(57)【要約】  被験体内のグラム陽性細菌を少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質に再感作する方法であって、被験体に少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質及び溶解素ポリペプチドを共投与し、それにより被験体内のグラム陽性細菌を少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質に再感作することを含む、方法が開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体内のグラム陽性細菌を少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質に再感作する方法であって、前記被験体に前記少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質と溶解素ポリペプチドとを共投与し、それにより前記被験体内の前記グラム陽性細菌を前記少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質に再感作することを含む、方法。
【請求項２】
前記グラム陽性細菌がブドウ球菌細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記グラム陽性細菌がスタフィロコッカス・アウレウスである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記グラム陽性細菌がメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記グラム陽性細菌がバンコマイシン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＶＲＳＡ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質がオキサシリン、ナフシリン及びセファゾリンからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質がオキサシリンである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記グラム陽性細菌が皮膚感染又は軟部組織感染、菌血症、心内膜炎、骨感染、関節感染、及び／又は肺炎を引き起こす、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記骨感染が骨髄炎である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶解素ポリペプチドの投与後に、前記少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質が、そのＭＩＣ用量を下回る投与量で前記グラム陽性細菌の菌数を減少させる、それを死滅させる、その増殖を阻害する、及び／又はそれを根絶するのに効果的である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
共投与工程の後に、前記少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質を前記グラム陽性細菌の菌数を減少させる、それを死滅させる、その増殖を阻害する、及び／又はそれを根絶するのに効果的な量で前記被験体に投与する工程を更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶解素ポリペプチドを、そのＭＩＣ用量を下回る用量で投与する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記溶解素ポリペプチドを単回用量で投与する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記溶解素ポリペプチドが配列番号１〜１７からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号１〜１７に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性及び溶菌活性を有するその変異体を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記溶解素ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶解素ポリペプチドが配列番号３〜１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶解素ポリペプチドを前記少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質と実質的に同時に投与する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶解素ポリペプチドを前記少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質の投与の前に投与する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記溶解素ポリペプチドを前記少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質の投与の少なくとも２４時間前に投与する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
非生物表面上のグラム陽性細菌を少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質に再感作する方法であって、前記非生物表面に少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質と溶解素ポリペプチドとを共投与することを含み、前記非生物表面が前記少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質に耐性を示すグラム陽性細菌に感染しており、前記共投与工程により前記非生物表面上のグラム陽性細菌の量が減少し、前記グラム陽性細菌が前記少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質に再感作される、方法。
【請求項２１】
共投与工程の後に、前記少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質を、再感作された前記グラム陽性細菌の菌数を減少させる、それを死滅させる、その増殖を阻害する、及び／又はそれを根絶するのに効果的な量で前記非生物表面に投与する工程を更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記非生物表面がカテーテル、吸入器、挿管具、弁、外科用器械又は人工器官等の医療器具である、請求項２０又は２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１８年６月２２日付で出願された米国仮特許出願第６２／６８８，７５６号の利益を主張し、その出願日に依拠し、その開示全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【０００２】
［配列表］
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。２０１９年６月１８日付けで作製された上記ＡＳＣＩＩコピーの名前は０３４１＿００１７＿００＿３０４．ｔｘｔであり、３６８６４バイトのサイズである。
【０００３】
本開示は、概して抗菌剤、より具体的には溶解素ポリペプチド及びグラム陽性細菌を死滅させ、グラム陽性細菌を抗生物質に再感作する上での抗生物質と組み合わせたこれらのペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
抗生物質耐性は、世界的に増加しており、特に、（ａ）様々な病気及び他の病態を治療するために投与される抗生物質の使用の増加及び長期化、（ｂ）低い患者コンプライアンス、並びに（ｃ）既存の抗生物質に対する耐性を発現した病原体に対して採用することができる新たな抗微生物剤の不足の影響を受ける。
【０００５】
バクテリオファージエンドリシン（溶解素）は、細菌感染に対抗し、細菌耐性を克服する有望な代替的又は相補的なアプローチである。溶解素は、バクテリオファージによって自然に産生され得るペプチドグリカンヒドロラーゼである。外部から細菌と接触することで、組換えにより作製された溶解素ポリペプチドは、細菌を直接溶解し、死滅させる（１）、（２）。溶解素は、病原体への抗生物質剤のアクセスを促進することによっても抗生物質耐性を克服することができる。近年、幾つかの研究から、器官限局性（organ-confined）感染及び全身感染において粘膜表面上の病原体を制御する、これらの酵素の人間医学及び獣医学における大きな可能性が示されている。
【０００６】
グラム陽性細菌は、ポリペプチド及び多糖を含有する細胞壁に囲まれている。グラム陽性細胞壁は、約２０ｎｍ〜８０ｎｍの厚さであり得る幅広い緻密な壁のように見え、ペプチドグリカンの多数の相互接続層を含有する。グラム陽性細胞壁の６０％〜９０％が細胞形状、剛構造、及び浸透圧衝撃に対する耐性をもたらすペプチドグリカンである。細胞壁は、グラム染色クリスタルバイオレットを排除せず、細胞が紫色に染色され、したがって「グラム陽性」に分類される。
【０００７】
バクテリオファージ溶菌酵素は、様々な投与経路を介した被験体における様々なタイプの感染の特異的治療に有用であるとして確立されている。例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５及び特許文献６を参照されたい。Fischetti et al.に対する米国特許第９，０３４，３２２号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）は、溶解素ＰｌｙＳｓ２を含む、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）細菌に由来するバクテリオファージ溶解素に関する。これらの溶解素ポリペプチドは、ブドウ球菌、Ｂ群レンサ球菌、腸球菌及びリステリア細菌株等のグラム陽性細菌を含む複数の細菌に対して広範な死滅活性を示す。
【０００８】
ＰｌｙＳｓ２溶解素は、動物モデルにおいてスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）細菌を死滅させ、抗生物質と相乗作用を示すことが可能である。ＰｌｙＳｓ２は、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＶＲＳＡ）等の抗生物質耐性スタフィロコッカス・アウレウスに対して効果的であることが示されている。
【０００９】
抗微生物耐性は、β−ラクタム系抗生物質に関してよく知られている世界的な健康への脅威であるが、耐性を克服する戦略は、より高用量のβ−ラクタム系抗生物質の使用、β−ラクタマーゼ阻害剤との組合せ、及び新たなクラスの抗生物質の開発に限られている。ＭＲＳＡの治療に使用される薬物クラス（例えば、グリコペプチド、環状リポペプチド及びオキサゾリジノン）に対する耐性の出現は、新たな脅威となる。ＰｌｙＳｓ２及び他のグラム陽性溶解素は、例えばスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）感染性心内膜炎及び菌血症の治療のために開発され、標準治療の抗生物質に加えて使用される、組換えにより作製されたバクテリオファージ由来の溶解素（細胞壁ヒドロラーゼ）の新たなクラスである。
【００１０】
ＰｌｙＳｓ２は、１）ＭＲＳＡ、並びにバンコマイシン耐性株、ダプトマイシン耐性株及びリネゾリド耐性株を含む全てのスタフィロコッカス・アウレウス株に対する急速かつ強力な溶菌効果、２）強力な抗バイオフィルム活性、３）抗ブドウ球菌抗生物質との相乗作用、４）低い細菌耐性傾向、並びに５）抗生物質に対する耐性の出現をｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで抑制する能力を示す。
【００１１】
このため、薬物耐性細菌を以前は不活性であったβ−ラクタム系抗生物質に再感作し、それによりβ−ラクタム系抗生物質の有用性を回復するＰｌｙＳｓ２及び他のグラム陽性溶解素の能力が有益である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第５，９８５，２７１号
【特許文献２】米国特許第６，０１７，５２８号
【特許文献３】米国特許第６，０５６，９５５号
【特許文献４】米国特許第６，２４８，３２４号
【特許文献５】米国特許第６，２５４，８６６号
【特許文献６】米国特許第６，２６４，９４５号
【発明の概要】
【００１３】
本願は、グラム陽性細菌を少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質に再感作する方法における溶解素ポリペプチドの使用を開示する。１つの態様では、本方法は、前記被験体に少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質と溶解素ポリペプチドとを共投与し、それにより前記被験体内の前記グラム陽性細菌を前記少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質に再感作することを含む。或る特定の実施の形態では、本方法は、共投与工程の後に、前記少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質を、再感作された前記グラム陽性細菌の菌数（population）を減少させる、それを死滅させる、その増殖を阻害する、及び／又はそれを根絶するのに効果的な量で前記被験体に投与する工程を更に含む。
【００１４】
別の態様では、本方法は、非生物表面に少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質と溶解素ポリペプチドとを共投与することを含み、前記非生物表面が前記少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質に耐性を示すグラム陽性細菌に感染しており、前記共投与工程により前記非生物表面上のグラム陽性細菌の量が減少し、前記グラム陽性細菌が前記少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質に再感作される。或る特定の実施の形態では、本方法は、共投与工程の後に、前記少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質を、再感作された前記グラム陽性細菌の菌数を減少させる、それを死滅させる、その増殖を阻害する、及び／又はそれを根絶するのに効果的な量で前記非生物表面に投与する工程を更に含む。或る特定の実施の形態では、非生物表面は、限定されるものではないが、カテーテル、吸入器、挿管具、弁、外科用器械又は人工器官を含む医療器具である。
【００１５】
或る特定の実施の形態では、溶解素ポリペプチドを少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質の前、例えば少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質の少なくとも２４時間前に投与する。或る特定の実施の形態では、溶解素ポリペプチド及び少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質を実質的に同時に投与する。或る特定の実施の形態では、溶解素ポリペプチドを単回用量で投与する。或る特定の実施の形態では、少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質は、溶解素ポリペプチドの投与の前にグラム陽性細菌の菌数を減少させる、それを死滅させる、その増殖を阻害する、及び／又はそれを根絶するのに効果的ではない。
【００１６】
本明細書に開示のグラム陽性細菌を再感作する方法の或る特定の実施の形態では、グラム陽性細菌は、スタフィロコッカス・アウレウス等のブドウ球菌細菌である。或る特定の実施の形態では、少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質は、オキサシリン、ナフシリン及びセファゾリンからなる群から選択される。或る特定の実施の形態では、少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質は、オキサシリンである。或る特定の実施の形態では、グラム陽性細菌はＭＲＳＡであり、幾つかの実施の形態では、グラム陽性細菌はＶＲＳＡである。
【００１７】
本開示の或る特定の態様では、グラム陽性細菌は、皮膚感染又は軟部組織感染、菌血症、心内膜炎、骨髄炎等の骨感染、関節感染、及び／又は肺炎を引き起こす。或る特定の態様では、前記溶解素ポリペプチドの投与後に、前記少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質は、そのＭＩＣ用量を下回る投与量で前記グラム陽性細菌の菌数を減少させる、それを死滅させる、その増殖を阻害する、及び／又はそれを根絶するのに効果的である。或る特定の態様では、溶解素ポリペプチドは、そのＭＩＣ用量を下回る投与量でグラム陽性細菌を再感作するのに効果的である。或る特定の実施の形態では、溶解素ポリペプチド及び少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質はどちらも、順次又は同時に投与する場合、それらのＭＩＣ用量を下回る用量でグラム陽性細菌の菌数を減少させる、それを死滅させる、その増殖を阻害する、及び／又はそれを根絶するのに効果的である。
【００１８】
或る特定の実施の形態では、前記溶解素ポリペプチドは、配列番号１〜１７からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号１〜１７に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性及び溶菌活性を有するその変異体を含む。或る特定の実施の形態では、前記溶解素ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施の形態では、前記溶解素ポリペプチドは、配列番号３〜１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例２に記載される１回目の試験のＭＲＳＡ株ＭＷ２についての耐性条件下での連続継代の日数の関数としてのオキサシリン及びＰｌｙＳｓ２溶解素のＭＩＣ値の倍率変化を示すグラフである。
【図２】実施例２に記載される２回目の試験のＭＲＳＡ株ＭＷ２についての耐性条件下での連続継代の日数の関数としてのオキサシリン及びＰｌｙＳｓ２溶解素のＭＩＣ値の倍率変化を示すグラフである。
【図３】実施例２に記載される３回目の試験のＭＲＳＡ株ＭＷ２についての耐性条件下での連続継代の日数の関数としてのオキサシリン及びＰｌｙＳｓ２溶解素のＭＩＣ値の倍率変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
本明細書で使用される場合、以下の用語及びその同語源語は、文脈上そうでないことが明示されない限り、下記の意味を有するものとする。
【００２１】
「担体」は、活性化合物と共に投与される溶媒、添加剤、賦形剤、分散媒、可溶化剤、コーティング剤、保存料、等張剤及び吸収遅延剤（absorption delaying agent）、界面活性剤、噴射剤、希釈剤、ビヒクル等を指す。かかる担体は、滅菌液、例えば水、生理食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール水溶液、及び石油、動物、植物又は合成起源のものを含む油、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等であり得る。
【００２２】
「薬学的に許容可能な担体」は、生理学的に適合するあらゆる溶媒、添加剤、賦形剤、分散媒、可溶化剤、コーティング剤、保存料、等張剤及び吸収遅延剤、界面活性剤、噴射剤、希釈剤、ビヒクル等を指す。担体（複数の場合もある）は、薬剤中で通常使用される量で治療対象の被験体に有害でないという意味で「許容可能」でなくてはならない。薬学的に許容可能な担体は、組成物をその意図される目的に不適なものにすることなく組成物の他の成分に適合する。さらに、薬学的に許容可能な担体は、過度の有害な副作用（毒性、刺激及びアレルギー応答等）なしに本明細書に提示される被験体への使用に適している。副作用は、それらのリスクが組成物によってもたらされる利益を上回る場合に「過度」である。薬学的に許容可能な担体又は賦形剤の非限定的な例としては、任意の標準的な医薬担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水、水、並びに油／水エマルション及びマイクロエマルション等のエマルションが挙げられる。好適な医薬担体は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences by E.W. Martin, 18th Editionに記載されている。
【００２３】
「殺菌」は、細菌の初期菌数において１８時間〜２４時間にわたって少なくとも３ｌｏｇ１０（９９．９％）以上の減少の程度まで細菌の死滅を引き起こす特性を有するか、又は細菌を死滅させることが可能であることを指す。
【００２４】
「静菌」は、細菌細胞の増殖を阻害し、それにより細菌の初期菌数において１８時間〜２４時間にわたって２ｌｏｇ１０（９９％）以上かつ最大３ｌｏｇ弱の減少を引き起こすことを含む、細菌増殖を阻害する特性を有することを指す。
【００２５】
「抗菌剤」は、静菌剤及び殺菌剤の両方を指す。
【００２６】
「抗生物質」は、細菌に致死性又は増殖の低減等の負の影響を与える特性を有する化合物を指す。抗生物質は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌又はその両方に負の影響を与えることができる。例としては、抗生物質は、細胞壁ペプチドグリカンの生合成、細胞膜の完全性、又は細菌におけるＤＮＡ若しくはタンパク質の合成に影響を及ぼし得る。グラム陽性細菌に対して活性の抗生物質の非限定的な例としては、メチシリン、バンコマイシン、ダプトマイシン、ムピロシン、リソスタフィン、ペニシリン、クロキサシリン、エリスロマイシン、カルバペネム、セファロスポリン、グリコペプチド、リンコサミド、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン、スピラマイシン、及びフィダキソマイシンが挙げられる。
【００２７】
「薬物耐性」は、概して薬物の抗菌活性に耐性を示す細菌を指す。或る特定の方法で使用される場合、薬物耐性は、特に抗生物質耐性を指し得る。場合によっては、一般に特定の抗生物質の影響を受けやすい細菌は、抗生物質に対する耐性を発現し、それにより薬物耐性微生物又は株となる可能性がある。「多剤耐性」（「ＭＤＲ」）病原体は、各々が単剤療法として使用される少なくとも２つのクラスの抗微生物薬に対する耐性を発現した病原体である。例えば、スタフィロコッカス・アウレウスの或る特定の株は、メチシリン及び／又はバンコマイシンを含む幾つかの抗生物質に耐性を示すことが見出されている（Antibiotic Resistant Threats in the United States, 2013, U.S. Department of Health and Services, Centers for Disease Control and Prevention）。当業者は、薬物又は抗生物質に対する細菌の感受性又は耐性を決定する日常的な実験技術を用いて、細菌が薬物耐性であるかを容易に決定することができる。
【００２８】
「有効量」は、適切な頻度又は投与計画で適用又は投与した場合に、細菌増殖若しくは細菌負荷を予防、低減、阻害若しくは解消するか、又は治療される障害（例えば細菌病原体の増殖又は感染）の発症、重症度、期間若しくは進行を予防、低減若しくは改善するか、治療される障害の進展を予防するか、治療される障害の退行を引き起こすか、又は抗生物質若しくは静菌療法等の別の療法の予防効果若しくは治療効果（複数の場合もある）を高める若しくは改善するのに十分な量を指す。
【００２９】
「共投与する」は、順次的な２種類の薬剤、例えば溶解素ペプチド及び抗生物質又は任意の他の抗菌剤の別々の投与、並びに実質的に同時の、例えば単一の混合物／組成物中での、又は別個に与えられるが、それでも実質的に同時に、例えば同日又は２４時間中に異なる時点で被験体に投与される用量でのこれらの作用物質の投与を包含することを意図する。このような溶解素ペプチドと１つ以上の付加的な抗菌剤との共投与は、最大数日、数週間又は数ヶ月続く継続的な治療として行うことができる。さらに、用途に応じて、共投与は、継続的又は同延的（coextensive）である必要はない。例えば、用途が局所抗菌剤として、例えば細菌性潰瘍又は感染した糖尿病性潰瘍を治療することがであった場合、溶解素ポリペプチドを初めのみ、最初の抗生物質の使用の２４時間以内に投与することができ、その後、抗生物質の使用を溶解素ポリペプチドの更なる投与なしに継続してもよい。
【００３０】
「被験体」は、哺乳動物、植物、下等動物、単細胞生物又は細胞培養物を指す。例えば、「被験体」という用語は、細菌感染、例えばグラム陽性細菌又はグラム陰性細菌感染の影響を受けやすい又はそれを患う生物、例えば原核生物及び真核生物を含むことを意図する。被験体の例としては、哺乳動物、例えばヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット及びトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。或る特定の実施形態では、被験体はヒト、例えばかかる感染が全身性であるか、局所性であるか、又は別の形で特定の器官若しくは組織に集中若しくは限局しているかに関わらず、グラム陽性細菌による感染を患う、それを患うリスクがある又はその影響を受けやすいヒトである。
【００３１】
「ポリペプチド」は、「タンパク質」及び「ペプチド」という用語と区別なく使用され、アミノ酸残基からなるポリマーを指す。或る特定の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも約３０個のアミノ酸残基を有する。この用語は、単離形態のポリペプチドだけでなく、その活性フラグメント及び誘導体も含み得る。「ポリペプチド」という用語は、修飾溶解素ポリペプチドを含み、溶解素機能を維持する融合タンパク質又は融合ポリペプチドも包含する。文脈に応じて、ポリペプチドは、自然発生ポリペプチド、又は組換え、改変若しくは合成的に作製されたポリペプチドであり得る。特定の溶解素ポリペプチドは、例えば、酵素的若しくは化学的切断によって天然タンパク質から得るか若しくは取り出しても、又は従来のペプチド合成法（例えば、固相合成）若しくは分子生物学的手法（例えば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に開示されるもの）を用いて調製しても、又は戦略的に切断若しくはセグメント化して、同じ若しくは少なくとも１つの一般的な標的細菌に対する溶菌活性を維持する活性フラグメントを得てもよい。
【００３２】
「融合ポリペプチド」は、通例、異なる特性又は機能性を有する２つ以上のドメイン又はセグメントを有する融合発現産物を生じる、２つ以上の核酸セグメントの融合から得られる発現産物を指す。或る特定の実施形態では、「融合ポリペプチド」という用語は、直接、又はアミノ酸若しくはペプチドリンカーを介して共有結合的に連結した２つ以上の異種ポリペプチド又はペプチドを含むポリペプチド又はペプチドも指す。融合ポリペプチドを形成するポリペプチドは通例、Ｃ末端からＮ末端に連結されるが、Ｃ末端からＣ末端、Ｎ末端からＮ末端又はＮ末端からＣ末端に連結されてもよい。「融合ポリペプチド」という用語は、「融合タンパク質」という用語と区別なく使用される場合もある。このため、或る特定の構造「を含むポリペプチド」というオープンエンドの表現は、融合ポリペプチド又は構築物等の列挙される構造よりも大きい分子を含む。本明細書で言及される構築物は、融合ポリペプチド又はコンジュゲート（２つ以上の部分を連結することによる）として作製され得る。
【００３３】
「異種」は、天然では隣接しないヌクレオチド、ペプチド又はポリペプチドの配列を指す。例えば、本開示との関連で、「異種」という用語は、融合ペプチド又はポリペプチドが通常は天然に見られない２つ以上のペプチド及び／又はポリペプチドの組合せ又は融合、例えば増強した溶菌活性を有し得る、修飾溶解素ポリペプチド、並びにカチオン性及び／又はポリカチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、ｓｕｓｈｉペプチド（Ding et al. Cell Mol Life Sci., 65(7-8):1202-19 (2008)）、ディフェンシンペプチド（Ganz, T. Nature Reviews Immunology 3, 710-720 (2003)）、疎水性ペプチド及び／又は抗微生物ペプチドを記載するために使用することができる。２つ以上の溶解素ポリペプチド又はその活性フラグメントがこの定義に含まれる。これらを用いて溶菌活性を有する融合ポリペプチドを作製することができる。
【００３４】
「活性フラグメント」は、フラグメントが得られた単離ポリペプチドの１つ以上の機能又は生物活性を保持するポリペプチドの部分を指す。本明細書で使用される場合、溶解素ポリペプチドの活性フラグメントは、スタフィロコッカス・アウレウス等の少なくとも１つのグラム陽性細菌種の増殖を阻害するか、又はその菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。
【００３５】
「両親媒性ペプチド」は、親水性官能基及び疎水性官能基の両方を有するペプチドを指す。或る特定の実施形態では、二次構造により疎水性及び親水性アミノ酸残基が両親媒性ペプチドの両側（例えば、ペプチドが水等の溶媒中にある場合、内側対外側）に置かれる。これらのペプチドは、或る特定の実施形態では、αヘリックス二次構造等のヘリックス二次構造を取ることができる。
【００３６】
「カチオン性ペプチド」は、正に帯電したアミノ酸残基を高い割合で有するペプチドを指す。或る特定の実施形態では、カチオン性ペプチドは、８．０以上のｐＫａ値を有する。本開示との関連での「カチオン性ペプチド」という用語は、主に正に帯電したアミノ酸残基、例えばリシン及び／又はアルギニン残基で構成される、合成的に作製されたペプチドであるポリカチオン性ペプチドも包含する。正に帯電していないアミノ酸残基は、中性に帯電したアミノ酸残基、負に帯電したアミノ酸残基、及び／又は疎水性アミノ酸残基であり得る。
【００３７】
「疎水性基」は、水分子に対する親和性が低いか又は親和性を有しないが、油分子に対してより高い親和性を有するアミノ酸側鎖等の化学基を指す。疎水性物質は、水又は水相への溶解性が低いか又は溶解性を有しない傾向があり、通例非極性であるが、油相への溶解性がより高い傾向がある。疎水性アミノ酸の例としては、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）が挙げられる。
【００３８】
「高める（Augmenting）」は、本明細書で使用される場合、そうでない場合よりも高い抗微生物活性等の作用物質の活性の程度を指す。「高める」は、相加的効果及び相乗（超相加的（superadditive））効果を包含する。
【００３９】
「相乗的」又は「超相加的」は、独立して働く２つの作用物質の効果の総和を超える、組合せでの２つの物質によってもたらされる有益な効果を指す。或る特定の実施形態では、相乗又は超相加的効果は、独立して働く２つの作用物質の効果の総和を有意に、すなわち統計的に有意に超える。一方又は両方の活性成分を閾値下レベル、すなわち活性物質が個別に用いられる場合に効果を生じないか、又は非常に限られた効果しか生じないレベルで用いることができる。効果は、本明細書に記載されるチェッカーボードアッセイ等のアッセイによって測定することができる。
【００４０】
「治療」は、ヒトを含む被験体が、直接的又は間接的に、障害を治癒するか、又は病原体を根絶するか、又は被験体の状態を改善する目的で医療を受ける任意のプロセス、行為、適用、療法等を指す。治療は、発生率の低減、症状の軽減、再発の解消、再発の予防、発生の予防、発生リスクの低減、症状の改善、予後の改善、又はそれらの組合せも指す。「治療」は、被験体における細菌の菌数、増殖速度又は病原性を低減することで、被験体における細菌感染、又は器官、組織若しくは環境の細菌汚染を制御又は低減することを更に包含し得る。このため、発生率を低減する「治療」は、被験体であるか又は環境であるかを問わず、特定のミリュー（milieu）での少なくとも１つのグラム陽性細菌の増殖を阻害するのに効果的である。一方、既に確立された感染の「治療」は、感染又は汚染の原因となるグラム陽性細菌の菌数を減少させるか、それを死滅させるか、その増殖を阻害するか、及び／又はそれを根絶することを指す。
【００４１】
「予防する」という用語は、細菌感染等の障害の発生、再発、拡大、発症又は確立の予防を含む。本開示が感染の完全な予防又は感染の確立の予防に限定されることは意図されない。幾つかの実施形態では、発症を遅らせるか、又は続いて発症した（contracted）疾患の重症度若しくはその発症の可能性を低減することが予防例を構成する。特にバイオフィルムの予防に関して、この用語は、例えば対象の表面、例えば医療器具（例えば、吸入器、カテーテル、挿管具、弁又は他の人工器官）の表面への細菌の付着を妨げることによるバイオフィルムの形成の予防を含む。
【００４２】
「発症した疾患」は、発熱、敗血症又は菌血症の検出等の臨床症状又は不顕性（subclinical）症状が現れた疾患、並びにかかる病理と関連する症状が未だ現れていない場合の細菌病原体の増殖（例えば、培養物中での）によって検出され得る疾患を指す。特に、医療器具に関して、発症した疾患は、ブドウ球菌又はレンサ球菌細菌等の細菌を含有し、かかる器具の使用時に形成されるバイオフィルムを含むものとする。
【００４３】
ペプチド又はポリペプチド（本明細書で述べられるように活性フラグメントを含む）との関連での「誘導体」という用語は、例えば溶菌活性等のポリペプチドの活性に実質的に悪影響を与えない若しくは溶菌活性等のポリペプチドの活性を損なわない、アミノ酸以外の１つ以上の化学的部分を含有するように修飾されたポリペプチドを包含することを意図する。化学的部分は、例えばアミノ末端のアミノ酸残基、カルボキシ末端のアミノ酸残基又は内部アミノ酸残基を介してペプチドに共有結合的に連結することができる。かかる修飾は、天然であっても又は非天然であってもよい。或る特定の実施形態では、非天然修飾は、反応性部分への保護基若しくはキャップ基（capping group）の付加、抗体及び／又は蛍光標識等の検出可能な標識の付加、グリコシル化の付加若しくは修飾、又はＰＥＧ（ペグ化）等の嵩高基（bulking group）の付加、並びに当業者に既知の他の変化を含み得る。或る特定の実施形態では、非天然修飾は、Ｎ末端アセチル化及びＣ末端アミド化等のキャップ修飾であり得る。溶解素ポリペプチドに付加することができる、例示的な保護基としては、ｔ−Ｂｏｃ及びＦｍｏｃが挙げられるが、これらに限定されない。限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）及びｍＣｈｅｒｒｙ等の一般に使用される蛍光標識タンパク質は、細胞タンパク質の正常機能に干渉することなく、溶解素ポリペプチドに共有結合的若しくは非共有結合的に結合するか、又は溶解素ポリペプチドに融合させることができる小型のタンパク質である。或る特定の実施形態では、蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドが溶解素ポリヌクレオチド配列の上流又は下流に挿入される。これにより、細胞機能又はそれが結合した溶解素ポリペプチドの機能を妨げない融合タンパク質（例えば、溶解素ポリペプチド：：ＧＦＰ）が生じる。タンパク質へのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のコンジュゲーションが、多くの医薬タンパク質の循環半減期を延長する方法として使用されている。このため、溶解素ポリペプチド誘導体との関連で、「誘導体」という用語は、１つ以上のＰＥＧ分子の共有結合によって化学修飾された溶解素ポリペプチドを包含する。ペグ化溶解素ポリペプチドは、生物活性及び治療活性を保持した上で非ペグ化溶解素ポリペプチドと比較して延長された循環半減期を示すことが予想される。別の例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗菌活性を改善するために短いポリカチオン性及び両親媒性αヘリックスを溶解素ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に付加する、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗レンサ球菌活性を改善するために短いポリカチオン性及び両親媒性αヘリックスをレンサ球菌溶解素のＮ末端又はＣ末端に付加する「ａｒｔｉｌｙｓｉｎ」の使用である。
【００４４】
「パーセントアミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を達成するように配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後に、任意の保存的置換を配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチド配列、例えば溶解素ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指す。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、当業者の能力の範囲内の様々な方法で、例えばＢＬＡＳＴ等の公開されているソフトウェア、又は例えばDNASTARにより市販されているソフトウェアを用いて達成することができる。２つ以上のポリペプチド配列は、０％〜１００％の間のいずれか、又はその間の任意の整数値で同一であり得る。本開示との関連で、２つのポリペプチドは、アミノ酸残基の少なくとも８０％（好ましくは少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも９９％）が同一である場合に「実質的に同一」である。本明細書に記載される「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」という用語は、ペプチドにも当てはまる。このため、「実質的に同一」という用語は、本明細書に記載されるもの等の単離ポリペプチド及びペプチドの突然変異型、切断型、融合型、又は別の形で配列が修飾された変異体、及びその活性フラグメント、並びに参照（野生型又は他の無傷）ポリペプチドと比較して相当の配列同一性（例えば１つ以上の上記の方法によって測定される、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、又は少なくとも９９％の同一性）を有するポリペプチドを包含する。２つのアミノ酸配列は、アミノ酸残基の少なくとも約８０％が同一である（好ましくは少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の同一性、又は少なくとも約９９％の同一性）か、又は保存的置換を示す場合に「実質的に相同」である。本開示のポリペプチドの配列は、ポリペプチド、例えば本明細書に記載の溶解素及び／又は融合ポリペプチドのアミノ酸の１つ以上、又は幾つか、又は最大１０％、又は最大１５％、又は最大２０％が同様の又は保存的アミノ酸置換で置換され、得られるポリペプチド、例えば本明細書に記載の溶解素及び／又は融合ポリペプチドが、参照ポリペプチド、例えば本明細書に記載の溶解素及び／又は融合ポリペプチドの少なくとも１つの活性、抗菌効果及び／又は細菌特異性を有する場合に実質的に相同である。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。
【００４６】
「吸入用組成物」は、日常呼吸又は補助呼吸（例えば、気管気管支内（intratracheobronchial）投与、経肺投与及び／又は経鼻投与による）時の、又はそれと同時の気道への直接送達のために配合されている本開示の医薬組成物を指し、霧化、噴霧化、乾燥粉末及び／又はエアロゾル化配合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
「バイオフィルム」は、表面に付着し、細菌及び／又は宿主に由来する成分で構成され得る水和したポリマーマトリックス中に凝集した細菌を指す。バイオフィルムは、生物表面又は非生物表面上で細胞が互いに接着した微生物の凝集物である。これらの接着細胞は、限定されるものではないが、細胞外高分子物質（ＥＰＳ）で構成されるマトリックス中に埋め込まれることが多い。バイオフィルムのＥＰＳは、スライム（スライムと記載されたもの全てがバイオフィルムという訳ではない）又はプラークとも称され、一般に細胞外ＤＮＡ、タンパク質及び多糖で構成されるポリマー集塊である。或る特定の実施形態では、バイオフィルムは、ブドウ球菌及び／又はレンサ球菌細菌を含有し得る。
【００４８】
或る特定の細菌に対する使用に適した抗生物質との関連での「適した、好適な（Suitable）」は、耐性が後に発現する場合であっても、これらの細菌に対して効果的であることが見出された抗生物質を指す。
【００４９】
「野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素」及び「ＰｌｙＳｓ２溶解素」は、アミノ酸配列：ＭＴＴＶＮＥＡＬＮＮＶＲＡＱＶＧＳＧＶＳＶＧＮＧＥＣＹＡＬＡＳＷＹＥＲＭＩＳＰＤＡＴＶＧＬＧＡＧＶＧＷＶＳＧＡＩＧＤＴＩＳＡＫＮＩＧＳＳＹＮＷＱＡＮＧＷＴＶＳＴＳＧＰＦＫＡＧＱＩＶＴＬＧＡＴＰＧＮＰＹＧＨＶＶＩＶＥＡＶＤＧＤＲＬＴＩＬＥＱＮＹＧＧＫＲＹＰＶＲＮＹＹＳＡＡＳＹＲＱＱＶＶＨＹＩＴＰＰＧＴＶＡＱＳＡＰＮＬＡＧＳＲＳＹＲＥＴＧＴＭＴＶＴＶＤＡＬＮＶＲＲＡＰＮＴＳＧＥＩＶＡＶＹＫＲＧＥＳＦＤＹＤＴＶＩＩＤＶＮＧＹＶＷＶＳＹＩＧＧＳＧＫＲＮＹＶＡＴＧＡＴＫＤＧＫＲＦＧＮＡＷＧＴＦＫ（配列番号１；翻訳後プロセシング時に除去され、２４４アミノ酸ペプチドを残す最初のメチオニン残基を含む２４５個のアミノ酸残基）を有するポリペプチドを指す。
【００５０】
「修飾溶解素ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素の非自然発生の変異体（又はその活性フラグメント）を指す。修飾溶解素ポリペプチドは、ＣＨＡＰドメイン及び／又はＳＨ３ｂドメイン中に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、スタフィロコッカス・アウレウス等のグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。配列番号３〜１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する修飾溶解素ポリペプチド等の修飾溶解素ポリペプチドは、例えば国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０１９６３８号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に開示されている。この用語が本明細書で使用される場合、溶解素ポリペプチドは、修飾溶解素ポリペプチドを包含する。
【００５１】
本開示の溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントの溶菌活性（抗微生物活性）との関連で使用される「実質的に」は、少なくとも野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素の抗菌活性の相当部分を意味し、かかる活性に基づいて、溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントは、単独で又は１つ以上の抗生物質及び／又はリソスタフィン等の他の抗微生物剤と共に、細菌を死滅させることによってブドウ球菌又はレンサ球菌感染を阻害する、それに対抗する又はそれを解消するのに有用である。野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素と比較して実質的なかかる活性の非限定的な例は、野生型溶解素の約５倍以下、例えば約４倍以下、約３倍以下又は約２倍以下のＭＩＣを含む。他の活性の尺度は、例えば最小バイオフィルム除去濃度（ＭＢＥＣ）、又は例えばマウス好中球減少性大腿感染モデル（ＭＮＴＩ）等の動物モデルを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ有効性であり得る。更に他の尺度は、抗生物質（バンコマイシン、ダプトマイシン、又はオキサシリン、ナフシリン及びセファゾリンを含むβ−ラクタム系抗生物質等）と相乗作用を示す能力、又は抗生物質の細菌耐性の発現を改善する、予防する若しくは遅らせる能力であり得る。
【００５２】
溶解素ポリペプチド
本願は、グラム陽性細菌を少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質に再感作する方法における溶解素ポリペプチドの使用に関する。
【００５３】
溶解素ＰｌｙＳｓ２を含む溶解素ポリペプチドは、複数の細菌、特にブドウ球菌及びレンサ球菌細菌株を含むグラム陽性細菌に対して広範な死滅活性を示し、β−ラクタム系抗生物質を含む或る特定の抗生物質との組合せで著しい相乗作用をもたらし、抗生物質に必要とされる有効ＭＩＣ用量を大幅に減少させることができる。さらに、溶解素ＰｌｙＳｓ２を含む溶解素ポリペプチドは、或る特定のβ−ラクタム系抗生物質に、以前はそのβ−ラクタム系抗生物質の影響を受けにくかったグラム陽性細菌株を再感作する能力をもたらす。
【００５４】
溶解素ポリペプチドは、特に抗生物質に対する耐性を発現したグラム陽性細菌の再感作に使用される、例えばオキサシリン、ナフシリン、セファゾリンの１つ以上のようなβ−ラクタム系抗生物質、及び／又は同様の抗生物質を含む抗生物質と組み合わせるか又は共投与することができる。特定の態様では、溶解素ポリペプチドをオキサシリンと組み合わせるか又は共投与して、特にＭＲＳＡを含むスタフィロコッカス・アウレウスを含むグラム陽性細菌をオキサシリンに再感作する。特定の態様では、溶解素ポリペプチドをナフシリンと組み合わせるか又は共投与して、特にＭＲＳＡを含むスタフィロコッカス・アウレウスを含むグラム陽性細菌をナフシリンに再感作する。特定の態様では、溶解素ポリペプチドをセファゾリンと組み合わせるか又は共投与して、特にＭＲＳＡを含むスタフィロコッカス・アウレウスを含むグラム陽性細菌をセファゾリンに再感作する。本発明の一態様では、溶解素ポリペプチドとの組合せ又は共投与により、特にＭＲＳＡを含むスタフィロコッカス・アウレウス等のグラム陽性細菌を死滅させるのに必要とされる抗生物質の用量が大幅に減少する。
【００５５】
本発明によると、当業者の技能の範囲内の従来の分子生物学、微生物学及び組換えＤＮＡ技術を用いることができる。かかる技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989)、"Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III [Ausubel, R. M., ed. (1994)]、"Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-IIII [J. E. Celis, ed. (1994)]、"Current Protocols in Immunology" Volumes I-III [Coligan, J. E., ed. (1994)]、"Oligonucleotide Synthesis" [(M. J. Gait ed. 1984)]、"Nucleic Acid Hybridization" [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)]、"Transcription And Translation" [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]、"Animal Cell Culture" [R. I. Freshney, ed. (1986)]、"Immobilized Cells and Enzymes" [IRL Press, (1986)]及びB. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984)を参照されたい。
【００５６】
溶解素の非存在下での抗生物質の使用が失敗する条件下でのグラム陽性細菌感染における抗生物質の有効性の溶解素に依存した増強が本明細書に更に開示される。ＰｌｙＳｓ２に媒介される抗生物質の活性の増強を説明し、溶解素とβ−ラクタム系抗生物質との間の一般的相乗作用に加えてβ−ラクタム系抗生物質へのグラム陽性細菌の再感作を示すデータを本明細書に提示する。
【００５７】
ＰｌｙＳｓ２及び修飾溶解素ポリペプチドを含む本明細書に開示の溶解素ポリペプチドは、ブドウ球菌、レンサ球菌、リステリア又はエンテロコッカス細菌を含むグラム陽性細菌の多数の異なる株及び種を死滅させることが可能である。特に、ＰｌｙＳｓ２は、抗生物質感受性及び抗生物質耐性の両方のスタフィロコッカス・アウレウス株（例えば、ＭＳＳＡ及びＭＲＳＡ）を含むブドウ球菌株を死滅させる上で活性がある。ＰｌｙＳｓ２及び修飾溶解素ポリペプチドは、Ａ群及びＢ群レンサ球菌株を含むレンサ球菌株を死滅させる上でも活性がある可能性がある。
【００５８】
幾つかの実施形態では、本溶解素ポリペプチドは、抗生物質の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を低下させる。ＭＩＣを評定する任意の既知の方法を用いることができる。幾つかの実施形態では、チェッカーボードアッセイを用いて、抗生物質濃度に対する溶解素の影響を決定する。チェッカーボードアッセイは、微量液体希釈によるＭＩＣ決定のためのＣＬＳＩの方法の修正に基づく（Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), CLSI. 2015. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-10th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）及びCeri et al. 1999. J. Clin. Microbiol. 37: 1771-1776（同様にその全体が引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい）。
【００５９】
チェッカーボードを、初めに横軸に沿って、例えば各ウェルが同量の２倍希釈した抗生物質を含む９６ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートの列を作成することによって構築する。別のプレートに、縦軸に沿って各ウェルが同量の、例えば２倍希釈した溶解素を有する比較用の行を作成する。次いで、各列が一定量の抗生物質及び溶解素の２倍希釈物を含み、各行が一定量の溶解素及び抗生物質の２倍希釈物を含むように、溶解素及び抗生物質の希釈物を組み合わせる。これにより、各ウェルは、溶解素と抗生物質との独自の組合せを有する。細菌を所与の濃度で薬物の組合せに添加する。次いで、単独及び組合せでの各薬物のＭＩＣを、例えば周囲空気中にて３７℃で１６時間の後に記録する。部分阻止濃度の総和（ΣＦＩＣ）を各薬物について算出し、最小のΣＦＩＣ値（ΣＦＩＣｍｉｎ）を用いて溶解素／抗生物質の組合せの効果を決定する。
【００６０】
或る特定の実施形態では、溶解素ポリペプチドはＰｌｙＳｓ２又はその活性フラグメントである。ＰｌｙＳｓ２は、ストレプトコッカス・スイス細菌に由来し得るバクテリオファージ溶解素である。ＰｌｙＳｓ２は、ＭＲＳＡ及びＶＲＳＡ等の抗生物質耐性スタフィロコッカス・アウレウスを含むブドウ球菌、レンサ球菌、エンテロコッカス及びリステリア細菌株を含むグラム陽性細菌を含む複数の細菌に対して広範な死滅活性を示す。野生型ＰｌｙＳｓ２は、以下のアミノ酸配列を有する：ＭＴＴＶＮＥＡＬＮＮＶＲＡＱＶＧＳＧＶＳＶＧＮＧＥＣＹＡＬＡＳＷＹＥＲＭＩＳＰＤＡＴＶＧＬＧＡＧＶＧＷＶＳＧＡＩＧＤＴＩＳＡＫＮＩＧＳＳＹＮＷＱＡＮＧＷＴＶＳＴＳＧＰＦＫＡＧＱＩＶＴＬＧＡＴＰＧＮＰＹＧＨＶＶＩＶＥＡＶＤＧＤＲＬＴＩＬＥＱＮＹＧＧＫＲＹＰＶＲＮＹＹＳＡＡＳＹＲＱＱＶＶＨＹＩＴＰＰＧＴＶＡＱＳＡＰＮＬＡＧＳＲＳＹＲＥＴＧＴＭＴＶＴＶＤＡＬＮＶＲＲＡＰＮＴＳＧＥＩＶＡＶＹＫＲＧＥＳＦＤＹＤＴＶＩＩＤＶＮＧＹＶＷＶＳＹＩＧＧＳＧＫＲＮＹＶＡＴＧＡＴＫＤＧＫＲＦＧＮＡＷＧＴＦＫ（配列番号１）。配列番号１は、翻訳後プロセシング時に除去され、２４４アミノ酸ポリペプチドを残す最初のメチオニン残基を含む２４５個のアミノ酸残基を有する。アミノ酸残基１〜１４６は、ＣＨＡＰドメインに対応し、アミノ酸残基１５７〜２４５は、ＳＨ３ｂドメインに対応する。２つのドメイン間の自然発生リンカーは、ＰＰＧＴＶＡＱＳＡＰ（配列番号２）である。
【００６１】
或る特定の実施形態では、溶解素ポリペプチドは、溶菌活性を有する修飾溶解素ポリペプチドである。本明細書で使用される場合、「溶菌活性」は、細菌を死滅させるか、細菌の菌数を減少させるか、又は細菌増殖を阻害する溶解素の能力を包含する。溶菌活性は、バイオフィルムを除去若しくは低減する能力、及び／又は抗生物質の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を低下させる能力も包含する。修飾溶解素ポリペプチドは、野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素ポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことができ、野生型ＰｌｙＳｓ２溶解素ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ（ＣＨＡＰ）ドメイン及び細胞壁結合（ＳＨ３ｂ）ドメインを有し、少なくとも１つのアミノ酸置換は、ＣＨＡＰドメイン及び／又はＳＨ３ｂドメイン中にあり、修飾溶解素ポリペプチドは、グラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。通例、修飾溶解素ポリペプチドは、野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、ＣＨＡＰドメイン中にある。或る特定の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、ＳＨ３ｂドメイン中にある。或る特定の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、ＣＨＡＰドメイン及びＳＨ３ｂドメイン中にある。
【００６２】
幾つかの実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）等の参照溶解素ポリペプチドと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％又は例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００６３】
幾つかの実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、参照溶解素ポリペプチドの１つ以上の機能活性又は生物活性を保持する。幾つかの実施形態では、修飾により溶解素の抗菌活性が改善する。通例、溶解素変異体は、参照溶解素ポリペプチドと比較して改善されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗菌活性（例えば、緩衝液及び／又は培地中）を有する。他の実施形態では、溶解素変異体は、改善されたｉｎ  ｖｉｖｏ抗菌活性（例えば、動物感染モデル内）を有する。
【００６４】
或る特定の実施形態では、少なくとも１つの置換は、ＣＨＡＰドメイン中の配列番号１のアミノ酸残基３５、９２、１０４、１２８及び１３７から選択される少なくとも１つの位置にある。或る特定の実施形態では、少なくとも１つの置換は、ＳＨ３ｂドメイン中の配列番号１のアミノ酸残基１６４、１８４、１９５、１９８、２０４、２０６、２１２及び２１４から選択される少なくとも１つの位置にある。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、ＣＨＡＰドメイン中の配列番号１のアミノ酸３５、９２、１０４、１２８及び１３７から選択される少なくとも１つの位置での少なくとも１つの置換と、ＳＨ３ｂドメイン中の配列番号１のアミノ酸１６４、１８４、１９５、１９８、２０４、２０６、２１２及び２１４から選択される少なくとも１つの位置での少なくとも１つの置換とを有する。
【００６５】
幾つかの実施形態では、ＣＨＡＰドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｒ３５Ｅ、Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓからなる群から選択される。或る特定の実施形態では、ＳＨ３ｂドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｙ１６４Ｎ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、Ｒ１９５Ｅ、Ｓ１９８Ｈ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ｋ、Ｖ２０４Ａ、Ｉ２０６Ｅ、Ｖ２１２Ａ、Ｖ２１２Ｅ及びＶ２１４Ｇからなる群から選択される。
【００６６】
或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、ＣＨＡＰドメイン中のＲ３５Ｅ、Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換と、ＳＨ３ｂドメイン中のＹ１６４Ｎ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、Ｒ１９５Ｅ、Ｓ１９８Ｈ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ｋ、Ｖ２０４Ａ、Ｉ２０６Ｅ、Ｖ２１２Ａ、Ｖ２１２Ｅ及びＶ２１４Ｇからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換とを有する。
【００６７】
また他の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、ＣＨＡＰドメイン中に少なくとも２つのアミノ酸置換を有する。更に他の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、ＳＨ３ｂドメイン中に少なくとも２つのアミノ酸置換を有する。他の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、ＳＨ３ｂドメイン中に少なくとも３つのアミノ酸置換を有する。また他の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、ＣＨＡＰドメインとＳＨ３ｂドメインとの間に分散した５つ、６つ、７つ又は８つのアミノ酸置換を有し、或る特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列は、Ｒ３５Ｅ、Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｎ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、Ｒ１９５Ｅ、Ｓ１９８Ｈ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ｋ、Ｖ２０４Ａ、Ｉ２０６Ｅ、Ｖ２１２Ｅ、Ｖ２１２Ａ及びＶ２１４Ｇからなる群から選択される３つ〜９つのアミノ酸置換によって修飾される。
【００６８】
或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む：（ｉ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓ（ｐｐ５５）、（ｉｉ）Ｙ１６４Ｎ、Ｎ１８４Ｄ、Ｒ１９５Ｅ、Ｖ２０４Ｋ及びＶ２１２Ｅ（ｐｐ３８８）、（ｉｉｉ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｓ１９８Ｈ及びＩ２０６Ｅ（ｐｐ６１）、（ｉｖ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ａ及びＶ２１２Ａ（ｐｐ６５）、（ｖ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ及びＳ１９８Ｑ（ｐｐ２９６）、（ｖｉ）Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ及びＹ１６４Ｋ（ｐｐ６１６）、（ｖｉｉ）Ｒ３５Ｅ、Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓ（ｐｐ４００）、（ｖｉｉｉ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｖ２０４Ｋ及びＶ２１２Ｅ（ｐｐ６２８）、（ｉｘ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ｋ及びＶ２１２Ｅ（ｐｐ６３２）、（ｘ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｎ及びＮ１８４Ｄ（ｐｐ３２４）、（ｘｉ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｎ及びＲ１９５Ｅ（ｐｐ３２５）、（ｘｉｉ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｎ１８４Ｄ、Ｖ２０４Ａ及びＶ２１２Ａ（ｐｐ３４１）、（ｘｉｉｉ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ及びＹ１６４Ｋ（ｐｐ６１９）、（ｘｉｖ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｉ２０６Ｅ及びＶ２１４Ｇ（ｐｐ６４２）、並びに（ｘｖ）Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｎ１８４Ｄ及びＳ１９８Ｈ（ｐｐ３３８）。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号３〜１７の１つから選択されるアミノ酸配列を有する。
【００６９】
或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号３と少なくとも８５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号３と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
【００７０】
或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
【００７１】
或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
【００７２】
或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号６と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
【００７３】
或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号７と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号７と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
【００７４】
或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号８と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
【００７５】
或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号９と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
【００７６】
或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１０と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１０と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
【００７７】
或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１１と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
【００７８】
或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
【００７９】
或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１３と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１３と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
【００８０】
或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１４と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１４と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
【００８１】
或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１５と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
【００８２】
或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１６と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１６と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
【００８３】
或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１７と少なくとも８０％の配列同一性を有し、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１７と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
【００８４】
或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓ。或る特定の実施形態では、修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ及びＳ１９８Ｑ（ｐｐ２９６）。
【００８５】
本明細書に開示の修飾溶解素ポリペプチドの活性フラグメントであって、ＣＨＡＰドメイン及び／又はＳＨ３ｂドメイン中に１つ以上のアミノ酸置換を含む、活性フラグメントも開示される。
【００８６】
本明細書に開示される修飾ＰｌｙＳｓ２  ＣＨＡＰドメインと、別の溶解素の結合ドメイン又は別の溶解素の触媒ドメインと、本明細書に開示される修飾ＰｌｙＳｓ２  ＳＨ３ｂドメインとを含むキメラ溶解素が本明細書に更に開示される。
【００８７】
ポリヌクレオチド
一態様では、本開示は、本明細書に開示される溶解素ポリペプチド又はその活性フラグメントをコードする核酸分子を含む単離ポリヌクレオチドに関する。或る特定の実施形態では、溶解素ポリペプチドは、ＰｌｙＳｓ２溶解素ポリペプチド（配列番号１）である。或る特定の実施形態では、溶解素ポリペプチドは、修飾溶解素ポリペプチド（配列番号３〜１７）からなる群から選択される。或る特定の実施形態では、コードされる溶解素ポリペプチド又はその活性フラグメントは、グラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。
【００８８】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２ポリペプチド（配列番号１）と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、修飾溶解素ポリペプチドがＣＨＡＰドメイン中の配列番号１のアミノ酸残基３５、９２、１０４、１２８及び１３７から選択される少なくとも１つの位置での少なくとも１つのアミノ酸置換、及び／又はＳＨ３ｂドメイン中の配列番号１のアミノ酸残基１６４、１８４、１９５、１９８、２０４、２０６、２１２及び２１４から選択される少なくとも１つの位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸残基９２、１０４、１２８及び１３７にアミノ酸置換を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸残基９２、１０４、１２８、１３７、１６４、１８４及び１９８にアミノ酸置換を含む。
【００８９】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換の１つ以上を含む：Ｒ３５Ｅ、Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｎ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、Ｒ１９５Ｅ、Ｓ１９８Ｈ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ｋ、Ｖ２０４Ａ、Ｉ２０６Ｅ、Ｖ２１２Ｅ、Ｖ２１２Ａ及びＶ２１４Ｇ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがＣＨＡＰドメイン中に位置する以下のアミノ酸置換の１つ以上：Ｒ３５Ｅ、Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓ、及び／又はＳＨ３ｂドメイン中に位置する以下のアミノ酸置換の１つ以上：Ｙ１６４Ｎ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、Ｒ１９５Ｅ、Ｓ１９８Ｈ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ｋ、Ｖ２０４Ａ、Ｉ２０６Ｅ、Ｖ２１２Ａ、Ｖ２１２Ｅ及びＶ２１４Ｇを含む。
【００９０】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号３と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
【００９１】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｓ１９８Ｈ、及びＩ２０６Ｅ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号４のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。
【００９２】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ａ、及びＶ２１２Ａ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号５のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。
【００９３】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、及びＳ１９８Ｑ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号６のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。或る特定の実施形態では、コードされる修飾溶解素ポリペプチドは、配列番号６と少なくとも８５％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
【００９４】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、及びＮ１８４Ｄ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号７のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。
【００９５】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｎ、及びＲ１９５Ｅ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号８のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。
【００９６】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｎ１８４Ｄ、及びＳ１９８Ｈ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号９のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。
【００９７】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｎ１８４Ｄ、Ｖ２０４Ａ、及びＶ２１２Ａ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１０のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。
【００９８】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｙ１６４Ｎ、Ｎ１８４Ｄ、Ｒ１９５Ｅ、Ｖ２０４Ｋ、及びＶ２１２Ｅ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１１のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。
【００９９】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｒ３５Ｅ、Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ及びＹ１３７Ｓ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１２のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。
【０１００】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、及びＹ１６４Ｋ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１３のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。
【０１０１】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、及びＹ１６４Ｋ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１４のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。
【０１０２】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｖ２０４Ｋ、及びＶ２１２Ｅ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１５のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。
【０１０３】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｎ１８４Ｄ、Ｓ１９８Ｑ、Ｖ２０４Ｋ、及びＶ２１２Ｅ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１６のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。
【０１０４】
或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１に対して以下のアミノ酸置換を含む：Ｌ９２Ｗ、Ｖ１０４Ｓ、Ｖ１２８Ｔ、Ｙ１３７Ｓ、Ｙ１６４Ｋ、Ｉ２０６Ｅ、及びＶ２１４Ｇ。或る特定の実施形態では、核酸分子は、修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドが配列番号１７のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する修飾溶解素ポリペプチドをコードし、修飾溶解素ポリペプチドがグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させ、任意に修飾溶解素ポリペプチドが野生型ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）と比較して低下した免疫原性を有する。
【０１０５】
ベクター及び宿主細胞
別の態様では、本開示は、本明細書に開示の溶解素ポリペプチドをコードする核酸分子を含む単離ポリヌクレオチド又は本単離ポリヌクレオチドの相補配列を含むベクターに関する。幾つかの実施形態では、ベクターはプラスミド又はコスミドである。他の実施形態では、ベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲートすることができる。幾つかの実施形態では、ベクターは、それが導入された宿主細胞において自律的に複製することができる。幾つかの実施形態では、ベクターは、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれることで、宿主ゲノムと共に複製され得る。
【０１０６】
幾つかの実施形態では、本明細書で「組み換え発現ベクター」又は「発現ベクター」と称される特定のベクターは、それらが操作可能に連結した遺伝子の発現を誘導することができる。ポリヌクレオチド配列は、別のヌクレオチド配列と機能的関係に置かれる場合、「操作可能に連結する」。例えば、プロモーター又は調節ＤＮＡ配列は、ＲＮＡ及び／又はタンパク質をコードするＤＮＡ配列に、２つの配列が操作可能に連結する、すなわちプロモーター又は調節ＤＮＡ配列がコード又は構造ＤＮＡ配列の発現レベルに影響を及ぼすように位置する場合に「操作可能に連結した」と言われる。操作可能に連結したＤＮＡ配列は、必ずしもというわけではないが、通例、連続する。
【０１０７】
概して、ポリペプチドを宿主内で維持、増加又は発現するのに適した任意の系又はベクターを本明細書に開示の溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントの発現に使用することができる。適切なＤＮＡ／ポリヌクレオチド配列を様々な既知の日常的な手法、例えばSambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001)に記載される手法のいずれかによって発現系に挿入することができる。さらに、簡便な単離方法を得るためにタグ、例えばｃ−ｍｙｃ、ビオチン、ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ等を本開示の溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントに付加することもできる。かかる発現系のキットが市販されている。
【０１０８】
広範な宿主／発現ベクターの組合せを、本溶解素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の発現に用いることができる。多数の好適なベクターが当業者に既知であり、市販されている。適切なベクターの例は例えば、Sambrook et al, eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001)に提示されている。かかるベクターとしては、特に染色体ベクター、エピソームベクター及びウイルス由来ベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入因子、酵母染色体要素、バキュロウイルス、ＳＶ４０等のパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルス等のウイルスに由来するベクター、並びにそれらの組合せに由来するベクター、例えばプラスミドとコスミド及びファージミド等のバクテリオファージ遺伝要素とに由来するベクターが挙げられる。
【０１０９】
さらに、上記ベクターは、本開示の溶解素ポリペプチドの構成的又は誘導性発現をもたらすことができる。好適なベクターとしては、ＳＶ４０の誘導体、並びに既知の細菌プラスミド、例えば大腸菌プラスミドｃｏｌＥｌ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体、ＲＰ４、ｐＢＡＤ２４及びｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ等のプラスミド；ファージＤＮＡ、例えばファージＡの多数の誘導体、例えばＮＭ９８９、並びに他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３及び繊維状一本鎖ファージＤＮＡ；２Ｄプラスミド等の酵母プラスミド又はその誘導体；昆虫又は哺乳動物細胞に有用なベクター等の真核細胞に有用なベクター；ファージＤＮＡ又は他の発現制御配列を用いるように改変されたプラスミド等のプラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。上述のベクターの多くがNew England Biolabs Inc.、Addgene、Takara Bio Inc.、ThermoFisher Scientific Inc.等の供給業者から市販されている。
【０１１０】
さらに、ベクターは、様々な調節要素（プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する様々なシスエレメントを含む）を含んでいてもよく、ベクターは、宿主細胞に応じて構築される。広範な発現制御配列（それに操作可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現を制御する配列）のいずれかを、本開示の溶解素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現するために、これらのベクターに用いることができる。有用な制御配列としては、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマ又はアデノウイルスの初期又は後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ＬＴＲ系、ファージＡの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄ外被タンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼ（例えば、Ｐｈｏ５）のプロモーター、酵母接合因子のプロモーター、細菌における発現のための大腸菌プロモーター、並びに原核若しくは真核細胞、又はそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られる他のプロモーター配列、並びにそれらの様々な組合せが挙げられるが、これらに限定されない。通例、溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列は、異種プロモーター又は調節要素に操作可能に連結する。
【０１１１】
別の態様では、本開示は、本開示の溶解素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む本明細書に開示のベクターのいずれかを含む単離宿主細胞に関する。広範な宿主細胞が本ポリペプチドの発現に有用である。本ポリペプチドの発現に適した宿主細胞の非限定的な例としては、大腸菌、シュードモナス属、バシラス属、ストレプトミセス属の株、酵母等の真菌、並びに組織培養物中のＣＨＯ、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ及びＬ−Ｍ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ  １、ＣＯＳ  ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０及びＢＭＴ１０）等の動物細胞、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、並びにヒト細胞及び植物細胞等の既知の真核生物及び原核生物宿主が挙げられる。
【０１１２】
発現宿主は、任意の既知の発現宿主細胞であってもよいが、典型的な実施形態では、発現宿主は大腸菌株の１つである。これらとしては、Ｔｏｐ１０（ThermoFisher Scientific, Inc.）、ＤＨ５ａ（Thermo Fisher Scientific, Inc.）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Agilent Technologies, Inc.）、ＳＣＳ１１０（Agilent Technologies, Inc.）、ＪＭ１０９（Promega, Inc.）、ＬＭＧ１９４（ATCC）及びＢＬ２１（Thermo Fisher Scientific, Inc.）等の市販の大腸菌株が挙げられるが、これらに限定されない。大腸菌を宿主系として使用することの利点は幾つかあり、最適な環境条件下で、その倍加時間が約２０分間である急速な増殖動態（Sezonov et al., J. Bacterial. 189 8746-8749 (2007)）、容易に達成される高密度の培養物、外来性ＤＮＡによる容易かつ急速な形質転換等が挙げられる。プラスミド選択及び株選択を含む、大腸菌におけるタンパク質発現に関する詳細は、Rosano, G. and Ceccarelli, E., Front Microbial., 5: 172 (2014)に詳細に論考されている。
【０１１３】
本溶解素ポリペプチドの効率的な発現は、最適発現シグナル（転写及び翻訳の両方のレベルで）、正確なタンパク質フォールディング及び細胞増殖特性等の様々な要因によって決まる。ベクターを構築する方法及び構築した組換えベクターを宿主細胞に形質導入する方法に関して、当該技術分野で既知の従来の方法を利用することができる。全てのベクター、発現制御配列及び宿主が本開示の溶解素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現するよう同様に良好に機能するわけではないことが理解されるが、当業者は、本開示の範囲から逸脱することなく所望の発現を達成するために過度な実験なしに適当なベクター、発現制御配列及び宿主を選択することが可能である。
【０１１４】
本開示の溶解素ポリペプチドは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む既知の方法によって組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。高速液体クロマトグラフィーを溶解素ポリペプチド精製に用いることもできる。
【０１１５】
代替的には、本開示の溶解素ポリペプチドの作製に用いられるベクター系は、無細胞発現系であってもよい。様々な無細胞発現系が市販されており、限定されるものではないが、Promega、LifeTechnologies、Clonetech等から入手可能なものが挙げられる。
【０１１６】
溶解素ポリペプチドを含む組成物
本明細書に開示の溶解素ポリペプチドは、単独で又は１つ以上の従来の抗生物質及び他の殺菌剤と共に抗微生物及び殺菌組成物、並びにその単位剤形に組み込まれ得る。
【０１１７】
通例、組成物は、本明細書に開示される溶解素ポリペプチドを、グラム陽性細菌を死滅させるのに効果的な量で含有する。或る特定の実施形態では、グラム陽性細菌は、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）；リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）；スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）群、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（Staphylococcus saprophyticus）群、スタフィロコッカス・シミュランス（Staphylococcus simulans）群、スタフィロコッカス・インターメディウス（Staphylococcus intermedius）群、スタフィロコッカス・シウリ（Staphylococcus sciuri）群及びスタフィロコッカス・ヒイカス（Staphylococcus hyicus）群等のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌；ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）；ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）；ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Streptococcus agalactiae）；ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ（Streptococcus dysgalactiae）；ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）；ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosis）群、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）群、ストレプトコッカス・サングイニス（Streptococcus sanguinis）群、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）群、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）群及びストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）群等の緑色レンサ球菌群に含まれる種；エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）；並びにエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）からなる群から選択される。
【０１１８】
本明細書に開示の組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル、液体を含むカプセル、散剤、徐放製剤、坐剤、タンポン塗布、エアロゾル、スプレー、ロゼンジ剤、トローチ剤、キャンディ、注射剤、チューインガム、軟膏、擦り込み剤、時間放出貼付剤、液体を吸収したワイプ、及びそれらの組合せの形態を取り得る。したがって、組成物は、固体、例えば錠剤、再構成のための凍結乾燥粉末、リポソーム若しくはミセルとして利用され得るか、又は組成物は、液体、例えば液剤、懸濁剤、含嗽剤（gargles）、乳剤、若しくは固体若しくは液体を充填した、例えば経口使用のためのカプセルとして利用され得る。或る特定の実施形態では、組成物は、直腸投与のための坐剤若しくはカプセルの形態、又は非経口（例えば、静脈内又は皮下を含む）若しくは局所、例えば皮膚、鼻、咽頭若しくは肺への使用のための滅菌注射用若しくは吸入用溶液若しくは懸濁液の形態であり得る。かかる組成物には医薬組成物が含まれ、その単位剤形は、付加的な活性化合物又は成分を伴う又は伴わない、従来の又は特別な割合での従来の又は新たな成分を含み得る。かかる単位剤形は、用いるべき意図される１日投与量範囲に応じた任意の好適な有効量の活性成分を含有し得る。
【０１１９】
担体及び賦形剤は、ヒト又は動物への使用に許容可能な多種多様の物質から選択することができる。薬学的に許容可能な担体又は賦形剤の非限定的な例としては、標準的な薬学的担体、例えばリン酸緩衝食塩水、水、ポリオール、二糖又は多糖、並びにエマルション、例えば油／水エマルション及びマイクロエマルションが挙げられる。他の安定化賦形剤としては、安定化剤及び保護溶液（ＳＰＳ）の保護されたブレンド、シクロデキストリン、並びに組換えヒトアルブミン（ｒＨＳＡ）が挙げられる。他の賦形剤としては、充填剤、緩衝剤、浸透圧調整剤（例えば塩及びアミノ酸）、界面活性剤、保存料、抗酸化剤、及び共溶媒を挙げることができる。本明細書に開示の溶解素ポリペプチドを含む固形経口組成物について、好適な薬学的に許容可能な賦形剤としては、限定されないが、デンプン、糖、希釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等が挙げられる。液体経口組成物について、好適な薬学的に許容可能な賦形剤としては、限定されないが、水、グリコール、油、アルコール、矯味剤、保存料等を挙げることができる。局所固形組成物、例えばクリーム剤、ゲル剤、フォーム、軟膏、又はスプレーについて、好適な賦形剤としては、限定されないが、クリーム剤、セルロース性又は油性の基剤、乳化剤、硬化剤、レオロジー調整剤又は増粘剤、界面活性剤、皮膚軟化剤、保存料、保湿剤、アルカリ化剤又は緩衝剤、及び溶媒を挙げることができる。
【０１２０】
例えば、本明細書に開示の溶解素ポリペプチドは、液体懸濁液、溶液又はエマルションのｐＨを溶解素ポリペプチドの活性に実質的に影響を及ぼさない範囲内に維持する緩衝液と組み合わせることができる。例えば、組成物又は投与時に活性成分が見られる環境の望ましいｐＨ範囲は約４．０〜約９．０、例えば約４．５〜約８．５であり得る。
【０１２１】
溶解素ポリペプチドが最適化された形で活性を発揮するように安定化緩衝液が任意に含まれていてもよい。緩衝液は、ジチオスレイトール等の還元試薬を含有し得る。安定化緩衝液は、エチレンジアミン四酢酸ジナトリウム塩等の金属キレート試薬であっても若しくはそれを含んでいてもよく、又はリン酸緩衝液若しくはクエン酸リン酸緩衝液、若しくはＴｒｉｓ若しくはコハク酸エステル等の任意の他の緩衝剤を含有していてもよい。
【０１２２】
温和な界面活性剤が、組成物に使用される溶解素ポリペプチドの治療効果を高めるのに効果的な量で医薬組成物中に含まれていてもよい。好適な温和な界面活性剤としては、特にポリオキシエチレンソルビタン及び脂肪酸のエステル（Ｔｗｅｅｎシリーズ等）、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘシリーズ等）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ポロキサマー、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリエチレングリコール、並びに生物学的に生じる界面活性剤、例えば脂肪酸、グリセリド、モノグリセリド、デオキシコール酸及びデオキシコール酸のエステルを挙げることができる。
【０１２３】
保存料を本明細書に開示の組成物に使用してもよく、例えば全組成物の約０．０５重量％〜約０．５重量％を占めることができる。保存料の使用は、製品が微生物で汚染される場合、配合物が微生物の増殖を予防又は軽減する（又は配合物の効力を弱める）ことを確実にし得る。例示的な保存料としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、クロロキシレノール、安息香酸ナトリウム、ＤＭＤＭヒダントイン、３−ヨード−２−プロピルブチルカルバメート、ソルビン酸カリウム、クロルヘキシジンジグルコン酸塩、又はそれらの組合せが挙げられる。
【０１２４】
経口投与のため、本明細書に開示の溶解素ポリペプチドは、固形又は液体の製剤、例えば錠剤、カプセル、散剤、液剤、懸濁剤、及び分散剤に配合され得る。錠剤又はカプセルの形態での経口投与のため、活性成分は１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤、例えば結合剤（例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えばラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、他の還元及び非還元糖、微結晶性セルロース、硫酸カルシウム、又はリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、ステアリン酸、フマル酸ステアリルナトリウム、ベヘン酸グリセリル、ステアリン酸カルシウム等）；崩壊剤（例えばジャガイモデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）；湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）、着色及び矯味剤、ゼラチン、甘味料、天然及び合成ガム（例えばアカシア、トラガント又はアルギン酸塩）、緩衝塩、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス等と組み合わせられ得る。液体形態での経口投与のため、薬物成分は、非毒性の、薬学的に許容可能な不活性の担体（例えばエタノール、グリセロール、水）、懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ剤、セルロース誘導体又は水素化食用油脂）、乳化剤（例えばレシチン又はアカシア）、非水性ビヒクル（例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール又は分画された植物油）、保存料（例えばメチル若しくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）等と組み合わせられ得る。安定化剤、例えば抗酸化剤（例えばＢＨＡ、ＢＨＴ、プロピルガレート、アスコルビン酸ナトリウム又はクエン酸）を加えて、剤形を安定化させることもできる。
【０１２５】
或る特定の実施形態では、錠剤を当該技術分野で既知の方法によってコーティングしてもよい。本明細書に開示の組成物を、例えばポリグリコール酸／乳酸（ＰＧＬＡ）から製造されたマイクロスフェア又はマイクロカプセル内に導入することもできる。経口投与用の液体製剤は、例えば溶液、シロップ、エマルション若しくは懸濁液の形態を取ることができ、又は使用前に水若しくは他の好適なビヒクルで再構成される乾燥製品として与えることができる。経口投与用の製剤は、活性化合物の制御又は遅延（postponed）放出をもたらすように適切に配合することができる。
【０１２６】
活性剤を小型単層ベシクル、大型単層ベシクル及び多層ベシクル等のリポソーム送達系の形態で投与してもよい。リポソームは、既知のコレステロール、ステアリルアミン又はホスファチジルコリン等の様々なリン脂質から形成することができる。
【０１２７】
錠剤及び丸剤等の固体組成物を調製するために、本明細書に開示される溶解素ポリペプチドを医薬賦形剤と混合し、固体製剤化前（preformulation）組成物を形成することができる。必要に応じて、錠剤を標準的な手法により糖コーティング又は腸溶コーティングしてもよい。錠剤又は丸剤をコーティングするか又は他の形で調合して、持続性又は遅延作用の利点をもたらす剤形を得ることができる。例えば、錠剤又は丸剤が内部投薬成分（dosage component）及び外部投薬成分を含み、後者が前者の外層の形態であってもよい。２つの成分が、胃内での崩壊に対抗し、内部成分が無傷で十二指腸に運ばれるか又は更に放出を遅らせるように働く腸溶層で隔てられてもよい。様々な材料をかかる腸溶層又はコーティングに使用することができ、かかる材料としては、多数のポリマー酸、並びにポリマー酸とセラック、セチルアルコール及び酢酸セルロース等の材料との混合物が挙げられる。同様に、経口投与される薬剤を拡散制御系、浸透圧デバイス（osmotic devices）、溶解制御マトリックス及び浸食性／分解性マトリックスを含む時間制御放出ビヒクルの形態で投与することができる。
【０１２８】
本明細書に開示される局所用組成物は、皮膚科学的に又は耳に（otically）許容可能な担体等の薬学的又は生理学的に許容可能な担体を更に含み得る。かかる担体は、皮膚科学的に許容可能な担体の場合、皮膚、爪、粘膜、組織及び／又は毛髪に適合することができ、これらの要件を満たす任意の通常使用される皮膚用担体を含み得る。耳に許容可能な担体の場合、担体は耳の全ての部位に適合することができる。かかる担体は、当業者が容易に選択することができる。本明細書に開示の化合物の局所投与用の担体としては、鉱油、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン及び／又はポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水が挙げられるが、これらに限定されない。皮膚用軟膏の配合では、本開示の活性成分を油脂性炭化水素基剤、無水吸水性基剤、油中水型吸水性基剤、水中油型水除去性（water-removable）基剤及び／又は水溶性基剤中に配合することができる。耳用組成物の配合では、本開示の活性成分を担体、例えばデキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、多糖ゲル、Ｇｅｌｒｉｔｅ（商標）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロースポリマー、及びアクリル酸のポリマー又はコポリマー等のカルボキシ含有ポリマー、並びに他のポリマー粘滑剤を含む水性ポリマー懸濁液中に配合することができる。本明細書に開示される局所用組成物は、水性、水性アルコール性若しくは油性溶液、ローション若しくは血清分散液、水性、無水若しくは油性ゲル、水相への脂肪相（fatty phase）の分散（Ｏ／Ｗ又は水中油型）、若しくは逆に脂肪相への水相の分散（Ｗ／Ｏ又は油中水型）によって得られるエマルション、マイクロエマルション、若しくは代替的にはマイクロカプセル、マイクロ粒子、又はイオン性及び／又は非イオン性の脂質ベシクル分散液、クリーム、ローション、ゲル、フォーム（加圧キャニスター、好適なアプリケーター、乳化剤及び不活性噴射剤が用いられ得る）、エッセンス、乳液、懸濁液、又はパッチを含む局所適用に適した任意の形態であり得る。本明細書に開示の局所用組成物は、親水性又は親油性ゲル化剤、親水性又は親油性活性剤、保存剤、酸化防止剤、溶媒、香料、増量剤、日焼け止め剤、消臭剤（odor-absorbers）及び染料等の補助剤を含有していてもよい。更なる態様では、本明細書に開示の局所用組成物は、被験体の皮膚、又は他の組織若しくは器官に付着するか又は他の形で結合することが可能であり、治療有効量の本明細書に開示される１つ以上の溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントを送達することが可能である経皮パッチ、包帯剤、パッド、ラップ、マトリックス及び包帯等の道具を用いて投与することができる。
【０１２９】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示の局所用組成物は、局所熱傷の治療に使用される１つ以上の成分を付加的に含む。かかる成分としては、プロピレングリコールヒドロゲル；グリコール、セルロース誘導体及び水溶性アルミニウム塩の組合せ；防腐剤；抗生物質；並びにコルチコステロイドを挙げることができるが、これらに限定されない。保湿剤（固体又は液体ワックスエステル等）、吸収促進剤（親水性クレイ又はデンプン等）、粘度上昇剤（viscosity building agents）及び皮膚保護剤を添加することもできる。局所用配合物は、洗口液等の洗浄剤の形態であってもよい。例えば、国際公開第２００４／００４６５０号を参照されたい。
【０１３０】
本明細書に開示の溶解素ポリペプチドは、適切な量の溶解素ポリペプチドと担体とを含む治療剤の注射によって投与することもできる。例えば、溶解素ポリペプチドは、グラム陽性細菌等の細菌による感染を治療するために筋肉内に、脳室内に、髄腔内に、真皮下に（subdermally）、皮下に、腹腔内に、静脈内に、又は直接注射若しくは持続注入によって投与することができる。担体は、蒸留水、生理食塩水、アルブミン、血清又はそれらの任意の組合せで構成され得る。さらに、非経口注射の医薬組成物は、溶解素ポリペプチドの薬学的に許容可能な水溶液又は非水溶液を以下の１つ以上に加えて含み得る：ｐＨ緩衝液、補助剤（例えば、保存料、湿潤剤、乳化剤、安定化剤及び分散剤）、リポソーム配合物、ナノ粒子、分散液、懸濁液及びエマルション、並びに使用直前に滅菌注射用溶液又は分散液に再構成される滅菌粉末。
【０１３１】
或る特定の実施形態では、注射用の配合物は単位剤形で、例えばアンプル又は複数回投与用容器内で与えることができ、或る特定の実施形態では、保存料が添加され得る。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の賦形剤、懸濁液、溶液又はエマルション等の形態を取ることができ、懸濁化剤、安定化剤、充填剤及び／又は分散剤等の調合剤（formulatory agents）を含有し得る。活性成分は、使用前に好適なビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水で再構成される粉末形態であってもよい。緩衝剤の例としては、ヒスチジン、Ｔｒｉｓ、リン酸、コハク酸、クエン酸、メチオニン、シスチン、グリシン、温和な界面活性剤、カルシウム及びマグネシウムを挙げることができる。ジチオスレイトール等の還元剤が含まれていてもよい。
【０１３２】
非経口注射が選ばれる投与方法である場合、等張配合物が使用され得る。概して、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、スクロース、グルコース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを挙げることができる。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水等の等張液を使用してもよい。安定化剤としては、ヒスチジン、メチオニン、グリシン、アルギニン、ゼラチン、及びヒト又はウシ血清アルブミン等のアルブミンを挙げることができる。上述の賦形剤の多くが注射用の組成物にも使用され得ることが当業者には容易に理解される。
【０１３３】
血管収縮剤を本明細書に開示の組成物に添加することができる。或る特定の実施形態では、組成物は、滅菌かつパイロジェンフリーで提供され得る。
【０１３４】
別の実施形態では、本明細書に開示の組成物は、乾燥吸入用粉末、又はエアロゾル若しくはスプレー等の他の吸入用組成物であり得る。本明細書に開示の吸入用組成物は、薬学的に許容可能な担体を更に含み得る。吸入による投与については、溶解素ポリペプチドは、好適な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の好適なガスを用いた吸入器、加圧エアロゾルディスペンサー又はネブライザー等の器具からのエアロゾルスプレーの提供の形態で都合よく送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を送達するための弁を設けることによって決定することができる。吸入器又は注入器に使用される、例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジを、活性成分とラクトース又はデンプン等の好適な粉末基剤との粉末混合物を含有させて配合することができる。
【０１３５】
一実施形態では、本明細書に開示の溶解素ポリペプチドは、乾燥吸入用粉末、又はエアロゾル若しくはスプレーとして配合することができる。具体的な実施形態では、溶解素ポリペプチド吸入溶液には、エアロゾル送達のための噴射剤を更に配合することができる。或る特定の実施形態では、溶液を噴霧することができる。多くの分注器具が、吸入によるポリペプチドを含む医薬組成物の送達のために当該技術分野で利用可能である。これらにはネブライザー、加圧エアロゾルディスペンサー及び吸入器が含まれる。
【０１３６】
薬剤と噴射剤との間の表面張力及び界面張力を低下させるために、界面活性剤を本明細書に開示される吸入用医薬組成物に添加することができる。薬剤、噴射剤及び賦形剤で懸濁液を形成する場合、界面活性剤が必要とされる場合も又は必要とされない場合もある。薬剤、噴射剤及び賦形剤で溶液を形成する場合、特定の薬剤及び賦形剤の溶解性に部分的に依存して、界面活性剤が必要とされる場合も又は必要とされない場合もある。界面活性剤は、薬剤と反応せず、薬剤、賦形剤及び噴射剤間の表面張力を低下させ、及び／又は弁潤滑剤として作用する任意の好適な非毒性の化合物であり得る。
【０１３７】
好適な界面活性剤の例としては、限定されないが、オレイン酸；ソルビタントリオレエート；塩化セチルピリジニウム；大豆レシチン；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート；ポリオキシエチレン（１０）ステアリルエーテル；ポリオキシエチレン（２）オレイルエーテル；ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンエチレンジアミンブロックコポリマー；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート；ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー；ひまし油エトキシレート及びそれらの組合せが挙げられる。
【０１３８】
好適な噴射剤の例としては、限定されないが、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ−テトラフルオロエタン及び二酸化炭素が挙げられる。
【０１３９】
吸入用組成物における使用に適した賦形剤の例としては、限定されないが、ラクトース、デンプン、中鎖脂肪酸のプロピレングリコールジエステル；中鎖、短鎖若しくは長鎖、又はそれらの組合せの脂肪酸のトリグリセリドエステル；パーフルオロジメチルシクロブタン；パーフルオロシクロブタン；ポリエチレングリコール；メントール；ラウログリコール；ジエチレングリコールモノエチルエーテル；中鎖脂肪酸のポリグリコール化グリセリド；アルコール；ユーカリ油；短鎖脂肪酸；及びそれらの組合せが挙げられる。
【０１４０】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示の組成物は、鼻腔適用を含む。鼻腔適用としては、例えば、鼻腔用スプレー、鼻腔用ドロップ、鼻腔用軟膏、鼻腔用洗浄液、鼻腔用注射剤、鼻腔用パッキング、気管支スプレー、及び吸入剤、又は咽喉ロゼンジ剤、洗口液若しくは含嗽剤の間接的な使用によるもの、又は鼻孔若しくは顔へ適用される軟膏の適用の使用によるもの、又はこれらの及び類似の適用方法の任意の組合せが挙げられる。
【０１４１】
本明細書に開示の組成物は、直腸投与のために、例えば坐剤又は停留浣腸（例えば、ココアバター又は他のグリセリド等の従来の坐剤基剤を含有する）として配合することもできる。
【０１４２】
或る特定の実施形態では、本明細書に開示の組成物は、グラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させるのに効果的な少なくとも１つの抗生物質等の少なくとも１つの抗生物質を更に含み得る。或る特定の実施形態では、少なくとも１つの抗生物質は、スタフィロコッカス・アウレウス；リステリア・モノサイトゲネス；スタフィロコッカス・エピデルミディス群、スタフィロコッカス・サプロフィティカス群、スタフィロコッカス・シミュランス群、スタフィロコッカス・インターメディウス群、スタフィロコッカス・シウリ群及びスタフィロコッカス・ヒイカス群等のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌；ストレプトコッカス・スイス；ストレプトコッカス・ピオゲネス；ストレプトコッカス・アガラクティアエ；ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ；ストレプトコッカス・ニューモニアエ；ストレプトコッカス・アンギノーサス群、ストレプトコッカス・ミティス群、ストレプトコッカス・サングイニス群、ストレプトコッカス・ボビス群、ストレプトコッカス・サリバリウス群及びストレプトコッカス・ミュータンス群等の緑色レンサ球菌群に含まれる種；エンテロコッカス・フェカーリス；並びにエンテロコッカス・フェシウムの１つ以上に対して効果的である。
【０１４３】
本明細書に開示の組成物の或る特定の実施形態では、少なくとも１つの抗生物質と組み合わせた溶解素ポリペプチドは、相乗作用、例えばグラム陽性細菌の少なくとも１つの種の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる溶解素ポリペプチド、そのフラグメント、又は抗生物質の能力における相乗作用を示すことができる。相乗作用は、２つの活性剤の組合せの阻害活性を指す場合があり、組合せの部分阻止濃度（ＦＩＣ）指数は１未満、強い相乗作用については、０．５以下である。作用物質のＦＩＣは、別の作用物質と組み合わせて使用した場合に細菌を死滅させるその作用物質の最小濃度を、第１の作用物質を単独で使用した場合に同じ効果を有する第１の作用物質の濃度で除算したものである。Ａ及びＢの組合せのＦＩＣ指数は、それらの個々のＦＩＣ値の総和である。
【０１４４】
相乗作用は、チェッカーボードアッセイにおいて評価することができる（時間−死滅曲線によって検証することができる）。各チェッカーボードアッセイにより多くの異なる組合せが生成し、慣例により、最も効果的な組合せのＦＩＣ値がＦＩＣ指数の算出に用いられる。ＦＩＣ指数により相互作用の性質が規定される。相加的相互作用を有する抗微生物剤は、ＦＩＣ指数が１であり、１未満のＦＩＣ指数は、相乗的相互作用を規定し、ＦＩＣ指数が１を超える組合せは、拮抗する。ＦＩＣ指数が低いほど、組合せがより相乗的となる。例えば、Singh, P.K. et al, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 279: L799-L805, 2000を参照されたい。相乗作用は、溶解素ポリペプチドと抗生物質との共投与に基づく効果的な新たな一般的抗感染戦略に影響がある。特に、溶解素ポリペプチド及び抗生物質の両方の各々を、殺菌及び静菌活性を高め、耐性発現のリスクを低下させて、より少ない用量及び量で投与することができる。言い換えると、相乗作用の利点は、一方又は両方の作用物質をＭＩＣ以下の濃度で使用する場合に実現されるだけでなく、相乗作用の存在を、ＭＩＣ以下の濃度の各作用物質を用いて試験することで明らかにすることができる。
【０１４５】
方法
本明細書に開示の溶解素ポリペプチドは、その影響を受けやすい適応症又は病態の治療、軽減若しくは改善、緩和、又は解消のために、それを必要とする被験体、例えば生きている動物（ヒトを含む）に投与することができる。特に、本明細書に開示されるように、溶解素ポリペプチドは、少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質と共投与することができ、グラム陽性細菌を少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質に再感作する方法において使用することができる。
【０１４６】
したがって、本開示の溶解素ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば被験体においてスタフィロコッカス・アウレウス等のグラム陽性細菌による細菌感染を治療するため、更にはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば表面、例えば医療器具の表面での、例えば細菌汚染のレベルを低下させるため、またグラム陽性細菌を少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質に再感作するために少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質と共投与することができる。
【０１４７】
上で論考されるように、抗生物質耐性は、以前は特定の抗生物質に対して感受性を有していた細菌が、その抗生物質に対する耐性を発現し、抗生物質の更なる投与により細菌感染が予防、制御、阻害又は治療されない場合に生じ得る。再感作は、細菌が以前は耐性を示していた抗生物質に対する感受性を取り戻す細菌の能力である。したがって、或る特定の態様によると、被験体内のグラム陽性細菌を少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質等の少なくとも１つの抗生物質に再感作する方法であって、被験体に少なくとも１つの抗生物質と溶解素ポリペプチドとを共投与し、それによりグラム陽性細菌を少なくとも１つの抗生物質に再感作することを含む、方法が本明細書に開示される。或る特定の実施形態では、溶解素ポリペプチドは、ＰｌｙＳｓ２（配列番号１）又はその活性フラグメントであり得る。或る特定の実施形態では、溶解素ポリペプチドは、配列番号３〜１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する修飾溶解素ポリペプチドであり得る。
【０１４８】
一態様では、溶解素ポリペプチド及び少なくとも１つの抗生物質を順次に投与する。例えば、或る特定の実施形態では、溶解素ポリペプチドを少なくとも１つの抗生物質の投与の前に投与する。一態様では、溶解素ポリペプチド及び少なくとも１つの抗生物質を実質的に同時に投与する。或る特定の実施形態では、少なくとも１つの抗生物質は、溶解素ポリペプチドの投与の前にグラム陽性細菌の菌数を減少させる、それを死滅させる、その増殖を阻害する、及び／又はそれを根絶するのに効果的ではない。
【０１４９】
幾つかの実施形態では、本溶解素ポリペプチドは、少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質と共投与することができ、少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質へのバイオフィルムを形成するグラム陽性細菌の再感作、並びにグラム陽性細菌によって形成される細菌バイオフィルムの予防、制御、破壊及び処理に使用される。バイオフィルム形成は、微生物細胞が互いに接着し、表面上の細胞外高分子物質（ＥＰＳ）のマトリックス中に埋め込まれる場合に生じる。生体高分子（例えば、多糖、核酸及びタンパク質）及び栄養素が豊富な、かかる保護環境での微生物の増殖は、微生物クロストークを増強し、病原性を増大させる。バイオフィルムは、生物表面及び非生物表面、例えばＣＦ肺の粘液栓、汚染カテーテル、インプラント、コンタクトレンズ等を含む任意の支持環境で発生し得る（Sharma et al. Biologicals, 42(1):1-7 (2014)（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす））。バイオフィルムが細菌を保護するため、細菌が従来の抗微生物治療により高い耐性を示すことが多く、深刻な健康リスクとなる。これは、多くがバイオフィルム関連細菌に起因し得る、毎年１００万件を超えるカテーテル関連尿路感染（ＣＡＵＴＩ）の報告から明らかである（Donlan, RM (2001) Emerg Infect Dis7(2):277-281、Maki D and Tambyah P (2001) Emerg Infect Dis 7(2):342-347）。
【０１５０】
このため、一実施形態では、本開示の溶解素ポリペプチドは、少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質と共投与することができ、少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質へのグラム陽性細菌の再感作、並びにグラム陽性細菌が細菌バイオフィルムによって保護される場合のグラム陽性細菌による細菌感染の予防、制御、阻害及び治療に使用することができる。
【０１５１】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されるグラム陽性細菌を少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質に再感作する方法であって、細菌感染と診断された、そのリスクがある又はその症状を示す被験体に、本明細書に記載される医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【０１５２】
本明細書に開示の相乗作用データは、幾つかの実施形態では、本溶解素が実施例に記載されるＭＲＳＡ等のＭＤＲ生物を含むグラム陽性細菌の再感作を推進することが可能であることを示す。概して、再感作は、抗生物質のＭＩＣ値が確立された限界点、例えば抗生物質感受性細菌について２以下のＭＩＣ値、中程度感受性細菌について４というＭＩＣ値、及び抗生物質耐性細菌、例えばβ−ラクタム耐性分離株について８以上のＭＩＣ値を下回る相乗的組合せで生じる。Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), CLSI. 2019. M100 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 29th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PAを参照されたい。本明細書で使用される場合、限界点値は、細菌株が抗生物質に対して感受性を有する又は耐性を示すかを規定する抗生物質の選択濃度（例えば、ｍｇ／Ｌ）である。抗生物質のＭＩＣ値が限界点値以下である場合、細菌は、その抗生物質に対して感受性を有するとみなされる。
【０１５３】
「感染」及び「細菌感染」という用語は、気道感染（ＲＴＩ）、例えば嚢胞性線維症（ＣＦ）を有する患者における気道感染、下気道感染、例えば慢性気管支炎の急性増悪（ＡＣＥＢ）、急性副鼻腔炎、市中肺炎（ＣＡＰ）、院内肺炎（ＨＡＰ）及び院内気道感染；淋菌性子宮頸管炎及び淋菌性尿道炎等の性感染症；尿路感染；急性中耳炎；新生児敗血症及びカテーテル関連敗血症を含む敗血症；並びに骨髄炎を含むことが意図される。薬物耐性細菌及び多剤耐性細菌によって引き起こされる感染も企図される。
【０１５４】
グラム陽性細菌によって引き起こされる感染の非限定的な例としては、Ａ）院内感染：１．気道感染、特に嚢胞性線維症患者及び人工呼吸器を装着している患者における気道感染、２．菌血症及び敗血症、３．創傷感染、特に火傷被害者の創傷感染、４．尿路感染、５．侵襲的器具上での術後感染、６．汚染された薬液の静脈内投与による心内膜炎、７．後天性免疫不全症候群、癌化学療法、ステロイド療法、血液悪性疾患、臓器移植、腎代替療法、及び重度の好中球減少症を伴う他の病態の患者における感染、Ｂ）市中感染：１．市中気道感染、２．髄膜炎、３．汚染水に起因する毛包炎及び外耳道感染、４．高齢者及び糖尿病患者における悪性外耳炎、５．小児における踵骨の骨髄炎、６．一般に汚染されたコンタクトレンズと関連した眼感染、７．手が頻繁に水に曝される人々における爪感染等の皮膚感染、８．消化管感染、並びに９．筋骨格系感染を挙げることができる。
【０１５５】
本方法のグラム陽性細菌の１つ以上の種には、本明細書に記載されるか又は当該技術分野で既知のグラム陽性細菌の任意の種が含まれ得る。通例、グラム陽性細菌の種としては、リステリア・モノサイトゲネス、スタフィロコッカス・アウレウス、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（限定されるものではないが、スタフィロコッカス・エピデルミディス群、スタフィロコッカス・サプロフィティカス群、スタフィロコッカス・シミュランス群、スタフィロコッカス・インターメディウス群、スタフィロコッカス・シウリ群、スタフィロコッカス・ヒイカス群を含む少なくとも４０の認定種、及び「不特定種群」と称される任意の分離株を含む）、ストレプトコッカス・スイス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・アガラクティアエ、ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ、ストレプトコッカス・ニューモニアエ、緑色レンサ球菌群に含まれる任意の付加的な種（ストレプトコッカス・アンギノーサス群、ストレプトコッカス・ミティス群、ストレプトコッカス・サングイニス群、ストレプトコッカス・ボビス（現ガロリティカス）群、ストレプトコッカス・サリバリウス群及びストレプトコッカス・ミュータンス群に含まれる全ての種及び株を含むが、これらに限定されない）、エンテロコッカス・フェカーリス及びエンテロコッカス・フェシウムを挙げることができる。グラム陽性細菌の他の例としては、アクチノマイセス属、バシラス属、ラクトコッカス属、マイコバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びクロストリジウム属が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５６】
本開示の溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントは、限定されるものではないが、ペニシリン及びその誘導体、セファロスポリン、モノバクタム、カルバペネム、並びにカルバセフェムを含む１つ以上のβ−ラクタム系抗生物質と共投与される。或る特定の実施形態では、少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質は、ペニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、テモシリン、アモキシシリン、アンピシリン、メシリナム、カルベニシリン、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリン、ピペラシリン、セファゾリン、セファレキシン、セファロスポリン、セファロチン、セファクロル、セファマンドール、セフロキシム、セフォテタン、セフォキシチン、セフィキシム、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフトリアキソン、セフジニル、セフェピム、セフピロム、セフタロリン、ビアペネム、ドリペネム、エルタペネム、ファロペネム、イミペネム、メロペネム、パニペネム、ラズペネム、テビペネム及びチエナマイシンから選ばれ得る。或る特定の実施形態では、少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質は、オキサシリン、ナフシリン、セファゾリン及びメチシリンから選ばれ得る。或る特定の実施形態では、１つ以上の付加的な標準療法の抗生物質又は最終手段の抗生物質を、個別に又は当業者の技能の範囲内の様々な組合せで投与することが望ましい場合もある。β−ラクタム系抗生物質以外のグラム陽性細菌に対して使用される従来の抗生物質は、本明細書に記載され、例えばバンコマイシン、ダプトマイシン、ムピロシン、リソスタフィン、ペニシリン、クロキサシリン、エリスロマイシン、カルバペネム、セファロスポリン、グリコペプチド、リンコサミド、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン、スピラマイシン及びフィダキソマイシンを挙げることができる。
【０１５７】
本開示の溶解素ポリペプチドと少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質とを組み合わせることで、効果的な抗菌療法がもたらされる。幾つかの実施形態では、本開示の溶解素ポリペプチド又はその活性フラグメントと１つ以上のβ−ラクタム系抗生物質との共投与は、より少ない用量及び量の溶解素ポリペプチド又はβ−ラクタム系抗生物質のいずれか又は両方、及び／又はより少ない治療頻度及び／又は期間で、殺菌及び静菌活性を高め、抗生物質耐性のリスクを低下させ、有害な神経学的又は腎臓副作用のリスクを低下させて行うことができる。本明細書で使用される場合、「より少ない用量」という用語は、同じ活性成分による単剤療法と比較した組合せでの或る活性成分の用量を指す。幾つかの実施形態では、組合せでの溶解素ポリペプチド又はβ−ラクタム系抗生物質の用量は、それぞれの単剤療法と比較して最適値以下又は更には閾値以下であり得る。
【０１５８】
幾つかの実施形態では、本開示は、被験体に本明細書に開示の１つ以上の溶解素ポリペプチドを対象のβ−ラクタム系抗生物質と共に投与することによって、グラム陽性細菌に対する１つ以上のβ−ラクタム系抗生物質の抗生物質活性を単独で使用される該β−ラクタム系抗生物質の活性と比較して高める方法を提供する。溶解素ポリペプチドとβ−ラクタム系抗生物質との共投与は、グラム陽性細菌に対して効果的であり、抗生物質に対する耐性を克服し、及び／又は抗生物質をより低い用量で用いることを可能にし、望ましくない副作用を減少させる。
【０１５９】
グラム陽性細菌を少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質に再感作する方法の幾つかの実施形態では、方法は、グラム陽性細菌と本明細書に記載される溶解素ポリペプチド及び少なくとも１つのβ−ラクタム系抗生物質とを接触させることを含み、グラム陽性細菌は、例えば病院及び他の健康関連又は公共の建物における医療器具、床、階段、壁及び調理台の表面、並びに手術室、救急治療室、病室、診療所及び浴室等における機器の表面上に存在する。
【０１６０】
本明細書に記載の方法を用いて保護することができる医療器具の例としては、管類及び他の表面医療器具、例えば尿道カテーテル、粘液吸引カテーテル、吸引カテーテル、臍帯カニューレ（umbilical cannulae）、コンタクトレンズ、子宮内器具、膣内及び腸内器具、気管内チューブ、気管支鏡、歯科補綴物及び歯列矯正器具、外科用器械、歯科用器械、管類、歯科用送水管、布、紙、指示薬ストリップ（例えば、紙の指示薬ストリップ又はプラスチックの指示薬ストリップ）、接着剤（例えば、ヒドロゲル接着剤、ホットメルト接着剤又は溶剤系接着剤）、包帯、組織包帯剤（tissue dressings）又は治療器具、及び密封パッチ（occlusive patches）、並びに医療分野で使用される任意の他の表面器具が挙げられるが、これらに限定されない。器具には、電極、外部人工装具、固定テープ、圧迫包帯、及び様々なタイプのモニターが含まれ得る。医療器具には、挿入又は移植部位近くの皮膚等の挿入又は移植部位に設置することができ、グラム陽性細菌によるコロニー形成の影響を受けやすい少なくとも１つの表面を含み得る任意の器具も含まれ得る。
【０１６１】
投与量及び投与
投与される投与量は、治療される感染の活性、治療対象の被験体の年齢、健康及び全身的な身体状態、特定の溶解素ポリペプチドの活性、もしあれば、本開示による溶解素ポリペプチドと組み合わされる抗生物質の性質及び活性、並びにかかる組合せの複合効果等の多数の要因によって決まる。或る特定の実施形態では、投与される溶解素ポリペプチド又はそのフラグメントの有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（又は１ｍｃｇ／ｍｌ〜１００ｍｃｇ／ｍｌ）、例えば０．５ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。或る特定の実施形態では、溶解素ポリペプチドは、１日〜１４日間の範囲の期間にわたって１日１回〜４回投与することができる。抗生物質は、標準的な投与計画で又は任意の相乗作用を考慮してより少ない量で投与することができる。しかしながら、かかる全ての投与量及び計画は（溶解素ポリペプチド、又はそれと共に投与される任意の抗生物質のいずれに関わらず）、最適化に供される。最適投与量は、当業者の技能の範囲内であるが、本開示を考慮に入れてｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ予備有効性実験を行うことで決定することができる。
【０１６２】
本明細書に開示の溶解素ポリペプチドが急速な殺菌をもたらすことができ、ＭＩＣ以下の量で使用した場合に静菌効果をもたらすことができることが企図される。本明細書に開示の溶解素ポリペプチドが様々な抗生物質耐性細菌に対して活性であり得ることが更に企図される。本開示に基づき、臨床状況では、本溶解素ポリペプチドは、薬物耐性及び多剤耐性細菌から生じる感染の治療、並びにβ−ラクタム系抗生物質に対する耐性の克服の有力な付加的手段となり得る。
【０１６３】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示の溶解素ポリペプチドへの曝露時間は、１ｍｌ当たりの活性ポリペプチド単位の所望の濃度に影響を及ぼし得る。「長時間」又は「持続」放出担体に分類される担体（例えば、或る特定の鼻腔用スプレー又はロゼンジ剤等）は、より低濃度であるが、より長時間にわたってポリペプチド単位／ｍｌを含む又は提供することができ、「短時間」又は「急速」放出担体（例えば、含嗽剤等）は、高濃度であるが、より短時間でポリペプチド単位（ｍｃｇ）／ｍｌを含む又は提供することができる。より高い単位／ｍｌの投与量又はより低い単位／ｍｌの投与量を有することが望ましい場合もある。
【０１６４】
本開示の溶解素ポリペプチド及びβ−ラクタム系抗生物質について、治療有効用量は、初めに細胞培養アッセイ、又は動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ若しくはブタのいずれかにおいて推定することができる。動物モデルは、望ましい濃度範囲及び投与経路を達成するために使用することもできる。次いで、得られた情報を用いて、ヒトにおける有効用量及び投与経路を決定することができる。投与量及び投与は、十分な活性成分のレベルをもたらすか又は所望の効果を維持するために更に調整することができる。考慮され得る付加的な要因としては、疾患状態の重症度、患者の年齢、体重及び性別、食生活、所望の治療期間、投与方法、投与の時間及び頻度、薬物の組合せ、反応感度、療法に対する耐容性／応答、並びに治療を行う医師の判断が挙げられる。
【０１６５】
治療計画は、連日投与（例えば、１日１回、２回、３回等）、隔日（例えば、隔日で１回、２回、３回等）、週２回、週１回、２週間に１回、月に１回等を必要とし得る。一実施形態では、治療は持続注入として行うことができる。単位用量を何度も投与することができる。間隔は、臨床症状のモニタリングによって指定されるように不規則であってもよい。代替的には、単位用量を持続放出配合物として投与してもよく、この場合、より低頻度の投与を用いることができる。投与量及び頻度は、患者に応じて異なり得る。かかる指針が限局的投与、例えば鼻腔内、吸入、直腸等、又は全身投与、例えば経口、直腸（例えば、浣腸による）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、経尿道等のために調整されることが当業者には理解される。
【０１６６】
本明細書に開示される特定の実施形態は、特許請求の範囲で「からなる（consisting of）」及び／又は「から本質的になる（consisting essentially of）」という言い回しを用いて更に限定され得る。請求項で用いられる場合、出願時のものであるか又は補正によって追加されたかに関わらず、「からなる」という移行句は、その請求項に明記されない任意の要素、工程又は成分を除外する。「から本質的になる」という移行句は、請求項の範囲を指定の材料又は工程、及び基本的な新規の特徴（複数の場合もある）に実質的に影響を与えない材料又は工程に限定する。そのように特許請求される本発明の実施形態は、本明細書において本質的又は明示的に記載され、可能になる。本出願人らは、本明細書に記載される任意の実施形態又は特徴を放棄する権利を留保する。
【実施例】
【０１６７】
本明細書に記載の方法及び溶解素ポリペプチド、並びにそれらの調製、特性評価及び使用は、本開示の範囲の限定ではなく、説明として意図される以下の実施例との関連でより良く理解される。
【０１６８】
実施例１−ＰｌｙＳｓ２溶解素とβ−ラクタム系抗生物質との間の相乗作用
段階的アプローチを用い、ＰｌｙＳｓ２を再感作剤として評価した。初めに、微量液体希釈チェッカーボードアッセイを用いて、９つの異なるＭＲＳＡ株に対するＰｌｙＳｓ２と３つのβ−ラクタム系抗生物質（オキサシリン（ＯＸＡ）、ナフシリン（ＮＡＦ）及びセファゾリン（ＣＦＺ））との組合せについての部分阻止濃度指数（ＦＩＣＩ）値を決定した。チェッカーボードアッセイによるデータを生成し、ＰｌｙＳｓ２とβ−ラクタム系抗生物質との相互作用及び効力を、それらの個々の活性と比較して決定した。この比較を、０．５以下の値が相乗作用と一致し、０．５超〜１未満の値が非常に相加的であり、１〜２以下の値が無関係（indifferent）であり、２を超える値が拮抗的であるＦＩＣＩ値として表す。各作用物質単独（初期）及び組合せ（最終）で決定された代表的な単剤ＭＩＣも示す。再感作は、β−ラクタム系抗生物質のＭＩＣ値が確立された限界点、例えばβ−ラクタム感受性分離株について２以下のＭＩＣ値、β−ラクタム耐性分離株について４以上のＭＩＣ値を下回る相乗的組合せで生じる。Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), CLSI. 2019. M100 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 29th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PAを参照されたい。
【０１６９】
下記表１に示されるように、ＰｌｙＳｓ２との相乗的組合せは、試験した９つのＭＲＳＡ株の各々について限界点値を下回るＯＸＡ、ＮＡＦ及びＣＦＺのＭＩＣの低下を示した。これらの観察結果は再感作と一致する。抗生物質耐性細菌株を従来の抗生物質に再感作するＰｌｙＳｓ２溶解素の能力は、抗微生物耐性に対抗し、逆転させる治療剤としてのこれらの生物製剤の利益を示す。
【０１７０】
【表１】
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【０１７１】
表１に示されるように、ＰｌｙＳｓ２と各β−ラクタム系抗生物質との全ての組合せが評価した９つのＭＲＳＡ株に対して相乗作用を示した。さらに、スタフィロコッカス・アウレウスについて確立されたβ−ラクタム限界点を下回るＭＩＣ値の低下によって実証されるように、β−ラクタム感度がＭＲＳＡ株に回復した。
【０１７２】
実施例２−ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰｌｙＳｓ２溶解素曝露がオキサシリン感受性を増大する
連続継代耐性研究を行い、スタフィロコッカス・アウレウス感染の治療に使用されるオキサシリンと組み合わせて使用した場合に抗生物質耐性の出現を抑制するＰｌｙＳｓ２溶解素の能力を評定した。連続継代実験を行うために用いた方法は、Palmer et al., Genetic basis for daptomycin resistance in enterococci, ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY (2011); 55:3345-56及びBerti et al., Altering the Proclivity towards Daptomycin Resistance in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Using Combinations with Other Antibiotics, ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY (2012); 56:5046-53のそれぞれに記載されている。ＭＩＣ値の増大をオキサシリンの存在下、又は１．１倍希釈若しくは２倍希釈のＰｌｙＳｓ２溶解素の存在下で成長させたＭＲＳＡスタフィロコッカス・アウレウス株（ＭＷ２）について評定した。
【０１７３】
２１日間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ連続継代耐性アッセイを行い、オキサシリン及びＰｌｙＳｓ２のＭＩＣ値に対するＰｌｙＳｓ２（単独）の影響、並びにダプトマイシン又はバンコマイシンへの曝露がβ−ラクタム系抗生物質に対する感受性の増大（及び再感作の可能性）を伴っていた、以前に示されているものと同様の「シーソー」効果の可能性を決定した（Renzoni et al., Molecular Bases Determining Daptomycin Resistance-Mediated Resensitizatoin to β-Lactams (Seesaw Effect) in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY (2017) 61(1):e01634-16及びWerth et al., Evaluation of Ceftaroline Activity against Heteroresistant Vancomycin-Intermediate Staphylococcus aureus and Vancomycin-Intermediate Methicillin-Resistant S. aureus Strains in an In Vitro Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Model: Exploring the 'Seesaw Effect', ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY (2013); 57(6):2664-68）。
【０１７４】
ＭＲＳＡ株ＭＷ２を、１．１倍及び２倍の両方のＰｌｙＳｓ２希釈系列を用い、２１日間にわたって毎日三連で連続継代した。図１〜図３に示されるように、ＰｌｙＳｓ２のＭＩＣ値の僅か２倍のシフトしか観察されなかった。ＰｌｙＳｓ２曝露はシーソー効果を生じ、ＯＸＡのＭＩＣが低下した（６４μｇ／ｍＬから１６μｇ／ｍＬまでの０．２５というＭＩＣの倍率変化）。図１〜図３を参照されたい。このシーソー効果、すなわちオキサシリンに対する感受性の逆説的増大を伴う、ＰｌｙＳｓ２に対するＭＲＳＡの感受性の減少は、ＭＲＳＡをオキサシリンに再感作するＰｌｙＳｓ２溶解素の能力を示す。３つのＭＲＳＡ  ＭＷ２株の分離株を全ゲノムシークエンシングについて観察されたＭＩＣシフトの直前（図１〜図３のそれぞれ１６日目、１１日目及び８日目）及び直後（図１〜図３のそれぞれ１７日目、１２日目及び９日目）に採取した。
【０１７５】
ＭＲＳＡをオキサシリンに再感作するダプトマイシンの能力が、ＰＢＰ  ２ａ（ｍｅｃＡの産物）の成熟に必要とされる因子の誤った局在化をもたらす、ｍｐｒＦに媒介される細胞膜修飾によって推進されることが知られている（Renzono et al. (2017)）。ＰｌｙＳｓ２効果の同様の研究に着手するために、ＰｌｙＳｓ２及びＯＸＡのＭＩＣ値のシフトの直後に得られた３つの変異誘導体（図１〜図３のそれぞれ１７日目、１２日目及び９日目を参照）を全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）及びＳＮＰ／ＩＮＤＥＬによって分析した。同様に、ＭＩＣ値のシフトの直前に得られた対照株（図１〜図３のそれぞれ１６日目、１１日目及び８日目）を分析し、変異株と比較した。下記表２に示されるように、３つの異なる突然変異が関与し、ＰｌｙＳｓ２及びＯＸＡのＭＩＣに対する各突然変異の影響を、Abdelhamed et al, A novel suicide plasmid for efficient gene mutation in Listeria monocytogenes, PLASMID (2015); 81:1-8に記載されるように、明らかな遺伝的背景での二段階対立遺伝子交換プロセスを用いて確認した。
【０１７６】
【表２】
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【０１７７】
表２に示されるように、３つの異なる細胞壁修飾酵素をコードする遺伝子座（すなわち、ｍｕｒＡ、ｌｙｒＡ及びｏａｔＡ）での又はその近くでの突然変異は、各々独立してオキサシリンのＭＩＣを低下させるのに十分であった。これらの知見は、ＰｌｙＳｓ２についてｍｕｒＡ、ｌｙｒＡ及び／又はｏａｔＡによって媒介される細胞壁の摂動が、ｍｐｒＦ及びダプトマイシンについて観察されたように、膜のペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ  ２ａ）の量を減少させるモデルと一致する（Renzoni et al. (2017)）。理論に束縛されることを望むものではないが、ＰｌｙＳｓ２への曝露がＰＢＰ  ２ａの減少を媒介し得ることが同様に仮定される。
【０１７８】
実施例３−ｅｘ  ｖｉｖｏでのＰｌｙＳｓ２曝露がオキサシリン感受性の増大を高める
ｅｘ  ｖｉｖｏ分析を、Xiong et al., Comparative efficacy of telavancin and daptomycin in experimental endocarditis due to multi-clonotype MRSA strains, J. ANTIMIC. CHEMO. (2016); 71(1):2890-94に開示されるように、ＭＲＳＡ感染性心内膜炎（ＩＥ）の標準ウサギモデルにおいてＰｌｙＳｓ２処理の後に回収した組織サンプルに対して行った。標準ウサギＩＥモデルは、オキサシリンのＭＩＣに対するＰｌｙＳｓ２処理の影響を確認するために用いた。ＩＥモデルにおける単回用量のＰｌｙＳｓ２（０．１８ｍｇ／ｋｇ〜１．４ｍｇ／ｋｇ）での処理の４日後に、分離株を弁疣贅から回収し、ＴＳＡＢ（非選択条件、表３及び表４）及び様々な濃度のＰｌｙＳｓ２を添加したＴＳＡＢ（選択条件、表５及び表６）上にプレーティングした。ＭＲＳＡ分離株のＭＩＣ値をＰｌｙＳｓ２及びオキサシリンの両方について決定した。下記表３及び表４に、非選択条件に供した弁疣贅でＰｌｙＳｓ２及びオキサシリンのそれぞれについて算出したＭＩＣを示す。スタフィロコッカス・アウレウス株ＭＷ２のＰｌｙＳｓ２  ＭＩＣが１μｇ／ｍＬであり、スタフィロコッカス・アウレウス株ＭＷ２のオキサシリンＭＩＣが３２μｇ／ｍＬであることに留意する。
【０１７９】
【表３】
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【０１８０】
【表４】
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【０１８１】
表３に示されるように、ＰｌｙＳｓ２のＭＩＣは、１μｇ／ｍＬで安定したままであった。しかしながら、表４に示されるように、ＰｌｙＳｓ２曝露によりオキサシリン感受性の増大が生じた。例えば、１．４ｍｇ／ｋｇでのＰｌｙＳｓ２曝露後の７つのサンプル及び０．３５ｍｇ／ｋｇでのＰｌｙＳｓ２曝露後の６つのサンプルについての２μｇ／ｍＬ以下のオキサシリンＭＩＣを参照されたい。
【０１８２】
表５に、選択条件に供した弁疣贅上の細菌分離株の１ｇ当たりのＬｏｇ１０  ＣＦＵを示し、表６に、選択条件に供した弁疣贅でＰｌｙＳｓ２及びオキサシリンについて算出されたＭＩＣを示す。
【０１８３】
【表５】
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【０１８４】
【表６】
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【０１８５】
表６に示されるように、ＰｌｙＳｓ２のＭＩＣは、１μｇ／ｍＬで概ね安定したままであり、２倍の増大しか示さなかったが、ＰｌｙＳｓ２曝露によりオキサシリン感受性の増大が生じた。例えば、１．４ｍｇ／ｋｇでのＰｌｙＳｓ２曝露後の３つのサンプル及び０．３５ｍｇ／ｋｇでのＰｌｙＳｓ２曝露後の７つのサンプルについての２μｇ／ｍＬ以下のオキサシリンＭＩＣを参照されたい。これにより３２μｇ／ｍＬから２μｇ／ｍＬ未満までの１６倍を超えるオキサシリンＭＩＣ値の低下が証明される。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏで観察された再感作は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察された再感作よりも大幅に高められた。さらに、ＰｌｙＳｓ２については２倍までのＭＩＣの増大しか観察されなかった。
【０１８６】
上記実施例２で論考した連続継代アッセイにおいて再感作表現型を示す分離株と同様に、ウサギＩＥ研究からの分離株に全ゲノムシークエンシング及び付加的な遺伝子解析を行い、対象の特異的突然変異を特定した。
【０１８７】
オキサシリンＭＩＣの３２倍の減少を示す弁疣贅からの２つの突然変異体を特定し、全ゲノムシークエンシング及びＳＮＰ／ＩＮＤＥＬによって分析し、３つの対照分離株と比較した。各々の変異株及び対照株のＰｌｙＳｓ２及びオキサシリンのＭＩＣを下記表７及び表８に示す。ここで、＋は突然変異の存在を示し、−は突然変異の非存在を示す。
【０１８８】
【表７】
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【０１８９】
【表８】
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【０１９０】
本明細書の実施例から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究及びｉｎ  ｖｉｖｏ研究においてＰｌｙＳｓ２処理によりＭＲＳＡがβ−ラクタム系抗生物質に再感作されたことが結論付けられる。ＰｌｙＳｓ２との強力な相乗作用が、予測されるＰｌｙＳｓ２への感受性に対して悪影響を及ぼすことなくβ−ラクタムのＭＩＣを限界点未満に低下させる。さらに、ＰｌｙＳｓ２単独への曝露により、オキサシリンのＭＩＣを減少させる細胞壁生合成遺伝子又はＳＣＣｍｅｃの突然変異を選択することができる。β−ラクタム系抗生物質に対するＭＲＳＡ株の感度を回復させることで、ＰｌｙＳｓ２を、抗微生物耐性を対抗するだけでなく、逆転させるためにも使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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