(57)【要約】  本発明は、リガンド、例えば、小分子またはタンパク質に応答する誘導性キメラサイトカイン受容体と、誘導性キメラサイトカイン受容体を含む、Ｔ細胞などの、遺伝子組換え免疫細胞の機能的活性を改善するためのかかる受容体の使用と、かかる細胞を含む組成物と、を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
二量体形成ドメインと、
チロシンキナーゼ活性化ドメインと、
チロシンエフェクタードメインと、を含む、誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項２】
前記チロシンキナーゼ活性化ドメインが、タンパク質の、またはタンパク質に由来するヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）結合ドメインを含む、請求項１に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項３】
前記チロシンキナーゼ活性化ドメインが、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の、または受容体チロシンキナーゼに由来するチロシンキナーゼドメインを含む、請求項１に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項４】
前記チロシンキナーゼ活性化ドメインが、膜貫通ドメインを含む、請求項２または３に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項５】
前記チロシンエフェクタードメインが、受容体の、または受容体に由来する少なくとも１つのＳＴＡＴ活性化ドメインを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項６】
前記チロシンエフェクタードメインが、２つの受容体の、または２つの受容体に由来する少なくとも２つのＳＴＡＴ活性化ドメインを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項７】
前記チロシンエフェクタードメインが、少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の、または少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼに由来する細胞質側尾部の一部分を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項８】
前記二量体形成ドメインが、リガンドＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、二量体ＦＫ５０６、または二量体ＦＫ５０６様類似体に結合する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項９】
前記二量体形成ドメインがＦＫＢＰポリペプチドを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項１０】
前記ＦＫＢＰポリペプチドがＦＫＢＰ１２ポリペプチドである、請求項９に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項１１】
前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチドがアミノ酸置換Ｆ３６Ｖ（配列番号２１８）を含む、請求項１０に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項１２】
前記二量体形成ドメインが、（ｉ）１つ以上のアミノ酸置換を含むＦＫＢＰポリペプチド、（ｉｉ）未修飾ＦＫＢＰポリペプチドの２つまたは３つのタンデムリピート、および（ｉｉｉ）１つ以上のアミノ酸置換を含むＦＫＢＰポリペプチドの２つまたは３つのタンデムリピートからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項１３】
前記二量体形成ドメインが、配列番号６９〜８７から選択される二量体形成ドメイン配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項１４】
前記二量体形成ドメインが、配列番号６９〜７３から選択されるＦＫＢＰ二量体形成ドメイン配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項１５】
前記二量体形成ドメインが、ＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ）、ＯＸ−４０の細胞外ドメイン、およびＴＮＦＲ２スーパーファミリー受容体の細胞外ドメインからなる群から選択されるポリペプチドの、またはそれに由来するアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項１６】
前記ＴＮＦＲ２スーパーファミリー受容体が、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、またはＢＡＦＦＲである、請求項１５に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項１７】
前記二量体形成ドメインが小分子に結合する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項１８】
前記二量体形成ドメインがタンパク質に結合する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項１９】
前記二量体形成ドメインが、ＦＫＢＰ、シクロフィリン、ステロイド結合タンパク質、エストロゲン結合タンパク質、糖質コルチコイド結合タンパク質、ビタミンＤ結合タンパク質、テトラサイクリン結合タンパク質、サイトカイン受容体の細胞外ドメイン、受容体チロシンキナーゼ、ＴＮＦＲファミリー受容体、および免疫共受容体からなる群から選択されるタンパク質の、またはそれに由来するアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項２０】
前記免疫共受容体が、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、成長ホルモン受容体、トロンボポエチン受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、ＧＰ１３０、共通ガンマ鎖受容体、共通ベータ鎖受容体、ＩＦＮアルファ受容体、ＩＦＮガンマ受容体、ＩＦＮラムダ受容体、ＩＬ２／ＩＬ１５受容体、ＩＬ３受容体、ＩＬ４受容体、ＩＬ５受容体、ＩＬ７受容体、ＩＬ９受容体、ＩＬ１０受容体、ＩＬ１２受容体、ＩＬ１３受容体、ＩＬ２０受容体、ＩＬ２１受容体、ＩＬ２２受容体、ＩＬ２３受容体、ＩＬ２７受容体、ＴＳＬＰ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、ＣＮＴＦ受容体、ＯＳＭ受容体、ＬＩＦ受容体、ＣＴ−１受容体、ＴＧＦＢＲ１／ＡＬＫＬ５、ＴＧＦＢＲ２、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ３／ＨＥＲ３、ＥＲＲＢ４／ＨＥＲ４、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲＲ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＣＳＦ−１Ｒ、ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＦＬＫ２／ＦＬＴ３、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３、ＦＧＦＲ−４、ＣＣＫ４、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＲＥＴ、ＲＯＳ、ＬＴＫ、ＡＬＫ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ、ＡＡＴＹＫ２、ＡＡＴＹＫ３、ＲＴＫ１０６、ＴＮＦＲ１、Ｆａｓ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＮＧＦＲ、ＤＲ３、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、ＴＮＦＲ２、ＬＴｂＲ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４−１ＢＢ、ＲＡＮＫ、Ｆｎ１４、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＢＣＭＡ、ＧＩＴＲ、ＴＲＯＹ、ＲＥＬＴ、ＸＥＤＡＲ、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＤｃＲ３、ＰＤ−１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＬＡＧ３、およびＴＩＭ３からなる群から選択される、請求項１９に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項２１】
前記タンパク質が受容体である、請求項２に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項２２】
前記受容体がホルモン受容体である、請求項２１に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項２３】
前記タンパク質または前記受容体が、ＥＰＯＲ、ＧＰ１３０、ＰＲＬＲ、ＧＨＲ、ＧＣＳＦＲ、およびＴＰＯＲ／ＭＰＬＲからなる群から選択される、請求項２、２１、または２２に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項２４】
前記ＲＴＫが、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ３／ＨＥＲ３、ＥＲＲＢ４／ＨＥＲ４、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲＲ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＣＳＦ−１Ｒ、ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＦＬＫ２／ＦＬＴ３、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＦＧＦＲ−１  ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３、ＦＧＦＲ−４、ＣＣＫ４、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＲＥＴ、ＲＯＳ、ＬＴＫ、ＡＬＫ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ、ＡＡＴＹＫ２、ＡＡＴＹＫ３、およびＲＴＫ１０６からなる群から選択される、請求項３に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項２５】
前記ＲＴＫがＥＧＦＲである、請求項３または２４に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項２６】
前記チロシンキナーゼ活性化ドメインが、配列番号８８〜１３３から選択されるチロシンキナーゼ活性化ドメイン配列を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項２７】
前記膜貫通ドメインが、ＥＰＯＲ、ＧＰ１３０、ＰＲＬＲ、ＧＨＲ、ＧＣＳＦＲ、ＰＤ−１、およびＴＰＯＲ／ＭＰＬＲからなる群から選択されるタンパク質の、またはそれに由来する膜貫通ドメインを含む、請求項４〜２６のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項２８】
前記膜貫通ドメインがＴＰＯＲ／ＭＰＬＲに由来する膜貫通ドメインを含む、請求項４〜２７のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項２９】
前記膜貫通ドメインが、配列番号６４の天然に発生するＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ配列のアミノ酸４７８〜５８２に由来する、請求項４〜２７のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項３０】
前記膜貫通ドメインが、配列番号６４の天然に発生するＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ配列のアミノ酸領域４７８〜５８２の欠失バリアントを含む、請求項４〜２７のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項３１】
前記欠失バリアントが、配列番号６４の天然に発生するＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ配列の領域４７８〜５８２からの１〜１８アミノ酸の欠失を含む、請求項３０に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項３２】
前記欠失バリアントが、配列番号６４の天然に発生するＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ配列の領域４８９〜５１０からの１〜１８アミノ酸の欠失を含む、請求項３０または３１に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項３３】
前記膜貫通ドメインが、配列番号６４の天然に発生するＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ配列のアミノ酸領域４７８〜５８２の挿入バリアントを含む、請求項４〜２７のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項３４】
前記挿入バリアントが、配列番号６４の天然に発生するＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ配列の領域４７８〜５８２において１〜８アミノ酸の挿入を含む、請求項３３に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項３５】
前記挿入バリアントが、配列番号６４の天然に発生するＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ配列の領域４８９〜５１０において１〜８アミノ酸の挿入を含む、請求項３３または３４に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項３６】
前記挿入バリアントに挿入された前記アミノ酸が、ロイシン、バリン、およびイソロイシンからなる群から選択される、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項３７】
前記チロシンキナーゼ活性化ドメインが、配列番号１０４〜１３３から選択される配列を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項３８】
前記受容体がホルモン受容体である、請求項５または６に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項３９】
前記受容体がサイトカイン受容体である、請求項５または６に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項４０】
前記受容体が、ＢＬＮＫ、ＩＬ２ＲＧ、ＥＧＦＲ、ＥｐｏＲ、ＧＨＲ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＡＲ１／２、ＩＦＮＬＲ１、ＩＬ１０Ｒ１、ＩＬ１２Ｒｂ１、ＩＬ１２Ｒｂ２、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２Ｒｂ、ＩＬ２ｓｍａｌｌ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、およびＩＬ２１Ｒからなる群から選択される、請求項５〜７および３８〜３９のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項４１】
前記チロシンキナーゼ活性化ドメインが、膜貫通ドメインおよびヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）結合ドメインを含み、前記チロシンエフェクタードメインが、受容体の、または受容体に由来する少なくとも１つのＳＴＡＴ活性化ドメインを含む、請求項１に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項４２】
前記二量体形成ドメインがＦＫＢＰポリペプチドを含み、
前記膜貫通ドメインが、ＥＰＯＲ、ＧＰ１３０、ＰＲＬＲ、ＧＨＲ、ＧＣＳＦＲ、ＰＤ−１、およびＴＰＯＲからなる群から選択されるタンパク質の、またはそれに由来する膜貫通ドメインを含み、
前記ＪＡＫ結合ドメインが、ＥＰＯＲ、ＧＰ１３０、ＰＲＬＲ、ＧＨＲ、ＧＣＳＦＲ、およびＴＰＯＲからなる群から選択されるタンパク質の、またはそれに由来するＪＡＫ結合ドメインを含み、
前記ＳＴＡＴ活性化ドメインが、ＢＬＮＫ、ＩＬ２ＲＧ、ＥＧＦＲ、ＥｐｏＲ、ＧＨＲ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＡＲ１／２、ＩＦＮＬＲ１、ＩＬ１０Ｒ１、ＩＬ１２Ｒｂ１、ＩＬ１２Ｒｂ２、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２Ｒｂ、ＩＬ２ｓｍａｌｌ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、およびＩＬ２１Ｒからなる群から選択される受容体の、またはそれに由来する少なくとも１つのＳＴＡＴ活性化ドメインを含む、請求項４１に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項４３】
前記チロシンエフェクタードメインが、少なくとも２つの受容体の、または少なくとも２つの受容体に由来する少なくとも２つのＳＴＡＴ活性化ドメインを含む、請求項４２に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項４４】
前記チロシンエフェクタードメインが、配列番号１３４〜１７６から選択されるチロシンエフェクタードメイン配列を含む、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項４５】
前記二量体形成ドメインが、前記誘導性キメラサイトカイン受容体のＮ末端に位置付けられる、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項４６】
前記二量体形成ドメインが、前記誘導性キメラサイトカイン受容体のＣ末端に位置付けられる、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項４７】
前記誘導性キメラサイトカイン受容体が膜標的化モチーフを含む、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項４８】
前記膜標的化モチーフがミリストイル化モチーフを含む、請求項４７に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項４９】
前記受容体がミリストイル化されている、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項５０】
表２Ａまたは表２Ｂに開示される配列を含む、請求項１に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【請求項５１】
請求項１〜５０のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体をコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項５２】
請求項５１に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項５３】
請求項１〜５０のいずれか１項に記載の少なくとも１つの誘導性キメラサイトカイン受容体、または請求項５１に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、操作された免疫細胞。
【請求項５４】
前記細胞が、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の少なくとも２つの誘導性キメラサイトカイン受容体、または請求項５１に記載の少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む、請求項５３に記載の操作された免疫細胞。
【請求項５５】
前記細胞が、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の少なくとも３つもしくは４つの誘導性キメラサイトカイン受容体、または請求項５１に記載の少なくとも３つもしくは４つのポリヌクレオチドを含む、請求項５３または５４に記載の操作された免疫細胞。
【請求項５６】
２つ以上の誘導性キメラサイトカイン受容体が存在する際に、各受容体の前記二量体形成ドメイン、前記チロシンキナーゼ活性化ドメイン、および前記チロシンエフェクタードメインが、同じまたは異なり得る、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項５７】
前記細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項５３〜５６のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項５８】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、および幹細胞に由来する免疫細胞からなる群から選択される、請求項５３〜５７のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項５９】
前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項５３〜５８のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項６０】
対象において操作された免疫細胞を調節する方法であって、前記方法が、請求項５３〜５９のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞を以前に投与されている対象にリガンドを投与することを含み、二量体リガンドが前記誘導性キメラサイトカイン受容体の前記二量体形成ドメインに結合する、方法。
【請求項６１】
前記リガンドがＡＰ１９０３である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
操作された免疫細胞を調製する方法であって、前記方法が請求項５１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項５２に記載の発現ベクターを免疫細胞に導入することを含む、方法。
【請求項６３】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、および幹細胞に由来する免疫細胞からなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６５】
（ｉ）二量体形成ドメイン、チロシンキナーゼ活性化ドメイン、およびチロシンエフェクタードメインを含む、少なくとも１つの誘導性キメラサイトカイン受容体と、
（ｉｉ）細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、を含む、単離された免疫細胞。
【請求項６６】
前記誘導性キメラサイトカイン受容体が請求項１〜５０のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体である、請求項６５に記載の単離された免疫細胞。
【請求項６７】
細胞が、少なくとも２つ、３つ、または４つの誘導性キメラサイトカイン受容体を含む、請求項６６に記載の単離された免疫細胞。
【請求項６８】
前記ＣＡＲの前記細胞外リガンド結合ドメインが、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｆｌｔ−３、ＷＴ−１、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＣＤ３３、ＣＤ１３３、ＬｅＹ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、ＣＤ４４ｖ６、ＲＯＲ１、ＣＤ１９、クローディン１８．２（クローディン１８Ａ２、またはクローディン１８アイソフォーム２）、ＤＬＬ３（デルタ様タンパク質３、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａデルタホモログ３、Ｄｅｌｔａ３）、Ｍｕｃ１７（ムチン１７、Ｍｕｃ３、Ｍｕｃ３）、ＦＡＰアルファ（線維芽細胞活性化タンパク質アルファ）、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合遺伝子座タンパク質Ｇ６ｄ、ｃ６ｏｒｆ２３、Ｇ６Ｄ、ＭＥＧＴ１、ＮＧ２５）、ＲＮＦ４３（Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ４３、またはＲＩＮＧフィンガータンパク質４３）に特異的に結合する、請求項６５に記載の単離された免疫細胞。
【請求項６９】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、および幹細胞に由来する免疫細胞からなる群から選択される、請求項６５〜６８のいずれか１項に記載の単離された免疫細胞。
【請求項７０】
前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項６５〜６８のいずれか１項に記載の単離された免疫細胞。
【請求項７１】
前記単離された免疫細胞が、前記誘導性キメラサイトカイン受容体を発現しない単離された免疫細胞の残存性に対して、前記二量体形成ドメインに結合するリガンドとの接触時に改善された残存性を呈する、請求項６５〜７０のいずれか１項に記載の単離された免疫細胞。
【請求項７２】
前記単離された免疫細胞が、前記誘導性キメラサイトカイン受容体を発現しない単離された免疫細胞により呈されたＳＴＡＴの活性化に対して、前記二量体形成ドメインに結合するリガンドとの接触時に、ＳＴＡＴの増加した活性化を呈する、請求項６５〜７１のいずれか１項に記載の単離された免疫細胞。
【請求項７３】
前記ＳＴＡＴが、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、またはそれらの組み合わせである、請求項７２に記載の単離された免疫細胞。
【請求項７４】
前記単離された免疫細胞によるＳＴＡＴの前記活性化が、前記誘導性キメラサイトカイン受容体を発現しない前記単離された免疫細胞により示されたＳＴＡＴの活性化と比較して、前記二量体形成ドメインに結合するリガンドとの接触時に、前記リガンドの用量と共に増加する、請求項７２または７３に記載の単離された免疫細胞。
【請求項７５】
前記単離された免疫細胞が、前記誘導性キメラサイトカイン受容体を発現しない単離された免疫細胞により呈された細胞傷害性と比較して、前記二量体形成ドメインに結合するリガンドとの接触時に増加した細胞傷害性を呈する、請求項６５〜７４のいずれか１項に記載の単離された免疫細胞。
【請求項７６】
前記単離された免疫細胞が、前記誘導性キメラサイトカイン受容体を発現しない単離された免疫細胞と比較して、前記二量体形成ドメインに結合するリガンドとの接触時に増殖する、請求項６５〜７５のいずれか１項に記載の単離された免疫細胞。
【請求項７７】
前記単離された免疫細胞上の幹細胞メモリー（Ｔｓｃｍ）および／またはセントラルメモリー（Ｔｃｍ）に対する細胞マーカーのレベルが、前記誘導性キメラサイトカイン受容体を発現しない単離された免疫細胞上のこれらのマーカーのレベルと比較して、前記二量体形成ドメインに結合するリガンドとの接触時に増加または維持される、請求項６５〜７６のいずれか１項に記載の単離された免疫細胞。
【請求項７８】
前記単離された免疫細胞がＴ細胞である、請求項７１〜７７のいずれか１項に記載の単離された免疫細胞。
【請求項７９】
請求項１〜５０のいずれか１項に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体を含む単離された免疫細胞を生成する方法であって、前記方法が、
（ａ）免疫細胞を提供するステップと、
（ｂ）細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを前記免疫細胞に導入するステップと、
（ｃ）前記誘導性キメラサイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチドを前記免疫細胞に導入するステップと、を含む、方法。
【請求項８０】
ステップｃ）が、前記細胞中に前記誘導性キメラサイトカイン受容体を安定的に発現させることを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
ステップｃ）において、前記誘導性キメラサイトカイン受容体をコードする前記ポリヌクレオチドが、トランスポゾン／トランスポザーゼ系、ウイルスベースの遺伝子導入系、または電気穿孔によって前記細胞中に導入される、請求項７９または８０に記載の方法。
【請求項８２】
ステップｂ）において、前記キメラ抗体受容体をコードする前記ポリヌクレオチドが、トランスポゾン／トランスポザーゼ系またはウイルスベースの遺伝子導入系によって前記細胞中に導入される、請求項７９〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記ウイルスベースの遺伝子導入系が組換えレトロウイルスまたはレンチウイルスを含む、請求項８１または８２に記載の方法。
【請求項８４】
ステップ（ｂ）がステップ（ｃ）の前に発生する、請求項７９〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
ステップ（ｃ）がステップ（ｂ）の前に発生する、請求項７９〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、および幹細胞に由来する免疫細胞からなる群から選択される、請求項７９〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項７９〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
請求項６５〜７８のいずれか１項に記載の単離された免疫細胞を含む、医薬組成物。
【請求項８９】
前記方法が、請求項６５〜７８のいずれか１項に記載の単離された免疫細胞を前記対象に投与すること、または請求項８８に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、対象における障害を治療するための方法。
【請求項９０】
前記細胞または前記医薬組成物が２回以上前記対象に提供される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記細胞または前記医薬組成物が、少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、またはそれを超える差で前記対象に提供される、請求項８９または９０に記載の方法
【請求項９２】
前記対象が、前記単離された免疫細胞または前記医薬組成物の投与前に、治療薬で以前に治療されている、請求項８９〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記治療薬が抗体または化学療法薬である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記障害が、ウイルス性疾患、細菌性疾患、がん、炎症性疾患、免疫疾患、または加齢関連疾患である、請求項８９〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
前記がんが造血器腫瘍または固形癌である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記造血器腫瘍が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性好酸球性白血病（ＣＥＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、または多発性骨髄腫（ＭＭ）から選択される、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記固形癌が、胆管癌、膀胱癌、骨および軟部組織腫瘍、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸腺癌、結腸直腸癌、デスモイド腫瘍、胚性癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、胃腺癌、多形性膠芽腫、婦人科腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、肝癌、肺癌、悪性黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、膵管腺癌、原発性星状細胞腫瘍、原発性甲状腺癌、前立腺癌、腎癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、皮膚癌、軟部組織肉腫、精巣胚細胞腫瘍、尿路上皮癌、子宮肉腫、または子宮癌から選択される、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
障害を治療するための、請求項６５〜７８のいずれか１項に記載の単離された免疫細胞、または請求項８８に記載の医薬組成物の使用。
【請求項９９】
前記細胞または前記医薬組成物が２回以上前記対象に提供される、請求項９８に記載の使用。
【請求項１００】
前記細胞または前記医薬組成物が、少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、またはそれを超える差で前記対象に提供される、請求項９８または９９に記載の使用
【請求項１０１】
前記対象が、前記単離された免疫細胞または前記医薬組成物の投与前に、治療薬で以前に治療されている、請求項９８〜１００のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０２】
前記治療薬が抗体または化学療法薬である、請求項１０１に記載の使用。
【請求項１０３】
前記障害が、ウイルス性疾患、細菌性疾患、がん、炎症性疾患、免疫疾患、または加齢関連疾患である、請求項９８〜１０２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０４】
前記がんが造血器腫瘍または固形癌である、請求項１０３に記載の使用。
【請求項１０５】
前記造血器腫瘍が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性好酸球性白血病（ＣＥＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、または多発性骨髄腫（ＭＭ）から選択される、請求項１０４に記載の使用。
【請求項１０６】
前記固形癌が、胆管癌、膀胱癌、骨および軟部組織腫瘍、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸腺癌、結腸直腸癌、デスモイド腫瘍、胚性癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、胃腺癌、多形性膠芽腫、婦人科腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、肝癌、肺癌、悪性黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、膵管腺癌、原発性星状細胞腫瘍、原発性甲状腺癌、前立腺癌、腎癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、皮膚癌、軟部組織肉腫、精巣胚細胞腫瘍、尿路上皮癌、子宮肉腫、または子宮癌から選択される、請求項１０４に記載の使用。
【請求項１０７】
前記細胞が自己Ｔ細胞である、請求項５３〜５９のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項１０８】
前記細胞が同種Ｔ細胞である、請求項５３〜５９のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項１０９】
前記細胞が自己Ｔ細胞である、請求項６５〜７８のいずれか１項に記載の単離された免疫細胞。
【請求項１１０】
前記細胞が同種Ｔ細胞である、請求項６５〜７８のいずれか１項に記載の単離された免疫細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年３月２日に出願された米国出願第６２／６３７，６００号に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
配列表への参照
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子出願されており、．ｔｘｔ形式で電子的に提出された配列表を含む。．ｔｘｔファイルは、２０１９年２月２７日に作成され約８１４ＫＢのサイズを有する「ＡＬＧＮ＿０１６＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５」と題された配列表を含む。本．ｔｘｔファイルに含まれる配列表は、本明細書の部分であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本明細書は、概して、疾患を治療するための免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を用いる使用のための誘導性キメラサイトカイン受容体に関する。
【背景技術】
【０００４】
キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞は臨床講義に入っており、非常に将来性のある結果を実証している（Ｍａｕｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｂｌｏｏｄ  １２３，２６２５−３５）。対象の大多数が、対象自身のＴ細胞に由来する自己ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療されているが、健常ドナーに由来する同種ＣＡＲ−Ｔ細胞は、より幅広い対象を治療する能力を有するより商業的に利用可能な在庫を有する選択肢を提供する。
【０００５】
同種ＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍関連抗原により特異的に活性化されたＣＡＲを有する健常ドナーからＴ細胞を付与することにより生成される。機能的ＴＣＲ（例えば、ノックアウトまたはノックダウンを介した）を発現しない同種ＣＡＲ−Ｔ細胞は、基礎的ＴＣＲシグナル伝達において欠乏している。基礎的ＴＣＲシグナル伝達は、残存性を増加させる。ＴＣＲは、Ｃａ2+を可動化させ、最終的にＮＦＡＴおよびＮＦｋＢ活性化を引き起こす。サイトカインはＳＴＡＴ５を通じて残存性を増加することができるが、このことは固有のＴＣＲシグナル伝達を再現しない。したがって、同種ＣＡＲ−Ｔ細胞残存性を改善するための組成物および方法に対して、必要性がある。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、リガンド、例えば、小分子またはタンパク質に応答する誘導性キメラサイトカイン受容体と、誘導性キメラサイトカイン受容体を含む、遺伝子組換えＴ細胞（例えば、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞のような、遺伝子組換え抗原特異的Ｔ細胞）の機能的活性を改善するためのかかる受容体の使用と、かかる細胞を含む組成物と、を提供する。特に、本発明は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の治療有効性を補強するための方法および組成物を提供する。
【０００７】
一態様では、本発明は、二量体形成ドメイン、チロシンキナーゼ活性化ドメイン、およびチロシンエフェクタードメインを含む、誘導性キメラサイトカイン受容体を提供する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ活性化ドメインは、タンパク質の、またはタンパク質に由来するヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）結合ドメインを含む。これらの実施形態のうちのいくつかでは、チロシンキナーゼ活性化ドメインは、膜貫通ドメインをさらに含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ活性化ドメインは、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の、または受容体チロシンキナーゼに由来するチロシンキナーゼドメインを含む。これらの実施形態のうちのいくつかでは、チロシンキナーゼ活性化ドメインは、膜貫通ドメインをさらに含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、チロシンエフェクタードメインは、少なくとも１つの受容体の、または少なくとも１つの受容体に由来するＳＴＡＴ活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、チロシンエフェクタードメインは、２つの受容体の、または２つの受容体に由来する少なくとも２つのＳＴＡＴ活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、チロシンエフェクタードメインは、少なくとも３つ、４つ、またはそれを超える受容体のＳＴＡＴ活性化ドメイン、またはそれらに由来するＳＴＡＴ活性化ドメインを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、チロシンエフェクタードメインは、少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の、または少なくとも１つの受容体チロシンキナーゼに由来する細胞質側尾部の一部分を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、二量体形成ドメインは、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、二量体ＦＫ５０６、または二量体ＦＫ５０６様類似体のようなリガンドに結合する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、二量体形成ドメインは、ＦＫＢＰポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＦＫＢＰポリペプチドは、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｆ３６Ｖ（配列番号２１８）を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、二量体形成ドメインは、（ｉ）１つ以上のアミノ酸置換を含むＦＫＢＰポリペプチド、（ｉｉ）未修飾ＦＫＢＰポリペプチドの２つまたは３つのタンデムリピート、および（ｉｉｉ）１つ以上のアミノ酸置換を含むＦＫＢＰポリペプチドの２つまたは３つのタンデムリピートからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、二量体形成ドメインは、配列番号６９〜８７から選択される二量体形成ドメイン配列を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、二量体形成ドメインは、配列番号６９〜７３から選択されるＦＫＢＰ二量体形成ドメイン配列を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、二量体形成ドメインは、ＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ）、ＯＸ−４０の細胞外ドメイン、およびＴＮＦＲ２スーパーファミリー受容体の細胞外ドメインからなる群から選択されるポリペプチドの、またはそれに由来するアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、ＴＮＦＲ２スーパーファミリー受容体は、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、またはＢＡＦＦＲである。
【００１８】
いくつかの実施形態では、二量体形成ドメインは、小分子に結合する。例示的な実施形態では、小分子は、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、二量体ＦＫ５０６、または二量体ＦＫ５０６様類似体である。いくつかの実施形態では、二量体形成ドメインは、タンパク質に結合する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、二量体形成ドメインは、ＦＫＢＰ、シクロフィリン、ステロイド結合タンパク質、エストロゲン結合タンパク質、グルココルチコイド結合タンパク質、ビタミンＤ結合タンパク質、テトラサイクリン結合タンパク質、サイトカイン受容体の細胞外ドメイン、受容体チロシンキナーゼ、ＴＮＦＲファミリー受容体、および免疫共受容体からなる群から選択されるタンパク質の、またはそれに由来するアミノ酸配列を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、二量体形成ドメインが由来する免疫共受容体は、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、成長ホルモン受容体、トロンボポエチン受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、ＧＰ１３０、共通ガンマ鎖受容体、共通ベータ鎖受容体、ＩＦＮアルファ受容体、ＩＦＮガンマ受容体、ＩＦＮラムダ受容体、ＩＬ２／ＩＬ１５受容体、ＩＬ３受容体、ＩＬ４受容体、ＩＬ５受容体、ＩＬ７受容体、ＩＬ９受容体、ＩＬ１０受容体、ＩＬ１２受容体、ＩＬ１３受容体、ＩＬ２０受容体、ＩＬ２１受容体、ＩＬ２２受容体、ＩＬ２３受容体、ＩＬ２７受容体、ＴＳＬＰ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、ＣＮＴＦ受容体、ＯＳＭ受容体、ＬＩＦ受容体、ＣＴ−１受容体、ＴＧＦＢＲ１／ＡＬＫＬ５、ＴＧＦＢＲ２、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ３／ＨＥＲ３、ＥＲＲＢ４／ＨＥＲ４、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲＲ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＣＳＦ−１Ｒ、ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＦＬＫ２／ＦＬＴ３、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３、ＦＧＦＲ−４、ＣＣＫ４、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＲＥＴ、ＲＯＳ、ＬＴＫ、ＡＬＫ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ、ＡＡＴＹＫ２、ＡＡＴＹＫ３、ＲＴＫ１０６、ＴＮＦＲ１、Ｆａｓ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＮＧＦＲ、ＤＲ３、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、ＴＮＦＲ２、ＬＴｂＲ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４−１ＢＢ、ＲＡＮＫ、Ｆｎ１４、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＢＣＭＡ、ＧＩＴＲ、ＴＲＯＹ、ＲＥＬＴ、ＸＥＤＡＲ、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＤｃＲ３、ＰＤ−１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＬＡＧ３、およびＴＩＭ３からなる群から選択される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ活性化ドメインは、受容体の、または受容体に由来するＪＡＫ結合ドメインを含む。例示的な実施形態では、受容体は、ホルモン受容体である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ活性化ドメインは、ＥＰＯＲ、ＧＰ１３０、ＰＲＬＲ、ＧＨＲ、ＧＣＳＦＲ、およびＴＰＯＲ／ＭＰＬＲからなる群から選択される受容体の、またはそれに由来するＪＡＫ結合ドメインを含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ活性化ドメインは、ＲＴＫの、またはＲＴＫに由来するチロシンキナーゼドメインを含み、ＲＴＫは、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ３／ＨＥＲ３、ＥＲＲＢ４／ＨＥＲ４、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲＲ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＣＳＦ−１Ｒ、ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＦＬＫ２／ＦＬＴ３、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＦＧＦＲ−１  ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３、ＦＧＦＲ−４、ＣＣＫ４、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＲＥＴ、ＲＯＳ、ＬＴＫ、ＡＬＫ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ、ＡＡＴＹＫ２、ＡＡＴＹＫ３、およびＲＴＫ１０６からなる群から選択される。例示的な実施形態では、ＲＴＫは、ＥＧＦＲである。
【００２４】
いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ活性化ドメインは、配列番号８８〜１３３から選択されるチロシンキナーゼ活性化ドメインを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ活性化ドメインに存在する膜貫通ドメインは、ＥＰＯＲ、ＧＰ１３０、ＰＲＬＲ、ＧＨＲ、ＧＣＳＦＲ、ＰＤ−１、およびＴＰＯＲ／ＭＰＬＲからなる群から選択されるタンパク質の、またはそれに由来する膜貫通ドメインを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲに由来する膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号６４の天然に発生するＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ配列のアミノ酸４７８〜５８２に由来する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号６４の天然に発生するＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ配列のアミノ酸領域４７８〜５８２の欠失バリアントを含む。いくつかの実施形態では、欠失バリアントは、配列番号６４の天然に発生するＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ配列の領域４７８〜５８２からの１〜１８アミノ酸の欠失を含む。いくつかの実施形態では、欠失バリアントは、配列番号６４の天然に発生するＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ配列の領域４８９〜５１０からの１〜１８アミノ酸の欠失を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号６４の天然に発生するＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ配列のアミノ酸領域４７８〜５８２の挿入バリアントを含む。いくつかの実施形態では、挿入バリアントは、配列番号６４の天然に発生するＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ配列の領域４７８〜５８２において１〜８アミノ酸の挿入を含む。いくつかの実施形態では、挿入バリアントは、配列番号６４の天然に発生するＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ配列の領域４８９〜５１０において１〜８アミノ酸の挿入を含む。例示的な実施形態では、挿入バリアントに挿入されたアミノ酸は、ロイシン、バリン、およびイソロイシンからなる群から選択される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、チロシンエフェクタードメインは、受容体の、または受容体に由来する少なくとも１つのＳＴＡＴ活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、チロシンエフェクタードメインは、２つの受容体の、または２つの受容体に由来する少なくとも２つのＳＴＡＴ活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、チロシンエフェクタードメインは、少なくとも３つ、４つ、またはそれを超える受容体のＳＴＡＴ活性化ドメイン、またはそれらに由来するＳＴＡＴ活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、受容体は、ホルモン受容体および／またはサイトカイン受容体である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、チロシンエフェクタードメインは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれを超える受容体の、またはそれらに由来するＳＴＡＴ活性化ドメインを含み、受容体は、ＢＬＮＫ、ＩＬ２ＲＧ、ＥＧＦＲ、ＥｐｏＲ、ＧＨＲ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＡＲ１／２、ＩＦＮＬＲ１、ＩＬ１０Ｒ１、ＩＬ１２Ｒｂ１、ＩＬ１２Ｒｂ２、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２Ｒｂ、ＩＬ２ｓｍａｌｌ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、およびＩＬ２１Ｒからなる群から選択される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、チロシンエフェクタードメインは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれを超える受容体の、またはそれらに由来するサイトテール（ｃｙｔｏｔａｉｌ）（リン酸化され得る１つ以上のチロシン残基を含む受容体の細胞質側尾部の一部分）を含み、受容体は、サイトカイン受容体、ホルモン受容体、および／またはＲＴＫである。
【００３２】
いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体は、二量体形成ドメインと、膜貫通ドメインおよびＪＡＫ結合ドメインを含むチロシンキナーゼ活性化ドメインと、受容体の、または受容体に由来する少なくとも１つのＳＴＡＴ活性化ドメインを含むチロシンエフェクタードメインと、を含む。これらの実施形態うちのいくつかでは、チロシンエフェクタードメインは、少なくとも２つ、３つ、４つ、またはそれを超える受容体の、またはそれらに由来するＳＴＡＴ活性化ドメインを含み得る。
【００３３】
いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体は、二量体形成ドメインと、膜貫通ドメインおよびＪＡＫ結合ドメインを含むチロシンキナーゼ活性化ドメインと、受容体の、または受容体に由来する少なくとも１つのサイトテールを含むチロシンエフェクタードメインと、を含む。これらの実施形態うちのいくつかでは、チロシンエフェクタードメインは、少なくとも２つ、３つ、４つ、またはそれを超える受容体の、またはそれらに由来するサイトテールを含み得る。
【００３４】
いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体は、ＦＫＢＰポリペプチドを含む二量体形成ドメインと、膜貫通ドメインおよびＪＡＫ結合ドメインを含むチロシンキナーゼ活性化ドメインであって、膜貫通ドメインが、ＥＰＯＲ、ＧＰ１３０、ＰＲＬＲ、ＧＨＲ、ＧＣＳＦＲ、ＰＤ−１、およびＴＰＯＲからなる群から選択されるタンパク質の、またはそれに由来する膜貫通ドメインを含み、ＪＡＫ結合ドメインが、ＥＰＯＲ、ＧＰ１３０、ＰＲＬＲ、ＧＨＲ、ＧＣＳＦＲ、およびＴＰＯＲからなる群から選択されるタンパク質の、またはそれに由来するＪＡＫ結合ドメインを含む、チロシンキナーゼ活性化ドメインと、ＢＬＮＫ、ＩＬ２ＲＧ、ＥＧＦＲ、ＥｐｏＲ、ＧＨＲ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＡＲ１／２、ＩＦＮＬＲ１、ＩＬ１０Ｒ１、ＩＬ１２Ｒｂ１、ＩＬ１２Ｒｂ２、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２Ｒｂ、ＩＬ２ｓｍａｌｌ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、およびＩＬ２１Ｒからなる群から選択される受容体の、またはそれに由来する少なくとも１つのＳＴＡＴ活性化ドメインを含むチロシンエフェクタードメインと、を含む。これらの実施形態うちのいくつかでは、チロシンエフェクタードメインは、少なくとも２つ、３つ、４つ、またはそれを超える受容体の、またはそれらに由来するＳＴＡＴ活性化ドメインを含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、チロシンエフェクタードメインは、配列番号１３４〜１７６から選択されるチロシンエフェクタードメイン配列を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、二量体形成ドメインは、誘導性キメラサイトカイン受容体のＮ末端に位置付けられる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、二量体形成ドメインは、誘導性キメラサイトカイン受容体のＣ末端に位置付けられる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体は、膜標的化モチーフを含む。例示的な実施形態では、膜標的化モチーフは、ミリストイル化モチーフを含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体は、ミリストイル化される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体は、表２Ａまたは２Ｂに開示される配列を含む。いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体は、配列番号１〜５８、１８７〜２１５、および２２５〜３１１から選択される配列を含む。
【００４１】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される誘導性キメラサイトカイン受容体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。別の態様では、本開示は、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００４２】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される少なくとも１つの誘導性キメラサイトカイン受容体を含む操作された免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、少なくとも２つの誘導性キメラサイトカイン受容体を含む。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、本明細書に開示される少なくとも３つまたは４つの誘導性キメラサイトカイン受容体を含む。２つ以上の誘導性キメラサイトカイン受容体が免疫細胞に存在する際に、各受容体の二量体形成ドメイン、チロシンキナーゼ活性化ドメイン、およびチロシンエフェクタードメインは、同じまたは異なり得る。
【００４３】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される誘導性キメラサイトカイン受容体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む操作された免疫細胞を提供する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、およびＢ細胞からなる群から選択される。
【００４６】
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、幹細胞に由来する。例示的な実施形態では、免疫細胞は、成人幹細胞、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞に由来する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、自己Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、同種Ｔ細胞である。
【００４８】
別の態様では、本開示は、対象において操作された免疫細胞を調節する方法を提供し、方法は、本明細書に記載される操作された免疫細胞を以前に投与されている対象にリガンドを投与することを含み、二量体リガンドは誘導性キメラサイトカイン受容体の二量体形成ドメインに結合する。例示的な実施形態では、リガンドは、ＡＰ１９０３である。
【００４９】
別の態様では、操作された免疫細胞を調製する方法が、本明細書に提供され、方法は、誘導性キメラサイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドまたは発現ベクターを免疫細胞に導入することを含む。例示的な実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、および幹細胞に由来する免疫細胞からなる群から選択される。例示的な実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。
【００５０】
別の態様では、本開示は、（ｉ）本明細書に開示される二量体形成ドメイン、チロシンキナーゼ活性化ドメイン、およびチロシンエフェクタードメインを含む、少なくとも１つの誘導性キメラサイトカイン受容体と、（ｉｉ）細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、を含む、単離された免疫細胞を提供する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、単離された免疫細胞は、少なくとも２つの誘導性キメラサイトカイン受容体を含む。いくつかの他の実施形態では、単離された免疫細胞は、３つまたは４つの誘導性キメラサイトカイン受容体を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本開示の単離された免疫細胞は、誘導性キメラサイトカイン受容体を発現しない単離された免疫細胞の残存性に対して、二量体形成ドメインに結合するリガンドとの接触時に改善された残存性を呈する。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本開示の単離された免疫細胞は、誘導性キメラサイトカイン受容体を発現しない単離された免疫細胞により示されたＳＴＡＴの活性化に対して、二量体形成ドメインに結合するリガンドとの接触時にＳＴＡＴの増加した活性化を呈する。細胞において活性化されたＳＴＡＴは、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本開示の単離された免疫細胞によるＳＴＡＴの活性化は、誘導性キメラサイトカイン受容体を発現しない単離された免疫細胞により示されたＳＴＡＴの活性化と比較して、二量体形成ドメインに結合するリガンドとの接触時に、リガンドの用量と共に増加する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本開示の単離された免疫細胞は、誘導性キメラサイトカイン受容体を発現しない単離された免疫細胞により呈された細胞傷害性と比較して、二量体形成ドメインに結合するリガンドとの接触時に増加した細胞傷害性を呈する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本開示の単離された免疫細胞は、誘導性キメラサイトカイン受容体を発現しない単離された免疫細胞と比較して、二量体形成ドメインに結合するリガンドとの接触時に増殖（ｅｘｐａｎｄ）（増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ））する。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本開示の単離された免疫細胞上の幹細胞メモリー（Ｔｓｃｍ）および／またはセントラルメモリー（Ｔｃｍ）に対する細胞マーカーのレベルは、誘導性キメラサイトカイン受容体を発現しない単離された免疫細胞上のこれらのマーカーのレベルと比較して、二量体形成ドメインに結合するリガンドとの接触時に増加または維持される。
【００５８】
一態様では、本明細書に開示される誘導性キメラサイトカイン受容体を含む単離された免疫細胞を生成する方法が、本明細書に提供され、方法は、（ａ）免疫細胞を提供するステップと、（ｂ）細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを免疫細胞に導入するステップと、（ｃ）誘導性キメラサイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチドを免疫細胞に導入するステップと、を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、上記方法のステップｃ）は、細胞中に誘導性キメラサイトカイン受容体を安定的に発現させることを含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、上記方法のステップｃ）において、誘導性キメラサイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチドは、トランスポゾン／トランスポザーゼ系、ウイルスベースの遺伝子導入系、または電気穿孔によって細胞中に導入される。
【００６１】
いくつかの実施形態では、上記方法のステップｂ）において、誘導性キメラサイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチドは、トランスポゾン／トランスポザーゼ系またはウイルスベースの遺伝子導入系によって細胞中に導入される。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ウイルスベースの遺伝子導入系は、組換えレトロウイルスまたはレンチウイルスを含む。
【００６３】
上記方法のいくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）がステップ（ｃ）の前に発生するか、またはステップ（ｃ）がステップ（ｂ）の前に発生する。
【００６４】
一態様では、本開示は、本明細書に記載される単離された免疫細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００６５】
一態様では、本開示は対象における障害を治療するための方法を提供し、方法は、本明細書に開示される誘導性サイトカイン受容体を含む単離された免疫細胞を投与すること、またはかかる免疫細胞を含む医薬組成物を投与することを含む。
【００６６】
一態様では、本開示は、本明細書に開示される単離された免疫細胞、または障害を治療するための単離された免疫細胞を含む医薬組成物の使用を提供する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、細胞または医薬組成物は、２回以上対象に提供される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、細胞または医薬組成物は、少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、またはそれを超える差で対象に提供される。
【００６９】
いくつかの実施形態では、対象は、単離された免疫細胞または医薬組成物の投与前に、治療薬で以前に治療されている。例示的な実施形態では、治療薬は、抗体または化学療法薬である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本開示の方法を使用して治療される障害は、ウイルス性疾患、細菌性疾患、がん、炎症性疾患、免疫疾患、または加齢関連疾患である。がんは、造血器腫瘍または固形癌であり得る。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本方法を使用して治療される造血器腫瘍は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性好酸球性白血病（ＣＥＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、または多発性骨髄腫（ＭＭ）から選択される。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本方法を使用して治療される固形癌は、胆管癌、膀胱癌、骨および軟部組織腫瘍、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸腺癌、結腸直腸癌、デスモイド腫瘍、胚性癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、胃腺癌、多形性膠芽腫、婦人科腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、肝癌、肺癌、悪性黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、膵管腺癌、原発性星状細胞腫瘍、原発性甲状腺癌、前立腺癌、腎癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、皮膚癌、軟部組織肉腫、精巣胚細胞腫瘍、尿路上皮癌、子宮肉腫、または子宮癌から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】例示的な誘導性キメラサイトカイン受容体の概略図を示す。
【図２Ａ】ｍＴＯＲを阻害するためのＦＫＢＰ結合ラパマイシンの概略図を示す。
【図２Ｂ】ラパマイシン様化合物に結合するＦＫＢＰF36Vの概略図を示す。
【図２Ｃ】ＡＰ１９０３二量体化ＦＫＢＰF36Vの概略図を示す。
【図３】例示的な誘導性キメラサイトカイン受容体の概略図を示す。
【図４】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験するＳＴＡＴ５アッセイの結果を要約する棒グラフを示す。
【図５Ａ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験する細胞ベースのレポーターアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図５Ｂ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験する細胞ベースのレポーターアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図６】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験する細胞ベースのレポーターアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図７】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験する細胞ベースのレポーターアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図８】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験する細胞ベースのレポーターアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図９】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験する細胞ベースのレポーターアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図１０Ａ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験する細胞ベースのレポーターアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図１０Ｂ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験する細胞ベースのレポーターアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図１０Ｃ】キメラサイトカイン受容体を操作する伝統的なアプローチを示す概略図を示す。
【図１０Ｄ】キメラサイトカイン受容体を操作するために本開示において使用されるアプローチを示す概略図を示す。
【図１０Ｅ】実施例５Ｃにおける細胞ベースのレポーターアッセイにおいて試験されたキメラ受容体の概略図を示す。
【図１０Ｆ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験する細胞ベースのレポーターアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図１１】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験する細胞ベースのレポーターアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図１２】プロモーター配列に結合するＡＰ−１を有するＮＦＡＴの概略図を示す。
【図１３】Ｍｙｃ／Ｍａｘを通じたＦｏｓの上方制御を引き起こすＭＥＫ／ＥＲＫ経路の概略図を示す。
【図１４】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験する細胞ベースのレポーターアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図１５】ＢＴＫ経路の概略図を示す。
【図１６】細胞成長に対する示された誘導性キメラサイトカイン受容体の効果を要約するグラフを示す。
【図１７】細胞生存に対する示された誘導性キメラサイトカイン受容体の効果を要約するグラフを示す。
【図１８】細胞表現型に対する示された誘導性キメラサイトカイン受容体の効果を要約するグラフを示す。
【図１９】細胞表現型に対する示された誘導性キメラサイトカイン受容体の効果を要約するグラフを示す。
【図２０】サイトカイン放出に対する示された誘導性キメラサイトカイン受容体の効果を要約するグラフを示す。
【図２１】サイトカイン放出に対する示された誘導性キメラサイトカイン受容体の効果を要約するグラフを示す。
【図２２】シグナル伝達の非存在下における増殖に対する示された誘導性キメラサイトカイン受容体の効果を要約するグラフを示す。
【図２３】シグナル伝達の非存在下におけるサイトカイン放出に対する示された誘導性キメラサイトカイン受容体の効果を要約するグラフを示す。
【図２４】シグナル伝達の非存在下におけるサイトカイン放出に対する示された誘導性キメラサイトカイン受容体の効果を要約するグラフを示す。
【図２５】細胞成長に対する示された誘導性キメラサイトカイン受容体の効果を要約するグラフを示す。
【図２６】二重チロシンエフェクタードメインを有する例示的な誘導性サイトカイン受容体の概略図を示す。
【図２７Ａ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験する細胞ベースのレポーターアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図２７Ｂ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験する細胞ベースのレポーターアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図２８Ａ】ＣＡＲおよび誘導性サイトカイン受容体を含む例示的な構築物の概略図を示す。
【図２８Ｂ】図２８Ａに示された構築物を含むベクターを用いて形質導入されたＴ細胞の形質導入効率を示す。
【図２８Ｃ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験するＦＡＣＳ分析の結果を要約するグラフを示す。
【図２９】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験するＦＡＣＳ分析の結果を要約するグラフを示す。
【図３０Ａ】ＣＡＲおよび誘導性サイトカイン受容体を含む例示的な構築物の概略図を示す。
【図３０Ｂ】示されたＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性を試験するインビトロアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３０Ｃ】示されたＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性を試験するインビトロアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３０Ｄ】示されたＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性を試験するインビトロアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３０Ｅ】示されたＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性を試験するインビトロアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３１Ａ】示された治療群に対する腫瘍体積アッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３１Ｂ】示された治療群に対する腫瘍体積アッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３１Ｃ】示された治療群に対する腫瘍体積アッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３１Ｄ】示された治療群に対する腫瘍体積アッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３１Ｅ】示された治療群に対する腫瘍体積アッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３１Ｆ】示された治療群に対する腫瘍体積アッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３１Ｇ】示された治療群に対する腫瘍体積アッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３１Ｈ】示された治療群に対する全生存を要約するグラフを示す。
【図３２Ａ】示されたＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を要約するグラフを示す。
【図３２Ｂ】細胞表現型に対する示された誘導性キメラサイトカイン受容体の効果を要約するグラフを示す。
【図３３Ａ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験する細胞ベースのレポーターアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３３Ｂ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験する細胞ベースのレポーターアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３３Ｃ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験する細胞ベースのレポーターアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３３Ｄ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験する細胞ベースのレポーターアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３４Ａ】ＣＡＲおよび誘導性サイトカイン受容体を含む例示的な構築物の概略図を示す。
【図３４Ｂ】示されたＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性を試験するインビトロアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３４Ｃ】示されたＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性を試験するインビトロアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３４Ｄ】示されたＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性を試験するインビトロアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３４Ｅ】示されたＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を試験するアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３４Ｆ】示されたＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を試験するアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３５Ａ】ＣＡＲおよび誘導性キメラサイトカイン受容体を含む例示的な構築物の概略図を示す。
【図３５Ｂ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体を含む対照ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を示すグラフを示す。
【図３５Ｃ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体を含むＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を示すグラフを示す。
【図３５Ｄ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体を含むＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を示すグラフを示す。
【図３５Ｅ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体を含むＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を示すグラフを示す。
【図３６Ａ】例示的な誘導性キメラサイトカイン受容体の概略図を示す。
【図３６Ｂ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験する細胞ベースのレポーターアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３６Ｃ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験する細胞ベースのレポーターアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３７Ａ】例示的な誘導性キメラサイトカイン受容体の概略図を示す。
【図３７Ｂ】受容体ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、およびＢＡＦＦＲの間のそれらのリガンドＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬとの相互作用の概略図である。
【図３７Ｃ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験する細胞ベースのレポーターアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３７Ｄ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験する細胞ベースのレポーターアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３８Ａ】野生型ＴｐｏＲおよびさまざまな膜貫通欠失バリアントに対するアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｂ】野生型ＴｐｏＲおよびさまざまな膜貫通挿入バリアントに対するアミノ酸配列を示す。
【図３８Ｃ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験する細胞ベースのレポーターアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図３９Ａ】例示的な誘導性キメラサイトカイン受容体の概略図を示す。
【図３９Ｂ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体の機能を試験する細胞ベースのレポーターアッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図４０Ａ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体を含むＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害性アッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図４０Ｂ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体を含むＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害性アッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図４０Ｃ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体を含むＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害性アッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図４０Ｄ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体を含むＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害性アッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図４０Ｅ】示された誘導性キメラサイトカイン受容体を含むＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害性アッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図４０Ｆ】示されたキメラ受容体を含むＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害性アッセイの結果を要約するグラフを示す。
【図４１Ａ】サイトカイン放出に対する示された誘導性キメラサイトカイン受容体の効果を要約するグラフを示す。
【図４１Ｂ】サイトカイン放出に対する示された誘導性キメラサイトカイン受容体の効果を要約するグラフを示す。
【図４２Ａ】サイトカイン放出に対する示された誘導性キメラサイトカイン受容体の効果を要約するグラフを示す。
【図４２Ｂ】サイトカイン放出に対する示された誘導性キメラサイトカイン受容体の効果を要約するグラフを示す。
【図４３】示されたキメラサイトカイン受容体を含むＣＡＲ−Ｔ細胞の濃縮を要約するグラフを示す。
【図４４Ａ】示されたキメラサイトカイン受容体を含むＣＡＲ−Ｔ細胞のメモリーサブセット分配を要約するグラフを示す。
【図４４Ｂ】示されたキメラサイトカイン受容体を含むＣＡＲ−Ｔ細胞のメモリーサブセット分配を要約するグラフを示す。
【図４４Ｃ】示されたキメラサイトカイン受容体を含むＣＡＲ−Ｔ細胞のメモリーサブセット分配を要約するグラフを示す。
【図４４Ｄ】示されたキメラサイトカイン受容体を含むＣＡＲ−Ｔ細胞のメモリーサブセット分配を要約するグラフを示す。
【図４４Ｅ】示されたキメラサイトカイン受容体を含むＣＡＲ−Ｔ細胞のメモリーサブセット分配を要約するグラフを示す。
【図４４Ｆ】示されたキメラサイトカイン受容体を含むＣＡＲ−Ｔ細胞のメモリーサブセット分配を要約するグラフを示す。
【図４４Ｇ】示されたキメラサイトカイン受容体を含むＣＡＲ−Ｔ細胞のメモリーサブセット分配を要約するグラフを示す。
【図４５Ａ】細胞表現型に対する示された誘導性キメラサイトカイン受容体の効果を要約するグラフを示す。
【図４５Ｂ】細胞表現型に対する示された誘導性キメラサイトカイン受容体の効果を要約するグラフを示す。
【図４５Ｃ】細胞表現型に対する示された誘導性キメラサイトカイン受容体の効果を要約するグラフを示す。
【図４５Ｄ】細胞表現型に対する示された誘導性キメラサイトカイン受容体の効果を要約するグラフを示す。
【図４５Ｅ】細胞表現型に対する示された誘導性キメラサイトカイン受容体の効果を要約するグラフを示す。
【図４５Ｆ】細胞表現型に対する示された誘導性キメラサイトカイン受容体の効果を要約するグラフを示す。
【図４５Ｇ】細胞表現型に対する示された誘導性キメラサイトカイン受容体の効果を要約するグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
本発明は、キメラ受容体と、免疫細胞のインビボ残存性および治療有効性を改善するためのその使用と、を提供する。小分子（例えば、ＡＰ１９０３）またはタンパク質（例えば、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ、もしくはＰＤ−Ｌ１）のようなリガンドに応答する受容体が、本明細書に提供される。また、かかる誘導性キメラサイトカインを含む細胞、かかる細胞を含む組成物、およびＣＡＲ−Ｔ細胞のような単離されたＴ細胞の機能的活性を改善するための方法も、提供される。また、改善された残存性を有するＣＡＲ−Ｔ細胞、および障害を治療するためにかかるＣＡＲ−Ｔ細胞を使用する方法も、本明細書に提供される。
【００７５】
一般的技法
本発明の慣行は、別段示されない限り、当該分野の範囲内である、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技法を採用するであろう。かかる技法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３−１９９８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ａｎｄ  Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）のような文献において完全に説明される。
【００７６】
定義
本明細書で使用される場合、「自己」は、対象を治療するために使用される細胞、細胞株、または細胞の集団が、該対象から、またはヒト白血球（ＨＬＡ）適合性ドナーから生じていることを意味する。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「同種」は、対象を治療するために使用される細胞または細胞の集団が、該対象からではないが、ドナーから生じていることを意味する。
【００７８】
本明細書で使用される場合、用語「内因性」は、生物、細胞、組織または系からの、またはその内側で生み出された任意の材料を指す。
【００７９】
本明細書で使用される場合、用語「外因性」は、生物、細胞、組織または系から導入された、またはその外側で生み出された任意の材料を指す。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」は、自然および／または適応免疫応答の開始および／または遂行に機能的に関与した造血系由来の細胞を指す。免疫細胞の例は、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、インバリアントＮＫＴ細胞、マスト細胞、骨髄由来食細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マクロファージ、ならびに単球を含む。本明細書で使用される用語「免疫細胞」は、例えば、限定なく、幹細胞に由来する細胞も指す。幹細胞は、成人幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より具体的には非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。
【００８１】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、約１０〜２５０、１０〜５００、１０〜１０００、５０〜２００、５０〜５００、または５０〜１０００アミノ酸を含有するより長い鎖と同様に、任意の長さ、好ましくは、比較的短鎖（例えば、１０〜１００アミノ酸）のアミノ酸の鎖を指す。鎖は直線状または分岐状であり得、それは、修飾されたアミノ酸を含むことができ、および／または非アミノ酸により中断され得る。用語は、天然にまたは介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、もしくは標識構成成分とのコンジュゲーションのような、任意の他の操作もしくは修飾により修飾されているアミノ酸鎖も包含する。また、当該技術分野で既知の他の修飾と同様に、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１つ以上の類似体を含有するポリペプチドも、定義内に含まれる。ポリペプチドは１本鎖または関連する鎖として発生することができることが、理解される。
【００８２】
本明細書で使用される場合、用語「発現」は、プロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を指す。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に動作可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、裸の、またはリポソームに含有された）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含む、当該技術分野で既知のすべてのものを含む。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「動作可能に連結された」は、一方の機能が他方により影響されるような、単一の拡散断片上の核酸配列の対合を指す。例えば、プロモーターは、プロモーターがそのコード配列の発現に影響することができる（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）際に、コード配列に動作可能に連結される。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「発現制御配列」は、核酸の転写を方向付ける核酸配列を意味する。発現制御配列は、構成的もしくは誘導性プロモーターのようなプロモーター、またはエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写される核酸配列に動作可能に連結される。
【００８６】
「プロモーター」および「プロモーター配列」は、互換的に使用され、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置付けられる。異なるプロモーターは、異なる組織もしくは細胞型における、または異なる発達段階での、または異なる環境もしくは生理学的条件に応答する遺伝子の発現を方向付け得ることが、当業者によって理解される。
【００８７】
本発明のベクターのうちのいずれかでは、ベクターは、任意選択で、本明細書に開示されるプロモーターを含む。
【００８８】
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチド挿入物の組込みのためのベクター（複数可）に対するレシピエントであり得るか、またはそれであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は単一の宿主細胞の後代を含み、後代は、自然、偶発的、または計画的突然変異に起因して、必ずしも本来の親細胞に完全に同一であり得るわけではない（形態において、またはゲノムＤＮＡ補体において）。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチド（複数可）を用いてインビボでトランスフェクトされた細胞を含む。
【００８９】
本明細書で使用される用語「細胞外リガンド結合ドメイン」は、リガンドに結合することができるオリゴまたはポリペプチドを指す。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状況に関連して標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するために選択され得る。
【００９０】
用語「ストークドメイン」または「ヒンジドメイン」は、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結させるように機能する任意のオリゴまたはポリヌクレオチドを指すために、本明細書で互換的に使用される。特に、ストークドメインは、細胞外リガンド結合ドメインに対して可撓性および到達性をより提供するために使用される。
【００９１】
用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクターシグナル機能シグナルを形質導入し、特定化された機能を実行するよう細胞を方向づけるタンパク質の部分を指す。
【００９２】
本明細書で使用される「共刺激分子」は、共刺激リガンドに特異的に結合し、それによって、限定されないが、増殖のような細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体を含むが、これらに限定されない。共刺激分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３などに特異的に結合するリガンドを含む。
【００９３】
「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞上の同族共刺激シグナル分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のヒトに負荷されたＭＨＣ分子と結合することによって提供される主要なシグナルに加えて、これらに限定されないが、増殖活性化、分化などを含むＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する。共刺激リガンドは、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびＢ７−Ｈ３に特異的に結合するリガンドを含み得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドは、とりわけ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＴＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンドのような、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体も包含する。
【００９４】
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置付けられる少なくとも１つの抗原認識部位を通じて、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどのような標的に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書で使用される場合、用語は、無傷のポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、その抗原結合断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦｖ）、ならびに、例えば、限定なく、１本鎖（ｓｃＦｖ）およびドメイン抗体（例えば、サメおよびラクダ抗体を含む）、ならびに抗体、抗体模倣物または特異的タンパク質−タンパク質相互作用を提供する任意のタンパク質を含む融合タンパク質を含む、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された立体配置も包含する。
【００９５】
本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合断片」または「抗原結合部分」は、所与の抗原に特異的に結合する能力を保持する無傷の抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、無傷の抗体の断片によって実行され得る。抗体の用語「抗原結合断片」内に包含される結合断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９、ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００９６】
抗体、抗体複合体、または標的（例えば、ＢＣＭＡタンパク質）に「優先的に結合」もしくは「特異的に結合」するポリペプチドは、当該技術分野で周知の用語であり、かかる特異的または優先的結合を決定する方法はまた、当該技術分野で周知である。分子は、分子が代替的な細胞または物質と行うよりも頻繁に、急速に、長い持続期間で、および／または大きな親和性で、特定の細胞または物質と反応または会合する場合、「特異的結合」または「優先的結合」を呈すると言われる。抗体は、抗体が他の物質に結合するよりも大きな親和性、結合力で、容易に、および／または長い持続時間で結合する場合、標的に「特異的結合」または「優先的結合」する。本定義を読むことにより、例えば、第１の標的に特異的または優先的に結合する抗体（または部分またはエピトープ）は、特異的または優先的に第２の標的に結合することができるか、または結合することができないことも、理解される。したがって、「特異的結合」または「優先的結合」は、排他的結合を（含み得るが）必ずしも要求しない。必ずではないが、一般に、結合に対する参照は、優先的結合を意味する。
【００９７】
本明細書で互換的に使用され、当該技術分野で既知のように、「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドの鎖を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらの類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによって鎖の中に組み込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドのような修飾されたヌクレオチドおよびそれらの類似体を含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、鎖の構築の前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識構成成分とのコンジュゲーションのような重合後にさらに修飾され得る。修飾の他の型は、例えば、「キャップ」、１つ以上の天然に発生するヌクレオチドの類似体での置換、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄａｔｅ）、カルバメートなど）を伴う、および荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を伴うもの、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）のようなペンダント部分を含むもの、介入物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を有するもの（例えば、アルファアノマー核酸など）のようなヌクレオチド間修飾、同様にポリヌクレオチド（複数可）の未修飾形態を含む。さらに、糖において普通に存在するヒドロキシル基のうちのいずれかは、例えば、ホスホネート基、リン酸基により置き換えられるか、標準的な保護基により保護されるか、または追加的なヌクレオチドへの追加的な結合を調製するように活性化されることができるか、または固体支持物にコンジュゲートされ得る。５’および３’末端ＯＨは、リン酸化されるか、または１〜２０炭素原子のアミンまたは有機キャップ形成基部分で置換されることができる。他のヒドロキシルはまた、標準的な保護基に誘導体化され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、アルファ−またはベータ−アノマー糖、アラビノース、キシロースまたはリキソースのようなエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環状類似体およびメチルリボシドのような無塩基ヌクレオシド類似体を含む、当該技術分野で一般に既知のリボースまたはデオキシリボース糖の類似の形態も含むことができる。１つ以上のホスホジエステル結合は、代替的な結合基により置き換えられ得る。これらの代替的な結合基は、これらに限定されないが、リン酸塩がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ2（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ2（「ホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）」）により置き換えられる実施形態を含み、各Ｒまた���Ｒ’は、独立して、任意選択でエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）を含有するＨまたは置換されたもしくは未置換のアルキル（１〜２０のＣ）である。ポリヌクレオチドにおけるすべての結合が、同一である必要はない。先行する記載は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書で参照されるすべてのポリヌクレオチドに適用する。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」は、細胞による外因性または異種ＲＮＡまたはＤＮＡの取り込みを指す。かかるＲＮＡまたはＤＮＡが細胞の内側に導入されている際に、細胞は、外因性または異種ＲＮＡまたはＤＮＡにより「トランスフェクトされている」。トランスフェクトされたＲＮＡまたはＤＮＡが表現型の変化をもたらす際に、細胞は、外因性または異種ＲＮＡまたはＤＮＡにより「形質転換されている」。形質転換するＲＮＡまたはＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡ中に組み込まれ（共有結合で連結され）得る。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「形質転換」は、遺伝学的に安定的な遺伝を生じる、核酸断片の宿主生物中への導入を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組換え」または「形質転換された」生物と称される。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋な」は、少なくとも５０％純粋な（すなわち、汚染物質を含まない）、より好ましくは、少なくとも９０％純粋、より好ましくは、少なくとも９５％純粋、さらにより好ましくは、少なくとも９８％純粋、かつ最も好ましくは、少なくとも９９％純粋である材料を指す。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「治療」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的について、有益なまたは所望の臨床結果は、以下、腫瘍性またはがん性細胞の増殖を低下させること（もしくは破壊すること）、腫瘍性細胞の転移を阻害すること、腫瘍のサイズを縮小もしくは減少させること、疾患（例えば、がん）の寛解、疾患（例えば、がん）から生じる症状を減少させること、疾患（例えば、がん）に罹患する人々の生活の質を向上させること、疾患（例えば、癌）を治療するのに要求される他の薬物の用量を減少させること、疾患（例えば、がん）の進行を遅延させること、疾患（例えば、がん）を治癒させること、および／または疾患（例えば、がん）を有する対象の生存を延長させること、のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。
【０１０２】
「寛解すること」は、治療を投与しないことと比較して１つ以上の症状の減少または改善を意味する。「寛解すること」は、症状の持続期間の短縮または低下も含む。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、薬物、化合物、または医薬組成物の「有効投薬量」または「有効量」は、任意の１つ以上の有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。予防的使用について、有益なまたは所望の結果は、リスクを除去もしくは低下させること、重症度を減少させること、または疾患の発生を遅延させることを含み、疾患、その合併症および疾患の発症中に提示する中間病原表現型を含む。治療的使用について、有益なまたは所望の結果は、さまざまな疾患もしくは状態（例えば、がんのような）の１つ以上の症状の発生を低下させることもしくはその寛解、疾患を治療するのに要求される他の薬物の用量を減少させること、別の薬物の効果を増強すること、および／または疾患の進行を遅延させることのような、臨床結果を含む。有効投薬量は、１つ以上の投与において投与され得る。本発明の目的について、薬物、化合物、または医薬組成物の有効投薬量は、直接的または間接的のいずれかで予防的または治療的治療を達成するのに十分な量である。臨床的文脈において理解されるように、薬物、化合物、または医薬組成物の有効投薬量は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と組み合わされて達成されることができるか、またはできない。したがって、「有効投薬量」は、１つ以上の治療薬を投与する文脈において考慮され得、単一の薬剤は、１つ以上の他の薬剤と組み合わされて所望の結果が達成され得る場合、有効量で与えられるよう考慮され得る。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、限定なく、ヒトおよび他の霊長類（例えば、チンパンジー、カニクイザル、ならびに他の類人猿およびサル種）、農場動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）、スポーツ動物、飼育動物を含むペット（例えば、イヌおよびネコ）、実験動物（例えば、ウサギ、マウス、ラット、およびモルモットのようなげっ歯類）、ならびに鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、および他の家禽鳥類、アヒル、ガチョウなどのような飼育、野生およびゲーム用鳥類）を含む任意の脊椎動物を指す。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物である。例示的な実施形態では、対象は、ヒトである。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、宿主細胞における目的の１つ以上の遺伝子（複数可）または配列（複数可）を送達、および好ましくは、発現することができる構築物を意味する。ベクターの例は、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤と会合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、およびプロデューサー細胞のようなある特定の真核細胞を含むが、これらに限定されない。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」は、活性成分と組み合わされた際に、成分が生物学的活性を保持することを可能にし、かつ対象の免疫系と非反応性である、任意の材料を含む。例は、リン酸緩衝生理食塩水溶液のような標準的な薬学的担体、水、油／水乳濁液、およびさまざまな型の湿潤剤のうちのいずれかを含むが、これらに限定されない。エアロゾルまたは非経口投与のための好ましい希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または通常（０．９％）生理食塩水である。かかる担体を含む組成物は、周知の従来の方法により製剤化される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２００５を参照されたい）。
【０１０７】
本明細書の「約」値またはパラメータへの参照は、その値またはパラメータ自体に関する実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」を参照する記載は、「Ｘ」の記載を含む。数的範囲は、範囲を定義する数を含んでいる。
【０１０８】
実施形態が「含む」という言語を用いて本明細書に記載されるどのような場合でも、「からなる」および／または「から本質的になる」の点で記載される類似の実施形態も、提供されることが理解される。
【０１０９】
本発明の態様または実施形態がＭａｒｋｕｓｈグループまたは代替物の他のグループ化の点で記載される場合、本発明は、全体として列挙される全体的なグループだけでなく、グループの各メンバー個々および主なグループのすべての可能なサブグループ、また、非存在の主なグループグループメンバーのうちの１つ以上を包含する。本発明は、特許請求された発明におけるグループメンバーのうちのいずれかのうちの１つ以上の明示的な排除も考察する。
【０１１０】
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。紛争の場合には、定義を含む本明細書が、制御するであろう。本明細書および特許請求の範囲を通じて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと」のような変形は、述べられた整数または整数のグループの包含を意味するが、いずれの他の整数または整数のグループの排除も意味しないことが、理解されるであろう。文脈により別段要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。
【０１１１】
例示的な方法および材料は、本明細書に記載されるが、本明細書に記載されるものに類似するまたは同等である方法および材料は、本発明の慣行または試験においても使用され得る。材料、方法、および例は、例示的のみであり、限定することを意図されない。
【０１１２】
誘導性キメラサイトカイン受容体および改善され単離された免疫細胞
誘導性キメラサイトカイン受容体、かかる受容体を含む細胞、およびかかる細胞を含む方法が、本明細書に提供される。また、単離された免疫細胞、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む単離されたＴ細胞のような、単離されたＴ細胞の機能的活性を改善するためのかかる誘導性キメラサイトカイン受容体の使用も、提供される。本明細書に提供される方法および組成物は、ＣＡＲ−Ｔ細胞のようなＣＡＲを含む免疫細胞のインビボおよびインビトロ残存性、細胞傷害性、メモリー表現型、ならびに／または治療有効性を改善するために有用である。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体は、任意の順序で、二量体形成ドメイン、チロシンキナーゼ活性化ドメイン、およびチロシンエフェクタードメインを含む。任意選択で、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体は、膜標的化モチーフを含み得る。本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体のリガンド媒介性二量体形成は、誘導性キメラサイトカイン受容体を含有する宿主細胞における受容体媒介性シグナル伝達イベントを誘導する。いくつかの実施形態では、このシグナル伝達は、改善した残存性を生じ得る。例えば、例示的な実施形態では、リガンドによる本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体の二量体形成は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を活性化し、自然サイトカイン受容体により誘導されるシグナル伝達を模倣するであろう。「模倣する」により、本開示の誘導性キメラサイトカイン受容体により活性化されるシグナル伝達カスケードは、自然サイトカイン受容体により活性化されるシグナル伝達カスケードに類似するであろうが、一方で、本開示のキメラサイトカイン受容体により誘導される活性化の規模は、自然サイトカイン受容体のものとは異なり得る。例えば、本開示の誘導性キメラサイトカイン受容体および自然サイトカイン受容体の両方がＳＴＡＴ転写因子を活性化する場合、２つの受容体によるＳＴＡＴの活性化のレベルは、類似するか、または異なることができる。
【０１１４】
誘導性キメラサイトカイン受容体の「二量体形成ドメイン」は、二量体形成ドメインに結合することができるリガンドにより、二量体化または三量体化または多量体化もするように誘導され得る任意のアミノ酸配列であり得る。したがって、二量体形成ドメインは、リガンド結合ドメインである。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体の二量体形成ドメインは、細胞膜の外側に存在し得る。いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体の二量体形成ドメインは、細胞の内側に存在し得る。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、二量体形成ドメインに結合するリガンドは、二量体リガンドである。例えば、二量体形成ドメインは、ＦＫ５０６結合ドメイン（「ＦＫＢＰ」）のアミノ酸配列を含むことができる。ＦＫＢＰタンパク質は、薬物ＦＫ５０６に特異的に結合する。ＦＫ５０６の多量体類似体であるリガンド（すなわち、ＦＫ５０６の少なくとも２つのコピーを含むリガンド、またはそれらの誘導体）は、各々がＦＫＢＰのアミノ酸配列を含む第１のタンパク質および第２のタンパク質の二量体化を、第１のタンパク質および第２のタンパク質の両方に結合するリガンドによって誘導し、それによってそれらを一緒に結合することができる。第１および第２のタンパク質は、同一であるか、または異なり得る。したがって、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体は、誘導性キメラサイトカイン受容体の二量体形成ドメインに結合する好適な二量体リガンドに対する誘導性キメラサイトカイン受容体の曝露により二量体化するよう誘導され得る。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体の二量体形成ドメインは、例えば、ＦＫＢＰ、シクロフィリン、ステロイド結合タンパク質、エストロゲン結合タンパク質、グルココルチコイド結合タンパク質、ビタミンＤ結合タンパク質、またはテトラサイクリン結合タンパク質の、またはそれに由来するアミノ酸配列を含むことができる。本明細書で使用される場合、「ＦＫＢＰポリペプチド」、「シクロフィリンポリペプチド」などは、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその一部分もしくはバリアントを指し、その一部分またはバリアントは、高い親和性で対応するリガンド（例えば、ＦＫＢＰポリペプチドについては、リガンドＦＫ５０６および関連する分子）に結合する能力を保持する。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体の二量体形成ドメインは、例えば、限定なく、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、成長ホルモン受容体、トロンボポエチン受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、ＧＰ１３０、共通ガンマ鎖受容体、共通ベータ鎖受容体、ＩＦＮアルファ受容体、ＩＦＮガンマ受容体、ＩＦＮラムダ受容体、ＩＬ２／ＩＬ１５受容体、ＩＬ３受容体、ＩＬ４受容体、ＩＬ５受容体、ＩＬ７受容体、ＩＬ９受容体、ＩＬ１０受容体、ＩＬ１２受容体、ＩＬ１３受容体、ＩＬ２０受容体、ＩＬ２１受容体、ＩＬ２２受容体、ＩＬ２３受容体、ＩＬ２７受容体、ＴＳＬＰ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ＧＭ−ＣＳＦ  受容体、ＣＮＴＦ受容体、ＯＳＭ受容体、ＬＩＦ受容体、ＣＴ−１受容体、ＴＧＦＢＲ１／ＡＬＫＬ５、およびＴＧＦＢＲ２のようなサイトカイン受容体の細胞外ドメインの、またはそれらに由来するアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体の二量体形成ドメインは、例えば、限定なく、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ３／ＨＥＲ３、ＥＲＲＢ４／ＨＥＲ４、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲＲ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＣＳＦ−１Ｒ、ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＦＬＫ２／ＦＬＴ３、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３、ＦＧＦＲ−４、ＣＣＫ４、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＲＥＴ、ＲＯＳ、ＬＴＫ、ＡＬＫ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ、ＡＡＴＹＫ２、ＡＡＴＹＫ３、およびＲＴＫ１０６のような受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の細胞外ドメインの、またはそれらに由来するアミノ酸配列を含むことができる。サイトカイン受容体およびＲＴＫの細胞外ドメインは、対応するリガンドまたはアゴニストにより二量体化され得る（例えば、トロンボポエチン受容体ポリペプチドについては、対応するリガンドは、例えば、ＴＰＯ、エルトロンボパグ、および関連する分子を含んだ）。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体の二量体形成ドメインは、例えば、ＴＮＦＲ１、Ｆａｓ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＮＧＦＲ、ＤＲ３、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、ＴＮＦＲ２、ＬＴｂＲ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４−１ＢＢ、ＲＡＮＫ、Ｆｎ１４、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＢＣＭＡ、ＧＩＴＲ、ＴＲＯＹ、ＲＥＬＴ、ＸＥＤＡＲ、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＤｃＲ３のようなＴＮＦＲファミリーの細胞外ドメインの、またはそれらに由来するアミノ酸配列を含むことができる。ＴＮＦＲファミリー受容体の細胞外ドメインは、三量体ＴＮＦＲリガンドへの結合の際に、多量体化する。ＴＮＦＲファミリー受容体に由来する例示的な二量体形成ドメインアミノ酸配列（ＢＣＭＡ細胞外ドメインを含む）は、ＭＬＱＭＡＧＱＣＳＱＮＥＹＦＤＳＬＬＨＡＣＩＰＣＱＬＲＣＳＳＮＴＰＰＬＴＣＱＲＹＣＮＡＳＶＴＮＳＶＫＧＴＮＡ（配列番号２１６）である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体の二量体形成ドメインは、例えば、ＰＤ−１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＬＡＧ３、もしくはＴＩＭ３のような免疫共受容体もしくはリガンドの細胞外ドメインの、またはそれらに由来するアミノ酸配列を含むことができる。免疫共受容体の細胞外ドメインは、対応するリガンドを提示する細胞に結合する際にクラスター形成する。免疫共受容体に由来する例示的な二量体形成ドメインアミノ酸配列（ＰＤ−１細胞外を含む）は、ＭＱＩＰＱＡＰＷＰＶＶＷＡＶＬＱＬＧＷＲＰＧＷＦＬＤＳＰＤＲＰＷＮＰＰＴＦＳＰＡＬＬＶＶＴＥＧＤＮＡＴＦＴＣＳＦＳＮＴＳＥＳＦＶＬＮＷＹＲＭＳＰＳＮＱＴＤＫＬＡＡＦＰＥＤＲＳＱＰＧＱＤＣＲＦＲＶＴＱＬＰＮＧＲＤＦＨＭＳＶＶＲＡＲＲＮＤＳＧＴＹＬＣＧＡＩＳＬＡＰＫＡＱＩＫＥＳＬＲＡＥＬＲＶＴＥＲＲＡＥＶＰＴＡＨＰＳＰＳＰＲＰＡＧＱＦＱＴＬＶ（配列番号２１７）である。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、二量体形成ドメインは、ＦＫＢＰポリペプチドアミノ酸配列を含むことができる。ＦＫＢＰは、プロリルイソメラーゼ活性を有し、かつ薬物ＦＫ５０６および他の関連する薬物に結合するタンパク質のグループである。
【０１２０】
任意選択で、ＦＫＢＰは、ヒトＦＫＢＰ１２（ＦＫＢＰ１Ａ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＧ４６９６５．１としても知られる）であり得る。任意選択で、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、Ｆ３６Ｖ突然変異を含むことができる。Ｆ３６Ｖ突然変異を含むＦＫＢＰ１２は、高い親和性で二量体リガンドＡＰ１９０３に結合する（Ｊｅｍａｌ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ＣＡ  ＣａｎｃｅｒＪ．Ｃｌｉｎｉｃ．５８，７１−９６（２００８）、Ｓｃｈｅｒ，Ｈ．Ｉ．ａｎｄ  Ｋｅｌｌｙ，Ｗ．Ｋ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １１，１５６６−７２（１９９３））。加えて、Ｆ３６Ｖ突然変異を含むＦＫＢＰ１２は、野生型ＦＫＢＰ１２がＡＰ１９０３に結合するよりもさらに高い親和性で、ＡＰ１９０３に結合する。
【０１２１】
例示的な二量体形成ドメインアミノ酸配列（Ｆ３６Ｖ突然変異を有するＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む）は、ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥＳ（配列番号２１８）である。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体の二量体形成ドメインは、（ｉ）１つ以上のアミノ酸置換を含むＦＫＢＰポリペプチド、（ｉｉ）未修飾（天然に発生する）ＦＫＢＰアミノ酸配列の２つまたは３つのタンデムリピート、および（ｉｉｉ）１つ以上のアミノ酸置換を含むＦＫＢＰポリペプチドの２つまたは３つのタンデムリピートからなる群から選択される修飾を含む、ＦＫＢＰのアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＦＫＢＰタンパク質はヒトＦＫＢＰタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＧ４６９６５．１）であり、本明細書に記載されるＦＫＢＰに対する修飾はヒトＦＫＢＰタンパク質に対して行われる。いくつかの実施形態では、ＦＫＢＰにおける１つ以上のアミノ酸置換は、Ｆ３６Ｖ、Ｌ１０６Ｐ、Ｅ３１Ｇ、Ｒ７１Ｇ、およびＫ１０５Ｅ、ヒトＦＫＢＰタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＧ４６９６５．１）への参照における残基のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、二量体形成ドメインは、本明細書に開示される二量体形成ドメインの２つまたは３つのタンデムリピートを含み、各リピートは、その配列の異なる突然変異を含み得る。例えば、例示的な実施形態では、二量体形成ドメインは、ＦＫＢＰ配列の３つのタンデムリピートを含み、任意の順序で、リピートのうちの１つは自然ＦＫＢＰ配列を含み、第２のリピートはＦ３６Ｖ置換を含むＦＫＢＰを含み、第３のリピートはＦ３６ＶおよびＬ１０６Ｐ置換を含むＦＫＢＰを含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体の二量体形成ドメインは、（ｉ）Ｆ３６Ｖ置換を含むＦＫＢＰポリペプチド、（ｉｉ）Ｆ３６ＶおよびＬ１０６Ｐ置換を含むＦＫＢＰポリペプチド、（ｉｉｉ）Ｅ３１Ｇ、Ｆ３６Ｖ、Ｒ７１Ｇ、およびＫ１０５Ｅ置換を含むＦＫＢＰポリペプチド、ならびに（ｉｖ）これらのＦＫＢＰポリペプチドのいずれかの２つまたは３つのタンデムリピートからなる群から選択される修飾を含む、ＦＫＢＰのアミノ酸配列を含むことができる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、二量体形成ドメインは、シクロフィリンポリペプチドアミノ酸配列であり得る。シクロフィリンは、シクロスポリン（ｃｉｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）（シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）Ａ）に結合するタンパク質である。シクロフィリンは、例えば、シクロフィリンＡおよびシクロフィリンＤを含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、二量体形成ドメインは、すべての目的にために参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９４３４９３５号に開示されるリガンド結合領域の特徴のうちのいずれかを有することができる。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本開示の誘導性キメラサイトカイン受容体の二量体形成ドメインは、ＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ）、ＯＸ−４０の細胞外ドメイン、およびＴＮＦＲ２スーパーファミリー受容体（例えば、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦＲ）の細胞外ドメインからなる群から選択されるポリペプチドの、またはそれに由来するアミノ酸配列を含み得る。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体の二量体形成ドメインは、表１Ｂに開示される二量体形成ドメインアミノ酸配列を含む。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「二量体」リガンドは、任意選択で、好適な結合分子の３つ以上のコピーを含むことができる（すなわち、リガンドは多量体であり得る）が、それでもなお、かかるリガンドは、対応する結合分子を二量体化するかかるリガンドの能力に基づき、本明細書で使用される「二量体」とみなされ得る。同様に、いくつかの実施形態では、本明細書に提供される「二量体形成ドメイン」は、多量体化を支持することができ得る（例えば、二量体形成ドメインの複数のコピーが同じ分子に提供されるイベントにおいて）が、それでもなお、かかるドメインは、二量体化するかかるドメインの能力に基づき、本明細書で使用される「二量体形成ドメイン」とみなされ得る。典型的には、カスパーゼ−９は、カスパーゼ−９分子の二量体化の際に、効果的に誘導され得る（すなわち、三量体化または他の多量体化は要求されない）。加えて、「リガンド」への本明細書での参照は、文脈が別段明らかに指示しない限り、二量体リガンドに対するものである（例えば、本明細書に提供されるキメラカスパーゼ−９の二量体形成を誘導する「リガンド」を指す際に）。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンキナーゼ活性化ドメインは、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）結合ドメインまたはＲＴＫのチロシンキナーゼの前に膜貫通ドメインを含み得る。ＪＡＫおよびＲＴＫキナーゼは、多量体化により活性化される。ＪＡＫは、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、およびＴＹＫ２を含み、Ｂｏｘ１およびＢｏｘ２モチーフからなる膜近傍モチーフに結合する。ＪＡＫ２キナーゼを活性化する例示的なチロシンキナーゼ活性化ドメインアミノ酸配列（エリスロポエチン受容体膜貫通、Ｂｏｘ１、およびＢｏｘ２モチーフを含む）は、ＳＥＰＶＳＧＰＴＰＳＤＬＤＰＬＩＬＴＬＳＬＩＬＶＶＩＬＶＬＬＴＶＬＡＬＬＳＨＲＲＡＬＫＱＫＩＷＰＧＩＰＳＰＥＳＥＦＥＧＬＦＴＴＨＫＧＮＦＱＬＷＬＹＱＮＤＧＣＬＷＷＳＰＣＴＰＦＴＥＤＰＰＡＳＬＥＶＬＳＥＲＣ（配列番号２１９）である。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、リガンド独立二量体化を低下させる突然変異を含むことができる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンキナーゼ活性化ドメインは、タンパク質の、またはタンパク質に由来するＪＡＫ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、受容体である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ホルモン受容体またはサイトカイン受容体である。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ活性化ドメインは、プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）、トロンボポエチン受容体／骨髄増殖性白血病タンパク質受容体（ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ）、エリスロポエチン受容体（ＥＰＯＲ）、顆粒球コロニー刺激因子受容体（ＧＣＳＦＲ）、またはＧＰ１３０から選択されるタンパク質の、またはそれに由来するＪＡＫ結合ドメインを含む。用語「に由来する」は、１つ以上の修飾が自然配列に行われることを意味する。例えば、自然配列の一部分のみが使用され得るか、または自然配列は、置換、挿入、および／もしくは欠失突然変異、またはそれらの修飾の組み合わせを含むよう修飾され得る。いくつかの実施形態では、ＪＡＫ結合ドメインは、ＴＰＯＲまたはＥＰＯＲの、またはそれに由来するＪＡＫ結合ドメインを含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンキナーゼ活性化ドメインは、ＰＲＬＲ、ＧＨＲ、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ、ＥＰＯＲ、ＧＣＳＦＲ、およびＧＰ１３０から選択されるタンパク質の、またはそれに由来する膜貫通ドメインを含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンキナーゼ活性化ドメインは、ＰＤ−１の、またはＰＤ−１に由来する膜貫通ドメインを含む。これらの実施形態では、チロシンキナーゼ活性化ドメインは、本明細書に開示される受容体の、またはそれに由来するＪＡＫ結合ドメインまたはチロシンキナーゼドメインを含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンキナーゼ活性化ドメインは、膜貫通ドメインおよびＪＡＫ結合ドメインまたは膜貫通ドメインおよびチロシンキナーゼドメインを含み、膜貫通ドメインはチロシン／ホルモン受容体（例えば、ＴｐｏＲ）、単量体化サイトカイン／ホルモン受容体（例えば、ＥｐｏＲ  Ｌ２４１Ｇ  Ｌ２４２Ｐ）、または単量体受容体（例えば、ＰＤ１）に由来する。本明細書で使用される「単量体化サイトカイン／ホルモン受容体」は、自然形態でホモ二量体またはヘテロ二量体であるサイトカイン受容体またはホルモン受容体を指すが、単量体受容体として存在するよう変異導入される。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンキナーゼ活性化ドメインは、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲの、またはＴＰＯＲ／ＭＰＬＲに由来する膜貫通ドメインを含む。天然に発生するＴＰＯＲ／ＭＰＬＲの例示的な完全長配列が、表１Ａに示される（配列番号６４）。いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ活性化ドメインは、表１Ａに示されるＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ配列の、またはそれに由来する膜貫通ドメインを含む。例えば、いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ活性化ドメインは、表１Ａに示されるＴＰＯＲ／ＭＰＬＲのアミノ酸４７８〜５８２を含む（この配列は、表１Ｃに「ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ（４７８〜５８２）（野生型配列）」としても示される）。
【０１３６】
いくつかの他の実施形態では、チロシンキナーゼ活性化ドメインは、表１Ａに示されるＴＰＯＲ／ＭＰＬＲのアミノ酸４７８〜５８２に由来する配列を含む。これらの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンキナーゼ活性化ドメインは、表１Ａに示されるＴＰＯＲ／ＭＰＬＲのアミノ酸４７８〜５８２に由来する配列を含み、配列は、置換、欠失、挿入、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含む。例示的な実施形態では、チロシンキナーゼ活性化ドメインは、表１Ａに示されるＴＰＯＲ／ＭＰＬＲのアミノ酸配列４７８〜５８２の欠失バリアントを含む。いくつかの実施形態では、欠失バリアントは、表１Ａに示されるＴＰＯＲ／ＭＰＬＲの領域４７８〜５８２からの、１、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２アミノ酸の欠失を含む。いくつかの実施形態では、欠失バリアントは、表１Ａに示されるＴＰＯＲ／ＭＰＬＲの領域４８９〜５１０からの、１、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２アミノ酸の欠失を含む。例示的な実施形態では、チロシンキナーゼ活性化ドメインは、表１Ｃに示されるＴＰＯＲ／ＭＰＬＲのアミノ酸配列４７８〜５８２の欠失バリアントを含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ活性化ドメインは、表１Ａに示されるＴＰＯＲ／ＭＰＬＲのアミノ酸配列４７８〜５８２の挿入バリアントを含む。いくつかの実施形態では、挿入バリアントは、表１Ａに示されるＴＰＯＲ／ＭＰＬＲの領域４７８〜５８２における、１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２アミノ酸の挿入を含む。例示的な実施形態では、チロシンキナーゼ活性化ドメインは、表１Ｃに示されるＴＰＯＲ／ＭＰＬＲのアミノ酸配列４７８〜５８２の挿入バリアントを含む。いくつかの実施形態では、挿入バリアント中に挿入されたアミノ酸は、ロイシン、バリン、およびイソロイシンからなる群から選択される。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンキナーゼ活性化ドメインは、表１Ａに示されるＴＰＯＲ／ＭＰＬＲのアミノ酸４７８〜５８２に由来する配列を含み、配列は、この領域におけるアミノ酸の欠失と挿入との組み合わせを含む。例示的な実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンキナーゼ活性化ドメインは、表１Ａに示されるＴＰＯＲ／ＭＰＬＲのアミノ酸４７８〜５８２に由来する配列を含み、配列は、領域４７８〜５８２からの１〜１８アミノ酸の欠失と、領域４７８〜５８２における１〜８アミノ酸の挿入と、を含む。別の例示的な実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンキナーゼ活性化ドメインは、表１Ａに示されるＴＰＯＲ／ＭＰＬＲのアミノ酸４８９〜５１０に由来する配列を含み、配列は、領域４８９〜５１０からの１〜１８アミノ酸の欠失と、領域４８９〜５１０における１〜８アミノ酸の挿入と、を含む。いくつかの実施形態では、挿入バリアント中に挿入されたアミノ酸は、ロイシン、バリン、およびイソロイシンからなる群から選択される。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンキナーゼ活性化ドメインは、表１Ｃに開示される配列を含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンキナーゼ活性化ドメインは、ＰＲＬＲ、ＧＨＲ、ＥＰＯＲ、ＧＣＳＦＲ、またはＧＰ１３０の膜貫通ドメインの欠失および／または挿入バリアントを含む。天然に発生するＰＲＬＲ、ＧＨＲ、ＥＰＯＲ、ＧＣＳＦＲ、およびＧＰ１３０の例示的な完全長配列は、それらの受け入れ番号と共に、表１Ａに開示される。本開示からは、ＰＲＬＲ、ＧＨＲ、ＥＰＯＲ、ＧＣＳＦＲ、およびＧＰ１３０の膜貫通ドメインは位置付けられ得、これらの膜貫通ドメインの挿入および／または欠失バリアントは調製され得る。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ活性化ドメインの膜貫通および／またはＪＡＫ結合ドメインは、例えば、共通ガンマ鎖受容体、共通ベータ鎖受容体、ＩＦＮアルファ受容体（ＩＦＮＡＲ）、ＩＦＮガンマ受容体（ＩＦＮＧＲ）、ＩＦＮラムダ受容体（ＩＦＮＬＲ）、ＩＬ２／ＩＬ１５受容体（ＩＬ２Ｒ／ＩＬ１５Ｒ）、ＩＬ３受容体（ＩＬ３Ｒ）、ＩＬ４受容体（ＩＬ４Ｒ）、ＩＬ５受容体（ＩＬ５Ｒ）、ＩＬ７受容体（ＩＬ７Ｒ）、ＩＬ９受容体（ＩＬ９Ｒ）、ＩＬ１０受容体（ＩＬ１０Ｒ）、ＩＬ１２受容体（ＩＬ１２Ｒ）、ＩＬ１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）、ＩＬ２０受容体（ＩＬ２０Ｒ）、ＩＬ２１受容体（ＩＬ２１Ｒ）、ＩＬ２２受容体（ＩＬ２２Ｒ）、ＩＬ２３受容体（ＩＬ２３Ｒ）、ＩＬ２７受容体（ＩＬ２７Ｒ）、ＴＳＬＰ受容体（ＴＳＬＰＲ）、Ｇ−ＣＳＦ受容体（ＧＣＳＦＲ）、ＧＭ−ＣＳＦ受容体（ＧＭＣＳＦＲ）、ＣＮＴＦ受容体（ＣＮＴＦＲ）、ＯＳＭ受容体（ＯＳＭＲ）、ＬＩＦ受容体（ＬＩＦＲ）、またはＣＴ−１受容体（ＣＴ１Ｒ）に由来し得る。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンキナーゼ活性化ドメインは、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の、またはそれに由来するチロシンキナーゼドメインを含む。ＲＴＫキナーゼを活性化するＲＴＫからの例示的なチロシンキナーゼ活性化ドメイン（上皮成長因子受容体膜貫通およびキナーゼドメインを含む）は、
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である。
いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ活性化ドメインは、例えば、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ３／ＨＥＲ３、ＥＲＲＢ４／ＨＥＲ４、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲＲ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＣＳＦ−１Ｒ、ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＦＬＫ２／ＦＬＴ３、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＦＧＦＲ−１  ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３、ＦＧＦＲ−４、ＣＣＫ４、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＲＥＴ、ＲＯＳ、ＬＴＫ、ＡＬＫ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ、ＡＡＴＹＫ２、ＡＡＴＹＫ３、またはＲＴＫ１０６のような、他のＲＴＫに由来する膜貫通ドメインおよびチロシンキナーゼドメインを含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ活性化ドメインは、ＥＧＦＲの、またはＥＧＦＲに由来するチロシンキナーゼドメインを含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ活性化ドメインは、表１Ｂに開示されるチロシンキナーゼ活性化ドメイン配列を含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、チロシンエフェクタードメインは、サイトカイン受容体、ホルモン受容体、またはＲＴＫ、またはチロシンキナーゼアダプタータンパク質のような少なくとも１つの受容体の細胞質側尾部（サイトテール）の一部分を含むことができる。本明細書で使用される「サイトテール」は、活性化時にキナーゼによりリン酸化されることができる１つ以上のチロシン残基を含む一部分である。サイトテールまたはアダプタータンパク質内のチロシンは、活性化されたチロシンキナーゼによりリン酸化される。リン酸化されたチロシンモチーフは、シグナル形質導入因子を動員する。サイトカイン受容体からの例示的なチロシンエフェクタードメインアミノ酸配列（ＩＬ２Ｒｂ遠位サイトテールを含む）は、以下のとおりである。
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【０１４６】
サイトカイン受容体およびホルモン受容体のようなある特定の受容体のサイトテールは、ＳＴＡＴ活性化ドメインを含む（ＳＴＡＴ結合ドメインとして本明細書でも参照され得る）。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンエフェクタードメインは、受容体の、または受容体に由来する少なくとも１つのＳＴＡＴ活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンエフェクタードメインは、２つ、３つ、４つ、またはそれを超える受容体の、またはそれらに由来する少なくとも２つ、３つ、４つ、またはそれを超えるＳＴＡＴ活性化ドメインを含む。受容体は、サイトカイン受容体および／またはホルモン受容体であり得る。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンエフェクタードメインは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、もしくはそれを超える受容体（例えば、サイトカイン受容体、ホルモン受容体、もしくはＲＴＫ）もしくはチロシンキナーゼアダプタータンパク質の、またはそれらからなるサイトテール（キナーゼによりリン酸化されることのできる１つ以上のチロシン残基を含有する細胞質側尾部の一部分）を含む。例示的な実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンキナーゼ活性化ドメインは、サイトカイン受容体の、またはサイトカイン受容体に由来するサイトテールと、ホルモン受容体の、またはホルモン受容体に由来するサイトテールと、を含む。別の例示的な実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンエフェクタードメインは、サイトカイン受容体の、またはサイトカイン受容体に由来するサイトテールと、ＲＴＫの、またはＲＴＫに由来するサイトテールと、を含む。さらに別の例示的な実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンエフェクタードメインは、ホルモン受容体の、またはホルモン受容体に由来するサイトテールと、ＲＴＫの、またはＲＴＫに由来するサイトテールと、を含む。さらに別の例示的な実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンエフェクタードメインは、ホルモン受容体の、またはホルモン受容体に由来するサイトテールと、ＲＴＫの、またはＲＴＫに由来するサイトテールと、サイトカイン受容体の、またはサイトカイン受容体に由来するサイトテールと、を含む。少なくとも１つのサイトテールが、チロシンキナーゼアダプタータンパク質のリン酸化可能なチロシン含有部分を含む、サイトテールの同様の組み合わせが、企図される。誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンエフェクタードメインが２つ以上のサイトテールを含む際に、サイトテールは、任意の順序で提示され得る。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンエフェクタードメインは、２つのサイトカイン受容体の、またはそれらに由来するＳＴＡＴ活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンエフェクタードメインは、ＢＬＮＫ（Ｂ細胞リンカータンパク質）、ＩＬ２ＲＧ、ＥＧＦＲ、ＥｐｏＲ、ＧＨＲ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＡＲ１／２、ＩＦＮＬＲ１、ＩＬ１０Ｒ１、ＩＬ１２Ｒｂ１、ＩＬ１２Ｒｂ２、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２Ｒｂ、ＩＬ２ｓｍａｌｌ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、およびＩＬ２１Ｒからなる群から選択される少なくとも１つの受容体の、またはそれに由来するＳＴＡＴ活性化ドメインを含む。チロシンエフェクタードメインが２つ以上のＳＴＡＴ活性化ドメインを含む際に、ＳＴＡＴ活性化ドメインは、膜近位である１つのドメインおよび膜炎イデアル他のドメイン（複数可）に直列である。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンエフェクタードメインは、ＢＬＮＫ、ＩＬ２ＲＧ、ＥＧＦＲ、ＥｐｏＲ、ＧＨＲ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＡＲ１／２、ＩＦＮＬＲ１、ＩＬ１０Ｒ１、ＩＬ１２Ｒｂ１、ＩＬ１２Ｒｂ２、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２Ｒｂ、ＩＬ２ｓｍａｌｌ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、およびＩＬ２１Ｒからなる群から選択される第１の受容体の、またはそれに由来するサイトテールと、ＢＬＮＫ、ＩＬ２ＲＧ、ＥＧＦＲ、ＥｐｏＲ、ＧＨＲ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＡＲ１／２、ＩＦＮＬＲ１、ＩＬ１０Ｒ１、ＩＬ１２Ｒｂ１、ＩＬ１２Ｒｂ２、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２Ｒｂ、ＩＬ２ｓｍａｌｌ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、およびＩＬ２１Ｒからなる群から選択される第２の受容体の、またはそれに由来するサイトテールと、を含む。これらの実施形態では、第１の受容体からのサイトテールは膜近位であり、第２の受容体からのサイトテールは膜遠位であるか、または逆も同様であることができる。誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンエフェクタードメインが、本段落において記載される受容体からの、３つ、４つ、またはそれを超えるような、２つ超のサイトテールを含む類似の実施形態は、本開示により包含される。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンエフェクタードメインは、表１Ｂに開示される少なくとも１つのチロシンエフェクタードメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、チロシンエフェクタードメインは、表１Ｂに開示される少なくとも２つのチロシンエフェクタードメイン配列を含む。表１Ｂに開示される２つ以上のチロシンエフェクタードメイン配列が存在する際に、配列のうちのいずれかは膜近位であり得、他の配列（複数可）は膜遠位であり得る。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、チロシンエフェクタードメインは、共通ガンマ鎖受容体、共通ベータ鎖受容体、ＩＦＮアルファ受容体、ＩＦＮガンマ受容体、ＩＦＮラムダ受容体、ＩＬ２／ＩＬ１５受容体、ＩＬ３受容体、ＩＬ４受容体、ＩＬ５受容体、ＩＬ７受容体、ＩＬ９受容体、ＩＬ１０受容体、ＩＬ１２受容体、ＩＬ１３受容体、ＩＬ２０受容体、ＩＬ２１受容体、ＩＬ２２受容体、ＩＬ２３受容体、ＩＬ２７受容体、ＴＳＬＰ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、ＣＮＴＦ受容体、ＯＳＭ受容体、ＬＩＦ受容体、ＣＴ−１受容体、エリスロポエチン受容体、成長ホルモン受容体、プロラクチン受容体、トロンボポエチン受容体、またはＧＰ１３０のような、サイトカイン受容体のサイトテールからの配列を含有する。ＲＴＫからの例示的なチロシンエフェクタードメインアミノ酸配列（ＥＧＦＲ遠位サイトテールを含有する）は、ＶＩＱＧＤＥＲＭＨＬＰＳＰＴＤＳＮＦＹＲＡＬＭＤＥＥＤＭＤＤＶＶＤＡＤＥＹＬＩＰＱＱＧＦＦＳＳＰＳＴＳＲＴＰＬＬＳＳＬＳＡＴＳＮＮＳＴＶＡＣＩＤＲＮＧＬＱＳＣＰＩＫＥＤＳＦＬＱＲＹＳＳＤＰＴＧＡＬＴＥＤＳＩＤＤＴＦＬＰＶＰＥＹＩＮＱＳＶＰＫＲＰＡＧＳＶＱＮＰＶＹＨＮＱＰＬＮＰＡＰＳＲＤＰＨＹＱＤＰＨＳＴＡＶＧＮＰＥＹＬＮＴＶＱＰＴＣＶＮＳＴＦＤＳＰＡＨＷＡＱＫＧＳＨＱＩＳＬＤＮＰＤＹＱＱＤＦＦＰＫＥＡＫＰＮＧＩＦＫＧＳＴＡＥＮＡＥＹＬＲＶＡＰＱＳＳＥＦＩＧＡ（配列番号２２２）である。いくつかの実施形態では、チロシンエフェクタードメインは、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ３／ＨＥＲ３、ＥＲＲＢ４／ＨＥＲ４、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲＲ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＣＳＦ−１Ｒ、ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＦＬＫ２／ＦＬＴ３、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＦＧＦＲ−１  ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３、ＦＧＦＲ−４、ＣＣＫ４、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＲＥＴ、ＲＯＳ、ＬＴＫ、ＡＬＫ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ、ＡＡＴＹＫ２、ＡＡＴＹＫ３、またはＲＴＫ１０６のようなＲＴＫのサイトテールからの配列を含む。チロシンキナーゼアダプタータンパク質からの例示的なチロシンエフェクタードメインアミノ酸配列（ＢＬＮＫチロシンドメインを含む）は、ＡＳＥＳＰＡＤＥＥＥＱＷＳＤＤＦＤＳＤＹＥＮＰＤＥＨＳＤＳＥＭＹＶＭＰＡＥＥＮＡＤＤＳＹＥＰＰＰＶＥＱＥＴＲＰＶＨＰＡＬＰＦＡＲＧＥＹＩＤＮＲＳＳＱＲＨＳＰＰＦＳＫＴＬＰＳＫＰＳＷＰＳＥＫＡＲＬＴＳＴＬＰＡＬＴＡＬＱＫＰＱＶＰＰＫＰＫＧＬＬＥＤＥＡＤＹＶＶＰＶＥＤＮＤＥＮＹＩＨＰＴＥＳＳＳＰＰＰＥＫＡＰＭＶＮＲ（配列番号２２３）である。いくつかの実施形態では、チロシンエフェクタードメインは、ＡＬＸ、ＢＬＮＫ、Ｇｒｂ７、Ｎｓｐ、ＳＬＰ−７６、ＳＯＣＳ、ＴＳＡｄ、ＡＰＳ、Ｂａｍ３２、Ｃｒｋ、Ｇａｄｓ、Ｇｒｂ２、Ｎｃｋ、ＳＬＡＰ、Ｓｈｃ���ＦＲＳ２、Ｄａｂ、Ｄｏｋ、ＩＲＳ、ｅｐｓ８、ＡＦＡＰ１１０、Ｇａｂ、ＡＤＡＰ、Ｃａｒｍａ１、Ｃａｓ、ＣＩＮ８５、コルタクチン、Ｅ３Ｂ１、ビネキシン、ＳＫＡＰ−５５、ＢＡＮＫ、ＢＣＡＰ、Ｄｏｆ、パキシリン、ＬＡＴ、ＬＡＸ、ＬＩＭＥ、ＮＴＡＬ、ＰＡＧ、ＳＩＴ、またはＴＲＩＭのような、アダプタータンパク質からの配列を含むか、またはそれらに結合する。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体のチロシンエフェクタードメインは、１つ以上のサイトカイン受容体、ＲＴＫ、および／またはアダプタータンパク質からの配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、配列は、直列であり得る。いくつかの実施形態では、チロシンエフェクトドメインは、例えば、サイトカイン受容体、ＲＴＫ、またはチロシンキナーゼアダプタータンパク質からのより短いチロシン含有ペプチドを含有することができる。いくつかの実施形態では、チロシンエフェクタードメインは、例えば、ホスホロ−チロシン（ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ）結合タンパク質（ＰＴＢ）ドメイン、Ｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）ドメインを含む、１つ以上のタンパク質を結合することができる合成配列であり得る。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体は、二量体形成ドメインと、膜貫通ドメインおよびＪＡＫ結合ドメインを含むチロシンキナーゼ活性化ドメインと、少なくとも１つの受容体の、またはそれらに由来するＳＴＡＴ活性化ドメインを含むチロシンエフェクタードメインと、を含む。これらの実施形態のうちのいくつかでは、二量体形成ドメインは、ＦＫＢＰポリペプチドを含み、膜貫通ドメインは、ＥＰＯＲ、ＧＰ１３０、ＰＲＬＲ、ＧＨＲ、ＧＣＳＦＲ、ＰＤ−１、およびＴＰＯＲからなる群から選択されるタンパク質の、またはそれに由来する膜貫通ドメインを含み、ＪＡＫ結合ドメインは、ＥＰＯＲ、ＧＰ１３０、ＰＲＬＲ、ＧＨＲ、ＧＣＳＦＲ、およびＴＰＯＲから選択されるタンパク質の、またはそれに由来するＪＡＫ結合ドメインを含み、ＳＴＡＴ活性化ドメインは、ＢＬＮＫ、ＩＬ２ＲＧ、ＥＧＦＲ、ＥｐｏＲ、ＧＨＲ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＡＲ１／２、ＩＦＮＬＲ１、ＩＬ１０Ｒ１、ＩＬ１２Ｒｂ１、ＩＬ１２Ｒｂ２、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２Ｒｂ、ＩＬ２ｓｍａｌｌ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、およびＩＬ２１Ｒからなる群から選択される少なくとも１つの受容体の、またはそれらからなるＳＴＡＴ活性化ドメインを含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体は、表１Ｂから選択される二量体形成ドメイン、表１Ｂまたは表１Ｃから選択されるチロシンキナーゼ活性化ドメイン、および表１Ｂから選択されるチロシンエフェクタードメインを含む。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体は、表２Ａまたは表２Ｂから選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体は、配列番号１〜５８、１８７〜２１５、および２２５〜３１１から選択される配列を含む。
【０１５６】
表１Ａは、膜貫通タンパク質が由来する、本開示に提供される天然に発生する受容体の例示的な完全長配列を提供する。表１Ａに提供される配列は、例えば、表１Ｂおよび１Ｃにおいてどのより後期の突然変異が発現されるかに関する、参照配列である。
【０１５７】
【表１−１】
2021514677.tif 000005
【０１５８】
【表１−２】
2021514677.tif 000006
【０１５９】
本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体において有用な例示的なアミノ酸配列が、表１Ｂに示される。
【０１６０】
【表２−１】
2021514677.tif 000007
【０１６１】
【表２−２】
2021514677.tif 000008
【０１６２】
【表２−３】
2021514677.tif 000009
【０１６３】
【表２−４】
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【０１６４】
【表２−５】
2021514677.tif 000011
【０１６５】
【表２−６】
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【０１６６】
【表２−７】
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【０１６７】
【表２−８】
2021514677.tif 000014
【０１６８】
本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体において有用なＴＰＯＲ／ＭＰＬＲの、またはそれに由来する例示的な膜貫通およびＪＡＫ結合配列が、表１Ｃに示される。
【０１６９】
【表３−１】
2021514677.tif 000015
【０１７０】
【表３−２】
2021514677.tif 000016
【０１７１】
別の態様では、本明細書に開示される１つ以上の誘導性キメラサイトカイン受容体を含む単離された免疫細胞が、本明細書に提供される。他の実施形態では、本明細書に提供される単離された免疫細胞は、（ｉ）本明細書に開示される１つ以上の誘導性キメラサイトカイン受容体と、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、を含む。有利には、本明細書に提供される単離された免疫細胞は、誘導性キメラサイトカイン受容体を発現しない細胞に対して、二量体形成ドメインに結合するリガンドとの接触時に改善された残存性を呈する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される単離された免疫細胞は、誘導性キメラサイトカイン受容体を発現しない細胞に対して、二量体形成ドメインに結合するリガンドとの接触時に、改善された細胞傷害性、増加した増殖、および／またはメモリー表現型マーカーの増加したレベルを呈する。本明細書に記載される誘導性キメラサイトカイン受容体を含む単離された免疫細胞によって呈される残存性、細胞傷害性、増殖、および／またはメモリー表現型マーカーの改善は、インビトロまたはインビボであり得る。いくつかの実施形態では、単離された免疫細胞は、Ｔ細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、およびＢ細胞からなる群から選択される。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、単離された免疫細胞は、単離されたＴ細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される単離されたＴ細胞は、本明細書に開示される１つ以上の誘導性キメラサイトカイン受容体を含む。他の実施形態では、本明細書に提供される単離されたＴ細胞は、（ｉ）本明細書に開示される１つ以上の誘導性キメラサイトカイン受容体と、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、を含む。有利には、本明細書に提供される単離されたＴ細胞は、誘導性キメラサイトカイン受容体を発現しない細胞に対して、二量体形成ドメインに結合するリガンドとの接触時に改善されたインビボ残存性を呈する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される単離されたＴ細胞は、誘導性キメラサイトカイン受容体を発現しない細胞に対して、二量体形成ドメインに結合するリガンドとの接触時に、改善された細胞傷害性、増加した増殖、および／またはメモリー表現型マーカーの増加したレベルを呈する。これらの特徴のうちの１つ以上の改善は、インビトロまたはインビボであり得る。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される１つ以上の誘導性キメラサイトカイン受容体を含む単離された免疫細胞は、誘導性キメラサイトカイン受容体を発現しない細胞に対して、二量体形成ドメインに結合するリガンドとの接触時に、（ｉ）増加したインビボ残存性、（ｉｉ）増加したＳＴＡＴ活性化、（ｉｉｉ）増加した細胞傷害性、（ｉｖ）メモリー表現型マーカーの増加したレベル、（ｖ）増加した増殖、またはこれらの機能的特徴の組み合わせを呈する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される１つ以上の機能的特徴の改善は用量依存的であり、すなわち、誘導性キメラサイトカイン受容体を含む免疫細胞の機能的活性は、二量体形成ドメインに結合するリガンドの増加する用量との接触時に増加する。いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体によって活性化されるＳＴＡＴは、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、またはそれらの組み合わせを含む。ＳＴＡＴの活性化は、ＳＴＡＴの動員、ＳＴＡＴのリン酸化、および／またはＳＴＡＴの二量体化またはＳＴＡＴの転座を含む。いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体を含む免疫細胞によって増加または維持されるメモリー表現型マーカーは、幹細胞メモリー（Ｔｓｃｍ）マーカーおよびセントラルメモリー（Ｔｃｍ）マーカーを含む。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体を含む免疫細胞によって呈される１つ以上の機能的特徴の改善は、誘導性キメラサイトカイン受容体を発現しない免疫細胞と比較して、それらの間の値および範囲を含む、少なくとも約２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１２５倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、または約５００倍もである。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体を含む免疫細胞によって呈される１つ以上の機能的特徴の改善は、誘導性キメラサイトカイン受容体を発現しない免疫細胞と比較して、それらの間の値および範囲を含む、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、または約５００％もである。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、本発明の単離されたＴ細胞のような単離された免疫細胞は、表２Ａに示される誘導性キメラサイトカイン受容体を含む。
【０１７７】
【表４−１】
2021514677.tif 000017
【０１７８】
【表４−２】
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【０１７９】
【表４−３】
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【０１８０】
【表４−４】
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【０１８１】
【表４−５】
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【０１８２】
【表４−６】
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【０１８３】
【表４−７】
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【０１８４】
【表４−８】
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【０１８５】
【表４−９】
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【０１８６】
【表４−１０】
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【０１８７】
【表４−１１】
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【０１８８】
【表４−１２】
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【０１８９】
【表４−１３】
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【０１９０】
【表４−１４】
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【０１９１】
【表４−１５】
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【０１９２】
【表４−１６】
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【０１９３】
【表４−１７】
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【０１９４】
【表４−１８】
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【０１９５】
【表４−１９】
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【０１９６】
【表４−２０】
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【０１９７】
【表４−２１】
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【０１９８】
【表４−２２】
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【０１９９】
【表４−２３】
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【０２００】
【表４−２４】
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【０２０１】
【表４−２５】
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【０２０２】
【表４−２６】
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【０２０３】
【表４−２７】
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【０２０４】
【表４−２８】
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【０２０５】
いくつかの実施形態では、本発明の単離されたＴ細胞のような単離された免疫細胞は、表２Ｂに示される誘導性キメラサイトカイン受容体を含む。
【０２０６】
【表５−１】
2021514677.tif 000045
【０２０７】
【表５−２】
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【０２０８】
【０２０９】
【表５−３】
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【０２１０】
【表５−４】
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【０２１１】
【表５−５】
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【０２１２】
【表５−６】
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【０２１３】
【表５−７】
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【０２１４】
【表５−８】
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【０２１５】
【表５−９】
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【０２１６】
【表５−１０】
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【０２１７】
【表５−１１】
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【０２１８】
【表５−１２】
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【０２１９】
【表５−１３】
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【０２２０】
【表５−１４】
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【０２２１】
【表５−１５】
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【０２２２】
【表５−１６】
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【０２２３】
【表５−１７】
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【０２２４】
【表５−１８】
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【０２２５】
【表５−１９】
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【０２２６】
【表５−２０】
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【０２２７】
【表５−２１】
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【０２２８】
【表５−２２】
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【０２２９】
【表５−２３】
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【０２３０】
【表５−２４】
2021514677.tif 000068
【０２３１】
本発明は、表２Ａおよび２Ｂに示される本発明の実施形態の誘導性キメラサイトカイン受容体への修飾を包含し、それらの特性に顕著に影響しない修飾を有する機能的に等価なタンパク質と、増強または減少した活性および／または親和性を有するバリアントと、を含む。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野における日常的な慣行であり、本明細書で詳細に記載される必要はない。修飾されたポリペプチドの例は、アミノ酸残基の保存的置換を有する、機能的活性を顕著に有害に変化させない、もしくはそのリガンドに対するポリペプチドの親和性を成熟（増強）させるアミノ酸の１つ以上の欠失もしくは付加を有する、または化学的類似体の使用を伴うポリペプチドを含む。
【０２３２】
アミノ酸配列挿入は、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入と同様に、長さが１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体またはエピトープタグに融合された抗体を含む。
【０２３３】
置換バリアントは、除去された誘導性キメラサイトカイン受容体における少なくとも１つのアミノ酸残基と、その場所に挿入された異なる残基を有する。保存的置換は、「保存的置換」の見出しの下で表３に示される。かかる置換が生物学的活性の変化を生じる場合、表３において「例示的な置換」と称される、またはアミノ酸クラスへの参照において以下でさらに記載される、より実質的な変化は、導入され得、生成物はスクリーニングされ得る。
【０２３４】
【表６】
2021514677.tif 000069
【０２３５】
いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体は、誘導性キメラサイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチドを細胞中に導入した後、ＣＡＲ−Ｔ細胞のような単離された免疫細胞においてインサイチュで合成され得る。代替的には、誘導性キメラサイトカイン受容体は、細胞の外側で生み出され、次いで細胞中に導入され得る。ポリヌクレオチド構築物を細胞中に導入するための方法は、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、安定的な形質転換方法は、ポリヌクレオチド構築物を細胞のゲノム中に組み込むために使用され得る。他の実施形態では、一過性形質転換方法は、ポリヌクレオチド構築物、および細胞のゲノム中に組み込まれないポリヌクレオチド構築物を一過的に発現するために使用され得る。他の実施形態では、ウイルス媒介性方法が、使用され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソームなどのような任意の好適な手段によって細胞中に導入され得る。一過性形質転換方法は、例えば、限定なく、微量注射、電気穿孔または粒子衝撃を含む。ポリヌクレオチドは、例えばプラスミドベクターまたはウイルスベクターのようなベクターに含まれ得る。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、本発明の単離されたＴ細胞のような単離された免疫細胞は、少なくとも１つの誘導性キメラサイトカイン受容体と、少なくとも１つのＣＡＲと、を含み得る。いくつかの実施形態では、単離されたＴ細胞のような単離された免疫細胞は、少なくとも異なる誘導性キメラサイトカイン受容体の集団と、少なくとも１つのＣＡＲと、を含み得る。例えば、単離された免疫細胞に存在する異なる誘導性キメラサイトカイン受容体の集団は、異なるチロシンキナーゼ活性化ドメインおよび異なるチロシンエフェクタードメイン以外の同じ二量体形成ドメインを有する受容体、もしくは異なるチロシンエフェクタードメイン以外の同じ二量体形成ドメイン、同じチロシンキナーゼ活性化ドメインを有する受容体、または互いに異なっているすべての３つのドメインを有する受容体などを含み得る。いくつかの実施形態では、単離されたＴ細胞のような単離された免疫細胞は、少なくとも１つの誘導性キメラサイトカイン受容体と、ＣＡＲの集団と、を含み、各々は異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むことができる。
【０２３７】
異なる誘導性キメラサイトカイン受容体の集団を免疫細胞中に導入することは、細胞の機能的アウトカムおよび／または表現型の操作を可能にすることができる。例えば、単離された免疫細胞に存在する異なる誘導性キメラサイトカイン受容体は、異なる細胞内シグナル伝達事象を活性化することができ、各々が特定の機能的結果を生じ、および／または細胞を特定の表現型に方向付ける。細胞中に導入された誘導性キメラサイトカイン受容体の集団を操作することにより、細胞の機能的アウトカムおよび／または表現型は、操作され得る。例えば、免疫細胞中に導入された誘導性キメラサイトカイン受容体の集団は、１つのＳＴＡＴ転写因子を他のＳＴＡＴより優先して活性化し、それにより細胞の機能的アウトカムおよび／または表現型を、そのＳＴＡＴにより支配されるものへ歪ませるより多数の受容体を含むように操作され得る。
【０２３８】
本明細書に提供される単離されたＴ細胞のような単離された免疫細胞のいくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメイン（例えば、１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインは、１つのポリペプチド、すなわち、１本鎖にある。多重鎖（ｍｕｌｔｉｃｈａｉｎ）ＣＡＲおよびポリペプチドも、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、多重鎖ＣＡＲは、膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞外リガンド結合ドメインを含む第１のポリペプチドと、膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドと、を含み、ポリペプチドは一緒に構築して多重鎖ＣＡＲを形成する。
【０２３９】
ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、目的の標的に特異的に結合する。目的の標的は、例えば、限定なく、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｆｌｔ−３、ＷＴ−１、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＣＤ３３、ＣＤ１３３、ＬｅＹ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、ＣＤ４４ｖ６、ＲＯＲ１、ＣＤ１９、クローディン−１８．２（クローディン−１８Ａ２、またはクローディン１８アイソフォーム２）、ＤＬＬ３（デルタ様タンパク質３、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａデルタホモログ３、デルタ３）、Ｍｕｃ１７（ムチン１７、Ｍｕｃ３、Ｍｕｃ３）、ＦＡＰアルファ（線維芽細胞活性化タンパク質アルファ）、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合遺伝子座タンパク質Ｇ６ｄ、ｃ６ｏｒｆ２３、Ｇ６Ｄ、ＭＥＧＴ１、ＮＧ２５）、ＲＮＦ４３（Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ４３、ＲＩＮＧフィンガータンパク質４３）を含む、目的の任意の分子であり得る。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、可動性リンカーによって結合された標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽鎖可変（ＶＬ）領域および重鎖可変（ＶＨ）領域を含むｓｃＦｖを含む。１本鎖可変領域断片は、短い連結ペプチドを使用することによって軽鎖および／または重鎖可変領域を連結することにより作製される（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８）。連結ペプチドの例は、１つの可変領域のカルボキシ末端と他の可変領域のアミノ末端との間で約３．５ｎｍ架橋する、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）3（配列番号２２４）を有するＧＳリンカーである。他の配列のリンカーが、設計および使用されている（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８、上記）。一般に、リンカーは、短い、可動性ポリペプチドであり、好ましくは約２０以下のアミノ酸残基から構成され得る。次に、リンカーは、薬物の付着または固体支持物への付着のような、追加的機能のために修飾され得る。１本鎖バリアントは、組換えまたは合成的のいずれかで生み出され得る。ｓｃＦｖの合成生産のために、自動合成装置が使用され得る。ＳｃＦｖの組換え生産のために、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドは、酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物細胞のような真核生物、またはＥ．ｃｏｌｉのような原核生物のいずれかの好適な宿主細胞中に導入され得る。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションのような日常的な操作によって作製され得る。生じたｓｃＦｖは、当該技術分野で既知の標準的なタンパク質精製技法を使用して単離され得る。
【０２４１】
本発明に従うＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞の活性化および免疫応答を生じる標的への細胞外リガンド結合ドメインの結合に続く細胞内シグナル伝達に関与する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが発現する免疫細胞の通常のエフェクター機能のうちの少なくとも１つを活性化する能力を有する。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲにおける使用のための細胞内シグナル伝達ドメインは、これらの配列の任意の類似体またはバリアント、および同じ機能的能力を有する任意の合成配列と同様に、例えば、限定なく、抗原受容体の会合に続くシグナル形質導入を開始することと協調して作用するＴ細胞受容体および共受容体の細胞質配列であり得る。細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞質シグナル伝達配列の２つの異なるクラス、抗原依存性の一次活性化を開始するものと、抗原独立様式で作用して二次的または共刺激シグナルを提供するものと、を含む。一次細胞質シグナル伝達配列は、ＩＴＡＭの免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフとして知られているシグナル伝達モチーフを含み得る。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスのチロシンキナーゼに対する結合部位として機能するさまざまな受容体の細胞質内尾部において見出される明確に定義されたシグナル伝達モチーフである。本発明において使用されるＩＴＡＭの例は、非限定的な例として、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＦｃＲε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子のドメインを含む。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５３１３３．）およびＣＤ２８（ＮＰ＿００６１３０．１）の断片からなる群から選択される共刺激分子の一部を含む。
【０２４４】
ＣＡＲは、細胞の表面膜上に発現される。したがって、ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含み得る。本明細書に開示されるＣＡＲに好適な膜貫通ドメインは、（ａ）細胞、好ましくは、例えば、限定なく、リンパ球細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のような免疫細胞の表面上で発現される能力と、（ｂ）事前定義された標的細胞に対して免疫細胞の細胞応答を方向付けるために、リガンド結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインと相互作用する能力と、を有する。膜貫通ドメインは、天然または合成供給源のいずれかに由来し得る。膜貫通ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。非限定的な例として、膜貫通ポリペプチドは、ＣＤ３複合体、ＩＬ−２受容体ｐ５５（鎖）、ｐ７５（β鎖）もしくはγ鎖、Ｆｃ受容体のサブユニット鎖、特にＦｃγ受容体ＩＩＩもしくはＣＤタンパク質を構成するα、β、γまたはδポリペプチドのようなＴ細胞受容体のサブユニットであり得る。代替的には、膜貫通ドメインは、合成的であり得、ロイシンおよびバリンのような主に疎水性残基を含み得る。いくつかの実施形態では、該膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）に由来する。膜貫通ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインと該膜貫通ドメインとの間にストークドメインをさらに含み得る。ストークドメインは、最大３００アミノ酸、好ましくは１０〜１００アミノ酸、最も好ましくは２５〜５０アミノ酸を含み得る。ストーク領域は、ＣＤ８、ＣＤ４、またはＣＤ２８の細胞外領域のすべてもしくは一部から、または抗体定常領域のすべてもしくは一部からのような、天然に発生する分子のすべてまたは一部に由来し得る。代替的には、ストークドメインは、天然に発生するストーク配列に対応する合成配列であり得るか、または完全に合成ストーク配列であり得る。いくつかの実施形態では、該ストークドメインは、ヒトＣＤ８α鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）の一部である。別の特定の実施形態では、該膜貫通ドメインおよびヒンジドメインは、ヒトＣＤ８α鎖の一部を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲは、ＢＣＭＡ、ＣＤ８αヒトヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、ならびに４−１ＢＢシグナル伝達ドメインに特異的に結合する細胞外リガンド結合ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、プラスミドベクターを介して導入遺伝子として免疫細胞中に導入され得る。いくつかの実施形態では、プラスミドベクターはまた、例えば、ベクターを受けた細胞の特定および／または選択を提供する選択マーカーを含有することができる。
【０２４５】
表４は、本明細書に開示されるＣＡＲにおいて使用され得るＣＡＲ構成成分の例示的な配列を提供する。
【０２４６】
【表７】
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【０２４７】
ＣＡＲポリペプチドは、ＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞中への導入後に、細胞においてインサイチュで合成され得る。代替的には、ＣＡＲポリペプチドは、細胞の外側で産生され、次いで細胞中に導入され得る。ポリヌクレオチド構築物を細胞中に導入するための方法は、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、安定的な形質転換方法は、ポリヌクレオチド構築物を細胞のゲノム中に組み込むために使用され得る。他の実施形態では、一過性形質転換方法は、ポリヌクレオチド構築物、および細胞のゲノム中に組み込まれないポリヌクレオチド構築物を一過的に発現するために使用され得る。他の実施形態では、ウイルス媒介性方法が、使用され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソームなどのような任意の好適な手段によって細胞中に導入され得る。一過性形質転換方法は、例えば、限定なく、微量注射、電気穿孔または粒子衝撃を含む。ポリヌクレオチドは、例えばプラスミドベクターまたはウイルスベクターのようなベクターに含まれ得る。
【０２４８】
また、本明細書に記載される少なくとも１つの誘導性キメラサイトカイン受容体を含む単離された免疫細胞も、本明細書に提供される。単離された免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含み得る。本明細書を通じて言及される誘導性キメラサイトカイン受容体および／またはＣＡＲを発現するように修飾された単離された免疫細胞は、操作された免疫細胞とも互換的に称される。これらの単離された免疫細胞は、本明細書に記載される方法のうちのいずれか１つに従って調製され得る。異種ＤＮＡを発現することができる任意の免疫細胞は、目的の誘導性キメラサイトカイン受容体およびＣＡＲを発現する目的のために使用され得る。いくつかの実施形態では、単離された免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、例えば、限定なく、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成人幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より具体的には非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。いくつかの実施形態では、単離された免疫細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞またはＴ細胞であり得る。いくつかの実施形態では、単離された免疫細胞は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球またはヘルパーＴリンパ球からなる群から選択されるＴ細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球からなる群に由来し得る。いくつかの実施形態では、単離された免疫細胞は、自己Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、単離された免疫細胞は、同種Ｔ細胞である。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲ免疫細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）は、例えば、ＲＱＲ８のような自殺ポリペプチド（ｓｕｉｃｉｄｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３１５３３９１Ａを参照されたい。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、細胞の表面上で発現される。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、ＣＡＲ構築物に含まれる。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、ＣＡＲ構築物の部分でない。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲのうちのいずれか１つの細胞外ドメインは、モノクローナル抗体に対して特異的な（モノクローナル抗体に特異的に認識される）１つ以上のエピトープを含み得る。これらのエピトープは、本明細書ではｍＡｂ特異的エピトープとも称される。例示的なｍＡｂ特異的エピトープは、その全体が本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１６／１２０２１６号に開示される。これらの実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、目的の標的に特異的に結合する抗原結合ドメインと、１つ以上のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に結合する１つ以上のエピトープと、を含む。ｍＡｂ特異的エピトープを含むＣＡＲは、単鎖または多鎖であり得る。
【０２５１】
本明細書に記載されるＣＡＲの細胞外ドメインにおけるモノクローナル抗体に対して特異的なエピトープの包含は、ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞の選別および枯渇を可能にする。いくつかの実施形態では、枯渇を可能にすることは、例えば対象への投与時の有害な影響の場合に、安全スイッチを提供する。
【０２５２】
増殖および遺伝学的修飾の前に、細胞の供給源は、さまざまな非限定的な方法を通じて対象から得られることができる。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、いくつもの非限定的な供給源から得られることができる。いくつかの実施形態では、利用可能であり当業者に既知である、Ｔ細胞株のような任意の数の免疫細胞株が、使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、健常ドナー、がんと診断された対象、または感染症と診断された対象に由来し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、異なる表現型特徴を示す細胞の混合集団の部分であり得る。
【０２５３】
また、本明細書に記載される方法のいずれかに従って、形質転換されたＴ細胞のような形質転換された免疫細胞から得られた細胞株も、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本発明に従う単離されたＴ細胞のような単離された免疫細胞は、誘導性キメラサイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明に従う単離された免疫細胞は、誘導性キメラサイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチドおよびＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明に従う単離された免疫細胞は、誘導性キメラサイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチド、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、およびＮＫ細胞アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０２５４】
本発明の単離されたＴ細胞のような単離された免疫細胞は、例えば、限定することなく、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、および米国特許出願公開第２００６／０１２１００５号において一般に記載される方法を使用して、Ｔ細胞の遺伝学的修飾の前または後に、活性化および増殖され得る。免疫細胞は、インビトロまたはインビボで増殖され得る。一般に、本発明のＴ細胞は、例えば、Ｔ細胞に対する活性化シグナルを作成するために、Ｔ細胞の表面上のＣＤ３  ＴＣＲ複合体および共刺激分子を刺激する薬剤との接触により、増殖され得る。例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボール１２−ミリスチン酸１３−アセテート（ＰＭＡ）、またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）のような分裂促進性レクチンのような化学物質は、Ｔ細胞に対する活性化シグナルを作成するために使用され得る。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、免疫細胞集団は、適切な抗体またはその抗原結合断片との接触によってインビトロで刺激され得る。例えば、Ｔ細胞集団は、例えば、抗ＣＤ３抗体、もしくはその抗原結合断片、もしくは表面上に不動化された抗ＣＤ２８抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアと組み合わさったプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触によって、インビトロで刺激され得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子を結合するリガンドが、使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触され得る。Ｔ細胞培養に適した条件は、血清（例えば、胎仔ウシもしくはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＴＧＦｐ、およびＴＮＦ、または当業者に既知の細胞の成長のための任意の他の添加剤を含む、増殖および生存に必要な因子を含有することができる適切な培地（例えば、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ＭｅｄｉａまたはＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉａ  １６４０、またはＸ−ｖｉｖｏ  ５（Ｌｏｎｚａ）を含む。細胞の成長のための他の添加剤は、界面活性剤、プラズマネート（ｐｌａｓｍａｎａｔｅ）、ならびにＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールのような還元剤を含むが、これらに限定されない。培地は、添加されたアミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンを有し、血清を含まないか、または適切な量の血清（もしくは血漿）もしくは定義されたセットのホルモンを補充されているかのいずれかである、ＲＰＭＩ  １６４０、Ａ１Ｍ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １、およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含み、ならびに／あるいはＴ細胞の成長および増殖に十分なサイトカイン（複数可）の量を含み得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養物にのみ含まれ、対象中に注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、成長を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気および５％ＣＯ2）下で維持される。さまざまな刺激時間に曝露されているＴ細胞は、異なる特徴を呈することができる
【０２５６】
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、組織または細胞と共培養することによって増殖され得る。細胞はまた、例えば、細胞を対象中に投与した後、対象の血液においてインビボで増殖され得る。
【０２５７】
別の態様では、本発明は、本発明の細胞のうちのいずれかを含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載される誘導性キメラサイトカイン受容体のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドと、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、を含む単離されたＴ細胞を含む。
【０２５８】
発現ベクターおよびポリヌクレオチド組成物の投与は、本明細書にさらに記載される。
【０２５９】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドのうちのいずれかを作製する方法を提供する。
【０２６０】
任意のかかる配列に相補的なポリヌクレオチドも、本発明に包含される。ポリヌクレオチドは、１本鎖（コードもしくはアンチセンス）または２本鎖であり得、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子は、イントロンを含有しＤＮＡ分子に１対１様式で対応するＨｎＲＮＡ分子と、イントロンを含有しないｍＲＮＡ分子と、を含む。追加的なコード配列または非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るが、存在する必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料に連結され得るが、連結される必要はない。
【０２６１】
ポリヌクレオチドは、固有の配列（すなわち、抗体またはその一部分をコードする内因性配列）を含み得るか、またはかかる配列のバリアントを含み得る。ポリヌクレオチドバリアントは、固有の免疫反応性分子に対して、コードされたポリペプチドの免疫反応性が減少しないように、１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含む。コードされたポリペプチドの免疫反応性に対する影響は、一般に、本明細書に記載されるように評価され得る。バリアントは、固有の抗体またはその一部分をコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは、少なくとも約８０％の同一性、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％の同一性、および最も好ましくは、少なくとも約９５％の同一性を好ましくは呈する。
【０２６２】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、２つの配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載される最大の一致に対して整列された際に同じである場合、「同一」であると言われる。２つの配列の間の比較は、典型的には、比較ウィンドウにわたって配列を比較して、配列類似性の局所領域を特定および比較することによって実行される。本明細書で使用される「比較ウィンドウ」は、２つの配列が最適に整列された後に、近接する位置の同じ数の参照配列と比較され得る、少なくとも約２０の近接する位置、通常は３０〜約７５、または４０〜約５０のセグメントを参照する。
【０２６３】
比較のための配列の最適なアラインメントは、デフォルトパラメータを使用して、生物情報学ソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）におけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して実行され得る。このプログラムは、以下の参照文献に記載されるいくつかの整列スキームを具体化する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，１９７８，Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｉｎ  Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（ｅｄ．）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐｌ．３，ｐｐ．３４５−３５８、Ｈｅｉｎ  Ｊ．，１９９０，Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ｐｐ．６２６−６４５  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３、Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．ａｎｄ  Ｍｕｌｌｅｒ  Ｗ．，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．，１９７１，Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．１１：１０５、Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．，Ｎｅｓ，Ｍ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５、Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｓｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．，１９７３，Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ、Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０。
【０２６４】
好ましくは、「配列同一性の百分率」は、少なくとも２０の位置の比較のウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することにより決定され、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適な整列に対する参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。百分率は、一致した位置の数を生成するために両方の配列で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が発生する位置の数を決定し、一致した位置の数を参照配列の位置の総数（つまり、ウィンドウサイズ）で割り、結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を生成することによって計算される。
【０２６５】
バリアントは、または代替的には、固有の遺伝子またはその一部分もしくは相補体と実質的に相同でもあり得る。かかるポリヌクレオチドバリアントは、中程度にストリンジェントな条件下で、固有の抗体をコードする天然に発生するＤＮＡ配列（または相補的配列）にハイブリダイズすることができる。
【０２６６】
好適な「中程度にストリンジェントな条件」は、５Ｘ  ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液における事前洗浄すること、５０℃〜６５℃、５Ｘ  ＳＳＣで一晩ハイブリダイズすること、続いて、０．１％ＳＤＳを含有する２Ｘ、０．５Ｘ、０．２Ｘ  ＳＳＣの各々を用いて６５℃で２０分間２回洗浄することを含む。
【０２６７】
本明細書で使用される場合、「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度および高温を採用するもの、例えば、５０℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、（２）ハイブリダイゼーション中に、ホルムアミドのような変性剤、例えば、４２℃で０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウムを有するｐＨ６．５での５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを採用するもの、または（３）５５℃でＥＤＴＡを含有する０．１ｘ  ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄が後に続く、０．２ｘ  ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）における４２℃での、およびホルムアルデヒドにおける５５％での洗浄を伴う、４２℃で５０％ホルムアミド、５ｘ  ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％のデキストラン硫酸を採用するものである。当業者は、プローブの長さのような因子に対応する必要に応じて、温度、イオン強度などを調整する方法を認識するであろう。
【０２６８】
遺伝コードの縮重の結果として、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することは、当業者によって理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドのうちのいくつかは、任意の固有の遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用の差異に起因して変化するポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に企図される。さらに、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換のような１つ以上の突然変異の結果として改変された内因性遺伝子である。生じるｍＲＮＡおよびタンパク質は、改変された構造または機能を有することができるが、有する必要はない。対立遺伝子は、標準的な技法（ハイブリダイゼーション、増幅、データベース配列比較のような）を使用して特定され得る。
【０２６９】
本発明のポリヌクレオチドは、化学的合成、組換え方法、またはＰＣＲを使用して得られることができる。化学的ポリヌクレオチド合成の方法は、当該技術分野で周知であり、本明細書で詳細に記載される必要はない。当業者は、本明細書に提供される配列および商業的ＤＮＡ合成装置を使用して、所望のＤＮＡ配列を生み出すことができる。
【０２７０】
組換え方法を使用してポリヌクレオチドを調製するために、所望の配列を含むポリヌクレオチドは好適なベクター中に挿入され得、次に、ベクターは、本明細書でさらに考察されるように、複製および増幅のために好適な宿主細胞中に導入され得る。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の任意の手段によって宿主細胞中に挿入され得る。細胞は、直接取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ交配（Ｆ−ｍａｔｉｎｇ）または電気穿孔によって外因性ポリヌクレオチドを導入することにより、形質転換される。導入されると、外因性ポリヌクレオチドは、組み込まれていないベクター（プラスミドのような）として細胞内に維持されるか、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれ得る。そのように増幅されたポリヌクレオチドは、当該技術分野で周知の方法によって宿主細胞から単離され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照されたい。
【０２７１】
代替的には、ＰＣＲは、ＤＮＡ配列の複製を可能にする。ＰＣＲ技術は、当該技術分野で周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，７５４，０６５号および同第４，６８３，２０２号、同様にＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９４に記載される。
【０２７２】
ＲＮＡは、単離されたＤＮＡを適切なベクターにおいて使用し、好適な宿主細胞中に挿入することにより、取得され得る。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡに転写されると、次いで、ＲＮＡは、例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９に示されるように、当業者に周知の方法を使用して単離され得る。
【０２７３】
好適なクローニングベクターは、標準的な技法に従って構築され得るか、または当該技術分野で利用可能な多数のクローニングベクターから選択され得る。選択されるクローニングベクターは、使用されるよう意図された宿主細胞に従って異なり得るが、一方で、有用なクローニングベクターは、一般に自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼに対して単一の標的を持つことができ、ベクターを含有するクローンを選択するのに使用され得るマーカーに対する遺伝子を担持することができる。好適な例は、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ  ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８のようなシャトルベクターを含む。これらおよび多くの他のクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのような商業的販売業者から利用可能である。
【０２７４】
発現ベクターは、一般に、本発明に従うポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターは、エピソーム、または染色体ＤＮＡの不可欠な部分のいずれかとして、宿主細胞において複製可能でなければならないことが意味される。適切な発現ベクターは、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、コスミドを含むウイルスベクター、およびＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号に開示される発現ベクター（複数可）を含むが、これらに限定されない。ベクター構成成分は、一般に、以下、シグナル配列、複製の起点、１つ以上のマーカー遺伝子、好適な転写制御要素（プロモーター、エンハンサー、およびターミネーターのような）のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。通常、発現（すなわち、翻訳）のために、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および停止コドンのような、１つ以上の翻訳制御要素も、要求される。
【０２７５】
目的のポリヌクレオチドを含有するベクターは、電気穿孔、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を採用するトランスフェクション、微小粒子衝撃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、リポフェクション、および感染（例えば、ベクターがワクシニアウイルスのような感染因子である場合）を含むいくつもの適切な手段のうちのいずれかによって宿主細胞に導入され得る。ベクターまたはポリヌクレオチドを導入することの選択は、多くの場合、宿主細胞の特徴に依存するであろう。
【０２７６】
本明細書に開示される誘導性キメラサイトカイン受容体またはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば、細菌性宿主細胞中への導入のためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのバキュロウイルスベクターのようなウイルスベクター、または哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのレンチウイルスのようなプラスミドもしくはウイルスベクター）に存在し得る。いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体および／またはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルスベクターを使用して、単離された免疫細胞中に導入される。本開示の方法で使用され得る例示的な非ウイルスベクターは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）、Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（例えば、ＳＢ１００Ｘベクター）などのようなトランスポゾンベースのベクターを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体および／またはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、細胞のゲノム中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、組込みは、部位特異的である。部位特異的組込みを提供する方法の例は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のようなゲノム編集ヌクレアーゼ、およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼのような、クラスター化された規則的な間隔の短い回文反復関連ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ）のような、ゲノム編集ヌクレアーゼを採用する方法を含む。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、例えば、限定なく、２Ａペプチドをコードする配列のようなリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含み得る。ピコルナウイルスのＡｐｈｔｈｏｖｉｒｕｓサブグループにおいて特定された２Ａペプチドは、コドンによりコードされる２つのアミノ酸の間のペプチド結合の形成を伴わず、１つのコドンから次のものへのリボソームの「スキップ」を引き起こす（（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔｔ  ２００１、Ａｔｋｉｎｓ，Ｗｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７、Ｄｏｒｏｎｉｎａ，Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．２００８）を参照されたい）。「コドン」により、リボソームによって１つのアミノ酸残基により翻訳されるｍＲＮＡ上の（またはＤＮＡ分子のセンス鎖上の）３つのヌクレオチドが、意味される。したがって、ポリペプチドがフレーム内にある２Ａオリゴペプチド配列によって分離される場合、２つ、３つ、４つ、またはそれを超えるポリペプチドは、ｉｍＲＮＡ内の単一の近接するオープンリーディングフレームから合成され得る。かかるリボソームスキップ機構は、当該技術分野で周知であり、単一のメッセンジャーＲＮＡによってコードされるいくつかのタンパク質の発現のためにいくつかのベクターによって使用されることが知られている。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に方向付けるために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られる）は、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列に提供される。分泌シグナル配列は膜貫通核酸配列に動作可能に連結されており、すなわち、２つの配列は、正しいリーディングフレームにおいて結合され、新しく合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路中に方向付けるように配置される。分泌シグナル配列は、一般的に、目的のポリペプチドをコードする核酸配列の５’に配置されるが、ある特定の分泌シグナル配列は、目的の核酸配列の他の場所に配置され得る（例えば、Ｗｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，０３７，７４３号、Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，１４３，８３０号）。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号３１８または３２９に示されるアミノ酸配列を含む。当業者は、遺伝コードの縮重を考慮して、これらのポリヌクレオチド分子間でかなりの配列変動が可能であることを認識するであろう。いくつかの実施形態では、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞における発現、好ましくは、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。コドン最適化は、所与の種の高度に発現した遺伝子において一般に珍しいコドンの目的の配列における、かかる種の高度に発現した遺伝子において一般に頻繁であるコドンによる交換を指し、かかるコドンは交換されているコドンのようにアミノ酸をコードする。
【０２７９】
免疫療法での使用のための免疫細胞を調製する方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、方法は、誘導性キメラサイトカイン受容体およびＣＡＲを免疫細胞中に導入することと、細胞を増殖させることと、を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞を提供し、誘導性キメラサイトカイン受容体を発現させることと、少なくとも１つのＣＡＲを細胞の表面で発現させることと、を含む、免疫細胞を操作する方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、誘導性キメラサイトカイン受容体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、およびＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを用いて細胞をトランスフェクトすることと、細胞においてポリヌクレオチドを発現させることと、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、誘導性キメラサイトカイン受容体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを用いて細胞をトランスフェクトすることと、細胞内においてポリヌクレオチドを発現することと、を含む。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体およびＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、細胞における安定的な発現のために１つ以上の発現ベクターに存在する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞における安定的な発現のためにウイルスベクターに存在する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、例えば、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターであり得る。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、本発明に従うポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、電気穿孔によって細胞中に直接導入されるｍＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅのようなｃｙｔｏＰｕｌｓｅ技術は、細胞中への材料の送達のために生細胞を一過的に透過処理するために使用され得る（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｃｙｔｏｐｕｌｓｅ．ｃｏｍ、米国第６，０７８，４９０号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０００８２７、およびＰＣＴ／ＵＳ２００４／００５２３７）。パラメータは、最小の死亡率を伴う高トランスフェクション効率のための条件を決定するために変更され得る。
【０２８２】
本明細書では、Ｔ細胞のような免疫細胞をトランスフェクトする方法も、提供される。いくつかの実施形態では、方法は、免疫細胞をＲＮＡと接触させ、以下、（ａ）センチメートルあたり約２２５０〜３０００Ｖの電圧範囲を有する電気パルスと、（ｂ）０．１ｍｓのパルス幅と、（ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）の電気パルスの間の約０．２〜１０ｍｓのパルス間隔と、（ｄ）約１００ｍｓのパルス幅ならびにステップ（ｂ）の電気パルスおよびステップ（ｃ）の第１の電気パルスの間の約１００ｍｓのパルス間隔を有する、約２２５０〜３０００Ｖの電圧範囲を有する電気パルスと、（ｅ）約０．２ｍｓのパルス幅および４つの電気パルスのうちの各々の間の２ｍｓのパルス間隔を有する、約３２５Ｖの電圧を有する４つの電気パルスと、からなるアジャイルパルス配列を免疫細胞に適用することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、該免疫細胞をＲＮＡと接触させ、以下、（ａ）センチメートルあたり約２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２４００、２４５０、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００または３０００Ｖの電圧を有する電気パルスと、（ｂ）０．１ｍｓのパルス幅と、（ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）の電気パルスの間の約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｍｓのパルス間隔と、（ｄ）１００ｍｓのパルス幅ならびにステップ（ｂ）の電気パルスおよびステップ（ｃ）の第１の電気パルスの間の１００ｍｓのパルス間隔を有する、約２２５０、２２５０の、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２４００、２４５０、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００または３０００Ｖからの電圧範囲を有する電気パルスと、（ｅ）約０．２ｍｓのパルス幅および４つの電気パルスのうちの各々の間の約２ｍｓのパルス間隔を有する、約３２５Ｖの電圧を有する４つの電気パルスと、を含むアジャイルパルス配列を免疫細胞に適用することを含む。上記の値範囲に含まれる任意の値は、本出願に開示される。電気穿孔培地は、当該技術分野で既知の任意の好適な培地であり得る。いくつかの実施形態では、電気穿孔培地は、約０．０１〜約１．０ミリジーメンスにわたる範囲の導電率を有する。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、方法は、例えば、限定なく、ＴＣＲの構成成分、免疫抑制剤の標的、ＨＬＡ遺伝子、および／またはＰＤＣＤ１もしくはＣＴＬＡ−４のような免疫チェックポイントタンパク質を発現する少なくとも１つの遺伝子を不活性化することによる、細胞を遺伝学的に修飾するステップをさらに含み得る。遺伝子を不活性化することにより、目的の遺伝子は機能的なタンパク質形態で発現されないことが、意図される。いくつかの実施形態では、不活性化される遺伝子は、例えば、限定なく、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、ＧＲ、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）、ＰＤ−１、およびＣＴＬＡ−４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、方法は、選択的ＤＮＡ切断によって遺伝子を選択的に不活性化することができるレアカット（ｒａｒｅ−ｃｕｔｔｉｎｇ）エンドヌクレアーゼを細胞中に導入することによって１つ以上の遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）またはＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり得る。
【０２８４】
別の態様では、細胞を遺伝学的に修飾するステップは、免疫抑制剤の標的を発現する少なくとも１つの遺伝子を不活性化することによって免疫細胞を修飾することと、任意選択で、免疫抑制剤の存在下で細胞を増殖させることと、を含み得る。免疫抑制剤は、いくつかの作用機序うちの１つによって免疫機能を抑制する薬剤である。免疫抑制剤は、免疫応答の程度および／または貪欲さ（ｖｏｒａｃｉｔｙ）を減少することができる。免疫抑制剤の非限定的な例は、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インターロイキン−２α鎖遮断薬、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素の阻害剤、コルチコステロイド、および免疫抑制代謝拮抗薬を含む。いくつかの細胞傷害性免疫抑制剤は、ＤＮＡ合成を阻害することによって作用する。他のものは、Ｔ細胞の活性化を通じて、またはヘルパー細胞の活性化を阻害することによって作用することができる。本発明に従う方法は、Ｔ細胞における免疫抑制剤の標的を不活性化することにより、免疫療法のためにＴ細胞に免疫抑制耐性を付与することを可能にする。非限定的な例として、免疫抑制剤の標的は、例えば、限定なく、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ＦＫＢＰファミリー遺伝子メンバー、およびシクロフィリンファミリー遺伝子メンバーのような免疫抑制剤の受容体であり得る。
【０２８５】
治療法
上記の方法によって得られた単離された免疫細胞、またはかかる単離された免疫細胞に由来する細胞株は、それを必要とする対象に投与され、医薬品として使用され得る。いくつかの実施形態では、単離された免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、かかる医薬品は、例えばウイルス性疾患、細菌性疾患、がん、炎症性疾患、免疫疾患、または加齢関連疾患のような障害を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では、がんは、胃癌、肉腫、リンパ腫、白血病、頭頸部癌、胸腺癌、上皮癌、唾液癌、肝臓癌、胃癌、甲状腺癌、肺癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、食道癌、膵臓癌、神経膠腫、白血病、多発性骨髄腫、腎細胞癌、膀胱癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸癌、口腔癌、皮膚癌、および黒色腫からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、対象は、局所進行性もしくは転移性黒色腫、扁平上皮性頭頸部癌（ＳＣＨＮＣ）、卵巣癌、肉腫、または再発性もしくは難治性の古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）を有する以前に治療された成人対象である。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、本発明に従う単離されたＴ細胞のような単離された免疫細胞、または単離された免疫細胞に由来する細胞株は、それを必要とする対象における障害の治療のための医薬品の製造に使用され得る。いくつかの実施形態では、障害は、例えば、がん、自己免疫障害、または感染症であり得る。
【０２８７】
また、本明細書では、対象を治療するための方法も、提供される。いくつかの実施形態では、方法は、本発明の誘導性キメラサイトカイン受容体を含む単離された免疫細胞を、それを必要とする対象に提供することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、本発明の単離された免疫細胞を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。例示的な実施形態では、方法は、本発明の誘導性キメラサイトカイン受容体を含む単離されたＴ細胞を、それを必要とする対象に提供することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、本発明の単離されたＴ細胞を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、本発明の単離された免疫細胞は、頑健なインビボ細胞増殖を経ることができ、長期間残存することができる。
【０２８９】
方法は、ＣＡＲおよび本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体を有する操作された免疫細胞を投与する前に、１つ以上の治療薬を対象に投与することをさらに含み得る。ある特定の実施形態では、薬剤は、リンパ枯渇（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）（プレコンディショニング）レジメンである。例えば、かかる療法を必要とする対象をリンパ枯渇させる方法は、対象に特定の有効用量のシクロホスファミド（２００ｍｇ／ｍ2／日〜２０００ｍｇ／ｍ2／日、約１００ｍｇ／ｍ2／日〜約２０００ｍｇ／ｍ2／日、例えば、約１００ｍｇ／ｍ2／日、約２００ｍｇ／ｍ2／日、約３００ｍｇ／ｍ2／日、約４００ｍｇ／ｍ2／日、約５００ｍｇ／ｍ2／日、約６００ｍｇ／ｍ2／日、約７００ｍｇ／ｍ2／日、約８００ｍｇ／ｍ2／日、約９００ｍｇ／ｍ2／日、約１０００ｍｇ／ｍ2／日、約１５００ｍｇ／ｍ2／日または約２０００ｍｇ／ｍ2／日）および特定の用量のフルダラビン（２０ｍｇ／ｍ2／日〜９００ｍｇ／ｍ2／日、約１０ｍｇ／ｍ2／日〜約９００ｍｇ／ｍ2／日、例えば、約１０ｍｇ／ｍ2／日、約２０ｍｇ／ｍ2／日、約３０ｍｇ／ｍ2／日、約４０ｍｇ／ｍ2／日、約４０ｍｇ／ｍ2／日、約５０ｍｇ／ｍ2／日、約６０ｍｇ／ｍ2／日、約７０ｍｇ／ｍ2／日、約８０ｍｇ／ｍ2／日、約９０ｍｇ／ｍ2／日、約１００ｍｇ／ｍ2／日、約５００ｍｇ／ｍ2／日または約９００ｍｇ／ｍ2／日）を投与することを含む。例示的な投薬レジメンは、治療有効量の操作された免疫細胞の患者への投与の前３日間に約３０ｍｇ／ｍ2／日のフルダラビンを投与することと組み合わせて、またはその前、またはその後に、約３００ｍｇ／ｍ2／日のシクロホスファミドを患者に毎日投与することを含む、対象を治療することを伴う。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、特に、本明細書に提供される操作された細胞がＣＤ５２の表面発現を除去または最小化するように遺伝子編集されている場合に、リンパ枯渇は、アレムツズマブのような抗ＣＤ５２抗体の投与をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ５２抗体は、約１〜２０ｍｇ／日のＩＶ、例えば、約１３ｍｇ／日のＩＶの用量で、１、２、３日以上投与される。抗体は、リンパ枯渇レジメンの他の要素（例えば、シクロホスファミドおよび／またはフルダラビン）の投与と組み合わせて、その前に、またはその後に、投与され得る。
【０２９１】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む組成物は、任意の数の化学療法剤と組み合わされて投与され得る。
【０２９２】
本発明の治療方法は、改善すること、治癒的または予防的であり得る。本発明の方法は、自己免疫療法の一部または同種免疫療法治療の一部のいずれかであり得る。本発明は、同種免疫療法に特に好適である。例示的な実施形態では、ドナーからのＴ細胞は、標準プロトコルを使用して非アロ反応性細胞中に形質転換され、必要に応じて複製され、それにより１名または数名の対象に投与され得るＣＡＲ−Ｔ細胞を生み出すことができる。かかるＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、「在庫を有する」治療用製品として利用可能にされ得る。
【０２９３】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される有効量の単離された免疫細胞を対象に投与することを含む、腫瘍を有する対象における腫瘍の成長または進行を阻害する方法を提供する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載される単離された免疫細胞の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるがん細胞の転移を阻害または防止する方法を提供する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載される有効量の単離された免疫細胞を対象に投与することを含む、腫瘍を有する対象において腫瘍退縮を誘導する方法を提供する。例示的な実施形態では、単離された免疫細胞は、Ｔ細胞である。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、単離された免疫細胞は、対象に非経口投与され得る。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
【０２９５】
また、それを必要とする対象における、がんの治療のためのまたは腫瘍の成長もしくは進行を阻害するための医薬品の製造における、本明細書に提供される単離された免疫細胞うちのいずれかの使用も、提供される。例示的な実施形態では、単離された免疫細胞は、Ｔ細胞である。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、治療は、免疫抑制治療を受けている対象中に投与され得る。実際、本発明は、好ましくは、かかる免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活性化に起因して、少なくとも１つの免疫抑制剤に対して耐性を持たせられている細胞または細胞の集団に依存する。この態様では、免疫抑制治療は、対象内での本発明に従う免疫細胞の選択および増殖を助けるはずである。本発明に従う細胞または細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）または移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）によるものを含む、任意の簡便な様式で実施され得る。本明細書に記載される組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内もしくはリンパ内注射、または腹腔内で対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明の細胞組成物は、好ましくは、静脈内注射によって投与される。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、細胞または細胞の集団の投与は、それらの範囲内の細胞数のすべての整数値を含む、例えば、体重ｋｇあたり約１０4〜約１０9細胞の投与を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞または細胞の集団の投与は、それらの範囲内の細胞数のすべての整数値を含む、体重ｋｇあたり約１０5〜約１０6細胞の投与を含み得る。細胞または細胞の集団は、１つ以上の用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、該有効量の細胞は、単回用量として投与され得る。いくつかの実施形態では、該有効量の細胞は、期間にわたって２つ以上の用量として投与され得る。投与のタイミングは、主治医の判断の範囲内であり、対象の臨床状態に依存する。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーのような任意の供給源から得られることができる。個々の必要性は変化するが、一方で、当該分野の範囲内の特定の疾患または状態に対する所与の細胞型の有効量の最適範囲の決定。有効量は、治療的または予防的利益を提供する量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、同時治療の種類、もしあるなら、治療の頻度ならびに所望の効果の性質に依存するであろう。いくつかの実施形態では、有効量の細胞またはそれらの細胞を含む組成物は、非経口投与される。いくつかの実施形態では、投与は、静脈内投与であり得る。いくつかの実施形態では、投与は、腫瘍内の注射によって直接行われ得る。
【０２９８】
キット
本発明は、本方法での使用のためのキットも提供する。本発明のキットは、本明細書に記載される誘導性キメラサイトカイン受容体およびＣＡＲをコードする１つ以上のポリヌクレオチド（複数可）を含む単離された免疫細胞を含む１つ以上の容器と、本明細書に記載される本発明の方法のうちのいずれかに従う使用のための指示を含む。一般に、これらの指示は、上記の治療的治療のための単離された免疫細胞の投与の記載を含む。例示的な実施形態では、キットは、単離されたＴ細胞を含み得る。
【０２９９】
本明細書に記載される単離された免疫細胞の使用に関する指示は、一般に、意図される治療のための投薬量、投薬スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数用量パッケージ）またはサブユニット用量であり得る。本発明のキットに供給される指示は、典型的には、標識またはパッケージ挿入物（例えば、キットに含まれる紙シート）上に書かれた指示であるが、機械可読指示（例えば、磁気または光学記憶ディスク上に担持される指示）も許容される。
【０３００】
本発明のキットは、好適なパッケージング中にある。好適なパッケージングは、バイアル、ボトル、ジャー、可動性パッケージング（例えば、密封されたＭｙｌａｒまたはプラスチックバッグ）などを含むが、これらに限定されない。また、吸入器、経鼻投与デバイス（例えば、アトマイザー）またはミニポンプのような注入デバイスのような特定のデバイスと組み合わされた使用のための包装も、企図される。キットは、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。容器は、無菌アクセスポートも有することができる（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。組成物における少なくとも１つの活性剤は、誘導性キメラサイトカイン受容体およびＣＡＲを含む単離された免疫細胞である。容器は、第２の薬学的活性剤をさらに含み得る。
【０３０１】
キットは、任意選択で、バッファーおよび解釈情報のような追加的構成成分を提供する。通常、キットは、容器と、容器上または容器に関連する標識またはパッケージ挿入物（複数可）を含む。
【０３０２】
以下の実施例は、例示的目的のみのために提供され、決して本発明の範囲を限定するよう意図されない。実際、本明細書に示され、かつ記載されたものに加えて、本発明のさまざまな修正は、前述の記載から当業者に明らかになり、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるであろう。
【０３０３】
番号付きの実施形態
本明細書に開示される発明は、以下の番号付きの例示的実施形態への参照によって定義され得る。
【０３０４】
実施形態１．
二量体形成ドメインと、
チロシンキナーゼ活性化ドメインと、
チロシンエフェクタードメインと、を含む、誘導性キメラサイトカイン受容体。
【０３０５】
実施形態２．二量体形成ドメインが小分子に結合する、実施形態１に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【０３０６】
実施形態３．二量体形成ドメインが、二量体リガンドＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７、二量体ＦＫ５０６、または二量体ＦＫ５０６様類似体に結合する、実施形態１または２に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【０３０７】
実施形態４．二量体形成ドメインがＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【０３０８】
実施形態５．ＦＫＢＰ１２ポリペプチドがアミノ酸置換Ｆ３６Ｖを含む、実施形態４に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【０３０９】
実施形態６．二量体形成ドメインがタンパク質に結合する、実施形態１に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【０３１０】
実施形態７．二量体形成ドメインが、ＦＫＢＰ、シクロフィリン、ステロイド結合タンパク質、エストロゲン結合タンパク質、グルココルチコイド結合タンパク質、ビタミンＤ結合タンパク質、テトラサイクリン結合タンパク質、サイトカイン受容体の細胞外ドメイン、受容体チロシンキナーゼ、ＴＮＦＲファミリー受容体、および免疫共受容体からなる群から選択されるタンパク質のポリペプチドを含む、実施形態１に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【０３１１】
実施形態８．免疫共受容体が、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、成長ホルモン受容体、トロンボポエチン受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、ＧＰ１３０、共通ガンマ鎖受容体、共通ベータ鎖受容体、ＩＦＮアルファ受容体、ＩＦＮガンマ受容体、ＩＦＮラムダ受容体、ＩＬ２／ＩＬ１５受容体、ＩＬ３受容体、ＩＬ４受容体、ＩＬ５受容体、ＩＬ７受容体、ＩＬ９受容体、ＩＬ１０受容体、ＩＬ１２受容体、ＩＬ１３受容体、ＩＬ２０受容体、ＩＬ２１受容体、ＩＬ２２受容体、ＩＬ２３受容体、ＩＬ２７受容体、ＴＳＬＰ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、ＣＮＴＦ受容体、ＯＳＭ受容体、ＬＩＦ受容体、ＣＴ−１受容体、ＴＧＦＢＲ１／ＡＬＫＬ５、ＴＧＦＢＲ２、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ３／ＨＥＲ３、ＥＲＲＢ４／ＨＥＲ４、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲＲ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＣＳＦ−１Ｒ、ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＦＬＫ２／ＦＬＴ３、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３、ＦＧＦＲ−４、ＣＣＫ４、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＲＥＴ、ＲＯＳ、ＬＴＫ、ＡＬＫ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ、ＡＡＴＹＫ２、ＡＡＴＹＫ３、ＲＴＫ１０６、ＴＮＦＲ１、Ｆａｓ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＮＧＦＲ、ＤＲ３、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、ＴＮＦＲ２、ＬＴｂＲ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４−１ＢＢ、ＲＡＮＫ、Ｆｎ１４、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＢＣＭＡ、ＧＩＴＲ、ＴＲＯＹ、ＲＥＬＴ、ＸＥＤＡＲ、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＤｃＲ３、ＰＤ−１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＬＡＧ３、およびＴＩＭ３からなる群から選択される、実施形態７に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【０３１２】
実施形態９．チロシンキナーゼ活性化ドメインが、共通ガンマ鎖受容体、共通ベータ鎖受容体、ＩＦＮアルファ受容体、ＩＦＮガンマ受容体、ＩＦＮラムダ受容体、ＩＬ２／ＩＬ１５受容体、ＩＬ３受容体、ＩＬ４受容体、ＩＬ５受容体、ＩＬ７受容体、ＩＬ９受容体、ＩＬ１０受容体、ＩＬ１２受容体、ＩＬ１３受容体、ＩＬ２０受容体、ＩＬ２１受容体、ＩＬ２２受容体、ＩＬ２３受容体、ＩＬ２７受容体、ＴＳＬＰ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、ＣＮＴＦ受容体、ＯＳＭ受容体、ＬＩＦ受容体、ＣＴ−１受容体、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ３／ＨＥＲ３、ＥＲＲＢ４／ＨＥＲ４、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲＲ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＣＳＦ−１Ｒ、ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＦＬＫ２／ＦＬＴ３、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３、ＦＧＦＲ−４、ＣＣＫ４、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＲＥＴ、ＲＯＳ、ＬＴＫ、ＡＬＫ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ、ＡＡＴＹＫ２、ＡＡＴＹＫ３、およびＲＴＫ１０６受容体からなる群から選択されるタンパク質に由来するか、またはそのポリペプチドを含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【０３１３】
実施形態１０．チロシンエフェクタードメインが、共通ガンマ鎖受容体、共通ベータ鎖受容体、ＩＦＮアルファ受容体、ＩＦＮガンマ受容体、ＩＦＮラムダ受容体、ＩＬ２／ＩＬ１５受容体、ＩＬ３受容体、ＩＬ４受容体、ＩＬ５受容体、ＩＬ７受容体、ＩＬ９受容体、ＩＬ１０受容体、ＩＬ１２受容体、ＩＬ１３受容体、ＩＬ２０受容体、ＩＬ２１受容体、ＩＬ２２受容体、ＩＬ２３受容体、ＩＬ２７受容体、ＴＳＬＰ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、ＣＮＴＦ受容体、ＯＳＭ受容体、ＬＩＦ受容体、ＣＴ−１受容体、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２、ＥＲＢＢ３／ＨＥＲ３、ＥＲＲＢ４／ＨＥＲ４、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲＲ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＣＳＦ−１Ｒ、ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＦＬＫ２／ＦＬＴ３、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３、ＦＧＦＲ−４、ＣＣＫ４、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＲＥＴ、ＲＯＳ、ＬＴＫ、ＡＬＫ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ、ＡＡＴＹＫ２、ＡＡＴＹＫ３、ＲＴＫ１０６、ＡＬＸ、ＢＬＮＫ、Ｇｒｂ７、Ｎｓｐ、ＳＬＰ−７６、ＳＯＣＳ、ＴＳＡｄ、ＡＰＳ、Ｂａｍ３２、Ｃｒｋ、Ｇａｄｓ、Ｇｒｂ２、Ｎｃｋ、ＳＬＡＰ、Ｓｈｃ、ＦＲＳ２、Ｄａｂ、Ｄｏｋ、ＩＲＳ、ｅｐｓ８、ＡＦＡＰ１１０、Ｇａｂ、ＡＤＡＰ、Ｃａｒｍａ１、Ｃａｓ、ＣＩＮ８５、コルタクチン、Ｅ３Ｂ１、ビネキシン、ＳＫＡＰ−５５、ＢＡＮＫ、ＢＣＡＰ、Ｄｏｆ、パキシリン、ＬＡＴ、ＬＡＸ、ＬＩＭＥ、ＮＴＡＬ、ＰＡＧ、ＳＩＴ、およびＴＲＩＭからなる群から選択されるタンパク質に由来するか、またはそのポリペプチドを含む、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【０３１４】
実施形態１１．二量体形成ドメインが誘導性キメラサイトカイン受容体のＮ末端に位置付けられる、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【０３１５】
実施の形態１２．二量体形成ドメインが誘導性キメラサイトカイン受容体のＣ末端に位置付けられる、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【０３１６】
実施形態１３．誘導性キメラサイトカイン受容体が膜貫通ドメインを含む、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【０３１７】
実施形態１４．誘導性キメラサイトカイン受容体が膜標的化モチーフを含む、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【０３１８】
実施形態１５．膜標的化モチーフがＣＤ８シグナル配列またはミリストイルを含む、実施形態１４に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【０３１９】
実施形態１６．受容体がミリストイル化される、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【０３２０】
実施形態１７．二量体形成ドメインがＦＫＢＰポリペプチドを含み、チロシンキナーゼ活性化ドメインがＥｐｏＲまたはＴｐｏＲポリペプチドを含み、チロシンエフェクタードメインがＩＬ７受容体（ＩＬ７Ｒ）ポリペプチドを含む、実施形態１に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【０３２１】
実施形態１８．チロシンエフェクタードメインがＥＧＦＲポリペプチドをさらに含む、実施形態１７に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【０３２２】
実施形態１９．チロシンエフェクタードメインがＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）、ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５〜８２５）、および／またはＥＧＦＲ（１１２２〜１１６５）を含む、実施形態１７に記載の誘導性キメラサイトカイン受容体。
【０３２３】
実施形態２０．実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の誘導性キメラサイトカイン受容体をコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【０３２４】
実施形態２１．実施形態２０に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【０３２５】
実施形態２２．実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の誘導性キメラサイトカイン受容体または実施形態２０に記載のポリヌクレオチドを含む、操作された免疫細胞。
【０３２６】
実施形態２３．細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態２２に記載の操作された免疫細胞。
【０３２７】
実施形態２４．免疫細胞がＴ細胞である、実施形態２２または２３に記載の操作された免疫細胞。
【０３２８】
実施形態２５．対象において操作された免疫細胞を調節する方法であって、方法が、実施形態２２〜２４のいずれか１つに記載の操作された免疫細胞を以前に投与されている対象にリガンドを投与することを含み、二量体リガンドが誘導性キメラサイトカイン受容体の二量体形成ドメインに結合する、方法。
【０３２９】
実施形態２６．リガンドがＡＰ１９０３である、実施形態２５に記載の方法。
【０３３０】
実施形態２７．操作された免疫細胞を調製する方法であって、実施形態２０に記載のポリヌクレオチドまたは実施形態２１に記載の発現ベクターを免疫細胞中に導入することを含む、方法。
【０３３１】
実施形態２８．
（ｉ）二量体形成ドメイン、チロシンキナーゼ活性化ドメイン、およびサイトカイン受容体のチロシンエフェクタードメインを含む、誘導性キメラサイトカイン受容体と、
（ｉｉ）細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、を含む、単離された免疫細胞。
【０３３２】
実施形態２９．誘導性キメラサイトカイン受容体が、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の誘導性キメラサイトカイン受容体である、実施形態２８に記載の単離されたＴ細胞。
【０３３３】
実施形態３０．単離されたＴ細胞が、第２の単離されたＴ細胞のインビボ残存性に対して改善されたインビボ残存性を示し、第２の単離されたＴ細胞は、それが誘導性キメラサイトカイン受容体を含まないことを除いて、単離されたＴ細胞のすべての構成成分を含む、実施形態２８または２９に記載の単離されたＴ細胞。
【０３３４】
実施形態３１．方法が、
（ａ）Ｔ細胞を提供するステップと、
（ｂ）Ｔ細胞を修飾して、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させるステップと、
（ｃ）Ｔ細胞を修飾して、誘導性キメラサイトカイン受容体を発現させるステップと、を含む、単離されたＴ細胞を生成する方法。
【０３３５】
実施形態３２．ステップｃ）が、誘導性キメラサイトカイン受容体を細胞中に安定的に導入することを含む、実施形態３１に記載の方法。
【０３３６】
実施形態３３．ステップｃ）が、誘導性キメラサイトカイン受容体をコードするポリヌクレオチドを、トランスポゾン／トランスポザーゼ系、ウイルスベースの遺伝子導入系、または電気穿孔によって細胞に導入することを含む、実施形態３１または３２に記載の方法。
【０３３７】
実施形態３４．ステップｂ）が、トランスポゾン／トランスポザーゼ系またはウイルスベースの遺伝子導入系によって、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む、実施形態３１〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【０３３８】
実施形態３５．ウイルスベースの遺伝子導入系が組換えレトロウイルスまたはレンチウイルスを含む、実施形態３４に記載の方法。
【０３３９】
実施形態３６．ステップ（ｂ）がステップ（ｃ）の前に発生する、実施形態３１〜３５のいずれか１つに記載の方法。
【０３４０】
実施形態３７．ステップ（ｃ）がステップ（ｂ）の前に発生する、実施形態３１〜３５のいずれか１つに記載の方法。
【０３４１】
実施形態３８．障害を治療する際の使用のための、実施形態２８〜３０のいずれか１つに記載の単離されたＴ細胞を含む、医薬組成物。
【０３４２】
実施形態３９．障害が、がん、自己免疫疾患、または感染症である、実施形態３８に記載の医薬組成物。
【０３４３】
実施形態４０．細胞が２回以上提供される、実施形態３８または３９に記載の医薬組成物。
【０３４４】
実施形態４１．細胞が、少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、またはそれを超える差で個人に提供される、実施形態４０に記載の医薬組成物。
【０３４５】
実施形態４２．障害が、ウイルス性疾患、細菌性疾患、がん、炎症性疾患、免疫疾患、または加齢関連疾患である、実施形態４１に記載の医薬組成物。
【０３４６】
実施形態４３．方法が、実施形態２８〜３０のいずれか１つに記載の単離されたＴ細胞を対象に投与することを含む、対象における障害を治療するための方法。
【０３４７】
実施形態４４．細胞が２回以上対象に提供される、４３の方法。
【０３４８】
実施形態４５．対象が、単離されたＴ細胞の投与前に治療薬で以前に治療されている、実施形態４３または４４に記載の方法。
【０３４９】
実施形態４６．治療剤が抗体または化学療法剤である、実施形態４５に記載の方法。
【０３５０】
実施形態４７．障害が、ウイルス性疾患、細菌性疾患、がん、炎症性疾患、免疫疾患、または加齢関連疾患である、実施形態４３〜４６のいずれか１つに記載の方法。
【０３５１】
実施形態４８．がんが造血器腫瘍または固形癌である、実施形態４７に記載の方法。
【０３５２】
実施形態４９．造血器腫瘍が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性好酸球性白血病（ＣＥＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、または多発性骨髄腫（ＭＭ）から選択される、実施形態４８に記載の方法。
【０３５３】
実施形態５０．固形癌が、胆管癌、膀胱癌、骨および軟部組織腫瘍、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸腺癌、結腸直腸癌、デスモイド腫瘍、胚性癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、胃腺癌、多形性膠芽腫、婦人科腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、肝癌、肺癌、悪性黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、膵管腺癌、原発性星状細胞腫瘍、原発性甲状腺癌、前立腺癌、腎癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、皮膚癌、軟部組織肉腫、精巣胚細胞腫瘍、尿路上皮癌、子宮肉腫、または子宮癌から選択される、実施形態４９に記載の方法。
【０３５４】
実施例
実施例１Ａ：誘導性キメラサイトカイン受容体
ＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５のようなＴ細胞の残存性および機能を増強することが知られるサイトカインは、ＪＡＫ１およびＪＡＫ３キナーゼを次に活性化する天然のヘテロ二量体サイトカイン受容体を通じてシグナル伝達する（ＪＡＫキナーゼの例示的な活性化が図１に示される）。誘導性キメラサイトカイン受容体（図１）を、ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるサイトカインシグナル伝達を調節するのに有効であるように設計および実証した（以下の実施例）。ＡＰ１９０３誘導性キメラサイトカイン受容体は、ＡＰ１９０３応答性ＦＫＢＰF36V融合タンパク質である。内因性ＦＫＢＰは、ラパマイシンに結合してｍＴＯＲを阻害する（図２Ａ）。ＦＫＢＰF36Vは、ラパマイシン様化合物（ラパログ（Ｒａｐａｌｏｇ））に結合する（図２Ｂ）。ＡＰ１９０３は、ＦＫＢＰF36Vを二量体形成する臨床的に安全なラパログ二量体である（図２Ｃ）。
【０３５５】
４０超の既知のサイトカイン受容体のうち、５つのホモ二量体がある。これら５つのホモ二量体は、ＪＡＫ２に結合する。ＪＡＫ２は、ホモ二量体として活性化する。本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体の１つの例示的な実施形態が、図３に示される。
【０３５６】
さまざまな異なる受容体を有するＡＰ１９０３を利用するために、ヘテロ二量体サイトカイン受容体は、ホモ二量体に変換される。
【０３５７】
いくつかの実施形態では、ＦＫＢＰは、誘導性キメラサイトカイン受容体のＮ末端に位置付けられる。他の実施形態では、ＦＫＢＰは、誘導性キメラサイトカイン受容体のＣ末端に位置付けられる。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体は、膜貫通ドメインを有する。他の実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体は、膜貫通ドメインを欠く。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体は、ミリストイル化される。他の実施形態では、本明細書に提供される誘導性キメラサイトカイン受容体は、ミリストイル化されていない。
【０３５８】
実施例２：小分子誘導性Ｅｐｏ受容体の比較
この実施例は、本明細書に提供されるさまざまな誘導性キメラサイトカイン受容体の効力を例示する。
【０３５９】
この研究では、以下の誘導性キメラサイトカイン受容体が、活性について試験を受けた。
ａ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜５０８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−Ｖ５（配列番号１）
ｂ．Ｖ５−ＥｐｏＲ（２７３〜５０８）
ｃ．Ｖ５−ＥｐｏＲ（２７３〜５０８）−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）
ｄ．Ｖ５−ＥｐｏＲ（２７３〜５０８）−ＦＫＢＰ（Ｅ３１Ｇ、Ｆ３６Ｖ、Ｒ７１Ｇ、Ｋ１０５Ｅ）
ｅ．ミリストイル−Ｖ５−ＥｐｏＲ（２７３〜５０８）−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）
ｆ．ミリストイル−Ｖ５−ＥｐｏＲ（２７３〜５０８）−ＦＫＢＰ（Ｅ３１Ｇ、Ｆ３６Ｖ、Ｒ７１Ｇ、Ｋ１０５Ｅ）
ｇ．Ｖ５−ＥｐｏＲ（２７３〜５０８）−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）（配列番号２）
ｈ．Ｖ５−ＥｐｏＲ（２７３〜５０８）−ＦＫＢＰ（Ｅ３１Ｇ、Ｆ３６Ｖ、Ｒ７１Ｇ、Ｋ１０５Ｅ）−ＦＫＢＰ（Ｅ３１Ｇ、Ｆ３６Ｖ、Ｒ７１Ｇ、Ｋ１０５Ｅ）（配列番号３）
ｉ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＣＤ８（１３８〜２０６）−ＥｐｏＲ（２７３〜５０８）−Ｖ５
ｊ．ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ、Ｌ１０６Ｐ）−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ、Ｌ１０６Ｐ）−ＥｐｏＲ（２７３〜５０８）−Ｖ５
ｋ．ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ、Ｌ１０６Ｐ）−ＥｐｏＲ（２７３〜５０８）−Ｖ５
ｌ．ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２７３〜５０８）−Ｖ５
ｍ．ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２７３〜５０８）−Ｖ５
【０３６０】
構築物名に従うと、受容体は、膜標的化モチーフ（ＣＤ８シグナル配列（ＣＤ８  ＳＳ）もしくはミリストイル）、二量体形成ドメイン（ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）もしくはその変異体）、膜貫通（ＥｐｏＲ（  ２３７〜２７２））を含むＥｐｏＲの一部分、ＪＡＫ２結合モチーフ（ＥｐｏＲ（２７３〜３３８））、および／またはチロシンエフェクタードメイン（ＥｐｏＲ（３３９〜５０８））を含む。構築物は、ウエスタンブロットまたはフロー分析のためのエピトープタグ（ＭｙｃまたはＶ５）も含み得る。
【０３６１】
誘導性キメラサイトカイン受容体をコードするベクターを、ＳＴＡＴ５転写因子（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ４６５１）に対するルシフェラーゼレポーターと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。レポーターベクターは、ＳＴＡＴ５応答性ＤＮＡ要素の制御下で発現するホタルルフィセラーゼ（ｌｕｆｉｃｅｒａｓｅ）からなる。エリスロポエチン（Ｅｐｏ）の添加時に、エリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）は、ＪＡＫ２キナーゼを活性化し、次いで、ＥｐｏＲサイトテール上のチロシンをリン酸化してＳＴＡＴ５に対する結合部位を生成する。結合したＳＴＡＴ５は、リン酸化され、ＳＴＡＴ５を活性化してＤＮＡモチーフに会合し、転写を促進する。ＥｐｏをＥｐｏＲでトランスフェクトされた細胞を有する試料に添加し、ＡＰ１９０３をＥｐｏＲのＦＫＢＰへの融合物でトランスフェクトされた細胞を有する試料に添加した。ＥｐｏまたはＡＰ１９０３を、ベースラインシグナル伝達を評価するために試料に添加しなかった。ＳＴＡＴ５アッセイの結果が、図４に要約される。図４では、「リガンド」はＥｐｏまたはＡＰ１９０３のいずれかである。
【０３６２】
ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜５０８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−Ｖ５のシグナル伝達は、ＥｐｏＲ（１〜５０８）陽性対照に最も近かった（図４）。
【０３６３】
これらの結果は、ある特定のＡＰ１９０３誘導性キメラサイトカイン受容体がＡＰ１９０３による二量体化の際に効果的にシグナル伝達し、レポーターを活性化することができることを実証する。ＡＰ１９０３誘導性キメラサイトカイン受容体構築物ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜５０８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−Ｖ５は、頑健な活性を実証した。
【０３６４】
実施例３Ａ：ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ２１、およびＩＦＮａ／ｂシグナルを生成するためのキメラ小分子誘導性Ｅｐｏ受容体
キメラサイトカイン受容体（例えば、ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−サイトテールＸＹＺ）のチロシンエフェクタードメイン（サイトテール）を変更することにより、受容体は、選択のシグナル伝達に対してリダイレクトされ得る。テストされた誘導性キメラサイトカイン受容体は、ＣＤ８  ＳＳ膜標的化モチーフ、ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）二量体形成ドメイン、ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）チロシンキナーゼ活性化ドメイン、およびＥｐｏＲ、ＧＨＲ、ＩＬ２Ｒｂ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ１２Ｒｂ２、ＩＬ２１Ｒ、ＩＦＮＡＲ２、またはＩＦＮＬＲ１受容体のいずれかからのチロシンエフェクタードメインを利用した。ＪＡＫ２結合モチーフおよびチロシンエフェクター尾部を欠く陰性対照は、ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜２８２、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）が含まれている。以下の誘導性キメラサイトカイン受容体を、本研究において試験した。
ａ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＥｐｏＲ（３３９〜５０８）−Ｖ５（配列番号１）
ｂ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＧＨＲ（３５３〜６３８）（配列番号４）
ｃ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ２Ｒｂ（３３３〜５５１）（配列番号５）
ｄ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）（配列番号６）
ｅ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ１２Ｒｂ２（７１４〜８６２）（配列番号７）
ｆ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５〜８２５）（配列番号８）
ｇ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ２１Ｒ（３２２〜５３８）（配列番号９）
ｈ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＦＮＡＲ２（３１０〜５１５）（配列番号４１０）
ｉ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＦＮＬＲ１（３００〜５２０）（配列番号１１）
【０３６５】
ＨＥＫ２９３細胞を、上記の誘導性キメラサイトカイン受容体をコードする構築物と、示された経路に対するルシフェラーゼレポーターで一過的にトランスフェクトした。細胞をリガンドを用いて２４時間処理した。結果が、図５Ａに要約される。この研究では、「対照二量体化剤（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）」は、尾部なし構築物である。
【０３６６】
図５Ａでは、ブラックボックス誘導は、５倍超である。すべてのＳＴＡＴ４実験を、ＳＴＡＴ４の同時トランスフェクションを用いて行った。
【０３６７】
実施例３Ｂ：サイトテールドメインにおける無傷のＪＡＫ結合ドメインとリン酸化可能なチロシンはシグナル伝達に必要である
誘導性キメラサイトカイン受容体がシグナル伝達するのに不可欠な構成成分を特定するために、サイトテールドメインにおいてＪＡＫ結合ドメインまたはチロシン残基のいずれかを欠くＦＫＢＰスイッチを生成した。具体的には、ＴｐｏＲ（４７８〜５８２）からの１つまたは両方のＪＡＫ結合モチーフをグリシンリンカーで置き換えたか、またはＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）サイトテールにおけるすべてもしくは単一（すなわち、Ｙ４４９）チロシン残基（複数可）をフェニルアラニンに変異させた。実施例セクションで使用される用語「スイッチ」は、誘導性キメラサイトカイン受容体を指す。例えば、本明細書で使用される「ＦＫＢＰスイッチ」は、二量体形成ドメインとしてＦＫＢＰを含む誘導性キメラサイトカイン受容体である。
【０３６８】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞レポーターアッセイを使用して、これらのドメインの各々がサイトカインシグナル伝達にどのように影響するかを試験した。簡単に説明すると、２０，０００のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ポリ−Ｌ−リジン被覆された９６ウェルの平底プレートの各ウェル中に播種し、一晩接着させた。キメラサイトカイン受容体（２．５ｎｇ）、ホタルルシフェラーゼ（１００ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を駆動するＳｔａｔ応答要素、およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ対照レポーターベクター（１ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）において５ｕＬの最終体積で混合した（「ＤＮＡ混合物」）。５ｕＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭにおいて０．３ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温で５分間インキュベートし、次いで、ＤＮＡ混合物に添加した。混合物を室温で２０分間インキュベートし、１０ｕＬの総量をＨＥＫ−２９３Ｔを含む各ウェルに添加した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、未処理のままにするか、または無血清培地において希釈された示された濃度のＡＰ１９０３（Ａｐｅｘ  Ｂｉｏ）で処理し、Ｓｔａｔレポーター活性をＤｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して処理後５時間に決定した。ＴｐｏＲ（４７８〜５８２）および未変異ＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）からの２つの無傷のＪＡＫ結合モチーフを有するＦＫＢＰスイッチを、陽性対照として使用した。陰性対照（すなわち、トランスフェクトされたモック（Ｍｏｃｋ））として、細胞を、キメラサイトカイン受容体を除くすべての構成成分を用いてトランスフェクトした。Ｓｔａｔレポーター活性の誘導倍率を、誘導性サイトカイン受容体を除くすべてのベクターでトランスフェクトされ、未処理のままにされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のものに対して正規化した。三つ組みのウェルを、各条件について設定した。
【０３６９】
図５Ｂは、ＡＰ１９０３処理に続く示されたドメインを欠くＦＫＢＰスイッチのＳｔａｔ５レポーター活性を示す。陽性対照と比較して、ＪＡＫ結合モチーフのうちの１つ（すなわち、ＪＡＫ  ２なし、ＩＬ７）または両方（すなわち、ＪＡＫ  １、２なし、ＩＬ７）の除去は、ＡＰ１９０３誘導性Ｓｔａｔ５レポーター活性を抑止した。同様に、ＩＬ７Ｒ（３１７〜４５９）サイトテールにおける３つすべてのチロシン残基のフェニルアラニンへの突然変異は、ＡＰ１９０３誘導性Ｓｔａｔ５レポーター活性を抑止した。この例では、ＩＬ７Ｒ（３１７〜４５９）サイトテールにおけるＹ４９９を、Ｓｔａｔ５活性化を媒介する主要なチロシン残基として特定した。
【０３７０】
実施例４：同系研究のためのマウス受容体
操作された誘導性受容体のマウスバージョンを、生成した。ＦＫＢＰは高度に保存されているため、ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）配列を、変更しなかった。しかしながら、マウスＥｐｏＲの膜貫通およびＪＡＫ２結合部分、ならびにマウスＩＬ２ＲｂおよびＩＬ７Ｒ受容体のチロシンエフェクタードメインを、使用した。以下の誘導性キメラサイトカイン受容体を、本研究において試験した。
ａ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ｍｕＥｐｏＲ（２３６〜３３７、Ｌ２６４Ｇ、Ｌ２６５Ｐ）−ｍｕＩＬ２Ｒｂ（３３７〜５３９）（配列番号１２）
ｂ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ｍｕＥｐｏＲ（２３６〜３３７、Ｌ２６４Ｇ、Ｌ２６５Ｐ）−ｍｕＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）（配列番号１３）
【０３７１】
誘導性キメラサイトカイン受容体をコードするベクターを、ＳＴＡＴ５に対するルシフェラーゼレポーターと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトし、示された経路に対する二量体化剤を添加した。結果は、図６に要約される。
【０３７２】
マウス構築物はシグナル伝達することができた（一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞上のリガンドの６時間）（図６）。
【０３７３】
実施例５Ａ：改善されたシグナル伝達有する誘導性キメラサイトカイン受容体
別の研究では、以前の設計のＥｐｏＲ部分（ＦＫＢＰ−ＥｐｏＲｍ  ＴＭ−ＥｐｏＲ  ＪＡＫボックス−サイトテール）は、他のホモ二量体サイトカイン受容体の同等のドメインに置き換えられた。より強いおよび／またはより速いシグナル伝達を呈する膜貫通ドメインを特定するために、ＥｐｏＲ二量体化剤が不十分にシグナル伝達する初期時点（６〜８時間、右の画像）を、選択した。
【０３７４】
本研究のために、いくつかのチロシンキナーゼ活性化ドメインを、他の点では同一の誘導性サイトカイン受容体設計を使用して比較した。チロシンエフェクタードメインは、ＩＬ１２Ｒｂ２のＳＴＡＴ４活性化配列に融合したＩＬ７ＲからのＳＴＡＴ５活性化配列からなる。各構築物は、膜標的化モチーフ（ＣＤ８  ＳＳ）、二量体形成ドメイン（ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ））、ＥｐｏＲ、ＧＰ１３０、ＰｒｌＲ、ＧＨＲ、ＧＣＳＦＲ、またはＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体のいずれかに由来するチロシンキナーゼ活性化ドメイン、およびＩＬ１２Ｒｂ２（７７５〜８２５）ペプチドに融合したＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）サイトテールからなるチロシンエフェクタードメインを含む。キメラサイトカイン受容体は、検出用のエピトープタグ（Ｍｙｃ）も含む。以下の誘導性キメラサイトカイン受容体を、本研究において試験した。
ａ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）−ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５〜８２５）（配列番号１４）
ｂ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＧＰ１３０（６０９〜７００）−ＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）−ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５〜８２５）（配列番号１５）
ｃ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＰｒｌＲ（２２１〜３１９）−ＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）−ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５〜８２５）（配列番号１６）
ｄ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＧＨＲ（２５１〜３５２）−ＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）−ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５〜８２５）（配列番号１７）
ｅ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＧＣＳＦＲ（６１４〜７１０）−ＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）−ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５〜８２５）（配列番号１８）
ｆ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ（４７８〜５８２）−ＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）−ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５〜８２５）（配列番号１９）
【０３７５】
ＨＥＫ２９３細胞を、上記の誘導性キメラサイトカイン受容体をコードする構築物と、ＳＴＡＴ４またはＳＴＡＴ５のいずれかに対するルシフェラーゼレポーターでトランスフェクトした。ルシフェラーゼレポーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、ＳＴＡＴ４またはＳＴＡＴ５応答性要素のいずれかの制御下でルシフェラーゼをコードした。ＨＥＫ２９３細胞はＳＴＡＴ４を欠くため、ＳＴＡＴ４レポーターでトランスフェクトされたウェルでは、構成的に発現したＳＴＡＴ４をコードするプラスミドをトランスフェクトし、添加もした。トランスフェクトされたＥｐｏＲ、ＧＨＲ、およびＩＬ１２Ｒｂ１＋ＩＬ１２Ｒｂ２（ＩＬ１２受容体）を、陽性対照として使用した。結果は、図７、８、９、および１０Ａに要約される。誘導性キメラサイトカイン受容体に添加されたリガンドは、ＡＰ１９０３であった。ＥｐｏをＥｐｏＲトランスフェクトされた細胞に添加し、成長ホルモンをＧＨＲトランスフェクトされた細胞に、ＩＬ−１２をＩＬ１２受容体トランスフェクトされた細胞に添加した
【０３７６】
ＥｐｏＲ構成成分を有するチロシンキナーゼ活性化ドメインは、最も弱いシグナル伝達構築物であった（図７）。ＳＴＡＴ５およびＳＴＡＴ４の両方の最大の誘導倍率は、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲベースの二量体化剤によって達成された：ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ（４７８〜５８２）−ＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）−ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５〜８２５）（配列番号１９）（図７）。
【０３７７】
ＥｐｏＲベースのサイトカイン受容体（ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）−ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５〜８２５）（配列番号１４））は、最低の基礎的シグナル伝達（本質的にレポーターのみと同等）を実証した。ＧＣＳＦＲ構築物（ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＧＣＳＦＲ（６１４〜７１０）−ＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）−ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５〜８２５）（配列番号１８））は、ＳＴＡＴ４について最も強いシグナル伝達を有した（図９）が、基礎的シグナル伝達を有した。
【０３７８】
実施例５Ｂ：エクトドメイン親和性を調節することによりシグナル伝達出力の効力を最適化する
誘導性キメラサイトカイン受容体の応答性／感度がエクトドメインのそのリガンドへの親和性を調節することで調整され得るかどうかを決定するために、同じＪＡＫ結合ドメインとサイトテールを通じてシグナル伝達されるが、ＡＰ１９０３への低下した親和性を有するＦＫＢＰエクトドメインバリアントを有するＦＫＢＰスイッチを生成した。
【０３７９】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞レポーターアッセイを、エクトドメイン親和性がサイトカインシグナル伝達の応答性にどのように影響するかを試験するために使用した。簡単に説明すると、２０，０００のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ポリ−Ｌ−リジン被覆された９６ウェルの平底プレートの各ウェル中に播種し、一晩接着させた。キメラサイトカイン受容体（２．５ｎｇ）、ホタルルシフェラーゼ（１００ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を駆動するＳｔａｔ応答要素、およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ対照レポーターベクター（１ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）において５ｕＬの最終体積で混合した（「ＤＮＡ混合物」）。５ｕＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭにおいて０．３ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温で５分間インキュベートし、次いで、ＤＮＡ混合物に添加した。混合物を室温で２０分間インキュベートし、１０ｕＬの総量をＨＥＫ−２９３Ｔを含む各ウェルに添加した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、未処理のままにするか、または無血清培地において希釈された示された濃度のＡＰ１９０３（Ａｐｅｘ  Ｂｉｏ）で処理し、Ｓｔａｔレポーター活性をＤｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して処理後５時間に決定した。Ｓｔａｔレポーター活性の誘導倍率を、誘導性サイトカイン受容体を除くすべてのベクターでトランスフェクトされ、未処理のままにされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のものに対して正規化した。三つ組みのウェルを、各条件について設定した。
【０３８０】
図１０Ｂは、ＡＰ１９０３に応答するＦＫＢＰスイッチエクトドメインバリアントのＳｔａｔ５レポーター活性を示す。高親和性ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）変異体と比較して、ＡＰ１９０３に対するＦＫＢＰの親和性を弱めた他のＦＫＢＰバリアントも、Ｓｔａｔ５誘導についてのＥＣ５０を増加させた。
【０３８１】
実施例５Ｃ：改善されたシグナル伝達能力を有するキメラサイトカイン受容体を操作するための代替的アプローチ
キメラサイトカイン受容体を設計する伝統的なアプローチは、１つの受容体の細胞外リガンド結合ドメインを第２の受容体の膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメインに融合させることに関与する（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１４  Ｊｕｎ；２２（６）：１２１１−１２２０、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１７  Ｊａｎ  ４；２５（１）：２４９−２５８、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１８  Ｍａｙ  ２３；９（１）：２０３４．）。（ｉ）それらの自然形態でホモ二量体としてシグナル伝達し、（ｉｉ）異なるエクトドメインに結合される際にキメラとして十分にシグナル伝達する能力を保持するある特定のサイトカイン受容体に由来する膜貫通およびＪＡＫ結合ドメインを活用する、代替的アプローチを考案した（すなわち、図７に記載されるもの）。我々のアプローチでは、１つの受容体の膜貫通および細胞内ＪＡＫ結合ドメインは、第２の受容体の「サイトテール」（つまり、ＪＡＫ結合ドメインの後の領域）に融合される。
【０３８２】
図７では、ＴｐｏＲ  ＴＭおよびＪＡＫ結合ドメインが、最も強いシグナル対ノイズ比出力を生成した。したがって、ＴｐｏＲの細胞外ドメイン（ＴｐｏＲ／ＭＰＬＲ（１〜４７８））を異なるサイトカイン受容体の膜貫通および細胞内ドメインに融合することにより、伝統的なアプローチを使用してＴｐｏＲベースのサイトカイン受容体キメラを生成した。また、異なるサイトカイン受容体のサイトテールとの融合前に、ＴｐｏＲ膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメイン（すなわち、ＴｐｏＲ（４７８〜５８２））を含む領域を融合することにより、我々のアプローチを使用して類似のキメラも生成した。陽性対照として、完全長（ＦＬ）ＴｐｏＲをコードするベクターを使用した。
【０３８３】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞レポーターアッセイを、誘導能およびサイトカインシグナル伝達の規模を試験するために使用した。簡単に説明すると、２０，０００のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ポリ−Ｌ−リジン被覆された９６ウェルの平底プレートの各ウェル中に播種し、一晩接着させた。キメラサイトカイン受容体（２．５ｎｇ）、ホタルルシフェラーゼ（１００ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を駆動するＳｔａｔ応答要素、およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ対照レポーターベクター（１ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）において５ｕＬの最終体積で混合した（「ＤＮＡ混合物」）。５ｕＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭにおいて０．３ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温で５分間インキュベートし、次いで、ＤＮＡ混合物に添加した。混合物を室温で２０分間インキュベートし、１０ｕＬの総量をＨＥＫ−２９３Ｔを含む各ウェルに添加した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、未処理のままにするか、１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯで処理するか、または無血清培地において希釈された１０ｕｇ／ｍＬのＡＰ１９０３（Ａｐｅｘ  Ｂｉｏ）で処理した。Ｓｔａｔレポーター活性の誘導倍率を、誘導性サイトカイン受容体を除くすべてのベクターでトランスフェクトされ、未処理のままにされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のものに対して正規化した。三つ組みのウェルを、各条件について設定した。
【０３８４】
図１０Ｃおよび１０Ｄは、キメラサイトカイン受容体操作の伝統的なアプローチを我々のものに対して比較および対比する概略図を示す。伝統的なアプローチ（図１０Ｃ）は、受容体Ａのエクトドメインのみを膜貫通ドメイン、ＪＡＫ結合ドメイン、および受容体Ｂのサイトテールに融合するが、一方で、我々のアプローチ（図１０Ｄ）は、受容体Ａのエクトドメイン、膜貫通ドメイン、およびＪＡＫ結合ドメインを受容体Ｂのサイトテールに融合させる。
【０３８５】
図１０Ｅは、図１０Ｆにおいて試験されたキメラ受容体の概略図を示す。
【０３８６】
図１０Ｆは、Ｓｔａｔレポーターアッセイからの結果を要約するヒートマップを示す。各行はそれぞれの融合パートナーを表し、各列はそれぞれのＳｔａｔ応答性ホタルルシフェラーゼレポーターを表す。各ボックスは誘導倍率を示し、各列はそれぞれのＳｔａｔレポーターの最高誘導倍率に正規化される：ＳＴＡＴ１について２．７５倍、ＳＴＡＴ１／２について１３．５倍、ＳＴＡＴ３について３５４倍、ＳＴＡＴ４について３８倍、ＳＴＡＴ５について１７３倍、かつＳＴＡＴ６について１０．５倍。伝統的な設計に基づくキメラサイトカイン受容体と比較して、我々のアプローチを使用して操作されたものは、インデューサーＡＰ１９０３に応答する下流シグナル伝達のより大きな規模を示した。
【０３８７】
実施例６：誘導性キメラサイトカイン受容体
この例は、改善されたおよび特定化された機能を有する誘導性キメラサイトカイン受容体を例示する。
【０３８８】
いくつかの実施形態では、サイトカイン尾部は、複数の経路を刺激するために直列に連結され得る（例えば、残存促進性（ｐｒｏ−ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ）ＳＴＡＴ５および炎症促進性ＳＴＡＴ４についてのＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）−ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５〜８２５）断片融合）。すなわち、この実施形態では、少なくとも２つの受容体からのサイトカイン尾部を、使用した。他のいくつかの実施形態では、単一の受容体からのサイトカイン尾部を、使用した。
ＳＴＡＴ５またはＡＰ−１出力を有する最小のチロシンエフェクタードメイン
【０３８９】
各サイトテールでは、小さなチロシンペプチドは、シグナル伝達経路に関与する。適切なモチーフを、改善されたシグナル伝達を有する実質的により小さな構築物を開発するために特定した。例えば、Ｙ８００を含有するＩＬ１２Ｒｂ２（７７５〜８２５）ペプチドを、チロシンエフェクタードメインとして使用された際に、ＳＴＡＴ４シグナルを提供するのに十分であると決定した（実施例３および５を参照されたい）。
【０３９０】
本研究では、シグナル伝達の主要な態様に十分なチロシンを特定するために、ＩＬ２Ｒｂ、ＩＬ７Ｒ、およびＥＧＦＲサイトテールを分析した。例えば、ＳＴＡＴ５相互作用チロシンＹ４１８およびＹ４３６を含有するＩＬ２Ｒｂのセグメントは、ＳＴＡＴ５シグナル伝達を保持することができるが、これがＩＬ２ＲｂサイトテールのＹ３６４を要求するため、ＰＩ３Ｋシグナル伝達を失い得る。ＩＬ７Ｒ、ＩＬ２Ｒｂ、およびＩＦＮＡＲ２尾部を含む誘導性キメラサイトカイン受容体は、サイトテール内に１つ以上のチロシンモチーフを含み得る。尾部（例えば、ＩＬ１２Ｒｂ２尾部）の１つ以上の部分の除去は、いくつかの場合に、負の調節性モチーフの除去、およびより強いシグナル伝達を生じる。
【０３９１】
この研究では、ＥｐｏＲベースのチロシンキナーゼ活性化ドメインを使用して、さまざまなＩＬ７ＲａおよびＩＬ２Ｒｂ由来断片によるシグナル伝達を、試験した。以下の誘導性キメラサイトカイン受容体を、本研究において試験した。
ａ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）（配列番号６）
ｂ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ７Ｒ（３７６〜４１６）（配列番号２０）
ｃ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ７Ｒ（４２４〜４５９）（配列番号２１）
ｄ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ７Ｒ（３７６〜４１６、４２４−４５９）（配列番号２２）
ｅ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ７Ｒ（４２４〜４５９、Ｙ４５６Ｆ）（配列番号２３）
ｆ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ７Ｒ（３７６〜４１６、４２４−４５９、Ｙ４５６Ｆ）（配列番号２４）
ｇ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ２Ｒｂ（３３３〜５５１）（配列番号５）
ｈ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ２Ｒｂ（３９３〜４３３）（配列番号２５）
ｉ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ２Ｒｂ（５１８〜５５１）（配列番号２６）
ｊ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ２Ｒｂ（３３９〜３７９、３９３〜４３３）（配列番号２７）
ｋ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ２Ｒｂ（３３９〜３７９、５１８〜５５１）（配列番号２８）
ｌ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ２Ｒｂ（３９３〜４３３、５１８〜５５１）（配列番号２９）
ｍ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ２Ｒｂ（３３９〜３７９、３９３〜４３３、５１８〜５５１）（配列番号３０）
【０３９２】
ＩＦＮＡＲ２構築物は、試験されたが、ＣＤ８  ＳＳ膜標的化モチーフ、ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）二量体形成ドメイン、およびＥｐｏＲ（２３７〜３３９、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）チロシンキナーゼ活性化ドメインを使用して、短い（８時間）ＡＰ１９０３処理では実質的なシグナルを開始しなかった。プロットされた構築物は、ＩＬ７ＲおよびＩＬ２Ｒｂサイトテールに由来するチロシンエフェクタードメインを含む。
【０３９３】
ＳＴＡＴ５を通じたＩＬ７シグナル伝達を、Ｙ４０１およびＹ４４９を含有するが負の調節性Ｙ４５６（ＩＬ７Ｒ（３７６〜４１６、４２４〜４５９、Ｙ４５６Ｆ）、配列番号２４、図１１）を有しない２つの断片によって完全に再作成した。ＩＬ２  ＳＴＡＴ５シグナル伝達を、Ｙ３６４、Ｙ４１８、およびＹ４３６を含有する２つの断片によって再作成したが、はるかに大きいシグナル伝達が、Ｙ３６４（ＩＬ２Ｒｂ（３９３〜４３３、５１８〜５５１）、配列番号２９、図１１）を欠くより小さな構築物と共に観察された。Ｙ３６４は、Ｔ細胞の分化および増殖を促進し、アクチン骨格を再編成して受容体の内部移行を促進するＰＩ３Ｋを活性化することが報告されている。したがって、Ｙ３６４は、ＳＴＡＴ５シグナル伝達に対する負の調節性モチーフであり、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＴＯＲＣ軸に対する主要な正の調節性モチーフでもある。所望の機能的出力に依存して、Ｙ３６４は、含まれるか除外されることができる。
【０３９４】
非サイトカイン受容体
ＴＣＲ活性化時に、Ｃａ＋可動化は、ＮＦＡＴの活性化および炎症促進性標的（ＩＬ２、ＧｚｍＢなど）の上方制御を引き起こす。これらのプロモーターのうちの多くは、ＮＦＡＴ単独ではなく、むしろＡＰ−１（ＦｏｓおよびＪｕｎのコイルドコイル）を有するＮＦＡＴのヘテロ三量体によって活性化される（図１２）。疲弊は、過剰な抗原刺激で発生し、活性化したＮＦＡＴの量がＡＰ−１の量に取って代わり、ＮＦＡＴホモ二量体と異なるプロモーターの活性化戸を生じる際に発生すると考えられる。疲弊を防止する１つの方法は、ＡＰ−１（Ｆｏｓ／Ｊｕｎ）の量を増加させることであろう（図１３）。ＩＬ２ＲおよびＩＬ７Ｒのようなサイトカイン受容体は、ｃ−Ｊｕｎをリン酸化および活性化させるＪＮＫ（Ｊｕｎキナーゼ）を活性化させる。しかしながら、このこと単独は、Ｆｏｓも上方制御およびリン酸化されなくてはならないため、ＡＰ−１を上方制御するには不十分である。並列のＭＥＫ／ＥＲＫ経路は、Ｆｏｓの直接リン酸化と同様に、Ｍｙｃ／Ｍａｘを通じたＦｏｓの上方制御を引き起こす。
【０３９５】
ＡＰ−１は、協調的なＪＮＫおよびＥＲＫシグナル伝達によって誘導される。いくつかの実施形態では、ＪＮＫおよび／またはＭＥＫ／ＥＲＫを活性化することができる誘導性キメラサイトカイン受容体が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体は、ＡＰ−１を強力に誘導して疲弊を防止することができる。
【０３９６】
以下の誘導性キメラサイトカイン受容体をコードする構築物を、活性について試験した。各構築物は、膜標的化モチーフ（ＣＤ８  ＳＳ）、二量体形成ドメイン（ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ））、チロシンキナーゼ活性化ドメイン（ＥｐｏＲ（２３７−３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ））、およびＲＴＫ  ＥＧＦＲのサイトテールまたはサイトカイン受容体に由来するチロシンエフェクタードメインを含む。キメラサイトカイン受容体は、検出用のエピトープタグ（Ｍｙｃ）も含む。
ａ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＥＧＦＲ（９５５〜１１８６）（配列番号３１）
ｂ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＥＧＦＲ（９５５〜１０４４、１０５８〜１１８６、Ｙ９７４Ｆ）（配列番号３２）
ｃ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＥＧＦＲ（９５５〜１００９、Ｙ９７４Ｆ）（配列番号３３）
ｄ．
ｅ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＥＧＦＲ（１０１９〜１０８５）（配列番号３４）
ｆ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＥＧＦＲ（１０３７〜１０４４、１０５８〜１１０３、Ｙ１０６８／１１０１Ｆ）（配列番号３５）
ｇ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＥＧＦＲ（１０６６〜１１１８、Ｙ１０６８／１０８６Ｆ）（配列番号３６）
ｈ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７−３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＥＧＦＲ（１１２２〜１１６５）（配列番号３７）
ｉ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＥＧＦＲ（１１３３〜１１８６、Ｙ１１４８Ｆ）（配列番号３８）
ｊ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ２Ｒｂ（３３３〜５５１）（配列番号５）
ｋ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）（配列番号６）
ｌ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ１２Ｒｂ２（７１４〜８６２）（配列番号７）
ｍ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ２１Ｒ（３２２〜５３８）（配列番号９）
ｎ．ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＦＮＡＲ２（３１０〜５１５）（配列番号４１０）
【０３９７】
ＨＥＫ２９３細胞を、示された経路に対するルシフェラーゼレポーターである上記の構築物を用いて一過的にトランスフェクトした。ＳＴＡＴ５シグナル伝達を、測定した。結果は、図１４に要約される。すべてのキメラ抗原受容体に対するリガンドは、ＡＰ１９０３である。最も暗いボックスは、１０倍超の誘導を表す。ＦＬＴリガンドを、トランスフェクトされたＦｌｔ３受容体チロシンキナーゼに添加した。トランスフェクトされたＦｌｔ３受容体を、ＨＥＫ２９３細胞が内因性ＥＧＦＲ受容体を発現するため、ＥＧＦＲの代わりに対照として使用した。
【０３９８】
ＰＬＣ−＞ＮＦｋＢを活性化する受容体
同種ＣＡＲ−Ｔ細胞の１つの欠点は、ＴＣＲノックアウトまたはノックダウン（ＧｖＨＤを防止するため）が、基本的なＴＣＲシグナル伝達の損失を生じることである。基礎的ＴＣＲシグナル伝達は、ＴＣＲ残存性を増加させる。サイトカインはＳＴＡＴ５を通じて残存性を増加することができるが、このことはＴＣＲを正確に複製しない。ＴＣＲは、Ｃａ2+を可動化させてＰＬＣを活性化し、ＮＦＡＴおよびＮＦｋＢを引き起こす。
【０３９９】
本明細書に提供される小分子誘導性キメラサイトカイン受容体は、カルシウムを可動化させ、ＮＦＡＴおよびＮＦｋＢを活性化するように操作されている。
【０４００】
Ｂ細胞受容体は、次いでＰＬＣｙ２−＞ＰＫＣ−＞ＮＦＡＴおよびＮＦｋＢを活性化させる、ブルトンのチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）を活性化させる。この文脈では、ＢＴＫは、チロシンキナーゼアダプタータンパク質ＢＬＮＫ上のチロシンを通じて標的を認識する（図１５）。
【０４０１】
内因性ＢＬＮＫリン酸化キナーゼＢＴＫ（例えば、「ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＸＹＺサイトテール」）を置換するチロシンキナーゼ活性化ドメインとのＢＬＮＫ融合物を含む誘導性キメラサイトカイン受容体を生成した（配列番号３９、４０、および４１）。いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体は、サイトカイン受容体サイトテールおよびチロシンキナーゼアダプタータンパク質のようなタンデムチロシンエフェクタードメインを含む。
【０４０２】
実施例７：ＧｏＣＡＲＴと比較した、ＣＡＲ−Ｔ細胞残存性に対する誘導性キメラサイトカイン受容体の二量体化の影響
本研究では、コザック配列、誘導性キメラサイトカイン受容体、Ｔ２Ａ配列、およびキメラ抗原受容体が後に続くＳＦＦＶプロモーターを含むレンチウイルス（ｐＬＶＸ）構築物を、生成した。キメラ抗原受容体を、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞に方向付けた。比較のために、誘導性キメラサイトカイン受容体の代わりにＴａｇＢＦＰまたはＧｏＣＡＲＴのいずれかを有するレンチウイルス構築物を使用した。ＧｏＣＡＲＴは、ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）の２つのリピートに融合されたＭｙＤ８８およびＣＤ４０の一部分が後に続く、ミリストイル化配列からなる。
【０４０３】
ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ヒト末梢血単核細胞から分離し、ＩＬ−２と共に培養した。Ｔ細胞を、単離の２日後にレンチウイルスを用いて形質導入し、３日後にＡＰＣ標識ＥＧＦＲｖＩＩＩを結合することによりＦＡＣＳ選別した。選別されたＥＧＦＲｖＩＩＩ＋細胞を、単離後１４日まで培養した。
【０４０４】
１４日目に、０．５ｅ６細胞を、２４ウェルプレートに再懸濁させ、ＩＬ２、ＡＰ１９０３、または処理なしのいずれかで産生後８日間成長させた。生細胞数の結果は、図１６および図１７に要約される。
【０４０５】
ＡＰ１９０３誘導性受容体を含むいくつかの構築物は、わずかな成長を促進した（例えば、ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７−３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ２Ｒｂ（３３３〜５５１）（配列番号５）、およびＧｏＣＡＲＴ（以前に報告された多量体化剤、ミリストイル−Ｍｙｄ８８−ＣＤ４０−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）ｘ２が、ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜３３８、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）−ＩＬ７Ｒ（３１６〜４６９）（配列番号６）のみが、頑健な成長を促進した（図１６）。ＩＬ７Ｒ（３１６〜４６９）サイトテール含有受容体およびＧｏＣＡＲＴ尾部は、ＩＬ２処理に匹敵するＡＰ１９０３でより高い生存率を維持する（図１７）。
【０４０６】
ＡＰ１９０３またはＩＬ２を用いた産生後８日目に、細胞の表現型を決定した。結果は、図１８および図１９に要約される。誘導性ＩＬ７Ｒ（３１６〜４６９）含有受容体はより多くの幹細胞メモリーを実証する一方で、ＧｏＣＡＲＴはより少ない幹細胞メモリーおよびより多くのエフェクターメモリーを実証した。ＩＬ２を用いてさらに成長した際に、すべての細胞の生存率は同等に見えたが、ＧｏＣＡＲＴはやや分化したように見えた。結果は、小分子誘導性ＩＬ７Ｒ（３１６〜４６９）受容体があまり分化していない状態を保存しながら増殖を促進することを実証する。
【０４０７】
サイトカインを、２日目と８日目に測定した。ＡＰ１９０３のデータは、図２０および図２１に示される。すべての値を、未処理のＴａｇＢＦＰ発現ＣＡＲ−Ｔ細胞に対して正規化した。ＧｏＣＡＲＴはＮＦｋＢ経路を活性化するため、このことは頑健なサイトカイン放出を生じる一方で、他のものはそうでなかった。ＩＦＮ関連尾部は、いくつかのサイトカイン放出を招く。
【０４０８】
シグナル伝達なしでは、すべての構築物は同等の成長を提供する（１週間でおよそ倍増する）が、ＩＦＮＡＲ２尾部を有する誘導性キメラサイトカイン受容体を含む細胞のやや少ない成長を伴う（図２２）。
【０４０９】
いずれの処理も有しない産生後２日目および８日目のサイトカインの誘導を、測定した。結果は、図２３および図２４に要約される。小分子誘導性ＩＦＮＡＲ２（３１０〜５１５）構築物を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞は、構成的に少量のＩＬ５を放出するが、一方で、小分子誘導性ＩＬ２Ｒｂ（３３３〜５５１）構築物を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＩＬ１３および８日目（８日目、図２４）までに減少するいくらかのＴＮＦａ（２日目、図２３）を放出する。ＧｏＣＡＲＴ発現細胞ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ５、ＩＬ１３、ＩＬ２２、およびＭＩＰ１ａ、２日目時点および８日目時点はなおさらである。結果は、ＩＦＮＡＲ２（３１０〜５１５）およびＩＬ２Ｒｂ（３３３〜５５１）尾部が穏やかに自己活性化するが、一方で、ＧｏＣＡＲＴが強くそうであることを実証する。サイトカイン放出は、ＩＬ７Ｒ（３１６−４５９）尾部構築物から観察されず、最小のサイトカイン放出は、小分子活性化の非存在下ですべての誘導性キメラサイトカイン受容体構築物について観察された。
【０４１０】
図２５は、異なる尾部を有する誘導性キメラサイトカイン受容体、ＧｏＣＡＲＴ、ＪＡＫ２結合モチーフまたはチロシンエフェクタードメイン（ＣＤ８  ＳＳ−Ｍｙｃ−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−ＥｐｏＲ（２３７〜２８２、Ｌ２４１Ｇ、Ｌ２４２Ｐ）を有しない誘導性サイトカイン受容体、またはＴａｇＢＦＰで形質導入されたＣＡＲ  Ｔ細胞の産生後５日目および８日目のＣＡＲ−Ｔ細胞数を要約するグラフを示す。最小の成長はＩＦＮＡＲ２尾部について観察され、８日目のサイトカイン測定から、これらのＣＡＲ  Ｔ細胞はＩＬ−２をあまり消費しないことが観察された。
【０４１１】
本明細書に提供されるＡＰ１９０３誘導性サイトカイン受容体は、ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＩＦＮ、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ２１、ＥＧＦＲ、および他のチロシンキナーゼベースのシグナル伝達を扇動するための頑健なプラットフォームである。ＥｐｏＲは、ホモ二量体化時に活性化されるキナーゼ（ＪＡＫ２）を動員し、付着されたサイトテールに完全に依存するシグナル伝達エフェクターをリン酸化する。ＣＡＲ−Ｔ細胞における所望の機能に依存して、操作されたサイトテール（例えば、ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５〜８２５）またはＥＧＦＲサイトテール部分と融合したＩＬ７サイトテール）は、所望の効果を達成するために利用され得る。系のシグナル強度はまた、異なるチロシンキナーゼ活性化ドメインを使用して調整され得る。例えば、シグナル強度は、本明細書に記載される異なる膜貫通バリアントを含むチロシンキナーゼ活性化ドメインを使用して調整され得る。
【０４１２】
ＩＬ７（３１６〜４５０）チロシンエフェクタードメインは、分化またはサイトカイン放出を駆動することなく成長を促進するのに十分な最小のＰＩ３Ｋを用いてＳＴＡＴ５シグナル伝達を提供する。加えて、ＩＬ７尾部はまた、あまり内部移行および劣化されていない。
【０４１３】
実施例８：複数の出力を有する誘導性サイトカイン受容体を操作する
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞レポーターアッセイを、誘導能およびサイトカインシグナル伝達の規模を試験するために使用した。簡単に説明すると、２０，０００のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ポリ−Ｌ−リジン被覆された９６ウェルの平底プレートの各ウェル中に播種し、一晩接着させた。誘導性サイトカイン受容体（２．５ｎｇ）、ホタルルシフェラーゼ（１００ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を駆動するＳｔａｔ応答要素、およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ対照レポーターベクター（１ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）において５ｕＬの最終体積で混合した（「ＤＮＡ混合物」）。５ｕＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭにおいて０．３ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温で５分間インキュベートし、次いで、ＤＮＡ混合物に添加した。混合物を室温で２０分間インキュベートし、１０ｕＬの総量をＨＥＫ−２９３Ｔを含む各ウェルに添加した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、未処理のままにするか、または無血清培地において希釈された１ｕｇ／ｍＬのＡＰ１９０３（Ａｐｅｘ  Ｂｉｏ）で処理した。Ｓｔａｔ５レポーター活性の誘導倍率を、誘導性サイトカイン受容体を除くすべてのベクターでトランスフェクトされ、未処理のままにされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のものに対して正規化した。
【０４１４】
図２６は、二重のＩＬ−７ＲおよびＩＬ−２１Ｒ出力を有する誘導性サイトカイン受容体の概略的な例を示す。多くの場合、サイトカインがＴ細胞応答を増強することに対する相乗効果を有するため（例えば、ＩＬ−７とＩＬ−２１、ＩＬ−２とＩＬ−２１）、複数のサイトカインシグナル伝達出力を模倣する能力は、有益であり得る。複数のサイトカインシグナル伝達出力を生成するために、２つのサイトテールを、キメラ受容体の細胞内Ｃ末端で直列に結合した。
【０４１５】
複数の出力を生成する際に、個々のサイトテールの細胞膜への近接は、それらのそれぞれのシグナル伝達出力の強度に影響することができる。以下の表５は、各出力が細胞膜の近位または遠位のいずれかに配置された、二重出力を有する誘導性サイトカイン受容体の例を示す。
【０４１６】
図２７は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＳｔａｔレポーター活性についてのルシフェラーゼアッセイの読み出しを示す。ＩＬ−２１Ｒサイトテールの膜遠位配置は、より大きいＳｔａｔ５（図２７ａ）およびＳｔａｔ３（図２７ｂ）レポーター活性を生じた。したがって、異なるサイトテールの最大のシグナル伝達強度は、細胞膜に対するそれらの相対的な配置によって追加的に調整され得る。
【０４１７】
初代ヒトＣＡＲ  Ｔ細胞の文脈においてこれらの二重出力誘導性サイトカイン受容体を評価するために、誘導性サイトカイン受容体を、化学量論的共発現を可能にするようＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ（２１７３  ｓｃＦｖ、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１５  Ｆｅｂ  １８；７（２７５）：２７５ｒａ２２．に記載される）をコードするレンチウイルスベクター中にクローン化した。形質導入された細胞の検出を促進するために、ｖ５エピトープタグ（ＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）を、ｓｃＦｖおよびＣＤ８ヒンジドメインの間に挿入した。ＦＫＢＰスイッチＣＡＲをコードするレンチウイルスを作製するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１日目に、６ウェルプレートのウェルあたり１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を用いて補充された２ｍＬのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中にｍＬあたり４５万細胞で播種した。０日目に、レンチウイルスを、６ウェルプレートのウェルあたり２５０ｕＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）においてレンチウイルスパッケージングベクター１．５ｕｇのｐｓＰＡＸ２、０．５ｕｇのｐＭＤ２Ｇ、０．５ｕｇの適切なＣＡＲベクターを一緒に混合することによって調製した（「ＤＮＡミックス」）。２５０ｕＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭにおいて１０ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温で５分間インキュベートし、次いで、ＤＮＡ混合物に添加した。混合物を室温で２０分間インキュベートし、５００ｕＬの総量をＨＥＫ２９３Ｔを含むウェルの側面にゆっくりと添加した。０日目に、精製されたＴ細胞を、１００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で補充されたＸ−ｖｉｖｏ−１５培地（Ｌｏｎｚａ）において、Ｇｒｅｘ−２４プレート（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ、カタログ番号８０１９２Ｍ）を補充したＸ−Ｖｉｖｏ−１５培地（Ｌｏｎｚａ）において、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、およびヒトＴ  ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０−１１１−１６０、１：１００希釈）で活性化した。１日目に、６ウェルプレートにおけるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の各ウェルからの培地を、ウェルあたり２ｍＬのＴ細胞形質導入培地、すなわち、１０％ＦＢＳで補充されたＸ−Ｖｉｖｏ−１５で置き換えた。２日目に、Ｔ細胞を、Ｇｒｅｘ−２４プレートのウェルあたり１ｍＬのＴ細胞形質導入培地においてｍＬあたり５０万細胞で再懸濁させた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのレンチウイルス上清を、回収し、０．４５ミクロンフィルタ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して細胞片を除去し、次いで、１００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ−２と共にＴ細胞に添加した。５日目に、４．５ｍＬのＴ細胞増殖培地、すなわち、５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ）および１００ＩＵ／ｍＬヒトＩＬ−２で補充されたＸ−Ｖｉｖｏ−１５を、Ｇｒｅｘ−２４プレートの各ウェルに添加した。細胞を、Ｔ細胞増殖培地を使用して、必要に応じてより大きなＧ−Ｒｅｘ容器（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ）中に増殖させた。１３日目または１４日目に、形質導入効率を、フローサイトメトリーを使用してＦＩＴＣ複合体化ｖ５タグモノクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）に結合したＴ細胞の百分率を検出することにより、決定した。１４日目または１５日目に、ＣＡＲ−Ｔ細胞産物を、凍結保存し、さらなるアッセイのために必要に応じて解凍した。
【０４１８】
うまく形質導入されたＴ細胞の百分率を決定するために、Ｔ細胞を、まず４℃で２０分間ＰＢＳ＋１％ＢＳＡにおいて、ＦＩＴＣ複合体化ｖ５タグモノクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）と共にインキュベートした。次いで、細胞を、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで洗浄し、フローサイトメトリーを使用して分析した。
【０４１９】
図２８Ａは、図２８Ｂおよび２８Ｃに示されるサイトテールを含むＦＫＢＰスイッチＣＡＲベクターの概略図を示す。
【０４２０】
図２８Ｂは、ｖ５タグ染色によって決定された、ＦＫＢＰスイッチＣＡＲ  Ｔ細胞の形質導入効率を示す。
【０４２１】
ＦＫＢＰスイッチＣＡＲ  Ｔ細胞におけるサイトカインシグナル伝達の誘導能および規模を決定するために、解凍したＣＡＲ  Ｔ細胞産物を、５％ＣＯ２で３７％での加湿インキュベーター中で１００ｕＬの無血清ＲＰＭＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において４時間血清飢餓状態にし、次いで、１ｕｇ／ｍｌのＡＰ１９０３で１時間処理した。ＡＰ１９０３処理に入って４０分後、ＢＵＶ３９５複合体化抗ヒトＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＦＩＴＣ複合体化ｖ５タグモノクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含む抗体カクテルを、細胞に添加し、最後の２０分間インキュベートした。ＡＰ１９０３処理の１時間後、細胞を、３５ｕＬの１６％パラホルムアルデヒドの添加により固定し、各１００ｕＬの試料に添加し、３７℃で１５分間インキュベートさせた。次いで、細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、−２０℃で１または２晩１００％冷メタノールで透過処理した。ＦＡＣＳ分析の日に、細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、Ｆｃでブロッキングし、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡにおいて希釈されたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７複合体化抗マウス／ヒトＳｔａｔ５（ｐＹ６９４）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。暗所における室温での１時間のインキュベーション後、細胞を、ＦＡＣＳ分析前に３回洗浄した。
【０４２２】
図２８Ｃ、左下は、ＦＡＣＳ分析によるＡＰ１９０３誘導性ｐＳｔａｔ５染色を示す。ＨＥＫ２９３Ｔレポーターアッセイと一致して、初代ヒトＣＡＲ  Ｔ細胞の結果は、膜遠位のＩＬ−２１Ｒサイトテールがより大きなｐＳｔａｔ５誘導を生じることを明らかにした。
【０４２３】
【表８】
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【０４２４】
実施例９：ＦＫＢＰスイッチは、ＣＡＲ  Ｔ細胞において調整可能なサイトカインシグナル伝達を可能にする
ＡＰ１９０３に応答してＦＫＢＰスイッチＣＡＲ  Ｔ細胞におけるサイトカインシグナル伝達の調整可能性を決定するために、ＩＬ−７Ｒ（３１６〜４５９）サイトテールを有するＦＫＢＰスイッチＣＡＲ  Ｔ細胞を、５％ＣＯ２で３７℃の加湿インキュベーター中の１００ｕＬ無血清ＲＰＭＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において４時間血清飢餓状態にし、次いで、ＡＰ１９０３の示された作業濃度で１時間処理した。ＡＰ１９０３処理に入って４０分後、ＢＵＶ３９５複合体化抗ヒトＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＦＩＴＣ複合体化ｖ５タグモノクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含む抗体カクテルを、細胞に添加し、最後の２０分間インキュベートした。ＡＰ１９０３処理の１時間後、細胞を、３５ｕＬの１６％パラホルムアルデヒドの添加により固定し、各１００ｕＬの試料に添加し、３７℃で１５分間インキュベートさせた。次いで、細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、−２０％で１または２晩１００％冷メタノールで透過処理した。ＦＡＣＳ分析の日に、細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、Ｆｃでブロッキングし、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡにおいて希釈されたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７複合体化抗マウス／ヒトＳｔａｔ５（ｐＹ６９４）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。暗所における室温での１時間のインキュベーション後、細胞を、ＦＡＣＳ分析前に３回洗浄した。
【０４２５】
図２９は、ＦＫＢＰスイッチのＣＡＲ＋Ｔ細胞におけるＳｔａｔ５活性化が、ＡＰ１９０３と共に用量依存的様式で増加することを示す。加えて、ｐＳｔａｔ５はＦＫＢＰスイッチＣＡＲ＋Ｔ細胞において特異的に誘導されたが、同じ培養物においてＣＡＲ−Ｔ細胞では誘導されなかったため、サイトカインシグナル伝達は、ＦＫＢＰスイッチＣＡＲ＋Ｔ細胞特異的であった。このことは、ＦＫＢＰスイッチがサイトカインシグナルを治療用ＣＡＲ＋Ｔ細胞に特異的に送達するが、一方で、（ｉ）同種ＣＡＲ  Ｔ細胞拒絶を加速するであろうバイスタンダー免疫活性化を防止し、（ｉｉ）全身性サイトカイン投与に関連する毒性を回避することを示唆する。
【０４２６】
実施例１０：ＦＫＢＰスイッチのＡＰ１９０３誘導性活性化は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍活性を増強する
ＷＭ２６６．４およびＤＭＳ  ２７３細胞は、Ｓｉｇｍａから購入したＤＬＬ３＋標的細胞株である。ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞解析イメージングシステムを介した標的細胞イメージングを促進するために、ＷＭ２６６．４およびＤＭＳ  ２７３細胞を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｇｒｅｅｎレンチウイルス試薬（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いたレンチウイルス形質導入によって核ＧＦＰで安定的に標識し、それぞれＷＭ２６６．４−ｎｕｃＧＦＰおよびＤＭＳ  ２７３−ｎｕｃＧＦＰを生成した。ＦＫＢＰスイッチを、ＤＬＬ３  ＣＡＲ（２６Ｃ８  ｓｃＦｖ）中にクローン化して、化学量論的共発現を可能にした。
【０４２７】
ＦＫＢＰスイッチＣＡＲ  Ｔ細胞がＡＰ１９０３の存在下で標的細胞への反復曝露後に増強した標的細胞溶解および効力を示したかどうかを試験するために、少数のＣＡＲ−Ｔ細胞が過剰な標的を用いて共培養されるインビトロシリアルキリング（ｓｅｒｉａｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ）アッセイを利用した。これらの過酷な条件は、単一のＣＡＲ−Ｔ細胞が複数の標的細胞を連続的に溶解することを必要とし、次に、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、増殖、そして最終的には分化および疲弊を経るであろう。５，０００のＷＭ２６６．４−ｎｕｃＧＦＰ標的細胞を、播種し、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、および２０〜２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含有する５０ｕＬのＲＰＭＩにおいて黒色の壁および平坦で透明な底を有する９６ウェルプレートにおいて付着することを可能にした。ＦＫＢＰスイッチを有するＤＬＬ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞、または対照ＣＡＲ  Ｔ細胞を、解凍し、１：９のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で播種された標的細胞に添加した。
【０４２８】
図３０Ａは、使用された二重出力（ＩＬ７Ｒａ（３１６〜４５９）／ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５〜８２５）サイトテール）を有するＦＫＢＰスイッチを有するＤＬＬ３  ＣＡＲの概略図を示す。
【０４２９】
図３０Ｂおよび図３０Ｃは、ＤＬＬ３＋標的細胞に対するＤＬＬ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害性を示す。ＦＫＢＰスイッチを欠く対照ＣＡＲ  Ｔ細胞は、この低い最適以下のＥ：Ｔ比では標的細胞を効果的に溶解できなかったが（図３０Ｂ）、ＦＫＢＰスイッチのＡＰ１９０３誘導性活性化は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性を劇的に増強した（図３０Ｃ）。したがって、ＡＰ１９０３は、ＦＫＢＰスイッチＣＡＲ  Ｔ細胞の効力を増強する。
【０４３０】
ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の課題は、最適以下のＣＡＲの活性化および細胞傷害性を生じる、腫瘍標的の低い発現レベルである。ＦＫＢＰスイッチ活性化が低標的発現細胞に対するＣＡＲ  Ｔ細胞の感受性を増強するかどうかを試験するために、低いＤＬＬ３表面発現（４００ＤＬＬ３／細胞）を有するＤＭＳ  ２７３−ｎｕｃＧＦＰ標的細胞株を利用した。５，０００のＤＭＳ  ２７３−ｎｕｃＧＦＰ標的細胞を、播種し、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、および２０〜２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含有する５０ｕＬのＲＰＭＩにおいて黒色の壁および平坦で透明な底を有する９６ウェルプレートにおいて付着することを可能にした。ＦＫＢＰスイッチを有するＤＬＬ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞、または対照ＣＡＲ  Ｔ細胞を、解凍し、１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で播種された標的細胞に添加した。
【０４３１】
図３０Ｄおよび図３０Ｅは、低レベルのＤＬＬ３を発現する標的細胞に対するＤＬＬ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害性を示す。図３０Ｄは、対照のＣＡＲ  Ｔ細胞が、１：１のより高いＥ：Ｔ比でさえ無効であったことを示す。対照的に、図３０Ｅは、ＦＫＢＰスイッチの活性化が、ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性を増強し、低標的発現細胞に対するそれらの感受性を増加させたことを示す。
【０４３２】
次に、ヒト腫瘍異種移植モデルを使用して、インビボでＦＫＢＰスイッチＣＡＲ  Ｔ細胞の活性を調べた。ＬＮ２２９−ＥＧＦＲｖＩＩＩは、完全長のヒトＥＧＦＲｖＩＩＩを用いた安定的形質導入による、ヒト神経膠芽腫細胞株、ＬＮ２２９（ＡＴＣＣ）に由来した。２００μＬの無血清ＲＰＭＩにおける３００万のＬＮ２２９−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞を、ＮＳＧマウス中に皮下移植した。腫瘍成長を、移植後２１日目から始まるデジタルノギスを使用したノギス測定によって監視した。腫瘍サイズを、腫瘍体積＝（幅＾２×長さ／２）という式を使用して計算した。マウスを移植後２４日目の腫瘍体積に基づいて８つの群にランダム化し、群あたりの平均腫瘍体積は２００ｍｍ３であった。移植後２５日目に、非形質導入Ｔ細胞（ＮＴＤ）、対照ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＩＬ７Ｒａ（３１６〜４５９）／ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５〜８２５）サイトテールを有するＦＫＢＰスイッチＣＡＲ−Ｔ細胞を、解凍し、標準的手順に従って計数した。細胞を無血清ＲＰＭＩに再懸濁させ、３００万のＣＡＲ＋細胞／マウスを、１００ｕＬ／マウスの体積で静脈内注射した。Ｔ細胞注入の翌日、およびその後は毎週、各群は、５ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３またはビヒクル対照のいずれかの腹腔内注入も受けた（群あたりｎ＝８）。次いで、腫瘍を、研究の終わりまで３〜４日ごとに監視した。
【０４３３】
図３１Ａ〜３１Ｈは、処理されたマウスの各群における腫瘍進行および全生存を示す。対照ＣＡＲ  Ｔ細胞およびビヒクル対照と同時投与されたＦＫＢＰスイッチＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、ＡＰ１９０３によるＦＫＢＰスイッチの活性化は、優位に増強された腫瘍制御を生じ（図３１Ａ）、より耐久性のある完全な抗腫瘍応答が（図３１Ｂ〜３１Ｇ）および延長された全生存（図３１Ｈ）を可能にした。
【０４３４】
実施例１１：ＦＫＢＰスイッチのＡＰ１９０３誘導性活性化は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖および生着を増強する
臨床試験は、ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞療法に対する患者の応答が、ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖および生着の初期バーストを駆動するために重要であった恒常性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１５）の高い血清レベルと相関することを明らかにした（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１７  Ｊｕｎ  １；３５（１６）：１８０３−１８１３．）。さらに、循環における標的細胞がＣＡＲ  Ｔ細胞に容易に到達することができる造血器腫瘍とは異なり、固形腫瘍の治療は、ＣＡＲ  Ｔ細胞が固形腫瘍の血管外遊出および浸潤前に循環においてより長い時間を費やすことを必要としそうであり、したがって、標的独立し、サイトカイン支持されたＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖および生存は特に重要である。したがって、ＡＰ１９０３単独が標的独立ＣＡＲ  Ｔ細胞の拡大と残存性を駆動するのに十分かどうかを調査した。
【０４３５】
ＣＡＲ  Ｔ細胞またはＩＬ７Ｒ（３１６−４５９）／ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５〜８２５）サイトテールを有するＦＫＢＰスイッチＣＡＲ  Ｔ細胞を、２週間示された濃度のＡＰ１９０３を用い、かつ外因性サイトカイン（陽性対照の場合に明記されない限り）または標的細胞の非存在下で培養した。陽性対照として、ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＦＫＢＰスイッチ活性化によって伝達される二重ＩＬ−７Ｒ／ＩＬ１２Ｒｂ２出力を模倣するために、外因性組換えＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）およびＩＬ−１２ｐ７０（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を代替的に補充した。２週間の培養の終わりに、生存しているＣＡＲ  Ｔ細胞の数および質を、決定した。簡単に説明すると、各培養条件細胞からの重複した試料を、回収し、Ｚｏｍｂｉｅ  ＮＩＲ可動性生存キット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して染色した。試料を、ＰＢＳで洗浄し、Ｆｃでブロックし、次いで、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで希釈した以下の抗体カクテルで染色した：ＢＵＶ３９５複合体化抗ヒトＣＤ３、ＢＶ５１０複合体化抗ヒトＣＤ８、ＢＶ６０５複合体化ヒトＣＤ４およびＦＩＴＣ複合体化ｖ５タグ（ＣＡＲ検出用）、ＰＥ／Ｃｙ７複合体化抗ヒトＣＤ６２Ｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＢＶ７８５複合体化抗ヒトＣＤ４５ＲＯ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。最後に、試料をＰＢＳにおいて洗浄し、細胞ペレットをＦＡＣＳ分析の前に、１２３ｃｏｕｎｔ  ｅＢｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）（１２０ｕＬのＰＢＳ＋１％ＢＳＡにおける１０ｕＬの計数ビーズ）を含有する１３０ｕＬのＰＢＳ＋１％ＢＳＡに再懸濁させた。
【０４３６】
図３２Ａは、ＣＡＲ  Ｔ細胞のＡＰ１９０３駆動性増殖を示す。点線は、外因性ＩＬ７およびＩＬ１２ｐ７０で補充されたＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖倍率を示す。減退したＦＫＢＰスイッチを欠く対照ＣＡＲ  Ｔ細胞とは対照的に、ＡＰ１９０３で処理されたＦＫＢＰスイッチＣＡＲ  Ｔ細胞は、効率的に増殖した。特に、わずか１ｎｇ／ｍｌのＡＰ１９０３でも、外因性サイトカイン補充によって達成される増殖のレベルに到達するのに充分であった。
【０４３７】
図３２Ｂは、２週間の培養の終わりに生存しているＣＡＲ  Ｔ細胞の絶対数およびメモリーＴ細胞表現型を示す。長期にわたる抗腫瘍保護を媒介する長寿命の自己再生する集団である幹細胞メモリー（Ｔｓｃｍ）およびセントラルメモリー（Ｔｃｍ）ＣＡＲ＋Ｔ細胞の維持および増殖により明白であるように、ＣＡＲ  Ｔ細胞の量を増加させることに加え、ＦＫＢＰスイッチ活性化は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の質も改善した。
【０４３８】
実施例１２：低下した基礎的シグナル伝達を有する誘導性サイトカイン受容体を操作する
リガンドの存在下で、それらの天然型のホモ二量体サイトカイン／成長因子受容体（例えば、ＥｐｏＲおよびＴｐｏＲ）は、ＪＡＫ２活性化のための２つの要件に依存する：（ｉ）受容体ホモ二量体化と、トランスリン酸化および活性化のための十分に近く近接して２つのＪＡＫ２をもたらす膜貫通領域により媒介される受容体回転。膜貫通領域における主要なアミノ酸残基に変異導入することにより受容体回転を抑止することは、リガンドの存在下でさえ、受容体シグナル伝達を抑止することが示されている。真に誘導可能な受容体は、インデューサーの不在下でのクリーンなＯＦＦ（基礎的活性なし）、および最大の調整可能性のためのリガンド誘導性ＯＮの広いダイナミックレンジを必要とする。ホモ二量体サイトカイン／成長因子受容体からのチロシン活性化ドメインは、さまざまな程度の基礎的シグナル伝達を実証した（図９）。ＥｐｏＲおよびＴｐｏＲは、リガンドの非存在下で、単量体およびホモ二量体形態の間の平衡状態で存在することが示されており、この自発的ホモ二量体化は、それらの膜貫通ドメインにより媒介されることが見出され、したがって、我々の未処理のキメラサイトカイン受容体で観察された漏出は、それらの膜貫通ドメインによって媒介される自発的なリガンド独立ホモ二量化に起因すると仮定した。
【０４３９】
我々のキメラサイトカイン受容体における基礎シグナル伝達を低下させるために、ＥｐｏＲ／ＴｐｏＲの膜貫通領域を、単量体として天然に存在するＰＤ−１のもので置き換えた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞レポーターアッセイを、ＡＰ１９０３の存在下でのサイトカインシグナル伝達の誘導能および規模と同様に、ＡＰ１９０３の非存在下での基礎的シグナル伝達を評価するために使用した。簡単に説明すると、２０，０００のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ポリ−Ｌ−リジン被覆された９６ウェルの平底プレートの各ウェル中に播種し、一晩接着させた。誘導性サイトカイン受容体（２．５ｎｇ）、ホタルルシフェラーゼ（１００ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を駆動するＳｔａｔ応答要素、およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ対照レポーターベクター（１ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）において５ｕＬの最終体積で混合した（「ＤＮＡ混合物」）。５ｕＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭにおいて０．３ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温で５分間インキュベートし、次いで、ＤＮＡ混合物に添加した。混合物を室温で２０分間インキュベートし、１０ｕＬの総量をＨＥＫ−２９３Ｔを含む各ウェルに添加した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、未処理のままにしてＡＰ１９０３独立基礎的シグナル伝達を評価するか、または無血清培地において希釈された示された濃度のＡＰ１９０３（Ａｐｅｘ  Ｂｉｏ）で処理した。Ｓｔａｔ５レポーター活性の誘導倍率を、誘導性サイトカイン受容体を除くすべてのベクターでトランスフェクトされ、未処理のままにされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のものに対して正規化した。
【０４４０】
図３３Ａおよび図３３Ｂは、それぞれＳｔａｔ５およびＳｔａｔ４レポーター活性により決定される、各キメラ受容体によるＡＰ１９０３の不在下での基礎的シグナル伝達を示す。ＡＰ１９０３の非存在下で顕著な基礎的Ｓｔａｔ活性を示したＴｐｏＲ膜貫通領域を有するキメラ受容体と比較して、ＰＤ−１膜貫通領域での置換は、基礎Ｓｔａｔ活性を、ＦＫＢＰエクトドメインのみを含み、いずれのＪＡＫ活性化ドメインおよびサイトテールを欠構築物に匹敵するレベルに抑止した。いくつかの実施形態では、誘導性キメラサイトカイン受容体の基礎的シグナル伝達は、図３８Ｃに例示される膜貫通ドメインの挿入および／または欠失突然変異を使用して、さらに最適化され得る。
【０４４１】
図３３Ｃおよび図３３Ｄは、それぞれＳｔａｔ５およびＳｔａｔ４レポーター活性により決定される、示された濃度のＡＰ１９０３に対する各キメラ受容体の応答を示す。ＴｐｏＲ膜貫通ドメインを有するそれらの対応物と比較して、ＰＤ１膜貫通領域を有するＦＫＢＰスイッチバリアントは、ＡＰ１９０３処理に匹敵する規模で応答した。膜貫通ドメインも受容体の回転性活性化に重要であると考えられているが、ＴｐｏＲ膜貫通領域をＰＤ−１のものに置換することは、ＡＰ１９０３誘導性Ｓｔａｔ活性化を保存した。まとめると、ＰＤ−１膜貫通領域が、リガンド誘導性受容体活性化を保存する一方で基礎的シグナル伝達を低下させるために、ホモ二量体サイトカイン／成長因子受容体からのチロシン活性化ドメインと組み合わせて使用され得ることを実証する。
【０４４２】
ＰＤ１膜貫通領域での置換がキメラ受容体の細胞傷害活性を保存したかどうかを試験するために、いずれかの受容体バリアントを同時発現しているＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害活性とＡＰ１９０３駆動性増殖とを比較した。インビトロ細胞傷害性アッセイについては、５，０００のＵ８７ＫＯ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｎｕｃＧＦＰ標的細胞を、播種し、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、および２０〜２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含有する５０ｕＬのＲＰＭＩにおいて黒色の壁および平坦で透明な底を有する９６ウェルプレートにおいて付着することを可能にした。Ｕ８７ＫＯ−ＥＧＦＲｖＩＩＩは、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ  ＳＡ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）からの親切な寄贈品である。Ｕ８７ＫＯ−ＥＧＦＲｖＩＩＩは、まず転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を使用して内因性野生型ＥＧＦＲをノックアウトし、次いで、レンチウイルス形質導入を介して完全長ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩを安定的に過剰発現させることによって、親細胞株Ｕ８７ＭＧ（ＡＴＣＣ）に由来した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞解析イメージングシステムを介した標的細胞イメージングを促進するために、Ｕ８７ＫＯ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｎｕｃＧＦＰ標的細胞は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｇｒｅｅｎレンチウイルス試薬（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いた第２のレンチウイルス形質導入によってＵ８７ＫＯ−ＥＧＦＲｖＩＩＩに由来した。ＴｐｏＲまたはＰＤ１  ＴＭのいずれかと共にＦＫＢＰスイッチを有するＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ（２１７３  ｓｃＦｖ）Ｔ細胞を、解凍し、１：４のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で播種された標的細胞に添加した。示された濃度でＡＰ１９０３を各ウェルに添加した。重複したウェルを、各条件について設定した
【０４４３】
図３４Ａは、ＴｐｏＲ  ＴＭドメインまたはＰＤ１  ＴＭドメインのいずれかを有する、ＩＬ７Ｒ（３１６−４５９）／ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５〜８２５）サイトテールを有するＦＫＢＰスイッチＣＡＲの概略図を示し、ＦＫＢＰエクトドメイン（ＦＫＢＰのみ対照ＣＡＲ）を共発現し、ＪＡＫ活性化ドメインおよびサイトテールを有しないＣＡＲ  Ｔ細胞を、対照として使用した。
【０４４４】
図３４Ｂ〜３４Ｄは、対照ＣＡＲ  Ｔ細胞がＡＰ１９０３処理によって増強されなかったが、一方で、ＴｐｏＲ  ＴＭドメインまたはＰＤ１  ＴＭドメインのいずれかを有するＦＫＢＰスイッチが、ＡＰ１９０３の存在下で同等に増強されたことを示す。したがってＰＤ１  ＴＭドメインでの置換は基礎的ＦＫＢＰスイッチ活性を低下することができるが、一方で、ＡＰ１９０３誘導性スイッチ受容体の活性化およびシグナル伝達を保存する。
【０４４５】
次に、ＰＤ１膜貫通領域での置換がキメラ受容体のＡＰ１９０３駆動性増殖を保存するかどうかを試験した。ＣＡＲ  Ｔ細胞またはいずれかの膜貫通バリアントを有するＦＫＢＰスイッチＣＡＲ  Ｔ細胞を、２週間示された濃度のＡＰ１９０３を用い、かつ外因性サイトカイン（陽性対照の場合に明記されない限り）または標的細胞の非存在下で培養した。陽性対照として、ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＦＫＢＰスイッチ活性化によって伝達される二重ＩＬ−７Ｒ／ＩＬ１２Ｒｂ２出力を模倣するために、外因性組換えＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）およびＩＬ−１２ｐ７０（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を代替的に補充した。２週間の培養の終わりに、生存しているＣＡＲ  Ｔ細胞の数および質を、決定した。簡単に説明すると、各培養条件細胞からの重複した試料を、回収し、Ｚｏｍｂｉｅ  ＮＩＲ可動性生存キット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して染色した。試料を、ＰＢＳで洗浄し、Ｆｃでブロックし、次いで、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで希釈した以下の抗体カクテルで染色した：ＢＵＶ３９５複合体化抗ヒトＣＤ３、ＢＶ５１０複合体化抗ヒトＣＤ８、ＢＶ６０５複合体化ヒトＣＤ４およびＦＩＴＣ複合体化ｖ５タグ（ＣＡＲ検出用）、ＰＥ／Ｃｙ７複合体化抗ヒトＣＤ６２Ｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＢＶ７８５複合体化抗ヒトＣＤ４５ＲＯ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。最後に、試料をＰＢＳにおいて洗浄し、細胞ペレットをＦＡＣＳ分析の前に、１２３ｃｏｕｎｔ  ｅＢｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）（１２０ｕＬのＰＢＳ＋１％ＢＳＡにおける１０ｕＬの計数ビーズ）を含有する１３０ｕＬのＰＢＳ＋１％ＢＳＡに再懸濁させた。
【０４４６】
図３４Ｅは、示された濃度のＡＰ１９０３、または外因的に補充されたＩＬ−７およびＩＬ−１２ｐ７０において２週間の培養後の生きているＣＡＲ＋Ｔ細胞の数を示す。予想通り、ＡＰ１９０３は増殖および生存制御ＣＡＲ  Ｔ細胞をサポートせず、外因性ＩＬ７およびＩＬ１２ｐ７０は制御およびＦＫＢＰスイッチＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖および生存を支持した。ＡＰ１９０３の存在下で、ＰＤ１膜貫通ドメインを有するＦＫＢＰスイッチＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＴｐｏＲ膜貫通領域を有するそれらの対応物と同等かそれ以上に増殖した。
【０４４７】
図３４Ｆは、各メモリー区画におけるＣＡＲ＋Ｔ細胞の数を示す。ＴｐｏＲ膜貫通領域を有するそれらの対応物と比較して、ＦＫＢＰは、ＣＡＲ  Ｔ細胞とＡＰ１９０３に応答してＴｓｃｍおよびＴｃｍ  ＣＡＲ＋細胞を維持するのに同等かそれ以上のＰＤ１膜貫通ドメインに切り替える。これらの発見は、低下した基礎的シグナル伝達を有するＰＤ１膜貫通バリアントが、初代ヒトＣＡＲ  Ｔ細胞の文脈でスイッチ受容体の誘導能および機能を保存することを実証する。
【０４４８】
実施例１３：ＡＰ１９０３駆動性ＣＡＲ  Ｔ細胞増殖によってＣＡＲ  Ｔ細胞製造を改善する
レンチウイルスは比較的大きなカーゴを送達する能力を有するが、ＦＫＢＰスイッチを同時発現させることによるような、ペイロードを増加させることは、ウイルス力価およびそれに続く形質導入効率を必然的に低下させる。ＣＡＲ  Ｔ細胞製造の従来の方法は、高用量の補充されたサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、および／またはＩＬ−１５）の存在下で形質導入されたＴ細胞を増殖させることを伴い、同じ培養物中に形質導入された（ＣＡＲ＋）および形質導入されていない（ＣＡＲ−）Ｔ細胞の両方を増殖させるものであろう。ＦＫＢＰスイッチの活性化がＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖および濃縮を駆動することができるサイトカインシグナルを伝達することができるため、このことを活用し、かつ補充されたサイトカインをＡＰ１９０３に置換することがＦＫＢＰスイッチＣＡＲ  Ｔ細胞製造中の低い形質導入効率を克服することができると仮定した。
【０４４９】
０日目に、精製されたＴ細胞を、１００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で補充されたＸ−ｖｉｖｏ−１５培地（Ｌｏｎｚａ）において、Ｇｒｅｘ−２４プレート（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ、カタログ番号８０１９２Ｍ）を補充したＸ−Ｖｉｖｏ−１５培地（Ｌｏｎｚａ）において、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、およびヒトＴ  ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０−１１１−１６０、１：１００希釈）で活性化した。２日目に、Ｔ細胞を、Ｇｒｅｘ−２４プレート（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ、カタログ番号８０１９２Ｍ）のウェルあたり１ｍＬのＴ細胞形質導入培地においてｍＬあたり５０万細胞で再懸濁させた。レンチウイルス上清を上記のように作製し、形質導入を２日目に実行した。形質導入が完了した５日目に、細胞を、洗浄して残留ヒトＩＬ−２を除去し、新鮮なＴ細胞増殖培地、すなわち、５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ）で補充されたＸ−Ｖｉｖｏ−１５に再懸濁させ、Ｇｒｅｘ−２４ウェルプレートにおいて２０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２または示された濃度のＡＰ１９０３のいずれかにおいて増殖させた。細胞を、Ｔ細胞増殖培地を使用して、必要に応じてより大きなＧ−Ｒｅｘ容器（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ）中に増殖させた。５、９、および１５日目に、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の濃縮を、フローサイトメトリーを使用して、ＦＩＴＣ複合体化ｖ５タグモノクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）に結合したＴ細胞の百分率を検出することにより決定した。
【０４５０】
図３５Ａは、使用されたさまざまなサイトテールを有する対照ＢＦＰ  ＣＡＲおよびＦＫＢＰスイッチＣＡＲの概略図を示す。図３５Ｂ〜Ｅは、示された日のＦＡＣＳ分析によって決定された、ＩＬ−２またはＡＰ１９０３のいずれかにおいて増殖されたＣＡＲ＋Ｔ細胞の百分率を示す。予想通り、２０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２の増殖は、培養物内のＣＡＲ＋およびＣＡＲ−  Ｔ細胞集団の両方の同等な増殖に起因して、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の安定的な百分率を維持した。他方では、ＡＰ１９０３はＢＦＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を濃縮しなかったが（図３５Ｂ）、一方で、ＩＬ−２の代わりのＡＰ１９０３の使用は、ＦＫＢＰスイッチＣＡＲ  Ｔ細胞に対して５〜１４日目の間で用量依存的様式で段階的に濃縮し（図３５Ｃ〜Ｅ）、さらに、効果的なＣＡＲ  Ｔ細胞濃縮は、ＩＬ７Ｒａ（３１６〜４５９）／ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５〜８２５）（図３５Ｃ）、ＩＬ２Ｒｂ（３９３〜４３３、５１８〜５５１）／ＩＬ２１Ｒ（３２２〜５３８）（図３５Ｄ）およびＩＬ７Ｒａ（３１６〜４５９）／ＩＬ２１Ｒ（３２２〜５３８）（図３５Ｅ）を介してさまざまなシグナル伝達出力を伝達するＦＫＢＰスイッチで、達成され得る。
【０４５１】
実施例１４：抗体および他の多量体化リガンド／インデューサーに応答してサイトカインシグナル伝達を誘導する
二量体化は誘導性キメラサイトカイン受容体を活性化することができるため、適切なエクトドメイン、抗体（または抗体由来分子）、および多量体化リガンド／インデューサーがシグナル伝達も活性化することは、合理的である。
【０４５２】
抗体による活性化を評価するために、ヒトＯＸ４０（１〜２１４）エクトドメインを有するキメラサイトカイン受容体を生成し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ベースのＳｔａｔレポーターアッセイにおいて臨床抗ＯＸ４０抗体（ＧＳＫ１０９）に応答してシグナル伝達するその能力を試験した。簡単に説明すると、２０，０００のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ポリ−Ｌ−リジン被覆された９６ウェルの平底プレートの各ウェル中に播種し、一晩接着させた。ＯＸ４０エクトドメインサイトカイン受容体（２．５ｎｇ）、ホタルルシフェラーゼ（１００ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を駆動するＳｔａｔ応答要素、およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ対照レポーターベクター（１ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）において５ｕＬの最終体積で混合した（「ＤＮＡ混合物」）。５ｕＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭにおいて０．３ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温で５分間インキュベートし、次いで、ＤＮＡ混合物に添加した。混合物を室温で２０分間インキュベートし、１０ｕＬの総量をＨＥＫ−２９３Ｔを含む各ウェルに添加した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、未処理のままにするか、または無血清培地において希釈された抗ＯＸ４０抗体、ＧＳＫ１０９で処理し、Ｓｔａｔレポーター活性をＤｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して処理後５時間に決定した。Ｓｔａｔレポーター活性の誘導倍率を、ＯＸ４０エクトドメインサイトカイン受容体を除くすべてのベクターでトランスフェクトされ、未処理のままにされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のものに対して正規化した。４つのウェルを、各条件について設定した。
【０４５３】
図３６Ａは、ＯＸ４０エクトドメインを有するキメラサイトカイン受容体の概略図を示す。図３６Ｂ〜３６Ｃは、抗体に応答してシグナル伝達するサイトカインの活性化を示す。図３６Ｂ〜３６Ｃは、抗ＯＸ４０抗体、ＧＳＫ１０９の非存在下および存在下でのＳｔａｔ５（３６Ｂ）およびＳｔａｔ４（３６Ｃ）レポーター活性を示す。抗体媒介性ＯＸ４０エクトドメインの二量体化は、Ｓｔａｔ５およびＳｔａｔ４レポーター活性の増加に反映されるように、下流のサイトカインシグナル伝達を誘導した。
【０４５４】
リガンドインデューサーおよびエクトドメインのパネルがＡＰ１９０３−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）ペアリングを超えてさらに拡張され得るかどうかを試験するために、他の多量体リガンドインデューサーに応答するシグナル伝達を試験した。リガンドの腫瘍壊死ファミリー（ＴＮＦ）スーパーファミリーは三量体であるため、それらはそれぞれの受容体に多量体様式で会合する。したがって、ＢＣＭＡ（１〜５４）、ＴＡＣＩ（１〜１６５）、ＢＡＦＦＲ（１〜７８）のようなＴＮＦＲ２スーパーファミリー受容体に由来するエクトドメインを、我々のキメラサイトカイン受容体の膜貫通およびシグナル伝達ドメインに融合させ、可溶性三量体リガンドに応答するシグナル伝達を試験した。簡単に説明すると、２０，０００のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ポリ−Ｌ−リジン被覆された９６ウェルの平底プレートの各ウェル中に播種し、一晩接着させた。キメラサイトカイン受容体（２．５ｎｇ）、ホタルルシフェラーゼ（１００ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を駆動するＳｔａｔ応答要素、およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ対照レポーターベクター（１ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）において５ｕＬの最終体積で混合した（「ＤＮＡ混合物」）。５ｕＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭにおいて０．３ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温で５分間インキュベートし、次いで、ＤＮＡ混合物に添加した。混合物を室温で２０分間インキュベートし、１０ｕＬの総量をＨＥＫ−２９３Ｔを含む各ウェルに添加した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、未処理のままにするか、または無血清培地において希釈された可溶性ＢＡＦＦまたはＡＰＲＩＬ三量体で処理し、Ｓｔａｔレポーター活性をＤｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して処理後５時間に決定した。Ｓｔａｔレポーター活性の誘導倍率を、ＯＸ４０エクトドメインサイトカイン受容体を除くすべてのベクターでトランスフェクトされ、未処理のままにされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のものに対して正規化した。４つのウェルを、各条件について設定した。
【０４５５】
図３７Ａは、試験したＴＮＦＲ２スーパーファミリーに由来するさまざまなエクトドメインの概略図を示す。図３７Ｂは、受容体ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、およびＢＡＦＦＲの間のそれらのリガンドＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬとの相互作用の概略図である（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ  Ｄｅｖｅｌ  Ｔｈｅｒ．２０１５  Ｊａｎ  ７；９：３３３−４７．）。図３７Ｃ〜３７Ｄは、多量体リガンドインデューサーに応答するサイトカインシグナル伝達の活性化を示す。図３７Ｃ〜３７Ｄは、可溶性ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬ三量体に応答するＳｔａｔ５（３７Ｃ）およびＳｔａｔ４（３７Ｄ）レポーター活性を示す。可溶性ＢＡＦＦ三量体によるそれぞれのキメラサイトカイン受容体の多量体化は、Ｓｔａｔ５およびＳｔａｔ４の活性化を誘導し、可溶性ＡＰＲＩＬ三量体によるＢＣＭＡエクトドメインサイトカイン受容体の多量体化は、下流のＳｔａｔ活性化を誘導した。
【０４５６】
実施例１５：ＴＰＯＲ  ＴＭヘリックスを修飾することによりＦＫＢＰスイッチのシグナル伝達強度および感度を最適化する
ＴｐｏＲのらせん膜貫通（ＴＭ）領域はＪＡＫ２活性化を制御することによりリガンド誘導性受容体シグナル伝達に重要であることが、十分に確立されている。異なるエクトドメイン（例えば、ＦＫＢＰ）がＴｐｏＲ  ＴＭ／ＪＡＫ２活性化ドメインと融合されるキメラサイトカインスイッチでは、受容体活性化に最適な構造的立体配座が乱され得ることを仮定した。ＴｐｏＲ活性におけるＴＭ領域の重要性を活用して、ＴｐｏＲ  ＴＭ領域を修飾することにより、ＦＫＢＰスイッチの応答性を増加させようとした。この目的のために、ＴｐｏＲ  ＴＭ領域において欠失または挿入のいずれかを有するＦＫＢＰスイッチバリアントを生成し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞レポーターアッセイにおいてそれらを試験した。
【０４５７】
簡単に説明すると、２０，０００のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ポリ−Ｌ−リジン被覆された９６ウェルの平底プレートの各ウェル中に播種し、一晩接着させた。ＦＫＢＰスイッチ（２．５ｎｇ）、ホタルルシフェラーゼ（１００ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を駆動するＳｔａｔ５応答要素、およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ対照レポーターベクター（１ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）において５ｕＬの最終体積で混合した（「ＤＮＡ混合物」）。野生型ＴｐｏＲ膜貫通ドメインを有するＦＫＢＰスイッチをコンパレータ（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）として使用した。５ｕＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭにおいて０．３ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温で５分間インキュベートし、次いで、ＤＮＡ混合物に添加した。混合物を室温で２０分間インキュベートし、１０ｕＬの総量をＨＥＫ−２９３Ｔを含む各ウェルに添加した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、未処理のままにするか、または無血清培地において希釈された示された濃度のＡＰ１９０３（ＡＰＥＸ  Ｂｉｏ）で処理した。処理の２４時間後、Ｓｔａｔ５レポーター活性を、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して評価した。Ｓｔａｔ５レポーター活性の誘導倍率を、スイッチ受容体を除くすべてのベクターでトランスフェクトされ、未処理のままにされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のものに対して正規化した。
【０４５８】
図３８Ａ〜３８Ｃは、ＦＫＢＰスイッチによるシグナル伝達の強度および感度に対するＴｐｏＲ膜貫通ドメイン修飾の効果を示す。
【０４５９】
図３８Ａ〜３８Ｂは、野生型ＴｐｏＲおよびさまざまなＴＭ欠失（図３８Ａ）または挿入（図３８Ｂ）バリアントに対するアミノ酸配列を示す。
【０４６０】
図３８Ｃは、ＡＰ１９０３の非存在下または存在下でのＴｐｏＲ  ＴＭ欠失（図３８Ａ）および挿入（図３８Ｂ）を有するＦＫＢＰスイッチバリアントの応答を示す。長方形のボックスで強調表示されているのは、ＴＭバリアントが由来する野生型ＴｐｏＲ  ＴＭドメインを有するＦＫＢＰスイッチである。野生型ＴｐｏＲ  ＴＭドメインを有するＦＫＢＰスイッチ（すなわち、ＦＫＢＰスイッチ）と比較すると、ＴｐｏＲ（４７８〜５８２、Ｎ−３）、ＴｐｏＲ（４７８〜５８２、Ｎ−５）、ＴｐｏＲ（４７８〜５８２、Ｎ−６）およびＴｐｏＲ（４７８〜５８２、Ｎ−７）のようなＴｐｏＲ  ＴＭ欠失バリアントは、ＡＰ１９０３誘導性Ｓｔａｔ５活性の強度を増加させた。さらに、いくつかのＴｐｏＲ  ＴＭバリアントはまた、非常に低濃度のＡＰ１９０３（１ｎｇ／ｍｌまたは０．１ｎｇ／ｍｌ）に応答して感度を増加させ、ＴｐｏＲ（４７８〜５８２、Ｎ−７）およびＴｐｏＲ（４７８〜５８２、Ｎ−９）の感受性が最も高かった。これらは、ＴｐｏＲ  ＴＭ領域を調節することがＡＰ１９０３へのＦＫＢＰスイッチの応答性および感度を増強させたことを示す。
【０４６１】
実施例１６：異なるおよび組み合わせのサイトテールシグナル出力を介したＣＡＲ  Ｔ細胞分化を制御する
Ａ．サイトテールを組み合わせて追加的なシグナル伝達経路を活性化させる
ＴＣＲ活性化時に、Ｃａ＋可動化は、ＮＦＡＴの活性化および炎症促進性標的（ＩＬ２、ＧｚｍＢなど）の上方制御を引き起こす。これらのプロモーターの多くは、ＮＦＡＴ単独だけではなく、むしろＡＰ−１（ＦｏｓおよびＪｕｎのコイルドコイル）とのＮＦＡＴのヘテロ三量体によって活性化される。疲弊は、過剰な抗原刺激で発生し、活性化したＮＦＡＴの量がＡＰ−１の量に取って代わり、ＮＦＡＴホモ二量体と異なるプロモーターの活性化戸を生じる際に発生すると考えられる。疲弊を防止する１つの方法は、ＡＰ−１（Ｆｏｓ／Ｊｕｎ）の量を増加させることであろう。ＩＬ２ＲおよびＩＬ７Ｒのようなサイトカイン受容体は、ｃ−Ｊｕｎをリン酸化および活性化させるＪＮＫ（Ｊｕｎキナーゼ）を活性化させる。しかしながら、このこと単独は、Ｆｏｓも上方制御およびリン酸化されなくてはならないため、ＡＰ−１を上方制御するには不十分である。並列のＭＥＫ／ＥＲＫ経路は、Ｆｏｓの直接リン酸化と同様に、Ｍｙｃ／Ｍａｘを通じたＦｏｓの上方制御を引き起こす。したがって、ＪＮＫおよびＭＥＫ／ＥＲＫの両方を活性化した架空の受容体は、爆発的な（ｇａｎｇｂｕｓｔｅｒ）量のＡＰ−１を引き起こす。ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）は、ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路を活性化することが十分知られている受容体チロシンキナーゼのうちの１つである。ＥＧＦＲサイトテールを使用することにより、Ｍｙｃ／Ｍａｘを頑健に活性化し、その結果Ｆｏｓを活性化する能力を実証する。ＥＧＦＲおよびＩＬ７Ｒサイトテールを組み合わせることにより、ＣＡＲ  Ｔ細胞の末端の分化および疲弊を防ぐ、ＡＰ−１およびＭｙｃ／Ｍａｘの両方のシグナル伝達経路の成功した誘導を実証する。
【０４６２】
異なるサイトテールによって活性化されるシグナル伝達経路を試験するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞レポーターアッセイを利用した。簡単に説明すると、２０，０００のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ポリ−Ｌ−リジン被覆された９６ウェルの平底プレートの各ウェル中に播種し、一晩接着させた。誘導性サイトカイン受容体（２．５ｎｇ）、ホタルルシフェラーゼ（１００ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を駆動する応答性転写因子応答要素、およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ対照レポーターベクター（１ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）において５ｕＬの最終体積で混合した（「ＤＮＡ混合物」）。５ｕＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭにおいて０．３ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温で５分間インキュベートし、次いで、ＤＮＡ混合物に添加した。混合物を室温で２０分間インキュベートし、１０ｕＬの総量をＨＥＫ−２９３Ｔを含む各ウェルに添加した。陰性対照として、ＦＫＢＰエクトドメインを、ＪＡＫ結合ドメインおよびサイトテール（すなわち、ＴｐｏＲ  ＣＴＲＬ）を欠いたＴｐｏＲ（４７８〜５２８）の膜貫通領域と短い細胞内領域に結合させた。比較として、ＦＫＢＰエクトドメインを、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０シグナル伝達ドメインに結合させた（以降、「ＦＫＢＰ−ＭｙＤ８８−ＣＤ４０」と称される）。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、未処理のままにするか、または無血清培地において希釈された１ｕｇ／ｍＬのＡＰ１９０３（Ａｐｅｘ  Ｂｉｏ）で処理した。ＡＰ１９０３処理の６時間後、レポーター活性を、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して決定した。Ｓｔａｔ５レポーター活性の誘導倍率を、誘導性サイトカイン受容体を除くすべてのベクターでトランスフェクトされ、未処理のままにされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のものに対して正規化した。
【０４６３】
図３９Ａは、試験したキメラ受容体の概略図を示す。
【０４６４】
図３９Ｂは、単一のサイトテールおよびサイトテールの組み合わせを使用したＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるレポーター活性に対するルシフェラーゼアッセイ読み出しの結果を示す。各行は、それぞれの転写因子応答性ホタルルシフェラーゼレポーターを表し、各列は、それぞれのサイトテール／シグナル伝達ドメインを有するキメラ受容体を表す。各ボックスは誘導倍率を示し、各行はそれぞれのＦｉｒｅｆｌｙ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーターの最高誘導倍率に正規化される。予想通り、単一のサイトテール出力は所望のシグナル伝達経路を活性化し、ＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）はＳｔａｔ５を活性化し、ＩＬ１２Ｒｂ２ｓｍａｌｌ（７７５〜８２５）はＳｔａｔ４を活性化し、ＥＧＦＲ（１１２２〜１１６５）はＡＰ−１およびＭｙｃ／Ｍａｘ経路を活性化した。シグナル伝達経路をそれら自体で活性化する個々のサイトテールが組み合わされた際に、追加的な効果が結果として起こり、それは、ＡＰ１９０３の存在下で、ＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）／ＩＬ１２Ｒｂ２ｓｍａｌｌ（７７５〜８２５）サイトテールはＳｔａｔ５およびＳｔａｔ４活性化を誘導したが、一方で、ＩＬ７Ｒ（  ３１６〜４５９）／ＥＧＦＲ（１１２２〜１１６５）サイトテールはＳｔａｔ５（低い程度であるが）ＡＰ−１およびＭｙｃ／Ｍａｘの活性化を誘導した。ＦＫＢＰ−サイトテール受容体の誘導性の性質と比較して、ＦＫＢＰ−ＭｙＤ８８−ＣＤ４０受容体は、ＡＰ１９０３の非存在下で高い基礎的シグナル伝達を示した。
【０４６５】
Ｂ．異なるサイトテール出力を介したＴ細胞の細胞傷害性エフェクター活性およびメモリー分化を歪ませる
ＩＬ−１２シグナル伝達は、Ｔ細胞の細胞傷害性およびエフェクター分化を促進することについて十分に知られており、他方では、図Ｆｂは、ＥＧＦＲシグナル伝達が、Ｔ細胞の疲弊を防止し、メモリーＴ細胞の生成を促進することができることを示唆する。異なるサイトテールによって活性化された異なるシグナル伝達経路がＣＡＲ  Ｔ細胞のエフェクター機能およびメモリー分化を制御することができるかどうかを試験するために、同じ膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメインを有するＦＫＢＰスイッチを、直列で単一または二重のいずれかで異なるサイトテールと同時発現させた。
【０４６６】
異なるサイトテール出力がＣＡＲ  Ｔ細胞のエフェクター機能に影響するかどうかを試験するために、４日間のインビトロ細胞傷害性アッセイを実行した。簡単に説明すると、３０，０００のＵ８７ＫＯ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｎｕｃＲＦＰ標的細胞を、播種し、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、および２０〜２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含有する５０ｕＬのＲＰＭＩにおいて黒色の壁および平坦で透明な底を有する９６ウェルプレートにおいて付着することを可能にした。Ｕ８７ＫＯ−ＥＧＦＲｖＩＩＩは、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ  ＳＡ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）からの親切な寄贈品である。Ｕ８７ＫＯ−ＥＧＦＲｖＩＩＩは、まず転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を使用して内因性野生型ＥＧＦＲをノックアウトし、次いで、レンチウイルス形質導入を介して完全長ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩを安定的に過剰発現させることによって、親細胞株Ｕ８７ＭＧ（ＡＴＣＣ）に由来した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞解析イメージングシステムを介した標的細胞イメージングを促進するために、Ｕ８７ＫＯ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｎｕｃＲＦＰ標的細胞は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｇｒｅｅｎレンチウイルス試薬（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いた第２のレンチウイルス形質導入によってＵ８７ＫＯ−ＥＧＦＲｖＩＩＩに由来した。それぞれのサイトテールと共にＦＫＢＰスイッチを有するＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ（２１７３  ｓｃＦｖ）Ｔ細胞を、解凍し、１：８のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で播種された標的細胞に添加した。比較として、ＦＫＢＰ−ＭｙＤ８８−ＣＤ４０を同時発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を含めた。ウェルを、未処理のままにするか、または５００ｎｇ／ｍｌのＡＰ１９０３（ＡｐｅｘＢｉｏ）で処理した。各時点での生きている標的細胞の数を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞解析イメージングシステムを使用して、生きている核ＲＦＰ＋細胞の数を数えることによって決定した。重複したウェルを、各条件について設定した。
【０４６７】
４日間の細胞傷害性アッセイの最後に、プレートを遠心分離し、上清をサイトカイン放出の分析のためにＭＳＤアッセイ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して収集した。
【０４６８】
図４０Ａ〜４０Ｆは、ＡＰ１９０３の非存在下または存在下での、直列で単一または二重で異なるサイトテールを有するＦＫＢＰスイッチのインビトロ細胞傷害性アッセイからの結果を示す。
【０４６９】
図４０Ａ〜４０Ｃは、試験された幹細胞／セントラルメモリー（Ｔｓｃｍ／Ｔｃｍ）Ｔ細胞促進サイトテール、すなわち、ＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）およびＥＧＦＲ（１１２２〜１１６５）の細胞傷害性活性を示す。４日間という比較的短い時間枠内で、ＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）およびＥＧＦＲ（１１２２〜１１６５）は、単一または組み合わせのいずれかでも、ＡＰ１９０３の存在下ではＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性を増強しなかった。Ｔｓｃｍ／Ｔｃｍメモリー表現型のＴ細胞は、長期的に自己再生してより長く生存するが、細胞傷害性エフェクター機能を実行する際に遅延を呈するため、このことが予想され得る。
【０４７０】
図４０Ｄ〜４０Ｅは、ＩＬ−１２シグナル伝達を模倣してエフェクターメモリー／エフェクター（Ｔｅｍ／Ｔｅｍｒａ）Ｔ細胞分化を促進する、ＩＬ１２Ｒｂ２ｓｍａｌｌ（７７５〜８２５）サイトテールの細胞傷害性活性を示す。ＩＬ１２Ｒｂ２ｓｍａｌｌ（７７５〜８２５）サイトテールは、単独で、またはＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）と組み合わされる際に、ＡＰ１９０３の存在下でＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性効力を増強する。
【０４７１】
図４０Ｆは、ＦＫＢＰ−ＭｙＤ８８−ＣＤ４０を有するＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性活性を示す。図４０Ａ〜４０Ｅにおけるサイトテールとは異なり、ＦＫＢＰ−ＭｙＤ８８−ＣＤ４０を有するＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＡＰ１９０３の非存在下で、増強された殺傷活性を示した。さらに、ＡＰ１９０３の添加は、細胞傷害性をさらに増強せず、ＦＫＢＰ−ＭｙＤ８８−ＣＤ４０受容体が高い基礎的活性を有するものであり、誘導能を欠くものであることを示唆している。
【０４７２】
図４１Ａ〜４１Ｂは、ＡＰ１９０３の非存在下および存在下での、４日間の細胞傷害性アッセイの最後での培養上清におけるサイトカインのレベルを示す。各行はＡＰ１９０３の非存在下または存在下でのそれぞれのサイトテールを示し、各列はアッセイされたそれぞれのサイトカインを示す。各列は、１００％として設定された、アッセイされたそれぞれのサイトカインの最高濃度に正規化される。
【０４７３】
図４１Ａは、すべてのサイトテールのサイトカイン放出を示すが、ＦＫＢＰ−ＭｙＤ８８−ＣＤ４０受容体は含まない。ＡＰ１９０３の存在下で、エフェクター促進性ＩＬ１２Ｒｂｓｍａｌｌ（７７５〜８２５）サイトテールを含むＦＫＢＰスイッチは、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−２１、ＴＮＦａ、およびＩＦＮｇを含む上昇した量の炎症促進性サイトカインを放出した。興味深いことに、ＩＬ１２Ｒｂｓｍａｌｌ（７７５〜８２５）サイトテールはまた、強力な炎症シグナルに応答して負のフィードバック機構から生じそうである、増加したＩＬ−１０分泌を引き起こした。
【０４７４】
図４１Ｂは、ＦＫＢＰ−ＭｙＤ８８−ＣＤ４０受容体と同様に、すべてのサイトテールのサイトカイン放出を示す。サイトテールを有するＦＫＢＰスイッチと比較して、ＦＫＢＰ−ＭｙＤ８８−ＣＤ４０受容体は、ＡＰ１９０３の非存在下でも上昇したレベルのサイトカインを分泌し、結果はその高い基礎的活性と一致した。
【０４７５】
異なるサイトテール出力がＣＡＲ  Ｔ細胞のメモリー分化と長期生存に影響するかどうかを試験するために、ＡＰ１９０３駆動性成長アッセイを実行した。示されたキメラ受容体を有するＣＡＲ  Ｔ細胞を解凍し、ＣＡＲ＋細胞の百分率を、非形質導入Ｔ細胞を添加することにより、最も低い形質導入効率（すなわち、２０％ＣＡＲ＋）の試料に正規化した。細胞を、未処理のままにするか、または５００ｎｇ／ｍｌのＡＰ１９０３で、かつ外因性サイトカイン（陽性対照の場合に明記されない限り）もしくは標的細胞の非存在下で２週間処理した。陽性対照として、ＣＡＲ  Ｔ細胞を、外因性組換えＩＬ−７またはＩＬ−２（各々１０ｎｇ／ｍＬ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で代替的に補充した。ＡＰ１９０３駆動性成長アッセイの５日目に、上清を、ＭＳＤアッセイ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用するサイトカイン放出の分析のために、試料採取した。２週間の培養の終わりに、生存しているＣＡＲ  Ｔ細胞のメモリーおよび疲弊表現型を、決定した。簡単に説明すると、各培養条件細胞からの重複した試料を、回収し、Ｚｏｍｂｉｅ  ＮＩＲ可動性生存キット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して染色した。試料を、ＰＢＳで洗浄し、Ｆｃでブロックし、次いで、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで希釈した以下の抗体カクテルで染色した：ＢＵＶ３９５複合体化抗ヒトＣＤ３、ＢＶ５１０複合体化抗ヒトＣＤ８、ＢＶ６０５複合体化ヒトＣＤ４およびＦＩＴＣ複合体化ｖ５タグ（ＣＡＲ検出用）、ＰＥ／Ｃｙ７複合体化抗ヒトＣＤ６２Ｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＢＶ７８５複合体化抗ヒトＣＤ４５ＲＯ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ複合体化抗ヒトＰＤ−１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＢＶ７１１複合体化抗ヒトＴｉｍ−３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＰｅｒＣＰ／ｅＦｌｕｏｒ７１０複合体化抗ヒトＬａｇ−３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。最後に、試料をＰＢＳで洗浄し、細胞ペレットをＦＡＣＳ分析のためにＰＢＳ＋１％ＢＳＡに再懸濁させた。
【０４７６】
図４２Ａ〜４２Ｂは、ＡＰ１９０３の存在下での、ＡＰ１９０３駆動性成長の５日目の培養上清におけるサイトカインのレベルを示す。各行はＡＰ１９０３の存在下でのそれぞれのシグナル伝達ドメインを示し、各列はアッセイされたそれぞれのサイトカインを示す。各列は、１００％として設定された、アッセイされたそれぞれのサイトカインの最高濃度に正規化される。
【０４７７】
図４２Ａは、すべてのサイトテールのサイトカイン放出を示すが、ＦＫＢＰ−ＭｙＤ８８−ＣＤ４０受容体は含まない。ＩＬ１２Ｒｂｓｍａｌｌ（７７５〜８２５）を含有するサイトテールは、ＩＬ−１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−２１、ＴＮＦａ、および特にＩＦＮｇを含む上昇した量の炎症促進性サイトカインを分泌する。
【０４７８】
図４２Ｂは、ＦＫＢＰ−ＭｙＤ８８−ＣＤ４０受容体と同様に、すべてのサイトテールのサイトカイン放出を示す。ＦＫＢＰ−ＭｙＤ８８−ＣＤ４０受容体と比較して、ＡＰ１９０３駆動性成長中のＦＫＢＰ−サイトテールキメラ受容体によるサイトカイン放出は、全体的により低かった。
【０４７９】
図４３は、サイトテールを有するＣＡＲ  Ｔ細胞のＡＰ１９０３駆動性濃縮を示す。点線は、アッセイの開始時に播種されたＣＡＲ＋細胞の百分率（２０％）を示す。予想通り、外因性組換えＩＬ−７またはＩＬ−２での処理は、同じ培養物内のＣＡＲ＋およびＣＡＲ−  Ｔ細胞の両方の増殖および生存を促進し、ＣＡＲ＋細胞の約２０％での安定的な維持を引き起こした。対照的に、ＡＰ１９０３での処理は、ＦＫＢＰ−サイトテール受容体を発現するＣＡＲ  Ｔ細胞について選択および濃縮し、成長および生存の利点がＣＡＲ＋Ｔ細胞特異的であることを示唆している。
【０４８０】
図４４Ａ〜４４Ｇは、ＡＰ１９０３駆動性増殖の１４日目のＣＡＲ  Ｔ細胞のメモリーサブセット分配を示す。Ｓｔａｔ５活性を抑止するＩＬ７Ｒ（４２４〜４５９、Ｙ４５６Ｆ）サイトテールと比較して（図５Ｂ）、Ｓｔａｔ５適格ＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）サイトテールは、外因性組換えＩＬ−７と同等またはそれ以上の程度までＴｓｃｍ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞の濃縮を促進した。さらに、外因性組換えＩＬ−７またはＩＬ−２での処理と比較して、ＥＧＦＲ（１１２２〜１１６５）サイトテールのＡＰ１９０３誘導性活性化は、単独またはＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）との組み合わせのいずれかで、Ｔｃｍ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞の濃縮を生じ、ＥＧＦＲ（１１２２〜１１６５）サイトテールシグナル伝達がＴｃｍ分化を促進することを示唆している。
【０４８１】
図４５Ａ〜４５Ｇは、ＡＰ１９０３駆動性増殖の１４日目のＣＡＲ＋Ｔ細胞の疲弊表現型を示す。Ｓｔａｔ５活性を抑止するＩＬ７Ｒ（４２４〜４５９、Ｙ４５６Ｆ）サイトテールと比較して（図５Ｂ）、Ｓｔａｔ５適格ＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）サイトテールは、外因性組換えＩＬ−７と同等またはそれ以上の程度までＰＤ−１、Ｔｉｍ−３およびＬａｇ−３の発現を効果的に抑制した。さらに、外因性組換えＩＬ−７またはＩＬ−２での処理と比較して、ＥＧＦＲ（１１２２〜１１６５）サイトテールのＡＰ１９０３誘導性活性化は、単独またはＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）との組み合わせのいずれかで、Ｔｉｍ−３およびＬａｇ−３の発現を抑制した。
【０４８２】
まとめると、長寿命のＣＡＲ  Ｔ細胞の濃縮は、ＩＬ７Ｒ（３１６〜４５９）および／またはＥＧＦＲ（１１２２〜１１６５）のようなメモリー促進性および疲弊防止性サイトテールを組み込むことにより達成され得る一方、強力かつ即時型の細胞傷害性機能を有するＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｉｌ１２Ｒｂ２ｓｍａｌｌ（７７５〜８２５）のようなエフェクター促進性サイトテールを組み込むことによって支持され得る。
【０４８３】
開示された教示は、さまざまな用途、方法、キット、および組成物を参照して説明されているが、本明細書の教示および特許請求される本発明から逸脱することなく、さまざまな変更および修正がなされ得ることが、理解されるであろう。前述の例は、開示された教示をよりよく例示するために提供され、本明細書に提示された教示の範囲を限定するよう意図されていない。本教示はこれらの例示的な実施形態の点で説明されてきたが、当業者は、これらの例示的な実施形態の多数の変形および修正が過度の実験を伴わずに可能であることを、容易に理解するであろう。すべてのかかる変形および修正は、現在の教示の範囲内である。
【０４８４】
特許、特許出願、論文、教科書などを含む、本明細書で引用されたすべての参考文献、およびそれらにまだ引用されていない範囲で引用された参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。組み込まれた文献および類似の材料のうちの１つ以上が、定義された用語、用語の使用法、記載された技法などを含むがこれらに限定されない、本出願と異なるまたはそれに矛盾する場合、本出願は制御する。
【０４８５】
前述の記載および実施例は、本発明のある特定の実施形態を詳述し、発明者によって企図された最良の形態を記載する。しかしながら、前述のものが文章でどれほど詳細に見えることができても、本発明は多くの方法で実施され得、本発明は添付の特許請求の範囲およびその任意の均等物に従って解釈されるべきであることが、理解されるであろう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３０Ｅ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ−Ｅ】
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【図３１Ｆ−Ｇ】
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【図３１Ｈ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３Ａ−Ｂ】
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【図３３Ｃ−Ｄ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３４Ｅ】
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【図３４Ｆ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３５Ｅ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３７Ｄ】
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【図３８Ａ−Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図４０Ｅ】
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【図４０Ｆ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３】
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【図４４Ａ−Ｄ】
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【図４４Ｅ−Ｇ】
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【図４５Ａ−Ｄ】
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【図４５Ｅ−Ｇ】
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【配列表】
2021514677000001.app
【国際調査報告】
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