(57)【要約】  本発明は、Ｔｉｅ−２に対する抗体またはその抗原結合フラグメント、それをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ベクターで形質転換された細胞、前記抗体またはその抗原結合フラグメントの製造方法、および前記抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、血管新生疾患を予防または処置するための組成物に関する。【選択図】  なし
2021526801.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２を含むＴｉｅ２  Ｉｇ３−ＦＮＩＩＩ（１−３）ドメインに結合する、抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１の配列を構成するＴｉｅ２のアミノ酸６３３〜６４４および／またはアミノ酸７１３〜７２６に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、
配列番号３〜５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域および配列番号６〜８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域；
配列番号１３〜１５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域および配列番号１６〜１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域；
配列番号２３〜２５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域および配列番号２６〜２８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域；
配列番号３３〜３５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域および配列番号３６〜３８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域；または
配列番号４３〜４５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域および配列番号４６〜４８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、
配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号５７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸。
【請求項６】
前記核酸が、配列番号１０、１２、２０、２２、３０、３２、４０、４２、５０、５２、５５、５６、５９、６０、６３、６４、６７または６８を含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項５の核酸を含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７の発現ベクターを用いて形質転換された細胞。
【請求項９】
Ｔｉｅ２に結合する抗体または抗原結合フラグメントを製造する方法であって、
（ａ）請求項８の細胞の培養プロセス；および
（ｂ）培養細胞からの抗体またはその抗原結合フラグメントの回収プロセスを含む、方法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを有効成分として含む、血管新生疾患を予防または処置するための組成物。
【請求項１１】
組成物が以下を特徴とする、請求項１０に記載の方法：
血管新生疾患が、がん、転移、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植片拒絶、黄斑変性症、血管新生緑内障、全身性紅皮症、増殖性網膜症、乾癬、血友病関節炎、関連硬化症、アテローム性動脈硬化症プラークの毛細血管形成、ケロイド、創傷肉芽、血管接着、関節リウマチ、骨関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、間接リウマチ、猫引っかき傷、潰瘍、肝硬変、腎炎、糖尿病性腎症、糖尿病、炎症性疾患、および神経変性疾患からなる群より選択される。
【請求項１２】
組成物が以下を特徴とする、請求項１１に記載の方法：
がんが、食道がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、口腔がん、咽頭のがん、喉頭がん、肺がん、結腸がん、乳がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、膀胱がん、腎がん、肝がん、膵臓がん、骨がん、結合組織がん、皮膚がん、脳がん、甲状腺がん、白血病、ホジキンリンパ腫、リンパ腫、および多発性骨髄性血液がんからなる群より選択される。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、血管新生疾患用の他の治療薬との併用治療のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［１］  本発明は、Ｔｉｅ−２に対する抗体またはその抗原結合フラグメント、それらをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ベクターを用いて形質転換された細胞、前記抗体またはその抗原結合フラグメントを製造する方法、および血管新生疾患を予防または処置するための医薬組成物に関する。
［２］
【背景技術】
【０００２】
［３］  血管新生は、生物の発生、成長、維持および恒常性のなかで、様々な調節因子によって動的に発生する。この過程で新たに形成された血管は、その周辺の細胞では、栄養素、酸素およびホルモンなどの様々な生体材料の輸送チャネルとして機能する。機能的および構造的に異常な血管は、様々な疾患の発症および進行の直接的または間接的な原因である。腫瘍血管は、その機能上および構造上の欠陥のために低酸素症を悪化させ、結果的に腫瘍の進行および他の組織への転移をもたらし、また腫瘍塊の中心への抗がん剤の不十分な送達をもたらすためである。血管の欠陥は、がんに加えて、他の様々な疾病および状態でも見られる。その例としては、様々な眼の疾患（例えば糖尿病性黄斑浮腫、湿性加齢性黄斑変性症）、ウイルス感染症および敗血症などの急性炎症反応が挙げられる。したがって、病的な血管を正常化させることができる治療薬が利用可能であれば、それを、血管異常を有する様々な患者の処置に適用できる。
【０００３】
［４］  アンジオポエチンファミリーは、血管の形成および維持に重要な役割を果たし、４つのアンジオポエチン（Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３およびＡｎｇ４）で構成される。アンジオポエチン−１（Ａｎｇ１）は、血管内皮細胞の表面に存在するＴｉｅ２受容体に結合して、Ｔｉｅ２受容体をリン酸化および活性化し、結果的に、血管の安定化をもたらす。他方、アンジオポエチン−２（Ａｎｇ２）は、Ｔｉｅ２受容体に結合するが、アンタゴニストとして作用してＴｉｅ２受容体の不活性化を誘発し、結果的に、血管の不安定化および血管の漏出を引き起こす。Ａｎｇ２の発現レベルは、がん患者、眼の疾患、ウイルスおよび細菌感染症、ならびに炎症性疾患の血液で非常に増加していることが報告された（Ｓａｈａｒｉｎｅｎ  Ｐ等、２０１７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）。しかしながら、Ａｎｇ２は、リンパ管の形成および維持を含むいくつかの過程では、Ｔｉｅ２受容体の活性化を誘導するアゴニストとしても作用することが知られており、状況に応じて様々な機能を果たすと考えられている。
【０００４】
［５］  これまでに、様々な抗Ａｎｇ２抗体の開発および臨床試験が、多くのバイオ医薬品企業（例えば米国特許第７，６５８，９２４号および米国特許第８，９８７，４２０号）によって集中的に行われてきた。これらのＡｎｇ２抗体はＡｎｇ２のＴｉｅ２への結合を阻害し、これらのＡｎｇ２中和効果が最終的に新しい血管の形成を妨げることを示した。これらの抗Ａｎｇ２抗体の抗血管新生および抗がん活性は、多くの前臨床モデルで実証され、様々な抗Ａｎｇ２抗体が様々ながん患者で臨床試験されている。しかしながら、それらの抗がん作用は不十分であることが実証されている。例えばアムジェンが実施した第３相臨床試験では、卵巣がん患者におけるＡｎｇ２抗体の抗がん作用はわずかに過ぎないことが示された（Ｍａｒｔｈ  Ｃ等、２０１７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ）。がんモデルに加えて、Ａｎｇ２中和抗体であるネスバクマブは眼の患者で試験されたが、その臨床第２相併用試験でＥｙｌｅａ（抗ＶＥＧＦ）の有効性を改善できなかった。
【０００５】
［６］  前記したＡｎｇ２中和アプローチとは対照的に、直接的なＴｉｅ２活性化が、血管新生を阻害し、血管の透過を抑制するための代替アプローチとしても検討されている。Ｔｉｅ２受容体に直接結合し、Ｔｉｅ２のリン酸化および活性化を誘導する組換えタンパク質も開発され、多くの前臨床のがんおよび眼のモデルにて試験された。その例には、ＣＯＭＰ−Ａｎｇｌ（Ｃｈｏ等、２００４，ＰＮＡＳ）およびＶａｓｃｕｌｏｔｉｄｅ（Ｄａｖｉｄ  Ｓ等、２０１１，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ）が挙げられる。これらの薬剤は、抗血管新生および抗透過活性を示したが、非常に短い半減期および不安定な物理化学的特性を有する。さらに、リン酸化Ｔｉｅ２からリン酸基を除去することによってＴｉｅ２を不活性化するホスファターゼＶＥ−ＰＴＰの阻害剤として、小分子化合物（ＡＫＢ−９７７８）が開発された（Ｇｏｅｌ  Ｓ，２０１３，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ）。この化合物は、ＶＥ−ＰＴＰを阻害することによって間接的にＴｉｅ２活性を増加させるが、他の受容体も活性化するという欠点がある（Ｆｒｙｅ  Ｍ，２０１５，Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ、Ｈａｙａｓｈｉ  Ｍ，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、Ｍｅｌｌｂｅｒｇ  Ｓ等、２００９，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．）。さらに、アゴニストＴｉｅ２抗体が開発された（米国特許第６３６５１５４号、米国特許出願公開第２０１７０１７４７８９号）。これらの抗体は内皮細胞の生存を増加させ、血管漏出を抑制した。興味深いことに、ハーブ抽出物がＴｉｅ２活性を活性化することを示し、スキンケア化粧品との使用が主張された（例えば日本出願公開第２０１１１０２２７３号、日本出願公開第２０１８０４３９４９号、日本出願公開第２０１５１６８６５６号）。
【０００６】
［７］  この技術的背景のもと、本願発明者らは、Ｔｉｅ２に特異的に結合する抗体を開発するための努力を行った。その結果、本発明者らは、親和性でもって結合するＴｉｅ２抗体を開発し、これらのＴｉｅ２抗体がＴｉｅ２受容体のリン酸化および活性化を誘導することにより、血管新生疾患の治療薬として役立つことを確認し、本発明を完成させた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第７，６５８，９２４号
【特許文献２】米国特許第８，９８７，４２０号
【特許文献３】日本出願公開第２０１１１０２２７３号
【特許文献４】日本出願公開第２０１８０４３９４９号
【特許文献５】日本出願公開第２０１５１６８６５６号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓａｈａｒｉｎｅｎ  Ｐ等、２０１７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ
【非特許文献２】Ｍａｒｔｈ  Ｃ等、２０１７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ
【非特許文献３】Ｃｈｏ等、２００４，ＰＮＡＳ
【非特許文献４】Ｄａｖｉｄ  Ｓ等、２０１１，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ
【非特許文献５】Ｇｏｅｌ  Ｓ，２０１３，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ
【非特許文献６】Ｆｒｙｅ  Ｍ，２０１５，Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ
【非特許文献７】Ｈａｙａｓｈｉ  Ｍ，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ
【非特許文献８】Ｍｅｌｌｂｅｒｇ  Ｓ等、２００９，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．［８］
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
［９］（発明の要約）
［１０］  本発明の目的は、新規の抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合フラグメントを提供することである。
【００１０】
［１１］  本発明の別の目的は、前記抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸を提供することである。
【００１１】
[１２」  本発明の別の目的は、前記核酸を含むベクター、前記ベクターで形質転換された細胞、およびその製造方法を提供することである。
【００１２】
［１３］  本発明の別の目的は、前記抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、血管新生疾患を予防または処置するための組成物を提供することである。
【００１３】
［１４］  本発明の別の目的は、前記抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物、および血管新生疾患のための他の治療薬との同時投与のための組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
［１５］  上記目的を達成するために、本発明は、配列番号２の配列を含むＩｇ３−ＦＮＩＩＩ（１−３）ドメインに結合する抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１５】
［１６］  具体的には、本発明は、配列番号３〜５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域、配列番号６〜８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域；配列番号１３〜１５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域、配列番号１６〜１８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域；配列番号２３〜２５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域、配列番号２６〜２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域；配列番号３３〜３５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域、配列番号３６〜３８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域；または配列番号４３〜４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域、配列番号４６〜４８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域、を含む抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
【００１６】
［１７］  本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸を提供する。
【００１７】
［１８］  本発明はまた、前記核酸をコードするベクターを提供する。
【００１８】
［１９］  本発明はまた、前記ベクターを用いて形質転換された細胞を提供する。
【００１９】
［２０］  本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合フラグメントの製造方法であって、以下の工程：（ａ）その細胞を培養するための工程；および（ｂ）前記細胞からの前記抗体またはその抗原結合フラグメントの回収工程を含む、製造方法を提供する。
【００２０】
［２１］  本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合フラグメントを有効成分として含む、血管新生関連の疾患を予防または処置するための組成物を提供する。
【００２１】
［２２］  本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、他の血管新生疾患治療薬との同時投与のための組成物を提供する。
［２３］
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】［２４］  図１は、抗Ｔｉｅ２抗体によって誘導されるＡｋｔリン酸化に関する分析結果である。ＨＵＶＥＣを６時間の血清飢餓状態とし、ＣＯＭＰ−Ａｎｇ１（ＣＡ１、０．５μｇ／ｍｌ）または抗Ｔｉｅ２抗体（１１Ｃ４、４Ａ４、３Ｂ２、３Ｅ１２および３Ｈ７）とともに３０分間インキュベートした。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティングに供し、ブロットを抗ホスホＡｋｔ（Ｓ４７３）または抗Ａｋｔ抗体用いて調べた。
【００２３】
【図２】［２５］  図２は、抗Ｔｉｅ２抗体３Ｈ７によって引き起こされる用量依存的なＴｉｅ２リン酸化（ｐＴｉｅ２）についての分析結果である。Ｔｉｅ２リン酸化を誘導する３Ｈ７抗体の能力は、免疫沈降およびウエスタンブロッティング分析によって調べた。血清飢餓ＨＵＶＥＣを様々な濃度の３Ｈ７抗体とともに３０分間インキュベートした。コントロールとして、ＨＵＶＥＣをＡｎｇ２／コントロールＡｂ混合物とともにインキュベートした。その細胞溶解物を抗Ｔｉｅ２抗体で免疫沈降させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティング分析を行った。Ｔｉｅ２リン酸化は、マウス抗ホスホチロシン（ｐＹ）抗体４Ｇ１０によって調べた。
【００２４】
【図３】［２６］  図３は、抗Ｔｉｅ２抗体３Ｈ７によって引き起こされるＴｉｅ２エンドサイトーシスおよびＦＯＸＯ１移行に関する結果である。ＨＵＶＥＣを６時間血清飢餓状態とし、３Ｈ７またはＡｎｇ２（Ａ２）およびコントロール抗Ａｎｇ２抗体（コントロールＡｂ、１μｇ／ｍｌ）とともに３０分間インキュベートした。固定化後、ＨＵＶＥＣをＤＡＰＩ（青）、抗Ｔｉｅ２抗体（緑）、および抗ＦＯＸＯ１抗体（赤）で染色し、クラスター化したＴｉｅ２受容体およびＦＯＸＯ１の局在を調べた。矢頭は３Ｈ７によってエンドサイトーシスされたＴｉｅ２受容体を示す。
【００２５】
【図４】［２７］  図４は、ＶＥＧＦまたはＴＮＦ−α誘導型血管透過性の３Ｈ７による阻害に関する結果である。ＨＵＶＥＣをトランスウェルチャンバーに播種し、３日間増殖させた。ＨＵＶＥＣを１００％コンフルエンスでＡｎｇ２（Ａ２、１μｇ／ｍｌ）、Ａｎｇ２およびコントロールＡｂ（Ａ２＋コントロールＡｂ、１μｇ／ｍｌ）または３Ｈ７（１μｇ／ｍｌ）とともに３０分間前処理し、そしてＶＥＧＦ（５００ｎｇ／ｍｌ）を用いて４５分間（Ａ）またはＴＮＦ−α（１００ｎｇ／ｍｌ）で２２時間（Ｂ）、上部チャンバーにて処理した。血管透過性は、ＦＩＴＣ−デキストランを上部チャンバーに２０分間添加した後、下部チャンバーのＦＩＴＣ蛍光を測定することによって評価した。値は平均±ＳＤである。一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）にて、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００２６】
【図５】［２８］  図５は、Ｔｉｅ２単独またはＴｉｅ２／３Ｈ７コンプレックスを水素／重水素（Ｈ／Ｄ）交換質量分析にて試験した場合の、重水素取り込みの有意差領域を示すヒートマップに関する結果である。Ｈ／Ｄ交換質量分析のデータを用いて、抗Ｔｉｅ２抗体３Ｈ７の非存在下または存在下、０．３３３分、１０分、６０分および２４０分でのｈＴｉｅ２抗原についての残基あたりの重水素取り込みのヒートマップを作成した。カラースケールは、個々の時間でのＴｉｅ２単独とＴｉｅ２／３Ｈ７混合物との間の残基あたりのＨ／Ｄ交換のパーセンテージを示す。赤は重水素交換が増加した領域を示し、青は取り込みがないことを示す。
【００２７】
【図６】［２９］  図６は、Ｔｉｅ２上の３Ｈ７結合エピトープを示す概略図である。Ｈ／Ｄ交換質量分析によって分析されたｈＴｉｅ２抗原上の抗Ｔｉｅ２抗体３Ｈ７結合エピトープ（赤）を、ＰｙＭｏｌソフトウェアを用いてｈＴｉｅ２  ＦＮＩＩＩ（１−３）結晶構造（ＰＤＢ：５ＵＴＫ）の画像上で視覚化した。
【００２８】
【図７】［３０］  図７は、ヒト化抗Ｔｉｅ２抗体によって誘導されるＡｋｔ（ｐＡｋｔ）のリン酸化に関する結果である。血清飢餓ＨＵＶＥＣをヒト化抗Ｔｉｅ２抗体とともに３０分間インキュベートした。その後、その細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティングに供し、ブロットを抗ホスホ−Ａｋｔ（Ｓ４７３）または抗Ａｋｔ抗体でプローブした。
【００２９】
【図８】［３１］  図８は、原発性開放角緑内障のマウスモデルにおけるヒト化Ｔｉｅ２抗体３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４によるＳＣ面積の増加およびＩＯＰの減少に関する結果である。アンジオポエチン−１および−２の両方の誘導性欠失のためのタモキシフェン投与を、８週齢のＡ１：Ａ２ｉΔ／Δマウスにて実施した。３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４（片眼、５ｍｇ／ｍｌ溶液の１μｌ注射）およびＦｃ（反対側の眼、５ｍｇ／ｍｌ溶液の１μｌ注射）の眼内投与を１２週齢時に行った。眼圧（ＩＯＰ）の定期的な測定を１２週齢、１３週齢および１４週齢に実施した。ＣＤ１４４＋ＳＣ面積とＣＤ１４４＋ＳＣ内のＰｒｏｘ１およびＴｉｅ２免疫染色の強度を、３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４投与の２週間後に測定した。スケールバー、１００μｍ。ｎ＝各グループで５匹。値は平均±ＳＤである。クラスカル・ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）検定、その後のテューキー（Ｔｕｋｅｙ）のランク付きＨＳＤ検定による、＊ｐ＜０．０５。
【００３０】
【図９】［３２］  図９は、レーザー誘導ＣＮＶモデルにおいて硝子体内注射された３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４によるＣＮＶ（Choroidal Neo-Vascularization：脈絡膜血管新生）および血管漏出の抑制に関する結果である。抗体の硝子体内投与（５ｍｇ／ｍｌ溶液の１μｌ注射）はレーザー光硬化の７日後に実施した。ＣＤ３１＋ＣＮＶ体積を測定し、ＣＮＶ周囲の漏出領域を、レーザー光硬化の６日後および／または１４日後のＦＡ画像にて測定した強蛍光の合計面積をＩＣＧＡ画像にて測定したＣＮＶ合計面積で割ることで計算した。ｎ＝各グループで１１匹。値は平均±ＳＤである。一元配置分散分析、その後のスチューデント・ニューマン・クールズ事後検定による、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。対応のあるスチューデントのｔ検定による、＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃ｐ＜０．００１。
【００３１】
【図１０】［３３］  図１０は、ＣＮＶ領域内の内皮細胞における３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４およびＣＤ３１の共局在に関する結果である。３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４の皮下投与はレーザー光硬化の１日後に実施した。ＣＮＶの内皮細胞における３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４およびＣＤ３１の共局在は、レーザー光硬化の２日、４日および８日後に抗ヒトＩｇＧ二次抗体によって直接的に検出した。
【００３２】
【図１１】［３４］  図１１は、皮下注射した３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４による抑制に関する結果である。３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４の皮下投与はレーザー光硬化後の１日目に実施した。ＣＤ３１＋ＣＮＶ体積はレーザー光硬化の８日後に測定した。スケールバー、１００μｍ。ｎ＝各グループで１０匹。値は平均±ＳＤである。対応のないスチューデントのｔ検定による、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
［３５］
［３６］  本発明の詳しい説明および好ましい実施形態
［３７］  別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が関係する分野の当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。
【００３４】
［３８］  本出願の発明者らは、Ｔｉｅ２抗体が、配列番号２の配列を含むＴｉｅ２  Ｉｇ３−ＦＮＩＩＩ（１−３）ドメインに結合することによりＴｉｅ２活性を増加させる剤であることを確認した。
【００３５】
［３９］  Ｔｉｅ２は、血管の分化および安定化を促進し、血管にて高発現される受容体タンパク質であり、Ｔｉｅ２受容体は活性化されると、がん血管を安定化し、それは周囲の支持細胞を集めることを可能にする。本発明に係る抗体またはその抗原結合フラグメントにより、がん血管での活性型Ｔｉｅ２はがん血管を正常化し、腫瘍内の増加した低酸素症を排除し、腫瘍への血流を増加させることによって十分な酸素を供給し、そして他の抗がん剤の送達および免疫細胞の透過を増加させる。
【００３６】
［４０］  この点に関して、本発明は、配列番号２の配列を含むＴｉｅ２  Ｉｇ３−ＦＮＩＩＩ（１−３）ドメインに結合するＴｉｅ２抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００３７】
［４１］  本明細書で使用される用語「抗体」は、Ｔｉｅ２に特異的に結合する抗体を意味する。本発明の範囲において、Ｔｉｅ２に特異的に結合する完全抗体に加えて、前記抗体分子の抗原結合フラグメントも含む。
【００３８】
［４２］  完全抗体は、２つの全長軽鎖および２つの全長重鎖の構造を有し、各軽鎖はジスルフィド結合によって重鎖に連結されている。重鎖の定常領域には、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）およびイプシロン（ε）タイプがあり、サブクラスにはガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）がある。軽鎖の定常領域にはカッパ（κ）タイプおよびラムダ（λ）タイプがある。
【００３９】
［４３］  抗体の抗原結合フラグメントまたは抗体のフラグメントは、抗原に結合することができるフラグメントを意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖを含む。抗体フラグメントの中で、Ｆａｂは、軽鎖および重鎖の可変領域、軽鎖の定常領域、および重鎖の１番目のＣＨ１を有する構造を含む、１つの抗原結合部位を有する。
【００４０】
［４４］  Ｆａｂ’は、ＣＨ１ドメインのＣ末端に１個または複数個のシステイン残基を含むヒンジ領域を有する点でＦａｂと異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成によって生成される。Ｆｖは、重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域のみを有する最小の抗体フラグメントである。二本鎖Ｆｖ（二本鎖Ｆｖ）は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の非共有結合によって形成され、および一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、一般に、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域との間で共有結合のペプチドリンカーを通じて形成されるか、またはそのＣ末端で直接的に二本鎖Ｆｖのような二量体様構造を形成することによって連結される。このフラグメントは、タンパク質加水分解酵素によって得ることができ（例えば完全抗体をパパインで制限消化することでＦａｂを取得でき、ペプシンで切断することでＦ（ａｂ’）２を取得できる）、また、遺伝子操作技術によって作製することができる。
【００４１】
［４５］  １つの実施形態において、本発明に係る抗体は、Ｆｖの形態（例えばｓｃＦｖ）または完全抗体の形態である。さらに、重鎖の定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）またはイプシロン（ε）のいずれかのアイソタイプから選択されてよい。例えば定常領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）またはガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖定常領域はカッパまたはラムダタイプであってよい。
【００４２】
［４６］  本発明における用語「重鎖」は、全長の重鎖またはそのフラグメントを意味し、それは可変領域ドメインＶＨと、３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含み、抗原特異性を提供するのに十分な可変領域をともなうアミノ酸配列を有する。さらに、本発明における用語「軽鎖」は、全長の軽鎖またはそのフラグメントを意味し、それは可変領域ドメインＶＬと、定常領域ドメインＣＬを含み、抗原特異性を提供するのに十分な可変領域をともなうアミノ酸配列を有する。
【００４３】
［４７］  本発明の抗体は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦＶ）および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、または上記の抗体のエピトープ結合フラグメント、およびその類似物を含むが、これらに限定されない。
【００４４】
［４８］  モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体であり、すなわち、可能性のある自然突然変異を除いて微量で存在し得る集団中の同じ特有の抗体を意味する。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に対して誘導される。典型的に異なるエピトープによって指示される異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体とは対照的に、モノクローナル抗体はそれぞれ単一の決定因子によって指示される。
【００４５】
［４９］  「エピトープ」は、抗体が特異的に結合できるタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、化学的に活性な表面分子の群であり、例えばアミノ酸または糖の側鎖で構成され、一般に特定の電荷特性並びに特定の三次元構造特性を有する。立体的エピトープおよび非立体的エピトープは、変性溶媒の存在下で前者との結合を失うが、後者との結合は失わない。
【００４６】
［５０］  そのエピトープが水素／重水素交換を通じて同定されるとき、本発明に係るＴｉｅ２抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号１の配列を構成するＴｉｅ２の６３３〜６４４のアミノ酸ＴＬＳＤＩＬＰＰＱＰＥＮおよび／または７１３〜７２６のアミノ酸ＦＡＥＮＮＩＧＳＳＮＰＡＦＳに結合する。
【００４７】
［５１］  非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体（例えばドナーまたはソース抗体）由来の１個または複数個のアミノ酸配列（例えばＣＤＲ配列）を含む、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（受容体抗体）であり、その超可変領域は、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類（受容体抗体）の超可変領域由来の残基で置き換えられ、所望の特異性、親和性およびレシピエントの超可変領域由来の残基の能力を有する。ヒト化に関して、レシピエントヒト抗体のフレームワークドメイン（ＦＲ）の残基内の可変領域の１つまたは複数を、非ヒト種のドナー抗体による対応する残基で置き換えることができる。これにより、グラフトされたＣＤＲの適切な３次元構成が維持され、それにより、親和性および抗体の安定性が向上し得る。ヒト化抗体は、例えば抗体またはドナー抗体に現れない新しい残基を含めて、抗体の追加の性能をさらに洗練することができる。
【００４８】
［５２］  ヒト免疫グロブリンに由来する分子としての「ヒト化抗体」は、相補的決定領域および構造領域を含む抗体を構成するアミノ酸配列全体が、ヒト免疫グロブリンから構成されることを意味する。
【００４９】
［５３］  所望の生物学的活性を示す任意の「キメラ」抗体（免疫グロブリン）並びに前記抗体のフラグメントを含み、キメラ抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来するか、またはそのサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一もしくは相同であるが、残りの鎖が他の種に由来するか、または他の抗体クラスに属し、もしくはそのサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一である。
【００５０】
［５４］  本出願の特定の例に関し、マウス由来の１１Ｃ４、４Ａ４、３Ｂ２、３Ｅ１２および３Ｈ７抗体が産生され、ドナー抗体としての３Ｈ７抗体のＣＤＲをグラフト化し、ヒト化３Ｈ７Ｈ１１Ｇ４、３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４、３Ｈ７Ｈ２１Ｇ４または３Ｈ７Ｈ２２Ｇ４抗体が産生された。
【００５１】
［５５］  本明細書で使用される「抗体可変ドメイン」は、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）とフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖および重鎖の一部とを示す。ＶＨは重鎖の可変ドメインを示す。ＶＬは軽鎖の可変ドメインを示す。
【００５２】
［５６］  「相補性決定領域」（ＣＤＲ；すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）は、抗原結合に必要な抗体の可変ドメインのアミノ酸残基を示す。各可変ドメインは通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として識別される３つのＣＤＲ領域を含む。
【００５３】
［５７］  １つの実施形態では、Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３〜５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域、配列番号６〜８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含み得る；
【００５４】
［５８］  配列番号１３〜１５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域、配列番号１６〜１８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域；
【００５５】
［５９］  配列番号２３〜２５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域、配列番号２６〜２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域；
【００５６】
［６０］  配列番号３３〜３５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域、配列番号３６〜３８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域；
【００５７】
［６１］  配列番号４３〜４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域、配列番号４６〜４８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域。
【００５８】
［６２］  「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインには通常、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４として識別される４つのＦＲがある。
【００５９】
［６３］  Ｔｉｅ２抗体は一価または二価であり、一本鎖または二本鎖を含む。機能的には、Ｔｉｅ２抗体の結合親和性は１０−５Ｍから１０−１２Ｍの範囲にある。例えばＴｉｅ２抗体の結合親和性は、１０−６Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−７Ｍまたは１０−５Ｍ〜１０−６Ｍである。
【００６０】
［６４］  Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る；
【００６１】
［６５］  配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
【００６２】
［６６］  配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
【００６３】
［６７］  配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
【００６４】
［６８］  配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
【００６５】
［６９］  配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
【００６６】
［７０］  配列番号５７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
【００６７】
［７１］  配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
【００６８】
［７２］  配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００６９】
［７３］  本発明の抗体または抗体フラグメントは、Ｔｉｅ２を特異的に認識できる範囲で、その生物学的に同等な物を含み得る。例えばそれは抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性をさらに改善するために、アミノ酸配列に変化を導入することができる。そのような修飾には、例えば抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入および／または置換が含まれ得る。これらのアミノ酸のバリエーションは、アミノ酸側鎖の疎水性、親水性、電荷、サイズなどのアミノ酸置換基の相対的な類似性に基づいて成される。アミノ酸側鎖置換基のサイズ、形状およびタイプの分析により、アルギニン、リジンおよびヒスチジンはすべて正に帯電した残基であり；アラニン、グリシンおよびセリンは類似のサイズを有し；フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは類似の形状を有することが知られています。したがって、これらの考慮事項に基づいて、アルギニン、リジンおよびヒスチジン；アラニン、グリシンおよびセリン；フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、生物学的に機能的に同等な物であると言える。
【００７０】
［７４］  生物学的に同等な活性を有する上記の変異を考慮すると、本発明の抗体のアミノ酸配列または同抗体をコードする核酸分子は、配列番号の配列および実質的な同一性を示す任意の配列を含むと解釈される。実質的な同一性は、本発明に記載の配列と任意の他の配列とを可能な限り整列させ、当技術分野で用いられ一般的に使用されるアルゴリズムによって分析する場合に、少なくとも９０％の相同性、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の配列相同性を意味する。配列比較のためのアラインメント方法は当技術分野で既知である。ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）はＮＢＣＩなどからアクセスでき、インターネット上のｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘなどの配列分析プログラムと組み合わせて使用することができる。ＢＬＳＡＴは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／にてアクセスできる。このプログラムを用いる配列相同性比較法は、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.htmlにて見つけることができる。
【００７１】
［７５］  これに基づいて、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、本明細書中で特定された、または全ての配列と比較した場合に、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはより高い相同性を有し得る。この相同性は、当技術分野で既知の方法による配列比較および／またはアラインメントによって決定することができる。例えば配列比較アルゴリズム（すなわちＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０）、手動のアラインメント、目視での検査を用いて、本発明の核酸またはタンパク質のパーセント配列相同性を決定することができる。
【００７２】
［７６］  別の態様では、本発明は、抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸に関する。
【００７３】
［７７］  核酸は、配列番号１０、１２、２０、２２、３０、３２、４０、４２、５０、５２、５５、５６、５９、６０、６３、６４、６７、または６８の配列を含み得る。
【００７４】
［７８］  抗体またはその抗原結合フラグメントは、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸を単離することによって組換え的に産生することができる。核酸を単離し、それを複製可能なベクターに挿入することによるさらなるクローニング（ＤＮＡ増幅）を行うことができ、またはさらなる発現を行うことができる。これに基づいて、本発明は別の局面において核酸を含むベクターに関する。
【００７５】
［７９］  「核酸」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ）およびＲＮＡ分子を包括的に包含することを意味し、核酸の基本構造単位であるヌクレオチドは、本質的にヌクレオチド、ならびに修飾された糖または塩基部分を有する類似体を含む。本発明の重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸の配列を修飾することができる。修飾は、ヌクレオチドの付加、欠失または非保存的もしくは保存的置換を含む。
【００７６】
［８０］  抗体をコードするＤＮＡは、従来のプロセスを使用して（例えば重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡに特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に分離または合成される。多くのベクターを利用することができる。ベクター成分は、一般に、以下の１つまたは複数を含むが、これらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列。
【００７７】
［８１］  本明細書で使用される用語「ベクター」は、宿主細胞における目的の遺伝子を発現するための手段として、プラスミドベクター、コズミドベクター、バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターを含む。ベクター中の抗体をコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている。
【００７８】
［８２］  「作動可能に連結された」は、核酸の発現制御配列（例えばプロモーター、シグナル配列または転写調節因子結合部位の配列）と異なる核酸配列との間の機能的連結を意味し、それにより、前記制御配列はその別の核酸配列の転写および／または翻訳を制御する。
【００７９】
［８３］  宿主が原核細胞の場合、転写を処理できる強力なプロモーター（例えばｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーターおよびＴ７プロモーターなど）、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写／翻訳終結配列が一般的に含まれる。加えて、例えば宿主が真核細胞の場合、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例：メタロチオニンプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーターおよびヒト筋肉クレアチンプロモーター）または哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、バクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター）を使用することができ、一般に、ポリアデニル化配列を転写終結配列として含めることができる。
【００８０】
［８４］  幾つかの場合で、ベクターを、発現した抗体の精製を容易にするための他の配列と融合させてよい。融合される配列には、例えばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、米国）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ社、米国）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ社、米国）および６×Ｈｉｓ（ヘキサヒスチジン、Ｑｉａｇｅｎ社、米国）がある。
【００８１】
［８５］  ベクターは、選択マーカーとして当技術分野で一般的に使用される抗生物質耐性遺伝子、例えばアンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を含む。
【００８２】
［８６］  別の態様では、本発明は、上記ベクターで形質転換された細胞に関する。本発明の抗体を産生するために使用される細胞は、原核生物、酵母および高等真核細胞であってよいが、これらに限定されない。
【００８３】
［８７］  原核生物宿主細胞、例えば大腸菌、バチルス・サブチリスおよびバチルス・チューリンゲンシスなどのバチルス株、ストレプトミセス、シュードモナス（例えばシュードモナス・プチダ）、プロテウス・ミラビリスおよびスタフィロコッカス（例えばスタフィロコッカス・カルノサス）を使用することができる。
【００８４】
［８８］  しかしながら、動物細胞における関心が最も大きく、有用な宿主細胞株の例には、ＣＯＳ−７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、ＣＨＯ／−ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ３Ａ、Ｗ１３８、ＨｅｐＧ２、ＳＫ−Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、Ｕ２０ＳまたはＨＴ１０８０があるが、これらに限定されない。
【００８５】
［８９］  別の態様では、本発明は（ａ）細胞の培養のためのステップ；および（ｂ）培養細胞から抗体またはその抗原結合フラグメントを回収する工程を含む、抗体およびその抗原結合フラグメントを製造する方法に関する。
【００８６】
［９０］  細胞は様々な培地で培養することができる。任意の市販の培地を制限なく使用することができる。当業者に既知の他のすべての必須サプリメントを適切な濃度で含めることができる。温度、ｐＨなどの培養条件、および選択された宿主細胞はすでに用いられており、これは当業者には明らかであろう。
【００８７】
［９１］  抗体またはその抗原結合フラグメントの回収は、例えば遠心分離または限外濾過を使用して、および例えばアフィニティークロマトグラフィーなどを使用して、不純物を除去することによって行うことができる。更なる追加の精製技術、例えば陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびその類似技術を用いることができる。
【００８８】
［９２］  別の態様では、本発明は、活性成分である抗体の有効成分またはその抗原結合フラグメントを含む血管新生疾患を予防または治療するための組成物に関する。
【００８９】
［９３］  血管新生は、既存の血管からの新しい血管の形成または成長を意味する。「血管新生関連疾患」は、血管新生の発生または進行に関連する疾患を意味する。疾患が抗体で治療できる場合、その疾患は、制限なく、血管新生関連疾患の範囲に含まれ得る。血管新生関連疾患の例は、がん、転移、糖尿病性網膜症、未熟児の網膜症、角膜移植片拒絶、黄斑変性症、血管新生緑内障、全身性紅皮症、増殖性網膜症、乾癬、血友病関節炎、アテローム性動脈硬化症のプラークにおける毛細血管形成、ケロイド、創傷肉芽、血管接着、関節リウマチ、変形性骨関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、猫引っかき傷、潰瘍、肝硬変、腎炎、糖尿病性腎症、糖尿病、炎症性疾患および神経変性疾患からなる群より選択されるが、これらに限定されない。加えて、がんは、食道がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、口腔がん、咽頭のがん（pharynx cancer）、咽頭がん（larynx cancer）、肺がん、結腸がん、乳がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、膀胱がん、腎がん、肝臓がん、膵臓がん、骨がん、結合組織がん、皮膚がん、脳がん、甲状腺がん、白血病、ホジキンリンパ腫、リンパ腫および多発性骨髄性血液がんからなる群より選択されるが、これらに限定されない。
【００９０】
［９４］  本明細書で使用される用語「予防」は、本発明の抗体または組成物を投与することによって、目的の疾患の発症を阻止または遅延させる任意の作用を意味する。用語「処置または療法」は、本発明の抗体または組成物を投与することによって、目的の疾患の症状を改善または良くする任意の作用を示す。
【００９１】
［９５］  本発明の抗体を含む組成物は、好ましくは医薬組成物であり、当分野で典型的に使用される適切なビヒクル、賦形剤または希釈剤を含んでよい。
【００９２】
［９６］  薬学的に許容されるビヒクルを有する医薬組成物は、様々な経口または非経口剤形、例えば錠剤、ピル、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、経口溶液剤、エマルジョン剤、シロップ剤、滅菌水性液剤、非水性液剤、懸濁剤、凍結乾燥剤および坐剤であってよい。本発明の医薬組成物に関して、例えば充填剤、増粘剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの組合せで処方できる希釈剤または賦形剤であってよい。経口投与のための固体調製物は、錠剤、ピル、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤およびその類似の剤の形態であってよい。結束に関連して、本発明の化合物は、１つまたは複数の賦形剤、例えばデンプン、炭酸カルシウム、ショ糖、ラクトースまたはゼラチンを組合せることによって処方することができる。単純な賦形剤および潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、タルクおよびその類似物をさらに使用することができる。経口投与用の液体調製物は、懸濁剤、経口液剤、エマルジョン剤、シロップ剤またはその類似の剤であってよい。賦形剤、例えば水または湿ったパラフィンのような単純な希釈剤、様々な湿潤剤、甘味料、芳香剤、防腐剤などを液体製剤に含めることができる。加えて、本発明の医薬組成物は、非経口剤形、例えば滅菌水性液剤、非水性溶媒、懸濁剤、エマルジョン剤、凍結乾燥剤、坐剤などであってよい。注射可能なプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどのエステルは、不溶性の溶媒および懸濁剤に適している場合がある。坐剤の基本的な物質には、ウィテプソル、マクロゴール、トゥイーン６１、カカオバター、ローリンバターおよびグリセロゼラチンが含まれる。
【００９３】
［９７］  本発明の組成物は、薬学上の有効量で投与される。本明細書で使用される用語「薬学上の有効量」は、すべての医学的治療に適用できる適切な利益／リスク比を伴う、疾患治療に十分な医薬組成物の量を示す。有効量は、疾患の重症度、患者の年齢および性別、疾患の種類、薬物活性、薬物感受性、投与時間、投与経路、分泌速度、処置期間、薬物の同時投与などの様々なパラメーターを含む要因、および当分野で既知のその他の要因に依存して異なり得る。本発明の組成物は、単独でまたは他の治療と組合せて投与することができる。この場合、前記組成物は従来の療法を順次または同時に投与することができる。また、上記の組成物は、単回投与または複数回投与に分割して投与することができる。これらの要因を十分に考慮すれば、副作用なく最大の効果を得るのに十分な最小量を投与することが重要であり、その投与量は専門家によって容易に設定できる。本発明の医薬組成物の投与量は特に限定されないが、それは患者の健康状態および体重、疾患の重症度、薬の種類、投与経路および投与時間などの様々な要因に応じて変化する。前記組成物は、ラット、マウス、家畜、ヒトなどを含む哺乳動物に、典型的に許容される経路、例えば経口、直腸、静脈内、皮下、子宮内または脳血管内を介して、１日１回または複数回投与してよい。
【００９４】
［９８］  他の観点から本発明は、前記抗体または前記組成物をその必要のある個体に投与する工程を含む血管新生疾患の予防方法または治療方法に関する。
【００９５】
［９９］  本発明の方法は、血管新生の阻害の必要がある個体のために薬学上の有効投薬量の医薬組成物を投与するための手順を含む。その対象は、哺乳動物、例えばイヌ、ウシ、ウマ、ウサギ、マウス、ラット、ニワトリおよびヒトであるが、これらに限定されない。医薬組成物は、非経口的、皮下的、腹腔内、肺内または鼻腔内、および必要に応じて局所治療のために傷害内を含む適切な方法で投与することができる。本発明の医薬組成物の好ましい投与量は、個体の健康状態および体重、疾患の重症度、薬物の種類、投与の経路および時間を含む様々な要因に応じて変化し、そして、それは当業者によって容易に決定され得る。
【００９６】
［１００］  他の態様では、本発明は、抗体および組成物を必要とする個体に前記組成物または前記抗体の手順を投与することを含むがん予防または処置方法、および前記抗体を含む、がん予防または処置のための組成物または医薬組成物に関する。
【００９７】
［１０１］  がんは、それが本発明の抗体で処置可能である限り、限定されない。詳細には、本発明の抗体は、血管新生を阻害することにより、がんの発生または進行を防ぐことができる。がんの例には、食道がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、口腔がん、咽頭のがん、咽頭がん、肺がん、結腸がん、乳がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、膀胱がん、腎がん、肝臓がん、膵臓がん、骨がん、結合組織がん、皮膚がん、脳がん、甲状腺がん、白血病、ホジキンリンパ腫、リンパ腫および多発性骨髄がん、血液のがんが含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
［１０２］  加えて、本発明の抗体は、他の抗体または生物学的に活性な薬剤または様々な目的のための材料と組合せて用いることができる。これに関して、本発明は、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、血管新生疾患のための他の治療薬との併用投与のための組成物に関する。
【００９９】
［１０３］  血管新生疾患のための他の治療薬は、抗血管新生剤、抗炎症剤および／または抗がん剤を含む。これにより、相互の抵抗を克服し、効能を向上させることができる。
【０１００】
［１０４］  本発明による組成物において、血管新生疾患のための他の治療薬と組合せて投与される場合、Ｔｉｅ２抗体と血管新生疾患のための他の治療薬は順次または同時に投与されてよい。例えば抗血管新生剤、抗炎症剤および／または抗がん剤を標的の個体に投与した後に、Ｔｉｅ２に対する抗体またはその抗原結合フラグメントを有効成分として有する組成物を投与することができ、あるいは前記組成物を投与した後に、抗血管新生剤、抗炎症剤および／または抗がん剤を投与することができる。場合に応じて、前記組成物および抗血管新生剤、抗炎症剤および／または抗がん剤を標的個体に同時に投与することができる。
【０１０１】
［１０５］
［１０６］実施例
［１０７］  以下、本発明を、実施例により詳細に説明する。以下の実施例は、単に、本発明を説明することを意図し、本発明を制限するものではない。
【０１０２】
［１０８］
［１０９］  実施例１．  マウスモノクローナル抗Ｔｉｅ２抗体の調製
［１１０］  １．１  ヒトＴｉｅ２を用いたマウス免疫
［１１１］  ヒトＴｉｅ２のＩｇ３−ＦＮＩＩＩ（１−３）ドメイン（ｈＴｉｅ２−Ｉｇ３−ＦＮＩＩＩ（１−３）、配列番号２）を免疫原としてＣＭＶプロモーターを含むベクターにクローニングし、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞株へトランスフェクションすることにより一過性に発現させた。５日間のインキュベーション後に、発現した組換えｈＴｉｅ２−Ｉｇ３−ＦＮＩＩＩ（１−３）タンパク質を、プロテインＡを用いたアフィニティーカラムで精製した。５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、アジュバントと混合した精製ｈＴｉｅ２−Ｉｇ３−ＦＮＩＩＩ（１−３）（１００μｇ／注射）を用いて、週２回６週間、免疫した。免疫化したマウスの血清中の抗Ｔｉｅ２抗体のタイターは、ヒトＴｉｅ２（ｈＴｉｅ２）ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ）によって調べた。抗体のタイター（１：５，０００希釈）が適切に増加した場合（ＯＤ＞１．０）、その免疫したマウスから脾臓を摘出し、そこからＢリンパ球を分離し、培養した骨髄腫細胞（ＳＰ２／０）と融合させた。その融合細胞を、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含むＨＡＴ培地中で培養し、そこから骨髄腫細胞とＢリンパ球の融合体のみからなるハイブリドーマ細胞を選択して培養した。生き残ったハイブリドーマ細胞を９６ウェルプレートに播種し、その培養上清をｈＴｉｅ２ＥＬＩＳＡにより試験した。クローン選択のために、陽性シグナルを示すハイブリドーマプールを限界希釈により選択した。最終的に、３７個のモノクローナルハイブリドーマ系統を樹立した。その中から、いくつかのＴｉｅ２結合抗体が、Ｔｉｅ２活性化作用を示した。候補抗体は、Ｔｉｅ２活性化レベルおよびヒトＴｉｅ２に対する高い親和性に基づいて選択され、後にヒト化の処理を行った。
【０１０３】
［１１２］
［１１３］表１．ヒトＴｉｅ２全長（ｈＴｉｅ２）およびＩｇ３−ＦＮＩＩＩ（１−３）配列
【表１−１】
2021526801.tif 000003
【０１０４】
［１１４］
【表１−２】
2021526801.tif 000004
【０１０５】
［１１５］
［１１６］  １．２  マウスモノクローナルＴｉｅ２抗体の産生および精製
ＥＬＩＳＡ陽性シグナルに基づいて選択された抗Ｔｉｅ２抗体を産生するために、ハイブリドーマ細胞を、Ｔ７５（７５ｃｍ２面積）フラスコにて１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）中で培養した。細胞のコンフルエンシーが約９０％に達したときに、細胞をＰＢＳで洗浄し、５０ｍｌの無血清培地（ＳＦＭ、Ｇｉｂｃｏ）を用いてインキュベートし、３７℃で３日間培養した。次いで、各モノクローナルハイブリドーマから抗体が分泌された培地を回収し、遠心分離して細胞を除去し、その培養上清を回収して濾過した。次に、抗体を、プロテインＧアフィニティーカラム（ＧＥヘルスケア）を備えたＡＫＴＡ精製装置（ＧＥヘルスケア）を使用して精製した。遠心分離フィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ）を用いてその上清をＰＢＳで置換することにより、精製抗体を濃縮した。
【０１０６】
［１１８］
［１１９］  １．３  アンタゴニストＴｉｅ２抗体の同定およびスクリーニング
［１２０］  マウス抗Ｔｉｅ２抗体が内皮細胞におけるＴｉｅ２受容体の下流シグナル伝達を誘導するかどうかを調べるために、ＨＵＶＥＣ（Ｌｏｎｚａ）を抗Ｔｉｅ２抗体で処理し、次いで、Ａｋｔリン酸化のレベル、主要な下流シグナル伝達タンパク質であるＴｉｅ２受容体を免疫ブロッティングにより分析した。陽性コントロールとして、ＣＯＭＰ−Ａｎｇ１（ＣＡ１）を細胞に処理した。
【０１０７】
［１２１］  具体的には、ＨＵＶＥＣ（１×１０５細胞／ｍｌ）を、６０ｍｍ培養皿中でＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ）にて３７℃で培養した。９０％コンフルエンシーの細胞を、血清飢餓のために、無血清ＥＢＭ−２培地にて６時間インキュベートした。血清飢餓ＨＵＶＥＣを抗Ｔｉｅ２抗体で処理し、さらに３０分間インキュベートした。前記細胞を、冷ＰＢＳで洗浄し、溶解バッファーで処理し、４℃で２０分間溶解した。次いで、細胞溶解物を、１３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって調製した。５×ＳＤＳサンプルバッファーを加えることにより、細胞溶解物を調製し、細胞溶解物をＳＤＳ  ＰＡＧＥにかけ、タンパク質をニトロセルロースメンブレン（ＧＥ）に転写した。
【０１０８】
［１２２］  Ａｋｔリン酸化を調べるために、ブロットを５％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔを用いて室温（ＲＴ）にて１時間ブロックし、抗リン酸化Ａｋｔ抗体（Ｓ４７３）とともに４℃にて約８時間インキュベートした。ホスホ−Ａｋｔのシグナルを、増強化学発光（ＥＣＬ）により視覚化した。次いで、メンブレンを、ストリッピングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ）で１５分間インキュベートし、抗Ａｋｔ抗体で再プローブして総Ａｋｔ量を測定した。Ｓ４７３でのＡｋｔリン酸化が、１１Ｃ４、４Ａ４、３Ｂ２、３Ｅ１２および３Ｈ７などの抗Ｔｉｅ２抗体を用いて処理した幾つかの群において強く誘導された（図１）。
【０１０９】
［１２３］
［１２４］  １．４．オクテット分析によるｈＴｉｅ２に対する抗Ｔｉｅ２抗体の親和性測定
［１２５］  ｈＴｉｅ２に対するマウスモノクローナル抗体の親和性を、ブラック９６ウェルプレート（９６ウェルＦ型ブラックプレート、Ｇｒｅｉｎｅｒ）を用いたＯｃｔｅｔシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して測定した。親和性測定に使用するバイオセンサーを、ＡＲ２Ｇチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ）を用いた測定前に１０分間、水和させた。水和後、ｈＴｉｅ２を１０ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０バッファーで１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、ＡＲ２Ｇバイオセンサーに固定し、１Ｍ  エタノールアミンでブロックした。マウスモノクローナル抗Ｔｉｅ２抗体を、１×キネティックバッファーで５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５および０ｎＭに希釈し、３００秒間の会合と、９００秒間の解離を行った。親和性測定（ＫＤ）のために、結合速度（Ｋ−ｏｎ）および解離速度（Ｋ−ｏｆｆ）を結合曲線（グローバル）により分析し、Ｏｃｔｅｔデータ分析ｖ９．０．０．１０プログラムを用いて１：１結合モデルに対してフィッティングした。マウス抗Ｔｉｅ２抗体の親和性を表２に示す。
【０１１０】
［１２６］
［１２７］表２．マウス抗Ｔｉｅ２抗体のｈＴｉｅ２への親和性
【表２】
2021526801.tif 000005
【０１１１】
［１２８］
［１２９］  １．５．マウスＴｉｅ２抗体３Ｈ７によって誘導されたＴｉｅ２リン酸化
本発明において開発された抗Ｔｉｅ２抗体は、Ｔｉｅ２クラスタリングに結合して誘導し、最終的にＴｉｅ２活性化を誘発することを示す。実験を行い、ＨＵＶＥＣを使用してＴｉｅ２リン酸化に対する抗Ｔｉｅ２抗体の効果を分析した。
【０１１２】
［１３１］  具体的には、ＨＵＶＥＣ（Ｌｏｎｚａ）を、１００ｍｍ培養皿中のＥＧＭ−２（Ｌｏｎｚａ）にて３７℃および５％ＣＯ２濃度で培養した。８０〜９０％のコンフルエンシーにて、細胞を血清飢餓のためにＥＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ）培地に６時間交換した。培養した細胞に対して、様々な濃度（０．０２μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ）の抗Ｔｉｅ２抗体を処理し、さらに３０分間インキュベートした。前記細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、１０００μｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤）を用いて溶解し、次いで、４℃で６０分間インキュベートした。細胞抽出物を調製し、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その上清中のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイで定量した。
【０１１３】
［１３２］  Ｔｉｅ２免疫沈降のために、１μｇのＴｉｅ２抗体（Ｒ＆Ｄシステム、ＡＦ３１３）を０．５ｍｇのライセートに添加し、振盪しながら４℃で一晩インキュベートした。次いで、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＰｒｏｔｅｉｎＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を追加して２時間反応させた。前記ビーズを、磁石を用いてチューブの片側に固定し、溶解バッファーで３回洗浄した後、還元剤を含む２×ＳＤＳサンプルバッファーとともに７０℃で１０分間インキュベートした。前記ビーズを、サンプルから取り出し、４〜１５％ＳＤＳプロテインゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にて電気泳動した後、０．４５μｍＰＶＤＦメンブレンに転写した。
【０１１４】
［１３３］  メンブレンを５％（ｖ／ｖ）ＢＳＡと混合したＴＢＳ−Ｔを用いて室温にて１時間ブロックし、抗ホスホチロシン抗体（４Ｇ１０、ミリポア）とともに４℃にて８時間インキュベートした後、ＨＲＰ標識化抗マウス抗体のインキュベーション、それに続いてウエスタンブロッティング分析をした。免疫沈降したＴｉｅ２の量を測定するために、メンブレンをストリッピングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ）中で１５分間反応させ、次いで、再度ブロックし、抗Ｔｉｅ２抗体（Ｒ＆Ｄシステム、ＡＦ３１３）で再プローブした。図２で示されるように、抗Ｔｉｅ２抗体３Ｈ７をＨＵＶＥＣ細胞に添加した場合、Ｔｉｅ２のリン酸化が用量依存的に強く誘導された。これらのデータは、抗Ｔｉｅ２抗体３Ｈ７がヒト内皮細胞におけるＴｉｅ２受容体の活性化を直接誘導することを示す。
【０１１５】
［１３４］
［１３５］  １．６．Ｔｉｅ２抗体（３Ｈ７）によるＨＵＶＥＣにおけるクラスター化Ｔｉｅ２エンドサイトーシスおよびＦＯＸＯ１移行
［１３６］  Ｔｉｅ２局在化および核から細胞質ゾルへのＦＯＸＯ１移行に対する３Ｈ７の効果を、ＨＵＶＥＣにて免疫蛍光法によって調べた。具体的には、ＨＵＶＥＣを８ウェルスライドチャンバー（Ｌａｂ−ＴｅｋＩＩ）に播種し、ＥＧＭ−２培地中で２〜３日間維持した。１００％コンフルエンスにて、細胞を４時間のＥＢＭ−２培地にて血清飢餓にし、１μｇ／ｍｌの抗Ｔｉｅ２抗体３Ｈ７を用いて３０分間処理した。その後、細胞を、ＰＢＳ中４％ホルムアルデヒドを用いて室温（ＲＴ）にて１０分間固定し、ＰＢＳ中０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で透過処理を行い、ＰＢＳ中１％ＢＳＡを用いてＲＴにて６０分間ブロックし、一次抗体とともにＲＴにて１時間インキュベートした。ｈＴｉｅ２およびＦＯＸＯ１用の一次抗体を用いた。次に、細胞を、暗所にて室温で１時間二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とともにインキュベートし、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ）を用いて封入した。画像を、レーザー走査型共焦点顕微鏡（ＬＳＭ８８０、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社）を用いて撮影した。
【０１１６】
［１３７］  図３で示されるように、３Ｈ７処置は、Ｔｉｅ２のクラスター化および活性化を誘導することが知られているコントロールＡｎｇ２抗体（Ｈａｎ等、２０１６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）と同様に、Ｔｉｅ２エンドサイトーシスを著しく誘導した。ＦＯＸＯ１がリン酸化後に細胞質に局在することを示す既報（Ｚｈａｎｇ等、ＪＢＣ  ２００２，２７７，４５２７６-４５２８４）と一致して、ＦＯＸＯ１は基本となる血清飢餓状態では核内に局在したが、３Ｈ７処置により、ＦＯＸＯ１は血清飢餓のコントロール（赤）と比較して核内から明らかに消失した。
【０１１７】
［１３８］
［１３９］  １．７．ＨＵＶＥＣにおいて抗Ｔｉｅ２抗体３Ｈ７を処理した場合のＶＥＧＦまたはＴＮＦ−αにより誘発される血管浸透性の阻害。
［１４０］  血管漏出アッセイは、インビトロ血管浸透性アッセイキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用い、その製造元の指示に従って、ＨＵＶＥＣにて実施した。ＨＵＶＥＣをトランスウェルプレートのインサートに播種し、１００％コンフルエンスになるまで３日間培養した。ＨＵＶＥＣをＡｎｇ２（１μｇ／ｍｌ）、Ａｎｇ２（１μｇ／ｍｌ）と、コントロール抗体（１μｇ／ｍｌ）とともに、または３Ｈ７抗体（１μｇ／ｍｌ）のみと３０分間プレインキュベートし、次いで、ＶＥＧＦ（５００ｎｇ／ｍｌ）またはＴＮＦ−ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加し、細胞を３７℃でそれぞれ４５分または２２時間インキュベートした。ＦＩＴＣ−デキストランを上部チャンバーに加え、２０分間インキュベートした。ＨＵＶＥＣ単層を越えるＦＩＴＣ−デキストランの通過を、それぞれ４８５および５３５ｎｍの励起波長および発光波長で蛍光リーダーによって測定した。図４で示されるように、抗Ｔｉｅ２抗体３Ｈ７の前処理は、血管漏出促進因子ＶＥＧＦまたはＴＮＦ−ａによって誘発される血管漏出を有意に抑制した。
【０１１８】
「１４１］
［１４２］  実施例２．マウス抗Ｔｉｅ２抗体のＤＮＡ遺伝子配列分析
［１４３］  実施例１．３で選択された（ハイブリドーマ細胞に由来する）抗体のＤＮＡヌクレオチド配列を分析した。具体的には、ハイブリドーマ細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で培養し、次いで、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて全ＲＮＡを得た。次に、ＲＮＡ濃度を測定し、ｃＤＮＡを逆転写（ＲＴ）反応により合成した。重鎖および軽鎖可変領域の遺伝子配列を増幅するために、上記のｃＤＮＡをテンプレートとして用い、マウスＩｇプライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を使用して、以下の条件下でＰＣＲを実施した：  ９４℃で５分；［９４℃で１分、５０℃で１分、７２℃で２分］×３５サイクル；７２℃で６分；４℃に冷却。各反応で得られたＰＣＲ産物をＴＡベクターにクローニングし、ＤＮＡシーケンシングにかけ、それにより、各抗体のＣＤＲ、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を得た（表３〜表１２）。
【０１１９】
［１４４］
［１４５］表３．マウス抗Ｔｉｅ２抗体３Ｂ２のＣＤＲ配列
【表３】
2021526801.tif 000006
【０１２０】
［１４６］
［１４７］表４．マウス抗Ｔｉｅ２抗体３Ｂ２の可変領域配列
【表４】
2021526801.tif 000007
【０１２１】
［１４８］
［１４９］表５．マウス抗Ｔｉｅ２抗体３Ｅ１２のＣＤＲ配列
【表５】
2021526801.tif 000008
【０１２２】
［１５０］
［１５１］表６．マウス抗Ｔｉｅ２抗体３Ｅ１２の可変領域配列
【表６】
2021526801.tif 000009
【０１２３】
［１５２］
［１５３］表７．マウス抗Ｔｉｅ２抗体３Ｈ７のＣＤＲ配列
【表７】
2021526801.tif 000010
【０１２４】
［１５４］
［１５５］表８．マウス抗Ｔｉｅ２抗体３Ｈ７の可変領域配列
【表８】
2021526801.tif 000011
【０１２５】
［１５６］
［１５７］表９．マウス抗Ｔｉｅ２抗体４Ａ４のＣＤＲ配列
【表９】
2021526801.tif 000012
【０１２６】
［１５８］
［１５９］表１０．マウス抗Ｔｉｅ２抗体４Ａ４の可変領域配列
【表１０】
2021526801.tif 000013
【０１２７】
［１６０］
［１６１］表１１．マウス抗Ｔｉｅ２抗体１１Ｃ４のＣＤＲ配列
【表１１】
2021526801.tif 000014
【０１２８】
［１６２］
［１６３］表１２．マウス抗Ｔｉｅ２抗体１１Ｃ４の可変領域配列
【表１２】
2021526801.tif 000015
【０１２９】
［１６４］
［１６５］実施例３．ｈＴｉｅ２に対するマウス抗Ｔｉｅ２抗体のエピトープマッピング
［１６６］  マウスモノクローナル抗体３Ｈ７によって認識されるｈＴｉｅ２の抗原決定基（エピトープ）を、ＨＤＸ−ＭＳ（水素／重水素交換質量分析）技術によって分析した。ＨＤＸ−ＭＳ分析方法は次の文献に記載されている：ＨｏｕｄｅＤ，Ｅｎｇｅｎ  ＪＲ（２０１３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８８：２６９−８９およびＨｏｕｄｅ等、（２０１１）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１００（６），２０７１．
【０１３０】
［１６７］  組換えｈＴｉｅ２−Ｉｇ３−ＦＮＩＩＩ（１−３）タンパク質を使用して、抗体３Ｈ７の結合エピトープを分析した。重水素標識反応の前に、ｈＴｉｅ２−Ｉｇ３−ＦＮＩＩＩ（１−３）／抗体混合物を３時間以上インキュベートして、１５倍希釈した重水素標識バッファー（ＫＤ＝２５ｎＭ）下で最大結合（１００％）に維持した。調製したｈＴｉｅ２−Ｉｇ３−ＦＮＩＩＩ（１−３）／抗体複合体を、重水素標識バッファーを用いて１５倍に希釈し、様々な時間に標識し、次いで、同量のクエンチングバッファーを用いてクエンチした。標識反応時間は、０分（非重水素）、０．３３分、１０分、６０分および２４０分であった。しかしながら、非重水素状態では、重水素標識バッファーを平衡バッファーと交換し、反応はクエンチングバッファーを用いて直ちに停止させた。質量分析では、重水素標識化ｈＴｉｅ２−Ｉｇ３−ＦＮＩＩＩ（１−３）／抗体サンプルをペプシンカラムにロードし、ペプチド消化を行った。質量分析は８２．６％のカバレッジ・データが合計５０個の消化性ペプチドから得られることを示した。
【０１３１】
［１６８］  ｈＴｉｅ２−Ｉｇ３−ＦＮＩＩＩ（１−３）単独とｈＴｉｅ２−Ｉｇ３−ＦＮＩＩＩ（１−３）／抗体複合体条件との間での重水素取り込みの違いを比較分析し、重水素取り込みで明確な減少を示す領域は、前記抗体が直接的に結合するペプチドか、または構造的に変化した領域のいずれかである。ｈＴｉｅ２−Ｉｇ３−ＦＮＩＩＩ（１−３）単独とｈＴｉｅ２−Ｉｇ３−ＦＮＩＩＩ（１−３）／抗体複合体との間の重水素取り込み差が０．５〜１Ｄａ以上の場合、有意と見做され、表１３では太字で示される。
【０１３２】
［１６９］  Ｈ／Ｄ交換質量分析のデータ（図５）を用いて、ｈＴｉｅ２抗原の０．３３３、１０、６０および２４０分での残基あたりの重水素取り込みのヒートマップを、抗Ｔｉｅ２抗体３Ｈ７の非存在下または存在下で作成した。カラースケールは、各時間での抗原単独と抗原／ｍＡｂ混合物との間の残基あたりのＨ／Ｄ交換のパーセンテージを示す。赤色は重水素交換が増加している領域を示し、青色は取り込みがないことを示す。重水素取り込み差のヒートマップ分析は、抗体３Ｈ７が結合するエピトープがｈＴｉｅ２の残基６３３〜６４４（配列番号１、ＴＬＳＤＩＬＰＰＱＰＥＮ）および残基７１３〜７２６（配列番号１、ＦＡＥＮＮＩＧＳＳＮＰＡＦＳ）であることを示した（表１３）。エピトープを、ＰｙＭｏｌソフトウェアを使用して生成されたｈＴｉｅ２−ＦＮＩＩＩの３Ｄ構造上に赤色で示した（図６）。
【０１３３】
［１７０］
［１７１］表１３．ＨＤＸ−ＭＳによるｈＴｉｅ２への３Ｈ７結合のエピトープマッピング分析
【表１３−１】
2021526801.tif 000016
【０１３４】
［１７２］
【表１３−２】
2021526801.tif 000017
【０１３５】
［１７３］
［１７４］実施例４．マウス抗Ｔｉｅ２抗体のヒト化および全長ＩｇＧ変換
［１７５］  ヒトに投与した場合のマウス抗Ｔｉｅ２抗体３Ｈ７の免疫原性を排除するために、前記抗体を以下のようにヒト化した。
【０１３６】
［１７６］  ４．１．重鎖のヒト化
ヒト抗体重鎖可変遺伝子であるＩＧＨＶ１−４６−０１は、抗体３Ｈ７の重鎖配列と６６％の相同性を示した。これらの分析に基づいて、３Ｈ７抗体の３つのＣＤＲ領域をヒト抗体重鎖可変遺伝子ＩＧＨＶ１−４６−０１にグラフト化した。このプロセスでは、２つのヒト化重鎖抗体遺伝子を設計した（表１４）。グラフト化ＣＤＲは、タンパク質配列中では下線が付されている。マウス配列への逆突然変異を、ヒト化３Ｈ７の重鎖遺伝子に導入し、表１４のタンパク質配列では太字で示す。
【０１３７】
［１７８］
［１７９］４．２  軽鎖のヒト化
［１８０］  ヒト抗体軽鎖可変遺伝子であるＩＧＫＶ１−１７−０１は、抗体３Ｈ７の軽鎖配列と６８％の相同性を示した。これらの分析に基づいて、３Ｈ７抗体の３つのＣＤＲ領域をヒト抗体軽鎖可変遺伝子ＩＧＫＶ１−１７−０１にグラフト化した。このプロセスでは、２つのヒト化軽鎖抗体遺伝子を設計した（表１４）。グラフト化ＣＤＲは、タンパク質配列中では下線が付されている。マウス配列への逆突然変異を、ヒト化３Ｈ７の軽鎖遺伝子に導入し、表１４のタンパク質配列では太字で示す。
【０１３８】
［１８１］
［１８２］４．３．ヒト化遺伝子合成およびヒト全長ＩｇＧ抗体へのクローニング
［１８３］  表１４の抗体のヒト化可変領域を、ヒトＩｇＧ４アイソタイプバックボーンベクターの重鎖および軽鎖ベクターにクローニングした。抗体のヒト化重鎖可変領域（ＶＨ）のＤＮＡ断片を「ＥｃｏＲＩ−シグナル配列−ＶＨ−ＮｈｅＩ−ＣＨ−ＸｈｏＩ」の配列として合成した（Ｂｉｏｎｅｅｒ社）。抗体のヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）のＤＮＡ断片も「ＥｃｏＲＩ−シグナル配列−ＶＬ−ＢｓｉＷＩ−ＣＬ−ＸｈｏＩ」の配列として合成した。重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ断片を、それぞれｐＯｐｔｉＶＥＣ（登録商標）またはｐｃＤＮＡ（登録商標）３．３ベクターにクローニングした。
【０１３９】
［１８４］表１４．マウス３Ｈ７抗体に由来するヒト化抗Ｔｉｅ２抗体
［１８５］
【表１４−１】
2021526801.tif 000018
【０１４０】
［１８６］
【表１４−２】
2021526801.tif 000019
【０１４１】
［１８７］
【表１４−３】
2021526801.tif 000020
【０１４２】
［１８８］
［１８９］４．４．ヒト化抗Ｔｉｅ２抗体の産生および精製
［１９０］  ヒト化抗Ｔｉｅ２抗体を産生するために、組換えタンパク質を高効率で産生することができるＥｘｐｉ２９３Ｆ（Ｇｉｂｃｏ）細胞を用いた。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）を三角フラスコ中で培養し、重鎖および軽鎖をコードするプラスミドを、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３トランスフェクションキットを用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトした。細胞を、３７℃にて８％ＣＯ２下で振盪インキュベーター（オービタルシェーカー、１２５ｒｐｍ）にて５日間培養した。得られた培地を回収し、遠心分離して細胞を除去した。分泌された抗体を含む培養上清を単離し、４℃で保存するか、またはアフィニティーカラム（プロテインＡアガロースカラム、ＧＥヘルスケア）を備えたＡＫＴＡ精製システム（ＧＥヘルスケア）を用いて直ちに精製した。精製した抗体を、タンパク質遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ）に通じることにより濃縮しつつ、溶液をＰＢＳに交換した。
【０１４３】
［１９１］
［１９２］実施例５．ｈＴｉｅ２に対するヒト化抗Ｔｉｅ２抗体の親和性測定
［１９３］  ｈＴｉｅ２に対するヒト化抗Ｔｉｅ２抗体の親和性を、ブラック９６ウェルプレート（９６ウェルＦ型ブラックプレート、Ｇｒｅｉｎｅｒ）を用いたオクテットシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して測定した。親和性測定に使用されるバイオセンサーを、ＡＲ２Ｇチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ）を用いた測定の前に、１０分間水和させた。水和後、ヒト化抗Ｔｉｅ２抗体を、１０ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０バッファー中に濃度１０μｇ／ｍｌに希釈し、ＡＲ２Ｇバイオセンサー上に固定し、１Ｍ  エタノールアミンを用いてブロックした。組換えｈＴｉｅ２を、１×キネティックバッファーを用いて５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５および０ｎＭに希釈し、３００秒間の会合および９００秒間の解離にかけた。親和性測定（ＫＤ）のために、結合速度（Ｋ−ｏｎ）および解離速度（Ｋ−ｏｆｆ）を結合曲線（グローバル）により分析し、Ｏｃｔｅｔデータ分析ｖ９．０．０．１０プログラムを用いて１：１結合モデルに対してフィッティングした。ＫＤ値を、下記表１５に示した。
【０１４４】
［１９４］
［１９５］表１５．ｈＴｉｅ２−Ｉｇ３−ＦＮＩＩＩ（１−３）に対するヒト化３Ｈ７抗体の親和性
【表１５】
2021526801.tif 000021
【０１４５】
［１９６］
［１９７］実施例６．選択されたヒト化抗Ｔｉｅ２抗体のインビトロ生物学的特性の分析
［１９８］  ６．１．Ａｋｔリン酸化
［１９９］  ヒト化抗Ｔｉｅ２抗体が内皮細胞におけるＴｉｅ２受容体の下流シグナル伝達を誘導するかどうかを調べるために、ＨＵＶＥＣ（Ｌｏｎｚａ）を、ヒト化抗Ｔｉｅ２抗体を用いて処理した。次に、Ｔｉｅ２受容体の主要な下流シグナル伝達タンパク質であるＡｋｔリン酸化のレベルをイムノブロッティングにより測定した。Ａｋｔ活性化の程度を比較するために、実験では細胞を、陽性コントロールとしてＣＯＭＰ−Ａｎｇ１（ＣＡ１）を用いて処理した。具体的には、ＨＵＶＥＣ細胞（１×１０５細胞／ｍｌ）を６０ｍｍ培養皿においてＥＧＭ−２（Ｌｏｎｚａ）中で３７°Ｃにて培養した。９０％コンフルエンシーの細胞をＥＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ）とともに４時間インキュベートした。血清飢餓ＨＵＶＥＣを、抗Ｔｉｅ２抗体を用いて処理し、さらに３０分間インキュベートした。細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、溶解バッファーで処理し、４℃で２０分間溶解した。次に、細胞溶解物を、１３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって調製した。５×ＳＤＳサンプルバッファーを前記細胞溶解物に加え、その混合物を９５℃で５分間ボイルした。次に、前記混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、続いてウエスタンブロッティングに供した。
【０１４６】
［２００］  Ａｋｔのリン酸化を調べるために、メンブレンを、５％スキムミルク含有ＴＢＳＴを用いてＲＴにて１時間ブロックし、抗リン酸化Ａｋｔ抗体（Ｓ４７３）とともに４℃にて約８時間インキュベートした。リン酸化Ａｋｔの量を、増強化学発光（ＥＣＬ）により視覚化した。次に、前記メンブレンを、ストリッピングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ）中で１５分間インキュベートし、次いで、抗Ａｋｔ抗体で再プローブし、Ａｋｔの全量を測定した。
【０１４７】
［２０１］  図７に示されるように、Ａｋｔリン酸化は、ヒト化３Ｈ７抗体処理によって著しく増加した。これらのデータは、ヒト化抗Ｔｉｅ２抗体が、内皮細胞におけるＴｉｅ２受容体の主要な下流シグナル伝達分子であるＡｋｔの活性化を強力に誘導できることを示す。
【０１４８】
［２０２］
［２０３］実施例７．原発性解放角緑内障マウスモデルにおける３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４の効果。
［２０４］  ３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４によるＴｉｅ２の活性化が退行したＳＣ（シュレム管）およびより低いＩＯＰ（眼圧）をレスキューできるかどうかを試験するために、原発性解放角緑内障マウスモデルを用いた。該モデルは、アンジオポエチン−１および−２遺伝子の両方の誘導性欠失のために、タモキシフェンを８週齢の二重アンジオポエチン−１／アンジオポエチン−２欠損（Ａ１：Ａ２ｉΔ／Δ）マウスに投与することによって作製された（図８Ａ）。３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４（〜５μｇ、片眼）およびＦｃ（〜５μｇ、反対側の眼）の眼内投与は、１２週齢にて実施した（図８Ａ）。指示された試薬を硝子体内投与するために、各試薬５μｇを含む〜１μｌ（５ｍｇ／ｍｌ）を、ガラスキャピラリーピペットを備えたＮａｎｏｌｉｔｅｒ２０００マイクロインジェクター（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、硝子体内腔に注入した。ＩＯＰ測定を、１２週、１３週および１４週にリバウンド・トノメーター（ＴｏｎｏＬａｂ）を用いて実行した（図８Ａ）。ＩＯＰは、マウスに麻酔をかけた直後に、圧力センサーの先端を角膜中央から約１／８インチのところに置くことによって測定した。５回の連続したＩＯＰ測定のデジタル読み出し情報はトノメーターから取得した。野生型マウスでは、ＩＯＰは、３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４で処置した眼とＦｃで処置した眼との間に差異はない（図８Ｃ）。他方、Ａ１：Ａ２ｉΔ／Δマウスでは、ＩＯＰが、３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４で処置した眼においてＦｃで処置した眼と比較して２５．６％有意に減少したことを示した（図８Ｄ）。ＣＤ１４４＋ＳＣ面積と、ＣＤ１４４＋ＳＣでのＰｒｏｘ１およびＴｉｅ２免疫染色の強度とを、３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４投与の２週間後に測定した。抗ＣＤ１４４抗体（１：２００、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗Ｐｒｏｘ１抗体（１：２００、ＲｅｌｉａＴｅｃｈ）および抗Ｔｉｅ２抗体（１：２００、Ｒ＆Ｄシステム）を用いた。マウントされた角膜全体のＣＤ１４４＋ＳＣ面積は、ＣＤ１４４＋面積をそのコントロールの面積で割ったパーセンテージとして計算した。Ａ１：Ａ２ｉΔ／Δマウスでは、ＳＣ領域が、３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４処置眼においてＦｃ処置眼と比較して１１４．８％有意に増加したことを示した（図８Ｂ、Ｅ）。Ｐｒｏｘ１の相対的な発現を定量化するために、ＣＤ１４４＋ＳＣの核領域における強度を測定した。Ａ１：Ａ２ｉΔ／Δマウスでは、Ｐｒｏｘ１強度が、３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４処置眼においてＦｃ処置眼と比較して８８．４％有意に増加したことを示した（図８Ｂ、Ｆ）。Ｔｉｅ２の発現を定量化するために、強度をＣＤ１４４＋ＳＣ領域にて測定した。Ａ１：Ａ２ｉΔ／Δマウスでは、Ｔｉｅ２強度が、３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４処置眼においてＦｃ処置眼と比較して６３．０％有意に増加したことを示した（図８Ｂ、Ｆ）。全体として、これらの知見は、３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４によるＴｉｅ２の活性化が、Ａ１：Ａ２ｉΔ／Δマウスの障害のあるＳＣをレスキューすることを示す。
【０１４９】
［２０５］
［２０６］実施例８．レーザー誘導ＣＮＶモデルにおける硝子体内注射した３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４によるＣＮＶ退行および血管漏出抑制。
［２０７］  ３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４を、レーザー誘導脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）モデルを用いて、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）の特徴である脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を阻害する能力について試験した。５ｍｇ／ｍｌフェニレフリンおよび５ｍｇ／ｍｌトロピカミド点眼薬（Ｓａｎｔｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）を用いて瞳孔を拡張し、局所麻酔のために０．５％塩酸プロパラカイン点眼薬（Ａｌｃｏｎ）を点眼した後、スリットランプ送達システムを備えたレーザー光凝固装置（Ｌｕｍｅｎｉｓ社）を、コンタクトレンズとしてのガラスカバースリップとともに用いて、網膜を視覚化した。十分なレーザーエネルギー（５３２ｎｍの波長、２５０ｍＷの出力、１００ｍｓの持続時間、５０μｍのスポットサイズ）を、各眼につき４つ位置所（後極の３時、６時、９時および１２時の位置）に送った。レーザー光硬化時に気泡を発生させ、ブルッフ膜の破裂を示す火傷だけをこの研究に含めた。レーザー部位に出血を含むスポットは分析から除外した。臨床状況を要約するために、３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４（５μｇ）をレーザー光硬化の７日後にマウスに硝子体内投与した（図９Ａ）。コントロールまたは比較として、ＦｃまたはＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（各５μｇ）を同じ方法でマウスに投与した。所定の試薬を硝子体内投与するために、ガラスキャピラリーピペットを備えたナノリッター２０００マイクロインジェクター（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、各試薬５μｇを含む約１μｌ（５ｍｇ／ｍｌ）を硝子体内腔に注入した。網膜色素上皮（ＲＰＥ）−脈絡膜−強膜フラットマウントのＣＤ３１＋ＣＮＶ体積を、レーザー光硬化の１４日後に、ＭＡＴＬＡＢ画像処理ツールボックス（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）を用いて計算した。抗ＣＤ３１抗体（１：２００、ミリポア）をＣＮＶの内皮細胞の検出のために用いた。ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐは、Ｆｃと比較して６４．４％までＣＮＶ退行を効果的に誘発し、３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４は同様にＣＮＶ退行を誘発した（６５．７％）（図９Ｂ）。フルオレセイン血管造影（ＦＡ）とインドシアニングリーン血管造影（ＩＣＧＡ）とを組合せることで、レーザー損傷部位周辺での新生血管の血管漏出を測定することが可能となった。４８８ｎｍおよび７８５ｎｍの連続波レーザーモジュールを、それぞれフルオレセインおよびＩＣＧの励起源として用いた。励起レーザーのラスタ走査パターンは、回転ポリゴンミラー（ＭＣ−５；Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｌａｓｅｒ）およびガルバノメーターベースのスキャンミラー（６２３０Ｈ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で構成されるスキャナーシステムによって実行され、イメージングレンズのバック開口部に送られた。高い開口数（ＮＡ）の対物レンズ（ＰｌａｎＡｐｏλ、ＮＡ０．７５；Ｎｉｋｏｎ）をイメージングレンズとして使用し、広視野眼底蛍光画像を提供した。光電子増倍管（Ｒ９１１０；浜松ホトニクス）で検出された蛍光シグナルは、フレームグラバーによりデジタル化され、フレームあたり５１２×５１２ピクセルサイズの画像にリアルタイムで再構成された。血管造影システムを利用した後期（６分）のＦＡおよびＩＣＧＡ画像を視覚化するために、１０ｍｇのフルオレセインナトリウム（Ａ���ｃｏｎ）および０．１５ｍｇのＩＣＧ（Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）をそれぞれ腹腔内および静脈内に投与した。イメージング手順は、画像の品質を向上させるために全身麻酔および瞳孔拡張のもとで実行した。ＣＮＶからの漏出面積は、Ｊａｖａベースのイメージングソフトウェア（ＩｍａｊｅＪ；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）を用い、ＦＡ画像にて測定された高蛍光面積の合計をＩＣＧＡ画像にて測定されたＣＮＶの総面積で割ることで計算した。Ｆｃと比較して、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（３７．０％）および３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４（２４．６％）の両方が同様に血管漏出を抑制した（図９Ｃ）。注目すべきことに、Ｆｃ処置群ではレーザー光硬化後６日から１４日の間で血管漏出に有意な差はなかったが、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐおよび３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４では血管脱出が著しく減少した（それぞれ４５．６％および４２．５％）（図９Ｃ）。したがって、ＣＮＶおよび血管漏出の抑制の大きさは、レーザー誘導ＣＮＶのマウスモデルでは、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐと３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４との間で定量的に区別できなかった。
【０１５０】
［２０８］
［２０９］実施例９．ＣＮＶの内皮細胞における３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４およびＣＤ３１の共局在。
［２１０］  皮下注射された３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４がＣＮＶに対しても治療効果を発揮できるかどうかを調べるために、我々はまず、ＣＮＶの内皮細胞における３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４とＣＤ３１の共局在を評価した。３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４（２５ｍｇ／ｋｇ）の皮下投与は、レーザー光硬化の１日後に行った。コントロールとして、Ｆｃ（２５ｍｇ／ｋｇ）を同じ方法でマウスに投与した。ＣＮＶの内皮細胞における３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４と抗ＣＤ３１抗体（１：２００、ミリポア）の共局在を、レーザー光硬化の２日、４日および８日後に抗ヒトＩｇＧ抗体（１：１０００、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により直接検出した（図１０Ａ）。投与された３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４は、ＣＤ３１＋内皮細胞ＣＮＶで高度に検出可能であった（図１０Ｂ−Ｄ）。
【０１５１】
［２１１］
［２１２］実施例１０．皮下注射された３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４抗体のＣＮＶ阻害効果。
［２１３］  ＣＮＶ阻害における皮下注射された３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４の効果を決定するために、３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４（２５ｍｇ／ｋｇ）の皮下投与をレーザー光硬化の１日後に行った。コントロールとして、Ｆｃ（２５ｍｇ／ｋｇ）を同じ方法でマウスに投与した。ＣＮＶの内皮細胞の検出のために抗ＣＤ３１抗体（１：２００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用い、レーザー光硬化の８日後にＭＡＴＬＡＢ画像処理ツールボックス（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）を使用してＲＰＥ−脈絡膜−強膜フラットマウントのＣＤ３１＋ＣＮＶ体積を計算した（図１１Ａ）。３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４はＦｃと比較してＣＮＶ形成を６９．９％まで効果的に阻害し（図１１Ｂ、Ｃ）、これは３Ｈ７Ｈ１２Ｇ４の硝子体内注射だけでなく皮下注射でもＣＮＶに対して阻害効果があることを示す。
【０１５２】
［２１４］
産業上の利用可能性
［２１５］  本発明に係るＴｉｅ２に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、高い親和性でもってＴｉｅ２に結合し、ヒトおよびマウスに対する交差反応性を維持し、および所望の抗原反応性を示す。加えて、Ｔｉｅ２のリン酸化およびＴｉｅ２受容体の活性化を誘導することによって、目的の血管新生疾患を予防または処置するために有用に用いることができる。
【０１５３】
［２１６］
［２１７］  これまで、本発明の内容の特定の部分を詳細に説明してきたが、これらの特定の技術は単なる好ましい実施形態であることは当業者には明らかであろう、したがって、本発明の範囲は、これらの実施形態に限定されない。
【０１５４】
［２１８］
［２１９］
【図１】
2021526801.tif 000022
【図２】
2021526801.tif 000023
【図３】
2021526801.tif 000024
【図４】
2021526801.tif 000025
【図５】
2021526801.tif 000026
【図６】
2021526801.tif 000027
【図７】
2021526801.tif 000028
【図８】
2021526801.tif 000029
【図９】
2021526801.tif 000030
【図１０】
2021526801.tif 000031
【図１１】
2021526801.tif 000032
【配列表】
2021526801000001.app
【国際調査報告】
2021526801.tif 000033
2021526801.tif 000034
2021526801.tif 000035
2021526801.tif 000036
2021526801.tif 000037
2021526801.tif 000038