(57)【要約】ヒノキチオールの類似体、それらの調製方法、及びそれらの医薬組成物を開示する。また、鉄関連疾患の治療に使用される方法も開示する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
６−ブロモ−２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化１】
2021521116.tif 000404
またはその塩の調製方法であって、
ブレンステッド塩基及び７，７−ジブロモ−３−メトキシビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−２−オン：
【化２】
2021521116.tif 000405
またはその塩を組み合わせることによって、６−ブロモ−２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オンまたはその塩を形成する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記塩基が、無機塩基である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記塩基が、炭酸塩である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記塩基が、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸セシウム、炭酸カルシウム、またはそれらの組み合わせである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
７，７−ジブロモ−３−メトキシビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−２−オン：
【化３】
2021521116.tif 000406
またはその塩を調製し、
メチル化剤及び７，７−ジブロモ−３−ヒドロキシビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−２−オン：
【化４】
2021521116.tif 000407
またはその塩を組み合わせて、混合物を形成することによって、６−ブロモ−２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オンまたはその塩を形成する工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記メチル化剤が、ヨウ化メチルである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
無機塩基をさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記無機塩基が、炭酸塩である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記炭酸塩が、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸セシウム、炭酸カルシウム、またはそれらの組み合わせである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
約８０℃を超える温度（例えば、約９０℃）で前記混合物を加熱することをさらに含む、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
７，７−ジブロモ−３−ヒドロキシビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−２−オン：
【化５】
2021521116.tif 000408
またはその塩を調製し、
酸化剤及び７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−２，３−ジオール：
【化６】
2021521116.tif 000409
またはその塩を組み合わせることによって、７，７−ジブロモ−３−ヒドロキシビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−２−オンまたはその塩を形成する工程をさらに含む、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記酸化剤が、重クロム酸カリウム、クロロクロム酸ピリジニウム、デス−マーチンペルヨージナン、塩化オキサリル、ジメチルスルホキシド、アルミニウムアルコキシド（例えば、アルミニウムイソプロポキシド）、トリメチルアルミニウム、カリウム  ｔｅｒｔ−ブトキシド、炭酸銀、またはそれらのいずれかの混合物を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記酸化剤が、ジメチルスルホキシド、及びカルボジイミド、無水トリフルオロ酢酸、塩化オキサリル、及び三酸化硫黄ピリジン錯体からなる群から選択される１つ以上のさらなる試薬をさらに含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−２，３−ジオールを前記酸化剤と接触後に塩基性アミンと接触させる、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記塩基性アミンが、第三級アミンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記塩基性アミンが、トリエチルアミンである、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−２，３−ジオールを、約５℃未満の温度で前記酸化剤と接触させる、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−２，３−ジオールを、約−７８℃の温度で前記酸化剤と最初に接触させる、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
温度を約０℃に温めることをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が、４−ブロモ−２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化７】
2021521116.tif 000410
またはその塩を得ない、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
以下の構造式の化合物：
【化８】
2021521116.tif 000411
またはその塩の調製方法であって、
以下の構造式の化合物：
【化９】
2021521116.tif 000412
またはその塩をハロゲン化剤と反応させることによって、前記化合物を形成することを含み、
式中、Ｒｂが、Ｈまたはメチルであり、Ｘが、ハロゲンである、前記方法。
【請求項２２】
前記ハロゲン化剤が、臭素化剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記臭素化剤が、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）または臭化水素酸である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
４−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化１０】
2021521116.tif 000413
またはその塩の調製方法であって、
７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−２，３−ジオール：
【化１１】
2021521116.tif 000414
またはその塩を、酸化剤と組み合わせることによって、４−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オンまたはその塩を形成することを含む、前記方法。
【請求項２５】
７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−２，３−ジオール及び前記酸化剤を、塩基と組み合わせることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記塩基が、アミンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記アミンが、第三級アミンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記塩基が、トリエチルアミンである、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−２，３−ジオールを、約−７８℃の温度で前記酸化剤と最初に接触させる、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
温度を約０℃に温めることをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
５−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化１２】
2021521116.tif 000415
またはその塩の調製方法であって
７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−３，４−ジオール：
【化１３】
2021521116.tif 000416
またはその塩を、酸化剤と組み合わせることによって、５−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オンまたはその塩を形成することを含む、前記方法。
【請求項３２】
７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−３，４−ジオールを、約−７８℃の温度で前記酸化剤と最初に接触させる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
温度を約０℃に温めることをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記酸化剤が、重クロム酸カリウム、クロロクロム酸ピリジニウム、デス−マーチンペルヨージナン、塩化オキサリル、ジメチルスルホキシド、アルミニウムアルコキシド（例えば、アルミニウムイソプロポキシド）、トリメチルアルミニウム、カリウム  ｔｅｒｔ−ブトキシド、または炭酸銀のうちの１つ以上を含む、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記酸化剤が、ジメチルスルホキシド、及びカルボジイミド、無水トリフルオロ酢酸、塩化オキサリル、及び三酸化硫黄ピリジン錯体からなる群から選択される１つ以上のさらなる試薬を含む、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−３、４−ジオール及び前記酸化剤を、塩基と組み合わせることをさらに含む、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記塩基が、アミン塩基である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記塩基が、第三級アミン塩基である、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記塩基が、トリエチルアミンである、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
以下の構造式の化合物：
【化１４】
2021521116.tif 000417
またはその塩の調製方法であって、
以下の構造式の化合物：
【化１５】
2021521116.tif 000418
またはその塩を、２−ブロモ−７−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化１６】
2021521116.tif 000419
またはその塩と反応させることによって、構造式：
【化１７】
2021521116.tif 000420
またはその塩の化合物を得ることを含み、
式中：
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで任意選択で置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、前記方法。
【請求項４１】
Ｒ１’及びＲ２’が両方とも水素である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
Ｒａが、
【化１８】
2021521116.tif 000421
からなる群から選択される、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
構造式の化合物：
【化１９】
2021521116.tif 000422
またはその塩が、
【化２０】
2021521116.tif 000423
からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
Ｒａが、
【化２１】
2021521116.tif 000424
からなる群から選択される、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４５】
構造式の化合物：
【化２２】
2021521116.tif 000425
またはその塩が、
【化２３】
2021521116.tif 000426
からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
Ｒａが、
【化２４】
2021521116.tif 000427
からなる群から選択される、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４７】
構造式の化合物：
【化２５】
2021521116.tif 000428
またはその塩が、
【化２６−１】
2021521116.tif 000429
【化２６−２】
2021521116.tif 000430
またはその塩からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
前記方法が、前記反応化合物を金属触媒と接触させることをさらに含む、請求項４０〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記金属触媒が、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記金属触媒が、有機パラジウム触媒である、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記金属触媒が、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記反応が、プロモーターをさらに含む、請求項４８〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記プロモーターが、タリウム（Ｉ）エトキシドまたは酸化銀である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記プロモーターが、酸化銀である、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
構造式の化合物：
【化２７】
2021521116.tif 000431
またはその塩の調製方法であって、
構造式を有する化合物：
【化２８】
2021521116.tif 000432
またはその塩を、脱メチル化剤と組み合わせることによって、構造式の化合物：
【化２９】
2021521116.tif 000433
またはその塩を得ることを含み；
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換される、前記方法。
【請求項５６】
前記脱メチル化剤が、酸である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記脱メチル化剤が、鉱酸、有機酸、またはそれらの組み合わせである、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記脱メチル化剤が、塩酸、臭化水素酸、硫酸、酢酸、またはそれらの組み合わせである、請求項５５〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記脱メチル化剤が、酢酸中の臭化水素酸または塩酸である、請求項５５〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記脱メチル化剤が、硫酸である、請求項５５〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
構造式を有する化合物：
【化３０】
2021521116.tif 000434
またはその塩を脱メチル化剤と接触させて、沸騰するまで加熱することによって、構造式の化合物：
【化３１】
2021521116.tif 000435
またはその塩を得る、請求項５５〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
構造式の化合物：
【化３２】
2021521116.tif 000436
またはその塩が、
【化３３】
2021521116.tif 000437
またはそれらの塩から選択される、請求項５５〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
構造式の化合物：
【化３４】
2021521116.tif 000438
またはその塩が、
【化３５】
2021521116.tif 000439
またはその塩からなる群から選択される、請求項５５〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
構造式の化合物：
【化３６】
2021521116.tif 000440
またはその塩が、
【化３７−１】
2021521116.tif 000441
【化３７−２】
2021521116.tif 000442
またはその塩からなる群から選択される、請求項５５〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
構造式の化合物：
【化３８】
2021521116.tif 000443
またはその塩の調製方法であって、
（１）構造式の化合物：
【化３９】
2021521116.tif 000444
またはその塩を、構造式の化合物：
【化４０】
2021521116.tif 000445
またはその塩と反応させることによって、構造式を有する化合物：
【化４１】
2021521116.tif 000446
またはその塩を得ること；及び
（２）構造式を有する化合物：
【化４２】
2021521116.tif 000447
またはその塩を、脱メチル化剤と接触させることによって、構造式の化合物：
【化４３】
2021521116.tif 000448
またはその塩を得ることを含み；
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択及び独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、前記方法。
【請求項６６】
Ｒ１’及びＲ２’が両方とも水素である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記方法の工程（１）が、前記反応化合物を金属触媒と接触させることをさらに含む、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記金属触媒が、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記金属触媒が、有機パラジウム触媒である、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記金属触媒が、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記反応が、プロモーターをさらに含む、請求項６７〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記プロモーターが、タリウム（Ｉ）エトキシドまたは酸化銀である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記プロモーターが、酸化銀である、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記脱メチル化剤が、酸である、請求項６５〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記脱メチル化剤が、鉱酸、有機酸、またはそれらの組み合わせである、請求項６５〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記脱メチル化剤が、塩酸、臭化水素酸、硫酸、酢酸、またはそれらの組み合わせである、請求項６５〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記脱メチル化剤が、酢酸中の臭化水素酸または塩酸である、請求項６５〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記脱メチル化剤が、硫酸である、請求項６５〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
Ｒａが、
【化４４】
2021521116.tif 000449
からなる群から選択される、請求項６５〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
構造式の化合物：
【化４５】
2021521116.tif 000450
またはその塩が、
【化４６】
2021521116.tif 000451
またはその塩からなる群から選択される、請求項６５〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
構造式の化合物：
【化４７】
2021521116.tif 000452
またはその塩が、
【化４８】
2021521116.tif 000453
またはそれらの塩から選択される、請求項６５〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
Ｒａが、
【化４９】
2021521116.tif 000454
からなる群から選択される、請求項６５〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
構造式の化合物：
【化５０】
2021521116.tif 000455
またはその塩が、
【化５１】
2021521116.tif 000456
またはその塩からなる群から選択される、請求項６５〜７８及び８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
構造式の化合物：
【化５２】
2021521116.tif 000457
またはその塩が、
【化５３】
2021521116.tif 000458
またはその塩からなる群から選択される、請求項６５〜７８、８２及び８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
Ｒａが、
【化５４】
2021521116.tif 000459
からなる群から選択される、請求項６５〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
構造式の化合物：
【化５５】
2021521116.tif 000460
またはその塩が、
【化５６−１】
2021521116.tif 000461
【化５６−２】
2021521116.tif 000462
またはその塩からなる群から選択される、請求項６５〜７８及び８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
構造式の化合物：
【化５７】
2021521116.tif 000463
またはその塩が、
【化５８−１】
2021521116.tif 000464
【化５８−２】
2021521116.tif 000465
またはその塩からなる群から選択される、請求項６５〜７８、８５及び８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
構造式の化合物：
【化５９】
2021521116.tif 000466
またはその塩の調製方法であって、
構造式の化合物：
【化６０】
2021521116.tif 000467
またはその塩を、構造式の化合物：
【化６１】
2021521116.tif 000468
またはその塩と反応させることによって、構造式の化合物：
【化６２】
2021521116.tif 000469
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒｂが、水素またはメチルであり；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択及び独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、前記方法。
【請求項８９】
前記方法が、前記反応化合物を金属触媒と接触させることをさらに含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記金属触媒が、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記金属触媒が、有機パラジウム触媒である、請求項８９または９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記金属触媒が、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される、請求項８９〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記反応が、プロモーターをさらに含む、請求項８９〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記プロモーターが、タリウム（Ｉ）エトキシドまたは酸化銀である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記プロモーターが、酸化銀である、請求項９３または９４に記載の方法。
【請求項９６】
Ｒ１’及びＲ２’が両方とも水素である、請求項８８〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
Ｒａが、
【化６３】
2021521116.tif 000470
からなる群から選択される、請求項８８〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
構造式の化合物：
【化６４】
2021521116.tif 000471
またはその塩が、
【化６５】
2021521116.tif 000472
またはその塩からなる群から選択される、請求項８８〜９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
Ｒａが、
【化６６】
2021521116.tif 000473
からなる群から選択される、請求項８８〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
構造式の化合物：
【化６７】
2021521116.tif 000474
またはその塩が、
【化６８】
2021521116.tif 000475
またはその塩からなる群から選択される、請求項８８〜９６及び９９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
Ｒａが、
【化６９】
2021521116.tif 000476
から選択される、請求項８８〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
構造式の化合物：
【化７０】
2021521116.tif 000477
またはその塩が、
【化７１−１】
2021521116.tif 000478
【化７１−２】
2021521116.tif 000479
またはその塩からなる群から選択される、請求項８８〜９６及び１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
構造式の化合物：
【化７２】
2021521116.tif 000480
またはその塩の調製方法であって、構造式を有する化合物：
【化７３】
2021521116.tif 000481
またはその塩を、脱メチル化剤と組み合わせることによって、構造式の化合物：
【化７４】
2021521116.tif 000482
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換される、前記方法。
【請求項１０４】
前記脱メチル化剤が、酸である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記脱メチル化剤が、鉱酸、有機酸、またはそれらの組み合わせである、請求項１０３または１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記脱メチル化剤が、塩酸、臭化水素酸、硫酸、酢酸、またはそれらの組み合わせである、請求項１０３〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記脱メチル化剤が、酢酸中の臭化水素酸または塩酸である、請求項１０３〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記脱メチル化剤が、硫酸である、請求項１０３〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
構造式を有する化合物：
【化７５】
2021521116.tif 000483
またはその塩を脱メチル化剤と接触させて、沸騰するまで加熱することによって、構造式の化合物：
【化７６】
2021521116.tif 000484
またはその塩を得ることを含む、請求項１０３〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
構造式の化合物：
【化７７】
2021521116.tif 000485
またはその塩が、
【化７８】
2021521116.tif 000486
またはそれらの塩から選択される、請求項１０３〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１１】
構造式の化合物：
【化７９】
2021521116.tif 000487
またはその塩が、
【化８０】
2021521116.tif 000488
またはその塩からなる群から選択される、請求項１０３〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
構造式の化合物：
【化８１】
2021521116.tif 000489
またはその塩が、
【化８２−１】
2021521116.tif 000490
【化８２−２】
2021521116.tif 000491
またはその塩からなる群から選択される、請求項１０３〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１３】
構造式の化合物：
【化８３】
2021521116.tif 000492
またはその塩の調製方法であって、
（１）２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化８４】
2021521116.tif 000493
またはその塩を、臭素化剤と反応させることによって、３−ブロモ−２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化８５】
2021521116.tif 000494
またはその塩を形成すること、
（２）構造式の化合物：
【化８６】
2021521116.tif 000495
またはその塩を、３−ブロモ−２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化８７】
2021521116.tif 000496
またはその塩と反応させることによって、構造式を有する化合物：
【化８８】
2021521116.tif 000497
またはその塩を形成すること；及び
（３）構造式を有する化合物：
【化８９】
2021521116.tif 000498
またはその塩を、脱メチル化剤と接触させることによって、構造式の化合物：
【化９０】
2021521116.tif 000499
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択及び独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、前記方法。
【請求項１１４】
前記方法の工程（２）が、前記反応化合物を金属触媒と接触させることをさらに含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記金属触媒が、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記金属触媒が、有機パラジウム触媒である、請求項１１４または１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記金属触媒が、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される、請求項１１４〜１１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記反応が、プロモーターをさらに含む、請求項１１４〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記プロモーターが、タリウム（Ｉ）エトキシドまたは酸化銀である、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記プロモーターが、酸化銀である、請求項１１８または１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記脱メチル化剤が、酸である、請求項１０３〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記脱メチル化剤が、鉱酸、有機酸、またはそれらの組み合わせである、請求項１１３〜１２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記脱メチル化剤が、塩酸、臭化水素酸、硫酸、酢酸、またはそれらの組み合わせである、請求項１１３〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記脱メチル化剤が、酢酸中の臭化水素酸または塩酸である、請求項１１３〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記脱メチル化剤が、硫酸である、請求項１１３〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２６】
Ｒ１’及びＲ２’が両方とも水素である、請求項１１３〜１２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２７】
Ｒａが、
【化９１】
2021521116.tif 000500
からなる群から選択される、請求項１１３〜１２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２８】
構造式の化合物：
【化９２】
2021521116.tif 000501
またはその塩が、
【化９３】
2021521116.tif 000502
またはその塩からなる群から選択される、請求項１１３〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２９】
構造式の化合物：
【化９４】
2021521116.tif 000503
またはその塩が、
【化９５】
2021521116.tif 000504
またはそれらの塩から選択される、請求項１１３〜１２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３０】
Ｒａが、
【化９６】
2021521116.tif 000505
からなる群から選択される、請求項１１３〜１２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３１】
構造式の化合物：
【化９７】
2021521116.tif 000506
またはその塩が、
【化９８】
2021521116.tif 000507
またはその塩からなる群から選択される、請求項１１３〜１２６及び１３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３２】
構造式の化合物：
【化９９】
2021521116.tif 000508
またはその塩が、
【化１００】
2021521116.tif 000509
またはその塩からなる群から選択される、請求項１１３〜１２６、１３０及び１３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３３】
Ｒａが、
【化１０１】
2021521116.tif 000510
からなる群から選択される、請求項１１３〜１２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３４】
構造式の化合物：
【化１０２】
2021521116.tif 000511
またはその塩が、
【化１０３−１】
2021521116.tif 000512
【化１０３−２】
2021521116.tif 000513
またはその塩からなる群から選択される、請求項１１３〜１２６及び１３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３５】
構造式の化合物：
【化１０４】
2021521116.tif 000514
またはその塩が、
【化１０５−１】
2021521116.tif 000515
【化１０５−２】
2021521116.tif 000516
またはその塩からなる群から選択される、請求項１１３〜１２６、１３３及び１３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３６】
構造式の化合物：
【化１０６】
2021521116.tif 000517
またはその塩の調製方法であって、
構造式の化合物：
【化１０７】
2021521116.tif 000518
またはその塩を、構造式の化合物：
【化１０８】
2021521116.tif 000519
またはその塩と反応させることによって、構造式の化合物：
【化１０９】
2021521116.tif 000520
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒｂが、水素またはメチルであり；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択及び独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、前記方法。
【請求項１３７】
前記方法が、前記化合物を金属触媒と接触させることをさらに含む、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記金属触媒が、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
前記金属触媒が、有機パラジウム触媒である、請求項１３７または１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記金属触媒が、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される、請求項１３７〜１３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記反応が、プロモーターをさらに含む、請求項１３９〜１４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記プロモーターが、タリウム（Ｉ）エトキシドまたは酸化銀である、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記プロモーターが、酸化銀である、請求項１４１または１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
Ｒ１’及びＲ２’が両方とも水素である、請求項１３６〜１４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４５】
Ｒａが、
【化１１０】
2021521116.tif 000521
からなる群から選択される、請求項１３６〜１４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４６】
構造式の化合物：
【化１１１】
2021521116.tif 000522
またはその塩が、
【化１１２】
2021521116.tif 000523
またはその塩からなる群から選択される、請求項１３６〜１４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４７】
Ｒａが、
【化１１３】
2021521116.tif 000524
からなる群から選択される、請求項１３６〜１４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４８】
構造式の化合物：
【化１１４】
2021521116.tif 000525
またはその塩が、
【化１１５】
2021521116.tif 000526
またはその塩からなる群から選択される、請求項１３６〜１４４及び１４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４９】
Ｒａが、
【化１１６】
2021521116.tif 000527
からなる群から選択される、請求項１３６〜１４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５０】
構造式の化合物：
【化１１７】
2021521116.tif 000528
またはその塩が、
【化１１８−１】
2021521116.tif 000529
【化１１８−２】
2021521116.tif 000530
またはその塩からなる群から選択される、請求項１３６〜１４４及び１４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５１】
構造式の化合物：
【化１１９】
2021521116.tif 000531
またはその塩の調製方法であって、
構造式を有する化合物：
【化１２０】
2021521116.tif 000532
またはその塩を、脱メチル化剤と組み合わせることによって、構造式の化合物：
【化１２１】
2021521116.tif 000533
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換される、前記方法。
【請求項１５２】
前記脱メチル化剤が、酸である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記脱メチル化剤が、鉱酸、有機酸、またはそれらの組み合わせである、請求項１５１または１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記脱メチル化剤が、塩酸、臭化水素酸、硫酸、酢酸、またはそれらの組み合わせである、請求項１５１〜１５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５５】
前記脱メチル化剤が、酢酸中の臭化水素酸または塩酸である、請求項１５３〜１５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５６】
前記脱メチル化剤が、硫酸である、請求項１５３〜１５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５７】
構造式を有する化合物：
【化１２２】
2021521116.tif 000534
またはその塩を脱メチル化剤と接触させて、沸騰するまで加熱することによって、構造式の化合物：
【化１２３】
2021521116.tif 000535
またはその塩を得ることを含む、請求項１５３〜１５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５８】
構造式の化合物：
【化１２４】
2021521116.tif 000536
またはその塩が、
【化１２５】
2021521116.tif 000537
またはそれらの塩から選択される、請求項１５３〜１５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５９】
構造式の化合物：
【化１２６】
2021521116.tif 000538
またはその塩が、
【化１２７】
2021521116.tif 000539
またはその塩からなる群から選択される、請求項１５３〜１５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６０】
構造式の化合物：
【化１２８】
2021521116.tif 000540
またはその塩が、
【化１２９−１】
2021521116.tif 000541
【化１２９−２】
2021521116.tif 000542
またはそれらの塩から選択される、請求項１５３〜１５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６１】
構造式の化合物：
【化１３０】
2021521116.tif 000543
またはその塩の調製方法であって、
（１）７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−２，３−ジオール：
【化１３１】
2021521116.tif 000544
またはその塩を、酸化剤と接触させることによって、４−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化１３２】
2021521116.tif 000545
またはその塩を形成すること、
（２）構造式の化合物：
【化１３３】
2021521116.tif 000546
またはその塩を、４−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化１３４】
2021521116.tif 000547
またはその塩と反応させることによって、構造式を有する化合物：
【化１３５】
2021521116.tif 000548
またはその塩を形成することを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択及び独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、前記方法。
【請求項１６２】
前記方法の工程（１）では、７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−２，３−ジオールを、約−７８℃の温度で前記酸化剤と最初に接触させる、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
温度を約０℃に温めることをさらに含む、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
前記酸化剤が、ジメチルスルホキシド、及びカルボジイミド、無水トリフルオロ酢酸、塩化オキサリル、及び三酸化硫黄ピリジン錯体からなる群から選択される１つ以上のさらなる試薬を含む、請求項１６２または１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記酸化剤が、ジメチルスルホキシド、及びカルボジイミド、無水トリフルオロ酢酸、塩化オキサリル、及び三酸化硫黄ピリジン錯体からなる群から選択される１つ以上のさらなる試薬を含む、請求項１６２〜１６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６６】
前記方法の工程（１）が、７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−２，３−ジオール及び前記酸化剤を、塩基と接触させることをさらに含む、請求項１６１〜１６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６７】
前記塩基が、アミン塩基である、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１６８】
前記塩基が、第三級アミン塩基である、請求項１６６または１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
前記塩基が、トリエチルアミンである、請求項１６６〜１６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７０】
前記方法の工程（２）が、前記化合物を金属触媒と接触させることをさらに含む、請求項１６１〜１６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７１】
前記金属触媒が、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
前記金属触媒が、有機パラジウム触媒である、請求項１７０または１７１に記載の方法。
【請求項１７３】
前記金属触媒が、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される、請求項１７０〜１７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７４】
前記反応が、プロモーターをさらに含む、請求項１７０〜１７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７５】
前記プロモーターが、タリウム（Ｉ）エトキシドまたは酸化銀である、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
前記プロモーターが、酸化銀である、請求項１７４または１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
Ｒａが、
【化１３６】
2021521116.tif 000549
からなる群から選択される、請求項１６１〜１７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７８】
構造式の化合物：
【化１３７】
2021521116.tif 000550
またはその塩が、
【化１３８】
2021521116.tif 000551
またはそれらの塩から選択される、請求項１６１〜１７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７９】
Ｒａが、
【化１３９】
2021521116.tif 000552
からなる群から選択される、請求項１６１〜１７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８０】
構造式の化合物：
【化１４０】
2021521116.tif 000553
またはその塩が、
【化１４１】
2021521116.tif 000554
またはその塩からなる群から選択される、請求項１６１〜１７６及び１７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８１】
Ｒａが、
【化１４２】
2021521116.tif 000555
からなる群から選択される、請求項１６１〜１７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８２】
構造式の化合物：
【化１４３】
2021521116.tif 000556
またはその塩が、
【化１４４−１】
2021521116.tif 000557
【化１４４−２】
2021521116.tif 000558
またはその塩からなる群から選択される、請求項１６１〜１７６及び１８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８３】
構造式の化合物：
【化１４５】
2021521116.tif 000559
またはその塩の調製方法であって、
構造式の化合物：
【化１４６】
2021521116.tif 000560
またはその塩を、構造式の化合物：
【化１４７】
2021521116.tif 000561
またはその塩と反応させることによって、構造式の化合物：
【化１４８】
2021521116.tif 000562
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒｂが、水素またはメチルであり；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択及び独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、前記方法。
【請求項１８４】
前記方法が、前記化合物を金属触媒と接触させることをさらに含む、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
前記金属触媒が、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
前記金属触媒が、有機パラジウム触媒である、請求項１８４または１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
前記金属触媒が、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される、請求項１８４〜１８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８８】
前記反応が、プロモーターをさらに含む、請求項１８４〜１８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８９】
前記プロモーターが、タリウム（Ｉ）エトキシドまたは酸化銀である、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
前記プロモーターが、酸化銀である、請求項１８８または１８９に記載の方法。
【請求項１９１】
Ｒ１’及びＲ２’が両方とも水素である、請求項１８３〜１９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９２】
Ｒａが、
【化１４９】
2021521116.tif 000563
からなる群から選択される、請求項１８３〜１９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９３】
構造式の化合物：
【化１５０】
2021521116.tif 000564
またはその塩が、
【化１５１】
2021521116.tif 000565
またはその塩からなる群から選択される、請求項１８３〜１９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９４】
Ｒａが、
【化１５２】
2021521116.tif 000566
からなる群から選択される、請求項１８３〜１９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９５】
構造式の化合物：
【化１５３】
2021521116.tif 000567
またはその塩が、
【化１５４】
2021521116.tif 000568
またはその塩からなる群から選択される、請求項１８３〜１９１及び１９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９６】
Ｒａが、
【化１５５】
2021521116.tif 000569
からなる群から選択される、請求項１８３〜１９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９７】
構造式の化合物：
【化１５６】
2021521116.tif 000570
またはその塩が、
【化１５７−１】
2021521116.tif 000571
【化１５７−２】
2021521116.tif 000572
またはその塩からなる群から選択される、請求項１８３〜１９１及び１９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９８】
構造式の化合物：
【化１５８】
2021521116.tif 000573
またはその塩の調製方法であって、
構造式を有する化合物：
【化１５９】
2021521116.tif 000574
またはその塩を、脱メチル化剤と組み合わせることによって、構造式の化合物：
【化１６０】
2021521116.tif 000575
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換される、前記方法。
【請求項１９９】
前記脱メチル化剤が、酸である、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２００】
前記脱メチル化剤が、鉱酸、有機酸、またはそれらの組み合わせである、請求項１９８または１９９に記載の方法。
【請求項２０１】
前記脱メチル化剤が、塩酸、臭化水素酸、硫酸、酢酸、またはそれらの組み合わせである、請求項１９８〜２００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０２】
前記脱メチル化剤が、酢酸中の臭化水素酸または塩酸である、請求項１９８〜２０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０３】
前記脱メチル化剤が、硫酸である、請求項１９８〜２０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０４】
構造式を有する化合物：
【化１６１】
2021521116.tif 000576
またはその塩を脱メチル化剤と接触させて、沸騰するまで加熱することによって、構造式の化合物：
【化１６２】
2021521116.tif 000577
またはその塩を得る、請求項１９８〜２０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０５】
構造式の化合物：
【化１６３】
2021521116.tif 000578
またはその塩が、
【化１６４】
2021521116.tif 000579
またはその塩からなる群から選択される、請求項１９８〜２０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０６】
構造式の化合物：
【化１６５】
2021521116.tif 000580
またはその塩が、
【化１６６】
2021521116.tif 000581
またはその塩からなる群から選択される、請求項１９８〜２０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０７】
構造式の化合物：
【化１６７】
2021521116.tif 000582
またはその塩が、
【化１６８−１】
2021521116.tif 000583
【化１６８−２】
2021521116.tif 000584
またはその塩からなる群から選択される、請求項１９８〜２０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０８】
構造式の化合物：
【化１６９】
2021521116.tif 000585
またはその塩の調製方法であって、
（１）７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−３、４−ジオール：
【化１７０】
2021521116.tif 000586
またはその塩を、酸化剤と接触させることによって、５−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化１７１】
2021521116.tif 000587
またはその塩を形成すること；及び
（２）構造式の化合物：
【化１７２】
2021521116.tif 000588
またはその塩を、５−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化１７３】
2021521116.tif 000589
またはその塩と反応させることによって、構造式を有する化合物：
【化１７４】
2021521116.tif 000590
またはその塩を形成することを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択及び独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、前記方法。
【請求項２０９】
前記方法の工程（１）が、７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−３、４−ジオール及び前記酸化剤を、塩基と接触させることをさらに含む、請求項２０８に記載の方法。
【請求項２１０】
前記塩基が、アミン塩基である、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２１１】
前記塩基が、第三級アミン塩基である、請求項２０９または２１０に記載の方法。
【請求項２１２】
前記塩基が、トリエチルアミンである、請求項２０９〜２１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１３】
前記方法の工程（２）が、前記化合物を金属触媒と接触させることをさらに含む、請求項２０８〜２１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１４】
前記金属触媒が、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である、請求項２１３に記載の方法。
【請求項２１５】
前記金属触媒が、有機パラジウム触媒である、請求項２１３または２１４に記載の方法。
【請求項２１６】
前記金属触媒が、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される、請求項２１３〜２１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１７】
前記反応が、プロモーターをさらに含む、請求項２１３〜２１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１８】
前記プロモーターが、タリウム（Ｉ）エトキシドまたは酸化銀である、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２１９】
前記プロモーターが、酸化銀である、請求項２１７または２１８に記載の方法。
【請求項２２０】
Ｒａが、
【化１７５】
2021521116.tif 000591
からなる群から選択される、請求項２０８〜２１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２１】
構造式の化合物：
【化１７６】
2021521116.tif 000592
またはその塩が、
【化１７７】
2021521116.tif 000593
またはその塩からなる群から選択される、請求項２０８〜２２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２２】
Ｒａが、
【化１７８】
2021521116.tif 000594
からなる群から選択される、請求項２０８〜２１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２３】
構造式の化合物：
【化１７９】
2021521116.tif 000595
またはその塩が、
【化１８０】
2021521116.tif 000596
またはその塩からなる群から選択される、請求項２０８〜２１９及び２２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２４】
Ｒａが、
【化１８１】
2021521116.tif 000597
からなる群から選択される、請求項２０８〜２１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２５】
構造式の化合物：
【化１８２】
2021521116.tif 000598
またはその塩が、
【化１８３−１】
2021521116.tif 000599
【化１８３−２】
2021521116.tif 000600
またはその塩からなる群から選択される、請求項２０８〜２１９及び２２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２６】
構造式の化合物：
【化１８４】
2021521116.tif 000601
またはその塩の調製方法であって、
構造式の化合物：
【化１８５】
2021521116.tif 000602
またはその塩を、構造式の化合物：
【化１８６】
2021521116.tif 000603
またはその塩と反応させることによって、構造式の化合物：
【化１８７】
2021521116.tif 000604
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒｂが、水素またはメチルであり；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択及び独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、前記方法。
【請求項２２７】
Ｒ１’及びＲ２’が両方とも水素である、請求項２２６に記載の方法。
【請求項２２８】
前記方法が、前記化合物を金属触媒と接触させることをさらに含む、請求項２２６または２２７に記載の方法。
【請求項２２９】
前記金属触媒が、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である、請求項２２８に記載の方法。
【請求項２３０】
前記金属触媒が、有機パラジウム触媒である、請求項２２８または２２９に記載の方法。
【請求項２３１】
前記金属触媒が、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される、請求項２２８〜２３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３２】
前記反応が、プロモーターをさらに含む、請求項２２８〜２３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３３】
前記プロモーターが、タリウム（Ｉ）エトキシドまたは酸化銀である、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３４】
前記プロモーターが、酸化銀である、請求項２３２または２３３に記載の方法。
【請求項２３５】
構造式の化合物：
【化１８８】
2021521116.tif 000605
またはその塩の調製方法であって、構造式の化合物：
【化１８９】
2021521116.tif 000606
またはその塩を、構造式の化合物：
【化１９０】
2021521116.tif 000607
またはその塩と反応させることによって、構造式の化合物：
【化１９１】
2021521116.tif 000608
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒｂが、水素またはメチルであり；
Ｘａが、
【化１９２】
2021521116.tif 000609
または−Ｓｎ（Ｃ１−６−アルキル）であり；及び
Ｘｂが、ハロまたは擬ハロである、前記方法。
【請求項２３６】
Ｘｂが、クロロ、ブロモ、ヨード、トリフラート、メシラート、またはホスホネートである、請求項２３５に記載の方法。
【請求項２３７】
Ｒａが、
【化１９３】
2021521116.tif 000610
であり、
式中、ｎが、１〜２０の整数であり、Ｒ１が、水素、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、またはＣ１−６−アルコキシである、請求項２３５または２３６に記載の方法。
【請求項２３８】
構造式の化合物：
【化１９４】
2021521116.tif 000611
またはその塩を、金属触媒の存在下で、構造式の化合物：
【化１９５】
2021521116.tif 000612
またはその塩と反応させる、請求項２３５〜２３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３９】
前記金属触媒が、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である、請求項２３８に記載の方法。
【請求項２４０】
前記金属触媒が、有機パラジウム触媒である、請求項２３８または２３９に記載の方法。
【請求項２４１】
前記金属触媒が、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される、請求項２３８〜２４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４２】
構造式の化合物：
【化１９６】
2021521116.tif 000613
またはその塩の調製方法であって、構造式の化合物：
【化１９７】
2021521116.tif 000614
またはその塩を、３−ブロモ−７−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化１９８】
2021521116.tif 000615
またはその塩と反応させることによって、構造式の化合物：
【化１９９】
2021521116.tif 000616
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択及び独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、前記方法。
【請求項２４３】
前記方法が、前記反応化合物を金属触媒と接触させることをさらに含む、請求項２４２に記載の方法。
【請求項２４４】
前記金属触媒が、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である、請求項２４３に記載の方法。
【請求項２４５】
前記金属触媒が、有機パラジウム触媒である、請求項２４３または２４４に記載の方法。
【請求項２４６】
前記金属触媒が、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される、請求項２４３〜２４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４７】
前記反応が、プロモーターをさらに含む、請求項２４３〜２４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４８】
前記プロモーターが、タリウム（Ｉ）エトキシドまたは酸化銀である、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２４９】
前記プロモーターが、酸化銀である、請求項２４７または２４８に記載の方法。
【請求項２５０】
Ｒ１’及びＲ２’が両方とも水素である、請求項２４２〜２４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５１】
Ｒａが、
【化２００】
2021521116.tif 000617
からなる群から選択される、請求項２４２〜２５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５２】
構造式の化合物：
【化２０１】
2021521116.tif 000618
またはその塩が、
【化２０２】
2021521116.tif 000619
またはその塩からなる群から選択される、請求項２４２〜２５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５３】
Ｒａが、
【化２０３】
2021521116.tif 000620
からなる群から選択される、請求項２４２〜２５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５４】
構造式の化合物：
【化２０４】
2021521116.tif 000621
またはその塩が、
【化２０５】
2021521116.tif 000622
またはその塩からなる群から選択される、請求項２４２〜２５０及び２５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５５】
Ｒａが、
【化２０６】
2021521116.tif 000623
からなる群から選択される、請求項２４２〜２５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５６】
構造式の化合物：
【化２０７】
2021521116.tif 000624
またはその塩が、
【化２０８−１】
2021521116.tif 000625
【化２０８−２】
2021521116.tif 000626
またはその塩からなる群から選択される、請求項２４２〜２５０及び２５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５７】
構造式の化合物：
【化２０９】
2021521116.tif 000627
またはその塩の調製方法であって、
構造式を有する化合物：
【化２１０】
2021521116.tif 000628
またはその塩を、脱メチル化剤と組み合わせることによって、構造式の化合物：
【化２１１】
2021521116.tif 000629
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換される、前記方法。
【請求項２５８】
前記脱メチル化剤が、酸である、請求項２５７に記載の方法。
【請求項２５９】
前記脱メチル化剤が、鉱酸、有機酸、またはそれらの組み合わせである、請求項２５７または２５８に記載の方法。
【請求項２６０】
前記脱メチル化剤が、塩酸、臭化水素酸、硫酸、酢酸、またはそれらの組み合わせである、請求項２５７〜２５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６１】
前記脱メチル化剤が、酢酸中の臭化水素酸または塩酸である、請求項２５７〜２６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６２】
前記脱メチル化剤が、硫酸である、請求項２５７〜２６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６３】
構造式を有する化合物：
【化２１２】
2021521116.tif 000630
またはその塩を脱メチル化剤と接触させて、沸騰するまで加熱することによって、構造式の化合物：
【化２１３】
2021521116.tif 000631
またはその塩を得る、請求項２５７〜２６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６４】
構造式の化合物：
【化２１４】
2021521116.tif 000632
またはその塩が、
【化２１５】
2021521116.tif 000633
またはそれらの塩から選択される、請求項２５７〜２６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６５】
構造式の化合物：
【化２１６】
2021521116.tif 000634
またはその塩が、
【化２１７】
2021521116.tif 000635
またはその塩からなる群から選択される、請求項２５７〜２６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６６】
構造式の化合物：
【化２１８】
2021521116.tif 000636
またはその塩が、
【化２１９−１】
2021521116.tif 000637
【化２１９−２】
2021521116.tif 000638
またはその塩からなる群から選択される、請求項２５７〜２６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６７】
構造式の化合物：
【化２２０】
2021521116.tif 000639
またはその塩の調製方法であって、
（１）７，７−ジブロモ−３−メトキシビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−２−オン：
【化２２１】
2021521116.tif 000640
またはその塩を、塩基と接触させることによって、６−ブロモ−２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化２２２】
2021521116.tif 000641
またはその塩を形成すること；
（２）構造式の化合物
【化２２３】
2021521116.tif 000642
またはその塩を、６−ブロモ−２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オンまたはその塩と反応させることによって、構造式を有する化合物：
【化２２４】
2021521116.tif 000643
またはその塩を得ること；及び
（３）構造式を有する化合物：
【化２２５】
2021521116.tif 000644
またはその塩を、脱メチル化剤と接触させることによって、構造式の化合物：
【化２２６】
2021521116.tif 000645
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択及び独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、前記方法。
【請求項２６８】
前記方法の工程（１）では、７，７−ジブロモ−３−メトキシビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−２−オンを、約−７８℃の温度で前記酸化剤と最初に接触させる、請求項２６７に記載の方法。
【請求項２６９】
温度を約０℃に温めることをさらに含む、請求項２６８に記載の方法。
【請求項２７０】
前記酸化剤が、重クロム酸カリウム、クロロクロム酸ピリジニウム、デス−マーチンペルヨージナン、塩化オキサリル、ジメチルスルホキシド、アルミニウムアルコキシド（例えば、アルミニウムイソプロポキシド）、トリメチルアルミニウム、カリウム  ｔｅｒｔ−ブトキシド、または炭酸銀のうちの１つ以上を含む、請求項２６７〜２６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７１】
前記酸化剤が、ジメチルスルホキシド、及びカルボジイミド、無水トリフルオロ酢酸、塩化オキサリル、及び三酸化硫黄ピリジン錯体からなる群から選択される１つ以上のさらなる試薬を含む、請求項２６７〜２７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７２】
前記方法の工程（１）が、７，７−ジブロモ−３−メトキシビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−２−オン及び前記酸化剤を、塩基と接触させることをさらに含む、請求項２６７〜２７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７３】
前記塩基が、アミン塩基である、請求項２７２に記載の方法。
【請求項２７４】
前記塩基が、第三級アミン塩基である、請求項２７２または２７３に記載の方法。
【請求項２７５】
前記塩基が、トリエチルアミンである、請求項２７２〜２７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７６】
前記方法の工程（２）が、前記化合物を金属触媒と接触させることをさらに含む、請求項２６７〜２７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７７】
前記金属触媒が、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である、請求項２７６に記載の方法。
【請求項２７８】
前記金属触媒が、有機パラジウム触媒である、請求項２７６または２７７に記載の方法。
【請求項２７９】
前記金属触媒が、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される、請求項２７６〜２７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８０】
前記反応が、プロモーターをさらに含む、請求項２７６〜２７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８１】
前記プロモーターが、タリウム（Ｉ）エトキシドまたは酸化銀である、請求項２８０に記載の方法。
【請求項２８２】
前記プロモーターが、酸化銀である、請求項２８０または２８１に記載の方法。
【請求項２８３】
Ｒ１’及びＲ２’が両方とも水素である、請求項２６７〜２８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８４】
前記脱メチル化剤が、酸である、請求項２６７〜２８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８５】
前記脱メチル化剤が、鉱酸、有機酸、またはそれらの組み合わせである、請求項２６７〜２８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８６】
前記脱メチル化剤が、塩酸、臭化水素酸、硫酸、酢酸、またはそれらの組み合わせである、請求項２６７〜２８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８７】
前記脱メチル化剤が、酢酸中の臭化水素酸または塩酸である、請求項２６７〜２８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８８】
前記脱メチル化剤が、硫酸である、請求項２６７〜２８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８９】
Ｒａが、
【化２２７】
2021521116.tif 000646
からなる群から選択される、請求項２６７〜２８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９０】
構造式の化合物：
【化２２８】
2021521116.tif 000647
またはその塩が、
【化２２９】
2021521116.tif 000648
またはその塩からなる群から選択される、請求項２６７〜２８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９１】
構造式の化合物：
【化２３０】
2021521116.tif 000649
またはその塩が、
【化２３１】
2021521116.tif 000650
またはそれらの塩から選択される、請求項２６７〜２９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９２】
Ｒａが、
【化２３２】
2021521116.tif 000651
からなる群から選択される、請求項２６７〜２８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９３】
構造式の化合物：
【化２３３】
2021521116.tif 000652
またはその塩が、
【化２３４】
2021521116.tif 000653
またはその塩からなる群から選択される、請求項２６７〜２８８及び２９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９４】
構造式の化合物：
【化２３５】
2021521116.tif 000654
またはその塩が、
【化２３６】
2021521116.tif 000655
またはその塩からなる群から選択される、請求項２６７〜２８８、２９２及び２９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９５】
Ｒａが、
【化２３７】
2021521116.tif 000656
からなる群から選択される、請求項２６７〜２８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９６】
構造式の化合物：
【化２３８】
2021521116.tif 000657
またはその塩が、
【化２３９−１】
2021521116.tif 000658
【化２３９−２】
2021521116.tif 000659
またはその塩からなる群から選択される、請求項２６７〜２８８及び２９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９７】
構造式の化合物：
【化２４０】
2021521116.tif 000660
またはその塩が、
【化２４１−１】
2021521116.tif 000661
【化２４１−２】
2021521116.tif 000662
またはその塩からなる群から選択される、請求項２６７〜２８８、２９５及び２９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９８】
式（Ｉ）：
【化２４２】
2021521116.tif 000663
（Ｉ）
による構造を有する化合物またはその塩であって、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；及び
Ｒｂが、水素またはメチルであり、但し、前記化合物が、ヒノキチオールではない、前記化合物またはその塩。
【請求項２９９】
前記化合物が、：
【化２４３】
2021521116.tif 000664
またはその塩からなる群から選択される、請求項２９８に記載の化合物。
【請求項３００】
Ｒａが、Ｃ１−４−アルキル、Ｃ２−４−アルケニル、Ｃ２−４−アルキニル、またはＣ３−４−シクロアルキルであり、但し、前記化合物が、ヒノキチオールではない、請求項２９８または２９９に記載の化合物。
【請求項３０１】
Ｒａが、
【化２４４】
2021521116.tif 000665
からなる群から選択される、請求項２９８〜３００のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３０２】
Ｒａが、
【化２４５】
2021521116.tif 000666
からなる群から選択される、請求項２９８または２９９に記載の化合物。
【請求項３０３】
Ｒａが、
【化２４６】
2021521116.tif 000667
からなる群から選択される、請求項２９８または２９９に記載の化合物。
【請求項３０４】
【化２４７−１】
2021521116.tif 000668
【化２４７−２】
2021521116.tif 000669
【化２４７−３】
2021521116.tif 000670
【化２４７−４】
2021521116.tif 000671
またはそれらの塩から選択される、化合物。
【請求項３０５】
前記化合物が、
【化２４８】
2021521116.tif 000672
またはそれらの塩から選択される、請求項３０４に記載の化合物。
【請求項３０６】
前記化合物が、
【化２４９】
2021521116.tif 000673
またはそれらの塩から選択される、請求項３０４に記載の化合物。
【請求項３０７】
前記化合物が、
【化２５０】
2021521116.tif 000674
またはそれらの塩から選択される、請求項３０４に記載の化合物。
【請求項３０８】
前記化合物が、
【化２５１】
2021521116.tif 000675
またはそれらの塩から選択される、請求項３０４に記載の化合物。
【請求項３０９】
前記化合物が、
【化２５２】
2021521116.tif 000676
またはそれらの塩から選択される、請求項３０４に記載の化合物。
【請求項３１０】
【化２５３−１】
2021521116.tif 000677
【化２５３−２】
2021521116.tif 000678
及びそれらの塩からなる群から選択される、化合物。
【請求項３１１】
【化２５４−１】
2021521116.tif 000679
【化２５４−２】
2021521116.tif 000680
及びそれらの塩からなる群から選択される、化合物。
【請求項３１２】
【化２５５−１】
2021521116.tif 000681
【化２５５−２】
2021521116.tif 000682
及びそれらの塩からなる群から選択される、化合物。
【請求項３１３】
請求項２９８〜３１２のいずれか１項に記載の化合物またはその塩；及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項３１４】
鉄トランスポーターの欠乏または欠陥により特徴付けられる疾患または状態の治療方法であって、
トロポロン及び請求項２９８〜３１２のいずれか１項に記載の化合物からなる群から選択される治療有効量の化合物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項３１５】
鉄トランスポーターの欠乏または欠陥により特徴付けられる前記疾患または状態が、低色素性小球性貧血である、請求項３１４に記載の方法。
【請求項３１６】
トロポロン及び請求項２９８〜３１２のいずれか１項に記載の化合物からなる群から選択される化合物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、経上皮鉄輸送の増進方法。
【請求項３１７】
トロポロン及び請求項２９８〜３１２のいずれか１項に記載の化合物からなる群から選択される化合物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、生理機能の増進方法。
【請求項３１８】
トロポロン及び請求項２９８〜３１２のいずれか１項に記載の化合物からなる群から選択される化合物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、ヘモグロビン化の増進方法。
【請求項３１９】
トロポロン及び請求項２９８〜３１２のいずれか１項に記載の化合物からなる群から選択される化合物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、鉄放出の増進方法。
【請求項３２０】
アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）、カルシマイシン、ノナクチン、デフェリプロン、プルプロガリン、及びマルトールからなる群から選択される１つ以上のさらなる化合物の有効量を投与することをさらに含む、請求項３１４〜３１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２１】
前記化合物が、全身投与される、請求項３１４〜３２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２２】
前記化合物が、経口投与される、請求項３１４〜３２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２３】
前記化合物が、静脈内投与される、請求項３１４〜３２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２４】
前記対象が、哺乳動物である、請求項３１４〜３２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２５】
前記対象が、ヒトである、請求項３２４に記載の方法。
【請求項３２６】
前記対象が、二価金属トランスポーター１（ＤＭＴ１）が欠乏している、請求項３１４〜３２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２７】
細胞中の経上皮鉄輸送、生理機能、またはヘモグロビン化のインビトロ増進方法であって、
前記細胞を、トロポロン及び請求項２９８〜３１２のいずれか１項に記載の化合物からなる群から選択される化合物の有効量と接触させることを含む、前記方法。
【請求項３２８】
前記細胞を、アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）、カルシマイシン、ノナクチン、デフェリプロン、プルプロガリン、及びマルトール、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のさらなる化合物の有効量と接触させることをさらに含む、請求項３２７に記載の方法。
【請求項３２９】
臓器中の経上皮鉄輸送、生理機能、またはヘモグロビン化のエクスビボ増進方法であって、
前記臓器を、トロポロン及び請求項２９８〜３１２のいずれか１項に記載の化合物からなる群から選択される化合物の有効量と接触させることを含む、前記方法。
【請求項３３０】
前記臓器を、アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）、カルシマイシン、ノナクチン、デフェリプロン、プルプロガリン、及びマルトール、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のさらなる化合物の有効量と接触させることをさらに含む、請求項３２９に記載の方法。
【請求項３３１】
前記化合物が、トロポロンである、請求項３１４〜３３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３２】
前記化合物が、請求項２９８〜３１２のいずれか１項に記載の化合物である、請求項３１４〜３３０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２０１８年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／６５７，１２７号に基づく優先権の利益を主張し、この内容はその全体を参照により本明細書に組み込まれている。
【政府の支援】
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所から付与された助成金第ＧＭ１１８１８５号に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
鉄恒常性は、身体の正常機能に不可欠である。鉄はヘモグロビン産生の中心となるので、不十分なレベルの鉄は、鉄欠乏性貧血を生じる。鉄過剰負荷はまた、腸からの鉄吸収を不適切に増加させることにより鉄のバランスを乱す可能性もある。この増加は、多くの場合、肝臓、膵臓、心臓、下垂体及び他の臓器において鉄の沈着を生じ、組織損傷及びこれらの臓器の正常な機能障害を引き起こす。
【０００４】
鉄関連障害のための現在の治療選択には、エポエチンアルファ、エポエチンベータ及びダルベポエチンなどの赤血球生成剤の投与が含まれる。さらなる治療には、経口または非経口の鉄療法及び／または輸血が含まれる。しかしながら、鉄療法は限られた効能しかなく、通常、一部の患者には勧められていない。さらに、輸血は多臓器機能不全について進行中の問題があり、救命治療患者において死亡率が高くなっている。したがって、十分な様式でエポエチン及びこの関連する類似体に反応しない対象にとって非常に特異的で、良好な忍容性を示し、有用な治療として役立ち得る、鉄関連疾患を治療する新規方法についての必要性が存在している。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、ヒノキチオールの類似体、それらの調製方法、及び鉄関連疾患の治療に使用されるそれらの医薬化合物を提供する。
【０００６】
したがって、一態様では、本明細書で提供されるのは、６−ブロモ−２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化１】
2021521116.tif 000003
またはその塩の調製方法であって、
ブレンステッド塩基、及び７，７−ジブロモ−３−メトキシビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−２−オン：
【化２】
2021521116.tif 000004
またはその塩を組み合わせることによって、６−ブロモ−２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オンまたはその塩を形成する工程を含む、方法である。
【０００７】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、以下の構造式の化合物：
【化３】
2021521116.tif 000005
またはその塩の調製方法であって、
以下の構造式の化合物：
【化４】
2021521116.tif 000006
またはその塩を、ハロゲン化剤と反応させることによって、化合物を形成することを含み、式中、Ｒｂが、Ｈまたはメチルであり、Ｘが、ハロゲンである、方法である。
【０００８】
さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、４−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化５】
2021521116.tif 000007
またはその塩の調製方法であって、
７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−２，３−ジオール：
【化６】
2021521116.tif 000008
またはその塩を、酸化剤と組み合わせることによって、４−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オンまたはその塩を形成することを含む、方法である。
【０００９】
さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、５−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化７】
2021521116.tif 000009
またはその塩の調製方法であって、
７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−３、４−ジオール：
【化８】
2021521116.tif 000010
またはその塩を、酸化剤と組み合わせることによって、５−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オンまたはその塩を形成することを含む、方法である。
【００１０】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、以下の構造式の化合物：
【化９】
2021521116.tif 000011
またはその塩の調製方法であって、
以下の構造式の化合物：
【化１０】
2021521116.tif 000012
またはその塩を、２−ブロモ−７−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化１１】
2021521116.tif 000013
またはその塩と反応させることによって、構造式の化合物：
【化１２】
2021521116.tif 000014
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、独立して任意選択で、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、方法である。
【００１１】
さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化１３】
2021521116.tif 000015
またはその塩の調製方法であって、
構造式を有する化合物：
【化１４】
2021521116.tif 000016
またはその塩を、脱メチル化剤と組み合わせることによって、構造式の化合物：
【化１５】
2021521116.tif 000017
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換される、方法である。
【００１２】
さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化１６】
2021521116.tif 000018
またはその塩の調製方法であって、
（１）構造式の化合物
【化１７】
2021521116.tif 000019
またはその塩を、構造式の化合物：
【化１８】
2021521116.tif 000020
またはその塩と反応させることによって、構造式を有する化合物：
【化１９】
2021521116.tif 000021
またはその塩を得ること；及び
（２）構造式を有する化合物：
【化２０】
2021521116.tif 000022
またはその塩を、脱メチル化剤と接触させることによって、構造式の化合物：
【化２１】
2021521116.tif 000023
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択かつ独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、方法である。
【００１３】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化２２】
2021521116.tif 000024
またはその塩の調製方法であって、構造式の化合物：
【化２３】
2021521116.tif 000025
またはその塩を、構造式の化合物：
【化２４】
2021521116.tif 000026
またはその塩と反応させることによって、構造式の化合物：
【化２５】
2021521116.tif 000027
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒｂが、水素またはメチルであり；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択かつ独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、方法である。
【００１４】
さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化２６】
2021521116.tif 000028
またはその塩の調製方法であって、
構造式を有する化合物：
【化２７】
2021521116.tif 000029
またはその塩を、脱メチル化剤と組み合わせることによって、構造式の化合物：
【化２８】
2021521116.tif 000030
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換される、方法である。
【００１５】
さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化２９】
2021521116.tif 000031
またはその塩の調製方法であって、
（１）２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化３０】
2021521116.tif 000032
またはその塩を、臭素化剤と反応させることによって、３−ブロモ−２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化３１】
2021521116.tif 000033
またはその塩を形成すること、
（２）構造式の化合物：
【化３２】
2021521116.tif 000034
またはその塩を、３−ブロモ−２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化３３】
2021521116.tif 000035
またはその塩と反応させることによって、構造式を有する化合物：
【化３４】
2021521116.tif 000036
またはその塩を形成すること；及び
（３）構造式を有する化合物：
【化３５】
2021521116.tif 000037
またはその塩を、脱メチル化剤と接触させることによって、構造式の化合物：
【化３６】
2021521116.tif 000038
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択かつ独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、方法である。
【００１６】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化３７】
2021521116.tif 000039
またはその塩の調製方法であって、構造式の化合物：
【化３８】
2021521116.tif 000040
またはその塩を、構造式の化合物：
【化３９】
2021521116.tif 000041
またはその塩と反応させることによって、構造式の化合物：
【化４０】
2021521116.tif 000042
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒｂが、水素またはメチルであり；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択かつ独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、方法である。
【００１７】
さらに別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化４１】
2021521116.tif 000043
またはその塩の調製方法であって、
構造式を有する化合物：
【化４２】
2021521116.tif 000044
またはその塩を、脱メチル化剤と組み合わせることによって、構造式の化合物：
【化４３】
2021521116.tif 000045
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換される、方法である。
【００１８】
さらに別の態様では、提供されるのは、構造式の化合物：
【化４４】
2021521116.tif 000046
またはその塩の調製方法であって、
（１）７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−２，３−ジオール：
【化４５】
2021521116.tif 000047
またはその塩を、酸化剤と接触させることによって、４−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化４６】
2021521116.tif 000048
またはその塩を形成すること、
（２）構造式の化合物：
【化４７】
2021521116.tif 000049
またはその塩を、４−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化４８】
2021521116.tif 000050
またはその塩と反応させることによって、構造式を有する化合物：
【化４９】
2021521116.tif 000051
またはその塩を形成することを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択かつ独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、方法である。
【００１９】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化５０】
2021521116.tif 000052
またはその塩の調製方法であって、構造式の化合物：
【化５１】
2021521116.tif 000053
またはその塩を、構造式の化合物：
【化５２】
2021521116.tif 000054
またはその塩と反応させることによって、構造式の化合物：
【化５３】
2021521116.tif 000055
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒｂが、水素またはメチルであり；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択かつ独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、方法である。
【００２０】
さらに別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化５４】
2021521116.tif 000056
またはその塩の調製方法であって、構造式を有する化合物：
【化５５】
2021521116.tif 000057
またはその塩を、脱メチル化剤と組み合わせることによって、構造式の化合物：
【化５６】
2021521116.tif 000058
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換される、方法である。
【００２１】
さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化５７】
2021521116.tif 000059
またはその塩の調製方法であって、
（１）７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−３、４−ジオール：
【化５８】
2021521116.tif 000060
またはその塩を、酸化剤と接触させることによって、５−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化５９】
2021521116.tif 000061
またはその塩を形成すること；及び
（２）構造式の化合物：
【化６０】
2021521116.tif 000062
またはその塩を、５−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化６１】
2021521116.tif 000063
またはその塩と反応させることによって、構造式を有する化合物：
【化６２】
2021521116.tif 000064
またはその塩を形成することを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択かつ独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、方法である。
【００２２】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化６３】
2021521116.tif 000065
またはその塩の調製方法であって、
構造式の化合物：
【化６４】
2021521116.tif 000066
またはその塩を、構造式の化合物：
【化６５】
2021521116.tif 000067
またはその塩と反応させることによって、構造式の化合物：
【化６６】
2021521116.tif 000068
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒｂが、水素またはメチルであり；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択かつ独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、方法である。
【００２３】
さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化６７】
2021521116.tif 000069
またはその塩の調製方法であって、
構造式の化合物：
【化６８】
2021521116.tif 000070
またはその塩を、構造式の化合物：
【化６９】
2021521116.tif 000071
またはその塩と反応させることによって、構造式の化合物：
【化７０】
2021521116.tif 000072
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒｂが、水素またはメチルであり；
Ｘａが、
【化７１】
2021521116.tif 000073
または−Ｓｎ（Ｃ１−６−アルキル）であり；及び
Ｘｂが、ハロまたは擬ハロである、方法である。
【００２４】
さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化７２】
2021521116.tif 000074
またはその塩の調製方法であって、
構造式の化合物：
【化７３】
2021521116.tif 000075
またはその塩を、３−ブロモ−７−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化７４】
2021521116.tif 000076
またはその塩と反応させることによって、構造式の化合物：
【化７５】
2021521116.tif 000077
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択かつ独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、方法である。
【００２５】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化７６】
2021521116.tif 000078
またはその塩の調製方法であって、
構造式を有する化合物：
【化７７】
2021521116.tif 000079
またはその塩を、脱メチル化剤と組み合わせることによって、構造式の化合物：
【化７８】
2021521116.tif 000080
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換される、方法である。
【００２６】
さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化７９】
2021521116.tif 000081
またはその塩の調製方法であって、
（１）７，７−ジブロモ−３−メトキシビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−２−オン：
【化８０】
2021521116.tif 000082
またはその塩を、塩基と接触させることによって、６−ブロモ−２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
またはその塩を形成すること；
（２）構造式の化合物：
【化８１】
2021521116.tif 000083
またはその塩を、６−ブロモ−２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オンまたはその塩と反応させることによって、構造式を有する化合物：
【化８２】
2021521116.tif 000084
またはその塩を得ること；及び
（３）構造式を有する化合物：
【化８３】
2021521116.tif 000085
またはその塩を、脱メチル化剤と接触させることによって、構造式の化合物：
【化８４】
2021521116.tif 000086
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択かつ独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、方法である。
【００２７】
また、本明細書で提供されるのは、天然物であるヒノキチオールの類似体である化合物である。本発明の例示の化合物としては、
【化８５−１】
2021521116.tif 000087
【化８５−２】
2021521116.tif 000088
【化８５−３】
2021521116.tif 000089
【化８５−４】
2021521116.tif 000090
またはそれらの塩が挙げられる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される化合物は、医薬組成物として提供される。
【００２９】
本明細書で開示される化合物及び医薬組成物は、鉄欠乏、Ａｌ、及び鉄過剰を含むが、これらに限定されない任意の鉄関連障害の治療に使用され得る。過剰な鉄に起因する障害の他の例としては、肝硬変、肝がん、変形性関節症、骨減少症、骨軟化症、糖尿病、不整脈、心臓発作、甲状腺機能低下症、不妊症、勃起不全、うつ病、性腺機能低下症、及びブロンズまたはアシェングレーの肌の変色が挙げられる。本発明に従って診断して、治療し得る他の鉄関連障害の例としては、例えば、ヘモクロマトーシス、若年性ヘモクロマトーシス、後天性鉄過剰、鎌状赤血球貧血、サラセミア、アフリカ鉄沈着症、晩発性皮膚ポルフィリン症、鉄欠乏性貧血、フリードライヒ運動失調症、フェロポーチン病、高フェリチン血症、無トランスフェリン血症、及び鉄芽球性貧血が挙げられる。鉄関連障害としては、例えば、心不全、溶血性貧血、及び神経障害がさらに挙げられる。
【００３０】
また、本明細書で提供されるのは、鉄トランスポーターの欠乏または欠陥により特徴付けられる疾患または状態の治療方法であって、治療有効量のトロポロンまたは本明細書で開示される化合物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法である。いくつかのかかる実施形態では、鉄トランスポーターの欠乏または欠陥により特徴付けられる前記疾患または状態が、低色素性小球性貧血である。
【００３１】
他の実施形態では、本明細書で提供されるのは、トロポロンまたは本明細書で開示される化合物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、経上皮鉄輸送の増進方法である。
【００３２】
さらに他の実施形態では、本明細書で提供されるのは、トロポロンまたは本明細書で開示される化合物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、生理機能の増進方法である。
【００３３】
さらに他の実施形態では、本明細書で提供されるのは、トロポロンまたは本明細書で開示される化合物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、ヘモグロビン化の増進方法である。
【００３４】
他の実施形態では、本明細書で提供されるのは、トロポロンまたは本明細書で開示される化合物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、鉄放出の増進方法である。
【００３５】
また、本明細書で提供されるのは、細胞中の経上皮鉄輸送、生理機能、またはヘモグロビン化のインビトロ増進方法であって、細胞を、本明細書で開示される化合物の有効量と接触させることを含む、方法である。
【００３６】
他の実施形態では、本明細書で提供されるのは、臓器中の経上皮鉄輸送、生理機能、またはヘモグロビン化のエクスビボ増進方法であって、臓器を、本明細書で開示される化合物の有効量と接触させることを含む、方法である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】Ａ〜Ｇは、鉄トランスポーター欠乏生物に対する生理機能の回復を示す。（Ａ）膜貫通鉄輸送を自律的に行う小分子は、タンパク質鉄トランスポーターが欠如している家系において選択的に蓄積する不安定な鉄プールの局所イオン勾配を抑えると仮定される。茶色の球は、イオン性鉄と、クエン酸塩などの小分子に弱く結合した鉄との両方を含む不安定な鉄を表す。
【図１Ｂ】Ａ〜Ｇは、鉄トランスポーター欠乏生物に対する生理機能の回復を示す。（Ｂ）ヒノキチオール（Ｈｉｎｏ）及び輸送不活性誘導体Ｃ２−デオキシヒノキチオール（Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏ）の構造。
【図１Ｃ】Ａ〜Ｇは、鉄トランスポーター欠乏生物に対する生理機能の回復を示す。（Ｃ）１０μＭ  ＦｅＣｌ３を含有する低鉄ＳＤ寒天プレート上で縞模様になったｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ細胞のヒノキチオールによるディスク拡散は、中間濃度の小分子で酵母細胞増殖を回復させた。
【図１Ｄ】Ａ〜Ｇは、鉄トランスポーター欠乏生物に対する生理機能の回復を示す。（Ｄ）ヒノキチオールの不在下で、ｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母細胞増殖の低下は、連続１０倍希釈プレート法（ＯＤ６００＝１．０から）によって、１０μＭ  ＦｅＣｌ３を含有する低鉄ＳＤ寒天プレートで観察された。同一条件下で、細胞増殖の回復は、１０μＭ  ヒノキチオールを含有する同じ低鉄ＳＤ寒天プレートで観察された。
【図１Ｅ】Ａ〜Ｇは、鉄トランスポーター欠乏生物に対する生理機能の回復を示す。（Ｅ）１０μＭ  ヒノキチオールの不在下または存在下で、１０μＭ  ＦｅＣｌ３を含有する液体ＳＤ培地における酵母細胞増殖。Ｎ＝３。（Ｅ〜Ｇ）ＮＳ、有意ではない；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１Ｆ】Ａ〜Ｇは、鉄トランスポーター欠乏生物に対する生理機能の回復を示す。（Ｆ）ヒノキチオールは、ｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母の増殖を回復させた一方、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏは、回復させなかった。Ｎ＝３。（Ｅ〜Ｇ）ＮＳ、有意ではない；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１Ｇ】Ａ〜Ｇは、鉄トランスポーター欠乏生物に対する生理機能の回復を示す。ヒノキチオールは、５５Ｆｅのｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母への流入を増加させる一方、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏは、増加させない。Ｎ＝３。（Ｅ〜Ｇ）ＮＳ、有意ではない；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２Ａ】Ａ〜Ｆは、ヒノキチオール結合及び輸送の物理的特性を示す。（Ａ）デフェリプロンなどの水溶性キレート剤とは逆に、ヒノキチオール−鉄錯体は、無極性溶媒に分配する。
【図２Ｂ】Ａ〜Ｆは、ヒノキチオール結合及び輸送の物理的特性を示す。（Ｂ）ＦｅＣｌ３の増加に伴ったヒノキチオールのＵＶ−Ｖｉｓ滴定試験は、ヒノキチオールが鉄に結合することを示す。矢印は、０：１  Ｆｅ：Ｈｉｎｏから６：１  Ｆｅ：Ｈｉｎｏへの鉄の増加に伴ったＵＶスペクトルの変化を示す。
【図２Ｃ】Ａ〜Ｆは、ヒノキチオール結合及び輸送の物理的特性を示す。（Ｃ及びＤ）水溶性鉄キレート剤及びＣ２ｄｅＯＨｉｎｏとは対照的に、ヒノキチオールは、モデルＰＯＰＣリポソームからの（Ｃ）第一鉄及び（Ｄ）第二鉄の流出を自律的に促進する。Ｎ＝３。（Ｃ、Ｄ）グラフは、３つの独立した実験の代表的なランを示す。
【図２Ｄ】Ａ〜Ｆは、ヒノキチオール結合及び輸送の物理的特性を示す。（Ｃ及びＤ）水溶性鉄キレート剤及びＣ２ｄｅＯＨｉｎｏとは対照的に、ヒノキチオールは、モデルＰＯＰＣリポソームからの（Ｃ）第一鉄及び（Ｄ）第二鉄の流出を自律的に促進する。Ｎ＝３。（Ｃ、Ｄ）グラフは、３つの独立した実験の代表的なランを示す。
【図２Ｅ】Ａ〜Ｆは、ヒノキチオール結合及び輸送の物理的特性を示す。（Ｅ）Ｃ１対称性Ｆｅ（Ｈｉｎｏ）３錯体のＸ線結晶構造。
【図２Ｆ】Ａ〜Ｆは、ヒノキチオール結合及び輸送の物理的特性を示す。（Ｆ）１００ｍＶ／ｓ走査速度による５００μＭ  Ｈｉｎｏ及び１００μＭ  Ｆｅ（ＮＯ３）３を用いた、ｐＨ＝７．２での１：１  ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ中の０．１Ｍトリス緩衝液における鉄ヒノキチオール錯体のサイクリックボルタモグラム。（Ｆ）グラフは、４つの独立した実験の代表的なランを示す。
【図３Ａ】Ａ〜Ｋは、ヒノキチオールが哺乳動物細胞の生理機能を回復させることを示す。（Ａ）５５ＦｅのＤＭＴ１欠乏Ｃａｃｏ−２単層及び（Ｂ）経上皮輸送（頂端側から側底側）への取り込みは、ヒノキチオール（５００  ｎＭ）が正常な鉄吸収を回復させたことを示した。Ｎ＝３。（Ａ、Ｂ、Ｅ〜Ｊ）ＮＳ、有意ではない；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図３Ｂ】Ａ〜Ｋは、ヒノキチオールが哺乳動物細胞の生理機能を回復させることを示す。（Ａ）５５ＦｅのＤＭＴ１欠乏Ｃａｃｏ−２単層及び（Ｂ）経上皮輸送（頂端側から側底側）への取り込みは、ヒノキチオール（５００ｎＭ）が正常な鉄吸収を回復させたことを示した。Ｎ＝３。（Ａ、Ｂ、Ｅ〜Ｊ）ＮＳ、有意ではない；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図３Ｃ】Ａ〜Ｋは、ヒノキチオールが哺乳動物細胞の生理機能を回復させることを示す。（Ｃ）ヒノキチオール促進５５Ｆｅ輸送は、腸内の滞留時間に見合った時間で生じる。Ｎ＝３。
【図３Ｄ】Ａ〜Ｋは、ヒノキチオールが哺乳動物細胞の生理機能を回復させることを示す。（Ｄ）ｓｈ対照及びヒノキチオール処理（１μＭ）ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞からの細胞ペレットは、ヘモグロビンの特性であるピンクに見える一方、ＤＭＴ１欠乏細胞ペレットは、そうではなかった。
【図３Ｅ】Ａ〜Ｋは、ヒノキチオールが哺乳動物細胞の生理機能を回復させることを示す。（Ｅ）ｏ−ジアニシジンで茶色に染色したＭＥＬ細胞のＩｍａｇｅＪ定量化。点線は、ｓｈ対照レベルを表す。Ｎ＝６〜４８。（Ａ、Ｂ、Ｅ〜Ｊ）ＮＳ、有意ではない；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図３Ｆ】Ａ〜Ｋは、ヒノキチオールが哺乳動物細胞の生理機能を回復させることを示す。（Ｆ）ヒノキチオール救出ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞におけるヘムへの５５Ｆｅの組み込み。点線は、ｓｈ対照レベルを表す。Ｎ＝３〜２３。（Ａ、Ｂ、Ｅ〜Ｊ）ＮＳ、有意ではない；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図３Ｇ】Ａ〜Ｋは、ヒノキチオールが哺乳動物細胞の生理機能を回復させることを示す。（Ｇ）ヒノキチオールは、ｏ−ジアニシジン染色されたＭｆｒｎ１欠乏ＭＥＬ細胞の数を増加させる。点線は、ＤＳ１９レベルを表す。Ｎ＝２１〜４８。（Ａ、Ｂ、Ｅ〜Ｊ）ＮＳ、有意ではない；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図３Ｈ】Ａ〜Ｋは、ヒノキチオールが哺乳動物細胞の生理機能を回復させることを示す。（Ｈ）ヒノキチオール（１μＭ）は、鉄の取り込みに影響を与えることなく、ＦＰＮ１欠乏Ｃａｃｏ−２単層（Ａ、Ｂ、Ｅ〜Ｊ）ＮＳ、有意ではない；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図３Ｉ】Ａ〜Ｋは、ヒノキチオールが哺乳動物細胞の生理機能を回復させることを示す。（Ｉ）を横断する５５Ｆｅ経上皮輸送を回復させる。Ｎ＝１２。（Ａ、Ｂ、Ｅ〜Ｊ）ＮＳ、有意ではない；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図３Ｊ】Ａ〜Ｋは、ヒノキチオールが哺乳動物細胞の生理機能を回復させることを示す。（Ｊ）ヒノキチオール（５μＭ）は、ヘプシジン処理ＦＰＮ１欠乏Ｊ７７４マクロファージからの５５Ｆｅの放出を促進する（ｔ＝２時間）。Ｎ＝６〜２０。（Ａ、Ｂ、Ｅ〜Ｊ）ＮＳ、有意ではない；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図３Ｋ】Ａ〜Ｋは、ヒノキチオールが哺乳動物細胞の生理機能を回復させることを示す。（Ｋ）ヒノキチオール及びＣ２ｄｅＯＨｉｎｏで処理したまたは処理しなかった野生型及びＦＰＮ１欠乏Ｊ７７４マクロファージからの５５Ｆｅの時間依存性放出。Ｎ＝６〜２０。
【図４Ａ】Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが蓄積鉄勾配を活用することを示す。（Ａ）相対エンドソーム、サイトゾル、及びミトコンドリア鉄レベルをそれぞれ検出するため、ｏｘｙｂｕｒｓｔグリーン、カルセイングリーン、及びＲＰＡを用いた、ヒノキチオール（１μＭ）の不在下または存在下での分化ｓｈ対照及びＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞の代表的な蛍光画像。不安定な鉄の蓄積は、ヒノキチオール処理後に放出された、ＤＭＴ１欠乏細胞のエンドソームで観察された。スケールバー＝１０μｍ（Ａ）。
【図４Ｂ】Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが蓄積鉄勾配を活用することを示す。（Ｂ及びＣ）細胞内不安定鉄の蓄積は、カルセイングリーン蛍光の消失によって、２００μＭ  ＦｅＳＯ４で処理したＦＰＮ１欠乏Ｊ７７４マクロファージで観察される。Ｎ＝３。スケールバー＝２０μｍ（Ｂ、Ｈ）。
【図４Ｃ】Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが蓄積鉄勾配を活用することを示す。（Ｂ及びＣ）細胞内不安定鉄の蓄積は、カルセイングリーン蛍光の消失によって、２００μＭ  ＦｅＳＯ４で処理したＦＰＮ１欠乏Ｊ７７４マクロファージで観察される。Ｎ＝３。（Ｃ〜Ｅ）＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図４Ｄ】Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが蓄積鉄勾配を活用することを示す。（Ｄ）５０μＭ  ＦｅＣｌ３による鉄（ＩＩＩ）のＪ７７４マクロファージへの取り込みは、５５Ｆｅを放射性トレーサーとして用いた４時間後に、ＦＰＮ１欠乏細胞における総細胞内鉄の蓄積を同様に見せた。Ｎ＝８。（Ｃ〜Ｅ）＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図４Ｅ】Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが蓄積鉄勾配を活用することを示す。（Ｅ）細胞外鉄（ＩＩＩ）レベルの増加は、５５Ｆｅを放射性トレーサーとして用いて、ヒノキチオール（１μＭ）で処理した場合に、鉄のＪ７７４マクロファージへの取り込みの速度を増加させた。Ｎ＝３。（Ｃ〜Ｅ）＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図４Ｆ】Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが蓄積鉄勾配を活用することを示す。（Ｆ及びＧ）リポソーム内（Ｆ）第一鉄及び（Ｇ）第二鉄の増加は、ヒノキチオール（１０μＭ）の存在下で、鉄流出速度の増加をもたらす。ヒノキチオールの不在下で流出は観察されなかった。Ｎ＝３。（Ｆ、Ｇ）グラフは、３つの独立した実験の平均を示す。
【図４Ｇ】Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが蓄積鉄勾配を活用することを示す。（Ｆ及びＧ）リポソーム内（Ｆ）第一鉄及び（Ｇ）第二鉄の増加は、ヒノキチオール（１０μＭ）の存在下で、鉄流出速度の増加をもたらす。ヒノキチオールの不在下で流出は観察されなかった。Ｎ＝３。（Ｆ、Ｇ）グラフは、３つの独立した実験の平均を示す。
【図４Ｈ】Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが蓄積鉄勾配を活用することを示す。（Ｈ）反対方向における、Ｊ７７４マクロファージの人工的に作られた鉄勾配を用いた、カルセイングリーンによるサイトゾル鉄の蛍光イメージング。細胞にＦｅＳＯ４（２００μＭ）を負荷し、濯いだ後、ヒノキチオール（１００μＭ）をｔ＝５分で添加した。蛍光の増加が観察され、これは、細胞内不安定鉄の減少と合致する。その後、１００μＭ  ＦｅＣｌ３を培地にｔ＝１２分で添加することで、これらの同じ細胞における勾配は逆転した。蛍光消失が観察され、これは、鉄の取り込みと合致する。
【図４Ｉ】Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが蓄積鉄勾配を活用することを示す。（Ｉ）ＤＭＳＯ、ヒノキチオール、またはＣ２ｄｅＯＨｉｎｏをｔ＝５分で添加、及びＦｅＣｌ３をｔ＝１２分間で添加による、鉄負荷Ｊ７７４細胞におけるカルセイングリーン蛍光の代表的なＩｍａｇｅＪ定量化。（Ｉ）６つの独立した実験からの代表的なグラフ。
【図５Ａ】Ａ〜Ｊは、内因性ネットワークがヒノキチオール媒介Ｃａｃｏ−２輸送に関与することを示す。（Ａ）鉄吸収及び調節に関与するタンパク質の代表的なウェスタンブロット画像は、貧血状態がｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層で観察され、最大鉄吸収を促進することを示す。
【図５Ｂ】Ａ〜Ｊは、内因性ネットワークがヒノキチオール媒介Ｃａｃｏ−２輸送に関与することを示す。（Ｂ）ヒノキチオール（５００ｎＭ）及び５５Ｆｅ  放射性トレーサーの頂端側または側底側への添加による、ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層における一方向性ヒノキチオール媒介輸送。Ｎ＝３。スケールバー＝２０μｍ（Ｈ）。（Ｂ〜Ｆ、Ｉ、Ｊ）ＮＳ、有意ではない；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図５Ｃ】Ａ〜Ｊは、内因性ネットワークがヒノキチオール媒介Ｃａｃｏ−２輸送に関与することを示す。（Ｃ）Ｃａｃｏ−２単層における免疫沈降フェリチンの５５Ｆｅレベルの決定。Ｎ＝３。スケールバー＝２０μｍ（Ｈ）。（Ｂ〜Ｆ、Ｉ、Ｊ）ＮＳ、有意ではない；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図５Ｄ】Ａ〜Ｊは、内因性ネットワークがヒノキチオール媒介Ｃａｃｏ−２輸送に関与することを示す。（Ｄ）ケルセチンによるｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層におけるＦＰＮ１のノックダウンは、ヒノキチオール媒介輸送を抑制する。Ｎ＝３。スケールバー＝２０μｍ（Ｈ）。（Ｂ〜Ｆ、Ｉ、Ｊ）ＮＳ、有意ではない；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図５Ｅ】Ａ〜Ｊは、内因性ネットワークがヒノキチオール媒介Ｃａｃｏ−２輸送に関与することを示す。（Ｅ）４時間後のＤＭＳＯまたはヒノキチオール（５００ｎＭ）で処理した鉄の濃度の変化に伴うＣａｃｏ−２輸送の速度。輸送速度は、鉄濃度の増加に伴って横ばいになる。Ｎ＝３。スケールバー＝２０μｍ（Ｈ）。（Ｂ〜Ｆ、Ｉ、Ｊ）ＮＳ、有意ではない；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図５Ｆ】Ａ〜Ｊは、内因性ネットワークがヒノキチオール媒介Ｃａｃｏ−２輸送に関与することを示す。（Ｆ）ヒノキチオールの用量増加は、２５μＭ  ＦｅＣｌ３で頂端側から処理したｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層への取り込みを増加させ；しかしながら、バイモーダル効果は、５μＭヒノキチオールでの経上皮鉄輸送で観察される。Ｎ＝３。スケールバー＝２０μｍ（Ｈ）。（Ｂ〜Ｆ、Ｉ、Ｊ）ＮＳ、有意ではない；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図５Ｇ】Ａ〜Ｊは、内因性ネットワークがヒノキチオール媒介Ｃａｃｏ−２輸送に関与することを示す。（Ｇ）ヒノキチオール及び２５μＭ  ＦｅＣｌ３の増加に伴った、処理後の鉄吸収及び調節に関与するタンパク質の代表的なウェスタンブロット画像。バイモーダル効果は、鉄吸収及び調節に関与するタンパク質レベルで同様に観察された。
【図５Ｈ】Ａ〜Ｊは、内因性ネットワークがヒノキチオール媒介Ｃａｃｏ−２輸送に関与することを示す。（Ｈ）中間濃度のヒノキチオールは、１時間後に、２５μＭ  ＦｅＣｌ３で処理したｓｈＤＭＴ１単層における有意なカルセイングリーン消失をもたらし、これは、不安定な鉄の増加と合致する。この効果は、高用量のヒノキチオールで逆になった。スケールバー＝２０μｍ（Ｈ）。
【図５Ｉ】Ａ〜Ｊは、内因性ネットワークがヒノキチオール媒介Ｃａｃｏ−２輸送に関与することを示す。（Ｉ及びＪ）これらの単層におけるカルセイングリーン蛍光のＩｍａｇｅＪ定量化。Ｎ＝３〜６。（Ｂ〜Ｆ、Ｉ、Ｊ）ＮＳ、有意ではない；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図５Ｊ】Ａ〜Ｊは、内因性ネットワークがヒノキチオール媒介Ｃａｃｏ−２輸送に関与することを示す。（Ｉ及びＪ）これらの単層におけるカルセイングリーン蛍光のＩｍａｇｅＪ定量化。Ｎ＝３〜６。（Ｂ〜Ｆ、Ｉ、Ｊ）ＮＳ、有意ではない；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図６Ａ】Ａ〜Ｈは、ヒノキチオールが鉄トランスポーター欠乏動物における生理機能を回復させることを示す。（Ａ及びＢ）１．５ｍｇ／ｋｇヒノキチオールの強制経口投与は、１時間後に、５９Ｆｅの（Ａ）ＤＭＴ１欠乏ベオグラード（ｂ／ｂ）ラット及び（Ｂ）ＦＰＮ１欠乏Ｆｌａｔ鉄（ｆｆｅ／＋）マウスへの腸吸収を促進する。Ｎ＝４〜７。（Ａ〜Ｆ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；グラフは、（Ａ〜Ｃ、Ｅ）平均±ＳＥＭまたは（Ｄ、Ｆ）重量平均±ＳＥＭを示す。
【図６Ｂ】Ａ〜Ｈは、ヒノキチオールが鉄トランスポーター欠乏動物における生理機能を回復させることを示す。（Ａ及びＢ）１．５ｍｇ／ｋｇヒノキチオールの強制経口投与は、１時間後に、５９Ｆｅの（Ａ）ＤＭＴ１欠乏ベオグラード（ｂ／ｂ）ラット及び（Ｂ）ＦＰＮ１欠乏Ｆｌａｔ鉄（ｆｆｅ／＋）マウスへの腸吸収を促進する。Ｎ＝４〜７。（Ａ〜Ｆ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；グラフは、（Ａ〜Ｃ、Ｅ）平均±ＳＥＭまたは（Ｄ、Ｆ）重量平均±ＳＥＭを示す。
【図６Ｃ】Ａ〜Ｈは、ヒノキチオールが鉄トランスポーター欠乏動物における生理機能を回復させることを示す。（Ｃ）２４ｈｐｆでの胚への水に対するヒノキチオール処理（１μＭ）、及びさらに４８時間のインキュベーションは、ＧＦＰ標識赤血球系を含有するトランスジェニックフィッシュを用いて、ＤＭＴ１欠乏モルファントゼブラフィッシュにおけるＦＡＣＳ分析によるＧＦＰ陽性赤血球系の数を増加させる。Ｎ＝７〜１７。（Ａ〜Ｆ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；グラフは、（Ａ〜Ｃ、Ｅ）平均±ＳＥＭまたは（Ｄ、Ｆ）重量平均±ＳＥＭを示す。
【図６Ｄ】Ａ〜Ｈは、ヒノキチオールが鉄トランスポーター欠乏動物における生理機能を回復させることを示す。（Ｄ）ヒノキチオールは、ｏ−ジアニシジン染色によって決定された、＋／ｃｄｙフィッシュのヘテロ接合性交差からの貧血のフィッシュの数を減少させる一方、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏは、減少させない。（Ａ〜Ｆ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；グラフは、（Ａ〜Ｃ、Ｅ）平均±ＳＥＭまたは（Ｄ、Ｆ）重量平均±ＳＥＭを示す。
【図６Ｅ】Ａ〜Ｈは、ヒノキチオールが鉄トランスポーター欠乏動物における生理機能を回復させることを示す。（Ｅ）ヒノキチオール（１μＭ）は、Ｍｆｒｎ１欠乏モルファントゼブラフィッシュにおけるＧＦＰ陽性赤血球の数を増加させる。Ｎ＝１２〜１３。（Ａ〜Ｆ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；グラフは、（Ａ〜Ｃ、Ｅ）平均±ＳＥＭまたは（Ｄ、Ｆ）重量平均±ＳＥＭを示す。
【図６Ｆ】Ａ〜Ｈは、ヒノキチオールが鉄トランスポーター欠乏動物における生理機能を回復させることを示す。（Ｆ）ヒノキチオールは、＋／ｆｒｓフィッシュのヘテロ接合性交差からの非貧血胚の数を増加させる。（Ａ〜Ｆ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；グラフは、（Ａ〜Ｃ、Ｅ）平均±ＳＥＭまたは（Ｄ、Ｆ）重量平均±ＳＥＭを示す。
【図６Ｇ】Ａ〜Ｈは、ヒノキチオールが鉄トランスポーター欠乏動物における生理機能を回復させることを示す。（Ｇ）＋／ｆｒｓフィッシュのヘテロ接合性交差からの胚は、ＢｓｒＩによる制限酵素消化によって遺伝子型にした。レーン４及び５は、ヒノキチオールで４８時間処理したｆｒｓ／ｆｒｓフィッシュに対応する。（Ａ〜Ｆ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；グラフは、（Ａ〜Ｃ、Ｅ）平均±ＳＥＭまたは（Ｄ、Ｆ）重量平均±ＳＥＭを示す。
【図６Ｈ】Ａ〜Ｈは、ヒノキチオールが鉄トランスポーター欠乏動物における生理機能を回復させることを示す。（Ｈ）ヒノキチオール処理したｆｒｓ／ｆｒｓフィッシュは、ｏ−ジアニシジンで茶色に染色される一方、貧血ｆｒｓ／ｆｒｓフィッシュは染色されず、これは、ヒノキチオール処理後のヘモグロビンレベルの増加を示す。
【図７Ａ】Ａ〜Ｃは、小分子媒介増殖が親油性担体に一般的であることを示す。（Ａ）ヒノキチオール及び他の親油性α−ヒドロキシケトンは、１０μＭ  ＦｅＣｌ３を含有する低鉄ＳＤ寒天プレート上で縞模様になったｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母への増殖を回復させる一方、（Ｂ）他の鉄キレート剤及び（Ｃ）他のイオンの小分子トランスポーターは、同一条件下で増殖を回復させない。
【図７Ｂ】Ａ〜Ｃは、小分子媒介増殖が親油性担体に一般的であることを示す。（Ａ）ヒノキチオール及び他の親油性α−ヒドロキシケトンは、１０μＭ  ＦｅＣｌ３を含有する低鉄ＳＤ寒天プレート上で縞模様になったｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母への増殖を回復させる一方、（Ｂ）他の鉄キレート剤及び（Ｃ）他のイオンの小分子トランスポーターは、同一条件下で増殖を回復させない。
【図７Ｃ】Ａ〜Ｃは、小分子媒介増殖が親油性担体に一般的であることを示す。（Ａ）ヒノキチオール及び他の親油性α−ヒドロキシケトンは、１０μＭ  ＦｅＣｌ３を含有する低鉄ＳＤ寒天プレート上で縞模様になったｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母への増殖を回復させる一方、（Ｂ）他の鉄キレート剤及び（Ｃ）他のイオンの小分子トランスポーターは、同一条件下で増殖を回復させない。
【図８Ａ】Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが鉄欠乏酵母への増殖を回復させることを示す。（Ａ）ヒノキチオール（１０μＭ）の不在下または存在下で、１０μＭ  ＦｅＣｌ３を含有する低鉄ＳＧ寒天プレート上での鉄欠乏酵母（ｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ）の１０倍連続希釈プレート法（ＯＤ６００＝１．０から）。
【図８Ｂ】Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが鉄欠乏酵母への増殖を回復させることを示す。（Ｂ）ヒノキチオール（１０μＭ）はまた、１０μＭ  ＦｅＣｌ３を含有する低鉄ＳＤ寒天プレート上で、全ての公知のシデロホアタンパク質トランスポーター（ｆｅｔ３Δａｒｎ１−４Δ）が欠如している鉄欠乏酵母への増殖を回復させる。
【図８Ｃ】Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが鉄欠乏酵母への増殖を回復させることを示す。（Ｃ）ｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母への増殖回復は、１００日を超えて維持することができ、ヒノキチオールに継続的に依存している。Ｎ＝８。（Ｃ〜Ｅ、Ｇ）ＮＳ、有意ではない；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図８Ｄ】Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが鉄欠乏酵母への増殖を回復させることを示す。（Ｄ及びＥ）ヒノキチオール処理したｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母の倍加時間は、野生型酵母と同様である。Ｎ＝３。（Ｃ〜Ｅ、Ｇ）ＮＳ、有意ではない；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図８Ｅ】Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが鉄欠乏酵母への増殖を回復させることを示す。（Ｄ及びＥ）ヒノキチオール処理したｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母の倍加時間は、野生型酵母と同様である。Ｎ＝３。（Ｃ〜Ｅ、Ｇ）ＮＳ、有意ではない；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図８Ｆ】Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが鉄欠乏酵母への増殖を回復させることを示す。（Ｆ）輸送不活性誘導体、Ｃ２−デオキシヒノキチオール（Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏ）は、ヒノキチオールから２段階で、マルチグラムスケールで合成された。
【図８Ｇ】Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが鉄欠乏酵母への増殖を回復させることを示す。（Ｇ）ｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母のヒノキチオール促進増殖回復は、培地中の鉄レベルに依存する。Ｎ＝３。（Ｃ〜Ｅ、Ｇ）ＮＳ、有意ではない；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図８Ｈ】Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが鉄欠乏酵母への増殖を回復させることを示す。（Ｈ）環境鉄レベルの増加は、代わりに毒性が生じる前にヒノキチオール促進増殖が観察されるレスキューウィンドウを広くする。試験したいずれの鉄濃度で、ヒノキチオールの不在下で、ｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母の増殖は観察されなかった。Ｎ＝３。（Ｈ、Ｉ）グラフは、３つの独立した実験の平均を示す。
【図８Ｉ】Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが鉄欠乏酵母への増殖を回復させることを示す。（Ｉ）ｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母への増殖を回復させるまたは回復させない他の鉄キレート剤の鉄錯体のオクタノール／水分配係数。Ｎ＝３。（Ｈ、Ｉ）グラフは、３つの独立した実験の平均を示す。
【図９Ａ】Ａ〜Ｐは、鉄及びヒノキチオールの結合における生物物理学的試験を示す。（Ａ）ヒノキチオールは、小分子に弱く結合したイオン性鉄（ＩＩＩ）及び鉄（ＩＩＩ）の供給源を用いて、鉄（ＩＩＩ）に結合する。
【図９Ｂ】Ａ〜Ｐは、鉄及びヒノキチオールの結合における生物物理学的試験を示す。（Ｂ）Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏは、鉄に結合しない。
【図９Ｃ】Ａ〜Ｐは、鉄及びヒノキチオールの結合における生物物理学的試験を示す。（Ｃ）ヒノキチオールは、鉄（ＩＩ）との錯体を同様に形成する。
【図９Ｄ】Ａ〜Ｐは、鉄及びヒノキチオールの結合における生物物理学的試験を示す。（Ｄ）ＩＣＰ−ＭＳによるヒノキチオール結合鉄の抽出後に有機層中の鉄含有量によって決定されるように、鉄は、ｐＨ＝７．０での溶液中でヒノキチオールに定量的に結合する。Ｎ＝３。（Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｍ）ＮＳ、有意ではない；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図９Ｅ】Ａ〜Ｐは、鉄及びヒノキチオールの結合における生物物理学的試験を示す。（Ｅ）競合キレート剤ヒノキチオールの用量の増加に伴った、鉄（ＩＩ）に結合したフェロジンのＵＶ−Ｖｉｓスペクトル。高用量のヒノキチオールは、フェロジンから鉄を大きく除去する。
【図９Ｆ】Ａ〜Ｐは、鉄及びヒノキチオールの結合における生物物理学的試験を示す。（Ｆ）ヒノキチオールは、フェロジン競合試験から得たＥＣ５０値によって決定されるように、デフェリプロンに比べて鉄（ＩＩ）に強く結合する。Ｎ＝３。（Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｍ）ＮＳ、有意ではない；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図９Ｇ】Ａ〜Ｐは、鉄及びヒノキチオールの結合における生物物理学的試験を示す。（Ｇ）競合キレート剤ＥＤＴＡの用量の増加に伴った、鉄（ＩＩＩ）に結合したヒノキチオールのＵＶ−Ｖｉｓスペクトル。高用量のＥＤＴＡは、ヒノキチオールから鉄を大きく除去する。
【図９Ｈ】Ａ〜Ｐは、鉄及びヒノキチオールの結合における生物物理学的試験を示す。（Ｈ）ヒノキチオールは、ＥＤＴＡ競合試験から得たＥＣ５０値によって決定されるように、デフェリプロンに比べて鉄（ＩＩＩ）に強く結合する。Ｎ＝３。（Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｍ）ＮＳ、有意ではない；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図９Ｉ】Ａ〜Ｐは、鉄及びヒノキチオールの結合における生物物理学的試験を示す。（Ｉ）鉄で飽和したトランスフェリン（１００μＭ）は、酢酸エチルで抽出後に変性されない。
【図９Ｊ】（Ｊ及びＫ）ヒノキチオールは、５５Ｆｅを放射性トレーサーとして用いて、用量依存的に（Ｊ）トランスフェリン（１ｎＭ）及び（Ｋ）フェリチン（２．５ｎｇフェリチン／ｍＬ）から鉄を除去する。Ｎ＝３。（Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｍ）ＮＳ、有意ではない；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図９Ｋ】Ａ〜Ｐは、鉄及びヒノキチオールの結合における生物物理学的試験を示す。（Ｊ及びＫ）ヒノキチオールは、５５Ｆｅを放射性トレーサーとして用いて、用量依存的に（Ｊ）トランスフェリン（１ｎＭ）及び（Ｋ）フェリチン（２．５ｎｇフェリチン／ｍＬ）から鉄を除去する。Ｎ＝３。（Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｍ）ＮＳ、有意ではない；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図９Ｌ】Ａ〜Ｐは、鉄及びヒノキチオールの結合における生物物理学的試験を示す。（Ｌ）ヒノキチオールの３８７ｎｍでのピークの吸光度の増加は、ｐＨの増加に伴って増加する。明確な等吸収点が、（３６５ｎＭで）観察され、ヒノキチオールのプロトン化形態と脱プロトン化形態の間の種形成を示唆する。Ａｂｓ３８７／Ａｂｓ２４０対ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ上のｐＨのプロットのロジスティック適合を介して、ｐＫａを算出した（Ｒ２＝０．９９６）。
【図９Ｍ】Ａ〜Ｐは、鉄及びヒノキチオールの結合における生物物理学的試験を示す。（Ｍ）化学量論イオン性５５Ｆｅを、ｐＨ＝７．０で１０ｍＭ  Ｍｅｓ／トリス緩衝液中に予め形成された５６Ｆｅヒノキチオール錯体を含有する溶液に添加した。５５Ｆｅヒノキチオール錯体と５６Ｆｅヒノキチオール錯体の間の平衡は、１時間以内に達成した。Ｎ＝３。（Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｍ）ＮＳ、有意ではない；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図９Ｎ】Ａ〜Ｐは、鉄及びヒノキチオールの結合における生物物理学的試験を示す。（Ｎ及びＯ）鉄及びヒノキチオールによる滴定試験は、３：１  Ｈｉｎｏ：Ｆｅ比での４２０ｎｍの（Ｎ）λｍａｘ及び（Ｏ）吸光度の飽和によって示されるように、３：１  Ｈｉｎｏ：Ｆｅ錯体がｐＨ＝７．０の１０ｍＭ  Ｍｅｓ／トリス緩衝液中で主に形成されることを支援する。鉄の量の増加は、ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルの変化をもたらさない。
【図９Ｏ】Ａ〜Ｐは、鉄及びヒノキチオールの結合における生物物理学的試験を示す。（Ｎ及びＯ）鉄及びヒノキチオールによる滴定試験は、３：１  Ｈｉｎｏ：Ｆｅ比での４２０ｎｍの（Ｎ）λｍａｘ及び（Ｏ）吸光度の飽和によって示されるように、３：１  Ｈｉｎｏ：Ｆｅ錯体がｐＨ＝７．０の１０ｍＭ  Ｍｅｓ／トリス緩衝液中で主に形成されることを支援する。鉄の量の増加は、ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルの変化をもたらさない。
【図９Ｐ】Ａ〜Ｐは、鉄及びヒノキチオールの結合における生物物理学的試験を示す。（Ｐ）第２のＣ１対称性Ｆｅ（Ｈｉｎｏ）３錯体のＸ線結晶構造。
【図１０Ａ】Ａ〜Ｊは、ヒノキチオールが、多数の二価金属に結合して、輸送することができる広域スペクトルメタロフォアであることを示す。図１０Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが、リポソームにおいて、ＦｅＩＩよりも１０倍以上ＣｕＩＩに競合的に結合し、ＦｅＩＩよりも８０倍速くＣｕＩＩを輸送したが、銅の低アクセシビリティが、インビボでの高い鉄選択性をもたらす可能性があることを示す。
【図１０Ｂ】Ａ〜Ｊは、ヒノキチオールが、多数の二価金属に結合して、輸送することができる広域スペクトルメタロフォアであることを示す。図１０Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが、リポソームにおいて、ＦｅＩＩよりも１０倍以上ＣｕＩＩに競合的に結合し、ＦｅＩＩよりも８０倍速くＣｕＩＩを輸送したが、銅の低アクセシビリティが、インビボでの高い鉄選択性をもたらす可能性があることを示す。
【図１０Ｃ】Ａ〜Ｊは、ヒノキチオールが、多数の二価金属に結合して、輸送することができる広域スペクトルメタロフォアであることを示す。図１０Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが、リポソームにおいて、ＦｅＩＩよりも１０倍以上ＣｕＩＩに競合的に結合し、ＦｅＩＩよりも８０倍速くＣｕＩＩを輸送したが、銅の低アクセシビリティが、インビボでの高い鉄選択性をもたらす可能性があることを示す。
【図１０Ｄ】Ａ〜Ｊは、ヒノキチオールが、多数の二価金属に結合して、輸送することができる広域スペクトルメタロフォアであることを示す。図１０Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが、リポソームにおいて、ＦｅＩＩよりも１０倍以上ＣｕＩＩに競合的に結合し、ＦｅＩＩよりも８０倍速くＣｕＩＩを輸送したが、銅の低アクセシビリティが、インビボでの高い鉄選択性をもたらす可能性があることを示す。
【図１０Ｅ】Ａ〜Ｊは、ヒノキチオールが、多数の二価金属に結合して、輸送することができる広域スペクトルメタロフォアであることを示す。図１０Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが、リポソームにおいて、ＦｅＩＩよりも１０倍以上ＣｕＩＩに競合的に結合し、ＦｅＩＩよりも８０倍速くＣｕＩＩを輸送したが、銅の低アクセシビリティが、インビボでの高い鉄選択性をもたらす可能性があることを示す。
【図１０Ｆ】Ａ〜Ｊは、ヒノキチオールが、多数の二価金属に結合して、輸送することができる広域スペクトルメタロフォアであることを示す。図１０Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが、リポソームにおいて、ＦｅＩＩよりも１０倍以上ＣｕＩＩに競合的に結合し、ＦｅＩＩよりも８０倍速くＣｕＩＩを輸送したが、銅の低アクセシビリティが、インビボでの高い鉄選択性をもたらす可能性があることを示す。
【図１０Ｇ】Ａ〜Ｊは、ヒノキチオールが、多数の二価金属に結合して、輸送することができる広域スペクトルメタロフォアであることを示す。図１０Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが、リポソームにおいて、ＦｅＩＩよりも１０倍以上ＣｕＩＩに競合的に結合し、ＦｅＩＩよりも８０倍速くＣｕＩＩを輸送したが、銅の低アクセシビリティが、インビボでの高い鉄選択性をもたらす可能性があることを示す。
【図１０Ｈ】Ａ〜Ｊは、ヒノキチオールが、多数の二価金属に結合して、輸送することができる広域スペクトルメタロフォアであることを示す。図１０Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが、リポソームにおいて、ＦｅＩＩよりも１０倍以上ＣｕＩＩに競合的に結合し、ＦｅＩＩよりも８０倍速くＣｕＩＩを輸送したが、銅の低アクセシビリティが、インビボでの高い鉄選択性をもたらす可能性があることを示す。
【図１０Ｉ】Ａ〜Ｊは、ヒノキチオールが、多数の二価金属に結合して、輸送することができる広域スペクトルメタロフォアであることを示す。図１０Ａ〜Ｉは、ヒノキチオールが、リポソームにおいて、ＦｅＩＩよりも１０倍以上ＣｕＩＩに競合的に結合し、ＦｅＩＩよりも８０倍速くＣｕＩＩを輸送したが、銅の低アクセシビリティが、インビボでの高い鉄選択性をもたらす可能性があることを示す。
【図１０Ｊ】Ａ〜Ｊは、ヒノキチオールが、多数の二価金属に結合して、輸送することができる広域スペクトルメタロフォアであることを示す。図１０Ｊは、ヒノキチオールによるｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母を処理する際に、細胞内鉄レベルが、ビヒクル処理対照に比べて増加した一方、マンガン、コバルト、ニッケル、亜鉛、及び銅のレベルが変化しなかったことを示す。
【図１１Ａ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオール鉄錯体の電気化学的試験を示す。特に明記しない限り、全てのＣＶは、ｐＨ＝７．２の１：１  ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏの０．１Ｍトリス緩衝液、ならびに１００μＭ  Ｆｅ（ＮＯ３）３及び５００μＭヒノキチオールを用いて、Ｈｇ電極及びＡｇ／ＡｇＣｌ基準及びグラファイト補助による１００ｍＶ／ｓ走査速度で得られた。（Ａ）鉄及び鉄ヒノキチオール錯体のサイクリックボルタモグラム（ＣＶ）。２つの異なる酸化還元波が、ヒノキチオールのボルタモグラムに存在する。Ｎ＝４。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１１Ｂ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオール鉄錯体の電気化学的試験を示す。特に明記しない限り、全てのＣＶは、ｐＨ＝７．２の１：１  ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏの０．１Ｍトリス緩衝液、ならびに１００μＭ  Ｆｅ（ＮＯ３）３及び５００μＭヒノキチオールを用いて、Ｈｇ電極及びＡｇ／ＡｇＣｌ基準及びグラファイト補助による１００ｍＶ／ｓ走査速度で得られた。（Ｂ）Ｅ１と同一条件下で、異なる走査速度で得られたＣＶ。Ｎ＝１。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１１Ｃ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオール鉄錯体の電気化学的試験を示す。特に明記しない限り、全てのＣＶは、ｐＨ＝７．２の１：１  ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏの０．１Ｍトリス緩衝液、ならびに１００μＭ  Ｆｅ（ＮＯ３）３及び５００μＭヒノキチオールを用いて、Ｈｇ電極及びＡｇ／ＡｇＣｌ基準及びグラファイト補助による１００ｍＶ／ｓ走査速度で得られた。（Ｃ）拡散律速線形挙動は、Ｅ１の走査速度の平方根に対して観察された。Ｒａｎｄｌｅｓ−Ｓｅｖｃｉｋ方程式（参照文献８５を参照）を利用して得られた電子の数は、電気化学的還元プロセスでは１．１、酸化プロセスでは０．９であり、この酸化還元対が、ＦｅＩＩＩ（Ｈｉｎｏ）３錯体の１つの電子還元であることを示唆する。Ｎ＝１。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１１Ｄ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオール鉄錯体の電気化学的試験を示す。特に明記しない限り、全てのＣＶは、ｐＨ＝７．２の１：１  ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏの０．１Ｍトリス緩衝液、ならびに１００μＭ  Ｆｅ（ＮＯ３）３及び５００μＭヒノキチオールを用いて、Ｈｇ電極及びＡｇ／ＡｇＣｌ基準及びグラファイト補助による１００ｍＶ／ｓ走査速度で得られた。（Ｄ）Ｅ２と同一条件下で、異なる走査速度で得られたＣＶ。Ｎ＝１。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１１Ｅ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオール鉄錯体の電気化学的試験を示す。特に明記しない限り、全てのＣＶは、ｐＨ＝７．２の１：１  ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏの０．１Ｍトリス緩衝液、ならびに１００μＭ  Ｆｅ（ＮＯ３）３及び５００μＭヒノキチオールを用いて、Ｈｇ電極及びＡｇ／ＡｇＣｌ基準及びグラファイト補助による１００ｍＶ／ｓ走査速度で得られた。（Ｅ）非線形挙動が、Ｅ２の走査速度の平方根に対して観察された。これは、より負の電位での表面限定電極位置プロセスと合致しており、生物系における鉄ヒノキチオール錯体の電気化学的特性とは関係ない。Ｎ＝１。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１１Ｆ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオール鉄錯体の電気化学的試験を示す。特に明記しない限り、全てのＣＶは、ｐＨ＝７．２の１：１  ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏの０．１Ｍトリス緩衝液、ならびに１００μＭ  Ｆｅ（ＮＯ３）３及び５００μＭヒノキチオールを用いて、Ｈｇ電極及びＡｇ／ＡｇＣｌ基準及びグラファイト補助による１００ｍＶ／ｓ走査速度で得られた。（Ｆ）Ｈｉｎｏ：Ｆｅ比のＥ０１に対する効果。３つの独立した実験の代表的な痕跡。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１１Ｇ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオール鉄錯体の電気化学的試験を示す。特に明記しない限り、全てのＣＶは、ｐＨ＝７．２の１：１  ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏの０．１Ｍトリス緩衝液、ならびに１００μＭ  Ｆｅ（ＮＯ３）３及び５００μＭヒノキチオールを用いて、Ｈｇ電極及びＡｇ／ＡｇＣｌ基準及びグラファイト補助による１００ｍＶ／ｓ走査速度で得られた。（Ｇ）ＭｅＯＨの濃度の減少は、Ｅ０１を減少させた。Ｎ＝１。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１１Ｈ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオール鉄錯体の電気化学的試験を示す。特に明記しない限り、全てのＣＶは、ｐＨ＝７．２の１：１  ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏの０．１Ｍトリス緩衝液、ならびに１００μＭ  Ｆｅ（ＮＯ３）３及び５００μＭヒノキチオールを用いて、Ｈｇ電極及びＡｇ／ＡｇＣｌ基準及びグラファイト補助による１００ｍＶ／ｓ走査速度で得られた。（Ｈ）得られたＥ０１対ＭｅＯＨ濃度の外挿は、水溶液中のＦｅ（Ｈｉｎｏ）３の酸化還元電位が、ＮＨＥに対して、−３６１ｍＶまで低下すると推定される。Ｎ＝１。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１１Ｉ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオール鉄錯体の電気化学的試験を示す。特に明記しない限り、全てのＣＶは、ｐＨ＝７．２の１：１  ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏの０．１Ｍトリス緩衝液、ならびに１００μＭ  Ｆｅ（ＮＯ３）３及び５００μＭヒノキチオールを用いて、Ｈｇ電極及びＡｇ／ＡｇＣｌ基準及びグラファイト補助による１００ｍＶ／ｓ走査速度で得られた。（Ｉ）ｐＨのＦｅ（Ｈｉｎｏ）３の酸化還元電位に対する効果。Ｎ＝１〜２。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１１Ｊ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオール鉄錯体の電気化学的試験を示す。特に明記しない限り、全てのＣＶは、ｐＨ＝７．２の１：１  ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏの０．１Ｍトリス緩衝液、ならびに１００μＭ  Ｆｅ（ＮＯ３）３及び５００μＭヒノキチオールを用いて、Ｈｇ電極及びＡｇ／ＡｇＣｌ基準及びグラファイト補助による１００ｍＶ／ｓ走査速度で得られた。（Ｊ）Ｆｅ（Ｈｉｎｏ）３酸化還元電位は、ｐＨの増加に伴って減少する。Ｎ＝１。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１１Ｋ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオール鉄錯体の電気化学的試験を示す。特に明記しない限り、全てのＣＶは、ｐＨ＝７．２の１：１  ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏの０．１Ｍトリス緩衝液、ならびに１００μＭ  Ｆｅ（ＮＯ３）３及び５００μＭヒノキチオールを用いて、Ｈｇ電極及びＡｇ／ＡｇＣｌ基準及びグラファイト補助による１００ｍＶ／ｓ走査速度で得られた。（Ｋ）強還元アスコルビン酸塩（６２．５ｍＭ）緩衝液中で、鉄（ＩＩＩ）は、５６２ｎｍでのフェロジン−ＦｅＩＩ錯体の吸光度によって決定されるように、鉄（ＩＩ）に瞬時に還元される。予め形成されたＦｅＩＩＩ（Ｈｉｎｏ）３は、還元速度を大幅に減衰させた、しかしながら、鉄（ＩＩ）は、同じアスコルビン酸塩緩衝液を用いて、１時間後に主に存在した。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１１Ｌ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオール鉄錯体の電気化学的試験を示す。特に明記しない限り、全てのＣＶは、ｐＨ＝７．２の１：１  ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏの０．１Ｍトリス緩衝液、ならびに１００μＭ  Ｆｅ（ＮＯ３）３及び５００μＭヒノキチオールを用いて、Ｈｇ電極及びＡｇ／ＡｇＣｌ基準及びグラファイト補助による１００ｍＶ／ｓ走査速度で得られた。（Ｌ）同じ強還元アスコルビン酸塩緩衝液における鉄（ＩＩＩ）還元速度の経時的な定量化。Ｎ＝３。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１２Ａ】Ａ〜Ｇは、ヒノキチオールが、ＤＭＴ１欠乏Ｃａｃｏ−２細胞における取り込み及び輸送を促進することを示す。（Ａ）ｑＲＴ−ＰＣＲを介して定量化したＤｍｔ１  ｍＲＮＡレベルは、ｓｈ対照細胞単層と比較して、ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層で低下する。Ｎ＝９。（Ａ、Ｃ−Ｇ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１２Ｂ】Ａ〜Ｇは、ヒノキチオールが、ＤＭＴ１欠乏Ｃａｃｏ−２細胞における取り込み及び輸送を促進することを示す。（Ｂ及びＣ）ウェスタンブロットの定量的デンシトメトリー分析は、ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層におけるＤＭＴ１タンパク質レベルの減少を示した。ヒノキチオール（５００ｎＭ）処理は、ＤＭＴ１発現を誘導しなかった。Ｎ＝１３〜１４。
【図１２Ｃ】Ａ〜Ｇは、ヒノキチオールが、ＤＭＴ１欠乏Ｃａｃｏ−２細胞における取り込み及び輸送を促進することを示す。（Ｂ及びＣ）ウェスタンブロットの定量的デンシトメトリー分析は、ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層におけるＤＭＴ１タンパク質レベルの減少を示した。ヒノキチオール（５００ｎＭ）処理は、ＤＭＴ１発現を誘導しなかった。Ｎ＝１３〜１４。（Ａ、Ｃ−Ｇ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１２Ｄ】Ａ〜Ｇは、ヒノキチオールが、ＤＭＴ１欠乏Ｃａｃｏ−２細胞における取り込み及び輸送を促進することを示す。（Ｄ）ＤＭＳＯ、ヒノキチオール（５００ｎＭ）、またはＣ２ｄｅＯＨｉｎｏ（５００ｎＭ）で処理したＣａｃｏ−２単層の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）値は、実験の過程にわたって一貫したままである。Ｎ＝３。（Ａ、Ｃ−Ｇ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１２Ｅ】Ａ〜Ｇは、ヒノキチオールが、ＤＭＴ１欠乏Ｃａｃｏ−２細胞における取り込み及び輸送を促進することを示す。（Ｅ）ヒノキチオール（５００ｎＭ）は、十二指腸全体に見られるｐＨの範囲で、ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層における輸送を促進する。Ｎ＝３。（Ａ、Ｃ−Ｇ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１２Ｆ】Ａ〜Ｇは、ヒノキチオールが、ＤＭＴ１欠乏Ｃａｃｏ−２細胞における取り込み及び輸送を促進することを示す。（Ｆ及びＧ）ヒノキチオールとは対照的に、鉄キレート剤であるデフェリプロン、ＰＩＨ、ＳＩＨ、及びデフェロキサミンは、同一条件下（ｐＨ＝５．５頂端側、ｐＨ＝７．４側底側）で、（Ｆ）ＤＭＴ１欠乏Ｃａｃｏ−２単層への取り込みまたは（Ｇ）ＤＭＴ１欠乏Ｃａｃｏ−２単層を横断する経細胞輸送を同時に回復させない。点線は、ｓｈ対照レベルを表す。輸送の僅かな増加が、ＳＩＨ処理細胞において観察された一方、取り込みの低下が観察され、傍細胞鉄輸送と合致しており、経細胞鉄輸送と合致していない。小分子ごとに使用した濃度は、０、０．０１、０．１、１、及び１０μＭであった。Ｎ＝３。（Ａ、Ｃ−Ｇ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１２Ｇ】Ａ〜Ｇは、ヒノキチオールが、ＤＭＴ１欠乏Ｃａｃｏ−２細胞における取り込み及び輸送を促進することを示す。（Ｆ及びＧ）ヒノキチオールとは対照的に、鉄キレート剤であるデフェリプロン、ＰＩＨ、ＳＩＨ、及びデフェロキサミンは、同一条件下（ｐＨ＝５．５頂端側、ｐＨ＝７．４側底側）で、（Ｆ）ＤＭＴ１欠乏Ｃａｃｏ−２単層への取り込みまたは（Ｇ）ＤＭＴ１欠乏Ｃａｃｏ−２単層を横断する経細胞輸送を同時に回復させない。点線は、ｓｈ対照レベルを表す。輸送の僅かな増加が、ＳＩＨ処理細胞において観察された一方、取り込みの低下が観察され、傍細胞鉄輸送と合致しており、経細胞鉄輸送と合致していない。小分子ごとに使用した濃度は、０、０．０１、０．１、１、及び１０μＭであった。Ｎ＝３。（Ａ、Ｃ−Ｇ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１３Ａ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオールが、ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞における分化を促進することを示す。（Ａ）Ｄｍｔ１  ｍＲＮＡ（Ｎ＝１２〜１６）及び（Ｂ）ＤＭＴ１タンパク質レベルは、終末分化のＤＭＳＯ誘導後に、ｓｈ対照に比べて、ｓｈＤＭＴ１  ＭＥＬ細胞（クローン１、２、及び４）において低下する。Ｎ＝１３。（Ａ、Ｂ、Ｆ〜Ｉ、Ｋ、Ｌ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１３Ｂ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオールが、ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞における分化を促進することを示す。（Ａ）Ｄｍｔ１  ｍＲＮＡ（Ｎ＝１２〜１６）及び（Ｂ）ＤＭＴ１タンパク質レベルは、終末分化のＤＭＳＯ誘導後に、ｓｈ対照に比べて、ｓｈＤＭＴ１  ＭＥＬ細胞（クローン１、２、及び４）において低下する。Ｎ＝１３。（Ａ、Ｂ、Ｆ〜Ｉ、Ｋ、Ｌ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１３Ｃ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオールが、ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞における分化を促進することを示す。（Ｃ）分化ＭＥＬ細胞におけるＤＭＴ１タンパク質レベルの代表的なウェスタンブロット画像。
【図１３Ｄ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオールが、ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞における分化を促進することを示す。（Ｄ及びＥ）ヒノキチオール（３日間で１μＭ）は、ヘモグロビン化細胞をｏ−ジアニシジンで茶色に染色させることから明らかなように、分化を視覚的に回復させる。
【図１３Ｅ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオールが、ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞における分化を促進することを示す。（Ｄ及びＥ）ヒノキチオール（３日間で１μＭ）は、ヘモグロビン化細胞をｏ−ジアニシジンで茶色に染色させることから明らかなように、分化を視覚的に回復させる。
【図１３Ｆ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオールが、ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞における分化を促進することを示す。（Ｆ）ヒノキチオール（１μＭ）は、鉄の分化ｓｈＤＭＴ１  ＭＥＬ細胞のへの取り込みを回復させる一方、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏ（１μＭ）は、回復させない。Ｎ＝６〜２５。（Ａ、Ｂ、Ｆ〜Ｉ、Ｋ、Ｌ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１３Ｇ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオールが、ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞における分化を促進することを示す。（Ｇ及びＨ）ヒノキチオール（１μＭ）は、（Ｇ）時間依存的及び（Ｈ）用量依存的に、ｓｈＤＭＴ１  ４細胞の分化を回復させる。Ｎ＝３〜２７。（Ａ、Ｂ、Ｆ〜Ｉ、Ｋ、Ｌ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１３Ｈ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオールが、ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞における分化を促進することを示す。（Ｇ及びＨ）ヒノキチオール（１μＭ）は、（Ｇ）時間依存的及び（Ｈ）用量依存的に、ｓｈＤＭＴ１  ４細胞の分化を回復させる。Ｎ＝３〜２７。（Ａ、Ｂ、Ｆ〜Ｉ、Ｋ、Ｌ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１３Ｉ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオールが、ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞における分化を促進することを示す。（Ｉ）小分子（１μＭ）で処理したＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞におけるヘモグロビンレベルの定量化。Ｎ＝３。（Ａ、Ｂ、Ｆ〜Ｉ、Ｋ、Ｌ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１３Ｊ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオールが、ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞における分化を促進することを示す。（Ｊ）ＤＭＳＯ、ヒノキチオール（１μＭ）、またはＣ２ｄｅＯＨｉｎｏ（１μＭ）で処理した分化ＭＥＬ細胞におけるグロビンレベルの代表的なウェスタンブロット画像。
【図１３Ｋ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオールが、ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞における分化を促進することを示す。（Ｋ）誘導されたｓｈＤＭＴ１  ＭＥＬ細胞に対する３日間のヒノキチオール（１μＭ）処理は、ＭＥＬ細胞計数を減少させなかった。Ｎ＝３〜１５。（Ａ、Ｂ、Ｆ〜Ｉ、Ｋ、Ｌ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１３Ｌ】Ａ〜Ｌは、ヒノキチオールが、ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞における分化を促進することを示す。（Ｌ）ＤＭＳＯ誘導しないヒノキチオール（１μＭ）処理ＭＥＬ細胞において、分化は観察されない。Ｎ＝４〜６。スケールバー＝１００μｍ（Ｅ）（Ａ、Ｂ、Ｆ〜Ｉ、Ｋ、Ｌ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１４Ａ】Ａ〜Ｍは、ヒノキチオールが、他の鉄トランスポーター欠乏系におけるインビトロ生理機能を回復させることを示す。（Ａ）Ｍｆｒｎ１  ｍＲＮＡレベルは、終末分化の誘導後に、野生型細胞に比べて、ＣＲＩＳＰＲ由来のＭｆｒｎ１ノックダウンＭＥＬ細胞において低下する。Ｎ＝３。（Ａ〜Ｆ、Ｈ、Ｊ〜Ｍ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１４Ｂ】Ａ〜Ｍは、ヒノキチオールが、他の鉄トランスポーター欠乏系におけるインビトロ生理機能を回復させることを示す。（Ｂ及びＣ）ヒノキチオール（１μＭ）は、５５Ｆｅ放射性トレーサーを用いて、Ｍｆｒｎ１欠乏ＭＥＬ細胞における正常な（Ｂ）鉄の取り込み及び（Ｃ）ヘムへの鉄の組み込みを回復させる。Ｎ＝５〜２５。（Ａ〜Ｆ、Ｈ、Ｊ〜Ｍ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１４Ｃ】Ａ〜Ｍは、ヒノキチオールが、他の鉄トランスポーター欠乏系におけるインビトロ生理機能を回復させることを示す。（Ｂ及びＣ）ヒノキチオール（１μＭ）は、５５Ｆｅ放射性トレーサーを用いて、Ｍｆｒｎ１欠乏ＭＥＬ細胞における正常な（Ｂ）鉄の取り込み及び（Ｃ）ヘムへの鉄の組み込みを回復させる。Ｎ＝５〜２５。（Ａ〜Ｆ、Ｈ、Ｊ〜Ｍ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１４Ｄ】Ａ〜Ｍは、ヒノキチオールが、他の鉄トランスポーター欠乏系におけるインビトロ生理機能を回復させることを示す。（Ｄ〜Ｆ）予想した通り、ヒノキチオール（１μＭ）は、ポルフィリン生合成に関与するタンパク質が欠如しているＤＭＳＯ誘導ＴＭＥＭ１４ＣΔ  ＭＥＬ細胞における（Ｄ）分化（ｏ−ジアニシジン染色後のＩｍａｇｅＪ分析を介して定量化した）、（Ｅ）鉄の取り込み、または（Ｆ）鉄ヘム組み込みを回復させることができない。Ｎ＝８〜２５。（Ａ〜Ｆ、Ｈ、Ｊ〜Ｍ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１４Ｅ】Ａ〜Ｍは、ヒノキチオールが、他の鉄トランスポーター欠乏系におけるインビトロ生理機能を回復させることを示す。（Ｄ〜Ｆ）予想した通り、ヒノキチオール（１μＭ）は、ポルフィリン生合成に関与するタンパク質が欠如しているＤＭＳＯ誘導ＴＭＥＭ１４ＣΔ  ＭＥＬ細胞における（Ｄ）分化（ｏ−ジアニシジン染色後のＩｍａｇｅＪ分析を介して定量化した）、（Ｅ）鉄の取り込み、または（Ｆ）鉄ヘム組み込みを回復させることができない。Ｎ＝８〜２５。（Ａ〜Ｆ、Ｈ、Ｊ〜Ｍ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１４Ｆ】Ａ〜Ｍは、ヒノキチオールが、他の鉄トランスポーター欠乏系におけるインビトロ生理機能を回復させることを示す。（Ｄ〜Ｆ）予想した通り、ヒノキチオール（１μＭ）は、ポルフィリン生合成に関与するタンパク質が欠如しているＤＭＳＯ誘導ＴＭＥＭ１４ＣΔ  ＭＥＬ細胞における（Ｄ）分化（ｏ−ジアニシジン染色後のＩｍａｇｅＪ分析を介して定量化した）、（Ｅ）鉄の取り込み、または（Ｆ）鉄ヘム組み込みを回復させることができない。Ｎ＝８〜２５。（Ａ〜Ｆ、Ｈ、Ｊ〜Ｍ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１４Ｇ】Ａ〜Ｍは、ヒノキチオールが、他の鉄トランスポーター欠乏系におけるインビトロ生理機能を回復させることを示す。（Ｇ及びＨ）１８時間のケルセチンインキュベーションは、Ｃａｃｏ−２細胞におけるＦＰＮ１タンパク質レベルをノックダウンさせる；ヒノキチオール（１μＭ）は、ＦＰＮ１レベルを増加させない。Ｎ＝８。
【図１４Ｈ】Ａ〜Ｍは、ヒノキチオールが、他の鉄トランスポーター欠乏系におけるインビトロ生理機能を回復させることを示す。（Ｇ及びＨ）１８時間のケルセチンインキュベーションは、Ｃａｃｏ−２細胞におけるＦＰＮ１タンパク質レベルをノックダウンさせる；ヒノキチオール（１μＭ）は、ＦＰＮ１レベルを増加させない。Ｎ＝８。（Ａ〜Ｆ、Ｈ、Ｊ〜Ｍ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１４Ｉ】Ａ〜Ｍは、ヒノキチオールが、他の鉄トランスポーター欠乏系におけるインビトロ生理機能を回復させることを示す。（Ｉ及びＪ）ヘプシジンは、Ｊ７７４マクロファージにおけるＦＰＮ１レベルを低下させ；ヒノキチオール（５μＭ）は、ＦＰＮ１レベルを増加させない。Ｎ＝２０。
【図１４Ｊ】Ａ〜Ｍは、ヒノキチオールが、他の鉄トランスポーター欠乏系におけるインビトロ生理機能を回復させることを示す。（Ｉ及びＪ）ヘプシジンは、Ｊ７７４マクロファージにおけるＦＰＮ１レベルを低下させ；ヒノキチオール（５μＭ）は、ＦＰＮ１レベルを増加させない。Ｎ＝２０。（Ａ〜Ｆ、Ｈ、Ｊ〜Ｍ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１４Ｋ】Ａ〜Ｍは、ヒノキチオールが、他の鉄トランスポーター欠乏系におけるインビトロ生理機能を回復させることを示す。（Ｋ）ヒノキチオール（１μＭ）は、野生型単層に見合った速度で、ＦＰＮ１欠乏Ｃａｃｏ−２単層を横断する経上皮鉄輸送を回復させる。Ｎ＝３。（Ａ〜Ｆ、Ｈ、Ｊ〜Ｍ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１４Ｌ】Ａ〜Ｍは、ヒノキチオールが、他の鉄トランスポーター欠乏系におけるインビトロ生理機能を回復させることを示す。（Ｌ）ヒノキチオール（１μＭ）またはＣ２ｄｅＯＨｉｎｏ（１μＭ）の不在下または存在下における野生型単層及びケルセチン処理ＦＰＮ１欠乏単層は、一貫した経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）値から明らかなように、実験の期間中に無傷のままである。Ｎ＝３。（Ａ〜Ｆ、Ｈ、Ｊ〜Ｍ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１４Ｍ】Ａ〜Ｍは、ヒノキチオールが、他の鉄トランスポーター欠乏系におけるインビトロ生理機能を回復させることを示す。（Ｍ）ヒノキチオールは、２時間後に、用量依存的にＦＰＮ１欠乏Ｊ７７４細胞における鉄放出を促進する。Ｎ＝６〜２０。（Ａ〜Ｆ、Ｈ、Ｊ〜Ｍ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１５Ａ】Ａ〜Ｃは、細胞内鉄レベルを視覚化するための鉄感受性蛍光色素の使用のことを示す。（Ａ及びＢ）閉鎖型プローブの構造。それぞれ、（Ａ）サイトゾルの不安定な鉄レベルの視覚化に使用したカルセイングリーン、及び（Ｂ）ミトコンドリアの不安定な鉄レベルの視覚化に使用したＲＰＡ。蛍光消失は、鉄結合後に観察される。
【図１５Ｂ】Ａ〜Ｃは、細胞内鉄レベルを視覚化するための鉄感受性蛍光色素の使用のことを示す。（Ａ及びＢ）閉鎖型プローブの構造。それぞれ、（Ａ）サイトゾルの不安定な鉄レベルの視覚化に使用したカルセイングリーン、及び（Ｂ）ミトコンドリアの不安定な鉄レベルの視覚化に使用したＲＰＡ。蛍光消失は、鉄結合後に観察される。
【図１５Ｃ】Ａ〜Ｃは、細胞内鉄レベルを視覚化するための鉄感受性蛍光色素の使用のことを示す。（Ｃ）エンドソームにおけるＨ２Ｏ２及び不安定なＦｅによる酸化後のＢＳＡコンジュゲートＯｘｙＢｕｒｓｔグリーン蛍光。
【図１６Ａ】Ａ〜Ｊは、ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞におけるエンドソーム鉄の部位選択的蓄積のことを示す。（Ａ）エンドソームに局在したｏｘｙｂｕｒｓｔグリーン（緑色、左）、サイトゾルに局在したカルセイングリーン（緑色、中）、及びミトコンドリアに局在したＲＰＡ（赤色、右）からの蛍光の代表的な共焦点顕微鏡画像は、ｓｈ対照細胞に比べて、ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞における不安定なエンドソーム鉄の蓄積を支援する。ヒノキチオール（１μＭ）処理は、エンドソームｏｘｙｂｕｒｓｔグリーン蛍光を減少させ、かつ、カルセイングリーン及びＲＰＡ蛍光を消失させ、エンドソームからサイトゾルへの不安定な鉄のヒノキチオール媒介放出、及びその後のミトコンドリア利用を示唆する。Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏ（１μＭ）は効果を有さない。スケールバー＝１０μｍ（Ａ）
【図１６Ｂ】Ａ〜Ｊは、ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞におけるエンドソーム鉄の部位選択的蓄積のことを示す。（Ｂ）エンドソームｏｘｙｂｕｒｓｔグリーン蛍光のＩｍａｇｅＪ定量化。Ｎ≧４０。（Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｊ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。（
【図１６Ｃ】Ａ〜Ｊは、ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞におけるエンドソーム鉄の部位選択的蓄積のことを示す。（Ｃ及びＤ）ｏｘｙｂｕｒｓｔグリーンで染色されたＭＥＬ細胞のフローサイトメトリーは、ヒノキチオールが、エンドソームから鉄を放出することを支援する。Ｎ＝６。（Ｃ、Ｆ、Ｉ）３つの独立した実験からの代表的なグラフ。
【図１６Ｄ】Ａ〜Ｊは、ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞におけるエンドソーム鉄の部位選択的蓄積のことを示す。（Ｃ及びＤ）ｏｘｙｂｕｒｓｔグリーンで染色されたＭＥＬ細胞のフローサイトメトリーは、ヒノキチオールが、エンドソームから鉄を放出することを支援する。Ｎ＝６。（Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｊ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１６Ｅ】Ａ〜Ｊは、ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞におけるエンドソーム鉄の部位選択的蓄積のことを示す。（Ｅ）サイトゾルにおけるカルセイングリーン蛍光のＩｍａｇｅＪ定量化（Ｎ＝２３〜６７）及び（Ｆ及びＧ）フローサイトメトリー分析は、ｓｈＤＭＴ１  ＭＥＬ細胞へのヒノキチオール処理が、サイトゾルの不安定な鉄レベルを増加させることを支援する。Ｎ＝６。（Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｊ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１６Ｆ】Ａ〜Ｊは、ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞におけるエンドソーム鉄の部位選択的蓄積のことを示す。（Ｅ）サイトゾルにおけるカルセイングリーン蛍光のＩｍａｇｅＪ定量化（Ｎ＝２３〜６７）及び（Ｆ及びＧ）フローサイトメトリー分析は、ｓｈＤＭＴ１  ＭＥＬ細胞へのヒノキチオール処理が、サイトゾルの不安定な鉄レベルを増加させることを支援する。Ｎ＝６。（Ｃ、Ｆ、Ｉ）３つの独立した実験からの代表的なグラフ。
【図１６Ｇ】Ａ〜Ｊは、ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞におけるエンドソーム鉄の部位選択的蓄積のことを示す。（Ｅ）サイトゾルにおけるカルセイングリーン蛍光のＩｍａｇｅＪ定量化（Ｎ＝２３〜６７）及び（Ｆ及びＧ）フローサイトメトリー分析は、ｓｈＤＭＴ１  ＭＥＬ細胞へのヒノキチオール処理が、サイトゾルの不安定な鉄レベルを増加させることを支援する。Ｎ＝６。（Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｊ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１６Ｈ】Ａ〜Ｊは、ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞におけるエンドソーム鉄の部位選択的蓄積のことを示す。（Ｈ）ミトコンドリアにおけるＲＰＡ蛍光のＩｍａｇｅＪ定量化（Ｎ＝２３〜６７）及び（Ｉ及びＪ）フローサイトメトリー分析は、ｓｈＤＭＴ１  ＭＥＬ細胞へのヒノキチオール処理が、ミトコンドリアの不安定な鉄レベルを増加させることを支援する。Ｎ＝６。（Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｊ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１６Ｉ】Ａ〜Ｊは、ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞におけるエンドソーム鉄の部位選択的蓄積のことを示す。（Ｈ）ミトコンドリアにおけるＲＰＡ蛍光のＩｍａｇｅＪ定量化（Ｎ＝２３〜６７）及び（Ｉ及びＪ）フローサイトメトリー分析は、ｓｈＤＭＴ１  ＭＥＬ細胞へのヒノキチオール処理が、ミトコンドリアの不安定な鉄レベルを増加させることを支援する。Ｎ＝６。（Ｃ、Ｆ、Ｉ）３つの独立した実験からの代表的なグラフ。
【図１６Ｊ】Ａ〜Ｊは、ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞におけるエンドソーム鉄の部位選択的蓄積のことを示す。（Ｈ）ミトコンドリアにおけるＲＰＡ蛍光のＩｍａｇｅＪ定量化（Ｎ＝２３〜６７）及び（Ｉ及びＪ）フローサイトメトリー分析は、ｓｈＤＭＴ１  ＭＥＬ細胞へのヒノキチオール処理が、ミトコンドリアの不安定な鉄レベルを増加させることを支援する。Ｎ＝６。（Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｊ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１７Ａ】Ａ〜Ｅは、鉄勾配の関数としてヒノキチオール輸送を示す。（Ａ及びＢ）ヒノキチオールは、一定濃度の鉄（３０ｍＭ）による用量依存的に、ＰＯＰＣリポソームからの（Ａ）第一鉄及び（Ｂ）第二鉄の放出を増加させる。Ｎ＝３。（Ａ、Ｂ）３つの独立した実験からの代表的なグラフ。
【図１７Ｂ】Ａ〜Ｅは、鉄勾配の関数としてヒノキチオール輸送を示す。（Ａ及びＢ）ヒノキチオールは、一定濃度の鉄（３０ｍＭ）による用量依存的に、ＰＯＰＣリポソームからの（Ａ）第一鉄及び（Ｂ）第二鉄の放出を増加させる。Ｎ＝３。（Ａ、Ｂ）３つの独立した実験からの代表的なグラフ。
【図１７Ｃ】Ａ〜Ｅは、鉄勾配の関数としてヒノキチオール輸送を示す。（Ｃ及びＤ）ヒノキチオール処理（１０μＭ）ＰＯＰＣリポソームからの鉄放出の速度はまた、リポソームの内部の（Ｃ）第一鉄及び（Ｄ）第二鉄の量の関数として増加する。Ｎ＝３。（Ｃ、Ｄ）グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１７Ｄ】Ａ〜Ｅは、鉄勾配の関数としてヒノキチオール輸送を示す。（Ｃ及びＤ）ヒノキチオール処理（１０μＭ）ＰＯＰＣリポソームからの鉄放出の速度はまた、リポソームの内部の（Ｃ）第一鉄及び（Ｄ）第二鉄の量の関数として増加する。Ｎ＝３。（Ｃ、Ｄ）グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１７Ｅ】Ａ〜Ｅは、鉄勾配の関数としてヒノキチオール輸送を示す。（Ｅ）人工的な勾配を用いてＪ７７４マクロファージの膜を横断するヒノキチオール促進方向選択的鉄輸送の簡略図。ＦｅＳＯ４（２００μＭ）をＪ７７４細胞に最初に負荷し、細胞外液を低鉄培地（＜５００ｎＭ）に置き換えた後、ヒノキチオール（１００μＭ）をｔ＝５分で添加する。ヒノキチオールは、鉄を細胞外液に放出する。その後、細胞外ＦｅＣｌ３（１００μＭ）をｔ＝１２分で添加することで、勾配を逆にする。あるいは、ヒノキチオールは、鉄のＪ７７４マクロファージへの取り込みを促進し、予め形成された鉄勾配の方向に依存して、方向選択的輸送と合致する。
【図１８Ａ】Ａ〜Ｃは、ヒノキチオールが、膜貫通鉄勾配の関数として、鉄を指向的に輸送することを示す。（Ａ〜Ｃ）サイトゾルの不安定な鉄レベルの変化を経時的に検出するためのカルセイングリーン蛍光の代表的なＩｍａｇｅＪ定量化。野生型Ｊ７７４細胞をＦｅＳＯ４（２００μＭ）に負荷した。ｔ＝０分で、細胞外培地を低鉄培地（＜５００ｎＭ）に置き換えた後、（Ａ）ＤＭＳＯ、（Ｂ）１００μＭヒノキチオール、または（Ｃ）１００μＭ  Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏを５分で添加した。カルセイングリーン蛍光の増加は、ヒノキチオール処理細胞において観察され、これは、これらの細胞からの鉄のヒノキチオール媒介放出と合致する。その後、ＦｅＣｌ３（１００μＭ）を同じ細胞に１２分で細胞外添加することで、勾配を逆にし、あるいは、蛍光消失は、ヒノキチオール処理細胞で観察された。このデータは、鉄負荷Ｊ７７４細胞からの鉄の最初のヒノキチオール媒介放出、続いて、ｔ＝１２分での細胞外鉄の添加後のヒノキチオール媒介の鉄の取り込みと合致する。
【図１８Ｂ】Ａ〜Ｃは、ヒノキチオールが、膜貫通鉄勾配の関数として、鉄を指向的に輸送することを示す。（Ａ〜Ｃ）サイトゾルの不安定な鉄レベルの変化を経時的に検出するためのカルセイングリーン蛍光の代表的なＩｍａｇｅＪ定量化。野生型Ｊ７７４細胞をＦｅＳＯ４（２００μＭ）に負荷した。ｔ＝０分で、細胞外培地を低鉄培地（＜５００ｎＭ）に置き換えた後、（Ａ）ＤＭＳＯ、（Ｂ）１００μＭヒノキチオール、または（Ｃ）１００μＭ  Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏを５分で添加した。カルセイングリーン蛍光の増加は、ヒノキチオール処理細胞において観察され、これは、これらの細胞からの鉄のヒノキチオール媒介放出と合致する。その後、ＦｅＣｌ３（１００μＭ）を同じ細胞に１２分で細胞外添加することで、勾配を逆にし、あるいは、蛍光消失は、ヒノキチオール処理細胞で観察された。このデータは、鉄負荷Ｊ７７４細胞からの鉄の最初のヒノキチオール媒介放出、続いて、ｔ＝１２分での細胞外鉄の添加後のヒノキチオール媒介の鉄の取り込みと合致する。
【図１８Ｃ】Ａ〜Ｃは、ヒノキチオールが、膜貫通鉄勾配の関数として、鉄を指向的に輸送することを示す。（Ａ〜Ｃ）サイトゾルの不安定な鉄レベルの変化を経時的に検出するためのカルセイングリーン蛍光の代表的なＩｍａｇｅＪ定量化。野生型Ｊ７７４細胞をＦｅＳＯ４（２００μＭ）に負荷した。ｔ＝０分で、細胞外培地を低鉄培地（＜５００ｎＭ）に置き換えた後、（Ａ）ＤＭＳＯ、（Ｂ）１００μＭヒノキチオール、または（Ｃ）１００μＭ  Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏを５分で添加した。カルセイングリーン蛍光の増加は、ヒノキチオール処理細胞において観察され、これは、これらの細胞からの鉄のヒノキチオール媒介放出と合致する。その後、ＦｅＣｌ３（１００μＭ）を同じ細胞に１２分で細胞外添加することで、勾配を逆にし、あるいは、蛍光消失は、ヒノキチオール処理細胞で観察された。このデータは、鉄負荷Ｊ７７４細胞からの鉄の最初のヒノキチオール媒介放出、続いて、ｔ＝１２分での細胞外鉄の添加後のヒノキチオール媒介の鉄の取り込みと合致する。
【図１９Ａ】Ａ〜Ｑは、鉄の取り込み及び輸送に関与する内因性タンパク質を示す。（Ａ）予想した通り、ヒノキチオール（１０μＭ）の存在下で増殖させた野生型及びｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母は、細胞壁生合成の阻害剤であるカスポファンギンに等感受性であり、これは、鉄の取り込みの経路外である。Ｎ＝３。（Ａ〜Ｍ、Ｏ〜Ｑ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；’Ｋ’Ｋ’Ｋ’Ｋ  Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１９Ｂ】Ａ〜Ｑは、鉄の取り込み及び輸送に関与する内因性タンパク質を示す。（Ｂ及びＣ）陽子動力発生ポンプである、（Ｂ）エブセレンによるＰｍａ１及び（Ｃ）バフィロマイシンによるＶ−ＡＴＰａｓｅの阻害は、ヒノキチオール処理した野生型酵母に比べて、ヒノキチオール救出されたｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母の感受性増加をもたらす。これは、これらのタンパク質が、酵母細胞増殖のヒノキチオール媒介回復に役割を果たすことを示唆する。Ｎ＝３。（Ａ〜Ｍ、Ｏ〜Ｑ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；’Ｋ’Ｋ’Ｋ’Ｋ  Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１９Ｃ】Ａ〜Ｑは、鉄の取り込み及び輸送に関与する内因性タンパク質を示す。（Ｂ及びＣ）陽子動力発生ポンプである、（Ｂ）エブセレンによるＰｍａ１及び（Ｃ）バフィロマイシンによるＶ−ＡＴＰａｓｅの阻害は、ヒノキチオール処理した野生型酵母に比べて、ヒノキチオール救出されたｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母の感受性増加をもたらす。これは、これらのタンパク質が、酵母細胞増殖のヒノキチオール媒介回復に役割を果たすことを示唆する。Ｎ＝３。（Ａ〜Ｍ、Ｏ〜Ｑ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；’Ｋ’Ｋ’Ｋ’Ｋ  Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１９Ｄ】Ａ〜Ｑは、鉄の取り込み及び輸送に関与する内因性タンパク質を示す。（Ｄ〜Ｋ）ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層における鉄関連タンパク質のタンパク質レベルのウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ定量化は、他のタンパク質が、細胞鉄状態の変化に対する転写及び翻訳フィードバック機構を介して応答することを示唆する。重要なことに、（Ｅ）フェリチンの減少及び（Ｉ）ＦＰＮ１レベルの増加が観察され、恐らくは、小分子媒介鉄輸送に有利な環境を生成する。Ｎ＝３〜１６。（Ａ〜Ｍ、Ｏ〜Ｑ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；’Ｋ’Ｋ’Ｋ’Ｋ  Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１９Ｅ】Ａ〜Ｑは、鉄の取り込み及び輸送に関与する内因性タンパク質を示す。（Ｄ〜Ｋ）ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層における鉄関連タンパク質のタンパク質レベルのウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ定量化は、他のタンパク質が、細胞鉄状態の変化に対する転写及び翻訳フィードバック機構を介して応答することを示唆する。重要なことに、（Ｅ）フェリチンの減少及び（Ｉ）ＦＰＮ１レベルの増加が観察され、恐らくは、小分子媒介鉄輸送に有利な環境を生成する。Ｎ＝３〜１６。（Ａ〜Ｍ、Ｏ〜Ｑ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；’Ｋ’Ｋ’Ｋ’Ｋ  Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１９Ｆ】Ａ〜Ｑは、鉄の取り込み及び輸送に関与する内因性タンパク質を示す。（Ｄ〜Ｋ）ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層における鉄関連タンパク質のタンパク質レベルのウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ定量化は、他のタンパク質が、細胞鉄状態の変化に対する転写及び翻訳フィードバック機構を介して応答することを示唆する。重要なことに、（Ｅ）フェリチンの減少及び（Ｉ）ＦＰＮ１レベルの増加が観察され、恐らくは、小分子媒介鉄輸送に有利な環境を生成する。Ｎ＝３〜１６。（Ａ〜Ｍ、Ｏ〜Ｑ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；’Ｋ’Ｋ’Ｋ’Ｋ  Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１９Ｇ】Ａ〜Ｑは、鉄の取り込み及び輸送に関与する内因性タンパク質を示す。（Ｄ〜Ｋ）ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層における鉄関連タンパク質のタンパク質レベルのウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ定量化は、他のタンパク質が、細胞鉄状態の変化に対する転写及び翻訳フィードバック機構を介して応答することを示唆する。重要なことに、（Ｅ）フェリチンの減少及び（Ｉ）ＦＰＮ１レベルの増加が観察され、恐らくは、小分子媒介鉄輸送に有利な環境を生成する。Ｎ＝３〜１６。（Ａ〜Ｍ、Ｏ〜Ｑ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；’Ｋ’Ｋ’Ｋ’Ｋ  Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１９Ｈ】Ａ〜Ｑは、鉄の取り込み及び輸送に関与する内因性タンパク質を示す。（Ｄ〜Ｋ）ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層における鉄関連タンパク質のタンパク質レベルのウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ定量化は、他のタンパク質が、細胞鉄状態の変化に対する転写及び翻訳フィードバック機構を介して応答することを示唆する。重要なことに、（Ｅ）フェリチンの減少及び（Ｉ）ＦＰＮ１レベルの増加が観察され、恐らくは、小分子媒介鉄輸送に有利な環境を生成する。Ｎ＝３〜１６。（Ａ〜Ｍ、Ｏ〜Ｑ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；’Ｋ’Ｋ’Ｋ’Ｋ  Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１９Ｉ】Ａ〜Ｑは、鉄の取り込み及び輸送に関与する内因性タンパク質を示す。（Ｄ〜Ｋ）ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層における鉄関連タンパク質のタンパク質レベルのウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ定量化は、他のタンパク質が、細胞鉄状態の変化に対する転写及び翻訳フィードバック機構を介して応答することを示唆する。重要なことに、（Ｅ）フェリチンの減少及び（Ｉ）ＦＰＮ１レベルの増加が観察され、恐らくは、小分子媒介鉄輸送に有利な環境を生成する。Ｎ＝３〜１６。（Ａ〜Ｍ、Ｏ〜Ｑ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；’Ｋ’Ｋ’Ｋ’Ｋ  Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１９Ｊ】Ａ〜Ｑは、鉄の取り込み及び輸送に関与する内因性タンパク質を示す。（Ｄ〜Ｋ）ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層における鉄関連タンパク質のタンパク質レベルのウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ定量化は、他のタンパク質が、細胞鉄状態の変化に対する転写及び翻訳フィードバック機構を介して応答することを示唆する。重要なことに、（Ｅ）フェリチンの減少及び（Ｉ）ＦＰＮ１レベルの増加が観察され、恐らくは、小分子媒介鉄輸送に有利な環境を生成する。Ｎ＝３〜１６。（Ａ〜Ｍ、Ｏ〜Ｑ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；’Ｋ’Ｋ’Ｋ’Ｋ  Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１９Ｋ】Ａ〜Ｑは、鉄の取り込み及び輸送に関与する内因性タンパク質を示す。（Ｄ〜Ｋ）ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層における鉄関連タンパク質のタンパク質レベルのウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ定量化は、他のタンパク質が、細胞鉄状態の変化に対する転写及び翻訳フィードバック機構を介して応答することを示唆する。重要なことに、（Ｅ）フェリチンの減少及び（Ｉ）ＦＰＮ１レベルの増加が観察され、恐らくは、小分子媒介鉄輸送に有利な環境を生成する。Ｎ＝３〜１６。（Ａ〜Ｍ、Ｏ〜Ｑ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；’Ｋ’Ｋ’Ｋ’Ｋ  Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１９Ｌ】Ａ〜Ｑは、鉄の取り込み及び輸送に関与する内因性タンパク質を示す。（Ｌ）免疫沈降フェリチンへの５５Ｆｅの組み込みはまた、ｓｈ対照に比べて、ＤＭＴ１欠乏Ｃａｃｏ−２単層を減少させる。Ｎ＝１４。（Ａ〜Ｍ、Ｏ〜Ｑ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；’Ｋ’Ｋ’Ｋ’Ｋ  Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１９Ｍ】Ａ〜Ｑは、鉄の取り込み及び輸送に関与する内因性タンパク質を示す。（Ｍ）ｓｈＤＭＴ１単層へのヒノキチオール促進（５００ｎＭ）取り込みは、一方向である。５５ＦｅＣｌ３及びヒノキチオール（５００ｎＭ）の頂端側への添加は、細胞内部の鉄の有意レベルをもたらした一方、同じ濃度の５５ＦｅＣｌ３及びヒノキチオールの側底側への添加は、取り込みをもたらさなかった。Ｎ＝３。（Ａ〜Ｍ、Ｏ〜Ｑ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；’Ｋ’Ｋ’Ｋ’Ｋ  Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１９Ｎ】Ａ〜Ｑは、鉄の取り込み及び輸送に関与する内因性タンパク質を示す。（Ｎ及びＯ）１８時間のケルセチン（２５０μＭ）処理は、ウェスタンブロット分析によって、ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層におけるＦＰＮ１レベルを減少させた。Ｎ＝１６。
【図１９Ｏ】Ａ〜Ｑは、鉄の取り込み及び輸送に関与する内因性タンパク質を示す。（Ｎ及びＯ）１８時間のケルセチン（２５０μＭ）処理は、ウェスタンブロット分析によって、ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層におけるＦＰＮ１レベルを減少させた。Ｎ＝１６。（Ａ〜Ｍ、Ｏ〜Ｑ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；’Ｋ’Ｋ’Ｋ’Ｋ  Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１９Ｐ】Ａ〜Ｑは、鉄の取り込み及び輸送に関与する内因性タンパク質を示す。（Ｐ）Ｃａｃｏ−２単層におけるＦＰＮ１のケルセチン媒介ノックダウンは、ヒノキチオール（１μＭ）の存在下または不在下で、これらの細胞への鉄の取り込みに影響しなかった。Ｎ＝３。（Ａ〜Ｍ、Ｏ〜Ｑ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；’Ｋ’Ｋ’Ｋ’Ｋ  Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図１９Ｑ】Ａ〜Ｑは、鉄の取り込み及び輸送に関与する内因性タンパク質を示す。（Ｑ）Ｃａｃｏ−２単層における相対鉄輸送対取り込みの定量化は、ヒノキチオールが、これらの細胞における正常な鉄恒常性を回復させることを支援する。Ｎ＝３。（Ａ〜Ｍ、Ｏ〜Ｑ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；’Ｋ’Ｋ’Ｋ’Ｋ  Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２０Ａ】Ａ及びＢは、鉄関連タンパク質の翻訳及び転写調節簡略図を示す。（Ａ）十二指腸腸細胞における翻訳調節は、いくつかの鉄関連タンパク質のｍＲＮＡの５’または３’末端に位置する鉄応答エレメント（ＩＲＥ）を介して媒介される。鉄の不在下で、鉄応答タンパク質（ＩＲＰ１及びＩＲＰ２）は、５’−または３’−ＩＲＥに結合して、それぞれ、翻訳を遮断するかまたはｍＲＮＡを安定化させる。鉄結合の際に、ＩＲＰ１／２は、ＩＲＥ（及びＩＲＰ２は分解している）から解離し、翻訳が生じる（５’−ＩＲＥ）かまたはｍＲＮＡが分解して（３’−ＩＲＥ）、鉄の取り込み及び輸送に関与するタンパク質の鉄感受性を調節することができる。
【図２０Ｂ】Ａ及びＢは、鉄関連タンパク質の翻訳及び転写調節簡略図を示す。（Ｂ）Ｈｉｆ２αを介したＦＰＮ１の転写調節は、ＦＰＮ１の翻訳抑制を回避するために生じる。Ｈｉｆ２αは、鉄欠乏条件下でＦｐｎ１転写を活性化させる、しかしながら、鉄及びＯ２の存在下で、Ｈｉｆ２αは分解しているため、ＦＰＮ１タンパク質レベルを減少させる。
【図２１】ヒノキチオール及び鉄の増加に伴うＣａｃｏ−２輸送の速度を示す。広範囲のヒノキチオール濃度にわたって分化ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層を横断する鉄の経上皮輸送の速度は、鉄の増加に伴って増加する。鉄輸送の速度は、高濃度の鉄で横ばいになり、鉄の取り込み及び輸送の恒常性調節と合致して、正常な恒常性を維持し、鉄関連毒性を予防する。Ｎ＝３。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２２Ａ】Ａ〜Ｎは、鉄関連タンパク質レベルの翻訳及び転写調節が、Ｃａｃｏ−２上皮へのヒノキチオール媒介鉄の取り込みに応答することを示す。（Ａ及びＢ）ＦｅＣｌ３（２５μＭ）及び（細胞内鉄を増加させる）ヒノキチオールによるｓｈＤＭＴ１単層の４時間の処理の際に、（Ａ）フェリチン（５’−ＩＲＥ）レベルの増加（Ｎ＝６〜２１）及び（Ｂ）免疫沈降フェリチンへの５５Ｆｅの組み込みの増加が、最大５μＭのヒノキチオールで観察された。Ｎ＝１１〜１５。（Ａ〜Ｊ）これらの効果は、高用量のヒノキチオール（最大で５０μＭ）による処理の際に適度に逆転し、恐らくは、高用量ヒノキチオールによる不安定な鉄の競合キレート化によるものである。（Ａ〜Ｌ）ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層における実験は、前述のように、ｐＨ＝５．５の頂端緩衝液及びｐＨ＝７．４の側底緩衝液中に２５μＭの頂端ＦｅＣｌ３の存在下で、ヒノキチオールの４時間の頂端側添加（０、０．５、１、３、５、１０、２５、及び５０μＭ）を使用した。（Ａ〜Ｌ、Ｎ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２２Ｂ】Ａ〜Ｎは、鉄関連タンパク質レベルの翻訳及び転写調節が、Ｃａｃｏ−２上皮へのヒノキチオール媒介鉄の取り込みに応答することを示す。（Ａ及びＢ）ＦｅＣｌ３（２５μＭ）及び（細胞内鉄を増加させる）ヒノキチオールによるｓｈＤＭＴ１単層の４時間の処理の際に、（Ａ）フェリチン（５’−ＩＲＥ）レベルの増加（Ｎ＝６〜２１）及び（Ｂ）免疫沈降フェリチンへの５５Ｆｅの組み込みの増加が、最大５μＭのヒノキチオールで観察された。Ｎ＝１１〜１５。（Ａ〜Ｌ）ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層における実験は、前述のように、ｐＨ＝５．５の頂端緩衝液及びｐＨ＝７．４の側底緩衝液中に２５μＭの頂端ＦｅＣｌ３の存在下で、ヒノキチオールの４時間の頂端側添加（０、０．５、１、３、５、１０、２５、及び５０μＭ）を使用した。（Ｍ及びＮ）実験は、５００ｎＭ  Ｆｅを用いて、同一条件を利用した。（Ａ〜Ｊ）これらの効果は、高用量のヒノキチオール（最大で５０μＭ）による処理の際に適度に逆転し、恐らくは、高用量ヒノキチオールによる不安定な鉄の競合キレート化によるものである。（Ａ〜Ｌ、Ｎ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２２Ｃ】Ａ〜Ｎは、鉄関連タンパク質レベルの翻訳及び転写調節が、Ｃａｃｏ−２上皮へのヒノキチオール媒介鉄の取り込みに応答することを示す。（Ｃ）同様に、ＴｆＲ１（３’−ＩＲＥ）レベルは、最大５μＭのヒノキチオールで減少する。Ｎ＝８。（Ａ〜Ｌ）ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層における実験は、前述のように、ｐＨ＝５．５の頂端緩衝液及びｐＨ＝７．４の側底緩衝液中に２５μＭの頂端ＦｅＣｌ３の存在下で、ヒノキチオールの４時間の頂端側添加（０、０．５、１、３、５、１０、２５、及び５０μＭ）を使用した。（Ｍ及びＮ）実験は、５００ｎＭ  Ｆｅを用いて、同一条件を利用した。（Ａ〜Ｊ）これらの効果は、高用量のヒノキチオール（最大で５０μＭ）による処理の際に適度に逆転し、恐らくは、高用量ヒノキチオールによる不安定な鉄の競合キレート化によるものである。（Ａ〜Ｌ、Ｎ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２２Ｄ】Ａ〜Ｎは、鉄関連タンパク質レベルの翻訳及び転写調節が、Ｃａｃｏ−２上皮へのヒノキチオール媒介鉄の取り込みに応答することを示す。（Ｄ及びＥ）予想した通り、（Ｄ）ＩＲＰ１レベルは、変化しなかった（Ｎ＝１４）一方、（Ｅ）ＩＲＰ２タンパク質レベルの減少が観察され、不安定な鉄レベルのヒノキチオール媒介増加と合致して、フェリチン及びＴｆＲ１の翻訳調節をもたらす。Ｎ＝１２。（Ａ〜Ｌ）ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層における実験は、前述のように、ｐＨ＝５．５の頂端緩衝液及びｐＨ＝７．４の側底緩衝液中に２５μＭの頂端ＦｅＣｌ３の存在下で、ヒノキチオールの４時間の頂端側添加（０、０．５、１、３、５、１０、２５、及び５０μＭ）を使用した。（Ｍ及びＮ）実験は、５００ｎＭ  Ｆｅを用いて、同一条件を利用した。（Ａ〜Ｊ）これらの効果は、高用量のヒノキチオール（最大で５０μＭ）による処理の際に適度に逆転し、恐らくは、高用量ヒノキチオールによる不安定な鉄の競合キレート化によるものである。（Ａ〜Ｌ、Ｎ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２２Ｅ】Ａ〜Ｎは、鉄関連タンパク質レベルの翻訳及び転写調節が、Ｃａｃｏ−２上皮へのヒノキチオール媒介鉄の取り込みに応答することを示す。（Ｄ及びＥ）予想した通り、（Ｄ）ＩＲＰ１レベルは、変化しなかった（Ｎ＝１４）一方、（Ｅ）ＩＲＰ２タンパク質レベルの減少が観察され、不安定な鉄レベルのヒノキチオール媒介増加と合致して、フェリチン及びＴｆＲ１の翻訳調節をもたらす。Ｎ＝１２。（Ａ〜Ｌ）ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層における実験は、前述のように、ｐＨ＝５．５の頂端緩衝液及びｐＨ＝７．４の側底緩衝液中に２５μＭの頂端ＦｅＣｌ３の存在下で、ヒノキチオールの４時間の頂端側添加（０、０．５、１、３、５、１０、２５、及び５０μＭ）を使用した。（Ｍ及びＮ）実験は、５００ｎＭ  Ｆｅを用いて、同一条件を利用した。（Ａ〜Ｊ）これらの効果は、高用量のヒノキチオール（最大で５０μＭ）による処理の際に適度に逆転し、恐らくは、高用量ヒノキチオールによる不安定な鉄の競合キレート化によるものである。（Ａ〜Ｌ、Ｎ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２２Ｆ】Ａ〜Ｎは、鉄関連タンパク質レベルの翻訳及び転写調節が、Ｃａｃｏ−２上皮へのヒノキチオール媒介鉄の取り込みに応答することを示す。（Ｆ及びＧ）ＦＰＮ１のＨｉｆ２α媒介転写調節と合致して、（Ｆ）ＦＰＮ１タンパク質の減少（Ｎ＝１６）及び（Ｇ）Ｆｐｎ１  ｍＲＮＡレベルの減少は、最大５μＭのヒノキチオールで処理した際に観察された。Ｎ＝９〜１２。（Ａ〜Ｌ）ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層における実験は、前述のように、ｐＨ＝５．５の頂端緩衝液及びｐＨ＝７．４の側底緩衝液中に２５μＭの頂端ＦｅＣｌ３の存在下で、ヒノキチオールの４時間の頂端側添加（０、０．５、１、３、５、１０、２５、及び５０μＭ）を使用した。（Ｍ及びＮ）実験は、５００ｎＭ  Ｆｅを用いて、同一条件を利用した。（Ａ〜Ｊ）これらの効果は、高用量のヒノキチオール（最大で５０μＭ）による処理の際に適度に逆転し、恐らくは、高用量ヒノキチオールによる不安定な鉄の競合キレート化によるものである。（Ａ〜Ｌ、Ｎ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２２Ｇ】Ａ〜Ｎは、鉄関連タンパク質レベルの翻訳及び転写調節が、Ｃａｃｏ−２上皮へのヒノキチオール媒介鉄の取り込みに応答することを示す。（Ｆ及びＧ）ＦＰＮ１のＨｉｆ２α媒介転写調節と合致して、（Ｆ）ＦＰＮ１タンパク質の減少（Ｎ＝１６）及び（Ｇ）Ｆｐｎ１  ｍＲＮＡレベルの減少は、最大５μＭのヒノキチオールで処理した際に観察された。Ｎ＝９〜１２。（Ａ〜Ｌ）ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層における実験は、前述のように、ｐＨ＝５．５の頂端緩衝液及びｐＨ＝７．４の側底緩衝液中に２５μＭの頂端ＦｅＣｌ３の存在下で、ヒノキチオールの４時間の頂端側添加（０、０．５、１、３、５、１０、２５、及び５０μＭ）を使用した。（Ａ〜Ｊ）これらの効果は、高用量のヒノキチオール（最大で５０μＭ）による処理の際に適度に逆転し、恐らくは、高用量ヒノキチオールによる不安定な鉄の競合キレート化によるものである。（Ａ〜Ｌ、Ｎ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２２Ｈ】Ａ〜Ｎは、鉄関連タンパク質レベルの翻訳及び転写調節が、Ｃａｃｏ−２上皮へのヒノキチオール媒介鉄の取り込みに応答することを示す。（Ｈ及びＩ）Ｈｉｆ１α及びＨｉｆ２αレベルは、最大５μＭのヒノキチオールによる不安定な鉄の増加に応答する。Ｎ＝４〜１３。（Ａ〜Ｌ）ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層における実験は、前述のように、ｐＨ＝５．５の頂端緩衝液及びｐＨ＝７．４の側底緩衝液中に２５μＭの頂端ＦｅＣｌ３の存在下で、ヒノキチオールの４時間の頂端側添加（０、０．５、１、３、５、１０、２５、及び５０μＭ）を使用した。（Ａ〜Ｊ）これらの効果は、高用量のヒノキチオール（最大で５０μＭ）による処理の際に適度に逆転し、恐らくは、高用量ヒノキチオールによる不安定な鉄の競合キレート化によるものである。（Ａ〜Ｌ、Ｎ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２２Ｉ】Ａ〜Ｎは、鉄関連タンパク質レベルの翻訳及び転写調節が、Ｃａｃｏ−２上皮へのヒノキチオール媒介鉄の取り込みに応答することを示す。（Ｈ及びＩ）Ｈｉｆ１α及びＨｉｆ２αレベルは、最大５μＭのヒノキチオールによる不安定な鉄の増加に応答する。Ｎ＝４〜１３。（Ａ〜Ｌ）ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層における実験は、前述のように、ｐＨ＝５．５の頂端緩衝液及びｐＨ＝７．４の側底緩衝液中に２５μＭの頂端ＦｅＣｌ３の存在下で、ヒノキチオールの４時間の頂端側添加（０、０．５、１、３、５、１０、２５、及び５０μＭ）を使用した。（Ａ〜Ｊ）これらの効果は、高用量のヒノキチオール（最大で５０μＭ）による処理の際に適度に逆転し、恐らくは、高用量ヒノキチオールによる不安定な鉄の競合キレート化によるものである。（Ａ〜Ｌ、Ｎ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２２Ｊ】Ａ〜Ｎは、鉄関連タンパク質レベルの翻訳及び転写調節が、Ｃａｃｏ−２上皮へのヒノキチオール媒介鉄の取り込みに応答することを示す。（Ｊ）恐らくは、ｓｈＲＮＡ標的化ＤＭＴ１により、ＤＭＴ１の翻訳調節は、最大５μＭのヒノキチオールで観察されなかった。Ｎ＝６。（Ａ〜Ｊ）これらの効果は、高用量のヒノキチオール（最大で５０μＭ）による処理の際に適度に逆転し、恐らくは、高用量ヒノキチオールによる不安定な鉄の競合キレート化によるものである。（Ａ〜Ｌ）ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層における実験は、前述のように、ｐＨ＝５．５の頂端緩衝液及びｐＨ＝７．４の側底緩衝液中に２５μＭの頂端ＦｅＣｌ３の存在下で、ヒノキチオールの４時間の頂端側添加（０、０．５、１、３、５、１０、２５、及び５０μＭ）を使用した。（Ｍ及びＮ）実験は、５００ｎＭ  Ｆｅを用いて、同一条件を利用した。（Ａ〜Ｌ、Ｎ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２２Ｋ】Ａ〜Ｎは、鉄関連タンパク質レベルの翻訳及び転写調節が、Ｃａｃｏ−２上皮へのヒノキチオール媒介鉄の取り込みに応答することを示す。（Ｋ）鉄シャペロンＰＣＢＰ１のＩＲＥ独立タンパク質レベル（Ｎ＝６）及び（Ｌ）Ｈｉｆ２α独立Ｆｔｈ１  ｍＲＮＡレベルは、同一条件下で、ヒノキチオールで処理した際に変化しなかった。Ｎ＝１６。（Ａ〜Ｌ）ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層における実験は、前述のように、ｐＨ＝５．５の頂端緩衝液及びｐＨ＝７．４の側底緩衝液中に２５μＭの頂端ＦｅＣｌ３の存在下で、ヒノキチオールの４時間の頂端側添加（０、０．５、１、３、５、１０、２５、及び５０μＭ）を使用した。（Ａ〜Ｌ、Ｎ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２２Ｌ】Ａ〜Ｎは、鉄関連タンパク質レベルの翻訳及び転写調節が、Ｃａｃｏ−２上皮へのヒノキチオール媒介鉄の取り込みに応答することを示す。（Ｋ）鉄シャペロンＰＣＢＰ１のＩＲＥ独立タンパク質レベル（Ｎ＝６）及び（Ｌ）Ｈｉｆ２α独立Ｆｔｈ１  ｍＲＮＡレベルは、同一条件下で、ヒノキチオールで処理した際に変化しなかった。Ｎ＝１６。（Ａ〜Ｌ）ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層における実験は、前述のように、ｐＨ＝５．５の頂端緩衝液及びｐＨ＝７．４の側底緩衝液中に２５μＭの頂端ＦｅＣｌ３の存在下で、ヒノキチオールの４時間の頂端側添加（０、０．５、１、３、５、１０、２５、及び５０μＭ）を使用した。（Ａ〜Ｌ、Ｎ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２２Ｍ】Ａ〜Ｎは、鉄関連タンパク質レベルの翻訳及び転写調節が、Ｃａｃｏ−２上皮へのヒノキチオール媒介鉄の取り込みに応答することを示す。（Ｍ及びＮ）ヒノキチオールで処理したＦＰＮ１レベルの変化は、添加鉄の不在下で観察されず、観察された変化が、動的な細胞鉄状態に対する翻訳及び転写応答によるという結論を支援する。Ｎ＝６〜８。（Ｍ及びＮ）実験は、５００ｎＭ  Ｆｅを用いて、同一条件を利用した。
【図２２Ｎ】Ａ〜Ｎは、鉄関連タンパク質レベルの翻訳及び転写調節が、Ｃａｃｏ−２上皮へのヒノキチオール媒介鉄の取り込みに応答することを示す。（Ｍ及びＮ）ヒノキチオールで処理したＦＰＮ１レベルの変化は、添加鉄の不在下で観察されず、観察された変化が、動的な細胞鉄状態に対する翻訳及び転写応答によるという結論を支援する。Ｎ＝６〜８。（Ｍ及びＮ）実験は、５００ｎＭ  Ｆｅを用いて、同一条件を利用した。（Ａ〜Ｌ、Ｎ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２３Ａ】Ａ〜Ｆは、ヒノキチオールが、正常系に軽微な効果を有することを示す。（Ａ）ＤＭＳＯまたはヒノキチオール（５００ｎＭ）で処理したｓｈ対照Ｃａｃｏ−２単層における経上皮鉄輸送。Ｎ＝３。（Ａ〜Ｆ）ＮＳ、有意ではない；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２３Ｂ】Ａ〜Ｆは、ヒノキチオールが、正常系に軽微な効果を有することを示す。（Ｂ）ヒノキチオール（１μＭ）の存在下または不在下で、ＤＭＳＯ誘導後のｏ−ジアニシジンで陽性染色された、相対的なｓｈ対照ＭＥＬ細胞集団。Ｎ＝１２〜４８。（Ａ〜Ｆ）ＮＳ、有意ではない；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２３Ｃ】Ａ〜Ｆは、ヒノキチオールが、正常系に軽微な効果を有することを示す。（Ｃ）ヒノキチオール（５μＭ）の存在下または不在下で、野生型Ｊ７７４マクロファージからの鉄放出。Ｎ＝６〜１８。（Ａ〜Ｆ）ＮＳ、有意ではない；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２３Ｄ】Ａ〜Ｆは、ヒノキチオールが、正常系に軽微な効果を有することを示す。（Ｄ）ＤＭＴ１欠乏及びｓｈ対照単層にヒノキチオールを添加する際の、ＤＭＳＯ対照に対するＣａｃｏ−２輸送の変化。Ｎ＝３。（Ａ〜Ｆ）ＮＳ、有意ではない；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２３Ｅ】Ａ〜Ｆは、ヒノキチオールが、正常系に軽微な効果を有することを示す。（Ｅ）分化のために誘導されたＭｆｒｎ１欠乏及びｓｈ対照ＭＥＬ細胞にヒノキチオールを添加する際の、ＤＭＳＯ対照に対するｏ−ジアニシジン染色の変化。Ｎ＝６〜４８。（Ａ〜Ｆ）ＮＳ、有意ではない；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２３Ｆ】Ａ〜Ｆは、ヒノキチオールが、正常系に軽微な効果を有することを示す。（Ｆ）ＦＰＮ１欠乏及び野生型Ｊ７７４細胞にヒノキチオールを添加する際の、ＤＭＳＯ対照に対する鉄放出の変化。Ｎ＝６〜２０。（Ａ〜Ｆ）ＮＳ、有意ではない；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２４Ａ】Ａ〜Ｅは、鉄輸送タンパク質が欠如している動物における試験を示す。（Ａ）ビヒクル、ヒノキチオール（１．５ｍｇ／ｋｇ）、またはＣ２ｄｅＯＨｉｎｏ（１．５ｍｇ／ｋｇ）で処理したベオグラード（ｂ／ｂ）及び健康（＋／＋または＋／ｂ）ラットにおける時間依存性の腸鉄吸収。Ｎ＝４〜７。（Ａ〜Ｃ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２４Ｂ】Ａ〜Ｅは、鉄輸送タンパク質が欠如している動物における試験を示す。（Ｂ）ヒノキチオール処理（１．５ｍｇ／ｋｇ）されたＦＰＮ１欠乏フラットアイアン（ｆｌａｔｉｒｏｎ）マウスにおける腸吸収の速度の増加は、ビヒクル処理マウスに比べて、２時間後に観察された。Ｎ＝４。（Ａ〜Ｃ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２４Ｃ】Ａ〜Ｅは、鉄輸送タンパク質が欠如している動物における試験を示す。（Ｃ）ヒノキチオール（１．５ｍｇ／ｋｇ）の存在下または不在下で、野生型（＋／＋）マウスにおける５９Ｆｅの時間依存性の腸吸収。Ｎ＝６〜８。（Ａ〜Ｃ）ＮＳ、有意ではない；＊Ｐ＜０．０５；グラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２４Ｄ】Ａ〜Ｅは、鉄輸送タンパク質が欠如している動物における試験を示す。（Ｄ）ローティングコントロールとしてβアクチンによる半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定されるように、Ｔｇ（グロビンＬＣＲ：ｅＧＦＰ）フィッシュにおける定常状態Ｄｍｔ１  ｍＲＮＡのモルホリノ媒介ノックダウン。
【図２４Ｅ】Ａ〜Ｅは、鉄輸送タンパク質が欠如している動物における試験を示す。（Ｅ）ヒノキチオール（１μＭ）及びＣ２ｄｅＯＨｉｎｏ（１μＭ）は、小分子処理の４８時間後に、＋／ｓａｕフィッシュ７２  ｈｐｆのヘテロ接合性交差からのＡｌａｓ２欠乏ソーテルヌ（ｓａｕｔｅｒｎｅｓ）ゼブラフィッシュにおけるヘモグロビン化を促進しない。（Ｅ）グラフは、重量平均±ＳＥＭを示す。
【図２５Ａ】Ａ〜Ｄは、タンパク質鉄トランスポーター機能の欠如を置き換える活性について、トロポロン環上の炭化水素置換基の適最サイズのウィンドウを特定する構造−活性関係試験の結果を示す。（Ａ）ヒノキチオールは、低濃度で鉄トランスポーター欠乏酵母（Ｆｅｔ３Ｆｔｒ１）の増殖を救出し、高濃度でのみ野生型酵母（ＷＴ）を殺傷する。
【図２５Ｂ】Ａ〜Ｄは、タンパク質鉄トランスポーター機能の欠如を置き換える活性について、トロポロン環上の炭化水素置換基の適最サイズのウィンドウを特定する構造−活性関係試験の結果を示す。（Ｂ）トロポロンは、高濃度でのみＦｅｔ３Ｆｔｒ１酵母の救出を示し、野生型酵母または救出Ｆｅｔ３Ｆｔｒ１酵母のいずれかへの毒性を示さない。
【図２５Ｃ】Ａ〜Ｄは、タンパク質鉄トランスポーター機能の欠如を置き換える活性について、トロポロン環上の炭化水素置換基の適最サイズのウィンドウを特定する構造−活性関係試験の結果を示す。（Ｃ）鉄に結合しないまたは鉄を輸送しないＣ２ｄｅＯＨｉｎｏは、いずれかの酵母株における生物活性を有さない。
【図２５Ｄ】Ａ〜Ｄは、タンパク質鉄トランスポーター機能の欠如を置き換える活性について、トロポロン環上の炭化水素置換基の適最サイズのウィンドウを特定する構造−活性関係試験の結果を示す。（Ｄ）伸長アルキル鎖（５個の炭素、ヒノ側鎖に挿入された２つのメチレン）を有する合成誘導体である４−イソペンチルトロポロンは、Ｆｅｔ３Ｆｔｒ１酵母の救出を示さず、野生型酵母に最も有毒である。
【図２６Ａ】Ａ〜Ｅは、フラットアイアンマウスにおけるヒノキチオールの急性注入の結果を示す。野生型（＋／＋）及びＩ（ｆｆｅ／＋）マウスに、ＩＰ注射によってヒノキチオールを投与し、４時間後に犠牲にし、鉄含有量を測定した。（Ａ）平均±ＳＥＭ（ｎ＝４８／群）を提示する。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２６Ｂ】Ａ〜Ｅは、フラットアイアンマウスにおけるヒノキチオールの急性注入の結果を示す。野生型（＋／＋）及びＩ（ｆｆｅ／＋）マウスに、ＩＰ注射によってヒノキチオールを投与し、４時間後に犠牲にし、鉄含有量を測定した。（Ｂ）〜（Ｅ）平均±ＳＥＭ（ｎ＝２／群）を提示する。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２６Ｃ】Ａ〜Ｅは、フラットアイアンマウスにおけるヒノキチオールの急性注入の結果を示す。野生型（＋／＋）及びＩ（ｆｆｅ／＋）マウスに、ＩＰ注射によってヒノキチオールを投与し、４時間後に犠牲にし、鉄含有量を測定した。（Ｂ）〜（Ｅ）平均±ＳＥＭ（ｎ＝２／群）を提示する。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２６Ｄ】Ａ〜Ｅは、フラットアイアンマウスにおけるヒノキチオールの急性注入の結果を示す。野生型（＋／＋）及びＩ（ｆｆｅ／＋）マウスに、ＩＰ注射によってヒノキチオールを投与し、４時間後に犠牲にし、鉄含有量を測定した。（Ｂ）〜（Ｅ）平均±ＳＥＭ（ｎ＝２／群）を提示する。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２６Ｅ】Ａ〜Ｅは、フラットアイアンマウスにおけるヒノキチオールの急性注入の結果を示す。野生型（＋／＋）及びＩ（ｆｆｅ／＋）マウスに、ＩＰ注射によってヒノキチオールを投与し、４時間後に犠牲にし、鉄含有量を測定した。（Ｂ）〜（Ｅ）平均±ＳＥＭ（ｎ＝２／群）を提示する。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２７Ａ】Ａ〜Ｅは、急性貧血の炎症（ＡＩ）のモデルにおけるヒノキチオールの有効性を示す。マウス（雄；Ｃ５７ＢＬ／６；７週齢；ｎ＝８〜１０）にテレピン油（ＴＯ）（５ｍＬ／ｋｇ）または生理食塩水を投与し、注射の３、６、１２、１６、２４時間後に安楽死させた。（Ａ）ｑＰＣＲによって測定されたヘプシジンｍＲＮＡ。（Ｂ）ウェスタンブロット分析によって定量化されたタンパク質。（Ｃ）バソフェナントロリン比色分析によって測定された組織及び血清非ヘム鉄。（Ｄ）ヘパリン化されたキャピラリーの遠心分離によって測定されたヘマトクリット。（Ｅ）化合物を与えられたマウスは、３日間、１日１回表示した。３日目に、マウスに生理食塩水またはＴＯを注射し、注射の１６時間後に安楽死させた。
【図２７Ｂ】Ａ〜Ｅは、急性貧血の炎症（ＡＩ）のモデルにおけるヒノキチオールの有効性を示す。マウス（雄；Ｃ５７ＢＬ／６；７週齢；ｎ＝８〜１０）にテレピン油（ＴＯ）（５ｍＬ／ｋｇ）または生理食塩水を投与し、注射の３、６、１２、１６、２４時間後に安楽死させた。（Ａ）ｑＰＣＲによって測定されたヘプシジンｍＲＮＡ。（Ｂ）ウェスタンブロット分析によって定量化されたタンパク質。（Ｃ）バソフェナントロリン比色分析によって測定された組織及び血清非ヘム鉄。（Ｄ）ヘパリン化されたキャピラリーの遠心分離によって測定されたヘマトクリット。（Ｅ）化合物を与えられたマウスは、３日間、１日１回表示した。３日目に、マウスに生理食塩水またはＴＯを注射し、注射の１６時間後に安楽死させた。
【図２７Ｃ】Ａ〜Ｅは、急性貧血の炎症（ＡＩ）のモデルにおけるヒノキチオールの有効性を示す。マウス（雄；Ｃ５７ＢＬ／６；７週齢；ｎ＝８〜１０）にテレピン油（ＴＯ）（５ｍＬ／ｋｇ）または生理食塩水を投与し、注射の３、６、１２、１６、２４時間後に安楽死させた。（Ａ）ｑＰＣＲによって測定されたヘプシジンｍＲＮＡ。（Ｂ）ウェスタンブロット分析によって定量化されたタンパク質。（Ｃ）バソフェナントロリン比色分析によって測定された組織及び血清非ヘム鉄。（Ｄ）ヘパリン化されたキャピラリーの遠心分離によって測定されたヘマトクリット。（Ｅ）化合物を与えられたマウスは、３日間、１日１回表示した。３日目に、マウスに生理食塩水またはＴＯを注射し、注射の１６時間後に安楽死させた。
【図２７Ｄ】Ａ〜Ｅは、急性貧血の炎症（ＡＩ）のモデルにおけるヒノキチオールの有効性を示す。マウス（雄；Ｃ５７ＢＬ／６；７週齢；ｎ＝８〜１０）にテレピン油（ＴＯ）（５ｍＬ／ｋｇ）または生理食塩水を投与し、注射の３、６、１２、１６、２４時間後に安楽死させた。（Ａ）ｑＰＣＲによって測定されたヘプシジンｍＲＮＡ。（Ｂ）ウェスタンブロット分析によって定量化されたタンパク質。（Ｃ）バソフェナントロリン比色分析によって測定された組織及び血清非ヘム鉄。（Ｄ）ヘパリン化されたキャピラリーの遠心分離によって測定されたヘマトクリット。（Ｅ）化合物を与えられたマウスは、３日間、１日１回表示した。３日目に、マウスに生理食塩水またはＴＯを注射し、注射の１６時間後に安楽死させた。
【図２７Ｅ】Ａ〜Ｅは、急性貧血の炎症（ＡＩ）のモデルにおけるヒノキチオールの有効性を示す。マウス（雄；Ｃ５７ＢＬ／６；７週齢；ｎ＝８〜１０）にテレピン油（ＴＯ）（５ｍＬ／ｋｇ）または生理食塩水を投与し、注射の３、６、１２、１６、２４時間後に安楽死させた。（Ａ）ｑＰＣＲによって測定されたヘプシジンｍＲＮＡ。（Ｂ）ウェスタンブロット分析によって定量化されたタンパク質。（Ｃ）バソフェナントロリン比色分析によって測定された組織及び血清非ヘム鉄。（Ｄ）ヘパリン化されたキャピラリーの遠心分離によって測定されたヘマトクリット。（Ｅ）化合物を与えられたマウスは、３日間、１日１回表示した。３日目に、マウスに生理食塩水またはＴＯを注射し、注射の１６時間後に安楽死させた。
【図２８Ａ】Ａ〜Ｅは、慢性貧血の炎症（ＡＩ）の動物モデルの発達を示す。（Ａ）マウス（Ｃ５７ＢＬ／６；８週齢；ｎ＝３〜６）に、生理食塩水またはテレピン油（ＴＯ）を毎週、最大３回注射して注入し、最後の注射の１、４、７、１４、及び２１日後に安楽死させた。
【図２８Ｂ】Ａ〜Ｅは、慢性貧血の炎症（ＡＩ）の動物モデルの発達を示す。（Ｂ）ヘプシジンｍＲＮＡは、ｑＰＣＲによって測定され、血清非ヘム鉄は、バソフェナントロリンを用いた比色分析によって測定された。
【図２８Ｃ】Ａ〜Ｅは、慢性貧血の炎症（ＡＩ）の動物モデルの発達を示す。（Ｃ）タンパク質レベルは、ウェスタンブロット分析によって測定された。（Ｄ）組織非ヘム鉄レベルは、バソフェナントロリンを用いて測定した。（Ｅ）ヘモグロビンレベルは、キャピラリーチューブの遠心分離を介して、ドラブキン試薬及びヘマトクリットを用いた比色分析によって測定された。
【図２８Ｄ】Ａ〜Ｅは、慢性貧血の炎症（ＡＩ）の動物モデルの発達を示す。（Ｄ）組織非ヘム鉄レベルは、バソフェナントロリンを用いて測定した。（Ｅ）ヘモグロビンレベルは、キャピラリーチューブの遠心分離を介して、ドラブキン試薬及びヘマトクリットを用いた比色分析によって測定された。
【図２８Ｅ】Ａ〜Ｅは、慢性貧血の炎症（ＡＩ）の動物モデルの発達を示す。（Ｅ）ヘモグロビンレベルは、キャピラリーチューブの遠心分離を介して、ドラブキン試薬及びヘマトクリットを用いた比色分析によって測定された。
【図２９Ａ】Ａ〜Ｂは、マウスにおけるヒノキチオールの単回用量のインビボ薬物動態を示す。Ｃ５７ＢＬ／６及び１２９／Ｓｖバックグラウンドが混成したマウス（２〜３ヵ月齢）に、様々な濃度のヒノキチオール（３０または１００ｍｇ  Ｈｉｎｏ／ｋｇ体重）を、２つの異なる経路（Ａ）腹腔内注射及び（Ｂ）強制経口投与で投与した。血漿試料を様々な時点（５〜３６０分間）で回収し、ＨＰＬＣによる薬物測定をした。
【図２９Ｂ】Ａ〜Ｂは、マウスにおけるヒノキチオールの単回用量のインビボ薬物動態を示す。Ｃ５７ＢＬ／６及び１２９／Ｓｖバックグラウンドが混成したマウス（２〜３ヵ月齢）に、様々な濃度のヒノキチオール（３０または１００ｍｇ  Ｈｉｎｏ／ｋｇ体重）を、２つの異なる経路（Ａ）腹腔内注射及び（Ｂ）強制経口投与で投与した。血漿試料を様々な時点（５〜３６０分間）で回収し、ＨＰＬＣによる薬物測定をした。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
異なる部位及び方向で膜貫通型鉄フラックスを減少させる、鉄輸送タンパク質機能の遺伝性または後天性欠乏から多数のヒト疾患を引き起こす。他の鉄輸送タンパク質は活性のままである一方、不安定な鉄勾配は、対応するタンパク質欠乏膜を横断して蓄積する。ある特定の化学化合物は、そのような勾配を抑えて、細胞への、細胞内及び／または細胞外への鉄輸送を回復させることができる（例えば、実施例１を参照）ため、貧血、嚢胞性線維症、及び不整脈、並びに神経、骨格筋、内分泌、及び腎障害などの、受動イオン輸送タンパク質の欠乏に関連する状態の治療に有用であり得る。
【００３９】
同化合物は、ＤＭＴ１欠乏ラット及びフェロポーチン欠乏マウスにおける腸鉄吸収、並びにＤＭＴ１−及びマイトフェリン欠乏ゼブラフィッシュにおけるヘモグロビン化を促進する。これらの所見は、鉄輸送の小分子媒介部位及び方向選択的回復における一般的な機構の枠組みを示す。これらの所見はまた、鉄のタンパク質トランスポーター、あるいは、他のイオンを欠かせる機能を部分的に模倣する小分子が、ヒト疾患を治療する可能性を有し得ることを示唆する。したがって、本明細書で提供されるのは、化合物（すなわち、ヒノキチオールの類似体）、その調製方法、及び鉄関連疾患の治療に使用されるその医薬化合物である。
【００４０】
定義
本明細書で使用される場合、用語「生理学的条件」は、温度、ｐＨ、イオン強度、粘度、及び、生きている生物に適合する、及び／または、典型的には生きている哺乳動物の細胞における細胞内に存在する、同様の生化学的パラメーターを指す。
【００４１】
用語「プロドラッグ」は、本明細書で使用される場合、生理学的条件下で治療的に活性な薬剤に変換される化合物を網羅する。プロドラッグを製造する一般的な方法は、生理学的条件下で加水分解されて所望の分子を露呈する、選択部分を含めることである。他の実施形態では、プロドラッグは宿主動物の酵素活性によって転換される。
【００４２】
語句「薬学的に許容される賦形剤」または「薬学的に許容される担体」は、本明細書で使用される場合、対象化学を、身体の１つの器官または部位から、身体の別の器官または部位に運搬もしくは輸送することに関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料などの薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の原料に適合性であり、患者にとって有害ではなく、実質的に非発熱性であるという意味で「許容」されなければならない。薬学的に許容される担体としての役割をし得る材料のいくつかの例としては、（１）乳糖、ブドウ糖及びショ糖などの糖類；（２）トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）カカオバター及び坐剤蝋（坐剤ワックス）などの賦形剤；（９）ピーナツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油などの油；（１０）プロピルレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱性物質除去水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝液；及び（２１）医薬製剤に用いられる他の毒性のない適合物質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、非発熱性であり、すなわち、患者に投与した場合に著しい温度上昇を誘導しない。
【００４３】
用語「薬学的に許容される塩」は、本発明の化合物の、比較的毒性のない無機及び有機の酸付加塩を指す。これらの塩は、化合物（複数可）の最終単離及び精製中にその場で、あるいは適切な有機または無機の酸とともに遊離酸の形で精製した化合物（複数可）を、別々に反応すること、及びこのようにして形成された塩を単離することで調製可能である。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、及びラウリル硫酸塩などが挙げられる。例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ”，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照されたい。
【００４４】
他の場合には、本発明の方法で有用な化合物は、１つ以上の酸性官能基を含有することができ、従って、薬学的に許容される塩基と薬学的に許容される塩を形成することができる。これらの例における用語「薬学的に許容される塩」は、本発明の化合物の比較的非毒性の無機及び有機の塩基付加塩を意味する。これらの塩は、同様に、化合物（複数可）の最終単離及び精製中にその場で、あるいは薬学的に許容される金属カチオンの水酸化物、炭酸塩または重炭酸塩のような適切な塩基とともに遊離酸の形で精製した化合物（複数可）を、アンモニアと、または薬学的に許容される有機第一級、第二級または第三級アミンと別々に反応することにより、調製可能である。代表的なアルカリまたはアルカリ土類塩は、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、及びアルミニウム塩などが挙げられる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンとしては、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが挙げられる。（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，前出を参照されたい）。
【００４５】
治療における使用に対する化合物の「治療有効量」とは、例えば、医学的治療に適用できる合理的なベネフィット／リスク比での、治療される障害または状態、または美容目的のための臨床的に許容できる基準に従って、兆候を緩和し、症状を改善し、または疾患状態の発現を遅延させる目的とする（哺乳動物、好ましくはヒトへの）所望の投薬計画の一部として投与される場合の、製剤中の化合物の量を指す。
【００４６】
用語「予防的または治療的」は、当該技術分野で認識されており、被組成物の１つ以上の宿主への投与を含む。望ましくない状態（例えば、宿主動物の疾患または他の望ましくない状態）の臨床症状の前に投与される場合、治療は予防的である（すなわち、宿主が望ましくない状態を発症するのを防ぐ）一方、望ましくない状態が現れた後に投与される場合、治療は治療的である（すなわち、それは既存の望ましくない状態またはその副作用を減少させる、改善する、または安定させることを意図する）。
【００４７】
本発明で使用されるファルマコフォアは、対応する薬物が有効である通常の目的に有効であり、ある特定の実施形態では、薬物を特に有益である所望の細胞に輸送する、アジド糖標的指向化部分に固有の、能力のために優れた有効性を有する。
【００４８】
本実施形態に使用するのに好ましい治療剤は、がん治療に使用されるような細胞傷害性薬物である。そのような薬物には、一般に、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリンなどの抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、及びコルチコステロイドが含まれる。
【００４９】
当業者は、本発明のコンジュゲートを調製する目的で、その化合物の反応をより簡便にするために、所望の化合物を化学修飾することができる。
【００５０】
本発明のある特定の化合物は、特定の幾何学的形状または立体異性体で存在し得る。本発明は、本発明の範囲内に含まれる、シス型及びトランス型異性体、Ｒ−及びＳ−エナンチオマー、ジアステレオマー、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−異性体、それらのラセミ混合物、及びそれらの他の混合物を含めた全ての化合物を意図している。さらなる非対称性性の炭素原子がアルキル基などの置換基に存在していてもよい。このような異性体、ならびにそれらの混合物は全て、本発明に含まれることが意図されている。
【００５１】
例えば、本発明の化合物の特定のエナンチオマーを所望する場合、それは不斉合成により、またはキラル補助基を用いる誘導体化により調製することができ、この場合、得られたジアステレオマーの混合物は分離され、補助基を切断して純粋な所望のエナンチオマーが提供される。あるいは、分子がアミノなどの塩基性官能基またはカルボキシルなどの酸性官能基を含有している場合、ジアステレオマー塩は適切な光学活性な酸または塩基を用いて形成され、続いて、こうして形成されたジアステレオマーは、当該技術分野で公知の分別結晶化法またはクロマトグラフ法によって分割され、その後、純粋なエナンチオマーが回収される。
【００５２】
肪族鎖は、以下に定義されるアルキル、アルケニル及びアルキニルの種類を含む。脂脂肪族直鎖は、非分岐の炭素鎖部分に限られる。本明細書で使用される場合、用語「脂肪族基」は、直鎖、分岐鎖、または環状脂肪族炭化水素基を指し、アルキル基、アルケニル基、またはアルキニル基などの飽和及び不飽和の脂肪族基が含まれる。
【００５３】
「アルキル」とは、規定された炭素原子数、または規定されていない場合には最大３０までの炭素原子を有する、完全に飽和した、環式または非環式の、分岐または非分岐の炭素鎖部分を指す。例えば、１〜８炭素原子のアルキルとは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、及びオクチルなどの部分、及びそれらの部分の位置異性体である部分を指す。１０〜３０の炭素原子のアルキルとして、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、ヘンエイコシル、ドコシル、トリコシル及びテトラコシルが挙げられる。ある特定の実施形態では、直鎖または分岐鎖アルキルは、その骨格に３０以下の炭素原子（例えば、直鎖ではＣ１−Ｃ３０、分岐鎖ではＣ３−Ｃ３０）、さらに好ましくは２０以下の炭素原子を有する。
【００５４】
炭素数が別に規定されない限り、「低級アルキル」は、本明細書で使用される場合、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、及びｔｅｒｔ−ブチルなど、その骨格構造に、１〜１０の炭素、さらに好ましくは１〜６の炭素原子を有する先に定義したアルキル基を意味する。同様に、「低級アルケニル」及び「低級アルキニル」は、同様の鎖長を有する。本願を通じて、好ましいアルキル基は低級アルキルである。ある特定の実施形態では、本明細書でアルキルとして指定される置換基は、低級アルキルである。
【００５５】
「シクロアルキル」とは、各々が３〜１２の炭素原子を有する、単環式または二環式、または架橋した飽和または非飽和炭素環式環（すなわち、非芳香族構成において１つ以上の二重結合を含む）を意味する。同様に、好ましいシクロアルキルは、それらの環構造に５〜１２の炭素原子を有し、さらに好ましくは環構造に６〜１０の炭素を有する。
【００５６】
「アルケニル」とは、規定された炭素原子数、または炭素原子数の限定が特に規定されていない場合には最大２６までの炭素原子数を有し；その部分に１つ以上の二重結合を有する、環式のまたは非環式の、分岐したまたは非分岐の不飽和の炭素鎖部分を指す。６〜２６の炭素原子のアルケニルは、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、ノナデセニル、エイコセニル、ヘニコセニル（ｈｅｎｅｉｃｏｓｏｅｎｙｌ）、ドコセニル、トリコセニル、及びテトラコセニルのさまざまな異性体に例示され、ここで、不飽和結合（複数可）はその部分のどこかに位置すればよく、二重結合（複数可）について（Ｚ）または（Ｅ）配置のいずれかを有し得る。
【００５７】
「アルキニル」とは、部分において１つ以上の三重結合を有する、アルケニルの範囲のヒドロカルビル部分を指す。
【００５８】
用語「アルコキシル」または「アルコキシ」は、本明細書で使用される場合、結合した酸素部分を有する、以下に定義されるアルキル基を指す。代表的なアルコキシル基には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなどが含まれる。「エーテル」は、酸素によって共有結合的に連結した２つの炭化水素である。したがって、アルキルをエーテルにするアルキルの置換基は、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、−Ｏ−アルキニル、−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ１のうちの１つで表すことができるようなアルコキシルであるかアルコキシルに類似しているものであり、ここで、Ｒ１は、アルケニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル、またはポリシクリルを表し；ｍは、０〜約１０の値を有する整数である。
【００５９】
用語「アリール」は、本明細書で使用される場合、環の各原子が炭素である（すなわち、炭素環式アリール）か、または１つ以上の原子がヘテロ原子である（すなわち、ヘテロアリール）、３員環〜１２員環の置換または非置換の単環の芳香族基を含む。好ましくは、アリール基は、５員環〜１２員環、さらに好ましくは６員環〜１０員環を含む。ある特定の実施形態では、アリールは、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールを含む。用語「アリール」は、２つ以上の環式環を有する多環式の環系も含み、ここで、２つ以上の炭素を２つの隣接する環で共有しており、ここで、環のうち少なくとも１つは芳香族環であり、例えば、他の環式環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、及び／またはヘテロシクリルであり得る。炭素環式アリール基には、ベンゼン、ナフタレン、フェナントレン、フェノール、アニリンなどが含まれる。
【００６０】
ヘテロアリール基には、環構造内に１〜４つのヘテロ原子を含んだ、置換または非置換の芳香族の３員環〜１２員環構造が含まれ、さらに好ましくは５員環〜１２員環、さらに好ましくは６員環〜１０員環の構造のことをいう。ある特定の実施形態では、ヘテロアリールは、（Ｃ２−Ｃ９）ヘテロアリールを含む。ヘテロアリール基としては、例えば、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン及びピリミジンなどが挙げられる。
【００６１】
用語「ハロアルキル」は、本明細書で定義されたアルキル基を介して、親の分子部分に追加された、本明細書で定義された少なくとも１つのハロゲンを意味する。ハロアルキルの代表的な例としては、クロロメチル、２−フルオロエチル、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、及び２−クロロ−３−フルオロペンチルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
本明細書で使用される場合、用語「置換（した）」は、有機化合物の全ての許容される置換基の全てを含むことが意図されている。広範な態様では、許容される置換基には、有機化合物における非環式の及び環式の、分岐及び非分岐の、炭素環式及び複素環式の、芳香族及び非芳香族の置換基が含まれる。実例となる置換基としては、例えば、本明細書で先に説明したものが挙げられる。許容される置換基は、適切な有機化合物に１つ以上存在して差し支えなく、同一または異なっていて構わない。本発明の目的では、窒素などのヘテロ原子は、そのヘテロ原子の価数を満たす、本明細書に記載される有機化合物の水素置換基及び／または任意の許容される置換基を有していてもよい。本発明は、いかなる方法によっても、有機化合物の許容される置換基により制限されることを意図しない。「置換」または「〜で置換された」には、このような置換は、置換された原子及び置換基の許容される価数に従い、例えば、転位、環化、脱離などの変換を自発的に生じない、安定な化合物を生じるという暗黙の条件が含まれることが理解されよう。
【００６３】
本発明の目的では、化学元素は、ＣＡＳバージョンのＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ及びＰｈｙｓｉｃｓ，６７ｔｈ  ｅｄ．，１９８６−８７の内表紙の元素周期表に従って識別される。
【００６４】
本発明の化合物
有名な日本の化学者である野副鉄男が、１９３６年にタイワンヒノキの木（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ）からトロポロンモノテルペノイドヒノキチオールを最初に単離した。
【化８６】
2021521116.tif 000091
【００６５】
それ以来、日本のヒノキでは見られないが、Ｃｕｐｒｅｓｓａｃｅａｅ科の他の木で見つかっている。本発明は、一部は、ヒノキチオールの重要な医療用途、すなわち、動物における不規則な鉄輸送を克服することに関する。
【００６６】
本開示に含まれるのは、ヒノキチオールの類似体、具体的には、式（Ｉ）による構造を有する化合物：
【化８７】
2021521116.tif 000092
またはその塩であり；
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；及び
Ｒｂが、水素またはメチルであり、但し、化合物が、ヒノキチオールではない。
【００６７】
例えば、いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、
【化８８】
2021521116.tif 000093
及びそれらの塩からなる群から選択され、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−４−アルキル、Ｃ２−４−アルケニル、Ｃ２−４−アルキニル、またはＣ３−４−シクロアルキルであり、但し、化合物が、ヒノキチオールではない。いくつかのかかる実施形態では、Ｒａは、
【化８９】
2021521116.tif 000094
からなる群から選択される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、式（ＩＩ）による構造を有する化合物：
【化９０】
2021521116.tif 000095
またはそれらの塩である。
【００６９】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、式（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）による構造を有する化合物：
【化９１】
2021521116.tif 000096
またはそれらの塩である。
【００７０】
他の実施形態では、本明細書で提供されるのは、式（ＩＩＩ）による構造を有する化合物：
【化９２】
2021521116.tif 000097
またはそれらの塩である。
【００７１】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）による構造を有する化合物：
【化９３】
2021521116.tif 000098
またはそれらの塩である。
【００７２】
いくつかの実施形態では、Ｒａは、
【化９４】
2021521116.tif 000099
からなる群から選択される。
【００７３】
他の実施形態では、Ｒａは、
【化９５】
2021521116.tif 000100
からなる群から選択される。
【００７４】
いくつかの実施形態では、化合物は、
【化９６−１】
2021521116.tif 000101
【化９６−２】
2021521116.tif 000102
【化９６−３】
2021521116.tif 000103
【化９６−４】
2021521116.tif 000104
またはそれらの塩から選択される。
【００７５】
ある特定の実施形態では、化合物は、
【化９７】
2021521116.tif 000105
またはそれらの塩から選択される。
【００７６】
ある特定の他の実施形態では、化合物は、
【化９８】
2021521116.tif 000106
またはそれらの塩から選択される。
【００７７】
ある特定の他の実施形態では、化合物は、
【化９９】
2021521116.tif 000107
またはそれらの塩から選択される。
【００７８】
ある特定の他の実施形態では、化合物は、
【化１００】
2021521116.tif 000108
またはそれらの塩から選択される。
【００７９】
ある特定の他の実施形態では、化合物は、
【化１０１】
2021521116.tif 000109
またはそれらの塩から選択される。
【００８０】
また、本明細書で提供されるのは、
【化１０２−１】
2021521116.tif 000110
【化１０２−２】
2021521116.tif 000111
及びそれらの塩からなる群から選択される化合物である。
【００８１】
また、本明細書で提供されるのは、
【化１０３−１】
2021521116.tif 000112
【化１０３−２】
2021521116.tif 000113
及びそれらの塩からなる群から選択される化合物である。
【００８２】
また、本明細書で提供されるのは、
【化１０４−１】
2021521116.tif 000114
【化１０４−２】
2021521116.tif 000115
及びそれらの塩からなる群から選択される化合物である。
【００８３】
本発明の化合物の調製方法
本開示に含まれるのは、以下に記載の本発明の化合物（すなわち、式（Ｉ）による構造を有する化合物）の調製方法である。
【００８４】
方法Ａ
本明細書で提供されるのは、６−ブロモ−２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化１０５】
2021521116.tif 000116
またはその塩の調製方法であって、
ブレンステッド塩基、及び７，７−ジブロモ−３−メトキシビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−２−オン：
【化１０６】
2021521116.tif 000117
またはその塩を組み合わせることによって、６−ブロモ−２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オンまたはそれらの塩を形成する工程を含む、方法である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、塩基は、炭酸塩などの無機塩基である。例示の炭酸塩としては、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸セシウム、炭酸カルシウム、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
いくつかの実施形態では、方法は、７，７−ジブロモ−３−メトキシビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−２−オン：
【化１０７】
2021521116.tif 000118
またはその塩を調製し、
メチル化剤及び７，７−ジブロモ−３−ヒドロキシビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−２−オンまたはその塩を組み合わせて、混合物：
【化１０８】
2021521116.tif 000119
を形成することによって、６−ブロモ−２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オンまたはそれらの塩を形成する工程をさらに含む。
【００８７】
いくつかの実施形態では、メチル化剤は、ヨウ化メチルである。
【００８８】
いくつかの実施形態では、方法は、無機塩基を加えることをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、無機塩基は、炭酸塩である。例示の炭酸塩としては、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸セシウム、炭酸カルシウム、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、方法は、約８０℃を超える温度（例えば、約９０℃）で混合物を加熱することをさらに含む。
【００９０】
いくつかの実施形態では、方法は、７，７−ジブロモ−３−ヒドロキシビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−２−オン：
【化１０９】
2021521116.tif 000120
またはその塩を調製し、
酸化剤を、７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−２，３−ジオール：
【化１１０】
2021521116.tif 000121
またはその塩と組み合わせることによって、７，７−ジブロモ−３−ヒドロキシビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−２−オンまたはそれらの塩を形成する工程をさらに含む。
【００９１】
いくつかの実施形態では、酸化剤は、重クロム酸カリウム、クロロクロム酸ピリジニウム、デス−マーチンペルヨージナン、塩化オキサリル、ジメチルスルホキシド、アルミニウムアルコキシド（例えば、アルミニウムイソプロポキシド）、トリメチルアルミニウム、カリウム  ｔｅｒｔ−ブトキシド、炭酸銀、またはそれらのいずれかの混合物を含む。いくつかのかかる実施形態では、酸化剤は、ジメチルスルホキシド、及びカルボジイミド、無水トリフルオロ酢酸、塩化オキサリル、及び三酸化硫黄ピリジン錯体からなる群から選択される１つ以上のさらなる試薬をさらに含む。
【００９２】
いくつかの実施形態では、７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−２，３−ジオールを酸化剤と接触後に塩基性アミンと接触させる。いくつかのかかる実施形態では、塩基性アミンは、トリエチルアミンなどの第三級アミンである。
【００９３】
いくつかの実施形態では、７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−２，３−ジオールを、約５℃未満の温度で酸化剤と接触させる。いくつかのかかる実施形態では、７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−２，３−ジオールを、約−７８℃の温度で酸化剤と最初に接触させる。方法のある特定の実施形態では、温度を次いで約０℃に温める。
【００９４】
いくつかの実施形態では、方法は、４−ブロモ−２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化１１１】
2021521116.tif 000122
またはその塩を得ない。
【００９５】
方法Ｂ
また、本明細書で提供されるのは、以下の構造式の化合物：
【化１１２】
2021521116.tif 000123
またはその塩の調製方法であって、
以下の構造式の化合物：
【化１１３】
2021521116.tif 000124
またはその塩を、ハロゲン化剤と反応させることによって、化合物を形成することを含み、式中、Ｒｂが、Ｈまたはメチルであり、Ｘが、ハロゲンである、方法である。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ハロゲン化剤は、臭素化剤である。いくつかのかかる実施形態では、臭素化剤は、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）または臭化水素酸である。
【００９７】
方法Ｃ
また、本明細書で提供されるのは、４−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化１１４】
2021521116.tif 000125
またはその塩の調製方法であって、
７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−２，３−ジオール：
【化１１５】
2021521116.tif 000126
またはその塩を、酸化剤と組み合わせることによって、４−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オンまたはそれらの塩を形成することを含む、方法である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、方法は、７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−２，３−ジオール及び酸化剤を、塩基と組み合わせることをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、塩基は、アミンである。ある特定の実施形態では、アミンは、トリエチルアミンなどの第三級アミンである。
【００９９】
いくつかの実施形態では、７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−２，３−ジオールを、約−７８℃の温度で酸化剤と最初に接触させる。方法のある特定の実施形態では、温度を次いで約０℃に温める。
【０１００】
方法Ｄ
また、本明細書で提供されるのは、５−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化１１６】
2021521116.tif 000127
またはその塩の調製方法であって、
７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−３、４−ジオール：
【化１１７】
2021521116.tif 000128
またはその塩を、酸化剤と組み合わせることによって、５−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オンまたはその塩を形成することを含む、方法である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−３、４−ジオールを、約−７８℃の温度で酸化剤と最初に接触させる。方法のある特定の実施形態では、温度を次いで約０℃に温める。いくつかの実施形態では、酸化剤は、重クロム酸カリウム、クロロクロム酸ピリジニウム、デス−マーチンペルヨージナン、塩化オキサリル、ジメチルスルホキシド、アルミニウムアルコキシド（例えば、アルミニウムイソプロポキシド）、トリメチルアルミニウム、カリウム  ｔｅｒｔ−ブトキシド、または炭酸銀のうちの１つ以上を含む。他の実施形態では、酸化剤は、ジメチルスルホキシド、及びカルボジイミド、無水トリフルオロ酢酸、塩化オキサリル、及び三酸化硫黄ピリジン錯体からなる群から選択される１つ以上のさらなる試薬を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、方法は、７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−３、４−ジオール及び酸化剤を、塩基と組み合わせることをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、塩基は、アミン塩基である。ある特定の実施形態では、塩基は、トリエチルアミンなどの第三級アミン塩基である。
【０１０３】
方法Ｅ
また、本明細書で提供されるのは、以下の構造式の化合物：
【化１１８】
2021521116.tif 000129
またはその塩の調製方法であって、
以下の構造式の化合物：
【化１１９】
2021521116.tif 000130
またはその塩を、２−ブロモ−７−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化１２０】
2021521116.tif 000131
またはその塩と反応させることによって、構造式の化合物：
【化１２１】
2021521116.tif 000132
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、独立して任意選択で、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、方法である。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、Ｒ１’及びＲ２’が両方とも水素である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、Ｒａは、
【化１２２】
2021521116.tif 000133
からなる群から選択される。
【０１０６】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化１２３】
2021521116.tif 000134
またはその塩は、
【化１２４】
2021521116.tif 000135
からなる群から選択される。
【０１０７】
他の実施形態では、Ｒａは、
【化１２５】
2021521116.tif 000136
からなる群から選択される。
【０１０８】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化１２６】
2021521116.tif 000137
またはその塩は、
【化１２７】
2021521116.tif 000138
からなる群から選択される。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、Ｒａは、
【化１２８】
2021521116.tif 000139
からなる群から選択される。
【０１１０】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化１２９】
2021521116.tif 000140
またはその塩は、
【化１３０−１】
2021521116.tif 000141
【化１３０−２】
2021521116.tif 000142
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、方法は、反応化合物を金属触媒と接触させることをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、金属触媒は、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である。ある特定の実施形態では、金属触媒は、有機パラジウム触媒である。例えば、特定の実施形態では、金属触媒は、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、金属触媒との反応は、プロモーターをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、プロモーターは、タリウム（Ｉ）エトキシドまたは酸化銀である。好ましい実施形態では、プロモーターは、酸化銀である。
【０１１３】
方法Ｆ
また、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化１３１】
2021521116.tif 000143
またはその塩の調製方法であって、
構造式を有する化合物：
【化１３２】
2021521116.tif 000144
またはその塩を、脱メチル化剤と組み合わせることによって、構造式の化合物：
【化１３３】
2021521116.tif 000145
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換される、方法である。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、脱メチル化剤は、酸である。いくつかのかかる実施形態では、脱メチル化剤は、鉱酸、有機酸、またはそれらの組み合わせである。ある特定の実施形態では、脱メチル化剤は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、酢酸、またはそれらの組み合わせである。好ましい実施形態では、脱メチル化剤は、酢酸中の臭化水素酸または塩酸である。あるいは、脱メチル化剤は、硫酸である。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、構造式を有する化合物：
【化１３４】
2021521116.tif 000146
またはその塩を脱メチル化剤と接触させて、沸騰するまで加熱することによって、構造式の化合物：
【化１３５】
2021521116.tif 000147
またはそれらの塩を得る。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、構造式の化合物：
【化１３６】
2021521116.tif 000148
またはその塩は、
【化１３７】
2021521116.tif 000149
またはそれらの塩から選択される。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、構造式の化合物：
【化１３８】
2021521116.tif 000150
またはその塩は、
【化１３９】
2021521116.tif 000151
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、構造式の化合物：
【化１４０】
2021521116.tif 000152
またはその塩は、
【化１４１−１】
2021521116.tif 000153
【化１４１−２】
2021521116.tif 000154
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１１９】
方法Ｇ
また、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化１４２】
2021521116.tif 000155
またはその塩の調製方法であって、
（１）構造式の化合物：
【化１４３】
2021521116.tif 000156
またはその塩を、構造式の化合物：
【化１４４】
2021521116.tif 000157
またはその塩と反応させることによって、構造式を有する化合物：
【化１４５】
2021521116.tif 000158
またはその塩を得ること；及び
（２）構造式を有する化合物：
【化１４６】
2021521116.tif 000159
またはその塩を、脱メチル化剤と接触させることによって、構造式の化合物：
【化１４７】
2021521116.tif 000160
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択かつ独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、方法である。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、Ｒ１’及びＲ２’が両方とも水素である。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、方法の工程（１）は、反応化合物を金属触媒と接触させることをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、金属触媒は、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である。ある特定の実施形態では、金属触媒は、有機パラジウム触媒である。特定の実施形態では、金属触媒は、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、金属触媒との反応は、プロモーターをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、プロモーターは、タリウム（Ｉ）エトキシドまたは酸化銀である。好ましい実施形態では、プロモーターは、酸化銀である。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、脱メチル化剤は、酸である。いくつかのかかる実施形態では、脱メチル化剤は、鉱酸、有機酸、またはそれらの組み合わせである。ある特定の実施形態では、脱メチル化剤は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、酢酸、またはそれらの組み合わせである。好ましい実施形態では、脱メチル化剤は、酢酸中の臭化水素酸または塩酸である。あるいは、脱メチル化剤は、硫酸である。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、Ｒａは、
【化１４８】
2021521116.tif 000161
からなる群から選択される。
【０１２５】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化１４９】
2021521116.tif 000162
またはその塩は、
【化１５０】
2021521116.tif 000163
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、構造式の化合物：
【化１５１】
2021521116.tif 000164
またはその塩は、
【化１５２】
2021521116.tif 000165
またはそれらの塩から選択される。
【０１２７】
他の実施形態では、Ｒａは、
【化１５３】
2021521116.tif 000166
からなる群から選択される。
【０１２８】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化１５４】
2021521116.tif 000167
またはその塩は、
【化１５５】
2021521116.tif 000168
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、構造式の化合物：
【化１５６】
2021521116.tif 000169
またはその塩は、
【化１５７】
2021521116.tif 000170
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１３０】
さらに他の実施形態では、Ｒａは、
【化１５８】
2021521116.tif 000171
からなる群から選択される。
【０１３１】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化１５９】
2021521116.tif 000172
またはその塩は、
【化１６０−１】
2021521116.tif 000173
【化１６０−２】
2021521116.tif 000174
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、構造式の化合物：
【化１６１】
2021521116.tif 000175
またはその塩は、
【化１６２−１】
2021521116.tif 000176
【化１６２−２】
2021521116.tif 000177
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１３３】
方法Ｈ
また、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化１６３】
2021521116.tif 000178
またはその塩の調製方法であって、構造式の化合物：
【化１６４】
2021521116.tif 000179
またはその塩を、構造式の化合物：
【化１６５】
2021521116.tif 000180
またはその塩と反応させることによって、構造式の化合物：
【化１６６】
2021521116.tif 000181
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒｂが、水素またはメチルであり；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択かつ独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、方法である。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、方法は、反応化合物を金属触媒と接触させることをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、金属触媒は、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である。ある特定の実施形態では、金属触媒は、有機パラジウム触媒である。特定の実施形態では、金属触媒は、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、金属触媒との反応は、プロモーターをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、プロモーターは、タリウム（Ｉ）エトキシドまたは酸化銀である。好ましい実施形態では、プロモーターは、酸化銀である。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、Ｒ１’及びＲ２’が両方とも水素である。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、Ｒａは、Ｃ１−４−アルキル、Ｃ２−４−アルケニル、Ｃ２−４−アルキニル、またはＣ３−４−シクロアルキルである。いくつかのかかる実施形態では、Ｒａは、
【化１６７】
2021521116.tif 000182
からなる群から選択される。
【０１３８】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化１６８】
2021521116.tif 000183
またはその塩は、
【化１６９−１】
2021521116.tif 000184
【化１６９−２】
2021521116.tif 000185
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１３９】
いくつかの他の実施形態では、Ｒａは、
【化１７０】
2021521116.tif 000186
からなる群から選択される。
【０１４０】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化１７１】
2021521116.tif 000187
またはその塩は、
【化１７２】
2021521116.tif 000188
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１４１】
他の実施形態では、Ｒａは、
【化１７３】
2021521116.tif 000189
からなる群から選択される。
【０１４２】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化１７４】
2021521116.tif 000190
またはその塩は、
【化１７５】
2021521116.tif 000191
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１４３】
さらに他の実施形態では、Ｒａは、
【化１７６】
2021521116.tif 000192
からなる群から選択される。
【０１４４】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化１７７】
2021521116.tif 000193
またはその塩は、
【化１７８−１】
2021521116.tif 000194
【化１７８−２】
2021521116.tif 000195
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１４５】
方法Ｉ
また、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化１７９】
2021521116.tif 000196
またはその塩の調製方法であって、構造式を有する化合物：
【化１８０】
2021521116.tif 000197
またはその塩を、脱メチル化剤と組み合わせることによって、構造式の化合物：
【化１８１】
2021521116.tif 000198
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換される、方法である。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、脱メチル化剤は、酸である。いくつかのかかる実施形態では、脱メチル化剤は、鉱酸、有機酸、またはそれらの組み合わせである。ある特定の実施形態では、脱メチル化剤は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、酢酸、またはそれらの組み合わせである。好ましい実施形態では、脱メチル化剤は、酢酸中の臭化水素酸または塩酸である。あるいは、脱メチル化剤は、硫酸である。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、構造式を有する化合物：
【化１８２】
2021521116.tif 000199
またはその塩を脱メチル化剤と接触させて、沸騰するまで加熱することによって、構造式の化合物：
【化１８３】
2021521116.tif 000200
またはそれらの塩を得る。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、構造式の化合物：
【化１８４】
2021521116.tif 000201
またはその塩は、
【化１８５】
2021521116.tif 000202
またはそれらの塩から選択される。
【０１４９】
他の実施形態では、構造式の化合物：
【化１８６】
2021521116.tif 000203
またはその塩は、
【化１８７】
2021521116.tif 000204
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１５０】
さらに他の実施形態では、構造式の化合物：
【化１８８】
2021521116.tif 000205
またはその塩は、
【化１８９−１】
2021521116.tif 000206
【化１８９−２】
2021521116.tif 000207
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１５１】
方法Ｊ
また、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化１９０】
2021521116.tif 000208
またはその塩の調製方法であって、
（１）２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化１９１】
2021521116.tif 000209
またはその塩を、臭素化剤と反応させることによって、３−ブロモ−２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化１９２】
2021521116.tif 000210
またはその塩を形成すること、
（２）構造式の化合物：
【化１９３】
2021521116.tif 000211
またはその塩を、３−ブロモ−２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化１９４】
2021521116.tif 000212
またはその塩と反応させることによって、構造式を有する化合物：
【化１９５】
2021521116.tif 000213
またはその塩を形成すること；及び
（３）構造式を有する化合物：
【化１９６】
2021521116.tif 000214
またはその塩を、脱メチル化剤と接触させることによって、構造式の化合物：
【化１９７】
2021521116.tif 000215
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択かつ独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、方法である。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、方法の工程（２）は、反応化合物を金属触媒と接触させることをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、金属触媒は、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である。ある特定の実施形態では、金属触媒は、有機パラジウム触媒である。特定の実施形態では、金属触媒は、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、金属触媒との反応は、プロモーターをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、プロモーターは、タリウム（Ｉ）エトキシドまたは酸化銀である。好ましい実施形態では、プロモーターは、酸化銀である。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、脱メチル化剤は、酸である。いくつかのかかる実施形態では、脱メチル化剤は、鉱酸、有機酸、またはそれらの組み合わせである。ある特定の実施形態では、脱メチル化剤は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、酢酸、またはそれらの組み合わせである。好ましい実施形態では、脱メチル化剤は、酢酸中の臭化水素酸または塩酸である。あるいは、脱メチル化剤は、硫酸である。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、Ｒ１’及びＲ２’が両方とも水素である。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、Ｒａが、Ｃ１−４−アルキル、Ｃ２−４−アルケニル、Ｃ２−４−アルキニル、またはＣ３−４−シクロアルキルである。いくつかのかかる実施形態では、Ｒａは、
【化１９８】
2021521116.tif 000216
からなる群から選択される。いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物またはその塩：
【化１９９】
2021521116.tif 000217
は、
【化２００−１】
2021521116.tif 000218
【化２００−２】
2021521116.tif 000219
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、構造式の化合物：
【化２０１】
2021521116.tif 000220
またはその塩は、
【化２０２−１】
2021521116.tif 000221
【化２０２−２】
2021521116.tif 000222
またはそれらの塩から選択される。
【０１５８】
いくつかの他の実施形態では、Ｒａは、
【化２０３】
2021521116.tif 000223
からなる群から選択される。
【０１５９】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化２０４】
2021521116.tif 000224
またはその塩は、
【化２０５】
2021521116.tif 000225
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、構造式の化合物：
【化２０６】
2021521116.tif 000226
またはその塩は、
【化２０７】
2021521116.tif 000227
またはそれらの塩から選択される。
【０１６１】
他の実施形態では、Ｒａは、
【化２０８】
2021521116.tif 000228
からなる群から選択される。
【０１６２】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化２０９】
2021521116.tif 000229
またはその塩は、
【化２１０】
2021521116.tif 000230
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、構造式の化合物：
【化２１１】
2021521116.tif 000231
またはその塩は、
【化２１２】
2021521116.tif 000232
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１６４】
方法Ｋ
また、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化２１３】
2021521116.tif 000233
またはその塩の調製方法であって、構造式の化合物：
【化２１４】
2021521116.tif 000234
またはその塩を、構造式の化合物：
【化２１５】
2021521116.tif 000235
またはその塩と反応させることによって、構造式の化合物：
【化２１６】
2021521116.tif 000236
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒｂが、水素またはメチルであり；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択かつ独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、方法である。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、方法は、化合物を金属触媒と接触させることをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、金属触媒は、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である。ある特定の実施形態では、金属触媒は、有機パラジウム触媒である。特定の実施形態では、金属触媒は、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、金属触媒との反応は、プロモーターをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、プロモーターは、タリウム（Ｉ）エトキシドまたは酸化銀である。好ましい実施形態では、プロモーターは、酸化銀である。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、Ｒ１’及びＲ２’が両方とも水素である。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、Ｒａが、Ｃ１−４−アルキル、Ｃ２−４−アルケニル、Ｃ２−４−アルキニル、またはＣ３−４−シクロアルキルである。いくつかのかかる実施形態では、Ｒａは、
【化２１７】
2021521116.tif 000237
からなる群から選択される。いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化２１８】
2021521116.tif 000238
またはその塩は、
【化２１９−１】
2021521116.tif 000239
【化２１９−２】
2021521116.tif 000240
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１６９】
いくつかの他の実施形態では、Ｒａは、
【化２２０】
2021521116.tif 000241
からなる群から選択される。
【０１７０】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化２２１】
2021521116.tif 000242
またはその塩は、
【化２２２】
2021521116.tif 000243
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１７１】
他の実施形態では、Ｒａは、
【化２２３】
2021521116.tif 000244
からなる群から選択される。
【０１７２】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化２２４】
2021521116.tif 000245
またはその塩は、
【化２２５】
2021521116.tif 000246
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１７３】
方法Ｌ
また、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化２２６】
2021521116.tif 000247
またはその塩の調製方法であって、構造式を有する化合物：
【化２２７】
2021521116.tif 000248
またはその塩を、脱メチル化剤と組み合わせることによって、構造式の化合物：
【化２２８】
2021521116.tif 000249
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換される、方法である。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、脱メチル化剤は、酸である。いくつかのかかる実施形態では、脱メチル化剤は、鉱酸、有機酸、またはそれらの組み合わせである。ある特定の実施形態では、脱メチル化剤は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、酢酸、またはそれらの組み合わせである。好ましい実施形態では、脱メチル化剤は、酢酸中の臭化水素酸または塩酸である。あるいは、脱メチル化剤は、硫酸である。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、構造式を有する化合物：
【化２２９】
2021521116.tif 000250
またはその塩を脱メチル化剤と接触させて、沸騰するまで加熱することによって、構造式の化合物：
【化２３０】
2021521116.tif 000251
またはそれらの塩を得る。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、構造式の化合物：
【化２３１】
2021521116.tif 000252
またはその塩は、
【化２３２−１】
2021521116.tif 000253
【化２３２−２】
2021521116.tif 000254
またはそれらの塩から選択される。
【０１７７】
いくつかの他の実施形態では、構造式の化合物：
【化２３３】
2021521116.tif 000255
またはその塩は、
【化２３４】
2021521116.tif 000256
またはそれらの塩から選択される。
【０１７８】
他の実施形態では、構造式の化合物：
【化２３５】
2021521116.tif 000257
またはその塩は、
【化２３６】
2021521116.tif 000258
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１７９】
方法Ｍ
また、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化２３７】
2021521116.tif 000259
またはその塩の調製方法であって、
（１）７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−２，３−ジオール：
【化２３８】
2021521116.tif 000260
またはその塩を、酸化剤と接触させることによって、４−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化２３９】
2021521116.tif 000261
またはその塩を形成すること、
（２）構造式の化合物：
【化２４０】
2021521116.tif 000262
またはその塩を、４−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化２４１】
2021521116.tif 000263
またはその塩と反応させることによって、構造式を有する化合物：
【化２４２】
2021521116.tif 000264
またはその塩を形成すること；
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択かつ独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、方法である。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、方法の工程（１）では、７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−２，３−ジオールを、約−７８℃の温度で酸化剤と最初に接触させる。方法のある特定の実施形態では、温度を次いで約０℃に温める。いくつかの実施形態では、酸化剤は、重クロム酸カリウム、クロロクロム酸ピリジニウム、デス−マーチンペルヨージナン、塩化オキサリル、ジメチルスルホキシド、アルミニウムアルコキシド（例えば、アルミニウムイソプロポキシド）、トリメチルアルミニウム、カリウム  ｔｅｒｔ−ブトキシド、または炭酸銀のうちの１つ以上を含む。他の実施形態では、酸化剤は、ジメチルスルホキシド、及びカルボジイミド、無水トリフルオロ酢酸、塩化オキサリル、及び三酸化硫黄ピリジン錯体からなる群から選択される１つ以上のさらなる試薬を含む。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、方法の工程（１）は、７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−２，３−ジオール及び酸化剤を、塩基と接触させることをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、塩基は、アミン塩基である。ある特定の実施形態では、塩基は、トリエチルアミンなどの第三級アミン塩基である。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、方法の工程（２）は、化合物を金属触媒と接触させることをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、金属触媒は、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である。ある特定の実施形態では、金属触媒は、有機パラジウム触媒である。特定の実施形態では、金属触媒は、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、金属触媒との反応は、プロモーターをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、プロモーターは、タリウム（Ｉ）エトキシドまたは酸化銀である。好ましい実施形態では、プロモーターは、酸化銀である。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、Ｒａが、Ｃ１−４−アルキル、Ｃ２−４−アルケニル、Ｃ２−４−アルキニル、またはＣ３−４−シクロアルキルである。いくつかのかかる実施形態では、Ｒａは、
【化２４３】
2021521116.tif 000265
からなる群から選択される。したがって、構造式の化合物：
【化２４４】
2021521116.tif 000266
またはその塩は、
【化２４５−１】
2021521116.tif 000267
【化２４５−２】
2021521116.tif 000268
またはそれらの塩から選択される。
【０１８５】
いくつかの他の実施形態では、Ｒａは、
【化２４６】
2021521116.tif 000269
からなる群から選択される。
【０１８６】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化２４７】
2021521116.tif 000270
またはその塩は、
【化２４８】
2021521116.tif 000271
またはそれらの塩から選択される。
【０１８７】
他の実施形態では、Ｒａは、
【化２４９】
2021521116.tif 000272
からなる群から選択される。
【０１８８】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化２５０】
2021521116.tif 000273
またはその塩は、
【化２５１】
2021521116.tif 000274
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１８９】
方法Ｎ
また、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化２５２】
2021521116.tif 000275
またはその塩の調製方法であって、構造式の化合物：
【化２５３】
2021521116.tif 000276
またはその塩を、構造式の化合物：
【化２５４】
2021521116.tif 000277
またはその塩と反応させることによって、構造式の化合物：
【化２５５】
2021521116.tif 000278
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒｂが、水素またはメチルであり；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択かつ独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、方法である。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、方法は、化合物を金属触媒と接触させることをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、金属触媒は、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である。ある特定の実施形態では、金属触媒は、有機パラジウム触媒である。特定の実施形態では、金属触媒は、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、金属触媒との反応は、プロモーターをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、プロモーターは、タリウム（Ｉ）エトキシドまたは酸化銀である。好ましい実施形態では、プロモーターは、酸化銀である。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、Ｒ１’及びＲ２’が両方とも水素である。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、Ｒａが、Ｃ１−４−アルキル、Ｃ２−４−アルケニル、Ｃ２−４−アルキニル、またはＣ３−４−シクロアルキルである。いくつかのかかる実施形態では、Ｒａは、
【化２５６】
2021521116.tif 000279
からなる群から選択される。したがって、構造式の化合物：
【化２５７】
2021521116.tif 000280
またはその塩は、
【化２５８−１】
2021521116.tif 000281
【化２５８−２】
2021521116.tif 000282
またはその塩からなる群から選択される。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、Ｒａは、
【化２５９】
2021521116.tif 000283
からなる群から選択される。
【０１９５】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化２６０】
2021521116.tif 000284
またはその塩は、
【化２６１】
2021521116.tif 000285
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１９６】
他の実施形態では、Ｒａは、
【化２６２】
2021521116.tif 000286
からなる群から選択される。
【０１９７】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化２６３】
2021521116.tif 000287
またはその塩は、
【化２６４】
2021521116.tif 000288
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０１９８】
方法Ｏ
また、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化２６５】
2021521116.tif 000289
またはその塩の調製方法であって、構造式を有する化合物：
【化２６６】
2021521116.tif 000290
またはその塩を、脱メチル化剤と組み合わせることによって、構造式の化合物：
【化２６７】
2021521116.tif 000291
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換される、方法である。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、脱メチル化剤は、酸である。いくつかのかかる実施形態では、脱メチル化剤は、鉱酸、有機酸、またはそれらの組み合わせである。ある特定の実施形態では、脱メチル化剤は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、酢酸、またはそれらの組み合わせである。好ましい実施形態では、脱メチル化剤は、酢酸中の臭化水素酸または塩酸である。あるいは、脱メチル化剤は、硫酸である。
【０２００】
いくつかの実施形態では、構造式を有する化合物：
【化２６８】
2021521116.tif 000292
またはその塩を脱メチル化剤と接触させて、沸騰するまで加熱することによって、構造式の化合物：
【化２６９】
2021521116.tif 000293
またはそれらの塩を得る。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、構造式の化合物：
【化２７０】
2021521116.tif 000294
またはその塩は、
【化２７１−１】
2021521116.tif 000295
【化２７１−２】
2021521116.tif 000296
またはその塩からなる群から選択される。
【０２０２】
いくつかの他の実施形態では、構造式の化合物：
【化２７２】
2021521116.tif 000297
またはその塩は、
【化２７３】
2021521116.tif 000298
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０２０３】
他の実施形態では、構造式の化合物：
【化２７４】
2021521116.tif 000299
またはその塩は、
【化２７５】
2021521116.tif 000300
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０２０４】
方法Ｐ
また、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化２７６】
2021521116.tif 000301
またはその塩の調製方法であって、
（１）７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−３，４−ジオール：
【化２７７】
2021521116.tif 000302
またはその塩を、酸化剤と接触させることによって、５−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化２７８】
2021521116.tif 000303
またはその塩を形成すること；及び
（２）構造式の化合物：
【化２７９】
2021521116.tif 000304
またはその塩を、５−ブロモ−２−ヒドロキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化２８０】
2021521116.tif 000305
またはその塩と反応させることによって、構造式を有する化合物：
【化２８１】
2021521116.tif 000306
またはその塩を形成することを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択かつ独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、方法である。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、方法の工程（１）は、７，７−ジブロモビシクロ［４．１．０］ヘプタン−３、４−ジオール及び酸化剤を、塩基と接触させることをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、塩基は、アミン塩基である。ある特定の実施形態では、塩基は、トリエチルアミンなどの第三級アミン塩基である。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、方法の工程（２）は、化合物を金属触媒と接触させることをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、金属触媒は、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である。ある特定の実施形態では、金属触媒は、有機パラジウム触媒である。例えば、特定の実施形態では、金属触媒は、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、金属触媒との反応は、プロモーターをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、プロモーターは、タリウム（Ｉ）エトキシドまたは酸化銀である。好ましい実施形態では、プロモーターは、酸化銀である。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、Ｒａが、Ｃ１−４−アルキル、Ｃ２−４−アルケニル、Ｃ２−４−アルキニル、またはＣ３−４−シクロアルキルである。いくつかのかかる実施形態では、Ｒａは、
【化２８２】
2021521116.tif 000307
からなる群から選択される。したがって、いくつかの実施形態では、構造式の化合物：
【化２８３】
2021521116.tif 000308
またはその塩は、
【化２８４−１】
2021521116.tif 000309
【化２８４−２】
2021521116.tif 000310
またはその塩からなる群から選択される。
【０２０９】
いくつかの他の実施形態では、Ｒａは、
【化２８５】
2021521116.tif 000311
からなる群から選択される。
【０２１０】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化２８６】
2021521116.tif 000312
またはその塩は、
【化２８７】
2021521116.tif 000313
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０２１１】
他の実施形態では、Ｒａは、
【化２８８】
2021521116.tif 000314
からなる群から選択される。
【０２１２】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化２８９】
2021521116.tif 000315
またはその塩は、
【化２９０】
2021521116.tif 000316
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０２１３】
方法Ｑ
また、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化２９１】
2021521116.tif 000317
またはその塩の調製方法であって、構造式の化合物：
【化２９２】
2021521116.tif 000318
またはその塩を、構造式の化合物：
【化２９３】
2021521116.tif 000319
またはその塩と反応させることによって、構造式の化合物：
【化２９４】
2021521116.tif 000320
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒｂが、水素またはメチルであり；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択かつ独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、方法である。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、Ｒ１’及びＲ２’が両方とも水素である。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、方法は、化合物を金属触媒と接触させることをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、金属触媒は、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である。ある特定の実施形態では、金属触媒は、有機パラジウム触媒である。例えば、特定の実施形態では、金属触媒は、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、金属触媒との反応は、プロモーターをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、プロモーターは、タリウム（Ｉ）エトキシドまたは酸化銀である。好ましい実施形態では、プロモーターは、酸化銀である。
【０２１７】
方法Ｒ
また、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化２９５】
2021521116.tif 000321
またはその塩の調製方法であって、構造式の化合物：
【化２９６】
2021521116.tif 000322
またはその塩を、構造式の化合物：
【化２９７】
2021521116.tif 000323
またはその塩と反応させることによって、構造式の化合物：
【化２９８】
2021521116.tif 000324
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒｂが、水素またはメチルであり；
Ｘａが、
【化２９９】
2021521116.tif 000325
または−Ｓｎ（Ｃ１−６−アルキル）であり；及び
Ｘｂが、ハロまたは擬ハロである、方法である。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、Ｘｂは、クロロ、ブロモ、ヨード、トリフラート、メシラート、またはホスホネートである。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、Ｒａは、
【化３００】
2021521116.tif 000326
であり、式中、ｎは、１〜２０の整数であり、Ｒ１は、水素、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、またはＣ１−６−アルコキシである。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、構造式の化合物：
【化３０１】
2021521116.tif 000327
またはその塩を、金属触媒の存在下で、構造式の化合物：
【化３０２】
2021521116.tif 000328
またはその塩と反応させる。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、金属触媒は、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である。ある特定の実施形態では、金属触媒は、有機パラジウム触媒である。例えば、特定の実施形態では、金属触媒は、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される。
【０２２２】
方法Ｓ
また、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化３０３】
2021521116.tif 000329
またはその塩の調製方法であって、構造式の化合物：
【化３０４】
2021521116.tif 000330
またはその塩を、３−ブロモ−７−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化３０５】
2021521116.tif 000331
またはその塩と反応させることによって、構造式の化合物：
【化３０６】
2021521116.tif 000332
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択かつ独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、方法である。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、方法は、反応化合物を金属触媒と接触させることをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、金属触媒は、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である。ある特定の実施形態では、金属触媒は、有機パラジウム触媒である。例えば、特定の実施形態では、金属触媒は、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、金属触媒との反応は、プロモーターをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、プロモーターは、タリウム（Ｉ）エトキシドまたは酸化銀である。好ましい実施形態では、プロモーターは、酸化銀である。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、Ｒ１’及びＲ２’が両方とも水素である。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、Ｒａは、
【化３０７】
2021521116.tif 000333
からなる群から選択される。
【０２２７】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化３０８】
2021521116.tif 000334
またはその塩は、
【化３０９】
2021521116.tif 000335
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０２２８】
他の実施形態では、Ｒａは、
【化３１０】
2021521116.tif 000336
からなる群から選択される。
【０２２９】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化３１１】
2021521116.tif 000337
またはその塩は、
【化３１２】
2021521116.tif 000338
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、Ｒａは、
【化３１３】
2021521116.tif 000339
からなる群から選択される。
【０２３１】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化３１４】
2021521116.tif 000340
またはその塩は、
【化３１５−１】
2021521116.tif 000341
【化３１５−２】
2021521116.tif 000342
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０２３２】
方法Ｔ
また、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化３１６】
2021521116.tif 000343
またはその塩の調製方法であって、構造式を有する化合物：
【化３１７】
2021521116.tif 000344
またはその塩を、脱メチル化剤と組み合わせることによって、構造式の化合物：
【化３１８】
2021521116.tif 000345
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換される、方法である。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、脱メチル化剤は、酸である。いくつかのかかる実施形態では、脱メチル化剤は、鉱酸、有機酸、またはそれらの組み合わせである。ある特定の実施形態では、脱メチル化剤は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、酢酸、またはそれらの組み合わせである。好ましい実施形態では、脱メチル化剤は、酢酸中の臭化水素酸または塩酸である。あるいは、脱メチル化剤は、硫酸である。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、構造式を有する化合物：
【化３１９】
2021521116.tif 000346
またはその塩を脱メチル化剤と接触させて、沸騰するまで加熱することによって、構造式の化合物：
【化３２０】
2021521116.tif 000347
またはそれらの塩を得る。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、構造式の化合物：
【化３２１】
2021521116.tif 000348
またはその塩は、
【化３２２】
2021521116.tif 000349
またはそれらの塩から選択される。
【０２３６】
他の実施形態では、構造式の化合物：
【化３２３】
2021521116.tif 000350
またはその塩は、
【化３２４】
2021521116.tif 000351
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０２３７】
さらに他の実施形態では、構造式の化合物：
【化３２５】
2021521116.tif 000352
またはその塩は、
【化３２６−１】
2021521116.tif 000353
【化３２６−２】
2021521116.tif 000354
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０２３８】
方法Ｕ
また、本明細書で提供されるのは、構造式の化合物：
【化３２７】
2021521116.tif 000355
またはその塩の調製方法であって、
（１）７，７−ジブロモ−３−メトキシビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−２−オン：
【化３２８】
2021521116.tif 000356
またはその塩を、塩基と接触させることによって、６−ブロモ−２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン：
【化３２９】
2021521116.tif 000357
またはその塩を形成すること；
（２）構造式の化合物：
【化３３０】
2021521116.tif 000358
またはその塩を、６−ブロモ−２−メトキシシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン、またはその塩と反応させることによって、構造式を有する化合物：
【化３３１】
2021521116.tif 000359
またはその塩を得ること；及び
（３）構造式を有する化合物：
【化３３２】
2021521116.tif 000360
またはその塩を、脱メチル化剤と接触させることによって、構造式の化合物：
【化３３３】
2021521116.tif 000361
またはその塩を得ることを含み、
式中、
Ｒａが、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ２−２０−アルキニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々が、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換され；
Ｒ１’及びＲ２’が、各々独立して、水素またはＣ１−６−アルキルであり；または
Ｒ１’及びＲ２’が、それらが結合する原子と一緒になって、２〜４個の炭素原子を有する環を形成し、各々が、任意選択かつ独立して、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ＝Ｏで置換され；及び
Ｂが、ｓｐ３混成を有するホウ素原子である、方法である。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、方法の工程（１）では、７，７−ジブロモ−３−メトキシビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−２−オンを、約−７８℃の温度で酸化剤と最初に接触させる。方法のある特定の実施形態では、温度を次いで約０℃に温める。いくつかの実施形態では、酸化剤は、重クロム酸カリウム、クロロクロム酸ピリジニウム、デス−マーチンペルヨージナン、塩化オキサリル、ジメチルスルホキシド、アルミニウムアルコキシド（例えば、アルミニウムイソプロポキシド）、トリメチルアルミニウム、カリウム  ｔｅｒｔ−ブトキシド、または炭酸銀のうちの１つ以上を含む。他の実施形態では、酸化剤は、ジメチルスルホキシド、及びカルボジイミド、無水トリフルオロ酢酸、塩化オキサリル、及び三酸化硫黄ピリジン錯体からなる群から選択される１つ以上のさらなる試薬を含む。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、方法の工程（１）は、７，７−ジブロモ−３−メトキシビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−２−オン及び酸化剤を、塩基と接触させることをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、塩基は、アミン塩基である。ある特定の実施形態では、塩基は、トリエチルアミンなどの第三級アミン塩基である。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、方法の工程（２）は、化合物を金属触媒と接触させることをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、金属触媒は、パラジウム触媒またはパラジウムナノ材料ベースの触媒である。ある特定の実施形態では、金属触媒は、有機パラジウム触媒である。例えば、特定の実施形態では、金属触媒は、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、塩化パラジウム、及び酢酸パラジウム（ＩＩ）からなる群から選択される。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、金属触媒との反応は、プロモーターをさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、プロモーターは、タリウム（Ｉ）エトキシドまたは酸化銀である。好ましい実施形態では、プロモーターは、酸化銀である。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、Ｒ１’及びＲ２’が両方とも水素である。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、脱メチル化剤は、酸である。いくつかのかかる実施形態では、脱メチル化剤は、鉱酸、有機酸、またはそれらの組み合わせである。ある特定の実施形態では、脱メチル化剤は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、酢酸、またはそれらの組み合わせである。好ましい実施形態では、脱メチル化剤は、酢酸中の臭化水素酸または塩酸である。あるいは、脱メチル化剤は、硫酸である。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、Ｒａが、Ｃ１−４−アルキル、Ｃ２−４−アルケニル、Ｃ２−４−アルキニル、またはＣ３−４−シクロアルキルである。いくつかのかかる実施形態では、Ｒａは
【化３３４】
2021521116.tif 000362
からなる群から選択される。
【０２４６】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化３３５】
2021521116.tif 000363
またはその塩は、
【化３３６−１】
2021521116.tif 000364
【化３３６−２】
2021521116.tif 000365
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、構造式の化合物：
【化３３７】
2021521116.tif 000366
またはその塩は、
【化３３８−１】
2021521116.tif 000367
【化３３８−２】
2021521116.tif 000368
またはそれらの塩から選択される。
【０２４８】
いくつかの他の実施形態では、Ｒａは、
【化３３９】
2021521116.tif 000369
からなる群から選択される。
【０２４９】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化３４０】
2021521116.tif 000370
またはその塩は、
【化３４１】
2021521116.tif 000371
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、構造式の化合物：
【化３４２】
2021521116.tif 000372
またはその塩は、
【化３４３】
2021521116.tif 000373
またはそれらの塩から選択される。
【０２５１】
他の実施形態では、Ｒａは、
【化３４４】
2021521116.tif 000374
からなる群から選択される。
【０２５２】
いくつかのかかる実施形態では、構造式の化合物：
【化３４５】
2021521116.tif 000375
またはその塩は、
【化３４６】
2021521116.tif 000376
またはそれらの塩からなる群から選択される。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、構造式の化合物：
【化３４７】
2021521116.tif 000377
またはその塩は、
【化３４８】
2021521116.tif 000378
またはその塩からなる群から選択される。
【０２５４】
治療方法
いずれかの対象において、対象が、当該技術分野において公知の定型的な技術を用いて、鉄代謝関連障害を有するかどうかについての評価を行うことができる（例えば、このような評価には、ヘモグロビンレベル、赤血球カウント、網状赤血球カウント、血清フェリチン、血清鉄、飽和血清トランスフェリン、血清ヘプシジン、血清ＲＧＭなどを決定するために１つ以上の血液検査が含まれ得る）。対象が鉄欠乏または鉄過剰負荷に関連する鉄関連障害を有するかどうかについての評価を行うことができ、従って、この評価は、予防的療法、維持療法または調節療法などの適切な治療方針を示すことができる。参考として、血液専門医は、患者が、正常なレベルの対応するパラメーターを有することを示すために、以下の参照番号を用いることができる。表Ａを参照されたい。
2021521116.tif 000379
【０２５５】
したがって、本明細書で提供されるのは、鉄代謝の疾患を治療、予防、調節または軽減するための方法である。本明細書で開示される化合物は、それを必要とする対象に投与することができる。本明細書で開示される化合物は、対象に治療的に有効な量で投与されてもよく、前記量は当業者によって容易に決定することができる。
【０２５６】
鉄代謝の疾患または障害は、鉄恒常性が対象においてひどく乱れている任意の疾患または障害であってもよい。この恒常性は、適切な血漿鉄レベルの適切な調節に依存している。鉄は、細胞への鉄送達のためのビヒクルであるトランスフェリンに結合し、血漿中を循環する。血漿トランスフェリンは、通常、鉄で約３０％飽和されている。したがって、トランスフェリン飽和は、鉄消費に関与する経路からの様々なシグナルに応じて、適切な生理学的レベルで維持されなければならない。
【０２５７】
対象は、疲労、関節痛、骨または関節疾患（変形性関節症、骨粗鬆症）、関節リウマチ、炎症性腸疾患、息切れ、不整脈、肝臓障害、糖尿病、不妊症、勃起不全、うつ病、気分または精神障害、低い認知技能または神経変性疾患、ＡＣＤ、鉄剤不応性鉄欠乏性貧血、慢性腎臓病の貧血、赤血球生成促進剤に対する耐性、再生不良性貧血、二価金属トランスポーター１（ＤＭＴ１）、骨髄異形成症候群、鉄芽球性貧血、低形成貧血、発作性夜間血色素尿症、フォンヴィレブランド病、血友病遺伝性出血性毛細血管拡張症、赤血球酵素異常症；グルコース−６リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤ）またはピルビン酸キナーゼ欠損症（ＰＫＤ）、無トランスフェリン血症または低トランスフェリン血症、無セルロプラスミン血症または低セルロプラスミン血症、ＣＤＡＩＩ（先天性赤血球異形成貧血）（ＨＥＭＰＡＳ（酸溶血試験陽性の遺伝性多核赤芽球症）とも呼ばれる）などの疾患もしくは障害を有するまたはそのリスクがある場合がある。好ましい実施形態では、対象は、二価金属トランスポーター１（ＤＭＴ１）が欠乏している。
【０２５８】
鉄代謝の疾患は、体内で鉄が非常に少ないものであり得る。例えば、血清鉄が６０μｇ／ｄｌ未満、５５μｇ／ｄｌ未満、５０μｇ／ｄｌ未満、４５μｇ／ｄｌ未満または４０μｇ／ｄｌ未満であると判明された場合、対象は、鉄欠乏であると診断される場合がある。対象の総鉄結合能（「ＴＩＢＣ」）が５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％または１０％よりも低い場合、鉄欠乏であると診断される場合がある。対象が、鉄欠乏でない対象と比較して、フェリチンレベルが増加している場合、鉄欠乏であると診断される場合がある。対象が、ヘモグロビンレベルが１５．５、１５、１４．５、１４、１３．５、１３、１２．５、１２、１１．５、１１、１０．５、１０、９．５、９、８．５、８、７．５、７、６．５または６ｇ／ｄｌよりも低い場合、鉄欠乏であると診断される場合がある。２５％未満、２０％未満、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％または７％未満のトランスフェリン飽和率は、鉄欠乏を指示することがある。対象は、上記される１つ以上の因子に基づいて、鉄欠乏症を有するものとして診断されてもよい。
【０２５９】
成長及び発育の重要なタイミングでの鉄欠乏は、早産、低出生体重児、成長及び発育遅延、ならびに正常な乳児の活動及び運動の遅滞をもたらす可能性がある；鉄欠乏は、学校、仕事、軍隊またはレクリエーションにおける能力不足をもたらす記憶力低下または認知能力（精神機能）低下をもたらすことがある。低ＩＱは、成長の重要な時期において生じる鉄欠乏に結びついている。
【０２６０】
鉄欠乏性貧血（「ＩＤＡ」）は、対象が身体の要求を満たすために不十分な量の鉄を有している状態である。ＩＤＡは、鉄が少なすぎる対象に関連する、血液中の赤血球量の減少に起因する。ＩＤＡは、鉄が不十分な食事によって、または失血から生じることがある。ＩＤＡは、貧血の最も一般的な形態である。女性の約２０％、妊婦の５０％、男性の３％が鉄欠乏である。
【０２６１】
鉄不応性鉄貧血（「ＩＲＩＤＡ」）を罹患した対象は、小球性貧血を患っており、不適切に高いヘプシジンレベルのため、経口療法に反応せず、部分的に、非経口鉄に対して難治性である。ＩＲＩＤＡは、膜結合性ＲＧＭｃを切断することによって、ヘプシジン発現を負に制御するセリンプロテアーゼをコードするマトリプターゼ−２遺伝子（ＴＭＰＲＳＳ６）における突然変異によって引き起こされる。
【０２６２】
したがって、本明細書で開示される化合物は、鉄欠乏、Ａｌ、及び鉄過剰を含むが、これらに限定されない任意の鉄関連障害の治療に使用され得る。過剰な鉄に起因する障害の他の例としては、肝硬変、肝がん、変形性関節症、骨減少症、骨軟化症、糖尿病、不整脈、心臓発作、甲状腺機能低下症、不妊症、勃起不全、うつ病、性腺機能低下症、及びブロンズまたはアシェングレーの肌の変色が挙げられる。本発明に従って診断して、治療し得る他の鉄関連障害の例としては、例えば、ヘモクロマトーシス、若年性ヘモクロマトーシス、後天性鉄過剰、鎌状赤血球貧血、サラセミア、アフリカ鉄沈着症、晩発性皮膚ポルフィリン症、鉄欠乏性貧血、フリードライヒ運動失調症、フェロポーチン病、高フェリチン血症、無トランスフェリン血症、及び鉄芽球性貧血が挙げられる。鉄関連障害としては、例えば、心不全、溶血性貧血、及び神経障害がさらに挙げられる。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、鉄トランスポーターの欠乏または欠陥により特徴付けられる疾患または状態の治療方法であって、治療有効量のトロポロンまたは本明細書で開示される化合物を、それを必要とする対象に投与し、前記疾患及び状態を治療することを含む、方法である。いくつかのかかる実施形態では、鉄トランスポーターの欠乏または欠陥により特徴付けられる疾患または状態は、低色素性小球性貧血である。
【０２６４】
他の実施形態では、本明細書で提供されるのは、トロポロンまたは本明細書で開示される化合物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、経上皮鉄輸送の増進方法である。
【０２６５】
さらに他の実施形態では、本明細書で提供されるのは、トロポロンまたは本明細書で開示される化合物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、生理機能の増進方法である。
【０２６６】
さらに他の実施形態では、本明細書で提供されるのは、トロポロンまたは本明細書で開示される化合物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、ヘモグロビン化の増進方法である。
【０２６７】
他の実施形態では、本明細書で提供されるのは、トロポロンまたは本明細書で開示される化合物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、鉄放出の増進方法である。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、方法は、アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）、カルシマイシン、ノナクチン、デフェリプロン、プルプロガリン、及びマルトールからなる群から選択される１つ以上のさらなる化合物の有効量を投与することをさらに含む。
【０２６９】
また、本明細書で提供されるのは、細胞中の経上皮鉄輸送、生理機能、またはヘモグロビン化のインビトロ増進方法であって、細胞を、本明細書で開示される化合物の有効量と接触させることを含む、方法である。いくつかのかかる実施形態では、方法は、細胞を、アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）、カルシマイシン、ノナクチン、デフェリプロン、プルプロガリン、及びマルトール、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の化合物の有効量と接触させることをさらに含む。
【０２７０】
他の実施形態では、本明細書で提供されるのは、臓器中の経上皮鉄輸送、生理機能、またはヘモグロビン化のエクスビボ増進方法であって、臓器を、本明細書で開示される化合物の有効量と接触させることを含む、方法である。いくつかのかかる実施形態では、方法は、臓器を、アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）、カルシマイシン、ノナクチン、デフェリプロン、プルプロガリン、及びマルトール、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の化合物の有効量と接触させることをさらに含む。
【０２７１】
医薬組成物
また、本発明の化合物、または薬学的に許容されるその塩、及び薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、医薬組成物を提供する。また、そのような医薬組成物の作製方法を提供する。方法は、本発明の化合物または薬学的に許容されるその塩を、薬学的に許容される賦形剤または担体に載置することを含む。
【０２７２】
本発明の化合物及び本発明の医薬組成物は、対象におけるがんの治療に有用である。ある特定の実施形態では、治療有効量の本発明の化合物または薬学的に許容されるその塩を、それを必要とする対象に投与することによって、がんを治療する。
【０２７３】
本明細書で使用される場合、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」または「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」は、対照と比較して、客観的に測定可能な量または程度だけ低減することを意味する。一実施形態では、阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）または阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）は、対照と比較して、少なくとも統計学的に有意な量だけ低減することを意味する。一実施形態では、阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）または阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）は、対照と比較して、少なくとも５パーセントだけ低減することを意味する。様々な個々の実施形態では、阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）または阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）は、対照と比較して、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３３、４０、５０、６０、６７、７０、７５、８０、９０、または９５パーセントだけ低減することを意味する。
【０２７４】
本明細書で使用される場合、「治療する（ｔｒｅａｔ）」及び「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、（ａ）状態または疾患を発症する危険性があるか、またはそれを有する素因があり得るが、未だそれを有すると診断されていない対象において、状態または疾患が発生するのを予防すること、（ｂ）状態または疾患を阻害すること、例えば、その発症を緩徐化または停止すること、あるいは（ｃ）状態または疾患を緩和または改善させること、例えば、状態または疾患の退行を引き起こすこと、をもたらす介入を実行することを指す。一実施形態では、本明細書で使用される場合、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」という用語は、（ａ）状態または疾患を阻害すること、例えば、その発症を緩徐化または停止すること、あるいは（ｂ）状態または疾患を緩和または改善させること、例えば、状態または疾患の退行を引き起こすこと、をもたらす介入を実行することを指す。
【０２７５】
本明細書で使用される場合、「対象」とは、生きた哺乳動物を指す。様々な実施形態では、対象は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、ウシ、または非ヒト霊長類を非限定的に含む、非ヒト哺乳動物である。一実施形態では、対象は、ヒトである。
【０２７６】
ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。
【０２７７】
本明細書で使用される場合、「投与する」は、その通常の意味を有し、静脈内、筋肉内、腹腔内、鞘内、眼内（例えば、硝子体内）、皮下、（例えば、腫瘍内への）直接注射、粘膜、吸入、経口、及び局所を非限定的に含む、任意の好適な投与経路によって投与することを網羅する。
【０２７８】
一実施形態では、投与は、静脈内である。
【０２７９】
一実施形態では、投与は、経口である。
【０２８０】
本明細書で使用される場合、「有効な量」という語句は、所望される生物学的効果を達成するのに十分な任意の量を指す。
【０２８１】
本発明の化合物は、他の治療剤と組み合わせることができ、または、本発明の他の化合物と併用してもよい。本発明の化合物及び他の治療剤は、同時投与しても、または逐次投与してもよい。他の治療剤を同時投与する場合、それらは、同じまたは別個の製剤において投与することができるが、それらは実質的に同時に投与される。他の治療剤及び本発明の化合物の投与が時間的に離れる場合、他の治療剤は互いに及び本発明の化合物と逐次投与される。これら化合物の投与間の時間の分離は、ほんの数分であるか、あるいはそれより長くてもよい。
【０２８２】
他の治療剤の例としては、抗生物質、抗ウイルス剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、抗不整脈剤、ベータ遮断薬、鎮痛剤、及び抗がん剤が挙げられる。
【０２８３】
上記で述べられた「有効量」は、所望の生物学的効果を達成するのに十分な任意の量を指す。本明細書で提供される教示と相まって、様々な活性化合物の中から選択し、さらに、例えば効力、相対的バイオアベイラビリティ、患者の体重、有害な副作用の重篤性、及び好ましい投与方法等の因子を熟慮して、実質的な望ましくない毒性を生じずかつ特定の対象を治療するのに有効である、有効な予防的または治療的な処置計画をたてることができる。任意の特定の適用のための有効量は、治療される疾患または状態、投与される本発明の特定の化合物、対象のサイズ、または疾患または状態の重篤性等の因子によって変化し得る。当業者は、本発明の特定の化合物及び／または他の治療剤の有効量を、過度の実験を必要としないで経験によって決定できる。時には、最大用量を用いることが好ましく、すなわち、それはいくつかの医学的判断に従う最大安全用量である。１日当たり複数回投与は、化合物の適切な全身レベルを達成するのに熟慮され得る。適切な全身レベルは、例えば、患者の薬物のピークまたは持続血漿レベルの測定によって決定できる。「用量」と「投与量」は、本明細書において交換可能に用いられる。
【０２８４】
一般的に、活性化合物の１日の経口用量は、ヒト対象に関して、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇから１日当たり１０００ｍｇ／ｋｇまでである。１日当たり１または数回の投与で、０．５〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲での経口用量が所望の結果をもたらすことが予測される。投与量は、局所または全身、投与方法に依存して、所望の薬物レベルを達成するように適切に調整され得る。例えば、静脈内投与は、１桁から数桁低い１日当たりの用量であろうことが予測される。そのような用量で対象における応答が不十分であるような場合には、より高い用量（または異なるより局所化された送達経路によって有効なより高い用量）を、患者の耐性が許す限りにおいて、用いることができる。１日当たり複数回投与が、化合物の適切な全身レベルを達成するために熟慮される。
【０２８５】
一実施形態では、本発明の化合物の静脈内投与は、典型的には０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜２０ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。
【０２８６】
本明細書に記載されている任意の化合物に関して、治療有効量を最初に動物モデルから決定してもよい。治療有効用量は、ヒトにおいて試験された本発明の化合物に関して、及び他の関連活性薬剤のような類似の薬理学的活性を示すことが知られている化合物に関して、ヒトデータからも決定することができる。非経口投与にはより高い用量が必要となり得る。投与される化合物の相対的バイオアベイラビリティ及び効力に基づき、適用される用量を調整できる。上記の方法及び当業界で周知の他の方法に基づき最大効果を達成するために用量を調整することは、当業者の能力の範囲内である。
【０２８７】
本発明の製剤は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存料、適合可能な担体、アジュバント、及び必要に応じて他の治療成分を通常含み得る、薬学的に許容される溶液中において投与してもよい。
【０２８８】
治療での使用のために、有効量の本発明の化合物を、本発明の化合物を所望の位置または表面に送達する任意の方法で対象に投与することができる。本発明の医薬組成物の投与は、当業者に公知の任意の手段により達成することができる。投与経路として、限定はされないが、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、直接注入（例えば、腫瘍または膿瘍内に）、粘膜、吸入、及び局所が挙げられる。
【０２８９】
静脈内及び他の非経口投与経路では、化合物は、、デスオキシコール酸を有する凍結乾燥調製物として、リポソーム挿入または封入活性化合物の凍結乾燥調製物として、水性懸濁液中の脂質複合体として、またはコレステロール硫酸複合体として製剤化され得る。凍結乾燥製剤は、一般的に好適な水性溶液中で、例えば、無菌水または生理食塩水中で投与直前に再構成される。
【０２９０】
経口投与のため、化合物（すなわち、本発明の化合物、及び他の治療剤）は、活性化合物（複数可）を、当該技術分野において周知である薬学的に許容される担体と組み合わせることによって容易に製剤化され得る。そのような担体は、本発明の化合物が、治療される対象による経口摂取用の錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、及び懸濁液などとして製剤化されることを可能にする。経口用途用の薬学的調製物は固体賦形剤として得ることができ、得られた混合物を任意で粉砕し、所望される場合、好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を処理して、錠剤または糖衣錠コアを得る。好適な賦形剤は、具体的には、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖などの充填剤；例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物である。所望される場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤が添加されてもよい。任意で、経口製剤はまた、生理食塩水または緩衝剤（例えば、体内酸状態を中和するためのＥＤＴＡ）中に製剤化されてもよく、またはいかなる担体もなくして投与されてもよい。
【０２９１】
上記の成分（複数可）の経口剤形もまた特に企図される。成分（複数可）は、誘導体の経口送達が効果的であるように化学修飾されてもよい。一般的に、企図される化学修飾は、少なくとも１つの部分の、成分分子自体への結合であり、該部分は、（ａ）酸加水分解の阻害、及び（ｂ）胃または腸からの血流内への取り込みを容認する。成分（複数可）の全体的な安定性の増加、及び体内循環時間の増加もまた所望される。そのような部分の例としては、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、及びポリプロリンが挙げられる。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，“Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ”，Ｉｎ：Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ，Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．３６７−３８３（１９８１）、Ｎｅｗｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４：１８５−９（１９８２）。使用され得る他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−チオキソカンである。上に示すように、薬学的使用のために好ましいのは、ポリエチレングリコール部分である。
【０２９２】
成分（または誘導体）について、放出場所は、胃、小腸（十二指腸、空腸、もしくは回腸）または大腸であってもよい。当業者は、胃内で溶解しないが、十二指腸または腸内の他の場所で材料を放出する入手可能な製剤を有する。好ましくは、放出は、本発明の化合物（もしくは誘導体）の保護、または腸におけるような胃環境を超える生物活性材料の放出のいずれかによって胃環境の有害作用を避ける。
【０２９３】
完全な胃抵抗性を確保するためには、少なくともｐＨ５．０に対して不透過性のコーティングが必須である。腸内コーティングとして使用されるより一般的な不活性成分の例は、セルロースアセテートトリメリテート（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ５０、ＨＰＭＣＰ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ、及びシェラックである。これらのコーティングは、混合薄膜として使用されてもよい。
【０２９４】
コーティングまたはコーティングの混合物はまた、錠剤に使用されてもよく、これは、胃に対する保護を意図するものではない。これは、糖コーティングまたは錠剤の嚥下をより容易にするコーティングを含み得る。カプセルは、乾燥治療剤（例えば、粉末）の送達用の硬質シェル（ゼラチンなど）からなってもよく、液体形態では、軟質ゼラチンシェルが使用されてもよい。カシェ剤のシェル材料は、濃厚デンプンまたは他の食用紙であり得る。丸剤、ロゼンジ、湿製錠剤、または擦り込み錠剤には、湿潤塊化技術が使用され得る。
【０２９５】
治療剤は、約１ｍｍの粒径の顆粒またはペレットの形態の微細な多微粒子として製剤中に含まれ得る。カプセル投与用の材料の製剤はまた、粉末、軽く圧縮されたプラグ、または錠剤としてでさえあってもよい。治療剤は、圧縮によって調製され得る。
【０２９６】
着色剤及び香味剤が全て含まれてもよい。例えば、本発明の化合物（または誘導体）は、（リポソームまたはマイクロスフェアの封入などによって）製剤化され、次いで、着色剤及び香味剤を含有する冷蔵飲料などの食用品中に更に含有されてもよい。
【０２９７】
不活性材料によって治療剤の体積を希釈しても、それを増加させてもよい。これらの希釈剤としては、炭水化物、特にマンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストラン、及びデンプンが挙げられ得る。三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、及び塩化ナトリウムを含む特定の無機塩もまた、充填剤として使用されてもよい。いくつかの商業的に入手可能な希釈剤は、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ１５００、Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ、及びＡｖｉｃｅｌｌである。
【０２９８】
治療剤の製剤中、固体剤形の中に、崩壊剤が含まれてもよい。崩壊剤として使用される材料としては、デンプンに基づく商業的崩壊剤であるＥｘｐｌｏｔａｂを含むデンプンが挙げられるが、これに限定されない。デンプングリコール酸ナトリウム、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸カルボキシメチルセルロース、天然スポンジ、及びベントナイトが、全て使用されてもよい。崩壊剤の別の形態は、不溶性陽イオン交換樹脂である。崩壊剤及び結合剤として粉末ゴムが使用されてもよく、これらは、寒天、カラヤ、またはトラガカントなどの粉末ゴムを含み得る。アルギン酸及びそのナトリウム塩もまた、崩壊剤として有用である。
【０２９９】
結合剤は、治療剤をともに保持して、硬質錠剤を形成するために使用され得、アカシア、トラガカント、デンプン、及びゼラチンなどの天然物からの材料を含む。他のものとしては、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）、及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が挙げられる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）はともに、治療剤を顆粒化するためにアルコール溶液中で使用されてもよい。
【０３００】
製剤プロセス中の固着を予防するために、治療剤の製剤中に抗摩擦剤が含まれてもよい。治療剤とダイ壁との間の層として、滑沢剤が使用されてもよく、これらの滑沢剤としては、ステアリン酸（そのマグネシウム塩及びカルシウム塩を含む）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油、及びワックスが挙げられるが、これらに限定されない。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、様々な分子量のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ４０００及び６０００などの好適な滑沢剤もまた使用されてもよい。
【０３０１】
製剤化中の薬物の流動特性を改善し得、圧縮中の再配置を助けるための滑剤が添加されてもよい。滑剤としては、デンプン、タルク、発熱シリカ、及び水和シリコアルミネートが挙げられ得る。
【０３０２】
水性環境への治療剤の溶解を助けるために、湿潤剤として界面活性剤が添加されてもよい。界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルナトリウムスルホサクシネート、及びジオクチルナトリウムスルホネートなどの陰イオン性洗剤が挙げられ得る。陽イオン性洗剤が使用されてもよく、塩化ベンザルコニウム及び塩化ベンゼトニウムが挙げられ得る。界面活性剤として製剤中に含まれ得る潜在的非イオン性洗剤としては、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油１０、５０、及び６０、グリセロールモノステアレート、ポリソルベート４０、６０、６５、及び８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、及びカルボキシメチルセルロースが挙げられる。これらの界面活性剤は、本発明の化合物または誘導体の製剤中に、単独でまたは異なる比率の混合物として存在し得る。
【０３０３】
経口使用され得る薬学的調製物としては、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル、及びゼラチン及び可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）製の軟質密封カプセルが挙げられる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、及び／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、任意で安定剤との混合において、活性成分を含有し得る。軟質カプセルにおいて、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に溶解もしくは懸濁され得る。更に、安定剤が添加されてもよい。経口投与用に製剤化されたマイクロスフェアもまた、使用されてもよい。そのようなマイクロスフェアは、当該技術分野において明確に定義されている。経口投与のための全ての製剤は、そのような投与に好適な投与量であるべきである。
【０３０４】
頬側投与では、組成物は、従来の様式で製剤化された錠剤またはロゼンジの形態を取り得る。
【０３０５】
吸入による投与では、本発明に従う使用のための化合物は、好適な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適なガス）を使用して、便宜的に加圧パックまたは噴霧吸入器からのエアロゾルスプレー形の形態で送達されてもよい。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、定量を送達するバルブを提供することによって決定され得る。吸入器または気腹器における使用のための、例えばゼラチンのカプセル及び薬包は、化合物と好適な粉末ベース（ラクトースまたはデンプンなど）との粉末混合物を含有して製剤化されてもよい。
【０３０６】
本発明の化合物（またはその誘導体）の肺送達もまた、本明細書に企図される。本発明の化合物（または誘導体）は、吸入中に哺乳動物の肺に送達され、肺上皮内層を横切って血流へと横断する。吸入された分子についての他の報告としては、Ａｄｊｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ７：５６５−５６９（１９９０）、Ａｄｊｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ６３：１３５−１４４（１９９０）（酢酸ロイプロリド）、Ｂｒａｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １３（ｓｕｐｐｌ．５）：１４３−１４６（１９８９）（エンドセリン−１）、Ｈｕｂｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌ  Ｉｎｔ  Ｍｅｄ  ３：２０６−２１２（１９８９）（α１−アンチトリプシン）、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８４：１１４５−１１４６（ａ−１−プロテイナーゼ）、Ｏｓｗｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，“Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ＩＩ，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，Ｍａｒｃｈ，（組み換えヒト増殖ホルモン）、Ｄｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４０：３４８２−３４８８（インターフェロン−ガンマ及び腫瘍壊死因子アルファ）、及びＰｌａｔｚらの米国特許第５，２８４，６５６号明細書（顆粒球コロニー刺激因子）が挙げられる。全身的作用のための薬物の肺送達のための方法及び組成物は、１９９５年９月１９日にＷｏｎｇらに対して発行された米国特許第５，４５１，５６９号明細書に説明される。
【０３０７】
本発明の実施における使用のために、噴霧吸入器、定用量吸入器、及び粉末吸入器（その全てが当業者に知られる）を含むが、これらに限定されない、治療製品の肺送達用に設計された多種多様な機械装置が企図される。
【０３０８】
本発明の実施に好適な商業的に入手可能な装置のいくつかの具体的な例は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．製造のＵｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧吸入器、Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏ．製造のＡｃｏｒｎ  ＩＩ噴霧吸入器、Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ製造のＶｅｎｔｏｌｉｎ定用量吸入器、及びＦｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．製造のＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器である。
【０３０９】
全てのそのような装置は、本発明の化合物（または誘導体）の吐出に好適な製剤の使用を必要とする。典型的には、各製剤は、用いられる装置の種類に特異的であり、治療において有用である通常の希釈剤、アジュバント、及び／または担体に加えて、適切な噴霧剤材料の使用に関与し得る。また、リポソーム、マイクロカプセル、もしくはマイクロスフェア、包接複合体、または他の種類の担体の使用が企図される。化学修飾された本発明の化合物はまた、化学修飾の種類または用いられる装置の種類によって、異なる製剤中に調製され得る。
【０３１０】
ジェットまたは超音波のいずれかの噴霧吸入器との使用に好適な製剤は、典型的には１ｍＬの溶液当たり、本発明の生物活性化合物の約０．１〜２５ｍｇの濃度で水中に溶解した本発明の化合物（または誘導体）を含むであろう。製剤はまた、緩衝剤及び単純糖を含んでもよい（例えば、本発明の化合物では、浸透圧の安定化及び制御）。噴霧吸入器製剤はまた、エアロゾル形成時の溶液の微粒化によって引き起こされる本発明の化合物の表面誘起凝集を低減または予防するために、界面活性剤を含有してもよい。
【０３１１】
定用量吸入器装置での使用のための製剤は、一般的に、界面活性剤の助けを借りて噴霧剤中に懸濁した本発明の化合物（またはその塩）を含有する微細に分割された粉末を含むであろう。噴霧剤はまた、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、及び１，１，１，２−テトラフルオロエタン、もしくはこれらの組み合わせを含む、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、またはヒドロカーボンなどの、この目的のために用いられる任意の従来の材料であってもよい。好適な界面活性剤としては、ソルビタントリオレエート及び大豆レシチンが挙げられる。オレイン酸もまた、界面活性剤として有用であり得る。
【０３１２】
粉末吸入器装置から吐出するための製剤は、本発明の化合物（または誘導体）を含有する微細に分割された乾燥粉末を含み、装置からの粉末の分散を促進する量（例えば、製剤の５０〜９０重量％）のラクトース、ソルビトール、スクロース、またはマンニトールなどの増量剤もまた含んでもよい。本発明の化合物（または誘導体）は、肺深部への最も効果的な送達のため、１０マイクロメートル（μｍ）未満、最も好ましくは０．５〜５μｍの平均粒径を有する微粒子形態で有利に調製されるべきである。
【０３１３】
本発明の医薬組成物の経鼻送達もまた、企図される。経鼻送達は、製品を肺内に沈着させる必要性なく、治療製品の鼻への投与直後に、本発明の医薬組成物が血流へと通過することを可能にする。経鼻送達用の製剤としては、デキストランまたはシクロデキストランを有するものが挙げられる。
【０３１４】
経鼻投与では、有用な装置は、定用量スプレー器が取り付けられる小型硬質ビンである。一実施形態では、定用量は、本発明の溶液の医薬組成物を規定体積のチャンバー内へと引くことによって送達され、このチャンバーは、チャンバー内の液体が圧縮されるときにスプレーを形成することによって、エアロゾル製剤をエアロゾル化するように寸法形成された開口を有する。チャンバーが圧縮されて、本発明の医薬組成物が投与される。特定の一実施形態では、チャンバーはピストン配置である。そのような装置は、商業的に入手可能である。
【０３１５】
あるいは、圧搾されるときにスプレーを形成することによって、エアロゾル製剤をエアロゾル化するように寸法形成された開口または開口部を有するプラスチック圧搾ビンが使用される。開口部は通常ビンの上部に見られ、上部は一般的に、エアロゾル製剤の効率的な投与のため、鼻道内に部分的に適合するように細くなる。好ましくは、経鼻吸入器は、定用量の薬物の投与のために定量のエアロゾル製剤を提供するであろう。
【０３１６】
化合物は、それらを全身的に送達することが望ましい場合、注射による（例えば、ボーラス注射または持続注入による）非経口投与用に製剤化されてもよい。注射用の製剤は、単位剤形で、例えば、保存剤が添加されたアンプルまたは複数用量容器中に提供されてもよい。本組成物は、油性もしくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンなどの形態を取ってもよく、懸濁液、安定剤、及び／または分散剤などの製剤用剤を含有してもよい。
【０３１７】
非経口投与用の医薬製剤は、水溶性形態の活性化合物の水性溶液を含む。更に、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製されてもよい。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。任意で、懸濁液はまた、好適な安定剤または化合物の溶解度を増加させる薬剤を含有して、高濃度の溶液の調製を可能にしてもよい。
【０３１８】
あるいは、活性化合物は、好適なビヒクル（例えば、発熱物質を含有しない水）による構成のために、使用前には粉末形態であってもよい。
【０３１９】
化合物はまた、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤ベースを含有する、坐剤もしくは停留浣腸剤などの直腸組成物または腟組成物中に製剤化されてもよい。
【０３２０】
上述する製剤に加えて、化合物はまた、デポー調製物として製剤化されてもよい。そのような長時間作用性製剤は、（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）好適なポリマー材料もしくは疎水性材料によって、またはイオン交換樹脂として、あるいは難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として製剤化されてもよい。
【０３２１】
医薬組成物はまた、好適な固相もしくはゲル相の担体または賦形剤を含んでもよい。そのような担体または賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、及びポリエチレングリコールなどのポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２２】
好適な液体または固体医薬組成物形態は、例えば、吸入用の水溶液または生理食塩水溶液、マイクロカプセル化されたもの、蝸牛状化（ｅｎｃｏｃｈｌｅａｔｅｄ）されたもの、微視的金粒子上にコーティングされたもの、リポソームに含有されたもの、噴霧化されたもの、エアロゾル、皮膚内への埋め込み用のペレット、または皮膚に擦り付けられるように鋭利な物体上に乾燥されたものである。医薬組成物はまた、顆粒、粉末、錠剤、コーティングされた錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、エマルジョン、懸濁液、クリーム、液滴、または活性化合物を遅延放出する調製物を含み、これらの調製において、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、滑沢剤、香味剤、甘味剤、もしくは可溶化剤などの賦形剤及び添加剤及び／または補助剤が、上述の通り習慣的に使用され得る。医薬組成物は、様々な薬物送達系における使用に好適である。薬物送達のための方法の簡潔な概説については、Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−３３（１９９０）（参照によって組み込まれる）を参照されたい。
【０３２３】
本発明の化合物及び任意で他の治療剤は、それ自体（未希釈）で、または薬学的に許容される塩の形態で投与され得る。医薬において使用される場合、塩は薬学的に許容されるべきであるが、その薬学的に許容される塩を調製するために、薬学的に許容されない塩が便宜的に使用されてもよい。そのような塩としては、以下の酸、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、及びベンゼンスルホン酸から調製される塩が挙げられるが、これらに限定されない。また、そのような塩は、カルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩、またはカルシウム塩などのアルカリ金属またはアルカリ土類塩として調製され得る。
【０３２４】
好適な緩衝剤としては、酢酸及び塩（１〜２％ｗ／ｖ）、クエン酸及び塩（１〜３％ｗ／ｖ）、ホウ酸及び塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）、ならびにリン酸及び塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）が挙げられる。好適な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）、クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）、パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）、及びチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）が挙げられる。
【０３２５】
本発明の医薬組成物は、有効な量の本発明の化合物及び任意で薬学的に許容される担体中に含まれる治療剤を含有する。「薬学的に許容される担体」という用語は、ヒトまたは他の脊椎動物への投与に好適である、１つ以上の適合する固体もしくは液体充填剤、希釈剤、または封入物質を意味する。「担体」という用語は、適用を促進するために活性成分が組み合わされる、天然もしくは合成の有機または無機成分を表す。医薬組成物の成分はまた、所望される薬学的効率を実質的に損なう相互作用が存在しないような様式で、本発明の化合物と、及び互いに混成されることができる。
【０３２６】
本発明の化合物を特に含むが、これらに限定されない治療剤（複数可）は、粒子で提供されてもよい。本明細書で使用される場合、粒子は、全体もしくは一部分が本発明の化合物または本明細書に説明する他の治療剤（複数可）からなる、ナノ粒子もしくはマイクロ粒子（またはいくつかの場合より大きな粒子）を意味する。粒子は、腸内コーティングを含むが、これに限定されないコーティングに包まれたコアに、治療剤（複数可）を含有してもよい。治療剤（複数可）はまた、粒子を通して分散されてもよい。治療剤（複数可）はまた、粒子内に吸収されてもよい。粒子は、ゼロ次放出、１次放出、２次放出、遅延放出、持続放出、即時放出、及びこれらの任意の組み合わせなどを含む、任意の次数の放出速度論のものであり得る。粒子は、治療剤（複数可）に加えて、侵食性、非侵食性、生分解性、もしくは非生分解性材料、またはこれらの組み合わせを含むが、これに限定されない、薬学及び医学の当該技術分野において通例使用されるこれらの材料のうちのいずれかを含んでもよい。粒子は、溶液中の、または半固体状態の本発明の化合物を含有するマイクロカプセルであってもよい。粒子は、実質的にいかなる形状のものであってもよい。
【０３２７】
非生分解性または生分解性ポリマー材料の両方が、治療剤（複数可）を送達するための粒子の製造において使用され得る。そのようなポリマーは、天然ポリマーまたは合成ポリマーであり得る。ポリマーは、放出が所望される期間に基づいて選択される。特に対象となる生体付着性ポリマーは、Ｓａｗｈｎｅｙ  Ｈ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２６：５８１−７に説明される生侵食性ヒドロゲルを含み、その教示は本明細書に組み込まれる。これらには、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギネート、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、及びポリ（オクタデシルアクリレート）が挙げられる。
【０３２８】
治療剤（複数可）は、制御された放出系内に含有されてもよい。「制御された放出」という用語は、製剤からの薬物放出の様式及びプロファイルが制御される、任意の薬物含有製剤を指すことが意図される。これは、即時及び非即時放出製剤を指し、非即時放出製剤としては、持続放出製剤及び遅延放出製剤が挙げられるが、これらに限定されない。「持続放出」という用語（「徐放」とも呼ばれる）は、その従来の意味において使用されて、長期間にわたって薬物の徐々の放出を提供し、必然的ではないものの、好ましくは、長期間にわたって実質的に一定の薬物の血中レベルをもたらす薬物製剤を指す。「遅延放出」という用語は、その従来の意味において使用されて、製剤の投与とそこからの薬物の放出との間に時間遅延が存在する薬物製剤を指す。「遅延放出」は、長期間にわたる薬物の徐々の放出に関与しても、しなくてもよいため、「持続放出」であっても、なくてもよい。
【０３２９】
長期間の持続放出埋め込み剤の使用は、慢性病態の治療に特に好適であり得る。「長期間の」放出は、本明細書で使用される場合、埋め込み剤が、少なくとも７日間、好ましくは３０〜６０日間、治療レベルの活性成分を送達するように構築され、配置されることを意味する。長期間の持続放出埋め込み剤は、当業者に周知であり、上述する放出系のいくつかを含む。
【０３３０】
本明細書に説明される組成物及び方法に対する好適な修飾及び適合は、当業者に既知である情報に照らして、本明細書に含まれる本発明の説明から容易に明らかであり、本発明またはその任意の実施形態の範囲から逸脱することなくなされ得ることが、当業者によって理解されるであろう。
【実施例】
【０３３１】
ここまで概して本発明を説明しているが、それは、本発明の特定の態様及び実施形態の説明のみのために含まれ、本発明を限定することが意図されない、以下の実施例への参照により、よりはっきりと理解されるであろう。
【０３３２】
実施例１：小分子による鉄輸送の回復は、動物における吸収及びヘモグロビン化を促進する
概要
本実施例は、小分子天然物のヒノキチオールが、そのような勾配を抑えて、細胞への、細胞内及び／または細胞外への鉄輸送を回復させることができることを示す。同じ化合物は、ＤＭＴ１欠乏ラット及びフェロポーチン欠乏マウスにおける腸鉄吸収、並びにＤＭＴ１−及びマイトフェリン欠乏ゼブラフィッシュにおけるヘモグロビン化を促進する。これらの所見は、鉄輸送の小分子媒介部位及び方向選択的回復における一般的な機構の枠組みを示す。これらの所見はまた、鉄のタンパク質トランスポーター、あるいは、他のイオンを欠かせる機能を部分的に模倣する小分子が、ヒト疾患を治療する可能性を有し得ることを示唆する。
【０３３３】
部位及び方向選択的膜貫通イオン輸送は、局所電気化学的勾配を生成する能動イオン輸送タンパク質と、それらを使用する受動イオン輸送タンパク質との協調的機能を介して、ほとんどの生体系において達成される（１）。受動イオン輸送タンパク質の欠乏は、貧血、嚢胞性線維症、不整脈、及び神経、骨格筋、内分泌、及び腎障害を含む多くのヒト疾患を引き起こす（２〜５）。対応する能動イオン輸送タンパク質は、典型的には、機能を維持するため、これらの欠如しているタンパク質を正常に提供する膜の上流のイオン勾配を蓄積し得る。これらの堅牢なネットワークが、多くのイオン輸送タンパク質の非選択的な性質にもかかわらず、イオン選択的輸送を達成する能力に留意すると（１、２）、イオン輸送を自律的に行うことができる小分子は、そのような勾配を活用して、膜貫通イオンフラックスを部位及び方向選択的に回復させることができたと仮説を立てた（図１Ａ）。
【０３３４】
鉄恒常性は、能動及び受動鉄輸送タンパク質と、本質的な使用が可能なそれらの調節物質との動的ネットワークによって維持される一方、この酸化還元活性金属の毒性を最小限にする（２）。鉄排泄の既知の調節機構は存在しないため（６）、全身の鉄レベルは、食事に含まれる鉄吸収の厳格な調節を通じて主に制御される（２、６）。鉄輸送、恒常性、または代謝に関与するタンパク質の欠乏または機能不全は、細胞への、細胞内及び／または細胞外への鉄の移動を妨げることが多く（図１Ａ）、２５個を超えるメンデル病と関連している（表Ｓ１）（６〜９）。小分子鉄トランスポーターが、そのような状況において選択的に蓄積する不安定な鉄プール（２）の膜貫通勾配を活用して、細胞への、細胞内及び／または細胞外への鉄の移動を回復させることで、内因性の鉄依存性生理学的プロセスにおけるその使用が可能になるかどうかが問題であった（図１Ａ）。
【０３３５】
異なる方向、細胞位置、及び組織における鉄移動を混乱させる３つの疾患関連鉄トランスポーター欠乏を、この試験のために具体的に選択した（２、６）。二価金属トランスポーター１（ＤＭＴ１、ａｋａ  Ｎｒａｍｐ２、ＤＣＴ１、ＳＬＣ１１Ａ２）の欠乏は、十二指腸腸細胞の頂端側の鉄取り込みを低下させ、赤血球前駆細胞におけるエンドソーム鉄放出を予防する（２、６）。ミトコンドリア内膜におけるマイトフェリン（Ｍｆｒｎ１、ａｋａ  ＳＬＣ２５Ａ３７）欠乏は、ミトコンドリア基質への鉄流入を損なう（１０、１１）。フェロポーチン（ＦＰＮ１、ａｋａ  ＩＲｅｇ１、ＭＴＰ１、ＳＬＣ４０Ａ１）欠乏は、腸上皮及び細網内皮系マクロファージからの鉄流出を低下させる（１２〜１５）。
【０３３６】
以前の報告は、デフェリプロン及びピリドキサールイソニコチノイルヒドラゾン（ＰＩＨ））などの、高用量の親水性鉄キレート剤、並びにサリシルアルデヒドイソニコチノイルヒドラゾン（ＳＩＨ）などの親油性の高い誘導体が、過剰な鉄に結合して、再配置させ得ることを示唆している（１６、１７）。しかしながら、これらのキレート剤のうちの多くの対応する錯体は、限られた膜透過を示し、共局在タンパク質が鉄動員を達成する働きを必要とする場合がある（１８、１９）。あるいは、膜貫通鉄輸送を自律的に行って、上述のタンパク質の各々が欠如している細胞及び動物における生理機能を促進することができる親油性小分子を特定しようとした。
【０３３７】
酵母における小分子媒介機能的相補性
そのような分子を見つけるため、修正された機能的相補性実験（２０）を設計し、ここで、鉄に結合すると知られているかまたは予測される候補化合物を、鉄輸送錯体ＦｅｔＦｔｒ１（ｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ）が欠如しているＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株への増殖を回復させる能力を試験した（２１）。デフェリプロン、ＰＩＨ、及びＳＩＨは、増殖救出を示さなかった（図７Ｂ）。これに対し、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ（タイワンヒノキ）木の精油から野副によって最初に単離された、天然物ヒノキチオール（Ｈｉｎｏ、β−ツヤプリシン、図１Ｂ）（２２）は、非常に効果的であった（図１Ｃ〜Ｅ及び図８Ａ）。この天然物は、広範な他の生物活性を発揮する鉄及び他の金属の強力なキレート剤（２３〜２６）として以前に特徴付けられている（２５〜３１）。ヒノキチオールは、発酵及び呼吸状態下（図１Ｄ及び図８Ａ）、かつ、公知のシデロホアトランスポーターに非依存的に（図８Ｂ）、鉄トランスポーター欠乏酵母への増殖を回復させた（２１、３２）。ヒノキチオールは、同様の倍加時間により野生型レベルへの増殖を持続的に回復させる（図１Ｅ及び図８Ｃ〜Ｅ）。
【０３３８】
水素化分解によるＣ−２酸素原子の合成除去により、Ｃ２−デオキシヒノキチオールが得られた（Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏ、図１Ｂ及び図８Ｆ）。ヒノキチオールとは対照的に、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏは、鉄に結合するかまたは鉄を輸送することができないため、陰性対照として機能させた（図９Ａ、Ｂ）。ヒノキチオールは、酵母増殖を用量依存的に回復させる一方、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏは、回復させない（図１Ｆ）。ヒノキチオールはまた、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏではなく、鉄流入を回復させ（図１Ｇ）、ヒノキチオール媒介増殖は、鉄依存性である（図８Ｇ、Ｈ）。増殖回復は、他の親油性α−ヒドロキシケトンで同様に観察されたが、親水性α−ヒドロキシケトンでも、他のイオンを輸送する小分子でも観察されなかった（図７Ａ〜Ｃ及び図８Ｉ）。
【０３３９】
ヒノキチオールによる鉄結合及び輸送の特徴付け
ヒノキチオールが、第一鉄及び第二鉄に結合して、脂質膜を横断して第一鉄及び第二鉄を輸送する能力をより良く理解するために、生物物理実験を行った。この天然物は、第二鉄または第一鉄を添加する際の色及びＵＶ−Ｖｉｓスペクトルの急激な変化から明らかなように、鉄に速やかに結合して、ヒノキチオール：鉄錯体を形成する（図２Ａ、Ｂ及び図９Ａ、Ｃ）。水溶性鉄キレート剤（１７）と異なり、ヒノキチオール：鉄錯体は、水上の無極性溶媒中に優勢的に分配する（図２Ａ及び図８Ｉ）。例えば、９５％超のヒノキチオール：鉄錯体は、水上のオクタノール中に分配する一方、デフェリプロン：鉄錯体は、あるいは、水中に９５％超の分配を呈する（図８Ｉ）。これは、ＩＣＰ−ＭＳ分析を介して決定されたように、水性層から有機層へのヒノキチオール：鉄錯体の定量的抽出と合致する（図９Ｄ）。
【０３４０】
ヒノキチオールは、第一鉄及び第二鉄に強く結合し、第一鉄では、ＫＡ＝５．１×１０１５、第二鉄では、ＫＡ＝５．８×１０２５であり、後者は、デフェリプロンよりも一桁を超えて強力である（図９Ｅ〜Ｈ及び表２）。その高親和性と合致して、ヒノキチオールは、不安定な鉄プールを構成する鉄クエン酸錯体から鉄を除去する（図９Ａ）。緩衝溶液中で、競合実験は、ヒノキチオールが、鉄結合タンパク質であるトランスフェリン及びフェリチンから鉄を除去することもできるが、ヒノキチオールを、トランスフェリンに比べて１，０００倍超過剰に、フェリチンに比べて１，０００，０００倍超過剰に使用した場合のみであることを示す（図９Ｉ〜Ｋ）。ヒノキチオールは、ｐＫａ＝７．３３を有し、中性及び陰イオン状態の両方が、生理学的条件下でアクセス可能であることを示唆する（図９Ｌ）。さらに、ヒノキチオールに結合した５６Ｆｅは、溶液中の５５Ｆｅと容易に置換され、２０％超の置換が、１０分以内に観察された（図９Ｍ）。従って、生理学的条件下のヒノキチオールによる鉄の結合は、非常に動的であると予想され、ヒノキチオール錯体から鉄結合タンパク質への鉄の簡単に放出、及び鉄関連生理学的プロセスにおけるその後の使用を可能にし得る。
【０３４１】
ヒノキチオールは、モデルリポソーム膜を横断して第一鉄及び第二鉄の両方を自律的に輸送する一方、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏ、デフェリプロン、及びＰＩＨは、最小輸送を示す（図２Ｃ、Ｄ）。輸送活性錯体はまだ特定されていないが、種形成研究は、水性緩衝液中の３：１  Ｈｉｎｏ：ＦｅＩＩＩ錯体の優勢的な形成と合致する（図９Ｎ、Ｏ）。トリス（ヒナコラト）鉄（ＩＩＩ）のＸ線結晶構造分析は、一対のＣ１−対称錯体を明らかにし、各々は、親水性の鉄結合中心コアを包み込む親油性の外側シェルからなった（図２Ｅ及び図９Ｐ）。
【０３４２】
ヒノキチオールは、多数の二価金属に結合し、輸送することができる広域のスペクトルメタロフォアである（図１０Ａ〜Ｉ、及び表Ｓ３）。ヒノキチオールは、ＦｅＩＩよりもＣｕＩＩに１０倍以上競合的に結合し、リポソーム中でＦｅＩＩよりもＣｕＩＩを８０倍速く輸送したが、銅の低アクセシビリティは、インビボでの高い鉄選択性をもたらす可能性がある。具体的に、サイトゾルの不安定な銅プールは、鉄よりも１００億倍低い（表Ｓ３）（３３〜３５）。これは、並外れた親和性及び選択性でＣｕＩＩに結合するトランスポーター、シャペロン、貯蔵タンパク質、流出タンパク質、及び調節物質の堅牢なネットワークによるものである（３５）。例えば、酵母銅恒常性の調節に不可欠である転写活性物質Ｍａｃ１は、９．７×１０−２０ＭのＫＤで銅に結合する（３５）。ヒノキチオールによるｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母を処理する際に、細胞内鉄レベルは、ビヒクル処理対照に比べて増加した一方、マンガン、コバルト、ニッケル、亜鉛、及び銅のレベルは、変化しなかった（図１０Ｊ）。
【０３４３】
水性系におけるＦｅ（Ｈｉｎｏ）３の酸化還元電位は、遊離鉄の＋７７０ｍＶと比較して、−３６１ｍＶまで低下すると推定される（図２Ｆ、図１１Ａ〜Ｊ、及び表Ｓ２、４〜６）。これと合致して、還元環境において、鉄（ＩＩＩ）の還元は、ヒノキチオールの存在下で遅くなるが、２時間未満ではまだほぼ定量的である（図１１Ｋ、Ｌ）。さらに、酸化還元電位は、ｐＨの減少及びヒノキチオール濃度の減少に伴って増加する（図１１Ｆ、Ｉ、Ｊ及び表Ｓ４、５）。まとめると、これらのデータは、第二鉄及び第一鉄の両方が、生理学的条件下で、ヒノキチオールの存在下で容易にアクセスできる必要があることを示唆する。
【０３４４】
鉄輸送の回復は、細胞における吸収及びヘモグロビン化を促進する
従って、ヒノキチオールが、ＤＭＴ１、Ｍｆｒｎ１、またはＦＰＮ１が欠乏している哺乳動物細胞への、哺乳動物細胞内及び／または哺乳動物細胞外への鉄移動を促進することができたかどうか仮説を立てた。安定したｓｈＲＮＡトランスフェクション（図１２Ａ〜Ｃ）を介して確立された、分化ＤＭＴ１欠乏Ｃａｃｏ−２腸上皮単層（図Ｓ１Ａ）における鉄の取り込み及び経上皮輸送（３６、３７）について最初に試験した。野生型対照に比べて、ＤＭＴ１欠乏単層は、５５ＦｅＣｌ３の頂端側への添加後に、細胞への鉄の取り込みの低下、及び側底液への経上皮鉄輸送の低下を示した（図３Ａ、Ｂ）。ヒノキチオール（５００ｎＭ）の頂端側への添加は、腸内の滞留時間に見合った時間枠で取り込み及び輸送（図３Ａ、Ｂ）を回復させた（図３Ｃ）。ヒノキチオールは、単層の一体性を混乱させなかったが（図１２Ｄ）、観察可能な毒性を引き起こさず（表Ｓ７）、及び基底ＤＭＴ１発現に影響を及ぼさなかった（図１２Ｂ、Ｃ）。ヒノキチオール媒介輸送は、十二指腸全体に見られるｐＨの範囲にわたって生じ、ｐＨの減少に伴って増加する（図１２Ｅ）。ヒノキチオールが、広範囲の濃度にわたって取り込み及び輸送を促進する一方、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏ、及び準毒性濃度の鉄キレート剤：デフェリプロン、デフェロキサミン、ＰＩＨ、及びＳＩＨは、取り込み及び輸送の両方を促進しなかった（図１２Ｆ、Ｇ及び表Ｓ７）。高濃度のこれらのより親水性の鉄キレート剤は、あるいは、ＤＭＴ１欠乏単層への鉄の取り込みを減少させた（図１２Ｆ）。
【０３４５】
ＤＭＴ１が、欠如、欠失、または低形質である場合には、赤血球系前駆細胞のエンドソームからの細胞内鉄（ＩＩ）流出は除外されるため、ヘモグロビン化を予防する（図Ｓ１Ｂ）（２、６、３８）。ヒノキチオールの不在下または存在下で、ＤＳ１９マウス赤白血病（ＭＥＬ）細胞（３９）、並びにｓｈＲＮＡトランスフェクトＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞におけるＤＭＳＯ誘導分化及びヘモグロビン化を試験した（図１３Ａ〜Ｃ）。対照細胞は、細胞ペレットにおけるヘモグロビンの特徴的なピンク色（図３Ｄ）、及びｏ−ジアニシジンによるヘモグロビン化細胞の茶色染色によって示されるように、３日後に正常に分化した（図１３Ｄ、Ｅ）。ヘモグロビン化の低下は、ＤＭＴ１欠乏細胞において観察された（図３Ｄ〜Ｆ、及び図１３Ｄ〜Ｆ）。３日間のヒノキチオール処理（１μＭ）は、観察可能な毒性を有さずに、５５Ｆｅ取り込み（図１３Ｆ）、５５Ｆｅ−ヘム組み込み（図３Ｆ）、及びヘモグロビン化（図３Ｄ及び図１３Ｄ〜Ｊ）を回復させた一方（図１３Ｋ及び表Ｓ７）、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏは、効果がなかった（図３Ｅ、Ｆ及び図１３Ｆ、Ｉ、Ｊ）。予想した通り、分化は、ヒノキチオール処理（図１３Ｌ）の有無に依らず、ＤＭＳＯの不在下で観察されなかった。
【０３４６】
ＤＭＴ１欠乏細胞へのかつＤＭＴ１欠乏細胞内への鉄のヒノキチオール媒介輸送が観察された後、同じ小分子を、他の鉄輸送タンパク質と置き換えることができるかどうかも仮説を立てた。ミトコンドリア内膜中のＭｆｒｎ１は、鉄をミトコンドリア基質に流入させて、ヘモグロビン化させる（図Ｓ１Ｃ）（２、１０）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介ノックアウトを介して発育させたＭｆｒｎ１欠乏ＭＥＬ細胞（図１４Ａ）は、ＤＭＳＯ誘導後に、ｏ−ジアニシジン染色（図３Ｇ）、５５Ｆｅ取り込み（図１４Ｂ）、及び５５Ｆｅ−ヘム組み込み（図１４Ｃ）によるヘモグロビン化の低下を呈した。ヒノキチオール（１μＭ）は、ヘモグロビン化を回復させた一方、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏは、効果を示さず（図３Ｇ及び図１４Ｂ、Ｃ）、鉄のヒノキチオール媒介ミトコンドリア送達を示唆する。予想した通り、ヒノキチオールは、ポルフィリン生合成に関与するタンパク質があるいは欠乏しているＭＥＬ細胞（ＴＭＥＭ１４ＣΔ）へのヘモグロビン化を促進しなかった（図１４Ｄ〜Ｆ）。
【０３４７】
ＦＰＮ１欠乏は、腸上皮の側底側膜を横断する鉄流出（図Ｓ１Ｄ）、及び老化赤血球から鉄を再利用する細網内皮系マクロファージからの鉄流出（図Ｓ１Ｅ）を低下させる（１３、１４）。ケルセチン（４０）及びヘプシジン（４１）を使用して、分化Ｃａｃｏ−２上皮単層及びＪ７７４マクロファージ（４１）のＦＰＮ１レベルをそれぞれ一時的に減少させた（図１４Ｇ〜Ｊ）。ヒノキチオール（１μＭ）は、鉄の取り込みに影響を与えることなく（図３Ｉ）、かつ、単層の一体性を破壊することなく（図１４Ｌ）、ＦＰＮ１欠乏Ｃａｃｏ−２単層における経上皮鉄輸送を回復させた（図３Ｈ及び図１４Ｋ）。ヒノキチオールはまた、観察可能な毒性なく、ＦＰＮ１欠乏Ｊ７７４マクロファージからの鉄放出を時間依存的かつ用量依存的に回復させた（図３Ｊ、Ｋ、図１４Ｍ、及び表Ｓ７）。
【０３４８】
鉄勾配の部位及び方向選択的蓄積及び放出
その後、ヒノキチオールが、トランスポーター欠乏系における蓄積膜貫通鉄勾配を抑えることによって、部位及び方向選択的鉄移動を促進するという機構仮説（図１Ａ）について調査した。ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞におけるコンパートメント化された鉄を蛍光色素で最初に視覚化した（図１５Ａ〜Ｃ）（４２、４３）。ｏｘｙｂｕｒｓｔグリーン−ＢＳＡコンジュゲートは、鉄媒介酸化の際にエンドソーム蛍光に局在し（図１５Ｃ）、サイトゾル及びミトコンドリアにそれぞれおける閉鎖型プローブのカルセイングリーン（図１５Ａ）及びＲＰＡ（図１５Ｂ）からの蛍光発光は、鉄結合の際に消失される。比較的低いエンドソーム、高いサイトゾル、及び高いミトコンドリア鉄レベルは、誘導ｓｈ対照ＭＥＬ細胞で観察された（図４Ａ及び図１６Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｈ）。ＤＭＴ１欠乏ＭＥＬ細胞における鉄促進ｏｘｙｂｕｒｓｔグリーン蛍光の２倍増加は、サイトゾル及びミトコンドリア鉄の低下（図４Ａ及び図１６Ａ、Ｅ、Ｈ）と共に観察された（図４Ａ及び図１６Ａ、Ｂ）。ヒノキチオール処理は、ｏｘｙｂｕｒｓｔグリーン蛍光を２．１倍減少させて、カルセイングリーン及びＲＰＡ蛍光を付随して消失した（図４Ａ及び図１６Ａ〜Ｊ）。任意の１つの特定の理論に束縛されることなく、これらのデータは、エンドソーム鉄の蓄積プールのサイトゾルへのヒノキチオール媒介放出、及びその後のミトコンドリアの取り込みを支援する。
【０３４９】
カルセイングリーン及び５５Ｆｅ試験はまた、野生型細胞に比べて、ＦＰＮ１欠乏Ｊ７７４マクロファージにおける不安定な鉄の蓄積を明らかにした（図４Ｂ〜Ｄ）。ヒノキチオールは、高い細胞外または細胞内鉄の存在にそれぞれ依存して、Ｊ７７４マクロファージからの鉄流入（図４Ｅ）及び流出（図３Ｊ及び図１４Ｍ）の両方を方向選択的に促進する。さらに、リポソームからのヒノキチオール媒介鉄（ＩＩ）及び鉄（ＩＩＩ）流出、及びＪ７７４マクロファージへの鉄（ＩＩＩ）の取り込みは、膜貫通鉄勾配に正比例する（図４Ｅ〜Ｇ及び図１７Ａ〜Ｄ）。最終的に、Ｊ７７４マクロファージに鉄を負荷し、細胞を濯いで、細胞外鉄を除去し、カルセイングリーンで染色した（図１７Ｅ）。ヒノキチオール添加（ｔ＝５分）は、カルセイングリーン蛍光を急速に増加させた一方、ビヒクル及びＣ２ｄｅＯＨｉｎｏは、効果がなかった（図４Ｈ、Ｉ、図１８Ａ〜Ｃ、及び動画Ｓ１）。その後、ＦｅＣｌ３（ｔ＝１２分）の外部添加を介して、これらの同じ細胞における勾配が逆転した（図１７Ｅ）。ＤＭＳＯまたはＣ２ｄｅＯＨｉｎｏ処理細胞は、効果がなかった（図４Ｉ及び図１８Ａ、Ｃ）一方、カルセイングリーン蛍光の消失は、ヒノキチオール処理で観察された（図４Ｈ、Ｉ、図１８Ｂ）。これらの結果は、細胞内鉄レベルが高い場合のＪ７７４マクロファージからの鉄の最初のヒノキチオール媒介放出、その後、この膜貫通勾配が細胞外鉄の添加により逆転する場合にこれらのマクロファージへの鉄のヒノキチオール媒介取り込みと合致する（図１７Ｅ）。
【０３５０】
鉄恒常性を維持する機構
次に、鉄トランスポーター欠乏細胞における他のイオン輸送タンパク質及び調節物質（２）の内因性ネットワークが、小分子ヒノキチオールと協働して、部位及び方向選択的鉄輸送の回復を促進しながら、なお鉄恒常性の維持に役立つかどうかについて仮説を立てた。酵母では、鉄の細胞内移動及び貯蔵は、プロトン駆動力として知られるプロトン勾配に依存し、血漿及び液胞膜それぞれにおけるＡＴＰ依存性能動イオン輸送タンパク質Ｐｍａ１及びＶ−ＡＴＰａｓｅによって生成される（２１、３５）。このプロトン駆動力におけるヒノキチオール媒介鉄輸送の依存性と合致して、ヒノキチオール救出ｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母は、Ｐｍａ１及びＶ−ＡＴＰａｓｅの化学的阻害に非常に敏感であるが、オフ経路阻害剤には敏感ではない（図１９Ａ〜Ｃ）。
【０３５１】
腸上皮では、鉄輸送タンパク質を転写的及び翻訳的に調節して、全身の鉄レベルを維持する一方、過負荷を回避する（２、４４）。具体的に、過剰鉄、側底側の流出タンパク質ＦＰＮ１、及びトランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）の隔離を担うフェリチンの頂端側のＨ＋／Ｆｅ２＋共輸送体ＤＭＴ１、重（ＦＴＨ１）及び軽（ＦＴＬ１）鎖のレベルは、対応するｍＲＮＡ転写産物の５’−及び３’−非翻訳領域に位置する短鎖ヘアピン鉄応答エレメント（ＩＲＥ）を介して翻訳的に調節される（図２０Ａ）（２）。鉄感受性鉄応答タンパク質（ＩＲＰ１及びＩＲＰ２）は、これらのＩＲＥに結合して、鉄飢餓下で、翻訳（５’−ＩＲＥ、Ｆｔｈ１、Ｆｔｌ１、Ｆｐｎ１）を遮断するかまたはｍＲＮＡ（３’−ＩＲＥ、Ｄｍｔ１、ＴｆＲ１）を安定化させる（図２０Ａ）。鉄刺激及び結合の際に、ＩＲＰは、ｍＲＮＡから解離し、記載されている効果を逆転させる。転写調節は、転写活性化物質の低酸素誘導性因子２−α（Ｈｉｆ２α）を通じて達成され、Ｏ２及び鉄媒介プロリン水酸化後に分解される（図２０Ｂ）（２）。Ｈｉｆ２αは、Ｆｐｎ１の転写を活性化して、鉄欠乏下でＩＲＥ媒介翻訳抑制を回避する（２）。
【０３５２】
これらの恒常性機構と合致して、貧血状態（４５）は、フェリチンレベルの減少及びＦＰＮ１レベルの増加に伴って、ＤＭＴ１欠乏Ｃａｃｏ−２単層に最初に観察されるため（図５Ａ及び図１９Ｄ〜Ｌ）、小分子媒介鉄輸送に対して好ましい細胞環境を提供する。これらの内因性タンパク質との機能的協働に支援を提供することで、ＤＭＴ１欠乏Ｃａｃｏ−２単層を横断するヒノキチオール媒介鉄の取り込み及び輸送は、一方向である（図５Ｂ及び図１９Ｍ）。低用量のヒノキチオール（５００ｎＭ）による頂端側の処理により、フェリチンへの５５Ｆｅの組み込みが可能になり（図５Ｃ）、高親和性の鉄シャペロンポリ（ｒＣ）結合タンパク質１（ＰＣＢＰ１）によって媒介される可能性がある（２）。最終的に、ＦＰＮ１（４０）のケルセチン媒介ノックダウンは、頂端側の取り込みに影響を与えることなく、ヒノキチオール媒介膜貫通輸送を拮抗する（図５Ｄ及び図１９Ｎ〜Ｐ）。
【０３５３】
さらに、ＤＭＴ１欠乏単層における経上皮輸送の速度の増加は、頂端側ＦｅＣｌ３の濃度の増加に伴って観察されたが、これらの効果は、高濃度の鉄で横ばいになる（図５Ｅ）。さらに、膜貫通輸送の同様のレベリングは、持続的な鉄の勾配（２５μＭ  ＦｅＣｌ３）で、かつ、ヒノキチオールの濃度を増加させて、同じ単層を処理する場合に観察される（図５Ｆ）。この現象は、広範囲のヒノキチオール及び鉄濃度にわたって観察された（図２１）。次いで、内因性系が、持続的な鉄の勾配の存在下で、細胞鉄状態のヒノキチオール媒介変化にどのように応答するか確かめた。ＩＲＰ媒介翻訳調節と合致して、ＩＲＰ２の減少、フェリチンサブユニット（５’−ＩＲＥ）の増加、及びＴｆＲ１（３’−ＩＲＥ）タンパク質レベルの減少は、持続的な鉄の勾配の存在下で、最大５μＭのヒノキチオール濃度の関数として観察された（図５Ｇ及び図２２Ａ〜Ｅ）。転写因子Ｈｉｆ１α及びＨｉｆ２αは、Ｆｐｎ１  ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの減少と共に同様に減少した（図５Ｇ及び図２２Ｆ〜Ｉ）。予想した通り、サイトゾル鉄シャペロンＰＣＢＰ１及びＨｉｆ２α非依存性Ｆｔｈ１  ｍＲＮＡレベルのＩＲＥ非依存的発現は変化せず、鉄の不在下でヒノキチオールを添加した際に、ＦＰＮ１の変化は観察されなかった（図５Ｇ及び図２２Ｋ〜Ｎ）。これらの効果の軽度の逆転は、高濃度のヒノキチオールで観察された（図５Ｇ及び図２２Ａ〜Ｊ）。カルセイングリーンによるサイトゾル鉄の視覚化は、ヒノキチオールの増加に伴ったＤＭＴ１欠乏Ｃａｃｏ−２単層のインキュベーションが、不安定な鉄の最大５μＭへの増加をもたらしたことを示した（図５Ｈ〜Ｊ）。さらには、ヒノキチオールの増加は、蛍光消失を予防し、恐らくは、高用量の強結合メタロフォアによる不安定な鉄の競合細胞内キレート化によるものであった（図５Ｈ〜Ｊ）。まとめると、これらの結果は、内因性恒常性ネットワークが、小分子ヒノキチオールと協働して、鉄輸送の促進に役立ちながら、その恒常性を維持し、鉄毒性を予防することができるという結論を支援する。
【０３５４】
この機構の枠組みに基づいて、ヒノキチオールが、野生型細胞において、比較的最小の効果を有すると仮説を立てた。同濃度のヒノキチオールが、正常なＣａｃｏ−２単層、ＭＥＬ細胞、及びＪ７７４細胞のそれぞれにおける経上皮鉄輸送、ヘモグロビン化、及び鉄放出を乱す能力を試験した（図２３Ａ〜Ｆ）。対応するタンパク質欠乏系で観察された経上皮鉄輸送（図３Ｂ）、ヘモグロビン化（図３Ｇ）、及び鉄放出（図３Ｊ）のヒノキチオール促進増加とは対照的に、軽微な影響が、同一条件下で、ヒノキチオール処理した野生型系において観察された（図２３Ａ〜Ｆ）。まとめると、これらの結果は、ヒノキチオールが、特異的鉄トランスポータータンパク質が欠如している脂質膜を横断して選択的に蓄積する勾配を抑えることによって、部位及び方向選択的鉄輸送を回復させることと合致する。
【０３５５】
動物における腸鉄吸収及び末梢ヘモグロビン化の回復
その後、ヒノキチオールが、これらの鉄トランスポーター欠乏の動物モデルにおける腸鉄吸収及びヘモグロビン化を回復させることができたかどうかを確かめた。十二指腸腸細胞におけるＤＭＴ１欠乏及びＦＰＮ１欠乏は、細胞の頂端側の鉄取り込み、及び血液の側底側の流出をそれぞれ混乱させることによって、腸内での鉄吸収の速度を低下させる（２、６、１２〜１５）。強制経口投与を介した単回用量の５９Ｆｅ及び１．５ｍｇ／ｋｇのヒノキチオールを投与する際のＤＭＴ１欠乏ベオグラード（ｂ／ｂ）ラット（６）及びＦＰＮ１欠乏フラットアイアン（ｆｆｅ／＋）マウス（１４、１５）における腸鉄吸収を試験した。高用量のヒノキチオールは、２年間の慢性経口投与の際に、ラットにおいて非毒性であることが報告される（４６）。ｂ／ｂラットで以前に報告された鉄吸収の低下（４７）と同様に、５９Ｆｅ吸収の２倍低下が、兄弟対照（＋／＋または＋／ｂ）に比べて、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏ処理ｂ／ｂラットで観察された（図６Ａ及び図２４Ａ）。ヒノキチオールによるｂ／ｂラットの処理は、５９Ｆｅ吸収を増加させて、１時間後に対照レベルに戻した（図６Ａ及び図２４Ａ）。以前の結果（１５）と合致して、ｆｆｅ／＋マウスはまた、鉄を低速度で吸収した（図６Ｂ）。ヒノキチオールは、１時間及び２時間後に、ｆｆｅ／＋マウスにおける５９Ｆｅ吸収を増加させた（図６Ｂ及び図２４Ｂ）。５９Ｆｅ吸収の速度における統計的に有意な増加は、１時間後にヒノキチオール処理した野生型マウスで観察されたが、２時間後には観察されなかった（図２４Ｃ）。
【０３５６】
相補性ＲＮＡによるＭｆｒｎ１タンパク質の異所性発現を介した、Ｍｆｒｎ１欠乏ゼブラフィッシュにおけるヘモグロビン化の回復が以前に示されている（１０）。Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏは、造血試験における強力なモデル生物として十分に確立されている。（４８）、あるいは、これを採用して、小分子鉄トランスポーターによる長期処理が、ＤＭＴ１欠乏及びＭｆｒｎ１欠乏におけるヘモグロビン化を回復させることができたかどうかを試験した（１０、４９）。最初に、ＧＦＰ標識赤血球を発現するＴｇ（グロビンＬＣＲ：ｅＧＦＰ）ゼブラフィッシュ株におけるＤＭＴ１のモルホリノ媒介の一時的なノックダウンを行った（５０）。未成熟Ｄｍｔ１  ｍＲＮＡのエクソン４／イントロン４接合部を標的化する設計されたアンチセンスモルホリノの注入は、定常状態Ｄｍｔ１レベルを低下させ（図２４Ｄ）、ＦＡＣＳ分析によるＧＦＰ陽性赤血球系細胞の数を減少させた（図６Ｃ）。受精後２４時間（ｈｐｆ）のヒノキチオールの水への添加、及びさらに２日間のインキュベーションは、観察可能な毒性なく、これらのＤＭＴ１欠乏モルファントゼブラフィッシュにおけるヘモグロビン化を促進した一方、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏは、効果がなかった（図６Ｃ）。ヒノキチオールが、遺伝的に変異したシャルドネ（Ｃｈａｒｄｏｎｎａｙ）（ｃｄｙｔｅ２１６）ゼブラフィッシュにおけるヘモグロビン化を同様に回復させることができたかどうかさらに試験した。このゼブラフィッシュは、短縮ＤＭＴ１につながるナンセンス突然変異を含むため、重度の低色素性小球性貧血を呈する（４９）。＋／ｃｄｙフィッシュのヘテロ接合性交配は、７２ｈｐｆのｏ−ジアニシジン染色後の各クラッチ中の約７５％健常（＋／＋及び＋／ｃｄｙ）胚及び約２５％貧血（ｃｄｙ／ｃｄｙ）胚のメンデル分布をもたらした（図６Ｄ）。２日間のヒノキチオール処理は、高ヘモグロビンレベルを呈するフィッシュの数を増加させた一方、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏは、効果がなかった（図６Ｄ）。
【０３５７】
また、Ｍｆｒｎ１欠乏モルファントＴｇ（グロビンＬＣＲ：ｅＧＦＰ）ゼブラフィッシュ（１０、５０）におけるヘモグロビン化を試験した。４８時間のヒノキチオール処理は、これらのモルファントにおけるヘモグロビン化及びＧＦＰ陽性赤血球の数をもう一度回復させた（図６Ｅ）。最終的に、ヒノキチオールを試験して、遺伝的に突然変異したフラスカティ（Ｆｒａｓｃａｔｉ）（ｆｒｓｔｑ２２３）ゼブラフィッシュにおけるヘモグロビン化を回復させることができたかどうか確認した。このゼブラフィッシュは、不活性Ｍｆｒｎ１ミトコンドリアタンパク質及び胚発生中の重度の貧血につながるミスセンス突然変異を含む（１０、１１）。＋／ｆｒｓフィッシュのヘテロ接合性交配から回収した胚のヒノキチオール処理は、貧血表現型を救出した（図６Ｆ）。遺伝子型（図６Ｇ）の健常な仔フィッシュ（＋／＋及び＋／ｆｒｓ）は、ｏ−ジアニシジンによる茶色染色を呈する一方、未処理ｆｒｓ／ｆｒｓフィッシュは、茶色染色を呈しない（図６Ｈ）。ヒノキチオール処理は、ｆｒｓ／ｆｒｓフィッシュへの茶色染色を回復させた（図６Ｈ）。予想した通り、ヒノキチオールは、ポルフィリン生合成（Ａｌａｓ２）に関与する初期酵素が欠乏しているソーテルヌ（ｓａｕｔｂ２２３）ゼブラフィッシュ（５１）を救出せず（図２４Ｅ）、鉄輸送の欠陥への救出の特異性を示す。
【０３５８】
展望
従って、小分子は、３つの異なる鉄輸送タンパク質が欠乏している異なる細胞における部位及び方向選択的鉄輸送を回復させることができ、同じ化合物は、対応する動物モデルにおける食事による腸鉄吸収または末梢ヘモグロビン化を促進することができる。機構的試験は、鉄トランスポーターが欠如している家系において蓄積する膜貫通イオン勾配の役割を支援し、ヒノキチオールは、部位及び方向選択的膜貫通鉄輸送を回復させることができる。さらに、内因性タンパク質に基づく恒常性機構は、この不完全な小分子と連結して、他の細胞プロセスを混乱させることなく鉄関連生理学的プロセスを促進する。
【０３５９】
ヒノキチオールと同様に、多くのイオン輸送タンパク質は、不完全に選択的である。しかしながら、異なるイオンの相対的存在度は、生体系における選択性の増加に寄与する。例えば、タンパク質クロライドチャンネルは、ブロミド及びヨージドに対して、クロリドに対して主に非選択的であるが、後者のハロゲンの低天然存在度は、インビボでのクロリド選択性に有利である（１、５２）。示差イオンアクセシビリティは、多くの不完全なイオン輸送タンパク質に観察されたインビボ選択性をさらに増強させる（３３〜３５）。ヒノキチオールと同様に、ＤＭＴ１及びＦＰＮ１は、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、及び／またはＣｕ２＋を輸送する（６、１３、１５）。しかしながら、高親和性金属タンパク質は、これらの他の金属の不安定なプールを著しく減少させて、高いアクセシビリティよるインビボでの鉄の選択的結合及び輸送につながる（３３〜３５）。
【０３６０】
これらの所見はまた、概念的枠組み及び概念実証のデモンストレーションを提供して、小分子の追跡が、多くのヒト疾患の根底にある欠如または機能不全の鉄輸送タンパク質の代わりになることを支援する。ＦＰＮ１の後天性欠乏が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、及び炎症性腸疾患を含む多くの一般的な疾患に罹患している患者において頻繁に発生する慢性炎症性貧血（ＡＩ）の根底にあることが最近認識されている（９）。さらに、このアプローチは、多くの多様な鉄過剰障害において組織（例えば、肝臓または脳）中に蓄積する過剰鉄の急速な排泄を促進する可能性を有し得る。
【０３６１】
材料及び方法
細胞株及び増殖条件
野生型（ＤＥＹ１４５７）及び同質遺伝子ｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、Ｄ．Ｋｏｓｍａｎ（５３）から得た。野生型（ＹＰＨ４９９）及び同質遺伝子ｆｅｔ３Δａｒｎ１−４Δ  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、Ｃ．Ｐｈｉｌｐｏｔｔ（５４）から得た。２０ｇ／Ｌの寒天なし（液体培地）またはあり（固体培地）で、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２０ｇ／Ｌのペプトン、及び２０ｇ／Ｌのデキストロースを含有する標準ＹＰＤ培地上で酵母を維持した。特に断りのない限り、酵母の増殖回復アッセイは、２０ｇ／Ｌの寒天なし（液体培地）またはあり（固体培地）で、ｐＨ＝７．０の５０ｍＭ  ＭＥＳ／トリス緩衝液中の１．９１ｇ／Ｌの鉄遊離ＹＮＢ−ＦｅＣｌ３（ＦｏｒＭｅｄｉｕｍ  ＣＹＮ  １２０１）、０．７９ｇ／ＬのＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｓｕｎｒｉｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  １００１−０１０）、５ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ  Ａ４４１８）、２０ｇ／Ｌのデキストロース、１０μＭのＦｅＣｌ３（Ｓｉｇｍａ  ４５１６４９）、及び１０μＭのヒノキチオール（β−Ｔｈｕｊａｐｌｉｃｉｎ、Ｓｉｇｍａ  ４６９５２１）からなる低鉄ＳＤ培地を使用した。ろ過滅菌した水中の４０％ｗ／ｖデキストロース溶液、調製したてのＤＭＳＯ中の無菌１０ｍＭヒノキチオールストック、及び調製したての無菌水中の１０ｍＭ  ＦｅＣｌ３ストックからの高圧蒸気滅菌後に、デキストロース、ヒノキチオール、及びＦｅＣｌ３をそれぞれ添加した。非発酵性の増殖回復には、３０ｇ／Ｌのグリセロールをデキストロースの代わりに使用したことを除いては、同じ合成培地を使用した。
【０３６２】
ヒトＣａｃｏ−２細胞（ＨＴＢ−３７）及びマウスマクロファージ（Ｊ７７４Ａ．１）は、ＡＴＣＣから得て、１０％のＨＩ  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  １６０００−０３６）、４ｍＭ  グルタミン（Ｌｏｎｚａ  ＢＥ１７−６０５Ｅ）、１００μｇ／ｍＬのＰＥＮ−ＳＴＲＥＰ（Ｌｏｎｚａ  ＤＥ１７−６０２Ｅ）、及び１％のＭＥＭ  ＮＥＡＡ（Ｆｉｓｈｅｒ  １１１４０−０５０）を含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  １０３１３−０２１）で培養した。トランスフェクトＣａｃｏ−２細胞株は、８００ｍｇ／ＬのＧ４１８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−２９０６５Ｂ）を含有するこの培地上で維持した。フレンド（Ｆｒｉｅｎｄ）マウス赤白血病細胞（ＭＥＬ、ＤＳ１９サブクローン）は、Ａｒｔｈｕｒ  Ｓｋｏｕｌｔｃｈｉ（Ａｌｂｅｒｔ  Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｒｏｎｘ，ＮＹ）から得て、１０％のＨＩ  ＦＢＳ、２ｍＭ  グルタミン、１００μｇ／ｍＬのＰＥＮ−ＳＴＲＥＰ、及び１％ＭＥＭのＮＥＡＡを含有するＤＭＥＭで培養した。トランスフェクトｓｈ対照及びｓｈＤＭＴ１  ＭＥＬ細胞株は、１ｇ／ＬのＧ４１８を含有するこの培地上で維持した。
【０３６３】
Ｃａｃｏ−２細胞（継代１８〜５０）をＴ７５フラスコ中で≧９０％密集度に増殖させた後、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｆｉｓｈｅｒ  ２５２００−０５６）でトリプシン処理して、Ｇ４１８なし（野生型）またはＧ４１８あり（トランスフェクト）で、Ｃａｃｏ−２培地中で、１０：１希釈で継代した。２×１０５個の細胞／ウェルでの６ウェルコンパニオンプレート（Ｆｉｓｈｅｒ  ０８−７７１−２４）中に、０．４μｍのＰＥＴ細胞培養挿入物（Ｆｉｓｈｅｒ  ０８−７７１）上にＣａｃｏ−２細胞（継代２０〜５０）を播種することによって、単層を増殖させて、２１〜２８日間で完全に分化させた後、３〜４日ごとに培地を変えて実験を行った。
【０３６４】
ＭＥＬ細胞を、Ｔ２５フラスコ中の懸濁液で約１×１０６個の細胞／ｍＬになるまで増殖させて、Ｇ４１８の有無に依らず、ＭＥＬ完全培地中に、１×１０５個の細胞／ｍＬで新しいＴ２５フラスコに再播種した。毎月の培養で、ＭＥＬ細胞の新しいバックストックを使用した。
【０３６５】
Ｊ７７４細胞（継代２０〜８０）をＴ７５フラスコ中で９０％密集度に増殖させた後、剥離して、Ｊ７７４完全培地中で、５：１希釈で再播種した。１〜２日ごとに培地を変えた。
【０３６６】
動物及び動物の管理
ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈで概説される指針及び推奨事項に厳密に準拠して試験を行った。
【０３６７】
健常（＋／＋）及びフラットアイアン（ｆｆｅ／＋）マウスにおける試験に使用したプロトコルは、ｔｈｅ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅによって承認された。フラットアイアンマウスの繁殖、食事、及び遺伝子型決定は、前述のように行った（５５）。
【０３６８】
全てのゼブラフィッシュ実験は、ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの規制に準拠して行った。以下の野生型ＡＢ株及びゼブラフィッシュ変異株を使用した：フラスカティ（ｆｒｓｔｑ２２３）（１０）、シャルドネ（ｃｄｙｔｅ２１６）（４９）、及びソーテルヌ（ｓａｕｔｂ２２３）（５１）。
【０３６９】
ベオグラード（＋／＋、＋／ｂ、またはｂ／ｂ）ラットにおける試験のプロトコルは、ｔｈｅ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＤＬＡＭ）及びｔｈｅ  Ｎｏｒｔｈｅａｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＮＵ−ＩＡＣＵＣ）によって承認された。ヘテロ接合（＋／ｂ）及びホモ接合性（ｂ／ｂ）ベオグラードラット（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｆ３４４バックグラウンド）の育種者は、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｇａｒｒｉｃｋ博士（ＳＵＮＹ  Ｂｕｆｆａｌｏ）によって厚意により提供され、１２：１２時間の明暗周期を維持し、水及び施設の食事を自由に摂取させた。５９Ｆｅ腸鉄吸収実験前に、様々な予備試験を（３〜５ヵ月齢の範囲の）ベオグラードラットのコホートで行い、その間、５００ｍｇ／ｋｇの鉄を含有する鉄補充食（ＴＤ．０２３８５，Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で、＜１５週間、ラットをビヒクルまたは様々な化合物で処理した。全てのラットに薬物を摂取させず、鉄添加食を少なくとも１週間受け続けた後、５９Ｆｅ腸吸収実験を行った。
【０３７０】
統計
全てのデータは、平均または重量平均±ＳＥＭを示し、特に記載がない限り、最小で３つの生物学的反復を含む。統計分析は、スチューデントｔ検定または一元配置もしくは二元配置の分散分析（ＡＮＯＶＡ）から得たＰ値を表し、必要に応じてテューキーの事後検定を行った。ＮＳ、有意ではない；特に記載がない限り、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【０３７１】
寒天プレート上の小分子による鉄欠乏酵母の増殖救出（図１Ｃ、Ｄ、図７Ａ〜Ｃ、及び図８Ａ、Ｂ）
酵母の増殖救出は、２％のアガロースゲル、１０μＭのＦｅＣｌ３、及び１０μＭのヒノキチオール（ＤＭＳＯ中の４０×ストックから）を含有する、ｐＨ＝７．０の５０ｍＭ  ＭＥＳ／トリス緩衝液中の低鉄ＳＤ寒天プレート上で、以前に報告されたものと同様に行った（２０）。野生型対照及びビヒクル（ＤＭＳＯ）で処理したｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δまたはｆｅｔ３Δａｒｎ１−４Δ対照は、ヒノキチオールの不在下で、１０μＭのＦｅＣｌ３を含有する同じ低鉄ＳＤ培地を用いて同一条件下で行った。酵母をＹＰＤ培地中で一晩増殖させて、低鉄ＳＤ培地中で１．０の６００ｎＭの光学密度（ＯＤ６００）に希釈した後、１０倍連続希釈し、ＤＭＳＯビヒクルまたはヒノキチオール（４０×ＤＭＳＯストックから１０μＭ）のいずれかを含有する上述の低鉄ＳＤ寒天プレート上に、これらの酵母懸濁液（１ドット当たり１０μＬ）を接種した。
【０３７２】
ディスク拡散アッセイでは、酵母をＹＰＤ培地中で一晩増殖させて、低鉄ＳＤ培地中でＯＤ６００＝０．１に希釈し、１０μＭのＦｅＣｌ３を含有する低鉄ＳＤ寒天プレート上に画線した。ディスク拡散アッセイは、適当な酵母株（低鉄ＳＤ培地中でＯＤ６００＝０．１から）で画線した１０μＭのＦｅＣｌ３を含有する低鉄ＳＤ寒天プレート上で、ヒノキチオール、トロポロン（Ｓｉｇｍａ  Ｔ８９７０２）、α−ドラブリン（Ｓｐｅｃｓ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ  ＡＮ−５８４／４３４１６８９７）、マルトール（Ｓｉｇｍａ  Ｈ４３４０７）、デフェリプロン（ＤＦＰ、Ｓｉｇｍａ  ３７９４０９）、ピリドキサールイソニコチノイルヒドラゾン（ＰＩＨ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−２０４１９２）、サリシルアルデヒドイソニコチノイルヒドラゾン（ＳＩＨ、以下の合成及び特徴付けを参照）、コメン酸（ＣＯＭＡ、Ｏｂｉｔｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＬＬＣによって厚意にて寄付された）、アムホテリシンＢ（ＡＫ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌ９７０）、ノナクチン（Ｓｉｇｍａ  Ｎ２２８６）、カルシマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ｃ７５２２）、またはプロジギオシン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−２０２２９８）（ペーパーディスク当たり１０μＬ）の≧１０ｍＭストック溶液（ＤＭＳＯ中）を用いて行った。非発酵性条件下の増殖回復は、２％デキストロースの代わりに３％グリセロールを用いて行った。特に記載がない限り、３０℃での接種及びインキュベーションの４８〜７２時間後に画像を撮影した。
【０３７３】
液体培地中の小分子によるｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母の増殖救出（図１Ｅ、Ｆ及び図Ｓ３Ｇ、Ｈ）
酵母の増殖救出は、特に記載がない限り、９６ウェルプレート中で、１０μＭのＦｅＣｌ３を含有する低鉄ＳＤ液体培地中の１０μＭヒノキチオールを用いて、以前に報告されたものと同様に行った（２０）。ビヒクル（ＤＭＳＯ）で処理した野生型対照及びｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δは、ヒノキチオールの不在下で、１０μＭのＦｅＣｌ３を含有する同じ低鉄ＳＤ培地を用いて同一条件下で行った。酵母をＹＰＤ培地中で一晩増殖させて、ＳＤ培地中で０．１のＯＤ６００で希釈し、１０倍希釈し、連続的に攪拌しながら（２００ｒｐｍ）３０℃でインキュベートした。ＯＤ６００は、特に記載がない限り、接種の２４〜４８時間後に得た。
【０３７４】
ヒノキチオール及びＣ２−デオキシヒノキチオール（Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏ、以下の合成を参照）による小分子用量応答（図１Ｆ）は、小分子（ＤＭＳＯ中の４０×ストック溶液）を添加して、示された最終濃度を得ることによって決定した。
【０３７５】
鉄用量応答試験（図８Ｇ）は、１０μＭヒノキチオール（ＤＭＳＯ中の４０×ストック溶液から）を含有するＦｅＣｌ３なしで、同じ低鉄ＳＤ培地中で行った。ＦｅＣｌ３（水中の４０×ストック溶液）を添加して、最大１０μＭのＦｅＣｌ３で、示された最終濃度を得た。
【０３７６】
ＦｅＣｌ３の投与量を増加させた用量依存的なヒノキチオール促進救出では（図８Ｈ）、１０ｍＭ  ＦｅＣｌ３ストックから１０、２５、５０、または１００μＭのＦｅＣｌ３のいずれかを含有するＳＤ培地を作製した後、ヒノキチオール（ＤＭＳＯ中の４０×ストック溶液）を添加して、示された最終濃度を得た。
【０３７７】
持続可能性アッセイ（図８Ｃ）
ｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母の持続可能なヒノキチオール促進増殖回復は、１０μＭのヒノキチオール及び１０μＭのＦｅＣｌ３を含有する低鉄ＳＤ寒天プレートから、１０μＭのヒノキチオール及び１０μＭのＦｅＣｌ３を含有する低鉄ＳＤ液体培地にヒノキチオール救出酵母を接種した後、寒天プレート上に酵母懸濁液（０．１のＯＤ６００に希釈）を画線したことによって、以前に報告されたものと同様に行った（２０）。このプロセスを１００日超繰り返した。ヒノキチオールのＳＤ寒天プレートからの除去は、ｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母細胞増殖なしをもたらしたため、ｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母増殖に対するヒノキチオールの継続的な信頼が観察された。
【０３７８】
ヒノキチオールで処理したｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母の倍化時間（図１３Ｄ、Ｅ）
野生型及びヒノキチオール救出ｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母の倍加時間は、１０μＭのＦｅＣｌ３及びＤＭＳＯまたは１０μＭのヒノキチオール（ＤＭＳＯ中の４０×ストックから）を含有する同じ低鉄ＳＤ培地中でＯＤ６００を毎時４８時間にわたって追跡し、対数増殖期中に式Ｔｄ＝（ｔ２−ｔ１）×［ｌｏｇ（２）／ｌｏｇ（ｑ２／ｑ１）］を適用することによって、以前に報告されたものと同様に決定した（２０）。
【０３７９】
Ｐｍａ１の阻害剤、Ｖ−ＡＴＰａｓｅによる酵母細胞増殖の化学的阻害（図１９Ａ〜Ｃ）
ヒノキチオール処理した野生型及びヒノキチオール救出ｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母細胞増殖の化学的阻害は、１０μＭのＦｅＣｌ３及び１０μＭのヒノキチオールを含有する低鉄ＳＤ培地中で、以前に報告されたように行った（２０）。カスポファンギン（Ｓｉｇｍａ  ＳＭＬ０４２５）、エブセレン（Ｓｉｇｍａ  ７０５３０）またはバフィロマイシンＢ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−２０２０７２）（ＤＭＳＯ中の４０×ストック）の投与量を増やして、酵母懸濁液（ＯＤ６００＝０．１から１０倍希釈）に添加して、示された最終用量を得た。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭを用いて、酵母増殖曲線に適合させて計算した。
【０３８０】
酵母におけるＦｅ３＋取り込みアッセイ（図１Ｇ）
野生型及びｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母への鉄（ＩＩＩ）の取り込みは、Ｋｏｓｍａｎとその同僚らから適応した（５６）。一晩、酵母培養を繰り返し遠心分離して、水で濯いだ。細胞ペレットをＭｉｌｌｉＱ水中で再懸濁させて、ＦｅＣｌ３なしのＳＤ培地中で希釈した。細胞を３０℃で３時間インキュベートし、遠心分離して、水で２回濯いだ。その後、細胞を５０ｍＭ  クエン酸ナトリウム及び２％グルコースを含有するＳＤ培地中に３×１０７個の細胞／ｍＬで懸濁させた。ヒノキチオールまたはＣ２ｄｅＯＨｉｎｏ（ＤＭＳＯ中の４０×ストックから）を添加して、１００μＭの最終濃度にした後、５５ＦｅＣｌ３（１．１μＣｉ）を酵母懸濁液に添加した。懸濁液を継続的に均質化した後、アリコートを採取して、１０ｍＬの室温水で希釈した。その後、０．４５μｍニトロセルロースフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＨＡＷＰ）を通じた真空ろ過を介して細胞を回収し、室温水（１００ｍＬの×５）で濯いだ。次いで、３ｍＬのシンチレーションカクテルを含有するシンチレーションバイアルにフィルターを移して、液体シンチレーション計数器を用いて、放射能を測定した。ヒノキチオールは、５〜１００μＭの５５Ｆｅ取り込みの用量依存的増加を示した一方、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏは、最大１００μＭの取り込みを示さなかった。
【０３８１】
小分子鉄キレートの親油性決定（図２Ａ及び図８Ｉ）
オクタノール−水分配係数は、平衡化したｐＨ＝５の水とオクタノールを等量で用いて、１００μＭの小分子及び３３μＭのＦｅＣｌ３（ＰＩＨは、２：１錯体を形成するため、ＰＩＨに対して５０μＭのＦｅＣｌ３）で、以前に報告されたように得た（５７、５８）。水中の小分子の濃度は、公知の初期基準と比較して、ＵＶ−Ｖｉｓ分光法を介して決定した。
【０３８２】
ヘキサン−水分配は、ｐＨ＝７．０での５０ｍＭ  Ｍｅｓ−トリス緩衝液とヘキサンを等量で用いて、５００μＭの小分子及び５０μＭのＦｅＣｌ３で、上述と同様に得た。
【０３８３】
ヒノキチオールのｐＫａの決定（図９Ｌ）
ヒノキチオールのｐＫａは、ｐＨを変化させた分光光度滴定によって決定した。ヒノキチオール（１００μＭ）をＨ２Ｏ中の０．１Ｍ  ＫＣｌ溶液中に溶解させて、（０．１Ｍ  ＨＣｌを用いて）ｐＨ＝３．０に酸性化した。０．１Ｍ  ＫＯＨの連続滴定を用いてＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを繰り返し得て、ｐＨ（３．０、３．４、３．９、４．２、４．６、４．９、６．０、６．４、７．０、７．２、７．６、８．４、９．３、９．７、１０．４、１０．９、１１．７、１２．０）の範囲を得た。明確な等吸収点は、３６５ｎｍで観察され、新しいλｍａｘは、３８７ｎｍで、ｐＨの減少に伴って観察された。その後、ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ（Ｒ２＝０．９９６）でｐＨ及びロジスティック適合に対するＡｂｓ３８７／Ａｂｓ２４０のプロットを介して、ｐＫａを決定し、変曲点（ｐＫａ＝７．３３）を計算した。
【０３８４】
小分子鉄結合の決定（図９Ａ〜Ｃ）
小分子鉄（ＩＩＩ）結合は、ｐＨ＝７．０の１０ｍＭ  ＭＥＳ／トリス緩衝液中のＦｅＣｌ３（１０μＭ）またはクエン酸鉄（ＩＩＩ）（１０μＭの、Ｓｉｇｍａ  Ｆ３３８８）の添加前後に、小分子（３０μＭ）のＵＶ−Ｖｉｓ分光法によって決定した。鉄（ＩＩ）結合は、６２．５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを含有するｐＨ＝７．０の２５ｍＭ  ＭＥＳ／トリス緩衝液中の小分子（３０μＭ）及びＦｅＣｌ２（１０μＭ）のＵＶ−Ｖｉｓ分光法によって決定した。
【０３８５】
鉄（ＩＩＩ）によるヒノキチオールの滴定（図２Ｂ及び図９Ｎ、Ｏ）
鉄（ＩＩＩ）滴定試験は、５０μＭのヒノキチオールを添加して、ｐＨ＝７．０の１０ｍＭ  ＭＥＳ／トリス緩衝液中のＦｅＣｌ３（０、１、５、１０、１２．５、１５、１６．６７、１７．５、２０、２５、３０、３５、３７．５、４０、及び５０μＭ）の当量を増加させて行った。沈殿物は、全ての場合で観察されず、溶液は、鉄（ＩＩＩ）の当量の増加に伴って、茶色い溶液に変化した。鉄の量を増加させると、λｍａｘは、約２４０から２５０ｎｍにシフトし、４２０ｎｍの吸光度は、最大で約３：１  Ｈｉｎｏ：Ｆｅに増加した。
【０３８６】
小分子による鉄（ＩＩ）及び鉄（ＩＩＩ）結合親和性の決定（図１４Ｅ〜Ｈ及び表Ｓ２）
ヒノキチオール、デフェリプロン、トロポロン、マルトール、及び／またはＥＤＴＡの鉄（ＩＩ）または鉄（ＩＩＩ）との会合定数は、以前に報告されたものと同様に、競合試験を通じて決定した（５９）。具体的に、鉄（ＩＩ）に対する会合定数は、フェロジン競合アッセイ（フェロジンのＫＡ＝３．６５×１０１５）によって決定した（６０）。ＦｅＣｌ２（２５μＭ）を、６２．５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを含有するｐＨ＝７．０の２５ｍＭ  ＭＥＳ／トリス緩衝液中のフェロジン（７５μＭ）と事前に混合した。小分子の（ＤＭＳＯ中の４０×ストックから）増加濃度を添加して、示された最終濃度にした。溶液を２４時間平衡化した後、５６２ｎｍで吸光度を読み取った。ヒノキチオール、トロポロン、及びデフェリプロンの鉄（ＩＩＩ）に対する会合定数は、ＥＤＴＡ（ＫＡ＝１．７×１０２４）競合アッセイ（５９）、マルトールに対する会合定数は、クエン酸塩（ＫＡ＝１×１０１７）競合アッセイ（６１）によって決定した。各キレート剤を、０．１Ｍ  ＫＣｌを含有するｐＨ＝７．０の５０ｍＭ  ＭＥＳ／トリス緩衝液中で、ＦｅＣｌ３と３：１比で混合し、対応する鉄錯体を形成した。３：１キレート剤：鉄錯体に対応するピークのλｍａｘを、錯体ごとに決定した（約４００〜５００ｎＭ）。その後、このＦｅ（キレート剤）３ストックを、０．１Ｍ  ＫＣｌを含有するｐＨ＝７．０の５０ｍＭ  ＭＥＳ／トリス緩衝液中にＥＤＴＡまたはクエン酸塩の増加濃度を含有する溶液に添加し、示された最終濃度のキレート剤（７５μＭ）、ＦｅＣｌ３（２５μＭ）、及び競合キレート剤を得た。系を一晩平衡化させて、Ｆｅ（キレート剤）３錯体に対応する吸光度を決定した。キレート剤ごとのＥＣ５０値は、滴定液の濃度に対する吸光度をプロットすることで、ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ上の非線形曲線適合（Ｈｉｌｌ１）によって計算し、錯体ごとのＫＡは、ＫＡ、リガンド＝（ＫＡ、競合物＊［ＥＣ５０］）／［リガンド］の式から決定した。ここで、リガンドは、鉄にもともと結合している分子であり、競合物は、競合キレート剤である。
【０３８７】
ヒノキチオールによる鉄結合タンパク質からの５５Ｆｅの除去（図１４Ｉ〜Ｋ）
ヒノキチオールがトランスフェリンから鉄を除去する能力は、Ｃｅｒａｍｉ及び同僚らから適合した５５Ｆｅアッセイを通じて決定した（６２）。５５Ｆｅを、ＰＢＳ緩衝液中で、前述と同様にトランスフェリン（Ｔｆ）上に負荷した（６３）。ヒノキチオールの増加用量（ＤＭＳＯ中の１０００×ストックから）をＰＢＳ緩衝液中の５５Ｆｅ２Ｔｆ（１ｎＭ）の溶液に添加し、示された最終濃度を得た。溶液を３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、ヒノキチオール結合した任意の５５Ｆｅを、ＥｔＯＡｃによる鉄：ヒノキチオール錯体の抽出によって単離した。有機層の放射性レベルは、シンチレーションカクテルで希釈後に決定した。５５Ｆｅの抽出は、ヒノキチオールの不在下で観察されず、トランスフェリンは、ＰＢＳ緩衝液中のＥｔＯＡｃ抽出の前後に、ホロ−トランスフェリンのＵＶ−Ｖｉｓ分光法によって決定されるように、抽出プロセスから変性しなかった。
【０３８８】
以下に記載のように、野生型Ｃａｃｏ−２単層のインキュベーション及び免疫沈降を通じたフェリチンの単離によって、フェリチンを５５Ｆｅに負荷した。免疫沈降フェリチンを、ｐＨ＝７．０の５０ｍＭ  ＭＥＳ／トリス緩衝液中で、２．５ｎｇフェリチン／ｍＬ（以下に記載のように、ＥＬＩＳＡによって決定）に希釈し、ヒノキチオールの増加濃度を添加し（ＤＭＳＯ中の１０００×ストックから）、示された最終濃度を得た。懸濁液を室温で２時間混合した。インキュベーション後、遠心分離及びＰＢＳでの濯ぎを繰り返し行って、フェリチンに結合しなかった任意の５５Ｆｅを除去し、寒天ペレット中に残っている放射性レベルを、シンチレーションカクテルで希釈し、液体シンチレーション計数した後に決定した。
【０３８９】
Ｆｅ（Ｈｉｎｏ）３の結晶構造（図２Ｅ、図１４Ｐ、及び表Ｓ８）
合成Ｆｅ（Ｈｉｎｏ）３のＸ線品質結晶は、溶媒を一晩ゆっくりと平静に蒸発させることによる、キャップのない１ｍＬバイアルにおけるアセトン（２ｍＬ）及びベンゼン（０．２ｍＬ）中のＦｅ（Ｈｉｎｏ）３（１０ｍｇ）の再結晶から得た。Ｘ線単結晶分析は、イリノイ大学Ｘ線施設によって行った。
【０３９０】
ＩＣＰ−ＭＳによるヒノキチオール結合選択性の決定（図９Ｄ、図１５Ａ、Ｂ、及び表Ｓ２）
多数の二価金属によるヒノキチオールの結合選択性は、前述と同様に決定した（３２）。具体的に、ｐＨ＝７．０の１：１  Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨにおける１０ｍＭ  ＭＥＳ／トリス緩衝液中のヒノキチオール２ｍＭ溶液を、ｐＨ＝７．０の１：１  Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨにおける１０ｍＭ  ＭＥＳ／トリス緩衝液中の２ｍＭ  ＦｅＣｌ２、２ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２ｍＭ  ＣｏＣｌ２、２ｍＭ  ＮｉＣｌ２、２ｍＭ  ＺｎＣｌ２、及び２ｍＭ  ＣｕＣｌ２を含有する溶液と等量で混合し、二価金属及びヒノキチオールごとに１ｍＭ  最終濃度を得た。着色溶液を室温で４時間インキュベートした。溶液を緩衝液中で希釈し、１：１  ヘキサン：酢酸エチルを用いて抽出した（×３）。有機層を回収して、ＭｇＳＯ４で乾燥させて、ろ過した。溶媒を真空で除去し、７０％ＨＮＯ３で消化させて、金属含有量は、イリノイ大学ＳＣＳ微量分析施設を通じて、ＩＣＰ−ＭＳ分析によって決定した。
【０３９１】
対照実験は、ヒノキチオールの不在以外は上述のものと同様に行った。有機層中の金属は、ＩＣＰ−ＭＳによって検出されなかった。また、対照実験は、６０ｍＭヒノキチオールを用いた以外は上述のものと同様に行った。抽出後の金属含有量を、抽出前の水溶液中の初期金属含有量と比較して、金属：ヒノキチオール錯体が、有機層中で抽出されることを決定した。
【０３９２】
フェロジンを用いた、リポソームからの鉄流出の決定（図２Ｃ、Ｄ、図４Ｆ、Ｇ、及び図Ｓ１７Ａ〜Ｄ）
ＰＯＰＣリポソームからの鉄（ＩＩＩ）流出は、以前に報告されたものと同様に決定した（６４）。ＰＯＰＣリポソームは、２５ｍＭ  Ｍｅｓ／トリス緩衝液中のｐＨ＝７．０の３０ｍＭ  ＦｅＣｌ３、６２．５ｍＭのクエン酸塩を用いて、報告されたものと同様に調製した（６５）。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０を用いたサイズ排除クロマトグラフィー、及び外部緩衝液での溶出によって、外部鉄を除去した。外部緩衝液は、２５ｍＭ  Ｍｅｓ／トリス緩衝液中のｐＨ＝７．０の６２．５ｍＭのアスコルビン酸塩からなった。この緩衝液中の１ｍＭのリンにリポソームを希釈した。フェロジン（Ｓｉｇｍａ  １６０６０１）を添加して（外部緩衝液中の１００×ストック）、５００μＭの最終濃度にした。その後、リポソーム懸濁液を９６ウェルプレートに移して、ＤＭＳＯまたは５μＭのヒノキチオール、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏ、デフェリプロン、またはＰＩＨ（ＤＭＳＯ中の４０×ストック溶液）のいずれかを添加して、実験を開始させた。３０℃で連続的に攪拌しながらプレートリーダーを用いて、２時間の経過にわたって、ＯＤ５６２を毎分決定し、示された時間で、外部フェロジン−鉄キレートの相対量を検出した。２時間後、リポソームをＴｒｉｔｏｎ−Ｘで溶解して、１００％の鉄流出を得た。ヒノキチオールは、ＰＯＰＣリポソームから鉄（ＩＩＩ）流出を用量及び温度依存的に促進した一方、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏは、最大１００μＭの流出を示さなかった。
【０３９３】
鉄（ＩＩ）流出は、上述のように行ったが、しかしながら、内部緩衝液は、あるいは、２５ｍＭ  Ｍｅｓ／トリス緩衝液中でｐＨ＝７．０の３０ｍＭ  ＦｅＳＯ４、６２．５ｍＭのアスコルビン酸塩からなり、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ溶解を１時間後に行った。
【０３９４】
リポソーム内鉄及び／またはヒノキチオールの濃度の増加に伴った鉄流出の速度は、示された濃度の鉄及びヒノキチオールを用いて、上述のように決定した。様々な濃度の鉄に対して、ヒノキチオール（１０μＭ）をＰＯＰＣリポソームに添加し、５６２ｎｍでの吸光度の変化を２時間にわたって決定した。様々な濃度のヒノキチオールに対して、３０ｍＭのリポソーム内鉄を上述のように使用した。リポソームの外側の鉄濃度は、フェロジン−鉄の消光係数（２７，９００Ｍ−１ｃｍ−１）を用いて決定した（６６）。これを使用して、実験ごとの総容量を用いて、示された時間にリポソームから放出された鉄の量を決定した。鉄流出の速度は、ヒノキチオール処理の１時間後に決定した。
【０３９５】
ＰｈｅｎＧｒｅｅｎを用いた、リポソームからの金属流出の決定（図１５Ｃ〜Ｉ及び表Ｓ２）
ＰＯＰＣリポソームからの異なる二価金属のヒノキチオール促進放出は、以前に報告されたものと同様に、ＰｈｅｎＧｒｅｅｎ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｐ１４３１２）の消失を追跡することによって行った（６７、６８）。
【０３９６】
リポソームは、（Ｆｅ２＋に対して）ｐＨ＝７．０の５ｍＭ  ＭＥＳ／トリス緩衝液中の１０ｍＭのアスコルビン酸塩、（Ｃｕ２＋に対して）ｐＨ＝７．０の５ｍＭ  ＭＥＳ／トリス緩衝液中の１０ｍＭのクエン酸塩、または（Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、及びＺｎ２＋に対して）ｐＨ＝７．０の５ｍＭ  ＭＥＳ／トリス緩衝液のいずれかからなる内部緩衝液で上述のように調製した。いずれの場合も、リポソームは、内部緩衝液に添加したＦｅＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＮｉＣｌ２、ＺｎＣｌ２、またはＣｕＣｌ２のいずれかの５ｍＭを用いて調製した。外部緩衝液は、１０μＭのＰｈｅｎＧｒｅｅｎを含有するｐＨ＝７．０の５ｍＭ  ＭＥＳ／トリス緩衝液（ＤＭＳＯ中の１０００×ストックから）であった。リポソーム懸濁液を１ｍＭのリンに希釈した。リポソーム懸濁液を９６ウェルプレートに移して、ＤＭＳＯまたは２μＭのヒノキチオール（ＤＭＳＯ中の４０×ストックから）のいずれかをｔ＝２分で添加した。蛍光は、５００ｎｍの励起、及び５３０ｎｍの発光を１時間にわたって監視した。１時間後、リポソームをＴｒｉｔｏｎ−Ｘで溶解して、蛍光を記録した。いずれの場合も、蛍光の消失は、溶解後のＤＭＳＯ処理リポソーム中で観察され、溶解前のヒノキチオール処理リポソームのものと同様のレベルに到達した（Ｈｉｎｏ処理リポソームで流出が観察されなかったＭｎ２＋を除いて、蛍光消失は、Ｍｎ２＋の溶解後に観察された）。ＤＭＳＯ処理リポソーム及びヒノキチオール処理リポソームは、溶解後に同様の蛍光消失レベルを有した。金属流出の総量は、１０μＭのＰｈｅｎＧｒｅｅｎ及び各金属の公知濃度による外部緩衝液中の蛍光消失の標準曲線を用いて決定した。ｔ１／２値は、ＯｒｉｇｉｎＰｒｏで漸近適合を用いて計算した。ｔ１／２値は、金属ごとの最大金属流出の半分への到達に要する時間を示す。
【０３９７】
酵母における金属選択性の決定（図１０Ｊ）
細胞内金属レベルのヒノキチオール媒介変化は、図１３Ｈからの増殖救出条件、及び図１ＧのＦｅ取り込み試験の適合を用いて決定した。具体的に、野生型及びｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母をＹＰＤ培地中で一晩増殖させて、濯ぎ、ＦｅＣｌ３を有さないＳＤ培地中で、３０℃で３時間インキュベートした。次いで、酵母を、１００μＭのＦｅＣｌ３、及びＤＭＳＯビヒクルまたは１０μＭのヒノキチオールのいずれかを含有するＳＤ培地（５０ｍＭ  ＭＥＳ／Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝７．０）中で、ＯＤ６００＝０．５０で再懸濁させた。インキュベーションの２．５時間後、細胞を５℃で遠心分離して、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝６．５）中の冷たい１０ｍＭ  ＥＤＴＡで２回、冷たい金属遊離水で１回濯いだ。その後、細胞を４８時間凍結乾燥させた。凍結乾燥細胞をＨＮＯ３：ＨＣｌの５：１混合物で消化させた後、ＣＥＭ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  ＳＰ−Ｄマイクロ波分解器中で、自動化された順次マイクロ波分解を施した。得られた澄明な溶液を金属遊離水中で希釈し、ＩＣＰ−ＭＳによって元素分析を行った。
【０３９８】
ヒノキチオールに結合した第二鉄の交換可能性（図１４Ｍ）
ヒノキチオールに結合した第二鉄の可逆的置換は、前述と同様に決定した（６９）。非放射能ＦｅＣｌ３（１０００×ストックから１００ｎＭ、５６Ｆｅと称される）を、ｐＨ＝７．０の１０ｍＭ  ＭＥＳ／トリス緩衝液中のヒノキチオール（１０００×ストックから１００ｎＭ）に添加した。溶液を３７℃で１時間平衡化した後、等量の５５ＦｅＣｌ３（１００ｎＭ）を添加した。溶液を３７℃でインキュベートし、示された時点で、アリコートを採取し、水に添加した。鉄ヒノキチオール錯体は、酢酸エチルによる抽出を通じて、非結合鉄から直ちに分離し、放射性計数は、シンチレーション計数によって決定した。２％未満の鉄が、ヒノキチオールの不在下で、酢酸エチル層中で見られた。
【０３９９】
その後、平衡化率は、ヒノキチオール錯体（平衡状態で、１：１  ５５Ｆｅ：５６Ｆｅ）で見られた理論上の最大値の５５Ｆｅから放射性計数を正規化することによって決定した。
【０４００】
ヒノキチオール及び他のキレート剤の電気化学的試験（図２Ｆ、図１１Ａ〜Ｊ、及び表Ｓ２、４〜６）
定電位電気化学的方法は、３つの電極細胞で、ＣＨ機器電気化学ワークステーション（モデル７６０Ｃ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）で行った。Ｈｇ作用電極は、Ｂａｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌによって前述された手順を利用して、Ｐｔワイヤ上のＨｇの電極位置によって組み立てた（７０）。全ての実験は、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極に対して報告され、グラファイト補助電極を利用した。電解質は、測定前にＵＨＰアルゴンを注入した。アルゴンの陽圧を、実験全体を通じて維持した。
【０４０１】
特に断りのない限り、実験は、ＨＮＯ３及びＫＯＨを滴定液として用いて、Ｈ２ＯまたはｐＨ＝７．２の１：１  ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ中の０．１Ｍトリス緩衝液を使用した。特に断りのない限り、実験は、１００ｍＶ／ｓの走査速度、１００μＭのＦｅ（ＮＯ３）３、及び５００μＭの小分子を使用した。全ての酸化還元電位は、正常な水素電極（ＮＨＥ）に対して記録した。
【０４０２】
Ｆｅ（Ｈｉｎｏ）ｎの推定酸化還元電位は、ｐＨ＝７．２の０．１Ｍトリス緩衝液中のＭｅＯＨの濃度の関数として、Ｆｅ（Ｈｉｎｏ）ｎの決定した酸化還元電位の最良適合線の外挿を通じて決定した。
【０４０３】
鉄（ＩＩＩ）還元の速度（図１１Ｋ、Ｌ）
ヒノキチオールの不在下または存在下での鉄（ＩＩＩ）還元の速度は、フェロジンを用いて決定し、前述と同様に、鉄（ＩＩ）の濃度を定量化した（７１）。具体的に、鉄（ＩＩＩ）またはＦｅ（Ｈｉｎｏ）３をＨ２Ｏの溶液中で事前に混合し、６２．５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム及びフェロジン（３ｍＭ）を含有するｐＨ＝７．０の２５ｍＭ  ＭＥＳ／トリス緩衝液に希釈し、１０μＭのＦｅＣｌ３及び３０μＭのヒノキチオールの最終濃度にした。Ｆｅ（フェロジン）３に対応する５６２ｎｍでの吸光度は、示された時点で決定した。その後、鉄（ＩＩ）の濃度は、この緩衝液中のフェロジン−鉄の決定した消光係数を通じて計算した（ε＝１９，２００Ｍ−１ｃｍ−１）。
【０４０４】
ＤＭＴ１に対するＣａｃｏ−２細胞及びＭＥＬ細胞のトランスフェクション
Ｃａｃｏ−２細胞は、６ウェルプレート中に２×１０５個の細胞／ウェル（約３０％コンフルエント）を播種した２４時間後に、非標的化対照ｈＲＮＡコンストラクトまたはヒトＤＭＴ１（Ｑｉａｇｅｎ  ＫＨ０５７６０Ｎ）を標的化する４つの他のｓｈＲＮＡコンストラクトのいずれかの１０μｇ／ウェルを有するリポフェクタミンＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １５３３８−１００）及びＰｌｕｓ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １１５１４−０１５）を用いて、以前に報告された（３６）ようにトランスフェクトされた。トランスフェクション剤を除去し、細胞を２４時間回復させた後、０．８ｇ／ＬのＧ４１８を含有するＣａｃｏ−２完全培地で処理した。細胞をＧ４１８培地中で約２週間インキュベートし、トランスフェクト細胞の選択を促進した一方、完全な細胞死が、非トランスフェクト細胞で観察された。非標的化対照コンストラクト＝５’−ＧＧＡＡＴＣＴＣＡＴＴＣＧＡＴＧＣＡＴＡＣ−３’；ｓｈＤＭＴ１コンストラクト（クローン４）＝５’−ＡＡＣＣＴＡＴＴＣＴＧＧＣＣＡＧＴＴＴＧＴ−３’。
【０４０５】
ＭＥＬ細胞は、非標的化対照ｈＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ、ＣＭＶ−ネオベクターを用いた、５’−ＣＡＡＣＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡ−３’）またはマウスＤＭＴ１を標的化する５つのｓｈＲＮＡコンストラクト（Ｓｉｇｍａ、クローン１〜５：ＴＲＣＮ００００３３２７４８、ＴＲＣＮ００００３０６６１０、ＴＲＣＮ０００００７９５３３、ＴＲＣＮ０００００７９５３５、及びＴＲＣＮ０００００７９５３６）のいずれかを５０μｇ有する２×１０７個の細胞／ｍＬで、３０ｍＭ  ＮａＣｌを有する４００μＬの血清遊離ＤＭＥＭを含有する０．４ｃｍキュベット（Ｂｉｏｒａｄ  １６５２０８１）中のエレクトロポレーション（０．２８ｋＶ、９７５μＦパルス）によってトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を１０ｍＬのＭＥＬ完全培地を含有するＴ２５フラスコに移して、６日間増殖させて、新鮮なＭＥＬ完全培地中に１０：１の希釈で２日ごとに再播種した。この後、細胞を１ｇ／ＬのＧ４１８を含有するＭＥＬ完全培地中に１×１０５個の細胞／ｍＬの細胞で再播種し、非電気穿孔野生型（ＤＳ１９）ＭＥＬ細胞をもともと含有しているＴ２５フラスコで細胞が観察されなくなるまで、新鮮なＧ４１８培地中に１０：１の希釈で約２日ごとに再播種することによって、２週間の期間にわたって細胞を選択した。
【０４０６】
Ｍｆｒｎ１欠乏ＭＥＬ細胞株は、前述のように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集を用いて発生させた（７２〜７４）。Ｍｆｒｎ１遺伝子座のエクソン２及び４を標的にした。エクソン２標的化配列は、５’−ＧＡＴＧＣＴＴＧＴＡＴＡＣＣＧＧＧＣＴＴ−３’であり、エクソン４標的化配列は、５’−ＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＴＡＡＡＣＧＧＡＣＣ−３’であった。Ｍｆｒｎ１マウス遺伝子座の遺伝子内の欠失を文書化するのに使用したプライマーは、以下のものであった：エクソン４（フォワード）５’−ＧＴＴＴＧＣＣＴＣＴＧＣＧＧＴＧＴＧＡＴＣ−３’；エクソン２（フォワード）５’−ＧＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧ−３’；エクソン２（リバース）５’−ＧＴＣＣＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＡＡＧＣＣ−３’。
【０４０７】
ｑＲＴ−ＰＣＲ条件（図１２Ａ、図１３Ａ、図１４Ａ、及び図２２Ｇ、Ｌ）
Ｄｍｔ１  ｍＲＮＡレベルは、以下に記載のように処理を行った後、製造者のプロトコルに従って、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ６００８２５）を用いたｑＲＴ−ＰＣＲを介して決定した。分化Ｃａｃｏ−２単層におけるＤｍｔ１  ｍＲＮＡレベルを決定するため（播種後の２１〜２８日目）、ｍＲＮＡは、製造者の指示に従って、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ７４１０４）を用いて単離した。Ｄｍｔ１の閾値サイクル（Ｃｔ）値は、Ｐｆａｆｆｌ法を用いて、Ｄｍｔ１（Ｏｒｉｇｅｎｅ  ＨＰ２００５８４）及びアクチン（Ｏｒｉｇｅｎｅ  ＨＰ２０４６６０）に対するプライマーを用いて内部対照アクチンに正規化した後、ｓｈ対照レベルに正規化した。
【０４０８】
ＭＥＬクローンにおける相対Ｄｍｔ１  ｍＲＮＡレベルを決定するため、ｍＲＮＡは、製造者の指示に従って、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ７４１０４）を用いて、２％ＤＭＳＯ及び１０μＭのクエン酸鉄（ＩＩＩ）で３日間かけて分化させたＭＥＬクローンから単離した。Ｄｍｔ１のＣｔ値は、Ｐｆａｆｆｌ法を用いて、Ｄｍｔ１（Ｏｒｉｇｅｎｅ  ＭＰ２１５６５０）及びＨｐｒｔ１（Ｏｒｉｇｅｎｅ  ＭＰ２０６４５５）に対するプライマーを用いて内部対照Ｈｐｒｔ１に正規化した後、ｓｈ対照レベルに正規化した。
【０４０９】
上述のように、４時間、２５μＭのＦｅＣｌ３で処理し、ヒノキチオール濃度（０、０．５、１、３、５、１０、２５、及び５０μＭ）を増加させた際のｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層におけるＦｐｎ１及びＦｔｈ１  ｍＲＮＡレベルは、上述のように、ｍＲＮＡの単離後に決定した。閾値サイクル値は、Ｐｆａｆｆｌ法を用いて、Ｆｐｎ１（Ｏｒｉｇｅｎｅ  ＨＢ２１０９８８）及びＦｔｈ１（Ｏｒｉｇｅｎｅ  ＨＰ２０５７８６）に対するプライマーを用いて内部対照アクチンに正規化した後、ヒノキチオールの不在下で、ｓｈＤＭＴ１レベルに正規化した。
【０４１０】
相対Ｍｆｒｎ１  ｍＲＮＡレベルは、前述のように、ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ｑＲＴ−ＰＣＲを介して決定した（７５）。
【０４１１】
ウェスタンブロット条件（図５Ａ、Ｇ、図１２Ｂ、Ｃ、図１３Ｂ、Ｃ、Ｊ、図１４Ｇ〜Ｊ、図１９Ｄ、Ｆ〜Ｋ、Ｎ、Ｏ、及び図２２Ｃ〜Ｆ、Ｈ〜Ｎ）
Ｃａｃｏ−２単層、分化ＭＥＬ細胞、またはＪ７７４細胞に、救出実験で記載された処理を行った後、プロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ  ８８２６６）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  ８９９０１）で溶解した。ＢＣＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  ２３２２５）によってタンパク質濃度を決定し、同じＲＩＰＡ緩衝液中で２ｍｇ／ｍＬに希釈した。その後、相対タンパク質レベルは、室温で２時間、５％ＢＳＡで遮断する１０または２０μｇのタンパク質溶解物のウェスタンブロットを介して、かつ、５℃で一晩、５％ＢＳＡ中のヒト抗ＤＭＴ１（１：３，０００希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−３０１２０）、マウス抗ＤＭＴ１（１：１，０００希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−１６６８８４）、ヒト抗ＦＴＬ１（１：１，０００希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−７４５１３）、ヒト抗ＦＰＮ１  ＨＲＰコンジュゲート（１：１０，０００希釈、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ＮＢＰ１−２１５０２Ｈ）、マウス抗グロビンα  ＨＲＰコンジュゲート（１００℃で加熱しない、１：１０，０００希釈、Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＳ−Ｃ２１２１７２）、ヒト抗ＴｆＲ１  ＨＲＰコンジュゲート（１：１０，０００希釈、Ａｂｃａｍ  ａｂ１０２５０）、ヒト抗ＩＲＰ１（１：１，０００希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−１４２１６）、ヒト抗ＩＲＰ２（１：１，０００希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−３３６８２）、ヒト抗Ｈｉｆ１α  ＨＲＰコンジュゲート（１：１，０００希釈、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ＮＢ１００−１０５Ｈ）、ヒト抗Ｈｉｆ２α  ＨＲＰコンジュゲート（１：１，０００希釈、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ＮＢ１００−１２２Ｈ）、ヒト抗ＰＣＢＰ１（１：１，０００希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−３９３０７６）、またはヒト抗アクチンＨＲＰコンジュゲート（１：１０，０００希釈、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ５１２５Ｓ）のいずれかからなる一次抗体を用いて決定した後、ＴＢＳＴで徹底的に濯ぎ、ヤギ抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲート（１：５，０００希釈−ＤＭＴ１、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ７０７４、５％乳汁中）、ヤギ抗マウス  ＩｇＧ１  ＨＲＰコンジュゲート（１：１，０００希釈−ＰＣＢＰ１、１：５，０００希釈−ＩＲＰ２、１：３，０００希釈−ＤＭＴ１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−２０６０、５％ＢＳＡ中）、ロバ抗ヤギＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲート（１：１，０００希釈−ＩＲＰ１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−２０２０、５％ＢＳＡ中）、またはヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ  ＨＲＰコンジュゲート（１：１０，０００希釈−ＦＴＬ１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−２０６１、５％ＢＳＡ中）のいずれかからなる二次抗体で（非ＨＲＰコンジュゲートではない場合には）室温にて２時間インキュベーションした。ブロットをＴＢＳＴで徹底的に濯ぎ、製造者の指示に従って、フェムト秒化学発光溶液の添加後に撮像した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ３４０９５）。
【０４１２】
ＥＬＩＳＡによるフェリチンレベルの決定（図１９Ｅ及び図２２Ａ）
ｓｈ対照及びｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層溶解物における絶対フェリチンタンパク質レベルは、製造者の指示に従って、市販のサンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ  ａｂ１０８８３７）を用いて決定した。
【０４１３】
図１９Ｅで見られる結果について、タンパク質溶解物は、以下に記載のように、５００ｎＭ  ＦｅＣｌ３で処理後に単離した。図２２Ａで見られる結果について、Ｃａｃｏ−２単層は、以下に記載のように、２５μＭのＦｅＣｌ３及び０，０．５、１、３、５、１０、２５、または５０μＭのヒノキチオールで処理した。
【０４１４】
分化Ｃａｃｏ−２単層における５５Ｆｅ取り込み及び輸送（図３Ａ〜Ｃ、Ｈ、Ｉ、図５Ｂ、Ｄ〜Ｆ、図１２Ｅ〜Ｇ、図１４Ｋ、図１９Ｍ、Ｐ、Ｑ、図２１、及び図２３Ａ、Ｄ）
６ウェルプレート中のＰＥＴインサート上で増殖させた分化Ｃａｃｏ−２単層（Ｐ２５〜５０、播種後の２１〜２８日目）からの培地を吸引し、単層をＰＢＳで濯いだ。２ｍＬの側底液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中のｐＨ＝７．４の血清遊離ＤＭＥＭ）を側底側に添加し、２００ｎＭの５５ＦｅＣｌ３または示された濃度のＦｅＣｌ３と、ＤＭＳＯビヒクル、ヒノキチオール、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏ、デフェリプロン、ＰＩＨ、ＳＩＨ、またはメシル酸デフェロキサミン（Ｓｉｇｍａ  Ｄ９５３３）（ＤＭＴ１欠乏では、５００ｎＭのＨｉｎｏ／Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏ、ＦＰＮ１欠乏では、１μＭのＨｉｎｏ／Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏ、または、ＤＭＳＯ中の１０００×ストックの示された濃度の小分子）のいずれかとを含有する１ｍＬの頂端液（１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液中のｐＨ＝５．５の血清遊離ＤＭＥＭ）を、細胞単層を混乱させることなく、膜インサートの壁への添加を介して、頂端側に添加した。その後、特に記載がない限り、単層を３７℃で４時間インキュベートした。側底液の１００μＬアリコートを除去し、シンチレーションカクテル中で希釈し、液体シンチレーション計数器で放射能を決定し、５５Ｆｅ輸送の相対量を定量化した。細胞内５５Ｆｅを決定するため、側底側及び頂端側培地を除去し、単層をＰＢＳ（×２）で濯いだ。その後、細胞を５００μＬの２００ｍＭ  ＮａＯＨで溶解して、ニューテーターを一晩混合し、シンチレーションカクテル中で細胞溶解物を希釈後に、液体シンチレーション計数器で放射能を決定した。特に記載がない限り、全ての値をｓｈ対照単層に正規化した。絶対鉄レベルは、公知の基準による５５Ｆｅ放射能レベルの較正を通じて決定し、１枚の膜当たりのタンパク質の平均ｍｇは、プロテアーゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡ緩衝液によるタンパク質溶解によって決定し、製造者の指示に従って、ＢＣＡキットを通じて定量化した。
【０４１５】
ｐＨの関数としての５５Ｆｅ輸送の決定（図１２Ｅ）には、ＤＭＥＭ中の１０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ（ｐＨ＝６．５）または１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４）を含有する頂端液の使用を除いて、上述のプロトコルを使用した。
【０４１６】
一方向取り込み及び輸送の決定（図５Ｂ及び図１９Ｍ）は、５５ＦｅＣｌ３（２００ｎＭ）の側底添加、及びＤＭＳＯまたはヒノキチオール（５００ｎＭ）の側底添加を除いて、上述のように決定した。その後、頂端液のアリコートを採取して、側底側から頂端側への輸送を決定した。細胞内５５Ｆｅは、上述のように決定した。
【０４１７】
鉄及び／またはヒノキチオールの濃度の関数としての５５Ｆｅ輸送の決定（図５Ｅ及び図２１）は、示された濃度の鉄（濃度ごとに２０：１  ５６Ｆｅ：５５Ｆｅ）またはヒノキチオール（ＤＭＳＯ中の１０００×ストックから）の使用を除いて、上述のように行った。ヒノキチオール濃度を増加させて添加した際の内因性タンパク質の翻訳及び転写調節変化の実験（図５Ｆ〜Ｊ、図２１、及び図２２Ａ〜Ｌ）には、２５μＭの非放射能ＦｅＣｌ３、及び示された濃度のヒノキチオール（ＤＭＳＯ中の１０００×ストックから）を使用した。
【０４１８】
鉄の不在下でヒノキチオール濃度を増加させる際のフェロポーチンレベルの決定（図２２Ｍ、Ｎ）は、２００ｎＭの非放射能ＦｅＣｌ３を含有する上述のような手順を使用した。
【０４１９】
ＦＰＮ１ノックダウン後の５５Ｆｅ輸送の決定（図５Ｄ及び図１９Ｎ〜Ｐ）は、以下に記載のように、ケルセチンをインキュベートして、ＦＰＮ１をノックダウンした後、２００ｎＭの５５ＦｅＣｌ３を用いて、上述のように決定した（４０）。
【０４２０】
Ｃａｃｏ−２単層におけるフェリチンの５５Ｆｅ免疫沈降（図５Ｃ、図１９Ｌ、及び図２２Ｂ）
フェリチンの免疫沈降は、ヒト抗ＦＴＬ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−７４５１３）及びタンパク質Ｇ  ＰＬＵＳ−アガロースビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−２００２）を用いて行った。細胞溶解物は、上述のように、ＤＭＳＯまたはヒノキチオール（図１９Ｌでは、５００ｎＭ、図２２Ｂでは、０、０．５、１、３、５、１０、２５、または５０μＭ）及びＦｅＣｌ３（図１９Ｌでは、２００ｎＭの５５Ｆｅ、２５μＭの２０：１  ５６Ｆｅ：５５Ｆｅ）で４時間頂端処理した後、ｓｈ対照及びｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層から得た。細胞溶解物を一次抗体（１：１００希釈）で室温にて１時間インキュベートした後、一定混合しながら、二次抗体（１：１０希釈）で室温にて１時間インキュベートした。遠心分離、及びＰＢＳによる濯ぎを繰り返し行い、アガロースペレット中の放射性レベルは、シンチレーション液中の希釈によって決定した。
【０４２１】
Ｃａｃｏ−２単層におけるＴＥＥＲ決定（図１２Ｄ及び図１４Ｌ）
Ｃａｃｏ−２膜完全性を決定するため、輸送試験は、５５ＦｅＣｌ３の代わりに非放射能鉄の使用を除いて、上述のように行った。示された時点で、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）は、上皮電圧抵抗計で決定し、実験の開始時に、膜のＴＥＥＲと比較した。
【０４２２】
細胞株におけるＷＳＴ−８毒性（表Ｓ７）
Ｃａｃｏ−２、ＭＥＬ、及び／またはＪ７７４細胞における小分子媒介毒性の決定は、ＤＭＳＯ中の１０００×ストックの示された小分子を用いて、示された最終濃度を得た以前に報告されたものと同様に（７６）、ＷＳＴ−８キット（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  １００１０１９９）を用いて、製造者の指示に従って行った。
【０４２３】
ＤＭＳＯによるＭＥＬ細胞の分化（図３Ｄ）
ＭＥＬ細胞による分化実験（３９）を行うため、示されたＭＥＬ細胞を、１２ウェルプレート中の１μＭのヒノキチオールまたはＣ２ｄｅＯＨｉｎｏ（ＤＭＳＯ中の１０００×ストックから添加）の不在下または存在下で、１０μＭのクエン酸鉄（ＩＩＩ）及び２％ＤＭＳＯを含有するＭＥＬ完全培地中で１×１０５個の細胞／ｍＬに希釈した。その後、特に記載がない限り、細胞を３７℃で７２時間インキュベートした。ＤＭＳＯの不在下、同一条件下で対照実験を行い、以下に記載のように、分化が、ｏ−ジアニシジン染色によって観察されなかったことが分かった。
【０４２４】
ジアニシジンによる誘導ＭＥＬ細胞の染色（図３Ｅ、Ｇ、図１３Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、図１４Ｄ、及び図２３Ｂ、Ｅ）
以前に報告されたものと同様に、ｏ−ジアニシジン染色を介したＤＭＳＯ誘導の３日後に、ヘモグロビン化ＭＥＬ細胞を定量化した（７４）。誘導の３日後に細胞を遠心分離して、ＰＢＳで濯いだ。その後、細胞を、水中に７．５ｍＭ  ｏ−ジアニシジン、９００ｍＭ  Ｈ２Ｏ２、及び１５０ｍＭ  酢酸を含有する溶液中に、約１×１０６個の細胞／ｍＬで懸濁させた。その後、細胞をＡＸＩＯ  Ｚｏｏｍ  Ｖ１６顕微鏡で撮像し、カラー画像を得た。その後、染色細胞の数を、ＩｍａｇｅＪ分析を介して定量化し、各画像の総細胞数と比較した。ヒノキチオールがヘモグロビン化のためにＤＭＳＯ誘導を必要とすることを決定するため、２％ＤＭＳＯは、７２時間インキュベーション及びｏ−ジアニシジン染色の前に、実験の開始時に添加しなかった。
【０４２５】
ＭＥＬ細胞における５５Ｆｅ取り込み（図１３Ｆ、Ｋ及び図１４Ｂ、Ｅ）
ＭＥＬ細胞を上述のように誘導して、分化させ、３７℃で７０時間インキュベートした後、飽和鉄トランスフェリン（５５Ｆｅ２Ｔｆ）溶液（１０μＭの５５Ｆｅ２Ｔｆストックから４０ｎＭの最終濃度）を添加した。細胞をさらに２時間インキュベートした。完了後、細胞を血球計算器で計数し、遠心分離後に培地を除去し、細胞をＰＢＳ（×３）で濯ぎ、細胞懸濁液をシンチレーションカクテル中で希釈し、放射能を決定した。放射性レベルは、野生型（ＤＳ１９）レベルに比べて、細胞ごとに正規化した（血球計算器によって計数した）。
【０４２６】
ＭＥＬ細胞における５５Ｆｅヘム組み込み（図３Ｆ、図１３Ｋ、及び図１４Ｃ、Ｆ）
ＭＥＬ細胞を上述のように誘導して、分化させ、３７℃で６４時間インキュベートした後、飽和５５Ｆｅ２Ｔｆ溶液（１０μＭの５５Ｆｅ２Ｔｆストックから２５０ｎＭの最終濃度）を添加した。細胞をさらに８時間インキュベートした。完了後、細胞を血球計算器で計数し、遠心分離後に培地を除去し、細胞をＰＢＳ（×３）で濯いだ。その後、細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解して、水で希釈し、３：１  酢酸エチル：酢酸溶液を用いて、ヘムを抽出した。有機抽出物のアリコートをシンチレーションカクテル中で希釈し、放射能を決定した。放射性レベルは、野生型（ＤＳ１９）レベルに比べて、細胞ごとに正規化した（血球計算器によって計数した）。
【０４２７】
ヘモグロビンレベルの決定（図１３Ｉ、Ｊ）
ＭＥＬ細胞を上述のように誘導して、分化させ、３７℃で７２時間インキュベートした。完了後、細胞を血球計算器で計数し、遠心分離後に培地を除去し、細胞をＰＢＳ（×２）で濯いだ。その後、水による凍結／解凍サイクルを繰り返して、細胞を溶解し、１０６個の細胞ごとのヘモグロビンレベルは、遠心分離後にＯＤ４１５を決定することによって、前述のように決定した（７７）。ウェスタンブロットによるグロビンレベルは、上述のように、分化後に決定した。インキュベーションの７２時間後、細胞を溶解し、グロビンレベルは、上述のように、ウェスタンブロットによって決定した。
【０４２８】
Ｃａｃｏ−２細胞及びＪ７７４細胞におけるＦＰＮ１のノックダウン（図３Ｈ〜Ｋ、図５Ｄ、図１４Ｇ〜Ｍ、及び図１９Ｎ〜Ｐ）
野生型Ｃａｃｏ−２細胞におけるＦＰＮ１レベルをノックダウンするため、分化上皮単層を、前述と同様に、Ｇ４１８を含有するＣａｃｏ−２完全培地中の１５０μＭのケルセチン（Ｓｉｇｍａ  ３３７９５１）で１８時間インキュベートした（４０）。ｓｈ対照及びｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層におけるＦＰＮ１レベルをノックダウンするため、インキュベーションは、２５０μＭのケルセチンを除いて、上述のように行った。インキュベーションの完了後、頂端液及び側底液を吸引し、ＰＢＳで濯いだ後、５５Ｆｅ輸送及び取り込みは、上述のように決定した。
【０４２９】
野生型Ｊ７７４細胞におけるＦＰＮ１レベルをノックダウンするため、前述と同様に（４１）、細胞を、Ｊ７７４完全培地中の２μｇ／ｍＬマウスヘプシジン（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰＬＰ−３７７３−ＰＩ）で１時間インキュベートした後、５５ＦｅをＪ７７４細胞に負荷し、５５Ｆｅ放出を決定した。
【０４３０】
Ｊ７７４マクロファージからの５５Ｆｅ放出（図３Ｊ、Ｋ、図１４Ｍ、及び図２３Ｃ、Ｆ）
Ｊ７７４細胞を１２ウェルプレート中で増殖させて、約８０％の密集度にした。その後、細胞を新鮮なＪ７７４完全培地（１ｍＬ）中でビヒクルまたはヘプシジンで処理し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を吸引した後、ビヒクルまたはヘプシジンを含有するＪ７７４完全培地（１ｍＬ）中の５５Ｆｅ２Ｔｆ（５０ｎＭ）溶液を添加した。細胞を３７℃で１０分間インキュベートし、培地を除去した。細胞をＰＢＳ（×２）で濯いだ後、３７℃で１０分間、Ｊ７７４完全培地（１ｍＬ）で濯いだ。培地を吸引した後、ＤＭＳＯまたは小分子（特に記載がない限り、５μＭ、１０００×希釈液）を含有するＪ７７４完全培地（１ｍＬ）を、ヘプシジンの存在下または不在下で添加した。示された時間で、培地のアリコート（≦１００μＬ）を除去し、シンチレーションカクテル中で希釈し、放射能は、液体シンチレーション計数によって決定した。実験の完了後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで濯ぎ、連続的に攪拌しながら（５０ｒｐｍ）、細胞を５００μＬの２００ｍＭ  ＮａＯＨで、３７℃で２時間溶解した。細胞溶解物をシンチレーションカクテル中で希釈し、細胞内５５Ｆｅレベルは、液体シンチレーション計数によって決定した。％５５Ｆｅ放出は、示された時間での細胞外５５Ｆｅの総（細胞内＋細胞外）５５Ｆｅに対する比によって決定した。
【０４３１】
Ｊ７７４マクロファージへの５５Ｆｅの取り込み（図４Ｄ、Ｅ）
Ｊ７７４細胞を１２ウェルプレート中で増殖させて、約８０％の密集度にした。その後、細胞を、５０μＭのＦｅＣｌ３（１００：１  ５６Ｆｅ：５５Ｆｅ）を含有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（１ｍＬ）中のｐＨ＝７．４の血清遊離ＤＭＥＭ培地におけるビヒクルまたはヘプシジンで処理した。３７℃でのインキュベーションの４時間後、細胞をＰＢＳ（×２）で濯ぎ、プロテアーゼ阻害剤を含有する５００μＬ  ＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。細胞溶解物をシンチレーションカクテル中で希釈し、細胞内５５Ｆｅは、液体シンチレーション計数によって決定し、各ウェル中の総タンパク質に正規化した。
【０４３２】
細胞外鉄の関数としてのヒノキチオール促進鉄の取り込み（図４Ｅ）は、１μＭのヒノキチオール（ＤＭＳＯ中の１０００×ストックから）、及び示された最終濃度のＦｅＣｌ３（２０：１  ５６Ｆｅ：５５Ｆｅ）を用いて、野生型Ｊ７７４マクロファージにおいて上述と同様に行った。示された時間で、細胞をＰＢＳ（×２）で濯ぎ、２００ｍＭ  ＮａＯＨで溶解した。細胞溶解物をシンチレーションカクテル中で希釈し、細胞内５５Ｆｅは、液体シンチレーション計数によって決定し、各ウェル中の総タンパク質に正規化した。
【０４３３】
ＭＥＬ細胞の生細胞蛍光イメージング（図４Ａ及び図１６Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｈ）
サイトゾル及びミトコンドリア鉄を視覚化するため、カルセイングリーン及びＲＰＡ蛍光の共焦点イメージングをそれぞれ行った。ＭＥＬ細胞を誘導して、上述のように分化させた。インキュベーションの７０時間後、クエン酸鉄（ＩＩＩ）（１０μＭの最終濃度）を添加した。細胞をさらに２時間インキュベートした後、遠心分離して、ＰＢＳで濯いだ。その後、細胞を、１μＭのカルセイングリーン−ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃ３４８５２）及び１μＭのＲＰＡ（Ａｘｘｏｒａ  ＳＱＸ−ＲＰＡ．１）を含有するＰＢＳ中に再懸濁させた。その後、細胞を３７℃で１５分間インキュベートした。細胞を遠心分離して、ＰＢＳで濯ぎ、１０μＭのＦｅ２Ｔｆを含有するＤＭＥＭ中に再懸濁させた。その後、ＬＳＭ７１０顕微鏡で１０分以内に細胞を撮像した。細胞ごとの相対カルセイングリーン及びＲＰＡ蛍光は、実験ごとに１００超個の細胞を用いて、ＩｍａｇｅＪ分析によって決定した。
【０４３４】
エンドソーム鉄レベルを視覚化するため、ｏｘｙｂｕｒｓｔグリーン−ＢＳＡコンジュゲート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｏ１３２９１）の共焦点イメージングを行った。ＭＥＬ細胞を誘導して、上述のように分化させた。７０時間後、クエン酸鉄（ＩＩＩ）（１０μＭの最終濃度）及びｏｘｙｂｕｒｓｔグリーン−ＢＳＡコンジュゲート（２００μｇ／ｍＬ）を添加した。細胞をさらに２時間インキュベートした後、遠心分離して、ＰＢＳで濯いだ。その後、細胞をＤＭＥＭ−ＨＥＰＥＳ緩衝液中に再懸濁させて、Ｈ２Ｏ２（５０ｍＭの最終濃度）を添加した。細胞を室温でインキュベートした後、ｏｘｙｂｕｒｓｔグリーン蛍光は、ＬＳＭ７１０顕微鏡で、Ｈ２Ｏ２を添加した１０分後に決定した。細胞ごとの相対ｏｘｙｂｕｒｓｔグリーン蛍光は、実験ごとに１００超個の細胞を用いて、ＩｍａｇｅＪ分析によって決定した。
【０４３５】
ＭＥＬ細胞のフローサイトメトリー（図１６Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｊ）
フローサイトメトリーによる細胞カルセイングリーン及びＲＰＡ蛍光の中央値を定量化するため、細胞の染色は、０．１μＭのカルセイングリーン−ＡＭ及び０．１μＭのＲＰＡの使用を除いて、上述のように行った。その後、カルセイングリーン及びＲＰＡ蛍光は、実験ごとに≧１０，０００個の細胞を計数するＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩソーターを用いて、３７℃で決定した。次いで、蛍光の中央値を、色素ごとにｓｈＤＭＴ１に正規化した。
【０４３６】
フローサイトメトリーによる細胞ｏｘｙｂｕｒｓｔグリーン蛍光の中央値を定量化するため、細胞の染色は、５００μｇ／ｍＬのｏｘｙｂｕｒｓｔグリーン−ＢＳＡコンジュゲートの使用、５ｍＭ  Ｈ２Ｏ２の使用を除いて、上述のように行い、Ｈ２Ｏ２の添加後に細胞を３７℃で２０分間インキュベートした後、実験ごとに２０，０００個の細胞を計数するＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターを用いて、蛍光分析をした。次いで、蛍光の中央値を、色素ごとにｓｈＤＭＴ１に正規化した。
【０４３７】
Ｊ７７４マクロファージにおけるサイトゾル鉄レベルの一時的イメージング（図４Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、図１８Ａ〜Ｃ）
ヒノキチオールが、人工鉄勾配の生成を通じて血漿膜を横断して、鉄を可逆的かつ自律的に輸送する能力を評価するため、Ｊ７７４マクロファージをＩｂｉｄｉ皿（Ｉｂｉｄｉ  ＮＣ０７２３６２４）中で増殖させて、約８０％の密集度にした後、５ｍＭアスコルビン酸及び２００μＭ  ＦｅＳＯ４を含有するＪ７７４完全培地でインキュベートした。細胞を１．５時間インキュベートし、培地を吸引し、細胞をＰＢＳで濯いだ。その後、細胞を、３７℃で２０分間、ＤＭＥＭ中でカルセイングリーン−ＡＭ（１μＭ）でインキュベートした。培地を吸引し、細胞をＰＢＳ（×２）で濯いだ後、ＤＭＥＭ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中でｐＨ＝７．４）及び１ｍＭプロベネシド（Ｓｉｇｍａ  Ｐ８７６１）を添加した。その後、カルセイングリーン蛍光を、示された３０分の時点で、５％ＣＯ２、３７℃で、ＬＳＭ８８０顕微鏡で撮像した。ヒノキチオール（１００μＭの最終濃度）、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏ（１００μＭの最終濃度）、またはＤＭＳＯ（全ては、５０μＬ  ＤＭＥＭ中の１０００×ストックから）を５分で添加し、ＦｅＣｌ３（１００μＭの最終濃度、ＤＭＥＭ中の５０μＬ）の溶液を１２分で添加した。各時点での各画像の蛍光をＩｍａｇｅＪ分析によって分析した後、実験ごとに１００超個の細胞を用いて、画像ごとにｔ＝０での蛍光に正規化した。
【０４３８】
野生型及びＦＰＮ１欠乏Ｊ７７４細胞における鉄の取り込みの一時的な生細胞イメージングは、上述のように、カルセイングリーンによる細胞の染色後に行った。その後、細胞をＰＢＳ（×２）で濯ぎ、ヘプシジンの存在下または不在下で、２００μＭ  ＦｅＳＯ４、５ｍＭアスコルビン酸、及び５ｍＭプロベネシドを含有するＪ７７４完全培地中でインキュベートした。カルセイングリーン蛍光は、示された時点で得られ、各時点での各画像の蛍光をＩｍａｇｅＪ分析によって分析した後、実験ごとに１００超個の細胞を用いて、画像ごとにｔ＝０での蛍光に正規化した。
【０４３９】
Ｃａｃｏ−２単層におけるカルセイングリーンによるサイトゾル鉄の一時的イメージング（図５Ｈ〜Ｊ）
ｓｈＤＭＴ１  Ｃａｃｏ−２単層における不安定な鉄レベルの一時的な生細胞イメージングは、ｐＨ＝７．４  ＤＭＥＭ中の頂端液及び側底液におけるカルセイングリーン−ＡＭ（５μＭ）によるＣａｃｏ−２単層の３０分間の染色後に行った。ＰＢＳ（×２頂端側及び側底側）で濯いだ後、単層を、ＤＭＥＭ（側底側）中のｐＨ＝７．４  ＨＥＰＥＳ緩衝液と、２５μＭのＦｅＣｌ３及び０、０．５、１、３、５、１０、２５、または５０μＭのヒノキチオール（ＤＭＳＯ中の１０００×ストックから）のいずれかを含有する頂端液（ＤＭＥＭ中のｐＨ＝５．５  ＭＥＳ緩衝液）とによるＣａｃｏ−２輸送実験と同様に処理した。カルセイングリーン蛍光は、ｔ＝０分及びｔ＝６０分で得られ、各画像の蛍光をＩｍａｇｅＪ分析によって定量化した。
【０４４０】
５９Ｆｅ腸吸収（図６Ａ、Ｂ及び図２４Ａ〜Ｃ）
健常（＋／＋）及びｆｆｅ／＋マウスにおける鉄の胃腸吸収に対するヒノキチオールの効果を特徴付けるため、胃内強制投与前には、４時間（８ａｍ〜１２ｐｍ）食事を控えた。マウスに最大で２％のイソフルランで麻酔をかけて、２０ゲージの１．５インチ強制経口投与針を用いて、５９ＦｅＣｌ３を投与した。５９ＦｅＣｌ３（２００μＣｉ／ｋｇ体重）は、６ｍＭヒノキチオールの存在下または不在下で、１０ｍＭアスコルビン酸を含有するトリス緩衝生理食塩水中で希釈した。投与した最終容量は、マウスごとに１．５ｍＬ／ｋｇであり、個々の体重ごとに補正した。投与した６０、１２０、及び２４０分後に血液を回収し、５９Ｆｅレベルを決定した。６時間後にイソフルランを過剰投与することで、マウスをヒトの手で犠牲にし、心臓穿刺によって血液を回収した。放射能は、ガンマ計数によって定量化し、強制経口投与用量のパーセンテージ（±ＳＥＭ）として計算した。４匹の遺伝子型一致マウス／日で実験を行った；予備分析を決定し、胃内強制投与後の５９Ｆｅの取り込みに対する性別間の効果はなかった；示した実験で性別混合を使用した。
【０４４１】
３〜５ヵ月齢のｂ／ｂラットにおける鉄の５９Ｆｅ胃腸吸収は、６ｍＭヒノキチオールまたは６ｍＭ  Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏのいずれかの存在下で、上述の手順と同様に特徴付けた。正常な鉄の取り込みの速度と比較するため、同齢の兄弟対照（＋／＋または＋／ｂ）ベオグラードラットは、小分子なしで５９Ｆｅを投与したことを除いて、同じ手順で試験した。投与した１５、３０、６０、１２０、１８０、２４０、及び３６０分後に、尾静脈から血液（５０μＬ）を採取した。放射能は、ガンマ計数によって定量化し、強制経口投与用量のパーセンテージ（±ＳＥＭ）として計算した。動物は、６時間でヒトの手で安楽死させた。
【０４４２】
モルファントゼブラフィッシュにおけるノックダウン（図６Ｃ、Ｅ及び図２４Ｄ）
モルホリノ（ＭＯ）は、ＧｅｎｅＴｏｏｌｓ，ＬＬＣ（Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ，ＯＲ）から購入した。使用したＭｏの配列は、以下の通りであった：ｄｍｔ１  ＭＯ：５’−ＧＡＧＴＧＴＧＡＡＡＣＧＴＧＡＣＧＣＡＣＣＣＣＴＴ−３’；ｍｆｒｎ１  ＭＯ：５’−ＴＡＡＧＴＴＧＣＡＴＴＡＣＣＴＴＧＡＣＴＧＡＡＴＣ−３’。１細胞期でのゼブラフィッシュ胚に、前述のように、ＭＯを注入した（７２、７８）。胚中のヘモグロビン化細胞のｏ−ジアニシジン染色は、前述の通りであった（７９）。トランスジェニックＴｇ（グロビンＬＣＲ：ｅＧＦＰ）株由来の蛍光標識赤血球を用いたフローサイトメトリーによる定量化（５０）は、前述のように行った（７２、７５）。モルファントにおけるｄｍｔ１  ｍＲＮＡの半定量的ＲＴ−ＰＣＲは、前述のように、カスタム仕様のプローブを用いて行った（８０）。ｄｍｔ１プライマーの配列は、以下の通りである：５’−ＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＴＧＧＴＣＣＣ−３’（フォワード）；５’−ＴＣＣＧＴＴＡＧＣＧＡＡＧＴＣＧＴＧＣＡＴＧ−３’（リバース）。対照ａｃｔｂプライマーの配列は、以下の通りであった：５’−ＧＴＴＧＧＴＡＴＧＧＧＡＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＧ−３’（フォワード）；５’−ＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧ−３’（リバース）。
【０４４３】
トランスポーター欠乏ゼブラフィッシュにおけるヘモグロビン化の回復（図６Ｃ〜Ｆ及び図２４Ｅ）
変異型胚またはモルファント胚のいずれかを、受精後の（ｈｐｆ）２４時間超に発生させた後、前述のように、プロナーゼで絨毛膜除去した（８１）。その後、絨毛膜除去した胚またはモルファントを、１μＭのヒノキチオール（またはビヒクル）及び１０μＭのクエン酸鉄（ＩＩＩ）の存在下で、さらに４８時間インキュベートした。ビヒクル処理胚を０．０１ｍＭ  ＤＭＳＯに暴露した。クエン酸鉄（ＩＩＩ）（１０μＭ）によるＣ２ｄｅＯＨｉｎｏ（１μＭ）は、陰性対照として使用した。対照胚、及び約７２ｈｐｆの変異型またはモルファント胚のいずれかを、（ａ）ｏ−ジアニシジンによる直接染色（７９）または（ｂ）フローサイトメトリーのために前述のように機械的に均質化（７５、７８）のいずれかで行った。
【０４４４】
ヘテロ接合性交配からの変異型ゼブラフィッシュの遺伝子型決定及びイメージング（図６Ｇ、Ｈ）
ヒノキチオール救出ｆｒｓｔｑ２２３胚の遺伝子型決定は、前述のように行った（１０）。
【０４４５】
小分子の合成及び特徴付け
材料
市販試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、特に記載がない限り、さらに精製せずに使用した。Ｐａｎｇｂｏｒｎ及び同僚らによって記載されるように、充填カラムを通じた継代を介して、溶媒を精製した（８２）。全ての水を使用前に脱イオン化した。
【０４４６】
一般的実験手順
特に記載がない限り、反応は、アルゴンの陽圧下で、ゴム隔膜を装備した、火炎乾燥丸底フラスコまたは改変シュレンクフラスコを行った。特に記載がない限り、有機溶液は、２０〜３５℃の浴温で、減圧下で、回転蒸発を介して濃縮した。Ｅ．Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０  Ｆ２５４プレート（０．２５ｍｍ）上で示された溶媒を用いて、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を分析することによって、反応を監視した。化合物は、ＵＶランプ（λ＝２５４ｎｍまたは３６６ｎＭ）への暴露、及び／またはＫＭｎＯ４の溶液による染色によって視覚化した後、Ｖａｒｉｔｅｍｐヒートガンを用いて加熱した。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、Ｍｅｒｃｋシリカゲルグレード９３８５  ６０Å（２３０〜２４０メッシュ）を用いて行った。分取ＨＰＬＣ精製は、ＳｕｎＦｉｒｅ  ５μｍ  Ｃ１８カラムによるＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙシリーズ分取ＨＰＬＣを用いて行った（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。
【０４４７】
構造分析
１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ  ＮＭＲ、及び１９Ｆ  ＮＭＲは、Ｕｎｉｔｙ  Ｉｎｏｖａ  ５００ＮＢ、Ｖａｒｉａｎ  ＸＲ５００、またはＵｎｉｔｙ  ５００機器上で、２０℃で記録した。化学シフト（δ）を、テトラメチルシランからの百万分率（ｐｐｍ）低磁場で報告し、ＮＭＲ溶媒中の残留プロチウムを基準とする（ＣＨＣｌ３、δ＝７．２６；ＤＭＳＯ−ｄ６、δ＝２．５０）。データを以下の通りに報告する：化学シフト、多重度（ｓ＝一重項、ｄ＝二重項、ｔ＝三重項、ｍ＝多重項、ａｐｐ＝見かけ）、ヘルツ（Ｈｚ）の結合定数（Ｊ）、及び積分。１３Ｃ  ＮＭＲは、ＮＭＲ溶媒中の炭素共鳴を基準とする（ＣＤＣｌ３、δ＝７７．１６；ＤＭＳＯ−ｄ６、δ＝３９．５２）。１９Ｆ  ＮＭＲは、外部標準中のフッ素共鳴を基準とする（ＣＦＣｌ３、δ＝０．００）
【０４４８】
鉄（ＩＩＩ）ヒノキチオール錯体
【化３４９】
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攪拌棒を装備した火炎乾燥２０ｍＬバイアルに、硝酸鉄（ＩＩＩ）非水和物（８１９．８ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）を添加した後、ヒノキチオール（１．００９２ｇ、６．１５ｍｍｏｌ）を添加した。その後、エタノール（１０ｍＬ）を添加した。反応を２時間激しく攪拌し、紫色の懸濁液を得た。生成物を、ろ過を介して回収し、アセトン中で再結晶して、紫色固体（９５９．９ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ、８６．７％収率）として生成物を得た。
【０４４９】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）
Ｃ３０Ｈ３４Ｏ６Ｆｅ（Ｍ＋Ｈ）＋に対する算出値：５４６．１７０５；観測値：５４６．１７０３
元素分析
算出値［Ｃ］：６６．０６％；観測値［Ｃ］：６５．８８％
算出値［Ｈ］：６．１０％；観測値［Ｈ］：６．２１％
算出値［Ｆｅ］：１０．２４％；観測値［Ｆｅ］：１０．１９％
【０４５０】
ヒノキチオールのトリフラート化
攪拌棒を装備したオーブン乾燥３００ｍＬ丸底フラスコに、ヒノキチオール（３．０１４ｇ、１８．２７ｍｍｏｌ）を添加した後、無水ＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）添加した。システムを窒素下に置き、蒸留したてのルチジン（２．５４ｍＬ、２１．９２ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して添加した。システムを氷／水浴中で０℃に冷却し、トリフラート無水物（３．３８ｍＬ、２０．１０ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して滴下して加えた。溶液を０℃で１５分間攪拌した後、室温に温めて、さらに３時間攪拌した。完了後、反応物を飽和水性ＮＨ４Ｃｌ溶液でクエンチした。生成物をＣＨ２Ｃｌ２中で抽出し、ＣｕＳＯ４で洗浄し、ブラインで洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させた。生成物をろ過し、溶媒を回転蒸発によって除去した。その後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（３：１  ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）によって、Ｃ−２及びＣ−７異性体の分離できない混合物として生成物を精製し、わずかに着色した油（４．８１９ｇ、１６．２７ｍｍｏｌ、Ｃ−２及びＣ−７異性体の５３：４７混合物として８８．６％収率）を得た。
ＴＬＣ（１：１  ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）
Ｒｆ＝０．６８，ＵＶ（２５４ｎｍ）及びＫＭｎＯ４染色によって視覚化
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ ７．３４−７．２４（ｍ，５Ｈ），７．１４（ｄｔ，Ｊ＝１１．５，０．７Ｈｚ，１Ｈ），７．０８（ｄｔ，Ｊ＝８．６，０．６Ｈｚ，１Ｈ），６．９９（ｄｄ，Ｊ＝１１．４，９．４Ｈｚ，１Ｈ），２．９１−２．８０（ａｐｐ．ｍ，２Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ）
１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ １７８．０，１７７．７，１５８．７，１５５．９，１５２．３，１３９．０，１３８．２，１３７．９，１３７．８，１３１．９，１２９．９，１２９．３，１２７．６，３８．８，３８．２，２２．９，２．８
１９Ｆ  ＮＭＲ（４７０．２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ−７４．７６，−７４．８４
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）
Ｃ１１Ｈ１２Ｆ３Ｏ４Ｓ（Ｍ＋Ｈ）＋に対する計算値：２９７．０４０８；観測値：２９７．０４０８
【０４５１】
ヒノキチオール−トリフラート水素化分解
酢酸ナトリウム（１．１１ｇ、１３．４ｍｍｏｌ）、トリフラート化ヒノキチオール（２．００ｇ、６．７６ｍｍｏｌ）、炭素上の１０重量％パラジウム（７１．８ｍｇ）、及びメタノール（７５ｍＬ）を、攪拌棒を含有する火炎乾燥２００ｍＬ丸底フラスコに添加した。懸濁液をＮ２で脱ガスした後、溶液を通じてＨ２をバブリングせずにＨ２雰囲気下に置いた。反応物を攪拌し、ＴＬＣ（Ｅｔ２Ｏ）によって３０分間分析した。完了後、Ｎ２を、システムを通じてバブリングし、黒色懸濁液をセライト上でろ過した。メタノールを回転蒸発によって除去し、生成物をジエチルエーテル中で抽出し、ブラインで洗浄した。無水ＭｇＳＯ４で乾燥後、溶媒を回転蒸発によって除去し、わずかに着色した油を得た。分取ＨＰＬＣ（２８３ｎｍ、Ｈ２Ｏ中の２０％ＭｅＣＮ）によって生成物を精製し、Ｃ２−デオキシヒノキチオール及びＣ７−デオキシヒノキチオールを透明油（Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏ：３２５ｍｇ、２．２１ｍｍｏｌ、３２．４％収率；Ｃ７ｄｅＯＨｉｎｏ：２０４ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ、２０．４％収率）として得た。
ＴＬＣ（Ｅｔ２Ｏ）
Ｒｆ＝０．４９，ＵＶ（２５４ｎｍ）及びＫＭｎＯ４染色によって視覚化
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ Ｃ２：７．１０−６．９７（ｍ，３Ｈ），６．９１（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．０，２．６，０．８Ｈｚ，１Ｈ），６．８１（ｄｄｄ，Ｊ＝８．７，１．５，０．７Ｈｚ，１Ｈ），２．７３（７重項，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），１．１９（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，６Ｈ）
δ Ｃ７：７．０９−７．０１（ｍ，３Ｈ），６．９３−６．９２（ｍ，２Ｈ），２．７４（７重項，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），１．２１（ｄ，Ｊ ＝６．９Ｈｚ，６Ｈ）
１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ Ｃ２：１８８．０，１５６．２，１４１．９，１４０．１，１３８．１，１３７．２，１３０．５，３８．１，２３．０
δ Ｃ７：１８８．０，１５７．４，１４１．９，１３８．７，１３７．１，１３６．１，１３３．８，３８．４，２２．９
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）
Ｃ１０Ｈ１３Ｏ（Ｍ＋Ｈ）＋に対する計算値：１４９．０９６６；観測値：１４９．０９７３
【０４５２】
サリシルアルデヒドイソニコチノイルヒドラゾンの合成
イソニコチン酸ヒドラジド（１９８ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を、攪拌棒及びＥｔＯＨ（３ｍＬ）を含有する火炎乾燥７ｍＬバイアルに添加した。その後、サリシルアルデヒド（１７５ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して滴下して加えた。溶液を、Ｎ２下で、７５℃で６時間攪拌した。溶液を０℃に冷却し、真空ろ過によって固体を回収した。生成物を冷ＥｔＯＨで濯ぎ、ＥｔＯＨ中で再結晶して、真空ろ過後に白色固体（２３７ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、６９％収率、＞９５％純度）を得た。特徴付けは、以前に報告されたものと一致した（８３）。
ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）
Ｒｆ＝０．３８，ＵＶ（２５４ｎｍ）及びＫＭｎＯ４染色によって視覚化
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）
δ １１．０８（ｓ，１Ｈ），８．８０（ｄｄ，Ｊ＝４．５，１．７Ｈｚ，２Ｈ），８．６８（ｓ，１Ｈ），７．８５（ｄｄ，Ｊ＝４．４，１．７Ｈｚ，２Ｈ），７．６１（ｄｄ，Ｊ＝７．７，１．７Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｄｄｄ，Ｊ＝８．２，７．２，１．７Ｈｚ，１Ｈ），６．９７−６．９０（ｍ，２Ｈ），−１．７６（ｓ，１Ｈ）
１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）
δ １６１．４，１５７．５，１５０．４，１４９．０，１４０．０，１３１．８，１２９．３，１２１．６，１１９．５，１１８．７，１１６．５
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）
Ｃ１３Ｈ１２Ｎ３Ｏ２（Ｍ＋Ｈ）＋に対する計算値：２４２．０９３０；観測値：２４２．０９２４
【０４５３】
イオン輸送タンパク質の定義
本明細書で使用される場合、「イオン輸送タンパク質」は、膜を横断してイオンを輸送する細胞によって使用されるタンパク質を意味するものであり、これらは、「能動イオン輸送タンパク質」及び「受動イオン輸送タンパク質」にさらに分枝する。語句「能動イオン輸送タンパク質」とは、ＡＴＰ（一次性能動）などのエネルギー源への「上り坂」輸送プロセスまたは別のイオンまたは基質分子（二次性能動）の「下り坂」移動を連結することによって、これらの電気化学的勾配に対してイオンを輸送するものと定義することを意味する。これらの能動イオン輸送タンパク質は、「ポンプ」または「交換体」と代替的に呼ばれることが多い。語句「受動イオン輸送タンパク質」とは、イオンの下り坂移動を単に触媒する受動的なタンパク質イオンチャンネル及び他のイオン輸送タンパク質を記述することを意味する。これらの受動イオン輸送タンパク質は、「チャンネル」及び／または「（受動）トランスポーター」と代替的に呼ばれることが多い。
【０４５４】
表
表１．鉄吸収、恒常性、及び代謝の障害。鉄吸収、恒常性、及び代謝の欠陥と関連する、ヒトにおける遺伝性疾患の非包括的一覧。これらの疾患は、３つのカテゴリーに大きく分類することができる：（ｉ）欠陥鉄吸収の疾患、（ｉｉ）異常な組織鉄レベルと関連する鉄関連タンパク質の疾患、及び（ｉｉｉ）異常な組織鉄レベルと関連する二次障害。他の効果に加えて、これらの疾患は、ある特定の細胞内コンパートメント、細胞、または組織における鉄の異常なレベルと関連し、小分子鉄トランスポーターは、異常な鉄恒常性の効果の改善に役立ち得る。
【表１−１】
2021521116.tif 000381
【表１−２】
2021521116.tif 000382
【０４５５】
表２．鉄キレート剤の物理的特性。ヒノキチオール及び他のキレート剤の結合親和性及び酸化還元電位は、それぞれ、競合アッセイ及びサイクリックボルタンメトリーを通じて決定した。ヒノキチオールは、デフェリプロンを含む多くの他の鉄キレート剤より強力に鉄（ＩＩ）及び鉄（ＩＩＩ）に結合する。鉄：ヒノキチオール錯体は、そのオクタノール−水分配係数によって決定されるように、無極性溶媒中に可溶性である。
【表２】
2021521116.tif 000383
【０４５６】
表３．ヒノキチオール結合及び輸送の選択性。ヒノキチオールは、抽出後の有機可溶性ヒノキチオール：金属錯体のＩＣＰ−ＭＳ分析、かつ、リポソームからの金属流出の速度の決定によって決定されるように、多くの他の二価金属に結合し、輸送する。生物系における結合及び輸送の選択性は、細胞の内部の他の金属によりも不安定な鉄のメタロミクス存在度が高いため、高くなる可能性が高い。（参考文献３３及び３４を参照）。ＮＤ＝未決定；値は、少なくとも３つの独立した実験の平均を表す。
【表３】
2021521116.tif 000384
【０４５７】
表Ｓ４．異なるＨｉｎｏ：Ｆｅ比のヒノキチオール：鉄錯体の標準酸化還元電位。２つの異なる酸化還元波は、ヒノキチオールのサイクリックボルタモグラム（ＣＶ）で観察された。酸化還元電位は、ヒノキチオール濃度の増加に伴って減少した。ＣＶは、ｐＨ＝７．２の１：１  ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏの０．１Ｍトリス緩衝液、及び１００μＭのＦｅ（ＮＯ３）３を用いて、Ｈｇ電極、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準、及びグラファイト補助による１００ｍＶ／ｓの走査速度で得られた。ＮＤ＝未決定；値は、３つの独立した実験の平均を表す。
【表４】
2021521116.tif 000385
【０４５８】
表５．異なるｐＨのヒノキチオール：鉄錯体の標準酸化還元電位。１つの電子酸化還元プロセス（Ｅ０１）に対応する酸化還元波の酸化還元電位は、様々なｐＨで決定した。酸化還元電位は、ｐＨの減少に伴って増加し、恐らくは、２：１または１：１ヒノキチオール：鉄錯体への種形成の増加によるものである。ＣＶは、示されたｐＨの１：１  ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏの０．１Ｍトリス緩衝液、及び５００μＭのヒノキチオール及び１００μＭのＦｅ（ＮＯ３）３を用いて、Ｈｇ電極、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準、及びグラファイト補助による１００ｍＶ／ｓの走査速度で得られた。ＮＤ＝未決定；値は、１〜３の独立した実験の平均を表す。
【表５】
2021521116.tif 000386
【０４５９】
表６．ＮＡＤＰ＋に関する異なる鉄錯体の酸化還元電位。酸化還元電位は、多くの異なる鉄：キレート剤錯体のサイクリックボルタンメトリーによって観察された。ＣＶは、ｐＨ＝７．２の１：１  ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏの０．１Ｍトリス緩衝液、及び５００μＭの小分子及び及び１００μＭのＦｅ（ＮＯ３）３を用いて、Ｈｇ電極、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準、及びグラファイト補助による１００ｍＶ／ｓの走査速度で得られた。値は、１〜３の独立した実験の平均を表す。
【表６】
2021521116.tif 000387
【０４６０】
表７．小分子毒性の評価。小分子処理の＞２４時間の後のＷＳＴ−８アッセイによって決定されるように、異なる細胞型におけるヒノキチオール、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏ、デフェリプロン、及びＰＩＨ  ＥＣ９０値。値は、３つの独立した実験の平均を表す。
【表７】
2021521116.tif 000388
【０４６１】
表８．Ｆｅ（Ｈｉｎｏ）３（ｃｍ６３ｄｓａ）の結晶データ及び構造精密化
【表８】
2021521116.tif 000389
【０４６２】
参考文献
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２０．Ａ．Ｇ．Ｃｉｏｆｆｉ，Ｊ．Ｈｏｕ，Ａ．Ｓ．Ｇｒｉｌｌｏ，Ｋ．Ａ．Ｄｉａｚ，Ｍ．Ｄ．Ｂｕｒｋｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３７，１００９６−１００９９（２０１５）．
２１．Ｍ．Ｒ．Ｂｌｅａｃｋｌｅｙ，Ｒ．Ｔ．Ａ．ＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙ，Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ  ２４，７８５−８０９（２０１１）．
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２３．Ｂ．Ｅ．Ｂｒｙａｎｔ，Ｗ．Ｃ．Ｆｅｒｎｅｌｉｕｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７６，１６９６−１６９７（２００２）．
２４．Ｍ．Ｃ．Ｂａｒｒｅｔ，Ｍ．Ｆ．Ｍａｈｏｎ，Ｋ．Ｃ．Ｍｏｌｌｏｙ，Ｊ．Ｗ．Ｓｔｅｅｄ，Ｐ．Ｗｒｉｇｈｔ，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４０，４３８４−４３８８（２００１）．
２５．Ｋ．Ｎｏｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８，４６−６０（２００４）．
２６．Ｋ．Ｎｏｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．３６２，４３−５５（２００９）．
２７．Ｃ．Ｍｅｃｋ，Ｍ．Ｐ．Ｄ’Ｅｒａｓｍｏ，Ｄ．Ｒ．Ｈｉｒｓｃｈ，Ｒ．Ｐ．Ｍｕｒｅｌｌｉ，ＭｅｄＣｈｅｍＣｏｍｍ  ５，８４２−８５２（２０１４）．
２８．Ｙ．Ｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆ．３２，６３−７３（１９９９）．
２９．Ｋ．Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｙ．Ｏｈａｒａ，Ｍ．Ｈａｎｅｄａ，Ｒ．Ｔｓｕｂｏｕｃｈｉ，Ｍ．Ｙｏｓｈｉｎｏ，Ｂａｓｉｃ  Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．９７，３９２−３９４（２００５）．
３０．Ｍ．Ｊ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｗ．Ｋｉｍ，Ｅ．Ｇ．Ｙａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３９６，３７０−３７５（２０１０）．
３１．Ｇ．Ｂｏｈｍｅ，Ｐ．Ｓｃｈｏｎｆｅｌｄ，Ｕ．Ｋｕｓｔｅｒ，Ｗ．Ｋｕｎｚ，Ｈ．Ｌｙｒ，Ａｃｔａ  Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．Ｇｅｒ．３９，１１５３−１１６３（１９８０）．
３２．Ｇ．Ｇｈｓｓｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５２，１１０５−１１０９（２０１６）．
３３．Ｌ．Ａ．Ｆｉｎｎｅｙ，Ｔ．Ｖ．Ｏ’Ｈａｌｌｏｒａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００，９３１−９３６（２００３）．
３４．Ｌ．Ａ．Ｂａ，Ｍ．Ｄｏｅｒｉｎｇ，Ｔ．Ｂｕｒｋｈｏｌｚ，Ｃ．Ｊａｃｏｂ，Ｍｅｔａｌｌｏｍｉｃｓ  １，２９２−３１１（２００９）．
３５．Ｍ．Ｓ．Ｃｙｅｒｔ，Ｃ．Ｃ．Ｐｈｉｌｐｏｔｔ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９３，６７７−７１３（２０１３）．
３６．Ａ．Ｅｓｐｉｎｏｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍ．Ｒｅｓ．１４６，２８１−２８６（２０１２）．
３７．Ｉ．Ｈｕｂａｔｓｃｈ，Ｅ．Ｇ．Ｅ．Ｒａｇｎａｒｓｓｏｎ，Ｐ．Ａｒｔｕｒｓｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２，２１１１−２１１９（２００７）．
３８．Ｍ．Ｔａｂｕｃｈｉ，Ｔ．Ｙｏｓｈｉｏｍｏｒｉ，Ｋ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｆ．Ｋｉｓｈｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，２２２２０−２２２２８（２０００）．
３９．Ｃ．Ｆｒｉｅｎｄ，Ｗ．Ｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ｇ．Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｔ．Ｓａｔｏ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．６８，３７８−３８２（１９７１）．
４０．Ｍ．Ｌｅｓｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９，ｅ１０２９００（２０１４）．
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４６．Ｎ．Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．３１，３５７−３７０（２００６）．
４７．Ｔ．Ｖｅｕｔｈｅｙ，Ｍ．Ｗｅｓｓｉｌｉｎｇ−Ｒｅｓｎｉｃｋ，Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５，１−８２（２０１４）．
４８．Ｓ．Ａｖａｇｙａｎ，Ｌ．Ｉ．Ｚｏｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２７，２８７−２９４（２０１６）．
４９．Ａ．Ｄｏｎｏｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １００，４６５５−４６５９（２００２）．
５０．Ｊ．Ｊ．Ｇａｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３６６，１８５−１９４（２０１２）．
５１．Ａ．Ｂｒｏｗｎｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０，２４４−２５０（１９９８）．
５２．Ｃ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ４４０，４８４−４８９（２００６）．
５３．Ｅ．Ｙ．Ｋｗｏｋ，Ｓ．Ｓｅｖｅｒａｎｃｅ，Ｄ．Ｊ．Ｋｏｓｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５，６３１７−６３２７（２００６）．
５４．Ｃ．−Ｗ．Ｙｕｎ，Ｊ．Ｓ．Ｔｉｅｄｅｍａｎ，Ｒ．Ｅ．Ｍｏｏｒｅ，Ｃ．Ｃ．Ｐｈｉｌｐｏｔｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１６３５４−１６３５９（２０００）．
５５．Ｙ．Ａ．Ｓｅｏ，Ｊ．Ａ．Ｅｌｋｈａｄｅｒ，Ｍ．Ｗｅｓｓｌｉｎｇ−Ｒｅｓｎｉｃｋ，Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ  ２９，１４７−１５５（２０１６）．
５６．Ｓ．Ｓｅｖｅｒａｎｃｅ，Ｓ．Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ｄ．Ｊ．Ｋｏｓｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８０，４８７−４９６（２００４）．
５７．Ｊ．Ｃ．Ｄｅａｒｄｅｎ，Ｇ．Ｍ．Ｂｒｅｓｎｅｎ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ７，１３３−１４４（２０１６）．
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６２．Ｇ．Ｐ．Ｗｈｉｔｅ，Ａ．Ｊａｃｏｂｓ，Ｒ．Ｗ．Ｇｒａｄｙ，Ａ．Ｃｅｒａｍｉ，Ｂｌｏｏｄ  ４８，９２３−９２９（１９７６）．
６３．Ｄ．Ｖｙｏｒａｌ，Ｊ．Ｐｅｔｒａｋ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４０３，１７９−１８８（１９９８）．
６４．Ｃ．Ｙ．Ｌｉ，Ｊ．Ａ．Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｊ．Ｇｌａｓｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１０２４２−１０２４６（１９９４）．
６５．Ｓ．Ａ．Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３７，１５１０２−１５１０４（２０１５）．
６６．Ｂ．Ｓ．Ｂｅｒｌｅｔｔ，Ｒ．Ｌ．Ｌｅｖｉｎｅ，Ｐ．Ｂ．Ｃｈｏｃｋ，Ｍ．Ｃｈｅｖｉｏｎ，Ｅ．Ｒ．Ｓｔａｄｔｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．９８，４５１−４５６（２００１）．
６７．Ａ．Ｃ．Ｉｌｌｉｎｇ，Ａ．Ｓｈａｗｋｉ，Ｃ．Ｌ．Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７，３０４８５−３０４９６（２０１２）．
６８．Ｉ．Ａ．Ｅｈｒｎｓｔｏｒｆｅｒ，Ｅ．Ｒ．Ｇｅｅｒｔｓｍａ，Ｅ．Ｐａｒｄｏｎ，Ｊ．Ｓｔｅｙａｅｒｔ，Ｒ．Ｄｕｔｚｌｅｒ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１，９９０−９９６（２０１４）．
６９．Ｗ．Ｌｏｖｅｎｂｅｒｇ，Ｂ．Ｂ．Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｊ．Ｃ．Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３８，３８９９−３９１３（１９６３）．
７０．Ｚ．Ｊ．Ｂａｒｔｏｎ，Ｊ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌｏｐｅｚ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８６，１０６６０−１０６６７（２０１４）．
７１．Ｐ．Ｎ．Ｄｉｏｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，４３７７−４３８２（２００２）．
７２．Ｊ．Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｓｉｇｎａｌ  ８，ｒａ３４（２０１５）．
７３．Ｍ．Ｃ．Ｃａｎｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９，２１３１２−２１３２４（２０１４）．
７４．Ｙ．Ｙ．Ｙｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２４，４２９４−４３０４（２０１４）．
７５．Ｇ．Ｈｉｌｄｉｃｋ−Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．９３，９０６−９１４（２０１３）．
７６．Ｂ．Ｃ．Ｗｉｌｃｏｃｋ，Ｍ．Ｍ．Ｅｎｄｏ，Ｂ．Ｅ．Ｕｎｏ，Ｍ．Ｄ．Ｂｕｒｋｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３５，８４８８−８４９１（２０１３）．
７７．Ｍ．Ｆｏｒｅｓｔｉ，Ｉ．Ｐａｏｌｅｔｔｉ，Ｆ．Ｍｅｌｅ，Ｇ．Ｇｅｒａｃｉ，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．３７４，２６９−２７５（１９９７）．
７８．Ｊ．Ｄ．Ｃｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３７３，４３１−４４１（２０１３）．
７９．Ｊ．Ｄ．Ａｍｉｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１４，４６５４−４６６３（２００９）．
８０．Ｒ．Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．１０，１１９−１３０（２００９）．
８１．Ｊ．Ｒ．Ｋａｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １６１，８５８−８６７（２０１５）．
８２．Ａ．Ｂ．Ｐａｎｇｂｏｒｎ，Ｍ．Ａ．Ｇｉａｒｄｅｌｌｏ，Ｒ．Ｈ．Ｇｒｕｂｂｓ，Ｒ．Ｋ．Ｒｏｓｅｎ，Ｆ．Ｊ．Ｔｉｍｍｅｒｓ，Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ  １５，１５１８−１５２０（１９９６）．
８３．Ｐ．Ａ．Ｐｒｏｖｅｎｃｈｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｌｏｖｅ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．８０，９６０３−９６０９（２０１５）．
８４．Ｄ．Ｃ．Ｇａｄｓｂｙ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０，３４４−３５２（２００９）．
８５．Ａ．Ｊ．Ｂａｒｄ，Ｌ．Ｒ．Ｆａｕｌｋｎｅｒ，Ｅｄ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｄ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｅ．Ｓｗａｉｎ，Ｃ．Ｒｏｂｅｙ，Ｅ．Ａｉｅｌｌｏ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２ｎｄ  Ｅｄ．，２００１）．
８６．Ａ．Ｉｏｌａｓｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１５２，１３６−１３９（２００８）．
８７．Ｙ．Ｗａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３９，７８４−７９３（２０１１）．
８８．Ａ．Ｐｉｅｔｒａｎｇｅｌｏ，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．３２，１３１−１３８（２００４）．
８９．Ｐ．Ｂｒｉｓｓｏｔ，Ｅ．Ｂａｒｄｏｕ−Ｊａｃｑｕｅｔ，Ａ．Ｍ．Ｊｏｕａｎｏｌｌｅ，Ｏ．Ｌｏｒｅａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１７，７０７−７１３（２０１１）．
９０．Ｃ．Ｎ．Ｒｏｙ，Ｎ．Ｃ．Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０，２１８１−２１８６（２００１）．
９１．Ｓ．Ｓｈｅｔｈ，Ｇ．Ｍ．Ｂｒｉｔｔｅｎｈａｍ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５１，４４３−４６４（２０００）．
９２．Ｌ．Ｇｏｕｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９３，２０１５−２１１０（１９９９）．
９３．Ａ．Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｓ．Ｈａｙｆｌｉｃｋ，Ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｂｒａｉｎ  Ｉｒｏｎ  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ．（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，２０１４）．
９４．Ｇ．Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ，Ｋ．Ｐａｎｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０２，１９９−２１１（２００５）．
９５．Ｂ．Ｇｒａｎｄｃｈａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１８，６６６０−６６６６（２０１１）．
９６．Ｊ．Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６９，１９１−１９７（２００１）．
９７．Ｍ．Ｈ．Ｍｅｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１７，１１５５−１１６３（１９９９）．
９８．Ｓ．Ｇａｒｄｅｎｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０９，５０２７−５０３５（２００７）．
９９．Ｈ．Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２０，１７４９−１７６１（２０１０）．
１００．Ａ．Ｇａｊｏｗｉａｋ，Ａ．Ｓｔｙｓ，Ｒ．Ｒ．Ｓｔａｒｚｙｎｓｋｉ，Ｒ．Ｓｔａｒｏｎ，Ｐ．Ｌｉｐｉｎｓｋｉ，Ｐｏｓｔｅｐｙ  Ｈｉｇ．Ｍｅｄ．Ｄｏｓｗ．７０，７０９−７２１（２０１６）．
１０１．Ｄ．Ｌ．Ｇｕｅｒｎｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４１，６５１−６５３（２００９）．
１０２．Ｒ．Ｒａｇｈｕｐａｔｈｙ，Ｄ．Ｍａｎｗａｎｉ，Ｊ．Ａ．Ｌｉｔｔｌｅ，Ａｄｖ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１０，１−９（２０１０）．
１０３．Ｎ．Ｓｈｅｎｏｙ，Ｎ．Ｖａｌｌｕｍｓｅｔｌａ，Ｅ．Ｒａｃｈｍｉｌｅｗｉｔｚ，Ａ．Ｖｅｒｍａ，Ｙ．Ｇｉｎｚｂｕｒｇ，Ｂｌｏｏｄ  １２４，８７３−８８１（２０１４）．
１０４．Ｒ．Ｃ．Ｈｉｄｅｒ，Ｙ．Ｍａ，Ｉｎ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｈｅｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｒ．Ｃｒｉｃｈｔｏｎ，Ｒ．Ｊ．Ｗａｒｄ，Ｒ．Ｃ．Ｈｉｄｅｒ，（Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ，２０１７）Ｃｈａｐｔｅｒ  ２：２４−５５．
１０５．Ｊ．Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｍ．Ｒａｎｇｅｌ，Ａｄｖ．Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０，１６７−２４３（２００８）．
１０６．Ｔ．Ｆｒａｎｚａ，Ｄ．Ｅｘｐｅｒｔ，Ｉｎ  Ｉｒｏｎ  Ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｐ．Ｃｏｒｎｅｌｉｓ，Ｓ．Ｃ．Ａｎｄｒｅｗｓ（Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＵＫ，１，２０１０）Ｃｈａｐｔｅｒ  ６：１０１−１１６．
１０７．Ｍ．Ｍｅｒｋｏｆｅｒ，Ｒ．Ｋｉｓｓｎｅｒ，Ｒ．Ｃ．Ｈｉｄｅｒ，Ｗ．Ｈ．Ｋｏｐｐｅｎｏｌ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ８７，３０２１−３０３４（２００４）．
１０８．Ｓ．Ａ．Ｋａｚｍｉ，Ｓ．Ａｍｉｎ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐａｋ．３０，８２４−８２８（２００８）．
１０９．Ｙ．Ｈ．Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１５３，Ａ９２９−Ａ９３４（２００６）．
【０４６３】
実施例２：ヒノキチオール誘導体の合成−β置換ブロミド
【化３５０】
2021521116.tif 000390
２００ｍｇのブロミドで約１５個の誘導体を作製することができる。
【０４６４】
実施例３：ヒノキチオール誘導体の合成−１００ｍｇのスケール反応
【化３５１】
2021521116.tif 000391
【０４６５】
実施例４：ヒノキチオールのモジュラー４工程の全合成
【化３５２】
2021521116.tif 000392
代替ボルネート：
【化３５３】
2021521116.tif 000393
式中、
Ｒは独立して、Ｃ１−２０−アルキル、Ｃ２−２０−アルケニル、Ｃ３−９−シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、各々は、未置換であるか、または、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−ハロアルキル、及びＣ１−６−アルコキシからなる群から選択される置換基で置換される。
【０４６６】
実施例５：ヒノキチオール誘導体一次ボロン酸の合成
【化３５４】
2021521116.tif 000394
【０４６７】
実施例６：ヒノキチオール誘導体の合成−親油性試験
【化３５５】
2021521116.tif 000395
【０４６８】
実施例７：ヒノキチオール誘導体の合成
【化３５６】
2021521116.tif 000396
【０４６９】
実施例８：ヒノキチオール誘導体の合成
【化３５７】
2021521116.tif 000397
【０４７０】
実施例９：３−ブロモ、４−ブロモ、及び５−ブロモトロポロンの合成
【化３５８−１】
2021521116.tif 000398
【化３５８−２】
2021521116.tif 000399
【０４７１】
実施例１０：ブロモトロポロンのクロスカップリング
【化３５９】
2021521116.tif 000400
【０４７２】
実施例１１：ヒノキチオール誘導体の合成−β置換ブロミド
【化３６０】
2021521116.tif 000401
【０４７３】
実施例１２：ヒノキチオール誘導体の合成−二次ボロン酸
【化３６１】
2021521116.tif 000402
【０４７４】
実施例１３：ヒノキチオール誘導体によるｆｅｔΔｆｔｒ１Δ増殖の回復
【化３６２】
2021521116.tif 000403
【０４７５】
実施例１４：ｆｅｔΔｆｔｒ１Δ増殖の回復におけるヒノキチオール誘導体の構造−活性関係試験
この試験は、最適活性のための、トロポロン環上の炭化水素置換基のサイズの最適なウィンドウを特定する。側鎖が長くなりすぎると、具体的には、４個を超える炭素になると、欠如しているタンパク質鉄トランスポーター機能を置き換える能力において大きな損失がある。このデータセットは、炭化水素置換基（すなわち、１〜４個の炭素が、最適であると思われる）の最適なウィンドウの有界性に対する強力なエビデンスを付加する。（図２５Ａ〜２５Ｄ）
【０４７６】
実施例１５：ヒノキチオールは、ＦＰＮ欠乏マウスの肝臓から鉄を放出する
フラットアイアンマウスにおける、鉄動員及び分布に対するヒノキチオールの効果を特徴付けるため、腹腔内（ＩＰ）注射を介して、用量（１〜５０ｍｇ／ｋｇ）の増加に伴って、ヒノキチオールを投与した。投与の４時間後にマウスを安楽死させて、血液及び組織の範囲を回収した。肝臓非ヘム鉄の用量依存的減少が観察された。肝臓及び脾臓を含む様々な組織中の全鉄はさらに、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）によって測定した。データは、ヒノキチオール（１０ｍｇ／ｋｇで）によるフラットアイアンマウスの処理が、肝臓からの鉄を放出させることを示す（図２６Ｂ）。これらのデータは、ヒノキチオールが、ＦＰＮ欠乏マウスの肝臓から鉄を放出することを示す。他の組織は、非ヘム鉄中の還元を示唆するデータが得られた（図２６Ｃ〜２６Ｅ）。
【０４７７】
実施例１６：テレビン油の注射によって誘導された低鉄血症は、ヒノキチオール処理によって軽減された
テレピン油（ＴＯ）の注射は、マウスにおける炎症を誘導する一般的な方法である。単回用量のＴＯは、十二指腸及び脾臓におけるＦＰＮタンパク質レベルの下方調節（図２７Ｂ）と付随して、肝臓におけるヘプシジンｍＲＮＡレベルを急速に増加させた（図２７Ａ）。結果として、鉄蓄積は、十二指腸及び脾臓で生じた。さらに、血清鉄は、ヘマトクリット値（図２７Ｄ）に影響を与えることなく減少した（図２７Ｃ）。ＴＯ注射によって誘導された低鉄血症は、ヒノキチオール処理によって軽減された一方、他のＦＤＡ承認薬は、その効果を提供できなかった（図２７Ｅ）。
【０４７８】
実施例１７：ＴＯを用いた慢性ＡＩの動物モデル
慢性ＡＩは臨床的に関連するので、ＴＯを用いた慢性ＡＩの動物モデルを発生させて、最適化した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＴＯの週１回注射を３週間することが、最良モデルであると分かった（図２８Ａ）。慢性炎症の際に、肝臓ヘプシジンの上方調節は、最後の注射の４日後に消失し、血清鉄は、ベースラインレベルに戻った（図２８Ｂ）。しかしながら、脾臓及び十二指腸におけるＦＰＮ下方調節（図２８Ｃ）及び組織鉄蓄積（図２８Ｄ）は、少なくとも２週間持続した。重要なことに、貧血が発生した（図２８Ｅ）。
【０４７９】
実施例１８：ｆｅｔΔｆｔｒ１Δ増殖の回復におけるヒノキチオール誘導体の構造−活性関係試験
ＡＩにおけるヒノキチオールの薬力学（効果）の評価に加えて、ヒノキチオールの薬物動態を特徴付けて、処理の最適な用量スキームをガイドした。腹腔内注射（図２９Ａ）及び強制経口投与（図２９Ｂ）による単回用量は、ヒノキチオールの迅速な処分を示した。ヒノキチオールは、用量依存的な薬物動態を呈し；半減期の増加は、高用量（１００ｍｇ／ｋｇ）で観察され、これは、ヒノキチオール代謝の飽和による可能性が高い。
【０４８０】
参照による組み込み
本明細書に記載した全てのＵＳ特許及びＵＳ及びＰＣＴ公開特許出願は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合は、ここに記載されている如何なる定義も含めて本出願が優先する。
【０４８１】
等価物
本発明の特定の実施形態について論述してきたが、上記明細書は例示的であって限定するものではない。本発明の多くの変形は、本明細書及び後述する特許請求の範囲を鑑みれば当業者には明らかなものである。本発明の完全な範囲は、特許請求の範囲、並びにその完全な範囲の等価物、及び明細書並びにその変形例を参照することにより決定されるべきである。
【図１Ａ】
2021521116.tif 000683
【図１Ｂ】
2021521116.tif 000684
【図１Ｃ】
2021521116.tif 000685
【図１Ｄ】
2021521116.tif 000686
【図１Ｅ】
2021521116.tif 000687
【図１Ｆ】
2021521116.tif 000688
【図１Ｇ】
2021521116.tif 000689
【図２Ａ】
2021521116.tif 000690
【図２Ｂ】
2021521116.tif 000691
【図２Ｃ】
2021521116.tif 000692
【図２Ｄ】
2021521116.tif 000693
【図２Ｅ】
2021521116.tif 000694
【図２Ｆ】
2021521116.tif 000695
【図３Ａ】
2021521116.tif 000696
【図３Ｂ】
2021521116.tif 000697
【図３Ｃ】
2021521116.tif 000698
【図３Ｄ】
2021521116.tif 000699
【図３Ｅ】
2021521116.tif 000700
【図３Ｆ】
2021521116.tif 000701
【図３Ｇ】
2021521116.tif 000702
【図３Ｈ】
2021521116.tif 000703
【図３Ｉ】
2021521116.tif 000704
【図３Ｊ】
2021521116.tif 000705
【図３Ｋ】
2021521116.tif 000706
【図４Ａ】
2021521116.tif 000707
【図４Ｂ】
2021521116.tif 000708
【図４Ｃ】
2021521116.tif 000709
【図４Ｄ】
2021521116.tif 000710
【図４Ｅ】
2021521116.tif 000711
【図４Ｆ】
2021521116.tif 000712
【図４Ｇ】
2021521116.tif 000713
【図４Ｈ】
2021521116.tif 000714
【図４Ｉ】
2021521116.tif 000715
【図５Ａ】
2021521116.tif 000716
【図５Ｂ】
2021521116.tif 000717
【図５Ｃ】
2021521116.tif 000718
【図５Ｄ】
2021521116.tif 000719
【図５Ｅ】
2021521116.tif 000720
【図５Ｆ】
2021521116.tif 000721
【図５Ｇ】
2021521116.tif 000722
【図５Ｈ】
2021521116.tif 000723
【図５Ｉ】
2021521116.tif 000724
【図５Ｊ】
2021521116.tif 000725
【図６Ａ】
2021521116.tif 000726
【図６Ｂ】
2021521116.tif 000727
【図６Ｃ】
2021521116.tif 000728
【図６Ｄ】
2021521116.tif 000729
【図６Ｅ】
2021521116.tif 000730
【図６Ｆ】
2021521116.tif 000731
【図６Ｇ】
2021521116.tif 000732
【図６Ｈ】
2021521116.tif 000733
【図７Ａ】
2021521116.tif 000734
【図７Ｂ】
2021521116.tif 000735
【図７Ｃ】
2021521116.tif 000736
【図８Ａ】
2021521116.tif 000737
【図８Ｂ】
2021521116.tif 000738
【図８Ｃ】
2021521116.tif 000739
【図８Ｄ】
2021521116.tif 000740
【図８Ｅ】
2021521116.tif 000741
【図８Ｆ】
2021521116.tif 000742
【図８Ｇ】
2021521116.tif 000743
【図８Ｈ】
2021521116.tif 000744
【図８Ｉ】
2021521116.tif 000745
【図９Ａ】
2021521116.tif 000746
【図９Ｂ】
2021521116.tif 000747
【図９Ｃ】
2021521116.tif 000748
【図９Ｄ】
2021521116.tif 000749
【図９Ｅ】
2021521116.tif 000750
【図９Ｆ】
2021521116.tif 000751
【図９Ｇ】
2021521116.tif 000752
【図９Ｈ】
2021521116.tif 000753
【図９Ｉ】
2021521116.tif 000754
【図９Ｊ】
2021521116.tif 000755
【図９Ｋ】
2021521116.tif 000756
【図９Ｌ】
2021521116.tif 000757
【図９Ｍ】
2021521116.tif 000758
【図９Ｎ】
2021521116.tif 000759
【図９Ｏ】
2021521116.tif 000760
【図９Ｐ】
2021521116.tif 000761
【図１０Ａ】
2021521116.tif 000762
【図１０Ｂ】
2021521116.tif 000763
【図１０Ｃ】
2021521116.tif 000764
【図１０Ｄ】
2021521116.tif 000765
【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１０Ｊ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１１Ｊ】
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【図１１Ｋ】
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【図１１Ｌ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１３Ｉ】
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【図１３Ｊ】
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【図１３Ｋ】
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【図１３Ｌ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１４Ｈ】
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【図１４Ｉ】
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【図１４Ｊ】
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【図１４Ｋ】
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【図１４Ｌ】
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【図１４Ｍ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１６Ｈ】
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【図１６Ｉ】
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【図１６Ｊ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図１９Ｇ】
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【図１９Ｈ】
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【図１９Ｉ】
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【図１９Ｊ】
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【図１９Ｋ】
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【図１９Ｌ】
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【図１９Ｍ】
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【図１９Ｎ】
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【図１９Ｏ】
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【図１９Ｐ】
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【図１９Ｑ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２２Ｇ】
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【図２２Ｈ】
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【図２２Ｉ】
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【図２２Ｊ】
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【図２２Ｋ】
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【図２２Ｌ】
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【図２２Ｍ】
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【図２２Ｎ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２８Ｅ】
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【図２９Ａ】
2021521116.tif 000901
【図２９Ｂ】
2021521116.tif 000902
【配列表】
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【国際調査報告】
2021521116.tif 000903
2021521116.tif 000904
2021521116.tif 000905
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