(57)【要約】  本発明は、心臓状態を処置する際に有用な組成物および方法に関する。開示された組成物および方法は、２以上の導入遺伝子を対象の心臓に送達するための組み換えＡＡＶベクターを含むＡＡＶ治療に基づいており、ここで、導入遺伝子は、Ｓ１００ファミリータンパク質およびアポトーシスインヒビターを含む。いくつかの側面において、１以上の心臓状態の複数の供給源を標的とすることは、処置の間に相乗的な利益を提供し得る。
2021526818.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の心臓に２以上の導入遺伝子を送達するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）核酸ベクターであって、該ベクターは、５’から３’の順に、第一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、２以上の導入遺伝子および２以上の導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター、ポリアデニル化シグナル、および第二のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含み、ここで２以上の導入遺伝子は、Ｓ１００ファミリータンパク質およびアポトーシスインヒビターを含む、前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）核酸ベクター。
【請求項２】
Ｓ１００ファミリータンパク質が、心臓Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１  （ｃＳ１００Ａ１）またはそのバリアントである、請求項１に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項３】
アポトーシスインヒビターが、カスパーゼ動員ドメインを有する心臓アポトーシスリプレッサー（ｃＡＲＣ）またはそのバリアントである、請求項１または２に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項４】
配列内リポソーム進入部位（ＩＲＥＳ）が、ｃＳ１００Ａ１導入遺伝子とｃＡＲＣ  導入遺伝子との間に存在する、請求項２または３に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項５】
導入遺伝子が、種特異的である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項６】
プロモーターが、心臓に限局的なプロモーターである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項７】
心臓に限局的なプロモーターが、α−ミオシン重鎖遺伝子、６−ミオシン重鎖遺伝子、ミオシン軽鎖２ｖ遺伝子、ミオシン軽鎖２ａ遺伝子、ＣＡＲＰ遺伝子、心臓α−アクチン遺伝子、心臓ｍ２ムスカリン性アセチルコリン遺伝子、ＡＮＦ、心臓トロポニンＣ、心臓トロポニンＩ、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、心筋小胞体Ｃａ−ＡＴＰアーゼ遺伝子、および骨格筋α−アクチンからなる遺伝子の群、およびＭＬＣ−２ｖ遺伝子に由来する人工心臓プロモーターから選択される、請求項６に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項８】
心臓に限局的なプロモーターが、ｃＴｎＴである、請求項６または７に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項９】
ＡＡＶカプシド中にカプシド化された、請求項１〜８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子。
【請求項１０】
ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９血清型に由来するカプシドタンパク質を含む、請求項９に記載のｒＡＡＶ粒子。
【請求項１１】
ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶｒｈ．１０血清型に由来するカプシドタンパク質を含む、請求項９に記載のｒＡＡＶ粒子。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ粒子を含む組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組成物または請求項９〜１１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ粒子を対象に投与することを含む、心臓疾患を患う対象の処置の方法。
【請求項１４】
心臓疾患が、対象において心不全を引き起こすものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
心臓疾患が、心筋症である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
心臓疾患が、肥大型心筋症または拡張型心筋症である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
心臓疾患が、急性虚血である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１８】
組成物が、対象の心臓に注射を介して投与される、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
組成物の投与が、対象の心臓における２以上の導入遺伝子の発現を結果として生じる、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
対象が、哺乳動物である、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物が、ヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
哺乳動物が、伴侶動物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
伴侶動物が、イヌまたはネコである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｓ１００ファミリータンパク質を含む導入遺伝子が、アポトーシスインヒビターを含む導入遺伝子の５’側に位置する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項２５】
アポトーシスインヒビターを含む導入遺伝子が、Ｓ１００ファミリータンパク質を含む導入遺伝子の５’側に位置する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１８年６月８日に出願された米国仮出願第 62/682,772号および２０１９年３月２１に出願された米国仮出願第 62/822,015号の出願日の利益を主張し、これらの各々の内容全体は、参照により援用される。
【０００２】
背景
拡張型心筋症（ＤＣＭ）は、イヌにおける心臓疾患の第二の最も一般的な原因であり、二次的兆候の医療管理は、唯一の治療選択肢である。罹患したイヌの予後は、疾患の段階および品種に依存する。ドーベルマン・ピンシェルは、一旦うっ血性心不全（ＣＨＦ）が生じると、最大の生存が６か月未満で、具体的に迅速なおよび一様な進行を示す。拡張型心筋症（ＤＣＭ）は、最も一般的なタイプのヒト心筋症であり、２０〜６０の成年者に発生する。それは、心臓の心室および心房、夫々、心臓の下方および上方の房(chamber)に影響する。
【０００３】
ＤＣＭのほとんどの形態は、冠動脈心疾患、心臓発作、高血圧、糖尿病、甲状腺疾患、心筋を炎症させるウイルス肝炎およびウイルス感染症を包含する多数の原因からの後天性の形態である。アルコール依存およびコカインおよびアンフェタミンなどのある薬物、ならびにがんの処置に使用される少なくとも２つの薬物（ドキソルビシンおよびダウノルビシン）はまた、ＤＣＭを導き得る。加えて、デュシェンヌ型およびベッカー型筋ジストロフィーに関連するＤＣＭを包含するが、これらに限定されない、ＤＣＭの多数の遺伝子形態が存在する。ベッカー型筋ジストロフィーのある形態の場合、ならびに、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのほとんどの場合では、心筋症は、結局は、患者の生存を制限し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
概要
心筋症は、対象における心臓疾患の第二の最も一般的な原因であり、および、二次的な兆候の医療管理が唯一の治療選択肢である。罹患した対象の予後は、疾患の段階および品種に依存する。心臓機能は、カルシウム依存性のシグナリングに重大に依存している。心臓疾患の間、心細胞内のカルシウムチャネルの機能障害は、カルシウム循環の異常を促進し、さらに心臓機能を阻害する。カルシウム循環の異常を低減するための遺伝子導入ストラテジーは、小および大動物モデルならびにヒト臨床試験における心疾患を寛解させることが示されている。
【０００５】
ヒトにおいて、拡張型心筋症は、最も一般的なタイプの心筋症であり、および、多数の後天性のならびに遺伝子の状態に由来し得る。イヌおよび他の動物モデルにおけるように、疾患の起源は、カルシウム操作機能障害に基づくが、疾患の最終的な進行は、ミトコンドリア機能障害および／または心筋細胞のストレッチ誘導性アポトーシスによって駆動される。カルシウム操作単独に取り組むことは、疾患初期段階において有効であるかもしれないが、カルシウム操作、ミトコンドリア機能障害、およびアポトーシスの組み合わせに取り組むことは、すべての形態のＤＣＭおよびすべての段階の疾患進行を処置するのに必要であろう。
【０００６】
本明細書に開示されるのは、心筋症およびうっ血性心不全を有する対象の処置のための遺伝子送達アプローチである。これらのアプローチは、アポトーシスのすべての供給源をブロックし、および、ミトコンドリア機能を正常化させるために、カルシウム操作およびＡＲＣ（カスパーゼ動員ドメインを有するアポトーシスリプレッサー）の発現に取り組むためのＳ１００Ａ１の発現を含む。開示された自己相補的なＡＡＶベクターアプローチを介するＳ１００Ａ１およびＡＲＣ導入遺伝子の発現は、迅速であり（すなわち、数時間以内）、これは、末期の心不全の影響に対抗する際に重大であり、心臓に限局的である。よって、これらのアプローチは、ＤＣＭの開始および進行の３つすべての駆動に取り組み、およびよって、疾患進行のいずれの段階におけるいずれのＤＣＭの形態にも適用可能なはずである。
【０００７】
本開示のいくつかの側面は、対象の心臓へ導入遺伝子を送達するための、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。いくつかの態様において、かかるｒＡＡＶベクターは、少なくとも２つの導入遺伝子を包含し、１つはＳ１００ファミリータンパク質をコードし、および１つはアポトーシスインヒビターをコードする。かかるｒＡＡＶベクターは、５’から３’の順で、第一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター、および第二のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を包含してもよい。いくつかの態様において、２つの導入遺伝子は、同じ単一のプロモーターに操作可能に連結されている。他の態様において、各導入遺伝子は、別々のプロモーターに操作可能に連結されている。
【０００８】
いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターはまた、少なくとも１のポリアデニル化シグナルを包含する（例として、単一のプロモーターから発現される２つの導入遺伝子の３’側、または異なるプロモーターから発現される１つまたは両方の導入遺伝子の３’側）。本開示の側面は、２以上の導入遺伝子を対象の心臓に送達するための、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）核酸ベクターを提供し、ここで該ベクターは、５’から３’への順で、第一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、２以上の導入遺伝子および２以上の導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター、ポリアデニル化シグナル、および第二のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含み、ここで２以上の導入遺伝子は、Ｓ１００ファミリータンパク質およびアポトーシスインヒビターを含む。
【０００９】
本開示の導入遺伝子は、Ｓ１００ファミリータンパク質およびアポトーシスインヒビターであり得る。例えば、Ｓ１００ファミリータンパク質は、心臓Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１（ｃＳ１００Ａ１）またはそのバリアントである。別の例において、アポトーシスインヒビターは、カスパーゼ動員ドメインを有する心臓アポトーシスリプレッサー（ｃＡＲＣ）またはそのバリアントである。
【００１０】
いくつかの態様において、本開示の１以上の導入遺伝子、天然に存在する配列である。いくつかの態様において、１以上の導入遺伝子は、種特異的であるように改変されている。いくつかの態様において、１以上の導入遺伝子は、目的の種、例としてイヌにおける発現のためにコドン最適化されている。ある態様において、１以上の導入遺伝子（例としてｃＡＲＣ導入遺伝子）は、コドン最適化されている。
【００１１】
いくつかの態様において、配列内リポソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、２以上の導入遺伝子の間（例として、ｃＳ１００Ａ１導入遺伝子とｃＡＲＣ導入遺伝子との間）に存在する。いくつかの態様において、Ｓ１００ファミリータンパク質をコードする導入遺伝子は、アポトーシスインヒビターをコードする導入遺伝子の５’側にある。他の態様において、アポトーシスインヒビターをコードする導入遺伝子は、Ｓ１００ファミリータンパク質をコードする導入遺伝子の５’側にある。
【００１２】
いくつかの態様において、プロモーターは、心臓に限局的なプロモーターである。心臓に限局的なプロモーターは、以下の遺伝子：α−ミオシン重鎖遺伝子、６−ミオシン重鎖遺伝子、ミオシン軽鎖２ｖ遺伝子、ミオシン軽鎖２ａ遺伝子、ＣＡＲＰ遺伝子、心臓α−アクチン遺伝子、心臓ｍ２ムスカリン性アセチルコリン遺伝子、ＡＮＦ、心臓トロポニンＣ、心臓トロポニンＩ、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、心筋小胞体Ｃａ−ＡＴＰアーゼ遺伝子、骨格α−アクチンのうちの１つからのプロモーター；またはＭＬＣ−２ｖ遺伝子に由来する人工心臓プロモーターであり得る。いくつかの態様において、心臓に限局的なプロモーターは、ｃＴｎＴプロモーターである。
【００１３】
さらに本明細書に提供されるのは、ＡＡＶカプシド中にカプシド化された、本明細書に開示のｒＡＡＶベクターを含有するｒＡＡＶ粒子である。いくつかの態様において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９血清型に由来するカプシドタンパク質を含む。いくつかの態様において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｒｈ．１０血清型に由来するカプシドタンパク質を含む。
【００１４】
本発明の他の側面は、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子を含有する組成物を包含する。かかる組成物は、心臓疾患のための遺伝子治療のために対象に投与され得る。いくつかの態様において、心臓疾患は、対象において心不全を引き起こす。いくつかの態様において、心臓疾患は、心筋症である。他の態様において、心臓疾患は、肥大型心筋症または拡張型心筋症である。他の態様において、心臓疾患は、急性虚血である。
【００１５】
本発明の組成物は、異なるルートを介して、対象に投与され得る。いくつかの態様において、組成物は、注射を介して対象の心臓に投与される。いくつかの態様において、組成物の投与は、対象の心臓における導入遺伝子の発現を結果として生じる。
【００１６】
いくつかの態様において、対象は、哺乳動物である。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの態様において、哺乳動物は、伴侶動物である。例えば、伴侶動物は、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギまたは他のペットであり得る。
【００１７】
本発明の要素の各々は、本発明の様々な態様を包含し得る。したがって、いずれか１つの要素または要素の組み合わせを伴う、本発明の制限の各々は、本発明の各側面に包含され得ることが予期される。本発明は、以下の記載で表される、または、図面において説明される、構成要素の構築の詳細および配置への適用に限定されない。本発明は、他の態様が可能であり、および、様々な手法で実践できるかまたは実施できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
図面の簡単な記載
以下の図面は、本願明細書の一部を形成し、および、本発明のある側面をさらに示すために包含される。本開示は、似たような参照数字が似たような要素を同定する、添付の図面と併せて、以下の記載を参照することによって、より良く理解され得る。
【００１９】
【図１】図１は、例示のＡＡＶ構築物の図表を描写する。第一のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、これに続き心臓トロポニンＴプロモーター（ｃＴｎＴ）、次いで種特異的Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１（ｃＳ１００Ａ１）についてコドン最適化された配列、これに続き配列内リポソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、これに続きカスパーゼ動員ドメインを有する種特異的アポトーシスリプレッサー（ｃＡＲＣ）についてコドン最適化された配列、これに続きポリアデニル化（ＰＡ）配列、および第二のＡＡＶ  ＩＴＲが続く。
【図２】図２は、ベースラインおよび遺伝子送達の数週間後における処置された筋ジストロフィーのイヌからの拡張期ＭＲＩ画像を描写する。データは、拡張期の左心室体積における軽度の減少を有する、安定したまたはわずかに改善した心臓リモデリングを支持する。
【００２０】
【図３】図３は、ベースラインおよび遺伝子送達の数週間後における処置された筋ジストロフィーのイヌからの収縮期ＭＲＩ画像を描写する。データは、処置後の安定したまたはわずかに改善した左心室収縮期機能を支持し、改善した収縮力および左心室心拍出量における増加を示唆する、収縮期体積の軽度の低減を有する。
【図４】図４は、ＡＡＶｒｈ．１０−Ｓ１００Ａ１／ＡＲＣ処置後の、Ｄ２．ｍｄｘ  マウスの駆出率、ピークストレイン、および心拍出量を示す。２４週期間にわたり、治療用ＡＡＶを注射したマウスは、シャム注射のマウスと比較して、駆出率、ストレイン発生、および心拍出量をよりよく維持していた。
【００２１】
【図５】図５は、組換えＡＡＶｒｈ．１０−Ｓ１００Ａ１／ＡＲＣベクターで処置したマウスおよび対照マウスにおけるＳ１００Ａ１およびＡＲＣ発現レベルを示す。タンパク質分析（ウェスタンブロット）は、Ｓ１００Ａ１およびＡＲＣの両方のレベルが、対照（シャム注射）と比較して、処置された組織において上昇したことを確認した。
【図６】図６は、１０Ｘおよび２０Ｘ倍率下での対照および処置マウスの心筋細胞を示す。心筋の組織学データは、対照心臓と比較して、ＤＭＤ病的状態を少なく示すことを表す。
【００２２】
【図７】図７は、（二匹のうちの）第一のジストロフィン欠損イヌ（ＧＲＭＤイヌ）カルビンが、組換えＡＡＶｒｈ．１０−Ｓ１００Ａ１／ＡＲＣ処置後に、改善した心筋機能を示したことを示す。両方の注射されたイヌは、心臓ＭＲＩによって測定され、および、エコーデータによって確認される、処置後の駆出率および他の心臓パラメータにおける改善を示した。
【図８】図８は、第二のＧＲＭＤイヌのセバスチャンが、ＡＡＶｒｈ．１０−Ｓ１００Ａ１／ＡＲＣ処置後に、改善された心臓機能を示したデータを示す。
【００２３】
【図９】図９Ａ〜９Ｃは、ＡＡＶ−Ｓ１００Ａ１／ＡＲＣ処置が、ＧＲＭＤイヌのセバスチャンおよびカルビンにおいて血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルを減少させ、および、筋委縮症を防止したことを示す。両肢の面積（図９Ａ）、最大断面積（ＣＳＡ）（図９Ｂ）、および両肢の体積（図９Ｃ）によって測定される場合の、肢筋肉質量のＭＲＩ測定値。結果は、骨格筋質量が、心臓処置後に、増加したかまたは変化しないままのいずれかであったことを示す。
【図１０】図１０は、ＧＲＭＤ対象の骨格筋における循環クレアチンキナーゼレベル（ＣＫ）レベルが、ＡＡＶｒｈ．１０−Ｓ１００Ａ１／ＡＲＣ注射後に低減されたことを示し、進行中の筋肉損傷における低減を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
詳細な記載
本発明は、対象における心臓疾患、例として心筋症についての心臓遺伝子治療の組成物および方法に関する。本発明の方法は、２つの導入遺伝子の同時送達および発現のための、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子の使用に関する。本発明の導入遺伝子は、少なくとも２つのクラスのタンパク質を含み、各々が、心臓疾患の異なる側面に取り組むための特定の機能を有する。１つのクラスの導入遺伝子は、心筋細胞におけるカルシウムシグナリングを調節する（例として、Ｓ１００ファミリータンパク質）。他のクラスの導入遺伝子は、アポトーシスリプレッサーを含む。いくつかの態様において、導入遺伝子は、心臓Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１（ｃＳ１００Ａ１）またはそのバリアント、およびカスパーゼ動員ドメインを有する心臓アポトーシスリプレッサー（ｃＡＲＣ）またはそのバリアントであり得る。
【００２５】
本発明の組成物および方法は、これらが対象の心臓に同時に送達されおよび発現するときの、２つの導入遺伝子、例としてＳ１００Ａ１およびＡＲＣの相乗効果に少なくとも一部基づいている。Ｓ１００Ａ１タンパク質は、収縮機能の正常化を導く筋小胞体トランジェントの正常化を包含する、カルシウム操作の側面を改善する。ＡＲＣタンパク質は、ミトコンドリアおよび非ミトコンドリア機構によって開始されるアポトーシス（ストレッチ誘導性アポトーシスなど）をブロックし、および、ミトコンドリア機能を改善する。換言すれば、Ｓ１００Ａ１およびＡＲＣは、相乗的な利益を有する、２つの別々の心不全の構成要素（カルシウム操作機能障害およびアポトーシス）に取り組み、より良い長期の治療成果を導く。さらに、本発明の組成物および方法は、心不全のいずれの疾患段階でも有効である。
【００２６】
さらに本明細書に提供されるのは、対象の心臓に導入遺伝子、例としてＳ１００Ａ１およびＡＲＣまたはそのバリアントを送達するのに好適なｒＡＡＶ粒子を作製する方法である。かかるｒＡＡＶ粒子は、導入遺伝子をコードする核酸分子を含む、組換えＡＡＶゲノムを含み得、ここで該核酸分子は、ＡＡＶカプシドタンパク質によってカプシド化される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）核酸ベクターを包含する。組換えＡＡＶゲノムは、宿主ゲノムへのＡＡＶゲノムの統合および導入遺伝子の発現を容易にする配列要素をさらに含み得る一本鎖  ＤＮＡである。例えば、組換えＡＡＶゲノムは、標的組織または器官における導入遺伝子の発現を保証するために、組織特異的プロモーターを含み得る。かかるｒＡＡＶ粒子  は、心臓状態の処置のための組成物において使用され得る。
【００２７】
よって、本開示はさらに、対象の心臓に導入遺伝子を送達するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。いくつかの態様において、開示されたｒＡＡＶベクターは、少なくとも２の導入遺伝子を包含し、１つは、Ｓ１００ファミリータンパク質をコードし、１つは、アポトーシスインヒビターをコードする。これらのｒＡＡＶベクターは、５’から３’の順で、第一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター、および第二のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を包含してもよい。いくつかの態様において、２つの導入遺伝子は、同じ単一のプロモーターに操作可能に連結されている。他の態様において、各導入遺伝子は、別々のプロモーターに操作可能に連結されている。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターはまた、少なくとも１のポリアデニル化シグナルを包含する（例として、単一のプロモーターから発現される２つの導入遺伝子の３’側に、または、異なるプロモーターから発現される１つまたは両方の導入遺伝子の３’側に）。
【００２８】
本開示はさらに、対象の心臓に２以上の導入遺伝子を送達するための、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）核酸ベクターを提供し、ここで該ベクターは、５’から３’の順に、第一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、２以上の導入遺伝子および２以上の導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター、ポリアデニル化シグナル、および第二のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、ここで２以上の導入遺伝子は、Ｓ１００ファミリータンパク質およびアポトーシスインヒビターを含む。
【００２９】
「導入遺伝子」は、本明細書に使用されるとき、１つの生物から別の生物へ天然にまたは数多の遺伝子工学技法のいずれかによって導入された遺伝子または遺伝子材料を指す。導入遺伝子は、目的のタンパク質またはポリペプチド（例として、Ｓ１００Ａ１、ＡＲＣ）または目的のＲＮＡ（例として、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ）であってもよい。いくつかの態様において、１つのｒＡＡＶベクターは、１以上の導入遺伝子についてのコード配列を含み得る。例えば、１つのｒＡＡＶベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の導入遺伝子についてコード配列を含み得る。いくつかの態様において、本開示のｒＡＡＶベクターは、Ｓ１００Ａ１およびＡＲＣの両方またはそのバリアントのコード配列を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターはさらに、Ｒｅｐタンパク質をコードする領域を含む。本開示の導入遺伝子は、２つのクラスのタンパク質を含み、各々は、１以上の心臓状態の異なる側面に取り組むための特定の機能を有する。導入遺伝子の１つのクラスは、心筋細胞におけるカルシウムシグナリングを調節し得る（例として、Ｓ１００ファミリータンパク質）。別のクラスの導入遺伝子は、アポトーシスリプレッサーを含み得る。
【００３０】
本明細書に使用されるとき、用語「バリアント」は、天然に存在するものから逸脱した特徴を有する核酸を指す（例として、「バリアント」は、野生型核酸と、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である）。実例として、導入遺伝子バリアントは、その野生型配列と比較して、導入遺伝子のヌクレオチドにおいて１以上の置換を含む核酸である。これらの置換は、サイレントであってもよく、すなわち、これらはコードされるいずれかのタンパク質のアミノ酸配列を改変しない（またはその他、バリアントアミノ酸配列を結果として生じる）。
【００３１】
代替的に、これらの置換は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列への改変を結果として生じ得、野生型タンパク質配列と比べて、１以上のアミノ酸置換を有する（例として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０〜１５、または１５〜２０アミノ酸置換を有する）コードされたタンパク質を結果として生じる。これらの置換は、化学的改変ならびにトランケーションを包含する。いくつかの態様において、１以上のアミノ酸置換を有するタンパク質は、野生型タンパク質機能を保持するか、または、野生型タンパク質機能と実質的に同じ機能（例として、機能の少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、例として５０〜７５％、または７５〜１００％）を保持する。この用語はさらに、野生型核酸配列の機能的フラグメントも包含する。
【００３２】
いくつかの態様において、１以上の開示された導入遺伝子は、天然に存在する配列である。いくつかの態様において、１以上の導入遺伝子は、種特異的であるように改変される。いくつかの態様において、１以上の導入遺伝子は、目的の種（例として、イヌ）における発現のためにコドン最適化されている。ある態様において、ｃＡＲＣ導入遺伝子は、コドン最適化されている。
【００３３】
本開示に従って使用され得るＳ１００ファミリータンパク質は、限定せずに、Ｓ１００Ａ１、Ｓ１００Ａ２、Ｓ１００Ａ３、Ｓ１００Ａ４、Ｓ１００Ａ５、Ｓ１００Ａ６、Ｓ１００Ａ７（例として、ソリアシン）、Ｓ１００Ａ８（例として、カルグラニュリンＡ）、Ｓ１００Ａ９（例として、カルグラニュリンＢ）、Ｓ１００Ａ１０、Ｓ１００Ａ１１、Ｓ１００Ａ１２（例として、カルグラニュリンＣ）、Ｓ１００Ａ１３、Ｓ１００Ａ１４、Ｓ１００Ａ１５（例として、koebnerisin）、Ｓ１００Ａ１６、Ｓ１００Ｂ、Ｓ１００Ｐ、およびＳ１００Ｚ、またはそれらのバリアントを包含する。
【００３４】
いくつかの態様において、Ｓ１００ファミリータンパク質は、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１（Ｓ１００Ａ１）であり得る。いくつかの態様において、Ｓ１００Ａ１は、心臓Ｓ１００Ａ１（ｃＳ１００Ａ１）またはそのバリアントである。ｃＳ１００Ａ１タンパク質は、心筋収縮性の調節因子である。ｃＳ１００Ａ１タンパク質レベルは、肺の高血圧症のモデルの右心室の肥大組織において低減した。さらに、Ｓ１００Ａ１は、ＭＹＨ７、ＡＣＴＡ１およびＳ１００Ｂを包含する、肥大性遺伝子のアルファ１アドレナリン作動性刺激を阻害する点で、Ｓ１００Ａ１は、心臓肥大の基礎となる遺伝子プログラムの調節因子である。心筋細胞において、Ｓ１００Ａ１は、ＲｙＲ２、ＳＥＲＣＡ２、タイチン、およびミトコンドリアＦ１−ＡＴＰアーゼ活性のモジュレーションを介して、ＳＲ、サルコメア、およびミトコンドリア機能のカルシウム制御されたネットワークを調節する。
【００３５】
結果として、増大したＳ１００Ａ１発現を有する心筋細胞および心臓は、増大した収縮性および弛緩性性能を示す（減少した弛緩性ＳＲ  Ｃａ２＋漏出および増強されたＣａ２＋再隔離(resquestration)と一緒に、増強されたＳＲ  Ｃａ２＋負荷およびこれに続く収縮期Ｃａ２＋放出から生じる改善されたＣａ２＋の一過性の振幅の結果）。同時に、Ｓ１００Ａ１は、ミトコンドリア高エネルギーホスファート産生を増大させ、およびよって、増強された心筋細胞Ｃａ２＋代謝回転によって増大したアデノシン５’−トリホスファート（ＡＴＰ）需要と、エネルギー供給を協調させる。心筋細胞における低減したＳ１００Ａ１発現は、低減した伸縮機能に関連し、このタンパク質の病態生理学的重要性を実証する。
【００３６】
いくつかの態様において、Ｓ１００Ａ１  ｃＤＮＡ（導入遺伝子）配列は、天然に存在するＳ１００Ａ１配列に対して１００％同一性を有する。他の態様において、Ｓ１００Ａ１  ｃＤＮＡ配列は、天然に存在するＳ１００Ａ１配列に対して、少なくとも約７０％同一性、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約９０％同一性、少なくとも約９５％同一性、少なくとも約９６％同一性、少なくとも約９７％同一性、少なくとも約９８％同一性、少なくとも約９９％同一性、少なくとも約９９．５％同一性、または少なくとも約９９．９％同一性を有する。
【００３７】
いくつかの態様において、Ｓ１００Ａ１  ｃＤＮＡ配列は、種特異的であるように改変されている。具体的な態様において、Ｓ１００Ａ１  ｃＤＮＡ配列は、目的の種における発現のためにコドン最適化されている。Ｓ１００Ａ１  ｃＤＮＡ配列の非制限例は、以下に列挙される。
【００３８】
S100A1 (canis lupus familiaris)
(NCBI参照配列: XM_005622816.2)
ATGGGCTCTGAGCTGGAGACAGCGATGGAGACTCTCATCAATGTGTTCCATGCCCACTCGGGCAAGGAGGGAAACAAGTACAAGCTGAGCAAGAAGGAGCTAAAGGAGCTGCTGCAGACTGAGCTCTCCGGCTTCCTGGACGCCCAGAAGGATGCGGATGCTGTGGACAAGGTGATGAAAGAGCTAGATGAGAATGGAGATGGGGAGGTGGACTTCCAGGAGTATGTGGTGCTGGTGGCTGCCCTCACAGTGGCCTGTAACAACTTCTTCTGGGAAAACAGTTGA  (配列番号1)
【００３９】
S100A1 (felis catus)
(NCBI参照配列: XM_003999773.3)
ATGGGCTCAGAGCTGGAGACGGCGATGGAGACTCTCATCAACGTGTTCCACGCCCACTCGGGCAAGGAGGGAGACAAGTACAAGCTGAGCAAGAAGGAGCTAAAAGAGCTGCTGCAGACCGAGCTCTCTGGCTTCCTGGACGCCCAGAAGGATGCCGACGCTGTGGACAAGGTGATGAAAGAGCTAGACGAGAATGGAGATGGGGAGGTGGACTTCCAAGAGTATGTGGTGCTGGTGGCTGCCCTCACAGTGGCCTGTAACAACTTTTTCTGGGAGAACAGTTGA  (配列番号2)
【００４０】
本出願のいくつかの側面は、アポトーシスインヒビター（例として、抗アポトーシス剤）をコードする導入遺伝子を包含する組成物およびその送達を包含する方法を提供する。アポトーシスインヒビターの説明に役立つ例は、アデノウイルスからのｆｉｎｋ、ｐ３５、ｃｒｍＡ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ、ならびにアポトーシス促進剤のアンタゴニスト（例として、アンチセンス、リボザイム、抗体、等々）を包含する。いくつかの態様において、アポトーシスインヒビターは、カスパーゼ動員ドメイン（ＡＲＣ）を有するアポトーシスリプレッサーである。他の態様において、アポトーシスインヒビターは、心臓ＡＲＣまたはそのバリアントである。
【００４１】
いくつかの態様において、Ｓ１００ファミリータンパク質およびアポトーシスインヒビターを個別に送達することが所望され得る。ある態様において、Ｓ１００ファミリータンパク質をコードする導入遺伝子は、１以上の小分子アポトーシスインヒビターと同時にまたは連続して送達される。例示の小分子アポトーシスインヒビターは、ｃ−Ｍｙｃインヒビター、Ｂａｘインヒビター、ｐ５３インヒビター、ｔＢｉｄインヒビター、カスパーゼインヒビター、およびアポトーシス促進性ＢＣＬ−２ファミリーメンバーのインヒビターを包含する。いくつかの態様において、アポトーシスリプレッサーは、カスパーゼ動員ドメインを有する心臓アポトーシスリプレッサー（ｃＡＲＣ）であり得る。
【００４２】
ｃＡＲＣは、筋芽細胞においてほとんど排他的に発現されるアポトーシス調節タンパク質である。それは、いくつかの開始剤カスパーゼの活性化をブロックする、カスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）を含有する。ＡＲＣはまた、アポトーシスに関連するカスパーゼ独立事象をブロックする。急性虚血およびこれに続く心室リモデリングによって引き起こされるアポトーシスは、心不全のメディエーターとして関係づけられる。虚血後の心不全は、複数の原因を有し得るが、近年の注目は、アポトーシスまたはプログラム細胞死の貢献の理解に向けられている。
【００４３】
アポトーシスは、ミトコンドリアおよび筋細胞膜の保存、核クロマチン縮合、および炎症反応を引き起こすことのないマクロファージまたは隣接する細胞による食作用によって特徴づけられる。アポトーシスの活性化は、不活性な前駆体として合成されたおよびその活性形態にタンパク質分解によって切断される、システインプロテアーゼのファミリーである、カスパーゼを伴う機構を介して生じることが知られている。ＡＲＣは、カスパーゼをブロックすることによって、アポトーシスの活性化をブロックすることができる。
【００４４】
いくつかの態様において、ｃＡＲＣ  ｃＤＮＡ（導入遺伝子）配列は、天然に存在するｃＡＲＣ配列に対して同一性を有する。他の態様において、ｃＡＲＣ  ｃＤＮＡ配列は、天然に存在するｃＡＲＣ配列に対して、少なくとも約７０％同一性、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約９０％同一性、少なくとも約９５％同一性、少なくとも約９６％同一性、少なくとも約９７％同一性、少なくとも約９８％同一性、少なくとも約９９％同一性、少なくとも約９９．５％同一性、または少なくとも約９９．９％同一性を有する。
【００４５】
いくつかの態様において、ｃＡＲＣ  ｃＤＮＡ配列は、種特異的であるように改変されている。具体的な態様において、ｃＡＲＣ  ｃＤＮＡ配列は、目的の種における発現のためにコドン最適化されている。具体的な態様において、ｃＡＲＣ  ｃＤＮＡ配列は、イヌ細胞における発現のためにコドン最適化されている。
【００４６】
Ｓ１００ファミリータンパク質（例として、ｃＳ１００Ａ１）をコードする導入遺伝子は、記載されたｒＡＡＶ核酸ベクター内で、アポトーシスインヒビター（例として、ｃＡＲＣ）をコードする導入遺伝子の５’側に位置付けられ得る。代替的に、アポトーシスインヒビターをコードする導入遺伝子は、記載されたｒＡＡＶ核酸ベクター内で、Ｓ１００ファミリータンパク質をコードする導入遺伝子の５’側に位置付けられ得る。
ｃＡＲＣ  ｃＤＮＡ配列の非制限例は、以下に列挙される。
【００４７】
ARC (canis lupus familiaris)
(NCBI参照配列: NM_001048121.1)
ATGCAGGAAGCGCCAGCCGCGCTGCCCACGGAGCCGGGCCCCAGCCCCGTGCCTGCCTTCCTCGGCAAGCTGTGGGCGCTGGTGGGCGACCCGGGGACCGACCACCTCATCCGCTGGAGCCCGAGCGGGACCAGTTTCCTCGTCAGCGACCAGAGCCGCTTCGCCAAGGAAGTGCTGCCCCAGTACTTCAAGCACAGCAACATGGCGAGCTTCGTGCGGCAGCTCAACATGTACGGTTTTCGGAAGGTGGTGAGCATCGAGCAGGGCGGCCTGCTCAGGCCGGAGCGCGACCACGTCGAGTTCCAGCACCCGAGCTTCGTCCGCGGCCGAGAGCAACTCCTGGAGCGCGTGCGGCGCAAGGTGCCCGCGCTGCGCAGCGACGACGGCCGCTGGCGCCCCGAGGACCTGGGCCGGCTGCTGGGCGAGGTGCAGGCTTTGCGGGGAGTGCAGGAGATCACCGAGGCGCGGCTGCGGGAGCTCAGGCAGCAGAACGAGATCTTATGGAGGGAGGTGGTGACTCTGCGGCAGAGCCACGGTCAGCAGCATCGCGTCATTGGCAAGCTGATCCAGTGCCTCTTTGGGCCACTTCAGACAGGGTCCAGCGGCGCAGGAGCTAAGAGAAAGCTGTCTCTGATGCTGGATGAGGGGAGCTCATGCCCAACACCGGCCAAATTCAACACCTGTCCTTTACCTGGTGCCCTCTTGCAGGATCCCTACTTTATCCAGTCGCCCCTCCCAGAGACCACCTTGGGCCTCAGCAGCTCTCATAGGACCAGGGGCCCTATCATCTCTGACATCCATGAAGACTCTCCCTCCCCTGATGGGACCAGGCTTTCTCCTTCCAGTGGTGGCAGGAGGGAGAAGGGCCTGGCACTGCTCAAAGAAGAGCCGGCCAGCCCAGGGGGGGAAGGCGAGGCCGGGCTGGCCCTGGCCCCAAACGAGTGTGACTTCTGCGTGACAGCCCCCCCCCCACTGTCCGTGGCTGTGGTGCAGGCCATCCTGGAAGGGAAGGGGAACTTCAGCCCCGAGGGGCCCAGGAATGCCCAACAGCCTGAACCAAGGGGTCCCAGGGAGGTACCTGACAGGGGGACTCTGGGCCTGGACAGGGGGGCACGAAGCCCAGAGAATCTGCTGCCTCCCATGCTGCTTCGGGCCCCCCCTGAAAGTGTGGAGCCTGCAGGGCCCCTGGATGTGCTGGGCCCCAGCCATCAAGGGCGAGAATGGACCCTGATGGACTTGGACATGGAGCTGTCCCTGATGCAGCCCTTGGGTCCAGAGAGGAGTGAGACTGAGCTGGCGGTCAAGGGGTTAAATTCTCCGGGGCCAGGGAAGGACTCCACACTTGGGGCACCACTCCTGCTCGATGTCCAAGCGGCTTTGGGAGGCCCAGCTCTCAGCCTTCCTGGAGCTTTAACCATTTACAGCACCCCTGAGAGCCGAGCCAACTACCTAGGCCCAGGGGCCAATCCCTCCCCCTGA  (配列番号3)
【００４８】
ARC (felis catus)
(NCBI参照配列: XM_006941587.2)
ATGGGCAATGCGCAGGAGCGGCCCTCAGAGACGATCGATCGCGAGCGGAAACGCCTAGTGGAGACGCTGCAGGACGACTCCGGGCTGCTGCTGGATGCACTGCTGGCGCGCGGCGTGCTCACCGGGCCTGAGTATGAGGCGTTGGACGCGCTGCCTGATGCCGAGCGCAGGGTGCGTCGCCTGCTGCTGCTGGTACAAAGCAAGGGCGAGGCCGCCTGCCAGGAGCTGCTGCACTGCGCCCAGCGTACTACGCGCGCGCCAGACCCGGCCTGGGACTGGCAGCACGTGGGCACTGGCTACCGGGAACGCAGCTACGACTCTCCATGCCCTGGCCACTGGACGCCTGAGGCACCTGACTTGAGGACCGCTTGCCCCGAAACGCCCAGAGCTTCAGACTGCGACGAGGCTGGGGTTTCAGGGGGCTCGGAGGCAGTATCCGGAACCCTCGAGGAACTCGATCCGGAAGTGGAAGCTGAAGTCTCTGAAGGGGCTGAGCCAGAGCCAGAGCCAGAGCCCGACTTTGAGGCGGGTGATGAGTCTGAAGATTCC  (配列番号4)
【００４９】
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター
本発明のいくつかの側面は、心臓疾患の遺伝子治療のために使用され得る組換えＡＡＶベクターに関する。本明細書に使用されるとき、用語「ベクター」は、核酸ベクター（例として、プラスミドまたは組換えウイルスゲノム）、野生型ＡＡＶゲノム、またはウイルスゲノムを含むウイルスを指し得る。
【００５０】
野生型ＡＡＶゲノムは、プラス鎖またはマイナス鎖のいずれかの一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）である。ゲノムは、２つの逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）（ＤＮＡ鎖の各末端に１つ）および２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ＩＴＲの間にｒｅｐおよびｃａｐを含む。ｒｅｐ  ＯＲＦは、ＡＡＶ生活環について必要なＲｅｐタンパク質をコードする４つの重複する遺伝子を含む。ｃａｐ  ＯＲＦは、一緒に相互作用してウイルスカプシドを形成する、カプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする重複する遺伝子を含む。
【００５１】
ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、２つの異なる様式でスプライシングされ得る、１つのｍＲＮＡ転写産物から翻訳される。より長いまたはより短いかのいずれかのイントロンが、切除され、２つのｍＲＮＡアイソフォーム：〜２．３ｋｂおよび〜２．６ｋｂ長の  ｍＲＮＡアイソフォームの形成を結果として生じ得る。カプシドは、およそ６０の個々のカプシドタンパク質サブユニットの、ＡＡＶゲノムを保護することができる、非エンベロープのＴ−１正二十面体格子の超分子アセンブリを形成する。成熟したＡＡＶカプシドは、約１：１：１０の比率で、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３（夫々およそ８７、７３、および６２ｋＤａの分子量）から構成される。
【００５２】
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子は、組換え核酸ベクター（以下、「ｒＡＡＶベクター」と称される）を含み得、これは、最小限で：（ａ）導入遺伝子をコードする配列を含む１以上の異種核酸領域；および（ｂ）目的のゲノムへの異種核酸領域の統合を容易にする配列を含む１以上の領域（任意に発現を容易にする配列を含む１以上の核酸領域を用いる）を含み得る。いくつかの態様において、対象のゲノムへの異種核酸領域の統合を容易にする配列（任意に発現を容易にする配列を含む１以上の核酸領域を用いる）は、１以上の核酸領域（例として、異種核酸領域）に隣接する逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列（例として、野生型ＩＴＲ配列または改変されたＩＴＲ配列）である。
【００５３】
ＩＴＲ配列は、いずれかのＡＡＶ血清型（例として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）に由来してもよいし、１を超える血清型に由来してもよい。いくつかの態様において、ＩＴＲ配列はＡＡＶ２またはＡＡＶ６血清型に由来する。いくつかの態様において、本明細書に提供される第一の血清型は、ＡＡＶ２またはＡＡＶ８血清型ではない。いくつかの態様において、第一の血清型のＩＴＲ配列は、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５またはＡＡＶ６に由来する。いくつかの態様において、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５またはＡＡＶ６に由来する。いくつかの態様において、ＩＴＲ  配列は、カプシドと同じ血清型である（例として、ＡＡＶ６  ＩＴＲ配列およびＡＡＶ６カプシド、等々）。いくつかの態様において、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶｒｈ．１０血清型に由来する。
【００５４】
ＩＴＲ配列およびＩＴＲ配列を含有するプラスミドは、当該技術分野において知られており、および市販されている（例として、Vector Biolabs, Philadelphia, PA; Cellbiolabs, San Diego, CA; Agilent Technologies, Santa Clara, Ca;およびAddgene, Cambridge, MAから入手可能な製品およびサービス;およびGene delivery to skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of a therapeutic protein. Kessler PD, Podsakoff GM, Chen X, McQuiston SA, Colosi PC, Matelis LA, Kurtzman GJ, Byrne BJ. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Nov 26;93(24):14082-7；およびCurtis A. Machida. Methods in Molecular Medicine（商標）. Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols. 10.1385/1-59259-304-6:201（著作権）Humana Press Inc. 2003.  Chapter 10. Targeted Integration by Adeno-Associated Virus. Matthew D. Weitzman, Samuel M. YoungJr., Toni Cathomen and Richard Jude Samulski；米国特許第５，１３９，９４１号および第５，９６２，３１３号を参照のこと、これらすべては参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、ｐＴＲ−ＵＦ−１１プラスミド主鎖を含み、これは、ＡＡＶ２  ＩＴＲを含有するプラスミドである。このプラスミドは、American Type Culture Collectionから市販されている(ATCC MBA-331)。
【００５５】
いくつかの態様において、本発明のｒＡＡＶベクターは、対象における同時送達および発現のために、ｃＳ１００Ａ１導入遺伝子およびＡＲＣ導入遺伝子の両方を含む。よって、いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、導入遺伝子（例として、異種核酸）の発現を容易にする配列（例として、核酸に操作可能に連結された発現制御配列）を含む１以上の領域を含む。無数のかかる配列は、当該技術分野において知られている。発現制御配列の非限定例は、プロモーター、インスレーター、サイレンサー、応答  エレメント、イントロン、エンハンサー、開始部位、配列内リポソーム進入部位（ＩＲＥＳ）終止シグナル、およびポリ（Ａ）シグナルを包含する。かかる制御配列のいずれかの組み合わせは、本明細書で企図される（例として、プロモーターおよびポリ（Ａ）シグナル）。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、導入遺伝子のコード配列に操作可能に連結され、および、導入遺伝子の発現を容易にするプロモーターを含む。
【００５６】
「プロモーター」は、明細書に使用されるときは、核酸配列の残りの転写の開始および速度が制御される核酸の制御領域を指す。プロモーターは、それが調節する核酸配列の転写を駆動し、よって、それは、遺伝子の転写開始部位かまたはその近くに典型的に位置付けられる。プロモーターは、例えば、１００〜１０００ヌクレオチドの長さを有し得る。いくつかの態様において、プロモーターは、核酸、または核酸の配列（ヌクレオチド配列）に操作可能に連結されている。プロモーターが配列を調節するように（例として、配列の転写開始および／または発現を制御する（「駆動する」）ように）その配列に関して正確な機能的な位置および配向でプロモーターが存在するとき、プロモーターは、それが調節する核酸の配列に「操作可能に連結」されていると考えられる。
【００５７】
本発明に従って使用され得るプロモーターは、対象の心臓において導入遺伝子の発現を駆動できるいずれかのプロモーターを含み得る。いくつかの態様において、プロモーターは、組織特異的プロモーターであり得る。「組織特異的プロモーター」は、本明細書に使用されるときは、特定のタイプの組織、例として心臓においてのみ機能することができるプロモーターを指す。よって、「組織特異的プロモーター」は、他のタイプの組織において導入遺伝子の発現を駆動することはできない。
【００５８】
いくつかの態様において、本発明に従って使用され得るプロモーターは、心臓に限局的なプロモーターである。例えば、プロモーターは、限定せずに、以下の遺伝子：α−ミオシン重鎖遺伝子、６−ミオシン重鎖遺伝子、ミオシン軽鎖２ｖ遺伝子、ミオシン軽鎖２ａ遺伝子、ＣＡＲＰ遺伝子、心臓α−アクチン遺伝子、心臓ｍ２ムスカリン性アセチルコリン遺伝子、ＡＮＦ、心臓トロポニンＣ、心臓トロポニンＩ、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、心臓筋小胞体Ｃａ−ＡＴＰアーゼ遺伝子、骨格筋α−アクチンの１つからのプロモーター；またはＭＬＣ−２ｖ遺伝子に由来する人工心臓プロモーターであり得る。
【００５９】
開示されたｒＡＡＶベクターのいくつかの態様において、２以上の導入遺伝子は、単一のプロモーターによって操作可能に制御される。他の態様において、２以上の導入遺伝子の各々は、別個のプロモーターによって操作可能に制御される。
【００６０】
いくつかの態様において、本発明のｒＡＡＶベクターはさらに、配列内リポソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。ＩＲＥＳは、タンパク質合成のより大きなプロセスの一部として、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列の中央における翻訳開始を可能にするヌクレオチド配列である。開始複合体のアセンブリのために５’キャップ認識が必要とされるので、大抵、真核生物において、翻訳は、ｍＲＮＡ分子の５’末端のみにおいて開始することができる。いくつかの態様において、ＩＲＥＳは、導入遺伝子の間に位置付けられる。かかる態様において、異なる導入遺伝子によってコードされるタンパク質は、個々に翻訳される（すなわち、融合タンパク質として翻訳されるのに対して）。
【００６１】
いくつかの態様において、本開示のｒＡＡＶベクターはさらに、ポリアデニル化（ｐＡ）シグナルを含む。真核生物のｍＲＮＡは、典型的には前駆体ｍＲＮＡとして転写される。前駆体ｍＲＮＡは、ポリアデニル化プロセスを包含し、成熟したｍＲＮＡを生成するようにプロセシングされる。ポリアデニル化のプロセスは、遺伝子ターミネーターの転写として開始する。新しく作製された前駆体ｍＲＮＡの最も３’側のセグメントは、一組のタンパク質によって最初に切断される。これらのタンパク質は次いで、ＲＮＡの３’末端においてポリ（Ａ）テールを合成する。切断部位は典型的には、ポリアデニル化シグナル、例として、ＡＡＵＡＡＡを含有する。ポリ（Ａ）テールは、ｍＲＮＡ核外輸送、翻訳、および安定性に重要である。
【００６２】
いくつかの態様において、本発明のｒＡＡＶベクターは少なくとも、５’から３’の順に、第一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、第一の導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター、第二の導入遺伝子に操作可能に連結されたＩＲＥＳ、ポリアデニル化シグナル、および第二のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。
【００６３】
いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、環状である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、直鎖状である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、一本鎖である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、二本鎖である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは、自己相補的なｒＡＡＶベクターである。本明細書に記載のいずれかのｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ６カプシドまたはいずれの他の血清型（例として、ＩＴＲ配列と同じ血清型である血清型）などのウイルスカプシドによってカプシド化されてもよい。
【００６４】
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子
さらに本明細書に提供されるのは、ｒＡＡＶ粒子またはかかる粒子を含有するｒＡＡＶ調製物である。ｒＡＡＶ粒子は、本明細書に記載のウイルスカプシドおよびｒＡＡＶベクターを含み、これは、ウイルスカプシドによってカプシド化される。ｒＡＡＶ  粒子を生成する方法は、当該技術分野において知られており、および、市販されている（例として、Zolotukhin et al., Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167；および米国特許出願公開番号US2007/0015238およびUS2012/0322861を参照のこと、これらは参照により本明細書に組み込まれる；ならびにプラスミドおよびキットは、ATCCおよびCell Biolabs, Inc.から入手可能である）。
【００６５】
例えば、ｒＡＡＶベクターを含有するプラスミドは、１以上のヘルパープラスミド、例として、ｒｅｐ遺伝子（例として、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードする）およびｃａｐ遺伝子（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードし、本明細書に記載の改変されたＶＰ３領域を包含する）を含有するものと組み合わされ得、およびｒＡＡＶ粒子がパッケージングされおよび続いて精製できるように、生産株にトランスフェクトされ得る。
【００６６】
本明細書に開示のｒＡＡＶ粒子またはｒＡＡＶ調製物内の粒子は、いずれかの誘導体またはシュードタイプ（例として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２／１、２／５、２／８、２／９、３／１、３／５、３／８、または３／９）を包含する、いずれかのＡＡＶ血清型であってもよい。本明細書に使用されるとき、ｒＡＡＶ  ｒＡＡＶ粒子の血清型は、組換えウイルスのカプシドタンパク質の血清型を指す。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ６またはｒＡＡＶ９である。誘導体およびシュードタイプの非限定例は、ＡＡＶｒｈ．１０、ｒＡＡＶ２／１、ｒＡＡＶ２／５、ｒＡＡＶ２／８、ｒＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２−ＡＡＶ３ハイブリッド、ＡＡＶｈｕ．１４、ＡＡＶ３ａ／３ｂ、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶ−ＨＳＣ１５、ＡＡＶ−ＨＳＣ１７、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＣＨｔ−Ｐ６、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ−ＨＳＣ１５／１７、ＡＡＶＭ４１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ６（Ｙ４４５Ｆ／Ｙ７３１Ｆ）、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ−ＨＡＥ１／２、ＡＡＶ  クローン３２／８３、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ２（Ｙ−＞Ｆ）、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ２．１５、ＡＡＶ２．４、ＡＡＶＭ４１、およびＡＡＶｒ３．４５を包含する。
【００６７】
かかるＡＡＶ血清型および誘導体／シュードタイプ、およびかかる誘導体／シュードタイプを生産する方法は、当該技術分野において知られている（例として、Mol Ther. 2012 Apr;20(4):699-708. doi: 10.1038/mt.2011.287. Epub 2012 Jan 24. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Asokan A1, Schaffer DV, Samulski RJ.を参照のこと）。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子は、偽型のｒＡＡＶ粒子であり、これは、（ａ）１つの血清型（例として、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３）からのＩＴＲを含むｒＡＡＶベクターおよび（ｂ）別の血清型（例として、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０）に由来するカプシドタンパク質から構成されるカプシドを含む。シュードタイプのｒＡＡＶベクターを生産および使用する方法は、当該技術分野において知られている（例として、Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671, 2001; Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532, 2000; Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167, 2002;およびAuricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081, 2001）。
【００６８】
心臓疾患のためのｒＡＡＶ遺伝子治療
本発明はまた、開示されたｒＡＡＶ粒子または調製物の１以上を含む組成物に関する。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ調製物は、第一の血清型（例として、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ９）のＩＴＲを含有するｒＡＡＶベクターおよびｒＡＡＶベクターをカプシド化するカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、第一の血清型（例として、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ９）のものである。いくつかの態様において、調製物は、ＡＡＶ２  ＩＴＲを含有するｒＡＡＶベクターを使用して調製された調製物と比較して、（例として、Ｈｕｈ７などのヒト肝細胞がん細胞株において）、少なくとも４倍高い形質導入効率を有する。
【００６９】
本明細書に記載のとおり、かかる組成物はさらに、医薬賦形剤、緩衝剤、または希釈剤を含んでいてもよく、およびex vivoで宿主細胞にまたは動物にin situで、具体的にはヒトへ投与のために、製剤化され得る。かかる組成物はさらに、任意に、リポソーム、脂質、脂質複合体、ミクロスフェア、マイクロ粒子、ナノスフェア、またはナノ粒子を含んでいてもよいし、または他に、細胞、組織、器官、またはこれを必要とする対象の身体への投与のために製剤化されてもよい。かかる組成物は、例えば、本明細書に記載の疾患または障害を結果として生じる状態を包含する、ペプチド欠乏症、ポリペプチド欠乏症、ペプチド過剰発現、ポリペプチド過剰発現などの状態の寛解、予防、および／または処置におけるなどの、様々な治療における使用のために製剤化され得る。
【００７０】
本開示のｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶ粒子、またはｒＡＡＶ粒子を含む組成物は、これを必要とする対象における心臓疾患の遺伝子治療のために使用され得る。本発明の方法および組成物を使用して処置され得る心臓疾患の例は、これらに限定されないが、心筋症および急性虚血を包含する。いくつかの態様において、心臓心筋症は、肥大型心筋症または拡張型心筋症である。心筋症または他の心臓疾患によって引き起こされる心不全は、２つの構成要素、カルシウム操作機能障害およびアポトーシスを含む。ｒＡＡＶベクター、粒子、およびｒＡＡＶ粒子を含む組成物は、例として、心臓への直接注射を介して、これを必要とする対象に投与される場合、かかる心不全の処置に使用され得る。
【００７１】
ｒＡＡＶベクター、粒子、およびｒＡＡＶ粒子を含む組成物は、対象の心筋細胞において、ｃＳ１００Ａ１タンパク質およびＡＲＣタンパク質の同時発現を駆動する。Ｓ１００Ａ１は、収縮機能の正常化を導く筋小胞体トランジェントの正常化を包含する、カルシウム操作の側面を改善するだろう。ＡＲＣは、ミトコンドリアおよび非ミトコンドリア機構（ストレッチ誘導性アポトーシスなどの）によって開始されるアポトーシスをブロックし、ならびに、ミトコンドリア機能を改善するだろう。よって、本開示の導入遺伝子によって発現される２つのタンパク質の相乗的な利益は、心筋症の両方の側面を標的化することにより、より良い長期治療効果を導き得る。
【００７２】
よって、本発明の他の側面は、本発明のｒＡＡＶ粒子を、それが必要な対象に投与することに関する。いくつかの態様において、対象に投与されるｒＡＡＶ粒子の数は、約１０６〜約１０１４  粒子／ｍＬまたは約１０３〜約１０１３  粒子／ｍＬの範囲のオーダー、または例えば、約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、または１０１４粒子／ｍＬなどの、いずれかの範囲の間のいずれかの値であり得る。いくつかの態様において、対象に投与されるｒＡＡＶ粒子の数は、約１０６〜約１０１４ベクターゲノム（ｖｇｓ）／ｍＬまたは１０３〜１０１５ｖｇｓ／ｍＬの範囲のオーダー、または例えば、約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、または１０１４ｖｇｓ／ｍＬなどの、いずれかの範囲の間のいずれかの値であり得る。ｒＡＡＶ粒子は、単回用量として投与することができ、または処置される具体的な疾患または障害の治療を達成するために要求され得るとおり、２以上の投与に分けることができる。いくつかの態様において、約０．０００１ｍＬ〜約１０ｍＬの範囲の用量が、対象に送達される。
【００７３】
所望される場合、ｒＡＡＶ粒子およびｒＡＡＶベクターは、治療用ポリペプチド、生物学的に活性なフラグメント、またはそのバリアントの１以上の投与を包含する、例として、タンパク質またはポリペプチドまたは様々な薬学的に活性な薬剤などの、他の薬剤と組み合わせて、同様に投与され得る。追加の薬剤が標的細胞または宿主組織と接触した際に有意な弊害を引き起こさないかぎり、事実上は包含され得る他の構成要素に制限はない。ｒＡＡＶ粒子または調製物は、よって、必要に応じ具体的な場合に、様々な他の薬学的に許容し得る薬剤と一緒に送達され得る。かかる組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製されてもよく、または代替的に本明細書に記載されるとおり、化学的に合成されてもよい。
【００７４】
薬学的に許容し得る賦形剤および／または担体溶液を含む製剤は、例として、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、関節内、および筋肉内の投与および製剤化を包含する様々な処置計画において、本明細書に記載の具体的な組成物を使用するための好適な投薬および処置計画の開発と同様に、当業者に周知である。
【００７５】
典型的には、これらの製剤は、少なくとも約０．１％またはそれ以上の治療剤（例として、ｒＡＡＶ粒子または調製物および／またはｒＡＡＶベクター）を含有してもよいが、活性成分（単数または複数）のパーセンテージは、もちろん、全製剤の重量または体積の約１または２％と、約７０％または８０％またはそれ以上との間で便宜上変化してもよい。当然ながら、各治療上有用な組成物中の治療剤（単数または複数）の量は、好適な投薬量がいずれかの所定の単位用量の化合物で得られるであろう様式で、調製され得る。可溶性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与ルート、製品貯蔵寿命などの因子、ならびに他の薬理学的な考慮は、かかる医薬製剤を調製する場合に、当業者に企図されるだろう。加えて様々な投薬量および処置計画が所望され得る。
【００７６】
ある状況において、皮下に、心臓内に、眼内に、硝子体内に、非経口的に、皮下に、静脈内に、脳室内に、筋肉内に、髄腔内に、経口的に、腹腔内に、経口または経鼻吸入によって、または１以上の細胞（例として、心筋細胞および／または他の心臓細胞）、組織、または器官への直接注射によってのいずれかで、本明細書に開示の好適に製剤化された医薬組成物中で、ｒＡＡＶ粒子または調製物および／またはｒＡＡＶベクターを送達することが望ましいだろう。いくつかの態様において、本発明のｒＡＡＶ粒子またはｒＡＡＶ粒子を含む組成物は、対象の心臓に直接注射される。心臓への直接注射は、例として、針カテーテルを使用する、心筋組織、心臓の裏層(lining)、または心臓を囲む骨格筋の１以上への注射を含み得る。
【００７７】
注射可能な用途に好適な組成物の医薬製剤は、滅菌水性溶液または分散体を包含する。いくつかの態様において、製剤は、滅菌され、および容易な通針性(syringability)が存在する程度に流動性である。いくつかの態様において、形態は、製造及び保管の条件下で安定であり、および、細菌および真菌などの微生物の混入作用に対して保存されている。担体は、例えば、水、生理食塩水、エタノール、ポリオール  （例として、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、好適なそれらの混合物、植物油または合衆国食品医薬品局によって一般的に安全と認められている(Generally Recognized as Safe(GRAS))ものなどの他の薬学的に許容し得る担体を含有する、溶媒または分散媒体である。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合の要求される粒子サイズの維持によって、および、界面活性剤の使用によって、維持され得る。
【００７８】
用語「担体」は、ｒＡＡＶ粒子または調製物および／またはｒＡＡＶベクターと一緒に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。かかる医薬担体は、水および油などの滅菌された液体（鉱油などの石油、落花生油、大豆油、およびゴマ油などの植物油、動物油、または合成起源の油のものを包含する）であり得る。生理食塩水溶液および水性のデキストロースおよびグリセロール溶液もまた、液体担体として使用され得る。
【００７９】
注射可能な水性溶液の投与のために、例えば、溶液は、好適に緩衝化され得、必要ならば、液体希釈剤が、充分な生理食塩水またはグルコースを用いて、最初に等張性にされる。これらの具体的な水性溶液は、静脈内、筋肉内、硝子体内、皮下および腹腔内の  投与にとくに好適である。この文脈では、使用され得る滅菌された水性媒体は、本開示を考慮して、当業者に公知であろう。例えば、１投薬量は、１ｍＬの等張性ＮａＣｌ溶液中に溶解され得、および、１０００ｍＬの皮下注入液に添加されるか、または、注入の提案部位において注射されるか、のいずれかである（例えば、”Remington’s Pharmaceutical Sciences” 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照）。投薬量におけるいくつかのバリエーションは、処置される対象の状態に応じて、必然的に発生するだろう。投与を担う人は、いずれの事象においても、個々の対象について適切な用量を決定するだろう。その上、ヒト投与のために、調製物は、無菌状態、発熱性、ならびに例として、ＦＤＡの生物製剤標準オフィス(Office of Biologics standards)によって要求される、一般的な安全性および純度標準を満たすべきである。
【００８０】
滅菌された注射可能な溶液は、ｒＡＡＶ粒子または調製物、Ｒｅｐタンパク質、および／またはｒＡＡＶベクターを、上に列挙される他の成分のいくつかと共に、要求される量で、適切な溶媒中に組み込み、これに続きフィルター滅菌ことによって調製される。一般に、分散体は、様々な滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体および上に列挙されるものからの他の成分を含有する滅菌されたビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌された注射可能な溶液の調製のための滅菌された粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥技法であり、これは、これまでに滅菌ろ過されたそれらの溶液からの、活性成分およびいずれかの追加の所望される成分の粉末を生産する。
【００８１】
ｒＡＡＶ粒子または調製物、および／またはｒＡＡＶベクター組成物の量、ならびにかかる組成物の投与の時間は、本発明の教示の利益を有する当業者のプレビューの範囲内であろう。しかしながら、治療的に有効量の本発明の組成物の投与は、単一の投与、例えば、かかる処置を受ける患者に治療上の利益を提供するのに充分な数の感染粒子の単一の注射によって達成され得るだろう。代替的に、いくつかの状況において、ｒＡＡＶ粒子または調製物、および／またはｒＡＡＶベクター組成物の複数または連続する投与を、かかる組成物の投与を監視する医師によって決定され得るように、相対的に短い期間、または相対的に長い期間のいずれかで、提供することが所望され得る。
【００８２】
本発明の組成物は、ｒＡＡＶ粒子または調製物および／またはｒＡＡＶベクターを、単独で、あるいは、天然または組換えの供給源から得られ得るまたは化学的に合成され得る、１以上の追加の活性成分と組み合わせて、包含し得る。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子または調製物は、ボルテゾミブなどのプロテアソームインヒビター、またはヒドロキシ尿素と、同じ組成物中で、または同じ処置計画の一部として、投与される。
【００８３】
用語として、疾患を「処置する」とは、対象によって経験される疾患または障害の兆候または症状の少なくとも１つの頻度または重症度を低減させることを意味する。上に記載の添え生物は、典型的には、有効量で対象に投与され、これは、所望される結果を産生することができる量である。所望される結果は、投与される活性剤に依存するだろう。例えば、有効量のｒＡＡＶ粒子は、異種核酸を宿主の器官、組織または細胞に移入させることができる粒子の量であり得る。
【００８４】
本発明の方法において利用される組成物の毒性および有効性は、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）を決定するために、培養細胞または実験動物のいずれかを使用して、標準的な医薬手順によって決定され得る。毒性と有効性との間の用量比率は、治療的指標であり、およびそれは、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０によって表され得る。大きい治療的指標を示す組成物が好ましい。毒性の副作用を示す組成物は使用され得るが、かかる副作用の潜在的な損傷を最小化する送達系を設計するように注意されるべきである。本明細書に記載の組成物の投薬量は、一般に、毒性がほとんどないかまたは毒性が全くないＥＤ５０を包含する範囲内である。投薬量は、使用される剤形および利用される投与ルートに依存して、この範囲内で変化し得る。
【００８５】
本発明の他の側面は、ヒトまたは非ヒト対象、対象におけるin situの宿主細胞、または対象に由来する宿主細胞などの、対象を用いる使用のための方法および調製物に関する。いくつかの態様において、対象は、哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は、伴侶動物である。「伴侶動物」は、本明細書に使用されるときは、ペットおよび他の飼育動物を指す。伴侶動物の非限定例は、イヌおよびネコ；ウマ、畜牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ、およびニワトリなどの家畜；およびマウス、ラット、モルモット、およびハムスターなどの他の動物を包含する。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象である。いくつかの態様において、対象は、遺伝子治療で処置され得る心臓疾患を有するかまたはこれを有すると疑われている。いくつかの態様において、対象は、心不全のいずれかの段階である。いくつかの態様において、心不全は、心筋症によって引き起こされる。いくつかの態様において、心不全は、肥大型心筋症または拡張型心筋症によって引き起こされる。
【００８６】
以下の例は、本発明のある態様の説明を意図するものであり、および、非限定的なものであることを意図しない。本願全体に引用されるすべての参考文献（参考文献、交付済み特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願を包含する）の内容全体は、本明細書に参照により明確に援用される。
【実施例】
【００８７】
例１：心不全の複数の側面を治療的に標的とする
いくつかの側面において、本発明は、１以上の心臓状態（例として、心筋症、肥大型  心筋症、拡張型心筋症、心不全、心臓疾患、等々）を処置する際に有用な組成物および方法を提供する。いくつかの態様において、本願によって提供される組成物は、心臓への複数回の直接注射を介して、対象に提供することができる。対象に提供することができる例示のＡＡＶ構築物は、図１に描写される。ある態様において、かかる例示の構築物は、組換えＡＡＶ（例として、ＡＡＶ６）によってカプシド化され、および、１以上の心臓状態（例として、心筋症）の２つの別々の側面に取り組むために、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１（Ｓ１００Ａ１）およびカスパーゼ動員ドメインを有するアポトーシスリプレッサー（ＡＲＣ）の種特異的コード配列を含む。図１における例示的な構築物の両方の導入遺伝子は、心臓ＴｎＴプロモーターによって駆動され、およびよって心筋細胞においてのみ発現するだろう。
【００８８】
Ｓ１００Ａ１は、収縮性機能の正常化を導く筋小胞体トランジェントの正常化を包含する、カルシウム操作の側面を改善するだろう。ＡＲＣは、ミトコンドリアおよび非ミトコンドリア機構によって開始されるアポトーシス（例として、ストレッチ誘導性アポトーシス）をブロックし、ならびにミトコンドリア機能を改善するだろう。心不全のこれら２つの別々の構成要素（カルシウム操作機能障害およびアポトーシス）は、個別に取り組まれるが、決して一緒に取り組まれない。そのため、かかるアプローチの相乗的な利益は、改善された長期成果を結果として生じ得る治療的選択肢を提供する。心筋症の両方の側面を標的とすることによって、本願によって提供される組成物および方法は、複数の心臓状態（例として、肥大型心筋症または拡張型心筋症）に取り組むために使用され得、および、心不全のいずれかの段階において有益であろう。
【００８９】
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許および配列データベースエントリーは、あたかも各々個々の刊行物または特許が具体的におよび個々に参照により援用されるように表されるかのように、それらの全体が参照により援用される。矛盾が生じる場合、本明細書のいずれかの定義を包含する本出願が優先する。
【００９０】
例２：イヌにおける拡張型心筋症の遺伝子治療
拡張型心筋症（ＤＣＭ）は、イヌにおける後天性心臓疾患の第二の最も一般的な原因であり、最も一般的にはドーベルマン・ピンシェル、グレート・デーンおよびアイリッシュ・ウルフハウンドなどの大型犬種に影響する。この疾患に罹患したヒトにおいて、心臓移植および左心室補助デバイスなどの外科手術選択肢が存在する。しかしながら、獣医学において、唯一の治療的選択肢は、心不全に関連する兆候の医療管理である。罹患したイヌの予後は、疾患の段階および品種に依存する。例えば、ほとんどのドーベルマン・ピンシェルは、うっ血性心不全（ＣＨＦ）の発症後６か月未満生存する。対照的にコッカー・スパニエルなどの他の品種は、それより長く生存する傾向がある。心臓疾患が進行するにつれて、心臓細胞内のカルシウム移動を調節するチャネルの機能障害は、カルシウム循環異常、さらに心臓の収縮および弛緩の機能障害を促進する。注目すべきことに、カルシウム輸送異常は、天然に存在するＤＣＭ５を有するイヌにおいて認識されており、および、多くの異なる病理学に続発する心不全とともに発生する。
【００９１】
カルシウム循環異常を正常化するように設計された遺伝子導入ストラテジーは、様々な形態の心臓疾患を有する小動物および大型動物モデルにおいて、心臓疾患を寛解する。事実上、臨床試験は、心筋症へのこの治療的アプローチを試験するために、ヒトにおいて既に進行中であり、および予備結果は、勇気づけるものである。パイロット研究は、ＤＣＭに罹患し、およびＣＨＦを示す、ドーベルマン・ピンシェルにおけるカルシウム操作を正常化するように設計された遺伝子送達の有効性を評価している。ドーベルマン・ピンシェルは、ＤＣＭがこの品種において広範囲に広がっており、および、一旦ＣＨＦが発症するとこの疾患がこの品種において迅速かつ均一に進行するので、利用されている。ＤＣＭに取り組むための新規なモダリティは、ドーベルマン・ピンシェル、ボクサー犬、グレート・デーン、ジャーマン・シェパード、ゴールデンレトリバー等々を包含するこの突発性疾患に罹りやすいすべてのイヌ品種に対して有意な影響を与えるだろう。注目すべきことに、最も一般的な形態の天然に存在する心臓疾患（イヌ変性性弁疾患およびＤＣＭ）を有するイヌからの試料における心筋タンパク質レベルの先の調査は、複数のタンパク質（Ｓ１００Ａ１を包含する）レベルが異常である（Ｓ１００Ａ１が減少している）ことを見出した。
【００９２】
これらの知見は、Ｓ１００Ａ１を標的とする遺伝子送達が、ＤＣＭおよび変性性弁疾患に続発する心不全の発症を有効に処置し得ることを示唆する。加えて、アポトーシス（プログラム細胞死）は、罹患した心筋において最も一般的であり、および、ＡＲＣは、アポトーシスの強力なおよび多機能性インヒビターである。目下、獣医学心不全のための治療標準は、流体過負荷およびうっ血の医療管理である。異常な心筋調節分子に向けられた遺伝子送達技法は、獣医学臨床医が、初めて、心筋疾患過程に具体的に取り組むことを可能にし得る分子標的を提供する。その上、現在のベクター産生技法およびベクターの心筋内遺伝子送達に関連する費用は、この治療の費用を、経時的に減少することが予測される費用を有する多くのオーナーにとって手が届くものとする。
【００９３】
ＡＡＶ  ２／６ベクターを使用する最小限に侵襲性の遺伝子導入方法は、正常なイヌにおいて、＞７５％の心筋細胞の形質導入を結果として生じた(Bish LT, Sleeper MM, Brainard B, et al. Percutaneous transendocardial delivery of self-complementary adeno-associated virus 6 achieves global cardiac gene transfer in canines. Mol. Ther. 16, 1953-9 (2008)を参照のこと）。６匹の正常な雑種犬を、ホスホランバンのドミナントネガティブ形態（ｄｎ−ＰＬＮ）（ネイティブなホスホランバンと競合する、したがってＳＥＲＣＡ２ａに対するその阻害性効果を低減する偽リン酸化(pseudophosphorylated)形態）（ｎ＝４）またはＡＡＶ２／６  ｄｎ−ＰＬＮおよびＳ１００Ａ１（ｎ＝２）をコードするＡＡＶ２またはＡＡＶ６ベクターのいずれかで処置した。すべてのイヌは、処置後２年にわたり、正常な心臓血管機能を有して健康なままであり、治療は、心筋炎を引き起こさず、または、心臓機能を有意に変更しないことを表し、したがって、この治療的アプローチの安全性を支持する。
【００９４】
実に、４０を超える正常なおよび疾患のイヌ（以下を参照のこと）が注射され、および、今日までの結果は、注射技法は、十分なに許容されることを表す。加えて、ペンシルベニア大学のMatthew J. Ryanベタリナリー病院における２０匹の無作為のイヌの症例を、ｒＡＡＶ２／６に対する抗体のためにサンプリングし、および、力価は、２０匹のイヌのうち１９匹において、処置について許容できる範囲内であることが見出され、先の免疫応答が有意な割合の治療候補を排除しないだろうということを表す。この治療的アプローチがＤＣＭの処置に効果的であるかどうかを決定するために、重篤な形態の迅速に進行する若年性ＤＣＭを有するポーチュギーズ・ウォーター・ドッグを次いで処置した。
【００９５】
注目すべきことに、ＡＡＶ２／６  ｄｎ−ＰＬＮを注射したイヌは、リン酸化された  ＰＬＮにおける著しい減少を示し、このアプローチの、この疾患モデルにおけるカルシウム循環を正常化する潜在的能力を支持する。その上、ｄｎ−ＰＬＮおよびＳ１００Ａ１の両方を含有する遺伝子送達は、ｄｎ−ＰＬＮ単独を含有するベクターの送達よりも大きい程度で、ＤＣＭに続発するＣＨＦの発症を示した。組み合わせベクターは、ｄｎ−ＰＬＮ治療単独と比較して、ＣＨＦの開始を平均４週間遅延させた。この理由のために、組み合わせベクターアプローチは、成体発病ＤＣＭおよびうっ血性心不全に罹患するドーベルマンの寿命を延長するのに遺伝子治療が有効であるかどうかを決定するための、パイロット研究において利用される。
【００９６】
研究は、盲目のプラセボ制御設計を有する。処置されたＤＣＭおよびＣＨＦの最後の１２のドーベルマン・ピンシェル症例に基づいて、１４８日の平均生存（１６０日の標準偏差）が存在した。０．８の検出力、０．０５のアルファ（両側）および１の症例対対照の比率を使用して、各群１３匹のイヌの試料サイズは、６か月生存における差異を検出するために必要とされる。この計算は、パラメータ試料サイズ試験を使用して決定された。ＤＣＭおよび制御されたＣＨＦを有する２６匹のドーベルマン・ピンシェルが登録される。登録に適格となるためには、イヌは、１：２０未満のＡＡＶ２／６に対する循環中和抗体力価を有しなければならず、および、心臓以外の疾患がなければならない。
【００９７】
加えて、先天性心疾患または原発性僧帽弁疾患の証拠を同時に有するイヌは除外される。ベースライン（登録時間）において、抗体力価、ＣＢＣ、および化学パネルは、スクリーニング目的で使用される。イヌは、３分間の心電図（ＥＣＧ）および完全な心エコー(complete echocardiogram)（ＥＣＨＯ）を受け、オーナーは、これまでに確証された生活の質のアンケートを完了する。ＥＣＧは、インターバル期間および不整脈の存在について評価される。ＥＣＨＯは、２Ｄ、Ｍモードおよびドプラ研究（組織ドプラを包含する）を包含する。胸部Ｘ線検査は疾患を段階づけるために使用される（イヌは、うっ血性心不全の病歴を臨床的に補償される）。
【００９８】
登録のための要件を満たすイヌは、無作為にプラセボ治療群（生理食塩水での心臓注射）または遺伝子治療群（ＡＡＶ２／６−ＡＲＣ−ｓ１００ａ１を用いる心臓注射）に割り当てられる。ＤＣＭおよびうっ血性心不全のための標準的な医療管理は、すべてのイヌの研究を通してずっと続く（ピモベンダン、アンギオテンシンインヒビターおよび利尿薬治療）。処置群がプラセボ群と比較して有意な改善を示す場合、対照イヌが遺伝子送達を受けることができるように、空のカプシドの代わりに生理食塩水が、シャム治療として使用される。治療の２、４、６、９、および１２月後において、ＥＣＧ、ＥＣＨＯ、生活の質のアンケートおよび実験室分析は、繰り返される。統計分析は、二か月の間隔で行われる。
【００９９】
図２および３は、夫々、処置された筋ジストロフィーイヌにおける、拡張期（弛緩）および収縮期（収縮）データを描写する。心内膜および心外膜の輪郭は、図の各々において観察され得る。データは、表１においてみられるような数週間にわたる処置後の安定したまたはわずかに改善された機能を表す。以下の表１は、時間１（処置前）および時間２（処置後）においてとられたデータについての、左心室質量（ＬＶＭ［ｇ］）、収縮終期体積（ＥＤＶ［ｍｌ］）、拡張終期体積（ＥＳＶ［ｍｌ］）、脳卒中体積（ＳＶ［ｍｌ］）、駆出率（ＥＦ［％］）、および心拍出量（ＣＯ［ｌ／ｍｉｎ］）の結果を示す。
【０１００】
表１
【表１】
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【０１０１】
例３：マウスおよびイヌへのベクター送達後のジストロフィー表現型の査定
Ｓ１００Ａ１／ＡＲＣ自己相補的なベクターの心臓ＡＡＶ遺伝子送達は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ジストロフィン欠乏症）のマウスおよびイヌモデルにおいて査定された。以前には、ＡＡＶ８（その複数のバリアントを包含する）、ＡＡＶ９、およびＡＡＶｒｈ．１０血清型は、イヌ心臓に感染するそれらの能力について比較され、およびＡＡＶｒｈ．１０は、最も効率的であると見出された。この理由のために、ＡＡＶｒｈ．１０は、この例において記載されるすべての実験のために使用された。
【０１０２】
ＤＢＡ／２ＪバックグラウンドのＭｄｘ（ジストロフィン欠損）マウス（「Ｄ２．ｍｄｘ」）は、組換えＡＡＶｒｈ．１０−Ｓ１００Ａ１／ＡＲＣベクター（以下、「治療的ＡＡＶ」と称される）で、４週齢で注射され、および、２４週後にサクリファイスされた。Ｄ２．ｍｄｘマウスは、低減した下方後肢筋肉質量、委縮した筋線維、増大した線維症および炎症、および筋肉衰弱などの、デュシェンヌ型筋ジストロフィーミオパチーの数個のヒト特徴を再現する。２４週間にわたり、治療用ＡＡＶを注射されたマウスは、心臓ＭＲＩによって測定する場合、シャム注射マウスと比較して、駆出率、ストレイン発生、および心拍出量をよりよく維持した（図４を参照のこと）。タンパク質分析（ウェスタンブロット）は、Ｓ１００Ａ１およびＡＲＣの両方のレベルが、対照（シャム注射）と比較して、処置組織おいて上がったことを確認した（図５を参照のこと）。さらにまた、心臓組織学は、処置された心臓が、対照心臓と比較して、病的状態がはるかに少ないことを示した（図６を参照のこと）。
【０１０３】
２匹のＧＲＭＤ（ジストロフィン欠損）イヌは、心臓駆出率における最初の減少の時期（心筋症の発病を表す兆候）において、治療用ベクターで注射された。イヌ対象の自然の病歴研究からの初期の知見は、駆出率が低下し始めるとすぐに、これらは、翌年にかけて、増進的に低下し続けることを表した。イヌは、典型的には、駆出率がこの着実な減少を開始した後、８〜１２か月より長くは生存しない。
【０１０４】
図７および８に示されるように、両方の対象は、心臓ＭＲＩによって測定される場合、および、エコー測定によって確認される場合、ＡＡＶｒｈ．１０−Ｓ１００Ａ１／ＡＲＣを用いる処置後数か月で、駆出率および他の心臓パラメータにおける改善を示した。処置の大体１２月後に、最初の対象は、正常範囲内の、着実な駆出率を示した。同じく、処置の大体７月後に、第二の対象は、着実な正常な駆出率を示した。
【０１０５】
心臓機能が改善されるだけでなく、運動の間に対象をフィルム撮影することによって定量的に評価する場合、イヌの運動能力における一定の改善がまた存在していた。この改善された運動能力と一貫して、対象の肢のＭＲＩ測定は、骨格筋質量が、ＡＡＶ処置後に増強されたかまたは変化しなかったかのいずれかであったことを示した（図９Ａ〜９Ｃ）。加えて、骨格筋において循環するクレアチンキナーゼレベル（ＣＫ）レベルは、処置後に低減され（図１０）、進行中の筋肉損傷における低減を表す。
【０１０６】
例４：追加のイヌ対象の処置
２匹のドーベルマン・ピンシェル対象は、今日までに、ＡＡＶｒｈ．１０−Ｓ１００Ａ１／ＡＲＣで処置され、ここで、両方のイヌは、処置の時点で心不全を経験していた。最初のイヌは、処置の時点で死に近く、１０％のみの心臓駆出率を呈した。処置後２４時間以内に、駆出率は、２５％まで改善した（データは示さず）。処置後４か月での、イヌの最初の経過観察訪問において、駆出率は、２６％で着実に維持されていた。この対象は、処置後５か月でも依然として生存していた。
【０１０７】
第二の処置されたドーベルマン・ピンシェルは、処置の前に３２％の駆出率（低い率）を有していたが、差し迫った死の危険はない。イヌの駆出率は、処置後２４時間以内に４９％まで改善し（データは示さず）、これは正常範囲内である。第二のイヌは、処置後５週間で、元気であると報告された。この対象は、処置後４か月で、最初の経過観察訪問を有した。
これらの予備知見に基づき、ＡＡＶｒｈ．１０−Ｓ１００Ａ１／ＡＲＣ処置は、イヌにおける心臓機能を正常範囲まで回復することができる。
【０１０８】
等価物
数個の本発明の態様が、本明細書に記載され、および、説明されているが、当業者は、本明細書に記載の、機能を実施するための、および／または、結果および／または１以上の利点を得るための、様々な他の手段および／または構造を容易に心に描くだろう。および、かかるバリエーションおよび／または改変の各々は、本明細書に記載の本発明の態様の範囲内であるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および配置は、例示的であることを意味すること、および、実際のパラメータ、寸法、材料および／または配置は、本発明の教示が使用される特定の出願（単数または複数）に依存するだろうということを、容易に理解するだろう。
【０１０９】
当業者は、本明細書に記載の特定の本発明の態様に対する多くの等価物を認識するか、または、ルーチンな実験法を使用するだけでこれを確かめることができるであろう。したがって、上記の態様は、一例としてのみ提示されること、および添付の請求項およびそれに対する等価物の範囲内で、本発明の態様は、具体的に記載されおよび特許請求される以外に実施され得ること、が理解されるべきである。本発明の複数の態様は、本明細書に記載の、各々の個々の特色、系、物品、材料、キット、および／または方法に関する。加えて、かかる特色、系、物品、材料、キット、および／または方法の２以上の組み合わせは、かかる特色、系、物品、材料、キット、および／または方法が相互に不一致でない場合、本開示の範囲内に包含される。
【０１１０】
すべての定義は、本明細書に定義されおよび使用される場合、辞書の定義、参照によって組み込まれる文献における定義、および／または定義される用語の通常の意味に優先することが理解されるべきである。
本明細書に開示の、すべての参考文献、特許および特許出願は、各々が引用される主題に関して、参考により援用され、いくつかのケースにおいて、文献全体を包含し得る。
不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書および請求項に使用されるとき、それとは反対であることが明確に表されない限り、「少なくとも１の」を意味すると理解されるべきである。
【０１１１】
句「および／または」は、本明細書および請求項に使用されるとき、等位接続される要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである（すなわち、いくつかのケースにおいて等位接続的に存在し、他のケースにおいて、選言的に存在する）。「および／または」とともに列挙される複数の要素は、同じ様式で解釈されるべきである（すなわち、そのように等位接続される要素の１以上）。具体的に同定されるこれらの要素に関連するか関連しないかにかかわらず、「および／または」節によって具体的に同定される要素以外の、他の要素は任意に存在してもよい。よって、非限定例として、「Ａおよび／またはＢ」への参照は、「含む(comprising)」などのオープンエンドの言語との接続において使用される場合、一態様において、Ａのみを指し得る（任意にＢ以外の要素を包含する）；別の態様において、Ｂのみを指し得る（任意にＡ以外の要素を包含する）；もう１つの態様において、ＡおよびＢの両方を指し得る（任意に他の要素を包含する）；等々。
【０１１２】
本明細書および請求項に使用されるとき、「または」は、上に定義されるとおりの「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リストにおける項目を分離する場合、「または」または「および／または」は、包括的であると解釈されるべきである（すなわち、要素の数またはリストのうち、少なくとも１つを包含するが、１を超えて包含し、および、任意に、追加の列挙されていない項目を包含する）。「のうち１つのみ」または「のうち厳密に１つ」、または、請求項において使用される場合「のみからなる」などの、それとは反対であることが明確に表される用語のみが、要素の数またはリストのうちの正確に１つの要素の包含を指す。一般に、用語「または」は、本明細書に使用されるとき、「のいずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」または「のうち厳密に１つ」などの、排他的な用語が先行する場合、代替（すなわち、「両方ではなく、一方または他方」）を排除することを表すものとしてのみ解釈されるべきである。「のみから本質的になる」は、請求項において使用される場合、特許法の分野において使用されるその通常の意味を有するべきである。
【０１１３】
本明細書および請求項に使用されるとき、句「少なくとも１の」は、１以上の要素のリストを参照して、要素のリスト中の要素のいずれか１以上から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、要素のリスト内に具体的に列挙される各要素および全ての要素の少なくとも１つを必ずしも包含しなくてもよく、要素のリスト中の要素のいずれかの組み合わせを排除しない。この定義はまた、具体的に同定されている要素に関連するかしないかにかかわらず、成句「少なくとも１つ」が参照する要素のリスト内に具体的に同定される要素以外の要素が任意に存在してもよいことを可能にする。
【０１１４】
よって、非限定例として、「ＡおよびＢの少なくとも１の」（または等価には、「ＡまたはＢの少なくとも１の」または等価には、「Ａおよび／またはＢの少なくとも１の」）は、一態様において、任意に１より多くのＡを包含し、Ｂが存在しない、少なくとも１つ（および任意にＢ以外の要素を包含する）；別の態様において、任意に１より多くのＢを包含し、Ａが存在しない、少なくとも１つ（および任意にＡ以外の要素を包含する）；もう１つの態様において、任意に１より多くのＡを包含する少なくとも１つ、および、任意に１より多くのＢを包含する少なくとも１つ（および任意に他の要素を包含する）；等々を指し得る。
【０１１５】
それとは反対であることが明確に表されない限り、１を超えるステップまたは行為を包含する、本明細書で特許請求されるいずれかの方法において、方法のステップまたは行為の順序は、方法のステップまたは行為が記載される順序に必ずしも限定されない。
【０１１６】
請求項において、ならびに、上記明細書において、「含む(comprising)」、「包含する(including)」、「保有する(carrying)」、「有する(having)」、「含有する(containing)」、「伴う(involving)」、「保持する(holding)」、「から構成される(composed of)」等などのすべての移行句は、オープンエンドであることが理解されるべきである（すなわち、包含するが、これに限定されないことを意味する）。移行句「のみからなる(consisting of)」および「から本質的になる(consisting essentially of)」のみが、合衆国特許庁特許審査便覧セクション２１１１．０３に表されるように、夫々、クローズまたは半クローズの移行句であるべきである。
【０１１７】
オープンエンドの移行句（例として、「含む」）を使用するこの文献において記載される態様はまた、代替の態様において、オープンエンドの移行句によって記載される特徴「のみからなる」および「から本質的になる」として企図されることが理解されるべきである。例えば、本開示が、「ＡおよびＢを含む組成物」を記載する場合、本開示はまた、「ＡおよびＢのみからなる組成物」および「ＡおよびＢから本質的になる組成物」の代替の態様を企図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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