(57)【要約】  本発明は、イブルチニブを有効成分として含む退行性脳疾患の予防又は治療用薬学的組成物に関するものであり、本発明のイブルチニブは、ミクログリア又はアストロサイトの活性を抑制して、活性化されたミクログリア又は活性化されたアストロサイトが神経細胞に及ぼす損傷を抑制する効果があり、ＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）によって誘導されるミクログリアの細胞移動を抑制する効果に優れ、アミロイドプラークの減少及びタウタンパク質のリン酸化阻害活性を有するばかりか、記憶力及び学習力を向上させることができる効果があることから、退行性脳疾患を予防又は治療することができる治療剤として活用可能である。【選択図】図２７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イブルチニブ（ｉｂｒｕｔｉｎｉｂ）又はこれの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、退行性脳疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項２】
上記組成物は、ミクログリア（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）又はアストロサイト（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）の活性を抑制して、活性化されたミクログリア又は活性化されたアストロサイトが神経細胞に及ぼす損傷を抑制する効果を有することを特徴とする、請求項１に記載の退行性脳疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項３】
上記組成物は、ミクログリアの細胞移動を抑制する活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の退行性脳疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項４】
ミクログリア又はアストロサイトの活性；又はミクログリアの細胞移動は、ＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）によって誘導されることを特徴とする、請求項２又は３に記載の退行性脳疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項５】
上記組成物は、アミロイドプラーク抑制又はタウタンパク質のリン酸化抑制活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の退行性脳疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項６】
上記組成物は、神経細胞で樹状突起棘（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｓｐｉｎｅ）の数、シナプトフィジン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）の数及びＰＳＤ−９５のパンクタ（ｐｕｎｃｔａ）数を増加させることを特徴とする、請求項１に記載の退行性脳疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項７】
上記組成物は、アルツハイマー疾病動物モデルで長期記憶を向上させることを特徴とする、請求項１に記載の退行性脳疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項８】
上記退行性脳疾患は、アルツハイマー、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、多発性神経萎縮、てんかん、脳疾患（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、脳卒中、記憶障害、認知障害及び学習障害からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の退行性脳疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項９】
試験管内でイブルチニブ又はこれの薬学的に許容可能な塩を脳神経細胞に処理する段階を含む、ミクログリア又はアストロサイトの活性を抑制する方法。
【請求項１０】
試験管内でイブルチニブ又はこれの薬学的に許容可能な塩を脳神経細胞に処理する段階を含む、ＬＰＳによって誘導されるミクログリアの細胞移動を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イブルチニブ（Ｉｂｒｕｔｉｎｉｂ）を有効成分として含む退行性脳疾患の予防又は治療用薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
退行性脳疾患は、加齢に伴って発生する退行性疾患の中でも脳で発生する疾患のことを意味し、主な症状と侵される脳部位を考慮して区分することができるが、代表的なものとしてアルツハイマー疾患（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ ｄｉｓｅａｓｅ）やパーキンソン疾患などが含まれる。退行性脳疾患は、老化による神経退化と遺伝的環境要因によりタンパク質が凝集されて神経細胞が死滅することにより引き起こされるものと知られている。
【０００３】
また、退行性脳疾患は、特定脳細胞の死滅又は退化が一時的に又は長期間かけて進行するものがあるが、一度死んだ脳細胞は再生不可能であるため、結局、致命的な脳機能の損失につながり発生するものとして知られており、特に、認知機能、感覚機能、運動機能、全身機能の進行性低下を伴う脳機能不全は、結局、性格と行動の変化をもたらし、患者を自分自身の面倒を見られなくなる状態に至らしめる。このような脳細胞死滅の主な経路としては酸化ストレスによる酸化毒性、興奮毒性、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）などが提示されており、それぞれ特異な信号伝達過程を通して細胞死滅を誘発する。具体的に、脳卒中、脳損傷、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）、パーキンソン病患者における脳細胞死滅の主な原因としては、活性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ）の蓄積後におけるタンパク質、核酸、脂質の酸化的損傷が提示されており、特に、フリーラジカル（ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌｓ）による酸化ストレスは、体内の各組織で起こる細胞死滅の主な原因として報告されており、脳神経疾患で生じる細胞死滅の主なメカニズムの一つとしても提示されてきた（Ｓｃｈａｐｉｒａ，Ａ．Ｈ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，９（４）：２６０−２６４，１９９６）。
【０００４】
また、ミクログリア（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）とアストロサイト（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）の活性は退行性脳神経疾患の発病及び進行にかかわると報告されており、ミクログリアは中枢神経系（ＣＮＳ）に常在する兔疫細胞であり、外部の刺激により活性化されて免疫反応及び炎症反応を誘発するものとして知られている。ミクログリアは、中枢神経系で一次的な免疫機能を行う細胞であり、細長い棘と薄い細胞体の模様を維持した状態から、外部から流入したり内部で発生する毒素が存在することになると、これら毒素から神経細胞を保護するために太くて短い棘と肥大した細胞体をもつ活性化された模様に変化する。
【０００５】
しかし、バクテリアの内毒素であるリポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）、インターフェロン−γ、ベータアミロイド又はガングリオシドのような物質によりミクログリアが活性化されると、正常状態のミクログリアとは異なり食作用を活発にし、細胞増殖してＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６などのようなサイトカイン、ケモカイン、ｉＮＯＳ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＣＯＸ−２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２）などの遺伝子を発現させ炎症メディエーターを生成する。このようなミクログリアの活性化は、損傷した細胞を取り除き外部から侵入するバクテリアやウイルスから神経細胞を保護する一面があるが、ｉＮＯＳによって生成される一酸化窒素（ＮＯ）とＣＯＸ−２により生成されるプロスタグランジン、ＴＮＦ−αなどは神経細胞にも毒性を示すため、結果的にミクログリアの活性化は神経細胞の損傷を悪化させることになる。したがって、ミクログリアの適切な活性化抑制は、退行性脳疾患を治療することができる一つの方法になり得る。
【０００６】
また、アストロサイトは、脳の発生過程だけでなく正常な脳活動を維持するのに重要な役割を行う。脳におけるアストロサイトは、神経細胞が分泌する神経伝達物質を適切に取り除いたり脳でのイオン濃度を調節したりしながら神経細胞の活性を補助する役割を行うことが明らかになっており、この他にも神経幹細胞が神経細胞に分化するのに決定的な役割をすることが明らかになっている。
【０００７】
しかし、アストロサイトは、脳に傷害を負ったとき、増殖が活発になりスウェリング（ｓｗｅｌｌｉｎｇ）が起きてアストログリオーシス（ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ）のような反応性アストロサイトに活性化される。このような反応性アストロサイトは、ＨＩＶ性認知症、脳損傷、虚血性脳疾患、アルツハイマー病などで観察されている。よって、持続的なアストロサイトの活性化は、結局、神経細胞の死滅をもたらす。したがって、アストロサイトの適切な活性化抑制も退行性脳疾患を治療することができるもう一つの方法になり得る。
【０００８】
現在、退行性脳疾患を治療するために使用されている治療法としては、薬物治療法、手術治療法及び物理治療法などがあるが、薬物治療の場合、一般的に脳で不足となったドーパミンを補い、ドーパミン不足による神経伝達物質の不均衡を合わせ、神経細胞の破壊を予防又は遅延させ、また、その他鬱病などの症状を調節するための薬物が使用されている。
【０００９】
しかし、このような薬物は、死んでしまった神経細胞を再び生き返らせることができないため、完治を目的とするものではなく症状の調節を目的とするという限界があって、より効果的に退行性脳疾患を予防又は治療することができる新たな治療剤の至急開発が望まれているのが実情である。
【００１０】
一方、イブルチニブは、Ｂ細胞悪性腫瘍を標的とする抗癌剤として知られており、悪性腫瘍Ｂ細胞が制御不可能に成長し分裂するように刺激する信号を遮断する作用をすることが明らかになっている。このようなイブルチニブは、２０１３年１１月にマントル細胞リンパ腫の治療に対して、２０１４年２月には慢性リンパ球性白血病の治療に対してアメリカＦＤＡの承認を受けた。
【００１１】
しかし、未だイブルチニブが退行性脳疾患を治療することができる治療剤として使用可能であることを糾明した例がない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
よって、本発明者等は、従来抗癌剤として知られているイブルチニブが退行性脳疾患を予防又は治療することができる治療剤として使用可能であることを確認することにより本発明を完成した。
【００１３】
したがって、本発明の目的は、イブルチニブ又はこれの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、退行性脳疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供することにある。
【００１４】
また、本発明の他の目的は、試験管内でイブルチニブ又はこれの薬学的に許容可能な塩を脳神経細胞に処理する段階を含む、ミクログリア又はアストロサイトの活性抑制方法を提供することにある。
【００１５】
さらに、本発明のまた他の目的は、試験管内でイブルチニブ又はこれの薬学的に許容可能な塩を脳神経細胞に処理する段階を含む、ＬＰＳによって誘導されるミクログリアの細胞移動を抑制する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記目的を達成するために、本発明は、イブルチニブ又はこれの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、退行性脳疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【００１７】
本発明の一実施例において、上記組成物は、ミクログリア又はアストロサイトの活性を抑制して、活性化されたミクログリア又は活性化されたアストロサイトが神経細胞に及ぼす損傷を抑制する効果を有するものであり得る。
【００１８】
本発明の一実施例において、上記組成物は、ミクログリアの細胞移動を抑制する活性を有するものであり得る。
【００１９】
本発明の一実施例において、上記ミクログリア又はアストロサイトの活性；又はミクログリアの細胞移動は、ＬＰＳによって誘導されるものであり得る。
【００２０】
本発明の一実施例において、上記組成物は、アミロイドプラークの抑制又はタウタンパク質のリン酸化抑制活性を有するものであり得る。
【００２１】
本発明の一実施例において、上記組成物は、神経細胞で記憶力と学習力に関与する樹状突起棘（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｓｐｉｎｅ）の数及びシナプトフィジン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）及びＰＳＤ−９５のパンクタ数（ｐｕｎｃｔａ ｎｕｍｂｅｒ）を増加させて機能的シナプスを増加させるものであり得る。
【００２２】
本発明の一実施例において、上記組成物は、アルツハイマー疾病モデルで長期記憶力を向上させるものであり得る。
【００２３】
本発明の一実施例において、上記退行性脳疾患は、アルツハイマー、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、多発性神経萎縮、てんかん、脳疾患（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、脳卒中、記憶障害、認知障害及び学習障害からなる群から選択されるものであり得る。
【００２４】
また、本発明は、試験管内でイブルチニブ又はこれの薬学的に許容可能な塩を脳神経細胞に処理する段階を含む、ミクログリア又はアストロサイトの活性を抑制する方法を提供する。
【００２５】
また、本発明は、試験管内でイブルチニブ又はこれの薬学的に許容可能な塩を脳神経細胞に処理する段階を含む、ＬＰＳによって誘導されるミクログリアの細胞移動を抑制する方法を提供する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は、イブルチニブの退行性脳疾患に対する治療剤の用途に関するものであり、ミクログリア及びアストロサイトの活性を効果的に抑制することにより炎症性サイトカインの生産を減少させて炎症を抑制し、活性化されたミクログリア及びアストロサイトが神経細胞に及ぼす損傷に対する保護効果に優れているばかりか、退行性脳疾患の原因であるアミロイドプラーク及びタウ（Ｔａｕ）リン酸化を抑制する効果があり、アミロイドβ分解酵素であるＩＤＥの発現水準を増加させてアミロイドプラークの生成を抑制しアルツハイマー疾病動物モデルで長期記憶を向上させる効果があり、さらに、記憶力及び学習力に連関する樹状突起棘の数を増加させて記憶力及び学習力の増進により退行性脳神経疾患を予防、改善及び治療できることから、イブルチニブを退行性脳疾患の予防又は治療剤として有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ミクログリアに対するイブルチニブの細胞毒性有無を確認した結果を示したものであり、図１Ａはイブルチニブを１００、２５０、５００、７５０、１０００ｎＭ濃度別に処理した後、細胞生存度を分析したものであり、図１Ｂはイブルチニブを１、５、１０、２５、５０μＭ濃度別に処理した後、細胞生存度を分析したものであり、図１ＣはＬＰＳによって刺激されたＢＶ２ミクログリア、及びイブルチニブを前処理した後、ＬＰＳによって刺激されたＢＶ２ミクログリアの細胞形態を顕微鏡で観察した写真を示したものである。
【図２】ＢＶ２ミクログリアにイブルチニブを前処理した後、各前炎症性サイトカインの発現水準をＲＴ−ＰＣＲを通して確認した結果を示したものであり（図２Ａ〜２Ｆ）、図２Ｇは分析細胞を抗ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＯＸ−２抗体又は抗ＣＤ１１ｂ及びＩＬ−１β抗体を用いて染色された細胞を顕微鏡で観察したものであり、図２Ｈ及び２Ｉはイブルチニブ処理によるＩＬ−１β、ＣＯＸ−２の発現水準を確認した結果を示したものである。
【図３】ＢＶ２ミクログリアにイブルチニブを前処理した後、ＬＰＳによって誘導された前炎症性サイトカインの水準をＲＴ−ＰＣＲを通して確認した結果を示したものである（図３Ａ〜３Ｆ）。
【図４】初代培養ミクログリアにイブルチニブを前処理した後、ＬＰＳによって誘導された前炎症性サイトカインの発現水準をＲＴ−ＰＣＲを通して確認した結果を示したものである（図４Ａ〜４Ｆ）。
【図５】初代培養アストロサイトにイブルチニブを前処理した後、ＬＰＳによって誘導された前炎症性サイトカインの発現水準をＲＴ−ＰＣＲを通して確認した結果を示したものである（図５Ａ〜５Ｆ）。
【図６】ＢＶ２ミクログリアにＴＬＲ４抑制剤であるＴＡＫ２４２、イブルチニブ及びＬＰＳを各条件別に処理し、細胞内で発現するＬ−１β及びＣＯＸ−２のｍＲＮＡ水準をＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した結果を示したものである。
【図７】ＥＲＫ／ＡＫＴ信号伝逹に及ぼすイブルチニブの役割を分析した結果であり、ＢＶ２ミクログリアにイブルチニブを前処理した後、ＥＲＫ／ＡＫＴ信号伝達抗体を用いてこれらタンパク質のリン酸化程度を分析したもので、図７Ａ〜７ＣはＥＲＫのリン酸化程度を確認したものである。
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、ＢＶ２ミクログリアにイブルチニブを前処理した後（１時間）、ＡＫＴのリン酸化程度を確認したものであり、図８Ｄ〜８Ｆは、イブルチニブの処理時間をより長くした後（５時間）、ＡＫＴのリン酸化程度を確認した結果を示したものである。図８Ｇ〜８Ｉは、イブルチニブを前処理し、ＬＰＳを処理した群におけるＣＯＸ−２及びＩＬ−１β ｍＲＮＡ水準を確認した結果を示したものである。
【図９】ＢＶ２ミクログリアをイブルチニブ（１μＭ）で前処理した後、細胞下分画化（ｓｕｂｃｕｌｌａｒ）を行って核とサイトゾル分画ではｐ−ＳＴＡＴ３水準をウエスタンブロットで確認した結果を示したものであり（図９Ｃ〜９Ｄ）、抗ｐ−ＳＴＡＴ３（ｓ７２７）及び抗ＣＤ１１ｂ抗体を用いた免疫細胞化学染色による顕微鏡観察結果（図９Ｅ）及びｐ−ＳＴＡＴ３の水準を確認した結果（図９Ｆ）を示したものである。
【図１０】イブルチニブがＬＰＳによって刺激されたミクログリアの移動を調節することができるかを確認した結果を示したものであり、培養されたミクログリアにイブルチニブを前処理した後、細胞にスクラッチをつけ、イブルチニブ処理による細胞移動程度を顕微鏡で確認した結果（１０Ａ）及び移動した細胞数を確認した結果（１０Ｂ）を示したものである。
【図１１】マウス動物モデルのｃｏｒｔｅｘ及びｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓでＬＰＳによるミクログリアの活性化及びイブルチニブによるミクログリア活性化抑制効果をミクログリアマーカーであるＩＢａ−１発現水準で確認したものであり、抗ＩＢａ−１抗体を用いた免疫組織化学染色結果を示したものである（図１１Ａ〜１１Ｃ）。
【図１２】マウス動物モデルのｃｏｒｔｅｘ及びｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓでＬＰＳによるアストロサイトの活性化及びイブルチニブによるアストロサイト活性化抑制効果をアストロサイトマーカーであるＧＦＡＰ発現水準で確認したものであり、抗ＧＦＡＰ抗体を用いた免疫組織化学染色結果を示したものである（図１２Ａ〜１２Ｃ）。
【図１３】アルツハイマー誘発疾病モデル（５ｘ ＦＡＤ ｍｉｃｅ）でイブルチニブ処理による記憶力及び学習力行動分析のためにＹ迷路実験と新規物質探索試験を行った結果を示したものである（図１３Ａ〜１３Ｂ）。
【図１４】アルツハイマー誘発疾病モデル（Ｔａｕを過剰発現させたＰＳ１９ ｍｉｃｅ）でイブルチニブ処理による記憶力及び学習力行動分析のためにＹ迷路実験と新規物質探索試験を行った結果を示したものである（図１４Ａ〜１４Ｂ）。
【図１５】イブルチニブ（１μＭ）の認知行動向上メカニズムのうち樹状突起棘数の変化を分析するために、初代培養海馬神経細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ）にＧＦＰを導入して形質転換してから、イブルチニブ（１μＭ）又はビヒクルを２４時間処理した後、免疫組織化学染色を行って樹状突起棘数の変化結果を示したものである（図１５Ａ〜１５Ｂ）。
【図１６】イブルチニブ（５μＭ）の認知行動向上メカニズムのうち樹状突起棘数の増加を分析するために、初代培養海馬神経細胞にＧＦＰを導入して形質転換してから、イブルチニブ（５μＭ）又はビヒクルを２４時間処理した後、免疫組織化学染色を行って樹状突起棘数の変化結果を示したものである（図１６Ａ〜１６Ｂ）。
【図１７】イブルチニブが機能的シナプス（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｙｎａｐｓｅ）に影響を与えるかを確認するために、初代培養海馬神経細胞にＧＦＰを導入して形質転換してから、抗シナプトフィジン抗体と抗ＰＳＤ−９５抗体を用いて免疫組織化学染色を行ってパンクタ数の変化を確認した結果を示したものである（図１７Ａ〜１７Ｄ）。
【図１８】イブルチニブの認知行動向上分子メカニズム研究を実験した研究結果であり、初代培養海馬神経細胞にＧＦＰを導入して形質転換してから、抗ｐ−ＦＡＫ抗体を用いて免疫組織化学染色を行った結果を示したものである（図１８Ａ〜１８Ｂ）。
【図１９】イブルチニブによる樹状突起棘数の変化を確認するために、正常マウスの脳にイブルチニブ（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｉ．Ｐ）又はビヒクルを毎日２週間腹腔投与した後、ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ＣＡ１部位でゴルジ（Ｇｏｌｇｉ）染色を行って樹状突起棘数の結果を示したものである（図１９Ａ〜１９Ｄ）。
【図２０】アルツハイマー疾病動物モデルでイブルチニブによる樹状突起棘数の変化を確認するために、アルツハイマー動物モデル（ＰＳ １９ ｍｉｃｅ）の脳にイブルチニブ（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｉ．Ｐ）又はビヒクルを毎日２週間腹腔投与した後、ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ＣＡ１及びｃｏｒｔｉｃａｌ ｌａｙｅｒ Ｖ部位でゴルジ染色を行って樹状突起棘数の結果を示したものである（図２０Ａ〜２０Ｈ）。
【図２１】アルツハイマー疾病動物モデル（５ｘＦＡＤ）のｃｏｒｔｅｘ及びｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓでイブルチニブ処理によるアミロイドプラーク抑制効果を確認したものであり、抗４Ｇ８抗体を用いた免疫組織化学染色結果を示したものである（図２１Ａ〜２１Ｅ）。
【図２２】アルツハイマー疾病動物モデル（５ｘＦＡＤ）のｃｏｒｔｅｘ及びｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓでイブルチニブ処理によるアミロイドプラークの減少に対する分子メカニズムを確認するために抗ＩＤＥ抗体を用いて免疫組織化学染色を行った結果を示したものである（図２２Ａ〜２２Ｅ）。
【図２３】アルツハイマー疾病動物モデル（５ｘＦＡＤ）のｃｏｒｔｅｘ及びｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓでイブルチニブ処理による総タウ（Ｔｏｔａｌ Ｔａｕ）タンパク質の発現変化を確認するために抗Ｔａｕ−５抗体を用いて免疫組織化学染色を行った結果を示したものである（図２３Ａ〜２３Ｅ）。
【図２４】アルツハイマー疾病動物モデル（５ｘＦＡＤ）のｃｏｒｔｅｘ及びｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓでイブルチニブ処理によるタウ（Ｔａｕ）リン酸化変化効果を確認するために抗ＡＴ８抗体を用いて免疫組織化学染色を行った結果を示したものである（図２４Ａ〜２４Ｅ）。
【図２５】アルツハイマー疾病動物モデル（５ｘＦＡＤ）のｃｏｒｔｅｘ及びｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓでイブルチニブ処理によるタウ（Ｔａｕ）リン酸化変化を確認するために抗ＡＴ１００抗体を用いて免疫組織化学染色を行った結果を示したものである（図２５Ａ〜２５Ｅ）。
【図２６】アルツハイマー疾病動物モデル（５ｘＦＡＤ）のｃｏｒｔｅｘ及びｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓでイブルチニブ処理によるタウ（Ｔａｕ）リン酸化変化効果を確認するために抗ＡＴ１８０抗体を用いて免疫組織化学染色を行った結果を示したものである（図２６Ａ〜２６Ｅ）。
【図２７】アルツハイマー疾病動物モデル（５ｘＦＡＤ）のｃｏｒｔｅｘ及びｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓでイブルチニブ処理によるタウ（Ｔａｕ）タンパク質のリン酸化を調節する遺伝子であるｐ−ＣＤＫの変化を確認するために抗ｐ−ＣＤＫ５抗体を用いて免疫組織化学染色を行った結果を示したものである（図２７Ａ〜２７Ｅ）。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、イブルチニブ又はこれの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、退行性脳疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供することに特徴がある。
【００２９】
イブルチニブは、先に従来技術でも言及したように、Ｂ細胞悪性腫瘍を標的とする抗癌剤として知られており、免疫疾患に対する治療可能性についての研究が報告されている。しかし、未だイブルチニブの脳疾患に対する治療可能性については研究されていない。
【００３０】
よって、本発明ではイブルチニブが退行性脳疾患治療剤として使用可能であることを最初に糾明した。
【００３１】
本発明の一実施例によれば、イブルチニブがミクログリア又はアストロサイトの活性を抑制して、活性化されたミクログリア又は活性化されたアストロサイトが神経細胞に及ぼす損傷を抑制する効果があることを確認した。それだけでなく、本発明では、活性化されたミクログリアの細胞移動をイブルチニブ処理時に効果的に抑制することにより、活性化されたミクログリアの細胞移動による退行性脳疾患の発病を抑制できることが分かった。
【００３２】
脳で大食細胞の役割をするミクログリア（ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）は、中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ，ＣＮＳ）内の免疫反応を調節する重要なエフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）である。これらの活性化は、薬物や毒素による異物を取り除き、神経成長因子を分泌してＣＮＳの恒常性を維持するのに重要な役割をする。しかし、損傷したニューロンから発生する信号、外部刺激によって変形された非正常な形態のタンパク質の蓄積、病原体の浸透のような有害なストレスに露出すると、ミクログリアの活性が過剰に増加して神経細胞の損傷を誘発することにより、アルツハイマー疾患、パーキンソン疾患、多発性硬化症、脳梗塞などのような退行性脳疾患を引き起こし得る。したがって、ミクログリアの過度な活性に対する抑制方法は、退行性脳疾患の新たな治療方法になり得る。
【００３３】
具体的に、過度に活性化されたミクログリアは、正常状態のミクログリアとは異なり、食作用を活発にし、細胞増殖し、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６等のようなサイトカイン、ケモカイン、ｉＮＯＳ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＣＯＸ−２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２）等の遺伝子を発現させて炎症メディエーターを生成する。ミクログリアの活性化は、損傷した細胞を取り除き、外部から侵入するバクテリアやウイルスから神経細胞を保護する一面があるが、ｉＮＯＳによって生成される一酸化窒素（ＮＯ）とＣＯＸ−２によって生成されるプロスタグランジン、ＴＮＦ−αなどは神経細胞にも毒性を示すため、結果的にミクログリアの活性化は神経細胞の損傷を悪化させることになり、退行性脳疾患の原因として作用する。
【００３４】
また、アストロサイトも正常な脳活動を維持するのに重要な役割をすることが知られており、特に、神経細胞のシナプス形成、シナプス数調節、シナプス機能、神経幹細胞の神経への分化に役割をすることが知られている。しかし、このようなアストロサイトが過度に反応性を有することになると、すなわち、過度な活性化状態を維持することになると、神経細胞の死滅をもたらし、隣合う神経細胞の死滅も誘導するなど、退行性脳疾患の原因として作用することになる。したがって、アストロサイトの過度な活性化に対する抑制も退行性脳疾患の新たな治療方法になり得る。
【００３５】
上記ミクログリア及びアストロサイトの過度な活性化原因物質としては、バクテリアの内毒素であるリポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）、インターフェロン−γ、ベータアミロイド及びガングリオシドなどが含まれることができるが、本発明の一実施例で望ましくはリポポリサッカライドであり得る。
【００３６】
また、本発明の他の一実施例では、イブルチニブがＢＶ２ミクログリアでＬＰＳによって誘導される前炎症性サイトカインの発現水準を有意に抑制できることを確認し、特に、イブルチニブ処理による前炎症性サイトカイン抑制効果は、神経細胞タイプ別に特異的な結果も確認し、初代培養アストロサイトではイブルチニブによる前炎症性サイトカイン抑制効果を示さないのに対して、ミクログリアではＣＯＸ−２及びＩＬ−６の前炎症性サイトカインの水準を効果的に抑制させることを示した。
【００３７】
また、本発明者等は、イブルチニブの脳神経細胞保護効果に作用する機作を確認した結果、イブルチニブがＴＲＬ４とＬＰＳとの間の相互作用を防止してＬＰＳ刺激による前炎症性反応を抑制できることが確認され、イブルチニブの前炎症反応調節はＡＫＴ信号伝達に依存的であることを確認することができた。
【００３８】
特に、退行性脳疾患の一種であるパーキンソン病の場合、活性化されたミクログリアでＴＲＬ４とＬＰＳとの間の活発な相互作用が観察されることが知られており、脳炎症反応にＡＫＴが関与していることが知られている。
【００３９】
よって、本発明の実験結果によれば、イブルチニブは、ミクログリアの表面に存在するＴＲＬ４受容体とＬＰＳの反応を効果的に抑制できることを確認し、ミクログリアでＬＰＳによって誘導されるｐ−ＡＫＴ（活性型ＡＫＴ）の水準を効果的に抑制することにより、退行性脳疾患の発病に関与する細胞内信号伝達を減少又は抑制できるということを確認した。
【００４０】
また、本発明の他の実験結果によれば、アルツハイマーが誘発されたマウス動物モデルを対象としてイブルチニブ処理によるアルツハイマー治療効果分析を行ったが、イブルチニブ処理時、アミロイド分解酵素であるＩＤＥの発現が増加することが示され、これによりアルツハイマーの原因となるアミロイドプラーク数が顕著に減少することを確認することができた。それだけでなく、イブルチニブを処理した群は、イブルチニブを処理していない群に比べて、アルツハイマーの原因となるタウタンパク質のリン酸化が顕著に減少することを確認した。さらに、本発明の一実施例で、イブルチニブを処理した群は、イブルチニブを処理していない群に比べて、樹状突起棘数が増加し、シナプトフィジン又はＰＳＤ−９５のパンクタ数が増加（すなわち、機能的シナプス（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｙｎａｓｐｅ）の増加）し、長期記憶力が向上することを確認した。
【００４１】
よって、本発明のイブルチニブ又はこれの薬学的に許容可能な塩は退行性脳疾患の治療剤として使用可能であり、イブルチニブ又はこれの薬学的に許容可能な塩を、これを必要とする個体に投与する段階を含む退行性脳疾患の治療方法を提供することができる。
【００４２】
本発明による上記退行性脳疾患は、これに制限されるものではないが、アルツハイマー、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、多発性神経萎縮、てんかん、脳疾患（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、脳卒中、記憶障害、認知障害及び学習障害からなる群から選択されるものであり得る。
【００４３】
本発明の退行性脳神経疾患の予防又は治療用組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。薬学的に許容可能な担体を含む上記組成物は、経口又は非経口の様々な剤形であり得る。製剤化する場合には普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製される。
【００４４】
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）又はラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調製される。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクなどのような潤滑剤も用いられる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当し、よく用いられる単純希釈剤である水、流動パラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれることができる。
【００４５】
非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレエートのような注射可能なエステルなどが用いられることができる。坐剤の基剤としては、ウィテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴ−ル、ｔｗｅｅｎ６１、カカオ脂、ラウリナム、グリセロゼラチンなどが用いられることができる。
【００４６】
上記薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形を有することができる。
【００４７】
また、これら薬学的組成物は、上述のように、神経退行及び／又はこれと連関した症状をはじめとする多様な疾患を治療するために投与されることができる。
【００４８】
上記本発明の組成物は薬学的に有効な量で投与する。用語“薬学的に有効な量”とは、医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスクの割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量水準は個体種類及び重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出割合、治療期間、同時使用される薬物を含む要素及びその他医学分野によく知られている要素によって決定されることができる。
【００４９】
本発明の組成物は、個別治療剤として投与することも、他の治療剤と併用して投与することもでき、従来の治療剤とは順次又は同時に投与することができ、単一又は多重投与することができる。上記要素をいずれも考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要である。本発明の薬剤学的組成物の一般的な投与量は、成人基準で０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
【００５０】
上記薬学的組成物の投与経路は、目的組織に到逹できる限り、如何なる一般的な経路を通して投与されてもよい。本発明の組成物は、目的とするところによって、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与されることができるが、これに限られない。また、上記組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置により投与されることができる。
【００５１】
本発明の組成物は、退行性脳疾患の予防及び治療のために、単独で、手術、ホロモン治療、薬物治療及び生物学的反応調節剤を用いる方法と併用して使用することができる。
【００５２】
さらに、本発明は、試験管内でイブルチニブ又はこれの薬学的に許容可能な塩を脳神経細胞に処理する段階を含む、ミクログリア又はアストロサイトの活性を抑制する方法を提供することができる。
【００５３】
また、本発明は、試験管内でイブルチニブ又はこれの薬学的に許容可能な塩を脳神経細胞に処理する段階を含む、ＬＰＳによって誘導されるミクログリアの細胞移動を抑制する方法を提供することができる。
【００５４】
また、本発明は、試験管内でイブルチニブ又はこれの薬学的に許容可能な塩を脳神経細胞に処理する段階を含む、アミロイドプラークの抑制、タウリン酸化の阻害又は長期記憶力の向上方法を提供することができる。
【００５５】
以下、本発明を実施例によってさらに詳しく説明する。これら実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に極限されないことは当業界で通常の知識を有する者にとって自明なことである。
【００５６】
＜準備例及び実験方法＞
細胞株及び培養条件 
ＢＶ２ミクログリア（ＢＶ２ ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ；Ｄｒ．Ｋｙｕｎｇ−Ｈｏ Ｓｕｋ博士から入手）を５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）が含有されたＤＭＥＭ／高含量グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）培地を用いて５％ＣＯ２培養器で培養した。
【００５７】
野生型マウス（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｍｉｃｅ）
全ての実験は韓国脳研究院（ＩＡＣＵＣ−２０１６−００１３）が承認された動物実験及び指針に則って行った。Ｃ５７ＢＬ６／ＮマウスはＯｒｉｅｎｔＢｉｏ Ｃｏｍｐａｎｙから購入して使用し、雄Ｃ５７ＢＬ６／Ｎ（８週、２５〜３０ｇ）マウスは病源菌のない施設で２２℃の周囲温度で１２時間の明暗周期下において飼育した。飼育したマウスへの薬物注入は、イブルチニブ（１０ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクル（ＤＭＳＯ）を３日間腹腔内（ｉ.ｐ）投与し、ＬＰＳ（１０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ）を３時間連続的に注射した。３時間後、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液を用いて野生型マウスを灌流及び固定させ、脳組織をフラッシュ凍結させた後、クリオスタット（ｃｒｙｏｓｔａｔ）で４０ｍｍ厚みになるように切片化した。各脳切片は免疫組織化学染色に使われた。脳切片をＰＢＳで洗浄し、室温で０.２％トリトンＸ−１００及び１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで１時間恒温培養して透過性を有するようにし、１時間後、一次抗体を４℃で一晩反応させ、組織を０.５％ＢＳＡで３回洗浄した後、室温で１時間、二次抗体を反応させた（ビオチン−結合された抗ウサギ抗体（１：４００、Ｖｅｃｔｏｒ実験室））。その後、脳切片を０.５％ＢＳＡで洗浄し、常温でａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ複合溶液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）において１時間培養した。０.１Ｍ ＰＢ緩衝液で３回洗浄した切片は、０.００３％Ｈ２Ｏ２を含有する０.１Ｍ ＰＢで０．５ｍｇ／ｍｌ ３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて反応結果の信号を検出した。切片は０．１Ｍ ＰＢですすぎ、ゼラチンコートスライドに載せた後、明視野顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用いてイメージ分析を行った。
【００５８】
アルツハイマー誘発マウス動物モデルの製作（５ｘ ＦＡＤ ｍｉｃｅ） 
５ｘＦＡＤマウス（ストックナンバー．００８７３０、Ｂ６ＳＪＬ−Ｔｇ ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ、ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ）Ｆ１世代をジャクソン研究所から入手し、形質転換雄マウス（５ｘＦＡＤ）をジャクソン研究所から購買した雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊと共に置いた。５ｘＦＡＤは、Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ（Ｓｗｅｄｉｓｈ）、Ｉ７１６Ｖ（Ｆｌｏｒｉｄａ）、及びＶ７１７Ｉ（Ｌｏｎｄｏｎ）を有する突然変異ヒトＡＰＰ（６９５）と２個のＦＡＤ変異（Ｍ１４６Ｌ及びＬ２８６Ｖ）を有するヒトＰＳ１に伴うヒト家族性アルツハイマー病（Ｆａｍｉｌｉａｌ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，ＦＡＤ）変異を過剰発現するものとして知られている。上記形質転換は、マウスＴｈｙ１プローモーターによって調節されて脳で過剰発現されるようにし、５ｘＦＡＤ形質転換に対するジェノタイピングは、ジャクソン研究所のジェノタイピングプロトコルによって提供されるＰＣＲ方法で行った。
【００５９】
５ｘＦＡＤマウスに対するジェノタイピング
４週齢マウスから尾を切りはなし、これから誘電体ＤＮＡを抽出した。尾を塩基性溶解溶液で９５℃、２時間インキュベーションした後、中性化溶液で反応を終了した。Ｐｒｉｍｅ Ｔａｑ Ｐｒｅｍｉｘ（ＧｅＮｅｔＢｉｏ，Ｋｏｒｅａ）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ生成物を１．５％アガロースゲルで電気泳動により分離した。本発明で使われたプライマー配列は、次の通りである：
フォワードプライマー：５−ＡＡＴＡＧＡＧＡＡＣＧＧＣＡＧＧＡＣＣＡ−３
リバースプライマー：５−ＧＣＣＡＴＧＡＧＧＧＣＡＣＴＡＡＴＣＡＴ−３
ＰＣＲ増幅は、９４℃で３０秒間変性、６０℃で３０秒間アニーリング及び７２℃で９０秒間延長のサイクルを３５回繰り返し行い、ＰＣＲ生成物をＥｃｏ Ｄｙｅ（１：５０００，Ｋｏｒｅａ）と共に１．５％アガロースゲル上で電気泳動により分離した。
【００６０】
免疫組織化学及び免疫蛍光分析
実験に用いたマウス動物を灌流溶液（０.９％ＮａＣｌ，Ｓｉｇｍａ）及び４％パラホルムアルデヒド溶液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて灌流及び固定し、脳組織を凍結組織切片機（Ｌｅｉｃａ）で切断し（４０ｍｍ厚み）、免疫蛍光及び免疫組織化学染色を行った。免疫蛍光染色のために、薄片をＰＢＳで洗浄してから、次の一次抗体とインキュベーションした。アミロイドプラークを検出することができるＡｎｔｉ−４Ｇ８抗体、アミロイド分解酵素であるＡｎｔｉ−ＩＤＥ抗体、タウリン酸化検出のための抗体Ａｎｔｉ−ＡＴ８を用いた。抗体は、０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳで希釈し、ゆっくりシェイクしながら４℃で一晩インキュベーションした。翌日、組織を０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄し、５５５−コンジュゲーション−Ａｎｔｉ−ラビットＩｇＧ（１：２００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）と共に室温で１時間インキュベーションした。組織をゼラチンコートされたカバーガラス上に載せ、ＤＡＰＩ含有マウント溶液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を上に加えた。染色された組織を共焦点顕微鏡（ＴＩ−ＲＣＰ，Ｎｉｋｏｎ）で撮影した。免疫組織化学のために、薄片をＰＢＳで洗浄しインキュベーションし、室温で０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び１％ＢＳＡと共にＰＢＳ内で１時間処理して透過性を有するようにした。次いで、一次抗体をゆっくりシェイクしながら４℃で一晩インキュベーションした。翌日、上記組織を０．５％ＢＳＡと共にＰＢＳで３回洗浄し、次の二次抗体と共に１時間室温でビオチン−コンジュゲーションされたＡｎｔｉラビット抗体（ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（１：４００，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と反応させた。薄片を０．５％ＢＳＡと共にＰＢＳで再び洗浄し、アビジン−ビオチン複合体（ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）溶液において１時間室温でインキュベーションした。０．１Ｍ ＰＢ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）内で３回洗浄した後、０．００３％Ｈ２Ｏ２を含有する０．１Ｍ ＰＢ内の０．５ｍｇ／ｍｌ３，３−ジアミノベンジジン（３，３−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）（ＤＡＢ，Ｓｉｇｍａ）で薄片をインキュベーションしてシグナルを検出した。そして、薄片を０．１Ｍ ＰＢで洗浄した後、ゼラチンコートされたスライド上に載せ、明視野顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で観察した。
【００６１】
抗体及び抑制剤
一次抗体としては、ｒａｔ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＣＤ１１ｂ（１：４００，ａｂｃａｍ），ｒａｂｂｉｔ−ａｎｔｉ−ＣＯＸ２（１：１０００，ａｂｃａｍ），ｒａｂｂｉｔ−ａｎｔｉ−ＩＬ−１ｂ（１：２００，ａｂｃａｍ），ｒａｂｂｉｔ−ａｎｔｉ−ＧＦＡＰ（１：５０００，ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ），ｒａｂｂｉｔ−ａｎｔｉ−Ｉｂａ１（１：１０００，Ｗａｋｏ），ｇｏａｔ−ａｎｔｉ−ＩｂａＩ（１：５００，Ｗａｋｏ），ｒａｂｂｉｔ−ａｎｔｉ−ＡＫＴ（１：１０００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ），ｐ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３，Ｔｈｒ３０８）（１：１０００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ），ｒａｂｂｉｔ−ａｎｔｉ−ＥＲＫ（１：１０００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ），ｒａｂｂｉｔ−ａｎｔｉ−ｐ−ＥＲＫ（Ｔｈｒ４２／４４）（１：１０００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ），ｒａｂｂｉｔ−ａｎｔｉ−ＳＴＡＴ３（１：１０００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ），ｒａｂｂｉｔ−ａｎｔｉ−ｐ−ＳＴＡＴ３（Ｓｅｒ７２７，ａｂｃａｍ），ｍｏｕｓｅ−ａｎｔｉ−ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ（１：２００，Ｓｉｇｍａ），ｍｏｕｓｅ−ａｎｔｉ−ＰＳＤ９５（１：２００，Ｎｅｕｒｏｍａｂ），ｒａｂｂｉｔ−ａｎｔｉ−ｐＦＡＫ（１：５００，Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ），ｍｏｕｓｅ−ａｎｔｉ−４Ｇ８（１：５００，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ），ｒａｂｂｉｔ−ａｎｔｉ−ＩＤＥ（１：２００，Ａｂｃａｍ），ｒａｂｂｉｔ−ａｎｔｉ−ＮＥＰ（１：２００, Ｍｉｌｌｉｐｐｏｒｅ），ｍｏｕｓｅ−ａｎｔｉ−Ｔａｕ５（１：２００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ｍｏｕｓｅ−ａｎｔｉ−ＡＴ８（１：２００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ｍｏｕｓｅ−ａｎｔｉ−ＡＴ１００（１：２００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ｍｏｕｓｅ−ａｎｔｉ−１８０（１：２００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ｒａｂｂｉｔ−ａｎｔｉ−ｐＣＤＫ５（１：２００，Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を用いた。また、抑制剤としては、ＴＬＲ４ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＡＫ−２４２，５００ｎＭ）、ＡＫＴ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＭＫ２２０６，１０ｍＭ）を用いた。
【００６２】
ＭＴＴアッセイ
細胞生存力は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）分析法を用いた。細胞を９６ウェルプレートに分注し、ＦＢＳの存在又は不在下で２４時間、多様な濃度のイブルチニブ（１００ｎＭ〜１μＭ、１ μＭ −５０μＭ）を処理した。その後、細胞を０．５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴで処理し、３７℃で３時間、５％ＣＯ２培養器で培養した後、５８０ｎｍで吸光度を測定した。
【００６３】
初代培養ミクログリア及びアストロサイト
一次混合されたグリア（ｇｌｉａ）細胞は、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙマウスの大脳皮質から分離して培養し、すなわち、マウス皮質を１０％ＦＢＳ及びペニシリン−ストレプトマイシン溶液（５０００単位／ｍｌペニシリン、５ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）を含有する高ブドウ糖ＤＭＥＭ培地に単一細胞として分注し、７５−ｃｍ２Ｔフラスコ（０．５半球／フラスコ）に２週間漬けておいた。ミクログリアを収穫するために、プレートを１２０ｒｐｍで２時間一定に振った後、培地を収集し、１５分間１５００ｒｐｍで遠心分離した後、細胞ペレットをプレートに１ｘ１０５細胞／２４ウェルになるように再懸濁した。一旦ミクログリアが収集されたら、フラスコの残りの細胞を０．１％トリプシンを用いて収穫してアストロサイト個体群を得た。アストロサイトとミクログリアをＰｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ）であらかじめコーティングされた１２ウェルプレート（３５ｍｍ）で培養した後、これを実験に使用した。
【００６４】
ＲＴ−ＰＣＲ
全体ＲＮＡはＴｒｉＺｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）を用いて細胞から抽出した。ｏｌｉｇｏＤＴ（ＧｅＮｅｔＢｉｏ，Ｋｏｒｅａ）が含まれたＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｐｒｅｍｉｘ Ｋｉｔ IIを用いて全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、Ｐｒｉｍｅ Ｔａｑ Ｐｒｅｍｉｘ（ＧｅＮｅｔＢｉｏ，韓国）を用いて行われたＲＴ−ＰＣＲ産物は、Ｅｃｏ Ｄｙｅ（１：５０００，Ｋｏｒｅａ）を含んだ１．５％アガロースゲルで電気泳動により分離した。電気泳動されたＲＴ−ＰＣＲは、Ｉｍａｇｅ Ｊ（ＮＩＨ）とＦｕｓｉｏｎ（Ｋｏｒｅａ）を用いてイメージ分析した。
【００６５】
兔疫細胞化学法 
ＢＶ２ミクログリアを４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄した後、抗ＣＤ１１ｂ及び抗ＩＬ−１β又は抗ＣＤ１１ｂ及び抗ＣＯＸ２抗体をＧDＢバッファ（０．１％ゼラチン、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１６ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ７．４及び４５０ｍＭ ＮａＣｌ）において４℃で一晩反応させた。翌日、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、室温で１時間、二次抗体と反応させた。二次抗体は、マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８及びウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５５５（１：２００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ＵＳＡ）を用いた。その後、共焦点顕微鏡（ニコン、日本）を用いてイメージを単一平面で撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて分析した。
【００６６】
ウェスタンブロット
イブルチニブがＥＲＫ／ＡＫＴ信号伝逹に影響を与えて神経炎症を変化させることができるかを調べるために、ＢＶ２ミクログリアをイブルチニブ（１μＭ）又はビヒクルで１時間処理した後、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）又はＰＢＳで４５分間処理した。４５分後、プロテアーゼ及びホスファターゼ抑制剤（Ｒｏｃｈｅ，ＵＳＡ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液を用いて細胞を溶解した。ウェスタンブロットは、従来一般的なウェスタンブロット方法により行い、イメージはＦｕｓｉｏｎソフトウェア又はＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて分析した。
【００６７】
創傷治癒アッセイ（Ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｉｎｇ ａｓｓａｙ）
ＢＶ２ミクログリアを１２ウェルプレートに接種し、細胞が８０〜９０％になるように培養した後、細胞スクラッチャー（ＳＰＬ，Ｋｏｒｅａ）で引っ掻いて傷をつけた。スクラッチ直後にイメージを撮影し、その後、イブルチニブ（５００ｎＭ）又はビヒクルで１時間細胞に処理してから、ＬＰＳ又はＰＢＳで２４時間処理した。２４時間後、イメージを再び撮影して創傷治癒程度を分析した（Ｎａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
【００６８】
細胞質及び核分画（Ｃｙｔｏｓｏｌ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）
ＢＶ２ミクログリアを細胞質分画用緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＫＣｌ、０.５ｍＭ ＤＴＴ、３００ｍＭ サッカロース、０.１％ＮＰ−４０及び０．５ｍＭ ＰＭＳＦ）を用いて溶解した。溶液を添加し、５分後、細胞溶解物を１０，０００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心分離して上澄液を細胞質分画で分離して保管した。ペレットは、氷上で１５分間、核分画用緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、２０％グリセロール、１００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＤＴＴ及び０．５ｍＭ ＰＭＳＦ）で溶解した。その後、４℃で１０，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、ウェスタンブロット分析は、ａｎｔｉ−ＳＴＡＴ３（ｓ７２７）、ＰＣＮＡ及びβ−ａｃｔｉｎ抗体を用い、Ｆｕｓｉｏｎソフトウェアを用いて分析した。
【００６９】
Ｙ迷路試験（Ｙ ｍａｚｅ）
正常動物（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｍｉｃｅ）あるいはアルツハイマー誘発動物モデル（５ｘＦＡＤ ｍｉｃｅ，ＰＳ１９ ｍｉｃｅ）にイブルチニブを投与したときの短期記憶力向上能力を検証するために、各アームの長さが４２ｃｍ、幅が３ｃｍ、高さが１２ｃｍであり、３つのアームの角度が１２０度からなるＹ字型の迷路の一アームの端に動物を位置させ、５分間訪問したアームを記録した。その後、Ｐｅｒｃｅｎｔ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ＝（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ回数／ｔｒｉａｄｓ回数）×１００を求めて短期記憶力の尺度として用いた。
ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ：３つの相異なるアームに順に入った場合に１点付与
ｔｒｉａｄｓ：全体訪問回数−２
【００７０】
新規物質探索試験（Ｎｏｖｅｌ ｏｂｊｅｃｔ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｔｅｓｔ, NOR Test）
正常動物（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｍｉｃｅ）あるいはアルツハイマー誘発動物モデル（５ｘＦＡＤ ｍｉｃｅ、ＰＳ１９ ｍｉｃｅ）にイブルチニブを投与したときの長期記憶力向上能力を検証するために、４２×４２×２５ｃｍの大きさの箱において模様と大きさが同一の２個の物体を隅に位置させた後、動物を箱の真ん中から出発させ、動物が物体に関心を示す時間を５分間記録した。２４時間後、２個の物体のうち１個を新規なものに取り替えてから、既存物体と新規物体に接近した時間をそれぞれ測定し、新たな物体に対する選好度を分析して長期記憶分析指標として使用した。
【００７１】
統計処理
Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ４ ソフトウェアを用いて両側Ｔ検定又はＡＮＯＶＡによりすべてのデータを分析した。ｐｏｓｔ−ｈｏｃ分析は、ＴｕｋｅｙのＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎテストで行い、有意性はｐ＜０．０５に設定した。データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍで示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００７２】
＜実施例１＞
イブルチニブのＢＶ２ミクログリアに対する細胞毒性有無の確認
イブルチニブがＢＶ２ミクログリアに対する細胞毒性を有するかを確認するために、ＢＶ２ミクログリアにビヒクル又はイブルチニブ（１００、２５０、５００、７５０、１０００ｎＭ）をそれぞれ２４時間処理し、ＭＴＴ分析を行った。また、ＢＶ２ミクログリアにビヒクル又はイブルチニブをより高い濃度である１、５、１０、２５、５０μＭで２４時間それぞれ処理し、ＭＴＴ分析を行った。
【００７３】
分析の結果、図１に示されているように、イブルチニブがＢＶ２ミクログリアに対して２５μＭ濃度までは細胞毒性を誘発しないことが分かる。その反面、５０μＭ濃度では細胞死滅が発生することが示されており、２５μＭ濃度までは細胞に対して比較的毒性を誘発しないことが分かった（図１Ａ〜１Ｂ参照）。
【００７４】
また、本発明者等は、イブルチニブがＬＰＳ−誘導ＢＶ２ミクログリアで細胞形態を変形させることができるかどうかを試験するために、ＢＶ２ミクログリアをイブルチニブ（１μＭ）又はビヒクルで３０分間前処理し、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）又はＰＢＳで５時間３０分処理した。その後、細胞を固定させ、抗ＣＤ１１ｂ抗体で免疫染色した。
【００７５】
分析の結果、図１ｃに示されているように、ＬＰＳによって刺激されたＢＶ２ミクログリアは、ビヒクル処理群と比較して細胞体が薄くて長い形態を示すことが分かる。一方、イブルチニブを前処理した群は、細胞体がＬＰＳ処理により薄くて長い形態に変化することが減少することと示されている（図１Ｃ参照）。
【００７６】
＜実施例２＞
イブルチニブ処理による、ＬＰＳで誘導された前炎症性サイトカインの水準減少効果の分析
イブルチニブをＢＶ２ミクログリアに１μＭの濃度で３０分間前処理した後、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）又はＰＢＳで５時間３０分処理した。その後、ＲＮＡを分離し、炎症性サイトカイン水準をＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。このとき、ｍＲＮＡ水準分析は、炎症性サイトカインＩＬ−１β、ＣＯＸ−２、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αの水準を測定した。
分析の結果、図２に示されているように、イブルチニブを前処理した結果、ＬＰＳで増加したＩＬ−１β、ＣＯＸ−２、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αの発現がイブルチニブ処理により減少したことが示されているのに対して、ｉＮＯＳは発現減少程度がＩＬ−１β、ＣＯＸ−２、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αの減少に比べてあまり減っていないことが示されている（図２Ａ〜２Ｆ参照）。
また、本発明者等は、上記のようなＲＴ−ＰＣＲの結果を免疫細胞化学分析を通して再検証し、上記実験に用いられた細胞を抗ＣＤ１１ｂ抗体及びＣＯＸ−２抗体又は抗ＣＤ１１ｂ及びＩＬ−１β抗体で免疫染色した後、確認した。また、ここで対照群として、イブルチニブの代わりにビヒクルを処理した群を用いた。
その結果、図２のＧ〜Ｉに示されているように、ミクログリアでＬＰＳによって増加されたＣＯＸ−２と ＩＬ−１β の濃度が、イブルチニブ処理時、減少することを確認することができた。
よって、このような結果を通して本発明者等は、本発明のイブルチニブがＢＶ２ミクログリアで発生する炎症反応を抑制できることを知ることができた。
さらに、本発明者等は、上記方法とは異なり、ミクログリアにイブルチニブを後処理した場合にも炎症性サイトカインの発現減少を上記結果のように誘導することができるかを確認するために、ミクログリアにＬＰＳ（１ｍｇ／ｍｌ）又はＰＢＳを３０分間前処理した後、イブルチニブ（１ｍＭ）を５時間３０分処理してから、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
その結果、上記図２の結果とは異なり、イブルチニブを後処理した場合はＩＬ−６の発現水準のみを有意に抑制することが示されている（図３参照）。
【００７７】
＜実施例３＞
初代培養ミクログリア（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）におけるイブルチニブ処理による前炎症性サイトカイン抑制効果の分析
初代培養ミクログリアとアストロサイトでイブルチニブ処理が炎症反応を調節することができるかを確認するために、ミクログリアにビヒクル又はイブルチニブ（１μＭ）を３０分間処理し、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）又はＰＢＳで５時間３０分処理した後、炎症性サイトカイン水準をＲＴ−ＰＣＲで分析した。
その結果、ミクログリアでイブルチニブを前処理した場合、ＣＯＸ−２及びＩＬ−６の前炎症性サイトカインの水準を他のサイトカインに比べて有意に減少させることが示されている（図４Ａ〜４Ｆ参照）。
また、本発明者等は、イブルチニブが初代培養アストロサイトでも前炎症性サイトカインの発現水準に影響を与え得るかを確認するために、初代培養アストロサイトにビヒクル又はイブルチニブ（１μＭ）を３０分間前処理し、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）又はＰＢＳで５時間３０分処理した後、炎症性サイトカイン数値をＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。
分析の結果、特異なことだが、初代培養アストロサイトではイブルチニブが前炎症性サイトカインの発現水準に影響を与えることができないことが示されている（図５参照）。このような結果は、イブルチニブの前炎症性サイトカインに対する影響が細胞タイプによって反応するということを意味する。
【００７８】
＜実施例４＞
イブルチニブのＴＬＲ４受容体抑制活性による、ＬＰＳで誘導された前炎症性サイトカインの水準抑制効果の分析
ＬＰＳがミクログリアの細胞表面にあるＴＬＲ４受容体と相互作用するということが知られている。よって、イブルチニブが細胞表面でＬＰＳ／ＴＬＲ４受容体の相互作用を抑制して脳神経の炎症を調節することができるかを分析した。これを確認するために、ＢＶ２ミクログリアにＴＡＫ２４２（ＴＬＲ４抑制剤、５００ｎＭ）又はビヒクルで３０分間前処理し、イブルチニブ（１μＭ）又はビヒクルで３０分間処理した後、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）又はＰＢＳで５時間処理した。その後、全ＲＮＡを分離し、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＩＬ−１β及びＣＯＸ−２のｍＲＮＡ水準を測定した。
分析の結果、イブルチニブは、ＬＰＳによって誘導されたＢＶ２ミクログリアでＣＯＸ−２及び ＩＬ−１β のｍＲＮＡ水準を有意に減少させることが示されている（図６Ａ〜６Ｃ参照）。また、ＴＬＲ４の抑制は、ＬＰＳによって誘導されたＢＶ２ミクログリアでイブルチニブの存在下においてＩＬ-１β及びＣＯＸ−２ｍのＲＮＡ水準をより減少させることが示されている（図６Ａ〜６Ｃ参照）。
よって、このような結果を通して本発明者等は、イブルチニブがＴＲＬ４とＬＰＳとの相互作用を防止してＬＰＳ刺激による前炎症性反応を抑制できることが分かった。
【００７９】
＜実施例５＞
イブルチニブのＡＫＴ信号伝逹を通した、ＬＰＳで誘導された前炎症性反応変化の分析
最近の研究結果によると、ＡＫＴ及びＥＲＫ信号伝達がグリア細胞（ＲＥＦ）で前炎症性サイトカインの調節に重要な役割をすると報告されている。よって、本発明者等は、ＬＰＳ媒介脳炎症反応調節にイブルチニブが役割をするかを確認するために、ＥＲＫ／ＡＫＴ信号伝逹に及ぼすイブルチニブの作用を分析した。このために、ＢＶ２ミクログリアをイブルチニブ（１μＭ）又はビヒクルで１時間前処理し、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）又はＰＢＳで４５分間処理した後、ＥＲＫ／ＡＫＴ信号伝達抗体を用いて信号伝達に関与する因子の発現変化をウェスタンブロットにより確認した。
その結果、予想外にもイブルチニブはＬＰＳによって誘導されたＢＶ２細胞でｐ−ＥＲＫを変化させないことが示されている（図７Ａ〜７Ｃ参照）。しかし、イブルチニブがＢＶ２ミクログリアでＬＰＳによって誘導されたｐ−ＡＫＴ水準を顕著に減少させることを確認することができた（図８Ａ〜８Ｃ参照）。
上記のような結果により、イブルチニブがＬＰＳによるＡＫＴ信号伝逹を調節することができるかを調査した。このために、ＢＶ２ミクログリアをイブルチニブ（１μＭ）又はビヒクルで５時間前処理し、ＬＰＳ（１μｇ/ｍｌ）又はＰＢＳで４５分間処理した後、抗ｐ−ＡＫＴを用いたウェスタンブロットを行った。
その結果、イブルチニブをより長時間処理した場合、ＬＰＳによって誘発されたｐ−ＡＫＴ水準を有意に減少させることを確認することができた（図８Ｄ〜８Ｆ参照）。
また、本発明者等は、イブルチニブがＡＫＴ信号伝達を通して炎症反応を調節するかを確認した。このために、ＢＶ２ミクログリアをＭＫ２２０６（ＡＫＴ抑制剤、１０μＭ）又はビヒクルで３０分間前処理し、イブルチニブ（１μＭ）又はビヒクルで３０分間処理した後、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）又はＰＢＳで５時間処理し、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＣＯＸ−２と ＩＬ−１β のｍＲＮＡ水準を測定した。
その結果、上記結果と同様に、イブルチニブで前処理し、ＬＰＳで処理した群でＣＯＸ−２と ＩＬ−１β のｍＲＮＡ水準が減少することが示されており（図８Ｇ〜８Ｉ参照）、また、ＭＫ２２０６、イブルチニブ及びＬＰＳで処理した群は、ＬＰＳ及びＭＫ２２０６で処理した群と比較してＣＯＸ−２及びＩＬ−１ｂｅｔａのｍＲＮＡ水準が減少することが示されている（図８Ｇ〜８Ｉ参照）。このような結果から、イブルチニブの前炎症反応調節はＡＫＴ信号伝達に依存的であることが分かった。
【００８０】
＜実施例６＞
イブルチニブの核内におけるＬＰＳで誘導されたｐ−ＳＴＡＴ３の水準減少効果の分析
転写因子であるＳＴＡＴ３は、ＬＰＳによる炎症誘発サイトカインの水準調節に重要な役割をすることが知られている。よって、イブルチニブが炎症反応を変化させるためにＳＴＡＴ３を要するかを確認した。このために、ＢＶ２ミクログリアをイブルチニブ（１μＭ）又はビヒクルで３０分間前処理し、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）又はＰＢＳで５時間３０分処理した後、細胞下分画（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）を行った。
分析の結果、イブルチニブは、ＬＰＳによって刺激された核のｐ−ＳＴＡＴ３水準を減少させ（図９Ａ〜９Ｂ）、サイトゾルのｐ−ＳＴＡＴ３水準も減少傾向を示した（図９Ｃ〜９Ｄ参照）。
上記結果を検証するために、抗ｐ−ＳＴＡＴ３（ｓ７２７）及び抗ＣＤ１１ｂ抗体を用いて兔疫細胞化学法を実施した。その結果、ＢＶ２ミクログリアでイブルチニブがＬＰＳによって誘導された核内のｐ−ＳＴＡＴ３水準を下向き調節することが示されている（図９Ｅ〜９Ｆ参照）。このような結果は、イブルチニブが脳神経炎症反応を変形させるＳＴＡＴ３信号伝逹に依存的であることを示す。
【００８１】
＜実施例７>
イブルチニブによるミクログリアの細胞移動抑制効果の分析
イブルチニブがＬＰＳ刺激によるミクログリアの移動を調節することができるかを確認する実験を行った。このために、イブルチニブ（５００nＭ）又はビヒクルでミクログリアに２３時間３０分前処理し、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）又はＰＢＳで３０分間処理した後、創傷治癒分析法を行った。すなわち、細胞が培養されたプレートにスクラッチをつけ、細胞がスクラッチされた部分へ移動するが、イブルチニブがその移動を調節できるかを分析した。
その結果、イブルチニブを前処理した群は、ＬＰＳ単独処理群に比べて、ＬＰＳ刺激によるミクログリアの移動が有意に減少することが示されている（図１０Ａ〜１０Ｂ参照）。
すなわち、このような結果は、イブルチニブがＬＰＳによる神経細胞の移動を抑制することができるため、神経細胞の移動による退行性脳疾患の発病を抑制又は治療できることを示唆する。
【００８２】
＜実施例８＞
マウス動物モデルにおいてＬＰＳで刺激されたミクログリア及びアストロサイトの活性に対するイブルチニブの抑制効果の分析
最近の研究結果によると、活性化されたミクログリア及びアストロサイトは退行性脳疾患の発病に関連があることが知られている。よって、本発明者等は、イブルチニブが退行性脳疾患の治療剤として使用可能であることを確認するために、動物モデルを対象としてＬＰＳによって誘導されたミクログリア及びアストロサイトの活性化に対するイブルチニブの効果を分析した。これを確認するために、野生型マウスにイブルチニブを３日間腹腔内注射し（１０ｍｇ／ｋｇ／日）、抗ＩＢａ−１（図１１Ａ〜１１Ｃ）及び抗ＧＦＡＰ抗体（図１２Ａ〜１２Ｃ）で免疫組織化学染色を行った。
その結果、ＬＰＳが注射された野生型マウスはミクログリア及びアストロサイトの活性化が上向き調節されることが示されているのに対して、イブルチニブ投与によりミクログリア及びアストロサイトの活性化は有意に抑制されることが示されている。よって、本発明者等は、このような結果を通してイブルチニブが野生型マウスでＬＰＳにより誘導されたミクログリア及びアストロサイトの活性化を調節できることが分かり、特に、これら細胞の活性化を抑制することにより退行性脳疾患を予防又は治療できることが分かった。
【００８３】
＜実施例９＞
アルツハイマー誘発動物モデルでイブルチニブ処理による記憶力と学習力関連行動変化の分析
イブルチニブが記憶力及び学習力にどのような影響を及ぼすかを確認するために、アルツハイマー誘発動物モデル（５ｘＦＡＤ，ＰＳ１９ ｍｉｃｅ）にイブルチニブ（１０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）又はビヒクルを１４日間処置した後、短期記憶行動評価のためにＹ迷路試験（Ｙ−ｍａｚｅ）を、長期記憶行動評価のために新規物質探索試験（Ｎｏｖｅｌ ｏｂｊｅｃｔ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｔｅｓｔ，ＮＯＲ）を行った。
その結果、アルツハイマー疾病誘発動物モデルのうち５ｘＦＡＤマウスにイブルチニブを処置した場合、長期記憶が顕著に増加することを行動学的に確認した（図１３Ａ〜１３Ｂ）。また、アルツハイマー疾病誘発モデルのうちＰＳ１９マウスにイブルチニブを処置した群は、長期記憶が向上する傾向を示した（図１４Ａ〜１４Ｂ参照）。
よって、本発明者等は、このような結果を通してイブルチニブがアルツハイマー動物モデルマウスで学習及び記憶力を向上させることを確認することができた。
【００８４】
＜実施例１０＞
初代培養海馬神経細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ）においてイブルチニブ処理による樹状突起棘数の増加及び形成関連遺伝子の発現促進効果の分析
イブルチニブの認知行動向上メカニズムを分析するために、初代培養海馬神経細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ）にＧＦＰをトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した後、イブルチニブ１又は５μＭを２４時間処理した。その後、樹状突起棘数の変化を観察し、プレシナプス（ｐｒｅ ｓｙｎａｐｔｉｃ）指標であるシナプトフィジン抗体とポストシナプス（ｐｏｓｔ−ｓｙｎａｐｔｉｃ）マーカー因子であるＰＳＤ−９５抗体を用いて染色した後、パンクタ数及びそれによる発現程度を確認した。
その結果、初代培養海馬神経細胞においてイブルチニブ１μＭ又は５μＭ処置群全てでビヒクル処置群に比べて樹状突起棘数が有意に増加し（図１５Ａ〜１５Ｂ、図１６Ａ〜１６Ｂ）、イブルチニブ５μＭ処置群でビヒクル処置群に比べてシナプトフィジン及びＰＳＤ−９５のパンクタ数が顕著に増加したことを確認した（図１７Ａ〜１７Ｄ）。よって、イブルチニブは海馬で機能的シナプスの増加を通して認知行動向上効果を現わすことを確認することができた。
【００８５】
＜実施例１１＞
初代培養海馬神経細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ）でイブルチニブの樹状突起棘数増加による分子メカニズム研究
イブルチニブの記憶行動向上メカニズムを分析するために、初代培養海馬神経細胞にＧＦＰをトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した後、イブルチニブ５μＭ又はビヒクルを２４時間処理した。その後、樹状突起棘数の調節に関与するｐ−ＦＡＫ抗体を用いて染色した後、発現程度を確認した。
その結果、イブルチニブ５μＭ処置群でビヒクル処置群に比べてｐ−ＦＡＫ発現が顕著に減少したことを確認した（図１８Ａ〜１８Ｂ）。よって、イブルチニブは海馬でＦＡＫシグナル伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を阻害するため、樹状突起棘数を調節することを確認した。
【００８６】
＜実施例１２＞
正常マウス及びアルツハイマー誘発動物モデルでイブルチニブ処理による樹状突起棘数増加効果の分析
イブルチニブの認知行動向上メカニズムを分析するために、正常マウス及びアルツハイマー誘発動物モデルであるＰＳ１９ ｍｉｃｅ（３ヶ月齢）にイブルチニブを（１０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ）を１４日間注射し、マウスの脳を摘出してゴルジ染色を行った後、ｃｏｒｔｅｘ及びｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ部位神経細胞（ＡＯ部位、ＢＳ位置）の突起棘数を分析した。
その結果、正常マウスでイブルチニブ処置群のｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ＣＡ１神経細胞の突起棘数がビヒクル処置群に比べて増加したことを確認した（図１９Ａ〜１９Ｄ）。また、アルツハイマー動物モデル（ＰＳ１９ mice）でイブルチニブ処置群のｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ神経細胞の突起棘数がビヒクル処置群に比べて顕著に増加したことを確認し（図２０Ａ〜２０Ｄ）、その反面、アルツハイマー動物モデルでイブルチニブ処置群のｃｏｒｔｉｃａｌ ｌａｙｅｒ Ｖ神経細胞の突起棘数はビヒクル処置群に比べて特別な変化がないことを確認した（図２０Ｅ〜２０Ｈ）。よって、イブルチニブが樹状突起棘の密度増加を通して認知機能を向上させることをインビボでも確認した。
【００８７】
＜実施例１３＞
アルツハイマー動物マウスでイブルチニブによるアミロイドプラーク抑制効果の分析
本発明者等は、イブルチニブが退行性脳疾患の治療剤として使用可能であることを確認するために、アルツハイマーが誘発されたマウス動物モデルを対象としてイブルチニブを処理した時の、アミロイドプラークの数、アミロイド分解酵素であるＩＤＥ、ＮＥＰの発現量を分析した。
これを確認するために、アルツハイマー動物マウス（５ｘＦＡＤ ｍｉｃｅ）にイブルチニブ（１０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ）又はビヒクルを１４日間注射し、抗４Ｇ８抗体、抗ＩＤＥ抗体を用いて免疫組織化学染色及び顕微鏡観察を行った。
その結果、図２１に示されているように、アミロイドを検出することができる抗４Ｇ８抗体を用いた免疫組織化学染色によると、ｃｏｒｔｅｘ及びｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓの両方でイブルチニブを処理した群が処理していない群に比べてアミロイドプラークが顕著に減少したことを確認することができた（図２１Ａ〜２１Ｅ）。さらに、イブルチニブがどのようにアミロイドプラークを減少させるかに対する分子メカニズム実験として、先ずアミロイド分解酵素であるＩＤＥの発現水準を確認した結果、図２１に示されているように、ｃｏｒｔｅｘ及びｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓの両方でイブルチニブを処理した群が処理していない群に比べてアミロイド分解酵素であるＩＤＥの発現が増加したことを確認することができた（図２２Ａ〜２２Ｅ）。すなわち、イブルチニブは、ＩＤＥの発現増加を通してアルツハイマーの誘発原因となるアミロイドプラークを抑制できることを示唆している。
【００８８】
＜実施例１４＞
アルツハイマー動物マウスでイブルチニブによるタウリン酸化調節効果の分析
本発明者等は、イブルチニブが退行性脳疾患の治療剤として使用可能であることを確認するために、イブルチニブがタウリン酸化も調節することができるかを確認する。そのために、アルツハイマー動物モデルである５ｘＦＡＤ（３ヶ月齢）マウスを対象としてイブルチニブを処理した時の、タウ発現変化及びタウリン酸化変化有無を分析した。これを確認するために、アルツハイマー誘発マウスにイブルチニブ（１０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ）又はビヒクルを１４日間注射し、抗Ｔａｕ５抗体、抗ＣＤＫ抗体、抗ＡＴ８抗体、抗ＡＴ１００抗体及び抗ＡＴ１８０抗体を用いて免疫組織化学染色及び顕微鏡観察を行った。
その結果、図２３に示されているように、総タウ（Ｔｏｔａｌ Ｔａｕ）を検出できる抗Ｔａｕ５抗体を用いた免疫組織化学染色によると、５ｘＦＡＤマウスのｃｏｒｔｅｘ及びｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓでイブルチニブを処理した群が処理していない群に比べてＴａｕ５の発現には有意な差異を示さなかった（図２３Ａ〜２３Ｅ）。しかし、図２４乃至２６に示されているように、タウリン酸化の有無を検出できる抗ＡＴ８抗体、抗ＡＴ１００抗体及び抗ＡＴ１８０抗体、タウリン酸化に関与するタンパク質を検出できる抗ｐＣＤＫ５抗体を用いた免疫組織化学染色結果によると、抗ＡＴ８抗体を用いて免疫組織化学染色をした結果、５ｘＦＡＤマウスのｃｏｒｔｅｘでのみイブルチニブ処理時にタウリン酸化が有意に減少したことを確認することができた（図２４Ａ〜２４Ｅ）。そして、抗ＡＴ１００抗体を用いて免疫組織化学染色をした結果、５ｘＦＡＤマウスのｃｏｒｔｅｘとｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓの両方でイブルチニブ処理時にタウ酸化が有意に減少したことを確認することができた（図２５Ａ〜２５Ｅ）。抗ＡＴ１８０抗体を用いて免疫組織化学染色をした結果、５ｘＦＡＤマウスのｃｏｒｔｅｘではイブルチニブ処理時にタウリン酸化が有意に減少したことを確認することができ、ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓではイブルチニブ処理時にタウリン酸化が減少する傾向を確認した（図２６Ａ〜２６Ｅ）。さらに、タウリン酸化を誘導する遺伝子である、抗ＣＤＫ抗体を用いて免疫組織化学染色をした結果、５ｘＦＡＤマウスのｃｏｒｔｅｘとｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓの両方でイブルチニブ処理時にＣＤＫリン酸化が有意に減少したことを確認することができた（図２７Ａ〜２７Ｂ）。
【００８９】
結論として、本発明者等は、イブルチニブがアミロイドプラーク、タウリン酸化、脳炎症抑制及び記憶力向上をいずれも調節できることを確認することにより、イブルチニブは退行性脳疾患を予防、改善又は治療することができる新たな治療剤として使用可能であることが分かった。
【００９０】
以上、本発明についてその望ましい実施例を中心に考察した。本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者は、本発明が本発明の本質的な特性から逸脱しない範囲において変形された形態で具現され得ることを理解することができるはずである。よって、開示されている実施例は、限定的な観点ではなく説明的な観点で考慮されなければならない。本発明の範囲は、上述の説明ではなく特許請求範囲に示されており、それと同等の範囲内にある全ての差異点は本発明に含まれるものとして解釈されなければならないと言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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