(57)【要約】  本発明は、ＨＥＲ−２標的化剤と組み合わせた、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト、特に４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を使用する併用療法、がんの治療のためのこれらの併用療法の使用、及びこれらの併用療法を使用する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストであって、ここで、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストは、ＨＥＲ−２標的化剤と組み合わせて使用され、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項２】
ＨＥＲ−２標的化剤が、ＨＥＲ−２抗体、ＨＥＲ−２二重特異性抗体及び／又はＨＥＲ−２抗体薬物コンジュゲートを含む、請求項１に記載の方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項３】
ＨＥＲ−２標的化剤が、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンを含む、請求項１又は２に記載の方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項４】
４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項５】
４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、ここで、４−１ＢＢＬのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項６】
４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）及びＣＥＡからなる群から選択される腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項７】
４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項８】
４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項９】
４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項１０】
腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含むＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項１１】
腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインであるか、又は、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項１２】
４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項１３】
４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項１４】
４−１ＢＢアゴニストが、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む抗原結合分子である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項１５】
４−１ＢＢアゴニストが、抗ＦＡＰ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、請求項１から３、又は７から１１のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項１６】
４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項１７】
腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ａ）（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、請求項１から８、又は１７のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項１８】
腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、請求項１から８、又は１６又は１７のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項１９】
４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む、請求項１から８、又は１６から１８のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項２０】
４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１から８、又は１６から１９のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項２１】
４−１ＢＢアゴニストが、抗ＣＥＡ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、請求項１から８、又は１７又は１８のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項２２】
４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤が、単一の組成物において一緒に投与されるか、又は２つ以上の異なる組成物において別々に投与される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項２３】
４−１ＢＢアゴニストが、ＨＥＲ−２標的化剤と相乗的に作用する、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項２４】
疾患、特にがんの併用治療、逐次治療又は同時治療における使用のための、（Ａ）活性成分としての４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト及び薬学的に許容される担体を含む第１の組成物であって、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である第１の組成物；及び（Ｂ）活性成分としてのＨＥＲ−２標的化剤及び薬学的に許容される担体を含む第２の組成物を含む薬学的製品。
【請求項２５】
４−１ＢＢアゴニストが、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である、４−１ＢＢアゴニストとＨＥＲ−２標的化剤を含む薬学的組成物。
【請求項２６】
ＨＥＲ−２標的化剤が、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンを含む、請求項２５に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
がんを治療すること又はがんの進行を遅延させることにおける使用のための、特に進行性固形腫瘍及び／又は転移性固形腫瘍の治療のための、請求項２５又は２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
増殖性疾患、特にがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための医薬の製造における、４−１ＢＢアゴニストとＨＥＲ−２標的化剤の組み合わせの使用であって、ここで、４−１ＢＢアゴニストが、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である、使用。
【請求項２９】
ＨＥＲ−２標的化剤が、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンを含む、請求項２８に記載の４−１ＢＢアゴニストとＨＥＲ−２標的化剤の組み合わせの使用。
【請求項３０】
４−１ＢＢアゴニストの有効量及びＨＥＲ−２標的化剤の有効量を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法であって、ここで、４−１ＢＢアゴニストが、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である、方法。
【請求項３１】
ＨＥＲ−２標的化剤が、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンである、請求項３０に記載の対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法。
【請求項３２】
４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、請求項３０又は３１に記載の対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法。
【請求項３３】
４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤が、単一の組成物において一緒に投与されるか、又は２つ以上の異なる組成物において別々に投与される、請求項３０から３２のいずれか一項に記載の対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法。
【請求項３４】
４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤が、静脈内又は皮下に投与される、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法。
【請求項３５】
４−１ＢＢアゴニストが、ＨＥＲ−２標的化剤と同時に、その前に、又はその後に投与される、請求項３０から３４のいずれか一項に記載の対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法。
【請求項３６】
請求項１から２３、又は２５から２７のいずれか一項に記載の使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト又は薬学的組成物、請求項２８若しくは２９に記載の４−１ＢＢアゴニストとＨＥＲ−２標的化剤との組み合わせの使用、又はがんがＨＥＲ−２陽性がんである、請求項３０から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、食道がん、肺がん、子宮がん、唾液腺管癌、膀胱がん、子宮内膜がん、膵臓がん、結腸がん、前立腺がん、及び／又は頭頸部がんである、請求項１から２３、又は２５から２７のいずれか一項に記載の使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト又は薬学的組成物、請求項２８若しくは２９に記載の４−１ＢＢアゴニストとＨＥＲ−２標的化剤との組み合わせの使用、又は請求項３０から３５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト、特に４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子、及びＨＥＲ−２標的化剤を使用する併用療法、及びがんの治療のためのこれらの併用療法の使用、及びこれらの併用療法を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
がんは、世界的に最も多い死因の１つである。治療の選択肢の進歩にもかかわらず、進行がん患者の予後は依然として不良である。それゆえに、許容できない毒性を引き起こすことなく、がん患者の生存期間を延ばすための最適な治療法に対する持続的かつ緊急の医学的必要性が存在する。最近の臨床試験の結果から、免疫療法ががん患者の全生存期間を延ばし、持続的応答をもたらすことが示されている。これらの有望な結果にも関わらず、現行の免疫に基づく治療法は患者の一部にしか効果がなく、治療効果を向上させるために組み合わせ戦略が必要とされている。
【０００３】
ヒト上皮増殖因子受容体−２（ＨＥＲ−２；ＥｒｂＢ２）は、受容体チロシンキナーゼであり、膜貫通型受容体の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーの一員である。ＨＥＲ−２は様々な種類の腫瘍で過剰発現しており、疾患の発症及び進行に関与している。それは予後不良に関連している。例えば、ＨＥＲ−２の過剰発現は、ヒト乳がんの約３０％で観察され、これらの腫瘍に関連する高悪性度の増殖と臨床転帰不良に関与していることが示唆されている（Slamon et al (1987) Science 235:177-182）。
【０００４】
ヒト化抗ＨＥＲ−２モノクローナル抗体トラスツズマブ（ＣＡＳ１８０２８８−６９−１、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、ＨＥＲ−２の細胞外ドメインを標的としている（米国特許第５６７７１７１号；米国特許第５８２１３３７号；米国特許第６０５４２９７号；米国特許第６１６５４６４号；米国特許第６３３９１４２号；米国特許第６４０７２１３号；米国特許第６６３９０５５号；米国特許第６７１９９７１号；米国特許第６８００７３８号；米国特許第７０７４４０４号； Coussens et al (1985) Science 230:1 132-9; Slamon et al (1989) Science 244:707-12; Slamon et al (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792）。トラスツズマブは、ＨＥＲ−２を過剰発現するヒト腫瘍細胞の増殖を阻害することが示されており、抗体依存性細胞傷害、ＡＤＣＣのメディエーターである（Hudziak et al (1989) Mol Cell Biol 9:1 165-72; Lewis et al (1993) Cancer Immunol Immunother; 37:255-63; Baselga et al (1998) Cancer Res. 58:2825-2831; Hotaling et al (1996) [abstract]. Proc. Annual Meeting Am Assoc Cancer Res; 37:471; Pegram MD, et al (1997) [abstract]. Proc Am Assoc Cancer Res; 38:602; Sliwkowski et al (1999) Seminars in Oncology 26(4), Suppl 12:60- 70; Yarden Y. and Sliwkowski, M. (2001) Nature Reviews: Molecular Cell Biology, Macmillan Magazines, Ltd., Vol. 2:127-137）。
【０００５】
ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ、ジェネンテック社）は、ＨＥＲ２を過剰発現する転移性乳がん患者の治療薬として１９９８年に承認された（Baselga et al, (1996) J. Clin. Oncol. 14:737-744）。２００６年、ＦＤＡは、ＨＥＲ２陽性、リンパ節陽性の乳がん患者のアジュバント療法のための、ドキソルビシン、シクロホスファミド、パクリタキセルを含む治療レジメンの一部としてＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）を承認した。
【０００６】
ＨＥＲ２陽性乳がんの治療のための新規抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であるトラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭｌ（Ｔ−ＤＭｌ、トラスツズマブエムタンシン、トラスツズマブエムタンシン（ａｄｏ−ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標））は、ＭＣＣリンカーを介してトラスツズマブにリジン側鎖にてコンジュゲートした細胞毒性剤ＤＭ１（チオール含有メイタンシノイド抗微小管剤）からなり、平均薬物負荷（薬物対抗体比）は約３．５である。腫瘍細胞上で発現したＨＥＲ２に結合した後、Ｔ−ＤＭ１は受容体を介した内部移行を受け、ＤＭ１を含む細胞傷害性異化産物の細胞内放出とその後の細胞死を引き起こす。ＦＤＡは、２０１３年に、以前にトラスツズマブとタキサンによる治療を受けていたＨＥＲ２陽性の転移性乳がん患者の治療のために、ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）の商品名で販売されているトラスツズマブエムタンシン（ａｄｏ−ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）を承認した。
【０００７】
ペルツズマブ（組換えヒト化モノクローナル抗体２Ｃ４、ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４、ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標）（ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ）としても知られる）は、ＨＥＲ−２を標的とする別の抗体治療法である。ペルツズマブはＨＥＲ二量体化阻害剤（ＨＤＩ）であり、ＨＥＲ２が他のＨＥＲ受容体（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４など）と活性なヘテロ二量体又はホモ二量体を形成する能力を阻害するように機能する。例えば、Harari and Yarden Oncogene 19:6102-14 (2000); Yarden and Sliwkowski. Nat Rev Mol Cell Biol 2:127-37 (2001); Sliwkowski Nat Struct Biol 10:158-9 (2003); Cho et al. Nature 421:756-60 (2003);及びMalik et al. Pro Am Soc Cancer Res 44:176-7 (2003)；米国特許第７５６０１１１号を参照。ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標）は、進行性又は後期（転移性）のＨＥＲ２陽性乳がん患者の治療のために、トラスツズマブとドセタキセルとの組み合わせで２０１２年に初めて承認された。トラスツズマブとペルツズマブを使用した併用療法は、ＨＥＲ２陽性、局所進行性、炎症性、又は初期の乳がんのネオアジュバント（手術前）治療のため、及び再発のリスクが高いＨＥＲ２陽性早期乳がん（ＥＢＣ）のアジュバント（手術後）治療のために承認されている。パージェタ（Ｐｅｒｊｅｔａ）とハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）の作用機序は、どちらもＨＥＲ２受容体に結合するが、異なる場所に結合するため、お互いに補完し合うと考えられている。パージェタとハーセプチンの組み合わせは、ＨＥＲのシグナル伝達経路をより包括的に、二重に遮断することで、腫瘍細胞の増殖と生存を妨げることができると考えられている。
【０００８】
ヒトＥｒｂＢ２のドメインＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶに対して向けられた二重特異性の二価ＨＥＲ−２抗体は、国際公開第２０１２／１４３５２３号に開示されている。Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇと呼ばれる、抗体ｒｈｕＭａｂ  ２Ｃ４及びｈｕ４Ｄ５の最適化された変異体を含む二重特異性ＨＥＲ−２抗体は、国際公開第２０１５／０９１７３８号に記載されている。
【０００９】
乳癌におけるトラスツズマブの治療効果は十分に実証されているが、耐性のためにトラスツズマブからの恩恵を受けない多くの患者がいる。低レベルのＨＥＲ２を発現している特定のがんにおける効果的な抗ＨＥＲ２療法がないこと、現在の治療法に対する耐性、及びＨＥＲ２関連がんの有病率を考慮すると、そのようながんを治療するためには新しい治療法が必要である。
【００１０】
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、活性化されたＴ細胞によって発現される誘導性分子として最初に同定された（Kwon and Weissman, 1989, Proc Natl Acad Sci USA 86, 1963-1967）。その後の研究により、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、好中球、マスト細胞、樹状細胞（ＤＣ）、内皮細胞や平滑筋細胞などの非造血性由来の細胞など、他の多くの免疫細胞も４−１ＢＢを発現することが実証された（Vinay and Kwon, 2011, Cell Mol Immunol 8, 281-284）。様々な細胞型における４−１ＢＢの発現は、大部分は誘導性であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体トリガーなどの様々な刺激シグナル、並びに共刺激分子又は炎症性サイトカインの受容体を通じて誘導されるシグナル伝達によって駆動される（Diehl et al., 2002, J Immunol 168, 3755-3762; Zhang et al., 2010, Clin Cancer Res 13, 2758-2767）。
【００１１】
４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ又はＣＤ１３７Ｌ）は、１９９３年に同定された（Goodwin et al., 1993, Eur J Immunol 23, 2631-2641）。４−１ＢＢＬの発現は、Ｂ細胞、ＤＣ及びマクロファージなどのプロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に制限されていることが示されている。４−１ＢＢＬの誘導性発現は、αβ及びγδ両方のＴ細胞サブセットを含むＴ細胞、並びに内皮細胞に特徴的である（Shao and Schwarz, 2011, J Leukoc Biol 89, 21-29）。
【００１２】
４−１ＢＢ受容体を通した共刺激（例えば４−１ＢＢＬのライゲーションによる）は、Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットの両方）内部において複数のシグナル伝達カスケードを活性化させ、Ｔ細胞活性化を強力に増強する（Bartkowiak and Curran, 2015）。ＴＣＲトリガーと組み合わせて、アゴニスト４−１ＢＢ特異的抗体は、Ｔ細胞の増殖を増強し、リンホカイン分泌を刺激し、活性化誘導細胞死に対するＴリンパ球の感受性を低下させる（Snell et al., 2011, Immunol Rev244, 197-217）。このような機序は、がん免疫療法における概念の最初の実証としてさらに進歩した。前臨床モデルでは、腫瘍を有するマウスにおける４−１ＢＢに対するアゴニスト抗体の投与は、強力な抗腫瘍効果をもたらした（Melero et al., 1997, Nat Med 3, 682-685）。その後、蓄積された証拠により、４−１ＢＢは通常、他の免疫調節化合物、化学療法剤、腫瘍特異的ワクチン接種又は放射線療法と組み合わせて投与されたときにのみ、抗腫瘍剤としてのその効力を示すことが示唆された（Bartkowiak and Curran, 2015, Front Oncol 5, 117）。
【００１３】
ＴＮＦＲスーパーファミリーのシグナル伝達は、受容体と係合するために三量体化リガンドの架橋を必要とし、野生型Ｆｃ結合を必要とする４−１ＢＢアゴニスト抗体も同様である（Li and Ravetch, 2011, Science 333, 1030-1034）。しかしながら、機能的に活性なＦｃドメインを有する４−１ＢＢ特異的アゴニスト抗体の全身投与は、マウスにおいて機能的Ｆｃ受容体の非存在下では減少するか又は有意に改善される肝毒性に関連するＣＤ８＋  Ｔ細胞の流入をもたらした（Dubrot et al., 2010, Cancer Immunol Immunother 59, 1223-1233）。クリニックにおいて、Ｆｃコンピテント４−１ＢＢアゴニストＡｂ（ＢＭＳ−６６３５１３）（ＮＣＴ００６１２６６４）は、グレード４の肝炎を生じさせ、治験終了に至った（Simeone and Ascierto, 2012, J Immunotoxicol 9, 241-247）。したがって、効果的で安全な４−１ＢＢアゴニストが必要とされている。
【００１４】
４−１ＢＢリガンドの１つの細胞外ドメインと、単鎖抗体断片（Hornig et al., 2012, J Immunother 35, 418-429; Mueller et al., 2008, J Immunother 31, 714-722）又は重鎖のＣ末端に融合した単一の４−１ＢＢリガンド（Zhang et al., 2007, Clin Cancer Res 13, 2758-2767）からなる融合タンパク質が作製されている。国際公開第２０１０／０１００５１号は、互いに連結され、抗体部分に融合された３つのＴＮＦリガンドエクトドメインからなる融合タンパク質の生成を開示している。本発明において、三量体、したがって生物学的に活性な４−１ＢＢリガンドと、腫瘍関連抗原に特異的な抗原結合ドメインと、Ｆｃ不活性ドメインとからなる抗原結合分子は、特に安定かつ強力であることが示されている。４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）を介した腫瘍特異的共刺激について、腫瘍間質におけるＦＡＰを標的とする抗原結合ドメイン及び４−１ＢＢリガンドの三量体を含む分子が特に有用であることが示され、以下ではＦＡＰ−４−１ＢＢＬと命名される。ＦＡＰ抗原結合ドメインは、特に肝臓におけるＦｃ媒介毒性の原因となる非特異的なＦｃγＲ媒介架橋を、ＦＡＰを標的とした特異的架橋に置き換えることで、毒性のリスクを低減させる。
【００１５】
本明細書では、ＨＥＲ−２を発現する腫瘍に対する新規の併用療法について説明する。
【発明の概要】
【００１６】
発明の要旨
本発明は、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト、特に４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子、及びＨＥＲ−２標的化療法と組み合わせたそれらの使用、特にがんの治療又は進行を遅延させるための方法におけるそれらの使用に関する。本明細書に記載される併用療法は、４−１ＢＢアゴニスト又は既知のＨＥＲ−２標的化療法単独での治療よりも、腫瘍増殖の阻害及び腫瘍細胞の除去においてより効果的であることが見出されている。
【００１７】
いくつかの態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストを提供し、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、ＨＥＲ−２標的化剤と組み合わせて使用され、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である。
【００１８】
いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、ＨＥＲ−２抗体、二重特異性ＨＥＲ−２抗体及び／又はＨＥＲ−２抗体薬物コンジュゲートを含む。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンを含む。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及びトラスツズマブエムタンシンからなる群から選択される。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンの組み合わせを含む。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ及びマルゲツキシマブ（ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）からなる群から選択されるＨＥＲ−２抗体を含む。一態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ又はペルツズマブである。より具体的には、ＨＥＲ−２標的化剤はトラスツズマブである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化は、糖操作ＨＥＲ−２抗体、例えば、ＴｒａｓＧｅｘである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、二重特異性ＨＥＲ−２抗体、例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、ＨＥＲ−２抗体薬物コンジュゲート、特にトラスツズマブエムタンシン（ａｄｏ−ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）である。
【００１９】
いくつかの態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む。いくつかの態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、ここで、４−１ＢＢＬのエクトドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【００２０】
さらなる態様では、４−１ＢＢアゴニストは、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である。いくつかの態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である。一態様では、腫瘍関連抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）及びＣＥＡからなる群から選択される。
【００２１】
さらなる態様では、４−１ＢＢアゴニストは、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。いくつかの態様では、４−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃγ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低減させる修飾を有するＦｃドメインを含む抗原結合分子である。腫瘍関連抗原による架橋は、非特異的ＦｃγＲ媒介架橋を回避することを可能にし、したがって、一般的な４−１ＢＢ抗体と比較して、４−１ＢＢアゴニストのより高用量かつより有効な用量を投与することができる。
【００２２】
いくつかの態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である。いくつかの態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む。
【００２３】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むか、又は、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
【００２４】
いくつかの態様では、４−１ＢＢアゴニストは、（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、及び（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、ここで、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む。いくつかの態様では、４−１ＢＢアゴニストは、（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、ここで、該抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【００２５】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む抗原結合分子である。
【００２６】
いくつかの態様では、４−１ＢＢアゴニストは、抗ＦＡＰ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である。
【００２７】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である。いくつかの態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ａ）（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
【００２８】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
【００２９】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む。
【００３０】
いくつかの態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【００３１】
さらなる態様では、４−１ＢＢアゴニストは抗ＣＥＡ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である。
【００３２】
他の態様では、４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤は、単一の組成物において一緒に投与されるか、又は２つ以上の異なる組成物において別々に投与される。さらなる態様では、４−１ＢＢアゴニストは、ＨＥＲ−２標的化剤と相乗的に作用する。他の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、ＨＥＲ−２標的化剤と同時に、その前に、又はその後に投与される。
【００３３】
さらなる態様では、４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤を含む組み合わせが提供される。一態様では、組み合わせは、医薬としての使用のためのものであり、ここで、４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤は、同時投与のためのものである。他の態様では、組み合わせは、医薬としての使用のためのものであり、ここで、４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤は、逐次投与のためのものである。
【００３４】
別の態様では、疾患、特にがんの併用治療、逐次治療又は同時治療における使用のための、（Ａ）活性成分としての４−１ＢＢアゴニスト及び薬学的に許容される担体を含む第１の組成物；及び（Ｂ）活性成分としてのＨＥＲ−２標的化剤及び薬学的に許容される担体を含む第２の組成物を含む薬学的製品が提供される。
【００３５】
さらなる態様では、４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤を含む薬学的組成物が提供される。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンを含む。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及びトラスツズマブエムタンシンからなる群から選択される。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンの組み合わせである。さらなる態様では、がんを治療すること又はがんの進行を遅延させることにおける使用のための、特に進行性固形腫瘍及び／又は転移性固形腫瘍の治療のための、薬学的組成物が提供される。
【００３６】
さらなる態様では、本発明は、増殖性疾患、特にがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための医薬の製造における、４−１ＢＢアゴニストとＨＥＲ−２標的化剤の組み合わせの使用に関する。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンを含む。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及びトラスツズマブエムタンシンからなる群から選択される。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンの組み合わせである。
【００３７】
別の態様では、本発明は、４−１ＢＢアゴニストの有効量及びＨＥＲ−２標的化剤の有効量を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法を提供する。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンを含む。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及びトラスツズマブエムタンシンからなる群から選択される。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンの組み合わせである。
【００３８】
いくつかの態様では、本発明は、４−１ＢＢアゴニストの有効量及びＨＥＲ−２標的化剤の有効量を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法に関し、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む。いくつかの態様では、４−１ＢＢアゴニストは、本明細書で提供される任意の４−１ＢＢアゴニストである。いくつかの態様では、４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤は、単一の組成物において一緒に投与されるか、又は２つ以上の異なる組成物において別々に投与される。いくつかの態様では、４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤は、静脈内又は皮下に投与される。いくつかの態様では、４−１ＢＢアゴニストは、ＨＥＲ−２標的化剤と同時に、その前に、又はその後に投与される。
【００３９】
さらなる態様では、本発明は、がんを治療すること又はがんの進行を遅延させることにおける使用のための、ＨＥＲ−２標的化剤又は薬学的組成物と組み合わせた４−１ＢＢアゴニスト；増殖性疾患、特にがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための医薬の製造における、４−１ＢＢアゴニストとＨＥＲ−２標的化剤の組み合わせの使用；又は対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法であって、がんがＨＥＲ−２陽性がんである方法に関する。いくつかの態様では、がんは、乳がん、卵巣がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、食道がん、肺がん、子宮がん、唾液腺管癌、膀胱がん、子宮内膜がん、膵臓がん、結腸がん、前立腺がん、及び／又は頭頸部がんである。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、特定のＦＡＰ−４−１ＢＢＬ抗原結合分子を示す。これらの分子は、実施例１においてより詳細に記載される。太い黒色の点は、ノブ・イントゥー・ホール修飾を表している。図１Ａは、４−１ＢＢＬ二量体及び４−１ＢＢＬ単量体に隣接するＣＨ１及びＣＬドメインに修飾を有する一価ＦＡＰ  ４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を示す。ＦＡＰバインダー４Ｂ９を含んでいるため、本明細書ではｍｏｎｏ  ＦＡＰ（４Ｂ９）−４−１ＢＢＬと命名した。図１Ｂは、ｂｉ  ＦＡＰ（４Ｂ９）−４−１ＢＢＬと命名された、バインダーＦＡＰ（４Ｂ９）を有する二価構築物を示す。図１Ｃ及び１Ｄは、非標的化対照分子を示している（ＦＡＰバインダーは、非結合性ＤＰ４７  Ｆａｂによって置換されている）。
【図２Ａ−Ｂ】図２Ａ及び２Ｂは、ハイブリッドサロゲートＦＡＰ−ｍｕ４−１ＢＢＬ（被分析物１）の、固定化マウス４−１ＢＢ及びヒトＦＡＰ又はマウスＦＡＰ（被分析物２）への同時結合をそれぞれ示す。
【図２Ｃ】図２Ｃでは、固定化マウス４−１ＢＢ及びマウスＦＡＰ（被分析物２）へのマウス二重特異性ＦＡＰ−４−１ＢＢ抗体ｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢ（被分析物１）の同時結合が示されている。
【図３】図３は、実施例４に記載したように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける単回注射後のｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢの薬物動態プロファイルを示す。安定したＰＫ挙動が観察され、化合物が１週間に１回のスケジュールで投与できることを示唆している。
【図４Ａ−Ｂ】図４Ａ及び図４Ｂは、実施例５に記載したように、ｈｕＣＤ１６ＴｇＳｃｉｄマウスの治療スケジュール及び治療群を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、トラスツズマブ単独、ハイブリッドＦＡＰ−ｍｕ４−１ＢＢＬ単独、又は両方の組み合わせで治療されたマウスにおいて観察される腫瘍増殖動態（平均±ＳＥＭ）を示す。
【図５Ｂ−Ｅ】すべての治療群に対する各動物の個々の腫瘍増殖動態を、図５Ｂ（対照群）、５Ｃ（トラスツズマブ単独による治療）、５Ｄ（ＦＡＰ−ｍｕ４−１ＢＢＬ単独による治療）、及び５Ｅ（併用による治療）に示す。試験終了時の腫瘍のないマウスの数が示されている。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
発明の詳細な説明
定義
特に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野において一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形を含み、その逆もまた同様である。
【００４２】
本明細書において使用される用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片、及び足場抗原結合タンパク質である。
【００４３】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定しないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性及び多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００４４】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる突然変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生し、一般的に少量で存在している可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、かつ／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【００４５】
本明細書で使用される用語「単一特異性」抗体とは、それぞれが同一の抗原の同一のエピトープに結合する１つ又は複数の結合部位を有する抗体を意味する。用語「二重特異性」は、抗原結合分子が少なくとも２つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は２つの抗原結合部位を含み、そのそれぞれは異なる抗原決定基に特異的である。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基、特に２つの別個の細胞上に発現した２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
【００４６】
本出願内で使用される用語「価」は、抗原結合分子における特定数の結合部位の存在を意味する。このように、用語「二価」、「四価」及び「六価」は、抗原結合分子中、それぞれ２つの結合部位、４つの結合部位及び６つの結合部位の存在を意味する。
【００４７】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然抗体構造と実質的に類似の構造を有する抗体を指す。「天然抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧクラスの抗体は、ジスルフィド結合している２つの軽鎖及び２つの重鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端にかけて、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、続いて重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端にかけて、各軽鎖は可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つの種類のうちの１つに割当てることができ、それらのいくつかはさらにサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に分けられる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つの種類のうちの１つに割り当てることができる。
【００４８】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ断片；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が挙げられる。特定の抗体断片の総説については、 Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照のこと；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片であり、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号； Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６２４８５１６（Ｂ１）号を参照のこと）。抗体断片は、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含むがこれらに限定されない様々な技術により作製することができる。
【００４９】
インタクトな抗体のパパイン消化は、各々が重鎖及び軽鎖可変ドメインと、さらには軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生成する。したがって、本明細書において使用される用語「Ｆａｂ断片」は、軽鎖（ＣＬ）のＶＬドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖断片と、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片である。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）とＦｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）２断片を生成する。
【００５０】
用語「ｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されているＦａｂ断片を指す。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの異なる鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されており、すなわちクロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖、及び重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるいるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。また一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖を含む。このクロスオーバー分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
【００５１】
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの１つを有し；ここで前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２〜５０アミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合を介して安定化されている。加えて、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基（例えばＫａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成により、さらに安定化される可能性がある。
【００５２】
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ−ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで前記抗体ドメイン及び前記リンカーはＮ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１及びｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの１つを有し；ここでＶＨ及びＶＬは、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成し、前記リンカーは少なくとも３０アミノ酸のポリペプチドである。加えて、これらのｘ−ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基（例えばＫａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成により、さらに安定化される可能性がある。
【００５３】
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０個から約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドにより連結された抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンが豊富であり、溶解性のためにセリン又はスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結するか、又はその逆に連結することができる。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の抗体の特異性を保持する。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96に記載されている。加えて、抗体断片は、ＶＨドメインの特性、すなわちＶＬドメインと一緒に機能的抗原結合部位へと組み立てられることが可能である特性、又はＶＬドメインの特性、すなわちＶＨドメインと一緒に機能的抗原結合部位へと組み立てられることが可能である特性を有し、それにより全長抗体の抗原結合特性を提供する単鎖ポリペプチドを含む。
【００５４】
「足場抗原結合タンパク質」は当技術分野で公知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）が、抗原結合ドメインのための代替足場として使用されている（例えば、Gebauer and Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeuticsを参照のこと）。Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009) and Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008)。本発明の一態様では、足場抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ−４（エビボディ（Ｅｖｉｂｏｄｙ））、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡのＺドメイン（アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）などのプロテインＡ由来分子、Ａ−ドメイン（アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）／マキシボディ（Ｍａｘｉｂｏｄｙ）、血清トランスフェリン（トランスボディ（ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ））；設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（アドネクチン（ＡｄＮｅｃｔｉｎ））、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン（Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ））；新規抗原受容体β−ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトγ−クリスタリン又はユビキチン（アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎ）分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ノッチンファミリー由来のタンパク質などのミクロボディー、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ））からなる群から選択される。
【００５５】
リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質などの小さな疎水性分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。それらは、異なる標的抗原に結合するように操作することができる円錐構造の開放端に多数のループを有する強固なβシート二次構造を有する。アンチカリンは、１６０−１８０アミノ酸のサイズであり、リポカリンに由来する。さらなる詳細は、Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)、米国特許第７２５０２９７（Ｂ１）号及び米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照のこと。
【００５６】
設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）は、内在性膜タンパク質の細胞骨格への付着を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリン（Ａｎｋｙｒｉｎ）に由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのαヘリックスとβターンとからなる３３残基のモチーフである。それらは、各リピートの第１のαヘリックス及びβターンの残基を無作為化することによって、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。それらの結合面は、モジュールの数を増加させることによって増大させることができる（親和性成熟の方法）。さらなる詳細は、J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) 及びJ. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) 及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８（Ａ１）号を参照のこと。
【００５７】
単一ドメイン抗体は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダ科の抗体重鎖の可変ドメインに由来するものであった（ナノボディ又はＶＨＨ断片）。さらに、単一ドメイン抗体という用語は、自律性ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメ由来のＶＮＡＲ断片を含む。
【００５８】
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」とは、競合アッセイにおいて参照分子とその抗原との結合を５０％以上遮断する抗原結合分子を指し、逆に参照分子は、競合アッセイにおいて抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上遮断する。
【００５９】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原に特異的に結合し、抗原の一部又は全部に相補的である領域を含む抗原結合分子の一部を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、エピトープと呼ばれる抗原の特定の部分にのみ結合することができる。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって提供されてもよい。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００６０】
本明細書において使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的区間又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体構造配置）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に見いだすことができる。本明細書の抗原として有用なタンパク質は、他に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然形態であり得る。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は「完全長」の未処理のタンパク質、並びに細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のタンパク質を包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。
【００６１】
「特異的結合」とは、結合が、抗原について選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合分子の、特定の抗原への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置における解析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)）、及び古典的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）により測定することができる。一実施態様では、抗原結合分子の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合分子の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００６２】
「親和性」又は「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（Ｋｄ）によって表される。この解離定数（Ｋｄ）は、解離速度定数と結合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比率である。したがって、等価な親和性は、速度定数の比率が同じままである限り、異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当技術分野で公知である一般的な方法により測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００６３】
用語「腫瘍関連抗原」は、腫瘍細胞によって又は腫瘍間質において高度に発現される任意の抗原を意味する。特定の腫瘍関連抗原は、ＣＥＡ又はＦＡＰである。
【００６４】
用語「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」は、プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又はセプラーゼ（ＥＣ３．４．２１）としても知られ、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＦＡＰを指す。その用語は、「完全長」の未処理のＦＡＰ並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＦＡＰを包含する。この用語は、天然に存在するＦＡＰの変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス及び／又はカニクイザルＦＡＰに特異的に結合することができる。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）アクセッション番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９、配列番号５６）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００４４５１に示されている。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６０に及ぶ。Ｈｉｓタグ付きヒトＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列は、配列番号８１に示されている。マウスＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ９７３２１（バージョン１２６、配列番号５８）、又はＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿０３２０１２に示されている。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６１に及ぶ。配列番号８３は、Ｈｉｓタグ付きマウスＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列を示している。配列番号８４は、Ｈｉｓタグ付きカニクイザルＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列を示している。好ましくは、本発明の抗ＦＡＰ結合分子はＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。例示的な抗ＦＡＰ結合分子は、国際特許出願番号ＷＯ２０１２／０２０００６Ａ２に記載されている。
【００６５】
用語「がん胎児性抗原（ＣＥＡ）」は、がん胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）としても知られており、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＣＥＡを指す。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０６７３１（バージョン１５１、配列番号６１）に示されている。ＣＥＡは、腫瘍関連抗原として長い間同定されてきた（Gold and Freedman, J Exp Med., 121:439-462, 1965; Berinstein N. L., J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002）。もともと胎児組織においてのみ発現されるタンパク質として分類されていたが、ＣＥＡは現在いくつかの正常な成人組織において同定されている。これらの組織は主に上皮起源であり、消化管、呼吸器、及び泌尿生殖器の管の細胞、並びに結腸、子宮頸部、汗腺、及び前立腺の細胞を含む（Nap et al., Tumour Biol., 9(2-3):145-53, 1988; Nap et al., Cancer Res., 52(8):2329-23339, 1992）。上皮起源の腫瘍、並びにそれらの転移は、腫瘍関連抗原としてＣＥＡを含む。ＣＥＡの存在自体はがん性細胞への形質転換を示さないが、ＣＥＡの分布は指標となる。正常組織では、ＣＥＡは一般に細胞の頂端膜側に発現しているため（Hammarstroem S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)）、血流中の抗体にアクセスできないようになっている。正常組織とは対照的に、ＣＥＡはがん性細胞の全表面にわたって発現される傾向がある（Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)）。この発現パターンの変化により、がん細胞ではＣＥＡが抗体結合にアクセスしやすくなる。さらに、ＣＥＡ発現は、がん性細胞において増加する。さらに、ＣＥＡ発現の増加は細胞間接着の増加を促進し、それが転移を引き起こし得る（Marshall J., Semin Oncol., 30(a Suppl. 8):30-6, 2003）。様々な腫瘍実体におけるＣＥＡ発現の有病率は、一般に非常に高い。公表されたデータと一致して、組織試料において行われた独自の分析は、その高い有病率を確認し、結腸直腸癌（ＣＲＣ）で約９５％、膵臓がんで９０％、胃がんで８０％、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ、ここではＨＥＲ３と共発現される）で６０％、乳がんで４０％であった；低発現は小細胞肺がん及び神経膠芽腫において見いだされた。
【００６６】
ＣＥＡは細胞表面から容易に切断され、腫瘍から直接又はリンパ管を介して血流に放出される。この特性のため、血清ＣＥＡのレベルは、がんの診断、及びがん、特に結腸直腸がんの再発のスクリーニングのための臨床マーカーとして使用されてきた（Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992; Chau I., et al., J Clin Oncol., 22:1420-1429, 2004; Flamini et al., Clin Cancer Res; 12(23):6985-6988, 2006）。
【００６７】
本明細書において使用される「Ｔ細胞抗原」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面に提示される抗原決定基を指す。
【００６８】
本明細書において使用される「Ｔ細胞活性化治療剤」は、対象においてＴ細胞活性化を誘導することができる治療剤、特に対象においてＴ細胞活性化を誘導するために設計された治療剤を指す。
【００６９】
本明細書において使用される「活性化Ｔ細胞抗原」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球によって発現される抗原決定基を指し、これは抗原結合分子との相互作用によりＴ細胞活性化を誘導又は増強することができる。具体的には、抗原結合分子と活性化Ｔ細胞抗原との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードをトリガーすることにより、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。例示的な活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３である。
【００７０】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原結合分子の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は、一般的に類似の構造を有し、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照のこと。抗原結合特異性を付与するためには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分な場合がある。
【００７１】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であり、かつ／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般に、天然の４鎖抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は最も高い配列可変性を有し、かつ／又は抗原認識に関与している。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）において生じる（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５及びＨ３の９５−１０２において生じる（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。超可変領域（ＨＶＲ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して本明細書では互換的に使用される。この特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」 (1983) 及びChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)に記載されており、ここでの定義には、互いに対して比較されたときのアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それにもかかわらず、抗体又はその変異体のＣＤＲを指す定義のいずれかの適用は、本明細書で定義され、使用される用語の範囲内であることを意図している。上記で引用した参考文献のそれぞれによって定義されるＣＤＲを含む適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表Ｂに示す。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変わるであろう。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられれば、どの残基が特定のＣＤＲを構成するかを日常的に決定することができる。
【００７２】
2021515781.tif 000002
【００７３】
また、Ｋａｂａｔらは、任意の抗体に適用可能な可変領域配列のための番号付けシステムを定義した。当業者は、配列自体を超える実験データに依存することなく、この「Ｋａｂａｔ番号付け」のシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。ここで使用される「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983)によって示された番号付けシステムを指す。特に明記しない限り、抗体可変領域内の特定のアミノ酸残基位置の番号付けへの参照は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従っている。
【００７４】
ＶＨのＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲはまた、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、短縮型（ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ−）ＣＤＲ又はａ−ＣＤＲと称されるＣＤＲの領域内に含まれている。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８及びＨ３の９５−１０２において生じる（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）。特に明記しない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では上記のＫａｂａｔらに従って番号付けされている。
【００７５】
本明細書において抗原結合分子（例えば抗体）の文脈で使用される用語「親和性成熟」は、参照抗原結合分子に由来し、例えば変異により、参照抗体と同じ抗原に、好ましくは同じエピトープに結合し；参照抗原結合分子の抗原に対する親和性よりも高い親和性を有する抗原結合分子を指す。親和性成熟は一般に、抗原結合分子の１つ又は複数のＣＤＲにおける１つ又は複数のアミノ酸残基の修飾を含む。典型的には、親和性成熟抗原結合分子は、最初の参照抗原結合分子と同じエピトープに結合する。
【００７６】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は一般に、ＶＨ（又はＶＬ）の次の配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４に現れる。
【００７７】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含み得るか、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。いくつかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００７８】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
【００７９】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００８０】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここではＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべて又は実質的にすべてが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定数領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して本発明による特性を生成するように定常領域が追加的に修飾されているもの又は元の抗体から変更されているものである。
【００８１】
「ヒト」抗体は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のものに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００８２】
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基に及ぶ。一実施態様では、糖鎖がＣＨ２ドメインに結合している。本明細書のＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインであり得る。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域のＣ末端からＣＨ２ドメインまでのひと続きの残基（すなわち、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基まで）を含む。本明細書におけるＣＨ３領域は、天然配列のＣＨ３ドメイン又は変異体ＣＨ３ドメイン（例えば、一方の鎖に「隆起」（「ノブ」）が導入され、他方の鎖に対応する「空洞」（「ホール」）が導入されたＣＨ３ドメイン；参照により本明細書に明示的に組み込まれる米国特許第５８２１３３３号を参照）であり得る。そのような変異体ＣＨ３ドメインは、本明細書に記載されるように、２つの同一でない抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進するために使用され得る。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在しなくてもよい。本明細書に特に明記しない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従っている。
【００８３】
ノブ・イントゥー・ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；米国特許第７６９５９３６号； Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載される。一般に、この方法は、第１のポリペプチドの接触面において隆起（「ノブ」）及び第２のポリペプチドの接触面において対応する空洞（「ホール」）を導入することを含み、その結果、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように、隆起が空洞内に配置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの接触面から小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。隆起と同一か又は類似のサイズの相補的空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することによって、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的変異誘発により、又はペプチド合成により改変することにより作り出すことができる。特定の実施態様では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのもう一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。さらなる特定の実施態様では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃをさらに含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃをさらに含む。これら２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、したがって二量体をさらに安定化する（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【００８４】
「免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子変異体、並びに置換、付加、又は欠失を生じさせるが、免疫グロブリンのエフェクター機能（抗体依存性細胞傷害など）の媒介能を実質的に低下させない改変を有する変異体を含むことを意図している。例えば、１つ又は複数のアミノ酸を、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から、生物学的機能を実質的に失うことなく欠失させることができる。そのような変異体は、活性に対する影響が最小限であるように、当技術分野で公知の一般的な規則に従って選択することができる（例えば、Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990)を参照のこと）。
【００８５】
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞の活性化が含まれる。
【００８６】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域の結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を生じさせるＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１を参照）。
【００８７】
「エクトドメイン」は、細胞外空間（すなわち標的細胞外の空間）中に延びる膜タンパク質のドメインである。エクトドメインは通常、表面との接触を開始するタンパク質の部分であり、シグナル伝達をもたらす。したがって、本明細書で定義される４−１ＢＢＬのエクトドメインは、細胞外空間（細胞外ドメイン）中に延びる４−１ＢＢＬの部分を指すが、三量体化及び対応する受容体４−１ＢＢへの結合に関与するそのより短い部分又はその断片も含まれる。したがって、用語「４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片」は、細胞外ドメインを形成する４−１ＢＢＬの細胞外ドメイン又は受容体に依然として結合することができるその部分（受容体結合ドメイン）を指す。
【００８８】
「４−１ＢＢＬ」又は「４−１ＢＢリガンド」又は「ＣＤ１３７Ｌ」は、Ｔ細胞の増殖及びサイトカイン産生を共刺激することができる共刺激性ＴＮＦリガンドファミリーメンバーである。共刺激性ＴＮＦファミリーリガンドは、対応するＴＮＦ受容体と相互作用するとＴＣＲシグナルを共刺激することができ、それらの受容体との相互作用は、Ｔ細胞活性化をもたらすシグナル伝達カスケードを開始するＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）の動員につながる。４−１ＢＢＬはＩＩ型膜貫通タンパク質である。配列番号６２のアミノ酸配列を有する完全又は完全長４−１ＢＢＬは、細胞の表面上に三量体を形成することが記載されている。三量体の形成は、４−１ＢＢＬのエクトドメインの特定のモチーフにより可能になる。前記モチーフは、本明細書では、「三量体化領域」と命名される。ヒト４−１ＢＢＬ配列（配列番号６３）のアミノ酸５０−２５４は、４−１ＢＢＬの細胞外ドメインを形成するが、その断片も三量体を形成することができる。本発明の特定の実施態様では、用語「４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片」は、配列番号４（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸５２−２５４）、配列番号１（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸７１−２５４）、配列番号３（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８０−２５４）、配列番号２（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８５−２５４）、配列番号５（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸７１−２４８）、配列番号６（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８５−２４８）、配列番号７（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８０−２４８）及び配列番号８（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸５２−２４８）から選択されるアミノ酸を有するポリペプチドを指すが、三量体化が可能なエクトドメインの他の断片も本明細書に含まれる。
【００８９】
本明細書で使用される用語「４−１ＢＢ」又は「ＣＤ１３７」は、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然４−１ＢＢを指す。その用語は、「完全長」の未処理の４−１ＢＢだけでなく、細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態の４−１ＢＢを含む。その用語はまた、４−１ＢＢの天然に生じる変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を含む。例示的なヒト４−１ＢＢのアミノ酸配列は、配列番号８８（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｑ０７０１１）に示されており、例示的なマウス４−１ＢＢのアミノ酸配列は配列番号８９（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ２０３３４）に示されており、例示的なカニクイザル４−１ＢＢのアミノ酸配列（アカゲザル由来）は配列番号６６（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｆ６Ｗ５Ｇ６）に示されている。
【００９０】
用語「抗４−１ＢＢ抗体」、「抗４−１ＢＢ」、「４−１ＢＢ抗体」及び「４−１ＢＢに特異的に結合する抗体」は、その抗体が４−１ＢＢを標的とする際に診断薬及び／又は治療剤として有用であるように、十分な親和性で４−１ＢＢに結合することができる抗体を指す。一実施態様では、抗４−１ＢＢ抗体の、無関係な、非４−１ＢＢタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定される場合、抗体の４−１ＢＢへの結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、４−１ＢＢに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−６Ｍ以下、例えば１０−６８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−８Ｍから１０−１０Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【００９１】
用語「ＨＥＲ−２」は、「ＥｒｂＢ２」、「ＥｒｂＢ２受容体」又は「ｃ−Ｅｒｂ−Ｂ２」としても知られ、細胞内でのＨＥＲ−２前駆体タンパク質のプロセシングから生じる、任意の天然の成熟ＨＥＲ−２を指す。この用語は、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のＨＥＲ−２を指す。この用語は、天然に存在するＨＥＲ−２の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も含む。例示的なヒトＨＥＲ−２タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号９５に示されている。
【００９２】
用語「ペプチドリンカー」は、１つ又は複数のアミノ酸、典型的には約２から２０個のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは当技術分野において公知であるか、又は本明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーであり、ここで「ｎ」は通常１から１０、典型的には２から４の数字、特に２であり、すなわち、ＧＧＧＧＳ（配列番号６７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６８）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号６９）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号７０）から成る群から選択されるペプチドであるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号７１）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７２）、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号７３）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号７４）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号７５）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号７６）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号７７）、ＧＧＳＧ（配列番号７８）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号７９）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号８０）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号８１）も含む。特に興味深いペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）（配列番号６７）、（Ｇ４Ｓ）２及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６８）である。
【００９３】
本出願の中で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシαアミノ酸の群を意味する。
【００９４】
「融合された」又は「連結された」とは、成分（例えば、４−１ＢＢＬのエクトドメイン及びポリペプチド）が、直接又は１つ又は複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合によって連結されることを意味する。
【００９５】
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の百分率として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ．ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。また、ＡＬＩＧＮ−２は、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であるか、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ(登録商標)のＶ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ(登録商標)オペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされていなければならない。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ａは、所与のアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有するか又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
１００×分率Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、そのプログラムのＡとＢとの配列比較において、完全一致を記録したアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように得られる。
【００９６】
特定の実施態様では、本明細書に提供される抗原結合分子のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗原結合分子の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗原結合分子のアミノ酸配列変異体は、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により調製することができる。そのような修飾には、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はそれへの挿入、及び／又はそれの置換が含まれる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを、最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を有することを条件として、最終構築物に到達するために行うことができる。置換突然変異誘発のための目的の部位には、ＨＶＲ及びフレームワーク（ＦＲ）が含まれる。保存的置換は、表Ｃにおいて「好ましい置換」の見出しの下で提供され、アミノ酸側鎖クラス（１）〜（６）を参照して以下にさらに記載される。アミノ酸置換を目的の分子に導入することができ、その生成物を、所望の活性、例えば抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善についてスクリーニングすることができる。
【００９７】
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【００９８】
アミノ酸は共通の側鎖特性に従ってグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
【００９９】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを必要とするであろう。
【０１００】
用語「アミノ酸配列変異体」は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ又は複数の超可変領域残基にアミノ酸置換が存在する実質的変異体を含む。一般に、さらなる研究のために選択された得られた変異体は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、かつ／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載のものなどファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を使用して簡便に生成することができる。簡潔には、１つ又は複数のＣＤＲ残基が変異され、変異体抗原結合分子がファージ上に提示され、特定の生物活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングされる。特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、そのような改変が抗原結合分子が抗原に結合する能力を実質的に低減させない限り、１つ又は複数のＣＤＲで起こり得る。例えば、実質的に結合親和性を低減させない保存的改変（例えば本明細書において提供される保存的置換）が、ＨＶＲにおいて行われ得る。突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により記載されているように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基のうちの残基又は群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置換される。そのアミノ酸位置にさらなる置換を導入して、最初の置換に対する機能的感受性を実証することができる。別法として又はそれに加えて、抗体と抗原との接触点を特定するための抗原−抗原結合分子複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされてもよいし、又は排除されてもよい。変異体は、所望の特性を含むかどうかを判定するためにスクリーニングされ得る。
【０１０１】
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗原結合分子が含まれる。分子の他の挿入変異体には、抗原結合分子の血清半減期を増加させるポリペプチドへのＮ末端又はＣ末端への融合が含まれる。
【０１０２】
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗原結合分子は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように改変される。分子のグリコシル化変異体は、１つ又は複数のグリコシル化部位が生成又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって簡便に得ることができる。抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合、それに結合している糖は改変され得る。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合によって通常結合している分枝状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖には、様々な糖、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施態様では、特定の改善された特性を有する変異体を作製するために、抗原結合分子中のオリゴ糖の修飾が行われ得る。一態様では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）結合するフコースを欠いた糖鎖構造を有する抗原結合分子の変異体が提供される。そのようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Presta, L.）又は米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照のこと。本発明の抗原結合分子のさらなる変異体は、二分されたオリゴ糖を含むもの、例えば、Ｆｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されているものを含む。そのような変異体は、フコシル化が低減されている可能性があり、かつ／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有する可能性がある。例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairet等）；米国特許第６６０２６８４号（Umana等）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umana等）を参照のこと。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する変異体も提供される。そのような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有してもよく、例えば国際公開第１９９７／３００８７号（Patel等）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju, S.）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Raju, S.）に記載されている。
【０１０３】
特定の実施態様では、本発明の抗原結合分子のシステイン操作変異体（ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｖａｒｉａｎｔ）、例えば分子の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換された「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作成することが望ましい場合がある。特定の実施態様では、置換される残基は分子の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能な部位に配置され、その反応性チオール基を使用して抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分に結合させ、イムノコンジュゲートを作成することができる。特定の実施態様では、次の残基のうちのいずれか１つ又は複数がシステインと置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗原結合分子は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
【０１０４】
特定の態様では、本明細書に提供される抗原結合分子は、当技術分野で公知であり、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むようにさらに修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマー）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール並びにこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは任意の分子量のものであってよく、分枝鎖又は非分枝鎖であってよい。抗体に付着するポリマーの数は変化してよく、１つを超えるポリマーが付着する場合、それらは同じ分子でも又は異なる分子でもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、二重特異性抗体誘導体が限定条件下での治療に使用されるかどうかなどを含むが、これらに限定されない考慮事項に基づいて決定することができる。別の態様では、抗体と、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る非タンパク質性部分とのコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質性部分はカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は、任意の波長であってよく、限定しないが、通常の細胞に害を与えないが抗体−非タンパク質部分の近位細胞を死滅させる温度に非タンパク質部分を加熱する波長を含む。別の態様では、本明細書に提供される４−１ＢＢＬ含有抗原結合分子のイムノコンジュゲートが得られる。「イムノコンジュゲート」は、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、１つ又は複数の異種分子にコンジュゲートした抗体である。
【０１０５】
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来ＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的な結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の１つ又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【０１０６】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、その天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。例えば、ベクターに含まれるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持される組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外に、又は天然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの本発明のＲＮＡ転写物、並びにプラス鎖型及びマイナス鎖型、及び二重鎖型を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成により生成されたそのような分子をさらに含む。さらに、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターなどの調節エレメントであり得るか、又はそれらを含み得る。
【０１０７】
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列がその参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドごとに５個までの点突然変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列がその参照配列と同一であることを意味する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが削除され又は別のヌクレオチドで置換されても良く、又は参照配列に含まれるすべてのヌクレオチドの最大５％までの複数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてもよい。参照配列のこのような改変は、参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置で、又はこれら末端位置の間のどの位置で起こってもよく、参照配列中の残基間に個々に散在してもよいし、又は参照配列内に１つ若しくは複数の連続した群として散在してもよい。実際問題として、特定のポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）などの既知のコンピュータプログラムを用いて慣例的に判定することができる。
【０１０８】
用語「発現カセット」は、組換え的又は合成的に生成されたポリヌクレオチドであって、標的細胞における特定の核酸の転写を可能にする一連の指定された核酸要素を有するものを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、他の配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【０１０９】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞内においてそれが作動可能に結合する特定の遺伝子を導入し、その発現を誘導するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及びそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞の転写及び／又は翻訳機構により産生される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【０１１０】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、それには初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、突然変異を含んでいてもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用することができる任意の種類の細胞系である。宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞等の哺乳動物の培養細胞、又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞が含まれるだけでなく、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。
【０１１１】
薬剤の「有効量」は、それが投与される細胞又は組織中に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
【０１１２】
本発明による併用療法は、相乗効果を有する。２つの化合物の「相乗効果」とは、２つの薬剤の組み合わせの効果がそれらの個々の効果の合計よりも大きく、対照や単一の薬物とは統計的に異なる効果のことである。別の実施態様では、本明細書に開示される併用療法は相加効果を有する。２つの化合物の「相加効果」とは、２つの薬剤の組み合わせの効果がそれらの個々の効果の合計であり、対照及び／又は単一の薬物のいずれかと統計的に異なる効果のことである。
【０１１３】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、減少させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
【０１１４】
「個体」又は「対象」とは、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
【０１１５】
用語「薬学的組成物」は、その中に含まれる活性成分の生物活性が有効であることを可能にするような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である付加的成分を含まない調製物を指す。
【０１１６】
「薬学的に許容される担体」は、薬学的組成物中の有効成分以外の成分で、対象に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容される添加物には、限定されないが、バッファー、安定剤又は保存剤が含まれる。
【０１１７】
用語「添付文書」は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、そのような治療製品の適応症、用法、用量、投与、併用療法、使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【０１１８】
本明細書で用いられる場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために行うことも、臨床病理の過程において行うこともできる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明の分子は、疾患の発症を遅延させるか、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【０１１９】
用語「がん」及び「がん性」とは、無秩序な細胞増殖、すなわち固形腫瘍又は黒色腫などの増殖性疾患によって典型的に特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指すか又は説明する。「腫瘍」は、１つ又は複数のがん性細胞を含む。本明細書で使用される用語「固形腫瘍」は、通常、嚢胞又は液体領域を含まない組織の異常な塊を指す。固形腫瘍は良性又は悪性の場合がある。がんの例には、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病及びリンパ性腫瘍が含まれる。このようながんの具体的な例には、乳がん、扁平上皮細胞がん（例えば、上皮性扁平上皮細胞がん）、小細胞肺がんを含む肺がん、非小細胞肺がん（「ＮＳＣＬＣ」）、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜のがん、肝細胞がん、消化管がんを含む胃（ｇａｓｔｒｉｃ又はｓｔｏｍａｃｈ）がん、膵がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、ヘパトーマ、大腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜又は子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ又はｒｅｎａｌ）がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌、肛門癌、陰茎癌、及び頭頸部がんが含まれる。好ましい実施態様では、がんは、乳がんである。別の好ましい実施態様では、がんは胃がんである。
【０１２０】
腫瘍又はがんを「ステージ０」、「ステージＩ」、「ステージＩＩ」、「ステージＩＩＩ」、「ステージＩＩＩ」又は「ステージＩＶ」、及びこの分類内の様々なサブステージとして言及することは、当技術分野で公知の総合的ステージ分類法又はローマ数字ステージ分類法を用いた腫瘍又はがんの分類を示している。がんの実際のステージはがんの種類によるものの、一般的に、ステージ０のがんはｉｎ  ｓｉｔｕ病変であり、ステージＩのがんは小さな限局性腫瘍であり、ステージＩＩとＩＩＩのがんは局所リンパ節の浸潤を示す局所進行性腫瘍であり、ステージＩＶのがんは転移性がんを表す。腫瘍の各種類の具体的なステージは、熟達した臨床医に知られている。
【０１２１】
用語「転移性乳がん」は、がん細胞が、元の部位から血管又はリンパ管によって体内の別の場所で１つ以上の部位に転移し、乳房以外の１つ以上の臓器に１つ以上の二次性腫瘍を形成する乳がんの状態をいう。
【０１２２】
「進行した」がんとは、局所浸潤又は転移のいずれかによって、発生部位又は臓器の外に広がったがんのことである。したがって、「進行した」がんという用語には、局所進行性及び転移性疾患の両方が含まれる。「難治性」のがんは、化学療法などの抗腫瘍剤ががん患者に投与されているにもかかわらず進行するがんである。難治性のがんの例は、プラチナ製剤不応性のがんである。「再発性」がんは、手術などの初期治療への反応後に、最初の部位又は離れた部位のいずれかで再成長したがんである。「局所再発」がんは、治療後に、以前に治療されたがんと同じ場所で再発するがんである。「手術可能な」又は「切除可能な」がんは、原発臓器に限局し、手術（切除）に適したがんである。「切除不能（ｎｏｎ−ｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ）」又は「切除不能（ｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ）」のがんは、手術によって取り除く（切除する）ことができない。
【０１２３】
「ＨＥＲの発現、増幅、又は活性化を示す」がん又は生物学的試料は、診断試験において、ＨＥＲ受容体を発現し（過剰発現を含む）、ＨＥＲ遺伝子を増幅し、及び／又はそうでなければＨＥＲ受容体の活性化又はリン酸化を示すものである。
【０１２４】
用語「ＨＥＲ−２陽性」及び「ＨＥＲ−２発現」は、本明細書では互換的に使用される。「ＨＥＲ−２陽性」がんは、ＨＥＲ−２のレベルが通常よりも高いがん細胞を含む。ＨＥＲ−２陽性のがんの例には、ＨＥＲ−２陽性の乳がん及びＨＥＲ２陽性の胃がんが含まれる。任意選択的に、ＨＥＲ２陽性はＨＥＲ−２過剰発現がんであり、特定の実施態様では、ＨＥＲ−２陽性がんは、２＋又は３＋の免疫組織化学（ＨＣ）スコア及び／又は≧２．０のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）増幅比を有する。
【０１２５】
Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、蛍光、発色、又は銀検出システム（すなわち、ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、又はＳＩＳＨ）、又はＣＩＳＨとＳＩＳＨシステムの組み合わせ（明視野二重ＩＳＨ（ＢＤＩＳＨ）又はデュアルハプテン、デュアルカラーＩＳＨ（ＤＤＩＳＨ））に結合されたＤＮＡプローブを使用して、ｈｅｒ２コピーの数を決定する。ＩＳＨは、核あたりのｈｅｒ２コピーのみを列挙するために単一のプローブを使用して実施することができ、又は染色体１７セントロメアプローブ（染色体列挙プローブ１７、ＣＥＰ１７）のハイブリダイゼーションが、ｈｅｒ２：ＣＥＰ１７の比を決定することを可能にするデュアルプローブ技術として実施することができる。２プローブアプローチは、同じスライド上の２つのプローブのコハイブリダイゼーションによるデュアルカラー技術として、又は各プローブが連続したスライド上で使用されるモノクロームアッセイとして実行することができる。ｈｅｒ２：ＣＥＰ１７比は、平均ｈｅｒ２コピー数よりもｈｅｒ２増幅状態のより良い反映と見なされることがあるが、後者が、腫瘍の有糸分裂指数、切片の厚さ、核のトランケーション効果、及び異常な染色体コピー数（ａｎｅｕｓｏｍｙ）などの他のパラメータにも依存するためである。「ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）増幅比≧２．０」という語句は、ｈｅｒ２：ＣＥＰ１７比≧２．０を指す。さらなる詳細については、Sauter G, et al. Guidelines for human epidermal growth factor receptor 2 testing: biologic and methodologic considerations. J Clin Oncol 2009; 27: 1323-1333、及びHanna et al. Modern Pathology(2014) 27, 4-18の総説論文を参照のこと。
【０１２６】
本明細書では、「患者」又は「対象」はヒト患者である。患者は、「がん患者」、すなわち、がん、特に胃がん又は乳がんのうちの１つ又は複数の症状に罹患しているか、又は罹患する危険性のある患者であり得る。
【０１２７】
「患者集団」は、がん患者の群を指す。そのような集団は、ペルツズマブなどの薬物の統計的に有意な有効性及び／又は安全性を実証するために使用できる。「再発した」患者とは、寛解後にがんの徴候又は症状を示す患者である。任意に、患者は、アジュバント又はネオアジュバント療法後に再発している。
【０１２８】
本明細書における「ネオアジュバント療法」又は「術前療法」は、手術前に行われる療法を指す。ネオアジュバント療法の目標は、即時の全身治療を提供することであり、通常の手術とそれに続く全身療法が行われた場合に増殖するであろう微小転移を根絶する可能性がある。ネオアジュバント療法は、腫瘍サイズの縮小にも役立ち、それにより当初は切除不可能な腫瘍の完全な切除、又は臓器の一部とその機能の維持を可能にする。さらに、ネオアジュバント療法は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの薬効評価を可能にし、その後の治療法の選択の指針となる可能性がある。
【０１２９】
本明細書における「アジュバント療法」は、疾患の再発のリスクを低減するために、残存疾患の証拠を検出することができない、根治手術後に行われる療法を指す。アジュバント療法の目標は、がんの再発を防ぎ、がんに関連した死亡の可能性を減らすことである。本明細書におけるアジュバント療法は、ネオアジュバント療法を特に除外する。
【０１３０】
「化学療法」は、がんの治療に有用な化学療法剤の使用を指す。
【０１３１】
「化学療法剤」は、作用機序にかかわらず、がんの治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤のクラスには、アルキル化剤、代謝拮抗剤、紡錘体毒植物アルカロイド、細胞傷害性／抗腫瘍性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、抗体、光増感剤、及びキナーゼ阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３２】
「ＣＤ２０」は、Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０を指し、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１又は白血球表面抗原Ｌｅｕ−１６としても知られており、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＣＤ２０を含む。ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ１１８３６（バージョン１４９、配列番号８５）に示されている。ＣＤ２０は、プレＢ及び成熟Ｂリンパ球に発現される、約３５ｋＤの分子量を有する疎水性膜貫通タンパク質である。対応するヒト遺伝子は、膜貫通４ドメイン、サブファミリーＡ、メンバー１であり、ＭＳ４Ａ１としても知られる。この遺伝子は、膜貫通４Ａ遺伝子ファミリーのメンバーをコードする。この新生タンパク質ファミリーのメンバーは、共通の構造的特徴及び類似のイントロン／エクソンのスプライス境界により特徴づけられ、造血細胞及び非リンパ系組織の中に固有の発現パターンを示す。この遺伝子は、Ｂ細胞の発生及び形質細胞への分化に役割を果たすＢリンパ球表面分子をコードしている。このファミリーメンバーは、ファミリーメンバーのクラスターの中で、１１ｑ１２に局在する。この遺伝子の選択的スプライシングにより、同じタンパク質をコードする２つの転写変異体が生じる。用語「ＣＤ２０」は、「完全長」の未処理のＣＤ２０だけでなく、細胞内でのプロセシングから生じるあらゆる形態のＣＤ２０を包含する。その用語はまた、ＣＤ２０の天然に生じる変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を含む。
【０１３３】
用語「抗ＣＤ２０抗体」及び「ＣＤ２０に結合する抗体」は、その抗体がＣＤ２０を標的とする際に診断薬及び／又は治療剤として有用であるように、十分な親和性でＣＤ２０に結合することができる抗体を指す。一実施態様では、抗ＣＤ２０抗体の、無関係な、非ＣＤ２０タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＣＤ２０への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、ＣＤ２０に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の実施態様では、抗ＣＤ２０抗体は、異なる種からのＣＤ２０間で保存されているＣＤ２０のエピトープに結合する。
【０１３４】
「ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体」は、Cragg et al., Blood 103 (2004) 2738-2743; Cragg et al., Blood 101 (2003) 1045-1052, Klein et al., mAbs 5 (2013), 22-33に記載される、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体の結合特性及び生物活性を有する抗ＣＤ２０抗体を意味する。ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、ＣＤ２０のクラスＩＩエピトープに結合し、ＣＤ２０を脂質ラフトに局在化せず、ＡＤＣＣ活性を示すが、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体であればＣＤＣが低く、クラスＩ  ＣＤ２０エピトープに結合する抗体と比較してＢ細胞への結合能力が低く、同型凝集及び強い死誘導を示す。ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体の例には、例えば、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１）、トシツモマブ（Ｂ１）、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体ＩｇＧ１（国際公開２００５／０４４８５９号に開示されるようなキメラヒト化ＩｇＧ１抗体）、１１Ｂ８  ＩｇＧ１（国際公開２００４／０３５６０７号に開示）及びＡＴ８０  ＩｇＧ１が含まれる。特定の態様では、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体はオビヌツズマブである（推奨国際一般名、WHO Drug Information, Vol. 26, No. 4, 2012, p. 453）。本明細書で使用される場合、オビヌツズマブは、ＧＡ１０１と同義である。商品名は、ＧＡＺＹＶＡ（登録商標）又はＧＡＺＹＶＡＲＯ（登録商標）である。これは、すべての旧バージョン（例えば、Vol. 25, No. 1, 2011, p.75-76）を置き換え、以前はアフツズマブとして知られていたものである（推奨国際一般名、WHO Drug Information, Vol. 23, No. 2, 2009, p. 176; Vol. 22, No. 2, 2008, p. 124）。一態様では、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体はトシツモマブである。
【０１３５】
本発明における使用のための例示的４−１ＢＢアゴニスト
本発明は、４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化療法と組み合わせたそれらの使用、特にがんの治療又は進行を遅延させるための方法におけるそれらの使用に関する。いくつかの実施態様では、４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化療法と組み合わせたそれらの使用は、固形腫瘍の治療又は進行を遅延させるための方法におけるものである。
【０１３６】
特に、ＨＥＲ−２標的化療法と組み合わせて使用される４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬを含む分子である。特に、本発明で使用される４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む。
【０１３７】
特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、ここで、４−１ＢＢＬのエクトドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【０１３８】
４−１ＢＢアゴニストは、腫瘍関連抗原、特にがん細胞上又は間質内の標的に特異的な抗原結合ドメインを含む場合に特に有用である。したがって、特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又はＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である。
【０１３９】
さらなる態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む。
【０１４０】
特定の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
【０１４１】
さらなる態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むか、又は、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。より具体的には、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
【０１４２】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である。一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。特に、４−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。
【０１４３】
一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む。
【０１４４】
特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする。
【０１４５】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【０１４６】
特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
ａ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｂ）配列番号４５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子
からなる群から選択される抗原結合分子である。
【０１４７】
特に、４−１ＢＢアゴニストは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む抗原結合分子である。
【０１４８】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である。
【０１４９】
一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び  
（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ここで、ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドは、任意選択的にペプチドリンカーを介して、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合される。
【０１５０】
特定の二重特異性抗体は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／０７５２７８Ａ１又はＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／１５６２９１Ａ１に記載されている。
【０１５１】
さらなる態様では、４−１ＢＢアゴニストは抗ＦＡＰ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である。
【０１５２】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
【０１５３】
さらなる態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
【０１５４】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である。一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。特に、４−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。
【０１５５】
一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む。
【０１５６】
特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする。
【０１５７】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【０１５８】
特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号８２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号８３のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む抗原結合分子である。
【０１５９】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である。
【０１６０】
一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び  
（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ここで、ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドは、任意選択的にペプチドリンカーを介して、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合される。
【０１６１】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、抗ＣＥＡ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である。
【０１６２】
ＨＥＲ−２を標的とする薬剤
本発明の態様では、本明細書に記載される４−１ＢＢアゴニストは、ＨＥＲ−２標的化療法と組み合わせて使用される。
【０１６３】
本発明のいくつかの態様では、４−１ＢＢアゴニストは、ＨＥＲ−２標的化剤と組み合わせて使用される。いくつかの実施態様では、薬剤は、ＨＥＲ−２と相互作用する。いくつかの実施態様では、薬剤はＨＥＲ−２アンタゴニストである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、ＨＥＲ−２抗体、二重特異性ＨＥＲ−２抗体及び／又はＨＥＲ−２抗体薬物コンジュゲートを含む。いくつかの実施態様では、薬剤は、抗体又は抗原結合断片、特に抗ＨＥＲ−２抗体である。いくつかの実施態様では、薬剤は、二重特異性ＨＥＲ−２抗体である。いくつかの実施態様では、薬剤は、抗体−薬物コンジュゲートである。
【０１６４】
いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンを含む。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及びトラスツズマブエムタンシンからなる群から選択される。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンの組み合わせを含む。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ及びマルゲツキシマブ（ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）からなる群から選択されるＨＥＲ−２抗体を含む。一態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ又はペルツズマブである。より具体的には、ＨＥＲ−２標的化剤はトラスツズマブである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化は、糖操作ＨＥＲ−２抗体、例えば、ＴｒａｓＧｅｘである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、二重特異性ＨＥＲ−２抗体、例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、ＨＥＲ−２抗体薬物コンジュゲート、特にトラスツズマブエムタンシン（ａｄｏ−ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）である。
【０１６５】
いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、配列番号９６の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号９７の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体を含む。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、配列番号９８の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号９９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体を含む。
【０１６６】
いくつかの実施態様では、及び本明細書に記載される任意の使用のために、薬剤は、トラスツズマブ（ＣＡＳ  １８０２８８−６９−１、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ペルツズマブ（ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４、ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）又はトラスツズマブエムタンシン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−ＭＣＣ−ＤＭｌ，Ｔ−ＤＭｌ、ａｄｏ−ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ、ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標））を含む。いくつかの実施態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンである。いくつかの実施態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及びトラスツズマブエムタンシンからなる群から選択される。いくつかの実施態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンの組み合わせを含む又はそれからなる。いくつかの実施態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブとペルツズマブの組み合わせを含む又はそれからなる。より具体的には、薬剤はトラスツズマブである。
【０１６７】
トラスツズマブは、細胞ベースのアッセイにおいて、ＨＥＲ−２の細胞外ドメインに高親和性で（Ｋｄ＝５ｎＭ）選択的に結合するマウス抗ＨＥＲ−２抗体（４Ｄ５）のヒト化バージョンである、組換えＤＮＡ由来のＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体である。トラスツズマブは、マウス４Ｄ５抗体の抗原結合残基を有するか、又はマウス４Ｄ５抗体に由来する抗体である（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４６３、１９９０年５月２４日に、ブダペスト条約の下でアメリカンタイプカルチャーコレクション、１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．２０８５２に寄託）。例示的なヒト化４Ｄ５抗体には、米国特許第５８２１３３７号にあるように、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−ｌ、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７及びｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））が含まれる。
【０１６８】
ペルツズマブは、ヒトＩｇＧ１（Ｋ）フレームワークに基づいて生成された組換えヒト化モノクローナル抗体であり、例えば米国特許第７５６０１１１号を参照のこと。ペルツズマブは、トラスツズマブとは、軽鎖のエピトープ結合領域（１２アミノ酸の違い）と重鎖のエピトープ結合領域（３０アミノ酸の違い）が異なる。これらの違いの結果として、ペルツズマブはＨＥＲ２受容体上の完全に異なるエピトープに結合する。ヒト上皮細胞のＨＥＲ２受容体へのペルツズマブの結合は、それがＨＥＲ受容体ファミリーの他のメンバーと複合体を形成するのを妨げる（Agus et al., Cancer Cell 2:127-137 (2002)）。複合体形成をブロックすることにより、ペルツズマブは複合体に対するリガンド（例えば、ＥＧＦ及びヘレグリン）の増殖刺激効果を妨げる。
【０１６９】
トラスツズマブエムタンシンは、トラスツズマブがリンカー部分ＭＣＣを介してメイタンシノイド薬物部分ＤＭ１に連結された抗体−薬物コンジュゲートである（米国特許第５２０８０２０号；米国特許第６４４１１６３号）。抗体に対する薬物の比率又は薬物負荷量は、１から約８までの整数値の範囲である。トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭｌには、１、２、３、４、５、６、７、及び８の薬物部分が抗体トラスツズマブに共有結合している、様々に負荷され、結合した抗体−薬物コンジュゲートのすべての混合物が含まれる（米国特許第７０９７８４０号；米国特許出願公開第２００５／０２７６８１２号；米国特許出願公開第２００５／０１６６９９３号）。平均薬物負荷は、約３．５である。
【０１７０】
トラスツズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブエムタンシンは任意の組み合わせで使用することができる。いくつかの実施態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ及びペルツズマブを含む。
【０１７１】
本明細書で使用される用語「ＨＥＲ−２標的化療法」、「ＨＥＲ−２標的化剤」及び「ＨＥＲ−２と相互作用する薬剤」は、ＨＥＲ−２（ＥｒｂＢ２）受容体チロシンキナーゼを標的とする１つ又は複数の薬剤を指す。特に、この用語は、ＨＥＲ−２に選択的に結合する１つ又は複数の薬剤を指す。薬剤は、抗体、特にモノクローナル抗体であってもよい。場合によっては、薬剤は、例えばｎＭ又はｐＭ範囲の高い親和性でＨＥＲ−２に選択的に結合する。場合によっては、薬剤は、ＨＥＲ−２受容体の細胞外ドメインに結合する。薬剤は以下を引き起こす可能性がある：ＨＥＲ−２受容体発現のダウンレギュレーション、ＨＥＲ−２タンパク質を過剰発現するヒト腫瘍細胞の増殖の阻害、ＨＥＲ−２タンパク質を過剰発現する腫瘍細胞に対する免疫増強及びＡＤＣＣの増強、及び／又は血管新生因子のダウンレギュレーション。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、糖操作ＨＥＲ−２抗体、例えば、ＴｒａｓＧｅｘである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、二重特異性ＨＥＲ−２抗体、例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇである。用語「抗ＨＥＲ−２抗体」又は「ヒトＨＥＲ−２に結合する抗体」又は「ヒトＨＥＲ−２に特異的に結合する抗体」又は「アンタゴニスト抗ＨＥＲ２」は、ヒトＨＥＲ−２に特異的に結合する抗体を指す。抗体は、＜１０ｎＭ、＜５ｎＭ、＜２ｎＭ、＜１ｎＭ、＜０．５ｎＭ、又はそれ以下のＫｄ値の結合親和性でヒトＨＥＲ−２抗原に結合する。結合親和性は、例えば表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）などの標準的な結合アッセイを用いて決定することができる。
【０１７２】
本発明における使用のための二重特異性抗体の調製
特定の態様では、組み合わせで使用される治療剤は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体を含む。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様では、結合特異性は異なる抗原に対するものである。特定の態様では、結合特異性は、同じ抗原上の異なるエピトープに対するものである。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【０１７３】
多重特異性抗体を作製するための技術には、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照）及び「ノブ・イン・ホール」エンジニアリング（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照）が含まれる。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号）；２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照）；二重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照）；及び、例えば、Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作製することができる。
【０１７４】
「オクトパス抗体」を含む３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作抗体も本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号を参照）。
【０１７５】
本明細書における抗体又は断片は、２つの異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用性ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」も含む（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号を参照）。本明細書には「Ｃｒｏｓｓｍａｂ」抗体も含まれる（例えば国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、又は国際公開第２００９／０８０２５４号を参照）。
【０１７６】
二重特異性抗体断片を作製するための別の技術は、「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー」又はＢｉＴＥ（登録商標）手法である（例えば、国際公開第２００４／１０６３８１号、国際公開第２００５／０６１５４７号、国際公開第２００７／０４２２６１、及び国際公開第２００８／１１９５６７号を参照）。この手法は、単一のポリペプチド上に配置される２つの抗体可変ドメインを利用する。例えば、単一ポリペプチド鎖は、各々が、２つのドメイン間の分子内会合を可能にするために十分な長さのポリペプチドリンカーにより分離された可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを有する、２つの短鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片を含む。この単一ポリペプチドは、２つのｓｃＦｖ断片の間にポリペプチドスペーサー配列をさらに含む。各ｓｃＦｖは異なるエピトープを認識し、各ｓｃＦｖがその同族エピトープと結合したときに、２つの異なる細胞型の細胞が近接するか又は繋がるように、これらのエピトープは異なる細胞型に特異的であり得る。この手法の特定の一実施態様には、例えば、悪性細胞又は腫瘍細胞などの標的細胞によって発現される細胞表面抗原を認識する別のｓｃＦｖに結合した、Ｔ細胞上のＣＤ３ポリペプチドなどの、免疫細胞によって発現される細胞表面抗原を認識するｓｃＦｖが含まれる。
【０１７７】
それは単一のポリペプチドであるので、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、当技術分野で公知の任意の原核生物又は真核生物細胞発現系、例えばＣＨＯ細胞株を使用して発現させることができる。しかしながら、単量体の意図された活性以外の生物活性を有し得る他の多量体種から単量体二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを分離するために、特定の精製技術（例えば、ＥＰ１６９１８３３を参照）が必要な場合もある。１つの例示的な精製スキームでは、分泌されたポリペプチドを含む溶液は、最初に金属アフィニティークロマトグラフィーにかけられ、ポリペプチドはイミダゾール濃度の勾配を用いて溶出される。この溶出液は、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用してさらに精製され、ポリペプチドは、塩化ナトリウム濃度の勾配を用いて溶出される。最後に、この溶出液をサイズ排除クロマトグラフィーにかけ、多量体種から単量体を分離する。一態様では、本発明で使用される二重特異性抗体は、ペプチドリンカーによって互いに融合された２つの単鎖ＦＶ断片（ｓｃＦＶ）を含む単一のポリペプチド鎖を含む。
【０１７８】
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低減させるＦｃドメインの修飾
本発明の抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは二量体であり、その各サブユニットはＣＨ２及びＣＨ３  ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定に会合することができる。
【０１７９】
Ｆｃドメインは、本発明の抗原結合分子に望ましい薬物動態特性を付与し、そのような薬物動態特性には、標的組織中への良好な蓄積に貢献する長い血清半減期、及び望ましい組織−血液分布比が含まれる。しかし同時に、Ｆｃドメインは、好ましい抗原保有細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対する、本発明の二重特異性抗体の望ましくない標的化をもたらす可能性があるしたがって、特定の態様では、本発明の抗原結合分子のＦｃドメインは、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を示す。一態様では、Ｆｃは、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、かつ／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃドメインはエフェクター機能を誘導しない。エフェクター機能の低減は、限定しないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの１つ又は複数を含むことができる。
【０１８０】
特定の態様では、１つ又は複数のアミノ酸修飾を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０１８１】
特定の態様では、本発明は、Ｆｃドメインが、特にＦｃ受容体に対するＦｃγ受容体への結合を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む抗体を提供する。
【０１８２】
一態様では、本発明の抗体のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに同じ１つ又は複数のアミノ酸変異が存在する。特に、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の２３４位及び２３５位（ＥＵ番号付け）及び／又は３２９位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む。より具体的には、ＩｇＧ重鎖においてアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」、ＥＵ番号付け）を有するＦｃドメインを含む本発明による抗体が提供される。アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａは、いわゆるＬＡＬＡ変異を指す。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」の組み合わせは、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させるもので、国際公開第２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載があり、同文献には、このような変異Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能などのその特性を決定するための方法も記載されている。
【０１８３】
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低減したＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ又は複数の置換を伴うものも含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。このようなＦｃ変異体には、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含め、アミノ酸２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７位のうちの２つ以上において置換を有するＦｃ変異体が含まれる（米国特許第７３３２５８１号）。
【０１８４】
別の態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減及びエフェクター機能の低減を示す。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（Ｋａｂａｔ番号付け）にアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。このようなＩｇＧ４  Ｆｃドメイン変異及びそのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号にも記載されている。
【０１８５】
変異体Ｆｃドメインは、当技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を用いたアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は修飾により調製することができる。遺伝学的方法は、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含み得る。正確なヌクレオチドの変化は、例えば配列決定により検証することができる。
【０１８６】
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な装置を用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に測定することができ、このようなＦｃ受容体は組換え発現により得ることができる。あるいは、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む細胞活性化抗体の、Ｆｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を使用して評価することができる。
【０１８７】
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の抗体のエフェクター機能は、当技術分野で公知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、本明細書に記載されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの他の例が、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) 及びHellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；米国特許第５８２１３３７号； Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えばフローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照のこと）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは又はそれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998)に開示されるように、例えば動物モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。
【０１８８】
いくつかの態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、特にＣ１ｑに対する結合が低減する。したがって、Ｆｃドメインがエフェクター機能を低減させるように操作されているいくつかの実施態様では、前記エフェクター機能の低減は、ＣＤＣの低減を含む。本発明の二重特異性抗体がＣ１ｑに結合することができ、それによりＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを行うことができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, and Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照のこと）。
【０１８９】
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインの修飾
本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合した異なる抗原結合部位を含み、したがって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれ得る。これらのポリペプチドの組換え共発現とそれに続く二量体化は、２つのポリペプチドの複数の可能な組み合わせをもたらす。したがって、組換え産生における本発明の二重特異性抗体の収率及び純度を改善するために、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利であろう。
【０１９０】
したがって、特定の態様では、本発明は、（ａ）腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含み、ここで、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、前記４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片のみを含むことを特徴とする二重特異性分子に関し、該抗原結合分子はさらに（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含み、ここで該Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も広範なタンパク質−タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。したがって、一態様では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。
【０１９１】
特定の態様では、前記修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を含み、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を含む、いわゆる「ノブ・イントゥー・ホール」修飾である。したがって、本発明は、（ａ）腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含み、
ここで、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片のみを含むことを特徴とする抗原結合分子に関し、該抗原結合分子はさらに（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含み、ここで、ノブ・イントゥー・ホール法に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットはノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、ホールを含む。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、及びＹ４０７Ｖ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１９２】
ノブ・イントゥー・ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；米国特許第７６９５９３６号; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載される。一般に、この方法は、第１のポリペプチドの接触面において隆起（「ノブ」）及び第２のポリペプチドの接触面において対応する空洞（「ホール」）を導入することを含み、その結果、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように、隆起が空洞内に配置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの接触面から小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。隆起と同一か又は類似のサイズの相補的空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することによって、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
【０１９３】
したがって、一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的変異誘発により、又はペプチド合成により改変することにより作り出すことができる。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置換され（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置換される（Ｙ４０７Ｖ）。一態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置換され（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置換される（Ｌ３６８Ａ）。
【０１９４】
さらなる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいてさらに、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置換される（Ｙ３４９Ｃ）。これらの２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、二量体をさらに安定化する（Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15）。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、及びＹ４０７Ｖ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１９５】
別の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、例えば、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているような静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成は静電的に不利になるが、ヘテロ二量体は静電的に有利になるように、２つのＦｃドメインサブユニットの接触面において、荷電したアミノ酸残基による１つ又は複数のアミノ酸残基の置換を含む。
【０１９６】
本明細書で報告される二重特異性抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終端する完全なＣ末端であり得る。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基の１つ又は２つが除去された短縮されたＣ末端であり得る。好ましい一態様では、重鎖のＣ末端は、ＰＧで終端する短縮されたＣ末端である。本明細書中に報告されたすべての態様のうちの一態様では、本明細書中に特定されるようなＣ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書中に報告されたすべての態様のうちの一実施態様では、Ｃ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、本明細書で規定されるように、Ｃ末端グリシン残基（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１９７】
Ｆａｂドメインにおける修飾
一態様では、本発明は、（ａ）腫瘍関連抗原に特異的に結合することができるＦａｂ断片、（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含み、ここで、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片のみを含むことを特徴とする４−１ＢＢＬ含有抗原結合分子に関し、該抗原結合分子はさらに（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含み、ここで、Ｆａｂ断片の１つにおいて、可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬのいずれかが交換されている。二重特異性抗体は、Ｃｒｏｓｓｍａｂ技術に従って調製される。
【０１９８】
１つの結合アームにドメインの置換／交換を有する多重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂ  ＶＨ−ＶＬ又はＣｒｏｓｓＭａｂ  ＣＨ−ＣＬ）は、国際公開第２００９／０８０２５２号及びSchaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191に詳細に記載されている。それらは、第１の抗原に対する軽鎖と第２の抗原に対する不適切な重鎖とのミスマッチによって引き起こされる副産物を（このようなドメイン交換のない手法と比較して）明らかに減少させる。
【０１９９】
一態様では、本発明は、（ａ）腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片、（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含み、ここで、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片のみを含み、ここでそれらの各々が、ＣＨ１又はＣＬドメインに連結されていることを特徴とする二重特異性抗原結合分子に関し、該抗原結合分子はさらに（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含み、ここで、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部となり、ＣＬドメインが重鎖の一部となるように、４−１ＢＢＬに隣接する定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置換されている。
【０２００】
別の態様では、本発明は、（ａ）４−１ＢＢに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、及び（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片を含む二重特異性抗原結合分子に関し、ここで前記追加のＦａｂ断片は各々、ペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に連結されている。特定の態様では、追加のＦａｂ断片は、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、ＶＨドメインが軽鎖の一部であり、かつ、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置換されているＦａｂ断片である。
【０２０１】
別の態様では、正しいペアリングをさらに改善するために、（ａ）腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片、（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含み、ここで、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片のみを含み、ここでそれらの各々が、ＣＨ１又はＣＬドメインに連結されていることを特徴とし、さらに（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子は、異なる荷電アミノ酸置換（いわゆる「荷電残基」）を含むことができる。これらの修飾は、交差又は非交差のＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに導入される。特定の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子に関し、ここで、ＣＬドメインの１つにおいて、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置換され、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、かつ、ＣＨ１ドメインの１つにおいて、１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている。
【０２０２】
より具体的には、本発明はＦａｂを含む二重特異性結合分子に関し、ここで、４−１ＢＢＬに隣接するＣＬドメインにおいて、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置換され、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、かつ、４−１ＢＢＬに隣接するＣＨ１ドメインにおいて、１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている。
【０２０３】
ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本明細書に記載される抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２０４】
本発明の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドは、抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数（例えば、２つ以上）のポリヌクレオチドとして発現され得る。共発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合して、機能的抗原結合分子を形成し得る。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現されると、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して免疫グロブリンを形成するであろう。
【０２０５】
いくつかの態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される本発明による抗体全体をコードする。他の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される本発明による抗体に含まれるポリペプチドをコードする。
【０２０６】
特定の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは一本鎖又は二本鎖であり得る。
【０２０７】
組換え法
本発明において使用される二重特異性抗体は、例えば、固相ペプチド合成（例えば、メリフィールド固相合成）又は組換え産生によって得ることができる。組換え産生のために、例えば上述したように、抗体又はそのポリペプチド断片をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために１つ又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定され得る。本発明の一態様では、本発明のポリヌクレオチドの１つ又は複数を含むベクタ−、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに抗体（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ  ｖｉｖｏでの組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及びAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)に記載される技術を参照のこと。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であり得るか、又は核酸断片であり得る。発現ベクターは、抗体又はそのポリペプチド断片（すなわち、コード領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合してクローニングされる発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断によって翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質に分離される１つ又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の抗体若しくはそのポリペプチド断片、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合しているか、又は融合していない異種コード領域をコードし得る。異種コード領域は、限定されないが、分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインなどの特殊なエレメント又はモチーフを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、遺伝子産物の発現を制御配列の影響下又は制御下に置くように、１つ又は複数の制御配列と結合している場合である。２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード領域とそれに結合しているプロモーターなど）は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡ��転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現調節配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡテンプレートの能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されているといえる。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーター以外に、他の転写調節エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を指示するポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。
【０２０８】
適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン−Ａと連結した最初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ−αグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列を含む。さらなる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、種々の翻訳調節エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、並びにウイルス系由来のエレメント（特に、配列内リボソーム進入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。また、発現カセットは、例えば複製起点及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の逆位末端配列（ＩＴＲ）などの染色体組み込みエレメントといった他の特徴を含んでいてもよい。
【０２０９】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と結合させることができる。例えば、抗体又はそのポリペプチド断片の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片をコードする核酸の上流に配置され得る。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質は、粗面小胞体上で成長するタンパク質鎖の排出が開始されると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが一般に、ポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有し、それが翻訳されたポリペプチドから切断されて分泌又は「成熟」型のポリペプチドを産生することを知っている。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又はそれに作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド又はその機能的誘導体が使用され得る。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
【０２１０】
後の精製を容易にするため（例えばヒスチジンタグ）又は融合タンパク質の標識化の補助のために使用され得る短タンパク質配列をコードするＤＮＡは、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド又はそのポリペプチド断片の中又は末端に含まれ得る。
【０２１１】
本発明のさらなる態様では、本発明の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、本発明の１つ又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。一態様では、宿主細胞は、本発明の抗体（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えばそのようなベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書中で使用される場合、用語「宿主細胞」は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するように操作され得る任意の種類の細胞系を指す。抗原結合分子の複製及び発現の補助に適切な宿主細胞は当技術分野で周知である。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、大量のベクター含有細胞を、臨床利用のための十分な量の抗原結合分子を得るために、大規模発酵槽に播種するために増殖させることができる。適切な宿主細胞には、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は種々の真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞等が含まれる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要でない場合、細菌中で産生され得る。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌細胞のペーストから単離することができ、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物は、グリコシル化経路が「ヒト化」され、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの産生をもたらす真菌及び酵母菌株を含む、ポリペプチドをコードするベクターの適切なクローニング宿主又は発現宿主である。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照のこと。
【０２１２】
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用できる多数のバキュロウイルス株が同定されている。植物細胞培養もまた宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、懸濁状態で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照のこと。宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が含まれ、さらにはトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。一実施態様では、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術は当技術分野で周知である。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンであるように、免疫グロブリン鎖の他方を発現するように操作することができる。
【０２１３】
一態様では、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片を生成する方法が提供され、この方法は、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片の発現に適した条件下で、本明細書に提供される本発明の抗体又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること、及び本発明の抗体又はそのポリペプチド断片を宿主細胞（又は宿主細胞培地）から回収することを含む。
【０２１４】
特定の実施態様では、抗原結合分子の一部を形成する、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分（例えばＦａｂ断片）は、少なくとも、抗原に結合することができる免疫グロブリン可変領域を含む。可変領域は、天然又は非天然の抗体及びその断片の一部を形成することができ、かつそのような抗体及び断片から誘導することができる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Harlow and Lane, “Antibodies, a laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照）。天然に存在しない抗体は、固体相−ペプチド合成を使用して構築することができ、（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）組換え的に産生することができ、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙへの米国特許第５９６９１０８号を参照）。
【０２１５】
任意の動物種の免疫グロブリンを本発明において使用することができる。本発明において有用な非限定的免疫グロブリンは、マウス、霊長類又はヒト起源のものであり得る。融合タンパク質がヒトでの使用を意図している場合、免疫グロブリンの定常領域がヒト由来であるキメラ型の免疫グロブリンを使用することができる。ヒト化又は完全ヒト型の免疫グロブリンも、当技術分野で周知の方法に従って調製することができる（例えばＷｉｎｔｅｒへの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、それらの方法には、限定されないが、（ａ）非ヒト（例えばドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合アフィニティー又は抗体機能を維持するために重要であるもの）の保持を伴うか又は伴わない、ヒト（例えばレシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってヒト様切片でそれらを「クローキング」することが含まれる。ヒト化抗体及びその製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、さらに、例えば、Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号； Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al.,  Methods 36, 25-34 (2005) （ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植について記載）；Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) （「リサーフェイシング」について記載）； Dall’Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) （「ＦＲシャフリング」について記載）； Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) （ＦＲシャフリングへの「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」アプローチについて記載）に記載されている。本発明による特定の免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野で公知の様々な技術を使用して生成することができる。ヒト抗体は、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に一般的に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、そのような抗体から由来することができる（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによっても調製することができる（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変��域配列を単離することによっても生成することができる（例えば、Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)；及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)を参照）。ファージは、典型的には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はＦａｂ断片として、抗体断片を提示する。
【０２１６】
特定の態様では、抗体は、例えば、国際公開第２０１２／０２０００６号（親和性成熟に関連する実施例を参照）又は米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号に開示された方法に従って、増強された結合親和性を有するように操作される。特定の抗原決定基に対する本発明の抗原結合分子の結合能は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329(2000)）及び古典的な結合アッセイ（Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229(2002)）によって測定することができる。競合アッセイは、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗原結合分子を同定するために使用され得る。特定の実施態様では、このような競合抗原結合分子は、参照抗原結合分子によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗原結合分子が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的な方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）によるＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第６６巻の「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。例示的な競合アッセイでは、固定化された抗原は、抗原に結合する第１の標識抗原結合分子と、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合するその能力について試験されている第２の非標識抗原結合分子とを含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗原結合分子はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化抗原が、第１の標識抗原結合分子を含むが第２の非標識抗原結合分子を含まない溶液中でインキュベートされる。第１の抗体の抗原への結合を許容する条件下でのインキュベーション後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。固定化抗原に結合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第２の抗原結合分子が、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies:  A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）を参照。
【０２１７】
本明細書で記載のように調製される本発明の抗体は、当技術分野で公知の技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製され得る。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの要因に依存し、当業者には明らかであろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用され得る。例えば、本発明の融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスが使用され得る。連続的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを、本質的に実施例に記載されるように抗原結合分子を単離するために使用することができる。抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法のいずれかによって決定することができる。例えば、実施例に記載されるように発現された４−１ＢＢＬ含有抗原結合分子は、還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示されるようにインタクトであり、適切に組み立てられていることが示された。
【０２１８】
アッセイ
本明細書で提供される抗原結合分子は、当技術分野で公知の様々なアッセイによって、その物理的／化学的性質及び／又は生物活性について同定、スクリーニング又は特徴づけすることができる。
【０２１９】
１．親和性アッセイ
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のその対応する受容体に対する親和性は、実施例に記載の方法に従って、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥヘルスケア）などの標準的装置と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することができる。標的細胞抗原に対する二重特異性抗原結合分子の親和性もまた、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的装置と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することができる。ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ抗原結合分子に関して、本方法は、国際公開第２０１６／０７５２７８号にさらに詳細に記載されている。一態様によれば、ＫＤは、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
【０２２０】
２．結合アッセイ及びその他のアッセイ
一態様では、本明細書で報告されるＦＡＰ−４−１ＢＢＬ抗原結合分子は、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１６／０７５２７８Ａ１にさらに詳細に記載されるように、その抗原結合活性について試験される。
【０２２１】
３．活性のアッセイ
一態様では、ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ抗原結合分子の生物活性を同定するためのアッセイが提供される。
【０２２２】
特定の実施態様では、本明細書で報告される抗体は、ヒト免疫エフェクター細胞とのｉｎ  ｖｉｔｒｏ共培養アッセイにおいてそのような生物活性について試験される。
【０２２３】
薬学的組成物、製剤、及び投与経路
さらなる態様では、本発明は、例えば、以下の治療方法のいずれかにおける使用のための、本明細書で提供される４−１ＢＢアゴニスト及び本明細書で提供されるＨＥＲ−２標的化療法又は薬剤を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、ＨＥＲ−２抗体、二重特異性ＨＥＲ−２抗体及び／又はＨＥＲ−２抗体薬物コンジュゲートを含む。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンを含む。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及びトラスツズマブエムタンシンからなる群から選択される。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンの組み合わせを含む。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ及びマルゲツキシマブ（ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）からなる群から選択されるＨＥＲ−２抗体を含む。一態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ又はペルツズマブである。より具体的には、ＨＥＲ−２標的化剤はトラスツズマブである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化は、糖操作ＨＥＲ−２抗体、例えば、ＴｒａｓＧｅｘである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、二重特異性ＨＥＲ−２抗体、例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、ＨＥＲ−２抗体薬物コンジュゲート、特にトラスツズマブエムタンシン（ａｄｏ−ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）である。
【０２２４】
一態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される４−１ＢＢアゴニストと、少なくとも１つの薬学的に許容される添加物とを含む。他の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される４−１ＢＢアゴニストと、例えば以下に記載されるような少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。いくつかの実施態様では、ＨＥＲ−２標的化剤と、少なくとも１つの薬学的に許容される添加物とを含む薬学的組成物が提供される。
【０２２５】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される添加物、担体、アジュバント又は希釈剤に溶解又は分散された１つ又は複数の抗体又は薬剤の治療的有効量を含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という語句は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに対して一般に無毒である、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー又は他の有害な反応を生じさせない分子実体及び組成物を指す。少なくとも１つの抗体と、任意選択的に追加的な活性成分とを含む薬学的組成物の調製物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990（参照により本明細書に包含される）によって例示されているように、本開示内容の見地から当業者には公知であろう。特に、組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容される添加物」には、当業者には既知であるように、任意の及びすべての溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、塩、安定剤及びそれらの組み合わせが含まれる。
【０２２６】
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射用に設計されたものが含まれる。注射の場合、本発明の抗原結合分子は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファーなどの生理的に適合性のバッファー中において製剤化され得る。溶液は、懸濁化剤、安定剤、及び／又は分散剤などの調合剤を含有することができる。あるいは、融合タンパク質は、使用前に適切なビヒクル、例えば、発熱性物質除去蒸留水と構成するために、粉末形態であってもよい。滅菌注射用溶液は、本発明の融合タンパク質を、必要に応じて、以下に列挙する様々な他の成分を含む適切な溶媒中に必要量で組み込むことによって調製される。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成することができる。分散体は通常、基本的な分散媒及び／又は他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、様々な滅菌活性成分を取り込むことにより調製される。滅菌注射用溶液、懸濁液又は乳濁液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過されたその液体媒質から、活性成分と任意の追加的所望成分の粉末を得る真空乾燥又は凍結乾燥技術である。場合によっては、液体媒質を適切に緩衝し、注射前にまず、その液体希釈剤を十分な生理食塩水又はグルコースで等張にする必要がある。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシン汚染は、安全なレベル、例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満で最小限に保たれるべきであることが理解されよう。薬学的に許容される適切な添加物には、限定されないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー類、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる化合物を含有し得る。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度溶液の調製を可能にする薬剤も含有し得る。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製され得る。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ごま油のような脂肪油、又はエチルクリート若しくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。
【０２２７】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルに、コロイド薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入することができる。これらの技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)に開示されている。徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、そのマトリックスは、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射可能な組成物の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はそれらの組み合わせなどの吸収を遅延させる薬剤を組成物に使用することによってもたらされ得る。
【０２２８】
本明細書における例示的な薬学的に許容される添加物には、間質性薬物分散剤（ｉｎｓｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質がさらに含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む、特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法については、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ又は複数の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０２２９】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤には、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸バッファーを含む。
【０２３０】
上記の組成物に加えて、抗原結合分子は、持効性製剤として製剤化されていてもよい。そのような長時間作用する製剤は、埋め込み（例えば、皮下又は筋肉内）によって、又は筋肉内注射によって投与され得る。したがって、例えば、融合タンパク質は、適切なポリマー性又は疎水性物質を用いて（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性誘導体として、例えば、難溶性の塩として製剤化することができる。
【０２３１】
本発明の抗原結合分子を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。薬学的組成物は、１つ又は複数の生理的に許容される担体、希釈剤、添加物、又はタンパク質の薬学的に使用可能な調製物への加工を容易にする補助剤を使用して、従来の方式で製剤化することができる。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。
【０２３２】
本発明の抗体は、遊離酸又は遊離塩基の、中性又は塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えばタンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸などの有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは水酸化第二鉄などの無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカインなどの有機塩基に由来し得る。薬学的塩は、対応する遊離塩基の形態よりも水性溶媒及び他のプロトン性溶媒に溶解しやすい傾向がある。
【０２３３】
本明細書中の組成物はまた、治療される特定の症状に必要な１つを超える活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含有し得る。そのような活性成分は、意図された目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
【０２３４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成することができる。
【０２３５】
４−１Ｂｂアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化療法の投与
４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化療法／薬剤（両方とも本明細書では物質と呼ばれる）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療が望ましい場合は病巣内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。しかしながら、本発明の方法は、非経口、特に静脈内注入により投与される治療剤に関して特に有用である。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、ＨＥＲ−２抗体、二重特異性ＨＥＲ−２抗体及び／又はＨＥＲ−２抗体薬物コンジュゲートを含む。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンを含む。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及びトラスツズマブエムタンシンからなる群から選択される。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンの組み合わせを含む。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ及びマルゲツキシマブ（ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）からなる群から選択されるＨＥＲ−２抗体を含む。一態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ又はペルツズマブである。より具体的には、ＨＥＲ−２標的化剤はトラスツズマブである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化は、糖操作ＨＥＲ−２抗体、例えば、ＴｒａｓＧｅｘである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、二重特異性ＨＥＲ−２抗体、例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、ＨＥＲ−２抗体薬物コンジュゲート、特にトラスツズマブエムタンシン（ａｄｏ−ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）である。
【０２３６】
非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。投薬は、その投与が短期間であるか長期間であるかに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内注射又は皮下注射などの注射によって行うことができる。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投薬スケジュールが企図される。一実施態様では、治療剤は、非経口的に、特に静脈内に投与される。特定の実施態様では、治療剤は、静脈内注入によって投与される。
【０２３７】
いくつかの態様では、４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤は、単一の組成物中で一緒に投与される。いくつかの実施態様では、４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤は、２つ以上の異なる組成物で別々に投与される。
【０２３８】
４−１ＢＢアゴニストとＨＥＲ−２標的化療法／薬剤の両方が、医学行動規範と一致した様式で製剤化され、用量分けされ、投与される。この文脈において考慮すべき要因には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与のスケジュール、及び医療従事者が知るその他の要因が含まれる。４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化療法／薬剤の両方は、必ずしもそうである必要はないが、任意選択的に、問題の障害を予防又は治療するために現在使用されている１つ又は複数の薬剤と共に製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する治療剤の量、障害又は治療の種類、及び上記で論じた他の要因に依存する。これらは一般に、本明細書に記載されているのと同じ投与量及び投与経路で、又は本明細書に記載の投与量の約１％〜９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投与量及び経路で使用される。
【０２３９】
疾患の予防又は治療のために、４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化療法／薬剤の適切な投与量は（それらの組み合わせで、又は１つ又は複数の他の追加的治療剤と併用して使用される場合）、治療される疾患の種類、４−１ＢＢ剤の種類、疾患の重症度及び経過、両薬剤が予防目的で又は治療目的で投与されるのか、治療歴、患者の病歴及び治療剤に対する応答、並びに主治医の判断によって決まるであろう。各物質は、患者に対して、一度に、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば単回又は複数回の個別投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の物質が対象への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な１日の投与量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であろう。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態にもよるが、治療は一般に疾患症状の望ましい抑制が起こるまで持続されることになる。各物質の１つの例示的な投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、７．０ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、９．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はその任意の組み合わせ）のうちの１つ又は複数の用量が対象に投与され得る。このような用量は断続的に、例えば毎週、２週毎、又は３週毎に（例えば対象が約２から約２０用量、例えば約６用量の治療剤を受けるように）投与され得る。より高い初回負荷用量と、それに続く１つ又は複数のより低い用量、又はより低い初回用量と、それに続く１つ又は複数のより高い用量が投与されてもよい。例示的投与レジメンは、約１０ｍｇの初回用量に続いて、隔週約２０ｍｇの治療剤を投与することを含む。しかしながら、他の投与レジメンも有用であり得る。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易に監視される。
【０２４０】
一態様では、４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化療法／薬剤の両方の投与は、単回投与である。いくつかの態様では、４−１ＢＢアゴニストとＨＥＲ−２標的化療法／薬剤は同時に投与される。用語「同時に」とは、同時に、又は通常は１時間未満の短時間内を意味する。特定の態様では、治療薬の投与は２回以上の投与である。１つ又は複数の他の薬物と「同時に」投与される薬物は、同じ治療サイクル中に、１つ又は複数の他の薬物と同じ治療日に、及び任意で１つ又は複数の他の薬物と同時に投与される。例えば、３週間ごとに行われる治療の場合、同時に投与される薬物はそれぞれ、３週間のサイクルの１日目に投与される。特定の一態様では、物質は、毎週、２週毎、又は３週毎、特に２週毎に投与される。一態様では、物質は治療的有効量で投与される。一態様では、物質は、約５０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約４００μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約６００μｇ／ｋｇ、約７００μｇ／ｋｇ、約８００μｇ／ｋｇ、約９００μｇ／ｋｇ又は約１０００μｇ／ｋｇの用量で投与される。一実施態様では、４−１ＢＢアゴニストは、Ｈｅｒ−２標的化療法／薬剤の投与なしの対応する治療レジメンにおける４−１ＢＢアゴニストの用量よりも高い用量で投与される。一実施態様では、ＨＥＲ−２標的化療法／薬剤は、４−１ＢＢアゴニストの投与なしの対応する治療レジメンにおけるＨＥＲ−２標的化療法／薬剤の用量よりも高い用量で投与される。一態様では、４−１ＢＢアゴニストの投与は、４−１ＢＢアゴニストの第１の用量の初回投与、及び４−１ＢＢアゴニストの第２の用量の１回以上のその後の投与を含み、ここで、第２の用量は第１の用量より高い。一態様では、４−１ＢＢアゴニストの投与は、４−１ＢＢアゴニストの第１の用量の初回投与及び４−１ＢＢアゴニストの第２の用量の１回以上のその後の投与を含み、ここで、第１の用量は第２の用量より低くない。
【０２４１】
両方の治療剤が連続的に共投与される場合、薬剤は、「特定の期間」だけ隔てられた２つの別々の投与で投与される。特定の期間という用語は、１時間から１５日間のどこかを意味する。例えば、薬剤の１つは、他の薬剤の投与から約１、２、３、４、５、６若しくは７日以内又は１〜２４時間以内に投与することができ、一実施態様では、特定の期間は１〜３日、又は２〜８時間である。
【０２４２】
一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、ＨＥＲ−２標的化療法／薬剤の投与前に投与される。別の態様では、ＨＥＲ−２標的化療法／薬剤は、４−１ＢＢアゴニストの投与前に投与される。
【０２４３】
いくつかの態様では、用量あたり投与されるトラスツズマブエムタンシンの初回の薬学的有効量は、患者の体重あたり約０．３〜１５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲になるであろう。市販のＴ−ＤＭ１製剤（ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）、トラスツズマブエムタンシン（ａｄｏ−ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ））は、使い捨てバイアルに入っている無菌で白色からオフホワイトの防腐剤を含まない凍結乾燥粉末である。各バイアルには、１００ｍｇ又は１６０ｍｇのトラスツズマブエムタンシンが含まれている。再構成後、各使い捨てバイアルは、トラスツズマブエムタンシン（２０ｍｇ／ｍＬ）、ポリソルベート２０［０．０２％（ｗ／ｖ）］、コハク酸ナトリウム（１０ｍＭ）、及びスクロース［６％＞（ｗ／ｖ）］を、ｐＨは５．０、密度は１．０２６ｇ／ｍＬで含んでいる。２０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブエムタンシンを含有する得られた溶液が、希釈後に静脈内注入によって投与される。
【０２４４】
ペルツズマブの市販製剤（ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標））には、静脈内注入用の防腐剤を含まない溶液の形態で、ペルツズマブ４２０ｍｇ／４ｍＬ（３０ｍｇ／ｍＬ）が含まれており、約４２０ｍｇ（７０ｋｇの対象の場合、６ｍｇ／ｋｇの用量に相当）、約５２５ｍｇ、約８４０ｍｇ、及び／又は約１０５０ｍｇの固定用量で投与され得る。治療は、より高い負荷用量（例えば、８４０ｍｇ、１２ｍｇ／体重ｋｇに相当）を用いて開始してもよい。治療用途に適したペルツズマブ製剤は、２０ｍＭヒスチジンアセテート、１２０ｍＭスクロース、０．０２％ポリソルベート２０、ｐＨ６．０中に３０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含む。別のペルツズマブ製剤は、２５ｍｇ／ｍＬペルツズマブ、１０ｍＭヒスチジン−ＨＣｌバッファー、２４０ｍＭスクロース、０．０２％ポリソルベート２０、ｐＨ６．０を含む。
【０２４５】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、ＨＥＲ−２標的化療法／薬剤と共に使用するためのものであり、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブによる前治療は、併用治療の前に行われ、ここで、前治療と併用治療の間の期間は、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブに応答した個体におけるＢ細胞の減少に十分である。
【０２４６】
Ｔ細胞の活性化は、重度のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を引き起こす可能性がある。ＴｅＧｅｎｅｒｏによって実施された第１相試験（Suntharalingam et al., N Engl J Med (2006) 355,1018-1028）では、６人の健常なボランティア全員が、不適切に投与されたＴ細胞刺激スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の注入後すぐに、ほぼ致命的な重度のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を経験した。本明細書に記載の４−１ＢＢアゴニストなどのＴ細胞活性化治療剤の対象への投与に関連するサイトカイン放出は、オビヌツズマブなどのＩＩ型抗ＣＤ２０抗体による前記対象の前治療によって有意に低減することができる。ＧＡＺＹＶＡ（登録商標）前治療（Ｇｐｔ）の使用は、投薬開始から腫瘍細胞の排除を媒介するのに十分に高いＴ細胞活性化治療剤の曝露レベルを維持しつつ、Ｔ細胞活性化治療剤（例えばＣＲＳ）による強力な全身性Ｔ細胞活性化に由来する関連性の高い有害事象（ＡＥ）のリスクが軽減されるように、末梢血と二次リンパ器官の両方で、Ｂ細胞の急速な枯渇を助けるはずである。今日まで、オビヌツズマブの安全性プロファイル（サイトカイン放出を含む）は、進行中のオビヌツズマブ臨床治験において数百人の患者で評価及び管理されている。最後に、Ｔ細胞活性化抗体の安全性プロファイルを維持することに加えて、Ｇｐｔは、これらのユニークな分子に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）の形成を防ぐのにも役立つはずある。
【０２４７】
本発明では、４−１ＢＢアゴニストとＨＥＲ−２標的化療法／薬剤の組み合わせは、治療においてさらなる薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、少なくとも１つの追加の治療剤が共投与され得る。特定の態様では、追加の治療剤は、免疫療法剤である。いくつかの実施態様では、追加の治療剤は化学療法剤である。適切な化学療法剤には、以下の１つ又は複数が含まれる：ドキソルビシン及びエピルビシン（ファルモルビシン（登録商標））などのアントラサイクリン系薬物；パクリタキセル（タキソール（登録商標））及びドセタキセル（タキソテール（登録商標））などのタキサン系薬物；フルオロウラシル（５ＦＵ）；シクロホスファミド；メトトレキセート；シスプラチン；及びカペシタビン。他の追加の治療剤には、キナーゼ阻害剤のラパチニブ（タイケルブ）及びネラチニブ（Ｎｅｒｌｙｎｘ）が含まれる。
【０２４８】
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一又は別々の製剤に含まれている）と、治療剤の投与が、追加の治療剤又は薬剤の投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起こり得る分離投与とを包含する。一実施態様では、治療剤の投与及び追加の治療剤の投与は、互いに、約１か月以内、又は約１週間、２週間、若しくは３週間以内、又は１日、２日、３日、４日、５日、若しくは６日間以内に行われる。
【０２４９】
治療方法及び組成物
別の態様では、本明細書に記載の４−１ＢＢアゴニストの有効量及び本明細書に記載のＨＥＲ−２標的化剤の有効量を対象に投与することを含む、個体におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法が提供される。様々な態様において、ＨＥＲ−２標的化剤は、ＨＥＲ−２抗体、二重特異性ＨＥＲ−２抗体及び／又はＨＥＲ−２抗体薬物コンジュゲートを含む。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンを含む。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及びトラスツズマブエムタンシンからなる群から選択される。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンの組み合わせを含む。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ及びマルゲツキシマブ（ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）からなる群から選択されるＨＥＲ−２抗体を含む。一態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ又はペルツズマブである。より具体的には、ＨＥＲ−２標的化剤はトラスツズマブである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化は、糖操作ＨＥＲ−２抗体、例えば、ＴｒａｓＧｅｘである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、二重特異性ＨＥＲ−２抗体、例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、ＨＥＲ−２抗体薬物コンジュゲート、特にトラスツズマブエムタンシン（ａｄｏ−ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）である。
【０２５０】
このような一態様では、方法は、個体に少なくとも１つの追加の治療剤の有効量を投与することをさらに含む。適切な追加の薬剤には、以下の１つ又は複数が含まれる：ドキソルビシン及びエピルビシン（ファルモルビシン（登録商標））などのアントラサイクリン系薬物；パクリタキセル（タキソール（登録商標））及びドセタキセル（タキソテール（登録商標））などのタキサン系薬物；フルオロウラシル（５ＦＵ）；シクロホスファミド；メトトレキセート；シスプラチン；及びカペシタビン。他の適切な追加の治療剤には、キナーゼ阻害剤のラパチニブ（タイケルブ）及びネラチニブ（Ｎｅｒｌｙｎｘ）が含まれる。さらなる実施態様では、本明細書に記載のように、有効量の４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤を対象に投与することを含む、腫瘍縮小のための方法が本明細書で提供される。上記のいずれの態様に記載の「個体」又は「対象」も、好ましくはヒトである。
【０２５１】
一態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストを提供し、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、ＨＥＲ−２標的化剤と組み合わせて使用される。別の態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤を提供する。いくつかの実施態様では、４−１ＢＢアゴニスト及び／又はＨＥＲ−２標的化剤は、追加の治療剤と組み合わされる。
【０２５２】
さらなる態様では、４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤を含む、がん免疫療法における使用のための組成物が提供される。特定の実施態様では、がん免疫療法の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤を含む組成物が提供される。
【０２５３】
さらなる態様では、本明細書では、医薬の製造又は調製における、４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤を含む組成物の使用が提供される。いくつかの実施態様では、医薬は、がんの治療のためのものである。一実施態様では、医薬は、固形腫瘍の治療のためのものである。いくつかの実施態様では、医薬は、固形腫瘍を有する個体に有効量の医薬を投与することを含む腫瘍縮小の方法における使用のためのものである。このような一実施態様では、方法は、少なくとも１つの追加の治療剤の有効量を個体に投与することをさらに含む。いくつかの実施態様では、医薬は、固形腫瘍を治療するためのものである。
【０２５４】
特定の態様では、個体はＨＥＲ−２陽性がんを有する。いくつかの実施態様では、がんは、ＨＥＲ−２を過剰発現する細胞を含み得る。いくつかの実施態様では、がんは固形腫瘍を含む。いくつかの実施態様では、固形腫瘍は、進行性及び／又は転移性固形腫瘍である。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２陽性がんは、乳がん、卵巣がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、食道がん、肺がん、例えば肺腺癌又は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、子宮がん、例えば子宮漿液性子宮内膜癌、食道がん、肺がん、子宮がん、唾液腺管癌、膀胱がん、子宮内膜がん、膵臓がん、結腸がん、前立腺がん、及び／又は頭頸部がんである。いくつかの態様では、乳がんは、乳癌、又は乳腺癌である。いくつかの実施態様では、乳癌は浸潤性乳管癌である。いくつかの実施態様では、肺がんは肺腺癌である。いくつかの実施態様では、結腸がんは結腸直腸腺癌である。上記の実施態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであり得る。
【０２５５】
いくつかの態様では、癌は、ＨＥＲ−２陽性乳癌、特に転移性乳癌（ステージＩＶの乳がん）である。いくつかの態様では、ステージＩＩ又はＩＩＩのＨＥＲ−２陽性乳がんである。いくつかの態様では、がんはＨＥＲ−２陽性の早期乳がんである。いくつかの態様では、がんはＨＥＲ−２陽性の胃がんである。
【０２５６】
治療は、がんの発生又は進行の予防を目的とする場合がある。したがって、対象は、本明細書に記載されている４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤を使用して、疾患状態の発症に対して予防的に治療され得る。これは、病状の症状の発症前に行われてもよく、かつ／又はがんの発生若しくは進行のリスクが大きいと考えられる対象に投与されてもよい。
【０２５７】
いくつかの態様では、４−１ＢＢアゴニストは、ＨＥＲ−２標的化剤と相乗的に作用する。
【０２５８】
上記の併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一又は別々の製剤に含まれている）と、本明細書に報告される抗体の投与が、追加の治療剤又は薬剤の投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起こり得る別々の投与とを包含する。一実施態様では、４−１ＢＢアゴニストとＨＥＲ−２標的化剤の投与、及び任意で追加の治療剤の投与は、互いに、約１か月以内、又は約１週間、２週間、若しくは３週間以内、又は１日、２日、３日、４日、５日、若しくは６日間以内に行われる。
【０２５９】
本明細書に記載の４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤の両方（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療が望ましい場合は病巣内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。投薬は、その投与が短期間であるか長期間であるかに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内注射又は皮下注射などの注射によって行うことができる。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投薬スケジュールが企図される。
【０２６０】
本明細書に記載の４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤の両方が、医学行動規範と一致した様式で製剤化され、用量分けされ、投与される。この文脈において考慮すべき要因には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与のスケジュール、及び医療従事者が知るその他の要因が含まれる。抗体は、必ずしもそうである必要はないが、任意選択的に、問題の障害を予防又は治療するために現在使用されている１つ又は複数の薬剤と共に製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類、及び上記で論じた他の要因に依存する。これらは一般に、本明細書に記載されているのと同じ投与量及び投与経路で、又は本明細書に記載の投与量の約１％〜９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投与量及び経路で使用される。
【０２６１】
製造品（キット）
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含有するキットが提供される。このキットは、少なくとも１つの容器、容器上又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、状態の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈注射用の溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。キット中の少なくとも２つの活性剤は、本発明の４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤である。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、ＨＥＲ−２抗体、二重特異性ＨＥＲ−２抗体及び／又はＨＥＲ−２抗体薬物コンジュゲートを含む。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンを含む。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及びトラスツズマブエムタンシンからなる群から選択される。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンの組み合わせを含む。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ及びマルゲツキシマブ（ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）からなる群から選択されるＨＥＲ−２抗体を含む。一態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、トラスツズマブ又はペルツズマブである。より具体的には、ＨＥＲ−２標的化剤はトラスツズマブである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化は、糖操作ＨＥＲ−２抗体、例えば、ＴｒａｓＧｅｘである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、二重特異性ＨＥＲ−２抗体、例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇである。いくつかの態様では、ＨＥＲ−２標的化剤は、ＨＥＲ−２抗体薬物コンジュゲート、特にトラスツズマブエムタンシン（ａｄｏ−ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）である。
【０２６２】
特定の態様では、（Ａ）活性成分としての４−１ＢＢアゴニスト及び薬学的に許容される担体を含む第１の組成物；（Ｂ）活性成分としてのＨＥＲ−２標的化剤及び薬学的に許容される担体を含む第２の組成物、及び（Ｃ）組成物を併用療法において使用するための説明書を含むパッケージを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるためのキットが提供される。
【０２６３】
ラベル又は添付文書は、選択された状態を治療するために組成物がどのように使用されるかを示し、併用療法において組成物を使用するための指示を提供する。さらに、キットは、（ａ）本発明の４−１ＢＢアゴニストを含む組成物が中に収容されている第１の容器；及び（ｂ）本発明のＨＥＲ−２標的化剤を含む組成物が中に収容されている第２の容器を含み得る。加えて、キットは、組み合わせて使用できるさらなる活性成分を含む１つ又は複数のさらなる容器を含み得る。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに含んでもよい。
【０２６４】
代替的に又は追加的に、キットは、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに含んでもよい。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
【０２６５】
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【０２６６】
ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に与えられている。抗体鎖のアミノ酸は、上で定義されたＫａｂａｔによる番号付けシステム（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）に従って番号が付けられ、参照される。
【０２６７】
発明の態様
以下に、本発明のいくつかの態様を列挙する。
１．  がんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストであって、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、ＨＥＲ−２標的化剤と組み合わせて使用される、４−１ＢＢアゴニスト。
２．  がんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストであって、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、ＨＥＲ−２標的化剤と組み合わせて使用され、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である、４−１ＢＢアゴニスト。
３．  ４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤が、単一の組成物において一緒に投与されるか、又は２つ以上の異なる組成物において別々に投与される、態様１に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
４．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、態様１又は２の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
５．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、ここで、４−１ＢＢＬのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
６．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
７．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
８．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
９．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むか、又は、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
１０．  ４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
１１．  ４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
１２．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
１３．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする、前述の態様のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
１４．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
１５．  ４−１ＢＢアゴニストが、
ａ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｂ）配列番号４５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子
からなる群から選択される抗原結合分子である、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
１６．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
１７．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ここで、ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドは、任意選択的にペプチドリンカーを介して、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合される、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
１８．  ４−１ＢＢアゴニストが、抗ＦＡＰ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
１９．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
２０．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ａ）（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
２１．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
２２．  ４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
２３．  ４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
２４．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
２５．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする、前述の態様のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
２６．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
２７．  ４−１ＢＢアゴニストが、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号８２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号８３のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む抗原結合分子である、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
２８．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
２９．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ここで、ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドは、任意選択的にペプチドリンカーを介して、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合される、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
３０．  ４−１ＢＢアゴニストが、抗ＣＥＡ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
３１．  ４−１ＢＢアゴニストが、ＨＥＲ−２標的化剤と組み合わせて使用され、この組み合わせが、約１週間から３週間の間隔で投与される、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
３２．  疾患、特にがんの併用治療、逐次治療又は同時治療における使用のための、（Ａ）活性成分としての４−１ＢＢアゴニスト及び薬学的に許容される担体を含む第１の組成物；及び（Ｂ）活性成分としてのＨＥＲ−２標的化剤及び薬学的に許容される担体を含む第２の組成物を含む薬学的製品。
３３．  ４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤を含む薬学的組成物。
３４．  固形腫瘍の治療における使用のための態様３２に記載の薬学的組成物。
３５．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
３６．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、ここで、４−１ＢＢＬのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
３７．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
３８．  腫瘍関連抗原がＦＡＰである、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
３９．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
４０．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むか、又は、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
４１．  ４−１ＢＢアゴニストが、安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
４２．  ４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
４３．  ４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
４４．  ４−１ＢＢアゴニストが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
４５．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
４６．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと  
を特徴とする、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
４７．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
４８．  ４−１ＢＢアゴニストが、
ａ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｂ）配列番号４５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子
からなる群から選択される抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
４９．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
５０．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ここで、ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドは、任意選択的にペプチドリンカーを介して、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合される、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
５１．  ４−１ＢＢアゴニストが、抗ＦＡＰ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
５２．  腫瘍関連抗原がＣＥＡである、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
５３．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
５４．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
５５．  ４−１ＢＢアゴニストが、安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
５６．  ４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
５７．  ４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
５８．  ４−１ＢＢアゴニストが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
５９．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
６０．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
６１．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
６２．  ４−１ＢＢアゴニストが、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号８２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号８３のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
６３．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
６４．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ここで、ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドは、任意選択的にペプチドリンカーを介して、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合される、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
６５．  ４−１ＢＢアゴニストが、抗ＣＥＡ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
６６．  ＨＥＲ−２標的化剤が、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンのうちの１つ又は複数である、前述の態様のいずれか一項に記載の使用のための４−１ＢＢアゴニスト又は薬学的組成物。
６７．  ＨＥＲ−２標的化剤が、トラスツズマブである、前述の態様のいずれか一項に記載の使用のための４−１ＢＢアゴニスト又は薬学的組成物。
６８．  ４−１ＢＢアゴニストが、ＨＥＲ−２標的化剤と組み合わせて使用され、この組み合わせが、約１週間から３週間の間隔で投与される、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
６９．  増殖性疾患、特にがんを治療すること又はがんの進行を遅延させることにおける使用のための、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
７０．  乳がん、卵巣がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、食道がん、肺がん、子宮がん、唾液腺管癌、膀胱がん、子宮内膜がん、膵臓がん、結腸がん、前立腺がん、及び／又は頭頸部がんの治療における使用のための、前述の態様のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
７１．  （Ａ）活性成分としての４−１ＢＢアゴニスト及び薬学的に許容される担体を含む第１の組成物；（Ｂ）活性成分としてのＨＥＲ−２標的化剤及び薬学的に許容される担体を含む第２の組成物、及び（Ｃ）組成物を併用療法において使用するための説明書を含むパッケージを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるためのキット。
７２．  増殖性疾患、特にがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための医薬の製造における、４−１ＢＢアゴニストとＨＥＲ−２標的化剤の組み合わせの使用。
７３．  医薬が固形腫瘍の治療のためのものである、医薬の製造における、４−１ＢＢアゴニストとＨＥＲ−２標的化剤の組み合わせの使用。
７４．  ４−１ＢＢアゴニストの有効量及びＨＥＲ−２標的化剤の有効量を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法。
７５．  ４−１ＢＢアゴニストの有効量及びＨＥＲ−２標的化剤の有効量を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法であって、ここで、４−１ＢＢアゴニストが抗原結合分子である、方法。
７６．  ４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
７７．  ４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃγ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低減させる修飾を有するＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
７８．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
７９．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
８０．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、ここで、４−１ＢＢＬのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
８１．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分とを含む抗原結合分子であり、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
８２．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むか、又は、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
８３．  ４−１ＢＢアゴニストが、安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
８４．  ４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
８５．  ４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
８６．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
８７．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
８８．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
８９．  ４−１ＢＢアゴニストが、
ａ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｂ）配列番号４５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子
からなる群から選択される抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
９０．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
９１．  ４−１ＢＢアゴニストが、抗ＦＡＰ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
９２．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分とを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
９３．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
９４．  ４−１ＢＢアゴニストが、安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
９５．  ４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
９６．  ４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
９７．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
９８．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
９９．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
１００．  ４−１ＢＢアゴニストが、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号８２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号８３のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
１０１．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
１０２．  ４−１ＢＢアゴニストが、抗ＣＥＡ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
１０３．  ４−１ＢＢアゴニストが、ＨＥＲ−２標的化剤と組み合わせて使用され、この組み合わせが、約１週間から３週間の間隔で投与される、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
１０４．  ４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤が、単一の組成物において一緒に投与されるか、又は２つ以上の異なる組成物において別々に投与される、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
１０５．  ４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤が、静脈内又は皮下に投与される、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
１０６．  ４−１ＢＢアゴニストが、ＨＥＲ−２標的化剤と同時に、その前に、又はその後に投与される、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
１０７．  ４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤が、同時に投与される、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
１０８．  ４−１ＢＢアゴニストが、ＨＥＲ−２標的化剤と組み合わせて使用され、かつ、４−１ＢＢアゴニストが、ＨＥＲ−２標的化剤と相乗的に作用する、前述の態様のいずれか一項に記載の、がんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
１０９．  ４−１ＢＢアゴニストが、ＨＥＲ−２標的化剤と組み合わせて使用され、ここで、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体による前治療は、併用治療の前に行われ、前治療と併用治療の間の期間は、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体に応答した個体におけるＢ細胞の減少に十分である、がんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
１１０．  ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体がオビヌツズマブである、態様１０９に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
１１１．  ４−１ＢＢアゴニストの有効量及びＨＥＲ−２標的化剤の有効量を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法であって、ここで、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体による前治療は、併用による治療の前に行われ、前治療と併用治療の間の期間は、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体に応答した個体におけるＢ細胞の減少に十分である、方法。
１１２．  ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体がオビヌツズマブである、態様１１１に記載の方法。
１１３．  ４−１ＢＢアゴニストが、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストとＨＥＲ−２標的化剤を含む組み合わせ。
１１４．  ＨＥＲ−２標的化剤が、ＨＥＲ−２抗体、ＨＥＲ−２二重特異性抗体及び／又はＨＥＲ−２抗体薬物コンジュゲートを含む、態様１１３に記載の組み合わせ。
１１５．  ＨＥＲ−２標的化剤が、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンを含む、態様１１３又は１１４に記載の組み合わせ。
１１６．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１１７．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、ここで、４−１ＢＢＬのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１１８．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）及びＣＥＡからなる群から選択される腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１１９．  ４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１２０．  ４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１２１．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１２２．  腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含むＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、前述の態様のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１２３．  腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインであるか、又は、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１２４．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１２５．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前述の態様のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１２６．  ４−１ＢＢアゴニストが、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１２７．  ４−１ＢＢアゴニストが、抗ＦＡＰ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、前述の態様のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１２８．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１２９．  腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ａ）（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、前述の態様のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１３０．  腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、ＣＥＡに特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、前述の態様のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１３１．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１３２．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むＣＥＡに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前述の態様のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１３３．  ４−１ＢＢアゴニストが、抗ＣＥＡ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、前述の態様のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１３４．  医薬としての使用のための、前述の態様のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１３５．  ４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤が、単一の組成物において一緒に投与されるか、又は２つ以上の異なる組成物において別々に投与される、前述の態様のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１３６．  ４−１ＢＢアゴニスト及びＨＥＲ−２標的化剤が、同時投与のため、又は逐次投与のためのものである、前述の態様のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１３７．  ＨＥＲ−２陽性がんの治療における使用のための、前述の態様のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【実施例】
【０２６８】
以下は本発明の方法及び組成物の例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【０２６９】
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242に与えられている。
【０２７０】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定された。
【０２７１】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを用いるＰＣＲによって生成されたか、又は自動遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物からＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成された。正確な遺伝子配列が利用できない場合、オリゴヌクレオチドプライマーは最も近いホモログからの配列に基づいて設計され、遺伝子は適切な組織に由来するＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって単離された。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／シーケンシングベクター中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にするために適切な制限部位を用いて設計された。すべてのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする、５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。
【０２７２】
細胞培養技術
Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Incに記載されているように、標準的な細胞培養技術を使用した。
【０２７３】
タンパク質の精製
標準的なプロトコールを参照して、濾過された細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、抗体を、プロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出は、ｐＨ２．８で達成され、続いて試料を直ちに中和した。凝集したタンパク質を、ＰＢＳ中又は２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０中でのサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、単量体抗体から分離した。単量体抗体画分をプールし、例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（３０  ＭＷＣＯ）遠心濃縮器を使用して濃縮し（必要に応じて）、−２０℃又は−８０℃で凍結し、保存した。試料の一部が、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析法によるその後のタンパク質分析及び分析的特徴づけのために提供された。
【０２７４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従って使用した。特に、１０％又は４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ビス−ＴＲＩＳ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化剤ランニングバッファー添加剤を含む）又はＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニングバッファーを使用した。
【０２７５】
分析的サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態の決定のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行った。簡潔には、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １１００システム上の３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５の中のＴｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷカラムに、又はＤｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣシステム上の２ｘＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶出したタンパク質を、ＵＶ吸光度及びピーク面積の積分によって定量化した。ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １５１−１９０１が標準として機能した。
【０２７６】
質量分析
このセクションでは、正しいアセンブリに重点を置いて、ＶＨ／ＶＬ交換を含む多重特異性抗体（ＶＨ／ＶＬ  ＣｒｏｓｓＭａｂｓ）の特徴を説明する。予想される一次構造を、脱グリコシル化されたインタクトなＣｒｏｓｓＭａｂ、及び脱グリコシル化／プラスミン消化又は別の方法で脱グリコシル化／限定されたＬｙｓＣ消化ＣｒｏｓｓＭａｂのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により分析した。
【０２７７】
ＶＨ／ＶＬ  ＣｒｏｓｓＭａｂを、３７℃で最大１７時間、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、リン酸又はＴｒｉｓバッファー中でＮ−ＧグリコシダーゼＦで脱グリコシル化した。プラスミン消化又は限定されたＬｙｓＣ（Ｒｏｃｈｅ）消化を、Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８）中１００μｇの脱グリコシル化ＶＨ／ＶＬ  ＣｒｏｓｓＭａｂで、室温で１２０時間、及び３７℃で４０分間、それぞれ行った。質量分析の前に、試料をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上のＨＰＬＣで脱塩した。総質量は、ＴｒｉＶｅｒｓａ  ＮａｎｏＭａｔｅ源（Ａｄｖｉｏｎ）を備えたｍａＸｉｓ  ４Ｇ  ＵＨＲ−ＱＴＯＦ  ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ）でＥＳＩ−ＭＳを介して決定された。
【０２７８】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（ＢＩＡＣＯＲＥ）を使用した、それぞれの抗原に対する多重特異性抗体の結合及び結合親和性の決定
生成された抗体のそれぞれの抗原への結合は、ＢＩＡＣＯＲＥ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した表面プラズモン共鳴によって調査される。簡潔には、親和性の測定のために、Ｇｏａｔ−Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ、ＪＩＲ  １０９−００５−０９８抗体を、それぞれの抗原に対する抗体の提示のためのアミンカップリングを介してＣＭ５チップ上に固定化する。結合は、ＨＢＳバッファー（ＨＢＳ−Ｐ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐｈ７．４）中において、２５℃（又は代替的に３７℃）で測定される。抗原（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ又は社内で精製）を溶液中に様々な濃度で添加した。８０秒から３分の抗原注入により会合を測定し；３〜１０分間にわたりＨＢＳバッファーでチップ表面を洗浄することにより解離を測定し、ラングミュア１：１結合モデルを使用してＫＤ値を測定した。システム固有のベースラインドリフトを補正するため及びノイズシグナル低減のために、陰性対照データ（例えば緩衝曲線）が試料曲線から差し引かれる。センサーグラムの分析のため及び親和性データの計算のために、それぞれのＢｉａｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅが使用される。
【０２７９】
実施例１
ＦＡＰ−４−１ＢＢＬ抗原結合分子の調製、精製及び特徴づけ
ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子を、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１６／０７５２７８Ａ１に記載されるように調製した。
【０２８０】
特に、以下の分子を作製した。
【０２８１】
ａ）一価のＦＡＰ標的化及び非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子
【０２８２】
ヒトＣＬドメインに融合した二量体４−１ＢＢリガンドをコードするポリペプチドを、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むフレーム内でサブクローニングした（Merchant, Zhu et al. 1998, Nature Biotechnol. 16, 677-681）。４−１ＢＢリガンドの１つのエクトドメインを含むポリペプチドを、ヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメインに融合させた。構築物２．４において、鎖の正確なペアリングを向上させるために、以下の変異を交差ＣＨ−ＣＬに追加的に導入した（荷電変異体）。ヒトＣＬに融合した二量体４−１ＢＢリガンドにおいて、Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ、ヒトＣＨ１に融合した単量体４−１ＢＢリガンドにおいて、Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ。
【０２８３】
ＦＡＰに特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域、クローン２８Ｈ１又はクローン４Ｂ９を、ヒトＩｇＧ１のホールの定常重鎖又は定常軽鎖のいずれかとフレーム内でサブクローニングした。国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するため、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を、ノブ及びホール重鎖の定常領域に導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む標的化抗ＦＡＰ−Ｆｃホール鎖及び抗ＦＡＰ軽鎖の組み合わせにより、組み立てられた三量体４−１ＢＢリガンド及びＦＡＰ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体が生成される（図１Ａ）。これに基づき、生殖系列ＤＰ４７によってＦＡＰバインダーを置換することにより非標的化バージョンが調製された（図１Ｃ）。
【０２８４】
表１：一価の構築物
2021515781.tif 000019
【０２８５】
ａ）二価のＦＡＰ標的化及び非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子
【０２８６】
ＦＡＰに特異的なバインダーに特異的な重鎖及び軽鎖の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列、クローン２８Ｈ１又はクローン４Ｂ９を、ヒトＩｇＧ１のホール、ノブの定常重鎖又は定常軽鎖のいずれかとフレーム内でサブクローニングした。国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を導入した。さらに、４−１ＢＢリガンドの２つのエクトドメインを含むポリペプチドを、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃホール鎖のＣ末端に融合させ、４−１ＢＢリガンドの１つのエクトドメインを含むポリペプチドを、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃノブ鎖のＣ末端に融合させた。Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１ホール二量体リガンド重鎖、Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１ノブ単量体リガンド重鎖、及び抗ＦＡＰ軽鎖の組み合わせにより、組み立てられた三量体４−１ＢＢリガンド及び２つのＦＡＰ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体が生成された（図１Ｂ）。これに基づき、生殖系列ＤＰ４７によってＦＡＰバインダーを置換することにより非標的化バージョンが調製された（図１Ｄ）。
【０２８７】
表２：二価の構築物
2021515781.tif 000020
【０２８８】
ＦＡＰ標的化及び非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の生成及び特徴づけは、それぞれ国際公開第２０１６／０７５２７８号、実施例１から６に詳細に記載されている。
【０２８９】
実施例２
ＦＡＰ標的化マウス４−１ＢＢＬ抗原結合分子（ハイブリッドサロゲート）の調製、精製、及び特徴づけ
ハイブリッドサロゲート又はＦＡＰ−ｍｕ４−１ＢＢＬとも呼ばれる、ＦＡＰに対する一価の結合を有するアゴニストマウス４−１ＢＢリガンドを含む二重特異性抗原結合分子は、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１６／０７５２７８Ａ１に記載されているように調製された。標的化マウス４−１ＢＢＬは、ヒトリガンドをマウスエクトドメインで置き換えることにより、ヒトリガンドについて記載されたように調製された。
【０２９０】
マウス４−１ＢＢリガンドのエクトドメインの一部（アミノ酸１０４−３０９、Ｃ１６０Ｓ変異を含む）をコードするＤＮＡ配列は、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースのＱ３Ｕ１Ｚ９−１配列に従って合成された。４−１ＢＢリガンドを標的とするために使用されたＦＡＰバインダーは、クローン４Ｂ９であった。ハイブリッドサロゲートＦＡＰ−ｍｕ４−１ＢＢＬのアミノ酸配列は、表３に示すとおりである。
【０２９１】
表３：成熟ハイブリッドサロゲートＦＡＰ−ｍｕ４−１ＢＢＬのアミノ酸配列
2021515781.tif 000021
2021515781.tif 000022
【０２９２】
ハイブリッドサロゲートＦＡＰ−ｍｕ４−１ＢＢＬは、ｅｖｉＦｅｃｔ（Ｅｖｉｔｒｉａ  ＡＧ）を使用して、懸濁液中で増殖するＣＨＯ−Ｋ１細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを、１：１：１：１の比率（「ベクターＦｃホール重鎖」：「ベクターＦＡＰ軽鎖」：「ベクター４−１ＢＢＬ  Ｆｃノブ重鎖」：「ベクターｍｕ４−１ＢＢＬ軽鎖」）でトランスフェクトされた。
【０２９３】
トランスフェクションのために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ｅｖｉＭａｋｅ培養培地（Ｅｖｉｔｒｉａ  ＡＧ）中の無血清懸濁液中で培養する。７日後、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター中において３７℃にて、培養上清を遠心分離による精製のために収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２ｍｍフィルター）、４℃に保った。
【０２９４】
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを使用したアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、２０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したプロテインＡ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。結合していないタンパク質を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム含有バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。結合したタンパク質を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭグリシン、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０  ｐＨ３．０の塩化ナトリウムの線形ｐＨ勾配を使用して溶出させた。次にカラムを、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭグリシン、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ３．０で洗浄した。収集した画分のｐＨを、１／４０（ｖ／ｖ）の２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加えることによって調整した。タンパク質を濃縮して濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０  ｐＨ６．０で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。
【０２９５】
精製された二重特異性構築物のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。二重特異性構築物の純度及び分子量を、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の存在下及び非存在下でＣＥ−ＳＤＳによって分析した。二重特異性構築物の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３、ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー中で、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
【０２９６】
表４：ハイブリッドサロゲートＦＡＰ−ｍｕ４−１ＢＢＬの生化学的分析
2021515781.tif 000023
【０２９７】
２．１  表面プラズモン共鳴によるハイブリッドサロゲートＦＡＰ−ｍｕ４−１ＢＢＬの機能的特徴づけ
マウス４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）とヒト又はマウスＦＡＰを同時に結合する能力を、国際公開第２０１６／０７５２７８（Ａ１）号に記載されている方法で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。すべてのＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、２５℃で行われた。ビオチン化マウス４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）を、ストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップのフローセルに直接結合させた。最大６００共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルが使用された。
【０２９８】
ＦＡＰ標的化ｍｕ４−１ＢＢＬ構築物を、２００ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速で９０秒間にわたってフローセルを通過させ、解離をゼロ秒に設定した。ヒト又はマウスＦＡＰを、第２の被分析物として、５００ｎＭの濃度で３０μＬ／分の流速で９０秒間にわたってフローセルを通して注入した。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。
【０２９９】
図２Ａ及び２Ｂのグラフに見られるように、ハイブリッドサロゲートＦＡＰ−ｍｕ４−１ＢＢＬは、マウス４−１ＢＢ及びマウス／ヒトＦＡＰに同時に結合することができる。
【０３００】
実施例３
マウス４−１ＢＢへの二価結合及びＦＡＰへの一価結合を有する二重特異性抗原結合分子の調製、精製及び特徴づけ
【０３０１】
４−１ＢＢに対して二価結合及びＦＡＰに対して一価結合を有する、２＋１とも呼ばれる二重特異性アゴニストマウス４−１ＢＢ抗体が、図１と同様にして調製された。この実施例では、構築物の第１の重鎖ＨＣ１は、以下の成分から構成された：抗４−１ＢＢ（クローンＭＵ１３７−１）のＶＨＣＨ１、それに続いて変異Ｌｙｓ３９２Ａｓｐ及びＬｙｓ４０９Ａｓｐを含むＦｃ（Ｆｃ−ＤＤと呼ばれる）、そのＣ末端に抗ＦＡＰバインダー（クローン２８Ｈ１）のＶＬ又はＶＨが融合している。第２の重鎖ＨＣ２は、以下から構成された：抗４−１ＢＢ（クローンＭＵ１３７−１）のＶＨＣＨ１、それに続いて変異Ｇｌｕ３５６Ｌｙｓ及びＡｓｐ３９９Ｌｙｓを含むＦｃ（Ｆｃ−ＫＫと呼ばれる）、そのＣ末端に抗ＦＡＰバインダー（クローン２８Ｈ１）のＶＨ又はＶＬが融合している。抗体Ｆｃヘテロ二量体形成を増強するためのＤＤＫＫ変異は、とりわけ、Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 2010,19637-19646に記載されている。標的化抗ＦＡＰ−ＦｃＤＤと抗４−１ＢＢ−ＦｃＫＫ鎖との組み合わせは、ＦＡＰ結合部分及び２つのネズミ科マウス４−１ＢＢ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする。マウスＦｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Baudino et al. J. Immunol. (2008), 181, 6664-6669、又は国際公開第２０１６／０３０３５０（Ａ１）号に記載された方法に従って、ＤＡＰＧ変異が重鎖の定常領域に導入された。簡潔には、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ａｓｐ２６５Ａｌａ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙ変異がＦｃ−ＤＤ及びＦｃ−ＫＫ重鎖の定常領域に導入された（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け；すなわちＤ２６５Ａ、Ｐ３２９Ｇ）。
【０３０２】
Ｆｃ−ＫＫに融合したａ−ＦＡＰ（２８Ｈ１）ＶＨ及びＦｃ−ＤＤ鎖に融合したＶＬを有する２＋１抗４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）、抗ＦＡＰ（２８Ｈ１）構築物のアミノ酸配列は、それぞれ表５に見いだすことができる。Ｆｃ−ＫＫに融合したａ−ＦＡＰ（２８Ｈ１）ＶＬ及びＦｃ−ＤＤ鎖に融合したＶＨを有する２＋１抗４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）、抗ＦＡＰ（２８Ｈ１）構築物のアミノ酸配列は、それぞれ表６に見いだすことができる。
【０３０３】
表５：二重特異性、二価抗４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）／抗ＦＡＰ（２８Ｈ１）マウスＩｇＧ１  ＤＡＰＧ抗原結合分子の配列（Ｆｃ−ＤＤ鎖に融合したＦＡＰ  ＶＬ及びＦｃ−ＫＫ鎖に融合したＶＨを有する構築物、以下でＦｃ−ＤＤ−ＶＬと呼ばれる）
2021515781.tif 000024
【０３０４】
表６：二重特異性、二価抗４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）／一価抗ＦＡＰ（２８Ｈ１）マウスＩｇＧ１  ＤＡＰＧ抗原結合分子の配列（Ｆｃ−ＤＤ鎖に融合したＦＡＰ  ＶＨ及びＦｃ−ＫＫ鎖に融合したＶＬを有する構築物、Ｆｃ−ＤＤ−ＶＨと呼ばれる）
2021515781.tif 000025
【０３０５】
二重特異性２＋１抗４−１ＢＢ、抗ＦＡＰ  ｍｕＩｇＧ１  ＤＡＰＧは、ｅｖｉＦｅｃｔ（Ｅｖｉｔｒｉａ  ＡＧ）を使用して、懸濁液中で増殖するＣＨＯ−Ｋ１細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを、１：１：１の比率（「ベクターＦｃ−ＤＤ重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクターＦｃ−ＫＫ重鎖」）でトランスフェクトされた。
【０３０６】
トランスフェクションのために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞をｅｖｉＭａｋｅ（Ｅｖｉｔｒｉａ  ＡＧ）培地中の無血清懸濁液中で培養する。７日後、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター中において３７℃にて、培養上清を遠心分離による精製のために収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２ｍｍフィルター）、４℃に保った。
【０３０７】
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを使用したアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、４０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したプロテインＡ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム含有バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。結合したタンパク質を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０の１５カラム容量にわたって作製された塩化ナトリウムの線形ｐＨ勾配（２０から１００ｍＭ）を使用して溶出させた。次にカラムを、１０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で洗浄した。収集した画分のｐＨを、１／４０（ｖ／ｖ）の２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加えることによって調整した。タンパク質を濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  １６／６００  Ｓ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。
【０３０８】
精製された二重特異性構築物のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。二重特異性構築物の純度及び分子量を、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の存在下及び非存在下でＣＥ−ＳＤＳによって分析した。二重特異性構築物の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中で２５℃で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を使用して分析した。
【０３０９】
表７  -  ４−１ＢＢへの二価結合及びＦＡＰへの一価結合を有する二重特異性抗原結合分子、（２＋１）抗４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）、抗ＦＡＰ（２８Ｈ１）マウスＩｇＧ１  ＤＡＰＧの生化学的分析
2021515781.tif 000026
【０３１０】
３．１  表面プラズモン共鳴によるマウスサロゲートｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢの機能的特徴づけ
マウス４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）とマウスＦＡＰを同時に結合する能力を、国際公開第２０１６／０７５２７８（Ａ１）号に記載されている方法で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。すべてのＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、２５℃で行われた。ビオチン化マウス４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）を、ストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップのフローセルに直接結合させた。最大６００共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルが使用された。
【０３１１】
ＦＡＰ標的化４−１ＢＢ構築物を、２００ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速で９０秒間にわたってフローセルを通過させ、解離をゼロ秒に設定した。マウスＦＡＰを、第２の被分析物として、５００ｎＭの濃度で３０μＬ／分の流速で９０秒間にわたってフローセルを通して注入した。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。マウスサロゲートｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢは、マウス４−１ＢＢとマウスＦＡＰに同時に結合することができる。
【０３１２】
実施例４
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢの単回注射後の薬物動態プロファイル
【０３１３】
２．５ｍｇ／ｋｇのｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢ（実施例３に従って調製されたもの）の単回用量をＣ５７ＢＬ／６マウスに注射した。すべてのマウスに２００μｌの適切な溶液を静脈内注射した。２００μｌあたりの適切な量の化合物を得るために、ストック溶液（ｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢ；２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０中に１．８１ｍｇ／ｍＬ）をヒスチジンバッファーで希釈した。時点ごとに３匹のマウスから１０分、１時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、６日及び９日で採血した。注射された化合物は、ＥＬＩＳＡによって血清試料で分析された。ビオチン化マウス４−１ＢＢ、試験血清試料、ＨＲＰで標識された検出抗体抗ｍｓＩｇＧを９６ウェルのストレプトアビジンコーティングマイクロタイタープレートに段階的に加え、各工程の後に室温で１時間インキュベートした。各工程の後にプレートを３回洗浄して、未結合の物質を除去した。最後に、ペルオキシダーゼ結合複合体を、ＡＢＴＳ基質溶液を添加して着色された反応生成物を形成することによって可視化した。反応生成物の強度は、４０５ｎｍ（４９０ｎｍの参照波長による）で測光法で決定され、血清試料中の被分析物濃度に比例した。結果を図３に示す。ｍｕＦＡＰ−４−１ＢＢは安定したＰＫ挙動を示し、これは週１回の有効性試験のスケジュールを示唆していた。
【０３１４】
実施例５
トラスツズマブと組み合わせたハイブリッドＦＡＰ−ｍｕ４−１ＢＢＬ構築物のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果
ハイブリッドＦＡＰ−ｍｕ４−１ＢＢＬ（抗ＦＡＰ、マウス４−１ＢＢＬ、ヒトＩｇＧバックボーン）とトラスツズマブの組み合わせの概念の最初の実証は、腫瘍を有する（Ｎ８７を有する）ｈｕＣＤ１６ＴｇＳｃｉｄマウスで行われた。
【０３１５】
Ｎ８７細胞（Ｈｅｒ２＋ヒト胃癌）は、もともとＡＴＣＣから取得され、増殖後、Ｒｏｃｈｅ  Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞バンクに寄託された。細胞を、１０％のＦＣＳ及び１％のＧｌｕｔａｍａｘを含むＲＰＭＩ中で培養した。細胞は、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気下で３７℃で培養した。動物１匹当たり５ｘ１０６個の細胞を、ＲＰＭＩ細胞培地（Ｇｉｂｃｏ）及びＧＦＲマトリゲル（１：１、総量１００μｌ）中において、生存率＞９５．０％で動物の右脇腹に皮下注射した。
【０３１６】
実験開始時８−１０週齢のヒトＦｃｇＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）トランスジェニックＳＣＩＤマウス（これは、エフェクターとしてマウスＦｃγＲＩＶ陽性マクロファージとヒトＦｃγＲＩＩＩａ陽性トランスジェニックマウスＮＫ細胞の両方を発現する）（フランスのチャールズリバーで飼育）は、コミットされたガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、特定の病原体フリーの条件下で毎日１２時間明／１２時間暗のサイクルで維持された実験研究プロトコールが地方自治体により審査され、承認された。動物は、到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。
【０３１７】
プロトコール（図４Ａ）に従って、上記のように雌ｈｕＣＤ１６ＴｇＳｃｉｄマウスに腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍サイズがおよそ２２０ｍｍ３（２８日目）に達したときに、化合物又はＰＢＳ（ビヒクル）で週１回治療した。すべてのマウスに、２００μｌの適切な溶液を週１回静脈内注射した。２００μｌあたりの適切な量の化合物を得るために、保存溶液（表１）を必要に応じてヒスチジンバッファーで希釈した。トラスツズマブとＦＡＰ−４−１ＢＢＬ構築物との併用療法（群Ｄ、図４Ｂ）については、治療薬は同時に注射された。腫瘍の増殖をノギスを使用して週に２回測定し（図５Ａ及び５Ｂ）、腫瘍体積を以下のように計算した：
Ｔｖ：（Ｗ２／２）ｘＬ（Ｗ：幅，Ｌ：長さ）
【０３１８】
化合物を８回注射した後、試験を終了してすべてのマウスを屠殺した（腫瘍細胞注射後８６日目）。図５Ａ及び５Ｂは、すべての治療群における腫瘍増殖動態（平均＋／−ＳＥＭ）、並びにすべての群について各動物の個々の腫瘍増殖動態を示す。ハイブリッドＦＡＰ−ｍｕ４−１ＢＢＬの単剤療法では、腫瘍増殖阻害は明らかにならなかった。単剤療法として投与されたトラスツズマブは、腫瘍のうっ血を誘導し（ＴＧＩ：９５及びＴＣＲ：０．３５）、試験終了時には１匹のマウスに腫瘍がなかった。しかしながら、トラスツズマブとハイブリッドＦＡＰ−ｍｕ４−１ＢＢＬの組み合わせは、強力な腫瘍退縮を誘導し（ＴＧＩ：１３２及びＴＣＲ：０．０９）、８６日目までに６０％の腫瘍のないマウスが得られた。
【０３１９】
統計解析は、ＪＭＰソフトウェアを使用して行われた。
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【０３２０】
試験の５９日目に基づく計算を、以下の表９に示す。
【０３２１】
表８：ｉｎ  ｖｉｖｏ実験に使用した組成物
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【０３２２】
表９：５９日目の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）及びＴＣＲ
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【０３２３】
実施例６
ＣＥＡ−４−１ＢＢＬ抗原結合分子の調製、精製及び特徴づけ
ＣＥＡ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子を、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１６／０７５２７８Ａ１に記載されるように調製した。
【０３２４】
特に、一価のＣＥＡ標的化及び非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子が作製された。
【０３２５】
ヒトＣＬドメインに融合した二量体４−１ＢＢリガンドをコードするポリペプチドを、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むフレーム内でサブクローニングした（Merchant, Zhu et al. 1998, Nature Biotechnol. 16, 677-681）。４−１ＢＢリガンドの１つのエクトドメインを含むポリペプチドを、ヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメインに融合させた。鎖の正確なペアリングを向上させるために、以下の変異を交差ＣＨ−ＣＬに追加的に導入した（荷電変異体）：ヒトＣＬに融合した二量体４−１ＢＢリガンドにおいて、Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ、ヒトＣＨ１に融合した単量体４−１ＢＢリガンドにおいて、Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ。
【０３２６】
ＣＥＡに特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域、クローンＴ８４．６６−ＬＣＨＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）を、ヒトＩｇＧ１のホールの定常重鎖又は定常軽鎖のいずれかとフレーム内でサブクローニングした。国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む標的化抗ＣＥＡ−Ｆｃホール鎖及び抗ＣＥＡ軽鎖の組み合わせは、組み立てられた三量体４−１ＢＢリガンドとＣＥＡ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図１Ａに類似して、抗ＦＡＰは抗ＣＥＡに置き換えられている）。
【０３２７】
表１０：一価の構築物
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【０３２８】
ＣＥＡ標的化及び非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の生成及び特徴づけは、国際公開第２０１６／０７５２７８号、実施例１１から１３のそれぞれに詳細に記載されている。
【図１】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ−Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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