(57)【要約】本発明は、生体試料の複数周回の染色を可能にする、ブロッキング緩衝液、画像化緩衝液及び溶出緩衝液の緩衝液の組み合わせを使用することを含む、生体試料の多重染色のための方法に関する。ブロッキング緩衝液は、疎水性結合部位に非特異的に結合可能な化合物及びスルフヒドリル反応性化合物を含む。画像化緩衝液は中性ｐＨであり、ラジカル捕捉剤を含み、そして溶出緩衝液はｐＨが４より低く、緩衝成分、還元剤、及び水素結合を切断する少なくとも１つの化合物を含む。本発明はさらに、本発明の方法の実施に使用される緩衝液、及びこれらの緩衝液を含むキットに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料を多重染色する方法であって、以下のステップ：
ａ．  ブロッキングステップにおいて、画像化のために調製される生体試料をブロッキング溶液と接触させるステップであって、前記ブロッキング溶液は、
ｉ．  非特異的に疎水性結合部位に結合することが可能であるブロッキング化合物、及び
ｉｉ．  スルフヒドリル反応性化合物、
を含む、前記ステップ、
ｂ．  第１の洗浄ステップにおいて、前記生体試料を洗浄液と接触させるステップ、
ｃ．  第１の染色ステップにおいて、前記生体試料を第１の抗原に特異的な第１の抗体と接触させるステップであって、
ｉ．  前記第１の抗体は、検出可能な標識、特に蛍光標識を有する、又は
ｉｉ．  前記第１の抗体は、検出可能な標識を有さず、第１の染色ステップの後に、試料を洗浄液に接触させ、そして前記生体試料を第２の抗体と接触させる第２の染色ステップが実施され、前記第２の抗体は、
−  検出可能な標識、特に蛍光標識を有する、及び
−  第１の抗体に特異的である、
前記ステップ、
ｄ．  第２の洗浄ステップにおいて、前記生体試料を洗浄液と接触させるステップ、
ｅ．  画像化ステップにおいて、前記生体試料を、ラジカル捕捉剤を含有する中性ｐＨにて画像化溶液に接触させ、その後、試料の蛍光画像を記録するステップ、
ｆ．  第３の洗浄ステップにおいて、前記生体試料を洗浄液と接触させるステップ、
ｇ．  溶出ステップにおいて、前記生体試料を溶出液と接触させるステップであって、前記溶出液は、
ｉ  ｐＨが（＜）４より低い、特にｐＨ＜３、より特に≦２．７であることを特徴とする、及び
ｉｉ．  緩衝成分、還元剤、及び水素結合を切断する少なくとも１つの化合物を含む、
前記ステップ、
を含み、ステップａ〜ｇは、各繰り返しにおいて異なる第１の抗体を使用して、特に１、２、３、４、５回以上（≧５）、≧１０、≧１５、≧２０、≧３０、≧５０、又はさらに≧１００回繰り返される、
前記方法。
【請求項２】
画像化ステップ（ステップ（e））の直前に、以下のステップ：
ｉ．  前記生体試料をＤＮＡ結合性蛍光化合物に接触させる、核標識化ステップ、
ｉｉ．  前記生体試料を洗浄液に接触させる、洗浄ステップ、
が実施される、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
−  ブロッキング溶液中のブロッキング化合物は、ブロッキングポリペプチドである、及び／又は
−  水素結合を切断する溶出液中の化合物は、カオトロピック塩である、
請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
−  ブロッキングポリペプチドは、ＢＳＡ、ＦＢＳ、ＳＡ、ヒト血清、ゼラチン、脱脂粉乳、又はブタ由来の高純度皮膚コラーゲンのポリペプチド画分（Ｐｒｉｏｎｅｘ（登録商標）試薬）から選択される、及び／又は
−  スルフヒドリル反応性化合物は、マレイミド、ハロアセチル、又はピリジルジスルフィドから選択される、及び／又は
−  ラジカル捕捉剤は、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルシステインアミド、システイン、Ｌ−アスコルビン酸、レスベラトロール、β−カロテン、セレノ−Ｌ−メチオニン、クロロゲン酸及び／又はカフェイン酸から選択される、及び／又は
−  緩衝成分は、リン酸塩／クエン酸塩、フタル酸水素カリウム、及びＬ−グリシンから選択される、及び／又は
−  還元剤は、ＴＣＥＰ、ジチオスレイトール、又は２−メルカプトエタノールから選択される、及び／又は
−  カオトロピック塩は、塩化グアニジニウム、尿素、ドデシル硫酸ナトリウム、又は塩化マグネシウムの１つ又は複数から選択される、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
−  ブロッキング溶液は、ＢＳＡ、ＦＢＳ、ＳＡ、ヒト血清、ゼラチン、脱脂粉乳又はＰｒｉｏｎｅｘ（登録商標）試薬から選択される０．１〜４％、特に０．５〜２％の化合物、及び／又は１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌ、特に１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの、マレイミド、ハロアセチル、又はピリジルジスルフィドを含む、及び／又は
−  画像化溶液は、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルシステインアミド、システイン、Ｌ−アスコルビン酸、レスベラトロール、β−カロテン、セレノ−Ｌ−メチオニン、クロロゲン酸又はカフェイン酸から選択される１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌ、特に３００ｍｍｏｌ／Ｌ〜１．５ｍｏｌ／Ｌの化合物を含み、及び／又はｐＨが７．２〜７．６で構成される、及び／又は
−  溶出液は、０．５ＭのＬ−グリシン、及びＴＣＥＰ、ジチオスレイトール又は２−メルカプトエタノールから選択される１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌの化合物、及び／又は１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｏｌ／Ｌの塩化グアニジニウム、尿素、ドデシル硫酸ナトリウム又は塩化マグネシウムの１つ又は複数を含み、及び／又はｐＨが２．２〜２．６で構成される、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
−  ブロッキング溶液は、ＰＢＳ中に１％のＢＳＡ及び１５０ｍＭのマレイミドを含む、及び／又は
−  画像化溶液は、ｐＨ  ７．４でＨ２Ｏ中に、７００ｍＭのＮ−アセチルシステインを含む、及び／又は
−  溶出液は、ｐＨ  ２．５でＨ２Ｏ中に、０．５ＭのＬ−グリシン、７０ｍＭのＴＣＥＰ、３Ｍの塩化グアニジニウム及び３Ｍの尿素を含む、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
−  第１の抗体は、１０分〜１６時間、特に１時間〜３時間インキュベートされる、及び／又は
−  第２の抗体は、１０分〜２時間インキュベートされる、及び／又は
−  ブロッキング溶液は、５分〜１時間インキュベートされる、及び／又は
−  溶出液は、１分〜３０分間インキュベートされる、及び／又は
すべてのステップは、室温で実施される、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ブロッキング緩衝液であって、
ｉ．  非特異的に疎水性結合部位に結合することが可能であるブロッキング化合物であって、
特に前記ブロッキング化合物は、ブロッキングポリペプチドであり、
より特にＢＳＡ、ＦＢＳ、ＳＡ、正常血清、ゼラチン、脱脂粉乳又はＰｒｉｏｎｅｘ（登録商標）試薬から選択されるブロッキングポリペプチドであり、
なおより特にＢＳＡ、ＦＢＳ、ＳＡ、正常血清、ゼラチン、脱脂粉乳又はＰｒｉｏｎｅｘ（登録商標）試薬から選択される０．５％〜２％の化合物であり、
最も特に約１％のＢＳＡである、
前記ブロッキング化合物、及び
ｉｉ．  スルフヒドリル反応性化合物、特にマレイミド、ハロアセチル、又はピリジルジスルフィドから選択される化合物、より特にマレイミド、ハロアセチル、又はピリジルジスルフィドから選択される１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜５００ｍｏｌ／Ｌの化合物、最も特に１５０ｍＭのマレイミド、
ｉｉｉ．  緩衝成分、特にＰＢＳ、
を含む、前記ブロッキング緩衝液。
【請求項９】
画像化緩衝液であって、
ｉ．  ラジカル捕捉剤、特にＮ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルシステインアミド、システイン、Ｌ−アスコルビン酸、レスベラトロール、β−カロテン、セレノ−Ｌ−メチオニン、クロロゲン酸及び／又はカフェイン酸から選択される化合物、より特にＮ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルシステインアミド、システイン、Ｌ−アスコルビン酸、レスベラトロール、β−カロテン、セレノ−Ｌ−メチオニン、クロロゲン酸又はカフェイン酸から選択される１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌの化合物、最も特に７００ｍＭのＮ−アセチルシステイン、
を含み、及び
ｉｉ．  ｐＨが７．２〜７．６、特にｐＨが７．４、
で構成される、前記画像化緩衝液。
【請求項１０】
溶出緩衝液であって、
ｉ．  還元剤、特にＴＣＥＰ、ジチオスレイトール、又は２−メルカプトエタノールから選択される化合物、より特にＴＣＥＰ、ジチオスレイトール、又は２−メルカプトエタノールから選択される１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌの化合物、最も特に７０ｍＭのＴＣＥＰ、及び
ｉｉ．  水素結合を切断する少なくとも１つの化合物、特にカオトロピック塩、特に塩化グアニジニウム、尿素、ドデシル硫酸ナトリウム又は塩化マグネシウムから選択される化合物、より特に１ｍｍｏｌ／Ｌから１０ｍｏｌ／Ｌの塩化グアニジニウム、尿素、ドデシル硫酸ナトリウム又は塩化マグネシウムの１つ又は複数、最も特に３Ｍの塩化グアニジニウム及び３Ｍの尿素、及び
ｉｉｉ．  緩衝成分、特にＬ−グリシン、より特に０．５ＭのＬ−グリシン、
を含み、及び
ｉｖ．  ｐＨが（＜）４より低い、特にｐＨ＜３、より特に≦２，７、
で構成される、前記溶出緩衝液。
【請求項１１】
請求項８に記載のブロッキング緩衝液、及び請求項９に記載の画像化緩衝液、及び請求項１０に記載の溶出緩衝液を含む部品（セット）のキット。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法に従う方法を実行するための指示書をさらに含む、請求項１１に記載の部品のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブロッキング、画像化（ｉｍａｇｉｎｇ）及び溶出のための緩衝液を含む、画像化のために生体試料を多重抗体染色することを可能にする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な方法により、単一細胞からの数百、数千の異なる分子種の存在量を多重測定するための技術が革新されてきた。これらにより大規模な取り組みを介して人体の機能的に関連するすべての細胞型がこれらのデータから不偏の様式で明らかになるであろうという期待をもたらしてきた。これらの方法のいくつかはｉｎ  ｓｉｔｕで適用することができるので、同定される細胞型は、細胞集団又は組織の環境内に配置していることが可能である。しかしながら、タンパク質若しくはタンパク質状態、又はＲＮＡ転写物の存在量は、細胞機能への関与について直接的には情報を与えないことがよく知られている。これは、特定の細胞内の位置、及び他の分子及び細胞内構造との相互作用に依存しており、全細胞プールのごく一部しか関与していない可能性がある。さらに、個々の細胞の表現型は、細胞内小器官及び細胞骨格構造の機能状態、存在量、形態、ターンオーバーなどによって決定される。したがって、機能的に関連する情報を得るためには、これらの不偏的な大規模な方法は、分子多重化の長さスケールを細胞内領域にまで拡張し、最終的には経時的な情報を得る必要がある。近年、ツアー・ド・フォース（ｔｏｕｒ−ｄｅ−ｆｏｒｃｅ）研究では、１２，０００個のタンパク質の高分解能細胞内免疫蛍光画像化を実現し、これによりヒトプロテオームの平均的な細胞下マップを作成した。ただし、プロテオームの細胞下分布が細胞の表現型状態及びその微小環境にどのように機能的に関連しているか、及び変化する条件にどのように応答するかを理解するには、そのようなマップを同じ単一細胞で、かつｉｎ  ｓｉｔｕで多くの細胞にわたって直接測定する必要がある。組織又は単一細胞上で空間的に分解される抗体の多重化を実現できる強力な方法は数多く存在するが、組織、単一細胞、及び高分解の細胞内の長さスケールを同時にカバーしながら、複数の条件でのハイスループットな様式で試料の品質を維持し、かつ大規模な画像処理及び多変量統計学的アプローチと組み合わせて、そのようなデータに存在する豊富な量の生物学的情報を抽出するというすべての要件を満たしているものはない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
このような多重化データを記録する際の主な問題は、抗体を試料に架橋させることなく、抗体染色の複数の周回を可能にすることである。
【０００４】
本発明の目的は、抗体を試料に架橋させることなく、抗体染色の複数の周回を可能にする手段及び方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この目的は、本明細書の独立請求項の主題によって達成される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図面の簡単な説明
【図１Ａ】４ｉは、単一細胞及びピクセルレベルで高い再現性を維持しながら、同じ細胞による少なくとも４０プレックスの空間的に分解される分子読み出しを実現する。（Ａ）蛍光シグナルの画像取得では、試料に対する抗体の光架橋を引き起こす。ＴＵＢＡ１Ａに対する免疫蛍光（ＩＦ）を実施した。試料を画像化緩衝液なしで画像化した（１，オレンジ色のボックス、灰色は画像化されていないウェル領域を表す）。次いで、抗体を試料から溶出させた。次に、試料を二次抗体とインキュベートし、２回目の画像化をテール化様式で行い（緑色のボックス）、レーザー光に暴露された領域及びされていない領域の両方で蛍光をそれぞれ記録した（２）。前者は明らかに高いシグナルを示し、一次抗体が試料に架橋する際の光の影響を示している。第１及び第２の画像化からの画像は独立して再スケーリングされる。
【図１Ｂ】（Ｂ）４ｉは、エピトープの完全性を維持しながら、画像取得後に試料から一次及び二次抗体を溶出する。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５８８（左）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（右）で標識された二次抗体によって検出される複数の一次抗体の統合された細胞の強度の箱ひげ図。バックグラウンド強度は、二次抗体のみで細胞をインキュベートすることによって定量した（左から１番目の箱ひげ図）。２回及び２０回の溶出後に細胞の強度を測定したところ（左から２番目及び４番目の箱ひげ図）、同様のダイナミックレンジを示した。一次抗体及び二次抗体の複合体を溶出し、二次抗体のみで染色した後に、細胞の強度はバックグラウンドまで低下した（左から３番目及び５番目の箱ひげ図）（図３Ｂ）。箱ひげ図は、中央のマークは母集団の中央値を示し、ボックスは２５〜７５パーセンタイルの母集団の範囲を示し、ひげは母集団の範囲の９９．３％をカバーし、外れ値はドットとしてマークされるように構成される。
【図１Ｃ】（Ｃ）サイクル（ｃｙｃｌｅ）１、１１及び２１、又はサイクル２、１０及び２０から、それぞれＣＴＮＮＢ１又はＴＵＢＡ１Ａのいずれかで染色された同じ細胞の重ね合わせ画像。サイクル１及び２の画像はシアンで、サイクル１１及び１０の画像はマゼンタで、サイクル２１及び２０の画像は黄色で色分けされている。３つのサイクル間の共局在性が高い領域は白く表示される。異なる４ｉサイクルの画像は、重ね合わせ画像を作成する前に別々に再スケーリングされる。
【図１Ｄ】（Ｄ）４ｉは、２１サイクルの反復的ＩＦにわたって、統合された単一細胞の強度の高い相関関係を保持する。箱ひげ図は、ＣＴＮＮＢ１又はＴＵＢＡ１Ａのいずれかについて、互いにそれぞれのサイクルのすべてのサイクルにわたって測定された統合された細胞の強度の単一細胞の相関を表す。箱ひげ図は、中央のマークは母集団の中央値を示し、ボックスは２５〜７５パーセンタイルの母集団の範囲を示し、ひげは母集団の範囲の９９．３％をカバーし、外れ値はドットとしてマークされるように構成される細胞数１６，０００個。
【図１Ｅ】（Ｅ）４ｉは、２１サイクルの反復的ＩＦにわたって高いピクセルの強度の相関を保持する。箱ひげ図は、サイズの増加する平均フィルタ（なし、２×２、３×３、５×５、７×７、及び１０×１０ピクセル）によって平滑化された画像において、ＣＴＮＮＢ１とＣＴＮＮＢ１（シアン）、ＴＵＢＡ１ＡとＴＵＢＡ１Ａ（緑）、及びＣＴＮＮＢ１とＴＵＢＡ１Ａ（紫）について、２１つの４ｉサイクルにわたって細胞間で測定されたピクセルの強度の相関を示す（図３Ｄ，Ｅ）。箱ひげ図は、中央のマークは母集団の中央値を示し、ボックスは２５〜７５パーセンタイルの母集団の範囲を示し、ひげは母集団の範囲の９９．３％をカバーし、外れ値はドットとしてマークされるように構成される。細胞数１６，０００個。
【図２】４ｉのハイスループット設定での適用は、生物学的スケールにわたる情報を生成する。４ｉの手順の概略図を示す。（１）マレイミドとのチオエーテル反応により、非特異的な抗体の結合及び遊離スルホヒドリル／チオールのブロッキングを防止するために試料をブロッキングする。（２）目的の２つの異なる抗原に対する間接的免疫蛍光（ＩＦ）を行う。（３）試料に画像化緩衝液を添加し、画像化する。（４）溶出緩衝液を使用して、試料から一次抗体及び二次抗体を溶出させ、これにより、以降に４ｉの別の周回を行う準備ができる。
【図３Ａ】４ｉ手順の最適化（Ａ）画像化緩衝液は、画像取得中の抗体と試料との架橋結合を防止する。一次抗体及び二次抗体を用いてＴＵＢＡ１Ａを染色した細胞の顕微鏡写真（左の最初の２つのパネル）及び二次抗体のみでインキュベートした細胞の顕微鏡写真（左から３番目のパネル、対照）。４ｉは、ＴＵＢＡ１Ａ（左から最初の２つのパネル、一次抗体及び二次抗体）、並びに二次抗体のみ（対照、左から３番目のパネル）に対して細胞において行った。抗体を試料から溶出させ（各パネルの第１の顕微鏡写真）、試料細胞を二次抗体のみでインキュベートして一次抗体の完全溶出をプローブし（各パネルの２番目の顕微鏡写真）、ＴＵＢＡ１Ａについて再染色した（各パネルの３番目の顕微鏡写真）。個々のパネルの顕微鏡写真は、同じように再スケーリングした。１番目のパネルの顕微鏡写真は、２番目のパネル及び３番目のパネルとは、異なって再スケーリングした。
【図３Ｂ１】（Ｂ）試料のブロッキングにおいてマレイミド処理は、試料の構造的完全性を保持しながら、抗体の溶出を補助する。上段の散布図は、ＡｌｅｘａＦｕｒｏｕｒ４８８（左上）又はＡｌｅｘａＦｕｒｏｕｒ５６８（右上）で標識した二次抗体を用いて、Ｘ軸において、免疫蛍光（染色１）後に取得したシグナルと試料の溶出後に二次抗体のみで再染色した（二次抗体再染色（ＳｅｃＡｂＲｅｓｔａｉｎ））後に取得したシグナルとの間で測定されたピクセル強度の単一細胞内で定量化された相関の平均値、及びＹ軸において、免疫蛍光（染色１）後に取得したシグナルと、抗体溶出後に第２の周回の免疫蛍光（染色２）の後に取得したシグナルとの間で測定されたピクセル強度について、単一細胞において定量化される相関関係の平均値を可視化する。染色１と染色２の間の最高の相関値、及び二次抗体再染色と染色１の間の最低の相関値が、ブロッキング緩衝液にマレイミドを添加することによって達成される。同様の解析を行い、単一細胞の強度の相関関係を定量化した結果、同じ結果となった（下段）
【図３Ｂ２】（Ｂ）試料のブロッキングにおいてマレイミド処理は、試料の構造的完全性を保持しながら、抗体の溶出を補助する。上段の散布図は、ＡｌｅｘａＦｕｒｏｕｒ４８８（左上）又はＡｌｅｘａＦｕｒｏｕｒ５６８（右上）で標識した二次抗体を用いて、Ｘ軸において、免疫蛍光（染色１）後に取得したシグナルと試料の溶出後に二次抗体のみで再染色した（二次抗体再染色（ＳｅｃＡｂＲｅｓｔａｉｎ））後に取得したシグナルとの間で測定されたピクセル強度の単一細胞内で定量化された相関の平均値、及びＹ軸において、免疫蛍光（染色１）後に取得したシグナルと、抗体溶出後に第２の周回の免疫蛍光（染色２）の後に取得したシグナルとの間で測定されたピクセル強度について、単一細胞において定量化される相関関係の平均値を可視化する。染色１と染色２の間の最高の相関値、及び二次抗体再染色と染色１の間の最低の相関値が、ブロッキング緩衝液にマレイミドを添加することによって達成される。同様の解析を行い、単一細胞の強度の相関関係を定量化した結果、同じ結果となった（下段）
【図３Ｃ】（Ｃ）マウス（二次抗体ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８）で産生される抗体を４ｉの２０サイクルにわたり実験に使用して測定した統合された細胞の強度の箱ひげ図。灰色の箱ひげ図は、一次抗体と二次抗体の両方でインキュベートした細胞で測定した細胞の強度を表す。青色の箱ひげ図は、二次抗体のみでインキュベートした細胞で測定した細胞の強度を示す。これは、二次抗体の非特異的結合、試料からの一次抗体及び二次抗体の不完全な溶出、及びエピトープの安定性によるバックグラウンドシグナルの増強を定量するための対照として働く。免疫蛍光を表す白い箱ひげ図の間の実験全体の類似性は、４ｉの２０サイクルについて安定なダイナミックレンジを示し、並びに４ｉの２０サイクルにわたり試料からの抗体の溶出の成功を示し、これは、二次抗体のみで試料（一次抗体なし）を再染色する全てのステップでの白と青の箱ひげ図の類似性によって例示される。最後に、バックグラウンドシグナルの増強は検出されず、これは、実験のすべての段階で青い箱ひげ図の類似性によって浮き彫りにされる。上段に記載されるとおり同じ実験及び結果であるが、ウサギで産生された一次抗体（及び二次抗体ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８）を使用する。箱ひげ図は、中央のマークは母集団の中央値を示し、ボックスは２５〜７５パーセンタイルの母集団の範囲を示し、ひげは母集団の範囲の９９．３％をカバーし、外れ値はドットとしてマークされるように構成される。
【図３Ｄ】（Ｄ）棒グラフは、サイクル１から２１までのＰＣＮＡ、ＦＢＬ、ＣＴＮＮＢ１及びＴＵＢＡ１Ａの統合された細胞の強度を、第１の染色のサイクル（ＰＣＮＡ及びＣＴＮＢ１についてはサイクル１、ＦＢＬ及びＴＵＢＡ１Ａについてはサイクル２）と比較したときの相関（青でピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、緑でスピアマン（Ｓｐｅａｒｍａｍ））を示す。
【図３Ｅ】（Ｅ）４ｉは、２１サイクルの反復的ＩＦにわたって高いピクセルの強度の相関を保持する。箱ひげ図は、サイズを増加する（なし、２×２、３×３、５×５、７×７、及び１０×１０ピクセル）平均フィルタによって平滑化された画像におけるＰＣＮＡとＰＣＮＡ（シアン）、ＦＢＬとＦＢＬ（緑）、及びＰＣＮＡとＦＢＬ（紫）について、４ｉの２１サイクルにわたって細胞間で測定されたピクセル強度の相関を表す。箱ひげ図は、中央のマークは母集団の中央値を示し、ボックスは２５〜７５パーセンタイルの母集団の範囲を示し、ひげは母集団の範囲の９９．３％をカバーし、外れ値はドットとしてマークされるように構成される。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
用語と定義
本明細書の文脈における用語「４ｉ」は、反復的間接免疫蛍光画像化アプローチの略語である。
【０００８】
本明細書の文脈における用語「ＰＢＳ」は、１０ｍｍｏｌ／ＬのＰＯ４３−、１３７ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、及び２．７ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌの濃度、及び７．４のｐＨを有するリン酸緩衝生理食塩水に関する。
【０００９】
本明細書の文脈における用語「ＢＳＡ」は、ウシ血清アルブミンに関する。
【００１０】
本明細書の文脈における用語「ＦＢＳ」は、ウシ胎児血清に関する。
【００１１】
本明細書の文脈における用語「ＳＡ」は、任意の種の血清アルブミンに関する。
【００１２】
本明細書の文脈における用語「ＴＣＥＰ」は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンに関する。
【００１３】
本明細書の文脈において、「画像化のために調製される生体試料」という用語は、画像化のために使用可能なデバイスに固定される任意の生物学的材料を指し、特に蛍光顕微鏡法に限定されるものではない。画像化のために調製される生体試料は、顕微鏡検査に適したスライドガラス又はマルチウェルプレート（ガラス／プラスチック）又は他の種類の検体ホルダー上に、直接的に、又は３Ｄ有機若しくは無機マトリックスによって支持されるフレッシュフローズン、又はホルマリン固定パラフィン包埋など、異なる調製物の生物学的材料のパラホルムアルデヒド固定の単一細胞又は細胞集合体（例えば、オルガノイド、スフェロイド）、又は組織又は切片から選択され得るが、これらに限定されない。
【００１４】
本明細書の文脈において、「抗体」という用語は、これらに限定されないが、免疫グロブリンＧ型（ＩｇＧ）、Ａ型（ＩｇＡ）、Ｄ型（ＩｇＤ）、Ｅ型（ＩｇＥ）又はＭ型（ＩｇＭ）を含む全ての抗体、任意の抗原結合断片又はその一本鎖、及び関連又は誘導構築物を指す。全ての抗体とは、ジスルフィド結合で相互に連結された、少なくとも２つの重鎖（Ｈ）及び２つの軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）で構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の３つのドメインで構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（以下、ＶＬと略記）及び軽鎖定常領域（以下、ＣＬと略記）で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。同様に、この用語は、いわゆるナノボディ又は単一ドメイン抗体、単一単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片を包含する。
【００１５】
本明細書の文脈において、「標識抗体」という用語は、検出可能な標識に共有結合されている抗体に使用される。このような検出可能な標識は、例えば、限定されることなく、オクタデシルローダミンＢ、７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジン及び誘導体、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−（３−［ビニルスルホニル］フェニル）ナフタルイミド−３，６−ジスルホネートジリチウム塩、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ＢＯＤＩＰＹ、ブリリアントイエロー、クマリン及び誘導体、シアニン染料、シアノシン、４’６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ブロモピロガロールレッド、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン、ジエチレントリアミン五酢酸、４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、ダンシルクロリド、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）、エオシン及び誘導体、エリスロシン及び誘導体、エチジウム、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、Ｘ−ローダミン−５−（及び６）−イソチオシアネート（ＱＦＩＴＣ又はＸＲＩＴＣ）、フルオレサミン、ＩＲ−１４４（２−［２−［３−［［１，３−ジヒドロ−１，１−ジメチル−３−（３−スルホプロピル）−２Ｈ−ｂｅｎｚ［ｅ］インドール２−イリデン］エチリデン］−２−［４−（エトキシカルボニル）−１−ピペラジニル］−１−シクロペンテン−１−イル］エテニル］  −１，１−ジメチル−３−（３−スルホルプロピル）−１Ｈ−ｂｅｎｚ［ｅ］インドリウムヒドロキシド、分子内塩、ｎ，ｎ−ジエチルエタンアミン（１：１）との化合物、ＣＡＳ番号：５４８４９−６９−３）、５−クロロ−２−［２−［３−［（５−クロロ−３−エチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾール−イリデン）エチリデン］−２−（ジフェニルアミノ）−１−シクロペンテン−１−イル］エテニル］−３−エチルベンゾチアゾリウム過塩素酸塩（ＩＲ１４０）、マラカイトグリーンイソチオシアネート、４−メチルウンベリフェロン、オルソクレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラロサニリン、フェノールレッド、Ｂ−フィコエリスリン、ｏ−フタルジアルデヒド、ピレン、ピレンブチレート、サクシニミジル１−ピレン、酪酸量子ドット、リアクティブレッド４（チバクロンブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）、ローダミン及び誘導体、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリドローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スル���ローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサスレッド）、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リボフラビン、ロソル酸、テルビウムキレート誘導体、シアニン−３（Ｃｙ３）、シアニン−５（Ｃｙ５）、シアニン−５．５（Ｃｙ５．５）、シアニン−７（Ｃｙ７）、ＩＲＤ７００、ＩＲＤ８００、Ａｌｅｘａ６４７、ラジョルタブルー、フタロシアニン、及びナフタロシアニンを含む。
【００１６】
本明細書の文脈において、「ラジカル捕捉剤」という用語は、フリーラジカルと迅速に反応し、それによってフリーラジカルを除去する化合物に使用される。
【００１７】
本明細書の文脈において、「洗浄液」という用語は、本明細書で採用されるいずれの他の緩衝液又は染色液のうち、試料に特異的に結合していない残りの成分を洗い流すことができる溶液に使用される。洗浄液は、試料から特異的に結合したリガンド（抗体など）を除去するものではない。
【００１８】
本明細書の文脈において、「多重染色」という用語は、生体試料を２種以上の（一次的又は二次的に）標識抗体で染色することによる方法、言い換えれば２種以上の抗原が検出される方法に使用される。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明の第１の態様は、特定の抗原に特異的に結合することができる標識抗体又は抗体様リガンドで生体試料を多重染色する方法に関する。
【００２０】
この方法は、以下のステップを含む：
（ａ）ブロッキングステップでは、画像化のために調製される生体試料を、後の染色ステップで使用される抗体の非特異的結合（この非特異的結合は高いバックグラウンド染色を引き起こすであろう）を減少させるために使用されるブロッキング溶液と接触させる。ブロッキング溶液は、疎水性結合部位に非特異的に結合可能なブロッキング化合物及び抗体と試料との共有結合を引き起こす可能性のあるジスルフィド橋の形成を防止するスルフヒドリル反応性化合物を含む。その後、ブロッキング溶液を除去する。
（ｂ）第１の洗浄ステップでは、前記生体試料を洗浄液に接触させ、その後、前記洗浄液を除去する。任意に、第１の洗浄ステップは、１〜１０回、特に３〜６回繰り返され得る。
（ｃ）第１の染色ステップでは、前記生体試料を、第１の抗原に特異的な第１の抗体と接触させる。特定の実施形態では、前記第１の抗体は、検出可能な標識、特に蛍光標識を有する。よって、ステップｄ及びｅは行われない。前記第１の抗体が検出可能な標識を持たない場合、第２の染色ステップが必要である。
（ｄ）第２の洗浄ステップでは、前記生体試料を洗浄液に接触させ、その後、前記洗浄液を除去する。任意に、第１の洗浄ステップは、１〜１０回、特に３〜６回繰り返され得る。
（ｅ）第２の染色ステップでは、前記生体試料を、検出可能な標識、特に蛍光標識を有する第２の抗体と接触させる。前記第２の抗体は、前記第１の抗体に対して特異的である。
（ｆ）第３の洗浄ステップでは、前記生体試料を洗浄液に接触させ、その後、前記洗浄液を除去する。任意に、第１の洗浄ステップは、１〜１０回、特に３〜６回繰り返され得る。
（ｇ）画像化ステップでは、前記生体試料を、中性のｐＨを有し、ラジカル捕捉剤を含む画像化溶液と接触させる。その後、試料の蛍光画像を記録し、その後、画像化溶液を除去する。
（ｈ）第４の洗浄ステップでは、前記生体試料を洗浄液に接触させ、その後、前記洗浄液を除去する。任意に、第１の洗浄ステップは、１〜１０回、特に３〜６回繰り返され得る。
（ｉ）溶出ステップでは、前記生体試料を、試料から結合抗体を溶出するように選択される溶出液と接触させる。溶出液は、（＜）４より低いｐＨ、特にｐＨ＜３、より好ましくは≦２，７を有し、緩衝成分、還元剤、及び水素結合を破壊する少なくとも１種の化合物を含む。その後、溶出液を除去する。
【００２１】
特定の実施形態では、ステップａ〜ｉは、各繰り返しにおいて異なる第１の抗体を使用して、１、２、３、４、５回以上（≧５）、≧１０、≧１５、≧２０、≧２５、≧３０、≧３５、又はさらには≧４０回繰り返される。
【００２２】
この方法を使用した抗体の溶出能力は、１回、１１回、及び２１回の周回の染色で同じ抗体で得られた画像を重ね合わせすることによって調査された。これにより、さまざまな種類の細胞内構造に対してほぼ完全な重ね合わせが得られ、すべての周回の間で非常に高い単一細胞及び単一ピクセルの強度の相関が得られた。
【００２３】
従来の緩衝液では、抗体が試料に光架橋しているためと考えられるため、光を照射した領域での溶出効率が大きく低下した。
【００２４】
特定の実施形態では、画像化ステップの直前に、核標識するステップが実行され、ＤＮＡ結合性蛍光化合物を前記生体試料に接触させ、次いで洗浄ステップが実行され、洗浄液を前記生体試料に接触させ、その後に洗浄液を除去し、任意に第１の洗浄ステップを１、２、３、４、５、又は６回繰り返す。
【００２５】
特定の実施形態では、標識抗体の検出可能な標識は蛍光色素分子である。
【００２６】
特定の実施形態では、生体試料の画像化は、蛍光顕微鏡法、特に共焦点蛍光顕微鏡法として実行される。
【００２７】
特定の実施形態では、洗浄液は、Ｈ２Ｏ又はＰＢＳ、特にＰＢＳ又はＨ２Ｏのみから構成される。
【００２８】
特定の実施形態では、ブロッキング溶液中のブロッキング化合物は、第１の染色ステップ又は第２の染色ステップで採用される抗体のいずれによっても認識されないブロッキングポリペプチドである。
【００２９】
特定の実施形態では、ブロッキングポリペプチドは、ＢＳＡ、ＦＢＳ、ＳＡ、ヒト血清、ゼラチン、脱脂粉乳、又はブタ由来の高純度皮膚コラーゲンのポリペプチド画分（Ｐｒｉｏｎｅｘ（登録商標）試薬）から選択される。
【００３０】
特定の実施形態では、スルフヒドリル反応性化合物は、マレイミド、ハロアセチル、又はピリジルジスルフィドから選択される。
【００３１】
特定の実施形態では、ブロッキング溶液は、ＢＳＡ、ＦＢＳ、ＳＡ、正常血清、ゼラチン、脱脂粉乳又はＰｒｉｏｎｅｘ（登録商標）試薬から選択される０．５〜２％、特に約１％の化合物及び／又は１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌ、特に１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜５００ｍｏｌ／Ｌのマレイミド、ハロアセチル、又はピリジルジスルフィドを含む。
【００３２】
特定の実施形態では、ブロッキング溶液は、ＰＢＳ中に１％のＢＳＡ及び１５０ｍＭのマレイミドを含む。
【００３３】
特定の実施形態では、水素結合を切断する溶出液中の化合物は、カオトロピック塩である。
【００３４】
特定の実施形態では、溶出液の緩衝成分は、Ｌ−グリシン、リン酸塩／クエン酸塩、又はフタル酸水素カリウムから選択される。
【００３５】
特定の実施形態では、還元剤は、ＴＣＥＰ、ジチオスレイトール、又は２−メルカプトエタノールから選択される。
【００３６】
特定の実施形態では、カオトロピック塩は、塩化グアニジニウム、尿素、ドデシル硫酸ナトリウム、又は塩化マグネシウムの１つ又は複数から選択される。
【００３７】
特定の実施形態では、溶出液は、０．５ＭのＬ−グリシンと、ＴＣＥＰ、ジチオスレイトール、又は２−メルカプトエタノールから選択される１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌの化合物、及び／又は１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｏｌ／Ｌの塩化グアニジニウム、尿素、ドデシル硫酸ナトリウム、又は塩化マグネシウムの１つ又は複数を含み、及び／又はｐＨが２．２〜２．６である。
【００３８】
特定の実施形態では、溶出液は、Ｈ２Ｏ中でｐＨ  ２．５で、０．５ＭのＬ−グリシン、７０ｍＭのＴＣＥＰ、３Ｍの塩化グアニジニウム及び３Ｍの尿素を含む。
【００３９】
特定の実施形態では、ラジカル捕捉剤は、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルシステインアミド、システイン、Ｌ−アスコルビン酸、レスベラトロール、β−カロテン、セレノ−Ｌ−メチオニン、クロロゲン酸及び／又はカフェイン酸から選択される。
【００４０】
特定の実施形態では、画像化溶液は、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルシステインアミド、システイン、Ｌ−アスコルビン酸、レスベラトロール、β−カロテン、セレノ−Ｌ−メチオニン、クロロゲン酸又はカフェ酸から選択される１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌの化合物を含み、及び／又はｐＨが７．２〜７．６である。
【００４１】
特定の実施形態では、画像化溶液は、ｐＨ７．４でＨ２Ｏ中の７００ｍＭのＮ−アセチルシステインを含む。
【００４２】
特定の実施形態では、第１の抗体は、１０分〜１６時間インキュベートされる。
【００４３】
特定の実施形態では、第２の抗体は、１０分〜２時間インキュベートされる。
【００４４】
特定の実施形態では、ブロッキング溶液は、５分〜１時間インキュベートされる。
【００４５】
特定の実施形態では、溶出液は、１分から３０分間インキュベートされる。
【００４６】
特定の実施形態では、言及されたすべてのステップは、室温で実行される。
【００４７】
本発明の第２の態様は、以下を含むブロッキング緩衝液に関する：
（ａ）疎水性結合部位に非特異的に結合することができるブロッキング化合物、特にブロッキングポリペプチド、より特にＢＳＡ、ＦＢＳ、ＳＡ、正常血清、ゼラチン、脱脂粉乳又はＰｒｉｏｎｅｘ（登録商標）試薬から選択されるブロッキングポリペプチド、なおより特にＢＳＡ、ＦＢＳ、ＳＡ、正常血清、ゼラチン、脱脂粉乳又はＰｒｉｏｎｅｘ（登録商標）試薬から選択される０．５〜２％化合物、最も特に１％のＢＳＡ、及び
（ｂ）スルフヒドリル反応性化合物、特にマレイミド、ハロアセチル、又はピリジルジスルフィドから選択される化合物、より特にマレイミド、ハロアセチル、又はピリジルジスルフィドから選択される１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌ、特に１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜５００ｍｏｌ／Ｌの化合物、最も特に１５０ｍＭのマレイミド、及び
（ｃ）緩衝成分、特にＰＢＳ。
【００４８】
本発明の第３の態様は、以下を含む画像化緩衝液に関する：
（ａ）ラジカル捕捉剤、特にＮ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルシステインアミド、システイン、Ｌ−アスコルビン酸、レスベラトロール、β−カロテン、セレノ−Ｌ−メチオニン、クロロゲン酸及び／又はカフェイン酸から選択される化合物、より特にＮ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルシステインアミド、システイン、Ｌ−アスコルビン酸、レスベラトロール、β−カロテン、セレノ−Ｌ−メチオニン、クロロゲン酸又はカフェイン酸から選択される１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌの化合物、最も特に７００ｍＭのＮ−アセチルシステイン、及び
（ｂ）ｐＨが７．２〜７．６、特にｐＨが７．４。
【００４９】
本発明の第４の態様は、以下を含む溶出緩衝液に関する：
（ａ）還元剤、特にＴＣＥＰ、ジチオスレイトール、又は２−メルカプトエタノールから選択される化合物、より特にＴＣＥＰ、ジチオスレイトール、又は２−メルカプトエタノールから選択される１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌの化合物、最も特に７０ｍＭのＴＣＥＰ、及び
（ｂ）水素結合を切断する少なくとも１つの化合物、特にカオトロピック塩、より特に塩化グアニジニウム、尿素、ドデシル硫酸ナトリウム又は塩化マグネシウムから選択される化合物、より特に１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｏｌ／Ｌの塩化グアニジニウム、尿素、ドデシル硫酸ナトリウム又は塩化マグネシウムの１つ又は複数、最も特に３Ｍの塩化グアニジニウム及び３Ｍの尿素、及び
（ｃ）緩衝成分、特にＬ−グリシン、より特に０．５ＭのＬ−グリシン、及び
（ｄ）ｐＨが（＜）４より低い、特にｐＨ＜３、より特に≦２，７。
【００５０】
本発明の第５の態様は、第２の態様に従ったブロッキング緩衝液、第３の態様に従った画像化緩衝液、及び第４の態様に従った溶出緩衝液を含む部品（セット）のキットに関する。
【００５１】
特定の実施形態では、キットは、第１の側態様の方法に従って進める追加の指示書を含む。
【００５２】
例えば、ラジカル捕捉剤又はブロッキングポリペプチドなどの単一の分離可能な特徴の代替が「実施形態」として本明細書に記載されている場合はどこでも、そのような代替は、本明細書に開示される本発明の離散的な実施形態を形成するために自由に組み合わせてもよいことが理解されるであろう。
【００５３】
本発明は、以下の実施例及び図面によってさらに例示され、そこからさらなる実施形態及び利点を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を例示するためのものであるが、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００５４】
材料及び方法
細胞培養
細胞株
ＨｅＬａ  Ｋｙｏｔｏ（ヒト子宮頸部上皮細胞株、Ｊ．Ｅｌｌｅｎｂｅｒｇ教授研究室、ＥＭＢＬ、ドイツ）。細胞を、使用前にカリオタイプ法で同一性を検査し、マイコプラズマが存在しないことを検査した。
【００５５】
完全培地（ＣＭ）
ＣＭは、ＤＭＥＭ中、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び５％のグルタミンからなる。
ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、グルタミン（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【００５６】
薬理学的摂動
上皮成長因子（ＥＧＦ）（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）、ノコダゾール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ラトランクリンＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、バフィロマイシンＡ１（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ブレフェルディンＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ウォルトマニン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ラパマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【００５７】
反復的間接免疫蛍光画像化（４ｉ）
４ｉブロッキング溶液（ｓＢＳ）
ｓＢＳは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と１５０ｍＭのマレイミドからなる。
マレイミドを、４ｉ手順のブロッキングステップの直前に水溶液に添加する。
ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、マレイミド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）
【００５８】
従来のブロッキング溶液（ｃＢＳ）
ｃＢＳは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からなる。
ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）
【００５９】
画像化緩衝液（ＩＢ）
ＩＢは、ｄＨ２Ｏ中の７００ｍＭのＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）からなる。
ｐＨ  ７．４に調整する。
ＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）
【００６０】
溶出緩衝液（ＥＢ）
ＥＢは、ｄｄＨ２Ｏ中に０．５ＭのＬ−グリシン、３Ｍの尿素、３Ｍの塩化グアニジニウム（ＧＣ）、及び７０ｍＭのＴＣＥＰ−ＨＣｌ（ＴＣＥＰ）からなる。
ｐＨ  ２．５に調整する。
Ｌ−グリシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、尿素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＧＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＴＣＥＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
【００６１】
一次抗体
抗体は、以下の基準に基づいて選択した：１．免疫蛍光における抗体の成功した使用については、過去に科学文献に発表されていること。２．抗体は、小器官の真正なマーカー上のエピトープに対して産生されること。３．マウスとウサギの両方で同じ数の抗体が産生されることを確認すること。
【００６２】
【表１】
2021522495.tif 000002
【００６３】
【表２】
2021522495.tif 000003
【００６４】
この公表の抗体を試験する間に、５０以上の抗体のうち２つ（ＴＯＭ２０上のエピトープに対する抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ５６７８３）とＣＡＴ（Ａｂｃａｍ  ａｂ１１０２９２））は、４ｉ手順と一緒に動作しないことが確認された。
【００６５】
二次抗体
それぞれｃＢＳに、抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８を１：６００に希釈し、抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５６８を１：３００に希釈した。
抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５６８（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
【００６６】
ＤＮＡ染色溶液（ＤＳＳ）
４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）をＰＢＳ中に１：２５０〜１：５０に希釈した。
ＤＮＡの脱プリンによって失われたシグナルを補うために、溶出回数の増加に伴ってＤＡＰＩ濃度が増加し、その結果、ＤＡＰＩの結合親和性が低下した。
ＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
【００６７】
計算的インフラストラクチャ
画像解析のステップは、ＥＴＨ  チューリッヒにて高性能クラスターコンピューターＢｒｕｔｕｓで実行した。多重化ピクセルプロファイルの抽出、及び自己組織化アルゴリズムを使用したそれらのクラスタリングは、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｌｏｕｄ  ＵＺＨで実行した。記載される他のすべての計算的な方法は、デスクトップコンピュータで実行した。
【００６８】
補足的方法
細胞培養
細胞を、３７°Ｃ、９５％湿度、５％のＣＯ２にて完全培地で培養した。１ウェルあたり７５０個の細胞を３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に播種し、上記の条件で３日間増殖した。
【００６９】
薬理学的及び代謝的摂動
すべての化合物を、ＥＧＦを除き、ＤＭＥＭのみで希釈した完全培地を用いてそれぞれの最終濃度に希釈した。
【００７０】
【表３】
2021522495.tif 000004
薬理学的な摂動：
細胞を化合物で３時間インキュベートした。
【００７１】
【表４】
2021522495.tif 000005
【００７２】
顕微鏡
強化されたＣＳＵ−Ｗ１スピニングディスク（マイクロレンズ強化デュアルニプコーディスク共焦点スキャナー、ワイドビュー型）を備えた横河電機の自動回転ディスク顕微鏡（ＣｅｌｌＶｏｙａｇｅｒ  ７０００）を、０．９５ＮＡの４０倍オリンパス対物レンズ及びＮｅｏ  ｓＣＭＯＳカメラ（Ａｎｄｏｒ、２，５６０×２，１６０ピクセル）と組み合わせて使用し顕微鏡画像を取得した。各部位ごとに５００ｎｍのｚ間隔で１８個のｚ平面を取得し、最大強度の投影を計算し、その後の画像解析に使用した。ＵＶ（４０６ｎｍ）、緑（４８８ｎｍ）、赤（５６８ｎｍ）のシグナルを順次取得した。
【００７３】
反復的間接免疫蛍光画像化（４ｉ）
試料の調製
それぞれ記載されない場合は、すべてのステップは室温で実行した。細胞を４％のパラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で３０分間固定化した。その後、細胞を０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１５分間透過処理した。細胞を透過処理前と透過処理後の両方にてＰＢＳで６回洗浄した。固定化及び透過処理は室温で行った。
【００７４】
免疫蛍光
次の各ステップを、言及の順序で、かつ４ｉのすべてのサイクルで実行した。それぞれ記載されない場合は、すべてのステップは室温で実行した。
１．抗体溶出
試料をｄｄＨ２Ｏで６回洗浄した。残留したｄｄＨ２Ｏを、最小の体積まで吸引した。次の動作を３回繰り返す：試料にＥＢを添加し、１００ｒｐｍで１０分間振とうした。その後、ＥＢを可能な限り最小の体積まで吸引した。
２．ブロッキング
ｓＢＳを試料に添加し、１００回転／分（ｒｐｍ）で１時間振とうした。
１時間後、試料をＰＢＳで６回洗浄した。
３．間接免疫蛍光、一次抗体染色
一次抗体溶液を試料に添加し、１００ｒｐｍで２時間振とうした。
２時間後、試料をＰＢＳで６回洗浄した。
４．間接免疫蛍光、二次抗体染色
二次抗体溶液を試料に添加し、１００ｒｐｍで２時間振とうした。
２時間後、試料をＰＢＳで６回洗浄した。
５．核染色
試料にＤＳＳを添加し、１００ｒｐｍで１０分間振とうした。
１０分後に試料をｄｄＨ２Ｏで６回洗浄した。残留したｄｄＨ２Ｏを、最小の体積まで吸引した。
６．画像化
試料にＩＢを添加し、試料を画像化した。
７．必要とされるプレキシティ（ｐｌｅｘｉｔｙ）が達成されるまで、ステップ１から６を実行する。
４ｉの手順のすべての液体を調合するステップ及び洗浄するステップは、Ｗａｓｈｅｒ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ  ＥＬ４０６（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して実行した。一次抗体及び二次抗体は、ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＢｒａｖｏ液体処理プラットフォームを使用して調合した。
【００７５】
４ｉの２０サイクルにわたる抗体の溶出性及びダイナミックレンジの保存
試料の安定性、試料からの一次抗体及び二次抗体の溶出、及び４ｉの２０サイクルの間の二次抗体の非特異的結合による可能なバックグランドシグナルの増加を試験するために、以下の実験を行った。（１）試料を最初にＥＢ（１×溶出）で処理し、（２）次いで二次抗体のみで染色して蛍光バックグラウンドレベルを記録した（二次抗体のみ）。（３）その後、試料をＥＢ（２×溶出）で処理し、次いで（４）試験ウェルにおいて一次抗体と二次抗体の両方を、対照ウェルにおいて二次抗体のみをインキュベートした（ＩＦ）。（５）試料から一次抗体及び二次抗体を溶出させ（３×溶出）、（６）試料を試験ウェル及び対照ウェルの両方で二次抗体のみ（二次抗体のみ）でインキュベートした。次に（７）抗体染色及び画像取得を行わない試料を用いて４ｉを５サイクル行い、（８）その後、別の周回のＩＦを行った（８×溶出）。（９）一次抗体及び二次抗体を試料から溶出し（９×溶出）、（１０）二次抗体のみでインキュベートした（二次抗体のみ）。ステップ７〜１０を２回繰り返した（１５×溶出、２１×溶出）。
【００７６】
単一細胞のピクセルの相関の計算
ピクセル相関を、２つの４ｉのシグナル間で計算した。同一の取得中にシグナルが記録されない場合は、相関測定の前に画像アライメントを行った。第１に、同じバックグラウンド値を両画像から減算した。次に、同じ細胞に由来する２つの異なる４ｉシグナルの単一ピクセル強度を、セグメント化領域（細胞、細胞質、核）において相関させた。これは、各セルごとに個別に行った。ピクセル相関は、２×２、３×３、５×５、７×７、１０×１０のピクセル平均フィルタで平滑化されていない画像、又は平滑化された画像のいずれかで計算した。
【００７７】
図１Ｅ及び図３Ｅのピクセル相関は、以下のように算出した。最初のＣＴＮＮＢ１染色（サイクル１）のピクセル強度を、２１番目のサイクルまでＣＴＮＮＢ１染色（奇数サイクル）と互いに相関させた。最初のＴＵＢＡ１Ａ染色（サイクル２）のピクセル強度を、２０番目のサイクルまでＴＵＢＡ１Ａ染色（偶数サイクル）と互いに相関させた（緑色の箱ひげ図）。ＣＴＮＮＢ１とＴＵＢＡ１Ａとの間のピクセル強度相関を、最初のＣＴＮＮＢ１染色（サイクル１）と各ＴＵＢＡ１Ａ染色（サイクル２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０）の間で計算した。各染色のすべてのサイクルにわたって計算される相関を、それぞれ１つの箱ひげ図に集約し、そして対応する画像を、全てのサイクルのサイズの増加（なし、２×２、３×３、５×５、７×７、及び１０×１０ピクセル）のピクセル相関の平均フィルタによって平滑化した後に計算した。
【００７８】
異なる４ｉサイクルから取得される画像アライメント
同じ部位からの異なるサイクルの顕微鏡画像は、不完全であるステージの再配置のために、取得の間にＸとＹのわずかなシフトが発生するため、画像のアラインメントが必要である。２つのサイクルのＤＡＰＩ画像に対して、高速フーリエ変換に基づく画像記録を行った。４８８ｎｍと５６８ｎｍの取得、及びセグメンテーションマスクは、計算されたオフセットによってシフトされ、結果として顕微鏡部位がアライメントされた。
【００７９】
実施例１：
すべての要件を満たすアプローチを得るために、ハイスループット多変量画像化及びコンピュータビジョンのアプローチ（Ｓｎｉｊｄｅｒら、（２００９）Ｎａｔｕｒｅ４６１，５２０〜５２３；Ｌｉｂｅｒａｌｉら、（２０１４）Ｃｅｌｌ  １５７，１４７３〜１４８７；Ｂａｔｔｉｃｈら（２０１５）．Ｃｅｌｌ  １６３，１５９６〜１６１０)を、他の蛍光ベースの多重化アプローチで使用される原理である、染色、シグナル除去、及び再染色の複数の反復を適用する自動液体処理プラットフォームと組み合わせた（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、（２００６）、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２４、１２７０〜１２７８；Ｗａｈｌｂｙら、（２００２）、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ４７，３２〜４１；Ｌｉｎら、（２０１５）、Ｎａｔ  ６項、８３９０）。これらのスケールでは、シグナル除去のためのフォトブリーチングは実用的ではなかったため、化学的抗体溶出を選択した。さらに、抗体の選択に制限がなく、一次抗体の結合を必要としないために、本発明者らは、従来の間接免疫蛍光法に目を向け、そして予想外の発見をした（図１Ａ及び図３Ａ）。標準的な免疫蛍光の手順（第１の画像化）の後、試料の１つの部位を自動化高分解能スピニングディスク共焦点顕微鏡で画像化し、結合した抗体を試料から溶出させ、二次抗体のみで再染色し、抗体溶出効率を確認したところ（第２の画像化）、本発明者らは、第１の画像化の第１の周回の間に、光に曝された領域では溶出効率が強く損なわれるが、光に曝されなかった領域では損なわれないことを観察した（図１Ａ）。これは、蛍光色素分子の励起中に、蛍光色素分子の近くにあるタンパク質の反応性アミノ酸（メチオニン及びシステイン）間に共有結合を導入することができる一重項酸素ラジカルが形成され、共焦点顕微鏡で使用される高エネルギーレーザー光への曝露中に、試料に対する抗体の架橋が生じることに起因する可能性がある。これまでの抗体溶出アプローチでは気づかずに進められたため、それは完全な溶出を妨げ、特に試料を分解する過酷な条件を使用することをもたらしていた可能性がある。
【００８０】
次に、光発光の効率を低下させることなく、画像化中のそのような光誘発性架橋結合を防止し、したがって、抗原を除去又は分解しない非常にマイルドな条件下で完全な抗体溶出を可能にする試薬の組み合わせを介してスクリーニングした（図３Ｂ）。これにより、低量のラジカル捕捉剤、並びにフリーラジカル誘導性光架橋結合の受容体を含む画像化緩衝液、還元剤、低ｐＨ及びカオトロピック塩によるマイルドな溶出緩衝液、並びに試料中の遊離スルフヒドリル基をブロックするブロッキング緩衝液を同定した。４０種類以上の異なる抗体について、この組み合わせは、染色及び溶出の、試験された最大サイクル数である最大２１回の反復にわたって一次抗体及び二次抗体の完全な溶出を達成し、一方で、染色における検出可能な損失又は形態学的変化を防止した（図１Ｂ及び図３Ｂ、Ｃ）。第１の周回、第１１の周回、及び第２１の周回の染色で同じ抗体を用いて得られた画像を重ね合わせると、様々な種類の細胞内構造のほぼ完全なグレースケール画像が得られ（図１Ｃ）、すべての周回の間で非常に高い単一細胞と単一ピクセルの強度の相関が得られた（図１Ｄ〜Ｅ及び図３Ｄ〜Ｅ）。このように、ハイスループット自動反復性間接免疫蛍光画像化アプローチ（４ｉと呼ばれる）は、４０倍対物レンズ及びｓＣＭＯＳカメラを用いた単一ピクセルの表面積に対応する１６５ｎｍ×１６５ｎｍのように小さい副試料から、少なくとも２０回の反復にわたって定量的に再現可能な数ｍｍ２の大きさの表面積からのシグナルを得ることができる。
【００８１】
実施例２：
次に、ヒト組織培養細胞に４ｉを適用し（図２）、１１種類の実験条件で、１８つのｚ平面で細胞の全高及び総表面積９ｍｍ２をカバーし、約２万個の単一細胞を捕捉した。集合的に、これらの画像には、数桁の空間スケールにわたる多変量の分子及び表現型情報を含有し、複数のレベルの生物学的組織間のつながりを直接研究することができる可能性を提供している。例えば、細胞集団レベルでの新生特性である小器官の存在量に対する局所的な細胞の混み合い影響、又は細胞サイクルにおける位置が細胞レベルでの特性であるタンパク質のリン酸化状態にどのように影響するかを可視化することができる。同時に、例えば微小管、アクチンラッフル（ａｃｔｉｎ  ｒｕｆｆｌｅ）及び焦点性接着、エンドソームの複数の型、ミトコンドリアの個々の細管、及びゴルジ複合体のリボンなど細胞骨格構造及び小器官の詳細な形態を捕らえるために十分な分解能で、同一の単一細胞内、かつ数十万個の細胞にわたって全てにおいて細胞下レベルでの特性であるタンパク質の亜区画化を評価することを可能にする。
【００８２】
議論
本発明者らは、同一の生体試料において、ｍｍ〜ｎｍの長さスケールにまたがる４０回のタンパク質測定値をハイスループットかつ複数の条件で取得し、これらの様々な生物学的なスケールから抽出した情報を一つのデータセットに組み合わせた。既存のタンパク質多重化アプローチは、これらのスケールの異なるサブレンジに対して同程度のレベルの多重化を達成するが、低スループット又はハイスループットのいずれにおいても、すべてを同時に網羅したものはない。さらに、本発明者らは、同一細胞内のすべての細胞内小器官のほぼ包括的な可視化を初めて達成した。基本的な方法論は簡潔である。４ｉの技術は、反復的な染色及びシグナル除去の実証された原理を適用した自動液体処理を組み合わせる、十分に確立された高スループット多変量画像化プラットフォームに構築される。４ｉは特別な結合を必要としない市販の抗体を使用しているため、明るい蛍光色素分子の使用及び二次抗体によるシグナル増幅により、高いシグナル収率を実現している。これにより重要な要因は、画像化中の光架橋結合の防止であり、これは多数のサイクル数に渡って最小の空間スケールでもなお試料を完全に保持しながら、マイルドな溶出緩衝液で一次抗体と二次抗体の両方を完全に除去することを可能にした。これは、近接した複数の抗原の検出時にエピトープのマスキングをおこさないという付加的な利点がある。興味深いことに、本発明者らは本明細書で、解析を単一細胞の２次元投影に限定したが、そのアプローチは３次元解析のためのボクセルにも適用可能である。さらに、定量的に再現性のある単一ピクセル測定が可能であることから、４ｉは超解像顕微鏡へ適用できることが約束される。実際に、隣接するピクセルの高度に多重化された測定は、以前に提案されたように、画像の解像度を向上させることができる付加的な情報を提供することが可能である。生物学的な長さスケールを橋渡しする能力は、生命科学の主要な課題の一つである。通常、外挿や推論が適用される。しかし、より高いスケールでの特性が、より低いスケールで発生する複数の相互作用からどのように発生し、それがどのように相互にフィードバックされるかを予測するためには、１つの測定されるデータセットの中で複数の長さスケールをカバーする必要がある。このようなデータセットには、現在の生物学的プロセスのモデルではまだ考慮されていないスケール間のつながりを多く含有している。しかし、どの遺伝子発現が細胞の状態に適合されるか、細胞の型がどのように決定されるか、病理学的な細胞表現型がどのように出現するか、又は腫瘍細胞がどのように薬剤に応答するかは、まさにこれらのつながりによる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ１】
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【図３Ｂ２】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【国際調査報告】
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