(57)【要約】  とりわけ、非毒性、生体反応性の非天然アミノ酸およびそれを使用する方法が、本明細書に提供される。
2021515561.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオコンジュゲートリンカーを介して第２の生体分子部分にコンジュゲートされた第１の生体分子部分を含む生体分子コンジュゲートであって、前記バイオコンジュゲートリンカーが、式：
【化１】
2021515561.tif 000057
を有する、生体分子コンジュゲート。
【請求項２】
前記生体分子コンジュゲートが、式：
Ｒ１−Ｌ１−Ａ−Ｘ１−Ｌ２−Ｒ２
を有し、式中、
Ａが、前記バイオコンジュゲートリンカーであり、
Ｒ１が、第１の生体分子部分であり、
Ｒ２が、第２の生体分子部分であり、
Ｌ１が、結合または第１の共有リンカーであり、
Ｌ２が、結合または第２の共有リンカーであり、
Ｘ１が、−ＮＲ５−、−Ｏ−、−Ｓ−、または
【化２】
2021515561.tif 000058
であり、
式中、環Ａが、置換もしくは非置換ヘテロアリーレンまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレンであり、Ａ内の窒素が、前記バイオコンジュゲートリンカーに結合しており、
Ｒ５が、水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、
式中、Ｒ１およびＲ２が、任意に、一緒に結合されて、分子内でコンジュゲートされた生体分子コンジュゲートを形成する、請求項１に記載の生体分子コンジュゲート。
【請求項３】
Ｌ１が、結合、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＮＲ３Ａ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ａ−、−ＮＲ３ＡＣ（Ｏ）−、−ＮＲ３ＡＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｂ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、または置換もしくは非置換ヘテロアリーレンであり、
Ｌ２が、結合、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＮＲ４Ａ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ａ−、−ＮＲ４ＡＣ（Ｏ）−、−ＮＲ４ＡＣ（Ｏ）ＮＲ４Ｂ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、または置換もしくは非置換ヘテロアリーレンであり、
置換基Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、およびＲ４Ｂが、独立して、水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである、請求項２に記載の生体分子コンジュゲート。
【請求項４】
Ｘ１が、−ＮＨ−、−Ｏ−、またはイミダゾリレンである、請求項２に記載の生体分子コンジュゲート。
【請求項５】
前記第１の生体分子部分が、ペプチジル部分、核酸部分、または炭水化物部分である、請求項１に記載の生体分子コンジュゲート。
【請求項６】
前記第１の生体分子部分が、ペプチジル部分であり、前記ペプチジル部分が、リジン、ヒスチジン、またはチロシンを介して前記バイオコンジュゲートリンカーに共有結合している、請求項５に記載の生体分子コンジュゲート。
【請求項７】
前記第２の生体分子部分が、ペプチジル部分、核酸部分、または炭水化物部分である、請求項１に記載の生体分子コンジュゲート。
【請求項８】
前記第２の生体分子部分が、ペプチジル部分であり、前記ペプチジル部分が、リジン、ヒスチジン、またはチロシンを介して前記バイオコンジュゲートリンカーに共有結合している、請求項７に記載の生体分子コンジュゲート。
【請求項９】
−Ｌ１−Ｒ１が、ペプチジル部分、核酸部分、または炭水化物部分である、請求項２に記載の生体分子コンジュゲート。
【請求項１０】
−Ｌ２−Ｒ２が、ペプチジル部分、核酸部分、または炭水化物部分である、請求項２に記載の生体分子コンジュゲート。
【請求項１１】
前記バイオコンジュゲートリンカーが、分子間リンカーである、請求項１に記載の生体分子コンジュゲート。
【請求項１２】
前記バイオコンジュゲートリンカーが、分子内リンカーである、請求項１に記載の生体分子コンジュゲート。
【請求項１３】
式（Ｉ）、式（ＩＩ）、または式（ＩＩＩ）：
【化３】
2021515561.tif 000059
のタンパク質であって、
式中、Ｒ１およびＲ２が、各々独立して、ペプチジル部分であり、Ｒ１およびＲ２が、任意に一緒に結合されて、分子内でコンジュゲートされたタンパク質を形成する、タンパク質。
【請求項１４】
前記タンパク質が、式（Ｉ）のものである、請求項１３に記載のタンパク質。
【請求項１５】
前記タンパク質が、式（ＩＩ）のものである、請求項１３に記載のタンパク質。
【請求項１６】
前記タンパク質が、式（ＩＩＩ）のものである、請求項１３に記載のタンパク質。
【請求項１７】
Ｒ１およびＲ２が、各々独立して、タンパク質α鎖またはタンパク質β鎖を含む、請求項１３に記載のタンパク質。
【請求項１８】
ｔＲ１およびＲ２が、一緒に結合されて、分子内でコンジュゲートされたタンパク質を形成する、請求項１３に記載のタンパク質。
【請求項１９】
Ｒ１およびＲ２が、一緒に結合されていない、請求項１３に記載のタンパク質。
【請求項２０】
配列番号３のアミノ酸配列を有するピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位内に少なくとも５個のアミノ酸残基置換を含む、ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素。
【請求項２１】
前記基質結合部位が、配列番号３のアミノ酸配列に示されるように、３０２位のアラニン、３０５位のロイシン、３０６位のチロシン、３０９位のロイシン、３２２位のイソロイシン、３４６位のアスパラギン、３４８位のシステイン、３８４位のチロシン、４０１位のバリン、および４１７位のトリプトファンの残基を含む、請求項２０に記載のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素。
【請求項２２】
前記少なくとも５個のアミノ酸残基置換が、配列番号３のアミノ酸配列に示されるように、３０２位のアラニンの置換、３４６位のアスパラギンの置換、３４８位のシステインの置換、３８４位のチロシンの置換、および４１７位のトリプトファンの置換である、請求項２１に記載のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素。
【請求項２３】
前記少なくとも５個のアミノ酸残基置換が、配列番号３のアミノ酸配列に示されるように、３０２位のアラニンに対するイソロイシン、３４６位のアスパラギンに対するトレオニン、３４８位のシステインに対するイソロイシン、３８４位のチロシンに対するロイシン、および４１７位のトリプトファンに対するリジンである、請求項２２に記載のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素。
【請求項２４】
前記ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項２０に記載のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素。
【請求項２５】
前記ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、配列番号２の核酸配列によってコードされる、請求項２０に記載のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素。
【請求項２６】
請求項２０に記載のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸配列を含む、ベクター。
【請求項２７】
ｔＲＮＡＰｙｌをコードする核酸配列をさらに含む、請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
請求項２０に記載のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素と、以下の式：
【化４】
2021515561.tif 000060
を有するフルオロサルフェート−Ｌ−チロシンと、を含む、複合体。
【請求項２９】
ｔＲＮＡＰｙｌをさらに含む、請求項２８に記載の複合体。
【請求項３０】
請求項１に記載の生体分子コンジュゲートを含む、細胞。
【請求項３１】
請求項１３に記載のタンパク質を含む、細胞。
【請求項３２】
請求項２０に記載のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素を含む、細胞。
【請求項３３】
請求項２６に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項３４】
請求項２８に記載の複合体を含む、細胞。
【請求項３５】
式：
【化５】
2021515561.tif 000061
のフルオロサルフェート−Ｌ−チロシンを含む、細胞。
【請求項３６】
配列番号３に示されるピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位内に少なくとも５個のアミノ酸残基置換を含むピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素をさらに含む、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３７】
配列番号３に示されるピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位内に少なくとも５個のアミノ酸残基置換を含むピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸配列を含むベクターをさらに含む、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３８】
ｔＲＮＡＰｙｌをさらに含む、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３９】
前記細胞が、細菌細胞または哺乳類細胞である、請求項３０に記載の細胞。
【請求項４０】
請求項１１に記載の生体分子コンジュゲートを形成する方法であって、
（ｉ）ＦＳＹ生体分子内のＦＳＹ部分を、前記第２の生体分子部分を含む化合物と接触させ（前記第２の生体分子は、前記ＦＳＹ部分と反応性である）、
それによって分子間リンカーを有する前記生体分子コンジュゲートを形成することを含む、方法。
【請求項４１】
請求項１２に記載の生体分子コンジュゲートを形成する方法であって、
（ｉ）ＦＳＹ生体分子内のＦＳＹ部分を、前記ＦＳＹ生体分子内の第２の生体分子部分と接触させ（前記第２の生体分子は、前記ＦＳＹ部分と反応性である）、
それによって分子内リンカーを有する生体分子コンジュゲートを形成することを含む、方法。
【請求項４２】
（ｉ）における前記接触させることが、細胞内で行われる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
ステップ（ｉ）における前記接触させることの前に、
（ｉｉ）生体分子、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素、ｔＲＮＡＰｙｌ、および式：
【化６】
2021515561.tif 000062
を有するフルオロサルフェート−Ｌ−チロシンを接触させて、前記ＦＳＹ生体分子を形成するステップを行うことをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
（ｉｉ）における前記接触させることが、細胞内で行われる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＦＳＹタンパク質を、リジン、ヒスチジン、またはチロシンを含む第２のタンパク質と接触させ、それによって前記分子内でコンジュゲートされたタンパク質を形成することを含む、請求項１８に記載のタンパク質を形成する方法。
【請求項４６】
ＦＳＹタンパク質中の前記フルオロサルフェート−Ｌ−チロシンを、第２のタンパク質中のリジン、ヒスチジン、またはチロシンと接触させ、それによって分子間でコンジュゲートされたタンパク質を形成することを含む、請求項１９に記載のタンパク質を形成する方法。
【請求項４７】
前記ＦＳＹタンパク質を産生することをさらに含み、前記方法が、タンパク質、請求項２０に記載のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素、ｔＲＮＡＰｙｌ、および式：
【化７】
2021515561.tif 000063
を有するフルオロサルフェート−Ｌ−チロシンを接触させ、それによって前記ＦＳＹタンパク質を産生することを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
接触させることが、硫黄−フッ化物交換反応を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
接触させることが、近接により可能になる硫黄−フッ化物交換反応を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
接触させることが、細胞内で行われる、請求項４０に記載の方法。
【請求項５１】
リジン、ヒスチジン、またはチロシンの近位にある非天然アミノ酸を含むタンパク質であって、前記非天然アミノ酸が、式：
【化８】
2021515561.tif 000064
の側鎖を有する、タンパク質。
【請求項５２】
式（Ａ）の部分、式（Ｂ）の部分、式（Ｃ）の部分、またはそれらの２つ以上の組み合わせを含む、タンパク質：
【化９】
2021515561.tif 000065
【請求項５３】
請求項５１に記載のタンパク質を含む、細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年３月８日に出願された米国特許出願第６２／６４０，４５０号の優先権を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の下でなされた発明に対する権利に関する記述
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によって付与された助成金番号Ｒ０１  ＧＭ１１８３８４およびＭＨ１１４０７９の下で政府支援を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質のアミノ酸側鎖は、通常、弱く可逆的なジスルフィド結合を生成するシステインを除いて、互いに共有結合を形成することができない。したがって、タンパク質は、主にタンパク質内またはタンパク質間の非共有相互作用を使用する。細胞に対して非毒性であり、複数の天然アミノ酸残基と反応することができる潜在的な生体反応性非天然アミノ酸は、インビボで共有結合に適したタンパク質の多様性を劇的に拡大するであろう。インビボでの共有結合に適したタンパク質の多様性を拡大することにより、新規の共有結合を利用することによって、既存のタンパク質特性を増強するか、または新しい機能を進化させることが可能である。加えて、タンパク質間で共有結合を形成する能力は、タンパク質同定、創薬ターゲット探索、または生物療法学に有用であり得る、インビボでのタンパク質−タンパク質相互作用の不可逆的な捕捉を可能にするであろう。
【０００４】
とりわけ、当該技術分野におけるこれらおよび他の問題に対する解決策が、本明細書に提供されている。
【発明の概要】
【０００５】
態様では、バイオコンジュゲートリンカーを介して第２の生体分子部分にコンジュゲートされる第１の生体分子部分を含む、生体分子コンジュゲートが提供され、バイオコンジュゲートリンカーは、式：
【化１】
2021515561.tif 000003
を有する。
【０００６】
態様では、
【化２】
2021515561.tif 000004
の非天然アミノ酸側鎖を有するタンパク質が提供される。態様では、タンパク質は、この非天然アミノ酸側鎖の近位にあるリジン、ヒスチジン、チロシン、またはそれらの２つ以上の組み合わせをさらに含む。
【０００７】
態様では、式（Ｉ）のタンパク質：
【化３】
2021515561.tif 000005
が提供され、
式中、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、ペプチジル部分である。
【０００８】
態様では、式（ＩＩ）のタンパク質：
【化４】
2021515561.tif 000006
が提供され、
式中、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、ペプチジル部分である。
【０００９】
態様では、式（ＩＩＩ）のタンパク質：
【化５】
2021515561.tif 000007
が提供され、
式中、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、ペプチジル部分である。
【００１０】
態様では、式（Ａ）の部分、式（Ｂ）の部分、式（Ｃ）の部分、またはそれらの２つ以上の組み合わせを含む、タンパク質が提供される。
【化６】
2021515561.tif 000008
【００１１】
態様では、配列番号３の突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位内に少なくとも５つのアミノ酸残基置換を含む、ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素が提供される。
【００１２】
態様では、本明細書に記載の突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸配列を含む、ベクターが提供される。
【００１３】
態様では、本明細書に記載のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素、およびフルオロサルフェート−Ｌ−チロシン（ＦＳＹ）を含む、複合体が提供される。
【００１４】
態様では、フルオロサルフェート−Ｌ−チロシン（ＦＳＹ）、本明細書に記載の生体分子コンジュゲート、本明細書に記載のＦＳＹ生体分子、本明細書に記載のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素、本明細書に記載のベクター、または本明細書に記載の複合体を含む、細胞が提供される。態様では、細胞は、細菌細胞または哺乳類細胞である。
【００１５】
本開示のこれらおよび他の実施形態ならびに態様は、本明細書においてより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ−１Ｅ】Ｅ．ｃｏｌｉ中のタンパク質にＦＳＹを遺伝子コードする。
【図１Ａ】ＦＳＹの構造。
【図１Ｂ】ＦＳＹと天然求核残基（Ｎｕと略される）との間の近接により可能になるＳｕＦＥｘ反応を示すスキーム。
【図１Ｃ】Ｅ．ｃｏｌｉ中のＡｆｂ（３６ＴＡＧ）へのＦＳＹ組み込みを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図１Ｄ】無傷のＡｆｂ−３６ＦＳＹのＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル。
【図１Ｅ】Ｚ−２４ＦＳＹのタンデムＭＳスペクトル。
【図２Ａ−２Ｃ】哺乳類細胞中のタンパク質にＦＳＹを遺伝子コードする。
【図２Ａ】ＨｅＬａ細胞中のＥＧＦＰ−１８２ＴＡＧへのＦＳＹ組み込みのＦＡＣＳ分析。
【図２Ｂ】同じ数のＨｅＬａ−ＥＧＦＰ−１８２ＴＡＧレポーター細胞から測定された全ＥＧＦＰ蛍光強度。エラーバー：平均値の標準誤差、ｎ＝６。
【図２Ｃ】ＨｅＬａ−ＥＧＦＰ−１８２ＴＡＧレポーター細胞の蛍光画像。
【図３Ａ−３Ｄ】ＦＳＹは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で直接ＳｕＦＥｘを介して近位のＬｙｓ、Ｈｉｓ、およびＴｙｒに架橋する。
【図３Ａ】ＦＳＹおよび標的残基Ｘ組み込みのための２つの近位部位を示すＡｆｂ−Ｚ複合体の構造。
【図３Ｂ】上：Ｅ．ｃｏｌｉ細胞溶解物のウェスタンブロット、下：Ｅ．ｃｏｌｉから精製されたタンパク質ＨｉｓタグのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図３Ｃ−３Ｄ】ＭＢＰ−Ｚ−２４ＦＳＹ／Ａｆｂ−７Ｌｙｓ（図３Ｃ）およびＭＢＰ−Ｚ−２４ＦＳＹ／Ａｆｂ−７Ｈｉｓ（図３Ｄ）のタンデムＭＳスペクトル。
【図４Ａ−４Ｃ】ＦＳＹは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中で分子内でＳｕＦＥｘを介してＴｙｒに架橋する。
【図４Ａ】ＦＳＹおよび標的Ｔｙｒの部位を示すＣａＭの構造。精製ＣａＭ−７６ＦＳＹ−８０Ｔｙｒの（図４Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび（図４Ｃ）タンデムＭＳスペクトル。
【図５Ａ−５Ｃ】ＦＳＹは、分子間でＳｕＦＥｘを介してＴｙｒに架橋する。（図５Ａ）ＦＳＹ部位および未変性Ｔｙｒ１９１を示す、ＰＡＰＳ還元酵素と複合したＴｒｘ１の構造。ＰＡＰＳ還元酵素と架橋されたＴｒｘ１の（図５Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび（図５Ｃ）タンデムＭＳスペクトル。
【図６】１ｍＭ  ＦＳＹの存在下または非存在下、３７℃でのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞の成長曲線を提供する。実験を３回繰り返した。
【図７】ＥＧＦＰ−１８２ＴＡＧ  ＨｅＬａレポーター細胞へのＡｚＦ組み込みのＦＡＣＳ分析を示す。
【図８】様々な濃度のＦＳＹでインキュベートされたＨｅＬａ−ＥＧＦＰ−１８２ＴＡＧレポーター細胞および２９３Ｔ細胞の細胞生存率アッセイを示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す、ｎ＝３。
【図９】ｐＨ７．４および８．０でのＰＡＰＳ還元酵素とのＴｒｘ６２ＦＳＹ架橋のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１０】生細胞中のＦＳＹ挙動の例示を提供する。
【図１１】ｈＧＨ上のＦＳＹ組み込み部位（Ｑ６８）およびｈＧＨ受容体上の標的残基Ｌｙｓ１６６を示すリガンド−受容体界面を提供する。
【図１２】ｈＧＨ受容体の細胞外ドメインとのｈＧＨ（ＦＳＹ）結合のウェスタンブロット分析である。
【図１３】実施例２に記載される、ｈＧＨ（ＦＳＹ）またはｈＧＨ（ＷＴ）による刺激時のＢＡＦ３細胞中のｐＳＴＡＴ５産生のウェスタンブロット分析である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
細胞に対して非毒性であり、複数の天然アミノ酸残基と反応することができる潜在的な生体反応性非天然アミノ酸は、インビボで共有結合に適したタンパク質の多様性を劇的に拡大するであろう。フルオロサルフェート−Ｌ−チロシン（ＦＳＹ）を生細胞中の生体分子（例えば、タンパク質）に遺伝子コードするための新しいｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素対が、本明細書に記載される。細胞に対して非毒性であることが見出されたＦＳＹは、インビトロおよび生細胞の両方のタンパク質において近位のリジン、ヒスチジン、およびチロシンと反応することができる。
【００１８】
タンパク質のアミノ酸側鎖は、通常、弱く可逆的なジスルフィド結合を生成するシステインを除いて、互いに共有結合を形成することができない。したがって、タンパク質は、主にタンパク質内またはタンパク質間の非共有相互作用を使用する。共有結合能力を有するタンパク質を付与するために、本発明者らは、潜在的な生体反応性非天然アミノ酸フルオロサルフェート−Ｌ−チロシンを遺伝子に組み込み、これは、リジン、ヒスチジン、またはチロシンと選択的に反応し、タンパク質内およびタンパク質間の共有結合をインビボで直接形成することができる。
【００１９】
遺伝子コードされたフルオロサルフェート−Ｌ−チロシンは、複数の残基を標的とすることによって共有結合する能力をタンパク質に提供する。タンパク質内で使用される場合、これは、既存のタンパク質特性を強化する、または新規の共有結合を利用することによって新たな機能を進化させるための新規のタンパク質工学的方法である。タンパク質間で使用される場合、タンパク質同定、創薬ターゲット探索、または生物療法学に有用であり得る、不可逆的に相互作用するタンパク質を捕捉することができる。
【００２０】
タンパク質修飾または生体直交化学などの既存の技術は、インビトロでタンパク質に共有結合能力を備えることができる。しかしながら、本明細書に記載の技術は、インビボで共有結合能力を有するタンパク質を備えることができる。最終産物は、インビボ（生細胞内）で開発することができ、これは、生理学的関連性を有する標的同定および組み換えアプローチによる産生のスケールアップに有利である。
【００２１】
定義
本明細書で使用される略語は、化学および生物学の分野におけるそれらの従来の意味を有する。本明細書に示される化学構造および化学式は、化学の分野で知られている化学原子価の標準法則に従って構築される。
【００２２】
置換基が、左から右に書かれるそれらの従来の化学式によって特定される場合、それらは、右から左に構造を書くことから生じ得る化学的に同一の置換基を包含する。例えば、−ＣＨ２Ｏ−は−ＯＣＨ２−と等価である。
【００２３】
「アルキル」という用語は、それ自体で、または別の置換基の一部として、別段の記述がない限り、直鎖（すなわち、非分枝）もしくは分枝の炭素鎖（または炭素）、またはそれらの組み合わせを意味し、これは、完全飽和、一価または多価不飽和であってもよく、かつ一価、二価、および多価ラジカルを含み得る。アルキルは、指定された数の炭素を含んでもよい（例えば、Ｃ１〜Ｃ１０は１〜１０個の炭素を意味する）。アルキルは、非環化鎖である。飽和炭化水素基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、メチル、例えばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−オクチルの同族体および異性体等の基が挙げられるが、これらに限定されない。不飽和アルキル基は、１つ以上の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例としては、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびに高級同族体および異性体が挙げられるが、これらに限定されない。アルコキシは、酸素リンカー（−Ｏ−）を介して分子の残りの部分に結合しているアルキルである。アルキル部分は、アルケニル部分であってもよい。アルキル部分は、アルキニル部分であってもよい。アルキル部分は、完全に飽和していてもよい。アルケニルは、１つ以上の二重結合に加えて、２つ以上の二重結合および／または１つ以上の三重結合を含んでもよい。アルキニルは、１つ以上の三重結合に加えて、２つ以上の三重結合および／または１つ以上の二重結合を含んでもよい。
【００２４】
「アルキレン」という用語は、それ自体で、または別の置換基の一部として、別段の記述がない限り、例として−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であるがこれに限定されない、アルキルから誘導される二価ラジカルを意味する。典型的には、アルキル（またはアルキレン）基は、１〜２４個の炭素原子を有し、１０個以下の炭素原子を有する基が本明細書においては好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般に８個以下の炭素原子を有する短鎖アルキルまたはアルキレン基である。「アルケニレン」という用語は、それ自体で、または別の置換基の一部として、別段の記述がない限り、アルケンから誘導される二価ラジカルを意味する。
【００２５】
「ヘテロアルキル」という用語は、それ自体でまたは別の用語と組み合わせて、特に明記しない限り、少なくとも１個の炭素原子および少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｐ、Ｓｉ、およびＳ）を含む安定な直鎖または分岐鎖、またはそれらの組み合わせを意味し、窒素原子および硫黄原子は、任意に酸化されて、窒素ヘテロ原子は、任意に四級化され得る。ヘテロ原子（複数可）（例えば、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、またはＰ）は、ヘテロアルキル基の任意の内部位置またはアルキル基が分子の残りの部分に結合している位置に配置されていてもよい。ヘテロアルキルは非環化鎖である。例としては、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ３、および−ＣＮが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３などの、最大２個または３個のヘテロ原子が連続していてもよい。ヘテロアルキル部分は、１個のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、またはＰ）を含んでもよい。ヘテロアルキル部分は、２個の任意に異なるヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、またはＰ）を含んでもよい。ヘテロアルキル部分は、３個の任意に異なるヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、またはＰ）を含んでもよい。ヘテロアルキル部分は、４個の任意に異なるヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、またはＰ）を含んでもよい。ヘテロアルキル部分は、５個の任意に異なるヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、またはＰ）を含んでもよい。ヘテロアルキル部分は、最大８個の任意に異なるヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、またはＰ）を含んでもよい。「ヘテロアルケニル」という用語は、それ自体で、または別の用語と組み合わせて、別段の記述がない限り、少なくとも１つの二重結合を含むヘテロアルキルを意味する。ヘテロアルケニルは、任意に、１つ以上の二重結合に加えて、２つ以上の二重結合および／または１つ以上の三重結合を含んでもよい。「ヘテロアルキニル」という用語は、それ自体で、または別の用語と組み合わせて、別段の記述がない限り、少なくとも１つの三重結合を含むヘテロアルキルを意味する。ヘテロアルキニルは、任意に、１つ以上の三重結合に加えて、２つ以上の三重結合および／または１つ以上の二重結合を含んでもよい。
【００２６】
同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、それ自体で、または別の置換基の一部として、別段の記述がない限り、例として−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−であるがこれらに限定されない、ヘテロアルキルから誘導される二価ラジカルを意味する。ヘテロアルキレン基について、ヘテロ原子はまた、鎖末端の一方または両方を占めることもできる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ等）。なおさらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基については、連結基の式が書かれている方向によって、連結基の配向が示唆されることはない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ´−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ´−と−Ｒ´Ｃ（Ｏ）２−との両方を表す。上記のように、本明細書で使用される場合、ヘテロアルキル基は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ´、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ´、−ＮＲ´Ｒ´´、−ＯＲ´、−ＳＲ´、および／または−ＳＯ２Ｒ´などのヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合している基を含む。「ヘテロアルキル」が記載され、その後に特定のヘテロアルキル基、例えば−ＮＲ´Ｒ´´等が記載される場合、ヘテロアルキルおよび−ＮＲ´Ｒ´´という用語は、重複または相互に排他的ではないことが理解されよう。むしろ、特定のヘテロアルキル基は、明確さを加えるために記載されている。したがって、「ヘテロアルキル」という用語は、本明細書では、特定のヘテロアルキル基、例えば、−ＮＲ´Ｒ´´等を除外するものとして解釈されるべきではない。
【００２７】
「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」という用語は、それら自体で、または他の用語と組み合わせて、別段の記述がない限り、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環式バージョンを意味する。シクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルは芳香族ではない。加えて、ヘテロシクロアルキルについては、ヘテロ原子が、複素環が分子の残りの部分に結合している位置を占めることができる。シクロアルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチル等が挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例としては、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル等が挙げられるが、これらに限定されない。「シクロアルキレン」および「ヘテロシクロアルキレン」は、単独で、または別の置換基の一部として、それぞれシクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルから誘導される二価ラジカルを意味する。
【００２８】
実施形態では、「シクロアルキル」という用語は、単環式、二環式、または多環式シクロアルキル環系を意味する。態様では、単環式環系は、３〜８個の炭素原子を含有する環状炭化水素基であり、そのような基は、飽和または不飽和であり得るが、芳香族ではない。態様では、シクロアルキル基は、完全に飽和している。単環式シクロアルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられる。二環式シクロアルキル環系は、架橋単環式環または縮合二環式環である。態様では、架橋単環式環は、単環式環の２つの非隣接炭素原子が、１〜３個の追加の炭素原子の間のアルキレン架橋（すなわち、ｗが１、２、または３である形態（ＣＨ２）ｗの架橋基）によって連結される、単環式シクロアルキル環を含む。二環式環系の代表的な例としては、ビシクロ［３．１．１］ヘプタン、ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［２．２．２］オクタン、ビシクロ［３．２．２］ノナン、ビシクロ［３．３．１］ノナン、およびビシクロ［４．２．１］ノナンが挙げられるが、これらに限定されない。態様では、縮合二環式シクロアルキル環系は、フェニル、単環式シクロアルキル、単環式シクロアルケニル、単環式ヘテロシクリル、または単環式ヘテロアリールのいずれかに縮合した単環式シクロアルキル環を含有する。態様では、架橋または縮合二環式シクロアルキルは、単環式シクロアルキル環内に含まれる任意の炭素原子を介して親分子部分に結合する。態様では、シクロアルキル基は、独立して、オキソまたはチアである１つまたは２つの基で任意に置換される。態様では、縮合二環式シクロアルキルは、フェニル環、５もしくは６員単環式シクロアルキル、５もしくは６員単環式シクロアルケニル、５もしくは６員単環式ヘテロシクリル、または５もしくは６員単環式ヘテロアリールのいずれかに縮合された５もしくは６員単環式シクロアルキル環であり、この縮合二環式シクロアルキルは、独立して、オキソまたはチアである１つまたは２つの基によって任意に置換される。態様では、多環式シクロアルキル環系は、（ｉ）二環式アリール、二環式ヘテロアリール、二環式シクロアルキル、二環式シクロアルケニル、および二環式ヘテロシクリルからなる群から選択される１つの環系、または（ｉｉ）独立して、フェニル、二環式アリール、単環式もしくは二環式ヘテロアリール、単環式もしくは二環式シクロアルキル、単環式もしくは二環式シクロアルケニル、および単環式もしくは二環式ヘテロシクリルからなる群から選択される２つの他の環系のいずれかに縮合された単環式シクロアルキル環（塩基環）である。態様では、多環式シクロアルキルは、塩基環内に含有される任意の炭素原子を介して親分子部分に結合する。態様では、多環式シクロアルキル環系は、（ｉ）二環式アリール、二環式ヘテロアリール、二環式シクロアルキル、二環式シクロアルケニル、および二環式ヘテロシクリルからなる群から選択される１つの環系、または（ｉｉ）独立して、フェニル、単環式ヘテロアリール、単環式シクロアルキル、単環式シクロアルケニル、および単環式ヘテロシクリルからなる群から選択される２つの他の環系のいずれかに縮合された単環式シクロアルキル環（塩基環）である。多環式シクロアルキル基の例としては、テトラデカヒドロフェナントレニル、ペルヒドロフェノチアジン−１−イル、およびペルヒドロフェノキサジン−１−イルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
実施形態では、シクロアルキルは、シクロアルケニルである。「シクロアルケニル」という用語は、その単純な通常の意味に従って使用される。態様では、シクロアルケニルは、単環式、二環式、または多環式シクロアルケニル環系である。態様では、単環式シクロアルケニル環系は、３〜８個の炭素原子を含有する環状炭化水素基であり、そのような基は、不飽和（すなわち、少なくとも１つの環状炭素炭素二重結合を含有する）が、芳香族ではない。単環式シクロアルケニル環系の例としては、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルが挙げられる。態様では、二環式シクロアルケニル環は、架橋単環式環または縮合二環式環である。態様では、架橋単環式環は、単環式環の２つの非隣接炭素原子が、１〜３個の追加の炭素原子の間のアルキレン架橋（すなわち、ｗが１、２、または３である形態（ＣＨ２）ｗの架橋基）によって連結される、単環式シクロアルキル環を含む。二環式シクロアルケニルの代表的な例としては、ノルボルネニルおよびビシクロ［２．２．２］オクト２エニルが挙げられるが、これらに限定されない。態様では、縮合二環式シクロアルケニル環系は、フェニル、単環式シクロアルキル、単環式シクロアルケニル、単環式ヘテロシクリル、または単環式ヘテロアリールのいずれかに縮合した単環式シクロアルケニル環を含有する。態様では、架橋または縮合二環式シクロアルケニルは、単環式シクロアルケニル環内に含有される任意の炭素原子を介して親分子部分に結合する。態様では、シクロアルケニル基は、独立して、オキソまたはチアである１つまたは２つの基で任意に置換される。態様では、多環式シクロアルケニル環系は、（ｉ）二環式アリール、二環式ヘテロアリール、二環式シクロアルキル、二環式シクロアルケニル、および二環式ヘテロシクリルからなる群から選択される１つの環系、または（ｉｉ）独立して、フェニル、二環式アリール、単環式もしくは二環式ヘテロアリール、単環式もしくは二環式シクロアルキル、単環式もしくは二環式シクロアルケニル、および単環式もしくは二環式ヘテロシクリルからなる群から選択される２つの環系のいずれかに縮合された単環式シクロアルキル環（塩基環）を含有する。態様では、多環式シクロアルケニルは、塩基環内に含有される任意の炭素原子を介して親分子部分に結合する。態様では、多環式シクロアルケニル環系は、（ｉ）二環式アリール、二環式ヘテロアリール、二環式シクロアルキル、二環式シクロアルケニル、および二環式ヘテロシクリルからなる群から選択される１つの環系、または（ｉｉ）独立して、フェニル、単環式ヘテロアリール、単環式シクロアルキル、単環式シクロアルケニル、および単環式ヘテロシクリルからなる群から選択される２つの環系のいずれかに縮合された単環式シクロアルキル環（塩基環）を含有する。
【００３０】
実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、ヘテロシクリルである。本明細書で使用される場合、「ヘテロシクリル」という用語は、単環式、二環式、または多環式複素環を意味する。ヘテロシクリル単環式複素環は、独立して、Ｏ、Ｎ、およびＳからなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有する３、４、５、６、または７員環であり、この環は、飽和または不飽和であるが、芳香族ではない。３または４員環は、Ｏ、Ｎ、およびＳからなる群から選択される１個のヘテロ原子を含有する。５員環は、０または１つの二重結合、およびＯ、Ｎ、およびＳからなる群から選択される１、２、または３個のヘテロ原子を含有し得る。６または７員環は、０、１、または２つの二重結合、およびＯ、Ｎ、およびＳからなる群から選択される１、２、または３個のヘテロ原子を含有する。ヘテロシクリル単環式複素環は、ヘテロシクリル単環式複素環内に含まれる任意の炭素原子または任意の窒素原子を介して親分子部分に接続される。ヘテロシクリル単環式複素環の代表的な例としては、アゼチジニル、アゼパニル、アジリジニル、ジアゼパニル、１，３−ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、１，３−ジチオラニル、１，３−ジチアニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オキサジアゾリニル、オキサジアゾリニル、オキサジアゾリニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、チアジアゾリニル、チアジアゾリニル、チアゾリニル、チアゾリニル、チオモルホリニル、１，１−ジオキシドチオモルホリニル（チオモルホリンスルホン）、チオピラニル、およびトリアニルが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクリル二環式複素環は、フェニル、単環式シクロアルキル、単環式シクロアルケニル、単環式複素環、または単環式ヘテロアリールのいずれかに縮合された単環式複素環である。ヘテロシクリル二環式複素環は、二環式環系の単環式複素環部分内に含まれる任意の炭素原子または任意の窒素原子を介して親分子部分に接続される。二環式ヘテロシクリルの代表例としては、２，３−ジヒドロベンゾフラン−２−イル、２，３−ジヒドロベンゾフラン−３−イル、インドリン−１−イル、インドリン−２−イル、インドリン−３−イル、２，３−ジヒドロベンゾチエン−２−イル、デカヒドロキノリニル、デカヒドロイソキノリニル、オクタヒドロ−１Ｈ−インドリル、およびオクタヒドロベンゾフラニルが挙げられるが、これらに限定されない。態様では、ヘテロシクリル基は、独立して、オキソまたはチアである１つまたは２つの基で任意に置換される。ある特定の態様では、二環式ヘテロシクリルは、フェニル環、５もしくは６員単環式シクロアルキル、５もしくは６員単環式シクロアルケニル、５もしくは６員単環式ヘテロシクリル、または５もしくは６員単環式ヘテロアリールに縮合された５もしくは６員単環式ヘテロシクリル環であり、この二環式ヘテロシクリルは、独立して、オキソまたはチアである１つまたは２つの基によって任意に置換される。多環式ヘテロシクリル環系は、（ｉ）二環式アリール、二環式ヘテロアリール、二環式シクロアルキル、二環式シクロアルケニル、および二環式ヘテロシクリルからなる群から選択される１つの環系、または（ｉｉ）独立して、フェニル、二環式アリール、単環式もしくは二環式ヘテロアリール、単環式もしくは二環式シクロアルキル、単環式もしくは二環式シクロアルケニル、および単環式もしくは二環式ヘテロシクリルからなる群から選択される２つの他の環系のいずれかに縮合された単環式ヘテロシクリル環（塩基環）である。多環式ヘテロシクリルは、塩基環内に含有される任意の炭素原子または窒素原子を介して親分子部分に結合する。態様では、多環式ヘテロシクリル環系は、（ｉ）二環式アリール、二環式ヘテロアリール、二環式シクロアルキル、二環式シクロアルケニル、および二環式ヘテロシクリルからなる群から選択される１つの環系、または（ｉｉ）独立して、フェニル、単環式ヘテロアリール、単環式シクロアルキル、単環式シクロアルケニル、および単環式ヘテロシクリルからなる群から選択される２つの他の環系のいずれかに縮合された単環式ヘテロシクリル環（塩基環）である。多環式ヘテロシクリル基の例としては、１０Ｈ−フェノチアジン−１０−イル、９，１０−ジヒドロアクリジン−９−イル、９，１０−ジヒドロアクリジン−１０−イル、１０Ｈ−フェノキサジン−１０−イル、１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピン−５−イル、１，２，３，４−テトラヒドロピリド［４，３−ｇ］イソキノリン−２−イル、１２Ｈ−ベンゾ［ｂ］フェノキサジン−１２−イル、およびドデカヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−９−イルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、それら自体で、または別の置換基の一部として、別段の記述がない限り、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。加えて、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むことを意味する。例えば、「ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル」という用語は、限定されないが、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピル等を含む。
【００３２】
「アシル」という用語は、別段の記述がない限り、−Ｃ（Ｏ）Ｒを意味し、式中、Ｒは、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
【００３３】
「アリール」という用語は、別段の記述がない限り、単環、または共に縮合している（すなわち、縮合環アリール）もしくは共有結合的に連結している複数の環（好ましくは１〜３環）であり得る、多価不飽和の芳香族炭化水素置換基を意味する。縮合環アリールは、縮合環のうちの少なくとも１つがアリール環である、共に縮合した複数の環を指す。「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ、またはＳなどの少なくとも１つのヘテロ原子を含むアリール基（または環）を指し、窒素原子および硫黄原子は任意に酸化され、窒素原子（複数可）は任意に四級化される。したがって、「ヘテロアリール」という用語は、縮合環ヘテロアリール基（すなわち、縮合した環のうちの少なくとも１つが複素芳香環である、共に縮合した複数の環）を含む。５，６−縮合環ヘテロアリーレンは、一方の環が５員を有し、他方の環が６員を有し、かつ少なくとも１つの環がヘテロアリール環である、共に縮合した２つの環を指す。同様に、６，６−縮合環ヘテロアリーレンは、一方の環が６員を有し、他方の環が６員を有し、かつ少なくとも１つの環がヘテロアリール環である、共に縮合した２つの環を指す。そして、６，５−縮合環ヘテロアリーレンは、一方の環が６員を有し、他方の環が５員を有し、かつ少なくとも１つの環がヘテロアリール環である、共に縮合した２つの環を指す。ヘテロアリール基は、炭素またはヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合することができる。アリール基およびヘテロアリール基の非限定的な例としては、フェニル、ナフチル、ピロリル、ピラゾリル、ピリダジニル、トリアジニル、ピリミジニル、イミダゾリル、ピラジニル、プリニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、フリル、チエニル、ピリジル、ピリミジル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル  ベンズイミダゾリル、ベンゾフラン、イソベンゾフラニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾチオフェニル、イソキノリル、キノキサリニル、キノリル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが挙げられる。上記のアリール環系およびヘテロアリール環系の各々に対する置換基は、下記の許容される置換基の群から選択される。「アリーレン」および「ヘテロアリーレン」は、単独で、または別の置換基の一部として、それぞれアリールおよびヘテロアリールから誘導される二価ラジカルを意味する。ヘテロアリール基置換基は、環ヘテロ原子窒素に−Ｏ−結合していてもよい。
【００３４】
縮合環ヘテロシクロアルキル−アリールは、ヘテロシクロアルキルに縮合されたアリールである。縮合環ヘテロシクロアルキル−ヘテロアリールは、ヘテロシクロアルキルに縮合されたヘテロアリールである。縮合環ヘテロシクロアルキル−シクロアルキルは、シクロアルキルに縮合されたヘテロシクロアルキルである。縮合環ヘテロシクロアルキル−ヘテロシクロアルキルは、別のヘテロシクロアルキルに縮合されたヘテロシクロアルキルである。縮合環ヘテロシクロアルキル−アリール、縮合環ヘテロシクロアルキル−ヘテロアリール、縮合環ヘテロシクロアルキル−シクロアルキル、または縮合環ヘテロシクロアルキル−ヘテロシクロアルキルは、各々独立して、非置換であってもよく、または本明細書に記載の置換基のうちの１つ以上で置換されていてもよい。
【００３５】
スピロ環式環は、隣接する環が単一の原子を介して結合している、２つ以上の環である。スピロ環式環内の個々の環は、同一であっても異なっていてもよい。スピロ環式環内の個々の環は、置換されていても非置換であってもよく、一組のスピロ環式環内に他の個々の環とは異なる置換基を有していてもよい。スピロ環式環内の個々の環に対する可能な置換基は、スピロ環式環の一部ではない場合、同じ環に対する可能な置換基（例えば、シクロアルキル環またはヘテロシクロアルキル環に対する置換基）である。スピロ環式環は、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、または置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレンであってもよく、スピロ環式環基内の個々の環は、一種類の全ての環を有するもの（例えば、全ての環が置換ヘテロシクロアルキレンであり、各環は同じまたは異なる置換ヘテロシクロアルキレンであり得る）を含む、直前のリストのうちのいずれかであり得る。スピロ環式環系に言及するとき、複素環式スピロ環式環は、少なくとも１つの環が複素環式環であり、かつ各環が異なる環であり得る、スピロ環式環を意味する。スピロ環式環系に言及するとき、置換スピロ環式環は、少なくとも１つの環が置換されており、各置換基が任意に異なっていてもよいことを意味する。
【００３６】
【化７】
2021515561.tif 000009
または「−」という記号は、分子または化学式の残りの部分への化学部分の結合点を示す。
【００３７】
本明細書で使用される「オキソ」という用語は、炭素原子に二重結合している酸素を意味する。
【００３８】
本明細書で使用される「アルキルスルホニル」という用語は、式−Ｓ（Ｏ２）−Ｒ´を有する部分を意味し、式中、Ｒ´は、上で定義される置換または非置換アルキル基である。Ｒ´は、指定された数の炭素を有してもよい（例えば、「Ｃ１〜Ｃ４アルキルスルホニル」）。
【００３９】
アルキレン部分に共有結合したアリーレン部分としての「アルキルアリーレン」という用語（本明細書ではアルキレンリンカーとも称される）。態様では、アルキルアリーレン基は、式：
【化８】
2021515561.tif 000010
を有する。
【００４０】
アルキルアリーレン部分は、アルキレン部分またはアリーレンリンカー（例えば、炭素２、３、４、もしくは６）において、ハロゲン、オキソ、−Ｎ３、−ＣＦ３、−ＣＣｌ３、−ＣＢｒ３、−ＣＩ３、−ＣＮ、−ＣＨＯ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＳＨ、−ＳＯ２ＣＨ３−ＳＯ３Ｈ、−ＯＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ５アルキル、または置換もしくは非置換２〜５員ヘテロアルキル）で置換され得る。態様では、アルキルアリーレンは、非置換である。
【００４１】
上記の用語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「シクロアルキル」、「ヘテロシクロアルキル」、「アリール」、および「ヘテロアリール」）の各々は、示されたラジカルの置換形態と非置換形態との両方を含む。各種類のラジカルに対する好ましい置換基を以下に提供する。
【００４２】
アルキルラジカルおよびヘテロアルキルラジカルに対する置換基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと称されることが多い基を含む）は、０〜（２ｍ´＋１）（ｍ´は、そのようなラジカル中の炭素原子の総数である）の範囲の数で、限定されないが、−ＯＲ´、＝Ｏ、＝ＮＲ´、＝Ｎ−ＯＲ´、−ＮＲ´Ｒ´´、−ＳＲ´、−ハロゲン、−ＳｉＲ´Ｒ´´Ｒ´´´、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ´、−Ｃ（Ｏ）Ｒ´、−ＣＯ２Ｒ´、−ＣＯＮＲ´Ｒ´´、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ´Ｒ´´、−ＮＲ´´Ｃ（Ｏ）Ｒ´、−ＮＲ´−Ｃ（Ｏ）ＮＲ´´Ｒ´´´、−ＮＲ´´Ｃ（Ｏ）２Ｒ´、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ´Ｒ´´Ｒ´´´）＝ＮＲ´´´´、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ´Ｒ´´）＝ＮＲ´´´、−Ｓ（Ｏ）Ｒ´、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ´、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ´Ｒ´´、−ＮＲＳＯ２Ｒ´、−ＮＲ´ＮＲ´´Ｒ´´´、−ＯＮＲ´Ｒ´´、−ＮＲ´Ｃ（Ｏ）ＮＲ´´ＮＲ´´´Ｒ´´´´、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＮＲ´ＳＯ２Ｒ´´、−ＮＲ´Ｃ（Ｏ）Ｒ´´、−ＮＲ´Ｃ（Ｏ）−ＯＲ´´、−ＮＲ´ＯＲ´´から選択される様々な基のうちの１つ以上であり得る。Ｒ、Ｒ´、Ｒ´´、Ｒ´´´、およびＲ´´´´は各々、好ましくは、独立して、水素、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール（例えば、１〜３つのハロゲンで置換されたアリール）、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシ、またはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。例えば、本明細書に記載の化合物が１つ超のＲ基を含む場合、Ｒ基の各々は、独立して、これらの基のうちの１つ超が存在する場合の各Ｒ´、Ｒ´´、Ｒ´´´、およびＲ´´´´基のように選択される。Ｒ´およびＲ´´が同じ窒素原子に結合している場合、それらは、窒素原子と組み合わさって、４、５、６、または７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ´Ｒ´´としては、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルが挙げられるが、これらに限定されない。置換基の上記考察から、当業者は、「アルキル」という用語が、水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基、例えば、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３等）を含むことを意味すると理解するであろう。
【００４３】
アルキルラジカルについて記載される置換基と同様に、アリールおよびヘテロアリール基の置換基は様々であり、０〜芳香族環系上の原子価の総数の範囲の数で、例えば、−ＯＲ´、−ＮＲ´Ｒ´´、−ＳＲ´、−ハロゲン、−ＳｉＲ´Ｒ´´Ｒ´´´、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ´、−Ｃ（Ｏ）Ｒ´、−ＣＯ２Ｒ´、−ＣＯＮＲ´Ｒ´´、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ´Ｒ´´、−ＮＲ´´Ｃ（Ｏ）Ｒ´、−ＮＲ´−Ｃ（Ｏ）ＮＲ´´Ｒ´´´、−ＮＲ´´Ｃ（Ｏ）２Ｒ´、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ´Ｒ´´Ｒ´´´）＝ＮＲ´´´´、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ´Ｒ´´）＝ＮＲ´´´、−Ｓ（Ｏ）Ｒ´、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ´、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ´Ｒ´´、−ＮＲＳＯ２Ｒ´、−ＮＲ´ＮＲ´´Ｒ´´´、−ＯＮＲ´Ｒ´´、−ＮＲ´Ｃ（Ｏ）ＮＲ´´ＮＲ´´´Ｒ´´´´、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｒ´、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、−ＮＲ´ＳＯ２Ｒ´´、−ＮＲ´Ｃ（Ｏ）Ｒ´´、−ＮＲ´Ｃ（Ｏ）−ＯＲ´´、−ＮＲ´ＯＲ´´から選択され、Ｒ´、Ｒ´´、Ｒ´´´、およびＲ´´´´は、好ましくは、独立して、水素、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから選択される。例えば、本明細書に記載の化合物が１つ超のＲ基を含む場合、Ｒ基の各々は、これらの基のうちの１つ超が存在する場合の各Ｒ´、Ｒ´´、Ｒ´´´、およびＲ´´´´基のように、独立して選択される。
【００４４】
環に対する置換基（例えば、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレン）は、環の特定の原子上ではなく環上の置換基として表され得る（一般に浮遊置換基と称される）。そのような場合、置換基は、（化学原子価の規則に従って）環原子のいずれかに結合されてもよく、縮合環またはスピロ環式環の場合、縮合環またはスピロ環式環の１員と結合されるものとして示される置換基（単環上の浮遊置換基）は、縮合環またはスピロ環式環のいずれか上の置換基（多環上の浮遊置換基）であり得る。置換基が、特定の原子ではなく、環に結合して場合（浮遊置換基）、置換基の下付き文字は、１より大きい整数であり、複数の置換基が、同じ原子、同じ環、異なる原子、異なる縮合環、異なるスピロ環式環上にあってもよく、各置換基が、任意に異なり得る。分子の残りの部分への環の結合点が単一の原子（浮動置換基）に限定されない場合、結合点は、環の任意の原子であってもよく、縮合環またはスピロ環式環の場合、化学原子価の法則に従って、縮合環またはスピロ環式環のいずれかの任意の原子であり得る。環、縮合環、またはスピロ環式環が１つ以上の環ヘテロ原子を含有し、環、縮合環、またはスピロ環式環が１つ以上の浮動置換基と共に示される場合（限定されないが、分子の残りの部分に対する結合点を含む）、浮遊置換基は、ヘテロ原子に結合され得る。ヘテロ原子が、浮遊置換基を有する構造または式中で１つ以上の水素に結合して示される場合（例えば、環原子への２つの結合、および水素への３番目の結合を伴う環窒素）、ヘテロ原子が浮遊置換基に結合するとき、置換基は、化学原子価の法則に従いながら、水素を置き換えると理解されるであろう。
【００４５】
２つ以上の置換基が任意に結合して、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基を形成してもよい。そのようないわゆる環形成置換基は、典型的には、必ずではないが、環式塩基構造に結合していることが見出される。一実施形態では、環形成置換基は、塩基構造の隣接する構成員に結合している。例えば、環式塩基構造の隣接する構成員に結合した２つの環形成置換基は、縮合環構造を創出する。別の実施形態では、環形成置換基は、塩基構造の単一の構成員に結合している。例えば、環式塩基構造の単一の構成員に結合した２つの環形成置換基は、スピロ環式構造を創出する。さらに別の実施形態では、環形成置換基は、基本構造の隣接していない構成員に結合されている。
【００４６】
アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは、任意選択で、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ´）ｑ−Ｕ−の環を形成してもよく、式中、ＴおよびＵは、独立して、−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ´−、または単結合であり、ｑは、０〜３の整数である。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは、任意に、式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−の置換基で置き換えられてもよく、式中、ＡおよびＢは、独立して、−ＣＲＲ´−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ´−、または単結合であり、ｒは、１〜４の整数である。このように形成された新たな環の単結合のうちの１つは、任意に、二重結合で置き換えられてもよい。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは、任意に、式−（ＣＲＲ´）ｓ−Ｘ´−（Ｃ´´Ｒ´´Ｒ´´´）ｄ−の置換基で置き換えられてもよく、式中、ｓおよびｄは、独立して、０〜３の整数であり、Ｘ´は、−Ｏ−、−ＮＲ´−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ´−である。置換基Ｒ、Ｒ´、Ｒ´´、およびＲ´´´は、好ましくは、独立して、水素、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリールから選択される。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「ヘテロ原子」または「環ヘテロ原子」という用語は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、およびケイ素（Ｓｉ）を含むことを意味する。
【００４８】
本明細書で使用される「置換基」は、以下の部分から選択される基を意味する：（Ａ）オキソ、ハロゲン、−ＣＣｌ３、−ＣＢｒ３、−ＣＦ３、−ＣＩ３、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＳＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＳＯ２Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−ＯＣＣｌ３、−ＯＣＦ３、−ＯＣＢｒ３、−ＯＣＩ３、−ＯＣＨＣｌ２、−ＯＣＨＢｒ２、−ＯＣＨＩ２、−ＯＣＨＦ２、非置換アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、もしくはＣ１〜Ｃ４アルキル）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２〜８員ヘテロアルキル、２〜６員ヘテロアルキル、もしくは２〜４員ヘテロアルキル）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、もしくはＣ５〜Ｃ６シクロアルキル）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３〜８員ヘテロシクロアルキル、３〜６員ヘテロシクロアルキル、もしくは５〜６員ヘテロシクロアルキル）、非置換アリール（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ１０アリール、もしくはフェニル）、または非置換ヘテロアリール（例えば、５〜１０員ヘテロアリール、５〜９員ヘテロアリール、もしくは５〜６員ヘテロアリール）、および（Ｂ）以下から選択される少なくとも１つの置換基で置換される、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール：（ｉ）オキソ、ハロゲン、−ＣＣｌ３、−ＣＢｒ３、−ＣＦ３、−ＣＩ３、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＳＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＳＯ２Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−ＯＣＣｌ３、−ＯＣＦ３、−ＯＣＢｒ３、−ＯＣＩ３、−ＯＣＨＣｌ２、−ＯＣＨＢｒ２、−ＯＣＨＩ２、−ＯＣＨＦ２、非置換アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、もしくはＣ１〜Ｃ４アルキル）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２〜８員ヘテロアルキル、２〜６員ヘテロアルキル、もしくは２〜４員ヘテロアルキル）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、もしくはＣ５〜Ｃ６シクロアルキル）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３〜８員ヘテロシクロアルキル、３〜６員ヘテロシクロアルキル、もしくは５〜６員ヘテロシクロアルキル）、非置換アリール（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ１０アリール、もしくはフェニル）、または非置換ヘテロアリール（例えば、５〜１０員ヘテロアリール、５〜９員ヘテロアリール、もしくは５〜６員ヘテロアリール）、および（ｉｉ）以下から選択される少なくとも１つの置換基で置換される、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、（ａ）オキソ、ハロゲン、−ＣＣｌ３、−ＣＢｒ３、−ＣＦ３、−ＣＩ３、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＳＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＳＯ２Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−ＯＣＣｌ３、−ＯＣＦ３、−ＯＣＢｒ３、−ＯＣＩ３、−ＯＣＨＣｌ２、−ＯＣＨＢｒ２、−ＯＣＨＩ２、−ＯＣＨＦ２、非置換アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、もしくはＣ１〜Ｃ４アルキル）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２〜８員ヘテロアルキル、２〜６員ヘテロアルキル、もしくは２〜４員ヘテロアルキル）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、もしくはＣ５〜Ｃ６シクロアルキル）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３〜８員ヘテロシクロアルキル、３〜６員ヘテロシクロアルキル、もしくは５〜６員ヘテロシクロアルキル）、非置換アリール（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ１０アリール、もしくはフェニル）、または非置換ヘテロアリール（例えば、５〜１０員ヘテロアリール、５〜９員ヘテロアリール、もしくは５〜６員ヘテロアリール）、および（ｂ）以下から選択される少なくとも１つの置換基で置換される、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール：オキソ、ハロゲン、−ＣＣｌ３、−ＣＢｒ３、−ＣＦ３、−ＣＩ３、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＳＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＳＯ２Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−ＯＣＣｌ３、−ＯＣＦ３、−ＯＣＢｒ３、−ＯＣＩ３、−ＯＣＨＣｌ２、−ＯＣＨＢｒ２、−ＯＣＨＩ２、−ＯＣＨＦ２、非置換アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、もしくはＣ１〜Ｃ４アルキル）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２〜８員ヘテロアルキル、２〜６員ヘテロアルキル、もしくは２〜４員ヘテロアルキル）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、もしくはＣ５〜Ｃ６シクロアルキル）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３〜８員ヘテロシクロアルキル、３〜６員ヘテロシクロアルキル、もしくは５〜６員ヘテロシクロアルキル）、非置換アリール（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ１０アリール、もしくはフェニル）、または非置換ヘテロアリール（例えば、５〜１０員ヘテロアリール、５〜９員ヘテロアリール、もしくは５〜６員ヘテロアリール）。
【００４９】
本明細書で使用される「サイズ制限置換基（ｓｉｚｅ−ｌｉｍｉｔｅｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）」または「サイズ制限置換基（ｓｉｚｅ−ｌｉｍｉｔｅｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）」は、「置換基」について上で説明した全ての置換基から選択される基を意味し、各置換または非置換アルキルは、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキルであり、各置換または非置換ヘテロアルキルは、置換または非置換２〜２０員ヘテロアルキルであり、各置換または非置換シクロアルキルは、置換または非置換Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキルであり、各置換または非置換ヘテロシクロアルキルは、置換または非置換３〜８員ヘテロシクロアルキルであり、各置換または非置換アリールは、置換または非置換Ｃ６〜Ｃ１０アリールであり、各置換または非置換ヘテロアリールは、置換または非置換５〜１０員ヘテロアリールである。
【００５０】
「低級置換基（ｌｏｗｅｒ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）」または「低級置換基（ｌｏｗｅｒ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）」は、本明細書で使用される場合、「置換基」について上で説明した全ての置換基から選択される基を意味し、各置換または非置換アルキルは、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ８アルキルであり、各置換または非置換ヘテロアルキルは、置換または非置換２〜８員ヘテロアルキルであり、各置換または非置換シクロアルキルは、置換または非置換Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキルであり、各置換または非置換ヘテロシクロアルキルは、置換または非置換３〜７員ヘテロシクロアルキルであり、各置換または非置換アリールは、置換または非置換Ｃ６〜Ｃ１０アリールであり、各置換または非置換ヘテロアリールは、置換または非置換５〜９員ヘテロアリールである。
【００５１】
実施形態では、本明細書の化合物において説明される各置換基は、少なくとも１つの置換基で置換されている。より具体的には、態様では、本明細書の化合物において説明される各置換アルキル、置換ヘテロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アリール、置換ヘテロアリール、置換アルキレン、置換ヘテロアルキレン、置換シクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、置換アリーレン、および／または置換ヘテロアリーレンは、少なくとも１つの置換基で置換されている。態様では、これらの基のうちの少なくとも１つまたは全てが、少なくとも１つのサイズ制限置換基で置換されている。態様では、これらの基のうちの少なくとも１つまたは全てが、少なくとも１つの低級置換基で置換されている。
【００５２】
本明細書の化合物の実施形態では、各置換または非置換アルキルは、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキルであってもよく、各置換または非置換ヘテロアルキルは、置換または非置換２〜２０員ヘテロアルキルであり、各置換または非置換シクロアルキルは、置換または非置換Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキルであり、各置換または非置換ヘテロシクロアルキルは、置換または非置換３〜８員ヘテロシクロアルキルであり、各置換または非置換アリールは、置換または非置換Ｃ６〜Ｃ１０アリールであり、かつ／あるいは各置換または非置換ヘテロアリールは、置換または非置換５〜１０員ヘテロアリールである。本明細書の化合物の態様では、各置換または非置換アルキレンは、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキレンであり、各置換または非置換ヘテロアルキレンは、置換または非置換２〜２０員ヘテロアルキレンであり、各置換または非置換シクロアルキレンは、置換または非置換Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキレンであり、各置換または非置換ヘテロシクロアルキレンは、置換または非置換３〜８員ヘテロシクロアルキレンであり、各置換または非置換アリーレンは、置換または非置換Ｃ６〜Ｃ１０アリーレンであり、かつ／あるいは各置換または非置換ヘテロアリーレンは、置換または非置換５〜１０員ヘテロアリーレンである。
【００５３】
実施形態では、各置換または非置換アルキルは、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ８アルキルであり、各置換または非置換ヘテロアルキルは、置換または非置換２〜８員ヘテロアルキルであり、各置換または非置換シクロアルキルは、置換または非置換Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキルであり、各置換または非置換ヘテロシクロアルキルは、置換または非置換３〜７員ヘテロシクロアルキルであり、各置換または非置換アリールは、置換または非置換Ｃ６〜Ｃ１０アリールであり、かつ／あるいは各置換または非置換ヘテロアリールは、置換または非置換５〜９員ヘテロアリールである。態様では、各置換または非置換アルキレンは、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ８アルキレンであり、各置換または非置換ヘテロアルキレンは、置換または非置換２〜８員ヘテロアルキレンであり、各置換または非置換シクロアルキレンは、置換または非置換Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキレンであり、各置換または非置換ヘテロシクロアルキレンは、置換または非置換３〜７員ヘテロシクロアルキレンであり、各置換または非置換アリーレンは、置換または非置換Ｃ６〜Ｃ１０アリーレンであり、かつ／あるいは各置換または非置換ヘテロアリーレンは、置換または非置換５〜９員ヘテロアリーレンである。態様では、化合物は、以下の実施例セクション、図面、または表に示される化学種である。
【００５４】
実施形形態では、置換または非置換部分（例えば、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、および／または置換もしくは非置換ヘテロアリーレン）は、非置換である（例えば、それぞれ、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、非置換アルキレン、非置換ヘテロアルキレン、非置換シクロアルキレン、非置換ヘテロシクロアルキレン、非置換アリーレン、および／または非置換ヘテロアリーレン）。態様では、置換または非置換部分（例えば、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、および／または置換もしくは非置換ヘテロアリーレン）は、置換されている（例えば、それぞれ、置換アルキル、置換ヘテロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アリール、置換ヘテロアリール、置換アルキレン、置換ヘテロアルキレン、置換シクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、置換アリーレン、および／または置換ヘテロアリーレン）。
【００５５】
実施形態では、置換部分（例えば、置換アルキル、置換ヘテロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アリール、置換ヘテロアリール、置換アルキレン、置換ヘテロアルキレン、置換シクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、置換アリーレン、および／または置換ヘテロアリーレン）は、少なくとも１つの置換基で置換され、置換部分が複数の置換基で置換される場合、各置換基は、任意に異なっていてもよい。態様では、置換部分が複数の置換基で置換される場合、各置換基は異なる。
【００５６】
実施形態では、置換部分（例えば、置換アルキル、置換ヘテロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アリール、置換ヘテロアリール、置換アルキレン、置換ヘテロアルキレン、置換シクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、置換アリーレン、および／または置換ヘテロアリーレン）は、少なくとも１つのサイズ制限置換基で置換され、置換部分が複数のサイズ制限置換基で置換される場合、各サイズ制限置換基は、任意に異なっていてもよい。態様では、置換部分が複数のサイズ制限置換基で置換される場合、各サイズ制限置換基は異なる。
【００５７】
実施形態では、置換部分（例えば、置換アルキル、置換ヘテロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アリール、置換ヘテロアリール、置換アルキレン、置換ヘテロアルキレン、置換シクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、置換アリーレン、および／または置換ヘテロアリーレン）は、少なくとも１つの低級置換基で置換され、置換部分が、複数の低級置換基で置換されている場合、各低級置換基は、任意に異なっていてもよい。態様では、置換部分が複数の低級置換基で置換される場合、各低級置換基は異なる。
【００５８】
実施形態では、置換部分（例えば、置換アルキル、置換ヘテロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アリール、置換ヘテロアリール、置換アルキレン、置換ヘテロアルキレン、置換シクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、置換アリーレン、および／または置換ヘテロアリーレン）は、少なくとも１つの置換基、サイズ制限置換基、または低級置換基で置換され、置換部分が、置換基、サイズ制限置換基、および低級置換基から選択される複数の基で置換されている場合、各置換基、サイズ制限置換基、および／または低級置換基は、任意に異なっていてもよい。態様では、置換部分が、置換基、サイズ制限置換基、および低級置換基から選択される複数の基で置換される場合、各置換基、サイズ制限置換基、および／または低級置換基は異なる。
【００５９】
本開示のある特定の化合物は、不斉炭素原子（光学中心もしくはキラル中心）または二重結合を保有する。エナンチオマー、ラセミ体、ジアステレオマー、互変異性体、幾何異性体、絶対立体化学の観点からアミノ酸について（Ｒ）−もしくは（Ｓ）−として、または（Ｄ）−もしくは（Ｌ）−として定義され得る立体異性形態、および個々の異性体が、本開示の範囲に包含される。本開示の化合物は、合成および／または単離するには不安定すぎることが当該技術分野において知られているものを含まない。本開示は、ラセミ形態および光学的に純粋な形態の化合物を含むことを意味する。光学活性な（Ｒ）−および（Ｓ）−または（Ｄ）−および（Ｌ）−異性体は、キラルシントンまたはキラル試薬を使用して調製してもよく、あるいは従来の技法を使用して分割してもよい。本明細書に記載の化合物がオレフィン結合または他の幾何学的不斉中心を含む場合、また別段の指示がない限り、化合物はＥおよびＺ両方の幾何異性体を含むことが意図される。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「異性体」という用語は、同じ数および種類の原子、したがって同じ分子量を有するが、原子の構造配置または立体配置に関しては異なる化合物を指す。
【００６１】
本明細書で使用される「互変異性体」という用語は、平衡状態で存在し、ある異性型から別の異性型に容易に変換される２つ以上の構造異性体のうちの１つを指す。
【００６２】
本開示のある特定の化合物が互変異性形態で存在してもよく、化合物のそのような互変異性形態が全て本開示の範囲内であることは当業者に明らかであろう。
【００６３】
別段の記述がない限り、本明細書に示される構造は、その構造の全ての立体化学形態、すなわち、各不斉中心についてＲ配置およびＳ配置も含むことを意味する。したがって、本化合物の単一の立体化学異性体、およびエナンチオマーとジアステレオマーとの混合物が本開示の範囲内である。
【００６４】
別段の記述がない限り、本明細書に示される構造はまた、１つ以上の同位体濃縮原子の存在下でのみ異なる化合物を含むことを意味する。例えば、重水素もしくは三重水素による水素の代置または１３Ｃ−もしくは１４Ｃ−濃縮炭素による炭素の代置を除いて本構造を有する化合物は、本開示の範囲内である。
【００６５】
本開示の化合物はまた、そのような化合物を構成する原子のうちの１つ以上において、不自然な均衡の原子同位体を含み得る。例えば、これらの化合物は、例えば三重水素（３Ｈ）、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）、または炭素１４（１４Ｃ）などの放射性同位体で放射性標識されていてもよい。本開示の化合物の全ての同位体変形は、放射性であろうとなかろうと、本開示の範囲内に包含される。
【００６６】
本出願全体を通して、代替物は、マーカッシュ群、例えば、１つ超の可能なアミノ酸を含む各アミノ酸位置で書かれていることに留意されたい。マーカッシュ群の各構成員は別々に考慮されて、別の実施形態を構成するべきであり、マーカッシュ群は単一の単位として読まれるべきではないことが、明確に企図される。
【００６７】
「類似体（ａｎａｌｏｇ）」または「類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）」は、化学および生物学におけるその単純な通常の意味に従って使用され、別の化合物（すなわち、いわゆる「参照」化合物）と構造的に類似しているが、組成において、例えば、ある原子の異なる元素の原子による代置、または特定の官能基の存在下、またはある官能基の別の官能基による代置、または参照化合物の１つ以上のキラル中心の絶対立体化学において異なる化学化合物を指す。したがって、類似体は、機能および外観において類似または同等であるが、参照化合物と構造または起源においては類似または同等でない化合物である。
【００６８】
本明細書で使用される「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つ以上を意味する。加えて、本明細書で使用される「［ｎ］で置換された（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ［ｎ］）」という語句は、特定された基が、任意のまたは全ての指定された置換基のうちの１つ以上で置換されていてもよいことを意味する。例えば、アルキル基またはヘテロアリール基などの基は、「非置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、または非置換２〜２０員ヘテロアルキルで置換される」場合、その基は、１つ以上の非置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、および／または１つ以上の非置換２〜２０員ヘテロアルキルを含有することができる。
【００６９】
さらに、ある部分がＲ置換基で置換されている場合、その基は、「Ｒ置換」と称され得る。ある部分がＲ置換である場合、この部分は、少なくとも１つのＲ置換基で置換され、各Ｒ置換基は、任意に異なる。特定のＲ基が化学種（式（Ｉ）など）の説明中に存在する場合、ローマアルファベット記号が、その特定のＲ基の各外観を区別するために使用することができる。例えば、複数のＲ１３置換基が存在する場合、各Ｒ１３置換基は、Ｒ１３Ａ、Ｒ１３Ｂ、Ｒ１３Ｃ、Ｒ１３Ｄ等として区別されてもよく、Ｒ１３Ａ、Ｒ１３Ｂ、Ｒ１３Ｃ、Ｒ１３Ｄ等の各々は、Ｒ１３の定義の範囲内で定義され、任意に異なっている。
【００７０】
「検出可能な薬剤」または「検出可能な部分」は、分光、光化学、生化学、免疫化学、化学、磁気共鳴イメージング、または他の物理的手段などの適切な手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な検出可能な薬剤としては、１８Ｆ、３２Ｐ、３３Ｐ、４５Ｔｉ、４７Ｓｃ、５２Ｆｅ、５９Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７７Ａｓ、８６Ｙ、９０Ｙが挙げられる。８９Ｓｒ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、９９Ｍｏ、１０５Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５４〜１５８１Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７５Ｌｕ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１１Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、Ｃｒ、Ｖ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、３２Ｐ、フルオロフォア（例えば、蛍光色素）、電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般的に使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、常磁性分子、常磁性ナノ粒子、極小超常磁性酸化鉄（「ＵＳＰＩＯ」）ナノ粒子、ＵＳＰＩＯナノ粒子凝集体、超常磁性酸化鉄（「ＳＰＩＯ」）ナノ粒子、ＳＰＩＯナノ粒子凝集体、単結晶酸化鉄ナノ粒子、単結晶酸化鉄、ナノ粒子造影剤、リポソーム、またはガドリニウムキレート（「Ｇｄ−キレート」）分子を含む他の送達ビヒクル、ガドリニウム、放射性同位体、放射性核種（例えば、炭素−１１、窒素−１３、酸素−１５、フッ素−１８、ルビジウム−８２）、フルオロデオキシグルコース（例えば、フッ素−１８標識化）、任意のガンマ線放射性核種、ポジトロン放射性核種、放射性標識グルコース、放射性標識水、放射性標識アンモニア、バイオコロイド、マイクロバブル（例えば、アルブミン、ガラクトース、脂質、および／またはポリマーを含むマイクロバブル殻；空気、重量ガス（複数可）、ペルフルオロカーボン、窒素、オクタフルオロプロパン、ペルフレキサン脂質微粒子、ペルフルトレン等を含むマイクロバブルガスコア）；ヨウ素化造影剤（例えば、イオヘキソール、イオジキサノール、イオパミドール、イオキシラン、イオプロミド、ジアトリゾエート、メトリゾエート、イオキサグラート）、硫酸バリウム、二酸化トリウム、金、金ナノ粒子、金ナノ粒子凝集体、フルオロフォア、２光子フルオロフォア、もしくはハプテンおよびタンパク質、あるいは例えば、ペプチドに放射標識を組み込むことによって検出可能にすることができる他の実体、または標的ペプチドと特異的に反応する抗体。検出可能な部分は、一価の検出可能な薬剤または別の組成物との結合を形成することができる検出可能な薬剤である。
【００７１】
本開示の実施形態に従って撮像剤および／または標識剤として使用され得る放射性物質（例えば、放射性同位体）としては、１８Ｆ、３２Ｐ、３３Ｐ、４５Ｔｉ、４７Ｓｃ、５２Ｆｅ、５９Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７７Ａｓ、８６Ｙ、９０Ｙが挙げられるが、これらに限定されない。８９Ｓｒ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、９９Ｍｏ、１０５Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５４〜１５８１Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７５Ｌｕ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１１Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、および２２５Ａｃ。本開示の実施形態に従って追加の撮像剤として使用され得る副磁気イオンとしては、遷移イオンおよびランタニド金属（例えば、２１〜２９、４２、４３、４４、または５７〜７１の原子番号を有する金属）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの金属には、Ｃｒ、Ｖ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、およびＬｕのイオンが含まれる。
【００７２】
本開示の化合物の説明は、当業者に知られている化学結合の原理によって制限される。したがって、基がある数の置換基のうちの１つ以上によって置換され得る場合、かかる置換は、化学結合の原理に従うように、また本質的に不安定ではなく、かつ／または水性、中性、およびいくつかの既知の生理学的条件などの周囲条件下で不安定である可能性が高いものとして当業者に知られている化合物を生じさせるように、選択される。例えば、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールは、当業者に既知の化学結合の原理に準じて、環ヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合することにより、本質的に不安定な化合物を回避する。
【００７３】
当業者であれば、化合物または化合物属（例えば、本明細書に記載の属）の変数（例えば、部分またはリンカー）が、全ての価を充填したスタンドアロン化合物の名前または式によって説明されるとき、変数の未充填価（複数可）は、変数が使用される文脈によって指示されることを理解するであろう。例えば、本明細書に記載の化合物の変数が、単一の結合を通じて化合物の残りの部分に接続される（例えば、結合される）場合、その変数は、スタンドアロン化合物の一価形態（すなわち、未充填の価に起因して単一の結合を形成することができる）を表すと理解される（例えば、実施形態において、変数が「メタン」と命名されるが、変数が化合物の残りの部分に単一の結合によって結合されることが知られている場合、当業者は、その変数が実際にメタンの一価形態、すなわち、メチルまたは−ＣＨ３であることを理解するであろう）。同様に、リンカー変数（例えば、本明細書に記載のＬ１、Ｌ２、またはＬ３）に関して、当業者は、変数がスタンドアロン化合物の二価形態であることを理解するであろう（例えば、実施形態において、変数が「ＰＥＧ」または「ポリエチレングリコール」に割り当てられているが、変数が化合物の残りの部分に２つの別個の結合によって接続されている場合、当業者は、変数がスタンドアロン化合物ＰＥＧの代わりにＰＥＧの二価（すなわち、２つの未充填価を介して２つの結合を形成することができる）形態であることを理解するであろう。
【００７４】
「核酸」とは、一本鎖、二本鎖、または多本鎖のいずれかの形態のヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド）およびそれらのポリマー、あるいはそれらの相補体を指す。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「オリゴ」等の用語は、通常および慣習的な意味で、ヌクレオチドの線状配列を指す。「ヌクレオチド」という用語は、通常のおよび慣習的な意味で、単一のポリヌクレオチド単位、すなわちモノマーを指す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの修飾型であり得る。本明細書で企図されるポリヌクレオチドの例には、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖ＤＮＡとＲＮＡの混合物を有するハイブリッド分子が含まれる。本明細書で企図される核酸、例えばポリヌクレオチドの例には、あらゆるタイプのＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびガイドＲＮＡ、ならびにあらゆる種類のＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、およびミニサークルＤＮＡ、ならびにそれらのあらゆる断片が含まれる。ポリヌクレオチドの文脈における「二本鎖」という用語は、通常のおよび慣習的な意味で、二本鎖性を指す。核酸は、直鎖または分岐鎖であり得る。例えば、核酸は、ヌクレオチドの直鎖であり得るか、または核酸は、例えば、核酸がヌクレオチドの１つ以上のアームまたは分岐を含むように分岐し得る。任意に、分岐核酸は、繰り返し分岐して、デンドリマー等の高次構造を形成する。
【００７５】
例えばホスホチオエート骨格を有する核酸を含む核酸は、１つ以上の反応性部分を含み得る。本明細書で使用される場合、反応性部分という用語は、共有結合、非共有結合、または他の相互作用を介して別の分子、例えば、核酸またはポリペプチドと反応することができる任意の基を含む。例として、核酸は、共有結合、非共有結合、または他の相互作用を介してタンパク質またはポリペプチド上のアミノ酸と反応するアミノ酸反応性部分を含み得る。
【００７６】
この用語はまた、既知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基もしくは結合を含む核酸も包含し、合成、天然に存在する、および天然に存在せず、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと類似の方法で代謝される。そのような類似体の例としては、限定されないが、例えば、ホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、ホスホロチオエート（リン酸中の酸素を二重結合硫黄で置換するホスホチオエートとしても知られる）、ホスホロジアミデート、ホスホノカルボン酸、ホスホノカルボキシレート、ホスホノ酢酸、ホスホノギ酸、メチルホスホネート、ボロンホスホネート、またはＯ−メチルホスホロアミダイト結合を含むホスホジエステル誘導体（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照）、ならびに５−メチルシチジンまたはプソイドウリジンなどの場合にはヌクレオチド塩基、およびペプチド核酸骨格と結合に対する修飾が挙げられる。他の類似体核酸としては、米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号、ならびに第６章および第７章、ＡＳＣシンポジウムシリーズ５８０、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓａｎｇｈｕｉ＆Ｃｏｏｋ，ｅｄｓ．に記載されているものを含む、陽性骨格、非イオン性骨格、修飾糖、および非リボース骨格（例えば、当該技術分野において公知のホスホロジアミデートモルホリノオリゴまたはロックド核酸（ＬＮＡ））を有するものが挙げられる。１つ以上の炭素環式糖を含有する核酸もまた、核酸の１つの定義内に含まれる。リボース−ホスフェート骨格の修飾は、例えば、生理学的環境におけるそのような分子の安定性および半減期を増加させるために、またはバイオチップ上のプローブとして、様々な理由で行うことができる。天然に存在する核酸と類似体の混合物が作製され得るか、あるいは、異なる核酸類似体の混合物、および天然に存在する核酸と類似体の混合物が作製され得る。態様では、ＤＮＡ中のヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル、ホスホジエステル誘導体、または両方の組み合わせである。
【００７７】
核酸は、非特異的配列を含み得る。本明細書で使用される場合、「非特異的配列」という用語は、任意の他の核酸配列に相補的であるように設計されていないか、または部分的に相補的であるにすぎない一連の残基を含む核酸配列を指す。例として、非特異的核酸配列は、細胞または生物と接触したときに阻害性核酸として機能しない核酸残基の配列である。
【００７８】
本明細書で使用され得るように、「核酸」、「核酸分子」、「核酸オリゴマー」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸配列」、「核酸断片」、および「ポリヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、限定されないが、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体、誘導体、もしくは修飾のいずれかの様々な長さを有し得る、一緒に共有結合したヌクレオチドのポリマー形態を含むことが意図される。異なるポリヌクレオチドは、異なる三次元構造を有してもよく、既知または未知の様々な機能を実行してもよい。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、遺伝子間ＤＮＡ（限定されないが、複素色素ＤＮＡを含む）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、配列の単離されたＤＮＡ、配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。本開示の方法に有用なポリヌクレオチドは、天然核酸配列およびその変異体、人工核酸配列、またはそのような配列の組み合わせを含み得る。
【００７９】
ポリヌクレオチドは、典型的には、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびチミン（Ｔ）（ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合は、チミン（Ｔ）に対してウラシル（Ｕ））の４つのヌクレオチド塩基の特定の配列で構成される。したがって、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット順の表現であり、代替として、この用語は、ポリヌクレオチド分子自体に適用され得る。このアルファベット表現は、中央処理ユニットを有するコンピュータ内のデータベースに入力することができ、機能ゲノム学および相同性検索などのバイオインフォマティクスアプリケーションに使用することができる。ポリヌクレオチドは、任意に、１つ以上の非標準ヌクレオチド（複数可）、ヌクレオチド類似体（複数可）、および／または修飾ヌクレオチドを含んでもよい。
【００８０】
本明細書で使用される「相補体」という用語は、相補的なヌクレオチドまたはヌクレオチドの配列と塩基対合することができる、ヌクレオチド（例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡ）またはヌクレオチドの配列を指す。本明細書に記載され、当該技術分野において一般的に公知であるように、アデノシンの相補的（マッチング）ヌクレオチドは、チミジンであり、グアニジンの相補的（マッチング）ヌクレオチドは、シトシンである。したがって、相補体は、第２の核酸配列の対応する相補的ヌクレオチドと塩基対合するヌクレオチドの配列を含み得る。相補体のヌクレオチドは、第２の核酸配列のヌクレオチドと部分的にまたは完全に一致し得る。相補体のヌクレオチドが第２の核酸配列の各ヌクレオチドと完全に一致する場合、その相補体は、第２の核酸配列の各ヌクレオチドと塩基対を形成する。相補体のヌクレオチドが第２の核酸配列のヌクレオチドと部分的に一致する場合、相補体のヌクレオチドの一部のみが第２の核酸配列のヌクレオチドと塩基対を形成する。相補的配列の例には、コード配列および非コード配列が含まれ、非コード配列は、コード配列に対する相補的ヌクレオチドを含み、したがって、コード配列の相補体を形成する。相補的配列のさらなる例は、センスおよびアンチセンス配列であり、センス配列は、アンチセンス配列に対する相補的ヌクレオチドを含み、したがってアンチセンス配列の相補体を形成する。
【００８１】
本明細書に記載されるように、配列の相補性は、部分的であり得、そのうちいくつかの核酸のみが塩基対合に従って一致するか、または完全な場合、全ての核酸が塩基対合に従って一致する。したがって、互いに相補的な２つの配列は、同一の特定の割合のヌクレオチド（すなわち、特定の領域にわたって約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性）を有し得る。
【００８２】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と類似の方法で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムと同じ塩基性化学構造を有する化合物を指す。そのような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ塩基性化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸に類似の方法で機能する化学化合物を指す。「天然に存在しないアミノ酸」および「非天然アミノ酸」という用語は、天然に見出されないアミノ酸類似体、合成アミノ酸、およびアミノ酸模倣物を指す。
【００８３】
アミノ酸は、本明細書において、それらの一般的に知られている３つの文字記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される１つの文字記号のいずれかによって参照され得る。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般的に許容される単一文字コードによって参照され得る。
【００８４】
「アミノ酸側鎖」という用語は、アミノ酸に含まれる機能的置換基を指す。例えば、アミノ酸側鎖は、天然に存在するアミノ酸の側鎖であり得る。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コード（例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリン）によってコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸塩、およびＯ−ホスホセリンであるアミノ酸である。態様では、アミノ酸側鎖は、非天然アミノ酸側鎖であり得る。態様では、アミノ酸側鎖は、Ｈ、
【化９】
2021515561.tif 000011
である。
実施形態では、非天然アミノ酸側鎖は、
【化１０】
2021515561.tif 000012
である。
【００８５】
「非天然アミノ酸側鎖（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）」または「非天然アミノ酸側鎖（ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）」または「Ｕａａ」という用語は、天然に存在するアミノ酸、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素と同じ塩基性化学構造を有する化合物の機能的置換基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム、アリルアラニン、２−アミノイソブトリル酸を指す。非天然アミノ酸は、天然に存在するか、または化学合成されるかのいずれかである非タンパク質原性アミノ酸である。そのような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ塩基性化学構造を保持する。非限定的な例としては、エキソ−シス−３−アミノビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−２−カルボン酸塩酸塩、シス−２−アミノシクロヘプタンカルボン酸塩酸塩、シス−６−アミノ−３−シクロヘキセン−１−カルボン酸塩酸塩、シス−２−アミノ−２−メチルシクロヘキサンカルボン酸塩酸塩、シス−２−アミノ−２−メチルシクロペンタンカルボン酸塩酸塩、２−（Ｂｏｃ−アミノメチル）安息香酸、２−（Ｂｏｃ−アミノ）オクタン二酸、Ｂｏｃ−４，５−デヒドロ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ジシクロヘキシルアンモニウム）、Ｂｏｃ−４−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−Ｌ−フェニルアラニン、Ｂｏｃ−β−ホモピル−ＯＨ、Ｂｏｃ−（２−インダニル）−Ｇｌｙ−ＯＨ、４−Ｂｏｃ−３−モルホリン酢酸、４−Ｂｏｃ−３−モルホリン酢酸、Ｂｏｃ−ペンタフルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、Ｂｏｃ−ペンタフルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ（２−Ｂｒ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ（４−Ｂｒ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ（４−Ｂｒ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＮＨ２）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＮＯ２）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ（３，５−Ｆ２）−ＯＨ、２−（４−Ｂｏｃ−ピペラジノ）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）酢酸プルム、２−（４−Ｂｏｃ−ピペラジノ）−２−（２−フルオロフェニル）酢酸プルム、２−（４−Ｂｏｃ−ピペラジノ）−２−（３−フルオロフェニル）酢酸プルム、２−（４−Ｂｏｃ−ピペラジノ）−２−（４−フルオロフェニル）酢酸プルム、２−（４−Ｂｏｃ−ピペラジノ）−２−（４−メトキシフェニル）酢酸プルム、２−（４−Ｂｏｃ−ピペラジノ）−２−フェニル酢酸プルム、２−（４−Ｂｏｃ−ピペラジノ）−２−（３−ピリジル）酢酸プルム、２−（４−Ｂｏｃ−ピペラジノ）−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］酢酸プルム、Ｂｏｃ−β−（２−キノリル）−Ａｌａ−ＯＨ、Ｎ−Ｂｏｃ−１，２，３，６−テトラヒドロ−２−ピリジンカルボン酸、Ｂｏｃ−β−（４−チアゾリル）−Ａｌａ−ＯＨ、Ｂｏｃ−β−（２−チエニル）−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｎ−（４−Ｂｏｃ−アミノブチル）−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｎ−（２，４−ジメトキシベンジル）−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−（２−インダニル）���Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ペンタフルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｆｍｏｃ−Ｐｅｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（２−Ｂｒ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−Ｂｒ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３，５−Ｆ２）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−β−（４−チアゾリル）−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−β−（２−チエニル）−Ａｌａ−ＯＨ、４−（ヒドロキシメチル）−Ｄ−フェニルアラニンが挙げられる。実施形態では、非天然アミノ酸は、以下の式：
【化１１】
2021515561.tif 000013
を有するフルオロサルフェート−Ｌ−チロシン（ＦＳＹ）である。
【００８６】
「保存的に修飾された変異形」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に修飾された変異形」は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指す。遺伝子コードの変性のため、いくつかの核酸配列は、任意の所与のタンパク質をコードするであろう。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって指定される全ての位置において、コドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載される対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸変異は、保存的に修飾された変異のうちの１つの種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能なサイレント変異を説明する。当業者は、核酸中の各コドン（通常はメチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して機能的に同一の分子を得ることができることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、各記載の配列において暗黙的である。
【００８７】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列中の単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変化させる、付加する、または欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失、または付加が、「保存的に修飾された変異形」であり、その変化は、化学的に類似するアミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらすことを認識するであろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換テーブルは、当該技術分野において周知である。そのような保存的修飾変異形は、本開示の多型変異形、種間同族体、および対立遺伝子に加えられ、これらを除外しない。
【００８８】
以下の８つの基は各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：（１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；（４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；（７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および（８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照）。
【００８９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で交換可能に使用され、このポリマーは、実施形態ではアミノ酸から構成されない部分に共役されてもよい。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の合成化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。「融合タンパク質」は、単一の部分として組み換え発現される２つ以上の別個のタンパク質配列をコードするキメラタンパク質を指す。
【００９０】
アミノ酸またはヌクレオチド塩基の「位置」は、Ｎ末端（または５´末端）に対するその位置に基づいて、参照配列中の各アミノ酸（またはヌクレオチド塩基）を順次同定する数によって示される。最適なアラインメントを決定する際に考慮に入れなければならない欠失、挿入、切断、融合等のため、一般に、Ｎ末端から単にカウントすることによって決定される試験配列中のアミノ酸残基数は、必ずしも参照配列中のその対応する位置の数と同じではない。例えば、変異形が整列された参照配列に対して欠失を有する場合、欠失部位における参照配列中の位置に対応するアミノ酸が変異形中に存在しないであろう。整列された参照配列に挿入がある場合、その挿入は、参照配列内の番号付けされたアミノ酸位置に対応しない。切断または融合の場合、対応する配列中の任意のアミノ酸に対応しない参照配列または整列された配列のいずれかのアミノ酸の伸長が存在し得る。
【００９１】
所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈で使用される場合、「に関連する番号付け」または「に対応する」という用語は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較される場合、特定の参照配列の残基の番号付けを指す。
【００９２】
タンパク質中のアミノ酸残基は、それがタンパク質内で所与の残基と同じ必須構造位置を占めるときに、所与の残基に「対応する」。例えば、選択された残基が、ＰｙｌＲＳタンパク質中のＡｌａ３０２と同じ本質的な空間的関係または他の構造的関係を占める場合、選択されたタンパク質中の選択された残基は、ＰｙｌＲＳタンパク質のＡｌａ３０２に対応する。実施形態では、選択されたタンパク質が、ＰｙｌＲＳタンパク質で最大の相同性のために整列される場合、Ａｌａ３０２と整列する整列された選択されたタンパク質における位置は、Ａｌａ３０２に対応すると言われている。一次配列アラインメントの代わりに、例えば、選択されたタンパク質の構造が、ＰｙｌＲＳおよび比較される全体的構造と最大限に一致するように整列される場合、三次元構造アラインメントも使用され得る。この場合、構造モデルにおいてＡｌａ３０２と同じ必須位置を占めるアミノ酸は、Ａｌａ３０２残基に対応すると言われる。
【００９３】
「配列同一性パーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列した配列を比較することによって決定され、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置数を決定して、マッチした位置数を出し、そのマッチした位置数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【００９４】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「同一の」または「同一性」の割合という用語は、下記のデフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを使用するか、マニュアルアラインメントおよび目視検査によって測定されるように、同一であるか、または同一である特定のパーセンテージ（すなわち、比較ウィンドウまたは指定された領域に関して最大に対応するように比較およびアラインメントを行った場合に、特定の領域について、約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性）のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する、２つ以上の配列または部分配列を指す（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／等を参照）。次いで、そのような配列は、「実質的に同一」であると言われる。この定義はまた、試験配列の相補物を指すか、またはこれに適用することができる。定義はまた、欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有するものを含む。以下に説明するように、好ましいアルゴリズムは、ギャップ等を計算することができる。好ましくは、同一性は、少なくとも約２５アミノ酸長またはヌクレオチド長の領域にわたり、またより好ましくは５０〜１００アミノ酸長またはヌクレオチド長の領域にわたって存在する。
【００９５】
本明細書で使用される「生体分子」という用語は、例えば、タンパク質、炭水化物、脂質、および核酸などの大分子、ならびに例えば、一次代謝産物および二次代謝産物などの小分子を指す。態様では、生体分子という用語は、タンパク質を指す。態様では、生体分子という用語は、核酸を指す。態様では、生体分子という用語は、炭水化物を指す。
【００９６】
「生体分子部分」という用語は、生体分子を形成するペプチジル部分、炭水化物部分、脂質部分、または核酸部分を指す。
【００９７】
本明細書で使用される「ペプチジル部分」という用語は、生体分子または生体分子コンジュゲートの一部を形成し得るタンパク質、タンパク質断片、またはペプチドを指す。態様では、ペプチジル部分は、生体分子（例えば、タンパク質）の一部を形成する。態様では、ペプチジル部分は、生体分子（例えば、タンパク質）コンジュゲートの一部を形成する。ペプチジル部分はまた、追加の化学部分（例えば、追加のＲ置換基）で置換されてもよい。
【００９８】
本明細書で使用される「炭水化物部分」という用語は、炭水化物、例えば、生体分子または生体分子コンジュゲートの一部を形成し得る、ポリヒドロキシアルデヒド、ケトン、アルコール、酸、それらの単純誘導体、およびアセタール型の結合を有するそれらのポリマーを指す。態様では、炭水化物部分は、生体分子の一部を形成する。態様では、炭水化物部分は、生体分子コンジュゲートの一部を形成する。炭水化物部分はまた、追加の化学部分（例えば、追加のＲ置換基）で置換されてもよい。
【００９９】
本明細書で使用される「核酸部分」という用語は、例えば、生体分子または生体分子コンジュゲートの一部を形成し得るＤＮＡおよびＲＮＡを指す。態様では、核酸部分は、生体分子の一部を形成する。態様では、核酸部分は、生体分子コンジュゲートの一部を形成する。核酸部分はまた、追加の化学部分（例えば、追加のＲ置換基）で置換されてもよい。
【０１００】
「ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素」という用語は、ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素活性を有する酵素（その同族体、異性体、および機能的断片を含む）を指す。ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、α−アミノ酸ピロリジンを同族ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡｐｙｌ）に結合させるのに必要な反応を触媒するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素であり、それによってアンバー停止コドン（すなわち、ＵＡＧ）でのタンパク質産生中にピロリジンの組み込みを可能にする。この用語は、（例えば、野生型ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素と比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは１００％の活性の範囲内の）ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素活性を維持するピロリシル−ｔＲＮＡ、またはその変異形、同族体、もしくは異性体の任意の組み換えまたは天然に存在する形態を含む。態様では、変異形、同族体、または異性体は、天然に存在するピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素と比較して、配列全体または配列の一部（例えば、５０、１００、１５０、または２００の連続するアミノ酸部分）にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。態様では、ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号３に示される配列を含む。態様では、ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号３に示される配列である。
【０１０１】
「突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素」または「突然変異体ＰｙｌＲＳ」という用語は、配列番号３に示されるＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉｔピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素の野生型アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する、任意のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素を指す。態様では、「突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素」は、ｔＲＮＡｐｙｌへのフルオロサルフェート−Ｌ−チロシン（ＦＳＹ）の結合を触媒する任意のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素を指す。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１に示される配列を含む。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１に示される配列である。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号２に示される配列によってコードされる。態様では、「突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素」は、「ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素」と称され、当業者は、野生型配列番号３との比較に基づいて、ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素が突然変異体であるかどうかを容易に認識するであろう。
【０１０２】
「ｔＲＮＡＰｙｌ」および「
【化１２】
2021515561.tif 000014
」（すなわち、ｔＲＮＡ（上付き文字Ｐｙｌ）（下付き文字ＣＵＡ））という用語はいずれも、鎖内塩基対合を介して折り畳んで、特定のアミノ酸（例えば、ピロリジン、ＦＳＹ）を担持し、タンパク質合成中にｍＲＮＡ上のその対応するコドン（すなわち、ｔＲＮＡのアンチコドンに相補的なもの）に一致する特徴的なクローバーリーフ構造を形成する約５０〜約１００ヌクレオチドを含有する、一本鎖ＲＮＡ分子を指す。ｔＲＮＡＰｙｌでは、アンチコドンは、ＣＵＡである。アンチコドンＣＵＡは、アンバー停止コドンＵＡＧに相補的である。ｔＲＮＡＰｙｌの略語「Ｐｙｌ」は、ピロリジンを表し、ｔＲＮＡＰｙｌの「ＣＵＡ」は、そのアンチコドンＣＵＡを指す。態様では、ｔＲＮＡＰｙｌは、ＦＳＹに結合している。態様では、ｔＲＮＡＰｙｌは、約７０〜約９０ヌクレオチドを含有する一本鎖ＲＮＡ分子を指す。
【０１０３】
本明細書で使用される「基質結合部位」という用語は、基質と一時的な結合または相互作用を形成する酵素活性部位に位置する残基を指す。態様では、ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位は、アミノ酸基質と一時的な結合または相互作用を形成するピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素の活性部位に位置する残基を指す。態様では、ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位は、配列番号３のアミノ酸配列に示されるように、３０２位のアラニン、３０５位のロイシン、３０６位のチロシン、３０９位のロイシン、３２２位のイソロイシン、３４６位のアスパラギン、３４８位のシステイン、３８４位のチロシン、４０１位のバリン、および４１７位のトリプトファンのうちの１つ以上の残基を含む。
【０１０４】
「プラスミド」、「ベクター」、または「発現ベクター」という用語は、遺伝子の発現に必要な遺伝子および／または調節エレメントをコードする核酸分子を指す。プラスミドからの遺伝子の発現は、シスまたはトランスで生じ得る。遺伝子がシスで発現される場合、遺伝子および調節エレメントは、同じプラスミドによってコードされる。トランスにおける発現とは、遺伝子および調節エレメントが別個のプラスミドによってコードされる場合を指す。
【０１０５】
「複合体」という用語は、２つ以上の成分を含む組成物を指し、成分は一緒に結合して機能的単位を作製する。態様では、本明細書に記載の複合体は、本明細書に記載の突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素およびアミノ酸基質（例えば、ＦＳＹ）を含む。態様では、本明細書に記載の複合体は、本明細書に記載の突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素およびｔＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡＰｙｌ）を含む。態様では、本明細書に記載の複合体は、本明細書に記載の突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素、アミノ酸基質（例えば、ＦＳＹ）、およびｔＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡＰｙｌ）を含む。態様では、本明細書に記載の複合体は、本明細書に記載の突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素、アミノ酸基質（例えば、ＦＳＹ）、ＦＳＹを含有するポリペプチド、およびｔＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡＰｙｌ）からなる群から選択される少なくとも２つの成分を含む。
【０１０６】
「トランスフェクション」、「形質導入」、「トランスフェクトする」、または「形質導入する」という用語は、交換可能に使用することができ、核酸分子またはタンパク質を細胞に導入するプロセスとして定義される。核酸は、非ウイルスまたはウイルスベースの方法を使用して細胞に導入される。核酸分子は、完全なタンパク質またはその機能部分をコードする遺伝子配列であり得る。非ウイルス性トランスフェクション方法としては、核酸分子を細胞に導入するために、ウイルスＤＮＡまたはウイルス粒子を送達系として使用しない任意の適切なトランスフェクション方法が挙げられる。例示的な非ウイルストランスフェクション方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソームトランスフェクション、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショックによるトランスフェクション、マグネトフェクション、およびエレクトロポレーションが挙げられる。態様では、核酸分子は、当該技術分野で周知である標準手順に従って、エレクトロポレーションを使用して細胞内に導入される。ウイルスベースのトランスフェクション方法については、本明細書に記載の方法において、任意の有用なウイルスベクターを使用してもよい。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、およびアデノ関連ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。態様では、核酸分子は、当該技術分野で周知の標準手順に従って、レトロウイルスベクターを使用して細胞内に導入される。「トランスフェクション」または「形質導入」という用語はまた、タンパク質を外部環境から細胞に導入することを指す。典型的には、タンパク質の形質導入またはトランスフェクションは、対象となるタンパク質への細胞膜を交差させることができるペプチドまたはタンパク質の結合に依存する。例えば、Ｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：１−４およびＰｒｏｃｈｉａｎｔｚ（２００７）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：１１９−２０を参照されたい。
【０１０７】
「単離された」という用語は、核酸またはタンパク質に適用される場合、核酸またはタンパク質が、それが天然状態で会合する他の細胞成分を本質的に含まないことを示す。それは、例えば、均質な状態であってもよく、乾燥溶液または水溶液のいずれかであってもよい。純度および均質性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技法を使用して決定される。調製物中に存在する主要種であるタンパク質は、実質的に精製される。
【０１０８】
「接触させる」とは、その平易な通常の意味に従って使用され、少なくとも２つの異なる種（例えば、生体分子、生体分子部分、または細胞を含む化学化合物）が、反応、相互作用、または物理的に接触するのに十分近位になることを可能にするプロセスを指す。しかしながら、得られた反応産物は、添加された試薬間の反応から、または反応混合物中で産生され得る添加された試薬のうちの１つ以上からの中間体から直接産生され得る。
【０１０９】
「接触させる」という用語は、２つの種が反応、相互作用、または物理的に接触するのを可能にすることを含むことができ、２つの種は、本明細書に記載の生体分子および／または生体分子部分であり得る。態様では、接触させるとは、本明細書に記載の２つの生体分子部分が相互作用するのを可能にすることを含み、生体分子部分は、共有結合してコンジュゲートを形成する。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「バイオコンジュゲート反応性部分」および「バイオコンジュゲート反応性基」という用語は、バイオコンジュゲート反応性基の原子または分子間の会合の結果として、バイオコンジュゲート（例えば、共有結合性リンカー）を形成することができる部分または基を指す。会合は、直接的または間接的であり得る。例えば、本明細書に提供される第１のバイオコンジュゲート反応基（例えば、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、もしくは−マレイミド）と第２のバイオコンジュゲート反応基（例えば、スルフヒドリル、硫黄含有アミノ酸、アミン、アミノ酸を含有するアミン側鎖、もしくはカルボキシレート）との間のコンジュゲートは、例えば、共有結合またはリンカー（例えば、第２のリンカーの第１のリンカー）によって直接的であり得るか、あるいは例えば、非共有結合（例えば、静電相互作用（例えば、イオン結合、水素結合、ハロゲン結合）、ファンデルワールス相互作用（例えば、双極子、双極子誘起双極子、ロンドン分散）、環スタッキング（パイ効果）、疎水性相互作用等）によって間接的であり得る。態様では、求核置換（例えば、アシルハロゲン化物、活性エステルとのアミンおよびアルコールの反応）、求電子置換（例えば、エナミン反応）、ならびに炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子多重結合への付加（例えば、マイケル反応、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ付加）を含むがこれらに限定されない、バイオコンジュゲート化学（すなわち、２つのバイオコンジュゲート反応基の会合）を使用して、バイオコンジュゲートまたはバイオコンジュゲートリンカーが形成される。これらおよび他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６、およびＦｅｅｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．１９８，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８２において論じられている。態様では、第１のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、マレイミド部分）は、第２のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、スルフヒドリル）に共有結合している。態様では、第１のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、ハロアセチル部分）は、第２のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、スルフヒドリル）に共有結合している。態様では、第１のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、ピリジル部分）は、第２のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、スルフヒドリル）に共有結合している。態様では、第１のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分）は、第２のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、アミン）に共有結合している。態様では、第１のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、マレイミド部分）は、第２のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、スルフヒドリル）に��有結合している。態様では、第１のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、−スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分）は、第２のバイオコンジュゲート反応性基（例えば、アミン）に共有結合している。
【０１１１】
本明細書におけるバイオコンジュゲート化学に使用される有用なバイオコンジュゲート反応性部分としては、例えば、以下が挙げられる。（ａ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、および芳香族エステルを含むがこれらに限定されないカルボキシル基、およびそれらの様々な誘導体；（ｂ）エステル、エーテル、アルデヒド等に変換することができる、ヒドロキシル基；（ｃ）ハロゲン化物が後に、例えばアミン、カルボキシレートアニオン、チオールアニオン、カルバニオン、またはアルコキシドイオンなどの求核基で置換され得、それによってハロゲン原子の部位での新しい基の共有結合をもたらす、ハロアルキル基；（ｄ）例えば、マレイミドまたはマレイミド基などのＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応に関与することができる、ジエノフィル基；（ｅ）例えばイミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンまたはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を介して、またはグリニャール付加またはアルキルリチウム付加などの機序を介して、後続の誘導体化が可能になるようなアルデヒドまたはケトン基；（ｆ）例えば、スルホンアミドを形成するアミンとの後続反応のためのハロゲン化スルホニル基；（ｇ）ジスルフィドに変換することができるか、アシルハロゲン化物と反応することができるか、金などの金属に結合することができるか、またはマレイミドと反応することができる、チオール基；（ｈ）例えばアシル化、アルキル化、または酸化することができる、アミンまたはスルフヒドリル基（例えばシステイン中に存在する）；（ｉ）例えば、付加環化、アシル化、マイケル付加等を受けることができる、アルケン；（ｊ）例えば、アミンおよびヒドロキシル化合物と反応することができる、エポキシド；（ｋ）ホスホラミダイトおよび核酸合成に有用な他の標準的な官能基；（ｌ）金属酸化ケイ素結合；（ｍ）例えば、リン酸ジエステル結合を形成する反応性リン基（例えば、ホスフィン）への金属結合；（ｎ）銅触媒付加環化クリック化学を使用してアルキンに結合したアジド；（ｏ）ビオチンコンジュゲートは、アビジンまたはストレプトビジンと反応して、アビジン−ビオチン複合体またはストレプトアビジン−ビオチン複合体を形成することができる。
【０１１２】
バイオコンジュゲート反応性基は、それらが本明細書に記載のコンジュゲートの化学的安定性に関与しない、または干渉しないように選択することができる。あるいは、反応性官能基は、保護基の存在によって架橋反応に関与することから保護することができる。態様では、バイオコンジュゲートは、マレイミドなどの不飽和結合とスルフヒドリル基との反応から誘導される分子実体を含む。
【０１１３】
「フルオロサルフェート−Ｌ−チロシン」および「ＦＳＹ」という用語は、構造：
【化１３】
2021515561.tif 000015
を有する非天然アミノ酸を指す。ＦＳＹは、式：
【化１４】
2021515561.tif 000016
のアミノ酸側鎖を含む。
【０１１４】
「ＦＳＹ生体分子」という用語は、ＦＳＹ非天然アミノ酸および／またはそのアミノ酸側鎖を含む生体分子を指す。
【０１１５】
「生体分子コンジュゲート」という用語は、式：
【化１５】
2021515561.tif 000017
のバイオコンジュゲートリンカーを含む任意の生体分子を指す。
【０１１６】
「ＦＳＹタンパク質」という用語は、ＦＳＹ非天然アミノ酸および／またはそのアミノ酸側鎖を含むタンパク質を指す。
【０１１７】
「タンパク質コンジュゲート」という用語は、式：
【化１６】
2021515561.tif 000018
のバイオコンジュゲートリンカーを含む任意のタンパク質を指す。
【０１１８】
「硫黄−フッ化物交換反応」または「ＳｕＦＥｘ」という用語は、例えば、Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，５３（３６）：９３４０−９４４８（２０１４）、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１４０（１５）：４９９５−４９９９（２０１８）によって詳細に記載されるクリック化学のタイプを指し、本明細書の実施例に記載のとおりである。「近接により可能になる」ＳｕＦＥｘという用語は、反応性種が互いに近位にあるとき、すなわち、ＳｕＦＥｘ反応が生じるのに十分に空間的に近いときに生じる硫黄−フッ化物交換反応を指す。近接性は、単一の生体分子（例えば、タンパク質）内で、または２つの異なる生体分子（例えば、タンパク質）間で生じ得る。当業者は、反応性種が、反応（例えば、バイオコンジュゲート、式（Ａ）、（Ｂ）、もしくは（Ｃ）の部分、または式（Ｉ）、（ＩＩ）、もしくは（ＩＩＩ）のタンパク質を形成する、ＦＳＹとリジン、ヒスチジン、またはチロシンとの間の硫黄−フッ化物交換反応）が生じるのに十分に近位にあるかどうかを容易に決定することができる。
【０１１９】
「分子間リンカー」という用語は、２つの生体分子間の連結基を指す。例えば、式（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）の部分が分子間リンカーである場合、次いで、Ｒ１ペプチジル部分は、第１のタンパク質であり、Ｒ２のペプチジル部分は、第２のタンパク質であり、それにより第１のタンパク質および第２のタンパク質は、式（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）の部分を介して共有結合する。態様では、第１のタンパク質および第２のタンパク質は、例えば、同じアミノ酸配列を有する２つのタンパク質間で分子間リンカーを提供する、同じタンパク質であり得る。態様では、第１のタンパク質および第２のタンパク質は、例えば、ホルモンおよびホルモンの受容体などの２つの異なるタンパク質間に分子間リンカーを提供する、異なるタンパク質であり得る。
【０１２０】
「分子内リンカー」という用語は、生体分子内の連結基を指す。例えば、式（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）の部分が分子内リンカーである場合、Ｒ１のペプチジル部分およびＲ２のペプチジル部分は、同じタンパク質中にある。分子内リンカーを有する化合物は、分子内でコンジュゲートされた生体分子コンジュゲートまたは分子内でコンジュゲートされた生体分子タンパク質とも称され得る。
【０１２１】
生体分子および生体分子コンジュゲート
本明細書では、潜在的な生体反応性非天然アミノ酸と天然に存在するアミノ酸との相互作用を通じて形成される生体分子および生体分子コンジュゲートを提供する。潜在的な生体反応性非天然アミノ酸であるフルオロサルフェート−Ｌ−チロシン（ＦＳＹ）は、クリック化学反応（例えば、硫黄−フッ化物交換反応（ＳｕＦＥｘ））を受けることによって、近位標的アミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、チロシン）との共有結合の形成を促進する。例えば、ＦＳＹは、天然に存在するタンパク質中のアミノ酸に挿入されてもよく、または置き換えられてもよく、それによってタンパク質自体上に、またはそれが天然に相互作用するタンパク質上に、近位に位置付けられた標的アミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、チロシン）と共有結合を形成する能力をタンパク質に付与する。ＦＳＹは、少なくとも部分的に、その細胞に対して非毒性であることに起因して、インビトロおよびインビボ条件の両方でタンパク質間またはタンパク質内の共有結合の形成を促進するために使用され得る。したがって、潜在的な生体反応性非天然アミノ酸ＦＳＹは、生体分子（例えば、タンパク質、炭水化物、核酸）を共有結合して生体分子コンジュゲートを形成するのに有用である。態様では、潜在的な生体反応性非天然アミノ酸ＦＳＹは、単一の生体分子（例えば、タンパク質）内の生体分子部分（例えば、ペプチジル部分）を共有結合させるのに有用である。態様では、潜在的な生体反応性非天然アミノ酸ＦＳＹは、異なる生体分子中の生体分子部分（例えば、ペプチジル部分）を共有結合的に連結するのに有用である（例えば、２つのタンパク質を共有結合的に連結する）。
【０１２２】
本明細書に示されるように、ＦＳＹは、潜在的な生体反応性非天然アミノ酸として、前述の生体反応性非天然アミノ酸と比較して優れた化学機能性（すなわち、優れた特性）を示している。例えば、ＦＳＹは、細胞内で安定しており、非毒性であり、非反応性であるが、標的残基に対して近位に配置されると、細胞条件下で反応性になる。ＦＳＹは、生理学的条件下で、タンパク質内およびタンパク質間の近接により可能になるＳｕＦＥｘ反応を介して、優れた選択性でリジン、ヒスチジン、およびチロシンと特異的に反応することができる。細胞内で非毒性であり、２個以上のアミノ酸残基と反応することができる生体反応性の非天然アミノ酸は報告されていない。
【０１２３】
１つ以上の潜在的な生体反応性非天然アミノ酸を含む生体分子が、本明細書に提供される。態様では、生体分子は、タンパク質、核酸、または炭水化物である。態様では、生体分子は、タンパク質である。態様では、潜在的な生体反応性非天然アミノ酸は、式：
【化１７】
2021515561.tif 000019
を有するフルオロサルフェート−Ｌ−チロシン（ＦＳＹ）である。態様では、生体分子は、ＦＹＳ非天然アミノ酸を含むタンパク質である。態様では、生体分子は、式：
【化１８】
2021515561.tif 000020
で表されるＦＹＳアミノ酸側鎖を含むタンパク質である。態様では、タンパク質は、リジン、ヒスチジン、チロシン、またはそれらの２つ以上の組み合わせの近位にあるＦＳＹを含む。態様では、タンパク質は、リジンの近位にあるＦＳＹを含む。態様では、タンパク質は、ヒスチジンの近位にあるＦＳＹを含む。態様では、タンパク質は、チロシンの近位にあるＦＳＹを含む。態様では、「近位」とは、ＦＳＹおよびリジン、ヒスチジン、またはチロシンが、ＳｕＦＥｘ反応が正常に生じるために互いに十分に近接していることを意味する。態様では、「近位」とは、ＦＳＹが、リジン、ヒスチジン、またはチロシンの１〜２０アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近位」とは、ＦＳＹが、リジン、ヒスチジン、またはチロシンの１〜１５アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近位」とは、ＦＳＹが、リジン、ヒスチジン、またはチロシンの１〜１０アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近位」とは、ＦＳＹが、リジン、ヒスチジン、またはチロシンの１〜９アミノ酸以内にあることを意味する。態様では、「近位」とは、ＦＳＹが、リジン、ヒスチジン、またはチロシンの１〜８アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近位」とは、ＦＳＹが、リジン、ヒスチジン、またはチロシンの１〜７アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近位」とは、ＦＳＹが、リジン、ヒスチジン、またはチロシンの１〜６アミノ酸以内にあることを意味する。態様では、「近位」とは、ＦＳＹが、リジン、ヒスチジン、またはチロシンの１〜５アミノ酸以内にあることを意味する。態様では、「近位」とは、ＦＳＹが、リジン、ヒスチジン、またはチロシンの１〜４アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近位」とは、ＦＳＹが、リジン、ヒスチジン、またはチロシンの１〜３アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近位」とは、ＦＳＹが、リジン、ヒスチジン、またはチロシンの１〜２アミノ酸内にあることを意味する。態様では、「近位」とは、ＦＳＹが、リジン、ヒスチジン、またはチロシンに隣接していることを意味する。態様では、ＦＳＹおよびリジン、ヒスチジン、またはチロシンは、タンパク質のα鎖にある。態様では、ＦＳＹおよびリジン、ヒスチジン、またはチロシンは、タンパク質のβ鎖にある。態様では、タンパク質は、ホルモンである。態様では、タンパク質は、ホルモン受容体である。
【０１２４】
バイオコンジュゲートリンカーを介して第２の生体分子部分にコンジュゲートされた第１の生体分子部分を含む生体分子コンジュゲートが本明細書に提供され、バイオコンジュゲートリンカーは、式：
【化１９】
2021515561.tif 000021
を有する。態様では、第１の生体分子部分および第２の生体分子部分は、各々独立して、ペプチジル部分である。態様では、生体分子コンジュゲートは、タンパク質コンジュゲートである。態様では、生体分子コンジュゲートは、タンパク質コンジュゲートであり、バイオコンジュゲートリンカーは、分子内リンカーである。態様では、タンパク質コンジュゲートは、複数の分子内リンカーを含む。態様では、生体分子コンジュゲートは、タンパク質コンジュゲートであり、バイオコンジュゲートリンカーは、分子間リンカーである。態様では、タンパク質コンジュゲートは、複数の分子間リンカーを含む。態様では、タンパク質コンジュゲートは、分子内リンカーおよび分子間リンカーを含む。
【０１２５】
実施形態では、生体分子コンジュゲートは、式：Ｒ１−Ｌ１−Ａ−Ｘ１−Ｌ２−Ｒ２を有し、式中、Ａは、バイオコンジュゲートリンカーであり、Ｒ１は、第１の生体分子部分であり、Ｒ２は、第２の生体コンジュゲート部分であり、Ｌ１は、結合または第１の共有結合リンカーであり、Ｌ２は、第２の共有結合リンカーの結合であり、
Ｘ１は、−ＮＲ５−、−Ｏ−、−Ｓ−、または
【化２０】
2021515561.tif 000022
であり、環Ａは、置換もしくは非置換ヘテロアリーレンまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレンであり、Ａ中の窒素は、バイオコンジュゲートリンカーに結合している。Ｒ５は、水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。
【０１２６】
実施形態では、Ｌ１は、結合、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＮＲ３Ａ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ａ−、−ＮＲ３ＡＣ（Ｏ）−、−ＮＲ３ＡＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｂ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、または置換もしくは非置換ヘテロアリーレンである。実施形態では、Ｌ２は、結合、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＮＲ４Ａ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ａ−、−ＮＲ４ＡＣ（Ｏ）−、−ＮＲ４ＡＣ（Ｏ）ＮＲ４Ｂ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、または置換もしくは非置換ヘテロアリーレンである。Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、およびＲ４Ｂは、独立して、水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリーリル、または置換もしくは非置換ヘテロアリーリルである。
【０１２７】
実施形態では、Ｘ１は、−ＮＲ５−、−Ｏ−、−Ｓ−、または
【化２１】
2021515561.tif 000023
、であり、環Ａは、置換もしくは非置換ヘテロアリーレンまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレンである。態様では、Ｘ１は、−ＮＲ５である−。態様では、Ｘ１は、−Ｏ−である。態様では、Ｘ１は、−Ｓ−である。態様では、Ｘ１は、
【化２２】
2021515561.tif 000024
であり、環Ａは、置換もしくは非置換ヘテロアリーレンまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレンである。態様では、環Ａは、置換または非置換ヘテロアリーレンである。態様では、環Ａは、置換または非置換ヘテロシクロアルキレンである。態様では、環Ａは、非置換ヘテロアリーレンである。態様では、環Ａは、非置換ヘテロシクロアルキレンである。態様では、環Ａは、置換ヘテロシクロアルキレン（例えば、３〜８員、３〜６員、４〜６員、４〜５員、または５〜６員）である。態様では、環Ａは、非置換ヘテロシクロアルキレン（例えば、３〜８員、３〜６員、４〜６員、４〜５員、または５〜６員）である。態様では、環Ａは、置換もしくは非置換ヘテロアリーレン（例えば、５〜１０員、５〜９員、または５〜６員）である。態様では、環Ａは、置換ヘテロアリーレン（例えば、５〜１０員、５〜９員、または５〜６員）である。態様では、環Ａは、非置換ヘテロアリーレン（例えば、５〜１０員、５〜９員、または５〜６員）である。
【０１２８】
実施形態では、Ｒ５は、水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである。態様では、Ｒ５は、水素である。
【０１２９】
実施形態では、Ｒ５は、水素、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換アルキル、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換ヘテロアルキル、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換シクロアルキル、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換ヘテロシクロアルキル、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換アリール、あるいは置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換ヘテロアリールである。
【０１３０】
実施形態では、Ｒ５は、水素、置換もしくは非置換（例えば、Ｃ１〜Ｃ２０、Ｃ１〜Ｃ１０、Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、置換もしくは非置換（例えば、２〜２０員、２〜１０員、２〜５員）ヘテロアルキル、置換もしくは非置換（例えば、Ｃ３〜Ｃ８、Ｃ３〜Ｃ６、Ｃ３〜Ｃ５）シクロアルキル、置換もしくは非置換（例えば、３〜８員、３〜６員、３〜５員）ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０、Ｃ６〜Ｃ８、Ｃ６〜Ｃ５）アリール、または置換もしくは非置換（例えば、５〜１０員、５〜８員、５〜６員）ヘテロアリールである。
【０１３１】
実施形態では、Ｒ５は、水素、非置換（例えば、Ｃ１〜Ｃ２０、Ｃ１〜Ｃ１０、Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、非置換（例えば、２〜２０員、２〜１０員、２〜５員）ヘテロアルキル、非置換（例えば、Ｃ３〜Ｃ８、Ｃ３〜Ｃ６、Ｃ３〜Ｃ５）シクロアルキル、非置換（例えば、３〜８員、３〜６員、３〜５員）ヘテロシクロアルキル、非置換（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０、Ｃ６〜Ｃ８、Ｃ６〜Ｃ５）アリール、または非置換（例えば、５〜１０員、５〜８員、５〜６員）ヘテロアリールである。
【０１３２】
実施形態では、Ｌ１は、結合、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＮＲ３Ａ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ａ−、−ＮＲ３ＡＣ（Ｏ）−、−ＮＲ３ＡＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｂ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、または置換もしくは非置換ヘテロアリーレンである。
【０１３３】
実施形態では、Ｌ１は、結合、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＮＲ３Ａ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ａ−、−ＮＲ３ＡＣ（Ｏ）−、−ＮＲ３ＡＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｂ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、または置換もしくは非置換ヘテロアリーレンである。態様では、Ｌ１は、結合、置換もしくは非置換アルキレン、または置換もしくは非置換ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ１は、結合、非置換アルキレン、または非置換ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ１は、非置換アルキレンである。態様では、Ｌ１は、非置換ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ１は、結合である。
【０１３４】
実施形態では、Ｌ１は、−Ｏ−、−Ｓ−、Ｒ３２−置換または非置換Ｃ１〜Ｃ２アルキレン（例えば、Ｃ１もしくはＣ２）あるいはＲ３２−置換または非置換２員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ１は、Ｒ３２−置換または非置換アルキレン（例えば、Ｃ１〜Ｃ８アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、もしくはＣ１〜Ｃ４アルキレン）、Ｒ３２−置換または非置換ヘテロアルキレン（例えば、２〜８員ヘテロアルキレン、２〜６員ヘテロアルキレン、もしくは２〜４員ヘテロアルキレン）、Ｒ３２−置換または非置換シクロアルキレン（例えば、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキレン、もしくはＣ５〜Ｃ６シクロアルキレン）、Ｒ３２−置換または非置換ヘテロシクロアルキレン（例えば、３〜８員ヘテロシクロアルキレン、３〜６員ヘテロシクロアルキレン、もしくは５〜６員ヘテロシクロアルキレン）、Ｒ３２−置換または非置換アリーレン（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０アリーレン、Ｃ１０アリーレン、もしくはフェニレン）、あるいはＲ３２−置換または非置換ヘテロアリーレン（例えば、５〜１０員ヘテロアリーレン、５〜９員ヘテロアリール、もしくは５〜６員ヘテロアリーレン）である。態様では、Ｌ１は、独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、非置換Ｃ１〜Ｃ２アルキレン（例えば、Ｃ１もしくはＣ２）または非置換２員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ１は、独立して、非置換メチレンである。態様では、Ｌ１は、独立して、非置換エチレンである。態様では、Ｌ１は、置換２員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ１は、置換３員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ１は、置換４員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ１は、非置換２員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ１は、非置換３員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ１は、非置換４員ヘテロアルキレンである。
【０１３５】
Ｒ３２は、独立して、オキソ、ハロゲン、−ＣＸ３２３、−ＣＨＸ３２２、−ＣＨ２Ｘ３２、−ＯＣＸ３２３、−ＯＣＨ２Ｘ３２、−ＯＣＨＸ３２２、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＳＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＳＯ２Ｈ、−ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−Ｎ３、Ｒ３３−置換または非置換アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ８、Ｃ１〜Ｃ６、Ｃ１〜Ｃ４、もしくはＣ１〜Ｃ２）、Ｒ３３−置換または非置換ヘテロアルキル（例えば、２〜８員、２〜６員、４〜６員、２〜３員、もしくは４〜５員）、Ｒ３３−置換または非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ３〜Ｃ８、Ｃ３〜Ｃ６、Ｃ４〜Ｃ６、もしくはＣ５〜Ｃ６）、Ｒ３３−置換または非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３〜８員、３〜６員、４〜６員、４〜５員、もしくは５〜６員）、Ｒ３３−置換または非置換アリール（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０もしくはフェニル）、あるいはＲ３３−置換または非置換ヘテロアリール（例えば、５〜１０員、５〜９員、もしくは５〜６員）である。態様では、Ｒ３２は、独立して、オキソ、ハロゲン、−ＣＸ３２３、−ＣＨＸ３２２、−ＣＨ２Ｘ３２、−ＯＣＸ３２３、−ＯＣＨ２Ｘ３２、−ＯＣＨＸ３２２、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＳＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＳＯ２Ｈ、−ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−Ｎ３、非置換アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ８、Ｃ１〜Ｃ６、Ｃ１〜Ｃ４、もしくはＣ１〜Ｃ２）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２〜８員、２〜６員、４〜６員、２〜３員、もしくは４〜５員）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ３〜Ｃ８、Ｃ３〜Ｃ６、Ｃ４〜Ｃ６、もしくはＣ５〜Ｃ６）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３〜８員、３〜６員、４〜６員、４〜５員、もしくは５〜６員）、非置換アリール（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０もしくはフェニル）、または非置換ヘテロアリール（例えば、５〜１０員、５〜９員、もしくは５〜６員）である。Ｘ３２は、独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉである。
【０１３６】
実施形態では、Ｒ３２は、独立して、非置換メチルである。態様では、Ｒ３２は、独立して、非置換エチルである。
【０１３７】
Ｒ３３は、独立して、オキソ、ハロゲン、−ＣＸ３３３、−ＣＨＸ３３２、−ＣＨ２Ｘ３３、−ＯＣＸ３３３、−ＯＣＨ２Ｘ３３、−ＯＣＨＸ３３２、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＳＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＳＯ２Ｈ、−ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−Ｎ３、Ｒ３４−置換または非置換アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ８、Ｃ１〜Ｃ６、Ｃ１〜Ｃ４、もしくはＣ１〜Ｃ２）、Ｒ３４−置換または非置換ヘテロアルキル（例えば、２〜８員、２〜６員、４〜６員、２〜３員、もしくは４〜５員）、Ｒ３４−置換または非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ３〜Ｃ８、Ｃ３〜Ｃ６、Ｃ４〜Ｃ６、もしくはＣ５〜Ｃ６）、Ｒ３４−置換または非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３〜８員、３〜６員、４〜６員、４〜５員、もしくは５〜６員）、Ｒ３４−置換または非置換アリール（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０もしくはフェニル）、あるいはＲ３４−置換または非置換ヘテロアリール（例えば、５〜１０員、５〜９員、もしくは５〜６員）である。態様では、Ｒ３３は、独立して、オキソ、ハロゲン、−ＣＸ３３３、−ＣＨＸ３３２、−ＣＨ２Ｘ３３、−ＯＣＸ３３３、−ＯＣＨ２Ｘ３３、−ＯＣＨＸ３３２、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＳＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＳＯ２Ｈ、−ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−Ｎ３、非置換アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ８、Ｃ１〜Ｃ６、Ｃ１〜Ｃ４、もしくはＣ１〜Ｃ２）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２〜８員、２〜６員、４〜６員、２〜３員、もしくは４〜５員）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ３〜Ｃ８、Ｃ３〜Ｃ６、Ｃ４〜Ｃ６、もしくはＣ５〜Ｃ６）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３〜８員、３〜６員、４〜６員、４〜５員、もしくは５〜６員）、非置換アリール（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０もしくはフェニル）、または非置換ヘテロアリール（例えば、５〜１０員、５〜９員、もしくは５〜６員）である。Ｘ３３は、独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉである。
【０１３８】
実施形態では、Ｒ３３は、独立して、非置換メチルである。態様では、Ｒ３３は、独立して、非置換エチルである。
【０１３９】
態様では、Ｒ３４は、独立して、オキソ、ハロゲン、−ＣＸ３４３、−ＣＨＸ３４２、−ＣＨ２Ｘ３４、−ＯＣＸ３４３、−ＯＣＨ２Ｘ３４、−ＯＣＨＸ３４２、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＳＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＳＯ２Ｈ、−ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−Ｎ３、非置換アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ８、Ｃ１〜Ｃ６、Ｃ１〜Ｃ４、もしくはＣ１〜Ｃ２）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２〜８員、２〜６員、４〜６員、２〜３員、もしくは４〜５員）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ３〜Ｃ８、Ｃ３〜Ｃ６、Ｃ４〜Ｃ６、もしくはＣ５〜Ｃ６）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３〜８員、３〜６員、４〜６員、４〜５員、もしくは５〜６員）、非置換アリール（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０もしくはフェニル）、または非置換ヘテロアリール（例えば、５〜１０員、５〜９員、もしくは５〜６員）である。Ｘ３４は、独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉである。
【０１４０】
実施形態では、Ｒ３４は、独立して、非置換メチルである。態様では、Ｒ３４は、独立して、非置換エチルである。
【０１４１】
実施形態では、Ｒ３Ａは、水素、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、または置換もしくは非置換ヘテロアリーレンである。
【０１４２】
実施形態では、Ｒ３Ａは、水素、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換アルキル、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換ヘテロアルキル、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換シクロアルキル、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換ヘテロシクロアルキル、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換アリール、あるいは置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換ヘテロアリールである。
【０１４３】
実施形態では、Ｒ３Ａは、水素、置換もしくは非置換（例えば、Ｃ１〜Ｃ２０、Ｃ１〜Ｃ１０、Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、置換もしくは非置換（例えば、２〜２０員、２〜１０員、２〜５員）ヘテロアルキル、置換もしくは非置換（例えば、Ｃ３〜Ｃ８、Ｃ３〜Ｃ６、Ｃ３〜Ｃ５）シクロアルキル、置換もしくは非置換（例えば、３〜８員、３〜６員、３〜５員）ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０、Ｃ６〜Ｃ８、Ｃ６〜Ｃ５）アリール、または置換もしくは非置換（例えば、５〜１０員、５〜８員、５〜６員）ヘテロアリールである。
【０１４４】
実施形態では、Ｒ３Ａは、水素、非置換（例えば、Ｃ１〜Ｃ２０、Ｃ１〜Ｃ１０、Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、非置換（例えば、２〜２０員、２〜１０員、２〜５員）ヘテロアルキル、非置換（例えば、Ｃ３〜Ｃ８、Ｃ３〜Ｃ６、Ｃ３〜Ｃ５）シクロアルキル、非置換（例えば、３〜８員、３〜６員、３〜５員）ヘテロシクロアルキル、非置換（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０、Ｃ６〜Ｃ８、Ｃ６〜Ｃ５）アリール、または非置換（例えば、５〜１０員、５〜８員、５〜６員）ヘテロアリールである。
【０１４５】
実施形態では、Ｒ３Ｂは、水素、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、または置換もしくは非置換ヘテロアリーレンである。
【０１４６】
実施形態では、Ｒ３Ｂは、水素、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換アルキル、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換ヘテロアルキル、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換シクロアルキル、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換ヘテロシクロアルキル、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換アリール、あるいは置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換ヘテロアリールである。
【０１４７】
実施形態では、Ｒ３Ｂは、水素、置換もしくは非置換（例えば、Ｃ１〜Ｃ２０、Ｃ１〜Ｃ１０、Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、置換もしくは非置換（例えば、２〜２０員、２〜１０員、２〜５員）ヘテロアルキル、置換もしくは非置換（例えば、Ｃ３〜Ｃ８、Ｃ３〜Ｃ６、Ｃ３〜Ｃ５）シクロアルキル、置換もしくは非置換（例えば、３〜８員、３〜６員、３〜５員）ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０、Ｃ６〜Ｃ８、Ｃ６〜Ｃ５）アリール、または置換もしくは非置換（例えば、５〜１０員、５〜８員、５〜６員）ヘテロアリールである。
【０１４８】
実施形態では、Ｒ３Ｂは、水素、非置換（例えば、Ｃ１〜Ｃ２０、Ｃ１〜Ｃ１０、Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、非置換（例えば、２〜２０員、２〜１０員、２〜５員）ヘテロアルキル、非置換（例えば、Ｃ３〜Ｃ８、Ｃ３〜Ｃ６、Ｃ３〜Ｃ５）シクロアルキル、非置換（例えば、３〜８員、３〜６員、３〜５員）ヘテロシクロアルキル、非置換（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０、Ｃ６〜Ｃ８、Ｃ６〜Ｃ５）アリール、または非置換（例えば、５〜１０員、５〜８員、５〜６員）ヘテロアリールである。
【０１４９】
実施形態では、Ｌ２は、結合、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＮＲ４Ａ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ａ−、−ＮＲ４ＡＣ（Ｏ）−、−ＮＲ４ＡＣ（Ｏ）ＮＲ４Ｂ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、または置換もしくは非置換ヘテロアリーレンである。
【０１５０】
実施形態では、Ｌ２は、結合、置換もしくは非置換アルキレン、または置換もしくは非置換ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ２は、結合、非置換アルキレン、または非置換ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ２は、非置換アルキレンである。態様では、Ｌ２は、非置換ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ２は、結合である。
【０１５１】
実施形態では、Ｌ２は、−Ｏ−、−Ｓ−、Ｒ３５−置換または非置換Ｃ１〜Ｃ２アルキレン（例えば、Ｃ１もしくはＣ２）あるいはＲ３５−置換または非置換２員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ２は、Ｒ３５−置換または非置換アルキレン（例えば、Ｃ１〜Ｃ８アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、もしくはＣ１〜Ｃ４アルキレン）、Ｒ３５−置換または非置換ヘテロアルキレン（例えば、２〜８員ヘテロアルキレン、２〜６員ヘテロアルキレン、もしくは２〜４員ヘテロアルキレン）、Ｒ３５−置換または非置換シクロアルキレン（例えば、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキレン、もしくはＣ５〜Ｃ６シクロアルキレン）、Ｒ３５−置換または非置換ヘテロシクロアルキレン（例えば、３〜８員ヘテロシクロアルキレン、３〜６員ヘテロシクロアルキレン、もしくは５〜６員ヘテロシクロアルキレン）、Ｒ３５−置換または非置換アリーレン（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０アリーレン、Ｃ１０アリーレン、もしくはフェニレン）、あるいはＲ３５−置換または非置換ヘテロアリーレン（例えば、５〜１０員ヘテロアリーレン、５〜９員ヘテロアリーレン、もしくは５〜６員ヘテロアリーレン）である。態様では、Ｌ２は、−Ｏ−、−Ｓ−、非置換Ｃ１〜Ｃ２アルキレン（例えば、Ｃ１もしくはＣ２）または非置換２員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ２は、独立して、非置換メチレンである。態様では、Ｌ２は、独立して、非置換エチレンである。態様では、Ｌ２は、置換２員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ２は、置換３員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ２は、置換４員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ２は、非置換２員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ２は、非置換３員ヘテロアルキレンである。態様では、Ｌ２は、非置換４員ヘテロアルキレンである。
【０１５２】
Ｒ３５は、独立して、オキソ、ハロゲン、−ＣＸ３５３、−ＣＨＸ３５２、−ＣＨ２Ｘ３５、−ＯＣＸ３５３、−ＯＣＨ２Ｘ３５、−ＯＣＨＸ３５２、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＳＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＳＯ２Ｈ、−ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−Ｎ３、Ｒ３６−置換または非置換アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ８、Ｃ１〜Ｃ６、Ｃ１〜Ｃ４、もしくはＣ１〜Ｃ２）、Ｒ３６−置換または非置換ヘテロアルキル（例えば、２〜８員、２〜６員、４〜６員、２〜３員、もしくは４〜５員）、Ｒ３６−置換または非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ３〜Ｃ８、Ｃ３〜Ｃ６、Ｃ４〜Ｃ６、もしくはＣ５〜Ｃ６）、Ｒ３６−置換または非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３〜８員、３〜６員、４〜６員、４〜５員、もしくは５〜６員）、Ｒ３６−置換または非置換アリール（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０もしくはフェニル）、あるいはＲ３６−置換または非置換ヘテロアリール（例えば、５〜１０員、５〜９員、もしくは５〜６員）である。態様では、Ｒ３５は、独立して、オキソ、ハロゲン、−ＣＸ３５３、−ＣＨＸ３５２、−ＣＨ２Ｘ３５、−ＯＣＸ３５３、−ＯＣＨ２Ｘ３５、−ＯＣＨＸ３５２、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＳＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＳＯ２Ｈ、−ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−Ｎ３、非置換アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ８、Ｃ１〜Ｃ６、Ｃ１〜Ｃ４、もしくはＣ１〜Ｃ２）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２〜８員、２〜６員、４〜６員、２〜３員、もしくは４〜５員）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ３〜Ｃ８、Ｃ３〜Ｃ６、Ｃ４〜Ｃ６、もしくはＣ５〜Ｃ６）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３〜８員、３〜６員、４〜６員、４〜５員、もしくは５〜６員）、非置換アリール（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０もしくはフェニル）、または非置換ヘテロアリール（例えば、５〜１０員、５〜９員、もしくは５〜６員）である。Ｘ３５は、独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉである。
【０１５３】
実施形態では、Ｒ３５は、独立して、非置換メチルである。態様では、Ｒ３５は、独立して、非置換エチルである。
【０１５４】
Ｒ３６は、独立して、オキソ、ハロゲン、−ＣＸ３６３、−ＣＨＸ３６２、−ＣＨ２Ｘ３６、−ＯＣＸ３６３、−ＯＣＨ２Ｘ３６、−ＯＣＨＸ３６２、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＳＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＳＯ２Ｈ、−ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−Ｎ３、Ｒ３７−置換または非置換アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ８、Ｃ１〜Ｃ６、Ｃ１〜Ｃ４、もしくはＣ１〜Ｃ２）、Ｒ３７−置換または非置換ヘテロアルキル（例えば、２〜８員、２〜６員、４〜６員、２〜３員、もしくは４〜５員）、Ｒ３７−置換または非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ３〜Ｃ８、Ｃ３〜Ｃ６、Ｃ４〜Ｃ６、もしくはＣ５〜Ｃ６）、Ｒ３７−置換または非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３〜８員、３〜６員、４〜６員、４〜５員、もしくは５〜６員）、Ｒ３７−置換または非置換アリール（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０もしくはフェニル）、あるいはＲ３７−置換または非置換ヘテロアリール（例えば、５〜１０員、５〜９員、もしくは５〜６員）である。態様では、Ｒ３６は、独立して、オキソ、ハロゲン、−ＣＸ３６３、−ＣＨＸ３６２、−ＣＨ２Ｘ３６、−ＯＣＸ３６３、−ＯＣＨ２Ｘ３６、−ＯＣＨＸ３６２、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＳＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＳＯ２Ｈ、−ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−Ｎ３、非置換アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ８、Ｃ１〜Ｃ６、Ｃ１〜Ｃ４、もしくはＣ１〜Ｃ２）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２〜８員、２〜６員、４〜６員、２〜３員、もしくは４〜５員）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ３〜Ｃ８、Ｃ３〜Ｃ６、Ｃ４〜Ｃ６、もしくはＣ５〜Ｃ６）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３〜８員、３〜６員、４〜６員、４〜５員、もしくは５〜６員）、非置換アリール（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０もしくはフェニル）、または非置換ヘテロアリール（例えば、５〜１０員、５〜９員、もしくは５〜６員）である。Ｘ３６は、独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉである。
【０１５５】
実施形態では、Ｒ３６は、独立して、非置換メチルである。態様では、Ｒ３６は、独立して、非置換エチルである。
【０１５６】
態様では、Ｒ３７は、独立して、オキソ、ハロゲン、−ＣＸ３７３、−ＣＨＸ３７２、−ＣＨ２３７、−ＯＣＸ３７３、−ＯＣＨ２Ｘ３７、−ＯＣＨＸ３７２、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＳＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ４Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＳＯ２Ｈ、−ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−Ｎ３、非置換アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ８、Ｃ１〜Ｃ６、Ｃ１〜Ｃ４、もしくはＣ１〜Ｃ２）、非置換ヘテロアルキル（例えば、２〜８員、２〜６員、４〜６員、２〜３員、もしくは４〜５員）、非置換シクロアルキル（例えば、Ｃ３〜Ｃ８、Ｃ３〜Ｃ６、Ｃ４〜Ｃ６、もしくはＣ５〜Ｃ６）、非置換ヘテロシクロアルキル（例えば、３〜８員、３〜６員、４〜６員、４〜５員、もしくは５〜６員）、非置換アリール（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０もしくはフェニル）、または非置換ヘテロアリール（例えば、５〜１０員、５〜９員、もしくは５〜６員）である。Ｘ３７は、独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉである。
【０１５７】
実施形態では、Ｒ３７は、独立して、非置換メチルである。態様では、Ｒ３７は、独立して、非置換エチルである。
【０１５８】
実施形態では、Ｒ４Ａは、水素、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、または置換もしくは非置換ヘテロアリーレンである。
【０１５９】
実施形態では、Ｒ４Ａは、水素、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換アルキル、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換ヘテロアルキル、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換シクロアルキル、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換ヘテロシクロアルキル、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換アリール、あるいは置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換ヘテロアリールである。
【０１６０】
実施形態では、Ｒ４Ａは、水素、置換もしくは非置換（例えば、Ｃ１〜Ｃ２０、Ｃ１〜Ｃ１０、Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、置換もしくは非置換（例えば、２〜２０員、２〜１０員、２〜５員）ヘテロアルキル、置換もしくは非置換（例えば、Ｃ３〜Ｃ８、Ｃ３〜Ｃ６、Ｃ３〜Ｃ５）シクロアルキル、置換もしくは非置換（例えば、３〜８員、３〜６員、３〜５員）ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０、Ｃ６〜Ｃ８、Ｃ６〜Ｃ５）アリール、または置換もしくは非置換（例えば、５〜１０員、５〜８員、５〜６員）ヘテロアリールである。
【０１６１】
実施形態では、Ｒ４Ａは、水素、非置換（例えば、Ｃ１〜Ｃ２０、Ｃ１〜Ｃ１０、Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、非置換（例えば、２〜２０員、２〜１０員、２〜５員）ヘテロアルキル、非置換（例えば、Ｃ３〜Ｃ８、Ｃ３〜Ｃ６、Ｃ３〜Ｃ５）シクロアルキル、非置換（例えば、３〜８員、３〜６員、３〜５員）ヘテロシクロアルキル、非置換（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０、Ｃ６〜Ｃ８、Ｃ６〜Ｃ５）アリール、または非置換（例えば、５〜１０員、５〜８員、５〜６員）ヘテロアリールである。
【０１６２】
実施形態では、Ｒ４Ｂは、水素、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、または置換もしくは非置換ヘテロアリーレンである。
【０１６３】
実施形態では、Ｒ４Ｂは、水素、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換アルキル、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換ヘテロアルキル、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換シクロアルキル、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換ヘテロシクロアルキル、置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換アリール、あるいは置換（例えば、置換基（複数可）、サイズ制限置換基、もしくは低級置換基（複数可）で置換）または非置換ヘテロアリールである。
【０１６４】
実施形態では、Ｒ４Ｂは、水素、置換もしくは非置換（例えば、Ｃ１〜Ｃ２０、Ｃ１〜Ｃ１０、Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、置換もしくは非置換（例えば、２〜２０員、２〜１０員、２〜５員）ヘテロアルキル、置換もしくは非置換（例えば、Ｃ３〜Ｃ８、Ｃ３〜Ｃ６、Ｃ３〜Ｃ５）シクロアルキル、置換もしくは非置換（例えば、３〜８員、３〜６員、３〜５員）ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０、Ｃ６〜Ｃ８、Ｃ６〜Ｃ５）アリール、または置換もしくは非置換（例えば、５〜１０員、５〜８員、５〜６員）ヘテロアリールである。
【０１６５】
実施形態では、Ｒ４Ｂは、水素、非置換（例えば、Ｃ１〜Ｃ２０、Ｃ１〜Ｃ１０、Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、非置換（例えば、２〜２０員、２〜１０員、２〜５員）ヘテロアルキル、非置換（例えば、Ｃ３〜Ｃ８、Ｃ３〜Ｃ６、Ｃ３〜Ｃ５）シクロアルキル、非置換（例えば、３〜８員、３〜６員、３〜５員）ヘテロシクロアルキル、非置換（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０、Ｃ６〜Ｃ８、Ｃ６〜Ｃ５）アリール、または非置換（例えば、５〜１０員、５〜８員、５〜６員）ヘテロアリールである。
【０１６６】
実施形態では、Ｘ１は、イミダゾリレン、−ＮＨ−、または−Ｏ−である。態様では、Ｘ１は、イミダゾリレン（すなわち、二価イミダゾール）である。態様では、Ｘ１は、−ＮＨ−である。態様では、Ｘ１は、−Ｏ−である。
【０１６７】
実施形態では、第１の生体分子部分は、ペプチジル部分である。態様では、第２の生体分子部分は、ペプチジル部分である。態様では、第１の生体分子部分は、ペプチジル部分であり、第２の生体分子部分は、ペプチジル部分である。態様では、第１の生体分子部分および第２の生体分子部分のペプチジル部分は、同じタンパク質中にある。態様では、第１の生体分子部分および第２の生体分子部分のペプチジル部分は、異なるタンパク質中にある。
【０１６８】
実施形態では、−Ｌ１−Ｒ１は、ペプチジル部分である。実施形態では、−Ｌ２−Ｒ２は、ペプチジル部分である。態様では、−Ｌ１−Ｒ１および−Ｌ２−Ｒ２のペプチジル部分は、同じタンパク質中にある。態様では、−Ｌ１−Ｒ１および−Ｌ２−Ｒ２のペプチジル部分は、異なるタンパク質中にある。
【０１６９】
実施形態では、第１の生体分子部分は、核酸部分または炭水化物部分である。実施形態では、第１の生体分子部分は、核酸部分である。実施形態では、第１の生体分子部分は、炭水化物部分である。実施形態では、第２の生体分子部分は、核酸部分または炭水化物部分である。実施形態では、第２の生体分子部分は、核酸部分である。実施形態では、第２の生体分子部分は、炭水化物部分である。
【０１７０】
実施形態では、−Ｌ１−Ｒ１は、核酸部分または炭水化物部分である。態様では、−Ｌ１−Ｒ１は、核酸部分である。態様では、−Ｌ１−Ｒ１は、炭水化物部分である。態様では、−Ｌ２−Ｒ２は、核酸部分または炭水化物部分である。態様では、−Ｌ２−Ｒ２は、核酸部分である。態様では、−Ｌ２−Ｒ２は、炭水化物部分である。
【０１７１】
実施形態では、第１の生体分子部分は、ペプチジル部分、核酸部分、および炭水化物部分からなる群から選択される。態様では、第２の生体分子部分は、ペプチジル部分、核酸部分、および炭水化物部分からなる群から選択される。態様では、第１の生体分子部分は、第２の生体分子部分と同じである。態様では、第１の生体分子部分は、第２の生体分子部分とは異なる。態様では、第１の生体分子部分および第２の生体分子部分は、同じ生体分子内にある。態様では、第１の生体分子部分および第２の生体分子部分は、異なる生体分子内にある。態様では、第１の生体分子部分および第２の生体分子部分は、各々独立して、ペプチジル部分である。
【０１７２】
実施形態では、−Ｌ１−Ｒ１は、ペプチジル部分、核酸部分、および炭水化物部分からなる群から選択される。態様では、−Ｌ２−Ｒ２は、ペプチジル部分、核酸部分、および炭水化物部分からなる群から選択される。態様では、−Ｌ１−Ｒ１は、−Ｌ２−Ｒ２と同じである。態様では、−Ｌ１−Ｒ１は、−Ｌ２−Ｒ２とは異なる。態様では、−Ｌ１−Ｒ１および−Ｌ２−Ｒ２は、各々独立して、ペプチジル部分である。
【０１７３】
態様では、本開示は、式（Ａ）の部分、式（Ｂ）の部分、式（Ｃ）の部分、またはそれらの２つ以上の組み合わせを含むタンパク質を提供する。
【化２３】
2021515561.tif 000025
態様では、タンパク質は、式（Ａ）の部分を含む。態様では、タンパク質は、式（Ｂ）の部分を含む。態様では、タンパク質は、式（Ｃ）の部分を含む。態様では、タンパク質は、式（Ａ）の部分および式（Ｂ）の部分を含む。態様では、タンパク質は、式（Ａ）の部分および式（Ｃ）の部分を含む。態様では、タンパク質は、式（Ｂ）の部分および式（Ｃ）の部分を含む。態様では、タンパク質は、式（Ａ）の部分、式（Ｂ）の部分、および式（Ｃ）の部分を含む。態様では、式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、またはそれらの組み合わせの部分は、分子内共有結合を形成する。態様では、式（Ａ）の部分は、分子内共有結合を形成する。態様では、式（Ｂ）の部分は、分子内共有結合を形成する。態様では、式（Ｃ）の部分は、分子内共有結合を形成する。態様では、式（Ａ）および（Ｂ）の部分は、分子内共有結合を形成する。態様では、式（Ａ）および（Ｃ）の部分は、分子内共有結合を形成する。態様では、式（Ｂ）および（Ｃ）の部分は、分子内共有結合を形成する。態様では、式（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）の部分は、分子内共有結合を形成する。態様では、式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の部分、またはそれらの組み合わせは、分子間共有結合を形成する。態様では、式（Ａ）の部分は、分子間共有結合を形成する。態様では、式（Ｂ）の部分は、分子間共有結合を形成する。態様では、式（Ｃ）の部分は、分子間共有結合を形成する。態様では、式（Ａ）および（Ｂ）の部分は、分子間共有結合を形成する。態様では、式（Ａ）および（Ｃ）の部分は、分子間共有結合を形成する。態様では、式（Ｂ）および（Ｃ）の部分は、分子間共有結合を形成する。態様では、式（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）の部分は、分子間共有結合を形成する。
【０１７４】
態様では、本開示は、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、または式（ＩＩＩ）：
【化２４】
2021515561.tif 000026
のタンパク質を提供し、
式中、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、一緒に結合されるペプチジル部分であり、すなわち、式（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）のタンパク質は、分子内共有結合を含む。態様では、タンパク質は、式（Ｉ）である。態様では、タンパク質は、式（ＩＩ）である。態様では、タンパク質は、式（ＩＩＩ）である。態様では、Ｒ１のペプチジル部分およびＲ２のペプチジル部分は、タンパク質α鎖を含む。態様では、Ｒ１のペプチジル部分およびＲ２のペプチジル部分は、タンパク質β鎖を含む。態様では、Ｒ１のペプチジル部分は、タンパク質α鎖を含み、Ｒ２のペプチジル部分は、タンパク質β鎖を含む。態様では、Ｒ１のペプチジル部分は、タンパク質β鎖を含み、Ｒ２のペプチジル部分は、タンパク質α鎖を含む。
【０１７５】
態様では、本開示は、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、または式（ＩＩＩ）：
【化２５】
2021515561.tif 000027
のタンパク質を提供し、
式中、Ｒ１は、第１のタンパク質のペプチジル部分であり、Ｒ２は、第２のタンパク質のペプチジル部分であり、すなわち、２つのタンパク質間に分子間共有結合が存在する。態様では、分子間結合は、２つの異なるタンパク質の間にある。態様では、分子間結合は、同じタンパク質（例えば、分子間結合されている同じアミノ酸配列を有する２つのタンパク質）のうちの２つの間にある。態様では、第１のタンパク質は、式（Ａ）の部分を介して第２のタンパク質に共有結合して、式（Ｉ）の分子間結合タンパク質を形成する。態様では、第１のタンパク質は、式（Ｂ）の部分を介して第２のタンパク質に共有結合して、式（ＩＩ）の分子間結合タンパク質を形成する。態様では、第１のタンパク質は、式（Ｃ）の部分を介して第２のタンパク質に共有結合して、式（ＩＩＩ）の分子間結合タンパク質を形成する。態様では、第１のタンパク質は、式（Ａ）の部分および式（Ａ）の部分を介して第２のタンパク質に共有結合している。態様では、第１のタンパク質は、式（Ａ）の部分および式（Ｃ）の部分を介して第２のタンパク質に共有結合している。態様では、第１のタンパク質は、式（Ｂ）の部分および式（Ｃ）の部分を介して第２のタンパク質に共有結合している。態様では、第１のタンパク質は、式（Ａ）の部分、式（Ｂ）の部分、および式（Ｃ）の部分を介して第２のタンパク質に共有結合している。態様では、第１のタンパク質は、ホルモンであり、第２のタンパク質は、ホルモンの受容体である。態様では、ペプチジル部分Ｒ１およびＲ２は、タンパク質α鎖を含む。態様では、ペプチジル部分Ｒ１およびＲ２は、タンパク質β鎖を含む。態様では、ペプチジル部分Ｒ１は、タンパク質α鎖を含み、ペプチジル部分Ｒ２は、タンパク質β鎖を含む。態様では、ペプチジル部分Ｒ１は、タンパク質β鎖を含み、ペプチジル部分Ｒ２は、タンパク質α鎖を含む。
【０１７６】
態様では、タンパク質コンジュゲートは、３つ以上の異なるおよび／または別個のタンパク質を含んでもよい。例えば、第１のタンパク質は、式（Ａ）の部分、式（Ｂ）の部分、式（Ｃ）の部分、またはそれらの２つ以上の組み合わせを介して第２のタンパク質に共有結合し、第２のタンパク質は、式（Ａ）の部分、式（Ｂ）の部分、式（Ｃ）の部分、またはそれらの２つ以上の組み合わせを介して第３のタンパク質に共有結合する。別の例として、第１のタンパク質は、式（Ａ）の部分、式（Ｂ）の部分、式（Ｃ）の部分、またはそれらの２つ以上の組み合わせを介して第２のタンパク質に共有結合し、第１のタンパク質はまた、式（Ａ）の部分、式（Ｂ）の部分、式（Ｃ）の部分、またはそれらの２つ以上の組み合わせを介して第３のタンパク質に共有結合する。これらの態様の各々では、第１のタンパク質、第２のタンパク質、および第３のタンパク質は各々、任意に、式（Ａ）の部分、式（Ｂ）の部分、式（Ｃ）の部分、またはそれらの２つ以上の組み合わせをさらに含んでよく、Ｒ１およびＲ２のペプチジル部分は、それぞれ、第１のタンパク質、第２のタンパク質、または第３のタンパク質内に分子内結合を形成する。
【０１７７】
ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素
本明細書に記載のように、非天然アミノ酸（例えば、ＦＳＹ）は、生体分子（例えば、タンパク質）中の天然に存在するアミノ酸に挿入されてもよく、または置き換えられてもよい。非天然アミノ酸を生体分子（例えば、タンパク質）中のアミノ酸に挿入するか、または置き換えるためには、タンパク質生成中に組み込むことができる必要がある。したがって、非天然アミノ酸は、翻訳に使用することができるように、転移ＲＮＡ分子（ｔＲＮＡ）上に存在しなければならない。アミノ酸の負荷は、適切なアミノ酸の、ｔＲＮＡ分子への結合を促進する酵素である、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を介して発生する。しかしながら、ｔＲＮＡへの非天然アミノ酸の結合は、必ずしも天然に存在するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によって達成されるとは限らない場合がある。操作されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（例えば、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙＩＲＳ））は、非天然アミノ酸をｔＲＮＡに結合させるのに有用であり得る。ＰｙＩＲＳ突然変異体ライブラリを生成した。前述のＰｙＩＲＳ突然変異体ライブラリと比較して、本明細書で生成されたＰｙＩＲＳ突然変異体ライブラリは、より多くのアミノ酸残基（例えば、１０個のアミノ酸残基）を同時に突然変異させることを可能にする新しい小知能突然変異誘発アプローチを使用して構築された。選択され、スクリーニングされた合計２．７６×１０７個のクローンのうち、ＦＳＹを結合することができる１つのＰｙＩＲＳ突然変異体（６個のクローン内）が同定された（例えば、実施例１を参照）。
【０１７８】
本開示は、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位内の少なくとも５個のアミノ酸残基置換を含む、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素を提供する。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも５個のアミノ酸残基置換を含む。態様では、基質結合部位は、配列番号３のアミノ酸配列に示されるように、３０２位のアラニン、３０５位のロイシン、３０６位のチロシン、３０９位のロイシン、３２２位のイソロイシン、３４６位のアスパラギン、３４８位のシステイン、３８４位のチロシン、４０１位のバリン、および４１７位のトリプトファンを含む。態様では、少なくとも５個のアミノ酸残基置換は、配列番号３のアミノ酸配列に示されるように、３０２位のアラニンの置換、３４６位のアスパラギンの置換、３４８位のシステインの置換、３８４位のチロシンの置換、および４１７位のトリプトファンの置換である。態様では、少なくとも５個のアミノ酸残基置換は、配列番号３のアミノ酸配列に示されるように、３０２位のアラニンに対するイソロイシン、３４６位のアスパラギンに対するトレオニン、３４８位のシステインに対するイソロイシン、３８４位のチロシンに対するロイシン、および４１７位のトリプトファンに対するリジンである。
【０１７９】
実施形態では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を有する。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１８０】
実施形態では、突然変異ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号２の核酸配列によってコードされる。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号２の配列を含む核酸配列によってコードされる。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性である核酸配列によってコードされる。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号２に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号２に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１８１】
ベクター
本明細書に提供される組成物（例えば、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素、ｔＲＮＡＰｙｌ）は、当該技術分野において周知の方法を使用して細胞に送達され得ることが企図される。したがって、態様では、本明細書に記載の突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸配列を含むベクターであって、その実施形態を含む、ベクターが提供される。態様では、ベクターは、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位内に少なくとも５個のアミノ酸残基置換を含む、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは、ｔＲＮＡＰｙｌをコードする核酸配列をさらに含む。態様では、ベクターは、配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも５個のアミノ酸残基置換を含む突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは、ｔＲＮＡＰｙｌをコードする核酸配列をさらに含む。態様では、ベクターは、配列番号３のアミノ酸配列に示されるように、３０２位の残基アラニン、３０５位のロイシン、３０６位のチロシン、３０９位のロイシン、３２２位のイソロイシン、３４６位のアスパラギン、３４８位のシステイン、３８４位のチロシン、４０１位のバリン、および４１７位のトリプトファンのアミノ酸置換を含む、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは、ｔＲＮＡＰｙｌをコードする核酸配列をさらに含む。態様では、ベクターは、配列番号３のアミノ酸配列に示されるように、３０２位のアラニンのアミノ酸置換、３４６位のアスパラギンの置換、３４８位のシステインの置換、３８４位のチロシンの置換、および４１７位のトリプトファンの置換を含む、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは、ｔＲＮＡＰｙｌをコードする核酸配列をさらに含む。態様では、ベクターは、配列番号３のアミノ酸配列に示されるように、３０２位のアラニンに対する残基イソロイシン、３４６位のアスパラギンに対するトレオニン、３４８位のシステインに対するイソロイシン、３８４位のチロシンに対するロイシン、および４１７位のトリプトファンに対するリジンのアミノ酸置換を含む、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸配列を含む。態様では、ベクターは、ｔＲＮＡＰｙｌをコードする核酸配列をさらに含む。
【０１８２】
実施形態では、ｔＲＮＡＰｙｌをコードする核酸配列は、配列番号４に示される配列である。態様では、ｔＲＮＡＰｙｌをコードする核酸配列は、配列番号４に示される配列を含む。態様では、ｔＲＮＡＰｙｌをコードする核酸配列は、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を有する。態様では、ｔＲＮＡＰｙｌをコードする核酸配列は、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有する。態様では、ｔＲＮＡＰｙｌをコードする核酸配列は、配列番号４に対して少なくとも８５％の同一性を有する配列を有する。態様では、ｔＲＮＡＰｙｌをコードする核酸配列は、配列番号４に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を有する。態様では、ｔＲＮＡＰｙｌをコードする核酸配列は、配列番号４に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を有する。態様では、ｔＲＮＡＰｙｌをコードする核酸配列は、配列番号４に対して少なくとも９８％の同一性を有する配列を有する。
【０１８３】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが結合している別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。１つのタイプのベクターは、「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる直鎖または環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノムにライゲーションされ得る。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作用可能に結合している遺伝子の発現を誘導することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。一般に、組み換えＤＮＡ技法において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。「プラスミド」および「ベクター」という用語は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるため、交換可能に使用することができる。しかしながら、本開示は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス）などの、そのような他の形態の発現ベクターを含むことを意図する。加えて、いくつかのウイルスベクターは、特定の細胞型を特異的または非特異的に標的化することができる。使用され得る例示的なベクターとしては、ｐＥｖｏｌベクター、ｐＭＰベクター、ｐＥＴベクター、ｐＴａｋベクター、ｐＢａｄベクターが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、実施例１を参照）。
【０１８４】
複合体
態様では、本明細書に記載の突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素（その実施形態を含む）、および以下の式：
【化２６】
2021515561.tif 000028
を有するフルオロサルフェート−Ｌ−チロシン（ＦＳＹ）を含む複合体が提供される。
【０１８５】
態様では、複合体は、配列番号３のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位内に少なくとも５個のアミノ酸残基置換を含む、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素を含む。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号３のアミノ酸配列に示されるように、３０２位の残基アラニン、３０５位のロイシン、３０６位のチロシン、３０９位のロイシン、３２２位のイソロイシン、３４６位のアスパラギン、３４８位のシステイン、３８４位のチロシン、４０１位のバリン、および４１７位のトリプトファンにおける基質結合部位内にアミノ酸残基置換を含む。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号３のアミノ酸配列に示されるように、３０２位の残基アラニンにおける置換結合部位内のアミノ酸残基置換、３４６位のアスパラギンの置換、３４８位のシステインの置換、３８４位のチロシンの置換、および４１７位のトリプトファンの置換を含む。態様では、少なくとも５個のアミノ酸残基置換は、配列番号３のアミノ酸配列に示されるように、３０２位のアラニンに対するイソロイシン、３４６位のアスパラギンに対するトレオニン、３４８位のシステインに対するイソロイシン、３８４位のチロシンに対するロイシン、および４１７位のトリプトファンに対するリジンである。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【０１８６】
実施形態では、複合体は、本明細書に記載される突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素（その実施形態を含む）、フルオロサルフェート−Ｌ−チロシン（ＦＳＹ）、および本明細書に記載されるｔＲＮＡＰｙｌ（その実施形態を含む）を含む。態様では、ｔＲＮＡＰｙｌは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。態様では、ｔＲＮＡＰｙｌは、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。態様では、ｔＲＮＡＰｙｌは、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。態様では、ｔＲＮＡＰｙｌは、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。態様では、ｔＲＮＡＰｙｌは、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【０１８７】
細胞組成物
本開示は、その実施形態を含む、本明細書に提供される組成物および複合体を含む細胞を提供する。したがって、態様では、以下の式：
【化２７】
2021515561.tif 000029
を有するフルオロサルフェート−Ｌ−チロシン（ＦＳＹ）を含む細胞が提供される。
【０１８８】
実施形態では、細胞は、その態様を含む、本明細書に記載の突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素をさらに含む。態様では、細胞は、その態様を含む、本明細書に記載のベクターをさらに含む。態様では、細胞は、ｔＲＮＡＰｙｌをさらに含む。
【０１８９】
実施形態では、ＦＳＹは、細胞内で生合成され、それによってＦＳＹを含有する細胞を生成する。態様では、ＦＳＹは、細胞の外側の培地に含有され、細胞内に浸透し、それによってＦＳＹを含有する細胞を生成する。態様では、細胞は、ＦＳＹ生体分子を含む。態様では、細胞は、ＦＳＹタンパク質を含む。態様では、細胞は、細胞内で合成されるＦＳＹ生体分子を含む。態様では、細胞は、細胞内で合成されるＦＳＹタンパク質を含む。態様では、細胞は、細胞の外側で合成され、細胞内に浸透するＦＳＹ生体分子を含む。態様では、細胞は、細胞の外側で合成され、細胞内に浸透するＦＳＹタンパク質を含む。
【０１９０】
実施形態では、細胞は、本明細書に記載の生体分子コンジュゲートを含む。態様では、細胞は、バイオコンジュゲートリンカーを介して第２の生体分子部分にコンジュゲートされた第１の生体分子部分を含む生体分子コンジュゲートを含み、バイオコンジュゲートリンカーは、式：
【化２８】
2021515561.tif 000030
を有する。態様では、細胞は、式Ｒ１−Ｌ１−Ａ−Ｘ１−Ｌ２−Ｒ２の生体分子コンジュゲートを含み、置換基は、本明細書に定義されるとおりである。態様では、第１および第２の生体分子部分は、各々独立して、ペプチジル部分、核酸部分、または炭水化物部分である。態様では、第１および第２の生体分子部分は各々、同じタンパク質内のペプチジル部分である。態様では、第１および第２の生体分子部分は各々、異なるタンパク質内のペプチジル部分である。
【０１９１】
実施形態では、細胞は、式（Ａ）の部分、式（Ｂ）の部分、式（Ｃ）の部分、またはそれらの２つ以上の組み合わせを含むタンパク質を含む。
【化２９】
2021515561.tif 000031
態様では、式（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）の部分は、タンパク質内に分子内共有結合を形成する。態様では、式（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）の部分は、２つのタンパク質間で分子間共有結合を形成する。
【０１９２】
実施形態では、細胞は、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、または式（ＩＩＩ）：
【化３０】
2021515561.tif 000032
のタンパク質を含み、
式中、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、ペプチジル部分である。態様では、Ｒ１およびＲ２は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）のタンパク質が分子内結合を含むように、一緒に結合される。態様では、Ｒ１およびＲ２は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）のタンパク質が２つのタンパク質間の分子間結合を含むように、２つの異なるタンパク質中のペプチジル部分である。
【０１９３】
細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、本明細書に記載される組成物のうちのいずれかは、Ｅ．ｃｏｌｉ、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞（例えば、Ｈｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）などの細菌細胞内で発現することができる。態様では、細胞は、細菌細胞である。態様では、細胞は、早期哺乳類細胞、すなわち、多能性幹細胞であり得る。態様では、細胞は、他のヒト組織に由来し得る。態様では、細胞は、哺乳類細胞である。他の好適な細胞は、当業者に既知である。
【０１９４】
生体分子または生体分子コンジュゲートを形成する方法
本明細書で提供される組成物は、生体分子または生体分子コンジュゲートを形成するのに有用である。したがって、態様では、生体分子、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素、ｔＲＮＡＰｙｌ、および式：
【化３１】
2021515561.tif 000033
を有するフルオロサルフェート−Ｌ−チロシン（ＦＳＹ）に接触し、それによってＦＳＹ生体分子、すなわちＦＳＹの非天然アミノ酸を含む生体分子を産生することによってＦＳＹ生体分子を形成する方法が提供される。この方法によって産生される生体分子は、式：
【化３２】
2021515561.tif 000034
の非天然アミノ酸側鎖を含むであろう。生体分子を産生する方法で使用される突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、本明細書に記載のいずれかである。生体分子を産生する方法で使用されるｔＲＮＡＰｙｌは、本明細書に記載のいずれかである。態様では、生体分子は、タンパク質である。態様では、生体分子は、核酸である。態様では、生体分子は、炭水化物である。態様では、反応は、インビトロで行われる。態様では、反応は、インビボで行われる。態様では、反応は、１つ以上の生細胞中で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生細菌細胞中で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生哺乳類細胞中で行われる。
【０１９５】
実施形態では、本開示は、タンパク質、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素、ｔＲＮＡＰｙｌ、および式：
【化３３】
2021515561.tif 000035
を有するフルオロサルフェート−Ｌ−チロシン（ＦＳＹ）に接触し、それによってＦＳＹタンパク質、すなわちＦＳＹの非天然アミノ酸を含むタンパク質を産生することによってＦＳＹタンパク質を産生するための方法を提供する。この方法によって産生されるタンパク質は、式：
【化３４】
2021515561.tif 000036
の非天然アミノ酸側鎖を含むであろう。タンパク質を産生する方法で使用される突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、本明細書に記載のいずれかである。タンパク質を産生する方法に使用されるｔＲＮＡＰｙｌは、本明細書に記載のいずれかである。態様では、ＦＳＹタンパク質は、リジン、ヒスチジン、チロシン、またはそれらの２つ以上をさらに含む。態様では、ＦＳＹタンパク質は、リジン、ヒスチジン、チロシン、またはそれらの２つ以上の近位にあるＦＳＹを含む。態様では、ＦＳＹタンパク質は、リジンの近位にあるＦＳＹを含む。態様では、ＦＳＹタンパク質は、ヒスチジンの近位にあるＦＳＹを含む。態様では、ＦＳＹタンパク質は、チロシンの近位にあるＦＳＹを含む。「近位」という用語は、本明細書に記載される。態様では、反応は、インビトロで行われる。態様では、反応は、インビボで行われる。態様では、反応は、１つ以上の生細胞中で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生細菌細胞中で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生哺乳類細胞中で行われる。
【０１９６】
実施形態では、本開示は、１つ以上の分子内共有結合（例えばタンパク質コンジュゲート）を含むタンパク質を提供する。態様では、ＦＳＹおよび近位のリジン、ヒスチジン、またはチロシンは、分子内共有結合を形成するための反応を受け、式（Ａ）の部分、式（Ｂ）の部分、式（Ｃ）の部分、またはそれらの２つ以上の組み合わせをもたらす。
【化３５】
2021515561.tif 000037
ＦＳＹおよびそれの近位にあるリジン、ヒスチジン、またはチロシンは、タンパク質のα鎖および／またはタンパク質のβ鎖上にあり得る。態様では、ＦＳＹとリジン、ヒスチジン、またはチロシンとの間の分子内共有結合を形成する反応は、クリック化学を介して達成される。態様では、ＦＳＹとリジン、ヒスチジン、またはチロシンとの間の分子内共有結合を形成する反応は、近接により可能になるクリック化学を介して達成される。態様では、ＦＳＹとリジン、ヒスチジン、またはチロシンとの間の分子内共有結合を形成する反応は、硫黄−フッ化物交換反応を介して達成される。態様では、ＦＳＹとリジン、ヒスチジン、またはチロシンとの間の分子内共有結合を形成する反応は、近接により可能になる硫黄−フッ化物交換反応を介して達成される。態様では、反応は、インビトロで行われる。態様では、反応は、インビボで行われる。態様では、反応は、１つ以上の生細胞中で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生細菌細胞中で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生哺乳類細胞中で行われる。
【０１９７】
実施形態では、本開示は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）のタンパク質コンジュゲートを提供し、式中、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、ペプチジル部分である：
【化３６】
2021515561.tif 000038
態様では、Ｒ１およびＲ２は、一緒に結合されて、分子内共役タンパク質を形成する。態様では、Ｒ１およびＲ２は、一緒に結合されない。態様では、タンパク質コンジュゲートを形成する反応は、クリック化学を介して達成される。態様では、タンパク質コンジュゲートを形成する反応は、近接により可能になるクリック化学を介して達成される。態様では、タンパク質コンジュゲートを形成する反応は、硫黄−フッ化物交換反応を介して達成される。態様では、タンパク質コンジュゲートを形成する反応は、近接により可能になる硫黄−フッ化物交換反応を介して達成される。態様では、反応は、インビトロで行われる。態様では、反応は、インビボで行われる。態様では、反応は、１つ以上の生細胞中で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生細菌細胞中で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生哺乳類細胞中で行われる。
【０１９８】
実施形態では、２つ以上のタンパク質は、本明細書に記載の方法および組成物によって共有結合され得る。態様では、ＦＳＹは、第１のタンパク質中の非天然アミノ酸であり、リジン、ヒスチジン、またはチロシンは、第２のタンパク質中のアミノ酸であり、第１のタンパク質および第２のタンパク質は異なる。第１のタンパク質中のＦＳＹは、第２のタンパク質中のリジン、ヒスチジン、またはチロシンとの反応を経て、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の分子間共有結合を形成する。２つのタンパク質を連結する分子間共有結合は、式（Ａ）の部分、式（Ｂ）の部分、式（Ｃ）の部分、またはそれらの２つ以上の組み合わせで表される：
【化３７】
2021515561.tif 000039
ＦＳＹおよびリジン、ヒスチジン、またはチロシンは、それぞれのタンパク質のα鎖および／またはそれぞれのタンパク質のβ鎖上にあり得る。態様では、第１のタンパク質中のＦＳＹと第２のタンパク質中のリジン、ヒスチジン、またはチロシンとの間の分子間共有結合を形成する反応は、クリック化学を介して達成される。態様では、第１のタンパク質中のＦＳＹと第２のタンパク質中のリジン、ヒスチジン、またはチロシンとの間に分子間共有結合を形成する反応は、近接により可能になるクリック化学を介して達成される。態様では、第１のタンパク質中のＦＳＹと第２のタンパク質中のリジン、ヒスチジン、またはチロシンとの間の分子間共有結合を形成する反応は、硫黄−フッ化物交換を介して達成される。態様では、第１のタンパク質中のＦＳＹと第２のタンパク質中のリジン、ヒスチジン、またはチロシンとの間の分子間共有結合を形成する反応は、近接により可能になる硫黄−フッ化物交換を介して達成される。態様では、反応は、インビトロで行われる。態様では、反応は、インビボで行われる。態様では、反応は、１つ以上の生細胞中で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生細菌細胞中で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生哺乳類細胞中で行われる。
【０１９９】
実施形態では、本開示は、バイオコンジュゲートリンカーを介して第２の生体分子部分にコンジュゲートされた第１の生体分子部分を含む生体分子コンジュゲートを提供し、バイオコンジュゲートリンカーは、式：
【化３８】
2021515561.tif 000040
を有する。態様では、生体分子コンジュゲートは、式Ｒ１−Ｌ１−Ａ−Ｘ１−Ｌ２−Ｒ２を有し、置換基は、本明細書に定義されるとおりである。態様では、生体分子コンジュゲートを形成する反応は、クリック化学を介して達成される。態様では、生体分子コンジュゲートを形成する反応は、近接により可能になるクリック化学を介して達成される。態様では、生体分子コンジュゲートを形成する反応は、硫黄−フッ化物交換反応を介して達成される。態様では、生体分子コンジュゲートを形成する反応は、近接により可能になる硫黄−フッ化物交換反応を介して達成される。態様では、反応は、インビトロで行われる。態様では、反応は、インビボで行われる。態様では、反応は、１つ以上の生細胞中で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生細菌細胞中で行われる。態様では、反応は、１つ以上の生哺乳類細胞中で行われる。
【０２００】
実施形態１〜５３
実施形態１．バイオコンジュゲートリンカーを介して第２の生体分子部分にコンジュゲートされた第１の生体分子部分を含む生体分子コンジュゲートであって、バイオコンジュゲートリンカーが、式：
【化３９】
2021515561.tif 000041
を有する、生体分子コンジュゲート。
【０２０１】
実施形態２．生体分子コンジュゲートが、式：Ｒ１−Ｌ１−Ａ−Ｘ１−Ｌ２−Ｒ２を有し、式中、Ａが、バイオコンジュゲートリンカーであり、Ｒ１が、第１の生体分子部分であり、Ｒ２が、第２の生体分子部分であり、Ｌ１が、結合または第１の共有結合リンカーであり、Ｌ２が、結合または第２の共有結合リンカーであり、Ｘ１が、−ＮＲ５−、−Ｏ−、−Ｓ−、または
【化４０】
2021515561.tif 000042
であり、式中、環Ａが、置換もしくは非置換ヘテロアリーレンまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレンであり、Ａ中の窒素が、バイオコンジュゲートリンカーに結合しており、Ｒ５が、水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、Ｒ１およびＲ２が、分子内でコンジュゲートされた生体分子コンジュゲートを形成するために、任意に一緒に結合している、実施形態１に記載の生体分子コンジュゲート。
【０２０２】
実施形態３．Ｌ１が、結合、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＮＲ３Ａ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ａ−、−ＮＲ３ＡＣ（Ｏ）−、−ＮＲ３ＡＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｂ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、または置換もしくは非置換ヘテロアリーレンであり、Ｌ２が、結合、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＮＲ４Ａ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ａ−、−ＮＲ４ＡＣ（Ｏ）−、−ＮＲ４ＡＣ（Ｏ）ＮＲ４Ｂ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、または置換もしくは非置換ヘテロアリーレンであり、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、およびＲ４Ｂが、独立して、水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールである、実施形態２に記載の生体分子コンジュゲート。
【０２０３】
実施形態４．Ｘ１が、−ＮＨ−、−Ｏ−、またはイミダゾリレンである、実施形態２または３に記載の生体分子コンジュゲート。
【０２０４】
実施形態５．第１の生体分子部分が、ペプチジル部分、核酸部分、または炭水化物部分である、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の生体分子コンジュゲート。
【０２０５】
実施形態６．第１の生体分子部分が、ペプチジル部分であり、ペプチジル部分が、リジン、ヒスチジン、またはチロシンを介してバイオコンジュゲートリンカーに共有結合している、実施形態５に記載の生体分子コンジュゲート。
【０２０６】
実施形態７．第２の生体分子部分が、ペプチジル部分、核酸部分、または炭水化物部分である、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の生体分子コンジュゲート。
【０２０７】
実施形態８．第２の生体分子部分が、ペプチジル部分であり、ペプチジル部分が、リジン、ヒスチジン、またはチロシンを介してバイオコンジュゲートリンカーに共有結合している、実施形態７に記載の生体分子コンジュゲート。
【０２０８】
実施形態９．−Ｌ１−Ｒ１が、ペプチジル部分、核酸部分、または炭水化物部分である、実施形態２または３に記載の生体分子コンジュゲート。
【０２０９】
実施形態１０．−Ｌ２−Ｒ２が、ペプチジル部分、核酸部分、または炭水化物部分である、実施形態２、３、または９に記載の生体分子コンジュゲート。
【０２１０】
実施形態１１．バイオコンジュゲートリンカーが、分子間リンカーである、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の生体分子コンジュゲート。
【０２１１】
実施形態１２．バイオコンジュゲートリンカーが、分子内リンカーである、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の生体分子コンジュゲート。
【０２１２】
実施形態１３．式（Ｉ）、式（ＩＩ）、または式（ＩＩＩ）：
【化４１】
2021515561.tif 000043
のタンパク質であって、Ｒ１およびＲ２が、各々独立して、ペプチジル部分であり、Ｒ１およびＲ２が、任意に一緒に結合されて、分子内でコンジュゲートされたタンパク質を形成する、タンパク質。
【０２１３】
実施形態１４．タンパク質が、式（Ｉ）のものである、実施形態１３に記載のタンパク質。
【０２１４】
実施形態１５．タンパク質が、式（ＩＩ）のものである、実施形態１３に記載のタンパク質。
【０２１５】
実施形態１６．タンパク質が、式（ＩＩＩ）のものである、実施形態１３に記載のタンパク質。
【０２１６】
実施形態１７．Ｒ１およびＲ２が、各々独立して、タンパク質α鎖またはタンパク質β鎖を含む、実施形態１３〜１８のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２１７】
実施形態１８．ｔＲ１およびＲ２が、一緒に結合されて、分子内でコンジュゲートされたタンパク質を形成する、実施形態１３〜１７のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２１８】
実施形態１９．Ｒ１およびＲ２が、一緒に結合されていない、実施形態１３〜１７のいずれか１つに記載のタンパク質。
【０２１９】
実施形態２０．配列番号３のアミノ酸配列を有するピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位内に少なくとも５個のアミノ酸残基置換を含む、ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素。
【０２２０】
実施形態２１．基質結合部位が、配列番号３のアミノ酸配列に示されるように、３０２位の残基アラニン、３０５位のロイシン、３０６位のチロシン、３０９位のロイシン、３２２位のイソロイシン、３４６位のアスパラギン、３４８位のシステイン、３８４位のチロシン、４０１位のバリン、および４１７位のトリプトファンを含む、実施形態２０に記載のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素。
【０２２１】
実施形態２２．少なくとも５個のアミノ酸残基置換が、配列番号３のアミノ酸配列に示されるように、３０２位のアラニンの置換、３４６位のアスパラギンの置換、３４８位のシステインの置換、３８４位のチロシンの置換、および４１７位のトリプトファンの置換である、実施形態２１に記載のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素。
【０２２２】
実施形態２３．少なくとも５個のアミノ酸残基置換が、配列番号３のアミノ酸配列に示されるように、３０２位のアラニンに対するイソロイシン、３４６位のアスパラギンに対するトレオニン、３４８位のシステインに対するイソロイシン、３８４位のチロシンに対するロイシン、および４１７位のトリプトファンに対するリジンである、実施形態２２に記載のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素。
【０２２３】
実施形態２４．ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、配列番号１のアミノ酸配列を有する、実施形態２０〜２３のいずれか１つに記載のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素。
【０２２４】
実施形態２５．ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、配列番号２の核酸配列によってコードされる、実施形態２０〜２４のいずれか１つに記載のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素。
【０２２５】
実施形態２６．実施形態２０〜２５のいずれか１つに記載のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸配列を含む、ベクター。
【０２２６】
実施形態２７．ｔＲＮＡＰｙｌをコードする核酸配列をさらに含む、実施形態２６に記載のベクター。
【０２２７】
実施形態２８．実施形態２０〜２７のいずれか１つに記載のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素と、以下の式：
【化４２】
2021515561.tif 000044
を有するフルオロサルフェート−Ｌ−チロシンと、を含む、複合体。
【０２２８】
実施形態２９．ｔＲＮＡＰｙｌをさらに含む、実施形態２８に記載の複合体。
【０２２９】
実施形態３０．実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の生体分子コンジュゲートを含む、細胞。
【０２３０】
実施形態３１．実施形態１３〜１９のいずれか１つに記載のタンパク質を含む、細胞。
【０２３１】
実施形態３２．実施形態２０〜２５のいずれか１つに記載のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素を含む、細胞。
【０２３２】
実施形態３３．実施形態２６または２７に記載のベクターを含む、細胞。
【０２３３】
実施形態３４．実施形態２８または２９に記載の複合体を含む、細胞。
【０２３４】
実施形態３５．式：
【化４３】
2021515561.tif 000045
のフルオロサルフェート−Ｌ−チロシンを含む、細胞。
【０２３５】
実施形態３６．配列番号３に示されるピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位内に少なくとも５個のアミノ酸残基置換を含むピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素をさらに含む、実施形態３５に記載の細胞。
【０２３６】
実施形態３７．配列番号３に示されるピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位内に少なくとも５個のアミノ酸残基置換を含むピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸配列を含むベクターをさらに含む、実施形態３５に記載の細胞。
【０２３７】
実施形態３８．ｔＲＮＡＰｙｌをさらに含む、実施形態３５〜３７のいずれか１つに記載の細胞。
【０２３８】
実施形態３９．細胞が、細菌細胞または哺乳類細胞である、実施形態３０〜３８のいずれか１つに記載の細胞。
【０２３９】
実施形態４０．実施形態１１に記載の生体分子コンジュゲートを形成する方法であって、（ｉ）ＦＳＹ生体分子内のＦＳＹ部分を、第２の生体分子部分を含む化合物と接触させ（第２の生体分子は、ＦＳＹ部分と反応性である）、それによって分子間リンカーを有する生体分子コンジュゲートを形成することを含む、方法。
【０２４０】
実施形態４１．実施形態１２に記載の生体分子コンジュゲートを形成する方法であって、（ｉ）ＦＳＹ生体分子内のＦＳＹ部分を、ＦＳＹ生体分子内の第２の生体分子部分と接触させ（第２の生体分子は、ＦＳＹ部分と反応性である）、それによって分子内リンカーを有する生体分子コンジュゲートを形成することを含む、方法。
【０２４１】
実施形態４２．（ｉ）における接触が、細胞内で行われる、実施形態４０または４１に記載の方法。
【０２４２】
実施形態４３．ステップ（ｉ）における接触の前に、（ｉｉ）生体分子、実施形態２０〜２５のいずれか１つに記載のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素、ｔＲＮＡＰｙｌ、および式：
【化４４】
2021515561.tif 000046
を有するフルオロサルフェート−Ｌ−チロシンに接触させて、ＦＳＹ生体分子を形成することをさらに含む、実施形態４０または４１に記載の方法。
【０２４３】
実施形態４４．（ｉｉ）における接触が、細胞内で行われる、実施形態４３に記載の方法。
【０２４４】
実施形態４５．ＦＳＹタンパク質を、リジン、ヒスチジン、またはチロシンを含む第２のタンパク質と接触させ、それによって分子内でコンジュゲートされたタンパク質を形成することを含む、実施形態１８に記載のタンパク質を形成する方法。
【０２４５】
実施形態４６．ＦＳＹタンパク質中のフルオロサルフェート−Ｌ−チロシンを、第２のタンパク質中のリジン、ヒスチジン、またはチロシンと接触させ、それによって分子間でコンジュゲートされたタンパク質を形成する、実施形態１９に記載のタンパク質を形成する方法。
【０２４６】
実施形態４７．ＦＳＹタンパク質を産生することをさらに含み、方法が、タンパク質、実施形態２０〜２５のいずれか１つに記載のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素、ｔＲＮＡＰｙｌ、および式：
【化４５】
2021515561.tif 000047
を有するフルオロサルフェート−Ｌ−チロシンを接触させ、それによってＦＳＹタンパク質を産生することを含む、実施形態４５または４６に記載の方法。
【０２４７】
実施形態４８．接触させることが、硫黄−フッ化物交換反応を含む、実施形態４０〜４７のいずれか１つに記載の方法。
【０２４８】
実施形態４９．接触させることが、近接により可能になる硫黄−フッ化物交換反応を含む、実施形態４８に記載の方法。
【０２４９】
実施形態５０．接触させることが、細胞内で行われる、実施形態４６〜５０のいずれか１つに記載の方法。
【０２５０】
実施形態５１．リジン、ヒスチジン、またはチロシンの近位にある非天然アミノ酸を含むタンパク質であって、非天然アミノ酸が、式：
【化４６】
2021515561.tif 000048
の側鎖を有する、タンパク質。
【０２５１】
実施形態５２．式（Ａ）の部分、式（Ｂ）の部分、式（Ｃ）の部分、またはそれらの２つ以上の組み合わせを含むタンパク質
【化４７】
2021515561.tif 000049
【０２５２】
実施形態５３．実施形態５１または５２に記載のタンパク質を含む、細胞。
【０２５３】
実施形態Ｐ１〜Ｐ２９
実施形態Ｐ１．バイオコンジュゲートリンカーを介して第２の生体分子部分にコンジュゲートされた第１の生体分子部分を含む生体分子コンジュゲートであって、当該バイオコンジュゲートリンカーが、式：
【化４８】
2021515561.tif 000050
を有する、生体分子コンジュゲート。
【０２５４】
実施形態Ｐ２．当該生体分子コンジュゲートが、式：Ｒ１−Ｌ１−Ａ−Ｘ１−Ｌ２−Ｒ２を有し、式中、Ａが、当該バイオコンジュゲートリンカーであり、Ｒ１が、当該第１の生体分子部分であり、Ｒ２が、当該第２のバイオコンジュゲート部分であり、Ｌ１が、結合または第１の共有結合リンカーであり、Ｌ２が、結合または第２の共有結合リンカーであり、Ｘ１が、−ＮＲ５−、−Ｏ−、−Ｓ−、または
【化４９】
2021515561.tif 000051
であり、環Ａが、置換もしくは非置換ヘテロアリーレンまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレンであり、Ａ中の窒素が、当該バイオコンジュゲートリンカーに結合され、Ｒ５が、水素、置換もしくは非置換アルキリル、置換もしくは非置換ヘテロアルキリル、置換もしくは非置換シクロアルキリル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキリル、置換もしくは非置換アリーリル、または置換もしくは非置換ヘテロアリーリルである、実施形態Ｐ１に記載の生体分子コンジュゲート。
【０２５５】
実施形態Ｐ３．Ｌ１が、結合、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＮＲ３Ａ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ａ−、−ＮＲ３ＡＣ（Ｏ）−、−ＮＲ３ＡＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｂ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、または置換もしくは非置換ヘテロアリーレンであり、Ｌ２が、結合、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＮＲ４Ａ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ａ−、−ＮＲ４ＡＣ（Ｏ）−、−ＮＲ４ＡＣ（Ｏ）ＮＲ４Ｂ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレン、または置換もしくは非置換ヘテロアリーレンであり、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、およびＲ４Ｂが、独立して、水素、置換もしくは非置換アルキリル、置換もしくは非置換ヘテロアルキリル、置換もしくは非置換シクロアルキリル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキリル、置換もしくは非置換アリーリル、または置換もしくは非置換ヘテロアリーリルである、実施形態Ｐ２に記載の生体分子コンジュゲート。
【０２５６】
実施形態Ｐ４．Ｘ１が、イミダゾール、−ＮＨ−、または−Ｏ−である、実施形態Ｐ２に記載の生体分子コンジュゲート。
【０２５７】
実施形態Ｐ５．当該第１の生体分子部分が、ペプチジル部分である、実施形態Ｐ１に記載の生体分子コンジュゲート。
【０２５８】
実施形態Ｐ６．当該第２の生体分子部分が、ペプチジル部分である、実施形態Ｐ１に記載の生体分子コンジュゲート。
【０２５９】
実施形態Ｐ７．−Ｌ１−Ｒ１が、ペプチジル部分である、実施形態Ｐ２〜Ｐ４のいずれか１つに記載の生体分子コンジュゲート。
【０２６０】
実施形態Ｐ８．−Ｌ２−Ｒ２が、ペプチジル部分である、実施形態Ｐ２〜Ｐ４のいずれか１つに記載の生体分子コンジュゲート。
【０２６１】
実施形態Ｐ９．当該第１の生体分子部分が、核酸部分または炭水化物部分である、実施形態Ｐ１に記載の生体分子コンジュゲート。
【０２６２】
実施形態Ｐ１０．当該第２の生体分子部分が、核酸部分または炭水化物部分である、実施形態Ｐ１に記載の生体分子コンジュゲート。
【０２６３】
実施形態Ｐ１１．−Ｌ１−Ｒ１が、核酸部分または炭水化物部分である、実施形態Ｐ２〜Ｐ４のいずれか１つに記載の生体分子コンジュゲート。
【０２６４】
実施形態Ｐ１２．−Ｌ２−Ｒ２が、核酸部分または炭水化物部分である、実施形態Ｐ２〜Ｐ４のいずれか１つに記載の生体分子コンジュゲート。
【０２６５】
実施形態Ｐ１３．当該突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素の基質結合部位内に少なくとも５個のアミノ酸残基置換を含む、突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素。
【０２６６】
実施形態Ｐ１４．当該基質結合部位が、配列番号３のアミノ酸配列に示されるように、３０２位の残基アラニン、３０５位のロイシン、３０６位のチロシン、３０９位のロイシン、３２２位のイソロイシン、３４６位のアスパラギン、３４８位のシステイン、３８４位のチロシン、４０１位のバリン、および４１７位のトリプトファンを含む、実施形態Ｐ１３に記載の突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素。
【０２６７】
実施形態Ｐ１５．当該少なくとも５個のアミノ酸残基置換が、配列番号３のアミノ酸配列に示されるように、３０２位のアラニンの置換、３４６位のアスパラギンの置換、３４８位のシステインの置換、３８４位のチロシンの置換、および４１７位のトリプトファンの置換である、実施形態Ｐ１４に記載の突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素。
【０２６８】
実施形態Ｐ１６．当該少なくとも５個のアミノ酸残基置換が、配列番号３のアミノ酸配列に示されるように、３０２位のアラニンに対するイソロイシン、３４６位のアスパラギンに対するトレオニン、３４８位のシステインに対するイソロイシン、３８４位のチロシンに対するロイシン、および４１７位のトリプトファンに対するリジンである、実施形態Ｐ１５に記載の突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素。
【０２６９】
実施形態Ｐ１７．当該突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、配列番号１のアミノ酸配列を有する、実施形態Ｐ１３〜Ｐ１６のいずれか１つに記載の突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素。
【０２７０】
実施形態Ｐ１８．当該突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素が、配列番号２の核酸配列によってコードされる、実施形態Ｐ１３〜Ｐ１７のいずれか１つに記載の突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素。
【０２７１】
実施形態Ｐ１９．実施形態Ｐ１３〜Ｐ１８のいずれか１つに記載の突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸配列を含む、ベクター。
【０２７２】
実施形態Ｐ２０．ｔＲＮＡＰｙｌをコードする核酸配列をさらに含む、実施形態Ｐ１９に記載のベクター。
【０２７３】
実施形態Ｐ２１．実施形態Ｐ１３〜Ｐ１８のいずれか１つに記載の突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素と、以下の式：
【化５０】
2021515561.tif 000052
を有するフルオロサルフェート−Ｌ−チロシン（ＦＳＹ）と、を含む、複合体。
【０２７４】
実施形態Ｐ２２．ｔＲＮＡＰｙｌをさらに含む、実施形態Ｐ２１に記載の複合体。
【０２７５】
実施形態Ｐ２３．実施形態Ｐ１〜Ｐ１２のいずれか１つに記載の生体分子コンジュゲート、実施形態Ｐ１３〜Ｐ１８のいずれか１つに記載の突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素、実施形態Ｐ１９もしくはＰ２０に記載のベクター、または実施形態Ｐ２１もしくはＰ２２に記載の複合体を含む、修飾細胞。
【０２７６】
実施形態Ｐ２４．以下の式：
【化５１】
2021515561.tif 000053
を有する、フルオロ硫酸塩−Ｌ−チロシン（ＦＳＹ）を含む、修飾細胞。
【０２７７】
実施形態Ｐ２５．実施形態Ｐ１３〜Ｐ１８のいずれか１つに記載の突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素をさらに含む、実施形態Ｐ２４に記載の修飾細胞。
【０２７８】
実施形態Ｐ２６．実施形態Ｐ１９またはＰ２０に記載のベクターをさらに含む、実施形態Ｐ２４に記載の修飾細胞。
【０２７９】
実施形態Ｐ２７．ｔＲＮＡＰｙｌをさらに含む、実施形態Ｐ２４に記載の修飾細胞。
【０２８０】
実施形態Ｐ２８．生体分子コンジュゲートを形成する方法であって、実施形態Ｐ１３〜Ｐ１８のいずれか１つに記載の突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素、ｔＲＮＡＰｙｌ、および以下の式：
【化５２】
2021515561.tif 000054
を有するフルオロサルフェート−Ｌ−チロシン（ＦＳＹ）を接触させることを含む、方法。
【０２８１】
実施形態Ｐ２９．当該接触させることが、細胞内で行われる、実施形態２８に記載の方法。
【実施例】
【０２８２】
以下の実施例は、本開示のある特定の実施形態および態様をさらに例示することを意図している。実施例は、本開示または特許請求の範囲の趣旨または範囲を限定することを意図していない。
【０２８３】
実施例１
インビボでタンパク質中のＳｕＦＥｘを介してリジン、ヒスチジン、およびチロシンと反応するようにフルオロサルフェート−Ｌ−チロシンを遺伝子コードする
【０２８４】
生細胞中のタンパク質に新しい化学反応性を導入することは、インビボでの研究および操作のためのタンパク質への革新的な共有結合能力を付与するであろう。潜在的な生体反応性の非天然アミノ酸（Ｕａａｓ）をタンパク質中に組み込み、近接により可能になる反応性を介して標的天然アミノ酸残基と反応させることができる。そのようなインビボでの反応性に適したタンパク質の多様性を拡大するために、生体適合性であり、生理学的条件下で複数の天然残基と反応することができる化学官能性が非常に望ましい。ここで、発明者らは、インビボでタンパク質上で硫黄−フッ化物交換（ＳｕＦＥｘ）を受ける第１の潜在的な生体反応性Ｕａａであるフルオロサルフェート−Ｌ−チロシン（ＦＳＹ）の遺伝子コードを報告する。ＦＳＹは、Ｅ．ｃｏｌｉおよび哺乳類細胞に対して非毒性であることが見出され、タンパク質に組み込まれた後、ＳｕＦＥｘを介して近位リジン、ヒスチジン、およびチロシンと選択的に反応し、生細胞内で直接相互作用するタンパク質の共有タンパク質内架橋およびタンパク質間架橋を生成した。ＦＳＹの近接活性化可能な反応性、多標的化能力、および優れた生体適合性は、インビボでのタンパク質の共有結合操作に非常に貴重であろう。さらに、遺伝子コードされたＦＳＹは、これによって化学生物学、創薬、および生物療法学において広範な有用性を提供するであろう次世代のクリック化学、ＳｕＦＥｘで一般タンパク質に力を与える。
【０２８５】
Ｅ．ｃｏｌｉおよび哺乳類細胞中のタンパク質にフルオロサルフェート−Ｌ−チロシン（ＦＳＹ）（図１Ａ）を遺伝的に組み込むために、新しいｔＲＮＡ合成酵素対を開発した。本発明者らは、ＦＳＹが一般に細胞に対して非毒性であり、生理学的条件下でタンパク質内およびタンパク質間の近接により可能になるＳｕＦＥｘ反応を介してＬｙｓ、Ｈｉｓ、およびＴｙｒと反応することができることを見出した（図１Ｂ）。本発明者らは、インビボで直接ＦＳＹを使用した相互作用タンパク質の架橋を実証した。
【０２８６】
ＳＯ２Ｆ２／ホウ砂法（収率８８％）を使用して、ＦＳＹを合成した。Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ，５３：９４３０−９４４８（２０１４）、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，５５：１８３５−１８３８（２０１６）。ＦＳＹを遺伝子的にコードするために、本発明者らは、ＦＳＹに特異的な突然変異体ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）を開発した。小知能突然変異誘発アプローチを使用して、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ  ＰｙｌＲＳの残基Ａｌａ３０２、Ｌｅｕ３０５、Ｔｙｒ３０６、Ｌｅｕ３０９、Ｉｌｅ３２２、Ａｓｎ３４６、Ｃｙｓ３４８、Ｔｙｒ３８４、Ｖａｌ４０１、およびＴｒｐ４１７を突然変異させることによって、ＰｙｌＲＳ突然変異体ライブラリを生成し、記載されるように選択した。Ｌａｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，１４：２１００−２１０５（２０１３）、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，４４：３４−６６（２００５）、Ｔａｋｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６：７３３−７４３（２０１１）。ＦＳＹ依存性表現型を示す６つのヒットが同定され、それらは全て、本明細書でＦＳＹＲＳと称される同じアミノ酸配列（３０２Ｉ／３４６Ｔ／３４８Ｉ／３８４Ｌ／４１７Ｋ）上に集中していた。
【０２８７】
Ｅ．ｃｏｌｉ中のタンパク質へのＦＳＹの組み込み特異性を評価した。３６位にＴＡＧコドンを含有するＺｓｐａアフィボディ（Ａｆｂ）遺伝子（Ａｆｂ−３６ＴＡＧ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ中のｔＲＮＡＰｙｌ／ＦＳＹＲＳ対と共発現させた。ＦＳＹが存在しない場合、全長Ａｆｂは検出されず、成長培地に１ｍＭのＦＳＹを添加した場合、全長Ａｆｂ３６ＦＳＹを１．６ｍｇ／Ｌの収率で産生した（図１Ｃ）。精製したＡｆｂ３６ＦＳＹを、エレクトロスプレーイオン化飛行時間質量分析（ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）によって分析した（図１Ｄ）。７８５５．９６Ｄａで観察されたピークは、部位３６でＦＳＹを含有する無傷のＡｆｂに対応する（Ａｆｂ３６ＦＳＹ：予想７８５６．６９Ｄａ）。７７２４．７７Ｄａで測定されたピークは、開始Ｍｅｔを欠くＡｆｂ３６ＦＳＹに対応する（Ａｆｂ３６ＦＳＹ−Ｍｅｔ：予想７７２５．５０Ｄａ）。７８３６．５５および７７０５．１６Ｄａで観察された２つの軽微なピークは、それぞれＦを欠くＡｆｂ３６ＦＳＹ（予想７８３６．６９Ｄａ）およびＦを欠くＡｆｂ３６ＦＳＹ−Ｍｅｔ（予想７７０５．４９Ｄａ）に対応し、ＭＳ測定中にわずかなＦ消失を示唆した。特に、３６位に他のアミノ酸を含有するＡｆｂに対応するピークは観察されなかった。ＦＳＹはまた、Ｚタンパク質の２４位に組み込まれ、タンデムＭＳで分析された。一連のｂおよびｙイオンは、ＦＳＹがＴＡＧ指定位置２４に組み込まれたことを明確に示した（図１Ｅ）。１ｍＭのＦＳＹの存在は、Ｅ．ｃｏｌｉの成長に影響を及ぼさず（図６）、明らかな細胞毒性がないことを示した。これらの結果は、進化したｔＲＮＡＰｙｌ／ＦＳＹＲＳ対が、Ｅ．ｃｏｌｉ中で高効率かつ特異性でＦＳＹを組み込むことができることを示した。
【０２８８】
哺乳類細胞中のタンパク質へのＦＳＹ組み込みを試験した。ＨｅＬａ−ＥＧＦＰ−１８２ＴＡＧレポーター細胞を、ＦＳＹＲＳおよびｔＲＮＡＰｙｌ遺伝子を発現するプラスミドｐＭＰ−ＦＳＹＲＳ−３ｘｔＲＮＡでトランスフェクトした。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１０：１０６３−１０７２（２００７）。１８２ＴＡＧコドンの抑制により、全長ＥＧＦＰレンダリング細胞が蛍光性になる。トランスフェクション後、細胞を３７℃で２４時間または４８時間、様々な濃度のＦＳＹでインキュベートし、続いて、フローサイトメトリーを行った。強いＥＧＦＰ蛍光は、ＦＳＹを付加したときにのみ細胞から測定した（図２Ａ）。蛍光強度は、ＦＳＹ濃度およびインキュベーション時間と共に増加した（図２Ｂ、図７）。陽性対照として、プラスミドｐＩｒｅ−Ａｚｉ３を使用して、我々の手中にある哺乳類細胞において最も効率的なＵａａ組み込み系である、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（ＡｚＦ）をレポーター細胞に並行して組み込んだ。Ｃｏｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，１５５：１２５８−１２６９（２０１３）。ＦＳＹ組み込みは、ＡｚＦと比較して良好であり、ＡｚＦレベルの７６％に達する。特に、細胞毒性は、しばしば生体反応性Ｕａａｓの問題であるが、ＨｅＬａまたは２９３Ｔ細胞に対するＦＳＹの明らかな毒性は観察されなかったが（図８）、ＦＳＹの貴重な特徴は、細胞内のフルオロ硫酸アリールの極めて低いバックグラウンド反応性に起因する可能性がある。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３８：７３５３−７３６４（２０１６）。これらの結果はまた、蛍光共焦点顕微鏡法によっても確認された（図２Ｃ）。ＦＳＹの存在下では、細胞全体にわたって強いＥＧＦＰ蛍光が観察され、細胞形態は正常なままであった。ＦＳＹを付加しなかった場合、蛍光シグナルは検出されなかった。これらの結果により、ＦＳＹが有害な効果を引き起こさずに、高い効率および特異性で哺乳類細胞中のタンパク質に組み込まれたことが実証される。
【０２８９】
次いで、本発明者らは、組み込まれたＦＳＹがＥ．ｃｏｌｉ中で直接近接により可能になる反応性を介して天然アミノ酸残基と反応することができるかどうかを決定した。Ａｆｂは、適度な親和性でその基質Ｚタンパク質に結合し、インビボでＦＳＹ架橋を研究するための好適なタンパク質フレームワークを提供する。Ａｆｂ−Ｚ複合体の結晶構造に照らして（Ｈｏｇｂｏｍ，ｅｔ  ａｌ，Ｐ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：３１９１−３１９６（２００３））、本発明者らは、Ｚタンパク質の２４位にＦＳＹを導入し、Ａｆｂの７位に標的天然残基を導入し、Ａｆｂ−Ｚ結合時に２つの残基を近接して配置した（図３Ａ）。フルオロ硫酸アリールが弱い求電子体であるため、発明者らは、陰性対照としてＡｌａを使用して、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒに対するＦＳＹの反応性を試験することにした。類似の分子量のＡｆｂタンパク質およびＺタンパク質をより良好に分離するために、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をＺのＮ末端（ＭＢＰ−Ｚ）に融合させた。ＭＢＰ−ＺおよびＡｆｂは共に、Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグを付加した。生細胞中で化学架橋が生じる可能性があるかどうかを判断するために、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＭＢＰ−Ｚ２４ＦＳＹおよびＡｆｂ−７Ｘ（Ｘ＝標的残基）を共発現させた。３７℃で６時間培養した後、同じ数の細胞を、変性条件下でウェスタンブロットを使用して分析した。Ａｆｂ−７Ｌｙｓ、Ａｆｂ−７Ｈｉｓ、またはＡｆｂ−７Ｔｙｒを発現する細胞から、ＭＢＰ−Ｚ２４ＦＳＹおよびＡｆｂ付加物に対応する分子量で架橋バンドが観察された（図３Ｂ）。６×Ｈｉｓタグ付けタンパク質を細胞から精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。一貫して、Ａｆｂと架橋したＭＢＰ−Ｚに対応するタンパク質バンドは、Ａｆｂ−７Ｌｙｓ、Ａｆｂ−７Ｈｉｓ、およびＡｆｂ−７Ｔｙｒについて明確に観察され（図３Ｂ）、架橋効率は、それぞれ５９％、５３％、および３５％であった。対照的に、ＭＢＰ−Ｚ２４ＦＳＹを、Ａｆｂ−７Ｃｙｓ、Ａｆｂ−７Ｓｅｒ、Ａｆｂ−７Ｔｈｒ、またはＡｆｂ−７Ａｌａと共発現させた場合、架橋バンドは観察されなかった。アリールカルバメートは、インビトロでＡｆｂ／Ｚ界面でＬｙｓまたはＴｙｒを架橋するために塩基性ｐＨを必要とするが（Ｘｕａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，５６：５０９６−５１００（２０１７））、ＦＳＹは、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、またはＴｙｒを生きたＥ．ｃｏｌｉ細胞内で直接架橋することができた。
【０２９０】
ＦＳＹのインビボ化学架橋能力をさらに検証するために、精製タンパク質をタンデムＭＳを使用して分析した。予想どおり、ＭＢＰ−Ｚ２４ＦＳＹおよびＡｆｂ−７Ｌｙｓの共有結合ペプチドに対応する強力なシグナルを同定した（図３Ｃ）。一連のｂおよびｙ断片化イオンは、組み込まれたＦＳＹがＡｆｂのＬｙｓ７と独占的に架橋されていることを明確に示した。Ａｆｂ−７Ｈｉｓと共発現したＭＢＰ−Ｚ２４ＦＳＹについても同様のＭＳ結果を得て、標的Ｈｉｓ７と架橋したＦＳＹを確認した（図３Ｄ）。一方、ウェスタンおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果と一致して、Ａｆｂ−７Ｓｅｒ、Ａｆｂ−７Ｔｈｒ、Ａｆｂ−７Ｃｙｓ、またはＡｆｂ−７ＡｌａとのＭＢＰ−Ｚ２４ＦＳＹの架橋ペプチドは、タンデムＭＳによって検出されなかった。ＭＢＰ−Ｚ２４ＦＳＹとＡｆｂ−７Ｔｙｒとの架橋は、ウェスタンおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して検出されたが（図３Ｂ）、タンデムＭＳとの架橋ペプチドは同定できなかった。
【０２９１】
ＦＳＹがＴｙｒと反応する追加の証拠を探求するために、ＦＳＹおよびＴｙｒを、インビボでの分子内架橋のために単一タンパク質に組み込んだ。Ｅ．ｃｏｌｉでは、ｔＲＮＡＰｙｌ／ＦＳＹＲＳ対を、ＦＳＹ組み込みのための７６ＴＡＧをコードする突然変異体カルモジュリン遺伝子（ＣａＭ−７６ＴＡＧ）、および近くの部位８０におけるＴｙｒと共発現させた（図４Ａ）。このＣａＭタンパク質を、１ｍＭ  ＦＳＹの存在下で発現させ、精製し（図４Ｂ）、タンデムＭＳで分析した（図４Ｃ）。一連のｂおよびｙ断片イオンは、ＦＳＹがＳｕＦＥｘを介してＴｙｒ８０と共有結合を形成し、ＨＦの質量を失うことを明確に示す。
【０２９２】
ＦＳＹが天然Ｔｙｒ残基を標的とすることを通じて相互作用タンパク質を架橋することができることを実証するために、ＦＳＹアーム型チオレドキシン（Ｔｒｘ）が、３´−ホスホアデノシン−５´−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）還元酵素を共有結合的に捕捉できるかどうかを試験した。Ｔｒｘは、ＰＡＰＳ還元酵素と相互作用して、デノボシステイン生合成のためのアデニル化硫酸塩の亜硫酸塩への還元を促進する。Ｃｈａｒｔｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４６：３９４２−３９５１（２００７）。Ｔｒｘ１を有するＰＡＰＳ還元酵素の複合体構造に基づいて（Ｃｈａｒｔｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４６：３９４２−３９５１（２００７））、ＦＳＹを部位６２のＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｒｘ１に組み込み、ＰＡＰＳ還元酵素の近位Ｔｙｒ１９１を標的にした（図５Ａ）。Ｔｒｘ１（６２ＦＳＹ）およびＷＴ  ＰＡＰＳ還元酵素を、ｐＨ７．４または８．０のＴｒｉｓ緩衝液中で１２時間発現、精製、およびインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＰＡＰＳ還元酵素を有するＴｒｘ１の共有結合複合体に対応する明確なバンドを示した（図５Ｂ、図９）。試料をタンデムＭＳを使用してさらに分析し、これは、Ｔｒｘ１のＦＳＹがＳｕＦＥｘ反応を介してＰＡＰＳ還元酵素の標的Ｔｙｒ１９１と共有結合的に架橋したことを明確に示した（図５Ｃ）。まとめると、分子内ＣａＭ架橋および分子間Ｔｒｘ１−ＰＡＰＳ還元酵素架橋は、ＳｕＦＥｘ反応を介してＦＳＹがＴｙｒと近接して反応したことを確認した。
【０２９３】
要約すると、生細胞に優しいＦＳＹを、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞および哺乳類細胞中のタンパク質に遺伝子コードし、生きたＥ．ｃｏｌｉ細胞中で直接ＳｕＦＥｘを介して近位のＬｙｓ、Ｈｉｓ、およびＴｙｒ残基と選択的に反応させた。生体反応性Ｕａａｓを使用する分子間架橋は、Ｃｙｓを標的とする少数の例外を除いて、主にインビトロでの使用に限定されてきた（Ｃｏｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，１５５：１２５８−１２６９（２０１３）、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，８：２２４０（２０１７））、ＦＳＹは、インビボで相互作用するタンパク質の分子間架橋を可能にし、３つの異なる残基を標的とする。ＦＳＹの標的残基は、タンパク質表面および界面にしばしば見出されるため、ＦＳＹは、共有結合に適したタンパク質の多様性を劇的に拡大し、タンパク質共有結合能力を利用するための創造的なインビボ用途を可能にする。さらに、ＦＳＹを遺伝子コードすることで、新世代のクリック化学、ＳｕＦＥｘでタンパク質を強化し、これは化学生物学、創薬、および生物療法学における広範な応用を見出すであろう。
【０２９４】
材料および方法
ＦＳＹの化学合成：フルオロサルフェート−Ｌ−チロシンＨＣｌ塩を、従来のＳＯ２Ｆ２／ホウ砂法に基づいて合成した。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２０１６，５５，１８３５−１８３８、Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２０１４，５３，９４３０−９４４８。
【化５３】
2021515561.tif 000055
【０２９５】
磁気撹拌棒を含む２Ｌの二口丸底フラスコに、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ−ＯＨ（５．００ｇ、１７．８ｍｍｏｌ）、２１０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２、および８６０ｍＬの飽和ホウ砂溶液を添加した。混合物を２０分間激しく撹拌した。二相溶液が脱気を開始するまで反応系を真空処理し、ＳＯ２Ｆ２を３回再充填した。反応混合物を２５℃で一晩激しく撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２は、回転式蒸発器を使用して慎重に除去した。次いで、１ＭのＨＣｌ水溶液（２１０ｍＬ）を、撹拌しながらゆっくりと反応混合物に添加したところ、白色固体が沈殿した。混合物を濾過し、固体を水（８０ｍＬ×３）で洗浄した。白色固体を真空下（１ｍｍＨｇ）、４０℃で４時間乾燥させ、６．０７ｇ（１６．７ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−Ｔｙｒ−ＯＳＯ２Ｆを得、これをさらに精製することなく次のステップで直接使用した。
【０２９６】
Ｂｏｃ−Ｔｙｒ−ＯＳＯ２Ｆ（２．０ｇ、５．５ｍｍｏｌ）をジオキサン（１１ｍＬ）中の４Ｍ  ＨＣｌで処理し、反応混合物を一晩撹拌し、その間に白色固体が沈殿した。固体を濾過し、冷たいエーテル（５ｍＬ×２）によって洗浄して、標的化フルオロサルフェート−Ｌ−チロシンＨＣｌ塩を白色固体として得た（１．４６ｇ、８８％収率）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ（ｐｐｍ）３．２３−３．４１（ｍ，２Ｈ），４．３２−４．３４（ｍ，１Ｈ），７．４５−７．５３（ｍ，４Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ（ｐｐｍ）３８．９，５７．２，１２５．０，１３５．３，１３９．５，１５３．５，１７３．３；ＭＳ：２６４．０［ＮＨ３−Ｔｙｒ−ＯＳＯ２Ｆ］＋，２８６．０［ＮＨ２−Ｔｙｒ−ＯＳＯ２Ｆ＋Ｎａ］＋
【０２９７】
合成酵素ライブラリの構築および選択：ＭｍＰｙｌＲＳのｐＢＫ−ＴＫ３突然変異体ライブラリは、各アミノ酸に対して単一のコドンを使用し、したがってより多くの残基を同時に突然変異させる新しい小知能突然変異誘発アプローチを使用して構築された。Ｌａｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，１４：２１００−２１０５（２０１３）によって以前に記載された手順を使用して、ＭｍＰｙｌＲＳの以下の残基を突然変異させた：３０２ＮＹＴ、３０５ＷＴＧ、３０６ＷＴＧ／ＴＡＣ、３０９ＫＹＡ、３２２ＡＹＡ、３４６ＮＤＴ／ＶＭＡ／ＡＴＧ／ＴＧＧ、３４８ＮＤＴ／ＶＭＡ／ＡＴＧ／ＴＧＧ、３８４ＴＴＭ／ＴＡＴ、４０１ＶＴＴ、４１７ＮＤＴ／ＶＭＡ／ＡＴＧ／ＴＧＧ。
【０２９８】
ｐＲＥＰ陽性選択レポーターを保有するＤＨ１０Ｂ細胞（１００μＬ）を、エレクトロポレーションを介して１００ｎｇのｐＢＫ−ＴＫ３ライブラリで形質転換した。エレクトロポレーションした細胞を、１ｍＬの予温したＳＯＣ培地で直ちに回収し、３７℃で１時間激しく撹拌した。回収した細胞を、１ｍＭのＦＳＹ、１２．５μｇｍＬ−１のテトラサイクリン（Ｔｅｔ）、２５μｇｍＬ−１のカナマイシン（Ｋａｎ）、および６８μｇｍＬ−１のクロラムフェニコール（Ｃｍ）を補充したＬＢ−寒天選択プレート上に直接播種した。選択プレートを３７℃で４８時間インキュベートし、次いで室温で保管した。緑色蛍光を示すコロニーを、１００μＬのＬＢ中で希釈し、１）Ｔｅｔ１２．５Ｋａｎ２５、２）Ｔｅｔ１２．５Ｋａｎ２５Ｃｍ１００、３）Ｔｅｔ１２．５Ｋａｎ２５Ｃｍ１００を含有する、１ｍＭのＦＳＹを補充したＬＢ−寒天スクリーニングプレート上で複製した。３７℃で４８時間のインキュベーション後、ＦＳＹ依存性蛍光および成長を示した６個のクローンをヒットとしてみなし、さらに特徴付けた。ＰｙｌＲＳ突然変異体をコードするｐＢＫプラスミドをミニプレップによって抽出し、次いでＤＮＡゲル電気泳動によってレポータープラスミドから分離した。精製したｐＢＫプラスミドを、Ｓａｎｇｅｒ配列決定によって分析した。
【０２９９】
プラスミド構築
ｐＥｖｏｌ−ＦＳＹ：ｐＥｖｏｌ−ＦＳＹプラスミドは、ライゲーション非依存性クローニングを介して、ＦＳＹＲＳコード遺伝子をｐＥｖｏｌベクターに導入することによって生成した。Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｓ．Ｊ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４：２５１−２５６（２００７）。簡潔に述べると、ＦＳＹＲＳ遺伝子を以下のプライマーで増幅し、精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼでｐＥｖｏｌベクターにライゲーションした（Ｂｇｌ  ＩＩおよびＳａｌ  Ｉで直線化した）。ＦＳＲＹＳ−ＢｇｌＩＩ−Ｆは、配列番号５である。ＦＳＹＲＳ−ＳａｌＩ−Ｒは、配列番号６である。
【０３００】
ｐＭＰ−３×ｔＲＮＡＰｙｌ−ＦＳＹＲＳ：ｐＭＰ−３ｘ
【化５４】
2021515561.tif 000056
−ＦＳＹＲＳプラスミドは、標準クローニングを介してＦＳＹＲＳ遺伝子をｐＭＰベクターに導入することによって構築した。ＦＳＹＲＳ遺伝子を以下のプライマーで増幅し、Ｎｃｏ  ＩおよびＮｈｅ  Ｉで消化し、同じ制限酵素で前処理したｐＭＰベクターにライゲーションした。ＦＳＹＲＳ−ＮｃｏＩ−Ｆは、配列番号７である。ＦＳＹＲＳ−ＮｈｅＩ−Ｒは、配列番号８である。
【０３０１】
ｐＥＴ−Ｄｕｅｔ−Ａｆｂ４Ａ−７Ｘ−ＭＢＰ−Ｚ２４ＴＡＧ：ＦＳＹのインビボ架橋能力を評価するために、ｐＥＴ−Ｄｕｅｔ−Ａｆｂ４Ａ−７Ｘ−ＭＢＰ−Ｚ２４ＴＡＧプラスミドを、部位特異的突然変異誘発を介して、ｐＥＴ−Ｄｕｅｔ−ＭＢＰ−Ｚ２４ＴＡＧ発現ベクター内のＡｆｂ４Ａ−７Ｘ（Ｘ＝Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、またはＡｌａ）遺伝子の残基７に突然変異を導入することによって生成した。Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎｉ，８：２２４０（２０１７）。以下のプライマーを使用した。Ａｆｂ−４Ａ７Ａ−Ｆは、配列番号９である。Ａｆｂ−４Ａ７Ｋ−Ｆは、配列番号１０である。
【０３０２】
ｐＴａｋ−ＣａＭ−７６ＴＡＧ−８０Ｔｙｒ：ＦＳＹの分子内架橋能力を調査するために、遺伝子ＣａＭをコードするカルモジュリンの残基７６および８０を、それぞれアンバー停止コドンＴＡＧおよびＴｙｒに突然変異させた。一方、ＣａＭの残基７５、７７、７９、８１を、重複ＰＣＲを介してＡｌａに突然変異させ、架橋反応を補助した。ＣａＭ遺伝子を以下のプライマーで増幅し、Ｓｐｅ  ＩおよびＢｌｐ  Ｉで消化し、同じ制限酵素で前処理したｐＴａｋ−ＣａＭベクターにライゲーションした。ＣａＭ−ＳｐｅＩ−Ｆは、配列番号１８である。８０Ｔｙｒ−Ｒは、配列番号１９である。８０Ｔｙｒ−Ｆは、配列番号２０である。
【０３０３】
ｐＢａｄ−ＣｙｓＨ：ｐＢａｄ−ＣｙｓＨプラスミドを生成するために、遺伝子ＣｙｓＨをコードするＰＡＰＳ還元酵素をコロニーＰＣＲによって増幅し、Ｎｄｅ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化し、同じ制限酵素で前処理されたｐＢａｄベクターにライゲーションした。ＣｙｓＨ−ＮｄｅＩ−Ｆは、配列番号２２である。ＣｙｓＨ−Ｈｉｎｄ３−Ｒは、配列番号２３である。
【０３０４】
ｐＢａｄ−Ｔｒｘ３５Ａ６２ＴＡＧ：ｐＢａｄ−Ｔｒｘ３５Ａ６２ＴＡＧプラスミドを生成するために、Ｔｒｘ３５Ａ遺伝子の残基６２を、以下のプライマーを用いた部位特異的突然変異誘発を使用して、アンバー停止コドンＴＡＧに突然変異させた。Ｔｒｘ−６２ＴＡＧ−Ｆは、配列番号２４である。Ｔｒｘ−６２ＴＡＧ−Ｒは、配列番号２５である。
【０３０５】
タンパク質発現：
Ａｆｂ３６ＦＳＹ：ｐＴａｋ−Ａｆｂ３６ＴＡＧ−ＨｉｓおよびｐＢＫ−ＦＳＹＲＳを、ＤＨ１０Ｂ  Ｅ．ｃｏｌｉ化学能細胞に共形質転換した。形質転換体をＬＢ−Ｋａｎ５０Ｃｍ３４寒天プレート上に配置し、３７℃で一晩インキュベートした。単一のコロニーを５ｍＬの２ｘＹＴ−Ｋａｎ５０Ｃｍ３４に接種し、３７℃で一晩培養した。翌日、２ｍＬの一晩細胞培養物を１００ｍＬの２ｘＹＴ−Ｋａｎ５０Ｃｍ３４に希釈し、３７℃で激しく撹拌した。ＯＤ６００が０．４〜０．６に達したとき、細胞培養物の半分（５０ｍＬ）を１ｍＭのＦＳＹおよび０．５ｍＭのＩＰＴＧで補充し、次いで、３０℃で６時間誘導した。陰性対照として、残りの５０ｍＬの細胞培養物を、３０℃で６時間、０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。細胞ペレットを、４℃で３０分間、４２００ｇで遠心分離することによって収集し、−８０℃で貯蔵した。
【０３０６】
Ａｆｂ４Ａ−７ＸおよびＭＢＰ−Ｚ２４ＦＳＹ：ｐＥｖｏｌ−ＦＳＹＲＳおよびｐＥＴ−Ｄｕｅｔ−Ａｆｂ４Ａ−７Ｘ−ＭＢＰ−Ｚ２４ＴＡＧを、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ化学能細胞に共形質転換した。形質転換体をＬＢ−Ａｍｐ１００Ｃｍ３４寒天プレート上に配置し、３７℃で一晩インキュベートした。単一のコロニーを５ｍＬの２ｘＹＴ−Ａｍｐ１００Ｃｍ３４に接種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１ｍＬの一晩細胞培養物を５０ｍＬの２ｘＹＴ−Ａｍｐ１００Ｃｍ３４に希釈し、３７℃で激しく撹拌した。ＯＤ６００が０．４〜０．６に達したとき、細胞培養物を０．５ｍＭのＩＰＴＧおよび０．２％のアラビノースで誘導し、次いで、３７℃で６時間インキュベートした。細胞ペレットを、４℃で３０分間、４２００ｇで遠心分離することによって収集し、−８０℃で貯蔵した。
【０３０７】
ＣａＭ−７６ＦＳＹ−８０Ｔｙｒ：ｐＢａｄ−ＣａＭ７６ＴＡＧ８０ＴｙｒおよびｐＥｖｏｌ−ＦＳＹＲＳをＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ化学能細胞に共形質転換した。形質転換体をＬＢ−Ａｍｐ１００Ｃｍ３４寒天プレート上に配置し、３７℃で一晩インキュベートした。単一のコロニーを５ｍＬの２ｘＹＴ−Ａｍｐ１００Ｃｍ３４に接種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１ｍＬの一晩細胞培養物を５０ｍＬの２ｘＹＴ−Ａｍｐ１００Ｃｍ３４に希釈し、３７℃で激しく撹拌した。ＯＤ６００が０．４〜０．６に達したとき、細胞培養物を０．２％のアラビノースで誘導し、次いで、３７℃で６時間インキュベートした。細胞ペレットを、４℃で３０分間、４２００ｇで遠心分離することによって収集し、−８０℃で貯蔵した。
【０３０８】
Ｔｒｘ３５Ａ６２ＦＳＹ：ｐＢａｄ−Ｔｒｘ３５Ａ６２ＴＡＧおよびｐＥｖｏｌ−ＦＳＹＲＳをＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ化学能細胞に共形質転換した。形質転換体をＬＢ−Ａｍｐ１００Ｃｍ３４寒天プレート上に配置し、３７℃で一晩インキュベートした。単一のコロニーを５ｍＬの２ｘＹＴ−Ａｍｐ１００Ｃｍ３４に接種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１ｍＬの一晩細胞培養物を５０ｍＬの２ｘＹＴ−Ａｍｐ１００Ｃｍ３４に希釈し、３７℃で激しく撹拌した。ＯＤ６００が０．４〜０．６に達したとき、細胞培養物を０．２％のアラビノースで誘導し、次いで、３０℃で６時間インキュベートした。細胞ペレットを、４℃で３０分間、４２００ｇで遠心分離することによって収集し、−８０℃で貯蔵した。
【０３０９】
ＰＡＰＳ還元酵素：ｐＢａｄ−ＣｙｓＨを、ＤＨ１０Ｂ  Ｅ．ｃｏｌｉ化学能細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢ−Ａｍｐ１００寒天プレート上に配置し、３７℃で一晩インキュベートした。単一のコロニーを１０ｍＬの２ｘＹＴ−Ａｍｐ１００に接種し、３７℃で一晩培養した。翌日、１０ｍＬの一晩細胞培養物を１Ｌの２ｘＹＴ−Ａｍｐ１００に希釈し、３７℃で激しく撹拌した。ＯＤ６００が０．４〜０．６に達したとき、細胞培養物を０．２％のアラビノースで誘導し、次いで、３０℃で６時間インキュベートした。細胞ペレットを、４℃で３０分間、４２００ｇで遠心分離することによって収集し、−８０℃で貯蔵した。
【０３１０】
Ｈｉｓタグタンパク質精製：上記の細胞ペレットを、１４ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ  ２０、１０％ｖ／ｖのグリセロール、リゾザイム１ｍｇ／ｍＬ、ＤＮａｓｅ  ０．１ｍｇ／ｍＬ、およびプロテアーゼ阻害剤）に再懸濁した。細胞懸濁液を４℃で３０分間溶解した。細胞溶解物を、氷水浴中でＳｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３０％出力、３分、１秒オフ、１秒オン）で超音波処理し、続いて遠心分離を行った（２０，０００ｇ、３０分、４℃）。可溶性画分を収集し、事前平衡化Ｐｒｏｔｉｎｏ（登録商標）Ｎｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（４００μＬ）を用いて４℃で１時間、一定の機械的回転でインキュベートした。スラリーをＰｏｌｙ−Ｐｒｅｐ（登録商標）クロマトグラフィーカラムに充填し、５ｍＬの洗浄緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、および１０％ｖ／ｖのグリセロール）で３回洗浄し、２００μＬの溶出緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール、および１０％ｖ／ｖのグリセロール）で５回溶出させた。溶出液を濃縮し、緩衝液を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａカラムを使用して１００μＬのタンパク質貯蔵緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４または８．０、および１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に交換し、将来の分析のために−８０℃で貯蔵した。
【０３１１】
ＨｅＬａ−ＧＦＰ−１８２ＴＡＧレポーター細胞へのＵａａ組み込みのＦＡＣＳ分析：トランスフェクションの１日前に、４．５×１０４個のＨｅＬａ−ＥＧＦＰ−１８２ＴＡＧレポーター細胞（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１０：１０６３−１０７２（２００７））を、１０％のＦＢＳを有する５００μＬのＤＭＥＭ培地を含有するＧｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ２４ウェル細胞培養皿に播種し、ＣＯ２インキュベーター中３７℃でインキュベートした。プラスミドｐＭＰ−３ｘｔＲＮＡ−ＦＳＹＲＳ（５００ｎｇ、ＦＳＹＲＳおよびｔＲＮＡＰｙｌの３コピーをコードする）を、製造業者の指示に従って、２．５μＬのリポフェクタミン２０００を使用して標的細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後、トランスフェクション複合体を含有する培地を、１ｍＭ  ＦＳＹの存在下または非存在下で１０％  ＦＢＳを有する新鮮なＤＭＥＭ培地で置き換えた。ＡｚＦ組み込みのために、プラスミドｐＩｒｅ−Ａｚｉ３（Ｃｏｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，１５５：１２５８−１２６９（２０１３））を同様にトランスフェクトし、１ｍＭのＡｚＦの有無にかかわらず、１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地を使用した。３７℃で２４〜４８時間のインキュベーション後、トランスフェクトした細胞をトリプシン化し、遠心分離しによって収集した（１５００ｒｐｍ、５分、室温）。細胞を３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ、２％  ＦＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％アジドナトリウム、０．２８μＭ  ＤＡＰＩ）中に再懸濁し、ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）細胞分析器によって分析した。
【０３１２】
ＨｅＬａ−ＥＧＦＰ−１８２ＴＡＧレポーター細胞の蛍光共焦点顕微鏡：トランスフェクションの１日前に、４．５×１０４個のＨｅＬａ−ＥＧＦＰ−１８２ＴＡＧ細胞を、１０％のＦＢＳを有する５００μＬのＤＭＥＭ培地を含有するＧｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ  ＣＥＬＬビューガラス底皿に播種し、ＣＯ２インキュベーター中３７℃でインキュベートした。プラスミドｐＭＰ−３ｘｔＲＮＡ−ＦＳＹＲＳ（５００ｎｇ）を、製造業者の指示に従って、２．５μＬのリポフェクタミン２０００を使用して標的細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後、培地を１ｍＭのＦＳＹの有無にかかわらず完全なＤＭＥＭ培地で置き換えた。細胞を３７℃でさらに２４〜４８時間インキュベートし、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ共焦点顕微鏡で撮像した。
【０３１３】
質量分析：無傷のＦＳＹ含有Ａｆｂを、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムに結合したＡｇｉｌｅｎｔ  ６２１０質量分析計を使用して、ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析した。２マイクログラムのタンパク質試料を、オートサンプラーによって注入し、０〜８０％のアセトニトリルの逆相勾配により、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ８カラム（長さ２．１ｍｍ  ＩＤ×１０ｃｍ）上で１５分間分離した。分析の直前に質量較正を行った。タンパク質スペクトルを平均化し、電荷状態を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェアを使用してデコンボリューションした。
【０３１４】
タンパク質消化およびタンデム質量分析測定は、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎｉ．，８：２２４０（２０１７）によって以前に記載されたように行った。Ａｆｂ／ＭＢＰ−Ｚ試料をＧｌｕ−Ｃで消化した。ＣａＭおよびＴｒｘ１／ＰＡＰＳ還元酵素試料をトリプシンによって消化した。消化されたペプチドを、インラインＥＡＳＹスプレー源およびＥｌｉｔｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）と連動したナノ−ＬＣ  ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００高性能液体クロマトグラフィーシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で分析した。ペプチドを、２％〜４０％緩衝液Ｂ（８０％アセトニトリル、２０％  Ｈ２Ｏ、０．１％ギ酸）の勾配にわたって、ＥＡＳＹ−Ｓｐｒａｙ  ＰｅｐＭａｐ  Ｃ１８カラム（５０ｃｍ；粒径、２μｍ；孔径、１００Å；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）から流量３００ｎＬ／分で溶出させた。異なる試料について、分離方法にわずかな修正を加えた。エリート質量分析計を、データ依存モードで、Ｒ＝６０，０００（ｍ／ｚ＝２００）質量範囲が３７５〜１８００（ＡＧＣ標的１×１０６）、続いて１０回のＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ走査で操作した。３０秒の動的除外時間を使用し、単一荷電イオンを除外した。質量分析の生データは、Ｍａｘｑｕａｎｔによって検索された。
【０３１５】
実施例２
ＦＳＹを使用して、リガンドをその未変性受容体に共有結合させた。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、下垂体前葉によって分泌されるホルモンである。ｈＧＨは、ｈＧＨ受容体と結合し、ヒトの成長、細胞繁殖、および細胞再生を刺激する。また、インスリン様成長因子の産生を刺激する。成長ホルモン欠乏症は、米国の４０００人に１人の子供に影響を及ぼし、治療するのに高価であるため、ｈＧＨは、興味深い治療標的である（Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｔ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｏｂｅｓ．２０１２，１９．４７−５２）。加えて、過剰なｈＧＨは、乳癌の発達、進行、および転移に関与している（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，６：１５４３−１５５５（２０１７））。
【０３１６】
その受容体とのｈＧＨ結合の結晶構造に基づいて、ＦＳＹを、部位６８のｈＧＨに遺伝子的に組み込み、受容体の残基Ｌｙｓ１６６を標的とした（図１１）。Ｅ．ｃｏｌｉ中でｈＧＨ（ＦＳＹ６８）を発現させ、続いて精製した後、ｈＧＨ（ＦＳＹ）をＰＢＳ緩衝液中のｈＧＨ受容体の細胞外ドメインと共に異なる期間にわたってインキュベートした。次いで、反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ｈＧＨのＣ末端に付加されたＨｉｓｘ６タグに特異的な抗体を用いるウェスタンブロットを使用して検出した。
【０３１７】
図１２に示されるように、ｈＧＨ（ＦＳＹ）をｈＧＨ受容体と共有結合し、約５０ｋＤの新しいバンドによって示された。同じ条件下で野生型（ＷＴ）ｈＧＨを使用した場合、５０ｋＤで架橋バンドは検出されなかった。これらの結果は、ｈＧＨに組み込まれたＦＳＹが、ｈＧＨがその受容体と不可逆的に結合するのを可能にしたことを示している。
【０３１８】
また、ｈＧＨへのＦＳＹの組み込みが、その生物学的活性に影響を及ぼすかどうかも調べた。ｈＧＨがその受容体と結合すると、ＳＴＡＴ５は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介して下流シグナルとしてリン酸化され、細胞免疫、増殖、およびアポトーシスに重要な遺伝子の転写をもたらす（Ｗａｔｅｒｓ，ＭＪ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９９，１０７６０−７６４）。本発明者らは、ｈＧＨ受容体発現を有する細胞株であるＢＡＦ３細胞を、ｈＧＨ（ＷＴ）およびｈＧＨ（ＦＳＹ）で刺激し、次いで細胞溶解物のウェスタンブロット分析を使用してｐＳＴＡＴ５発現をプローブした。図１３に示されるように、ｈＧＨ（ＦＳＹ）は、ｈＧＨ（ＷＴ）と同じＳＴＡＴ５リン酸化を刺激する効果を示したが、ＰＢＳ緩衝液を使用した陰性対照は、ｐＳＴＡＴ５産生を示さなかった。したがって、これらの結果は、ｈＧＨへのＦＳＹの組み込みが、ｈＧＨのシグナル伝達能力に影響を与えなかったことを示している。
【０３１９】
配列一覧
配列番号１（ＦＳＹＲのアミノ酸配列）
ＭＤＫＫＰＬＮＴＬＩＳＡＴＧＬＷＭＳＲＴＧＴＩＨＫＩＫＨＨＥＶＳＲＳＫＩＹＩＥＭＡＣＧＤＨＬＶＶＮＮＳＲＳＳＲＴＡＲＡＬ
ＲＨＨＫＹＲＫＴＣＫＲＣＲＶＳＤＥＤＬＮＫＦＬＴＫＡＮＥＤＱＴＳＶＫＶＫＶＶＳＡＰＴＲＴＫＫＡＭＰＫＳＶＡＲＡＰＫＰＬＥ
ＮＴＥＡＡＱＡＱＰＳＧＳＫＦＳＰＡＩＰＶＳＴＱＥＳＶＳＶＰＡＳＶＳＴＳＩＳＳＩＳＴＧＡＴＡＳＡＬＶＫＧＮＴＮＰＩＴＳＭＳ
ＡＰＶＱＡＳＡＰＡＬＴＫＳＱＴＤＲＬＥＶＬＬＮＰＫＤＥＩＳＬＮＳＧＫＰＦＲＥＬＥＳＥＬＬＳＲＲＫＫＤＬＱＱＩＹＡＥＥＲＥ
ＮＹＬＧＫＬＥＲＥＩＴＲＦＦＶＤＲＧＦＬＥＩＫＳＰＩＬＩＰＬＥＹＩＥＲＭＧＩＤＮＤＴＥＬＳＫＱＩＦＲＶＤＫＮＦＣＬＲＰＭ
ＬＩＰＮＬＹＮＹＬＲＫＬＤＲＡＬＰＤＰＩＫＩＦＥＩＧＰＣＹＲＫＥＳＤＧＫＥＨＬＥＥＦＴＭＬＴＦＩＱＭＧＳＧＣＴＲＥＮＬＥ
ＳＩＩＴＤＦＬＮＨＬＧＩＤＦＫＩＶＧＤＳＣＭＶＬＧＤＴＬＤＶＭＨＧＤＬＥＬＳＳＡＶＶＧＰＩＰＬＤＲＥＷＧＩＤＫＰＫＩＧＡ
ＧＦＧＬＥＲＬＬＫＶＫＨＤＦＫＮＩＫＲＡＡＲＳＥＳＹＹＮＧＩＳＴＮＬ＊
【０３２０】
配列番号２（ＦＳＹＲの核酸（ＤＮＡ）配列）
ＡＴＧＧＡＴＡＡＡＡＡＧＣＣＴＴＴＧＡＡＣＡＣＴＣＴＧＡＴＴＴＣＴＧＣＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＴＧＧＡＴＧＴＣＣＣＧＣＡＣＣＧＧＣＡＣＣＡＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＴＡＧＣＣＧＴＴＣＣＡＡＡＡＴＣＴＡＣＡＴＴＧＡＡＡＴＧＧＣＴＴＧＣＧＧＣＧＡＴＣＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＣＡＡＣＡＡＣＴＣＣＣＧＴＴＣＴＴＣＴＣＧＴＡＣＣＧＣＴＣＧＣＧＣＡＣＴＧＣＧＣＣＡＣＣＡＣＡＡＡＴＡＴＣＧＣＡＡＡＡＣＣＴＧＣＡＡＡＣＧＴＴＧＣＣＧＴＧＴＴＡＧＣＧＡＴＧＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＴＣＣＴＧＡＣＣＡＡＡＧＣＴＡＡＣＧＡＧＧＡＴＣＡＧＡＣＣＴＣＣＧＴＡＡＡＡＧＴＧＡＡＧＧＴＡＧＴＡＡＧＣＧＣＴＣＣＧＡＣＣＣＧＴＡＣＴＡＡＡＡＡＧＧＣＴＡＴＧＣＣＡＡＡＡＡＧＣＧＴＧＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＣＧＡＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＴＣＡＧＧＣＴＣＡＡＣＣＡＴＣＣＧＧＴＴＣＴＡＡＡＴＴＴＴＣＴＣＣＧＧＣＧＡＴＣＣＣＡＧＴＧＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＡＡＴＣＴＧＴＴＴＣＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＡＧＣＧＴＧＴＣＴＡＣＣＡＧＣＡＴＴＡＧＣＡＧＣＡＴＴＴＣＴＡＣＣＧＧＴＧＣＴＡＣＣＧＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＧＧＴＡＡＡＡＧＧＴＡＡＣＡＣＴＡＡＣＣＣＧＡＴＴＡＣＴＡＧＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＣＣＧＧＴＡＣＡＧＧＣＡＡＧＣＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＡＣＴＡＡＡＴＣＣＣＡＧＡＣＧＧＡＣＣＧＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＣＡＡＡＧＧＡＴＧＡＡＡＴＣＴＣＴＣＴＧＡＡＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＴＴＴＣＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧＴＣＴＣＧＴＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＧＣＡＡＣＡＧＡＴＣＴＡＣＧＣＴＧＡＧＧＡＡＣＧＣＧＡＧＡＡＣＴＡＴＣＴＧＧＧＴＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＣＴＣＧＣＴＴＣＴＴＣＧＴＧＧＡＴＣＧＣＧＧＴＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＴＣＴＣＣＧＡＴＴＣＴＧＡＴＴＣＣＧＣＴＧＧＡＡＴＡＣＡＴＴＧＡＡＣＧＴＡＴＧＧＧＣＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧＡＴＡＣＣＧＡＡＣＴＧＴＣＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＡＴＡＡＡＡＡＣＴＴＣＴＧＴＣＴＧＣＧＴＣＣＧＡＴＧＣＴＧＡＴＴＣＣＧＡＡＣＴＴＧＴＡＣＡＡＣＴＡＴＴＴＡＣＧＴＡＡＡＣＴＧＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＣＣＧＧＡＣＣＣＧＡＴＣＡＡＡＡＴＡＴＴＣＧＡＧＡＴＣＧＧＴＣＣＴＴＧＣＴＡＣＣＧＴＡＡＡＧＡＧＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＡＣＡＴＴＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＧＧＴＡＧＣＧＧＴＴＧＣＡＣＧＣＧＴＧＡＡＡＡＣＣＴＧＧＡＡＴＣＣＡＴＴＡＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＴＣＡＣＣＴＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＴＴＣＡＡＡＡＴＴＧＴＴＧＧＴＧＡＣＡＧＣＴＧＴＡＴＧＧＴＧＴＴＡＧＧＣＧＡＴＡＣＧＣＴＧＧＡＴＧＴＴＡＴＧＣＡＣＧＧＣＧＡＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＴＴＣＣＧＣＡＧＴＴＧＴＧＧＧＣＣＣＡＡＴＣＣＣＧＣＴＧＧＡＴＣＧＴＧＡＧＴＧＧＧＧＴＡＴＣＧＡＣＡＡＡＣＣＴＡＡＡＡＴＣＧＧＴＧＣＧＧＧＴＴＴＴＧＧＴＣＴＧＧＡＧＣＧＴＣＴＧＣＴＧＡＡＡＧＴＡＡＡＡＣＡＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＡＴＣＡＡＡＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＡＧＴＣＣＴＡＴＴＡＣＡＡＴＧＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＴＡＡＣＣＴＧＴＡＡ
【０３２１】
配列番号３（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ  ＰｙｌＲＳの野生型アミノ酸配列）
ＭＤＫＫＰＬＮＴＬＩＳＡＴＧＬＷＭＳＲＴＧＴＩＨＫＩＫＨＨＥＶＳＲＳＫＩＹＩＥＭＡＣＧＤＨＬＶＶＮＮＳＲＳＳＲＴ
ＡＲＡＬＲＨＨＫＹＲＫＴＣＫＲＣＲＶＳＤＥＤＬＮＫＦＬＴＫＡＮＥＤＱＴＳＶＫＶＫＶＶＳＡＰＴＲＴＫＫＡＭＰＫＳＶ
ＡＲＡＰＫＰＬＥＮＴＥＡＡＱＡＱＰＳＧＳＫＦＳＰＡＩＰＶＳＴＱＥＳＶＳＶＰＡＳＶＳＴＳＩＳＳＩＳＴＧＡＴＡＳＡＬ
ＶＫＧＮＴＮＰＩＴＳＭＳＡＰＶＱＡＳＡＰＡＬＴＫＳＱＴＤＲＬＥＶＬＬＮＰＫＤＥＩＳＬＮＳＧＫＰＦＲＥＬＥＳＥＬＬ
ＳＲＲＫＫＤＬＱＱＩＹＡＥＥＲＥＮＹＬＧＫＬＥＲＥＩＴＲＦＦＶＤＲＧＦＬＥＩＫＳＰＩＬＩＰＬＥＹＩＥＲＭＧＩＤＮ
ＤＴＥＬＳＫＱＩＦＲＶＤＫＮＦＣＬＲＰＭＬＡＰＮＬＹＮＹＬＲＫＬＤＲＡＬＰＤＰＩＫＩＦＥＩＧＰＣＹＲＫＥＳＤＧＫ
ＥＨＬＥＥＦＴＭＬＮＦＣＱＭＧＳＧＣＴＲＥＮＬＥＳＩＩＴＤＦＬＮＨＬＧＩＤＦＫＩＶＧＤＳＣＭＶＹＧＤＴＬＤＶＭＨ
ＧＤＬＥＬＳＳＡＶＶＧＰＩＰＬＤＲＥＷＧＩＤＫＰＷＩＧＡＧＦＧＬＥＲＬＬＫＶＫＨＤＦＫＮＩＫＲＡＡＲＳＥＳＹＹＮＧＩＳＴＮＬ＊
【０３２２】
配列番号４（ｔＲＮＡＰｙｌの核酸配列）ｇｇａａａｃｃｔｇａｔｃａｔｇｔａｇａｔｃｇａａｔｇｇａｃｔｃｔａａａｔｃｃｇｔｔｃａｇｃｃｇｇｇｔｔａｇａｔｔｃｃｃｇｇｇｇｔｔｔｃｃｇ
【０３２３】
配列番号５は、ＣＴＡＡＣＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＡＴＡＡＡＡＡＧＣＣＴである
【０３２４】
配列番号６は、ＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＡＧＧＴＴＡＧＴＡＧＡＡである
【０３２５】
配列番号７は、ＴＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＡＡＡＡＡＧＣＣＴＴＴＧである
【０３２６】
配列番号８は、ＣＴＡＴＧＣＴＡＧＣＴＴＡＣＡＧＧＴＴＡＧＴＡＧＡである
【０３２７】
配列番号９は、ＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＴＡＴＣＡＧＴＣＧＣＣＧＧＣである
【０３２８】
配列番号１０は、ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＣＴＡＴＣＡＧＴＣＧＣＣＧＧＣである
【０３２９】
配列番号１１は、ＡＡＣＴＧＣＧＡＡＣＴＡＴＣＡＧＴＣＧＣＣＧＧＣである
【０３３０】
配列番号１２は、ＡＡＣＡＧＣＧＡＡＣＴＡＴＣＡＧＴＣＧＣＣＧＧＣである
【０３３１】
配列番号１３は、ＡＡＣＡＣＣＧＡＡＣＴＡＴＣＡＧＴＣＧＣＣＧＧＣである
【０３３２】
配列番号１４は、ＡＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＡＴＣＡＧＴＣＧＣＣＧＧＣである
【０３３３】
配列番号１５は、ＧＡＡＣＧＣＧＴＴＧＴＣＴＡＣＣＡＴＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣである
【０３３４】
配列番号１６は、ＣＣＡＴＧＧＴＡＧＡＣＡＡＣＧＣＧＴＴＣＡＡＣＴＡＴＧＡＡＣＴＡＴＣＡＧＴＣＧＣＣである
【０３３５】
配列番号１７は、ＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＴＡＧＡＧＧＧＧである
【０３３６】
配列番号１８は、ＡＡＣＴＡＴＧＡＣＴＡＧＴＣＡＴＧＡＣＣＡＡＣＴＧＡＣである
【０３３７】
配列番号１９は、ＣＧＣＡＴＡＣＧＣＧＴＣＣＧＣＣＴＡＣＧＣＴＣＴＡＧＣＣＡＴＣＡＴＡＧＴである
【０３３８】
配列番号２０は、ＴＧＧＣＴＡＧＡＧＣＧＴＡＧＧＣＧＧＡＣＧＣＧＴＡＴＧＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＴＣＣＧである
【０３３９】
配列番号２１は、ＣＣＡＡＧＣＴＣＡＧＣＴＴＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧである
【０３４０】
配列番号２２は、ＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＣＣＡＡＡＣＴＣＧＡＴＣＴＡＡＡＣＧである
【０３４１】
配列番号２３は、ＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＴＧＴＡＡＣＣＣＡＣＡＴＴＣＣである
【０３４２】
配列番号２４は、ＧＡＡＣＡＴＣＧＡＴＴＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＣＡＣである
【０３４３】
配列番号２５は、ＡＧＴＴＴＴＧＣＡＡＣＧＧＴＣＡＧＴＴＴＧである
【図１Ａ】
2021515561.tif 000066
【図１Ｂ】
2021515561.tif 000067
【図１Ｃ】
2021515561.tif 000068
【図１Ｄ】
2021515561.tif 000069
【図１Ｅ】
2021515561.tif 000070
【図２Ａ】
2021515561.tif 000071
【図２Ｂ】
2021515561.tif 000072
【図２Ｃ】
2021515561.tif 000073
【図３Ａ】
2021515561.tif 000074
【図３Ｂ】
2021515561.tif 000075
【図３Ｃ】
2021515561.tif 000076
【図３Ｄ−１】
2021515561.tif 000077
【図３Ｄ−２】
2021515561.tif 000078
【図４Ｃ】
2021515561.tif 000079
【図５Ａ】
2021515561.tif 000080
【図５Ｂ】
2021515561.tif 000081
【図５Ｃ−１】
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【図５Ｃ−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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