(57)【要約】本発明は、対象において、皮膚の色素沈着をモジュレートする、ならびにＵＶ誘発性皮膚損傷、紅斑、皮膚のエイジング、日焼けおよび色素沈着過度を処置または予防するための化合物、組成物および方法に関する。本発明の化合物、組成物および方法は、マラセジンおよびインジルビン、ならびに／またはそれらの化学アナログを含めた、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ由来の化合物を一般に含む。本明細書において開示されている化合物および組成物の他の用途には、以下に限定されないが、メラノサイトアポトーシスを含めた色素沈着過度障害により引き起こされる色素沈着過度の改善、ならびに芳香族炭化水素受容体（ＡｈＲ）活性、メラニン形成、メラニン産生、メラノソーム生物発生、メラノソーム輸送、メラノサイト活性およびメラニン濃度のモジュレートが含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において皮膚を美白する方法であって、前記対象に組成物を接触させるステップを含み、前記組成物が、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む、方法。
【請求項２】
前記組成物が、表５に列挙される化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が、表６に列挙される化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が、表７に列挙される化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が、表８に列挙される化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物が、表９に列挙される化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
対象においてメラノサイトアポトーシスを誘導する方法であって、前記対象に組成物を接触させるステップを含み、前記組成物が、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む、方法。
【請求項８】
前記組成物が、表５に列挙される化合物を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、表６に列挙される化合物を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が、表７に列挙される化合物を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が、表８に列挙される化合物を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が、表９に列挙される化合物を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
対象において芳香族炭化水素受容体（ＡｈＲ）活性をモジュレートする方法であって、前記対象に組成物を接触させるステップを含み、前記組成物が、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む、方法。
【請求項１４】
前記組成物が、表５に列挙される化合物を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物が、表６に列挙される化合物を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が、表７に列挙される化合物を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が、表８に列挙される化合物を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、表９に列挙される化合物を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
対象においてメラニン形成をモジュレートする方法であって、前記対象に組成物を接触させるステップを含み、前記組成物が、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む、方法。
【請求項２０】
前記組成物が、表５に列挙される化合物を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物が、表６に列挙される化合物を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物が、表７に列挙される化合物を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物が、表８に列挙される化合物を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物が、表９に列挙される化合物を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
対象においてメラニン濃度をモジュレートする方法であって、前記対象に組成物を接触させるステップを含み、前記組成物が、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む、方法。
【請求項２６】
前記組成物が、表５に列挙される化合物を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物が、表６に列挙される化合物を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物が、表７に列挙される化合物を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記組成物が、表８に列挙される化合物を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物が、表９に列挙される化合物を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本発明は、２０１８年８月２４日に出願の米国仮出願第６２／７２２，４１２号、および２０１８年１０月８日に出願の米国仮出願第６２／７４２，６５７号に対する利益を主張する。上記の出願の全内容が、参照により本明細書に組み込まれている。さらに、２０１６年３月１０日に出願の米国仮出願第６２／３０６，４６８号、２０１８年４月１２日に出願の米国仮出願第６２／６５６，７６９号、２０１８年５月７日に出願の米国仮出願第６２／６６８，００７号、２０１８年６月１５日に出願の米国仮出願第６２／６８５，８００号、２０１８年６月１９日に出願の米国仮出願第６２／６８６，９１２号、２０１７年３月１０日に出願の米国特許出願第１５／４５５，９３２号、現在は米国特許第１０，１３１，６３１号、２０１９年４月１２日に出願の米国特許出願第１６／３８２，８９１号、２０１９年５月７日に出願の米国特許出願第１６／４０５，１２７号および２０１９年６月１４日に出願の米国特許出願第１６／４４１，５２２号の全内容が、参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ酵母により産生される、またはこれに由来する化合物、およびその化学アナログに関する。本発明の化合物、および前記化合物を含有する組成物は、有益な特性の中でもとりわけ、光保護特性を有する。本発明の化合物および組成物を使用する方法も企図されている。
【背景技術】
【０００３】
世界中の個体が、皮膚美白剤を使用して、アンチエイジング効果の発生、日焼けによる損傷の修復、および美のある種の文化的基準の合致を含めた、いくつかの化粧目的を実現している。多数の市販の皮膚の美白製品は、有効性の程度は様々であるが、有害成分を含有しており、その一部は、がんにリンクしている。したがって、現在、市販されている作用剤よりも、高いレベルの安全性および／または有効性を示す、新規な皮膚美白剤および製剤が必要とされている。
【０００４】
Ｍａｌａｓｓｅｚｉａは、ヒト皮膚の正常細菌叢に一般に見いだされる、親油性酵母の属である。Ｍａｌａｓｓｅｚｉａは、癜風（ｔｉｎｅａ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）（癜風（ｐｉｔｙｒｉａｓｉｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ））、脂漏性皮膚炎およびアトピー性皮膚炎を含めた、いくつかの皮膚疾患の原因である。
【０００５】
Ｍ．ｆｕｒｆｕｒの自然生息地は、表皮上層である。しかし、紫外光への曝露は、その自然生息地における生物を破壊する。したがって、ＵＶフィルター剤が、生物の生存に必要となることがある。生物により産生される２つのそのようなＵＶフィルター性インドール：ピチリアシトリンおよびピチリアラクトンが特定されている。Ｍａｙｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２に最初に記載されたピチリアシトリンは、Ｍ．ｆｕｒｆｕｒによって合成される。ピチリアシトリンは、ＵＶＡ、ＵＶＢおよびＵＶＣスペクトルに幅広い吸収を示す安定な黄色の親油性化合物である。Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属に由来する類似化合物が単離されており、ＵＶ保護剤として権利化されている（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１８）。
【０００６】
Ｇａｍｂｉｃｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ試験方法を使用する、ヒトにおけるピチリアシトリンのＵＶ保護効果を検討した。２９０〜４００ｎｍの波長範囲において、ピチリアシトリンクリームおよびビヒクルの分光測光法が行われた。様々なクリーム製剤に関するＵＶ透過率および日焼け防止指数（「ＳＰＦ」）が評価された。その著者らは、比色分析を使用し、健常な対象のクリームによる保護皮膚および非保護皮膚の照射後の紅斑および色素沈着を評価した。ピチリアシトリン濃度の増加に伴って、ＵＶＢおよびＵＶＡの透過率は低下した。１．２５、２．５および５％のピチリアシトリン濃度の増加は、それぞれ、１．４、１．５および１．７のＳＰＦというわずかな向上を伴った。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定されたピチリアシトリン５％クリームのＳＰＦの有効性が確認された。総合的に、ピチリアシトリンのＵＶ保護効果は、非常に弱く、ピチリアシトリンは、恐らく、日光への曝露後の白色癜風病変において、低色素沈着の発症の劣性補因子でしかないことを示唆している。
【０００７】
ピチリアシトリンのＵＶフィルター効果のさらなる検討が、ヒト皮膚微生物叢に対して行われた（Ｍａｃｈｏｗｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。この著者らは、ピチリアシトリンは、試験した範囲では、毒性のないＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓおよびｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉに対してＵＶ保護効果を有すると決定した。ピチリアラクトンのＵＶ保護特性が、酵母モデルでも確認された（Ｍａｙｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。ピチリアラクトンは、ウッド灯試験において、癜風の黄色蛍光の原因のように思われる。
【０００８】
癜風は、色素沈着レベルを局部的に改変するＭａｌａｓｓｅｚｉａの過成長によって引き起こされる非伝染性皮膚疾患である。Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ酵母は、メラニンおよびトリプトファンに由来するインドール色素を合成する２つの代謝経路を有する。マラセジンおよびインジルビンは、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａの過成長に特有の脱色素に寄与し得る、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａのトリプトファン代謝産物である。
【０００９】
本明細書において開示されている発明は、安全かつ有効な皮膚美白性組成物および皮膚色素沈着性組成物の基礎原料として、マラセジン、インジルビンを含めたＭａｌａｓｓｅｚｉａ酵母によって産生するまたはこれに由来する化合物、およびその化学アナログを利用する。マラセジン、インジルビンおよびそれらの化学アナログを含む光保護性組成物もまた、本明細書において開示されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一実施形態は、組成物である。本組成物は、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、対象において皮膚を美白する方法である。本方法は、対象に、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を接触させるステップを含む。
【００１２】
本発明のさらなる実施形態は、対象においてメラノサイトアポトーシスを誘導する方法である。本方法は、対象に、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を接触させるステップを含む。
【００１３】
本発明の追加的な実施形態は、対象において芳香族炭化水素受容体（ＡｈＲ）活性をモジュレートする方法である。本方法は、対象に、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を接触させるステップを含む。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、対象においてメラニン形成をモジュレートする方法である。本方法は、対象に、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を接触させるステップを含む。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、対象においてメラニン濃度をモジュレートする方法である。本方法は、対象に、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を接触させるステップを含む。
【００１６】
本発明の追加的な実施形態は、組成物である。本組成物は、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む。
【００１７】
本発明のさらなる実施形態は、皮膚を美白する組成物である。本組成物は、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、メラノサイトアポトーシスを誘導する組成物である。本組成物は、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む。
【００１９】
本発明の追加的な実施形態は、芳香族炭化水素受容体（ＡｈＲ）活性をモジュレートする組成物である。本組成物は、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態は、メラニン形成をモジュレートする組成物である。本組成物は、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、メラニン濃度をモジュレートする組成物である。本組成物は、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む。
【００２２】
本発明の追加的な実施形態は、対象において皮膚を美白する方法である。本方法は、対象に、組成物を接触させるステップであって、該組成物が、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む、ステップを含む。
【００２３】
本発明のさらなる実施形態は、対象においてメラノサイトアポトーシスを誘導する方法である。本方法は、対象に、組成物を接触させるステップであって、該組成物が、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む、ステップを含む。
【００２４】
本発明の別の実施形態は、対象において芳香族炭化水素受容体（ＡｈＲ）活性をモジュレートする方法である。本方法は、対象に、組成物を接触させるステップであって、該組成物が、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む、ステップを含む。
【００２５】
本発明の追加的な実施形態は、対象においてメラニン形成をモジュレートする方法である。本方法は、対象に、組成物を接触させるステップであって、該組成物が、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む、ステップを含む。
【００２６】
本発明のさらなる実施形態は、対象においてメラニン濃度をモジュレートする方法である。本方法は、対象に、組成物を接触させるステップであって、該組成物が、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む、ステップを含む。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、組成物である。本組成物は、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ酵母、および化粧品としてまたは薬学的に許容されるビヒクル、希釈剤または担体を含む。
【００２８】
本発明の追加的な実施形態は、組成物である。本組成物は、以下の式の構造を有する化合物：
【化１】
2021535123.tif 000002
（式中、
Ｘは、ＮＲ１４およびＯからなる群から選択され、Ｙは、共有結合、ＣＲ５Ｒ６、ＯまたはＮＲ１５であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は、水素、ハロゲン、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｒ１６またはＯＲ１６からなる群から独立して選択され、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は、独立して、水素またはＲ１６であり、Ｒ５およびＲ６は、水素、ヒドロキシル、ＯＲ１６、Ｒ１６およびＣ３〜６シクロアルキルからなる群から独立して選択されるか、またはＲ５とＲ６は一緒になって、オキソ（＝Ｏ）基もしくはＣ３〜６シクロアルキルを形成し、Ｒ１２は、水素、−ＣＯＲａおよびＲ１６からなる群から選択され、Ｒ１６はそれぞれ、独立して、ホルミル、Ｃ１〜９アルキル、Ｃ２〜９アルケニルまたはＣ２〜９アルキニルであり、Ｒａは、水素、ヒドロキシルおよびＯＲ１６からなる群から選択される）
またはその結晶形態、水和物、もしくは化粧品としてもしくは薬学的に許容される塩、および化粧品としてまたは薬学的に許容されるビヒクル、希釈剤または担体を含む。
【００２９】
本発明のさらなる実施形態は、組成物である。本組成物は、以下の式の構造を有する化合物：
【化２】
2021535123.tif 000003
（式中、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９およびＲ１０は、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、ＣＮ、Ｒ１３、ＯＲ１３、ＯＣＯＲ１３および−ＣＨＯからなる群から独立して選択され、Ｒ２およびＲ３は、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、ＣＮ、Ｒ１３、ＯＲ１３、ＯＣＯＲ１３および−ＣＨＯからなる群から独立して選択されるか、またはＲ２とＲ３は一緒になって、５員または６員のヘテロシクリルを形成し、Ｒ７およびＲ８は、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、ＣＮ、Ｒ１３、ＯＲ１３、ＯＣＯＲ１３および−ＣＨＯからなる群から独立して選択されるか、またはＲ７とＲ８は一緒になって、５員または６員のヘテロシクリルを形成し、Ｒ１１およびＲ１２は、独立して、水素またはＲ１３であり、Ｒ１３はそれぞれ、独立して、Ｃ１〜９アルキル、Ｃ２〜９アルケニルまたはＣ２〜９アルキニルである）
またはその結晶形態、水和物、もしくは化粧品としてもしくは薬学的に許容される塩、および化粧品としてまたは薬学的に許容されるビヒクル、希釈剤または担体を含む。
【００３０】
本発明の別の実施形態は、組成物である。本組成物は、表１または図３に列挙される化合物、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは化粧品としてもしくは薬学的に許容される塩、および化粧品としてまたは薬学的に許容されるビヒクル、希釈剤または担体を含む。
【００３１】
本発明の追加的な実施形態は、対象においてＵＶ誘発性皮膚損傷を処置または予防する方法である。本方法は、対象に、本明細書において開示されている組成物のいずれかを接触させるステップを含む。
【００３２】
本発明のさらなる実施形態は、対象においてＵＶ誘発性紅斑を処置または予防する方法である。本方法は、対象に、本明細書において開示されている組成物のいずれかを接触させるステップを含む。
【００３３】
本発明の別の実施形態は、対象において皮膚のＵＶ誘発性エイジングを処置または予防する方法である。本方法は、対象に、本明細書において開示されている組成物のいずれかを接触させるステップを含む。
【００３４】
本発明の追加的な実施形態は、対象において日焼けを処置または予防する方法である。本方法は、対象に、本明細書において開示されている組成物のいずれかを接触させるステップを含む。
【００３５】
本発明のさらなる実施形態は、対象においてＵＶ誘発性色素沈着過度を処置または予防する方法である。本方法は、対象に、本明細書において開示されている組成物のいずれかを接触させるステップを含む。
【００３６】
本発明の別の実施形態は、対象において皮膚を美白する方法である。本方法は、対象に、本明細書において開示されている組成物のいずれかを接触させるステップを含む。
【００３７】
本発明の追加的な実施形態は、対象においてメラノサイトアポトーシスを誘導する方法である。本方法は、対象に、本明細書において開示されている組成物のいずれかを接触させるステップを含む。
【００３８】
本発明のさらなる実施形態は、対象において芳香族炭化水素受容体（ＡｈＲ）活性をモジュレートする方法である。本方法は、対象に、本明細書において開示されている組成物のいずれかを接触させるステップを含む。
【００３９】
本発明の別の実施形態は、対象においてメラニン形成をモジュレートする方法である。本方法は、対象に、本明細書において開示されている組成物のいずれかを接触させるステップを含む。
【００４０】
本発明の追加的な実施形態は、対象においてメラニン濃度をモジュレートする方法である。本方法は、対象に、本明細書において開示されている組成物のいずれかを接触させるステップを含む。
【００４１】
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、要請および必要な料金の支払いがあれば事務所より提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１−１】図１〜２は、様々な濃度の示されている試験物品により処置されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）基質を用いる個別の実験から解明された平均組織生存率およびメラニン濃度データを示す表である。
【図１−２】同上。
【図２−１】同上。
【図２−２】同上。
【００４３】
【図３−１】図３は、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａにより産生する化合物を示す図である。
【図３−２】同上。
【図３−３】同上。
【図３−４】同上。
【００４４】
【図４】図４〜５は、様々な濃度の示されている試験物品／試験組成物により処置されたＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）基質を用いる個別の実験から解明された平均組織生存率およびメラニン濃度データを示す表である。
【図５】同上。
【００４５】
【図６−１】図６Ａ〜６Ｂは、ＡＢ１７５９０（図６Ａ）およびＡＢ１７６５３、ＡＢ１７６５４、ＡＢ１７６５５、ＡＢ１７６５６、ＡＢ１７６５７およびＡＢ１７６５８（図６Ｂ）に関する合成スキームを示す図である。
【図６−２】同上。
【００４６】
【図７】図７は、皮膚タイプＩＶの患者の場合の皮膚処置の型を示す概略図である。値は、ｍＪ／ｃｍ２単位の任意の領域のＵＶ用量を示す。
【００４７】
【図８】図８は、皮膚タイプＩ〜ＶＩに関するＤｕａｌｉｇｈｔスケールを示す表である。
【００４８】
【図９】図９は、７日目に照射した後の８日目における、メラニンおよび紅斑のメグザメーターＭＸ１６による測定値を示す表である。
【００４９】
【図１０−１】図１０は、１４日目の照射後の１５日目における、メラニンおよび紅斑のメグザメーターＭＸ１６による測定値を示す表である。
【図１０−２】同上。
【００５０】
【図１１】図１１は、様々な程度の紅斑に関連する数値である紅斑スケールを示す表である。
【００５１】
【図１２】図１２は、図７に示されている皮膚処置の型による、様々なレベルのＵＶを用いた照射後２４時間の対象の皮膚を示す写真である。照射後の２４時間の最小紅斑量（「ＭＥＤ」）は、１２０ｍＪ  ＵＶＢであった。
【００５２】
【図１３】図１３は、７日目における、対象の皮膚上の試験部位を示す写真である。
【００５３】
【図１４】図１４は、１２０ｍＪ  ＵＶＢで照射後２４時間の８日目における、対象の皮膚上の試験部位を示す写真である。
【００５４】
【図１５】図１５は、さらに１週間のマラセジン治療をした後の１４日目における、対象の皮膚上の試験部位を示す写真である。処置領域に、１２０ｍＪ  ＵＶＢを投与した。
【００５５】
【図１６】図１６は、１２０ｍＪ  ＵＶＢで照射後２４時間の１５日目における、対象の皮膚上の試験部位を示す写真である。７日目および９日目の場合、ビヒクル部位に紅斑があることに留意されたい。１日目および３日目に、かすかな紅斑を伴う、１４日目、１０日目および８日目の場合、マラセジン１％処置部位では、最小限から軽度の紅斑があることにも留意されたい。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
本発明の追加的な実施形態は、組成物である。本組成物は、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む。
【００５７】
本発明の別の実施形態は、皮膚を美白する組成物である。本組成物は、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む。
【００５８】
本発明のさらなる実施形態は、メラノサイトアポトーシスを誘導する組成物である。本組成物は、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む。
【００５９】
本発明の追加的な実施形態は、芳香族炭化水素受容体（ＡｈＲ）活性をモジュレートする組成物である。本組成物は、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む。
【００６０】
本発明の別の実施形態は、メラニン形成をモジュレートする組成物である。本組成物は、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む。
【００６１】
本発明のさらなる実施形態は、メラニン濃度をモジュレートする組成物である。本組成物は、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む。
【００６２】
本発明の追加的な実施形態は、対象において皮膚を美白する方法である。本方法は、対象に、組成物を接触させるステップであって、該組成物が、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む、ステップを含む。
【００６３】
本発明の別の実施形態は、対象においてメラノサイトアポトーシスを誘導する方法である。本方法は、対象に、組成物を接触させるステップであって、該組成物が、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む、ステップを含む。
【００６４】
本発明のさらなる実施形態は、対象において芳香族炭化水素受容体（ＡｈＲ）活性をモジュレートする方法である。本方法は、対象に、組成物を接触させるステップであって、該組成物が、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む、ステップを含む。
【００６５】
本発明の追加的な実施形態は、対象においてメラニン形成をモジュレートする方法である。本方法は、対象に、組成物を接触させるステップであって、該組成物が、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む、ステップを含む。
【００６６】
本発明の別の実施形態は、対象においてメラニン濃度をモジュレートする方法である。本方法は、対象に、組成物を接触させるステップであって、該組成物が、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む、ステップを含む。
【００６７】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、表５に列挙される化合物を含む。
【００６８】
他の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、表６に列挙される化合物を含む。
【００６９】
追加的な好ましい実施形態では、本発明の組成物は、表７に列挙される化合物を含む。
【００７０】
さらに好ましい実施形態では、本発明の組成物は、表８に列挙される化合物を含む。
【００７１】
他の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、表９に列挙される化合物を含む。
【００７２】
追加的な好ましい実施形態では、本発明の方法は、対象に、表５に列挙される化合物を含む組成物を接触させるステップを含む。
【００７３】
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、対象に、表６に列挙される化合物を含む組成物を接触させるステップを含む。
【００７４】
他の好ましい実施形態では、本発明の方法は、対象に、表７に列挙される化合物を含む組成物を接触させるステップを含む。
【００７５】
追加的な好ましい実施形態では、本発明の方法は、対象に、表８に列挙される化合物を含む組成物を接触させるステップを含む。
【００７６】
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、対象に、表９に列挙される化合物を含む組成物を接触させるステップを含む。
【００７７】
本発明のさらなる実施形態は、組成物である。本組成物は、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ酵母、および化粧品としてまたは薬学的に許容されるビヒクル、希釈剤または担体を含む。
【００７８】
本発明の追加的な実施形態は、組成物である。本組成物は、以下の式の構造を有する化合物：
【化３】
2021535123.tif 000004
（式中、
Ｘは、ＮＲ１４およびＯからなる群から選択され、Ｙは、共有結合、ＣＲ５Ｒ６、ＯまたはＮＲ１５であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は、水素、ハロゲン、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｒ１６またはＯＲ１６からなる群から独立して選択され、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は、独立して、水素またはＲ１６であり、Ｒ５およびＲ６は、水素、ヒドロキシル、ＯＲ１６、Ｒ１６およびＣ３〜６シクロアルキルからなる群から独立して選択されるか、またはＲ５とＲ６は一緒になって、オキソ（＝Ｏ）基もしくはＣ３〜６シクロアルキルを形成し、Ｒ１２は、水素、−ＣＯＲａおよびＲ１６からなる群から選択され、Ｒ１６はそれぞれ、独立して、ホルミル、Ｃ１〜９アルキル、Ｃ２〜９アルケニルまたはＣ２〜９アルキニルであり、Ｒａは、水素、ヒドロキシルおよびＯＲ１６からなる群から選択される）
またはその結晶形態、水和物、もしくは化粧品としてもしくは薬学的に許容される塩
および化粧品としてまたは薬学的に許容されるビヒクル、希釈剤または担体を含む。
【００７９】
本発明の別の実施形態は、組成物である。本組成物は、以下の式の構造を有する化合物：
【化４】
2021535123.tif 000005
（式中、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９およびＲ１０は、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、ＣＮ、Ｒ１３、ＯＲ１３、ＯＣＯＲ１３および−ＣＨＯからなる群から独立して選択され、Ｒ２およびＲ３は、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、ＣＮ、Ｒ１３、ＯＲ１３、ＯＣＯＲ１３および−ＣＨＯからなる群から独立して選択されるか、またはＲ２とＲ３は一緒になって、５員または６員のヘテロシクリルを形成し、Ｒ７およびＲ８は、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、ＣＮ、Ｒ１３、ＯＲ１３、ＯＣＯＲ１３および−ＣＨＯからなる群から独立して選択されるか、またはＲ７とＲ８は一緒になって、５員または６員のヘテロシクリルを形成し、Ｒ１１およびＲ１２は、独立して、水素またはＲ１３であり、Ｒ１３はそれぞれ、独立して、Ｃ１〜９アルキル、Ｃ２〜９アルケニルまたはＣ２〜９アルキニルである）
またはその結晶形態、水和物、もしくは化粧品としてもしくは薬学的に許容される塩
および化粧品としてまたは薬学的に許容されるビヒクル、希釈剤または担体を含む。
【００８０】
本発明のさらなる実施形態は、組成物である。本組成物は、表１または図３に列挙される化合物、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは化粧品としてもしくは薬学的に許容される塩
および化粧品としてまたは薬学的に許容されるビヒクル、希釈剤または担体を含む。
【００８１】
好ましい実施形態では、本発明の組成物のいずれも、対象においてＵＶ誘発性紅斑を予防する。
【００８２】
好ましい実施形態では、本発明の組成物のいずれも、対象において表皮メラニンを低減する。
【００８３】
好ましい実施形態では、本発明の組成物のいずれも、対象において光保護効果またはＵＶ保護効果を生じる。
【００８４】
好ましい実施形態では、本発明の組成物のいずれも、ＵＶをフィルターにかける、これを吸収するまたはこれを反射する。
【００８５】
好ましい実施形態では、本発明の組成物のいずれも、色素沈着過度を予防する、かつ／または低色素沈着を促進する。
【００８６】
好ましい実施形態では、本発明の組成物のいずれも、日焼け防止剤、光保護剤および／またはＵＶ保護剤である。
【００８７】
本発明の追加的な実施形態は、対象においてＵＶ誘発性皮膚損傷を処置または予防する方法である。本方法は、対象に、本明細書において開示されている組成物のいずれかを接触させるステップを含む。
【００８８】
本発明の別の実施形態は、対象においてＵＶ誘発性紅斑を処置または予防する方法である。本方法は、対象に、本明細書において開示されている組成物のいずれかを接触させるステップを含む。
【００８９】
本発明のさらなる実施形態は、対象において皮膚のＵＶ誘発性エイジングを処置または予防する方法である。本方法は、対象に、本明細書において開示されている組成物のいずれかを接触させるステップを含む。
【００９０】
本発明の追加的な実施形態は、対象において日焼けを処置または予防する方法である。本方法は、対象に、本明細書において開示されている組成物のいずれかを接触させるステップを含む。
【００９１】
本発明の別の実施形態は、対象においてＵＶ誘発性色素沈着過度を処置または予防する方法である。本方法は、対象に、本明細書において開示されている組成物のいずれかを接触させるステップを含む。
【００９２】
本発明のさらなる実施形態は、対象において皮膚を美白する方法である。本方法は、対象に、本明細書において開示されている組成物のいずれかを接触させるステップを含む。
【００９３】
本発明の追加的な実施形態は、対象においてメラノサイトアポトーシスを誘導する方法である。本方法は、対象に、本明細書において開示されている組成物のいずれかを接触させるステップを含む。
【００９４】
本発明の別の実施形態は、対象において芳香族炭化水素受容体（ＡｈＲ）活性をモジュレートする方法である。本方法は、対象に、本明細書において開示されている組成物のいずれかを接触させるステップを含む。
【００９５】
本発明のさらなる実施形態は、対象においてメラニン形成をモジュレートする方法である。本方法は、対象に、本明細書において開示されている組成物のいずれかを接触させるステップを含む。
【００９６】
本発明の追加的な実施形態は、対象においてメラニン濃度をモジュレートする方法である。本方法は、対象に、本明細書において開示されている組成物のいずれかを接触させるステップを含む。
定義
【００９７】
本明細書で使用する場合、用語「化合物」とは、１つまたは複数の化学結合によって結合されている２個またはそれより多い原子を指す。本発明では、化学結合には、以下に限定されないが、共有結合、イオン性結合、水素結合およびファンデルワールス相互作用が含まれる。本発明の共有結合は、単結合、二重結合および三重結合を含む。本発明の化合物には、以下に限定されないが、有機分子が含まれる。
【００９８】
本発明の有機化合物／分子は、官能基を有するまたは有していない、線状、分岐状および環式炭化水素を含む。用語「Ｃｘ〜ｙ」は、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアルコキシなどの化学部分と合わせて使用される場合、鎖中にｘ〜ｙ個の炭素を含有する基を含むことが意図される。例えば、用語「Ｃｘ〜ｙアルキル」は、トリフルオロメチルおよび２，２，２−トリフルオロエチルなどのハロアルキル基を含めた、鎖中にｘ〜ｙ個の炭素を含有する直鎖アルキルおよび分岐鎖アルキル基を含めた、置換または無置換の飽和炭化水素基を意味する。用語「Ｃｘ〜ｙアルケニル」および「Ｃｘ〜ｙアルキニル」とは、長さが類似しており、上で記載したアルキルに置換がある可能性がある、置換または無置換の不飽和脂肪族基を指すが、それぞれ、少なくとも１つの二重結合または三重結合を含有する。
【００９９】
用語「脂肪族」は、本明細書で使用する場合、芳香族環を含有しない、炭素および水素原子からなる基を意味する。したがって、脂肪族基には、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびカルボシクリル基が含まれる。
【０１００】
本明細書で使用する場合、用語「アルキル」は、線状および分岐状の非環式炭化水素基を意味し、例えば、「Ｃ１〜Ｃ２０アルキル」とは、１〜２０個の炭素を有するアルキル基を指す。アルキル基は、線状または分岐状であってもよい。アルキル基の例には、以下に限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチルヘキシル、イソヘキシルなどが含まれる。他のアルキル基は、本開示の利益を得る分野の当業者に容易に明白になると予想される。アルキル基は、無置換であってもよく、または本明細書に記載されている１つもしくは複数の置換基により置換されていてもよい。例えば、アルキル基は、ハロゲン、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＯＨ、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＮＨ２、−ＮＨＲ’、−Ｎ（Ｒ’）２、−ＳＲ’または−ＳＯ２Ｒ’のうちの１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの独立して選択される置換基）により置換されていてもよく、Ｒ’の各場合は、独立して、Ｃ１〜Ｃ３アルキルである。実施形態では、アルキルは、無置換である。実施形態では、アルキルは、置換されている（例えば、本明細書に記載されている、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの置換基による）。例えば、用語「ヒドロキシアルキル」とは、ヒドロキシル（−ＯＨ）置換基を含む、本明細書に記載されているアルキル基を指し、−ＣＨ２ＯＨなどの基を含む。
【０１０１】
本明細書で使用する場合、「アルケニル」は、鎖に沿った任意の安定な点において起こり得る１つまたは複数の不飽和炭素−炭素二重結合を有する、任意の線状または分岐状の炭化水素鎖を意味し、例えば、「Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル」とは、２〜２０個の炭素を有するアルケニル基を指す。例えば、アルケニル基には、プロパ−２−エニル、ブタ−２−エニル、ブタ−３−エニル、２−メチルプロパ−２−エニル、ヘキサ−２−エニル、ヘキサ−５−エニル、２，３−ジメチルブタ−２−エニルなどが含まれる。実施形態では、アルケニルは、１つ、２つまたは３つの炭素−炭素二重結合を含む。実施形態では、アルケニルは、１つの炭素−炭素二重結合を含む。実施形態では、複数の二重結合（例えば、２つまたは３つ）は、共役している。アルケニル基は、無置換であってもよく、または本明細書に記載されている１つもしくは複数の置換基により置換されていてもよい。例えば、アルケニル基は、ハロゲン、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＮＨ２、−ＮＨＲ’、−Ｎ（Ｒ’）２、−ＳＲ’または−ＳＯ２Ｒ’のうちの１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの独立して選択される置換基）により置換されていてもよく、Ｒ’の各場合は、独立して、Ｃ１〜Ｃ３アルキルである。実施形態では、アルケニルは、無置換である。実施形態では、アルケニルは、置換されている（例えば、本明細書に記載されている、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの置換基による）。
【０１０２】
本明細書で使用する場合、「アルキニル」は、鎖に沿った任意の安定な点において起こる１つまたは複数の炭素−炭素三重結合を有する、線状または分岐状のどちらかの立体配置の任意の炭化水素鎖を意味し、例えば、「Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル」とは、２〜２０個の炭素を有するアルキニル基を指す。アルキニル基の例には、プロパ−２−イニル、ブタ−２−イニル、ブタ−３−イニル、ペンタ−２−イニル、３−メチルペンタ−４−イニル、ヘキサ−２−イニル、ヘキサ−５−イニルなどが含まれる。実施形態では、アルキニルは、１つの炭素−炭素三重結合を含む。アルキニル基は、無置換であってもよく、または本明細書に記載されている１つもしくは複数の置換基により置換されていてもよい。例えば、アルキニル基は、ハロゲン、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＮＨ２、−ＮＨＲ’、−Ｎ（Ｒ’）２、−ＳＲ’または−ＳＯ２Ｒ’のうちの１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの独立して選択される置換基）により置換されていてもよく、Ｒ’の各場合は、独立して、Ｃ１〜Ｃ３アルキルである。実施形態では、アルキニルは、無置換である。実施形態では、アルキニルは、置換されている（例えば、本明細書に記載されている、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの置換基による）。
【０１０３】
本明細書で使用する場合、用語「シクロアルキル」は、飽和の非芳香族環式基、例えば「Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル」を意味する。実施形態では、シクロアルキルは、単環式である。実施形態では、シクロアルキルは、多環式（例えば、二環式または三環式）である。多環式シクロアルキル基では、個々の環は、縮合することができる、架橋することができる、またはスピロ環式とすることができる。シクロアルキル基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ノルボルナニル、ビシクロ［３．２．１］オクタニル、オクタヒドロ−ペンタレニルおよびスピロ［４．５］デカニルなどが含まれる。用語「シクロアルキル」は、用語「炭素環」と互換的に使用されてもよい。シクロアルキル基は、無置換であってもよく、または本明細書に記載されている１つもしくは複数の置換基により置換されていてもよい。例えば、シクロアルキル基は、ハロゲン、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＮＨ２、−ＮＨＲ’、−Ｎ（Ｒ’）２、−ＳＲ’または−ＳＯ２Ｒ’のうちの１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの独立して選択される置換基）により置換されていてもよく、Ｒ’の各場合は、独立して、Ｃ１〜Ｃ３アルキルである。実施形態では、シクロアルキルは、無置換である。実施形態では、シクロアルキルは、置換されている（例えば、本明細書に記載されている、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの置換基による）。
【０１０４】
本明細書で使用する場合、用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。
【０１０５】
本明細書で使用する場合、「芳香族化合物」、「芳香族」、または「芳香族環」を含有する化合物は、アリールまたはヘテロアリール化合物である。用語「アリール」は、本明細書で使用する場合、環の原子がそれぞれ炭素である置換または無置換の単環芳香族基を含む。好ましくは、環は、３〜８員の環、より好ましくは６員環である。用語「アリール」はまた、２つまたはそれより多い環式環を有する多環式環系であって、２個またはそれより多い炭素が、２つの隣接する環に共通しており、環の少なくとも１つが、芳香族であり、例えば、他の環式環が、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよび／またはヘテロシクリルとすることができる、多環式環系を含む。アリール基には、ベンゼン、ナフタレン、フェナントレン、フェノール、アニリンなどが含まれる。用語「ヘテロアリール」は、置換または無置換の芳香族単環構造、好ましくは３〜８員環、より好ましくは５〜７員環、さらにより好ましくは５〜６員環を含み、その環構造は、少なくとも１個のヘテロ原子、好ましくは１〜４個のヘテロ原子、より好ましくは１個または２個のヘテロ原子を含む。用語「ヘテロアリール」はまた、２つまたはそれより多い環式環を有する多環式環系であって、２個またはそれより多い炭素が、２つの隣接する環に共通しており、環の少なくとも１つが、複素芳香族であり、例えば、他の環式環が、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリールおよび／またはヘテロシクリルとすることができる、多環式環系を含む。ヘテロアリール基には、例えば、ピロール、フラン、チオフェン、インドール、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジンなどが含まれる。好ましくは、本発明のある特定の化合物には、少なくとも１つの、好ましくは２つのインドール基、および少なくとも１つのアルデヒド基が含まれる。
【０１０６】
用語「置換されている」は、主鎖の１つまたは複数の炭素上の水素原子を置き換える、少なくとも１つの置換基を有する部分を意味する。「置換」または「により置換されている」は、このような置換が、置換されている原子および置換基の許容される価数に従うこと、およびこの置換が、例えば、転位、環化、脱離などによって変換を自発的に受けない安定な化合物をもたらすという暗黙の前提を含むことが理解されよう。許容される置換基は、１つまたは複数とすることができ、適切な有機化合物に対して同一または異なることができる。
【０１０７】
本明細書で使用する場合、用語「複素環」または「複素環式」は、少なくとも１個のヘテロ原子を含有する、単環式、二環式または三環式環系を意味する。ヘテロ原子には、以下に限定されないが、酸素、窒素および硫黄が含まれる。
【０１０８】
単環式複素環式環は、少なくとも１個のヘテロ原子を含有する、例えば、３、４、５、６、７、８、９または１０員環からなる。単環式複素環式環の代表例には、以下に限定されないが、アゼチジニル、アゼパニル、アジリジニル、ジアゼパニル、１，３−ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、１，３−ジチオラニル、１，３−ジチアニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オキサジアゾリニル、オキサジアゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピロリニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、チアジアゾリニル、チアジアゾリジニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、チオモルホリニル、１，１−ジオキシドチオモルホリニル（チオモルホリンスルホン）、チオピラニルおよびトリチアニルが含まれる。
【０１０９】
二環式複素環式環は、非限定的な例により、端部の（ｄｉｓｔａｌ）アリール環に縮合した単環式複素環式環、または端部のシクロアルキル環に縮合した単環式複素環式環、または端部のシクロアルケニル環に縮合した単環式複素環式環、または端部の単環式複素環式環に縮合した単環式複素環式環、または端部の単環式ヘテロアリール環に縮合した単環式複素環式環である。二環式複素環式環の代表例には、以下に限定されないが、１，３−ベンゾジオキソリル、１，３−ベンゾジチオリル、２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシニル、２，３−ジヒドロ−１−ベンゾフラニル、２，３−ジヒドロ−１−ベンゾチエニル、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドリルおよび１，２，３，４−テトラヒドロキノリニルが含まれる。
【０１１０】
三環式複素環式環は、非限定的な例によって、フェニル基に縮合した二環式複素環式環、またはシクロアルキル基に縮合した二環式複素環式環、またはシクロアルケニル基に縮合した二環式複素環式環、または別の単環式複素環式環に縮合した二環式複素環式環である。三環式複素環式環の代表例には、以下に限定されないが、２，３，４，４ａ，９，９ａ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−カルバゾリル、５ａ，６，７，８，９，９ａ−ヘキサヒドロジベンゾ［ｂ，ｄ］フラニルおよび５ａ，６，７，８，９，９ａ−ヘキサヒドロジベンゾ［ｂ，ｄ］チエニルが含まれる。
【０１１１】
本発明の複素環は、非限定的な例によって、アルケニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルコキシアルキニル、アルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアルキル、アルコキシ−ＮＨ＝Ｃ（アルキル）−、アルキル、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルアルキル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルスルホニル、アルキルチオ、アルキニル、アリール、アリールアルコキシ、アリールアルキル、アリールカルボニル、アリールオキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、シアノ、シアノアルキル、シクロアルキル、カルボニル、シクロアルキルアルキル、ホルミル、ハロゲン、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシシクロアルキル、メルカプト、ニトロ、オキソおよびフェニルから独立して選択される置換基により置換され得る。
【０１１２】
本明細書で使用する場合、「皮膚色素沈着のモジュレート」およびその文法上の変形は、一般に、本発明の化合物および組成物の、皮膚美白作用および皮膚の暗色化作用を指す。
【０１１３】
本明細書で使用する場合、「皮膚美白」およびその文法上の変形は、皮膚色素沈着の、なんらかの実際のまたは見た目に感じる低下を一般に指す。皮膚の美白方法は、年齢、日光への曝露または色素沈着過度障害に起因する過度に色素沈着した皮膚領域の色素沈着を低減するために使用されている。本発明の化合物および組成物を、例えば対象の皮膚に施用すると、色素沈着を低減することができ、その結果、皮膚は、前記施用前よりも薄く見えるか、または白く見える。皮膚色素沈着は、以下に限定されないが、例えば、ｖｏｎ  Ｌｕｓｃｈａｎの色彩スケール（ｖｏｎ  Ｌｕｓｃｈａｎ  ｃｈｒｏｍａｔｉｃ  ｓｃａｌｅ）、フィッツパトリック皮膚分類試験（Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）およびＴａｙｌｏｒの色素沈着過度スケール（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）を使用する目視評価、ならびに反射分光測色法（Ｚｏｎｉｏｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）を含めたいくつかの方法で評価することができる。例えば、フィッツパトリック皮膚分類試験は、６種のタイプの皮膚（Ｉ〜ＶＩ）を含み、この用語が本明細書において使用される場合、タイプＶまたはそれ未満になるタイプＶＩの皮膚が、「美白されている」。以下でさらに議論される通り、皮膚の美白は、以下に限定されないが、メラノサイト活性のモジュレート、メラノサイトアポトーシスの誘導、または芳香族炭化水素受容体（ＡｈＲ）活性、メラニン形成、メラノソーム生物発生、メラノソーム輸送もしくはメラニン濃度のモジュレートを含めた、いくつかの現象によって生じ得る。
【０１１４】
同様に、本明細書で使用する場合、「皮膚の暗色化」およびその文法上の変形は、皮膚色素沈着の、なんらかの実際のまたは見た目に感じる増大を一般に指す。皮膚を暗色化する方法は、例えば、低色素沈着障害に起因する色素沈着が減少した皮膚領域の色素沈着を増大するために使用されている。本発明の化合物および組成物を、例えば、対象の皮膚に施用すると、色素沈着を増大することができ、その結果、皮膚は、前記施用前よりも黒く見える。
【０１１５】
本発明のある特定の化合物は、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ酵母により産生される、これに由来する、これから単離される、またはこれから単離可能である。Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ酵母は、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ属の酵母であり、以下に限定されないが、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｇｌｏｂｏｓａ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｒｅｓｔｒｉｃｔａ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｆｕｒｆｕｒ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｓｙｍｐｏｄｉａｌｉｓ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｓｌｏｏｆｆｉａｅ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｏｂｔｕｓａ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｄｅｒｍａｔｉｓ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｎａｎａ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｙａｍａｔｏｅｎｓｉｓ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｅｑｕｉｎｅ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｃａｐｒａｅおよびＭａｌａｓｓｅｚｉａ  ｃｕｎｉｃｕｌｉを含む（Ｇｕｅｈｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６；Ｇａｉｔａｎｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ酵母は、正常なヒトの皮膚微生物叢の一部であり、通常、病原性作用を生じない。しかし、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ酵母は、以下に限定されないが、癜風（黒色癜風と白色癜風の両方）、脂漏性皮膚炎、ふけ、アトピー性皮膚炎、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ毛嚢炎、乾癬および融合性細網状乳頭腫症を含めた、いくつかの疾患を引き起こす恐れがある（Ｇａｉｔａｎｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。
【０１１６】
本明細書で使用する場合、用語「化学アナログ」とは、親化合物に構造上、関連する化合物を指し、異なる官能基または置換基を含有する。例えば、本発明の親化合物には、マラセジンおよびインジルビンが含まれ、マラセジンおよびインジルビンの化学アナログは、それぞれ、マラセジンおよびインジルビンとは異なるある特定の官能基および置換基を含有する。本発明の化学アナログは、化粧品使用または医薬品使用に好適な薬物動態プロファイルを含めた、所与の親化合物よりも有意な利点を有することがある。一部の実施形態では、化学アナログは、１つまたは複数の化学反応によって、親分子から生成する。他の実施形態では、親化合物を起源としない代替合成スキームを使用して、本発明の化学アナログを生成することができる。
【０１１７】
本発明の化合物は、その寿命サイクルの過程にわたり、適切な成長条件下で、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ酵母が、本化合物を合成する、分泌する、蓄積する、または他には、生成する場合、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ酵母によって産生される。Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ酵母は、その成長培地に補給されるものに応じて、異なる化合物を分泌する（Ｎａｚｚａｒｏ−Ｐｏｒｒｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９７８）。本発明は、任意の成長条件下で、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ酵母によって産生されるいかなる化合物も含むが、好ましい化合物は、例えば、マラセジン、インジルビンおよびそれらの化学アナログを含む。
【０１１８】
酵母の寿命サイクルの過程における任意の時に、本化合物が酵母表面またはその内部に存在した場合、本発明の化合物は、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ酵母に由来する。
【０１１９】
マラセジンは、本発明のＭａｌａｓｓｅｚｉａ酵母によって産生される化合物の一例である。２−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）−１Ｈ−インドール−３−カルボアルデヒドとしても公知のマラセジンは、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｆｕｒｆｕｒから元々単離されたトリプトファン代謝産物である。マラセジンは、細胞成長、分化および遺伝子発現に関与する受容体である、芳香族炭化水素受容体（ＡｈＲ）の既知のアゴニストである（Ｗｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。マラセジンはまた、一次ヒトメラノサイトにおいてアポトーシスを誘導する（Ｋｒａｍｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。最近、マラセジンのある特定の化学アナログが、Ｗｉｎｓｔｏｎ−ＭｃＰｈｅｒｓｏｎおよび共同研究者によって合成され、彼らは、そのアナログのＡｈＲアゴニスト活性を試験した。（Ｗｉｎｓｔｏｎ−ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）。
【０１２０】
インジルビンは、本発明のＭａｌａｓｓｅｚｉａ酵母によって産生される化合物の別の例である。インジルビンは、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｆｕｒｆｕｒから単離された代謝産物である。インジルビンは、細胞成長、分化および遺伝子発現に関与する受容体である、芳香族炭化水素受容体（ＡｈＲ）の既知のアゴニストである。
【０１２１】
本明細書で使用する場合、用語「メラノサイト」とは、チロシナーゼ、およびメラノソーム内でメラニン色素を通常、合成する、表皮の樹状細胞を指す。本発明のメラノサイトは、以下に限定されないが、以下：チロシナーゼ（眼皮膚白皮症ＩＡ）、小眼球症関連転写因子、アルファ−２−マクログロブリン、チロシナーゼ関連タンパク質１、溶質キャリアファミリー１６、ＧＳ３９５５タンパク質、ｖ−ｋｉｔ  Ｈａｒｄｙ−Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ４ネコ肉腫、眼白子症１、Ｒａｇ  Ｄタンパク質、グリコゲニン２、Ｇタンパク質共役型受容体、ファミリーＣ、食道がん１において切除される眼皮膚白皮症ＩＩ、メラン−Ａ、ＳＲＹ−ｂｏｘ１０、ＡＴＰアーゼ、クラスＶ、タイプ１０Ｃ、マトリックスメタロプロテイナーゼ１、潜在型トランスフォーミング増殖因子ベータｂ、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＣ、ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ１５、膜貫通７スーパーファミリーメンバー１、グルタミニル−ペプチドシクロトランスフェラーゼ、ならびにＬｅｅおよび共同研究者ら（Ｌｅｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）によって特定された他の遺伝子のうちの１種または複数を含めた、ある特定の遺伝子の上方調節を示す。
【０１２２】
メラノサイトは、他の多くの細胞タイプと同様に、プログラム細胞死、すなわちアポトーシスを受ける。メラノサイトアポトーシス経路は、当業者には公知であり（Ｗａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）、アポトーシス経路は、Ｅｌｍｏｒｅによって全般的に概説されている（Ｅｌｍｏｒｅ，  ２００７）。本発明の化合物または組成物は、例えば、メラノサイトにおいて、ある特定のアポトーシス促進性シグナル伝達経路の活性化を引き起こすか、またはある特定の抗アポトーシス経路の抑制を引き起こすことによって、メラノサイトアポトーシスを「誘導する」。本発明の化合物または組成物は、アポトーシスに関連する経路のシグナル伝達分子と直接相互作用することによって、またはこの経路内で通常、機能しない１つまたは複数の中間分子との直接相互作用を介する、この経路の分子との間接的相互作用によって、この経路を直接、活性化／抑制することができることが構想される。
【０１２３】
メラノサイト活性は、以下に限定されないが、メラノサイトアポトーシスを誘導する、またはメラノサイト遺伝子発現、細胞運動性、細胞成長、メラニン産生、メラノソーム生物発生もしくはメラノソーム輸送を改変することを含めた、本発明に企図されているいくつかの方法でモジュレートすることができる。
【０１２４】
本明細書で使用する場合、用語「モジュレートする」、「モジュレートすること」、およびそれらの文法上の変形は、生物活性または現象を所望のレベルまで調整することを指す。本発明の「モジュレート」は、生物活性または現象のレベルを増大または低下させる調整を含むことが構想される。
【０１２５】
本明細書で使用する場合、用語「アゴニスト」、「作動させる」、およびそれらの文法上の変形は、１つまたは複数の生物活性の引き金となる（例えば、開始または促進する）、これらを部分的にもしくは完全に増強する、刺激するまたは活性化する分子を指す。本発明のアゴニストは、受容体と相互作用して、これを活性化することができ、これにより、その受容体に特徴的な、生理的または薬理学的応答を開始する。本発明のアゴニストは、天然物質および合成物質を含む。
【０１２６】
本明細書で使用する場合、用語「アンタゴニスト」、「拮抗する」、およびそれらの文法上の変形は、１つまたは複数の生物活性を部分的にもしくは完全に抑制する、阻害するまたは不活性化する分子を指す。本発明のアンタゴニストは、アゴニストと同じ部位で受容体に競合的に結合することができるが、受容体の活性形態によって開始される細胞内応答を活性化することはない。本発明のアンタゴニストは、アゴニストまたは部分アゴニストの細胞内応答を阻害することができる。
【０１２７】
本発明の芳香族炭化水素受容体（ＡｈＲ）は、本明細書に記載されている対象において、自然に存在する任意の芳香族炭化水素受容体である。芳香族炭化水素受容体は、当業者に公知である（Ｎｏａｋｅｓ，  ２０１５）。芳香族炭化水素受容体のアゴニストには、以下に限定されないが、キヌレニン、キヌレン酸、シンナバリニン酸および６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ）などのトリプトファン関連化合物が含まれる。マラセジンはまた、芳香族炭化水素受容体アゴニストとしても公知である（Ｗｉｌｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。
【０１２８】
本明細書で使用する場合、本発明の化合物、組成物および方法は、色素沈着過度障害によって引き起こされる色素沈着過度を、例えば、色素沈着過度障害に罹患している領域において、色素沈着過度のレベルを低下させることによって、さらなる色素沈着過度を減速させることによって、またはさらなる色素沈着過度が発生するのを防止することによって改善するために使用され得る。しかし、対象の全員が、特定の投与プロトコール、レジメンまたは方法に応答しない可能性があるので、色素沈着過度障害によって引き起こされる色素沈着過度の改善は、あらゆる対象または対象集団において、所望の生理学的応答または転帰を実現することを必要としない。したがって、所与の対象または対象集団は、投与に応答しないことがあるか、または不適切に応答することがあるが、他の対象または対象集団は、応答することがあり、したがって、その色素沈着過度障害の改善を実感する。
【０１２９】
本明細書で使用する場合、用語「色素沈着過度」は、過度に黒い色をしているという実際のまたは見た目に感じる皮膚障害である。皮膚損傷は、実際のもの、例えば、年齢に起因するもの、過度の日光への曝露、または皮膚領域を黒くする疾患もしくは状態とすることができる。黒い皮膚領域は、斑点、染み、または比較的大きな黒色領域の形態となり得る。この皮膚損傷はまた、見た目に感じ得るもの、例えば、個体の皮膚の色調が暗すぎるという個体による知覚とすることができる。個体は、皮膚の色調を明るくしたいという美容上の希望を有することがある。
【０１３０】
色素沈着過度障害は、色素沈着過度が一次症状である障害、および色素沈着過度が二次症状として生じる障害である。本発明の色素沈着過度障害には、以下に限定されないが、先天性色素沈着過度障害および後天性色素沈着過度障害が含まれる。本発明の先天性色素沈着過度障害には、以下に限定されないが、表皮の色素沈着過度を伴うもの（母斑細胞母斑、スピッツ母斑および扁平母斑）、真皮の色素沈着過度（青色母斑、太田母斑、皮膚メラノーシス、伊藤母斑およびモンゴル斑）、そばかす、網状肢端色素沈着症、先端色素沈着症／肢端色素沈着症および黒子症（全身性黒子症、レオパード症候群、遺伝性パターン化黒子症、カーニー複合体、ポイツ−ジェガーズ症候群、Ｌａｕｇｉｅｒ−Ｈｕｎｚｉｋｅｒ−Ｂａｒａｎ症候群およびクロンカイト−カナダ症候群）が含まれる。（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）。本発明の後天性色素沈着過度障害には、以下に限定されないが、老人性レンチギン／黒子、黒皮症／肝斑、リールのメラノーシス、唇の黒色子斑、陰茎／外陰膣メラノーシス、顔面毛包性紅斑黒皮症（北村）、ＵＶ誘発色素沈着（日焼けおよび光線性花弁状色素斑）、炎症後の色素沈着（摩擦メラノーシスおよび灰性皮膚症（ａｓｈｙ  ｄｅｒｍａｔｏｓｉｓ））、化学的／薬物誘発性色素沈着（ポリ塩化ビフェニル、ヒ素、５−ＦＵ、ブレオマイシン、シクロホスファミド、メトトレキセート、クロルプロマジン、フェニトイン、テトラサイクリンおよびクロロキン）、色素性境界線および異物の堆積（カロテン、銀、金、水銀、ビスマスおよび入れ墨など）が含まれる。全身性障害に関連する色素沈着過度には、代謝／酵素障害（ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、ゴーシェ病、ニーマンピック病、アミロイドーシス、組織褐変症、黒色表皮腫および晩発性皮膚ポルフィリン症）、内分泌障害（アジソン病、クッシング症候群および甲状腺機能亢進症）、栄養障害（ペラグラ、ビタミンＢ１２欠如、葉酸欠乏症、ヴァガボンド病および色素性痒疹）、肥満細胞症、膠原病、肝機能障害および腎臓機能障害が含まれる。色素沈着過度はまた、感染症（麻疹、梅毒およびＭａｌａｓｓｅｚｉａ  ｆｕｒｆｕｒ）および症候群（フォンレックリングハウゼン病、ソトス症候群、ＰＯＥＭＳ症候群、ネーゲリ症候群、カントゥ症候群、マッキューン・オルブライト症候群、ワトソン症候群およびブルーム症候群）に関連し得る（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）。
【０１３１】
メラニンは、皮膚および毛髪に色調をもたらす、天然で産生される色素である。メラニンは、メラニン形成として公知の過程によって、メラノソームとして公知の細胞小器官において、メラノサイトによって産生される。本発明の化合物または組成物は、対象において、例えば、メラノソーム生物発生をモジュレートする、およびメラニン合成を酵素レベルで直接または間接的に阻害することによって、メラニン産生（別名はメラニン形成）をモジュレートする。
【０１３２】
メラノソーム生物発生は、４段階で起こる：段階Ｉは、本質的に非色素性の液胞であるプレメラノソームを特徴とする。段階ＩＩにおいて、プレメラノソームは、段階ＩＩＩでメラニンが沈着する条線を発達させる。段階ＩＶによって、メラニン含有量が豊富な成熟メラノソームとなる。本発明の化合物および組成物は、正常に、これらの段階のいずれかまたはすべてを促進する生物学的過程を阻害するまたは減弱させることによって、メラノソーム生物発生をモジュレートする（Ｗａｓｍｅｉｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。
【０１３３】
メラニン合成は、主に、３種の酵素：チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１およびドーパクロムトートメラーゼを含む。これらの酵素の細胞内輸送に影響を及ぼす追加的な因子には、以下に限定されないが、ＢＬＯＣ−１、ＯＡ１およびＳＬＣ４５Ａ２が含まれる。本発明の化合物および組成物は、例えば、これらの酵素または因子のいずれかの活性を阻害するまたは減弱させることによって、メラニン産生をモジュレートすることができる。（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）。
【０１３４】
一旦、メラノソームが形成され、メラニンが合成されると、メラノソームは表皮のメラノサイトから皮膚および毛髪のケラチノサイトへと輸送される必要がある。メラノソームは、メラノサイトの核の近傍で生じ、微小管およびアクチンフィラメントに沿ってメラノサイトの周辺部に輸送される。本発明の化合物および組成物は、メラノソームの核周囲領域からメラノサイト周辺部への、および隣接するケラチノサイト内部への輸送をもたらす生物学的過程のいずれかを妨げることによって、メラノソーム輸送をモジュレートする。
【０１３５】
メラニン濃度は、例えば、対象において、メラニン形成を増大もしくは低下させることによって、またはメラニン分解を促進することによって、または対象からなくすことによってモジュレートされ得る。
【０１３６】
本発明のＭａｌａｓｓｅｚｉａ酵母から単離された化合物は、単離前に、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ酵母中に必ず存在するか、またはＭａｌａｓｓｅｚｉａ酵母によって産生される。したがって、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ酵母から単離された化合物は、実際の酵母細胞に由来する。細胞物質から化合物を抽出するための標準プロトコールは、当業者に公知である。
【０１３７】
Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ酵母から単離可能な化合物は、実際の酵母細胞に由来する必要はない。代わりに、合成反応を使用して、実際の酵母細胞の関与なしに、酵母中で産生する化合物を生成することができる。有機合成反応は、当業者に周知であり、この点で使用することができる。
【０１３８】
本明細書で使用する場合、用語「表皮メラニン」とは、表皮中で産生される、表皮に輸送される、または他には、表皮中で見いだされるメラニンを指す。
【０１３９】
本明細書で使用する場合、用語「低下させる」およびその文法上の変形は、所与の生物学的現象または種のレベルの低下を引き起こすことを意味する。例えば、本発明の化合物および組成物は、対象における表皮メラニンを低下させ、このことは、本発明の化合物および組成物は、対象における表皮メラニンのレベルの低下を誘発することを意味する。用語「低下させる」およびその文法上の変形は、例えば、所与の現象または種のレベルを、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％または１００％、低下させることを意味することができる。
【０１４０】
本明細書で使用する場合、用語「接触させる」およびその文法上の変形は、２種またはそれより多い物質を、それらが相互作用することができるほど十分に近接させることを指す。したがって、例示の目的のみの場合では、本発明の化合物は、例えば、メラノサイトの表面の受容体と相互作用することによって、メラノサイトに接触することができる。同様に、本発明の組成物は、例えば、対象の皮膚に直接、施用されることによって、ヒト対象に接触することができる。
【０１４１】
本明細書で使用する場合、「対象」とは、哺乳動物細胞、組織、生物またはそれらの集団を意味する。本発明の対象は、ヒト細胞、組織および生物を含めた、好ましくはヒトであるが、他には、霊長類、家畜、飼育動物、実験室用動物などを含む。農業用動物の一部の例には、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギなどが含まれる。飼育動物の一部の例には、イヌ、ネコなどが含まれる。実験室用動物の一部の例には、霊長類、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなどが含まれる。
【０１４２】
本明細書で使用する場合、色素沈着過度障害によって引きこされる色素沈着過度の改善を「必要とする」対象には、改善を実際に必要とする、または見た目で感じて必要とされる対象が含まれる。
【０１４３】
本明細書で使用する場合、用語は「処置する」、「処置すること」、「処置」およびそれらの文法上の変形は、個々の対象にプロトコール、レジメン、方法または治療を施すことを意味し、その対象、例えば患者において、生理学的応答または転帰を得ることが望まれる。特に、本発明の方法および組成物は、疾患症状の発症を減速させるため、または疾患もしくは状態の発現を遅延させるため、または疾患の発達の進行を停止させるために使用されてもよい。しかし、処置される対象の全員が、特定の処置プロトコール、レジメン、方法または治療に応答しない可能性があるので、処置することは、あらゆる対象または対象集団、例えば患者集団において、所望の生理学的応答または転帰を実現することを必要としない。したがって、所与の対象または対象集団、例えば、患者集団は、処置に応答しないこと、または不適切に応答することがある。
【０１４４】
本明細書で使用する場合、用語「予防する」、「予防すること」、「予防」およびそれらの文法上の変形は、本発明の化合物は、投与時点で障害または疾患を有している可能性があると診断されていないが、障害もしくは疾患を発症すること、または障害もしくは疾患のリスクが増大状態にあると通常、予想される患者に投与されると、有用であることを意味する。本発明の化合物および組成物は、例えば、障害もしくは疾患の症状の発症を減速させる、障害もしくは疾患の発現を遅延させる、または障害もしくは疾患を個体が発症するのを完全に予防する。予防はまた、年齢、家族歴、遺伝的もしくは染色体異常により、および／または障害もしくは疾患に対する１つもしくは複数の生物学的マーカーの存在により、障害または疾患に罹患しやすいと考えられるそのような個体に本発明の化合物を投与することを含む。
【０１４５】
本明細書で使用する場合、用語「促進する」およびその文法上の変形は、可能にすること、増強すること、許容すること、容易にすること、助長すること、後押しすること、誘発すること、または他には、引き起こす一助となることを意味する。
【０１４６】
本明細書で使用する場合、用語「生じる」およびその文法上の変形は、特定の結果を発生させること、起こすこと、または出現させることを意味する。非限定的な例として、本発明の化合物および組成物は、対象において光保護効果またはＵＶ保護効果を生じる。
【０１４７】
本明細書で使用する場合、用語「紅斑」とは、皮膚の発赤を指す。紅斑は、表面の毛細血管の拡張および／または刺激によって引き起こされることがある。用語「ＵＶ誘発性紅斑」とは、ＵＶ曝露の結果として発症する、皮膚の発赤を指す。本明細書で使用する場合、「日焼け」およびその文法上の変形は、日光への曝露または人工的なＵＶ源（例えば、日焼け用ベッド）への曝露によって引き起こされるＵＶ誘発性紅斑を指す。
【０１４８】
本明細書で使用する場合、用語「色素沈着過度」とは、色素沈着が、皮膚の隣接領域の色素沈着よりも大きな皮膚の領域（例えば、色素斑、加齢斑、黒子など）を一般に指す。本発明の色素沈着過度には、以下に限定されないが、メラノサイト過活性による局所色素沈着過度、良性メラノサイト過活性および増殖による他の局在的色素沈着過度、疾患関連性色素沈着過度に加えて、光過敏、遺伝子構造、化学品摂取または他の曝露（例えばＵＶ曝露）、年齢、ならびに病変後の瘢痕化によるものなどの偶発的色素沈着過度が含まれる。本明細書で使用する場合、「ＵＶ誘発性色素沈着過度」とは、自然ＵＶまたは人工ＵＶへの曝露によって引き起こされる、任意の色素沈着過度を指す。
【０１４９】
本明細書で使用する場合、用語「低色素沈着」とは、色素沈着が、皮膚の隣接領域の色素沈着よりも少ない皮膚の領域を一般に指す。本発明の低色素沈着には、以下に限定されないが、白斑、脱色素、白色粃糠疹、限局性低色素沈着、炎症後低色素沈着、まだら症、白皮症、癜風、光過敏性、先天性色素欠如、低メラニン症、アトピー性皮膚炎、乾癬などが含まれる。
【０１５０】
本明細書で使用する場合、「ＵＶ誘発性皮膚損傷」とは、ＵＶＡ、ＵＶＢおよびＵＶＣを含めたＵＶへの曝露に起因する皮膚損傷を意味する。本発明のＵＶ誘発性皮膚損傷には、以下に限定されないが、しわ、色素沈着過度、形成異常、光線性角化症および皮膚がんが含まれる。
【０１５１】
本明細書で使用する場合、「皮膚のＵＶ誘発性エイジング」とは、ＵＶＡ、ＵＶＢおよびＵＶＣを含めたＵＶへの曝露に起因する皮膚のエイジングを意味する。本発明のＵＶ誘発性の皮膚エイジングは、例えば、しわ、細線、加齢斑、黒子、乾燥、薄化、または皮膚の弾性低下、不均質な皮膚の色調、およびＵＶ曝露により全体にまたは一部に引き起こされる、皮膚の輝き、質感、弾力性、堅さ、たるみおよび透明感における他の低下として現れる。
【０１５２】
本明細書で使用する場合、用語「光保護性」およびその文法上の変形は、本発明の化合物および組成物の効果を説明するために使用される場合、本明細書に記載されている化合物および組成物が、光、特に日光によって引き起こされる損傷を予防および／または緩和することを意味する。同様に、本発明の「光保護剤」は、光、特に日光によって引き起こされる損傷を予防および／または緩和する、本明細書に記載されている化合物および組成物である。
【０１５３】
本明細書で使用する場合、用語「ＵＶ保護性」およびその文法上の変形は、本発明の化合物および組成物の効果を説明するために使用される場合、本明細書に記載されている化合物および組成物が、紫外線（「ＵＶ」）光によって引き起こされる損傷を予防および／または緩和することを意味する。同様に、本発明の「ＵＶ保護剤」は、ＵＶによって引き起こされる損傷を予防および／または緩和する、本明細書に記載されている化合物および組成物である。本発明の紫外光には、例えば、ＵＶＡ（３２０〜２４０ｎｍ）、ＵＶＢ（２９０〜３２０ｎｍ）およびＵＶＣ（２００〜２９０ｎｍ）が含まれる。
【０１５４】
本明細書で使用する場合、用語「フィルター」およびその文法上の変形は、ＵＶを遮断する、反射する、吸収する、または散乱させることを意味する。本発明の「日焼け防止剤」は、ＵＶを遮断する、反射する、吸収するまたは散乱させる、本発明の化合物および組成物のすべてを含む。
【０１５５】
本明細書で使用する場合、用語「吸収する」およびその文法上の変形は、ＵＶを取り込むか、またはＵＶを熱エネルギーに変換することを意味する。非限定的な例として、本発明の化合物および組成物は、ＵＶを吸収することができ、その結果、その周囲に熱エネルギーを放射することができる。
【０１５６】
本明細書で使用する場合、用語「反射する」およびその文法上の変形は、ＵＶの文脈において使用される場合、ＵＶを吸収しないで、ＵＶを発射するか、またはこれを跳ね返すことを意味する。
【０１５７】
本明細書で使用する場合、用語「組成物」とは、１つまたは複数の本発明の化合物を含む実体、および１つまたは複数の本発明の化合物と他の成分との組合せ物に直接または間接的に由来する任意の実体を意味する。本発明の組成物は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの研究試薬として使用することができる。本発明の組成物はまた、美容効果または医薬品効果のために、ヒトまたは非ヒト対象の皮膚に直接施用することもできる。さらに、本発明の組成物は、表１または図３に列挙される化合物の１つまたは複数、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含む。
【０１５８】
本発明の組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの用途の両方のため：経口服用あるいは非経口投与、または腹腔内、皮下、局所、皮内、吸入、肺内、直腸、膣内、舌下、筋肉内、静脈内、動脈内、鞘内もしくはリンパ内などの任意の適切な方法での他の投与のために、任意の所望の有効な方法で投与されてもよい。さらに、本発明の組成物は、他の組成物と連携して投与されてもよい。本発明の組成物は、カプセル封入されていてもよく、または他には、所望の場合、胃もしくは他の分泌物から保護されてもよい。
【０１５９】
本発明の組成物は、１種または複数の化粧品としてまたは薬学的に許容される担体、ならびに必要に応じて、１つまたは複数の他の化合物、成分および／または物質と混合した、１種または複数の活性成分を含む。選択される投与経路にかかわらず、本発明の化合物および組成物は、当業者に公知の従来の方法によって、化粧品としてまたは薬学的に許容される剤形に製剤化される。
【０１６０】
化粧品としてまたは薬学的に許容されるビヒクル、希釈剤および担体は、当分野で周知であり、過度の毒性、不適合性、不安定性、刺激、アレルギー反応などなしに、ヒトおよび非ヒトの組織に接触させるのに好適な物質を含む。化粧品としてまたは薬学的に許容されるビヒクル、希釈剤および担体は、例えば、化粧品または医薬品の局所、経口、腹腔または皮下投与に慣用的に使用可能な任意の実質的に非毒性の物質を含み、本発明の化合物および組成物は、ヒトまたは非ヒト対象に施用されても、服用されても、注射されても、またはそれ以外の方法で投与されても、安定で生体利用可能なままである。局所施用に好適な化粧品としてまたは薬学的に許容される担体は当業者に公知であり、慣用的な化粧用ナイトクリーム、ファンデーションクリーム、日焼けローション、日焼け防止剤、ハンドローション、メーキャップおよびメーキャップ基剤、マスクなどの化粧品としてまたは薬学的に許容される液体、クリーム、オイル、ローション、軟膏、ジェルまたは固体を含む。選択される剤形および意図される投与経路に好適な担体は、当分野で周知であり、選択された剤形および投与方法に許容される担体は、当分野における通常の技量を使用して決定することができる。
【０１６１】
本発明の組成物は、芳香剤、エストロゲン、ビタミンＡ、ＣおよびＥ、ピルビン酸、乳酸またはグリコール酸などのアルファ−ヒドロキシ酸またはアルファ−ケト酸、ラノリン、ワセリン、アロエ、メチルパラベンまたはプロピルパラベン、顔料などを含めた、化粧品において慣用的な他の成分を含有することができる。本発明の非限定的な化粧品としてまたは薬学的に許容されるビヒクル、希釈剤および担体には、糖（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールおよびソルビトール）、デンプン、セルロース調製物、リン酸カルシウム（例えば、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウムおよびリン酸水素カルシウム）、クエン酸ナトリウム、水、水溶液（例えば、生理食塩水、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、乳酸リンゲル注射液）、アルコール（例えば、エチルアルコール、プロピルアルコールおよびベンジルアルコール）、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール）、有機エステル（例えば、オレイン酸エチルおよびトリグリセリド）、生分解性ポリマー（例えば、ポリラクチド−ポリグリコリド、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物））、エラストマーマトリックス、リポソーム、マイクロスフィア、オイル（例えば、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ、ゴマ、綿実およびラッカセイ）、カカオ脂、ワックス（例えば、坐剤用ワックス）、パラフィン、シリコーン、タルク、サリチレート（ｓｉｌｉｃｙｌａｔｅ）などが含まれる。
【０１６２】
本発明の組成物は、化粧用組成物に一般に使用される、追加的な成分および／または物質を必要に応じて含有してもよい。これらの成分および物質は、当分野で周知であり、例えば、（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸などの充填剤または増量剤、（２）カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースおよびアカシアなどの結合剤、（３）グリセロールなどの保湿剤、（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のシリケート、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、（５）パラフィンなどの溶解遅延剤、（６）第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、（７）セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤、（８）カオリンおよびベントナイトクレイなどの吸収剤、（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコールおよびラウリル硫酸ナトリウムなどの滑沢剤、（１０）エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、マイクロクリスタリンセルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカントなどの懸濁化剤、（１１）緩衝化剤、（１２）ラクトース、乳糖、ポリエチレングリコール、動物性および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、カカオ脂、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、サリチレート、酸化亜鉛、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、ならびにポリアミド粉末などの賦形剤、（１３）水または他の溶媒などの不活性希釈剤、（１４）防腐剤、（１５）界面活性剤、（１６）分散剤、（１７）ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、生分解性ポリマー、リポソーム、マイクロスフェア、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンおよびワックスなどの制御放出剤または吸収遅延剤、（１８）乳白剤、（１９）アジュバント、（２０）湿潤剤、（２１）乳化剤および懸濁化剤、（２２）エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルなどの可溶化剤および乳化剤、（２３）クロロフルオロ炭化水素および揮発性無置換炭化水素（ブタンおよびプロパンなど）などの噴射剤、（２４）酸化防止剤、（２５）糖および塩化ナトリウムなどの、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張性にする作用剤、（２６）増粘剤、（２７）レシチンなどのコーティング材料、ならびに（２８）甘味剤、着香剤、着色剤、香料および防腐剤を含む。このような成分または物質はそれぞれ、製剤の他の成分と適合可能である、および対象に有害でないという意味において、「許容される」ものでなければならない。選択される剤形および意図される投与経路に好適な成分および物質は、当分野で周知であり、選択された剤形および投与方法に許容される成分および物質は、当分野における通常の技量を使用して決定することができる。
【０１６３】
経口投与に好適な本発明の組成物は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、散剤、顆粒剤、溶液剤、または水性もしくは非水性液体中の懸濁液剤、水中油型もしくは油中水型液体エマルション剤、エリキシル剤もしくはシロップ剤、香錠、ボーラス剤、舐剤またはペースト剤の形態とすることができる。これらの製剤は、当分野において公知の方法によって、例えば、慣用的なパンコーティング、混合、造粒または凍結乾燥法によって調製することができる。
【０１６４】
経口投与用の固形剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤など）は、例えば、活性成分を、１種または複数の化粧品としてまたは薬学的に許容される担体、ならびに必要に応じて１種または複数の充填剤、増量剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、溶解遅延剤、吸収促進剤、湿潤剤、吸収剤、滑沢剤および／または着色剤と混合することによって調製することができる。同様のタイプの固形組成物は、好適な賦形剤を使用して、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として使用されてもよい。錠剤は、必要に応じて１種または複数の副成分と共に、圧縮または成型することによって作製されてもよい。圧縮錠剤は、好適な結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤、界面活性剤または分散剤を使用して調製されてもよい。成型錠剤は、好適な機械で成型することによって作製されてもよい。錠剤、ならびにカプセル剤、丸剤および顆粒剤などの他の固形剤形は、必要に応じて、刻み目が入れられるか、または腸溶コーティングおよび化粧品配合分野で周知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルと共に調製されてもよい。それらはまた、その中の活性成分の持続または制御放出を実現するよう製剤化されてもよい。それらは、例えば、細菌保持フィルターを通すろ過によって滅菌されてもよい。これらの組成物はまた、乳白剤を必要に応じて含有してもよく、胃腸管のある特定の部分において、必要に応じて、遅延様式で、活性成分だけを、または活性成分を優先的に放出するような組成であってもよい。活性成分はまた、マイクロカプセル封入形態にあることもできる。
【０１６５】
経口投与向けの液状剤形には、化粧品としてまたは薬学的に許容されるエマルション剤、マイクロエマルション剤、溶液剤、懸濁液剤、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。液状剤形は、当分野において一般に使用される好適な不活性希釈剤を含有してもよい。不活性希釈剤の他に、本経口組成物はまた、湿潤剤、乳化および懸濁化剤、甘味剤、着香剤、着色剤、香料および防腐剤などのアジュバントを含んでもよい。懸濁液剤は、懸濁化剤を含んでもよい。
【０１６６】
直腸または膣内投与向けの本発明の組成物は、坐剤として提供されてもよく、坐剤は、１つまたは複数の活性成分と、１種または複数の好適な非刺激性担体とを混合することにより調製することができ、この担体は、室温では固体であるが、体温では液体であり、したがって、直腸または膣腔中で融解して、活性化合物を放出する。膣内投与に好適な本発明の組成物は、当分野で適切であることが公知のこのような化粧品としてまたは薬学的に許容される担体を含有する、ペッサリー剤、タンポン剤、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、フォーム剤またはスプレー製剤も含む。
【０１６７】
局所または経皮投与向け剤形には、散剤、噴霧剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、溶液剤、パッチ剤、点剤、エマルション剤、懸濁液剤、エアゾール剤および吸入剤が含まれる。所望の任意の慣用的なビヒクル、助剤、および必要に応じてさらなる活性成分が、製剤に添加されてもよい。
【０１６８】
好ましい助剤は、防腐剤、酸化防止剤、安定剤、可溶化剤、ビタミン、着色剤、臭気改善剤、フィルム形成剤、増粘剤および保湿剤を含む群に由来する。
【０１６９】
溶液剤およびエマルション剤は、溶媒、可溶化剤および乳化剤などの慣用的なビヒクル、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコール、油、特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油、グリセロール脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、ならびにソルビタンの脂肪酸エステル、またはこれらの物質の混合物を含むことができる。
【０１７０】
エマルション剤は、様々な形態で存在してもよい。したがって、それらは、例えば、油中水（Ｗ／Ｏ）型もしくは水中油（Ｏ／Ｗ）型、または多重エマルション、例えば水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型のエマルション剤またはマイクロエマルション剤とすることができる。
【０１７１】
本発明による組成物はまた、乳化剤を含まない、分散調製物の形態であってもよい。それらは、例えば、水分散体またはピッカリングエマルションとすることができる。
【０１７２】
懸濁液剤は、液体希釈剤、例えば、水、エタノールまたはプロピレングリコール、懸濁媒体、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステル、マイクロクリスタリンセルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、またはこれらの物質の混合物などの慣用的なビヒクルを含んでもよい。
【０１７３】
ペースト剤、軟膏剤、ゲル剤およびクリーム剤は、慣用的なビヒクル、例えば、動物性および植物性脂肪、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはこれらの物質の混合物を含んでもよい。
【０１７４】
フェイスオイルおよびボディオイルは、合成油（脂肪酸エステル、脂肪アルコール、シリコーン油など）、天然油（植物油および油性植物エキス、パラフィン油、ラノリン油など）、またはこれらの物質の混合物などの慣用的なビヒクルを含んでもよい。
【０１７５】
噴霧剤は、慣用的な噴射剤、例えば、クロロフルオロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルを含んでもよい。
【０１７６】
非経口投与に好適な本発明の組成物は、１種または複数の化粧品としてまたは薬学的に許容される滅菌等張性水溶液または非水溶液、分散液、懸濁液もしくはエマルション、または使用直前に滅菌注射用溶液もしくは分散液に復元することができる滅菌粉末と組み合わせた１つまたは複数の化合物を含み、これらは、好適な酸化防止剤、緩衝化剤、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質、または懸濁化剤もしくは増粘剤を含有してもよい。適切な流動性は、例えば、コーティング材料の使用により、分散液の場合、必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。これらの組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの好適なアジュバントを含有してもよい。等張剤を含むことも望ましいことがある。さらに、吸収を遅延させる作用剤を含ませることにより、注射用化粧品形態の長期吸収をもたらすことができる。
【０１７７】
一部の場合、効果を延長するため、皮下または筋肉内注射からのその吸収を減速させるのが望ましい。これは、水難溶性を有する、結晶性またはアモルファス物質の液体懸濁液の使用により達成することができる。
【０１７８】
次に、活性剤／薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、ひいては結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。代替的に、活性組成物を油性ビヒクルに溶解するまたは懸濁させることにより、非経口投与される組成物の遅延吸収を達成することができる。注射可能なデポ剤形態は、生分解性ポリマー中に活性成分のマイクロカプセルマトリックスを形成することにより作製することができる。活性成分のポリマーに対する比、および使用される特定のポリマーの性質に応じて、活性成分の放出速度を制御することができる。注射可能なデポ製剤はまた、身体組織と適合可能なリポソームまたはマイクロエマルション中に薬物を捕捉することにより調製される。注射可能な物質は、例えば、細菌保持フィルターに通すろ過によって滅菌することができる。
【０１７９】
本発明の組成物は、単位用量または多回用量用封止容器、例えば、アンプルおよびバイアルで提供されてもよく、使用直前に、滅菌液体担体、例えば注射用の水を添加することだけを必要とする凍結乾燥状態で保管することができる。即時使用注射溶液剤および懸濁液剤は、上記のタイプの滅菌散剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。
【０１８０】
本発明では、用語「結晶形態」は、化合物の結晶構造を意味する。化合物は、１つまたは複数の結晶形態で存在してもよく、それらは、異なる構造的、物理的、薬理学的または化学的特性を有することがある。核生成、成長速度、凝集および破壊の差を使用して、異なる結晶形態を得ることができる。核生成は、相転移エネルギー障壁が克服されたときに生じ、それによって粒子は過飽和溶液から形成させることが可能となる。結晶成長は、結晶の既存の表面上に化学化合物が堆積することによって生じる結晶粒子の拡大である。核生成および成長の相対速度により、形成される結晶のサイズ分布が決まる。核生成および成長のどちらの熱力学的推進力も過飽和であり、これは熱力学的平衡からの逸脱として定義される。凝集とは、２つまたはそれより多い粒子（例えば、結晶）が互いに付着し合って、より大きな結晶構造を形成することによって、より大きな粒子を形成することである。
【０１８１】
「水和物」という用語は、本明細書で使用する場合、分子複合体中に水を含有する固体または半固体形態の化学化合物を意味する。水は、一般に、化学化合物に対して化学量論量にある。
【０１８２】
本明細書で使用する場合、「化粧品としてまたは薬学的に許容される塩」は、化合物が、その酸塩または塩基塩を作製することにより修飾される、本明細書において開示されている化合物の誘導体を指す。化粧品としてまたは薬学的に許容される塩の例は、以下に限定されないが、アミンなどの塩基性残基の無機酸塩または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などを含む。例えば、このような塩には、アンモニア、Ｌ−アルギニン、ベタイン、ベネタミン、ベンザチン、水酸化カルシウム、コリン、デアノール、ジエタノールアミン（２，２’−イミノビス（エタノール））、ジエチルアミン、２−（ジエチルアミノ）−エタノール、２−アミノエタノール、エチレンジアミン、Ｎ−エチル−グルカミン、ヒドラバミン、１Ｈ−イミダゾール、リジン、水酸化マグネシウム、４−（２−ヒドロキシエチル）−モルホリン、ピペラジン、水酸化カリウム、１−（２−ヒドロキシ−エチル）−ピロリジン、水酸化ナトリウム、トリエタノールアミン（２，２’，２”−ニトリロトリス（エタノール））、トロメタミン、水酸化亜鉛、酢酸、２．２−ジクロロ−酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、Ｌ−アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、４−アセトアミド−安息香酸、（＋）−ショウノウ酸、（＋）−カンファ−１０−スルホン酸、炭酸、桂皮酸、クエン酸、シクラミン酸、デカン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−二スルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸、エチレンジアミノ四酢酸、ギ酸、フマル酸、粘液酸（ｇａｌａｃａｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ゲンチシン酸、Ｄ−グルコヘプトン酸、Ｄ−グルコン酸、Ｄ−グルクロン酸、グルタミン酸、グルタンチン酸（ｇｌｕｔａｎｔｉｃ  ａｃｉｄ）、グルタル酸、２−オキソ−グルタル酸、グリセロ−リン酸、グリシン、グリコール酸、ヘキサン酸、馬尿酸、臭化水素酸、塩酸、イソ酪酸、ＤＬ−乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、リジン、マレイン酸、（−）−Ｌ−リンゴ酸、マロン酸、ＤＬ−マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタレン−１，５−二スルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、硝酸、オクタン酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸（エンボン酸）、リン酸、プロピオン酸、（−）−Ｌ−ピログルタミン酸、サリチル酸、４−アミノ−サリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、タンニン酸、（＋）−Ｌ−酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸およびウンデシレン酸からの塩が含まれる。さらなる化粧品としてまたは薬学的に許容される塩は、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛などのような金属からの陽イオンと共に形成することができる。
【０１８３】
本発明の化粧品としてまたは薬学的に許容される塩は、慣用的な化学的方法により、塩基性または酸性部分を含有する、本明細書において開示されている化合物から合成することができる。一般に、このような塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基の形態のものを、水中、あるいはエーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールもしくはアセトニトリル、またはそれらの混合物のような有機希釈剤中で、十分量の適切な塩基または酸と反応させることにより調製することができる。
【０１８４】
本発明の化合物および組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの用途の両方のための、化粧用または医薬組成物に含まれ得ることが構想される。
【０１８５】
表１または図３に列挙される１つもしくは複数の化合物を含めた、本発明の化合物および組成物、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩は、対象に共投与されて、本発明の皮膚の色素沈着をモジュレートする目的を実現することが可能であることが構想される。
【０１８６】
本発明の組成物は、表１または図３に列挙される１つまたは複数の化合物、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含むことができることも構想される。例えば、本発明の組成物は、インジルビンまたはその化学アナログをマラセジンまたはその化学アナログと組み合わせて含んでもよい。
【０１８７】
さらに、本発明の化合物は、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａによって産生される化合物、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含むことが構想される。さらに、本発明の組成物および方法は、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａによって産生される１つまたは複数の化合物、またはその化学アナログ、結晶形態、水和物、もしくは薬学的にもしくは化粧品として許容される塩を含み得ることが構想される。例えば、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａによって産生される、またはこれに由来する化合物は、以下に限定されないが、図３に示されている化合物を含む。
【０１８８】
本発明の方法は、本発明の２つまたはそれより多い化合物、および／または組成物を共投与して、本明細書に記載されている皮膚の色素沈着をモジュレートする目的を実現するステップを含むことができることがさらに構想される。
【０１８９】
本発明の共投与される化合物および組成物は、例えば、実質的に同時に、または逐次に、対象に接触させてもよい。
【０１９０】
１つまたは複数のＭａｌａｓｓｅｚｉａ由来の化合物またはその化学アナログを含有する本発明の組成物は、以下に限定されないが、平均組織生存率、メラニン濃度、皮膚の美白、皮膚の暗色化、メラノサイトアポトーシスの誘導、および芳香族炭化水素（ＡｈＲ）活性、メラニン形成またはメラニン濃度のモジュレートを含めた、様々な有効性基準に対して、構成成分化合物単独よりも相乗効果を実証することがある。
【０１９１】
本明細書において使用される技術用語は、特定の実施形態を説明するために過ぎず、限定することを意図するものでない。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が特に明白に指示しない限り、複数の指示物を含む。
【０１９２】
本明細書における数値範囲の列挙に関すると、同じ精度のそれらの間の介在数値の各々は、明確に企図される。例えば、６〜９という範囲の場合、６および９に加えて７および８の数値が企図され、６．０〜７．０の範囲の場合、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９および７．０の数値が明確に企図されている。
【０１９３】
以下の実施例は、本発明の方法をさらに例示するために提示されている。これらの実施例は、単なる例示に過ぎず、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１９４】
（実施例１）
化合物名称
以下の表１は、本発明の化合物の構造および名称を示す。
表１
【表１−１】
2021535123.tif 000006
【表１−２】
2021535123.tif 000007
【表１−３】
2021535123.tif 000008
【表１−４】
2021535123.tif 000009
【表１−５】
2021535123.tif 000010
【表１−６】
2021535123.tif 000011
【表１−７】
2021535123.tif 000012
【表１−８】
2021535123.tif 000013
（実施例２）
インジルビンおよびインジルビン誘導体のアポトーシス誘導活性
試薬
【０１９５】
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８アネキシンＶ／死細胞アポトーシスキット、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（１×）、カスパーゼ−Ｇｌｏ３／７アッセイ、ＲＰＭＩ１６４０培地、ダルベッコの改変イーグル培地および抗生物質抗真菌剤溶液（１００×）。
【０１９６】
細胞系ＭｅＷｏ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−６５（商標））、ＷＭ１１５（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１６７５）およびＢ１６Ｆ１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−６３２３）は、以下の培養培地：ＭｅＷｏおよびＢ１６Ｆ１用の培養培地：１０％ＦＢＳを補給したＤＭＥＭ；ＷＭ１１５用の培養培地：１０％ＦＢＳを補給したＲＰＭＩ１６４０に維持する。
実験方法
【０１９７】
細胞を収穫し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓセルカウンターを使用して細胞数を決定する。所望の密度まで細胞を培養培地で希釈する。最終的な細胞密度は、例えば、６時間および２４時間の処置の場合、４，０００細胞／ウェルであり、４８時間および７２時間の処置の場合、２，０００細胞／ウェルとすることができる。アネキシンＶアッセイの場合、３８４ウェルクリアボトムプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３７１２）を使用する一方、カスパーゼ−Ｇｌｏアッセイの場合、３８４ウェルソリッドホワイトボトムプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３５７０）を使用する。プレートはすべて、蓋で覆い、細胞を付着させるため、３７℃および５％ＣＯ２で、一晩、置く。
【０１９８】
試験化合物をＤＭＳＯに溶解し、３０ｍＭの保存溶液にする。１０倍希釈を行い、３ｍＭおよび０．３ｍＭ濃度を生成する。０．９ｍＭのスタウロスポリンを陽性対照として使用し、ＤＭＳＯを陰性対照（ＮＣ）として使用する。液体ハンドラーＥｃｈｏ５５０を使用して、１３２．５ｎＬの化合物を化合物源プレートから３８４ウェル細胞培養プレートに移す。表示されているインキュベート時間の後、検出のためにプレートをインキュベータから取り出す。
【０１９９】
アネキシンＶアッセイのため、プレートをインキュベータから取り出し、培養培地を除去する。細胞を４０ｕＬのＰＢＳにより２回、洗浄し、ウェルあたり、１５ｕＬの事前混合アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２色素作業溶液を加える。プレートを室温で２０分間、インキュベートし、封止して、１，０００ｒｐｍで１分間、遠心分離し、気泡を除去する。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｎａｎｏを使用してプレートを読み取る。
【０２００】
カスパーゼ−Ｇｌｏアッセイのため、プレートをインキュベータから取り出し、室温で１５分間、平衡にする。カスパーゼ−Ｇｌｏ３／７試薬もまた、実験前に解凍して、室温に平衡にする。カスパーゼ−Ｇｌｏ試薬は、培養培地に対して、１：１の比で必要なウェルに加える。プレートを室温で１５分間、インキュベートし、ＥｎＳｐｉｒｅ（商標）プレートリーダーを使用して読み取る。誘導倍率を以下の式に従って計算する：誘導倍率＝発光量Ｓａｍｐｌｅ／発光量ＮＣ
アネキシンＶアッセイおよびカスパーゼ３／７アッセイの結果
【０２０１】
インジルビンおよびその化学アナログを含めた、本発明の化合物および組成物は、細胞死を誘導することが予想される。インジルビンの化学アナログは、インジルビンと比べて、例えば、より強力なアポトーシス誘導活性を示すことが予想される。同様に、インジルビンのある特定の化学アナログは、インジルビンと比べて、例えば、それほど有効なアポトーシス誘導活性を実証しないことが予想される。このような化合物は、より効力の高い化合物と比較して、より有利な毒性プロファイルを有することができる。
（実施例３）
インジルビンおよびインジルビン誘導体への曝露後の細胞生存率
試薬
【０２０２】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）２．０アッセイ。
実験方法
【０２０３】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイに関すると、試験化合物を１０ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液中で調製する。化合物を１２種の濃度まで段階的に希釈する。１００，０００細胞／ｍＬの懸濁液からの細胞４０ｕＬを３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３５７０）の各ウェルに分注する。プレートを３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度で一晩、インキュベートする。試験化合物をビヒクル対照としてのＤＭＳＯと共に加える。プレートを３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度で、６、２４または４８時間、インキュベートし、ウェルに４０ｕＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を加え、細胞生存率を評価する。
結果
【０２０４】
インジルビンおよびその化学アナログを含めた、本発明の化合物および組成物は、細胞死を誘導することが予想される。インジルビンの化学アナログは、インジルビンと比べて、例えば、より強力なアポトーシス誘導活性を示すことが予想される。同様に、インジルビンのある特定の化学アナログは、インジルビンと比べて、例えば、それほど有効なアポトーシス誘導活性を実証しないことが予想される。このような化合物は、より効力の高い化合物と比較して、より有利な毒性プロファイルを有することができる。
（実施例４）
インジルビンおよびインジルビン誘導体の芳香族炭化水素受容体活性化能
アッセイ手順
【０２０５】
安定にトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞用の培養培地は、ＤＭＥＭに高グルコースおよびＬ−グルタミン、ならびに１０％ＦＢＳを補給することによって調製する。
【０２０６】
ＨｅｐＧ２−ＡｈＲ−Ｌｕｃ細胞を、Ｔ−７５フラスコ内で、３７℃、５％ＣＯ２および９５％の相対湿度で培養する。細胞を８０〜９０％のコンフルエンスに到達させた後、剥離および分割する。
【０２０７】
培養細胞は、５ｍＬのＰＢＳですすぐ。ＰＢＳを吸引除去し、１．５ｍＬのトリプシンをフラスコに加え、３７℃で約５分間、または細胞が剥離して浮き上がるまで、細胞をインキュベートする。過剰な血清含有培地を添加することによって、トリプシンを不活性化させる。
【０２０８】
細胞懸濁液を円錐管に移し、１２０ｇで１０分間、遠心分離して、細胞をペレットにする。細胞を適度な密度で播種培地中に再懸濁させる。４０μＬの細胞を３８４ウェル培養プレートに移す（５×１０３細胞／ウェル）。プレートを３７℃で２４時間、インキュベータ中に置く。
【０２０９】
その後、試験化合物の保存溶液およびオメプラゾール陽性対照を調製する。Ｅｃｈｏ５５０を使用し、化合物溶液をアッセイプレートに移す。次に、このプレートを化合物処置のためにインキュベータ内に戻す。
【０２１０】
後に、２４時間の処置後に、プレートをインキュベータから取り出し、周囲温度で冷却する。培養培地のものと等量のＯｎｅ−Ｇｌｏ試薬３０μＬを各ウェルに加える。細胞を少なくとも３分間、溶解し、次に照度計で測定する。
【０２１１】
ＸＬｆｉｔの非線形回帰解析を使用して用量応答をグラフにし、ＥＣ５０値も計算する。
結果
【０２１２】
インジルビンおよびその化学アナログを含めた、本発明の化合物および組成物は、ＡｈＲ活性をモジュレートすることが予想される。インジルビンの化学アナログは、インジルビンと比べて、例えば、より強力なＡｈＲアゴニスト活性を示すことが予想される。同様に、インジルビンのある特定の化学アナログは、インジルビンと比べて、例えば、それほど有効なＡｈＲアゴニスト活性を実証しないことが予想される。
（実施例５）
ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）アッセイ
【０２１３】
この検討の目的は、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）皮膚モデルにおける、試験物品の反復曝露後の皮膚メラニン形成モジュレーターとしての試験物品の潜在作用を評価することであった。第２に、この検討の目的は、反復曝露後のＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）皮膚モデルに対する試験物品の潜在的な皮膚刺激を評価することであった。毒性は、試験物品処置組織におけるＭＴＴ（臭化３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウム）の、陰性／溶媒対照処置組織と比較した相対変換率を測定することによって決定した。メラニン産生に及ぼす潜在的な影響は、陰性／溶媒対照処置組織と比較して、試験物品処置組織によって産生されたメラニンの濃度を測定することにより決定した。
試験物質およびアッセイ対照の特定
表２  希釈形態で試験した試験物品
【表２】
2021535123.tif 000014
表３  組合せ物として試験した試験物品
【表３−１】
2021535123.tif 000015
【表３−２】
2021535123.tif 000016
【０２１４】
アッセイ対照には、ＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ中で調製した、陽性対照−１％コウジ酸；陰性対照−滅菌脱イオン水；および溶媒対照−ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）が含まれる。
【０２１５】
この検討に関すると、陰性対照を使用しなかった。代わりに、溶媒対照（１７ＡＡ７０）を使用して、それぞれ、陽性対照処置組織および試験物品処置組織に関連するデータを補正した。
【０２１６】
さらに、試験物品および対照は、４つの組織の群に施用し、それぞれ、このうちの２つは、組織生存率（ＭＴＴ）エンドポイントに使用し、２つは、メラニンのエンドポイントに使用した。
試験システム
【０２１７】
ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ）によって提供されているＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）皮膚モデルを本検討に使用した。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）の組織は、高度に分化した複数層のヒト表皮モデルを形成するように培養された、正常なヒト由来表皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）およびメラノサイト（ＮＨＭ）からなる。共培養物中のＮＨＭは、自発的なメラニン形成を受けて、様々なレベルの色素沈着の組織をもたらす。培養物は、細胞培養インサート上の気液界面で増殖させて、皮膚モジュレーターを局所施用することが可能となった。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）モデルは、ｉｎ  ｖｉｖｏに似た形態学的特性および微細構造特性を示す。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織の基底細胞層に局在するＮＨＭは樹状であり、自発的にメラニン顆粒を産生し、それは、次第に組織の層を占めていく。したがって、この試験システムは、陰性対照と比較して、メラニン産生を阻害または刺激し得る物質をスクリーニングするために使用する。
実験設計および方法
【０２１８】
本検討の実験設計は、可能な場合、無希釈の試験物品（および／または必要に応じて投与用溶液）のｐＨの決定、ならびに反復曝露後の相対的な組織生存率およびＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）皮膚モデルに対する皮膚メラニン形成モジュレーターとしての試験物品の潜在作用を決定するための決定的アッセイからなった。試験物品は、合計で７日間、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）皮膚モデルに曝露させた。４８時間（前回の処置から４８＋２時間の時間枠内）毎に試験物品をＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）皮膚モデルに局所施用した。試験物品の毒性は、対照および試験物品処置組織におけるＭＴＴのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性ミクロソーム酵素還元によって（および、比較的低い程度のＭＴＴのコハク酸デヒドロゲナーゼ還元によって）決定した。データは、相対生存率の形態（陰性／溶媒対照と比較したＭＴＴ変換率）で提示した。メラニン産生に及ぼす潜在的な影響は、陰性／溶媒対照処置組織と比較して、試験物品処置組織において産生されたメラニンの濃度を決定することにより評価した。データは、メラニン標準品曲線を使用して決定した試験物品処置組織によって産生されるメラニンの濃度の形態で提示した。代替的に、データは、陰性／溶媒対照処置組織に対するメラニン濃度の変化率として提示されてもよい。
【０２１９】
使用した方法は、ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって提供されている手順を修正したものである。
培地および試薬
【０２２０】
ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）維持培地（ＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ）は、ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）皮膚モデル（ＭＥＬ−３００−Ａ）は、ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。１％コウジ酸（滅菌脱イオン水中で調製）は、Ｓｉｇｍａから購入した。ＭＴＴ（臭化３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウム）は、Ｓｉｇｍａから購入した。２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＭＴＴ添加培地）は、Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。抽出溶媒（イソプロパノール）は、Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まない滅菌ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＣＭＦ−ＤＰＢＳ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。メラニンはＳｉｇｍａから購入した。滅菌脱イオン水は、Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。可溶物は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒから購入した。
試験物品の調製および送達
【０２２１】
このプロトコール内で別段の指定がない限り、２５マイクロリットルの各試験物品を、組織に直接、上側表面を覆うように施用した。試験物品の性質（液体、ゲル、クリーム、フォームなど）に応じて、試験物品を組織の表面上に一様に広げることができる投与装置、メッシュまたは他の補助具の使用が必要となることがあった。
投与経路
【０２２２】
７日間の試験の間、４８時間（前回の処置から４８＋２時間の時間枠内）毎に試験物品をＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織に局所施用した。２５マイクロリットルの各試験物品を各組織に施用した。２５マイクロリットルの陽性および陰性／溶媒対照をそれぞれ各組織に施用した。
ｐＨ決定
【０２２３】
可能な場合、無希釈液体試験物品（および／または、適切な場合、投与用溶液）のｐＨを決定した。ｐＨは、ｐＨ試験紙（例えば、推定する０〜１４のｐＨ範囲を有するもの、および／またはより正確な値を決定する５〜１０のｐＨ範囲を有するもの）を使用して決定した。範囲が狭い方のｐＨ試験紙の典型的なｐＨ増分は、約０．３〜０．５ｐＨの単位とした。ｐＨ試験紙に対する最大増分は１．０ｐＨの単位とした。
対照
【０２２４】
決定的なアッセイは、陰性対照、陽性対照および１つの溶媒対照（ＤＭＳＯ）を含んだ。アッセイの陰性対照に指定したＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を、２５μＬの滅菌脱イオン水で処置した。アッセイ陽性対照に指定した組織への投与には、２５マイクロリットルの１％コウジ酸（滅菌脱イオン水中に調製し、調製時にろ過した）を使用した。１％コウジ酸は、調製の２時間以内に使用するまで、アルミニウムホイルで覆った管中に保管した。陰性／溶媒および陽性対照の曝露時間は、試験物品に対して使用した時間と同じとした。未処置組織も、対照として使用した。
試験物品によるＭＴＴの直接還元の評価
【０２２５】
各試験物品が、ＭＴＴを直接還元する能力を評価することが必要であった。ＭＴＴ溶液１．０ｍｇ／ｍＬを、ＭＴＴ添加培地中で調製した。約２５μＬの試験物品をＭＴＴ溶液１ｍＬに加え、この混合物を暗所中３７±１℃で１〜３時間、インキュベートした。陰性対照である滅菌脱イオン水２５μＬを、同時に試験した。ＭＴＴ溶液の色が青色／紫色に変わった場合、試験物品はＭＴＴを還元したと推定した。水不溶性試験物質は、試験物品と培地との界面でのみ、直接的な還元（暗色化）を示すことができた。
ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）の受領
【０２２６】
ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）皮膚キットの受領時、製造業者によって指示されている通りに溶液を保管した。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を使用するまで、２〜８℃で保管した。
【０２２７】
受領した日（投与の前日）に、適切な体積のＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）維持培地（ＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ）を除去し、約３７±１℃に温めた。ＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ／ウェルの９／１０（０．９）ｍＬを、６ウェルプレートの適正なウェルに等分した。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織をそれぞれ、封止パッケージを開口する前に、アガロースゲルと細胞培養インサートとの間の気泡について検査した。細胞培養インサート領域の５０％より広い気泡を有する組織は使用しなかった。２４ウェルの輸送用容器をプラスチック製バッグから取り出し、その表面を７０％エタノールで消毒した。適切な数のＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を、２４ウェルの輸送用容器から６ウェルプレートに無菌で移した。組織を順応させるため、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を、空気中５±１％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７±１℃（標準培養条件）で一晩（少なくとも１６時間）、インキュベートした。バッグの開口時に、組織の移送時に輸送用寒天に残るいかなる未使用組織も、５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気で短時間で脱気し、バッグを封止して、後の使用のため、２〜８℃に保管した。
決定的なアッセイ
【０２２８】
組織曝露：培養の開始後、少なくとも１６時間時に、デジタルカメラを使用して５つのＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織（０日目での未処置と見なす）の写真を撮り、アッセイのゼロ時間での組織の色素沈着の程度の目視評価の一助とした。２つのＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織をＣＭＦ−ＤＰＢＳによりすすぎ、滅菌吸収紙上で水分を吸い取って乾燥させ、過剰な液体を除去した。すすぎ後、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を適正なＭＴＴ含有ウェルに移し、ＭＴＴアッセイにおいて処理した。３つのＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織をＣＭＦ−ＤＰＢＳによりすすぎ、滅菌吸収紙上で水分を吸い取って乾燥させ、過剰な液体を除去した。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を、滅菌外科用メスを使用して細胞培養インサートから取り除き、ラベルを付けた１．５ｍＬマイクロフュージ管に入れて、後のメラニン分析のために、＜−６０℃で保管した。
【０２２９】
培養の開始後、少なくとも１６時間時に、事前加温した新たなＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ  ０．９ｍＬ／ウェルを含有する新しい６ウェルプレート上に組織の残部を移した。試験は７日間の時間枠にわたり行った。５つの組織を、初日および４８時間（前回の処置から４８＋２時間の時間枠内）毎に、２５μＬの各試験物品で局所的に処置した。培地は毎日（前回の再供給から２４＋２時間の時間枠内）新しくした。組織を、事前加温した新たなＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ  ０．９ｍＬ／ウェルを含有する新しい６ウェルプレートに移した。
【０２３０】
５つの組織を、初日および４８時間（前回の処置から４８＋２時間の時間枠内）毎に、それぞれ、２５μＬの陽性および陰性／溶媒対照で局所的に処置した。培地は毎日（前回の再供給から２４＋２時間の時間枠内）新しくした。組織を、事前加温した新たなＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ  ０．９ｍＬ／ウェルを含有する新しい６ウェルプレートに移した。組織を、空気中５±１％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７±１℃（標準培養条件）で適正な曝露時間、インキュベートした。
【０２３１】
投与日に、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を、最初に１回のすすぎあたりＣＭＦ−ＤＰＢＳ約５００μＬを使用して３回、やさしくすすぎ、いずれの残留試験物品も除去した。ＣＭＦ−ＤＰＢＳは、やさしいピペット操作でウェルに入れて、次に、滅菌アスピレーターを用いて抜き取った。この組織を、事前加温した新たなＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ  ０．９ｍＬを含有する新しい６ウェルプレートに移し、適正な試験物品、陰性／溶媒または陽性対照を投与した。組織を、空気中５±１％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７±１℃（標準培養条件）で適正な曝露時間、インキュベートした。
【０２３２】
７日間の試験の終了時に、デジタルカメラを使用して陰性／溶媒または陽性対照、および各試験物品により処置したＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織の写真を撮り、アッセイ終了時（７日目）の組織の色素沈着の程度の目視評価の一助とした。次に、陽性および陰性対照によりそれぞれ処置した、および各試験物品により処置した２つの組織の生存率を、ＭＴＴ還元によって決定した。７日間の試験の終了時に、それぞれ、各試験物品、陽性および陰性／溶媒対照により処置した３つの組織により産生したメラニンを決定した。
【０２３３】
ＭＴＴアッセイ：ＰＢＳ中で調製したＭＴＴの１０×保存溶液（回分調製時にろ過したもの）を、使用前２時間以内に解凍し、温かいＭＴＴ添加培地で希釈して、１．０ｍｇ／ｍＬの溶液を生成した。予めラベルを付けた２４ウェルプレートの各指定ウェルにＭＴＴ溶液３００μＬを添加した。
【０２３４】
曝露時間後に、ＭＴＴアッセイ用に指定した各ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織をＣＭＦ−ＤＰＢＳですすぎ（このステップの許容されるスプレーボトルを使用）、滅菌吸収紙上で水分を吸い取って乾燥させ、過剰な液体を除去した。すすぎ後、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を適正なＭＴＴ含有ウェルに移した。２４ウェルプレートを、標準条件で３±０．１時間、インキュベートした。
【０２３５】
３±０．１時間後、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を、滅菌吸収紙上で水分を吸い取り、過剰な液体を除去し、各指定ウェルにイソプロパノール２．０ｍＬを含有する、予めラベルを付けた２４ウェルプレートに移した。このプレートをパラフィルムで覆い、最後の曝露時間まで冷蔵庫（２〜８℃）内で保管し、収穫した。必要な場合、ＭＴＴを抽出する前に、プレートを冷蔵庫内に一晩保管した（または最後の曝露時間後、最大２４時間保管し、収穫する）。次に、これらのプレートを室温で少なくとも２時間、振とうした。抽出期間の終了時に、細胞培養インサート内の液体を、細胞培養インサートを取り出したウェル内にデカンテーションした。抽出溶液を混合し、２００μＬを９６ウェルプレートの適正なウェルに移した。２００μＬのイソプロパノールを、ブランクと指定したウェルに添加した。各ウェルの５５０ｎｍでの吸光度（ＯＤ５５０）をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｖｍａｘプレートリーダーで測定した。
【０２３６】
メラニンアッセイ：適切な曝露時間の終了時に、メラニンアッセイに指定したＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を、１回のすすぎあたり約５００μＬのＣＭＦ−ＤＰＢＳを使用して、少なくとも３回、やさしくすすぎ、培養培地に由来するいかなる残留試験物品も過剰のフェノールレッドも除去し、滅菌吸収紙上で水分を吸い取って乾燥させ、過剰な液体を除去した。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織は、本アッセイの終了時に、デジタルカメラを使用して写真を撮影した。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を、滅菌外科用メスまたは滅菌パンチを使用して細胞培養インサートから取り除き、ラベルを付けた１．５ｍＬマイクロフュージ管に入れて、後のメラニン分析のために、＜−６０℃で保管した。
【０２３７】
メラニン抽出アッセイの当日、切除した組織を室温で約１０分間、解凍した。可溶物２５０μＬを各マイクロフュージ管に加え、これらの管を少なくとも１６時間、６０＋２℃でインキュベートした。メラニンを可溶物に溶解することにより、１ｍｇ／ｍＬのメラニンの標準保存溶液を調製した。一連のメラニン標準品を０ｍｇ／ｍＬ〜０．３３ｍｇ／ｍＬの範囲の保存溶液１ｍｇ／ｍＬから調製した。標準品のシリーズは、１ｍｇ／ｍＬのメラニンの標準保存溶液０．６ｍＬを１．２ｍＬの可溶物に加えて、次に、さらに一連の５つの希釈液（希釈ファクター３）を作製することによって調製した。可溶物をゼロ標準品として使用した。メラニン標準品シリーズおよび可溶物を、６０＋２℃で少なくとも１６時間、インキュベートした。
【０２３８】
メラニン抽出を開始して、少なくとも１６時間後に、試料（ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織から抽出したメラニンとする）および標準品を含有する管を室温で冷却し、室温で、１３，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。試料２００μＬ（単一ウェル）または標準品（二連のウェル）を９６ウェルプレートの適正なウェルに移した。２００μＬの可溶物を、二連のウェルでブランクと指定したウェルに添加した。各ウェルの４９０ｎｍでの吸光度（ＯＤ４９０）をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｖｍａｘプレートリーダー（Ａｕｔｏｍｉｘ機能を選択）で測定した。
残留試験物品によるＭＴＴの還元を評価するための死滅対照
【０２３９】
考えられる残留試験物品がＭＴＴを直接還元するように作用していないことを実証するために、決定的アッセイで機能確認を行い、試験物質が組織に結合して、偽のＭＴＴ還元シグナルを生じることがないことを示した。
【０２４０】
残留試験物品がＭＴＴを直接還元するように作用しているかどうかを判定するために、凍結死滅させた対照組織を使用した。凍結死滅組織は、未処置のＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）／ＥｐｉＤｅｒｍ（商標）（メラノサイトを含まないＭｅｌａｎｏｄｅｒｍ（商標））組織を−２０℃の冷凍庫内に少なくとも一晩入れ、室温に解凍し、次に再凍結することによって調製した。組織は、一旦、死滅すると、冷凍庫内で無期限に保管してもよい。凍結死滅組織は、ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから既に調製済みのものを入手し、使用するまで−２０℃の冷凍庫内に保管することができる。残留試験物品の還元について試験するために、通常の様式で死滅組織を試験物品で処置した。すべてのアッセイ手順は、生存組織と同じ方法で実施した。死滅組織内の残留ＮＡＤＨおよび関連酵素から、少量のＭＴＴ還元が予想されるので、滅菌脱イオン水で処置した少なくとも１つの死滅対照（陰性死滅対照）を並行して試験した。
【０２４１】
試験物品で処置した死滅対照において、ＭＴＴ還元がほとんどまたは全く観察されなかった場合、試験物品で処置した生存組織に観察されるＭＴＴ還元は、生存細胞に起因し得る。処置した死滅対照においてかなりのＭＴＴ還元があった場合（処置した生存組織の量に対して）、化学還元を説明する追加ステップを講じなければならないか、またはこの試験物品は、このシステムでは試験不能と見なされ得る。
【０２４２】
データ分析
【０２４３】
ブランクのウェルの平均ＯＤ５５０値を計算した。陰性／溶媒対照の補正後の平均ＯＤ５５０値は、これらの平均ＯＤ５５０値からブランクのウェルの平均ＯＤ５５０値を減算することによって求めた。個々の試験物品に曝露したものおよび陽性対照に曝露したものの補正後のＯＤ５５０値は、それぞれからブランクのウェルの平均ＯＤ５５０値を減算することによって求めた。すべての計算は、Ｅｘｃｅｌのスプレッドシートを使用して実施した。議論したアルゴリズムは、処置群レベルでの最終エンドポイント解析を計算するために実施するが、同じ計算を個々の反復試験に適用することができる。
補正した試験物品の曝露ＯＤ５５０＝試験物品の曝露ＯＤ５５０−ブランク平均ＯＤ５５０
【０２４４】
死滅対照（ＫＣ）を使用する場合、試験物品の残留物によって直接還元されたＭＴＴの量を補正するために、以下の追加的な計算を実施した。陰性対照での死滅対照の生のＯＤ５５０値を、試験物品で処置した死滅対照のそれぞれの生のＯＤ５５０値から減算し、試験物品で処置した死滅対照の正味のＯＤ５５０値を求めた。
各試験物品ＫＣの正味のＯＤ５５０＝生のＯＤ５５０試験物品のＫＣ−生のＯＤ５５０陰性／溶媒対照ＫＣ
【０２４５】
正味のＯＤ５５０値は、試験物品残留物による特定の曝露時間での直接還元により還元されたＭＴＴの量を表す。一般に、正味のＯＤ５５０値が、０．１５０より大きい場合、ＭＴＴ還元の正味の量を、処置した生存組織の補正後のＯＤ５５０値から減算して、最終補正後のＯＤ５５０値を得る。次に、これらの最終補正後のＯＤ５５０値を使用して、対照生存率の％を求める。
最終補正後のＯＤ５５０＝補正した試験物品のＯＤ５５０（生存）−正味のＯＤ５５０試験物品（ＫＣ）
【０２４６】
最後に、以下の対照の％の計算を行う：
生存率（％）＝［（試験物品または陽性対照の最終的な補正後のＯＤ５５０）／（陰性／溶媒対照の補正後の平均ＯＤ５５０）］×１００
【０２４７】
メラニン分析：吸光度の生データを取り込み、印刷ファイルとして保存し、Ｅｘｃｅｌのスプレッドシートにインポートした。各試験試料（０日目の未処置ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織から抽出したメラニン、７日目の各試験物品、陰性／溶媒または陽性対照により処置したＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織とする）およびメラニン標準品のＯＤ４９０値を求めた。試験試料および各メラニン標準品に関する補正後のＯＤ４９０値は、ブランクのウェルの平均ＯＤ４９０値を減算することによって求めた。標準曲線は、対応する補正後吸光度に対するｍｇ／ｍＬでの標準品の濃度（ｙ軸）としてプロットした。個々の組織のそれぞれにおけるメラニンの量は、標準曲線（線形）から補間した。最後に、各試験物品または対照処置群のメラニン濃度の平均値をそれぞれ、計算した。
結果
【０２４８】
図１は、試験物品、陽性対照および未処置組織に対する平均組織生存率およびメラニン濃度の結果を要約している。予備結果は、本発明のカルバゾール化合物に適用したある特定の製剤は、カルバゾールの皮膚暗色化活性を抑制する中程度の皮膚美白作用を独立して示すことがあることを示唆している。
【０２４９】
図２は、個別の実験において観察された試験物品および未処置組織の平均組織生存率およびメラニン濃度の結果を要約している。例えば、マラセジンおよびインジルビンを含む併用処置は、それ自体、どちらかの一方の化合物よりも効果的な皮膚美白作用を示した。
（実施例６）
インジルビンおよびインジルビン誘導体のメラニン形成能
【０２５０】
この検討の目的は、インジルビンおよびインジルビン誘導体に曝露されたＢ１６メラノサイトのメラニン形成および生存率を観察ならびに報告することである。
物質および試薬
【０２５１】
プレート培養用の培地は、Ｌ−グルタミン、ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびＬ−グルタミンを含まないＤＭＥＭを含む。アッセイ培地は、フェノールレッドおよびＬ−グルタミン、ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンおよびａＭＳＨを含まないＤＭＥＭを含む。他の試薬は、コウジ酸、ＤＭＳＯおよびＭＴＴを含む。試験する細胞は、Ｂ１６細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６４７５）となる。
プロトコール
【０２５２】
Ｂ１６メラノサイトは、７０％コンフルエントになるまで培養し、収穫する。４０００細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレートに細胞を播種し、一晩、付着させる。翌日、試験物品および対照をＢ１６アッセイ培地に希釈する。一晩、培地を吸引し、２００ｕｌの試験物品および対照を施用する。細胞を３７℃および１０％ＣＯ２で７２時間、インキュベートする。７２時間のインキュベート後、吸光度を５４０ｎｍで読み取る。培地を除去し、１ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴを含有するプレート培養用培地１００ｕｌと置き換え、３７℃および１０％ＣＯ２で、２時間、インキュベートする。ＭＴＴ培地を除去し、２００ｕｌの９５％エタノール／５％イソプロパノールにより置き換え、１５分間、振とうさせる。次に、ＭＴＴの吸光度を５７０ｎｍで読み取る。
結果
【０２５３】
インジルビンおよびその化学アナログを含めた、本発明の化合物および組成物は、メラニン形成を阻害することが予想される。インジルビンの化学アナログは、インジルビンと比べて、例えば、より強力なメラニン形成阻害活性を示すことが予想される。同様に、インジルビンのある特定の化学アナログは、インジルビンと比べて、例えば、それほど有効なメラニン形成阻害活性を実証しないことが予想される。
（実施例７）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性
【０２５４】
本発明の化合物および組成物は、インジルビンと少なくとも同程度強力にメラノサイトアポトーシスを誘導し、メラノサイトの活性、メラニン産生、メラノソーム生物発生および／またはメラノソーム輸送をモジュレートすると予想される。本発明の化合物および組成物のいくつかは、インジルビンほど強力に、これらの生物学的過程に影響を及ぼさないことも企図される。このような化合物および組成物は、より効力の高い化学種と比較して、より有利な毒性プロファイルを有することができる。
（実施例８）
ｉｎ  ｖｉｖｏ効力
【０２５５】
本発明の化合物および組成物は、皮膚の美白、および様々な障害によって引き起こされる色素沈着過度／低色素沈着の改善を含めた、皮膚の色素沈着のモジュレートに関して、インジルビンと少なくとも同程度に有効であると予想される。本発明の化合物および組成物は、例えば、半減期および吸収に関して、有利な薬物動態プロファイルを示すことがさらに予想される。ある特定の化合物は、より長い半減期を示す一方、他の化合物は、より短い半減期を示すこととなる。同様に、ある特定の化合物は、異なる吸収プロファイルを示し、一部の化合物は、完全に吸収されるのにより時間がかかり、他の化合物は完全に吸収されるのに時間はそれほどかからないであろう。
（実施例９）
Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ由来の化合物および／またはその化学アナログを含有する組成物のアポトーシス誘導活性
試薬
【０２５６】
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８アネキシンＶ／死細胞アポトーシスキット、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（１×）、カスパーゼ−Ｇｌｏ３／７アッセイ、ＲＰＭＩ１６４０培地、ダルベッコの改変イーグル培地および抗生物質抗真菌剤溶液（１００×）。
【０２５７】
細胞系ＭｅＷｏ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−６５（商標））、ＷＭ１１５（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１６７５）およびＢ１６Ｆ１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−６３２３）は、以下の培養培地：ＭｅＷｏおよびＢ１６Ｆ１用の培養培地：１０％ＦＢＳを補給したＤＭＥＭ；ＷＭ１１５用の培養培地：１０％ＦＢＳを補給したＲＰＭＩ１６４０に維持する。
実験方法
【０２５８】
細胞を収穫し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓセルカウンターを使用して細胞数を決定する。所望の密度まで細胞を培養培地により希釈する。最終的な細胞密度は、例えば、６時間および２４時間の処置の場合、４，０００細胞／ウェルであり、４８時間および７２時間の処置の場合、２，０００細胞／ウェルとすることができる。アネキシンＶアッセイの場合、３８４ウェルクリアボトムプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３７１２）を使用する一方、カスパーゼ−Ｇｌｏアッセイの場合、３８４ウェルソリッドホワイトボトムプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３５７０）を使用する。プレートはすべて、蓋で覆い、細胞を付着させるため、３７℃および５％ＣＯ２で、一晩、置く。
【０２５９】
試験化合物をＤＭＳＯに溶解し、３０ｍＭの保存溶液にする。１０倍希釈を行い、３ｍＭおよび０．３ｍＭ濃度を生成する。０．９ｍＭスタウロスポリンを陽性対照として使用し、ＤＭＳＯを陰性対照（ＮＣ）として使用する。液体ハンドラーＥｃｈｏ５５０を使用して、１３２．５ｎＬの化合物を化合物源プレートから３８４ウェル細胞培養プレートに移す。表示されているインキュベート時間の後、検出のためにプレートをインキュベータから取り出す。
【０２６０】
試験組成物を、ＤＭＳＯ、ＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭまたは任意の適切な溶媒に溶解し、以下の表２〜７中の指示書に準拠して調製することができる。適切な溶媒は当業者に周知である。
【０２６１】
アネキシンＶアッセイのため、プレートをインキュベータから取り出し、培養培地を除去する。細胞を４０ｕＬのＰＢＳにより２回、洗浄し、ウェルあたり、１５ｕＬの事前混合アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２色素の作業溶液を加える。プレートを室温で２０分間、インキュベートし、封止して、１，０００ｒｐｍで１分間、遠心分離し、気泡を除去する。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｎａｎｏを使用してプレートを読み取る。
【０２６２】
カスパーゼ−Ｇｌｏアッセイのため、プレートをインキュベータから取り出し、室温で１５分間、平衡にする。カスパーゼ−Ｇｌｏ３／７試薬もまた、実験前に解凍して、室温と平衡にする。カスパーゼ−Ｇｌｏ試薬は、培養培地に対して、１：１の比で必要なウェルに加える。プレートを室温で１５分間、インキュベートし、ＥｎＳｐｉｒｅ（商標）プレートリーダーを使用して読み取る。誘導倍率を以下の式に従って計算する：誘導倍率＝発光量Ｓａｍｐｌｅ／発光量ＮＣ
アネキシンＶアッセイおよびカスパーゼ３／７アッセイの結果
【０２６３】
組成物＃１〜５を含む、本発明の化合物および組成物は、細胞死を誘導することが予想される。本発明の組成物は、例えば、少なくとも１つの構成成分化合物単独に比べて、より強力なアポトーシス誘導活性を示すことが予想される。同様に、本発明の組成物は、例えば、少なくとも１つの構成成分化合物単独に比べて、それほど有効ではないアポトーシス誘導活性を実証することが予想される。このような組成物は、より効力の高い組成物と比較すると、より有利な毒性プロファイルを有することができる。
（実施例１０）
Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ由来の化合物および／またはその化学アナログを含有する組成物への曝露後の細胞生存率
試薬
【０２６４】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）２．０アッセイ
実験方法
【０２６５】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイに関すると、試験化合物を１０ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液中で調製する。化合物を１２種の濃度まで段階的に希釈する。１００，０００細胞／ｍＬの懸濁液からの細胞４０ｕＬを３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３５７０）の各ウェルに分注する。プレートを３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度で一晩、インキュベートする。試験化合物をビヒクル対照としてのＤＭＳＯと共に加える。プレートを３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度で、６、２４または４８時間、インキュベートし、ウェルに４０ｕＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を加え、細胞生存率を評価する。
【０２６６】
試験組成物を、ＤＭＳＯ、ＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭまたは任意の適切な溶媒に溶解し、以下の表４〜９中の指示書に準拠して調製することができる。適切な溶媒は当業者に周知である。
結果
【０２６７】
組成物＃１〜５を含む、本発明の化合物および組成物は、細胞死を誘導することが予想される。本発明の組成物は、例えば、少なくとも１つの構成成分化合物単独に比べて、より強力なアポトーシス誘導活性を示すことが予想される。同様に、本発明の組成物は、例えば、少なくとも１つの構成成分化合物単独に比べて、それほど有効ではないアポトーシス誘導活性を実証することが予想される。このような組成物は、より効力の高い組成物と比較すると、より有利な毒性プロファイルを有することができる。
（実施例１１）
Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ由来の化合物および／またはその化学アナログを含有する組成物の芳香族炭化水素受容体活性化能
アッセイ手順
【０２６８】
安定にトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞用の培養培地は、ＤＭＥＭに高グルコースおよびＬ−グルタミン、ならびに１０％ＦＢＳを補給することによって調製する。
【０２６９】
ＨｅｐＧ２−ＡｈＲ−Ｌｕｃ細胞を、Ｔ−７５フラスコ内で、３７℃、５％ＣＯ２および９５％の相対湿度で培養する。細胞を８０〜９０％のコンフルエンスに到達させた後、剥離および分割する。
【０２７０】
培養細胞は、５ｍＬのＰＢＳですすぐ。ＰＢＳを吸引除去し、１．５ｍＬのトリプシンをフラスコに加え、３７℃で約５分間、または細胞が剥離して浮き上がるまで、細胞をインキュベートする。過剰な血清含有培地を添加することによって、トリプシンを不活性化させる。
【０２７１】
細胞懸濁液を円錐管に移し、１２０ｇで１０分間、遠心分離して、細胞をペレットにする。細胞を適度な密度で播種培地中に再懸濁させる。４０μＬの細胞を３８４ウェル培養プレートに移す（５×１０３細胞／ウェル）。プレートを３７℃で２４時間、インキュベータ中に置く。
【０２７２】
その後、試験化合物、試験組成物およびオメプラゾール陽性対照の保存溶液を調製する。Ｅｃｈｏ５５０を使用し、化合物および組成物溶液をアッセイプレート中に移す。次に、このプレートを化合物／組成物処置のためにインキュベータ内に戻す。
【０２７３】
後に、２４時間の処置後に、プレートをインキュベータから取り出し、周囲温度で冷却する。培養培地のものと等量のＯｎｅ−Ｇｌｏ試薬３０μＬを各ウェルに加える。細胞を少なくとも３分間、溶解し、次に照度計で測定する。
【０２７４】
ＸＬｆｉｔの非線形回帰解析を使用して用量応答をグラフにし、ＥＣ５０値も計算する。
結果
【０２７５】
組成物＃１〜５を含む、本発明の化合物および組成物は、ＡｈＲ活性をモジュレートすることが予想される。本発明の組成物は、例えば、少なくとも１つの構成成分化合物単独と比べて、より強力なＡｈＲアゴニスト活性を示すことが予想される。同様に、本発明の組成物は、例えば、少なくとも１つの構成成分化合物単独に比べて、それほど有効ではないＡｈＲアゴニスト活性を実証することが予想される。本発明の組成物は、例えば、少なくとも１つの構成成分化合物単独に比べて、より強力なＡｈＲアンタゴニスト活性を示すことも予想される。同様に、本発明の組成物はまた、例えば、少なくとも１つの構成成分化合物単独に比べて、それほど有効ではないＡｈＲアンタゴニスト活性を実証することが予想される。
（実施例１２）
ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）アッセイ
【０２７６】
この検討の目的は、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）皮膚モデルにおける、試験物品の反復曝露後の皮膚メラニン形成モジュレーターとしての試験物品の潜在作用を評価することであった。第２に、この検討の目的は、反復曝露後のＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）皮膚モデルに対する試験物品の潜在的な皮膚刺激を評価することであった。毒性は、試験物品処置組織におけるＭＴＴ（臭化３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウム）の、陰性／溶媒対照処置組織と比較した相対変換率を測定することによって決定した。メラニン産生に及ぼす潜在的な影響は、陰性／溶媒対照処置組織と比較して、試験物品処置組織によって産生されたメラニンの濃度を測定することにより決定した。
試験物質およびアッセイ対照の特定
表４  希釈形態で試験した試験物品
【表４】
2021535123.tif 000017
表５  組成物＃１
【表５】
2021535123.tif 000018
表６  組成物＃２
【表６】
2021535123.tif 000019
表７  組成物＃３
【表７−１】
2021535123.tif 000020
【表７−２】
2021535123.tif 000021
表８  組成物＃４
【表８−１】
2021535123.tif 000022
【表８−２】
2021535123.tif 000023
表９  組成物＃５
【表９−１】
2021535123.tif 000024
【表９−２】
2021535123.tif 000025
【０２７７】
アッセイ対照には、ＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ中で調製した、陽性対照−マラセジン（ＣＶ−８６８４）（５００μＭ）（１７ＡＪ４１）および溶媒対照−ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）が含まれる。
【０２７８】
さらに、試験物品および対照は、４つの組織の群に施用し、それぞれ、このうちの２つは、組織生存率（ＭＴＴ）エンドポイントに使用し、２つは、メラニンのエンドポイントに使用した。
試験システム
【０２７９】
ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ）によって提供されているＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）皮膚モデルを本検討に使用した。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織は、高度に分化した複数層のヒト表皮モデルを形成するように培養された、正常なヒト由来表皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）およびメラノサイト（ＮＨＭ）からなる。共培養物中のＮＨＭは、自発的なメラニン形成を受けて、様々なレベルの色素沈着の組織をもたらす。培養物は、細胞培養インサート上の気液界面で増殖させて、皮膚モジュレーターを局所施用することが可能となった。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）モデルは、ｉｎ  ｖｉｖｏに似た形態学的特性および微細構造特性を示す。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織の基底細胞層に局在するＮＨＭは樹状であり、自発的にメラニン顆粒を産生し、それは、次第に組織の層を占めていく。したがって、この試験システムは、陰性対照と比較して、メラニン産生を阻害または刺激し得る物質をスクリーニングするために使用する。
実験設計および方法
【０２８０】
本検討の実験設計は、可能な場合、無希釈の試験物品（および／または必要に応じて投与用溶液）のｐＨの決定、ならびに反復曝露後の相対的な組織生存率およびＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）皮膚モデルに対する皮膚メラニン形成モジュレーターとしての試験物品の潜在作用を決定するための決定的アッセイからなった。試験物品は、合計で７日間、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）皮膚モデルに曝露させた。４８時間（前回の処置から４８±２時間の時間枠内）毎に試験物品をＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）皮膚モデルに局所施用した。試験物品の毒性は、対照および試験物品処置組織におけるＭＴＴのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性ミクロソーム酵素還元によって（および、比較的低い程度のＭＴＴのコハク酸デヒドロゲナーゼ還元によって）決定した。データは、相対生存率の形態（陰性／溶媒対照と比較したＭＴＴ変換率）で提示した。メラニン産生に及ぼす潜在的な影響は、陰性／溶媒対照処置組織と比較して、試験物品処置組織において産生されたメラニンの濃度を決定することにより評価した。データは、メラニン標準品曲線を使用して決定した試験物品処置組織によって産生されるメラニンの濃度の形態で提示した。代替的に、データは、陰性／溶媒対照処置組織に対するメラニン濃度の変化率として提示されてもよい。
【０２８１】
使用した方法は、ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって提供されている手順の修正である。
培地および試薬
【０２８２】
ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）維持培地（ＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ）は、ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）皮膚モデル（ＭＥＬ−３００−Ａ）は、ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。１％のコウジ酸（滅菌脱イオン水中で調製）は、Ｓｉｇｍａから購入した。ＭＴＴ（臭化３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウム）は、Ｓｉｇｍａから購入した。２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＭＴＴ添加培地）は、Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。抽出溶媒（イソプロパノール）は、Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まない滅菌ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＣＭＦ−ＤＰＢＳ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。メラニンはＳｉｇｍａから購入した。滅菌脱イオン水は、Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。可溶物は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒから購入した。
試験物品の調製および送達
【０２８３】
このプロトコール内で別段の指定がない限り、２５マイクロリットルの各試験物品を、組織に直接、上側表面を覆うように施用した。試験物品の性質（液体、ゲル、クリーム、フォームなど）に応じて、試験物品を組織の表面上に一様に広げることができる投与装置、メッシュまたは他の補助具の使用が必要となることがあった。
投与経路
【０２８４】
７日間の試験の間、４８時間（前回の処置から４８＋２時間の時間枠内）毎に試験物品をＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織に局所施用した。２５マイクロリットルの各試験物品を各組織に施用した。２５マイクロリットルの陽性および陰性／溶媒対照をそれぞれ各組織に施用した。
ｐＨ決定
【０２８５】
可能な場合、無希釈液体試験物品（および／または、適切な場合、投与用溶液）のｐＨを決定した。ｐＨは、ｐＨ試験紙（例えば、推定する０〜１４のｐＨ範囲を有するもの、および／またはより正確な値を決定する５〜１０のｐＨ範囲を有するもの）を使用して決定した。範囲が狭い方のｐＨ試験紙の典型的なｐＨ増分は、約０．３〜０．５ｐＨの単位とした。ｐＨ試験紙に対する最大増分は１．０ｐＨの単位とした。
対照
【０２８６】
決定的なアッセイは、陰性対照、陽性対照および１つの溶媒対照（ＤＭＳＯ）、または陽性対照および溶媒対照（ＤＭＳＯ）を含んだ。アッセイ陰性／溶媒対照に指定したＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を、２５μＬの滅菌脱イオン水またはＤＭＳＯで処置した。アッセイ陽性対照に指定した組織は、２５μＬの１％コウジ酸、マラセジン（ＣＶ−８６８４）（１７ＡＪ４１）５００μＭまたは組成物＃２により処置した。１％コウジ酸は、調製の２時間以内に使用するまで、アルミニウムホイルで覆った管中に保管した。陰性／溶媒および陽性対照の曝露時間は、試験物品に対して使用した時間と同じとした。未処置組織も、対照として使用した。
試験物品によるＭＴＴの直接還元の評価
【０２８７】
各試験物品が、ＭＴＴを直接還元する能力を評価することが必要であった。ＭＴＴ溶液１．０ｍｇ／ｍＬを、ＭＴＴ添加培地中で調製した。約２５μＬの試験物品をＭＴＴ溶液１ｍＬに加え、この混合物を暗所中３７±１℃で１〜３時間、インキュベートした。陰性対照である滅菌脱イオン水２５μＬ、または溶媒対照であるＤＭＳＯ２５μＬを同時に試験した。ＭＴＴ溶液の色が青色／紫色に変わった場合、試験物品はＭＴＴを還元したと推定した。水不溶性試験物質は、試験物品と培地との界面でのみ、直接的な還元（暗色化）を示すことができた。
ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）の受領
【０２８８】
ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）皮膚キットの受領時、製造業者によって指示されている通りに溶液を保管した。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を使用するまで、２〜８℃で保管した。
【０２８９】
受領した日（投与の前日）に、適切な体積のＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）維持培地（ＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ）を除去し、３７±１℃に温めた。ＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ／ウェルの９／１０（０．９）ｍＬを、６ウェルプレートの適正なウェルに等分した。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織をそれぞれ、封止パッケージを開口する前に、アガロースゲルと細胞培養インサートとの間の気泡について検査した。細胞培養インサート領域の５０％より広い気泡を有する組織は使用しなかった。２４ウェルの輸送用容器をプラスチック製バッグから取り出し、その表面を７０％エタノールで消毒した。適切な数のＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を、２４ウェルの輸送用容器から６ウェルプレートに無菌で移した。組織を順応させるため、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を、空気中５±１％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７±１℃（標準培養条件）で一晩（少なくとも１６時間）、インキュベートした。バッグの開口時に、組織の移送時に輸送用寒天に残るいかなる未使用組織も、５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気で短時間脱気し、バッグを封止して、後の使用のため、２〜８℃に保管した。
決定的なアッセイ
【０２９０】
組織曝露：培養の開始後、少なくとも１６時間時に、デジタルカメラを使用して５つのＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織（０日目での未処置と見なす）の写真を撮り、アッセイのゼロ時間での組織の色素沈着の程度の目視評価の一助とした。２つのＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織をＣＭＦ−ＤＰＢＳによりすすぎ、滅菌吸収紙上で水分を吸い取って乾燥させ、過剰な液体を除去した。すすぎ後、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を適正なＭＴＴ含有ウェルに移し、ＭＴＴアッセイにおいて処理した。２つまたは３つのＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織をＣＭＦ−ＤＰＢＳによりすすぎ、滅菌吸収紙上で水分を吸い取って乾燥させ、過剰な液体を除去した。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を、滅菌外科用メスを使用して細胞培養インサートから取り除き、ラベルを付けた１．５ｍＬマイクロフュージ管に入れて、後のメラニン分析のために、＜−６０℃で保管した。
【０２９１】
培養の開始後、少なくとも１６時間時に、事前加温した新たなＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ  ０．９ｍＬ／ウェルを含有する新しい６ウェルプレート上に組織の残部を移した。試験は７日間の時間枠にわたり行う。４つまたは５つの組織を、初日および４８時間（前回の処置から４８＋２時間の時間枠内）毎に、２５μＬの各試験物品で局所的に処置した。培地は毎日（前回の再供給から２４＋２時間の時間枠内）新しくした。組織を、事前加温した新たなＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ  ０．９ｍＬ／ウェルを含有する新しい６ウェルプレートに移した。
【０２９２】
４つまたは５つの組織を、初日および４８時間（前回の処置から４８＋２時間の時間枠内）毎に、それぞれ、２５μＬの陽性および陰性／溶媒対照で局所的に処置した。培地は毎日（前回の再供給から２４＋２時間の時間枠内）新しくした。組織を、事前加温した新たなＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ  ０．９ｍＬ／ウェルを含有する新しい６ウェルプレートに移した。組織を、空気中５±１％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７±１℃（標準培養条件）で適正な曝露時間、インキュベートした。
【０２９３】
投与日に、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を、最初に１回のすすぎあたりＣＭＦ−ＤＰＢＳ約５００μＬを使用して３回、やさしくすすぎ、いずれの残留試験物品も除去した。ＣＭＦ−ＤＰＢＳは、やさしいピペット操作でウェルに入れて、次に、滅菌アスピレーターを用いて抜き取った。この組織を、事前加温した新たなＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ  ０．９ｍＬを含有する新しい６ウェルプレートに移し、適正な試験物品、陰性／溶媒または陽性対照を投与した。組織を、空気中５±１％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７±１℃（標準培養条件）で適正な曝露時間、インキュベートした。
【０２９４】
７日間の試験の終了時に、デジタルカメラを使用して陰性／溶媒または陽性対照、および各試験物品により処置したＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織の写真を撮り、アッセイ終了時（７日目）の組織の色素沈着の程度の目視評価の一助とした。次に、陽性および陰性対照によりそれぞれ処置した、および各試験物品により処置した２つの組織の生存率を、ＭＴＴ還元によって決定した。７日間の試験の終了時に、それぞれ、各試験物品、陽性および陰性／溶媒対照により処置した３つの組織により産生したメラニンを決定した。
【０２９５】
ＭＴＴアッセイ：ＰＢＳ中で調製したＭＴＴの１０×保存溶液（回分調製時にろ過したもの）を、使用前２時間以内に解凍し、温かいＭＴＴ添加培地に希釈して、１．０ｍｇ／ｍＬの溶液を生成した。予めラベルを付けた２４ウェルプレートの各指定ウェルにＭＴＴ溶液３００μＬを加えた。
【０２９６】
曝露時間後に、ＭＴＴアッセイ用に指定した各ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織をＣＭＦ−ＤＰＢＳですすぎ（このステップに許容されるスプレーボトルを使用）、滅菌吸収紙上で水分を吸い取って乾燥させ、過剰な液体を除去した。すすぎ後、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を適正なＭＴＴ含有ウェルに移した。２４ウェルプレートを、標準条件で３±０．１時間、インキュベートした。
【０２９７】
３±０．１時間後、ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を、滅菌吸収紙上で水分を吸い取り、過剰な液体を除去し、各指定ウェルにイソプロパノール２．０ｍＬを含有する、予めラベルを付けた２４ウェルプレートに移した。このプレートをパラフィルムで覆い、最後の曝露時間まで冷蔵庫（２〜８℃）内で保管し、収穫した。必要な場合、ＭＴＴを抽出する前に、プレートを冷蔵庫内に一晩保管した（または最後の曝露時間後、最大２４時間保管し、収穫する）。次に、これらのプレートを室温で少なくとも２時間、振とうした。抽出期間の終了時に、細胞培養インサート内の液体を、細胞培養インサートを取り出したウェル内にデカンテーションした。抽出溶液を混合し、２００μＬを９６ウェルプレートの適正なウェルに移した。２００μＬのイソプロパノールを、ブランクと指定したウェルに添加した。各ウェルの５５０ｎｍでの吸光度（ＯＤ５５０）をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｖｍａｘプレートリーダーで測定した。
【０２９８】
メラニンアッセイ：適切な曝露時間の終わりに、メラニンアッセイに指定したＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を、１回のすすぎあたり約５００μＬのＣＭＦ−ＤＰＢＳを使用して、少なくとも３回、やさしくすすぎ、培養培地に由来するいかなる残留試験物品または過剰のフェノールレッドも除去し、滅菌吸収紙上で水分を吸い取って乾燥させ、過剰な液体を除去した。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織は、本アッセイの終わりに、デジタルカメラを使用して写真を撮影した。ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織を、滅菌外科用メスまたは滅菌パンチを使用して細胞培養インサートから取り除き、ラベルを付けた１．５ｍＬマイクロフュージ管に入れて、後のメラニン分析のために、＜−６０℃で保管した。
【０２９９】
メラニン抽出アッセイの当日、切除した組織を室温で約１０分間、解凍した。可溶物２５０μＬを各マイクロフュージ管に加え、これらの管を少なくとも１６時間、６０＋２℃でインキュベートした。メラニンを可溶物に溶解することにより、１ｍｇ／ｍＬのメラニンの標準保存溶液を調製した。一連のメラニン標準品を０ｍｇ／ｍＬ〜０．３３ｍｇ／ｍＬの範囲の１ｍｇ／ｍＬ保存溶液から調製した。標準品のシリーズは、１ｍｇ／ｍＬのメラニンの標準保存溶液０．６ｍＬを１．２ｍＬの可溶物に加えて、次に、さらに一連の５つの希釈液（希釈ファクター３）を作製することによって調製した。可溶物をゼロ標準品として使用した。メラニン標準品シリーズおよび可溶物を、６０＋２℃で少なくとも１６時間、インキュベートした。
【０３００】
メラニン抽出を開始して、少なくとも１６時間後に、試料（ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織から抽出したメラニンとする）および標準品を含有する管を室温で冷却し、室温で、１３，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。試料２００μＬ（単一ウェル）または標準品（二連のウェル）を９６ウェルプレートの適正なウェルに移した。２００μＬの可溶物を、二連のウェルでブランクと指定したウェルに加えた。各ウェルの４９０ｎｍでの吸光度（ＯＤ４９０）をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｖｍａｘプレートリーダー（Ａｕｔｏｍｉｘ機能を選択）で測定した。
残留試験物品によるＭＴＴの還元を評価するための死滅対照
【０３０１】
考えられる残留試験物品がＭＴＴを直接還元するように作用していないことを実証するために、決定的アッセイで機能確認を行い、試験物質が組織に結合して、偽のＭＴＴ還元シグナルを生じることがないことを示した。
【０３０２】
残留試験物品がＭＴＴを直接還元するように作用しているかどうかを判定するために、凍結死滅させた対照組織を使用した。凍結死滅組織は、未処置のＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）／ＥｐｉＤｅｒｍ（商標）（メラノサイトを含まないＭｅｌａｎｏｄｅｒｍ（商標））組織を−２０℃の冷凍庫内に少なくとも一晩入れ、室温に解凍し、次に再凍結することによって調製した。組織は、一旦、死滅すると、冷凍庫内で無期限に保管してもよい。凍結死滅組織は、ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから既に調製済みのもの受領し、使用するまで−２０℃の冷凍庫内に保管することができる。残留試験物品の還元について試験するために、通常の様式で死滅組織を試験物品で処置した。すべてのアッセイ手順は、生存組織と同じ方法で実施した。死滅組織内の残留ＮＡＤＨおよび関連酵素から、少量のＭＴＴ還元が予想されるので、滅菌脱イオン水で処置した少なくとも１つの死滅対照（陰性死滅対照）を並行して試験した。
【０３０３】
試験物品で処置した死滅対照において、ＭＴＴ還元がほとんどまたは全く観察されなかった場合、試験物品で処置した生存組織に観察されるＭＴＴ還元は、生存細胞に起因し得る。処置した死滅対照においてかなりのＭＴＴ還元があった場合（処置した生存組織の量に対して）、化学還元を説明する追加ステップを講じなければならないか、またはこの試験物品は、このシステムでは試験不能と見なされ得る。
データ分析
【０３０４】
ブランクのウェルの平均ＯＤ５５０値を計算した。陰性／溶媒対照の補正後の平均ＯＤ５５０値は、これらの平均ＯＤ５５０値からブランクのウェルの平均ＯＤ５５０値を減算することによって求めた。個々の試験物品に曝露したものおよび陽性対照に曝露したものの補正後のＯＤ５５０値は、それぞれからブランクのウェルの平均ＯＤ５５０値を減算することによって求めた。すべての計算は、Ｅｘｃｅｌのスプレッドシートを使用して実施した。議論したアルゴリズムは、処置群レベルでの最終エンドポイント解析を計算するために実施するが、同じ計算を個々の反復試験に適用することができる。
補正した試験物品の曝露ＯＤ５５０＝試験物品の曝露ＯＤ５５０−ブランクの平均ＯＤ５５０
【０３０５】
死滅対照（ＫＣ）を使用する場合、試験物品の残留物によって直接還元されたＭＴＴの量を補正するために、以下の追加的な計算を実施した。陰性対照での死滅対照の生のＯＤ５５０値を、試験物品で処置した死滅対照のそれぞれの生のＯＤ５５０値から減算し、試験物品で処置した死滅対照の正味のＯＤ５５０値を求めた。
各試験物品ＫＣの正味のＯＤ５５０＝生のＯＤ５５０試験物品のＫＣ−生のＯＤ５５０陰性／溶媒対照ＫＣ
【０３０６】
正味のＯＤ５５０値は、試験物品残留物による特定の曝露時間での直接還元により還元されたＭＴＴの量を表す。一般に、正味のＯＤ５５０値が、０．１５０より大きい場合、ＭＴＴ還元の正味の量を、処置した生存組織の補正後のＯＤ５５０値から減算して、最終補正後のＯＤ５５０値を得る。次に、これらの最終補正後のＯＤ５５０値を使用して、対照生存率の％を求める。
最終補正後のＯＤ５５０＝補正した試験物品のＯＤ５５０（生存）−正味のＯＤ５５０試験物品（ＫＣ）
【０３０７】
最後に、以下の対照の％の計算を行う：
生存率（％）＝［（試験物品または陽性対照の最終的な補正後のＯＤ５５０）／（陰性／溶媒対照の補正後の平均ＯＤ５５０）］×１００
【０３０８】
メラニン分析：吸光度の生データを取り込み、印刷ファイルとして保存し、Ｅｘｃｅｌのスプレッドシートにインポートした。各試験試料（０日目の未処置ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織から抽出したメラニン、７日目の各試験物品、陰性／溶媒または陽性対照により処置したＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）組織とする）およびメラニン標準品のＯＤ４９０値を求めた。試験試料および各メラニン標準品に関する補正後のＯＤ４９０値は、ブランクのウェルの平均ＯＤ４９０値を減算することによって求めた。標準曲線は、対応する補正後吸光度に対するｍｇ／ｍＬでの標準品の濃度（ｙ軸）としてプロットした。個々の組織のそれぞれにおけるメラニンの量は、標準曲線（線形）から補間した。最後に、各試験物品または対照処置群のメラニン濃度の平均値をそれぞれ、計算した。
結果
【０３０９】
図４は、試験物品、試験組成物、陽性対照および溶媒対照に関する平均組織生存率およびメラニン濃度の結果を要約している。組成物＃１および＃２を構成する化合物は、単一組成物中で組み合わされると、相乗効果を実証した。
【０３１０】
図５は、試験物品、試験組成物、陽性対照および溶媒対照に関する平均組織生存率およびメラニン濃度の結果を要約している。組成物＃２、＃３、＃４および＃５を構成する化合物は、単一組成物中で組み合わされると、相乗効果を実証した。
（実施例１３）
Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ由来の化合物および／またはその化学アナログを含有する組成物のメラニン形成能
【０３１１】
この検討の目的は、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ由来の化合物および／またはその化学アナログを含有する組成物に曝露されたＢ１６メラノサイトのメラニン形成および生存率を観察ならびに報告することである。
物質および試薬
【０３１２】
プレート培養用の培地は、Ｌ−グルタミン、ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびＬ−グルタミンを含まないＤＭＥＭを含む。アッセイ培地は、フェノールレッドおよびＬ−グルタミン、ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンおよびａＭＳＨを含まないＤＭＥＭを含む。他の試薬は、コウジ酸、ＤＭＳＯおよびＭＴＴを含む。試験する細胞は、Ｂ１６細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６４７５）となる。
プロトコール
【０３１３】
Ｂ１６メラノサイトは、７０％コンフルエントになるまで培養し、収穫する。４０００細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレートに細胞を播種し、一晩、付着させる。翌日、試験物品、試験組成物および対照をＢ１６アッセイ培地に希釈する。一晩、培地を吸引し、２００ｕｌの試験物品および対照を施用する。細胞を３７℃および１０％ＣＯ２で７２時間、インキュベートする。７２時間のインキュベート後、吸光度を５４０ｎｍで読み取る。培地を除去し、１ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴを含有するプレート培養用培地１００ｕｌと置き換え、３７℃および１０％ＣＯ２で、２時間、インキュベートする。ＭＴＴ培地を除去し、２００ｕｌの９５％エタノール／５％イソプロパノールにより置き換え、１５分間、振とうさせる。次に、ＭＴＴの吸光度を５７０ｎｍで読み取る。
結果
【０３１４】
組成物＃１〜５を含む、本発明の化合物および組成物は、メラニン形成を阻害することが予想される。本発明の組成物は、例えば、少なくとも１つの構成成分化合物に比べて、より強力なメラニン形成阻害活性を示すことが予想される。同様に、ある特定の組成物は、例えば、少なくとも１つの構成成分化合物に比べて、それほど有効ではないメラニン形成阻害活性を実証することが予想される。
（実施例１４）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性
【０３１５】
本発明の化合物および組成物は、メラノサイトアポトーシスを誘導し、メラノサイト活性、メラニン産生、メラニン濃度、メラノソーム生物発生および／またはメラノソーム輸送をモジュレートすると予想される。本発明の化合物および組成物のいくつかは、これらの生物学的過程にそれほど強力に影響を及ぼさないことも企図される。このような化合物および組成物は、より効力の高い化学種と比較して、より有利な毒性プロファイルを有することができる。
（実施例１５）
ｉｎ  ｖｉｖｏ効力
【０３１６】
本発明の化合物および組成物は、皮膚の美白、および様々な障害によって引き起こされる色素沈着過度／低色素沈着の改善を含めた、皮膚の色素沈着をモジュレートすると予想される。本発明の化合物および組成物は、例えば、半減期および吸収に関して、有利な薬物動態プロファイルを示すことがさらに予想される。ある特定の化合物は、より長い半減期を示す一方、他の化合物は、より短い半減期を示すこととなる。同様に、ある特定の化合物は、異なる吸収プロファイルを示し、一部の化合物は、完全に吸収されるのにより時間がかかり、他の化合物は完全に吸収されるのに時間はそれほどかからないであろう。
（実施例１６）
マラセジンおよびインジルビンの化学アナログの合成
ＡＢ１７５９０の合成
【０３１７】
図６Ａに示されている通り、化合物１ａ（２５．０ｇ、０．３５７ｍｏｌ、１．０当量）のテトラヒドロフラン（２５０ｍＬ）溶液に、０℃で臭化エチニルマグネシウム（ＴＨＦ中の０．５Ｍ、１．０７Ｌ、０．５３５ｍｏｌ、１．５当量）を加え、この反応混合物を室温まで温めて、２時間、撹拌した。次に、この混合物を塩化アンモニウムの飽和水溶液によりクエンチし、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル中の０〜１０％酢酸エチル）により精製すると、化合物１ｂ（９．５ｇ、２７％）が得られた。ＴＬＣ：ＰＥ：ＥＡ＝２０：１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物１ａ）＝０．３；Ｒｆ（化合物１ｂ）＝０．７。
【０３１８】
テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中の化合物１ｂ（９．５ｇ、９８．９６ｍｍｏｌ、１．０当量）の混合物に、窒素雰囲気下、０℃で６０％水素化ナトリウム（４．７ｇ、０．１１９ｍｏｌ、１．２当量）のジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）溶液を加えた。３０分後、０℃でジメチル硫酸（２２．４ｇ、０．１７８ｍｏｌ、１．８当量）を加えた。添加後、この反応混合物を室温まで温め、３０分間、室温で撹拌し、次に、酢酸（１ｍｌ）をゆっくりと加えた。生成物を反応混合物から、直接、蒸留した。こうして、化合物１ｃ（１０．０ｇ、９１％収率）が得られた。
【０３１９】
化合物１（８．０ｇ、２４．０２ｍｍｏｌ、１．０当量）および化合物１ｃ（２．９ｇ、２６．４３ｍｍｏｌ、１．１当量）のトリエチルアミン（８０ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下、室温でヨウ化第一銅（４５６ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ、０．１当量）およびＰｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（３３７ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ、０．０２当量）を加えた。この混合物を室温で２時間、撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニタリングした。この反応混合物を水により希釈し、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル中の０〜１０％酢酸エチル）により精製すると、化合物２（７．０ｇ、９２％）が得られた。ＴＬＣ：ＰＥ：ＥＡ＝１０：１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物１）＝０．８；Ｒｆ（化合物２）＝０．６。
【０３２０】
オーブン乾燥フラスコに、ジオキサン（６５０ｍＬ）中の二塩化白金（６９４ｍｇ、２．０６ｍｍｏｌ、０．１当量）、炭酸ナトリウム（３．３ｇ、３０．９５ｍｍｏｌ、１．５当量）、トリス（ペンタフルオロフェニル）ホスフィン（２．２ｇ、４．１３ｍｍｏｌ、０．２当量）、６−メチルインドール（４．８ｇ、４１．２７ｍｍｏｌ、２．０当量）および化合物２（６．５ｇ、２０．６３ｍｍｏｌ、１．０当量）の混合物を加えた。このフラスコを窒素により脱気して封止し、１６時間、１００℃に加熱した。この反応混合物の進行をＴＬＣによってモニタリングした。溶媒を減圧下で濃縮した。残留物を酢酸エチルにより希釈し、水、飽和ブラインで抽出した、有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル中の０〜１０％酢酸エチル）により精製すると、化合物３（３．０ｇ、３６％）が得られた。ＴＬＣ：ＰＥ：ＥＡ＝１０：１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物２）＝０．６；Ｒｆ（化合物３）＝０．２。
【０３２１】
化合物３（３．０ｇ、７．５０ｍｍｏｌ、１．０当量）のテトラヒドロフラン（３０ｍＬ）溶液に、０℃でナトリウムメタノレート（ＭｅＯＨ中の５Ｍ、６．０ｍＬ、２９．９８ｍｍｏｌ、４．０当量）を加えた。この反応混合物を室温まで温め、２時間、撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニタリングした。この反応混合物を減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル中の０〜１０％酢酸エチル）により精製すると、化合物４（１．５ｇ、６６％）が得られた。ＴＬＣ：ＰＥ：ＥＡ＝５：１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物３）＝０．７；Ｒｆ（化合物４）＝０．４。
【０３２２】
アルゴン下、乾燥した５００ｍＬの３つ口丸底フラスコに、０℃でジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）を加えた。次に、内温を５℃未満に維持しながら、１０分間かけて、オキシ塩化リン（１．２ｇ、７．６０ｍｍｏｌ、１．２当量）をゆっくりと加えた。０℃で３０分間、撹拌した後、内温を５℃未満に維持しながら、１０分間かけて、化合物４（１．９ｇ、６．３３ｍｍｏｌ、１．０当量）のジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）溶液をゆっくりと加えた。得られた混合物を、室温で１６時間、撹拌した。反応が完了した後（ヘキサン中の２０％酢酸エチルを使用して、ＴＬＣによりモニタリング）、この反応混合物を飽和水性炭酸水素ナトリウム（５０ｍＬ）に注ぎ入れて、１時間、撹拌した。得られた混合物を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）により抽出した。合わせた有機層を水、飽和ブラインにより洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水した。この溶媒をろ過して、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル中の１０〜５０％酢酸エチル）により精製すると、化合物５（１．８ｇ、８９％）が得られた。ＴＬＣ：ＰＥ：ＥＡ＝１：１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物４）＝０．８；Ｒｆ（化合物５）＝０．５。
【０３２３】
化合物５（１．８ｇ、５．４９ｍｍｏｌ、１．０当量）のテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）溶液に、０℃でジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（３．０ｇ、１３．７２ｍｍｏｌ、２．５当量）および４−ジメチルアミノピリジン（１．４ｇ、１１．２５ｍｏｌ、２．０５当量）を加えた。この反応混合物を室温まで温め、３時間、撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニタリングした。反応混合物を減圧下で濃縮し、残留物を酢酸エチルで希釈して、１Ｎ塩酸、飽和水性炭酸水素ナトリウム（３００ｍＬ）およびブライン（３００ｍＬ）により洗浄した。有機層を分離して無水硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過して濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル中の０〜１０％酢酸エチル）により精製すると、化合物６（２．４ｇ、８２％）が得られた。ＴＬＣ：ＰＥ：ＥＡ＝１０：１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物５）＝０．１；Ｒｆ（化合物６）＝０．５。
【０３２４】
化合物６（２．４ｇ、４．５５ｍｍｏｌ、１．０当量）のｔｅｒｔ−ブタノール（６０ｍＬ）溶液に、０℃で２−メチル−２−ブテン（３０ｍＬ）を加え、次いで亜塩素酸ナトリウム（８．２ｇ、９０．９１ｍｍｏｌ、２０．０当量）、リン酸二水素ナトリウム（１４．２ｇ、９０．９１ｍｍｏｌ、２０．０当量）および水（６０ｍＬ）を加えた。この混合物を室温までゆっくりと温め、１５時間、室温で撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニタリングした。この反応混合物をジクロロメタン（１００ｍＬ）により希釈し、分離した。有機層を水（８０ｍＬ）、ブライン（８０ｍＬ）により洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水して減圧下で濃縮すると、粗製化合物７（２．５ｇ、９９％）が得られた。ＴＬＣ：ＰＥ：ＥＡ＝２：１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物６）＝０．７；Ｒｆ（化合物７）＝０．３。
【０３２５】
化合物７（２．５ｇ、４．６０ｍｍｏｌ、１．０当量）のジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）溶液に、０℃で炭酸カリウム（９５２ｍｇ、６．８９ｍｍｏｌ、１．５当量）およびヨウ化メチル（９７８ｍｇ、６．８９ｍｍｏｌ、１．５当量）を加えた。この反応混合物を室温まで温め、２時間、撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニタリングした。この反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、水（１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル中の５〜１７％酢酸エチル）により精製すると、化合物８（２．３ｇ、８９％）が得られた。ＴＬＣ：ＰＥ：ＥＡ＝５：１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物７）＝０．１；Ｒｆ（化合物８）＝０．６。
【０３２６】
塩酸（ＥＡ中の３Ｍ、３０ｍＬ）中の化合物８（１．３ｇ、２．３３ｍｍｏｌ、１．０当量）の混合物を、室温で１６時間、撹拌した。反応をＴＬＣによってモニタリングした。次に、この混合物を減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル中の１０〜２５％酢酸エチル）により精製すると、化合物ＡＢ１７５９０（５０２ｍｇ、６１％）が黄色固体として得られた。ＴＬＣ：ＰＥ：ＥＡ＝３：１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物８）＝０．８；Ｒｆ（化合物ＡＢ１７５９０）＝０．５；ＬＣ−ＭＳ：３５９（Ｍ＋１）＋；１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ８．１２  （ｄ，  Ｊ  ＝  １９．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．９４  （ｓ，  １Ｈ），  ７．４２  （ｓ，  １Ｈ），  ７．３５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．１３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．０４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．９３  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １５．７，  ８．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ５．０４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．９５  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．４５  （ｓ，  ３Ｈ），  １．４２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ０．７８  −  ０．６８  （ｍ，  １Ｈ），  ０．６２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ４．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ０．５４  −  ０．４１  （ｍ，  ２Ｈ）．
ＡＢ１７６５３の合成
【０３２７】
図６Ｂに示されている通り、メタノール（１０ｍＬ）中の化合物１（７２１ｍｇ、３．２０ｍｍｏｌ、１．０当量）、化合物１ａ（５６０ｍｇ、３．２０ｍｍｏｌ、１．０当量）および炭酸ナトリウム（８６６ｍｇ、８．１７ｍｍｏｌ、２．５５当量）の混合物を窒素雰囲気下、室温で３時間、撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニタリングした。この反応の完了後、この混合物をろ過して、フィルターケーキをメタノールおよび水で洗浄すると、化合物ＡＢ１７６５３（９７９ｍｇ、８９％）が赤色固体として得られた。ＴＬＣ：ＰＥ／ＥＡ＝３／１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物１）＝０．６；Ｒｆ（化合物ＡＢ１７６５３）＝０．４；ＬＣ−ＭＳ：３３８．９５（Ｍ−１）−；１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）  δ１１．０１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２１．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ８．６４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．６２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．５５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．１８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．００  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．８，  ４．６  Ｈｚ，  ２Ｈ）．
ＡＢ１７６５４の合成
【０３２８】
図６Ｂに示されている通り、ピリジン（３０ｍＬ）中の化合物ＡＢ１７６５３（９７９ｍｇ、２．８８ｍｍｏｌ、１．０当量）およびヒドロキシルアミン塩酸塩（５２０ｍｇ、７．４９ｍｍｏｌ、２．６当量）の混合物を、窒素雰囲気下、１２０℃で２時間、撹拌した。反応混合物の進行をＬＣＭＳによってモニタリングした。この反応の完了後、混合物を減圧下で濃縮し、固体が現れるまで１Ｎ  ＨＣｌを加えた。この混合物をろ過して、フィルターケーキを１Ｎ  ＮａＯＨに溶解した。次に、３Ｎ  ＨＣｌを加えて、ｐＨ＝５に調整し、ろ過した。フィルターケーキを１Ｎ  ＨＣｌにより洗浄すると、化合物ＡＢ１７６５４（５００ｍｇ、４８％）が赤色固体として得られた。ＬＣ−ＭＳ：３５７．９５（Ｍ＋１）＋；１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）  δ  １３．５９  （ｓ，  １Ｈ），  １１．７１  （ｓ，  １Ｈ），  １０．８２  （ｓ，  １Ｈ），  ８．５３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．４２  −  ７．３５  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．１１  −  ６．９６  （ｍ，  ３Ｈ）．
ＡＢ１７６５５の合成
【０３２９】
図６Ｂに示されている通り、メタノール（１０ｍＬ）中の化合物２（６３７ｍｇ、３．８６ｍｍｏｌ、１．０当量）、化合物１ａ（６７６ｍｇ、３．８６ｍｍｏｌ、１．０当量）および炭酸ナトリウム（１０４４ｍｇ、９．８４ｍｍｏｌ、２．５５当量）の混合物を窒素雰囲気下、室温で３時間、撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニタリングした。この反応の完了後、混合物をろ過して、フィルターケーキをメタノールおよび水で洗浄すると、化合物ＡＢ１７６５５（１０２７ｍｇ、９５％）が赤色固体として得られた。ＬＣ−ＭＳ：２８１．０５（Ｍ＋１）＋；１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）  δ１１．０６  （ｓ，  １Ｈ），  １０．８６  （ｓ，  １Ｈ），  ８．５４  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １０．５，  ２．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．６７  −  ７．５３  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４１  −  ７．３８  （ｍ，  １Ｈ），  ７．０９  −  ６．９８  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．８５  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．５，  ４．８  Ｈｚ，  １Ｈ）．
ＡＢ１７６５６の合成
【０３３０】
図６Ｂに示されている通り、ピリジン（３０ｍＬ）中の化合物ＡＢ１７６５５（１０２７ｍｇ、３．６７ｍｍｏｌ、１．０当量）およびヒドロキシルアミン塩酸塩（６６３ｍｇ、９．５４ｍｍｏｌ、２．６当量）の混合物を、窒素雰囲気下、１１０℃で２時間、撹拌した。反応混合物の進行をＬＣＭＳによってモニタリングした。この反応の完了後、混合物を減圧下で濃縮し、固体が現れるまで１Ｎ  ＨＣｌを加えた。この混合物をろ過して、フィルターケーキを１Ｎ  ＮａＯＨに溶解した。次に、３Ｎ  ＨＣｌを加えて、ｐＨ＝５に調整し、ろ過した。フィルターケーキを１Ｎ  ＨＣｌにより洗浄すると、化合物ＡＢ１７６５６（５００ｍｇ、４８％）が赤色固体として得られた。ＬＣ−ＭＳ：２９６．００（Ｍ＋１）＋；１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）  δ１３．６０  （ｓ，  １Ｈ），  １１．７７  （ｓ，  １Ｈ），  １０．６９  （ｓ，  １Ｈ），  ８．４３  （ｓ，  １Ｈ），  ８．２０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．０２  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９１  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ４．９  Ｈｚ，  １Ｈ）．
ＡＢ１７６５７の合成
【０３３１】
図６Ｂに示されている通り、メタノール（１０ｍＬ）中の化合物３（３６２ｍｇ、２．４６ｍｍｏｌ、１．０当量）、化合物１ａ（４３１ｍｇ、２．４６ｍｍｏｌ、１．０当量）および炭酸ナトリウム（６６６ｍｇ、６．２８ｍｍｏｌ、２．５５当量）の混合物を窒素雰囲気下、室温で３時間、撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニタリングした。この反応の完了後、この混合物をろ過して、フィルターケーキをメタノールおよび水で洗浄すると、化合物４（６０６ｍｇ、９３％）が得られた。ＴＬＣ：ＰＥ／ＥＡ＝１／１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物３）＝０．７；Ｒｆ（化合物４）＝０．５。
【０３３２】
ピリジン（２０ｍＬ）中の化合物４（６０６ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ、１．０当量）およびヒドロキシルアミン塩酸塩（４１８ｍｇ、６．０１ｍｍｏｌ、２．６当量）の混合物を、窒素雰囲気下、１２０℃で２時間、撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニタリングした。この反応の完了後、混合物を減圧下で濃縮し、固体が現れるまで１Ｎ  ＨＣｌを加えた。この混合物をろ過して、フィルターケーキを１Ｎ  ＮａＯＨに溶解した。次に、３Ｎ  ＨＣｌを加えて、ｐＨ＝５に調整し、ろ過した。フィルターケーキを１Ｎ  ＨＣｌにより洗浄すると、ＡＢ１７６５７（５００ｍｇ、７８％）が褐色固体として得られた。ＴＬＣ：ＰＥ／ＥＡ＝１／１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物４）＝０．５；Ｒｆ（化合物ＡＢ１７６５７）＝０．４；ＬＣ−ＭＳ：２７８．１０（Ｍ＋１）＋；１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）  δ１３．６０  （ｓ，  １Ｈ），  １１．７７  （ｓ，  １Ｈ），  １０．６９  （ｓ，  １Ｈ），  ８．４３  （ｓ，  １Ｈ），  ８．２０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．０２  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９１  （ｓ，  １Ｈ），  ６．８３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ４．９  Ｈｚ，  １Ｈ）．
ＡＢ１７６５８の合成
【０３３３】
図６Ｂに示されている通り、アセトニトリル（１０ｍＬ）中の化合物５ａ（３３７ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ、１．０当量）、化合物５ｂ（５５４ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ、１．０当量）および水酸化カリウム（１１１４ｍｇ、３．４６ｍｍｏｌ、２．０当量）の混合物を窒素雰囲気下、３５℃で１．５時間、撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニタリングした。反応の完了後、この混合物を減圧下で濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーによって残留物を精製すると、化合物５ｃ（４３６ｍｇ、９９％）が得られた。ＴＬＣ：ＰＥ／ＥＡ＝１／１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物５ａ）＝０．８；Ｒｆ（化合物５ｃ）＝０．５。
【０３３４】
メタノール（１０ｍＬ）中の化合物５（３３０ｍｇ、１．７２ｍｍｏｌ、１．０当量）、化合物５ｃ（４３６ｍｇ、１．７２ｍｍｏｌ、１．０当量）および炭酸ナトリウム（４６５ｍｇ、４．３８ｍｍｏｌ、２．５５当量）の混合物を、窒素雰囲気下、室温で３時間、撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニタリングした。この反応の完了後、この混合物をろ過して、フィルターケーキをメタノールおよび水で洗浄すると、化合物６（６１７ｍｇ、９３％）が得られた。ＴＬＣ：ＰＥ／ＥＡ＝１／１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物５）＝０．５；Ｒｆ（化合物６）＝０．４。
【０３３５】
ピリジン（２０ｍＬ）中の化合物６（６１７ｍｇ、１．６０ｍｍｏｌ、１．０当量）およびヒドロキシルアミン塩酸塩（２９０ｍｇ、４．１７ｍｍｏｌ、２．６当量）の混合物を、窒素雰囲気下、１１０℃で２時間、撹拌した。反応混合物の進行をＴＬＣによってモニタリングした。この反応の完了後、混合物を減圧下で濃縮し、固体が現れるまで１Ｎ  ＨＣｌを加えた。この混合物をろ過して、フィルターケーキを１Ｎ  ＮａＯＨに溶解した。次に、３Ｎ  ＨＣｌを加えて、ｐＨ＝５に調整し、ろ過した。フィルターケーキを１Ｎ  ＨＣｌにより洗浄すると、化合物ＡＢ１７６５８（５００ｍｇ、７８％）が赤色固体として得られた。ＴＬＣ：ＰＥ／ＥＡ＝１／１、２５４ｎｍ；Ｒｆ（化合物６）＝０．４；Ｒｆ（化合物ＡＢ１７６５８）＝０．３；ＬＣ−ＭＳ：４０２．９５（Ｍ＋１）＋；１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）  δ１１．８６  （ｓ，  １Ｈ），  １１．３９  （ｓ，  １Ｈ），  ９．４０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．３３  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．０６  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．６，  ２．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．５９  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．４，  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．４３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．０２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．６  Ｈｚ，  １Ｈ）．
（実施例１７）
マラセジン、他のＭａｌａｓｓｅｚｉａ由来の化合物およびそれらの化学アナログの光保護特性のｉｎ  ｖｉｖｏ評価
マラセジン１％製剤
【０３３６】
この検討において使用されるマラセジン１％製剤は、以下の成分：水（水（ａｑｕａ））−６５．９３９％；ジメチルイソソルバイド−２０．０００％；オリーブ油グリセレス−８エステル−３．０００％；グリセリン−２．９９１％；ヤシアルカン−２．７００％；アクリル酸ヒドロキシエチル／アクリロイルジメチルタウリン酸のナトリウムのコポリマー−１．７００％；マラセジン−１．０００％；ペンチレングリコール−１．０００％；フェノキシエタノール−０．６４０％；ココ−カプリレート／カプレート−０．３００％；カプリリルグリコール−０．２００％；クロルフェネシン−０．１６０％；イソステアリン酸ソルビタン−０．１４０％；トコフェロール−０．１００％；ポリソルベート６０−０．０８０％；およびＥＤＴＡ二ナトリウム−０．０５０％を含有した。
実験設計
【０３３７】
皮膚タイプＩＶの３９歳の女性を、この概念実証検討に含ませた。
【０３３８】
実験の１日目に、対象を評価し、ターゲット型ブロードバンドＤｕａｌｉｇｈｔ  ＵＶＢ装置を使用して、最小量の紅斑量（「ＭＥＤ」）を決定した。６つの正方形の型を試験対象の背中の左下（１．５ｃｍ×１．５ｃｍ）に置いた。図７を参照されたい。
【０３３９】
対象の皮膚タイプに関するＭＥＤ光試験量（ｐｈｏｔｏ  ｔｅｓｔ  ｄｏｓｅ）をｍＪ／ｃｍ２単位で図８に列挙する。照射して２４時間後に、対象をＭＥＤ評価に戻した。図１２に示されている通り、対象のＭＥＤは１２０ｍＪであった。
【０３４０】
続いて、対象は、７日間、１日２回、背中の右側の上の試験正方形にマラセジン１％を施用した。第２の右の下側の正方形を、４日目〜７日目に１日２回、処置し、第３の中央の正方形には、７日目に１回、施用した。生成物ビヒクルは、背中の左側に７日間、１日２回、施用した。図１３を参照されたい。対象は、７日目に、照射を受けるため、研究施設に戻された。図９を参照されたい。各試験部位に、１２０ｍＪのＵＶＢ曝露を照射した。対象を、光毒性／光保護を評価するために、２４時間後に戻した。図１４を参照されたい。
【０３４１】
この対象は実験を継続し、合計で１４日間、マラセジン１％を受けた。図１５〜１６は、以下の処置に曝露させた対象の皮膚の領域を示している：部位１４に、マラセジン１％を１４日間、１日２回、施用した。部位１０に、１１日間、１日２回、マラセジン１％を施用した。部位８に、８日間、１日２回、マラセジン１％を施用した。部位３に、３日間、１日２回、マラセジン１％を施用した。部位１に、１回、マラセジン１％を施用した。ビヒクル部位に、それぞれ、７日間および９日間、１日２回、ビヒクルを施用した。
結果
【０３４２】
図１４に示されている通り、ＵＶＢ曝露の２４時間後に、対象は、ビヒクル試験部位において、１プラス〜２プラスの紅斑を示した。紅斑スケールに関しては、図１１を参照されたい。対照的に、マラセジン１％を７日間処置した部位では、紅斑はそれほど顕著ではなかった（軽度）。３日間、処置した部位の評価は、最小限の紅斑を示し、１日間の施用部位には紅斑はなかった。メグザメーターＭＸ１６を使用して各部位から比色分析測定値を得たところ、臨床観察が裏付けられた。最大紅斑の読取り値をビヒクル部位、次いで、マラセジンによる７日間の処置部位で観察した。最低値は、マラセジンの場合、それぞれ、３日目および１日目の部位に観察された。図９を参照されたい。
【０３４３】
対象は実験を継続し、１４日目にＵＶＢの繰り返し照射を受け、１５日目に解明を行うために戻された。図１５を参照されたい。１５日目の臨床評価により、７日目の場合、ビヒクル部位に中程度の紅斑があること、および９日目には顕著に少ないことが明らかになった。図１６を参照されたい。より少ない紅斑（軽度）が、１４日目、１０日目および８日目の部位を含めた、マラセジン１％処置部位において認められた。最小限の紅斑が、１日目および３日目に関して、マラセジン１％の部位において認められた。比色分析の読取り値を各部位から得て、紅斑およびメラニン指数を測定した。結果により、マラセジン１％により処置した部位において、紅斑がより少ないという臨床的観察が支持された。図１０を参照されたい。
【０３４４】
９日目にビヒクル部位から、ならびに１日目および３日目の場合、マラセジン１％により処置した部位から生検を採取した。メラノサイトの定量およびａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ検討のために、試験体を、ヘマトキシリンおよびエオシン、フォンタナマッソン染色、ならびにＭＡＲＴ  Ｉに関して分析した。
【０３４５】
診断：（Ａ）皮膚  −  処置１日目（マラセジン１％）：バスケットウィーブ状角層、正常に見えるメラノサイトは（Ｍａｒｔ−１を使用するイムノペルオキシダーゼ染色により確認）および表皮メラニン（フォンタナマッソンによるイムノペルオキシダーゼ染色により確認）。
【０３４６】
診断：（Ｂ）皮膚  −  処置３日目（マラセジン１％）：バスケットウィーブ状角層、ＣおよびＤと比べた場合、それほど樹状性ではないメラノサイト（ＭＡＲＴ−１／メランＡを使用するイムノペルオキシダーゼ染色により確認）、および不連続領域として、表皮メラニンのわずかな低下を伴う（フォンタナマッソンによるイムノペルオキシダーゼ染色により確認）。
【０３４７】
診断：（Ｃ）皮膚  −  ビヒクル：正常に見える表皮メラノサイト（Ｍａｒｔ−１を使用するイムノペルオキシダーゼ染色により確認）、および表皮メラニン（フォンタナマッソンによるイムノペルオキシダーゼ染色により確認）。
【０３４８】
診断：（Ｄ）皮膚  −  正常：正常に見える表皮メラノサイト（Ｍａｒｔ−１を使用するイムノペルオキシダーゼ染色により確認）、および表皮メラニン（フォンタナマッソンによるイムノペルオキシダーゼ染色により確認）。
結論
【０３４９】
この概念実証検討の結果により、マラセジンのＵＶ保護特性が実証される。
【０３５０】
追加の患者を含むさらなる検討により、マラセジンの等価なまたはより効果的なＵＶ保護特性が実証されると構想される。追加検討により、マラセジンにより誘導される光保護に関連する分子シグナル伝達経路が解明されることも構想される。
参考文献
【化５−１】
2021535123.tif 000026
【化５−２】
2021535123.tif 000027
【化５−３】
2021535123.tif 000028
【０３５１】
本出願に引用されているすべての書類が、あたかも、本明細書において完全に列挙されているかのごとく参照により本明細書に組み込まれている。
【０３５２】
本発明の例示的な実施形態が本明細書に記載されているが、本発明は、記載されているものに限定されないこと、および本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、様々な他の変更または修正が当業者によって行われ得ることを理解すべきである。
【図１−１】
2021535123.tif 000029
【図１−２】
2021535123.tif 000030
【図２−１】
2021535123.tif 000031
【図２−２】
2021535123.tif 000032
【図３−１】
2021535123.tif 000033
【図３−２】
2021535123.tif 000034
【図３−３】
2021535123.tif 000035
【図３−４】
2021535123.tif 000036
【図４】
2021535123.tif 000037
【図５】
2021535123.tif 000038
【図６−１】
2021535123.tif 000039
【図６−２】
2021535123.tif 000040
【図７】
2021535123.tif 000041
【図８】
2021535123.tif 000042
【図９】
2021535123.tif 000043
【図１０−１】
2021535123.tif 000044
【図１０−２】
2021535123.tif 000045
【図１１】
2021535123.tif 000046
【図１２】
2021535123.tif 000047
【図１３】
2021535123.tif 000048
【図１４】
2021535123.tif 000049
【図１５】
2021535123.tif 000050
【図１６】
2021535123.tif 000051
【国際調査報告】
2021535123.tif 000052
2021535123.tif 000053
2021535123.tif 000054
2021535123.tif 000055
2021535123.tif 000056
2021535123.tif 000057