(57)【要約】  本開示は、ヒトＮＤ４遺伝子を発現する組み換えベクター、ヒトＮＤ４遺伝子を発現する組み換えベクターを作製する方法、及びその使用に関する。本明細書に開示される組み換えＡＡＶ２ベクターは、ＮＤ４関連ＬＨＯＮを含むレーベル遺伝性視神経網膜症（ＬＨＯＮ）の治療に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１３を含むＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）ポリペプチドをコードする核酸配列と、
配列番号１１を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０ポリペプチドをコードする核酸配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
【請求項２】
配列番号１を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１３を含むＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）ポリペプチドをコードする核酸配列と、
配列番号１２を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０ポリペプチドをコードする核酸配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
【請求項３】
配列番号１４を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１３を含むＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）ポリペプチドをコードする核酸配列と、
配列番号１１を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０ポリペプチドをコードする核酸配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
【請求項４】
配列番号１４を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１３を含むＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）ポリペプチドをコードする核酸配列と、
配列番号１２を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０ポリペプチドをコードする核酸配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
【請求項５】
配列番号１を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号２を含むＮＤ４をコードする核酸配列と、
配列番号３を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
【請求項６】
配列番号１からなる３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号２からなるＮＤ４をコードする核酸配列と、
配列番号３からなるＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
【請求項７】
配列番号１を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１７を含むＮＤ４をコードする核酸配列と、
配列番号３を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
【請求項８】
配列番号１からなる３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１７からなるＮＤ４をコードする核酸配列と、
配列番号３からなるＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
【請求項９】
配列番号１４を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１５を含むＮＤ４をコードする核酸配列と、
配列番号１６を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
【請求項１０】
配列番号１４からなる３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１５からなるＮＤ４をコードする核酸配列と、
配列番号１６からなるＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
【請求項１１】
配列番号１４を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１８を含むＮＤ４をコードする核酸配列と、
配列番号１６を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
【請求項１２】
配列番号１４からなる３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１８からなるＮＤ４をコードする核酸配列と、
配列番号１６からなるＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
【請求項１３】
配列番号４を含むＨＢＢ２イントロン配列と、
配列番号５を含むＣＭＶプロモーター配列と、
配列番号６を含む第１のＩＴＲ配列と、
配列番号７を含む第２のＩＴＲ配列と、
を更に含む、請求項１、２又は５〜８のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶ２ベクター。
【請求項１４】
配列番号４からなるＨＢＢ２イントロン配列と、
配列番号５からなるＣＭＶプロモーター配列と、
配列番号６からなる第１のＩＴＲ配列と、
配列番号７からなる第２のＩＴＲ配列と、
を更に含む、請求項１、２又は５〜８のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶ２ベクター。
【請求項１５】
配列番号２４を含むＨＢＢ２イントロン配列と、
配列番号２５を含むＣＭＶプロモーター配列と、
配列番号２６を含む第１のＩＴＲ配列と、
配列番号２７を含む第２のＩＴＲ配列と、
を更に含む、請求項３、４又は９〜１２のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶ２ベクター。
【請求項１６】
配列番号２４からなるＨＢＢ２イントロン配列と、
配列番号２５からなるＣＭＶプロモーター配列と、
配列番号２６からなる第１のＩＴＲ配列と、
配列番号２７からなる第２のＩＴＲ配列と、
を更に含む、請求項３、４又は９〜１２のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶ２ベクター。
【請求項１７】
配列番号１を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１７を含むＮＤ４をコードする配列と、
配列番号３を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号４からなるＨＢＢ２イントロン配列と、
配列番号５からなるＣＭＶプロモーター配列と、
配列番号６からなる第１のＩＴＲ配列と、
配列番号７からなる第２のＩＴＲ配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
【請求項１８】
配列番号１４を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１８を含むＮＤ４をコードする配列と、
配列番号１６を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号２４からなるＨＢＢ２イントロン配列と、
配列番号２５からなるＣＭＶプロモーター配列と、
配列番号２６からなる第１のＩＴＲ配列と、
配列番号２７からなる第２のＩＴＲ配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
【請求項１９】
治療を必要とする患者においてレーベル遺伝性視神経網膜症を治療する方法であって、前記患者に請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶ２ベクターを有効量投与することを含む、方法。
【請求項２０】
治療を必要とする患者においてレーベル遺伝性視神経網膜症を治療する方法であって、前記患者に請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組み換えベクターを有効量投与することを含み、該患者が９ヶ月未満の罹病期間を経験している、方法。
【請求項２１】
治療を必要とする患者においてレーベル遺伝性視神経網膜症を治療する方法であって、前記患者に請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶ２ベクターを有効量投与することを含み、該患者が６ヶ月〜９ヶ月の罹病期間を経験している、方法。
【請求項２２】
治療を必要とする患者においてレーベル遺伝性視神経網膜症を治療する方法であって、前記患者に請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶ２ベクターを有効量投与することを含み、該患者が約１．６ＬｏｇＭＡＲ未満のベースライン視力を有する、方法。
【請求項２３】
治療を必要とする患者においてレーベル遺伝性視神経網膜症を治療する方法であって、前記患者に請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶ２ベクターを有効量投与することを含み、該患者が９ヶ月未満の罹病期間を経験しており、該患者が約１．６ＬｏｇＭＡＲ未満のベースライン視力を有する、方法。
【請求項２４】
治療を必要とする患者においてレーベル遺伝性視神経網膜症を治療する方法であって、前記患者に請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶ２ベクターを有効量投与することを含み、該患者が６ヶ月〜９ヶ月の罹病期間を経験しており、該患者が約１．６ＬｏｇＭＡＲ未満のベースライン視力を有する、方法。
【請求項２５】
前記レーベル遺伝性視神経網膜症がＮＤ４関連レーベル遺伝性視神経網膜症である、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記組み換えＡＡＶ２ベクターを硝子体内に投与する、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記組み換えＡＡＶ２ベクターを約１０９ウイルスゲノム／眼〜１０１１ウイルスゲノム／眼の量で硝子体内に投与する、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記組み換えＡＡＶ２ベクターを約１０１０ウイルスゲノム／眼〜１０１１ウイルスゲノム／眼の量で硝子体内に投与する、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記組み換えＡＡＶ２ベクターを約５．０×１０１０ウイルスゲノム／眼〜１．０×１０１１ウイルスゲノム／眼の量で硝子体内に投与する、請求項１９〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記組み換えＡＡＶ２ベクターを約９．０×１０１０ウイルスゲノム／眼の量で硝子体内に投与する、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年６月１１日に出願された米国特許出願第６２／６８３，５０１号に対する優先権を主張し、その内容は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする。
【０００２】
本開示は、ヒトＮＤ４遺伝子を発現する組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヒトＮＤ４遺伝子を発現する組み換えＡＡＶベクターを作製する方法、及びその使用に関する。本明細書に開示される組み換えＡＡＶベクターは、ＮＤ４関連ＬＨＯＮを含むレーベル遺伝性視神経網膜症（ＬＨＯＮ）の治療に有用である。
【背景技術】
【０００３】
「レーベル遺伝性視神経症」又は「レーベル遺伝性視神経萎縮」としても知られるレーベル遺伝性視神経網膜症（Leber Hereditary Optic Neuroretinopathy：ＬＨＯＮ）は、網膜神経節細胞の変性に起因する両側性、急性又は亜急性の中心視力の低下として現れる視神経機能障害である。ＬＨＯＮは、母性遺伝するミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の点突然変異に関係している（非特許文献１）。ＬＨＯＮと関連する最も一般的なｍｔＤＮＡ点突然変異は、Ｇ３４６０Ａ／ＮＤ１、Ｇ１１７７８Ａ／ＮＤ４及びＴ１４４８４Ｃ／ＮＤ６である。これらの突然変異は、ミトコンドリアの複合体Ｉ（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ−ユビキノン還元酵素）のサブユニットの欠陥と関係している。
【０００４】
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＮＤ４遺伝子）のＧ１１７７８ＡミトコンドリアＤＮＡ点突然変異は、ミトコンドリア複合体Ｉの活性を変化させ、酸化的リン酸化を減少させるミスフォールドしたタンパク質の産生をもたらす（非特許文献２）。これは、ＡＴＰの産生を減少させ、活性酸素種の生成を増大して、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の死につながる（非特許文献３、非特許文献４）。Ｇ１１７７８ＡミトコンドリアＤＮＡ点突然変異では重度の視力障害が現れる。
【０００５】
ＬＨＯＮはウイルスベクター、例えば組み換えアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、例えば血清型２（組み換えＡＡＶ２ベクター）の使用を含む遺伝子療法に適している。場合によっては、組み換えＡＡＶベクターの使用により、ヒトの中心窩及び周中心窩の網膜神経節細胞への組み換えＤＮＡの移入が可能となる。ミトコンドリアＮＤ４をコードするｃＤＮＡの移入は、ミトコンドリアの複合体Ｉに局在化するＮＤ４タンパク質をもたらす。
【０００６】
場合によっては、理論に束縛されることを望むものではないが、ＮＤ４遺伝子を発現する組み換えＡＡＶ２ベクターは、例えば、（１）細胞質への内在化（エンドサイトーシスによる）及びＡＡＶ２粒子とヌクレオリン（核シャトルタンパク質）との結合による核内移行によって標的細胞の核に到達する能力、（２）機能的ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４タンパク質をコードするＮＤ４  ｍＲＮＡを転写する核内エピソームを形成する能力、並びに（３）ミトコンドリア標的配列（Mitochondrial Targeting Sequence：ＭＴＳ）によってＮＤ４  ｍＲＮＡをミトコンドリアに標的化し、ミトコンドリアへのＮＤ４タンパク質発現を可能にする能力によって生物活性を発揮することができる（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第９，０１７，９９９号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Orssaud, C., Orphanet Encyclopedia, http://www.orpha.net/data/patho/GB/uk-LHON.pdf, 2003
【非特許文献２】Baracca, et al., Arch. Neurol., 62, pp. 730-736 (2005)
【非特許文献３】Perier et al., Proc Natl Acad Sci USA, 102, pp. 19126-19131 (2005)
【非特許文献４】Qi et al., Arch. Ophthalmol., 125, pp. 268-272 (2007)
【発明の概要】
【０００９】
幾つかの態様において、本開示は、以下の実施の形態に関する。
１．  配列番号１を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１３を含むＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）ポリペプチドをコードする核酸配列と、
配列番号１１を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０ポリペプチドをコードする核酸配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
２．  配列番号１を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１３を含むＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）ポリペプチドをコードする核酸配列と、
配列番号１２を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０ポリペプチドをコードする核酸配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
３．  配列番号１４を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１３を含むＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）ポリペプチドをコードする核酸配列と、
配列番号１１を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０ポリペプチドをコードする核酸配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
４．  配列番号１４を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１３を含むＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）ポリペプチドをコードする核酸配列と、
配列番号１２を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０ポリペプチドをコードする核酸配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
５．  配列番号１を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号２を含むＮＤ４をコードする配列と、
配列番号３を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
６．  配列番号１からなる３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号２からなるＮＤ４をコードする配列と、
配列番号３からなるＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
７．  配列番号１を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１７を含むＮＤ４をコードする配列と、
配列番号３を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
８．  配列番号１からなる３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１７からなるＮＤ４をコードする配列と、
配列番号３からなるＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
９．  配列番号１４を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１５を含むＮＤ４をコードする配列と、
配列番号１６を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
１０．  配列番号１４からなる３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１５からなるＮＤ４をコードする配列と、
配列番号１６からなるＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
１１．  配列番号１４を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１８を含むＮＤ４をコードする配列と、
配列番号１６を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
１２．  配列番号１４からなる３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１８からなるＮＤ４をコードする配列と、
配列番号１６からなるＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
１３．  配列番号４を含むＨＢＢ２イントロン配列と、
配列番号５を含むＣＭＶプロモーター配列と、
配列番号６を含む第１のＩＴＲ配列と、
配列番号７を含む第２のＩＴＲ配列と、
を更に含む、実施の形態１、２又は５〜８のいずれか１つの組み換えＡＡＶ２ベクター。
１４．  配列番号４からなるＨＢＢ２イントロン配列と、
配列番号５からなるＣＭＶプロモーター配列と、
配列番号６からなる第１のＩＴＲ配列と、
配列番号７からなる第２のＩＴＲ配列と、
を更に含む、実施の形態１、２又は５〜８のいずれか１つの組み換えＡＡＶ２ベクター。
１５．  配列番号２４を含むＨＢＢ２イントロン配列と、
配列番号２５を含むＣＭＶプロモーター配列と、
配列番号２６を含む第１のＩＴＲ配列と、
配列番号２７を含む第２のＩＴＲ配列と、
を更に含む、実施の形態３、４又は９〜１２のいずれか１つの組み換えＡＡＶ２ベクター。
１６．  配列番号２４からなるＨＢＢ２イントロン配列と、
配列番号２５からなるＣＭＶプロモーター配列と、
配列番号２６からなる第１のＩＴＲ配列と、
配列番号２７からなる第２のＩＴＲ配列と、
を更に含む、実施の形態３、４又は９〜１２のいずれか１つの組み換えＡＡＶ２ベクター。
１７．  配列番号１を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１７を含むＮＤ４をコードする配列と、
配列番号３を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号４からなるＨＢＢ２イントロン配列と、
配列番号５からなるＣＭＶプロモーター配列と、
配列番号６からなる第１のＩＴＲ配列と、
配列番号７からなる第２のＩＴＲ配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
１８．  配列番号１４を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１８を含むＮＤ４をコードする配列と、
配列番号１６を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号２４からなるＨＢＢ２イントロン配列と、
配列番号２５からなるＣＭＶプロモーター配列と、
配列番号２６からなる第１のＩＴＲ配列と、
配列番号２７からなる第２のＩＴＲ配列と、
を含む組み換えＡＡＶ２ベクター。
１９．  治療を必要とする患者においてレーベル遺伝性視神経網膜症を治療する方法であって、前記患者に実施の形態１〜１８のいずれか１つによる組み換えＡＡＶ２ベクターを有効量投与することを含む、方法。
２０．  治療を必要とする患者においてレーベル遺伝性視神経網膜症を治療する方法であって、前記患者に実施の形態１〜１８のいずれか１つによる組み換えベクターを有効量投与することを含み、該患者が９ヶ月未満の罹病期間を経験している、方法。
２１．  治療を必要とする患者においてレーベル遺伝性視神経網膜症を治療する方法であって、前記患者に請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組み換えＡＡＶ２ベクターを有効量投与することを含み、該患者が６ヶ月〜９ヶ月の罹病期間を経験している、方法。
２２．  治療を必要とする患者においてレーベル遺伝性視神経網膜症を治療する方法であって、前記患者に実施の形態１〜１８のいずれか１つによる組み換えＡＡＶ２ベクターを有効量投与することを含み、該患者が約１．６ＬｏｇＭＡＲ未満のベースライン視力を有する、方法。
２３．  治療を必要とする患者においてレーベル遺伝性視神経網膜症を治療する方法であって、前記患者に実施の形態１〜１８のいずれか１つによる組み換えＡＡＶ２ベクターを有効量投与することを含み、該患者が９ヶ月未満の罹病期間を経験しており、該患者が約１．６ＬｏｇＭＡＲ未満のベースライン視力を有する、方法。
２４．  治療を必要とする患者においてレーベル遺伝性視神経網膜症を治療する方法であって、前記患者に実施の形態１〜１８のいずれか１つによる組み換えＡＡＶ２ベクターを有効量投与することを含み、該患者が６ヶ月〜９ヶ月の罹病期間を経験しており、該患者が約１．６ＬｏｇＭＡＲ未満のベースライン視力を有する、方法。
２５．  前記レーベル遺伝性視神経網膜症がＮＤ４関連レーベル遺伝性視神経網膜症である、実施の形態１９〜２４のいずれか１つによる方法。
２６．  前記組み換えＡＡＶ２ベクターを硝子体内に投与する、実施の形態１９〜２５のいずれか１つによる方法。
２７．  前記組み換えＡＡＶ２ベクターを約１０９ウイルスゲノム／眼〜１０１１ウイルスゲノム／眼の量で硝子体内に投与する、実施の形態１９〜２６のいずれか１つによる方法。
２８．  前記組み換えＡＡＶ２ベクターを約１０１０ウイルスゲノム／眼〜１０１１ウイルスゲノム／眼の量で硝子体内に投与する、実施の形態１９〜２７のいずれか１つによる方法。
２９．  前記組み換えＡＡＶ２ベクターを約５．０×１０１０ウイルスゲノム／眼〜１．０×１０１１ウイルスゲノム／眼の量で硝子体内に投与する、実施の形態１９〜２８のいずれか１つによる方法。
３０．  前記組み換えＡＡＶ２ベクターを約９．０×１０１０ウイルスゲノム／眼の量で硝子体内に投与する、実施の形態１９〜２９のいずれか１つによる方法。
３１．  配列番号１を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号２を含むコード配列ＮＤ４と、
配列番号３を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号４を含むＨＢＢ２イントロン配列と、
配列番号５を含むＣＭＶプロモーター配列と、
配列番号６を含むＩＴＲ配列と、
配列番号７を含むＩＴＲ配列と、
を含むｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミド。
３２．  配列番号１を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１７を含むコード配列ＮＤ４と、
配列番号３を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号４を含むＨＢＢ２イントロン配列と、
配列番号５を含むＣＭＶプロモーター配列と、
配列番号６を含むＩＴＲ配列と、
配列番号７を含むＩＴＲ配列と、
を含むｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミド。
３３．  配列番号８を含むｆ１複製起点配列と、
配列番号９を含むカナマイシン耐性遺伝子配列と、
配列番号１０を含むＣｏｌＥ１複製起点配列と、
を更に含む、実施の形態３１又は３２のｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミド。
３４．  配列番号１からなる３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号２からなるコード配列ＮＤ４と、
配列番号３からなるＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号４からなるＨＢＢ２イントロン配列と、
配列番号５からなるＣＭＶプロモーター配列と、
配列番号６からなるＩＴＲ配列と、
配列番号７からなるＩＴＲ配列と、
を含むｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミド。
３５．  配列番号１からなる３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１７からなるコード配列ＮＤ４と、
配列番号３からなるＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号４からなるＨＢＢ２イントロン配列と、
配列番号５からなるＣＭＶプロモーター配列と、
配列番号６からなるＩＴＲ配列と、
配列番号７からなるＩＴＲ配列と、
を含むｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミド。
３６．  配列番号８からなるｆ１複製起点配列と、
配列番号９からなるカナマイシン耐性遺伝子配列と、
配列番号１０からなるＣｏｌＥ１複製起点配列と、
を更に含む、実施の形態３４又は３５のｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミド。
３７．  配列番号２２を含むｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミド。
３８．  配列番号２３を含むｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミド。
３９．  実施の形態１〜１８のいずれか１つによる組み換えＡＡＶ２ベクターを作製する方法であって、パッケージング細胞株において、
（ｉ）実施の形態３１〜３８のいずれか１つによるｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミドと、
（ｉｉ）ｒｅｐ／ｃａｐプラスミドと、
（ｉｉｉ）アデノウイルスヘルパープラスミドと、
を三重トランスフェクトする（tri-transfecting）ことを含む、方法。
４０．  パッケージング細胞株がヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ  ２９３）細胞株を含む、実施の形態３９による方法。
４１．  ｒｅｐ／ｃａｐプラスミドがｐＲｅｐ２Ｃａｐ２プラスミドである、実施の形態３８又は４０による方法。
４２．  アデノウイルスヘルパープラスミドがｐＸＸ６プラスミドである、実施の形態３８〜４１のいずれか１つによる方法。
【００１０】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部をなす添付の図面は、本開示の幾つかの非限定的な実施形態を示し、本明細書と共に本開示の原理を説明する働きをする。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】逆方向末端反復（ＩＴＲ）、イントロン含有発現カセット（ベータグロビンイントロン、ＨＢＢ２）中のサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、ＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列、コード配列ＮＤ４及び３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列を含む本開示の組み換えＡＡＶ２ベクターの一実施形態を示す図である。
【図２】本開示のｐＡＡＶ−ＮＤ４プラスミドの一実施形態の構造を示す図である。
【図３】本開示のｐＲｅｐ２Ｃａｐ２プラスミドの一実施形態を示す図である。
【図４】本開示のアデノウイルスヘルパーｐＸＸ６プラスミドの一実施形態を示す図である。
【図５】ペリ−ロブソンチャートの一例を示す図である。
【図６】治療によるＢＣＶＡの持続的な両側性の改善を示す図である。
【図７】研究過程でのコントラスト感度の進展を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４型（ＮＤ４）タンパク質ＮＤ４（配列番号１３）をコードする遺伝子を発現する組み換えベクターが本明細書の幾つかの実施形態に開示される。ヒトＮＤ４タンパク質を発現する組み換えＡＡＶ２ベクターの投与によってＬＨＯＮを治療する方法も本明細書に開示される。
【００１３】
「a」、「an」又は「the」という用語は、１つ又は２つ以上の、その冠詞の文法上の対象を指す。この用語は、「１つ」、「１つ以上」、「少なくとも１つ」又は「１つ又は２つ以上」を意味し得る。例として、「要素（an element）」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。「又は」という用語は、他に記載のない限り、「及び／又は」を意味する。「含む（including）」又は「含有する（containing）」という用語は、限定的ではない。
【００１４】
「コドン」という用語は、アミノ酸をコードする遺伝コードの単位を共に形成する３つのヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの配列を指すことを意図する。「遺伝コード」という用語は、生細胞に用いられるコドンとアミノ酸との完全な一連の関係を指すことを意図する。遺伝コードは、全ての生物で極めて類似しており、「普遍的遺伝コード」又は「標準遺伝コード」という用語が、ヒトを含む殆どの生物に用いられる最も一般的な遺伝コードを指すことを意図することが当業者には理解される。幾つかの実施形態では、普遍的遺伝コードは、真核細胞で用いられる遺伝コードである。幾つかの実施形態では、普遍的遺伝コードは、核遺伝子の遺伝コードである。「ミトコンドリア遺伝コード」という用語は、ミトコンドリアで用いられるコードを指すことを意図し、ミトコンドリアの核酸及びタンパク質のコードを定める。幾つかの実施形態では、ミトコンドリア遺伝コードは、脊椎動物ミトコンドリアのコードである。幾つかの実施形態では、ミトコンドリア遺伝コードは、ヒトミトコンドリアのコードである。普遍的遺伝コードに対するミトコンドリア遺伝コードのコドン使用頻度は、Lewin, Genes V, Oxford University Press; New York 1994（その内容が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されている。
【００１５】
ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４型（ＮＤ４）タンパク質は、ミトコンドリア内膜を標的とし、電子伝達鎖の５つの複合体では最大であるＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）のサブユニットである。ミトコンドリアコード化ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＭＴ−ＮＤ４）としても知られるＮＤ４遺伝子は、ヒトミトコンドリアＤＮＡ内にある。ＮＤ４タンパク質をコードする例示的な核酸配列としては、ＮＣＢＩ  ＮＣ＿０１２９２０．１が挙げられるが、これに限定されない。幾つかの実施形態では、ＮＤ４ポリペプチドをコードする核酸配列は、ヒトＮＤ４ポリペプチドをコードするミトコンドリアの核酸又は核の核酸であり得る。幾つかの実施形態では、ＮＤ４ポリペプチドをコードする核酸配列は、ヒトＮＤ４ポリペプチドをコードする任意の核酸配列であり得る。幾つかの実施形態では、ヒトＮＤ４タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２、１５、１７又は１８を含む。ヒトＮＤ４ポリペプチドの例示的なアミノ酸配列としては、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＣＦ７０８１４．１が挙げられるが、これに限定されない。幾つかの実施形態では、ヒトＮＤ４ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１３を含む。
【００１６】
【表１】
2021526834.tif 000002
2021526834.tif 000003
2021526834.tif 000004
2021526834.tif 000005
【００１７】
理論に束縛されるものではないが、ミトコンドリア遺伝子には、核遺伝子に用いられる普遍的遺伝コードとは異なるミトコンドリア遺伝コードが用いられ得る。ミトコンドリア遺伝子を核内で発現される組み換えベクターに挿入すると、ミトコンドリア核酸配列は、ミトコンドリア外で正確に発現及び／又は翻訳されるように普遍的遺伝コードに従って再コード化され得る。幾つかの実施形態では、ミトコンドリアにコードされる遺伝子を再コード化して、同じ遺伝子の核コードバージョンを形成することができる。幾つかの実施形態では、核コードバージョンは、ミトコンドリア核酸のコドン置換によって作製される。幾つかの実施形態では、核コードバージョンは、ミトコンドリア遺伝コードのコドンを普遍的遺伝コードのコドンに置き換えるコドン置換によって作製される。普遍的遺伝コードに対するミトコンドリア遺伝コードのコドン使用頻度は、Lewin, Genes V, Oxford University Press; New York 1994（その内容が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されている。例示的なコドン置換としては、ＵＧＡからＵＧＧへ、ＡＧＡからＵＡＡ、ＵＡＧ、又はＵＧＡへ、ＡＧＧからＵＡＡ、ＵＡＧ、又はＵＧＡへ、ＡＵＡからＡＵＧ、ＣＵＧ、又はＧＵＧへ、ＡＵＵからＡＵＧ、ＣＵＧ、又はＧＵＧへ、の置換が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、ヒトＮＤ４ポリペプチドをコードする核酸は、普遍的遺伝コードに従って再コード化される自然発生ミトコンドリア核酸の配列である。
【００１８】
遺伝コードの縮重のために、殆どのアミノ酸は複数の同義コドンによってコードされ得る（Grantham et al., Nucleic Acids Res., 8(1):r49-r62 (1980)）。理論に束縛されるものではないが、同義コドンは、異なる生物において異なる頻度で自然発生する。コドンの選択は、タンパク質の発現、構造及び機能に影響を及ぼし得る。組み換えタンパク質を発現させる場合、好ましいコドン使用頻度を考慮することによって、選択された宿主系での発現、ひいては再コード化について最適化するように特定のコドンを選択することができる。幾つかの実施形態では、再コード化は、哺乳動物細胞の好ましい使用頻度のコドンを考慮して行われる。幾つかの実施形態では、再コード化は、ヒトにおける好ましいコドン使用頻度を考慮して行われる。
【００１９】
幾つかの実施形態では、普遍的遺伝コードに従い、ヒトの好ましい使用頻度のコドンを考慮して再コード化されたヒトＮＤ４タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２の核酸配列（３’→５’配列）又はその逆相補体、配列番号１５（５’→３’配列）を含む。
【００２０】
幾つかの実施形態では、普遍的遺伝コードに従い、ヒトの好ましい使用頻度のコドンを考慮して再コード化されたヒトＮＤ４タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１７の核酸配列（３’→５’配列）又はその逆相補体、配列番号１８（５’→３’配列）を含む。
【００２１】
「ベクター」という用語は、適当な制御要素に結合している場合に複製が可能であり、細胞間で遺伝子配列を伝達することができる任意の遺伝要素、例えばプラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオン等を指す。このため、この用語は、クローニングビヒクル及び発現ビヒクル、並びにウイルスベクターを含む。幾つかの実施形態では、ベクターはＤＮＡベクターである。幾つかの実施形態では、ベクターは環状ベクターである。幾つかの実施形態では、ベクターはプラスミドである。幾つかの実施形態では、ベクターは二本鎖である。幾つかの実施形態では、ベクターは一本鎖である。
【００２２】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示される組み換えベクターは、組み換えウイルスベクターである。幾つかの実施形態では、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、キメラＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＤＮＡウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、又はそれらの任意の突然変異体若しくは誘導体である。幾つかの実施形態では、組み換えウイルスベクターは、組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。幾つかの実施形態では、「ＡＡＶベクター」とは、限定されるものではないが、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８及びＡＡＶ−９を含むアデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターを意味する。ＡＡＶベクターは、機能的な隣接逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を保持した上で、ＡＡＶ野生型遺伝子の１つ以上、例えばｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子の全体又は一部が欠失していてもよい。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの回復、複製及びパッケージングに必要である。このため、ＡＡＶベクターは、シス型でウイルスの複製及びパッケージングをもたらす配列（例えば、機能的ＩＴＲ）を少なくとも含むことが本明細書で規定される。ＩＴＲは野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、配列が機能的な回復、複製及びパッケージングをもたらす限りにおいて、例えばヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によって変化していてもよい。「ＡＡＶベクター」は、標的細胞の核へのベクター核酸の送達に効率的なビヒクルをもたらすタンパク質シェル又はカプシドを指す場合もある。幾つかの実施形態では、組み換えウイルスベクターは、組み換えＡＡＶ２ベクターである。幾つかの実施形態では、本開示の組み換えベクターは、血清型２の組み換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ２／２）である。
【００２３】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示される組み換えＡＡＶベクターは、ＮＤ４タンパク質をコードする核酸配列と、プロモーター、エンハンサー、終結シグナルを含むが、これらに限定されない操作可能に連結した遺伝子調節制御配列とを含む。理論に束縛されるものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーターは、細胞内で操作可能に連結した核酸配列の高い持続発現レベルをもたらすことができる。幾つかの実施形態では、本開示の組み換えＡＡＶベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーターを含む。理論に束縛されるものではないが、組み換え核酸配列又は導入遺伝子に組み込まれるイントロン配列は、ｍＲＮＡレベルを安定化し、操作可能に連結した核酸配列の発現を高めることができる。幾つかの実施形態では、本開示の組み換えＡＡＶ２ベクターは、ベータグロビン（ＨＢＢ２）由来のイントロン配列を含む。
【００２４】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えＡＡＶ２ベクターは、イントロン含有発現カセット（ベータグロビンイントロン、ＨＢＢ２）中のサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）の制御下のヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）をコードし、ＡＡＶ２／２に由来するウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）を更に含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２（ｒＡＡＶ２／２）である（図１）。幾つかの実施形態では、ＣＭＶプロモーターは、配列番号５又は配列番号２５を含む。幾つかの実施形態では、ＨＢＢ２イントロンは、配列番号４又は配列番号２４を含む。幾つかの実施形態では、ＩＴＲ配列は、配列番号６、７、２６又は２７を含む。
【００２５】
【表２】
2021526834.tif 000006
2021526834.tif 000007
2021526834.tif 000008
【００２６】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えＡＡＶ２ベクターは、ヒト細胞における発現の改善のためにコドン最適化されたヒトＮＤ４のコード配列を含む。
【００２７】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えＡＡＶベクターは、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）の遺伝子をコードする組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２（ｒＡＡＶ２／２）であり、
（ｉ）配列番号１を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｉ）配列番号２を含むコード配列ＮＤ４と、
（ｉｉｉ）配列番号３を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む。
【００２８】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えＡＡＶベクターは、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）の遺伝子をコードする組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２（ｒＡＡＶ２／２）であり、
（ｉ）配列番号１からなる３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｉ）配列番号２からなるコード配列ＮＤ４と、
（ｉｉｉ）配列番号３からなるＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む。
【００２９】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えＡＡＶベクターは、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）の遺伝子をコードする組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２（ｒＡＡＶ２／２）であり、
（ｉ）配列番号１を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｉ）配列番号１７を含むコード配列ＮＤ４と、
（ｉｉｉ）配列番号３を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む。
【００３０】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えＡＡＶベクターは、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）の遺伝子をコードする組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２（ｒＡＡＶ２／２）であり、
（ｉ）配列番号１からなる３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｉ）配列番号１７からなるコード配列ＮＤ４と、
（ｉｉｉ）配列番号３からなるＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む。
【００３１】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えＡＡＶベクターは、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）の遺伝子をコードする組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２（ｒＡＡＶ２／２）であり、
（ｉ）配列番号１４を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｉ）配列番号１５を含むコード配列ＮＤ４と、
（ｉｉｉ）配列番号１６を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む。
【００３２】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えＡＡＶベクターは、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）の遺伝子をコードする組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２（ｒＡＡＶ２／２）であり、
（ｉ）配列番号１４からなる３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｉ）配列番号１５からなるコード配列ＮＤ４と、
（ｉｉｉ）配列番号１６からなるＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む。
【００３３】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えＡＡＶベクターは、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）の遺伝子をコードする組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２（ｒＡＡＶ２／２）であり、
（ｉ）配列番号１４を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｉ）配列番号１８を含むコード配列ＮＤ４と、
（ｉｉｉ）配列番号１６を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む。
【００３４】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えＡＡＶベクターは、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）の遺伝子をコードする組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２（ｒＡＡＶ２／２）であり、
（ｉ）配列番号１４からなる３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｉ）配列番号１８からなるコード配列ＮＤ４と、
（ｉｉｉ）配列番号１６からなるＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
を含む。
【００３５】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えＡＡＶベクターは、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）の遺伝子をコードする組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２（ｒＡＡＶ２／２）であり、
（ｉ）
aacatgtggaatccccagtcccagtgcacagcagccgggtcctagctattggtattgttagaaggactatgg ttgagaatgtgtggggtggggaaaaccaaaaatgcaggccctggctcagtcaccaggaagggggtgctc cgaggcctttgagggacctgagctcacagaactacagacagcagatcatgaggctcacactttctggcca ccaagtgccactctgctgggcatgtggagtgtgcgtgtggtgtggtggtaaggatggaaccaaaagagga agctgtgtatgtgtacccccatgtgaggaggaagaaacagaatagagggtggggttggaggagagatgt ataaagaccctcaaagggaaaaataattccttttttgtattcactgactgagctgatgcatttcttatttggggag cattttgggtaatatttaaaaaaaaaaaaaactgtcaagtgatcactgggcaccgaattcgtttataatcttgtt ctaaacccagcaatttctcttcttgtgttccagaattaccacaacatgctcgcctggcagcggagggaaagg ggcggtgggcgtcccagtgctc（配列番号１）の３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｉ）
atgagaaaccagtgataatgtctgggttcagggacagcagcaggatgggagacagatgcataaacatca gggtgttctctctggtgaatgagggcttcatgttattaatgtggtgagtcagtgagccccactgggtagtggtaa acatgtacaggctgtagagggctgtgaccagcatgttcagtcctgtcaggagcagggtgatgttgctccagg agaatgttgtcaccagcactgacagctctcccagcaggttaattgtagggggcagagccaggttggccag actagccaggagccaccagaaagccatcagtgggagcagggtctggagcccctgactcaggatcataat tcttgagtgagttctttcatagttgctatttgccaggcagaacaggaggctgctggtcagcccatgagcaatca tgaggatcactgccccagtaaaggaccagggtgtctgaatcagaatggcagtcaccaccagtgccatgtg gctgatggagctgtaagcaatcaggctcttgaggtcagtctgcctgagacagatggagctggtcatgatcat accccagaggctcagaaccaggaaagggtaagccatgtgctttgtcagagggttcaggatcagggtgag cctcatcataccataaccacccagcttcaggaggacagcagccaggaccatggagccagctattggagct tccacatgagccttggggagccagaggtgcaggccatagaggggcatcttcaccataaaggccattgtat aagccagccacatcaggttgtttgcccaggagttactcagctcctgggcagtcagagtcagcaggaggatg ttcaggctacccagtgtgttgtgggtatagatcagtgcaatcagcaggggcagtgagcccaccagtgtataa aagagaaagtaggtgcctgcattcagcctctcaggctgatttccccacctagtgatgatggccagggttggg atgagagtggtctcaaagaagatatagaacatgatcagctcagtggctgtgaaggtcataatcaggctgatt tgcaggctaatgagcatggacaggtacagctttttccttgacagaggctctgagctgaggtgcctctgactgg ccatgatagtcagaggcagcagccatgtggtcagcatgagcaggggggttgtcaggggatcagaggaa aaggtaggggagcatgaaaagaggttattattaatctggttgaaaaacagcagtgggatgatgctgataat caggctgtgggttgtggtgttaatccaaatcatgtgctttttgctcagccatgtgagaggcagcagcatgatggt tggcacaatcagcttcagca（配列番号２）のコード配列ＮＤ４と、
（ｉｉｉ）
agtcctcctttccaggtaccacacactcccccccacacagccagtcaggagcctggatgacagtgtatggg ggctggcagccat（配列番号３）のＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｖ）
aattctttgccaaagtgatgggccagcacacagaccagcacgttgcccaggagctgtgggaggaagata agaggtatgaacatgattagcaaaagggcctagcttggactcagaataatccagccttatcccaaccataa aataaaagcagaatggtagctggattgtagctgctattagcaatatgaaacctcttacatcagttacaatttat atgcagaaatatttatatgcagaaatattgctattgccttaacccagaaattatcactgttattctttagaatggtg caaagaggcatgatacattgtatcattattgccctgaaagaaagagattagggaaagtattagaaataaga taaacaaaaaagtatattaaaagaagaaagcatttt（配列番号４）のＨＢＢ２イントロン配列と、
（ｖ）
ggaggctggatcggtcccggtgtcttctatggaggtcaaaacagcgtggatggcgtctccaggcgatctga cggttcactaaacgagctctgcttatatagacctcccaccgtacacgcctaccgcccatttgcgtcaatgggg cggagttgttacgacattttggaaagtcccgttgattttggtgccaaaacaaactcccattgacgtcaatgggg tggagacttggaaatccccgtgagtcaaaccgctatccacgcccattgatgtactgccaaaaccgcatcac catggtaatagcgatgactaatacgtagatgtactgccaagtaggaaagtcccataaggtcatgtactgggc ataatgccaggcgggccatttaccgtcattgacgtcaatagggggcgtacttggcatatgatacacttgatgtactgccaagtgggcagtttaccgtaaatactccacccattgacgtcaatggaaagtccctattggcgttactat gggaacatacgtcattattgacgtcaatgggcgggggtcgttgggcggtcagccaggcgggccatttaccg taagttatgtaacgcggaactccatatatgggctatgaactaatgaccccgtaattgattactattaataactag（配列番号５）のＣＭＶプロモーター配列と、
（ｖｉ）
aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgacca aaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgc（配列番号６）のＩＴＲ配列と、
（ｖｉｉ）
ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccgg cctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct（配列番号７）のＩＴＲ配列と、
を含む。
【００３６】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えＡＡＶベクターは、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）の遺伝子をコードする組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２（ｒＡＡＶ２／２）であり、
（ｉ）配列番号１を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｉ）配列番号１７を含むコード配列ＮＤ４と、
（ｉｉｉ）配列番号３を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｖ）配列番号４を含むＨＢＢ２イントロン配列と、
（ｖ）配列番号５を含むＣＭＶプロモーター配列と、
（ｖｉ）配列番号６を含むＩＴＲ配列と、
（ｖｉｉ）配列番号７を含むＩＴＲ配列と、
を含む。
【００３７】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えＡＡＶベクターは、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）の遺伝子をコードする組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２（ｒＡＡＶ２／２）であり、
（ｉ）配列番号１４を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｉ）配列番号１５を含むコード配列ＮＤ４と、
（ｉｉｉ）配列番号１６を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｖ）配列番号２４を含むＨＢＢ２イントロン配列と、
（ｖ）配列番号２５を含むＣＭＶプロモーター配列と、
（ｖｉ）配列番号２６を含むＩＴＲ配列と、
（ｖｉｉ）配列番号２７を含むＩＴＲ配列と、
を含む。
【００３８】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えＡＡＶベクターは、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）の遺伝子をコードする組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２（ｒＡＡＶ２／２）であり、
（ｉ）配列番号１４を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｉ）配列番号１８を含むコード配列ＮＤ４と、
（ｉｉｉ）配列番号１６を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｖ）配列番号２４を含むＨＢＢ２イントロン配列と、
（ｖ）配列番号２５を含むＣＭＶプロモーター配列と、
（ｖｉ）配列番号２６を含むＩＴＲ配列と、
（ｖｉｉ）配列番号２７を含むＩＴＲ配列と、
を含む。
【００３９】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えベクターは、
（ｉ）配列番号４を含むＨＢＢ２イントロン配列と、
（ｉｉ）配列番号５を含むＣＭＶプロモーター配列と、
（ｉｉｉ）配列番号６を含むＩＴＲ配列と、
（ｉｖ）配列番号７を含むＩＴＲ配列と、
を更に含む。
【００４０】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えベクターは、
（ｉ）配列番号４からなるＨＢＢ２イントロン配列と、
（ｉｉ）配列番号５からなるＣＭＶプロモーター配列と、
（ｉｉｉ）配列番号６からなるＩＴＲ配列と、
（ｉｖ）配列番号７からなるＩＴＲ配列と、
を更に含む。
【００４１】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えベクターは、
（ｉ）配列番号２４を含むＨＢＢ２イントロン配列と、
（ｉｉ）配列番号２５を含むＣＭＶプロモーター配列と、
（ｉｉｉ）配列番号２６を含むＩＴＲ配列と、
（ｉｖ）配列番号２７を含むＩＴＲ配列と、
を更に含む。
【００４２】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えベクターは、
（ｉ）配列番号２４からなるＨＢＢ２イントロン配列と、
（ｉｉ）配列番号２５からなるＣＭＶプロモーター配列と、
（ｉｉｉ）配列番号２６からなるＩＴＲ配列と、
（ｉｖ）配列番号２７からなるＩＴＲ配列と、
を更に含む。
【００４３】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えベクターは、ＮＤ４タンパク質をコードする組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２（ｒＡＡＶ２／２）であり、
配列番号１４を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１３を含むＮＤ４ポリペプチドをコードする核酸配列と、
配列番号１１を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０ポリペプチド配列をコードする核酸配列と、
を含む。
【００４４】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えベクターは、ＮＤ４タンパク質をコードする組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２（ｒＡＡＶ２／２）であり、
配列番号１４を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１３を含むＮＤ４ポリペプチドをコードする核酸配列と、
配列番号１２を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０ポリペプチド配列をコードする核酸配列と、
を含む。
【００４５】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えベクターは、ＮＤ４タンパク質をコードする組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２（ｒＡＡＶ２／２）であり、
配列番号１を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１３を含むＮＤ４ポリペプチドをコードする核酸配列と、
配列番号１１を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０ポリペプチド配列をコードする核酸配列と、
を含む。
【００４６】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えベクターは、ＮＤ４タンパク質をコードする組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２（ｒＡＡＶ２／２）であり、
配列番号１を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１３を含むＮＤ４ポリペプチドをコードする核酸配列と、
配列番号１２を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０ポリペプチド配列をコードする核酸配列と、
を含む。
【００４７】
【表３】
2021526834.tif 000009
【００４８】
プロモーター、イントロン又はＩＴＲ等の配列が当業者によく知られており、当業者は、それぞれの配列を当該技術分野で既知の他の要素で容易に置き換えることができる。
【００４９】
本開示の組み換えベクターは、ＮＤ４関連ＬＨＯＮを含むレーベル遺伝性視神経網膜症（ＬＨＯＮ）の治療に有用である。
【００５０】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えベクターは、それを必要とする患者に硝子体内注射によって投与される。
【００５１】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えベクターは、それを必要とする患者に単回硝子体内注射によって投与される。
【００５２】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えウイルスベクターは、それを必要とする患者に約１０９ｖｇ（ウイルスゲノム）／眼〜１０１１ｖｇ／眼の１つ以上の用量で投与される。幾つかの実施形態では、本開示の組み換えＡＡＶ２ベクターは、それを必要とする患者に約１０１０ｖｇ／眼、例えば９×１０１０ｖｇ／眼の１つ以上の用量で投与される。
【００５３】
本開示の一態様は、幾つかの実施形態で本開示の組み換えＡＡＶ２ベクターの作製に使用することができるｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミドに関する。
【００５４】
幾つかの実施形態では、本開示のｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミドは、以下の機能要素及び配列を含む：
３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０：ｎｔ  １１〜６０５＝５９５ｂｐ
コーディング配列ＮＤ４：ｎｔ  ６１８〜１９９７＝１３８０ｂｐ
ＭＴＳ  Ｃｏｘ１０：ｎｔ  １９９８〜２０８１＝８４ｂｐ
ＨＢＢ２イントロン：ｎｔ  ２１２４〜２６１６＝４９３ｂｐ
ＣＭＶプロモーター：ｎｔ  ２６２４〜３２８３＝６６０ｂｐ
ＩＴＲ：ｎｔ  ３３２７〜３４５４＝１２８ｂｐ
Ｆ１起点：ｎｔ  ３８７２〜４３２７＝４５６ｂｐ
Ｋａｎａ  Ｒ遺伝子：ｎｔ  ４４８２〜５２７３＝７９２ｂｐ
ＣＯＬＥ１起点：ｎｔ  ５４８８〜６１０２＝６１５ｂｐ
ＩＴＲ：ｎｔ  ６３２４〜６４５３＝１３０ｂｐ。
【００５５】
【表４】
2021526834.tif 000010
2021526834.tif 000011
2021526834.tif 000012
【００５６】
幾つかの実施形態では、本開示のｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミドは、
（ｉ）配列番号１の３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｉ）配列番号２のコード配列ＮＤ４と、
（ｉｉｉ）配列番号３のＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｖ）配列番号４のＨＢＢ２イントロン配列と、
（ｖ）配列番号５のＣＭＶプロモーター配列と、
（ｖｉ）配列番号６のＩＴＲ配列と、
（ｖｉｉ）配列番号７のＩＴＲ配列と、
を含む。
【００５７】
幾つかの実施形態では、本開示のｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミドは、
（ｉ）配列番号１の３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｉ）配列番号１７のコード配列ＮＤ４と、
（ｉｉｉ）配列番号３のＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｖ）配列番号４のＨＢＢ２イントロン配列と、
（ｖ）配列番号５のＣＭＶプロモーター配列と、
（ｖｉ）配列番号６のＩＴＲ配列と、
（ｖｉｉ）配列番号７のＩＴＲ配列と、
を含む。
【００５８】
幾つかの実施形態では、本開示のｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミドは、
（ｉ）配列番号１４の３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｉ）配列番号１５のコード配列ＮＤ４と、
（ｉｉｉ）配列番号１６のＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｖ）配列番号２４のＨＢＢ２イントロン配列と、
（ｖ）配列番号２５のＣＭＶプロモーター配列と、
（ｖｉ）配列番号２６のＩＴＲ配列と、
（ｖｉｉ）配列番号２７のＩＴＲ配列と、
を含む。
【００５９】
幾つかの実施形態では、本開示のｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミドは、
（ｉ）配列番号１４の３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｉ）配列番号１８のコード配列ＮＤ４と、
（ｉｉｉ）配列番号１６のＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列と、
（ｉｖ）配列番号２４のＨＢＢ２イントロン配列と、
（ｖ）配列番号２５のＣＭＶプロモーター配列と、
（ｖｉ）配列番号２６のＩＴＲ配列と、
（ｖｉｉ）配列番号２７のＩＴＲ配列と、
を含む。
【００６０】
幾つかの実施形態では、本開示のｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミドは、
gctcggtccgaacatgtggaatccccagtcccagtgcacagcagccgggtcctagctattggtattgttaga aggactatggttgagaatgtgtggggtggggaaaaccaaaaatgcaggccctggctcagtcaccaggaa gggggtgctccgaggcctttgagggacctgagctcacagaactacagacagcagatcatgaggctcaca ctttctggccaccaagtgccactctgctgggcatgtggagtgtgcgtgtggtgtggtggtaaggatggaacca aaagaggaagctgtgtatgtgtacccccatgtgaggaggaagaaacagaatagagggtggggttggag gagagatgtataaagaccctcaaagggaaaaataattccttttttgtattcactgactgagctgatgcatttctt atttggggagcattttgggtaatatttaaaaaaaaaaaaaactgtcaagtgatcactgggcaccgaattcgttt ataatcttgttctaaacccagcaatttctcttcttgtgttccagaattaccacaacatgctcgcctggcagcgga gggaaaggggcggtgggcgtcccagtgctcagatctctcgagtcaggatgagaaaccagtgataatgtct gggttcagggacagcagcaggatgggagacagatgcataaacatcagggtgttctctctggtgaatgagg gcttcatgttattaatgtggtgagtcagtgagccccactgggtagtggtaaacatgtacaggctgtagagggc tgtgaccagcatgttcagtcctgtcaggagcagggtgatgttgctccaggagaatgttgtcaccagcactga cagctctcccagcaggttaattgtagggggcagagccaggttggccagactagccaggagccaccagaa agccatcagtgggagcagggtctggagcccctgactcaggatcataattcttgagtgagttctttcatagttgc tatttgccaggcagaacaggaggctgctggtcagcccatgagcaatcatgaggatcactgccccagtaaa ggaccagggtgtctgaatcagaatggcagtcaccaccagtgccatgtggctgatggagctgtaagcaatc aggctcttgaggtcagtctgcctgagacagatggagctggtcatgatcataccccagaggctcagaaccag gaaagggtaagccatgtgctttgtcagagggttcaggatcagggtgagcctcatcataccataaccaccca gcttcaggaggacagcagccaggaccatggagccagctattggagcttccacatgagccttggggagcc agaggtgcaggccatagaggggcatcttcaccataaaggccattgtataagccagccacatcaggttgttt gcccaggagttactcagctcctgggcagtcagagtcagcaggaggatgttcaggctacccagtgtgttgtg ggtatagatcagtgcaatcagcaggggcagtgagcccaccagtgtataaaagagaaagtaggtgcctgc attcagcctctcaggctgatttccccacctagtgatgatggccagggttgggatgagagtggtctcaaagaa gatatagaacatgatcagctcagtggctgtgaaggtcataatcaggctgatttgcaggctaatgagcatgga caggtacagctttttccttgacagaggctctgagctgaggtgcctctgactggccatgatagtcagaggcagc agccatgtggtcagcatgagcaggggggttgtcaggggatcagaggaaaaggtaggggagcatgaaaa gaggttattattaatctggttgaaaaacagcagtgggatgatgctgataatcaggctgtgggttgtggtgttaat ccaaatcatgtgctttttgctcagccatgtgagaggcagcagcatgatggttggcacaatcagcttcagcata gtcctcctttccaggtaccacacactcccccccacacagccagtcaggagcctggatgacagtgtatgggg gctggcagccatgtcgactctagaggatccccggggaattcaatcgatgttcgaatcccaattctttgccaaa gtgatgggccagcacacagaccagcacgttgcccaggagctgtgggaggaagataagaggtatgaaca tgattagcaaaagggcctagcttggactcagaataatccagccttatcccaaccataaaataaaagcaga atggtagctggattgtagctgctattagcaatatgaaacctcttacatcagttacaatttatatgcagaaatattt atatgcagaaatattgctattgccttaacccagaaattatcactgttattctttagaatggtgcaaagaggcatg atacattgtatcattattgccctgaaagaaagagattagggaaagtattagaaataagataaacaaaaaag tatattaaaagaagaaagcattttttgtgggcctatagactctataggcggtacttacgtcactcttggcacggg gaatccgcgttccaatgcaccgttcccggccgggattcgaatccgcggaggctggatcggtcccggtgtctt ctatggaggtcaaaacagcgtggatggcgtctccaggcgatctgacggttcactaaacgagctctgcttata tagacctcccaccgtacacgcctaccgcccatttgcgtcaatggggcggagttgttacgacattttggaaagt cccgttgattttggtgccaaaacaaactcccattgacgtcaatggggtggagacttggaaatccccgtgagtc aaaccgctatccacgcccattgatgtactgccaaaaccgcatcaccatggtaatagcgatgactaatacgt agatgtactgccaagtaggaaagtcccataaggtcatgtactgggcataatgccaggcgggccatttaccg tcattgacgtcaatagggggcgtacttggcatatgatacacttgatgtactgccaagtgggcagtttaccgtaaatactccacccattgacgtcaatggaaagtccctattggcgttactatgggaacatacgtcattattgacgtca atgggcgggggtcgttgggcggtcagccaggcgggccatttaccgtaagttatgtaacgcggaactccata tatgggctatgaactaatgaccccgtaattgattactattaataactagacgcgtgcggccgtagataagtag catggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgct cgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagc gagcgagcgcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgca gcctgaatggcgaatggattccagacgattgagcgtcaaaatgtaggtatttccatgagcgtttttccgttgca atggctggcggtaatattgttctggatattaccagcaaggccgatagtttgagttcttctactcaggcaagtgat gttattactaatcaaagaagtattgcgacaacggttaatttgcgtgatggacagactcttttactcggtggcctc actgattataaaaacacttctcaggattctggcgtaccgttcctgtctaaaatccctttaatcggcctcctgtttag ctcccgctctgattctaacgaggaaagcacgttatacgtgctcgtcaaagcaaccatagtacgcgccctgta gcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc gcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggc tccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttc caaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattg gttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtgg cacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatga gacaataaccctgataaatgcttcaataatagcacctagatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatg attgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggca caacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtca agaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacga cgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaa gtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgc ggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagc acgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgcca gccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgat gcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggc ggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgacc gcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttct gaattattaacgcttacaatttcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatcaggt ggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcat gaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttct tgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgc cggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtcc ttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatc ctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccgg ataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctac accgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcgg acaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacg cctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcagggggg cggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacat gttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgca gccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccg cctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaa agcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtg gccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatcta（配列番号２２）を含む。
【００６１】
幾つかの実施形態では、本開示のｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミドは、以下の機能要素及び配列を含む：
３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０：ｎｔ  １１〜６０５＝５９５ｂｐ
コーディング配列ＮＤ４：ｎｔ  ６１８〜１９９７＝１３８０ｂｐ
ＭＴＳ  Ｃｏｘ１０：ｎｔ  １９９８〜２０８１＝８４ｂｐ
ＨＢＢ２イントロン：ｎｔ  ２１２４〜２６１６＝４９３ｂｐ
ＣＭＶプロモーター：ｎｔ  ２６２４〜３２８３＝６６０ｂｐ
ＩＴＲ：ｎｔ  ３３２７〜３４５４＝１２８ｂｐ
Ｆ１起点：ｎｔ  ３８２７〜４２８２＝４５６ｂｐ
Ｋａｎａ  Ｒ遺伝子：ｎｔ  ４４３７〜５２２８＝７９２ｂｐ
ＣＯＬＥ１起点：ｎｔ  ５４４３〜６０５７＝６１５ｂｐ
ＩＴＲ：ｎｔ  ６２７９〜６４０８＝１３０ｂｐ。
【００６２】
【表５】
2021526834.tif 000013
2021526834.tif 000014
2021526834.tif 000015
【００６３】
幾つかの実施形態では、本開示のｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミドは、
gctcggtccgaacatgtggaatccccagtcccagtgcacagcagccgggtcctagctattggtattgttaga aggactatggttgagaatgtgtggggtggggaaaaccaaaaatgcaggccctggctcagtcaccaggaa gggggtgctccgaggcctttgagggacctgagctcacagaactacagacagcagatcatgaggctcaca ctttctggccaccaagtgccactctgctgggcatgtggagtgtgcgtgtggtgtggtggtaaggatggaacca aaagaggaagctgtgtatgtgtacccccatgtgaggaggaagaaacagaatagagggtggggttggag gagagatgtataaagaccctcaaagggaaaaataattccttttttgtattcactgactgagctgatgcatttctt atttggggagcattttgggtaatatttaaaaaaaaaaaaaactgtcaagtgatcactgggcaccgaattcgttt ataatcttgttctaaacccagcaatttctcttcttgtgttccagaattaccacaacatgctcgcctggcagcgga gggaaaggggcggtgggcgtcccagtgctcagatctctcgagtcaggatgagaaaccagtgataatgtct gggttcagggacagcagcaggatgggagacagatgcataaacatcagggtgttctctctggtgaatgagg gcttcatgttattaatgtggtgagtcagtgagccccactgggtagtggtaaacatgtacaggctgtagagggc tgtgaccagcatgttcagtcctgtcaggagcagggtgatgttgctccaggagaatgttgtcaccagcactga cagctctcccagcaggttaattgtagggggcagagccaggttggccagactagccaggagccaccagaa agccatcagtgggagcagggtctggagcccctgactcaggatcataattcttgagtgagttctttcatagttgc tatttgccaggcagaacaggaggctgctggtcagcccatgagcaatcatgaggatcactgccccagtaaa ggaccagggtgtctgaatcagaatggcagtcaccaccagtgccatgtggctgatggagctgtaagcaatc aggctcttgaggtcagtctgcctgagacagatggagctggtcatgatcataccccagaggctcagaaccag gaaagggtaagccatgtgctttgtcagagggttcaggatcagggtgagcctcatcataccataaccaccca gcttcaggaggacagcagccaggaccatggagccagctattggagcttccacatgagccttggggagcc agaggtgcaggccatagaggggcatcttcaccataaaggccattgtataagccagccacatcaggttgttt gcccaggagttactcagctcctgggcagtcagagtcagcaggaggatgttcaggctacccagtgtgttgtg ggtatagatcagtgcaatcagcaggggcagtgagcccaccagtgtataaaagagaaagtaggtgcctgc attcagcctctcaggctgatttccccacctagtgatgatggccagggttgggatgagagtggtctcaaagaa gatatagaacatgatcagctcagtggctgtgaaggtcataatcaggctgatttgcaggctaatgagcatgga caggtacagctttttccttgacagaggctctgagctgaggtgcctctgactggccatgatagtcagaggcagc agccatgtggtcagcatgagcaggggggttgtcaggggatcagaggaaaaggtaggggagcatgaaaa gaggttattattaatctggttgaaaaacagcagtgggatgatgctgataatcaggctgtgggttgtggtgttaat ccaaatcatgtgctttttgctcagccatgtgagaggcagcagcatgatggttggcacaatcagcttcagcata gtcctcctttccaggtaccacacactcccccccacacagccagtcaggagcctggatgacagtgtatgggg gctggcagccatgtcgactctagaggatccccggggaattcaatcgatgttcgaatcccaattctttgccaaa gtgatgggccagcacacagaccagcacgttgcccaggagctgtgggaggaagataagaggtatgaaca tgattagcaaaagggcctagcttggactcagaataatccagccttatcccaaccataaaataaaagcaga atggtagctggattgtagctgctattagcaatatgaaacctcttacatcagttacaatttatatgcagaaatattt atatgcagaaatattgctattgccttaacccagaaattatcactgttattctttagaatggtgcaaagaggcatg atacattgtatcattattgccctgaaagaaagagattagggaaagtattagaaataagataaacaaaaaag tatattaaaagaagaaagcattttttgtgggcctatagactctataggcggtacttacgtcactcttggcacggg gaatccgcgttccaatgcaccgttcccggccgggattcgaatccgcggaggctggatcggtcccggtgtctt ctatggaggtcaaaacagcgtggatggcgtctccaggcgatctgacggttcactaaacgagctctgcttata tagacctcccaccgtacacgcctaccgcccatttgcgtcaatggggcggagttgttacgacattttggaaagt cccgttgattttggtgccaaaacaaactcccattgacgtcaatggggtggagacttggaaatccccgtgagtc aaaccgctatccacgcccattgatgtactgccaaaaccgcatcaccatggtaatagcgatgactaatacgt agatgtactgccaagtaggaaagtcccataaggtcatgtactgggcataatgccaggcgggccatttaccg tcattgacgtcaatagggggcgtacttggcatatgatacacttgatgtactgccaagtgggcagtttaccgtaa atactccacccattgacgtcaatggaaagtccctattggcgttactatgggaacatacgtcattattgacgtca atgggcgggggtcgttgggcggtcagccaggcgggccatttaccgtaagttatgtaacgcggaactccata tatgggctatgaactaatgaccccgtaattgattactattaataactagacgcgtgcggccgtagataagtag catggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgct cgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagc gagcgagcgcgcagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgattccgttgcaatggctggcggtaatattgttctggatattaccagcaaggccga tagtttgagttcttctactcaggcaagtgatgttattactaatcaaagaagtattgcgacaacggttaatttgcgt gatggacagactcttttactcggtggcctcactgattataaaaacacttctcaggattctggcgtaccgttcctgt ctaaaatccctttaatcggcctcctgtttagctcccgctctgattctaacgaggaaagcacgttatacgtgctcg tcaaagcaaccatagtacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcg tgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccgg ctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaa aaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttgga gtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgattt ataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaa caaaatattaacgcttacaatttaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttcta aatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatagcacctagatcaa gagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtg gagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtca gcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggc agcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgg gaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgaga aagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccacc aagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctgga cgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcg aggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattc atcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaa gagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcg ccttctatcgccttcttgacgagttcttctgaattattaacgcttacaatttcctgatgcggtattttctccttacgcat ctgtgcggtatttcacaccgcatcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttct aaatacattcaaatatgtatccgctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagac cccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaa accaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttca gcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagc accgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccg ggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacgggggggtcgtgcacac agcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgcc acgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgc acgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagc gtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggtt cctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcct ttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcg gaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctgcgcgctcg ctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgag cgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgc catgctacttatctac（配列番号２３）を含む。
【００６４】
幾つかの実施形態では、本開示のｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミドは、抗生物質選択を可能にするためにカナマイシン耐性遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、本開示のｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミドは、プラスミドの複製を可能にするためにｆ１複製起点配列を含む。幾つかの実施形態では、本開示のｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミドは、プラスミドの複製を可能にするためにＣｏｌＥ１複製起点配列を含む。
【００６５】
このため、幾つかの実施形態では、本開示のｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミドは、
（ｉ）
acgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgc cagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctc taaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggt gatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaata gtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccg atttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgctt acaattt（配列番号８）を含むｆ１複製起点配列と、
（ｉｉ）
attgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggca caacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtca agaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacga cgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaa gtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgc ggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagc acgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgcca gccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgat gcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggc ggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgacc gcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttct ga（配列番号９）を含むカナマイシン耐性遺伝子配列と、
（ｉｉｉ）
aaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagc ggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagata ccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacct cgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagac gatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagc gaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaaggg agaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctc gtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcg（配列番号１０）を含むＣｏｌＥ１複製起点配列と、
を更に含む。
【００６６】
本開示のｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミドの生成は、当該技術分野で既知の好適な遺伝子工学技術を用いて達成することができる（例えば、Green, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition, Cold Spring Harbor Press, (2012)を参照されたい）。
【００６７】
幾つかの実施形態では、本開示の組み換えＡＡＶベクターは、一過性パッケージング細胞株における（ｉ）本開示のｐＡＡＶ−ＮＤ４トランスファープラスミド（例えば、図２に示すプラスミド）、（ｉｉ）ＡＡＶ２／２粒子の産生に関与する必須タンパク質（例えば、非限定的な例としては、酵素及び構造タンパク質）の合成をコードする遺伝物質を宿主細胞に与えるｒｅｐ／ｃａｐプラスミド、及び（ｉｉｉ）ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子の発現を誘導するヘルパー機能を与えるアデノウイルスヘルパープラスミドによる三重トランスフェクションによって作製される。
【００６８】
幾つかの実施形態では、パッケージング細胞株がヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ  ２９３）細胞株を含む。
【００６９】
幾つかの実施形態では、ｒｅｐ／ｃａｐプラスミドは、ｐＲｅｐ２Ｃａｐ２プラスミドである。幾つかの実施形態では、ｒｅｐ／ｃａｐプラスミドは、以下の要素：
ｉ．  ＡＡＶ２／２血清型に由来するｒｅｐ配列（ｎｔ  ２８１〜２２１２、１９３２ｂｐ）と、
ｉｉ．  ＡＡＶ２／２血清型に由来するｃａｐ配列（ｎｔ  ２１６３〜４３７０；２２０８ｂｐ）と、
ｉｉｉ．  カナマイシン耐性遺伝子（ｎｔ  ５７１２〜６５０６、相補的；７９５ｂｐ）と、
ｉｖ．  原核生物複製起点（ｎｔ  ４８９６〜５４９６；６０１ｂｐ）及びファージｆ１複製起点（ｎｔ  ６６５８〜７１１３；４５６ｂｐ）と、
を含むｐＲｅｐ２Ｃａｐ２プラスミドである（図３）。
【００７０】
幾つかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、ｐＸＸ６プラスミドである。幾つかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、以下の要素：
ｉ．  アデノウイルスＩＴＲ（ｎｔ  １〜８５及び１８６３８〜１８７３２）と、
ｉｉ．  カナマイシン耐性遺伝子（ｎｔ  １４０２〜２１９６、７９５ｂｐ）と、
ｉｉｉ．  原核生物複製起点（ｎｔ  ２４１１〜３０２５；６１５ｂｐ）及びファージｆ１複製起点（ｎｔ  ７９５〜１２５０；４５６ｂｐ）と、
ｉｖ．  １３個の特異的アデノウイルス配列（ＶＡ１  ＲＮＡ配列からＥ４ｏｒｆ２配列まで、ｎｔ  ４２５９〜１７９１６）と、
を含むｐＸＸ６プラスミドである（図４）。
【００７１】
ＬＨＯＮを患い、本明細書に開示される組み換えベクターで治療される患者は、例えば視力の改善による治療効果を得ることができる。「治療」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患、疾患の１つ以上の症状、又は疾患の素因を治癒する、回復させる、緩和する、軽減する、変化させる、矯正する、寛解させる、改善する、又はそれに影響を及ぼす目的での疾患、疾患の症状又は疾患の素因を有する被験体への治療剤の適用又は投与として定義される。本開示の組成物が単独で又は別の治療剤と組み合わせて、治療されるＬＨＯＮの少なくとも１つの症状を治療の非存在下でのその症状と比較して治癒する、回復させる、緩和する、軽減する、変化させる、矯正する、寛解させる、改善する、又はそれに影響を及ぼす限りにおいて、障害の全ての症状が治癒する、回復する、緩和する、軽減する、変化する、矯正される、寛解する、改善する又は影響を受けるか否かに関わらず、結果は基礎障害の治療とみなされる。治療は、「有効量」の治療剤を用いて達成することができ、これは部分的及び完全な治療、例えば疾患、疾患の１つ以上の症状、又は疾患の素因を部分的又は完全に治癒する、回復させる、緩和する、軽減する、変化させる、矯正する、寛解させる、改善する、又はそれに影響を及ぼすことを包含すると理解されるものとする。「有効量」は、経験的に決定することができる。同様に、「治療有効量」は、既定の治療効果を達成するのに効果的な濃度である。
【００７２】
一実施形態では、「治療する」という用語は、本明細書に開示される核酸、ベクター、組み換えウイルス又は医薬組成物を含む組成物の有効用量又は有効複数回用量（multiple doses）を、それを必要とする動物（ヒトを含む）に投与する工程を含む。用量を障害／疾患の発生前に投与する場合、投与は予防的である。用量を障害／疾患の発生後に投与する場合、投与は治療的である。実施形態では、有効用量は、治療される障害／疾患状態と関連する少なくとも１つの症状を検出可能に緩和する（解消するか又は減少させる）、障害／疾患状態への進行を遅らせる又は防ぐ、障害／疾患状態の進行を遅らせる又は防ぐ、疾患の範囲を減らす、疾患の寛解（部分又は完全）をもたらす、及び／又は生存を延長する用量である。この用語は、完全な治療（すなわち、治癒）及び／又は予防を包含するが、必要とはしない。
【００７３】
幾つかの実施形態では、投与される組み換えベクターの力価は、ウイルスゲノム（ｖｇ）で測定される。幾つかの実施形態では、投与される組み換えベクターの力価は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって測定される。幾つかの実施形態では、投与される組み換えベクターの力価は、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって測定される。幾つかの実施形態では、組み換えＡＡＶベクターは、約１．０×１０９ｖｇ／眼〜１．０×１０１２ｖｇ／眼の量で硝子体内に投与される。幾つかの実施形態では、組み換えＡＡＶベクターは、約５．０×１０９ｖｇ／眼〜５×１０１１ｖｇ／眼の量で硝子体内に投与される。幾つかの実施形態では、組み換えＡＡＶベクターは、約１．０×１０１０ｖｇ／眼〜１×１０１１ｖｇ／眼の量で硝子体内に投与される。幾つかの実施形態では、組み換えＡＡＶベクターは、約９×１０１１０ｖｇ／眼の量で硝子体内に投与される。組み換えベクターの力価は、組み換えベクター内にハイブリダイズするプライマーからのＰＣＲによって測定することができる。プライマーの例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：
ＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＴＧ  ＡＡＶ２２ｍｅｒｓ．Ｆ（配列番号１９）
ＧＴＡＧＡＴＡＡＧＴＡＧＣＡＴＧＧＣ  ＡＡＶ１８ｍｅｒｓ．Ｒ（配列番号２０）
ＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣ  ＡＡＶ＿ＭＧＢ．Ｐ（配列番号２１）
【００７４】
幾つかの実施形態では、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）の遺伝子をコードする本開示の組み換えベクター、例えばＡＡＶ血清型２（ｒＡＡＶ）は、
配列番号１を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１３を含むＮＤ４ポリペプチドをコードする核酸配列と、
配列番号１１を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０ポリペプチドをコードする核酸配列と、
を含み、それを必要とする患者に有効用量で投与される。幾つかの実施形態では、患者はＬＨＯＮを患う。
【００７５】
幾つかの実施形態では、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）の遺伝子をコードする本開示の組み換えベクター、例えばＡＡＶ血清型２（ｒＡＡＶ）は、
配列番号１を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１３を含むＮＤ４ポリペプチドをコードする核酸配列と、
配列番号１２を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０ポリペプチドをコードする核酸配列と、
を含み、それを必要とする患者に有効用量で投与される。幾つかの実施形態では、患者はＬＨＯＮを患う。
【００７６】
幾つかの実施形態では、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）の遺伝子をコードする本開示の組み換えベクター、例えばＡＡＶ血清型２（ｒＡＡＶ）は、
配列番号１４を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１３を含むＮＤ４ポリペプチドをコードする核酸配列と、
配列番号１１を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０ポリペプチドをコードする核酸配列と、
を含み、それを必要とする患者に有効用量で投与される。幾つかの実施形態では、患者はＬＨＯＮを患う。
【００７７】
幾つかの実施形態では、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）の遺伝子をコードする本開示の組み換えベクター、例えばＡＡＶ血清型２（ｒＡＡＶ）は、
配列番号１４を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列と、
配列番号１３を含むＮＤ４ポリペプチドをコードする核酸配列と、
配列番号１２を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０ポリペプチドをコードする核酸配列と、
を含み、それを必要とする患者に有効用量で投与される。幾つかの実施形態では、患者はＬＨＯＮを患う。
【００７８】
ＬＨＯＮの発症は、症状の存在によって決定することができる。幾つかの実施形態では、組み換えベクターは９ヶ月未満、例えば６ヶ月〜９ヶ月、３ヶ月〜６ヶ月又は１ヶ月〜３ヶ月の疾患発症を有する患者に投与される。幾つかの実施形態では、組み換えベクターは９ヶ月超、例えば１２ヶ月、２年間又は３年間にわたる疾患発症を有する患者に投与される。幾つかの実施形態では、患者はＬＨＯＮの１つ以上の症状、例えば視力の低下を示す。
【００７９】
患者の視力を測定するスケールは、最小分離視角（Minimum Angle of Resolution：ＭＡＲ）の（１０を底とする）対数として表すことができる（Bailey IL, Lovie JE. I, Am. J. Optom. Physiol. Opt., 53 (11): 740-745 (1976)）。ＬｏｇＭＡＲスケールにより、従来のチャートの幾何学的配列が線形スケールに変換される。これは視力低下を測定するものであり、正の値は視覚低下（vision loss）を示し、負の値は正常又はより良好な視力を意味する。幾つかの実施形態では、ＬＨＯＮを患う患者の視力は、ＬｏｇＭａｒスケールによって測定される。幾つかの実施形態では、ＬＨＯＮを患う患者の視力は、スネレンスケールによって測定される。
【００８０】
別の一般に用いられる視力の尺度は、非常に低い視覚レベルまで視力を数値化することが可能な早期治療糖尿病性網膜症研究（ＥＴＤＲＳ）視力チャートである（Ferris et al., Am. J. Opthalmol., 94:91-96 (1982)）。幾つかの実施形態では、ＬＨＯＮを患う患者の視力は、ＥＴＤＲＳチャートによって測定される。
【００８１】
コントラストは、同じ視野内の物体と他の物体との色及び明るさの差によって決定される。ＬＨＯＮを患う患者は、コントラストに対する感度の低下を有し得る。視力を測定する別のスケールは、ペリ−ロブソンコントラスト感度チャートであり得る（Pelli et al., Clin. Vision Sci., 2(3):187-199 (1988)）。幾つかの実施形態では、ＬＨＯＮを患う患者の視力は、ペリ−ロブソンチャートによって測定される。
【００８２】
幾つかの実施形態では、治療は治療前、例えばベースライン時の視力が２．０ＬｏｇＭＡＲ未満、例えば１．８ＬｏｇＭＡＲ未満、１．６ＬｏｇＭＡＲ未満、１．４ＬｏｇＭＡＲ未満、１．２ＬｏｇＭＡＲ未満、１．０ＬｏｇＭＡＲ未満又は０．８ＬｏｇＭＡＲ未満の患者において行われる。幾つかの実施形態では、治療は治療前、例えばベースライン時の視力が少なくとも３文字、例えば少なくとも４文字、５文字、６文字、７文字、８文字、９文字、１０文字、１１文字又は１２文字の患者において行われる。
【００８３】
治療に対する有効性又は反応は、疾患症状の好転又は改善によって測定することができる。幾つかの実施形態では、ベースライン視力は、治療を行う前に測定される。幾つかの実施形態では、治療に対する有効性又は反応は、視力の向上によって測定される。幾つかの実施形態では、治療に対する有効性又は反応は、治療前のベースラインと比較した治療後の視力の向上によって測定される。幾つかの実施形態では、治療に対する有効性又は反応は、治療前及び治療後のＥＴＤＲＳスコアの差によって測定される。幾つかの実施形態では、治療に対する有効性又は反応は、ベースラインと比較した治療後の少なくとも＋５．０、例えば少なくとも＋６．０、＋７．０、＋８．０、＋９．０、＋１０．０、＋１１．０、＋１２．０、＋１３．０、＋１４．０、＋１５．０又は＋１６．０のＥＴＤＲＳスコアの差によって測定される。幾つかの実施形態では、治療に対する有効性又は反応は、ベースラインと比較した治療後の少なくとも０．０５、例えば少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９又は１．０のＬｏｇＭＡＲの差によって測定される。
【００８４】
本明細書に開示されるように、理論に束縛されるものではないが、本開示の組み換えベクターによる治療に反応する患者（例えば、視力の向上が観察された患者）は、９ヶ月未満、例えば６ヶ月〜９ヶ月のベースライン時の罹病期間（例えば、視覚低下）、及び／又は１．６ＬｏｇＭＡＲ未満のベースライン時の視力を有する患者を含み得る。幾つかの実施形態では、基準（例えば、９ヶ月未満、又は６ヶ月〜９ヶ月のベースライン時の視覚低下によって測定される罹病期間、及び／又は１．６ＬｏｇＭＡＲ未満のベースライン時の視力）は、本開示の組み換えベクターによる治療により良好に反応することが予想される患者亜集団（例えば、視力の向上が予想され得る患者集団）の特定に用いることができる。
【００８５】
本開示は、（ｉ）９ヶ月未満（例えば、６ヶ月〜９ヶ月）のベースライン時の罹病期間、及び／又は（ｉｉ）１．６ＬｏｇＭＡＲ未満のベースライン時の視力を有する患者群に対するレーベル遺伝性視神経網膜症（ＬＨＯＮ）の治療におけるヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）ポリペプチドをコードし、（ｉ）配列番号１１を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列をコードする核酸配列と、（ｉｉ）配列番号１３を含むＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）ポリペプチドをコードする核酸配列と、（ｉｉｉ）配列番号１４を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列（又はその逆相補体、配列番号１）とを含む組み換えベクターの使用を更に記載する。
【００８６】
本開示は、（ｉ）９ヶ月未満（例えば、６ヶ月〜９ヶ月）のベースライン時の罹病期間、及び／又は（ｉｉ）１．６ＬｏｇＭＡＲ未満のベースライン時の視力を有するＬＨＯＮを患う患者を治療する方法であって、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）ポリペプチドをコードし、（ｉ）配列番号１１を含むＭＴＳ  Ｃｏｘ１０配列をコードする核酸配列と、（ｉｉ）配列番号１３を含むＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ４（ＮＤ４）ポリペプチドをコードする核酸配列と、（ｉｉｉ）配列番号１４を含む３’ＵＴＲ  Ｃｏｘ１０配列（又はその逆相補体、配列番号１）とを含む組み換えベクターを有効量投与することを含む、方法も記載する。
【００８７】
本開示を以下の実施例によって更に説明するが、実施例は限定と解釈されるものではない。本願全体を通して引用される全ての参照文献、特許及び公開特許出願の内容、並びに図面は、その全体があらゆる目的で引用することにより本明細書の一部をなす。
【実施例】
【００８８】
実施例１
レーベル遺伝性視神経網膜症を有する患者における組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター血清型２を含み、ヒトミトコンドリアＮＤ４遺伝子を有する本明細書に開示されるベクター（ｒＡＡＶ２／２−ＮＤ４）（「ベクターＡ」）の安全性及び有効性を調査した。
【００８９】
研究に参加する患者は、６ヶ月超〜１年までの期間にわたって視覚低下を患っていた。登録された被験体では、ＮＤ４遺伝子にＧ１１７７８Ａ突然変異が確認された。また、登録された被験体は、指数弁（Count Fingers）以上のベースライン視覚を有していた。
【００９０】
各患者の一方の眼を無作為に選択してベクターＡの単回注射を行い、もう一方の眼に偽注射を行った。第１の患者群では、右眼（ＯＤ）をベクターＡで処置し、左眼（ＯＳ）を偽処置した。第２の患者群では、右眼（ＯＤ）を偽処置し、左眼（ＯＳ）をベクターＡで処置した。
【００９１】
ベクターＡによる処置には、９０μＬの平衡塩類溶液＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８（商標）中に９×１０１０ウイルスゲノムを含有する硝子体内注射を用いた。偽処置は、針を有しない注射器の鈍端を用いて通常の硝子体内注射手順の位置で眼に圧力をかけることによって行われる硝子体内注射を含むものであった。
【００９２】
ベクターＡで処置した眼と偽処置した眼とで、ベースライン（研究前）点からの変化及び処置後４８週目に患者がＥＴＤＲＳチャート上で読んだ文字の数から得られる４８週目のＬｏｇＭＡＲ視力（acuity）の比較を行った。別の比較様式で、各患者の視力が良い方の眼を初回来院時の無作為化の前に視覚検査の結果に基づいて決定した。ベクターＡを受けた視力が良い方の眼を、偽注射を受けた視力が良い方の眼と比較した。同様の分析を視力が悪い方の眼について行った。当業者には理解されるように、ＥＴＤＲＳ（早期治療糖尿病性網膜症研究）は、非常に低い視覚レベルまで視力を数値化することが可能な視力の測定である。
【００９３】
当業者には理解されるように、ＭＡＲは、認識された最小の文字の線幅の最小分離視角（角度の分単位）を指す。ＭＡＲの対数（ＬｏｇＭＡＲ）、非限定的な例としてＬｏｇＭＡＲチャートが視力の決定に使用される（Johnston, A., Association of Contact Lens Manufacturers Year Book 2011-2016, pp. 38-39 (2016)）。
【００９４】
ベースライン時の患者背景を表６に示す。
【００９５】
【表６】
2021526834.tif 000016
【００９６】
ベースライン時の患者視力に関するデータを表７に示す。
【００９７】
【表７】
2021526834.tif 000017
【００９８】
４８週目にベクターＡの良好な安全性プロファイルが報告された。有害事象（ＡＥ）の７５％が眼のものであった。眼ＡＥの５０％がベクターＡに関連しており、眼ＡＥの４８％が手順に関連していた。最も一般的な眼ＡＥは、前房炎症（１５％）、硝子体炎（９％）、点状角膜炎（９％）及びＩＯＰ上昇（８％）を含んでいた。
【００９９】
４８週目に、ｔＲＮＦＬ（側頭網膜神経線維層（temporal retinal nerve fiber layer））／ＰＭ（乳頭黄斑）束の厚さは、処置した眼で有意に保持され、処置していない眼で減少した。ベースラインから４８週目までのＲＮＦＬ側頭象限の変化に関するデータを表８に示す。
【０１００】
【表８】
2021526834.tif 000018
【０１０１】
４８週目に、ＧＣＬ（神経節細胞層）体積は処置した眼で有意に保持され、処置していない眼で減少した。少なくともこれらの結果から、ベクターＡの生物学的標的が首尾よく関与することが示唆された。ベースラインから４８週目までのＧＣＬ体積及びトポグラフィーマップの変化に関するデータを表９に示す。
【０１０２】
【表９】
2021526834.tif 000019
【０１０３】
４８週目に、視力の改善が両眼で観察された（平均して−０．２１ＬｏｇＭＡＲ）。ベースラインから４８週目までのＬｏｇＭＡＲの変化に関するデータを表１０に示す。処置した眼と処置していない眼との統計的有意差は観察されなかった。
【０１０４】
【表１０】
2021526834.tif 000020
【０１０５】
４８週目に、Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（商標）視野分析（平均偏差及び中心窩閾値）を用いて視野検査を行った。視野検査に関するデータを表１１及び表１２に示す。処置した眼と処置していない眼との差は観察されなかった。
【０１０６】
【表１１】
2021526834.tif 000021
【０１０７】
【表１２】
2021526834.tif 000022
【０１０８】
４８週目に、ペリ−ロブソンチャートを用いてコントラスト感度を評定した（図５も参照されたい）。ベースライン時には、コントラスト感度は処置した眼でより悪かった（ＬｏｇＭＡＲ視力によって決定される）。４８週目に、ベクターＡで処置した眼におけるコントラスト感度の測定値は、ほぼ２倍となり、偽処置した眼におけるコントラスト感度の測定値は、一定のままであった。ペリ−ロブソンチャートを用いて評定したコントラスト感度に関するデータを表１３に示す。
【０１０９】
【表１３】
2021526834.tif 000023
【０１１０】
ファーンスワース−マンセル１００ヒュー色試験を用いて色覚を試験した。ベースライン時には、色識別について極めて悪いスコアが観察された。４８週目に、処置した眼と処置していない眼との差は観察されなかった。試験した色覚に関するデータを表１４に示す。
【０１１１】
【表１４】
2021526834.tif 000024
【０１１２】
視覚機能アンケート−２５（ＶＦＱ−２５）を用いて４８週目に生活の質を評定した。選択したサブスケールからのデータを表１５に示す。スコア間のスコアの差は小さいが、患者の視力が悪い方の眼の処置は、生活の質の測定基準の改善をもたらすようであった。このような傾向がアンケートの全セクションにわたって観察された。
【０１１３】
【表１５】
2021526834.tif 000025
【０１１４】
研究データを更に分析して、ベクターＡによる処置に特に反応する患者集団（例えば、視力の向上が観察された患者）を特定した。
【０１１５】
ベクターＡで処置したオンチャート（on-chart）の最も視力が良い眼及び偽処置したオンチャートの最も視力が良い眼についてのベースラインからの視力の変化に関するデータを表１６に示す。「オンチャート」は、ＥＴＤＲＳチャート上で少なくとも３文字読むことができ、及び／又は１．６ＬｏｇＭＡＲ未満の視力を有する被験体を指す。
【０１１６】
【表１６】
2021526834.tif 000026
【０１１７】
ベースラインと比べたＥＴＤＲＳスコアの変化の差を測定した。表１７に示されるように、この差は、全てのオンチャートの眼の組と比べてオンチャートの最も視力が良い眼の組で大きかった（＋６．１対＋４．５）。
【０１１８】
【表１７】
2021526834.tif 000027
【０１１９】
ベクターＡで処置し、視力の向上が４８週目に測定されたオンチャートの眼の組の中で、７５％（１２／１６）が６ヶ月〜９ヶ月のベースライン時の罹病期間を有し、２５％（４／１６）が９ヶ月〜１２ヶ月のベースライン時の罹病期間を有していた（表１８を参照）。視力の向上が４８週目に測定されたオンチャートの偽処置した眼の組の中で、５０％（８／１６）が６ヶ月〜９ヶ月のベースライン時の罹病期間を有し、５０％（８／１６）が９ヶ月〜１２ヶ月のベースライン時の罹病期間を有していた。
【０１２０】
【表１８】
2021526834.tif 000028
【０１２１】
更なる分析では、「レスポンダー」は、少なくとも０．２５ＬｏｇＭＡＲ（＋１２．５のＥＴＤＲＳ換算値）のオンチャートの患者における視力の改善を指すものであった。表１９に示されるように、ベクターＡで処置した全てのオンチャートの眼の２４．０％及び偽処置した全てのオンチャートの眼の１４．３％が「レスポンダー眼」と特徴付けられた。
【０１２２】
【表１９】
2021526834.tif 000029
【０１２３】
更なる分析では、「レスポンダー」は、少なくとも０．２５ＬｏｇＭＡＲ（＋１２．５のＥＴＤＲＳ換算値）のオンチャートの患者の最も視力が良い眼における視力の改善を指すものであった。表２０に示されるように、ベクターＡで処置したオンチャートの最も視力が良い眼の２５．０％及び偽処置したオンチャートの最も視力が良い眼の５．６％が「レスポンダー眼」と特徴付けられた。
【０１２４】
【表２０】
2021526834.tif 000030
【０１２５】
一般化推定方程式（ＧＥＥ）モデルを用いて研究データを更に分析して、２０／２００視力エンドポイントの達成に対するベクターＡによる処置の効果を評定した。結果から、ベクターＡで処置した眼が偽処置した眼よりも２０／２００視力エンドポイントを達成する可能性が有意に高いことが示された（ｐ＝０．０００５）。オッズ比は１８．４５であった（下側９５％境界＝３．６０）。
【０１２６】
ベースライン時に法律上失明していた眼の数、及びベースライン時に失明していた眼のうち法律上の失明から回復した眼の数に関するデータを表２１に示す。これに関連して、法律上失明している眼は、２０／２００よりも悪い視力を有すると定義される。
【０１２７】
【表２１】
2021526834.tif 000031
【０１２８】
研究データの分析から、ベクターＡによる処置により良好に反応した患者の組（例えば、視力の向上が観察された患者）が９ヶ月未満、例えば６ヶ月〜９ヶ月のベースライン時の罹病期間（例えば、視覚低下）、及び／又は１．６ＬｏｇＭＡＲ未満のベースライン時の視力を有する患者を含むことが示された。このため、幾つかの実施形態では、これらの基準（９ヶ月未満、例えば６ヶ月〜９ヶ月のベースライン時の罹病期間（例えば、視覚低下）、及び／又は１．６ＬｏｇＭＡＲ未満のベースライン時の視力）を用いて、ベクターＡによる処置により良好に反応することが予想される患者亜集団（例えば、視力の向上が予想され得る患者集団）を特定することができる。
【０１２９】
実施例２
試験により、１１７７８−ＮＤ４レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）に起因する視力低下が研究処置の６ヶ月前〜１２ヶ月前に始まった３７人の被験体においてベクターＡ（ｒＡＡＶ２／２−ＮＤ４）の単回硝子体内注射の安全性及び有効性を評価した。９６週目が予定された最後の試験の読み出しであり、データが明らかになり、個々の患者プロファイルへのアクセスを与える時点を示す。
【０１３０】
９６週目に、ベクターＡで処置した眼は、ベースラインと比較して、＋１５．４のＥＴＤＲＳ文字又はＥＴＤＲＳ視覚チャート上で３列に等しい−０．３０８ＬｏｇＭＡＲの平均改善を示した（図６）。この臨床的に意義のあるレベルの視力の改善は、７２週目に観察される増加（＋１４．７のＥＴＤＲＳ文字換算値）を維持する。４８週目及び７２週目の読み出しと同様に、偽処置した眼の最良矯正視力（ＢＣＶＡ）は、比較的並行した軌跡で展開し、９６週目にベースラインに対して−０．２５９ＬｏｇＭＡＲの平均改善、すなわち＋１２．９のＥＴＤＲＳ文字換算値の増加を達成した。大きさはより小さいが、偽処置した眼の平均ＢＣＶＡ改善は、ベクターＡで処置した眼と比べて統計的に有意ではなかった。
【０１３１】
自然史と一致して、被験体に低視力の初期点、すなわち最下点（nadir）が見られた。最下点は、測定の週までにＬｏｇＭＡＲによって測定される最低の処置後のＢＣＶＡとして定義される。試験の被験体の眼は顕著に回復した。９６週目までに、ベクターＡで処置した眼は、その最下点と比べて＋２８文字の増加を得た。
【０１３２】
【表２２】
2021526834.tif 000032
【０１３３】
９６週目に、ペリ−ロブソンチャート上で測定される低コントラスト視力は、ベクターＡで処置した眼及び偽処置した眼の両方について同様の改善傾向を示した。偽処置した眼及びベクターＡで処置した眼の軌跡は、ＢＣＶＡほど密接には互いを追わなかった。平均コントラスト感度は、試験を通してより着実なベースラインに対する改善を示した（図７）。
【０１３４】
９６週目にベースラインに対して少なくとも−０．２ＬｏｇＭＡＲ又は＋１０のＥＴＤＲＳ文字換算値の改善を達成した、ベクターＡで処置した眼の割合は、対応する偽処置した眼の割合よりも統計的に有意に高かった（６５％対４６％、ｐ値＝０．０３４８）。また、ベクターＡで処置した眼は、偽処置した眼よりも治療成功の別の尺度を達成する可能性が有意に高く、９６週目にベースライン時のオンチャート視力から少なくとも１５  ＥＴＤＲＳ文字改善するか、又は９６週目に２０／２００という米国の法律上の失明の閾値を回避した（３２％対１６％、ｐ＝０．０１９６）。
【０１３５】
一般化推定方程式（ＧＥＥ）モデルに基づくと、ベクターＡで処置した眼は、偽処置した眼よりも２０／２００以上となる可能性が２．８倍高かった（ｐ＝０．００９４）。厳密に閾値を超えた眼のみを考慮すると、オッズ比は３．６に上昇した（ｐ＝０．００３２）。
【０１３６】
さらに、試験の被験体の６８％が９６週目に少なくとも片方の眼で、（ａ）オンチャート視力から少なくとも１０  ＥＴＤＲＳ文字の改善、又は（ｂ）オフチャート（off-chart）視力から少なくとも５  ＥＴＤＲＳ文字を読むことが可能となるまでの改善によって定義される、自然な「臨床的に関連する回復（ＣＲＲ）」を達成した。ベクターＡで処置した眼は、これを達成する可能性が偽処置した眼よりも有意に高かった（６２％対４３％、ｐ＝０．０３４８）。比較すると、先の自然史研究では、同じ１１７７８Ａ突然変異を有する患者の１５％のみがＣＲＲを達成した。
【０１３７】
生活の質の観点では、視覚機能の改善は、試験の被験体によって記入された、有効な視覚特有の生活の質の評価法である国立眼病研究所（National Eye Institute）の視覚機能アンケート−２５（ＮＥＩ  ＶＦＱ−２５）調査でのスコアに反映された。表２３に示されるように、平均総合スコア及び関連サブスケールスコアの平均は、特に近見視力による行動及び遠見視力による行動を取る能力についてベースラインに対して改善され続けた。ベースラインに対する平均サブスケールスコアの上昇は、他の眼疾患における１５文字のＢＣＶＡの改善と関連付けられているものを上回っていた。
【０１３８】
【表２３】
2021526834.tif 000033
【０１３９】
構造的測定基準から、ＧＳ０１０で処置した眼が先の読み出しにおいて達成された神経節細胞体積の安定性を維持することが示される。しかしながら、療法の効果差は、先の読み出しでより顕著であった。
【図１】
2021526834.tif 000034
【図２】
2021526834.tif 000035
【図３】
2021526834.tif 000036
【図４】
2021526834.tif 000037
【図５】
2021526834.tif 000038
【図６】
2021526834.tif 000039
【図７】
2021526834.tif 000040
【配列表】
2021526834000001.app
【国際調査報告】
2021526834.tif 000041
2021526834.tif 000042
2021526834.tif 000043