(57)【要約】  本明細書において、多株集団制御系、方法、キット、および組成物が提供されている。また、多株生態系および時間的に配列された多株生態系において細菌細胞を培養するための方法、系、キット、および組成物、または同期溶解回路を複数の毒素／抗毒素系と組み合わせて使用して、長期間にわたって連続的にサイクルするための培養物が、提供されている。【選択図】図２Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
方法であって、
成長環境で第１の期間、第１の細菌株を培養することと、
第２の細菌株を前記成長環境に加え、かつ第２の期間、前記第２の細菌株を培養することと、
第３の細菌株を前記成長環境に加え、かつ第３の期間、前記第３の細菌株を培養することと、を含み、
前記第１、第２、および第３の細菌株の各々が、毒素系を含み、
前記第１の細菌株の前記毒素系が、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第３の毒素／第３の抗毒素対から第３の抗毒素を産生し、前記第１の細菌株が、前記第３の毒素を産生せず、
前記第２の細菌株の前記毒素系が、第２の毒素／第２の抗毒素対、および前記第１の毒素／第１の抗毒素対から前記第１の抗毒素対を産生し、前記第２の細菌株が、前記第１の毒素を産生せず、
前記第３の細菌株の前記毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対、および前記第２の毒素／第２の抗毒素対から前記第２の抗毒素対を産生し、前記第３の細菌株が、前記第２の毒素を産生せず、
任意選択的に、前記第１、第２、および第３の細菌株の各々が、
活性化可能なプロモータの制御下にある溶解遺伝子を有する溶解プラスミドと、
活性化遺伝子を有する活性化プラスミドであって、その発現が、クォーラム感知分子の蓄積を促進する、活性化プラスミドと、を含み、
前記溶解遺伝子の前記活性化可能なプロモータおよび前記活性化遺伝子の前記発現の両方が、前記クォーラム感知分子によって活性化される、方法。
【請求項２】
前記クォーラム感知分子が、前記第１、第２、および第３の細菌株の各々において同じである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の細菌株、前記第２の細菌株、前記第３の細菌株、および１つ以上の追加の細菌株の各々の前記毒素系が、ゲノム内で、プラスミド上で、複数のプラスミド上で、またはそれらの組み合わせ上で独立してコードされる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々において、前記溶解プラスミドが、溶解遺伝子、活性化可能なプロモータ、および任意選択的に、レポータ遺伝子を含み、前記活性化プラスミドが、活性化遺伝子、任意選択的に、溶解タグ、および任意選択的に、レポータ遺伝子を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々における前記溶解遺伝子が、バクテリオファージΦＸ１７４からのＥである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々における前記活性化可能なプロモータが、ＬｕｘＲ−ＡＨＬ活性化可能なｌｕｘＩプロモータであり、活性化遺伝子が、ＬｕｘＩである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１、第２、および第３の細菌株のうちの１つ以上が、プロモータに動作可能に連結された異種核酸および／または異種タンパク質をコードする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記異種核酸および／または異種タンパク質が、治療剤である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記治療剤が、阻害性核酸、サイトカイン、酵素、ペプチドホルモン、融合タンパク質、凝固因子、毒素、抗菌ペプチド、およびその抗体または抗原結合断片からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
方法であって、
少なくとも第１の細菌株と、第２の細菌株と、ｎ番目の細菌株と、を含む、ｎ個の細菌株を提供することと、
成長環境で１つ以上の独立した期間、前記細菌株の各々を連続的に共培養することと、を含み、
前記第２の細菌株〜前記ｎ番目の細菌株の各々が、前の細菌株を有し、
ｎが、少なくとも３であり、
前記ｎ個の細菌株の各々が、毒素系を含み、
前記第２〜ｎ番目の細菌株の各々の前記毒素系が、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、前記第１の毒素が、前の細菌株、および前記前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効であり、
前記第１の細菌株の前記毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、前記第３の毒素が、前記ｎ番目の細菌株、および前記ｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である、方法。
【請求項１１】
前記ｎ個の細菌株の前記毒素系が、ゲノム内で、プラスミド上で、複数のプラスミド上で、またはそれらの組み合わせ上で独立してコードされる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記期間のうちの１つ以上が、部分的または完全に重複する、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｎ個の細菌株のうちの１つ以上が、プロモータに動作可能に連結された異種核酸および／または異種タンパク質をコードする、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記異種核酸および／または異種タンパク質が、治療剤である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療剤が、阻害性核酸、サイトカイン、酵素、ペプチドホルモン、融合タンパク質、凝固因子、毒素、抗菌ペプチド、およびその抗体または抗原結合断片からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の細菌株〜前記ｎ番目の細菌株の各々が、前記前の株の前記毒素系の前記第２の毒素を産生せず、前記第１の細菌株が、前記ｎ番目の細菌株の前記毒素系の前記第４の毒素を産生しない、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
毒素系を含む細菌株であって、前記毒素系が、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素を産生し、前記細菌株が、前記第２の毒素を産生しない、細菌株。
【請求項１８】
前記毒素系が、ゲノム内で、プラスミド上で、複数のプラスミド上で、またはそれらの組み合わせ上でコードされる、請求項１７に記載の細菌株。
【請求項１９】
前記細菌株が、治療剤をコードする核酸をさらに含む、請求項１７または１８に記載の細菌株。
【請求項２０】
前記治療剤が、阻害性核酸、サイトカイン、酵素、ペプチドホルモン、融合タンパク質、凝固因子、毒素、抗菌ペプチド、およびその抗体または抗原結合断片からなる群から選択される、請求項１９に記載の細菌株。
【請求項２１】
前記治療剤が、治療用ポリペプチドである、請求項１９または２０に記載の細菌株。
【請求項２２】
前記治療剤が、標的細胞に対する細胞傷害性または細胞停止性である、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の細菌株。
【請求項２３】
請求項１７〜２２に記載の細菌株のうちのいずれか１つ以上を含む、医薬組成物。
【請求項２４】
系であって、
少なくとも第１の細菌株と、第２の細菌株と、ｎ番目の細菌株と、を含む、ｎ個の細菌株を含み、
前記第２の細菌株〜前記ｎ番目の細菌株の各々が、前の細菌株を有し、
ｎが、少なくとも３であり、
前記ｎ個の株の各々が、毒素系を含み、
前記第２〜ｎ番目の細菌株の各々の前記毒素系が、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、前記第１の毒素が、前の細菌株、および前記前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効であり、
前記第１の細菌株の前記毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、前記第３の毒素が、前記ｎ番目の細菌株、および前記ｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である、系。
【請求項２５】
ｎが、３である、請求項２４に記載の系。
【請求項２６】
ｎが、４、５、６、７、８、９、または１０である、請求項２４に記載の系。
【請求項２７】
疾患を治療することを必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
少なくとも第１の細菌株と、第２の細菌株と、ｎ番目の細菌株と、を含む、治療有効量のｎ個の細菌株の各々を前記対象に投与することを含み、
前記第２の細菌株〜前記ｎ番目の細菌株の各々が、前の細菌株を有し、
ｎが、少なくとも３であり、
前記ｎ個の株の各々が、毒素系を含み、
前記第２〜ｎ番目の細菌株の各々の前記毒素系が、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、前記第１の毒素が、前の細菌株、および前記前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効であり、
前記第１の細菌株の前記毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、前記第３の毒素が、前記ｎ番目の細菌株、および前記ｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である、方法。
【請求項２８】
ｎが、３である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ｎが、４、５、６、７、８、９、または１０である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記毒素系の各々が、ゲノム内で、プラスミド上で、複数のプラスミド上で、またはそれらの組み合わせ上で独立してコードされる、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２の細菌株〜前記ｎ番目の細菌株の各々が、前記前の株の前記毒素系の前記第２の毒素を産生せず、前記第１の細菌株が、前記ｎ番目の細菌株の前記毒素系の前記第４の毒素を産生しない、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記疾患が、癌または感染症である、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記感染症が、Ｃａｍｐｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａからなる群から選択される感染因子によって引き起こされる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記癌が、グリア芽腫、扁平上皮癌、乳癌、結腸癌、肝細胞癌、黒色腫、神経芽腫、膵臓癌、および前立腺癌からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１８年６月８日に出願された米国仮特許出願第６２／６８２，７５５号の利益を主張するものであり、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府が支援する研究または開発
本発明は、国立衛生研究所および国立総合医療科学研究所から授与された助成金番号ＲＯ１−ＧＭ０６９８１１の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に関して一定の権利を有している。
【０００３】
本開示は、細菌細胞を培養するための方法、系、キット、および組成物に関し、より具体的には、クォーラム調節多溶解系を含む多株生態系のための方法、系、キット、および組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
微生物の生態学者は、天然の微生物叢６，７の複雑さを調べるための還元剤ツールとして、小規模で合成された生態系１−５にますます注目している。同時に、合成生物学者は、単一細胞遺伝子回路８−１１から、細胞間シグナル伝達１２−１６を用いる集団全体の制御に至っている。
【発明の概要】
【０００５】
理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、多株生態系を設計するために、および／または治療剤などの１つ以上のペイロードの周期的送達を可能にするために使用され得る、三溶解または多溶解系を開示している。各株は、例えば、単一の治療用タンパク質のペイロードまたは複数の治療用タンパク質のペイロードを送達する一方で、以前に投与された株、または疾患部位において以前に存在する株を除外することができる。例えば、この系を構成する少なくとも３つの株が存在してもよく、各株は、他の２つの株のうちの１つを死滅させる毒素、それ自体を保護するための抗毒素、および毒素によって標的とされない他の株を産生する。例えば、株Ａ、株Ｂ、および株Ｃと標識された株を含む例示的な系では、株Ａは、株Ｂを死滅させる毒素を産生することができ、次に、株Ｂは、株Ｃを死滅させる毒素を産生することができ、株Ｃは、株Ａを死滅させる毒素を産生することができる。より多くの株が、系内に存在することができ、環状毒素系に存在するか、またはそれに関与しなくてもよい。本系は、３つの株系に限定されず、３つより多い株（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２株）から構成される可能性があり、各株は、抗毒素を有しない系内の別の株を死滅させる能力を有する毒素を産生し、それによって、環状系（４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上の株から成る）が許容される。さらに、系は、３つより多い株（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２株）から構成される可能性があり、この株のうちの少なくとも３つの株の各々は、抗毒素を有しない系内の別の株を死滅させる能力を有する毒素を産生し、それによって、系の他の株が三溶解または多溶解回路に従って制御されない一方で、少なくとも３つの株のうちの環状系が許容される。一態様では、このような系は、系内のその後の株が投与されるまでの一定時間、改変株を介して治療剤（複数可）の特定の送達を提供し、それによって、所望の場合に、空間および時間における特定の治療剤（複数可）の送達を分離することができる。
【０００６】
一部の実施形態では、株の各々は、治療用タンパク質または治療用タンパク質の一群を産生することができ、その発現は、同期溶解回路（ＳＬＣ）などの遺伝子回路によって制御され得る。一部の実施形態では、例示的なＳＬＣは、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／３３５５５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるものを含み得る。
【０００７】
一部の実施形態では、三溶解または多溶解系は、Ｌｕｘ  ＡＨＬクォーラム感知溶解回路と組み合わせて、十分に特徴付けられたＥ．ｃｏｌｉ特異的毒素−抗毒素系を利用し、それにより、細菌集団サイズの自己制限制御を提供するだけでなく、長期連続培養を可能にする周期的な「じゃんけん」様式で不要な株を正確に除去することを可能にする。三溶解または多溶解系は、系内のその後の株が投与されるまでの一定時間、改変株を介して治療用タンパク質（複数可）の特定の送達を確実にし、それによって、空間および時間における特定の治療用タンパク質（複数可）の送達を分離する。三溶解または多溶解系はまた、疾患部位に治療用タンパク質の特異的プロファイルを出力するように設計されてもよい。
【０００８】
別の態様では、三溶解または多溶解系はまた、商業的に価値のある化合物を合成する目的で、複数の株が特定の中間体を代謝または生成し得る、「分業」生態系の設計に適用することができる。追加的な類似の用途では、三溶解または多溶解分析系は、修復および感知用途を含むことができる。
【０００９】
さらに、回路安定性を確実にする方法としての三溶解または多溶解系の使用は、必ずしも治療用途に限定されないが、細菌における操作された遺伝子構築物の安定性が必要とされる任意の用途に適用可能であり得る。
【００１０】
本明細書において、一定の期間、一定の比（例えば、１：１：１）で少なくとも３つ（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０）の細菌株を共培養することを含む、クォーラム感知による共培養を維持する方法が提供されており、少なくとも３つの細菌株の各々は、溶解プラスミドおよび活性化プラスミドを含む。
【００１１】
本明細書においてまた、一定の期間、一定の比（例えば、１：１：１）で少なくとも３つ（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０）の細菌株を共培養することを含む、クォーラム感知による共培養を維持する方法が提供されており、少なくとも３つの細菌株の各々は、毒素系を含む。
【００１２】
本明細書においてまた、一定の期間、一定の比（例えば、１：１：１）で少なくとも３つ（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０）の細菌株を共培養することを含む、共培養を維持する方法が提供されており、少なくとも３つの細菌株の各々は、毒素系を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、少なくとも３つの細菌株は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはその細菌変異体である。一部の実施形態では、少なくとも３つの細菌株は、グラム陰性細菌株、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ株、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ株、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ株、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ株、またはＥ．ｃｏｌｉ株である。一部の実施形態では、少なくとも３つの細菌株は、グラム陽性細菌株、例えば、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ株、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ株、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ株、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株である。一部の実施形態では、少なくとも３つの細菌株は、すべてグラム陰性細菌株であるか、またはすべてグラム陽性株である。一部の実施形態では、少なくとも３つの細菌株のうちの少なくとも１つは、グラム陰性細菌株である。一部の実施形態では、少なくとも３つの細菌株のうちの少なくとも１つは、グラム陽性細菌株である。
【００１４】
一部の実施形態では、溶解プラスミドは、溶解遺伝子、活性化可能なプロモータ、および任意選択的に、レポータ遺伝子を含み、活性化プラスミドは、活性化遺伝子、溶解タグ、および任意選択的に、レポータ遺伝子を含む。一部の実施形態では、溶解遺伝子は、バクテリオファージΦＸ１７４からのＥである。一部の実施形態では、活性化可能なプロモータは、ＬｕｘＲ−Ｎ−アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）活性化可能ｌｕｘＩプロモータであり、活性化遺伝子は、ＬｕｘＩである。一部の実施形態では、活性化可能なプロモータは、ＲｐａＲ−Ｎ−アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）活性化可能ＲｐａＩプロモータであり、活性化遺伝子は、ＲｐａＩである。一部の実施形態では、レポータ遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、またはその変異体である。一部の実施形態では、溶解タグは、ｓｓｒＡ−ＬＡＡ溶解タグである。一部の実施形態では、少なくとも３つの細菌株の各々は、溶解プラスミドおよび活性化プラスミドを含む。一部の実施形態では、少なくとも３つの細菌株の各々は、異なるレポータ遺伝子を含む。
【００１５】
一部の実施形態では、共培養は、１：１：１の比率で接種される。一部の実施形態では、１つ以上の細菌株が、共培養され得る。一部の実施形態では、共培養は、使用される株、系の所望の特徴、結果の目標、および同類のものに基づいて、一定の比（例えば、１：１、１：５、１：１０、１：１：１、１：５：１、および同類のもの）で接種される。一部の実施形態では、系中の１つ以上の株は、系中の１つ以上の他の株よりも成長上の利点を有し得る。
【００１６】
一部の実施形態では、プラスミドは、少なくとも３つの細菌株のうちの少なくとも１つのゲノムに組み込まれる。
【００１７】
一部の実施形態では、共培養は、マイクロ流体装置内で起こる。一部の実施形態では、共培養は、細胞培養容器（例えば、細胞培養プレート、バイオリアクター）内で起こる。
【００１８】
一部の実施形態では、期間は、０〜７２時間（例えば、０〜７２；０〜６０時間；０〜４８時間；０〜３６時間；０〜２４時間；０〜１６時間；０〜１４時間；０〜１２時間；０〜１０時間；０〜８時間；０〜６時間；０〜４時間；０〜２時間；２〜７２時間；２〜６０時間；２〜４８時間；２〜３６時間；２〜２４時間；２〜１６時間；２〜１４時間；２〜１２時間；２〜１０時間；２〜８時間；２〜６時間；２〜４時間；４〜７２時間；４〜６０時間；４〜４８時間；４〜３６時間；４〜２４時間；４〜１６時間；４〜１４時間；４〜１２時間；４〜１０時間；４〜８時間；４〜６時間；６〜８時間；６〜１０時間；６〜１２時間；６〜１４時間；６〜１６時間；６〜１８時間；６〜２０時間；６〜２２時間；６〜２４時間；８〜１０時間；８〜１２時間；８〜１６時間；８〜２４時間；８〜３６時間；８〜４８時間；８〜６０時間；８〜７２時間；１〜２時間；１〜３時間；１〜４時間；１〜６時間；１〜８時間；１〜１０時間；１〜１２時間；１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、または７２時間）である。
【００１９】
一部の実施形態では、少なくとも３つの細菌株の共培養は、一定の溶解状態にあり、一定の溶解状態は、少なくとも３つの細菌株の成長および溶解の定常状態バランスを特徴とする。
【００２０】
本明細書において、溶解プラスミドおよび活性化プラスミドを含む細菌株が提供されており、溶解プラスミドは、溶解遺伝子、活性化可能なプロモータ、および任意選択的に、レポータ遺伝子を含み、活性化プラスミドは、活性化遺伝子、溶解タグ、および任意選択的に、レポータ遺伝子を含む。
【００２１】
一部の実施形態では、溶解遺伝子は、バクテリオファージΦＸ１７４からのＥである。
【００２２】
一部の実施形態では、活性化可能なプロモータは、ＬｕｘＲ−Ｎ−アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）活性化可能ｌｕｘＩプロモータであり、活性化遺伝子は、ＬｕｘＩである。
【００２３】
本明細書においてまた、本明細書に記載される細菌株のうちのいずれかを含む医薬組成物が提供されている。一部の実施形態では、医薬組成物は、原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）での薬物送達のために製剤化される。医薬組成物は、その意図された投与経路と適合性があるように製剤化される。投与経路の例には、経口または非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、吸入、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与が含まれる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」という文言は、薬剤投与と適合性がある、溶媒、分散媒体、コーティング、等張剤、および吸収遅延剤等を含む。補助的な活性化合物がまた、組成物に組み込まれ得る。
【００２４】
本明細書において、本明細書に記載されるような少なくとも３つの細菌株の共培養を含む系が提供されている。
【００２５】
本明細書において、本明細書に記載される系のうちのいずれかを含む薬物送達系が提供されている。本明細書において、本明細書に記載される系のうちのいずれかを含む定期的な薬物送達系が提供されている。
【００２６】
本明細書において、対象における疾患を治療するために、本明細書に記載されるような少なくとも３つの細菌株、または本明細書に記載されるような治療有効量の医薬組成物を、必要とする対象に投与することを含む、対象における疾患を治療するための方法が本明細書に提供されている。一部の実施形態において、投与することは、対象に少なくとも３つの細菌株の各々を連続的に投与することを含む。一部の実施形態において、投与することは、少なくとも３つの細菌株の各々を同時に投与することを含む。一部の実施形態では、少なくとも３つの細菌株の各々は、異なる治療剤を発現する。一部の実施形態において、疾患は、癌または感染症である。
【００２７】
本明細書において、本明細書に記載される系のうちのいずれかを含むマイクロ流体サンプルトラップが提供されている。
【００２８】
本明細書において、１つ以上のマイクロ流体サンプルトラップを含むマイクロ流体装置が提供されている。一部の実施形態では、マイクロ流体系は、マイクロ流体サンプルトラップと流体連通する少なくとも１つのチャネルをさらに含む。
【００２９】
本明細書において、成長環境で第１の期間、第１の細菌株を培養することと、第２の細菌株を成長環境に加え、かつ第２の期間、第２の細菌株を培養することと、第３の細菌株を成長環境に加え、かつ第３の期間、第３の細菌株を培養することと、を含む方法が提供されており、第１、第２、および第３の細菌株の各々は、毒素系を含み、第１の細菌株の毒素系は、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第３の毒素／第３の抗毒素対から第３の抗毒素を産生し、第１の細菌株は、第３の毒素を産生せず、第２の細菌株の毒素系は、第２の毒素／第２の抗毒素対、および第１の毒素／第１の抗毒素対から第１の抗毒素対を産生し、第２の細菌株は、第１の毒素を産生せず、第３の細菌株の毒素系は、第３の毒素／第３の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素を産生し、第３の細菌株は、第２の毒素を産生せず、そして任意選択的に、第１、第２、および第３の細菌株の各々は、活性化可能なプロモータの制御下にある溶解遺伝子を有する溶解プラスミドと、活性化遺伝子を有する活性化プラスミドであって、その発現が、クォーラム感知分子の蓄積を促進する、活性化プラスミドと、を含み、溶解遺伝子の活性化可能なプロモータおよび活性化遺伝子の発現の両方は、クォーラム感知分子によって活性化され得る。
【００３０】
実装形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。クォーラム感知分子は、第１、第２、および第３の細菌株の各々において異なっていてもよい。第１、第２、および第３の細菌株の各々の各クォーラム感知分子は、別の株の溶解遺伝子の活性化可能なプロモータに対して全くまたは実質的に影響を及ぼさない可能性がある。クォーラム感知分子は、第１、第２、および第３の細菌株の各々において同じであり得る。方法は、成長環境で１つ以上の追加の細菌株を培養または共培養することをさらに含むことができる。１つ以上の追加の細菌株の各々は、活性化可能なプロモータの制御下にある溶解遺伝子を有する溶解プラスミドと、活性化遺伝子を有する活性化プラスミドであって、その発現が、クォーラム感知分子の蓄積を促進する、活性化プラスミドと、を含むことができ、溶解遺伝子の活性化可能なプロモータおよび活性化遺伝子の発現の両方は、クォーラム感知分子によって活性化され得る。クォーラム感知分子は、第１、第２、第３、および１つ以上の追加の細菌株の各々において異なっていてもよい。第１、第２、第３、および１つ以上の追加の細菌株の各々の各各クォーラム感知分子は、成長環境で使用される別の細菌株の溶解遺伝子の活性化可能なプロモータに対して全くまたは実質的に影響を及ぼさない可能性がある。クォーラム感知分子は、第１、第２、第３、および１つ以上の追加の細菌株の各々において同じであり得る。１つ以上の追加の細菌株の各々は、毒素系を含み得る。第１の細菌株、第２の細菌株、第３の細菌株、および１つ以上の追加の細菌株の各々の毒素系は、ゲノム内で、プラスミド上で、複数のプラスミド上で、またはそれらの組み合わせ上で独立してコードされ得る。少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々の溶解プラスミドおよび活性化プラスミドは、同じプラスミドのコピーであってもよい。少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々の溶解プラスミドおよび活性化プラスミドは、異なるプラスミドであってもよい。少なくとも第１、第２、および第３の細菌株は、代謝的に競合的であり得る。少なくとも第１、第２、および第３の細菌株は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはその細菌変異体から選択され得る。少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々は、成長環境の別の株と比較して成長利点を有しない可能性がある。少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々において、溶解プラスミドは、溶解遺伝子、活性化可能なプロモータ、および任意選択的に、レポータ遺伝子を含むことができ、活性化プラスミドは、活性化遺伝子、任意選択的に、溶解タグ、および任意選択的に、レポータ遺伝子を含む。少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々における溶解遺伝子は、バクテリオファージΦＸ１７４からのＥであってもよい。少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々における活性化可能なプロモータは、ＬｕｘＲ−ＡＨＬ活性化可能なｌｕｘＩプロモータであってもよく、活性化遺伝子は、ＬｕｘＩであってもよい。少なくとも１つのレポータ遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、またはそれらの変異体をコー���する遺伝子から選択され得る。溶解タグは、ｓｓｒＡ−ＬＡＡ溶解タグであり得る。プラスミドのうちの少なくとも１つは、第１、第２、および第３の細菌株のうちの少なくとも１つのゲノムに組み込まれ得る。培養は、マイクロ流体装置内で起こり得る。培養は、バイオリアクター内で起こり得る。培養は、インビボで起こり得る。第１、第２、および第３の期間の各々は、約１２〜約７２時間の範囲であり得る。第１、第２、および第３の期間の各々は、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、および少なくとも９６時間から選択され得る。第１、第２、および第３の期間の各々は、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および９６時間から選択され得る。第１、第２、および第３の期間の各々は、独立して、約１時間〜約７２時間の範囲であり得る。第１、第２、および第３の期間の各々は、独立して、約１時間〜約４８時間の範囲であり得る。第１、第２、および第３の期間の各々は、独立して、約１時間〜約２４時間の範囲であり得る。第１、第２、および第３の期間の各々は、独立して、約１時間〜約１８時間の範囲であり得る。第１、第２、および第３の期間の各々は、独立して、約１時間〜約１２時間の範囲であり得る。第１、第２、および第３の期間の各々は、独立して、約１時間〜約６時間の範囲であり得る。第１、第２、および第３の期間の各々は、独立して、約１時間〜約３時間の範囲であり得る。第１、第２、および第３の期間は、連続的に発生し得る。第１および第２の期間、第２および第３の期間、または第１および第３の期間は、部分的または完全に重複していてもよい。第１、第２、および第３の細菌株のうちの１つ以上は、プロモータに動作可能に連結された異種核酸および／または異種タンパク質をコードしてもよい。プロモータは、活性化可能なプロモータとすることができる。プロモータは、クォーラム感知分子によって活性化され得る。プロモータは、構成的プロモータとすることができる。異種核酸および／または異種タンパク質は、治療剤とすることができる。治療剤は、阻害性核酸、サイトカイン、酵素、ペプチドホルモン、融合タンパク質、凝固因子、毒素、抗菌ペプチド、およびその抗体または抗原結合断片からなる群から選択され得る。阻害性核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはアンチセンスであり得る。
【００３１】
本明細書においてまた、少なくとも第１の細菌株と、第２の細菌株と、ｎ番目の細菌株と、を含むｎ個の細菌株を提供することと、成長環境で独立した期間、細菌株の各々を連続的に共培養することと、を含む方法が提供されており、第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々は、前の細菌株を有し、ｎは、少なくとも３とすることができ、ｎ個の株の各々は、活性化可能なプロモータの制御下にある溶解遺伝子を有する溶解プラスミドと、活性化遺伝子を有する活性化プラスミドであって、その発現が、クォーラム感知分子の蓄積を促進する、活性化プラスミドと、を含み、溶解遺伝子の活性化可能なプロモータおよび活性化遺伝子の発現の両方は、クォーラム感知分子によって活性化され得、ｎ個の細菌株の各々は、毒素系を含み、第２〜ｎ番目の細菌株の各々の毒素系は、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、第１の毒素は、前の細菌株、および前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効であり、第１の細菌株の毒素系は、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、第３の毒素は、ｎ番目の細菌株、およびｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である。
【００３２】
実装形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。ｎ個の細菌株の各々において、溶解プラスミドは、溶解遺伝子、活性化可能なプロモータ、および任意選択的に、レポータ遺伝子を含むことができ、活性化プラスミドは、活性化遺伝子、任意選択的に、溶解タグ、および任意選択的に、レポータ遺伝子を含む。ｎ個の細菌株の各々における溶解遺伝子は、バクテリオファージΦＸ１７４からのＥであってもよい。ｎ個の細菌株の各々における活性化可能なプロモータは、ＬｕｘＲ−ＡＨＬ活性化可能なｌｕｘＩプロモータであってもよく、活性化遺伝子は、ＬｕｘＩであってもよい。少なくとも１つのレポータ遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、またはそれらの変異体をコードする遺伝子から選択され得る。溶解タグは、ｓｓｒＡ−ＬＡＡ溶解タグであり得る。プラスミドのうちの少なくとも１つは、ｎ個の細菌株のうちの少なくとも１つのゲノムに組み込まれ得る。クォーラム感知分子は、ｎ個の細菌株の各々において異なっていてもよい。ｎ個の細菌株の各々の各クォーラム感知分子は、別の株の溶解遺伝子の活性化可能なプロモータに対して全くまたは実質的に影響を及ぼさない。クォーラム感知分子は、ｎ個の細菌株の各々において同じであり得る。ｎ個の細菌株の各々の溶解プラスミドおよび活性化プラスミドは、同じプラスミドのコピーであってもよい。ｎ個の細菌株の各々の溶解プラスミドおよび活性化プラスミドは、異なるプラスミドであってもよい。
【００３３】
本明細書においてまた、少なくとも第１の細菌株と、第２の細菌株と、ｎ番目の細菌株と、を含むｎ個の細菌株を提供することと、成長環境で独立した期間、細菌株の各々を連続的に共培養することと、を含む方法が提供されており、第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々は、前の細菌株を有し、ｎは、少なくとも３とすることができ、ｎ個の株の各々は、毒素系を含み、第２〜ｎ番目の細菌株の各々の毒素系は、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、第１の毒素は、前の細菌株、および前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効であり、第１の細菌株の毒素系は、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、第３の毒素は、ｎ番目の細菌株、およびｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である。ｎ個の細菌株は、代謝的に競合的であり得る。ｎ個の細菌株の各々は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはその細菌変異体から選択され得る。ｎ個の細菌株の各々は、成長環境の別の株と比較して成長利点を有しない可能性がある。ｎ個の細菌株の毒素系は、ゲノム内で、プラスミド上で、複数のプラスミド上で、またはそれらの組み合わせ上で独立してコードされ得る。培養は、マイクロ流体装置内で起こり得る。培養は、バイオリアクター内で起こり得る。培養は、インビボで起こり得る。独立した期間の各々は、約１２〜約７２時間の範囲であり得る。独立した期間の各々は、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、および少なくとも９６時間から選択され得る。独立した期間の各々は、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および９６時間から選択され得る。期間の各々は、独立して、約１時間〜約７２時間の範囲であり得る。期間の各々は、独立して、約１時間〜約４８時間の範囲であり得る。期間の各々は、独立して、約１時間〜約２４時間の範囲であり得る。期間の各々は、独立して、約１時間〜約１８時間の範囲であり得る。期間の各々は、独立して、約１時間〜約１２時間の範囲であり得る。期間の各々は、独立して、約１時間〜約６時間の範囲であり得る。期間の各々は、独立して、約１時間〜約３時間の範囲であり得る。期間のうちの１つ以上は、部分的または完全に重複していてもよい。ｎ個の細菌株のうちの１つ以上は、プロモータに動作可能に連結された異種核酸および／または異種タンパク質をコードしてもよい。プロモータは、活性化可能なプロモータとすることができる。活性化可能なプロモータは、クォーラム感知分子によって活性化され得る。プロモータは、構成的プロモータとすることができる。異種核酸および／または異種タンパク質は、治療剤とすることができる。治療剤は、阻害性核酸、サイトカイン、酵素、ペプチドホルモン、融合タンパク質、凝固因子、毒素、抗菌ペプチド、およびその抗体または抗原結合断片からなる群から選択され得る。阻害性核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはアンチセンスであり得る。第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々は、前の株の毒素系の第２の毒素を産生することができず、第１の細菌株は、ｎ番目の細菌株の毒素系の第４の毒素を産生することができない。
【００３４】
本明細書においてまた、溶解プラスミドおよび活性化プラスミドを含む細菌株が提供されており、溶解プラスミドは、溶解遺伝子と、活性化可能なプロモータと、任意選択的にレポータ遺伝子と、を含み、活性化プラスミドは、活性化遺伝子と、任意選択的に溶解タグと、任意選択的にレポータ遺伝子と、を含み、細菌株は、毒素系をさらに含み、毒素系は、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素対を産生し、細菌株は、第２の毒素を産生しない。
【００３５】
実装形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。溶解遺伝子は、バクテリオファージΦＸ１７４からのＥとすることができる。活性化可能なプロモータは、ＬｕｘＲ−ＡＨＬ活性化可能なｌｕｘＩプロモータであってもよく、活性化遺伝子は、ＬｕｘＩであってもよい。活性化遺伝子は、活性化可能なプロモータを直接的または間接的に活性化する分子をコードすることができる。活性化可能なプロモータを直接的または間接的に活性化する分子は、クォーラム感知分子であってもよい。溶解遺伝子は、活性化可能なプロモータに動作可能に連結され得る。レポータ遺伝子は、活性化可能なプロモータに動作可能に連結され得る。活性化プラスミドは、活性化可能なプロモータをさらに含むことができる。活性化プラスミドの活性化可能なプロモータは、溶解プラスミドの活性化可能なプロモータのコピーであってもよい。活性化遺伝子は、活性化プラスミドの活性化可能なプロモータに動作可能に連結され得る。活性化プラスミドのレポータ遺伝子は、活性化プラスミドの活性化可能なプロモータに動作可能に連結され得る。溶解タグは、活性化プラスミドの活性化可能なプロモータに動作可能に連結され得る。毒素系は、溶解プラスミドの活性化可能なプロモータに動作可能に連結され得る。溶解タグは、ｓｓｒＡ−ＬＡＡ溶解タグであり得る。溶解プラスミドのレポータ遺伝子、活性化プラスミドのレポータ遺伝子、またはその両方は、蛍光タンパク質であり得る。溶解プラスミドのレポータ遺伝子および活性化プラスミドのレポータ遺伝子は、異なる遺伝子であってもよい。
【００３６】
本明細書においてまた、毒素系を含む細菌株が提供されており、毒素系は、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素を産生し、細菌株は、第２の毒素を産生しない。
【００３７】
実装形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。細菌株は、プロモータに動作可能に連結された異種核酸および／または異種タンパク質をコードしてもよい。プロモータは、活性化可能なプロモータとすることができる。活性化可能なプロモータは、クォーラム感知分子によって活性化され得る。プロモータは、構成的プロモータとすることができる。異種核酸および／または異種タンパク質は、治療剤とすることができる。毒素系は、ゲノム内で、プラスミド上で、複数のプラスミド上で、またはそれらの組み合わせ上で独立してコードされ得る。細菌株は、治療剤をコードする核酸をさらに含み得る。治療剤は、阻害性核酸、サイトカイン、酵素、ペプチドホルモン、融合タンパク質、凝固因子、毒素、抗菌ペプチド、およびその抗体または抗原結合断片からなる群から選択され得る。治療剤は、治療用ポリペプチドとすることができる。治療剤は、標的細胞に対して細胞傷害性または細胞停止性であり得る。標的細胞は、癌細胞または感染細胞であり得る。
【００３８】
本明細書においてまた、本明細書に記載される細菌株のうちのいずれか１つ以上を含む医薬組成物が提供されている。医薬組成物は、原位置での薬物送達のために製剤化され得る。
【００３９】
本明細書においてまた、第１の溶解プラスミドと、第１の活性化プラスミドと、を含む第１の細菌株であって、第１の溶解プラスミドが、第１の溶解遺伝子、第１の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の活性化プラスミドが、第１の活性化遺伝子、任意選択的に第１の溶解タグ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の細菌株が、第１の毒素系をさらに含み、第１の毒素系が、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第３の毒素／第３の抗毒素対から第３の抗毒素を産生し、第１の細菌株が、第３の毒素を産生しない、第１の細菌株と、第２の溶解プラスミドと、第２の活性化プラスミドと、を含む第２の細菌株であって、第２の溶解プラスミドが、第２の溶解遺伝子、第２の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の活性化プラスミドが、第２の活性化遺伝子、任意選択的に第２の溶解タグ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の細菌株が、第２の毒素系をさらに含み、第２の毒素系が、第２の毒素／第２の抗毒素対、および第１の毒素／第１の抗毒素対から第１の抗毒素を産生し、第２の細菌株が、第１の毒素を産生しない、第２の細菌株と、第３の溶解プラスミドと、第３の活性化プラスミドと、を含む第３の細菌株であって、第３の溶解プラスミドが、第３の溶解遺伝子、第３の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の活性化プラスミドが、第３の活性化遺伝子、任意選択的に第３の溶解タグ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の細菌株が、第３の毒素系をさらに含み、第３の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素を産生し、第３の細菌株が、第２の毒素を産生しない、第３の細菌株と、を含む、系が提供されている。
【００４０】
本明細書においてまた、第１の毒素系を含む第１の細菌株であって、第１の毒素系が、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第３の毒素／第３の抗毒素対から第３の抗毒素を産生し、第１の細菌株が、第３の毒素を産生せず、第１の細菌株が、第１の溶解プラスミドおよび第１の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第１の溶解プラスミドが、第１の溶解遺伝子、第１の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の活性化プラスミドが、第１の活性化遺伝子、任意選択的に第１の溶解タグ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含む、第１の細菌株と、第２の毒素系を含む第２の細菌株であって、第２の毒素系が、第２の毒素／第２の抗毒素対、および第１の毒素／第１の抗毒素対から第１の抗毒素を産生し、第２の細菌株が、第１の毒素を産生せず、第２の細菌株が、第２の溶解プラスミドおよび第２の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第２の溶解プラスミドが、第２の溶解遺伝子、第２の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の活性化プラスミドが、第２の活性化遺伝子、任意選択的に第２の溶解タグ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含む、第２の細菌株と、第３の毒素系を含む第３の細菌株であって、第３の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素を産生し、第３の細菌株が、第２の毒素を産生せず、第３の細菌株が、第３の溶解プラスミドおよび第３の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第３の溶解プラスミドが、第３の溶解遺伝子、第３の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の活性化プラスミドが、第３の活性化遺伝子、任意選択的に第３の溶解タグ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含む、第３の細菌株と、を含む、系が提供されている。
【００４１】
いくつかの系の実装形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。系は、１つ以上の追加の細菌株をさらに含み得る。第１の毒素系、第２の毒素系、および第３の毒素系は、ゲノム内で、プラスミド上で、複数のプラスミド上で、またはそれらの組み合わせ上で独立してコードされ得る。
【００４２】
本明細書においてまた、少なくとも第１の細菌株と、第２の細菌株と、ｎ番目の細菌株と、を含むｎ個の細菌株を含む、系が提供されており、第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々は、前の細菌株を有し、ｎは、少なくとも３とすることができ、ｎ個の株の各々は、毒素系を含み、第２〜ｎ番目の細菌株の各々の毒素系は、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、第１の毒素は、前の細菌株、および前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効であり、第１の細菌株の毒素系は、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、第３の毒素は、ｎ番目の細菌株、およびｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である。
【００４３】
本明細書においてまた、少なくとも第１の細菌株と、第２の細菌株と、ｎ番目の細菌株と、を含むｎ個の細菌株を含む、系が提供されており、第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々は、前の細菌株を有し、ｎは、少なくとも３とすることができ、ｎ個の株の各々は、活性化可能なプロモータの制御下にある溶解遺伝子を有する溶解プラスミドと、活性化遺伝子を有する活性化プラスミドであって、その発現が、クォーラム感知分子の蓄積を促進する、活性化プラスミドと、を含み、溶解遺伝子の活性化可能なプロモータおよび活性化遺伝子の発現の両方は、クォーラム感知分子によって活性化され得、ｎ個の細菌株の各々は、毒素系を含み、第２〜ｎ番目の細菌株の各々の毒素系は、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、第１の毒素は、前の細菌株、および前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効であり、第１の細菌株の毒素系は、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、第３の毒素は、ｎ番目の細菌株、およびｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である。
【００４４】
いくつかの系の実装形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。ｎの値は、３であり得る。ｎの値は、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る。毒素系の各々は、ゲノム内で、プラスミド上で、複数のプラスミド上で、またはそれらの組み合わせ上で独立してコードされ得る。第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々は、前の株の毒素系の第２の毒素を産生することができず、第１の細菌株は、ｎ番目の細菌株の毒素系の第４の毒素を産生しない。
【００４５】
本明細書においてまた、第１の溶解プラスミドと、第１の活性化プラスミドと、を含む第１の細菌株であって、第１の溶解プラスミドが、第１の溶解遺伝子、第１の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の活性化プラスミドが、第１の活性化遺伝子、第１の溶解タグ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の細菌株が、第１の毒素系をさらに含み、第１の毒素系が、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第３の毒素／第３の抗毒素対から第３の抗毒素を産生し、第１の細菌株が、第３の毒素を産生しない、第１の細菌株を含む、第１の医薬組成物と、第２の溶解プラスミドと、第２の活性化プラスミドと、を含む第２の細菌株であって、第２の溶解プラスミドが、第２の溶解遺伝子、第２の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の活性化プラスミドが、第２の活性化遺伝子、第２の溶解タグ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の細菌株が、第２の毒素系をさらに含み、第２の毒素系が、第２の毒素／第２の抗毒素対、および第１の毒素／第１の抗毒素対から第１の抗毒素を産生し、第２の細菌株が、第１の毒素を産生しない、第２の細菌株を含む、第２の医薬組成物と、第３の溶解プラスミドと、第３の活性化プラスミドと、を含む第３の細菌株であって、第３の溶解プラスミドが、第３の溶解遺伝子、第３の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の活性化プラスミドが、第３の活性化遺伝子、第３の溶解タグ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の細菌株が、第３の毒素系をさらに含み、第３の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素を産生し、第３の細菌株が、第２の毒素を産生しない、第３の細菌株を含む、第３の医薬組成物と、を含む、キットが提供されている。
【００４６】
本明細書においてまた、第１の毒素系を含む第１の細菌株であって、第１の毒素系が、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第３の毒素／第３の抗毒素対から第３の抗毒素を産生し、第１の細菌株が、第３の毒素を産生せず、第１の細菌株が、第１の溶解プラスミドおよび第１の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第１の溶解プラスミドが、第１の溶解遺伝子、第１の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の活性化プラスミドが、第１の活性化遺伝子、任意選択的に第１の溶解タグ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含む、第１の細菌株を含む、第１の医薬組成物と、第２の毒素系を含む第２の細菌株であって、第２の毒素系が、第２の毒素／第２の抗毒素対、および第１の毒素／第１の抗毒素対から第１の抗毒素を産生し、第２の細菌株が、第１の毒素を産生せず、第２の細菌株が、第２の溶解プラスミドおよび第２の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第２の溶解プラスミドが、第２の溶解遺伝子、第２の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の活性化プラスミドが、第２の活性化遺伝子、任意選択的に第２の溶解タグ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含む、第２の細菌株を含む、第２の医薬組成物と、第３の毒素系を含む第３の細菌株であって、第３の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素を産生し、第３の細菌株が、第２の毒素を産生せず、第３の細菌株が、第３の溶解プラスミドおよび第３の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第３の溶解プラスミドが、第３の溶解遺伝子、第３の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の活性化プラスミドが、第３の活性化遺伝子、任意選択的に第３の溶解タグ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含む、第３の細菌株を含む、第３の医薬組成物と、を含む、キットが提供されている。
【００４７】
いくつかのキットの実装形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。第１の毒素系、第２の毒素系、および第３の毒素系は、ゲノム内で、プラスミド上で、複数のプラスミド上で、またはそれらの組み合わせ上で独立してコードされ得る。キットは、第１、第２、第３、および／または１つ以上の追加の医薬組成物中の１つ以上の追加の細菌株をさらに含み得る。
【００４８】
本明細書においてまた、少なくとも第１の細菌株と、第２の細菌株と、ｎ番目の細菌株と、を含むｎ個の細菌株を含む、キットが提供されており、第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々は、前の細菌株を有し、ｎは、少なくとも３とすることができ、ｎ個の株の各々は、毒素系を含み、第２〜ｎ番目の細菌株の各々の毒素系は、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、第１の毒素は、前の細菌株、および前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効であり、第１の細菌株の毒素系は、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、第３の毒素は、ｎ番目の細菌株、およびｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である。
【００４９】
本明細書においてまた、少なくとも第１の細菌株と、第２の細菌株と、ｎ番目の細菌株と、を含むｎ個の細菌株を含む、キットが提供されており、第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々は、前の細菌株を有し、ｎは、少なくとも３とすることができ、ｎ個の株の各々は、活性化可能なプロモータの制御下にある溶解遺伝子を有する溶解プラスミドと、活性化遺伝子を有する活性化プラスミドであって、その発現が、クォーラム感知分子の蓄積を促進する、活性化プラスミドと、を含み、溶解遺伝子の活性化可能なプロモータおよび活性化遺伝子の発現の両方は、クォーラム感知分子によって活性化され得、ｎ個の細菌株の各々の溶解プラスミドは、毒素系を含み、第２〜ｎ番目の細菌株の各々の溶解プラスミドの毒素系は、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、第１の毒素は、前の細菌株、および前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効であり、第１の細菌株の溶解プラスミドの毒素系は、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、第３の毒素は、ｎ番目の細菌株、およびｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である。
【００５０】
いくつかのキットの実装形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。ｎの値は、３であり得る。ｎの値は、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る。
【００５１】
本明細書においてまた、本明細書に記載の系またはキットのうちのいずれか１つ以上を含む、薬物送達系が提供されている。
【００５２】
本明細書においてまた、本明細書に記載の系またはキットのうちのいずれか１つ以上を含む、定期的な薬物送達系が提供されている。
【００５３】
本明細書においてまた、疾患を治療することを必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、第１の溶解プラスミドと、第１の活性化プラスミドと、を含む第１の細菌株であって、第１の溶解プラスミドが、第１の溶解遺伝子、第１の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の活性化プラスミドが、第１の活性化遺伝子、任意選択的に第１の溶解タグ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の細菌株が、第１の毒素系をさらに含み、第１の毒素系が、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第３の毒素／第３の抗毒素対から第３の抗毒素を産生し、第１の細菌株が、第３の毒素を産生しない、第１の細菌株と、第２の溶解プラスミドと、第２の活性化プラスミドと、を含む第２の細菌株であって、第２の溶解プラスミドが、第２の溶解遺伝子、第２の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の活性化プラスミドが、第２の活性化遺伝子、任意選択的に第２の溶解タグ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の細菌株が、第２の毒素系をさらに含み、第２の毒素系が、第２の毒素／第２の抗毒素対、および第１の毒素／第１の抗毒素対から第１の抗毒素を産生し、第２の細菌株が、第１の毒素を産生しない、第２の細菌株と、第３の溶解プラスミドと、第３の活性化プラスミドと、を含む第３の細菌株であって、第３の溶解プラスミドが、第３の溶解遺伝子、第３の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の活性化プラスミドが、第３の活性化遺伝子、任意選択的に第３の溶解タグ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の細菌株が、第３の毒素系をさらに含み、第３の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素を産生し、第３の細菌株が、第２の毒素を産生しない、第３の細菌株と、の治療有効量の各々を対象に投与することを含む、方法が提供されている。
【００５４】
本明細書においてまた、疾患を治療することを必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、第１の溶解プラスミドと、第１の活性化プラスミドと、を含む第１の細菌株であって、第１の溶解プラスミドが、第１の溶解遺伝子、第１の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の活性化プラスミドが、第１の活性化遺伝子、任意選択的に第１の溶解タグ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の細菌株が、第１の毒素系をさらに含み、第１の毒素系が、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第３の毒素／第３の抗毒素対から第３の抗毒素を産生し、第１の細菌株が、第３の毒素を産生しない、第１の細菌株を含む、第１の医薬品と、第２の溶解プラスミドと、第２の活性化プラスミドと、を含む第２の細菌株であって、第２の溶解プラスミドが、第２の溶解遺伝子、任意選択的に第２の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の活性化プラスミドが、第２の活性化遺伝子、第２の溶解タグ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の細菌株が、第２の毒素系をさらに含み、第２の毒素系が、第２の毒素／第２の抗毒素対、および第１の毒素／第１の抗毒素対から第１の抗毒素を産生し、第２の細菌株が、第１の毒素を産生しない、第２の細菌株を含む、第２の医薬品と、第３の溶解プラスミドと、第３の活性化プラスミドと、を含む第３の細菌株であって、第３の溶解プラスミドが、第３の溶解遺伝子、第３の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の活性化プラスミドが、第３の活性化遺伝子、任意選択的に第３の溶解タグ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の細菌株が、第３の毒素系をさらに含み、第３の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素を産生し、第３の細菌株が、第２の毒素を産生しない、第３の細菌株を含む、第３の医薬品と、の治療有効量の各々を対象に投与することを含む、方法が提供されている。
【００５５】
本明細書においてまた、疾患を治療することを必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、第１の毒素系を含む第１の細菌株であって、第１の毒素系が、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第３の毒素／第３の抗毒素対から第３の抗毒素を産生し、第１の細菌株が、第３の毒素を産生せず、第１の細菌株が、第１の溶解プラスミドおよび第１の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第１の溶解プラスミドが、第１の溶解遺伝子、第１の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の活性化プラスミドが、第１の活性化遺伝子、任意選択的に第１の溶解タグ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含む、第１の細菌株と、第２の毒素系を含む第２の細菌株であって、第２の毒素系が、第２の毒素／第２の抗毒素対、および第１の毒素／第１の抗毒素対から第１の抗毒素を産生し、第２の細菌株が、第１の毒素を産生せず、第２の細菌株が、第２の溶解プラスミドおよび第２の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第２の溶解プラスミドが、第２の溶解遺伝子、第２の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の活性化プラスミドが、第２の活性化遺伝子、任意選択的に第２の溶解タグ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含む、第２の細菌株と、第３の毒素系を含む第３の細菌株であって、第３の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素を産生し、第３の細菌株が、第２の毒素を産生せず、第３の細菌株が、第３の溶解プラスミドおよび第３の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第３の溶解プラスミドが、第３の溶解遺伝子、第３の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の活性化プラスミドが、第３の活性化遺伝子、任意選択的に第３の溶解タグ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含む、第３の細菌株と、の治療有効量の各々を対象に投与することを含む、方法が提供されている。
【００５６】
本明細書においてまた、疾患を治療することを必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、第１の毒素系を含む第１の細菌株であって、第１の毒素系が、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第３の毒素／第３の抗毒素対から第３の抗毒素を産生し、第１の細菌株が、第３の毒素を産生せず、第１の細菌株が、第１の溶解プラスミドおよび第１の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第１の溶解プラスミドが、第１の溶解遺伝子、第１の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の活性化プラスミドが、第１の活性化遺伝子、任意選択的に第１の溶解タグ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含む、第１の細菌株を含む、第１の医薬組成物と、第２の毒素系を含む第２の細菌株であって、第２の毒素系が、第２の毒素／第２の抗毒素対、および第１の毒素／第１の抗毒素対から第１の抗毒素を産生し、第２の細菌株が、第１の毒素を産生せず、第２の細菌株が、第２の溶解プラスミドおよび第２の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第２の溶解プラスミドが、第２の溶解遺伝子、第２の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の活性化プラスミドが、第２の活性化遺伝子、任意選択的に第２の溶解タグ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含む、第２の細菌株を含む、第２の医薬組成物と、第３の毒素系を含む第３の細菌株であって、第３の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素を産生し、第３の細菌株が、第２の毒素を産生せず、第３の細菌株が、第３の溶解プラスミドおよび第３の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第３の溶解プラスミドが、第３の溶解遺伝子、第３の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の活性化プラスミドが、第３の活性化遺伝子、任意選択的に第３の溶解タグ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含む、第３の細菌株を含む、第３の医薬組成物と、の治療有効量の各々を対象に投与することを含む、方法が提供されている。
【００５７】
いくつかの方法の実装形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。投与することは、第１、第２、および第３の細菌株、または第１、第２、および第３の医薬組成物の各々を、連続的に対象に投与することを含み得る。投与することは、第１、第２、および第３の医薬組成物の各々を同時に投与することを含み得、第１、第２、および第３の医薬組成物の各々は、第１、第２、および第３の細菌株を放出するための異なる放出プロファイルを有する。第１、第２、および第３の細菌株の各々は、異なる治療剤を発現することができる。
【００５８】
本明細書においてまた、疾患を治療することを必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、少なくとも第１の細菌株と、第２の細菌株と、ｎ番目の細菌株と、を含む、治療有効量のｎ個の細菌株の各々を対象に投与することを含み、第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々は、前の細菌株を有し、ｎは、少なくとも３とすることができ、ｎ個の株の各々は、毒素系を含み、第２〜ｎ番目の細菌株の各々の毒素系は、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、第１の毒素は、前の細菌株、および前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効であり、第１の細菌株の毒素系は、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、第３の毒素は、ｎ番目の細菌株、およびｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である、方法が提供されている。
【００５９】
本明細書においてまた、疾患を治療することを必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、少なくとも第１の細菌株と、第２の細菌株と、ｎ番目の細菌株と、を含む、治療有効量のｎ個の細菌株の各々を対象に投与することを含み、第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々は、前の細菌株を有し、ｎは、少なくとも３とすることができ、ｎ個の株の各々は、活性化可能なプロモータの制御下にある溶解遺伝子を有する溶解プラスミドと、活性化遺伝子を有する活性化プラスミドであって、その発現が、クォーラム感知分子の蓄積を促進する、活性化プラスミドと、を含み、溶解遺伝子の活性化可能なプロモータおよび活性化遺伝子の発現の両方は、クォーラム感知分子によって活性化され得、ｎ個の細菌株の各々の溶解プラスミドは、毒素系を含み、第２〜ｎ番目の細菌株の各々の溶解プラスミドの毒素系は、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、第１の毒素は、前の細菌株、および前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効であり、第１の細菌株の溶解プラスミドの毒素系は、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、第３の毒素は、ｎ番目の細菌株、およびｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である、方法が提供されている。
【００６０】
いくつかの方法の実装形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。ｎの値は、３であり得る。ｎの値は、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る。
【００６１】
本明細書においてまた、疾患を治療することを必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、各々がｎ個の細菌株のうちの少なくとも１つを含み、ｎ個の細菌株が、少なくとも第１の細菌株と、第２の細菌株と、ｎ番目の細菌株と、を含む、治療有効量のｍ個の医薬組成物の各々を対象に投与することを含み、第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々は、前の細菌株を有し、ｎは、少なくとも３とすることができ、ｎ個の株の各々は、毒素系を含み、第２〜ｎ番目の細菌株の各々の毒素系は、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、第１の毒素は、前の細菌株、および前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効であり、第１の細菌株の毒素系は、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、第３の毒素は、ｎ番目の細菌株、およびｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である、方法が提供されている。
【００６２】
本明細書においてまた、疾患を治療することを必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、各々がｎ個の細菌株のうちの少なくとも１つを含み、ｎ個の細菌株が、少なくとも第１の細菌株と、第２の細菌株と、ｎ番目の細菌株と、を含む、治療有効量のｍ個の医薬組成物の各々を対象に投与することを含み、第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々は、前の細菌株を有し、ｎは、少なくとも３とすることができ、ｎ個の株の各々は、活性化可能なプロモータの制御下にある溶解遺伝子を有する溶解プラスミドと、活性化遺伝子を有する活性化プラスミドであって、その発現が、クォーラム感知分子の蓄積を促進する、活性化プラスミドと、を含み、溶解遺伝子の活性化可能なプロモータおよび活性化遺伝子の発現の両方は、クォーラム感知分子によって活性化され得、ｎ個の細菌株の各々の溶解プラスミドは、毒素系を含み、第２〜ｎ番目の細菌株の各々の溶解プラスミドの毒素系は、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、第１の毒素は、前の細菌株、および前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効であり、第１の細菌株の溶解プラスミドの毒素系は、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、第３の毒素は、ｎ番目の細菌株、およびｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である、方法が提供されている。
【００６３】
いくつかの方法の実装形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。値ｎは、３であり得る。ｎの値は、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る。値ｍ＝ｎ。毒素系の各々は、ゲノム内で、プラスミド上で、複数のプラスミド上で、またはそれらの組み合わせ上で独立してコードされ得る。第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々は、前の株の毒素系の第２の毒素を産生せず、第１の細菌株は、ｎ番目の細菌株の毒素系の第４の毒素を産生しない。投与することは、ｎ個の細菌株またはｍ個の医薬組成物の各々を、連続的に対象に投与することを含み得る。投与することは、ｍ個の医薬組成物の各々を同時に投与することを含み得、ｍ個の医薬組成物の各々は、第１、第２、および第３の細菌株を放出するための異なる放出プロファイルを有する。第１、第２、および第３の細菌株の各々は、異なる治療剤を発現することができる。疾患は、癌または感染症であり得る。感染症は、以下からなる群から選択される感染因子によって引き起こされ得る：Ｃａｍｐｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ。癌は、グリア芽腫、扁平上皮癌、乳癌、結腸癌、肝細胞癌、黒色腫、神経芽腫、膵臓癌、および前立腺癌からなる群から選択され得る。
【００６４】
本明細書に記載される方法、細菌株、医薬組成物、系、またはキットのうちのいずれか１つ以上の一部の実装形態において、細菌株のうちの１つ以上は、治療剤を発現し得る。本明細書に記載される方法、細菌株、医薬組成物、系、またはキットのうちのいずれか１つ以上の一部の実装形態において、細菌株のうちの１つ以上は、阻害性核酸、サイトカイン、酵素、ペプチドホルモン、融合タンパク質、凝固因子、毒素、抗菌ペプチド、およびその抗体または抗原結合断片からなる群から選択される治療剤を発現する。
【００６５】
本明細書においてまた、成長環境で第１の期間、第１の細菌株を培養することと、第２の細菌株を成長環境に加え、かつ第２の期間、第２の細菌株を培養することと、第３の細菌株を成長環境に加え、かつ第２の期間、第３の細菌株を培養することと、を含む方法が提供されており、第１、第２、および第３の細菌株の各々は、毒素系を含み、第１の細菌株の毒素系は、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第３の毒素／第３の抗毒素対から第３の抗毒素を産生し、第１の細菌株は、第３の毒素を産生せず、第２の細菌株の毒素系は、第２の毒素／第２の抗毒素対、および第１の毒素／第１の抗毒素対から第１の抗毒素対を産生し、第２の細菌株は、第１の毒素を産生せず、第３の細菌株の毒素系は、第３の毒素／第３の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素を産生し、第３の細菌株は、第２の毒素を産生せず、毒素系は、プラスミド、複数のプラスミド上にコードされてもよく、宿主ゲノム内に組み込まれてもよく、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００６６】
実装形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。第１、第２、および第３の細菌株の各々は、活性化可能なプロモータの制御下にある溶解遺伝子を有する溶解プラスミドと、活性化遺伝子を有する活性化プラスミドであって、その発現が、クォーラム感知分子の蓄積を促進する、活性化プラスミドと、を含むことができ、溶解遺伝子の活性化可能なプロモータおよび活性化遺伝子の発現の両方は、クォーラム感知分子によって活性化され得、クォーラム感知分子は、第１、第２、および第３の細菌株の各々で異なっていてもよく、または異なっていなくてもよく、第１、第２、および第３の細菌株の各々の各クォーラム感知分子は、別の株の溶解遺伝子の活性化可能なプロモータに対して何らかの効果を有していてもよく、または有していなくてもよい。第１、第２、および第３の細菌株の溶解プラスミドの各々は、かかる細菌株の毒素系を含有するプラスミドであってもよく、または第１、第２、および第３の細菌株の活性化プラスミドの各々は、かかる細菌株の毒素系を含有するプラスミドであってもよく、または各細菌株の毒素系は、ゲノム内に組み込まれてもよい。
【００６７】
本明細書においてまた、培養中の第１の期間、ｎ個の細菌株のうちの第１の細菌株を培養することと、ｎ個の細菌株のうちの第２の細菌株を培養物に加え、かつ第２の期間、第２の細菌株を培養することと、ｎ個の細菌株のうちのその他の細菌株の各々を培養物に加え、かつある期間、各そのような細菌株を培養することと、を含む、ｎ個の細菌株を培養する方法が提供されており、ｎは、３以上の整数であってもよく、ｎ個の細菌株の各々のプラスミドは、毒素系を含み、第１の細菌株のプラスミドの毒素系は、第１の毒素／第１の抗毒素対、およびｎ番目の毒素／ｎ番目の抗毒素対からｎ番目の抗毒素を産生し、第１の細菌株は、ｎ番目の毒素を産生せず、ｎ個の細菌株中のその他の細菌株のうちの各ｍ番目のプラスミドの毒素系（ｍは、組｛２、３、．．．、ｎ｝の要素であり得る）は、ｍ番目の毒素／ｍ番目の抗毒素対、および（ｍ−１）番目の毒素／（ｍ−１）番目の抗毒素対から（ｍ−１）番目の抗毒素を産生する。
【００６８】
本明細書に記載されるいくつかの方法の実装形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。ｎ個の細菌株の各々は、活性化可能なプロモータの制御下にある溶解遺伝子を有する溶解プラスミドと、活性化遺伝子を有する活性化プラスミドであって、その発現が、クォーラム感知分子の蓄積を促進する、活性化プラスミドと、を含むことができ、溶解遺伝子の活性化可能なプロモータおよび活性化遺伝子の発現の両方は、クォーラム感知分子によって活性化され得、クォーラム感知分子は、ｎ個の細菌株の各々で異なっていてもよく、または異なっていなくてもよく、ｎ個の細菌株の各々の各クォーラム感知分子は、ｎ個の細菌株の別の株の溶解遺伝子の活性化可能なプロモータに対して何らかの効果を有していてもよく、または有していなくてもよい。ｎ個の株の溶解プラスミドの各々は、このような細菌株の毒素系を含有するプラスミドであり得る。ｎ個の細菌株の各々は、ペイロードを産生することができる。ｎ個の細菌株の各々は、異なるペイロードを産生することができる。ｎ個の細菌株の各々は、同じペイロードを産生することができる。各ペイロードは、治療剤であり得る。ｍ番目の細菌株のペイロードは、（ｍ−１）番目の細菌株の基質に直接的または間接的に作用することによってｍ番目の基質を産生し、第１の細菌株のペイロードは、ｎ個の細菌株が培養される環境に存在する基質に作用する。ｎの値は、４であり得る。ｎの値は、５であり得る。ｎの値は、６であり得る。方法は、培養物中の１つ以上の追加の細菌株を培養または共培養することをさらに含むことができる。１つ以上の追加の細菌株の各々は、活性化可能なプロモータの制御下にある溶解遺伝子を有する溶解プラスミドと、活性化遺伝子を有する活性化プラスミドであって、その発現が、クォーラム感知分子の蓄積を促進する、活性化プラスミドと、を含むことができ、溶解遺伝子の活性化可能なプロモータおよび活性化遺伝子の発現の両方は、クォーラム感知分子によって活性化され得、クォーラム感知分子は、第１、第２、第３、および１つ以上の追加の細菌株の各々で異なっていてもよく、第１、第２、第３、および１つ以上の追加の細菌株の各々の各クォーラム感知分子は、培養物で使用される別の細菌株の溶解遺伝子の活性化可能なプロモータに対して、全く、または実質的に効果を有しない可能性がある。１つ以上の追加の細菌株の各々の溶解プラスミドは、毒素系を含み得る。少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々の溶解プラスミドおよび活性化プラスミドは、同じプラスミドであってもよい。少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々の溶解プラスミドおよび活性化プラスミドは、別個のプラスミドであってもよい。少なくとも第１、第２、および第３の細菌株は、代謝的に競合的であり得る。少なくとも第１、第２、および第３の細菌株は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはその細菌変異体から選択され得る。少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々は、培養物中の別の株と比較して成長利点を有しない可能性がある。少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々において、溶解プラスミドは、溶解遺伝子、活性化可能なプロモータ、および任意選択的に、レポータ遺伝子を含み、活性化プラスミドは、活性化遺伝子、溶解タグ、および任意選択的に、レポータ遺伝子を含む。少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々における溶解遺伝子は、バクテリオファージΦＸ１７４からのＥであってもよい。少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々における活性化可能なプロモータは、ＬｕｘＲ−ＡＨＬ活性化可能なｌｕｘＩプロモータであってもよく、活性化遺伝子は、ＬｕｘＩであってもよい。少なくとも１つのレポータ遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、またはそれらの変異体をコードする遺伝子から選択され得る。溶解タグは、ｓｓｒＡ−ＬＡＡ溶解タグであり得る。プラスミドのうちの少なくとも１つは、第１、第２、および第３の細菌株のうちの少なくとも１つのゲノムに組み込まれ得る。培養は、指定された成長環境で起こり得る。培養は、マイクロ流体装置内で起こり得る。培養は、バイオリアクター内で起こり得る。培養は、インビボで起こり得る。細菌株の各々は、治療ペイロードを産生することができ、培養は、治療ペイロードを必要とするヒトまたは動物患者において起こり得る。第１、第２、および第３の期間の各々は、約１２〜約７２時間の範囲であり得る。第１、第２、および第３の期間の各々は、約１時間〜約ｎ時間の範囲であり得る。第１、第２、および第３の期間の各々は、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、および少なくとも９６時間から選択され得る。ｎ個の期間の各々は、部分的または完全に重複していてもよい。ｎ個の細菌株は、一緒に培養され得る。各ｎ個の細菌株の各々は、各ｍ番目の細菌株が（ｍ−１）番目の期間の経過後に培養物に加えられ得るように、培養物に連続的に加えられる。第１、第２、および第３の期間は、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および９６時間から選択され得る。
【００６９】
本明細書においてまた、共培養を維持する方法が提供されており、方法は、少なくとも３つの細菌株を共培養することを含み、少なくとも３つの細菌株の各々が、活性化可能なプロモータの制御下にある溶解遺伝子を有する溶解プラスミドと、活性化遺伝子を有する活性化プラスミドであって、その発現が、クォーラム感知分子の蓄積を促進する、活性化プラスミドと、を含むことができ、溶解遺伝子の活性化可能なプロモータおよび活性化遺伝子の発現の両方は、クォーラム感知分子によって活性化され得、クォーラム感知分子は、少なくとも３つの細菌株の各々で異なっていてもよく、少なくとも３つの細菌株の各々の各クォーラム感知分子は、別の株の溶解遺伝子の活性化可能なプロモータに対して、全く、または実質的に効果を有さず、溶解プラスミドは、毒素／抗毒素系を含む。
【００７０】
本明細書に記載されるいくつかの方法の実装形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を有し得る。毒素／抗毒素系は、別の株の毒素／抗毒素対および異なる抗毒素を産生することができる。少なくとも３つの細菌株の各々の溶解プラスミドおよび活性化プラスミドは、同じプラスミドであってもよい。少なくとも３つの細菌株の各々の溶解プラスミドおよび活性化プラスミドは、別個のプラスミドであってもよい。少なくとも３つの株は、代謝的に競合的であり得る。少なくとも３つの細菌株は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはその細菌変異体から選択され得る。少なくとも３つの株の各々は、別の株と比較して成長利点を有しない。少なくとも３つの株の各々において、溶解プラスミドは、溶解遺伝子、活性化可能なプロモータ、および任意選択的に、レポータ遺伝子を含み得、活性化プラスミドは、活性化遺伝子、任意選択的に、溶解タグ、および任意選択的に、レポータ遺伝子を含み得る。少なくとも３つの株における溶解遺伝子は、バクテリオファージΦＸ１７４からのＥとすることができる。活性化可能なプロモータは、ＬｕｘＲ−ＡＨＬ活性化可能なｌｕｘＩプロモータであってもよく、活性化遺伝子は、ＬｕｘＩであってもよい。少なくとも１つのレポータ遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、またはそれらの変異体をコードする遺伝子から選択され得る。溶解タグは、ｓｓｒＡ−ＬＡＡ溶解タグであり得る。共培養は、少なくとも３つの細菌株の各々に対して１：１：１の比率で接種され得る。プラスミドのうちの少なくとも１つは、少なくとも３つの株のうちの少なくとも１つのゲノムに組み込まれ得る。培養が起こると、マイクロ流体装置が発生する可能性がある。期間は、１２〜７２時間であり得る。期間は、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、および少なくとも９６時間から選択され得る。期間は、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および９６時間から選択され得る。少なくとも３つの株の共培養は、一定の溶解状態にあり得、一定の溶解状態は、少なくとも３つの細菌株の成長および溶解の定常状態バランスを特徴とする。
【００７１】
本明細書に記載される方法、系、キット、細菌株、および組成物は、いくつかの利点を提供することができる。第１に、三溶解または多溶解系は、系内のその後の株が投与されるまでの一定時間、改変株を介して治療用タンパク質（複数可）の特定の送達を確実にし得、それによって所望の場合に、空間および時間における特定の治療用タンパク質（複数可）の送達を分離する。この能力は、他の方法では、治療に対する改変細菌アプローチで利用できないであろう。なぜなら、それらは、疾患部位を長期間にわたって定着させ、結果として、別の株が疾患環境に導入されたかどうかにかかわらず、単一の治療が送達される可能性があり、また、以前に導入された株によって使い果たされた病気の環境におけるリソースの減少により、将来の株の定着能力を低下させるからである。
【００７２】
第２に、三溶解または多溶解系はまた、疾患部位に治療用タンパク質の特異的プロファイルを出力するように設計されてもよい。例えば、３つの株によって産生されるタンパク質、およびそれらが疾患部位を定着させるのを許容する時間は、適用の文脈に応じて調節され得る。
【００７３】
第３に、三溶解または多溶解系は、株内の回路構成要素の安定性を確実にすることができる。これは、三溶解サイクルのその後の株が、その集団のメンバーが回路機構を変異させた場合であっても、疾患部位に取り込まれた以前の株を死滅させ、および除去することができるため、達成可能である。例えば、株Ａは、投与され、所望される期間、疾患部位を定着させることが許可され、集団のメンバーは、溶解遺伝子（または回路の機能に重要な任意の他の遺伝子）を変異させた。次いで、疾患部位への株Ｂの導入は、株Ｂによって放出された毒素に対する免疫を担持しないため、集団の変異したメンバーを含む環境からの株Ａの脱離を可能にする。
【００７４】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を持つ。本発明で使用するための方法および材料が本明細書に記載されており、当技術分野で公知のその他の適切な方法および材料がまた使用され得る。材料、方法、および実施例は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。本明細書に記述されるすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、およびその他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾がある場合、定義を含む現在の仕様が制御することになる。
【００７５】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１Ａ】図１は、連続培養における活性集団に対する迅速で、かつ信頼できる制御を提供する戦略を示している。図１Ａは、株Ａが一対の毒素抗毒素系を使用して、株Ｂに対する改変された選択的利点を有する、２つの株系の概略図である。株Ａは、毒素Ａ、抗毒素Ａ、および抗毒素Ｂを産生し、一方で、株Ｂは、毒素Ｂおよび抗毒素Ｂのみを産生する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、マイクロ流体細胞チャンバ内の図１Ａからの株Ｂの例示的な成長を示している。パルス負荷（灰色の網掛け領域）による株Ａの導入後、株Ｂの崩壊が進行する一方で、株Ａの分率は指数関数的に増加している。プロットの下の画像は、示された時点での位相コントラストおよび蛍光の合成を示している。ＡＵ：任意の蛍光単位（バックグラウンドを除く）。
【図１Ｃ】図１Ｃは、クォーラム感知同期溶解回路と統合された毒素抗毒素系の例示的な遺伝的図である。回路は、毒素、抗毒素系、および活性化／レポータプラスミドを含有する溶解プラスミドを含有する。ＬｕｘＩの一過性の産生は、最終的に、ＬｕｘＩ、レポータ蛍光タンパク質（ｓｆＧＦＰ、ＣＦＰ、またはｍＫＡｔｅ２）および溶解遺伝子Ｘ１７４Ｅの産生を制御するＰｌｕｘＩプロモータから転写を促進することによって正のフィードバックループを開始する、ＬｕｘＲを活性化するために必要なクォーラム閾値を超えるＡＨＬの蓄積をもたらす。この系のＬｕｘＲは、ネイティブのＬｕｘＲプロモータによって促進される。
【図１Ｄ】図１Ｄは、例示的な２つの株集団ダイナミクスの概略図であり、同期した溶解回路を統合して、集団サイズを制御している。同期溶解回路の自己限定的な挙動、ならびに一次株が最も低い集団にある場合の毒素放出の同期により、より迅速な株の接収が可能になるはずである。
【図１Ｅ】図１Ｅは、振動子回路によって生成される相コントラスト、ＧＦＰ、およびＣＦＰ蛍光の複合体を示すフィルムストリップを示している。同期溶解回路の統合（下部ストリップ）は、同期溶解回路の株（上部ストリップ）と比較して、マイクロ流体トラップの完全な取り込みを達成するのに必要な時間を短縮する。同期溶解株のｓｆＧＦＰおよびＣＦＰ蛍光レポータは、ＡＨＬの産生によって促進され、クォーラム閾値に達した場合にのみ発現されることに留意されたい。
【図２Ａ】図２は、改変された株間で一方向にサイクルする３つの株系の例示的な図を示している。図２Ａは、自己溶解Ｅ．ｃｏｌｉの３つの株系の例示的な概略図である。各株は、それぞれ独自の毒素−抗毒素対を産生し、一方で、次の株の抗毒素も産生する。これら３つの株はすべて、同じＬｕｘ  ＡＨＬクォーラム感知系を利用して、蛍光レポータタンパク質の発現と自己限定的な同期溶解を促進する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、各株の溶解ＯＤ６００を示す、３つの株の例示的なバッチ培養成長曲線を示している。すべての株は、同じ希釈密度から、同じ成長条件（ｎ＝３）で開始された。
【図２Ｃ】図２Ｃは、同じ成長条件下（ｎ＝１５）で二層マイクロ流体チャンバで測定された３つの株系の例示的な溶解期間を示している。
【図２Ｄ】図２Ｄは、初期濃度の２０％の優性株および８０％の感受性株のマイクロ流体装置に播種された２つの株の共培養インキュベーションを示している。株の接収は、優性株がマイクロ流体チャンバを接収する状態で、一方向に進む。
【図２Ｅ】図２Ｅは、二層マイクロ流体チャンバ内の株１による株の接収を示す、４０パーセントの株１、６０パーセントの株２の初期密度で播種された共培養静止画を示している。
【図２Ｆ】図２Ｆは、二層マイクロ流体チャンバ内の株２による株の接収を示す、４０パーセントの株２、６０パーセントの株３の初期密度で播種された共培養静止画を示している。
【図２Ｇ】図２Ｇは、二層マイクロ流体チャンバ内の株３による株の接収を示す、４０パーセントの株３、６０パーセントの株１の初期密度で播種された共培養静止画を示している。
【図２Ｈ】図２Ｈ、図２Ｉ、および図２Ｊは、各々、マイクロ流体チャンバ内での株の同期溶解および株の接収を示す、図Ｅ〜図Ｇに示されるマイクロ流体実験の蛍光発現の時系列を示している。同期溶解株の蛍光レポータは、ＡＨＬの産生によって促進され、クォーラム閾値に達した場合にのみ発現される。
【図２Ｉ】図２Ｈ、図２Ｉ、および図２Ｊは、各々、マイクロ流体チャンバ内での株の同期溶解および株の接収を示す、図Ｅ〜図Ｇに示されるマイクロ流体実験の蛍光発現の時系列を示している。同期溶解株の蛍光レポータは、ＡＨＬの産生によって促進され、クォーラム閾値に達した場合にのみ発現される。
【図２Ｊ】図２Ｈ、図２Ｉ、および図２Ｊは、各々、マイクロ流体チャンバ内での株の同期溶解および株の接収を示す、図Ｅ〜図Ｇに示されるマイクロ流体実験の蛍光発現の時系列を示している。同期溶解株の蛍光レポータは、ＡＨＬの産生によって促進され、クォーラム閾値に達した場合にのみ発現される。
【図３Ａ】図３は、３つの株の共培養ダイナミクス、モデルおよび実験結果を示している。図３Ａは、３つの株が同時に共培養され、推定パラメータの下で、３つの株が、１つの株がトラップを追い越すまで各サイクルを１回行うことを実証する、コリシンモデルの時系列ダイナミクスを示している。３つのグラフは、株、コリシン、およびＡＨＬの経時的な濃度を示している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、３つの株のすべてがほぼ等しい比率でロードされる３株共培養実験からの単一トラップのＧＦＰ、ＣＦＰ、およびＲＦＰ蛍光発現の時間トレースを示している。
【図３Ｃ】図３Ｃは、図３Ｂに示すマイクロ流体チャンバの位相コントラスト、ＧＦＰ、ＣＦＰ、およびＲＦＰのビデオ静止画を示している。
【図３Ｄ】図３Ｄは、図３Ｃの実験からの単一のトラップのＧＦＰ、ＣＦＰ、およびＲＦＰ蛍光発現の時間トレースを示しており、単一の連続的な中断のない実行において、３つの株すべてを通るサイクルを示している。図３Ｄは、コリシンモデルの時系列ダイナミクスを示しており、これは、３つの株が同時に共培養され、かつ推定パラメータの下で、一定の播種を前提として、３つの株が無期限にサイクルすることを示している。
【図３Ｅ】図３Ｅは、３つの株間の安定した遷移を示す３つの株系の制限サイクルを示している。また、妥当な値の入力パラメータはすべて、安定した制限サイクルに収束するという結果をもたらす。
【図３Ｆ】図３Ｆは、３つの改変された株すべてがほぼ等しい比率で同時にロードされる、１６００個のマイクロ流体トラップにわたって観察された株の接収イベントを表す図を示している。矢印は、３つの株間で起こり得る各遷移イベントを表し、矢印の色は、各矢印について観察された遷移の数を示している。
【図４】図４は、一部の実施形態によって使用され得る例示的な毒素を示している。
【図５Ａ】図５は、９６個のウェルプレートリーダー実験における、非溶解株におけるコリシンおよび免疫活性の例示的な検証を示している。図５Ａは、ｍＫａｔｅ２発現プラスミドを有するＭＧ１６５５野生型対照株を示している。ＯＤ６００およびＲＦＰ蛍光発現の経時的トレース。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＧＦＰ発現プラスミドを有するＭＧ１６５５野生型対照株を示している。ＯＤ６００およびＧＦＰ蛍光発現（ＲＦＵ）の経時的トレース。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＯＤ６００およびＧＦＰ蛍光発現のＭＧ１６５５株１（ｐＭＬ０００１）経時的トレースを示している。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ＯＤ６００およびＲＦＰ蛍光発現のＭＧ１６５５株２経時的トレースを示している。
【図５Ｅ】図５Ｅは、ＯＤ６００およびＲＦＰ蛍光発現のＭＧ１６５５株３経時的トレースを示している。
【図５Ｆ】図５Ｆは、コリシンＥ３とＭＧ１６５５株１の共インキュベーションを示している。ＯＤ６００、ＧＦＰ、およびＲＦＰ蛍光（ＲＦＵ）発現の経時的トレースにより、株１がコリシンＥ３の存在下で成長できることを検証する。
【図５Ｇ】図５Ｇは、コリシンＥ７とＭＧ１６５５株２の共インキュベーションを示している。ＯＤ６００、およびＧＦＰ蛍光（ＲＦＵ）発現の経時的トレースにより、株１がコリシンＥ７の存在下で成長できることを検証する。
【図５Ｈ】図５Ｈは、コリシンＶとＭＧ１６５５株３（ｐＭＬ０００４）の共インキュベーションを示している。ＯＤ６００、およびＲＦＰ蛍光発現の経時的トレースにより、株３がコリシンＶの存在下で成長できることを検証する。
【図５Ｉ】図５Ｉ、図５Ｊ、および図５Ｋは、ＭＧ１６５５野生型対照株とコリシンＥ３、Ｅ７、およびＶの共インキュベーションを示し、ＭＧ１６５５野生型成長の阻害におけるコリシンの有効性を示している。ＯＤ６００、ＧＦＰおよびＲＦＰ蛍光（ＡＵ）の経時的トレース。
【図５Ｊ】図５Ｉ、図５Ｊ、および図５Ｋは、ＭＧ１６５５野生型対照株とコリシンＥ３、Ｅ７、およびＶの共インキュベーションを示し、ＭＧ１６５５野生型成長の阻害におけるコリシンの有効性を示している。ＯＤ６００、ＧＦＰおよびＲＦＰ蛍光（ＡＵ）の経時的トレース。
【図５Ｋ】図５Ｉ、図５Ｊ、および図５Ｋは、ＭＧ１６５５野生型対照株とコリシンＥ３、Ｅ７、およびＶの共インキュベーションを示し、ＭＧ１６５５野生型成長の阻害におけるコリシンの有効性を示している。ＯＤ６００、ＧＦＰおよびＲＦＰ蛍光（ＡＵ）の経時的トレース。
【図６−１】図６は、他の株の毒素産生による１つの株の成長阻害を示すために、例示的なマイクロ流体実験から取られたビデオ静止画を示している。この実験では、株１は、毒素１、抗毒素１、および抗毒素３を産生する。株３は、毒素３、抗毒素３、および抗毒素２を産生する。株１が放出する毒素による成長の阻害は、株３の正常な成長（シナリオ２）と株１が近接しているときの成長速度（シナリオ３）を比較すると明らかである。（シナリオ４）に示すように、毒素の活性は近接度に依存することが実証されており、２つの株が近接していないとき、株３の成長は影響を受けない。    図６Ａは、マイクロ流体トラップにおける株１単独の成長を示すシナリオ１である。図６Ｂは、マイクロ流体トラップにおける株３単独の成長を示すシナリオ２である。図６Ｃは、株１および株３が互いに近接しているときの、成長ならびに株１および株３を示すシナリオ３である。株３の成長は、株１によって阻害される。図６Ｄは、株１および株３が互いに近接していないときの、成長ならびに株１および株３を示すシナリオ４である。
【図６−２】図６Ｅおよび図６Ｆは、ＧＦＰおよびＲＦＰにおける様々なシナリオの蛍光軌道を示している。
【図６−３】図６Ｅおよび図６Ｆは、ＧＦＰおよびＲＦＰにおける様々なシナリオの蛍光軌道を示している。
【図７Ａ】図７は、プレートリーダーおよびマイクロ流体実験の両方における溶解株の例示的な特徴付けを示している。マイクロ流体実験における透過光の振動の振幅は、溶解イベントにおける表現型の違いによって変化し得る。例えば、株１の溶解イベントは、より大きな力で起こり、トラップから細胞溶解物を放出する。しかしながら、株３の溶解イベントにより、マイクロ流体トラップ内に細胞溶解物がさらに蓄積される。図７Ａは、３つの溶解株の溶解のプレートリーダーＯＤ６００、および対応する蛍光の発現を示している（ｎ＝３）。
【図７Ｂ】図７Ｂは、最大値（実線）に正規化された株１蛍光強度と、マイクロ流体トラップ領域（１００×８０×２μｍ）の最大値（破線）に正規化された透過光強度とのオーバーレイを示している。
【図７Ｃ】図７Ｃは、最大値（実線）に正規化された株２蛍光強度と、マイクロ流体トラップ領域（１００×８０×２μｍ）の最大値（破線）に正規化された透過光強度とのオーバーレイを示している。
【図７Ｄ】図７Ｄは、最大値（実線）に正規化された株３蛍光強度と、マイクロ流体トラップ領域（１００×８０×２μｍ）の最大値（破線）に正規化された透過光強度とのオーバーレイを示している。
【図８Ａ】図８は、例示的な３つの株の三溶解系の決定論的モデリングを示している。図８Ａは、Ａｃの関数としてのマップモードの非ゼロ固有値の大きさを示している。振動への遷移は、λ２３＝１であるときに、Ａｃ＝１．２５で発生する。
【図８Ｂ】図８Ｂは、Ｈｏｐｆ分岐のスイッチングサイクルごとの溶解イベントの数を示している。
【図８Ｃ】図８Ｃは、マップモデルのＨｏｐｆ分岐図を示している。
【図８Ｄ】図８Ｄ、図８Ｅ、図８Ｆ、および図８Ｇは、各々、振動レジームにおける系パラメータに対するスイッチングサイクルごとの溶解イベントといくつかの溶解イベントとの間の間隔の依存性を評価するパラメータスイープを示している。
【図８Ｅ】図８Ｄ、図８Ｅ、図８Ｆ、および図８Ｇは、各々、振動レジームにおける系パラメータに対するスイッチングサイクルごとの溶解イベントといくつかの溶解イベントとの間の間隔の依存性を評価するパラメータスイープを示している。
【図８Ｆ】図８Ｄ、図８Ｅ、図８Ｆ、および図８Ｇは、各々、振動レジームにおける系パラメータに対するスイッチングサイクルごとの溶解イベントといくつかの溶解イベントとの間の間隔の依存性を評価するパラメータスイープを示している。
【図８Ｇ】図８Ｄ、図８Ｅ、図８Ｆ、および図８Ｇは、各々、振動レジームにおける系パラメータに対するスイッチングサイクルごとの溶解イベントといくつかの溶解イベントとの間の間隔の依存性を評価するパラメータスイープを示している。
【図９】図９は、分析された４つの別個の３株共培養実験からのおよそ１６００個の個々の例示的なマイクロ流体トラップを示している。マイクロ流体装置には、３つすべての改変株が同時にロードされ、その結果、各マイクロ流体トラップの初期播種細胞濃度が変動した。株間の遷移を示すトラップを記録し、上の表に示した。色（灰色、黒色、淡灰色）は、それぞれ、株１、株２、および株３に対応し、実験の所与の時点におけるトラップ内の優性株を表している。  図９Ａは、経時的な株１（灰色）から株３（淡灰色）への遷移イベントを示している。図９Ｂは、経時的な株２（黒色）から株１（灰色）への遷移イベントを示している。図９Ｃは、経時的な株３（淡灰色）から株２（黒色）への遷移イベントを示している。図９Ｄは、経時的な株１（灰色）から株３（淡灰色）、株２（黒色）への遷移イベントを示している。図９Ｅは、経時的な株２（黒色）から株１（灰色）、株３（淡灰色）への遷移イベントを示している。
【図１０】図１０は、一部の実施形態に従って使用され得る各プラスミド上に存在する例示的な株および遺伝子発現構築物を示している。
【図１１】図１１は、一部の実施形態によって使用され得る例示的なプラスミドを示している。
【図１２Ａ】図１２は、多株集団におけるプラスミド安定化毒素−抗毒素モジュールの機能の例示的な拡張を示している。図１２Ａは、モノクローナル集団において、プラスミド安定化毒素−抗毒素モジュールが、抗毒素遺伝子を変異させたかまたは喪失した子孫細胞の殺傷を可能にすることを示している。ｎ＞１株の系に拡張すると、ＴＡモジュールを含む株は、自己安定化機能を維持しつつ、抗毒素を持たない株を死滅させる能力が付加される。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、各株が自身の毒素−抗毒素対を産生し、同時に以下の株の抗毒素も産生し、連続的な株阻害を可能にすることを示す図である。株Ｒは、毒素１、抗毒素１、および抗毒素２を含有していた。株Ｐは、毒素３、抗毒素３、抗毒素１を含有していた。株Ｓは、毒素２、抗毒素２、抗毒素３を含有していた。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ＲＰＳ株の一般的なプラスミド図である。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、改変されたＲＰＳおよび野生型Ｅ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５株（ｎ＝３）のバッチ培養成長速度のプロットである。すべての株は、同じ希釈密度から、同じ成長条件で開始された。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、感受性に対して優性な１：２の初期比で播種した株共培養の経時的なおおよその集団分率を示す一組の棒グラフである（ｎ＝８）。上から下へ：（１）株Ｒ（淡灰色）は、株Ｓ（黒色）を阻害し、（２）株Ｓ（黒色）は、株Ｐ（灰色）を阻害し、（３）株Ｐ（灰色）は、株Ｒ（淡灰色）を阻害する。
【図１２Ｆ】図１２Ｆは、相コントラスト、ＧＦＰ、ＣＦＰ、およびＲＦＰ蛍光の合成物を示す蛍光顕微鏡画像である。左から右へ：（１）株Ｒ（淡灰色）は、株Ｓ（濃い灰色）を阻害し、（２）株Ｓ（濃い灰色）は、株Ｐ（灰色）を阻害し、（３）株Ｐ（灰色）は、株Ｒ（淡灰色）を阻害する。
【図１３Ａ】図１３は、改変されたじゃんけんの生態学の例示的な開発を示している。図１３Ａは、ＳＬＣの統合を伴う例示的な２つの株集団ダイナミクスの概略図である。描写は、株の接収イベント中の連続同期集団溶解である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、クォーラム感知同期溶解回路およびＴＡモジュールの例示的な遺伝的図である。第１のプラスミドは、ｌｕｘＩプロモータによって促進されるＸ１７４Ｅ溶解タンパク質と、対応する毒素／抗毒素／抗毒素遺伝子とを含有していた。第２の「活性化」プラスミドは、その天然プロモータｐＬｕｘＩによって促進されるｌｕｘＩおよびＬｕｘＲ遺伝子を含有していた。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、各株が、それ自体の毒素−抗毒素対を産生する一方で、次の株の抗毒素も産生することを示す概略図である。これら３つの株はすべて、同じＬｕｘ−ＡＨＬクォーラム感知系を利用して、蛍光レポータタンパク質の発現と自己限定的な同期溶解を促進した。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、１：１比の株１から株２に播種された共培養の蛍光発現の時系列およびビデオ静止画を示し、マイクロ流体チャンバ内の株１による株の接収を示している。
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、１：１比の株２から株３に播種された共培養の蛍光発現の時系列およびビデオ静止画を示し、マイクロ流体チャンバ内の株２による株の接収を示している。
【図１３Ｆ】図１３Ｆは、１：１比の株３から株１に播種された共培養の蛍光発現の時系列およびビデオ静止画を示し、マイクロ流体チャンバ内の株３による株の接収を示している。
【図１３Ｇ】図１３Ｇは、３株系の制限サイクルを図示したプロットであり、初期株比率に関係なく、３株間の安定した遷移への収束を示している。
【図１３Ｈ】図１３Ｈは、３つの改変された株すべてが同時に培養されたときに観察された株の接収イベントを表す図である。矢印は、３つの株間で起こり得る各遷移イベントを表し、矢印の陰影は、各矢印について観察された遷移の数を示す。
【図１４Ａ】図１４は、抗生物質の非存在下での回路機能の例示的な延長を示している。図１４Ａは、成長フェーズと溶解との間の振動が、回路機能の喪失による制御されていない成長に遷移する系を示す、シナリオ１の概略図である。シナリオ２は、系の次の株の追加によって制御されていない成長への移行が防止される、３つの株系から構成されるサイクルを示している。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、株の各々の蛍光発現の時間トレースであり、経時的な回路機能の喪失を示している。図１４Ａのシナリオ１に従い、各株をカナマイシンの非存在下で３２時間培養した。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、各株（ｎ＝１６）の機能の喪失までの時間を示すボックスプロットである。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、図１４Ａのシナリオ２に従って、株を、株２および株１から開始して連続的にロードした。上−単一のトラップのＧＦＰ、ＣＦＰ、およびＲＦＰ蛍光発現の時間トレースであり、単一の連続的な中断のない実行において、３つの株すべてを通るサイクルを示している。下−ビデオ静止画は、示された時点での位相コントラストおよび蛍光の合成を示している。ＡＵ：任意の蛍光単位（バックグラウンドを除く）。
【図１５Ａ】図１５は、変異可能な遺伝子回路に対する例示的なＲＰＳ効果を示している。図１５Ａは、単一溶解イベントの持続時間の間、株１が９６個のウェルプレート中で培養され、１２時間ごとに経過する、系を示すシナリオ１を示している。シナリオ２は、単一溶解イベントの持続時間の間、株１が９６個のウェルプレート中で培養され、１２時間ごとに経過する、系を示している。３回の経過ごとに、ＲＰＳ系の次の株が、培養物に同時に加えられる。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、図１５Ａの各シナリオ（ｎ＝１２）の１２回の経過の持続時間における並列比較を示している。淡灰色の四角は、機能している同期集団の溶解を表す。灰色の四角は、同期集団の溶解の喪失を表す。濃い灰色の四角は、後に回復した同期集団の溶解の喪失を表す。さらに、各シナリオからの１２個の対応するサンプルを、Ｘ１７４Ｅ溶解タンパク質およびＬｕｘカセットを含有する１０００ベース対領域にわたってサンガー配列決定した。チェックマークは正しい配列を示し、（Ｘ）は、誤った配列を示し、（ｉ）は、決定的でない配列決定リードを示している。すべての株は、同じ希釈密度から、同じ成長条件で開始された。
【図１６Ａ】図１６は、９６個のウェルプレートリーダー実験における、非溶解株におけるコリシン活性の例示的な検証を示している。図１６Ａは、ＭＧ１６５５野生型Ｅ．ｃｏｌｉに対するＯＤ６００の経時的トレースである。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、コリシンＶ産生株の濾過された溶解物と共インキュベーションされたＭＧ１６５５野生型Ｅ．ｃｏｌｉに対するＯＤ６００の経時的トレースである。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、コリシンＥ７産生株の濾過された溶解物と共インキュベーションされたＭＧ１６５５野生型Ｅ．ｃｏｌｉに対するＯＤ６００の経時的トレースである。
【図１６Ｄ】図１６Ｄは、コリシンＥ３産生株の濾過された溶解物と共インキュベーションされたＭＧ１６５５野生型Ｅ．ｃｏｌｉに対するＯＤ６００の経時的トレースである。
【図１７Ａ】図１７は、プレートリーダーおよびマイクロ流体実験の両方における株の例示的な特徴付けを示している。図１７Ａは、３つの溶解株の溶解のプレートリーダーＯＤ６００、および対応する蛍光の発現のプロットを示している（ｎ＝３）。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、最大値（実線）に正規化された株１蛍光強度と、マイクロ流体トラップ領域（１００×８０×１．２μｍ）の最大値（破線）に正規化された透過光強度とのオーバーレイのプロットである。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、最大値（実線）に正規化された株２蛍光強度と、マイクロ流体トラップ領域（１００×８０×１．２μｍ）の最大値（破線）に正規化された透過光強度とのオーバーレイのプロットである。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、最大値（実線）に正規化された株３蛍光強度と、マイクロ流体トラップ領域（１００×８０×１．２μｍ）の最大値（破線）に正規化された透過光強度とのオーバーレイのプロットである。
【図１８Ａ】図１８は、マイクロ流体装置における株対の例示的な共培養インキュベーションを示している。図１８Ａは、各対の株が、優性（太字）と感受性（斜字）の比率が１：１で共培養されたことを示す棒グラフである（ｎ＝３５）。各株ペアについて、優性株は、培養領域の１００％で感受性株を置換した。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、各対の株が、優性（太字）と感受性（斜字）の比率が１：５で共培養されたことを示す棒グラフである（ｎ＝３９６）。各株ペアについて、優性株は、培養領域の１００％、１００％、および９２％で感受性株を置換した。
【図１９】図１９は、系が新しい細胞の導入に閉鎖されていると仮定した、コリシンモデルの例示的な時系列ダイナミクスを示している。３つのグラフは、株３が最初により高い濃度で開始され、新しい細胞の導入がない場合の株、コリシン、およびＡＨＬの経時的な濃度を示している。
【図２０Ａ】図２０は、例示的な３つの株の共培養ダイナミクスを示している。図２０Ａは、３つの株のすべてがほぼ等しい比率でロードされる３株共培養実験からの単一トラップのＧＦＰ、ＣＦＰ、およびＲＦＰ蛍光発現の時間トレースである。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、図２０Ａに示すマイクロ流体チャンバの位相コントラスト、ＧＦＰ、ＣＦＰ、およびＲＦＰのビデオ静止画を示している。
【図２１】図２１は、一部の実施形態に従って使用され得る例示的なプラスミドを示している。
【図２２】図２２は、一部の実施形態によって使用され得る例示的な毒素を示している。
【図２３】図２３は、一部の実施形態に従って使用され得る例示的な株を示している。
【図２４Ａ】図２４は、γＡ＝１、γＣ＝０．２、α＝１、β＝１、δ＝０．０２、Ａｃ＝１、ε＝０．００１のコリシンモデルの例示的なダイナミクスを示している。図２４Ａは、例示的な時系列を示している。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、Ｐｉ、Ｑｉ、Ｒｉの例示的なマップを示している。
【図２５Ａ】図２５は、γＡ＝１０、γＣ＝１、α＝１０、β＝１、δ＝０．０２、Ａｃ＝１００、ε＝０．００１のコリシンモデルの例示的なダイナミクスを示している。図２５Ａは、例示的な時系列を示している。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、Ｐｉ、Ｑｉ、Ｒｉの例示的なマップを示している。
【図２６Ａ】図２６は、γＡ＝１０、γＣ＝１、α＝１０、β＝２０、δ＝０．０１、Ａｃ＝１００、ε＝０．０２のコリシンモデルの例示的なダイナミクスを示している。図２６Ａは、例示的な時系列を示している。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、Ｐｉ、Ｑｉ、Ｒｉの例示的なマップを示している。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
集団制御は、合成生物学における強力なツールである。微生物コミュニティの制御は、過去１０年間でいくつかの系で達成されている。今まで、集団制御は、２つの系に分類され得る。１つ目は、自己限定集団密度を示す単一株コミュニティが関与する。これらの系の背後にある機構は、ＬｕｘＩ／ＬｕｘＲ  ＡＨＬ系などの細菌クォーラム感知系を利用する。細胞が一定の密度まで成長し、「クォーラム」に達すると、毒性または溶解誘導タンパク質の生成が誘導される。第２のカテゴリは、２つの株集団として分類され得、その株は、捕食者−被食者行動、振動行動を示すか、または２つの株間の一定の比率を維持する。単一の株系と同様に２つの株系は、いずれかの株における毒素または溶解タンパク質の産生を促進するために、クォーラム感知に依存する。例えば、捕食者被食者モデルでは、捕食者が存在するときのみ、被食者における毒性タンパク質の産生を促進するために、二方向クォーラム感知系が使用される。２つの株系の他の機構としては、ＬｕｘおよびＬａｓなどの直交式クォーラム感知系を使用して、２つの株間の振動性溶解イベントを促進し、その後、時間の経過とともに集団密度で振動することが含まれる。
【００７８】
合成生物学の進歩により、原理証明の細菌回路の武器が生み出され、治療からバイオ生産まで、様々な用途に活用され得る。ほとんどの用途で統一的な課題は、操作された細菌に対して高い突然変異率をもたらす選択的な圧力の存在である。一般的な戦略は、単一細胞における有害な変異に対する固定時間を増やすことを目的としたクローニング技術を開発することである。本明細書において、生態学的相互作用によって誘導される相補的アプローチが提供されており、それにより、環状集団制御が、細胞内遺伝子回路の機能を安定化するように操作される。
【００７９】
過去２０年にわたり合成生物学者は、個々の細胞の活性を制御するための高度な分子回路を開発した（例えば、Ｍ．Ｂ．Ｅｌｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｌｅｉｂｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，３３５（２０００）、Ｔ．Ｓ．Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｃ．Ｒ．Ｃａｎｔｏｒ，Ｊ．Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，３３９（２０００）、Ｊ．Ｈａｓｔｙ，Ｄ．ＭｃＭｉｌｌｅｎ，Ｊ．Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ４２０，２２４（２００２）、Ｌ．Ｙｏｕ，Ｒ．Ｓ．Ｃｏｘ  ＩＩＩ，Ｒ．Ｗｅｉｓｓ，Ｆ．Ｈ．Ａｒｎｏｌｄ，Ｎａｔｕｒｅ  ４２８，８６８（２００４）、Ｐ．Ｅ．Ｐｕｒｎｉｃｋ，Ｒ．Ｗｅｉｓｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １０，４１０（２００９）、Ｈ．Ｈ．Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４６０，８９４（２００９）、Ｓ．Ａｕｓｌａｎｄｅｒ，Ｄ．Ａｕｓｌａｎｄｅｒ，Ｍ．Ｍｕｌｌｅｒ，Ｍ．Ｗｉｅｌａｎｄ，Ｍ．Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ４８７，１２３（２０１２）、Ｐ．Ｓｉｕｔｉ，Ｊ．Ｙａｚｂｅｋ，Ｔ．Ｋ．Ｌｕ，Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１，４４８（２０１３）、Ｔ．Ｈ．Ｓｅｇａｌｌ−Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｅ．Ｄ．Ｓｏｎｔａｇ，Ｃ．Ａ．Ｖｏｉｇｔ，Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３６，３５２（２０１８）を参照）。時間の経過とともに、このような系は必然的に、暴走突然変異につながる進化選択圧力のために機能を失う（例えば、Ｆ．Ｋ．Ｂａｌａｇａｄｄｅ，Ｌ．Ｙｏｕ，Ｃ．Ｌ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｆ．Ｈ．Ａｒｎｏｌｄ，Ｓ．Ｒ．Ｑｕａｋｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９，１３７（２００５）を参照）。この課題に対するアプローチには、宿主ゲノムへの組み換え要素の統合（例えば、Ｍ．Ｙ．Ｐｅｒｅｄｅｌｃｈｕｋ，Ｇ．Ｎ．Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｇｅｎｅ  １８７，２３１（１９９７）を参照）、またはプラスミド安定化要素（例えば、Ｋ．Ｇｅｒｄｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６，１４０２（１９８８）を参照）、合成「キルスイッチ」（例えば、Ｃ．Ｔ．Ｃｈａｎ，Ｊ．Ｗ．Ｌｅｅ，Ｄ．Ｅ．Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｃ．Ｊ．Ｂａｓｈｏｒ，Ｊ．Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １２，８２（２０１６）を参照）、もしくは合成アミノ酸（例えば、Ｄ．Ｊ．Ｍａｎｄｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５１８，５５（２０１５）、Ａ．Ｊ．Ｒｏｖｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５１８，８９（２０１５）、Ｎ．Ｏｓｔｒｏｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５３，８１９（２０１６）、Ｊ．Ｗ．Ｌｅｅ，Ｃ．Ｔ．Ｃｈａｎ，Ｓ．Ｓｌｏｍｏｖｉｃ，Ｊ．Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｐ．１（２０１８）を参照）の使用が含まれる。安定化要素は変異への進行を延長することができるが、進化は、必然的に安定化要素を無効にする（例えば、Ｆ．Ｋ．Ｂａｌａｇａｄｄｅ，Ｌ．Ｙｏｕ，Ｃ．Ｌ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｆ．Ｈ．Ａｒｎｏｌｄ，Ｓ．Ｒ．Ｑｕａｋｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９，１３７（２００５）を参照）。これは特に、抗生物質の送達が困難である場合（例えば、Ｗ．Ｃ．Ｒｕｄｅｒ，Ｔ．Ｌｕ，Ｊ．Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ��３３，１２４８（２０１１）、Ｍ．Ａ．Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ，Ｊ．Ａ．Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，Ｗ．Ａ．Ｌｉｍ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５，１７９ｐｓ７（２０１３）、Ｄ．Ｔ．Ｒｉｇｌａｒ，Ｐ．Ａ．Ｓｉｌｖｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １６，２１４（２０１８）、Ｍ．Ｏ．Ｄｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５３６，８１（２０１６）、Ａ．Ｐ．Ｔｅｉｘｅｉｒａ，Ｍ．Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４７，５９（２０１７）、Ｂ．Ｐ．Ｌａｎｄｒｙ，Ｊ．Ｊ．Ｔａｂｏｒ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ５（２０１７）を参照）、またはプラスミド機能の中断が特に問題がある場合（例えば、Ｊ．Ｓｈｏｎｇ，Ｍ．Ｒ．Ｊ．Ｄｉａｚ，Ｃ．Ｈ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，７９８（２０１２）を参照）のインビボでの用途のケースに当てはまる。本明細書には、単一細胞レベルでの遺伝子改変を補完するような様式で遺伝子回路機能を安定化するために、小さな生態系をどのように改変することができるかが記載されている。安定化要素を単一の株内に収容する代わりに、安定性の構成要素は、１つの株の暴走変異が安定化生態学を失敗させないように、生態系の異なる亜集団に分離される。
【００８０】
過去１０年間、合成生物学の分野は、単一細胞の改変から集団全体の改変へと進化してきた。本明細書では、以前には達成されていないが、長期間にわたって連続的にサイクルすることができる、３つの株（またはそれ以上）の集団制御系および方法が記載されている。現在、この三溶解または多溶解系は、多集団ダイナミクス制御（セル内の回路ではなく、生態系内の回路）の新しいパラダイムを示しており、改変された合成系に興味深い新しい可能性を開く。これらの多株系は、単一細胞または単一集団の改変によって以前は不可能であった可能性のある複雑な相互作用を科学者が達成することを可能にし得る。
【００８１】
本明細書において、多株の「三溶解」または「多溶解」微生物系に関する方法、材料および回路／装置／系が開示される。「じゃんけん」系は、選択圧によって引き起こされるプラスミド喪失または負担の大きい回路の突然変異の合成生物学問題に対する独自のソリューションを提供する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの３つの株は、各株が他の２つの株のうちの１つで死滅し得るか、または死滅され得るように設計され得る。得られた「じゃんけん」生態学は、マイクロ流体装置における株の急速なサイクルを示し、細胞培養における遺伝子回路機能の安定性の著しい増加をもたらす。これは、三溶解または多溶解サイクルのその後の株が、その集団のメンバーが回路機構を変異させた場合であっても、以前の株集団を死滅させ、および除去することができるため、三溶解または多溶解系によって達成可能である。「三溶解」または「多溶解」系は、少なくとも３つの細菌の株を使用して、各株を周期的または時間特異的な様式で相補的に死滅させる。例えば、株Ａは、投与され、一定の期間、領域を定着させることが許可され、集団は、溶解遺伝子（または回路の機能に重要な任意の他の遺伝子）を変異させ始めることができる。別の実施例として、株Ａが投与され、一定の期間、領域を定着させることが許可され、集団は、対象の遺伝子（例えば、異種核酸および／またはタンパク質をコードする遺伝子、例えば、治療剤またはペイロードなど）を変異させ始めることができる。次いで、株Ｂを生態系に導入することにより、株Ｂによって放出された毒素に対する免疫を有しないため、集団の変異メンバーを含む環境からの株Ａの脱離が可能となる。回路の安定性を確保するための方法として本明細書に提供されるような系の使用は、治療、生産、および感知用途の分野で多くの広範な用途を有する。本明細書で使用される場合、「溶解」は、その完全性を損なう方法で細胞を破壊するプロセス、ならびに細胞を死滅させる任意のプロセスを含む。「溶解」に包含される細胞死の例示的なプロセスには、例えば、溶解遺伝子の発現、毒素の作用などが含まれる。一部の例示的な実施形態では、毒素による細胞死は、細胞の完全性を損なう方法で細胞を破壊するプロセスを通して発生し得る。一部の実施形態では、毒素は、細胞を破壊するプロセスなしに細胞死を開始することができる。
【００８２】
本明細書に記載される毒素系のうちのいくつかは、適切な細胞死系によって置換され得る。一部の場合に、細胞死系は、異なる材料の対（例えば、毒素、抗毒素に類似したもの）を含み得る。さらに他の場合では、隣接または連続する細菌株の異なる特徴は、前の株に特異的であり得る（例えば、株は、前の株に対して特異的かつ有害な材料を生成することができるが、前の株と比較していくつかの異なる特徴のために、そのような材料自体によって害を受けない）。本明細書で使用され得る追加の例示的な材料の対は、以下のとおりである。（ｉ）抗生物質ペプチドまたは抗菌ペプチドおよび宿主防御ペプチド（例えば、細菌、真菌、または動物の供給源に由来するもの）、（ｉｉ）（例えば、バクテリオファージが前の株に特異的である場合、前の株を一掃するための細菌によるバクテリオファージの連続送達）サイクルの初期の前の株に特定の特異的であるバクテリオファージを含む系、（ｉｉｉ）前の株に特異的な細菌タンパク質による酵素活性化によって前の株を死滅させるプロドラッグの送達を含む系、（ｉｖ）各細菌株がサイクル中の前の株の天然捕食者である（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ（捕食者）、およびＥ．ｃｏｌｉ（被食者）、サイクル中の異なる細菌株の使用を含む系、（ｖ）各株が同じ単一の毒素を産生するが、直交するクォーラム感知を使用して、前の株の毒素発現を活性化する、系（このような毒素の産生の場合、前の株は、ｎ株が加えられるときにｎ−１株において、毒素または溶解タンパク質の産生を開始する直交するクォーラム系などの別の株の存在によって（他の株のクォーラム感知分子を介して）活性化される）。さらに、一部の実施形態では、発現された抗毒素の代わりに、毒素系は、特定の細菌種に特異的であり、かつ他の株には特異的ではない毒素（または本明細書に記載されるものなどの他のタイプの細胞死系）を使用し得る。そのような場合、抗毒素を発現する代わりに、毒素（または本明細書に記載のものなどの他のタイプの細胞死系）を発現する細菌は、他の株に特異的であるそれが産生する毒素（または本明細書に記載されているものなどの他のタイプの細胞死系）に対して非感受性にする特徴を有することができる。例えば、異なる種特異的な毒素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、続いてＳａｌｍｏｎｅｌｌａ）で標的化され得る異なる細菌種を使用してもよく、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、Ｅ．ｃｏｌｉに特異的な抗菌ペプチドを産生する（例えば、コリシンは、Ｅ．ｃｏｌｉのみを死滅させ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを死滅させない）。そのような系では、抗毒素の類似体は、前の株の種に特異的な毒素に発現する、後続の株固有の非感受性である。同様に、細菌株のその他の特徴は、グラム陽性細菌である一方の株が、グラム陽性細菌に特異的な毒素（または本明細書に記載のものなどの他のタイプの細胞死系）として産生されるグラム陰性細菌株がそれに続く場合など、適切な細胞死系を構成し得、グラム陰性細菌における抗毒素の類似体は、グラム陽性細菌株ではない状態である。さらに他の場合には、細菌株の抗毒素の類似体は、他の細菌株と比較して、特定の表面受容体または細胞取り込み／排出系の存在または非存在であり得る。例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉ株は、ＳｄａＣ／ＤｃｒＡ受容体（コリシンＶが有毒であるために必要である）を発現するＥ．Ｃｏｌｉ、続いて、ＳｄａＣ／ＤｃｒＡ受容体を発現しないが、コリシンＶを発現するＥ．Ｃｏｌｉ株（このような場合、２番目の株でのＳｄａＣ／ＤｃｒＡ受容体の非発現は、抗毒素に類似している）などのその受容体を欠くＥ．Ｃｏｌｉ株を発現する毒素（または、本明細書に記載されるものなどの他のタイプの細胞死系）の毒性に必要な受容体を有する可能性がある。ある特定の実施形態では、毒素系の概念に関する前述の変形は、本発明のサイクル中のすべての細菌株が、同じタイプの毒素系または毒素／抗毒素対の組み合わせを使用する必要がないように、組み合わされ得る。毒素系および細胞死系の任意の適切な組み合わせを使用することができることが理解されるであろう。
【００８３】
さらに、三溶解または多溶解系はまた、系内のその後の株が投与されるまでの一定時間、改変株を介して治療用タンパク質（複数可）の特定の送達を確実にし得、それによって所望の場合に、空間および時間における特定の治療用タンパク質（複数可）の送達を分離する。この能力は、他の方法では、治療に対する改変細菌アプローチで利用できないであろう。なぜなら、それらは、疾患部位を長期間にわたって定着させ、結果として、別の株が疾患環境に導入されたかどうかにかかわらず、単一の治療が送達される可能性があり、また、以前に導入された株によって使い果たされた病気の環境におけるリソースの減少により、将来の株の定着能力を低下させるからである。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「共培養」または「共培養する」という用語は、単一のレシピエントまたは環境（例えば、単一の細胞培養容器、単一の細胞培養プレート、単一のバイオリアクター、単一のマイクロ流体装置、または単一の対象（例えば、インビボにおける））内で、２つ以上（例えば、３つ以上）の異なる細胞型（例えば、少なくとも２つの異なる細菌株または少なくとも３つの細菌株）を成長または培養することを指す。一部の場合に、共培養は、２つ以上（例えば、３つ以上）の異なる細胞型を同時に成長または培養することを含み得る。一部の場合に、共培養は、単一のレシピエント内の２つ以上（例えば、３つ以上）の異なる細胞型を、一定の期間にわたって成長または培養することを含み得る（例えば、第１の細胞型を成長させ、続いて第２の細胞型を成長させ、続いて第３の細胞型を成長させることを含み得、成長する期間は、重複してもよく、または重複しなくてもよい）。一部の実施形態では、共培養は、単一のレシピエント内の２つ以上（例えば、３つ以上）の異なる細胞型を一定の期間にわたって成長または培養することを含み得、この場合において、異なる細胞型の各々の成長期間は、部分的に重複する。
【００８５】
当技術分野で公知の様々な異なる方法を使用して、本明細書に開示されるプラスミドのいずれかを細菌細胞（例えば、グラム陰性細菌細胞、グラム陽性細菌細胞）に導入することができる。核酸を細胞内に導入する方法の非限定的な例としては、形質転換、マイクロインジェクション、電気穿孔法、細胞圧排、ソノポレーションが含まれる。当業者であれば、本明細書に記載されるプラスミドが、本明細書に提供される任意の細胞に導入され得ることを理解するであろう。
【００８６】
「治療（処置）」という用語は本明細書では、疾患、例えば、癌、感染症に罹患する対象の発症を遅らせる、それを阻害する、その効果を緩和させる、または対象の寿命を延ばすことを意味するために使用される。
【００８７】
「有効量」および「治療に有効な量」という用語は、本明細書で使用される場合、意図される効果または生理学的転帰を引き起こすためにその投与の文脈内で有効である期間（急性または慢性投与および定期的または連続投与を含む）の間使用される、少なくとも３つの細菌株の本明細書に記載の組成物または治療の量または濃度を指す。例えば、本開示で使用するための治療剤（例えば、本明細書に記載される任意の治療剤）を発現および／または分泌する少なくとも３つの細菌株の有効量、例えば、癌（例えば、腫瘍細胞および／または腫瘍関連免疫細胞）の成長を阻害する量には、腫瘍成長の改善または遅延、癌に罹患している、または癌を発症するリスクのある対象の生存の改善、および他の癌治療の転帰の改善が含まれる。別の実施例として、治療剤（例えば、本明細書に記載される治療剤のいずれか）を発現および／または分泌する少なくとも３つの細菌株の有効量は、腫瘍微小環境に有利に影響を与える量を含み得る。
【００８８】
「対象」（「患者」と互換的に使用される）という用語は、本開示の方法による治療が提供される動物、ヒトまたは非ヒトを説明するために、本明細書全体を通して使用される。動物への適用は、本開示によって明確に予期される。その用語は、鳥類、虫類、両生類、ならびに哺乳類、例えば、ヒト、他の霊長類、ブタ、齧歯類（例えば、マウスおよびラット）、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウマ、ウシ、ネコ、イヌ、ヒツジ、およびヤギなどを含むが、これらに限定されない。好ましい対象は、ヒト、家畜、ならびにネコおよびイヌなどの家庭内ペットである。一部の実施形態において、対象はヒトである。例えば、本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、対象は、少なくとも２歳以上（例えば、４歳以上、６歳以上、１０歳以上、１３歳以上、１６歳以上、１８歳以上、２１歳以上、２５歳以上、３０歳以上、３５歳以上、４０歳以上、４５歳以上、５０歳以上、６０歳以上、６５歳以上、７０歳以上、７５歳以上、８０歳以上、８５歳以上、９０歳以上、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２４、２５、２７、２８、３０、３３、３５、３７、３９、４０、４２、４４、４５、４８、５０、５２、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、もしくは１０４歳）であり得る。
【００８９】
名詞の前に「集団」という用語が使われる場合は、さらに２つの特定の名詞を意味する。例えば、「細菌株の集団」という語句は、３つ以上の細菌株を意味し得る。
【００９０】
「癌」という用語は、無制限の自律的成長能力を有する細胞を指す。このような細胞の例は、急速に成長する細胞成長を特徴とする異常な状態または条件を有する細胞を含む。用語は、癌性成長、例えば、腫瘍、発癌性プロセス、転移性組織、悪性形質転換細胞を含むことを意図する。
【００９１】
転移性腫瘍は、前立腺、結腸、肺、乳房、骨および肝臓由来のものを含むがこれに限定されない、多数の原発性腫瘍タイプから生じ得る。転移は、例えば、腫瘍細胞が原発腫瘍から脱落、剥離または遊走し、血管系に入り、周囲組織に侵入し、成長して、異なる解剖学的部位、例えば、原発腫瘍から分離された部位で腫瘍を形成する場合に、発生する。
【００９２】
癌を発症するリスクがあると考えられる個体は、例えば、予防治療が疾患の証拠および／または診断が存在する前に開始され得るため、本開示から利益を得ることができる。「リスクのある」個体には、例えば、摂取（例えば、吸入および／または摂取による）により、感受性のある個体における癌を促進することが統計的に示されたレベルで、例えば、癌原性物質に曝露された個体が含まれる。また、紫外線被曝、もしくはその環境、職業、および／または遺伝、ならびにポリープなどの前癌状態の兆候を示すリスクのある個体も含まれる。同様に、非常に早期の癌または転移の発生の段階にある個体（すなわち、１個または数個の異常細胞のみが、個人の身体または個人の組織の特定の部位に存在する）は、このような予防的治療から利益を得る場合がある。
【００９３】
当業者は、例えば、医療専門家、例えば、医師または看護師（または診断される対象に適切な獣医師）によって、例えば、患者の病歴の評価、診断検査の実施、および／または画像技術の利用によって、例えば、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、癌などの本明細書に記載される状態を患っている、またはリスクがあるとして、対象が診断され得ることを理解するであろう。
【００９４】
また、当業者は、対象を診断した同一個人（または当該対象に対して治療を処方した同一個人）によって対象に治療を実施する必要がないことも理解するであろう。治療は、例えば、診断および／または処方する個人、および／または被験者自身（例えば、被験者が自己投与できる場合）を含む任意の他の個人によって、投与することができる（および／または投与を監督することができる）。
【００９５】
また、組換え細菌細胞で産生される治療剤をコードする核酸、および任意選択的に、プラスミド安定化要素（プラスミド安定化要素は、毒素／抗毒素系である）を含む、治療剤を発現および／または分泌することができる組換え細菌細胞を生成するための、ならびに毒素、抗毒素および治療剤の発現および／または分泌に十分な条件下で、組換え細菌細胞を培養するための方法が本明細書で提供される。また、溶解プラスミド、活性化プラスミド、組換え細菌細胞で産生される治療剤をコードする核酸、およびプラスミド安定化要素を、細菌細胞内に導入することを含む、治療剤を発現および／または分泌することができる組換え細菌細胞を生成するための、ならびに毒素、抗毒素および治療剤の発現および／または分泌に十分な条件下で、組換え細菌細胞を培養するための方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、プラスミド安定化要素は、毒素／抗毒素系である。一部の実施形態では、プラスミド安定化要素は、溶解プラスミド中で発現されてもよい。一部の実施形態では、毒素／抗毒素系は、別の株の毒素／抗毒素対および異なる抗毒素を産生することができる。一部の実施形態では、導入するステップは、組換え細菌細胞に、組換え細菌細胞に産生される治療剤をコードする核酸を含む発現ベクターを導入することを含み得る。一部の実施形態では、細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞、またはそれらの細菌変異体である。一部の実施形態では、細菌株は、グラム陰性細菌株、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ株、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ株、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ株、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ株、またはＥ．ｃｏｌｉ株である。一部の実施形態では、細菌株は、グラム陽性細菌株、例えば、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ株、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ株、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ株、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株である。一部の実施形態では、少なくとも３つの細菌株は、すべてグラム陰性細菌株であるか、またはすべてグラム陽性株である。一部の実施形態では、少なくとも３つの細菌株のうちの少なくとも１つは、グラム陰性細菌株である。一部の実施形態では、少なくとも３つの細菌株のうちの少なくとも１つは、グラム陽性細菌株である。
【００９６】
細菌細胞を培養する方法は当技術分野で周知であり、そのような方法の例を、実施例において提供している。細菌細胞は、増殖および成長に有利な条件下でインビトロで維持され得る。簡潔に述べると、細菌細胞は、細菌細胞（例えば、本明細書に記載の任意の細菌細胞）を、細胞生存率および成長を支持するために必要な成長因子および補足を含む細胞培養培地と接触させることによって培養され得る。
【００９７】
核酸および発現ベクターを細菌細胞に導入する方法は、当技術分野で公知である。例えば、形質転換は、核酸を細菌細胞に導入するために使用され得る。一部の実施形態では、細菌細胞は、本明細書に記載されるプラスミドのうちのいずれかを含み得る。
【００９８】
毒素／抗毒素対（例えば、抗毒素は毒素に対して有効である）を含む毒素系（毒素／抗毒素系とも呼ばれる）を含む細菌株が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、毒素系は、別の株の毒素／抗毒素対および異なる抗毒素を産生することができる。毒素系は、任意の適切な位置に含まれ得る（例えば、コードされ得る）。一部の実施形態では、毒素系は、細菌株のゲノムに含まれ得る。一部の実施形態では、毒素系は、１つ以上のプラスミドに含まれ得る。一部の実施形態では、毒素系は、ゲノムに部分的に含まれてもよく、１つ以上のプラスミドに部分的に含まれてもよい。一部の実施形態では、毒素系は、溶解プラスミドに含まれ得る。一部の実施形態では、毒素系は、活性化プラスミドに含まれ得る。一部の実施形態では、毒素系は、第３のプラスミドに含まれ得る。第３のプラスミドは、任意の適切なプラスミドであってもよい。一部の実施形態では、毒素系は、遺伝子操作され得るか、または細菌株内で天然に存在することができる。一部の実施形態では、毒素系は、細菌株内に挿入され得る。
【００９９】
毒素系は、任意の適切な毒素系であり得る。一部の実施形態では、毒素系は、ファーズ毒素／第１の抗毒素対（例えば、第１の抗毒素は第１の毒素に対して有効である）および第２の抗毒素を含む。一部の実施形態では、このような毒素系をコードする細菌株は、第２の抗毒素が有効である第２の毒素をコードしない。
【０１００】
一部の実施形態では、毒素／抗毒素系は、タイプＩ毒素／抗毒素系、タイプＩＩ毒素／抗毒素系、タイプＩＩ毒素／抗毒素系、タイプＩＶ毒素／抗毒素系、タイプＶ毒素／抗毒素系、またはタイプＶＩ毒素／抗毒素系であってもよい。タイプＩ毒素／抗毒素の非限定的な例としては、ＨｏｋおよびＳｏｋ、ＦｓｔおよびＲＮＡＩＩ、ＴｉｓＢおよびＩｓｔＲ、ＬｄｒＢおよびＲｄｌＤ、ＦｌｍＡおよびＦｌｍＢ、ＩｂｓおよびＳｉｂ、ＴｘｐＡ／ＢｒｎＴおよびＲａｔＡ、ＳｙｍＥおよびＳｙｍＲ、ならびにＸＸＣＶ２１６２およびｐｔａＲＮＡ１が含まれる。タイプＩＩ毒素／抗毒素の非限定的な例としては、ＣｃｄＢおよびＣｃｄＡ、ＰａｒＥおよびＰａｒＤ、ＭａｘＦおよびＭａｚＥ、ｙａｆＯおよびｙａｆＮ、ＨｉｃＡおよびＨｉｃＢ、ＫｉｄおよびＫｉｓ、ＺｅｔａおよびＥｐｓｉｌｏｎ、ＤａｒＴおよびＤａｒＧが含まれる。例えば、タイプＩＩＩ毒素／抗毒素系は、毒性タンパク質とＲＮＡ抗毒素、例えば、ＴｏｘＮおよびＴｏｘＩとの間の相互作用を含む。例えば、タイプＩＶ毒素／抗毒素系には、毒素の活性を妨害する毒素／抗毒素系が含まれ、２つのタンパク質は、直接的に相互作用しない。タイプＶ毒素／抗毒素系の一例は、ＧｏＴおよびＧｏＳである。タイプＶＩ毒素／抗毒素系の一例は、ＳｏｃＡおよびＳｏｃＢである。
【０１０１】
一部の実施形態では、毒素／抗毒素系は、バクテリオシン／免疫タンパク質系によって置換されてもよい。本明細書で使用される場合、「毒素／抗毒素」という用語は、バクテリオシン／免疫タンパク質系を含む、上記の本明細書に記載された毒素／抗毒素系の両方を含む。バクテリオシンは、細菌によって産生されるリボソーム合成ペプチドである。バクテリオシンは、バクテリオシンを産生する細菌には無毒性であり、一般に他の細菌には毒性がある。典型的には、バクテリオシンを産生する細菌はまた、バクテリオシンの毒性効果を阻害または防止することができる免疫タンパク質を産生する。したがって、バクテリオシンおよび対応する免疫タンパク質は、本明細書に記載されるような毒素／抗毒素系と類似の様式で使用され得る。ほとんどのバクテリオシンは極めて強力で、ナノモル濃度で抗菌活性を示す。一例として、真核生物が産生する微生物の活性は、１０２〜１０３低い（Ｋａｕｒ  ａｎｄ  Ｋａｕｒ（２０１５）Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｐｈａｒ．２０１５．００２７２）。
【０１０２】
本明細書に記載される細菌株、系および方法のうちのいずれかに含まれ得るバクテリオシンの非限定的な例は、アシドシン、アクタガルジン、アグロシン、アルベイシン、オーレオシン、オーレオシンＡ５３、オーレオシンＡ７０、ビシン、カルノシン、カルノサイクリン、カゼイシン、セレイン、サーキュリンＡ、コリシン、クルバチシン、ダイバーシン、デュラマイシン、エンテロシン、エンテロリシン、エピデルミン／ガリデルミン、エルウィニオシン、ガルジマイシン、ガセリシンＡ、グリシネシン、ハロシン、クレビシン、ラクトシンＳ、ラクトコシン、ラクチシン、ロイコシン、リソスタフィン、マセドシン、メルサシジン、メセンテリシン、ミクロビスポリシン、ミクロシンＳ、ムタシン、ナイシン、ペニバシリン、プラノスポリシン、ペディオシン、ペントシン、プランタリシン、ニューモシクリシン、ピオシン、ロイテリシン６、サカシン、サリバリシン、サブランシン、スブチリシン、スルホロビシン、タスマンシン、ツリシン１７、トリフォリトキシン、バリアシン、ビブリオシン、ワルネリシン、サイトリシン、ピオシンＳ２、コリシンＡ、コリシンＥ１、マイクロシンＭｃｃＥ４９２、およびワルネリンを含む。
【０１０３】
一部の実施形態では、バクテリオシンは、グラム陰性細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのマイクロシンＶ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓのサブチロシンＡ）、コリシン（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、コリシンＡ、コリシンＢ、コリシンＥ１、コリシンＥ３、コリシンＥ５、およびコリシンＥ７）の特定の株によって産生され、特定の株に対して毒性のあるコリシン、テイロシン（例えば、Ｒ型ピオシン、Ｆ型ピオシン））から取得される。
【０１０４】
一部の実施形態では、バクテリオシンは、グラム陽性細菌（例えば、クラスＩバクテリオシン（例えば、ナイシン、ランチビオティック）、クラスＩＩバクテリオシン（例えば、ＩＩａペディオシン様バクテリオシン、ＩＩｂバクテリオシン（例えば、ラクトコシンＧ）、ＩＩｃ環状ペプチド（例えば、エンテロシンＡＳ−４８）、ＩＩｄ単一ペプチドバクテリオシン（例えば、オーレオシンＡ５３）、クラスＩＩＩバクテリオシン（例えば、ＩＩＩａ（例えば、バクテリオリシン）、およびＩＩＩｂ（膜電位を破壊することによって標的を死滅させる）、またはクラスＩＶバクテリオシン（例えば、脂質または炭水化物部分を含む複合バクテリオシン））から得られる。
【０１０５】
本明細書に記載の細菌系のうちのいずれかは、溶解プラスミドおよび活性化プラスミドをさらに含み得る。溶解プラスミドおよび活性化プラスミドは、各々独立して、任意の適切な構成要素を含み得る。溶解プラスミドおよび活性化プラスミドは、任意の適切な既存のプラスミドに基づくことができる。
【０１０６】
溶解プラスミドは、溶解遺伝子、活性化可能なプロモータ、および任意選択的に、レポータ遺伝子を含み得る。溶解遺伝子は、活性化可能なプロモータに動作可能に連結され得る。一部の実施形態では、レポータ遺伝子は、活性化可能なプロモータに動作可能に連結され得る。一部の実施形態では、溶解遺伝子およびレポータ遺伝子の両方は、活性化可能なプロモータの単一コピーに動作可能に連結され得る。一部の実施形態では、溶解遺伝子およびレポータ遺伝子の両方は、独立して、活性化可能なプロモータの別個のコピーに動作可能に連結され得る。
【０１０７】
活性化プラスミドは、活性化遺伝子、任意選択的に、溶解タグ、および任意選択的に、レポータ遺伝子を含み得る。一部の実施形態では、活性化プラスミド中の活性化可能なプロモータは、溶解プラスミド中のものと同じ活性化可能なプロモータである。一部の実施形態では、活性化プラスミド中の活性化可能なプロモータは、溶解プラスミド中の活性化可能なプロモータと同じ機構によって（例えば、直接的または間接的に、同じクォーラム感知分子によって）活性化される。活性化遺伝子は、一部の実施形態では、クォーラム感知分子の蓄積を促進することができる（例えば、活性化遺伝子は、クォーラム感知分子の生合成経路内のタンパク質をコードすることができる）。一部の実施形態では、活性化遺伝子は、活性化可能なプロモータに動作可能に連結され得る。
【０１０８】
クォーラム感知分子は、任意の適切なクォーラム感知分子であってもよい。一部の実施形態では、クォーラム感知分子は、Ｎ−アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）であってもよい。一部の実施形態では、クォーラム感知分子は、ホモセリンラクトン（ＨＳＬ）またはそのホモログであってもよい。一部の実施形態では、クォーラム感知分子は、グラム陽性細菌からの自動誘導ペプチド（ＡＩＰ）であってもよい。他のクォーラム感知分子は、当技術分野で公知である。
【０１０９】
活性化可能なプロモータは、任意の適切な活性化可能なプロモータであってもよい。一部の実施形態では、活性化可能なプロモータは、クォーラム感知分子によって直接的または間接的に活性化され得る。このようにして、一部の実施形態では、フィードバックループは、クォーラム感知分子の存在がクォーラム感知分子の蓄積を促進するようにセットアップされ得る。本明細書に記載の細菌株のうちのいずれかの一部の実施形態では、活性化可能なプロモータは、ＡＨＬ活性化可能なプロモータである。本明細書に記載の細菌株のうちのいずれかの一部の実施形態では、活性化可能なプロモータは、ＬｕｘＲ−ＡＨＬ活性化可能ｌｕｘＩプロモータである。一部の実施形態では、活性化可能なプロモータは、ＲｐａＲ−ＡＨＬ活性化可能ＲｐａＩプロモータである。一部の実施形態では、活性化可能なプロモータは、ＴｒａＲ−ＨＳＬ活性化可能ｔｒａＩプロモータである。他の活性化可能なプロモータは、当技術分野で公知である。
【０１１０】
溶解遺伝子は、任意の適切な溶解遺伝子であってもよい。本明細書に記載の細菌株のうちのいずれかの一部の実施形態では、溶解遺伝子は、バクテリオファージΦＸ１７４からのＥである。一部の実施形態では、溶解遺伝子は、ｃｏｌ  Ｅ１  Ｌｙｓｉｓタンパク質である。他の溶解遺伝子が、当技術分野で公知である。
【０１１１】
活性化遺伝子は、任意の適切な活性化遺伝子であってもよい。一部の実施形態では、活性化遺伝子は、ＬｕｘＩである。一部の実施形態では、活性化遺伝子は、ＲｐａＩである。一部の実施形態では、活性化遺伝子は、ＴｒａＩ他の活性化遺伝子であり、当技術分野で公知である。
【０１１２】
一部の実施形態では、クォーラム感知分子は、ＡＨＬであり、活性化可能なプロモータは、ＬｕｘＲ−ＡＨＬ活性化可能ｌｕｘＩプロモータであり、活性化遺伝子は、ＬｕｘＩである。
【０１１３】
一部の実施形態では、クォーラム感知分子は、ＡＨＬであり、活性化可能なプロモータは、ＲｐａＲ−ＡＨＬ活性化可能ＲｐａＩプロモータであり、活性化遺伝子は、ＲｐａＩである。
【０１１４】
一部の実施形態では、クォーラム感知分子は、ＨＳＬであり、活性化可能なプロモータは、ＴｒａＲ−ＨＳＬ活性化可能ｔｒａＩプロモータであり、活性化遺伝子は、ＴｒａＩである。
【０１１５】
レポータ遺伝子は、任意の適切なレポータ遺伝子であり得る。一部の実施形態では、レポータ遺伝子は、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、またはそれらの変異体）であり得る。一部の実施形態では、レポータ遺伝子は、酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ）であってもよい。他のレポータ遺伝子が、当技術分野で公知である。
【０１１６】
溶解タグは、任意の適切な溶解タグであり得る。一部の実施形態では、溶解タグは、ｓｓｒＡ−ＬＡＡ溶解タグである。他の溶解タグは、当技術分野で公知である。
【０１１７】
一部の実施形態では、細菌株は、プロモータに動作可能に連結された追加の核酸および／またはタンパク質（例えば、異種核酸および／またはタンパク質（例えば、ペイロード））をコードしてもよい。一部の実施形態では、プロモータに動作可能に連結された追加の核酸および／またはタンパク質（例えば、異種核酸および／またはタンパク質）は、プラスミド上にコードされる。プラスミドは、任意の適切なプラスミドであってもよい。一部の実施形態では、プラスミドは、溶解プラスミドまたは活性化プラスミドである。追加的な核酸および／またはタンパク質は、任意の適切な核酸および／またはタンパク質であり得る。例えば、追加の核酸および／またはタンパク質は、治療剤であり得る。任意の適切なプロモータが、使用され得る。プロモータは、活性化可能なプロモータとすることができる。一部の実施形態では、プロモータは、クォーラム感知分子によって直接的または間接的に活性化されたプロモータであり得る。一部の実施形態では、プロモータは、上述のような活性化可能なプロモータであってもよい。一部の実施形態では、プロモータは、構成的プロモータであってもよい。多くの構成的プロモータが、当技術分野で公知である。治療剤は、任意の適切な治療剤とすることができる。一部の実施形態では、治療剤は、本明細書に記載される治療剤のうちのいずれかであってもよい。例えば、一部の実施形態において、治療剤は、阻害性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはアンチセンス（例えば、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、または合成類似体））、サイトカイン、酵素、ペプチドホルモン、融合タンパク質、凝固因子、および抗体、またはその抗原結合断片からなる群から選択され得る。一部の実施形態では、追加の核酸および／またはタンパク質（例えば、異種核酸および／またはタンパク質）は、本明細書に記載されるような細菌株から分泌、外皮細胞形成、または別の方法で排出されてもよい。一部の実施形態では、追加の核酸および／またはタンパク質（例えば、異種核酸および／またはタンパク質）は、本明細書に記載されるような細菌株の溶解時に放出され得る。一部の実施形態では、追加の核酸および／またはタンパク質（例えば、異種核酸および／またはタンパク質）は、本明細書に記載されるような細菌株の表面上に表示されてもよい。
【０１１８】
一部の実施形態では、細菌株によってコードされる追加の核酸および／またはタンパク質（例えば、ペイロード）は、三溶解または多溶解系において、前の（例えば、直前の）細菌株によってコードされる追加の核酸および／またはタンパク質（またはその産物）に作用することができる。一部の実施形態では、ｍ番目の細菌株のペイロード（例えば、ｎ個の細菌株のうちの１つ）は、（ｍ−１）番目の細菌株の基質に直接的または間接的に作用することによってｍ番目の基質を産生することができ、第１の細菌株のペイロードは、ｎ個の細菌株が培養される環境に存在する基質に作用することができる。
【０１１９】
本明細書において、本明細書に記載されるような２つ以上の（例えば、３つ以上の）細菌株を含む系が提供されている。一部の実施形態では、記載されるような系は、多溶解系であってもよい。一部の実施形態では、かかる系は、３つの細菌株を含み得る。一部の実施形態において、かかる系は、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の細菌株を含み得る。
【０１２０】
一部の実施形態では、活性化プラスミド／溶解プラスミド系が使用されるときに、系内の細菌株の各々のクォーラム感知分子は、異なっていてもよい。一部の実施形態では、系中の細菌株の各々のクォーラム感知分子は、別の株の溶解遺伝子の活性化可能なプロモータに対して全く、または実質的に影響を及ぼさない可能性がある。一部の実施形態では、クォーラム感知分子は、細菌株の各々において同じであり得る。一部の実施形態では、細菌株の各々の溶解プラスミドは、同じプラスミドのコピーであってもよい。一部の実施形態では、細菌株の各々の活性化プラスミドは、同じプラスミドのコピーであってもよい。一部の実施形態では、細菌株の各々の溶解プラスミドは、異なるプラスミドであってもよい。一部の実施形態では、細菌株の各々の活性化プラスミドは、異なるプラスミドであってもよい。一部の実施形態では、細菌株のうちの２つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）は、代謝的に競合的であり得る。一部の実施形態では、細菌株は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはその細菌変異体から選択され得る。一部の実施形態では、いずれの細菌株も、系の別の株と比較して成長上の利点を有しない。
【０１２１】
２つ以上の細菌株を含む一部の系では、すべての細菌株は、追加の核酸および／またはタンパク質（例えば、異種核酸および／またはタンパク質）をコードすることができる。２つ以上の細菌株を含む一部の系では、すべての細菌株は、追加の核酸および／またはタンパク質（例えば、異種核酸および／またはタンパク質）をコードすることができない。２つ以上の細菌株を含む一部の系では、一部の細菌株は、追加の核酸および／またはタンパク質（例えば、異種核酸および／またはタンパク質）をコードするが、一部の細菌株はコードしない可能性がある。追加の核酸および／またはタンパク質（例えば、異種核酸および／またはタンパク質）をコードする２つ以上の細菌株を含む系では、そのような各細菌株のコードされた追加の核酸および／またはタンパク質は、独立して選択される（例えば、そのようなすべての細菌株は、異なる追加の核酸および／もしくはタンパク質をコードすることができ、そのようなすべての細菌株は、同じ追加の核酸および／もしくはタンパク質をコードすることができ、またはいくつかのそのような細菌株は、同じ追加の核酸および／またはタンパク質をコードするが、他のものは、１つ以上の異なる追加の核酸および／またはタンパク質をコードすることができる）。
【０１２２】
多溶解系は、適切な数の株を含むことができる。三溶解系には、３つの株（これは「じゃんけん」（ＲＰＳ）エコロジーとも呼ばれ得る）が含まれ得る。このような系では、各株は、毒素／抗毒素対および二次抗毒素をコードすることができ、その結果、株は、サイクル内の前の株を死滅させることができ（例えば、前の株によってコードされた二次抗毒素は、本株の毒素に対して有効ではなく、本株によってコードされた二次抗毒素は、前の株の毒素に対して有効である）、およびサイクル内の次の株によって死滅され得る（例えば、本株によってコードされる二次抗毒素は、次の株の毒素に対して有効ではなく、次の株によってコードされる二次抗毒素は、本株の二次毒素に対して有効である）。例示的な三溶解系を、図１２Ｂに示している。
【０１２３】
一部の実施形態において、多溶解系は、少なくとも３つの株（例えば、少なくとも４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の株）を含み得る。一部の実施形態では、多溶解系は、第１の株、第２の株、およびｎ番目の株を含む、ｎ個の株を有し得る。一部のこうした場合では、第２の株〜ｎ番目の株は各々、株の番号付けに基づいて、前の株（例えば、第２の株の前の株は、第１の株である）を有することができる。一部のこうした場合では、第２〜ｎ−１番目の株の各々は、次の株（例えば、ｎ−１番目の株の次の株は、ｎ番目の株である）を有する。一部のこうした場合では、第２の株〜ｎ番目の株の各々は、前の株に対して有効な第１の毒素、第１の毒素に対する第１の抗毒素、および前の株によって産生された毒素に対する第２の抗毒素をコードする。一部のこうした場合では、第１の株は、ｎ番目の株に対して有効な第１の毒素、第１の毒素に対する第１の抗毒素、およびｎ番目の株によって産生された毒素に対する第２の抗毒素をコードする。ｎの値は、任意の適切な値であり得る。一部の実施形態において、ｎは、少なくとも３（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上）であり得る。
【０１２４】
本明細書においてまた、少なくとも３つ（例えば、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個）の細菌株（例えば、本明細書に記載の細菌株のうちのいずれか）を共培養する方法が提供されている。一部の実施形態では、共培養することは、初期段階である比率で接種された、少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個）の細菌株（例えば、本明細書に記載の細菌株のうちのいずれか）を培養物に接種することを含み得る。接種の比率は、任意の適切な比率とすることができる。一部の実施形態では、少なくとも１つの細菌株と少なくとも１つの他の細菌株との接種の比率は、１：１とすることができる（例えば、３つの株の場合、比率は、１：１：１とすることができる）。一部の実施形態では、少なくとも１つの細菌株と少なくとも１つの他の細菌株との接種の比率は、１：２とすることができる（例えば、３つの株の場合、比率は、１：２：ｍ、２：１：ｍ、１：ｍ：２、２：ｍ：１、ｍ：１：２、ｍ：２：１とすることができる）。一部の実施形態では、少なくとも１つの細菌株と少なくとも１つの他の細菌株との接種の比率は、１：５とすることができる（例えば、３つの株の場合、比率は、１：５：ｍ、５：１：ｍ、１：ｍ：５、５：ｍ：１、ｍ：１：５、ｍ：５：１とすることができる）。一部の実施形態では、少なくとも１つの細菌株と少なくとも１つの他の細菌株との接種の比率は、１：１０とすることができる（例えば、３つの株の場合、比率は、１：１０：ｍ、１０：１：ｍ、１：ｍ：１０、１０：ｍ：１、ｍ：１：１０、ｍ：１０：１とすることができる）。ｍの値は、任意の適切な値であり得る。例えば、一部の実施形態では、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上であり得る。
【０１２５】
一部の実施形態では、共培養することは、連続的に、第１の細菌株と培養物で開始し、一定期間培養し、第２の細菌株を加え、および一定期間培養することを含むことができる。本明細書で使用される場合、連続的とは、２つ以上の株を培養する特定の順序を含み得る。一部の実施形態において、連続的とは、完全に重複する期間（例えば、成長期間）、部分的に重複する期間、および／または重複しない期間を含み得る。一部の実施形態において、１つ以上の成長期間は、重複していてもよいが、同じ系内の他の成長期間は、重複していなくてもよい。一部の実施形態において、所与の系におけるすべての成長期間は、重複していてもよく、または重複していなくてもよい。一部の実施形態では、１つ以上の追加の細菌株は、第２の細菌株と同じ様式で連続的に培養され得る。このように、部分的に重複した成長期間で、連続的に共培養を行うことができる。一部の実施形態では、第１の細菌株は、第２の細菌株を含有する培養物に加えられ、一定期間、任意選択的に続いて、交互に、第２の細菌株および第１の細菌株を培養され得る。このように、部分的に重複した成長期間で、交互に共培養を行うことができる。細菌株の追加は、任意の適切な接種比で行うことができ、接種比は、培養物中の細胞の集団（複数可）に基づいている。例えば、一部の実施形態では、接種比は、本明細書に記載の接種比のうちのいずれかであってもよい。
【０１２６】
一部の実施形態では、共培養することは、連続的に、第１の細菌株と培養物で開始し、一定期間培養し、第２の細菌株を加え、一定期間培養し、第３の細菌株を加え、および一定期間培養することを含むことができる。一部の実施形態では、１つ以上の追加の細菌株は、第２および細菌株と同じ様式で連続的に培養され得る。このように、部分的に重複した成長期間で、連続的に共培養を行うことができる。一部の実施形態では、部分的に重複する成長期間での環状共培養は、第１の細菌株を、第３のもの（または１つ以上の追加の細菌株）を含有する培養物に加えることと、一定期間培養されることと、続いて連続的に、第２の細菌株、第３の細菌株、および１つ以上の追加の細菌株を、最初に実施された順序と同じ順序で加えて、培養することと、によって実施され得る。細菌株の追加は、任意の適切な接種比で行うことができ、接種比は、培養物中の細胞の集団（複数可）に基づいている。例えば、一部の実施形態では、接種比は、本明細書に記載の接種比のうちのいずれかであってもよい。
【０１２７】
一部の実施形態では、培養物に加えられる細菌株は、培養物中に存在する１つ以上の細菌株の集団を減少させるか、または排除することができる。例えば、第２の細菌株は、一部の実施形態では、第１の細菌培養物の集団を減少させるか、または除去することができる。
【０１２８】
一部の実施形態では、本明細書に記載の細菌株のうちのいずれかの培養の期間（例えば、成長期間）は、１時間〜３５日（例えば、１時間〜３０日、１時間〜２８日、１時間〜２６日、１時間〜２５日、１時間〜２４日、１時間〜２２日、１時間〜２０日、１時間〜１８日、１時間〜１６日、１時間〜１４日、１時間〜１２日、１時間〜１０日、１時間〜８日、１時間〜７日、１時間〜６日、１時間〜５日、１時間〜４日、１時間〜７２時間、１時間〜７０時間、１時間〜６８時間、１時間〜６６時間、１時間〜６４時間、１時間〜６２時間、１時間〜６０時間、１時間〜５８時間、１時間〜５６時間、１時間〜５４時間、１時間〜５２時間、１時間〜５０時間、１時間〜４８時間、１時間〜４６時間、１時間〜４４時間、１時間〜４０時間、１時間〜３８時間、１時間〜３６時間、１時間〜３４時間、１時間〜３２時間、１時間〜３０時間、１時間〜２８時間、１時間〜２６時間、１時間〜２４時間、１時間〜２２時間、１時間〜２０時間、１時間〜１８時間、１時間〜１６時間、１時間〜１４時間、１時間〜１２時間、１時間〜１０時間、１時間〜８時間、１時間〜６時間、１時間〜４時間、１時間〜２時間、２時間〜３５日、２時間〜３０日、２時間〜２８日、２時間〜２６日、２時間〜２５日、２時間〜２４日、２時間〜２２日、２時間〜２０日、２時間〜１８日、２時間〜１６日、２時間〜１４日、２時間〜１２日、２時間〜１０日、２時間から８日、２時間から７日、２時間〜６日、２時間〜５日、２時間〜４日、２時間〜７２時間、２時間〜７０時間、２時間〜６８時間、２時間〜６６時間、２時間〜６４時間、２時間〜６２時間、２時間〜６０時間、２時間〜５８時間、２時間〜５６時間、２時間〜５４時間、２時間〜５２時間、２時間〜５０時間、２時間〜４８時間、２時間〜４６時間、２時間〜４４時間、２時間〜４０時間、２時間〜３８時間、２時間〜３６時間、２時間〜３４時間、２時間〜３２時間、２時間〜３０時間、２時間〜２８時間、２時間〜２６時間、２時間〜２４時間、２時間〜２２時間、２時間〜２０時間、２時間〜１８時間、２時間〜１６時間、２時間〜１４時間、２時間〜１２時間、２〜１０時間、２〜８時間、２〜６時間、２時間〜４時間、４時間〜３５日、４時間〜３０日、４時間〜２８日、４時間〜２６日、４時間〜２５日、４時間〜２４日、４時間〜２２日、４時間〜２０日、４時間〜１８日、４時間〜１６日、４時間〜１４日、４時間〜１２日、４時間〜１０日、４時間〜８日  ４時間〜７日、４時間〜６日、４時間〜５日、４時間〜４日、４時間〜７４時間、４時間〜７０時間、４時間〜６８時間、４時間〜６６時間、４時間〜６４時間、４時間〜６４時間、４時間〜６０時間、４時間〜５８時間、４時間〜５６時間、４時間〜５４時間、４時間〜５４時間、４時間〜５０時間、４時間〜４８時間、４時間〜４６時間、４時間〜４４時間、４時間〜４０時間、４時間〜３８時間、４時間〜３６時間、４時間〜３４時間、４時間〜３４時間、４時間〜３０時間、４時間〜２８時間、４時間〜２６時間、４時間から２４時間、４時間〜２４時間、４時間〜２０時間、４時間〜１８時間、４時間〜１６時間、４時間〜１４時間、４時間〜１４時間、４時間〜１０時間、４時間〜８時間���４時間〜６時間、６時間〜３５日、６時間〜３０日、６時間〜２８日、６時間〜２６日、６時間〜２５日、６時間〜２４日、６時間〜２２日、６時間〜２０日、６時間〜１８日、６時間〜１６日、６時間〜１４日、６時間〜１２日、６時間〜１０日、６時間〜８日、６時間〜７日、６時間〜６日、６時間から５日、６時間〜４日、６時間〜７６時間、６時間〜７０時間、６時間〜６８時間、６時間〜６６時間、６時間〜６４時間、６時間〜６６時間、６時間〜６０時間、６時間〜５８時間、６時間〜５６時間、６時間〜５４時間、６時間〜５６時間、６時間〜５０時間、６時間〜４８時間、６時間〜４６時間、６時間〜４４時間、６時間〜４０時間、６時間〜３８時間、６時間〜３６時間、６時間〜３４時間、６時間〜３６時間、６時間〜３０時間、６時間〜２８時間、６時間〜２６時間、６時間〜２４時間、６時間〜２６時間、６時間〜２０時間、６時間〜１８時間、６時間〜１６時間、６時間〜１４時間、６時間〜１６時間、６時間〜１０時間、６時間〜８時間、１２時間〜３５日、１２時間〜３０日、１２時間〜２８日、１２時間〜２６日、１２時間〜２５日、１２時間〜２４日、１２時間〜２２日、１２時間〜２０日、１２時間〜１８日、１２時間〜１６日、１２時間〜１４日、１２時間〜１２日、１２時間〜１０日、１２時間〜８日、１２時間〜７日、１２時間〜６日、１２時間〜５日、１２時間〜４日、１２時間〜７２時間、１２時間〜７０時間、１２時間〜６８時間、１２時間〜６６時間、１２時間〜６４時間、１２時間〜６２時間、１２時間〜６０時間、１２時間〜５８時間、１２時間〜５６時間、１２時間〜５４時間、１２時間〜５１２時間、１２時間〜５０時間、１２時間〜４８時間、１２時間〜４６時間、１２時間〜４４時間、１２時間〜４０時間、１２時間〜３８時間、１２時間〜３６時間、１２時間〜３４時間、１２時間〜３１２時間、１２時間〜３０時間、１２時間〜２８時間、１２時間〜２６時間、１２時間〜２４時間、１２時間〜２２時間、１２時間〜２０時間、１２時間〜１８時間、１２時間〜１６時間、１２時間〜１４時間、１日〜３５日、１日〜３０日、１日〜２８日、１日〜２６日、１日〜２５日、１日〜２４日、１日〜２２日、１日〜２０日、１日〜１８日、１日〜１６日、１日〜１４日、１日〜１２日、１日〜１０日、１日〜８日、１日〜６日、１日〜５日、１日〜４日、１日〜３日、１日〜２日、２日〜３５日、２日〜３０日、２日〜２８日、２日〜２６日、２日〜２５日、２日〜２４日、２日〜２２日、２日〜２０日、２日〜１８日、２日〜１６日、２日〜１５日、２日〜１４日、２日〜１２日、２日〜１０日、２日〜８日、２日〜６日、２日〜４日、２日〜３日、４日〜３５日、４日〜３０日、４日〜２８日、４日〜２６日、４日〜２５日、４日〜２４日、４日〜２２日、４日〜２０日、４日〜１８日、４日〜１６日、４日〜１５日、４日〜１４日、４日〜１２日、４〜１０日、４日〜８日、４日〜６日、７日〜３５日、７日〜３０日、７日〜２８日、７日〜２６日、７日〜２５日、７日〜２４日、７日〜２２日、７日〜２０日、７日〜１８日、７日〜１６日、７日〜１５日、７日〜１４日、７日〜１２日、７日〜１０日、７日〜８日、１４日〜３５日、１４日〜３０日、１４���〜２８日、１４日〜２６日、１４日〜２５日、１４日〜２４日、１４日〜２２日、１４日〜２０日、１４日〜１８日、１４日〜１６日、１４日〜１５日、２１日〜３５日、２１日〜３０日、２１日〜２８日、２１日〜２６日、２１日〜２５日、２１日〜２４日、２１日〜２２日、２８日〜３５日、または２８日〜３０日；１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、１０日、１２日、１４日、１６日、１８日、２０日、２１日、２２日、２４日、２５日、２６日、２８日、３０日、３２日、３４日、または３５日）であり得る。
【０１２９】
サイクルの長さは、適切な方法によって調節され得る。例えば、サイクルの長さは、異なるＯＤで溶解する株を使用することによって調節され得る。細胞溶解はまた、例えば、ＡＨＬ溶解のチューニング、タンパク質溶解のチューニング溶解、クォーラム感知回路に関与する分子の発現を増加または減少させるためのプロモータのチューニングなど、クォーラム感知構成要素の内部回路のチューニングによって調節され得る。
【０１３０】
クォーラム閾値に達したかどうかを決定するために、当技術分野で公知の様々な方法を使用することができる。例えば、クォーラム閾値は、培養培地中のＡＨＬ発現のレベルを測定するために、従来のタンパク質定量法を使用して測定され得る。クォーラム閾値はまた、ｌｕｘＩプロモータによって促進されるレポータタンパク質を使用して測定され得る。一部の実施形態では、レポータタンパク質は、蛍光タンパク質、生体発光ルシフェラーゼレポータ、分泌血液／血清または尿レポータ（例えば、分泌アルカリホスファターゼ、可溶性ペプチド、ガウスルシフェラーゼ）である。
【０１３１】
細胞溶解を決定および／または測定するための様々な方法が、当技術分野で公知である。例えば、細胞溶解は、６００ｎｍの光を含む様々な波長における透過光および／または吸光度の強度の変化によって、顕微鏡を用いて表現型的に決定され得る。一部の実施形態では、細菌細胞溶解は、同期される。他の実施形態では、細菌細胞溶解は、同期されない。同期された溶解は、プレートリーダーまたは他の定量的機器における６００ｎｍ吸光度（ＯＤ６００）での光学密度を介して測定され得る。
【０１３２】
本明細書に記載の細菌株のうちのいずれかの一部の実施形態では、治療剤は、阻害性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはアンチセンス）、サイトカイン、酵素、ペプチドホルモン、融合タンパク質、凝固因子、毒素（例えば、ジフテリア毒素、ジェロニン毒素、アントラックス毒素）、抗菌ペプチド、および抗原、またはその抗原からなる群から選択される。サイトカインの非限定的な例としては、フィルグラスチム、インターロイキン、インターフェロン（例えば、ＩＦＮｂ−１ｂ）、および形質転換成長因子ベータが含まれる。酵素の非限定的な例としては、アスパラギナーゼ、グルカルピダーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、エロスルファーゼアルファ、アスホターゼアルファ、およびセベリパーゼアルファが含まれる。ペプチドホルモンの非限定的な例としては、メトレペプチン、副甲状腺ホルモン、およびインスリンが含まれる。融合タンパク質の非限定的な例としては、アルビグルチド、デュラグルチド、第ＩＸ因子Ｆｃ融合、および第ＶＩＩＩ因子Ｆｃ融合が含まれる。凝固因子の非限定的な例としては、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、および第ＸＩＩＩ因子Ａサブユニットが含まれる。抗体またはその抗原結合断片の非限定的な例としては、ベリムマブ、イピリムマブ、ベラタセプト、ブレンツキシマブ、アフィルバーセプト、ペルツズマブ、ラキシバクマブ、トラスツズマブ、ゴリムマブ、ベバシズマブ、オビヌツズマブ、ラムシルマブ、シルツキシマブ、リツキシマブ、アダリムマブ、ベドリズマブ、ペンブロリズマブ、ブリントモマブ、ニボルマブ、セクキヌマブ、ジヌツキシマブ、アリロクマブ、エボロクマブ、イダルシズマブ、メポリズマブ、ダラツムマブ、ネシツムマブ、エロツズマブ、オビルトキサキシマブ、イキセキズマブ、レスリズマブ、インフリキシマブ、アテゾリズマブ、ダクリズマブ、ウステキヌマブ、およびエタネルセプトが含まれる。一部の実施形態では、治療剤は、Ｃ１エステラーゼ阻害剤であってもよい。一部の実施形態では、治療剤は、フォンウィルブランド因子とすることができる。
【０１３３】
本明細書において、本明細書に記載されるような細菌株のうちのいずれか１つ以上を含む医薬組成物が提供されている。一部の実施形態では、医薬組成物は、原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）での薬物送達のために製剤化される。
【０１３４】
本明細書においてまた、本明細書に記載されるような少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個）の共培養を含み得る系が、提供されている。
【０１３５】
本明細書においてまた、本明細書に記載されるような１つ以上の系を含む薬剤系が提供されている。
【０１３６】
本明細書においてまた、本明細書に記載されるような１つ以上の系を含む定期的な薬剤系が提供されている。
【０１３７】
本明細書においてまた、本明細書に記載されるような１つ以上の細菌株を含むキットが提供されている。
【０１３８】
本明細書においてまた、本明細書に記載されるような１つ以上の系を含むキットが提供されている。
【０１３９】
本明細書において、対象における疾患（例えば、癌、感染病、自己免疫性障害、遺伝的障害、代謝性障害）を治療する方法が提供されている。例示的な方法は、治療を必要とする対象に、本明細書に記載の細菌株のうちのいずれか１つ以上、または本明細書に記載の医薬組成物のうちのいずれか１つ以上、または本明細書に記載の系のうちのいずれか１つ以上の治療有効量を投与し、それによって対象における疾患を治療することを含む。例えば、本明細書において、少なくとも第１の細菌株、第２の細菌株、およびｎ番目の細菌株を含む、治療有効量のｎ個の細菌株の各々を、対象に投与することを含む、対象における疾患を治療する方法が、提供されている。第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々は、前の細菌株を有することができる。ｎの値は、少なくとも３であり得る。ｎ個の株の各々は、本明細書に記載されるような毒素系を含み得る。一部の場合に、第２〜ｎ番目の細菌株の各々の毒素系は、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、第１の毒素は、前の細菌株、および前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効である。第１の細菌株の毒素系は、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、第３の毒素は、ｎ番目の細菌株、およびｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である。一部の実施形態では、ｎ個の株のうちの１つ以上は、本明細書に記載される溶解プラスミドおよび／または本明細書に記載されるような活性化プラスミドを含み得る。ｎの値は、任意の適切な値であり得る。一部の実施形態において、ｎは、少なくとも３（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上）であり得る。
【０１４０】
本明細書において、対象における疾患（例えば、癌、感染病、自己免疫性障害、遺伝的障害、代謝性障害）を治療する方法が提供されている。例示的な方法は、治療を必要とする対象に、本明細書に記載の細菌株のうちのいずれか１つ以上、または本明細書に記載の医薬組成物のうちのいずれか１つ以上、または本明細書に記載の系のうちのいずれか１つ以上を含む治療有効量の医薬組成物を投与し、それによって対象における疾患を治療することを含む。例えば、本明細書において、少なくとも第１の細菌株、第２の細菌株、およびｎ番目の細菌株を含むｎ個の細菌株のうちの１つ以上を各々含む、治療有効量のｍ個の医薬組成物を、対象に投与することを含む、対象における疾患を治療する方法が、提供されている。第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々は、前の細菌株を有することができる。ｎの値は、少なくとも３であり得る。ｍの値は、少なくとも３であり得る。ｍの値はｎの値に等しくてもよい。ｎ個の株の各々は、本明細書に記載されるような毒素系を含み得る。一部の場合に、第２〜ｎ番目の細菌株の各々の毒素系は、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、第１の毒素は、前の細菌株、および前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効である。第１の細菌株の毒素系は、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、第３の毒素は、ｎ番目の細菌株、およびｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である。一部の実施形態では、ｎ個の株のうちの１つ以上は、本明細書に記載される溶解プラスミドおよび／または本明細書に記載されるような活性化プラスミドを含み得る。ｎの値は、任意の適切な値であり得る。一部の実施形態において、ｎは、少なくとも３（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上）であり得る。ｍの値は、任意の適切な値であり得る。一部の実施形態において、ｍは、少なくとも３（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上）であり得る。
【０１４１】
投与には、任意の適切なスケジュールが含まれ得る。例えば、投与は、本明細書に記載されるような共培養に有効なスケジュールを含み得る。一部の実施形態では、投与は、本明細書に記載されるように、部分的に重複する成長期間を含む共培養に有効なスケジュールを含み得る。本明細書に記載の方法において、投与は、対象に少なくとも２つ（例えば、少なくとも３つ）の細菌株を投与することを含み得る。
【０１４２】
本明細書においてまた、治療を必要とする対象に、治療有効量の第１の細菌株（例えば、本明細書に記載の細菌株のうちのいずれか）を第１の期間、投与すること、治療有効量の第２の細菌株（例えば、本明細書に記載の細菌株のうちのいずれか）を第２の期間、投与すること、および治療有効量の第３の細菌株（例えば、本明細書に記載の細菌株のうちのいずれか）を第３の期間、投与することを含む、対象における疾患（例えば、癌、感染病、自己免疫疾患、遺伝性疾患、代謝性障害）を治療する方法が、提供されている。
【０１４３】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、ｎ個の細菌株（例えば、第１、第２、および第３の細菌株）は、各々が異なる治療剤（例えば、本明細書に記載の治療剤のうちのいずれか）を発現および／または分泌する、異なる細菌株である。本明細書に記載の方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、ｎ個の細菌株（例えば、第１、第２、および第３の細菌株）は、各々が同じ治療剤（例えば、本明細書に記載の治療剤のうちのいずれか）を発現および／または分泌する、異なる細菌株である。本明細書に記載の方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、ｎ個の細菌株（例えば、第１、第２、および第３の細菌株）は、各々が異なる治療剤（例えば、本明細書に記載の治療剤のうちのいずれか）を発現および／もしくは分泌する可能性がある、または発現および／もしくは分泌しない可能性がある、異なる細菌株である（例えば、２つの株が、１つの治療剤を発現および／または分泌することができ、３つの株が、異なる治療剤を発現および／または分泌することができる）。ｎの値は、任意の適切な値であり得る。一部の実施形態において、ｎは、少なくとも３（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上）であり得る。
【０１４４】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、ｎ個の細菌株（例えば、第１、第２、および第３の細菌株）は、治療剤（例えば、本明細書に記載の治療剤のうちのいずれか）を発現または分泌しない。本明細書に記載の方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、ｎ個の細菌株（例えば、第１、第２、および第３の細菌株）は、バクテリオシン（例えば、本明細書に記載のバクテリオシンのうちのいずれか）を産生する。ｎの値は、任意の適切な値であり得る。一部の実施形態において、ｎは、少なくとも３（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上）であり得る。
【０１４５】
本明細書に記載の方法のうちの一部の実施形態では、投与することは、治療サイクルを含み、治療サイクルは、少なくとも２回（例えば、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回）繰り返される。
【０１４６】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、第１、第２、および第３の期間は、１時間〜３５日（例えば、１時間〜２８日、１時間〜２１日、１時間〜１４日、１時間〜７日、１時間〜５日、１時間〜３日、１時間〜２日、１時間〜１日、１日〜３５日、１日〜２８日、１日〜２１日、１日〜１４日、１日〜７日、１日〜５日、１日〜３日、１日〜２日、７日〜３５日、７日〜２８日、７日〜１４日、７日〜１０日、１４日〜３５日、１４日〜２８日、１４日〜２１日、２１日〜３５日、２１〜２８日、２１日〜２４日、または２８日〜３５日）であり得る。
【０１４７】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の態様では、第１、第２、および第３の期間は、長さ、例えば、同じ時間の長さが類似している。
【０１４８】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかの他の態様では、第１、第２、および第３の期間は、同じ時間の長さではない。いくつかの態様では、第１および第３の期間は、同じである。いくつかの態様では、第１および第３の期間は、同じではない。いくつかの態様では、第１および第２の期間は、同じである。いくつかの態様では、第１および第２の期間は、同じではない。いくつかの態様では、第２および第３の期間は、同じである。いくつかの態様では、第２および第３の期間は、同じではない。
【０１４９】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、成長期間は、１時間〜３５日（例えば、１時間〜２８日、１時間〜２１日、１時間〜１４日、１時間〜７日、１時間〜５日、１時間〜３日、１時間〜２日、１時間〜１日、１日〜３５日、１日〜２８日、１日〜２１日、１日〜１４日、１日〜７日、１日〜５日、１日〜３日、１日〜２日、７日〜３５日、７日〜２８日、７日〜１４日、７日〜１０日、１４日〜３５日、１４日〜２８日、１４日〜２１日、２１日〜３５日、２１〜２８日、２１日〜２４日、または２８日〜３５日）であり得る。
【０１５０】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかの一部の態様では、ｎ個の細菌株の各々の成長期間は、ほぼ同じである。本明細書に記載の方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、ｎ個の細菌株のうちの１つ以上の成長期間は、他の細菌株のうちの１つ以上とは異なる。
【０１５１】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、投与することは、対象に少なくとも３つの細菌株の各々を連続的に投与することを含む。本明細書に記載の方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、投与することは、対象にｎ個の細菌株の各々を連続的に投与することを含む。
【０１５２】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、投与することは、少なくとも３つの細菌株の各々を同時に投与することを含む。本明細書に記載の方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、投与することは、ｎ個の細菌株の各々を同時に投与することを含む。
【０１５３】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、対象は、癌または感染症を有する。
【０１５４】
対象が癌を有する一部の実施形態では、癌は、例えば、原発性腫瘍、または転移性腫瘍であり得る。
【０１５５】
一部の実施形態において、癌は、非Ｔ細胞浸潤性腫瘍である。
【０１５６】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、癌は、グリア芽腫、扁平上皮癌、乳癌、結腸癌、肝細胞癌、黒色腫、神経芽腫、膵臓癌、および前立腺癌からなる群から選択される。同時に複数の癌タイプの治療が、本開示によって、および本開示内で予期されている。
【０１５７】
場合によっては、癌を有する対象は、癌治療（例えば、本明細書に記載される癌治療のうちのいずれか）を以前に受けたことがある場合がある。
【０１５８】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、対象は、感染症（例えば、感染病）を有する。本明細書に記載される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、感染症は、以下からなる群から選択される感染因子によって引き起こされる：Ｃａｍｐｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ。
【０１５９】
一部の実施形態では、株Ａ、または第１の株は、まず、特定の期間、培養物またはコロニー形成の部位に導入され、治療用タンパク質（複数可）のそのペイロードを送達される。次いで、第２の株である株Ｂが導入され得、これが、株Ａを死滅および除去するための毒素を産生し、次いで、株Ｂは、指定された期間の間、治療用タンパク質（複数可）のそのペイロードを送達し得る。次いで、第３の株である株Ｃが導入され得、これが、株Ｂを死滅および除去することになり、次いで、指定された期間の間、治療用タンパク質（複数可）のそのペイロードを送達する。次いで、株Ａは、サイクルを繰り返すために再導入され得る。この系は、３つの株系に限定されず、３つより多い株から構成される可能性があり、各株は、抗毒素を有しない系内の別の株を死滅させる能力を有する毒素を産生し、それによって、環状系（４、５、６、またはそれ以上の株から成る）が許容される。
【０１６０】
投与は、例えば、少なくとも１回（例えば、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、または少なくとも１４回）行われてもよい。また、毎月の治療、例えば、少なくとも１か月（例えば、少なくとも２、３、４、５、または６か月以上、例えば、１２か月以上）に少なくとも１回、および毎年の治療（例えば、１年以上のうちの１回の投与）も予期されている。投与は、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、経口、局所、および／もしくは直腸投与、または既知の投与方法の任意の組み合わせなど、任意の当技術分野で既知の手段によって行われ得る。
【０１６１】
本明細書で使用される場合、治療することは、「予防的治療」を含み、これは、疾患（例えば、癌、感染症）を発症するリスクのある対象における疾患（例えば、癌、感染症）の徴候または症状の発生率を減少させるか、または予防する（またはそのリスクを減少させる）ことを意味する。「治療的治療」という用語は、例えば、癌の進行を減少させる、癌の重症度を減少させる、および／または癌を有する対象における再発を減少させる、対象における炎症を減少させる、対象における感染症の広がりを減少させるなどの、疾患の兆候または症状を減少させることを指す。
【０１６２】
本明細書に記載の方法は、癌治療に使用され得る。癌の非限定的な例には、以下が含まれる：急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、基底細胞癌、脳腫瘍、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、原発不明の癌腫、心臓腫瘍、頸部癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性新生物、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、管癌、胚性腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、嗅神経芽細胞腫、線維性組織球腫、ユーイング肉腫、眼癌、胚細胞腫瘍、胆嚢癌、胃癌、胃腸癌腫瘍、胃腸腫瘍、消化管間質疾患、神経膠腫、頭頸部癌、毛細胞白血病、肝細胞癌、組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、白血病、唇および口腔癌、肝癌、原位置小葉癌、肺癌、リンパ腫、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、ＮＵＴ遺伝子を含む潜在性原発性正中線管癌を伴う転移性扁平上皮癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、真菌症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物、鼻腔および傍鼻洞癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺癌、中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎骨盤癌、尿管癌、網膜芽細胞腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺癌、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、脊髄コード腫瘍、胃癌、Ｔ細胞リンパ腫、奇形腫、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、膣癌、外陰癌、ならびにウィルムス腫瘍。
【０１６３】
例えば、本明細書に記載される方法のうちのいずれかを使用して、グリア芽腫、扁平上皮癌、乳癌、結腸癌、肝細胞癌、黒色腫、神経芽腫、膵臓癌、および前立腺癌からなる群から選択される癌を治療することができる。
【０１６４】
「治療剤」という用語は、疾患（例えば、癌、感染症）の治療に有用であることが知られている治療剤を対象に投与することを含む治療的治療を指す。例えば、癌治療剤は、腫瘍成長のサイズまたは速度を低減することができる。他の例では、癌治療剤は、腫瘍微小環境に影響を及ぼし得る。
【０１６５】
本明細書に記載される細菌株のうちのいずれかにおいて発現および／または分泌され得る治療剤の非限定的な例としては、阻害性核酸（例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンス）、サイトカイン、酵素、ペプチドホルモン、融合タンパク質、凝固因子、毒素（例えば、ジフテリア毒素、ゲロニン毒素、炭疽毒素）、抗菌ペプチド、および抗体、またはその抗原結合フラグメントが含まれる。
【０１６６】
一部の例において、治療剤は、治療用ポリペプチドである。一部の例において、治療用ポリペプチドは、１つ以上のポリペプチド（例えば、２、３、４、５、または６）を含む。一部の例において、治療用ポリペプチドは、リンカー（例えば、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー）を介して毒素、放射性同位体、または薬物と複合体化される。
【０１６７】
一部の例において、治療剤は、標的細胞に対して細胞傷害性または細胞停止性である。
【０１６８】
「標的細胞に対する細胞傷害性」という語句は、標的細胞の死（例えば、壊死またはアポトーシス）における直接的または間接的な誘発を指す。例えば、標的細胞は、癌細胞（例えば、癌性細胞または腫瘍関連免疫細胞（例えば、マクロファージ））または感染細胞であり得る。
【０１６９】
「標的細胞に対する細胞停止性」という語句は、インビボでのまたはインビトロでの標的細胞の増殖（細胞分裂）の直接的または間接的な低減を指す。治療剤が標的細胞に対して細胞停止性である場合、治療剤は、例えば、標的細胞の細胞周期停止を直接的または間接的にもたらし得る。いくつかの実施例では、細胞増殖抑制性である治療剤は、（治療剤との接触前のＳ期にある細胞の集団における標的細胞の数と比較して）Ｓ期にある細胞の集団における標的細胞の数を低減することができる。いくつかの実例では、サイトスタティックである治療剤は、治療剤と接触する前のＳ期にある細胞の集団における標的細胞のパーセンテージと比較して、Ｓ期における標的細胞のパーセンテージを少なくとも２０％（例えば、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％）減少させることができる。
【０１７０】
本明細書においてまた、本明細書に記載の治療剤のいずれかのうちの少なくとも１つ発現および／または分泌する本明細書に記載の細菌株のうちのいくつかの少なくとも３つ（例えば、３、４、５、６、７、８、９、または１０）を含む、医薬組成物が提供されている。
【０１７１】
医薬組成物は、当技術分野で公知の任意の物質で製剤化され得る。医薬組成物は、それらの意図された投与経路（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、直腸、局所、または経口）に適合するように製剤化される。一部の実施形態において、医薬組成物は、例えば、腫瘍内に投与され、感染した組織内に投与されるように、疾患の部位または疾患組織に直接的に投与される。一部の実施形態では、投与は標的化され、例えば、医薬組成物は、標的化部分（例えば、標的化タンパク質またはペプチド）を含む。
【０１７２】
一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）を含み得る。医薬組成物は、例えば、当技術分野で公知であるような賦形剤、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、滑沢剤、結合剤、可溶化剤、充填剤、緩衝剤、界面活性剤、キレート剤、アジュバント、およびこれに類するものなど、任意の適切な追加の薬剤を含み得る。製剤の単回または複数回の投与は、例えば、用量（すなわち、ｍＬあたりの細菌細胞数）、ならびに対象が必要とするおよび忍容性のある頻度に応じて提供され得る。対象を効果的に治療するために必要な用量、頻度、およびタイミングは、対象の年齢、対象の全般的な健康状態、疾患の重症度、過去の治療、および併存症（例えば、糖尿病、心血管疾患）の存在によって影響され得る。製剤は、状態、疾患または症状を効果的に治療、予防または改善するのに十分な量の活性剤を提供する必要がある。組成物の毒性および治療有効性は、細胞培養、前臨床モデル（例えば、マウス、ラット、またはサル）、およびヒトにおける従来の手順を使用して決定され得る。インビトロアッセイおよび前臨床試験から得られたデータを使用して、本明細書に記載される任意の組成物（例えば、本明細書に記載される医薬組成物）の適切な用量を製剤化することができる。
【０１７３】
本明細書に記載される組成物のうちのいずれかの有効性は、疾患の臨床徴候（例えば、腫瘍サイズ、転移の存在）の観察などの、当技術分野で公知の方法を使用して決定され得る。
【０１７４】
本明細書においてまた、本明細書に記載の治療剤のいずれかのうちの少なくとも１つ発現および／または分泌する本明細書に記載の細菌株のうちのいくつかの少なくとも３つを含む、キットが提供されている。一部の例では、キットは、本明細書に記載の方法のうちのいずれかを実施するための命令を含み得る。一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載の医薬組成物のうちのいずれかの少なくとも１回分の用量を含み得る。本明細書に記載されるキットは、そのように限定されず、他の変形例が、当業者には明らかであろう。
【実施例】
【０１７５】
本発明は、以下の実施例においてさらに記載されており、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
【０１７６】
材料および方法
株およびプラスミド。
回路株を、ＣｏｌＥ１起源プラスミドおよびｐ１５Ａ起源プラスミドを含有する株については、それぞれ５０μｇ  ｍｌ−１のカナマイシン、および３４μｇ  ｍｌ−１のクロラムフェニコールとともに溶原性ブロス（ＬＢ）培地で培養し、さらに３７°振とうインキュベーター内の非溶解コリシン株については、０．２％ブドウ糖、または５０μｇ  ｍｌ−１のスペクチノマイシンとともに溶原性ブロス（ＬＢ）培地で培養した。例示的な毒素を、図４および図２２に示している。例示的な株を、図５および図２３に示している。本試験で使用された例示的なプラスミドを、図１１および図２１に記載する。コリシンＥ３およびＥ５遺伝子を、重複した遺伝子ブロック（ＩＤＴ）のＰＣＲで組み立てた。コリシンＶ遺伝子は、野生型コリシンＶＥ．ｃｏｌｉ（Ｄｒ．Ｊｏｅ  Ｐｏｇｌｉａｎｏ、およびＤｒ．Ｒｏｂｅｒｔｏ  Ｋｏｌｔｅｒから取得した）のＰＣＲから取得した。すべてのプラスミドは、Ｇｉｂｓｏｎ組立品によって構築され、その後、ＤＨ５α（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社）の化学的に有能なＥ．ｃｏｌｉに形質転換された。プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５への形質転換前に、サンガー配列決定により検証された。
【０１７７】
毒素共培養実験では、野生型ＭＧ１６５５Ｅ．ｃｏｌｉを−８０°グリセロールストックから２ｍｌ  ＬＢに播種し、３７℃の振とうインキュベーター中でインキュベートした。細胞を０．２〜０．４のＯＤ６００に到達させた後、標準Ｆａｌｃｏｎ組織培養９６ウェルの平底プレート中で、５μｌの培養物を２００μｌの新鮮な培地に添加した。さらに、５μｌの精製したコリシン溶解物を各ウェルに添加した。培養を、３７°振とうで１９時間成長させ、６００ｎｍの吸光度でのそれらの光学密度を、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  Ｐｒｏを用いて５分毎に測定した。ＧＦＰ、ＣＦＰ、およびＲＦＰについて、それぞれ、４８５ｎｍ励起、５２０ｎｍ発光、４３３ｎｍ励起、４７５ｎｍ発光、および５９０ｎｍ励起、６３０ｎｍ発光で、蛍光測定を５分毎に行った。
【０１７８】
マイクロ流体および顕微鏡検査。
この研究で使用されるマイクロ流体装置および実験調製プロトコルは、他で報告されたものと類似している（例えば、Ｐｒｉｎｄｌｅ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ａｒｒａｙ  ｏｆ  ｒａｄｉｃａｌｌｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｂｉｏｐｉｘｅｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ，４８１（７３７９）：３９−４４，２０１２．を参照）。すべてのマイクロ流体実験を、細菌成長チャンバの面積が約１００×８０μｍ、高さが約１．２μｍのサイドトラップアレイ装置で実施した。適切なＥ．ｃｏｌｉを、適切な抗生物質とともに、−８０°グリセロールストックから５ｍｌ  ＬＢに播種した。溶解株については、０．２％のブドウ糖を培地に添加した。振とうインキュベーター中で３７℃で８〜１２時間成長させた後、培養物を、５０ｍｌの三角フラスコ中で２５ｍｌの同培地に１００倍希釈し、０．４〜０．６のＯＤに達するまで成長させた（Ｐｌａｓｔｉｂｒａｎｄ  １．５ｍｌキュベットを使用した）。上記のＯＤに到達したら、細胞を、５，０００ｇで１分間遠心分離して濃縮し、０．７５％のＴｗｅｅｎ−２０および適切な抗生物質を用いて１０μｌのＬＢ培地に再懸濁した。この濃縮物は、単一株実験のために細胞を真空負荷するために使用された。多株実験では、培養物は、遠心分離前に最初に同じＯＤ６００に正規化され、２株実験では、１：１、１：２、４：６、または１：５の比率のいずれかで混合され、または３株実験では、真空負荷の前に１：１：１の比率で混合された。マイクロ流体装置への媒体の流れの制御は、重力促進であった。顕微鏡全体を包含するプレキシガラスインキュベーションチャンバを用いて、チップ温度を３７℃に維持した。
【０１７９】
連続負荷実験では、最初の２つの株を、２株実験について記載したように調製した。次いで、後の株を、０．２％のブドウ糖および適切な抗生物質とともに、−８０°グリセロールストックから５ｍｌ  ＬＢに播種した。振とうインキュベーター中で３７°で８〜１２時間成長させた後、培養物を、５００ｍｌの三角フラスコ中で１００ｍｌの同培地に１００倍希釈し、０．１〜０．４のＯＤに達するまで成長させた（Ｐｌａｓｔｉｂｒａｎｄ  １．５ｍｌキュベットを使用した）。上記のＯＤに到達したら、細胞を、５，０００ｇで５分間遠心分離して濃縮し、０．０７５％のＴｗｅｅｎ−２０および適切な抗生物質を用いて１ｍｌのＬＢ培地に再懸濁した。次いで、細胞を、マイクロ流体装置の第２または第３の入口ポートに装填し、フリック装填によってトラップに導入した。装置内の層流を乱し、細胞がマイクロ流体トラップ内で洗浄されるようにするために、マイクロ流体装置の入口につながるタイゴン管をフリックすることによって、フリック装填を行った。マイクロ流体装置への媒体の流れの制御は、重力促進であった。実験の期間中は、３４μｇ  ｍｌ−１のクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地を使用した。顕微鏡全体を包含するプレキシガラスインキュベーションチャンバを用いて、チップ温度を３７℃に維持した。
【０１８０】
顕微鏡検査には、位相コントラストベースの撮像を用いるＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＩのエピ蛍光顕微鏡を使用した。画像取得は、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  ＣｏｏｌＳｎａｐ冷却ＣＣＤカメラおよびＮｉｋｏｎ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを用いて実施した。１０倍倍率の実験では、５０〜１００μｓの露出時間で位相コントラスト画像を撮影した。蛍光露光時間は、ｇｆｐ、ｒｆｐ、およびｃｆｐについて、それぞれ、３０％強度で１００μｓ、３０％強度で３００μｓ、および３０％強度で１００μｓであった。画像は、実験期間中（１〜４日）は３分毎または６分毎に撮影した。６０倍倍率の実験では、２０〜５０μｓの露出時間で位相コントラスト画像を撮影した。蛍光露光時間は、ｇｆｐ、ｒｆｐ、およびｃｆｐについて、それぞれ、３０％強度で５０μｓ、３０％強度で２００μｓ、および３０％強度で５０μｓであった。画像は、実験期間中（１〜４日）は３分毎または６分毎に撮影した。連続負荷実験では、撮像を、株負荷の持続時間の間一時停止した。
【０１８１】
ＲＰＳ株の集団推定および成長速度。
共培養混合物中のおおよその集団分率の集団推定を、以下の方法で行った。優性株からの蛍光チャネル画像スタックは、ＩｍａｇｅＪで８ビットに変換された（Ｐｒｏｃｅｓｓ＞Ｂｉｎａｒｙ＞Ｍａｋｅ  Ｂｉｎａｒｙ）。次いで、Ｚ軸プロファイルを、細胞インキュベート領域（画像＞スタックプロットＺ軸プロファイル）に対して取得し、最大値で割ることによって、その値を１に正規化した。優性株の蛍光時系列トレースの最大値を、１００％優性株のみを有する培養物の蓄積された蛍光のスタンダードとして使用した。感受性株分率を、正規化した優性株の値を１から引くことによって推定した。次いで、その値を、約７０％の優性株および３０％の感受性株に対応する初期細胞分率に対して正規化した。最初の細胞分率は、ＩｍａｇｅＪ細胞カウンタープラグインを使用して手動で計数した。
【０１８２】
成長速度実験のために、適切なＥ．ｃｏｌｉを、−８０°グリセロールストックから２ｍｌのＬＢおよび適切な抗生物質に播種し、３７℃の振とうインキュベーター中でインキュベートした。細胞が０．１のＯＤ６００に達した後、適切な抗生物質とともに２５ｍｌの新鮮な培地を含む１２５ｍｌの三角フラスコに１ｍｌの培養物を加え、２７０ｒｐｍで振とうした。サンプルが０．１のＯＤ６００に到達したら、１０分毎にサンプルを採取し、ＤＵ７４０ライフサイエンスＵｖ／ｖｉｓ分光光度計を用いてＯＤ６００で測定した。
【０１８３】
経過およびプレートリーダー実験。
経過実験のために、適切なＥ．ｃｏｌｉを、適切な抗生物質を有する０．２％のブドウ糖とともに−８０°グリセロールストックから２ｍｌのＬＢに播種し、３７℃の振とうインキュベーター中でインキュベートした。０．２のＯＤ６００で、標準Ｆａｌｃｏｎ組織培養９６ウェルの平底プレート中で、１０μｌの培養物を、適切な抗生物質を含有する１９０μｌの新鮮な培地に添加した。細胞をＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  Ｐｒｏ中で３７°振とうした状態でインキュベートし、各経過物を１２時間成長させ、６００ｎｍ吸光度での光学密度を１０分毎に測定した。ＧＦＰ、ＣＦＰ、およびＲＦＰについて、それぞれ、４８５ｎｍ励起で５２０ｎｍ発光、４３３ｎｍ励起で４７５ｎｍ発光、および５９０ｎｍ励起で６３０ｎｍ発光で、蛍光測定を１０分毎に行った。１２時間後、各サンプルのＯＤ６００を０．２まで希釈し、１０μｌの各サンプルを、新しい培養プレート中で適切な抗生物質を含有する１９０μｌの新鮮な培地に経過させた。サイクル株については、適切なＥ．ｃｏｌｉを、前述したように、−８０°グリセロールストックから０．２のＯＤ６００まで適切な経過の直前に成長させ、次いで、新しい株を含有する１０μｌの培養物を、適切な経過に添加して、測定を行った。各経過の終了時に、サンガー配列決定のためのサンプルを採取した。分析のために、成功した溶解イベントは、定義されたピークを有し、続いてＯＤが減少するＯＤ６００成長曲線として定義された。
【０１８４】
プレートリーダーの蛍光。
ウェルプレート実験のために、適切なＥ．ｃｏｌｉを、０．２％ｇのブドウ糖および適切な抗生物質とともに−８０°グリセロールストックから２ｍｌのＬＢに播種し、３７℃の振とうインキュベーター中でインキュベートした。細胞を０．２〜０．６のＯＤ６００に到達させた後、標準Ｆａｌｃｏｎ組織培養９６ウェルの平底プレート中で、５μｌの培養物を適切な抗生物質を含有する２００μｌの新鮮な培地に添加した。細胞を３７°振とうでインキュベートし、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  Ｐｒｏ中で５分毎に撮像した。希釈を１９時間成長させ、６００ｎｍ吸光度でのそれらの光学密度を５分毎に測定した。ＧＦＰ、ＣＦＰ、およびＲＦＰについて、それぞれ、４８５ｎｍ励起で５２０ｎｍ発光、４３３ｎｍ励起で４７５ｎｍ発光、および５９０ｎｍ励起で６３０ｎｍ発光で、蛍光測定を５分毎に行った。得られた曲線を用いて、各株の溶解および成長ダイナミクスのＯＤ６００を推定した。
【０１８５】
実施例１−２株系
開発の第１の段階は、選択的な利点から成っていた。ある株を他の株より選択的に有利にするための戦略を最初に調査した。
【０１８６】
ある株を他の株より選択的に有利にするための戦略を最初に調査した。可能性のある範囲のコリシンから、ＤＮａｓｅおよびｒＲＮａｓｅ活性を通して致命的な２つの（コリシンＥ３、コリシンＥ７）が特定された（例えば、図４および図２２を参照）。毒素効果は、マイクロ流体およびプレートリーダー実験で検証された（図５、図６）。この効果を特徴付けるために、ｐ１５Ａ起源プラスミドを、弱い構成的プロモータで構築し、コリシンおよびＣｏｌ  Ｅ１溶解タンパク質を促進した。さらに、プラスミドは、蛍光レポータタンパク質に連結された免疫タンパク質を促進する構成的プロモータを含んでいた。第２の同一の構成的プロモータは、二次免疫タンパク質を促進する（例示的なプラスミド図を、図１１および図２１に示す）。プラスミド構築物の各々を、ＭＧ１６５５  Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させた。「株Ａ」および「株Ｂ」として扱われる初期株は、それぞれ、コリシンＥ３＋Ｅ３免疫＋Ｅ７免疫＋ｓｆＧＦＰ、およびコリシンＥ７＋Ｅ７免疫＋ｍＣｈｅｒｒｙを産生する（図１Ａ）。我々の改変株のダイナミクスを研究するために、寸法１００μｍ×８０μｍ×１μｍの長方形トラップを含むマイクロ流体装置を使用した。「不利な株」と名付けられた株Ｂは、当初、マイクロ流体装置内に播種され、トラップを完全にコロニー定着させた。この時点で、「優性株」と呼ばれる株Ａを、マイクロ流体装置に導入した。株Ａの導入後、優性株の指数関数的な増加および不利な株の減衰が観察された（図１Ｂ）。これらの実験は、コリシンが集団ダイナミクスの制御に使用され得ることを示している。しかしながら、この実験の潜在的な結果は、低濃度のコリシンに長期間曝露されたことによる、優性株に対する「不利な株」の突然変異である可能性がある。
【０１８７】
この懸念に対処するために、コリシンの同時放出により、より致命性の高いコリシン濃度の同時放出が可能になる一方で、曝露時間がまた、低濃度のコリシンに制限されることが推論された。この仮説を検証するために、ｐ１５Ａ起源プラスミドを構築し、初期段階のｃｏｌ  Ｅ１溶解タンパク質を除去し、ｌｕｘＩプロモータの制御下でＸ１７４  Ｅ溶解タンパク質と置換した（図１Ｃ）。合成振動子からの第２のプラスミドは、別の場所で報告されており（Ｄａｎｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．．Ａ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ  ｑｕｏｒｕｍ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｌｏｃｋｓ．Ｎａｔｕｒｅ，４６３（７２７９）：３２６−３３０，２０１０）、またＣｏｌＥ１起源プラスミド（‘活性化プラスミド’）上のそれらの天然双方向性プロモータによって促進されるｌｕｘＩおよびｌｕｘＲを含有する。さらに、第２のｌｕｘプロモータは、蛍光レポータタンパク質の産生を促進する。この２つのプラスミド構造において、Ａｌｉｉｖｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ由来のｌｕｘクォーラム感知系を使用して、クォーラム溶解を促進する陽性フィードバックループを作製した。要するに、ＬｕｘＩは、拡散性クォーラム感知分子Ｎ−アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）の産生を触媒する。この分子は、構成的に産生されたｌｕｘＲ転写因子に結合し、ｌｕｘＩプロモータの転写活性化因子として作用する複合体を形成する。異なる株が同時に溶解し、両方の集団が最も低い時にコリシンの同時放出が生じることが予想された（図１Ｄ）。このアイデアを試験するために、これらの両方のプラスミドを含有するＥ．Ｃｏｌｉを、前述のマイクロ流体装置中で成長させた。優性株および不利な株を、それぞれ１：５の比率で負荷し、６００分間共培養した。両方の株が各チャンバ内で同期的に溶解し、同期溶解を欠く株と比較して、株の持ち越し速度が劇的に改善したことが観察された（図１Ｅ）。この合成コリシンベースの回路は、改変された選択的利点と組み合わせた場合、溶解媒介集団制御が集団制御のための強力なツールであることを実証する。
【０１８８】
実施例２−３株系
開発の第２段階では、系を３つの株に拡張した。
【０１８９】
２株集団制御系は、１つの株からもう１つの別の株へのスイッチングのみが可能であるため、設計を、「じゃんけん」アプローチで循環することができる３株系に拡張した。これを探求するために、第３の毒素であるコリシンＶが同定され、これは、膜電位を破壊することによって作用した。各株は、図１Ｃに記載されたものと同じ２つのプラスミド構造を含むが、コリシンの直交セットを伴う。株１、株２、および株３と呼ばれる３つの株は、それぞれ、コリシンＥ３、コリシンＥ７、およびコリシンＶを含有する。この系では、各株は、先行株および２つの免疫タンパク質に対して致命的なコリシンを産生する（図２Ａ）。第１の免疫タンパク質は、自身のコリシン産生に対する現時点の株の保護を与える。さらに、第２の免疫タンパク質は、前の株によって産生されたコリシンの毒性に対して現時点の株を保護する。
【０１９０】
３つのＥ．ｃｏｌｉを改変して、各株が固有の毒素および抗毒素系（ＴＡモジュール）を含有するようにした。単クローン性集団では、ＴＡモジュールは、プラスミドの安定化を助ける。なぜなら、抗毒素の変異または喪失は、健康な細菌によって産生される細胞外毒素の存在、または毒素産生ｍＲＮＡの長期間の持続性を通した新生のプラスミドを含まない細胞の死滅のいずれかによって細胞死をもたらすからである（例えば、Ｋ．Ｇｅｒｄｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６，１４０２（１９８８）を参照）。ＴＡモジュールの機構を多株生態系に拡張することによって、各ＴＡモジュールは、対応する抗毒素を有しない任意の他の株を死滅させる追加の能力を、その宿主株の与え、既存の集団の変位に対する外部制御を可能にする（図１２Ａ）。合成「じゃんけん」（ＲＰＳ）生態学は、二次抗毒素を各株に加えることによって作成され、その結果、各株は、サイクル中のその後の株によって死滅され得る（図１２Ｂ）。このＲＰＳ系は、任意の目的の回路と結合して、安定性を高めることができる。この組み合わせた系では、１つの株で変異した回路は、次のＲＰＳハウジング株の新鮮なバッチの導入によって置き換えられ得る。そのため、「ｂｅａｔ  Ｄａｒｗｉｎ」を試みるのではなく、生態学の進化および構成を外部から制御することができる改変戦略が開発された。
【０１９１】
多株競合ダイナミクスは、典型的には、成長速度の違いによって決定されるため、３つの株のダイナミクスを、まず個別に特徴付けた。３つの溶解株と野生型ＭＧ１６５５  Ｅ．Ｃｏｌｉの成長速度を、蛍光マイクロプレートリーダーの吸光度実験を用いて比較した。溶解イベントが発生する前、改変された回路の追加は、野生型対照と比較して成長にほとんど影響しなかったことが見出された。閾値ＯＤ６００は、３つの株の各々の溶解で記録された（図２Ｂ）。
【０１９２】
次に、溶解期間に対するＯＤ６００の溶解の違いへの影響を、マイクロ流体装置で探求した。マイクロ流体装置には、各個別の株をロードし、６分ごとに撮像した。異なるＯＤ６００の溶解閾値にもかかわらず、３つの株間の溶解期間は比較的均一であることが見出された（図２Ｃ）。
【０１９３】
理論に拘束されることを望まないが、これは、株２および株３に属する生存細胞と比較して、株１の細胞の溶解後生存割合が低いことに起因する可能性があると仮定した。３つの株の溶解ダイナミクスにおける表現型の違いが顕著であった。株１の溶解イベントは、より爆発的な溶解イベントをもたらし、生存細胞のより小さな割合を残し、トラップからより多くの溶解物を排出する。あるいは、株３は、非常に軽度の溶解イベントを有し、その結果、生存細胞の割合が高くなり、マイクロ流体トラップ内により多くの細胞溶解物が蓄積する（図７）。
【０１９４】
いずれの環境でも、改変された細胞が一旦変異したら、それらを変異のない状態に戻すことはできない。それらは除去され、健康な細胞で置き換えられなければならない。このような「系リブート」は、環境内の動的回路機能を遮断する。多株ＲＰＳ生態学は、理論上、目的の回路のダイナミクスを中断することなく、変異した、または変異しやすい細胞の除去を可能にするべきである。ＲＰＳ系でＴＡモジュールの拡張機能を検証した後、高い選択圧を受ける遺伝的回路を有する安定化ＲＰＳ要素の有用性を試験した。クォーラム促進型同期溶解回路（ＳＬＣ）が選択されたが、これは、インビボでの腫瘍への薬物送達などの微生物治療剤について研究されている（例えば、Ｍ．Ｏ．Ｄｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５３６，８１（２０１６）；Ｔ．Ｄａｎｉｎｏ，Ｏ．Ｍｏｎｄｒａｇｏｎ−Ｐａｌｏｍｉｎｏ，Ｌ．Ｔｓｉｍｒｉｎｇ，Ｊ．Ｈａｓｔｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ４６３，３２６（２０１０）を参照）。ＳＬＣ回路では、クォーラム感知分子（ＡＨＬ）は、集団密度に比例して成長環境に徐々に蓄積する。集団が閾値密度に到達すると、同期溶解により細菌の約９０％が除去され、集団成長を再シードするために約１０％が残る。結果として生じる細胞集団のダイナミクスは、細胞成長および同期溶解のサイクルである。しかしながら、選択培地が使用できないインビボ環境で用いられる場合、プラスミド喪失または変異は、長期間にわたって機能喪失をもたらすことが予想される。
【０１９５】
ＲＰＳ系からのプラスミド安定化が成功したことによって、振動ダイナミクスの中断なしに株の接収が生じるかどうかを調査した（図１３Ａ）。ＳＬＣおよびＴＡモジュールは、２つのプラスミド系に統合され、１つのプラスミドは、ファージΦＸ１７４（Ｘ１７４Ｅ）、ＴＡモジュール、免疫タンパク質、および活性化レポータプラスミドから、溶解遺伝子Ｅを含むものであった（図１３Ｂ）。株の異なるダイナミクスがそれらの間の相互作用にどのように影響するかを調べるために、株ペアの各々を、マイクロ流体装置で試験した。溶解閾値の違いにより、株１は、株２および株３の前に溶解し、それにより、株の接収に問題が生じることが予期された。３株のＲＰＳ系が開発され、各株は、そのうちの他の１つの株に対して別個の毒素−抗毒素対、ならびに二次的な抗毒素を含んでいた（図１２Ｃ）。これを達成するために、使用したコリシンを使用しこれは、特定のＥ．ｃｏｌｉ株に対して致命性であり、インビボでＥ．ｃｏｌｉ集団内の有効なアンタゴニスト剤である（図１６Ａ〜図１６Ｄ）（例えば、Ｂ．Ｃ．Ｋｉｒｋｕｐ，Ｍ．Ａ．Ｒｉｌｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ４２８，４１２（２００４），Ａ．Ｅ．Ｂｏｙｅｒ，Ｐ．Ｃ．Ｔａｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８０，１６６２（１９９８）、Ｅ．Ｃａｓｃａｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ７１，１５８（２００７）、Ｍ．Ｍ．Ｚａｍｂｒａｎｏ，Ｄ．Ａ．Ｓｉｅｇｅｌｅ，Ｍ．Ａｌｍｉｒｏｎ，Ａ．Ｔｏｒｍｏ，Ｒ．Ｋｏｌｔｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９，１７５７（１９９３）を参照）。
【０１９６】
これを試験するために、各株ペアを、感受性に対して有利に１：５の初期播種比でマイクロ流体装置で共培養した。３つの株の各々を、蛍光レポータタンパク質ｓｆＧＦＰ、ＣＦＰ、およびｍＫａｔｅ２を介して監視した。蛍光レポータの産生は、ｌｕｘＩプロモータによって促進される。株３は、コリシンＥ７およびＥ７免疫タンパク質、ならびにコリシンＶ免疫タンパク質を産生する、プラスミドを含有する。株２は、コリシンＥ３およびＥ３免疫タンパク質、ならびにＥ７免疫タンパク質を産生する、プラスミドを含有する。株１は、コリシンＶおよびＶ免疫タンパク質、ならびにＥ３免疫タンパク質を産生する、プラスミドを含有する。したがって、各ペアの株は、他方の株によって産生される毒素に対する免疫である１つの「優性株」、および他方によって産生される毒素に対して脆弱である「感受性」株を有する。したがって、レポータタンパク質は、ＡＨＬクォーラムベースの陽性フィードバックループの開始後にのみ産生される。
【０１９７】
微生物共培養内の変位は、典型的には成長速度の差によって支配されるため、各ＲＰＳ株の成長速度を測定した（図１２Ｄ）。また、優性対感受性の１：２の比で株ペアを共培養することにより、マイクロ流体装置における改変されたコリシン死滅回路の有効性を決定した。いずれの場合も、優性株の急速な増加および感受性株の崩壊が観察され、優性株によって産生されたコリシンが感受性株に対して有効であったが、その逆ではないことが観察された（図１２Ｅ、図１２Ｆ）。
【０１９８】
このアーキテクチャを使用して、同期溶解および一定のＲＰＳ競合の同時サイクルを示す、３つの株が生成された（図１３Ｃ）。各ＲＰＳ溶解株を個別に特徴解析し（図１７Ａ〜図１７Ｄ）、各株ペアを、感受性に優勢な１：１および１：５の両方の初期播種比で、マイクロ流体装置で検証した。すべての株が各チャンバ内で同期的に溶解するため、株置換の成功に加えて、同期溶解回路の機能は影響を受けないことが観察された。１：１の優性対感受性では、各株対について培養物（ｎ＝３５）の１００％で接収が発生し、単一の溶解イベントは、株接収を完了するのに十分であった（図１８Ａ）。１：５の比での３つのペアの株（株１および株３、株３および株２、株２および株１）について、優性株の接収は、それぞれ培養物（ｎ＝３９６）の１００％、１００％、および９２％で発生した（図２Ｄ、図１８Ｂ）。株１および株２から成る共培養では、小さな分率（＜８％）の株２が、株１を追い越してトラップをコロニー形成することができた。いずれの場合においても、株切り換え時に、ＳＬＣ回路の機能が遮断されなかった（図１３Ｄ〜図１３Ｆ）。
【０１９９】
理論に拘束されることを望まないが、これは株１を特徴付ける低い溶解閾値によって引き起こされ得るという仮説が立てられた。株１は、株２の前に溶解を開始した。結果として、放出されたコリシンは、標的株２に対する相対濃度が低い。さらに、２つの株は最初に１：５の優性対不利の比でロードされたが、ほとんどの場合、最初の溶解イベントの時点で観察された比は異なっていた。
【０２００】
これをさらに調査するために、マイクロ流体実験を行い、両方の株を１：１の等比でロードした。大半のケースでは、最初の溶解イベントが発生する前に、優性株がすでにマイクロ流体トラップを完全に覆っていた。少数のケースでは、トラップに、依然として両方の株が存在していた。しかしながら、優性株は、より大きな集団サイズを有し、単一の溶解イベントがトラップ接収に十分であった（例えば、図２Ｅ〜図２Ｇ、図１３Ｄ〜図１３Ｆを参照）。
【０２０１】
単細胞解像度（倍率６０倍）での顕微鏡検査により、不利な細胞が同時溶解前に死滅し始めたことを視覚的に確認した。理論に拘束されることを望まないが、これは、あるレベルの溶解タンパク質の「リーキー発現」が、指数成長フェーズ中に少量のコリシンの放出につながることを示唆し得る。
【０２０２】
実施例３−集団ダイナミクス
優性感受性株ペアの共培養は、一貫した株置換を可能にしたが、３つのアンタゴニスト株からなる生態学は、同時に培養されたときに新規に出現した特性を導入し得る。スイッチング集団ダイナミクスを説明し、それを、スイッチング周波数および間隔期間についての分析予測を可能にする離散時間マップに低減した数学的モデルが開発された（実施例５を参照）。３つの株すべてが同時に存在した場合、３つの株間の集団優性のサイクルは、系の出現特性であったことが分かった。系が新鮮な細胞の導入に閉鎖されたと仮定すると、最初に高濃度で開始された株は、その後トラップを支配した（図１９）。あるいは、各株のわずかな一定の供給量を考慮すると、３つの株の間の初期比に関係なく、３株系の軌道は、安定した制限サイクルに収束した（図３Ｅ、図１３Ｇ）。
【０２０３】
この出現特性を試験するために、３つの株すべてを、単一のマイクロ流体装置に同時にロードした。上述したものと同じ実験セットアップを使用して、系の理論的ロバスト性を試験した。プロトコルの唯一の違いは、マイクロ流体装置での細胞ロード後に高流量を適用することであった。この手順は、トラップから細胞の大部分をフラッシュすることを意図しており、各トラップには約１〜１０個の細胞しか残っていない。この方法を使用して、様々なトラップ中の３つの株間の幅広い相対比が得られ、それにより、初期濃度の大きな分布を試験することが可能となった。
【０２０４】
合計１５８２個の個々のマイクロ流体トラップの４つの別個のマイクロ流体実験を解析した。３つの異なるダイナミクスが、観察された。４つの別個のマイクロ流体実験が分析され、ここにおいて、合計１５８２個の個々のマイクロ流体培養領域があり、系は、株２から株１から株３までなどの３つの株の間で循環挙動を示したことが観察された（図２０Ａおよび図２０Ｂ）。トラップの約７５％のダイナミクスは、最初の溶解イベントが発生する前に、他のものよりも競合で打ち勝つ単独の株で構成されていた。実験の間、単一株がトラップを支配した。第２のケース（約２０％）では、トラップは、例えば、株１から株２まで、２つの株の間で循環した。第３のケースでは（約５％）、トラップは、例えば、株１から株２から株３まで、３つの株を循環した。４つの実験からのすべての遷移イベントを集約することにより、実験結果が理論軌道とよく整合することが観察される（図３Ｆ）。モデルから予測するように、３つの株は、２つの株が排除され、１つの株が生存するまで競合した（図３Ｆ、図１３Ｈ）。
【０２０５】
理想的な実験条件下では、サイクル中に次の株を一定に供給した。しかしながら、実験上の制約により、株サイクルは、上流トラップおよびチャネルからトラップ内に洗浄される細胞に依存した。３つの株および３つのコリシンをすべて含む可変条件下では、株は、連続的に循環することが実証された。しかしながら、トラップ形状のため、実験の期間が長くなるにつれて、マイクロ流体トラップ内の細胞溶解物の蓄積は、新しい細胞が上流で洗浄されることを防止し、株サイクルの継続能力を低下させる。これらのマイクロ流体実験の制限により、１回のランで系の全サイクルを表示することはできない。しかしながら、株が株２から株１へとサイクルし、次に株３へとサイクルする実例、およびその他のシナリオが、いくつか示されている（図３Ｄおよび図３Ｅ、図１３Ｇ）。それにもかかわらず、４つの実験および１，６００個のマイクロ流体トラップのデータを集約することによって、系の初期条件（すなわち、どの各株の濃度が初期に始まるか）の変動が、３つの株系間の振動が安定に達することを妨げず、株を一時に１つずつ連続して循環させることが実証された（図３Ｃ、図１９Ａおよび図１９Ｂ、図９）。これは、初期条件における変動が系の定常状態を妨害しないという点で、系のロバスト性を実証している。インビボでのアプリケーションでは、これは、望ましい株サイクルを達成することが、初期条件（例えば、投与の濃度、投与時間など）に対してあまり敏感ではないことを意味する。
【０２０６】
ＲＰＳ生態学と予期される挙動との一貫した収束は、予測可能かつ正確なダイナミクスを示すための改変生態学の実現可能性を支持する。合成微生物コミュニティが新しいバイオテクノロジー応用を可能にするその可能性は、長い間知られている（例えば、Ｂ．Ｋｅｒｒ，Ｍ．Ａ．Ｒｉｌｅｙ，Ｍ．Ｗ．Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｂ．Ｊ．Ｂｏｈａｎｎａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ４１８，１７１（２００２）、Ｌ．Ｒ．Ｌｙｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６，１６９（２００８）、Ｔ．Ｇｒｏβｋｏｐｆ，Ｏ．Ｓ．Ｓｏｙｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １８，７２（２０１４）、Ｋ．Ｚｈｏｕ，Ｋ．Ｑｉａｏ，Ｓ．Ｅｄｇａｒ，Ｇ．Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３，３７７（２０１５）を参照）。改変生態学は、単一の集団に改変することが難しい可能性がある複雑な機能を示す（例えば、Ｊ．Ｓｈｏｎｇ，Ｍ．Ｒ．Ｊ．Ｄｉａｚ，Ｃ．Ｈ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，７９８（２０１２）、Ｋ．Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｌ．Ｙｏｕ，Ｆ．Ｈ．Ａｒｎｏｌｄ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６，４８３（２００８）を参照）。
【０２０７】
実施例４−プラスミド安定性
ＲＰＳ合成生態学戦略は、生態学の進化および構成に対する外部制御を可能にし、回路機能を中断することなく、手動の入力を通して望ましくない株の置換を可能にする。この概念を実証し、ＲＰＳ系を用いてＳＬＣの機能安定性を持続させるために、選択抗生物質（カナマイシン）の非存在下での動的発現を試みた。この場合、ＳＬＣ活性化プラスミドに対する選択圧は、急速な機能喪失をもたらすはずである。
【０２０８】
２つのシナリオ（図１４Ａ）が、調査された。シナリオ１では、各株をカナマイシンを含まないＬＢ培地中で個別に培養した。選択的抗生物質の非存在下では、回路機能の喪失は普容的であり、蛍光発現および同期溶解ダイナミクスの喪失をもたらした。同期溶解までの経過時間（ｎ＝１６）が記録され、プラスミド損失の８０〜９０％が３２時間以内に発生し、その後、株が制御不能に成長することが見出された（図１４Ｂ、図１４Ｃ、Ｌ．Ｏ．Ｆ．は「機能喪失」を表す）。シナリオ２では、実験は、株２と株１の共培養で開始され、株１がトラップを引き継ぐことを可能にした。１２時間後、株３を加えて、株１を置換し、３０時間後、株２を再導入して株３を置換した。したがって、株２から開始して、無期限に維持される可能性が高い方法でフルサイクルを完了した。前の株が変異する前に、次の株を手動で追加することによって、回路の安定性の持続時間を、回路機能を中断することなく延長することができた（図１４Ｄ）。
【０２０９】
変異可能な遺伝子回路に対するＲＰＳ系の効果をさらに探索するために、バッチ経過実験を行い、２つのシナリオを比較した（図１５Ａ）。最初のシナリオでは、抗生物質を含む培養培地に、株１を接種し、１２時間ごとに培養物を新鮮な成長培地に経過させた。シナリオ２では、培養物にも株１を接種し、１２時間ごとに経過させたが、３回の経過ごとに、ＲＰＳサイクルにおける次の株も追加した。シナリオ１では、突然変異は経過４で開始され、同期溶解の喪失が起こった後、それは回復しなかったことが観察された。しかしながら、シナリオ２では、前の経過で喪失した後でも、同期溶解の喪失の遅延および溶解機能の回復が観察された（図１５Ｂ）。Ｘ１７４Ｅ溶解遺伝子およびＬｕｘカセットを含有する１キロ塩基対領域のサンガー配列決定により、ＲＰＳ戦略が、同じ期間にわたる変異の発生を減少させることが示された。このようにして、個々の変異細胞を排除する課題を集団全体の排除へとシフトさせることによって、突然変異またはプラスミド喪失によるかどうかにかかわらず、回路の機能喪失を防止するＲＰＳ系の能力が実証された。
【０２１０】
遺伝的安定性を保証する拡張可能なモジュラープラットフォームとして、ＲＰＳ系は、プラスミド安定性を維持するために他の従来の戦略と組み合わせることを可能にする追加の制御層を提供する。このアプローチにより、合成生物学者は、選択的抗生物質の非存在下で長期間維持することができる系を設計することができ、治療剤からバイオレメディエーション、産生、および感知技術に及ぶ用途に影響を与えることができる。これらの用途では、コリシン耐性の有病率が環境条件に応じて比較的迅速に現れ得るため、異なる天然または合成毒素−抗毒素系を備える新しいＲＰＳ株の開発が必要となる。より広い範囲において、遺伝子構築物の安定性を制御するための改変された「合成生態学」の使用により、個々の亜集団のプログラム化された操作および相互作用を通して、適用された動的合成生態系の可能性がもたらされる。
【０２１１】
実施例３−モデル
これらの観察は、この３株の溶解ベースの系が、広範なパラメータに対してどのように作用することができるかを視覚的に示す計算モデルに統合された。各株がその他の株によって完全に死滅し得るという仮定の下で、３つの株の各々は、１回サイクルすること、そしてより高い濃度で最初に開始された株は、トラップを支配することを発見した（図３Ａ）。３つの株すべてを、単一のマイクロ流体装置に同時にロードした。３つの株すべてを、同様の概ねＯＤに培養し、次いでともに混合した。次いで、細胞の混合物をマイクロ流体装置にロードした。系は、３つの株、例えば、株２から株１から株３までを循環させることができた（図３Ｂおよび図３Ｃ）。株が第１の株に戻り、フルサイクルを完了した例は観察されなかった。１つの株が別の株に致命的な影響を及ぼすため、１つの優れたものが残るまで、３つの株が競合し得る。
【０２１２】
モデルにおいて持続的なスイッチングを達成するには、細胞の定常シードを表す小さなε（イプシロン）を加えることが、いずれかの株の完全な除去を回避するために有用であるという仮説が立てられた（図３Ｄ）。このεという用語は、各細胞型を一定に供給するための系内の次の株の連続的な追加を表す。さらに、３株系の軌道は、幅広い初期条件および系パラメータに関して堅牢な安定した制限サイクルに収束する（図８）。
【０２１３】
密度ｐ、ｑ、ｒの３つの細菌株は、コリシンがない場合、同じ公称成長速度で指数関数的に成長し、一般性を失うことなくスケールアウトできると考えられる。この３つの株は、３種類のコリシンを産生する。細胞外培地中のこれらのコリシンの濃度は、それぞれＣｐ、Ｃｑ、Ｃｒである。これらのコリシンの役割は、互いに成長を円を描くように減速させることである。Ｃｐは、ｑの成長を遅らせるため、レート（１＋Ｃｐ）−１で成長し、Ｃｑも同様にｒを遅くし、Ｃｒは、ｐを遅くする。さらに、すべての株は、クォーラム感知分子ＡＨＬを産生し、ＡＨＬの細胞外濃度は、Ａと示されている。細胞が産生するコリシンは、それぞれの細胞に閉じ込められたままで、溶解イベント中に細胞外培地に放出されるまで、他の株には影響しない。すべての株の溶解は、ＡがＡｃ以上の場合に起こり、その間にほとんどの細胞が溶解するが、わずかな分率δが生存する。細胞外空間のＡＨＬは、常にレートγＡで希釈され、一方でコリシンは、レートγＣで希釈される。
【０２１４】
溶解イベントｉの直後の時点ｔｉで、７つの全濃度の値が、それぞれ
【数１】
2021526802.tif 000003
であると仮定する。Ａｉ＝Ａｃ（溶解イベントが短く、ＡＨＬの濃度が変化する可能性がない）と仮定した場合について留意する。これらの動的変数のその後の変化は、次の式によって制御される。
【数２】
2021526802.tif 000004
【０２１５】
溶解イベントｉの後、ｐ、ｑ、ｒの濃度が小さくなり、ＡＨＬの濃度は、希釈により最初に低下する。しかしながら、ｐ＋ｑ＋ｉの総細菌密度がかなり大きくなると、ＡＨＬの濃度は上昇し始める。Ａが再度、時間ｔｉ＋１でＡｃに達すると、新たな溶解イベントが発生する。この時点で、それぞれＰｉ＋１、Ｑｉ＋１、Ｒｉ＋１に等しい３つの株の濃度は、分率δだけ即座に減少する
【数３】
2021526802.tif 000005
［注：すべての株が完全に除去されないように、わずかなεを追加した。一見軽微に見えるが、重要な持続的なスイッチングは、それなしでは起こらないように思われる］。同時に、コリシンは、溶解した細胞から細胞外空間に放出され、以前に存在していたコリシンに追加される。
【数４】
2021526802.tif 000006
【０２１６】
【数５】
2021526802.tif 000007
は、ｉ＋１回目の溶解イベントの直前の株ｐの密度であり、ＱおよびＲについても同様である。パラメータβは、溶解中の細菌によるコリシンの放出速度を特徴付ける（３つの株すべてについて同じと仮定した）。
【０２１７】
式（１）〜式（１３）のシミュレーションは、広範なパラメータ値における優性株密度のロバストなスイッチングダイナミクスを示す（図２４Ａ、図２４Ｂ、図２５Ａ、図２５Ｂ、図２６Ａ、および図２６Ｂ）。
【０２１８】
分析。
溶解イベント間のコリシンダイナミクスの式は、直線的であるため、ごく簡単に統合することができる。
【数６】
2021526802.tif 000008
【０２１９】
時間関数としてのコリシン濃度が既知であるため、株濃度の式を統合することができる。
【数７】
2021526802.tif 000009
【０２２０】
最後に、溶解イベント間のＡＨＬ濃度を以下のように計算した。
【数８】
2021526802.tif 000010
【０２２１】
次の溶解イベントの時間は、超越方程式から見出され、
【数９】
2021526802.tif 000011
【０２２２】
ここからは、ＡＨＬのダイナミクスは集団ダイナミクスよりもはるかに速いと仮定した（すなわち、γＡ＞＞１）。次に、ＡＨＬ濃度は、チャンバ内の細胞の合計量を追跡し、Ａの発現は簡略化され得る。
【数１０】
2021526802.tif 000012
【０２２３】
そのため、次の溶解イベントの状態は、
【数１１】
2021526802.tif 000013
【０２２４】
コリシンも十分に急速に溶解する場合、図２５Ａ、図２５Ｂ、図２６Ａ、および図２６Ｂに示す実施例のように、各溶解サイクルの終わりまでにコリシンが無視できるほど小さい値に分解する時間があり、次いで、
【数１２】
2021526802.tif 000014
の値は、前の溶解サイクル中のコリシン濃度に依存せず、式（２３）〜式（２５）に従って、Ｐｉ、Ｑｉ、Ｒｉに正比例する。
【数１３】
2021526802.tif 000015
【０２２５】
これらの式と、次の溶解イベント、ｔ＝ｔｉ＋１、の時点での式（１５）〜式（１７）の（８）〜（１０）を置換し、以下の暗黙的マッピングを達成する。
【数１４】
2021526802.tif 000016
【０２２６】
Ｔｉ＝ｔｉ＋１−ｔｉという表記は、ｉ番目の溶解イベントと（ｉ＋１）番目の溶解イベントとの間の時間間隔で導入される。値Ｔｉはまだ未決定であるため、マッピングは、依然として暗黙的である。δ＜＜の場合
【数１５】
2021526802.tif 000017
【０２２７】
１、すなわち、細胞密度が溶解イベント間で著しく増加すると、１つ下げることにより、角括弧内の１つの式を簡略化することができる。
Ｔｉは、これらのツリー式を合計し、式（２２）を使用して計算され得る。
【数１６】
2021526802.tif 000018
【０２２８】
最終的に、Ｐｉ、Ｑｉ、Ｒｉの明確な三次元マッピングが達成される。
【数１７】
2021526802.tif 000019
【０２２９】
式（３２）からの溶解イベント間の間隔は、によって与えられる。
【数１８】
2021526802.tif 000020
【０２３０】
固定点およびＨｏｐｆ分岐。
マッピング（３３）〜（３３）の固定点の３つの株すべてが等しい場合、Ｐｉ＝Ｑｉ＝Ｒｉ＝Ｐ０＝
γＡＡｃ／３αが考慮される。このレジメンでは、溶解イベント間の期間は、によって与えられる。
【数１９】
2021526802.tif 000021
【０２３１】
この固定点の安定性を調べるために、その近くのマップは線形化され、
【数２０】
2021526802.tif 000022
【０２３２】
これらの式を置換すると、次の線形マップが達成された。
【数２１】
2021526802.tif 000023
【０２３３】
固定点の安定性は、特性マトリックスの固有値によって決定された
【数２２】
2021526802.tif 000024
【０２３４】
このマトリックスには、３  つの固有値がある：λ１＝０、λ２；３＝３Ａ＋３Ｂ／２±ｉ３  ｓｑｒｔ（３）Ｂ／２。最初の固有値はゼロであり、超安定性に対応する。２番目と３番目の固有値は、複雑であり、それらの絶対値｜λ２，３｜が１より大きい場合（ｓｑｒｔ（（３Ａ＋３Ｂ／２）２＋２７Ｂ２／４）＞１または）、指数関数的に成長するソリューションに対応することができる。
【数２３】
2021526802.tif 000025
【０２３５】
これは、このモデルのＨｏｐｆ分岐についての条件である。小さいＡｃについては、左側が小さいのは分かりやすいが、単調にＡｃが、１／９より大きい非対称値に対して増加し、
【数２４】
2021526802.tif 000026
【０２３６】
したがって、Ｈｏｐｆ分岐は、常に有限Ａｃで起こる（図８Ａを参照）。Ｈｏｐｆ分岐で、｜λ２，３｜＝１の場合、１スイッチングサイクル（期間の１／３）あたりの溶解イベントの数は、図８Ｂおよび図８Ｃは、マップおよび基礎となるフルモデルの溶解パルス数および分岐図を示している。
【０２３７】
強いスイッチングレジーム。
Ｈｏｐｆ分岐点から遠く離れて、１つの株が多数の溶解期間の間、ダイナミクスを支配し、その後急速に次の株の支配等へとスイッチングすると、スイッチングは強く非線形になる（図２５、２６）。このレジームのダイナミクスを特徴付けるために、溶解イベントとスイッチングサイクルの期間の間の時間間隔を計算した。
【０２３８】
溶解間隔は、スイッチングサイクル内で変化する。これらは、１つの株が強く支配的であるサイクルの途中で最も小さく、２つの株がほぼ等しい場合、サイクル間でやや長い。
【０２３９】
最小溶解間隔。各スイッチングサイクルのバルクでは、株のうちの一方は、溶解が起こる高濃度に成長し、他方の２つの株は、ずっと小さいままである（ε＜＜γＡＡ／αと推定される）。このレジームでは、マップは、ほぼ一次元となり、軽微となった（一般性の喪失なしに、ｐが優性な株として選択され、Ｑｉ＝Ｒｉ＝０が
【数２５】
2021526802.tif 000027
推定される）：
［我々がε＜＜δγＡＡ／αと仮定したことが、推定される。このフェーズにおける溶解イベントの間隔は予想通りである。
【０２４０】
最大溶解間隔次の株に対して支配的である１つの株からのスイッチング中に最大溶解間隔が生じる。
【数２６】
2021526802.tif 000028
【０２４１】
このスイッチング中、２つの濃度が一定のｉ＝ｋ＋１で短時間で等しくなる（決定性については、Ｐｋ＋１＝Ｑｋ＋１、Ｒｋ＋１＝０を想定）。等価性Ｐｋ＋１＝Ｑｋ＋１の条件は、であることが容易に分かる
【数２７】
2021526802.tif 000029
（ここでは、わずかなεは無視した）。十分なシャープスイッチでは、Ｐｋの大きさは、依然としてＰＭ＝γＡＡｃ／αに近付いている。これにより、Ｒｋを解析し、次いでそれを使用して、Ｔｋを見つけることができる。βＲｋ＞＞１（後天的を検証）である場合、１が無視され得、式を明確に解くことができ、
【数２８】
2021526802.tif 000030
【０２４２】
ここから、この式がγｃ〜１について有効かどうかの条件は、βγＡＡｃα＞＞１である。その後、最大溶解間隔を明示的に計算した
【数２９】
2021526802.tif 000031
【０２４３】
平均溶解間隔Ｔａは、ＴｍとＴＭとの間のどこかであるが、スイッチング間隔が長くなるにつれて、徐々にＴｍに近づく。
【０２４４】
スイッチング間隔の期間。１つの株が支配するスイッチングサイクルの期間を推定するために、２つのサブインターバルからなることが観察された。第１のサブインターバルでは、株のうちの１つ（特異性についてはｐ）は、支配的であり、溶解イベントの前にはＰＭに近接したままであり、一方で他の２つの株（ｑおよびｒ）は小さい。それらのうちの１つ（ｑ）は、その成長が大きなｐによって強く抑制されるため、サブインターバル全体を通して非常に小さい（Ｏ（ε））ままである一方、他の株（ｒ）は、抑制されず、小さな初期レベルからＯ（ＰＭ）まで着実に成長し、最終的にＰＭと同等の振幅に達する。これが発生すると、第２のサブインターバルが開始され、その間、第１の株（ｐ）の振幅は、その成長が大きなｒによって抑制されるので、急速に小さく（Ｏ（ε）に減少する。最初のサブインターバルの期間を取得するために、Ｒｉのマッピングを考慮し、
【数３０】
2021526802.tif 000032
【数３１】
2021526802.tif 000033
が推定される。
【０２４５】
式（３２）によれば、
【数３２】
2021526802.tif 000034
【０２４６】
この式を式（３１）で用いて、以下の１Ｄマッピングを得た。
【数３３】
2021526802.tif 000035
【０２４７】
第１のサブインターバルの期間を見つけるために、ＲｉがＲ０＝０から開始するＰＭの次数の値に到達する反復の回数が、決定された。このサブインターバル自体は、２つの部分に分けることができる。βＲｉ＜＜１のとき、第２の括弧が拡張され、以下の二次的マップ、
【数３４】
2021526802.tif 000036
または新しい変数
【数３５】
2021526802.tif 000037
の導入が取得され、
【数３６】
2021526802.tif 000038
ａ＝εβ／δγｃであり、初期状態
【数３７】
2021526802.tif 000039
であった。小さいａ＜＜１の場合、
【数３８】
2021526802.tif 000040
に達する反復回数ｎは大きく、連続制限値を取り、次の微分方程式を積分することによって推定され得、
わずかなａイールドの場合、
【数３９】
2021526802.tif 000041
から
【数４０】
2021526802.tif 000042
までであり、
当然、最後の数回は条件βＲｉ＜＜１が違反したが、この式は依然として
【数４１】
2021526802.tif 000043
Ｒｎ＝β−１に達するために必要な反復回数の良好な推定値を示した。次に
【数４２】
2021526802.tif 000044
Ｒｉについて、Ｒｎ＝β−１からＰＭになるように、追加反復回数を推定した。前提条件β＞＞ε／δでは、Ｒｉのこの範囲において、後者はマップ（６３）から無視され、全体として簡略化され、
【数４３】
2021526802.tif 000045
であり、初期状態
【数４４】
2021526802.tif 000046
であった。このマップの最初のいくつかの反復は、次のようであった：
【数４５】
2021526802.tif 000047
γｃ＝Ｏ（１）の場合、この配列はｉとともに急速に（超指数関数的に）成長するため、ｉ＝ｎ＋２の後すでに、１は、式（６８）の括弧内で無視され、次のように単純に記述された。
【数４６】
2021526802.tif 000048
【０２４８】
したがって、Ｎ１反復では、
【数４７】
2021526802.tif 000049
【０２４９】
この式をＰＭと等しくして、ｎの式を想起すると、Ｎ１について以下の近似式が得られた。
【数４８】
2021526802.tif 000050
【０２５０】
第２のサブインターバル中、Ｒｉの大きさはすでにＰＭの近くにあり、株Ｐの成長は、強く抑制される。これは、各溶解イベントにおいて、係数δ、Ｐｉ＋１＝δＰｉによって減少されることを意味する。これにより、Ｐｉが「バックグラウンド」レベルＯ（ε）に達するために必要な反復回数の推定値が直ちに得られた。
【数４９】
2021526802.tif 000051
【０２５１】
したがって、単一のスイッチングサイクル内の溶解間隔の総数は、によって得られる。
【数５０】
2021526802.tif 000052
【０２５２】
図８Ｄ〜図８Ｇは、正確なモデル、３Ｄマップ、および分析近似から得られたいくつかのモデルパラメータの関数として、溶解イベント間の間隔（最小、最大、および平均）および１スイッチング間隔あたりの溶解イベントの数を示している。驚くべきことに、分析近似は、３Ｄマップの結果よりも正確であるように見えた。
【０２５３】
参考文献
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１６．Ｄｉｎ，Ｍ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ  ｃｙｃｌｅｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ５３６，８１−８５（２０１６）。
【０２５４】
その他の実施形態
実施形態１は、
成長環境で第１の期間、第１の細菌株を培養することと、
第２の細菌株を成長環境に加え、かつ第２の期間、第２の細菌株を培養することと、
第３の細菌株を成長環境に加え、かつ第３の期間、第３の細菌株を培養することと、を含み、
第１、第２、および第３の細菌株の各々が、毒素系を含み、
第１の細菌株の毒素系が、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第３の毒素／第３の抗毒素対から第３の抗毒素を産生し、第１の細菌株が、第３の毒素を産生せず、
第２の細菌株の毒素系が、第２の毒素／第２の抗毒素対、および第１の毒素／第１の抗毒素対から第１の抗毒素対を産生し、第２の細菌株が、第１の毒素を産生せず、
第３の細菌株の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素対を産生し、第３の細菌株が、第２の毒素を産生せず、
任意選択的に、第１、第２、および第３の細菌株の各々が、
活性化可能なプロモータの制御下にある溶解遺伝子を有する溶解プラスミドと、
活性化遺伝子を有する活性化プラスミドであって、その発現が、クォーラム感知分子の蓄積を促進する、活性化プラスミドと、を含み、
溶解遺伝子の活性化可能なプロモータおよび活性化遺伝子の発現の両方が、クォーラム感知分子によって活性化される、方法である。
【０２５５】
実施形態２は、クォーラム感知分子が、第１、第２、および第３の細菌株の各々において異なっている、実施形態１に記載の方法である。
【０２５６】
実施形態３は、第１、第２、および第３の細菌株の各々の各クォーラム感知分子が、別の株の溶解遺伝子の活性化可能なプロモータに対して全くまたは実質的に影響を及ぼさない、実施形態２に記載の方法である。
【０２５７】
実施形態４は、クォーラム感知分子が、第１、第２、および第３の細菌株の各々において同じである、実施形態１に記載の方法である。
【０２５８】
実施形態５は、成長環境で１つ以上の追加の細菌株を培養または共培養することをさらに含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法である。
【０２５９】
実施形態６は、１つ以上の追加の細菌株の各々が、
活性化可能なプロモータの制御下にある溶解遺伝子を有する溶解プラスミドと、
活性化遺伝子を有する活性化プラスミドであって、その発現が、クォーラム感知分子の蓄積を促進する、活性化プラスミドと、を含み、
溶解遺伝子の活性化可能なプロモータおよび活性化遺伝子の発現の両方が、クォーラム感知分子によって活性化される、実施形態５に記載の方法である。
【０２６０】
実施形態７は、クォーラム感知分子が、第１、第２、第３、および１つ以上の追加の細菌株の各々において異なっている、実施形態６に記載の方法である。
【０２６１】
実施形態８は、第１、第２、第３、および１つ以上の追加の細菌株の各々の各クォーラム感知分子が、成長環境で使用される別の細菌株の溶解遺伝子の活性化可能なプロモータに対して全くまたは実質的に影響を及ぼさない、実施形態７に記載の方法である。
【０２６２】
実施形態９は、クォーラム感知分子が、第１、第２、第３、および１つ以上の追加の細菌株の各々において同じである、実施形態６に記載の方法である。
【０２６３】
実施形態１０は、１つ以上の追加の細菌株の各々が、毒素系を含む、実施形態６〜９のいずれか１つに記載の方法である。
【０２６４】
実施形態１１は、第１の細菌株、第２の細菌株、第３の細菌株、および１つ以上の追加の細菌株の各々の毒素系が、ゲノム内で、プラスミド上で、複数のプラスミド上で、またはそれらの組み合わせ上で独立してコードされる、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の方法である。
【０２６５】
実施形態１２は、少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々の溶解プラスミドおよび活性化プラスミドが、同じプラスミドのコピーである、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の方法である。
【０２６６】
実施形態１３は、少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々の溶解プラスミドおよび活性化プラスミドが、異なるプラスミドである、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の方法である。
【０２６７】
実施形態１４は、少なくとも第１、第２、および第３の細菌株が、代謝的に競合的である、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の方法である。
【０２６８】
実施形態１５は、少なくとも第１、第２、および第３の細菌株が、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはその細菌変異体から選択される、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の方法である。
【０２６９】
実施形態１６は、少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々が、成長環境の別の株と比較して成長利点を有しない、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の方法である。
【０２７０】
実施形態１７は、少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々において、溶解プラスミドが、溶解遺伝子、活性化可能なプロモータ、および任意選択でレポータ遺伝子を含み、活性化プラスミドが、活性化遺伝子、任意選択的に、溶解タグ、および任意選択的にレポータ遺伝子を含む、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の方法である。
【０２７１】
実施形態１８は、少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々における溶解遺伝子が、バクテリオファージΦＸ１７４からのＥである、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の方法である。
【０２７２】
実施形態１９は、少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々における活性化可能なプロモータが、ＬｕｘＲ−ＡＨＬ活性化可能なｌｕｘＩプロモータであり、活性化遺伝子が、ＬｕｘＩである、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の方法である。
【０２７３】
実施形態２０は、少なくとも１つのレポータ遺伝子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、またはそれらの変異体をコードする遺伝子から選択される、実施形態１７に記載の方法である。
【０２７４】
実施形態２１は、溶解タグが、ｓｓｒＡ−ＬＡＡ溶解タグである、実施形態１７に記載の方法である。
【０２７５】
実施形態２２は、プラスミドのうちの少なくとも１つが、第１、第２、および第３の細菌株のうちの少なくとも１つのゲノムに組み込まれる、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載の方法である。
【０２７６】
実施形態２３は、培養が、マイクロ流体装置内で起こる、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の方法である。
【０２７７】
実施形態２４は、培養が、バイオリアクター内で起こる、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の方法である。
【０２７８】
実施形態２５は、培養が、インビボで起こる、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の方法である。
【０２７９】
実施形態２６は、第１、第２、および第３の期間の各々が、約１２〜約７２時間の範囲である、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の方法である。
【０２８０】
実施形態２７は、第１、第２、および第３の期間の各々が、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、および少なくとも９６時間から選択される、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の方法である。
【０２８１】
実施形態２８は、第１、第２、および第３の期間の各々が、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および９６時間から選択される、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の方法である。
【０２８２】
実施形態２９は、第１、第２、および第３の期間の各々が、独立して、約１時間〜約７２時間の範囲である、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の方法である。
【０２８３】
実施形態３０は、第１、第２、および第３の期間の各々が、独立して、約１時間〜約４８時間の範囲である、実施形態２９に記載の方法である。
【０２８４】
実施形態３１は、第１、第２、および第３の期間の各々が、独立して、約１時間〜約２４時間の範囲である、実施形態２９に記載の方法である。
【０２８５】
実施形態３２は、第１、第２、および第３の期間の各々が、独立して、約１時間〜約１８時間の範囲である、実施形態２９に記載の方法である。
【０２８６】
実施形態３３は、第１、第２、および第３の期間の各々が、独立して、約１時間〜約１２時間の範囲である、実施形態２９に記載の方法である。
【０２８７】
実施形態３４は、第１、第２、および第３の期間の各々が、独立して、約１時間〜約６時間の範囲である、実施形態２９に記載の方法である。
【０２８８】
実施形態３５は、第１、第２、および第３の期間の各々が、独立して、約１時間〜約３時間の範囲である、実施形態２９に記載の方法である。
【０２８９】
実施形態３６は、第１、第２、および第３の期間が、連続的に発生する、実施形態１〜３５のいずれか１つに記載の方法である。
【０２９０】
実施形態３７は、第１および第２の期間、第２および第３の期間、または第１および第３の期間が、部分的または完全に重複する、実施形態１〜３６のいずれか１つに記載の方法である。
【０２９１】
実施形態３８は、第１、第２、および第３の細菌株のうちの１つ以上が、プロモータに動作可能に連結された異種核酸および／または異種タンパク質をコードする、実施形態１〜３７のいずれか１つに記載の方法である。
【０２９２】
実施形態３９は、プロモータが、活性化可能なプロモータである、実施形態３８に記載の方法である。
【０２９３】
実施形態４０は、プロモータが、クォーラム感知分子によって活性化される、実施形態３９に記載の方法である。
【０２９４】
実施形態４１は、プロモータが、構成的プロモータである、実施形態３８に記載の方法である。
【０２９５】
実施形態４２は、異種核酸および／または異種タンパク質が、治療剤である、実施形態３８〜４１のいずれか１つに記載の方法である。
【０２９６】
実施形態４３は、治療剤が、阻害性核酸、サイトカイン、酵素、ペプチドホルモン、融合タンパク質、凝固因子、毒素、抗菌ペプチド、およびその抗体または抗原結合断片からなる群から選択される、実施形態４２に記載の方法である。
【０２９７】
実施形態４４は、阻害性核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはアンチセンスである、実施形態４３に記載の方法である。
【０２９８】
実施形態４５は、
少なくとも第１の細菌株と、第２の細菌株と、ｎ番目の細菌株と、を含む、ｎ個の細菌株を提供することと、
成長環境で独立した期間、細菌株の各々を連続的に共培養することと、を含み、
第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々が、前の細菌株を有し、
ｎが、少なくとも３であり、
ｎ個の株の各々が、
活性化可能なプロモータの制御下にある溶解遺伝子を有する溶解プラスミドと、
活性化遺伝子を有する活性化プラスミドであって、その発現が、クォーラム感知分子の蓄積を促進する、活性化プラスミドと、を含み、
溶解遺伝子の活性化可能なプロモータおよび活性化遺伝子の発現の両方が、クォーラム感知分子によって活性化され、
ｎ個の細菌株の各々が、毒素系を含み、
第２〜ｎ番目の細菌株の各々の毒素系が、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、第１の毒素が、前の細菌株、および前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効であり、
第１の細菌株の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、第３の毒素が、ｎ番目の細菌株、およびｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である、方法である。
【０２９９】
実施形態４６は、ｎ個の細菌株の各々において、溶解プラスミドが、溶解遺伝子、活性化可能なプロモータ、および任意選択でレポータ遺伝子を含み、活性化プラスミドが、活性化遺伝子、任意選択的に、溶解タグ、および任意選択的にレポータ遺伝子を含む、実施形態４５に記載の方法である。
【０３００】
実施形態４７は、ｎ個の細菌株の各々の溶解遺伝子が、バクテリオファージΦＸ１７４からのＥである、実施形態４５または４６に記載の方法である。
【０３０１】
実施形態４８は、ｎ個の細菌株の各々における活性化可能なプロモータが、ＬｕｘＲ−ＡＨＬ活性化可能なｌｕｘＩプロモータであり、活性化遺伝子が、ＬｕｘＩである、実施形態４５〜４７のいずれか１つに記載の方法である。
【０３０２】
実施形態４９は、少なくとも１つのレポータ遺伝子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、またはそれらの変異体をコードする遺伝子から選択される、実施形態４６に記載の方法である。
【０３０３】
実施形態５０は、溶解タグが、ｓｓｒＡ−ＬＡＡ溶解タグである、実施形態４６に記載の方法である。
【０３０４】
実施形態５１は、プラスミドのうちの少なくとも１つが、ｎ個の細菌株のうちの少なくとも１つのゲノムに組み込まれる、実施形態４５〜５０のいずれか１つに記載の方法である。
【０３０５】
実施形態５２は、クォーラム感知分子が、ｎ個の細菌株の各々において異なっている、実施形態４５〜５１のいずれか１つに記載の方法である。
【０３０６】
実施形態５３は、ｎ個の細菌株の各々の各クォーラム感知分子が、別の株の溶解遺伝子の活性化可能なプロモータに対して全くまたは実質的に影響を及ぼさない、実施形態５２に記載の方法である。
【０３０７】
実施形態５４は、クォーラム感知分子が、ｎ個の細菌株の各々において同じである、実施形態４５〜５１のいずれか１つに記載の方法である。
【０３０８】
実施形態５５は、ｎ個の細菌株の各々の溶解プラスミドおよび活性化プラスミドが、同じプラスミドのコピーである、実施形態４５〜５４のいずれか１つに記載の方法である。
【０３０９】
実施形態５６は、ｎ個の細菌株の各々の溶解プラスミドおよび活性化プラスミドが、異なるプラスミドである、実施形態４５〜５４のいずれか１つに記載の方法である。
【０３１０】
実施形態５７は、
少なくとも第１の細菌株と、第２の細菌株と、ｎ番目の細菌株と、を含む、ｎ個の細菌株を提供することと、
成長環境で独立した期間、細菌株の各々を連続的に共培養することと、を含み、
第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々が、前の細菌株を有し、
ｎが、少なくとも３であり、
ｎ個の細菌株の各々が、毒素系を含み、
第２〜ｎ番目の細菌株の各々の毒素系が、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、第１の毒素が、前の細菌株、および前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効であり、
第１の細菌株の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、第３の毒素が、ｎ番目の細菌株、およびｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である、方法である。
【０３１１】
実施形態５８は、ｎ個の細菌株が、代謝的に競合的である、実施形態４４〜５７のいずれか１つに記載の方法である。
【０３１２】
実施形態５９は、ｎ個の細菌株の各々が、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはその細菌変異体から選択される、実施形態４４〜５８のいずれか１つに記載の方法である。
【０３１３】
実施形態６０は、ｎ個の細菌株の各々が、成長環境の別の株と比較して成長利点を有しない、実施形態４４〜５９のいずれか１つに記載の方法である。
【０３１４】
実施形態６１は、ｎ個の細菌株の毒素系が、ゲノム内で、プラスミド上で、複数のプラスミド上で、またはそれらの組み合わせ上で独立してコードされる、実施形態４４〜６０のいずれか１つに記載の方法である。
【０３１５】
実施形態６２は、培養が、マイクロ流体装置内で起こる、実施形態４４〜６１のいずれか１つに記載の方法である。
【０３１６】
実施形態６３は、培養が、バイオリアクター内で起こる、実施形態４４〜６１のいずれか１つに記載の方法である。
【０３１７】
実施形態６４は、培養が、インビボで起こる、実施形態４４〜６１のいずれか１つに記載の方法である。
【０３１８】
実施形態６５は、独立した期間の各々が、約１２〜約７２時間の範囲である、実施形態４４〜６４のいずれか１つに記載の方法である。
【０３１９】
実施形態６６は、独立した期間の各々が、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、および少なくとも９６時間から選択される、実施形態４４〜６４のいずれか１つに記載の方法である。
【０３２０】
実施形態６７は、独立した期間の各々が、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および９６時間から選択される、実施形態４４〜６４のいずれか１つに記載の方法である。
【０３２１】
実施形態６８は、期間の各々が、独立して、約１時間〜約７２時間の範囲である、実施形態４４〜６４のいずれか１つに記載の方法である。
【０３２２】
実施形態６９は、期間の各々が、独立して、約１時間〜約４８時間の範囲である、実施形態６８に記載の方法である。
【０３２３】
実施形態７０は、期間の各々が、独立して、約１時間〜約２４時間の範囲である、実施形態６８に記載の方法である。
【０３２４】
実施形態７１は、期間の各々が、独立して、約１時間〜約１８時間の範囲である、実施形態６８に記載の方法である。
【０３２５】
実施形態７２は、期間の各々が、独立して、約１時間〜約１２時間の範囲である、実施形態６８に記載の方法である。
【０３２６】
実施形態７３は、期間の各々が、独立して、約１時間〜約６時間の範囲である、実施形態６８に記載の方法である。
【０３２７】
実施形態７４は、期間の各々が、独立して、約１時間〜約３時間の範囲である、実施形態６８に記載の方法である。
【０３２８】
実施形態７５は、期間のうちの１つ以上が、部分的または完全に重複する、実施形態４５〜７４のいずれか１つに記載の方法である。
【０３２９】
実施形態７６は、ｎ個の細菌株のうちの１つ以上が、プロモータに動作可能に連結された異種核酸および／または異種タンパク質をコードする、実施形態４５〜７５のいずれか１つに記載の方法である。
【０３３０】
実施形態７７は、プロモータが、活性化可能なプロモータである、実施形態７６に記載の方法である。
【０３３１】
実施形態７８は、活性化可能なプロモータが、クォーラム感知分子によって活性化される、実施形態７７に記載の方法である。
【０３３２】
実施形態７９は、プロモータが、構成的プロモータである、実施形態７６に記載の方法である。
【０３３３】
実施形態８０は、異種核酸および／または異種タンパク質が、治療剤である、実施形態７６〜７９のいずれか１つに記載の方法である。
【０３３４】
実施形態８１は、治療剤が、阻害性核酸、サイトカイン、酵素、ペプチドホルモン、融合タンパク質、凝固因子、毒素、抗菌ペプチド、およびその抗体または抗原結合断片からなる群から選択される、実施形態８０に記載の方法である。
【０３３５】
実施形態８２は、阻害性核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはアンチセンスである、実施形態８１に記載の方法である。
【０３３６】
実施形態８３は、第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々が、前の株の毒素系の第２の毒素を産生せず、第１の細菌株が、ｎ番目の細菌株の毒素系の第４の毒素を産生しない、実施形態４５〜８２のいずれか１つに記載の方法である。
【０３３７】
実施形態８４は、溶解プラスミドおよび活性化プラスミドを含む細菌株であって、溶解プラスミドが、溶解遺伝子と、活性化可能なプロモータと、任意選択的にレポータ遺伝子と、を含み、活性化プラスミドが、活性化遺伝子と、任意選択的に溶解タグと、任意選択的にレポータ遺伝子と、を含み、細菌株が、毒素系をさらに含み、毒素系が、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素対を産生し、細菌株が、第２の毒素を産生しない、細菌株である。
【０３３８】
実施形態８５は、溶解遺伝子が、バクテリオファージΦＸ１７４からのＥである、実施形態８４に記載の細菌株である。
【０３３９】
実施形態８６は、活性化可能なプロモータが、ＬｕｘＲ−ＡＨＬ活性化可能なｌｕｘＩプロモータであり、活性化遺伝子が、ＬｕｘＩである、実施形態８４または８５に記載の細菌株である。
【０３４０】
実施形態８７は、活性化遺伝子が、活性化可能なプロモータを直接的または間接的に活性化する分子をコードする、実施形態８４〜８６のいずれか１つに記載の細菌株である。
【０３４１】
実施形態８８は、活性化可能なプロモータを直接的または間接的に活性化する分子が、クォーラム感知分子である、実施形態８７に記載の細菌株である。
【０３４２】
実施形態８９は、溶解遺伝子が、活性化可能なプロモータに動作可能に連結されている、実施形態８４〜８８のいずれか１つに記載の細菌株である。
【０３４３】
実施形態９０は、溶解プラスミド上のレポータ遺伝子が、活性化可能なプロモータに動作可能に連結されている、実施形態８４〜８９のいずれか１つに記載の細菌株である。
【０３４４】
実施形態９１は、活性化プラスミドが、活性化可能なプロモータをさらに含む、実施形態８４〜９０のいずれか１つに記載の細菌株である。
【０３４５】
実施形態９２は、活性化プラスミドの活性化可能なプロモータが、溶解プラスミドの活性化可能なプロモータのコピーである、実施形態９１に記載の細菌株である。
【０３４６】
実施形態９３は、活性化遺伝子が、活性化プラスミドの活性化可能なプロモータに動作可能に連結されている、実施形態９１または９２に記載の細菌株である。
【０３４７】
実施形態９４は、活性化プラスミドのレポータ遺伝子が、活性化プラスミドの活性化可能なプロモータに動作可能に連結されている、実施形態９１〜９３のいずれか１つに記載の細菌株である。
【０３４８】
実施形態９５は、溶解タグが、活性化プラスミドの活性化可能なプロモータに動作可能に連結されている、実施形態９１〜９４のいずれか１つに記載の細菌株である。
【０３４９】
実施形態９６は、毒素系が、溶解プラスミドの活性化可能なプロモータに動作可能に連結されている、実施形態８４〜９５のいずれか１つに記載の細菌株である。
【０３５０】
実施形態９７は、溶解タグが、ｓｓｒＡ−ＬＡＡ溶解タグである、実施形態８４〜９６のいずれか１つに記載の細菌株である。
【０３５１】
実施形態９８は、溶解プラスミドのレポータ遺伝子、活性化プラスミドのレポータ遺伝子、またはその両方が、蛍光タンパク質である、実施形態８４〜９７のいずれか１つに記載の細菌株である。
【０３５２】
実施形態９９は、溶解プラスミドのレポータ遺伝子および活性化プラスミドのレポータ遺伝子が、異なる遺伝子である、実施形態８４〜９７のいずれか１つに記載の細菌株である。
【０３５３】
実施形態１００は、毒素系を含む細菌株であって、毒素系が、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素を産生し、細菌株が、第２の毒素を産生しない、細菌株である。
【０３５４】
実施形態１０１は、細菌株が、プロモータに動作可能に連結された異種核酸および／または異種タンパク質をコードする、実施形態８４〜１００のいずれか１つに記載の細菌株である。
【０３５５】
実施形態１０２は、プロモータが、活性化可能なプロモータである、実施形態１０１に記載の細菌株である。
【０３５６】
実施形態１０３は、活性化可能なプロモータが、クォーラム感知分子によって活性化される、実施形態１０２に記載の細菌株である。
【０３５７】
実施形態１０４は、プロモータが、構成的プロモータである、実施形態１０１に記載の細菌株である。
【０３５８】
実施形態１０５は、異種核酸および／または異種タンパク質が、治療剤である、実施形態１０１〜１０４のいずれか１つに記載の細菌株である。
【０３５９】
実施形態１０６は、毒素系が、ゲノム内で、プラスミド上で、複数のプラスミド上で、またはそれらの組み合わせ上でコードされる、実施形態８４〜１０５のいずれか１つに記載の細菌株である。
【０３６０】
実施形態１０７は、細菌株が、治療剤をコードする核酸をさらに含む、実施形態８４〜１０６のいずれか１つに記載の細菌株である。
【０３６１】
実施形態１０８は、治療剤が、阻害性核酸、サイトカイン、酵素、ペプチドホルモン、融合タンパク質、凝固因子、毒素、抗菌ペプチド、およびその抗体または抗原結合断片からなる群から選択される、実施形態１０５または実施形態１０７に記載の細菌株である。
【０３６２】
実施形態１０９は、治療剤が、治療用ポリペプチドである、実施形態１０５または実施形態１０７〜１０８のいずれか１つに記載の細菌株である。
【０３６３】
実施形態１１０は、治療剤が、標的細胞に対して細胞傷害性または細胞停止性である、実施形態１０５または実施形態１０７〜１０９のいずれか１つに記載の細菌株である。
【０３６４】
実施形態１１１は、標的細胞が、癌細胞または感染細胞である、実施形態１１０に記載の細菌株である。
【０３６５】
実施形態１１２は、実施形態８４〜１１１に記載の細菌株のうちのいずれか１つ以上を含む医薬組成物である。
【０３６６】
実施形態１１３は、医薬組成物が、原位置での薬物送達のために製剤化される、実施形態１１２に記載の医薬組成物である。
【０３６７】
実施形態１１４は、
第１の溶解プラスミドと、第１の活性化プラスミドと、を含む第１の細菌株であって、第１の溶解プラスミドが、第１の溶解遺伝子、第１の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の活性化プラスミドが、第１の活性化遺伝子、任意選択的に第１の溶解タグ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の細菌株が、第１の毒素系をさらに含み、第１の毒素系が、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第３の毒素／第３の抗毒素対から第３の抗毒素を産生し、第１の細菌株が、第３の毒素を産生しない、第１の細菌株と、
第２の溶解プラスミドと、第２の活性化プラスミドと、を含む第２の細菌株であって、第２の溶解プラスミドが、第２の溶解遺伝子、第２の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の活性化プラスミドが、第２の活性化遺伝子、任意選択的に第２の溶解タグ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の細菌株が、第２の毒素系をさらに含み、第２の毒素系が、第２の毒素／第２の抗毒素対、および第１の毒素／第１の抗毒素対から第１の抗毒素を産生し、第２の細菌株が、第１の毒素を産生しない、第２の細菌株と、
第３の溶解プラスミドと、第３の活性化プラスミドと、を含む第３の細菌株であって、第３の溶解プラスミドが、第３の溶解遺伝子、第３の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の活性化プラスミドが、第３の活性化遺伝子、任意選択的に第３の溶解タグ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の細菌株が、第３の毒素系をさらに含み、第３の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素を産生し、第３の細菌株が、第２の毒素を産生しない、第３の細菌株と、を含む、系である。
【０３６８】
実施形態１１５は、
第１の毒素系を含む第１の細菌株であって、第１の毒素系が、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第３の毒素／第３の抗毒素対から第３の抗毒素を産生し、第１の細菌株が、第３の毒素を産生せず、第１の細菌株が、第１の溶解プラスミドおよび第１の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第１の溶解プラスミドが、第１の溶解遺伝子、第１の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の活性化プラスミドが、第１の活性化遺伝子、任意選択的に第１の溶解タグ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含む、第１の細菌株と、
第２の毒素系を含む第２の細菌株であって、第２の毒素系が、第２の毒素／第２の抗毒素対、および第１の毒素／第１の抗毒素対から第１の抗毒素を産生し、第２の細菌株が、第１の毒素を産生せず、第２の細菌株が、第２の溶解プラスミドおよび第２の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第２の溶解プラスミドが、第２の溶解遺伝子、第２の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の活性化プラスミドが、第２の活性化遺伝子、任意選択的に第２の溶解タグ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含む、第２の細菌株と、
第３の毒素系を含む第３の細菌株であって、第３の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素を産生し、第３の細菌株が、第２の毒素を産生せず、第３の細菌株が、第３の溶解プラスミドおよび第３の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第３の溶解プラスミドが、第３の溶解遺伝子、第３の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の活性化プラスミドが、第３の活性化遺伝子、任意選択的に第３の溶解タグ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含む、第３の細菌株と、を含む、系である。
【０３６９】
実施形態１１６は、１つ以上の追加の細菌株をさらに含む、実施形態１１４または実施形態１１５の系である。
【０３７０】
実施形態１１７は、第１の毒素系、第２の毒素系、および第３の毒素系が、ゲノム内で、プラスミド上で、複数のプラスミド上で、またはそれらの組み合わせ上で独立してコードされる、実施形態１１４〜１１６のいずれか１つに記載の系である。
【０３７１】
実施形態１１８は、
少なくとも第１の細菌株と、第２の細菌株と、ｎ番目の細菌株と、を含む、ｎ個の細菌株を含み、
第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々が、前の細菌株を有し、
ｎが、少なくとも３であり、
ｎ個の株の各々が、毒素系を含み、
第２〜ｎ番目の細菌株の各々の毒素系が、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、第１の毒素が、前の細菌株、および前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効であり、
第１の細菌株の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、第３の毒素が、ｎ番目の細菌株、およびｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である、系である。
【０３７２】
実施形態１１９は、
少なくとも第１の細菌株と、第２の細菌株と、ｎ番目の細菌株と、を含む、ｎ個の細菌株を含み、
第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々が、前の細菌株を有し、
ｎが、少なくとも３であり、
ｎ個の株の各々が、
活性化可能なプロモータの制御下にある溶解遺伝子を有する溶解プラスミドと、
活性化遺伝子を有する活性化プラスミドであって、その発現が、クォーラム感知分子の蓄積を促進する、活性化プラスミドと、を含み、
溶解遺伝子の活性化可能なプロモータおよび活性化遺伝子の発現の両方が、クォーラム感知分子によって活性化され、
ｎ個の細菌株の各々が、毒素系を含み、
第２〜ｎ番目の細菌株の各々の毒素系が、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、第１の毒素が、前の細菌株、および前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効であり、
第１の細菌株の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、第３の毒素が、ｎ番目の細菌株、およびｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である、系である。
【０３７３】
実施形態１２０は、ｎが、３である、実施形態１１８または実施形態１１９に記載の系である。
【０３７４】
実施形態１２１は、ｎが、４、５、６、７、８、９、または１０である、実施形態１１８または実施形態１１９に記載の系である。
【０３７５】
実施形態１２２は、毒素系の各々が、ゲノム内で、プラスミド上で、複数のプラスミド上で、またはそれらの組み合わせ上で独立してコードされる、実施形態１１８〜１２１のいずれか１つに記載の系である。
【０３７６】
実施形態１２３は、第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々が、前の株の毒素系の第２の毒素を産生せず、第１の細菌株が、ｎ番目の細菌株の毒素系の第４の毒素を産生しない、実施形態１１８〜１２２のいずれか１つに記載の系である。
【０３７７】
実施形態１２４は、
第１の溶解プラスミドと、第１の活性化プラスミドと、を含む第１の細菌株であって、第１の溶解プラスミドが、第１の溶解遺伝子、第１の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の活性化プラスミドが、第１の活性化遺伝子、第１の溶解タグ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の細菌株が、第１の毒素系をさらに含み、第１の毒素系が、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第３の毒素／第３の抗毒素対から第３の抗毒素を産生し、第１の細菌株が、第３の毒素を産生しない、第１の細菌株を含む、第１の医薬組成物と、
第２の溶解プラスミドと、第２の活性化プラスミドと、を含む第２の細菌株であって、第２の溶解プラスミドが、第２の溶解遺伝子、第２の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の活性化プラスミドが、第２の活性化遺伝子、第２の溶解タグ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の細菌株が、第２の毒素系をさらに含み、第２の毒素系が、第２の毒素／第２の抗毒素対、および第１の毒素／第１の抗毒素対から第１の抗毒素を産生し、第２の細菌株が、第１の毒素を産生しない、第２の細菌株を含む、第２の医薬組成物と、
第３の溶解プラスミドと、第３の活性化プラスミドと、を含む第３の細菌株であって、第３の溶解プラスミドが、第３の溶解遺伝子、第３の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の活性化プラスミドが、第３の活性化遺伝子、第３の溶解タグ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の細菌株が、第３の毒素系をさらに含み、第３の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素を産生し、第３の細菌株が、第２の毒素を産生しない、第３の細菌株を含む、第３の医薬組成物と、を含む、キットである。
【０３７８】
実施形態１２５は、
第１の毒素系を含む第１の細菌株であって、第１の毒素系が、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第３の毒素／第３の抗毒素対から第３の抗毒素を産生し、第１の細菌株が、第３の毒素を産生せず、第１の細菌株が、第１の溶解プラスミドおよび第１の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第１の溶解プラスミドが、第１の溶解遺伝子、第１の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の活性化プラスミドが、第１の活性化遺伝子、任意選択的に第１の溶解タグ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含む、第１の細菌株を含む、第１の医薬組成物と、
第２の毒素系を含む第２の細菌株であって、第２の毒素系が、第２の毒素／第２の抗毒素対、および第１の毒素／第１の抗毒素対から第１の抗毒素を産生し、第２の細菌株が、第１の毒素を産生せず、第２の細菌株が、第２の溶解プラスミドおよび第２の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第２の溶解プラスミドが、第２の溶解遺伝子、第２の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の活性化プラスミドが、第２の活性化遺伝子、任意選択的に第２の溶解タグ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含む、第２の細菌株を含む、第２の医薬組成物と、
第３の毒素系を含む第３の細菌株であって、第３の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素を産生し、第３の細菌株が、第２の毒素を産生せず、第３の細菌株が、第３の溶解プラスミドおよび第３の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第３の溶解プラスミドが、第３の溶解遺伝子、第３の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の活性化プラスミドが、第３の活性化遺伝子、任意選択的に第３の溶解タグ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含む、第３の細菌株を含む、第３の医薬組成物と、を含む、キットである。
【０３７９】
実施形態１２６は、第１の毒素系、第２の毒素系、および第３の毒素系が、ゲノム内で、プラスミド上で、複数のプラスミド上で、またはそれらの組み合わせ上で独立してコードされる、実施形態１２４〜１２５のいずれか１つに記載のキットである。
【０３８０】
実施形態１２７は、第１、第２、第３、および／または１つ以上の追加の医薬組成物中の１つ以上の追加の細菌株をさらに含む、実施形態１２４または１２５に記載のキットである。
【０３８１】
実施形態１２８は、
少なくとも第１の細菌株と、第２の細菌株と、ｎ番目の細菌株と、を含む、ｎ個の細菌株を含み、
第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々が、前の細菌株を有し、
ｎが、少なくとも３であり、
ｎ個の株の各々が、毒素系を含み、
第２〜ｎ番目の細菌株の各々の毒素系が、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、第１の毒素が、前の細菌株、および前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効であり、
第１の細菌株の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、第３の毒素が、ｎ番目の細菌株、およびｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である、キットである。
【０３８２】
実施形態１２９は、
少なくとも第１の細菌株と、第２の細菌株と、ｎ番目の細菌株と、を含む、ｎ個の細菌株を含み、
第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々が、前の細菌株を有し、
ｎが、少なくとも３であり、
ｎ個の株の各々が、
活性化可能なプロモータの制御下にある溶解遺伝子を有する溶解プラスミドと、
活性化遺伝子を有する活性化プラスミドであって、その発現が、クォーラム感知分子の蓄積を促進する、活性化プラスミドと、を含み、
溶解遺伝子の活性化可能なプロモータおよび活性化遺伝子の発現の両方が、クォーラム感知分子によって活性化され、
ｎ個の細菌株の各々の溶解プラスミドが、毒素系を含み、
第２〜ｎ番目の細菌株の各々の溶解プラスミドの毒素系が、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、第１の毒素が、前の細菌株、および前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効であり、
第１の細菌株の溶解プラスミドの毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、第３の毒素が、ｎ番目の細菌株、およびｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である、キットである。
【０３８３】
実施形態１３０は、ｎが、３である、実施形態１２８または実施形態１２９に記載のキットである。
【０３８４】
実施形態１３１は、ｎが、４、５、６、７、８、９、または１０である、実施形態１２８または実施形態１２９に記載のキットである。
【０３８５】
実施形態１３２は、実施形態１１４〜１２３に記載の系または実施形態１２４〜１３１に記載のキットを含む、薬物送達系である。
【０３８６】
実施形態１３３は、実施形態１１４〜１２３に記載の系または実施形態１２４〜１３１に記載のキットを含む、定期的な薬物送達系である。
【０３８７】
実施形態１３４は、疾患を治療することを必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
第１の溶解プラスミドと、第１の活性化プラスミドと、を含む第１の細菌株であって、第１の溶解プラスミドが、第１の溶解遺伝子、第１の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の活性化プラスミドが、第１の活性化遺伝子、任意選択的に第１の溶解タグ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の細菌株が、第１の毒素系をさらに含み、第１の毒素系が、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第３の毒素／第３の抗毒素対から第３の抗毒素を産生し、第１の細菌株が、第３の毒素を産生しない、第１の細菌株と、
第２の溶解プラスミドと、第２の活性化プラスミドと、を含む第２の細菌株であって、第２の溶解プラスミドが、第２の溶解遺伝子、第２の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の活性化プラスミドが、第２の活性化遺伝子、任意選択的に第２の溶解タグ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の細菌株が、第２の毒素系をさらに含み、第２の毒素系が、第２の毒素／第２の抗毒素対、および第１の毒素／第１の抗毒素対から第１の抗毒素を産生し、第２の細菌株が、第１の毒素を産生しない、第２の細菌株と、
第３の溶解プラスミドと、第３の活性化プラスミドと、を含む第３の細菌株であって、第３の溶解プラスミドが、第３の溶解遺伝子、第３の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の活性化プラスミドが、第３の活性化遺伝子、任意選択的に第３の溶解タグ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の細菌株が、第３の毒素系をさらに含み、第３の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素を産生し、第３の細菌株が、第２の毒素を産生しない、第３の細菌株と、の治療有効量の各々を対象に投与することを含む、方法である。
【０３８８】
実施形態１３５は、疾患を治療することを必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
第１の溶解プラスミドと、第１の活性化プラスミドと、を含む第１の細菌株であって、第１の溶解プラスミドが、第１の溶解遺伝子、第１の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の活性化プラスミドが、第１の活性化遺伝子、任意選択的に第１の溶解タグ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の細菌株が、第１の毒素系をさらに含み、第１の毒素系が、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第３の毒素／第３の抗毒素対から第３の抗毒素を産生し、第１の細菌株が、第３の毒素を産生しない、第１の細菌株を含む、第１の医薬品と、
第２の溶解プラスミドと、第２の活性化プラスミドと、を含む第２の細菌株であって、第２の溶解プラスミドが、第２の溶解遺伝子、任意選択的に第２の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の活性化プラスミドが、第２の活性化遺伝子、第２の溶解タグ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の細菌株が、第２の毒素系をさらに含み、第２の毒素系が、第２の毒素／第２の抗毒素対、および第１の毒素／第１の抗毒素対から第１の抗毒素を産生し、第２の細菌株が、第１の毒素を産生しない、第２の細菌株を含む、第２の医薬品と、
第３の溶解プラスミドと、第３の活性化プラスミドと、を含む第３の細菌株であって、第３の溶解プラスミドが、第３の溶解遺伝子、第３の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の活性化プラスミドが、第３の活性化遺伝子、任意選択的に第３の溶解タグ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の細菌株が、第３の毒素系をさらに含み、第３の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素を産生し、第３の細菌株が、第２の毒素を産生しない、第３の細菌株を含む、第３の医薬品と、の治療有効量の各々を対象に投与することを含む、方法である。
【０３８９】
実施形態１３６は、疾患を治療することを必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
第１の毒素系を含む第１の細菌株であって、第１の毒素系が、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第３の毒素／第３の抗毒素対から第３の抗毒素を産生し、第１の細菌株が、第３の毒素を産生せず、第１の細菌株が、第１の溶解プラスミドおよび第１の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第１の溶解プラスミドが、第１の溶解遺伝子、第１の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の活性化プラスミドが、第１の活性化遺伝子、任意選択的に第１の溶解タグ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含む、第１の細菌株と、
第２の毒素系を含む第２の細菌株であって、第２の毒素系が、第２の毒素／第２の抗毒素対、および第１の毒素／第１の抗毒素対から第１の抗毒素を産生し、第２の細菌株が、第１の毒素を産生せず、第２の細菌株が、第２の溶解プラスミドおよび第２の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第２の溶解プラスミドが、第２の溶解遺伝子、第２の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の活性化プラスミドが、第２の活性化遺伝子、任意選択的に第２の溶解タグ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含む、第２の細菌株と、
第３の毒素系を含む第３の細菌株であって、第３の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素を産生し、第３の細菌株が、第２の毒素を産生せず、第３の細菌株が、第３の溶解プラスミドおよび第３の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第３の溶解プラスミドが、第３の溶解遺伝子、第３の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の活性化プラスミドが、第３の活性化遺伝子、任意選択的に第３の溶解タグ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含む、第３の細菌株と、の治療有効量の各々を対象に投与することを含む、方法である。
【０３９０】
実施形態１３７は、疾患を治療することを必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
第１の毒素系を含む第１の細菌株であって、第１の毒素系が、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第３の毒素／第３の抗毒素対から第３の抗毒素を産生し、第１の細菌株が、第３の毒素を産生せず、第１の細菌株が、第１の溶解プラスミドおよび第１の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第１の溶解プラスミドが、第１の溶解遺伝子、第１の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含み、第１の活性化プラスミドが、第１の活性化遺伝子、任意選択的に第１の溶解タグ、および任意選択的に第１のレポータ遺伝子を含む、第１の細菌株を含む、第１の医薬組成物と、
第２の毒素系を含む第２の細菌株であって、第２の毒素系が、第２の毒素／第２の抗毒素対、および第１の毒素／第１の抗毒素対から第１の抗毒素を産生し、第２の細菌株が、第１の毒素を産生せず、第２の細菌株が、第２の溶解プラスミドおよび第２の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第２の溶解プラスミドが、第２の溶解遺伝子、第２の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含み、第２の活性化プラスミドが、第２の活性化遺伝子、任意選択的に第２の溶解タグ、および任意選択的に第２のレポータ遺伝子を含む、第２の細菌株を含む、第２の医薬組成物と、
第３の毒素系を含む第３の細菌株であって、第３の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素を産生し、第３の細菌株が、第２の毒素を産生せず、第３の細菌株が、第３の溶解プラスミドおよび第３の活性化プラスミドを任意選択的にさらに含み、第３の溶解プラスミドが、第３の溶解遺伝子、第３の活性化可能なプロモータ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含み、第３の活性化プラスミドが、第３の活性化遺伝子、任意選択的に第３の溶解タグ、および任意選択的に第３のレポータ遺伝子を含む、第３の細菌株を含む、第３の医薬組成物と、の治療有効量の各々を対象に投与することを含む、方法である。
【０３９１】
実施形態１３８は、投与することが、第１、第２、および第３の細菌株、または第１、第２、および第３の医薬組成物の各々を、連続的に対象に投与することを含む、実施形態１３４〜１３７のいずれか１つに記載の方法である。
【０３９２】
実施形態１３９は、投与することが、第１、第２、および第３の医薬組成物の各々を同時に投与することを含み、第１、第２、および第３の医薬組成物の各々が、第１、第２、および第３の細菌株を放出するための異なる放出プロファイルを有する、実施形態１３８に記載の方法である。
【０３９３】
実施形態１４０は、第１、第２、および第３の細菌株の各々が、異なる治療剤を発現する、実施形態１３４〜１３９のいずれか１つに記載の方法である。
【０３９４】
実施形態１４１は、疾患を治療することを必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
少なくとも第１の細菌株と、第２の細菌株と、ｎ番目の細菌株と、を含む、治療有効量のｎ個の細菌株の各々を対象に投与することを含み、
第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々が、前の細菌株を有し、
ｎが、少なくとも３であり、
ｎ個の株の各々が、毒素系を含み、
第２〜ｎ番目の細菌株の各々の毒素系が、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、第１の毒素が、前の細菌株、および前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効であり、
第１の細菌株の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、第３の毒素が、ｎ番目の細菌株、およびｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である、方法である。
【０３９５】
実施形態１４２は、疾患を治療することを必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
少なくとも第１の細菌株と、第２の細菌株と、ｎ番目の細菌株と、を含む、治療有効量のｎ個の細菌株の各々を対象に投与することを含み、
第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々が、前の細菌株を有し、
ｎが、少なくとも３であり、
ｎ個の株の各々が、
活性化可能なプロモータの制御下にある溶解遺伝子を有する溶解プラスミドと、
活性化遺伝子を有する活性化プラスミドであって、その発現が、クォーラム感知分子の蓄積を促進する、活性化プラスミドと、を含み、
溶解遺伝子の活性化可能なプロモータおよび活性化遺伝子の発現の両方が、クォーラム感知分子によって活性化され、
ｎ個の細菌株の各々の溶解プラスミドが、毒素系を含み、
第２〜ｎ番目の細菌株の各々の溶解プラスミドの毒素系が、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、第１の毒素が、前の細菌株、および前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効であり、
第１の細菌株の溶解プラスミドの毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、第３の毒素が、ｎ番目の細菌株、およびｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である、方法である。
【０３９６】
実施形態１４３は、ｎが、３である、実施形態１４１または実施形態１４２に記載の方法である。
【０３９７】
実施形態１４４は、ｎが、４、５、６、７、８、９、または１０である、実施形態１４１または実施形態１４２に記載の方法である。
【０３９８】
実施形態１４５は、疾患を治療することを必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
各々がｎ個の細菌株のうちの少なくとも１つを含み、ｎ個の細菌株が、少なくとも第１の細菌株と、第２の細菌株と、ｎ番目の細菌株と、を含む、治療有効量のｍ個の医薬組成物の各々を対象に投与することを含み、
第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々が、前の細菌株を有し、
ｎが、少なくとも３であり、
ｎ個の株の各々が、毒素系を含み、
第２〜ｎ番目の細菌株の各々の毒素系が、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、第１の毒素が、前の細菌株、および前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効であり、
第１の細菌株の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、第３の毒素が、ｎ番目の細菌株、およびｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である、方法である。
【０３９９】
実施形態１４６は、疾患を治療することを必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
各々がｎ個の細菌株のうちの少なくとも１つを含み、ｎ個の細菌株が、少なくとも第１の細菌株と、第２の細菌株と、ｎ番目の細菌株と、を含む、治療有効量のｍ個の医薬組成物の各々を対象に投与することを含み、
第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々が、前の細菌株を有し、
ｎが、少なくとも３であり、
ｎ個の株の各々が、
活性化可能なプロモータの制御下にある溶解遺伝子を有する溶解プラスミドと、
活性化遺伝子を有する活性化プラスミドであって、その発現が、クォーラム感知分子の蓄積を促進する、活性化プラスミドと、を含み、
溶解遺伝子の活性化可能なプロモータおよび活性化遺伝子の発現の両方が、クォーラム感知分子によって活性化され、
ｎ個の細菌株の各々の溶解プラスミドが、毒素系を含み、
第２〜ｎ番目の細菌株の各々の溶解プラスミドの毒素系が、独立して、第１の毒素／第１の抗毒素対を産生し、第１の毒素が、前の細菌株、および前の細菌株によって産生された第２の毒素／第２の抗毒素対からの第２の抗毒素に対して有効であり、
第１の細菌株の溶解プラスミドの毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対を産生し、第３の毒素が、ｎ番目の細菌株、およびｎ番目の細菌株によって産生された第４の毒素／抗毒素対からの第４の抗毒素に対して有効である、方法である。
【０４００】
実施形態１４７は、ｎが、３である、実施形態１４５または実施形態１４６に記載の方法である。
【０４０１】
実施形態１４８は、ｎが、４、５、６、７、８、９、または１０である、実施形態１４５または実施形態１４６に記載の方法である。
【０４０２】
実施形態１４９は、ｍ＝ｎである、実施形態１４５または１４６に記載の方法である。
【０４０３】
実施形態１５０は、毒素系の各々が、ゲノム内で、プラスミド上で、複数のプラスミド上で、またはそれらの組み合わせ上で独立してコードされる、実施形態１４１〜１４９のいずれか１つに記載の方法である。
【０４０４】
実施形態１５１は、第２の細菌株〜ｎ番目の細菌株の各々が、前の株の毒素系の第２の毒素を産生せず、第１の細菌株が、ｎ番目の細菌株の毒素系の第４の毒素を産生しない、実施形態１４１〜１５０のいずれか１つに記載の方法である。
【０４０５】
実施形態１５２は、投与することが、ｎ個の細菌株またはｍ個の医薬組成物の各々を、連続的に対象に投与することを含む、実施形態１４５〜１５１のいずれか１つに記載の方法である。
【０４０６】
実施形態１５３は、投与することが、ｍ個の医薬組成物の各々を同時に投与することを含み、ｍ医薬組成物の各々が、第１、第２、および第３の細菌株を放出するための異なる放出プロファイルを有する、実施形態１５２に記載の方法である。
【０４０７】
実施形態１５４は、第１、第２、および第３の細菌株の各々が、異なる治療剤を発現する、実施形態１４１〜１５３のいずれか１つに記載の方法である。
【０４０８】
実施形態１５５は、疾患が、癌または感染症である、実施形態１４１〜１５４のいずれか１つに記載の方法である。
【０４０９】
実施形態１５６は、感染症が、Ｃａｍｐｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａからなる群から選択される感染因子によって引き起こされる、実施形態１５５に記載の方法である。
【０４１０】
実施形態１５７は、癌が、グリア芽腫、扁平上皮癌、乳癌、結腸癌、肝細胞癌、黒色腫、神経芽腫、膵臓癌、および前立腺癌からなる群から選択される、実施形態１５５に記載の方法である。
【０４１１】
実施形態１５８は、細菌株のうちの１つ以上が、治療剤を発現する、実施形態１〜８３もしくは実施形態１３４〜１５７のいずれか１つに記載の方法、実施形態８４〜１１１のいずれか１つに記載の細菌株、実施形態１１２もしくは１１３に記載の医薬組成物、実施形態１１４〜１２３、１３２、もしくは１３３のいずれか１つに記載の系、または実施形態１２４〜１３１のいずれか１つに記載のキットである。
【０４１２】
実施形態１５９は、細菌株のうちの１つ以上が、阻害性核酸、サイトカイン、酵素、ペプチドホルモン、融合タンパク質、凝固因子、毒素、抗菌ペプチド、およびその抗体または抗原結合断片からなる群から選択される治療剤を発現する、実施形態１〜８３もしくは実施形態１３４〜１５７のいずれか１つに記載の方法、実施形態８４〜１１１のいずれか１つに記載の細菌株、実施形態１１２もしくは１１３に記載の医薬組成物、実施形態１１４〜１２３、１３２、もしくは１３３のいずれか１つに記載の系、または実施形態１２４〜１３１のいずれか１つに記載のキットである。
【０４１３】
実施形態１６０は、
成長環境で第１の期間、第１の細菌株を培養することと、
第２の細菌株を成長環境に加え、かつ第２の期間、第２の細菌株を培養することと、
第３の細菌株を成長環境に加え、かつ第２の期間、第３の細菌株を培養することと、を含み、
第１、第２、および第３の細菌株の各々が、毒素系を含み、
第１の細菌株の毒素系が、第１の毒素／第１の抗毒素対、および第３の毒素／第３の抗毒素対から第３の抗毒素を産生し、第１の細菌株が、第３の毒素を産生せず、
第２の細菌株の毒素系が、第２の毒素／第２の抗毒素対、および第１の毒素／第１の抗毒素対から第１の抗毒素対を産生し、第２の細菌株が、第１の毒素を産生せず、
第３の細菌株の毒素系が、第３の毒素／第３の抗毒素対、および第２の毒素／第２の抗毒素対から第２の抗毒素対を産生し、第３の細菌株が、第２の毒素を産生せず、
毒素系が、プラスミド、複数のプラスミド上にコードされる、宿主ゲノム内に組み込まれる、またはそれらの組み合わせである、方法である。
【０４１４】
実施形態１６１は、第１、第２、および第３の細菌株の各々が、
活性化可能なプロモータの制御下にある溶解遺伝子を有する溶解プラスミドと、
活性化遺伝子を有する活性化プラスミドであって、その発現が、クォーラム感知分子の蓄積を促進する、活性化プラスミドと、を含み、
溶解遺伝子の活性化可能なプロモータおよび活性化
遺伝子の発現の両方が、クォーラム感知分子によって活性化され、
クォーラム感知分子が、第１、第２、および第３の細菌株の各々で異なっていてもよく、または異なっていなくてもよく、
第１、第２、および第３の細菌株の各々の各クォーラム感知分子が、
別の株の溶解遺伝子の活性化可能なプロモータに対して何らかの効果を有していてもよく、または有していなくてもよい、実施形態１６０に記載の方法である。
【０４１５】
実施形態１６２は、第１、第２、および第３の細菌株の溶解プラスミドの各々が、かかる細菌株の毒素系を含有するプラスミドであり、または第１、第２、および第３の細菌株の活性化プラスミドの各々が、かかる細菌株の毒素系を含有するプラスミドであり、または各細菌株の毒素系が、ゲノム内に組み込まれる、実施形態１６１に記載の方法である。
【０４１６】
実施形態１６３は、
培養中の第１の期間、ｎ個の細菌株のうちの第１の細菌株を培養することと、
ｎ個の細菌株のうちの第２の細菌株を培養物に加え、かつ第２の期間、第２の細菌株を培養することと、
ｎ個の細菌株のうちのその他の細菌株の各々を培養物に加え、かつある期間、各そのような細菌株を培養することと、を含む、ｎ個の細菌株を培養する方法であって、
ｎが、３以上の整数であり、
ｎ個の細菌株の各々のプラスミドが、毒素系を含み、
第１の細菌株のプラスミドの毒素系が、第１の毒素／第１の抗毒素対、およびｎ番目の毒素／ｎ番目の抗毒素対からｎ番目の抗毒素を産生し、
第１の細菌株が、ｎ番目の毒素を産生せず、
ｎ個の細菌株中のその他の細菌株のうちの各ｍ番目のプラスミドの毒素系（ｍは、組｛２、３、．．．、ｎ｝の要素である）が、ｍ番目の毒素／ｍ番目の抗毒素対、および（ｍ−１）番目の毒素／（ｍ−１）番目の抗毒素対から（ｍ−１）番目の抗毒素を産生する、方法である。
【０４１７】
実施形態１６４は、ｎ個の細菌株の各々が、
活性化可能なプロモータの制御下にある溶解遺伝子を有する溶解プラスミドと、
活性化遺伝子を有する活性化プラスミドであって、その発現が、
クォーラム感知分子の蓄積を促進する、活性化プラスミドと、を含み、
溶解遺伝子の活性化可能なプロモータおよび活性化遺伝子の発現の両方は、
クォーラム感知分子によって活性化され、
クォーラム感知分子が、ｎ個の細菌株の各々で異なっていてもよく、または異なっていなくてもよく、
ｎ個の細菌株の各々の各クォーラム感知分子が、ｎ個の細菌株の別の株の溶解遺伝子の活性化可能なプロモータに対して何らかの効果を有していてもよく、または有していなくてもよい、実施形態１６３に記載の方法である。
【０４１８】
実施形態１６５は、ｎ個の株の溶解プラスミドの各々が、このような細菌株の毒素系を含有するプラスミドである、実施形態１６４に記載の方法である。
【０４１９】
実施形態１６６は、ｎ個の細菌株の各々が、ペイロードを産生する、実施形態１６３または１６４に記載の方法である。
【０４２０】
実施形態１６７は、ｎ個の細菌株の各々が、異なるペイロードを産生する、実施形態１６３〜１６５のいずれか１つに記載の方法である。
【０４２１】
実施形態１６８は、ｎ個の細菌株の各々が、同じペイロードを産生する、実施形態１６３〜１６５のいずれか１つに記載の方法である。
【０４２２】
実施形態１６９は、各ペイロードが、治療剤である、実施形態１６６〜１６８のいずれか１つに記載の方法である。
【０４２３】
実施形態１７０は、ｍ番目の細菌株のペイロードが、（ｍ−１）番目の細菌株の基質に直接的または間接的に作用することによってｍ番目の基質を産生し、第１の細菌株のペイロードが、ｎ個の細菌株が培養される環境に存在する基質に作用する、実施形態１６７に記載の方法である。
【０４２４】
実施形態１７１は、ｎが４である、実施形態１６３〜１７０のいずれか１つに記載の方法である。
【０４２５】
実施形態１７２は、ｎが５である、実施形態１６３〜１７０のいずれか１つに記載の方法である。
【０４２６】
実施形態１７３は、ｎが６である、実施形態１６３〜１７０のいずれか１つに記載の方法である。
【０４２７】
実施形態１７４は、培養物中の１つ以上の追加の細菌株を培養または共培養することをさらに含む、実施形態１６０〜１６２のいずれか１つに記載の方法である。
【０４２８】
実施形態１７５は、１つ以上の追加の細菌株の各々が、
活性化可能なプロモータの制御下にある溶解遺伝子を有する溶解プラスミドと、
活性化遺伝子を有する活性化プラスミドであって、その発現が、
クォーラム感知分子の蓄積を促進する、活性化プラスミドと、を含み、
溶解遺伝子の活性化可能なプロモータおよび活性化遺伝子の発現の両方が、
クォーラム感知分子によって活性化され、
クォーラム感知分子が、第１、第２、第３、および
１つ以上の追加の細菌株の各々で異なっており、
第１、第２、第３、および
１つ以上の追加の細菌株の各々の各クォーラム感知分子が、
培養物で使用される別の細菌株の溶解遺伝子の活性化可能なプロモータに対して、全く、または実質的に効果を有しない、実施形態１７４に記載の方法である。
【０４２９】
実施形態１７６は、１つ以上の追加の細菌株の各々の溶解プラスミドが、毒素系を含む、実施形態１７５に記載の方法である。
【０４３０】
実施形態１７７は、少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々の溶解プラスミドおよび活性化プラスミドが、同じプラスミドである、実施形態１６０〜１６２または実施形態１７４〜１７６のいずれか１つに記載の方法である。
【０４３１】
実施形態１７８は、少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々の溶解プラスミドおよび活性化プラスミドが、別個のプラスミドである、実施形態１６０〜１６２または実施形態１７４〜１７６のいずれか１つに記載の方法である。
【０４３２】
実施形態１７９は、少なくとも第１、第２、および第３の細菌株が、代謝的に競合的である、実施形態１６０〜１６２または実施形態１７４〜１７８のいずれか１つに記載の方法である。
【０４３３】
実施形態１８０は、少なくとも第１、第２、および第３の細菌株が、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはその細菌変異体から選択される、実施形態１６０〜１６２または実施形態１７４〜１７９のいずれか１つに記載の方法である。
【０４３４】
実施形態１８１は、少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々が、培養物中の別の株と比較して成長上の利点を有しない、実施形態１６０〜１６２または１７４〜１８０のいずれか１つに記載の方法である。
【０４３５】
実施形態１８２は、少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々において、溶解プラスミドが、溶解遺伝子、活性化可能なプロモータ、および任意選択的にレポータ遺伝子を含み、活性化プラスミドが、活性化遺伝子、溶解タグ、および任意選択的にレポータ遺伝子を含む、実施形態１６０〜１６２または実施形態１７４〜１８１のいずれか１つに記載の方法である。
【０４３６】
実施形態１８３は、少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々における溶解遺伝子が、バクテリオファージΦＸ１７４からのＥである、実施形態１６０〜１６２または実施形態１７４〜１８２のいずれか１つに記載の方法である。
【０４３７】
実施形態１８４は、少なくとも第１、第２、および第３の細菌株の各々における活性化可能なプロモータが、ＬｕｘＲ−ＡＨＬ活性化可能なｌｕｘＩプロモータであり、活性化遺伝子が、ＬｕｘＩである、実施形態１６０〜１６２または実施形態１７４〜１８３のいずれか１つに記載の方法である。
【０４３８】
実施形態１８５は、少なくとも１つのレポータ遺伝子が、
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光
タンパク質（ＲＦＰ）、またはそれらの変異体をコードする遺伝子から選択される、実施形態１８２に記載の方法である。
【０４３９】
実施形態１８６は、溶解タグが、ｓｓｒＡ−ＬＡＡ溶解タグである、実施形態１８２に記載の方法である。
【０４４０】
実施形態１８７は、プラスミドのうちの少なくとも１つが、第１、第２、および第３の細菌株のうちの少なくとも１つのゲノムに組み込まれる、実施形態１６０〜１６２または実施形態１７４〜１８６のいずれか１つに記載の方法である。
【０４４１】
実施形態１８８は、培養が、指定された成長環境で起こる、実施形態１６０〜１６２または実施形態１７４〜１８７のいずれか１つに記載の方法である。
【０４４２】
実施形態１８９は、培養物が、マイクロ流体装置内で起こる、実施形態１６０〜１６２または実施形態１７４〜１８８のいずれか１つに記載の方法である。
【０４４３】
実施形態１９０は、培養物が、バイオリアクター内で起こる、実施形態１６０〜１６２または実施形態１７４〜１８８のいずれか１つに記載の方法である。
【０４４４】
実施形態１９１は、培養物が、インビボで起こる、実施形態１６０〜１６２または実施形態１７４〜１８８のいずれか１つに記載の方法である。
【０４４５】
実施形態１９２は、細菌株の各々が、治療ペイロードを産生し、培養物が、治療ペイロードを必要とするヒトまたは動物患者において起こる、実施形態１６０〜１９１のいずれか１つに記載の方法である。
【０４４６】
実施形態１９３は、第１、第２、および第３の期間の各々が、約１２〜約７２時間の範囲である、実施形態１６０〜１６２または実施形態１７４〜１９１のいずれか１つに記載の方法である。
【０４４７】
実施形態１９４は、第１、第２、および第３の期間の各々が、約１〜約ｎ時間の範囲である、実施形態１６０〜１６２、実施形態１７４〜１９１、または実施形態１９３のいずれか１つに記載の方法である。
【０４４８】
実施形態１９５は、第１、第２、および第３の期間の各々が、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、および少なくとも９６時間から選択される、実施形態１６０〜１６２、実施形態１７４〜１９１、または実施形態１９３のいずれか１つに記載の方法である。
【０４４９】
実施形態１９６は、ｎ個の期間の各々が、部分的または完全に重複する、実施形態１６３〜１７３のいずれか１つに記載の方法である。
【０４５０】
実施形態１９７は、ｎ個の細菌株が、一緒に培養される、実施形態１６３〜１７３、または実施形態１９６のいずれか１つに記載の方法である。
【０４５１】
実施形態１９８は、ｎ個の細菌株の各々が、各ｍ番目の細菌株が（ｍ−１）番目の期間の経過後に培養に加えられるように、培養に連続的に加えられる、実施形態１６３〜１７３、実施形態１９６、または実施形態１９７のいずれか１つに記載の方法である。
【０４５２】
実施形態１９９は、第１、第２、および第３の期間の各々が、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および９６時間から選択される、実施形態１６０〜１６２、実施形態１７４〜１９１、または実施形態１９３〜１９５のいずれか１つに記載の方法である。
【０４５３】
実施形態２００は、共培養を維持する方法であって、
少なくとも３つの細菌株を共培養することを含み、
少なくとも３つの細菌株の各々が、活性化可能なプロモータの制御下にある溶解遺伝子を有する溶解プラスミドと、
活性化遺伝子を有する活性化プラスミドであって、その発現が、クォーラム感知分子の蓄積を促進する、活性化プラスミドと、を含み、
溶解遺伝子の活性化可能なプロモータおよび活性化遺伝子の発現の両方が、クォーラム感知分子によって活性化され、
クォーラム感知分子が、少なくとも３つの細菌株の各々で異なっており、
少なくとも３つの細菌株の各々の各クォーラム感知分子が、別の株の溶解遺伝子の活性化可能なプロモータに対して、全く、または実質的に効果を有さず、
溶解プラスミドが、毒素／抗毒素系を含む、方法である。
【０４５４】
実施形態２０１は、毒素／抗毒素系が、別の株の毒素／抗毒素対および異なる抗毒素を産生する、実施形態２００に記載の方法である。
【０４５５】
実施形態２０２は、少なくとも３つの細菌株の各々の溶解プラスミドおよび活性化プラスミドが、同じプラスミドである、実施形態２００または２０１に記載の方法である。
【０４５６】
実施形態２０３は、少なくとも３つの細菌株の各々の溶解プラスミドおよび活性化プラスミドが、別個のプラスミドである、実施形態２００〜２０２のいずれか１つに記載の方法である。
【０４５７】
実施形態２０４は、少なくとも３つの株が、代謝的に競合的である、実施形態２００〜２０３のいずれか１つに記載の方法である。
【０４５８】
実施形態２０５は、少なくとも３つの株が、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはその細菌変異体から選択される、実施形態２００〜２０４のいずれか１つに記載の方法である。
【０４５９】
実施形態２０６は、少なくとも３つの株の各々が、別の株と比較して成長利点を有しない、実施形態２００〜２０５のいずれか１つに記載の方法である。
【０４６０】
実施形態２０７は、少なくとも３つの株の各々において、溶解プラスミドが、溶解遺伝子、活性化可能なプロモータ、および任意選択的に、レポータ遺伝子を含み、活性化プラスミドが、活性化遺伝子、任意選択的に、溶解タグ、および任意選択的に、レポータ遺伝子を含む、実施形態２００〜２０６のいずれか１つに記載の方法である。
【０４６１】
実施形態２０８は、少なくとも３つの株における溶解遺伝子が、バクテリオファージΦＸ１７４からのＥである、実施形態２００〜２０７のいずれか１つに記載の方法である。
【０４６２】
実施形態２０９は、活性化可能なプロモータが、ＬｕｘＲ−ＡＨＬ活性化可能なｌｕｘＩプロモータであり、活性化遺伝子が、ＬｕｘＩである、実施形態２００〜２０８のいずれか１つに記載の方法である。
【０４６３】
実施形態２１０は、少なくとも１つのレポータ遺伝子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、またはそれらの変異体をコードする遺伝子から選択される、実施形態２０７に記載の方法である。
【０４６４】
実施形態２１１は、溶解タグが、ｓｓｒＡ−ＬＡＡ溶解タグである、実施形態２０７に記載の方法である。
【０４６５】
実施形態２１２は、共培養物が、少なくとも３つの細菌株の各々に対して１：１：１の比率で接種される、実施形態２００〜２１１のいずれか１つに記載の方法である。
【０４６６】
実施形態２１３は、プラスミドのうちの少なくとも１つが、少なくとも３つの株のうちの少なくとも１つのゲノムに組み込まれる、実施形態２００〜２１２のいずれか１つに記載の方法である。
【０４６７】
実施形態２１４は、培養物が、マイクロ流体装置内で起こる、実施形態２００〜２１３のいずれか１つに記載の方法である。
【０４６８】
実施形態２１５は、期間が、１２〜７２時間である、実施形態２００〜２１４のいずれか１つに記載の方法である。
【０４６９】
実施形態２１６は、期間が、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、および少なくとも９６時間から選択される、実施形態２００〜２１４のいずれか１つに記載の方法である。
【０４７０】
実施形態２１７は、期間が、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および９６時間から選択される、実施形態２００〜２１４のいずれか１つに記載の方法である。
【０４７１】
実施形態２１８は、少なくとも３つの株の共培養物が、一定の溶解状態にあり、一定の溶解状態が、少なくとも３つの細菌株の成長および溶解の定常状態バランスを特徴とする、実施形態２００〜２１７のいずれか１つに記載の方法である。
【０４７２】
本発明は、その詳細な説明とともに説明されてきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示すること意図しており、および本発明の範囲を限定することを意図していないことが理解されるべきである。その他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
【図１Ａ】
2021526802.tif 000053
【図１Ｂ】
2021526802.tif 000054
【図１Ｃ】
2021526802.tif 000055
【図１Ｄ】
2021526802.tif 000056
【図１Ｅ】
2021526802.tif 000057
【図２Ａ】
2021526802.tif 000058
【図２Ｂ】
2021526802.tif 000059
【図２Ｃ】
2021526802.tif 000060
【図２Ｄ】
2021526802.tif 000061
【図２Ｅ】
2021526802.tif 000062
【図２Ｆ】
2021526802.tif 000063
【図２Ｇ】
2021526802.tif 000064
【図２Ｈ】
2021526802.tif 000065
【図２Ｉ】
2021526802.tif 000066
【図２Ｊ】
2021526802.tif 000067
【図３Ａ】
2021526802.tif 000068
【図３Ｂ】
2021526802.tif 000069
【図３Ｃ】
2021526802.tif 000070
【図３Ｄ】
2021526802.tif 000071
【図３Ｅ】
2021526802.tif 000072
【図３Ｆ】
2021526802.tif 000073
【図４】
2021526802.tif 000074
【図５Ａ】
2021526802.tif 000075
【図５Ｂ】
2021526802.tif 000076
【図５Ｃ】
2021526802.tif 000077
【図５Ｄ】
2021526802.tif 000078
【図５Ｅ】
2021526802.tif 000079
【図５Ｆ】
2021526802.tif 000080
【図５Ｇ】
2021526802.tif 000081
【図５Ｈ】
2021526802.tif 000082
【図５Ｉ】
2021526802.tif 000083
【図５Ｊ】
2021526802.tif 000084
【図５Ｋ】
2021526802.tif 000085
【図６−１】
2021526802.tif 000086
【図６−２】
2021526802.tif 000087
【図６−３】
2021526802.tif 000088
【図７Ａ】
2021526802.tif 000089
【図７Ｂ】
2021526802.tif 000090
【図７Ｃ】
2021526802.tif 000091
【図７Ｄ】
2021526802.tif 000092
【図８Ａ】
2021526802.tif 000093
【図８Ｂ】
2021526802.tif 000094
【図８Ｃ】
2021526802.tif 000095
【図８Ｄ】
2021526802.tif 000096
【図８Ｅ】
2021526802.tif 000097
【図８Ｆ】
2021526802.tif 000098
【図８Ｇ】
2021526802.tif 000099
【図９】
2021526802.tif 000100
【図１０】
2021526802.tif 000101
【図１１】
2021526802.tif 000102
【図１２Ａ】
2021526802.tif 000103
【図１２Ｂ】
2021526802.tif 000104
【図１２Ｃ】
2021526802.tif 000105
【図１２Ｄ】
2021526802.tif 000106
【図１２Ｅ】
2021526802.tif 000107
【図１２Ｆ】
2021526802.tif 000108
【図１３Ａ】
2021526802.tif 000109
【図１３Ｂ】
2021526802.tif 000110
【図１３Ｃ】
2021526802.tif 000111
【図１３Ｄ】
2021526802.tif 000112
【図１３Ｅ】
2021526802.tif 000113
【図１３Ｆ】
2021526802.tif 000114
【図１３Ｇ】
2021526802.tif 000115
【図１３Ｈ】
2021526802.tif 000116
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【国際調査報告】
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