(57)【要約】本発明は、ＣＤ７９Ａを発現する癌の養子細胞療法のための改良された組成物を提供する。種々の実施形態では、ａ）ヒトＣＤ７９Ａポリペプチドの１つもしくは複数のエピトープを結合させる抗ＣＤ７９Ａ抗体もしくはその抗原結合断片であって、配列番号１〜配列番号３、配列番号９〜配列番号１１、もしくは配列番号１７〜配列番号１９に記載されたＣＤＲＬ１配列〜ＣＤＲＬ３配列を備えた可変軽鎖配列、及び／もしくは配列番号４〜配列番号６、配列番号１２〜配列番号１４、もしくは配列番号２０〜配列番号２２に記載されたＣＤＲＨ１配列〜ＣＤＲＨ３配列を備えた可変重鎖配列を含む、抗ＣＤ７９Ａ抗体もしくはその抗原結合断片を備えた細胞外ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、ｃ）１つもしくは複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびに／またはｄ）一次シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供されている。
2021527409.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヒトＣＤ７９Ａポリペプチドの１つまたは複数のエピトープを結合させる抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１〜配列番号３、配列番号９〜配列番号１１、または配列番号１７〜配列番号１９に記載されたＣＤＲＬ１配列〜ＣＤＲＬ３配列を備えた可変軽鎖配列と、配列番号４〜配列番号６、配列番号１２〜配列番号１４、または配列番号２０〜配列番号２２に記載されたＣＤＲＨ１配列〜ＣＤＲＨ３配列を備えた可変重鎖配列とを含む、抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片を備えた細胞外ドメインと、
ｂ）膜貫通ドメインと、
ｃ）１つまたは複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、
ｄ）一次シグナル伝達ドメインと、
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２】
前記ヒトＣＤ７９Ａポリペプチドを結合させる前記抗ＣＤ７９Ａ抗体または抗原結合断片が、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、二重特異性Ｆａｂ二量体（Ｆａｂ２）、三重特異性Ｆａｂ三量体（Ｆａｂ３）、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ビスｓｃＦｖ（bis-scFv）、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）からなる群から選択される、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項３】
前記ヒトＣＤ７９Ａポリペプチドを結合させる前記抗ＣＤ７９Ａまたは抗原結合断片がｓｃＦｖである、請求項１または請求項２に記載のＣＡＲ。
【請求項４】
前記抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１〜配列番号３のいずれか１つに記載された１つもしくは複数の軽鎖ＣＤＲ、及び／または配列番号４〜配列番号６のいずれか１つに記載された１つもしくは複数の重鎖ＣＤＲを含む、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項５】
前記抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号９〜配列番号１１のいずれか１つに記載された１つもしくは複数の軽鎖ＣＤＲ、及び／または配列番号１２〜配列番号１４のいずれか１つに記載された１つもしくは複数の重鎖ＣＤＲを含む、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項６】
前記抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１７〜配列番号１９のいずれか１つに記載された１つもしくは複数の軽鎖ＣＤＲ、及び／または配列番号２０〜配列番号２２のいずれか１つに記載された１つもしくは複数の重鎖ＣＤＲを含む、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項７】
前記抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号７、配列番号１５、もしくは配列番号２３のいずれか１つに記載された可変軽鎖配列、及び／または配列番号８、配列番号１６、もしくは配列番号２４のいずれか１つに記載された可変重鎖配列を含む、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項８】
前記抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号７に記載された可変軽鎖配列、及び／または配列番号８に記載された可変重鎖配列を含む、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項９】
前記抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１５に記載された可変軽鎖配列、及び／または配列番号１６に記載された可変重鎖配列を含む、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１０】
前記抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２３に記載された可変軽鎖配列、及び／または配列番号２４に記載された可変重鎖配列を含む、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１１】
前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドから単離されている、請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１２】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１、及びＣＤ１５２からなる群から選択されるポリペプチドから単離されている、請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１３】
前記膜貫通ドメインがＣＤ８αから単離されている、請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１４】
前記１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子から単離されている、請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１５】
前記１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、及びＣＤ１３７からなる群から選択される共刺激分子から単離されている、請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１６】
前記１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ１３７から単離されている、請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１７】
前記一次シグナル伝達ドメインが、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離されている、請求項１から請求項１６のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１８】
前記一次シグナル伝達ドメインがＣＤ３ζから単離されている、請求項１から請求項１７のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１９】
ヒンジ領域ポリペプチドをさらに含む、請求項１から請求項１８のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項２０】
前記ヒンジ領域ポリペプチドがＣＤ８αのヒンジ領域を含む、請求項１９に記載のＣＡＲ。
【請求項２１】
スペーサー領域をさらに含む、請求項１から請求項２０のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項２２】
シグナルペプチドをさらに含む、請求項１から請求項２１のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項２３】
前記シグナルペプチドが、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、ＣＤ８αシグナルポリペプチド、またはヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファシグナルポリペプチドを含む、請求項２２に記載のＣＡＲ。
【請求項２４】
配列番号２５〜配列番号３０のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１から請求項２３のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項２５】
配列番号２５に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１から請求項２４のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項２６】
配列番号２６に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１から請求項２４のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項２７】
配列番号２７に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１から請求項２４のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項２８】
配列番号２８に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１から請求項２４のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項２９】
配列番号２９に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１から請求項２４のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項３０】
配列番号３０に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１から請求項２４のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項３１】
請求項１から請求項３０のいずれか１項に記載のＣＡＲのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項３２】
請求項１から請求項３１のいずれか１項に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３３】
配列番号３１〜配列番号３６のいずれか１つに記載の配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項３４】
請求項３２または請求項３３のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３５】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３６】
前記ベクターがエピソームベクターである、請求項３４または請求項３５に記載のベクター。
【請求項３７】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項３４から請求項３６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３８】
前記ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項３４から請求項３７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３９】
前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項３４から請求項３８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項４０】
前記ベクターが、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）から本質的になる群から選択されるレンチウイルスベクターである、請求項３４から請求項３９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項４１】
左（５’）レトロウイルスＬＴＲ、プサイ（Ψ）パッケージングシグナル、セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルス輸送エレメント、請求項３２または請求項３３に記載のポリヌクレオチドに作用可能に連結されているプロモーター、及び右（３’）レトロウイルスＬＴＲを含む、請求項３４から請求項３９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項４２】
異種ポリアデニル化配列をさらに含む、請求項３４から請求項４１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項４３】
Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）またはウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む、請求項３４から請求項４１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項４４】
前記５’ＬＴＲのプロモーターが異種プロモーターと置換されている、請求項４１から請求項４３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項４５】
前記異種プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである、請求項４４に記載のベクター。
【請求項４６】
前記５’ＬＴＲまたは３’ＬＴＲがレンチウイルスＬＴＲである、請求項４１から請求項４５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項４７】
前記３’ＬＴＲが１つまたは複数の修飾を含む、請求項４１から請求項４６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項４８】
前記３’ＬＴＲが１つまたは複数の欠失を含む、請求項４１から請求項４７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項４９】
前記３’ＬＴＲが自己不活型（ＳＩＮ）ＬＴＲである、請求項４１から請求項４８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５０】
請求項３２または請求項３３に記載のポリヌクレオチドに作用可能に連結されているプロモーターが、サイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、伸長因子１アルファプロモーター（ＥＦ１−α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーター（ＰＧＫ）、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＱ−Ｃ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＡＧ）、ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ＭＣ１）、ベータアクチンプロモーター（β−ＡＣＴ）、シミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、及び負の制御領域が欠失した骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーのｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）Ｕ３プロモーターからなる群から選択される、請求項４１から請求項４９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５１】
請求項３４から請求項５０のいずれか１項に記載のベクターを含む、免疫エフェクター細胞。
【請求項５２】
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びＮＫＴ細胞からなる群から選択される、請求項５１に記載の免疫エフェクター細胞。
【請求項５３】
請求項５１または請求項５２に記載の免疫エフェクター細胞と、生理学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
【請求項５４】
請求項１から請求項３０のいずれか１項に記載のＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞群を産生する方法であって、請求項３２もしくは請求項３３に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３４から請求項５０のいずれか１項に記載のベクターを、免疫エフェクター細胞群に導入することを含む、方法。
【請求項５５】
ＣＤ３を結合させる抗体及びＣＤ２８に結合する抗体と、前記免疫エフェクター細胞とを接触させることにより、前記細胞を刺激し、かつ前記細胞の増殖を誘導し、それにより免疫エフェクター細胞群を増殖させることをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記免疫エフェクター細胞がＴ細胞、ＮＫ細胞、及び／またはＮＫＴ細胞を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記免疫エフェクター細胞がＴ細胞を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
対象においてＣＤ７９Ａ発現癌細胞の細胞傷害性を増加させる方法であって、請求項５３に記載の組成物を前記対象に投与することにおいて、前記投与前のＣＤ７９Ａ発現癌細胞の細胞傷害性と比べて、ＣＤ７９Ａ発現癌細胞の細胞傷害性を増加させるのに十分な量の前記組成物を投与することを含む、方法。
【請求項５９】
対象においてＣＤ７９Ａ発現癌細胞の数を減少させる方法であって、請求項５３に記載の組成物を前記対象に投与することにおいて、前記投与前のＣＤ７９Ａ発現癌細胞の数と比べて、ＣＤ７９Ａ発現癌細胞の数を減少させるのに十分な量の前記組成物を投与することを含む、方法。
【請求項６０】
癌の治療が必要な対象における癌の治療方法であって、請求項５３に記載の組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６１】
前記癌が液性癌である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記癌が血液悪性腫瘍である、請求項６０または請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記癌が、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリーセル白血病（ＨＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である、請求項６０から請求項６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記非ホジキンリンパ腫が、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、または辺縁層リンパ腫（ＭＺＬ）である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記非ホジキンリンパ腫がびまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記癌が、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリーセル白血病（ＨＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である、請求項６０から請求項６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記癌が、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌型骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、及び髄外性形質細胞腫からなる群から選択される多発性骨髄腫（ＭＭ）である、請求項６０から請求項６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
対象においてＣＤ７９Ａを発現する癌に関連する１つまたは複数の症状を改善する方法であって、請求項５３に記載の組成物を前記対象に投与することにおいて、ＣＤ７９Ａ発現癌細胞に関連する少なくとも１つの症状を改善するのに十分な量の前記組成物を投与することを含む、方法。
【請求項６９】
前記改善される１つまたは複数の症状が、脱力、疲労、息切れ、易傷性及び易出血性、頻回感染、リンパ節腫大、腹部の膨張または痛み、骨痛または関節痛、骨折、予期しない体重減少、食欲不振、寝汗、持続性微熱、ならびに排尿減少からなる群から選択される、請求項６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１８年６月１４日に出願された米国特許仮出願第６２／６８５，０７８号の利益を主張するものであり、この仮出願はその全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
配列表に関する記述
本出願に関連する配列表は、紙の写しの代わりにテキストフォーマットで提供されており、参照により本明細書に援用される。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＢＬＢＤ＿１００＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、サイズが６４ｋＢであり、２０１９年６月１４日に作成され、明細書の提出と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出されている。
【０００３】
本発明は、癌を治療するための改良された組成物及び方法に関する。より詳細には、本発明は、改良された抗ＣＤ７９Ａキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、遺伝子改変免疫エフェクター細胞と、ＣＤ７９Ａを発現する癌を効果的に治療するためのこれらの組成物の使用とに関するものである。
【背景技術】
【０００４】
癌は、世界の至るところで深刻な健康問題となっている。２００８年〜２０１０年に算出した割合に基づけば、今日生まれた男女の中で４０．７６％の人が、一生のうちのどこかの時点で、癌の何らかの形態を有すると診断されることになる。５０歳〜６９歳の間に癌になる割合は、女性の場合は１５．３０％であるのに対し、男性の場合は２０．３７％であると考えられる。米国では、現在生存している人のうち癌を患ったことがある男女の数は、２０１０年１月１日の時点でおよそ１３，０２７，９１４人であり、男性６，０７８，９７４人、女性６，９４８，９４０人であった。２０１３年には、米国の１，６６０，２９０人の男女（男性８５４，７９０人、女性８０５，５００人）がいずれかの部位に癌があると診断されており、５８０，３５０人の男女が癌で亡くなっていると推定される。Howlader  et  al.  2013を参照されたい。
【０００５】
Ｂ細胞の悪性形質転換は癌の原因となっており、癌の例として、以下に限定されないが、リンパ腫、例えば、多発性骨髄腫及び非ホジキンリンパ腫などが挙げられる。非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）及び多発性骨髄腫（ＭＭ）などのＢ細胞悪性腫瘍を持つ患者の大多数は、癌の死亡率を大きく増加させている。各種治療形態に対するＢ細胞悪性腫瘍の応答は様々である。化学療法及び放射線療法を含めたＢ細胞悪性腫瘍の従来の治療方法は、有害な副作用があるために、限られた効用しか持たない。抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ２３、抗ＣＤ５２、抗ＣＤ８０、及び抗ＨＬＡ−ＤＲといった治療用抗体を用いた免疫療法も、限られた成果しか挙げられていない。その原因として、薬物動態プロファイルが良好ではなく、血清プロテアーゼ及び糸球体濾過による抗体の排除が速く、腫瘍部位への浸潤が十分ではなく、癌細胞における標的抗原の発現レベルも十分ではないことが挙げられる。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変細胞を使用するという試みも、限られた成果しかあげられていない。また、特定のＣＡＲで使用される特定の抗原結合ドメインがもたらす治療有効性を予測できない可能性もある。抗原結合ドメインの結合が強すぎる場合、ＣＡＲ−Ｔ細胞は大量のサイトカイン放出を誘導し「サイトカインストーム」とみなされる致死的な免疫反応を引き起こす可能性があり、抗原結合ドメインの結合が弱すぎる場合、ＣＡＲ−Ｔ細胞が癌細胞の除去に十分な治療有効性を示さない場合があるからである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、養子細胞療法剤を作製するための改良ベクターと、それを用いる方法とを提供するものである。より詳細には、本発明は、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲ分子と、ＣＤ７９Ａを発現する癌の治療、予防、または改善における該分子の使用とを提供する。
【０００７】
種々の実施形態では、ａ）ヒトＣＤ７９Ａポリペプチドの１つもしくは複数のエピトープを結合させる抗ＣＤ７９Ａ抗体もしくはその抗原結合断片であって、配列番号１〜配列番号３、配列番号９〜配列番号１１、もしくは配列番号１７〜配列番号１９に記載されたＣＤＲＬ１配列〜ＣＤＲＬ３配列を備えた可変軽鎖配列、及び／もしくは配列番号４〜配列番号６、配列番号１２〜配列番号１４、もしくは配列番号２０〜配列番号２２に記載されたＣＤＲＨ１配列〜ＣＤＲＨ３配列を備えた可変重鎖配列を含む、抗ＣＤ７９Ａ抗体もしくはその抗原結合断片を備えた細胞外ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、ｃ）１つもしくは複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびに／またはｄ）一次シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供されている。
【０００８】
特定の実施形態では、ヒトＣＤ７９Ａポリペプチドを結合させる抗ＣＤ７９Ａ抗体または抗原結合断片は、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、二重特異性Ｆａｂ二量体（Ｆａｂ２）、三重特異性Ｆａｂ三量体（Ｆａｂ３）、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ビスｓｃＦｖ（bis-scFv）、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）からなる群から選択される。
【０００９】
特定の実施形態では、ヒトＣＤ７９Ａポリペプチドを結合させる抗ＣＤ７９Ａ抗体または抗原結合断片はｓｃＦｖである。
【００１０】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１〜配列番号３のいずれか１つに記載された１つもしくは複数の軽鎖ＣＤＲ、及び／または配列番号４〜配列番号６のいずれか１つに記載された１つもしくは複数の重鎖ＣＤＲを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９〜配列番号１１のいずれか１つに記載された１つもしくは複数の軽鎖ＣＤＲ、及び／または配列番号１２〜配列番号１４のいずれか１つに記載された１つもしくは複数の重鎖ＣＤＲを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１７〜配列番号１９のいずれか１つに記載された１つもしくは複数の軽鎖ＣＤＲ、及び／または配列番号２０〜配列番号２２のいずれか１つに記載された１つもしくは複数の重鎖ＣＤＲを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７、配列番号１５、もしくは配列番号２３のいずれか１つに記載された可変軽鎖配列、及び／または配列番号８、配列番号１６、もしくは配列番号２４のいずれか１つに記載された可変重鎖配列を含む。
【００１４】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７、配列番号１５、もしくは配列番号２３のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸同一性を有する可変軽鎖配列、及び／または配列番号８、配列番号１６、もしくは配列番号２４のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸同一性を有する可変重鎖配列を含む。
【００１５】
さらなる実施形態では、抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７に記載された可変軽鎖配列、及び／または配列番号８に記載された可変重鎖配列を含む。
【００１６】
さらなる実施形態では、抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１５に記載された可変軽鎖配列、及び／または配列番号１６に記載された可変重鎖配列を含む。
【００１７】
さらなる実施形態では、抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２３に記載された可変軽鎖配列、及び／または配列番号２４に記載された可変重鎖配列を含む。
【００１８】
さらなる実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチド由来である。
【００１９】
別の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１、及びＣＤ１５２からなる群から選択されるポリペプチド由来である。
【００２０】
ある実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ８α由来である。
【００２１】
さらなる実施形態では、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子由来である。
【００２２】
特定の実施形態では、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、及びＣＤ１３７からなる群から選択される共刺激分子由来である。
【００２３】
ある実施形態では、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ１３７由来である。
【００２４】
特定の実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離されている。
【００２５】
特定の実施形態では、一次シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζから単離されている。
【００２６】
別の実施形態では、ＣＡＲはヒンジ領域ポリペプチドをさらに含む。
【００２７】
ある実施形態では、ヒンジ領域ポリペプチドは、ＣＤ８αのヒンジ領域を含む。
【００２８】
別の実施形態では、ＣＡＲはスペーサー領域をさらに含む。
【００２９】
さらなる実施形態では、ＣＡＲはシグナルペプチドをさらに含む。
【００３０】
特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、ＣＤ８αシグナルポリペプチド、またはヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファシグナルポリペプチドを含む。
【００３１】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２５〜配列番号３０のうちのいずれか１つに記載されたアミノ酸配列を含む。
【００３２】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２５に記載されたアミノ酸配列を含む。
【００３３】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２６に記載されたアミノ酸配列を含む。
【００３４】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２７に記載されたアミノ酸配列を含む。
【００３５】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２８に記載されたアミノ酸配列を含む。
【００３６】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２９に記載されたアミノ酸配列を含む。
【００３７】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３０に記載されたアミノ酸配列を含む。
【００３８】
種々の実施形態において、本明細書で考察されているＣＡＲのアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供されている。
【００３９】
種々の実施形態において、本明細書で考察されているＣＡＲをコードするポリヌクレオチドが提供されている。
【００４０】
特定の実施形態では、本明細書で考察されているＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３１〜配列番号３６のうちのいずれか１つに記載された配列を含む。
【００４１】
種々の実施形態において、本明細書で考察されているＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供されている。
【００４２】
特定の実施形態では、ベクターは発現ベクターである。
【００４３】
特定の実施形態では、ベクターはエピソームベクターである。
【００４４】
さらなる実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。
【００４５】
さらなる実施形態では、ベクターはレトロウイルスベクターである。
【００４６】
特定の実施形態では、ベクターはレンチウイルスベクターである。
【００４７】
さらなる実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）から本質的になる群から選択される。
【００４８】
特定の実施形態では、ベクターは、左（５’）レトロウイルスＬＴＲ、プサイ（Ψ）パッケージングシグナル、セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルス輸送エレメント、前述のポリヌクレオチドに作用可能に連結されているプロモーター、及び右（３’）レトロウイルスＬＴＲを含む。
【００４９】
さらなる実施形態では、ベクターは異種ポリアデニル化配列をさらに含む。
【００５０】
特定の実施形態では、ベクターは、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）またはウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む。
【００５１】
さらなる実施形態では、５’ＬＴＲのプロモーターが異種プロモーターと置換されている。
【００５２】
さらなる実施形態では、異種プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである。
【００５３】
ある実施形態では、５’ＬＴＲまたは３’ＬＴＲは、レンチウイルスＬＴＲである。
【００５４】
特定の実施形態では、３’ＬＴＲは１つまたは複数の修飾を含む。
【００５５】
特定の実施形態では、３’ＬＴＲは１つまたは複数の欠失を含む。
【００５６】
特定の実施形態では、３’ＬＴＲは自己不活型（ＳＩＮ）ＬＴＲである。
【００５７】
特定の実施形態では、ポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化またはシグナルウサギβグロビンポリアデニル化配列である。
【００５８】
さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは最適化されたコザック配列を含む。
【００５９】
さらなる実施形態では、該ポリヌクレオチドに作用可能に連結されたプロモーターは、サイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、伸長因子１アルファプロモーター（ＥＦ１−α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーター（ＰＧＫ）、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＱ−Ｃ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＡＧ）、ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ＭＣ１）、ベータアクチンプロモーター（β−ＡＣＴ）、シミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、及び負の制御領域が欠失した骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーのｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される。
【００６０】
種々の実施形態において、本明細書で考察されているＣＡＲをコードするベクターを含む免疫エフェクター細胞が提供されている。
【００６１】
特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びＮＫＴ細胞からなる群から選択される。
【００６２】
ある実施形態では、免疫エフェクター細胞は、本明細書で考察されているベクターで形質導入されており、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化かつ刺激される。これにより、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の不在下で活性化かつ刺激された形質導入免疫エフェクター細胞の増殖と比べて、形質導入免疫エフェクター細胞の増殖が保持されることになる。
【００６３】
特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化かつ刺激された免疫エフェクター細胞は、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択される１つもしくは複数のマーカーの発現、または、ｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８の全マーカーの発現を、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の不在下で活性化かつ刺激された免疫エフェクター細胞と比べて増加させている。
【００６４】
特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化かつ刺激された免疫エフェクター細胞は、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８からなる群から選択される１つもしくは複数のマーカーの発現、または、ｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８の全マーカーの発現を、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の不在下で活性化かつ刺激された免疫エフェクター細胞と比べて増加させている。
【００６５】
一実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はＺＳＴＫ４７４である。
【００６６】
種々の実施形態では、本明細書で考察されている免疫エフェクター細胞と、生理学的に許容される賦形剤とを含む組成物が提供されている。
【００６７】
種々の実施形態では、本明細書で考察されているＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞群を作製する方法であって、本明細書で考察されているＣＡＲをコードするベクターを、免疫エフェクター細胞群に導入することを含む方法が、提供されている。
【００６８】
特定の実施形態では、方法は、ＣＤ３を結合させる抗体及びＣＤ２８に結合する抗体と免疫エフェクター細胞とを接触させることにより、該細胞を刺激し、かつ該細胞の増殖を誘導し、それにより免疫エフェクター細胞群を増殖させることをさらに含む。
【００６９】
特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ベクターを導入する前に刺激され、かつ増殖を誘導される。
【００７０】
さらなる実施形態では、免疫エフェクター細胞群はＴ細胞を含む。
【００７１】
ある実施形態では、免疫エフェクター細胞群はＮＫ細胞を含む。
【００７２】
特定の実施形態では、細胞は、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化かつ刺激されており、これにより、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の不在下で活性化かつ刺激された免疫エフェクター細胞の増殖と比べて、形質導入免疫エフェクター細胞の増殖が保持されることになる。
【００７３】
ある実施形態では、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化かつ刺激された免疫エフェクター細胞は、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択される１つもしくは複数のマーカーの発現、または、ｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８の全マーカーの発現を、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の不在下で活性化かつ刺激された免疫エフェクター細胞と比べて増加させている。
【００７４】
特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化かつ刺激された免疫エフェクター細胞は、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーの発現、または、ｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８の全マーカーの発現を、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の不在下で活性化かつ刺激された免疫エフェクター細胞と比べて増加させている。
【００７５】
一実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はＺＳＴＫ４７４である。
【００７６】
種々の実施形態では、対象においてＣＤ７９Ａを発現する癌細胞の細胞傷害性を増加させる方法が提供されており、該方法は、本明細書で考察されている組成物を該対象に投与することであって、投与前のＣＤ７９Ａ発現癌細胞の細胞傷害性と比べて、ＣＤ７９Ａ発現癌細胞の細胞傷害性を増加させるのに十分な量の該組成物を投与すること、を含む。
【００７７】
種々の実施形態では、対象においてＣＤ７９Ａ発現癌細胞の数を減少させる方法が提供されており、該方法は、本明細書で考察されている組成物を該対象に投与することであって、投与前のＣＤ７９Ａ発現癌細胞の数と比べてＣＤ７９Ａ発現癌細胞の数を減少させるのに十分な量の該組成物を投与すること、を含む。
【００７８】
種々の実施形態では、癌の治療が必要な対象における癌の治療方法であって、本明細書で考察されている組成物の治療有効量を該対象に投与することを含む方法が提供されている。
【００７９】
特定の実施形態では、癌は液性癌である。
【００８０】
ある実施形態では、癌は血液悪性腫瘍である。
【００８１】
さらなる実施形態では、癌は、肺癌、乳癌、膵癌、卵巣癌、前立腺癌、副腎癌、黒色腫、子宮癌、精巣癌、もしくは膀胱癌、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリーセル白血病（ＨＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。
【００８２】
特定の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、または辺縁層リンパ腫（ＭＺＬ）である。
【００８３】
特定の実施形態では、癌は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリーセル白血病（ＨＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。
【００８４】
特定の実施形態では、癌はびまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。
【００８５】
特定の実施形態では、癌は、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌型骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、及び髄外性形質細胞腫からなる群から選択される多発性骨髄腫（ＭＭ）である。
【００８６】
種々の実施形態では、対象においてＣＤ７９Ａを発現する癌に関連する１つまたは複数の症状を改善する方法が提供されており、該方法は、本明細書で考察されている組成物を該対象に投与することであって、ＣＤ７９Ａ発現癌細胞に関連する少なくとも１つの症状を改善するのに十分な量の該組成物を投与することを含む。
【００８７】
特定の実施形態では、改善される１つまたは複数の症状は、脱力、疲労、息切れ、易傷性及び易出血性、頻回感染、リンパ節腫大、腹部の膨張または痛み、骨痛または関節痛、骨折、予期しない体重減少、食欲不振、寝汗、持続性微熱、ならびに排尿減少からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１Ａ】標的細胞におけるＣＤ７９Ａ発現と、ＣＡＲ発現と、ＣＤ７９Ａ発現標的細胞の存在下での抗ＣＤ７９ＡＣＡＲ−Ｔ細胞抗原依存性活性とを示す図である。Ａ）Ｐｆｅｉｆｆｅｒ細胞及びＤａｕｄｉ細胞ではＣＤ７９Ａの発現を示す一方、Ｋ５６２細胞では発現しないことを示すパネルである。Ｂ）フローサイトメトリーを用いて測定した、Ｔ細胞における代表的な抗ＣＤ７９ＡＣＡＲ発現を示すパネルである。Ｃ）標的細胞の不在下で共培養したか、またはＫ５６２細胞（ＣＤ７９Ａ−）、Ｄａｕｄｉ細胞（ＣＤ７９Ａ＋、高発現）、もしくはＰｆｅｉｆｆｅｒ細胞（ＣＤ７９Ａ＋、低発現）と共に共培養した、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲ−Ｔ細胞のＩＦＮγ分泌を示すパネルである。
【図１Ｂ】同上。
【図１Ｃ】同上。
【図２Ａ】標的細胞におけるＣＡＲ発現と、ＣＤ７９Ａ発現と、ＣＤ７９Ａ発現標的細胞の存在下での抗ＣＤ７９ＡＣＡＲ−Ｔ細胞抗原依存性活性とを示す図である。Ａ）Ｄａｕｄｉ細胞、ＮＵ−ＤＵＬ−１細胞、ＳＵ−ＤＨＬ−２細胞、及びＰｆｅｉｆｆｅｒ細胞のＣＤ７９Ａ受容体密度を示すパネルである。Ｂ）フローサイトメトリーを用いて測定した、Ｔ細胞における代表的な抗ＣＤ７９ＡＣＡＲ発現を示すパネルである。Ｃ）標的細胞の不在下で共培養したか、またはＨｕｈ７細胞（ＣＤ７９Ａ−）、Ｈｕｈ７．ＣＤ７９Ａ細胞（ＣＤ７９Ａ＋）、Ｄａｕｄｉ細胞（ＣＤ７９Ａ＋）、ＮＵ−ＤＵＬ−１（ＣＤ７９Ａ＋）、ＳＵ−ＤＨＬ−２（ＣＤ７９Ａ＋）、もしくはＰｆｅｉｆｆｅｒ細胞（ＣＤ７９Ａ＋）と共に共培養した、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲ−Ｔ細胞のＩＦＮγ分泌を示すパネルである。
【図２Ｂ】同上。
【図２Ｃ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
配列の簡単な説明
配列番号１〜配列番号２４は、本明細書で考察されている抗ＣＤ７９ＡＣＡＲの例示的な軽鎖ＣＤＲ配列、重鎖ＣＤＲ配列、可変ドメイン軽鎖、及び可変ドメイン重鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号２５〜配列番号３０は、例示的な抗ＣＤ７９ＡＣＡＲのアミノ酸配列を示す。
配列番号３１〜配列番号３６は、例示的な抗ＣＤ７９ＡＣＡＲの核酸配列を示す。
配列番号３７〜配列番号３８は、例示的なヒトＣＤ７９Ａポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３９〜配列番号４９は、種々のリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号５０〜配列番号７４は、プロテアーゼの切断部位及び自己切断型ポリペプチドの切断部位のアミノ酸配列を示す。
【００９０】
Ａ．概要
本発明は、ＣＤ７９Ａを発現する癌を予防もしくは治療するための改良された組成物及び方法、またはＣＤ７９Ａ発現癌に関連する少なくとも１つの症状を予防、治療、もしくは改善するための改良された組成物及び方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、遺伝子改変免疫エフェクター細胞を用いた、ＣＤ７９Ａを発現する癌の改良された養子細胞療法に関する。遺伝学的手法は、癌細胞の免疫認識を高めかつ排除を促進させる手段として有望である。将来性のある戦略の一つは、癌細胞に対する細胞傷害性をリダイレクトさせるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように免疫エフェクター細胞の遺伝子組み換えを行うことである。
【００９１】
本明細書で考察されている養子細胞療法の改良された組成物及び方法は、遺伝子改変免疫エフェクター細胞であって、容易に増殖でき、ｉｎ  ｖｉｖｏで長時間の持続性を示し、かつＣＤ７９Ａ（Ｂ細胞抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖、膜結合型免疫グロブリン関連タンパク質（ＭＢ１、ＭＢ−１）、表面ＩｇＭ関連タンパク質、及びＩｇアルファ（ＩＧＡ）としても知られる）を発現する細胞に対して抗原依存性細胞傷害性を示す細胞を提供するものである。ＣＤ７９Ａをコードするポリヌクレオチド配列の例として、以下に限定されないが、ＮＭ＿００１７８３．３、ＮＭ＿０２１６０１．３、ＥＮＳＴ０００００２２１９７２（ｕｃ００２ｏｒｖ．３）、ＥＮＳＴ０００００５９７４５４（ｕｃ０６０ｚｄｊ．１）、ＥＮＳＴ０００００４４４７４０（ｕｃ００２ｏｒｕ．４）、Ｈｓ．６３１５６７、及びＡＫ２２３３７１が挙げられる。ＣＤ７９Ａをコードするポリペプチド配列の例として、以下に限定されないが、Ｐ１１９１２−１、Ｐ１１９１２−２、ＥＮＳＰ０００００４００６０５、ＥＮＳＰ０００００４６８９２２、ＥＮＳＰ０００００２２１９７２、ＮＰ＿００１７７４．１、及びＮＰ＿０６７６１２．１が挙げられる。
【００９２】
ＣＤ７９は、２つのタンパク質である、ＣＤ７９ＡとＣＤ７９Ｂとからなる。ＣＤ７９Ａは染色体１９ｑ１３．２にあり、約４７ｋＤａの２２６アミノ酸糖タンパク質をコードする。正確な分子量はグリコシル化の程度によって異なる。ＣＤ７９Ｂは染色体１７ｑ２３にあり、約３７ｋＤａの２２９アミノ酸糖タンパク質をコードする。ＣＤ７９ＡとＣＤ７９Ｂは、エキソン−イントロン構造を共に持っており、両方ともＩｇスーパーファミリー（ＳＦ）の単一Ｉｇドメイン（ＣＤ７９Ａの場合１１１残基Ｃ型、ＣＤ７９Ｂの場合１２９残基Ｖ型）を含んでいる。またそれぞれ、高度に保存された膜貫通ドメインと、顕著なアミノ酸の進化的保存性を示す６１アミノ酸の細胞質側末端（ＣＤ７９Ａ）または４８アミノ酸の細胞質側末端（ＣＤ７９Ｂ）とを含んでいる。ＣＤ７９ＡとＣＤ７９Ｂは、初期段階のＢ細胞前駆体により発現される。ＣＤ７９Ａ／Ｂヘテロダイマーは、どちらのタンパク質も前駆体のＢ細胞系への関与に必須なものではないが、μ重鎖のない状態で初期Ｂ細胞前駆体の表面に見られるものである。成長の後期で、ＣＤ７９ＡとＣＤ７９Ｂは、Ｂ細胞の表面で全アイソタイプのＩｇと共に、成熟ＢＣＲ複合体として共発現される。ＣＤ７９タンパク質はＢ系統に特異的であり、Ｂリンパ球新生を通して発現する。ＣＤ７９ＡとＣＤ７９Ｂとを、Ｂ細胞性新生物、例えば、Ｂ細胞株、Ｂ細胞リンパ腫、及び一部の骨髄腫において、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、大半の前駆体Ｂ細胞性急性白血病などを特定するマーカーとして使用することができる。
【００９３】
種々の実施形態では、抗ＣＤ７９Ａ抗体配列を含むＣＡＲは、極めて有効なものであり、ロバストにｉｎ  ｖｉｖｏ増殖し、ＣＤ７９Ａ発現癌細胞を認識し、ＣＤ７９Ａ発現癌細胞に対する細胞傷害性活性を示す。
【００９４】
一実施形態では、抗ＣＤ７９Ａ抗体または抗原結合断片と、膜貫通ドメインと、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインとを含むＣＡＲが提供されている。
【００９５】
一実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変されている。ＣＡＲを発現するＴ細胞を、本明細書ではＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ改変Ｔ細胞と称する。
【００９６】
種々の実施形態では、遺伝子改変免疫エフェクター細胞を、ＣＤ７９Ａ発現癌細胞を有する対象、例えば以下に限定されないが、液性腫瘍及び血液系腫瘍を有する対象に投与する。一実施形態では、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲ−Ｔ細胞を、ＤＬＢＣＬを有する対象に投与する。
【００９７】
組み換え（すなわち改変）ＤＮＡ、ペプチド、及びオリゴヌクレオチドの合成、イムノアッセイ、組織培養、形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）、酵素反応、精製に関する技術、ならびに関連する技術及び手順については、概して、本明細書の全体を通して引用及び議論されている微生物学、分子生物学、生化学、分子遺伝学、細胞生物学、ウイルス学、及び免疫学の様々な一般文献及びより専門的な文献に記載されているように実施することができる。例えば、Sambrook  et  al.,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  3d  ed.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.、Current  Protocols  in  Molecular  Biology  (John  Wiley  and  Sons、２００８年７月に改訂)、Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates  and  Wiley-Interscience、Glover,  DNA  Cloning:  A  Practical  Approach,  vol.  I  &  II  (IRL  Press,  Oxford  Univ.  Press  USA,  1985)、Current  Protocols  in  Immunology  (編集：John  E.  Coligan,  Ada  M.  Kruisbeek,  David  H.  Margulies,  Ethan  M.  Shevach,  Warren  Strober  2001  John  Wiley  &  Sons,  NY,  NY)、Real-Time  PCR:  Current  Technology  and  Applications,  Edited  by  Julie  Logan,  Kirstin  Edwards  and  Nick  Saunders,  2009,  Caister  Academic  Press,  Norfolk,  UK、Anand,  Techniques  for  the  Analysis  of  Complex  Genomes,  (Academic  Press,  New  York,  1992)、Guthrie  and  Fink,  Guide  to  Yeast  Genetics  and  Molecular  Biology  (Academic  Press,  New  York,  1991)、Oligonucleotide  Synthesis  (N.  Gait,  Ed.,  1984)、Nucleic  Acid  The  Hybridization  (B.  Hames  &  S.  Higgins,  Eds.,  1985)、Transcription  and  Translation  (B.  Hames  &  S.  Higgins,  Eds.,  1984)、Animal  Cell  Culture  (R.  Freshney,  Ed.,  1986)、Perbal,  A  Practical  Guide  to  Molecular  Cloning  (1984)、Next-Generation  Genome  Sequencing  (Janitz,  2008  Wiley-VCH)、PCR  Protocols  (Methods  in  Molecular  Biology)  (Park,  Ed.,  3rd  Edition,  2010  Humana  Press)、Immobilized  Cells  And  Enzymes  (IRL  Press,  1986)、専門書Methods  In  Enzymology  (Academic  Press,  Inc.,  N.Y.)、Gene  Transfer  Vectors  For  Mammalian  Cells  (J.  H.  Miller  and  M.  P.  Calos  eds.,  1987,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory)、Harlow  and  Lane,  Antibodies,  (Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.,  1998)、Immunochemical  Methods  In  Cell  And  Molecular  Biology  (Mayer  and  Walker,  eds.,  Academic  Press,  London,  1987)、Handbook  Of  Experimental  Immunology,  Volumes  I-IV  (D.  M.  Weir  andCC  Blackwell,  eds.,  1986)、Roitt,  Essential  Immunology,  6th  Edition,  (Blackwell  Scientific  Publications,  Oxford,  1988)、Current  Protocols  in  Immunology  (Q.  E.  Coligan,  A.  M.  Kruisbeek,  D.  H.  Margulies,  E.  M.  Shevach  and  W.  Strober,  eds.,  1991)、Annual  Review  of  Immunology、及びAdvances  in  Immunologyなどの学術雑誌の論文を参照されたい。
【００９８】
Ｂ．定義
本開示についてさらに詳細に述べる前に、本明細書で使用される特定の用語の定義を記載することは、本開示の理解を助けると考える。
【００９９】
別段の定めがない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するものと同一の意味を有する。本明細書に記載の方法及び材料と同様または同等の任意の方法及び材料を、特定の実施形態の実施または試験に使用することができるが、組成物、方法、及び材料の好ましい実施形態を本明細書に記載している。本開示では、以下の用語を下記のように定義する。補足的な定義については本開示全体を通して示している。
【０１００】
冠詞の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、本明細書で使用する場合、その冠詞の文法上の対象が１つであるかまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つまたは１つもしくは複数）であることを意味する。一例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つの要素、または１つもしくは複数の要素を意味する。
【０１０１】
選択接続詞（例えば「または」）が使用されている場合、代替物のうちの１つ、両方、または任意の組み合わせを意味すると理解すべきである。
【０１０２】
用語「及び／または」は、代替物のうちの１つまたは両方を意味すると理解すべきである。
【０１０３】
「約」または「およそ」という用語は、本明細書で使用する場合、分量、レベル、値、数、頻度、パーセント、寸法、サイズ、量、重量、または長さが、参照する分量、レベル、値、数、頻度、パーセント、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％程度変動していることを意味する。一実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、参照する分量、レベル、値、数、頻度、パーセント、寸法、サイズ、量、重量、または長さの近傍±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の分量、レベル、値、数、頻度、パーセント、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を意味する。
【０１０４】
一実施形態では、範囲（例えば、１〜５、約１〜５、または約１〜約５）は、その範囲によって包含される各数値を意味する。例えば、非限定的で単なる例示的な実施形態では、範囲「１〜５」は、１、２、３、４、５、または１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、もしくは５．０、または１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、もしくは５．０と等価である。
【０１０５】
用語「およそ」は、本明細書で使用する場合、参照する分量、レベル、値、数、頻度、パーセント、寸法、サイズ、量、重量、または長さの８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の分量、レベル、値、数、頻度、パーセント、寸法、サイズ、量、重量、または長さを意味する。一実施形態では、「実質的に同じ」は、参照する分量、レベル、値、数、頻度、パーセント、寸法、サイズ、量、重量、または長さとおよそ同一の作用、例えば同一の生理学的作用をもたらす、分量、レベル、値、数、頻度、パーセント、寸法、サイズ、量、重量、または長さを意味する。
【０１０６】
本明細書では、別途明記しない限り、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、及び「含んでいる（comprising）」という語は、記載されている工程もしくは要素または工程群もしくは要素群を含めるものであるが、任意の他の工程もしくは要素または工程群もしくは要素群を除外するものではないことを意味すると理解されるであろう。「からなる（consisting  of）」は、この語句に続くもの全てを含み、かつそれらに限定されることを意味する。したがって、語句「からなる（consisting  of）」は、列挙した要素が必要または必須であり、他のいかなる要素も存在し得ないことを示すものである。「本質的になる（consisting  essentially  of）」は、この語句に続いて列挙した任意の要素を含み、かつその列挙した要素に対して本開示で詳述する活性または作用を阻害したり付与したりすることがない他の要素に限定されることを意味する。したがって、語句「本質的になる（consisting  essentially  of）」は、列挙した要素は必要または必須であるが、列挙した要素の活性または作用に実質的に影響を与えるいかなる他の要素も存在しないことを示している。
【０１０７】
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「別の実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはこれらの組み合わせの記載は、実施形態に関連して説明されている特定の特性、構造、または特徴が、少なくとも１つの実施形態に含まれていることを意味する。したがって、本明細書の様々な箇所で見られる前述の語句は、必ずしも全てが同じ実施形態を参照しているというわけではない。さらに、特定の特性、構造、または特徴を、１つまたは複数の実施形態において任意の適切な様式で組み合わせることができる。また、一実施形態においてある特性を肯定的に記載することは、ある特定の実施形態において該特性を除外することの根拠となることも理解されたい。
【０１０８】
Ｃ．キメラ抗原受容体
種々の実施形態では、ＣＤ７９Ａ発現癌細胞に対して免疫エフェクター細胞の細胞傷害性をリダイレクトさせる、遺伝子操作された受容体が提供されている。これらの遺伝子操作された受容体は、本明細書においてキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と称されている。ＣＡＲは、所望の抗原（例えばＣＤ７９Ａ）に対する抗体の特異性と、Ｔ細胞受容体活性化細胞内ドメインとを組み合わせて、特定の抗ＣＤ７９Ａ細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を産生する分子である。用語「キメラ」は、本明細書で使用する場合、異なる供給源に由来する別々のタンパク質またはＤＮＡの一部から構成されていることを示している。
【０１０９】
特性の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ７９Ａに結合する細胞外ドメイン（結合ドメインまたは抗原特異的結合ドメインとも称される）と、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。ＣＡＲの抗ＣＤ７９Ａ抗原結合ドメインが標的細胞表面のＣＤ７９Ａと結合すると、ＣＡＲがクラスター化し、ＣＡＲ含有細胞に活性化刺激が送達される。ＣＡＲの主な特徴は、免疫エフェクター細胞の特異性をリダイレクトし、それにより、増殖、サイトカイン産生、食作用、または主要組織適合性（ＭＨＣ）に関係なく標的抗原発現細胞の細胞死を媒介可能な分子の産生を誘発することができることであり、これは、モノクローナル抗体、溶解性リガンド、または細胞特異的共受容体の細胞特異的な標的化能を引き出すものである。
【０１１０】
種々の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ７９Ａ特異的結合ドメインを含む細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、１つまたは複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン及び／もしくは一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１１１】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外結合ドメインと、１つまたは複数のヒンジドメインまたはスペーサードメインと、膜貫通ドメインと、１つまたは複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン及び／もしくは一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１１２】
１．結合ドメイン
特定の実施形態では、ＣＡＲは、標的細胞、例えば癌細胞に発現したヒトＣＤ７９Ａポリペプチドに特異的に結合する抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片を備えた、細胞外結合ドメインを含む。「結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合ドメイン」、「抗原特異的結合ドメイン」、及び「細胞外抗原特異的結合ドメイン」という用語は、本明細書で使用する場合、交換可能に使用されており、目的の標的抗原、例えばＣＤ７９Ａに特異的に結合することができるＣＡＲを提示するものである。結合ドメインは、天然、合成、半合成、または組み換え体の供給源に由来し得る。
【０１１３】
「特異的結合親和性」、または「特異的に結合する」、または「特異的に結合した」、または「特異的結合」、または「特異的に標的化する」という用語は、本明細書で使用する場合、抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片（またはそれらを含むＣＡＲ）が、バックグラウンドの結合よりも高い結合親和性で、ＣＤ７９Ａに結合することを示している。結合ドメイン（または結合ドメインを含むＣＡＲ、または結合ドメインを含む融合タンパク質）は、親和性またはＫａ（すなわち、単位が１／Ｍである特定の結合相互作用の平衡結合定数）が、例えば、約１０５Ｍ−１よりも大きいか、または約１０５Ｍ−１に等しい値でＣＤ７９Ａと結合または会合する場合に、ＣＤ７９Ａポリペプチドに「特異的に結合する」ことになる。特定の実施形態では、結合ドメイン（または、その融合タンパク質）は、Ｋａが約１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、または１０１３Ｍ−１よりも大きいか、これらと等しい値で標的に結合する。「高い親和性」の結合ドメイン（またはその一本鎖融合タンパク質）は、Ｋａが少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、またはそれ以上の値を持つ結合ドメインを意味する。
【０１１４】
あるいは、親和性は、単位がＭである特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ、またはそれ以下）として定義することもできる。本開示の結合ドメインポリペプチド及びＣＡＲタンパク質の持つ親和性は、従来技術を用いて容易に測定することができる。従来技術として、例えば、競合ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）、または標識したリガンドを用いるか、もしくはBiacore社製（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）Biacore  T100などの表面プラズモン共鳴デバイス、もしくはCorning社製のEPICシステムもしくはPerkin  Elmer社製のEnSpireなど光バイオセンサ技術を用いる、結合会合もしくは置換アッセイがある（例えば、Scatchard  et  al.  (1949)  Ann.  N.Y.  Acad.  Sci.  51:660、及び米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号、または同等の文献を参照されたい）。
【０１１５】
一実施形態では、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合よりも約２倍、バックグラウンド結合よりも約５倍、バックグラウンド結合よりも約１０倍、バックグラウンド結合よりも約２０倍、バックグラウンド結合よりも約５０倍、バックグラウンド結合よりも約１００倍、またはバックグラウンド結合よりも約１０００倍以上高い。
【０１１６】
特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片を含む。「抗体」は、抗原決定基を含むペプチド、脂質、多糖、または核酸など（例えば、免疫細胞によって認識されるものなど）の抗原のエピトープを特異的に認識しかつ結合させる、少なくとも軽鎖または重鎖の免疫グロブリン可変領域を含む、ポリペプチドの結合剤を指す。「単離された抗体またはその抗原結合断片」は、天然の環境の成分から同定され、分離及び／または回収されたものである。
【０１１７】
「抗原（Ａｇ）」は、動物における抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、または物質を意味し、例えば、動物に注射または吸収される組成物（癌特異的タンパク質を含むものなど）を含む。抗原は、本開示の抗原などの異種抗原によって誘導される産物も含めた、特定の液性免疫または細胞性免疫の産生物と反応する。特定の実施形態では、標的抗原は、ＣＤ７９Ａポリペプチドのエピトープである。
【０１１８】
「エピトープ」または「抗原決定基」は、結合剤が結合する抗原の領域を意味する。エピトープは、隣接アミノ酸で構成され得るか、またはタンパク質の三次折り畳み構造により近接して隣り合う非隣接アミノ酸で構成され得る。隣接アミノ酸で構成されたエピトープは通例、変性溶媒に曝露された際にも構造を保持するのに対して、三次折り畳み構造により構成されたエピトープは通例、変性溶媒で処理した際にその構造を失う。エピトープは、特有の立体構造に、少なくとも３個、さらに一般的には少なくとも５個、約９個、または約８個〜１０個のアミノ酸を含むことが多い。
【０１１９】
抗体には、その抗原結合断片が含まれており、例えば、ラクダＩｇ、ＩｇＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、二重特異性Ｆａｂ二量体（Ｆａｂ２）、三重特異性Ｆａｂ三量体（Ｆａｂ３）、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ビスｓｃＦｖ（bis-scFv）、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、ならびに抗原結合に関わる完全長抗体の一部などがある。この用語には、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ結合抗体（二重特異性抗体など）、及びそれらの抗原結合断片などの遺伝子操作型も含まれる。Pierce  Catalog  and  Handbook,  1994-1995  (Pierce  Chemical  Co.,  Rockford,  IL)、Kuby,  J.,  Immunology,  3rd  Ed.,  W.  H.  Freeman  &  Co.,  New  York,  1997も参照されたい。
【０１２０】
完全抗体は、当業者に理解されるように、かつ本明細書のいずれかに記載されているように、２つの重鎖と２つの軽鎖とを含むものである。各重鎖は、１つの可変領域と、第１の定常領域、第２の定常領域、及び第３の定常領域とからなるのに対し、各軽鎖は、１つの可変領域と１つの定常領域とからなる。哺乳動物の重鎖は、α、δ、ε、γ、及びμとして分類されている。哺乳動物の軽鎖は、λまたはκとして分類されている。α、δ、ε、γ、及びμの重鎖を含む免疫グロブリンは、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ａ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭとして分類されている。完全抗体は「Ｙ字型」構造である。Ｙ字型の幹の部分は、相互に結合した２つの重鎖の第２の定常領域及び第３の定常領域（ならびに、ＩｇＥ及びＩｇＭについては第４の定常領域）からなり、ジスルフィド結合（鎖間）がヒンジ領域に形成されている。重鎖λ、α、及びδは、３つのタンデム（一列に並んだ）Ｉｇドメインから構成される定常領域と、可撓性を持たせるヒンジ領域とを有し、重鎖μ及びεは、４つの免疫グロブリンドメインから構成される定常領域を有する。第２の定常領域は「ＣＨ２ドメイン」と称され、第３の定常領域は「ＣＨ３ドメイン」と称されている。Ｙ字型の各アームには、単一軽鎖の可変領域と定常領域とに結合している、単一重鎖の可変領域と第１の定常領域とが含まれている。軽鎖及び重鎖の可変領域は、抗原結合に関わっている。
【０１２１】
軽鎖及び重鎖の可変領域には、３つの超可変領域（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも称される）に挟まれた「フレームワーク」領域が含まれている。ＣＤＲは、従来方法、例えば、Kabatらによる配列を用いて（Wu,  TT  and  Kabat,  E.  A.,  J  Exp  Med.  132(2):211-50,  (1970)、Borden,  P.  and  Kabat  E.  A.,  PNAS,  84:  2440-2443  (1987)）（参照により本明細書に援用される、Kabat  et  al.,  Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,  U.S.  Department  of  Health  and  Human  Services,  1991を参照）、またはChothiaらによる構造を用いて（Chothia,  C.  and  Lesk,  A.M.,  J  Mol.  Biol.,  196(4):  901-917  (1987)、Chothia,  C.  et  al,  Nature,  342:  877  -  883  (1989)）、特徴付けられ、または特定され得る。
【０１２２】
軽鎖ＣＤＲを見つけるための判断材料の具体例は以下の通りである。ＣＤＲ−Ｌ１は、およそ残基２４から始まり、Ｃｙｓを先頭にして、約１０残基〜１７残基の長さで、Ｔｒｐ（通例、Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎであるが、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕの場合もある）が続く。ＣＤＲ−Ｌ２は、ＣＤＲ−Ｌ１末端のおよそ１６残基後から始まり、通例Ｉｌｅ−Ｔｙｒを先頭にするが、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ、Ｉｌｅ−Ｐｈｅを先頭にする場合もあり、７残基の長さである。ＣＤＲ−Ｌ３は、ＣＤＲ−Ｌ２末端のおよそ３３残基後から始まり、Ｃｙｓを先頭にして、７残基〜１１残基の長さで、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＸＸＸ−Ｇｌｙ（配列番号７６）（ＸＸＸは任意のアミノ酸である）が続く。
【０１２３】
重鎖ＣＤＲを見つけるための判断材料の具体例は以下の通りである。ＣＤＲ−Ｈ１は、およそ残基２６から始まり、Ｃｙｓ−ＸＸＸ−ＸＸＸ−ＸＸＸ（配列番号７７）を先頭にして、約１０残基〜１２残基の長さで、Ｔｒｐ（通例、Ｔｒｐ−Ｖａｌであるが、Ｔｒｐ−Ｉｌｅ、Ｔｒｐ−Ａｌａの場合もある）が続く。ＣＤＲ−Ｈ２は、ＣＤＲ−Ｈ１末端のおよそ１５残基後から始まり、通例Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（配列番号７８）またはいくつかの変異形を先頭にして、１６残基〜１９塩基の長さで、Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａが続く。ＣＤＲ−Ｈ３は、ＣＤＲ−Ｈ２末端のおよそ３３残基後から始まり、Ｃｙｓ−ＸＸＸ−ＸＸＸ（通例、Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ）を先頭にして、３残基〜２５残基の長さで、Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−ＸＸＸ−Ｇｌｙ（配列番号７９）が続く。
一実施形態では、軽鎖ＣＤＲ及び重鎖ＣＤＲは、Kabatの方法を用いて特定される。
【０１２４】
一実施形態では、軽鎖ＣＤＲならびに重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３をKabatの方法を用いて特定し、重鎖ＣＤＲ１をKabat法とClothia法の間に相当するＡｂＭ法を用いて特定する。例えば、Whitelegg  N  &  Rees  AR,  Protein  Eng.  2000  Dec;13(12):819-24、及びMethods  Mol  Biol.  2004;248:51-91を参照されたい。ＣＤＲを見つけるためのプログラムも一般に利用可能であり、例えばAbYsis（www.bioinf.org.uk/abysis/）などがある。
【０１２５】
種々の軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、例えばヒトなどの種内では比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域は、抗体の構成要素である軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域を組み合わせたものであり、三次元空間でＣＤＲを配置し、かつアライメントさせるものである。ＣＤＲは主に、抗原のエピトープに対する結合の役割を担っている。各鎖のＣＤＲは通例、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と称され、Ｎ末端から順に連続して番号を付けられており、一般に特有のＣＤＲがある鎖によっても特定される。したがって、抗体重鎖の可変ドメインにあるＣＤＲは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３と表記される一方、抗体軽鎖の可変ドメインにあるＣＤＲは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３と表記される。異なる特異性（すなわち、種々の抗原に対して異なる結合部位）を持つ抗体は、異なるＣＤＲを持つ。抗体毎にＣＤＲは異なるが、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置のみが抗原結合に直接関与している。ＣＤＲ内のこれらの位置は特異性決定残基（ＳＤＲ）と称されている。特定の実施形態で考察されている抗ＣＤ７９ＡＣＡＲを構築するのに適した軽鎖ＣＤＲの具体例として、以下に限定されないが、配列番号１〜配列番号３、配列番号９〜配列番号１１、及び配列番号１７〜配列番号１９に記載されたＣＤＲ配列が挙げられる。特定の実施形態で考察されている抗ＣＤ７９ＡＣＡＲを構築するのに適した重鎖ＣＤＲの具体例として、以下に限定されないが、配列番号４〜配列番号６、配列番号１２〜配列番号１４、及び配列番号２０〜配列番号２２に記載されたＣＤＲ配列が挙げられる。
【０１２６】
「ＶＬ」または「ＶＬ」は、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を表し、抗体の可変領域である、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、または本明細書に記載の他の抗体断片を含む。特定の実施形態で考察されている抗ＣＤ７９ＡＣＡＲを構築するのに適した軽鎖可変領域の具体例として、以下に限定されないが、配列番号７、配列番号１５、及び配列番号２３に記載された軽鎖可変領域の配列が挙げられる。
【０１２７】
「ＶＨ」または「ＶＨ」は、免疫グロブリン重鎖の可変領域を表し、抗体の可変領域である、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、または本明細書に記載の他の抗体断片を含む。特定の実施形態で考察されている抗ＣＤ７９ＡＣＡＲを構築するのに適した重鎖可変領域の具体例として、以下に限定されないが、配列番号８、配列番号１６、及び配列番号２４に記載された重鎖可変領域の配列が挙げられる。
【０１２８】
「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一クローンから得られるか、または単一抗体の軽鎖及び重鎖の遺伝子をトランスフェクトした細胞から得られる抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法、例えば、骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞との融合体からハイブリッド抗体形成細胞を作製することにより産生することができる。モノクローナル抗体にはヒト化モノクローナルが含まれる。
【０１２９】
「キメラ抗体」は、ヒトなどの１つの種由来のフレームワーク残基と、マウスなどの他の種由来のＣＤＲ（通例、抗原結合をもたらす部分）とを有するものである。特定の好ましい実施形態では、ＣＡＲは、キメラ抗体またはその抗原結合断片の抗原特異的結合ドメインを含む。
【０１３０】
好ましい実施形態では、抗体は、ヒトＣＤ７９Ａポリペプチドに特異的に結合するヒト抗体（ヒトモノクローナル抗体など）またはその断片である。ヒト抗体は、上述したように、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列と、既知のヒト定常ドメイン配列とを組み合わせることによって構築することができる。あるいは、ヒトモノクローナル抗体をハイブリドーマ法により作製してもよい。ヒトモノクローナル抗体の産生に適したヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫の細胞株について、例えば、by  Kozbor  J.  Immunol.,  133:  3001  (1984)、Brodeur  et  al.,  Monoclonal  Antibody  Production  Techniques  and  Applications,  pp.    51-63  (Marcel  Dekker,  Inc.,  New  York,  1987)、及びBoerner  et  al.,  J.  Immunol.,  147:  86  (1991)に記載されている。さらに、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を用いて、内因性免疫グロブリンを産生することなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することができる。例えば、Jakobovits  et  al.,  PNAS  USA,  90:  2551  (1993)、Jakobovits  et  al.,  Nature,  362:  255  (1993)、Bruggermann  et  al.,  Year  in  Immunol.,  7:  33  (1993)を参照されたい。遺伝子シャッフリングを用いて、非ヒト（例えば、げっ歯類抗体）由来のヒト抗体であって、元の非ヒト抗体と同様の親和性と特異性を持つ、ヒト抗体を得ることができる。（１９９３年の４月１日に公開された国際出願ＰＣＴ９３／０６２１３を参照）。従来のＣＤＲ移植法による非ヒト抗体のヒト化とは異なり、本手法により、非ヒト由来のＦＲ残基もＣＤＲ残基も持たない完全ヒト抗体が得られる。
【０１３１】
一実施形態では、ＣＡＲは「ヒト化」抗体を含む。ヒト化抗体は、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト（例えば、マウス、ラット、または合成）免疫グロブリンに由来する１つまたは複数のＣＤＲとを含む、免疫グロブリンである。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と称され、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と称される。一実施形態では、全てのＣＤＲは、ヒト化免疫グロブリンではドナー免疫グロブリン由来である。定常領域を持つ必要はないが、持つ場合には、定常領域は、ヒト免疫グロブリンの定常領域と実質的に同一、すなわち少なくとも約８５％〜９０％、例えば約９５％以上同一でなければならない。したがって、ヒト化免疫グロブリンの全ての部分（ＣＤＲを除外する場合もある）は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。ヒト化抗体または他のモノクローナル抗体は、さらなる保存的アミノ酸置換を有する場合があるが、この置換は、抗原結合または他の免疫グロブリン機能に実質的に何ら影響を与えない。ヒト化抗体は、遺伝子操作により構築することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照）。
【０１３２】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片には、以下に限定されないが、ラクダＩｇ（ラクダ科抗体（ＶＨＨ））、ＩｇＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、二重特異性Ｆａｂ二量体（Ｆａｂ２）、三重特異性Ｆａｂ三量体（Ｆａｂ３）、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ビスｓｃＦｖ（bis-scFv）、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）が含まれる。
【０１３３】
本明細書で使用する「ラクダＩｇ」または「ラクダ科ＶＨＨ」は、重鎖抗体の中で最も小さいものとして知られる抗原結合単位を表す（Koch-Nolte,  et  al,  FASEB  J.,  21:  3490-3498  (2007)）。「重鎖抗体」または「ラクダ科抗体」は、２つのＶＨドメインを含み、かつ軽鎖を含まない抗体を意味する（Riechmann  L.  et  al,  J.  Immunol.  Methods  231:25-38  (1999)、国際公開第９４／０４６７８号、国際公開第９４／２５５９１号、米国特許第６，００５，０７９号）。
【０１３４】
「免疫グロブリン新抗原受容体」すなわち「ＩｇＮＡＲ」は、１つの可変新抗原受容体（ＶＮＡＲ）ドメインと、５つの定常新抗原受容体（ＣＮＡＲ）ドメインとのホモダイマーからなるサメ免疫レパートリー由来の抗体のクラスを意味する。ＩｇＮＡＲは、最も小さいものとして知られる免疫グロブリン系タンパク質骨格の例であり、安定性が高く、高効率の結合特性を持つ。ＩｇＮＡＲの安定性が高いのは、（ｉ）マウス抗体で見られる従来の抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインと比べて、帯電しかつ親和性表面が露出した残基の数がかなり多いベースＩｇ骨格と、（ｉｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）ループの安定化構造特性、例えば、ループ内のジスルフィド架橋、及びループ内水素結合のパターンなどと、を持つことに起因すると考えられている。
【０１３５】
抗体のパパイン分解により、「Ｆａｂ」断片と称される２つの同一の抗原結合断片であって、それぞれが単一の抗原結合部位を持つ断片と、高い結晶化能にちなんだ名称を持つ残りの「Ｆｃ」断片とを得る。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を持ち、かつ抗原を架橋可能なＦ（ａｂ’）２断片を得る。
【０１３６】
「Ｆｖ」は、全抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。一実施形態では、二本鎖Ｆｖ類は、堅固に非共有結合的に会合した、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとが可撓性ペプチドリンカーにより共有結合で連結し、その軽鎖及び重鎖が、二本鎖Ｆｖの構造と類する「二量体」構造で会合できるものである。この構成では、各可変ドメインの３つの超可変領域（ＨＶＲ）が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を画定している。全体として、６つのＨＶＲがその抗体に抗原結合特異性を付与することになる。一方、単一の可変ドメイン（すなわち、抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを備えたＦｖの半分）であっても、全結合部位を用いるよりは親和性が低くなるものの、抗原を認識し結合させる能力を持つ。
【０１３７】
Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとを含み、さらに軽鎖の定常ドメインと、重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端において、いくつかの残基が付加されているという点で、Ｆａｂ断片とは異なっている。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つ場合のＦａｂ’を表す。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元来、Ｆａｂ’断片の対であって、その間にヒンジシステインを持つ対として作製されたものである。抗体断片の他の化学的結合も公知である。二重特異性Ｆａｂ二量体（Ｆａｂ２）は、２つのＦａｂ’断片を持ち、その各々が異なる抗原を結合させる。三重特異性Ｆａｂ三量体（Ｆａｂ３）は、３つのＦａｂ’断片を持ち、その各々が異なる抗原を結合させる。
【０１３８】
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を持つ抗体断片を意味し、その断片は、同一のポリペプチド鎖において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。同一鎖の２つのドメインが対を形成できない程度に短いリンカーを用いることにより、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対を形成せざるを得ず、２つの抗原結合部位が形成される。ダイアボディは、二価でも二重特異性でもよい。ダイアボディについては、例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第１９９３／０１１６１号、Hudson  et  al.,  Nat.  Med.  9:129-134  (2003)、及びHollinger  et  al.,  PNAS  USA  90:  6444-6448  (1993)にさらに詳細に記載されている。トリアボディ及びテトラボディについても、Hudson  et  al.,  Nat.  Med.  9:129-134  (2003)に記載されている。
【０１３９】
「単一ドメイン抗体」、または「ｓｄＡｂ」、または「ナノボディ」は、抗体重鎖の可変領域（ＶＨドメイン）、または抗体軽鎖の可変領域（ＶＬドメイン）からなる抗体断片を意味する（Holt,  L.,  et  al,  Trends  in  Biotechnology,  21(11):  484-490）。
【０１４０】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」の抗体断片は、抗体のＶＨドメインとＶＬドメインとを含み、この２つのドメインは、単一ポリペプチド鎖であり、どちらかの向き（例えば、ＶＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＬ）で構成されている。一般的に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合に適した構造を形成できるようになる。ｓｃＦｖの総説としては、例えば、Pluckthun,  in  The  Pharmacology  of  Monoclonal  Antibodies,  vol.  113,  Rosenburg  and  Moore  eds.,  (Springer-Verlag,  New  York,  1994),  pp.    269-315を参照されたい。
【０１４１】
好ましい実施形態では、抗ＣＤ７９Ａ抗原結合断片はｓｃＦｖである。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、マウスｓｃＦｖ、ヒトｓｃＦｖ、またはヒト化ｓｃＦｖである。一本鎖抗体は、所望の標的に特異的なハイブリドーマのＶ領域遺伝子からクローニングされ得る。こうしたハイブリドーマの産生は常套的に行われている。可変領域重鎖（ＶＨ）と可変領域軽鎖（ＶＬ）とをクローニングするのに用いることができる手法については、例えば、Orlandi  et  al.,  PNAS,  1989;  86:  3833-3837に記載されている。
【０１４２】
種々の実施形態では、抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１〜配列番号３、配列番号９〜配列番号１１、もしくは配列番号１７〜配列番号１９に記載されたＣＤＲＬ１配列〜ＣＤＲＬ３配列を備えた可変軽鎖配列、及び／または配列番号４〜配列番号６、もしくは配列番号１２〜配列番号１４に記載されたＣＤＲＨ１配列〜ＣＤＲＨ３配列を備えた可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７、配列番号１５、もしくは配列番号２３のいずれか１つに記載された可変軽鎖配列、及び／または配列番号８、配列番号１６、もしくは配列番号２４のいずれか１つに記載された可変重鎖配列を含む。
【０１４３】
特定の実施形態では、抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＤ７９Ａポリペプチドに結合するｓｃＦｖである。
【０１４４】
ＣＤ７９Ａ特異的結合ドメインの一例は、少なくとも１つのヒトフレームワーク領域を含むＣＤ７９Ａに特異的な免疫グロブリン可変領域である。「ヒトフレームワーク領域」は、ヒト免疫グロブリン可変領域の野生型（すなわち天然の）フレームワーク領域か、またはヒト免疫グロブリン可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸のうちの約５０％未満（例えば、好ましくは約４５％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満）が欠失または置換された（例えば、対応する位置で非ヒト免疫グロブリンフレームワーク領域の１つまたは複数のアミノ酸残基と置換された）改変フレームワーク領域、または非ヒト免疫グロブリン可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸のうちの約５０％未満（例えば、４５％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満）が欠失または置換された（例えば、露出した残基の位置で欠失または置換された、及び／または対応する位置でヒト免疫グロブリンフレームワーク領域の１つもしくは複数のアミノ酸残基と置換された）改変フレームワーク領域であって、その結果、一態様において免疫原性が減じた、フレームワーク領域を意味するものである。
【０１４５】
特定の実施形態では、ヒトフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリン可変領域の野生型フレームワーク領域である。他の特定の実施形態では、ヒトフレームワーク領域は、１箇所、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、６箇所、７箇所、８箇所、９箇所、または１０箇所以上でアミノ酸欠失またはアミノ酸置換を有する、ヒト免疫グロブリン可変領域の改変フレームワーク領域である。他の実施形態では、ヒトフレームワーク領域は、１箇所、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、６箇所、７箇所、８箇所、９箇所、または１０箇所以上でアミノ酸欠失またはアミノ酸置換を有する、非ヒト免疫グロブリン可変領域の改変フレームワーク領域である。
【０１４６】
特定の実施形態では、ＣＤ７９Ａ特異的結合ドメインは、ヒト軽鎖ＦＲ１、ヒト重鎖ＦＲ１、ヒト軽鎖ＦＲ２、ヒト重鎖ＦＲ２、ヒト軽鎖ＦＲ３、ヒト重鎖ＦＲ３、ヒト軽鎖ＦＲ４、及びヒト重鎖ＦＲ４から選択される、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。
【０１４７】
ＣＤ７９Ａ特異的結合ドメインに含まれ得るヒトＦＲはまた、本明細書で提供される例示的なＦＲの変異体を含み、該変異体では、例示的なＦＲの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のアミノ酸が置換または欠失されている。
【０１４８】
特定の実施形態では、ＣＤ７９Ａ特異的結合ドメインは、（ａ）ヒト軽鎖ＦＲ１、ヒト軽鎖ＦＲ２、ヒト軽鎖ＦＲ３、及びヒト軽鎖ＦＲ４を含むヒト化軽鎖可変領域と、（ｂ）ヒト重鎖ＦＲ１、ヒト重鎖ＦＲ２、ヒト重鎖ＦＲ３、及びヒト重鎖ＦＲ４を含むヒト化重鎖可変領域とを含む。
【０１４９】
さらに、本明細書で提供されるＣＤ７９Ａ特異的結合ドメインは、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のＣＤＲを含む。こうしたＣＤＲは、軽鎖のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３、ならびに重鎖のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３から選択される、非ヒトＣＤＲであっても改変非ヒトＣＤＲであってもよい。特定の実施形態では、ＣＤ７９Ａ特異的結合ドメインは、（ａ）軽鎖ＣＤＲＬ１、軽鎖ＣＤＲＬ２、及び軽鎖ＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、（ｂ）重鎖ＣＤＲＨ１、重鎖ＣＤＲＨ２、及び重鎖ＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域とを含む。
【０１５０】
ある実施形態では、抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１〜配列番号３、配列番号９〜配列番号１１、もしくは配列番号１７〜配列番号１９に記載のアミノ酸に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸同一性を有する、ＣＤＲＬ１配列〜ＣＤＲＬ３配列を備えた可変軽鎖配列、及び／または配列番号４〜配列番号６、配列番号１２〜配列番号１４、もしくは配列番号２０〜配列番号２２に記載のアミノ酸に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸同一性を有する、ＣＤＲＨ１配列〜ＣＤＲＨ３配列を備えた可変重鎖配列を含む。
【０１５１】
一実施形態では、ＣＤ７９Ａ特異的結合ドメインは、配列番号１〜配列番号３、配列番号９〜配列番号１１、配列番号１７〜配列番号１９に記載された軽鎖ＣＤＲ配列を含む。特定の実施形態では、ＣＤ７９Ａ特異的結合ドメインは、配列番号１〜配列番号３、配列番号９〜配列番号１１、または配列番号１７〜配列番号１９に記載された軽鎖ＣＤＲ配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有する軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【０１５２】
一実施形態では、ＣＤ７９Ａ特異的結合ドメインは、配列番号４〜配列番号６、配列番号１２〜配列番号１４、または配列番号２０〜配列番号２２に記載された重鎖ＣＤＲ配列を含む。特定の実施形態では、ＣＤ７９Ａ特異的結合ドメインは、配列番号４〜配列番号６、配列番号１２〜配列番号１４、または配列番号２０〜配列番号２２に記載された重鎖ＣＤＲ配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有する重鎖ＣＤＲ配列を含む。
【０１５３】
特定の実施形態では、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７、配列番号１５、もしくは配列番号２３のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸同一性を有する可変軽鎖配列、及び／または配列番号８、配列番号１６、もしくは配列番号２４のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸同一性を有する可変重鎖配列を含む。
【０１５４】
２．リンカー
特定の実施形態では、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲは、種々のドメイン間にリンカー残基を含み、リンカーは、例えば、分子の適正な空間及び構造を得るために付加されている。特定の実施形態では、リンカーは、可変領域連結配列である。「可変領域連結配列」は、ＶＨドメインとＶＬドメインとを連結し、２つのサブ結合ドメインの相互作用に適合したスペーサー機能を付与するアミノ酸配列である。得られたポリペプチドは、同一の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対して、特異的結合親和性を保持している。特定の実施形態では、ＣＡＲは、１個、２個、３個、４個、もしくは５個、またはそれ以上のリンカーを含む。特定の実施形態では、リンカーの長さは、約１個〜約２５個のアミノ酸、約５個〜約２０個のアミノ酸、もしくは約１０個〜約２０個のアミノ酸、または任意のその間のアミノ酸の長さである。ある実施形態では、リンカーは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、またはそれ以上のアミノ酸の長さである。
【０１５５】
リンカーの具体例として、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（Ｇ１−５Ｓ１−５）ｎ（式中、ｎは少なくとも１、２、３、４、または５の整数）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、及び当該技術分野で公知の他の可撓性リンカーが挙げられる。グリシンポリマー及びグリシン−セリンポリマーは構造が比較的不定形であることから、本明細書に記載のＣＡＲといった融合タンパク質のドメイン間において、中間的つなぎ鎖として機能することができる。グリシンは、アラニンに比べて有意に多くのΦΨ空間にアクセスし、長い側鎖を持つ残基よりもはるかに制約が少ないものである（Scheraga,  Rev.  Computational  Chem.  11173-142  (1992)を参照）。特定の実施形態におけるＣＡＲの設計には、全体的または部分的に可撓性を持つリンカーが含まれる場合があり、したがって、リンカーが、可撓性リンカーと、可撓性の少ない構造を付与する１つまたは複数の部分とを備えて、所望のＣＡＲ構造が得られる場合があることを、当業者は認識するであろう。
【０１５６】
他のリンカーの例として、以下に限定されないが、下記のアミノ酸配列である、ＤＧＧＧＳ（配列番号３９）、ＴＧＥＫＰ（配列番号４０）（例えば、  Liu  et  al.,  PNAS  5525-5530  (1997)を参照）、ＧＧＲＲ（配列番号４１）（Pomerantz  et  al.  1995、上掲）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは１、２、３、４、または５）（配列番号４２）（Kim  et  al.,  PNAS  93,  1156-1160  (1996)）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号４３）（Chaudhary  et  al.,  1990,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  87:1066-1070）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号４４）（Bird  et  al.,  1988,  Science  242:423-426）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号４５）、ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号４６）、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号４７）、ＬＲＱＫＤ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号４８）が挙げられる。あるいは、可撓性リンカーを、ＤＮＡ結合部位とそのペプチドとをモデル化することができるコンピュータープログラムを用いて（Desjarlais  &  Berg,  PNAS  90:2256-2260  (1993),  PNAS  91:11099-11103  (1994)）、またはファージディスプレイ法を用いて、合理的に設計することができる。一実施形態では、リンカーは、以下のアミノ酸配列であるＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号４９）（Cooper  et  al.,  Blood,  101(4):  1637-1644  (2003)）を含む。
【０１５７】
３．スペーサードメイン
特定の実施形態では、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲの結合ドメインの後に、１つまたは複数の「スペーサードメイン」が続いており、このスペーサードメインは、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から遠ざけて、適正な細胞／細胞接触、抗原結合、及び活性化を可能にする領域のことである（Patel  et  al.,  Gene  Therapy,  1999;  6:  412-419）。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組み換え体の供給源に由来し得る。特定の実施形態では、スペーサードメインは、免疫グロブリンの一部であり、以下に限定されないが、１つまたは複数の重鎖定常領域、例えば、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。スペーサードメインは、天然の免疫グロブリンヒンジ領域または改変免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０１５８】
一実施形態では、スペーサードメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２及びＣＨ３を含む。
【０１５９】
４．ヒンジドメイン
抗ＣＤ７９ＡＣＡＲの結合ドメインの後には通例、１つまたは複数の「ヒンジドメイン」が続いており、このヒンジドメインは、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から遠ざけて、適正な細胞／細胞接触、抗原結合、及び活性化を可能にするのに貢献するものである。抗ＣＤ７９ＡＣＡＲは通例、結合ドメインと膜貫通（ＴＭ）ドメインとの間に１つまたは複数のヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組み換え体の供給源に由来し得る。ヒンジドメインは、天然の免疫グロブリンヒンジ領域または改変免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【０１６０】
「改変ヒンジ領域」は、（ａ）最大３０％のアミノ酸変化（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のアミノ酸置換または欠失）を持つ天然のヒンジ領域、（ｂ）最大３０％のアミノ酸変化（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のアミノ酸置換または欠失）を持つ長さが少なくとも１０個のアミノ酸（例えば、少なくとも１２個、１３個、１４個、または１５個のアミノ酸）の天然ヒンジ領域の一部、または（ｃ）コアヒンジ領域（長さ４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、もしくは１５個、または少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、もしくは少なくとも１５個のアミノ酸）を含む天然ヒンジ領域の一部を意味する。特定の実施形態では、天然の免疫グロブリンヒンジ領域の１つまたは複数のシステイン残基が、１つまたは複数の他のアミノ酸残基（例えば、１つまたは複数のセリン残基）で置換されている場合がある。あるいはまたは加えて、改変した免疫グロブリンヒンジ領域が、別のアミノ酸残基（例えば、セリン残基）で置換された野生型免疫グロブリンヒンジ領域のプロリン残基を持つ場合がある。
【０１６１】
本明細書に記載のＣＡＲにおける使用に適したヒンジドメインの例として、ＣＤ８α及びＣＤ４などのＩ型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域が挙げられ、このヒンジ領域は、Ｉ型膜タンパク質の野生型ヒンジ領域であっても、改変されたものであってもよい。一実施形態では、ヒンジはＰＤ−１ヒンジまたはＣＤ１５２ヒンジであり、別の実施形態では、ヒンジドメインはＣＤ８αヒンジ領域を含む。
【０１６２】
５．膜貫通（ＴＭ）ドメイン
「膜貫通ドメイン」は、細胞外結合部と細胞内シグナル伝達ドメインとを融合して、ＣＡＲを免疫エフェクター細胞の形質膜に固定させる、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲの一部である。ＴＭドメインは、天然、合成、半合成、または組み換え体の供給源に由来し得る。ＴＭドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１のうちの少なくとも膜貫通領域由来であり得、すなわち該膜貫通領域を含み得る。特定の実施形態では、ＴＭドメインは合成されたものであり、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を主に含んでいる。
【０１６３】
一実施形態では、ＣＡＲは、ＰＤ１、ＣＤ１５２、ＣＤ２８、またはＣＤ８α由来のＴＭドメインを含む。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＰＤ１、ＣＤ１５２、ＣＤ２８、またはＣＤ８α由来のＴＭドメインと、ＴＭドメインをＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインと連結している、長さが好ましくは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のアミノ酸の短いオリゴリンカーまたはポリペプチドリンカーとを含む。グリシン−セリン系リンカーは、特に好適なリンカーである。
【０１６４】
６．細胞内シグナル伝達ドメイン
特定の実施形態では、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲは、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲがヒトＣＤ７９Ａポリペプチドに実質的に結合しているというメッセージを、免疫エフェクター細胞の内部に伝達して、エフェクター細胞の機能を引き出すＣＡＲの一部を意味する。該機能として、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖活性及び細胞傷害性活性があり、例えば、ＣＡＲが結合した標的細胞への細胞傷害性因子の放出、または細胞外ＣＡＲドメインに対する抗原結合により誘発される他の細胞応答などがある。
【０１６５】
用語「エフェクター機能」は、免疫エフェクター細胞の特有の機能を意味する。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性もしくは補助、またはサイトカインの分泌を含めた活性を担うと考えられている。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞が特有の機能を果たすように誘導する、タンパク質の一部を意味する。細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることもできるが、多くの場合、必ずしも全ドメインを用いる必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分を用いる場合、切断部分がエフェクター機能シグナルを伝達する限り、全ドメインの代わりに用いることができる。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むことが意図されている。
【０１６６】
ＴＣＲ単体から生成されるシグナルだけでは、Ｔ細胞を完全に活性化させるには不十分であり、二次シグナルまたは共刺激シグナルも必要となることが知られている。したがって、Ｔ細胞活性化は、細胞内シグナル伝達ドメインの以下の２つの異なるクラスである、ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）を介して抗原依存性一次活性化を惹起する一次シグナル伝達ドメインと、抗原非依存的に作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルを発する共刺激シグナル伝達ドメインと、によって媒介されるとも言われている。好ましい実施形態では、ＣＡＲは、１つまたは複数の「共刺激シグナル伝達ドメイン」と、「一次シグナル伝達ドメイン」とを備えた、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０１６７】
一次シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を、刺激するようにまたは阻害するように調節するものである。刺激するように作用する一次シグナル伝達ドメインには、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるシグナル伝達モチーフが含まれていてもよい。
【０１６８】
特定の実施形態に有用な一次シグナル伝達ドメインを含むＩＴＡＭの具体例として、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、及びＣＤ６６ｄ由来のものが挙げられる。特定の好ましい実施形態では、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲは、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインと、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。細胞内一次シグナル伝達ドメインと共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインのカルボキシル末端に任意の順で一列に連結されていてもよい。
【０１６９】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲ受容体を発現するＴ細胞の効力及び増殖を増大させる、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。「共刺激シグナル伝達ドメイン」または「共刺激ドメイン」という用語は、本明細書で使用する場合、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを意味する。共刺激分子とは、抗原受容体またはＦｃ受容体以外の細胞表面分子であり、抗原に結合した際にＴリンパ球を効果的に活性化し、かつ機能させるために必要な、第２のシグナルを発する分子である。共刺激分子の具体例として、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０が挙げられる。一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、及びＣＤ１３４からなる群から選択される１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１７０】
別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８及びＣＤ１３７の共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１７１】
さらに別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８及びＣＤ１３４の共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１７２】
一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１３７及びＣＤ１３４の共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１７３】
一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１３７共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１７４】
一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１３４共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１７５】
一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１７６】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、癌細胞に発現したＣＤ７９Ａポリペプチドに特異的に結合する抗ＣＤ７９Ａ抗体またはその抗原結合断片を含む。
【０１７７】
一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ７９Ａポリペプチドを結合させる抗ＣＤ７９ＡｓｃＦｖと、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ１、及びＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチド由来の膜貫通ドメインと、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子由来の１つまたは複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、及びＣＤ６６ｄから選択される一次シグナル伝達ドメインと、を含む。
【０１７８】
一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ７９Ａポリペプチドを結合させる抗ＣＤ７９ＡｓｃＦｖと、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＰＤ１ヒンジ、ＣＤ１５２ヒンジ、及びＣＤ８αヒンジからなる群から選択されるヒンジドメインと、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ１、及びＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチド由来の膜貫通ドメインと、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子由来の１つまたは複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、及びＣＤ６６ｄから選択される一次シグナル伝達ドメインと、を含む。
【０１７９】
一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ７９Ａポリペプチドを結合させる抗ＣＤ７９ＡｓｃＦｖと、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＰＤ１ヒンジ、ＣＤ１５２ヒンジ、及びＣＤ８αヒンジからなる群から選択されるヒンジドメインと、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ１、及びＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチド由来の膜貫通（ＴＭ）ドメインと、ＴＭドメインをＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインと連結する、長さが好ましくは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のアミノ酸の短いオリゴリンカーまたはポリペプチドリンカーと、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子由来の１つまたは複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、及びＣＤ６６ｄから選択される一次シグナル伝達ドメインと、を含む。
【０１８０】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ７９Ａポリペプチドを結合させる抗ＣＤ７９ＡｓｃＦｖと、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３ポリペプチド及びＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメインと、約３個〜約１０個のアミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＣＤ８α膜貫通ドメインと、ＣＤ１３７細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１８１】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ７９Ａポリペプチドを結合させる抗ＣＤ７９ＡｓｃＦｖと、ＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメインと、約３個〜約１０個のアミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＣＤ８α膜貫通ドメインと、ＣＤ１３４細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１８２】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ７９Ａポリペプチドを結合させる抗ＣＤ７９ＡｓｃＦｖと、ＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメインと、約３個〜約１０個のアミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＣＤ８α膜貫通ドメインと、ＣＤ２８細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１８３】
特定の実施形態で考察したＣＡＲを設計することにより、該ＣＡＲを発現するＴ細胞において、未改変のＴ細胞または他のＣＡＲを発現するように改変したＴ細胞と比べて、増殖、長時間持続性、及び細胞傷害性が改良される。
【０１８４】
Ｄ．ポリペプチド
ＣＡＲポリペプチド及びその断片などを含むがこれらに限定されない、種々ポリペプチド、融合ポリペプチド、ポリペプチド変異体が、本明細書で検討されている。好ましい実施形態では、１つまたは複数のＣＡＲを含むポリペプチドが提供されている。特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２５〜配列番号３０のうちのいずれか１つに記載されたアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７９ＡＣＡＲである。
【０１８５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、別段の指定がない限り、交換可能に用いられており、従来の意味に従って、すなわちアミノ酸の配列を意味するものとして用いられている。ポリペプチドは、特定の長さに限定されておらず、例えば、完全長ポリペプチドまたはポリペプチド断片を含む場合がある。ポリペプチドはまた、ポリペプチドの１つまたは複数の翻訳後修飾を含む場合があり、翻訳後修飾には、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、ならびに当該技術分野で公知の天然及び非天然の他の修飾などがある。種々の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、シグナル配列（またはリーダー配列）をタンパク質のＮ末端に含んでおり、これが翻訳時または翻訳後にタンパク質の導入を誘導する。特定の実施形態で考察されているＣＡＲに有用である適切なシグナル配列の具体例として、以下に限定されないが、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、ＣＤ８αシグナルポリペプチド、またはヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファポリペプチドが挙げられる。ポリペプチドは、様々な周知の組み換え手法及び／または合成手法のいずれかを用いて調製することができる。本明細書で考察されているポリペプチドは、本開示のＣＡＲ、または本明細書で考察されているＣＡＲの１つもしくは複数のアミノ酸が欠失、付加、及び／もしくは置換された配列を含む。
【０１８６】
「単離ポリペプチド」及び同様の表現は、本明細書で使用する場合、ペプチド分子またはポリペプチド分子を、細胞環境から及び細胞の他の成分と会合した状態から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成、単離及び／または精製したものを意味する。すなわち、このポリペプチドはｉｎ  ｖｉｖｏの物質とは有意には会合していない。特定の実施形態では、単離ポリペプチドは、合成ポリペプチド、半合成ポリペプチド、または組み換え供給源から得られたポリペプチドもしくは該供給源由来のポリペプチドである。
【０１８７】
ポリペプチドは、「ポリペプチド変異体」を含む。ポリペプチド変異体は、１つまたは複数の置換、欠失、付加、及び／挿入を持つ点で天然ポリペプチドとは異なり得る。こうした変異体は、天然であっても、合成して作製されていてもよく、例えば、上述のポリペプチド配列の１つまたは複数を改変して作製されていてもよい。例えば、特定の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドの結合ドメイン、ヒンジドメイン、ＴＭドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、または一次シグナル伝達ドメインに、１つまたは複数の置換、欠失、付加、及び／または挿入を導入することにより、ＣＡＲの結合親和性及び／または他の生物学的特性を向上させることが望ましい場合がある。特定の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で考察されている参照配列のいずれかに対して、少なくとも約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、８６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含み、多くの場合、その変異体は参照配列の少なくとも１つの生物学的活性を保持している。特定の実施形態では、生物学的活性は結合親和性である。特定の実施形態では、生物学的活性は細胞溶解活性である。
【０１８８】
ポリペプチドは、「ポリペプチド断片」を含む。ポリペプチド断片は、天然または組み換え産生ポリペプチドのアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、及び／または内部欠失もしくは置換を有する、単量体または多量体となり得るポリペプチドを意味する。生物学的に活性なポリペプチド断片の具体例には抗体断片が含まれる。用語「生物学的に活性な断片」または「最小の生物学的に活性な断片」という用語は、本明細書で使用する場合、天然ポリペプチドの活性の少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、または少なくとも５％を保持するポリペプチド断片を意味する。好ましい実施形態では、生物学的活性は、イディオタイプへの結合親和性のことである。特定の実施形態では、ポリペプチド断片には、長さが少なくとも５個〜約５００個のアミノ酸であるアミノ酸鎖が含まれ得る。特定の実施形態では、断片の長さは、少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１１０個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、または４５０個のアミノ酸であることは理解されるであろう。特に有用なポリペプチド断片には、抗原結合ドメインまたは抗体の断片を含めた機能ドメインが含まれる。抗ＣＤ７９Ａ抗体の場合、有用な断片には、以下に限定されないが、ＣＤＲ領域、重鎖または軽鎖のＣＤＲ３領域、重鎖または軽鎖の可変領域、２つのＣＤＲを含む抗体鎖または可変領域の一部などが含まれる。
【０１８９】
ポリペプチドの合成、精製、もしくは特定（例えば、ｐｏｌｙ−Ｈｉｓなど）を行いやすくするために、またはポリペプチドの固体支持体への結合を強化するために、ポリペプチドは、インフレームで融合されていても、リンカーまたは他の配列とコンジュゲートされていてもよい。
【０１９０】
上述したように、特定の実施形態では、ポリペプチドを、アミノ酸の置換、欠失、トランケーション、及び挿入などの様々な方法で改変することができる。こうした操作方法は、当該技術分野で一般的に知られている。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列変異体を、ＤＮＡを変異させることにより調製することができる。変異誘発法及びヌクレオチド配列改変方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Kunkel（1985,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA.  82:  488-492）、Kunkelら（1987,  Methods  in  Enzymol,  154:  367-382）、米国特許４，８７３，１９２号、Watson,  J.  D.ら（Molecular  Biology  of  the  Gene,  Fourth  Edition,  Benjamin/Cummings,  Menlo  Park,  Calif.,  1987）、及び本明細書で引用した参考文献を参照されたい。目的タンパク質の生物学的活性に影響を与えない適正なアミノ酸置換の手引については、Dayhoffらのモデル（(1978)  Atlas  of  Protein  Sequence  and  Structure  (Natl.  Biomed.  Res.  Found.,  Washington,  D.C.)）に記載されている。
【０１９１】
特定の実施形態では、ポリペプチド変異体には、１つまたは複数の保存的置換が含まれる。「保存的置換」は、あるアミノ酸を同様の特性を持つ別のアミノ酸の代わりに用いるが、ペプチド化学分野の当業者が、ポリペプチドの二次構造及び疎水性親水性特性が実質的に変化しないと予測できる置換のことである。特定の実施形態で考察されているポリヌクレオチド及びポリペプチドの構造に修飾をすることもでき、それにより所望の特性を持つ変異体ポリペプチドまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能性分子がさらに得られることになる。ポリペプチドのアミノ酸配列を改変して、同等ないし改良された変異体ポリペプチドを作製することが望ましい場合、当業者は、例えば、コードＤＮＡ配列のコドンのうちの１つまたは複数を、例えば表１に従って変えることができる。
【表１】
2021527409.tif 000003
【０１９２】
生物学的活性を消失することなく、置換、挿入、または欠失できるアミノ酸残基を判定する方法については、DNASTAR、DNA  Strider、Geneious、Mac  Vector、またはVector  NTIソフトウェアなどの当該技術分野で周知のコンピュータープログラムを用いて参照することができる。本明細書に開示されたタンパク質変異体のアミノ酸変化は、保存的なアミノ酸変化であること、すなわち、同様に帯電したアミノ酸または無電荷のアミノ酸の置換であることが好ましい。保存的なアミノ酸変化には、側鎖における類似するアミノ酸ファミリーのうちの１つの置換が含まれる。天然アミノ酸は通例、４つのファミリーである、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）と、塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）と、無極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）と、非電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）とに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、芳香族アミノ酸として共に分類される場合がある。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の適正な保存的置換は、当業者に知られており、得られる分子の生物学的活性を変えることなく行うことができる。一般的に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が、生物学的活性を実質的に変えるものではないことは、当業者に認識されている（例えば、Watson  et  al.  Molecular  Biology  of  the  Gene,  4th  Edition,  1987,  The  Benjamin/Cummings  Pub.  Co.,  p.224を参照）。
【０１９３】
上記に概説したように、アミノ酸は、アミノ酸側鎖置換体の相対的な類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいて置換され得る。
【０１９４】
ポリペプチド変異体には、グリコシル化型、他の分子との複合体、及び相互作用しない化学的部分との共有結合複合体（例えば、ペグ化分子）がさらに含まれる。共有結合変異体は、当該技術分野で知られているように、アミノ酸鎖内の基か、またはＮ末端残基もしくはＣ末端残基の基と、官能基とを結合させることにより調製することができる。変異体にはまた、対立遺伝子変異体、種変異体、及びムテインが含まれる。タンパク質の機能活性に影響を及ぼさない領域のトランケーション体または欠失体も変異体である。
【０１９５】
２つ以上のポリペプチドの発現が必要となる一実施形態では、それらをコードするポリヌクレオチド配列が、本明細書のいずれかで論じているＩＲＥＳ配列によって分離されていてもよい。別の実施形態では、２つ以上のポリペプチドを、１つまたは複数の自己切断型ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現することができる。
【０１９６】
特定の実施形態で考察されているポリペプチドは、融合ポリペプチドを含む。好ましい実施形態では、融合ポリペプチド、及び融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えばＣＡＲが提供されている。融合ポリペプチド及び融合タンパク質は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれ以上のポリペプチドセグメントを備えたポリペプチドを意味する。融合ポリペプチドは通例、Ｃ末端からＮ末端に結合しているが、Ｃ末端からＣ末端に、Ｎ末端からＮ末端に、またはＮ末端からＣ末端に結合している場合もある。融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順でもあっても、特定の順であってもよい。また、融合ポリペプチドまたは融合タンパク質は、融合ポリペプチドの所望の転写活性が保たれている限り、保存的に改変された変異体、多型変異体、対立遺伝子、突然変異体、部分配列、及び種間相同体を含んでいてもよい。融合ポリペプチドを、化学合成法により、もしくは２つの部分を化学的に結合させることにより作製することができ、または多くの場合、他の標準的な方法を用いて作製することもできる。融合ポリペプチドを含むライゲーションしたＤＮＡ配列は、本明細書のいずれかで論じている適正な転写制御エレメントまたは翻訳制御エレメントに作用可能に連結されている。
【０１９７】
一実施形態では、融合パートナーは、元の組み換えタンパク質よりも効率の高いタンパク質発現を補助する配列（発現エンハンサー）を含む。タンパク質の溶解性が増加するように、またはタンパク質が所望の細胞内区分に標的化されるように、または融合タンパク質が細胞膜を介して輸送されやすくなるように、他方の融合パートナーを選択することができる。
【０１９８】
融合ポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドドメインの各々の間に、ポリペプチド切断シグナルをさらに含む場合がある。また、ポリペプチド切断部位を、任意のリンカーペプチド配列に入れることができる。ポリペプチド切断シグナルの例として、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、低頻度制限酵素認識部位、自己切断型リボザイム認識部位など）、及び自己切断型ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位が挙げられる（deFelipe  and  Ryan,  2004.  Traffic,  5(8);  616-26を参照）。
【０１９９】
適切なプロテアーゼ切断部位及び自己切断型ペプチドは当業者に知られている（例えば、Ryan  et  al.,  1997.  J.  Gener.  Virol.  78,  699-722、Scymczak  et  al.  (2004)  Nature  Biotech.  5,  589-594を参照）。プロテアーゼ切断部位の例として、以下に限定されないが、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコエッチウイルスプロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（byovirus）ＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ−２コードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロ球状ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップイエローフレックウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子、及びエンテロキナーゼが挙げられる。一実施形態においては、ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）プロテアーゼ切断部位が、高い切断ストリンジェンシーを持つために好ましいが、該切断部位の例として、例えばＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号５０）、例えばＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号５１）及びＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号５２）があり、Ｘは任意のアミノ酸を示している（ＴＥＶによる切断は、ＱとＧの間またはＱとＳの間で生じる）。
【０２００】
特定の実施形態では、ポリペプチド切断シグナルは、ウイルス自己切断型ペプチドまたはリボソームスキッピング配列（ribosomal  skipping  sequence）である。
【０２０１】
リボソームスキッピング配列の具体例として、以下に限定されないが、２Ａまたは２Ａ様の部位、配列、またはドメインが挙げられる（Donnelly  et  al.,  2001.  J.  Gen.  Virol.  82:1027-1041）。特定の実施形態では、ウイルス２Ａペプチドは、アフトウイルス２Ａペプチド、ポティウイルス２Ａペプチド、またはカルジオウイルス２Ａペプチドである。
【０２０２】
一実施形態では、ウイルス２Ａペプチドは、口蹄病ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａペプチド、ゾーシーアシグナ（Thosea  asigna）ウイルス（ＴａＶ）２Ａペプチド、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ−１）２Ａペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、及び脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択される。
【０２０３】
２Ａ部位の具体例を表２に示している。
【表２】
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【０２０４】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲポリペプチドを含む。
【０２０５】
Ｅ．ポリヌクレオチド
好ましい実施形態では、１つまたは複数のＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供されている。用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書で使用する場合、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、及びＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを意味する。ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、また組み換え体でも、合成されたものでも、単離されたものでもよい。ポリヌクレオチドには、以下に限定されないが、プレメッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、または組み換えＤＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドは、長さが少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００、もしくは少なくとも１５０００、またはそれ以上のヌクレオチド、及びその間の全ての長さのヌクレオチドの重合形態のことであり、リボヌクレオチドであってもデオキシリボヌクレオチドであってもよく、またはヌクレオチドのいずれか種の修飾形態であってもよい。本文脈において「その間の長さ」とは、明記した値の間にある任意の長さ、例えば、６、７、８、９など、１０１、１０２、１０３など、１５１、１５２、１５３など、２０１、２０２、２０３などを意味することは容易に理解されるであろう。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは変異体は、参照配列に対して、少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％，７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％，８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【０２０６】
ポリヌクレオチドの具体例として、以下に限定されないが、配列番号３１〜配列番号３６が挙げられ、及び配列番号１〜配列番号３０をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【０２０７】
「単離ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、天然状態で隣接している配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ断片であって、該断片に通常隣接している配列から取り出された断片を意味する。特定の実施形態では、「単離ポリヌクレオチド」はまた、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組み換えＤＮＡ、または天然では存在せずに人工的に作製された他のポリヌクレオチドを意味する。特定の実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチド、半合成ポリヌクレオチド、または組み換え供給源から得られたポリヌクレオチドもしくは該供給源由来のポリヌクレオチドである。
【０２０８】
種々の実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書で考察されているポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、キャップ、すなわち１つまたは複数のヌクレオチドと、ポリ（Ａ）テールとを含む。
【０２０９】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはコドン最適化されていてもよい。用語「コドン最適化」は、本明細書で使用する場合、ポリペプチドの発現、安定性、及び／または活性を増加させるために、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいて、コドンを置換することを意味する。コドン最適化に影響を与える因子として、以下に限定されないが、（ｉ）２つ以上の生体間もしくは遺伝子間、もしくは総合的にまとめられたバイアス表（bias  table）間のコドンバイアスの違い、（ｉｉ）生体内、遺伝子内、もしくは遺伝子群内のコドンバイアスの程度の違い、（ｉｉｉ）コンテクストを含むコドンの系統的な違い、（ｉｖ）デコードｔＲＮＡに基づくコドンの違い、（ｖ）全体におけるもしくはトリプレットの一位置におけるＧＣ％に基づくコドンの違い、（ｖｉ）参照配列、例えば天然配列に対する類似度の違い、（ｖｉｉ）コドン頻度カットオフの違い、（ｖｉｉｉ）ＤＮＡ配列から転写されるｍＲＮＡの構造特性、（ｉｘ）コドン置換セットの設計に必要なＤＮＡ配列の機能に関する予備知識、（ｘ）各アミノ酸のコドンセットの系統的な違い、及び／または（ｘｉ）偽性翻訳開始部位の分離除去、のうちの１つまたは複数が挙げられる。
【０２１０】
用語「ポリヌクレオチド変異体」及び「変異体」ならびに同様の表現は、本明細書で使用する場合、参照ポリヌクレオチド配列と実質的に配列同一性を示すポリヌクレオチド、または下記に定義されるストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを意味する。これらの用語は、参照ポリヌクレオチドと比較して、１つもしくは複数のヌクレオチドが付加もしくは欠失されているか、または異なるヌクレオチドで置換されているポリヌクレオチドを含む。この点に関して当該技術分野で十分に理解されているのは、参照ポリヌクレオチドに対して、変異、付加、欠失、及び置換を含む特定の改変を行うことができ、改変ポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持しているということである。
【０２１１】
ポリヌクレオチド変異体には、生物学的活性ポリペプチド断片または変異体をコードするポリヌクレオチド断片が含まれる。用語「ポリヌクレオチド断片」は、本明細書で使用する場合、天然ポリペプチドの活性の少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、または少なくとも５％を保持するポリペプチド変異体をコードする、長さが少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、またはそれ以上のヌクレオチドであるポリヌクレオチド断片を意味する。ポリヌクレオチド断片は、天然または組み換え産生ポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸におけるアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、及び／または内部欠失もしくは置換を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを意味する。
【０２１２】
「５０％同一の配列」などを例として含めた記述「配列同一性」は、本明細書で使用する場合、比較領域にわたって配列がヌクレオチド毎またはアミノ酸毎に同一である程度を意味する。したがって、「配列同一性パーセント」は、比較領域で最適にアライメントされた２つの配列を比較し、両方の配列において同一性の核酸基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、及びＭｅｔ）となる位置の数を算出して、一致した位置の数を求め、その一致した位置の数を比較領域（すなわちウィンドウサイズ）全位置の数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって算出することができる。本明細書に記載の参照配列のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、８６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド及びポリペプチドも含まれ、多くの場合、ポリペプチド変異体は参照配列の少なくとも１つの生物学的活性を保持している。
【０２１３】
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列関係性を記述するのに用いる用語には、「参照配列」、「比較領域」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、及び「実質的同一性」がある。「参照配列」の長さは、ヌクレオチド及びアミノ酸残基を含む単量体単位数が少なくとも１２であるが、１５〜１８であることが珍しくなく、少なくとも２５であることが多い。２つのポリヌクレオチドは、それぞれ（１）２つのポリヌクレオチドの間で類似性のある配列（すなわち、完全ポリヌクレオチド配列の一部のみ）と、（２）２つのポリヌクレオチドの間で異なる配列とを含む場合があるため、２つ（以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、２つのポリヌクレオチドの配列の「比較領域」を比較して、配列類似性の局所的な領域を特定及び比較することによって行う。「比較領域」は、少なくとも６個の連続する位置、一般的には約５０個〜約１００個、より一般的には約１００個〜約１５０個の連続する位置の概念的セグメントを指し、２つの配列を至適にアライメントした後に、配列を同一数の連続する位置の参照配列と比較する。２つの配列を至適にアライメントするために、比較領域は参照配列（付加も欠失も含んでいない配列）と比べて約２０％以下の付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでいてもよい。比較領域をアライメントするための配列の至適アライメントは、アルゴリズム（Genetics  Computer  Group（米国ウィスコンシン州マディソン、575  Science  Drive）製のWisconsin  Geneticsソフトウェアパッケージリリース７．０におけるGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA）のコンピューター処理により、または選択した種々の方法のいずれかを用いた分析及び最適アライメント（すなわち、比較領域で最高割合の相同性が得られるもの）により行うことができる。また、例えば、Altschul  et  al.,  1997,  Nucl.  Acids  Res.  25:3389に開示されているプログラムのＢＬＡＳＴファミリーを参照することもできる。配列分析の詳細な検討については、Ausubel  et  al.,  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  John  Wiley  &  Sons  Inc,  1994-1998,  Chapter  15のUnit  19.3に記載されている。
【０２１４】
ポリヌクレオチドの方向について記載する用語には、５’（通例、遊離リン酸基を持つポリヌクレオチドの末端）及び３’（通例、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を持つポリヌクレオチドの末端）が含まれる。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’方向、または３’から５’方向にアノテーションされ得る。ＤＮＡ及びｍＲＮＡについて、５’から３’方向の鎖は「センス」鎖、「プラス」鎖、または「コード」鎖と称されているが、これは、その配列が、プレメッセンジャー（プレｍＲＮＡ）の配列と同一である（ＤＮＡのチミン（Ｔ）の部分がＲＮＡではウラシル（Ｕ）になっていることを除く）からである。ＤＮＡとｍＲＮＡについて、相補的な３’から５’方向の鎖は、ＲＮＡポリメラーゼにより転写される鎖であり、「テンプレート」鎖、「アンチセンス」鎖、「マイナス」鎖、または「非コード」鎖と称されている。用語「逆方向」は、本明細書で使用する場合、３’から５’方向で書かれた５’から３’方向の配列、または５’から３’方向に書かれた３’から５’方向の配列を意味する。
【０２１５】
用語「相補」及び「相補性」という用語は、塩基対合則で関連付けられているポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド配列）を意味する。例えば、ＤＮＡ配列５’ＡＧＴＣＡＴＧ３’の相補鎖は、３’ＴＣＡＧＴＡＣ５’である。後者の配列は、左側に５’末端を持ち、右側に３’末端を持つ逆相補鎖の５’ＣＡＴＧＡＣＴ３’と記載されることが多い。この逆相補鎖と同じ配列は回文配列と言われている。核酸塩基の一部のみが塩基対合則に従ってマッチングしている場合には、相補性は「部分的」になり得る。あるいは、核酸間に「完全」相補性または「全」相補性がある場合もある。
【０２１６】
また、当業者に理解されることは、遺伝コードの縮重があるために、本明細書に記載されているポリペプチドまたはその変異体の断片をコードするヌクレオチド配列が多数存在することである。これらのポリヌクレオチドの中には、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列との相同性を最小限にしか持たないものもある。しかしながら、コドン使用頻度が異なるために様々となるポリヌクレオチド、例えば、ヒト及び／または霊長類のコドン選択について最適化されているポリヌクレオチドが、特定の実施形態で特に考察されている。さらに、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子を使用することもできる。対立遺伝子は、１つまたは複数の変異、例えば、ヌクレオチドの欠失、付加、及び／または置換により改変された内因性遺伝子である。
【０２１７】
「核酸カセット」または「発現カセット」という用語は、本明細書で使用する場合、ＲＮＡを発現し、続いてポリペプチドを発現することができるベクター内の遺伝子配列を意味する。一実施形態では、核酸カセットは、目的の遺伝子、例えば、目的のポリヌクレオチドを含有する。別の実施形態では、核酸カセットは、１つまたは複数の発現制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ（Ａ）配列、及び目的の遺伝子、例えば、目的のポリヌクレオチドを含有する。ベクターが、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個またはそれ以上の核酸カセットを含む場合もある。核酸カセットは、ベクター内で位置及び順序が定められており、カセット内の核酸が、ＲＮＡに転写され、必要な場合には、タンパク質またはポリペプチドに翻訳されるように、また形質転換された細胞の活性に必要となる適正な翻訳後修飾を施されるように、さらには適正な細胞内領域への標的化または細胞外領域への分泌によって生物学的活性の適正な領域に移動するようになっている。カセットは、ベクター内への即時挿入に適した３’末端及び５’末端を有することが好ましく、例えば、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。好ましい実施形態では、核酸カセットには、ＣＤ７９Ａを発現する癌細胞の細胞傷害性を増加させるのに用いられるキメラ抗原受容体の配列が含まれる。カセットは除去することができ、プラスミドまたはウイルスベクターに単一ユニットとして挿入することもできる。
【０２１８】
ポリヌクレオチドは、目的のポリヌクレオチドを含む。用語「目的のポリヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、ポリペプチド、ポリペプチド変異体、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。ベクターは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の目的のポリヌクレオチドを含んでいてもよい。特定の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、疾患または障害の治療または予防において治療作用を付与するポリペプチドをコードする。目的のポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドからコードされるポリペプチドは、野生型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、その機能的変異体及び断片とを含む。特定の実施形態では、機能的変異体は、対応する野生型の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を持つ。特定の実施形態では、機能的変異体または断片は、対応する野生型ポリペプチドの生物学的活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％を有する。
【０２１９】
本明細書で考察されているポリヌクレオチドは、そのコード配列の長さに関係なく、他のＤＮＡ配列と組み合わせられる場合があり、他のＤＮＡ配列には、本明細書のいずれかに開示されているか当該技術分野で知られている、プロモーター及び／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、シグナル配列、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、付加的制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位、及びＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終止シグナル、及び自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどがある。このため、全体の長さが大きく異なることがある。したがって、ほぼ全ての長さのポリヌクレオチド断片を特定の実施形態で使用することができ、全体の長さは、好ましくは、調製の簡便さ及び所定の組み換えＤＮＡプロトコルでの使用によって制限されると考えられる。
【０２２０】
ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知でありかつ適用できる十分確立された様々な技術のうちのいずれかを用いて、調製、操作、及び／または発現することができる。所望のポリペプチドを発現するために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を適切なベクターに挿入することができる。
【０２２１】
ベクターの具体例として、以下に限定されないが、プラスミド、自己複製配列、及び転移因子が挙げられ、転移因子には、例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｍｏｓ１、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ、Ｔｏｌ２、ｍｉｎｉ−Ｔｏｌ２、Ｔｃ３、ＭｕＡ、Ｈｉｍａｒ  Ｉ、Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ、及びそれらの誘導体がある。
【０２２２】
ベクターのさらなる具体例として、限定されるものではないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体（酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）など）、バクテリオファージ（ラムダファージまたはＭ１３ファージなど）、及び動物ウイルスが挙げられる。
【０２２３】
ベクターとして有用なウイルスの具体例として、限定されるものではないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、及びパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。
【０２２４】
発現ベクターの具体例として、以下に限定されないが、哺乳動物細胞における発現用にｐＣｌｎｅｏベクター（Promega社）、ならびに哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介遺伝子導入及び発現用にｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、及びｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Invitrogen社）が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書に開示されているポリペプチドのコード配列は、哺乳動物細胞でポリペプチドを発現させるために、こうした発現ベクターにライゲーションされていてもよい。
【０２２５】
特定の実施形態では、ベクターはエピソーム性ベクターであるか、または染色体外に残るベクターである。用語「エピソーム性」は、本明細書で使用する場合、宿主の染色体ＤＮＡに組み込むことなく、かつ分裂宿主細胞から徐々に失われていくことなく、複製することができるベクター、つまり、染色体外またはエピソームで複製するベクターを意味している。
【０２２６】
発現ベクターに含まれる「調節エレメント」または「調節配列」は、ベクターの非翻訳領域にあり、転写及び翻訳を行うように宿主細胞のタンパク質と相互作用する、複製の起点、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（シャイン−ダルガルノ配列またはコザック配列）イントロン、ポリアデニル化配列、５’及び３’非翻訳領域などである。こうしたエレメントは、その強さ及び特異性が様々であってもよい。使用するベクター系及び宿主によって、任意の数の適切な転写エレメント及び翻訳エレメント、例えば、遍在性プロモーター及び誘導性プロモーターなどを使用することができる。
【０２２７】
特定の実施形態では、ベクターは、発現ベクター及びウイルスベクターに限定されるものではなく、プロモーター及び／またはエンハンサーなどの外因性制御配列、内因性制御配列、または異種制御配列を含む。「内因性」制御配列は、ゲノムにおいて所定の遺伝子と天然の状態で連結された配列である。「外因性」制御配列は、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的手法）により遺伝子の近位に置かれた配列であって、その遺伝子の転写が連結エンハンサー／プロモーターにより誘導される、配列である。「異種」制御配列は、遺伝子操作される細胞とは異なる種由来の外因性配列である。
【０２２８】
用語「プロモーター」は、本明細書で使用する場合、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を意味する。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターと作用可能に連結したポリヌクレオチドを惹起し、転写させる。特定の実施形態では、哺乳動物細胞で作用可能なプロモーターには、転写が開始される部位から約２５塩基〜３０塩基上流に位置するＡＴに富む領域、及び／または転写開始部から７０塩基〜８０塩基上流の別の配列であるＣＮＣＡＡＴ領域（Ｎは任意のヌクレオチドであってもよい）が含まれる。
【０２２９】
用語「エンハンサー」は、転写を増強させることができ、ある例では、別の制御配列に対する方向とは無関係に機能することができる配列を含むＤＮＡセグメントを意味する。エンハンサーは、プロモーター及び／または他のエンハンサーエレメントと協同的または付加的に作用することができる。用語「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーターの機能とエンハンサーの機能の両方を付与することができる配列を含むＤＮＡセグメントを意味する。
【０２３０】
用語「作用可能に連結」とは、近接した状態であり、記載された成分同士が意図したように機能できる関係にあることを意味する。一実施形態では、この用語は、核酸発現制御配列（プロモーター、及び／またはエンハンサーなど）と、第２のポリヌクレオチド配列、例えば、目的のポリヌクレオチドとの機能的連結であって、該発現制御配列が第２の配列に相当する核酸の転写を誘導する、機能的連結を意味する。
【０２３１】
用語「構成的発現制御配列」は、本明細書で使用する場合、作用可能に連結した配列の転写を連続的または継続的に可能にする、プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを意味する。構成的発現制御配列は、広範な種々の細胞種もしくは組織種における発現を可能にする「遍在性」プロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサーであっても、または限定された種々の細胞種もしくは組織種における発現を可能にする「細胞特異的」、「細胞種特異的」、「細胞系統特異的」、もしくは「組織特異的」なプロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサーであってもよい。
【０２３２】
特定の実施形態における使用に適した遍在性発現制御配列の例として、以下に限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルス性シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５プロモーター、Ｐ７．５プロモーター及びＰ１１プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β−キネシン（β−ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座（Irions  et  al.,  Nature  Biotechnology  25,  1477  -  1482  (2007)）、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーター、ならびに負の制御領域が欠失した骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーのｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）Ｕ３プロモーター（Haas  et  al.  Journal  of  Virology.  2003;77(17):  9439-9450）が挙げられる。
【０２３３】
一実施形態では、ベクターはＭＮＤＵ３プロモーターを含む。
【０２３４】
一実施形態では、ベクターは、ヒトＥＦ１ａ遺伝子の第１のイントロンを備えたＥＦ１ａプロモーターを含む。
【０２３５】
一実施形態では、ベクターは、ヒトＥＦ１ａ遺伝子の第１のイントロンを欠くＥＦ１ａプロモーターを含む。
【０２３６】
特定の実施形態では、ＣＡＲを含むポリヌクレオチドをＴ細胞特異的プロモーターから発現することが望ましい場合がある。
【０２３７】
「条件付き発現」は、本明細書で使用する場合、任意の種類の条件付き発現を意味してもよく、該発現には、以下に限定されないが、誘導性発現、抑制性発現、及び特定の生理学的状態、生物学的状態、または疾患状態などを有する細胞または組織における発現が含まれる。この定義は、細胞種特異的発現または組織特異的発現を除外することを意図するものではない。特定の実施形態では、目的のポリヌクレオチドの条件付き発現が用いられており、例えば、細胞、組織、生体などを、目的のポリヌクレオチドを発現させるか、または目的のポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドの発現を増加または減少させる、処置または状態にさらすことにより、発現を制御する。
【０２３８】
誘導性プロモーター／系の具体例として、以下に限定されないが、グルココルチコイド受容体またはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーターなどのステロイド誘導性プロモーター（対応ホルモンで処理することにより誘導可能）、メタロチオネインプロモーター（種々の重金属で処理することにより誘導可能）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンにより誘導可能）、「GeneSwitch」ミフェプリストン調節可能系（Sirin  et  al.,  2003,  Gene,  323:67）、クミン酸誘導性遺伝子スイッチ（国際公開第２００２／０８８３４６号）、テトラサイクリン依存性調節系などが挙げられる。
【０２３９】
部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを用いることによっても、条件付き発現を行うことができる。特定の実施形態によると、ベクターには、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組み換えのための少なくとも１つ（典型的には２つ）の部位が含まれる。「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、本明細書で使用する場合、１個または複数個（例えば、２個、３個、４個、５個、７個、１０個、１２個、１５個、２０個、３０個、５０個など）の組み換え部位における組み換え反応に関与する、切除または組み込み用のタンパク質、酵素、補助因子、または関連タンパク質を含み、これらは、野生型タンパク質（Landy,  Current  Opinion  in  Biotechnology  3:699-707  (1993)を参照）、またはその変異体、誘導体（例えば、組み換えタンパク質配列またはその断片を含有する融合タンパク質など）、断片、及び多様体であってもよい。特定の実施形態での使用に適したリコンビナーゼの具体例として、以下に限定されないが、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、及びＰａｒＡが挙げられる。
【０２４０】
ベクターは、種々の部位特異的リコンビナーゼのいずれかに対する１つまたは複数の組み換え部位を含む。部位特異的リコンビナーゼに対する標的部位は、ベクター（例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）の組み込みに必要な任意の部位以外の部分であることを理解されたい。「組み換え配列」、「組み換え部位」、または「部位特異的組み換え部位」という用語は、本明細書で使用する場合、リコンビナーゼが認識し、結合する特定の核酸配列を意味する。
【０２４１】
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼの１つの組み換え部位は、８塩基対コア配列に隣接した２つの１３塩基対逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位として作用）を含む３４塩基対配列のｌｏｘＰである（Sauer,  B.,  Current  Opinion  in  Biotechnology  5:521-527  (1994)の図１を参照）。他のｌｏｘＰ部位の例として、以下に限定されないが、ｌｏｘ５１１（Hoess  et  al.,  1996;  Bethke  and  Sauer,  1997）、ｌｏｘ５１７１（Lee  and  Saito,  1998）、ｌｏｘ２２７２（Lee  and  Saito,  1998）、ｍ２（Langer  et  al.,  2002）、ｌｏｘ７１（Albert  et  al.,  1995）、及びｌｏｘ６６（Albert  et  al.,  1995）が挙げられる。
【０２４２】
ＦＬＰリコンビナーゼの適切な認識部位として、以下に限定されないが、ＦＲＴ（McLeod,  et  al.,  1996）、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３（Schlake  and  Bode,  1994）、Ｆ４、Ｆ５（Schlake  and  Bode,  1994）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Senecoff  et  al.,  1988）、ＦＲＴ（ＲＥ）（Senecoff  et  al.,  1988）が挙げられる。
【０２４３】
認識配列の他の例には、リコンビナーゼ酵素λインテグラーゼ、例えばｐｈｉ−ｃ３１により認識される、ａｔｔＢ配列、ａｔｔＰ配列、ａｔｔＬ配列、及びａｔｔＲ配列がある。φＣ３１ＳＳＲは、ヘテロタイプ部位であるａｔｔＢ（長さ３４ｂｐ）とａｔｔＰ（長さ３９ｂｐ）との間のみ、組み換えを媒介するものである（Groth  et  al.,  2000）。ａｔｔＢとａｔｔＰは、細菌ゲノム及びファージゲノムのファージインテグラーゼに対する付着部位に付けられた名称であり、それぞれ、φＣ３１ホモダイマーにより結合していると考えられる不完全な逆方向反復を含んでいる（Groth  et  al.,  2000）。産生部位のａｔｔＬ及びａｔｔＲは、さらなるφＣ３１媒介組み換えに対して実質不活性であり（Belteki  et  al.,  2003）、反応を不可逆にする。挿入の誘発に関しては、ａｔｔＢ含有ＤＮＡをゲノムａｔｔＰ部位に挿入するのは、ａｔｔＰ部位をゲノムａｔｔＢ部位に挿入するよりも容易であることが分かっている（Thyagarajan  et  al.,  2001;  Belteki  et  al.,  2003）。したがって、典型的な戦略では、相同組み換えにより、決められた遺伝子座にａｔｔＰ含有「ドッキング部位」を配置し、続いて、これを別のａｔｔＢ含有配列と組み合わせて挿入させる。
【０２４４】
「配列内リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」は、本明細書で使用する場合、シストロン（タンパク質コード領域）の開始コドン（例えば、ＡＴＧ）に配列内リポゾームを直接的に進入させることで遺伝子のキャップ非依存的翻訳をもたらす、エレメントを意味する。例えば、Jackson  et  al.,  1990.  Trends  Biochem  Sci  15(12):477-83、及びJackson  and  Kaminski.  1995.  RNA  1(10):985-1000を参照されたい。特定の実施形態では、ベクターは、１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の目的ポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、複数のポリペプチドの各々を効率的に翻訳するために、ポリヌクレオチド配列を、１つまたは複数のＩＲＥＳ配列により、または自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列により分離することができる。一実施形態では、本明細書で考察されているポリヌクレオチドで用いられるＩＲＥＳは、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳである。
【０２４５】
用語「コザック配列」は、本明細書で使用する場合、ｍＲＮＡとリボソームの小サブユニットとの初期結合を強く促進しかつ翻訳を増やす、短いヌクレオチド配列を意味する。コンセンサスコザック配列は、（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号７５）であり、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）である（Kozak,  1986.  Cell.  44(2):283-92、及びKozak,  1987.  Nucleic  Acids  Res.  15(20):8125-48）。特定の実施形態では、ベクターは、コンセンサスコザック配列を有し、かつ所望のポリペプチド、例えばＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０２４６】
異種核酸転写の効果的な終結とポリアデニル化とを誘導するエレメントは、異種遺伝子発現を増加させる。転写終結シグナルは一般的に、ポリアデニル化シグナルの下流にある。特定の実施形態では、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列３’を含む。本明細書で使用される「ポリＡ部位」、「ポリＡ配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写の終結とポリアデニル化とを誘導するＤＮＡ配列を意味する。ポリアデニル化配列は、コード配列の３’末端にポリＡテールを付加することにより、ｍＲＮＡの安定性を増すことができ、ひいては翻訳効率を向上させる一因となる。切断及びポリアデニル化は、ＲＮＡのポリ（Ａ）配列によって誘導される。哺乳動物プレｍＲＮＡのコアポリ（Ａ）配列は、切断−ポリアデニル化部位に隣接する２つの認識エレメントを備える。典型的には、ほぼインバリアントなＡＡＵＡＡＡ六量体が、Ｕ残基またはＧＵ残基に富む可変性の高いエレメントの２０ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド上流に置かれている。新生転写物の切断は、この２つのエレメント間で生じ、５’切断産物に対して最大２５０個のアデノシンの付加を伴う。特定の実施形態では、コアポリ（Ａ）配列は理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）である。特定の実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、ＳＶ４０ポリＡ配列、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβグロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、それらの変異体、または当該技術分野で公知の他の適切な異種もしくは内因性のポリＡ配列である。
【０２４７】
ある実施形態では、ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを保有する細胞は、誘導性自殺遺伝子を含めた自殺遺伝子を利用して、直接的な毒性を及ぼすリスク、及び／または制御不能に増殖するリスクを軽減する。特定の態様では、自殺遺伝子は、該ポリヌクレオチドまたは細胞を保有する宿主に対して免疫原性を持たない。使用可能な自殺遺伝子の特定の例は、カスパーゼ９、またはカスパーゼ８、またはシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ９は、特有の二量体化化学的誘導因子（ＣＩＤ）を用いて活性化され得る。
【０２４８】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターを用いて細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）に導入する。
【０２４９】
用語「ベクター」は、別の核酸分子を導入または輸送することができる核酸分子を意味するものとして本明細書で使用されている。導入される核酸は通例、ベクター核酸分子に連結、例えば挿入されている。ベクターは、細胞における自律増殖を誘導する配列を含んでいてもよく、宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にする配列を含んでいてもよい。特定の実施形態では、非ウイルスベクターを用いて、本明細書で考察されている１つまたは複数のポリヌクレオチドをＴ細胞に輸送する。一実施形態では、ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されたか、または合成的に調製された、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲをコードするｍＲＮＡである。
【０２５０】
非ウイルスベクターの具体例として、以下に限定されないが、ｍＲＮＡ、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、及び細菌人工染色体が挙げられる。
【０２５１】
特定の実施形態で考察されているポリヌクレオチドの非ウイルス輸送の具体例として、以下に限定されないが、エレクトロポレーション、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質・核酸複合体、裸ＤＮＡ、人工ビリオン、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介導入、遺伝子銃、及び熱ショックが挙げられる。
【０２５２】
特定の実施形態で考察されている、特定の実施形態での使用に適したポリヌクレオチド輸送システムの具体例として、以下に限定されないが、Amaxa  Biosystems社、Maxcyte社、BTX  Molecular  Delivery  Systems社、及びCopernicus  Therapeutics社により提供されているものが挙げられる。リポフェクションの試薬は市販されている（例えば、Transfectam（商標）及びLipofectin（商標））。効果的なポリヌクレオチドの受容体認識リポフェクションに適したカチオン性脂質及び中性脂質については、文献で説明されている。例えば、Liu  et  al.  (2003)  Gene  Therapy.  10:180-187、及びBalazs  et  al.  (2011)  Journal  of  Drug  Delivery.  2011:1-12を参照されたい。抗体を標的にした、細菌由来の非生物ナノ細胞系の輸送も、特定の実施形態で考察されている。
【０２５３】
種々の実施形態では、ポリヌクレオチドは、所望のポリペプチドを過渡的に発現させるために細胞に導入されるｍＲＮＡである。「過渡的」は、本明細書で使用する場合、数時間、数日間、または数週間の間、導入されない導入遺伝子の発現を意味し、発現期間は、ゲノムに導入された場合、または細胞の適切なプラスミドレプリコンに挿入された場合のポリヌクレオチドの発現期間よりも短い期間となる。
【０２５４】
特定の実施形態では、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡはｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡである。「ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用する場合、ＲＮＡ、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されたｍＲＮＡを意味する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡは通例、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ベクターから作製される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡを作製するために使用されるテンプレートを含む。
【０２５５】
特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップもしくは修飾５’キャップ及び／またはポリ（Ａ）配列をさらに含んでいてもよい。５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ７−メチルグアノシンキャップ、またはＲＮＡｍ７Ｇキャップとも称される）は、本明細書で使用する場合、転写開始直後に真核生物メッセンジャーＲＮＡの「先端部」または５’末端に付加された、修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップには、第１の転写ヌクレオチドに連結されており、かつリボソームにより認識され、リボヌクレアーゼから保護される末端基が含まれる。キャッピング部分を修飾して、例えば翻訳の安定性または効率といったｍＲＮＡの機能性を調節することができる。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、約５０個〜約５０００個のアデニンから構成されるポリ（Ａ）配列を含む。一実施形態では、ｍＲＮＡは、約１００塩基〜約１０００塩基、約２００塩基〜約５００塩基、または約３００塩基〜約４００塩基のポリ（Ａ）配列を含む。一実施形態では、ｍＲＮＡは、約６５塩基、約１００塩基、約２００塩基、約３００塩基、約４００塩基、約５００塩基、約６００塩基、約７００塩基、約８００塩基、約９００塩基、または約１０００以上の塩基のポリ（Ａ）配列を含む。ポリ（Ａ）配列を化学的にまたは触媒的に修飾して、局在性、翻訳安定性、または翻訳効率といったｍＲＮＡの機能性を調節することができる。
【０２５６】
特定の実施形態に考察されているポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、個々の患者に投与することによって、一般的には、以下に記載しているように、全身投与（例えば、静脈内注入、腹腔内注入、筋肉内注入、皮下注入、または頭蓋内注入）または局所投与によってｉｎ  ｖｉｖｏ送達することができる。あるいは、ベクターは、個々の患者から外植された細胞（例えば、動員末梢血液、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検など）または万能ドナー造血幹細胞といった細胞にｅｘ  ｖｉｖｏ送達することができ、その後、その細胞を患者に再移植をすることができる。
【０２５７】
一実施形態では、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを生体に直接投与して、細胞をｉｎ  ｖｉｖｏ形質導入する。あるいは裸ＤＮＡを投与することもできる。投与は、分子を血液または組織細胞と最大限接触させるために通常用いる経路のいずれかによって行い、例えば、以下に限定されないが、注射、注入、局所投与、及びエレクトロポレーションなどにより行う。こうした核酸を投与するのに適した方法は、利用可能でありかつ当業者に周知である。２つ以上経路を用いて特定の組成物を投与する場合があるが、多くの場合、ある特定の経路が別の経路よりも即時性が高くかつ高効率な反応をもたらすことになる。
【０２５８】
本明細書で考察されている特定の実施形態に使用するのに適したウイルスベクター系の具体例として、以下に限定されないが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、及びワクシニアウイルスのベクターが挙げられる。
【０２５９】
種々の実施形態では、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞に、該１つまたは複数のポリヌクレオチドを含めた組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を用いて形質導入することによって組み込む。
【０２６０】
ＡＡＶは、小さいサイズ（約２６ｎｍ）であり、主としてエピソーム性の複製欠損非エンベロープウイルスである。ＡＡＶは、分裂細胞と非分裂細胞の両方を感染することができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は通例少なくとも、導入遺伝子及びその調節配列と、５’及び３’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）とから構成されている。ＩＴＲ配列は長さが約１４５ｂｐである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＩＴＲと、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０から単離されたカプシド配列とを含む。
【０２６１】
ある実施形態では、キメラｒＡＡＶが用いられ、ＩＴＲ配列は１つのＡＡＶセロタイプから単離されており、カプシド配列が異なるＡＡＶセロタイプから単離されている。例えば、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列を有するｒＡＡＶとＡＡＶ６由来のカプシド配列とを、ＡＡＶ２／ＡＡＶ６と称する。特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲと、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０のうちのいずれか１つ由来のカプシドタンパク質とを含み得る。好ましい実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列と、ＡＡＶ６由来のカプシド配列とを含む。好ましい実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列と、ＡＡＶ２由来のカプシド配列とを含む。
【０２６２】
ある実施形態では、工学的方法及び選択方法をＡＡＶカプシドに適用して、目的の細胞を形質導入しやすくすることができる。
【０２６３】
ｒＡＡＶベクターの構築物、その生成物、及びその精製物は、米国特許第９，１６９，４９４号、同第９，１６９，４９２号、同第９，０１２，２２４号、同第８，８８９，６４１号、同第８，８０９，０５８号、及び同第８，７８４，７９９号で開示されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用されている。
【０２６４】
種々の実施形態では、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを、免疫エフェクター細胞に、該１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）を用いて細胞の形質導入することによって組み込む。
【０２６５】
用語「レトロウイルス」は、本明細書で使用する場合、ゲノムＲＮＡを直鎖二本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、続いて、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合的に組み込むＲＮＡウイルスを意味する。特定の実施形態での使用に適したレトロウイルスの具体例として、以下に限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ならびにレンチウイルスが挙げられる。
【０２６６】
用語「レンチウイルス」は、本明細書で使用する場合、複雑型レトロウイルス群（または属）を意味する。レンチウイルスの具体例として、以下に限定されないが、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ１型及びＨＩＶ２型を含む）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。一実施形態では、ＨＩＶベースのベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用配列エレメント）が好適である。
【０２６７】
種々の実施形態では、本明細書で考察されているレンチウイルスベクターには、１つまたは複数のＬＴＲ、及び以下の随伴要素であるｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ、Ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル、輸送エレメント、ポリ（Ａ）のうちの１つもしくは複数または全てが含まれており、任意選択的に、本明細書のいずれかに記載されている、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥ、インスレーター配列、選択可能マーカー、及び細胞自殺遺伝子が含まれていてもよい。
【０２６８】
特定の実施形態では、本明細書で考察されているレンチウイルスベクターは、組み込みレンチウイルス、非組み込みレンチウイルス、または組み込み欠損レンチウイルスであってもよい。用語「組み込み欠損レンチウイルス」または「ＩＤＬＶ」は、本明細書で使用する場合、ウイルスゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込む能力を欠くインテグラーゼを有するレンチウイルスを意味する。組み込み不能なウイルスベクターについては、国際公開第２００６／０１０８３４号に記載されており、この特許出願はその全体が参照により本明細書に援用されている。
【０２６９】
インテグラーゼ活性を減少させるのに適したＨＩＶ−１ｐｏｌ遺伝子の変異の例として、以下に限定されないが、Ｈ１２Ｎ、Ｈ１２Ｃ、Ｈ１６Ｃ、Ｈ１６Ｖ、Ｓ８１Ｒ、Ｄ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｈ５１Ａ、Ｑ５３Ｃ、Ｄ５５Ｖ、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ６９Ａ、Ｋ７１Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ８７Ａ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６１、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０１、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｋ１６０Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ１６７Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｈ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８６Ｑ、Ｋ１８６Ｔ、Ｋ１８８Ｔ、Ｅ１９８Ａ、Ｒ１９９ｃ、Ｒ１９９Ｔ、Ｒ１９９Ａ、Ｄ２０２Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｑ２１４Ｌ、Ｑ２１６Ｌ、Ｑ２２１Ｌ、Ｗ２３５Ｆ、Ｗ２３５Ｅ、Ｋ２３６Ｓ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｇ２４７Ｗ、Ｄ２５３Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｒ２６３Ａ、及びＫ２６４Ｈが挙げられる。
【０２７０】
一実施形態では、ＨＩＶ−１インテグラーゼ欠損ｐｏｌ遺伝子には、Ｄ６４Ｖ、Ｄ１１６Ｉ、Ｄ１１６Ａ、Ｅ１５２Ｇ、もしくはＥ１５２Ａの変異か、Ｄ６４Ｖ、Ｄ１１６Ｉ、及びＥ１５２Ｇの変異か、またはＤ６４Ｖ、Ｄ１１６Ａ、及びＥ１５２Ａの変異が含まれる。
【０２７１】
一実施形態では、ＨＩＶ−１インテグラーゼ欠損ｐｏｌ遺伝子にはＤ６４Ｖ変異が含まれる。
【０２７２】
用語「末端反復配列（ＬＴＲ）」は、レトロウイルスＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインであって、その天然配列構成では、直接反復配列であり、Ｕ３領域、Ｒ領域、及びＵ５領域を含有するドメインを意味する。
【０２７３】
「ＦＬＡＰエレメント」または「ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ」という用語は、本明細書で使用する場合、その配列が、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）のセントラルポリプリン配列とセントラル終止配列（ｃＰＰＴ及びＣＴＳ）とを含む核酸を意味する。好適なＦＬＡＰエレメントについては、米国特許第６，６８２，９０７号及びZennou,  et  al.,  2000,  Cell,  101:173に記載されている。別の実施形態では、レンチウイルスベクターには、ｃＰＰＴエレメント及び／またはＣＴＳエレメントにおいて１つまたは複数の変異を有するＦＬＡＰエレメントが含まれる。さらに別の実施形態では、レンチウイルスベクターには、ｃＰＰＴエレメントまたはＣＴＳエレメントが含まれる。さらに別の実施形態では、レンチウイルスベクターにはｃＰＰＴエレメントもＣＴＳエレメントも含まれていない。
【０２７４】
「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、本明細書で使用する場合、ウイルスＲＮＡをウイルスカプシドまたはウイルス粒子に挿入するのに必要となる、レトロウイルスゲノム内のプサイ［Ψ］配列を意味する（例えば、Clever  et  al.,  1995.  J.  of  Virology,  Vol.  69,  No.  4;  pp.  2101-2109を参照）。
【０２７５】
用語「輸送エレメント」は、細胞の核から細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を調節する、シス作用転写後調節エレメントを意味する。ＲＮＡ輸送エレメントの例として、以下に限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）（例えば、Cullen  et  al.,  1991.  J.  Virol.  65:  1053、及びCullen  et  al.,  1991.  Cell  58:  423を参照）、及びＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）が挙げられる。
【０２７６】
特定の実施形態では、転写後調節エレメント、高効率ポリアデニル化部位、及び任意選択的に転写終止シグナルをウイルスベクターに組み込むことによって、ウイルスベクターにおける異種配列の発現を増加させる。様々な転写後調節エレメントが、タンパク質における異種核酸の発現を増加することができ、該調節エレメントには、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ、Zufferey  et  al.,  1999,  J.  Virol.,  73:2886）、Ｂ型肝炎ウイルス含まれる転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）（Huang  et  al.,  Mol.  Cell.  Biol.,  5:3864）、及び同類のもの（Liu  et  al.,  1995,  Genes  Dev.,  9:1766）がある。
【０２７７】
レンチウイルスベクターは、ＬＴＲを改変した結果として、いくつかの安全性強化部を含んでいることが好ましい。「自己不活型」（ＳＩＮ）ベクターは複製欠損ベクターを指し、例えば、該ベクターでは、Ｕ３領域として知られる右（３’）ＬＴＲエンハンサー−プロモーター領域を改変（例えば、欠失または置換）して、最初のウイルス複製サイクル後のウイルス転写を妨げている。ウイルス粒子産生の間、ウイルスゲノムの転写を駆動するように５’ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターで置換することによって、さらなる安全性強化部が得られる。使用することができる異種プロモーターの例として、例えば、ウイルス性シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、最初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）のプロモーターが挙げられる。
【０２７８】
「シュードタイプ」または「シュードタイピング」という用語は、本明細書で使用する場合、好ましい特性を持つ別のウイルスのタンパク質と置換されたウイルスエンベロープタンパク質を有するウイルスを意味する。例えば、ＨＩＶを、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質でシュードタイプ化することができ、これにより、ＨＩＶが広範囲の細胞を感染できるようになる。一般的に、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によりコードされるタンパク質）が、ウイルスをＣＤ４＋提示細胞に対して標的化するからである。
【０２７９】
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターを既知の方法により作製する。例えば、Kutner  et  al.,  BMC  Biotechnol.  2009;9:10.  doi:  10.1186/1472-6750-9-10、  Kutner  et  al.  Nat.  Protoc.  2009;4(4):495-505.  doi:  10.1038/nprot.2009.22を参照されたい。
【０２８０】
本明細書で考察されている特定の実施形態によると、ウイルスベクター骨格配列のほとんどまたは全てがレンチウイルス（例えば、ＨＩＶ−１）由来である。しかしながら、レトロウイルス配列及び／またはレンチウイルス配列の種々の供給源を使用することができ、レンチウイルス配列の中で、本明細書に記載の機能を遂行する導入ベクターの能力を損なうことなく、複数の置換及び改変が組み合わされる場合があることを理解されたい。さらに、種々のレンチウイルスベクターが当該技術分野で公知であり、Naldini  et  al.,  (1996a,  1996b,  and  1998)、Zufferey  et  al.,  (1997)、Dull  et  al.,  1998、米国特許第６，０１３，５１６号、同第５，９９４，１３６号を参照されたい。これらのベクターの多くを、本明細書で考察されているウイルスベクターまたは導入プラスミドを産生するように転用することができる。
【０２８１】
種々の実施形態では、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを、免疫エフェクター細胞に、該１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスを用いて形質導入することによって組み込む。
【０２８２】
アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において極めて高い形質導入効率をもたらすことができ、細胞分裂を必要としない。こうしたベクターを用いて、高い力価及び高いレベルの発現が得られている。このベクターは、比較的簡単な系で大量に作製することができる。アデノウイルスベクターのほとんどは操作されており、その結果、導入遺伝子が、ＡｄＥ１ａ遺伝子、ＡｄＥ１ｂ遺伝子、及び／またはＡｄＥ３遺伝子の代わりに用いられ、続いて複製欠損ベクターが、ｉｎ  ｔｒａｎｓで欠失遺伝子機能を提供するヒト２９３細胞で増殖するようになっている。アデノウイルス（Ａｄ）ベクターは、肝臓、腎臓、及び筋肉に見られる細胞などの非分裂の分化細胞を含めた複数種の組織にｉｎ  ｖｉｖｏで形質導入することができる。Ａｄベクターは通常、高い運搬能を持っている。
【０２８３】
現行の複製欠損アデノウイルスベクターの産生及び増殖には、２９３と称される特有のヘルパー細胞株を用いることができ、該細胞株は、Ａｄ５ＤＮＡ断片を用いてヒト胎児腎臓細胞から形質転換したものであり、かつＥ１タンパク質を恒常的に発現するものである（Graham  et  al.,  1977）。Ｅ３領域はアデノウイルスゲノムには必須ではないため（Jones  &  Shenk,  1978）、現行のアデノウイルスベクターは、２９３細胞を利用することにより、Ｅ１領域、Ｄ３領域、またはその両方の領域に外来ＤＮＡを持つ（Graham  &  Prevec,  1991）。アデノウイルスベクターは、真核生物の遺伝子発現（Levrero  et  al.,  1991;  Gomez-Foix  et  al.,  1992）及びワクチン開発（Grunhaus  &  Horwitz,  1992;  Graham  &  Prevec,  1992）に用いられてきた。組み換えアデノウイルスを種々の組織に投与する方法には、気管滴下注入（Rosenfeld  et  al.,  1991、Rosenfeld  et  al.,  1992）、筋肉注射（Ragot  et  al.,  1993）、末梢静脈内注射（Herz  &  Gerard,  1993）、及び脳への定位接種（Le  Gal  La  Salle  et  al.,  1993）がある。臨床試験におけるＡｄベクターの使用例には、筋肉内注射による抗腫瘍免疫処置のためのポリヌクレオチド療法がある（Sterman  et  al.,  Hum.  Gene  Ther.  7:1083-9  (1998)）。
【０２８４】
種々の実施形態では、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを、該１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む単純ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２）を用いて免疫エフェクター細胞に形質導入することによって、細胞に組み込む。
【０２８５】
成熟ＨＳＶビリオンは、１５２ｋｂの直鎖二本鎖ＤＮＡ分子からなるウイルスゲノムを有するエンベロープ正二十面体カプシドから構成されている。一実施形態では、ＨＳＶベースのウイルスベクターは、１つまたは複数の必須ＨＳＶ遺伝子または非必須ＨＳＶ遺伝子を欠損している。一実施形態では、ＨＳＶベースのウイルスベクターは複製欠損性である。複製欠損ＨＳＶベクターのほとんどは、１つまたは複数の中間初期、初期、または後期のＨＳＶ遺伝子を排除する欠失を備えており、複製を妨げている。例えば、ＨＳＶベクターは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される最初期遺伝子が欠失している場合がある。ＨＳＶベクターの利点は、長期ＤＮＡ発現をもたらすことができる潜伏段階に進めることができること、及び最大２５ｋｂの外因性ＤＮＡインサートを組み込むことができる大型ウイルスＤＮＡゲノムであることである。ＨＳＶベースのベクターについては、例えば、米国特許第５，８３７，５３２号、同第５，８４６，７８２号、及び同第５，８０４，４１３号、ならびに国際公開第９１／０２７８８号、同第９６／０４３９４号、同第９８／１５６３７号、及び同第９９／０６５８３号に記載されており、これらの特許文献の各々はその全体が参照により本明細書に援用される。
【０２８６】
Ｆ．遺伝子改変細胞
種々の実施形態では、本明細書で考察されているＣＡＲを発現するように遺伝子改変された細胞であって、癌の治療に使用する細胞が提供されている。「遺伝子操作」または「遺伝子改変」という用語は、本明細書で使用する場合、ＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態の別の遺伝子材料を、細胞の全遺伝子材料に付加することを意味する。「遺伝子改変細胞」、「改変細胞」、及び「リダイレクト細胞」という用語は交換可能に使用される。用語「遺伝子療法」は、本明細書で使用する場合、ＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態の別の遺伝子材料を細胞の全遺伝子材料に導入し、遺伝子の発現を回復するか、修復するか、もしくは改変するか、または治療用ポリペプチド、例えばＣＡＲを発現させることを意味する。
【０２８７】
特定の実施形態では、本明細書で考察されている抗ＣＤ７９ＡＣＡＲを免疫エフェクター細胞に導入しかつ発現させて、目的の標的抗原、例えばＣＤ７９Ａポリペプチドに対する特異性をリダイレクトさせている。「免疫エフェクター細胞」は、１つまたは複数のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞の殺傷活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣ及び／またはＣＤＣの誘導）を持つ免疫系の任意の細胞である。本明細書で考察されている免疫エフェクター細胞の例はＴリンパ球であり、以下に限定されないが、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＴＩＬ、及びヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ、ＣＤ４＋Ｔ細胞）などがある。特定の実施形態では、細胞はαβＴ細胞を含む。特定の実施形態では、細胞はγδＴ細胞を含む。一実施形態では、免疫エフェクター細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。一実施形態では、免疫エフェクター細胞はナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む。
【０２８８】
免疫エフェクター細胞は、自家性／自律性（「自己」）であっても、非自家性（「非自己」、例えば同種、同系、または異種）であってもよい。「自家」は、本明細書で使用する場合、同一対象由来の細胞を意味する。「同種」は、本明細書で使用する場合、対照の細胞に対して遺伝学的に異なる同一種類の細胞を意味する。「同系」は、本明細書で使用する場合、対照の細胞に対して遺伝学的に同一である異なる対象の細胞を意味する。「異種」は、本明細書で使用する場合、対照の細胞に対して異なる種類の細胞を意味する。好ましい実施形態では、細胞は同種である。
【０２８９】
特定の実施形態で考察されている抗ＣＤ７９ＡＣＡＲと共に用いられる免疫エフェクター細胞の例には、Ｔリンパ球が含まれる。「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は、当該技術分野で認知されており、胸腺細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含むことを意図するものである。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であってもよい。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ、ＣＤ４＋Ｔ細胞）ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞、または任意の他のＴ細胞サブセットであってもよい。特定の実施形態で使用するのに適したＴ細胞の他の例として、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）、Ｔメモリー幹細胞（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）、及びエフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）が挙げられる。
【０２９０】
当業者に理解されるように、免疫エフェクター細胞として、本明細書で考察されている抗ＣＤ７９ＡＣＡＲと共に他の細胞を用いることもできる。特に、免疫エフェクター細胞には、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、及びマクロファージも含まれる。また、免疫エフェクター細胞には、エフェクター細胞の前駆体も含まれ、こうした前駆体細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫エフェクター細胞に分化するように誘導され得る。したがって、特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞には、臍帯血、骨髄、または動員末梢血液由来のＣＤ３４＋細胞群に含まれる造血幹細胞（ＨＳＣ）などの免疫エフェクター細胞の前駆体が含まれ、対象に投与すると成熟免疫エフェクター細胞に分化するか、または成熟免疫エフェクター細胞に分化するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導され得る。
ＣＤ７９Ａ特異的ＣＡＲを含むように遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、本明細書で使用する場合、「ＣＤ７９Ａ特異性リダイレクト免疫エフェクター細胞」と称されることがある。
【０２９１】
用語「ＣＤ３４＋細胞」は、本明細書で使用する場合、ＣＤ３４タンパク質を細胞表面で発現する細胞を意味する。「ＣＤ３４」は、本明細書で使用する場合、一般的に細胞間接着因子として作用し、かつＴ細胞がリンパ節に入ることに関与する、細胞表面糖タンパク質（例えば、シアロムチンタンパク質）を意味する。ＣＤ３４＋細胞群は、造血幹細胞（ＨＳＣ）を含み、患者に投与すると分化するものであり、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、及び単球／マクロファージ系の細胞などの全造血系に関わっている。
【０２９２】
本明細書で考察されている抗ＣＤ７９ＡＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞の作製方法については、特定の実施形態に記載されている。一実施形態では、該方法には、個体から単離した免疫エフェクター細胞をトランスフェクトするか、または形質導入することで、免疫エフェクター細胞に、本明細書で考察されている１つまたは複数の抗ＣＤ７９ＡＣＡＲを発現させることが含まれる。特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は個体から単離され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでさらに操作をすることなく遺伝子改変される。こうした細胞を、個体に直接再投与することができる。さらなる実施形態では、免疫エフェクター細胞をまず活性化かつ刺激し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖してから、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲを発現するように遺伝子改変する。この点に関して、免疫エフェクター細胞を、遺伝子改変する（すなわち、本明細書で考察されている抗ＣＤ７９ＡＣＡＲを発現するように形質導入またはトランスフェクトする）前及び／または遺伝子改変した後に培養することができる。
【０２９３】
特定の実施形態では、本明細書に記載の免疫エフェクター細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作または遺伝子改変する前に、細胞の採取源を対象から得る。特定の実施形態では、ＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞はＴ細胞を含む。
【０２９４】
特定の実施形態では、ＰＢＭＣは、本明細書で考察されている方法を用いて、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲを発現するように直接遺伝子改変されてもよい。ある実施形態では、ＰＢＭＣを単離した後に、Ｔリンパ球をさらに単離している。また、ある実施形態では、遺伝子改変及び／もしくは増殖の前または後のいずれかに、細胞傷害性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ球とを、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、及びエフェクターＴ細胞の亜群に分類することができる。
【０２９５】
Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞を、既知の方法を用いて単離した後に遺伝子改変することができるか、または、遺伝子改変する前に、免疫エフェクター細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化かつ増殖（または、前駆体の場合には分化）することができる。特定の実施形態では、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞を、本明細書で考察されているキメラ抗原受容体を用いて遺伝子改変し（例えば、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲをコードする核酸を含むウイルスベクターで形質導入し）、続いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化かつ増殖する。種々の実施形態では、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、及び米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載されている方法を用いて、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変する前または遺伝子改変した後に、Ｔ細胞を活性化及び増殖してもよい。
【０２９６】
一実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、本明細書で考察されている核酸構築物を用いて形質導入される。特定の実施形態では、形質導入されたＣＤ３４＋細胞は、対象に、通例では単離した細胞を採取した対象に投与された後、ｉｎ  ｖｉｖｏで成熟免疫エフェクター細胞に分化する。別の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、本明細書に記載されているように、ＣＡＲに曝露される前、またはＣＡＲで遺伝子改変された後に、以下のサイトカインである、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬＴ３）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、巨核球増殖分化因子（ＴＰＯ）、ＩＬ−３、及びＩＬ−６のうちの１つまたは複数を用いて、前述した方法に従ってｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激されてもよい（Asheuer  et  al.,  2004;  Imren,  et  al.,  2004）。
【０２９７】
特定の実施形態では、癌の治療のための改変した免疫エフェクター細胞群には、本明細書で考察されているＣＡＲが含まれる。例えば、改変した免疫エフェクター細胞群は、本明細書に記載のＢ細胞悪性腫瘍を有すると診断された患者（自家ドナー）から得た末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から調製される。ＰＢＭＣは、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＣＤ４＋及びＣＤ８＋となり得るＴリンパ球の不均一な群を形成している。
【０２９８】
ＰＢＭＣは、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞などの他の細胞傷害性リンパ球も含む場合がある。特定の実施形態で考察されているＣＡＲのコード配列を持つ発現ベクターを、ヒトドナーＴ細胞群、ＮＫ細胞群、またはＮＫＴ細胞群に導入する。特定の実施形態では、発現ベクターを持つ形質導入Ｔ細胞を、フローサイトメトリーを用いて分類して、ＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離することができ、続いてさらに増殖して、ＣＡＲタンパク質発現Ｔ細胞の数を増やすことができ、また抗ＣＤ３抗体及び／もしくは抗ＣＤ２８抗体ならびにＩＬ−２、または本明細書のいずれかに記載の当該技術分野で公知の任意の方法を用いて細胞活性化を増強することができる。ＣＡＲタンパク質Ｔ細胞を発現するＴ細胞を、保管用及び／またはヒト対象に使用するための調製用として、標準的な手順を用いて凍結保存する。一実施形態では、Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入、培養、及び／または増殖を、ウシ胎仔血清及びウシ胎児血清などの非ヒト動物由来産物を用いずに行う。ＰＢＭＣの不均一な群が遺伝子改変されるため、得られる形質導入された細胞は、本明細書で考察されている抗ＣＤ７９ＡＣＡＲを含む改変細胞の不均一な群となる。
【０２９９】
さらなる実施形態では、種々（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上）の異なる発現ベクターの混合物を、免疫エフェクター細胞のドナー群を遺伝子改変するのに用いることができ、各ベクターは、本明細書で考察されている種々のキメラ抗原受容体タンパク質をコードする。得られた改変免疫エフェクター細胞は、２つ以上の異なるＣＡＲタンパク質を発現する改変細胞群により改変細胞の混合群を形成している。
【０３００】
Ｇ．Ｔ細胞製造方法
種々の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞を、ＣＤ３ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤と、Ｔ細胞の表面で共刺激分子を刺激するリガンドとを接触させることにより増殖させる。
【０３０１】
特定の実施形態では、ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞を、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及び／またはＩＬ−１５などの適切なサイトカインを含む培地において、溶解性の抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、またはビーズもしくは他の表面に結合した抗体などの刺激性薬剤及び共刺激性薬剤と接触させる。
【０３０２】
特定の実施形態では、ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞を、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及び／もしくはＩＬ−１５などの適切なサイトカイン、ならびに／またはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ細胞シグナル伝達経路を調節する１つもしくは複数の薬剤を含む培地において、溶解性の抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、またはビーズもしくは他の表面に結合した抗体などの刺激性薬剤及び共刺激性薬剤と接触させる。
【０３０３】
好ましい実施形態では、本明細書で考察されている方法で製造されたＴ細胞は、改良された養子免疫療法組成物を提供する。いかなる特定の理論に束縛されることも望まないが、本明細書で考察されている特定の実施形態の方法で製造されたＴ細胞組成物は、生存率の増加、相対的に分化しない傾向の増加、及びｉｎ  ｖｉｖｏでの持続性などの優れた特性を持つと考えられる。一実施形態では、Ｔ細胞の製造方法には、Ｔ細胞と、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を調節する１つまたは複数の薬剤とを接触させることを含む。一実施形態では、Ｔ細胞の製造方法には、Ｔ細胞と、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ細胞シグナル伝達経路を調節する１つまたは複数の薬剤とを接触させることを含む。種々の実施形態では、Ｔ細胞は任意の供給源から得ることができ、製造プロセスの活性化段階及び／または増殖段階の間に薬剤と接触させることができる。得られたＴ細胞組成物は、以下のバイオマーカーであるＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ＣＤ３８、及びＣＤ８のうちの１つまたは複数を増殖かつ発現することができる発生的に強力なＴ細胞に富む。一実施形態では、１つまたは複数のＰＩ３Ｋ阻害剤で処理されたＴ細胞を含む細胞群には、以下のバイオマーカーである、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８のうちの１つもしくは複数、または全てを共発現するＣＤ８＋Ｔ細胞群が多く含まれている。
【０３０４】
一実施形態では、１つまたは複数のＰＩ３Ｋ阻害剤で処理されたＴ細胞を含む細胞群には、以下のバイオマーカーである、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８のうちの１つもしくは複数、または全てを共発現するＣＤ８＋Ｔ細胞群が多く含まれている。
【０３０５】
一実施形態では、増殖レベルを保持し、かつ分化を減少させた改変Ｔ細胞を製造している。特定の実施形態では、１つまたは複数の刺激性シグナルとＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の阻害剤である薬剤との存在下で活性化しかつ増殖するようにＴ細胞を刺激することによって、Ｔ細胞を製造する。
【０３０６】
続いて、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲを発現するようにＴ細胞を改変することができる。一実施形態では、本明細書で考察されている抗ＣＤ７９ＡＣＡＲを含むウイルスベクターでＴ細胞を形質導入することにより、Ｔ細胞を改変する。特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の阻害剤の存在下で刺激及び活性化する前に、Ｔ細胞を改変する。別の実施形態では、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の阻害剤の存在下で刺激及び活性化した後に、Ｔ細胞を改変する。特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の阻害剤の存在下で刺激及び活性化してから１２時間、２４時間、３６時間、または４８時間以内に、Ｔ細胞を改変する。
【０３０７】
Ｔ細胞を活性化させた後に、細胞を培養して増殖する。Ｔ細胞は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、もしくは１０回、またはそれ以上の増殖サイクルで、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、もしくは７日間、少なくとも２週間、少なくとも１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、もしくは６カ月間、またはそれ以上の間、培養することができる。
【０３０８】
種々の実施形態では、Ｔ細胞組成物を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ細胞シグナル伝達経路の１つまたは複数の阻害剤の存在下で製造する。阻害剤は、該経路において１つまたは複数の活性を標的にしても、単一の活性を標的にしてもよい。いかなる特定の理論に束縛されることも望まないが、製造プロセスの刺激段階、活性化段階、及び／または増殖段階の間に、ＰＩ３Ｋ経路の１つまたは複数の阻害剤で処理するか、または該阻害剤とＴ細胞を接触させることにより、優先的に幼若Ｔ細胞が増え、優れた治療用Ｔ細胞組成物が得られると考えられる。
【０３０９】
特定の実施形態では、操作されたＴ細胞受容体を発現するＴ細胞の増殖を増やす方法が提供されている。こうした方法には、例えば、対象由来のＴ細胞の供給源を採取することと、ＰＩ３Ｋ経路の１つまたは複数の阻害剤がある状態でＴ細胞を刺激かつ活性化することと、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲを発現するようにＴ細胞を改変することと、Ｔ細胞を培養液中で増殖させることとが含まれ得る。
【０３１０】
特定の実施形態では、以下のバイオマーカーである、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ＣＤ３８、及びＣＤ８のうちの１つまたは複数を発現させるために濃縮されたＴ細胞群を産生する方法が考察されている。一実施形態では、幼若Ｔ細胞には、バイオマーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８のうちの１つもしくは複数、または全てが含まれる。
【０３１１】
一実施形態では、幼若Ｔ細胞には、バイオマーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８のうちの１つもしくは複数、または全てが含まれる。
【０３１２】
一実施形態では、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３を発現しない幼若Ｔ細胞が提供されている。本明細書のいずれかで論じているように、幼若Ｔ細胞バイオマーカーの発現レベルは、より分化したＴ細胞または免疫エフェクター細胞群のバイオマーカーの発現レベルと相関する。
【０３１３】
一実施形態では、本明細書で考察されているＴ細胞製造方法において、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をＴ細胞の供給源として用いる。ＰＢＭＣは、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＣＤ４＋及びＣＤ８＋となり得るＴリンパ球の不均一な群を形成し、単球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫＴ細胞などの他の単核細胞を含み得る。特定の実施形態で考察されている操作されたＴＣＲまたはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、ヒトドナーＴ細胞群、ＮＫ細胞群、またはＮＫＴ細胞群に導入する。特定の実施形態では、発現ベクターを持つ形質導入Ｔ細胞を、フローサイトメトリーを用いて分類して、ＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離することができ、続いてさらに増殖して改変Ｔ細胞の数を増やすことができ、また抗ＣＤ３抗体及び／または抗ＣＤ２８抗体、ならびにＩＬ−２、ＩＬ−７及び／またはＩＬ−１５により細胞活性化を増強することができる。
【０３１４】
本明細書で考察されている製造方法には、ヒト対象に使用するための保管用及び／または調製用の改変Ｔ細胞の凍結保存法も含まれ得る。一実施形態では、ＣＤ７９Ａ発現細胞を標的にする、遺伝子改変マウスＣＡＲタンパク質、ヒトＣＡＲタンパク質、またはヒト化ＣＡＲタンパク質を発現する免疫エフェクター細胞を保存する方法には、免疫エフェクター細胞を、解凍時に生存したままになるように凍結保存することが含まれる。ＣＡＲタンパク質を発現する免疫エフェクター細胞の画分を、当該技術分野で公知の方法により冷凍保存して、ＣＤ７９Ａ発現癌細胞を持つ患者の将来の治療用としての細胞の継続的な供給源とすることができる。Ｔ細胞は、解凍時に生存したままになるように凍結保存される。必要な場合には、凍結保存された形質転換免疫エフェクター細胞を増やすために、解凍、成長、及び増殖させることができる。「凍結保存」は、本明細書で使用する場合、例えば（通例）７７Ｋ、すなわち−１９６℃氷点下温度（液体窒素の沸点）まで冷却することによる細胞の保存を意味する。保存した細胞が、低温度で凍結されたり、室温まで温度上昇したりすることによって損傷するのを防ぐために、氷点下温度では凍結保護剤を用いることが多い。凍結保護剤及び最適な冷却速度により、細胞損傷から保護することができる。使用できる凍結保護剤として、以下に限定されないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Lovelock  and  Bishop,  Nature,  1959;  183:  1394-1395、Ashwood-Smith,  Nature,  1961;  190:  1204-1205）、グリセロール、ポリビニルピロリジン（Rinfret,  Ann.  N.Y.  Acad.  Sci.,  1960;  85:  576）、及びポリエチレングリコール（Sloviter  and  Ravdin,  Nature,  1962;  196:  48）が挙げられる。好ましい冷却速度は、１℃／分〜３℃／分である。少なくとも２時間後に、Ｔ細胞は−８０℃まで達し、長期保存用として、例えば長期低温保存容器に入った液体窒素（−１９６℃）内に直接入れることができる。
【０３１５】
１．Ｔ細胞
改良されたＣＡＲ−Ｔ細胞組成物の製造については、特定の実施形態に記載されている。ＣＡＲ−Ｔ細胞産生用に用いるＴ細胞は、自家性／自律性（「自己」）であっても、非自家性（「非自己」、例えば同種、同系、または異種）であってもよい。好ましい実施形態では、Ｔ細胞を哺乳動物対象から得る。さらに好ましい実施形態では、Ｔ細胞を霊長類対象から得る。最も好ましい実施形態では、Ｔ細胞をヒト対象から得る。
【０３１６】
Ｔ細胞を種々の供給源から得ることができるが、供給源の例として、以下に限定されないが、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍が挙げられる。特定の実施形態では、当業者に知られた任意の様々な技術、例えば、沈降法、例としてFICOLL（商標）分離などを用いて、対象より採取した血液単位からＴ細胞を得ることができる。一実施形態では、個体の循環血液由来の細胞を、アフェレーシス法によって得る。アフェレーシス産物は通例、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板などのリンパ球を含有する。一実施形態では、アフェレーシス法により採取した細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、続いて処理するために細胞を適正な緩衝液または培地に入れることができる。細胞をＰＢＳで洗浄するか、またはカルシウムやマグネシウム、及び二価カチオンをほとんど含まない他の適正な溶液で洗浄することができる。当業者によって認識されるように、洗浄工程は、半自動式のフロースルー遠心分離を用いるなど、当該技術分野で公知の方法により行うことができる。例えば、Cobe  2991細胞処理装置、Baxter  CytoMateなどがある。洗浄した後に、種々の生体適合性緩衝液、または緩衝液を含有するもしくは含有しない他の生理食塩水に細胞を再懸濁することができる。特定の実施形態では、アフェレーシス試料の中の好ましくない成分を、細胞を直接再懸濁した培地において除去することができる。
【０３１７】
特定の実施形態では、Ｔ細胞を含む細胞群、例えばＰＢＭＣを、本明細書で考察されている製造方法で用いる。他の実施形態では、Ｔ細胞の単離した群または精製した群を、本明細書で考察されている製造方法で用いる。例えば、PERCOLL（商標）勾配による遠心分離を用いて、赤血球を溶解しかつ単球を枯渇させることにより、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から細胞を単離することができる。ある実施形態では、ＰＢＭＣを単離した後、活性化、増殖、及び／もしくは遺伝子改変前または後のいずれかに、細胞傷害性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ球とを、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、及びエフェクターＴ細胞の亜群に分類することができる。
【０３１８】
特定の実施形態では、Ｔ細胞を含む細胞群、例えばＰＢＭＣを、本明細書で考察されている製造方法で用いる。他の実施形態では、Ｔ細胞の単離した群または精製した群を、本明細書で考察されている製造方法で用いる。例えば、PERCOLL（商標）勾配による遠心分離を用いて、赤血球を溶解しかつ単球を枯渇させることにより、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から細胞を単離することができる。ある実施形態では、ＰＢＭＣを単離した後、活性化、増殖、及び／もしくは遺伝子改変前または後のいずれかに、細胞傷害性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ球とを、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、及びエフェクターＴ細胞の亜群に分類することができる。
【０３１９】
特定の実施形態では、本明細書に考察されている方法を用いてＣＡＲを発現するように遺伝子改変されているが、正の選択も負の選択も受けていないＰＢＭＣから、免疫エフェクター細胞群を製造する。ある実施形態では、ＰＢＭＣを単離した後に、Ｔリンパ球をさらに単離する。また、ある実施形態では、遺伝子改変及び／または増殖の前または後のいずれかに、細胞傷害性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ球とを、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、及びエフェクターＴ細胞の亜群に分類することができる。
【０３２０】
特定の実施形態では、以下のマーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２、ＣＤ１２７、及びＨＬＡ−ＤＲのうちの１つまたは複数を発現するＴ細胞の特定の亜集団を、正の選択技術または負の選択技術によりさらに単離することができる。一実施形態では、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、及びＣＤ１９７、ｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８、またはｉｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを発現するＴ細胞の特定の亜集団を、正の選択技術または負の選択技術によりさらに単離する。種々の実施形態では、製造されるＴ細胞組成物は、以下のマーカーＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３のうちの１つまたは複数を発現しないか、または実質的に発現しない。
【０３２１】
一実施形態では、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８、またはｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８からなる群から選択されるマーカーのうちの１つまたは複数の発現が、ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いずに活性化かつ増殖されたＴ細胞群に比べて、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、またはそれ以上増加する。一実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。
【０３２２】
一実施形態では、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３からなる群から選択されるマーカーのうちの１つまたは複数の発現が、ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いて活性化かつ増殖されたＴ細胞群に比べて、少なくとも１／１．５、少なくとも１／２、少なくとも１／３、少なくとも１／４、少なくとも１／５、少なくとも１／６、少なくとも１／７、少なくとも１／８、少なくとも１／９、少なくとも１／１０、少なくとも１／２５、またはそれ以上に減少する。一実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。
【０３２３】
一実施形態では、本明細書で考察されている製造方法により、ナイーブＴ細胞または発生的に強力なＴ細胞の１つまたは複数のマーカーを含むＣＡＲ−Ｔ細胞の数が増加する。いかなる特定の理論に束縛されることも望まないが、本発明者らは、Ｔ細胞を含む細胞群を１つまたは複数のＰＩ３Ｋ阻害剤で処理することにより、発生的に強力なＴ細胞の増殖が増え、現行のＣＡＲ−Ｔ細胞療法に比べて、よりロバストで効果的な養子ＣＡＲ−Ｔ細胞免疫療法がもたらされると考えている。
【０３２４】
特定の実施形態で考察されている方法を用いて製造したＴ細胞における、増加したナイーブＴ細胞または発生的に強力なＴ細胞のマーカーの具体例として、以下に限定されないが、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８、またはｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８が挙げられる。特定の実施形態では、ナイーブＴ細胞は、以下のマーカーＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３のうちの１つまたは複数を発現しないか、または実質的に発現しない。
【０３２５】
Ｔ細胞に関して、本明細書で考察されている様々な増殖方法で得られたＴ細胞群は、使用する状況によっては、特定の様々な表現型特性を持つことがある。種々の実施形態では、増殖したＴ細胞群には、以下の表現型マーカーであるＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ＣＤ３８、ＣＤ８、及びＨＬＡ−ＤＲのうちの１つまたは複数が含まれる。
【０３２６】
一実施形態において、こうした表現型マーカーでは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８のうちの１つもしくは複数、または全ての発現が増強されている。特定の実施形態では、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８を含めたナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられる、ＣＤ８＋Ｔリンパ球を増殖する。
【０３２７】
一実施形態において、こうした表現型マーカーでは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８のうちの１つもしくは複数、または全ての発現が増強されている。特定の実施形態では、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８を含めたナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられる、ＣＤ８＋Ｔリンパ球を増殖する。
【０３２８】
特定の実施形態では、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８を含むセントラルメモリーＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられ、かつグランザイムＢに対して陰性である、Ｔ細胞を増殖する。ある実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞はＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞、ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０３２９】
特定の実施形態では、ＣＤ６２Ｌを含むナイーブＣＤ４＋細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられ、かつＣＤ４５ＲＡ及び／またはＣＤ４５ＲＯの発現に対して陰性である、ＣＤ４＋Ｔリンパ球を増殖する。ある実施形態では、ＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌを含むセントラルメモリーＣＤ４＋細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられ、かつＣＤ４５ＲＯ陽性である。ある実施形態では、エフェクターＣＤ４＋細胞はＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陰性である。
【０３３０】
特定の実施形態では、Ｔ細胞は、個体から単離され、活性化かつ刺激されて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖してから、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲを発現するように遺伝子改変される。この点に関して、Ｔ細胞を、遺伝子改変する（すなわち、本明細書で考察されている抗ＣＤ７９ＡＣＡＲを発現するように形質導入またはトランスフェクトする）前及び／または遺伝子改変した後に培養することができる。
【０３３１】
２．活性化及び増殖
Ｔ細胞組成物の十分な治療用量を得るために、多くの場合、Ｔ細胞に１回または複数回のサイクルの刺激、活性化、及び／または増殖を受けさせる。一般的に以下の文献に記載された方法を用いて、Ｔ細胞を活性化及び増殖することができ、例えば、該方法は、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、及び同第６，８６７，０４１号に記載されており、これらの特許の各々はその全体が参照により本明細書に援用される。抗ＣＤ７９ＡＣＡＲを発現するように改変されるＴ細胞を、Ｔ細胞を改変する前及び／または改変した後に活性化及び／または増殖することができる。さらに、Ｔ細胞を、活性化及び／または増殖の前か、その間か、及び／またはその後に、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ細胞シグナル伝達経路を調節する１つまたは複数の薬剤と接触させてもよい。一実施形態では、本明細書で考察されている方法で製造されたＴ細胞を、１回、２回、３回、４回、もしくは５回、またはそれ以上のサイクルで活性化及び増殖し、そのサイクルの各々がＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ細胞シグナル伝達経路を調節する１つまたは複数の薬剤を含んでいてもよい。
【０３３２】
人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、天然のＡＰＣを使用する場合と異なり、外因性サイトカインの添加を必要とすることなく、機能的ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ成長と長期増殖とを維持させる。特定の実施形態では、ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞を、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及び／またはＩＬ−１５などの適切なサイトカインを含む培地において、通例ビーズまたは他の表面に結合した抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体などの刺激性薬剤及び共刺激性薬剤と接触させる。
【０３３３】
他の実施形態では、人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）は、種々の共刺激分子及びサイトカインの安定性の高い発現及び分泌を誘導するように、Ｋ５６２細胞、Ｕ９３７細胞、７２１．２２１細胞、Ｔ２細胞、及びＣ１Ｒ細胞を操作することによって作製されている。特定の実施形態では、Ｋ３２またはＵ３２のａＡＰＣを用いて、ａＡＰＣ細胞表面における１つまたは複数の抗体ベースの刺激性分子の提示を誘導する。ＣＤ１３７Ｌ（４−１ＢＢＬ）、ＣＤ１３４Ｌ（ＯＸ４０Ｌ）、及び／またはＣＤ８０もしくはＣＤ８６を含むがこれらに限定されない種々の共刺激分子を発現するａＡＰＣにより、Ｔ細胞群を増殖することができる。ａＡＰＣは、遺伝子改変Ｔ細胞を増殖し、かつＣＤ８＋Ｔ細胞でのＣＤ２８発現を保持する、効果的なプラットフォームを提供するものである。国際公開第０３／０５７１７１号、米国特許出願公開第２００３／０１４７８６９号に記載されているａＡＰＣについて、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０３３４】
一実施形態では、共刺激リガンドは、Ｔ細胞の同種共刺激分子に特異的に結合する抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）に提示され、それにより、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって付与される一次シグナルに加えて、所望のＴ細胞応答を媒介するシグナルを付与する。適切な共刺激リガンドには、以下に限定されないが、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４と、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体と、Ｂ７−Ｈ３に特異的に結合するリガンドとが挙げられる。
【０３３５】
特定の実施形態では、共刺激リガンドは、Ｔ細胞に提示される共刺激分子に特異的結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、以下に限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３と、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンドとを含む。
【０３３６】
適切な共刺激リガンドは、標的抗原をさらに含み、該抗原は、可溶型であってもよく、または改変Ｔ細胞で発現した改変ＴＣＲまたはＣＡＲを結合させるＡＰＣもしくはａＡＰＣで発現されてもよい。
【０３３７】
種々の実施形態では、本明細書で考察されているＴ細胞の製造方法には、Ｔ細胞を含む細胞群を活性化し、Ｔ細胞群を増殖させることを含む。Ｔ細胞のＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介して、またはＣＤ２表面タンパク質の刺激を介して、一次刺激シグナルを与えることにより、かつ例えばＣＤ２８などのアクセサリー分子を介して二次共刺激シグナルを与えることにより、Ｔ細胞を活性化することができる。
【０３３８】
Ｔ細胞と、適切なＣＤ３結合剤、例えば、ＣＤ３リガンドまたは抗ＣＤ３モノクローナル抗体などとを接触させることにより、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激することができる。ＣＤ３抗体の具体例として、以下に限定されないが、ＯＫＴ３、Ｇ１９−４、ＢＣ３、及び６４．１が挙げられる。
【０３３９】
別の実施形態では、ＣＤ２結合剤を用いて、一次刺激シグナルをＴ細胞に付与することができる。ＣＤ２結合剤の具体例として、以下に限定されないが、ＣＤ２リガンド及び抗ＣＤ２抗体が挙げられ、例えば、Ｔ１１．１抗体と組み合わせたＴ１１．３抗体またはＴ１１．２抗体と組み合わせたＴ１１．３抗体（Meuer,  S.  C.  et  al.  (1984)  Cell  36:897-906）、及び９−１抗体と組み合わせた９．６抗体（ＴＩ  １．１と同じエピトープを認識するもの）（Yang,  S.  Y.  et  al.  (1986)  J.  Immunol.  137:1097-1100）が挙げられる。上述した抗体のいずれかと同じエピトープに結合する他の抗体を使用することもできる。さらなる抗体または抗体の組み合わせを調製し、本明細書のいずれかに記載の標準的な方法により同定することができる。
【０３４０】
Ｔ細胞応答の誘導には、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介してまたはＣＤ２を介して付与される一次刺激シグナルに加えて、第２の共刺激シグナルが必要になる。特定の実施形態では、ＣＤ２８結合剤を用いて、共刺激シグナルを付与することができる。ＣＤ２８結合剤の具体例として、以下に限定されないが、天然ＣＤ２８リガンド、例えば、ＣＤ２８の天然リガンド（例として、Ｂ７−１（ＣＤ８０）及びＢ７−２（ＣＤ８６）などのタンパク質Ｂ７ファミリーのメンバー、ならびにＣＤ２８分子を架橋可能な抗ＣＤ２８モノクローナル抗体またはその断片、例えば、モノクローナル抗体９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８、ＫＯＬＴ−２、１５Ｅ８、２４８．２３．２、及びＥＸ５．３Ｄ１０など）が挙げられる。
【０３４１】
一実施形態では、一次刺激シグナルを与える分子、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介してまたはＣＤ２を介して刺激を与える分子と、共刺激分子とが、同一表面で結合している。
【０３４２】
特定の実施形態では、刺激性シグナルと共刺激シグナルとを与える結合剤を細胞表面上に局在化させる。結合剤をコードする核酸を用いて、細胞を細胞表面での発現に適した形態でトランスフェクトもしくは形質導入することにより、または結合剤を細胞表面と結合させることにより、局在化させることができる。
【０３４３】
別の実施形態では、一次刺激シグナルを与える分子、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介してまたはＣＤ２を介して刺激を与える分子と、共刺激分子とが、抗原提示細胞に提示されている。
【０３４４】
一実施形態では、一次刺激シグナルを与える分子、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介してまたはＣＤ２を介して刺激を与える分子と、共刺激分子とが、別々の表面に与えられている。
【０３４５】
特定の実施形態では、刺激性シグナルと共刺激シグナルとを与える結合剤のうちの一方が溶解性（溶液で供給されるもの）であり、他方の薬剤は１つまたは複数の表面上に供給される。
【０３４６】
特定の実施形態では、刺激性シグナルと共刺激シグナルとを与える結合剤は共に溶解形態で供給される（溶液で供給される）。
【０３４７】
種々の実施形態では、本明細書で考察されているＴ細胞の製造方法には、Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で活性化することが含まれる。
【０３４８】
特定の実施形態で考察されている方法で製造したＴ細胞組成物には、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を阻害する１つまたは複数の薬剤の存在下で活性化及び／または増殖されたＴ細胞が含まれる。抗ＣＤ７９ＡＣＡＲを発現するように改変されるＴ細胞を、Ｔ細胞を改変する前及び／または改変した後に活性化及び増殖することができる。特定の実施形態では、Ｔ細胞群を活性化し、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲを発現するように改変してから、増殖するために培養する。
【０３４９】
一実施形態において、本明細書で考察されている方法で製造されたＴ細胞では、高い増殖ポテンシャルと自己複製能とを示すマーカーを発現するが、Ｔ細胞分化のマーカーを発現しないか、または実質的に検出不可能なＴ細胞分化のマーカーしか発現しない、Ｔ細胞の数が増加する。これらのＴ細胞をロバストな方法で繰り返し活性化かつ増殖して、改良された治療用Ｔ細胞組成物を提供することができる。
【０３５０】
一実施形態では、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を阻害する１つまたは複数の薬剤の存在下で活性化かつ増殖されたＴ細胞群は、ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いずに活性化かつ増殖されたＴ細胞群に比べて、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、またはそれ以上増殖する。
【０３５１】
一実施形態では、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を阻害する１つまたは複数の薬剤の存在下で幼若Ｔ細胞が活性化かつ増殖されていることを示すマーカーの発現によって特徴付けられるＴ細胞群は、ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いずに活性化かつ増殖されたＴ細胞群に比べて、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、またはそれ以上増殖する。
【０３５２】
一実施形態では、本明細書で考察されている方法により活性化されたＴ細胞を増殖することは、Ｔ細胞を含む細胞群を、数時間（約３時間）から約７日〜約２８日の間、またはその間の任意の１時間単位の整数値で表される時間の間、培養することをさらに含む。別の実施形態では、Ｔ細胞組成物を１４日間培養することができる。特定の実施形態では、Ｔ細胞を約２１日間培養する。別の実施形態では、Ｔ細胞組成物を約２日間〜３日間培養する。また、Ｔ細胞の培養時間が６０日以上になるように、刺激／活性化／増殖の複数サイクルが望ましい場合がある。
【０３５３】
特定の実施形態では、Ｔ細胞培養に適した条件には、適正な培地（例えば、Minimal  Essential  Media、またはRPMI  Media  1640、またはX-vivo  15（Lonza製））、ならびに増殖及び生存能に必要な１つまたは複数の要素が含まれ、該要素には、以下に限定されないが、血清（例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ、及びＴＮＦ−α、または当業者に公知の細胞増殖に適した任意の他の添加剤などがある。
【０３５４】
細胞培地のさらなる具体例として、以下に限定されないが、ＲＰＭＩ１６４０、Ｃｌｉｃｋｓ、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５、及びＸ−Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが挙げられ、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンが添加されており、無血清であっても、適正な量の血清（または血漿）もしくは典型的な一連のホルモン、ならびに／またはＴ細胞を成長及び増殖させるのに十分な量のサイトカインで補充されていてもよい。
【０３５５】
Ｔ細胞を増殖させるための他の添加剤の具体例として、以下に限定されないが、界面活性剤と、ピアスマネート（piasmanate）と、ＨＥＰＥＳなどのｐＨ緩衝液と、Ｎ−アセチル化−システイン及び２−メルカプトエタノールなどの還元剤とが挙げられる。
【０３５６】
対象に注入される予定の細胞培養液の中ではなく、実験培養液の中にのみ、ペニシリン及びストレプトマイシンなどの抗生物質が含まれている。増殖を維持させるのに必要な条件下、例えば、適正な温度（例として３７℃）及び雰囲気（例として空気＋５％ＣＯ２）下で、標的細胞を保持する。
【０３５７】
３．薬剤
種々の実施形態では、Ｔ細胞とＴ細胞内のＰＩ３Ｋ経路を調節する薬剤とを接触させることを含む、未分化Ｔ細胞または発生的に強力なＴ細胞を増殖するＴ細胞の製造方法が提供されている。種々の実施形態では、Ｔ細胞とＴ細胞内のＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路を調節する薬剤とを接触させることを含む、未分化Ｔ細胞または発生的に強力なＴ細胞を増殖するＴ細胞の製造方法が提供されている。細胞を、活性化及び増殖する前、活性化及び増殖している間、または活性化及び増殖した後に接触させることができる。Ｔ細胞組成物は、実質的に分化を増やすことなく増殖の複数サイクルを可能にするのに十分なＴ細胞の能力を保持している。
【０３５８】
「調節する」、「調節因子」、もしくは「調節剤」という用語、または類似の用語は、本明細書で使用する場合、細胞シグナル伝達経路に変化をもたらす薬剤の能力があるものを意味する。調節因子は、経路成分の量、活性を増加もしくは減少させることができるか、または細胞シグナル伝達経路の所望の作用もしくは出力を増加もしくは減少させることができる。一実施形態では、調節因子は阻害剤である。別の実施形態では、調節因子は活性化剤である。
【０３５９】
用語「薬剤」は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の調節に使用される、化合物、少分子、例えば、小有機分子、核酸、ポリペプチド、またはそれらの断片、アイソフォーム、変異体、類似体、もしくは誘導体を意味する。
【０３６０】
「少分子」は、約５ｋＤ未満、約４ｋＤ未満、約３ｋＤ未満、約２ｋＤ未満、約１ｋＤ未満、または約０．５ｋＤ未満の分子量を持つ組成物を意味する。少分子には、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド、炭水化物、脂質、それらの成分、または他の有機分子もしくは無機分子が含まれていてもよい。真菌、細菌、または藻類の抽出物などの化学混合物及び／または生物学的混合物のライブラリーが当該技術分野で公知であり、任意のアッセイを用いて該ライブラリーをスクリーニングすることができる。分子ライブラリーの合成方法の例は、以下の文献に記載されている（Carell  et  al.,  1994a、Carell  et  al.,  1994b、Cho  et  al.,  1993、DeWitt  et  al.,  1993、Gallop  et  al.,  1994、Zuckermann  et  al.,  1994）。
【０３６１】
「類似体」は、小有機化合物、ヌクレオチド、タンパク質、もしくはポリペプチド、または所望の活性を有する化合物と同等もしくは同一の活性または機能を有するが、好ましい実施形態の配列または構造と同等もしくは同一の配列または構造を必ずしも備える必要はない、小有機化合物、ヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチドを意味するものである。
【０３６２】
「誘導体」は、アミノ酸残基の置換、欠失、もしくは付加の導入により改変された、親タンパク質もしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含む化合物、タンパク質、もしくはポリペプチドを意味するか、またはヌクレオチドの置換、欠失、付加、もしくは変異の導入のいずれかにより改変された核酸もしくはヌクレオチドを意味する。誘導体の核酸、ヌクレオチド、タンパク質、またはポリペプチドは、親ポリペプチドと同等または同一の機能を持つ。
【０３６３】
種々の実施形態では、ＰＩ３Ｋ経路を調節する薬剤は、ＰＩ３Ｋ経路の成分を活性化する。「活性化剤」または「アゴニスト」は、ＰＩ３Ｋの１つまたは複数の活性を活性化する分子を含むがこれに限定されない、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の分子の１つまたは複数の活性を、促進、増加、または誘導させる薬剤を意味する。
【０３６４】
種々の実施形態では、ＰＩ３Ｋ経路を調節する薬剤は、ＰＩ３Ｋ経路の成分を阻害する。「阻害剤」または「アンタゴニスト」は、ＰＩ３Ｋの１つまたは複数の活性を阻害する分子を含むがこれに限定されない、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路における分子の１つまたは複数の活性を、阻害、減少、または低減させる薬剤を意味する。一実施形態では、阻害剤は二重分子阻害剤である。特定の実施形態では、阻害剤は、同一の活性または実質的に同等な活性を持つ分子種を阻害することができる（汎阻害剤）か、または分子の活性化を特異的に阻害することができる（選択的または特異的阻害剤）。阻害は不可逆的であっても、可逆的であってもよい。
【０３６５】
一実施形態では、阻害剤のＩＣ５０は、少なくとも１ｎＭ、少なくとも２ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも５０μＭ、または少なくとも１００μＭである。ＩＣ５０は、当該技術分野で公知の任意の従来技術を用いて算出することができる。例えば、ＩＣ５０は、特定の酵素の活性を、検討中の阻害剤の濃度を変えて測定することにより算出できる。実験的に得られた酵素活性の値を、用いた阻害剤の濃度に対してプロットする。５０％の酵素活性（いかなる阻害剤も用いない場合の活性と比較した場合）を示す阻害剤の濃度を「ＩＣ５０」値とする。同様に、他の阻害濃度を、活性を適正に測定することによって定めることができる。
【０３６６】
種々の実施形態では、Ｔ細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の１つまたは複数の調節因子と、少なくとも１ｎＭ、少なくとも２ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも１００μＭ、または少なくとも１Ｍの濃度で接触させるか、処理するか、または培養する。
【０３６７】
特定の実施形態では、Ｔ細胞を、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の１つまたは複数の調節因子と、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、もしくは１０回、またはそれ以上の増殖サイクルで、少なくとも１２時間、１８時間、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、もしくは７日間、少なくとも２週間、少なくとも１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、もしくは６カ月間、またはそれ以上接触させるか、処理するか、または培養することができる。
【０３６８】
ラパマイシン経路のホスファチジル−イノシトール−３キナーゼ／Ａｋｔ／哺乳動物標的は、導管的な働きをして、成長因子シグナル伝達と、細胞の増殖、分化、代謝、及び生存とを結びつける。ＰＩ３Ｋは、高度に保存的された細胞内脂質キナーゼのファミリーである。クラスＩＡのＰＩ３Ｋは、成長因子受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）により、直接的に、またはアダプター分子のインスリン受容体基質ファミリーとの相互作用を介して、活性化される。この活性により、セリン／スレオニンキナーゼＡｋｔの制御因子であるホスファチジル−イノシトール−３，４，５−三リン酸（ＰＩＰ３）が産生する。ｍＴＯＲは、カノニカルＰＩ３Ｋ経路により２つの異なる複合体を介して作用し、それぞれの複合体は固有の活性を付与する異なる結合パートナーにより特徴付けられている。ｍＴＯＲＣ１（ＰＲＡＳ４０、ＲＡＰＴＯＲ、及びｍＬＳＴ８／ＧｂＬと複合体化したｍＴＯＲ）は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達の下流エフェクターとして作用し、成長因子シグナルとタンパク質翻訳、細胞成長、細胞増殖、及び細胞生存とをつなげる。ｍＴＯＲＣ２（ＲＩＣＴＯＲ、ｍＳＩＮ１、ＰＲＯＴＯＲ、及びｍＬＳＴ８と複合体化したｍＴＯＲ）はＡｋｔの上流活性化因子として作用する。
【０３６９】
ＰＩ３Ｋの成長因子受容体媒介活性化の際に、Ａｋｔが、プレクストリン相同ドメインとＰＩＰ３との相互作用を介して膜に漸加され、構成的活性型ホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ１（ＰＤＫ１）により活性化ループを曝露し、スレオニン３０８（Ｔｈｒ３０８）においてリン酸化する。最大限活性化させるために、Ａｋｔを、Ｃ末端疎水性モチーフのセリン４７３（Ｓｅｒ４７３）において、ｍＴＯＲＣ２によりさらにリン酸化する。また、Ａｋｔ活性の制御には、ＤＮＡ−ＰＫ及びＨＳＰが重要であることが分かっている。Ａｋｔは、ＴＳＣ２の阻害性リン酸化によりｍＴＯＲＣ１を活性化するが、ＴＳＣ２は、ＴＳＣ１と合わせて、ｍＴＯＲＣ１の正の制御因子であるＲｈｅｂＧＴＰアーゼを阻害することにより、ｍＴＯＲＣ１を負に制御するものである。ｍＴＯＲＣ１は、２つの十分明らかになっている基質であるｐ７０Ｓ６Ｋ（以下Ｓ６Ｋ１と称する）と４Ｅ−ＢＰ１とを有し、この２つはタンパク質合成を大きく制御する。したがって、ｍＴＯＲＣ１は、ＰＩ３Ｋの重要な下流エフェクターであり、成長因子シグナル伝達とタンパク質翻訳及び細胞増殖とをつなげるものである。
【０３７０】
ａ．ＰＩ３Ｋ阻害剤
用語「ＰＩ３Ｋ阻害剤」は、本明細書で使用する場合、ＰＩ３Ｋに結合し、ＰＩ３Ｋの少なくとも１つの活性を阻害する核酸、ペプチド、化合物、または小有機分子を意味する。ＰＩ３Ｋタンパク質は、３つのクラスである、クラス１のＰＩ３Ｋ、クラス２のＰＩ３Ｋ、及びクラス３のＰＩ３Ｋに分類することができる。クラス１のＰＩ３Ｋは、４つのｐ１１０触媒サブユニット（ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、及びｐ１１０γ）のうちの１つと、調節サブユニットの２つのファミリーのうちの１つとからなるヘテロダイマーとして存在する。ＰＩ３Ｋ阻害剤は、好ましくはクラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤を対象にする。一実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤の１つまたは複数のアイソフォームに対する選択性（すなわち、ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、及びｐ１１０γに対する選択性、またはｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、及びｐ１１０γのうちの１つもしくは複数に対する選択性）を示す。別の態様では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、アイソフォーム選択性を示さず、「汎ＰＩ３Ｋ阻害剤」とみなされる。一実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ触媒ドメインへの結合に対してＡＴＰと競合する。
【０３７１】
特定の実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、例えば、ＰＩ３Ｋと、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の別のタンパク質とを標的にすることができる。特定の実施形態では、ｍＴＯＲとＰＩ３Ｋとを標的にするＰＩ３Ｋ阻害剤を、ｍＴＯＲ阻害剤またはＰＩ３Ｋ阻害剤と称する場合がある。ＰＩ３Ｋのみを標的にするＰＩ３Ｋ阻害剤は、選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤と称される場合がある。一実施形態では、選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋに対して、ｍＴＯＲ及び／またはこの経路の他のタンパク質に対する該阻害剤のＩＣ５０値よりも、少なくとも１／１０、少なくとも１／２０、少なくとも１／３０、少なくとも１／５０、少なくとも１／１００、少なくとも１／１０００、またはそれ以上低い５０％阻害濃度を示す薬剤を指すものとして理解され得る。
【０３７２】
特定の実施形態では、典型的なＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＩＣ５０（活性の５０％を阻害する濃度）が約２００ｎＭ以下、好ましくは約１００ｎＭ以下、さらにより好ましくは約６０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、１００μＭ以下、５０μＭ以下、２５μＭ以下、１０μＭ以下、または１μＭ以下という値で、ＰＩ３Ｋを阻害する。一実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＩＣ５０が約２ｎＭ〜約１００ｎＭ、より好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、さらにより好ましくは約２ｎＭ〜約１５ｎＭという値でＰＩ３Ｋを阻害する。
【０３７３】
特定の実施形態で考察されているＴ細胞製造方法で使用するのに適したＰＩ３Ｋ阻害剤の具体例として、以下に限定されないが、ＢＫＭ１２０（クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤、Novartis社製）、ＸＬ１４７（クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤、Exelixis社製）、（汎ＰＩ３Ｋ阻害剤、GlaxoSmithKline社製）、及びＰＸ−８６６（クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤、ｐ１１０α、ｐ１１０β、及びｐ１１０γのアイソフォーム、Oncothyreon社製）が挙げられる。
【０３７４】
選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤の他の具体例としては、以下に限定されないが、ＢＹＬ７１９、ＧＳＫ２６３６７７１、ＴＧＸ−２２１、ＡＳ２５２４２、ＣＡＬ−１０１、ＺＳＴＫ４７４、及びＩＰＩ−１４５が挙げられる。
【０３７５】
さらに、汎ＰＩ３Ｋ阻害剤の具体例として、以下に限定されないが、ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２、ＧＳＫ１０５９６１５、ＴＧ１００７１３、及びＧＤＣ−０９４１が挙げられる。
【０３７６】
好ましい実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はＺＳＴＫ４７４である。
【０３７７】
ｂ．Ａｋｔ阻害剤
用語「Ａｋｔ阻害剤」は、本明細書で使用する場合、Ａｋｔの少なくとも１つの活性を阻害する核酸、ペプチド、化合物、または小有機分子を意味する。Ａｋｔ阻害剤は、脂質系阻害剤（例えば、Ａｋｔが形質膜に局在化することを阻止する、Ａｋｔのプレクストリン相同ドメインを標的にする阻害剤）、ＡＴＰ競合阻害剤、及びアロステリック阻害剤などのいくつかのクラスに分類することができる。一実施形態では、Ａｋｔ阻害剤は、Ａｋｔ触媒部位に結合することにより作用する。特定の実施形態では、Ａｋｔ阻害剤は、ｍＴＯＲなどの下流Ａｋｔ標的のリン酸化を阻害することにより作用する。別の実施形態では、例えば、ＡｋｔのＤＮＡ−ＰＫ活性化、ＡｋｔのＰＤＫ−１活性化、及び／またはＡｋｔのｍＴＯＲＣ２活性化を阻害することによって、Ａｋｔを活性化する入力シグナルを阻害することにより、Ａｋｔの活性を阻害する。
【０３７８】
Ａｋｔ阻害剤は、Ａｋｔの３つのアイソフォームであるＡｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３の全てを標的にすることができるが、アイソフォーム選択的であってもよく、Ａｋｔアイソフォームの１つまたは２つのみを標的にすることもできる。一実施形態では、Ａｋｔ阻害剤は、Ａｋｔと、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の別のタンパク質とを標的にすることができる。Ａｋｔのみを標的にするＡｋｔ阻害剤は、選択的Ａｋｔ阻害剤と称される場合がある。一実施形態では、選択的Ａｋｔ阻害剤は、Ａｋｔに対して、この経路の他のタンパク質に対する該阻害剤のＩＣ５０値よりも、少なくとも１／１０、少なくとも１／２０、少なくとも１／３０、少なくとも１／５０、少なくとも１／１００、少なくとも１／１０００、またはそれ以上低い５０％の阻害濃度を示す薬剤を指すものとして理解され得る。
【０３７９】
特定の実施形態では、典型的なＡｋｔ阻害剤は、ＩＣ５０（活性の５０％を阻害する濃度）が約２００ｎＭ以下、好ましくは約１００ｎＭ以下、さらにより好ましくは約６０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、１００μＭ以下、５０μＭ以下、２５μＭ以下、１０μＭ以下、または１μＭ以下という値で、Ａｋｔを阻害する。一実施形態では、Ａｋｔ阻害剤は、ＩＣ５０が約２ｎＭ〜約１００ｎＭ、より好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、さらにより好ましくは約２ｎＭ〜約１５ｎＭという値でＡｋｔを阻害する。
【０３８０】
アウリスタチン系抗体薬剤コンジュゲートと組み合わせて使用するＡｋｔ阻害剤の具体例として、例えば、ペリフォシン（Keryx社製）、ＭＫ２２０６（Merck社製）、ＶＱＤ−００２（VioQuest社製）、ＸＬ４１８（Exelixis社製）、ＧＳＫ６９０６９３、ＧＤＣ−００６８、及びＰＸ３１６（PROLX  Pharmaceuticals社製）が挙げられる。
【０３８１】
選択的Ａｋｔ１阻害剤の非限定的な例はＡ−６７４５６３である。
【０３８２】
選択的Ａｋｔ２阻害剤の非限定的な例はＣＣＴ１２８９３０である。
【０３８３】
特定の実施形態では、Ａｋｔ阻害剤は、ＡｋｔのＤＮＡ−ＰＫ活性化、ＡｋｔのＰＤＫ−１活性化、ＡｋｔのｍＴＯＲＣ２活性化、またはＡｋｔのＨＳＰ活性化を阻害する。
【０３８４】
ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤の具体例として、以下に限定されないが、ＮＵ７４４１、ＰＩ−１０３、ＮＵ７０２６、ＰＩＫ−７５、及びＰＰ−１２１が挙げられる。
【０３８５】
ｃ．ｍＴＯＲ阻害剤
「ｍＴＯＲ阻害剤」または「ｍＴＯＲを阻害する薬剤」という用語は、ｍＴＯＲタンパク質の少なくとも１つの活性、例えば、基質（例として、ｐ７０Ｓ６キナーゼ１、４Ｅ−ＢＰ１、Ａｋｔ／ＰＫＢ、及びｅＥＦ２）のうちの少なくとも１つに対するセリン／スレオニンタンパク質キナーゼ活性を阻害する核酸、ペプチド、化合物、または小有機分子を意味する。ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲＣ１、ｍＴＯＲＣ２、またはｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２の両方に直接結合し、これらを阻害することができる。
【０３８６】
ｍＴＯＲＣ１及び／またはｍＴＯＲＣ２の活性の阻害は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路のシグナル伝達の減少により測定することができる。様々な読み出し情報を用いて、シグナル伝達経路の出力の低減を明らかにすることができる。いくつかの読み出し情報の非限定的な例として、（１）残基（５４７３及びＴ３０８を含むがこれらに限定されない残基）におけるＡｋｔのリン酸化の減少、（２）Ａｋｔ基質（例えば、Ｆｏｘ０１／Ｏ３ａ  Ｔ２４／３２、ＧＳＫ３ａ／β、Ｓ２１／９、及びＴＳＣ２  Ｔ１４６２を含むがこれらに限定されない基質）のリン酸化の減少から明らかなＡｋｔの活性化低減、（３）ｍＴＯＲ下流のシグナル伝達分子（例えば、リボソームＳ６  Ｓ２４０／２４４、７０Ｓ６Ｋ  Ｔ３８９、及び４ＥＢＰ１  Ｔ３７／４６）のリン酸化の減少、ならびに（４）癌細胞の増殖の阻害が挙げられる。
【０３８７】
一実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤は活性部位阻害剤である。ｍＴＯＲのＡＴＰ結合部位（ＡＴＰ結合ポケットとも称される）に結合し、ｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２の両方の触媒活性を阻害するｍＴＯＲ阻害剤がある。特定の実施形態で考察されているＴ細胞製造方法で使用するのに適した活性部位阻害剤の１つのクラスは、ＰＩ３ＫとｍＴＯＲの両方を標的化しかつ直接阻害する二重特異性阻害剤である。二重特異性阻害剤は、ｍＴＯＲとＰＩ３Ｋの両方のＡＴＰ結合部位に結合する。こうした阻害剤の具体例として、以下に限定されないが、イミダゾキナゾリン類、ワートマニン、ＬＹ２９４００２、ＰＩ−１０３（Cayman  Chemical社製）、ＳＦ１１２６（Semafore社製）、ＢＧＴ２２６（Novartis社製）、ＸＬ７６５（Exelixis社製）、及びＮＶＰ−ＢＥＺ２３５（Novartis社製）が挙げられる。
【０３８８】
特定の実施形態で考察されている方法での使用に適したｍＴＯＲ活性部位阻害剤の別のクラスは、１つまたは複数のＩ型ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（例えば、ＰＩ３キナーゼα、β、γ、またはδ）に対するｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２の活性を、選択的に阻害する。これらの活性部位阻害剤は、ｍＴＯＲの活性部位に結合するが、ＰＩ３Ｋには結合しない。こうした阻害剤の具体例として、以下に限定されないが、ピラゾロピリミジン類、Ｔｏｒｉｎ１（Guertin  and  Sabatini）、ＰＰ２４２（２−（４−アミノ−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−５−オール）、ＰＰ３０、Ｋｕ−００６３７９４、ＷＡＹ−６００（Wyeth社製）、ＷＡＹ−６８７（Wyeth社製）、ＷＡＹ−３５４（Wyeth社製）、及びＡＺＤ８０５５（Liu  et  al.,  Nature  Review,  8,  627-644,  2009）が挙げられる。
【０３８９】
一実施形態では、選択的ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲＣ１及び／またはｍＴＯＲＣ２に対して、１種、２種、３種、もしくはそれ以上のＩ型ＰＩ３キナーゼまたはＩ型ＰＩ３キナーゼの全てに対する該阻害剤の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）よりも、少なくとも１／１０、少なくとも１／２０、少なくとも１／５０、少なくとも１／１００、少なくとも１／１０００、またはそれ以上低いＩＣ５０を示す薬剤を意味する。
【０３９０】
ｍＴＯＲ阻害剤の別のクラスは、本明細書では「ラパログ」と称されている。用語「ラパログ」は、本明細書で使用する場合、ｍＴＯＲのＦＲＢドメイン（ＦＫＢＰラパマイシン結合ドメイン）に特異的に結合し、ラパマイシンと構造的に類似し、ｍＴＯＲ阻害特性を保持する化合物を意味する。ラパログという用語は、ラパマイシンを除外している。ラパログには、ラパマイシンのエステル類、エーテル類、オキシム類、ヒドラゾン類、及びヒドロキシルアミン類と、ラパマイシンコア構造の官能基が例えば還元または酸化により修飾されている化合物とが含まれる。こうした化合物の薬学的に許容される塩は、ラパマイシン誘導体ともみなされる。特定の実施形態で考察されている方法での使用に適したラパログの具体例として、限定されるものではないが、テムシロリムス（ＣＣ１７７９）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、デフォロリムス（ＡＰ２３５７３）、ＡＺＤ８０５５（AstraZeneca社製）、及びＯＳＩ−０２７（ＯＳＩ）が挙げられる。
【０３９１】
一実施形態では、薬剤はｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシン（シロリムス）である。
【０３９２】
特定の実施形態では、典型的なｍＴＯＲ阻害剤は、ＩＣ５０（活性の５０％を阻害する濃度）が約２００ｎＭ以下、好ましくは約１００ｎＭ以下、さらにより好ましくは約６０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、１００μＭ以下、５０μＭ以下、２５μＭ以下、１０μＭ以下、または１μＭ以下という値で、ｍＴＯＲＣ１、ｍＴＯＲＣ２、またはｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２の両方を阻害する。一態様では、ｍＴＯＲ阻害剤は、ＩＣ５０が約２ｎＭ〜約１００ｎＭ、より好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、さらにより好ましくは約２ｎＭ〜約１５ｎＭという値で、ｍＴＯＲＣ１、ｍＴＯＲＣ２、またはｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２の両方を阻害する。
【０３９３】
一実施形態では、典型的なｍＴＯＲ阻害剤は、ＩＣ５０（活性の５０％を阻害する濃度）が約２００ｎＭ以下、好ましくは約１００ｎＭ以下、さらにより好ましくは約６０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、１００μＭ以下、５０μＭ以下、２５μＭ以下、１０μＭ以下、または１μＭ以下という値で、ＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲＣ１、ＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲＣ２、またはｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２の両方及びＰＩ３Ｋを阻害する。一態様では、ｍＴＯＲ阻害剤は、ＩＣ５０が約２ｎＭ〜約１００ｎＭ、より好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、さらにより好ましくは約２ｎＭ〜約１５ｎＭという値で、ＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲＣ１、ＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲＣ２、またはｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２の両方及びＰＩ３Ｋを阻害する。
【０３９４】
特定の実施形態での使用に適したｍＴＯＲ阻害剤のさらなる具体例として、以下に限定されないが、ＡＺＤ８０５５、ＩＮＫ１２８、ラパマイシン、ＰＦ−０４６９１５０２、及びエベロリムスが挙げられる。
【０３９５】
ｍＴＯＲは、ウエスタンブロットでリン酸化特異抗体を用いて測定することで、生理学的基質タンパク質であるｐ７０  Ｓ６リボソームタンパク質キナーゼＩ（ｐ７０Ｓ６Ｋ１）及びｅＩＦ４Ｅ結合タンパク質１（４ＥＢＰ１）に対して、ロバストで特異的な触媒活性を示すことが分かっている。
【０３９６】
一実施形態では、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＢＩ−Ｄ１８７０、Ｈ８９、ＰＦ−４７０８６７１、ＦＭＫ、及びＡＴ７８６７からなる群から選択されるＳ６キナーゼ阻害剤である。
【０３９７】
Ｈ．組成物及び製剤
本明細書で考察されている組成物は、本明細書に記載されているように、１つまたは複数のＣＡＲポリペプチド、ポリヌクレオチド、それらを含むベクター、遺伝子改変された免疫エフェクター細胞などを含み得る。組成物は、以下に限定されるものではないが、医薬組成物を含む。「医薬組成物」は、単体でまたは１つもしくは複数の他の治療法と組み合わせて細胞または動物に投与するための、薬学的に許容される溶液または生理学的に許容される溶液で製剤された組成物を意味する。当然のことながら必要な場合には、組成物を、他の薬剤、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、少分子、化学療法剤、プロドラッグ、薬剤、抗体、または他の様々な薬学的に活性な薬剤と組み合わせて投与することもできる。付加的な薬剤が、該組成物の持つ目的の療法を遂行する能力に悪影響を与えない場合には、該組成物に含まれ得る他の成分に対しては実質的にいかなる制限もない。
【０３９８】
本明細書で使用されている語句「薬学的に許容される」は、適切な医学的判断の範囲内であり、合理的な利益／リスク比に見合いつつ、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を引き起こさずに、ヒト及び動物の組織と接触させて使用することに適した化合物、物質、組成物、及び／または剤形を意味する。
【０３９９】
「薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤」は、本明細書で使用する場合、限定されるものではないが、任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、染料／着色剤、風味相乗剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、または乳化剤であって、ヒトまたは家畜への使用に適用可能であると米国食品医薬品局により認可されているものを含む。薬学的に許容される担体の例として、以下に限定されないが、ラクトース、グルコース、及びスクロースなどの糖類と、コーンスターチ及びジャガイモデンプンなどのデンプン類と、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体と、トラガントと、麦芽と、セラチンと、タルクと、カカオバター、ワックス、動物及び植物の脂肪、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛と、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、及び大豆油などの油類と、プロピレングリコールなどのグリコール類と、グリセリン、ソルビトール、マニトール、及びポリエチレングリコールなどのポリオール類と、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル類と、寒天と、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤と、アルギン酸と、発熱性物質を含まない水と、等張食塩水と、リンゲル液と、エチルアルコールと、リン酸緩衝液と、医薬製剤で用いられる任意の他の適合性のある物質とが挙げられる。
【０４００】
特定の実施形態では、組成物は、本明細書で考察されているＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞のある量を含む。用語「量」は、本明細書で使用する場合、有益なまたは所望の予防結果または治療結果（臨床結果を含む）が得られる、遺伝子改変された治療用細胞、例えばＴ細胞の「有効量」または「有効な量」を意味する。
【０４０１】
「予防的有効量」は、所望の予防結果を得るのに有効な、遺伝子改変された治療用細胞の量を意味する。予防用量は、疾患の初期段階の前または初期段階で対象に用いられるため、予防的有効量は治療有効量よりも少ないのが典型的であるが、必ずしもそうとは限らない。
【０４０２】
遺伝子改変された治療用細胞の「治療有効量」は、個体の疾患段階、年齢、性別、及び体重、ならびに個体における所望の応答を引き出す幹細胞及び前駆体細胞の能力などの因子によって様々になり得る。また、治療有効量は、治療に有益な作用が、ウイルスまたは形質導入された治療用細胞の及ぼすいかなる毒性作用や有害作用をも上回る状態となる量である。用語「治療有効量」には、対象（例えば、患者）を治療するのに有効な量が含まれる。治療量を決める際、投与される組成物の正確な量は、個体の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、及び患者（対象）の病態を考慮して、医師により決定され得る。本明細書に記載のＴ細胞を含む医薬組成物は、体重１ｋｇ当たり１０２個〜１０１０個、好ましくは体重１ｋｇ当たり１０５個〜１０６個、またはそれらの範囲内の全ての整数値を含む用量で投与されてもよい。細胞数は、組成物に含まれる細胞種に合わせた、組成物の主な使用法により異なる。本明細書に記載の使用の際には、細胞は通例、１リットル以下の容量であるが、５００ｍＬ以下の容量、さらには２５０ｍＬ以下または１００ｍＬ以下の容量でもよい。したがって、所望の細胞の密度は一般的に、１０６個の細胞／ｍＬよりも大きくなり、通例、１０７個の細胞／ｍＬよりも大きく、多くの場合１０８個の細胞／ｍＬ以上となる。免疫細胞の臨床的に意義ある数が複数の注入液に割り当てられるが、その数は１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１０１０個、１０１１個、または１０１２個の細胞に累積的に等しいか、またはそれを超えるものである。いくつかの態様では、全ての注入された細胞が特定の標的抗原にリダイレクトされるため、１０６個／キログラム（患者１人当たり１０６個〜１０１１個）の範囲において、比較的少数の細胞を投与してもよい。ＣＡＲ発現細胞組成物をこれらの範囲内の用量で複数回投与することができる。細胞は、療法を受けている患者と同種、同系、異種、または該患者の自家性であってもよい。必要に応じて、治療では、本明細書に記載のマイトジェン（例えば、ＰＨＡ）もしくはリンホカイン、サイトカイン、及び／またはケモカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１８、及びＴＮＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１αなど）の投与を行って、免疫応答をさらに誘導させてもよい。
【０４０３】
本明細書に記載の活性化かつ増殖した細胞を含む組成物は、免疫不全者に生じる疾患の治療及び予防に使用することができる。特定の実施形態では、本明細書で考察されているＣＡＲ改変Ｔ細胞を含む組成物を、癌の治療に使用する。ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、単体で、または担体、希釈剤、賦形剤、及び／もしくはＩＬ−２もしくは他のサイトカインもしくは細胞群などの他の成分と組み合わせた医薬組成物として投与され得る。特定の実施形態では、医薬組成物は、ある量の遺伝子改変Ｔ細胞を、１つまたは複数の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含んでいる。
【０４０４】
Ｔ細胞などのＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞群を含む医薬組成物には、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液と、グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストランなどの炭水化物と、タンパク質と、グリシンなどのポリペプチドまたはアミノ酸と、酸化防止剤と、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤と、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）と、保存剤とが含まれていてもよい。組成物は、好ましくは非経口投与用、例えば、血管内（静脈内または動脈内）投与、腹腔内投与、または筋肉内投与用に製剤化される。
【０４０５】
液体医薬組成物は、溶液であるか、懸濁液であるか、または他の形態であるかにかかわらず、注射用の水、食塩水（好ましくは生理食塩水、リンゲル溶液、等張食塩水）、固定油（溶媒または懸濁媒体として機能し得る合成モノグリセリドまたはジグリセリドなど）、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒などの無菌希釈剤と、ベンジルアルコールまたはメチルメチルパラベンなどの抗菌剤と、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤と、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤と、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝液と、塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧の調整剤と、のうちの１つまたは複数を含んでいてもよい。非経口製剤は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブルシリンジ、または多人数用バイアルに封入され得る。注射用医薬組成物は好ましくは無菌である。
【０４０６】
一実施形態では、本明細書で考察されているＴ細胞組成物は、薬学的に許容される細胞培地で製剤化される。こうした組成物は、ヒト対象への投与に適している。特定の実施形態では、薬学的に許容される細胞培地は、無血清培地である。
【０４０７】
無血清培地は、血清含有培地よりもいくつかの有利な点があり、この有利な点は、組成物が単純でかつ詳細が明らかになっており、汚染の度合いが低く、感染病原体になり得る供給源がなく、低コストであることなどである。種々の実施形態では、無血清培地は動物質を含まず、任意選択的にタンパク質を含んでいなくてもよい。任意選択的に、培地は生物薬学的に許容される組み換えタンパク質であってもよい。「動物質を含まない」培地は、組成物が非動物源由来である培地を意味する。動物質を含まない培地において、組み換えタンパク質が天然の動物タンパク質の代わりに用いられ、栄養分は合成源、植物源、または微生物源から得ている。一方、「タンパク質を含まない」培地は、タンパク質を実質的に含まないものとして定義される。
【０４０８】
特定の組成物で用いられている血清を含まない培地の具体例として、以下に限定されないが、QBSF-60（Quality  Biological社製）、StemPro-34（Life  Technologies社製）、及びX-VIVO10が挙げられる。
【０４０９】
１つの好ましい実施形態では、本明細書で考察されている免疫エフェクター細胞を含む組成物は、PlasmaLyte  Aを含む溶液で製剤化される。
【０４１０】
別の好ましい実施形態では、本明細書で考察されている免疫エフェクター細胞を含む組成物は、凍結保存培地を含む溶液で製剤化される。例えば、凍結保存剤を含む凍結保存培地を用いて、解凍後の細胞生存率を高く維持することができる。特定の組成物で用いられる凍結保存培地の具体例として、以下に限定されないが、CryoStor  CS10、CryoStor  CS5、及びCryoStor  CS2が挙げられる。  
【０４１１】
より好ましい実施形態では、本明細書で考察されている免疫エフェクター細胞を含む組成物は、５０：５０のPlasmaLyte  AとCryoStor  CS10とを含む溶液で製剤化される。
【０４１２】
特定の実施形態では、組成物は、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の有効量を、単体で、または１つもしくは複数の治療剤と組み合わせた状態で含む。したがって、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞組成物を、単体で、または他の既知の癌治療、例えば、放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光線力学療法などと組み合わせて投与することができる。組成物を、抗生物質と組み合わせて投与することもできる。こうした治療剤は、当該技術分野において、本明細書に記載の特定の病状（例えば特定の癌など）に対する標準的な治療として受け入れられている。特定の実施形態で考察されている治療剤の例として、サイトカイン、成長因子、ステロイド類、ＮＳＡＩＤｓ、ＤＭＡＲＤｓ、抗炎症剤、化学療法剤、放射線療法剤、治療用抗体、または他の活性剤及び補助剤が挙げられる。
【０４１３】
特定の実施形態では、本明細書に開示されているＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む組成物を、任意の数の化学療法剤と合わせて投与することができる。化学療法剤の具体例として、チオテパ、シクロホスファミド（CYTOXAN（商標））などのアルキル化剤と、ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなどのスルホン酸アルキルと、ベンゾドパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドパ（meturedopa）、及びウレドパ（uredopa）などのアジリジン類と、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、及びトリメチルオロメラミン（trimethylolomelamine）レジュームを含めたエチレンイミン類及びメチルアメラミン類と、クロラムブシル、クロルナファジン、クロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビシン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード類と、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソ尿素類と、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、オースラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン類、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン類、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質と、メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤と、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体類と、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体と、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジン類似体と、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン類と、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（anti-adrenal）と、フロリン酸（frolinic  acid）などの葉酸補充剤と、アセグラトンと、アルドホスファミド配糖体（aldophosphamide  glycoside）と、アミノレブリン酸と、アムサクリンと、ベストラブシル（bestrabucil）と、ビサントレン（bisantrene）と、エダトラキセート（edatraxate）と、デフォファミン（defofamine）と、デメコルチンと、ジアジコン（diaziquone）と、エルホルミチン（elformithine）と、酢酸エリプチニウム（elliptinium  acetate）と、エトグルシドと、硝酸ガリウムと、ヒドロキシウレアと、レンチナンと、ロニダミンと、���トグアゾンと、ミトキサントロンと、モピダモールと、ニトラクリンと、ペントスタチンと、フェナメット（phenamet）と、ピラルビシンと、ポドフィリン酸（podophyllinic  acid）と、２−エチルヒドラジドと、プロカルバジンと、ＰＳＫ（登録商標）と、ラゾキサンと、シゾフィランと、スピロゲルマニウムと、テヌアゾン酸と、トリアジコンと、２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミンと、ウレタンと、ビンデシンと、ダカルバジンと、マンノムスチンと、ミトブロニトールと、ミトラクトールと、ピポブロマンと、ガシトシン（gacytosine）と、アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）と、シクロホスファミドと、チオテパと、タキソイド類、例えば、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、ニュージャージー州プリンストンBristol-Myers  Squibb  Oncology,  Princeton社）及びドセタキセル（doxetaxel）（TAXOTERE（登録商標）、フランス国アントニーRhne-Poulenc  Rorer社）と、クロラムブシルと、ゲムシタビンと、６−チオグアニンと、メルカプトプリンと、メトトレキサートと、シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金類似体と、ビンブラスチンと、白金と、エトポシド（ＶＰ−１６）と、イホスファミドと、マイトマイシンＣと、ミトキサントロンと、ビンクリスチンと、ビノレルビンと、ナベルビンと、ノバントロンと、テニポシドと、ダウノマイシンと、アミノプテリンと、ゼローダと、イバンドロネートと、ＣＰＴ−１１と、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００と、ジフルオロメチルオルニチン（difluoromethylomithine）（ＤＭＦＯ）と、タルグレチン（商標）（ベキサロテン）、パンレチン（Panretin）（商標）（アリトレチノイン）などのレチノイン酸誘導体と、ONTAK（商標）（デニロイキンジフチトクス）と、エスペラミシン類と、カペシタビンと、上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体とが挙げられる。癌へのホルモン作用を制御または阻害するように機能する抗ホルモン剤がこの定義に含まれており、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、４（５）−イミダゾールを阻害するアロマターゼ、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（フェアストン）などの抗エストロゲンと、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲンと、上述のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体とがある。
【０４１４】
様々な他の治療剤を、本明細書に記載の組成物と併用して使用することができる。一実施形態では、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む組成物を、抗炎症剤と共に投与する。抗炎症性剤または薬剤として、以下に限定されないが、ステロイド類及びグルココルチコイド類（例えば、ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン酢酸エステル、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンなど）、非ステロイド性抗炎症薬剤（ＮＳＡＩＤｓ）（例えば、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ薬、シクロホスファミド、及びミコフェノール酸など）が挙げられる。
【０４１５】
他のＮＳＡＩＤｓの例は、イブプロフェンと、ナプロキセンと、ナプロキセンナトリウムと、VIOXX（登録商標）（ロフェコキシブ）及びセレブレックス（登録商標）（セレコキシブ）などのＣｏｘ−２阻害剤と、シアル化物とからなる群から選択される。鎮痛剤の例は、アセトアミノフェン、オキシコドン、塩酸プロポキシフェンのトラマドールからなる群から選択される。グルココルチコイド類の例は、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、またはプレドニゾンからなる群から選択される。生物学的応答調節剤の例として、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４、ＣＤ５など）に対する分子と、例えば、ＴＮＦアンタゴニスト（例としてエタネルセプト（ENBREL）（登録商標））、アダリムマブ（HUMIRA（登録商標））、及びインフリキシマブ（REMICADE（登録商標））などのサイトカイン阻害剤と、ケモカイン阻害剤と、接着分子阻害剤とが挙げられる。生物学的応答調節剤には、モノクローナル抗体と分子の組み換え型とが含まれる。ＤＭＡＲＤｓの例として、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、ペニシラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、Gold（経口（オーラノフィン）及び筋肉内用）、及びミノサイクリンが挙げられる。
【０４１６】
特定の実施形態で考察されているＣＡＲ改変Ｔ細胞と併用するのに適した治療用抗体の具体例として、以下に限定されないが、アテゾリズマブ、アベルマブ、バビツキシマブ、ベバシズマブ（アバスチン）、ビバツズマブ（bivatuzumab）、ブリナツモマブ、コナツムマブ、クリゾチニブ、ダラツムマブ、デュリゴツマブ（duligotumab）、ダセツズマブ、ダロツズマブ、デュルバルマブ、エロツズマブ（HuLuc63）、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、インダツキシマブ（indatuximab）、イノツズマブ、イピリムマブ、ロルボツズマブ（lorvotuzumab）、ルカツムマブ（lucatumumab）、ミラツズマブ、モキセツモマブ（moxetumomab）、ニボルマブ、オカラツズマブ（ocaratuzumab）、オファツムマブ、ペムブロリズマブ、リツキシマブ、シルツキシマブ、テプロツムマブ、及びウブリツキシマブ（ublituximab）が挙げられる。
【０４１７】
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物をサイトカインと合わせて投与する。本明細書で使用される「サイトカイン」は、一方の細胞群により放出されるタンパク質であって、他方の細胞に対して細胞間媒介物質として作用するタンパク質の一般名称を意味する。こうしたサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び一般的なポリペプチドホルモン類である。サイトカインの中には、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン類と、副甲状腺ホルモンと、チロキシンと、インスリンと、プロインスリンと、リラキシンと、プロリラキシンと、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン類と、肝成長因子と、線維芽細胞成長因子と、プロラクチンと、胎盤性ラクトゲンと、腫瘍壊死因子アルファ及び腫瘍壊死因子ベータと、ミュラー管抑制因子と、マウスゴナドトロピン関連ペプチドと、インヒビンと、アクチビンと、血管内皮成長因子と、インテグリンと、トロンボポエチン（ＴＰＯ）と、ＮＧＦベータなどの神経成長因子と、血小板成長因子と、ＴＧＦアルファ及びＴＧＦベータなどのトランスフォーミング成長因子類（ＴＧＦ）と、インスリン様成長因子Ｉ及びインスリン様成長因子ＩＩと、エリスロポエチン（ＥＰＯ）と、骨誘導因子と、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、及びインターフェロンガンマなどのインターフェロン類と、マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、及び顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）と、ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５などのインターロイキン（ＩＬ）類と、ＴＮＦアルファまたはＴＮＦベータなどの腫瘍壊死因子と、ＬＩＦ及びＫｉｔリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子とが含まれる。サイトカインという用語は、本明細書で使用する場合、天然供給源由来または組み換え細胞培養由来のタンパク質と、天然配列サイトカインの生物学的活性同等物とを含む。
【０４１８】
特定の実施形態では、組成物は、本明細書で考察されているように、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で培養され、かつ以下のマーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、及びＨＬＡ−ＤＲのうちの１つまたは複数を発現する本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞を含み、正の選択技術または負の選択技術によりさらに単離され得る。一実施形態では、組成物は、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ＣＤ３８、ならびにｉｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ１２７、及びＣＤ８からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを発現する、Ｔ細胞の特定の亜集団を含み、正の選択技術または負の選択技術によりさらに単離される。種々の実施形態では、組成物は、以下のマーカーＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３のうちの１つまたは複数を発現しないか、または実質的に発現しない。
【０４１９】
一実施形態では、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択されるマーカーのうちの１つまたは複数の発現が、ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いずに活性化かつ増殖されたＴ細胞群に比べて、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、またはそれ以上増加する。
【０４２０】
一実施形態では、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８からなる群から選択されるマーカーのうちの１つまたは複数の発現が、ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いずに活性化かつ増殖されたＴ細胞群に比べて、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、またはそれ以上増加する。
【０４２１】
一実施形態では、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３からなる群から選択されるマーカーのうちの１つまたは複数の発現が、ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いて活性化かつ増殖されたＴ細胞群に比べて、少なくとも１／１．５、少なくとも１／２、少なくとも１／３、少なくとも１／４、少なくとも１／５、少なくとも１／６、少なくとも１／７、少なくとも１／８、少なくとも１／９、少なくとも１／１０、少なくとも１／２５、またはそれ以上に減少する。
【０４２２】
Ｉ．標的細胞及び抗原
標的細胞（例えば、癌細胞）にリダイレクトされ、かつ標的細胞でＣＤ７９Ａに結合する結合ドメインを有するＣＡＲを含む、遺伝子改変免疫エフェクター細胞が、特定の実施形態で提供されている。用語「癌」は通例、本明細書で使用する場合、異常細胞が際限なく分裂し、近くの組織に入り込むことができる疾患または病態のクラスを意味する。
【０４２３】
用語「悪性」は、本明細書で使用する場合、腫瘍細胞群が、制御不能な増殖（すなわち、正常限界を上回る分裂）、浸潤（すなわち、隣接する組織への侵入及び該組織の破壊）、及び転移（すなわち、リンパまたは血液を介した体内の他の部位への拡散）のうちの１つまたは複数を示す癌を意味する。用語「転移する」は、本明細書で使用する場合、癌が身体の一部位から他の部位に広がることを意味する。広がった細胞により形成された腫瘍は、「転移腫瘍」または「転移」と称されている。転移腫瘍は、元の（一次）腫瘍の細胞と同様の細胞を含んでいる。
【０４２４】
「良性」または「非悪性」という用語は、本明細書で使用する場合、大きさは大きくなり得るが、体内の他の部位には広がることのない腫瘍を意味する。良性腫瘍は自己限定的であり、通例、浸潤も転移もしない。
【０４２５】
「癌細胞」は、癌性増殖または癌性組織の個々の細胞を意味する。癌細胞には、固形癌及び液性癌が含まれる。「腫瘍」または「腫瘍細胞」は、一般的に細胞の異常増殖により形成された腫脹または病変であって、良性、前癌性、または悪性であり得る腫脹または病変を意味する。多くの癌が腫瘍を形成するが、液体性癌、例えば白血病は、必ずしも腫瘍を形成するとは限らない。腫瘍を形成するこうした癌に関して、癌（細胞）と腫瘍（細胞）という用語は交換可能に用いられる。個体における腫瘍の量は「腫瘍量」であり、腫瘍の数、体積、または重量として測定され得るものである。
【０４２６】
用語「再発」は、改善または寛解の期間後の癌再発の診断または癌再発の症候及び兆候を意味する。
【０４２７】
「寛解」は「臨床的寛解」と称されることもあり、部分寛解と完全寛解とを含む。部分寛解では、全てではないが一部の癌の症候及び兆候がなくなっている。完全寛解では、全ての癌の症候及び兆候がなくなっているが、癌はまだ体内に残っている場合がある。
【０４２８】
「難治性」は、特定の治療剤を用いた療法に対して抵抗性のある癌であるか、または非応答性の癌を意味する。癌は、治療の初期から難治性である（すなわち、治療剤への最初の曝露に対して非応答性である）か、または最初の治療期間にわたって、もしくは後に続く治療期間の間に、治療剤への抵抗性をつけた結果として難治性となる場合がある。
【０４２９】
一実施形態では、標的細胞は、抗原、例えば他の正常（所望の）細胞表面では実質的に見られない標的抗原を発現する。
【０４３０】
一実施形態では、標的細胞は、造血細胞、リンパ球系細胞、または骨髄系細胞である。
【０４３１】
特定の実施形態では、標的細胞は、血液、リンパ組織、骨髄組織の一部である。
【０４３２】
特定の実施形態では、標的細胞は、ＣＤ７９Ａを発現する癌細胞または癌幹細胞である。
【０４３３】
特定の実施形態では、標的細胞は、ＣＤ７９Ａを発現する液性癌細胞または血液癌細胞である。
【０４３４】
特定の実施形態で考察されている組成物を用いて予防、治療、または改善され得る液性癌または血液癌の具体例として、以下に限定されないが、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫が挙げられる。
【０４３５】
特定の実施形態で考察されている抗ＣＤ７９ＡＣＡＲにより標的化され得る細胞の具体例として、以下に限定されないが、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、ヘアリーセル白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、ならびに真性多血症などの白血病の細胞が挙げられる。
【０４３６】
特定の実施形態で考察されている組成物及び方法により標的化され得る細胞の具体例として、以下に限定されないが、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫といったリンパ腫の細胞が挙げられ、非ホジキンリンパ腫には、以下に限定されないが、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫などのＢ細胞非ホジキンリンパ腫と、菌状息肉症、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、及び前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫などのＴ細胞非ホジキンリンパ腫とが含まれる。
【０４３７】
特定の実施形態で考察されている組成物及び方法により標的化され得る細胞の具体例として、以下に限定されないが、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫（ＭＧＵＳ）、形質細胞性白血病、非分泌型骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、及び髄外性形質細胞腫が挙げられる。
【０４３８】
好ましい実施形態では、ＣＤ７９Ａ発現標的細胞はＤＬＢＣＬ癌細胞である。
【０４３９】
Ｊ．治療方法
本明細書で考察されている遺伝子改変された免疫エフェクター細胞は、ＣＤ７９Ａを発現する癌の予防、治療、及び改善に使用するための、またはＣＤ７９Ａ発現癌と関連する少なくとも１つの症状を予防、治療もしくは改善するための、改良された養子免疫療法を提供するものである。
【０４４０】
また種々の実施形態では、本明細書で考察されている遺伝子改変された免疫エフェクター細胞は、対象においてＣＤ７９Ａ発現癌細胞の細胞傷害性を高めるのに使用するための、または対象においてＣＤ７９Ａ発現癌細胞の数を減じるのに使用するための、改良された養子免疫療法を提供するものである。
【０４４１】
特定の実施形態では、一次免疫エフェクター細胞を本明細書に記載のＣＡＲで遺伝子改変することにより、一次免疫エフェクター細胞の特異性を、ＣＤ７９Ａを発現する細胞、例えば癌細胞にリダイレクトする。種々の実施形態では、ウイルスベクターを用いて、ＣＤ７９Ａポリペプチドを結合させる抗ＣＤ７９Ａ抗原結合ドメインと、ヒンジドメインと、膜貫通（ＴＭ）ドメインと、該ＴＭドメインとＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインを連結する短いオリゴリンカーまたはポリペプチドリンカーと、１つまたは複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、一次シグナル伝達ドメインとを含むＣＡＲをコードする特定のポリヌクレオチドを用いて、免疫エフェクター細胞を遺伝子改変する。
【０４４２】
一実施形態では、ＣＤ７９Ａ発現癌細胞を標的化する抗ＣＤ７９ＡＣＡＲを発現するようにＴ細胞を遺伝子改変し、ＣＡＲ−Ｔ細胞を、必要とするレシピエントに注入する細胞療法の一種が提供されている。注入された細胞は、レシピエントの疾患原因細胞を死滅することができる。抗体療法とは異なり、ＣＡＲ−Ｔ細胞はｉｎ  ｖｉｖｏで自己複製することができ、癌療法を持続させることができる長期持続性をもたらす。
【０４４３】
一実施形態では、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲ−Ｔ細胞は、ロバストなｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞増殖が可能であり、長時間残存することができる。別の実施形態では、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲ−Ｔ細胞は、任意のさらなる腫瘍形成または腫瘍増殖を阻止するように再活性化され得る、特定のメモリーＴ細胞または幹細胞メモリーＴ細胞へと変わる。
【０４４４】
特定の実施形態では、本明細書で考察されているＣＡＲを備えた免疫エフェクター細胞を含む組成物を、ＣＤ７９Ａ発現癌細胞または癌幹細胞に関連した病態の治療に使用する。
ＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞を用いて治療、予防、または改善され得る病態の具体例は、特定の実施形態で考察されている。
【０４４５】
特定の実施形態では、本明細書で考察されているＣＡＲ改変Ｔ細胞を含む組成物を、液性癌または血液癌の治療に使用する。
【０４４６】
特定の実施形態では、液性癌または血液癌は、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。
【０４４７】
特定の実施形態では、液性癌または血液癌は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、ヘアリーセル白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、真性多血症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁層リンパ腫、菌状息肉症、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、非分泌型骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、ならびに髄外性形質細胞腫からなる群から選択される。
【０４４８】
特定の実施形態では、液性癌または血液癌は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリーセル白血病（ＨＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群から選択される。
【０４４９】
好ましい実施形態では、液性癌または血液癌はＤＬＢＣＬである。
【０４５０】
好ましい実施形態では、液性癌または血液癌は再発性／難治性ＤＬＢＣＬである。
【０４５１】
特定の実施形態では、本明細書で考察されている抗ＣＤ７９ＡＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、または該細胞を含む組成物の治療有効量を、それを必要とする患者に、単体で、または１つもしくは複数の治療剤と組み合わせて投与することを含む方法が提供されている。特定の実施形態では、ＣＤ７９Ａ発現癌細胞に関連する病態を発症するリスクのある患者の治療に、該細胞を用いる。したがって、特定の実施形態では、該ＣＡＲ改変細胞の治療有効量を必要とする対象に投与することを含む、癌の少なくとも１つの症状の治療、または予防、または改善方法が本明細書で考察されている。
【０４５２】
「個体」及び「対象」という用語は、本明細書で使用する場合、交換可能に用いられることが多く、遺伝子療法ベクター、細胞ベース療法、及び本明細書のいずれかに記載の方法で治療することができる疾患、障害、または病態の症状を呈する任意の動物を意味する。好ましい実施形態では、対象は、遺伝子療法ベクター、細胞ベース療法、及び本明細書のいずれかに記載の方法で治療することができる癌に関連する疾患、障害、または病態の症状を呈する任意の動物を含む。好適な対象（例えば、患者）には、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど）、家畜、及び飼育動物またはペット（ネコまたはイヌなど）が含まれる。非ヒト霊長類、及び好ましくはヒト患者も含まれる。典型的な対象として、ＣＤ７９Ａ発現癌（例えば、ＤＬＢＣＬ）を有するか、ＣＤ７９Ａ発現癌を有すると診断されているか、またはＣＤ７９Ａ発現癌を有するリスクのあるヒト患者が挙げられる。
【０４５３】
用語「患者」は、本明細書で使用する場合、遺伝子療法ベクター、細胞ベース療法、及び本明細書のいずれかに開示された方法で治療することができる特定の疾患、障害、または病態を持つと診断された対象を意味する。
【０４５４】
「治療」または「治療する」は、本明細書で使用する場合、疾患の症状もしくは病態または病状に対する任意の有益な作用または望ましい作用を含んでおり、処置する疾患または病態の１つまたは複数の測定可能なマーカーを最小限減少させることを含む場合もある。治療は、任意選択的に、疾患もしくは病態が軽減されること、または疾患もしくは病態の進行が遅れることを含む場合がある。「治療」は、疾患または病態またはその関連症候の完全な根絶または治癒を必ずしも意味するものではない。
【０４５５】
「予防する」、及び同様の語である「予防した」「予防している」といった用語は、本明細書で使用する場合、疾患もしくは病態の発症する可能性または再発する可能性を、防止、阻止、または低減する手段を示している。これらの用語はまた、疾患もしくは病態の発病もしくは再発を遅らせること、または疾患もしくは病態の症状の発症もしくは再発を遅らせることを意味する。「予防」及び同様の語は、本明細書で使用する場合、疾患もしくは病態の発病前または再発前に、疾患もしくは病態の程度、影響、症状、及び／または負荷を軽減することを含む。
【０４５６】
語句「少なくとも１つの症状を改善する」は、本明細書で使用する場合、対象が治療を受けている疾患または病態の１つまたは複数の症状を軽減することを意味する。特定の実施形態では、治療される疾患または病態は癌であり、そこで、改善される１つまたは複数の症状には、以下に限定されないが、脱力、疲労、息切れ、易傷性及び易出血性、頻回感染、リンパ節腫大、腹部の膨張または痛み（腹部臓器肥大に起因）、骨痛または関節痛、骨折、予期しない体重減少、食欲不振、寝汗、持続性微熱、ならびに排尿減少（腎臓機能障害に起因）が含まれる。
【０４５７】
「増大」、または「促進」、または「増加」、または「増殖」は、本明細書で考察されている組成物（例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子改変Ｔ細胞またはベクター）が、ビヒクルまたは対照分子／組成物により生じる生理学的応答に比べて、該応答の増大（すなわち下流作用）を生じさせるか、誘発するか、または引き起こすことができることを意味する。測定可能な生理学的応答には、当該技術分野及び本明細書における理解から明白であるものの中で、Ｔ細胞増殖の増加、活性化の増加、持続性の増加、及び／または癌細胞死滅能の増加などが含まれ得る。「増加」または「増大」した量は通例、「統計学的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照組成物により生じる応答に対して、１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、またはそれ以上（例えば、５００倍、１０００倍）（これらの数値間かつ１を超える全ての整数及び小数点を含み、例えば１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍などを含む）増加した量を含み得る。
【０４５８】
「減少」、または「低下」、または「減る」、または「低減」、または「軽減」は、通例、本明細書で考察されている組成物が、ビヒクルまたは対照分子組成物により生じる生理学的応答に比べて、該応答の低下（すなわち下流作用）を生じさせるか、誘発するか、または引き起こすことができることを意味する。「減少」または「低減」した量は通例、「統計学的に有意な」量であり、ビヒクルもしくは対照組成物により生じる応答（参照応答）または特定の細胞系統の応答に対して、１／１．１、１／１．２、１／１．５、１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、１／１０、１／１５、１／２０、１／３０、またはそれ以上（例えば、１／５００、１／１０００）（分母の値は、前記分母の数値間かつ１を超える全ての整数及び小数点を含み、例えば１．５、１．６、１．７、１．８なども含む）に減少した量を含み得る。
【０４５９】
「維持する」、または「持続する」、または「維持」、または「変化なし」、または「実質的な変化なし」、または「実質的な減少なし」は、通例、ビヒクルもしくは対照分子／組成物により生じる生理学的応答または特定の細胞系統の応答に比べて、本明細書で考察されている組成物が、細胞内で同様の応答（すなわち下流作用）を生じさせるか、誘発するか、または引き起こす性質を意味する。同様の応答は、参照応答とは実質的に異なっていないか、測定可能な違いが見られない応答である。
【０４６０】
一実施形態では、癌の治療を必要とする対象における癌の治療方法は、本明細書で考察されている遺伝子改変免疫エフェクター細胞を含む組成物の有効量、例えば治療有効量を投与することを含む。投与の量及び頻度は、患者の病態、患者の疾患の種類及び重症度などの因子により決定されるが、適正な投与量を臨床試験により決定することもできる。
【０４６１】
一実施形態では、対象に投与される組成物に含まれる免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の量は、少なくとも０．１×１０５個の細胞、少なくとも０．５×１０５個の細胞、少なくとも１×１０５個の細胞、少なくとも５×１０５個の細胞、少なくとも１×１０６個の細胞、少なくとも０．５×１０７個の細胞、少なくとも１×１０７個の細胞、少なくとも０．５×１０８個の細胞、少なくとも１×１０８個の細胞、少なくとも０．５×１０９個の細胞、少なくとも１×１０９個の細胞、少なくとも２×１０９個の細胞、少なくとも３×１０９個の細胞、少なくとも４×１０９個の細胞、少なくとも５×１０９個の細胞、または少なくとも１×１０１０個の細胞である。
【０４６２】
特定の実施形態では、約１×１０７個のＴ細胞〜約１×１０９個のＴ細胞、約２×１０７個のＴ細胞〜約０．９×１０９個のＴ細胞、約３×１０７個のＴ細胞〜約０．８×１０９個のＴ細胞、約４×１０７個のＴ細胞〜約０．７×１０９個のＴ細胞、約５×１０７個のＴ細胞〜約０．６×１０９個のＴ細胞、または約５×１０７個のＴ細胞〜約０．５×１０９個のＴ細胞を対象に投与する。
【０４６３】
一実施形態では、対象に投与される組成物に含まれる免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の量は、体重１ｋｇ当たり少なくとも０．１×１０４個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも０．５×１０４個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも１×１０４個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも５×１０４個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも１×１０５個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも０．５×１０６個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも１×１０６個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも０．５×１０７個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも１×１０７個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも０．５×１０８個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも１×１０８個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも２×１０８個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも３×１０８個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも４×１０８個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも５×１０８個の細胞、または体重１ｋｇ当たり少なくとも１×１０９個の細胞である。
【０４６４】
特定の実施形態では、体重１ｋｇ当たり約１×１０６個のＴ細胞〜体重１ｋｇ当たり約１×１０８個のＴ細胞、体重１ｋｇ当たり約２×１０６個のＴ細胞〜体重１ｋｇ当たり約０．９×１０８個のＴ細胞、体重１ｋｇ当たり約３×１０６個のＴ細胞〜体重１ｋｇ当たり約０．８×１０８個のＴ細胞、体重１ｋｇ当たり約４×１０６個のＴ細胞〜体重１ｋｇ当たり約０．７×１０８個のＴ細胞、体重１ｋｇ当たり約５×１０６個のＴ細胞〜体重１ｋｇ当たり約０．６×１０８個のＴ細胞、体重１ｋｇ当たり約５×１０６個のＴ細胞〜体重１ｋｇ当たり約０．５×１０８個のＴ細胞を対象に投与する。
【０４６５】
所望の治療をもたらすために、本明細書で考察されている組成物の複数回投与が必要である場合があることを、当業者は理解するであろう。例えば、１週間、２週間、３週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、１年、２年、５年、１０年、またはそれ以上の期間にわたり、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、もしくは１０回、またはそれ以上の回数で組成物を投与する場合がある。
【０４６６】
特定の実施形態では、活性化された免疫エフェクター細胞を対象に投与し、続いて血液を再び採取し（またはアフェレーシスを行い）、そこから得た免疫エフェクター細胞を活性化し、活性化かつ増殖された免疫エフェクター細胞を患者に再び注入することが好ましい場合がある。このプロセスを数週間毎に複数回行うことができる。特定の実施形態では、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採取した血液から得た免疫エフェクター細胞を活性化することができる。特定の実施形態では、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、１００ｃｃ、１５０ｃｃ、２００ｃｃ、２５０ｃｃ、３００ｃｃ、３５０ｃｃ、もしくは４００ｃｃ、またはそれ以上の採取した血液から得られた免疫エフェクター細胞を活性化する。理論に束縛されないが、この複数回の採血／複数回の再注入プロトコルを用いることで、免疫エフェクター細胞のうちの特定の集団を選び出すことができる。
【０４６７】
本明細書で考察されている組成物の投与は、任意の従来からの方法で行うことができ、該方法には、例えば、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸注、注入または移植などがある。好ましい実施形態では、組成物を非経口的に投与する。本明細書で使用される「非経口的投与」及び「非経口的に投与する」という語句は、腸内投与及び局所投与以外には、通例注射による投与様式を意味し、以下に限定されないが、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、及び胸骨内への注射及び注入を含む。一実施形態では、本明細書で考察されている組成物を、腫瘍、リンパ節、または感染部位への直接注射により対象に投与する。
【０４６８】
一実施形態では、必要な対象に、組成物の有効量を投与して、対象のＢ細胞に関連する病態に対する細胞免疫応答を増加させる。免疫応答には、感染した細胞を死滅させることができる細胞傷害性Ｔ細胞、調節Ｔ細胞、及びヘルパーＴ細胞応答により媒介される細胞免疫応答が含まれ得る。Ｂ細胞を活性化させ、それにより抗体を産生させることができるヘルパーＴ細胞が主に媒介する液性免疫応答も誘導され得る。種々の技術を用いて、組成物により誘導される免疫応答の種類を分析することができ、これについては、当該技術分野では、例えば、Current  Protocols  in  Immunology,  Edited  by:  John  E.  Coligan,  Ada  M.  Kruisbeek,  David  H.  Margulies,  Ethan  M.  Shevach,  Warren  Strober  (2001)  John  Wiley  &  Sons,  NY,  N.Yに詳細に記載されている。
【０４６９】
Ｔ細胞の媒介で死滅に至らせる場合には、ＣＡＲとリガンドとの結合がＴ細胞に対するＣＡＲシグナル伝達を惹起し、その結果、種々の機序により、標的細胞のアポトーシスを誘導できるタンパク質を産生するかまたは放出するようにＴ細胞を誘導する、様々なＴ細胞シグナル伝達経路が活性化される。こうしたＴ細胞媒介機序には、（以下に限定されないが、）細胞内細胞傷害性顆粒をＴ細胞から標的細胞に導入することと、標的細胞の死滅を直接的に（または他の死滅エフェクター細胞の動員を介して間接的に）誘導することができる炎症性サイトカインをＴ細胞が分泌することと、標的細胞上の同種の死受容体（例えば、Ｆａｓ）に結合した後に標的細胞のアポトーシスを誘導するＴ細胞表面の死受容体リガンド（例えば、ＦａｓＬ）を上方制御することとが含まれる。
【０４７０】
一実施形態では、ＣＤ７９Ａ発現癌と診断された対象を治療する方法であって、ＣＤ７９Ａ発現癌と診断された対象から免疫エフェクター細胞を採取することと、該免疫エフェクター細胞を本明細書で考察されているＣＡＲをコードする核酸を含むベクターで遺伝子改変し、それにより改変した免疫エフェクター細胞群を産生することと、該改変した免疫エフェクター細胞群を同一対象に投与することとを含む方法が提供されている。好ましい実施形態では、免疫エフェクター細胞はＴ細胞を含む。
【０４７１】
特定の実施形態では、対象における標的細胞群に対する免疫エフェクター細胞媒介免疫調節応答を刺激する方法であって、ＣＡＲ分子をコードする核酸構築物を発現する免疫エフェクター細胞群を対象に投与する工程を含む方法が、提供されている。
【０４７２】
特定の実施形態で考察されている細胞組成物を投与する方法には、ｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝子改変した免疫エフェクター細胞を再導入するのに効果的な任意の方法が含まれており、該免疫エフェクター細胞は、対象においてＣＡＲを直接発現するものであるか、または免疫エフェクター細胞の遺伝子改変前駆体を再導入して、対象に導入した際にＣＡＲを発現する成熟免疫エフェクター細胞に分化するものである。１つの方法には、本明細書で考察されている核酸構築物を用いて末梢血Ｔ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで形質導入することと、形質導入した細胞を対象に戻すこととが含まれる。
【０４７３】
本明細書において引用された全ての刊行物、特許出願、及び発行特許は、各個別の刊行物、特許出願及び発行特許が具体的かつ個別に参照により組み込まれると明記されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０４７４】
上記の実施形態では、理解を明確にするための説明及び例を示して詳細に記載しているが、本明細書に考察されている教示を考慮すれば、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲を逸脱することなく、それに一定の変更及び修飾を加えることができることは当業者には容易に分かることであろう。以下の実施例は、例示のためだけに提供されており、限定のために提供されるものではない。当業者は、変更または改変しても実質的に同様の結果を与えることになる種々の重要ではないパラメータを容易に認識するであろう。
【実施例】
【０４７５】
実施例１
抗ＣＤ７９ＡＣＡＲの構築物
ヒト化抗ＣＤ７９ＡｓｃＦｖ抗体を含むＣＡＲを、抗ＣＤ７９ＡｓｃＦｖに作用可能に連結されたＭＮＤプロモーターと、ＣＤ８α由来のヒンジドメイン及び膜貫通ドメインと、ＣＤ１３７共刺激ドメインと、それらに続くＣＤ３ζ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインとを含有するように設計した。抗ＣＤ７９ＡＣＡＲには、免疫エフェクター細胞の表面発現に適したＣＤ８αシグナルペプチド（ＳＰ）配列が含まれる。表３は、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲレンチウイルスベクターの様々なヌクレオチドセグメントの固有の特性、ジェンバンク参照番号、ソース名称、及び引用元を示す。ＣＤ７９ＡＣＡＲポリペプチド配列の例を配列番号２５〜配列番号３０に記載し、ＣＤ７９ＡＣＡＲポリヌクレオチド配列の例を配列番号３１〜配列番号３６に記載している。
【表３−１】
2021527409.tif 000005
【表３−２】
2021527409.tif 000006
【０４７６】
実施例２
ヒト抗ＣＤ７９ＡＣＡＲ−Ｔ細胞の評価
ＣＤ７９Ａに特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（例えば、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、及び配列番号３０）を、ＣＤ７９Ａ発現細胞に対するＣＡＲ発現及び生物学的活性に関して評価した。
【０４７７】
標的抗原発現
１つの実験では、Ｋ５６２細胞、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ細胞、及びＤａｕｄｉ標的細胞について、抗ＣＤ７９Ａ抗体を用いてＣＤ７９Ａ発現に関して調べた。これらの細胞をＣＤ７９Ａ抗体とインキュベートして、発現をフローサイトメトリーで評価した。ＣＤ７９Ａは、その発現がＫ５６２細胞では検出できず、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ細胞では中程度に発現されており、Ｄａｕｄｉ細胞では高発現されていた。図１Ａを参照されたい。
【０４７８】
別の実験では、ＣＤ７９Ａ発現を、抗ＣＤ７９Ａ抗体を用いて、Ｄａｕｄｉ標的細胞、ＮＵ−ＤＵＬ−１標的細胞、ＳＵ−ＤＨＬ−２標的細胞、及びＰｆｅｉｆｆｅｒ標的細胞で測定した。これらの細胞をＣＤ７９Ａ抗体とインキュベートして、発現をフローサイトメーターで評価した。ＣＤ７９Ａ発現は、前の結果と同様にＤａｕｄｉ細胞で最も高くなり、ＮＵ−ＤＵＬ−１細胞、ＳＵ−ＤＨＬ−２細胞、及びＰｆｅｉｆｆｅｒ細胞の順に少なくなった。図２Ａを参照されたい。
【０４７９】
抗ＣＤ７９ＡＣＡＲ発現
大規模の臨床上の製造プロセスにそのまま拡張可能なシステムを用いて、ＣＡＲ−Ｔ細胞を産生した。簡単に説明すると、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＩＬ−２（CellGenix社製）と、ＣＤ３及びＣＤ２８に特異的な抗体（Miltenyi  Biotec社製）とを含有する培地で培養した。培養開始１日後に、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲをコードするレンチウイルスを添加した。培養の全１０日間、ＩＬ−２を含む新鮮な培地を添加することにより、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲ−Ｔ細胞を対数期に保持した。培養終了時に、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲ−Ｔ細胞の発現について、フローサイトメトリーを用いて調べた。１つの実験では、抗ＣＤ７９ＡＣＡＲを発現するレンチウイルスを用いて操作した一次ヒトＴ細胞を、ビオチンと結合しており、かつＰＥ結合ストレプトアビジンで検出されるヤギ抗マウス（ＧａＭ）で染色した。図１Ｂを参照されたい。別の実験では、Ｔ細胞の抗ＣＤ７９ＡＣＡＲ発現を、ヤギ抗マウス（ＧａＭ）染色を用いて評価し、溶解性ＣＤ７９Ａ抗原と抗ＣＤ７９ＡＣＡＲ−Ｔ細胞との結合を、フィコエリトリン（ＰＥ）でラベル化したＣＤ７９Ａ細胞外ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質で染色することによって評価した。図２Ｂを参照されたい。これらの試薬で抗ＣＤ７９ＡＣＡＲを発現したＴ細胞を特異的に特定した。
【０４８０】
抗原依存性抗ＣＤ７９ＡＣＡＲ−Ｔ細胞活性
１つの実験では、ＣＤ７９Ａ陽性（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ及びＤａｕｄｉ）細胞株及びＣＤ７９Ａ陰性（Ｋ５６２）細胞株に対する抗ＣＤ７９ＡＣＡＲ−Ｔ細胞の生物学的活性を、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）放出アッセイを用いて評価した。抗ＣＤ７９ＡＣＡＲ−Ｔ細胞を、標的細胞の不在下で共培養するか、またはＫ５６２細胞（ＣＤ７９Ａ−）、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ細胞（ＣＤ７９Ａ−低発現）、及びＤａｕｄｉ細胞（ＣＤ７９Ａ−高発現）と２４時間共培養した。抗ＣＤ７９ＡＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ７９Ａ陽性細胞株が存在する場合にのみＩＦＮγを放出した。図１Ｃを参照されたい。
【０４８１】
別の実験では、ＣＤ７９Ａ陽性（Ｈｕｈ７．ＣＤ７９Ａ、Ｄａｕｄｉ、ＮＵ−ＤＵＬ−１、ＳＵ−ＤＨＬ−２、及びＰｆｅｉｆｆｅｒ）細胞株及びＣＤ７９Ａ陰性（Ｈｕｈ７）細胞株に対する抗ＣＤ７９ＡＣＡＲ−Ｔ細胞の生物学的活性を、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）放出アッセイを用いて評価した。抗ＣＤ７９ＡＣＡＲ−Ｔ細胞を、標的細胞の不在下（Ｔ細胞のみ）で共培養するか、またはＨｕｈ７細胞（ＣＤ７９Ａ−）、Ｈｕｈ７．ＣＤ７９Ａ細胞（ＣＤ７９Ａ＋）、Ｄａｕｄｉ細胞（ＣＤ７９Ａ＋）、ＮＵ−ＤＵＬ−１（ＣＤ７９Ａ＋）、ＳＵ−ＤＨＬ−２（ＣＤ７９Ａ＋）、もしくはＰｆｅｉｆｆｅｒ細胞（ＣＤ７９Ａ＋）と共培養した。図２Ｃを参照されたい。
【０４８２】
以下の特許請求の範囲では、使用される用語は一般的に、特許請求の範囲を明細書及び特許請求の範囲で開示されている特定の実施形態に限定するものとして解釈されるべきではなく、特許請求の範囲が権利を付与する均等物の全範囲を含めた全ての可能な実施形態を含むものとして解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示により限定されるものではない。
【図１Ａ】
2021527409.tif 000007
【図１Ｂ】
2021527409.tif 000008
【図１Ｃ】
2021527409.tif 000009
【図２Ａ】
2021527409.tif 000010
【図２Ｂ】
2021527409.tif 000011
【図２Ｃ】
2021527409.tif 000012
【配列表】
2021527409000001.app
【国際調査報告】
2021527409.tif 000013
2021527409.tif 000014
2021527409.tif 000015