(57)【要約】本開示は、高度に不均一な環境的供給源から新規殺虫タンパク質を発見するためのプラットフォームを提示する。方法論は、幅広いクラスの未知の微生物多様性およびその結果としてのプロテオームへのアクセスを可能にする、メタゲノム富化手順および特有の遺伝子増幅技法を利用する。開示されている殺虫タンパク質発見プラットフォーム（ＩＰＤＰ）は、計算的に駆動され得、分子生物学、自動化および先進的機械学習プロトコールを統合することができる。プラットフォームは、研究者が、特徴付けされていない複合的な微生物環境試料によって産生される未利用の殺虫タンパク質の膨大なレパートリーに迅速かつ正確にアクセスすることを可能にするであろう。殺虫タンパク質発見プラットフォームを利用して発見された、希少なクラスの殺虫タンパク質由来の新たに発見されたポア形成毒素（ＰＦＴ）の群もまた本明細書に提示されている。
2021514643.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対し少なくとも約８０％の配列同一性を有する、または（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を有するタンパク質に対し少なくとも約９１％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を有する殺虫タンパク質をコードする、単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号２、配列番号４、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対し少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する殺虫タンパク質をコードする、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対し少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する殺虫タンパク質をコードする、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対し少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する殺虫タンパク質をコードする、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する殺虫タンパク質をコードする、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
目的の宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
前記目的の宿主細胞が、植物細胞である、請求項６に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９および配列番号２１からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
（ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対し少なくとも約８０％の配列同一性を有する、または（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を有するタンパク質に対し少なくとも約９１％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を有する殺虫タンパク質をコードする核酸分子を含むヌクレオチド構築物であって、前記核酸分子が、異種調節エレメントに作動可能に連結されている、ヌクレオチド構築物。
【請求項１０】
前記核酸分子が、配列番号２、配列番号４、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対し少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する殺虫タンパク質をコードする、請求項９に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項１１】
前記核酸分子が、配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対し少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する殺虫タンパク質をコードする、請求項９に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項１２】
前記核酸分子が、配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対し少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する殺虫タンパク質をコードする、請求項９に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項１３】
前記核酸分子が、配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する殺虫タンパク質をコードする、請求項９に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項１４】
前記異種調節エレメントが、プロモーターである、請求項９〜１３のいずれか一項に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項１５】
発現カセットに含有される、請求項９〜１４のいずれか一項に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項１６】
前記異種調節エレメントが、植物においてコードされた前記タンパク質を発現することができる、請求項９〜１５のいずれか一項に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項１７】
前記核酸分子が、目的の宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項９〜１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項１８】
前記目的の宿主細胞が、植物細胞である、請求項１７に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項１９】
前記核酸分子が、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９および配列番号２１からなる群より選択される、請求項９〜１８のいずれか一項に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項２０】
請求項９〜１９のいずれか一項に記載のヌクレオチド構築物を含む、発現ベクター。
【請求項２１】
請求項９〜１９のいずれか一項に記載のヌクレオチド構築物を含む、プラスミド。
【請求項２２】
請求項９〜１９のいずれか一項に記載のヌクレオチド構築物を含む、宿主細胞。
【請求項２３】
昆虫を死滅させる方法であって、前記昆虫を請求項２２に記載の宿主細胞と接触させるステップを含む、方法。
【請求項２４】
請求項９〜１９のいずれか一項に記載のヌクレオチド構築物を含む、原核宿主細胞。
【請求項２５】
請求項９〜１９のいずれか一項に記載のヌクレオチド構築物を含む、真核宿主細胞。
【請求項２６】
請求項９〜１９のいずれか一項に記載のヌクレオチド構築物を含む、植物細胞。
【請求項２７】
請求項９〜１９のいずれか一項に記載のヌクレオチド構築物を含む、単子葉類植物細胞。
【請求項２８】
請求項９〜１９のいずれか一項に記載のヌクレオチド構築物を含む、双子葉類植物細胞。
【請求項２９】
請求項９〜１９のいずれか一項に記載のヌクレオチド構築物で安定に形質転換された植物。
【請求項３０】
請求項９〜１９のいずれか一項に記載のヌクレオチド構築物で安定に形質転換された植物によって作出される種子。
【請求項３１】
（ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０もしくは配列番号２２に対し少なくとも約８０％の配列同一性を有する、または（ｉｉ）配列番号８に対し少なくとも約９１％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む、単離された殺虫タンパク質。
【請求項３２】
配列番号２、配列番号４、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０または配列番号２２に対し少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の単離された殺虫タンパク質。
【請求項３３】
配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０または配列番号２２に対し少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の単離された殺虫タンパク質。
【請求項３４】
配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０または配列番号２２に対し少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の単離された殺虫タンパク質。
【請求項３５】
配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０または配列番号２２から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の単離された殺虫タンパク質。
【請求項３６】
（ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０もしくは配列番号２２に対し少なくとも約８０％の配列同一性を有する、または（ｉｉ）配列番号８に対し少なくとも約９１％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む、組換え殺虫タンパク質。
【請求項３７】
配列番号２、配列番号４、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０または配列番号２２に対し少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の組換え殺虫タンパク質。
【請求項３８】
配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０または配列番号２２に対し少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の組換え殺虫タンパク質。
【請求項３９】
配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０または配列番号２２に対し少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の組換え殺虫タンパク質。
【請求項４０】
配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０または配列番号２２から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の組換え殺虫タンパク質。
【請求項４１】
ａ．（ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有する、または（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有する、アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種調節配列とを含むＤＮＡ構築物
を含む、トランスジェニック植物細胞。
【請求項４２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項４１に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４３】
前記異種調節エレメントが、プロモーターである、請求項４１に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４４】
単子葉類種に由来する、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４５】
トウモロコシ、コムギ、カラスムギまたはイネに由来する、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４６】
双子葉類種に由来する、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４７】
ワタ、ジャガイモまたはダイズに由来する、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４８】
農業用条播作物種に由来する、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４９】
ａ．（ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有する、または（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有する、アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、
ｂ．前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種調節配列と
を含むＤＮＡ構築物で安定に形質転換された、トランスジェニック植物。
【請求項５０】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項４９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５１】
前記異種調節エレメントが、プロモーターである、請求項４９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５２】
単子葉類種である、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５３】
トウモロコシ、コムギ、カラスムギまたはイネである、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５４】
双子葉類種である、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５５】
ワタ、ジャガイモまたはダイズである、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５６】
農業用条播作物種に由来する、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５７】
請求項４９〜５６のいずれか一項に記載の植物によって作出される種子。
【請求項５８】
請求項４９〜５６のいずれか一項に記載の植物から作出される後代植物。
【請求項５９】
モナライシンタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ殺虫タンパク質、Ｃｒｙタンパク質、Ｃｙｔタンパク質、栄養型殺虫タンパク質、毒素複合体タンパク質、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物をさらに含む、請求項４９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６０】
標的有害生物を死滅させる方法であって、請求項４９〜５６および５９のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物をある区域に提供するステップを含み、前記標的有害生物が、前記トランスジェニック植物に曝露される、方法。
【請求項６１】
前記標的有害生物が、前記トランスジェニック植物を摂食する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
殺有害生物タンパク質に対し抵抗性である標的有害生物を死滅させる方法であって、請求項４９〜５６および５９のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物をある区域に提供するステップを含み、前記標的有害生物が、前記トランスジェニック植物に曝露され、前記標的有害生物が、モナライシンタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ殺虫タンパク質、Ｃｒｙタンパク質、Ｃｙｔタンパク質、栄養型殺虫タンパク質、毒素複合体タンパク質、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択されるタンパク質に対し抵抗性である、方法。
【請求項６３】
殺有害生物タンパク質に対し抵抗性である標的有害生物を死滅させる方法であって、請求項４９〜５６および５９のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物をある区域に提供するステップを含み、前記標的有害生物が、前記トランスジェニック植物を摂食し、前記標的有害生物が、モナライシンタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ殺虫タンパク質、Ｃｒｙタンパク質、Ｃｙｔタンパク質、栄養型殺虫タンパク質、毒素複合体タンパク質、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択されるタンパク質に対し抵抗性である、方法。
【請求項６４】
標的有害生物を死滅させる方法であって、請求項４９〜５６および５９のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物をある区域に提供するステップを含み、前記標的有害生物が、前記トランスジェニック植物に曝露され、前記標的有害生物が、甲虫目、双翅目、膜翅目、鱗翅目、半翅目、直翅目、総翅目または革翅目のメンバーである、方法。
【請求項６５】
ａ．（ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有する、または（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有する、アミノ酸配列を有する単離された殺虫タンパク質と、
ｂ．農業的に許容される担体と
を含む、殺虫組成物。
【請求項６６】
前記単離された殺虫タンパク質が、配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項６５に記載の殺虫組成物。
【請求項６７】
前記単離された殺虫タンパク質が、殺虫有効量で存在する、請求項６５に記載の殺虫組成物。
【請求項６８】
前記農業的に許容される担体が、アジュバント、不活性構成成分、分散剤、界面活性剤、固着剤、粘着付与剤、結合剤、天然または再生ミネラル物質、溶媒、湿潤剤、肥料、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項６５〜６７のいずれか一項に記載の殺虫組成物。
【請求項６９】
乾燥固体として製剤化された、請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の殺虫組成物。
【請求項７０】
液体として製剤化された、請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の殺虫組成物。
【請求項７１】
葉面適用のために製剤化された、請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の殺虫組成物。
【請求項７２】
畝間適用のために製剤化された、請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の殺虫組成物。
【請求項７３】
種子コーティングまたは種子処理として製剤化された、請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の殺虫組成物。
【請求項７４】
少なくとも１種の追加的な殺有害生物化合物をさらに含む、請求項６５〜７３のいずれか一項に記載の殺虫組成物。
【請求項７５】
前記少なくとも１種の追加的な殺有害生物化合物が、モナライシンタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ殺虫タンパク質、Ｃｒｙタンパク質、Ｃｙｔタンパク質、栄養型殺虫タンパク質、毒素複合体タンパク質、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項７４に記載の殺虫組成物。
【請求項７６】
除草化合物をさらに含む、請求項６５〜７５のいずれか一項に記載の殺虫組成物。
【請求項７７】
標的有害生物を死滅させる方法であって、前記標的有害生物に、請求項６５〜７６のいずれか一項に記載の殺虫組成物を適用するステップを含む、方法。
【請求項７８】
標的有害生物を死滅させる方法であって、場所に、請求項６５〜７６のいずれか一項に記載の殺虫組成物を適用するステップを含み、前記標的有害生物が、前記場所と接触する、方法。
【請求項７９】
標的有害生物を死滅させる方法であって、作物に、請求項６５〜７６のいずれか一項に記載の殺虫組成物を適用するステップを含み、前記標的有害生物が、前記作物と接触する、方法。
【請求項８０】
標的有害生物を死滅させる方法であって、作物に、請求項６５〜７６のいずれか一項に記載の殺虫組成物を適用するステップを含み、前記標的有害生物が、前記作物と接触し、前記標的有害生物が、甲虫目、双翅目、膜翅目、鱗翅目、半翅目、直翅目、総翅目または革翅目のメンバーである、方法。
【請求項８１】
（ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０もしくは配列番号２２に対し少なくとも約８０％の配列同一性を有する、または（ｉｉ）配列番号８に対し少なくとも約９１％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む殺虫タンパク質を含む、細胞ライセート。
【請求項８２】
配列番号２、配列番号４、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０または配列番号２２に対し少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む殺虫タンパク質を含む、請求項８１に記載の細胞ライセート。
【請求項８３】
配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０または配列番号２２に対し少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む殺虫タンパク質を含む、請求項８１に記載の細胞ライセート。
【請求項８４】
配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０または配列番号２２に対し少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む殺虫タンパク質を含む、請求項８１に記載の細胞ライセート。
【請求項８５】
配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２から選択されるアミノ酸配列を含む殺虫タンパク質を含む、請求項８１に記載の細胞ライセート。
【請求項８６】
標的有害生物を死滅させる方法であって、前記標的有害生物に、請求項８１〜８５のいずれか一項に記載の細胞ライセートを適用するステップを含む、方法。
【請求項８７】
標的有害生物を死滅させる方法であって、前記標的有害生物に、（ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有する、または（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列に対し少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有する、アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する宿主細胞を適用するステップを含む、方法。
【請求項８８】
前記宿主細胞が、配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記宿主細胞が、原核宿主細胞である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記宿主細胞が、前記ポリヌクレオチドを天然に発現する、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
前記宿主細胞が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に由来する、請求項８７に記載の方法。
【請求項９２】
前記標的有害生物が、甲虫目、双翅目、膜翅目、鱗翅目、半翅目、直翅目、総翅目または革翅目のメンバーである、請求項８７〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
殺虫タンパク質をコードするＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来のＤＮＡが富化されたゲノムライブラリーを構築するための方法であって、
ａ．１種または複数の微生物を含む初期試料を提供するステップと、
ｂ．前記初期試料を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来の種の成長を富化する固体栄養限定培地に曝露し、これにより、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．が富化されたその後の試料をもたらすステップと、
ｃ．前記その後の富化された試料からＤＮＡを単離するステップと、
ｄ．前記単離されたＤＮＡからＤＮＡを抽出し、標的殺虫タンパク質遺伝子を増幅するために選択されたプライマーによる縮重ＰＣＲを行うステップと、
ｅ．前記ＰＣＲ増幅されたＤＮＡをプラスミドにクローニングするステップと、
ｆ．前記プラスミドから前記クローニングされたＤＮＡを配列決定するステップと
を含む、方法。
【請求項９４】
前記配列決定されたＤＮＡをゲノムライブラリーへとアセンブルするステップをさらに含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記配列決定されたＤＮＡ内の殺虫タンパク質遺伝子を同定するステップをさらに含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記配列決定されたＤＮＡ内の殺虫タンパク質遺伝子を同定するステップをさらに含み、前記同定された殺虫タンパク質遺伝子が、未知のものである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
隠れマルコフモデルを利用して、前記配列決定されたＤＮＡ内の殺虫タンパク質遺伝子を同定するステップをさらに含む、請求項９３、９５および９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記配列決定されたＤＮＡ内の殺虫タンパク質遺伝子を同定するステップをさらに含み、前記同定された殺虫タンパク質遺伝子が、配列番号１、３、７、１１、１３、１５、１７、１９および２１からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９９】
前記配列決定されたＤＮＡ内の殺虫タンパク質遺伝子を同定するステップをさらに含み、前記同定された殺虫タンパク質遺伝子が、配列番号２、４、８、１２、１４、１６、１８、２０および２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、請求項９３に記載の方法。
【請求項１００】
前記プライマーが、配列番号８７に対し少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする標的殺虫タンパク質遺伝子を増幅するために選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項１０１】
前記初期試料が、土壌に由来する、請求項９３に記載の方法。
【請求項１０２】
請求項９３に記載の方法によって構築される、殺虫タンパク質をコードするＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来のＤＮＡが富化された殺虫ゲノムライブラリー。
【請求項１０３】
表６におけるＨＭＭを使用してスコア化またはマッチされたときに、ａ）５２１．５のビットスコアのもしくはそれを上回るスコアを得るアミノ酸配列、および／またはｂ）７．９ｅ−１６１に満たないもしくはそれに等しいＥ値でマッチするアミノ酸配列を含む、殺虫タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年３月２日に出願された米国特許仮出願第６２／６３７，５１５号に対する優先権の利益を主張するものであり、その全体は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表に関する記載
本願に関連する配列表は、書面の写しの代わりにテキスト形式で提供され、これにより参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、ＺＹＭＲ＿０２２＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、ほぼ１６７ＫＢであり、２０１９年２月２７日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出されている。
【０００３】
分野
本開示は、高度に不均一な環境的供給源から新規殺虫タンパク質を発見するためのアプローチを対象にする。方法論は、幅広いクラスの未知の微生物多様性およびその結果としてのプロテオームへのアクセスを可能にする、メタゲノム富化手順および特有の遺伝子増幅技法を利用する。
【０００４】
開示されている殺虫タンパク質発見プラットフォーム（ＩＰＤＰ）は、計算的に駆動され得、分子生物学、自動化および先進的機械学習プロトコールを統合することができる。プラットフォームは、研究者が、特徴付けされていない複合的な微生物環境試料によって産生される未利用の殺虫タンパク質の膨大なレパートリーに迅速かつ正確にアクセスすることを可能にするであろう。
【０００５】
殺虫タンパク質発見プラットフォームを利用して発見された、希少なクラスの殺虫タンパク質由来の新たに発見されたポア形成毒素（ＰＦＴ）の群もまた本明細書に提示されている。
【背景技術】
【０００６】
２０５０年までに、地球の人口は、９０億人超に達しているであろうと推定される。国連のプロジェクトにおける農業の専門家による推定によると、このように多くの世界人口養うためには、総食物生産を７０％増加させて、将来の需要を満たす必要がある。この課題は、淡水資源の縮小、限られた耕作可能地の供給、エネルギー価格の上昇、投入コストの増加、および現代の条播作物（ｒｏｗ  ｃｒｏｐ）農業に伴う環境懸念を含む、多数の要因によって深刻になる。
【０００７】
我々の世界的な農産業に直面する最も差し迫った懸念の１つであり続けるであろう、長年の問題は、殺有害生物剤の圧力、ならびにそれに端を発する関連する収量低下および生産性低下である。伝統的な合成化学物質は、農家が、問題のある昆虫と戦うのを助けることに成功したが、これらの化学物質は、ヒトの健康に対するその影響および潜在的な有害環境効果に関する懸念による増加しつつある精査に直面する。結果的に、増えつつある世界人口の必要を満たすために、農業上の有害生物に対抗するためのバイオテクノロジーによる解決法に対する需要が増加するであろう。
【０００８】
主要なバイオテクノロジーによる殺有害生物剤解決法の１つは、グラム陽性、胞子形成細菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）によってもたらされる。Ｂｔ細菌は、昆虫病原体として同定され、その殺虫活性は、Ｃｒｙ遺伝子によってコードされる副胞子（ｐａｒａｓｐｏｒａｌ）結晶に起因し、そのうち、１００種を超える公知アイソフォームが存在する。この観察は、ある特定の昆虫種の防除のための、Ｂｔ細菌に基づくバイオ殺虫剤の開発をもたらした。そこで、植物を、Ｂｔ殺虫タンパク質を発現するように遺伝子操作し、これにより、植物への外部適用の必要が軽減された。しかし、化学殺虫剤の連続的使用により昆虫抵抗性が発生する状況と同様に、植物におけるこれらの殺虫性Ｂｔタンパク質の連続的発現もまた、標的有害生物集団における抵抗性に対する強い選択を課す。結果的に、産業は、Ｂｔ作物に対し抵抗性になった憂慮すべき比率の昆虫集団を知った。さらに、Ｂｔタンパク質は、限られた範囲の活性を有し、現在問題のある昆虫種のいくつかに対して有効ではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
よって、膨張する世界人口、伝統的な化学殺虫剤に関連する環境上の懸念、およびＢｔ形質に対する高まりつつある昆虫抵抗性を考慮すると、当技術分野において、現代農業に有用なバイオテクノロジー製品に取り込むことができる、新規殺虫タンパク質の同定の必要が大いにある。
【００１０】
本開示は、現代の条播作物農業において利用することができる、新規殺虫タンパク質を提供する。これらの殺虫タンパク質は、植物種への直接的適用のためのスタンドアロン製品へと開発することができる、または発現のために宿主植物のゲノムに取り込むことができる。
【００１１】
伝統的な合成化学殺虫剤とは異なり、教示されている殺虫タンパク質は、環境上の懸念を提起しない。さらに、殺虫タンパク質は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）にコードされる配列に由来する現在産業標準のＣｒｙタンパク質製品を上回るいくつかの利点を有する、新たに発見されたクラスに属する。
【００１２】
新規殺虫タンパク質それ自体の他に、本開示は、特徴付けされていない複合的な微生物環境試料によって産生される未利用の殺虫タンパク質の膨大なレパートリーにアクセスすることにより、追加的な殺虫タンパク質を発見するためのプラットフォームを提供する。
【００１３】
殺虫タンパク質発見プラットフォーム（ＩＰＤＰ）は、幅広いクラスの未知の微生物多様性およびその結果としてのプロテオームへのアクセスを可能にする、メタゲノム富化手順および特有の遺伝子増幅技法を利用する。プラットフォームは、計算的に駆動され得、分子生物学、自動化および先進的機械学習プロトコールを統合することができるため、そこで、研究者は、モデルおよび検索クエリを迅速かつ系統的に開発して、追加的な新規殺虫タンパク質を同定することができるであろう。
【００１４】
ある特定の実施形態では、本開示は、殺虫タンパク質をコードするＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来のＤＮＡが富化されたゲノムライブラリーを構築するための方法であって、ａ）１種または複数の微生物を含む初期試料を提供するステップと、ｂ）初期試料を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来の種の成長を富化する固体栄養限定培地に曝露し、これにより、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．が富化されたその後の試料をもたらすステップと、ｃ）その後の富化された試料からＤＮＡを単離するステップと、ｄ）単離されたＤＮＡからＤＮＡを抽出し、標的殺虫タンパク質遺伝子を増幅するために選択されたプライマーによる縮重ＰＣＲを行うステップと、ｅ）ＰＣＲ増幅されたＤＮＡをプラスミドにクローニングするステップと、ｆ）前記プラスミドからクローニングされたＤＮＡを配列決定するステップとを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、配列決定されたＤＮＡをゲノムライブラリーへとアセンブルするステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、配列決定されたＤＮＡ内の殺虫タンパク質遺伝子を同定するステップを含む。一部の実施形態では、同定された殺虫タンパク質は、未知のものである。一部の実施形態では、隠れマルコフモデルは、殺虫タンパク質遺伝子の同定に使用される。一部の実施形態では、表３における任意の遺伝子（すなわち、ヌクレオチド配列）（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９および７１）を見出すことができる。一部の実施形態では、表３に見出されるタンパク質（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０および７２）をコードする任意の遺伝子を見出すことができる。一部の実施形態では、プライマーは、配列番号８７に対し少なくとも５０％の配列同一性を有するタンパク質をコードする標的殺虫タンパク質遺伝子を増幅するために選択される。
【００１５】
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０および７２からなる群より選択されるタンパク質に対し少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する殺虫タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。ある特定の実施形態では、単離された核酸分子は、目的の宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている。ある特定の実施形態では、単離された核酸分子は、植物細胞における発現のためにコドン最適化されている。ある特定の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９および７１からなる群より選択される核酸配列に対し少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する。
【００１６】
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０および７２からなる群より選択されるタンパク質に対し少なくとも約８０％の配列同一性を有する殺虫タンパク質をコードする核酸分子を含むヌクレオチド構築物であって、前記核酸分子が、異種調節エレメントに作動可能に連結されている、ヌクレオチド構築物を提供する。態様では、異種調節エレメントは、プロモーターである。態様では、異種調節エレメントは、植物プロモーターである。一部の実施形態では、本開示は、前記ヌクレオチド構築物を含む、トランスジェニック植物細胞を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ヌクレオチド構築物から前記タンパク質を発現する、安定に形質転換された植物を提供する。一部の実施形態では、昆虫は、トランスジェニック植物を摂食し、死滅する。
【００１７】
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０および７２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された殺虫タンパク質を提供する。一部の実施形態では、単離された殺虫タンパク質は、組換えである。一部の実施形態では、本開示は、前記タンパク質を発現する、トランスジェニック植物細胞を提供する。一部の実施形態では、昆虫は、トランスジェニック植物を摂食し、死滅する。一部の実施形態では、上述の殺虫タンパク質は、農業組成物に含有される。一部の実施形態では、前記農業組成物は、有効な昆虫防除をもたらすために、植物および／または昆虫への噴霧に使用される。一部の実施形態では、殺虫タンパク質は、細胞ライセートに見出され、細胞ライセートを利用して、害虫集団を防除することができる。一部の実施形態では、天然Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ宿主生物を組成物へと製剤化し、害虫に対抗するために利用することができる。
【００１８】
ある特定の実施形態では、本開示は、新規殺虫タンパク質であって、表６におけるＨＭＭを使用してスコア化されたときに、５２１．５のビットスコアのもしくはそれを超えるスコアを得るアミノ酸配列、および／または７．９ｅ−１６１に満たないもしくはそれに等しいＥ値でマッチする配列を有するタンパク質を提供する。これらのタンパク質は、任意の形態で（例えば、単離されたまたは組換えタンパク質として）、または本明細書に開示されている組成物（例えば、植物または農業組成物）のいずれかの一部として提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本教示の殺虫タンパク質発見プラットフォーム（ＩＰＤＰ）のワークフローを概説する。
【００２０】
【図２】図２は、本教示の殺虫タンパク質発見プラットフォーム（ＩＰＤＰ）のワークフローを概説し、現行のＩＰＤＰでは必要ではない、先行技術の方法が利用する２つのステップを説明する。
【００２１】
【図３】図３は、ＩＰＤＰを利用して発見された、表３に見出される８個の新規殺虫タンパク質（ＺＩＰ１、ＺＩＰ２、ＺＩＰ６、ＺＩＰ８、ＺＩＰ９、ＺＩＰ１０、ＺＩＰ１１、ＺＩＰ１２）のマルチプル配列アライメントを説明する。
【００２２】
【図４】図４は、ＩＰＤＰを利用して発見された、表３に見出される８個の新規殺虫タンパク質（ＺＩＰ１、ＺＩＰ２、ＺＩＰ６、ＺＩＰ８、ＺＩＰ９、ＺＩＰ１０、ＺＩＰ１１、ＺＩＰ１２）のマルチプル配列アライメントをモナライシンと比較して説明する。
【００２３】
【図５】図５は、ＩＰＤＰを利用して発見された、表３および図３に見出される８個の新規殺虫タンパク質の系統樹を説明する。
【００２４】
【図６】図６は、ＩＰＤＰを利用して発見された、表３および図４に見出される８個の新規殺虫タンパク質の系統樹をモナライシンと比較して説明する。
【００２５】
【図７】図７は、表３に見出される１０個の精製殺虫タンパク質による昆虫バイオアッセイ実験の結果を説明する。ＩＰＤＰを介して発見された精製殺虫タンパク質（ＺＩＰ１、ＺＩＰ２、ＺＩＰ４、ＺＩＰ６、ＺＩＰ８、ＺＩＰ９、ＺＩＰ１０、ＺＩＰ１１、およびＺＩＰ１２、およびＺＩＰ１６）を含有する水を摂取した昆虫（Ｈａｌｙｏｍｏｒｐｈａ  ｈａｌｙｓ−クサギカメムシ）は、様々な程度の死亡率を示した。この実験で使用した精製殺虫タンパク質の濃度もまた、図７に示す。
【００２６】
【図８】図８は、表３に見出される３つの精製殺虫タンパク質（ＺＩＰ１、ＺＩＰ２、およびＺＩＰ４）によるクサギカメムシに対する昆虫バイオアッセイ実験の結果を説明する。様々な濃度の精製タンパク質を、昆虫に摂取させ（Ｎ＝アッセイした昆虫の数）、死亡率データをＰｒｏｂｉｔ解析に供し、集団の５０％を死滅させるために必要な致死濃度（ＬＣ５０）を上限および下限９５％信頼区間と共に生成した。
【００２７】
【図９】図９Ａ〜Ｂは、表３に見出される３つの精製殺虫タンパク質（ＺＩＰ１、ＺＩＰ２、およびＺＩＰ４）による２つの主要な昆虫目のメンバー：ツマジロクサヨトウおよびジュウイチホシウリハムシ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃｏｒｎ  Ｒｏｏｔｗｏｒｍ）に対する昆虫バイオアッセイ実験の結果を説明する。緩衝液のみの対照と比較して、固形飼料と混合した精製タンパク質の記載の濃度を摂取した昆虫の平均重量のパーセント低減を報告する。図９Ａは、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）について実施した実験を示し、図９Ｂは、ジュウイチホシウリハムシ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ）について実施した実験を説明する。
【００２８】
【図１０】図１０は、昆虫ライセート実験の結果を説明する。ＩＰＤＰを介して発見された殺虫タンパク質を含有する細菌ライセートを摂取した昆虫（Ｈａｌｙｏｍｏｒｐｈａ  ｈａｌｙｓ−クサギカメムシ）は、１００％の死亡率を示した。
【００２９】
【図１１】図１１は、ダイズおよびコーンの葉からのＺＩＰタンパク質の発現を示す、実施例６のウエスタンブロットの結果を説明する。レーン１および１１：陰性対照（非形質転換ダイズの葉）。レーン２および３：ＺＩＰ１形質転換ダイズの葉；レーン４〜１０：ＺＩＰ２形質転換ダイズの葉；レーン１２および１３：ＺＩＰ４形質転換ダイズの葉；レーン１４：陰性対照（非形質転換トウモロコシの葉）；レーン１５および１６：ＺＩＰ２形質転換トウモロコシの葉。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
定義
次の用語は、当業者に十分に理解されていると思われるが、本開示の主題の説明を容易にするために、次の定義を表記する。
【００３１】
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、当該実体の１つまたは複数を指す、すなわち、複数の指示対象を指すことができる。そのようなものとして、用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」、「１つまたは複数の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」および「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」は、本明細書で互換的に使用されている。加えて、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」による「エレメント（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」の参照は、唯一のエレメントが存在することを文脈が明らかに要求しない限り、エレメントの２つ以上が存在する可能性を除外するものではない。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「細胞生物（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）」、「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」または「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」は、幅広く解釈するべきである。これらの用語は、互換的に使用され、そのようなものとして、２種の原核生物ドメインの細菌および古細菌、ならびにある特定の真核生物の真菌および原生生物が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、本開示は、本開示に提示されているリスト／表および図の「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」または「細胞生物」または「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」を指す。この特徴付けは、表および図の同定された分類学上の属のみならず、前記表または図における任意の生物の同定された分類学上の種、ならびに様々な新規および新たに同定または設計された株を指すこともできる。同じ特徴付けは、実施例など、本明細書の他の部分におけるこれらの用語の記述に当てはまる。
【００３３】
用語「原核生物」は、当技術分野で認識されており、核も他の細胞オルガネラも含有しない細胞を指す。原核生物は、一般に、２種のドメイン、細菌および古細菌の一方に分類される。古細菌および細菌ドメインの生物の間の決定的な差は、１６ＳリボソームＲＮＡにおけるヌクレオチド塩基配列の根本的な差に基づく。
【００３４】
用語「古細菌」は、普通でない環境において典型的に見出され、リボソームタンパク質の数および細胞壁におけるムラミン酸の欠如を含むいくつかの判断基準によって原核生物の残りと区別される、Ｍｅｎｄｏｓｉｃｕｔｅｓ門の生物のカテゴリー化を指す。ｓｓｒＲＮＡ解析に基づいて、古細菌は、２種の系統発生上別個の群：ＣｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａおよびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａからなる。その生理学に基づいて、古細菌は、３つの型：メタン生成菌（メタンを生成する原核生物）；高度好塩菌（非常に高い濃度の塩（ＮａＣｌ）で生きる原核生物）；および高度（超）好熱菌（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（非常に高い温度で生きる原核生物）に組織化することができる。これらを細菌から区別する統一古細菌の特色（すなわち、細胞壁にムレインなし、エステル連結された膜脂質など）の他に、これらの原核生物は、これらをその特定の生息地に適応させる特有の構造的または生化学的特質を示す。Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａは、主に超好熱性硫黄依存性原核生物からなり、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａは、メタン生成菌および高度好塩菌を含有する。
【００３５】
「細菌」または「真正細菌」は、原核の生物のドメインを指す。細菌は、次の少なくとも１１種の別個の群を含む：（１）２つの主要な亜門：（１）高Ｇ＋Ｃ群（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ他）（２）低Ｇ＋Ｃ群（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ）が存在する、グラム陽性（グラム＋）細菌；（２）プロテオバクテリア、例えば、紅色光合成＋非光合成グラム陰性細菌（最も「一般的な」グラム陰性細菌を含む）；（３）シアノバクテリア、例えば、酸素発生型光栄養生物；（４）スピロヘータおよび近縁種；（５）プランクトミセス属；（６）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ；（７）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ；（８）緑色硫黄細菌；（９）緑色非硫黄細菌（嫌気性光栄養生物も）；（１０）放射線抵抗性小球菌および近縁種；（１１）ＴｈｅｒｍｏｔｏｇａおよびＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ好熱菌。
【００３６】
「真核生物」は、その細胞が、膜内に封入された核および他のオルガネラを含有する、任意の生物である。真核生物は、分類群ＥｕｋａｒｙａまたはＥｕｋａｒｙｏｔａに属する。原核細胞（上述の細菌および古細菌）から真核細胞を区別する定義的特色は、真核細胞が、膜結合されたオルガネラ、特に、遺伝子材料を含有し、核エンベロープに封入された、核を有することである。
【００３７】
用語「遺伝子改変された宿主細胞」、「組換え宿主細胞」および「組換え株」は、本明細書で互換的に使用されており、本開示のクローニングおよび形質転換方法によって遺伝子改変された宿主細胞を指す。よって、用語は、これが由来する天然に存在する生物と比較して、変更された、改変されたまたは異なる遺伝子型および／または表現型（例えば、遺伝子改変が、微生物のコード核酸配列に影響を与える場合）を示すように、遺伝的に変更、改変または操作された宿主細胞（例えば、細菌、酵母細胞、真菌細胞、ＣＨＯ、ヒト細胞など）を含む。一部の実施形態では、用語が、問題になっている特定の組換え宿主細胞のみならず、そのような宿主細胞の後代または潜在的後代も指すことが理解される。
【００３８】
用語「野生型微生物」または「野生型宿主細胞」は、自然界に存在する細胞、すなわち、遺伝子改変されていない細胞について記載する。
【００３９】
用語「遺伝子操作された」は、宿主細胞のゲノムの任意の操作（例えば、核酸の挿入、欠失、変異または置き換えによる）を指すことができる。
【００４０】
用語「対照」または「対照宿主細胞」は、遺伝子改変または実験処置の効果を決定するための、適切な比較基準宿主細胞を指す。一部の実施形態では、対照宿主細胞は、野生型細胞である。他の実施形態では、対照宿主細胞は、処置宿主細胞を識別する遺伝子改変（複数可）は別として、遺伝子改変された宿主細胞と遺伝的に同一である。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「対立遺伝子（複数可）」は、遺伝子の１種または複数の代替形態のいずれかを意味し、これらの対立遺伝子の全てが、少なくとも１種の形質または特徴に関係する。二倍体細胞において、所与の遺伝子の２個の対立遺伝子は、一対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占有する。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）」（複数形は遺伝子座（ｌｏｃｉ））は、例えば、遺伝子または遺伝的マーカーが見出される、染色体上の特異的な箇所（単数または複数）または部位を意味する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝的に連鎖した」は、交差による分離が困難なように、育種中に高い率で共遺伝する２種またはそれよりも多い形質を指す。
【００４４】
「組換え」または「組換え事象」は、本明細書で使用される場合、染色体乗換えまたは独立性組合せを指す。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語「表現型」は、当該個体の遺伝的構成（すなわち、遺伝子型）および環境の間の相互作用に起因する、個々の細胞、細胞培養物、生物または生物群の観察可能な特徴を指す。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「キメラ」または「組換え」は、核酸配列またはタンパク質配列について記載する場合、少なくとも２個の異種ポリヌクレオチドもしくは２個の異種ポリペプチドを単一の高分子へと連結する、または少なくとも１個の天然核酸もしくはタンパク質配列の１個もしくは複数のエレメントを再編成する、核酸またはタンパク質配列を指す。例えば、用語「組換え」は、例えば、化学合成による、または遺伝子操作技法による単離された核酸セグメントの操作による、２個のそのままでは分離された配列セグメントの人工の組合せを指すことができる。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「合成ヌクレオチド配列」または「合成ポリヌクレオチド配列」は、自然界に存在することが公知でない、または天然に存在しないヌクレオチド配列である。一般に、そのような合成ヌクレオチド配列は、他の任意の天然に存在するヌクレオチド配列と比較した場合、少なくとも１個のヌクレオチド差を含む。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「合成アミノ酸配列」または「合成ペプチド」または「合成タンパク質」は、自然界に存在することが公知でない、または天然に存在しないアミノ酸配列である。一般に、そのような合成タンパク質配列は、他の任意の天然に存在するタンパク質配列と比較した場合、少なくとも１個のアミノ酸差を含む。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはこれらのアナログのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は、分子の一次構造を指し、よって、二本鎖および一本鎖ＤＮＡならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを含む。これは、メチル化および／またはキャッピングされた核酸、改変された塩基、骨格改変を含有する核酸、他など、改変された核酸も含む。用語「核酸」および「ヌクレオチド配列」は、互換的に使用される。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」は、生物学的機能に関連するＤＮＡの任意のセグメントを指す。よって、遺伝子として、コード配列、および／またはその発現に要求される調節配列が挙げられるがこれらに限定されない。遺伝子は、例えば、他のタンパク質のための認識配列を形成する、発現されないＤＮＡセグメントを含むこともできる。遺伝子は、目的の供給源からのクローニング、または公知のもしくは予測される配列情報からの合成を含む、種々の供給源から得ることができ、所望のパラメーターを有するように設計された配列を含むことができる。
【００５１】
本明細書で使用される場合、用語「相同」または「ホモログ」または「オルソログ」は、当技術分野で公知であり、共通の祖先またはファミリーメンバーを共有する関連配列を指し、配列同一性の程度に基づき推論することができる。用語「相同性」、「相同」、「実質的に同様」および「実質的に対応する」は、本明細書で互換的に使用されている。これらは、１個または複数のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を媒介するまたはある特定の表現型を生じる核酸断片の能力に影響を与えない、核酸断片を指す。これらの用語は、初期の無改変断片と比べて、その結果得られる核酸断片の機能的特性を実質的に変更しない、１個または複数のヌクレオチドの欠失または挿入など、本開示の核酸断片の改変も指す。したがって、当業者であれば認めるであろうが、本開示が、特異的な例示的配列を超えるものを包含することが理解される。これらの用語は、１つの種、亜種、変種、栽培品種または株に見出される遺伝子と、別の種、亜種、変種、栽培品種または株における対応するまたは等価な遺伝子との間の関係性について記載する。本開示の目的のため、相同配列が比較される。「相同配列」または「ホモログ」または「オルソログ」は、機能的に関係すると考えられる、思われるまたは知られている。機能的関係性は、（ａ）配列同一性の程度および／または（ｂ）同じもしくは同様の生物学的機能が挙げられるがこれらに限定されない、いくつかの仕方のいずれか１種で示され得る。好ましくは、（ａ）および（ｂ）の両方が示される。相同性は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９８７）  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０，  ｓｅｃｔｉｏｎ  ７．７１８，  Ｔａｂｌｅ  ７．７１に論じられているものなど、当技術分野で容易に利用可能なソフトウェアプログラムを使用して決定することができる。一部のアライメントプログラムは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．）、ＡＬＩＧＮ  Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）およびＡｌｉｇｎＸ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）である。別のアライメントプログラムは、デフォルトパラメーターを使用したＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）である。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「内在性」または「内在性遺伝子」は、宿主細胞ゲノム内の、これが天然に見出される位置における天然に存在する遺伝子を指す。本開示の文脈において、異種プロモーターを内在性遺伝子に作動可能に連結することは、当該遺伝子が天然に存在する位置において、現存する遺伝子の前に異種プロモーター配列を遺伝的に挿入することを意味する。本明細書に記載されている内在性遺伝子は、本開示の方法のいずれかに従って変異された天然に存在する遺伝子の対立遺伝子を含むことができる。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「外因性」は、用語「異種」と互換的に使用され、そのネイティブ供給源以外のある供給源に由来する物質を指す。例えば、用語「外因性タンパク質」または「外因性遺伝子」は、非ネイティブ供給源または位置に由来し、生物システムに人工的に供給された、タンパク質または遺伝子を指す。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド変化」は、例えば、当技術分野で十分に理解されている通り、ヌクレオチド置換、欠失および／または挿入を指す。例えば、変異は、サイレントな置換、付加または欠失を生じる変更を含有するが、コードされるタンパク質の特性もしくは活性またはタンパク質が作製される仕方を変更しない。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質改変」は、例えば、当技術分野で十分に理解されている通り、アミノ酸置換、アミノ酸改変、欠失および／または挿入を指す。
【００５６】
本明細書で使用される場合、核酸またはポリペプチドの「少なくとも部分」または「断片」という用語は、そのような配列の最小サイズ特徴を有する部分、または最大で全長分子であり全長分子を含む、全長分子の任意のより大型の断片を意味する。本開示のポリヌクレオチドの断片は、遺伝的調節エレメントの生物学的に活性な部分をコードすることができる。遺伝的調節エレメントの生物学的に活性な部分は、遺伝的調節エレメントを含む本開示のポリヌクレオチドの１個の部分を単離し、本明細書に記載されている通りに活性を評価することにより調製することができる。同様に、ポリペプチドの部分は、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸などであり、全長ポリペプチドになり得る。使用されるべき部分の長さは、特定の適用に依存する。ハイブリダイゼーションプローブとして有用な核酸の部分は、１２ヌクレオチドもの短さであり得；一部の実施形態では、これは、２０ヌクレオチドである。エピトープとして有用なポリペプチドの部分は、４アミノ酸もの短さであり得る。全長ポリペプチドの機能を行うポリペプチドの部分は、一般に、４アミノ酸よりも長くなるであろう。
【００５７】
バリアントポリヌクレオチドは、ＤＮＡシャッフリングなど、変異原性および組換え誘導性手順に由来する配列も包含する。そのようなＤＮＡシャッフリングのための戦略は、当技術分野で公知である。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ  （１９９４）  ＰＮＡＳ  ９１：１０７４７−１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ  （１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１；Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １５：４３６−４３８；Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２７２：３３６−３４７；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  ＰＮＡＳ  ９４：４５０４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１；ならびに米国特許第５，６０５，７９３号および同第５，８３７，４５８号を参照されたい。
【００５８】
本明細書に開示されているポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のため、オリゴヌクレオチドプライマーは、任意の目的の生物から抽出されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから対応するＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲ反応における使用のために、設計することができる。ＰＣＲプライマーおよびＰＣＲクローニングを設計するための方法は一般に、当技術分野で公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）  に開示されている。Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  （１９９０）  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｉｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，  ｅｄｓ．  （１９９５）  ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＩｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，  ｅｄｓ．  （１９９９）  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）も参照されたい。ＰＣＲの公知の方法として、ペアードプライマー、ネステッドプライマー、単一の特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的にミスマッチしたプライマーなどを使用した方法が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５９】
用語「プライマー」は、本明細書で使用される場合、増幅標的にアニーリングして、ＤＮＡポリメラーゼを付着させ、これにより、プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に置かれると、すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの重合のための薬剤の存在下、適した温度およびｐＨで、ＤＮＡ合成の開始点として機能することができるオリゴヌクレオチドを指す。（増幅）プライマーは、好ましくは、増幅における最大効率のために一本鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合のための薬剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングするのに十分な長さである必要がある。プライマーの正確な長さは、温度およびプライマーの組成（Ａ／Ｔ対Ｇ／Ｃ含量）を含む、多くの要因に依存する。一対の双方向性プライマーは、ＰＣＲ増幅など、ＤＮＡ増幅の技術分野で一般的に使用される通り、１種のフォワードプライマーおよび１種のリバースプライマーからなる。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一部の実施形態では、プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントは、エンハンサーと称されることが多い。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーターの固有のエレメント、またはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入された異種エレメントであり得る。プロモーターは、その全体が、ネイティブ遺伝子に由来していても、または自然界に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されていても、またはさらには、合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当業者であれば、異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞型における、または異なる発生段階での、または異なる環境条件に応答した、遺伝子の発現を方向付けることができることが理解される。多くの場合、調節配列の正確な境界は完全に定義されている訳ではないため、一部の変形形態のＤＮＡ断片は、同一プロモーター活性を有することができることがさらに認識される。
【００６１】
本明細書で使用される場合、語句「組換え構築物」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」および「組換えＤＮＡ構築物」は、本明細書で互換的に使用されている。組換え構築物は、自然界に一緒には見出されない、核酸断片、例えば、調節およびコード配列の人工の組合せを含む。例えば、キメラ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが、自然界に見出される様式とは異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含むことができる。そのような構築物は、それだけで使用することができる、またはベクターと併せて使用することができる。ベクターが使用される場合には、ベクターの選択は、当業者にとって周知の通り、宿主細胞の形質転換に使用される方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。当業者は、本開示の単離された核酸断片のいずれかを含む宿主細胞を成功裏に形質転換し、選択し、増やすために、ベクターに存在する必要がある遺伝的エレメントを十分に承知している。当業者であれば、異なる独立した形質転換事象が、発現の異なるレベルおよびパターンをもたらし（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８５）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ４：２４１１−２４１８；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８−８６）、よって、所望の発現レベルおよびパターンを呈する系統を得るために、複数の事象をスクリーニングする必要があることも認識するであろう。そのようなスクリーニングは、とりわけ、ＤＮＡのサザン解析、ｍＲＮＡ発現のノーザン解析、タンパク質発現のイムノブロッティング解析、または表現型解析によって達成することができる。ベクターは、自律的に複製する、または宿主細胞の染色体に組み込むことができる、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などであり得る。ベクターは、自律的に複製しない、ネイキッドＲＮＡポリヌクレオチド、ネイキッドＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内でＤＮＡおよびＲＮＡの両方で構成されたポリヌクレオチド、ポリ−リシンコンジュゲートされたＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチドコンジュゲートされたＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソームコンジュゲートされたＤＮＡなどであってもよい。本明細書で使用される場合、用語「発現」は、機能的最終産物、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質（前駆体または成熟）の産生を指す。
【００６２】
「作動可能に連結された」は、この文脈において、本開示に係るプロモーターポリヌクレオチドの、さらなるオリゴまたはポリヌクレオチドとの逐次配置を意味し、前記さらなるポリヌクレオチドの転写をもたらす。
【００６３】
用語「目的の産物」または「生体分子」は、本明細書で使用される場合、供給材料から微生物によって産生される任意の産物を指す。一部の場合、目的の産物は、小分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコールなどであり得る。例えば、目的の産物または生体分子は、任意の一次または二次細胞外代謝物であり得る。一次代謝物は、とりわけ、エタノール、クエン酸、乳酸、グルタミン酸、グルタメート、リシン、スレオニン、トリプトファンおよび他のアミノ酸、ビタミン、多糖などであり得る。二次代謝物は、とりわけ、ペニシリンなどの抗生物質化合物、またはシクロスポリンＡなどの免疫抑制剤、ジベレリンなどの植物ホルモン、ロバスタチンなどのスタチン系薬物、グリセオフルビンなどの殺真菌薬などであり得る。目的の産物または生体分子は、カタラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、グルコースイソメラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ラクターゼ、ストレプトキナーゼおよび他の多くを含む、微生物酵素など、微生物によって産生される任意の細胞内構成成分であってもよい。細胞内構成成分は、インスリン、Ｂ型肝炎ワクチン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、ストレプトキナーゼ他など、組換えタンパク質を含むこともできる。
【００６４】
用語「炭素源」は、一般に、細胞成長のための炭素の供給源としての使用に適した物質を指す。炭素源として、バイオマス加水分解物、デンプン、スクロース、セルロース、ヘミセルロース、キシロースおよびリグニン、ならびにこれらの基質の単量体構成成分が挙げられるがこれらに限定されない。炭素源は、ポリマー、炭水化物、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチドなどが挙げられるがこれらに限定されない、様々な形態の様々な有機化合物を含むことができる。これらは、例えば、グルコース、デキストロース（Ｄ−グルコース）などの様々な単糖、マルトース、オリゴ糖、多糖、飽和もしくは不飽和脂肪酸、スクシネート、ラクテート、アセテート、エタノールなど、またはこれらの混合物を含む。光合成生物は、その上、光合成の産物として炭素源を生成することができる。一部の実施形態では、炭素源は、バイオマス加水分解物およびグルコースから選択することができる。
【００６５】
用語「供給材料」は、他の産物を作製することができる、微生物または発酵プロセスに供給される原材料または原材料の混合物として定義される。例えば、バイオマスまたはバイオマスに由来する炭素化合物などの炭素源は、発酵プロセスにおいて目的の産物（例えば、小分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど）を産生する微生物のための供給材料である。しかし、供給材料は、炭素源以外の栄養素を含有することができる。
【００６６】
用語「体積生産性（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）」または「生産速度」は、単位時間当たりの培地体積当たりの形成される産物の量として定義される。体積生産性は、１時間当たりの１リットル当たりのグラム（ｇ／Ｌ／ｈ）単位で報告することができる。
【００６７】
用語「比生産性」は、産物の形成の比率として定義される。本明細書における比生産性は、１時間当たりの細胞乾燥重量（ＣＤＷ）１グラム当たりの産物のグラム数（ｇ／ｇ  ＣＤＷ／ｈ）単位の比生産性としてさらに定義される。所与の微生物のＯＤ６００に対するＣＤＷの関係を使用して、比生産性は、１時間当たりの６００ｎｍにおける培養ブロスの光学密度（ＯＤ）当たりの培養培地１リットル当たりの産物のグラム数（ｇ／Ｌ／ｈ／ＯＤ）として表現することもできる。
【００６８】
用語「収量」は、原材料の単位重量当たりの得られる産物の量として定義され、基質１ｇ当たりの産物のｇ数として表現することができる（ｇ／ｇ）。収量は、理論的収量のパーセンテージとして表現することができる。「理論的収量」は、産物の作製に使用される代謝経路の化学量論によって指示される通り、所与の量の基質当たりの生成され得る産物の最大量として定義される。
【００６９】
用語「タイター」または「力価」は、溶液の強度または溶液中の物質の濃度として定義される。例えば、発酵ブロス中の目的の産物（例えば、小分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど）のタイターは、発酵ブロス１リットル当たりの溶液中の目的の産物のｇ数（ｇ／Ｌ）として記載される。
【００７０】
用語「総力価」は、プロセスにおける初期体積またはプロセスにおける運転体積と比べた、溶液中の目的の産物、該当する場合は気相中の目的の産物、およびプロセスから除去され、回収される任意の目的の産物が挙げられるがこれらに限定されない、プロセスにおいて産生される目的の産物全ての和として定義される。
【００７１】
用語「殺虫タンパク質」または「殺有害生物タンパク質」または「殺虫毒素」または「殺有害生物毒素」は、１種または複数の有害生物に対し有毒活性を有するタンパク質を指すように使用される。有害生物の例として、数例を挙げると、鱗翅目、双翅目、半翅目および甲虫目を含む、昆虫の様々な目が挙げられる。有害生物は、例えば、線形動物門のメンバーを含む、農業にとって有害生物である非昆虫生物も含む。
【００７２】
殺虫／殺有害生物タンパク質
本開示は、殺虫タンパク質発見プラットフォームおよびそこから発見される殺虫タンパク質を教示する。しかし、用語「殺虫」は、単なる昆虫に限定されないが、むしろ、「有害生物」と一般的に称される、生物のより幅広い分類学的グループ分けを網羅することを理解されたい。結果的に、語句「殺虫タンパク質」は、「殺有害生物タンパク質」と同義であると解釈することができ、語句「殺虫タンパク質発見プラットフォーム」は、「殺有害生物タンパク質発見プラットフォーム」と同義であると解釈することができる。さらに、一部の態様では、本開示は、タンパク質実施形態に限定されなくてよい、殺虫毒素、および殺虫毒素を発見するためのプラットフォームを提供する。
【００７３】
殺虫タンパク質  −  モナライシン（Ｍｏｎａｌｙｓｉｎ）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａは、ショウジョウバエに感染しこれを死滅させる、昆虫病原性細菌である。Ｐ．ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ病原性は、ショウジョウバエの腸に不可逆的な損傷を引き起こし、上皮再生および修復を防止するその能力に関連付けられる。近年、Ｏｐｏｔａと同僚らは、新規ポア形成毒素（ＰＦＴ）の同定を報告し、彼らはこれを「モナライシン」と命名し、これは、ショウジョウバエに対するＰ．ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａのビルレンスに寄与する。Ｏｐｏｔａ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｍｏｎａｌｙｓｉｎ，  ａ  Ｎｏｖｅｌ  β−Ｐｏｒｅ−Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ，  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｈｏｓｔ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  Ｌｅｔｈａｌｉｔｙ，”  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１１，  Ｖｏｌ．  ７，  Ｉｓｓｕｅ  ９。Ｏｐｏｔａは、モナライシンが、十分に活性になるためにＮ末端切断を要求し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでオリゴマーを形成し、人工脂質膜におけるポア形成を誘導することを実証した。膜貫通型ドメインの二次構造の予測は、モナライシンが、β型のＰＦＴであることを示す。モナライシンの発現は、Ｐ．ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ病原性を制御する２種のシグナル伝達系である、ＧａｃＳ／ＧａｃＡ二成分系およびＰｖｆ調節因子の両方によって調節される。加えて、Ｐ．ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａによって分泌されるメタロプロテアーゼであるＡｐｒＡは、プロ−モナライシンの、その活性形態への迅速な切断を誘導することができる。モナライシン産生が欠損した変異体による感染後に、細胞死低下が観察され、モナライシンが、腸管細胞損傷を誘導するＰ．ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａの能力における役割を果たすことを示し、このことは、ＰＦＴとしてのその活性と矛盾しない。Ｏｐｏｔａの研究は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  Ｃｒｙ毒素の十分に確立された作用と共に、ＰＦＴの産生が、昆虫の腸の恒常性を破壊する昆虫病原体の共通戦略であることを示唆する。同上。
【００７４】
Ｏｐｏｔａは、未知の遺伝子ｐｓｅｅｎ３１７４のタンパク質産物を特徴付けることにより、モナライシン（ＰＳＥＥＮ３１７４）を発見した。Ｏｐｏｔａによると、モナライシンアミノ酸配列は、Ｐ  Ｂｌａｓｔを使用すると、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｆ１株に見出される２種の特徴付けされていないオルソログを除いて、他の配列に対する相同性を示さない（Ｏｐｏｔａの図Ｓ１）。Ｐ．ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ遺伝子産物もＰ．ｐｕｔｉｄａ遺伝子産物も、明らかなタンパク質ドメインを全く示さなかった。しかし、Ｏｐｏｔａは、ＨＨｐｒｅｄソフトウェア（ＨＭＭ−ＨＭＭ比較による相同性検出＆構造予測）を利用して、β−バレルポア形成毒素の膜貫通型領域の目印である、セリンおよびスレオニン残基のストレッチに隣接した交互になった極性および疎水性残基を有する内部領域の存在を明らかにした。同上。
【００７５】
ＯｐｏｔａのＤＮＡ配列検索および解析は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓゲノムデータベース（「ｗｗｗ」プレフィックスを使用してワールドワイドウェブ上でアクセスすることができる、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ．ｃｏｍ）を使用して行われた。モナライシン遺伝子（ＯＲＦ  ＰＳＥＥＮ３１７４）は、受託番号ＹＰ＿６０８７２８．１に対応する。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａにおけるモナライシン推定オルソログ、Ｐｐｕｔ＿１０６３およびＰｐｕｔ＿１０６４は、それぞれ受託番号ＹＰ＿００１２６６４０８．１、ＹＰ＿００１２６６４０９．１に対応する。ＶＩ型分泌系の産生に関与するＯＲＦ  ＰＳＥＥＮ０５３５は、受託番号ＹＰ＿６０６２９８．１に対応する。
【００７６】
殺虫タンパク質  −  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ殺虫タンパク質（ＰＩＰ）
ＰＩＰ−１、４５、４７、６４、７２、７４、７５および７７を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ殺虫タンパク質のいくつかの公知ファミリーが存在する。これらのＰＩＰタンパク質は、特徴を同定すると共に、下の表１に提供されている。さらなる情報は、（１）参照により本明細書に組み込まれる、Ｕ．  Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｏｒｎ  ｒｏｏｔｗｏｒｍｓ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２０１６  Ｎｏｖ  ４；３５４（６３１２）：６３４−６３７（８６ＡＡタンパク質、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＴ７９５２９１である、ＩＰＤ０７２Ａａを提供）；および（２）参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｕｎ−Ｚｈｉ  Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｏｓｓｅｌｉｉ  ｆｏｒ  ｃｏｒｎ  ｒｏｏｔｗｏｒｍ  ｃｏｎｔｒｏｌ，”  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ２０１８，  Ｖｏｌ．  １６，  ｐｇｓ．  ６４９−６５９（ＰＩＰ−４７ａａを提供）に見出すことができる。
【表１−１】
2021514643.tif 000003
【表１−２】
2021514643.tif 000004
【表１−３】
2021514643.tif 000005
【表１−４】
2021514643.tif 000006
【表１−５】
2021514643.tif 000007
【表１−６】
2021514643.tif 000008
【００７７】
殺虫タンパク質  −  Ｃｒｙタンパク質
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）は、昆虫病原特性を有する、グラム陽性胞子形成細菌である。Ｂｔは、副胞子結晶として胞子形成期中に殺虫タンパク質を産生する。これらの結晶は、δ−内毒素とも呼ばれる、１種または複数のタンパク質（ＣｒｙおよびＣｙｔ毒素）で主に構成される。Ｃｒｙタンパク質は、標的生物に対し実験的に検証可能な毒性効果を示す、または公知Ｃｒｙタンパク質に対し顕著な配列類似性を有する、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ由来の副胞子封入（結晶）タンパク質である。同様に、Ｃｙｔタンパク質は、溶血（細胞溶解）活性を示す、または公知のＣｙｔタンパク質に対し明らかな配列類似性を有する、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ由来の副胞子封入タンパク質である。これらの毒素は、その標的昆虫に高度に特異的であり、ヒト、脊椎動物および植物にとって無害であり、完全に生分解性である。Ｂｒａｖｏ  Ａ，  Ｇｉｌｌ  ＳＳ，  Ｓｏｂｅｒｏｎ  Ｍ．，  ”Ｍｏｄｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  Ｃｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔ  ｔｏｘｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ，”  Ｔｏｘｉｃｏｎ：  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｎ  Ｔｏｘｉｎｏｌｏｇｙ．  ２００７；４９（４）：４２３−４３５。
【００７８】
Ｂｔ  ＣｒｙおよびＣｙｔ毒素は、水溶性タンパク質として分泌される、ポア形成毒素（ＰＦＴ）として公知の細菌毒素のクラスに属し、宿主の細胞膜に挿入するために、または細胞膜を横切ってトランスロケーションするために、コンフォメーション変化を起こす。ＰＦＴの２つの主要な群が存在する：（ｉ）α−ヘリックス領域が膜貫通ポアを形成する、α−ヘリックス毒素、および（ｉｉ）各単量体由来のβ−シートヘアピンで構成されるβ−バレルを形成することにより膜に挿入する、β−バレル毒素。Ｐａｒｋｅｒ  ＭＷ，  Ｆｅｉｌ  ＳＣ，  ”Ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏｘｉｎｓ：  ｆｒｏｍ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”  Ｐｒｏｇ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２００５  Ｍａｙ；  ８８（１）：９１−１４２を参照されたい。ＰＦＴの第１のクラスは、コリシン、外毒素Ａ、ジフテリア毒素などの毒素を含み、Ｃｒｙ  ３−ドメイン毒素も含む。他方では、アエロリジン、α−ヘモリジン、炭疽菌保護抗原、パーフリンゴリジンＯなどのコレステロール依存性毒素、およびＣｙｔ毒素は、β−バレル毒素に属する。同上。一般に、ＰＦＴ産生細菌は、その毒素を分泌し、これらの毒素は、宿主細胞表面に位置する特異的受容体と相互作用する。多くの場合、ＰＦＴは、受容体結合後に宿主プロテアーゼによって活性化され、挿入適格性であるオリゴマー構造の形成を誘導する。最後に、多くの場合、タンパク質のモルテングロビュール状態を誘導するｐＨ減少により、膜挿入が誘発される。同上。
【００７９】
Ｂｔ  Ｃｒｙタンパク質を産生するトランスジェニック作物の開発は、環境に優しい代替物による化学殺虫剤の置換を可能にした。トランスジェニック植物において、Ｃｒｙ毒素は、連続的に産生され、分解から毒素を保護し、咀嚼および穿孔する昆虫に対して到達可能にする。植物におけるＣｒｙタンパク質産生は、植物に偏ったコドン使用によりｃｒｙ遺伝子を操作することにより、また、推定スプライシングシグナル配列の除去およびプロ毒素のカルボキシ末端領域の欠失により改善された。Ｓｃｈｕｌｅｒ  ＴＨ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｉｎｓｅｃｔ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ，”  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９９８；１６：１６８−１７５を参照されたい。昆虫抵抗性作物の使用は、これらのトランスジェニック作物が植えられた区域における化学的殺有害生物剤の使用を相当に縮小した。Ｑａｉｍ  Ｍ，  Ｚｉｌｂｅｒｍａｎ  Ｄ，  ”Ｙｉｅｌｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｒｏｐｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００３  Ｆｅｂ  ７；  ２９９（５６０８）：９００−９０２を参照されたい。
【００８０】
公知Ｃｒｙタンパク質は、δ−内毒素遺伝子のＣｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ４、Ｃｒｙ５、Ｃｒｙ６、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９、Ｃｒｙ１０、Ｃｒｙ１１、Ｃｒｙ１２、Ｃｒｙ１３、Ｃｒｙ１４、Ｃｒｙ１５、Ｃｒｙ１６、Ｃｒｙ１７、Ｃｒｙ１８、Ｃｒｙ１９、Ｃｒｙ２０、Ｃｒｙ２１、Ｃｒｙ２２、Ｃｒｙ２３、Ｃｒｙ２４、Ｃｒｙ２５、Ｃｒｙ２６、Ｃｒｙ２７、Ｃｒｙ２８、Ｃｒｙ２９、Ｃｒｙ３０、Ｃｒｙ３１、Ｃｒｙ３２、Ｃｒｙ３３、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ３６、Ｃｒｙ３７、Ｃｒｙ３８、Ｃｒｙ３９、Ｃｒｙ４０、Ｃｒｙ４１、Ｃｒｙ４２、Ｃｒｙ４３、Ｃｒｙ４４、Ｃｒｙ４５、Ｃｒｙ４６、Ｃｒｙ４７、Ｃｒｙ４９、Ｃｒｙ５１、Ｃｒｙ５２、Ｃｒｙ５３、Ｃｒｙ５４、Ｃｒｙ５５、Ｃｒｙ５６、Ｃｒｙ５７、Ｃｒｙ５８、Ｃｒｙ５９、Ｃｒｙ６０、Ｃｒｙ６１、Ｃｒｙ６２、Ｃｒｙ６３、Ｃｒｙ６４、Ｃｒｙ６５、Ｃｒｙ６６、Ｃｒｙ６７、Ｃｒｙ６８、Ｃｒｙ６９、Ｃｒｙ７０およびＣｒｙ７１クラスが挙げられるがこれらに限定されない、δ−内毒素、ならびにＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞溶解性ｃｙｔ１およびｃｙｔ２遺伝子を含む。
【００８１】
Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ殺虫タンパク質のこれらのクラスのメンバーとして、ＣｒｙｌＡａ１（受託番号ＡＡＡ２２３５３）；Ｃｒｙ１Ａａ２（受託番号ＡＡＡ２２５５２）；Ｃｒｙ１Ａａ３（受託番号ＢＡＡ００２５７）；Ｃｒｙ１Ａａ４（受託番号ＣＡＡ３１８８６）；Ｃｒｙ１Ａａ５（受託番号ＢＡＡ０４４６８）；Ｃｒｙ１Ａａ６（受託番号ＡＡＡ８６２６５）；Ｃｒｙ１Ａａ７（受託番号ＡＡＤ４６１３９）；Ｃｒｙ１Ａａ８（受託番号１２６１４９）；Ｃｒｙ１Ａａ９（受託番号ＢＡＡ７７２１３）；ＣｒｙｌＡａ１０（受託番号ＡＡＤ５５３８２）；ＣｒｙｌＡａ１１（受託番号ＣＡＡ７０８５６）；Ｃｒｙ１Ａａ１２（受託番号ＡＡＰ８０１４６）；Ｃｒｙ１Ａａ１３（受託番号ＡＡＭ４４３０５）；Ｃｒｙ１Ａａ１４（受託番号ＡＡＰ４０６３９）；Ｃｒｙ１Ａａ１５（受託番号ＡＡＹ６６９９３）；Ｃｒｙ１Ａａ１６（受託番号ＨＱ４３９７７６）；Ｃｒｙ１Ａａ１７（受託番号ＨＱ４３９７８８）；Ｃｒｙ１Ａａ１８（受託番号ＨＱ４３９７９０）；Ｃｒｙ１Ａａ１９（受託番号ＨＱ６８５１２１）；Ｃｒｙ１Ａａ２０（受託番号ＪＦ３４０１５６）；Ｃｒｙ１Ａａ２１（受託番号ＪＮ６５１４９６）；Ｃｒｙ１Ａａ２２（受託番号ＫＣ１５８２２３）；Ｃｒｙ１Ａｂｌ（受託番号ＡＡＡ２２３３０）；Ｃｒｙ１Ａｂ２（受託番号ＡＡＡ２２６１３）；Ｃｒｙ１Ａｂ３（受託番号ＡＡＡ２２５６１）；Ｃｒｙ１Ａｂ４（受託番号ＢＡＡ０００７１）；Ｃｒｙ１Ａｂ５（受託番号ＣＡＡ２８４０５）；Ｃｒｙ１Ａｂ６（受託番号ＡＡＡ２２４２０）；Ｃｒｙ１Ａｂ７（受託番号ＣＡＡ３１６２０）；Ｃｒｙ１Ａｂ８（受託番号ＡＡＡ２２５５１）；Ｃｒｙ１Ａｂ９（受託番号ＣＡＡ３８７０１）；Ｃｒｙ１Ａｂ１０（受託番号Ａ２９１２５）；ＣｒｙｌＡｂ１１（受託番号Ｉｌ２４１９）；Ｃｒｙ１Ａｂ１２（受託番号ＡＡＣ６４００３）；Ｃｒｙ１Ａｂ１３（受託番号ＡＡＮ７６４９４）；Ｃｒｙ１Ａｂ１４（受託番号ＡＡＧ１６８７７）；Ｃｒｙ１Ａｂ１５（受託番号ＡＡ０１３３０２）；Ｃｒｙ１Ａｂ１６（受託番号ＡＡＫ５５５４６）；Ｃｒｙ１Ａｂ１７（受託番号ＡＡＴ４６４１５）；Ｃｒｙ１Ａｂ１８（受託番号ＡＡＱ８８２５９）；Ｃｒｙ１Ａｂ１９（受託番号ＡＡＷ３１７６１）；Ｃｒｙ１Ａｂ２０（受託番号ＡＢＢ７２４６０）；Ｃｒｙ１Ａｂ２１（受託番号ＡＢＳ１８３８４）；Ｃｒｙ１Ａｂ２２（受託番号ＡＢＷ８７３２０）；Ｃｒｙ１Ａｂ２３（受託番号ＨＱ４３９７７７）；Ｃｒｙ１Ａｂ２４（受託番号ＨＱ４３９７７８）；Ｃｒｙ１Ａｂ２５（受託番号ＨＱ６８５１２２）；Ｃｒｙ１Ａｂ２６（受託番号ＨＱ８４７７２９）；Ｃｒｙ１Ａｂ２７（受託番号ＪＮ１３５２４９）；Ｃｒｙ１Ａｂ２８（受託番号ＪＮ１３５２５０）；Ｃｒｙ１Ａｂ２９（受託番号ＪＮ１３５２５１）；Ｃｒｙ１Ａｂ３０（受託番号ＪＮ１３５２５２）；Ｃｒｙ１Ａｂ３１（受託番号ＪＮ１３５２５３）；Ｃｒｙ１Ａｂ３２（受託番号ＪＮ１３５２５４）；Ｃｒｙ１Ａｂ３３（受託番号ＡＡＳ９３７９８）；Ｃｒｙ１Ａｂ３４（受託番号ＫＣ１５６６６８）；Ｃｒｙ１Ａｂ様（受託番号ＡＡＫ１４３３６）；Ｃｒｙ１Ａｂ様（受託番号ＡＡＫ１４３３７）；Ｃｒｙ１Ａｂ様（受託番号ＡＡＫ１４３３８）；Ｃｒｙ１Ａｂ様（受託番号ＡＢＧ８８８５８）；Ｃｒｙ１Ａｃ１（受託番号ＡＡＡ２２３３１）；Ｃｒｙ１Ａｃ２（受託番号ＡＡＡ２２３３８）；Ｃｒｙ１Ａｃ３（受託番号ＣＡＡ３８０９８）；Ｃｒｙ１Ａｃ４（受託番号ＡＡＡ７３０７７）；Ｃｒｙ１Ａｃ５（受託番号ＡＡＡ２２３３９）；Ｃｒｙ１Ａｃ６（受託番号ＡＡＡ８６２６６）；Ｃｒｙ１Ａｃ７（受託番号ＡＡＢ４６９８９）；Ｃｒｙ１Ａｃ８（受託番号ＡＡＣ４４８４１）；Ｃｒｙ１Ａｃ９（受託番号ＡＡＢ４９７６８）；ＣｒｙｌＡｃ１０（受託番号ＣＡＡ０５５０５）；ＣｒｙｌＡｃ１１（受託番号ＣＡＡ１０２７０）；Ｃｒｙ１Ａｃ１２（受託番号Ｉｌ２４１８）；Ｃｒｙ１Ａｃ１３（受託番号ＡＡＤ３８７０１）；Ｃｒｙ１Ａｃ１４（受託番号ＡＡＱ０６６０７）；Ｃｒｙ１Ａｃ１５（受託番号ＡＡＮ０７７８８）；Ｃｒｙ１Ａｃ１６（受託番号ＡＡＵ８７０３７）；ＣｒｙｌＡｃ１７（受託番号ＡＡＸ１８７０４）；Ｃｒｙ１Ａｃ１８（受託番号ＡＡＹ８８３４７）；Ｃｒｙ１Ａｃ１９（受託番号ＡＢＤ３７０５３）；Ｃｒｙ１Ａｃ２０（受託番号ＡＢＢ８９０４６）；Ｃｒｙ１Ａｃ２１（受託番号ＡＡＹ６６９９２）；Ｃｒｙ１Ａｃ２２（受託番号ＡＢＺ０１８３６）；Ｃｒｙ１Ａｃ２３（受託番号ＣＡＱ３０４３１）；Ｃｒｙ１Ａｃ２４（受託番号ＡＢＬ０１５３５）；Ｃｒｙ１Ａｃ２５（受託番号ＦＪ５１３３２４）；Ｃｒｙ１Ａｃ２６（受託番号ＦＪ６１７４４６）；Ｃｒｙ１Ａｃ２７（受託番号ＦＪ６１７４４７）；Ｃｒｙ１Ａｃ２８（受託番号ＡＣＭ９０３１９）；Ｃｒｙ１Ａｃ２９（受託番号ＤＱ４３８９４１）；Ｃｒｙ１Ａｃ３０（受託番号ＧＱ２２７５０７）；Ｃｒｙ１Ａｃ３１（受託番号ＧＵ４４６６７４）；Ｃｒｙ１Ａｃ３２（受託番号ＨＭ０６１０８１）；Ｃｒｙ１Ａｃ３３（受託番号ＧＱ８６６９１３）；Ｃｒｙ１Ａｃ３４（受託番号ＨＱ２３０３６４）；Ｃｒｙ１Ａｃ３５（受託番号ＪＦ３４０１５７）；Ｃｒｙ１Ａｃ３６（受託番号ＪＮ３８７１３７）；Ｃｒｙ１Ａｃ３７（受託番号ＪＱ３１７６８５）；ＣｒｙｌＡｄ１（受託番号ＡＡＡ２２３４０）；Ｃｒｙ１Ａｄ２（受託番号ＣＡＡ０１８８０）；ＣｒｙｌＡｅ１（受託番号ＡＡＡ２２４１０）；ＣｒｙｌＡｆ１（受託番号ＡＡＢ８２７４９）；ＣｒｙｌＡｇ１（受託番号ＡＡＤ４６１３７）；ＣｒｙｌＡｈ１（受託番号ＡＡＱ１４３２６）；Ｃｒｙ１Ａｈ２（受託番号ＡＢＢ７６６６４）；Ｃｒｙ１Ａｈ３（受託番号ＨＱ４３９７７９）；ＣｒｙｌＡｉ１（受託番号ＡＡ０３９７１９）；Ｃｒｙ１Ａｉ２（受託番号ＨＱ４３９７８０）；Ｃｒｙ１Ａ様（受託番号ＡＡＫ１４３３９）；Ｃｒｙ１Ｂａｌ（受託番号ＣＡＡ２９８９８）；Ｃｒｙ１Ｂａ２（受託番号ＣＡＡ６５００３）；Ｃｒｙ１Ｂａ３（受託番号ＡＡＫ６３２５１）；Ｃｒｙ１Ｂａ４（受託番号ＡＡＫ５１０８４）；Ｃｒｙ１Ｂａ５（受託番号ＡＢ０２０８９４）；Ｃｒｙ１Ｂａ６（受託番号ＡＢＬ６０９２１）；Ｃｒｙ１Ｂａ７（受託番号ＨＱ４３９７８１）；ＣｒｙｌＢｂ１（受託番号ＡＡＡ２２３４４）；Ｃｒｙ１Ｂｂ２（受託番号ＨＱ４３９７８２）；Ｃｒｙ１Ｂｃｌ（受託番号ＣＡＡ８６５６８）；Ｃｒｙ１Ｂｄｌ（受託番号ＡＡＤ１０２９２）；Ｃｒｙ１Ｂｄ２（受託番号ＡＡＭ９３４９６）；ＣｒｙｌＢｅ１（受託番号ＡＡＣ３２８５０）；Ｃｒｙ１Ｂｅ２（受託番号ＡＡＱ５２３８７）；Ｃｒｙ１Ｂｅ３（受託番号ＡＣＶ９６７２０）；Ｃｒｙ１Ｂｅ４（受託番号ＨＭ０７００２６）；ＣｒｙｌＢｆ１（受託番号ＣＡＣ５０７７８）；Ｃｒｙ１Ｂｆ２（受託番号ＡＡＱ５２３８０）；Ｃｒｙ１Ｂｇｌ（受託番号ＡＡ０３９７２０）；Ｃｒｙ１Ｂｈｌ（受託番号ＨＱ５８９３３１）；Ｃｒｙ１Ｂｉｌ（受託番号ＫＣ１５６７００）；Ｃｒｙ１Ｃａｌ（受託番号ＣＡＡ３０３９６）；Ｃｒｙ１Ｃａ２（受託番号ＣＡＡ３１９５１）；Ｃｒｙ１Ｃａ３（受託番号ＡＡＡ２２３４３）；Ｃｒｙ１Ｃａ４（受託番号ＣＡＡ０１８８６）；Ｃｒｙ１Ｃａ５（受託番号ＣＡＡ６５４５７）；Ｃｒｙ１Ｃａ６  ［１］（受託番号ＡＡＦ３７２２４）；Ｃｒｙ１Ｃａ７（受託番号ＡＡＧ５０４３８）；Ｃｒｙ１Ｃａ８（受託番号ＡＡＭ００２６４）；Ｃｒｙ１Ｃａ９（受託番号ＡＡＬ７９３６２）；ＣｒｙｌＣａ１０（受託番号ＡＡＮ１６４６２）；Ｃｒｙ１Ｃａ１１（受託番号ＡＡＸ５３０９４）；Ｃｒｙ１Ｃａ１２（受託番号ＨＭ０７００２７）；Ｃｒｙ１Ｃａ１３（受託番号ＨＱ４１２６２１）；Ｃｒｙ１Ｃａ１４（受託番号ＪＮ６５１４９３）；ＣｒｙｌＣｂ１（受託番号Ｍ９７８８０）；Ｃｒｙ１Ｃｂ２（受託番号ＡＡＧ３５４０９）；Ｃｒｙ１Ｃｂ３（受託番号ＡＣＤ５０８９４）；Ｃｒｙ１Ｃｂ様（受託番号ＡＡＸ６３９０１）；Ｃｒｙ１Ｄａｌ（受託番号ＣＡＡ３８０９９）；Ｃｒｙ１Ｄａ２（受託番号Ｉ７６４１５）；Ｃｒｙ１Ｄａ３（受託番号ＨＱ４３９７８４）；Ｃｒｙ１  Ｄｂｌ（受託番号ＣＡＡ８０２３４）；Ｃｒｙ１  Ｄｂ２（受託番号ＡＡＫ４８９３７）；Ｃｒｙ１  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；Ｃｒｙ６０Ａａｌ（受託番号ＡＣＵ２４７８２）；Ｃｒｙ６０Ａａ２（受託番号ＥＡ０５７２５４）；Ｃｒｙ６０Ａａ３（受託番号ＥＥＭ９９２７８）；Ｃｒｙ６０Ｂａｌ（受託番号ＧＵ８１０８１８）；Ｃｒｙ６０Ｂａ２（受託番号ＥＡ０５７２５３）；Ｃｒｙ６０Ｂａ３（受託番号ＥＥＭ９９２７９）；Ｃｒｙ６１Ａａｌ（受託番号ＨＭ０３５０８７）；Ｃｒｙ６１Ａａ２（受託番号ＨＭ１３２１２５）；Ｃｒｙ６１Ａａ３（受託番号ＥＥＭ１９３０８）；Ｃｒｙ６２Ａａｌ（受託番号ＨＭ０５４５０９）；Ｃｒｙ６３Ａａｌ（受託番号ＢＡ１４４０２８）；Ｃｒｙ６４Ａａｌ（受託番号ＢＡＪ０５３９７）；Ｃｒｙ６５Ａａｌ（受託番号ＨＭ４６１８６８）；Ｃｒｙ６５Ａａ２（受託番号ＺＰ＿０４１２３８３８）；Ｃｒｙ６６Ａａｌ（受託番号ＨＭ４８５５８１）；Ｃｒｙ６６Ａａ２（受託番号ＺＰ  ＿０４０９９９４５）；Ｃｒｙ６７Ａａｌ（受託番号ＨＭ４８５５８２）；Ｃｒｙ６７Ａａ２（受託番号ＺＰ＿０４１４８８８２）；Ｃｒｙ６８Ａａｌ（受託番号ＨＱ１１３１１４）；Ｃｒｙ６９Ａａｌ（受託番号ＨＱ４０１００６）；Ｃｒｙ６９Ａａ２（受託番号ＪＱ８２１３８８）；Ｃｒｙ６９Ａｂｌ（受託番号ＪＮ２０９９５７）；Ｃｒｙ７０Ａａｌ（受託番号ＪＮ６４６７８１）；Ｃｒｙ７０Ｂａｌ（受託番号ＡＤ０５１０７０）；Ｃｒｙ７０Ｂｂｌ（受託番号ＥＥＬ６７２７６）；Ｃｒｙ７１Ａａｌ（受託番号ＪＸ０２５５６８）；Ｃｒｙ７２Ａａｌ（受託番号ＪＸ０２５５６９）；Ｃｙｔ１Ａａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３１８２）；Ｃｙｔ１Ａｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ９８７９３）；Ｃｙｔ１Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ３７１９６）；Ｃｙｔ２Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ１４１４７）；およびＣｙｔ２Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ５２０４３）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８２】
δ−内毒素の例として、米国特許第５，８８０，２７５号、同第７，８５８，８４９号、同第８，５３０，４１１号、同第８，５７５，４３３号および同第８，６８６，２３３号のＣｒｙ１Ａタンパク質；米国特許第８，３０４，６０４号、同第８，３０４，６０５号および同第８，４７６，２２６号のＤＩＧ−３またはＤＩＧ−１１毒素（Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ３Ａなど、ｃｒｙタンパク質のα−ヘリックス１および／またはα−ヘリックス２バリアントのＮ末端欠失）；米国特許出願第１０／５２５，３１８号のＣｒｙ１Ｂ；米国特許第６，０３３，８７４号のＣｒｙ１Ｃ；米国特許第５，１８８，９６０号および同第６，２１８，１８８号のＣｒｙ１Ｆ；米国特許第７，０７０，９８２号；同第６，９６２，７０５号および同第６，７１３，０６３号）のＣｒｙ１Ａ／Ｆキメラ；米国特許第７，０６４，２４９号）のＣｒｙ２Ａｂタンパク質など、Ｃｒｙ２タンパク質；少なくとも２種の異なるＣｒｙタンパク質の可変領域および保存ブロックの特有の組合せを融合することにより作製された、操作されたハイブリッド殺虫タンパク質（ｅＨＩＰ）が挙げられるがこれらに限定されない、Ｃｒｙ３Ａタンパク質（米国特許出願公開第２０１０／００１７９１４号）；Ｃｒｙ４タンパク質；Ｃｒｙ５タンパク質；Ｃｒｙ６タンパク質；米国特許第７，３２９，７３６号、同第７，４４９，５５２号、同第７，８０３，９４３号、同第７，４７６，７８１号、同第７，１０５，３３２号、同第７，３７８，４９９号および同第７，４６２，７６０号のＣｒｙ８タンパク質；米国特許第８，８０２，９３３号のＣｒｙ９Ｄタンパク質および米国特許第８，８０２，９３４号のＣｒｙ９Ｂタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない、Ｃｒｙ９Ａ、Ｃｒｙ９Ｂ、Ｃｒｙ９Ｃ、Ｃｒｙ９Ｄ、Ｃｒｙ９ＥおよびＣｒｙ９Ｆファミリーのメンバーなど、Ｃｒｙ９タンパク質；Ｎａｉｍｏｖ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００８），  ”Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，”  ７４：７１４５−７１５１のＣｒｙ１５タンパク質；米国特許第６，１２７，１８０号、同第６，６２４，１４５号および同第６，３４０，５９３号のＣｒｙ２２、Ｃｒｙ３４Ａｂｌタンパク質；米国特許第６，２４８，５３５号、同第６，３２６，３５１号、同第６，３９９，３３０号、同第６，９４９，６２６号、同第７，３８５，１０７号および同第７，５０４，２２９号のＣｒｙＥＴ３３およびＣｒｙＥＴ３４タンパク質；米国特許出願公開第２００６／０１９１０３４号、同第２０１２／０２７８９５４号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／１３９００４のＣｒｙＥＴ３３およびＣｒｙＥＴ３４ホモログ；米国特許第６，０８３，４９９号、同第６，５４８，２９１号および同第６，３４０，５９３号のＣｒｙ３５Ａｂｌタンパク質；Ｃｒｙ４６タンパク質、Ｃｒｙ５１タンパク質、Ｃｒｙバイナリー毒素；ＴＩＣ９０１または関連する毒素；米国特許出願公開第２００８／０２９５２０７号のＴＩＣ８０７；ＰＣＴ  ＵＳ２００６／０３３８６７のＥＴ２９、ＥＴ３７、ＴＩＣ８０９、ＴＩＣ８１０、ＴＩＣ８１２、ＴＩＣ１２７、ＴＩＣ１２８；米国特許第８，５１３，４９４号のＴＩＣ８５３毒素、米国特許第８，２３６，７５７号のＡＸＭＩ−０２７、ＡＸＭＩ−０３６およびＡＸＭＩ−０３８；米国特許第７，９２３，６０２号のＡＸＭＩ−０３１、ＡＸＭＩ−０３９、ＡＸＭＩ−０４０、ＡＸＭＩ−０４９；ＷＯ２００６／０８３８９１のＡＸＭＩ−０１８、ＡＸＭＩ−０２０およびＡＸＭＩ−０２１；ＷＯ２００５／０３８０３２のＡＸＭＩ−０１０；ＷＯ２００５／０２１５８５のＡＸＭＩ−００３；米国特許出願公開第２００４／０２５０３１１号のＡＸＭＩ−００８；米国特許出願公開第２００４／０２１６１８６号のＡＸＭＩ−００６；米国特許出願公開第２００４／０２１０９６５号のＡＸＭＩ−００７；米国特許出願第２００４／０２１０９６４号のＡＸＭＩ−００９；米国特許出願公開第２００４／０１９７９１７号のＡＸＭＩ−０１４；米国特許出願公開第２００４／０１９７９１６号のＡＸＭＩ−００４；ＷＯ２００６／１１９４５７のＡＸＭＩ−０２８およびＡＸＭＩ−０２９；ＷＯ２００４／０７４４６２のＡＸＭＩ−００７、ＡＸＭＩ−００８、ＡＸＭＩ−００８ｏｒｆ２、ＡＸＭＩ−００９、ＡＸＭＩ−０１４およびＡＸＭＩ−００４；米国特許第８，０８４，４１６号のＡＸＭＩ−１５０；米国特許出願公開第２０１１／００２３１８４号のＡＸＭＩ−２０５；米国特許出願公開第２０１１／０２６３４８８号のＡＸＭＩ−０１１、ＡＸＭＩ−０１２、ＡＸＭＩ−０１３、ＡＸＭＩ−０１５、ＡＸＭＩ−０１９、ＡＸＭＩ−０４４、ＡＸＭＩ−０３７、ＡＸＭＩ−０４３、ＡＸＭＩ−０３３、ＡＸＭＩ−０３４、ＡＸＭＩ−０２２、ＡＸＭＩ−０２３、ＡＸＭＩ−０４１、ＡＸＭＩ−０６３およびＡＸＭＩ−０６４；米国特許出願公開第２０１０／０１９７５９２号のＡＸＭＩ−Ｒｌおよび関連するタンパク質；ＷＯ２０１１／１０３２４８のＡＸＭＩ２２１ｚ、ＡＸＭＩ２２２ｚ、ＡＸＭＩ２２３ｚ、ＡＸＭＩ２２４ｚおよびＡＸＭＩ２２５ｚ；ＷＯ２０１１／１０３２４７および米国特許第８，７５９，６１９号のＡＸＭＩ２１８、ＡＸＭＩ２１９、ＡＸＭＩ２２０、ＡＸＭＩ２２６、ＡＸＭＩ２２７、ＡＸＭＩ２２８、ＡＸＭＩ２２９、ＡＸＭＩ２３０およびＡＸＭＩ２３１；米国特許第８，３３４，４３１号のＡＸＭＩ−１１５、ＡＸＭＩ−１１３、ＡＸＭＩ−００５、ＡＸＭＩ−１６３およびＡＸＭＩ−１８４；米国特許出願公開第２０１０／０２９８２１１号のＡＸＭＩ−００１、ＡＸＭＩ−００２、ＡＸＭＩ−０３０、ＡＸＭＩ−０３５およびＡＸＭＩ−０４５；米国特許出願公開第２００９／０１４４８５２号のＡＸＭＩ−０６６およびＡＸＭＩ−０７６；米国特許第８，３１８，９００号のＡＸＭＩ１２８、ＡＸＭＩ１３０、ＡＸＭＩ１３１、ＡＸＭＩ１３３、ＡＸＭＩ１４０、ＡＸＭＩ１４１、ＡＸＭＩ１４２、ＡＸＭＩ１４３、ＡＸＭＩ１４４、ＡＸＭＩ１４６、ＡＸＭＩ１４８、ＡＸＭＩ１４９、ＡＸＭＩ１５２、ＡＸＭＩ１５３、ＡＸＭＩ１５４、ＡＸＭＩ１５５、ＡＸＭＩ１５６、ＡＸＭＩ１５７、ＡＸＭＩ１５８、ＡＸＭＩ１６２、ＡＸＭＩ１６５、ＡＸＭＩ１６６、ＡＸＭＩ１６７、ＡＸＭＩ１６８、ＡＸＭＩ１６９、ＡＸＭＩ１７０、ＡＸＭＩ１７１、ＡＸＭＩ１７２、ＡＸＭＩ１７３、ＡＸＭＩ１７４、ＡＸＭＩ１７５、ＡＸＭＩ１７６、ＡＸＭＩ１７７、ＡＸＭＩ１７８、ＡＸＭＩ１７９、ＡＸＭＩ１８０、ＡＸＭＩ１８１、ＡＸＭＩ１８２、ＡＸＭＩ１８５、ＡＸＭＩ１８６、ＡＸＭＩ１８７、ＡＸＭＩ１８８、ＡＸＭＩ１８９；米国特許出願公開第２０１０／０００５５４３号のＡＸＭＩ０７９、ＡＸＭＩ０８０、ＡＸＭＩ０８１、ＡＸＭＩ０８２、ＡＸＭＩ０９１、ＡＸＭＩ０９２、ＡＸＭＩ０９６、ＡＸＭＩ０９７、ＡＸＭＩ０９８、ＡＸＭＩ０９９、ＡＸＭＩ１００、ＡＸＭＩ１０１、ＡＸＭＩ１０２、ＡＸＭＩ１０３、ＡＸＭＩ１０４、ＡＸＭＩ１０７、ＡＸＭＩ１０８、ＡＸＭＩ１０９、ＡＸＭＩ１１０、ＡＸＭＩ１１１、ＡＸＭＩ１１２、ＡＸＭＩ１１４、ＡＸＭＩ１１６、ＡＸＭＩ１１７、ＡＸＭＩ１１８、ＡＸＭＩ１１９、ＡＸＭＩ１２０、ＡＸＭＩ１２１、ＡＸＭＩ１２２、ＡＸＭＩ１２３、ＡＸＭＩ１２４、ＡＸＭＩ１２５７、ＡＸＭＩ１２６８、ＡＸＭＩ１２７、ＡＸＭＩ１２９、ＡＸＭＩ１６４、ＡＸＭＩ１５１、ＡＸＭＩ１６１、ＡＸＭＩ１８３、ＡＸＭＩ１３２、ＡＸＭＩ１３８、ＡＸＭＩ１３７、米国特許出願公開ＵＳ２０１４０２２３５９８のＡＸＭＩ２７０、米国特許出願公開ＵＳ２０１４０２２３５９９のＡＸＭＩ２７９、米国特許第８，３１９，０１９号の改変されたタンパク質分解部位を有するＣｒｙ１ＡおよびＣｒｙ３Ａなどのｃｒｙタンパク質；米国特許出願公開第２０１１／００６４７１０号のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株ＶＢＴＳ  ２５２８由来のＣｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ２ＡａおよびＣｒｙ１Ｃａ毒素タンパク質も挙げられるがこれらに限定されない。
【００８３】
他のＣｒｙタンパク質は、当業者にとって周知である。Ｎ．  Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，”  （１９９８）  Ｖｏｌ  ６２：  ８０７−８１３を参照されたい；「ｗｗｗ」プレフィックスを使用してワールドワイドウェブ上でアクセスすることができるｂｔｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．ｉｎｆｏにおいて、Ｎ．  Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｔｏｘｉｎ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ”  （２０１６）も参照されたい。
【００８４】
トランスジェニック植物形質としてのＣｒｙタンパク質の使用は、当業者にとって周知であり、ＣｒｙｌＡｃ、Ｃｒｙ１Ａｃ＋Ｃｒｙ２Ａｂ、ＣｒｙｌＡｂ、ＣｒｙｌＡ．１０５、ＣｒｙｌＦ、Ｃｒｙ１Ｆａ２、ＣｒｙｌＦ＋ＣｒｙｌＡｃ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ３Ａ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ３Ｂｂｌ、Ｃｒｙ３４Ａｂｌ、Ｃｒｙ３５Ａｂｌ、Ｖｉｐ３Ａ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ９ｃおよびＣＢＩ−Ｂｔを発現する植物が挙げられるがこれらに限定されない、Ｃｒｙトランスジェニック植物は、規制当局による承認を受けた。Ｓａｎａｈｕｊａ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ：  ａ  ｃｅｎｔｕｒｙ  ｏｆ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”  （２０１１）  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｊｏｕｒｎａｌ，  Ａｐｒｉｌ  ９（３）：２８３−３００、および「ｗｗｗ」プレフィックスを使用してワールドワイドウェブ上でアクセスすることができるｃｅｒａ−ｇｍｃ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ａｃｔｉｏｎ＝ｇｍ＿ｃｒｏｐ＿ｄａｔａｂａｓｅにおける、ＣＥＲＡ  （２０１０）  ＧＭ  Ｃｒｏｐ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｒｉｓｋ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  （ＣＥＲＡ），  ＩＬＳＩ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．  を参照されたい。Ｖｉｐ３Ａｂ＆ＣｒｙｌＦａ（ＵＳ２０１２／０３１７６８２）；ＣｒｙｌＢＥ＆ＣｒｙｌＦ（ＵＳ２０１２／０３１１７４６）；ＣｒｙｌＣＡ＆ＣｒｙｌＡＢ（ＵＳ２０１２／０３１１７４５）；ＣｒｙｌＦ＆ＣｒｙＣａ（ＵＳ２０１２／０３１７６８１）；ＣｒｙｌＤａ＆ＣｒｙｌＢｅ（ＵＳ２０１２／０３３１５９０）；ＣｒｙｌＤＡ＆ＣｒｙｌＦａ（ＵＳ２０１２／０３３１５８９）；ＣｒｙｌＡｂ＆ＣｒｙｌＢｅ（ＵＳ２０１２／０３２４６０６）；ＣｒｙｌＦａ＆Ｃｒｙ２ＡａおよびＣｒｙ１Ｉ＆ＣｒｙｌＥ（ＵＳ２０１２／０３２４６０５）；Ｃｒｙ３４Ａｂ／３５ＡｂおよびＣｒｙ６Ａａ（ＵＳ２０１３０１６７２６９）；Ｃｒｙ３４Ａｂ／ＶＣｒｙ３５Ａｂ＆Ｃｒｙ３Ａａ（ＵＳ２０１３０１６７２６８）；ＣｒｙｌＡｂ＆ＣｒｙｌＦ（ＵＳ２０１４０１８２０１８）；ならびにＣｒｙ３ＡおよびＣｒｙｌＡｂまたはＶｉｐ３Ａａ（ＵＳ２０１３０１１６１７０）など、当業者にとって周知の２種以上の殺有害生物タンパク質を植物において発現させることもできる。殺有害生物タンパク質は、米国特許第７，４９１，８６９号の脂質アシルヒドロラーゼ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来などのコレステロールオキシダーゼ（Ｐｕｒｃｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １５：１４０６−１４１３）を含む、殺虫リパーゼも含む。
【００８５】
殺虫タンパク質  −  Ｖｉｐ
殺有害生物タンパク質は、Ｖｉｐ（栄養型殺虫タンパク質（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ  ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ））毒素も含む。
【００８６】
当技術分野で記載されている通り、「昆虫病原性細菌」は、封入体または副胞子結晶の中に蓄積する殺虫タンパク質（上述のＣｒｙおよびＣｙｔタンパク質など）、ならびに培養培地中に分泌される殺虫タンパク質を産生する。後者のうち、そのアミノ酸同一性に従って４つのファミリーに分けられるＶｉｐタンパク質が挙げられる。Ｖｉｐ１およびＶｉｐ２タンパク質は、バイナリー毒素として作用し、甲虫目および半翅目の一部のメンバーに対して毒性である。Ｖｉｐ１構成成分は、昆虫中腸の膜における受容体に結合すると考えられ、Ｖｉｐ２構成成分は、細胞に進入し、そこで、アクチンに対するそのＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を呈し、微小線維形成を防止する。Ｖｉｐ３は、Ｖｉｐ１またはＶｉｐ２に対する配列類似性がなく、鱗翅目の多種多様なメンバーに対して毒性である。その作用機序は、タンパク質分解活性化、中腸上皮膜への結合およびポア形成の観点から、Ｃｒｙタンパク質の作用機序に似ていることが示されたが、Ｖｉｐ３Ａタンパク質は、Ｃｒｙタンパク質と結合部位を共有しない。後者の特性は、これらを、トランスジェニック植物（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ処理作物［Ｂｔ作物］）においてＣｒｙタンパク質と組み合わせて、昆虫抵抗性を防止または遅延し、殺虫性スペクトルを広げるための優れた候補にする。Ｃｒｙタンパク質と組み合わせてＶｉｐ３Ａａタンパク質を発現する、ＢｔワタおよびＢｔトウモロコシの商業栽培された変種が存在する。ごく最近報告されたＶｉｐ４ファミリーに関して、標的昆虫は未だ見出されていない。Ｃｈａｋｒｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （Ｖｉｐ）  ｆｒｏｍ  Ｅｎｔｏｍｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，”  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ２０１６  Ｍａｒ  ２；８０（２）：３２９−３５０を参照されたい。
【００８７】
ＶＩＰは、米国特許第５，８７７，０１２号、同第６，１０７，２７９号、同第６，１３７，０３３号、同第７，２４４，８２０号、同第７，６１５，６８６号および同第８，２３７，０２０号などに見出すことができる。他のＶＩＰタンパク質は、当業者にとって周知である（「ｗｗｗ」プレフィックスを使用してワールドワイドウェブ上でアクセスすることができる、ｌｉｆｅｓｃｉ．ｓｕｓｓｅｘ．ａｃ．ｕｋ／ｈｏｍｅ／Ｎｅｉｌ＿Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ／Ｂｔ／ｖｉｐ．ｈｔｍｌを参照）。
【００８８】
殺虫タンパク質  −  毒素複合体（ＴＣ）ファミリータンパク質
殺有害生物タンパク質は、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ、ＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓおよびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓなどの生物から得ることができる毒素複合体（ＴＣ）タンパク質も含む（米国特許第７，４９１，６９８号および同第８，０８４，４１８号を参照）。一部のＴＣタンパク質は、「スタンドアロン」殺虫活性を有し、他のＴＣタンパク質は、同じ所与の生物によって産生されるスタンドアロン毒素の活性を増強する。「スタンドアロン」ＴＣタンパク質（例えば、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ、ＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓまたはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓに由来）の毒性は、異なる属の供給源の生物に由来する１種または複数のＴＣタンパク質「増強物質」によって増強され得る。ＴＣタンパク質の３つの主要な型が存在する。本明細書に参照される通り、クラスＡタンパク質（「タンパク質Ａ」）は、スタンドアロン毒素である。クラスＢタンパク質（「タンパク質Ｂ」）およびクラスＣタンパク質（「タンパク質Ｃ」）は、クラスＡタンパク質の毒性を増強する。クラスＡタンパク質の例は、ＴｃｂＡ、ＴｃｄＡ、ＸｐｔＡｌおよびＸｐｔＡ２である。クラスＢタンパク質の例は、ＴｃａＣ、ＴｃｄＢ、ＸｐｔＢｌＸｂおよびＸｐｔＣｌＷｉである。クラスＣタンパク質の例は、ＴｃｃＣ、ＸｐｔＣｌＸｂおよびＸｐｔＢｌ  Ｗｉである。殺有害生物タンパク質は、クモ、ヘビおよびサソリ毒液タンパク質も含む。クモ毒液ペプチドの例として、リコトキシン（ｌｙｃｏｔｏｘｉｎ）−１ペプチドおよびその変異体が挙げられるがこれらに限定されない（米国特許第８，３３４，３６６号）。
【００８９】
殺虫タンパク質  −  組合せ
一部の実施形態では、本開示は、１種または複数の殺虫タンパク質の組合せの利用を企図する。例えば、Ｃｒｙタンパク質は、感受性昆虫種に見出される特異的受容体のみを標的化するため、Ｃｒｙタンパク質が、全ての一般的な農業上の有害生物に対しては限られた有用性を有することが公知である。結果的に、本明細書に教示されている新規殺虫タンパク質と共にＣｒｙを発現することにより、植物種が、より幅広いクラスの昆虫に対して拡張された保護を有するであろうことが企図される。
【００９０】
本開示は、したがって、本明細書に教示されている新規殺虫タンパク質を産生する操作された植物種を、１種または複数の他の殺虫タンパク質、例えば、モナライシン、ＰＩＰ、Ｃｒｙ、Ｃｙｔ、ＶＩＰ、ＴＣおよびこれらの任意の組合せも発現する前記植物種と組み合わせて企図する。
【００９１】
発見された殺虫タンパク質をコードする核酸分子
本開示の一態様は、殺虫ポリペプチド、タンパク質、またはその生物学的に活性な部分をコードする核酸配列を含む、単離されたまたは組換え核酸分子、ならびに配列相同性の領域を有するタンパク質をコードする核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用に十分な核酸分子に関係する。
【００９２】
本明細書で使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびにヌクレオチドアナログを使用して生成されたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを指す。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。
【００９３】
「単離された」核酸分子（またはＤＮＡ）は、もはやその天然環境にない、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、核酸配列（またはＤＮＡ）を指すように本明細書で使用されている。「組換え」核酸分子（またはＤＮＡ）は、組換え細菌または植物宿主細胞に存在する核酸配列（またはＤＮＡ）を指すように本明細書で使用されている。一部の実施形態では、「単離された」または「組換え」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて核酸に天然に隣接する配列（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）を含まない。本開示の目的のため、「単離された」または「組換え」は、核酸分子を指すように使用される場合、単離された染色体を除外する。例えば、様々な実施形態では、本開示の殺虫タンパク質をコードする組換え核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて核酸分子に天然に隣接する、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満の核酸配列を含有することができる。
【００９４】
一部の実施形態では、殺虫タンパク質をコードする単離された核酸分子は、ネイティブまたはゲノム核酸配列と比較して、核酸配列の１個または複数の変化を有する。一部の実施形態では、ネイティブまたはゲノム核酸配列の変化として、遺伝暗号の縮重による核酸配列の変化；ネイティブまたはゲノム配列と比較した、アミノ酸置換、挿入、欠失および／または付加による核酸配列の変化；１個または複数のイントロンの除去；１個または複数の上流または下流調節領域の欠失；ならびにゲノム核酸配列に関連する５’および／または３’非翻訳領域の欠失が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、殺虫タンパク質をコードする核酸分子は、非ゲノム配列である。
【００９５】
本開示の殺虫タンパク質をコードする種々のポリヌクレオチドが企図される。そのようなポリヌクレオチドは、適したプロモーター、転写終止および／またはポリアデニル化配列に作動可能に連結されたときに、宿主細胞における殺虫タンパク質の産生に有用である。そのようなポリヌクレオチドは、さらなる殺虫タンパク質をコードする相同または実質的に相同なポリヌクレオチドを単離するためのプローブとしても有用である。
【００９６】
本開示の殺虫タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本明細書に開示されている配列からｄｅ  ｎｏｖｏ合成することができる。ポリヌクレオチド遺伝子の配列は、遺伝暗号の使用により、開示されているタンパク質配列から推論することができる。「ＢａｃｋＴｒａｎｓｌａｔｅ」（ＧＣＧ（商標）パッケージ、Ａｃｃｌｅｒｙｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）などのコンピュータプログラムを使用して、ペプチド配列を、ペプチドをコードする対応するヌクレオチド配列に変換することができる。
【００９７】
さらに、本開示の合成ポリヌクレオチド配列は、植物において発現されるように設計することができる。米国特許第５，５００，３６５号は、合成遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルを改善するための植物遺伝子を合成するための方法について記載する。本方法は、植物によってより効率的に転写、プロセシング、翻訳および発現させるための、外因性トランスジーンの構造遺伝子配列の改変に関する。植物において十分に発現される遺伝子の特色は、殺虫タンパク質の毒性部分のアミノ酸配列を実質的に保持しながらの、遺伝子転写物のコード領域における望まれないイントロンスプライシングまたはポリアデニル化を引き起こし得る配列の排除を含む。単子葉植物におけるトランスジーンの増強された発現を得るための同様の方法は、米国特許第５，６８９，０５２号に開示されている。「相補体」は、所与の核酸配列にハイブリダイズして、これにより、安定した二重鎖を形成することができるような、所与の核酸配列に対し十分に相補的な核酸配列を指すように本明細書で使用されている。「ポリヌクレオチド配列バリアント」は、遺伝暗号の縮重を除いて、同じポリペプチドをコードする、核酸配列を指すように本明細書で使用されている。
【００９８】
一部の実施形態では、本開示の殺虫タンパク質をコードする核酸分子は、非ゲノム核酸配列である。本明細書で使用される場合、「非ゲノム核酸配列」または「非ゲノム核酸分子」は、ネイティブまたはゲノム核酸配列と比較して、核酸配列の１個または複数の変化を有する核酸分子を指す。一部の実施形態では、ネイティブまたはゲノム核酸分子に対する変化として、遺伝暗号の縮重による核酸配列の変化；植物における発現のための核酸配列のコドン最適化；ネイティブまたはゲノム配列と比較した、少なくとも１個のアミノ酸置換、挿入、欠失および／または付加を導入するための核酸配列の変化；ゲノム核酸配列に関連する１個または複数のイントロンの除去；１個または複数の異種イントロン（ｉｎｔｒａｎ）の挿入；ゲノム核酸配列に関連する１個または複数の上流または下流調節領域の欠失；１個または複数の異種上流または下流調節領域の挿入；ゲノム核酸配列に関連する５’および／または３’非翻訳領域の欠失；異種５’および／または３’非翻訳領域の挿入；ならびにポリアデニル化部位の改変が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、非ゲノム核酸分子は、ｃＤＮＡである。
【００９９】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に教示されている殺虫タンパク質をコードする核酸分子、ならびにアミノ酸置換、欠失、挿入を有した本明細書に教示されているタンパク質およびこれらの断片ならびにこれらの組合せをコードする核酸分子を教示する。
【０１００】
その後にスプライシングされて機能的殺虫タンパク質を最終的に産生する、転写および／または翻訳産物をコードする核酸分子も提供される。スプライシングは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで達成することができ、シスまたはトランス−スプライシングが関与し得る。スプライシングの基質は、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ転写物）またはポリペプチドであり得る。ポリヌクレオチドのシス−スプライシングの例は、コード配列に挿入されたイントロンが除去され、２個の隣接するエクソン領域がスプライシングされて、殺虫タンパク質コード配列を生成する場合である。トランス−スプライシングの例は、ポリヌクレオチドが、コード配列を２個またはそれよりも多い断片に分離することにより暗号化され、これらの断片が別々に転写され、次いでスプライシングされて、全長殺有害生物タンパク質コード配列を形成することができる場合であろう。構築物に導入され得るスプライシングエンハンサー配列の使用は、ポリペプチドのシスまたはトランス−スプライシングのいずれかにおけるスプライシングを容易にすることができる（米国特許第６，３６５，３７７号および同第６，５３１，３１６号）。よって、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、全長殺虫タンパク質を直接的にコードしないが、むしろ、その断片（単数または複数）をコードする。
【０１０１】
殺虫タンパク質をコードする上述の配列の断片である核酸分子も、実施形態によって包含される。「断片」は、本明細書で使用される場合、殺虫タンパク質をコードする核酸配列の部分を指す。核酸配列の断片は、タンパク質の生物学的に活性な部分をコードすることができる、または本明細書に開示されている方法を使用してハイブリダイゼーションプローブもしくはＰＣＲプライマーとして使用することができる断片であり得る。核酸配列の断片である核酸分子は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００個もしくはそれよりも多い連続したヌクレオチド、または最大で、本明細書に教示されている殺虫タンパク質をコードする全長核酸配列に存在するヌクレオチドの数を含む。「連続したヌクレオチド」は、互いに直ちに隣り合ったヌクレオチド残基を指すように本明細書で使用されている。実施形態の核酸配列の断片は、殺虫タンパク質の生物活性を保持するタンパク質断片をコードする。一部の実施形態では、核酸配列の断片は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００個もしくはそれよりも多い連続したアミノ酸、または最大で、本明細書に教示されている全長殺虫タンパク質に存在するアミノ酸の総数をコードする。一部の実施形態では、断片は、例えば、タンパク質分解、開始コドンの挿入、停止コドンの付随する挿入を伴う欠失されるアミノ酸をコードするコドンの欠失による、またはコード配列における停止コドンの挿入による、本明細書に教示されている殺虫タンパク質と比べて、Ｎ末端および／またはＣ末端からの少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個またはそれよりも多いアミノ酸のＮ末端および／またはＣ末端トランケーションである。
【０１０２】
一部の実施形態では、殺虫タンパク質は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、または配列番号７１の核酸配列と十分に同様な核酸配列によってコードされる。「十分に同様」は、標準パラメーターを使用して、本明細書に記載されているまたは当業者にとって公知のアライメントプログラムの１種を使用して、参照配列と比較して、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列類似性を有するアミノ酸または核酸配列を指すように本明細書で使用されている。
【０１０３】
一部の実施形態では、殺虫タンパク質は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、または配列番号７１の核酸配列に対し十分な配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。「十分な配列同一性」は、標準パラメーターを使用して、本明細書に記載されているまたは当業者にとって公知のアライメントプログラムの１種を使用して、参照配列と比較して、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸または核酸配列を指すように本明細書で使用されている。
【０１０４】
パーセント同一性計算
当業者であれば、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム位置決定などを考慮に入れることにより、上述の値を適切に調整して、２種の核酸配列によってコードされるタンパク質の対応する相同性または同一性を決定することができることを認識するであろう。一部の実施形態では、配列相同性は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの全長配列に対するものである。一部の実施形態では、配列同一性は、全てデフォルトパラメーターで、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（登録商標）プログラム一式（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）のＡＬＩＧＮＸ（登録商標）モジュールにおけるＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用して計算される。一部の実施形態では、配列同一性は、全てデフォルトパラメーターで、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩプログラム一式（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）のＡＬＩＧＮＸモジュールにおけるＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用して計算される、ポリペプチドの全体の長さにわたる。
【０１０５】
２種のアミノ酸配列または２種の核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列は、最適な比較目的でアライメントされる。２種の配列間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、パーセント同一性＝同一位置の数／位置の総数（例えば、重複する位置）×ｌ００）。一実施形態では、２種の配列は、同じ長さである。別の実施形態では、比較は、参照配列の全体にわたる。２種の配列間のパーセント同一性は、ギャップありまたはなしで、後述する技法と同様の技法を使用して決定することができる。パーセント同一性の計算において、典型的に正確なマッチが計数される。
【０１０６】
２種の配列（核酸またはアミノ酸）間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２種の配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７における通りに改変された、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  （１９９０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：２２６４のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸプログラムに取り込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワードの長さ＝１２により行って、実施形態の殺有害生物核酸分子に相同な核酸配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワードの長さ＝３により行って、実施形態の殺有害生物タンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のギャップ入りアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９に記載されている通りにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０における）を利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の遠い関係性を検出する繰返し検索を行うことができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）上記を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＸおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。アライメントは、点検により手作業で行うこともできる。
【０１０７】
配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｈｉｇｇｉｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：４６７３−４６８０）である。ＣｌｕｓｔａｌＷは、配列を比較し、アミノ酸またはＤＮＡ配列の全体をアライメントし、これにより、アミノ酸配列全体の配列保存に関するデータを提供することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（登録商標）プログラム一式（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）のＡＬＩＧＮＸ（登録商標）モジュールなど、いくつかの市販のＤＮＡ／アミノ酸解析ソフトウェアパッケージにおいて使用されている。ＣｌｕｓｔａｌＷによるアミノ酸配列のアライメント後に、パーセントアミノ酸同一性を評価することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアライメントの解析に有用なソフトウェアプログラムの非限定的な例は、ＧＥＮＥＤＯＣ（商標）である。ＧＥＮＥ−ＤＯＣ（商標）（Ｋａｒｌ  Ｎｉｃｈｏｌａｓ）は、複数のタンパク質間のアミノ酸（またはＤＮＡ）類似性および同一性の評価を可能にする。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，  （１９８８）  ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ、バージョン１０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．、９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｄ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡから入手可）の一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長さペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用することができる。
【０１０８】
配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  （１９７０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８（３）：４４３−４５３のアルゴリズムであり、ＧＡＰバージョン１０ソフトウェアを使用して、次のデフォルトパラメーターを使用して配列同一性または類似性を決定する：ＧＡＰ重量５０および長さ重量３を使用した、核酸配列のための％同一性および％類似性；ＧＡＰ重量８および長さ重量２ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングプログラムを使用した、アミノ酸配列のための％同一性または％類似性。等価なプログラムを使用することもできる。よって、問題になっている任意の２種の配列のために、同一ヌクレオチドまたはアミノ酸残基マッチを有するアライメントを生成し、パーセント配列同一性を計算する、任意の配列比較プログラムを使用することができる。
【０１０９】
核酸分子バリアント
本開示は、殺虫タンパク質バリアントをコードする核酸分子を提供する。コード核酸配列の「バリアント」は、本明細書に開示されている殺虫タンパク質をコードするが、遺伝暗号の縮重のため保存的に異なる配列、ならびに上に論じられている通り十分に同一である配列を含むことができる。天然に存在する対立遺伝子バリアントは、下に概要を述べる、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技法など、周知の分子生物学技法の使用により同定することができる。バリアント核酸配列は、例えば、部位特異的変異誘発を使用することにより生成されたが、開示されている殺虫タンパク質を依然としてコードする、合成により得られる核酸配列も含む。
【０１１０】
本開示は、本明細書に開示されている殺虫タンパク質のいずれかをコードする、単離されたまたは組換えポリヌクレオチドを提供する。当業者であれば、遺伝暗号の縮重により、本開示のタンパク質をコードする多数のヌクレオチド配列が存在することを容易に認めるであろう。表Ａは、アミノ酸毎の同義コドンを提供するコドン表である。例えば、コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧおよびＣＧＵは全て、アミノ酸アルギニンをコードする。よって、コドンによってアルギニンが指定される、本開示の核酸の全位置において、コドンは、コードされるポリペプチドを変更することなく、上に記載されている対応するコドンのいずれかに変更することができる。ＲＮＡ配列におけるＵが、ＤＮＡ配列におけるＴに対応することが理解される。
【表Ａ−１】
2021514643.tif 000009
【表Ａ−２】
2021514643.tif 000010
【０１１１】
当業者は、核酸配列の変異によって変化を導入して、これにより、タンパク質の生物活性を変更することなく、コードされるタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすことができることをさらに認めるであろう。よって、１個または複数のアミノ酸置換、付加または欠失が、コードされるタンパク質に導入されるように、本明細書に開示されている対応する核酸配列に１個または複数のヌクレオチド置換、付加および／または欠失を導入することにより、バリアント核酸分子を作製することができる。部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発など、標準技法によって変異を導入することができる。そのようなバリアント核酸配列も、本開示によって包含される。
【０１１２】
あるいは、バリアント核酸配列は、飽和変異誘発によるなど、コード配列の全体または一部に沿ってランダムに変異を導入することにより作製することができ、結果としての変異体は、殺有害生物活性を付与する能力に関してスクリーニングして、活性を保持する変異体を同定することができる。変異誘発後に、コードされるタンパク質は、組換えにより発現させることができ、タンパク質の活性は、標準アッセイ技法を使用して決定することができる。
【０１１３】
本開示のポリヌクレオチドおよびその断片は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋに表記されている標準クローニング方法に加えて、種々の組換えおよび再帰的組換え反応のための基質として必要に応じて使用されて、すなわち、所望の特性を有する追加的な殺有害生物タンパク質ホモログおよびその断片を産生する。種々のそのような反応が公知である。第２の（またはそれよりも多い）ポリヌクレオチドによりそのようなポリヌクレオチドを再帰的に組換え、これにより、バリアントポリヌクレオチドのライブラリーを形成するステップを含む、本明細書に収載されている任意の核酸のバリアントを産生するための方法もまた、産生されるライブラリー、ライブラリーを含む細胞、およびそのような方法によって産生される任意の組換えポリヌクレオチドと同様に、本開示の実施形態である。
【０１１４】
核酸再帰的組換えプロトコールを含む、種々の多様性生成プロトコールを利用可能であり、これは、当技術分野で十分に記載されている。手順を、別々におよび／または組み合わせて使用して、核酸または核酸のセットの１種または複数のバリアント、ならびにコードされるタンパク質のバリアントを産生することができる。個々におよびまとめて、これらの手順は、例えば、新たなおよび／または改善された特徴を有する核酸、タンパク質、経路、細胞および／または生物の操作または迅速な進化に有用な、多様化された核酸および核酸のセット（例えば、核酸ライブラリーを含む）を生成する、頑強な、広く適用可能な仕方を提供する。
【０１１５】
明確にするために、後に続く議論の過程において区別および分類が行われるが、技法は相互排他的でないことが多いことが認められるであろう。実際に、単独にまたは組み合わせて、並行してまたは順次に、様々な方法を使用して、多様な配列バリアントにアクセスすることができる。
【０１１６】
本明細書に記載されている多様性生成手順のいずれかの結果は、望ましい特性を有するもしくはこれを付与する核酸、または望ましい特性を有するもしくはこれを付与するタンパク質をコードする核酸に関して選択またはスクリーニングされ得る、１種または複数の核酸の生成であり得る。本明細書における方法または当業者が利用可能な他の方法の１種または複数による多様化の後に、産生される任意の核酸が、所望の活性または特性、例えば、殺有害生物活性に関して選択され得る。これは、例えば、自動化されたまたは自動化可能な形式で、当技術分野におけるアッセイのいずれかによって、検出され得る任意の活性を同定するステップを含むことができる、例えば、殺虫活性のスクリーニングの議論、下記、を参照されたい。種々の関連する（またはさらには無関係の）特性は、実施者の裁量において、逐次にまたは並行して評価することができる。
【０１１７】
改変された核酸配列、例えば、殺有害生物活性を有するタンパク質またはその断片をコードする核酸配列を生成するための種々の多様性生成手順の記載は、次の刊行物およびその中に引用されている参考文献に見出される：Ｓｏｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２５（４）：４３６−４３９；Ｓｔｅｍｍｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ４：  １−４；Ｎｅｓｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ｌ７：８９３−８９６；Ｃｈａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ｌ７：７９３−７９７；Ｍｉｎｓｈｕｌｌ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍｍｅｒ，  （１９９９）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ３：２８４−２９０；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １７：２５９−２６４；Ｃｒａｍｅｒｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１；Ｃｒａｍｅｒｉ，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １５：４３６−４３８；Ｚｈａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９４：４５０４−４５０９；Ｐａｔｔｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ８：７２４−７３３；Ｃｒａｍｅｒｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ２：１００−１０３；Ｃｒａｍｅｒｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４：３１５−３１９；Ｇａｔｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２５５：３７３−３８６；Ｓｔｅｍｍｅｒ，（１９９６）  ”Ｓｅｘｕａｌ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＰＣＲ”  Ｉｎ：  Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．  ｐｐ．  ４４７−４５７；Ｃｒａｍｅｒｉ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍｍｅｒ，  （１９９５）  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：  １９４−１９５；Ｓｔｅｍｍｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｇｅｎｅ，  １６４：４９−５３；Ｓｔｅｍｍｅｒ，  （１９９５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：  １５１０；Ｓｔｅｍｍｅｒ，  （１９９５）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５４９−５５３；Ｓｔｅｍｍｅｒ，  （１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１およびＳｔｅｍｍｅｒ，  （１９９４）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１。
【０１１８】
多様性を生成する変異方法は、例えば、部位特異的変異誘発（Ｌｉｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２５４（２）：  １５７−１７８；Ｄａｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５７：３６９−３７４；Ｓｍｉｔｈ，  （１９８５）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  １９：４２３−４６２；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔｌｅ，  （１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３−１２０１；Ｃａｒｔｅｒ，  （１９８６）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２３７：  １−７およびＫｕｎｋｅｌ，  （１９８７）  ”Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｌｉｌｌｅｙ，  ｅｄｓ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ））；ウラシル含有鋳型を使用した変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ，  （１９８５）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４：３６７−３８２およびＢａｓｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：２４０−２４５）；オリゴヌクレオチド特異的変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  （１９８３）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １００：４６８−５００；Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  （１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４：３２９−３５０  （１９８７）；Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  （１９８２）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １０：６４８７−６５００）、ホスホロチオエート改変ＤＮＡ変異誘発（Ｔａｙｌｏｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８５）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：８７４９−８７６４；Ｔａｙｌｏｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８５）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：８７６５−８７８７  （１９８５）；Ｎａｋａｍａｙｅ  ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  （１９８６）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：９６７９−９６９８；Ｓａｙｅｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：７９１−８０２およびＳａｙｅｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：８０３−８１４）；ギャップ入り二重鎖ＤＮＡを使用した変異誘発（Ｋｒａｍｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：９４４１−９４５６；Ｋｒａｍｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ，  （１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４：３５０−３６７；Ｋｒａｍｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：７２０７およびＦｒｉｔｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：６９８７−６９９９）を含む。
【０１１９】
追加的な適した方法は、点ミスマッチ修復（Ｋｒａｍｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  Ｃｅｌｌ  ３８：８７９−８８７）、修復欠損宿主株を使用した変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８５）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：４４３１−４４４３およびＣａｒｔｅｒ，  （１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４：３８２−４０３）、欠失変異誘発（Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  （１９８６）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：  ５１１５）、制限選択および制限精製（Ｗｅｌｌｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）  Ｐｈｉｌ．  Ｔｒａｎｓ．  Ｒ．  Ｓｏｃ．  Ｌｏｎｄ．  Ａ３１７：４１５−４２３）、全遺伝子合成による変異誘発（Ｎａｍｂｉａｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９−１３０１；Ｓａｋａｍａｒ  ａｎｄ  Ｋｈｏｒａｎａ，  （１９８８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：６３６１−６３７２；Ｗｅｌｌｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８５）  Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３およびＧｒｕｎｄｓｔｒｉｉｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８５）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：３３０５−３３１６）、二本鎖切断修復（Ｍａｎｄｅｃｋｉ，  （１９８６）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，  ８３：７１７７−７１８１およびＡｒｎｏｌｄ，  （１９９３）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ４：４５０−４５５）を含む。上述の方法の多くに関する追加的な詳細は、様々な変異誘発方法に伴う問題のトラブルシューティングのための有用な制御についても記載する、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  Ｖｏｌｕｍｅ  １５４に見出すことができる。
【０１２０】
様々な多様性生成方法に関する追加的な詳細は、次の米国特許、ＰＣＴ公開および出願ならびにＥＰＯ公開に見出すことができる：米国特許第５，７２３，３２３号、米国特許第５，７６３，１９２号、米国特許第５，８１４，４７６号、米国特許第５，８１７，４８３号、米国特許第５，８２４，５１４号、米国特許第５，９７６，８６２号、米国特許第５，６０５，７９３号、米国特許第５，８１１，２３８号、米国特許第５，８３０，７２１号、米国特許第５，８３４，２５２号、米国特許第５，８３７，４５８号、ＷＯ１９９５／２２６２５、ＷＯ１９９６／３３２０７、ＷＯ１９９７／２００７８、ＷＯ１９９７／３５９６６、ＷＯ１９９９／４１４０２、ＷＯ１９９９／４１３８３、ＷＯ１９９９／４１３６９、ＷＯ１９９９／４１３６８、ＥＰ７５２００８、ＥＰ０９３２６７０、ＷＯ１９９９／２３１０７、ＷＯ１９９９／２１９７９、ＷＯ１９９８／３１８３７、ＷＯ１９９８／２７２３０、ＷＯ１９９８／２７２３０、ＷＯ２０００／００６３２、ＷＯ２０００／０９６７９、ＷＯ１９９８／４２８３２、ＷＯ１９９９／２９９０２、ＷＯ１９９８／４１６５３、ＷＯ１９９８／４１６２２、ＷＯ１９９８／４２７２７、ＷＯ２０００／１８９０６、ＷＯ２０００／０４１９０、ＷＯ２０００／４２５６１、ＷＯ２０００／４２５５９、ＷＯ２０００／４２５６０およびＷＯ２００１／２３４０１。
【０１２１】
関連する核酸を見出すための核酸分子プローブ
実施形態のヌクレオチド配列を使用して、他の生物、特に、他の細菌、特に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種から対応する配列を単離することもできる。この様式で、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどの方法を使用して、本明細書に表記されている配列に対するその配列相同性に基づき、そのような配列を同定することができる。
【０１２２】
本明細書に表記されている配列全体またはその断片に対するその配列同一性に基づき選択される配列は、実施形態によって包含される。そのような配列は、開示されている配列のオルソログである配列を含む。用語「オルソログ」は、共通先祖遺伝子に由来する、種分化の結果として異なる種に見出される遺伝子を指す。そのヌクレオチド配列および／またはそのコードされるタンパク質配列が、本明細書の他の箇所に定義される実質的同一性を共有する場合、異なる種に見出される遺伝子は、オルソログと考慮される。オルソログの機能は、種間で高度に保存されていることが多い。
【０１２３】
ＰＣＲアプローチにおいて、オリゴヌクレオチドプライマーは、任意の目的の生物から抽出されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから対応するＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲ反応における使用のために設計することができる。ＰＣＲプライマーおよびＰＣＲクローニングを設計するための方法は一般に、当技術分野で公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  Ｎ．Ｙ．）、以降「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」に開示されている。Ｉｎｎｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  （１９９０）  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｉｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，  ｅｄｓ．  （１９９５）  ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＩｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，  ｅｄｓ．  （１９９９）  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）も参照されたい。ＰＣＲの公知の方法として、ペアードプライマー、ネステッドプライマー、単一の特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的にミスマッチしたプライマーなどを使用した方法が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２４】
細菌収集物から本開示の殺虫タンパク質を同定するために、細菌細胞ライセートは、ウエスタンブロッティングおよび／またはＥＬＩＳＡ方法を使用して、教示されているタンパク質に対して生成された抗体によりスクリーニングすることができる。この種のアッセイは、ハイスループット様式で行うことができる。陽性試料は、抗体に基づくタンパク質精製および同定などの様々な技法によってさらに解析することができる。抗体を生成する方法は、下記に議論されている通り、当技術分野で周知である。
【０１２５】
あるいは、文献（Ｓｃｏｔｔ  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，  （１９９８），  １０．２２，  １−２４，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎ  Ｉｎｃ）におけるプロトコールを使用して、質量分析に基づくタンパク質同定方法を使用して、教示されているタンパク質のホモログを同定することができる。具体的には、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに基づくタンパク質同定方法を使用して、所与の細胞ライセートまたは所望の分子量富化試料（関連する分子量バンドのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから本明細書に教示されているタンパク質へと切り出された）のＭＳデータを、教示されているタンパク質およびホモログの配列情報と関連付けることができる。ペプチド配列における任意のマッチは、試料においてホモログを有する可能性を示す。追加的な技法（タンパク質精製および分子生物学）を使用して、タンパク質を単離し、ホモログの配列を同定することができる。
【０１２６】
ハイブリダイゼーション方法において、殺有害生物核酸配列の全体または一部を使用して、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。そのようなｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーの構築のための方法は一般に、当技術分野で公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  （２００１）、上記に開示されている。いわゆるハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片または他のオリゴヌクレオチドであり得、３２Ｐなどの検出可能な基、または他の放射性同位体、蛍光化合物、酵素もしくは酵素補因子などの他の任意の検出可能なマーカーで標識されていてよい。ハイブリダイゼーションのためのプローブは、本明細書に開示されている公知のペプチドコード核酸配列に基づく合成オリゴヌクレオチドを標識することにより作製することができる。さらに、核酸配列またはコードされるアミノ酸配列における保存されたヌクレオチドまたはアミノ酸残基に基づいて設計された縮重プライマーを使用することができる。プローブは典型的に、本開示のタンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする核酸配列の少なくとも約１２、少なくとも約２５、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５または２００個の連続したヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列の領域を含む。ハイブリダイゼーションのためのプローブの調製のための方法は一般に、当技術分野で公知であり、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  （２００１）、上記に開示されている。
【０１２７】
例えば、本明細書に教示されている殺虫タンパク質をコードする核酸配列全体、またはその１種もしくは複数の部分は、同様の配列をコードする対応する核酸配列およびメッセンジャーＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることができるプローブとして使用することができる。種々の条件下で特異的ハイブリダイゼーションを達成するために、そのようなプローブは、特有の配列を含み、好ましくは、少なくとも約１０ヌクレオチドの長さまたは少なくとも約２０ヌクレオチドの長さである。そのようなプローブを使用して、ＰＣＲによって選択された生物から対応する殺有害生物配列を増幅することができる。この技法を使用して、所望の生物から追加的なコード配列を単離する、または診断アッセイとして、生物におけるコード配列の存在を決定することができる。ハイブリダイゼーション技法は、プレーティングされたＤＮＡライブラリー（プラークまたはコロニーのいずれか）のハイブリダイゼーションスクリーニングを含む；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。
【０１２８】
そのような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実行することができる。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブが、他の配列に対するよりも検出可能なほど大きい程度（例えば、バックグラウンドよりも少なくとも２倍）で、その標的配列にハイブリダイズする条件を指すように本明細書で使用されている。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況で異なる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに対し１００％相補的な標的配列を同定することができる（相同プロービング）。あるいは、ストリンジェンシー条件は、より低い程度の類似性が検出されるように、配列におけるある程度のミスマッチを許容するように調整することができる（異種プロービング）。一般に、プローブは、約１０００ヌクレオチド未満の長さ、好ましくは、５００ヌクレオチド未満の長さである。
【０１２９】
典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で、約１．５Ｍ  Ｎａイオン未満、典型的には、約０．０１〜１．０Ｍ  Ｎａイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドよりも長い）では少なくとも約６０℃である、条件である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加により達成することもできる。例示的な低ストリンジェンシー条件は、３７℃での、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液によるハイブリダイゼーション、および５０〜５５℃での、１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）における洗浄を含む。例示的な中等度ストリンジェンシー条件は、３７℃での、４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション、および５５〜６０°での、０．５×〜１×ＳＳＣにおける洗浄を含む。例示的な高ストリンジェンシー条件は、３７℃での、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃での、０．１×ＳＳＣにおける洗浄を含む。必要に応じて、洗浄緩衝液は、約０．１％〜約１％ＳＤＳを含むことができる。ハイブリダイゼーションの持続時間は、一般に、約２４時間未満、通常、約４〜約１２時間である。
【０１３０】
特異性は、典型的に、ハイブリダイゼーション後洗浄の関数であり、決定的要因は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのため、Ｔｍは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｈｌ，  （１９８４）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １３８：２６７−２８４の方程式から近似され得る：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ  Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ；式中、Ｍは、一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡにおけるグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液におけるホルムアミドのパーセンテージであり、Ｌは、塩基対単位でのハイブリッドの長さである。Ｔｍは、相補的標的配列の５０％が、完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする、温度（定義されるイオン強度およびｐＨ下での）である。Ｔｍは、ミスマッチ１％につき約１℃低下される；よって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするように調整することができる。例えば、９０％同一性を有する配列が求められる場合、Ｔｍは、１０℃減少させることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されるイオン強度およびｐＨで、特異的配列およびその相補体のための熱的融解点（ｔｈｅｒｍａｌ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。しかし、重度にストリンジェントな条件は、熱的融解点（Ｔｍ）よりも１、２、３または４℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる；中等度にストリンジェントな条件は、熱的融解点（Ｔｍ）よりも６、７、８、９または１０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる；低ストリンジェンシー条件は、熱的融解点（Ｔｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５または２０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。方程式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成、ならびに所望のＴｍを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーにおける変形形態が、本質的に記載されていることを理解するであろう。所望の程度のミスマッチが、４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴｍをもたらす場合、より高い温度を使用することができるように、ＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，  （１９９３）  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｐａｒｔ  Ｉ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２  （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎ．Ｙ．）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  （１９９５）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２  （Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見出され��。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。
【０１３１】
新たに発見された殺虫タンパク質、そのバリアントおよび断片
新規殺虫タンパク質が、前記タンパク質のバリアントおよびその断片と共に、本明細書に開示されている。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、一部の例では、２つの用語間の区分が、単にアミノ酸配列の数に依存し得ることが当技術分野において理解される通り、互換的に使用されている。本開示の殺虫タンパク質は、１種または複数の昆虫または有害生物に対する殺虫または殺有害生物活性を実証する。
【０１３２】
一部の実施形態では、殺虫タンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２のアミノ酸配列に十分に相同である。「十分に相同」は、標準パラメーターを使用して、本明細書に記載されているまたは当業者にとって公知のアライメントプログラムの１種を使用して、参照配列と比較して、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１  ％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列相同性を有するアミノ酸または核酸配列を指すように本明細書で使用されている。
【０１３３】
一部の実施形態では、殺虫タンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２のアミノ酸配列に対し十分な配列同一性を有する。「十分な配列同一性」は、標準パラメーターを使用して、本明細書に記載されているまたは当業者にとって公知のアライメントプログラムの１種を使用して、参照配列と比較して、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１  ％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有するアミノ酸または核酸配列を指すように本明細書で使用されている。
【０１３４】
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９または配列番号７１の核酸配列によってコードされる、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２のアミノ酸配列を提供する。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質」、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、５個またはそれよりも多いアミノ酸を含む任意の分子を含む。タンパク質、ペプチドまたはポリペプチド分子が、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、リン酸化またはオリゴマー化などが挙げられるがこれらに限定されない、翻訳後改変を含む改変を起こし得ることが当技術分野で周知である。よって、本明細書で使用される場合、用語「タンパク質」、「ペプチド分子」または「ポリペプチド」は、任意の生物学的または非生物学的プロセスによって改変された任意のタンパク質を含む。
【０１３６】
「組換えタンパク質」は、もはやその天然環境にない、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるまたは組換え細菌もしくは植物宿主細胞におけるタンパク質を指すように本明細書で使用されている。細胞材料を実質的に含まない殺虫タンパク質は、約３０％、２０％、１０％または５％（乾燥重量で）未満の非殺有害生物タンパク質（本明細書において、「混入タンパク質」とも称される）を有するタンパク質の調製物を含む。
【０１３７】
「断片」または「生物学的に活性な部分」は、本明細書に教示されているタンパク質と十分に同一なアミノ酸配列を含み、殺虫活性を示すタンパク質断片を含む。
【０１３８】
よって、本開示は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２に表記されているアミノ酸配列の断片を企図する。
【０１３９】
一部の実施形態では、タンパク質断片は、例えば、タンパク質分解による、開始コドンの挿入による、欠失されるアミノ酸をコードするコドンの欠失および開始コドンの付随する挿入による、ならびに／または停止コドンの挿入による、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２と比べて、Ｎ末端および／またはＣ末端からの少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個またはそれよりも多いアミノ酸のＮ末端および／またはＣ末端トランケーションである。
【０１４０】
「バリアント」は、本明細書で使用される場合、親アミノ酸配列と少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１  ％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１  ％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１  ％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドを指す。
【０１４１】
用語「約」は、核酸またはアミノ酸の％配列同一性に関して本明細書で使用される場合、最大で、０．１％増分で±１．０％でありこれを含むことを意味する。例えば、「約９０％」の配列同一性は、８９．０％、８９．１％、８９．２％、８９．３％、８９．４％、８９．５％、８９．６％、８９．７％、８９．８％、８９．９％、９０％、９０．１％、９０．２％、９０．３％、９０．４％、９０．５％、９０．６％、９０．７％、９０．８％、９０．９％および９１％を含む。％配列同一性の文脈で使用されない場合には、「約」は、±１０％を意味する。
【０１４２】
一部の実施形態では、殺虫タンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２のアミノ酸配列の全体の長さにわたって少なくとも約５０％、５１  ％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１  ％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１  ％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する。
【０１４３】
一部の実施形態では、殺虫タンパク質は、改変された物理的特性を有する。本明細書で使用される場合、用語「物理的特性」は、タンパク質の物理化学的特徴を記載するのに適した任意のパラメーターを指す。本明細書で使用される場合、「目的の物理的特性」および「目的の特性」は、調査および／または改変されているタンパク質の物理的特性を指すように互換的に使用される。物理的特性の例として、正味表面電荷およびタンパク質表面における電荷分布、正味疎水性およびタンパク質表面における疎水性残基分布、表面電荷密度、表面疎水性密度、表面のイオン化可能な基の総計数、表面張力、タンパク質サイズおよび溶液中のその分布、融解温度、熱容量、ならびに第二ビリアル係数が挙げられるがこれらに限定されない。物理的特性の例として、溶解度、フォールディング、安定性および消化性も挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、教示されている殺虫タンパク質は、昆虫の腸におけるタンパク質分解断片の増加された消化性を有する。模擬胃液による消化のためのモデルは、当業者にとって公知である（Ｆｕｃｈｓ，  Ｒ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ｊ．  Ｄ．  Ａｓｔｗｏｏｄ．  Ｆｏｏｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５０：  ８３−８８，  １９９６；Ａｓｔｗｏｏｄ，  Ｊ．  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：  １２６９−１２７３，  １９９６；Ｆｕ  Ｔ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ５０：  ７１５４−７１６０，  ２００２）。
【０１４４】
一部の実施形態では、バリアントは、変異誘発によりアミノ酸配列が異なるポリペプチドを含む。本開示によって包含されるバリアントタンパク質は、生物学的に活性がある、すなわち、ネイティブタンパク質の所望の生物活性（すなわち、殺有害生物活性）を保有し続ける。一部の実施形態では、バリアントは、ネイティブタンパク質の殺虫活性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれよりも多くを有する。一部の実施形態では、バリアントは、ネイティブタンパク質よりも改善された活性を有することができる。
【０１４５】
細菌遺伝子は、頻繁に、オープンリーディングフレームの開始の近くに複数のメチオニン開始コドンを保有する。多くの場合、これらの開始コドンの１個または複数における翻訳開始は、機能的タンパク質の生成をもたらす。これらの開始コドンは、ＡＴＧコドンを含むことができる。しかし、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．などの細菌は、開始コドンとしてコドンＧＴＧも認識し、ＧＴＧコドンにおいて翻訳を開始するタンパク質は、最初のアミノ酸にメチオニンを含有する。稀に、細菌系における翻訳は、ＴＴＧコドンにおいて開始することができるが、この事象において、ＴＴＧは、メチオニンをコードする。さらに、これらのコドンのどれが、細菌において天然に使用されるか事前に決定されることは滅多にない。よって、代替メチオニンコドンの１個の使用が、殺有害生物タンパク質の生成をもたらすこともできることが理解される。これらの殺有害生物タンパク質は、本開示に包含され、本開示の方法において使用され得る。植物において発現される場合、適正な翻訳のために代替開始コドンをＡＴＧに変更することが必要となるであろうことが理解されるであろう。
【０１４６】
別の態様では、殺虫タンパク質は、多段階、翻訳後タンパク質スプライシングを触媒する介在配列を有する前駆体タンパク質として発現させることができる。タンパク質スプライシングは、隣接配列の付随する接合を有するポリペプチドからの介在配列の切出しが関与して、新たなポリペプチドを生じる（Ｃｈｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７１：２２１５９−２２１６８）。インテインと称される、この介在配列またはタンパク質スプライシングエレメントは、Ｎ末端およびＣ末端スプライスジャンクションにおける３種の協調的反応を介してそれ自体の切出しを触媒する：Ｎ末端システインまたはセリンのアシル転位；分枝エステルまたはチオエステル中間体を形成する、２つの末端間のエステル転移反応、およびインテインを遊離させる、インテインＣ末端アスパラギンの環化にカップリングされたペプチド結合切断（Ｅｖａｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５：９０９１−９０９４）。タンパク質スプライシング機構の解明は、いくつかのインテインに基づく適用をもたらした（Ｃｏｍｂ，  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，４９６，７１４号；Ｃｏｍｂ，  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，８３４，２４７号；Ｃａｍａｒｅｒｏ  ａｎｄ  Ｍｕｉｒ，  （１９９９）  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２１：５５９７−５５９８；Ｃｈｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｇｅｎｅ  １９２：２７１−２８１、Ｃｈｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２６：５１０９−５１１５；Ｃｈｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３：１０５６７−１０５７７；Ｃｏｔｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２１：１１００−１１０１；Ｅｖａｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：１８３５９−１８３６３；Ｅｖａｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：３９２３−３９２６；Ｅｖａｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ７：２２５６−２２６４；Ｅｖａｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：９０９１−９０９４；Ｉｗａｉ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，  （１９９９）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４５９：１６６−１７２；Ｍａｔｈｙｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｇｅｎｅ  ２３１：１−１３；Ｍｉｌｌｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：３５４３−３５４８；Ｍｕｉｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：６７０５−６７１０；Ｏｔｏｍｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：１６０４０−１６０４４；Ｏｔｏｍｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌｍｏｌ．  ＮＭＲ  １４：１０５−１１４；Ｓｃｏｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：  １３６３８−１３６４３；Ｓｅｖｅｒｉｎｏｖ  ａｎｄ  Ｍｕｉｒ，  （１９９８）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３：１６２０５−１６２０９；Ｓｈｉｎｇｌｅｄｅｃｋｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｇｅｎｅ  ２０７：  １８７−１９５；Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １７：９１８−９２６；Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２７：  １１０−１２０；Ｗｏｏｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １７：８８９−８９２；Ｗｕ，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８ａ）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：９２２６−９２３１；Ｗｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８ｂ）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １３８７：４２２−４３２；Ｘｕ，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：３８８−３９３；Ｙａｍａｚａｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １２０：５５９１−５５９２）。植物トランスジーンにおけるインテインの適用については、Ｙａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｒｅｓ．  １５：５８３−５９３  （２００６））およびＥｖａｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．  ５６：３７５−３９２  （２００５））を参照されたい。
【０１４７】
別の態様では、殺虫タンパク質は、２個の別々の遺伝子によってコードされ得、前駆体タンパク質のインテインは、２個の遺伝子に由来し、これは、分割インテインと称され、前駆体の２個の部分は、ペプチド結合形成によって接合される。このペプチド結合形成は、インテイン媒介性トランス−スプライシングによって達成される。この目的のため、２個の別々の遺伝子を含む第１および第２の発現カセットは、タンパク質トランス−スプライシングを媒介することができるインテインをさらにコードする。トランス−スプライシングによって、第１および第２の断片によってコードされるタンパク質およびポリペプチドは、ペプチド結合形成によって連結され得る。トランス−スプライシングインテインは、真核生物、古細菌および真正細菌を含む異なる生物の核小体（ｎｕｃｌｅｏｌａｒ）およびオルガネラゲノムから選択することができる。使用することができるインテインは、「ｗｗｗ」プレフィックスを使用してワールドワイドウェブ上でアクセスすることができる、ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂ／ｉｎｔｅｉｎｓ．ｈｔｍｌに収載されている。インテインをコードするヌクレオチド配列は、それぞれインテインの５’および３’部分をコードする５’および３’部分へと分割され得る。インテインスプライシングに必要ない配列部分（例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼドメイン）が欠失され得る。インテインコード配列は、５’および３’部分がトランス−スプライシングできるように、分割される。インテインコード配列の適した分割部位を選択するために、Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １７：９１８−９２６によって公開された考察に従うことができる。第１および第２の発現カセットの構築において、５’インテインコード配列は、ポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の断片の３’末端に連結され、３’インテインコード配列は、ポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の断片の５’末端に連結される。
【０１４８】
一般に、トランス−スプライシングパートナーは、任意の天然に存在するまたは人工的に分割されるインテインを含む、任意の分割インテインを使用して設計することができる。いくつかの天然に存在する分割インテイン、例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３のＤｎａＥ遺伝子（Ｗｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ９５（１６）：９２２６−３１およびＥｖａｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５（１３）：９０９１−４を参照）およびＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ由来のＤｎａＥ遺伝子（Ｉｗａｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５８０（７）：  １８５３−８を参照）の分割インテインが公知である。非分割インテインは、研究室において人工的に分割されて、新たな分割インテイン、例えば、人工的に分割されるＳｓｐ  ＤｎａＢインテイン（Ｗｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  １３８７：４２２−３２を参照）および分割Ｓｅｅ  ＶＭＡインテイン（Ｂｒｅｎｚｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５（６）：１５７１−８を参照）および人工的に分割される真菌ミニ−インテイン（Ｅｌｌｅｕｃｈｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００７）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３５５（３）：８３０−４を参照）が作製される。天然に存在する非分割インテインは、人工的に分割される分割インテインを設計する際に典型的に除去され得るエンドヌクレアーゼまたは他の酵素活性を有することができる。そのようなミニ−インテインまたは最小化された分割インテインは、当技術分野で周知であり、典型的に、２００アミノ酸未満の残基長である（Ｗｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  １３８７：  ４２２−３２を参照）。適した分割インテインは、他の精製を可能にするポリペプチドエレメントをその構造に付加することができるが、ただし、そのようなエレメントが、分割インテインのスプライシングを阻害しない、またはスプライシングに先立ち除去されることを可能にする様式で付加されることを条件とする。タンパク質スプライシングが、細菌インテイン様（ＢＩＬ）ドメイン（Ａｍｉｔａｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４７：６１−７３を参照）およびヘッジホッグ（Ｈｏｇ）自己プロセシングドメイン（後者は、Ｈｏｇ／インテインスーパーファミリーまたはＨＩＮＴファミリーと称される場合、インテインと組み合わされる（Ｄａｓｓａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９：３２００１−７を参照）を含むタンパク質を使用して報告されており、これらなどのドメインを使用して、人工的に分割されるインテインを調製することもできる。特に、そのようなファミリーの非スプライシングメンバーは、そのような近縁種においてスプライシング活性を導入または回復するように、分子生物学方法論によって改変することができる。
【０１４９】
組換えＤＮＡ法の開発は、タンパク質フォールディング、構造および機能における配列転位の効果を研究することを可能にした。新たな配列の作成において使用されるアプローチは、そのアミノ酸配列の直鎖状再構築によって関係付けられる天然に存在するタンパク質のペアのアプローチに似ている（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７６：３２１８−３２２２；Ｔｅａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｅｒｆｌｅ，  （１９９０）  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７２：３８３７−３８４１；Ｓｃｈｉｍｍｉｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２０４：１３−１９；Ｙａｍｉｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｍｉｎａｍｉｋａｗａ，  （１９９１）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２６０：１２７−１３０；ＭａｃＧｒｅｇｏｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３７８：２６３−２６６）。タンパク質に対するこの種の再編成の最初のｉｎ  ｖｉｔｒｏ適用は、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ  （Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １６５：４０７−４１３，  １９８３）によって記載された。環状の並べ替えたバリアントの作製において、新たなＮ末端は、本来の配列の内部部位（切断点）において選択され、新たな配列は、本来のＣ末端にあるまたはその付近にあるアミノ酸に達するまで、切断点から、本来の配列と同じ順序のアミノ酸を有する。この点において、新たな配列は、直接的に、または配列の追加的な部分（リンカー）を介して、本来のＮ末端にあるまたはその付近にあるアミノ酸に接合され、新たな配列は、本来の配列の切断点部位に対してＮ末端であったアミノ酸にあるまたはその付近にある点に達するまで、本来の配列と同じ配列で続き、この残基は、鎖の新たなＣ末端を形成する。リンカーのアミノ酸配列の長さは、経験的に、または構造情報からのガイダンスで、または２種のアプローチの組合せを使用することにより選択することができる。構造情報を利用できない場合、０〜５０Åの範囲に及ぶようにその長さが変動され、表面露出（親水性、Ｈｏｐｐ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ，  （１９８３）  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０：４８３−４８９；Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  （１９８２）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５７：  １０５−１３２；溶媒露出した表面積、Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓ，（１９７１）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５５：３７９−４００）および殺有害生物ポリペプチドの立体配置を混乱させずに必要なコンフォメーションを取る能力（コンフォメーション的に可撓性；Ｋａｒｐｌｕｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｚ，  （１９８５）  Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ  ７２：２１２−２１３）と矛盾しないようにその配列が選択される設計を使用して検査するために小型の一連のリンカーを調製することができる。残基当たり２．０〜３．８Åの翻訳の平均を仮定すると、これは、検査するための長さが、０〜３０残基の間であり、０〜１５残基が好ましい範囲であることを意味するであろう。そのような経験的シリーズの例示は、ｎ回反復したＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒなどのカセット配列を使用してリンカーを構築���ることであり、ｎは、１、２、３または４である。当業者であれば、リンカーとして機能し得る、長さまたは組成が変動する、そのような配列が多く存在し、主な考察として、これが過剰に長くも短くもないことを認識する（Ｓａｎｄｈｕ，  （１９９２）  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １２：４３７−４６２を参照）；長過ぎる場合、エントロピー効果が、三次元フォールディングを不安定化する可能性があり、フォールディングを動態学的に非実用的なものとする恐れもあり、短過ぎる場合、ねじれまたは立体ひずみにより分子を不安定化する可能性がある。タンパク質構造情報の解析分野の当業者であれば、ｃ−アルファ炭素間の距離として定義される鎖末端間の距離を使用して、使用されるべき配列の長さを定義するために使用する、または少なくとも、リンカーの経験的選択において検査しなければならない可能性の数を限定することができることを認識するであろう。当業者であれば、ポリペプチド鎖の末端の位置が、ｘ線回折または核磁気共鳴分光法データに由来する構造モデルにおいて不明確に定義される場合があり、そうである場合、したがって、要求されるリンカーの長さを適正に推定するために、この状況を考慮に入れる必要があることも認識するであろう。その位置が十分に定義された残基から、配列において鎖末端に近い２個の残基が選択され、それらのｃ−アルファ炭素間の距離が使用されて、それらの間のリンカーの近似の長さが計算される。計算された長さをガイドとして使用して、ある範囲の残基数を有するリンカー（残基当たり２〜３．８Åを使用して計算）が次いで選択される。これらのリンカーは、適宜短縮または延長された本来の配列で構成され得、延長される場合、追加的な残基は、上に記載されている通り、可撓性かつ親水性であるように選択することができる；または必要に応じて、本来の配列は、一連のリンカーを使用する代わりに用いることができ、一例は、上に言及されているＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒカセットアプローチである；または必要に応じて、適切な全長を有する本来の配列および新たな配列の組合せを使用することができる。生物学的に活性な状態へとフォールディングすることができる殺有害生物ポリペプチドの配列は、上に記載されているリンカー配列を使用しつつ、本来のポリペプチド鎖内からの始め（アミノ末端）および終わり（カルボキシル末端）の位置の適切な選択によって調製することができる。アミノおよびカルボキシル末端は、後述するガイドラインを使用して、切断点領域と称される配列の共通ストレッチ内から選択される。よって、新規アミノ酸配列は、同じ切断点領域内からアミノおよびカルボキシル末端を選択することにより生成される。多くの場合、新たな末端の選択は、カルボキシル末端の本来の位置が、アミノ末端の位置に直ちに先行するようなものであるであろう。しかし、当業者であれば、領域内のいずれかの箇所の末端の選択が機能することができ、これが、新たな配列のアミノまたはカルボキシル部分の欠失またはそこへの付加のいずれかを有効にもたらすであろうことを認識するであろう。
【０１５０】
分子生物学の中心的信条は、タンパク質の一次アミノ酸配列が、その生物学的機能の発現に必要な三次元構造へのフォールディングを指示することである。単一のタンパク質結晶のｘ線回折またはタンパク質溶液の核磁気共鳴分光法を使用して、三次元構造情報を得て解釈する方法は、当業者にとって公知である。切断点領域の同定に関連する構造情報の例として、タンパク質二次構造の位置および種類（アルファおよび３−１０ヘリックス、平行および逆平行ベータシート、鎖反転およびターン、ならびにループ；Ｋａｂｓｃｈ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒ，  （１９８３）  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：２５７７−２６３７）；アミノ酸残基の溶媒露出の程度、残基の互いの相互作用の度合および種類（Ｃｈｏｔｈｉａ，  （１９８４）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５３：５３７−５７２）、ならびにポリペプチド鎖に沿ったコンフォメーションの静的および動的分布（Ａｌｂｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｔｈｅｗｓ，  （１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４：５１１−５３３）が挙げられる。一部の場合では、追加的な情報は、残基の溶媒露出に関して公知である；一例は、タンパク質表面に必然的に存在する、炭水化物の翻訳後付着の部位である。実験的構造情報を利用できない、またはそれを得ることが実行不能である場合、タンパク質三次および二次構造、溶媒到達性、ならびにターンおよびループの出現の予測を行うために、一次アミノ酸配列を解析するための方法も利用可能である。直接的な構造的方法が実行不能である場合、表面露出を経験的に決定するために、生化学的方法も時には適用可能である；例えば、表面露出を推論するために、限定的なタンパク質分解後の鎖切断の部位の同定を使用すること（Ｇｅｎｔｉｌｅ  ａｎｄ  Ｓａｌｖａｔｏｒｅ，  （１９９３）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１８：６０３−６２１）。よって、実験により得られる構造情報または予測方法のいずれかを使用して（例えば、Ｓｒｉｎｉｖｉｓａｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅ，  （１９９５）  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔ．，  Ｆｕｎｃｔ．  ＆  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２：８１−９９）、親アミノ酸配列を点検して、二次および三次構造の維持に不可欠であるか否かに従って領域を分類する。周期的二次構造（アルファおよび３−１０ヘリックス、平行および逆平行ベータシート）に関与することが公知である領域内の配列の出現は、回避されるべき領域である。同様に、低い程度の溶媒露出を有することが観察または予測されるアミノ酸配列の領域は、タンパク質のいわゆる疎水性コアの一部である可能性がより高く、これもまた、アミノおよびカルボキシル末端の選択のために回避されるべきである。対照的に、表面ターンまたはループに存在することが公知であるまたは予測される領域、特に、生物活性に要求されないことが公知である領域は、ポリペプチド鎖の一番端の位置に好ましい部位である。上述の判断基準に基づき好ましいアミノ酸配列の連続的ストレッチは、切断点領域と称される。本来のＣ末端およびＮ末端を分離するリンカー領域を含有する、新たなＮ末端／Ｃ末端を有する環状の並べ替えたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、基本的に、Ｍｕｌｌｉｎｓ，  ｅｔ  ���ｌ．，  （１９９４）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１６：５５２９−５５３３に記載されている方法に従って作製することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の複数のステップを使用して、タンパク質の一次アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を再編成する。本来のＣ末端およびＮ末端を分離するリンカー領域を含有する、新たなＮ末端／Ｃ末端を有する環状の並べ替えたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｈｏｒｌｉｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ５：４２７−４３１に記載されている縦列重複方法に基づき作製することができる。新たなＮ末端／Ｃ末端遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅は、縦列に重複された鋳型ＤＮＡを使用して行われる。
【０１５１】
新規殺虫タンパク質を含む融合タンパク質
別の態様では、そのアミノ酸配列内で、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２からなる群より選択される配列、ならびにこれらの活性断片を含む融合タンパク質が提供される。
【０１５２】
融合タンパク質（およびこれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に公知である。殺虫タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、原核もしくは真核細胞の特定の区画へとポリペプチドの局在化を方向付ける、および／または原核もしくは真核細胞からのポリペプチドの分泌を方向付ける、シグナル配列に融合させることができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、細胞膜周辺腔へのタンパク質の発現を方向付けることを望むことができる。
【０１５３】
細菌の細胞膜周辺腔へのポリペプチドの発現を方向付けるために、殺虫ポリペプチドを融合させることができるシグナル配列またはタンパク質（またはその断片）の例として、ｐｅｌＢシグナル配列、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）シグナル配列、ＭＢＰ、ｏｍｐＡシグナル配列、周辺質Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシンＢ−サブユニットのシグナル配列、およびアルカリホスファターゼのシグナル配列が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５４】
Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）（２４０  Ｃｏｕｎｔｙ  Ｒｏａｄ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓ．０１９３８−２７２３）から入手可能なベクターのｐＭＡＬシリーズ（ｐＭＡＬ−ｐシリーズ）など、タンパク質の局在化を方向付ける融合タンパク質の構築のために、いくつかのベクターが市販されている。具体的な実施形態では、ポリペプチドは、ｐｅｌＢペクチン酸リアーゼシグナル配列に融合させて、グラム陰性細菌におけるそのようなポリペプチドの発現および精製の効率を増加させることができる（米国特許第５，５７６，１９５号および同第５，８４６，８１８号を参照）。植物色素体トランジットペプチド／ポリペプチド融合体が、当技術分野で周知である（米国特許第７，１９３，１３３号を参照）。イネまたはオオムギアルファ−アミラーゼ分泌シグナルなど、アポプラストトランジットペプチドも、当技術分野で周知である。色素体トランジットペプチドは一般に、標的化されるべきポリペプチド（例えば、融合パートナー）のＮ末端に融合される。しかし、融合タンパク質が、色素体に少なくとも部分的に標的化されるのであれば、追加的なアミノ酸残基が、色素体トランジットペプチドに対しＮ末端であってもよい。具体的な実施形態では、色素体トランジットペプチドは、融合タンパク質のＮ末端半分、Ｎ末端３分の１またはＮ末端４分の１に存在する。色素体トランジットペプチドの大部分または全体は一般に、色素体への挿入の際に、融合タンパク質から切断される。切断の位置は、植物種間で、異なる植物発生段階において、特異的な細胞間条件、または使用されるトランジットペプチド／融合パートナーの特定の組合せの結果として、僅かに変動し得る。一実施形態では、融合タンパク質の集団において切断部位が同一となるように、色素体トランジットペプチド切断は同質である。別の実施形態では、融合タンパク質の集団において切断部位が１〜１０アミノ酸変動するように、色素体トランジットペプチドは同質ではない。色素体トランジットペプチドは、いくつかの仕方の１つにおいて、第２のタンパク質に組換えにより融合させることができる。例えば、そのＣ末端側の末端に対応する位置において、トランジットペプチドのヌクレオチド配列に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を導入することができ、同じまたは適合性の部位を、そのＮ末端側の末端において、標的化されるべきタンパク質のヌクレオチド配列に操作して入れることができる。トランジットペプチドおよび第２のタンパク質のコード配列が、「インフレーム」に維持されて、所望の融合タンパク質の合成を可能にすることを確実にするために、これらの部位の設計において注意を払う必要がある。一部の場合では、新たな制限部位が導入される場合、第２のタンパク質の開始メチオニンコドンを除去することが好ましいことがある。両方の親分子における制限エンドヌクレアーゼ認識部位の導入、および組換えＤＮＡ技法によるこれらのその後の接合は、トランジットペプチドおよび第２のタンパク質の間に１個または複数の余分なアミノ酸の付加をもたらし得る。トランジットペプチド切断部位が到達可能なままであり、そのＮ末端におけるこれらの余分なアミノ酸の付加によって第２のタンパ���質の機能が変更されない限りにおいて、これは一般に、標的化活性に影響を与えない。あるいは、当業者であれば、遺伝子合成（Ｓｔｅｍｍｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｇｅｎｅ  １６４：４９−５３）または同様の方法を使用して、トランジットペプチドおよび第２のタンパク質の間に正確な切断部位を作製することができる（その開始メチオニンの有無にかかわらず）。加えて、トランジットペプチド融合体は、切断部位の下流にアミノ酸を意図的に含むことができる。成熟タンパク質のＮ末端におけるアミノ酸は、色素体にタンパク質を標的化するトランジットペプチドの能力および／またはタンパク質移入後の切断効率に影響を与えることがある。これは、標的化されるべきタンパク質に依存し得る。例えば、Ｃｏｍａｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６３（２９）：１５１０４−９を参照されたい。
【０１５５】
一部の実施形態では、アミノ酸リンカーによって接合された、本明細書に教示されている殺虫ポリペプチドおよび別の殺虫ポリペプチドを含む融合タンパク質が提供される。一部の実施形態では、Ｒ１−Ｌ−Ｒ２、Ｒ２−Ｌ−Ｒ１、Ｒ１−Ｒ２またはＲ２−Ｒ１（式中、Ｒ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２からなる群より選択されるポリペプチドであり、Ｒ２は、別の殺虫ポリペプチドである）からなる群より選択される式によって表される、融合タンパク質が提供される。Ｒ１ポリペプチドは、Ｒ２ポリペプチドに直接的に、またはリンカー（Ｌ）セグメントを介して融合される。用語「直接的に」は、ペプチドリンカーなしでポリペプチドが接合された融合体を定義する。よって、「Ｌ」は、Ｒ１およびＲ２の両方がインフレームで融合された、化学結合またはポリペプチドセグメントを表し、最も一般的には、Ｌは、Ｒ１およびＲ２がアミド結合によって結合された、直鎖状ペプチドであり、Ｒ１のカルボキシ末端をＬのアミノ末端に、Ｌのカルボキシ末端をＲ２のアミノ末端に連結する。「インフレームで融合された」とは、Ｒ１およびＲ２のリーディングフレーム間に翻訳終止も破壊もないことを意味する。連結基（Ｌ）は一般に、１〜５００アミノ酸の間の長さのポリペプチドである。２個の分子を接合するリンカーは、好ましくは、（１）２個の分子が、互いに独立してフォールディングし、作用することができる、（２）２個のタンパク質の機能的ドメインに干渉し得る、規則正しい二次構造を生じる傾向を有さない、（３）機能的タンパク質ドメインと相互作用し得る、最小の疎水性または荷電特徴を有する、ならびに（４）Ｒ１およびＲ２が、単一の細胞上におけるそれらの対応する受容体と同時に相互作用することができるような、Ｒ１およびＲ２の立体的分離を提供するように設計される。典型的には、可撓性タンパク質領域における表面アミノ酸は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒを含む。Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒを含有するアミノ酸配列の実質的にいかなる並べ替えも、リンカー配列のための上述の判断基準を満足させることが予想される。ＴｈｒおよびＡｌａなど、他の中性アミノ酸をリンカー配列において使用することもできる。融合体の構築を容易にするためのリンカー配列における特有の制限部位の付加により、追加的なアミノ酸がリンカーに含まれてもよい。
【０１５６】
一部の実施形態では、リンカーは、式：（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ５Ｓｅｒ）ｎ、（ＧｌｙｎＳｅｒ）ｎまたは（ＡｌａＧｌｙＳｅｒ）ｎ（式中、ｎは、整数である）の群から選択される配列を含む。高度に可撓性のリンカーの一例は、糸状バクテリオファージ、例えば、バクテリオファージＭ１３またはｆｄのｐｉｌｌタンパク質内に存在する（ＧｌｙＳｅｒ）リッチスペーサー領域である（Ｓｃｈａｌｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９７５）。この領域は、ｐｉｌｌ表面タンパク質の２個のドメイン間に長い可撓性スペーサー領域を提供する。エンドペプチダーゼ認識配列が含まれるリンカーも含まれる。そのような切断部位は、融合体の個々の構成成分を分離して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで適正にフォールディングされ、活性であるか決定するのに役立ち得る。様々なエンドペプチダーゼの例として、プラスミン、エンテロキナーゼ、カリクレイン（Ｋａｌｌｉｋｅｒｉｎ）、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、クロストリパイン、キモシン、コラゲナーゼ、ラッセルクサリヘビ毒液プロテアーゼ、ポストプロリン切断酵素、ＶＳプロテアーゼ、トロンビンおよび第Ｘａ因子が挙げられるがこれらに限定されない。他の実施形態では、重鎖免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥのヒンジ領域由来のペプチドリンカーセグメントは、付着したポリペプチド間の角度の関係性を提供する。融合タンパク質は、用いられるリンカー配列の形態、サイズまたは数によって限定されず、リンカーの唯一の要件は、機能的に、融合体の個々の分子のフォールディングおよび機能に有害に干渉しないことである。
【０１５７】
別の態様では、キメラ遺伝子を作製するための、別々の殺虫タンパク質を本来コードした教示されている殺虫タンパク質遺伝子の２個またはそれよりも多い部分の接合により作製される、キメラタンパク質が提供される。キメラ遺伝子の翻訳は、本来のタンパク質のそれぞれに由来する領域、モチーフまたはドメインを有する単一のキメラタンパク質をもたらす。ある特定の実施形態では、キメラタンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２の部分、モチーフまたはドメインを任意の組合せで含む。
【０１５８】
ＤＮＡ配列が、様々な方法によって変更され得、これらの変更が、野生型（またはネイティブ）殺有害生物タンパク質によってコードされる配列とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列をもたらし得ることが認識される。一部の実施形態では、本明細書に教示されている殺虫タンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２と比較して、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個またはそれよりも多いアミノ酸置換、欠失および／もしくは挿入、またはこれらの組合せを含む、１個または複数のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失、トランケーション、および挿入を含む様々な仕方で変更することができる。
【０１５９】
そのような操作のための方法は一般に、当技術分野で公知である。例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡにおける変異によって調製することができる。これは、いくつかの形態の変異誘発の１種によっておよび／または定向進化において達成することもできる。一部の態様では、アミノ酸配列においてコードされる変化は、タンパク質の機能に実質的に影響を与えない。そのようなバリアントは、所望の殺有害生物活性を保有する。しかし、殺有害生物活性を付与する教示されているポリペプチドの能力が、本開示の組成物に対するそのような技法の使用によって改善され得ることが理解される。
【０１６０】
例えば、保存的アミノ酸置換は、１個または複数の、予測される非必須アミノ酸残基において行うことができる。「非必須」アミノ酸残基は、生物活性を変更することなく、教示されているポリペプチドの野生型配列から変更され得る残基である。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）；極性の、負に荷電した残基およびそのアミド（例えば、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン）；無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）；小型の脂肪族、非極性または僅かに極性の残基（例えば、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン（ｐｒａｌｉｎｅ）、グリシン）；非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；大型の脂肪族、非極性残基（例えば、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、システイン）；ベータ−分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）；芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）；大型の芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）を有するアミノ酸が含まれる。
【０１６１】
アミノ酸置換は、機能を保持する非保存領域において行うことができる。一般に、保存されたアミノ酸残基に対しまたは保存されたモチーフ内に存在するアミノ酸残基に対し、そのような残基がタンパク質活性に必須である場合、そのような置換は行われないであろう。保存された、タンパク質活性に必須であり得る残基の例として、例えば、実施形態の配列と同様のまたは関連する毒素のアライメントに含有される全タンパク質間で同一である残基（例えば、ホモログのアライメントにおいて同一である残基）が挙げられる。保存されたが、保存的アミノ酸置換を可能にすることができ、活性を依然として保持する残基の例として、例えば、実施形態の配列と同様のまたは関連する毒素のアライメントに含有される全タンパク質間で保存的置換のみを有する残基（例えば、ホモログのアライメントに含有される全タンパク質間で保存的置換のみを有する残基）が挙げられる。しかし、当業者であれば、機能的バリアントが、保存された残基に僅かに保存されたまたは保存されていない変更を有し得ることを理解するであろう。目的のタンパク質の生物活性に影響を与えない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、参照により本明細書に組み込まれるＤａｙｈｏｆｆ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７８）  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  （Ｎａｔｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出すことができる。
【０１６２】
そのような変化を行う際に、アミノ酸のヒドロパシー指標が考慮され得る。タンパク質への相互作用的生物学的機能の付与におけるヒドロパシーアミノ酸指標の重要性は一般に、当技術分野で理解されている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  （１９８２）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １５７（１）：１０５−１３２）。アミノ酸の相対的ヒドロパシー特徴が、結果としてのタンパク質の二次構造に寄与し、このことが次いで、タンパク質の、他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を定義することが受け入れられる。
【０１６３】
ある特定のアミノ酸が、同様のヒドロパシー指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換され、依然として、同様の生物活性を有するタンパク質をもたらす、すなわち、依然として、生物学的機能的に等価なタンパク質を得ることができることが当技術分野で公知である。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特徴に基づいてヒドロパシー指標を割り当てられている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、同書）。これらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）およびアルギニン（−４．５）である。そのような変化を行う際に、そのヒドロパシー指標が＋２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、＋１以内の置換が特に好ましく、＋０．５以内の置換がさらにより特に好ましい。
【０１６４】
親水性に基づいて、類似のアミノ酸の置換を有効に行うことができることも当技術分野で理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号は、その隣り合ったアミノ酸の親水性によって支配される、タンパク質の最大局所的平均親水性が、タンパク質の生物学的特性と相関することを記述する。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述される通り、次の親水性の値が、アミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０．＋０．１）；グルタメート（＋３．０．＋０．１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５．＋０．１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。
【０１６５】
あるいは、活性に実質的に影響を与えることなく、アミノまたはカルボキシ末端において多くのタンパク質のタンパク質配列に対し変更を行うことができる。これは、ＰＣＲ増幅において利用されるオリゴヌクレオチドにおけるアミノ酸コード配列の包含によってタンパク質コード配列を変更または拡張するＰＣＲ増幅を含むＰＣＲなど、現代の分子的方法によって導入される挿入、欠失または変更を含むことができる。あるいは、付加されるタンパク質配列は、タンパク質融合体を生成するために当技術分野で一般的に使用される配列など、タンパク質コード配列全体を含むことができる。そのような融合タンパク質は、（１）目的のタンパク質の発現を増加させる、（２）タンパク質精製、タンパク質検出、または当技術分野で公知の他の実験使用のいずれかを容易にするための、結合ドメイン、酵素活性、またはエピトープを導入する、（３）グラム陰性細菌の細胞膜周辺腔、植物のミトコンドリアもしくは葉緑体、または真核細胞の小胞体（このうち後者は、タンパク質のグリコシル化をもたらすことが多い）など、細胞内オルガネラへのタンパク質の分泌または翻訳を標的化するために使用されることが多い。
【０１６６】
本開示のバリアントヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＤＮＡシャッフリングなど、変異原性および組換え誘導性手順に由来する配列も包含する。そのような手順により、１種または複数の異なる殺虫ポリペプチドコード領域を使用して、所望の特性を保有する新たなポリペプチドを作製することができる。この様式で、実質的な配列同一性を有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで相同組換えができる配列領域を含む関連配列ポリヌクレオチドの集団から、組換えポリヌクレオチドのライブラリーが生成される。例えば、このアプローチを使用して、目的のドメインをコードする配列モチーフを、殺有害生物遺伝子および他の公知の殺有害生物遺伝子の間でシャッフリングして、増加された殺虫活性など、改善された目的の特性を有するタンパク質をコードする新たな遺伝子を得ることができる。そのようなＤＮＡシャッフリングのための戦略は、当技術分野で公知である。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，  （１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ，  （１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−  ３９１；Ｃｒａｍｅｒｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １５：４３６−４３８；Ｍｏｏｒｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２７２：３３６−３４７；Ｚｈａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：４５０４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１；ならびに米国特許第５，６０５，７９３号および同第５，８３７，４５８号を参照されたい。
【０１６７】
ドメイン交換またはシャッフリングは、変更されたポリペプチドを生成するための別の機構である。ドメインを、ポリペプチド間で交換して、改善された殺虫活性または標的スペクトルを有するハイブリッドまたはキメラ毒素をもたらすことができる。組換えタンパク質を生成し、これを殺有害生物活性に関して検査するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｎａｉｍｏｖ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６７：５３２８−５３３０；ｄｅ  Ｍａａｇｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６２：１５３７−１５４３；Ｇｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６：１７９５４−１７９５８；Ｓｃｈｎｅｐｆ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５：２０９２３−２０９３０；Ｒａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  ９１９９９）  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６５：２９１８−２９２５を参照）。
【０１６８】
ＤＮＡシャッフリングおよび部位特異的変異誘発の両方を使用して、殺有害生物活性を保有するポリペプチド配列を定義することができる。当業者であれば、他のタンパク質との比較または機能的アッセイを使用して、モチーフをさらに定義することができるであろう。ハイスループットスクリーニングを使用して、これらのモチーフの変形形態を検査して、特異的な残基の役割を決定することができる。
【０１６９】
受容体同定および単離
教示されている殺虫タンパク質、またはそのバリアントもしくは断片に対する受容体も包含される。受容体を同定するための方法は、当技術分野で周知であり（Ｈｏｆｍａｎｎ，  ｅｔ．  ａｌ．，  （１９８８）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １７３：８５−９１；Ｇｉｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２７７−２７２８２を参照）、感受性昆虫由来の刷子縁膜小胞を使用して、教示されている殺虫タンパク質を認識する受容体の同定および単離に用いることができる。引用文献に収載されている放射性標識方法に加えて、教示されているタンパク質は、蛍光色素およびストレプトアビジンなどの他の一般的な標識で標識することができる。ダイズシャクトリムシ（ｓｏｙｂｅａｎ  ｌｏｏｐｅｒ）およびカメムシなどの感受性昆虫の刷子縁膜小胞（ＢＢＭＶ）を、参考文献に収載されているプロトコールに従って調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、適した膜にブロットすることができる。標識されたタンパク質を、ＢＢＭＶのブロットされた膜と共にインキュベートし、標識されたレポーターにより同定することができる。タンパク質と相互作用するタンパク質バンド（複数可）の同定は、Ｎ末端アミノ酸気相配列決定または質量分析に基づくタンパク質同定方法によって検出することができる（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，  （１９９８）  １０．２２，  １−２４，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎ  Ｉｎｃ）。タンパク質が同定されると、対応する遺伝子を、感受性昆虫のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーからクローニングすることができ、結合親和性をタンパク質により直接的に測定することができる。教示されているタンパク質による殺虫活性のための受容体機能は、ＲＮＡｉ型の遺伝子ノックアウト方法によって検証することができる（Ｒａｊａｇｏｐａｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：４６８４９−４６８５１）。
【０１７０】
ヌクレオチド構築物、発現カセットおよびベクター
本明細書における用語「ヌクレオチド構築物」の使用は、ＤＮＡを含むヌクレオチド構築物に実施形態を限定することを意図しない。当業者であれば、ヌクレオチド構築物、特に、リボヌクレオチドならびにリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの組合せで構成されたポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを、本明細書に開示されている方法において用いることもできることを認識するであろう。さらに、実施形態のヌクレオチド構築物、核酸およびヌクレオチド配列は、そのような構築物、分子および配列のあらゆる相補的形態を包含する。さらに、実施形態のヌクレオチド構築物、ヌクレオチド分子およびヌクレオチド配列は、植物を形質転換するための実施形態の方法において用いることができるあらゆるヌクレオチド構築物、分子および配列を包含し、これには、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよびこれらの組合せで構成されたものが挙げられるがこれらに限定されない。そのようなデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは、天然に存在する分子および合成アナログの両方を含む。実施形態のヌクレオチド構築物、核酸およびヌクレオチド配列は、一本鎖形態、二本鎖形態、ヘアピン、ステム・ループ構造などが挙げられるがこれらに限定されない、あらゆる形態のヌクレオチド構築物も包含する。
【０１７１】
さらなる実施形態は、植物および昆虫細胞、細菌、酵母、バキュロウイルス、原生動物、線虫ならびに藻類から選択される生物など、形質転換された生物に関する。形質転換された生物は、形質転換された生物のゲノムに安定に取り込まれ得る、実施形態のＤＮＡ分子、ＤＮＡ分子を含む発現カセット、または発現カセットを含むベクターを含む。
【０１７２】
実施形態の配列は、目的の生物における発現のためのＤＮＡ構築物に提供される。構築物は、実施形態の配列に作動可能に連結された５’および３’調節配列を含む。用語「作動可能に連結された」は、本明細書で使用される場合、プロモーターおよび第２の配列の間の機能的連結を指し、プロモーター配列は、第２の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始および媒介する。一般に、作動可能に連結されたとは、連結されている核酸配列が近接しており、同じリーディングフレームにおいて２個のタンパク質コード領域を接合する必要があったことを意味する。さらに、構築物は、生物へと同時形質転換されるべき少なくとも１個の追加的な遺伝子を含有することができる。あるいは、追加的な遺伝子（複数可）は、複数のＤＮＡ構築物に提供することができる。
【０１７３】
一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、異種調節配列に作動可能に連結された、本明細書に教示されている殺虫タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１７４】
一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、異種調節配列に作動可能に連結された、本明細書に教示されている殺虫タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９および配列番号７１，または目的の宿主細胞、例えば、一部の実施形態では、植物細胞における発現のためにコドン最適化された上述に対応する配列からなる群より選択される。
【０１７５】
一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、異種調節配列に作動可能に連結された、本明細書に教示されている殺虫タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、前記タンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２またはそのバリアントからなる群より選択される。
【０１７６】
そのようなＤＮＡ構築物は、調節領域の転写調節下にあるべきポリペプチド遺伝子配列の挿入のための複数の制限部位を備えて提供される。さらに、ＤＮＡ構築物は、選択可能マーカー遺伝子を含有することができる。
【０１７７】
ＤＮＡ構築物は、一般に、宿主として機能する生物、例えば、細菌細胞または植物細胞において機能的な、転写および翻訳開始領域（すなわち、プロモーター）、実施形態のＤＮＡ配列、ならびに転写および翻訳終止領域（すなわち、終止領域）を転写の５’から３’への方向で含む。
【０１７８】
転写開始領域（すなわち、プロモーター）は、宿主生物および／または実施形態の配列に対してネイティブ、類似、外来性または異種であり得る。その上、プロモーターは、天然配列あるいは合成配列であり得る。用語「外来性」は、本明細書で使用される場合、プロモーターが、プロモーターが導入されるネイティブ生物に見出されないことを示す。プロモーターが、実施形態の配列に対して「異種」である場合、プロモーターが、作動可能に連結された実施形態の配列にとってネイティブまたは天然に存在するプロモーターでない（すなわち、ネイティブ位置にない）ことが意図される。本明細書で使用される場合、キメラ遺伝子は、コード配列に対して異種である転写開始領域に作動可能に連結されたコード配列を含む。プロモーターが、ネイティブまたは天然配列である場合、作動可能に連結された配列の発現は、野生型発現から変更され、これにより、表現型の変更がもたらされる。
【０１７９】
一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、転写エンハンサー配列を含むこともできる。本明細書で使用される場合、用語「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができ、プロモーターの固有のエレメント、またはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであり得るＤＮＡ配列を指す。例えば、植物における遺伝子発現増強特性を有するイントロン（米国特許出願公開第２００９／０１４４８６３号、ユビキチンイントロン（すなわち、トウモロコシユビキチンイントロン１（例えば、ＮＣＢＩ配列Ｓ９４４６４；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｉｌ  （１９９６）  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．  ５：２１３−２１８；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １８：６７５−６８９を参照））、オメガエンハンサーまたはオメガプライムエンハンサー（Ｇａｌｌｉｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｅｄ．  Ｃｅｃｈ  （Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）  ２３７−２５６およびＧａｌｌｉｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  Ｇｅｎｅ  ６０：２１７−２５）、ＣａＭＶ  ３５Ｓエンハンサー（例えば、Ｂｅｎｆｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ９：  １６８５−９６を参照）、トウモロコシＡｄｈｌイントロン（Ｋｙｏｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２２８：４０−４８；Ｋｙｏｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｍａｙｄｉｃａ  ３５：３５３−３５７）、米国特許第７，８０３，９９２号のエンハンサー、およびＷ０２０１３１３０８１３のサトウキビ桿状ウイルス（ＳＣＢＶ）エンハンサーを含む、様々なエンハンサーが当技術分野で公知であり、これを使用することもでき、これら文献のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。転写エンハンサーの上述のリストは、限定を意味するものではない。実施形態において任意の適切な転写エンハンサーを使用することができる。
【０１８０】
終止領域は、転写開始領域と共にネイティブであり得、作動可能に連結された目的のＤＮＡ配列と共にネイティブであり得、植物宿主と共にネイティブであり得、または別の供給源に由来し得る（すなわち、プロモーター、目的の配列、植物宿主またはこれらの任意の組合せに対して外来性または異種）。
【０１８１】
簡便な終止領域は、オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ終止領域など、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉ−プラスミドから入手可能である。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２６２：１４１−１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，  （１９９１）  Ｃｅｌｌ  ６４：６７１−６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ５：１４１−１４９；Ｍａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２６１−１２７２；Ｍｕｎｒｏｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｇｅｎｅ  ９１：１５１−１５８；Ｂａｌｌａｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７：７８９１−７９０３およびＪｏｓｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５：９６２７−９６３９も参照されたい。
【０１８２】
適切であれば、核酸は、宿主生物における発現増加のために最適化することができる。よって、宿主生物が植物である場合、発現改善のために植物好適コドンを使用して合成核酸を合成することができる。例えば、宿主好適コドン使用の議論については、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｏｗｒｉ，  （１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ９２：１−１１を参照されたい。例えば、実施形態の核酸配列は、単子葉および双子葉植物種の両方において発現させることができるが、配列は、単子葉類または双子葉類の特異的コドン優先度およびＧＣ含量優先度を構成するように改変することができる。なぜなら、これらの優先度が、異なることが示されているためである（Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７：４７７−４９８）。
【０１８３】
よって、当業者であれば、特異的植物コドン使用表を利用して、本開示の殺虫タンパク質の発現に最適な配列を得る仕方を理解するであろう。例えば、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１６／０３６６８９１（米国特許出願第１５／０２２，１０９号）を参照されたい。
【０１８４】
追加的な配列改変は、細胞宿主における遺伝子発現を増強することが公知である。これらとして、疑似ポリアデニル化シグナル、エクソン−イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復、および遺伝子発現にとって有害であり得る他の十分に特徴付けされた配列をコードする配列の排除が挙げられる。配列のＧＣ含量は、宿主細胞において発現される公知の遺伝子を参照して計算される通り、所与の細胞宿主にとって平均のレベルに調整することができる。用語「宿主細胞」は、本明細書で使用される場合、ベクターを含有し、発現ベクターの複製および／または発現を支持する細胞を指す。宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞、あるいは酵母、昆虫、両生類もしくは哺乳動物細胞または単子葉もしくは双子葉植物細胞などの真核細胞であり得る。単子葉宿主細胞の例は、トウモロコシ宿主細胞である。可能であれば、配列は、予測されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を回避するように改変される。
【０１８５】
発現カセットは、さらに５’リーダー配列を含有することができる。そのようなリーダー配列は、翻訳を増強するように作用することができる。翻訳リーダーは、当技術分野で公知であり、ピコルナウイルス（ｐｉｃｏｍａｖｉｒｕｓ）リーダー、例えば、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コード領域）（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：６１２６−６１３０）；ポティウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコエッチウイルス）（Ｇａｌｌｉｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｇｅｎｅ  １６５（２）：２３３−２３８）、ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ矮性モザイクウイルス）、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：９０−９４）；アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質ｍＲＮＡ由来の非翻訳リーダー（ＡＭＹ  ＲＮＡ４）（Ｊｏｂｌｉｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：６２２−６２５）；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）（Ｇａｌｌｉｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＲＮＡ，  ｅｄ．  Ｃｅｃｈ  （Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），  ｐｐ．  ２３７−２５６）およびトウモロコシ退緑斑紋ウイルスリーダー（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｍｍｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８１：３８２−３８５）を含む。Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ８４：９６５−９６８も参照されたい。
【０１８６】
そのような構築物は、葉緑体（または他の色素体）、小胞体またはゴルジ装置などのある特定の細胞内構造へのペプチドの同時翻訳または翻訳後輸送を容易にするための「シグナル配列」または「リーダー配列」を含有することもできる。「シグナル配列」は、本明細書で使用される場合、細胞膜を通った同時翻訳または翻訳後ペプチド輸送をもたらすことが公知であるまたはそれが疑われる配列を指す。真核生物において、これは典型的に、その結果生じるグリコシル化をある程度伴う、ゴルジ装置への分泌が関与する。細菌の殺虫毒素は、標的有害生物の腸内でタンパク質分解により活性化される、プロ毒素として合成されることが多い（Ｃｈａｎｇ，  （１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５３：５０７−５１６）。一部の実施形態では、シグナル配列は、ネイティブ配列に位置する、または実施形態の配列に由来し得る。「リーダー配列」は、本明細書で使用される場合、翻訳されると、細胞内オルガネラへのペプチド鎖の同時翻訳輸送を誘発するのに十分なアミノ酸配列をもたらす、任意の配列を指す。よって、これは、小胞体の通過、液胞、葉緑体を含む色素体、ミトコンドリアなどの通過による輸送および／またはグリコシル化を標的化するリーダー配列を含む。葉緑体チラコイドルーメン区画に標的化された核コードタンパク質は、ストローマ標的化シグナルペプチドおよびルーメン標的化シグナルペプチドで構成された、特徴的な二分されたトランジットペプチドを有する。ストローマ標的化情報は、トランジットペプチドのアミノ近位部分に存在する。ルーメン標的化シグナルペプチドは、トランジットペプチドのカルボキシル近位部分に存在し、ルーメンに標的化するための全情報を含有する。高等植物葉緑体のプロテオミクスにおける近年の研究は、多数の核コードルーメンタンパク質の同定を達成しており（Ｋｉｅｓｅｌｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４８０：２７１−２７６，  ２０００；Ｐｅｌｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １２：３１９−３４１，  ２０００；Ｂｒｉｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １５０３：３５０−３５６，  ２００１）、そのルーメン標的化シグナルペプチドは、本開示に従って使用することができる可能性がある。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来の約８０種のタンパク質、ならびにホウレンソウおよびエンドウ由来の相同タンパク質が、Ｋｉｅｓｅｌｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ７８：２４９−２６４，  ２００３によって報告されている。特に、これにより参照により本明細書に組み込まれる、この刊行物の表２は、その受託番号によって同定される、葉緑体ルーメン由来の８５種のタンパク質を開示する（米国特許出願公開第２００９／０９０４４２９８号も参照）。加えて、イネゲノムの公開されたドラフトバージョン（Ｇｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：９２−１００，  ２００２）は、本開示に従って使用することができるルーメン標的化シグナルペプチドに適した供給源である。
【０１８７】
適した葉緑体トランジットペプチド（ＣＴＰ）は、当業者にとって周知であり、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ−１−デオキシ−Ｄキシルロース（ｘｙｕｌｏｓｅ）−５−リン酸シンターゼ、ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ−スーパーオキシドジスムターゼ、ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ−可溶性デンプンシンターゼ、ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ−ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素、ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ−ホスホ−２−デヒドロ−３−デオキシヘプタン酸（ｈｅｐｔｏｎａｔｅ）アルドラーゼ２、ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ−Ｌ−アスコルビン酸ペルオキシダーゼ５、ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ−ホスホグルカン水ジキナーゼ、Ｚｅａ  Ｍａｙｓ  ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ、Ｚｅａ  Ｍａｙｓ−ベータ−グルコシダーゼ、Ｚｅａ  Ｍａｙｓ−リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、Ｚｅａ  ＭａｙｓチオレドキシンＭ型（米国特許出願公開第２０１２／０３０４３３６号）由来のＣＴＰ由来のＮ末端ドメイン、中央ドメインまたはＣ末端ドメインを含むがこれらに限定されない、キメラＣＴＰも含む。米国特許公開のＵＳ２０１３０２０５４４０Ａｌ、ＵＳ２０１３０２０５４４１ＡｌおよびＵＳ２０１３０２１０１１４Ａｌの葉緑体トランジットペプチドも挙げられる。葉緑体に標的化されるべきポリペプチド遺伝子は、植物核およびこのオルガネラの間のコドン使用の差を説明するように、葉緑体における発現のために最適化することができる。
【０１８８】
発現カセットの調製において、適正な配向性で、適宜、適正なリーディングフレームにおいてＤＮＡ配列をもたらすように、様々なＤＮＡ断片を操作することができる。この目標に向かって、アダプターまたはリンカーを用いて、ＤＮＡ断片を接合することができる、または簡便な制限部位の提供、過剰ＤＮＡの除去、制限部位の除去などのために他の操作が関与し得る。この目的のため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えば、転移およびトランスバージョンが関与し得る。
【０１８９】
プロモーター
実施形態の実施において、いくつかのプロモーターを使用することができる。プロモーターは、所望の成果に基づき選択することができる。核酸は、宿主生物における発現のために、構成的な、組織好適、誘導性のまたは他のプロモーターと組み合わせることができる。本発明のプロモーターは、本発明のプロモーター配列と相同性を示す、遺伝子調節をもたらすことが公知のシスエレメントのホモログを含む。これらのシスエレメントとして、酸素応答性シスエレメント（Ｃｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８（３６）：２６９０４−２６９１０  （１９９３））、光調節エレメント（Ｂｒｕｃｅ  ａｎｄ  Ｑｕａｉｌｌ，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２  （１１）：１０８１−１０８９  （１９９０）；Ｂｒｕｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：３０１５−３０２４  （１９９１）；Ｒｏｃｈｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  ９７：１８９−１９８  （１９９４）；Ｂｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：５３８７−５３９１  （１９９０）；Ｇｉｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：７０８９−７０９３  （１９８８）；Ｓｔａｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：６９３０−６９３４  （１９８９）；Ｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ６：１２７７−１２８７  （１９９４）；Ｍｅｎｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０：５０６−５１０  （１９９５）；Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ８：１９２−２００  （１９９４）；Ｐｌｅｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅ．  ２５４：２５８−２６６  （１９９７）；Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６：２５４３−２５４９  （１９８７）；Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３８：２２１−２５７  （１９８７）；Ｖｉｌｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：３２５９３−３２５９８  （１９９６）；Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：８５７−８６６  （１９９０）；Ｇｉｌｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：３６９−３７８  （１９９０）；Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：１０６９−１０７７  （１９８９）；Ｇｉｌｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：３６９−３７８  （１９９０）；Ｃａｓｔｒｅｓａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ７：１９２９−１９３６  （１９８８）；Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：２１７−２２７  （１９８９）；Ｔｅｒｚａｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４６：４４５−４７４  （１９９５）；Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６：２５４３−２５４９  （１９８７）；Ｖｉｌｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：３２５９３−３２５９８  （１９９６）；Ｔｊａｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ６：１０７−１１８  （１９９４）；Ｔｊａｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０８：１１０９−１１１７  （１９９５）；Ｎｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １２：１０２１−１２３４  （１９９７）；Ｂｒｕｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：３０１５−３０２４  （１９９１）；Ｎｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １２：１０２１−１０３４  （１９９７））、ジベレリンに応答性のエレメント（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １４５：６０６−６１３  （１９９５）；Ｃｒｏｉｓｓａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１６：２７−３５  （１９９６）；Ｌｏｈｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：６１７−６２４  （１９９１）；Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：１４４３−１４５１  （１９９２）；Ｌａｎａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：２０３−２１１  （１９９２）；Ｓｋｒｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：７２６６−７２７０  （１９９１）；Ｇｉｌｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：３６９−３７８  （１９９０）；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １４：６５５−６６８  （１９９０）、Ｇｕｂｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：１８７９−１８９１  （１９９５））、アブシジン酸に応答性のエレメント（Ｂｕｓｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ９：２２６１−２２７０  （１９９７）；Ｇｕｉｌｔｉｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：２６７−２７０  （１９９０）；Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：２９５−３０７  （１９９５）；Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８：１１０７−１１１９  （１９９６）；Ｓｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２７：１１１９−１１３１  （１９９５）；Ｍａｒｃｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：９６９−９７６  （１９８９）；Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：２９５−３０７  （１９９５）；Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２４７：３９１−３９８  （１９９５）；Ｈａｔｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ６：６０９−６１８  （１９９２）；Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１４０１−１４１０  （１９９３））、アブシジン酸応答性エレメントと同様のエレメント（Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３２：１０１９−１０２７  （１９９６））、オーキシン応答性エレメント（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ６：６４５−６５７  （１９９４）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１５：３９７−４０７  （１９９７）；Ｋｏｓｕｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ７：８７７−８８６  （１９９５）；Ｋｏｓｕｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ９：１６０７−１６１９  （１９９７）；Ｂａｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２３３：  ５８０−５９６  （１９９３））、ジャ���モン酸メチル処理に応答性のシスエレメント（Ｂｅａｕｄｏｉｎ  ａｎｄ  Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３３：８３５−８４６  （１９９７））、アブシジン酸およびストレス応答に応答性のシスエレメント（Ｓｔｒａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６：６１７−６３０  （１９９４））、エチレン応答性シスエレメント（Ｉｔｚｈａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：８９２５−８９２９  （１９９４）；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５９３９−５９４３  （１９９３）；Ｓｅｓｓａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８：１４５−１５３  （１９９５）；Ｓｈｉｎｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２７：９２３−９３２  （１９９５））、サリチル酸シス応答性エレメント（Ｓｔｒａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １１：１３１５−１３２４  （１９９７）；Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ６：８６３−８７４  （１９９４））、水ストレスおよびアブシジン酸に応答するシスエレメント（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６：  １７１３１−１７１３５  （１９９１）；Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１４０１−１４１０  （１９９３）；Ｐｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２１：２５９−２６６  （１９９３））、Ｍ期特異的発現に必須なシスエレメント（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １０：３３１−３４１  （１９９８））、スクロース応答性エレメント（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １４：６５５−６６８  （１９９０）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３６：３３１−３４１  （１９９８）；Ｇｒｉｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ５：８１５−８２６  （１９９４））、熱ショック応答エレメント（Ｐｅｌｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １：３１−３５  （１９８５））、オーキシンおよび／またはサリチル酸に応答性であり、光調節についても報告されたエレメント（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：７８９０−７８９７  （１９８９）；Ｂｅｎｆｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：９５９−９６６  （１９９０））、エチレンおよびサリチル酸に応答性のエレメント（Ｏｈｍｅ−Ｔａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５：９４１−９４６  （１９９０））、創傷および非生物的ストレスに応答性のエレメント（Ｌａａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：９２３０−９２３４  （１９９２）；Ｍｈｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３３：２５７−２６６  （１９９７））、抗酸化応答エレメント（Ｒｕｓｈｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６：  １１６３２−１１６３９；Ｄａｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：５０１６−５０２３  （���９９４））、Ｓｐｈエレメント（Ｓｕｚｎｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ９：７９９−８０７  １９９７））、エリシター応答性エレメント（Ｆｎｋｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３４：８１−８７  （１９９７）；Ｒｕｓｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １５：５６９０−５７００  （１９９６））、金属応答性エレメント（Ｓｔｕａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：８２８−８３１  （１９８５）；Ｗｅｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ７：３７６３−３７７０  （１９８８）；Ｔｈｉｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０：１１８３−１１９１  （１９９２）；Ｆａｉｓｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０：３−２６  （１９９２））、低温応答性エレメント（Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４：７０１−７１３  （１９９４）；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３０：６７９−６８４  （１９９６）；Ｎｏｒｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１：６４１−６５３  （１９９３）；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７：２３５１５−２３５１９  （１９９２））、乾燥応答性エレメント（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ６：２５１−２６４  （１９９４）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８：６０５−６１７  （１９９５）；Ｂｒａｙ  ＥＡ，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２：４８−５４  （１９９７））、グルテニンのエンハンサーエレメント（Ｃｏｌｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６：３５５９−３５６４  （１９８７）；Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１１７１−１１８０  （１９９０）；Ｋｒｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｉｌｏｓ．  
Ｔｒａｎｓ．  Ｒ．  Ｓｏｃ．  Ｌｏｎｄ．，  Ｂ３１４：３５５−３６５  （１９８６））、光非依存性調節エレメント（Ｌａｇｒａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ９：１４６９−１４７９  （１９９７）；Ｖｉｌｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：  ３２５９３−３２５９８  （１９９６））、ＯＣＳエンハンサーエレメント（Ｂｏｕｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ８：４１９７−４２０４  （１９８９）；Ｆｏｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ３：６６９−６７９  （１９９３））、ＡＣＧＴエレメント（Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ８：１９２−２００  （１９９４）；Ｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ６：１２７７−１２８７  （１９９４）；Ｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２３０：１１３１−１１４４  （１９９３））、色素体関連遺伝子における負のシスエレメント（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７：２３５１５−２３５１９  （１９９２）；Ｌａｇｒａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １３：２６１４−２６２２  （１９９３）；Ｌａｇｒａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ９：１４６９−１４７９  （１９９７）；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７：  ２３５１５−２３５１９  （１９９２））、プロラミンボックスエレメント（Ｆｏｒｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：７３２７−７３３９  （１９８５）；Ｃｏｌｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６：３５５９−３５６４  （１９８７）；Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１１７１−１１８０  （１９９０）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５：７５５−７６４  （１９９０）；Ｖｉｃｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：７６８５−７６９０  （１９９７））、ＩｇＭ重鎖遺伝子由来のエンハンサーにおけるエレメント（Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ３３：７１７−７２８  （１９８３）；Ｗｈｉｔｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５：２５１５−２５３５  （１９８７））が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１９０】
プロモーターの例として、米国特許第６，４３７，２１７号（トウモロコシＲＳ８１プロモーター）、米国特許第５，６４１，８７６号（イネアクチンプロモーター）、米国特許第６，４２６，４４６号（トウモロコシＲＳ３２４プロモーター）、米国特許第６，４２９，３６２号（トウモロコシＰＲ−１プロモーター）、米国特許第６，２３２，５２６号（トウモロコシＡ３プロモーター）、米国特許第６，１７７，６１１号（構成的トウモロコシプロモーター）、米国特許第５，３２２，９３８号、同第５，３５２，６０５号、同第５，３５９，１４２号および同第５，５３０，１９６号（３５Ｓプロモーター）、米国特許第６，４３３，２５２号（トウモロコシＬ３オレオシンプロモーター、Ｐ−Ｚｍ．Ｌ３）、米国特許第６，４２９，３５７号（イネアクチン２プロモーターおよびイネアクチン２イントロン）、米国特許第５，８３７，８４８号（根特異的プロモーター）、米国特許第６，２９４，７１４号（光誘導性プロモーター）、米国特許第６，１４０，０７８号（塩誘導性プロモーター）、米国特許第６，２５２，１３８号（病原体誘導性プロモーター）、米国特許第６，１７５，０６０号（リン欠乏誘導性プロモーター）、米国特許第６，６３５，８０６号（ガンマ（ｇａｍａ）−コイキシンプロモーター、Ｐ−ＣＩ．Ｇｃｘ）、米国特許出願第０９／７５７，０８９号（トウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーター）、ならびに米国特許第８，７７２４６６号（トウモロコシ転写因子核因子Ｂ（ＮＦＢ２））に記載されているプロモーターが挙げられる。
【０１９１】
植物宿主細胞における使用のための適した構成的プロモーターは、例えば、ＷＯ１９９９／４３８３８および米国特許第６，０７２０５０号に開示されているＲｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーター、および他の構成的プロモーター；コアＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）；イネアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１６３−１７１）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １２：６１９−６３２およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８：６７５−６８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ８１：５８１−５８８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３：２７２３−２７３０）；ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号）などを含む。
【０１９２】
他の構成的プロモーターは、例えば、米国特許第５，６０８，１４９号；同第５，６０８，１４４号；同第５，６０４，１２１号；同第５，５６９，５９７号；同第５，４６６，７８５号；同第５，３９９，６８０号；同第５，２６８，４６３号；同第５，６０８，１４２号および同第６，１７７，６１１号に論じられている構成的プロモーターを含む。
【０１９３】
米国特許である米国特許第８，３３８，６６２号に開示されているバナナ線条ウイルス（Ａｃｕｍｉｎａｔａ  Ｙｕｎｎａｎ）プロモーター（ＢＳＶ（ＡＹ））；米国特許である米国特許第８，３５０，１２１号に開示されているバナナ線条ウイルス（Ａｃｕｍｉｎａｔａ  Ｖｉｅｔｎａｍ）プロモーター（ＢＳＶ（ＡＶ））；および米国特許である米国特許第８，３９５，０２２号に開示されているバナナ線条ウイルス（Ｍｙｓｏｒｅ）プロモーター（ＢＳＶ（Ｍ  ＹＳ））が挙げられるがこれらに限定されない、適した構成的プロモーターは、ほぼ全ての組織において強い発現を有するが、花粉においては低い発現を有するプロモーターも含む。
【０１９４】
所望の成果に応じて、誘導性プロモーターから遺伝子を発現させることが有益であり得る。植物における実施形態のヌクレオチド配列の発現調節について、創傷誘導性プロモーターが特に興味深い。そのような創傷誘導性プロモーターは、昆虫摂食に起因する損傷に応答することができ、参照により本明細書に組み込まれる、ジャガイモプロテイナーゼ阻害剤（ｐｉｎ  ＩＩ）遺伝子（Ｒｙａｎ，  （１９９０）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈ．  ２８：４２５−４４９；Ｄｕａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：４９４−４９８）；ｗｕｎｌおよびｗｕｎ２、米国特許第５，４２８，１４８号；ｗｉｎｌおよびｗｉｎ２（Ｓｔａｎｆｏｒｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２１５：２００−２０８）；システミン（ＭｃＧｕｒｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２５：１５７０−１５７３）；ＷＩＰｌ（Ｒｏｈｍｅｉｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２：７８３−７９２；Ｅｃｋｅｌｋａｍｐ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３２３：７３−７６）；ＭＰＩ遺伝子（Ｃｏｒｄｅｒｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ６（２）：１４１−１５０）などを含む。
【０１９５】
その上、実施形態の方法およびヌクレオチド構築物において、病原体誘導性プロモーターを用いることができる。そのような病原体誘導性プロモーターは、病原体による感染後に誘導される、病態形成関連タンパク質（ＰＲタンパク質）、例えば、ＰＲタンパク質、ＳＡＲタンパク質、ベータ−１，３−グルカナーゼ、キチナーゼなど由来のプロモーターを含む。例えば、Ｒｅｄｏｌｆｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８３）  Ｎｅｔｈ．  Ｊ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ．  ８９：２４５−２５４；Ｕｋｎｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：  ６４５−６５６およびＶａｎ  Ｌｏｏｎ，  （１９８５）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４：１１１−１１６を参照されたい。参照により本明細書に組み込まれるＷＯ１９９９／４３８１９も参照されたい。
【０１９６】
病原体感染の部位にまたはその付近で局所的に発現されるプロモーターが興味深い。例えば、Ｍａｒｉｎｅａｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ９：３３５−３４２；Ｍａｔｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ２：３２５−  ３３１；Ｓｏｍｓｉｓｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：２４２７−２４３０；Ｓｏｍｓｉｓｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２：９３−９８およびＹａｎｇ，  （１９９６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：１４９７２−１４９７７を参照されたい。Ｃｈｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １０：９５５−９６６；Ｚｈａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａ  ｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：２５０７−２５１１；Ｗａｒｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ３：１９１−２０１；Ｓｉｅｂｅｒｔｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：９６１−９６８；米国特許第５，７５０，３８６号（線虫誘導性）、およびそれらの中で引用されている参考文献も参照されたい。その発現が病原体Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅによって誘導される、トウモロコシＰＲｍｓ遺伝子の誘導性プロモーターが特に興味深い（例えば、Ｃｏｒｄｅｒｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｍｏｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈ．  ４１：１８９−２００を参照）。
【０１９７】
化学物質調節性プロモーターを使用して、外因性化学的調節因子の適用により、植物における遺伝子の発現をモジュレートすることができる。目標に応じて、プロモーターは、化学物質の適用が遺伝子発現を誘導する場合、化学物質誘導性プロモーター、または化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する場合、化学物質抑制性プロモーターであり得る。化学物質誘導性プロモーターは、当技術分野で公知であり、それには、ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ  ｓａｆｅｎｅｒ）によって活性化されるトウモロコシＩｎ２−２プロモーター、発芽前除草剤（ｐｒｅ−ｅｍｅｒｇｅｎｔ  ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ）として使用される疎水性求電子性化合物によって活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモーター、およびサリチル酸によって活性化されるタバコＰＲ−ｌａプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。目的の他の化学物質調節性プロモーターは、参照により本明細書に組み込まれる、ステロイド応答性プロモーター（例えば、Ｓｃｈｅｎａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：１０４２１−１０４２５およびＭｃＮｅｌｌｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １４（２）：２４７−２５７におけるグルココルチコイド誘導性プロモーターを参照）ならびにテトラサイクリン誘導性およびテトラサイクリン抑制性プロモーター（例えば、Ｇａｔｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２２７：２２９−２３７ならびに米国特許第５，８１４，６１８号および同第５，７８９，１５６号を参照）を含む。
【０１９８】
組織好適プロモーターを利用して、特定の植物組織内で増強されたポリペプチド発現を標的化することができる。組織好適プロモーターは、Ｙａｍａｍｏｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １２（２）２５５−２６５；Ｋａｗａｍａｔａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３８（７）：７９２−８０３；Ｈａｎｓｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．  ２５４（３）：３３７−３４３；Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．  ６（２）：１５７−１６８；Ｒｉｎｅｈａｒｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１２（３）：１３３１−１３４１；Ｖａｎ  Ｃａｍｐ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１２（２）：５２５−５３５；Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１２（２）：５１３−５２４；Ｙａｍａｍｏｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３５（５）：７７３−７７８；Ｌａｍ，  （１９９４）  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．  ２０：  １８１−１９６；Ｏｒｏｚｃｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２３（６）：  １１２９−１１３８；Ｍａｔｓｕｏｋａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０（２０）：９５８６−９５９０およびＧｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ４（３）：４９５−５０５に論じられているプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、必要であれば、所望に応じて弱い発現のために改変することができる。
【０１９９】
葉好適プロモーターは、当技術分野で公知である。例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １２（２）：２５５−２６５；Ｋｗｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０５：３５７−６７；Ｙａｍａｍｏｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３５（５）：７７３−７７８；Ｇａｔｏｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ３：５０９−１８；Ｏｒｏｚｃｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２３（６）：１１２９−１１３８およびＭａｔｓｕｏｋａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０（２０）：９５８６−９５９０を参照されたい。
【０２００】
根好適または根特異的プロモーターは、公知であり、文献から入手可能な多くから選択するまたは様々な適合性の種からｄｅ  ｎｏｖｏ単離することができる。例えば、Ｈｉｒｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０（２）：２０７−２１８（ダイズ根特異的グルタミンシンテターゼ遺伝子）；Ｋｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，  （１９９１）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３（１０）：１０５１−１０６１（サヤインゲンのＧＲＰ１．８遺伝子における根特異的制御エレメント）；Ｓａｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １４（３）：４３３−４４３（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのマンノピンシンターゼ（ＭＡＳ）遺伝子の根特異的プロモーター）およびＭｉａｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３（１）：１１−２２（ダイズの根および根粒において発現される、サイトゾルグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）をコードする全長ｃＤＮＡクローン）を参照されたい。窒素固定非マメ科植物Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ  ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉおよび関連する非窒素固定非マメ科植物Ｔｒｅｍａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ由来のヘモグロビン遺伝子から単離される２種の根特異的プロモーターが記載されている、Ｂｏｇｕｓｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２（７）：  ６３３−６４１も参照されたい。これらの遺伝子のプロモーターをβ−グルクロニダーゼレポーター遺伝子に連結し、非マメ科植物Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍおよびマメ科植物Ｌｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓの両方に導入し、両方の例で、根特異的プロモーター活性が保存された。Ｌｅａｃｈ  ａｎｄ  Ａｏｙａｇｉ，  （１９９１）は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの高度に発現されるｒｏｌＣおよびｒｏｌＤ根誘導性遺伝子のプロモーターに関する彼らの解析について記載する（Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｌｉｍｅｒｉｃｋ）  ７９（１）：６９−７６を参照）。彼らは、エンハンサーおよび組織好適ＤＮＡ決定基が、これらのプロモーターにおいて解離されることを結論付けた。Ｔｅｅｒｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）は、ｌａｃＺへの遺伝子融合を使用して、オクトピンシンターゼをコードするＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｔ−ＤＮＡ遺伝子が、根端の表皮において特に活性であり、ＴＲ２’遺伝子が、無傷植物において根特異的であり、葉組織における創傷によって刺激され、殺虫または殺幼虫遺伝子による使用のための特徴の特に望ましい組合せであることを示した（ＥＭＢＯ  Ｊ．  ８（２）：  ３４３−３５０を参照）。ｎｐｔｌｌ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ）に融合されたＴＲＩ’遺伝子は、同様の特徴を示した。追加的な根好適プロモーターは、ＶｆＥＮＯＤ−ＧＲＰ３遺伝子プロモーター（Ｋｕｓｔｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９（４）：７５９−７７２）およびｒｏｌＢプロモーター（Ｃａｐａｎａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２５（４）：６８１−６９１）を含む。米国特許第５，８３７，８７６号；同第５，７５０，３８��号；同第５，６３３，３６３号；同第５，４５９，２５２号；同第５，４０１，８３６号；同第５，１１０，７３２号および同第５，０２３，１７９号も参照されたい。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの根好適調節配列は、米国特許出願のＵＳ２０１３０１１７８８３に開示されている。根好適モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）ＲＣｃ３プロモーターは、米国特許出願のＵＳ２０１２／０２１０４６３に開示されている。米国特許出願公開第２００３／０１３１３７７号、米国特許第７，６４５，９１９号および同第８，７３５，６５５号の根好適トウモロコシプロモーター。米国特許出願公開第２０１３／００２５０００号の根冠特異的１（ＺｍＲＣＰｌ）トウモロコシプロモーター。米国特許出願公開第２０１３／０３１２１３６号の根好適トウモロコシプロモーター。
【０２０１】
「種子好適」プロモーターは、「種子特異的」プロモーター（種子貯蔵タンパク質のプロモーターなど、種子発生中において活性なプロモーター）と「種子発芽」プロモーター（種子発芽中において活性なプロモーター）の両方を含む。参照により本明細書に組み込まれるＴｈｏｍｐｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  １０：１０８を参照されたい。そのような種子好適プロモーターとして、Ｃｉｍｌ（サイトカイニン誘導性メッセージ）；ｃＺ１９Ｂｌ（トウモロコシ１９ｋＤａゼイン）；およびｍｉｌｐｓ（ミオイノシトール−１−リン酸シンターゼ）（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２２５，５２９号を参照）が挙げられるがこれらに限定されない。ガンマ−ゼインおよびＧｌｂ−１は、胚乳特異的プロモーターである。双子葉類について、種子特異的プロモーターとして、クニッツトリプシン阻害剤３（ＫＴｉ３）（Ｊｏｆｕｋｕ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，  （１９８９）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：１０７９−１０９３）、マメβ−ファゼオリン、ナピン（ｎａｐｉｎ）、β−コングリシニン、グリシニン１、ダイズレクチン、クルシフェリンなどが挙げられるがこれらに限定されない。単子葉類について、種子特異的プロモーターとして、トウモロコシ１５ｋＤａゼイン、２２ｋＤａゼイン、２７ｋＤａゼイン、ｇ−ゼイン、ワキシー（ｗａｘｙ）、シュランケン（ｓｈｒｕｎｋｅｎ）１、シュランケン２、グロブリン１などが挙げられるがこれらに限定されない。参照により本明細書に組み込まれる、ｅｎｄ１およびｅｎｄ２遺伝子由来の種子好適プロモーターが開示されている、ＷＯ２０００／１２７３３も参照されたい。双子葉類において、種子特異的プロモーターとして、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来の種皮プロモーター、ｐＢＡＮ；ならびにＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来の初期種子プロモーター、ｐ２６、ｐ６３およびｐ６３ｔｒ（米国特許第７，２９４，７６０号および同第７，８４７，１５３号）が挙げられるがこれらに限定されない。特定の組織において「好適」発現を有するプロモーターは、少なくとも１種の他の植物組織よりも大きい程度で、当該組織において発現される。一部の組織好適プロモーターは、ほとんど排他的に、特定の組織における発現を示す。
【０２０２】
低レベル発現が所望される場合、弱いプロモーターが使用される。一般に、用語「弱いプロモーター」は、本明細書で使用される場合、低レベルでのコード配列の発現を駆動するプロモーターを指す。低レベルによって、約１／１０００転写物〜約１／１００，０００転写物〜約１／５００，０００転写物のレベルにおける発現が意図される。あるいは、用語「弱いプロモーター」は、ごく僅かな細胞における発現を駆動し、他の細胞においては駆動せず、低レベルの総発現をもたらすプロモーターも包含することが認識される。プロモーターが、受け入れ難いほど高レベルで発現を駆動する場合、プロモーター配列の部分を欠失または改変して、発現レベルを減少させることができる。そのような弱い構成的プロモーターは、例えば、Ｒｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーター（ＷＯ１９９９／４３８３８および米国特許第６，０７２０５０号）、コア３５Ｓ  ＣａＭＶプロモーターなどを含む。他の構成的プロモーターは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６０８，１４９号；同第５，６０８，１４４号；同第５，６０４，１２１号；同第５，５６９，５９７号；同第５，４６６，７８５号；同第５，３９９，６８０号；同第５，２６８，４６３号；同第５，６０８，１４２号および同第６，１７７，６１１号に開示されている構成的プロモーターを含む。
【０２０３】
プロモーターの上述のリストは、限定を意味するものではない。任意の適切なプロモーターを実施形態において使用することができる。
【０２０４】
一般に、発現カセットは、形質転換された細胞の選択のための選択可能マーカー遺伝子を含む。選択可能マーカー遺伝子は、形質転換された細胞または組織の選択に利用される。マーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子など、抗生物質抵抗性をコードする遺伝子、ならびにグルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノンおよび２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）などの除草化合物に対する抵抗性を付与する遺伝子を含む。適した選択可能マーカー遺伝子の追加的な例として、クロラムフェニコール（Ｈｅｒｒｅｒａ  Ｅｓｔｒｅｌｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８３）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２：９８７−９９２）；メトトレキセート（Ｈｅｒｒｅｒａ  Ｅｓｔｒｅｌｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８３）  Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：２０９−２１３およびＭｅｉｊｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １６：８０７−８２０）；ストレプトマイシン（Ｊｏｎｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２１０：８６−９１）；スペクチノマイシン（Ｂｒｅｔａｇｎｅ−Ｓａｇｎａｒｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．  ５：１３１−１３７）；ブレオマイシン（Ｈｉｌｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７：１７１−１７６）；スルホンアミド（Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５：１２７−１３６）；ブロモキシニル（Ｓｔａｌｋｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４１９−４２３）；グリフォセート（Ｓｈａｗ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４７８−４８１ならびに米国特許出願第１０／００４，３５７号および同第１０／４２７，６９２号）；ホスフィノトリシン（ＤｅＢｌｏｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  （ｌ９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６：２５１３−２５１８）に対する抵抗性をコードする遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。全般的には、Ｙａｒｒａｎｔｏｎ，  （１９９２）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ３：５０６−５１１；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：６３１４−６３１８；Ｙａｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｃｅｌｌ  ７１：６３−７２；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，  （１９９２）  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６：２４１９−２４２２；Ｂａｒｋｌｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８０）  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｏｐｅｒｏｎ，  ｐｐ．  １７７−２２０；Ｈｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  Ｃｅｌｌ  ４８：５５５−５６６；Ｂｒｏｗｎ，  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）  Ｃｅｌｌ  ４９：６０３−６１２；Ｆｉｇｇｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｃｅｌｌ  ５２：７１３−７２２；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：５４００−５４０４；Ｆｕｅｒｓｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ���  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：２５４９−２５５３；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：  ４８０−４８３；Ｇｏｓｓｅｎ，  （１９９３）  Ｐｈ．Ｄ．  Ｔｈｅｓｉｓ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｒｅｉｎｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：１９１７−１９２１；Ｌａｂｏｗ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １０：３３４３−３３５６；Ｚａｍｂｒｅｔｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：３９５２−３９５６；Ｂａｉｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：５０７２−５０７６；Ｗｙｂｏｒｓｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９：４６４７−４６５３；Ｈｉｌｌｅｎａｎｄ−Ｗｉｓｓｍａｎ，（１９８９）  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃ．  Ｂｉｏｌ．  １０：１４３−１６２；Ｄｅｇｅｎｋｏｌｂ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ３５：１５９１−１５９５；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｄｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７：１０９４−１１０４；Ｂｏｎｉｎ，  （１９９３）  Ｐｈ．Ｄ．  Ｔｈｅｓｉｓ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｇｏｓｓｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１；Ｏｌｉｖａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ３６：９１３−９１９；Ｈｌａｖｋａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８５）  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ７８  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ）およびＧｉｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：７２１−７２４を参照されたい。そのような開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０５】
選択可能マーカー遺伝子の上述のリストは、限定を意味するものではない。任意の選択可能マーカー遺伝子を実施形態において使用することができる。
【０２０６】
植物形質転換
本実施形態の方法は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを植物に導入することを伴う。「導入する」は、本明細書で使用される場合、配列が植物の細胞内部に対するアクセスを得るように、植物にポリヌクレオチドまたはポリペプチドを提示することを意味する。本実施形態の方法は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを植物に導入する特定の方法には依存せず、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、植物の少なくとも１つの細胞の内部に対するアクセスを得るのみである。安定な形質転換法、一過性の形質転換法、およびウイルス媒介法を含むがこれらに限定されない、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを植物に導入する方法が、当技術分野で公知である。
【０２０７】
「安定な形質転換」は、本明細書で使用される場合、植物に導入されたヌクレオチド構築物が植物のゲノムに取り込まれ、その子孫によって受け継がれることが可能であることを意味する。本明細書で使用される場合、「一過性の形質転換」は、ポリヌクレオチドが植物に導入されるが、植物のゲノムに取り込まれないこと、またはポリペプチドが植物に導入されることを意味する。本明細書で使用される場合、「植物」は、植物全体、植物の器官（例えば、葉、茎、根等）、種子、植物細胞、栄養繁殖体、胚、およびその子孫を指す。植物細胞は、分化したものまたは未分化のもの（例えば、カルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の細胞、根の細胞、師部細胞、および花粉）であり得る。
【０２０８】
形質転換プロトコールならびにヌクレオチド配列を植物に導入するためのプロトコールは、形質転換の標的となる植物または植物細胞のタイプ、すなわち、単子葉植物または双子葉植物に応じて変化し得る。ヌクレオチド配列を植物細胞に導入し、その後植物ゲノムに挿入するための適した方法は、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：３２０−３３４）、電気穿孔（Ｒｉｇｇｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：５６０２−５６０６）、アグロバクテリウム媒介形質転換（米国特許第５，５６３，０５５号および第５，９８１，８４０号）、直接遺伝子移入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３：２７１７−２７２２）およびバリスティック粒子加速（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）（例えば、米国特許第４，９４５，０５０号；第５，８７９，９１８号；第５，８８６，２４４号および第５，９３２，７８２号；Ｔｏｍｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｔｉｓｓｕｅ，  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ｅｄ．  Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ）、およびＭｃＣａｂｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−９２６を参照されたい）、ならびにＬｅｄ形質転換（国際公開第００／２８０５８号）が挙げられる。ジャガイモの形質転換に関しては、Ｔｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３７：８２９−８３８およびＣｈｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９：７１−７８を参照されたい。さらなる形質転換手順は、Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２２：４２１−４７７；Ｓａｎｆｏｒｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：２７−３７（タマネギ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ８７：６７１−６７４（ダイズ）；ＭｃＣａｂｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−９２６（ダイズ）；Ｆｉｎｅｒ  ａｎｄ  ＭｃＭｕｌｌｅｎ，  （１９９１）  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  ２７Ｐ：１７５−１８２（ダイズ）；Ｓｉｎｇｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ９６：３１９−３２４（ダイズ）；Ｄａｔｔａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：７３６−７４０（コメ）；Ｋｌｅｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：４３０５−４３０９（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：５５９−５６３（トウモロコシ）；米国特許第５，２４０，８５５号；第５，３２２，７８��号および第５，３２４，６４６号；Ｋｌｅｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ９１  ：４４０−４４４（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３−８３９（トウモロコシ）；Ｈｏｏｙｋａａｓ  Ｖａｎ  Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  Ｎａｔｕｒｅ  （Ｌｏｎｄｏｎ）  ３１１：７６３−７６４；米国特許第５，７３６，３６９号（穀物）；Ｂｙｔｅｂｉｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：５３４５−５３４９（ユリ科）；Ｄｅ  Ｗｅｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８５）  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｖｕｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，  ｅｄ．  Ｃｈａｐｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （Ｌｏｎｇｍａｎ，  Ｎ．Ｙ．），  ｐｐ．  １９７−２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ９：４１５−４１８、およびＫａｅｐｐｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ８４：５６０−５６６（ウィスカー媒介形質転換）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：１４９５−１５０５（電気穿孔）；Ｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １２：２５０−２５５、およびＣｈｒｉｓｔｏｕ  ａｎｄ  Ｆｏｒｄ，  （１９９５）  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ７５：４０７−４１３（コメ）；Ｏｓｊｏｄａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：７４５−７５０（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを介したトウモロコシ）に見出すことができ、その全てが参照により本明細書に組み込まれている。
【０２０９】
特定の実施形態では、本実施形態の配列は、多様な一過性の形質転換法を使用して植物に提供することができる。そのような一過性の形質転換法は、ポリペプチドまたはそのバリアントおよび断片の植物への直接導入、またはポリペプチド転写物の植物への導入を含むがこれらに限定されない。そのような方法は、例えばマイクロインジェクションまたは粒子衝突を含む。例えば、その全てが参照により本明細書に組み込まれている、Ｃｒｏｓｓｗａｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２０２：１７９−１８５；Ｎｏｍｕｒａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  ４４：５３−５８；Ｈｅｐｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：２１７６−２１８０およびＨｕｓｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０７：７７５−７８４を参照されたい。
【０２１０】
あるいは、ポリペプチドポリヌクレオチドを、当技術分野で公知の技術を使用して植物に一過性に形質転換することができる。そのような技術は、ＤＮＡのその後の放出を妨害するように、ウイルスベクター系およびポリヌクレオチドの沈殿を含む。このように、粒子結合ＤＮＡからの転写は起こり得るが、それが放出されてゲノムに取り込まれるようになる頻度は大きく低減される。そのような方法は、ポリエチレンイミンによってコーティングされた粒子の使用を含む（ＰＥＩ；Ｓｉｇｍａ＃Ｐ３１４３）。
【０２１１】
植物ゲノムの特定の位置でポリヌクレオチドを標的化挿入する方法は、当技術分野で公知である。一実施形態では、所望のゲノム位置でのポリヌクレオチドの挿入は、部位特異的組換えシステムを使用して達成される。例えば、その全てが参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第１９９９／２５８２１号、国際公開第１９９９／２５８５４号、国際公開第１９９９／２５８４０号、国際公開第１９９９／２５８５５号、および国際公開第１９９９／２５８５３号を参照されたい。簡単に説明すると、本実施形態のポリヌクレオチドを、２つの同一でない組換え部位が隣接する移入カセットに含めることができる。移入カセットを、移入カセットの部位に対応する２つの同一でない組換え部位が隣接する標的部位がそのゲノムに安定に組み込まれた植物に導入する。適切なリコンビナーゼを提供し、移入カセットを標的部位に取り込む。目的のポリヌクレオチドは、それによって植物ゲノムの特定の染色体位置に取り込まれる。
【０２１２】
植物形質転換ベクターは、植物形質転換を達成するために必要な１つまたは複数のＤＮＡベクターで構成され得る。例えば、１つより多くの連続するＤＮＡセグメントで構成される植物形質転換ベクターを利用することは、当技術分野で一般的な実施である。これらのベクターはしばしば、当技術分野で「バイナリーベクター」と呼ばれる。バイナリーベクターならびにヘルパープラスミドを有するベクターは、アグロバクテリウム媒介形質転換のために最も頻繁に使用され、ここで効率的な形質転換を達成するために必要なＤＮＡセグメントのサイズおよび複雑度が極めて大きく、個別のＤＮＡ分子に機能を分離するために有利である。バイナリーベクターは、典型的には、Ｔ−ＤＮＡ移入のために必要なシス作用配列（例えば、左境界および右境界）、植物細胞における発現を可能にするように操作された選択可能マーカー、および「目的の遺伝子」（トランスジェニック植物の生成が望ましい植物細胞における発現を可能にするように操作された遺伝子）を含有するプラスミドベクターを含有する。同様に、このプラスミドベクターには、細菌の複製にとって必要な配列も存在する。シス作用配列は、植物細胞への効率的な移入およびその発現を可能にするように配置される。例えば、選択可能マーカー遺伝子および殺有害生物遺伝子は、左右境界の間に位置する。しばしば、第２のプラスミドベクターは、アグロバクテリウムから植物細胞へのＴ−ＤＮＡ移入を媒介するトランス作用因子を含有する。このプラスミドはしばしば、当技術分野で理解されるように、アグロバクテリウムによる植物細胞の感染、境界配列での切断によるＤＮＡの移入、およびｖｉｒ媒介ＤＮＡ移入を可能にするビルレンス機能（Ｖｉｒ遺伝子）を含有する（Ｈｅｌｌｅｎｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ，  （２０００）  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５：４４６−４５１）。いくつかのタイプのアグロバクテリウム株（例えば、ＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５等）を、植物形質転換のために使用することができる。第２のプラスミドベクターは、マイクロプロジェクション、マイクロインジェクション、電気穿孔、ポリエチレングリコール等の他の方法によって植物を形質転換するために必要ではない。
【０２１３】
一般的に、植物形質転換法は、異種ＤＮＡを標的植物細胞（例えば、未成熟または成熟胚、懸濁培養物、未分化カルス、プロトプラスト等）に移入した後に、適切な選択の最大の閾値レベルを適用して（選択可能なマーカー遺伝子に応じて）、非形質転換細胞塊の群から形質転換植物細胞を回収することを伴う。異種外来ＤＮＡの植物細胞への取り込み後、培地中の適切な選択の最大閾値レベルを適用して、非形質転換細胞を死滅させ、定期的に新鮮な培地に移すことによって、この選択処理から生存した推定の形質転換細胞を分離して増殖させる。連続的な継代および適切な選択のチャレンジによって、プラスミドベクターによって形質転換された細胞を同定して増殖させる。次に、分子的および生化学的方法を使用して、トランスジェニック植物のゲノムに取り込まれた目的の異種遺伝子の存在を確認することができる。
【０２１４】
外植体を、典型的に同じ培地の新鮮な供給物に移し、通常通りに培養する。次に、形質転換細胞を、最大閾値レベルの選択剤を補充した再生培地に入れた後、苗条へと分化させる。次に、苗条を、発根した苗条または小植物を回収するために選択的発根培地に移す。次に、トランスジェニック小植物を、成熟植物へと成長させて、結実能力のある種子を作出させる（例えば、Ｈｉｅｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：２７１−２８２；Ｉｓｈｉｄａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：７４５−７５０）。外植体を、典型的に同じ培地の新鮮な供給物に移し、通常通りに培養する。トランスジェニック植物を生成する技術および方法に関する一般的な説明は、Ａｙｒｅｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ，  （１９９４）  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １３：２１９−２３９、およびＢｏｍｍｉｎｅｎｉ  ａｎｄ  Ｊａｕｈａｒ，  （１９９７）  Ｍａｙｄｉｃａ  ４２：１０７−１２０に見出される。形質転換された材料は、多くの細胞を含有することから、形質転換および非形質転換細胞の両方が、本発明の標的カルスまたは組織または細胞群のいずれかの小片に存在する。非形質転換細胞を死滅させることができ、かつ形質転換細胞を増殖させることができることによって、形質転換植物培養物が得られる。しばしば、非形質転換細胞を除去することができることは、形質転換植物細胞の迅速な回収およびトランスジェニック植物の生成の成功に対する制限となる。
【０２１５】
形質転換されている細胞を、通常の方法に従って植物に成長させてもよい。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５：８１−８４を参照されたい。次に、これらの植物を成長させ、同じ形質転換株または異なる株を受粉させて、得られた所望の表現型特徴の構成的または誘導型発現を有するハイブリッドを同定してもよい。２つまたはそれより多くの世代を成長させて、所望の表現型特徴の発現が安定に維持され、受け継がれていることを確実にした後、種子を収穫して、所望の表現型特徴の発現が達成されていることを確実にしてもよい。
【０２１６】
本実施形態のヌクレオチド配列は、植物にウイルスまたはウイルス核酸を接触させることによって植物に提供され得る。一般的に、そのような方法は、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に目的のヌクレオチド構築物を組み込むことを伴う。本実施形態の組換えタンパク質は、ウイルスポリタンパク質の一部として当初合成されてもよく、後にｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのタンパク質分解によってプロセシングされて、所望のポリペプチドを産生してもよいことが認識される。同様に、本実施形態のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも一部を含むそのようなウイルスポリタンパク質は、所望の殺有害生物活性を有し得ることも認識される。そのようなウイルスポリタンパク質およびそれらをコードするヌクレオチド配列は、本実施形態に包含される。ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ分子を伴う、植物にヌクレオチド構築物を提供する方法および植物においてコードされるタンパク質を産生する方法は、当技術分野で公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，８８９，１９１号；第５，８８９，１９０号；第５，８６６，７８５号；第５，５８９，３６７号、および第５，３１６，９３１号を参照されたい。
【０２１７】
葉緑体を形質転換する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｓｖａｂ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：８５２６−８５３０；Ｓｖａｂ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｇａ，  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：９１３−９１７；Ｓｖａｂ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｇａ，  （１９９３）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １２：６０１−６０６を参照されたい。方法は、選択可能マーカーを含有するＤＮＡの粒子銃送達、および相同組換えを通してプラスチドゲノムへのＤＮＡの標的化に依存する。さらに、プラスチド形質転換は、核コードおよびプラスチド指向性のＲＮＡポリメラーゼの組織好適発現によるサイレントなプラスチド媒介性トランスジーンのトランス活性化によって達成することができる。そのようなシステムは、ＭｃＢｒｉｄｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：７３０１−７３０５に報告されている。
【０２１８】
本実施形態は、種子、塊茎、球茎、球根、葉、および根挿しおよび苗条を含むがこれらに限定されない本実施形態の形質転換植物の植物繁殖材料にさらに関する。
【０２１９】
形質転換されて殺虫タンパク質を発現することが可能な植物種
本実施形態は、単子葉植物および双子葉植物を含むがこれらに限定されない任意の植物種の形質転換のために使用され得る。目的の植物の例には、コーン（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．（例えば、Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｒａｐａ、Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、特に種子油の供給源として有用なＢｒａｓｓｉｃａ種、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ライ麦（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、雑穀（例えば、トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、アワ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ）、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ））、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、落花生（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ  ｓｐｐ．）、ココナツ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）、柑橘樹（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｐ．）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ  ｓｐｐ．）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、テンサイ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐ．）、オートムギ、オオムギ、野菜、観賞用植物、および針葉樹が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２２０】
野菜には、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、レタス（例えば、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）、サヤインゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、エンドウ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ  ｓｐｐ．）、およびキュウリ属のメンバー、例えばキュウリ（Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ）、カンタロープ（Ｃ．ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ）、およびマスクメロン（Ｃ．ｍｅｌｏ）が挙げられる。観賞用植物には、アザレア（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ  ｓｐｐ．）、アジサイ（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ  ｈｙｄｒａｎｇｅａ）、ハイビスカス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ）、バラ（Ｒｏｓａ  ｓｐｐ．）、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ  ｓｐｐ．）、スイセン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｓｐｐ．）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ポインセチア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、およびキクが挙げられる。本実施形態の実施において使用され得る針葉樹には、例えばマツ、例えばテーダマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）、スラッシュパイン（Ｐｉｎｕｓ  ｅｌｌｉｏｔｔｉｉ）、ポンデローサマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｐｏｎｄｅｒｏｓａ）、コントルタマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔａ）、およびラジアータパイン（Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ）；ダグラスファー（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）；アメリカツガ（Ｔｓｕｇａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）；シトカトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ｇｌａｕｃａ）；セコイア（Ｓｅｑｕｏｉａ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）；トドマツ、例えばヨーロッパモミ（Ａｂｉｅｓ  ａｍａｂｉｌｉｓ）およびバルサムモミ（Ａｂｉｅｓ  ｂａｌｓａｍｅａ）；およびヒマラヤスギ、例えばベイスギ（Ｔｈｕｊａ  ｐｌｉｃａｔａ）およびアラスカイエローシーダー（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ）が挙げられる。本実施形態の植物は、作物植物（例えば、コーン、アルファルファ、ヒマワリ、ナタネ、ダイズ、ワタ、ベニバナ、落花生、モロコシ、コムギ、雑穀、タバコ等）、例えばコーンおよびダイズ植物を含む。
【０２２１】
芝草には、スズメノカタビラ（Ｐｏａ  ａｎｎｕａ）；ネズミムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）；カナダブルーグラス（Ｐｏａ  ｃｏｍｐｒｅｓｓａ）；オオウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｒｕｂｒａ）；イトコヌカグサ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｔｅｎｕｉｓ）；ハイコヌカグサ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）；ニセコムギダマシ（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｄｅｓｅｒｔｏｒｕｍ）；コムギダマシ（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｃｒｉｓｔａｄｔｕｍ）；ハードフェスク（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ）；ケンタッキーブルーグラス（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）；カモガヤ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ）；ホソムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ）；オオウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｒｕｂｒａ）；コヌカグサ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ａｌｂａ）；オオスズメノカタビラ（Ｐａａ  ｔｒｉｖｉａｌｉｓ）；ウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｏｖｉｎａ）；コスズメノチャヒキ（Ｂｒｏｍｕｓ  ｉｎｅｒｍｉｓ）；オニウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）；オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）；ヒメヌカボ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｃａｎｉｎａ）；アレチタチドジョウツナギ（Ｐｕｃｃｉｎｅｌｌｉａ  ｄｉｓｔａｎｓ）；ヒメカモジグサ（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｓｍｉｔｈｉ）；ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｓｐｐ．）；セントオーガスチングラス（Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ  ｓｅｃｕｎｄａｔｕｍ）；ノシバ（Ｚｏｙｓｉａ  ｓｐｐ．）；バヒアグラス（Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ）；カーペットグラス（Ａｘｏｎｏｐｕｓ  ａｉｆｉｎｉｓ）；ムカデシバ（Ｅｒｅｍｏｃｈｌｏａ  ｏｐｈｉｕｒｏｉｄｅｓ）；キクユシバ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｃｌａｎｄｅｓｉｎｕｍ）；サワスズメノヒエ（Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｖａｇｉｎａｔｕｍ）；ブルーグラマ（Ｂｏｕｔｅｌｏｕａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）；バッファローグラス（Ｂｕｃｈｌｏｅ  ｄａｃｔｙｌｏｉｄｓ）；シデオートグラマ（Ｂｏｕｔｅｌｏｕａ  ｃｕｒｔｉｐｅｎｄｕｌａ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２２２】
目的の植物は、穀物、目的の種子を提供する穀粒植物、脂肪種子植物、およびマメ科植物を含む。目的の種子は、穀粒種子、例えばコーン、コムギ、オオムギ、コメ、モロコシ、ライ麦、雑穀等を含む。脂肪種子植物は、ワタ、ダイズ、ベニバナ、ヒマワリ、ナタネ、トウモロコシ、アルファルファ、ヤシ、ココナツ、亜麻、トウゴマ、オリーブ等を含む。マメ科植物は、インゲン類（ｂｅａｎ）およびエンドウ類（ｐｅａ）を含む。インゲン類のマメは、グアーマメ、ローカストビーン、コロハ、ダイズ、インゲンマメ、ササゲ、リョクトウ、ライマメ、ソラマメ、レンズマメ、ヒヨコマメ等を含む。
【０２２３】
形質転換の評価
異種外来ＤＮＡの植物細胞への導入後、異種遺伝子の植物ゲノムへの形質転換または取り込みを、取り込まれた遺伝子に関連する核酸、タンパク質、および代謝物の分析等の様々な方法によって確認する。
【０２２４】
ＰＣＲ分析は、土壌に移植する前のより早期の段階で組み込まれた遺伝子の存在に関して形質転換細胞、組織、または苗条をスクリーニングするための迅速な方法である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  （２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）。ＰＣＲは、目的の遺伝子またはアグロバクテリウムベクターバックグラウンド等に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施される。
【０２２５】
植物形質転換を、ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析によって確認してもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  （２００１）、上記）。一般的に総ＤＮＡを、形質転換体から抽出し、適切な制限酵素によって消化し、アガロースゲルで分画し、ニトロセルロースまたはナイロンメンブレンに転写する。次に、メンブレンまたは「ブロット」を、例えば放射標識３２Ｐ標的ＤＮＡ断片によってプローブし、標準的な技術に従って植物ゲノムに導入された遺伝子の取り込みを確認する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  （２００１）、上記）。
【０２２６】
ノーザンブロット分析では、ＲＮＡを、当技術分野で通常通りに使用される標準手順に従って、形質転換体の特定の組織から単離し、ホルムアルデヒドアガロースゲルにおいて分画し、ナイロンフィルター上でブロットする（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  （２００１）、上記）。次に、殺有害生物遺伝子によってコードされるＲＮＡの発現を、当技術分野で公知の方法によって、フィルターを殺有害生物遺伝子に由来する放射性プローブとハイブリダイズさせることによって試験する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  （２００１）、上記）。
【０２２７】
ウエスタンブロット、生化学アッセイ等を、トランスジェニック植物について実施して、本教示の殺虫タンパク質に存在する１つまたは複数のエピトープに結合する抗体を使用して、標準手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ２００１、上記）によって殺有害生物遺伝子によってコードされるタンパク質の存在を確認してもよい。
【０２２８】
植物におけるトランスジェニック形質のスタッキング
トランスジェニック植物は、１つまたは複数の追加のポリヌクレオチドと共に本明細書に開示の１つまたは複数の殺虫ポリヌクレオチドのスタックを含み、それによって複数のポリペプチド配列の産生または抑制が起こり得る。
【０２２９】
ポリヌクレオチド配列のスタックを含むトランスジェニック植物は、従来の育種法または遺伝子操作法のいずれかもしくは両方によって得ることができる。これらの方法は、各々が目的のポリヌクレオチドを含む個々の系統を育種すること、本明細書に開示の遺伝子を含むトランスジェニック植物を、その次の遺伝子によって形質転換すること、複数の遺伝子を単一の植物細胞に同時形質転換することを含むがこれらに限定されない。
【０２３０】
本明細書で使用される場合、用語「スタックされた」は、同じ植物に存在する複数の形質を有することを含む（すなわち、両方の形質が核ゲノムに組み込まれるか、１つの形質が核ゲノムに組み込まれ、１つの形質がプラスチドのゲノムに組み込まれるか、または両方の形質がプラスチドのゲノムに組み込まれる）。１つの非制限的な例では、「スタックされた形質」は、配列が互いに物理的に隣接する分子スタックを含む。形質は、本明細書で使用される場合、特定の配列または配列の群に由来する表現型を指す。遺伝子の同時形質転換は、複数の遺伝子を含む単一の形質転換ベクターを使用して行うことができ、または遺伝子を複数のベクターで個別に運ぶことができる。配列が、植物を遺伝的に形質転換することによってスタックされる場合、目的のポリヌクレオチド配列を、任意の時間および任意の順序で組み合わせることができる。形質は、形質転換カセットの任意の組合せによって提供された目的のポリヌクレオチドとの同時形質転換プロトコールで同時に導入することができる。例えば、２つの配列を導入する場合、２つの配列を個別の形質転換カセットに含有することができ（トランス）、または同じ形質転換カセットに含有することができる（シス）。配列の発現は、同じプロモーターによってまたは異なるプロモーターによって駆動することができる。ある特定の例では、目的のポリヌクレオチドの発現を抑制する形質転換カセットを導入することが望ましい場合があり得る。これを、他の抑制カセットまたは過剰発現カセットの任意の組合せと組み合わせて、植物において形質の所望の組合せを生成してもよい。ポリヌクレオチド配列は、部位特異的組換えシステムを使用して所望のゲノム位置でスタックすることができるとさらに認識される。例えば、その全てが参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第１９９９／２５８２１号、国際公開第１９９９／２５８５４号、国際公開第１９９９／２５８４０号、国際公開第１９９９／２５８５５号および国際公開第１９９９／２５８５３号を参照されたい。
【０２３１】
一部の実施形態では、単独の、または１つもしくは複数の追加の昆虫抵抗性形質とスタックされた本明細書に開示の殺有害生物タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、１つまたは複数の追加の入力形質（例えば、除草剤抵抗性、真菌抵抗性、ウイルス抵抗性、ストレス耐性、疾患抵抗性、雄性不念性、茎の長さ等）、または出力形質（例えば、収量の増加、デンプンの改変、油プロファイルの改善、バランスのとれたアミノ酸、高いリシンまたはメチオニン、消化性の増加、繊維品質の改善、干ばつ抵抗性等）とスタックすることができる。このように、ポリヌクレオチド実施形態を使用して、任意の数の農業有害生物を柔軟かつ費用効果的に防除する能力と共に作物品質が改善された完全な農学パッケージを提供することができる。
【０２３２】
スタッキングにとって有用なトランスジーンは、他の殺有害生物タンパク質、例えばモナライシン、ＰＩＰ、Ｃｒｙ、Ｃｙｔ、Ｖｉｐ、ＴＣ、およびその任意の組合せを含む。これらの殺有害生物タンパク質は、本明細書の先の節により詳細に記載されている。
【０２３３】
本教示の殺有害生物タンパク質によるスタッキングにとって有用な他のトランスジーンは、植物の疾患抵抗性、昆虫特異的ホルモンまたはフェロモン、抗真菌活性、および殺線虫活性をコードする遺伝子を含む。
【０２３４】
除草剤に対し抵抗性を付与するトランスジーンもまた、以下（以下の９個の除草剤クラスの非制限的なクラス）を含む本教示の殺有害生物タンパク質と共にスタックすることができる：
【０２３５】
（１）成長点または分裂組織を阻害する除草剤、例えばイミダゾリノンまたはスルホニルウレアに対する抵抗性をコードするポリヌクレオチド。このカテゴリーの例示的な遺伝子は、例えば、Ｌｅｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ７：１２４１およびＭｉｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ８０：４４９によってそれぞれ記載される変異体ＡＬＳおよびＡＨＡＳ酵素をコードする。同様に、米国特許第５，６０５，０１１号；第５，０１３，６５９号；第５，１４１，８７０号；第５，７６７，３６１号；第５，７３１，１８０号；第５，３０４，７３２号；第４，７６１，３７３号；第５，３３１，１０７号；第５，９２８，９３７号および第５，３７８，８２４号；米国特許出願第１１／６８３，７３７号、および国際出願国際公開第１９９６／３３２７０号も参照されたい。
【０２３６】
（２）グリホサート（変異体５−エノールピルビル（ｐｙｒｕｖｌ）シキミ酸−３−リン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｉｋｉｍａｔｅ）合成酵素（ＥＰＳＰＳ）およびａｒｏＡ遺伝子によってそれぞれ付与される抵抗性）、および他のホスホノ化合物、例えばグルホシネート（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子）、およびピリジノキシまたはフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソン（ＡＣＣアーゼ阻害剤をコードする遺伝子）に対する抵抗性に関するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。例えばグリホサート抵抗性を付与することができるＥＰＳＰＳの一形態のヌクレオチド配列を開示するＳｈａｈらに対する米国特許第４，９４０，８３５号を参照されたい。Ｂａｒｒｙらに対する米国特許第５，６２７，０６１号もまた、ＥＰＳＰＳ酵素をコードする遺伝子を記載している。同様に、この目的のために参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，５６６，５８７号；第６，３３８，９６１号；第６，２４８，８７６Ｂ１号；第６，０４０，４９７号；第５，８０４，４２５号；第５，６３３，４３５号；第５，１４５，７８３号；第４，９７１，９０８号；第５，３１２，９１０号；第５，１８８，６４２号；第５，０９４，９４５号；第４，９４０，８３５号；第５，８６６，７７５号；第６，２２５，１１４Ｂ１号；第６，１３０，３６６号；第５，３１０，６６７号；第４，５３５，０６０号；第４，７６９，０６１号；第５，６３３，４４８号；第５，５１０，４７１号；Ｒｅ．３６，４４９；ＲＥ３７，２８７Ｅおよび第５，４９１，２８８号、および国際出願欧州特許第１１７３５８０号；国際公開第２００１／６６７０４号；欧州特許第１１７３５８１号および欧州特許第１１７３５８２号を参照されたい。グリホサート抵抗性はまた、この目的のために参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，７７６，７６０号および第５，４６３，１７５号により詳しく記載されているグリホサートオキシドレダクターゼ酵素をコードする遺伝子を発現する植物にも付与される。加えて、グリホサート抵抗性は、グリホサートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の過剰発現によって植物に付与することができる。例えば、米国特許第７，４６２，４８１号；第７，４０５，０７４号、および米国特許出願公開第２００８／０２３４１３０号を参照されたい。変異体ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ（登録商標）受託番号３９２５６によって得ることができ、変異体遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｃｏｍａｉに対する米国特許第４，７６９，０６１号に開示されている。Ｋｕｍａｄａらに対する欧州特許出願第０  ３３３  ０３３号およびＧｏｏｄｍａｎらに対する米国特許第４，９７５，３７４号は、Ｌ−ホスフィノトリシン等の除草剤に対する抵抗性を付与するグルタミンシンテターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示している。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｌｅｅｍａｎｓらに対する欧州特許出願第０  ２４２  ２４６号および第０  ２４２  ２３６���に提供され、Ｄｅ  Ｇｒｅｅｆ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｂｉｏｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：６１は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性をコードするキメラｂａｒ遺伝子を発現するトランスジェニック植物の作出を記載している。同様に、この目的のために参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，９６９，２１３号；第５，４８９，５２０号；第５，５５０，３１８号；第５，８７４，２６５号；第５，９１９，６７５号；第５，５６１，２３６号；第５，６４８，４７７号；第５，６４６，０２４号；第６，１７７，６１６Ｂ１号および第５，８７９，９０３号も参照されたい。フェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサン、例えばセトキシジムおよびハロキシホップに対する抵抗性を付与する例示的な遺伝子は、Ｍａｒｓｈａｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ８３：４３５によって記載されるＡｃｃｌ−Ｓｌ、Ａｃｃｌ−Ｓ２およびＡｃｃｌ−Ｓ３遺伝子である。
【０２３７】
（３）光合成を阻害する除草剤、例えばトリアジン（ｐｓｂＡおよびｇｓ＋遺伝子）およびベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）に対する抵抗性に関するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。Ｐｒｚｉｂｉｌｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：１６９は、変異体ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドによるＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓの形質転換を記載している。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｔａｌｋｅｒらに対する米国特許第４，８１０，６４８号に開示され、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ（登録商標）受託番号５３４３５、６７４４１および６７４４２として利用可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現は、Ｈａｙｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２８５：１７３に記載されている。
【０２３８】
（４）アセトヒドロキシ酸合成酵素を発現する植物を複数のタイプの除草剤に対し抵抗性にすることが見出されているアセトヒドロキシ酸合成酵素に対する抵抗性に関するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、多様な植物に導入されている（例えば、Ｈａｔｔｏｒｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２４６：４１９を参照されたい）。除草剤に対し抵抗性を付与する他の遺伝子は、ラットシトクロムＰ４５０７Ａｌおよび酵母ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼのキメラタンパク質をコードする遺伝子（Ｓｈｉｏｔａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０６：ｌ  ７）、グルタチオンレダクターゼおよびスーパーオキシドジスムターゼに関する遺伝子（Ａｏｎｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３６：１６８７）、ならびに様々なホスホトランスフェラーゼに関する遺伝子（Ｄａｔｔａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０：６１９）を含む。
【０２３９】
（５）クロロフィルの産生にとって必要なプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）を標的とする除草剤に対する抵抗性をコードするポリヌクレオチド。ｐｒｏｔｏｘ酵素は、多様な除草化合物の標的としての役目を果たす。これらの除草剤はまた、存在する植物の異なる種全ての成長を阻害し、その全体的な破壊を引き起こす。これらの除草剤に対し抵抗性である変化したｐｒｏｔｏｘ活性を含有する植物の開発は、米国特許第６，２８８，３０６Ｂ１号；第６，２８２，８３７Ｂ１号および第５，７６７，３７３号および国際出願国際公開第２００１／１２８２５号に記載されている。
【０２４０】
（６）ａａｄ−１遺伝子（当初はＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｈｅｒｂｉｃｉｄｏｖｏｒａｎｓに由来する）は、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−１）タンパク質をコードする。この形質は、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸およびアリールオキシフェノキシプロピオネート（一般的に「ホップ」除草剤、例えばキザロホップと呼ばれる）除草剤に対する耐性を付与する。植物における除草剤耐性に関するａａｄ−１遺伝子そのものは、国際公開第２００５／１０７４３７号（同様に、米国特許出願公開第２００９／００９３３６６号も参照されたい）において初めて開示された。ａａｄ−１２遺伝子は、Ｄｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓに由来し、これは、フェノキシオーキシン（例えば、２，４−Ｄ、ＭＣＰＡ）ならびにピリジルオキシオーキシン（例えば、フルオロキシピル、トリクロピル）を含むアリールオキシアルカノエート部分を有するいくつかの除草剤を無効にすることによって、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸およびピリジルオキシアセテート除草剤に対する耐性を付与するアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−１２）タンパク質をコードする。
【０２４１】
（７）ジカンバ耐性を付与するための米国特許出願公開第２００３／０１３５８７９号に開示される除草剤抵抗性ジカンバモノオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。
【０２４２】
（８）ブロモキシニル耐性を付与するための米国特許第４，８１０，６４８号に開示されるブロモキシニルニトリラーゼ（Ｂｘｎ）をコードするポリヌクレオチド分子。
【０２４３】
（９）ノルフルラゾン耐性に関してＭｉｓａｗａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ４：８３３−８４０およびＭｉｓａｗａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ６：４８１−４８９に記載されるフィトエン（ｃｒｔｌ）をコードするポリヌクレオチド分子。
【０２４４】
以下（穀粒中の脂肪酸の変化に関連する以下の非制限的なクラス）を含む、変化した穀粒特徴を付与するまたはそれに寄与するトランスジーンもまた、本教示の殺有害生物タンパク質と共にスタックすることができる：（１）植物のステアリン酸含有量を増加させるためのステアロイル−ＡＣＰの下方調節。Ｋｎｕｌｔｚｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：２６２４および国際公開第１９９９／６４５７９号（コーンにおける脂質プロファイルを変化させる遺伝子）を参照されたい。（２）ＦＡＤ−２遺伝子改変を介したオレイン酸の上昇および／またはＦＡＤ−３遺伝子改変を介したリノレン酸の減少（米国特許第６，０６３，９４７号；第６，３２３，３９２号；第６，３７２９６５号および国際公開第１９９３／１１２４５号を参照されたい）。（３）例えば国際公開第２００１／１２８００号に記載のような共役リノレン酸またはリノール酸含有量の変化。（４）ＬＥＣｌ、ＡＧＰ、Ｄｅｋｌ、Ｓｕｐｅｒａｌｌ、ｍｉｌ  ｐｓ、様々なＩｐａ遺伝子、例えばＩｐａｌ、Ｉｐａ３、ｈｐｔまたはｈｇｇｔの変化。例えば、国際公開第２００２／４２４２４号、国際公開第１９９８／２２６０４号、国際公開第２００３／０１１０１５号、国際公開第２００２／０５７４３９号、国際公開第２００３／０１１０１５号、米国特許第６，４２３，８８６号、第６，１９７，５６１号、第６，８２５，３９７号、および米国特許出願公開第２００３／００７９２４７号、米国特許出願公開第２００３／０２０４８７０号、およびＲｉｖｅｒａ−Ｍａｄｒｉｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：５６２０−５６２４を参照されたい。（５）長鎖多価不飽和脂肪酸を作製するためのデルタ−８デサチュラーゼ（米国特許第８，０５８，５７１号および第８，３３８，１５２号）、飽和脂肪酸を低下させるためのデルタ−９デサチュラーゼ（米国特許第８，０６３，２６９号）、オメガ−３脂肪酸プロファイルを改善するためのサクラソウＡ６−デサチュラーゼをコードする遺伝子。（６）トランスジェニック植物を作出する方法、および脂質、脂肪酸、デンプン、または種子貯蔵タンパク質を含む種子貯蔵化合物のレベルをモジュレートする方法において使用される、ならびに植物の種子サイズ、種子数、種子重量、根の長さおよび葉のサイズをモジュレートする方法において使用される、脂質および糖の代謝調節に関連する単離された核酸およびタンパク質、特に脂質代謝タンパク質（ＬＭＰ）（欧州特許第２４０４４９９号）。（７）植物におけるＨＳＩ２の発現を増加または減少させるために、植物における高レベル発現糖誘導２（ＨＳＩ２）タンパク質の発現を変化させること。ＨＳＩ２の発現を増加させると油含有量を増加させるが、ＨＳＩ２の発現を減少させるとアブシジン酸感受性を減少させ、および／または干ばつ抵抗性を増加させる（米国特許出願公開第２０１２／００６６７９４号）。（８）植物種子における油含有量をモジュレートするための、特にオメガ−３脂肪酸のレベルを増加させ、オメガ−６のオメガ−３脂肪酸に対する比を改善するための、シトクロムｂ５（Ｃｂ５）単独���発現またはＣｂ５とＦＡＤ２との発現（米国特許出願公開第２０１１／０１９１９０４号）。（９）糖代謝をモジュレートするためのｗｒｉｎｋｌｅｄ１様ポリペプチドをコードする核酸分子（米国特許第８，２１７，２２３号）。
【０２４５】
以下（穀粒中のリン含有量の変化に関連する以下の非制限的なクラス）を含む、変化した穀粒特徴を付与するまたはそれに寄与するトランスジーンもまた、本教示の殺有害生物タンパク質とスタックすることができる：（１）フィターゼコード遺伝子の導入は、フィチン酸塩の分解を増強し、形質転換植物により多くの遊離ホスフェートを与える。例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒフィターゼ遺伝子のヌクレオチド配列の開示に関しては、Ｖａｎ  Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｇｅｎｅ  １２７：８７を参照されたい。（２）フィチン酸塩の含有量を低減させる遺伝子をモジュレートする。トウモロコシでは、これは例えば、国際公開第２００５／１１３７７８号のように低レベルのフィチン酸によって特徴付けられるトウモロコシ変異体において同定されたＬＰＡ対立遺伝子等の１つまたは複数の対立遺伝子に関連するＤＮＡをクローニングした後再導入することによって、ならびに／または国際公開第２００２／０５９３２４号、米国特許出願公開第２００３／０００９０１１号、国際公開第２００３／０２７２４３号、米国特許出願公開第２００３／００７９２４７号、国際公開第１９９９／０５２９８号、米国特許第６，１９７，５６１号、米国特許第６，２９１，２２４号、米国特許第６，３９１，３４８号、国際公開第２００２／０５９３２４号、米国特許出願公開第２００３／００７９２４７号、国際公開第１９９８／４５４４８号、国際公開第１９９９／５５８８２号、国際公開第２００１／０４１４７号のようにイノシトールキナーゼ活性を変化させることによって達成することができる。
【０２４６】
以下（穀粒中の炭水化物含有量の変化に関連する以下の非制限的なクラス）を含む、変化した穀粒特徴を付与するまたはそれに寄与するトランスジーンもまた、本教示の殺有害生物タンパク質とスタックすることができる：（１）デンプンの分岐パターンに影響を及ぼす酵素の遺伝子、またはＮＴＲおよび／もしくはＴＲＸ等のチオレドキシンを変化させる遺伝子（この目的のために参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第６，５３１，６４８号を参照されたい）、および／またはガンマゼインノックアウト、またはｃｓ２７もしくはＴＵＳＣ２７もしくはｅｎ２７等の変異体（この目的のために参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第６，８５８，７７８号および米国特許出願公開第２００５／０１６０４８８号、米国特許出願公開第２００５／０２０４４１８号を参照されたい）を変化させること。Ｓｈｉｒｏｚａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７０：８１０（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｔフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８５）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２００：２２０（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｐｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２９２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファアミラーゼを発現するトランスジェニック植物の作出）、Ｅｌｌｉｏｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２１：５１５（トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｓｅｇａａｒｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８：２２４８０（オオムギアルファ−アミラーゼ遺伝子の部位特異的変異誘発）、およびＦｉｓｈｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０２：１０４５（トウモロコシ内胚葉デンプン分岐酵素ＩＩ）、国際公開第１９９９／１０４９８号（ＵＤＰ−Ｄ−キシロース４−エピメラーゼ、Ｆｒａｇｉｌｅ１および２、Ｒｅｆｌ、ＨＣＨＬ、Ｃ４Ｈの改変を通しての消化性および／またはデンプン抽出の改善）、米国特許第６，２３２，５２９号（デンプンレベルの改変により高い脂肪種子を作出する方法（ＡＧＰ））を参照されたい。本明細書で言及した脂肪酸改変遺伝子もまた、デンプンおよび油の経路の相互関係を通してデンプン含有量および／または組成に影響を及ぼすために使用してもよい。
【０２４７】
以下（穀粒中の抗酸化剤含有量の変化に関連する以下の非制限的なクラス）を含む、変化した穀粒特徴を付与するまたはそれに寄与するトランスジーンもまた、本教示の殺有害生物タンパク質とスタックすることができる：（１）トコフェロールまたはトコトリエノールの変化。例えば、米国特許第６，７８７，６８３号、米国特許出願公開第２００４／００３４８８６号、および抗酸化剤レベルの操作を伴う国際公開第２０００／６８３９３号、およびホモゲンチジン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ｈｇｇｔ）の変化を通しての国際公開第２００３／０８２８９９号を参照されたい。
【０２４８】
以下（穀粒中の必須アミノ酸含有量の変化に関連する以下の非制限的なクラス）を含む、変化した穀粒特徴を付与するまたはそれに寄与するトランスジーンもまた、本教示の殺有害生物タンパク質とスタックすることができる：（１）例えば、米国特許第６，１２７，６００号（種子における必須アミノ酸の蓄積を増加させる方法）、米国特許第６，０８０，９１３号（種子における必須アミノ酸の蓄積を増加させるバイナリー方法）、米国特許第５，９９０，３８９号（高いリシン）、国際公開第１９９９／４０２０９号（種子におけるアミノ酸組成の変化）、国際公開第１９９９／２９８８２号（タンパク質のアミノ酸含有量を変化させる方法）、米国特許第５，８５０，０１６号（種子におけるアミノ酸組成の変化）、国際公開第１９９８／２０１３３号（必須アミノ酸レベルが増強されたタンパク質）、米国特許第５，８８５，８０２号（高いメチオニン）、米国特許第５，８８５，８０１号（高いスレオニン）、米国特許第６，６６４，４４５号（植物アミノ酸生合成酵素）、米国特許第６，４５９，０１９号（リシンおよびスレオニンの増加）、米国特許第６，４４１，２７４号（植物トリプトファン合成酵素ベータサブユニット）、米国特許第６，３４６，４０３号（メチオニン代謝酵素）、米国特許第５，９３９，５９９号（高い硫黄）、米国特許第５，９１２，４１４号（メチオニンの増加）、国際公開第１９９８／５６９３５号（植物アミノ酸生合成酵素）、国際公開第１９９８／４５４５８号（より高いパーセンテージの必須アミノ酸を有する操作された種子タンパク質）、国際公開第１９９８／４２８３１号（リシンの増加）、米国特許第５，６３３，４３６号（硫黄アミノ酸含有量の増加）、米国特許第５，５５９，２２３号（植物の栄養価を改善するためのプログラム可能な必須アミノ酸レベルを含有する規定の構造を有する合成貯蔵タンパク質）、国際公開第１９９６／０１９０５号（スレオニンの増加）、国際公開第１９９５／１５３９２号（リシンの増加）、米国特許出願公開第２００３／０１６３８３８号、米国特許出願公開第２００３／０１５００１４号、米国特許出願公開第２００４／００６８７６７号、米国特許第６，８０３，４９８号、国際公開第２００１／７９５１６号を参照されたい。
【０２４９】
雄性不念性を付与するまたはそれに寄与するトランスジーンもまた、本教示の殺有害生物タンパク質とスタックすることができる。部位特異的ＤＮＡ取り込みのための部位を創出するトランスジーンもまた、本教示の殺有害生物タンパク質とスタックすることができる。
【０２５０】
以下を含むがこれらに限定されない、作物植物の非生物ストレス抵抗性に影響を及ぼすトランスジーンもまた、本教示の殺有害生物タンパク質とスタックすることができる：開花、穂、および種子の発達、窒素利用効率の増強、窒素応答性の変化、干ばつ抵抗性または耐性、低温抵抗性または耐性、および塩抵抗性または耐性、およびストレス下での収量の増加。本教示の殺有害生物タンパク質とスタックすることができる非生物ストレス抵抗性遺伝子のさらなる例には以下が含まれる：（１）水の使用効率がリンゴ酸塩の変化を通して変化する国際公開第２０００／７３４７５号；米国特許第５，８９２，００９号、第５，９６５，７０５号、第５，９２９，３０５号、第５，８９１，８５９号、第６，４１７，４２８号、第６，６６４，４４６号、第６，７０６，８６６号、第６，７１７，０３４号、第６，８０１，１０４号、国際公開第２０００／０６００８９号、国際公開第２００１／０２６４５９号、国際公開第２００１／０３５７２５号、国際公開第２００１／０３４７２６号、国際公開第２００１／０３５７２７号、国際公開第２００１／０３６４４４号、国際公開第２００１／０３６５９７号、国際公開第２００１／０３６５９８号、国際公開第２００２／０１５６７５号、国際公開第２００２／０１７４３０号、国際公開第２００２／０７７１８５号、国際公開第２００２／０７９４０３号、国際公開第２００３／０１３２２７号、国際公開第２００３／０１３２２８号、国際公開第２００３／０１４３２７号、国際公開第２００４／０３１３４９号、国際公開第２００４／０７６６３８号、国際公開第１９９８０９５２１号。（２）植物に及ぼす凍結、高い塩分、および干ばつの負の影響を軽減するために、ならびに植物表現型に他の正の効果を付与するために有効なＣＢＦ遺伝子および転写因子を含む遺伝子を記載する国際公開第１９９９３８９７７号。（３）アブシジン酸が植物において変化して、それによって植物表現型の改善、例えば収量の増加および／または非生物ストレスに対する耐性の増加をもたらす、米国特許出願公開第２００４／０１４８６５４号および国際公開第２００１／３６５９６号。（４）サイトカイニン発現が改変され、それによってストレス耐性、例えば干ばつ耐性の増加、および／または収量の増加を有する植物をもたらす、国際公開第２０００／００６３４１号、国際公開第２００４／０９０１４３号、米国特許第７，５３１，７２３号および第６，９９２，２３７号。同様に、国際公開第２００２／０２７７６号、国際公開第２００３／０５２０６３号、日本国特許第２００２／２８１９７５号、米国特許第６，０８４，１５３号、国際公開第２００１／６４８９８号、米国特許第６，１７７，２７５号および米国特許第６，１０７，５４７号（窒素利用の増強および窒素応答性の変化）も参照されたい。（５）エチレンの変化に関しては、米国特許出願公開第２００４／０１２８７１９号、米国特許出願公開第２００３／０１６６１９７号、および国際公開第２０００／３２７６１号を参照されたい。（６）植物転写因子または非生物ストレスの転写調節因子に関しては、例えば米国特許出願公開第２００４／００９８７６４号または米国特許出願公開第２００４／００７８８５２号を参照されたい。（７）収量を増加させるために、液胞ピロホスファターゼの発現を増加させる遺伝子、例えばＡＶＰｌ（米国特許第８，０５８，５１５号）；ＨＳＦ  Ａ４またはＨＳＦ  Ａ５（クラスＡ４またはＡ５の熱ショック因子）ポリペプチド、オリゴペプチド輸送体タンパク質（ＯＰＴ４様）ポリペプチドをコードする核酸；プラストクロン２様（ＰＬＡ２様）ポリペプチド、またはＷｕｓｃｈｅｌ関連ホメオボックスＩ様（ＷＯＸｌ様）ポリペプチド（米国特許出願公開第２０１１／０２８３４２０号）。（８）活力を増加させるために、プログラム細胞死をモジュレートするためのポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドの下方調節（米国特許第８，０５８，５１０号）。（９）干ばつ抵抗性を付与するためのＤＴＰ２１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（米国特許出願公開第２０１１／０２７７１８１号）。（１０）発達をモジュレートする、ストレスに対する応答をモジュレートする、およびストレス耐性をモジュレートするためのＡＣＣ合成酵素３（ＡＣＳ３）タンパク質をコードするヌクレオチド配列（米国特許出願公開第２０１０／０２８７６６９号）。（１１）干ばつ抵抗性を付与するための干ばつ耐性表現型（ＤＴＰ）を付与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド（国際公開第２０１２／０５８５２８号）。（１２）干ばつおよび塩耐性を付与するためのトコフェロールシクラーゼ（ＴＣ）遺伝子（米国特許出願公開第２０１２／０２７２３５２号）。（１３）ストレス耐性に関するＣＡＡＸアミノ末端ファミリータンパク質（米国特許第８，３３８，６６１号）。（１４）ＳＡＬ１コード遺伝子の変異は、干ばつ抵抗性の増加を含む、ストレス耐性の増加を有する（米国特許出願公開第２０１０／０２５７６３３号）。（１５）収量関連形質を増加させるＧＲＦポリペプチド、ＲＡＡｌ様ポリペプチド、ＳＹＲポリペプチド、ＡＲＫＬポリペプチド、およびＹＴＰポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列の発現（米国特許出願公開第２０１１／００６１１３３号）。（１６）植物における収量関連形質を増強するための、特に種子収量を増加させるための、クラスＩＩＩトレハロースリン酸ホスファターゼ（ＴＰＰ）ポリペプチドをコードする核酸の植物における発現をモジュレートする（米国特許出願公開第２０１０／００２４０６７号）。（１７）干ばつ耐性表現型（ＤＴＰ６）ポリペプチドをコードする核酸配列の発現、特に米国特許出願公開第２０１４／０２２３５９５号のＡＴ−ＤＴＰ６の発現。
【０２５１】
植物の成長および農業形質、例えば収量、開花、植物の成長および／または植物の構造に影響を及ぼす他の遺伝子および転写因子を、植物に導入するか、または遺伝子移入することができ、例えば国際公開第１９９７／４９８１１号（ＬＨＹ）、国際公開第１９９８／５６９１８号（ＥＳＤ４）、国際公開第１９９７／１０３３９号および米国特許第６，５７３，４３０号（ＴＦＬ）、米国特許第６，７１３，６６３号（ＦＴ）、国際公開第１９９６／１４４１４号（ＣＯＮ）、国際公開第１９９６／３８５６０号、国際公開第２００１／２１８２２号（ＶＲＮ１）、国際公開第２０００／４４９１８号（ＶＲＮ２）、国際公開第１９９９／４９０６４号（ＧＩ）、国際公開第２０００／４６３５８号（ＦＲＩ）、国際公開第１９９７／２９１２３号、米国特許第６，７９４，５６０号、米国特許第６，３０７，１２６号（ＧＡＩ）、国際公開第１９９９／０９１７４号（Ｄ８およびＲｈｔ）、および国際公開第２００４／０７６６３８号および国際公開第２００４／０３１３４９号（転写因子）を参照されたい。
【０２５２】
作物植物に収量の増加を付与するトランスジーンもまた、本教示の殺有害生物タンパク質とスタックすることができ、例えば：（１）作物植物における核酸配列の発現が、野生型品種の植物と比較して植物の根の成長の増加、および／または収量の増加、および／または環境ストレスに対する耐性の増加をもたらす、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸デアミナーゼ様ポリペプチド（ＡＣＣＤＰ）コード核酸によって形質転換されたトランスジェニック作物植物（米国特許第８，０９７，７６９号）。（２）種子好適プロモーターを使用するトウモロコシジンクフィンガータンパク質遺伝子（Ｚｍ−ＺＦＰｌ）の過剰発現は、植物の成長を増強する、穀粒数および植物あたりの総穀粒重量を増加させることが示されている（米国特許出願公開第２０１２／００７９６２３号）。（３）トウモロコシｌａｔｅｒａｌ  ｏｒｇａｎ  ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ（ＬＯＢ）ドメインタンパク質（Ｚｍ−ＬＯＢＤＰｌ）の構成的過剰発現は、穀粒数および植物あたりの総穀粒重量を増加させることが示されている（米国特許出願公開第２０１２／００７９６２２号）。（４）ＶＩＭ１（メチル化バリアント１）様ポリペプチドまたはＶＴＣ２様（ＧＤＰ−Ｌ−ガラクトースホスホリラーゼ）ポリペプチドまたはＤＵＦ１６８５ポリペプチドまたはＡＲＦ６様（オーキシン応答性因子）ポリペプチド（国際公開第２０１２／０３８８９３号）をコードする核酸の植物における発現をモジュレートすることによって植物における収量関連形質を増強する。（５）Ｓｔｅ２０様ポリペプチドまたはそのホモログをコードする核酸の植物における発現をモジュレートすることは、対照植物と比較して収量が増加した植物を与える（欧州特許第２４３１４７２号）。（６）植物の根の構造を改変するためのヌクレオシドジホスファターゼキナーゼ（ＮＤＫ）ポリペプチドおよびそのホモログをコードする遺伝子（米国特許出願公開第２００９／００６４３７３号）。
【０２５３】
一部の態様では、殺有害生物タンパク質を、規制当局の承認を得た任意の遺伝子形質とスタックすることができる。そのような形質の非網羅的なリストは、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２０１６／０３６６８９１Ａ１号の表４Ａ〜４Ｆに見出すことができる。さらに、本明細書に教示の本教示の新規殺虫タンパク質は、以下に記載の表Ｂ〜Ｇからの任意の遺伝子形質とスタックするかまたは組み合わせることができる。
【表Ｂ】
2021514643.tif 000011
【表Ｃ−１】
2021514643.tif 000012
【表Ｃ−２】
2021514643.tif 000013
【表Ｄ−１】
2021514643.tif 000014
【表Ｄ−２】
2021514643.tif 000015
【表Ｅ】
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【表Ｆ−１】
2021514643.tif 000017
【表Ｆ−２】
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【表Ｆ−３】
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【表Ｆ−４】
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【表Ｇ−１】
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【表Ｇ−２】
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【表Ｇ−３】
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【表Ｇ−４】
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【表Ｇ−５】
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【表Ｇ−６】
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【表Ｇ−７】
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【表Ｇ−８】
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【表Ｇ−９】
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【表Ｇ−１０】
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【表Ｇ−１１】
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【表Ｇ−１２】
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【０２５４】
殺虫タンパク質を発現する微生物の利用
目的の１つまたは複数の作物の「植物体圏（ｐｈｙｔｏｓｐｈｅｒｅ）」（葉面（ｐｈｙｌｌｏｐｌａｎｅ）、葉圏（ｐｈｙｌｌｏｓｐｈｅｒｅ）、根圏、および／または根面（ｒｈｉｚｏｐｌａｎａ））を占有することが知られている微生物宿主を選択してもよい。これらの微生物は、野生型微生物と特定の環境において首尾良く競合することが可能となるように選択され、本明細書に教示の殺有害生物タンパク質を発現する遺伝子の安定な維持および発現を提供し、そして環境による分解および不活化からの殺有害生物剤の保護の改善を提供する。
【０２５５】
そのような微生物は、細菌、藻類、および真菌を含む。特に興味深いのは、微生物、例えば細菌、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｉｕｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、およびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、真菌、特に酵母、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、およびＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍである。特に興味深いのは、植物体圏細菌種、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｊｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｏｔｉ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｎｔｒｏｐｈｕｓ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉおよびＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、ならびに植物体圏酵母種、例えばＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｒｕｂｒａ、Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｒ．ｍａｒｉｎａ、Ｒ．ａｕｒａｎｔｉａｃａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｉｄｕｓ、Ｃ．ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ、Ｃ．ｌａｕｒｅｎｔｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｉ、Ｓ．ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｚｓｚａｅ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｕｓ、Ｓ．ｏｄｏｒｕｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｒｏｎａｅ、およびＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｏｌｌｕｌａｎｓである。特に興味深いのは色素産生微生物である。特に興味深い宿主生物は、酵母、例えばＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｓｐｐ．、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、葉面生物、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．（例えばＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｊｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐ．ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐｐ．、およびＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、ならびにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ等を含む他のそのような生物が挙げられる。
【０２５６】
本教示の殺有害生物タンパク質をコードする遺伝子は、植物において複製する微生物（着生生物）に導入することができる。着生生物は、グラム陽性またはグラム陰性細菌であり得る。根定着細菌は、当技術分野で公知の方法によって目的の植物から単離することができる。本教示の殺有害生物タンパク質をコードする遺伝子は、例えば電気的形質転換によって根定着または着生細菌に導入することができる。遺伝子を、シャトルベクター、例えばｐＨＴ３１０１（Ｌｅｒｅｃｉｕｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ６０：２１１−２１８）においてクローニングすることができる。特定のポリペプチド遺伝子のコード配列を含有するシャトルベクターｐＨＴ３１０１を、例えば電気穿孔によって細菌に形質転換することができる（Ｌｅｒｅｃｉｕｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ６０：２１１−２１８）。発現系は、本教示の殺有害生物タンパク質がグラム陰性細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉの細胞質外に分泌されるように設計することができる。
【０２５７】
本明細書に教示の殺有害生物タンパク質を、細菌宿主において発酵させてもよく、得られた細菌を、Ｂｔ株が殺虫剤スプレーとして使用されているのと同じように、微生物スプレーとして処理および使用してもよい。Ｂａｃｉｌｌｕｓから分泌される殺有害生物タンパク質の場合、分泌シグナルを、当技術分野で公知の手順を使用して除去するかまたは変異させる。そのような変異および／または欠失は、発酵プロセスの間にタンパク質が増殖培地中に分泌するのを防止する。殺有害生物タンパク質は、細胞内に保持され、次に細胞を処理してカプセル化されたタンパク質を生じる。任意の適した微生物をこの目的のために使用することができる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓは、カプセル化されたタンパク質としてＢｔ毒素を発現するために使用されており、得られた細胞は、殺虫剤として処理および噴霧されている（Ｇａｅｒｔｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３），  ｉｎ：  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ，  ｅｄ．  Ｋｉｍ）。
【０２５８】
あるいは、本教示の殺有害生物タンパク質は、異種遺伝子を細胞宿主に導入することによって産生される。異種遺伝子の発現によって、直接または間接的に殺有害生物剤の細胞内産生および維持がもたらされる。次に、これらの細胞を、細胞が標的有害生物の環境に適用された場合に細胞内で産生された毒素の活性を延長させる条件下で処理する。得られた産物は、毒素の毒性を保持する。次に、これらの天然にカプセル化されたタンパク質を、標的有害生物を受け入れる環境、例えば、土壌、水、および植物の葉に適用するために通常の技術に従って製剤化してもよい。例えばＥＰＡ０１９２３１９、およびその中で引用された参考文献を参照されたい。
【０２５９】
殺有害生物組成物
一部の実施形態では、活性成分を、組成物の形態で適用することができ、他の化合物と同時または逐次的に処理される耕作区域または植物に適用することができる。これらの化合物は、肥料、除草剤、凍結保護剤、界面活性剤、洗浄剤、殺有害生物石けん、ドーマントオイル、ポリマー、および／または製剤の１回適用後に標的領域の長期間投薬を可能にする時限放出もしくは生物分解性担体製剤であり得る。それらはまた、選択的除草剤、化学殺虫剤、殺ウイルス剤、殺菌剤、殺アメーバ剤、殺有害生物剤、殺真菌剤、殺細菌剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤、またはこれらの調製物のいくつかの混合物であり得、望ましければさらなる農学的に許容可能な担体、界面活性剤、または製剤の技術分野で慣例的に使用される適用促進アジュバントを含む。適した担体（すなわち、農学的に許容可能な担体）およびアジュバントは、固体または液体であり得、製剤技術において通常使用される物質、例えば天然または再生ミネラル物質、溶媒、分散剤、湿潤剤、固着剤、粘着付与剤、結合剤、または肥料に対応し得る。同様に、製剤は、殺有害生物製剤の標的有害生物による摂食または摂取を可能にするために食用可能な餌に調製してもよく、または有害生物トラップに作製してもよい。
【０２６０】
細菌株によって産生された本教示の殺虫タンパク質の少なくとも１つを含有する活性成分または農業化学組成物を適用する方法は、葉への適用、種子コーティング、および土壌への適用を含む。適用回数および適用速度は、対応する有害生物による蔓延の強さに依存する。
【０２６１】
組成物は、粉末、ダスト、ペレット、顆粒、スプレー、乳剤、コロイド、溶液等として製剤化してもよく、ポリペプチドを含む細胞の培養物の乾燥、凍結乾燥、ホモジナイゼーション、抽出、濾過、遠心分離、沈降、または濃縮等の通常の手段によって調製してもよい。少なくとも１つのそのような殺有害生物ポリペプチドを含有するそのような全ての組成物において、ポリペプチドは、約１重量％〜約９９重量％の濃度で存在してもよい。
【０２６２】
鱗翅目、双翅目、半翅目、異翅目（Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａｎ）、線虫、または甲虫目は、本開示の方法によって所定の領域において死滅し得るかもしくは数が低減され得るか、または感受性がある有害生物による蔓延を防止するために環境地域に予防的に適用され得る。好ましくは、害虫は本開示の殺虫タンパク質の殺有害生物的に有効な量を摂取するか、またはそれらに接触する。「殺有害生物的に有効な量」は、少なくとも１匹の有害生物に死をもたらすことができる、または有害生物の成長、摂食、もしくは通常の生理的発達を顕著に低減することができる殺有害生物剤の量を指す。この量は、例えば防除すべき特定の標的有害生物、特定の環境、場所、植物、処理される作物または農業用場所、環境条件、ならびに殺有害生物的に有効なタンパク質組成物の適用の方法、速度、濃度、安定性、および量等の要因に応じて変化する。製剤はまた、気候条件、環境の検討事項、および／または適用頻度および／または有害生物蔓延の重症度に応じても変化し得る。
【０２６３】
本明細書に記載の殺虫組成物は、所望の農学的に許容可能な担体と共に細菌細胞、結晶、および／または胞子懸濁物、または単離されたタンパク質構成成分のいずれかを製剤化することによって作製され得る。
【０２６４】
組成物は、凍結乾燥、フリーズドライ、乾燥、または水性担体、培地、もしくは適した希釈剤、例えば食塩水、または他の緩衝液中等の適切な手段によって投与前に製剤化され得る。製剤化された組成物は、ダストまたは顆粒材料、または油中懸濁物（植物油または鉱油）または水もしくは油／水乳剤、または水和剤、または農学適用にとって適した他の任意の担体材料と組み合わせた形態であり得る。適した農学的担体は、固体または液体であり得、当技術分野で周知である。用語「農学的に許容可能な担体」は、殺有害生物剤製剤技術において通常使用される全てのアジュバント、不活性構成成分、分散剤、界面活性剤、粘着剤、粘着付与剤、結合剤等を含む。これらは殺有害生物剤製剤の当業者に周知である。製剤を、１つまたは複数の固体または液体アジュバントと混合してもよく、様々な手段、例えば通常の製剤技術を使用して、殺有害生物組成物を適したアジュバントと共に均一に混合、ブレンド、および／または粉砕することによって調製してもよい。適した製剤および適用方法は、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，４６８，５２３号に記載されている。植物はまた、１つまたは複数の除草剤、殺虫剤、または殺真菌剤を含む１つまたは複数の化学組成物によって処理することができる。
【０２６５】
例示的な化学組成物には：果実／野菜用除草剤：アトラジン、ブロマシル、ジウロン、グリホサート、リヌロン、メトリブジン、シマジン、トリフルラリン、フルアジホップ、グルホシネート、ハロスルホンＧｏｗａｎ、パラコート、プロピザミド、セトキシジム、ブタフェナシル、ハロスルフロン、インダジフラム；果実／野菜用殺虫剤：アルジカルブ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、カルバリル、カルボフラン、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、ジアジノン、マラチオン、アバメクチン、シフルトリン／ベータシフルトリン、エスフェンバレレート、ラムダ−シハロトリン、アセキノシル、ビフェナザート、メトキシフェノジド、ノバルロン、クロマフェノジド、チアクロプリド、ジノテフラン、フルアクリピリム、トルフェンピラド、クロチアニジン、スピロジクロフェン、ガンマ−シハロトリン、スピロメシフェン、スピノサド、リナキシピル、サイアジピル、スピネトラム、トリフルムロン、スピロテトラマト、イミダクロプリド、フルベンジアミド、チオジカルブ、メタフルミゾン、スルホキサフロル、シフルメトフェン、シアノピラフェン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、スピネトラム、チオジカルブ、フロニカミド、メチオカルブ、エマメクチン安息香酸塩、インドキサカルブ、ホスチアゼート（Ｆｏｒｔｈｉａｚａｔｅ）、フェナミホス、カズサホス、ピリプロキシフェン、酸化フェンブタスズ、ヘキシチアゾクス、メトミル、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン；果実野菜用殺真菌剤：カルベンダジム、クロロタロニル、ＥＢＤＣ、硫黄、チオファネート−メチル、アゾキシストロビン、シモキサニル、フルアジナム、フォセチル、イプロジオン、クレソキシム−メチル、メタラキシル／メフェノキサム、トリフロキシストロビン、エタボキサム、イプロバリカルブ、トリフロキシストロビン、フェンヘキサミド、オキスポコナゾールフマル酸塩、シアゾファミド、フェナミドン、ゾキサミド、ピコキシストロビン、ピラクロストロビン、シフルフェナミド、ボスカリド；穀物用除草剤：イソプロツロン、ブロモキシニル、ロキシニル、フェノキシ樹脂、クロルスルフロン、クロジナホップ、ジクロホップ、ジフルフェニカン、フェノキサプロプ、フロラスラム、フルオキシピル、メトスルフロン、トリアスルフロン、フルカルバゾン、ロドスルフロン、プロポキシカルバゾン、ピコリナフェン、メソスルフロン、ベフルブタミド、ピノキサデン、アミドスルフロン、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロン、フルピルスルフロン、スルホスルフロン、ピラスルホトル、ピロクススラム、フルフェナセト、トラルコキシジム、ピロキサスルホン；穀物用殺真菌剤：カルベンダジム、クロロタロニル、アゾキシストロビン、シプロコナゾール、シプロジニル、フェンプロピモルフ、エポキシコナゾール、クレソキシム−メチル、キノキシフェン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン、シメコナゾール、ピコキシストロビン、ピラクロストロビン、ジモキシストロビン、プロチオコナゾール、フルオキサストロビン；穀物用殺虫剤：ジメトエート、ラムダ−シ���ロトリン、デルタメトリン、アルファ−シペルメトリン、β−シフルトリン、ビフェントリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、クロルフィリホス、メタミドホス、オキシデメトンメチル、ピリミカルブ、メチオカルブ；トウモロコシ用除草剤：アトラジン、アラクロル、ブロモキシニル、アセトクロル、ジカンバ、クロピラリド、Ｓ−ジメテナミド、グルホシネート、グリホサート、イソキサフルトール、Ｓ−メトラクロール、メソトリオン、ニコスルフロン、プリミスルフロン、リムスルフロン、スルコトリオン、フォラムスルフロン、トプラメゾン、テムボトリオン、サフルフェナシル、チエンカルバゾン、フルフェナセト、ピロキサスルホン；トウモロコシ用殺虫剤：カルボフラン、クロルピリホス、ビフェントリン、フィプロニル、イミダクロプリド、ラムダ−シハロトリン、テフルトリン、テルブホス、チアメトキサム、クロチアニジン、スピロメシフェン、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、デルタメトリン、チオジカルブ、β−シフルトリン、シペルメトリン、ビフェントリン、ルフェヌロン、トリフルモロン（Ｔｒｉｆｌｕｍｏｒｏｎ）、テフルトリン、テブピリムホス、エチプロール、サイアジピル、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、アベルメクチン、メチオカルブ、スピロジクロフェン、スピロテトラマト；トウモロコシ用殺真菌剤：フェニトロパン、チラム、プロチオコナゾール、テブコナゾール、トリフロキシストロビン；コメ用除草剤：ブタクロル、プロパニル、アジムスルフロン、ベンスルフロン、シハロホップ、ダイムロン、フェントラザミド、イマゾスルフロン、メフェナセト、オキサジクロメホン、ピラゾスルフロン、ピリブチカルブ、キンクロラック、チオベンカルブ、インダノファン、フルフェナセト、フェントラザミド、ハロスルフロン、オキサジクロメホン、ベンゾビシクロン、ピリフタリド、ペノクスラム、ビスピリバック、オキサジアルギル、エトキシスルフロン、プレチラクロル、メソトリオン、テフリルトリオン、オキサジアゾン、フェノキサプロプ、ピリミスルファン；コメ用殺虫剤：ジアジノン、フェニトロチオン、フェノブカルブ、モノクロトホス、ベンフラカルブ、ブプロフェジン、ジノテフラン、フィプロニル、イミダクロプリド、イソプロカルブ、チアクロプリド、クロマフェノジド、チアクロプリド、ジノテフラン、クロチアニジン、エチプロール、フルベンジアミド、リナキシピル、デルタメトリン、アセタミプリド、チアメトキサム、サイアジピル、スピノサド、スピネトラム、エマメクチン安息香酸塩、シペルメトリン、クロルピリホス、カルタップ、メタミドホス、エトフェンプロックス、トリアゾホス、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、カルボフラン、ベンフラカルブ；コメ用殺真菌剤：チオファネート−メチル、アゾキシストロビン、カルプロパミド、エジフェンホス、フェリムゾン、イプロベンホス、イソプロチオラン、ペンシクロン、プロベナゾール、ピロキロン、トリシクラゾール、トリフロキシストロビン、ジクロシメット、フェノキサニル、シメコナゾール、チアジニル；ワタ用除草剤：ジウロン、フルオメツロン、ＭＳＭＡ、オキシフルオルフェン、プロメトリン、トリフルラリン、カルフェントラゾン、クレトジム、フルアジホップ−ブチル、グリホサート、ノルフルラゾン、ペンジメタリン、ピリチオバック−ナトリウム、トリフロキシスルフロン、テプラロキシジム、グルホシネート、フルミオキサジン、チジアズロン；ワタ用殺虫剤：アセフェート、アルジカルブ、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、マラチオン、モノクロトホス、アバメクチン、アセタミプリド、エマメクチン安息香酸塩、イミダクロプリド、インドキサカルブ、ラムダ−シハロトリン、スピノサド、チオジカルブ、ガンマ−シハロトリン、スピロメシフェン、ピリダリル、フロニカミド、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、ベータ−シフルトリン、スピロテトラマト、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、シアジピル、スピノサド、スピネトラム、ガンマシハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、チオジカルブ、アベルメクチン、フロニカミド、ピリダリル、スピロメシフェン、スルホキサフロル、プロフェノホス、トリアゾホス、エンドスルファン；ワタ用殺真菌剤：エトリジアゾール、メタラキシル、キントゼン；ダイズ用除草剤：アラクロル、ベンタゾン、トリフルラリン、クロリムロン−エチル、クロランスラム−メチル、フェノキサプロプ、ホメサフェン、フルアジホップ、グリホサート、イマザモックス、イマザキン、イマゼタピル、（Ｓ−）メトラクロル、メトリブジン、ペンジメタリン、テプラロキシジム、グルホシネート；ダイズ用殺虫剤：ラムダ−シハロトリン、メトミル、パラチオン、チオカルブ、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、リナキシピル、サイアジピル、スピノサド、スピネトラム、エマメクチン−安息香酸塩、フィプロニル、エチプロール、デルタメトリン、β−シフルトリン、ガンマおよびラムダシハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、スピロテトラマト、スピノジクロフェン、トリフルムロン、フロニカミド、チオジカルブ、ベータ−シフルトリン；ダイズ用殺真菌剤：アゾキシストロビン、シプロコナゾール、エポキシコナゾール、フルトリアホル、ピラクロストロビン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン、プロチオコナゾール、テトラコナゾール；テンサイ用除草剤：クロリダゾン、デスメジファム、エトフメセート、フェンメディファム、トリアレート、クロピラリド、フルアジホップ、レナシル、メタミトロン、キンメラック、シクロキシジム、トリフルスルフロン、テプラロキシジム、キザロホップ；テンサイ用殺虫剤：イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、デルタメトリン、β−シフルトリン、ガンマ／ラムダシハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，��−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、テフルトリン、リナキシピル、サイアジピル（Ｃｙａｘｙｐｙｒ）、フィプロニル、カルボフラン；キャノーラ用除草剤：クロピラリド、ジクロホップ、フルアジホップ、グルホシネート、グリホサート、メタザクロル、トリフルラリン、エタメトスルフロン、キンメラック、キザロホップ、クレトジム、テプラロキシジム；キャノーラ用殺真菌剤：アゾキシストロビン、カルベンダジム、フルジオキソニル、イプロジオン、プロクロラズ、ビンクロゾリン；キャノーラ用殺虫剤：カルボフラン有機リン酸塩、ピレスロイド、チアクロプリド、デルタメトリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ジネトフラン、β−シフルトリン、ガンマおよびラムダシハロトリン、タウ−フルバレリエート、エチプロール、スピノサド、スピネトラム、フルベンジアミド、リナキシピル、サイアジピル、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オンが挙げられる。
【０２６６】
有害生物
「有害生物」は、昆虫、真菌、細菌、線虫、ダニ、マダニ等を含むがこれらに限定されない。害虫は、甲虫目、双翅目、膜翅目、鱗翅目、食毛目、同翅目、半翅目  直翅目（Ｏｒｔｈｒｏｐｔｅｒａ）、総翅目、革翅目、等翅目、シラミ目、ノミ目、毛翅目等、特に鱗翅目および甲虫目から選択される昆虫を含む。
【０２６７】
当業者は、全ての化合物が、全ての有害生物に対して必ずしも等しく有効ではないことを認識するであろう。本実施形態の化合物は、経済的に重要な農業用、林業用、温室用、観賞用花苗、食品および繊維、公衆衛生および動物衛生、家庭内および商業用構造、家庭用および貯蔵製品有害生物を含み得る害虫に対して活性を示す。
【０２６８】
鱗翅目の幼虫は、ヤガ科のアーミーワーム、ネキリムシ、ルーパー、およびタバコガ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｊ  Ｅ  Ｓｍｉｔｈ（ツマジロクサヨトウ）；Ｓ．ｅｘｉｇｕａ  Ｈｕｂｎｅｒ（シロイチモジヨトウ）；Ｓ．ｌｉｔｕｒａ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（ハスモンヨトウ、ハスモンヨトウ）；Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ  Ｗａｌｋｅｒ（バーサアーミーワーム（ｂｅｒｔｈａ  ａｒｍｙｗｏｒｍ））；Ｍ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ヨトウガ）；Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ  Ｈｕｆｎａｇｅｌ（タマナヤガ）；Ａ．ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（ウエスタンカットワーム（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｃｕｔｗｏｒｍ））；Ａ．ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（グラヌレートカットワーム（ｇｒａｎｕｌａｔｅ  ｃｕｔｗｏｒｍ））；Ａｌａｂａｍａ  ａｒｇｉｌｌａｃｅａ  Ｈｕｂｎｅｒ（コットンリーフワーム）；Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ  Ｈｕｂｎｅｒ（イラクサキンウワバ）；Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ  Ｗａｌｋｅｒ（ダイズシャクトリムシ）；Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ  Ｈｕｂｎｅｒ（ベルベットビーンキャタピラー（ｖｅｌｖｅｔ  ｂｅａｎ  ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））；Ｈｙｐｅｎａ  ｓｃａｂｒａ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（グリーンクローバーワーム）；Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（オオタバコガ）；Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ  Ｈａｗｏｒｔｈ（アーミーワーム）；Ａｔｈｅｔｉｓ  ｍｉｎｄａｒａ  ＢａｒｎｅｓおよびＭｃｄｕｎｎｏｕｇｈ（ラフスキンドカットワーム（ｒｏｕｇｈ  ｓｋｉｎｎｅｄ  ｃｕｔｗｏｒｍ））；Ｅｕｘｏａ  ｍｅｓｓｏｒｉａ  Ｈａｒｒｉｓ（ダークサイデッドカットワーム（ｄａｒｋｓｉｄｅｄ  ｃｕｔｗｏｒｍ））；Ｅａｒｉａｓ  ｉｎｓｕｌａｎａ  Ｂｏｉｓｄｕｖａｌ（ミスジアオリンガ）；Ｅ．ｖｉｔｔｅｌｌａ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（クサオビリンガ）；Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ  Ｈｕｂｎｅｒ（アメリカボールワーム（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｂｏｌｌｗｏｒｍ））；Ｈ．ｚｅａ  Ｂｏｄｄｉｅ（オオタバコガまたはコットンボールワーム（ｃｏｔｔｏｎ  ｂｏｌｌｗｏｒｍ））；Ｍｅｌａｎｃｈｒａ  ｐｉｃｔａ  Ｈａｒｒｉｓ（ゼブラキャタピラー（ｚｅｂｒａ  ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））；Ｅｇｉｒａ（Ｘｙｌｏｍｙｇｅｓ）ｃｕｒｉａｌｉｓ  Ｇｒｏｔｅ（シトラスカットワーム）；メイガ科のボーラー（ｂｏｒｅｒ）、ツツミノガ、ウェブワーム、コーンワーム、およびスケリトナイザー、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ  Ｈｕｂｎｅｒ（ヨーロッパアワノメイガ）；Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ  Ｗａｌｋｅｒ（ネーブルオレンジワーム）；Ａｎａｇａｓｔａ  ｋｕｅｈｎｉｅｌｌａ  Ｚｅｌｌｅｒ（スジコナマダラメイガ）；Ｃａｄｒａ  ｃａｕｔｅｌｌａ  Ｗａｌｋｅｒ（コナマダラメイガ）；Ｃｈｉｌｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ  Ｗａｌｋｅｒ（ニカメイガ）；Ｃ．ｐａｒｔｅｌｌｕｓ（ソルガムボーラー）；Ｃｏｒｃｙｒａ  ｃｅｐｈａｌｏｎｉｃａ  Ｓｔａｉｎｔｏｎ（ガイマイツヅリガ）；Ｃｒａｍｂｕｓ  ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕ���  Ｃｌｅｍｅｎｓ（ハムシモドキ）；Ｃ．ｔｅｔｅｒｒｅｌｌｕｓ  Ｚｉｎｃｋｅｎ（シバツトガ）；Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ  ｍｅｄｉｎａｌｉｓ  Ｇｕｅｎｅｅ（コブノメイガ）；Ｄｅｓｍｉａ  ｆｕｎｅｒａｌｉｓ  Ｈｕｂｎｅｒ（グレープリーフフォルダー）；Ｄｉａｐｈａｎｉａ  ｈｙａｌｉｎａｔａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（メロンワーム）；Ｄ．ｎｉｔｉｄａｌｉｓ  Ｓｔｏｌｌ（ピクルスワーム）；Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ  Ｄｙａｒ（サウスウエスタンコーンボーラー）、Ｄ．ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（シュガーケーンボーラー）；Ｅｏｒｅｕｍａ  ｌｏｆｔｉｎｉ  Ｄｙａｒ（メキシカンライスボーラー）；Ｅｐｈｅｓｔｉａ  ｅｌｕｔｅｌｌａ  Ｈｕｂｎｅｒ（タバコ（カカオ）モス）；Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（オオハチミツガ）；Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ  ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ  Ｗａｌｋｅｒ（ソッドウェブワーム（ｓｏｄ  ｗｅｂｗｏｒｍ））；Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ  ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ  Ｈｕｌｓｔ（サンフラワーモス（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｔｈ））；Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ  Ｚｅｌｌｅｒ（モロコシマダラメイガ）；Ａｃｈｒｏｉａ  ｇｒｉｓｅｌｌａ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（コハチノスツヅリガ）；Ｌｏｘｏｓｔｅｇｅ  ｓｔｉｃｔｉｃａｌｉｓ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ヘリキスジノメイガ）；Ｏｒｔｈａｇａ  ｔｈｙｒｉｓａｌｉｓ  Ｗａｌｋｅｒ（ティーツリーウェブモス（ｔｅａ  ｔｒｅｅ  ｗｅｂ  ｍｏｔｈ））；Ｍａｒｕｃａ  ｔｅｓｔｕｌａｌｉｓ  Ｇｅｙｅｒ（マメノメイガ）；Ｐｌｏｄｉａ  ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ  Ｈｕｂｎｅｒ（ノシメマダラメイガ）；Ｓｃｉｒｐｏｐｈａｇａ  ｉｎｃｅｒｔｕｌａｓ  Ｗａｌｋｅｒ（イッテンオオメイガ）；Ｕｄｅａ  ｒｕｂｉｇａｌｉｓ  Ｇｕｅｎｅｅ（セロリリーフティアー（ｃｅｌｅｒｙ  ｌｅａｆｔｉｅｒ））；ならびにハマキガ科のハマキムシ、芽を食害する虫、種子を食害する虫、および果実を食害する虫、Ａｃｌｅｒｉｓ  ｇｌｏｖｅｒａｎａ  Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ（ウエスタンブラックヘデッドバッドワーム（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌａｃｋｈｅａｄｅｄ  ｂｕｄｗｏｒｍ））；Ａ．ｖａｒｉａｎａ  Ｆｅｒｎａｌｄ（イースタンブラックヘデッドバッドワーム（Ｅａｓｔｅｒｎ  ｂｌａｃｋｈｅａｄｅｄ  ｂｕｄｗｏｒｍ））；Ａｒｃｈｉｐｓ  ａｒｇｙｒｏｓｐｉｌａ  Ｗａｌｋｅｒ（果樹ハマキムシ）；Ａ．ｒｏｓａｎａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ヨーロッパハマキガ）；ならびに他のＡｒｃｈｉｐｓ種、Ａｄｏｘｏｐｈｙｅｓ  ｏｒａｎａ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｖｏｎ  Ｒｏｓｓｌｅｒｓｔａｍｍ（リンゴコカクモンハマキガ）；Ｃｏｃｈｙｌｉｓ  ｈｏｓｐｅｓ  Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ（バンデッドサンフラワーモス（ｂａｎｄｅｄ  ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｔｈ））；Ｃｙｄｉａ  ｌａｔｉｆｅｒｒｅａｎａ  Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ（フィルバートワーム（ｆｉｌｂｅｒｔｗｏｒｍ））；Ｃ．ｐｏｍｏｎｅｌｌａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（コドリンガ）；Ｐｌａｔｙｎｏｔａ  ｆｌａｖｅｄａｎａ  Ｃｌｅｍｅｎｓ（バリエイテッドリーフローラー（ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ  ｌｅａｆｒｏｌｌｅｒ））；Ｐ．ｓｔｕｌｔａｎａ  Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ（雑食性リーフローラー（ｏｍｎｉｖｏｒｏｕｓ  ｌｅａｆｒｏｌｌｅｒ））；Ｌｏｂｅｓｉａ  ｂｏｔｒａｎａ  Ｄｅｎｉｓ  ＆  Ｓｃｈｉｆｆｅｒｍｕｌｌｅｒ（ホソバヒメハマキ）；Ｓｐｉｌｏｎｏｔａ  ｏｃｅｌｌａｎａ  Ｄｅｎｉｓ  ＆  Ｓｃｈｉｆｆｅｒｍｕｌｌｅｒ（リンゴシロヒメハマキ）；Ｅｎｄｏｐｉｚａ  ｖｉｔｅａｎａ  Ｃｌｅｍｅｎｓ（グレープベリーモス（ｇｒａｐｅ  ｂｅｒｒｙ  ｍｏｔｈ））；Ｅｕｐｏｅｃｉｌｉａ  ａｍｂｉｇｕｅｌｌａ  Ｈｕｂｎｅｒ（ブドウホソハマキ）；Ｂｏｎａｇｏｔａ  ｓａｌｕｂｒｉｃｏｌａ  Ｍｅｙｒｉｃｋ（ブラジリアンアップルリーフローラー（Ｂｒａｚｉｌｉａｎ  ａｐｐｌｅ  ｌｅａｆｒｏｌｌｅｒ））；Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ  ｍｏｌｅｓｔａ  Ｂｕｓｃｋ（ナシヒメシンクイ）；Ｓｕｌｅｉｍａ  ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ  Ｒｉｌｅｙ（ヒマワリハマキガ）；Ａｒｇｙｒｏｔａｅｎｉａ  ｓｐｐ．；Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｓｐｐ．を含むがこれらに限定されない。
【０２６９】
鱗翅目の選択される他の農業有害生物は、Ａｌｓｏｐｈｉｌａ  ｐｏｍｅｔａｒｉａ  Ｈａｒｒｉｓ（フォールカンカーワーム（ｆａｌｌ  ｃａｎｋｅｒｗｏｒｍ））；Ａｎａｒｓｉａ  ｌｉｎｅａｔｅｌｌａ  Ｚｅｌｌｅｒ（モモキバガ）；Ａｎｉｓｏｔａ  ｓｅｎａｔｏｒｉａ  Ｊ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ（オレンジストライプドオークワーム（ｏｒａｎｇｅ  ｓｔｒｉｐｅｄ  ｏａｋｗｏｒｍ））；Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ  Ｇｕｅｒｉｎ−Ｍｅｎｅｖｉｌｌｅ（チャイニーズオークタッサーモス（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｏａｋ  Ｔｕｓｓａｈ  Ｍｏｔｈ））；Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（カイコ）；Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ  ｔｈｕｒｂｅｒｉｅｌｌａ  Ｂｕｓｃｋ（コットンリーフパーフォレーター（ｃｏｔｔｏｎ  ｌｅａｆ  ｐｅｒｆｏｒａｔｏｒ））；Ｃｏｌｉａｓ  ｅｕｒｙｔｈｅｍｅ  Ｂｏｉｓｄｕｖａｌ（アルファルファキャタピラー（ａｌｆａｌｆａ  ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））；Ｄａｔａｎａ  ｉｎｔｅｇｅｒｒｉｍａ  Ｇｒｏｔｅ  ＆  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（ウォルナッツキャタピラー（ｗａｌｎｕｔ  ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））；Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｓ  Ｔｓｃｈｅｔｗｅｒｉｋｏｖ（シベリアシルクモス（Ｓｉｂｅｒｉａｎ  ｓｉｌｋ  ｍｏｔｈ））、Ｅｎｎｏｍｏｓ  ｓｕｂｓｉｇｎａｒｉａ  Ｈｕｂｎｅｒ（エルムスパンワーム（ｅｌｍ  ｓｐａｎｗｏｒｍ））；Ｅｒａｎｎｉｓ  ｔｉｌｉａｒｉａ  Ｈａｒｒｉｓ（リンデンルーパー（ｌｉｎｄｅｎ  ｌｏｏｐｅｒ））；Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ  ｃｈｒｙｓｏｒｒｈｏｅａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ブラウンテールモス（ｂｒｏｗｎｔａｉｌ  ｍｏｔｈ））；Ｈａｒｒｉｓｉｎａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ  Ｇｕｅｒｉｎ−Ｍｅｎｅｖｉｌｌｅ（グレープリーフスケルトナイザー（ｇｒａｐｅｌｅａｆ  ｓｋｅｌｅｔｏｎｉｚｅｒ））；Ｈｅｍｉｌｅｕｃａ  ｏｌｉｖｉａｅ  Ｃｏｃｋｒｅｌｌ（レンジキャタピラー（ｒａｎｇｅ  ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））；Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ  ｃｕｎｅａ  Ｄｒｕｒｙ（アメリカシロヒトリ）；Ｋｅｉｆｅｒｉａ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｅｌｌａ  Ｗａｌｓｉｎｇｈａｍ（トマトピンワーム（ｔｏｍａｔｏ  ｐｉｎｗｏｒｍ））；Ｌａｍｂｄｉｎａ  ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ  ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ  Ｈｕｌｓｔ（イースタンヘムロックルーパー（Ｅａｓｔｅｒｎ  ｈｅｍｌｏｃｋ  ｌｏｏｐｅｒ））；Ｌ．ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ  ｌｕｇｕｂｒｏｓａ  Ｈｕｌｓｔ（ウエスタンヘムロックルーパー（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｈｅｍｌｏｃｋ  ｌｏｏｐｅｒ））；Ｌｅｕｃｏｍａ  ｓａｌｉｃｉｓ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ヤナギドクガ）；Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（マイマイガ）；Ｍａｎｄｕｃａ  ｑｕｉｎｑｕｅｍａｃｕｌａｔａ  Ｈａｗｏｒｔｈ（ファイブスポテッドホークモス（ｆｉｖｅ  ｓｐｏｔｔｅｄ  ｈａｗｋ  ｍｏｔｈ）、トマトスズメガ）；Ｍ．ｓｅｘｔａ  Ｈａｗｏｒｔｈ（トマトスズメガ、タバコスズメガ）；Ｏｐｅｒｏｐｈｔｅｒａ  ｂｒｕｍａｔａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ナミスジフユナミシャク）；Ｐａｌｅａｃｒｉｔａ  ｖｅｒｎａｔａ  Ｐｅｃｋ（スプリングカンカーワーム）；Ｐａｐｉｌｉｏ  ｃｒｅｓｐｈｏｎｔｅｓ  Ｃｒａｍｅｒ（オオタスキアゲハ）；Ｐｈ��ｙｇａｎｉｄｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  Ｐａｃｋａｒｄ（カリフォルニアオークワーム（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ｏａｋｗｏｒｍ））；Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ  ｃｉｔｒｅｌｌａ  Ｓｔａｉｎｔｏｎ（ミカンコハモグリガ）；Ｐｈｙｌｌｏｎｏｒｙｃｔｅｒ  ｂｌａｎｃａｒｄｅｌｌａ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（スポテッドテンチフォームリーフマイナー（ｓｐｏｔｔｅｄ  ｔｅｎｔｉｆｏｒｍ  ｌｅａｆｍｉｎｅｒ））；Ｐｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（オオモンシロチョウ）；Ｐ．ｒａｐａｅ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（モンシロチョウ）；Ｐ．ｎａｐｉ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（エゾスジグロシロチョウ）；Ｐｌａｔｙｐｔｉｌｉａ  ｃａｒｄｕｉｄａｃｔｙｌａ  Ｒｉｌｅｙ（アーティチョークプルームモス（ａｒｔｉｃｈｏｋｅ  ｐｌｕｍｅ  ｍｏｔｈ））；Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（コナガ）；Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ（ワタアカミムシ）；Ｐｏｎｔｉａ  ｐｒｏｔｏｄｉｃｅ  ＢｏｉｓｄｕｖａｌおよびＬｅｃｏｎｔｅ（サザンキャベッジワーム（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｃａｂｂａｇｅｗｏｒｍ））；Ｓａｂｕｌｏｄｅｓ  ａｅｇｒｏｔａｔａ  Ｇｕｅｎｅｅ（雑食性ルーパー（ｏｎｍｉｖｏｒｏｕｓ  ｌｏｏｐｅｒ））；Ｓｃｈｉｚｕｒａ  ｃｏｎｃｉｎｎａ  Ｊ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ（レッドハンプドキャタピラー（ｒｅｄ  ｈｕｍｐｅｄ  ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））；Ｓｉｔｏｔｒｏｇａ  ｃｅｒｅａｌｅｌｌａ  Ｏｌｉｖｉｅｒ（バクガ）；Ｔｈａｕｍｅｔｏｐｏｅａ  ｐｉｔｙｏｃａｍｐａ  Ｓｃｈｉｆｆｅｒｍｕｌｌｅｒ（マツノギョウレツケムシガ）；Ｔｉｎｅｏｌａ  ｂｉｓｓｅｌｌｉｅｌｌａ  Ｈｕｍｍｅｌ（コイガ）；Ｔｕｔａ  ａｂｓｏｌｕｔａ  Ｍｅｙｒｉｃｋ（トマトキバガ）；Ｙｐｏｎｏｍｅｕｔａ  ｐａｄｅｌｌａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（エルミンモス（ｅｒｍｉｎｅ  ｍｏｔｈ））；Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｓｕｂｆｌｅｘａ  Ｇｕｅｎｅｅ；Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．およびＯｒｇｙｉａ  ｓｐｐ．を含むがこれらに限定されない。
【０２７０】
重要であるのは、甲虫目の幼虫および成虫であり、これらは、ヒゲナガゾウムシ科、マメゾウムシ科、およびゾウムシ科のゾウムシ（Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ  Ｂｏｈｅｍａｎ（ワタミゾウムシ）；Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ  ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ  Ｋｕｓｃｈｅｌ（イネミズゾウムシ）；Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｇｒａｎａｒｉｕｓ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（オサゾウムシ）；Ｓ．ｏｒｙｚａｅ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ココクゾウムシ）；Ｈｙｐｅｒａ  ｐｕｎｃｔａｔａ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（オオタコゾウムシ）；Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃｏｐｔｕｒｕｓ  ａｄｓｐｅｒｓｕｓ  ＬｅＣｏｎｔｅ（ヒマワリ茎ゾウムシ（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ  ｓｔｅｍ  ｗｅｅｖｉｌ））；Ｓｍｉｃｒｏｎｙｘ  ｆｕｌｖｕｓ  ＬｅＣｏｎｔｅ（レッドサンフラワーシードウィービル（ｒｅｄ  ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ  ｓｅｅｄ  ｗｅｅｖｉｌ））；Ｓ．ｓｏｒｄｉｄｕｓ  ＬｅＣｏｎｔｅ（グレーサンフラワーシードウィービル（ｇｒａｙ  ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ  ｓｅｅｄ  ｗｅｅｖｉｌ））；Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ  ｍａｉｄｉｓ  Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎ（メイズビルバグ（ｍａｉｚｅ  ｂｉｌｌｂｕｇ））を含むがこれらに限定されない）；ハムシ科のノミハムシ、ウリハムシ、ルートワーム、ハムシ、ジャガイモハムシ（ｐｏｔａｔｏ  ｂｅｅｔｌｅ）、およびハモグリガ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ  Ｓａｙ（コロラドハムシ）；Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ＬｅＣｏｎｔｅ（ウエスタンコーンルートワーム）；Ｄ．ｂａｒｂｅｒｉ  ＳｍｉｔｈおよびＬａｗｒｅｎｃｅ（ノザンコーンルートワーム（ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｃｏｒｎ  ｒｏｏｔｗｏｒｍ））；Ｄ．ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉ  Ｂａｒｂｅｒ（ジュウイチホシウリハムシ）；Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ  ｐｕｌｉｃａｒｉａ  Ｍｅｌｓｈｅｉｍｅｒ（コーンフリービートル（ｃｏｒｎ  ｆｌｅａ  ｂｅｅｔｌｅ））；Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ  ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ  Ｇｏｅｚｅ（コーンフリービートル）；Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ  ｓｔｒｉｏｌａｔａ（キスジノミハムシ）；Ｃｏｌａｓｐｉｓ  ｂｒｕｎｎｅａ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（グレープコラスピス（ｇｒａｐｅ  ｃｏｌａｓｐｉｓ））；Ｏｕｌｅｍａ  ｍｅｌａｎｏｐｕｓ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（クビアカホソハムシ）；Ｚｙｇｏｇｒａｍｍａ  ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎｉｓ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（サンフラワービートル（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ  ｂｅｅｔｌｅ））を含むがこれらに限定されない）；テントウムシ科の甲虫（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ  ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ  Ｍｕｌｓａｎｔ（インゲンテントウ）を含むがこれらに限定されない）；コガネムシ科のコガネムシおよび他の甲虫（Ｐｏｐｉｌｌｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｎｅｗｍａｎ（マメコガネ）；Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ  ｂｏｒｅａｌｉｓ  Ａｒｒｏｗ（ノザンマスクドシェイファー（ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｍａｓｋｅｄ  ｃｈａｆｅｒ）、地虫）；Ｃ．ｉｍｍａｃｕｌａｔａ  Ｏｌｉｖｉｅｒ（サザンマスクドシェイファー（ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｍａｓｋｅｄ  ｃｈａｆｅｒ）、地虫）；Ｒｈｉｚｏｔｒｏｇｕｓ  ｍａｊａｌｉｓ  Ｒａｚｏｕｍｏｗｓｋｙ（ヨーロピアンコガネムシ）；���ｈｙｌｌｏｐｈａｇａ  ｃｒｉｎｉｔａ  Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ（地虫）；Ｌｉｇｙｒｕｓ  ｇｉｂｂｏｓｕｓ  Ｄｅ  Ｇｅｅｒ（キャロットビートル（ｃａｒｒｏｔ  ｂｅｅｔｌｅ））を含むがこれらに限定されない）；カツオブシムシ科のカツオブシムシ；コメツキムシ科、Ｅｌｅｏｄｅｓ  ｓｐｐ．、Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ  ｓｐｐ．；Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ  ｓｐｐ．のハリガネムシ；Ｌｉｍｏｎｉｕｓ  ｓｐｐ．；Ａｇｒｉｏｔｅｓ  ｓｐｐ．；Ｃｔｅｎｉｃｅｒａ  ｓｐｐ．；Ａｅｏｌｕｓ  ｓｐｐ．；キクイムシ科のキクイムシおよびゴミムシダマシ科の甲虫を含む。
【０２７１】
双翅目の成虫および幼虫は重要であり、これらは、潜葉性昆虫、Ａｇｒｏｍｙｚａ  ｐａｒｖｉｃｏｒｎｉｓ  Ｌｏｅｗ（コーンブロッチリーフマイナー（ｃｏｒｎ  ｂｌｏｔｃｈ  ｌｅａｆｍｉｎｅｒ））；ミジ（Ｃｏｎｔａｒｉｎｉａ  ｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ  Ｃｏｑｕｉｌｌｅｔｔ（ソルガムミジ（ｓｏｒｇｈｕｍ  ｍｉｄｇｅ））；Ｍａｙｅｔｉｏｌａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ  Ｓａｙ（ヘシアンバエ）；Ｓｉｔｏｄｉｐｌｏｓｉｓ  ｍｏｓｅｌｌａｎａ  Ｇｅｈｉｎ（ムギアカタマバエ）；Ｎｅｏｌａｓｉｏｐｔｅｒａ  ｍｕｒｔｆｅｌｄｔｉａｎａ  Ｆｅｌｔ（サンフラワーシードミジ（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ  ｓｅｅｄ  ｍｉｄｇｅ））を含むがこれらに限定されない）；ミバエ（Ｔｅｐｈｒｉｔｉｄａｅ）、Ｏｓｃｉｎｅｌｌａ  ｆｒｉｔ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ミバエ）；ウジ（Ｄｅｌｉａ  ｐｌａｔｕｒａ  Ｍｅｉｇｅｎ（タネバエ）；Ｄ．ｃｏａｒｃｔａｔａ  Ｆａｌｌｅｎ（ウィートバルブフライ（ｗｈｅａｔ  ｂｕｌｂ  ｆｌｙ））および他のＤｅｌｉａ  ｓｐｐ．、Ｍｅｒｏｍｙｚａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ  Ｆｉｔｃｈ（ムギキモグリバエ）；Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（イエバエ）；Ｆａｎｎｉａ  ｃａｎｉｃｕｌａｒｉｓ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ、Ｆ．ｆｅｍｏｒａｌｉｓ  Ｓｔｅｉｎ（ヒメイエバエ）；Ｓｔｏｍｏｘｙｓ  ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（サシバエ）を含むがこれらに限定されない）；イエバエ（ｆａｃｅ  ｆｌｙ）、ノサシバエ、クロバエ、Ｃｈｒｙｓｏｍｙａ  ｓｐｐ．；Ｐｈｏｒｍｉａ  ｓｐｐ．および他のキンバエ有害生物、ウシアブＴａｂａｎｕｓ  ｓｐｐ．；ヒツジバエＧａｓｔｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．；Ｏｅｓｔｒｕｓ  ｓｐｐ．；ウシバエＨｙｐｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．；シカバエＣｈｒｙｓｏｐｓ  ｓｐｐ．；Ｍｅｌｏｐｈａｇｕｓ  ｏｖｉｎｕｓ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ヒツジシラミバエ）および他のＢｒａｃｈｙｃｅｒａ、蚊Ａｅｄｅｓ  ｓｐｐ．；Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｐｐ．；Ｃｕｌｅｘ  ｓｐｐ．；クロバエＰｒｏｓｉｍｕｌｉｕｍ  ｓｐｐ．；Ｓｉｍｕｌｉｕｍ  ｓｐｐ．；ヌカカ、サシチョウバエ、微小ハエ（ｓｃｉａｒｉｄ）、および他のＮｅｍａｔｏｃｅｒａを含む。
【０２７２】
重要な昆虫として、半翅目および同翅目の成虫および若虫、例えばカサアブラムシ（Ａｄｅｌｇｉｄａｅ）科のカサアブラムシ、メクラカメムシ科のカスミカメムシ、セミ科のセミ、ヨコバイ、Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｓｐｐ．；オオヨコバイ科、ヒシウンカ（Ｃｉｘｉｉｄａｅ）科、アオバハゴロモ（Ｆｌａｔｉｄａｅ）科、ビワハゴロモ上科、マルウンカ科、およびウンカ科のウンカ、ツノゼミ科のツノゼミ、キジラミ科のキジラミ、コナジラミ科のコナジラミ、アブラムシ科のアブラムシ、ネアブラムシ科のブドウネアブラムシ、コナカイガラムシ科のコナカイガラムシ、Ａｓｔｅｒｏｌｅｃａｎｉｄａｅ科、カタカイガラムシ科、コチニールカイガラムシ科、マルカイガラムシ科、フクロカイガラムシ科、ハカマカイガラムシ科、ヤシカイガラムシ科、およびワタフキカイガラムシ科のカイガラムシ、グンバイムシ科のグンバイムシ、カメムシ科のカメムシ、アメリカコバネナガカメムシ、Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｓｐｐ．；ならびにナガカメムシ科の他のヘリカメムシ、アワフキムシ科のアワフキムシ、ヘリカメムシ科のヘリカメムシ、ならびにホシカメムシ科のアカホシカメムシおよびホシカメムシを含むがこれらに限定されない。
【０２７３】
同翅目の農業上重要なメンバーはさらに、Ａｃｙｒｔｈｉｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ  Ｈａｒｒｉｓ（エンドウヒゲナガアブラムシ）；Ａｐｈｉｓ  ｃｒａｃｃｉｖｏｒａ  Ｋｏｃｈ（マメアブラムシ）；Ａ．ｆａｂａｅ  Ｓｃｏｐｏｌｉ（マメクロアブラムシ）；Ａ．ｇｏｓｓｙｐｉｉ  Ｇｌｏｖｅｒ（ワタアブラムシ、ワタアブラムシ）；Ａ．ｍａｉｄｉｒａｄｉｃｉｓ  Ｆｏｒｂｅｓ（コーンルートアフィド（ｃｏｒｎ  ｒｏｏｔ  ａｐｈｉｄ））；Ａ．ｐｏｍｉ  Ｄｅ  Ｇｅｅｒ（リンゴアブラムシ）；Ａ．ｓｐｉｒａｅｃｏｌａ  Ｐａｔｃｈ（スピレアアフィド（ｓｐｉｒｅａ  ａｐｈｉｄ）））；Ａｕｌａｃｏｒｔｈｕｍ  ｓｏｌａｎｉ  Ｋａｌｔｅｎｂａｃｈ（ジャガイモヒゲナガアブラムシ）；Ｃｈａｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ｆｒａｇａｅｆｏｌｉｉ  Ｃｏｃｋｅｒｅｌｌ（イチゴケナガアブラムシ）；Ｄｉｕｒａｐｈｉｓ  ｎｏｘｉａ  Ｋｕｒｄｊｕｍｏｖ／Ｍｏｒｄｖｉｌｋｏ（ロシアコムギアブラムシ）；Ｄｙｓａｐｈｉｓ  ｐｌａｎｔａｇｉｎｅａ  Ｐａａｓｅｒｉｎｉ（バラリンゴアブラムシ）；Ｅｒｉｏｓｏｍａ  ｌａｎｉｇｅｒｕｍ  Ｈａｕｓｍａｎｎ（リンゴワタムシ）；Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（キャベツアブラムシ）；Ｈｙａｌｏｐｔｅｒｕｓ  ｐｒｕｎｉ  Ｇｅｏｆｆｒｏｙ（モモコフキアブラムシ）；Ｌｉｐａｐｈｉｓ  ｅｒｙｓｉｍｉ  Ｋａｌｔｅｎｂａｃｈ（ニセダイコンアブラムシ）；Ｍｅｔｏｐｏｌｏｐｈｉｕｍ  ｄｉｒｒｈｏｄｕｍ  Ｗａｌｋｅｒ（シリアルアフィド（ｃｅｒｅａｌ  ａｐｈｉｄ））；Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ  ｅｕｐｈｏｒｂｉａｅ  Ｔｈｏｍａｓ（チューリップヒゲナガアブラムシ）；Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ  Ｓｕｌｚｅｒ（モモアカアブラムシ、モモアカアブラムシ）；Ｎａｓｏｎｏｖｉａ  ｒｉｂｉｓｎｉｇｒｉ  Ｍｏｓｌｅｙ（レタスヒゲナガアブラムシ）；Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ  ｓｐｐ．（ルートアフィド（ｒｏｏｔ  ａｐｈｉｄ）およびガルアフィド（ｇａｌｌ  ａｐｈｉｄ））；Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ  ｍａｉｄｉｓ  Ｆｉｔｃｈ（トウモロコシアブラムシ）；Ｒ．ｐａｄｉ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ムギクビレアブラムシ）；Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ  ｇｒａｍｉｎｕｍ  Ｒｏｎｄａｎｉ（ムギミドリアブラムシ）；Ｓｉｐｈａ  ｆｌａｖａ  Ｆｏｒｂｅｓ（イエローシュガーケーンアフィド（ｙｅｌｌｏｗ  ｓｕｇａｒｃａｎｅ  ａｐｈｉｄ））；Ｓｉｔｏｂｉｏｎ  ａｖｅｎａｅ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（ムギヒゲナガアブラムシ）；Ｔｈｅｒｉｏａｐｈｉｓ  ｍａｃｕｌａｔａ  Ｂｕｃｋｔｏｎ（マダラアルファルファアブラムシ）；Ｔｏｘｏｐｔｅｒａ  ａｕｒａｎｔｉｉ  Ｂｏｙｅｒ  ｄｅ  Ｆｏｎｓｃｏｌｏｍｂｅ（コミカンアブラムシ）およびＴ．ｃｉｔｒｉｃｉｄａ  Ｋｉｒｋａｌｄｙ（ミカンクロアブラムシ）；Ｍｅｌａｎａｐｈｉｓ  ｓａｃｃｈａｒｉ（サトウキビアブラムシ）；Ａｄｅｌｇｅｓ  ｓｐｐ．（カサアブラムシ）；Ｐｈｙｌｌｏｘｅｒａ  ｄｅｖａｓｔａｔｒｉｘ  Ｐｅｒｇａｎｄｅ（ペカンネアブラムシ）；Ｂｅｍｉｓｉａ  ｔａｂａｃｉ  Ｇｅｎｎａｄｉｕｓ（タバココナジラミ、ワタコナジラミ）；Ｂ．ａｒｇｅｎｔｉｆｏｌｉｉ  Ｂｅｌｌｏｗｓ  ＆  Ｐｅｒｒｉｎｇ（シルバーリーフコナジラミ��；Ｄｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ  ｃｉｔｒｉ  Ａｓｈｍｅａｄ（ミカンコナジラミ）；Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ  ａｂｕｔｉｌｏｎｅｕｓ（バンデッドウィングドホワイトフライ（ｂａｎｄｅｄｗｉｎｇｅｄ  ｗｈｉｔｅｆｌｙ））、およびＴ．ｖａｐｏｒａｒｉｏｒｕｍ  Ｗｅｓｔｗｏｏｄ（オンシツコナジラミ）；Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｆａｂａｅ  Ｈａｒｒｉｓ（ジャガイモヒメヨコバイ）；Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ  ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ  Ｆａｌｌｅｎ（ヒメトビウンカ）；Ｍａｃｒｏｌｅｓｔｅｓ  ｑｕａｄｒｉｌｉｎｅａｔｕｓ  Ｆｏｒｂｅｓ（フタテンヨコバイ）；Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｃｉｎｔｉｃｅｐｓ  Ｕｈｌｅｒ（ツマグロヨコバイ）；Ｎ．ｎｉｇｒｏｐｉｃｔｕｓ  Ｓｔａｌ（ツマグロヨコバイ）；Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ  ｌｕｇｅｎｓ  Ｓｔａｌ（トビイロウンカ）；Ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｓ  ｍａｉｄｉｓ  Ａｓｈｍｅａｄ（トウモロコシウンカ）；Ｓｏｇａｔｅｌｌａ  ｆｕｒｃｉｆｅｒａ  Ｈｏｒｖａｔｈ（セジロウンカ）；Ｓｏｇａｔｏｄｅｓ  ｏｒｉｚｉｃｏｌａ  Ｍｕｉｒ（イネウンカ）；Ｔｙｐｈｌｏｃｙｂａ  ｐｏｍａｒｉａ  ＭｃＡｔｅｅ（シロリンゴヨコバイ（ｗｈｉｔｅ  ａｐｐｌｅ  ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ））；Ｅｒｙｔｈｒｏｎｅｏｕｒａ  ｓｐｐ．（チマダラヒメヨコバイ）；Ｍａｇｉｃｉｃａｄａ  ｓｅｐｔｅｎｄｅｃｉｍ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ジュウシチネンゼミ）；Ｉｃｅｒｙａ  ｐｕｒｃｈａｓｉ  Ｍａｓｋｅｌｌ（ワタフキカイガラムシ）；Ｑｕａｄｒａｓｐｉｄｉｏｔｕｓ  ｐｅｒｎｉｃｉｏｓｕｓ  Ｃｏｍｓｔｏｃｋ（サンホゼカイガラムシ）；Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｉｔｒｉ  Ｒｉｓｓｏ（ミカンコナカイガラムシ）；Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．（他のコナカイガラムシ群）；Ｃａｃｏｐｓｙｌｌａ  ｐｙｒｉｃｏｌａ  Ｆｏｅｒｓｔｅｒ（フタホシナシキジラミ）；Ｔｒｉｏｚａ  ｄｉｏｓｐｙｒｉ  Ａｓｈｍｅａｄ（カキキジラミ）を含むがこれらに限定されない。
【０２７４】
半翅目の目的の農業上重要な種は：Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｈｉｌａｒｅ  Ｓａｙ（ミナミアオカメムシ）；Ａｎａｓａ  ｔｒｉｓｔｉｓ  Ｄｅ  Ｇｅｅｒ（ヘリカメムシ）；Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ  Ｓａｙ（アメリカコバネナガカメムシ）；Ｃｏｒｙｔｈｕｃａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（グンバイムシ）；Ｃｙｒｔｏｐｅｌｔｉｓ  ｍｏｄｅｓｔａ  Ｄｉｓｔａｎｔ（トマトバグ（ｔｏｍａｔｏ  ｂｕｇ））；Ｄｙｓｄｅｒｃｕｓ  ｓｕｔｕｒｅｌｌｕｓ  Ｈｅｒｒｉｃｈ−Ｓｃｈａｆｆｅｒ（ホシカメムシ）；Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｓｅｒｖｕｓ  Ｓａｙ（クサギカメムシ）；Ｅ．ｖａｒｉｏｌａｒｉｕｓ  Ｐａｌｉｓｏｔ  ｄｅ  Ｂｅａｕｖａｉｓ（イッテンカメムシ）；Ｇｒａｐｔｏｓｔｅｔｈｕｓ  ｓｐｐ．（ヒメマダラナガカメムシ群）；Ｌｅｐｔｏｇｌｏｓｓｕｓ  ｃｏｒｃｕｌｕｓ  Ｓａｙ（マツノミヘリカメムシ）；Ｌｙｇｕｓ  ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ  Ｐａｌｉｓｏｔ  ｄｅ  Ｂｅａｕｖａｉｓ（サビイロカスミカメ）；Ｌ．Ｈｅｓｐｅｒｕｓ  Ｋｎｉｇｈｔ（ウエスタンターニッシュプラントバグ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｔａｒｎｉｓｈｅｄ  ｐｌａｎｔ  ｂｕｇ））；Ｌ．ｐｒａｔｅｎｓｉｓ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（コモンミドウバグ（ｃｏｍｍｏｎ  ｇｒｅｅｎ  ｃａｐｓｉｄ））；Ｌ．ｒｕｇｕｌｉｐｅｎｎｉｓ  Ｐｏｐｐｉｕｓ（マキバカスミカメ）；Ｌｙｇｏｃｏｒｉｓ  ｐａｂｕｌｉｎｕｓ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ナガミドリカスミカメ）；Ｎｅｚａｒａ  ｖｉｒｉｄｕｌａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ミナミアオカメムシ）；Ｏｅｂａｌｕｓ  ｐｕｇｎａｘ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（イネカメムシ）；Ｏｎｃｏｐｅｌｔｕｓ  ｆａｓｃｉａｔｕｓ  Ｄａｌｌａｓ（ラージミルクウィードバグ（ｌａｒｇｅ  ｍｉｌｋｗｅｅｄ  ｂｕｇ））；Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ  ｓｅｒｉａｔｕｓ  Ｒｅｕｔｅｒ（ワタノミハムシ）を含むがこれらに限定されない。
【０２７５】
さらに、本実施形態は、半翅目、例えばＣａｌｏｃｏｒｉｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  Ｇｍｅｌｉｎ（ストロベリーバグ（ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ  ｂｕｇ））；Ｏｒｔｈｏｐｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ；Ｐｌｅｓｉｏｃｏｒｉｓ  ｒｕｇｉｃｏｌｌｉｓ  Ｆａｌｌｅｎ（アップルカプシッド（ａｐｐｌｅ  ｃａｐｓｉｄ））；Ｃｙｒｔｏｐｅｌｔｉｓ  ｍｏｄｅｓｔｕｓ  Ｄｉｓｔａｎｔ（トマトバグ）；Ｃｙｒｔｏｐｅｌｔｉｓ  ｎｏｔａｔｕｓ  Ｄｉｓｔａｎｔ（サックフライ（ｓｕｃｋｆｌｙ））；Ｓｐａｎａｇｏｎｉｃｕｓ  ａｌｂｏｆａｓｃｉａｔｕｓ  Ｒｅｕｔｅｒ（ホワイトマークドフリーホッパー（ｗｈｉｔｅｍａｒｋｅｄ  ｆｌｅａｈｏｐｐｅｒ））；Ｄｉａｐｈｎｏｃｏｒｉｓ  ｃｈｌｏｒｉｏｎｉｓ  Ｓａｙ（ハニーローカストプラントバグ（ｈｏｎｅｙｌｏｃｕｓｔ  ｐｌａｎｔ  ｂｕｇ））；Ｌａｂｏｐｉｄｉｃｏｌａ  ａｌｌｉｉ  Ｋｎｉｇｈｔ（オニオンプラントバグ（ｏｎｉｏｎ  ｐｌａｎｔ  ｂｕｇ））；Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ  ｓｅｒｉａｔｕｓ  Ｒｅｕｔｅｒ（ワタノミハムシ）；Ａｄｅｌｐｈｏｃｏｒｉｓ  ｒａｐｉｄｕｓ  Ｓａｙ（ラピッドプラントバグ（ｒａｐｉｄ  ｐｌａｎｔ  ｂｕｇ））；Ｐｏｅｃｉｌｏｃａｐｓｕｓ  ｌｉｎｅａｔｕｓ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（フォーラインドプラントバグ（ｆｏｕｒ  ｌｉｎｅｄ  ｐｌａｎｔ  ｂｕｇ））；Ｎｙｓｉｕｓ  ｅｒｉｃａｅ  Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ（フォールスチンクバグ（ｆａｌｓｅ  ｃｈｉｎｃｈ  ｂｕｇ））；Ｎｙｓｉｕｓ  ｒａｐｈａｎｕｓ  Ｈｏｗａｒｄ（フォールスチンクバグ）；Ｎｅｚａｒａ  ｖｉｒｉｄｕｌａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ミナミアオカメムシ）；Ｅｕｒｙｇａｓｔｅｒ  ｓｐｐ．；Ｃｏｒｅｉｄａｅ  ｓｐｐ．；Ｐｙｒｒｈｏｃｏｒｉｄａｅ  ｓｐｐ．；Ｔｉｎｉｄａｅ  ｓｐｐ．；Ｂｌｏｓｔｏｍａｔｉｄａｅ  ｓｐｐ．；Ｒｅｄｕｖｉｉｄａｅ  ｓｐｐ．およびＣｉｍｉｃｉｄａｅ  ｓｐｐ．に対して有効であり得る。
【０２７６】
また、ダニ目（ダニ）の成虫および幼虫、例えばＡｃｅｒｉａ  ｔｏｓｉｃｈｅｌｌａ  Ｋｅｉｆｅｒ（ウィートカールマイト（ｗｈｅａｔ  ｃｕｒｌ  ｍｉｔｅ））；Ｐｅｔｒｏｂｉａ  ｌａｔｅｎｓ  Ｍｕｌｌｅｒ（ホモノハダニ）；ハダニ科のハダニおよびアカダニ、Ｐａｎｏｎｙｃｈｕｓ  ｕｌｍｉ  Ｋｏｃｈ（リンゴハダニ）；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ  Ｋｏｃｈ（ナミハダニ）；（Ｔ．ｍｃｄａｎｉｅｌｉ  ＭｃＧｒｅｇｏｒ（マクダニエルダニ）；Ｔ．ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ  Ｂｏｉｓｄｕｖａｌ（ニセナミハダニ）；Ｔ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉ  Ｕｇａｒｏｖ  ＆  Ｎｉｋｏｌｓｋｉ（ストロベリースパイダーマイト（ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ  ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ））；ヒメハダニ科のヒメハダニ、Ｂｒｅｖｉｐａｌｐｕｓ  ｌｅｗｉｓｉ  ＭｃＧｒｅｇｏｒ（カンキツヒメハダニ）；フシダニ科のサビダニおよびフシダニ、ならびに他の食葉性ダニおよびヒトおよび動物に健康にとって重要なダニ、すなわちトリハダダニ科のヒョウダニ、ニキビダニ科のニキビダニ、ニクダニ科のムギコナダニ、マダニ目のマダニ、Ｉｘｏｄｅｓ  ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ  Ｓａｙ（シカダニ）；Ｉ．ｈｏｌｏｃｙｃｌｕｓ  Ｎｅｕｍａｎｎ（オーストラリアマダニ）；Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  Ｓａｙ（アメリカイヌカクマダニ）；Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ローンスターチック（ｌｏｎｅ  ｓｔａｒ  ｔｉｃｋ））およびＰｓｏｒｏｐｔｉｄａｅ科、Ｐｙｅｍｏｔｉｄａｅ科、およびＳａｒｃｏｐｔｉｄａｅ科のキュウセンダニおよびヒゼンダニも含まれる。
【０２７７】
シミ目の害虫、例えばＬｅｐｉｓｍａ  ｓａｃｃｈａｒｉｎａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（セイヨウシミ）；Ｔｈｅｒｍｏｂｉａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ  Ｐａｃｋａｒｄ（マダラシミ）も重要である。
【０２７８】
網羅されるさらなる節足動物有害生物は、真正クモ目のクモ、例えばＬｏｘｏｓｃｅｌｅｓ  ｒｅｃｌｕｓａ  ＧｅｒｔｓｃｈおよびＭｕｌａｉｋ（ドクイトグモ）およびＬａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｍａｃｔａｎｓ  Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ（クロゴケグモ）、ならびにゲジ目のムカデ、例えばＳｃｕｔｉｇｅｒａ  ｃｏｌｅｏｐｔｒａｔａ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ（ゲジ）を含む。
【０２７９】
目的の害虫は、カメムシ科（Ｎｅｚａｒａ  ｖｉｒｉｄｕｌａ、Ｈａｌｙｏｍｏｒｐｈａ  ｈａｌｙｓ、Ｐｉｅｚｏｄｏｒｕｓ  ｇｕｉｌｄｉｎｉ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｓｅｒｖｕｓ、Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｈｉｌａｒｅ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｈｅｒｏｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｔｒｉｓｔｉｇｍｕｓ、Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｈｉｌａｒｅ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ  ｆｕｒｃａｔｕｓ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ  ｍｅｌａｃａｎｔｈｕｓ、およびＢａｇｒａｄａ  ｈｉｌａｒｉｓ（バグラダバグ（Ｂａｇｒａｄａ  Ｂｕｇ）））、マルカメムシ科（Ｍｅｇａｃｏｐｔａ  ｃｒｉｂｒａｒｉａ−タイワンマルカメムシ）、およびツチカメムシ科（Ｓｃａｐｔｏｃｏｒｉｓ  ｃａｓｔａｎｅａ−ルートスティンクバグ（Ｒｏｏｔ  ｓｔｉｎｋ  ｂｕｇ））に属する種、ならびにコナガ、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ  Ｂｏｄｄｉｅ；ダイズシャクトリムシ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ  Ｗａｌｋｅｒおよびベルベットビーンキャタピラー、例えば、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ  Ｈｕｂｎｅｒを含むがこれらに限定されない鱗翅目種を含むがこれらに限定されないカメムシ上科および他の関連する昆虫を含む。
【０２８０】
殺有害生物活性を測定する方法は、当技術分野で周知である。例えば、その全ての全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｃｚａｐｌａ  ａｎｄ  Ｌａｎｇ，  （１９９０）  Ｊ．  Ｅｃｏｎ．  Ｅｎｔｏｍｏｌ．  ８３：２４８０−２４８５；Ａｎｄｒｅｗｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２５２：１９９−２０６；Ｍａｒｒｏｎｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８５）  Ｊ．  ｏｆ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ  ７８：２９０−２９３および米国特許第５，７４３，４７７号を参照されたい。一般的に、タンパク質を混合して、摂食アッセイにおいて使用する。例えば、Ｍａｒｒｏｎｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８５）  Ｊ．  ｏｆ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ  ７８：２９０−２９３を参照されたい。そのようなアッセイは、植物に、１つまたは複数の有害生物を接触させること、および植物が生存する能力および／または有害生物の死を引き起こす能力を決定することを含み得る。
【０２８１】
線虫は、寄生性の線虫、例えばＨｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｓｐｐ．、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｓｐｐ．、およびＧｌｏｂｏｄｅｒａ  ｓｐｐ．を含む根瘤線虫病、シストおよびネグサレ線虫；特にＨｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ（ダイズシスト線虫）；Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｓｃｈａｃｈｔｉｉ（ビーツシスト線虫）；Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ａｖｅｎａｅ（穀物シスト線虫）およびＧｌｏｂｏｄｅｒａ  ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓおよびＧｌｏｂｏｄｅｒａ  ｐａｉｌｉｄａ（ジャガイモシスト線虫）を含むがこれらに限定されないシスト線虫のメンバーを含む。ネグサレ線虫は、Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｓｐｐ．を含む。
【０２８２】
一部の態様では、本教示の殺虫タンパク質は、Ｃｒｙタンパク質に対し抵抗性である昆虫に対して活性である。例えば、本教示の殺虫タンパク質は、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ３Ｂｂ１、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ、およびバイナリータンパク質複合体Ｃｒｙ３４Ａｂ１／Ｃｒｙ３５Ａｂ１に対し抵抗性である昆虫に対して活性であり得る。態様では、本教示の殺虫タンパク質は、Ｃｒｙタンパク質（例えば、ＭＯＮ８８０１７によって発現されるＣｒｙ３Ｂｂ１タンパク質）に対し抵抗性であるウエスタンコーンルートワーム（ＷＣＲ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ＬｅＣｏｎｔｅ）に対して活性である。態様では、本教示の殺虫タンパク質は、Ｃｒｙタンパク質（例えば、ｍＣｒｙ３Ａ）に対し抵抗性であるウエスタンコーンルートワーム（ＷＣＲ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ＬｅＣｏｎｔｅ）に対して活性である。態様では、本教示の殺虫タンパク質は、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｂａｒｂｅｒｉおよびＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉのコーンルートワーム、ならびにＤｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｓｐｅｃｉｏｓａおよびＰｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ  ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ等の他の甲虫種に対して毒性であり得る。態様では、本教示の殺虫タンパク質は、ナナホシテントウ（Ｃｏｌｅｏｍｅｇｉｌｌａ  ｍａｃｕｌａｔａ）またはある特定の鱗翅目またはある特定の半翅目に対して毒性ではない。参照により本明細書に組み込まれている、Ｕ．  Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｏｒｎ  ｒｏｏｔｗｏｒｍｓ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２０１６  Ｎｏｖ  ４；３５４（６３１２）：６３４−６３７（ＩＰＤ０７２Ａａ、８６ＡＡタンパク質、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＴ７９５２９１を提供する）；および参照により本明細書に組み込まれている、Ｊｕｎ−Ｚｈｉ  Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｏｓｓｅｌｉｉ  ｆｏｒ  ｃｏｒｎ  ｒｏｏｔｗｏｒｍ  ｃｏｎｔｒｏｌ，”  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ２０１８，  Ｖｏｌ．  １６，  ｐｇｓ．  ６４９−６５９（ＰＩＰ−４７ａａを提供する）を参照されたい。
【０２８３】
種子処理
収量生産および形質技術を保護および増強するために、種子処理の選択肢は、追加の作物計画の柔軟性、ならびに昆虫、雑草、および病害に対する費用対効果の高い防除を提供することができる。種子材料を、化学または生物学的除草剤、除草剤解毒剤、殺虫剤、殺真菌剤、発芽阻害剤および増強剤、栄養、植物成長調節剤および活性化剤、殺細菌剤、殺線虫剤、および／または軟体動物駆除剤の組合せを含む組成物によって処理、典型的に表面処理することができる。
【０２８４】
これらの化合物は典型的には、さらなる担体、界面活性剤、または製剤の技術分野で通常使用される適用促進アジュバントと共に製剤化される。繁殖材料に液体製剤を含浸させることによって、または複合湿式または乾燥製剤によってコーティングすることによってコーティングを適用してもよい。種子処理として使用され得る様々なタイプの化合物の例は、参照により本明細書に組み込まれている、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌによって発行されたＴｈｅ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｍａｎｕａｌ：  Ａ  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ，  Ｃ．Ｄ．Ｓ．  Ｔｏｍｌｉｎ  Ｅｄ．に提供される。
【０２８５】
作物種子について使用され得るいくつかの種子処理には、アブシジン酸、アシベンゾラル−Ｓ−メチル、アベルメクチン、アミトロール、アザコナゾール、アゾスピリラム、アザジラクチン、アゾキシストロビン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．（ｃｅｒｅｕｓ、ｆｉｒｍｕｓ、ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、ｐｕｍｉｌｉｓ、ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、ｓｕｂｔｉｌｉｓ、および／またはｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ種の１つまたは複数を含む）、ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐｐ．（ｂｅｔａｅ、ｃａｎａｒｉｅｎｓｅ、ｅｌｋａｎｉｉ、ｉｒｉｏｍｏｔｅｎｓｅ、ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、ｌｉａｏｎｉｇｅｎｓｅ、ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ、および／またはｙｕａｎｍｉｎｇｅｎｓｅの１つまたは複数を含む）、カプタン、カルボキシン、キトサン、クロチアニジン、銅、サイアジピル、ジフェノコナゾール、エチジアゾール、フィプロニル、フルジオキソニル、フルオキサストロビン、フルキンコナゾール、フルラゾール、フルキソフェニム、ハーピンタンパク質、イマザリル、イミダクロプリド、イプコナゾール、イソフラベノイド、リポ−キトオリゴ糖、マンコゼブ、マンガン、マネブ、メフェノキサム、メタラキシル、メトコナゾール、ミクロブタニル、ＰＣＮＢ、ペンフルフェン、ペニシリニウム、ペンチオピラド、ペルメトリン、ピコキシストロビン、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、リナキシピル、Ｓ−メトラクロール、サポニン、セダキサン、ＴＣＭＴＢ、テブコナゾール、チアベンダゾール、チアメトキサム、チオカルブ、チラム、トルクロホス−メチル、トリアジメノール、トリコデルマ属、トリフロキシストロビン、トリチコナゾール、および／または亜鉛の１つまたは複数が挙げられるがこれらに限定されない。ＰＣＮＢ種子コーティングは、キントゼンおよびテラゾールを含有するＥＰＡ登録番号００２９３５００４１９を指す。ＴＣＭＴＢは、２−（チオシアノメチルチオ）ベンゾチアゾールを指す。
【０２８６】
種子品種および特定のトランスジェニック形質を有する種子を試験して、種子処理の選択肢および適用率が収量を増強するためにそのような品種およびトランスジェニック形質を補完し得るか否かを決定してもよい。例えば、良好な生産力を有するが糸黒穂病に対して感受性を有する品種は、糸黒穂病に対して保護を提供する種子処理の使用によって利益が得られ、良好な生産力を有するがシスト線虫感受性を有する品種は、シスト線虫に対する保護を提供する種子処理の使用によって利益が得られ得る等である。同様に、昆虫抵抗性を付与するトランスジェニック形質を包含する品種は、種子処理によって付与される第２の作用機序から利益が得られ、除草剤抵抗性を付与するトランスジェニック形質を包含する品種は、その除草剤に対する植物抵抗性を増強する解毒剤による種子処理によって利益が得られ得る等である。さらに、種子処理の適切な使用に起因する良好な根の確立および早期発芽によって、種子処理と組み合わせた場合にある特定の形質を含有する品種または複数の品種のより効率的な窒素の使用、より良好な干ばつ抵抗能、および全体的な生産力の増加がもたらされ得る。
【０２８７】
害虫を死滅させるおよび昆虫集団を防除するための方法。
一部の実施形態では、害虫を死滅させる方法であって、害虫を、殺虫有効量の本明細書に教示の組換えタンパク質と接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、害虫を死滅させる方法であって、害虫を、殺虫有効量の配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２の殺有害生物タンパク質またはそのバリアントと接触させるステップを含む方法を提供する。
【０２８８】
一部の実施形態では、害虫集団を防除する方法であって、害虫集団を殺虫有効量の本明細書に教示の組換えタンパク質と接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、害虫集団を防除する方法であって、害虫集団を、殺虫有効量の配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２の殺有害生物タンパク質またはそのバリアントと接触させるステップを含む方法を提供する。
【０２８９】
本明細書で使用される場合、「有害生物集団を防除する」または「有害生物を防除する」とは、有害生物が引き起こす被害の制限をもたらす、有害生物に及ぼす任意の効果を指す。有害生物の防除は、有害生物の死滅、有害生物の発達の阻害、有害生物が植物に対してより少ない被害を提供するような有害生物の生殖または成長の変化、作出される子孫の数の減少、より適合性の低い有害生物を作出する、捕食者の攻撃に対してより感受性が高い有害生物を作出する、または有害生物が植物を食べるのを抑止することが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２９０】
一部の実施形態では、殺有害生物タンパク質に対し抵抗性の害虫集団を防除する方法であって、害虫集団を、殺虫有効量の本明細書に教示の組換えタンパク質と接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、殺有害生物タンパク質に対し抵抗性の害虫集団を防除する方法であって、害虫集団を、殺虫有効量の配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２の組換え殺有害生物タンパク質またはそのバリアントと接触させるステップを含む方法を提供する。
【０２９１】
一部の実施形態では、害虫から植物を保護する方法であって、植物またはその細胞において本明細書に教示の殺有害生物タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを発現させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、害虫から植物を保護する方法であって、植物またはその細胞において配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２の殺有害生物タンパク質またはそのバリアントをコードする組換えポリヌクレオチドを発現させるステップを含む方法を提供する。
【０２９２】
植物収量を増加させる方法
植物収量を増加させる方法を提供する。方法は、本明細書に開示の殺有害生物ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを発現する植物または植物細胞を提供するステップ、および植物またはその種子を、ポリペプチドが殺有害生物活性を有する有害生物を蔓延させた圃場で成長させるステップを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、鱗翅目、甲虫目、双翅目、半翅目または線虫有害生物に対して殺有害生物活性を有し、圃場は、鱗翅目、半翅目、甲虫目、双翅目または線虫有害生物が蔓延している。
【０２９３】
本明細書で定義される場合、植物の「収量」は、植物によって産生されるバイオマスの質および／または量を指す。「バイオマス」は、本明細書で使用される場合、任意の測定された植物産物を指す。バイオマス産生の増加は、測定した植物産物の収量の任意の改善である。植物収量の増加は、いくつかの商業的適用を有する。例えば、植物の葉のバイオマスの増加は、ヒトまたは動物が消費するための葉物野菜の収量を増加させ得る。加えて、葉のバイオマスの増加を使用して、植物由来の薬学または工業産物の産生を増加させることができる。収量の増加は、殺有害生物配列を発現しない植物と比較して収量の少なくとも１％増加、少なくとも３％増加、少なくとも５％増加、少なくとも１０％増加、少なくとも２０％増加、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも１００％またはそれを上回る増加を含むがこれらに限定されない任意の統計学的に有意な増加を含み得る。特定の方法では、植物収量は、本明細書に開示の殺虫タンパク質を発現する植物の有害生物抵抗性の改善の結果として増加する。
【０２９４】
隠れマルコフモデル
隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）は、直接観測可能ではない内部要因に依存する観測可能事象の展開を記述するために使用することができる統計学的モデルである。観察された事象は、「シンボル」と呼ばれ、観測の基礎となる目に見えない要因を「状態」と呼ぶ。ＨＭＭは、２つの確率過程、すなわち隠れた状態の目に見えない過程と、観測可能なシンボルの目に見える過程からなる。マルコフ連鎖の隠れた状態および観測されたシンボルの確率分布は、基礎となる状態に依存する。この理由から、ＨＭＭはまた、二重に埋め込まれた確率過程とも呼ばれる。これらの２つの層、すなわち１つは目に見え、もう１つは目に見えない層における観測のモデリングは、多くの現実世界の問題が、生の観測を、より意味があるいくつかのカテゴリーまたはクラスラベルへと分類することを扱うことから、非常に有用である。このアプローチは、タンパク質およびＤＮＡ配列等の生物学的配列のモデリングにおいて有用である。典型的には、生物学的配列は、異なる機能を有するより小さい小構造からなり、異なる機能領域はしばしば、別個の統計学的特性を示す。例えば、タンパク質が一般的に複数のドメインからなることは周知である。新規タンパク質の場合、ＨＭＭを使用して構成ドメイン（ＨＭＭにおける１つまたは複数の状態に対応する）およびアミノ酸配列におけるその位置（観測）を予測することができる。さらに、本発明者らはまた、この新規タンパク質配列が属するタンパク質ファミリーを発見することを求め得る。実際に、ＨＭＭは、生物学的配列を表すために非常に有効であることが示されている。その結果、ＨＭＭは、分子計算生物学、バイオインフォマティクスにおいてますます一般的になりつつあり、多くの最先端の配列解析アルゴリズムがＨＭＭにおいて構築されている。総説に関しては、参照により本明細書に組み込まれている、Ｂｙｕｎｇ−Ｊｕｎ  Ｙｏｏｎ，  ”Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，”  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ２００９，  Ｖｏｌ．  １０，  ｐｇｓ．  ４０２−４１５を参照されたい。
【０２９５】
このように、マルコフモデルは、マルコフ連鎖を生じさせるシステムであり、隠れマルコフモデルは、連鎖を生じさせる規則が不明であるか、または「隠れている」モデルであると理解される。規則は２つの確率：（ｉ）ある特定の観測が存在する確率、および（ｉｉ）ある特定の時間でのモデルの状態が与えられた場合に、ある特定の状態遷移が存在する確率を含む。隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）法は、ある特定のタイプの問題を解決するための数学的アプローチである：（ｉ）モデルが与えられた場合に、観測の確率を発見する；（ｉｉ）モデルおよび観測が与えられた場合に、最も可能性が高い状態遷移トラジェクトリーを発見する；および（ｉｉｉ）モデルのパラメーターを調整することによってｉまたはｉｉのいずれかを最大限にする。これらの問題の各々に関して、アルゴリズム、例えば中でも、（ｉ）Ｆｏｒｗａｒｄ−Ｂａｃｋｗａｒｄ、（ｉｉ）Ｖｉｔｅｒｂｉ、および（ｉｉｉ）Ｂａｕｍ−Ｗｅｌｃｈ（およびセグメントＫ平均代替法）が開発されている。
【０２９６】
ＨＭＭＥＲソフトウェア
ＨＭＭＥＲは、タンパク質またはＤＮＡ配列のホモログに関して配列データベースを検索するために、および配列アライメントを作成するために使用されるＨＭＭソフトウェアパッケージである。ＨＭＭＥＲは、単一のクエリ配列で配列データベースを検索するために使用することができるが、これはクエリが配列ファミリーの複数の例のアライメントである場合には、特に強力となる。ＨＭＭＥＲは、置換、挿入、および欠失に関して位置特異的スコアリングシステムを割付するクエリのプロファイルを作成する。ＨＭＭＥＲプロファイルは、「プロファイル隠れマルコフモデル」（プロファイルＨＭＭ）と呼ばれる確率論モデルである（Ｋｒｏｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４；Ｅｄｄｙ，  １９９８；Ｄｕｒｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、および他の配列アライメント、ならびにより古いスコアリング方法論に基づくデータベース検索ツールと比較すると、ＨＭＭＥＲは、その基礎となる確率論モデルの強度のために、有意により正確に離れたホモログを検出できることを狙いとする。
【０２９７】
プロファイルＨＭＭは、マルチプル配列アライメントまたは単一の配列にいたる統計学的モデルである。それらは、アライメントの各々のカラムがどのように保存されているか、およびどの残基が可能性を有するかに関する位置特異的情報を獲得する。Ａｎｄｅｒｓ  Ｋｒｏｇｈ、Ｄａｖｉｄ  Ｈａｕｓｓｌｅｒ、および共同研究者は、ＵＣ  Ｓａｎｔａ  ＣｒｕｚにおいてプロファイルＨＭＭを計算生物学に導入し（Ｋｒｏｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）、言語認識において何年もの間使用されているＨＭＭ技術を採用した。ＨＭＭは、Ｋｒｏｇｈ／Ｈａｕｓｓｌｅｒの研究の前でも、特にＧａｒｙ  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，  １９８９）によって生物学において使用されていたが、Ｋｒｏｇｈの論文は、ＨＭＭ技術が単一のクエリ配列の代わりにマルチプル配列アライメントを使用して、データベースを検索するための一般的な「プロファイル」法に良好に適合したことから強いインパクトを与えた。「プロファイル」は、Ｇｒｉｂｓｋｏｖおよび共同研究者（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  １９９０）によって導入されており、いくつかの他のグループがほぼ同時に類似のアプローチ、例えば「フレキシブルパターン（Ｂａｒｔｏｎ，  １９９０）、および「テンプレート」（Ｂａｓｈｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７；Ｔａｙｌｏｒ，  １９８６）を導入した。用語「プロファイル」は、固定されている。全てのプロファイル法（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）を含む）は、マルチプル配列アライメントのコンセンサスのより多いまたはより少ない統計学的説明である。それらは、アミノ酸またはヌクレオチド（残基）の位置特異的スコア、および挿入または欠失を開始および伸長させるための位置特異的ペナルティを使用する。従来のペアワイズアライメント（例えば、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  １９８８）、またはＳｍｉｔｈ／Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  １９８１）は、位置非依存的スコアリングパラメーターを使用する。プロファイルのこの特性は、マルチプルアライメントにおける様々な位置での保存の程度、ならびにギャップおよび挿入が許容される様々な程度に関する重要な情報を獲得する。
【０２９８】
ＨＭＭを使用する利点は、ＨＭＭが公式な確率論根拠を有する点である。それらは、全てのスコアリングパラメーターをどのように設定すべきかを誘導するために確率理論を使用する。例えば、ＨＭＭは、位置特異的ギャップおよび挿入スコアを設定するための一貫した理論を有する。方法は、一貫しており、したがって高度に自動化可能であり、プロファイルＨＭＭの何百ものライブラリーを作製することができ、それらを全ゲノム分析に非常に大きい規模で適用することができる。タンパク質ドメインモデルのそのような１つのデータベースは、Ｐｆａｍ（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７；Ｆｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）であり、これは、Ｉｎｔｅｒｐｒｏタンパク質ドメインアノテーションシステムの重要な部分である（Ｍｕｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。Ｐｆａｍの構築および使用は、ＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージに密接に結びついている。
【０２９９】
殺虫タンパク質発見プラットフォーム（ＩＰＤＰ）
本開示は、高度に不均一な環境的供給源から新規殺虫タンパク質を発見するためのプラットフォームを示す。本方法論は、広いクラスの未知の微生物多様性およびその結果としてのプロテオームに対するアクセスを可能にするメタゲノム富化手順および遺伝子増幅技術を利用する。
【０３００】
図１は、以下に詳細に説明するＩＰＤＰを説明する全体的なワークフローを提供する。
【０３０１】
土壌試料の収集
材料１〜１０グラムを高い微生物多様性を含有する環境試料から収集する。
【０３０２】
緩衝溶液中での再懸濁
環境材料を、ＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）１０〜１００ｍＬ中で懸濁し、１５分間絶えず撹拌した。次に、大きい粒子を沈降させる。
【０３０３】
希釈および固体栄養制限寒天培地への播種
上清の一連の希釈物を、真菌の成長を低減させるためにシクロヘキサミドを含有する栄養制限寒天上に播種する。
【０３０４】
特定のファミリーの微生物の成長に都合がよい様々な培地のレシピが、文献に記載されている。
【０３０５】
現在のＩＰＤＰは、特定の属の微生物（例えば、ある特定の実施形態ではＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に関して富化するために所有権のある培地および培地成長手順を利用する。
【０３０６】
プレートからの細菌成長物の収集−溶解および沈殿を介して混合物としての富化試料からの全てのゲノムＤＮＡの単離
プレート上の全ての細菌成長物を、水による洗浄によって収集し、細胞を遠心分離によってペレット化し、上清を捨てる。
【０３０７】
ゲノムＤＮＡを、標準的な細菌ゲノムＤＮＡ単離技術を使用して、ペレット化したメタゲノム試料から単離した。
【０３０８】
モナライシンクラスのタンパク質をコードする遺伝子を、縮重ＰＣＲを使用してさらに富化し、回収および配列決定のためにプラスミドベクターにクローニングする。
所有権のある縮重プライマーを利用して、メタゲノムＤＮＡ試料からモナライシンクラスのタンパク質をコードする遺伝子を増幅した。
【０３０９】
「モナライシンクラス」のタンパク質は、例えば、表１の配列番号８７とある程度の類似性を有するタンパク質であり得る。本発明のＩＰＤＰは、このクラスにおけるタンパク質を検索するために利用することができる所有権のある縮重プライマーの実質的なライブラリーを有する。
【０３１０】
サイズが約８００ｂｐの増幅されたＤＮＡを、ゲル電気泳動によって分離し、標準的な技術を利用して回収した。
【０３１１】
縮重プライマーは、ＤＮＡプラスミドへのクローニングに適合性のテールを含む。ＰＣＲ増幅ＤＮＡをクローニングして配列決定し、Ｏｐｏｔａらの公表されたモナライシン配列と類似性を有するタンパク質をコードする完全長の遺伝子を同定した。
【０３１２】
１）栄養制限寒天上でのある特定の微生物集団の初回富化、その後に２）富化集団から単離したゲノムＤＮＡからの縮重ＰＣＲを使用したモナライシンクラスのタンパク質をコードする遺伝子の増幅の組合せはいずれも、一部の実施形態では、モナライシン様タンパク質をコードする遺伝子を回収するために好ましいステップである。
【０３１３】
「モナライシン様」タンパク質は、Ｏｐｏｔａらに記載されたモナライシンタンパク質とある程度の類似性を有するタンパク質として定義することができる。Ｏｐｏｔａ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｍｏｎａｌｙｓｉｎ，  ａ  Ｎｏｖｅｌ  β−Ｐｏｒｅ−Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ，  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｈｏｓｔ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  Ｌｅｔｈａｌｉｔｙ，”  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１１，  Ｖｏｌ．  ７，  Ｉｓｓｕｅ  ９（参照により本明細書に組み込まれている）を参照されたい。用語「モナライシン様」および「モナライシンクラス」のタンパク質は、互換的に使用される。さらに、上記のように、本出願は、表１のＯｐｏｔａおよび配列番号８７に記載されるモナライシンの配列を提供する。
【０３１４】
元の環境試料からのリッチ培地上で単離された細菌から収集されたゲノムＤＮＡは、縮重ＰＣＲを使用していかなる増幅産物も生じなかった。このように、栄養制限寒天（特定の属の微生物に関して富化するために開発された）ステップは、当技術分野における現在の方法にしばしば利用可能ではない微生物にＩＰＤＰがアクセスすることができるという点で成功した。さらに、富化されたゲノムＤＮＡの配列決定は、上記の組合せアプローチ（すなわち、富化および縮重ＰＣＲ増幅）を利用して最終的に得られた数の配列を生じず、このことは、発見された殺虫タンパク質配列が、富化集団においても極めてまれであり、富化後の増幅ステップが一部の態様では好ましいことを示唆している。
【０３１５】
相同性およびプロファイル／ＨＭＭ法を利用した新規殺虫タンパク質の同定
ＩＰＤＰは、必要に応じて殺虫タンパク質を同定するためにＨＭＭの使用を伴い得る。公知の殺虫タンパク質に基づいて構築されたＨＭＭプロファイル（例えば、公知のモナライシンに基づいて構築されたＨＭＭ）を使用して、ＨＭＭプロファイルを使用して分析した場合に高いスコアを有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子に関して富化ＤＮＡライブラリーをスキャンすることができる。加えてまたはあるいは、富化ＤＮＡライブラリーにおける配列を、例えばＢＬＡＳＴ等の配列分析ツールを使用してゲノムデータベースにおける公知の殺虫タンパク質をコードする配列と比較すること、およびＧＥＮＢＡＮＫにおける配列に対して相互に最善にヒットする配列に関して検索することによって、新規殺虫タンパク質を同定することができる。
【０３１６】
ＨＭＭプロセスの例を実施例５に記載し、本明細書に記載の方法を使用して同定された殺虫タンパク質を使用して構築された例としてのＨＭＭを表６に提供する。ＨＭＭは、ＩＰＤＰを介して発見された、および表３に見出される８個の殺虫タンパク質を使用して構築した。これらのタンパク質は：ａ）ＺＩＰ１である配列番号２、ｂ）ＺＩＰ２である配列番号４、ｃ）ＺＩＰ６である配列番号１２、ｄ）ＺＩＰ８である配列番号１４、ｅ）ＺＩＰ９である配列番号１６、ｆ）ＺＩＰ１０である配列番号１８、ｇ）ＺＩＰ１１である配列番号２０、およびｈ）ＺＩＰ１２である配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する。新規殺虫タンパク質を発見するために、本明細書に開示の方法を使用して構築された富化ゲノムＤＮＡライブラリーを、表６に提供するＨＭＭを使用して検索することができる。比較に基づいて高いスコアを得た配列を、新規殺虫タンパク質として同定することができる。ある特定の実施形態では、高いスコアを有する配列は、表６のＨＭＭを使用してスコアを付けた場合に５２１．５のビットスコアまたはそれを上回るスコアを有する配列、および／または７．９ｅ−１６１より小さいまたはそれに等しいＥ値でマッチする配列である。
【０３１７】
このように、ある特定の実施形態では、本開示は、新規殺虫タンパク質、表６のＨＭＭを使用してスコアを付けた場合に５２１．５のビットスコアまたはそれを上回るスコアを有するアミノ酸配列、および／または７．９ｅ−１６１より小さいまたはそれに等しいＥ値でマッチする配列を有するタンパク質を提供する。これらのタンパク質は、任意の形態で（例えば、単離されたまたは組換えタンパク質）または本明細書に開示の組成物（例えば、植物または農業用組成物）のいずれかの一部として提供することができる。
【実施例】
【０３１８】
以下の実施例は、本開示の様々な実施形態を説明する目的のために与えられ、本開示をいかなるようにも制限しないことを意味する。特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨内に包含されるその変化および他の使用が、当業者に認識されるであろう。
【０３１９】
内容の簡単な表を、単に読者を助ける目的のために提供する。この表のいかなる内容も、本出願の実施例または開示の範囲を制限しないことを意味する。
【表２】
2021514643.tif 000033
【０３２０】
（実施例１：殺虫タンパク質発見プラットフォーム（ＩＰＤＰ））
本実施例は、ＩＰＤＰの実行を記載する。ＩＰＤＰに関するさらなる詳細は、実施例の節の直前の上記のＩＰＤＰの節に見出され得る。
【０３２１】
最初に、微生物多様性に富む環境試料からの材料５グラムを収集して保存した。
【０３２２】
この材料を、ＰＢＳ５０ｍＬに再懸濁し、１５分間連続して撹拌した。１５分後、大きい粒子を沈降させ、上清の連続希釈物を、真菌の成長を低減させるためにシクロヘキサミドを含有する所有権のある栄養制限寒天培地に播種した。プレートを１８℃で１０〜１４日間成長させた。
【０３２３】
これらのプレートにおける細菌成長物を、水４ｍＬによって繰り返し洗浄することによって収集し、１５ｍＬコニカルチューブに収集した。微生物細胞を遠心分離によってペレット化し、上清を捨てた。
【０３２４】
ゲノムＤＮＡを、ＰｒｏｍｅｇａのＷｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ精製キットを使用して細胞ペレットから単離した。
【０３２５】
所有権のある縮重プライマーを使用して、ＰＣＲを介してＤＮＡを増幅した。約８００ｂｐのアンプリコンをゲル精製し、ＤＮＡプラスミドベクターにクローニングした。
【０３２６】
クローニングしたアンプリコンを、サンガー配列決定を使用して配列決定し、コードされるタンパク質を、公表されたモナライシン配列（すなわち、Ｏｐｏｔａらに記載され、表１および配列番号８７に見出される配列）と比較した。
【０３２７】
（実施例２：ＩＰＤＰによって発見された新規殺虫タンパク質）
実施例１からの上記のＩＰＤＰは、以下の表３に示す少なくとも３６個の新規殺虫タンパク質を同定することができた。
【０３２８】
これらの３６個の新規殺虫タンパク質から、相同性に基づく分析により、これらのタンパク質の少なくとも３２個が、このクラスにおける任意の殺虫タンパク質の公知の配列同一性と少なくとも２０％の配列同一性の差を有することが明らかとなった。これは、本教示のＩＰＤＰの、当技術分野で見出されたタンパク質に対して新規である殺虫タンパク質を見出すことにおける能力を実証することから、有意な発見である。
【０３２９】
少なくとも２０％の配列同一性の差を有する３２個の配列のうち、このクラスの任意の公知のタンパク質と少なくとも２０％の配列同一性の差を有する８個の殺虫タンパク質を、さらなる解析のために選択し、これらは：（１）ＺＩＰ１、（２）ＺＩＰ２、（３）ＺＩＰ６、（４）ＺＩＰ８、（５）ＺＩＰ９、（６）ＺＩＰ１０、（７）ＺＩＰ１１、および（８）ＺＩＰ１２を含む。これらのタンパク質は、互いに有意な相同性を共有し、したがって、殺虫タンパク質のこの新規群において共有され得る保存された殺虫ドメインを示している。これらの８個のタンパク質のマルチプル配列アライメントは、図３に見出すことができ、対応する系統樹は図５に見出すことができる。
【表３−１】
2021514643.tif 000034
【表３−２】
2021514643.tif 000035
【表３−３】
2021514643.tif 000036
【表３−４】
2021514643.tif 000037
【表３−５】
2021514643.tif 000038
【表３−６】
2021514643.tif 000039
【表３−７】
2021514643.tif 000040
【表３−８】
2021514643.tif 000041
【表３−９】
2021514643.tif 000042
【表３−１０】
2021514643.tif 000043
【表３−１１】
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【表３−１２】
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【表３−１３】
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【表３−１４】
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【表３−１５】
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【表３−１６】
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【表３−１７】
2021514643.tif 000050
【表３−１８】
2021514643.tif 000051
【０３３０】
さらに、図４を参照することができ、これは、図６に見出される対応する系統樹と共に、発見された殺虫タンパク質のうちの８個（すなわち、ＺＩＰ１、ＺＩＰ２、ＺＩＰ６、ＺＩＰ８、ＺＩＰ９、ＺＩＰ１０、ＺＩＰ１１、およびＺＩＰ１２）を、モナライシンの配列と比較するマルチプル配列アライメントを説明する。
【０３３１】
以下の表４は、このクラスの任意の公知のタンパク質と少なくとも２０％の配列同一性の差を有する３２個の上記のタンパク質におけるパーセント同一性を説明する同一性マトリクスである。
【０３３２】
さらに、表５は、これらの新規に発見された３２個のタンパク質の同一性を、このクラスにおいて発見された最初のタンパク質であるモナライシンの同一性と比較する。表５に見られるように、本教示の殺虫タンパク質は、アミノ酸レベルでモナライシンとは十分に異なる。
【０３３３】
この結果は、本教示のＩＰＤＰが新規タンパク質を発見する能力をさらに説明する。
【表４】
2021514643.tif 000052
【表５】
2021514643.tif 000053
【０３３４】
表３の８個の新規殺虫タンパク質（すなわち、ＺＩＰ１、ＺＩＰ２、ＺＩＰ６、ＺＩＰ８、ＺＩＰ９、ＺＩＰ１０、ＺＩＰ１１、およびＺＩＰ１２）のマルチプル配列アライメントを、図５に見出される対応する系統樹と共に図３に見出すことができる。表３からの８個の新規殺虫タンパク質（すなわち、ＺＩＰ１、ＺＩＰ２、ＺＩＰ６、ＺＩＰ８、ＺＩＰ９、ＺＩＰ１０、ＺＩＰ１１、およびＺＩＰ１２）ならびにモナリシンのマルチプル配列アライメントを、図６に見出される対応する系統樹と共に図４に見出すことができる。
【０３３５】
（実施例３：殺虫タンパク質−ライセート昆虫摂食アッセイ）
ＺＩＰ１（配列番号２）、または空のベクター対照のいずれかを発現する細菌からのライセートを、昆虫摂食アッセイにおいてクサギカメムシ（Ｈａｌｙｏｍｏｒｐｈａ  ｈａｌｙｓ）を利用して水と比較した。
【０３３６】
２ｃｍの茎芯（ｗｉｃｋ）をライセートまたは水０．５ｍＬによって湿らせ、初齢若虫２匹（１回の観測）と共にプレートに入れた。ライセートまたは水あたり８回の観測を、全体で試料あたり１６匹の昆虫について試験した。
【０３３７】
７日後に死亡率を測定した。
【０３３８】
空のベクターを含有する細胞からの細菌ライセートを摂取させた昆虫は、水を摂取した昆虫と類似の死亡率レベルを示した。
【０３３９】
ＺＩＰ１（配列番号２）を発現する細菌ライセートを摂取させた昆虫は、このアッセイにおいて１００％の死亡率を示した。これらの結果を図１０に説明する。
【０３４０】
その結果、本明細書に教示の殺虫タンパク質は、半翅目およびカメムシ科のメンバーに対して有意な殺虫活性を実証する。
【０３４１】
（実施例４：殺虫タンパク質−精製タンパク質昆虫摂食アッセイ）
表３に示す３６個の新規殺虫タンパク質から、本発明者らは、１０個のタンパク質配列を操作して、精製のためにＮ末端の６×Ｈｉｓタンパク質タグと融合させた：ａ）ＺＩＰ１である配列番号２、ｂ）ＺＩＰ２である配列番号４、ｃ）ＺＩＰ４である配列番号８、ｄ）ＺＩＰ６である配列番号１２、ｅ）ＺＩＰ８である配列番号１４、ｆ）ＺＩＰ９である配列番号１６、ｇ）ＺＩＰ１０である配列番号１８、ｈ）ＺＩＰ１１である配列番号２０、ｉ）ＺＩＰ１２である配列番号２２、およびｉ）ＺＩＰ１６である配列番号２６。これらの１０個のタグ付きタンパク質を発現する細菌のライセートをＮｉ−ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）と共にインキュベートし、タンパク質に特異的に結合させた。これらのタンパク質をビーズから溶出させて透析し、クサギカメムシ（Ｈａｌｙｏｍｏｒｐｈａ  ｈａｌｙｓ）を利用する昆虫摂食アッセイのために使用した。
【０３４２】
クサギカメムシに関して、２ｃｍの茎芯を精製タンパク質、または緩衝液対照、または水０．５ｍＬによって湿らせ、２匹の初齢若虫と共にプレートに入れた（１回の観測）。ライセートまたは水あたり８回の観測を、全体で試料あたり１６匹の昆虫に関して試験した。
【０３４３】
５日後に死亡率を測定した。
【０３４４】
これらの１０個の精製タンパク質を摂取させた昆虫は、このアッセイにおいて様々な程度の死亡率を示した。これらの結果を図７に説明する。
【０３４５】
さらに、試験した１０個のタンパク質のうち、３つの精製タンパク質（ＺＩＰ１、ＺＩＰ２、およびＺＩＰ４）の様々な希釈物を、クサギカメムシによる昆虫摂食アッセイの反復実験のために使用して、Ｐｒｏｂｉｔ解析を通してＬＣ５０値を確立した。これらの結果を図８に説明する。
【０３４６】
その結果、本明細書に教示のこれらの殺虫タンパク質は、半翅目およびカメムシ科のメンバーに対して有意な殺虫活性を実証する。
【０３４７】
これらの殺虫タンパク質に関する昆虫の有効範囲を決定するために、本発明者らは、他の２つの主要な昆虫目のメンバー：鱗翅目のツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）および甲虫目のジュウイチホシウリハムシ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ）に対して昆虫バイオアッセイを実施した。簡単に説明すると、ツマジロクサヨトウの場合、暖かい多種昆虫用飼料を、標準的な１２８ウェルバイオアッセイトレイに、各ウェル内に１．５ｃｍ２の表面積を提供する１．０ｍｌ／ウェルの割合で分配する。各試験ウェルを、飼料表面に精製タンパク質４０μｌを適用することによって処理した。塗布を乾燥させた後、１匹のツマジロクサヨトウ幼虫を各ウェルに入れる。アッセイは、処理あたり１６個の個々のウェルからなる。緩衝液のみで処理したウェルを陰性対照とする。重量による成長を、７日後に測定した。
【０３４８】
ジュウイチホシウリハムシのために使用した方法は、ジュウイチホシウリハムシ特異的飼料を使用したことを除き、ツマジロクサヨトウのために使用した方法と類似であった。
【０３４９】
ＺＩＰ１、ＺＩＰ２およびＺＩＰ４を発現する精製タンパク質を摂取させた昆虫は、このアッセイにおいて様々な程度の成長阻害を示した。ツマジロクサヨトウの結果を図９Ａに説明し、ジュウイチホシウリハムシの結果を図９Ｂに説明する。
【０３５０】
結果として、本明細書に教示のこれらの殺虫タンパク質は、鱗翅目およびヤガ科、ならびに甲虫目およびハムシ科のメンバーに対して有意な成長阻害活性を実証する。
【０３５１】
（実施例５：相同性およびプロファイル／ＨＭＭ法（ＩＰＤＰ−ＨＭＭ構築）を利用する新規殺虫タンパク質の同定）
以前に考察したように、ＩＰＤＰは、必要に応じてＨＭＭアルゴリズムおよびモデリング手順の利用を伴い得る。この手順は、当技術分野のいくつかの方法、例えばＢＬＡＳＴを使用して同定することが可能ではないモナライシン様殺虫タンパク質をコードする遺伝子を同定する、発見された殺虫タンパク質配列からのＨＭＭプロファイルの開発を可能にする。
【０３５２】
ＨＭＭプロセスの例を以下に記載し、ＩＰＤＰを介して発見され、表３に見出され、図４に強調した８個の殺虫タンパク質を使用して構築した。本明細書に記載の方法を使用して同定された８個の殺虫タンパク質を使用して構築された例としてのＨＭＭを表６に提供する。これらのタンパク質は、ａ）ＺＩＰ１である配列番号２、ｂ）ＺＩＰ２である配列番号４、ｃ）ＺＩＰ６である配列番号１２、ｄ）ＺＩＰ８である配列番号１４、ｅ）ＺＩＰ９である配列番号１６、ｆ）ＺＩＰ１０である配列番号１８、ｇ）ＺＩＰ１１である配列番号２０およびｈ）ＺＩＰ１２である配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する。
【０３５３】
モデルを、ＨＭＭＥＲソフトウェア（バージョン３．１ｂ２；２０１５年２月）を使用して構築し、出力モデルは表６に見出すことができる。ＨＭＭは、上記の８個の配列を利用して、「モナライシン様」配列（８個の利用した配列に基づく）が必要とするモデルを創出した。ここで、ＨＭＭに基づいて、新規発見配列が「モナライシン様」配列である可能性を決定するために、ＩＰＤＰによって発見される未来の推定殺虫タンパク質をさらに解析することが可能である。
【０３５４】
（実施例６：形質転換植物）
本明細書に開示の殺虫タンパク質の安定な発現のために目的の植物（例えば、トウモロコシおよびダイズ）を形質転換する実験を実施した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオアッセイ（例えば、実施例４を参照されたい）において昆虫を死滅させることが実証された３つのＺＩＰタンパク質、ＺＩＰ１、ＺＩＰ２およびＺＩＰ４を、目的の２つの作物植物−ダイズおよびトウモロコシを形質転換するために選択した。これらの配列を、目的の植物における最適な発現のためにコドン最適化し、合成して、ダイズおよびトウモロコシの両方のための特異的発現ベクターにクローニングした。
【０３５５】
ダイズ
【０３５６】
ダイズ種子を２０％クロロックスによって表面殺菌し、滅菌水ですすいだ後、室温で２時間放置することによって刺激した。次に、種子を発芽培地中で一晩浸す。翌日に、種子から種皮および子葉を除去することによって、分裂組織外植体を調製する。次に分裂組織外植体を、多様な条件下で乾燥させるか、またはそのまま使用する。微粒子銃ＤＮＡ送達の場合、ベクターを、標準的なプロトコールに従ってＢｉｏ−Ｒａｄ  ＰＤＳ−１０００ヘリウムガンを介する粒子衝突のために金粒子（０．６μｍ）上にコーティングする。粒子衝突の場合、外植体を一晩プレ培養し、衝突させ、休息させた後、選択のために移入する。スペクチノマイシン抵抗性の小植物からの苗条を収穫し、ＩＡＡおよびスペクチノマイシンを含有する発根培地で発根させる。発根した植物を土壌に移植し、温室で成長させてＴ１種子を作出する。
【０３５７】
トウモロコシ
【０３５８】
温室または圃場で成長させたＨｉ−ＩＩトウモロコシからの未成熟胚（１．５〜２．０ｍｍ）を、滅菌フード内で切断する。胚を２３℃の暗所でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＡＧＬ−１と共に１〜２日間、最終ＯＤ６６０が約０．４で、固体同時培養培地上で軸側を下にして同時培養する。次に、胚を固体誘導培地に移し、軸側を下にして、２８℃の暗所で５日間インキュベートする。次に、胚を固体選択１培地（ビアラホス）に移し、２８℃の暗所で２週間インキュベートする。胚を、固体選択培地２（ビアラホス）に移し、２８℃の暗所でインキュベートする。抵抗性のカルス形成胚を、直径が約１．５〜２ｃｍとなるまで２週間毎に移す。抵抗性のカルスを固体再生培地１に２８℃で２週間移す。苗条および根が発達するまで、カルスを再生培地２に、２８℃で１６時間の照明期間で移す。小植物を土壌に移し、成熟するまで成長させる。
【０３５９】
本開示で教示される殺虫タンパク質を発現する植物を選択するために、抗生物質選択培地を、カルスから再生した苗条をさらに成長させるために使用し、再生した植物を、本明細書に開示の殺虫タンパク質の発現に関して試験した。図１１に示すように、ＺＩＰ１、ＺＩＰ２およびＺＩＰ４タンパク質の発現を、形質転換ダイズ植物の葉からのＺＩＰ特異的抗体によるウエスタンブロッティングによって検出した（図１１のレーン２〜１０および１２〜１３）。同様に、ＺＩＰ２タンパク質発現を、ＺＩＰ２に対して特異的な発現ベクターによって形質転換したトウモロコシ植物の葉において確認した（図１１のレーン１５および１６）。表３に見出される殺虫タンパク質を発現する他のトランスジェニックダイズおよびトウモロコシ植物は、目的のタンパク質の発現に関して試験中である。
【０３６０】
さらに、昆虫摂食アッセイを、実施例６に示す     ＺＩＰ１、ＺＩＰ２、およびＺＩＰ４を含む目的の殺虫タンパク質、ならびに表３に見出される他のＺＩＰタンパク質を安定に発現する形質転換植物の部分（例えば、葉、茎、根、花、果実、種子、または実生）について実施中である。
【表６−１】
2021514643.tif 000054
【表６−２】
2021514643.tif 000055
【表６−３】
2021514643.tif 000056
【表６−４】
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【表６−５】
2021514643.tif 000058
【表６−６】
2021514643.tif 000059
【表６−７】
2021514643.tif 000060
【表６−８】
2021514643.tif 000061
【表６−９】
2021514643.tif 000062
【表６−１０】
2021514643.tif 000063
【表６−１１】
2021514643.tif 000064
【表６−１２】
2021514643.tif 000065
【表６−１３】
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【表６−１４】
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【表６−１５】
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【表６−１６】
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【０３６１】
本開示の番号付きの実施形態
添付の特許請求の範囲があるとはいえ、本開示は、次の番号付きの実施形態を表記する：
単離された核酸
１．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２からなる群より選択されるタンパク質に対し少なくとも約８０％の配列同一性を有する殺虫タンパク質をコードする、単離された核酸分子。
２．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２からなる群より選択されるタンパク質に対し少なくとも約９０％の配列同一性を有する殺虫タンパク質をコードする、実施形態１に記載の単離された核酸分子。
３．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２からなる群より選択されるタンパク質に対し少なくとも約９５％の配列同一性を有する殺虫タンパク質をコードする、実施形態１に記載の単離された核酸分子。
４．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２からなる群より選択されるタンパク質に対し少なくとも約９９％の配列同一性を有する殺虫タンパク質をコードする、実施形態１に記載の単離された核酸分子。
５．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２からなる群より選択される殺虫タンパク質をコードする、実施形態１に記載の単離された核酸分子。
６．目的の宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態１に記載の単離された核酸分子。
７．植物細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態１に記載の単離された核酸分子。
８．配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９および配列番号７１からなる群より選択される、実施形態１に記載の単離された核酸分子。
９．表３に提示されている単離された核酸。
１０．表３に提示されている単離されたタンパク質、ポリペプチド、アミノ酸配列、またはそれらのバリアント。
ヌクレオチド構築物
１．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２からなる群より選択されるタンパク質に対し少なくとも約８０％の配列同一性を有する殺虫タンパク質をコードする核酸分子を含むヌクレオチド構築物であって、前記核酸分子が、異種調節エレメントに作動可能に連結されている、ヌクレオチド構築物。
２．前記核酸分子が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２からなる群より選択されるタンパク質に対し少なくとも約９０％の配列同一性を有する殺虫タンパク質をコードする、実施形態１に記載のヌクレオチド構築物。
３．前記核酸分子が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２からなる群より選択されるタンパク質に対し少なくとも約９５％の配列同一性を有する殺虫タンパク質をコードする、実施形態１に記載のヌクレオチド構築物。
４．前記核酸分子が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２からなる群より選択されるタンパク質に対し少なくとも約９９％の配列同一性を有する殺虫タンパク質をコードする、実施形態１に記載のヌクレオチド構築物。
５．前記核酸分子が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２からなる群より選択される殺虫タンパク質をコードする、実施形態１に記載のヌクレオチド構築物。
６．前記異種調節エレメントが、プロモーターである、実施形態１に記載のヌクレオチド構築物。
７．発現カセットに含有される、実施形態１に記載のヌクレオチド構築物。
８．前記異種調節エレメントが、植物においてコードされたタンパク質を発現することができる、実施形態１に記載のヌクレオチド構築物。
９．前記核酸分子が、目的の宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態１に記載のヌクレオチド構築物。
１０．前記核酸分子が、植物細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態１に記載のヌクレオチド構築物。
１１．前記核酸分子が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９および配列番号７１からなる群より選択される、実施形態１に記載のヌクレオチド構築物。
１２．実施形態１に記載のヌクレオチド構築物を含む、発現ベクター。
１３．実施形態１に記載のヌクレオチド構築物を含む、プラスミド。
１４．実施形態１に記載のヌクレオチド構築物を含む、宿主細胞。
１５．昆虫を死滅させる方法であって、昆虫を、実施形態１に記載のヌクレオチド構築物を発現する宿主細胞と接触させるステップを含む、方法。
１６．実施形態１に記載のヌクレオチド構築物を含む、原核宿主細胞。
１７．実施形態１に記載のヌクレオチド構築物を含む、真核宿主細胞。
１８．実施形態１に記載のヌクレオチド構築物を含む、植物細胞。
１９．実施形態１に記載のヌクレオチド構築物を含む、単子葉類植物細胞。
２０．実施形態１に記載のヌクレオチド構築物を含む、双子葉類植物細胞。
２１．実施形態１に記載のヌクレオチド構築物で安定に形質転換された植物。
２２．実施形態１に記載のヌクレオチド構築物で安定に形質転換された植物によって作出される種子。
単離されたタンパク質
１．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２に対し少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された殺虫タンパク質。
２．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２に対し少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離された殺虫タンパク質。
３．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２に対し少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離された殺虫タンパク質。
４．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２に対し少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離された殺虫タンパク質。
５．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の単離された殺虫タンパク質。
組換えタンパク質
１．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２に対し少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え殺虫タンパク質。
２．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２に対し少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の組換え殺虫タンパク質。
３．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２に対し少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の組換え殺虫タンパク質。
４．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２に対し少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の組換え殺虫タンパク質。
５．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の組換え殺虫タンパク質。
トランスジェニック植物細胞
１．ａ．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種調節配列と
を含むＤＮＡ構築物を含む、トランスジェニック植物細胞。
２．前記ポリヌクレオチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、実施形態１に記載のトランスジェニック植物細胞。
３．前記異種調節エレメントが、プロモーターである、実施形態１に記載のトランスジェニック植物細胞。
４．単子葉類種に由来する、実施形態１に記載のトランスジェニック植物細胞。
５．トウモロコシ、コムギ、カラスムギまたはイネに由来する、実施形態１に記載のトランスジェニック植物細胞。
６．双子葉類種に由来する、実施形態１に記載のトランスジェニック植物細胞。
７．ワタ、ジャガイモまたはダイズに由来する、実施形態１に記載のトランスジェニック植物細胞。
８．農業用条播作物種に由来する、実施形態１に記載のトランスジェニック植物細胞。
トランスジェニック植物
１．ａ．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、
ｂ．ポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種調節配列と
を含むＤＮＡ構築物で安定に形質転換されたトランスジェニック植物。
２．前記ポリヌクレオチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、実施形態１に記載のトランスジェニック植物。
３．前記異種調節エレメントが、プロモーターである、実施形態１に記載のトランスジェニック植物。
４．単子葉類種である、実施形態１に記載のトランスジェニック植物。
５．トウモロコシ、コムギ、カラスムギまたはイネである、実施形態１に記載のトランスジェニック植物。
６．双子葉類種である、実施形態１に記載のトランスジェニック植物。
７．ワタ、ジャガイモまたはダイズである、実施形態１に記載のトランスジェニック植物。
８．農業用条播作物種に由来する、実施形態１に記載のトランスジェニック植物。
９．実施形態１に記載の植物によって作出される種子。
１０．実施形態１に記載の植物から作出される後代植物。
１１．モナライシンタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ殺虫タンパク質、Ｃｒｙタンパク質、Ｃｙｔタンパク質、栄養型殺虫タンパク質、毒素複合体タンパク質、およびこれらの任意の組合せをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物をさらに含む、実施形態１に記載のトランスジェニック植物。
１２．標的有害生物を死滅させる方法であって、実施形態１に記載のトランスジェニック植物をある区域に提供するステップを含み、前記標的有害生物が、トランスジェニック植物に曝露される、方法。
１３．標的有害生物を死滅させる方法であって、実施形態１に記載のトランスジェニック植物をある区域に提供するステップを含み、前記標的有害生物が、トランスジェニック植物を摂食する、方法。
１４．殺有害生物タンパク質に対し抵抗性である標的有害生物を死滅させる方法であって、実施形態１に記載のトランスジェニック植物をある区域に提供するステップを含み、前記標的有害生物が、トランスジェニック植物に曝露され、標的有害生物が、モナライシンタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ殺虫タンパク質、Ｃｒｙタンパク質、Ｃｙｔタンパク質、栄養型殺虫タンパク質、毒素複合体タンパク質、およびこれらの任意の組合せの少なくとも１種に対し抵抗性である、方法。
１５．殺有害生物タンパク質に対し抵抗性である標的有害生物を死滅させる方法であって、実施形態１に記載のトランスジェニック植物をある区域に提供するステップを含み、前記標的有害生物が、トランスジェニック植物を摂食し、標的有害生物が、モナライシンタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ殺虫タンパク質、Ｃｒｙタンパク質、Ｃｙｔタンパク質、栄養型殺虫タンパク質、毒素複合体タンパク質、およびこれらの任意の組合せの少なくとも１種に対し抵抗性である、方法。
１６．標的有害生物を死滅させる方法であって、実施形態１に記載のトランスジェニック植物をある区域に提供するステップを含み、前記標的有害生物が、トランスジェニック植物に曝露され、前記標的有害生物が、甲虫目、双翅目、膜翅目、鱗翅目、半翅目、直翅目、総翅目または革翅目のメンバーである、方法。
農業組成物
１．ａ．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を有する単離された殺虫タンパク質と、
ｂ．農業的に許容される担体と
を含む、殺虫組成物。
２．単離された殺虫タンパク質が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、実施形態１に記載の殺虫組成物。
３．前記単離された殺虫タンパク質が、殺虫有効量で存在する、実施形態１に記載の殺虫組成物。
４．前記農業的に許容される担体が、アジュバント、不活性構成成分、分散剤、界面活性剤、固着剤、粘着付与剤、結合剤、天然または再生ミネラル物質、溶媒、湿潤剤、肥料、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種である、実施形態１に記載の殺虫組成物。
５．乾燥固体として製剤化された、実施形態１に記載の殺虫組成物。
６．液体として製剤化された、実施形態１に記載の殺虫組成物。
７．葉面適用のために製剤化された、実施形態１に記載の殺虫組成物。
８．畝間（ｉｎ−ｆｕｒｒｏｗ）適用のために製剤化された、実施形態１に記載の殺虫組成物。
９．種子コーティングまたは種子処理として製剤化された、実施形態１に記載の殺虫組成物。
１０．少なくとも１種の追加的な殺有害生物化合物をさらに含む、実施形態１に記載の殺虫組成物。
１１．モナライシンタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ殺虫タンパク質、Ｃｒｙタンパク質、Ｃｙｔタンパク質、栄養型殺虫タンパク質、毒素複合体タンパク質、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１種の追加的な殺有害生物化合物をさらに含む、実施形態１に記載の殺虫組成物。
１２．少なくとも１種の追加的な除草化合物をさらに含む、実施形態１に記載の殺虫組成物。
１３．標的有害生物を死滅させる方法であって、前記標的有害生物に、実施形態１に記載の殺虫組成物を適用するステップを含む、方法。
１４．標的有害生物を死滅させる方法であって、場所に、実施形態１に記載の殺虫組成物を適用するステップを含み、前記標的有害生物が、前記場所と接触する、方法。
１５．標的有害生物を死滅させる方法であって、作物に、実施形態１に記載の殺虫組成物を適用するステップを含み、前記標的有害生物が、前記作物と接触する、方法。
１６．標的有害生物を死滅させる方法であって、作物に、実施形態１に記載の殺虫組成物を適用するステップを含み、前記標的有害生物が、前記作物と接触し、前記標的有害生物が、甲虫目、双翅目、膜翅目、鱗翅目、半翅目、直翅目、総翅目または革翅目のメンバーである、方法。
細胞ライセート
１．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２に対し少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む殺虫タンパク質を含む、細胞ライセート。
２．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２に対し少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む殺虫タンパク質を含む、実施形態１に記載の細胞ライセート。
３．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２に対し少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む殺虫タンパク質を含む、実施形態１に記載の細胞ライセート。
４．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２に対し少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む殺虫タンパク質を含む、実施形態１に記載の細胞ライセート。
５．配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２から選択されるアミノ酸配列を含む殺虫タンパク質を含む、実施形態１に記載の細胞ライセート。
６．標的有害生物を死滅させる方法であって、前記標的有害生物に、実施形態１に記載の細胞ライセートを適用するステップを含む、方法。
殺虫タンパク質を発現する天然微生物により有害生物を死滅させる方法
１．標的有害生物を死滅させる方法であって、前記標的有害生物に、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する宿主細胞を適用するステップを含む、方法。
２．宿主細胞が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する、実施形態１に記載の方法。
３．宿主細胞が、原核宿主細胞である、実施形態１に記載の方法。
４．宿主細胞が、ポリヌクレオチドを天然に発現する、実施形態１に記載の方法。
５．宿主細胞が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に由来する、実施形態１に記載の方法。
６．前記標的有害生物が、甲虫目、双翅目、膜翅目、鱗翅目、半翅目、直翅目、総翅目または革翅目のメンバーである、実施形態１に記載の方法。
殺虫タンパク質発見プラットフォーム
１．殺虫タンパク質をコードするＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来のＤＮＡが富化されたゲノムライブラリーを構築するための方法であって、
ａ．１種または複数の微生物を含む初期試料を提供するステップと、
ｂ．初期試料を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来の種の成長を富化する固体栄養限定培地に曝露し、これにより、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．が富化されたその後の試料をもたらすステップと、
ｃ．その後の富化された試料からＤＮＡを単離するステップと、
ｄ．単離されたＤＮＡからＤＮＡを抽出し、標的殺虫タンパク質遺伝子を増幅するために選択されたプライマーによる縮重ＰＣＲを行うステップと、
ｅ．ＰＣＲ増幅されたＤＮＡをプラスミドにクローニングするステップと、
ｆ．前記プラスミドからクローニングされたＤＮＡを配列決定するステップと
を含む、方法。
２．配列決定されたＤＮＡをゲノムライブラリーへとアセンブルするステップをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
３．配列決定されたＤＮＡ内の殺虫タンパク質遺伝子を同定するステップをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
４．配列決定されたＤＮＡ内の殺虫タンパク質遺伝子を同定するステップをさらに含み、前記同定された殺虫タンパク質遺伝子が、未知のものである、実施形態１に記載の方法。
５．隠れマルコフモデルを利用して、配列決定されたＤＮＡ内の殺虫タンパク質遺伝子を同定するステップをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
６．配列決定されたＤＮＡ内の殺虫タンパク質遺伝子を同定するステップをさらに含み、前記同定された殺虫タンパク質遺伝子が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９および７１からなる群より選択される、実施形態１に記載の方法。
７．配列決定されたＤＮＡ内の殺虫タンパク質遺伝子を同定するステップをさらに含み、前記同定された殺虫タンパク質遺伝子が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０および７２からなる群より選択されるタンパク質をコードする、実施形態１に記載の方法。
８．プライマーが、配列番号３９に対し少なくとも５０％の配列同一性を有するタンパク質をコードする標的殺虫タンパク質遺伝子を増幅するために選択される、実施形態１に記載の方法。
９．初期試料が、土壌に由来する、実施形態１に記載の方法。
１０．実施形態１に記載の方法によって構築される、殺虫タンパク質をコードするＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来のＤＮＡが富化された殺虫ゲノムライブラリー。
ＨＭＭモデルタンパク質
１．表６におけるＨＭＭを使用してスコア化またはマッチされたときに、ａ）５２１．５のビットスコアのもしくはそれを上回るスコアを得るアミノ酸配列；および／またはｂ）７．９ｅ−１６１に満たないもしくはそれに等しいＥ値でマッチするアミノ酸配列を含む、殺虫タンパク質。
【０３６２】
表３に表記されている殺虫タンパク質をコードする核酸、または表３に表記されているアミノ酸配列を有する殺虫タンパク質は、害虫の防除のためにこれらを使用する方法、およびこれらを発見する方法と共に、本開示の実施形態である。
【０３６３】
参照による援用
本明細書に引用されているあらゆる参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開および特許出願は、あらゆる目的のため、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。しかし、本明細書に引用されているいかなる参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開および特許出願の言及も、これらが、有効な先行技術を構成する、または世界のいずれかの国における共通一般知識の一部を形成することの承認またはいかなる形態の示唆でもなく、そのように受け取るべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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