(57)【要約】本発明は、シトルリン含有エピトープに対する抗体又はその結合断片を提供する。本発明の抗体又はその結合断片は、治療法、例えば、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）関連病態の治療又は予防において使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片であって、
ａ）アミノ酸配列ＱＳＬ−Ｘ１−Ｄ−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−ＫＴＹ（式中、Ｘ１は、Ｖ又はＬであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＮであり、Ｘ３は、Ｇ又はＡである）を含むか又はからなるが、但し、前記アミノ酸配列が、ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３６）でもＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３７）でもない、ＶＬのＣＤＲ１と；
ｂ）配列番号１〜５から選択される少なくとも１つのＣＤＲと
を含む、抗体又はその結合断片。
【請求項２】
ａ）アミノ酸配列ＱＳＬ−Ｘ１−Ｄ−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−ＫＴＹ（式中、Ｘ１は、Ｖ又はＬであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＮであり、Ｘ３は、Ｇ又はＡである）を含むか又はからなるが、但し、前記アミノ酸配列が、ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３６）でもＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３７）でもない、ＶＬのＣＤＲ１と；
ｂ）配列番号３及び配列番号５のＣＤＲと
を含む、請求項１に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項３】
ａ）アミノ酸配列ＱＳＬ−Ｘ１−Ｄ−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−ＫＴＹ（式中、Ｘ１は、Ｖ又はＬであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＮであり、Ｘ３は、Ｇ又はＡである）を含むか又はからなるが、但し、前記アミノ酸配列が、ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３６）でもＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３７）でもない、ＶＬのＣＤＲ１と；
ｂ）配列番号１〜５のＣＤＲと
を含む、請求項２に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項４】
ａ）配列番号６、７、８、９、及び１０のＣＤＲのうちの１つ；
ｂ）配列番号１〜５のＣＤＲ
を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体又はその結合断片。
【請求項５】
ａ）アミノ酸配列ＱＳＬ−Ｘ１−Ｄ−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−ＫＴＹ（式中、Ｘ１は、Ｖ又はＬであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＮであり、Ｘ３は、Ｇ又はＡである）を含むか又はからなるが、但し、前記アミノ酸配列が、ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３６）でもＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３７）でもない、ＶＬのＣＤＲ１と；
ｂ）配列番号４及び５のＣＤＲのうちの少なくとも１つと；
ｃ）
ｉ）配列番号１１若しくは１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列；又は
ｉｉ）（ｉ）の少なくとも７アミノ酸の断片であって、前記抗体若しくはその結合断片が、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／若しくはヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープと特異的に反応する能力を保持している断片；又は
ｉｉｉ）（ｉ）の配列と少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する（ｉ）のバリアントであって、前記抗体又はその結合断片が、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／若しくはヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープと特異的に反応する能力を保持しているバリアントと
を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項６】
ａ）配列番号６、７、８、９、及び１０のＣＤＲのうちの１つと；
ｂ）配列番号４及び５のＣＤＲと；
ｃ）配列番号１１又は１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列と
を含む、請求項５に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項７】
ａ）配列番号１１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１３の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１４の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１５の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｅ）配列番号１１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１７の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｆ）配列番号１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１３の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｇ）配列番号１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１４の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｈ）配列番号１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１５の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｉ）配列番号１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；又は
ｊ）配列番号１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１７の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列
を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項８】
脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片であって、
ａ）配列番号１３、１４、１５、１６、又は１７のＣＤＲ１；及び
ｂ）配列番号１１又は１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列
のＣＤＲを含む、抗体又はその結合断片。
【請求項９】
配列番号１８、１９、２０、２１、及び２２からなる群から選択されるペプチドに特異的に結合し、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４に結合する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項１０】
少なくとも１ｎＭ以下の親和性で、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項１１】
組換え抗体、一本鎖抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変断片（Ｆｖ）、断片抗原結合領域（Ｆａｂ）、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨＨ抗体、ナノボディ、ラクダ由来のシングルドメイン抗体、サメＩｇＮＡＲ由来のシングルドメイン抗体断片（ＶＮＡＲ）、ダイアボディ、トリアボディ、アンチカリン、及びアプタマーからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項１２】
前記抗体が、好ましくは完全長抗体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項１３】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４領域等のＦｃ領域を含む、請求項１２に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項１４】
重鎖定常領域が配列番号２３若しくは５６を含む、及び／又は軽鎖定常領域が配列番号２４を含む、請求項１３に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項１５】
前記抗体が、配列番号１１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列、配列番号１６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列、配列番号２３又は５６の重鎖定常領域アミノ酸配列、及び配列番号２４の軽鎖定常領域アミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項１６】
追加の部分にコンジュゲートしている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又はその結合断片。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又はその結合断片をコードしているポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むクローニング若しくは発現ベクター、又は前記クローニング若しくは発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１８】
脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片を生成するプロセスであって、請求項１７に記載の宿主細胞を培養することと、該細胞から抗体又はその結合断片を単離することとを含む、プロセス。
【請求項１９】
本請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体又はその結合断片と、少なくとも１つの薬学的に許容し得る希釈剤又は担体とを含む、医薬組成物。
【請求項２０】
他の有効成分を更に含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
治療において使用するための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体、若しくはその結合断片、又は請求項１９若しくは２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ＮＥＴ関連病態を治療又は予防する方法において使用するための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体若しくはその結合断片、又は請求項１９若しくは２０に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記ＮＥＴ関連病態が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス、敗血症、血管炎、炎症性関節炎、関節リウマチ及び変形性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、若年性特発性関節炎、シェーグレン病、抗リン脂質症候群、ベーチェット病、脊椎炎、脊椎関節症、多系統萎縮症、パーキンソン病、レビー小体型認知症、喘息、アレルギー性ライノウイルス増悪性喘息、アレルギー性喘息、嚢胞性線維症、線維症及び特発性肺線維症、ドライアイ疾患、ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、ＣＯＰＤ、気管支炎、又は別のＮＥＴ関連病態、例えば、糖尿病における創傷治癒、がん、がん転移、及びインビボ又はエクスビボにおける移植臓器の健康である、請求項２２に従って使用するための抗体、その結合断片、又は医薬組成物。
【請求項２４】
非経口的な投与経路、例えば、静脈内、皮下、眼内、筋肉内、皮内、腹腔内、脊髄の経路によって、又は注射若しくは注入によって；あるいは、別の投与経路、例えば、直腸、経口、眼、外用、表皮、粘膜、局所、腫瘍周囲、腫瘍近傍、腫瘍内、腫瘍の切除縁へ、病巣内、病巣周囲、腔内注入によって、小胞内の投与、又は吸入によって投与される、請求項２１〜２３のいずれか一項に従って使用するための抗体、その結合断片、又は医薬組成物。
【請求項２５】
患者を治療する方法であって、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体若しくはその結合断片、又は請求項１９若しくは２０に記載の医薬組成物の治療上有効な量を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項２６】
前記治療が、ＮＥＴ関連病態の治療である、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シトルリン含有エピトープに対する抗体又はその結合断片を提供する。本発明の抗体又はその結合断片は、治療法、例えば、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）関連病態の治療又は予防において使用することができる。本発明の抗体又はその結合断片は、ＮＥＴ関連病態、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス、敗血症、血管炎、炎症性関節炎、関節リウマチ及び変形性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、若年性特発性関節炎、シェーグレン病、抗リン脂質症候群、ベーチェット病、脊椎炎、脊椎関節症、多系統萎縮症、パーキンソン病、レビー小体型認知症、喘息、アレルギー性ライノウイルス増悪性喘息、アレルギー性喘息、嚢胞性線維症、線維症及び特発性肺線維症、ドライアイ疾患、ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、ＣＯＰＤ、気管支炎、又は糖尿病における創傷治癒、がん、がん転移、及びインビボ又はエクスビボにおける移植臓器の健康等の他のＮＥＴ関連病態の治療又は予防において使用することができる。本発明は、また、ＮＥＴ関連病態、例えば、ＳＬＥ、ループス、敗血症、血管炎、炎症性関節炎、関節リウマチ及び変形性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、若年性特発性関節炎、シェーグレン病、抗リン脂質症候群、ベーチェット病、脊椎炎、脊椎関節症、多系統萎縮症、パーキンソン病、レビー小体型認知症、喘息、アレルギー性ライノウイルス増悪性喘息、アレルギー性喘息、嚢胞性線維症、線維症及び特発性肺線維症、ドライアイ疾患、ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、ＣＯＰＤ、気管支炎、又は他のＮＥＴ関連病態、例えば、糖尿病における創傷治癒、がん、がん転移、及びインビボ又はエクスビボにおける移植臓器の健康を治療又は予防するための医薬組成物及び方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
炎症状態は、慢性的性質であるか急性的性質であるかにかかわらず、ヘルスケア業界では重要な問題となっている。簡潔に述べると、慢性炎症とは、活動性炎症、組織破壊、及び治癒の試みが同時に進行している長期（数週間又は数ヶ月）の炎症であると考えられている。慢性炎症は、急性炎症性エピソードに続いて生じることもあるが、例えば、遅延性過敏反応を引き起こす持続的な感染症（例えば、結核、梅毒、真菌感染症）、内因性（例えば、血漿脂質の上昇）若しくは外因性（例えば、シリカ、アスベスト、タバコのタール、手術用縫合糸）の毒素への長期曝露、又は身体自身の組織に対する自己免疫反応（例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、血管炎、多発性硬化症、乾癬）の結果として、経時的に進行する潜行性プロセスとして始まる場合もある。
【０００３】
炎症の１つの帰結は、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の形成である。ＮＥＴが炎症を引き起こすことも知られている。ＮＥＴは、病原体に対する宿主の防御機構の一部として好中球によって生成されるＤＮＡ及びヒストンを含む構造体である。ＮＥＴは、様々な細菌、真菌、ウイルス、及び原虫の病原体を捕捉し、殺傷することができ、そして、ＮＥＴの放出は、病原体に対する防御の第一線の１つである。微生物又はサイトカインによる活性化に続いて、ヒストンが過シトルリン化され、好中球核は、好中球細胞死の形態であるＮＥＴｏｓｉｓによって、ＮＥＴの形成につながるクロマチン脱縮合のプロセスを受ける。
【０００４】
ＮＥＴは、例えば異常な炎症を引き起こすことによって、様々な疾患において病理学的役割を果たしている。従って、ＮＥＴは、様々な炎症状態、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス、敗血症、血管炎、炎症性関節炎、関節リウマチ及び変形性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、若年性特発性関節炎、ベーチェット病、脊椎炎、脊椎関節症、多系統萎縮症、パーキンソン病、レビー小体型認知症、喘息、アレルギー性ライノウイルス増悪性喘息、嚢胞性線維症、及び特発性肺線維症の病態に関与している。
【０００５】
例えば、ＮＥＴは、自己抗原の細胞外空間への曝露、及びその後の被験体による病的な自己抗体の産生を引き起こし得る。更に、ＮＥＴ及びＮＥＴレムナントは、血管の損傷並びにその後の臓器の損傷及び不全を誘導する毒性ヒストンを有している。従って、このような疾患では、ＮＥＴの形成に干渉し、循環及び組織からのＮＥＴ及びＮＥＴレムナントのクリアランスを誘導することは、治療上の利益を有するであろう。
【０００６】
好中球はまた、腫瘍の進行における重要な要素としても次第に認識されるようになってきている。好中球は、腫瘍の進行のほぼ全ての段階で重要な効果を発揮することが示されており、多くの研究により、その存在が腫瘍の発達にとって極めて重要であることが実証されている。また、研究によって、ＮＥＴは腫瘍の進行及び転移の促進因子に関係があるともされている。また、好中球は、ＮＥＴの生成を通して、腫瘍における血小板粘着、血栓の形成及び凝固のための足場及び刺激を提供することも示されている。
【０００７】
更に、ＮＥＴは、移植後の臓器の健康状態の低下にも関与している。ＮＥＴは、原発性移植片機能不全の一因となり、肺移植後の早期死亡の一因となる。ＮＥＴは、固形臓器移植において病原性の役割を果たすことが示されている。
【０００８】
従って、ＮＥＴ形成をブロックする、ＮＥＴをクリアランスする、及び／又はＮＥＴｏｓｉｓを防ぐことができる治療剤を同定することは、炎症性疾患、例えば、炎症性関節炎、関節リウマチ及び変形性関節炎、並びに他のＮＥＴ関連病態、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス、敗血症、血管炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、若年性特発性関節炎、シェーグレン病、抗リン脂質症候群、ベーチェット病、脊椎炎、脊椎関節症、多系統萎縮症、パーキンソン病、レビー小体型認知症、喘息、アレルギー性ライノウイルス増悪性喘息、アレルギー性喘息、嚢胞性線維症、線維症及び特発性肺線維症、ドライアイ疾患、ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、ＣＯＰＤ、気管支炎、糖尿病における創傷治癒、がん、がん転移、及びインビボ又はエクスビボにおける移植臓器の健康において臨床的有用性を有するであろう。
【０００９】
ＮＥＴ関連病態を治療又は予防するための化合物が依然として必要とされている。
【００１０】
脱イミノ化したヒトのヒストン２Ａ及びヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに結合する抗体は、特許文献１、２及び３に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００９１４７２０１号
【特許文献２】国際公開第２０１１０７０１７２号
【特許文献３】国際公開第２０１６０９２０８２号
【発明の概要】
【００１２】
本発明者らは、ヒストン２Ａ及び／又はヒストン４のアミノ末端におけるシトルリン化されたエピトープに結合する改良された抗体を作製した。これら抗体は、シトルリン化に関連する疾患又は病態、例えば、ＮＥＴ関連病態及び炎症状態を治療するために使用することができる。
【００１３】
本発明者らは、特許文献１、２及び３に開示されている治療用抗体よりも改善された特性を示す抗体を作製した。本発明者らは、加速安定性試験及び質量分析により、特許文献１、２及び３に開示されている抗体の軽鎖の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）における特定のアミノ酸残基が異性化された結果、試験したヒストン由来のペプチドに対する抗体の結合親和性が経時的に低下することを見出した。その後、本発明者らは、抗体の結合特性を保持することを試みつつ、異性化の問題を解決するために、ＣＤＲ１軽鎖変異体の徹底的な分析を行った。幾つかの試みの結果、標的ペプチドに対する結合親和性の低下した抗体が得られた。
【００１４】
最後に、本発明者らは、元の抗体の結合特性を維持しつつ、異性化の問題が取り除かれた軽鎖のＣＤＲ１における変異群を同定することに成功した。驚くべきことに、この変異体抗体は、インビトロ及びインビボの両方において、元の抗体よりも改善された特性を示した。
【００１５】
従って、本発明は、
−  脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片であって、
ａ）アミノ酸配列ＱＳＬ−Ｘ１−Ｄ−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−ＫＴＹ（式中、Ｘ１は、Ｖ又はＬであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＮであり、Ｘ３は、Ｇ又はＡである）を含むか又はからなるが、但し、該アミノ酸配列は、ＱＳＬＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３６）でもＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３７）でもない、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲ１と；
ｂ）配列番号１〜５から選択される少なくとも１つのＣＤＲと
を含む、抗体又はその結合断片を提供する。
【００１６】
本発明はまた、
−  脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片であって、
ａ）配列番号１３、１４、１５、１６、又は１７のＣＤＲ１；及び
ｂ）配列番号１１又は１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列
のＣＤＲを含む、抗体又はその結合断片を提供する。
【００１７】
本発明はまた、
−  本明細書に定義される抗体若しくはその結合断片をコードしているポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むクローニング若しくは発現ベクター、又は該クローニング若しくは発現ベクターを含む、宿主細胞を提供する。
【００１８】
本発明はまた、
−  脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片を生成するプロセスであって、本明細書に定義される宿主細胞を培養することと、該細胞から抗体又はその結合断片を単離することとを含む、プロセスを提供する。
【００１９】
本発明はまた、
−  本明細書に定義される通りに従う抗体又はその結合断片と、少なくとも１つの薬学的に許容し得る希釈剤又は担体とを含む、医薬組成物を提供する。
【００２０】
本発明はまた、
−  治療において使用するための、本明細書に定義される抗体、若しくはその結合断片、又は本明細書に定義される医薬組成物を提供する。
【００２１】
本発明はまた、
−  ＮＥＴ関連病態を治療又は予防する方法において使用するための、本明細書に定義される抗体、若しくはその結合断片、又は本明細書に定義される医薬組成物を提供する。
【００２２】
本発明はまた、
−  患者を治療する方法であって、本明細書に定義される抗体若しくはその結合断片又は本明細書に定義される医薬組成物の治療上有効な量を該患者に投与することを含む、方法を提供する。
【００２３】
配列表の簡単な説明
抗体の命名法
ＣＤＲ＝相補性決定領域。
ＶＨ＝重鎖可変ドメイン。
ＶＬ＝軽鎖可変ドメイン。
ＣＨ＝重鎖定常ドメイン。
ＣＬ＝軽鎖定常ドメイン。
ｍｓＶＨ２２．１０１＝治療用抗体のマウスＶＨ。
ｍｓＶＬ２２．１０１＝治療用抗体のマウスＶＬ。
ｈＶＨ２２．１０１ｘ＝治療用抗体のヒト化ＶＨ、「ｘ」は重鎖を指す。
ｈＶＬ２２．１０１ｙ＝治療用抗体のヒト化ＶＬ、「ｙ」は軽鎖を指す。
ｈＶＨ２２．１０１（ＨＣ）ｘ＝治療用抗体の最適化ヒト化ＶＨ、「（ＨＣ）ｘ」は重鎖を指す。
ｈＶＬ２２．１０１（ＬＣ）ｙ＝治療用抗体の最適化ヒト化ＶＬ、「（ＬＣ）ｙ」は軽鎖を指す。
ｈＭＱ２２．１０１ｘ／ｙ＝ヒト化治療用抗体、「ｘ」は重鎖を指し、「ｙ」は軽鎖を指す。
ｈＭＱ２２．１０１（ＨＣ）ｘ／（ＬＣ）ｙ＝本発明の最適化ヒト化治療用抗体、「（ＨＣ）ｘ」は重鎖を指し、「（ＬＣ）ｙ」は軽鎖を指す。
【００２４】
【表１−１】
2021535211.tif 000002
【表１−２】
2021535211.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅ及びｈＭＱ２２．１０１ｆ／ｇの加速安定性試験  ２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅ（１２．５ｍｇ／ｍＬ）又はｈＭＱ２２．１０１ｆ／ｇ（３．３１ｍｇ／ｍＬ）を含有する０．７５ｍＬのアリコート（ガラス管）を、３７℃でそれぞれ８週間保存した。毎週、無菌条件下で各ガラス管から幾つかの１０μＬ及び２０μＬのサンプルを取り出し、更に分析（ＥＬＩＳＡ及び質量分析）を行うまで−８０℃で保存した。  ０週目、２週目、４週目、６週目、及び８週目のｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅサンプル並びに０週目、３週目、及び６週目のｈＭＱ２２．１０１ｆ／ｇサンプルを、ヒストン由来のペプチド（配列番号１８）に対する結合を評価する、インハウスで検証したＣＭＣ  ＥＬＩＳＡに供した。  ０週目の加速安定性サンプルの抗体結合親和性を１００％とし、加速安定性サンプル（２週目、３週目、４週目、６週目、及び８週目）の他の全ての結合親和性値を０週目（１００％）の百分率として再計算し、棒グラフとしてプロットした。
【図２】ｈＭＱ２２．１０１ｘ／ｙ抗体の質量分析  図２Ａ  抗体ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅからの加速安定性サンプルの質量分析（ＭＳ）分析。  ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅ（１２．５ｍｇ／ｍＬ）を含有する０．７５ｍＬのアリコート（ガラス管）を、３７℃でそれぞれ８週間保存した。毎週、無菌条件下で各ガラス管からサンプルを取り出し、ＭＳ分析を行うまで−８０℃で保存した。  実施例２に記載の通りＭＳ分析を行った。表は、ｈＶＬ２２．１０１ｅのＣＤＲ１内及びＣＤＲ２付近の相対的なアスパラギン酸（Ｄ）異性化レベルを示す。  図２Ｂ  ｈＶＬ２２．１０１ｙのアスパラギン酸が変異したＣＤＲ１を含有するヒト化抗体を用いた抗原結合アッセイ。  生成されたＣＤＲ１アスパラギン酸変異抗体ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｈ、ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｉ、及びｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｊを、実施例１に記載の通りインハウスで検証したＣＭＣ  ＥＬＩＳＡを用いて、アスパラギン酸含有抗体ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅと比較した。グラフは、３種のｈＶＬ２２．１０１ｙ  ＣＤＲ１変異体（ｈＶＬ２２．１０１ｈのＣＤＲ１＝ＤＳ部位のＡＳへの変異；ｈＶＬ２２．１０１ｉのＣＤＲ１＝ＤＳ部位のＥＳへの変異；ｈＶＬ２２．１０１ｊのＣＤＲ１＝ＤＳ部位のＳＳへの変異）の光学密度の結果を示す。  図２Ｃ  抗体ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｉからの加速安定性サンプルのＭＳ分析。実施例２に記載の通りＭＳ分析を行った。表は、ｈＶＬ２２．１０１ｉのＣＤＲ１内及びＣＤＲ２付近の相対的なアスパラギン酸（Ｄ）異性化レベルを示す。
【図３Ａ】ｈＭＱ２２．１０１異性化変異体の生成及び親和性解析  表は、ｈＶＬ２２．１０１ｅ及びｈＶＬ２２．１０１ｇの未変異ＣＤＲ１に加えて作製した、ｈＶＬ２２．１０１（ＬＣ）ｙのＣＤＲ１が変異したドメイン１７個を示す。
【図３Ｂ】ｈＭＱ２２．１０１異性化変異体の生成及び親和性解析  Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６機器を用いて測定した、シトルリン化されたＨ２Ａ由来ペプチド（配列番号１８）及びＨ４由来ペプチド（配列番号２０）に対する異性化変異体の解離速度（ｋｄｉｓ×Ｅ−０７（１／ｓ））を示すグラフ。解離速度が低いほど、抗原に対する抗体の親和性が高いことを示す。
【図４】ｈＭＱ２２．１０１異性化変異体の加速安定性試験  指定の変異抗体（２．０６〜４．２９ｍｇ／ｍＬの範囲）を含有する０．４ｍＬのアリコート（ガラス管）を３７℃でそれぞれ６週間保存した。毎週、無菌条件下で各ガラス管からサンプルを取り出し、更に分析を行うまで−８０℃で保存した。０週目、３週目、及び６週目のサンプルを、シトルリン化されたＨ２Ａ由来のペプチド（配列番号１８）に対する結合を評価する、インハウスで検証したＣＭＣ  ＥＬＩＳＡに供した。  ０週目の加速安定性サンプルからの再計算された抗体結合親和性を１００％とし、加速安定性サンプルの他の全ての結合親和性値を０週目（１００％）の百分率として再計算し、棒グラフとしてプロットした。  加速安定性試験で使用した好ましい重鎖は、ｈＶＨ２２．１０１ｆ及びｈＶＨ２２．１０１ＨＣ９であった。重鎖とＣＤＲ１が変異した軽鎖との９つの組み合わせを試験した。ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４２、ｈＭＱ２２．１０１ＨＣ９／ＬＣ２１、ｈＭＱ２２．１０１ＨＣ９／ＬＣ２７、及びｈＭＱ２２．１０１ＨＣ９／ＬＣ４２が、６週間後に最も高い安定性を示した。
【図５】ｈＭＱ２２．１０１異性化変異体の質量分析  指定の変異抗体（２．０６〜４．２９ｍｇ／ｍＬの範囲）を含有する０．４ｍＬのアリコート（ガラス管）を３７℃でそれぞれ６週間保存した。毎週、無菌条件下で各ガラス管からサンプルを取り出し、更に分析を行うまで−８０℃で保存した。０週目及び６週目の加速安定性サンプルを使用し、ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅの異性化レベルと比較したことを除いて実施例２に記載の通り、ＶＬ  ＣＤＲ１が変異したｈＭＱ２２．１０１抗体（異性化変異体）の質量（ＭＳ）分析を実施した。表は、ｈＶＬ２２．１０１（ＬＣ）ｙのＣＤＲ１内の相対的なアスパラギン酸（Ｄ）異性化レベルを示す。ｈＭＱ２２．１０１異性化変異体のＭＳ分析は、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１が最も少ない経時的な異性化（０．５％）を示し、従って最も好ましい候補であったことを示す。他の好ましい候補は、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４２及びｈＭＱ２２．１０１ＨＣ９／ＬＣ４２であった。
【図６】好ましいｈＭＱ２２．１０１異性化変異体の凝集及び分解アッセイ  指定の変異抗体（２．０６〜４．２９ｍｇ／ｍＬの範囲）を含有する０．４ｍＬのアリコート（ガラス管）を３７℃でそれぞれ６週間保存した。毎週、無菌条件下で各ガラス管からサンプルを取り出し、更に分析を行うまで−８０℃で保存した。ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４２、及びｈＭＱ２２．１０１ＨＣ９／ＬＣ４２異性化変異体からの０週目及び６週目の安定性サンプルを、実施例１０に記載の通り凝集及び分解分析のために使用した。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＧＦ−２５０カラムと組み合わせたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００システムで測定を行った。２４０ｎｍの紫外光を用いてタンパク質を検出した。抗体のメインピークは約４．２５分で検出された。メインピークの前後のショルダーを定量し、それぞれ凝集率及び分解率のレベルの指標とする。ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４２、及びｈＭＱ２２．１０１ＨＣ９／ＬＣ４２は、許容可能な凝集及び分解のプロファイルを示し、このことは、これらが更なる開発のために許容可能であることを示した。
【図７】好ましい異性化変異体ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１及びｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４２を用いたＮＥＴｏｓｉｓ阻害実験  健常ボランティア（ドナー１５４及び１５５）からの好中球を、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７で４時間刺激した。Ａ２３１８７を細胞に添加する１５分前に、２５μｇ／ｍＬの濃度の抗体又はアッセイバッファを添加することによって、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）低減抗体の効果を試験した。３７℃及び５％ＣＯ２で４時間インキュベーションした後、細胞を洗浄し、その後、細胞外ＤＮＡをＳ７ヌクレアーゼで消化した。ＮＥＴ断片をウェルから収集し、収集したＮＥＴ５０μＬに３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質５０μＬを添加することによってサンプル中のＭＰＯ活性を測定することにより定量した。ＲＴで１０分間インキュベーションした後、Ｈ２ＳＯ４５０μＬを添加し、４５０ｎｍで光学密度を測定した。Ａ２３１８７処理を受けていない好中球から生じたバックグラウンドシグナルを差し引き、Ａ２３１８７＋無関係の抗体で処理された好中球からのシグナルを１００％とした。他の全ての処理群からのシグナルは、無関係の抗体処理の百分率とした。
【図８】マウスＣＡＩＡモデルにおけるｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４２、及びｈＭＱ２２．１０１ｆ／ｇの用量応答  リード最適化候補抗体は、炎症の発症を予防する。コラーゲン抗体誘発性関節炎（ＣＡＩＡ）モデルを用いて、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４２、又はｈＭＱ２２．１０１ｆ／ｇの用量応答有効性を試験した。０日目に、抗コラーゲン−ＩＩ抗体２．８ｍｇをｉ．ｐ．注射することを通して５頭のマウスのグループを処理した。３日目に、それぞれ６．２５、１２．５、及び２５ｍｇ／ｋｇのｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４２、又はｈＭＱ２２．１０１ｆ／ｇ、無関係アイソタイプ適合対照抗体（２５ｍｇ／ｋｇでＭＱＲ２．２０１）と同時に、又は抗体なし（プラセボ）で、ＬＰＳ（２５μｇ／マウス）をｉ．ｐ．注射した。肢における腫脹の程度を２週間にわたって採点し、「平均関節炎スコア／マウス」としてグラフに表した。
【図９Ａ】ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１によるインビトロにおけるＮＥＴ阻害及びＮＥＴの結合  骨髄由来のマウス好中球をＡ２３１８７で刺激して、インビトロにおいてＮＥＴ放出を誘導した。ＮＥＴ放出は、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１によって阻害されたが、ＭＱＲ２．２０１には阻害されなかった（図Ａ；左の棒グラフ、Ｈｏｅｃｈｓｔ（ＤＮＡ）及びシトルリン化されたヒストン３（ｃｉｔＨ３）の共局在の定量、そして、右の棒グラフ、Ｈｏｅｃｈｓｔのみの定量）。ＮＥＴ及びプレＮＥＴを含むＤＮＡの検出にはＳｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎを使用し、ＮＥＴ及びプレＮＥＴに結合しているｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４の検出には抗ｈＩｇＧを使用する。スケールバー：２５μｍ。
【図９Ｂ】ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１によるインビトロにおけるＮＥＴ阻害及びＮＥＴの結合  骨髄由来のマウス好中球をＡ２３１８７で刺激して、インビトロにおいてＮＥＴ放出を誘導した。更に、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１は、排出されたＮＥＴ（黄矢印）及びプレＮＥＴ（白矢印）に結合し、これはマクロファージによるＮＥＴのクリアランスに向けた最初の段階である可能性がある（図Ｂ）。ＮＥＴ及びプレＮＥＴを含むＤＮＡの検出にはＳｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎを使用し、ＮＥＴ及びプレＮＥＴに結合しているｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４の検出には抗ｈＩｇＧを使用する。スケールバー：２５μｍ。
【図１０Ａ】ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１によるインビボにおけるＮＥＴ阻害及びＮＥＴの結合  インビボにおいてＮＥＴ形成を誘導するために、プリスタン誘導性腹膜細胞流入マウスモデルを用いた。プリスタン油５００μＬを注射した直後に５０ｍｇ／ｋｇ  ＭＱＲ２．２０１又はｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１を投与し、続いて、１２時間後に５０ｍｇ／ｋｇ  ＭＱＲ２．２０１又はｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１の２回目の注射を行った。２４時間後、細胞を収集した。マウスをｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１で処理したときにはインビボにおいてＮＥＴ放出の阻害が観察されたが、ＭＱＲ２．２０１では観察されなかった。  代表的な写真。ＮＥＴ及びプレＮＥＴを含むＤＮＡの検出にはＳｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎを使用し、ＮＥＴ及びプレＮＥＴに結合しているｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４の検出には抗ｈＩｇＧを使用する。スケールバー：５０μｍ。
【図１０Ｂ】ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１によるインビボにおけるＮＥＴ阻害及びＮＥＴの結合  インビボにおいてＮＥＴ形成を誘導するために、プリスタン誘導性腹膜細胞流入マウスモデルを用いた。プリスタン油５００μＬを注射した直後に５０ｍｇ／ｋｇ  ＭＱＲ２．２０１又はｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１を投与し、続いて、１２時間後に５０ｍｇ／ｋｇ  ＭＱＲ２．２０１又はｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１の２回目の注射を行った。２４時間後、細胞を収集した。マウスをｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１で処理したときにはインビボにおいてＮＥＴ放出の阻害が観察されたが、ＭＱＲ２．２０１では観察されなかった。  共局在しているＨｏｅｃｈｓｔ（ＤＮＡ）及びシトルリン化されたヒストン３（ｃｉｔＨ３）によるＮＥＴの定量。（ＮＥＴ及びプレＮＥＴを含むＤＮＡの検出にはＳｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎを使用し、ＮＥＴ及びプレＮＥＴに結合しているｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４の検出には抗ｈＩｇＧを使用する。
【図１０Ｃ】ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１によるインビボにおけるＮＥＴ阻害及びＮＥＴの結合  インビボにおいてＮＥＴ形成を誘導するために、プリスタン誘導性腹膜細胞流入マウスモデルを用いた。プリスタン油５００μＬを注射した直後に５０ｍｇ／ｋｇ  ＭＱＲ２．２０１又はｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１を投与し、続いて、１２時間後に５０ｍｇ／ｋｇ  ＭＱＲ２．２０１又はｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１の２回目の注射を行った。２４時間後、細胞を収集した。マウスをｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１で処理したときにはインビボにおいてＮＥＴ放出の阻害が観察されたが、ＭＱＲ２．２０１では観察されなかった。  ＮＥＴ及びプレＮＥＴへのｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１の結合、これは、マクロファージによるＮＥＴクリアランスに向けた最初の段階である可能性がある。ＮＥＴ及びプレＮＥＴを含むＤＮＡの検出にはＳｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎを使用し、ＮＥＴ及びプレＮＥＴに結合しているｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４の検出には抗ｈＩｇＧを使用する。スケールバー：２５μｍ。
【図１１】ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１を多く含むＮＥＴは、インビボにおいてマウスマクロファージによって貪食される  インビボにおいてＮＥＴ形成を誘導するために、プリスタン誘導性腹膜細胞流入マウスモデルを用いた。プリスタン油５００μＬを注射した直後に５０ｍｇ／ｋｇ  ＭＱＲ２．２０１又はｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１を投与し、続いて、１２時間後に５０ｍｇ／ｋｇ  ＭＱＲ２．２０１又はｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１の２回目の注射を行った。２４時間後、細胞を収集し、Ｈｏｅｃｈｓｔ（ＤＮＡ：青）、マクロファージマーカー抗Ｆ４／８０（マゼンタ）、抗ＮＥ（緑）、抗ｃｉｔＨ３（黄）、及び抗ｈＩｇＧ（シアン）で染色した。ＮＥ（青矢印）、ｃｉｔＨ３（赤矢印）、及びｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１（白矢印）を含有するＮＥＴ粒子は、マクロファージ（Ｆ４／８０）に存在する。スケールバー：１０μｍ。
【図１２Ａ】ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅは、慢性ＣＩＡマウスにおいて、ＮＥＴが媒介する組織損傷及び疾患の進行を予防する。  ＲＡのＣＩＡマウスモデルの概略図。慢性関節炎を誘導するために、マウスにＣＩＩＩを２回（０日目及び２１日目）注射した。ＭＡＳが≧０．７５であった場合疾患の発症（２１日目〜２８日目）後に治療的処理を開始した。処理は、ＭＱＲ２．２０１（５０／５０／５０／５０ｍｇ／ｋｇ）又はｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅ（３０／３０／３０／１０、５０／５０／５０／１５、又は５０／１０／１０／１０ｍｇ／ｋｇ）の漸減投与レジメンによる４回の注射（４日間隔）を含む。マウスは、処理開始の１４日後に終了させた。
【図１２Ｂ】ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅは、慢性ＣＩＡマウスにおいて、ＮＥＴが媒介する組織損傷及び疾患の進行を予防する。  ＣＩＡマウスの平均関節炎スコア（ＭＡＳ）を１４日間にわたって評価した（ｎ＝１０頭のマウス／群；ＭＱＲ２．２０１を用いて統計的差異を計算した）。結果を平均±ＳＥＭとして示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ダネットの多重比較検定を伴う二元配置分散分析を使用。
【図１２Ｃ】ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅは、慢性ＣＩＡマウスにおいて、ＮＥＴが媒介する組織損傷及び疾患の進行を予防する。  １回目の抗体注射後１４日目に、左右の後肢の膝及び足首の骨損傷をＸ線で分析した（ｎ＝１０）。結果を平均±ＳＥＭとして示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、独立両側スチューデントのｔ検定を使用。
【図１２Ｄ】ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅは、慢性ＣＩＡマウスにおいて、ＮＥＴが媒介する組織損傷及び疾患の進行を予防する。  左右の足首の関節のＨ＆Ｅ及びＳＯ染色を用いた組織学的分析によって、１回目の抗体注射後１４日目に、炎症細胞の流入が認められた（ｎ＝１６〜２０頭のマウス足首）。結果を平均±ＳＥＭとして示す。両側マンホイットニー統計検定を使用。
【図１２Ｅ】ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅは、慢性ＣＩＡマウスにおいて、ＮＥＴが媒介する組織損傷及び疾患の進行を予防する。  左右の足首の関節のＨ＆Ｅ及びＳＯ染色を用いた組織学的分析によって、１回目の抗体注射後１４日目に、骨侵食が認められた（ｎ＝１６〜２０頭のマウス足首）。結果を平均±ＳＥＭとして示す。＊Ｐ＜０．０５、両側マンホイットニー統計検定を使用。
【図１２Ｆ】ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅは、慢性ＣＩＡマウスにおいて、ＮＥＴが媒介する組織損傷及び疾患の進行を予防する。  左右の足首の関節のＨ＆Ｅ及びＳＯ染色を用いた組織学的分析によって、１回目の抗体注射後１４日目に、軟骨侵食が認められた（ｎ＝１６〜２０頭のマウス足首）。結果を平均±ＳＥＭとして示す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側マンホイットニー統計検定を使用。
【図１２Ｇ】ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅは、慢性ＣＩＡマウスにおいて、ＮＥＴが媒介する組織損傷及び疾患の進行を予防する。  左右の足首の関節のＨ＆Ｅ及びＳＯ染色を用いた組織学的分析によって、１回目の抗体注射後１４日目に、軟骨ＰＧの枯渇が認められた（ｎ＝１６〜２０頭のマウス足首）。結果を平均±ＳＥＭとして示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、両側マンホイットニー統計検定を使用。
【図１２Ｈ】ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅは、慢性ＣＩＡマウスにおいて、ＮＥＴが媒介する組織損傷及び疾患の進行を予防する。  左右の足首の関節のＨ＆Ｅ及びＳＯ染色を用いた組織学的分析によって、１回目の抗体注射後１４日目に、軟骨細胞の死が認められた（ｎ＝１６〜２０頭のマウス足首）。結果を平均±ＳＥＭとして示す。＊＊Ｐ＜０．０１、両側マンホイットニー統計検定を使用。
【図１２Ｉ】ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅは、慢性ＣＩＡマウスにおいて、ＮＥＴが媒介する組織損傷及び疾患の進行を予防する。  シトルリン化されたヒストン３（ｃｉｔＨ３；赤）、ＤＡＰＩ（青）、好中球マーカーＬｙ６Ｇ（緑）、及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ；黄色）を示す右後肢の関節内におけるＮＥＴ放出の代表的な免疫蛍光及びＨ＆Ｅ画像。核及び細胞外のＤＮＡ染色にはＤＡＰＩを用いた。スケールバー：１００μｍ。
【図１２Ｊ】ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅは、慢性ＣＩＡマウスにおいて、ＮＥＴが媒介する組織損傷及び疾患の進行を予防する。  マウス（ｎ＝１０）の右後肢の脛骨足根骨関節、近位足根間関節、遠位足根間関節、及び足根中足関節におけるＬｙ６Ｇの定量。結果を平均±ＳＥＭとして示す。＊＊Ｐ＜０．０１、両側マンホイットニー統計検定を使用。
【図１２Ｋ】ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅは、慢性ＣＩＡマウスにおいて、ＮＥＴが媒介する組織損傷及び疾患の進行を予防する。  マウス（ｎ＝１０）の右後肢の脛骨足根骨関節、近位足根間関節、遠位足根間関節、及び足根中足関節におけるＮＥＴ（ｃｉｔＨ３及びＭＰＯの共局在）の定量。結果を平均±ＳＥＭとして示す。＊Ｐ＜０．０５、両側マンホイットニー統計検定。
【図１２Ｌ】ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅは、慢性ＣＩＡマウスにおいて、ＮＥＴが媒介する組織損傷及び疾患の進行を予防する。  巨視的スコア（肢の腫脹）と関節あたりのＮＥＴとの有意な相関。スピアマンのｒ検定を使用。
【図１２Ｍ】ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅは、慢性ＣＩＡマウスにおいて、ＮＥＴが媒介する組織損傷及び疾患の進行を予防する。  巨視的スコア（肢の腫脹）と関節あたりの好中球（Ｌｙ６Ｇ）との有意な相関。スピアマンのｒ検定を使用。
【図１３】ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅは健常白血球には結合しない。  健常ボランティアの血液からＰＢＭＣ及び好中球を単離した。赤血球及び血小板から白血球を区別するためにＣＤ４５を使用し、Ｔ細胞、ＤＣ、単球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及び好中球をマークするために、それぞれ、ＣＤ３、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ５６、及びＣＤ６６ｂを使用した。ＨｉＬｙｔｅ（商標）Ｆｌｕｏｒ４８８コンジュゲートｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅの、健常な静止期のＴ細胞、Ｂ細胞、単球、ＮＫ細胞、ＤＣ、及び好中球への結合は認められなかった。活性化好中球（５μＭ  Ａ２３１８７、４５分間）をポジティブコントロールとして使用し、ＨｉＬｙｔｅ（商標）ＭＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲートｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅ結合の増加を示す。＊＊＊＊Ｐ＜０．００１、ダネットの多重比較検定を伴う通常の一元配置分散分析を使用。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
開示される発明の様々な用途は、当技術分野における具体的なニーズに応じて調整できることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定を意図するものではないことも理解されたい。
【００２７】
更に、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、特に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「抗体（ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」に対する言及は、「複数の抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」等を含む。
【００２８】
上記であろうと下記であろうと、本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２９】
本発明は、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片に関する。ヒトのヒストン２Ａ及び４の脱イミノ化は、酵素、例えば、ＰＡＤ２及びＰＡＤ４等のペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によって行うことができる。また、本発明の抗体は、ヒトのヒストン３におけるシトルリン化されたエピトープにも特異的に結合し得る。本発明の抗体は、ヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４及び／又はヒストン３におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合し得る。本発明はまた、このような抗体又はその結合断片の使用、例えば、治療への使用に関する。
【００３０】
本発明は、ＮＥＴ関連病態の治療又は予防において使用するための、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片に関する。本発明の抗体又はその結合断片は、ＮＥＴ関連病態、例えば、ＳＬＥ、ループス、敗血症、血管炎、炎症性関節炎、関節リウマチ及び変形性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、若年性特発性関節炎、シェーグレン病、抗リン脂質症候群、ベーチェット病、脊椎炎、脊椎関節症、多系統萎縮症、パーキンソン病、レビー小体型認知症、喘息、アレルギー性ライノウイルス増悪性喘息、アレルギー性喘息、嚢胞性線維症、線維症及び特発性肺線維症、ドライアイ疾患、ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、ＣＯＰＤ、気管支炎、又は他のＮＥＴ関連病態、例えば、糖尿病における創傷治癒、がん、がん転移、及びインビボ又はエクスビボにおける移植臓器の健康の治療又は予防において使用することができる。
【００３１】
本発明の抗体又はその結合断片の標的
シトルリンは、正常な翻訳中にはタンパク質に組み込まれることのないアミノ酸であるが、ＰＡＤ；（ＥＣ３．５．３．１５）等の酵素によるアルギニン残基の翻訳後修飾により生成され得る。哺乳類（ヒト、マウス、及びラット）では、それぞれが異なる遺伝子によってコードされている５つのＰＡＤアイソタイプ（ＰＡＤ１〜ＰＡＤ６；「ＰＡＤ４」及び「ＰＡＤ５」は同じアイソタイプに使用）がこれまでに同定されている。
【００３２】
ヒストン２Ａ及び／又はヒストン４のシトルリン化は、ＮＥＴの形成に関連している。ＮＥＴ形成の下流の病理学的効果は、多数である可能性がある。例えば、該効果は、自己抗原の細胞外空間への曝露、及びその後の被験体による病的な自己抗体の産生であり得る。ＮＥＴ由来のヒストンは、血管壁及び臓器に対して毒性である場合があり、血管損傷及び臓器不全を引き起こす。ＮＥＴは、例えばＳＬＥ患者の腎臓において、更に炎症を亢進させる自己抗原／自己抗体免疫複合体の形成を引き起こし得る。ＮＥＴは、がんの進行における転移にも関与している。
【００３３】
本発明に係る抗体又はその結合断片は、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する。また、本発明の抗体は、脱イミノ化されたヒトのヒストンＨ３におけるシトルリン化されたエピトープにも特異的に結合し得る。特定の実施形態では、本発明に係る抗体又はその結合断片は、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合し、該エピトープは、配列番号１８、１９、２０、２１、及び２２からなる群から選択されるペプチドを含む。また、抗体又はその結合断片は、配列番号５３又は５４のペプチドを含むエピトープにも結合し得る。
【００３４】
抗体又はその結合断片
用語「複数の抗体」、「抗体」、又は「その結合断片」とは、本明細書で使用するとき、「抗原」と呼ばれることの多い標的分子に特異的に結合することができる構造体、好ましくはタンパク質又はポリペプチドの構造体を指す。
【００３５】
抗体分子とは、本明細書で使用するとき、抗体又はその結合断片を指す。用語「抗体」は、本明細書で使用するとき、一般に、インタクトな（全）抗体、すなわち、２本の重鎖及び２本の軽鎖の要素を含む抗体に関する。抗体は、例えば、国際公開第２００７／０２４７１５号に開示されている分子ＤＶＤ−Ｉｇ又は国際公開第２０１１／０３０１０７号に記載のいわゆる（ＦａｂＦｖ）２Ｆｃのように、追加の結合ドメインを更に含んでいてもよい。従って、「抗体」とは、本明細書で使用するとき、一価、二価、三価、又は四価の完全長抗体を含む。
【００３６】
抗体の結合断片としては、一本鎖抗体（すなわち、完全長の重鎖及び軽鎖）；Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、シングルドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、一価、二価、三価、又は四価の抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリボディ、トリアボディ、テトラボディ、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片が挙げられる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ  ＰＪ，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３，：１１２６−１１３６；Ａｄａｉｒ  ＪＲ  ａｎｄ  Ｌａｗｓｏｎ  ＡＤＧ，２００５，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ，２，２０９−２１７を参照）。これら抗体断片を作製及び製造する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｖｅｒｍａ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５−１８１を参照）。Ｆａｂ−Ｆｖフォーマットは、国際公開第２００９／０４０５６２号に最初に開示され、そのジスルフィド安定化バージョンであるＦａｂ−ｄｓＦｖは、国際公開第２０１０／０３５０１２号に最初に開示された。本発明において使用するための他の抗体断片としては、Ｆａｂ及びＦａｂ’断片が挙げられる。多価抗体は、多重特異性を有していてもよく、例えば二重特異的であってもよく、単一特異的であってもよい。
【００３７】
抗体又はその結合断片は、一本鎖抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変断片（Ｆｖ）、断片抗原結合領域（Ｆａｂ）、組換え抗体、モノクローナル抗体、ネイティブ抗体の抗原結合ドメイン又はアプタマーを含む融合タンパク質、ＶＨＨ抗体としても知られているシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ナノボディ（ラクダ由来のシングルドメイン抗体）、ＶＮＡＲと呼ばれるサメＩｇＮＡＲ由来のシングルドメイン抗体断片、ダイアボディ、トリアボディ、アンチカリン、アプタマー（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、及びこれらの活性成分又は断片からなる群から選択され得る。
【００３８】
ＩｇＧ１重鎖及び軽鎖を有するＩｇＧ１（例えば、ＩｇＧ１／κ）抗体は、本発明において有利に使用され得る。しかしながら、κ又はλ軽鎖と組み合わせたＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを含む、他のヒト抗体アイソタイプも本発明に包含される。また、様々なアイソタイプの動物由来の抗体は全て、本発明において使用することができる。抗体は、フルサイズ抗体であってもよく、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ断片、又は単一ドメインＶＨＨ、ＶＨ又はＶＬ単一ドメインを含む抗体の抗原結合断片であってもよい。
【００３９】
用語「シトルリンに特異的に結合する」又は「シトルリン化されたエピトープに特異的に結合する」とは、この状況では、抗体又はその結合断片が、シトルリン残基を含有するペプチド等の構造には結合するが、一方、該抗体又はその結合断片は、シトルリン残基の代わりにアルギニン残基を含有する同一構造にはより弱くしか又は好ましくは全く結合しないことを意味する。用語ペプチドは、本明細書に記載の抗体又はその結合断片との免疫反応性についての適正な状況において、好ましくは、ヒト又は動物の体内に存在するのと同じ状況において、好ましくは、ネイティブポリペプチドの状況において、シトルリン残基を提示することができる構造体として解釈されるべきである。
【００４０】
本発明の抗体又はその結合断片は、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する。脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに抗体又はその結合断片が結合すると、ＮＥＴ形成がブロッキングされる。ヒストンのシトルリン化は、ＮＥＴの形成に関連している。
【００４１】
ＮＥＴ形成のブロッキングは、全体的である場合も部分的である場合もある。例えば、本発明の抗体又はその結合断片は、ＮＥＴ形成を１０〜５０％、少なくとも５０％、又は少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％減少させることができる。ＮＥＴのブロッキングは、任意の好適な手段によって、例えば、インビトロでＮＥＴｏｓｉｓを測定することによって測定することができる（Ｋｒａａｉｊ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．１５，５７７−５８４）。
【００４２】
用語「結合活性」及び「結合親和性」は、抗体分子が標的に結合する又は結合しない傾向を指すことを意図する。結合親和性は、抗体及びその標的についての解離定数（Ｋｄ）を求めることによって定量することができる。同様に、抗体のその標的への結合の特異性は、抗体及び別の非標的分子に関する解離定数と比較した、抗体のその標的に対する比較解離定数（Ｋｄ）の観点で定義され得る。
【００４３】
典型的には、標的に関する抗体のＫｄは、環境中の無関係な物質又は共存する物質等の他の非標的分子に関するＫｄよりも２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍低い。より好ましくは、Ｋｄは、５０倍以下、更により好ましくは１００倍以下、更により好ましくは２００倍以下である。
【００４４】
この解離定数の値は、周知の方法によって直接求めることができ、複雑な混合物であっても、例えば、Ｃａｃｅｃｉ  ＭＳ  ａｎｄ  Ｃａｃｈｅｒｉｓ  ＷＰ（１９８４，Ｂｙｔｅ，９，３４０−３６２）に記載されているもの等の方法によってコンピュータで計算することができる。例えば、Ｋｄは、Ｗｏｎｇ  Ｉ  ａｎｄ  Ｌｏｈｍａｎ  ＴＭ（１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５４２８−５４３２）によって開示されているもの等のダブルフィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイを用いて、又は例えばＯｃｔｅｔ表面プラズモン共鳴を用いることによって確立され得る。
【００４５】
脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４についての結合親和性を評価する１つの方法は、ＥＬＩＳＡによる方法である。例えば、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、及びフローサイトメトリー分析を含む、標的に対する抗体等のリガンドの結合能力を評価するための他の標準的なアッセイは、当技術分野において公知である。抗体の結合反応速度（例えば、結合親和性）は、また、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システム分析によって、表面プラズモン共鳴等の当技術分野において公知の標準的なアッセイによって評価することもできる。
【００４６】
好ましくは、本発明の抗体は、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４について１ｎＭ以下の結合親和性を有する。好ましくは、本発明の抗体は、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／若しくはヒストン４、並びに／又は脱イミノ化されたヒトのヒストンＨ３について０．５ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、５０ｐＭ以下、１０ｐＭ以下、５ｐＭ以下、２ｐＭ以下、又は１ｐＭ以下の結合親和性を有する。
【００４７】
また、抗体又はその結合断片は、ネイティブ抗体の抗原結合ドメインを含む融合タンパク質であってもよく、ＤＮＡ又はＲＮＡの形態のアプタマー等のアプタマーであってもよい。
【００４８】
好ましくは、本発明の抗体又はその結合断片は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、互いに同一であり、かつ特定のエピトープについて単一の結合特異性及び親和性を有する免疫グロブリン分子である。本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体の方法を含む様々な技術、例えば、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”（Ｚｏｌａ  Ｈ，１９８７，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）及び“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”（Ｈｕｒｒｅｌｌ  ＪＧＲ，１９８２  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）に開示されているものによって生成することができる。
【００４９】
本発明の抗体又はその結合断片は、結合ドメインを含む。結合ドメインは、一般に、重鎖から３個及び軽鎖から３個の６個のＣＤＲ（ＶＨＨの場合は３個）を含む。一実施形態では、ＣＤＲはフレームワーク内にあり、一緒に可変領域又はドメインを形成する。従って、一実施形態では、抗体又は結合断片は、軽鎖可変領域又はドメイン及び重鎖可変領域又はドメインを含む、抗原に特異的な結合ドメインを含む。
【００５０】
抗体可変ドメインにおける残基は、従来、ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に従って付番される。このシステムは、Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰ（１９９７，Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１８，５０９）に記載されている。本明細書では、特に指定のある場合を除き、この付番システムを使用する。
【００５１】
ＩＭＧＴの残基指定は、必ずしもアミノ酸残基の直鎖付番に直接対応するものではない。実際の直鎖アミノ酸配列は、フレームワークであろうとＣＤＲであろうと、基本可変ドメイン構造の構造的構成要素の短縮又は該構造的構成要素への挿入に対応する厳密なＩＭＧＴ付番よりも少ないアミノ酸又は追加のアミノ酸を含有している場合がある。抗体の配列中の相同性の残基を「標準的な」ＩＭＧＴ付番配列とアラインメントすることによって、所与の抗体について残基の正しいＩＭＧＴ付番を決定することができる。
【００５２】
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、ＩＭＧＴ付番システムに従って、残基２７〜３８（ＶＨのＣＤＲ１）、残基５６〜６５（ＶＨのＣＤＲ２）、及び残基１０５〜１１７（ＶＨのＣＤＲ３）に位置する。
【００５３】
軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、ＩＭＧＴ付番システムに従って、残基２７〜３８（ＶＬのＣＤＲ１）、残基５６〜６５（ＶＬのＣＤＲ２）、及び残基１０５〜１１７（ＶＬのＣＤＲ３）に位置する。
【００５４】
本発明の抗体又はその結合断片は、そのＣＤＲ領域の一次アミノ酸配列によって本明細書に開示されている。本発明の抗体又はその結合断片は、その重鎖及び軽鎖の一次アミノ酸配列によって本明細書に開示されている。
【００５５】
本発明は、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片のＶＬの改変されたＣＤＲ１が、該抗体又はその結合断片に、ＶＬのＣＤＲ１の改変されていないバージョンを含む抗体又はその結合断片よりも改善された特性を提供するという知見に基づくものである。本発明を導き出すために使用される抗体のＶＬの改変されていないＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＱＳＬＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３６）又はＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３７）を含むか又はからなる。
【００５６】
本発明の抗体又はその結合断片のＶＬ鎖の改変されたＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＱＳＬ−Ｘ１−Ｄ−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−ＫＴＹ（式中、Ｘ１は、Ｖ又はＬであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＮであり、Ｘ３は、Ｇ又はＡである）を含むか又はからなるが、但し、該アミノ酸配列は、ＱＳＬＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３６）でもＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３７）でもない。本発明の抗体又はその結合断片のＶＬ鎖の改変されたＣＤＲ１は、配列番号３６又は３７の改変されていないＣＤＲ１と比較して、異性化の減少を示すが、改変されていないＣＤＲ１の結合特性は維持している。
【００５７】
本発明の特定の抗体又はその結合断片のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号１、２、及び３に示す。ＶＬのＣＤＲ２及び３を配列番号４及び５に示す。
【００５８】
本発明の特定の抗体又はその結合断片のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を配列番号１１及び１３に与える。ＶＨのＣＤＲを配列番号１、２、及び３に示す。ＶＬのＣＤＲを配列番号６、４、及び５に示す。
【００５９】
本発明の別の抗体又はその結合断片のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を配列番号１１及び１４に与える。ＶＨのＣＤＲを配列番号１、２、及び３に示す。ＶＬのＣＤＲを配列番号７、４、及び５に示す。
【００６０】
本発明の別の抗体又はその結合断片のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を配列番号１１及び１５に与える。ＶＨのＣＤＲを配列番号１、２、及び３に示す。ＶＬのＣＤＲを配列番号８、４、及び５に示す。
【００６１】
本発明の別の抗体又はその結合断片のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を配列番号１１及び１６に与える。ＶＨのＣＤＲを配列番号１、２、及び３に示す。ＶＬのＣＤＲを配列番号９、４、及び５に示す。
【００６２】
本発明の別の抗体又はその結合断片のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を配列番号１１及び１７に与える。ＶＨのＣＤＲを配列番号１、２、及び３に示す。ＶＬのＣＤＲを配列番号１０、４、及び５に示す。
【００６３】
本発明の別の抗体又はその結合断片のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を配列番号１２及び１３に与える。ＶＨのＣＤＲを配列番号１、２、及び３に示す。ＶＬのＣＤＲを配列番号６、４、及び５に示す。
【００６４】
本発明の別の抗体又はその結合断片のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を配列番号１２及び１４に与える。ＶＨのＣＤＲを配列番号１、２、及び３に示す。ＶＬのＣＤＲを配列番号７、４、及び５に示す。
【００６５】
本発明の別の抗体又はその結合断片のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を配列番号１２及び１５に与える。ＶＨのＣＤＲを配列番号１、２、及び３に示す。ＶＬ鎖のＣＤＲを配列番号８、４、及び５に示す。
【００６６】
本発明の別の抗体又はその結合断片のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を配列番号１２及び１６に与える。ＶＨのＣＤＲを配列番号１、２、及び３に示す。ＶＬのＣＤＲを配列番号９、４、及び５に示す。
【００６７】
本発明の別の抗体又はその結合断片のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を配列番号１２及び１７に与える。ＶＨのＣＤＲを配列番号１、２、及び３に示す。ＶＬのＣＤＲを配列番号１０、４、及び５に示す。
【００６８】
本発明の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列、配列番号１６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列、配列番号２３又は５６を含む重鎖定常領域アミノ酸配列、及び配列番号２４の軽鎖定常領域アミノ酸配列を含む。
【００６９】
本発明の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列、配列番号１６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列、配列番号２３又は５６の重鎖定常領域アミノ酸配列、及び配列番号２４の軽鎖定常領域アミノ酸配列を含む。
【００７０】
本発明の抗体又はその結合断片は、ＶＬのＣＤＲ１が、常に、アミノ酸配列ＱＳＬ−Ｘ１−Ｄ−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−ＫＴＹ（式中、Ｘ１は、Ｖ又はＬであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＮであり、Ｘ３は、Ｇ又はＡである）を含むか若しくはからなるものとして存在するが、但し、該アミノ酸配列は、ＱＳＬＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３６）でもＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３７）でもないか、又は配列番号６、７、８、９、若しくは１０を含むか又はからなるものとして存在することを除いて、上記の特定の抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲ配列のうちの１つ以上を含み得る。
【００７１】
本発明の抗体又はその結合断片は、ＶＬ  ＣＤＲ１に加えて、該特定の抗体の１つ以上のＶＨ  ＣＤＲ配列、そして、代替的に又は追加的に１つ以上のＶＬ  ＣＤＲ配列を含み得る。本発明の抗体又はその結合断片は、上記の特定の抗体又はその結合断片のＶＨ  ＣＤＲ配列のうちの１つ、２つ、又は３つ全て、そして、代替的に又は追加的にＶＬ  ＣＤＲ１を含む該特定の抗体又はその結合断片のＶＬ鎖ＣＤＲ配列のうちの１つ、２つ、又は３つ全てを含み得る。本発明の抗体又はその結合断片は、上記の特定の抗体又は結合断片の６つのＣＤＲ配列全てを含み得る。一例として、本発明の抗体は、配列番号６、７、８、９、又は１０のうちの１つと、配列番号１、２、３、４、及び５のうちの１つ以上とを含み得る。
【００７２】
本発明の実施形態では、本発明の抗体又はその結合断片のＶＬ鎖の改変されたＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＱＳＬ−Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−ＫＴＹ（式中、Ｚ１は、Ｖ又はＬであり、Ｚ２は、Ｄ又はＥであり、Ｚ３は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＮであり、Ｚ４は、Ｄ、Ｅ、Ｓ、又はＡであり、Ｚ５は、Ｇ又はＡである）を含むか又はからなるが、但し、該アミノ酸配列は、ＱＳＬＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３６）でもＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３７）でもない。本発明の抗体又はその結合断片のＶＬ鎖の改変されたＣＤＲ１は、配列番号３６又は３７の改変されていないＣＤＲ１と比較して、異性化の減少を示すが、改変されていないＣＤＲ１の結合特性は維持している。本発明の抗体又はその結合断片のＶＬ鎖の改変されたＣＤＲ１は、配列番号６、７、８、９、１０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、又は５２を含んでいてもよく、からなっていてもよい。本発明の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６、７、８、９、１０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、又は５２のうちの１つと、配列番号１、２、３、４、及び５のうちの１つ以上とを含み得る。本発明の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６、７、８、９、１０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１又は５２のうちの１つと、配列番号１、２、３、４及び５の全てとを含む。
【００７３】
本発明の抗体又はその結合断片は、これらの重鎖可変ドメインのうちの１つ又はＶＬのＣＤＲ２若しくは３のＣＤＲ配列のバリアントを代替的に含んでいてもよい。例えば、バリアントは、上記アミノ酸配列のいずれかの置換、欠失、又は付加バリアントであってよい。
【００７４】
バリアント抗体は、本明細書に記載の抗体の活性を維持しながら、上述の特定の配列及び断片から１個、２個、３個、４個、５個、１０個以下、２０個以下、３０個以下、又はそれ以上のアミノ酸の置換及び／又は欠失を含み得る。「欠失」バリアントは、例えば、１個、２個、３個、４個、若しくは５個の個々のアミノ酸、又は２個、３個、４個、若しくは５個のアミノ酸等の１つ以上のアミノ酸の小さな群の欠失を含んでいてよい。「アミノ酸の小さな群」とは、互いに連続しているか、又は近接しているが連続してはいないものとして定義することができる。「置換」バリアントは、好ましくは、１つ以上のアミノ酸を同じ数のアミノ酸で置換すること、及び保存的アミノ酸置換を行うことを含む。例えば、アミノ酸を、類似の性質を有する別のアミノ酸、例えば、別の塩基性アミノ酸、別の酸性アミノ酸、別の中性アミノ酸、別の荷電アミノ酸、別の親水性アミノ酸、別の疎水性アミノ酸、別の極性アミノ酸、別の芳香族アミノ酸、別の脂肪族アミノ酸、別の極めて小さなアミノ酸、別の小さなアミノ酸、又は別の大きなアミノ酸で置換してよい。好適な置換基を選択するために使用することができる２０種の主なアミノ酸の幾つかの性質は、以下の通りである：
【００７５】
【表２】
2021535211.tif 000004
【００７６】
好ましい「誘導体」又は「変異体」は、天然に存在するアミノ酸の代わりに、配列中に存在するアミノ酸がその構造類似体であるものを含む。また、配列において使用されるアミノ酸は、抗体の機能が著しく悪影響を受けることのない限り、誘導体化又は修飾、例えば標識されていてもよい。
【００７７】
上記の誘導体及びバリアントは、抗体の合成中に、又は生成後の修飾によって、又は抗体が組換え体の形態である場合、核酸の部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、又は酵素的切断及び／若しくはライゲーションの公知の技術を用いて調製することができる。
【００７８】
好ましくは、本発明に係るバリアント抗体は、本明細書に開示される抗体のＶＬ及び／若しくはＶＨ又はその断片に対して、６０％超、又は７０％超、例えば７５％又は８０％、より好ましくは８５％超、例えば９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、又は９９％超のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有する。このアミノ酸同一性のレベルは、関連する配列番号の配列の全長にわたって、又は配列の一部にわたって、例えば、完全長ポリペプチドのサイズに応じて２０、３０、５０、７５、１００、１５０、２００、又はそれ以上のアミノ酸にわたってみられ得る。
【００７９】
好ましくは、バリアント抗体は、本明細書に記載のＣＤＲ配列のうちの１つ以上を含む。
【００８０】
アミノ酸配列に関連して、「配列同一性」とは、以下のパラメータでＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２２，４６７３−４６８０）を用いて評価したときに指定の値を有する配列を指す：
ペアワイズアラインメントパラメーター法：緩徐／正確、マトリクス：ＰＡＭ、ギャップオープンペナルティ：１０．００、ギャップエクステンションペナルティ：０．１０；
マルチプルアライメントパラメータ−マトリクス：ＰＡＭ、ギャップオープンペナルティ：１０．００、遅延についての同一性％：３０、エンドギャップのペナルティ：オン、ギャップの分離距離：０、ネガティブマトリクス：なし、ギャップエクステンションペナルティ：０．２０、残基特異的ギャップペナルティ：オン、親水性ギャップペナルティ：オン、親水性残渣：Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｋ、Ｒ。特定の残基における配列同一性は、単に誘導体化されている同一の残基を含むことを意図する。
【００８１】
従って、本発明は、特定のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列並びにそのバリアント及び断片を有する抗体であって、これらＶＨ及びＶＬの機能又は活性を維持している抗体を提供する。
【００８２】
従って、本発明は、ヒトの脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する能力を保持しているＶＨのバリアントを含む抗体又はその結合断片を包含する。重鎖のバリアントは、改変されていないＶＨと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し得る。ＶＨのバリアントは、ｈＶＨ２２．１０１ｆ若しくはｈＶＨ２２．１０１ＨＣ９（それぞれ配列番号１１及び１２）の少なくとも７アミノ酸の断片であって、抗体若しくはその結合断片が脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／若しくはヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープと特異的に反応する能力を保持している断片を含んでいてもよく；又は
ｈＶＨ２２．１０１ｆ若しくはｈＶＨ２２．１０１ＨＣ９（それぞれ配列番号１１及び１２）の配列と少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するｈＶＨ２２．１０１ｆ若しくはｈＶＨ２２．１０１ＨＣ９（それぞれ配列番号１１及び１２）のバリアントであって、抗体若しくはその結合断片が脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／若しくはヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープと特異的に反応する能力を保持しているバリアントを含んでいてもよい。
【００８３】
ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞
本発明はまた、本明細書に記載の抗体又はその結合断片をコードしているポリヌクレオチド、ベクター、及び発現ベクターを包含する。
【００８４】
本発明はまた、本発明の抗体をコードしているポリヌクレオチドに関する。従って、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意の抗体又は断片をコードしていてよい。用語「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書では互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド又はこれらの類似体のいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例は、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーを含む。本発明のポリヌクレオチドは、単離又は精製された形態で提供され得る。
【００８５】
選択されたポリヌクレオチドを「コードしている」核酸配列は、適切な調節配列の制御下におかれたとき、インビボでポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）及び翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドン及び３’（カルボキシ）末端における翻訳終止コドンによって決定される。本発明の目的のために、このような核酸配列は、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核生物又は真核生物のｍＲＮＡ、ウイルス又は原核生物のＤＮＡ又はＲＮＡ由来のゲノム配列、及び更には合成ＤＮＡ配列を含んでいてよいが、これらに限定されない。転写終結配列は、コード配列の３’側に位置していてよい。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、上記のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をコードしている配列を含む。ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されている特定の抗体又はその結合断片のＶＨ又はＶＬの配列をコードしていてよい。
【００８６】
従って、本発明の抗体又はその結合断片は、それをコードしておりかつそれを発現することができるポリヌクレオチドから生成されてもよく、又は該ポリヌクレオチドの形態で送達されてもよい。抗体が２本以上の鎖を含む場合、本発明のポリヌクレオチドは、１本以上の抗体鎖をコードしていてよい。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、抗体軽鎖、抗体重鎖、又は両方をコードしていてよい。一方が抗体軽鎖をコードし、他方が対応する抗体重鎖をコードしている、２つのポリヌクレオチドが提供されてもよい。このようなポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド対は、本発明の抗体が生成されるように一緒に発現し得る。
【００８７】
本発明のポリヌクレオチドは、一例としてＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載されている通り、当技術分野において周知の方法に従って合成することができる。
【００８８】
本発明の核酸分子は、挿入された配列に動作可能に連結され、それによって、インビボで本発明の抗体を発現することができる制御配列を含む、発現カセットの形態で提供され得る。次に、これら発現カセットは、典型的には、ベクター（例えば、プラスミド又は組み換えウイルスベクター）内に提供される。このような発現カセットを宿主被験体に直接投与してもよい。あるいは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを宿主被験体に投与してもよい。好ましくは、遺伝子ベクターを使用してポリヌクレオチドを調製及び／又は投与する。好適なベクターは、十分な量の遺伝情報を保有し、本発明のポリペプチドを発現することができる任意のベクターであってよい。
【００８９】
従って、本発明は、このようなポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。このような発現ベクターは、分子生物学の技術分野においてルーチン的に構築され、例えば、本発明のペプチドを発現させるために、プラスミドＤＮＡ、並びに適切なイニシエータ、プロモータ、エンハンサ、及び他のエレメント、例えば、必要になる場合がありかつ正確な配向で配置されたポリアデニル化シグナルの使用を伴っていてよい。他の好適なベクターは、当業者には明らかであろう。これに関する更なる例として、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を参照する。
【００９０】
当業者であれば、本明細書に記載の配列を使用して、例えば以下の実施例に記載されるｃＤＮＡ又はゲノム配列をクローニング又は生成することができる。ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のような適切な真核生物発現ベクター又はその誘導体にこれら配列をクローニングし、その後、適切な軽鎖及び重鎖含有ベクターの組み合わせで（ＣＨＯ細胞のような）哺乳類細胞をトランスフェクションした結果、本明細書に記載の抗体が発現及び分泌される。
【００９１】
当業者はまた、抗体配列の特異的結合ドメインを使用することによって本明細書に記載の抗体又はその結合断片の類似体を作製し、融合タンパク質等のポリペプチド等の異なる状況で発現させることができる。これは、当技術分野において周知である。
【００９２】
また、本発明は、本発明の抗体を発現するように改変された細胞を含む。このような細胞としては、哺乳類細胞若しくは昆虫細胞等の一過性又は好ましくは安定性の高等真核細胞株、酵母等の低級真核細胞、又は細菌細胞等の原核細胞が挙げられる。本発明の抗体をコードしているベクター又は発現カセットの挿入により改変され得る細胞の具体例としては、哺乳類のＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＮＳ０、及びＣＯＳの細胞が挙げられる。好ましくは、選択される細胞株は、安定しているだけでなく、成熟グリコシル化を可能にするものである。
【００９３】
このような本発明の細胞株は、本発明の抗体若しくはその結合断片を生成するためにルーチンな方法を用いて培養してもよく、又は本発明の抗体若しくはその結合断片を被験体に送達するために治療的若しくは予防的に使用してもよい。あるいは、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、又はベクターを、エクスビボで被験体からの細胞に投与し、次いで、細胞を被験体の体内に戻してもよい。
【００９４】
また、本発明は、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片を生成するプロセスであって、本明細書に記載の宿主細胞を培養することと、該細胞から抗体又はその結合断片を単離することと、を含むプロセスを包含する。
【００９５】
医薬組成物
本発明は、本発明の抗体又はその結合断片を含む医薬組成物を包含する。本発明は、本発明の抗体又はその結合断片と、薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物を包含する。
【００９６】
本明細書で使用するとき、「薬学的に許容し得る担体」は、生理学的に適合する任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含む。好ましくは、担体は、非経口的、例えば、静脈内、眼内、筋肉内、皮下、皮内、又は腹腔内の投与（例えば、注射又は注入による）に好適である。特定の実施形態では、薬学的に許容し得る担体は、共溶媒溶液、リポソーム、ミセル、液晶、ナノ結晶、ナノ粒子、エマルジョン、微粒子、ミクロスフェア、ナノスフィア、ナノカプセル、ポリマー又はポリマー担体、界面活性剤、懸濁剤、シクロデキストリン等の錯化剤、又はアルブミン等の吸着分子、表面活性粒子、及びキレート剤からなる群から選択される少なくとも１つの担体を含む。更なる実施形態では、多糖類は、ヒアルロン酸及びその誘導体、デキストラン及びその誘導体、セルロース及びその誘導体（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、酢酸コハク酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）、キトサン及びその誘導体、［β］−グルカン、アラビノキシラン、カラギーナン、ペクチン、グリコーゲン、フコイダン、コンドロチン、デルマタン、ヘパラン、ヘパリン、ペントサン、ケラタン、アルギネート、シクロデキストリン、並びにこれらのエステル及び硫酸塩を含む塩及び誘導体を含む。
【００９７】
好ましい薬学的に許容し得る担体は、水性担体又は希釈剤を含む。本発明の医薬組成物において使用することができる好適な水性担体の例としては、水、緩衝水、及び生理食塩水が挙げられる。他の担体の例としては、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、及びこれらの好適な混合物、オリーブオイル等の植物油、並びにオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルが挙げられる。例えば、レシチン等のコーティング材料を使用することによって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。
【００９８】
本発明の医薬組成物はまた、薬学的に許容し得る酸化防止剤を含んでいてもよい。これら組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤等のアジュバントを含有していてもよい。上記の滅菌手順によっても、様々な抗菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等を含めることによっても、微生物の存在を確実に予防することができる。また、糖類、塩化ナトリウム等の等張化剤を組成物に含めることが望ましい場合もある。更に、注射可能な医薬形態の持続性吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収を遅延させる剤を含めることによって実現することができる。
【００９９】
治療組成物は、典型的には、無菌でなければならず、製造及び保管の条件下で安定でなければならない。医薬組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に好適な他の秩序構造として製剤化することができる。
【０１００】
滅菌注射液は、必要に応じて上に列挙した成分のうちの１つ又は組み合わせと共に、適切な溶媒中に必要量の活性剤（例えば、抗体）を配合し、続いて、滅菌精密濾過することによって調製され得る。一般的に、分散液は、塩基性分散媒と上に列挙したもののうちの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに活性剤を配合することによって調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）であり、これにより、活性剤の粉末に加えて、その既に滅菌濾過された溶液から任意の更なる所望の成分が得られる。
【０１０１】
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体に加えて追加の活性成分を含んでいてもよい。上述したように、本発明の組成物は、本発明の１つ以上の抗体を含んでいてもよい。また、該組成物は、追加の治療又は予防用の活性剤を含んでいてもよい。
【０１０２】
投与経路に応じて、抗体を不活化又は変性させる可能性のある酸及び他の自然条件の作用から該抗体を保護するための材料で、抗体又はその結合断片をコーティングしてもよい。
【０１０３】
好ましい実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、水溶液、ゲル、ヒドロゲル、フィルム、ペースト、クリーム、スプレー、軟膏、又はラップからなる群から選択される形態である。
【０１０４】
更なる実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、静脈内、皮下、眼内、筋肉内、関節内、皮内、腹膜内、脊髄等の経路によって、又は他の非経口的な投与経路、例えば注射若しくは注入によって投与することができる。投与は、直腸、経口、眼、外用、表皮、又は粘膜の経路で行うことができる。投与は、腫瘍周囲、腫瘍近傍、腫瘍内、腫瘍の切除縁へ、病巣内、病巣周囲、腔内注入による、小胞内投与、又は吸入によるものを含む局所的なものであってもよい。好ましい実施形態では、医薬組成物は、静脈内又は皮下に投与される。
【０１０５】
また、本発明の抗体又は他の組成物と使用説明書とを含むキットも本発明の範囲内である。キットは、本明細書で論じる通りの追加の治療剤又は予防剤等の１つ以上の追加の試薬を更に含有していてもよい。
【０１０６】
本発明の抗体及びその結合断片の治療的使用
本発明に係る抗体又はその結合断片は、治療法において使用することができる。治療用途では、既に障害又は状態に罹患している被験体に、状態又はその症状のうちの１つ以上を治癒、緩和、又は部分的に停止させるのに十分な量の抗体又は組成物を投与する。このような治療的処置の結果、疾患の症状の重症度が低下し得る又は無症状期間の頻度若しくは期間が増加し得る。これを達成するのに適切な量を「治療上有効な量」と定義する。所与の目的のための有効な量は、疾患又は傷害の重症度、並びに被験体の体重及び全身状態に依存する。本明細書で使用するとき、用語「被験体」は、任意のヒトを含む。
【０１０７】
特定の実施形態では、本発明の抗体又はその結合断片は、別の部分に（直接的又は間接的に）連結されていてもよい。他の部分は、薬物等の治療剤であってよい。他の部分は、検出可能な標識であってもよい。他の部分は、治療標的に特異的な抗体又はポリペプチドの結合ドメイン等の結合部分であってもよい。本発明の抗体又はその結合断片は、二重特異性抗体であってもよい。
【０１０８】
治療剤又は検出可能な標識は、例えば化学的コンジュゲーションによって、本発明の抗体又はその結合断片に直接結合し得る。抗体に剤又は標識をコンジュゲーションさせる方法は、当技術分野において公知である。例えば、カルボジイミドコンジュゲーション（Ｂａｕｍｉｎｇｅｒ  Ｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｃｈｅｋ  Ｍ，１９８０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，１５１−１５９）は、ドキソルビシンを含む様々な剤を抗体又はペプチドにコンジュゲーションするために使用することができる。水溶性カルボジイミドである１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）は、機能性部分を結合部分にコンジュゲーションさせるのに特に有用である。
【０１０９】
部分を抗体にコンジュゲーションさせるために他の方法を使用することもできる。例えば、グルタルアルデヒドの架橋と同様に、適切な反応物質の過ヨウ素酸ナトリウム酸化に続く還元的アルキル化を使用してもよい。しかしながら、本発明のコンジュゲートを生成するどの方法を選択するかにかかわらず、抗体がそのターゲティング能力を維持し、機能性部分がその関連機能を維持していると確認されなければならないことが認識される。
【０１１０】
抗体に連結された治療剤は、治療上有益なポリペプチド又はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいてよい。このようなポリペプチドの例としては、抗増殖性又は抗炎症性のサイトカインが挙げられる。
【０１１１】
抗体は、検出可能な標識に連結されてもよい。「検出可能な標識」とは、抗体を患者に投与した後に標的部分に位置しているときに、典型的には体外及び標的が位置している部位から非侵襲的に検出することができる部分に抗体が連結されていることを意味する。従って、抗体は、イメージング及び診断において有用であり得る。
【０１１２】
典型的には、標識は、イメージングにおいて有用な放射性原子であるか、又はそれを含む。好適な放射性原子としては、シンチグラフィー研究のための９９ｍＴｃ及び１２３Ｉが挙げられる。他の標識としては、例えば、ここでも１２３Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１９Ｆ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、ガドリニウム、マンガン、又は鉄等の磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）用のスピン標識が挙げられる。明らかに、分子を容易に検出できるようにするためには、十分な量の適切な原子同位体が抗体に連結されていなければならない。
【０１１３】
放射標識又は他の標識は、公知の方法で組み込まれ得る。例えば、抗体又はその断片は、生合成されてもよく、又は例えばフッ素１９を含む好適なアミノ酸前駆体を水素の代わりに用いて、化学的アミノ酸合成によって合成されてもよい。９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈ、及び１１１Ｉｎ等の標識は、例えば、ポリペプチドにおけるシステイン残基を介して結合することができる。イットリウム−９０は、リジン残基を介して結合することができる。好ましくは、検出可能な標識は、テクネチウム−９９ｍ又はヨウ素−１２３等の放射性原子を含む。あるいは、検出可能な標識は、ヨウ素−１２３；ヨウ素−１３１；インジウム−１１１；フッ素−１９；炭素−１３；窒素−１５；酸素−１７；ガドリニウム；マンガン；鉄を含む群から選択され得る。
【０１１４】
一実施形態では、本発明の抗体は、直接又は間接的に、細胞傷害性部分又は検出可能な標識に選択的に結合することができる。従って、この実施形態では、抗体は、細胞傷害性又は容易に検出可能な更なる化合物又は成分に選択的に結合する部分に連結される。
【０１１５】
本発明の抗体若しくは結合断片、又は該抗体若しくは断片を含む組成物は、当該技術分野において公知の様々な方法のうちの１つ以上の方法を用いて、１つ以上の投与経路を介して投与してよい。当業者には理解される通り、投与経路及び／又は投与モードは、所望の結果に応じて変化する。本発明の抗体又は組成物の好ましい投与経路としては、静脈内、皮下、眼内、筋肉内、皮内、腹腔内、脊髄、又は他の非経口的な投与経路、例えば、注射又は注入が挙げられる。「非経口投与」という表現は、本明細書で使用するとき、経腸投与及び外用投与以外の投与モードを意味し、通常は注射による。投与は、直腸、経口、眼、外用、表皮、又は粘膜の経路で行うことができる。投与は、腫瘍周囲、腫瘍近傍、腫瘍内、腫瘍の切除縁へ、病巣内、病巣周囲、腔内注入による、小胞内投与、又は吸入によるものを含む局所的なものであってもよい。好ましい実施形態では、医薬組成物は、静脈内又は皮下に投与される。
【０１１６】
本発明の抗体又はその結合断片の好適な投与量は、熟練の医師によって決定され得る。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与レベルは、患者にとって毒性であることなく、特定の患者、組成物、及び投与モードについて所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量が得られるように変化させてよい。選択される投与量レベルは、使用される特定の抗体の活性、投与経路、投与時間、抗体の排泄速度、治療期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康、及び前病歴、並びに医学分野で周知である同様の要因を含む様々な薬物動態学的要因に依存する。
【０１１７】
本発明の抗体又はその結合断片の好適な用量は、例えば、約０．１μｇ／ｋｇ（治療される患者の体重）〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例えば、好適な投与量は、１週間あたり約１μｇ／ｋｇ（体重）〜約５０ｍｇ／ｋｇ、１週間あたり約１００μｇ／ｋｇ（体重）〜約２５ｍｇ／ｋｇ、又は１週間あたり約１０μｇ／ｋｇ（体重）〜約１２．５ｍｇ／ｋｇであってよい。
【０１１８】
好適な投与量は、１日あたり約１μｇ／ｋｇ（体重）〜約５０ｍｇ／ｋｇ、１日あたり約１００μｇ／ｋｇ（体重）〜約２５ｍｇ／ｋｇ、又は１日あたり約１０μｇ／ｋｇ（体重）〜約１２．５ｍｇ／ｋｇであってよい。
【０１１９】
投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整してよい。例えば、単回急速投与してもよく、経時的に何回か分割用量を投与してもよく、治療状況の緊急性によって適応があれば用量を比例的に減少させたり、増加させたりしてもよい。投与を容易にし、投与量を均一にするために、非経口組成物を単位剤形に製剤化することが特に有利である。単位剤形とは、本明細書で使用するとき、治療される被験体のための単一の投薬量として適している物理的に別々の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と共同して所望の治療効果を生じさせるように計算された所定の量の活性化合物を含有する。
【０１２０】
抗体は、単回投与又は複数回投与で投与してよい。複数回投与では、同一又は異なる経路を介して、同一又は異なる位置に投与してよい。あるいは、抗体を徐放性製剤として投与してもよく、この場合には、必要な投与頻度がより少なくなる。投与量及び頻度は、患者における抗体の半減期及び所望の治療期間に応じて変化し得る。また、投与量及び投与頻度は、処置が予防的なものであるか治療的なものであるかによっても変化し得る。予防的用途では、比較的低投与量を長期間にわたって比較的広い間隔で投与してよい。治療的用途では、比較的高投与量を、例えば、患者が疾患の症状の部分的又は完全な寛解を示すまで投与してよい。
【０１２１】
２つ以上の剤の併用投与は、多数の異なる方法で達成され得る。一実施形態では、抗体又はその結合断片と他の剤とを、単一の組成物で一緒に投与してよい。別の実施形態では、抗体と他の剤とを、併用療法の一部として別々の組成物で投与してもよい。例えば、抗体又はその結合断片を、他の剤の前に、後に、又は同時に投与してよい。
【０１２２】
治療される疾患
本発明の抗体若しくはその結合断片、又は本明細書に定義される医薬組成物は、ＮＥＴ関連病態及び炎症状態等のシトルリン化に関連する病態の治療又は予防における使用に特に適している。
【０１２３】
本発明はまた、任意で、ＮＥＴ関連病態及び炎症状態等のシトルリン化に関連する病態を治療又は予防するために、本明細書に定義される抗体若しくはその結合断片又は本明細書に定義される医薬組成物の治療上有効な量を患者に投与することを含む、患者を治療する方法を包含する。
【０１２４】
本発明はまた、ＮＥＴ関連病態及び炎症状態等のシトルリン化に関連する病態を予防又は治療するための医薬の製造において使用するための、本明細書に定義される抗体若しくはその結合断片又は本明細書に定義される医薬組成物を包含する。
【０１２５】
本発明はまた、ＮＥＴ関連病態及び炎症状態等のシトルリン化に関連する病態を治療又は予防するための、本発明の抗体又はその結合断片を含む医薬組成物を包含する。
【０１２６】
シトルリン化に関連する病態とは、シトルリン化が疾患又は状態の病理学的状態に関連している任意の疾患又は状態であると定義することができる。シトルリン化が疾患の病態形成において役割を果たすかどうかは、当技術分野で利用可能なルーチンな試験を用いて、当業者であれば容易に決定することができる。例えば、これら疾患は、患部組織又は疾患に関連する組織に異常なレベルのシトルリン化タンパク質が存在することを特徴とし得る。このようなことは、患部組織を抗原として使用し、本明細書に記載の抗シトルリン抗体を利用して該抗原のシトルリン化を検出することができる、ウエスタンブロット又はＥＬＩＳＡ等の免疫学的試験によって達成することができる。あるいは、当業者は、質量分析等のプロテオミクスアプリケーションを使用して、罹患した患者からの健常組織に対して罹患組織のシトルリン化のレベル及びタイプを比較することもできる。
【０１２７】
ＮＥＴ関連病態は、シトルリン化に関連する病態とみなすことができる。ＮＥＴ関連病態は、ＮＥＴ形成及びＮＥＴｏｓｉｓが疾患又は状態の病理学的状態と関連している疾患又は状態と定義することができる。ＮＥＴ形成及びＮＥＴｏｓｉｓが疾患の病態形成において役割を果たすかどうかは、当技術分野で利用可能なルーチンな試験を用いて、当業者であれば容易に決定することができる。例えば、これら疾患は、関連する組織にＮＥＴが存在することを特徴とし得る。
【０１２８】
従って、本発明は、ＮＥＴ関連病態の治療又は予防において使用するための抗体又はその結合断片に関する。
【０１２９】
従って、本発明は、治療上有効な量の本発明の抗体又はその結合断片で、それを必要としている患者を治療する方法であって、該患者がＮＥＴ関連病態に罹患している方法に関する。
【０１３０】
ＮＥＴ関連病態の例としては、炎症状態又は炎症性疾患、眼の炎症性疾患、自己免疫疾患、がん、及び移植後の臓器の健康等が挙げられる。
【０１３１】
「炎症状態」又は「炎症性疾患」とは、血管の変化を特徴とする多数の状態又は疾患のいずれか：浮腫及び好中球の浸潤（例えば、急性炎症反応）；単核細胞による組織の浸潤；炎症細胞、結合組織細胞、及びこれらの細胞生産物による組織破壊；並びに結合組織の置換による修復の試み（例えば、慢性炎症反応）を指す。このような疾患は、例えば、関節リウマチ及び変形性関節炎を含む炎症性関節炎、ＳＬＥ、ループス、敗血症、血管炎、多発性硬化症、乾癬性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、若年性特発性関節炎、脊椎関節症、多系統萎縮症、パーキンソン病、レビー小体型認知症、特発性肺線維症、ドライアイ疾患、ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、並びにＣＯＰＤ及び気管支炎等の肺疾患である。非肉芽腫性ブドウ膜炎は、好中球優位の炎症と関連している場合があり、肉芽腫性ブドウ膜炎は、マクロファージ優位の炎症と関連している場合がある。
【０１３２】
ＮＥＴは、ＲＡ、ＳＬＥ、及び血管炎を含む自己免疫疾患の病態において役割を果たしている。治療用抗体又はその結合断片が疾患を改善する経路は、ＮＥＴｏｓｉｓの阻害、毒性ヒストンを含むＮＥＴレムナント並びに組織及び循環からの他の自己抗原のクリアランス、ＮＥＴレムナント並びに組織及び循環からの毒性ヒストンのクリアランスを介している可能性が高い。幾つかの自己免疫疾患の多くについて、ＰＡＤノックアウトモデル又はＰＡＤ阻害剤で処理された野生型動物では病態が好転することが示されており、これは、ＮＥＴの量及び疾患の重症度と強い相関があることを意味する。
【０１３３】
このように、本発明の抗体及びその結合断片により、炎症状態又は炎症性疾患及び自己免疫疾患を治療することができる。
【０１３４】
好ましい実施形態では、治療される疾患は、ＮＥＴ関連病態、例えば、ＳＬＥ、ループス、敗血症、血管炎、炎症性関節炎、関節リウマチ及び変形性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、若年性特発性関節炎、シェーグレン病、抗リン脂質症候群、ベーチェット病、脊椎炎、脊椎関節症、多系統萎縮症、パーキンソン病、レビー小体型認知症、喘息、アレルギー性ライノウイルス増悪性喘息、アレルギー性喘息、嚢胞性線維症、線維症及び特発性肺線維症、ドライアイ疾患、ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、ＣＯＰＤ、気管支炎、又は他のＮＥＴ関連病態、例えば、糖尿病における創傷治癒、がん、がん転移、及びインビボ又はエクスビボにおける移植臓器の健康である。
【０１３５】
好ましい実施形態では、治療される疾患は、炎症状態、例えば、ＳＬＥ、ループス、敗血症、血管炎、炎症性関節炎、関節リウマチ及び変形性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、若年性特発性関節炎、シェーグレン病、抗リン脂質症候群、ベーチェット病、脊椎炎、脊椎関節症、多系統萎縮症、パーキンソン病、レビー小体型認知症、喘息、アレルギー性ライノウイルス増悪性喘息、アレルギー性喘息、嚢胞性線維症、線維症、特発性肺線維症、ドライアイ疾患、ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、ＣＯＰＤ、気管支炎である。
【０１３６】
更なる実施形態
本発明は、以下の実施形態によって更に記載される：
１．  脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片であって、
ａ）アミノ酸配列ＱＳＬ−Ｘ１−Ｄ−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−ＫＴＹ（式中、Ｘ１は、Ｖ又はＬであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＮであり、Ｘ３は、Ｇ又はＡである）を含むか又はからなるが、但し、該アミノ酸配列が、ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３６）でもＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３７）でもない、ＶＬのＣＤＲ１と；
ｂ）配列番号１〜５から選択される少なくとも１つのＣＤＲと
を含む、抗体又はその結合断片。
【０１３７】
２．
ａ）アミノ酸配列ＱＳＬ−Ｘ１−Ｄ−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−ＫＴＹ（式中、Ｘ１は、Ｖ又はＬであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＮであり、Ｘ３は、Ｇ又はＡである）を含むか又はからなるが、但し、該アミノ酸配列が、ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３６）でもＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３７）でもない、ＶＬのＣＤＲ１と；
ｂ）配列番号３及び配列番号５のＣＤＲと
を含む、１に記載の抗体又はその結合断片。
【０１３８】
３．
ａ）配列番号６、７、８、９、及び１０のＣＤＲのうちの１つと；
ｂ）配列番号３及び配列番号５のＣＤＲと
を含む、２に記載の抗体又はその結合断片。
【０１３９】
４．
ａ）アミノ酸配列ＱＳＬ−Ｘ１−Ｄ−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−ＫＴＹ（式中、Ｘ１は、Ｖ又はＬであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＮであり、Ｘ３は、Ｇ又はＡである）を含むか又はからなるが、但し、該アミノ酸配列が、ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３６）でもＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３７）でもない、ＶＬのＣＤＲ１と；
ｂ）配列番号１〜５のＣＤＲと
を含む、２に記載の抗体又はその結合断片。
【０１４０】
５．
ａ）配列番号６、７、８、９、及び１０のＣＤＲのうちの１つ；
ｂ）配列番号１〜５のＣＤＲ
を含む、１〜４のいずれかに記載の抗体又はその結合断片。
【０１４１】
６．
ａ）アミノ酸配列ＱＳＬ−Ｘ１−Ｄ−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−ＫＴＹ（式中、Ｘ１は、Ｖ又はＬであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＮであり、Ｘ３は、Ｇ又はＡである）を含むか又はからなるが、但し、該アミノ酸配列が、ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３６）でもＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３７）でもない、ＶＬのＣＤＲ１と；
ｂ）配列番号４及び５のＣＤＲのうちの少なくとも１つと；
ｃ）
ｉ）配列番号１１若しくは１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列；又は
ｉｉ）（ｉ）の少なくとも７アミノ酸の断片であって、該抗体若しくはその結合断片が、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／若しくはヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープと特異的に反応する能力を保持している断片；又は
ｉｉｉ）（ｉ）の配列と少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する（ｉ）のバリアントであって、該抗体又はその結合断片が、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／若しくはヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープと特異的に反応する能力を保持しているバリアントと
を含む、１又は２に記載の抗体又はその結合断片。
【０１４２】
７．
ａ）アミノ酸配列ＱＳＬ−Ｘ１−Ｄ−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−ＫＴＹ（式中、Ｘ１は、Ｖ又はＬであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＮであり、Ｘ３は、Ｇ又はＡである）を含むか又はからなるが、但し、該アミノ酸配列が、ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３６）でもＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３７）でもない、ＶＬのＣＤＲ１と；
ｂ）配列番号４及び５のＣＤＲのうちの少なくとも１つと；
ｃ）配列番号１１又は１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列と
を含む、６に記載の抗体又はその結合断片。
【０１４３】
８．
ａ）アミノ酸配列ＱＳＬ−Ｘ１−Ｄ−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−ＫＴＹ（式中、Ｘ１は、Ｖ又はＬであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＮであり、Ｘ３は、Ｇ又はＡである）を含むか又はからなるが、但し、該アミノ酸配列が、ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３６）でもＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ（配列番号３７）でもない、ＶＬのＣＤＲ１と；
ｂ）配列番号４及び５のＣＤＲと；
ｃ）配列番号１１又は１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列と
を含む、７に記載の抗体又はその結合断片。
【０１４４】
９．
ａ）配列番号６、７、８、９、及び１０のＣＤＲのうちの１つと；
ｂ）配列番号４及び５のＣＤＲと；
ｃ）配列番号１１又は１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列と
を含む、８に記載の抗体又はその結合断片。
【０１４５】
１０．
ａ）配列番号１１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１３の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１４の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１５の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｅ）配列番号１１の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１７の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｆ）配列番号１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１３の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｇ）配列番号１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１４の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｈ）配列番号１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１５の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；
ｉ）配列番号１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；又は
ｊ）配列番号１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号１７の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列
を含む、１〜９のいずれか１つに記載の抗体又はその結合断片。
【０１４６】
１１．  脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片であって、
ａ）配列番号１３、１４、１５、１６、又は１７のＣＤＲ１；及び
ｂ）配列番号１１又は１２の重鎖可変ドメインアミノ酸配列
のＣＤＲを含む、抗体又はその結合断片。
【０１４７】
１２．  配列番号１８、１９、２０、２１、及び２２からなる群から選択されるペプチドに特異的に結合し、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４に結合する、１〜１１のいずれか１つに記載の抗体又はその結合断片。
【０１４８】
１３．  少なくとも１ｎＭ以下の親和性で、脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する、１〜１２のいずれか１つに記載の抗体又はその結合断片。
【０１４９】
１４．  組換え抗体、一本鎖抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変断片（Ｆｖ）、断片抗原結合領域（Ｆａｂ）、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨＨ抗体、ナノボディ、ラクダ由来のシングルドメイン抗体、サメＩｇＮＡＲ由来のシングルドメイン抗体断片（ＶＮＡＲ）、ダイアボディ、トリアボディ、アンチカリン、及びアプタマーからなる群から選択される、１〜１３のいずれか１つに記載の抗体又はその結合断片。
【０１５０】
１５．  該抗体が、好ましくは完全長抗体である、１〜１３のいずれか１つに記載の抗体又はその結合断片。
【０１５１】
１６．  ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４領域等のＦｃ領域を含む、１５に記載の抗体又はその結合断片。
【０１５２】
１７．  重鎖定常領域が配列番号２３を含む及び／又は軽鎖定常領域が配列番号２４を含む、１６に記載の抗体又はその結合断片。
【０１５３】
１８．  追加の部分にコンジュゲートしている、１〜１７のいずれか１つに記載の抗体又はその結合断片。
【０１５４】
１９．  １〜１７のいずれか１つに記載の抗体又はその結合断片をコードしているポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むクローニング若しくは発現ベクター、又は該クローニング若しくは発現ベクターを含む宿主細胞。
【０１５５】
２０．  脱イミノ化されたヒトのヒストン２Ａ及び／又はヒストン４におけるシトルリン化されたエピトープに特異的に結合する抗体又はその結合断片を生成するプロセスであって、１９に記載の宿主細胞を培養することと、該細胞から抗体又はその結合断片を単離することと、を含むプロセス。
【０１５６】
２１．  １〜１８のいずれか１つに記載の抗体又はその結合断片と、少なくとも１つの薬学的に許容し得る希釈剤又は担体と、を含む医薬組成物。
【０１５７】
２２．  他の有効成分を更に含む、２１に記載の医薬組成物。
【０１５８】
２３．  治療において使用するための、１〜１８のいずれか１つに記載の抗体若しくはその結合断片、又は２１若しくは２２に記載の医薬組成物。
【０１５９】
２４．  ＮＥＴ関連病態を治療又は予防する方法において使用するための、１〜１８のいずれか１つに記載の抗体若しくはその結合断片、又は２１若しくは２２に記載の医薬組成物。
【０１６０】
２５．  該ＮＥＴ関連病態が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス、敗血症、血管炎、炎症性関節炎、関節リウマチ及び変形性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、若年性特発性関節炎、シェーグレン病、抗リン脂質症候群、ベーチェット病、脊椎炎、脊椎関節症、多系統萎縮症、パーキンソン病、レビー小体型認知症、喘息、アレルギー性ライノウイルス増悪性喘息、アレルギー性喘息、嚢胞性線維症、線維症及び特発性肺線維症、ドライアイ疾患、ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、ＣＯＰＤ、気管支炎、又は他のＮＥＴ関連病態、例えば、糖尿病における創傷治癒、がん、がん転移、及びインビボ又はエクスビボにおける移植臓器の健康である、２４に従って使用するための抗体、その結合断片、又は医薬組成物。
【０１６１】
２６．  非経口的な投与経路、例えば、静脈内、皮下、眼内、筋肉内、皮内、腹腔内、脊髄の経路によって、又は注射若しくは注入によって；あるいは、他の経路、例えば、直腸、経口、眼、外用、表皮、粘膜、局所、腫瘍周囲、腫瘍近傍、腫瘍内、腫瘍の切除縁へ、病巣内、病巣周囲、腔内注入によって、小胞内の投与、又は吸入によって投与される、２３〜２５のいずれか１つに従って使用するための抗体、その結合断片、又は医薬組成物。
【０１６２】
２７．  患者を治療する方法であって、１〜１８のいずれか１つに記載の抗体若しくはその結合断片、又は２１若しくは２２に記載の医薬組成物の治療上有効な量を該患者に投与することを含む方法。
【０１６３】
２８．  該治療が、ＮＥＴ関連病態の治療である、２７に記載の方法。
【０１６４】
本発明は、以下の実施例によって更に例示されるが、これらは、更なる限定であると解釈されるべきではない。本出願全体を通して引用される全ての図及び全ての参照文献、特許及び公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【実施例】
【０１６５】
実施例１：ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅ及びｈＭＱ２２．１０１ｆ／ｇの加速安定性試験。
２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅ（１２．５ｍｇ／ｍＬ）又はｈＭＱ２２．１０１ｆ／ｇ（３．３１ｍｇ／ｍＬ）を含有する０．７５ｍＬのアリコート（ガラス管）を、３７℃でそれぞれ８週間保存した。毎週、無菌条件下で各ガラス管から幾つかの１０μＬ及び２０μＬのサンプルを取り出し、更に分析（ＥＬＩＳＡ及び質量分析）を行うまで−８０℃で保存した。
【０１６６】
０週目、２週目、４週目、６週目、及び８週目のｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅサンプル並びに０週目、３週目、及び６週目のｈＭＱ２２．１０１ｆ／ｇサンプルを、インハウスで検証したＣＭＣ  ＥＬＩＳＡに供した。４℃で一晩インキュベーションすることによって、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをニュートラアビジン（０．１μｇ／ウェル）でコーティングした。ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）で５回洗浄し、室温（ＲＴ）でＰＢＳ−Ｔ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共に２時間インキュベーションすることによってブロックした。ＰＢＳ−Ｔで更に５回洗浄した後、ウェルを、ＰＢＳ−Ｔ＋０．２％ＢＳＡ中の３位のシトルリン（Ｘ）およびＣ末端ビオチン（４０ｎｇ／ウェル）を含有するヒストン由来のペプチド（配列番号１８：ＳＧＸＧＫＱＧＧＫＡＲＡ）と共にＲＴで１時間インキュベーションした。ＰＢＳ−Ｔで更に５回洗浄した後、１３５０ｎｇ／ウェルから開始し、ＰＢＳ−Ｔ＋０．２％ＢＳＡ中０．６６ｎｇ／ｍＬの濃度に達するまで１：１の比率で更に希釈してウェルに添加し、ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅ又はｈＭＱ２２．１０１ｆ／ｇの基準ロットから較正曲線を作成した。高濃度（ＨＱＣ、２５０ｎｇ／ｍＬ）、中濃度（ＭＱＣ、５０ｎｇ／ｍＬ）、低濃度（ＬＱＣ、３．７５ｎｇ／ｍＬ）及び下限濃度の品質管理（ＬＬＱＣ、１．２５ｎｇ／ｍＬ）における同じ基準ロットのｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅ又はｈＭＱ２２．１０１ｆ／ｇから作製されたスパイク品質管理（ＱＣ）サンプルを、ＰＢＳ−Ｔ＋０．２％ＢＳＡで希釈し、同様にプレートに添加した。これらＱＣサンプルをＥＬＩＳＡの結果を検証するために使用した。
【０１６７】
最後に、３７℃で０週間、２週間、３週間、４週間、６週間、及び８週間インキュベーションした加速安定性サンプルを、ＰＢＳ−Ｔ＋０．２％ＢＳＡ中４０ｎｇ／ｍＬの濃度で同じプレートに添加し、ＲＴで２時間インキュベーションした。ウェルをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ウサギ抗ヒトＨＲＰ抗体（ＰＢＳ−Ｔ＋０．２％ＢＳＡ中１：１２．０００）と共にＲＴで１時間インキュベーションし、続いて、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄した。ウェルをＴＭＢ基質と共に１０分間インキュベーションした後、２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、その後、波長４５０ｎｍで光学密度を測定した。シグモイド較正曲線をプロットし、連続希釈した基準抗体からの値を使用してフィッティングさせた。シグモイド近似曲線からの式を用いて、ＱＣサンプル及び加速安定性サンプルの濃度を再計算した。０週目の加速安定性サンプルの再計算された抗体濃度を１００％とし、他の全ての加速安定性再計算濃度（２週目、３週目、４週目、６週目、及び８週目）を０週目目（１００％）の百分率として計算し、棒グラフにプロットした（ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅについては図１の上パネル、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ｇについては図１の下パネル）。
【０１６８】
加速安定性試験は、ヒストン由来のシトルリン含有ペプチドに対するｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅ及びｈＭＱ２２．１０１ｆ／ｇの結合親和性が経時的に低下することを示した。
【０１６９】
実施例２：ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅ加速安定性サンプルの質量分析
ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅ抗体の結合親和性が経時的に低下する原因を調べた。ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅは、ＶＬ  ＣＤＲ領域（ＣＤＲ１及びＣＤＲ２）内又はその付近に、幾つかの潜在的なアスパラギン酸異性化部位を有する。この実施例の目的は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）−質量分析（ＭＳ）−ベースのペプチドマッピングにより、異性化に対するアスパラギン酸残基の感受性を決定することであった。
【０１７０】
消化前に、各加速安定性サンプル（０週目、４週目、及び８週目）５０μｇを、脱塩、ジチオスレイトールによる還元、及びヨードアセトアミドを用いたアルキル化に供した。還元及びアルキル化に続いて、１／５０（ｗ／ｗ）の酵素／タンパク質比でシーケンシンググレードの修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、サンプルを３７℃で１８時間消化した。消化物を、ＬＣ−ＭＳ分析まで−２０℃で保存した。トリプシンは、アルギニン又はリジンのＣ末端を特異的に切断するセリンプロテアーゼである。ＵＶ及び質量分析検出と組み合わせた逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）（ＲＰＬＣ−ＵＶ−ＭＳ）を使用して、トリプシン消化物の分析を行った。Ｊｅｔｓｔｒｅａｍエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を備えるＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ６５４０  Ｑ−ＴＯＦにハイフネートされたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １２９０  ＵＨＰＬＣシステムを使用してデータを取得した。ＵＶ２１４ｎｍ及びＭＳ（／ＭＳ）検出の前に、移動相成分として水、トリフルオロ酢酸、及びアセトニトリルを使用して、ＲＰＬＣカラム（ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍａｐ  Ｃ１８、２５０ｍｍ  Ｌ、２．１ｍｍ  ＩＤ、２．７μｍ  ｄｐ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でサンプルを分離した。約４．５μｇの量をカラムにロードした。拡張ダイナミックレンジモード（２ＧＨｚ）で、質量９２２．００９７９８に対して分解能２０，０００で、基準質量を使用することなく、高い質量精度（典型的には＜１０ｐｐｍ）で、ＭＳシステムを作動させた。１秒間あたり２つのスペクトルを取得し、取得範囲はＭＳ及びＭＳ／ＭＳモードで１００〜３０００ａｍｕであった。ＭＳ／ＭＳデータは、データ依存モードで取得した。衝突エネルギーをペプチド断片化に最適化した。全てのＭＳ測定は、正イオン化モードで行った。
【０１７１】
Ａｇｉｌｅｎｔ  ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェアに組み込まれたＢｉｏＣｏｎｆｉｒｍアルゴリズムを使用して、測定されたシグナルを配列にマッチングさせた。実験データを配列にマッチングさせるための質量許容差は２０ｐｐｍとした。指定された酵素は、トリプシン（リジン又はアルギニンでＣ末端切断）であり、０〜２回の切断ミスは許容した。修飾の定量には、質量精度２０ｐｐｍで得られた抽出イオンクロマトグラムのピーク面積を使用した。ほぼ完全な配列包括度に鑑みて、ｈＣＤＲ領域における全てのアスパラギン酸異性化候補部位がカバーされていた。これらペプチドを手動で統合した。存在する場合、イソアスパラギン酸を含有するペプチドは、アスパラギン酸を含有するペプチドの直前に溶出する。次いで、それぞれの場合において相対的な異性化レベルを計算した。
【０１７２】
ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅのＶＬ  ＣＤＲ１の相対的なアスパラギン酸（Ｄ）異性化レベルは、経時的に増加した（図２Ａ）。ＶＬのＣＤＲ１及びＣＤＲ２で試験した異性化部位を図２Ａに示す。ＶＬ  ＣＤＲ１の異性化が、抗体の結合親和性が経時的に失われる原因であると考えられた。
【０１７３】
実施例３：３種のＶＬ  ＣＤＲ１のアスパラギン酸が変異したｈＭＱ２２．１０１抗体の生成。
次に、ＶＬのＣＤＲ１における非生殖系列異性化部位の欠失が異性化を妨げるかどうかについて調べた。ＣＤＲ１のアミノ酸位置３１（Ｌ：Ａｓｐ３１）に単一のアスパラギン酸変異を含む３種のｈＶＬ２２．１０１ｙドメインのＤＮＡをそれぞれＧｅｎｅＡｒｔによって合成した。Ｌ：Ａｓｐ３１は、１）大きさ、２）極性、及び３）電荷等のアミノ酸の類似性に基づいて、アラニン、グルタミン、又はセリンに変異させた。これらアスパラギン酸が変異したＶＬドメインを、完全長ヒト軽鎖をコードしている哺乳類発現ベクターにクローニングした。その後、これら軽鎖コンストラクト（ｈＶＬ２２．１０１ｈ、ｈＶＬ２２．１０１ｉ、及びｈＶＬ２２．１０１ｊ）を、全て完全長ヒト重鎖コンストラクト（ｈＶＨ２２．１０１ｊ）と組み合わせて使用して、それぞれｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｈ、ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｉ、及びｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｊを生成させるためにＨＥＫ２９３細胞を一過的にトランスフェクションした。いずれもＡｋｔａ−ＦＰＬＣシステムにおいて、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅアフィニティーカラムを用いて培養上清からフルサイズ抗体を精製し、その後、脱塩カラムを用いることによって２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０にバッファ交換した。次に、イオン交換スピンカラムを用いて抗体を研磨（ｐｏｌｉｓｈ）して、宿主細胞タンパク質及び残留プロテインＡ由来樹脂を除去し、続いて、高容量エンドトキシン除去樹脂によるエンドトキシン除去工程を行った。最後に、ＭｉｃｒｏＳｅｐ  Ａｄｖａｎｃｅ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｄｅｖｉｃｅ（１０Ｋ  ＭＷＣＯ）で抗体を濃縮した。
【０１７４】
実施例４：ＶＬ  ＣＤＲ１のアスパラギン酸が変異したｈＭＱ２２．１０１抗体を用いた抗原結合アッセイ。
生成されたＶＬ  ＣＤＲ１のアスパラギン酸が変異した抗体ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｈ、ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｉ、及びｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｊを、実施例１に記載の通りインハウスで検証したＣＭＣ  ＥＬＩＳＡを用いて、アスパラギン酸含有抗体ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅと比較した。ここでは、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、及び１００ｎｇ／ｍＬにおける較正曲線、並びに１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、及び８０ｎｇ／ｍＬにおける別個のスパイクＱＣサンプルに、ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅ基準ロットを使用した。ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｈ、ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｉ、ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｊ、及びｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅを１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、及び１００ｎｇ／ｍＬで試験し、用量応答曲線をグラフにプロットした（図２Ｂ）。
【０１７５】
図２Ｂは、３種のＶＬ  ＣＤＲ１変異体（ｈＶＬ２２．１０１ｈのＣＤＲ１＝ＤＳ部位のＡＳへの変異、ｈＶＬ２２．１０１ｉのＣＤＲ１＝ＤＳ部位のＥＳへの変異、ｈＶＬ２２．１０１ｊのＣＤＲ１＝ＤＳ部位のＳＳへの変異）の光学密度の結果を示す。最も改善された光学密度の結果は、ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｉ抗体によって達成された。
【０１７６】
実施例５：ＶＬ  ＣＤＲ１のアスパラギン酸が変異したｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｉの加速安定性試験に続く質量分析。
２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｉ（１２．５ｍｇ／ｍＬ）を含有する０．７５ｍＬのアリコート（ガラス管）を、３７℃でそれぞれ４週間保存した。毎週、無菌条件下で各ガラス管から幾つかの１０μＬ及び２０μＬのサンプルを取り出し、更に分析（質量分析）を行うまで−８０℃で保存した。
【０１７７】
０週目及び４週目の加速安定性サンプルのみを使用したことを除いて、実施例２に記載の方法と同様に、質量分析を行った。ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｉの異性化の百分率を、異性化含有抗体ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅの百分率と比較した（図２Ｃ）。
【０１７８】
ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｉ抗体の質量分析データ（図２Ｃ）は、ＶＬのＣＤＲ１における異性化が依然として経時的に少し増加したことを示すが、ＶＬのＣＤＲ１における非生殖系列ＤＳ異性化部位を欠失させることで、異性化の問題はほとんど解決された。
【０１７９】
しかし、ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｉは、ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅに比べて標的（配列番号１８）に対する親和性が低いため、治療用抗体候補としては適していなかった。
【０１８０】
実施例６：他のｈＭＱ２２．１０１異性化変異体の生成。
次に、ＶＬのＣＤＲ１における異性化部位の網羅的変異解析を行って、標的に対する変異抗体の親和性を維持しながらＣＤＲ１の異性化を除去することが可能であるかどうかについて調べた。ｈＶＬ２２．１０１の１７種の変異ＣＤＲ１ドメインを作製した。これら１７種のＶＬ  ＣＤＲ１変異配列、並びにｈＶＬ２２．１０１ｅ及びｈＶＬ２２．１０１ｇの非変異ＣＤＲ１の配列を図３Ａに示す。
【０１８１】
ｈＶＬ２２．１０１の１７種の変異ＶＬ  ＣＤＲ１ドメイン及びｈＶＨ２２．１０１の４種のＶＨドメインバリアントのＤＮＡをＧｅｎｅＡｒｔによって合成した。全ての変異したＶＬ及びＶＨのドメインを、それぞれ、完全長のヒト軽鎖及び重鎖をコードしている哺乳類発現ベクターにクローニングした。１７種の変異軽鎖（ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ１６、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ１７、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ１９、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２０、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２１、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２２、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２３、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２４、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２５、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２６、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２７、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ３７、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ３８、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ３９、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ４０、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ４１、及びｈＶＬ２２．１０１ＬＣ４２）を、非バリアント重鎖ｈＶＨ２２．１０１ｊと又は４種のバリアント重鎖（ｈＶＨ２２．１０１ＨＣ７、ｈＶＨ２２．１０１ＨＣ８、ｈＶＨ２２．１０１ＨＣ９、ｈＶＨ２２．１０１ＨＣ１０）と組み合わせた。従って、軽鎖（ｈＶＬ２２．１０１ｅ、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ１６、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ１７、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ１９、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２０、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２１、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２２、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２３、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２４、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２５、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２６、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２７、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ３７、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ３８、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ３９、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ４０、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ４１、及びｈＶＬ２２．１０１ＬＣ４２）及び重鎖（ｈＶＨ２２．１０１ｊ、ｈＶＨ２２．１０１ＨＣ７、ｈＶＨ２２．１０１ＨＣ８、ｈＶＨ２２．１０１ＨＣ９、ｈＶＨ２２．１０１ＨＣ１０）のコンストラクトの全ての可能な組み合わせを用いて、フルサイズ抗体（異性化変異体）を生成させるためにＨＥＫ２９３細胞を一過的にトランスフェクションした。実施例３に記載の通り、抗体を精製、脱塩、研磨、及び濃縮した。
【０１８２】
実施例７：ｈＭＱ２２．１０１異性化変異体の解離速度解析。
Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６機器（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）において、異性化変異抗体のオフレートスクリーニングを実施した。全ての測定は３０℃で行った。ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサーを、まず、ＰＢＳで５０秒間洗浄した。３位のシトルリン及びＣ末端のビオチンの両方を含有する、１μｇ／ｍＬ  Ｎ末端ヒストン２Ａ（配列番号１８）及びヒストン４（配列番号２０）のペプチドを、２００秒間かけてＳＡバイオセンサーに固定化し、ＰＢＳで５０秒間洗浄し、過剰の反応性ストレプトアビジン分子をＥＺ−ｌｉｎｋビオサイチンで２００秒間ブロックした。ＰＢＳで５０秒間洗浄する工程を更に２回行った後、ＰＢＳで希釈した７２ｎＭの濃度の抗体を２００秒間バイオセンサーに結合させた。その後、それらの解離速度を測定するために、センサーを４０００秒間ＰＢＳ中に入れておいた。
【０１８３】
各抗体についての解離曲線をプロットする前に、様々な抗体に曝露された非コーティングバイオセンサーから発生したバックグラウンドシグナル及び様々な抗体に曝露されていないコーティングバイオセンサーから発生したシグナルを差し引いた。ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ解析ソフトウェア８．１を用いて、１：１相互作用モデル（フィッティングローカル、フル）を適用して、各抗体についてのヒストン２Ａ及びヒストン４の解離速度定数（ｋｄｉｓ×Ｅ−０７（１／ｓ））を計算した。
【０１８４】
結果を図３Ｂに示す。より小さな数は、オフレートがより遅いことを示し、これは、抗原の放出がより遅いことを意味する。１×Ｅ−０７  １／ｓはＯｃｔｅｔによって検出される最小値であり、測定可能なオフレートがほとんどないことを意味する。
【０１８５】
幾つかのｈＭＱ２２．１０１異性化変異体が、１×Ｅ−０７  １／ｓの解離速度を示した。好ましい重鎖：ｈＶＨ２２．１０１ｊ及びｈＶＨ２２．１０１ＨＣ９。好ましい軽鎖：ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ１７、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２１、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２７、ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ４１、及びｈＶＬ２２．１０１ＬＣ４２。
【０１８６】
実施例８：９種の最良のｈＭＱ２２．１０１異性化変異体の加速安定性試験。
【０１８７】
２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の以下の選択された変異抗体（２．０６〜４．２９ｍｇ／ｍＬの範囲）からの０．４ｍＬのアリコート（ガラス管）を、３７℃でそれぞれ６週間保存した。
【０１８８】
【表３】
2021535211.tif 000005
【０１８９】
毎週、無菌条件下で各ガラス管から幾つかの１０μＬ及び２０μＬのサンプルを取り出し、更に分析（ＥＬＩＳＡ及びＭＳ分析）を行うまで−８０℃で保存した。
【０１９０】
較正曲線、並びにＨＱＣ、ＭＱＣ、ＬＱＣ、ＬＱＣ、及びＬＬＱＣのスパイクＱＣサンプルにｈＭＱ２２．１０１ｆ／ｇ基準ロットのみを使用したことを除いて実施例１に記載の通り、０週目、３週目、及び６週目の抗体サンプルを、インハウスで検証されたＣＭＣ  ＥＬＩＳＡに供した。
【０１９１】
結果を図４に示す。５種の最高性能の異性化変異体（ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４２、ｈＭＱ２２．１０１ＨＣ９／ＬＣ２１、ｈＭＱ２２．１０１ＨＣ９／ＬＣ２７、ｈＭＱ２２．１０１ＨＣ９／ＬＣ４２、箱入り）を使用して、ＭＳ分析を介して０週目及び６週目における異性化を評価した。
【０１９２】
実施例９：５種の最良のｈＭＱ２２．１０１異性化突然変異体の質量分析。
加速安定性試験（実施例５）で最高の性能を発揮した５種の抗体からの３７℃加速安定性サンプルを、ＶＬのＣＤＲ１における異性化レベルについてＭＳ分析により更に分析した。
【０１９３】
【表４】
2021535211.tif 000006
【０１９４】
０週目及び６週目の加速安定性サンプルのみを使用したことを除いて、実施例２に記載の方法と同様に、ＭＳ分析を行った。異性化の百分率を、抗体ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅの百分率と比較した（図５）。ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１は、経時的にほとんど異性化を示さず（０．５％）、好ましい候補であると考えられた。２番目に優れていた抗体は、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４２及びｈＭＱ２２．１０１ＨＣ９／ＬＣ４２であった。好ましい２番目に優れていた抗体は、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４２であったが、その理由は、ＨＣ鎖ｆがＨＣ９よりもヒトに近く、０週目と６週目との間の異性化の差がより小さい（１．９％対２．６％）ためである。
【０１９５】
実施例１０：３種の最高性能のｈＭＱ２２．１０１異性化変異体の凝集及び分解解析。
より少ないＶＬのＣＤＲ１の異性化を示した（実施例６）３種の抗体からの３７℃加速安定性サンプルを、それらの凝集及び分解のレベルに関して更に分析した。
【０１９６】
【表５】
2021535211.tif 000007
【０１９７】
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＧＦ−２５０、４μｍ、９．４×２５０ｍｍカラムと組み合わせて、Ｇ１３１１Ａクォータナリポンプ、Ｇ１３２２Ａデガッサ、Ｇ１３２９Ａオートサンプラー、Ｇ１３３０Ｂサーモスタット、Ｇ１３１６Ａカラムオーブン、及びＧ１３１４Ｂ  ＶＷＤ検出器（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を備えるＡｇｉｌｅｎｔ  １２００システムで測定を行った。抗体１０μＬを注入し、Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．０中２００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４からなる移動相を用いて、２ｍＬ／分の流速で１０分間流した。２４０ｎｍの紫外光を用いてタンパク質を検出した。抗体のメインピークは約４．２５分で検出された。メインピークの前後のショルダーを定量し、これらはそれぞれ凝集及び分解のレベルの指標となる。結果を図６に示す。
【０１９８】
ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４２、及びｈＭＱ２２．１０１ＨＣ９／ＬＣ４２は、許容可能な凝集及び分解プロファイルを示し、このことは更なる開発のために許容可能であることを示した。
【０１９９】
実施例１１：最高性能のｈＭＱ２２．１０１異性化変異体のフラグメンテーション解析。
ＵＶ及び質量分析（ＭＳ）検出と組み合わせた逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）（ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＵＶ−ＭＳ）を用いて、インタクトなｍＡｂサンプルの分析を行った。Ｊｅｔｓｔｒｅａｍエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を備えるＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ６５４０  Ｑ−ＴＯＦにハイフネートされたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １２９０  ＵＨＰＬＣシステムを使用してデータを取得した。移動相Ａとして水中０．１％ＴＦＡを、移動相Ｂとしてアセトニトリル中０．１％ＴＦＡを使用して、サンプルをＲＰＬＣカラム（Ｚｏｒｂａｘ  ３００  ＳＢ−Ｃ８、１００ｍｍ  Ｌ、２．１ｍｍ  ＩＤ、１．８μｍ  ｄｐ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分離した。１５％Ｂ→８０％Ｂの勾配を６５分にわたって適用した。約５μｇをカラムにロードした。高分解能モード（４ＧＨｚ）、フラグメンター電圧３５０Ｖ、及びＱｕａｄ  ＡＭＵ設定３００で、ＭＳシステムを作動させた。ポジティブＭＳモードにおいて３００〜３２００ａｍｕの取得範囲で１秒間あたり１つのスペクトルを取得した。ＢｉｏＣｏｎｆｉｒｍアドオンを搭載したＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェアに組み込まれた最大エントロピーアルゴリズムを使用して、生スペクトルをデコンボリューションした。潜在的なＣ末端のリジンの切断及びＮ−グリコシル化を考慮して、測定されたＭＷを、完全配列によって求められた理論的ＭＷと比較した。
【０２００】
ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＵＶ−ＭＳ分析を使用して、３７℃で６週間インキュベーションしたｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１及びｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅの両サンプルについて、ストレスを与えていないサンプルと比較した場合、断片化の増加が観察された。断片化の量は、臨床試験に使用される他の治療用抗体について観察されたフラグメンテーションプロファイルに類似しており、許容できるものである。
【０２０１】
実施例１２：ヒト好中球細胞外トラップアッセイ。
２人の異なる健常ドナーからヘパリンナトリウムチューブ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に全血を採取した。ドナー１人あたり３０ｍＬの血液を０．９％ＮａＣｌ中６％デキストラン１５ｍＬと混合し、ＲＴで６０分間インキュベーションした。インキュベーション後、赤血球の大部分を含有する下層及び好中球を含有する上層の２つの透明な層が見えた。上層を回収し、ＲＴにおいて３００ｇで１０分間スピンダウンさせた。ペレットをＰＢＳ２５ｍＬに再懸濁させ、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた密度勾配遠心分離により好中球を分離し、続いて、ＲＴで１０分間の赤血球溶解工程を行った。Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーターを用いて細胞を計数した。１ウェルあたり９００．０００個の好中球を、２４ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）における、１％熱不活化ウシ胎児血清及び１ｍＭ  ＣａＣｌ２を添加した好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）アッセイバッファ（ｇｌｕｔａｍａｘを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））に播種した。好中球をカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で４時間刺激した。２５μｇ／ｍＬの濃度の以下の抗体（ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ｇ、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４２、及びアイソタイプコントロール抗体ＭＱＲ２．２０１）のうちの１つ又はアッセイバッファを、Ａ２３１８７を細胞に添加する１５分前に添加することによって、ＮＥＴ低減抗体の効果を試験した。３７℃及び５％ＣＯ２で４時間インキュベーションした後、ＮＥＴアッセイバッファを用いて細胞を非常に穏やかに２回洗浄した。その後、細胞外ＤＮＡを３７℃、１５分間Ｓ７ヌクレアーゼ（７．５Ｕ／０．５ｍＬ）で消化し、その後、５００ｍＭ  ＥＤＴＡ１０μＬを添加して更なる消化を停止させた。ＮＥＴをウェルから収集し、インタクトな細胞を取り除くために２０ｇで５分間スピンダウンさせた。収集したＮＥＴ５０μＬに３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質５０μＬを添加することによってサンプル中のＭＰＯ活性を測定することにより、ＮＥＴの量を定量した。ＲＴで１０分間インキュベーションした後、Ｈ２ＳＯ４５０μＬを添加し、４５０ｎｍで光学密度を測定した。Ａ２３１８７処理を受けていない好中球から発生したバックグラウンドシグナルを差し引き、Ａ２３１８７＋ＭＱＲ２．２０１で処理された好中球からのシグナルを１００％とした。他の全ての抗体処理群からのシグナルを、Ａ２３１８７＋ＭＱＲ２．２０１処理群と比較した（図７）。
【０２０２】
驚くべきことに、開発候補のｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１は、２５μｇ／ｍＬの濃度でｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４２及びｈＭＱ２２．１０１ｆ／ｇよりも優れている（ｎ＝２）。異性化変異体抗体は、非変異体抗体の特性を維持していただけでなく、それを改善させた。
【０２０３】
実施例１３：炎症の実験マウスモデル。
本研究の目的は、コラーゲン抗体誘発性関節炎（ＣＡＩＡ）マウスモデルにおいて、以前の候補であるｈＭＱ２２．１０１ｆ／ｇ及びアイソタイプ適合対照抗体ＭＱＲ２．２０１と比較して、指定の開発候補であるｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１又はｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４２（異性化の問題が取り除かれている）を用いて用量反応範囲を試験することであった。肢及び足首の腫脹を定量した。
【０２０４】
ＭｏｄｉＱｕｅｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂ．Ｖ．から市販されているＣＡＩＡマウスモデル（カタログ番号ＭＱ１８．１０１）を製造業者の仕様書に従って使用して、マウスにおいて関節炎を誘導した。その目的のために、ＤＢＡ／Ｊ１マウスに抗コラーゲン−ＩＩ抗体ミックス２．８ｍｇをｉ．ｐ．注射した。３日後、マウス間で炎症を同期させるために、ＬＰＳ２５μｇを含有する別のｉ．ｐ．注射をマウスに施した。ＬＰＳと同時に、ｔＡＣＰＡ  ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ｇ、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１、又はｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４２（６．２５ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、及び２５ｍｇ／ｋｇ）、無関係アイソタイプ適合対照抗体ＭＱＲ２．２０１（２５ｍｇ／ｋｇ）、又はプラセボ（０．９％  ＮａＣｌの生理食塩水）をマウスに投与した。典型的には、ＬＰＳ注射の２日後（すなわち５日目）から、前肢及び後肢の炎症が視認できた。０日目から１３日間、肢の腫脹の程度を巨視的に採点した。腫脹の程度の最高スコアは８（４本の肢で除した）である。採点システムについては、以下の表を参照。
【０２０５】
【表６】
2021535211.tif 000008
【０２０６】
結果を図８に示す。治療用抗体で処理したマウスは、対照抗体又は生理食塩水で処理したマウスと比較して、用量依存的に肢の炎症の有意な減少を示した。最適化されたリード抗体ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１及びｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４２（異性化の問題が除去されている）はいずれも、以前のリード候補ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ｇよりも更により炎症を予防し、これは２５ｍｇ／ｋｇの用量で明確に示されている（図８、上のパネル）。有害作用は観察されなかった。６．２５ｍｇ／ｋｇの最低用量では（図８、下のパネル）、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１は他の全ての抗体よりも優れており、１３日目におけるスチューデントのｔ検定のｐ値は、プラセボ処理群と比較して、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４２、及びｈＭＱ２２．１０１ｆ／ｇについてそれぞれｐ＜０．００１、ｐ＜０．０５、及びｐ＝０．４６であった。
【０２０７】
実施例１４：マウスインビトロＮＥＴアッセイにおける開発候補ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１の更なる特性評価
ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１がＮＥＴ形成の強力な阻害剤であるという概念を更に強化するために、マウスのＮＥＴ及びプレＮＥＴへのｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１の結合に加えて、マウスＮＥＴ形成の阻害について、以下に記載の通り研究した。プレＮＥＴは、崩壊した核膜を有し、細胞内に依然として存在するシトルリン化クロマチンを含有する非晶質の脱縮合核構造を有する好中球であると定義される。
【０２０８】
本研究の目的は、指定の開発候補であるｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１がマウスのＮＥＴ形成を阻害することができるかどうかについて試験することであった。製造業者の指示に従って、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）マウス好中球濃縮キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、陰性選択によりＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの骨髄から好中球を単離した。Ｌｙ６Ｇに対する抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いたフローサイトメトリーによって、単離された好中球の純度を確認したところ、９０％超であった。単離された骨髄好中球を、カルシウム及びマグネシウムを含有するＨＢＳＳ中２×１０６細胞／ｍＬの濃度に調整した。合計１００μＬの細胞懸濁液を、８ウェルチャンバースライド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに添加した。２５μｇ／ｍＬ  ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１、ＭＱＲ２．２０１、又は抗体なしを、１μｇ／ｍＬ  Ａ２３１８７又はビヒクルコントロールを含有するＨＢＳＳ１５０μＬを細胞に添加する前に１５分間細胞と共にインキュベーションさせた。チャンバースライドを３７℃及び５％ＣＯ２で３時間インキュベーションした。その後、２％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｍｅｒｃｋ）を各ウェルに添加し、調製物を４℃で１２時間インキュベーションした。室温、１時間、ＰＢＳ中１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｂｉｏｃｈｒｏｍｅ）でサンプルをブロッキングした。一次ウサギ抗ｃｉｔＨ３抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ５１０３；１：２００）又はＴＲＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、１０９−０２５−００３；１：１００）を、４℃で１２時間かけてＰＢＳ中１０％ＦＣＳに添加した。スライドをＰＢＳで３回洗浄し、二次Ｃｙ５コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１１１−１７５−１４４；１：４００）を暗所において室温、１．５時間かけて添加した。スライドを再びＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳ中２．５μＭ  Ｈｏｅｃｈｓｔを含有する染色溶液を、室温、１５分間かけて添加した。ＰＢＳで洗浄した後、サンプルを封入剤（ＢＩＯＺＯＬ）に包埋した。スライドをＢＺ−Ｘ７１０顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）で分析し、ＮＥＴ及びプレＮＥＴをＦｉｊｉイメージングソフトウェアで定量した（図９Ａ）。ＮＥＴ（黄矢印）及びプレＮＥＴ（白矢印）へのｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１結合（ｈＩｇＧ；赤）を示す代表的な画像を図９Ｂに示す。
【０２０９】
ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１でマウス骨髄（ＢＭ）由来の好中球をインビトロにおいて処理した結果、ＭＱＲ２．２０１で処理したマウスＢＭ由来の好中球と比較して、Ａ２３１８７に誘導されるＮＥＴの排出が減少した（図９Ａ）。更に、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１は、排出されたマウスのＮＥＴ（図９Ｂ；黄矢印）及びプレＮＥＴ（図９Ｂ；白矢印）に結合し、これはマクロファージによるＮＥＴのクリアランスに向けた最初の段階である可能性がある。
【０２１０】
実施例１５：プリスタン誘発性腹膜炎マウスモデルを用いたマウスインビボＮＥＴ／マクロファージアッセイにおける開発候補ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１の更なる特性評価
【０２１１】
Ｋｉｅｎｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ＪＣＩ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  ２０１７；２（１）：ｅ９２９２０）によって既に記載されている腹膜細胞流入のプリスタン誘発性マウスモデルを用いて、開発候補ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１のインビボにおいてＮＥＴ形成を阻害する能力を試験した。
【０２１２】
簡潔に述べると、プリスタン油（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）５００μＬを注射した直後に５０ｍｇ／ｋｇ  ＭＱＲ２．２０１又はｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１を投与し、続いて、１２時間後に５０ｍｇ／ｋｇ  ＭＱＲ２．２０１又はｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１の２回目の注射を行った。合計２４時間後、炎症細胞を腹膜から単離し、１×１０６細胞／ｍＬに調整し、免疫蛍光顕微鏡を介した分析のためにフローチャンバースライド又はサイトスピンスライドのいずれかに移した。その後、スライドを、ＰＢＳ＋１０％ＦＣＳでブロッキングし、ウサギ抗ｃｉｔＨ３（Ａｂｃａｍ、ａｂ５１０３；１：２００）、ウサギ抗ＮＥ（Ａｂｃａｍ、ａｂ２１５９５；１：２００）、ＡＦ４８８コンジュゲートラット抗マウスＦ４／８０（Ｂｉｏｌｏｇｅｎｄ、１２３１２０；１：２００）、又はＴＲＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｏｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｎｏｒｅｓａｒｃｈ、１０９−０２５−００３；１：１００）と共にインキュベーションした。スライドをＰＢＳで３回洗浄し、二次Ｃｙ５コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１１１−１７５−１４４；１：４００）を暗所において室温、１．５時間かけて添加した。スライドを再びＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳ中２．５μＭ  Ｈｏｅｃｈｓｔを含有する染色溶液を、室温、１５分間かけて添加した。ＰＢＳで洗浄した後、サンプルを封入剤（ＢＩＯＺＯＬ）に包埋した。スライドをＢＺ−Ｘ７１０顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）で分析し（図１０Ａ及びＣ）、ＮＥＴ及びプレＮＥＴをＦｉｊｉイメージングソフトウェアで定量した（図１０Ｂ）。図１０Ｃは、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１のＮＥＴ及びプレＮＥＴへの結合を示す。図１１は、マクロファージによるｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１を多く含むＮＥＴの取り込みを示す。
【０２１３】
ＭＱＲ２．２０１処理マウスからの腹膜細胞と比較して、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１処理マウスの腹膜細胞では、ＤＮＡ及びシトルリン化ヒストン３（ｃｉｔＨ３）を含有するＮＥＴフィラメントの減少が観察される（図１０Ａ）。ＮＥＴの定量（ｃｉｔＨ３及びＤＮＡ（Ｈｏｅｃｈｓｔ）の共局在）によってこの観察結果を確認した（図１０Ｂ）。ＤＮＡ及びｃｉｔＨ３の共局在は、ＮＥＴ形成の特徴である。更に、ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１は、排出されたマウスＮＥＴ及びマウスプレＮＥＴに結合し（図１０Ｃ）、これはマクロファージによるＮＥＴクリアランスに向けた最初の段階である可能性がある。実際、ｃｉｔＨ３又は好中球エラスターゼと組み合わせて貪食されたｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１を含有していた細胞浸潤物の中では、Ｆ４／８０陽性マクロファージが観察された（図１１）。
【０２１４】
実施例１６：ＲＡのＣＩＡマウスモデル
ＮＥＴに誘導される組織損傷に対するｔＡＣＰＡの有効性を調べるために、様々な漸減ｔＡＣＰＡストラテジーを、ＲＡの慢性コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）マウスモデルで使用した。
【０２１５】
慢性関節炎を誘導するために、ウシコラーゲンＩＩを０．０５Ｍ酢酸中２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、等体積のフロイント完全アジュバントで乳化した。０日目に、１０〜１２週齢の雄ＤＢＡ／Ｊ１マウスの尾基部をウシＣＩＩ１００μｇで皮内免疫した。２１日目に、ＰＢＳに溶解させたウシＣＩＩ５０μｇのｉ．ｐ．ブースター注射をマウスに施したところ、数日後に関節炎が発症した（図１２Ａ）。指又は肢の他の部分に発赤及び／又は腫脹の著しい変化が認められたとき、マウスが関節炎を有しているとみなした。各肢の関節炎症を上記の通り採点した（ＲＡのＣＡＩＡマウスモデル）。０〜８（肢１本あたり０〜２）の任意スケールで平均関節炎スコア（ＭＡＳ）が≧０．７５であった場合、疾患の発症後早期（２１日目〜２８日目）に治療的処理を開始した。指定の用量のｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅ（５０／１０／１０、３０／３０／３０／１０、及び５０／５０／５０／１５ｍｇ／ｋｇ）を互いに４日間離して４回反復ｉ．ｖ．注射する治療的投与は、５０／５０／５０／５０ｍｇ／ｋｇ  ＭＱＲ２．２０１と比較して、１４日目のＭＡＳをそれぞれ３８％、５２％、及び８１％低下させた（図１２Ｂ）。マウスは、処理開始後１４日目に終了させた。足首及び膝の関節を摘出し、組織学的分析のためにホルマリン中で保存した。
【０２１６】
特に注目すべきは、全てのｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅ処理によって最初の８日間は疾患の発症が予防され、その後ＭＡＳが上昇し始めたことであり、これは恐らく、これらマウスにおける抗薬物抗体の発生に起因している。５０／５０／５０／１５ｍｇ／ｋｇ  ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅによる処理のみが、ＭＡＳ０．７５が超えることなく合計１４日間にわたって疾患を完全に安定化させた。
【０２１７】
骨損傷に対するｔＡＣＰＡの効果を更に研究するために、ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅ及びＭＱＲ２．２０１の処理レジメンから全ての後肢の膝及び足首のＸ線分析を行った。観察されたＭＡＳと一致して、全てのｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅ処理が、足首及び膝の両方において骨損傷を抑制した（図１２Ｃ）。ｔＡＣＰＡの保護効果についての更なる洞察を得るために、Ｈ＆Ｅ及びサフラニンＯ（ＳＯ）染色を用いて、足首関節の組織学的分析を行った。ＭＱＲ２．２０１処理マウスと比較して、ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅは炎症細胞の流入を阻害した（図１２Ｄ）。更に、ＭＱＲ２．２０１処理マウスと比較して、ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅは、骨及び軟骨の侵食並びに軟骨のプロテオグリカンの枯渇及び軟骨細胞死を有意に減少させた（図１２Ｅ〜Ｈ）。これらデータは、ｔＡＣＰＡが関節損傷を含む関節炎の症状を強力に軽減することを示す。
【０２１８】
次いで、５０／５０／５０／１５ｍｇ／ｋｇ  ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅ又は５０／５０／５０／５０ｍｇ／ｋｇ  ＭＱＲ２．２０１を投与したＣＩＡマウスの肢における好中球及びＮＥＴの存在について調べた。マウス好中球マーカーＬｙ６Ｇ、シトルリン化ヒストン３（ｃｉｔＨ３）、及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）は、ＭＱＲ２．２０１処理動物では示されたが、これらマーカーは、ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅ処理マウスではほとんど存在していなかった（図１２Ｉ）。核及び細胞外ＤＮＡ染色としてＤＡＰＩを用いた（図１２Ｉ）。脛骨足根骨関節、近位足根間関節、遠位足根間関節、及び足根中足関節を含む各動物の右後肢の複数の関節の分析によって、好中球（Ｌｙ６Ｇ）及びＮＥＴ（ｃｉｔＨ３及びＭＰＯの共局在）の定量を実施した。ＭＱＲ２．２０１処理マウスと比較して、ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅ処理マウスの関節では、好中球（図１２Ｊ）及びＮＥＴ（図１２Ｋ）の量が両方とも減少していることが確認された。関節におけるＮＥＴの量は、巨視的な肢の腫脹と有意に相関していることが見出された（図１２Ｌ；ｒ＝０．６１２０、Ｐ＝０．００４１）。同様に、肢の腫脹と関節における好中球の存在との間にも有意な相関がみられた（図１２Ｍ；ｒ＝０．８７２９、Ｐ＜０．０００１）。まとめると、これらデータは、ｔＡＣＰＡ処理の結果、インビボにおいて炎症組織のＮＥＴが根絶され、それによって、重度の骨及び組織の破壊が阻止されることを示す。
【０２１９】
実施例１７：ｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅは健常白血球には結合しない。
リチウムヘパリンチューブで採取した健常ボランティア（ＨＶ）の血液は、オランダのナイメーヘンにあるＳａｎｑｕｉｎ血液バンクから入手した。全ての供血者からインフォームドコンセントを得た。フィコール密度勾配遠心分離を行って、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及び好中球を分離した。ＰＢＭＣを回収し、１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び５０Ｕ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０（以下、ＲＰＭＩ  １０％と称する）で３回洗浄して、血小板を除去した。好中球／赤血球懸濁液を０．９％ＮａＣｌ中６％（ｗ／ｖ）デキストランと混合し、室温、２５分間インキュベーションした。その後、好中球を回収し、残りの赤血球を溶解させるために室温、１０分間塩化アンモニウム−カリウム（ＡＣＫ）バッファに曝露し、ＲＰＭＩ  １０％で２回洗浄した。
【０２２０】
ＰＢＭＣ及び好中球を、ＦＡＣＳバッファ中２×１０５細胞／ウェルの密度で９６ウェルＶ底プレートに播種した。Ｆｃ受容体をブロックするために、室温、２０分間、Ｈｕｍａｎ  Ｔｒｕｓｔａｉｎ  ＦｃＸ（ＦＡＣＳバッファで１：５０希釈）と共に細胞をインキュベーションした。その後、ＰＢＭＣを、６．２５μｇ／ｍＬ  ＨｉＬｙｔｅ（商標）Ｆｌｕｏｒ４８８コンジュゲートｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅ、０．１７μｇ／ｍＬ  抗ＣＤ３、１μｇ／ｍＬ  抗ＣＤ１１ｃ、０．３３μｇ／ｍＬ  抗ＣＤ１４、０．１７μｇ／ｍＬ  抗ＣＤ２０、８３ｎｇ／ｍＬ  抗ＣＤ４５、及び０．１７μｇ／ｍＬ  抗ＣＤ５６を含有する抗体ミックスと共に室温、４５分間インキュベーションし、一方、好中球は、６．２５μｇ／ｍＬ  ＨｉＬｙｔｅ（商標）Ｆｌｕｏｒ４８８コンジュゲートｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅ、８３ｎｇ／ｍＬ  抗ＣＤ４５、及び８３ｎｇ／ｍＬ  抗ＣＤ６６ｂを含有する抗体ミックスと共にインキュベーションした。ＨｉＬｙｔｅ（商標）Ｆｌｕｏｒ４８８コンジュゲートｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅ結合についてのポジティブコントロールとして、Ｆｃ受容体をブロックする前に好中球を５μＭ  Ａ２３１８７で４５分間刺激した。抗体のインキュベーション後、ＰＢＭＣ及び好中球を、室温、１５分間４％ホルムアルデヒドで固定し、ＦＡＣＳバッファで洗浄し、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーターで分析した。
【０２２１】
ＨｉＬｙｔｅ（商標）Ｆｌｕｏｒ４８８コンジュゲートｈＭＱ２２．１０１ｊ／ｅは、健常な静止期のＴ細胞、Ｂ細胞、単球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞樹状細胞（ＤＣ）、又は好中球には結合しなかったが、活性化された好中球には結合した（図１３）。ｈＭＱ２２．１０１ｆ／ＬＣ４１抗体についても同等の結果が期待される。
【０２２２】
配列表
配列番号１−ｍｓＶＨ２２．１０１及びｈＶＨ２２．１０１（ＨＣ）ｘのＣＤＲ１
ＧＹＴＦＴＮＹＧ
配列番号２−ｍｓＶＨ２２．１０１及びｈＶＨ２２．１０１（ＨＣ）ｘのＣＤＲ２
ＩＮＴＹＳＧＥＡ
配列番号３−ｍｓＶＨ２２．１０１及びｈＶＨ２２．１０１（ＨＣ）ｘのＣＤＲ３
ＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹ
配列番号４−ｍｓＶＬ２２．１０１及びｈＶＬ２２．１０１（ＬＣ）ｙのＣＤＲ２
ＬＶＳ
配列番号５−ｍｓＶＬ２２．１０１及びｈＶＬ２２．１０１（ＬＣ）ｙのＣＤＲ３
ＷＱＧＴＨＦＰＹＴ
配列番号６−ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ１７のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＴＤＧＫＴＹ
配列番号７−ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２１のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＳＤＡＫＴＹ
配列番号８−ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２７のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＴＤＡＫＴＹ
配列番号９−ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ４１のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＡＤＧＫＴＹ
配列番号１０−ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ４２のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＮＤＧＫＴＹ
配列番号１１−ｈＶＨ２２．１０１ｆ
ＲＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＥＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１２−ｈＶＨ２２．１０１ＨＣ９
ＲＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＥＡＴＹＶＤＤＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１３−ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ１７
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＴＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１４−ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２１
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＡＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１５−ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２７
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＴＤＡＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１６−ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ４１
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＡＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１７−ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ４２
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＮＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１８−ヒストン２Ａ由来の国際公開第２０１６０９２０８２号の配列番号１（実施例１／７で使用）
ＳＧＸＧＫＱＧＧＫＡＲＡ
式中、Ｘは、シトルリンである
配列番号１９−ヒストン４由来の国際公開第２０１６０９２０８２号の配列番号２（実施例７で使用）
ＳＧＸＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫＶＬＲ
式中、Ｘは、シトルリンである
配列番号２０−ヒストン４由来の国際公開第２０１６０９２０８２号の短縮形配列番号２（実施例７で使用）
ＳＧＸＧＫＧＧＫＧＬＧＫ
式中、Ｘは、シトルリンである
配列番号２１−ペプチド番号４（ヒトのヒストン２Ａ）（国際公開第２０１１０７０１７２号からの配列番号２４）
ＱＦＰＶＧＸＶＨＲＬＬＲ
式中、Ｘは、シトルリンである
配列番号２２−ペプチド番号６（ヒトのヒストン２Ａ）（国際公開第２０１１０７０１７２号からの配列番号２６）
ＶＨＲＬＬＸＫＧＮＹＳＥ
式中、Ｘは、シトルリンである
配列番号２３−ＩｇＧ１のヒト重鎖定常ドメイン
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
配列番号２４−ヒトκ鎖定常ドメイン
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号２５−ｍｓＶＨ２２．１０１
ＲＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＥＡＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＨＷＭＫＱＴＰＧＫＤＦＲＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＥＡＴＹＶＤＤＦＫＧＲＦＡＦＳＬＧＴＳＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＮＤＤＴＡＴＹＦＣＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹＷＧＱＧＴＡＬＴＶＳＳ
配列番号２６−ｈＶＨ２２．１０１ｊ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＥＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２７−ｈＶＨ２２．１０１ＨＣ７
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＥＡＴＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２８−ｈＶＨ２２．１０１ＨＣ８
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＥＡＴＹＶＤＤＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２９−ｈＶＨ２２．１０１ＨＣ１０
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＥＡＴＹＶＤＤＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＬＲＧＹＴＹＱＳＦＤＥＧＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３０−ｍｓＶＬ２２．１０１
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＴＴＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＦＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＩＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＧＧＴＮＬＥＩＫ
配列番号３１−ｈＶＬ２２．１０１ｅ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３２−ｈＶＬ２２．１０１ｇ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３３−ｈＶＬ２２．１０１ｈ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＡＳＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３４−ｈＶＬ２２．１０１ｉ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＥＳＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３５−ｈＶＬ２２．１０１ｊ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＳＳＤＧＫＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３６−ｍｓＶＬ２２．１０１及びｈＶＬ２２．１０１ｇのＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹ
配列番号３７−ｈＶＬ２２．１０１ｅのＣＤＲ１
ＱＳＬＶＤＳＤＧＫＴＹ
配列番号３８−ｈＶＬ２２．１０１ｈのＣＤＲ１
ＱＳＬＶＡＳＤＧＫＴＹ
配列番号３９−ｈＶＬ２２．１０１ｉのＣＤＲ１
ＱＳＬＶＥＳＤＧＫＴＹ
配列番号４０−ｈＶＬ２２．１０１ｊのＣＤＲ１
ＱＳＬＶＳＳＤＧＫＴＹ
配列番号４１−ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ１６のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＥＳＤＧＫＴＹ
配列番号４２−ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ１９のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＳＥＧＫＴＹ
配列番号４３−ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２０のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＳＳＧＫＴＹ
配列番号４４−ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２２のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＥＳＥＧＫＴＹ
配列番号４５−ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２３のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＥＳＳＧＫＴＹ
配列番号４６−ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２４のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＥＳＤＡＫＴＹ
配列番号４７−ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２５のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＴＥＧＫＴＹ
配列番号４８−ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ２６のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＴＳＧＫＴＹ
配列番号４９−ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ３７のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＳＡＧＫＴＹ
配列番号５０−ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ３８のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＥＳＡＧＫＴＹ
配列番号５１−ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ３９のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＡＥＧＫＴＹ
配列番号５２−ｈＶＬ２２．１０１ＬＣ４０のＣＤＲ１
ＱＳＬＬＤＮＥＧＫＴＹ
配列番号５３−ｍｓＦｉｂβ  ＸＧ（国際公開第２０１１０７０１７２号からの配列番号３７）
ＥＰＴＤＳＬＤＡＸＧＨＲＰＶＤＲＲ
式中、Ｘは、シトルリンである
配列番号５４−ｍｓＶｉｍ  ＸＳ／ＸＬ（国際公開第２０１１０７０１７２号からの配列番号３８）
ＹＶＴＸＳＳＡＶＸＬＸＳＳＶＰ
式中、Ｘは、シトルリンである
配列番号５５−ｍｓＶＬ２２．１０１及びｈＶＬ２２．１０１（ＬＣ）ｙのＣＤＲ２周辺領域
ＬＶＳＫＬＤＳ
配列番号５６−ｈＣＨ２２．１０１ｆの重鎖定常ドメイン
ａｓｔｋｇｐｓｖｆｐｌａｐｓｓｋｓｔｓｇｇｔａａｌｇｃｌｖｋｄｙｆｐｅｐｖｔｖｓｗｎｓｇａｌｔｓｇｖｈｔｆｐａｖｌｑｓｓｇｌｙｓｌｓｓｖｖｔｖｐｓｓｓｌｇｔｑｔｙｉｃｎｖｎｈｋｐｓｎｔｋｖｄｋｋｖｅｐｋｓｃｄｋｔｈｔｃｐｐｃｐａｐｅｌｌｇｇｐｓｖｆｌｆｐｐｋｐｋｄｔｌｍｉｓｒｔｐｅｖｔｃｖｖｖｄｖｓｈｅｄｐｅｖｋｆｎｗｙｖｄｇｖｅｖｈｎａｋｔｋｐｒｅｅｑｙｎｓｔｙｒｖｖｓｖｌｔｖｌｈｑｄｗｌｎｇｋｅｙｋｃｋｖｓｎｋａｌｐａｐｉｅｋｔｉｓｋａｋｇｑｐｒｅｐｑｖｙｔｌｐｐｓｒｄｅｌｔｋｎｑｖｓｌｔｃｌｖｋｇｆｙｐｓｄｉａｖｅｗｅｓｎｇｑｐｅｎｎｙｋｔｔｐｐｖｌｄｓｄｇｓｆｆｌｙｓｋｌｔｖｄｋｓｒｗｑｑｇｎｖｆｓｃｓｖｍｈｅａｌｈｎｈｙｔｑｋｓｌｓｌｓｐｇｋ
【図１】
2021535211.tif 000009
【図２】
2021535211.tif 000010
【図３Ａ】
2021535211.tif 000011
【図３Ｂ】
2021535211.tif 000012
【図４】
2021535211.tif 000013
【図５】
2021535211.tif 000014
【図６】
2021535211.tif 000015
【図７】
2021535211.tif 000016
【図８】
2021535211.tif 000017
【図９Ａ】
2021535211.tif 000018
【図９Ｂ】
2021535211.tif 000019
【図１０Ａ】
2021535211.tif 000020
【図１０Ｂ】
2021535211.tif 000021
【図１０Ｃ】
2021535211.tif 000022
【図１１】
2021535211.tif 000023
【図１２Ａ】
2021535211.tif 000024
【図１２Ｂ】
2021535211.tif 000025
【図１２Ｃ】
2021535211.tif 000026
【図１２Ｄ】
2021535211.tif 000027
【図１２Ｅ】
2021535211.tif 000028
【図１２Ｆ】
2021535211.tif 000029
【図１２Ｇ】
2021535211.tif 000030
【図１２Ｈ】
2021535211.tif 000031
【図１２Ｉ】
2021535211.tif 000032
【図１２Ｊ】
2021535211.tif 000033
【図１２Ｋ】
2021535211.tif 000034
【図１２Ｌ】
2021535211.tif 000035
【図１２Ｍ】
2021535211.tif 000036
【図１３】
2021535211.tif 000037
【配列表】
2021535211000001.app
【国際調査報告】
2021535211.tif 000038
2021535211.tif 000039
2021535211.tif 000040