(57)【要約】【課題】薬物誘発性代謝摂動を監視する標準的なアプローチは、集団ベースの測定値と限られた動態情報を提供するエンドポイントアッセイに限定されている。【解決手段】  ＡＴＰバイオセンサである融合タンパク質および細胞内のＡＴＰレベルをアッセイするためのそれらの使用が本明細書に開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５属のポリペプチドを含む融合タンパク質であって、
Ｘ１およびＸ５のうちの一方が受容体励起波長および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）発光波長を有するＦＲＥＴ受容体ポリペプチドを含み、Ｘ１およびＸ５のうちの他方が供与体励起波長および供与体発光波長を有するＦＲＥＴ供与体ポリペプチドを含み、
Ｘ２およびＸ４が独立して、任意のアミノ酸リンカーであり、
Ｘ３がＡＴＰ結合タンパク質を含み、
前記ＡＴＰ結合タンパク質によるＡＴＰの結合が前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチドと前記ＦＲＥＴ供与体ポリペプチドとの相互作用を引き起こす、融合タンパク質。
【請求項２】
Ｘ１がＦＲＥＴ受容体ポリペプチドを含み、Ｘ５がＦＲＥＴ供与体ポリペプチドを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
Ｘ１がＦＲＥＴ供与体ポリペプチドを含み、Ｘ５がＦＲＥＴ受容体ポリペプチドを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
Ｘ２が１〜２個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーであるか、または存在しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
Ｘ２が１個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーであるか、または存在しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
Ｘ２が１個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
Ｘ２が、Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｔ、ＴＳ、ＩＤからなる群から選択されるアミノ酸リンカーであるか、またはＸ２が存在しない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
Ｘ２が、Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｔ、ＴＳ、およびＩＤからなる群から選択されるアミノ酸リンカーである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
Ｘ２が、Ａ、Ｓ、Ｖ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸リンカーである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
Ｘ４が１〜５個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーであるか、またはＸ４が存在しない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
Ｘ４が１〜４個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーであるか、またはＸ４が存在しない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
Ｘ４が１〜２個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
Ｘ４が、ＡＴ、Ａ、ＳＡ、ＧＡ、ＦＦ、ＰＰＰＰ（配列番号２０）、ＦＬ、ＧＴＳＧ（配列番号２１）、Ｐ、Ｓ、ＡＮＥＦＭ（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸リンカーであるか、またはＸ４が存在しない、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
Ｘ４がＡＴ、Ａ、ＳＡ、ＧＡ、ＦＦ、ＦＬ、Ｐ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸リンカーである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
Ｘ４が、Ａ、ＦＦ、ＦＬ、およびＧＴＳＧ（配列番号２１）からなる群から選択されるアミノ酸リンカーである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
Ｘ２およびＸ４が両方ともＡである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
Ｘ２がＳであり、Ｘ４がＡである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
Ｘ２が存在せず、Ｘ４がＦＦである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
Ｘ２がＶであり、Ｘ４がＦＬである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
Ｘ２がＴであり、Ｘ４がＧＴＳＧ（配列番号２１）である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
Ｘ２がＳであり、Ｘ４がＳＡである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
Ｘ２およびＸ４がプロリン残基を含まない、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチドが、５００〜５６０ｎｍの範囲の最大受容体励起波長および５３０〜５８０ｎｍの範囲の受容体最大発光波長を有する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチドが、配列番号１〜３の１個以上のアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり、発色団で同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチド内にすべての任意のアミノ酸残基が存在する、請求項２３記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
前記ＦＲＥＴ供与体ポリペプチドが、４５０〜５００ｎｍの範囲の最大供与体励起波長および４８０〜５１５ｎｍの範囲の最大供与体発光波長を有する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
前記ＦＲＥＴ供与体ポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり、発色団で同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
Ｘ３が、配列番号５〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも６５％、６７％、６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＴＰ結合タンパク質を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
配列番号７〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５属のポリペプチドを含むコントロール融合タンパク質であって、
Ｘ１およびＸ５のうちの一方が受容体励起波長および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）発光波長を有するＦＲＥＴ受容体ポリペプチドを含み、Ｘ１およびＸ５のうちの他方が供与体励起波長および供与体発光波長を有するＦＲＥＴ供与体ポリペプチドを含み、
Ｘ２およびＸ４が独立して、任意のアミノ酸リンカーであり、
Ｘ３がＡＴＰに結合しないコントロールタンパク質を含む、コントロール融合タンパク質。
【請求項３１】
Ｘ１がＦＲＥＴ受容体ポリペプチドを含み、Ｘ５がＦＲＥＴ供与体ポリペプチドを含む、請求項３０に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項３２】
Ｘ１がＦＲＥＴ供与体ポリペプチドを含み、Ｘ５がＦＲＥＴ受容体ポリペプチドを含む、請求項３０記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項３３】
Ｘ２が１〜２個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーであるか、または存在しない、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項３４】
Ｘ２が１個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーであるか、または存在しない、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項３５】
Ｘ２が１個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーである、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項３６】
Ｘ２が、Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｔ、ＴＳ、ＩＤからなる群から選択されるアミノ酸リンカーであるか、またはＸ２が存在しない、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項３７】
Ｘ２が、Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｔ、ＴＳ、およびＩＤからなる群から選択されるアミノ酸リンカーである、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項３８】
Ｘ２が、Ａ、Ｓ、Ｖ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸リンカーである、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項３９】
Ｘ４が１〜５個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーであるか、またはＸ４が存在しない、請求項３０〜３８のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項４０】
Ｘ４が１〜４個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーであるか、またはＸ４が存在しない、請求項３０〜３８のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項４１】
Ｘ４が１〜２個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーである、請求項３０〜４０のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項４２】
Ｘ４が、ＡＴ、Ａ、ＳＡ、ＧＡ、ＦＦ、ＰＰＰＰ（配列番号２０）、ＦＬ、ＧＴＳＧ（配列番号２１）、Ｐ、Ｓ、ＡＮＥＦＭ（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸リンカーであるか、またはＸ４が存在しない、請求項３０〜４１のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項４３】
Ｘ４が、ＡＴ、Ａ、ＳＡ、ＧＡ、ＦＦ、ＦＬ、Ｐ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸リンカーである、請求項３０〜４１のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項４４】
Ｘ４が、Ａ、ＦＦ、ＦＬ、およびＧＴＳＧ（配列番号２１）からなる群から選択されるアミノ酸リンカーである、請求項３０〜４１のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項４５】
Ｘ２およびＸ４がともにＡである、請求項３０〜４４のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項４６】
Ｘ２がＳであり、Ｘ４がＡである、請求項３０〜４４のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項４７】
Ｘ２が存在せず、Ｘ４がＦＦである、請求項３０〜４４のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項４８】
Ｘ２がＶであり、Ｘ４がＦＬである、請求項３０〜４４のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項４９】
Ｘ２がＴであり、Ｘ４がＧＴＳＧ（配列番号２１）である、請求項３０から４４のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項５０】
Ｘ２がＳであり、Ｘ４がＳＡである、請求項３０〜４４のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項５１】
Ｘ２およびＸ４がプロリン残基を含まない、請求項３０〜５０のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項５２】
前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチドが、５００〜５６０ｎｍの範囲の最大受容体励起波長および５３０〜５８０ｎｍの範囲のＦＲＥＴ最大発光波長を有する、請求項３０〜５１のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項５３】
前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチドが、配列番号１〜３のアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、発色団で同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３０〜５２のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項５４】
前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチド内にすべての任意のアミノ酸残基が存在する、請求項５３に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項５５】
前記ＦＲＥＴ供与体ポリペプチドが、４５０〜５００ｎｍの範囲の最大供与体励起波長および４８０〜５１５ｎｍの範囲の最大供与体発光波長を有する、請求項３０から５４のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項５６】
前記ＦＲＥＴ供与体ポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、発色団で同一であるアミノ酸配列のアミノ酸配列を含む、請求項３０〜５５のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項５７】
Ｘ３が、配列番号１２のアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも６５％、６７％、６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、下線付きおよび太字の残基はＫでなければならない、請求項３０〜５６のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項５８】
配列番号１３のアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも６５％、６７％、６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、下線付きおよび太字の残基はＫでなければならない、請求項３０〜５７のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項５９】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６０】
請求項５９に記載のポリヌクレオチドをコードする発現ベクターであって、前記ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーター配列に作用可能に連結されている、発現ベクター。
【請求項６１】
請求項５９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６０に記載の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項６２】
前記宿主細胞が安定な形質転換細胞株の細胞である、請求項６１記載の組換え宿主細胞。
【請求項６３】
請求項３０〜５８のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６４】
請求項６３に記載のポリヌクレオチドをコードする発現ベクターであって、前記ポリヌクレオチドが前記ポリヌクレオチの発現を指示することができるプロモーター配列に作用可能に連結される、発現ベクター。
【請求項６５】
請求項６３に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６４に記載の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項６６】
前記宿主細胞が安定な形質転換細胞株の細胞である、請求項６５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６７】
キットであって、
（ａ）請求項１〜２９のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項５９に記載のポリヌクレオチド、請求項６０に記載の発現ベクター、および／または請求項６１もしくは６２に記載の組換え宿主細胞、
（ｂ）請求項３０〜５８のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質、請求項６３に記載のポリヌクレオチド、請求項６４に記載の発現ベクター、および／または請求項６５もしくは６６に記載の組換え宿主細胞、を含むキット。
【請求項６８】
対象細胞におけるＡＴＰのレベルを決定するための、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項６９】
ＡＴＰのアッセイ方法であって、
（ａ）請求項１〜２９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を１つ以上の第１の細胞で発現させ、
（ｉ）前記ＦＲＥＴ供与体ポリペプチド励起波長を有する光に前記１つ以上の第１の細胞を曝露したときに、前記１つ以上の第１の細胞から発光された、前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成された蛍光シグナルを検出することによって生成される第１の蛍光画像、および／または
（ｉｉ）前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチド励起波長を有する光に前記１つ以上の第１の細胞を曝露したときに、前記１つ以上の第１の細胞から発光された、前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成された蛍光シグナルを検出することによって生成される第２の蛍光画像、および／または
（ｉｉｉ）前記ＦＲＥＴ供与体ポリペプチド励起波長を有する光に前記１つ以上の第１の細胞を曝露したときに、前記１つ以上の第１の細胞から発光された、前記ＦＲＥＴ供与体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成された蛍光シグナルを検出することによって生成される第３の蛍光画像、からなる群から選択される１つ以上の画像を生成することと、
（ｂ）前記第１の蛍光画像、前記第２の蛍光画像および／または前記第３の蛍光画像中の蛍光シグナルの出力を比較することによって、前記１つ以上の第１の細胞中のＦＲＥＴ比を決定することと、を含み、
前記１つ以上の第１の細胞中のＡＴＰレベルが前記決定されたＦＲＥＴ比と比例する、方法。
【請求項７０】
請求項３０〜５８のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質を１つ以上の第１の細胞で発現させ、前記１つ以上の第１の細胞から発光された受容体発光波長を有する光によって生成されたコントロールシグナルを検出することをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記コントロールシグナルを検出することは、
（ｃ）本明細書に開示された任意の実施形態または実施形態の組み合わせの前記コントロール融合タンパク質を１つ以上のコントロール細胞（前記第１の細胞または第２の細胞など）で発現させ、
（ｉ）前記ＦＲＥＴ供与体ポリペプチド励起波長を有する光に前記１つ以上のコントロール細胞を曝露したときに、前記１つ以上のコントロール細胞から発光された、前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成された蛍光シグナルを検出することによって生成される第４の蛍光画像、および／または
（ｉｉ）前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチド励起波長を有する光に前記１つ以上のコントロール細胞を曝露したときに、前記１つ以上のコントロール細胞から発光された、前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成された蛍光シグナルを検出することによって生成される第５の蛍光画像、および／または
（ｉｉｉ）前記ＦＲＥＴ供与体ポリペプチド励起波長を有する光に前記１つ以上のコントロール細胞を曝露したときに、前記１つ以上のコントロール細胞から発光された、前記ＦＲＥＴ供与体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成された蛍光シグナルを検出することによって生成される第６の蛍光画像、からなる群から選択される１つ以上の画像を生成することと、
（ｄ）前記第４の蛍光画像、前記第５の蛍光画像および／または前記第６の蛍光画像中の蛍光シグナルの出力を比較することによって、前記１つ以上のコントロール細胞中のコントロール融合ＦＲＥＴ比を決定することと、を含み、
前記コントロール融合ＦＲＥＴ比の変化がＡＴＰ結合に無関係な実験条件の結果であると決定され、前記決定されたＦＲＥＴ比が前記コントロール融合ＦＲＥＴ比の変化に基づいて修正される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記１つ以上の第１の細胞がインキュベーター内で培養され、すべての画像化ステップがインキュベーターから前記１つ以上の第１の細胞を取り出すことなく実行される、請求項６９〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記１つ以上の第１の細胞を１つ以上の試験物質と接触させ、前記１つ以上の第１の細胞におけるＡＴＰの存在に対する試験物質の効果を決定することをさらに含む、請求項６９〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記１つ以上の第１の細胞中のＡＴＰの存在に対する前記１つ以上の試験物質の効果が、１分〜３ヶ月の範囲の期間にわたって連続的または断続的に決定される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記融合タンパク質は、受容体励起波長およびＦＲＥＴ発光波長を有するＦＲＥＴ受容体である第１のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第１のフルオロフォア、Ｎ−末端およびＣ−末端を有するＡＴＰ結合タンパク質、ならびに供与体励起波長および供与体発光波長を有するＦＲＥＴ供与体である第２のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第２のフルオロフォアを含み、第１のリンカーは前記第１のフルオロフォアの前記Ｃ−末端と前記ＡＴＰ結合タンパク質の前記Ｎ−末端との間に配置され、第２のリンカーは前記ＡＴＰ結合タンパク質の前記Ｃ−末端と前記第２のフルオロフォアの前記Ｎ−末端との間に配置され、前記第１のフルオロフォア、前記ＡＴＰ結合タンパク質、および前記第２のフルオロフォアは、前記ＡＴＰ結合タンパク質によるＡＴＰ結合が前記第１のフルオロフォアと前記第２のフルオロフォアとの相互作用を引き起こして、前記供与体励起波長を有する光に曝された時にＦＲＥＴ発光シグナルを生成するように作用可能に連結される、ポリヌクレオチド。
【請求項７６】
前記第１のリンカーがアラニン残基であり、前記第２のリンカーがアラニン残基である、請求項７５記載のポリヌクレオチド。
【請求項７７】
前記第１のリンカーがセリン残基であり、前記第２のリンカーがアラニン残基である、請求項７５記載のポリヌクレオチド。
【請求項７８】
前記第１のリンカーが無効であり、前記第２のリンカーがフェニルアラニン−フェニルアラニンジペプチド残基である、請求項７５記載のポリヌクレオチド。
【請求項７９】
前記第１のリンカーがバリン残基であり、前記第２のリンカーがフェニルアラニン−ロイシンジペプチド残基である、請求項７５記載のポリヌクレオチド。
【請求項８０】
前記第１のリンカーがスレオニン残基であり、前記第２のリンカーがグリシン−スレオニン−セリン−グリシンペプチド残基である、請求項７５記載のポリヌクレオチド。
【請求項８１】
前記第１のリンカーがセリン残基であり、前記第２のリンカーがセリン−アラニンジペプチド残基である、請求項７５記載のポリヌクレオチド。
【請求項８２】
前記第２のリンカーがアスパラギン残基を含まない、請求項７５記載のポリヌクレオチド。
【請求項８３】
作用可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項７５〜８２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８４】
請求項７５〜８３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８５】
請求項７５〜８４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項８４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項８６】
前記宿主細胞が安定な形質転換細胞株の細胞である、請求項８５記載の宿主細胞。
【請求項８７】
融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、受容体励起波長およびＦＲＥＴ発光波長を有するＦＲＥＴ受容体である第１のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第１のフルオロフォア、Ｎ−末端およびＣ−末端を有するＡＴＰ結合タンパク質、ならびに供与体励起波長および供与体発光波長を有するＦＲＥＴ供与体である第２のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第２のフルオロフォアを含み、第１のリンカーは前記第１のフルオロフォアの前記Ｃ−末端と前記ＡＴＰ結合タンパク質の前記Ｎ−末端との間に配置され、第２のリンカーは前記ＡＴＰ結合タンパク質の前記Ｃ−末端と前記第２のフルオロフォアの前記Ｎ−末端との間に配置され、前記第１のフルオロフォア、前記ＡＴＰ結合タンパク質、および前記第２のフルオロフォアは、前記ＡＴＰ結合タンパク質によるＡＴＰ結合が前記第１のフルオロフォアと前記第２のフルオロフォアとの相互作用を引き起こして、前記供与体励起波長を有する光に曝された時にＦＲＥＴ発光シグナルを生成するように作用可能に連結される、融合タンパク質。
【請求項８８】
前記ＡＴＰ結合タンパク質が、配列番号５のタンパク質と、ＡＴＰを結合し、配列番号５と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の置換変異、追加または欠失を有する配列番号５の変異体と、ＡＴＰを結合し、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１４に結合する配列番号１４の変異体によってコードされる配列番号５の変異体とからなる群から選択される、請求項７５〜８７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、方法、発現ベクター、宿主細胞または融合タンパク質。
【請求項８９】
コントロール融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記コントロール融合タンパク質は、受容体励起波長およびＦＲＥＴ発光波長を有するＦＲＥＴ受容体である第１のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第１のフルオロフォア、Ｎ−末端およびＣ−末端を有するコントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質であって、ＡＴＰを結合しないように変異されているコントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質、ならびに、供与体励起波長および供与体発光波長を有するＦＲＥＴ供与体である第２のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第２のフルオロフォアを含み、第１のリンカーは前記第１のフルオロフォアの前記Ｃ−末端と前記コントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質の前記Ｎ−末端との間に配置され、第２のリンカーは前記コントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質の前記Ｃ−末端と前記第２のフルオロフォアの前記Ｎ−末端との間に配置され、前記コントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質はＡＴＰを結合しないため、前記第１のフルオロフォア、前記コントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質および前記第２のフルオロフォアは、コントロールとして機能するように作用可能に連結されて、それにより、前記供与体励起波長を有する光に曝された時にＦＲＥＴ発光シグナルを生成するための前記第１のフルオロフォアと前記第２のフルオロフォアとの相互作用が、ＡＴＰの存在に無関係な非特異的バックグラウンドシグナルを表す、ポリヌクレオチド。
【請求項９０】
前記第１のリンカーがアラニン残基であり、前記第２のリンカーがアラニン残基である、請求項８９記載のポリヌクレオチド。
【請求項９１】
前記第１のリンカーがセリン残基であり、前記第２のリンカーがアラニン残基である、請求項８９記載のポリヌクレオチド。
【請求項９２】
前記第１のリンカーが無効であり、前記第２のリンカーがフェニルアラニン−フェニルアラニンジペプチド残基である、請求項８９記載のポリヌクレオチド。
【請求項９３】
前記第１のリンカーがバリン残基であり、前記第２のリンカーがフェニルアラニン−ロイシンジペプチド残基である、請求項８９記載のポリヌクレオチド。
【請求項９４】
前記第１のリンカーがスレオニン残基であり、前記第２のリンカーがグリシン−スレオニン−セリン−グリシンペプチド残基である、請求項８９記載のポリヌクレオチド。
【請求項９５】
前記第１のリンカーがセリン残基であり、前記第２のリンカーがセリン−アラニンジペプチド残基である、請求項８９記載のポリヌクレオチド。
【請求項９６】
前記第２のリンカーがアスパラギン残基を含まない、請求項８９記載のポリヌクレオチド。
【請求項９７】
作用可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項８９〜９６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９８】
請求項８９〜９７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項９９】
請求項８９〜９７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項９８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１００】
前記宿主細胞が安定な形質転換細胞株の細胞である、請求項９９記載の宿主細胞。
【請求項１０１】
融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、受容体励起波長およびＦＲＥＴ発光波長を有するＦＲＥＴ受容体である第１のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第１のフルオロフォア、Ｎ−末端およびＣ−末端を有するコントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質、ならびに供与体励起波長および供与体発光波長を有するＦＲＥＴ供与体である第２のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第２のフルオロフォアを含み、第１のリンカーは前記第１のフルオロフォアの前記Ｃ−末端と前記コントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質の前記Ｎ−末端との間に配置され、第２のリンカーは前記コントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質の前記Ｃ−末端と前記第２のフルオロフォアの前記Ｎ−末端との間に配置され、前記コントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質はＡＴＰを結合しないため、前記第１のフルオロフォア、前記コントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質および前記第２のフルオロフォアは、コントロールとして機能するように作用可能に連結され、それにより、前記供与体励起波長を有する光に曝された時にＦＲＥＴ発光シグナルを生成するための前記第１のフルオロフォアと前記第２のフルオロフォアとの相互作用が、ＡＴＰの存在に無関係な非特異的バックグラウンドシグナルを表す、融合タンパク質。
【請求項１０２】
前記コントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質が、配列番号１５のタンパク質と、ＡＴＰを結合せず、配列番号１５と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の置換変異、追加または欠失を有する配列番号１５の変異体と、ＡＴＰを結合せず、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１６に結合する配列番号１６の変異体によってコードされる配列番号１５の変異体とからなる群から選択される、請求項８９〜１０１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、方法、発現ベクター、宿主細胞または融合タンパク質。
【請求項１０２】
前記ＦＲＥＴ供与体がｃｐｍＥＧＦＰである、本出願のいずれかの請求項に記載のポリヌクレオチド、方法、発現ベクター、宿主細胞または融合タンパク質。
【請求項１０３】
前記ＦＲＥＴ受容体がｍＫＯｋである、本出願のいずれかの請求項に記載のポリヌクレオチド、方法、発現ベクター、宿主細胞または融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１８年３月９日に出願された米国仮特許出願第６２／６４０９８３号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
薬物誘発性代謝摂動を監視する標準的なアプローチは、集団ベースの測定値と限られた動態情報を提供するエンドポイントアッセイに限定されている。細胞ＡＴＰレベルの直接的な自動生細胞分析を可能にする遺伝的にコードされたＡＴＰセンサーが、使用方法とともに本開示の態様に従って提供される。
【発明の概要】
【０００３】
一態様では、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５属のポリペプチドを含む融合タンパク質が開示され、
Ｘ１およびＸ５のうちの一方は、受容体励起波長および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）発光波長を有するＦＲＥＴ受容体ポリペプチドを含み、Ｘ１およびＸ５のうちの他方は、供与体励起波長および供与体発光波長を有するＦＲＥＴ供与体ポリペプチドを含み、
Ｘ２およびＸ４は独立して、任意のアミノ酸リンカーであり、
Ｘ３はＡＴＰ結合タンパク質を含み、
ＡＴＰ結合タンパク質によるＡＴＰの結合は、ＦＲＥＴ受容体ポリペプチドとＦＲＥＴ供与体ポリペプチドの相互作用を引き起こす。
【０００４】
１つの実施形態では、Ｘ１はＦＲＥＴ受容体ポリペプチドを含み、Ｘ５はＦＲＥＴ供与体ポリペプチドを含む。別の実施形態では、Ｘ１はＦＲＥＴ供与体ポリペプチドを含み、Ｘ５はＦＲＥＴ受容体ポリペプチドを含む。様々な実施形態では、Ｘ２は１〜２個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーであるか、または存在しない。他の実施形態では、Ｘ２は、Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｔ、ＴＳ、ＩＤからなる群から選択されるアミノ酸リンカーであるか、またはＸ２は存在しない。さらなる実施形態では、Ｘ４は、１〜５個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーであるか、またはＸ４は存在しない。他の実施形態では、Ｘ４は、ＡＴ、Ａ、ＳＡ、ＧＡ、ＦＦ、ＰＰＰＰ（配列番号２０）、ＦＬ、ＧＴＳＧ（配列番号２１）、Ｐ、Ｓ、ＡＮＥＦＭ（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸リンカーであるか、またはＸ４は存在しない。様々な実施形態において、Ｘ２およびＸ４は両方ともＡであり；Ｘ２はＳ、Ｘ４はＡであり；
Ｘ２は存在せず、Ｘ４はＦＦであり；Ｘ２はＶ、Ｘ４はＦＬであり；Ｘ２はＴ、Ｘ４はＧＴＳＧ（配列番号２１）であり；または、Ｘ２はＳ、Ｘ４はＳＡである。別の実施形態では、Ｘ２およびＸ４はプロリン残基を含まない。他の実施形態において、ＦＲＥＴ受容体ポリペプチドは、５００〜５６０ｎｍの範囲の最大受容体励起波長および５３０〜５８０ｎｍの範囲の受容体最大発光波長を有する。さらなる態様において、ＦＲＥＴ受容体ポリペプチドは、配列番号１〜３の１つ以上のアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、発色団で同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＦＲＥＴ受容体ポリペプチド中のすべての任意のアミノ酸残基が存在する。１つの実施形態では、ＦＲＥＴ供与体ポリペプチドは、４５０〜５００ｎｍの範囲の最大供与体励起波長および４８０〜５１５ｎｍの範囲の最大供与体発光波長を有する。他の実施形態では、ＦＲＥＴ供与体ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、発色団で同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、Ｘ３は、配列番号５〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも６５％、６７％、６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むＡＴＰ結合タンパク質を含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０００５】
別の態様では、Ｘ３がＡＴＰに結合しないコントロールタンパク質を含むことを除いて、本明細書に開示される融合タンパク質およびその成分のすべての実施形態および実施形態の組み合わせを含むコントロール融合タンパク質が開示される。１つの実施形態では、Ｘ３は、配列番号１２のアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも６５％、６７％、６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、配列番号１２の下線付きおよび太字の残基はＫでなければならない。他の実施形態では、コントロール融合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも６５％、６７％、６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、配列番号１３の下線付きおよび太字の残基はＫでなければならない。
【０００６】
さらなる態様では、本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせの融合タンパク質またはコントロールタンパク質をコードするポリヌクレオチドが開示される。他の態様では、本開示は、本開示のポリヌクレオチドをコードする発現ベクターを提供し、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーター配列、および本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせのポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む組換え宿主細胞に作用可能に連結される。１つの実施形態では、宿主細胞は、安定した形質転換細胞株の細胞である。
【０００７】
さらなる態様では、本開示は、本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせの１つ以上の融合タンパク質および１つ以上のコントロール融合タンパク質を含むキットを提供する。別の態様では、本開示は、対象細胞におけるＡＴＰレベルを決定するための融合タンパク質の使用方法を提供する。１つの実施形態では、ＡＴＰをアッセイする方法は、
（ａ）本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせの融合タンパク質を１つ以上の第１の細胞で発現させ、
（ｉ）１つ以上の第１の細胞を、ＦＲＥＴ供与体ポリペプチド励起波長を有する光に曝露したときに、１つ以上の第１の細胞から発光されたＦＲＥＴ受容体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成される蛍光シグナルを検出することによって生成される第１の蛍光画像、および／または
（ｉｉ）１つ以上の第１の細胞を、ＦＲＥＴ受容体ポリペプチド励起波長を有する光に曝露したときに、１つ以上の第１の細胞から発光されたＦＲＥＴ受容体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成される蛍光シグナルを検出することによって生成される第２の蛍光画像、および／または
（ｉｉｉ）１つ以上の第１の細胞を、ＦＲＥＴ供与体ポリペプチド励起波長を有する光に曝露したときに、１つ以上の第１の細胞から発光されたＦＲＥＴ供与体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成される蛍光シグナルを検出することによって生成される第３の蛍光画像、からなる群から選択される１つ以上の画像を生成することと、
（ｂ）第１の蛍光画像、第２の蛍光画像、および／または第３の蛍光画像における蛍光シグナルの出力を比較することにより、１つ以上の第１の細胞におけるＦＲＥＴ比を決定することと、を含み、
１つ以上の第１の細胞におけるＡＴＰのレベルは、決定されたＦＲＥＴ比に比例する。１つの実施形態では、本方法は、本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせのコントロール融合タンパク質を１つ以上の第１の細胞で発現させること、および１つ以上の第１の細胞から発光された受容体発光波長を有する光によって生成されるコントロールシグナルを検出することをさらに含む。１つの実施形態では、コントロールシグナルを検出することは、
（ｃ）本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせのコントロール融合タンパク質を１つ以上のコントロール細胞（第１の細胞または第２の細胞など）で発現させ、
（ｉ）１つ以上のコントロール細胞を、ＦＲＥＴ供与体ポリペプチド励起波長を有する光に曝露したときに、１つ以上のコントロール細胞から発光されたＦＲＥＴ受容体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成される蛍光シグナルを検出することによって生成される第４の蛍光画像、および／または
（ｉｉ）１つ以上のコントロール細胞を、ＦＲＥＴ受容体ポリペプチド励起波長を有する光に曝露したときに、１つ以上のコントロール細胞から発光されたＦＲＥＴ受容体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成される蛍光シグナルを検出することによって生成される第５の蛍光画像、および／または
（ｉｉｉ）１つ以上のコントロール細胞を、ＦＲＥＴ供与体ポリペプチド励起波長を有する光に曝露したときに、１つ以上のコントロール細胞から発光されたＦＲＥＴ供与体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成される蛍光シグナルを検出することによって生成される第６の蛍光画像、からなる群から選択される１つ以上の画像を生成することと、
（ｄ）第４の蛍光画像、第５の蛍光画像、および／または第６の蛍光画像の蛍光シグナルの出力を比較することにより、１つ以上のコントロール細胞におけるコントロール融合ＦＲＥＴ比を決定することと、を含み、
コントロール融合ＦＲＥＴ比の変化は、ＡＴＰ結合とは無関係の実験条件の結果であると決定され、決定されたＦＲＥＴ比は、コントロール融合ＦＲＥＴ比の変化に基づいて修正される。
【０００８】
さらなる実施形態では、１つ以上の第１の細胞はインキュベーター内で培養されており、インキュベーターから１つ以上の第１の細胞を取り出すことなくすべての画像化ステップが実行される。別の実施形態では、本方法は、１つ以上の第１の細胞を１つ以上の試験物質と接触させ、１つ以上の第１の細胞におけるＡＴＰの存在に対する試験物質の効果を決定することをさらに含む。別の実施形態において、１つ以上の第１の細胞におけるＡＴＰの存在に対する１つ以上の試験物質の効果は、１分〜３ヶ月の範囲の期間にわたって連続的または断続的に決定される。
【０００９】
別の態様において、本開示は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドならびに融合タンパク質自体を提供し、融合タンパク質は、受容体励起波長およびＦＲＥＴ発光波長を有するＦＲＥＴ受容体である第１のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第１のフルオロフォア、Ｎ−末端およびＣ−末端を有するＡＴＰ結合タンパク質、ならびに供与体励起波長および供与体発光波長を有するＦＲＥＴ供与体である第２のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第２のフルオロフォアを含み、第１のリンカーは第１のフルオロフォアのＣ−末端とＡＴＰ結合タンパク質のＮ−末端との間に配置され、第２のリンカーはＡＴＰ結合タンパク質のＣ−末端と第２のフルオロフォアのＮ−末端との間に配置され、第１のフルオロフォア、ＡＴＰ結合タンパク質、および第２のフルオロフォアは、ＡＴＰ結合タンパク質によるＡＴＰ結合が第１のフルオロフォアと第２のフルオロフォアとの相互作用を引き起こして、供与体励起波長を有する光に曝された時にＦＲＥＴ発光シグナルを生成するように作用可能に連結される。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは作用可能に連結されたプロモーターをさらに含み、ポリヌクレオチドは発現ベクターに含まれ、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む宿主細胞が開示されている。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】処理２時間後のビヒクル処理細胞のＦＲＥＴ比から薬物処理細胞のＦＲＥＴ比を引くことにより、本開示の例示的な融合タンパク質について計算されたシグナルウィンドウのグラフ表示である。
【図２Ａ】各センサーの安定した発現を有する細胞株で、本開示の例示的な融合タンパク質を用いて観察されたＦＲＥＴ比のグラフ比較（（Ａ）ＧＯ−ＡＴｅａｍ１および（Ｂ）Ａ１）である。
【図２Ｂ】各センサーの安定した発現を有する細胞株で、本開示の例示的な融合タンパク質を用いて観察されたＦＲＥＴ比のグラフ比較（（Ａ）ＧＯ−ＡＴｅａｍ１および（Ｂ）Ａ１）である。
【図３Ａ】１０ｍＭ  ＡＴＰの存在下および非存在下でインキュベートされた本開示の例示的な融合タンパク質を用いて観察された励起スペクトルのグラフ比較である。センサーＡ１（ＧＯ−ＡＴｅａｍ−Ａ１）のパフォーマンス（図３Ａ）は、ＧＯ−Ａｔｅａｍ１センサーのパフォーマンス（図３Ｂ）と比較した場合、シグナルウィンドウで２倍超の増加を示している（ＡＴＰ結合（実線）とＡＴＰ非結合状態（破線）との比較）。
【図３Ｂ】１０ｍＭ  ＡＴＰの存在下および非存在下でインキュベートされた本開示の例示的な融合タンパク質を用いて観察された励起スペクトルのグラフ比較である。センサーＡ１（ＧＯ−ＡＴｅａｍ−Ａ１）のパフォーマンス（図３Ａ）は、ＧＯ−Ａｔｅａｍ１センサーのパフォーマンス（図３Ｂ）と比較した場合、シグナルウィンドウで２倍超の増加を示している（ＡＴＰ結合（実線）とＡＴＰ非結合状態（破線）との比較）。
【図４】標準培地で増殖させた細胞での、それぞれ２ＤＧおよびＫＣＮによる解糖およびＯＸＰＨＯＳの同時阻害によるＡＴＰ枯渇（図４Ａ）。データは、ＡＴＰ枯渇の時間経過と２ＤＧとＫＣＮの同時処理の濃度依存性を示している。グルコースまたはガラクトース培地で増殖した細胞での細胞傷害性化合物（クロルプロマジン、図４Ｂ）と細胞毒性化合物（ロテノン、図４Ｃ）との比較。最初の２つのパネルは、示されているようにグルコースまたはガラクトースで増殖した細胞における２４時間の時間経過にわたる各化合物の効果を示している。３番目のパネルは、２４時間の時点での各化合物の濃度反応曲線を示している。細胞傷害性化合物は、両方の培地条件下で同様の効果を示すが、細胞毒性化合物は、ガラクトースで増殖した細胞でより多くのＡＴＰ枯渇を誘発する。
【図５Ａ】線維芽細胞との単培養または共培養における乳癌細胞株におけるＣＢ−８３９の効果。代表的なデータは、ＣＣＤ−１０６８Ｓｋ線維芽細胞との共培養によって弱められるトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）細胞の長期にわたるＡＴＰ枯渇を示している（図５Ａ）。対照的に、受容体陽性細胞はＣＢ−８３９処理から４８時間以内に回復を示し、反応は線維芽細胞の存在による影響を受けなかった（図５Ｂ）。
【図５Ｂ】線維芽細胞との単培養または共培養における乳癌細胞株におけるＣＢ−８３９の効果。代表的なデータは、ＣＣＤ−１０６８Ｓｋ線維芽細胞との共培養によって弱められるトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）細胞の長期にわたるＡＴＰ枯渇を示している（図５Ａ）。対照的に、受容体陽性細胞はＣＢ−８３９処理から４８時間以内に回復を示し、反応は線維芽細胞の存在による影響を受けなかった（図５Ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有することを意図している。このような用語は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；３ｒｄ  Ｅｄ．，２００１、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｅｄ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；５ｔｈ  Ｅｄ．，２００２、Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ，２００２、Ｄ．Ｌ．Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｍ．Ｃｏｘ，Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ，２００４、およびＨｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．（Ｅｄ．），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００４を例示的に含む、様々な標準的な参考文献の文脈に見出され、定義され、使用されている。
【００１２】
単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、特に明記しない限り、または特に文脈が明確に示さない限り、限定することを意図せず、複数の指示対象を含む。
【００１３】
本明細書に開示されるすべての実施形態は、特に文脈が明確に示さない限り組み合わせることができる。
【００１４】
第１の態様では、本開示は、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５属のポリペプチドを含む融合タンパク質であって、
Ｘ１およびＸ５のうちの一方は、受容体励起波長および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）発光波長を有するＦＲＥＴ受容体ポリペプチドを含み、Ｘ１およびＸ５のうちの他方は、供与体励起波長および供与体発光波長を有するＦＲＥＴ供与体ポリペプチドを含み、
Ｘ２およびＸ４は独立して、任意のアミノ酸リンカーであり、
Ｘ３はＡＴＰ結合タンパク質を含み、
ＡＴＰ結合タンパク質によるＡＴＰの結合は、ＦＲＥＴ受容体ポリペプチドとＦＲＥＴ供与体ポリペプチドの相互作用を引き起こす、融合タンパク質を提供する。
【００１５】
この第１の態様の融合タンパク質は、以下の例で詳述するように、例えば生細胞のＡＴＰを検出および測定するために使用できる。
【００１６】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、励起された供与体フルオロフォアから供与体に近接した適切な受容体フルオロフォアへの非放射エネルギー移動である。本開示の融合タンパク質で使用するためのＦＲＥＴフルオロフォア供与体／受容体ポリペプチドペアの選択には、それぞれの吸収および発光波長が考慮される。本明細書の教示に基づいて、当業者は、特定の用途において様々なフルオロフォアのどれをＦＲＥＴ供与体／受容体ポリペプチドペアとして使用するかを容易に決定することができる。
【００１７】
１つの実施形態では、Ｘ１はＦＲＥＴ受容体ポリペプチドを含み、Ｘ５はＦＲＥＴ供与体ポリペプチドを含む。別の実施形態では、Ｘ１はＦＲＥＴ供与体ポリペプチドを含み、Ｘ５はＦＲＥＴ受容体ポリペプチドを含む。
【００１８】
緑色蛍光タンパク質、ならびにＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、ＥＣＦＰ、ＲＦＰ、およびＹＦＰなどの誘導体、ならびに本明細書に記載の他のポリペプチドフルオロフォアを含むが、これらに限定されない、任意の適切なポリペプチドフルオロフォアを使用することができる。
【００１９】
別の実施形態では、ＦＲＥＴ受容体ポリペプチドは、５００〜５６０ｎｍの範囲の最大受容体励起波長および５３０〜５８０ｎｍの範囲の受容体最大発光波長を有する。以下の実施例に記載される別の実施形態では、ＦＲＥＴ受容体ポリペプチドは、配列番号１〜３の１つ以上のアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり、発色団と同一であるアミノ酸配列を含む（強調された残基によって示される）。括弧内の残基は、全体を通して任意である。
【化１】
2021514603.tif 000003
【００２０】
１つの実施形態では、ＦＲＥＴ受容体ポリペプチド中のすべての任意のアミノ酸残基が存在する。
【００２１】
別の実施形態において、ＦＲＥＴ供与体ポリペプチドは、４５０〜５００ｎｍの範囲の最大供与体励起波長および４８０〜５１５ｎｍの範囲の最大供与体発光波長を有する。以下の実施例に記載される別の実施形態では、ＦＲＥＴ供与体ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、発色団で同一であるアミノ酸配列を含む（強調された残基）。
【化２】
2021514603.tif 000004
【００２２】
配列番号４と必要なアミノ酸配列同一性を有し、本開示の融合タンパク質で使用できる、例示的なＦＲＥＴ供与体ポリペプチドは、以下の表１に列挙される。
【表１−１】
2021514603.tif 000005
【表１−２】
2021514603.tif 000006
【表１−３】
2021514603.tif 000007
【００２３】
任意の適切なＡＴＰ結合タンパク質は、意図する用途に適切であるとみなされるように、融合タンパク質に使用することができる（すなわち、アッセイする細胞型で発現できるなど）。以下の実施例に記載される非限定的な実施形態では、Ｘ３は、配列番号５〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも６５％、６７％、６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＴＰ結合タンパク質を含む（括弧内の残基は任意である）。
配列番号５：バチルススブチリスＦｏＦ１−ＡＴＰシンターゼの修飾εサブユニット
（Ｍ）ＫＴＶＫＶＮＩＴＴＰＤＧＰＶＹＤＡＤＩＥＭＶＳＶＲＡＥＳＧＤＬＧＩＬＰＧＨＩＰＴＫＡＰＬＫＩＧＡＶＲＬＫＫＤＧＱＴＥＭＶＡＶＳＧＧＴＶＥＶＲＰＤＨＶＴＩＮＡＱＡＡＥＴＡＥＧＩＤＫＥＲＡＥＡＡＲＱＲＡＱＥＲＬＮＳＱＳＤＤＴＤＩＲＲＡＥＬＡＬＱＲＡＬＮＲＬＤＶＡＧＫ
配列番号６バチルス種のεサブユニットからの２つの要素を有するバチルススブチリスＦｏＦ１−ＡＴＰシンターゼの修飾εサブユニット。ＰＳ３ＦｏＦ１−ＡＴＰシンターゼ、ＭからＹへの変異、およびＧＫからＥＭＫへの置換（太字）。
【化３】
2021514603.tif 000008
【００２４】
配列番号５〜６と必要なアミノ酸配列同一性を有し、本開示の融合タンパク質で使用できる、例示的なＡＴＰ結合タンパク質は、以下の表２に列挙される。
表２
●複数種：ＡＴＰシンターゼイプシロン鎖［バチルス］、９７％、ｇｉ｜４８９３２０３５３｜ＷＰ＿００３２２７６８８．１
●ＡＴＰシンターゼイプシロン鎖［バチルススブチリス］、９６％、ｇｉ｜５０５２９６７１７｜ＷＰ＿０１５４８３８１９．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス］、９６％、ｇｉ｜５０４２９１１５２｜ＷＰ＿０１４４７８２５４．１
●ＡＴＰシンターゼイプシロン鎖［バチルステキレンシス］、９５％、ｇｉ｜６３９６５５００８｜ＷＰ＿０２４７１３７９８．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス］、９５％、ｇｉ｜５４５１１８１９２｜ＷＰ＿０２１４８０８１０．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス種ＦＭＱ７４］、９５％、ｇｉ｜１１０２０３２６３３｜ＷＰ＿０７１５７７６５７．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス］、９５％、ｇｉ｜１２８０９５２０５９｜ＷＰ＿１００２７５３９４．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルススブチリス属］、９５％、ｇｉ｜１０３９４７７８２７｜ＷＰ＿０６４８１６０１８．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［枯草菌］、９４％、ｇｉ｜１２０７６２７９７８｜ＷＰ＿０８７９９２６９３．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス］、９４％、ｇｉ｜７４５７８１４８２｜ＷＰ＿０３９０７５２０８．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス］、９２％、ｇｉ｜４９８０１８０７２｜ＷＰ＿０１０３３２２２８．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスハロトレランス］、９２％、ｇｉ｜５７０７５８３５８｜ＷＰ＿０２４１２３１６１．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルススブチリス属］、８９％、ｇｉ｜４８９４２０８１７｜ＷＰ＿００３３２６５５８．１
●複数種：ＡＴＰシンターゼイプシロン鎖［バチルス］、８７％、ｇｉ｜４８９２４２９７２｜ＷＰ＿００３１５１１７６．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスナカムライ］、８６％、ｇｉ｜１００４３４４９９４｜ＷＰ＿０６１５２２５３９．１
●複数種：ＡＴＰシンターゼＦ０Ｆ１サブユニットイプシロン［バチルス］、８６％、ｇｉ｜９２１９９５５７３｜ＷＰ＿０５３２８５３４４．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス］、８６％、ｇｉ｜７４０６７４８７８｜ＷＰ＿０３８４６０１６７．１
●複数種：ＡＴＰシンターゼイプシロン鎖［バチルス］、８６％、ｇｉ｜７２３５９７１６０｜ＷＰ＿０３３５７４３９５．１
●複数種：ＡＴＰシンターゼイプシロン鎖［バチルス］、８５％、ｇｉ｜５０３１１９２２６｜ＷＰ＿０１３３５３９０７．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスベレゼンシス］、８６％、ｇｉ｜１２０７６７６８７０｜ＷＰ＿０８８０３７２３８．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス］、９５％、ｇｉ｜４８９３１４５０１｜ＷＰ＿００３２２１８８２．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルススウェゼイイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｗｅｚｅｙｉ）］、８２％、ｇｉ｜１１４０９１０３７０｜ＷＰ＿０７６７５９２８７．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス］、８２％、ｇｉ｜６５１５９４１０９｜ＷＰ＿０２６５８９０８１．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス］、８２％、ｇｉ｜４８９２７８３３６｜ＷＰ＿００３１８６００４．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスソノレンシス］、８２％、ｇｉ｜４９３６８９３５２｜ＷＰ＿００６６３９４０６．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス］、８２％、ｇｉ｜５２１２８８９８６｜ＷＰ＿０２０４５３２５４．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス］、８２％、ｇｉ｜８０６４９７２１１｜ＷＰ＿０４６１３０３１６．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスグリシニフェルメンタンス］、８１％、ｇｉ｜８６０２４７７１５｜ＷＰ＿０４８３５５６５１．１
●ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルススブチリス  ＸＦ−１］、９５％、ｇｉ｜４４９０３００４９｜ＡＧＥ６５２８８．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスゴビエンシス］、７５％、ｇｉ｜９２６２６６３４９｜ＷＰ＿０５３６０４５３５．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［アノキシバチルスビタミニフィルス］、７３％、ｇｉ｜１４０８３９２３７２｜ＷＰ＿１１１６４４７４０．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス種Ｊ３７］、７３％、ｇｉ｜６５１５３１３８４｜ＷＰ＿０２６５６３１１６．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス］、７３％、ｇｉ｜７３６２２７４７２｜ＷＰ＿０３４３１８３２９．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスキアメネンシス］、７３％、ｇｉ｜４９５６３０３４７｜ＷＰ＿００８３５４９２６．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスファスチジオスス］、７２％、ｇｉ｜１０５４３５１０３９｜ＷＰ＿０６６２３０８８５．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスオヌベンシス］、７１％、ｇｉ｜１２７２１８７３２２｜ＷＰ＿０９９３６０９１１．１
●複数種：ＡＴＰシンターゼＦ０Ｆ１サブユニットイプシロン［バチルス］、７３％、ｇｉ｜９１５９７５８６９｜ＷＰ＿０５０９４４４３７．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス種ＭＢＧＬｉ７９］、８１％、ｇｉ｜１３３９８１０８９２｜ＡＵＺ４０７９０．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスプミルス］、７３％、ｇｉ｜１００２９４６０３４｜ＷＰ＿０６１４０９８５３．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス種ＹＮ−１］、７１％、ｇｉ｜１４９３４５０６１９｜ＷＰ＿１２１４４８４９９．１
●ＡＴＰシンターゼイプシロン鎖［バチルスプミルス］、７３％、ｇｉ｜７６３２７８７０６｜ＷＰ＿０４４１４０１４２．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス］、７２％、ｇｉ｜７３６６５２９８７｜ＷＰ＿０３４６６０２８２．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスオヌベンシス］、７０％、ｇｉ｜１２７２１７５３６７｜ＷＰ＿０９９３５４５７５．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス］、７２％、ｇｉ｜４９５６１８８１４｜ＷＰ＿００８３４３３９３．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスサフェンシス］、７２％、ｇｉ｜１２０７６１１９６１｜ＷＰ＿０８７９７７７５６．１
●複数種：ＡＴＰシンターゼイプシロン鎖［バチルス］、７２％、ｇｉ｜４８９３０７１５６｜ＷＰ＿００３２１４５９２．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスプミルス］、７２％、ｇｉ｜１２７４５５４３０８｜ＷＰ＿０９９６８２１８１．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスアウストラリマリス］、７２％、ｇｉ｜９８３５４７０５０｜ＷＰ＿０６０６９８６０５．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスインジクス］、７１％、ｇｉ｜６５７８６０８６２｜ＷＰ＿０２９５６６６０３．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスアルベアユエンシス］、７１％、ｇｉ｜７６５５４２６３６｜ＷＰ＿０４４７４９３５７．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス種ＮＭＴＤ１７］、７２％、ｇｉ｜１３６０７９５２４７｜ＷＰ＿１０６０７１３４２．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［アノキシシバチルス］、６７％、ｇｉ｜７６５５３４４０７｜ＷＰ＿０４４７４１５５５．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスストラトスフェリクス］、７１％、ｇｉ｜４９４７６２２１５｜ＷＰ＿００７４９７６２３．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスシネサロウメンシス］、７０％、ｇｉ｜１１４８９３０４５８｜ＷＰ＿０７７６１９９０３．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスウェイハイエンシス］、７１％、ｇｉ｜１１１９６５８５２７｜ＷＰ＿０７２５７８１８８．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスインジクス］、７１％、ｇｉ｜６５７０４０２８５｜ＷＰ＿０２９２８３３６５．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス種ＨＮＧ］、６９％、ｇｉ｜１４５２３９３６８１｜ＷＰ＿１１６３５２０１５．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス種ＨＭＳＣ７６Ｇ１１］、６９％、ｇｉ｜１０９３５３７８５３｜ＷＰ＿０７０８７７０８８．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス］、６８％、ｇｉ｜７３６７６１６０３｜ＷＰ＿０３４７６５１６８．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス］、６８％、ｇｉ｜６９２１６４２２０｜ＷＰ＿０３２０８６９１７．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス種ＵＭＢ０８９３］、６９％、ｇｉ｜１３２５６６３８００｜ＷＰ＿１０１５６７３４５．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス種ＭＫＵ００４］、６８％、ｇｉ｜１０３５７３０７３０｜ＷＰ＿０６４５６７８２１．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス］、６８％、ｇｉ｜７６４３７１６４５｜ＷＰ＿０４４３３９９８４．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスリトラリス］、７１％、ｇｉ｜１０５４５５９３０４｜ＷＰ＿０６６３２８６２７．１
●ＡＴＰシンターゼイプシロン鎖［バチルスプミルス］、７１％、ｇｉ｜１１２９１４０１６２｜ＯＬＰ６６７８４．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスチモネンシス］、６９％、ｇｉ｜４９８３６３０３５｜ＷＰ＿０１０６７７１９１．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［パラゲオバチルスサ−モグルコシダシウス］、６９％、ｇｉ｜１０３５７１２２１９｜ＷＰ＿０６４５５２７８３．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［ゲオバチルス］、６９％、ｇｉ｜４９６１５６１８５｜ＷＰ＿００８８８０６９２．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスアウイマリス］、６８％、ｇｉ｜１４３０９２７０３３｜ＷＰ＿１１３９６９２２９．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［アノキシバチルステピダマンス］、６７％、ｇｉ｜６５３１５９０４５｜ＷＰ＿０２７４０８０１７．１
●ＡＴＰシンターゼイプシロン鎖［パラゲオバチルストエビイ］、６９％、ｇｉ｜１００４９２０８３５｜ＫＹＤ２９８４３．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バシラス科］、６９％、ｇｉ｜１０１１８５９９２１｜ＷＰ＿０６２６７８１２５．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスアルカリテルリス］、７１％、ｇｉ｜１１５４１６９４５０｜ＷＰ＿０７８５４３４３５．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスカメリアエ］、７０％、ｇｉ｜１３１６７６９８６７｜ＷＰ＿１０１３５６０５１．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［ゲオバチルスゲノモスプ３］、７０％、ｇｉ｜５３０７８４７３７｜ＷＰ＿０２０９６１５０３．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス種ＳＪＳ］、６８％、ｇｉ｜７３７４２７３７１｜ＷＰ＿０３５４０８０６２．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスメタノリカス］、６８％、ｇｉ｜４８９４４１３２２｜ＷＰ＿００３３４６７９１．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスホリコシイ］、６８％、ｇｉ｜１０２５８２５４００｜ＷＰ＿０６３５５９２８６．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスサルスス］、６９％、ｇｉ｜１２２２８０８５６６｜ＷＰ＿０９０８５３３３０．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスアクイマリス］、６７％、ｇｉ｜１０３１４４６４４２｜ＷＰ＿０６４０９１９２７．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスヒュミ］、６７％、ｇｉ｜９５３３４７４７４｜ＷＰ＿０５７９９８２１６．１
●ＡＴＰシンターゼイプシロン鎖［ゲオバチルスステアロサーモフィルス］、６９％、ｇｉ｜１０１７２３１３０８｜ＫＺＥ９６５９５．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［ゲオバチルス］、７０％、ｇｉ｜１０１７２０４５２９｜ＷＰ＿０６３１６７１９８．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［ゲオバチルスリツアニクス］、７０％、ｇｉ｜１２２９３９４４５５｜ＷＰ＿０９４２３９３５４．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［ゲオバチルスサーモデニトリフィカンス］、６９％、ｇｉ｜１２９３３６９３２５｜ＷＰ＿１００６６０５６９．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスバタビエンシス］、６７％、ｇｉ｜４９４１４６４０６｜ＷＰ＿００７０８６１５２．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス種ＣＨＤ６ａ］、６８％、ｇｉ｜９８３５１２４４３｜ＷＰ＿０６０６６４６０９．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスホリコシイ］、６８％、ｇｉ｜１２０７６５８１６６｜ＷＰ＿０８８０１９７２９．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス種ＬＬ０１］、６８％、ｇｉ｜８４７２５５５３３｜ＷＰ＿０４７９７０２３６．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスソリ］、６８％、ｇｉ｜１０５３８２０１２２｜ＷＰ＿０６６０７２９５２．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［ゲオバチルス種４６Ｃ−ＩＩａ］、６９％、ｇｉ｜１１７３３５１５８２｜ＷＰ＿０８１２０７８６１．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスメタノリカス］、６９％、ｇｉ｜４８９４４６３４３｜ＷＰ＿００３３５１７６３．１
●複数種：Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［ゲオバチルス］、６８％、ｇｉ｜７６５５２０５７９｜ＷＰ＿０４４７３２８２６．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルス種ＦＪＡＴ−１４５７８］、６８％、ｇｉ｜６５４９４５８０４｜ＷＰ＿０２８３９５９６８．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［パラゲオバチルスサーマンタルクチクス］、６８％、ｇｉ｜１２２２９０６５５６｜ＷＰ＿０９０９４９５０１．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスマリスフラビ］、６８％、ｇｉ｜８５０２９５９３０｜ＷＰ＿０４８００４８７３．１
●Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットイプシロン［バチルスマリスフラビ］、６８％、ｇｉ｜８５０３３０６０２｜ＷＰ＿０４８０１４１８５．１
【００２５】
１つの実施形態では、アミノ酸リンカー（Ｘ２）はＸ１とＸ３の間に存在し、アミノ酸リンカー（Ｘ４）はＸ３とＸ５の間に存在する。任意の適切なアミノ酸リンカーを使用でき、詳細なガイダンスは次の例で提供される。様々な実施形態では、Ｘ２は、０〜２、１〜２、０、１、または２個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーである。様々なさらなる実施形態において、
●Ｘ２は、Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｔ、ＴＳ、ＩＤからなる群から選択されるアミノ酸リンカーであるか、またはＸ２は存在しない、
●Ｘ２は、Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｔ、ＴＳ、およびＩＤからなる群から選択されるアミノ酸リンカーであるか、または
●Ｘ２は、Ａ、Ｓ、Ｖ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸リンカーである。
【００２６】
他の実施形態では、Ｘ４は、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、１、２、３、４、または５個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーであるか、またはＸ４は存在しない。様々なさらなる実施形態において、
●Ｘ４は、ＡＴ、Ａ、ＳＡ、ＧＡ、ＦＦ、ＰＰＰＰ（配列番号２０）、ＦＬ、ＧＴＳＧ（配列番号２１）、Ｐ、Ｓ、ＡＮＥＦＭ（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸リンカーであるか、またはＸ４は存在しない、
●Ｘ４は、ＡＴ、Ａ、ＳＡ、ＧＡ、ＦＦ、ＦＬ、Ｐ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸リンカーであるか、または
●Ｘ４は、Ａ、ＦＦ、ＦＬ、およびＧＴＳＧ（配列番号２１）からなる群から選択されるアミノ酸リンカーである。
【００２７】
さらに特定の実施形態において、
●Ｘ２とＸ４は両方ともＡであり、
●Ｘ２はＳ、Ｘ４はＡであり、
●Ｘ２は存在せず、Ｘ４はＦＦであり、
●Ｘ２はＶ、Ｘ４はＦＬであり、
●Ｘ２はＴ、Ｘ４はＧＴＳＧ（配列番号２１）であり、または
●Ｘ２はＳ、Ｘ４はＳＡである。
【００２８】
別の実施形態では、リンカーを柔軟に維持するために、Ｘ２およびＸ４はプロリン残基を含まない。
【００２９】
さらなる実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列（以下の例で使用される名称を指す名前）の長さに沿って少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むか、または、以下の配列と同じであるが、以下に示されるリンカー（Ｘ２およびＸ４）（強調表示）は以下の例の表３に示される他のコンストラクトのリンカーと置き換えられるアミノ酸配列を含む。
配列番号７  ＧＯ−ＡＴｅａｍ−Ａ１
ｍＫＯｋ蛍光タンパク質（アミノ酸１〜２１８）、第１のアラニンリンカー（アミノ酸２１９）、ＡＴＰ結合タンパク質（アミノ酸２２０〜３５１）、第２のアラニンリンカー（アミノ酸３５２）、およびｃｐｍＥＧＦＰ蛍光タンパク質（アミノ酸３５３〜５９８）を含む融合タンパク質
【化４−１】
2021514603.tif 000009
【化４−２】
2021514603.tif 000010
【化４−３】
2021514603.tif 000011
【００３０】
第２の態様では、本開示は、例えば生細胞中のＡＴＰを検出および測定するアッセイのコントロールとして、本開示の第１の態様の活性融合タンパク質と一緒に使用できるコントロール融合タンパク質を提供する。コントロール融合タンパク質は、本開示の第１の態様の融合タンパク質と同じ一般式（Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５）を有する。第１の態様について開示されたＸ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５ドメインのすべての実施形態は、コントロール融合タンパク質に等しく適用可能である。Ｘ３ドメインは、ＡＴＰに結合しないコントロールタンパク質を含むことにより、コントロール融合タンパク質とは異なる。任意の適切なコントロールタンパク質を使用できる。１つの実施形態では、コントロールタンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも６５％、６７％、６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、下線付きおよび太字の残基はＫでなければならない。
【化５】
2021514603.tif 000012
【００３１】
この実施形態のコントロールタンパク質は、上記に開示されたＡＴＰ結合タンパク質と密接に関連しており、上記の必要なリジン残基を有する点で異なり、このことはＡＴＰ結合活性を無効にする。
【００３２】
１つの具体的な実施形態では、コントロール融合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも６５％、６７％、６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、下線付きおよび太字の残基はＫでなければならない。
【化６】
2021514603.tif 000013
【００３３】
この実施形態では、イタリック体で下線付きのリンカー残基は、実施例の表３に列挙されたものを含むがこれらに限定されない、任意の適切なリンカー残基に修飾することができる。
【００３４】
本出願全体で使用される場合、「タンパク質」という用語は、その最も広い意味で使用されて、サブユニットアミノ酸の配列を指す。本明細書に記載のポリペプチドは、化学合成または組換え発現させることができる。
【００３５】
当業者によって理解されるように、本開示の融合タンパク質は、記載された融合タンパク質には存在しないＮ−末端、Ｃ−末端、またはその両方に追加の残基を含むことがあり、これらの追加の残基は、参照ポリペプチドに対する本開示のポリペプチドの同一性の割合の決定には含まれない。そのような残基は、精製の目的に適したリガンド（Ｈｉｓタグなど）およびポリペプチドに機能性を追加する追加のペプチドドメインを含むがこれらに限定されない、意図する用途に適した任意の残基であってよい。
【００３６】
１つの実施形態では、参照融合タンパク質に対する変化は、保存的アミノ酸置換を含む。本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」とは、融合タンパク質またはドメイン機能または他の特徴を変更しないか、または実質的に変更しないアミノ酸または核酸置換を意味する。所定のアミノ酸は、同様の物理化学的特性をもつ残基で置き換えることができ、例えば、１つの脂肪族残基を別のものに置き換える（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａなどを互いに）、または、１つの極性残基を別のものに置き換える（ＬｙｓとＡｒｇ間、ＧｌｕとＡｓｐ間、またはＧｌｎとＡｓｎ間など）ことができる。他のそのような保存的置換、例えば類似の疎水性特性を有する領域全体の置換はよく知られている。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドは、所望の活性が保持されていることを確認するために、本明細書に記載のアッセイで試験することができる。
【００３７】
別の態様では、本開示は、本開示の任意の実施形態または実施形態の組み合わせの融合タンパク質またはコントロール融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドはＲＮＡまたはＤＮＡを含んでもよい。そのようなポリヌクレオチドは、ポリＡ配列、修飾コザック配列、およびエピトープタグをコードする配列、輸出シグナル、および分泌シグナル、核局在化シグナル、および血漿膜局在化シグナルを含むがこれらに限定されない、コードされたタンパク質の発現および／または精製を促進するのに有用な追加の配列を含んでよい。本明細書の教示に基づいて、どのポリヌクレオチドが本開示の融合タンパク質をコードするかは、当業者には明らかであろう。
【００３８】
別の態様では、本開示は、ポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーター配列に作用可能に連結された本開示の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを提供する。「組換え発現ベクター」は、融合タンパク質の発現をもたらすことができる任意のプロモーター配列にポリヌクレオチドを機能的に連結するベクターを含む。本開示の核酸配列に作用可能に連結された「プロモーター配列」は、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことができる核酸配列である。プロモーターは、ポリヌクレオチド発現を指示するように機能する限り、ポリヌクレオチドと隣接している必要はない。したがって、例えば、介在する非翻訳であるが転写された配列は、プロモーター配列とポリヌクレオチドの間に存在し得、プロモーター配列は依然としてコード配列に「作用可能に連結された」とみなされ得る。そのような発現ベクターは、プラスミドおよびウイルスベースの発現ベクターを含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意のタイプのものであり得る。プロモーターは、構成的（ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦを含むがこれらに限定されない様々なプロモーターのいずれかによって駆動される）でもよく、または誘導性（テトラサイクリン、エクジソン、ステロイド応答性を含むがこれらに限定されない多数の誘導性プロモーターのいずれかによって駆動される）でもよい。種々の実施形態において、発現ベクターは、プラスミド、ウイルスベースのベクター、または他の適切な発現ベクターを含むことができる。
【００３９】
さらなる態様において、本開示は、本明細書に開示される組換え発現ベクターを含む宿主細胞を提供し、宿主細胞は原核生物または真核生物のいずれでもよい。本開示の発現ベクターを組み込むために、細胞を一時的または安定的に操作することができる。本開示による融合タンパク質を生成する方法は、本開示の追加部分である。この方法は、（ａ）本開示のこの態様に従って、融合タンパク質の発現を促す条件下で宿主を培養するステップ、および（ｂ）場合により発現した融合タンパク質を回収するステップを含む。発現された融合タンパク質は、無細胞抽出物または細胞培養培地から回収することができる。
【００４０】
別の態様では、本開示は、
（ａ）本開示の任意の実施形態または実施形態の組み合わせの融合タンパク質、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および／または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む組換え宿主細胞と、
（ｂ）本開示の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのコントロール融合タンパク質、コントロール融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、コントロール融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および／またはコントロール融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む組換え宿主細胞と、を含むキットを提供する。
【００４１】
この態様のキットは、例えば、以下の例で詳述するように、生細胞のＡＴＰを検出および測定するために使用できる。
【００４２】
ＡＴＰ結合融合タンパク質
本開示の態様によるＡＴＰ結合融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供され、ＡＴＰ結合融合タンパク質は、受容体励起波長およびＦＲＥＴ発光波長を有するＦＲＥＴ受容体である第１のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第１のフルオロフォア、Ｎ−末端およびＣ−末端を有するＡＴＰ結合タンパク質、ならびに供与体励起波長および供与体発光波長を有するＦＲＥＴ供与体である第２のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第２のフロオロフォアを含み、第１のリンカーは第１のフルオロフォアのＣ−末端とＡＴＰ結合タンパク質のＮ−末端との間に配置され、第２のリンカーはＡＴＰ結合タンパク質のＣ−末端と第２のフルオロフォアのＮ−末端との間に配置され、第１のフルオロフォア、ＡＴＰ結合タンパク質、および第２のフルオロフォアは、ＡＴＰ結合タンパク質によるＡＴＰ結合が第１のフルオロフォアと第２のフルオロフォアとの相互作用を引き起こして、供与体励起波長を有する光に曝された時にＦＲＥＴ発光シグナルを生成するように作用可能に連結される。
【００４３】
本開示の態様によれば、ＡＴＰ結合融合タンパク質の第１のリンカーはアラニン残基であり、第２のリンカーはアラニン残基である。
【００４４】
本開示の態様によれば、ＡＴＰ結合融合タンパク質の第１のリンカーはセリン残基であり、第２のリンカーはアラニン残基である。
【００４５】
本開示の態様によれば、ＡＴＰ結合融合タンパク質の第１のリンカーは無効であり、第２のリンカーはフェニルアラニン−フェニルアラニンジペプチド残基である。
【００４６】
本開示の態様によれば、ＡＴＰ結合融合タンパク質の第１のリンカーはバリン残基であり、第２のリンカーはフェニルアラニン−ロイシンジペプチド残基である。
【００４７】
本開示の態様によれば、ＡＴＰ結合融合タンパク質の第１のリンカーはスレオニン残基であり、第２のリンカーはグリシン−スレオニン−セリン−グリシンペプチド残基である。
【００４８】
本開示の態様によれば、ＡＴＰ結合融合タンパク質の第１のリンカーはセリン残基であり、第２のリンカーはセリン−アラニンジペプチド残基である。
【００４９】
本開示の態様によれば、ＡＴＰ結合融合タンパク質の第２のリンカーはアスパラギン残基ではない、および／または含まない。
【００５０】
融合タンパク質は、本開示の態様に従って提供され、融合タンパク質は、受容体励起波長およびＦＲＥＴ発光波長を有するＦＲＥＴ受容体である第１のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第１のフルオロフォア、Ｎ−末端およびＣ−末端を有するＡＴＰ結合タンパク質、ならびに供与体励起波長および供与体発光波長を有するＦＲＥＴ供与体である第２のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第２のフルオロフォアを含み、第１のリンカーは第１のフルオロフォアのＣ−末端とＡＴＰ結合タンパク質のＮ−末端との間に配置され、第２のリンカーはＡＴＰ結合タンパク質のＣ−末端と第２のフルオロフォアのＮ−末端との間に配置され、第１のフルオロフォア、ＡＴＰ結合タンパク質、および第２のフルオロフォアは、ＡＴＰ結合タンパク質によるＡＴＰ結合が第１のフルオロフォアと第２のフルオロフォアとの相互作用を引き起こして、供与体励起波長を有する光に曝された時にＦＲＥＴ発光シグナルを生成するように作用可能に連結される。
【００５１】
本開示の態様によれば、融合タンパク質に含まれるＡＴＰ結合タンパク質は、配列番号１４によりコードされる配列番号５のＡＴＰ結合タンパク質である。
【００５２】
本開示の態様によれば、融合タンパク質に含まれるＡＴＰ結合タンパク質は、ＡＴＰを結合する配列番号５の変異体であり、配列番号５と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の置換変異、追加または欠失を有する。
【００５３】
本開示の態様によれば、融合タンパク質に含まれるＡＴＰ結合タンパク質は、ＡＴＰを結合する配列番号５の変異体であり、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で配列番号１４に結合する配列番号１４の変異体によってコードされる。
【００５４】
コントロール融合タンパク質
コントロール融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本開示の態様に従って提供され、コントロール融合タンパク質は、受容体励起波長および受容体発光波長を有するＦＲＥＴ受容体である第１のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第１のフルオロフォア、Ｎ−末端およびＣ−末端を有するコントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質であって、ＡＴＰを結合しないように変異されているコントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質、ならびに供与体励起波長および供与体発光波長を有するＦＲＥＴ供与体である第２のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第２のフルオロフォアを含み、第１のリンカーは第１のフルオロフォアのＣ−末端とコントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質のＮ−末端との間に配置され、第２のリンカーはコントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質のＣ−末端と第２のフルオロフォアのＮ−末端との間に配置され、コントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質はＡＴＰを結合しないため、第１のフルオロフォア、コントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質、および第２のフルオロフォアは、コントロールとして機能するように作用可能に連結され、それにより、供与体励起波長を有する光に曝された時にＦＲＥＴ発光シグナルを生成するための第１のフルオロフォアと第２のフルオロフォアとの相互作用が、ＡＴＰの存在とは無関係の非特異的バッググランドシグナルを表す。
【００５５】
本開示の態様によれば、コントロール融合タンパク質の第１のリンカーはアラニン残基であり、第２のリンカーはアラニン残基である。
【００５６】
本開示の態様によれば、コントロール融合タンパク質の第１のリンカーはセリン残基であり、第２のリンカーはアラニン残基である。
【００５７】
本開示の態様によれば、コントロール融合タンパク質の第１のリンカーは無効であり、第２のリンカーはフェニルアラニン−フェニルアラニンジペプチド残基である。
【００５８】
本開示の態様によれば、コントロール融合タンパク質の第１のリンカーはバリン残基であり、第２のリンカーはフェニルアラニン−ロイシンジペプチド残基である。
【００５９】
本開示の態様によれば、コントロール融合タンパク質の第１のリンカーはスレオニン残基であり、第２のリンカーはグリシン−スレオニン−セリン−グリシンペプチド残基である。
【００６０】
本開示の態様によれば、コントロール融合タンパク質の第１のリンカーはセリン残基であり、第２のリンカーはセリン−アラニンジペプチド残基である。
【００６１】
本開示の態様によれば、コントロール融合タンパク質の第２のリンカーはアスパラギン残基ではない、および／または含まない。
【００６２】
コントロール融合タンパク質であって、受容体励起波長およびＦＲＥＴ発光波長を有するＦＲＥＴ受容体である第１のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第１のフルオロフォア、Ｎ−末端およびＣ−末端を有するコントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質、ならびに供与体励起波長および供与体発光波長を有するＦＲＥＴ供与体である第２のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第２のフルオロフォアを含み、第１のリンカーは第１のフルオロフォアのＣ−末端とコントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質のＮ−末端との間に配置され、第２のリンカーはコントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質のＣ−末端と第２のフルオロフォアのＮ−末端との間に配置され、コントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質はＡＴＰを結合しないため、第１のフルオロフォア、コントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質、および第２のフルオロフォアは、コントロールとして機能するように作用可能に連結され、それにより、供与体励起波長を有する光に曝された時にＦＲＥＴ発光を生成するための第１のフルオロフォアと第２のフルオロフォアとの相互作用が、ＡＴＰの存在とは無関係の非特異的バッググランドシグナルを表す、コントロール融合タンパク質。
【００６３】
本開示の態様によれば、コントロール融合タンパク質を含むＡＴＰ結合タンパク質は、配列番号１６によりコードされる配列番号１５のＡＴＰ結合タンパク質である。
【００６４】
本開示の態様によれば、コントロール融合タンパク質に含まれる、ＡＴＰを結合しないコントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質は、ＡＴＰを結合しない配列番号１５の変異体であり、配列番号１５と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の置換変異、追加または欠失を有する。
【００６５】
本開示の態様によれば、融合タンパク質に含まれるコントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質は、ＡＴＰを結合しない配列番号１５の変異体であり、高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で配列番号１６に結合する配列番号１６の変異体によってコードされる。
【００６６】
本開示の態様によれば、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、作用可能に連結されたプロモーターを含む。本開示の態様によれば、本明細書に記載のポリヌクレオチドは発現ベクターに含まれる。本開示の態様によれば、本明細書に記載のポリヌクレオチドおよび／または発現ベクターは、ポリヌクレオチドおよびそのコードされた融合タンパク質を発現する安定な形質転換細胞株などの宿主細胞に存在するが、これに限定されない。
【００６７】
本開示の態様によれば、供与体フルオロフォアはｃｐｍＥＧＦＰである。本開示の態様によれば、受容体フルオロフォアはｍＫＯｋである。
【００６８】
ご承知のように、本開示の実施態様は本明細書に開示されるが、ＦＲＥＴ供与体フルオロフォアはＡＴＰ結合タンパク質またはコントロール変異体結合タンパク質のＣ−末端に（ＡＴＰ結合タンパク質またはコントロール変異体結合タンパク質のＣ−末端と、ＦＲＥＴ供与体フルオロフォアとの間に配置されたリンカーによって）配置され、ＦＲＥＴ受容体フルオロフォアはＡＴＰ結合タンパク質またはコントロール変異体結合タンパク質のＮ−末端に（ＡＴＰ結合タンパク質またはコントロール変異体結合タンパク質のＮ−末端と、ＦＲＥＴ受容体フルオロフォアとの間に配置されたリンカーによって）配置され、フルオロフォアの相対的位置は、任意に切り替えられ、それにより、本明細書に記載の融合タンパク質は、ＦＲＥＴ供与体フルオロフォアをＡＴＰ結合タンパク質またはコントロール変異体結合タンパク質のＮ−末端に（ＡＴＰ結合タンパク質またはコントロール変異体結合タンパク質のＮ−末端と、ＦＲＥＴ供与体フルオロフォアとの間に配置されたリンカーによって）配置させ、かつ、ＦＲＥＴ受容体フルオロフォアがＡＴＰ結合タンパク質またはコントロール変異体結合タンパク質のＣ−末端に（ＡＴＰ結合タンパク質またはコントロール変異体結合タンパク質のＣ−末端と、ＦＲＥＴ受容体フルオロフォアとの間に配置されたリンカーによって）配置される。
【００６９】
フルオロフォア
ＦＲＥＴ供与体／受容体ペアの例には、一般に、水色蛍光タンパク質／黄色蛍光タンパク質（ＣＦＰ−ＹＦＰ）ＦＲＥＴペア、緑色蛍光タンパク質／赤色蛍光タンパク質（ＧＦＰ−ＲＦＰ）ＦＲＥＴペア、およびその他の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００７０】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される融合タンパク質を使用して、対象細胞におけるＡＴＰのレベルを決定する方法を提供する。融合タンパク質は、融合タンパク質中のＡＴＰ結合タンパク質によるＡＴＰの結合がＦＲＥＴ受容体ポリペプチドとＦＲＥＴ供与体ポリペプチドとの相互作用を引き起こし、検出可能な光の発光をもたらすことでＡＴＰを検出する。発光された光の検出は、任意の適切なアッセイまたは画像化形式で実行できる。１つの実施形態では、そのような方法は、
（ａ）本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせの融合タンパク質を１つ以上の第１の細胞で発現させ、
（ｉ）１つ以上の第１の細胞を、ＦＲＥＴ供与体ポリペプチド励起波長を有する光に曝露したときに、１つ以上の第１の細胞から発光されたＦＲＥＴ受容体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成される蛍光シグナルを検出することによって生成される第１の蛍光画像；および／または
（ｉｉ）１つ以上の第１の細胞を、ＦＲＥＴ受容体ポリペプチド励起波長を有する光に曝露したときに、１つ以上の第１の細胞から発光されたＦＲＥＴ受容体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成される蛍光シグナルを検出することによって生成される第２の蛍光画像；および／または
（ｉｉｉ）１つ以上の第１の細胞を、ＦＲＥＴ供与体ポリペプチド励起波長を有する光に曝露したときに、１つ以上の第１の細胞から発光されたＦＲＥＴ供与体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成される蛍光シグナルを検出することによって生成される第３の蛍光画像、からなる群から選択される１つ以上の画像を生成すること、
（ｂ）第１の蛍光画像、第２の蛍光画像、および／または第３の蛍光画像における蛍光シグナルの出力を比較することにより、１つ以上の第１の細胞におけるＦＲＥＴ比を決定すること、を含み、
１つ以上の第１の細胞におけるＡＴＰのレベルは、決定されたＦＲＥＴ比に比例する。
【００７１】
この実施形態では、蛍光シグナルの出力を「比較する」とは、ある画像の蛍光シグナルの出力を別の画像の蛍光シグナルの出力で除算することを意味する。例えば：
●第１の蛍光画像の蛍光シグナルの出力は、第２の蛍光画像の蛍光シグナルの出力で除算できる。
●第１の蛍光画像の蛍光シグナルの出力は、第３の蛍光画像の蛍光シグナルの出力で除算できる。
●第２の蛍光画像の蛍光シグナルの出力は、第１の蛍光画像の蛍光シグナルの出力で除算できる。
●第２の蛍光画像の蛍光シグナルの出力は、第３の蛍光画像の蛍光シグナルの出力で除算できる。
●第３の蛍光画像の蛍光シグナルの出力は、第１の蛍光画像の蛍光シグナルの出力で除算できる。または
●第３の蛍光画像の蛍光シグナルの出力は、第２の蛍光画像の蛍光シグナルの出力で除算できる。
【００７２】
蛍光シグナルの「出力」は、画像全体で、セルごとに、ピクセルごとに、または任意の代替強度測定を使用することを含むが、これらに限定されない、任意の適切な基準で決定できる。
【００７３】
別の実施形態では、本方法は、本開示の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのコントロール融合タンパク質を１つ以上の第１の細胞で発現させ、１つ以上の第１の細胞から発光された受容体発光波長を有する光によって生成されるコントロールシグナルを検出することをさらに含む。コントロールシグナルを使用して、決定されたＦＲＥＴ比を修正するための任意の適切な方法が使用されてもよい。１つの実施形態では、コントロールシグナルを検出することは、
（ｃ）本明細書に開示される任意の実施形態または実施形態の組み合わせのコントロール融合タンパク質を１つ以上のコントロール細胞（第１の細胞または第２の細胞など）で発現させ、
（ｉ）１つ以上のコントロール細胞を、ＦＲＥＴ供与体ポリペプチド励起波長を有する光に曝露したときに、１つ以上のコントロール細胞から発光されたＦＲＥＴ受容体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成される蛍光シグナルを検出することによって生成される第４の蛍光画像、および／または
（ｉｉ）１つ以上のコントロール細胞を、ＦＲＥＴ受容体ポリペプチド励起波長を有する光に曝露したときに、１つ以上のコントロール細胞から発光されたＦＲＥＴ受容体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成される蛍光シグナルを検出することによって生成される第５の蛍光画像、および／または
（ｉｉｉ）１つ以上のコントロール細胞を、ＦＲＥＴ供与体ポリペプチド励起波長を有する光に曝露したときに、１つ以上のコントロール細胞から発光されたＦＲＥＴ供与体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成される蛍光シグナルを検出することによって生成される第６の蛍光画像、からなる群から選択される１つ以上の画像を生成することと、
（ｄ）第４の蛍光画像、第５の蛍光画像、および／または第６の蛍光画像の蛍光シグナルの出力を比較することにより、１つ以上のコントロール細胞におけるコントロール融合ＦＲＥＴ比を決定することと、を含み、
コントロール融合ＦＲＥＴ比の変化は、ＡＴＰ結合とは無関係の実験条件の結果であると決定され、決定されたＦＲＥＴ比は、コントロール融合ＦＲＥＴ比の変化に基づいて修正される。
【００７４】
１つ以上の細胞は、ＡＴＰレベルを決定する対象となる任意の細胞または細胞集団であり得る。１つの実施形態では、１つ以上の第１の細胞はインキュベーター内で培養される。別の実施形態では、インキュベーターから１つ以上の第１の細胞を取り出すことなく、すべての画像化ステップが実行される。この実施形態では、細胞はインキュベーター内の適切な細胞培養培地で培養され、インキュベーターは、細胞と試験物質との接触によるＡＴＰの変化などのＡＴＰを検出するためのアッセイの観察および／または記録中にアッセイされる細胞をインキュベーターから取り出す必要がないように構成される。
【００７５】
アッセイは、例えば、対象細胞のＡＴＰレベルに対する１つ以上の試験化合物の効果を試験するために使用できる。したがって、１つの実施形態では、本方法は、１つ以上の第１の細胞を１つ以上の試験物質と接触させ、１つ以上の第１の細胞におけるＡＴＰの存在に対する試験物質の効果を決定することをさらに含む。１つ以上の第１の細胞内のＡＴＰの存在に対する１つ以上の試験物質の効果は、目的の任意の期間にわたって決定することができ、１分〜３ヶ月の範囲の期間にわたって連続的にまたは断続的に決定することを含むがこれに限定されない。
【００７６】
細胞内ＡＴＰの生細胞分析のための代謝システムのＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｓ３生細胞解析
ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｓ３ハードウェアは、本開示の任意の方法に使用することができ、２つの構成要素、１）ガントリおよび２）コントローラで構成されている。ガントリは、生細胞培養の自動画像取得を可能にする顕微鏡、カメラ、および消耗品トレイを収容し、標準的な組織培養インキュベーター内に設置される。ＡＴＰアプリケーションでは、顕微鏡システムには、所望のスペクトルの蛍光画像を収集するように調整されたフィルターモジュールが含まれる。コントローラには、画像ストレージ、データ処理、データベースストレージ、ファイルシステム、自動画像処理、グラフ作成、およびグラフィカルユーザーインターフェイス（ＧＵＩ）を介したクライアントコンピューターからのネットワーク経由の相互作用を可能にするプロセッサー、メモリ、およびデータストレージドライブが含まれる。コントローラ上のソフトウェアは、１）サーバーとの対話、２）機器の制御という２つの目的に役立つ。
【００７７】
ガントリはインキュベーター内に設置され、顕微鏡とカメラを収容する。コントローラは顕微鏡システムを制御し、サーバーとして機能する。コントローラは、イーサネットポートなどの通信ポートに接続されるが、これに限定されない。グラフィカルユーザーインターフェイス（ＧＵＩ）がコンピューターに読み込まれ、コントローラー（すなわち、サーバー）と対話して、顕微鏡システムを制御し、データをやり取りする。本開示の態様によれば、すべての自動画像処理はコントローラ上で完了する。
【００７８】
自動画像キャプチャ
Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｓ３顕微鏡は、限定しないが、９６ウェルプレートなどの細胞培養容器のユーザー定義位置へ移動し、１０ｘ対物レンズを使用する７００ｍｓなどの所望の顕微鏡対物レンズを用いて、適切なＬＥＤをオンにし、所望の露光時に画像を取り込む。
【００７９】
以下のデータは、オブジェクト、例えば、細胞、ＡＴＰの存在および／またはレベル、および／または１つ以上の追加のメトリックを単独もしくは組み合わせたものを画像化したものから得られ、各オブジェクト、各ウェルまたはウェルの各セットについて計算され、データベースに保存され、そして、グラフィカルユーザーインターフェイスを介したクライアントコンピューターでのデータ取得の直後にユーザーに表示される。
【００８０】
通常、ウェルは２時間ごとにスキャンされるが、スキャンの頻度は多かれ少なかれ任意である。各スキャンに続いて、それらの時点でメトリックが計算され、例えばデータベースに保存される。例えば、３日間の実験の過程で、各メトリックについて３６の時点が収集され、時系列に連結され、実験の全時間枠の過程、つまり分、時間、日、週、月でグラフ化することができる。
【００８１】
本明細書で説明するように、本開示のシステムおよび方法により、ユーザーは、自動化された適度な処理方法で、長期間にわたってＡＴＰの存在および／またはレベルの変化を監視することができる。対照的に、以前の方法は、１）エンドポイントメソッド（様々な測定パラメータの１つまたは限られた読み取りのみを取得できる）、２）非常に混乱させるメソッド、３）分析／視覚化のためにインキュベーターから細胞を移動する必要がある、４）細胞数に依存する、５）ＡＴＰ産生の間接測定、および／または６）低い処理量（手動で、一度に１つのウェル）である。
【００８２】
本開示の組成物および方法の実施形態は、以下の実施例に示される。これらの例は、例示の目的で提供されており、特許請求されている組成物および方法の範囲に対する制限とはみなされない。
【００８３】
実施例１
リンカースクリーニング
リンカー領域の最適化のために、約１４，０００個の多様な固有の変異体を有するライブラリーがスクリーニングされた。簡単に言えば、特定の変異体が発現している細菌細胞でスクリーニングが完了した。光学的手法を使用して、１５，０００個を超える個々のコロニーの輝度とＦＲＥＴ比を評価した。これらの１５，０００個以上のコロニーのうち、ＡＴＰが結合した状態と結合していない状態の両方で測定できるように、タンパク質溶解物を使用したさらなる評価のために４００個が選択された。１２個の潜在的なコロニーが遺伝子配列決定のために選択され、哺乳類発現ベクターにクローン化され、一過性形質転換実験に使用された。これらのコンストラクトを発現している細胞は、細胞内ＡＴＰの量を減少させることで知られている薬物で処理された。シグナルウィンドウは、薬物処理細胞のＦＲＥＴ比を、処理２時間後のビヒクル処理細胞のＦＲＥＴ比から差し引くことにより計算された。結果を図１に示す。エラーバーはＳＥＭ、ｎ＝３である。Ａ１とＧＯ−ＡＴｅａｍ１の両側のＰ値は０．００８４である（対応のないｔ検定）。
【００８４】
試験したリンカー配列を以下の表３に示す。
【表２】
2021514603.tif 000014
【００８５】
コンストラクトＡ１およびＧｏ−ＡＴｅａｍ１を安定的に発現する細胞株を生成した。すなわち、細胞をレンチウイルス形質導入により感染させ、抗生物質選択マーカーを使用して選択し、安定した株を生成した。細胞を２．５μＭスタウロスポリンで処理してＡＴＰを増加させ、４０ｍＭ  ２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）と４ｍＭシアン化カリウム（ＫＣＮ）を組み合わせてＡＴＰを枯渇させた。センサーＡ１を発現する細胞のシグナルウィンドウは、Ｇｏ−ＡＴｅａｍ１を発現する細胞株のシグナルウィンドウの約２倍であった（図２Ａ−Ｂ）。
【００８６】
精製タンパク質を１０ｍＭ  ＡＴＰの有無でインキュベートし、その励起スペクトルを収集した（図３Ａおよび図３Ｂ）。ＡＴＰ処理タンパク質と未処理タンパク質のスペクトルの違いは、シグナルウィンドウを示す。センサーＡ１（ＧＯ−ＡＴｅａｍ−Ａ１）（図３Ａ）のパフォーマンスは、ＧＯ−ＡＴｅａｍ１センサー（図３Ｂ）のパフォーマンスと比較した場合、シグナルウィンドウの２倍超えの増加を示す（ＡＴＰ結合（実線）とＡＴＰ非結合状態（破線）の比較）。
【００８７】
実施例２
グルコース／ガラクトーススイッチモデルを使用して試験物質を非毒性、細胞傷害性、または細胞毒性として分類する生細胞イメージングアプローチを、生細胞のＡＴＰをアッセイする本開示の態様による方法および組成物を使用して評価した。成長培地中のグルコースをガラクトースに置き換えると、解糖を介して細胞がＡＴＰを生成する能力がブロックされ、ミトコンドリアの酸化的リン酸化に依存してＡＴＰを生成し、ミトコンドリア駆動毒性に対する感受性を高める（ＬＤ  Ｍａｒｒｏｑｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ  ９７（２）、５３９−５４７（２００７））。細胞のＡＴＰレベルは、試験物質処理後２４時間まで測定された。非毒性試験物質はＡＴＰにほとんど変化をもたらさず、細胞障害性試験物質はグルコースとガラクトースの両方の条件でＡＴＰの減少をもたらし、細胞毒性試験物質はガラクトース条件下で効力において左方向へのシフトを示した。ＡＴＰの減少は数分で観察でき、一時的な減少に続く回復は、以下でさらに詳細に説明するように、本開示の態様による組成物および方法を使用する生細胞イメージングアプローチを使用した動態データの感度および値を強調する。
【００８８】
ＡＴＰセンサー発現細胞株の生成
ｃｙｔｏＡＴＰ（ＡＴＰ結合）およびコントロール（変異ＡＴＰ結合ドメイン）センサーを安定して発現する細胞株は、レンチウイルス形質導入によって生成された。バイシストロン性発現カセットを含む第３世代レンチウイルス系は、センサーを発現させるために使用した。具体的には、ＥＦ−１アルファプロモーターを使用して、介在ＩＲＥＳ配列を使用して、センサーとピューロマイシン選択マーカーの発現を促進した。レンチウイルス感染の前日に、６ウェルプレートに細胞を５０，０００個／ウェルで播種した。８μｇ／ｍＬポリブレンの存在下で、細胞をｃｙｔｏＡＴＰまたはコントロールレンチウイルスに曝露した。２４時間後、培地をポリブレンフリー培地に交換した。細胞を１回継代した後、ピューロマイシン選択を行って、ｃｙｔｏＡＴＰまたはコントロールセンサーを発現する安定した均質な細胞集団を生成した。
【００８９】
細胞培養
細胞はＡＴＣＣ（登録商標）（ＣＲＬ−１６５８（商標））から購入し、３７℃の加湿５％ＣＯ２雰囲気で維持した。細胞は、２５ｍＭのグルコース、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０％ＦＢＳ、１％ＧｌｕｔａＭａｘ、および１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したグルコース（Ｇｉｂｃｏ）を含まないＤＭＥＭで培養した。グルコースを１０ｍＭガラクトースに置き換えた以外は、上記のようにガラクトース培地を調製した。ガラクトース適応のために、細胞をグルコース含有ＤＭＥＭに分割し、継代後２日目にガラクトース培地に切り替え、実験を開始する前にガラクトース培地でさらに２回継代した。
【００９０】
ＡＴＰアッセイ
ＡＴＰの測定は、特殊なＦＲＥＴベースのフィルターセットとデータ収集モジュールを備えたＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｓ３によって実行された。ｃｙｔｏＡＴＰセンサーは、ＡＴＰ結合ドメインで接続されたＦＲＥＴ供与体（ｃｐｍＥＧＦＰ）とＦＲＥＴ受容体（ｍＫＯｋ）で構成される遺伝的にコードされたインジケーターである。ＦＲＥＴの増加は、ＡＴＰ結合時に誘導される。コントロールセンサーには変異ＡＴＰ結合ドメインが含まれており、正規化にゼロポイントを提供し、かつＦＲＥＴシグナルの読み取りに影響するあらゆるアーティファクトを監視および修正するために使用される。センサーの測定は、二重励起比イメージングを使用して実行された。具体例では、供与体フルオロフォアｃｐｍＥＧＦＰの励起（４７５〜４９５ｎｍ、ＦＲＥＴの測定）または受容体フルオロフォアｍＫＯｋの直接励起（５２４〜５４６ｎｍ、総タンパク質の測定）の後に、受容体フルオロフォアｍＫＯｋの蛍光発光（５６７〜５８９ｎｍ）が収集される。細胞分析マスクは、ｍＫＯｋ直接励起から収集された蛍光画像の閾値処理によって生成される。このマスクは、ＦＲＥＴチャネルで収集された相補的な画像にも適用される。相対ＡＴＰレベルは、ｃｐｍＥＧＦＰ励起で収集された画像から測定された合計積分強度を、ｍＫＯｋ励起で収集された画像から測定された合計積分強度で除算することにより計算されるｃｐｍＥＧＦＰ／ｍＫＯｋ励起比として報告される。
【００９１】
濃度反応曲線を生成するために、各処理についてデータを修正し、次の式を使用して、所与の時点でのビヒクルコントロールに正規化した。
【数１】
2021514603.tif 000015
【００９２】
図４Ａ：標準培地で増殖した細胞で、それぞれ２ＤＧとＫＣＮによる解糖とＯＸＰＨＯＳの同時阻害によるＡＴＰの枯渇。データは、ＡＴＰ枯渇の時間経過と２ＤＧとＫＣＮの同時処理の濃度依存性を示す。図４Ｂおよび図４Ｃは、グルコースまたはガラクトース培地で増殖した細胞上の細胞傷害性化合物（クロルプロマジン、図４Ｂ）と細胞毒性化合物（ロテノン、図４Ｃ）との比較を示す。最初の２つのパネルは、示されているようにグルコースまたはガラクトースで増殖した細胞における２４時間の時間経過にわたる各化合物の効果を示す。３番目のパネルは、２４時間の時点での各化合物の濃度反応曲線を示す。細胞傷害性化合物は、両方の培地条件下で同様の効果を示すが、細胞毒性化合物は、ガラクトースで増殖した細胞でより多くのＡＴＰ枯渇を誘発する。
【００９３】
実施例３
材料および方法
遺伝的にコードされた蛍光ＡＴＰセンサーまたはコントロール（非ＡＴＰ結合）センサーを安定して発現する癌細胞株が生成された。細胞を、実験前に１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩに適応させて、グルタミナーゼ−１（ＧＬＳ１）阻害剤ＣＢ−８３９の効果を評価する研究を除き、細胞株は、推奨培地条件で培養した。特殊なフィルターセットとデータ収集モジュールを備えたＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｓ３を使用して、ＡＴＰレベルを監視および分析した。細胞のＡＴＰレベルは、化合物処理後数時間から数日間にわたって測定した。
【００９４】
データの概要
次に、生細胞イメージングアプローチを使用して、主に代謝の脆弱性を標的とする化合物に焦点を合わせて、腫瘍細胞株のＡＴＰレベルに対する癌治療の効果を評価した。たとえば、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）細胞株は、グルタミンを、ミトコンドリア代謝を刺激するために利用する第１のステップに触媒作用を及ぼすＧＬＳ１の活性に、受容体陽性の対応物よりも依存することが示されてきた。生細胞分析アプローチを使用すると、ＴＮＢＣ細胞株のＣＢ−８３９によるグルタミン欠乏またはＧＬＳ１の阻害時にＡＴＰの急速な低下が観察された。ＡＴＰレベルは、３日間の時間経過の間、ビヒクル処理細胞のＡＴＰレベルを下回ったままであった。対照的に、受容体陽性細胞株の応答は、４８時間以内にＡＴＰの変化がないから、より緩やかに減少し、完全に回復するまでの範囲であった。位相コンフルエンスの定量化により、ＡＴＰの持続的な減少は、ＡＴＰレベルの回復が観察された条件と比較して、抗増殖効果の強化と関連していることが確認された。間質細胞と共培養された腫瘍細胞の経時的な代謝摂動を測定するＡＴＰセンサーの能力を実証するさらなるデータが得られた。ＣＣＤ−１０６８Ｓｋ線維芽細胞の単層上で培養されたＴＮＢＣは、ＡＴＰレベルへの影響の減少によって評価したとき、ＣＢ−８３９処理に対する耐性を示した（図５Ａ）。対照的に、ＣＢ−８３９処理後にＡＴＰレベルの一時的な低下を示した受容体陽性の乳癌株の結果は、ＣＣＤ−１０６８Ｓｋ線維芽細胞の存在による影響を受けなかった（図５Ｂ）。
【００９５】
実施例４
レンチウイルス形質導入を使用して、Ｇｏ−ＡＴｅａｍＡ１を発現するプライマリおよびｉＰＳＣ由来のニューロンを作製した。発現はシナプシンプロモーターによって駆動され、レンチウイルスが神経細胞と星状細胞の共培養に送達されたとき、ニューロンに制限された。２ＤＧとＫＣＮを組み合わせて処理したニューロンは、ＦＲＥＴ比の低下によって示されるように、ＡＴＰの濃度依存的な枯渇で応答した。応答は、他の哺乳類細胞（例、癌細胞株、図４Ａ）で２ＤＧとＫＣＮを組み合わせて処理した後に観察される応答に匹敵した。
配列
配列番号５−ＡＴＰ結合タンパク質
ＭＫＴＶＫＶＮＩＴＴＰＤＧＰＶＹＤＡＤＩＥＭＶＳＶＲＡＥＳＧＤＬＧＩＬＰＧＨＩＰＴＫＡＰＬＫＩＧＡＶＲＬＫＫＤＧＱＴＥＭＶＡＶＳＧＧＴＶＥＶＲＰＤＨＶＴＩＮＡＱＡＡＥＴＡＥＧＩＤＫＥＲＡＥＡＡＲＱＲＡＱＥＲＬＮＳＱＳＤＤＴＤＩＲＲＡＥＬＡＬＱＲＡＬＮＲＬＤＶＡＧＫ
配列番号１４−配列番号１のＡＴＰ結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列
ＡＴＧＡＡＡＡＣＴＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＴＡＴＡＡＣＡＡＣＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＣＣＡＧＴＣＴＡＣＧＡＣＧＣＴＧＡＴＡＴＣＧＡＧＡＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＡＧＴＧＧＴＧＡＴＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＣＣＣＣＧＧＴＣＡＣＡＴＴＣＣＣＡＣＡＡＡＧＧＣＣＣＣＡＣＴＧＡＡＧＡＴＣＧＧＡＧＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＧＡＣＧＧＣＣＡＡＡＣＣＧＡＧＡＴＧＧＴＣＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧＧＣＧＧＣＡＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＧＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＣＧＴＴＡＣＣＡＴＴＡＡＴＧＣＴＣＡＡＧＣＣＧＣＴＧＡＡＡＣＡＧＣＣＧＡＡＧＧＡＡＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＧＣＡＡＧＡＣＡＧＡＧＧＧＣＣＣＡＧＧＡＧＣＧＧＣＴＧＡＡＣＴＣＴＣＡＡＴＣＣＧＡＴＧＡＣＡＣＣＧＡＴＡＴＴＣＧＣＣＧＧＧＣＣＧＡＧＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＡＧＡＧＧＧＣＣＣＴＧＡＡＣＡＧＡＣＴＧＧＡＣＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧ
配列番号１５−ＡＴＰを結合しないコントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質
ＭＫＴＶＫＶＮＩＴＴＰＤＧＰＶＹＤＡＤＩＥＭＶＳＶＲＡＥＳＧＤＬＧＩＬＰＧＨＩＰＴＫＡＰＬＫＩＧＡＶＲＬＫＫＤＧＱＴＥＭＶＡＶＳＧＧＴＶＥＶＲＰＤＨＶＴＩＮＡＱＡＡＥＴＡＥＧＩＤＫＥＲＡＥＡＡＲＱＲＡＱＥＲＬＮＳＱＳＤＤＴＤＩＲＲＡＥＬＡＬＱＫＡＬＮＫＬＤＶＡＧＫ
配列番号１６−配列番号３のコントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列
ＡＴＧＡＡＡＡＣＴＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＴＡＴＡＡＣＡＡＣＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＣＣＡＧＴＣＴＡＣＧＡＣＧＣＴＧＡＴＡＴＣＧＡＧＡＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＡＧＴＧＧＴＧＡＴＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＣＣＣＣＧＧＴＣＡＣＡＴＴＣＣＣＡＣＡＡＡＧＧＣＣＣＣＡＣＴＧＡＡＧＡＴＣＧＧＡＧＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＧＡＣＧＧＣＣＡＡＡＣＣＧＡＧＡＴＧＧＴＣＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧＧＣＧＧＣＡＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＧＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＣＧＴＴＡＣＣＡＴＴＡＡＴＧＣＴＣＡＡＧＣＣＧＣＴＧＡＡＡＣＡＧＣＣＧＡＡＧＧＡＡＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＧＣＡＡＧＡＣＡＧＡＧＧＧＣＣＣＡＧＧＡＧＣＧＧＣＴＧＡＡＣＴＣＴＣＡＡＴＣＣＧＡＴＧＡＣＡＣＣＧＡＴＡＴＴＣＧＣＣＧＧＧＣＣＧＡＧＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＣＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧ
ＧＯ−ＡＴｅａｍ−Ａ１
配列番号１７−ｍＫＯｋ蛍光タンパク質（ヌクレオチド１〜６５４）、第１アラニンリンカー（ヌクレオチド６５５〜６５７）、ＡＴＰ結合タンパク質（ヌクレオチド６５８〜１０５３）、第２アラニンリンカー（ヌクレオチド１０５４−１０５６）、およびｃｐｍＥＧＦＰ蛍光タンパク質（ヌクレオチド１０５７−１７９４）をコードするＤＮＡ配列
ＡＴＧＧＴＧＡＧＴＧＴＧＡＴＴＡＡＡＣＣＡＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＴＡＣＴＡＣＡＴＧＧＡＣＧＧＣＴＣＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＣＡＴＧＡＧＴＴＣＡＣＡＡＴＴＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＣＡＧＡＣＣＴＴＡＣＧＡＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＧＡＴＧＡＣＡＣＴＡＣＧＣＧＴＣＡＣＡＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＧＣＧＧＧＣＣＡＡＴＧＣＣＴＴＴＣＧＣＧＴＴＴＧＡＣＴＴＡＧＴＧＴＣＡＣＡＣＧＴＧＴＴＣＴＧＴＴＡＣＧＧＣＣＡＣＡＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＴＡＡＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡＧＡＧＡＴＡＣＣＡＧＡＣＴＡＴＴＴＣＡＡＡＣＡＡＧＣＡＴＴＴＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＣＡＴＧＧＧＡＡＡＧＧＴＣＧＴＴＧＧＡＧＴＴＣＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＴＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＣＧＣＡＴＡＴＡＡＧＣＣＴＴＡＧＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＡＣＡＡＡＴＣＣＡＡＡＴＴＴＡＣＴＧＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＣＣＴＧＣＣＧＡＴＧＧＴＣＣＴＡＴＣＡＴＧＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＴＧＴＴＧＡＴＴＧＧＧＡＧＣＣＡＴＣＡＡＣＣＧＡＧＡＡＡＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＧＡＣＧＧＡＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＧＴＧＡＴＧＴＴＡＣＧＡＴＧＴＡＣＣＴＡＡＡＡＣＴＴＧＡＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＡＡＴＣＡＣＡＡＡＴＧＣＣＡＡＴＴＣＡＡＧＡＣＴＡＣＴＴＡＣＡＡＧＧＣＧＧＣＡＡＡＡＧＡＧＡＴＴＣＴＴＧＡＡＡＴＧＣＣＡＧＧＡＧＡＣＣＡＴＴＡＣＡＴＣＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＴＣＧＴＣＡＧＧＡＡＡＡＣＣＧＡＡＧＧＣＡＡＣＡＴＴＡＣＴＧＡＧＣＡＧＧＴＡＧＡＡＧＡＴＧＣＡＧＴＡＧＣＴＣＡＴＴＣＣＧＣＴＡＴＧＡＡＡＡＣＴＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＴＡＴＡＡＣＡＡＣＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＣＣＡＧＴＣＴＡＣＧＡＣＧＣＴＧＡＴＡＴＣＧＡＧＡＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＡＧＴＧＧＴＧＡＴＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＣＣＣＣＧＧＴＣＡＣＡＴＴＣＣＣＡＣＡＡＡＧＧＣＣＣＣＡＣＴＧＡＡＧＡＴＣＧＧＡＧＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＧＡＣＧＧＣＣＡＡＡＣＣＧＡＧＡＴＧＧＴＣＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧＧＣＧＧＣＡＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＧＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＣＧＴＴＡＣＣＡＴＴＡＡＴＧＣＴＣＡＡＧＣＣＧＣＴＧＡＡＡＣＡＧＣＣＧＡＡＧＧＡＡＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＧＣＡＡＧＡＣＡＧＡＧＧＧＣＣＣＡＧＧＡＧＣＧＧＣＴＧＡＡＣＴＣＴＣＡＡＴＣＣＧＡＴＧＡＣＡＣＣＧＡＴＡＴＴＣＧＣＣＧＧＧＣＣＧＡＧＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＡＧＡＧＧＧＣＣＣＴＧＡＡＣＡＧＡＣＴＧＧＡＣＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＧＣＴＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＧＧＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＡＧＣＴ
配列番号７−配列番号１７によってコードされる融合タンパク質−ｍＫＯｋ蛍光タンパク質（アミノ酸１〜２１８）、第１のアラニンリンカー（アミノ酸２１９）、ＡＴＰ結合タンパク質（アミノ酸２２０〜３５１）、第２のアラニンリンカー（アミノ酸３５２）、およびｃｐｍＥＧＦＰ蛍光タンパク質（アミノ酸３５２〜５９８）を含むＭＶＳＶＩＫＰＥＭＫＭＲＹＹＭＤＧＳＶＮＧＨＥＦＴＩＥＧＥＧＴＧＲＰＹＥＧＨＱＥＭＴＬＲＶＴＭＡＥＧＧＰＭＰＦＡＦＤＬＶＳＨＶＦＣＹＧＨＲＶＦＴＫＹＰＥＥＩＰＤＹＦＫＱＡＦＰＥＧＬＳＷＥＲＳＬＥＦＥＤＧＧＳＡＳＶＳＡＨＩＳＬＲＧＮＴＦＹＨＫＳＫＦＴＧＶＮＦＰＡＤＧＰＩＭＱＮＱＳＶＤＷＥＰＳＴＥＫＩＴＡＳＤＧＶＬＫＧＤＶＴＭＹＬＫＬＥＧＧＧＮＨＫＣＱＦＫＴＴＹＫＡＡＫＥＩＬＥＭＰＧＤＨＹＩＧＨＲＬＶＲＫＴＥＧＮＩＴＥＱＶＥＤＡＶＡＨＳＡＭＫＴＶＫＶＮＩＴＴＰＤＧＰＶＹＤＡＤＩＥＭＶＳＶＲＡＥＳＧＤＬＧＩＬＰＧＨＩＰＴＫＡＰＬＫＩＧＡＶＲＬＫＫＤＧＱＴＥＭＶＡＶＳＧＧＴＶＥＶＲＰＤＨＶＴＩＮＡＱＡＡＥＴＡＥＧＩＤＫＥＲＡＥＡＡＲＱＲＡＱＥＲＬＮＳＱＳＤＤＴＤＩＲＲＡＥＬＡＬＱＲＡＬＮＲＬＤＶＡＧＫＡＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＫＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫＧＧＳＧＧＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＥＡ
ＧＯ−ＡＴｅａｍ−Ａ１コントロール
配列番号１８−ｍＫＯｋ蛍光タンパク質（ヌクレオチド１〜６５４）、第１のアラニンリンカー（ヌクレオチド６５５〜６５７）、ＡＴＰを結合しないように変異したコントロールＡＴＰ結合タンパク質（ヌクレオチド６５８〜１０５３）、第２のアラニンリンカー（ヌクレオチド１０５４〜１０５６）、およびｃｐｍＥＧＦＰ蛍光タンパク質（ヌクレオチド１０５７〜１７９４）をコードするＤＮＡ
ＡＴＧＧＴＧＡＧＴＧＴＧＡＴＴＡＡＡＣＣＡＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＴＡＣＴＡＣＡＴＧＧＡＣＧＧＣＴＣＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＣＡＴＧＡＧＴＴＣＡＣＡＡＴＴＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＣＡＧＡＣＣＴＴＡＣＧＡＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＧＡＴＧＡＣＡＣＴＡＣＧＣＧＴＣＡＣＡＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＧＣＧＧＧＣＣＡＡＴＧＣＣＴＴＴＣＧＣＧＴＴＴＧＡＣＴＴＡＧＴＧＴＣＡＣＡＣＧＴＧＴＴＣＴＧＴＴＡＣＧＧＣＣＡＣＡＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＴＡＡＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡＧＡＧＡＴＡＣＣＡＧＡＣＴＡＴＴＴＣＡＡＡＣＡＡＧＣＡＴＴＴＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＣＡＴＧＧＧＡＡＡＧＧＴＣＧＴＴＧＧＡＧＴＴＣＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＴＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＣＧＣＡＴＡＴＡＡＧＣＣＴＴＡＧＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＡＣＡＡＡＴＣＣＡＡＡＴＴＴＡＣＴＧＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＣＣＴＧＣＣＧＡＴＧＧＴＣＣＴＡＴＣＡＴＧＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＴＧＴＴＧＡＴＴＧＧＧＡＧＣＣＡＴＣＡＡＣＣＧＡＧＡＡＡＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＧＡＣＧＧＡＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＧＴＧＡＴＧＴＴＡＣＧＡＴＧＴＡＣＣＴＡＡＡＡＣＴＴＧＡＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＡＡＴＣＡＣＡＡＡＴＧＣＣＡＡＴＴＣＡＡＧＡＣＴＡＣＴＴＡＣＡＡＧＧＣＧＧＣＡＡＡＡＧＡＧＡＴＴＣＴＴＧＡＡＡＴＧＣＣＡＧＧＡＧＡＣＣＡＴＴＡＣＡＴＣＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＴＣＧＴＣＡＧＧＡＡＡＡＣＣＧＡＡＧＧＣＡＡＣＡＴＴＡＣＴＧＡＧＣＡＧＧＴＡＧＡＡＧＡＴＧＣＡＧＴＡＧＣＴＣＡＴＴＣＣＧＣＴＡＴＧＡＡＡＡＣＴＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＴＡＴＡＡＣＡＡＣＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＣＣＡＧＴＣＴＡＣＧＡＣＧＣＴＧＡＴＡＴＣＧＡＧＡＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＡＧＴＧＧＴＧＡＴＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＣＣＣＣＧＧＴＣＡＣＡＴＴＣＣＣＡＣＡＡＡＧＧＣＣＣＣＡＣＴＧＡＡＧＡＴＣＧＧＡＧＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＧＡＣＧＧＣＣＡＡＡＣＣＧＡＧＡＴＧＧＴＣＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧＧＣＧＧＣＡＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＧＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＣＧＴＴＡＣＣＡＴＴＡＡＴＧＣＴＣＡＡＧＣＣＧＣＴＧＡＡＡＣＡＧＣＣＧＡＡＧＧＡＡＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＧＣＡＡＧＡＣＡＧＡＧＧＧＣＣＣＡＧＧＡＧＣＧＧＣＴＧＡＡＣＴＣＴＣＡＡＴＣＣＧＡＴＧＡＣＡＣＣＧＡＴＡＴＴＣＧＣＣＧＧＧＣＣＧＡＧＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＣＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＧＣＴＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＧＧＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＡＧＣＴ
配列番号１９−配列番号１８によってコードされた融合タンパク質−ｍＫＯｋ蛍光タンパク質（アミノ酸１〜２１８）、第１のアラニンリンカー（アミノ酸２１９）、ＡＴＰを結合しないコントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質（アミノ酸２２０〜３５１）、第２のアラニンリンカー（アミノ酸３５２）、およびｃｐｍＥＧＦＰ蛍光タンパク質（アミノ酸３５２〜５９８）を含む
ＭＶＳＶＩＫＰＥＭＫＭＲＹＹＭＤＧＳＶＮＧＨＥＦＴＩＥＧＥＧＴＧＲＰＹＥＧＨＱＥＭＴＬＲＶＴＭＡＥＧＧＰＭＰＦＡＦＤＬＶＳＨＶＦＣＹＧＨＲＶＦＴＫＹＰＥＥＩＰＤＹＦＫＱＡＦＰＥＧＬＳＷＥＲＳＬＥＦＥＤＧＧＳＡＳＶＳＡＨＩＳＬＲＧＮＴＦＹＨＫＳＫＦＴＧＶＮＦＰＡＤＧＰＩＭＱＮＱＳＶＤＷＥＰＳＴＥＫＩＴＡＳＤＧＶＬＫＧＤＶＴＭＹＬＫＬＥＧＧＧＮＨＫＣＱＦＫＴＴＹＫＡＡＫＥＩＬＥＭＰＧＤＨＹＩＧＨＲＬＶＲＫＴＥＧＮＩＴＥＱＶＥＤＡＶＡＨＳＡＭＫＴＶＫＶＮＩＴＴＰＤＧＰＶＹＤＡＤＩＥＭＶＳＶＲＡＥＳＧＤＬＧＩＬＰＧＨＩＰＴＫＡＰＬＫＩＧＡＶＲＬＫＫＤＧＱＴＥＭＶＡＶＳＧＧＴＶＥＶＲＰＤＨＶＴＩＮＡＱＡＡＥＴＡＥＧＩＤＫＥＲＡＥＡＡＲＱＲＡＱＥＲＬＮＳＱＳＤＤＴＤＩＲＲＡＥＬＡＬＱＫＡＬＮＫＬＤＶＡＧＫＡＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＫＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫＧＧＳＧＧＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＥＡ
【００９６】
本明細書で言及される特許または刊行物は、個々の刊行物が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示される場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９７】
本明細書に記載される組成物および方法は、現在、好ましい実施形態の代表例、例示であり、本開示の範囲に対する制限として意図されていない。本明細書における変更および他の用途は、当業者に思い浮かぶであろう。そのような変更および他の使用は、特許請求の範囲に記載されるように本開示の範囲から逸脱することなく行うことができる。
【図１】
2021514603.tif 000016
【図２】
2021514603.tif 000017
【図３Ａ】
2021514603.tif 000018
【図３Ｂ】
2021514603.tif 000019
【図４Ａ】
2021514603.tif 000020
【図４Ｂ】
2021514603.tif 000021
【図４Ｃ】
2021514603.tif 000022
【図５Ａ】
2021514603.tif 000023
【図５Ｂ】
2021514603.tif 000024
【配列表】
2021514603000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年9月11日(2020.9.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５属のポリペプチドを含む融合タンパク質であって、
Ｘ１およびＸ５のうちの一方が受容体励起波長および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）発光波長を有するＦＲＥＴ受容体ポリペプチドを含み、Ｘ１およびＸ５のうちの他方が供与体励起波長および供与体発光波長を有するＦＲＥＴ供与体ポリペプチドを含み、
Ｘ２およびＸ４が独立して、任意のアミノ酸リンカーであり、
Ｘ３がＡＴＰ結合タンパク質を含み、
前記ＡＴＰ結合タンパク質によるＡＴＰの結合が前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチドと前記ＦＲＥＴ供与体ポリペプチドとの相互作用を引き起こす、融合タンパク質。
【請求項２】
Ｘ１がＦＲＥＴ受容体ポリペプチドを含み、Ｘ５がＦＲＥＴ供与体ポリペプチドを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
Ｘ１がＦＲＥＴ供与体ポリペプチドを含み、Ｘ５がＦＲＥＴ受容体ポリペプチドを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
Ｘ２が１〜２個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーであるか、または存在しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
Ｘ２が１個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーであるか、または存在しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
Ｘ２が１個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
Ｘ２が、Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｔ、ＴＳ、ＩＤからなる群から選択されるアミノ酸リンカーであるか、またはＸ２が存在しない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
Ｘ２が、Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｔ、ＴＳ、およびＩＤからなる群から選択されるアミノ酸リンカーである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
Ｘ２が、Ａ、Ｓ、Ｖ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸リンカーである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
Ｘ４が１〜５個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーであるか、またはＸ４が存在しない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
Ｘ４が１〜４個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーであるか、またはＸ４が存在しない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
Ｘ４が１〜２個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
Ｘ４が、ＡＴ、Ａ、ＳＡ、ＧＡ、ＦＦ、ＰＰＰＰ（配列番号２０）、ＦＬ、ＧＴＳＧ（配列番号２１）、Ｐ、Ｓ、ＡＮＥＦＭ（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸リンカーであるか、またはＸ４が存在しない、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
Ｘ４がＡＴ、Ａ、ＳＡ、ＧＡ、ＦＦ、ＦＬ、Ｐ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸リンカーである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
Ｘ４が、Ａ、ＦＦ、ＦＬ、およびＧＴＳＧ（配列番号２１）からなる群から選択されるアミノ酸リンカーである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
Ｘ２およびＸ４が両方ともＡである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
Ｘ２がＳであり、Ｘ４がＡである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
Ｘ２が存在せず、Ｘ４がＦＦである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
Ｘ２がＶであり、Ｘ４がＦＬである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
Ｘ２がＴであり、Ｘ４がＧＴＳＧ（配列番号２１）である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
Ｘ２がＳであり、Ｘ４がＳＡである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
Ｘ２およびＸ４がプロリン残基を含まない、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチドが、５００〜５６０ｎｍの範囲の最大受容体励起波長および５３０〜５８０ｎｍの範囲の受容体最大発光波長を有する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチドが、配列番号１〜３の１個以上のアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり、発色団で同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチド内にすべての任意のアミノ酸残基が存在する、請求項２３記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
前記ＦＲＥＴ供与体ポリペプチドが、４５０〜５００ｎｍの範囲の最大供与体励起波長および４８０〜５１５ｎｍの範囲の最大供与体発光波長を有する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
前記ＦＲＥＴ供与体ポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり、発色団で同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
Ｘ３が、配列番号５〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも６５％、６７％、６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＴＰ結合タンパク質を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
配列番号７〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５属のポリペプチドを含むコントロール融合タンパク質であって、
Ｘ１およびＸ５のうちの一方が受容体励起波長および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）発光波長を有するＦＲＥＴ受容体ポリペプチドを含み、Ｘ１およびＸ５のうちの他方が供与体励起波長および供与体発光波長を有するＦＲＥＴ供与体ポリペプチドを含み、
Ｘ２およびＸ４が独立して、任意のアミノ酸リンカーであり、
Ｘ３がＡＴＰに結合しないコントロールタンパク質を含む、コントロール融合タンパク質。
【請求項３１】
Ｘ１がＦＲＥＴ受容体ポリペプチドを含み、Ｘ５がＦＲＥＴ供与体ポリペプチドを含む、請求項３０に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項３２】
Ｘ１がＦＲＥＴ供与体ポリペプチドを含み、Ｘ５がＦＲＥＴ受容体ポリペプチドを含む、請求項３０記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項３３】
Ｘ２が１〜２個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーであるか、または存在しない、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項３４】
Ｘ２が１個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーであるか、または存在しない、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項３５】
Ｘ２が１個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーである、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項３６】
Ｘ２が、Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｔ、ＴＳ、ＩＤからなる群から選択されるアミノ酸リンカーであるか、またはＸ２が存在しない、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項３７】
Ｘ２が、Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｔ、ＴＳ、およびＩＤからなる群から選択されるアミノ酸リンカーである、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項３８】
Ｘ２が、Ａ、Ｓ、Ｖ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸リンカーである、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項３９】
Ｘ４が１〜５個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーであるか、またはＸ４が存在しない、請求項３０〜３８のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項４０】
Ｘ４が１〜４個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーであるか、またはＸ４が存在しない、請求項３０〜３８のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項４１】
Ｘ４が１〜２個のアミノ酸長のアミノ酸リンカーである、請求項３０〜４０のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項４２】
Ｘ４が、ＡＴ、Ａ、ＳＡ、ＧＡ、ＦＦ、ＰＰＰＰ（配列番号２０）、ＦＬ、ＧＴＳＧ（配列番号２１）、Ｐ、Ｓ、ＡＮＥＦＭ（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸リンカーであるか、またはＸ４が存在しない、請求項３０〜４１のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項４３】
Ｘ４が、ＡＴ、Ａ、ＳＡ、ＧＡ、ＦＦ、ＦＬ、Ｐ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸リンカーである、請求項３０〜４１のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項４４】
Ｘ４が、Ａ、ＦＦ、ＦＬ、およびＧＴＳＧ（配列番号２１）からなる群から選択されるアミノ酸リンカーである、請求項３０〜４１のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項４５】
Ｘ２およびＸ４がともにＡである、請求項３０〜４４のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項４６】
Ｘ２がＳであり、Ｘ４がＡである、請求項３０〜４４のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項４７】
Ｘ２が存在せず、Ｘ４がＦＦである、請求項３０〜４４のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項４８】
Ｘ２がＶであり、Ｘ４がＦＬである、請求項３０〜４４のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項４９】
Ｘ２がＴであり、Ｘ４がＧＴＳＧ（配列番号２１）である、請求項３０から４４のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項５０】
Ｘ２がＳであり、Ｘ４がＳＡである、請求項３０〜４４のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項５１】
Ｘ２およびＸ４がプロリン残基を含まない、請求項３０〜５０のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項５２】
前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチドが、５００〜５６０ｎｍの範囲の最大受容体励起波長および５３０〜５８０ｎｍの範囲のＦＲＥＴ最大発光波長を有する、請求項３０〜５１のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項５３】
前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチドが、配列番号１〜３のアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、発色団で同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３０〜５２のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項５４】
前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチド内にすべての任意のアミノ酸残基が存在する、請求項５３に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項５５】
前記ＦＲＥＴ供与体ポリペプチドが、４５０〜５００ｎｍの範囲の最大供与体励起波長および４８０〜５１５ｎｍの範囲の最大供与体発光波長を有する、請求項３０から５４のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項５６】
前記ＦＲＥＴ供与体ポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、発色団で同一であるアミノ酸配列のアミノ酸配列を含む、請求項３０〜５５のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項５７】
Ｘ３が、配列番号１２のアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも６５％、６７％、６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、下線付きおよび太字の残基はＫでなければならない、請求項３０〜５６のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項５８】
配列番号１３のアミノ酸配列の長さに沿って少なくとも６５％、６７％、６８％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、下線付きおよび太字の残基はＫでなければならない、請求項３０〜５７のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質。
【請求項５９】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６０】
請求項５９に記載のポリヌクレオチドをコードする発現ベクターであって、前記ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーター配列に作用可能に連結されている、発現ベクター。
【請求項６１】
請求項５９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６０に記載の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項６２】
前記宿主細胞が安定な形質転換細胞株の細胞である、請求項６１記載の組換え宿主細胞。
【請求項６３】
請求項３０〜５８のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６４】
請求項６３に記載のポリヌクレオチドをコードする発現ベクターであって、前記ポリヌクレオチドが前記ポリヌクレオチの発現を指示することができるプロモーター配列に作用可能に連結される、発現ベクター。
【請求項６５】
請求項６３に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６４に記載の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項６６】
前記宿主細胞が安定な形質転換細胞株の細胞である、請求項６５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６７】
キットであって、
（ａ）請求項１〜２９のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項５９に記載のポリヌクレオチド、請求項６０に記載の発現ベクター、および／または請求項６１もしくは６２に記載の組換え宿主細胞、
（ｂ）請求項３０〜５８のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質、請求項６３に記載のポリヌクレオチド、請求項６４に記載の発現ベクター、および／または請求項６５もしくは６６に記載の組換え宿主細胞、を含むキット。
【請求項６８】
対象細胞におけるＡＴＰのレベルを決定するための、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項６９】
ＡＴＰのアッセイ方法であって、
（ａ）請求項１〜２９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を１つ以上の第１の細胞で発現させ、
（ｉ）前記ＦＲＥＴ供与体ポリペプチド励起波長を有する光に前記１つ以上の第１の細胞を曝露したときに、前記１つ以上の第１の細胞から発光された、前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成された蛍光シグナルを検出することによって生成される第１の蛍光画像、および／または
（ｉｉ）前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチド励起波長を有する光に前記１つ以上の第１の細胞を曝露したときに、前記１つ以上の第１の細胞から発光された、前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成された蛍光シグナルを検出することによって生成される第２の蛍光画像、および／または
（ｉｉｉ）前記ＦＲＥＴ供与体ポリペプチド励起波長を有する光に前記１つ以上の第１の細胞を曝露したときに、前記１つ以上の第１の細胞から発光された、前記ＦＲＥＴ供与体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成された蛍光シグナルを検出することによって生成される第３の蛍光画像、からなる群から選択される１つ以上の画像を生成することと、
（ｂ）前記第１の蛍光画像、前記第２の蛍光画像および／または前記第３の蛍光画像中の蛍光シグナルの出力を比較することによって、前記１つ以上の第１の細胞中のＦＲＥＴ比を決定することと、を含み、
前記１つ以上の第１の細胞中のＡＴＰレベルが前記決定されたＦＲＥＴ比と比例する、方法。
【請求項７０】
請求項３０〜５８のいずれか１項に記載のコントロール融合タンパク質を１つ以上の第１の細胞で発現させ、前記１つ以上の第１の細胞から発光された受容体発光波長を有する光によって生成されたコントロールシグナルを検出することをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記コントロールシグナルを検出することは、
（ｃ）本明細書に開示された任意の実施形態または実施形態の組み合わせの前記コントロール融合タンパク質を１つ以上のコントロール細胞（前記第１の細胞または第２の細胞など）で発現させ、
（ｉ）前記ＦＲＥＴ供与体ポリペプチド励起波長を有する光に前記１つ以上のコントロール細胞を曝露したときに、前記１つ以上のコントロール細胞から発光された、前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成された蛍光シグナルを検出することによって生成される第４の蛍光画像、および／または
（ｉｉ）前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチド励起波長を有する光に前記１つ以上のコントロール細胞を曝露したときに、前記１つ以上のコントロール細胞から発光された、前記ＦＲＥＴ受容体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成された蛍光シグナルを検出することによって生成される第５の蛍光画像、および／または
（ｉｉｉ）前記ＦＲＥＴ供与体ポリペプチド励起波長を有する光に前記１つ以上のコントロール細胞を曝露したときに、前記１つ以上のコントロール細胞から発光された、前記ＦＲＥＴ供与体ポリペプチド発光波長を有する光によって生成された蛍光シグナルを検出することによって生成される第６の蛍光画像、からなる群から選択される１つ以上の画像を生成することと、
（ｄ）前記第４の蛍光画像、前記第５の蛍光画像および／または前記第６の蛍光画像中の蛍光シグナルの出力を比較することによって、前記１つ以上のコントロール細胞中のコントロール融合ＦＲＥＴ比を決定することと、を含み、
前記コントロール融合ＦＲＥＴ比の変化がＡＴＰ結合に無関係な実験条件の結果であると決定され、前記決定されたＦＲＥＴ比が前記コントロール融合ＦＲＥＴ比の変化に基づいて修正される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記１つ以上の第１の細胞がインキュベーター内で培養され、すべての画像化ステップがインキュベーターから前記１つ以上の第１の細胞を取り出すことなく実行される、請求項６９〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記１つ以上の第１の細胞を１つ以上の試験物質と接触させ、前記１つ以上の第１の細胞におけるＡＴＰの存在に対する試験物質の効果を決定することをさらに含む、請求項６９〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記１つ以上の第１の細胞中のＡＴＰの存在に対する前記１つ以上の試験物質の効果が、１分〜３ヶ月の範囲の期間にわたって連続的または断続的に決定される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記融合タンパク質は、受容体励起波長およびＦＲＥＴ発光波長を有するＦＲＥＴ受容体である第１のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第１のフルオロフォア、Ｎ−末端およびＣ−末端を有するＡＴＰ結合タンパク質、ならびに供与体励起波長および供与体発光波長を有するＦＲＥＴ供与体である第２のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第２のフルオロフォアを含み、第１のリンカーは前記第１のフルオロフォアの前記Ｃ−末端と前記ＡＴＰ結合タンパク質の前記Ｎ−末端との間に配置され、第２のリンカーは前記ＡＴＰ結合タンパク質の前記Ｃ−末端と前記第２のフルオロフォアの前記Ｎ−末端との間に配置され、前記第１のフルオロフォア、前記ＡＴＰ結合タンパク質、および前記第２のフルオロフォアは、前記ＡＴＰ結合タンパク質によるＡＴＰ結合が前記第１のフルオロフォアと前記第２のフルオロフォアとの相互作用を引き起こして、前記供与体励起波長を有する光に曝された時にＦＲＥＴ発光シグナルを生成するように作用可能に連結される、ポリヌクレオチド。
【請求項７６】
前記第１のリンカーがアラニン残基であり、前記第２のリンカーがアラニン残基である、請求項７５記載のポリヌクレオチド。
【請求項７７】
前記第１のリンカーがセリン残基であり、前記第２のリンカーがアラニン残基である、請求項７５記載のポリヌクレオチド。
【請求項７８】
前記第１のリンカーが無効であり、前記第２のリンカーがフェニルアラニン−フェニルアラニンジペプチド残基である、請求項７５記載のポリヌクレオチド。
【請求項７９】
前記第１のリンカーがバリン残基であり、前記第２のリンカーがフェニルアラニン−ロイシンジペプチド残基である、請求項７５記載のポリヌクレオチド。
【請求項８０】
前記第１のリンカーがスレオニン残基であり、前記第２のリンカーがグリシン−スレオニン−セリン−グリシンペプチド残基である、請求項７５記載のポリヌクレオチド。
【請求項８１】
前記第１のリンカーがセリン残基であり、前記第２のリンカーがセリン−アラニンジペプチド残基である、請求項７５記載のポリヌクレオチド。
【請求項８２】
前記第２のリンカーがアスパラギン残基を含まない、請求項７５記載のポリヌクレオチド。
【請求項８３】
作用可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項７５〜８２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８４】
請求項７５〜８３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８５】
請求項７５〜８４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項８４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項８６】
前記宿主細胞が安定な形質転換細胞株の細胞である、請求項８５記載の宿主細胞。
【請求項８７】
融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、受容体励起波長およびＦＲＥＴ発光波長を有するＦＲＥＴ受容体である第１のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第１のフルオロフォア、Ｎ−末端およびＣ−末端を有するＡＴＰ結合タンパク質、ならびに供与体励起波長および供与体発光波長を有するＦＲＥＴ供与体である第２のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第２のフルオロフォアを含み、第１のリンカーは前記第１のフルオロフォアの前記Ｃ−末端と前記ＡＴＰ結合タンパク質の前記Ｎ−末端との間に配置され、第２のリンカーは前記ＡＴＰ結合タンパク質の前記Ｃ−末端と前記第２のフルオロフォアの前記Ｎ−末端との間に配置され、前記第１のフルオロフォア、前記ＡＴＰ結合タンパク質、および前記第２のフルオロフォアは、前記ＡＴＰ結合タンパク質によるＡＴＰ結合が前記第１のフルオロフォアと前記第２のフルオロフォアとの相互作用を引き起こして、前記供与体励起波長を有する光に曝された時にＦＲＥＴ発光シグナルを生成するように作用可能に連結される、融合タンパク質。
【請求項８８】
前記ＡＴＰ結合タンパク質が、配列番号５のタンパク質と、ＡＴＰを結合し、配列番号５と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の置換変異、追加または欠失を有する配列番号５の変異体と、ＡＴＰを結合し、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１４に結合する配列番号１４の変異体によってコードされる配列番号５の変異体とからなる群から選択される、請求項７５〜８７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、方法、発現ベクター、宿主細胞または融合タンパク質。
【請求項８９】
コントロール融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記コントロール融合タンパク質は、受容体励起波長およびＦＲＥＴ発光波長を有するＦＲＥＴ受容体である第１のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第１のフルオロフォア、Ｎ−末端およびＣ−末端を有するコントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質であって、ＡＴＰを結合しないように変異されているコントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質、ならびに、供与体励起波長および供与体発光波長を有するＦＲＥＴ供与体である第２のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第２のフルオロフォアを含み、第１のリンカーは前記第１のフルオロフォアの前記Ｃ−末端と前記コントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質の前記Ｎ−末端との間に配置され、第２のリンカーは前記コントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質の前記Ｃ−末端と前記第２のフルオロフォアの前記Ｎ−末端との間に配置され、前記コントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質はＡＴＰを結合しないため、前記第１のフルオロフォア、前記コントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質および前記第２のフルオロフォアは、コントロールとして機能するように作用可能に連結されて、それにより、前記供与体励起波長を有する光に曝された時にＦＲＥＴ発光シグナルを生成するための前記第１のフルオロフォアと前記第２のフルオロフォアとの相互作用が、ＡＴＰの存在に無関係な非特異的バックグラウンドシグナルを表す、ポリヌクレオチド。
【請求項９０】
前記第１のリンカーがアラニン残基であり、前記第２のリンカーがアラニン残基である、請求項８９記載のポリヌクレオチド。
【請求項９１】
前記第１のリンカーがセリン残基であり、前記第２のリンカーがアラニン残基である、請求項８９記載のポリヌクレオチド。
【請求項９２】
前記第１のリンカーが無効であり、前記第２のリンカーがフェニルアラニン−フェニルアラニンジペプチド残基である、請求項８９記載のポリヌクレオチド。
【請求項９３】
前記第１のリンカーがバリン残基であり、前記第２のリンカーがフェニルアラニン−ロイシンジペプチド残基である、請求項８９記載のポリヌクレオチド。
【請求項９４】
前記第１のリンカーがスレオニン残基であり、前記第２のリンカーがグリシン−スレオニン−セリン−グリシンペプチド残基である、請求項８９記載のポリヌクレオチド。
【請求項９５】
前記第１のリンカーがセリン残基であり、前記第２のリンカーがセリン−アラニンジペプチド残基である、請求項８９記載のポリヌクレオチド。
【請求項９６】
前記第２のリンカーがアスパラギン残基を含まない、請求項８９記載のポリヌクレオチド。
【請求項９７】
作用可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項８９〜９６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９８】
請求項８９〜９７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項９９】
請求項８９〜９７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項９８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１００】
前記宿主細胞が安定な形質転換細胞株の細胞である、請求項９９記載の宿主細胞。
【請求項１０１】
融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、受容体励起波長およびＦＲＥＴ発光波長を有するＦＲＥＴ受容体である第１のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第１のフルオロフォア、Ｎ−末端およびＣ−末端を有するコントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質、ならびに供与体励起波長および供与体発光波長を有するＦＲＥＴ供与体である第２のフルオロフォアであって、Ｎ−末端およびＣ−末端を有する第２のフルオロフォアを含み、第１のリンカーは前記第１のフルオロフォアの前記Ｃ−末端と前記コントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質の前記Ｎ−末端との間に配置され、第２のリンカーは前記コントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質の前記Ｃ−末端と前記第２のフルオロフォアの前記Ｎ−末端との間に配置され、前記コントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質はＡＴＰを結合しないため、前記第１のフルオロフォア、前記コントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質および前記第２のフルオロフォアは、コントロールとして機能するように作用可能に連結され、それにより、前記供与体励起波長を有する光に曝された時にＦＲＥＴ発光シグナルを生成するための前記第１のフルオロフォアと前記第２のフルオロフォアとの相互作用が、ＡＴＰの存在に無関係な非特異的バックグラウンドシグナルを表す、融合タンパク質。
【請求項１０２】
前記コントロール変異体ＡＴＰ結合タンパク質が、配列番号１５のタンパク質と、ＡＴＰを結合せず、配列番号１５と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の置換変異、追加または欠失を有する配列番号１５の変異体と、ＡＴＰを結合せず、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１６に結合する配列番号１６の変異体によってコードされる配列番号１５の変異体とからなる群から選択される、請求項８９〜１０１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、方法、発現ベクター、宿主細胞または融合タンパク質。
【請求項１０３】
前記ＦＲＥＴ供与体がｃｐｍＥＧＦＰである、請求項１〜１０２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、方法、発現ベクター、宿主細胞または融合タンパク質。
【請求項１０４】
前記ＦＲＥＴ受容体がｍＫＯｋである、請求項１〜１０３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、方法、発現ベクター、宿主細胞または融合タンパク質。
【国際調査報告】
2021514603.tif 000025
2021514603.tif 000026
2021514603.tif 000027