(57)【要約】本発明は、病原性バリアントの検出のための遺伝学的解析を行うための方法およびシステムを提供する。したがって複数の態様では、本発明は、ヒトオルソログを蠕虫ゲノム中に組み込むことによって蠕虫をヒト化する段階を含む、ヒト蠕虫オルソログモデルを使用して遺伝学的解析を行うための様々な方法を提供する。複数の態様では、オルソログは、ヒトにおける発作、神経伝達、運動障害（例えば運動失調、ジストニア）または筋障害に関連する遺伝子である。別の態様では、本発明は、本発明の方法を行うためのシステムを提供する。2021526827.tif 000003
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)ヒトオルソログを蠕虫ゲノム中に組み込むことによって蠕虫をヒト化する段階；
(b)蠕虫集団にオリゴヌクレオチドのライブラリーをトランスフェクトする段階であって、該オリゴヌクレオチドのライブラリーが該オルソログの遺伝的バリアントを含有する、段階；
(c)該蠕虫集団中の各遺伝的バリアントの相対比率を検出する段階；
(d)該蠕虫集団の蠕虫を使用して走化性アッセイを行う段階；ならびに
(e)走化性アッセイにおいて刺激に応答する蠕虫および該刺激に応答できない蠕虫を検出し、蠕虫の各群における各オルソログバリアントの相対比率を測定する段階
を含む、方法。
【請求項２】
ライブラリーが、すべての可能なアミノ酸置換、欠失および/または変異のうちの少なくとも90%またはそれ以上を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ライブラリーが、すべての可能なアミノ酸置換、欠失および/または変異を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
走化性アッセイが、オルソログの機能を変更する試験化合物の存在下で行われ、該変更される機能が、走化性活性の変化である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
蠕虫集団が、カエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
(c)および(e)が、高スループットシーケンシングを含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
オルソログが、蠕虫において変更された場合に、走化性の欠損を引き起こす、請求項1記載の方法。
【請求項８】
オルソログが、CACNB4またはSTXBP1である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
遺伝子の遺伝的バリアントを同定するための、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法の使用。
【請求項１０】
遺伝的バリアントを病原性または非病原性として分類するための、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法の使用。
【請求項１１】
変異特異的な様式で薬物スクリーニングを行うための、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法の使用。
【請求項１２】
少なくとも1つのプロセッサおよび非一時的メモリを含み、請求項1の(b)、(c)および/または(e)を行うように構成された、コントローラ
を含む、システム。
【請求項１３】
以下の段階を含む、ヒト蠕虫オルソログモデルを使用して遺伝子中の病原性遺伝的変異を同定するための方法：
(a)ヒトオルソログを蠕虫ゲノム中に組み込むことによって蠕虫をヒト化する段階；
(b)蠕虫集団にオリゴヌクレオチドのライブラリーをトランスフェクトする段階であって、該オリゴヌクレオチドのライブラリーが該オルソログの遺伝的バリアントを含有する、段階；
(c)該蠕虫集団中の各遺伝的バリアントの相対比率を検出する段階；
(d)該蠕虫集団の蠕虫を使用して走化性アッセイを行う段階；ならびに
(e)走化性アッセイにおいて刺激に応答する蠕虫および該刺激に応答できない蠕虫を検出し、蠕虫の各群における各オルソログバリアントの相対比率を測定し、それにより、病原性遺伝的変異を同定する段階であって、該刺激に応答しない蠕虫が、該オルソログの、病原性である遺伝的バリアントを有する、段階。
【請求項１４】
ライブラリーが、すべての可能なアミノ酸置換、欠失および/または変異のうちの少なくとも90%またはそれ以上を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
ライブラリーが、すべての可能なアミノ酸置換、欠失および/または変異を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
走化性アッセイが、オルソログの機能を変更する試験化合物の存在下で行われ、該変更される機能が、走化性活性の変化である、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
蠕虫集団が、カエノラブディティス・エレガンスである、請求項13記載の方法。
【請求項１８】
(c)および(e)が、高スループットシーケンシングを含む、請求項13記載の方法。
【請求項１９】
オルソログが、蠕虫において変更された場合に、走化性の欠損を引き起こす、請求項13記載の方法。
【請求項２０】
オルソログが、CACNB4またはSTXBP1である、請求項13記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも1つのプロセッサおよび非一時的メモリを含み、請求項13の(b)、(c)および/または(e)を行うように構成された、コントローラ
を含む、システム。
【請求項２２】
以下の段階を含む、ヒト蠕虫オルソログモデルにおいて試験作用物質をスクリーニングするための方法：
(a)ヒトオルソログを蠕虫ゲノム中に組み込むことによって蠕虫をヒト化する段階；
(b)蠕虫集団にオリゴヌクレオチドのライブラリーをトランスフェクトする段階であって、該オリゴヌクレオチドのライブラリーが該オルソログの遺伝的バリアントを含有する、段階；
(c)該蠕虫集団中の各遺伝的バリアントの相対比率を検出する段階；
(d)該蠕虫集団の蠕虫を使用して走化性アッセイを行う段階であって、該アッセイが、試験化合物の存在下および非存在下で行われる、段階；ならびに
(e)該化合物の存在下および非存在下での走化性活性を比較することにより走化性活性の増加または減少を検出することによって、該試験化合物が該オルソログの機能を変更するかどうかを決定する段階。
【請求項２３】
ライブラリーが、すべての可能なアミノ酸置換、欠失および/または変異のうちの少なくとも90%またはそれ以上を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
ライブラリーが、すべての可能なアミノ酸置換、欠失および/または変異を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
蠕虫集団が、カエノラブディティス・エレガンスである、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
(c)が、高スループットシーケンシングを含む、請求項22記載の方法。
【請求項２７】
オルソログが、蠕虫において変更された場合に、走化性の欠損を引き起こす、請求項22記載の方法。
【請求項２８】
オルソログが、CACNB4またはSTXBP1である、請求項22記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも1つのプロセッサおよび非一時的メモリを含み、請求項22の(b)および/または(c)を行うように構成された、コントローラ
を含む、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2018年6月12日に出願された米国仮特許出願第62/684,039号の恩典を主張する。前述の出願の全内容は、その全体で参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般的に遺伝学的解析に関し、より具体的には動物モデルにおいて発作遺伝子などの遺伝子をアッセイするための方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景情報
どの遺伝子バリアントが疾患を引き起こし、どれが引き起こさないか、およびそれらのうちのどれが治療に応答するであろうかを特定する能力は、現代の遺伝学の中心課題である。遺伝子中のすべてのバリアントを同時に検査し、それらの病原性のみならず遺伝子型に特異的な薬物応答も評価できることが、精密医療の理想である。
【０００４】
すべての変異の影響を評価するための高スループットアッセイは、しばしば、以下の共通性をもつ：1）それらは、高スループットオリゴ製造を用いて、遺伝子からすべての可能なアミノ酸置換を含有するcDNAを産生する；2）それらは、いくつかのアッセイ/選択を用いて、遺伝子機能に対する変異の影響を評価する；および3）それらは、高スループットシーケンシングを用いて、選択プロセスの前および後に特定の置換の相対量を測定する。
【０００５】
遺伝子バリアントを同定するためのみならず、遺伝子型特異的に薬物スクリーニングを行うための改善されたアッセイ法の必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、遺伝学的解析を行うための方法およびシステムを提供する。本発明は、病原性遺伝子バリアントの検出を提供する。
【０００７】
したがって複数の態様では、本発明は、遺伝学的解析を行うための方法を提供する。一態様では、該方法は、以下を含む：
(a)ヒトオルソログを蠕虫ゲノム中に組み込むことによって蠕虫をヒト化する段階；
(b)蠕虫集団にオリゴヌクレオチドのライブラリーをトランスフェクトする段階であって、該オリゴヌクレオチドのライブラリーが該オルソログの遺伝的バリアントを含有する、段階；
(c)該蠕虫集団中の各遺伝的バリアントの相対比率を検出する段階；
(d)該蠕虫集団の蠕虫を使用して走化性アッセイを行う段階；ならびに
(e)走化性アッセイにおいて刺激に応答する蠕虫および該刺激に応答できない蠕虫を検出し、蠕虫の各群における各オルソログバリアントの相対比率を測定する段階。
【０００８】
本発明はさらに、ヒト蠕虫オルソログモデルを使用して遺伝子中の病原性遺伝的変異を同定するための方法を提供する。該方法は、以下を含む：
(a)ヒトオルソログを蠕虫ゲノム中に組み込むことによって蠕虫をヒト化する段階；
(b)蠕虫集団にオリゴヌクレオチドのライブラリーをトランスフェクトする段階であって、該オリゴヌクレオチドのライブラリーが該オルソログの遺伝的バリアントを含有する、段階；
(c)該蠕虫集団中の各遺伝的バリアントの相対比率を検出する段階；
(d)該蠕虫集団の蠕虫を使用して走化性アッセイを行う段階；ならびに
(e)走化性アッセイにおいて刺激に応答する蠕虫および該刺激に応答できない蠕虫を検出し、蠕虫の各群における各オルソログバリアントの相対比率を測定し、それにより、病原性遺伝的変異を同定する段階であって、該刺激に応答しない蠕虫が、該オルソログの、病原性である遺伝的バリアントを有する、段階。
【０００９】
さらに別の態様では、本発明は、ヒト蠕虫オルソログモデルにおいて試験作用物質をスクリーニングするための方法を提供する。該方法は、以下を含む：
(a)ヒトオルソログを蠕虫ゲノム中に組み込むことによって蠕虫をヒト化する段階；
(b)蠕虫集団にオリゴヌクレオチドのライブラリーをトランスフェクトする段階であって、該オリゴヌクレオチドのライブラリーが該オルソログの遺伝的バリアントを含有する、段階；
(c)該蠕虫集団中の各遺伝的バリアントの相対比率を検出する段階；
(d)該蠕虫集団の蠕虫を使用して走化性アッセイを行う段階であって、該アッセイが、試験化合物の存在下および非存在下で行われる、段階；ならびに
(e)該化合物の存在下および非存在下での走化性活性を比較することにより走化性活性の増加または減少を検出することによって、該試験化合物が該オルソログの機能を変更するかどうかを決定する段階。
【００１０】
複数の態様では、オリゴヌクレオチドのライブラリーは、ヒトオルソログのすべての可能なアミノ酸置換、欠失および/または変異のうちの少なくとも50、60、70、80、90%またはそれ以上を有するオリゴヌクレオチドを含む。一態様では、オリゴヌクレオチドのライブラリーは、ヒトオルソログのすべての可能なアミノ酸置換、欠失および/または変異を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【００１１】
複数の態様では、オルソログは、ヒトにおける発作、神経伝達、運動障害（例えば運動失調、ジストニア）、または筋障害に関連する遺伝子である。
【００１２】
複数の態様では、本発明の方法は、遺伝子の遺伝的バリアントを同定するために使用される。一態様では、本発明の方法は、遺伝子のあらゆる可能な遺伝的バリアントを同定するために使用される。
【００１３】
複数の態様では、本発明の方法は、遺伝的バリアントを病原性または非病原性として分類するために使用される。
【００１４】
複数の態様では、本発明の方法は、変異特異的な様式で薬物スクリーニングを行うために使用される。
【００１５】
別の態様では、本発明は、本発明の方法を行うためのシステムを提供する。システムは、少なくとも1つのプロセッサおよび非一時的メモリを有するコントローラを含む。コントローラは、本明細書に記載されるような方法のプロセスの1つまたは複数を行うように構成される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】一態様において本開示の方法によって生成される実験データを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、遺伝子バリアントを同定およびスクリーニングするための革新的な方法に基づく。該方法は、例えば、遺伝子のあらゆる可能な遺伝的バリアントを同定すること、遺伝的バリアントを病原性もしくは非病原性として分類すること、または変異特異的な様式で薬物スクリーニングを行うことを含む、いくつかの方法で使用され得る。
【００１８】
従来のアッセイは、遺伝子機能に対する変異の影響を評価するために有効である適切な選択プロセスを同定する段階によって、しばしば妨害される。これらのアッセイは、非常に遺伝子特異的であり、広く適用可能ではない傾向がある。本開示は、走化性を変更するバリアントおよび薬物について選択するメカニズムとして、C.エレガンス（elegans）走化性アッセイの使用を提唱する。発作遺伝子を含む多くのヒト疾患遺伝子が、蠕虫における走化性に影響を及ぼし得ることが、公知である。それは、同一のアッセイで試験することができる大きなクラスの遺伝子に相当するので、このことは有益である。
【００１９】
本組成物および方法を説明する前に、本発明が、記載される特定の方法および実験条件に限定されないことを理解すべきである。それは、そのような組成物、方法、および条件が変動する場合があるからである。また、本明細書において使用される用語法が、特定の態様だけを説明することを目的としており、限定することを意図していないことも理解すべきである。それは、本発明の範囲が、添付の特許請求の範囲だけに限定されるからである。
【００２０】
本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明らかに他のことを指示していないかぎり、複数の指示対象を含む。したがって例えば、「方法」への言及は、本開示を読んだときに当業者に明白になるであろう、1つもしくは複数の方法、および/または本明細書に記載される種類の段階などを含む。
【００２１】
特に定義されないかぎり、本明細書に使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または等価の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるものの、好ましい方法および材料をこれから説明する。
【００２２】
本明細書において使用されるように、「ヒトオルソログ」は、蠕虫遺伝子、すなわちカエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）遺伝子とオルソロガスなヒト遺伝子を指す。
【００２３】
方法
一局面では、本発明は、遺伝学的解析を行うための方法を提供する。複数の態様では、本発明は、遺伝子バリアントの検出および/または分類を提供する。
【００２４】
したがって一態様では、本発明は、ヒト蠕虫オルソログを同定するための方法を提供する。該方法は、以下を含む：
(a)ヒトオルソログを蠕虫ゲノム中に組み込むことによって蠕虫をヒト化する段階；
(b)蠕虫集団にオリゴヌクレオチドのライブラリーをトランスフェクトする段階であって、該オリゴヌクレオチドのライブラリーが該オルソログの遺伝的バリアントを含有する、段階；
(c)該蠕虫集団中の各遺伝的バリアントの相対比率を検出する段階；
(d)該蠕虫集団の蠕虫を使用して走化性アッセイを行う段階；ならびに
(e)走化性アッセイにおいて刺激に応答する蠕虫および該刺激に応答できない蠕虫を検出し、蠕虫の各群における各オルソログバリアントの相対比率を測定する段階。
【００２５】
本発明はさらに、ヒト蠕虫オルソログモデルを使用して遺伝子中の病原性遺伝的変異を同定するための方法を提供する。該方法は、以下を含む：
(a)ヒトオルソログを蠕虫ゲノム中に組み込むことによって蠕虫をヒト化する段階；
(b)蠕虫集団にオリゴヌクレオチドのライブラリーをトランスフェクトする段階であって、該オリゴヌクレオチドのライブラリーが該オルソログの遺伝的バリアントを含有する、段階；
(c)該蠕虫集団中の各遺伝的バリアントの相対比率を検出する段階；
(d)該蠕虫集団の蠕虫を使用して走化性アッセイを行う段階；ならびに
(e)走化性アッセイにおいて刺激に応答する蠕虫および該刺激に応答できない蠕虫を検出し、蠕虫の各群における各オルソログバリアントの相対比率を測定し、それにより、病原性遺伝的変異を同定する段階であって、該刺激に応答しない蠕虫が、該オルソログの、病原性である遺伝的バリアントを有する、段階。
【００２６】
さらに別の態様では、本発明は、ヒト蠕虫オルソログモデルにおいて試験作用物質をスクリーニングするための方法を提供する。該方法は、以下を含む：
(a)ヒトオルソログを蠕虫ゲノム中に組み込むことによって蠕虫をヒト化する段階；
(b)蠕虫集団にオリゴヌクレオチドのライブラリーをトランスフェクトする段階であって、該オリゴヌクレオチドのライブラリーが該オルソログの遺伝的バリアントを含有する、段階；
(c)該蠕虫集団中の各遺伝的バリアントの相対比率を検出する段階；
(d)該蠕虫集団の蠕虫を使用して走化性アッセイを行う段階であって、該アッセイが、試験化合物の存在下および非存在下で行われる、段階；ならびに
(e)該化合物の存在下および非存在下での走化性活性を比較することにより走化性活性の増加または減少を検出することによって、該試験化合物が該オルソログの機能を変更するかどうかを決定する段階。
【００２７】
複数の態様では、蠕虫集団は、カエノラブディティス・エレガンスである。
【００２８】
したがってある態様では、本開示は、以下を含む方法を提供する。
【００２９】
方法論は、以下を含むと考えられる：
(a)蠕虫において調節不全にされた場合に走化性の欠損を引き起こす、CACNB4などの蠕虫遺伝子とオルソロガスなヒト遺伝子（ヒトオルソログ）を同定し；
(b)ヒトオルソログcDNAを蠕虫中に導入することによって蠕虫をヒト化して、それが走化性を回復させること（すなわち、遺伝子レスキュー）を観察し；
(c)すべての可能なアミノ酸置換を有するオルソログ遺伝子バリアントの遺伝子バリアントオリゴヌクレオチドを生成し；
(d)C.エレガンス集団に遺伝子バリアントオリゴヌクレオチドをトランスフェクトし；
(e)トランスフェクトされた蠕虫集団のサブセットを高スループットシーケンシングして、各遺伝子バリアントの相対比率を測定し；
(f)走化性アッセイを行い；そして
(g)走化性アッセイにおいて刺激に応答した（それに近づくことまたはそれから離れることのいずれかによる）蠕虫および応答しなかった蠕虫を高スループットシーケンシングして、各群における各バリアントの相対的存在量を測定する。
【００３０】
走化性アッセイは、外部刺激に応答する蠕虫の移動度を試験することを含み得る。刺激は、化学物質、光、温度、圧力または当技術分野において一般的に公知の他の種類の刺激であり得る。刺激に対する正の応答は、蠕虫が刺激に近づくまたは刺激から離れる運動によって、測定される。負の応答は、蠕虫が刺激に近づくまたは刺激から離れる運動がほとんどまたは全くないことである。
【００３１】
本発明の特徴は、病原性または致死的遺伝子変異を同定するために蠕虫が死ぬ必要がないことである。本開示の方法論は、蠕虫の運動性/移動運動のレベルにより非病原性遺伝子変異から病原性遺伝子変異を同定および/または分離することを可能にする。例えば、蠕虫の運動性を、陰性対照と比較してもよく、病原性変異または致死的変異を含む公知の遺伝子の遺伝的バリアントを有する蠕虫と比較してもよい。複数の態様では、病原性または致死的であるとは未確定の変異を有する遺伝子バリアントを有する蠕虫の運動性が、公知の病原性変異または致死的変異を有する蠕虫の運動性と実質的に類似または同等であることは、当該未確定の遺伝子バリアントが病原性または致死的変異を有することを指し示す。同様に、病原性または致死的であるとは未確定の変異を有する遺伝子バリアントを有する蠕虫の運動性が、公知の非病原性変異または非致死的変異を有する蠕虫の運動性と実質的に類似または同等であることは、当該未確定の遺伝子バリアントが非病原性または非致死的変異を有することを指し示す。
【００３２】
走化性アッセイは、遺伝的変異の影響を改善または後退させることができる薬物候補の有効性をスクリーニングするために利用してもよい。これは、走化性アッセイ中に薬物候補（すなわち、試験作用物質）を導入し、試験作用物質および刺激の非存在下における蠕虫の移動度と比較して、薬物候補が試験作用物質および刺激の存在下で蠕虫の移動度を変更するかどうかを決定することによって行われ得る。
【００３３】
本開示の方法は、遺伝的シーケンシングを想定している。例えば、シーケンシングは、本方法の段階(c)および(e)を行うことに利用され得る。
【００３４】
シーケンシングは、当技術分野において公知の任意の方法によるものであり得る。シーケンシング方法は、マクサム-ギルバートシーケンシングベース技術、鎖終結ベース技術、ショットガンシーケンシング、ブリッジPCRシーケンシング、単一分子リアルタイムシーケンシング、イオン半導体シーケンシング（Ion Torrent（商標）シーケンシング）、ナノポアシーケンシング、パイロシーケンシング（454）、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング（SOLiD（商標）シーケンシング）、電子顕微鏡法によるシーケンシング、ジデオキシシーケンシング反応（サンガー法）、超並列シーケンシング、ポロニー（polony）シーケンシング、およびDNAナノボールシーケンシングを含むが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様では、シーケンシングは、プライマーをテンプレートにハイブリダイズさせてテンプレート/プライマー二重鎖を形成する段階、ポリメラーゼがテンプレート依存的にプライマーにヌクレオチドを付加させる条件下、検出可能に標識されたヌクレオチドの存在下で二重鎖をポリメラーゼ酵素と接触させる段階、組み込まれた標識ヌクレオチドからのシグナルを検出する段階、ならびに接触させる段階および検出する段階を少なくとも1回、逐次繰り返す段階を含み、その際、組み込まれた標識ヌクレオチドの逐次検出は、核酸の配列を決定する。いくつかの態様では、シーケンシングは、ペアードエンドのリードを得ることを含む。
【００３５】
いくつかの態様では、核酸のシーケンシングは、全ゲノムシーケンシング（WGS）または迅速WGSを用いて行われる。いくつかの態様では、標的シーケンシングが行われ、それは、DNAシーケンシングまたはRNAシーケンシングのいずれかであり得る。標的シーケンシングは、全ゲノムのサブセットに対するものであり得る。いくつかの態様では、標的シーケンシングは、イントロン、エクソン、ノンコーディング配列またはそれらの組み合わせに対するものである。他の態様では、試料からのDNAの標的全エクソームシーケンシング（WES）が行われる。DNAは、超並列シーケンシングである次世代シーケンシングプラットフォーム（NGS）を用いてシーケンシングされる。NGS技術は、高スループット配列情報を提供し、関心対象の配列と整列する各配列リードが可算である点でデジタル定量的情報を提供する。特定の態様では、クローン増幅されたDNAテンプレートまたは単一DNA分子がフローセル内で超並列的にシーケンシングされる（例えば、国際公開公報第2014/015084号に記載されるように）。NGSは、高スループット配列情報に加えて、各配列リードが可算であり、個別のクローンDNAテンプレートまたは単一のDNA分子を表す点で定量的情報を提供する。NGSのシーケンシング技術は、パイロシーケンシング、リバーシブルダイターミネータを用いる合成によるシーケンシング、オリゴヌクレオチドプローブライゲーションによるシーケンシングおよびイオン半導体シーケンシングを含む。個別の試料からのDNAを個別にシーケンシングすることができ（すなわち、シングルプレックス（singleplex）シーケンシング）、または複数の試料からのDNAをプールし、単一のシーケンシング運転でインデックス付きのゲノム分子としてシーケンシング（すなわち、マルチプレックス（multiplex）シーケンシング）して、最大で数億個のDNA配列のリードを生成することができる。市販のプラットフォームは、例えば、合成によるシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、パイロシーケンシング、リバーシブルダイターミネータシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、単一分子シーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、およびナノポアシーケンシングのためのプラットフォームを含む。複数の態様では、開示の方法論は、Illumina, Incによって提供されるシステム（NovaSeq、NextSeq、HiSeq（商標）X10、HiSeq（商標）1000、HiSeq（商標）2000、HiSeq（商標）2500、Genome Analyzers（商標）、MiSeq（商標）システム）、Applied Biosystems Life Technologiesによって提供されるシステム（SOLiD（商標）システム、Ion PGM（商標）シーケンサ、ion Proton（商標）シーケンサ）などのシステムを利用する。核酸解析はまた、BGIまたはBGI Americasまたは関連会社によって提供されるシステムにより実行されることができる。核酸解析はまた、Oxford Nanopore Technologiesによって提供されるシステム（GridiON（商標）、MiniON（商標））またはPacific Biosciencesによって提供されるシステム（Pacbio（商標）RS II）により実行されることができる。重要なことに、複数の態様では、シーケンシングは、本明細書に記載される任意の方法を用いて行われ得る。
【００３６】
本明細書に使用されるような、本明細書における「変異」という用語は、参照配列と比べて置換、挿入、欠失（短縮化を含む）を含むが、それらに限定されるわけではない、参照配列中に導入された変化を指す。変異は、DNAの大きな部分を伴うことができる（例えば、コピー数変化）。変異は、DNAの小さな部分を伴うことができる。DNAの小さな部分を伴う変異の例は、例えば、点変異または一塩基多型（SNP）、多塩基多型、挿入（例えば、ある座位での1つまたは複数のヌクレオチドの挿入であるが、座位全体よりも小さい）、複数のヌクレオチドの変化、欠失（例えば、ある座位での1つまたは複数のヌクレオチドの欠失）、および逆位（例えば、1つまたは複数のヌクレオチドの配列の逆転）を含む。変異の結果は、参照配列によってコードされるタンパク質に見られない新しい特徴、性質、機能、表現型、または形質の創出を含むが、それらに限定されるわけではない。
【００３７】
本明細書に使用されるような「遺伝子」は、ポリペプチドを産生するのに関与するDNAセグメントであって、コーディング領域に先行および後続する領域のみならず、個別のコーディングセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）も含むDNAセグメントを指す。
【００３８】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかのヌクレオチド、またはそれらの類似体の任意の長さのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、公知または未知の任意の機能を有し得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖または複数鎖（例えば、一本鎖、二本鎖、および三重らせん）であってよく、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および/または修飾ヌクレオチドもしくは塩基もしくはそれらの類似体を含む、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドの類似体もしくは修飾形態を含有してもよい。遺伝コードは縮重するので、特定のアミノ酸をコードするために1つよりも多いコドンが使用され得、本発明は、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを包含する。ポリヌクレオチドが使用条件下で所望の機能性を保持するかぎり、ヌクレアーゼ耐性を増加させる修飾（例えば、デオキシ、2'-O-Me、ホスホロチオエートなど）を含む、任意の種類の修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が使用され得る。検出または捕捉のために、標識、例えば、放射性または非放射性の標識またはアンカー、例えばビオチンが組み入れられる場合もある。ポリヌクレオチドという用語は、ペプチド核酸（PNA）もまた含む。ポリヌクレオチドは、天然または非天然であり得る。ポリヌクレオチドは、RNA、DNA、もしくは両方、ならびに/またはそれらの修飾形態および/もしくは類似体を含有してもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって分断され得る。1つまたは複数のホスホジエステル結合が代替的な結合基によって置換され得る。これらの代替的な結合基は、ホスフェートがP(O)S（「チオエート」）、P(S)S（「ジチオエート」）、(O)NR2（「アミデート」）、P(O)R、P(O)OR'、COまたはCH2（「ホルムアセタール」）［式中、各RまたはR'は、独立して、Hであるか、またはエーテル（--O--）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジル（araldyl）を含有してもよい、置換もしくは非置換アルキル（1-20C）である］によって置換されている態様を含むが、それに限定されるわけではない。ポリヌクレオチド中のすべての結合が環状部分を必要とするわけではない。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメントのコーディング領域またはノンコーディング領域、遺伝子間DNA、連鎖解析から定義される1つまたは複数の座位、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA（mRNA）、転移RNA、リボソームRNA、低分子干渉RNA（siRNA）、低分子ヘアピン型RNA（shRNA）、マイクロRNA（miRNA）、核小体低分子RNA、リボザイム、cDNA、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ、アダプター、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に与えられ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、重合の後に、標識化構成要素、タグ、反応性部分、または結合パートナーとのコンジュゲーションなどによりさらに修飾されてもよい。特に述べないかぎり、提供される場合のポリヌクレオチド配列は、5'から3'方向に記載される。
【００３９】
本明細書に使用されるように、「ポリペプチド」は、アミノ酸から構成される、当業者によってタンパク質として認識される組成物を指す。アミノ酸残基についての従来の一文字または三文字コードが本明細書において使用される。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用されて、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指す。ポリマーは、直鎖または分岐であってよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。これらの用語はまた、自然にまたは介入により；例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば標識化構成要素とのコンジュゲーションにより修飾されているアミノ酸ポリマーを包含する。例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸、合成アミノ酸およびその他を含む）の1つまたは複数の類似体のみならず、当技術分野において公知の他の修飾を含有するポリペプチドも定義の中に含まれる。
【００４０】
コンピュータシステム
本発明は、機能的構成要素および様々なプロセシング段階に関して部分的に説明される。そのような機能的構成要素およびプロセシング段階は、特定の機能を果たし、様々な結果を達成するように構成された任意の数の構成要素、操作および技術によって実現され得る。例えば、本発明は、様々な機能を果たし得る様々な生物学的試料、バイオマーカー、要素、材料、コンピュータ、データソース、記憶システムおよび媒体、情報収集技術およびプロセス、データプロセシング基準、統計解析、回帰分析およびその他を採用してもよい。加えて、本発明は、遺伝学的解析に関連して説明されているものの、本発明は、任意の数の適用、環境およびデータ解析と共に実行されてよく；本明細書に記載されるシステムは、本発明のための単に例示的な適用である。
【００４１】
本発明の様々な局面による遺伝学的解析のための方法は、任意の適切な方法で、例えばコンピュータシステム上で動作するコンピュータプログラムを使用して実装され得る。本発明の様々な局面による例示的な遺伝学的解析システムは、コンピュータシステム、例えばプロセッサおよびランダムアクセスメモリを含む従来のコンピュータシステム、例えば遠隔アクセス可能なアプリケーションサーバ、ネットワークサーバ、パーソナルコンピュータまたはワークステーションと共に実装され得る。コンピュータシステムはまた、大容量記憶システムなどの追加的なメモリデバイスまたは情報記憶システムおよびユーザインターフェース、例えば従来のモニタ、キーボードおよびトラッキングデバイスを適宜含む。しかし、コンピュータシステムは、任意の適切なコンピュータシステムおよび関連する機器を含んでよく、任意の適切な方法で構成され得る。一態様では、コンピュータシステムは、独立型システムを含む。別の態様では、コンピュータシステムは、サーバおよびデータベースを含むコンピュータネットワークの部分である。
【００４２】
遺伝情報を受け取り、プロセシングし、解析するために必要なソフトウェアは、単一のデバイスに実装される場合または複数のデバイスに実装され得る。ソフトウェアは、ネットワークを介してアクセス可能であってよく、その結果、情報の記憶およびプロセシングは、ユーザに対して遠隔で行われる。本発明の様々な局面による遺伝学的解析システムおよびそのさまざまな要素は、データの収集、プロセシングおよび/または解析などの遺伝学的解析を容易にするための機能および操作を提供する。本遺伝学的解析システムは、試料に関する情報を維持し、解析を容易にする。例えば本態様では、コンピュータシステムは、ゲノムに関する情報を受け取り、記憶し、検索し、解析し、かつ報告することができるコンピュータプログラムを実行する。コンピュータプログラムは、様々な機能または操作を行う複数のモジュール、例えば生データをプロセシングするためおよび補足データを生成するためのプロセシングモジュールならびに遺伝学的解析を行うために生データおよび補足データを解析するための解析モジュールを含み得る。
【００４３】
遺伝学的解析システムによって行われる手続きは、遺伝学的解析を容易にするための任意の適切なプロセスを含み得る。一態様では、遺伝学的解析システムは、遺伝子バリアントを同定するために構成される。
【００４４】
遺伝学的解析システムはまた、様々な追加的なモジュールおよび/または個別の機能を提供し得る。例えば、遺伝学的解析システムはまた、例えばプロセシング機能および解析機能に関係する情報を提供するための報告機能を含んでもよい。遺伝学的解析システムはまた、アクセスを制御することおよび他の管理用機能を行うことなどの、様々な管理用機能および管理機能を提供してもよい。
【００４５】
以下の実施例は、本発明の利点および特徴をさらに例証するために提供されるが、本発明の範囲を限定することを意図しない。本実施例は、使用され得るものの典型例であるが、当業者に公知の他の手続き、方法論、または技術がその代わりに使用される場合がある。
【実施例】
【００４６】
実施例I
C.エレガンスにおける発作遺伝子をアッセイするための超並列法
以下の方法論は、蠕虫モデルを使用して発作遺伝子をアッセイするために利用される。
【００４７】
方法論は、以下を含むと考えられる：
(a)蠕虫において調節不全にされた場合に走化性の欠損を引き起こす蠕虫遺伝子（CACNB4など）とオルソロガスなヒト遺伝子（ヒトオルソログ）を同定し；
(b)ヒトオルソログcDNAを蠕虫中に導入することによって蠕虫をヒト化して、それが走化性を回復させること（aka遺伝子レスキュー）を観察し；
(c)すべての可能なアミノ酸置換を有するオルソログ遺伝子バリアントの遺伝子バリアントオリゴヌクレオチドを生成し；
(d)C.エレガンス集団に遺伝子バリアントオリゴヌクレオチドをトランスフェクトし；
(e)これらの蠕虫のサブセットを高スループットシーケンシングして、各バリアントの相対比率を測定し；
(f)走化性アッセイを行い；そして
(g)走化性アッセイにおいて刺激に応答した（それに近づくことまたはそれから離れることのいずれかによる）蠕虫および応答しなかった蠕虫を高スループットシーケンシングして、各群における各バリアントの相対的存在量を測定する。
【００４８】
薬物有効性についての試験は、段階(f)が標的タンパク質の機能を変更すると予期される薬物の存在下で行われることを除いて類似の方法で、行われてもよい。
【００４９】
実施例II
CACNB4のアッセイ
CACNB4をヒトオルソログとして使用して、実施例Iに示される方法論を行った。
【００５０】
走化性アッセイのために、蠕虫を寒天平板または類似物の上に置いた。蠕虫からある程度離して誘引物質を置いた。しばらく後に（典型的には30〜60分）、誘引物質からある特定の距離（典型的には5mm）内の蠕虫の数を計数し、蠕虫の総数で割った。あるいは、何匹の蠕虫が最初の出発点から有意に（例えば5mm）移動するかを決定することによってもこれをスコア化した。
【００５１】
図1は、特定の変異を有するヒト化CACNB4を有する蠕虫の相対走化性を示す。N2 - 野生型蠕虫。hCACNB4、CACNB4オルソログがヒトCACNB4によって置換された野生型蠕虫。Odr-10嗅覚受容体10ヌル蠕虫（陰性対照）。HYPR484R、意義不確定のバリアント。C104F、公知の病原性変異。
【００５２】
本発明を、上記実施例を参照して説明してきたが、本発明の精神および範囲内で修飾および改変が包含されることが理解される。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲だけに限定される。
【図１】
2021526827.tif 000004
【国際調査報告】
2021526827.tif 000005
2021526827.tif 000006