(57)【要約】  本発明は、遺伝子治療のための遺伝子補正された幹細胞を製造および使用するためのシステムおよび方法を提供する。特に、対象の幹細胞が高ストリンジェンシーＣＤ３４＋選択および低ストリンジェンシーＣＤ３４＋選択の組み合わせによって選択され、ＦＡＮＣタンパク質をコードする遺伝子治療ベクター、または遺伝子編集システムを使用して遺伝的に改変され、対象に投与される、ファンコニ貧血を治療するための方法が、本明細書において提供される。2021521180.tif 000033
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファンコニ貧血の治療を必要とする対象においてファンコニ貧血を治療する方法であって、
（ｉ）前記対象から得られた第１の生体試料から高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって調製された、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団、および
（ｉｉ）前記対象から得られた第２の生体試料から低ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって調製された、低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団
を前記対象に提供する段階を含み、
前記高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および／または前記低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の一方または両方が、
（ｉ）ファンコニ貧血相補群（ＦＡＮＣ）ポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくは断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む、組換え遺伝子治療ベクター、または
（ｉｉ）内因性変異ＦＡＮＣ遺伝子の直接修復を標的とする遺伝子編集システム
によって遺伝的に改変され、かつ
前記第１の生体試料および前記第２の生体試料が、任意で同じ生体試料である、前記方法。
【請求項２】
（ａ）高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって、前記対象から得られた第１の生体試料から高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を調製する段階、
（ｂ）低ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって、前記対象から得られた第２の生体試料から低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を調製する段階、
（ｃ）前記高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団または前記低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の一方または両方を、
（ｉ）ファンコニ貧血相補群Ａ（ＦＡＮＣＡ）ポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくは断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む、前記組換え遺伝子治療ベクター、または
（ｉｉ）前記内因性変異ＦＡＮＣ遺伝子の直接修復を標的とする前記遺伝子編集システム
で遺伝的に改変する段階、ならびに
（ｄ）前記高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および前記低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を前記対象に提供する段階
をさらに含み、
それにより、ファンコニ貧血を治療する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の生体試料および前記第２の生体試料が、それぞれ独立して、末梢血または骨髄である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の生体試料および前記第２の生体試料が、前記対象がＧ−ＣＳＦ、プレリキサフォル、またはＧ−ＣＳＦおよびプレリキサフォルの組み合わせで治療された後に得られた末梢血である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することが、ＣＤ３４＋細胞と結合する捕捉マトリックスに前記第１の生体試料を適用すること、洗浄緩衝液を使用して前記捕捉マトリックスを１回以上洗浄すること、および溶出緩衝液を使用して前記捕捉マトリックスから前記高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を溶出することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記低ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することが、ＣＤ３４＋細胞と結合する捕捉マトリックスに前記第２の生体試料を適用すること、前記第２の生体試料の非結合画分を前記捕捉マトリックスに流れさせること、および溶出緩衝液を使用して前記捕捉マトリックスから前記低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を溶出することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団が遺伝的に改変される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団が遺伝的に改変される、請求項１、２、６、または７に記載の方法。
【請求項９】
前記高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の割合が、前記低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の割合よりも２〜４倍大きい、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団が、２０％を超える純度または３０％を超える純度でＣＤ３４＋細胞を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団が、３０％未満の純度でＣＤ３４＋細胞を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団が、２０％を超える収率でＣＤ３４＋細胞を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団が、３５％を超える収率でＣＤ３４＋細胞を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記組換え遺伝子治療ベクターが、
（ａ）真核生物で活性なプロモーター配列、および
（ｂ）ヒトＦＡＮＣ遺伝子ポリペプチドまたはその機能的断片もしくはバリアントをコードする配列
を５’から３’の順序で含むポリヌクレオチド配列を含み、
前記ヒトＦＡＮＣ遺伝子ポリペプチドまたはその機能的断片もしくはバリアントをコードする配列が、前記真核生物で活性なプロモーター配列と作動可能に連結され、かつ前記ＦＡＮＣ遺伝子が、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、およびＦＡＮＣＧから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子編集システムが、
（ａ）Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）ｇＲＮＡ、および
（ｃ）内因性ＦＡＮＣ遺伝子における１つ以上の変異と重複する前記ＦＡＮＣ遺伝子またはその断片を含む配列を含む、修復鋳型
を含み、
ｓｇＲＮＡが、前記修復鋳型を前記ＦＡＮＣ遺伝子に誘導するように構成され、前記ＦＡＮＣ遺伝子が、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、およびＦＡＮＣＧから選択され、かつ前記遺伝子編集システムは、内因性ＦＡＮＣ遺伝子の直接修復が可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象におけるファンコニ貧血の血液学的徴候の発生を阻害し、進行を停止し、および／または進行を逆転させる方法であって、前記ファンコニ貧血の血液学的徴候が、骨髄不全、血小板減少、白血球減少、汎血球減少、好中球減少、および貧血のうちの１つ以上から任意に選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記選択がビーズ系磁気選択によって実行される、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記末梢血に対して１回以上のアフェレーシスを実行することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１９】
経時的に遺伝子改変フランコニア貧血細胞の進行的増加をもたらす、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象に前記高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および前記低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を投与する前に前記対象において減少していた１つ以上の造血系統の回復をもたらす、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上の造血系統が、リンパ球、好酸球、好中球、赤血球、および血小板のうちの１つ以上を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象に前記高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および前記低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を投与する前に前記対象において減少していた１つ以上の血液学的パラメータの回復をもたらす、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記血液学的パラメータがヘモグロビンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ファンコニ貧血の治療のための遺伝的に改変された細胞を調製するための方法であって、
（ａ）高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって、対象から得られた第１の生体試料から高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を調製する段階、
（ｂ）低ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって、対象から得られた第２の生体試料から低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を調製する段階、および
（ｃ）前記高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団または前記低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の一方または両方を、ファンコニ貧血のための組換え遺伝子治療ベクターで遺伝的に改変する段階であって、前記遺伝子治療ベクターが、ファンコニ貧血相補群（ＦＡＮＣ）ポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくは断片をコードするポリヌクレオチドを任意に含む、段階
を含む、前記方法。
【請求項２５】
前記第１の生体試料および前記第２の生体試料が、それぞれ独立して、末梢血または骨髄である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の生体試料および前記第２の生体試料が、前記対象がＧ−ＣＳＦ、プレリキサフォル、またはＧ−ＣＳＦおよびプレリキサフォルの組み合わせで治療された後に得られた末梢血である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することが、ＣＤ３４＋細胞と結合する捕捉マトリックスに前記第１の生体試料を適用すること、洗浄緩衝液を使用して前記捕捉マトリックスを１回以上洗浄すること、および溶出緩衝液を使用して前記捕捉マトリックスから前記高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を溶出することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記低ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することが、ＣＤ３４＋細胞と結合する捕捉マトリックスに前記第２の生体試料を適用すること、前記第２の生体試料の非結合画分を前記捕捉マトリックスに流れさせること、および溶出緩衝液を使用して前記捕捉マトリックスから前記低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を溶出することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団が、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団が、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触する、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の割合が、前記低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の割合よりも２〜４倍大きい、請求項２４０〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団が、２０％を超える純度または３０％を超える純度でＣＤ３４＋細胞を含む、請求項２４〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団が、３０％未満の純度でＣＤ３４＋細胞を含む、請求項２４〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団が、２０％を超える収率でＣＤ３４＋細胞を含む、請求項２４〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団が、３５％を超える収率でＣＤ３４＋細胞を含む、請求項２４〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ファンコニ貧血のための組換え遺伝子治療ベクターが、
（ａ）真核生物で活性なプロモーター配列、および
（ｂ）ヒトＦＡＮＣ遺伝子ポリペプチドまたはその機能的断片もしくはバリアントをコードする配列
を５’から３’の順序で含むポリヌクレオチド配列を含み、
前記ヒトＦＡＮＣ遺伝子ポリペプチドまたはその機能的断片もしくはバリアントをコードする配列が、前記真核生物で活性なプロモーター配列と作動可能に連結され、かつ前記ＦＡＮＣ遺伝子が、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、およびＦＡＮＣＧから選択される、請求項２４〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ファンコニ貧血のための組換え遺伝子治療ベクターが、内因性ＦＡＮＣ遺伝子の直接修復が可能である遺伝子編集システムを含み、前記遺伝子編集システムが、
（ａ）Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）ｇＲＮＡ、および
（ｃ）前記内因性ＦＡＮＣ遺伝子における１つ以上の変異と重複する前記ＦＡＮＣ遺伝子またはその断片を含む配列を含む、修復鋳型
を含み、
前記ｓｇＲＮＡが、前記修復鋳型を前記ＦＡＮＣ遺伝子に誘導するように構成され、前記ＦＡＮＣ遺伝子が、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、およびＦＡＮＣＧから選択される、請求項２４〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記（ａ）および／または（ｂ）の選択が、ビーズ系磁気選択によって実行される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３９】
前記（ａ）および／または（ｂ）の選択が、ＣＤ３４と特異的に結合する抗体またはその機能的断片を使用して実行される、請求項２４または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記（ａ）および／または（ｂ）の選択が、１０〜２０ｍＬ／分の流速を使用して実行される、請求項２４または３８に記載の方法。
【請求項４１】
（ａ）第１の生体試料から高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって調製された、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団、および
（ｂ）第２の生体試料から低ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって調製された、低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団
を含み、
前記高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団または前記低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の一方または両方が、ファンコニ貧血のための組換え遺伝子治療ベクターと接触する、前記組成物。
【請求項４２】
前記第１の生体試料および前記第２の生体試料が、それぞれ独立して、末梢血または骨髄である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記第１の生体試料および前記第２の生体試料が、対象がＧ−ＣＳＦ、プレリキサフォル、またはＧ−ＣＳＦおよびプレリキサフォルの組成物で治療された後に前記対象から得られた末梢血である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４４】
前記高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の割合が、前記低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の割合よりも２〜４倍大きい、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団が、２０％を超える純度または３０％を超える純度でＣＤ３４＋細胞を含む、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団が、３０％未満の純度でＣＤ３４＋細胞を含む、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４７】
前記高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団が、２０％を超える収率でＣＤ３４＋細胞を含む、請求項４１〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団が、３５％を超える収率でＣＤ３４＋細胞を含む、請求項４１〜４７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団が、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触する、請求項４１〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団が、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触する、請求項４１〜４９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
前記組換え遺伝子送達ベクターが、
（ａ）真核生物で活性なプロモーター配列、および
（ｂ）ヒトＦＡＮＣＡポリペプチドまたはその機能的断片もしくはバリアントをコードする配列
を５’から３’の順序で含むポリヌクレオチド配列を含み、
前記ヒトＦＡＮＣポリペプチドまたはその機能的断片もしくはバリアントをコードする配列が、前記真核生物で活性なプロモーター配列と作動可能に連結され、かつ前記ＦＡＮＣ遺伝子が、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、およびＦＡＮＣＧから選択される、請求項４１〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５２】
請求項４１〜５１のいずれか一項に記載の組成物および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して、ファンコニ貧血（ＦＡ）の治療を含む、ＨＳＣ移植に使用するための遺伝子改変された造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む造血細胞の集団を調製する方法に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月１１日に出願された米国仮出願第６２／６５６，２９２号に対する優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本明細書に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。配列表のコンピュータ可読形式コピー（ファイル名：ＲＯＰＡ＿００８＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５、記録日：２０１９年４月１１日、ファイルサイズ約５２キロバイト）。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
エクスビボを介した標的細胞への遺伝子導入は、細胞および遺伝子治療に臨床的に適用される方法である。ＨＳＣを含むＣＤ３４濃縮細胞集団の単離およびエクスビボでの遺伝的な改変は、非標的細胞への遺伝子導入の減少、およびそれにより、例えば、遺伝子治療ベクターなどの遺伝的な改変因子の必要性／量を低減する、２つの大きな利点を提供し、これにより、遺伝的に改変されたＨＳＣの臨床生産に関連するコストが低減される。遺伝的に改変されたＨＳＣの移植のためのモデル系は、ＦＡである。ＦＡの状況下において開発された方法は、他の障害および状態にも適用可能である。
【０００５】
ＦＡは、常染色体劣性疾患であり（Ｘ連結型である補体群ＦＡ−Ｂを除く）、患者の生存期間の中央値は、約２４年である（Ｂｕｔｔｕｒｉｎｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｌｏｏｄ  ８４：１６５０−１６５５（非特許文献1）；Ｋｕｔｌｅｒ  ＤＩ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０１：１２４９−１２５６（非特許文献2））。出生時に、これらの患者の血球数は概して正常である。大赤血球症は、多くの場合、これらの患者で最初に検出される血液学的異常である。これは通常、血小板減少、貧血、および汎血球減少と共に発生する。骨髄不全（ＢＭＦ）は、通常、５〜１０年後にこれらの患者で観察され、血液学的疾患の平均発症年齢は７歳である。ＦＡを有する患者の約８０％は、生後１０年間にＢＭＦの証拠を開発するであろう。これまでの疫学的研究に基づいて、悪性エピソードが形成不全前に現れない場合、ＦＡを有する事実上すべての患者は４０歳までにＢＭＦを発症し（Ｂｕｔｔｕｒｉｎｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｌｏｏｄ  ８４：１６５０−１６５５；Ｋｕｔｌｅｒ  ＤＩ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０１：１２４９−１２５６）、これは、これらの患者における死亡の主な原因である。ＦＡの複雑な臨床症状のため、これらの患者の管理は、主に骨髄不全（ＢＭＦ）、骨髄性白血病、および固形腫瘍の臨床症状の改善に焦点を当てている。
【０００６】
ＦＡおよび他の疾患の治療は、遺伝的に改変したＨＳＣの効率的な生着に依存する。したがって、ＦＡ患者を含む患者において高レベルの生着を達成する遺伝的に改変されたＨＳＣを含む細胞集団を調製する方法が必要とされている。本発明は、この必要性などに対応する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｕｔｔｕｒｉｎｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｌｏｏｄ  ８４：１６５０−１６５５
【非特許文献２】Ｋｕｔｌｅｒ  ＤＩ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０１：１２４９−１２５６
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、概して、血液悪性腫瘍および幹細胞移植の分野に関し、特に、遺伝子送達および遺伝子修復の両方を含む、遺伝子治療に使用するためのＣＤ３４＋細胞の濃縮された幹細胞集団の製造および使用に関する。特に、これらのＣＤ３４濃縮細胞集団は、哺乳動物、特に、ファンコニ貧血相補群Ａ（ＦＡＮＣＡ）、群Ｃ（ＦＡＮＣＣ）、または群Ｇ（ＦＡＮＣＧ）遺伝子産物調節不全に関連するヒト疾患、障害、および機能不全を治療するための遺伝子治療において有用である。特定の実施形態では、本開示の方法は、エクスビボで実行され、人体自体では実行されない。
【０００９】
一実施形態では、本開示は、ファンコニ貧血の治療を必要とする対象においてファンコニ貧血を治療する方法であって、（ｉ）前記対象から得られた第１の生体試料から高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって調製された、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団、および（ｉｉ）前記対象から得られた第２の生体試料から低ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって調製された低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の組み合わせを対象に提供することを含み、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および／または低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の一方または両方が、機能的バリアントまたは断片または天然に存在するＦＡＮＣタンパク質（例えば、ＦＡＮＣＡまたはＦＡＮＣＣまたはＦＡＮＣＧ）を含むＦＡＮＣポリペプチドをコードする組換え遺伝子治療ベクターで形質導入されており、第１の生体試料および第２の生生体試料が、任意で同じ生体試料であり、それによりファンコニ貧血を治療する方法を提供する。
【００１０】
一実施形態では、本方法は、高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４濃縮細胞集団を調製する段階、低ストリンジェンシー条件下で別のＣＤ３４濃縮細胞集団を調製する段階、ＣＤ３４濃縮細胞集団のうちの一方または両方を組換え遺伝子治療ベクターと接触させる段階、および２つのＣＤ３４濃縮細胞集団を対象に順次または同時に投与する段階を含み、それによりファンコニ貧血を治療することにより、対象のファンコニ貧血を治療することを含む。特定の実施形態では、遺伝子治療ベクターと接触した細胞集団（複数可）は結果として形質導入され、したがって、ファンコニ貧血の治療のための治療用核酸またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、組換え遺伝子治療ベクターは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５０８３７号に記載されるベクターのような、治療用ＦＡＮＣ（例えば、ＦＡＮＣＡまたはＦＡＮＣＣまたはＦＡＮＣＧ）遺伝子セグメントまたはタンパク質をコードする自己不活化レンチウイルスベクターを含む。一実施形態では、組換え遺伝子治療ベクターは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、および１つ以上の変異が内因性ＦＡＮＣ遺伝子と重複するＦＡＮＣ遺伝子またはＦＡＮＣ遺伝子の断片を含む修復鋳型を送達することによって、内因性ＦＡＮＣ遺伝子（例えば、ＦＡＮＣＡまたはＦＡＮＣＣまたはＦＡＮＣＧ）を修復するように構成される。
【００１１】
一実施形態では、本開示は、ファンコニ貧血の治療を必要とする対象においてそれを治療するための方法であって、高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって、対象から得られた第１の生体試料から高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を調製する段階、低ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって、対象から得られた第２の生体試料から低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を調製する段階、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団または低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の一方または両方をファンコニ貧血に対する組換え遺伝子治療ベクターと接触させる段階、ならびに高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を対象に投与する段階を含み、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団または低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の一方または両方が、組換え遺伝子治療ベクターと接触させるまたは形質導入され、それによりファンコニ貧血を治療する、方法を提供する。
【００１２】
本発明の一態様では、第１の生体試料および第２の生体試料は、それぞれ独立して、末梢血または骨髄である。一態様では、第１の生体試料および第２の生体試料は、対象が顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、プレリキサフォル、またはＧ−ＣＳＦおよびプレリキサフォルの組み合わせで治療された後に得られた末梢血である。
【００１３】
一実施形態では、本方法のうちのいずれかでは、高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することをさらに含み、ＣＤ３４＋細胞と結合する捕捉マトリックスに第１の生体試料を適用することと、洗浄緩衝液を使用して捕捉マトリックスを１回以上洗浄することと、溶出緩衝液を使用して捕捉マトリックスから高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を溶出することとを含み得る。一実施形態では、適用ステップは、５〜１０  ｍＬ／分、５〜１５ｍＬ／分、１５〜２０ｍＬ／分、２０〜２５ｍＬ／分、または２５〜３０ｍＬ／分で実行される。一実施形態では、溶出ステップは、５〜１０ｍＬ／分、５〜１５ｍＬ／分、１５〜２０ｍＬ／分、２０〜２５ｍＬ／分、または２５〜３０ｍＬ／分で実行される。一実施形態では、適用ステップは、１０〜２０ｍＬ／分で実行される。一実施形態では、溶出ステップは、２０ｍＬ／分で実行される。
【００１４】
一実施形態では、本方法のうちのいずれかでは、低ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することをさらに含み、ＣＤ３４＋細胞と結合する捕捉マトリックスに第２の生体試料を適用することと、第２の生体試料の非結合画分を捕捉マトリックスに流れさせることと、溶出緩衝液を使用して捕捉マトリックスから低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を溶出することとを含み得る。一実施形態では、適用ステップは、５〜１０ｍＬ／分、５〜１５ｍＬ／分、１５〜２０ｍＬ／分、２０〜２５ｍＬ／分、または２５〜３０ｍＬ／分で実行される。一実施形態では、溶出ステップは、５〜１０ｍＬ／分、５〜１５ｍＬ／分、１５〜２０ｍＬ／分、２０〜２５ｍＬ／分、または２５〜３０ｍＬ／分で実行される。一実施形態では、適用ステップは、１０〜２０ｍＬ／分で実行される。一実施形態では、溶出ステップは、２０ｍＬ／分で実行される。
【００１５】
本発明の一態様では、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および／または低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を、組換え遺伝子療法ベクターと接触させる。いくつかの実施形態では、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の割合は、低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の割合よりも２〜４倍大きい。一実施形態では、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の割合は、約６０％であり、低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の割合は、６０％未満または１５〜６０％または１５〜３０％である。一実施形態では、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の割合は、約７０％以上であり、低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の割合は、１７．５〜３５％である。一実施形態では、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の割合は、約８０％以上であり、低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の割合は、４０％未満または２０〜４０％である。一実施形態では、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の割合は、約９０％以上であり、低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の割合は、４０％未満または２２．５〜４０％である。
【００１６】
本発明の一実施形態では、ファンコニ貧血の治療のための組換え遺伝子治療ベクターは、（ａ）真核生物で活性なプロモーター配列、および（ｂ）機能的断片およびそのバリアントを含む、ヒトＦＡＮＣ遺伝子またはポリペプチドをコードする配列を５’から３’の順序で含むポリヌクレオチド配列を含み、ヒトＦＡＮＣ遺伝子もしくはポリペプチドまたはその機能的断片もしくはバリアントをコードする配列は、真核生物活性プロモーター配列と機能的に連結されており、ＦＡＮＣ遺伝子またはポリペプチドは、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、およびＦＡＮＣＧ、例えば、天然ヒトＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、およびＦＡＮＣＧ、またはその機能的断片もしくはバリアントから選択される。特定の実施形態では、天然ＦＡＮＣタンパク質の機能的断片または機能的バリアントは、天然ＦＡＮＣタンパク質と実質的に同様の生物活性を有する。
【００１７】
本発明の一実施形態では、ファンコニ貧血のための組換え遺伝子治療ベクターは、内因性のＦＡＮＣ遺伝子の指示された修復が可能な遺伝子編集システムを含み、遺伝子編集システムは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ｇＲＮＡと、内因性ＦＡＮＣ遺伝子における１つ以上の変異と重複するＦＡＮＣ遺伝子またはその断片を含む配列を含む修復鋳型とを含み、ｓｇＲＮＡは、修復鋳型をＦＡＮＣ遺伝子に誘導するように構成され、ＦＡＮＣ遺伝子は、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、およびＦＡＮＣＧから選択される。
【００１８】
一実施形態では、選択方法は、ビーズ系磁気選択によって実行される。
【００１９】
一実施形態では、本明細書に開示される方法は、末梢血に対して１回以上のアフェレーシスを実行することをさらに含む。
【００２０】
一態様では、本明細書に開示される方法は、遺伝子改変ファンコニ貧血細胞の経時的な増加をもたらす。
【００２１】
一態様では、本明細書に開示される治療方法は、例えば、限定されないが、骨髄不全、血小板減少、白血球減少、汎血球減少、好中球減少、および貧血のうちの１つ以上など、対象におけるファンコニ貧血の血液学的徴候の発生を阻害し、進行を停止し、および／または進行を逆転させる。
【００２２】
一態様では、本明細書に開示される方法は、例えば、限定されないが、リンパ球、好酸球、好中球、赤血球、および血小板のうちの１つ以上など、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を対象に投与する前に対象において減少していた１つ以上の造血系統の回復をもたらす。特定の実施形態では、本方法は、１つ以上の造血系統の減退の遅延もしくは減少、または１つ以上の造血系統、例えば、リンパ球、好酸球、好中球、赤血球、および血小板のうちの１つ以上の集団の安定化をもたらす。
【００２３】
一態様では、本方法は、ヘモグロビンなど、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を対象に投与する前に対象において減少していた１つ以上の血液学的パラメータの安定化または回復をもたらす。
【００２４】
一実施形態では、本開示は、ファンコニ貧血の治療のための遺伝的に改変された細胞を調製するための方法であって、高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって、対象から得られた第１の生体試料から高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を調製する段階、低ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって、対象から得られた第２の生体試料から低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を調製する段階、および高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団または低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の一方または両方をファンコニ貧血に対する組換え遺伝子治療ベクターと接触させる段階を含む、方法を提供する。特定の実施形態では、遺伝子治療ベクターと接触した細胞集団（複数可）は、遺伝子治療ベクターによって形質導入され、治療用核酸もしくはポリペプチド（例えば、野生型もしくは天然ＦＡＮＣポリペプチドまたはその機能的断片もしくはバリアントであり得るＦＡＮＣポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む形質導入細胞を含む細胞集団をもたらす。
【００２５】
一態様では、低ストリンジェンシーおよび高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団のいずれかまたは両方の選択は、ＣＤ３４と特異的に結合する抗体またはその機能的断片を使用して実行される。一態様では、選択は、１０〜２０ｍＬ／分の流速を使用して実行される。
【００２６】
一実施形態では、本発明は、第１の生体試料から高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって調製された、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団と、第２の生体試料から低ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって調製された、低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団とを含むシステムを提供し、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団または低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の一方または両方は、ファンコニ貧血のための組換え遺伝子治療ベクターと接触しているか、またはそれにより形質導入されている。特定の実施形態では、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む第１の薬学的組成物中に存在し、低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む第２の薬学的組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の両方は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む同じ薬学的組成物中に存在する。特定の実施形態では、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の両方は、ファンコニ貧血の治療のための遺伝子療法ベクターによって形質導入されている。特定の実施形態では、遺伝子治療ベクターおよび／または形質導入細胞は、治療用核酸もしくはポリペプチド（例えば、野生型もしくは天然ＦＡＮＣポリペプチドまたはその機能的断片もしくはバリアントであり得るＦＡＮＣポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００２７】
別の実施形態では、本発明は、第１の生体試料から高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって調製された、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団と、第２の生体試料から低ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって調製された、低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団とを含む薬学的組成物を提供し、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団または低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の一方または両方は、組換え遺伝子療法ベクターで形質導入されている。特定の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、レンチウイルスである。特定の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、治療用ＦＡＮＣ（例えば、ＦＡＮＣＡまたはＦＡＮＣＣまたはＦＡＮＣＧ）遺伝子セグメントもしくはタンパク質またはその機能的バリアントもしくは断片をコードする。薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含み得る。
【００２８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載および特許請求の範囲から明らかであり、それによって包含される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】例示的な組換え遺伝子治療プラスミドベクター、ｐＣＣＬ−ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡＷ−８２−ＲＯのマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
詳細な説明
ファンコニ貧血（ＦＡ）は、製剤製造にとっていくつかの固有な課題を提示する。ＦＡについては、他のエクスビボ遺伝子療法用途と同様に、遺伝子導入のための標的細胞集団は、  ＣＤ３４細胞表面タンパク質を発現する。ＦＡ患者について、ＣＤ３４＋細胞をフローサイトメトリーによって分析すると、ＢＭ細胞の低い割合は、健康な個体と比較したＣＤ３４＋であり、それぞれ１〜３％と比較して０．１〜１．５％である。ＦＡ患者のｍＰＢ出発物質から製造された薬物物質からのより低い絶対ＣＤ３４＋細胞は、年齢とともに減少するＦＡ患者における限られたＣＤ３４＋細胞の確立された特徴を考えると、不思議ではなかった。しかしながら、これは、製造される医薬品の潜在的な有効性に直接影響を及ぼすため、ＦＡ患者からのＣＤ３４＋収率の低下および純度の悪さが懸念されていた。
【００３１】
標準的なＣＤ３４＋細胞濃縮では、ＣＤ３４＋細胞の低い割合（総細胞と比較して）は、免疫磁性ビーズによって結合され、したがって、純度が主な目的であるため、カラムは、比較的急速に充填され（ｍＬ／分）、洗浄は厳格である。本発明者らは、ＦＡ患者からのｍＰＢを使用する際に、このアプローチが低いＣＤ３４収率で不最適な結果をもたらすという問題を認識した。
【００３２】
ＦＡ患者のための標準的なＣＤ３４＋細胞濃縮プロトコルの限界に取り組むために、本発明者らは、より高い収量および有効な製剤をもたらす、ＦＡ患者からのＣＤ３４＋細胞集団を調製するための新しい方法を開発した。これらの方法は、２つの細胞集団を調製することを伴い、１つは標準的なＣＤ３４＋細胞濃縮条件（「高ストリンジェンシー」条件）下で選択され、もう１つは「低ストリンジェンシー」条件下で選択される。これらの２つの細胞集団の一方または両方を好適な遺伝子治療ベクターで形質導入し、ＦＡ患者に投与する。本明細書に示されるように、新しい方法は、有利な治療効果を示す。理論に拘束されることなく、より高い数のＣＤ３４＋細胞または他の細胞の存在またはより低いＣＤ３４＋細胞純度を伴う細胞の調製物中に存在する他の因子のいずれかが、本明細書に開示される方法に従って調製される組成物の驚くべき効力に寄与すると考えられる。
【００３３】
したがって、本開示は、遺伝子改変または遺伝子補正された幹細胞を遺伝子治療のために製造および使用するためのシステムおよび方法を提供する。詳細には、対象の幹細胞が高ストリンジェンシーＣＤ３４＋選択および低ストリンジェンシーＣＤ３４＋選択の組み合わせによって選択され、治療剤（例えば、ＦＡＮＣタンパク質）をコードするベクターで形質導入され、対象に投与される疾患または障害（例えば、ファンコニ貧血）を治療するための方法が本明細書に提供される。予想外に、治療ベクターで形質導入された高ストリンジェンシー選択ＣＤ３４＋細胞および低ストリンジェンシー選択ＣＤ３４＋細胞の組み合わせによる治療は、従来の高ストリンジェンシー製剤よりも低いＣＤ３４＋細胞純度を有する組み合わせであり、治療効果が向上した。
【００３４】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または等価の方法および材料を本発明の実施に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書に参照される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参照は、それらの全体が参照により明示的に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が、支配するであろう。加えて、本明細書に記載される材料、方法、および実施例は例示的であり、限定することを意図するものではない。
【００３５】
一態様では、高ストリンジェンシー条件下および／または低ストリンジェンシー条件下での生体試料からの高ストリンジェンシーおよび低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団（例えば、ＣＤ３４と特異的に結合する抗体またはその機能性断片を用いたビーズ系磁気選択によって）の製造、ならびに哺乳動物、特にヒトにおける疾患、障害、および機能不全の標的遺伝子治療に有用な薬物の調製におけるこれらのＣＤ３４濃縮細胞集団の使用のために提供される。
【００３６】
別の態様では、本発明は、高ストリンジェンシーおよび低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を投与することに基づいて、ファンコニア貧血およびＦＡＮＣ遺伝子産物関連障害を治療するためのＨＳＣ移植レジメンを提供し、ＣＤ３４濃縮細胞集団のいずれかまたは両方は、遺伝子治療ベクター（例えば、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、またはＦＡＮＣＧ遺伝子断片を有するレンチウイルスベクターで形質導入される）と接触するか、またはＦＡＮＣ遺伝子の部位特異的修復を誘導する遺伝子治療ベクター（例えば、ＣＲＩＳＰ−Ｃａｓ）のいずれかと接触する。
【００３７】
いくつかの実施形態では、生体試料は、対象、例えば、治療される対象から得られる末梢血または骨髄である。特定の実施形態では、生体試料は、対象がＧ−ＣＳＦ、プレリキサフォル、またはＧ−ＣＳＦおよびプレリキサフォルの組み合わせで治療された後に得られる末梢血である。一実施形態では、生体試料の一方または両方は、末梢血に対して１回以上のアフェレーシスを実行することによって調製される。本開示は、これらの方法をまとめて「動員白血球アフェレーシス」と称する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することは、ＣＤ３４＋細胞と結合する捕捉マトリックスに生体試料を適用することと、洗浄緩衝液を使用して捕捉マトリックスを１回以上洗浄することと、溶出緩衝液を使用して捕捉マトリックスから高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を溶出することとを含む。いくつかの事例では、生体試料は、２、３、４、５、または６回など、１回以上捕捉マトリックスに再適用される。一実施形態では、適用ステップは、５〜１０ｍＬ／分、５〜１５ｍＬ／分、１５〜２０ｍＬ／分、２０〜２５ｍＬ／分、または２５〜３０ｍＬ／分で実行される。特定の実施形態では、溶出ステップは、５〜１０ｍＬ／分、５〜１５ｍＬ／分、１５〜２０ｍＬ／分、２５〜２５ｍＬ／分、または２５〜３０ｍＬ／分で実行される。一実施形態では、適用ステップは、１０〜２０ｍＬ／分で実行される。一実施形態では、溶出ステップは、２０ｍＬ／分で実行される。いくつかの実施形態では、洗浄ステップは、洗浄緩衝液を使用して捕捉マトリックスを１回以上洗浄することを含む。いくつかの事例において、洗浄緩衝液は、少なくとも１００ｍＬ、少なくとも２００ｍＬ、少なくとも３００ｍＬ、少なくとも４００ｍＬ、少なくとも５００ｍＬ以上の容量を含む。一実施形態では、洗浄ステップは、５〜１０ｍＬ／分、５〜１５ｍＬ／分、１５〜２０ｍＬ／分、２０〜２５ｍＬ／分、または２５〜３０ｍＬ／分で実行される。一実施形態において、洗浄ステップは、１０〜２０ｍＬ／分で実行される。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液は、任意で、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、および／または任意で、例えば、約２．５％ｗ／ｖの濃度のヒト血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、任意で、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、および／または任意で、例えば、約２．５％ｗ／ｖの濃度のヒト血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液および溶出緩衝液は低張性である。
【００３９】
いくつかの実施形態では、低ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞について選択することは、ＣＤ３４＋細胞に結合する捕捉マトリックスに生体試料を適用し、生体試料の非結合画分を捕捉マトリックスに流れさせることと、溶出緩衝液を使用して、低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を捕捉マトリックスから溶出することとを含む。一実施形態では、適用ステップは、１〜２ｍＬ／分、２〜３ｍＬ／分、１〜２ｍＬ／分、１〜２ｍＬ／分、５〜１０ｍＬ／分、５〜１５ｍＬ／分、１５〜２０ｍＬ／分で実行される。一実施形態では、溶出ステップは、５〜１０ｍＬ／分、５〜１５ｍＬ／分、１５〜２０ｍＬ／分、２５〜２５ｍＬ／分、または２５〜３０ｍＬ／分で実行される。一実施形態では、適用ステップは、１０〜２０ｍＬ／分で実行される。いくつかの実施形態では、適用ステップは、高ストリンジェンシー条件下での流速よりも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれより低い流速、例えば、高ストリンジェンシー条件下で使用される流速よりも少なくとも１０％低い、少なくとも２０％低い、少なくとも３０％低い、少なくとも４０％低い、少なくとも５０％低い、少なくとも６０％低い、少なくとも７０％低い、少なくとも８０％低い、または少なくとも９０％低い流速で実行される。いくつかの実施形態では、洗浄ステップは、洗浄緩衝液を使用して捕捉マトリックスを１回以上洗浄することを含む。いくつかの事例では、洗浄緩衝液は、５００ｍＬ、４００ｍＬ、３００ｍＬ、２００ｍＬ、１００ｍＬ以下、例えば、５００ｍＬ未満、４００ｍＬ未満、３００ｍＬ未満、２００ｍＬ未満、または１００ｍＬ未満の容量を含む。いくつかの事例では、洗浄ステップは省略される。一実施形態では、洗浄ステップは、５〜１０ｍＬ／分、５〜１５ｍＬ／分、１５〜２０ｍＬ／分、２０〜２５ｍＬ／分、または２５〜３０ｍＬ／分で実行される。一実施形態において、洗浄ステップは、１０〜２０ｍＬ／分で実行される。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液は、任意で、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、および／または任意で、例えば、約２．５％ｗ／ｖの濃度のヒト血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、任意で、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、および／または任意で、例えば、約２．５％ｗ／ｖの濃度のヒト血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液および溶出緩衝液は低張性である。
【００４０】
いくつかの実施形態では、選択は、ビーズ系磁気選択によって実行される。一実施形態では、ＣＤ３４と特異的に結合する抗体またはその機能的断片は、選択、例えば、ビーズ系磁気選択のために使用される。選択は、いくつかの事例では、１０〜２０ｍＬ／分の流速を使用して実行される。いくつかの事例では、流速は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、もしくはそれ以上のｍＬ／分、またはその間の任意の値である。
【００４１】
実施形態では、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を組換え遺伝子療法ベクターと接触させ、低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を組換え遺伝子療法ベクターと接触させ、または高ストリンジェンシーおよび低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の両方を組換え遺伝子療法ベクターと接触させる。特定の実施形態では、ベクターは、ウイルス、リポソーム、または脂質もしくは脂質様ナノ粒子である。いくつかの事例では、ウイルスは、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、または発泡性ウイルスである。
【００４２】
いくつかの実施形態では、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の割合は、低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の割合よりも２〜４倍大きい。
【００４３】
本発明の方法またはシステムの実施形態では、組換え遺伝子治療ベクターは、（ａ）真核生物で活性なプロモーター配列および（ｂ）ヒトＦＡＮＣ遺伝子ポリペプチドまたはその機能的断片もしくはバリアントをコードする配列を、５’から３’の順序で含むポリヌクレオチド配列を含み、ヒトＦＡＮＣ遺伝子ポリペプチドまたはその機能的断片もしくはバリアントをコードする配列は、真核生物で活性なプロモーター配列と作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＦＡＮＣ遺伝子は、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、およびＦＡＮＣＧから選択される。
【００４４】
一実施形態では、本方法は、対象における疾患または障害（例えば、ファンコニ貧血）の血液学的徴候の発生を阻害し、進行を停止し、および／または進行を逆転させ、かつ任意で、ファンコニ貧血の血液学的徴候は、骨髄不全（ＢＭＦ）、血小板減少、白血球減少、汎血球減少、好中球減少、および貧血のうちの１つ以上から選択される。一実施形態では、本方法は、遺伝子改変フランコニア貧血（または骨髄増殖性障害または免疫不全性障害などの別の疾患または障害に罹患している対象の細胞）細胞の経時的な増加をもたらす。一実施形態では、方法は、高ストリンジェンシーのＣＤ３４濃縮細胞集団および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を対象に投与する前に対象において減少していた１つ以上の血液学的パラメータ（例えば、ヘモグロビン）の回復をもたらす。
【００４５】
一実施形態では、本方法は、対象に高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を投与する前に対象において減少していた１つ以上の造血系統の回復をもたらし、この１つ以上の造血系統は、リンパ球、好酸球、好中球、赤血球、および血小板のうちの１つ以上を含み得る。特定の細胞集団の回復は、いくつかの事例において達成される。回復は、流動活性化セルソーティング、サイトメトリー、または顕微鏡などの当該技術分野で既知の様々な方法によってモニタリングされ得る。
【００４６】
本発明は、これらの方法の実施形態のいずれかにおいて使用するための組成物およびシステムをさらに提供する。本発明は、遺伝子治療ベクター、例えば、ヒトＦＡＮＣタンパク質またはその機能的バリアントもしくは断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子治療ベクターで形質導入されるＣＤ３４濃縮細胞集団を含むが、これらに限定されない、医薬に使用するためのＣＤ３４濃縮細胞集団を提供する。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「高ストリンジェンシー」または「高ストリンジェンシー条件」は、特定の生物学的マーカー、例えば、ＣＤ３４を発現する細胞についての細胞の実質的な濃縮をもたらすことを意図した細胞集団のための濃縮する方法を指す。例えば、臨床的に使用される「高ストリンジェンシー」ＣＤ３４濃縮により、平均値：６１．６％、中央値：６５．７％収率のＣＤ３４＋細胞、平均値：８８．５％、中央値：９５．９％相対純度（Ｎ＝１６６）をもたらす（Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ．２０１６  Ｊｕｌ  １；６２（７）：１２４３−１２４８（ＰＭＩＤ：２８１６４６３８））。「高ストリンジェンシー」は、比較的希少な細胞型であるＣＤ３４＋の実質的な濃縮を目的としたプロセスを指し、これは、通常、動員白血球アフェレーシスまたは骨髄取集において細胞産物の０．２〜２％を構成する。動員白血球アフェレーシスまたは骨髄取集からのＣＤ３４＋細胞の高ストリンジェンシー濃縮は、０．２〜２％から＞８０％に増加している最終的なＣＤ３４＋割合を標的とする。これを達成するために、生体試料を捕捉マトリックスに初期適用した後、本明細書で「洗浄」と称される反復緩衝液交換は、捕捉マトリックスに弱くまたは非特異的に結合した細胞を除去することを目標として実行される。一般に、細胞を捕捉マトリックスから除去し、洗浄サイクルごとに再適用する。除去および再適用は、チューブからピペッティングすることにより手動で、またはポンプおよびチューブシステムを使用して自動的に達成することができる。例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）磁気細胞分離システムと結合されるＱｕａｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＭａｇＣｌｏｕｄｚ（登録商標）を使用して、細胞−磁気粒子複合体を磁気スタンド上のチューブ内で分離し、手動で洗浄する。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システムを使用して、予め設定された自動プログラムは、チューブセット内の磁気カラムに細胞磁粒子複合体を適用し、洗浄／再適用は、バルブポンプシステムを使用して行われる。特定の実施形態では、高ストリンジェンシー条件下での選択は、限定されないが、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ｔｙｔｏ（登録商標）、Ｑｕａｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＭａｇＣｌｏｕｄｚ（登録商標）、ＧＥ  Ｓｅｐａｘ（登録商標）細胞分離システム、Ｔｅｒｕｍｏ  Ｅｌｕｔｒａ（登録商標）細胞分離システム、ＣＯＢＥ  Ｓｐｅｃｔｒａ（登録商標）細胞分離器、ＳｙｎＧｅｎ  ＬＡＢ（登録商標）もしくはＷＡＳＨ（登録商標）システム、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ−Ｋａｂｉ  Ｌｏｖｏ（登録商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システム、またはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）システムを含む様々な機器で実行され得る。選択は、実験室またはポイントオブケアで実行され得る。高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択するための例示的な方法を含む、細胞および細胞集団の調製ならびに濃縮のための詳細な方法は、例えば、国際特許公開第ＷＯ  ２０１６／１１８７８０号に記載される。高ストリンジェンシー選択に有用な例示的な選択方法は、米国特許第８，７２７，１３２号に提供される。
【００４８】
高ストリンジェンシー濃縮プロトコルでは、ＣＤ３４＋細胞を含む生体試料は、ＣＤ３４標識試薬、例えば、直接的に結合された免疫磁気ビーズで標識される。生体試料は、限定されないが、細胞の生存能力と互換性のある緩衝液ｐＨおよび等張性のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を任意で含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの任意の好適な流体に懸濁され得る。いくつかの事例では、使用される流体はまた、約２．５％などの好適な濃度でヒト血清アルブミンを含有する。磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）技術を使用して、生体試料は、標識された後、磁気感受性または強磁性材料を含むカラムに適用される。ＭＡＣＳシステムを使用して、カラムの磁気感受性または強磁性材料は、非標的細胞がカラムを通って流出する能力に影響を与えることなく、標的細胞を保持する。かかる磁気感受性または強磁性材料には、鉄、鋼、コバルトニッケル、およびそれらの合金の他の強磁性希土類金属が含まれる。かかる材料が容易に磁化および消磁され得ることが当業者には理解されるであろう。いくつかの実施形態では、生体試料は、磁気感受性または強磁性材料上で１回以上再循環される。カラム負荷後、結合した細胞を洗浄、溶出、および／または低速でカラム上に再負荷して、濃縮画分の純度を増加させる。好適な洗浄緩衝液としては、（任意に）ＥＤＴＡおよび（任意に）ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳが含まれる。洗浄ステップ中に除去される標識された生体試料の任意の成分は、廃棄物または「非標的」バッグ中に収集される。好適な洗浄ステップの後、高ストリンジェンシー濃縮細胞は、標的細胞バッグに溶出させる。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」は、生体試料中の他の細胞と比較して、生物学的マーカーを発現する細胞の濃縮、すなわち、低減された濃縮を犠牲にして、高ストリンジェンシー選択によって達成されたよりも、濃縮された細胞集団のより高い収量を維持する様式で、特定の生物学的マーカーを発現する細胞、例えばＣＤ３４を発現する細胞についての細胞の濃縮をもたらすことを意図した細胞集団を濃縮する方法を指す。定義により、高ストリンジェンシー条件下での倍率濃縮は、低ストリンジェンシー条件下での倍率濃縮よりも大きい。高ストリンジェンシー（ＣＤ３４または他のマーカー）−濃縮細胞集団における、例えばＣＤ３４＋細胞の倍率濃縮は、いくつかの事例において、低ストリンジェンシー（ＣＤ３４または他のマーカー）濃縮細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の倍率濃縮の２、２．２５、２．５、２．７５、３、３．２５、３．５、３．７５、または４倍である。一実施形態では、高ストリンジェンシー（ＣＤ３４または他のマーカー）濃縮細胞集団における、例えばＣＤ３４＋細胞の倍率濃縮は、低ストリンジェンシー（ＣＤ３４または他のマーカー）濃縮細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の倍率濃縮の２〜４倍である。特定の実施形態では、低ストリンジェンシー条件下での選択は、限定されないが、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ｔｙｔｏ（登録商標）、Ｑｕａｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＭａｇＣｌｏｕｄｚ（登録商標）、ＧＥ  Ｓｅｐａｘ（登録商標）細胞分離システム、Ｔｅｒｕｍｏ  Ｅｌｕｔｒａ（登録商標）細胞分離システム、ＣＯＢＥ  Ｓｐｅｃｔｒａ（登録商標）細胞分離器、ＳｙｎＧｅｎ  ＬＡＢ（登録商標）もしくはＷＡＳＨ（登録商標）システム、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ−Ｋａｂｉ  Ｌｏｖｏ（登録商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システム、またはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）システムを含む様々な機器で実行され得る。選択は、実験室またはポイントオブケアで実行され得る。
【００５０】
低ストリンジェンシー濃縮プロトコルでは、ＣＤ３４＋細胞を含む生体試料は、ＣＤ３４標識試薬、例えば、直接的に結合された免疫磁気ビーズで標識される。磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）技術を使用して、生体試料は、標識された後、高ストリンジェンシー濃縮よりも低い流速で磁気感受性または強磁性材料を含むカラムに適用される。高ストリンジェンシー濃縮と同様に、磁気感受性または強磁性材料は、非標的細胞がカラムを通って流出する能力に影響を与えることなく、標的細胞を保持する。いくつかの実施形態では、生体試料は、磁気感受性または強磁性材料上で１回以上再循環される。カラム負荷後、低ストリンジェンシー濃縮のために、結合された細胞は、より低いストリンジェンシーで洗浄される。次いで、結合された細胞は、収集バッグに溶出させる。
【００５１】
例示的な実施形態では、低ストリンジェンシー濃縮は、高ストリンジェンシーの枯渇（すなわち、標的細胞の除去）を達成することを目的とした「枯渇モード」ソフトウェアプログラムは、代わりに低ストリンジェンシーの濃縮をもたらすように、ＭＡＣＳシステムの標準的な動作手順を修正することによって実行される。枯渇モードでのＭＡＣＳシステムの操作により、生体試料の標的細胞が、濃縮モードでの操作よりも遅いカラム負荷および低いストリンジェンシー洗浄ステップを使用して、カラム内の磁気感受性または強磁性材料に結合される。非標的細胞は、ＭＡＣＳシステムによって洗浄バッグまたはいわゆる「標的」バッグにフラッシュされる。次いで、枯渇モードプログラムは、出力バルブを切り替えて、いわゆる「非標的」バッグに流体を誘導し、その後、カラムを消磁する。消磁されたカラムに液体を流し続けると、低ストリンジェンシー条件下で濃縮されたＣＤ３４＋濃縮細胞集団が、いわゆる「非標的」バッグに溶出し、この方法を使用して標的細胞が収集される。
【００５２】
当業者は、この低ストリンジェンシー濃縮方法が、限定されないが、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ｔｙｔｏ（登録商標）、Ｑｕａｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＭａｇＣｌｏｕｄｚ（登録商標）、ＧＥ  Ｓｅｐａｘ（登録商標）細胞分離システム、Ｔｅｒｕｍｏ  Ｅｌｕｔｒａ（登録商標）細胞分離システム、ＣＯＢＥ  Ｓｐｅｃｔｒａ（登録商標）細胞分離器、ＳｙｎＧｅｎ  ＬＡＢ（登録商標）もしくはＷＡＳＨ（登録商標）システム、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ−Ｋａｂｉ  Ｌｏｖｏ（登録商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システム、またはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）システムを含む様々な機器で実施できることを認識するであろう。当業者は、過度の実験なしに、かかるＭＡＣシステムのソフトウェアを再プログラミングして、その結果、出力バルブは、初期結合ステップの通過画分を廃棄物または「非標的」バッグ（標的バッグではなく）に誘導し、溶出した低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮集団を「標的」バッグに誘導する。実際には、次に、従来のＭＡＣプログラムの通常の洗浄ステップなしに、低ストリンジェンシー濃縮を分離モードで実行する。
【００５３】
本明細書で使用される「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含むか、またはポリヌクレオチドと会合し、細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介するために使用できる高分子または高分子の会合を指す。例示的なベクターには、例えば、プラスミド、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクター）、リポソーム、および他の遺伝子送達ビヒクルが含まれる。
【００５４】
「ＬＶ」という用語は、レンチウイルスの略称であり、ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用され得る。この用語は、別様に必要とされる場合を除いて、全ての亜型、ならびに天然に存在する形態および組換え形態の両方を包含する。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「遺伝子」または「コード配列」という用語は、遺伝子産物をコードするインビトロまたはインビボのヌクレオチド配列を指す。いくつかの事例では、遺伝子は、コード配列、すなわち、遺伝子産物をコードする配列からなるかまたは本質的になる。他の事例では、遺伝子は、追加の非コード配列を含む。例えば、遺伝子は、コード領域の前後の領域、例えば５’非翻訳（５’ＵＴＲ）配列または「リーダー」配列、および３’ＵＴＲ配列または「トレーラー」配列、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含んでもまたは含まなくてもよい。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「治療用遺伝子」は、発現すると、それが存在する細胞もしくは組織、または遺伝子が発現される哺乳動物に有益な効果を与える遺伝子を指す。有益な効果の例としては、状態もしくは疾患の徴候もしくは症状の寛解、状態もしくは疾患の予防もしくは阻害、または所望の特徴の付与が含まれる。治療用遺伝子には、細胞または哺乳動物における遺伝的欠損を補正する遺伝子が含まれる。
【００５７】
本明細書で使用される場合、導入遺伝子は、ベクターによって細胞に送達される遺伝子である。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「遺伝子産物」という用語は、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、もしくは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む干渉ＲＮＡなどのポリヌクレオチド配列の所望の発現産物を指す。特定の実施形態では、遺伝子産物は治療用遺伝子産物であり、発現すると、それが存在する細胞もしくは組織、または遺伝子が発現される哺乳動物に有益な効果を与える。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。また、この用語は、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、ペグ化、リン酸化、または標識構成成分との抱合で改変されているアミノ酸ポリマーも包含する。
【００６０】
「含む」とは、列挙された要素が、例えば、組成物、方法、キットなどにおいて必要とされるが、例えば、特許請求の範囲に記載の範囲内で組成物、方法、キットなどを形成するために他の要素が含まれていてもよいことを意味する。例えば、プロモーターに作動可能に連結された治療用ポリペプチドをコードする遺伝子を「含む」発現カセットは、遺伝子およびプロモーターに加えて他の要素、例えば、ポリアデニル化配列、エンハンサ要素、他の遺伝子、リンカードメインなどを含み得る発現カセットである。例えば、ＣＤ３４濃縮細胞集団を調製することを「含む」調製方法または治療方法は、ＣＤ３４濃縮細胞集団を調製するための別の段階、例えば、幹細胞を動員するための薬剤を投与する段階、誘導療法を投与する段階、またはそれを組み合わせて薬物を共投与する段階を含み得る。
【００６１】
低ストリンジェンシー条件に関して本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、同じ選択ステップ中に同じ試料に適用される追加の高ストリンジェンシー選択を許容すると解釈されるべきではない。低ストリンジェンシー条件下および高ストリンジェンシー条件下の両方で選択を実行することは、高ストリンジェンシー選択をもたらす一方で、低ストリンジェンシー選択は、高ストリンジェンシー条件下での選択を除外するものとして本明細書に明示的に定義されることを理解されたい。低ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞のための選択によって低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を調製することは、生体試料をカラムに負荷してから、低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団をカラムから溶出するまでの間、カラムが高ストリンジェンシー条件下で洗浄されない、他の方法ステップを含み得る。
【００６２】
「から本質的になる」とは、例えば、組成物、方法、キットなどの基本的および新規特徴（複数可）に実質的な影響を与えない特定の材料またはステップに対して記載される、例えば、組成物、方法、キットなどの範囲の限定を意味する。例えば、プロモーターに作動可能に連結された治療用ポリペプチドをコードする遺伝子、およびポリアデニル化配列「から本質的になる」は、それらが遺伝子の転写または翻訳に実質的な影響を与えない限り、追加の配列、例えば、リンカー配列を含み得る。別の例として、列挙される配列「から本質的になる」バリアント、または変異体、ポリペプチド断片は、それが由来する全長ナイーブポリペプチドに基づく配列の境界に、列挙された配列のアミノ酸配列プラスまたはマイナス約１０アミノ酸残基を有し、例えば、列挙される結合アミノ酸残基よりも１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１残基少ない、または列挙される結合アミノ酸残基よりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０残基多い。
【００６３】
「からなる」とは、組成物、方法、またはキットから、特許請求の範囲において特定されていない任意の要素、ステップ、または成分が除外されることを意味する。例えば、プロモーターに作動可能に連結された治療用ポリペプチドをコードする遺伝子、および転写後調節要素「からなる」発現カセットは、プロモーター、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および転写後調節要素のみからなる。別の例として、列挙される配列「からなる」ポリペプチドは、列挙される配列のみを含有する。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「骨髄細胞」または「骨髄幹細胞」は、本明細書では、生検などによって骨髄から直接得られる細胞と、例えば動員後に骨髄に由来する末梢血から得られる細胞との両方を指す。
【００６５】
本明細書で使用される「発現ベクター」は、上記で論じられるかまたは当該技術分野で既知のように、目的の遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、例えば、プラスミド、ミニサークル、ウイルスベクター、リポソームなどを包含し、目的の標的細胞に遺伝子産物の発現をもたらすために使用される。発現ベクターはまた、標的における遺伝子産物の発現を促進するためにコード領域に作動的に連結される制御要素も含む。制御要素、例えば、プロモーター、エンハンサ、ＵＴＲ、ｍｉＲＮＡターゲティング配列など、およびそれらが発現のために作動可能に連結される１つ以上の遺伝子の組み合わせは、「発現カセット」と称されることがある。多くのかかる制御要素は、当該技術分野で既知であり、かつ入手可能であるか、または当該技術分野で入手可能な成分から容易に構築することができる。
【００６６】
本明細書で使用される「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を誘導し、それによってＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列、すなわち、転写を誘導するのに十分な最小の配列を包含する。プロモーターおよび対応するタンパク質またはポリペプチドの発現は遍在性であり得、これは、広囲の細胞、組織、および種において非常に活性であるか、または細胞型特異的、組織特異的、もしくは種特異的であることを意味する。プロモーターは、継続的活性を意味する「構成的」、または生物的または非生物的因子の存在または不在によってプロモーターを活性化または非活性化できることを意味する「誘導性」であり得る。本発明の核酸構築物またはベクターには、プロモーター配列と隣接していてもまたはしていなくてもよいエンハンサ配列も含まれる。エンハンサ配列は、プロモーター依存性遺伝子発現に影響を及ぼし、天然遺伝子の５’または３’領域に位置し得る。
【００６７】
本明細書で使用される「エンハンサ」は、隣接する遺伝子の転写を刺激または阻害するシス作用性要素を包含する。転写を阻害するエンハンサは、「サイレンサー」とも称される。エンハンサは、コード配列から、および転写される領域の下流の位置から、数キロベース対（ｋｂ）までの距離にわたって、いずれの方向にも機能することができる（すなわち、コード配列と会合することができる）。
【００６８】
本明細書で使用される「終結シグナル配列」は、例えば、ポリアデニル化シグナル配列などの、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終結させる任意の遺伝的要素を包含する。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「作動的に連結された」または「作動可能に連結された」という用語は、遺伝子要素、例えば、プロモーター、エンハンサ、終結シグナル配列、ポリアデニル化配列などが並列しており、要素が予測された様式で作動することを可能にする関係にあることを指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現の開始を補助する場合、プロモーターはコード領域に作動的に連結される。この機能的な関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に残基が介在してもよい。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、それが比較される実体の残りとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学の技法によって異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。別の例として、その天然コード配列から除去され、天然では連結されないことが見出されているコード配列に作動的に連結されたプロモーターは、異種プロモーターである。したがって、例えば、異種遺伝子産物をコードする異種核酸を含むＬＶベクターは、天然に存在する野生型ＬＶには通常含まれない核酸を含むＬＶベクターであり、コードされる異種遺伝子産物は、天然に存在する野生型ＬＶによって通常はコードされない遺伝子産物である。
【００７１】
ヌクレオチド分子または遺伝子産物に関して本明細書で使用される「内在性」という用語は、宿主ウイルスまたは細胞に天然に存在するかまたはそれに関連する核酸配列、例えば、遺伝子もしくは遺伝子要素、または遺伝子産物、例えば、ＲＮＡ、タンパク質を指す。
【００７２】
本明細書で使用される「天然」という用語は、野生型ウイルスまたは細胞に存在するヌクレオチド配列、例えば遺伝子、または遺伝子産物、例えばＲＮＡ、タンパク質を指す。本明細書で使用される「バリアント」という用語は、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列、例えば天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の変異体またはバリアント、すなわち参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と１００％未満の配列同一性を有することを指す。換言すると、バリアントは、参照ポリヌクレオチド配列、例えば、天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して少なくとも１つのアミノ酸の差異（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含む。例えば、バリアントは、全長の天然ポリヌクレオチド配列と７０％以上の配列同一性、例えば、８５％、９０％、または９５％以上などの７５％または８０％以上、全長天然ポリヌクレオチド配列と、例えば、９８％または９９％の同一性を有するポリヌクレオチドであり得る。別の例として、バリアントは、全長の天然ポリペプチド配列と７０％以上の配列同一性、例えば、８５％、９０％、または９５％以上などの７５％または８０％以上、全長天然ポリペプチド配列と、例えば、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドであり得る。バリアントはまた、例えば天然配列などの参照の断片と７０％以上の配列同一性、例えば、８５％、９０％、または９５％以上などの７５％または８０％以上の同一性、例えば、天然配列と９８％または９９％の同一性を共有する、例えば天然配列などの参照のバリアント断片を含み得る。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「生物活性」および「生物学的に活性な」という用語は、細胞内の特定の生物学的要素に起因する活性を指す。例えば、「免疫グロブリン」、「抗体」またはその断片もしくはバリアントの「生物活性」は、抗原性決定基に結合し、それによって免疫学的機能を促進する能力を指す。別の例として、ポリペプチドまたはその機能的断片もしくはバリアントの生物活性は、ポリペプチドまたはその機能的断片もしくはバリアントが、例えば、結合、酵素活性などの天然機能を行う能力を指す。第３の例として、遺伝子調節要素、例えば、プロモーター、エンハンサ、コザック配列などの生物活性は、調節要素またはその機能的断片もしくはバリアントが、それが作動可能に連結した遺伝子の翻訳を調節する、すなわち、それぞれ、促進する、増強する、または活性化する能力を指す。
【００７４】
「投与する」または「導入する」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、細胞集団を対象の血液に動脈内または静脈内に輸送することによって、細胞集団を対象に送達することを指す。細胞集団は、生理食塩水などの種々の溶液中で投与され得る。いくつかの実施形態では、使用される溶液は、対象の血液に対して等張性であり、ｐＨ緩衝される。
【００７５】
「形質転換」は、典型的には、異種ＤＮＡを細菌または別の細胞に導入するプロセス、またはがん遺伝子を発現しており、したがって、腫瘍細胞などの継続的な成長モードに変換されている細胞を指すために使用される。細胞を「形質転換する」ために使用されるベクターは、プラスミド、ウイルス、または他のビヒクルであり得る。
【００７６】
典型的には、異種ＤＮＡ（すなわち、ベクター）を細胞に投与、導入、または挿入するために使用される手段に応じて、細胞は、「形質導入された」、「感染させた」、「トランスフェクトされた」、または「形質転換された」と称される。「形質導入された」、「トランスフェクトされた」、および「形質転換された」という用語は、異種ＤＮＡの導入方法にかかわらず本明細書において互換的に使用され得る。
【００７７】
「宿主細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、ベクターで形質導入された、感染させた、トランスフェクトされた、または形質転換された細胞を指す。ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどであり得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に以前に使用されたものであり、当業者には明白であろう。「宿主細胞」という用語は、元の形質導入された、感染させた、トランスフェクトされた、または形質転換された細胞、およびその後代を指すことを理解されたい。
【００７８】
「治療」、「治療すること」などの用語は、概して、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを意味するために本明細書で使用される。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的予防すること、例えば、対象において疾患もしくはその症状が発生する可能性を低減させるという点では予防的であり得、かつ／または疾患の部分的もしくは完全な治癒および／または疾患に起因する悪影響、もしくは疾患の進行を遅らせることに関して治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物における疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患の素因があり得るが、まだそれを有すると診断されていない対象において疾患が発生するのを防止すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること、または（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退行を引き起こすことを含む。治療剤は、疾患または傷害の発生の前、その間、またはその後に投与され得る。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定させるかまたは低減する、進行中の疾患の治療が特に興味深い。かかる治療は、患部組織における機能が完全に失われる前に行うことが望ましい。対象の治療は、疾患の症候性段階の間に、いくつかの事例において、疾患の症候性段階の後に施され得る。特定の実施形態では、対象は、対象が疾患、例えば、ＦＡに関連するか、またはその原因となる変異を有すると特定された遺伝子検査に続いて治療を施される。
【００７９】
「個体」、「宿主」、「対象」、および「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、限定されないが、サルおよびヒトを含むヒトおよび非ヒト霊長類；哺乳動物の競技動物（例えば、ウマ）；哺乳動物の家畜（例えば、ヒツジ、ヤギなど）；哺乳動物の愛玩動物（イヌ、ネコなど）；およびげっ歯類（例えば、マウス、ラットなど）を含む哺乳動物を指す。
【００８０】
本明細書で使用される場合、ポリペプチドに適用される「断片」は、通常、長さが少なくとも１０アミノ酸残基、より典型的には少なくとも２０残基、好ましくは少なくとも３０（例えば、５０）残基であるが、完全な無傷の配列よりは短いであろう。断片は、例えば、天然または組換えタンパク質の酵素消化によって、定義された断片をコードする発現ベクターを用いた組換えＤＮＡ技法によって、または化学合成によって、当業者に既知の方法によって生成することができる。特定のＤＮＡ配列と結合する候補断片の能力は、本明細書に記載される方法によって評価することができる。精製された断片または抗原性断片は、調節領域を単離するため、または新しい調節酵素を生成するために（例えば、異なる酵素からの複数の機能的断片を使用して）、および抗体を生成するために使用でき、すべて当業者に既知の標準プロトコルを使用する。本明細書で使用される場合、「機能的断片」は、生物学的活性を保持するペプチド断片だけでなく、特定のヌクレオチド配列との結合特異性を保持するペプチド断片を包含することを意味する。
【００８１】
抗ＣＤ３４抗体の「機能的断片」は、ＣＤ３４＋細胞の選択または濃縮を可能にするのに十分な親和性および特異性で細胞表面のＣＤ３４分子と結合できる断片である。
【００８２】
「同一」または「パーセント同一性」という用語は、２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈において、最大の一致について比較および整列された場合、同じであるか、または同じであるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の指定されたパーセンテージを有する、２つ以上の配列またはサブ配列を指す。同一性パーセントを決定するために、配列は、最適な比較目的のために整列される（例えば、ギャップは、第２のアミノ酸または核酸配列との最適な整列のために、第１のアミノ酸または核酸配列の配列に導入できる）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、次いで、分子は、その位置において同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一位置数（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数（例えば、重複する位置）×１００）の関数である。いくつかの実施形態では、２つの配列は同じ長さである。
【００８３】
ギャップペナルティを考慮した最適な整列を実行するためのコンピュータプログラムの例は、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７）である。配列比較を実行することができる他のソフトウェアの例として、限定されないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ｉｂｉｄ−Ｃｈ．１８を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）、比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイート、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することができ、およびＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）１７４：２４７−５０；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）１７７：１８７−８を参照されたい）が含まれる。化学的類似性または進化距離に基づいて、各対比較にスコアを割り当てるスケール化された類似性スコアマトリックスが使用され得る。かかるマトリックスの例は、プログラムのＢＬＡＳＴスイートのデフォルトマトリックスであるＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである。ＧＣＧウィスコンシンプログラムは、提供される場合、公開デフォルト値またはカスタム記号比較テーブルのいずれかを使用することができる（詳細についてはユーザマニュアルを参照されたい）。
【００８４】
「実質的に同一である」という用語は、２つの核酸またはポリペプチドの文脈において、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する２つ以上の配列またはサブ配列を指す（例えば、以下に記載される方法のうちの１つを使用して決定される）。
【００８５】
文脈によって別途示されない限り、「バリアント」は、第２のポリペプチド（「誘導体」とも称される）と比較して１つ以上の非保存的または保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドもしくはその断片、または例えば異種ポリペプチドの結合、もしくはグリコシル化、アセチル化、リン酸化などによる第２の分子の共有結合によって改変されるポリペプチドもしくはその断片である。「バリアント」の定義にさらに含まれるのは、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸など）の１つ以上の類似体を含有するポリペプチド、非置換結合を有するポリペプチド、ならびに天然および非天然の両方で生じる、当該技術分野で既知の他の改変である。
【００８６】
本発明の種々の組成物および方法を以下に記載する。特定の組成物および方法が本明細書において例示されているが、多くの代替的な組成物および方法のいずれも、本発明を実施する際に使用するのに適用可能であり好適であることを理解されたい。また、本発明の発現構築物および方法の評価は、当該技術分野において標準的な手順を用いて行われ得ることも理解されたい。
【００８７】
本発明の実践には、別段の指示がない限り、当該技術分野の技能の範囲内である、細胞生物学、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、生化学、および免疫学の従来の技法が用いられる。かかる技術は、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ＆Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；および「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）などの文献に完全に記載されており、これらの各々が、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００８８】
本発明のいくつかの態様が、例示のために例示的な用途を参照して以下に記載される。多数の特定の詳細、関係、および方法は、本発明の完全な理解を提供するために記載されていることを理解されたい。しかしながら、本発明は、特定の詳細のうちの１つ以上を用いずに、または他の方法を用いて実施され得ることは、関連技術分野の当業者には容易に理解されよう。本発明は、例示される行為または事象の順序によって限定されず、いくつかの行為は、他の行為または事象と異なる順序で、かつ／またはそれと同時に行われ得る。さらに、例示される行為または事象の全てが本発明による方法を実行するために必要であるとは限らない。
【００８９】
本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により明らかにそうではないと指示されない限り、複数の形態も同様に含むことが意図される。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」という用語またはその変形が詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用されている限り、そのような用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様に、包括的なものであることが意図される。
【００９０】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値に対する許容誤差範囲内であることを意味し、それは、その値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの限界に一部依存する。例えば、「約」は、当該技術分野における慣例に従って、１以内のまたは１を超える標準偏差を意味し得る。代替として、「約」は、所与の値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、およびより好ましくはさらに最大１％の範囲を意味し得る。代替的に、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、およびより好ましくは２倍以内であることを意味し得る。本出願および特許請求の範囲において特定の値が記載される場合、別段の記載がない限り、特定の値について許容誤差範囲内であることを意味する「約」という用語が想定されるべきである。
【００９１】
本明細書で言及される全ての刊行物は、引用される刊行物に関連して方法および／または材料を開示し、説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾が生じる場合には、組み込まれた刊行物のいかなる開示よりも優先されることを理解されたい。
【００９２】
特許請求の範囲は、あらゆる任意の要素を除外するように立案され得ることにさらに留意されたい。そのため、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連する「単に」、「のみ」などの排他的な用語の使用、または「否定的」な限定の使用の先行詞としての役割を果たすことが意図される。
【００９３】
本明細書において論じられる刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供される。さらに、提供される刊行物の日付は実際の公開日とは異なる可能性があり、これらは独立して確認する必要があり得る。
【００９４】
別段の指示がない限り、本明細書で使用される全ての用語は、当業者にとっての意味と同じ意味を有し、本発明の実施には、当業者の知識の範囲内である微生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の技法が用いられる。
【００９５】
ＣＤ３４＋濃縮細胞集団を調製、導入、および使用するための方法
一態様では、本開示は、遺伝子改変ＣＤ３４＋細胞を含む、ＣＤ３４＋細胞が濃縮された細胞の集団を調製する方法を提供する。特定の実施形態では、本方法は、２つのＣＤ３４濃縮細胞集団を調製することを含み、一方は低ストリンジェンシー条件を使用して調製され、他方は高ストリンジェンシー条件を使用して調製される。本明細書で示されるように、低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の組み合わせの使用は、対象におけるＣＤ３４＋幹細胞の予想外に効果的な再構成を有利にもたらす。
【００９６】
別の態様では、本開示は、遺伝子改変ＣＤ３４＋細胞を含む、治療有効量のＣＤ３４＋細胞が濃縮された１つ以上の細胞集団を対象に提供することにより、疾患または障害を有する対象を治療する方法を提供し、遺伝子改変Ｃ３４＋細胞は、疾患または障害を治療するのに有効な治療剤をコードする。特定の実施形態では、治療剤は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、例えば、ＲＮＡである。特定の実施形態では、ＣＤ３４濃縮細胞集団は、治療を受ける対象から得られるＣＤ３４細胞から調製される。
【００９７】
本明細書に開示される方法の特定の実施形態では、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を含む、ＣＤ３４＋細胞が濃縮された２つの細胞集団が産生される。これらの２つの細胞集団は別々に保たれ得るか、またはそれらを組み合わせて高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞の両方を含む混合細胞集団を産生し得る。特定の実施形態では、２つの細胞集団のいずれかまたは両方は、遺伝子治療ベクター、例えば、ＦＡＮＣＡまたはその機能的断片もしくはバリアントをコードするＬＶベクターで形質導入される。
【００９８】
特定の実施形態では、細胞は、任意の哺乳動物種、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、スナネズミ、リス）、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、霊長類、ヒトに由来し得る。特定の実施形態では、細胞は、樹立細胞株に由来し得るか、または初代細胞であり得、「初代細胞」、「初代細胞株」、および「初代培養物」は、本明細書では互換的に使用され、対象に由来しており、培養の限られた数の継代、すなわち分裂のためにインビトロで増殖することができる細胞および細胞培養物を指す。例えば、初代培養物は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、または１５回継代されているが、クライシス期を経るのに十分な回数は継代されていない培養物である。典型的には、本発明の初代細胞株は、インビトロで１０回未満の継代の間で維持される。
【００９９】
特定の実施形態では、本方法は、対象から得られた生体試料からＣＤ３４濃縮細胞集団を調製することを含む。一実施形態では、生体試料は、骨髄試料である。別の実施形態では、生体試料は、末梢血である。
【０１００】
特定の実施形態では、生体試料、例えば、末梢血は、造血幹細胞（ＨＳＣ）の動員後に対象から得られる。一実施形態では、ＨＳＣおよび／または前駆細胞は、例えば、患者においてＨＳＣの動員を引き起こすのに十分な量および時間で、対象をＧ−ＣＳＦまたはその類似体で治療することによって動員される。末梢血中のＨＳＣおよび前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、生体試料の収集前に動員され得る。末梢血ＨＳＣおよびＨＳＰＣは、当該技術分野で既知の任意の方法によって動員され得る。末梢血ＨＳＣおよびＨＳＰＣは、対象の末梢血中を循環するＨＳＣおよび／またはＨＳＰＣの数を増加させる、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の任意の薬剤（複数可）で対象を治療することにより動員できる。ＨＳＣまたはＨＳＰＣのいずれかについての言及は、別段の指示がない限り、ＨＳＣおよびＨＳＰＣの両方を包含することを意図している。例えば、特定の実施形態において、末梢血は、対象を１つ以上のサイトカインまたは成長因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、キットリガンド（ＫＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、Ｆｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、トロンボポエチン、またはＧＭ−ＣＳＦ（サルグラモスチムなど））で治療することによって動員される。末梢血を動員するための方法で使用できるさまざまな種類のＧ−ＣＳＦには、フィルグラスチムおよびより長時間作用するＧ−ＣＳＦ：ペグフィルグラスチムが含まれる。特定の実施形態では、末梢血は、対象を１つ以上のケモカイン（例えば、マクロファージ炎症性タンパク質−１ａ（ＭＩＰ１ａ／ＣＣＬ３））、ケモカイン受容体リガンド（例えば、ケモカイン受容体２リガンドＧＲＯｌ３およびＧＲ０１３Ｍ）、ケモカイン受容体類似体（例えば、間質細胞由来因子−１ａ（ＳＤＦ−１ａ）タンパク質類似体、例えば、ＣＴＣＥ−００２１、ＣＴＣＥ−０２１４、またはＳＤＦ−１ａ、例えば、Ｍｅｔ−ＳＤＦ−１１３）、またはケモカイン受容体アンタゴニスト（例えば、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４（ＣＸＣＲ４）アンタゴニスト、例えば、ＡＭＤ３１００）で治療することによって動員される。特定の実施形態では、末梢血は、対象を１つ以上の抗インテグリンシグナル伝達物質（例えば、機能阻害抗超遅発性抗原４（ＶＬＡ−４）抗体、または抗血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１））で治療することによって動員される。特定の実施形態では、末梢血は、対象をシクロホスファミド、エトポシド、またはパクリタキセルなどの１つ以上の細胞傷害性薬物で治療することによって動員される。特定の実施形態では、末梢血は、対象に、上記に列挙される薬剤のうちの１つ以上を一定期間投与することによって動員され得る。例えば、対象は、ＨＳＰＣの収集前に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日日間、１日１回または１日２回の注入（例えば、皮下、静脈内、または腹腔内）を介して、１つ以上の薬剤（例えば、Ｇ−ＣＳＦ）で治療できる。特定の実施形態では、ＨＳＰＣは、ＨＳＰＣの末梢血への動員に使用される薬剤の最後の容量から１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１４、１６、１８、２０、または２４時間以内に収集される。特定の実施形態では、ＨＳＣおよびＨＳＰＣは、対象を、成長因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ）およびケモカイン受容体アンタゴニスト（例えば、ＣＸＣＲ４受容体アンタゴニスト、例えば、ＡＭＤ３１００）、または成長因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦまたはＫＬ）、および抗インテグリン剤（例えば、ＶＬＡ−４抗体を遮断する機能）などの上術されるまたは当該技術分野で既知の２つ以上の異なる種類の薬剤で治療することによって動員される。一実施形態では、ＨＳＣおよび／または前駆細胞は、対象をＧ−ＣＳＦまたはその類似体で治療することによって動員される。一実施形態では、Ｇ−ＣＳＦは、フィルグラスチムである。一実施形態では、ＨＳＣおよび／または前駆細胞は、対象をプレリキサフォルで治療することによって動員される。特定の実施形態では、ＨＳＣおよび／または前駆細胞は、フィルグラスチムおよびプレリキサフォルの組み合わせ、フィルグラスチム単独、またはプレリキサフォル単独を使用して動員される。特定の実施形態では、異なる種類の動員剤は、同時にまたは順次投与される。末梢血の動員の方法に関する追加情報については、例えば、Ｃｒａｄｄｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｌｏｏｄ  ９０（１２）：４７７９−４７８８；Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：３９；Ｐｅｌｕｓ，２００８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１５（４）：２８５−２９２；Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ  ９１（７）：２２３１−２２３９；Ｔｒｉｃｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９３（１１）：１７３９−１７４２；およびＷｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２７（２）：Ｓ２３−Ｓ２９）を参照されたい。
【０１０１】
特定の実施形態では、末梢血は、対象の静脈に挿入されたシリンジまたはカテーテルを通して得られる。例えば、末梢血は、アフェレーシス装置を使用して収集することができる。血液は静脈からカテーテルを通ってアフェレーシス装置に流れ、アフェレーシス装置は、ＨＳＰＣを含む白血球を残りの血液から分離し、その後、残りの血液を対象の体内に戻す。アフェレーシスは、十分なＨＳＰＣが収集されるまで数日間（例えば、１〜５日間）実施することができる。
【０１０２】
特定の実施形態では、骨髄は、針吸引によって対象の後方腸骨稜から得られる（例えば、Ｋｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．７３：１３７７−１３８４を参照されたい）。
【０１０３】
特定の実施形態では、生体試料のヘマトクリットレベルが決定され得る。ヘマトクリットレベルは、治療チャンバ内で試料を遠心分離して、試料のＲＢＣを層に分離し、その結果、パックされた細胞の体積を決定することによって決定され得る。ヘマトクリットレベルの決定を支援するために、試料を抗凝固剤と組み合わせてもよく、かかる抗凝固剤を遠心分離の前または最中に治療チャンバに加えてもよいことを理解されたい。代替的に、ヘマトクリットレベルは、試料の光学特性を測定することによって決定され得る。例えば、分光計を使用して、試料を分析することができる。ヘマトクリットレベルを決定する任意の種類の既知の分光法は、例えば、ラマン分光および／または光散乱技術などが使用され得ることを理解されたい。
【０１０４】
特定の実施形態では、生体試料は、例えば、生体試料からのＣＤ３４＋細胞が濃縮された１つ以上の細胞集団を調製する前に、赤血球を枯渇させる。いくつかの実施形態では、枯渇技術後に残る細胞が洗浄される。別の実施形態では、非特異的ＩｇＧは、洗浄された細胞に追加される。いくつかの実施形態では、非特異的ＩｇＧは、フレボガンマである。
【０１０５】
ＣＤ３４＋細胞が濃縮された２つの細胞集団は、高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞の細胞集団を選択し、低ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞の別の細胞集団を選択することによって産生され得、それによって２つの細胞集団を産生し、一方は、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団、他方は低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団である。ＣＤ３４＋細胞を選択するために使用される方法は、陽性選択、陰性選択、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、対象から得られる生体試料は、２つの試料に分けられ、一方の試料を使用して高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を調製し、他方の試料を使用して低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を調製する。
【０１０６】
他の実施形態では、対象から得られる生体試料は、最初に低ストリンジェンシーＣＤ３４＋選択に供して低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を調製し、次いで低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮集団の一部を高ストリンジェンシーＣＤ３４＋選択に供して高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を調製する。選択は、順次適用され得、例えば、低ストリンジェンシー条件下でのＣＤ３４濃縮細胞の選択が、最初に、続いて高ストリンジェンシー条件下でのさらなるＣＤ３４濃縮細胞の得られた集団からの選択が適用され得る。
【０１０７】
他の事例では、高ストリンジェンシー条件下でのＣＤ３４濃縮細胞の選択が、最初に、続いて低ストリンジェンシー条件下でのＣＤ３４濃縮細胞の残りの集団からの選択が適用され得る。いくつかの事例では、細胞集団は、低ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシー選択が、以前に高ストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシー選択に供された細胞の画分に適用されるように分割され得る。いくつかの事例では、１つの生体試料が、低ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４濃縮細胞を選択する前に、２つ以上の試料に分割される。
【０１０８】
いくつかの事例では、２つ以上の生体試料は、選択前に一緒に混合され、例えば、１、２、３、４日もしくはそれ以上の間隔、または１、２もしくは３週間の間隔、または１、２もしくは３ヶ月の間隔、または数年の間隔など、他の時間増分を含めて、異なる期間に取得した動員骨髄試料を含む。事例において、異なる対象由来の生体試料、例えば、自己生体試料および同種ドナー由来の試料などが混合される。全ての事例では、生体試料または濃縮細胞集団を混合または分割する前または後の高ストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシー選択が、全ての可能な順列において企図される。特定の実施形態では、本方法は、高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって、対象から得られた第１の生体試料から高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を調製する段階、および低ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって、対象から得られた第２の生体試料から低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を調製する段階を含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の割合は、低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞の割合よりも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、またはいくつかの事例では、５倍、６倍、７倍、もしくは８倍大きい。
【０１１０】
ＣＤ３４＋細胞の様々な収量および純度は、開示される方法によって達成され得る。いくつかの事例では、高ストリンジェンシー条件下でのＣＤ３４＋細胞の選択は、インプット生体試料と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％以上、もしくはその間の任意の値のＣＤ３４＋細胞の収率を有する高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団、かつ／または濃縮試料中の細胞の総数と比較して、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上、もしくはその間の任意の値の純度をもたらす。いくつかの事例では、高ストリンジェンシー条件下でのＣＤ３４＋細胞の選択は、インプット生体試料と比較して、約１０％〜２０％、２０％〜３０％、もしくは３０％〜４０％、もしくはその間の任意の値のＣＤ３４＋細胞の収率を有する高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団、かつ／または濃縮試料中の細胞の総数と比較して、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、もしくはその間の任意の値の純度をもたらす。特定の実施形態では、高ストリンジェンシー条件下でのＣＤ３４＋細胞の選択は、インプット生体試料と比較して、少なくとも約２０％のＣＤ３４＋細胞の収率を有する高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団、かつ／または濃縮試料中の細胞の総数と比較して、少なくとも約２０％もしくは少なくとも約３０％を超える純度をもたらす。
【０１１１】
いくつかの事例では、低ストリンジェンシー条件下でのＣＤ３４＋細胞の選択は、インプット生体試料と比較して、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上、もしくはその間の任意の値のＣＤ３４＋細胞の収率を有する低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団、かつ濃縮試料中の細胞の総数と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２５％、４０％、５０％以上、もしくはその間の任意の値の純度をもたらす。いくつかの事例では、低ストリンジェンシー条件下でのＣＤ３４＋細胞の選択は、インプット生体試料と比較して、３０％を超える、約３０％〜４０％、４０％〜５０％、もしくは５０％〜６０％、もしくはその間の任意の値のＣＤ３４＋細胞の収率を有する低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団、かつ濃縮試料中の細胞の総数と比較して、少なくとも約３％、５％、８％、１０％、もしくはその間の任意の値の純度をもたらす。特定の実施形態では、低ストリンジェンシー条件下でのＣＤ３４＋細胞の選択は、インプット生体試料と比較して、３５％を超えるＣＤ３４＋細胞の収率を有する高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団、かつ／または濃縮試料中の細胞の総数と比較して、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１０％未満、もしくは５％未満の純度をもたらす。特定の実施形態では、低ストリンジェンシー条件下でのＣＤ３４＋細胞の選択は、濃縮試料中の細胞の総数と比較して、１〜３０％、１〜２０％、１〜１０％、１０〜３０％、１０〜２０％、または２０〜３０％の純度を有する低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団をもたらす。いくつかの実施形態では、低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団は、少なくとも好中球およびＢ細胞をさらに含む。
【０１１２】
特定の実施形態では、高ストリンジェンシーおよび低ストリンジェンシー選択は、両方とも、例えば、ＣＤ３４＋細胞と結合する薬剤を使用して陽性選択によって実行される。特定の実施形態では、薬剤は溶液中であり、一方、他の実施形態では、薬剤は固体表面に固定される。特定の実施形態では、薬剤は、磁気ビーズの表面に結合される。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗ＣＤ３４抗体またはその機能的断片である。
【０１１３】
特定の実施形態では、高ストリンジェンシー条件および／または低ストリンジェンシー条件下での選択は、限定されないが、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ｔｙｔｏ（登録商標）、Ｑｕａｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＭａｇＣｌｏｕｄｚ（登録商標）、ＧＥ  Ｓｅｐａｘ（登録商標）細胞分離システム、Ｔｅｒｕｍｏ  Ｅｌｕｔｒａ（登録商標）細胞分離システム、ＣＯＢＥ  Ｓｐｅｃｔｒａ（登録商標）細胞分離器、ＳｙｎＧｅｎ  ＬＡＢ（登録商標）もしくはＷＡＳＨ（登録商標）システム、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ−Ｋａｂｉ  Ｌｏｖｏ（登録商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システム、またはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）システムを含む様々な機器で実行され得る。選択は、実験室またはポイントオブケアで実行され得る。高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択するための例示的な方法を含む、細胞および細胞集団の調製ならびに濃縮のための詳細な方法は、例えば、国際特許公開第ＷＯ  ２０１６／１１８７９０号に記載される。高ストリンジェンシー選択に有用な例示的な選択方法は、米国特許第８，７２７，１３２号に提供される。
【０１１４】
一実施形態では、本機器は、遠心分離および培養機能を備える少なくとも１つの処理チャンバ、閉鎖チューブセット、ポンプ、ならびに標的細胞セレクタの材料入力（例えば、試料、緩衝液、ガス）を含む閉鎖システム装置である。制御ソフトウェアは、デバイスが、特定の実施形態において、対象試料から直接エクスビボで標的細胞を単離し、遺伝的に改変し、製剤化することを可能にする。特定の実施形態では、選択プロセスは、最小限またはユーザ入力を伴わずに３０時間以内、２５時間以内、または２０時間以内に完了することができる。特定の実施形態では、プロセス全体は、７２時間以内または６４時間以内に完了する。特定の実施形態では、最小限のユーザ入力とは、デバイスへの試料入力と、対象への投与のために製剤化された遺伝的に改変された細胞の回収との間で、ユーザがデバイスと相互作用する回数が２０、１５、１０、もしくは５回以下であり、かつ／またはデバイスと相互作用する回数が１２時間、１０時間、８時間、５時間、４時間、もしくは３時間以下であることを意味する。ユーザからの例示的な相互作用は、滅菌チューブセットを接続すること、閉鎖された滅菌システムのメンテナンスを検証すること、ステージが繰り返されるべきであることを決定すること（例えば、沈殿）、ステージが正常に完了したことを検証すること、プロセス品質チェックに従って新しいステージが開始されることを可能にすること、デバイス入力のための試薬を提供すること、ならびに追加または除去のための用量を決定することおよび／または計算することのうちの１つ以上を含むことができる。相互作用は、試料受領後、ユーザがデバイスを調整している時間または実際にデバイスと相互作用している時間によって計時できる。
【０１１５】
特定の実施形態では、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および／または低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の一方または両方は、ＨＳＣ、アフェレーシスを処理するソフトウェア制御機器であるＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ｐｌｕｓ機器などのＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）機器を使用して調整される。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ｐｌｕｓ機器、ならびに関連する設備および試薬は、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙから市販されている）。使用される機器または試薬としては、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＣＤ３４抗原／試薬が含まれ、それは、ヒトＣＤ３４抗原のクラスＩＩエピトープに指向するモノクローナル抗体であるマウスＩｇＧからなる抗体コンジュゲートを含む溶液であり、それは、酸化鉄／水酸化物コアを有するデキストランビーズに化学的と結合されており、それは、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）チューブがＣＤ３４＋細胞の選択または濃縮に使用され、それは、６０ｘ１０９（標準スケール）の白血球を超えない総細胞数のうち、最大．６ｘ１０９のＣＤ３４＋細胞、または１２０ｘ１０９（大きいスケール）の白血球を超えない総細胞数のうち、最大１．２ｘ１０９のＣＤ３４＋細胞を処理するための２つの細胞分離カラムを備えた使い捨ての滅菌使い捨てチューブセット、およびＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液であり、これは、無菌の等張リン酸緩衝液、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、生理食塩水であり、ＨＳＣ、アフェレーシスのインビトロ処理用の外部洗浄および輸送液として使用される。洗浄は、ＰＢＳおよび２．５％ヒト血清アルブミンを含むＣｌｉｎｉＭＡＣＳ緩衝液を使用して実行できる。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システムを使用する手順は、ＭｉｌｔｅｎｙｉのＷｅｂサイトにあるＣｌｉｎｉＭＡＣＳユーザマニュアルに提供されており、例えば、２０１９年４月８日にｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ．ｃｏｍ／＿Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ／２ｃ２８ｃ８４９３９ｆ４ｃｅ７９３ｂ２９ｃ９ｆ２ｅ８９７ｃ０ｂｂ１ａ３３４ｃ４７／Ｕｓｅｒ％２０Ｍａｎｕａｌ％２０ｆｏｒ％２０ｔｈｅ％２０ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ％２０ＣＤ３４％２０Ｒｅａｇｅｎｔ％２０Ｓｙｓｔｅｍ．ｐｄｆで入手したＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＣＤ３４試薬システムについてのＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ユーザマニュアルが含まれる。一実施形態では、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団は、ＣＤ３４試薬を使用して細胞を標識することによって調製され、次いでＣＤ３４＋細胞は、標準ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＣＤ３４濃縮プログラムを使用して選択される。一実施形態では、低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）枯渇プログラムの修飾版を使用して調製される。この実施形態によれば、細胞は、ＣＤ３４試薬を使用して標識されるが、修正枯渇プログラムが実行される。マグネットをＯＮにして標識細胞を負荷した後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎバッグを取り外し、収集した細胞は移植に使用しない。代わりに、磁石をＯＦＦにし、溶出緩衝液を機器に���用し、ＣＤ３４＋細胞を溶出し、収集する。特定の実施形態では、選択モードと比較して、枯渇モード下で、機器はよりゆっくり（ｍＬ／分）負荷され、洗浄はより低いストリンジェンシーである。
【０１１６】
特定の実施形態では、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および／または低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の一方または両方は、例えば、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および／または低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団のいずれかまたは両方をベクターと接触させることにより、治療剤をコードするベクター、例えば、遺伝子治療ベクターで形質導入される。特定の実施形態では、細胞をベクターと約３０分間、約１時間、約１．５時間、約２時間、約２．５時間、約３時間、約３．５時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約１２時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間接触させる。いくつかの実施形態では、細胞は、６０時間未満、４８時間未満、３６時間未満、または２４時間未満で形質導入される。特定の実施形態では、細胞は、ベクターと１回以上、例えば、１回、２回、３回、または３回より多く接触させてもよく、各接触事象後のいくらかの時間、例えば、１６〜２４時間、細胞を薬剤（複数可）と共にインキュベートすることができ、その時間後、培地を新鮮な培地と交換し、細胞をさらに培養する。細胞をベクターと接触させることは、細胞の生存を促進する任意の培養培地において、かつ任意の培養条件下で実行され得る。培養物は、細胞が応答する増殖因子を含有し得る。本明細書において定義される増殖因子は、膜貫通型受容体に対する特異的な効果を通じて、培養物中またはインタクトな組織中のいずれかで、細胞の生存、成長および／または分化を促進することが可能な分子である。増殖因子は、ポリペプチドおよび非ポリペプチド因子を含む。
【０１１７】
特定の実施形態では、細胞は、コードされた治療剤の検出可能なレベルを達成するのに十分な有効量の遺伝子治療ベクターと接触させる。特定の実施形態では、治療剤は、疾患または障害の治療に有用または有効なポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。特定の実施形態では、治療剤は、対象から得られた細胞において調節解除または変異されたポリペプチド、例えば、ＦＡの治療のためのＦＡＮＣポリペプチドである。有効量は、例えば、治療剤の存在またはレベルを検出することによって、細胞の生存能または機能に対する影響を検出することなどによって、経験的に容易に決定することができる。典型的には、治療剤の発現は、非形質導入細胞と比較して、形質導入細胞において２倍もしくはそれ以上、例えば、３倍、４倍、または５倍もしくはそれ以上、いくつかの事例では、１０倍、２０倍、または５０倍もしくはそれ以上、例えば１００倍増強される。
【０１１８】
哺乳動物細胞にポリヌクレオチド配列を送達することに使用される任意の好都合な遺伝子治療ベクターは、本開示の遺伝子治療ベクターに包含される。例えば、ベクターは、一本鎖または二本鎖核酸、例えば、一本鎖または二本鎖ＤＮＡを含み得る。例えば、遺伝子治療ベクターは、ＤＮＡ、例えば、ネイキッドＤＮＡ、例えば、プラスミド、ミニサークルなどであり得る。ベクターは、ＲＮＡの改変形態を含む一本鎖または二本鎖ＲＮＡを含み得る。別の例では、遺伝子治療ベクターは、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡまたは改変ｍ  ＲＮＡであり得る。
【０１１９】
特定の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ウイルス、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス（ＬＶ）、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、またはレトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳がんウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）に由来するウイルスベクターであり得る。ＬＶの使用を包含する実施形態が以下により詳細に記載されているが、当業者は、当該技術分野における同様の知見および技術が非ＬＶ遺伝子治療ベクターにも同様に当てはめることができることを理解することが予想される。いくつかの実施形態では、遺伝子治療ベクターは、自己限定型ＬＶである。
【０１２０】
特に、本明細書に開示される特定の方法は、幹細胞または前駆細胞、例えば造血幹細胞（ＨＳＣ）または造血前駆細胞（本明細書において「造血前駆体」とも称される）の集団の一方または両方を、治療用ポリペプチド、例えばＦＡＮＣＡをコードするおよび／または発現する遺伝子療法ベクターで形質導入することに関し、一方の集団は、高ストリンジェンシー条件下での選択によって調製され、他方の集団は、低ストリンジェンシー条件下での選択によって調製され、一実施形態では、細胞集団は、ＣＤ３４＋細胞について濃縮される。一実施形態では、ＨＳＣまたは造血前駆体は、１つ以上のＦＡＮＣＡコードタンパク質からのタンパク質活性が低下したまたは全くない対象に由来する。一実施形態では、対象は、ＦＡ−Ａを有する。一実施形態では、ＨＳＣの内因性ＦＡＮＣＡ遺伝子は、欠失および／または変異される。
【０１２１】
一実施形態では、遺伝子治療ベクターで細胞を形質導入することは、遺伝子治療ベクター内の治療剤をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットの細胞ゲノムへの組み込みをもたらす。いくつかの実施形態では、遺伝子治療ベクターで細胞を形質導入することは、治療剤、例えば、生物活性ＦＡＮＣＡタンパク質の発現をもたらす。
【０１２２】
例えば、生物学的に活性なＦＡＮＣＡタンパク質は、ＦＡコア複合体の一部を形成する。特定の実施形態では、ＦＡＮＣＡ遺伝子は、ウイルスベクターを介して送達される。一実施形態では、ＦＡＮＣＡ遺伝子は、レンチウイルスベクターを介して送達される。特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡ．ＷＰＲＥ＊ＬＶである。ＦＡＮＣＡレンチウイルスベクター（ＬＶ）を用いたＦＡ−Ａ患者からの骨髄（ＢＭ）細胞または幹細胞または前駆細胞の形質導入後、治療用ベクターが細胞のゲノムに組み込まれることが企図される。組み込まれると、治療用タンパク質（例えば、ヒトＦＡＮＣＡタンパク質）は、細胞によって発現される。形質導入されたＦＡ細胞は、遺伝子補正され、したがって、ＦＡＮＣＤ２およびＦＡＮＣＩの単一ユビキチン化によってＦＡ経路を活性化することができる。次いで、これらのタンパク質は、ＤＮＡ損傷の領域に移動することができ、他のＤＮＡ修復タンパク質と協力して、健康な細胞で起こるように、これらの細胞のＤＮＡの修復を促進する。
【０１２３】
本明細書で論じられるように、主題の方法および組成物は、動物の細胞において導入遺伝子、例えば、ＦＡＮＣＡを発現することにおいて用途を見出す。例えば、主題の組成物は、例えば、遺伝子が細胞の生存能および／または機能に与える影響を決定するために、研究において使用され得る。別の例として、主題の組成物は、例えば、ＦＡなどの障害を治療するために、医薬品に使用され得る。
【０１２４】
したがって、本開示は、疾患または障害を治療する必要のある対象においてそれを治療する方法であって、本明細書に記載されるように調製された高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団、および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の組み合わせを対象に提供または投与することを含み、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団または低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団のうちの一方または両方が、治療剤をコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または治療剤を発現する発現カセットを含む組換え遺伝子治療ベクターで形質導入され、治療剤が、疾患または障害を治療するのに有効である、方法を提供する。特定の実施形態では、疾患はＦＡであり、治療剤は、ファンコニ貧血相補群Ａ（ＦＡＮＣＡ）ポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくは断片である。
【０１２５】
特定の実施形態では、方法は、（ａ）高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって、対象から得られた第１の生体試料から高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を調製する段階、（ｂ）低ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって、対象から得られた第２の生体試料から低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を調製する段階、（ｃ）高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団または低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の一方または両方を、治療薬をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え遺伝子治療ベクターで形質導入する段階、および（ｄ）高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を対象に提供または投与する段階を含み、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団または低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の一方または両方に組換え遺伝子治療ベクターを形質導入し、治療剤は、疾患または障害を治療するのに有効である。特定の実施形態では、疾患はＦＡであり、治療剤は、ファンコニ貧血相補群Ａ（ＦＡＮＣＡ）ポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくは断片である。特定の実施形態では、２つの細胞集団のそれぞれから得られた細胞の全てが、患者に投与される。２つの細胞集団の各々の細胞用量は、類似しているかまたは異なり得、例えば、より多くの総細胞およびより多くの総ＣＤ３４＋細胞は、低ストリンジェンシーの集団に由来する。特定の実施形態では、最初に患者から得られた細胞は、２つのほぼ等しい集団に分けられ、１つの集団は、高ストリンジェンシーＣＤ３４＋選択条件下で処理され、１つは、低ストリンジェンシーＣＤ３４＋選択条件下で処理され、これにより、低ストリンジェンシー選択プロセスに起因する約２倍以上のＣＤ３４＋細胞、および総細胞の５〜１０倍以上をもたらし得る。
【０１２６】
本明細書に記載される治療方法のうちのいずれかの特定の実施形態では、第１の生体試料および第２の生体試料は、それぞれ独立して、末梢血または骨髄である。特定の実施形態では、第１の生体試料および第２の生体試料は、対象がＧ−ＣＳＦ、プレリキサフォル、またはＧ−ＣＳＦおよびプレリキサフォルの組み合わせで治療された後に得られた末梢血である。
【０１２７】
本明細書に記載される治療方法の特定の実施形態では、高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することは、ＣＤ３４＋細胞と結合するカラムに第１の生体試料を適用することと、洗浄緩衝液を使用して負荷されたカラムを１回以上洗浄することと、溶出緩衝液を使用してカラムから高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を溶出することとを含む。一実施形態では、適用ステップは、５〜１０ｍＬ／分、５〜１５ｍＬ／分、１５〜２０ｍＬ／分、２０〜２５ｍＬ／分、または２５〜３０ｍＬ／分で実行される。一実施形態では、溶出ステップは、５〜１０ｍＬ／分、５〜１５ｍＬ／分、１５〜２０ｍＬ／分、２５〜２５ｍＬ／分、または２５〜３０ｍＬ／分で実行される。一実施形態では、適用ステップは、１０〜２０ｍＬ／分で実行される。一実施形態では、溶出ステップは、２０ｍＬ／分で実行される。
【０１２８】
本明細書に記載される治療方法の特定の実施形態では、低ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することは、ＣＤ３４＋細胞と結合するカラムに第２の生体試料を負荷することと、第２の生体試料をカラムに流れさせることと、溶出緩衝液を使用してカラムから低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を溶出することとを含む。一実施形態では、適用ステップは、５〜１０ｍＬ／分、５〜１５ｍＬ／分、１５〜２０ｍＬ／分、２０〜２５ｍＬ／分、または２５〜３０ｍＬ／分で実行される。一実施形態では、溶出ステップは、５〜１０ｍＬ／分、５〜１５ｍＬ／分、１５〜２０ｍＬ／分、２５〜２５ｍＬ／分、または２５〜３０ｍＬ／分で実行される。一実施形態では、適用ステップは、１０〜２０ｍＬ／分で実行される。一実施形態では、溶出ステップは、２０ｍＬ／分で実行される。
【０１２９】
本明細書に記載される治療方法の特定の実施形態では、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団は、形質導入され、かつ／または低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団は、形質導入される。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、主題の方法は、障害の発症を予防する、障害の進行を停止する、障害の進行を逆転させるなどの治療的利益をもたらす。例えば、一実施形態では、障害は、ＦＡである。別の実施形態では、疾患または障害は、ＢＭＦである。一実施形態では、障害は、血小板減少である。別の実施形態では、障害は、白血球減少である。一実施形態では、障害は、汎細胞減少である。一実施形態では、障害は、好中球減少である。別の実施形態では、障害は、貧血である。いくつかの実施形態では、主題の方法は、治療的利益が達成されていることを検出するステップを含む。当業者は、かかる治療的利益の測定値が改善される特定の疾患に適用可能であることを理解し、治療有効性を測定するために使用する適切な検出方法を認識するであろう。
【０１３１】
実施例でさらに詳細に記載されるように、末梢血生体試料に動員され、本発明の方法に従って投与される骨髄細胞に関する臨床データは、既存の技術の方法によって移植された他のＦＡ患者と比較して、予想外に、より迅速なインビボ選択生着動態を示した。特定の実施形態では、本開示の方法および組成物は、ＦＡを治療するために使用される。
【０１３２】
したがって、本発明は、ＦＡ、またはＦＡの１つ以上の血液学的徴候の治療方法を提供する。一実施形態では、ＦＡの血液学的徴候は、骨髄不全（ＢＭＦ）、血小板減少、白血球減少、汎血球減少、好中球減少、および貧血のうちの１つ以上から選択される。特定の実施形態では、血液学的徴候はＢＭＦであり、ほとんどのＦＡ患者の小児年齢に現れる。一実施形態では、血液学的徴候は、血小板減少である。別の実施形態では、血液学的徴候は、白血球減少である。一実施形態では、血液学的徴候は、汎細胞減少である。一実施形態では、血液学的徴候は、好中球減少である。別の実施形態では、血液学的徴候は、貧血である。一実施形態では、血液学的徴候は、ＢＭＦ、血小板減少、白血球減少、汎細胞減少、好中球減少、および貧血のうちの２つ以上の組み合わせである。
【０１３３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムなどを使用して、内因性ＦＡＮＣ遺伝子（例えば、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、および／またはＦＡＮＣＧ）を修復することも、本発明の目的である。ファンコニ貧血に関連する遺伝子のＣａｓ９を介した修復は、例えば、Ｏｂｓｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｆａｎｃｏｎｉ  ａｎｅｍｉａ  ｇｅｎｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１５  Ｆｅｂ；２６（２）：１１４−２６で、インビトロで実証されている。本発明は、修復のインビボ効率の向上および骨髄の再構成の向上をもたらすファンコニ貧血を治療するための方法、ならびに遺伝的に改変された細胞を調製する方法を提供する。いくつかの事例では、遺伝子編集システムは、単一のヌクレオチド多型、欠失、挿入、インデル、または別の遺伝子欠損を修復する。修復は、いくつかの事例において、遺伝子のコード領域、イントロン、または上流もしくは下流領域、例えば、疾患または障害に関連する遺伝子に近位または遠位のゲノムの遺伝子調節領域に向けられる。
【０１３４】
本発明の方法の一実施形態では、本開示は、ファンコニ貧血の治療を必要とする対象においてそれを治療するための方法であって、高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって、対象から得られた第１の生体試料から高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を調製する段階、低ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選択することによって、対象から得られた第２の生体試料から低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を調製する段階、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団または低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の一方または両方をファンコニ貧血に対する組換え遺伝子治療ベクターと接触させる段階、ならびに高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を対象に投与する段階を含み、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団または低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の一方または両方を組換え遺伝子治療ベクターと接触させ、遺伝子治療ベクターが、内因性遺伝子の指示された修復が可能な遺伝子編集システムを含み、それによりファンコニ貧血を治療する、方法を提供する。いくつかの事例では、遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）である。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムは、プロモーターに作動可能に連結されたＣａｓ、Ｃａｓ９、またはｓｐＣａｓ遺伝子産物（ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、プラスミドなど）をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムは、Ｃａｓ、Ｃａｓ９、またはｓｐＣａｓタンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの事例では、遺伝子治療ベクターは、リポソームもしくは脂質ナノ粒子、または他の脂質系もしくは脂質様送達システムである。いくつかの事例では、遺伝子治療ベクターは、レンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスなどのウイルスである。いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムは、ガイドＲＮＡ、例えば、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、および任意で修復鋳型を含む。修復鋳型およびガイドＲＮＡは、いくつかの事例では、異なる分子であるか、またはいくつかの事例では、同じ分子である。修復鋳型およびガイドＲＮＡは、共有的または非共有的に連結され得る。ガイドＲＮＡは、いくつかの事例では、Ｃａｓ、Ｃａｓ９、またはｓｐＣａｓタンパク質に事前に負荷される。遺伝子編集システムの成分は、いくつかの事例では、単一の遺伝子治療ベクターで送達される。いくつかの事例では、遺伝子編集システムは、個別の遺伝子治療ベクターで送達される。複数の遺伝子治療ベクターを使用することができる。例えば、限定されないが、複数の遺伝的病変は、同じまたは異なる遺伝子治療ベクターで修復できる。いくつかの事例では、２つ以上のＦＡＮＣ遺伝子が同時に修復される。いくつかの事例では、一方の遺伝子治療ベクターを高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団と接触させ、別の遺伝子治療ベクターを低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団と接触させる。いくつかの事例では、２つの遺伝子治療ベクターは同じである。いくつかの事例では、一方の遺伝子治療ベクターは、所与の遺伝子（例えば、ＦＡＮＣＡ）に関連する障害のための導入遺伝子を含み、他方の遺伝子治療ベクターは、遺伝子編集システムを含む。
【０１３６】
いくつかの事例では、遺伝子治療ベクターは、疾患または障害に関連する遺伝子以外の遺伝子の導入遺伝子を提供するか、または修復する。例えば、限定されないが、遺伝子療法ベクターは、免疫エフェクタ遺伝子を上方または下方制御し得、細胞表面マーカーを変更し得、代替のＭＨＣ分子を提供し得、または免疫グロブリン遺伝子をコードし得る。いくつかの事例では、遺伝子療法ベクターまたはベクターは、免疫マーカー（例えば、ＨＬＡまたはＭＨＣ遺伝子）を変更させるか、または免疫エフェクタ遺伝子の発現を引き起こすことによって、同種または不一致のドナー移植の使用を提供することが特に企図される。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、疾患または障害の治療を必要とする対象においてそれを治療する方法であって、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の組み合わせを対象に提供することを含み、両方とも対象から得られた１つ以上の生体試料から調製され、対象から得られたＣＤ３４細胞が、疾患または障害と関連するかまたはその原因となる１つ以上の遺伝子変異を含み、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団または低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の一方または両方が、対象に細胞集団を提供する前に、１つ以上の遺伝子変異を修復するために遺伝子編集に供される、方法を提供する。特定の実施形態では、遺伝子編集は、ＣＤ３４濃縮細胞集団の一方または両方をＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９またはｓｐＣａｓ）タンパク質、ガイドＲＮＡ（例えば、単一ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）、および修復鋳型と接触させることによって実行される。特定の実施形態では、疾患はＦＡであり、修復される遺伝子変異は、ファンコニ貧血相補群Ａ（ＦＡＮＣＡ）遺伝子の変異である。
【０１３８】
特定の実施形態では、本明細書に開示される遺伝子治療ベクターは、治療剤をコードする配列、すなわちコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、プロモーターが治療剤をコードする配列の発現を駆動することができることを意味する。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上のエンハンサを含む。エンハンサは、転写を増強するために当該技術分野で既知の核酸要素であり、例えば、上流、下流、イントロン内など、それらが調節する遺伝子と関連する任意の場所に位置することができる。任意のエンハンサ要素は、プロモーターと組み合わせて使用される場合に遺伝子の発現を増強する限り、本開示のポリヌクレオチドカセットおよび遺伝子治療ベクターに使用することができる。
【０１４０】
細胞で発現されるコード配列は、任意のポリヌクレオチド配列、例えば、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドまたはＲＮＡ系治療剤（ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、リボザイム、ｓｈＲＮＡなど）をコードする遺伝子またはｃＤＮＡであり得る。コード配列は、それが作動可能に連結されたプロモーター配列に対して異種であり得る、すなわち、天然ではそれと作動可能に会合していない。代替的に、コード配列は、それが作動可能に連結されたプロモーター配列に対して内在性であり得る、すなわち、天然ではそのプロモーターと会合している。遺伝子産物は、哺乳動物細胞において内因的に作用し得るか、または外因的に作用し得、例えば、それは分泌され得る。例えば、導入遺伝子が治療用遺伝子である場合、コード配列は、疾患または障害を治療するための治療薬として使用することができる所望の遺伝子産物またはその機能的断片もしくはバリアントをコードする任意の遺伝子であり得る。種々の実施形態では、導入遺伝子は、ヒトＦＡＮＣＡをコードする。
【０１４１】
本発明の一実施形態では、導入遺伝子コード配列は、出現頻度の低いコドンをより高い出現頻度のコドンで置き換えることによって発現を増強するように改変されるかまたは「コドン最適化される」。コード配列は、翻訳のためにアミノ酸をコードするｍＲＮＡ配列の一部である。翻訳中、６１個のトリヌクレオチドコドンの各々が２０個のアミノ酸のうちの１つに翻訳され、遺伝暗号に縮重または重複性が生じる。しかしながら、異なる細胞腫および異なる動物種は、同じアミノ酸をコードするｔＲＮＡ（各々がアンチコドンを有する）を異なる頻度で利用する。遺伝子配列が、対応するｔＲＮＡでの出現頻度の低いコドンを含有する場合、リボソーム翻訳機構が遅くなり、効率的な翻訳が妨げられる可能性がある。特定の種に対する「コドン最適化」によって発現を改善することができ、コード配列は、同じタンパク質配列をコードするが、高度に出現するコドンを利用する、かつ／または高度に発現するヒトタンパク質によって利用されるように改変される（Ｃｉｄ−Ａｒｒｅｇｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：４９２８）。本発明の一態様では、導入遺伝子のコード配列は、哺乳動物または霊長類において発現頻度の低いコドンを、霊長類において発現頻度の高いコドンで置き換えるように改変される。例えば、いくつかの実施形態では、導入遺伝子によってコードされるコード配列は、上記また本明細書に開示される配列によってコードされるポリペプチドと少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも９０％の配列同一性、例えば、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％配列同一性を有するポリペプチドをコードし、コード配列の少なくとも１つのコドンは、上記または本明細書に開示される配列の対応するコドンよりもヒトにおいてより高いｔＲＮＡ頻度を有する。
【０１４２】
本発明の追加の実施形態では、導入遺伝子コード配列は、所望の導入遺伝子をコードしないオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の終結または除去により発現を増強するように改変される。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、開始コドンに続き、終止コドンを含まない核酸配列である。ＯＲＦは、目的の遺伝子と比較して、順方向または逆方向であり得、「フレーム内」または「フレーム外」であり得る。かかるオープンリーディングフレームは、目的の遺伝子と並んで発現カセットで発現される可能性を有し、望ましくない悪影響をもたらす可能性がある。本発明の一態様では、導入遺伝子のコード配列は、コドン使用頻度をさらに変更することによって、オープンリーディングフレームを除去するように改変されている。これは、開始コドン（ＡＴＧ）を除去し、逆方向またはフレーム外ＯＲＦでの終止コドン（ＴＡＧ、ＴＡＡ、またはＴＧＡ）を導入することによって実行され得るが、一方で、アミノ酸配列を保存し、目的の遺伝子中で高度に利用されるコドンを維持する（すなわち、頻度が２０％未満のコドンを回避する）。本開示において、導入遺伝子コード配列は、コドン最適化および非導入遺伝子ＯＲＦの除去のいずれか、または両方の手法を使用して最適化され得る。当業者には明白であろうように、コドン最適化中に導入されるＯＲＦを除去するために、コドン最適化後に非導入遺伝子ＯＲＦを除去または最小化することが好ましい。
【０１４３】
本開示は、本明細書に記載の発現カセットまたは導入カセットを含むプラスミドを含む。特定の実施形態では、プラスミドは、ｐＣＣＬ−ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡ−ＷＰＲＥ＊（配列番号：２４）であり、かつ／またはプラスミドは、ｐＣＣＬ−ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡ−ＷＰＲＥ（配列番号：２５）からの発現カセットを含む。
【０１４４】
特定の実施形態では、遺伝子治療ベクターまたはその中の遺伝子導入カセットは、１つ以上の追加の要素、例えば、５’ＬＴＲ、３’ＬＴＲ、ｃＰＰＴ、ＣＴＳ、ＲＲＥ、エンハンサ配列、およびパッケージングシグナルから選択される１つ以上の要素を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子治療ベクターまたは遺伝子導入カセットは、国際特許公開第ＷＯ  ２０１８／０４９２７３  Ａ１号に開示される任意のベクターまたはカセットであり、その開示は、あらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。ファンコニ貧血相補群（ＦＡＮＣ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列には、米国特許第５，９５２，１９０号に開示されるものが含まれ、その開示は、あらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４５】
ＲＲＥ配列は、遺伝子導入の効率を向上させる。本明細書に記載される発現カセットおよび遺伝子治療ベクターのいずれかの特定の実施形態では、ＲＲＥ配列は、以下の配列、または以下の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列（いずれも５’から３｀方向に表示される）のいずれかを含むか、またはそれからなる：
2021521180.tif 000003
配列番号：２４のヌクレオチド２６４９〜２８８２もしくは配列番号：２５のポリヌクレオチド１２９６〜２１５３を含むかまたはそれからなる配列。
【０１４６】
レトロウイルスリーダー領域は、パッケージングシグナル（Ψ）を含有し、レトロウイルスゲノムをウイルスカプシドにパッケージ化することに関与する。ＬＶベクターは、この領域におけるＧａｇ遺伝子の約３００ｂｐを必要とすると考えられた。現在、このＧａｇ配列は、わずか４０ｂｐに減少している（図６５）。本明細書に記載される発現カセットおよび遺伝子治療ベクターのいずれかの特定の実施形態では、ψ配列は、ＨＩＶ−１ψ配列であるか、またはψ配列は、以下の配列、または以下の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列のいずれかを含むか、またはそれからなる：
2021521180.tif 000004
配列番号：２４のポリヌクレオチド２０３１〜２１５６もしくは配列番号：２５のポリヌクレオチド８８９〜９３３を含むかまたはそれからなる配列。
【０１４７】
本明細書に記載される発現カセットおよび遺伝子治療ベクターのいずれかの特定の実施形態では、切断型ＨＩＶ−１５’ＬＴＲは、以下の配列、または以下の配列のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列のいずれかを含むか、またはそれからなる：
2021521180.tif 000005
配列番号：２４のポリヌクレオチド１５８６〜９４９５もしくは配列番号：２５のポリヌクレオチド９３４〜１２９５を含むかまたはそれからなる配列。
【０１４８】
本明細書に記載される発現カセットおよび遺伝子治療ベクターのいずれかの特定の実施形態では、ＨＩＶ−１自己不活化３’ＬＴＲは、以下の配列、または以下の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列のいずれかを含むか、またはそれからなる：
2021521180.tif 000006
配列番号：２４のポリヌクレオチド９２６２〜９４９５もしくは配列番号：２５のポリヌクレオチド８０５６〜８２８９を含むかまたはそれからなる配列。
【０１４９】
本明細書に記載される発現カセットおよび遺伝子治療ベクターのいずれかの特定の実施形態では、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーターは、以下の配列、その機能的断片、または以下の配列のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列のいずれかを含むか、またはそれからなる：
2021521180.tif 000007
配列番号：２４のポリヌクレオチド１５８６〜１７８９もしくは配列番号：２５のポリヌクレオチド１〜５７７を含むかまたはそれからなる配列。
【０１５０】
本明細書に記載される発現カセットおよび遺伝子治療ベクターのいずれかの特定の実施形態では、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターは、以下の配列、その機能的断片、または以下の配列のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列のいずれかを含むか、またはそれからなる：
2021521180.tif 000008
【０１５１】
統合前複合体の核移行を促進するｃＰＰＴは、逆転写酵素の分離に関与するＣＴＳと共に、ウイルス力価を改善することが確認されている（Ｚｅｎｎｏｕ，ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｆｏｌｌｅｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。本明細書に記載される発現カセットおよび遺伝子治療ベクターのいずれかの特定の実施形態では、ＨＩＶ−１（ｃＰＰＴ／ＣＴＳ）の中枢ポリプリン管および中枢終結配列は、以下の配列、その機能的断片、または以下の配列のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列のいずれかを含むか、またはそれからなる：
2021521180.tif 000009
配列番号：２４のヌクレオチド３３７８〜３４９５もしくは配列番号：２５のヌクレオチド２１７６〜２３１２を含むかまたはそれからなる配列。
【０１５２】
本明細書に記載される発現カセットおよび遺伝子治療ベクターのいずれかの特定の実施形態では、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ１（ｈＰＧＫ）プロモーターは、以下の配列、その機能的断片、または以下の配列のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列のいずれかを含むか、またはそれからなる：
2021521180.tif 000010
配列番号：２４のヌクレオチド３５４１〜４０５１もしくは配列番号：２５のヌクレオチド２３３５〜２８４５を含むかまたはそれからなる配列。
【０１５３】
特定の実施形態では、本明細書に開示される発現カセットおよび遺伝子治療ベクターは、１つ以上の追加の要素、例えば、ＣＭＶプロモーターおよび／またはエンハンサ、ＳＶ  ４０ポリＡ配列、複製起点、例えば、ＳＶ４０  ｏｒｉ配列、または本明細書に開示される要素のいずれかをさらに含む。
【０１５４】
本明細書に記載される発現カセットおよび遺伝子治療ベクターの特定の実施形態では、ヒトＣＭＶエンハンサは、以下の配列、その機能的断片、または以下の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる：
2021521180.tif 000011
【０１５５】
本明細書に記載される発現カセットおよび遺伝子治療ベクターのいずれかの特定の実施形態では、サルウイルス４０（ＳＶ４０）ポリ（Ａ）シグナルは、以下の配列、その機能的断片、または以下の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる：
2021521180.tif 000012
配列番号：２５のヌクレオチド８３６１〜８４８２を含むかまたはそれからなる配列。
【０１５６】
本明細書に記載される発現カセットおよび遺伝子治療ベクターのいずれかの特定の実施形態では、ＳＶ４０複製起点は、以下の配列、その機能的断片、または以下の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる：
2021521180.tif 000013
配列番号：２５のヌクレオチド８５０２〜８６５７を含むかまたはそれからなる配列。
【０１５７】
本明細書に記載の発現カセットおよび遺伝子治療ベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載される発現カセットまたは遺伝子治療ベクターのいずれかに存在するｄＮＥＦシグナルは、以下の配列、その機能的断片、または以下の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる：
2021521180.tif 000014
【０１５８】
本明細書に記載される発現カセットおよび遺伝子治療ベクターのいずれかの特定の実施形態では、本明細書に記載される発現カセットまたは遺伝子治療ベクターのいずれかに存在するＫａｎＲ配列は、以下の配列を含むか、またはそれからなる：
2021521180.tif 000015
【０１５９】
本明細書に記載される発現カセットおよび遺伝子治療ベクターのいずれかの特定の実施形態では、本明細書に記載される発現カセットまたは遺伝子治療ベクターのいずれかに存在するＲＮＡ−ＯＵＴ配列は、以下の配列を含むか、またはそれからなる：
2021521180.tif 000016
配列番号：２５のヌクレオチド９７３１〜９８７１を含むかまたはそれからなる配列。
【０１６０】
本明細書に記載される発現カセットおよび遺伝子治療ベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載される発現カセットまたは遺伝子治療ベクターのいずれかに存在するｒｒｎＧターミネータ（Ｅ．ｃｏｌｉリボソームＲＮＡ  ｒｒｎＧオペロン（Ａｌｂｒｅｃｈｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）からの転写ターミネータ）は、以下の配列を含むか、またはそれからなる：
2021521180.tif 000017
【０１６１】
本明細書に記載の発現カセットおよび遺伝子治療ベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載される発現カセットまたは遺伝子治療ベクターのいずれかに存在するｏｒｉ（高コピー数のＣｏｌＥ１／ｐＭＢ１／ｐＢＲ３２２／ｐＵＣ複製起点）は、以下の配列、その機能的断片、または以下の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる：
2021521180.tif 000018
配列番号：２４のヌクレオチド９７３１〜９８７１もしくは配列番号：２５のヌクレオチド８７００〜９７１４を含むかまたはそれからなる配列。
【０１６２】
本明細書に記載の発現カセットおよび遺伝子治療ベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載される発現カセットまたは遺伝子治療ベクターのいずれかに存在するＣＡＰ結合部位は、以下の配列、その機能的断片、または以下の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる：
2021521180.tif 000019
【０１６３】
本明細書に記載の発現カセットおよび遺伝子治療ベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載される発現カセットまたは遺伝子治療ベクターのいずれかに存在するＥ．ｃｏｌｉ  ｌａｃプロモーターは、以下の配列、その機能的断片、または以下の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる：
2021521180.tif 000020
【０１６４】
本明細書に記載の発現カセットおよび遺伝子治療ベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載される発現カセットまたは遺伝子治療ベクターのいずれかに存在するｌａｃオペレータは、以下の配列、その機能的断片、または以下の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる：
2021521180.tif 000021
【０１６５】
本明細書に記載の発現カセットおよび遺伝子治療ベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載される発現カセットまたは遺伝子治療ベクターのいずれかに存在するＴ３プロモーター（バクテリオファージＴ３  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター）は、以下の配列、その機能的断片、または以下の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる：
2021521180.tif 000022
【０１６６】
本明細書に記載の発現カセットおよび遺伝子治療ベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載される発現カセットまたは遺伝子治療ベクターのいずれかに存在するＴ７プロモーター（バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター）は、以下の配列、その機能的断片、または以下の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる：
2021521180.tif 000023
【０１６７】
本明細書に記載の発現カセットおよび遺伝子治療ベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載される発現カセットまたは遺伝子治療ベクターのいずれかに存在するｆ１  ｏｒｉ（ｆ１バクテリオファージ複製起点）は、以下の配列、その機能的断片、または以下の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる：
2021521180.tif 000024
【０１６８】
本明細書で論じられるように、本発明の発現カセットおよび遺伝子治療ベクターは、ＲＮＡ核外遊出シグナルを含み得る。例示的なＲＮＡ核外遊出配列として、限定されないが、ＷＰＲＥが含まれる。ＷＰＲＥは、導入遺伝子、プロモーター、およびベクター非依存的様式におけるＲＮＡの安定性を増加させることによって、標的細胞における導入遺伝子発現を有意に増加させる（Ｚｕｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。しかしながら、肝臓がんに関与するＷＨＶ  Ｘ遺伝子に由来する切断型６０−アミノ酸タンパク質を発現することができる（Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。したがって、ほとんどの前臨床プロトコルおよび臨床試験は、ＷＰＲＥ要素の変異バージョンを含む（Ｚａｎｔａ−Ｂｏｕｓｓｉｆ  ｅｔ  ａｌ，２００９）。一方、ＳＩＮ−ＬＶベクターにおける２つのＳＶ４０−ＵＳＥ要素の使用は、転写リードスルーの抑制において、ＷＰＲＥ配列よりも効率的であることが見出されている（Ｓｃｈａｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。より正確には、本明細書に開示されるＷＰＲＥは、Ａｘｅｌ  Ｓｃｈａｍｂａｃｈ（ヌクレオチド１〜５８９）によって実行された改変ＷＰＲＥ（ＷＯ  ２００８／１３６６７０  Ａ２）からの５８９ヌクレオチド、および以前のＷＰＲＥ（ヌクレオチド５９０〜６７７）からの８８ヌクレオチドを運ぶキメラｗＰＲＥである（Ｚｕｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。本明細書に開示されるデータは、このキメラＷＰＲＥが、以前のｗＰＲＥよりも良好に機能することを示す。キメラｗＰＲＥ配列は、以下の配列、その機能的断片、または以下の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む：
2021521180.tif 000025
【０１６９】
特定の実施形態では、変異ＷＰＲＥ配列は、ＷＰＲＥ＊を含むか、またはそれからなり、配列番号：２４のヌクレオチド８５０２〜９１７８もしくは配列番号：２５のヌクレオチド７２９３〜７８８８に対応するか、または配列番号：２４もしくは配列番号：２５のこの領域と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する。
【０１７０】
本明細書に開示されるか、または当該技術分野で既知の両方の要素の他の組み合わせは、当業者によって容易に理解されるであろう。
【０１７１】
加えて、当業者には認識されるように、発現カセットおよび遺伝子治療ベクターは、特定の遺伝子治療ベクターのクローニングおよび調節要素を促進するための制限部位を含むがこれらに限定されない他の要素を任意に含み得る。
【０１７２】
本発明のいくつかの態様では、対象のポリヌクレオチドカセットは、遺伝子を細胞に送達するために、例えば、遺伝子が細胞の生存能および／または機能に及ぼす影響を決定するため、細胞障害などを治療するために使用される。様々な実施形態では、形質導入によるウイルスベクターの細胞への送達は、インビトロ、エクスビボ、またはインビトロで生じ得る。したがって、本発明のいくつかの態様では、哺乳動物細胞において導入遺伝子の発現を提供する組成物は、遺伝子治療ベクターであり、遺伝子治療ベクターは、本開示のポリヌクレオチドカセット、例えば遺伝子導入カセットを含む。
【０１７３】
ＦＡ患者からのＨＳＣの遺伝子補正、続いてこれらの細胞の自己移植（造血遺伝子治療）は、ＦＡ患者、特にＨＬＡ−同型兄弟を欠く患者にとって良好な代替物である。一実施形態では、造血遺伝子療法は、ＨＬＡ−同型兄弟を欠く患者にとって好ましい治療レジメンである。別の実施形態では、造血遺伝子療法は、ＨＬＡ−同型兄弟を有する患者の治療レジメンである。
【０１７４】
本明細書に開示される方法のいずれかの特定の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ＦＡＣタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、ベクターと共に透過された細胞は、ＦＡを治療するために対象に提供される。
【０１７５】
ＦＡ患者のほとんどがＦＡ−Ａ相補群に属するため（Ｃａｓａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｌｅｖｉｔｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、機能的ＦＡＮＣＡ遺伝子を保持するベクターが開発されている。ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＰＲＥ＊）の変異転写後調節要素を含み、任意の残留オープンリーディングフレームを欠く（Ｓｃｈａｍｂａｃｈ  Ａｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００６；１３：６４１−６４５）を用いて、治療遺伝子の発現レベルおよび安定性を改善する。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、
（ｉ）ホスホグリセートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター配列またはその機能的バリアントもしくは断片、
（ｉｉ）ヒトＦＡＮＣＡタンパク質またはその機能的断片もしくはバリアントをコードする配列、および
（ｉｉｉ）ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＰＲＥ）配列の転写後調節要素
を含む。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、
（ｉ）ヒトホスホグリセートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター配列、
（ｉｉ）ヒトＦＡＮＣＡタンパク質をコードする配列、および
（ｉｉｉ）変異型ＷＰＲＥ配列
を含む。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、
ａ）５’ＬＴＲ、任意に改変された５’ＬＴＲ、
ｂ）ｃＰＰＴ配列、
ｃ）ＰＧＫプロモーター配列、任意にヒトＰＧＫプロモーター配列、および
ｄ）ヒトＦＡＮＣＡタンパク質をコードする配列、任意にｃＤＮＡ配列またはコドン最適化配列、
ｅ）変異型ＷＰＲＥ配列、
ｆ）３’ＬＴＲ、任意に改変された３’ＬＴＲ
を含む。
【０１７９】
一実施形態では、改変されたＷＰＲＥは、ＷＰＲＥ＊と称される。ＷＰＲＥ＊は、オープンリーディングフレームを欠く改変されたＷＰＲＥである（例えば、Ｓｃｈａｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ，２００６  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３：６４１−６４５を参照されたい）。
【０１８０】
ＦＡ患者のほとんどがＦＡ−Ａ相補群に属するため（Ｃａｓａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｌｅｖｉｔｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、特定の実施形態では、コードされた治療用遺伝子産物はＦＡＮＣＡであるが、本開示は、他の相補群のＦＡタンパク質も送達され、したがって、例えば、ＦＡＮＣＡの代わりに、本明細書に開示される発現カセットにコードされ得ることを企図する。
【０１８１】
本明細書に記載される発現カセットおよび遺伝子治療ベクターのいずれかの特定の実施形態では、コドン最適化ＦＡＮＣＡをコードするポリヌクレオチド配列は、以下の配列、またはその機能的断片、または以下の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなるヒトＦＡＮＣＡ  ｃＤＮＡ配列である：
2021521180.tif 000026
2021521180.tif 000027
2021521180.tif 000028
2021521180.tif 000029
【０１８２】
本開示は、本明細書に記載の発現カセットまたは導入カセットを含むプラスミドを含む。特定の実施形態では、プラスミドは、ｐＣＣＬ−ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡ−ＷＰＲＥ＊またはｐＣＣＬ−ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡＷ−８２−ＲＯ（配列番号：２５）である。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、遺伝子治療ベクターは、自己限定型ＬＶである。本明細書に記載される発現カセットおよび遺伝子治療ベクターのいずれかの特定の実施形態では、導入カセットは、以下の配列、または配列番号：２４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる本開示のｐＣＣＬ−ＳＩＮ−ｃＰＰＴ／ＣＴＳ−ｈＰＧＫ−ｈＦＡＮＣＡ−ＷＰＲＥである。配列番号：２４は、ｐＣＣＬ−ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡ−ＷＰＲＥ＊プラスミドに対応する。配列番号：２５は、ｐＣＣＬ−ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡＷ−８２−ＲＯプラスミドに対応する。
【０１８４】
一実施形態では、ＦＡＮＣＡ遺伝子は、レンチウイルスベクター（ＬＶ）を介して送達される。本明細書に記載されるＦＡＮＣＡ  ＬＶは、自己不活性化レンチウイルスベクター（ＬＶ）を利用する。一実施形態では、ＦＡＮＣＡ  ＬＶは、ヒトホスホグリセレート（ＰＧＫ）遺伝子のプロモーターを含む。このベクターの安全性は、クリニックですでに使用されているガンマレトロウイルスベクターと比較して著しく改善されており、これは強力なウイルスプロモーターを含む。
【０１８５】
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡ．ＷＰＲＥ＊ＬＶであり、配列番号：２４に開示される配列を含む遺伝子導入カセットを含む。ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡ−ＷＰＲＥ＊ＬＶ遺伝子発現カセット部分は、ヒトＰＧＫプロモーター、ＦＡＮＣＡ  ｃＤＮＡのコード配列、およびＷＰＲＥ＊を含み、配列番号：２４のヌクレオチド３５４１〜９１７８に対応する。ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡ−ＷＰＲＥ＊ＬＶ導入カセット部分は、配列の約５’ＬＴＲ（Ｕ５）から約３’ＬＴＲ（Ｕ５）を含む。配列番号：２４に関して、配列番号：２４のヌクレオチド１５８６〜１７８９は、ヒトＣＭＶ前初期プロモーターを含む。配列番号：２４のヌクレオチド２０３１〜２１５６は、ＨＩＶ１  ｐｓｉパッケージングシグナルを含む。配列番号：２４のヌクレオチド２６４９〜２８８２は、ＨＩＶ１  ＲＲＥ要素を含む。配列番号：２４のヌクレオチド３３７８〜３４９５は、ＨＩＶ  ｃＰＰＴ／ＣＴＳ要素を含む。配列番号：２４のヌクレオチド３５４１〜４０５１は、ｈＰＧＫプロモーターを含む。配列番号：２４のヌクレオチド４０７８〜８４４５は、ヒトＦＡＮＣＡ−Ａ  ｃＤＮＡを含む。配列番号：２４のヌクレオチド８５０２〜９１７８は、変異型ＷＰＲＥ要素を含む。配列番号：２４のヌクレオチド９２６２〜９４９５は、ＨＩＶデルタＵ３’ＬＴＲを含む。
【０１８６】
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｐＣＣＬ−ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡＷ−８２−ＲＯであり、配列番号：２５に開示される配列を含む遺伝子導入カセットを含む。ｐＣＣＬ−ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡＷ−８２−ＲＯ遺伝子発現カセット部分は、ヒトＰＧＫプロモーター、ＦＡＮＣＡ  ｃＤＮＡのコード配列、およびＷＰＲＥ＊を含み、配列番号：２５のヌクレオチド２３３５〜７８８８に対応する。ｐＣＣＬ−ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡＷ−８２−ＲＯ導入カセット部分は、配列の約５’ＬＴＲ（Ｕ５）から約３’ＬＴＲ（Ｕ５）を含む。配列番号：２５に関して、配列番号：２５のヌクレオチド１〜５７７は、ヒトＣＭＶ前初期プロモーターを含む。配列番号：２５のヌクレオチド８８９〜９３３は、ＨＩＶ１  ｐｓｉパッケージングシグナルを含む。配列番号：２５のヌクレオチド１２９６〜２５３は、ＨＩＶ１  ＲＲＥ要素を含む。配列番号：２５のヌクレオチド２１７６〜２１９１は、ＨＩＶ  ｃＰＰＴ／ＣＴＳ要素を含む。配列番号：２５のヌクレオチド２３３５〜２８４５は、ｈＰＧＫプロモーターを含む。配列番号：２５のヌクレオチド２８７２〜７２４２は、ヒトＦＡＮＣＡ−Ａ  ｃＤＮＡを含む。配列番号：２５のヌクレオチド７２９３〜７８８８は、変異型ＷＰＲＥ要素を含む。配列番号：２５のヌクレオチド８０５６〜８２８９は、ＨＩＶデルタＵ３’ＬＴＲを含む。
【０１８７】
さらに別の実施形態では、レンチウイルスベクターは、以下の要素を含む：（ｉ）初期ｐＣＣＬｓｉｎ−ｃｐｐｔ−ｈＰＧＫ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥに由来するレンチウイルスベクターの骨格（Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９８  ；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７２  （１１），９８７３−９８８０）。ｐＣＣＬ骨格は、異種ＣＭＶ−ＨＩＶ  ５’ＬＴＲを利用して、プロデューサー細胞内で高レベルのウイルスＲＮＡ転写を得る。かかる異種のＬＴＲは、ｒＨＩＶ粒子の生成のためにＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質を使用する必要性から独立して構築物を与え、それはその安全性が特徴である。３’ＬＴＲのＵ３領域は、ベクターに自己不活性化特性を付与する（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，１９９８）に記載されるような４００ｂｐ欠失を含む；（ｉｉ）ヒトコンドン最適化ＦＡＮＣＡ遺伝子のｃＤＮＡ（４３６８ｂｐ  ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｘ＿９９２２６または本明細書に開示されるように）は、ヒトＰＧＫプロモーターの制御下でＦＡＮＣＡタンパク質（１４５５ＡＡ）をコードする。プロモーターは、すでに遺伝子治療において使用されている他のプロモーターと比較して、インビボでのその安定した活性および改善された安全性特性によって特徴付けられており、（ｉｉｉ）ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節要素（ＷＰＲＥ）の変異型バージョンは、Ｘタンパク質をコードする配列の３’領域、およびＳｃｈａｍｂａｃｈら（Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ，２００６；１３，６４１−６４５）によって記述された任意の残りのＯＲＦまたはＷＰＲＥ＊で除去される。
【０１８８】
特定の実施形態では、本明細書に記載されるＦＡＮＣＡ  ＬＶは、自己不活性化レンチウイルスベクター（ＬＶ）を利用する。一実施形態では、ＦＡＮＣＡ  ＬＶは、ヒトホスホグリセレート（ＰＧＫ）遺伝子のプロモーターを含む。このベクターの安全性は、クリニックですでに使用されているガンマレトロウイルスベクターと比較して著しく改善されており、これは強力なウイルスプロモーターを含む。一実施形態では、ＦＡＮＣＡ遺伝子は、レンチウイルスベクターを介して送達される。特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡ．ＷＰＲＥ＊ＬＶである。
【０１８９】
本開示のポリヌクレオチドカセットを封入する遺伝子治療ベクターは、標準的な方法を使用して産生され得る。例えば、ＬＶビリオンの場合、本発明によるＬＶ発現ベクターをプロデューサー細胞に導入し、続いてＬＶヘルパー構築物を導入してもよく、ヘルパー構築物は、プロデューサー細胞において発現させることが可能なＬＶコード領域を含み、ＬＶベクターの非存在下でＬＶヘルパー機能を補完する。これに続いて、ヘルパーウイルスおよび／または追加のベクターがプロデューサー細胞に導入され、ヘルパーウイルスおよび／または追加のベクターは、効率的なＬＶウイルス産生をサポートすることができるアクセサリー機能を提供する。次いで、プロデューサー細胞を培養してＬＶを産生させる。これらのステップは、標準的な方法を使用して行われる。特定の実施形態では、図３８〜４１に示されるプラスミドは、遺伝子治療ベクターを産生するために使用される。
【０１９０】
以下の実施例に記載されるものを含むが、これらに限定されない、対象のポリヌクレオチドカセットの送達のためのウイルスベクター粒子を産生するための任意の好適な方法を使用することができる。哺乳動物細胞を効率的に形質導入するのに好適な任意の濃度の感染性ウイルスベクター粒子は、インビトロまたはインビボで哺乳動物細胞と接触させるために調製することができる。ウイルス粒子は、１ｍｌあたり１０８感染単位またはそれ以上、例えば、１ｍＬあたり５ｘ１０８感染単位、１ｍＬあたり１０９感染単位、１ｍＬあたり５ｘ１０９感染単位、１ｍＬあたり１０１０感染単位、１ｍＬあたり５ｘ１０１０感染単位、１ｍＬあたり１０１１感染単位、１ｍＬあたり５ｘ１０１１感染単位、１ｍＬあたり１０１２感染単位、１ｍＬあたり５ｘ１０１２感染単位、１ｍＬあたり１０１３感染単位、１ｍＬあたり１．５ｘ１０１３感染単位、１ｍＬあたり３ｘ１０１３感染単位、１ｍＬあたり５ｘ１０１３感染単位、１ｍＬあたり７．５ｘ１０１３感染単位、１ｍＬあたり９ｘ１０１３感染単位、１ｍＬあたり１ｘ１０１４感染単位、１ｍＬあたり５ｘ１０１４感染単位またはそれ以上、ただし通常は１ｍＬあたり１ｘ１０１５感染単位以下の濃度で製剤化され得る。
【０１９１】
対象のＬＶ遺伝子治療ベクターの調製において、例えば、哺乳動物細胞（例えば、２９３細胞）、昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）、微生物、および酵母を含む、ＬＶビリオンを産生するための任意の宿主細胞が使用され得る。宿主細胞はまた、ＬＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子が、ＬＶベクターゲノムが安定して維持およびパッケージングされる宿主細胞またはプロデューサー細胞において安定して維持されるパッケージング細胞であり得る。例示的なパッケージング細胞およびプロデューサー細胞は、ＳＦ−９、２９３、Ａ５４９、またはＨｅＬａ細胞に由来する。ＬＶベクターは、当該技術分野で既知の標準的な技法を使用して精製および製剤化される。
【０１９２】
特定の実施形態では、本発明は、本明細書に開示される遺伝子発現カセット、遺伝子導入カセット、または遺伝子治療ベクターを含む細胞を含む。関連する実施形態では、細胞は、本明細書に開示される発現カセットを含む遺伝子療法ベクターで形質導入されるか、または細胞のゲノムに組み込まれる本明細書に開示される発現カセットを有する。特定の実施形態では、細胞は、ウイルス遺伝子治療ベクター、例えば、パッケージング細胞を産生するために使用される細胞である。
【０１９３】
他の実施形態では、細胞は、発現カセットによってコードされる遺伝子産物を対象に提供するために対象に送達される細胞である。したがって、特定の実施形態では、細胞は、治療される対象に対して自家であるか、または治療される対象から得られる。他の実施形態では、細胞は、治療される対象と同種であるか、または治療される対象以外のドナーから得られる。特定の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である。特定の実施形態では、細胞は、血液細胞、赤血球、造血前駆細胞、骨髄細胞、例えば、系統枯渇骨髄細胞、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋）、または関与する造血赤血球前駆細胞である。特定の実施形態では、細胞は、細胞が本明細書に開示される遺伝子治療ベクターによって形質導入された後に細胞で治療される対象から得られるＣＤ３４＋細胞である。特定の実施形態では、細胞は、ＦＡと診断された対象から得られたＣＤ３４＋ＦＡ細胞である。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、障害の発症を予防する、障害の進行を停止する、障害の進行を逆転させるなどの治療的利益をもたらす。例えば、一実施形態では、障害は、ＢＭＦである。一実施形態では、障害は、血小板減少である。別の実施形態では、障害は、白血球減少である。一実施形態では、障害は、汎細胞減少である。一実施形態では、障害は、好中球減少である。別の実施形態では、障害は、貧血である。いくつかの実施形態では、主題の方法は、治療的利益が達成されていることを検出するステップを含む。当業者は、かかる治療的利益の測定値が改善される特定の疾患に適用可能であることを理解し、治療有効性を測定するために使用する適切な検出方法を認識するであろう。
【０１９５】
別の実施形態では、本発明は、疾患の治療を必要とする対象においてそれを治療する方法であって、有効量の高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団のいずれかまたは両方を対象に提供することを含み、それらのいずれかまたは両方を、細胞内で治療用遺伝子産物を発現する遺伝子治療ベクター、例えばウイルスベクターと接触させる、方法を含む。特定の実施形態では、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団のいずれかまたは両方は、対象に対して自家である。特定の実施形態では、細胞は、赤血球細胞、例えば造血幹細胞または関与する造血赤血球前駆細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、骨髄細胞、例えば、系統枯渇骨髄細胞である。特定の実施形態では、本方法は、ＦＡを治療するために使用され、ウイルスベクターは、ＦＡＮＣＡ遺伝子ｃＤＮＡまたはコード配列に作動可能に連結されたヒトＰＧＫプロモーターを含む本明細書に開示される発現構築物、および本明細書に開示される変異ｗＰＲＥを含むＬＶである。特定の実施形態では、細胞は、例えば静脈内注射を介して非経口的に対象に提供される。
【０１９６】
別の実施形態では、本発明は、ＦＡの治療を必要とする対象においてそれを治療する方法であって、有効量の細胞内でＦＡＮＣＡ  ｃＤＮＡを発現するＬＶベクターで形質導入された幹細胞の自家高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および／または低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を対象に提供することを含み、ＬＶベクターが、ＦＡＮＣＡ  ｃＤＮＡまたはコード配列に作動可能に連結されたヒトＰＧＫプロモーター、および本明細書に開示される変異ｗＰＲＥ配列を含む、方法を含む。特定の実施形態では、細胞は、造血幹細胞または関与する造血赤血球前駆細胞、例えば、骨髄細胞である。特定の実施形態では、細胞は、例えば静脈内注射を介して非経口的に対象に提供される。
【０１９７】
対象の導入遺伝子を使用する導入遺伝子の発現は、頑強であることが予想される。したがって、いくつかの事例では、例えば、遺伝子産物のレベルを測定することによって、治療有効性を測定することなどによって検出される導入遺伝子の発現は、対象組成物の投与後２ヶ月以下、例えば、投与後４、３、または２週間以下、例えば、投与後１週間で観察され得る。導入遺伝子の発現はまた、経時的に持続することが予想される。したがって、いくつかの事例では、例えば、遺伝子産物のレベルを測定することによって、治療有効性を測定することなどによって検出される導入遺伝子の発現は、対象組成物の投与後２ヶ月以上、例えば、４、６、８、または１０ヶ月以上、いくつかの事例では、１年以上、例えば、２、３、４、または５年、特定の事例では、５年を超えて観察され得る。
【０１９８】
特定の実施形態では、方法は、細胞または対象における導入遺伝子の発現を検出するステップを含み、発現は、本開示の１つ以上の改善された要素を含まないポリヌクレオチドカセットからの発現と比較して増強される。例えば、より早い検出、より高いレベルの遺伝子産物、細胞に対するより強力な機能的影響などによって証明されるように、典型的には、発現は、参照、すなわち、対照ポリヌクレオチドカセットからの発現と比較して２倍以上、例えば、３倍、４倍、または５倍以上、いくつかの事例では、１０倍、２０倍、または５０倍以上、例えば、１００倍増強されるであろう。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、注入によって患者が受ける細胞の用量は、形質導入プロセスから得られるものであろう。種々の好ましい実施形態では、患者体重の少なくとも約１ｘ１０１、１ｘ１０２、１ｘ１０３、１ｘ１０４、１ｘ１０５、１ｘ１０６、１ｘ１０７、１ｘ１０８以上の高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞／ＫＧを患者に注入する。種々の好ましい実施形態では、患者体重の少なくとも少なくとも約１ｘ１０１、１ｘ１０２、１ｘ１０３、１ｘ１０４、１ｘ１０５、１ｘ１０６、１ｘ１０７、１ｘ１０８以上の低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞／ＫＧを患者に注入する。いくつかの実施形態では、患者体重の１×１０６〜４×１０６の高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞／Ｋｇを患者に注入する。他の実施形態では、患者体重の３×１０５〜４×１０６の高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞／Ｋｇを患者に注入する。いくつかの実施形態では、患者体重の１×１０６〜４×１０６の高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞／Ｋｇを患者に注入する。他の実施形態では、患者体重の３×１０５〜４×１０６の高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞／Ｋｇを患者に注入する。いくつかの実施形態では、細胞は、単回用量で患者に注入される。他の実施形態では、細胞は、複数用量で患者に注入される（例えば、高ストリンジェンシーおよび低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団は、１回または複数回で順次投与される）。形質導入された細胞は、形質導入プロセスが完了した直後に注入することができる。特定の実施形態では、形質導入された細胞は、使用前に保存または凍結されるが、特定の実施形態において、それらは、形質導入された直後またはすぐに、例えば、１時間、２時間、４時間、または８時間以内に対象に提供される。
【０２００】
組み込まれると、治療用タンパク質（例えば、ヒトＦＡＮＣＡタンパク質）は、細胞によって発現される。形質導入されたＦＡ細胞は、遺伝子補正され、したがって、ＦＡＮＣＤ２およびＦＡＮＣＩの単一ユビキチン化によってＦＡ経路を活性化することができる。これらのタンパク質は、ＤＮＡ損傷の領域に移動し、他のＤＮＡ修復タンパク質と協力して、健康な細胞に起こるように、これらの細胞のＤＮＡの修復を促進する
【０２０１】
実施例でさらに詳細に記載するように、ヒトＦＡ患者由来のＢＭ試料を用いた前臨床インビトロデータは、これらの細胞の表現型を修正するためのＦＡＮＣＡ  ＬＶの有効性をすでに示している。
【０２０２】
一実施形態では、患者体重１ｋｇあたりの少なくとも１〜４×１０６のＣＤ３４＋補正細胞（例えば、ＦＡＮＣＡ形質導入ＨＳＣ）が投与され、例えば、非条件化ＦＡ患者における造血を回復する。いくつかの実施形態では、形質導入細胞は、形質導入直後に患者に注入または投与される。他の実施形態では、形質導入細胞は、患者に注入または投与する前に凍結される。
【０２０３】
ＦＡ患者からのＨＳＣの遺伝子補正、続いてこれらの細胞の自己移植（造血遺伝子治療）は、ＦＡ患者、特にＨＬＡ−同型兄弟を欠く患者にとって良好な代替物である。一実施形態では、造血遺伝子療法は、ＨＬＡ−同型兄弟を欠く患者にとって好ましい治療レジメンである。別の実施形態では、造血遺伝子療法は、ＨＬＡ−同型兄弟を有する患者にとって好ましい治療レジメンである。
【０２０４】
組成物および製剤
本開示の特定の態様は、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団のシステムまたは組み合わせに関し、これらのいずれかまたは両方は、遺伝子治療ベクターで形質導入されている。いくつかの実施形態は、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の組み合わせを含み、これらのいずれかまたは両方は、ヒトＦＡＮＣ遺伝子、例えば、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、またはＦＡＮＣＧを含むレンチウイルスベクター、または機能的バリアントおよびその断片を含むＦＡＮＣタンパク質をコードする核酸配列で形質導入されている。いくつかの実施形態は、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の組み合わせを含み、これらのいずれかまたは両方は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガー、またはメガヌクレアーゼ遺伝子編集システムなどの遺伝子編集または遺伝子修復を受けている。いくつかの実施形態は、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の組み合わせを含み、これらは免疫不全障害などの疾患または状態に関連する導入遺伝子を含むレンチウイルス（または他のウイルス）ベクターで形質導入されている。
【０２０５】
本開示のいくつかの態様では、疾患または状態の治療のための製剤が提供される。製剤は、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団（複数可）、または低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団（複数可）、またはその両方を、本明細書に記載される生理学的に許容される担体もしくは薬学的に許容される担体と共に含み得る。製剤は、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団（複数可）、または低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団（複数可）、またはその両方を含み得、一方または両方の細胞集団は、遺伝子治療ベクターで形質導入され、本明細書に記載の生理学的に許容される担体または薬学的に許容される担体と共に治療剤を発現または発現することが可能である。
【０２０６】
本発明は、本明細書に記載される高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団遺伝子治療ベクターのいずれかまたは両方、ならびに薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む薬学的組成物および製剤を含む。対象の高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および／または低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団は、霊長類への使用が許容される賦形剤を含む、一般に安全、無毒性、かつ望ましい製剤の調製において有用な薬学的に許容される担体、希釈剤、および試薬と組み合わせることができる。かかる賦形剤、担体、または希釈剤の例として、限定されないが、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが含まれる。また、補助的な活性化合物も製剤に組み入れることができる。製剤に使用される溶液または懸濁物として、注射用水、食塩溶液、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの無菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌化合物、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化化合物、アセテート、シトレート、またはホスフェートなどの緩衝液、凝集を防止するためのＴｗｅｅｎ  ２０などの洗浄剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧を調整するための化合物を含むことができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整できる。特定の実施形態では、製剤は、無菌である。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３４濃縮細胞集団は、現在の適正製造基準に従って製造される。現在の適正製造基準に従って製造されることは、投与のために調製される製剤が、管理規制および政府の許可の下でヒト対象への投与を可能にするのに十分に安全であることを意味する。一般に、制御規制および認可は、規制および認可を管理することにより、製剤が同一性、強度、品質、および純度に関して事前承認された受容基準を満たすことを規定する。許容基準には、製剤が現在の適正製造基準を満たしているかを決定するために使用される試験結果の数値制限、範囲、または他の適切な尺度が含まれる。仕様書には、許容基準への適合性を試験するために使用される分析手順が記載されている。製剤は、バッチで評価することができる。バッチは、許容基準を確実に遵守するために試験される製剤の特定の量である。
【０２０８】
製剤は、容器、パック、またはディスペンサ、例えば、シリンジ、例えば、充填済みシリンジに、投与のための指示書と共に含まれ得る。
【０２０９】
必要または有益な場合、製剤は、注入部位の疼痛を緩和するためにリドカインなどの局所麻酔剤を含むことができる。
【０２１０】
製剤内の治療有効量の細胞は、１０２を超える細胞、１０３を超える細胞、１０４を超える細胞、１０５を超える細胞、１０６を超える細胞、１０７を超える細胞、１０８を超える細胞、１０９を超える細胞、１０１０を超える細胞、または１０１１を超えることができる。
【０２１１】
本明細書に開示される製剤では、細胞は、概して、１リットル以下、５００ｍｌ以下、２５０ｍｌ以下、または１００ｍｌ以下の容量にある。したがって、投与される細胞の密度は、典型的には、１０４細胞／ｍｌ、１０７細胞／ｍｌ、または１０８細胞／ｍｌを超える。
【０２１２】
本明細書に開示される製剤は、例えば、注入、点滴、灌流、または洗浄によって投与するために調製することができる。投与する治療有効量は、１０２を超える細胞、１０３を超える細胞、１０４を超える細胞、１０５を超える細胞、１０６を超える細胞、１０７を超える細胞、１０８を超える細胞、１０９を超える細胞、１０１０を超える細胞、または１０１１を超えて含むことができる。特定の実施形態では、最低用量は、２×１０６細胞／ｋｇの対象体重である。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される薬学的組成物は、治療有効量の本明細書で開示される高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団のいずれかまたは両方を、薬学的に許容される担体ならびに／または賦形剤、例えば、食塩水、リン酸緩衝食塩水、リン酸、およびアミノ酸、ポリマー、ポリオール、糖、緩衝液、防腐剤、および他のタンパク質との混合物中に含む。例示的なアミノ酸、ポリマー、および糖などは、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノステアレート化合物、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、スクロース、フルクトース、デキストロース、マルトース、グルコース、マンニトール、デキストラン、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、キシリトール、ラクトース、トレハロース、ウシまたはヒト血清アルブミン、クエン酸、酢酸、リンゲル液およびハンクス液、システイン、アルギニン、カルニチン、アラニン、グリシン、リジン、バリン、ロイシン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ならびにグリコールである。好ましくは、この製剤は、４℃で少なくとも６ヶ月間安定である。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される薬学的組成物は、緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、無菌水、およびＧｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９６６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：４６７に記載されるものなどの当業者に既知の他の緩衝液を含む。アデノウイルスベクター送達系に含まれる腫瘍抑制遺伝子を含む薬学的組成物が含まれる緩衝液のｐＨは、６．５〜７．７５、好ましくは７〜７．５、最も好ましくは７．２〜７．４の範囲であり得る。
【０２１５】
本明細書で言及される全ての刊行物は、引用される刊行物に関連して方法および／または材料を開示し、説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾が生じる場合には、組み込まれた刊行物のいかなる開示よりも優先されることを理解されたい。
【０２１６】
特許請求の範囲は、あらゆる任意の要素を除外するように立案され得ることにさらに留意されたい。そのため、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連する「単に」、「のみ」などの排他的な用語の使用、または「否定的」な限定の使用の先行詞としての役割を果たすことが意図される。
【０２１７】
本明細書において論じられる刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供される。さらに、提供される刊行物の日付は実際の公開日とは異なる可能性があり、これらは独立して確認する必要があり得る。
【０２１８】
ＦＡ−ＡがＦＡ患者における最も頻繁な相補群であるため（Ｃａｓａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、ＦＡＮＣＡ遺伝子および／またはＥＧＦＰマーカー遺伝子を発現するベクターが実施例の焦点であるが、他のＦＡＮＣＡ遺伝子を利用して、同様に他の相補群が治療され得る。
【０２１９】
本開示は、特許請求の範囲に記載される本開示の範囲を限定しない以下の実施例にさらに記載される。
【実施例】
【０２２０】
実施例１
高および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団での患者の治療
患者１は、ファンコニ貧血を呈した。その後、患者１は、Ｇ−ＣＳＦおよびプレリキサンを用いて動員し、続いて連日で２回のアフェレーシス収集を行った。同じ臨床試験における他のＦＡ患者と比較して、患者１は、循環ＣＤ３４細胞の末梢血分析によって示されるＣＤ３４細胞の適度な動員を有し、他の患者と同様の動員動態を有した。２回のアフェレーシス収集の後、収集したＨＳＰＣを２つの末梢血生体試料に分けた。
【０２２１】
高ストリンジェンシーＣＤ３４選択：第１の生体試料は、米国特許第８，７２７，１３２号に記載されるように、濃縮のためのＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＣＤ３４試薬で濃縮モードでＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システムを使用して、高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞について選択することによって濃縮した。高ストリンジェンシーＣＤ３４選択は、ＣＤ３４＋細胞の２９．０％の収率、および３６％の相対純度をもたらした。
【０２２２】
低ストリンジェンシーＣＤ３４選択：第２の生体試料は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システムの枯渇モード使用の修正を使用して、低ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞について選択することによって濃縮した。簡単に説明すると、第２の生体試料を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＣＤ３４試薬を使用して標識した。次いで、試料を機器の枯渇モードプログラムを使用してカラムに負荷した。磁石を「ＯＮ」にして試料を大量に負荷した後、細胞採取バッグ（標的細胞を採取するための機器の通常動作で使用）を取り外し、幹細胞移植には使用しなかった。「非標的細胞バッグ」を取り付け、次いで磁石を「ＯＦＦ」にし、次いで溶出緩衝液を機器に適用し、ＣＤ３４＋細胞を非標的細胞バッグに溶出させた。非標的細胞バッグに収集した細胞集団は保存し、低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団として指定した。低ストリンジェンシーＣＤ３４選択は、５．８％の相対純度で、ＣＤ３４＋細胞の５４．５％の収率をもたらした。低純度は、選択プロセス中にＣＤ３４＋細胞から精製されなかった他の造血細胞型に起因する。その結果を表１Ａおよび１Ｂに要約する。
【０２２３】
（表１Ａ）ＣＤ３４濃縮前
2021521180.tif 000030
（表１Ｂ）ＣＤ３４濃縮後
2021521180.tif 000031
ファンコニ貧血−Ａ患者からの開始細胞数、およびＣＤ３４＋細胞純度、および得られた細胞集団
Ａｐｈ：アフェレーシス
ＴＮＣ：  総有核細胞数
低：修正したＣｌｉｎｉＭＡＣＳ枯渇プログラム
高：標準ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３４濃縮プログラム
【０２２４】
続いて、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の両方を、各々、ＦＡＮＣＡ遺伝子産物をコードする組換え遺伝子療法ベクター（ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡ−ＷＰＲＥ＊）（配列番号：２５）で個別に形質導入し、得られた遺伝的に改変された細胞をそれぞれ生成物１．１および生成物１．２に指定した。
【０２２５】
生成物１．１および生成物１．２を一緒に混合し、その後、臨床指標をモニタリングしながら１０〜３０分間にわたって連続静脈内注入により患者１に投与した。
【０２２６】
患者１は、参加機関で移植された全てのＦＡ患者の中で、最も速い、またはほぼ最も速いインビボ選択生着動態を示している。移植前にこのＦＡ患者において低下していた造血系統の安定化の初期の傾向は、この治療法によって予想外に達成された臨床的成功のための説得力のあるエンドポイントである。他の５人のＦＡ患者が標準的なＣＤ３４選択アプローチで移植されており、いずれも患者１に匹敵する生着動態を示していない。
【０２２７】
理論に束縛されることなく、高ストリンジェンシー（生成物１．１）および低ストリンジェンシー（生成物１．２）ＣＤ３４濃縮細胞集団の混合物は、遺伝子改変されたＦＡ造血細胞にインビボ選択的優位性を付与し、経時的に遺伝子改変された細胞の進行的増加をもたらすと考えられる。生成物１．１（高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団）は、造血に寄与する遺伝子組改変された細胞の大部分を提供していると考えられ、生成物１．２（低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団）は、生成物１．１による頑強な生着および造血再増殖を促進したと考えられる。
【０２２８】
実施例２
系統枯渇細胞集団による治療の比較有効性
患者２は、ファンコニ貧血を呈した。末梢血生体試料を、実施例１と同等の手順を用いて動員アフェレーシスによって患者２から得た。系統枯渇細胞集団は、生体試料をＣＤ３／ＣＤ１４／ＣＤ１６／ＣＤ１９試薬で標識し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏｔｅｃＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システムを枯渇モードで使用して、標識された細胞の試料を枯渇させることによって調整した。系統枯渇ＣＤ３４選択は、１．６％の相対純度で、ＣＤ３４＋細胞の５６％の収率をもたらした。低純度は、選択プロセス中にＣＤ３４＋細胞から精製されなかった他の造血細胞型に起因する。ＣＤ３４細胞の収率および純度は、低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団において患者１で達成されたものと同等であった。高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団は、調製しなかった。系統枯渇細胞集団は、ＦＡＮＣＡ遺伝子産物をコードする組換え遺伝子療法ベクターで形質導入し、生成物２．１として指定した。
【０２２９】
製品２．１は、患者１で使用されているものに匹敵する細胞数の臨床指標をモニタリングしながら、１０〜３０分間の持続静脈内注入によって患者２に投与した。患者１とは対照的に、移植から６ヶ月後には、患者２の血液中で遺伝子組み換え細胞は検出できなかった。したがって、生成物１．２単独に類似していると考えられる生成物２．１は、検出可能な造血回復をもたらさない。
【０２３０】
実施例３
より高い収率のための低ストリンジェンシー条件の修正、および結果として生じる細胞集団による治療
患者３は、ファンコニ貧血を呈する。末梢血生体試料は、実施例１と同等の手順を用いて動員アフェレーシスによって患者３から得られる。アフェレーシス収集後、収集したＨＳＰＣを２つの末梢血生体試料に分ける。
【０２３１】
高ストリンジェンシーＣＤ３４選択：第１の生体試料は、実施例１に記載されるように、濃縮のためのＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＣＤ３４試薬で濃縮モードでＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システムを使用して、高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞について選択することによって濃縮した。高ストリンジェンシーＣＤ３４選択は、ＣＤ３４＋細胞の２０％を超える収率、および２０％を超える相対純度をもたらす。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システム上のＣＤ３４選択プログラムは、表２に示されるようなパラメータで上記に記載されるような試料を使用して実行した。プロセスは、およそ２０〜３０分間続く。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システムの「標的細胞バッグ」は、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を含む。
【０２３２】
（表２）
2021521180.tif 000032
【０２３３】
低ストリンジェンシーＣＤ３４選択：第２の生体試料は、患者１に適用される低ストリンジェンシー濃縮と比較してＣＤ３４＋細胞のより高い収量を提供することを意図した修正を伴う、実施例１に記載されるＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システムの枯渇モード使用の修正を使用する低ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞について選択することによって濃縮した。
【０２３４】
抗凝固クエン酸デキストロース溶液（ＡＣＤ−Ａ）で抗凝固された末梢血由来のアフェレーシス生成物は、６０×１０９〜６×１０８の総細胞（ＣＤ３４標識試薬の１つのバイアルを使用する場合）または１２０×１０９〜１２×１０８の総細胞（ＣＤ３４標識試薬の２つのバイアルを使用する場合）のいずれかで提供される。無菌条件下における層流フード内で、細胞数、細胞生存率、およびＣＤ３＋、ＣＤ１９＋、またはＣＤ３４＋細胞の亜集団の数を測定する。アフェレーシス生成物を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で６００ｍＬの総容量に満たされた導入バッグに導入する。内容物を２３０Ｇで１５分間遠心分離し、上清を除去し、９０ｍＬを残し、５ｍＬの免疫グロブリンを添加し、次に室温で１０分間混合する。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＣＤ３４試薬の１つまたは２つの７．５ｍｌのバイアルをバッグに注入し、それを混合し、室温で３０分間撹拌下でインキュベートする。細胞を２３０Ｇで１５分間遠心分離し、１５０ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁した。
【０２３５】
ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システム上のＣＤ３４選択プログラムは、表２に示されるようなパラメータで上記に記載されるような試料を使用して実行した。プロセスは、およそ２０〜３０分間続く。プログラムは、洗浄ステップのいずれかが行われ、ＣＤ３４濃縮細胞および他の非特異的細胞が「標的細胞袋」に流される前に中止される。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システムの「標的細胞バッグ」は、低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を含む。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システムの「非標的細胞バッグ」は、非標的細胞を含む。
【０２３６】
低ストリンジェンシーＣＤ３４選択は、ＣＤ３４＋細胞の約３５％〜６０％の収率、および約１０％〜３０％の相対純度をもたらす。
【０２３７】
続いて、高ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団の両方を、各々、個別に形質導入するか、または実施例１に記載されるように、ＦＡＮＣＡ遺伝子産物をコードする組換え遺伝子治療ベクターで組み合わして、形質導入し、得られた遺伝的に改変された細胞をそれぞれ生成物３．１および生成物３．２に指定した。
【０２３８】
個別に形質導入した生成物３．１および生成物３．２を一緒に混合し、その後静脈内ボーラスにより患者３に投与した。
【０２３９】
患者３は、急速なインビボ選択生着動態を示す。この治療プロトコルは、造血、好中球、赤血球、および血小板における多系統をもたらす。移植前に患者３において低下していた造血系統の安定化は、臨床的成功のための説得力のあるエンドポイントである。
【０２４０】
実施例４
高および低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団でＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳを使用する遺伝子治療
生体試料を追加の患者から採取し、実施例３に記載されるように高ストリンジェンシーおよび低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮細胞集団を調製する。組み換え遺伝子療法を創出し、これは内因性ＦＡＮＣ遺伝子の指示された修復が可能な遺伝子編集システムを提供するように設計した。遺伝子編集システムは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、ｇＲＮＡ、および修復鋳型を含む。修復鋳型は、追加の患者におけるＦＡＮＣ遺伝子（例えば、ＦＡＮＣＡ）に対する既知の変異（複数可）と重複する配列断片を含む。高ストリンジェンシーおよび低ストリンジェンシーＣＤ３４濃縮集団の一方または両方を組換え遺伝子療法ベクターと接触させ、次いで２つのＣＤ３４濃縮細胞集団の混合物を患者の各々に自家移植する。患者は、急速なインビボ選択生着動態を示す。この治療プロトコルは、造血、好中球、赤血球、血小板における多系統の増加をもたらす。移植前に患者において低下していた造血系統の回復は、臨床的成功のための説得力のあるエンドポイントである。
【図１】
2021521180.tif 000034
【配列表】
2021521180000001.app
【国際調査報告】
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