，Ｂ．Ｊ．＆  Ｌｏｗａｒｙ，Ｔ．Ｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｍａｎｎｏｓｙｌａｔｅｄ  Ｌｉｐｏａｒａｂｉｎｏｍａｎｎａｎ  Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｌｙ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｆｏｒ  Ｎｅｏｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．２２，１４９−１７０（２００３）；Ｊｏｅ，Ｍ．，Ｂａｉ，Ｙ．，Ｎａｃａｒｉｏ，Ｒ．Ｃ．＆  Ｌｏｗａｒｙ，Ｔ．Ｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｏｃｏｓａｎａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ａｒａｂｉｎａｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒａｂｉｎｏｇａｌａｃｔａｎ  ａｎｄ  ａ  ｐｒｏｐｏｓｅｄ  ｏｃｔａｄｅｃａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９，９８８５−９９０１（２００７）；Ｓａｈｌｏｕｌ，Ｋ．＆  Ｌｏｗａｒｙ，Ｔ．Ｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒａｂｉｎｏｍａｎｎａｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．８０，１１４１７−１１４３４（２０１５）；Ｚｈｅｎｇ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｈｏｓｔ  Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｒｒａｙ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｌｙｃａｎｓ．ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１２，２９９０−３００２（２０１７））。
【０１３０】
その後、フラグメントをＢＳＡに結合させ、マイクロアレイ生成に使用した。抗体の８種の段階希釈物（０．６ｎｇ／ｍｌ、２．４ｎｇ／ｍｌ、９．８ｎｇ／ｍｌ、３９ｎｇ／ｍｌ、１５６ｎｇ／ｍｌ、６２５ｎｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、および１０μｇ／ｍｌ）をスライド上で、３７℃で３０分間インキュベートし、洗浄後、蛍光標識二次抗種抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈのＣｙ（商標）３  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ウサギＩｇＧ）で４０分間染色した。洗浄と乾燥を繰り返した後、蛍光シグナルをＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂスキャナー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＵＳＡ）を用いて測定し、各スポットのバックグラウンドを上回る強度を、ＰｒｏＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ６．１を用いて定量化した。
【０１３１】
結果および考察
図７は、全６１種のオリゴ糖構造、３つのネガティブコントロールおよび１つのポジティブコントロールスポットに対する８種の異なる濃度での、３種のモノクローナル抗体の反応性を示す。
【０１３２】
ＭｏＡｂ２は、ジマンノースキャップ型ＬＡＭを選択的に認識し、モノおよびトリ置換構造に対しては低い反応性であった。これは、この抗体のＭｔｂに対する特異性、およびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ＰＩＬＡＭに対する反応性の欠如と一致した（Ｇｌｙｃａｎ４９）。ジマンノースキャップ型ＬＡＭに対する反応性は、ＭＴＸの付加により強く阻害され（グリカン３のグリカン７に対する反応性と比較されたい）、ＭｏＡｂ２が非修飾ジマンノースグリカンを優先的に認識したことを示す。マイクロアレイ分析は、ＭｏＡｂ２が、Ａｒａｆ糖を何ら含まないいくつかのＭａｎｐ含有複合多糖と強く反応することをさらに示した。これらのエピトープは、マンノース構造の末端もしくは中央のＭａｎｐにα−（１→２）またはα−（１→３）結合のいずれかにより連結された追加のＭａｎｐ残基を有する構造を共有し、従って、マンナン骨格およびキャッピング構造の両方と類似していた。ＭｏＡｂ２はまた、グリカン５９、Ｍａｎｐ−（１→３）−α−Ｍａｎｐ結合を分子の両端に含む五糖類構造ともかなり良く反応した。これらの結果は、この抗体はＭａｎｐ含有成分のみに依存し、隣接Ａｒａｆ残基のいずれかを認識のために必要としないことを明確に示している。Ｍａｎｐは、Ｍｔｂおよび他の成長が遅いマイコバクテリア中の保存された特徴であるが、スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）などのキャッピング急速成長種では発生しない。しかし、尿中の試験由来の実施例１は、非修飾Ｍａｎｐ（すなわち、非修飾ジマンノースグリカン）は、ほとんどのＴＢ患者の尿中の結合には利用できないことを示唆している。単一の仮説により限定されることを望むものではないが、可能な理由は、ＭＴＸの非存在下でのこのエピトープの分解である（例えば、１，２−マンノシダーゼのようなヒト酵素による）。従って、非修飾Ｍａｎｐモチーフを標的とする抗体は、患者の尿中のＭａｎＬＡＭを検出するのに診断的に有用でないであろう。
【０１３３】
対照的に、ＭｏＡｂ１は、α−（１→４）結合メチルチオキシロース（ＭＴＸ）残基でさらに置換されたＭａｎｐキャップ型構造に対し特有の特異性を有した。ＭｏＡｂ１は、ＭＴＸ修飾ジマンノース（グリカン７）およびトリマンノース（グリカン９）キャップ型構造と最大の反応性を有し、ＭＴＸ修飾モノマンノース構造（グリカン８、グリカン１０、グリカン１１）とより小さい反応性を有した。ＭｏＡｂ１は、ＭＴＸ−Ｍａｎモチーフが、Ａｒａ６のα−（１→５）結合（グリカン１０）またはα−（１→３）結合（グリカン１１）アーム上に存在する構造を認識し、ポリＡｒａｆ構造は、認識に重要ではないこと、および結合が主にＭＴＸ−ジマンノース部分で起こることを示唆している。ＭＴＸ置換は、現在までに分析された全てのＭｔｂ単離物中で特定され、最近のレポートは、Ｍｔｂ  ＬＡＭのＭＴＸキャッピングモチーフの生合成専用の５つの遺伝子クラスターについて記載している（Ａｎｇａｌａ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）。スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）はまた、これらの全ての遺伝子を有し、そのため、ＭｏＡｂ１のスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）および他の急速成長マイコバクテリアとの反応の欠如は、おそらく、このエピトープの形成を排除する、ＰＩＬＡＭ中のＭａｎｐキャッピングの非存在に関連している。ＭｏＡｂ２とは対照的に、ＭＴＸ−Ｍａｎｐ構造は、ＴＢ患者の尿中の結合に利用できると思われる。単一の仮説により限定されるのを望むものではないが、可能な説明は、ＭＴＸが、酵素またはＴＢ患者の身体中で起こり得る他の分解機序による分解からＭａｎｐユニットを保護するということである。
【０１３４】
ＭｏＡｂ３は、非キャップ型Ａｒａ４およびＡｒａ６構造を低い親和性で認識し、Ａｒａ４−Ｍａｎ１（グリカン２）、ジマンノースキャップ型Ａｒａ４およびＡｒａ６構造（グリカン３およびグリカン６）と、およびＭＴＸ修飾Ａｒａ４−Ｍａｎ２構造（グリカン７）と最も強力に反応した。ＭＴＸ修飾モノおよびトリマンノースキャップ型構造（グリカン８およびグリカン９）との反応性は低かった。ＭｏＡｂ２とは対照的に、ＭｏＡｂ３は、ポリマンノース構造（グリカン１７、グリカン５０、グリカン５９）のいずれも認識せず、Ａｒａ構造の存在がＭｏＡｂ３の結合のために重要であることを示唆している。他の２種の抗体と対照的に、ＭｏＡｂ３は、ホスホミオイノシトールキャップ型Ａｒａ４（グリカン４９）に対する弱い結合を含む広範な反応性を有した。
表６は、抗体結合結果の要約である。
【表９】
2021521462.tif 000011
【０１３５】
結果のまとめ
ＭｏＡｂ２およびＭｏＡｂ１の両方は、ＭｔＢおよびその他の成長が遅いマイコバクテリア中のみに存在するがスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）またはマイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）などの急速成長マイコバクテリアでは発生しないエピトープに特異的であり、これは、低成長から急速成長マイコバクテリアを区別する抗体の能力を説明する。これは、これらの抗体をベースにしたアッセイの優れた分析能力をさらに説明する。患者の尿中の非修飾Ｍａｎ２キャップ非存在に起因して、ＭｏＡｂ２は、尿中のＬＡＭの検出に基づく診断イムノアッセイのために重要な抗体ではないように見える。対照的に、ＭｏＡｂ１は、尿中に存在し安定であると思われるＭＴＸキャップ型Ｍａｎｐ構造を検出する。ＭｏＡｂ３は、２種の捕捉抗体に対しても重要なグリカンに対し重なり合う反応性を示し、Ａｒａ構造の存在は、ＭｏＡｂ３にとって重要であるように見え、この抗体がわずかに異なるエピトープを結合することを示唆している。
【０１３６】
実施例３−ＭｏＡｂ１捕捉用抗体およびＡ１９４−０１検出抗体用抗体を用いた追加のデータ（図中の「試験下の抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｕｎｄｅｒ  Ｔｅｓｔ）」または「試験下の抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｕ．Ｔｅｓｔ）」）
【０１３７】
この抗体の組み合わせを使用して、さらなる臨床データを取得し、尿中のＬＡＭの検出に対するこの抗体対の有効性を示した。
【０１３８】
方法
試験デザインおよび試験集団
２カ所の南アフリカの地方病院での３つの独立した前向きコホート試験で収集された、ＨＩＶを抱えて生きる入院患者（＞１８歳）由来の生体バンクに貯蔵された尿試料を評価した。コホートの選択基準は、ＴＢ風土病設定での入院ＰＬＨＩＶの全コホートについての凍結尿試料の入手可能性であった。この集団で、包括的精密検査を実施して、ＴＢまたは代替診断法を特定した。ＴＢおよびＨＩＶ管理のための標準的な国のガイドラインを３つ全てのコホートに使用した。第１のコホート（「コホート１」）については、ＴＢ症状があり喀痰を生成できる成人をＣＤ４カウントとは無関係に、２０１６年２月〜２０１７年８月に、Ｋｈａｙｅｌｉｔｓｈａ病院（ＫＨ）への入院の時点で登録した。コホート１は、肺外疾患のみの患者を除外した。第２コホート（「コホート２」）は、ＣＤ４カウントとは無関係に、２０１２年６月〜２０１３年１０月にＧＦ  Ｊｏｏｓｔｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの成人内科病棟に入院した成人を、喀痰を生成する能力に関係なく、またはＴＢを報告したがどうかに関わらず、登録した。コホート２については、試験スタッフが組織的に、入院の２４時間以内に試験するために、尿、血液および２回の喀痰を収集することを試みた。第３のコホート（「コホート３」）は、ＫＨへ入院した、ＣＤ４≦３５０細胞／μｌのＰＬＨＩＶを登録した。この集団では、ＴＢは、２０１４年１月〜２０１６年１０月の間の診察時に最も可能性の高い診断と考えられた。
【０１３９】
全てのコホートは、抗ＴＢ療法をすでに受けている患者を除外した。コホート１および２では、登録を連続して行った。コホート３は、全ての潜在的適格患者を毎日特定した後にランダム選択法を使用した。全てのコホートでは、患者を、入院時に登録した。Ｍ．ｔｂ参照標準検査用の喀痰、血液および尿検体を登録時に収集し、追加の臨床試料を、入院および追跡調査中に得た。全コホートにわたる喀痰収集を、経験豊かな看護師または訓練された臨床研究作業者により行い、以前に記載のように、必要に応じ喀痰誘導を実施した。
【０１４０】
全ての試験関連業務は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｔｏｗｎ（ＵＣＴ）のヒト研究倫理委員会（ＨＲＥＣ）により承認された。試験プロトコルに従って、書面でのインフォームドコンセントを患者から取得した。試験参加は、標準治療に影響を与えなかった。報告は、ＳＴＡＲＤガイドラインに従った。レトロスペクティブ尿ＬＡＭ試験を、スポンサー、ＦＩＮＤにより監督し、２０１８年４月にＵＣＴで実施した。
【０１４１】
検査室手法
未処理尿の凍結尿分割量を周囲温度に解凍し、マニュアルで混合した。すぐに試験に使用しない試料を、４℃で最大４時間保存した。アリーアＬＦ−ＬＡＭ試験を、製造業者の説明書に従って実施した。上述の試験下の抗体対（ＭｏＡｂ１捕捉用抗体およびＡ１９４−０１検出抗体用抗体）を、以下のように試験した。手短に説明すると、尿を、金標識Ａ１９４−０１を含む試薬チューブに指標線まで加え（約２００μｌ）、混合し、周囲温度で４０分間インキュベートした。再度混合後、チューブからの尿／試薬の２滴を、「検査」ライン上に固定されたＭｏＡｂ１捕捉抗体を有するラテラルフローポイント・オブ・ケアイムノアッセイである、検査片に添加した。尿中に抗原が存在する場合には、ＭｏＡｂ１捕捉抗体は「検査」ライン上の抗原−Ａ１９４−０１−金錯体を捕捉して、サンドイッチフォーマットでＭｏＡｂ１−抗原−Ａ１９４−０１−金錯体を形成する。結果を１０分以内に読み取った。読み取り装置は必要なく、結果を、目視検査により解釈した。試験ライン上に認められるすべての線を、ＴＢ陽性とみなした。
【０１４２】
両方のアッセイを、インデックス検査または対照薬検査のそれぞれの検査結果、患者状態および全てのその他の試験結果を知らない２人のリーダーにより独立に読み取った。初期の独立した検査解釈後に、リーダーは、結果を比較し、不一致がある場合には、検査片を再検査し、分析に使用される最終統一見解（相互の合意により）を形成する。アッセイの失敗の場合には、検査を１回反復した。
【０１４３】
参照標準検査では、検体を、南アフリカ国立臨床検査サービスの集中型公認試験室の規格化プロトコルを用いて処理した。参照標準検査は、全ての利用可能な喀痰検体で実施され、ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ  ＭＴＢ／ＲＩＦ（Ｘｐｅｒｔ，Ｃｅｐｈｅｉｄ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＵＳＡ；検査は、ＭＴＢ／ＲＩＦを延ばす前に行う）、オーラミンＯ染色後のスメア蛍光顕微鏡法、ＭＧＩＴ液体培養（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＵＳＡ）およびＬｏｗｅｎｓｔｅｉｎ−Ｊｅｎｓｅｎ（ＬＪ）培地上での固体培養を含んだ。
【０１４４】
固体および液体培養物中のＭｔｂ錯体の存在を、ＭＰＴ６４抗原検出および／またはＭＴＢＤＲｐｌｕｓラインプローブアッセイ（Ｈａｉｎ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｅｈｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で確認した。全ての参加者由来の血液培養を、ＢＡＣＴＥＣ（登録商標）Ｍｙｃｏ／Ｆ溶解培養バイアル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＵＳＡ）中で実施し、ＷＨＯ事前選定インビトロ診断検査を、ＨＩＶ検査（急速診断検査）およびＣＤ４細胞計数（フローサイトメトリー）のために使用した。尿中Ｘｐｅｒｔ試験では、２０〜４０ｍｌの尿を遠心分離し、上清を除去後、ペレットを残留物尿量中に再懸濁し、０．７５ｍｌを、Ｘｐｅｒｔを用いて検査した。コホート２および３については、臨床的に必要な場合には、胸水、脳脊髄液および組織細針吸引物などの追加の呼吸器および非呼吸器試料を得て、ＭＧＩＴ培養またはＸｐｅｒｔを用いて検査した。臨床情報、試験下の抗体対の結果およびアリーアＬＦ−ＬＡＭ結果は、検査の時点では、参照基準の査定者には利用できなかった。
【０１４５】
参照基準分類
患者を、臨床および検査所見の組み合わせを用いて、４つの診断分類に割り当てた。これを、データ分析の前にインデックス検査結果を知らなかった治験責任医師により実施した。「明確なＴＢ」は、微生物学的に確認されたＭｔｂ（入院中に任意の培養物または任意のＸｐｅｒｔ  ＭＴＢ／ＲＩＦ（「Ｘｐｅｒｔ」）でＭｔｂ陽性）を有する患者を含んだ。「ＴＢでない」は、顕微鏡、培養物およびＸｐｅｒｔ検査の全てでＭｔｂ陰性（および少なくとも１つの非汚染培養結果）を有し、抗ＴＢ治療を開始しておらず、３ヶ月追跡調査で生存または改善された患者であった。「ＴＢの可能性」は、「明確なＴＢ」の診断基準を満たさないが、ＴＢを示唆する臨床的／放射線医学的特徴を有し、ＴＢ治療を開始した患者であった。これらの分類に入らない患者を、この診断精度試験について「分類不可能」であるとみなし、主要分析から除いた。感度解析では、「分類不可能」分類を、診断精度に対して除外された影響を評価するために含めた。
【０１４６】
統計解析
試験下の抗体およびアリーアＬＦ−ＬＡＭを用いたＬＦＡの精度（感度、特異性、陽性的中率（ＰＰＶ）、陰性適中率（ＮＰＶ）、陽性尤度比（ＬＲ＋）および陰性尤度比（ＬＲ−））を、微生物学的参照基準（ＭＲＳ）ならびに複合参照基準（ＣＲＳ）と比較することにより決定した。「明確なＴＢ」対「ＴＢでない」を、参照基準陽性対陰性群に患者を割り付けるために使用した。「ＴＢの可能性」群を、ＭＲＳ内で陰性あるが、ＣＲＳ内では陽性であるとみなした。プロトコルに従って、診断精度を各コホートについて別々に決定した。不均一性を、コクランのＱ検定を用いて評価した。
【０１４７】
全てのコホートの統合感度および特異性およびＣＤ４層を推定するために、我々は、ベイジアン２変量ランダム効果モデルを用いて事後分析を実施し、試験デザイン差異を説明した。結果を、ウィルソンのスコア法に基づいて、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）で示す。差異（Δ）のパーセンテージによる９５％ＣＩ（試験下の抗体対およびアリーアＬＦ−ＬＡＭに対する）を、Ｔａｎｇｏのスコア法を用いて計算した。２つの検査間の差異を、差異の９５％ＣＩ中に０％が含まれない場合に有意であるとみなした。コーエンカッパ統計を用いて、ＬＡＭ検査の２人の独立したリーダーの間で陽性および陰性の結果の一致を計算した。事後分析に加えて、微生物学的に確認されたＴＢ患者（少なくとも１つの任意のタイプの臨床検体中の培養物またはＸｐｅｒｔによるＭｔｂの検出として定義された）の合計数を、受診の最初の２４時間以内に収集した試料の、試験下の抗体、アリーアＬＦ−ＬＡＭ、喀痰Ｘｐｅｒｔ（カートリッジバージョンＧ４）および喀痰スメア顕微鏡検査の単一検査の比較による診断収率を計算するための共通因子（分母）として使用した。この分析は、コホート２に限定された。理由は、このコホートが、入院の最初の２４時間以内に全ての患者中のこれらの診断試料（可能な場合にはいつでも、血液、尿および２回の喀痰試料）を収集するように組織的に試みることにより、診断収率を評価するようにデザインされたためである。データ分析を、Ｒ（バージョン３．５．１）およびＭａｔｌａｂバージョン２０１７ｂを用いて実施した。
【０１４８】
結果
患者
全体で、１１８８人の患者が適格であり、レトロスペクティブ検査を考慮した；２２０人の患者は、尿試料が利用できない（ｎ＝９３）、試験下の抗体検査に失敗した（ｎ＝６）または分類不可能である（ｎ＝１２１）という理由で主分析から除外された。「分類不可能」に対する主要な理由は、診断実施前に死亡（ｎ＝６２）および生命状態または臨床的状態の改善が診断には必要である場合の追跡不能（ｎ＝１７）であった。主解析に含めた９６８人の患者のうち、６００人（６２％）が明確なＴＢとして、９１人（９％）がＴＢの可能性として、および２７７人（２９％）がＴＢでないとして分類された。ＴＢ診断のための微生物学的参照基準は、合計６，３９７件の培養物検査およびＸｐｅｒｔ検査（平均６．２件／患者）により情報提供され、ならびに３，２６１件の喀痰試料検査および３，１３６件の非喀痰検査を含んだ。合計２３６人の患者（２４．４％）が、喀痰試料を提供できなかった。明確なＴＢ診断は、１９．５％の患者（１１７人／６００人）の非喀痰試料由来の結果に基づいた。ＴＢ発生率は、コホート１、２および３に対し、それぞれ４９％、３８％、および８２％であった。殆どの患者は、若い免疫無防備状態の成人（中間年齢：３５歳）であり、中央値ＣＤ４カウントは、コホート１、２、および３に対しそれぞれ、１１３細胞／μｌ、１５３細胞／μｌ、および５９細胞／μｌであった。全コホートでは、４５％が事前のＴＢ治療歴を有し、コホート１および３の全ての患者および９０％のコホート２が明確なＷＨＯのＴＢのための症状選別を有した。
【０１４９】
試験下の抗体およびアリーアＬＦ−ＬＡＭの精度
分析は、ＭＲＳに対してアリーアＬＦ−ＬＡＭの４２．３％（９５％ＣＩ：３１．７〜５１．８）の感度に比較して、試験下の抗体に対し、７０．４％（５３．０〜８３．１）の感度を示し、２種の検査間の差異は２８．１％（２１．５〜３４．４）であった（図８）。ＭＲＳに対する最大の試験下の抗体感度は、コホート２（６５．９％）およびコホート１（５９．６％）に比べて、より進行したＨＩＶ関連免疫抑制を有する患者を登録した（すなわち、より多くの患者が１００細胞／μｌ未満のＣＤ４カウントを有する）コホート３（８１．０％）で観察された。患者をＣＤ４カウントで層別化すると、増加する感度（両アッセイに対し）と減少するＣＤ４カウントの間に半比例関係が存在する。１００細胞／μｌ未満のＣＤ４カウントを有する患者では、アリーアＬＦ−ＬＡＭの５７．３％（４２．２〜６９．６）の感度に比較して、試験下の抗体は、８４．２％（７１．４〜９１．４）の感度を有し、２種の検査間の差異は２６．９％（１６．８〜３６．７）であった（図８）。感度（３１．８％；２２．７〜４０．３）の類似の差異は、より多くの免疫正常患者（ＣＤ４＞２００細胞／μｌ）で観察されたが、全体感度は、この集団では両アッセイでより低かった；試験下の抗体で４４．０％（２９．７〜５８．５）およびアリーアＬＦ−ＬＡＭで１２．２％（４．６〜２３．７）。ＣＲＳの使用により、両アッセイの感度がわずかに低下し、全体試験下の抗体の点推定は、６４．９％（５０．１〜７６．７）およびアリーアＬＦ−ＬＡＭの点推定は、３８．２％（２８．１〜４７．３）であった。試験下の抗体とアリーアＬＦ−ＬＡＭの間の感度の差異の９５％信頼区間は、ゼロで重なり合わなかったので（３つのコホート、およびＣＤ４層内の全体で）、試験下の抗体は統計的にアリーアＬＦ−ＬＡＭより有意により高感度であると見なされた（図８）。ＭＲＳに対して、特異性の推定値は、試験下の抗体、およびアリーアＬＦ−ＬＡＭで、それぞれ、９０．８％（８６．０〜９４．４）および９５．０％（８７．７〜９８．８）であり、統計的非有意差を表す（−４．２％；１２．７〜４．４）。ＣＲＳを用いた、特異性の推定値は、試験下の抗体で９５．７％（９２．０〜９８．０）、およびアリーアＬＦ−ＬＡＭで９８．２％（９５．７〜９９．６）に増大し、この場合も、統計的非有意差を表す（−２．５％；−１１．２〜６．３）。試験下の抗体アッセイの特異性は、ＣＤ４＞１００細胞／μｌを有するものに比べて、ＣＤ４≦１００細胞／μｌを有するものの中で、低かった（ＣＲＳを使って９１．２％）（図８）。ＣＲＳを使って、１１種の試験下の抗体の擬陽性の試料のうちの８種が、ＣＤ４カウント、≦１００細胞／μｌの患者由来であった。ＣＲＳを使って、３つの異なるコホートのＰＰＶは、試験下の抗体およびアリーアＬＦ−ＬＡＭに対しそれぞれ、９０．６〜９９．４％および９３．８〜１００．０％の範囲であった。ＮＰＶは、試験下の抗体およびアリーアＬＦ−ＬＡＭに対しそれぞれ、２４．８〜７１．８％および１３．７〜６２．５％の範囲であった。陽性尤度比（ＬＲ＋）は、試験下の抗体およびアリーアＬＦ−ＬＡＭに対しそれぞれ、８．９〜１８．５および１３．８〜１７．３の範囲であった。陰性尤度比（ＬＲ−）は、試験下の抗体およびアリーアＬＦ−ＬＡＭに対しそれぞれ、０．３〜０．４および０．６〜０．７の範囲であった。
【０１５０】
入院の２４時間以内の診断収率
コホート２からの合計４２０人の患者が、診断収率の分析に適格であった。適格患者中、３６．４％（１５３／４２０）のみが入院の最初の２４時間内に喀痰試料を生成可能であり、一方、９９．５％（４１８／４２０）が、このコホートに対し、前に説明のように尿試料を提供できた。合計１４１人の患者が、微生物学的に確認されたＴＢを有した。合計５９．６％（８４／１４１）のＴＢ症例が、迅速検査を用いて入院の最初の２４時間に収集した試料により診断可能であった：喀痰Ｘｐｅｒｔから２６．２％（３７．１４１）および１ｍｌの投入体積を利用して尿Ｘｐｅｒｔから４１．８％（５９／１４１）。ＴＢ診断の残りの４０．４％（５７／１４１）は、最初の２４時間に達成できず、患者の入院中の任意の時点で収集された任意の検体についてのマイコバクテリア培養物により達成され、２０〜４０ｍｌの尿由来の濃縮試料に対してＸｐｅｒｔにより診断、または最初の２４時間後に収集された検体に対するＸｐｅｒｔ検査により診断された。培養およびＸｐｅｒｔ検査のために収集された追加の検体は、腹水、血液、尿、喀痰、脳脊髄液、胃洗浄液膿または胸水を含んだ。図９は、最初の２４時間からの他の迅速診断法と比較した、試験下の抗体およびアリーアＬＦ−ＬＡＭの診断収率を示す。試験下の抗体の導入で、アリーアＬＦ−ＬＡＭの４３．３％（６１／１４１）に比べて、ＴＢ症例の６４．５％（９１／１４１）を、受診の数時間以内に臨床で迅速に診断できたであろう。入院の最初の２４時間以内の喀痰Ｘｐｅｒｔと試験下の抗体の組み合わせは、微生物学的に確認された症例の７２．３％（１０２／１４１）を診断できたであろう。喀痰スメア顕微鏡と試験下の抗体の組み合わせは、６９．５％（９８／１４１）の診断収率を有したであろう。
【０１５１】
失敗率およびリーダーの一致
合計で、１．６％（１８／１０９５）の試験下の抗体アッセイが最初の試みで失敗した。繰り返し得る１５件のうち、３件が２回目の試みに失敗し、１．９％の合計の全体エラー率（２１／１１１０検査）をもたらす。アリーアＬＦ−ＬＡＭエラー率は、最初の試みで０．４％（４／１０９５）であり、全４件の反復検査は、第２の試みで結果が得られた。まとめると、試験下の抗体アッセイは、アリーアＬＦ−ＬＡＭに類似の失敗率を有し、試験下の抗体アッセイの失敗率は、このようなアッセイの製造で一般に使用される標準的品質管理手段によりさらに減らすことができる。同じ検査の２人の独立の盲検下の目視読み取りの一致率は、試験下の抗体およびアリーアＬＦ−ＬＡＭの両方に対し、高かった。試験下の抗体は、９７．０％（９３８／９６７；カッパ係数０．９４）の一致率を有し、一方、アリーアＬＦ−ＬＡＭリーダー間の一致率は、９６．７％（９３４／９６６；カッパ計数０．９２）であった。
【０１５２】
考察
高負荷環境中でのこの９６８人の入院ＰＬＨＩＶの評価では、試験下の抗体ポイント・オブ・ケアアッセイは、アリーアＬＦ−ＬＡＭよりも有意により高い比率のＴＢ患者を特定し、同時に、同等の特異性を維持した。全てのサブ解析では、試験下の抗体の感度は、アリーアＬＦ−ＬＡＭより有意に高かった（２２〜３５％の範囲）。最大のリスクを有する患者（ＣＤ４≦１００細胞／μｌの患者）では、試験下の抗体は、８４．２％の最高の感度を有し、これは、アリーアＬＦ−ＬＡＭより２６．９％高かった。喀痰Ｘｐｅｒｔとの組み合わせでは、試験下の抗体は、入院の最初の日に、微生物学的に確証されたＴＢのほぼ３／４を診断し得る。アリーアＬＦ−ＬＡＭに対するＷＨＯ推奨に基づき形成したメタアナリシスは、ＰＬＨＩＶ中の４５％の全体感度を報告し、これは、この試験で見られるアリーアＬＦ−ＬＡＭの感度４２〜３％と類似であり、評価された集団がＷＨＯメタアナリシスの集団と類似であることを示唆する。
【０１５３】
まとめると、これらの結果は、臨床診療で実施され、かつ適切な治療と結びつけられる場合、試験下の抗体ポイント・オブ・ケアアッセイは、入院患者中の大きな比率のＨＩＶ関連ＴＢの早期診断を可能にすることにより、多くの命を救うことができるであろう。試験下の抗体特異性の点推定は、アリーアＬＦ−ＬＡＭに比べて低かった。試験下の抗体とアリーアＬＦ−ＬＡＭの間の特異性の差異は有意ではないが、アリーアＬＦ−ＬＡＭおよび試験下の抗体の両方の低減した特異性は、完全な感度を欠く不完全な参照基準により部分的に説明できるであろう。既存の参照基準は、これらの患者が少菌型の疾患および／または肺外結核を有する可能性がより高く、診断をより困難にするので、免疫無防備状態のＰＬＨＩＶ中のＴＢを特定するその能力に特に限界がある。
【０１５４】
不完全な参照基準は、より高好感度の検査に不釣り合いに影響を与え、擬陽性を増大させ、すなわち、より高感度の試験下の抗体アッセイ場合に、より低い特異性を生じる可能性がある。この試験でのＣＤ４カウントの低減に伴い認められる特異性の低減、およびＭＲＳに比べてＣＲＳで認められる改善された特異性は、この説明をさらに裏付ける。共通の尿路病原体および急成長非結核性マイコバクテリアに対する交差反応性は、試験下の抗体に対する以前の試験（実施例１、表２Ａ）では除外された。
【０１５５】
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【０１５６】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供され得ることも理解されよう。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態として説明されている本発明の種々の特徴は、別々にまたは任意の好適な副組み合わせで提供され得る。
【０１５７】
本発明はその特定の実施形態と共に説明されてきたが、多くの代替物、修正物および変形物があることは当業者には明らかであろう。従って、本発明は、添付の請求項の趣旨と広い範囲に入るこのような代替物、修正物および変形物のすべてを包含することが意図されている。本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願のそれぞれがあたかも具体的に、個別に参照により組み込まれることが示されているのと同程度に、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本出願における任意の文献の引用または特定が、このような文献が本発明の先行技術として利用できるということの承認と解釈されるべきではない。
【図１Ａ】
2021521462.tif 000012
【図１Ｂ】
2021521462.tif 000013
【図１Ｃ】
2021521462.tif 000014
【図１Ｄ】
2021521462.tif 000015
【図１Ｅ】
2021521462.tif 000016
【図１Ｆ】
2021521462.tif 000017
【図２Ａ】
2021521462.tif 000018
【図２Ｂ】
2021521462.tif 000019
【図３Ａ】
2021521462.tif 000020
【図３Ｂ】
2021521462.tif 000021
【図３Ｃ】
2021521462.tif 000022
【図４】
2021521462.tif 000023
【図５Ａ】
2021521462.tif 000024
【図５Ｂ】
2021521462.tif 000025
【図６】
2021521462.tif 000026
【図７−１】
2021521462.tif 000027
【図７−２】
2021521462.tif 000028
【図８Ａ】
2021521462.tif 000029
【図８Ｂ】
2021521462.tif 000030
【図８Ｃ】
2021521462.tif 000031
【図９】
2021521462.tif 000032
【国際調査報告】
2021521462.tif 000033
2021521462.tif 000034