(57)【要約】  がん細胞で発現されるヒトＣＤ２４に選択的に結合するが、非がん性細胞で発現されるヒトＣＤ２４には結合しない抗ＣＤ２４抗体、及びがん治療におけるかかる抗体の使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非がん性細胞上では糖鎖で遮蔽されている（glycan-shielded）ががん細胞上では露出するエピトープに結合する抗体を含む、組成物。
【請求項２】
前記抗体がＣＤ２４に結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗体が、配列番号４８に示される配列を含むペプチドに結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗体が、配列番号１に示される配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２に示される配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗体が、配列番号３〜配列番号１０のいずれか１つに示される配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１１〜配列番号１６のいずれか１つに示される配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗体が、配列番号６に示される配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６に示される配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗体が、配列番号２９〜配列番号３２のいずれか１つに示される配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３３〜配列番号３６のいずれか１つに示される配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗体が、配列番号３０に示される配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３５に示される配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗体が、配列番号３１に示される配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３５に示される配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載の組成物を含む第１の抗体ドメイン及び第２の抗体又はその抗原結合断片を含む第２の抗体ドメインを含む、二重特異性抗体。
【請求項１１】
前記第２の抗体ドメインががん免疫療法のために免疫エフェクターＴ細胞を前記がん細胞に引き付ける、請求項１０に記載の二重特異性抗体。
【請求項１２】
前記第２の抗体又はその抗原結合断片がＣＤ３に結合する、請求項１０に記載の二重特異性抗体。
【請求項１３】
配列番号１７に示される配列及び配列番号１８に示される配列を含む、請求項１０に記載の二重特異性抗体。
【請求項１４】
配列番号２３〜配列番号２７及び配列番号３７〜配列番号４１のいずれか１つに示される配列を含む、請求項１０に記載の二重特異性抗体。
【請求項１５】
前記第２の抗体又はその抗原結合断片がＴＣＲ−α鎖、ＴＣＲ−β鎖、ＴＣＲ−γ鎖又はＴＣＲ−δ鎖に結合する、請求項１０に記載の二重特異性抗体。
【請求項１６】
抗体介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する、請求項１〜請求項１５のいずれか一項に記載の抗体又は二重特異性抗体。
【請求項１７】
増強されたＡＤＣＣ活性を有するように設計されている、請求項１６に記載の抗体又は二重特異性抗体。
【請求項１８】
抗体介在性細胞貪食（ＡＤＣＰ）活性を有する、請求項１〜請求項１７のいずれか一項に記載の抗体又は二重特異性抗体。
【請求項１９】
増強されたＡＤＣＰ活性を有するように設計されている、請求項１８に記載の抗体又は二重特異性抗体。
【請求項２０】
請求項４〜請求項９のいずれか一項に記載の組成物を含む一本鎖抗体を含む、キメラ抗原受容体。
【請求項２１】
配列番号２８に示される配列を含む、請求項２０に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２２】
請求項１〜請求項２１のいずれか一項に記載の抗体、二重特異性抗体又はキメラ抗原受容体及び第二の抗がん治療剤を含む、組成物。
【請求項２３】
請求項１〜請求項２２のいずれか一項に記載の抗体、二重特異性抗体、キメラ抗原受容体又は組成物を、がん処置を必要としている患者に投与することを含む、前記患者におけるがんを処置する方法。
【請求項２４】
前記がんが肺がん、卵巣がん、乳がん、肝臓がん、脳がん、子宮頸がん、腎がん、精巣がん、前立腺がん又は神経芽細胞腫である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
抗ＣＤ２４抗体又はＣＤ２４に結合する受容体を発現する細胞を含む治療に関連する有害作用を処置する必要がある患者に、配列番号４８に示される配列を含む組成物を投与することを含む、前記患者における前記有害作用を処置する方法。
【請求項２６】
がんを処置又は予防（prophylaxis）する必要がある患者に、配列番号４８を含む組成物を投与することを含む、前記患者におけるがんを処置又は予防する方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の抗体の使用を含む、悪性組織又は転移性病変を診断する方法。
【請求項２８】
請求項１に記載の抗体の使用を含む、循環がん細胞を識別する方法。
【請求項２９】
がんを処置するための薬剤の製造における、請求項１〜請求項２２のいずれか一項に記載の抗体、二重特異性抗体、キメラ抗原受容体又は組成物の使用。
【請求項３０】
前記がんが肺がん、卵巣がん、乳がん、肝臓がん、脳がん、子宮頸がん、卵巣がん、腎がん、精巣がん、前立腺がん又は神経芽細胞腫である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
抗ＣＤ２４抗体又はＣＤ２４に結合する受容体を発現する細胞の治療的使用に関連する有害作用を処置するための薬剤の製造における、配列番号４８に示される配列を含む組成物の使用。
【請求項３２】
がんを処置又は予防するための薬剤の製造における、配列番号４８を含む組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、がん細胞で発現されるヒトＣＤ２４に選択的に結合するが、非がん性細胞で発現されるヒトＣＤ２４には結合しない抗ＣＤ２４抗体に関する。本開示はまた、がん治療におけるかかる抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ２４は、高度にグリコシル化された小さなムチン様グリコシルホスファチジルイノシトール（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ、ＧＰＩ）結合細胞表面タンパク質である。ＣＤ２４は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好中球、好酸球、樹状細胞、及びマクロファージなどの造血細胞、並びに神経細胞、神経節細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、筋肉細胞、膵細胞、及び上皮幹細胞などの非造血細胞で高レベルで発現する。通常、ＣＤ２４は、前駆細胞及び代謝的に活性な細胞では発現のレベルがより高く、最終分化細胞では発現のレベルがより低い傾向がある。ＣＤ２４の機能はほとんどの細胞タイプで不明であるものの、ＣＤ２４の多様な免疫学的機能が報告されている。
【０００３】
ＣＤ２４は多くの正常組織や細胞タイプに見られるが、ＣＤ２４はヒトのがんの７０％近くで過剰発現している。免疫組織化学によって検出された高レベルのＣＤ２４発現が、上皮性卵巣がん（８３％）、乳がん（８５％）、非小細胞肺がん（４５％）、前立腺がん（４８％）、及び膵臓がん（７２％）で認められている。ＣＤ２４は、がん細胞で最も過剰発現しているタンパク質の１つである。ＣＤ２４の発現は腫瘍形成中に上方制御されており、腫瘍の進行及び転移におけるその役割を示唆している。がんにおけるＣＤ２４の過剰発現は、がん患者の予後不良及び疾患のよりアグレッシブな経過を暗示するマーカーとしても特定されている。乳がんでは、ＣＤ２４の発現は、良性又は前がん性の病変よりも浸潤がんにおいて有意に高い。非小細胞肺がんでは、ＣＤ２４の発現が患者の全生存期間の独立したマーカーとして特定されている。さらに、食道扁平上皮がんでは、ＣＤ２４の過剰発現は、腫瘍リンパ節転移、腫瘍グレードの悪化、及び生存期間の短縮を示唆している。同様の観察結果は、結腸がん、肝細胞がん、神経膠腫、卵巣がん、及び前立腺がんを含む他の多くのがんでも見出されている。ＣＤ２４はがんの予後マーカーとして多用されてきたが、正常な細胞型における発現及び潜在的毒性のため、がん治療の可能性のある標的となり得る新抗原としては利用されていない。
【０００４】
成熟したＣＤ２４は、３１個のアミノ酸である小さな高度にグリコシル化されたシアロ糖タンパク質であり、１６個の潜在的なＯ−グリコシル化部位と２個の予測されるＮ−グリコシル化部位を有する。グリコシル化は、タンパク質の最も複雑な翻訳後修飾の１つである。通常のグリコシル化経路からのシフトが多くのがん細胞において発生することが知られており、これは糖鎖（グリカン）発現の変化をもたらし、多くの細胞タンパク質の高グリコシル化又は低グリコシル化（hypo-glycosylation）をもたらす。がん細胞に見られるグリコシル化パターンの変化は、転写レベルでの調節不全、グリコシル化中のシャペロンタンパク質の調節不全、グリコシダーゼ及びグリコトランスフェラーゼの活性の変化を含む多くの要因の結果である。腫瘍に関連する糖鎖の変化には、Ｎ型糖鎖の分岐の長化又は短化、Ｏ型糖鎖の密度の高低、通常の同等物（Ｔｎ抗原、ｓＴｎ抗原、及びＴ抗原）の短縮バージョンの生成、及びシアル酸及びフコース（ｓＬｅａエピトープ及びｓＬｅｘエピトープ）を有する異常な形態の末端構造の生成が含まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、当技術分野では、がんを識別及び処置する改善された方法、特にがん性細胞を非がん性細胞から区別することができる方法及び組成物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書で提供されるのは、正常細胞では生じるががん細胞では生じないグリコシル化によってＣＤ２４への結合がブロックされるモノクローナル抗ＣＤ２４抗体である。前記抗体は、がん細胞上には露出しているが非がん性細胞上には露出していない糖鎖で遮蔽されているエピトープ（glycan-shielded epitope）に結合し得る。前記抗体は、配列番号４８に示される配列を含むペプチドに結合し得る。
【０００７】
別の態様では、前記モノクローナル抗体は、非がん性細胞に対する反応性が最小限であるか全く有さず、がん性細胞に結合し得る。
【０００８】
別の態様では、前記モノクローナル抗体は、非腫瘍細胞に対する反応性が最小限であるか全く有さず、腫瘍細胞に結合し得る。
【０００９】
別の態様では、前記モノクローナル抗体は、造血細胞に対する反応性が最小限であるか全く有さず、循環がん細胞に結合し得る。
【００１０】
別の態様では、前記モノクローナル抗体は、がん特異的なグリコシル化パターンを欠く細胞上のＣＤ２４には結合し得ないが、がん特異的なグリコシル化パターンを持つ細胞上のＣＤ２４には結合し得る。
【００１１】
別の態様では、医薬組成物であり得る組成物は、モノクローナル抗体、又はその１又は複数の抗原結合断片を含む。
【００１２】
別の態様では、前記組成物は、抗体介在性細胞傷害（antibody mediated cellular cytotoxicity）（ＡＤＣＣ）を介してがん細胞を死滅させるために使用される。
【００１３】
別の態様では、前記組成物は、抗体介在性細胞貪食（antibody-mediated cellular phagocytosis）（ＡＤＣＰ）を介してがん細胞を死滅させるために使用される。
【００１４】
別の態様では、前記組成物は、ＡＤＣＣとＡＤＣＰとの組み合わせを介してがん細胞を死滅させるために使用される。
【００１５】
別の態様では、前記組成物は、がん細胞特異性をＴ細胞に付与するために使用され得るキメラ抗原受容体Ｔ細胞を含む。
【００１６】
別の態様では、前記組成物はモノクローナル抗体３Ｂ６を含む。
【００１７】
別の態様では、前記組成物は、配列番号１に示される配列及び配列番号２に示される配列を含むモノクローナル抗体を含む。
【００１８】
別の態様では、前記組成物は、モノクローナル抗体３Ｂ６の親和性成熟によって生成されたモノクローナル抗体を含む。
【００１９】
別の態様では、前記組成物は、配列番号３〜配列番号１０に示される配列のいずれか１つから選択される重鎖を含むモノクローナル抗体を含む。
【００２０】
別の態様では、前記組成物は、配列番号１１〜配列番号１６に示される配列のいずれか１つから選択される軽鎖を含むモノクローナル抗体を含む。
【００２１】
別の態様では、前記組成物は、モノクローナル抗体３Ｂ６の親和性成熟（affinity maturation）によって生成されたモノクローナル抗体ＰＰ６３７３を含む。
【００２２】
別の態様では、前記組成物は、配列番号６に示される配列及び配列番号１６に示される配列を含むモノクローナル抗体を含む。
【００２３】
別の態様では、前記組成物は、モノクローナル抗体ＰＰ６３７３をヒト化することによって生成されたモノクローナル抗体を含む。
【００２４】
別の態様では、前記組成物は、配列番号２９〜配列番号３２に示される配列のいずれか１つから選択される重鎖を含むモノクローナル抗体を含む。
【００２５】
別の態様では、前記組成物は、配列番号３３〜配列番号３６に示される配列のいずれか１つから選択される軽鎖を含むモノクローナル抗体を含む。
【００２６】
別の態様では、前記医薬組成物は、モノクローナル抗体ＰＰ６３７３をヒト化することによって生成されたモノクローナル抗体Ｈ２Ｌ３を含む。
【００２７】
別の態様では、前記医薬組成物は、モノクローナル抗体ＰＰ６３７３をヒト化することによって生成されたモノクローナル抗体Ｈ３Ｌ３を含む。
【００２８】
別の態様では、前記組成物は、配列番号３０に示される配列を含む重鎖可変配列と、配列番号３５に示される配列を含む軽鎖可変領域とを含む、モノクローナル抗体を含む。
【００２９】
別の態様では、前記組成物は、配列番号３１に示される配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３３に示される配列を含む軽鎖可変領域とを含む、モノクローナル抗体を含む。
【００３０】
別の態様では、前記組成物は、配列番号１７に示される配列を含む一本鎖モノクローナル抗体を含む。
【００３１】
別の態様では、前記組成物は、前記抗ＣＤ２４抗体又はその抗原結合断片を含む第１の抗体ドメインと、第２の抗体又は抗原結合断片を含む第２の抗体ドメインとを含む、二重特異性抗体を含む。前記二重特異性抗体は、がんの処置又は予防を必要とする患者においてがんと免疫エフェクターＴ細胞とを橋渡しするために使用され得る。
【００３２】
別の態様では、前記第２の抗体ドメインは、前記第１の抗体ドメインとは異なる結合特異性を有する。
【００３３】
別の態様では、前記第２の抗体ドメインは、免疫エフェクターＴ細胞を前記がん細胞に引き付ける。
【００３４】
別の態様では、前記第２の抗体又はその抗原結合断片はＣＤ３に結合する。
【００３５】
別の態様では、前記第２の抗体又はその抗原結合断片は、ＴＣＲ−α鎖、ＴＣＲ−β鎖、ＴＣＲ−γ鎖、又はＴＣＲ−δ鎖に結合する。
【００３６】
別の態様では、前記第１の抗体ドメインは、配列番号１７に示される配列を含む抗体を含み、前記第２の抗体ドメインは、配列番号１８に示される配列を含む。
【００３７】
別の態様では、前記第１の抗体ドメインは、配列番号２３〜配列番号２７及び３７〜配列番号４１に示される配列のいずれか１つを含む抗体を含む。
【００３８】
別の態様では、二重特異性抗体を含む前記組成物は、抗体介在性細胞傷害（antibody-mediated cellular cytotoxicity）（ＡＤＣＣ）を介してがん細胞を処置するために使用され得る。
【００３９】
別の態様では、前記組成物は、ＡＤＣＣ活性が増強された二重特異性抗体を含む。
【００４０】
別の態様では、前記組成物は、抗体介在性細胞貪食（antibody-mediated cellular phagocytosis）（ＡＤＣＰ）を介してがん細胞を処置するために使用される二重特異性抗体を含む。
【００４１】
別の態様では、二重特異性抗体を含む前記組成物は、増強されたＡＤＣＰ活性を有する。
【００４２】
別の態様では、前記組成物は、免疫治療剤（immunotherapy）において使用するためのキメラ抗原受容体を含み、この受容体は、配列番号１〜配列番号３６に示される配列のいずれか１つを含む一本鎖抗体を含む。
【００４３】
別の態様では、前記キメラ抗原受容体は免疫治療剤で使用され、前記受容体は、配列番号２８に示される配列を含む一本鎖抗体を含む。
【００４４】
別の態様では、前記医薬組成物は、第二の抗がん治療剤と組み合わせて使用される。
【００４５】
本明細書で提供されるのは、がん処置を必要としている患者のがんを処置する方法であって、本明細書に記載の抗体、二重特異性抗体、キメラ抗原受容体又は組成物のいずれか１又は複数を前記患者に投与することを含み、前記がんは、肺がん、肝臓がん、脳がん、子宮頸がん、卵巣がん、腎がん、精巣がん、前立腺がん又は神経芽細胞腫である、前記方法である。前記がんは、本明細書に記載の抗ＣＤ２４抗体組成物に結合し得る。
【００４６】
本明細書でさらに提供されるのは、前記抗ＣＤ２４抗体組成物を使用することによって悪性組織又は転移性病変を診断する方法である。前記抗ＣＤ２４抗体組成物は、閾値量を超えるレベルで悪性組織又は転移性病変に結合し得ることから、悪性組織又は転移性病変を示し得る。
【００４７】
前記抗ＣＤ２４抗体組成物を使用して循環がん細胞を識別する方法も本明細書で提供される。前記抗ＣＤ２４抗体組成物は、閾値量を超えるレベルで循環がん細胞に結合し得ることから、循環がん細胞を示し得る。本明細書でさらに提供されるのは、本明細書に記載の疾患又は状態を処置するための薬剤の製造における本明細書に記載の組成物の使用である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】抗ＣＤ２４モノクローナル抗体３Ｂ６の結合が糖鎖（グリカン）の存在によって妨げられるのに対し、市販の抗ＣＤ２４モノクローナル抗体ＭＬ５はそうでないことを示すＥＬＩＳＡ結果の棒グラフである。３Ｂ６は、Ｎ−グリカン修飾及びシアル酸修飾が除去されたＣＤ２４（Ｎ−ＳＡ−ＣＤ２４）及びＮ−グリカン修飾、シアル酸修飾、及びＯ−グリカン修飾が除去されたＣＤ２４（Ｎ−ＳＡ−Ｏ−ＣＤ２４）には強く結合するが、Ｎ−グリカン修飾が除去されたＣＤ２４（Ｎ−ＣＤ２４）又は完全に修飾された（Ｎ−グリカン修飾＋シアル酸修飾＋Ｏ−グリカン修飾）ＣＤ２４の双方への結合は非常に弱い。ＣＤ２４ＧＳＴは、陰性対照のＣＤ２４−ＧＳＴ融合を表す。
【００４９】
【図２Ａ】結合アッセイは、３Ｂ６が神経芽細胞腫細胞株及び髄芽腫腫瘍に結合することを示す。図２Ａは、６つの神経芽細胞腫細胞株ＩＭＲ３２、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、及びＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）Ｃに対して試験された抗ＣＤ２４モノクローナル抗体ＭＬ５、３Ｂ６、及びＳＮ３並びに対照抗体の正規化された親和性プロットである。３Ｂ６はＳＫ−Ｎ−ＡＳを除く全ての神経芽細胞腫細胞株に対してある程度の親和性を有するが、３Ｂ６の親和性は市販の抗ＣＤ２４抗体ＭＬ５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号５５５４２６）及びＳＮ３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社、カタログ番号ＭＡ５−１１８３３）と比較してかなり低かった。
【図２Ｂ】図２Ｂは、４つの髄芽腫腫瘍の３Ｂ６処置のＸ線蛍光撮影像を示す。３Ｂ６は４つの腫瘍のうち３つに結合した。
【００５０】
【図３】ＣＤ２４−ＧＳＴ融合タンパク質への３Ｂ６の結合をブロックする３Ｂ６変異体の能力を比較する競合ＥＬＩＳＡのプロットを示す。ＰＰ６２２６は３Ｂ６と同じ可変領域を有する。
【００５１】
【図４】ＣＤ２４−ＧＳＴ融合タンパク質への３Ｂ６の結合をブロックする能力について３Ｂ６変異体の能力を比較する競合ＥＬＩＳＡのプロットを示す。ＰＰ６２２６は３Ｂ６と同じ可変領域を有する。
【００５２】
【図５】ＣＤ２４−ＧＳＴ融合タンパク質への３Ｂ６の結合をブロックする能力について３Ｂ６変異体の能力を比較する競合ＥＬＩＳＡのプロットを示す。ＰＰ６２２６は３Ｂ６と同じ可変領域を有する。
【００５３】
【図６】ＣＨＯ細胞によって発現されたＣＤ２４に対しての親和性成熟キメラ抗ＣＤ２４抗体の相対的親和性を示すＥＬＩＳＡ結果の棒グラフである。クローンのうち１２個は、３Ｂ６（ＰＰ６２２６）と較べると、完全にグリコシル化されたＣＤ２４、Ｎ−ＣＤ２４、ＳＡ−ＣＤ２４、及びＮ−ＳＡ−ＣＤ２４に対する親和性が増加しており且つ特異性が異なっていた。
【００５４】
【図７】肺がん細胞株ＮＣＩ−Ｈ７２７（左パネル）及び神経芽細胞腫細胞株ＩＭＲ３２（右パネル）に対して試験した様々な親和性成熟キメラ抗ＣＤ２４抗体の滴定アッセイを示す。最小濃度０．０１μｇ／ｍＬに対して滴定係数（titration factor）を２×として試験した最大抗体濃度は５μｇ／ｍＬであった。未染色（０μｇ／ｍＬ）陰性対照も示されている。
【００５５】
【図８】異なるＣＤ２４グリコフォーム（glycoform）と抗ＣＤ２４抗体（親ＰＰ６２２９及び親和性成熟ＰＰ６３７３）と間の結合の定量的比較を示す。Ｆｃを除去したＣＤ２４をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、緩衝液（ＣＤ２４）、ＮａｎＡ（ＳＡ−）、又はＮａｎＡ＋Ｎ−グリカナーゼ（ＳＡ−Ｎ−）のいずれかで処理した後、ＰＰ６６２６（左パネル）又はＰＰ６３７３（右パネル）を所定の用量で添加した。最小濃度０．０２ｎｇ／ｍＬに対して滴定係数を５×として試験した最大抗体濃度は７８１２．５０ｎｇ／ｍＬであった。
【００５６】
【図９】ペプチド阻害アッセイによる３Ｂ６結合部位のマッピングを示す。試験した５つの重複するＣＤ２４ペプチドのうち、１つ（ペプチド４）のみが抗原性エピトープを含んでいる。
【００５７】
【図１０】ペプチド阻害アッセイによるＰＰ６３７３結合部位のマッピングを示す。試験した５つの重複するＣＤ２４ペプチドのうち、１つ（ＳＮＳＧＬＡＰＮＴ（配列番号４６））のみが抗原性エピトープを含んでいる。
【００５８】
【図１１】ペプチド４抗原性エピトープ配列からの短縮ペプチドを用いたＰＰ６３７３エピトープのマッピングを示す。データは、最適なエピトープが配列ＳＮＳＧＬＡＰＮ（配列番号４８）内に含まれていることを示す。
【００５９】
【図１２】ＰＰ６３７３がマウスモデルにおいてインビボでの腫瘍増殖を減少させることを示すプロットである。触知可能な肺がん異種移植片を有するヌードマウスに、矢印で示された２つの時点で対照ヒトＩｇＧ又はＰＰ６３７３のいずれかを投与し、その後、腫瘍増殖を毎週測定した。
【００６０】
【図１３】ＰＰ６３７３がヒトがん細胞株Ｈ７２７に対して細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発したことを示すプロットである。ＰＰ６３７３及びヒトＩｇＧＦＣを用いてエフェクター細胞ＰＢＬと５μｇ／ｍＬで共培養したＨ７２７細胞はＡＤＣＣを誘導した。
【００６１】
【図１４】コアフコシル化のないＰＰ６３７３（ｄ６８７３）は、ＰＰ６３７３よりも、ヒトがん細胞株Ｈ７２７に対しての強いＡＤＣＣを誘導することを示すプロットである。ｄ６３７３、ＰＰ６３７３、及びヒトＩｇＧＦＣを用いてエフェクター細胞ＰＢＬと５μｇ／ｍＬで共培養したＨ７２７細胞はＡＤＣＣを誘導した。
【００６２】
【図１５】ＰＰ６３７３−ホールとＯＫＴ３−ノブとの組み合わせが、ＰＰ６３７３−ノブとＯＫＴ３−ホールとの組み合わせよりも高い二重特異性を呈することを示すフローサイトメトリープロットである。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＰＰ６３７３、ＯＫＴ３、ＰＰ６３７３−ノブ＆ＯＫＴ３−ホール、又はＰＰ６３７３−ホール＆ＯＫＴ３−ノブでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の組織培養上清と共に染色した後、ビオチン化ＳＡ−Ｎ−ＣＤ２４タンパク質とインキュベートした。ＰＥ−ストレプトアビジンシグナルをフローサイトメトリーで測定した。３つの独立した実験を実施した。
【００６３】
【図１６】ＰＰ６３７３−ＯＫＴ３がＯＫＴ３−ＰＰ６３７３よりも高い二重特異性活性を誘導することを示すフローサイトメトリープロットである。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、空のプラスミド（陰性対照）、ＰＰ６３７３−ＯＫＴ３、又はＯＫＴ３−ＰＰ６３７３でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の組織培養上清と共に染色した後、ビオチン化ＳＡ−Ｎ−ＣＤ２４タンパク質とインキュベートした。ＰＥ−ストレプトアビジンシグナルをフローサイトメトリーで測定した。３つの独立した実験を実施した。
【００６４】
【図１７】二重特異性抗体ＰＰ６３７３−ＯＫＴ３が抗腫瘍活性を有することを示すフローサイトメトリープロットである。肺がん細胞Ｈ７２７と活性化ヒトＴ細胞とを１：５で、未処理２９３Ｔ細胞の組織培養上清又は空のプラスミド（未トランスフェクト）、ＰＰ６３７３、ＯＫＴ３若しくはＰＰ６３７３−ＯＫＴ３でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の組織培養上清と共に、１２時間インキュベートした。組織培養培地中のサイトカイン（ＩＦＮｒ、ＴＮＦ、ＩＬ１０、ＩＬ６、ＩＬ４、及びＩＬ２）をフローサイトメトリーで測定した。３つの独立した実験を実施した。
【００６５】
【図１８】二重特異性抗体ＰＰ６３７３−ＯＫＴ３がＴ細胞による腫瘍細胞の細胞傷害性を誘発したことを示すフローサイトメトリープロットである。肺がん細胞Ｈ７２７と活性化ヒトＴ細胞とを１：５で、未処理の２９３Ｔ細胞の組織培養上清又は空のプラスミド（未トランスフェクト）、ＰＰ６３７３、ＯＫＴ３若しくはＰＰ６３７３−ＯＫＴ３でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の組織培養上清と共に、１２時間インキュベートした。肺がん細胞及びヒトＴ細胞を採取し、抗ヒトＣＤ４５及びＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ試薬Ａｑｕａで染色した。腫瘍細胞数としては、抗ＣＤ４５及びＡｑｕａの二重陰性であるものをプロットした。３つの独立した実験を実施した。
【００６６】
【図１９】ＦＩＴ−Ｉｇにより誘導される高い二重特異性活性の、フローサイトメトリー分析を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を陰性対照（未トランスフェクト２９３Ｔ上清）又はＦＩＴ−Ｉｇと共に染色した後、ビオチン化ＳＡ−Ｎ−ＣＤ２４タンパク質とインキュベートした。ＰＥ−ストレプトアビジンシグナルをフローサイトメトリーで測定した。３つの独立した実験を実施した。
【００６７】
【図２０】ＦＩＴ−ＩｇがＰＰ６３７３−ＯＫＴ３及びＯＫＴ３−ＰＰ６３７３よりも高い抗腫瘍活性を有することを示すフローサイトメトリー分析である。肺がん細胞Ｈ７２７と活性化ヒトＴ細胞とを１：５で、陰性対照（未トランスフェクト２９３Ｔ上清）、ＰＰ６３７３−ＯＫＴ３、ＯＫＴ３−ＰＰ６３７３、又はＦＩＴ−Ｉｇと共に、１２時間インキュベートした。組織培養培地中のサイトカイン（ＩＦＮｒ、ＴＮＦ、ＩＬ１０、ＩＬ６、ＩＬ４、及びＩＬ２）をフローサイトメトリーで測定した。３つの独立した実験を実施した。
【００６８】
【図２１】ＦＩＴ−ＩｇがＴ細胞による腫瘍細胞の細胞傷害性を誘導することを示すフローサイトメトリー分析である。肺がん細胞Ｈ７２７と活性化ヒトＴ細胞とを１：５で、陰性対照（未トランスフェクト２９３Ｔ上清）、ＰＰ６３７３−ＯＫＴ３、ＯＫＴ３−ＰＰ６３７３、又はＦＩＴ−Ｉｇと共に、１２時間インキュベートした。肺がん細胞及びヒトＴ細胞を採取し、抗ヒトＣＤ４５及びＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ試薬Ａｑｕａで染色した。腫瘍細胞数としては、抗ＣＤ４５及びＡｑｕａの二重陰性であるものをプロットした。３つの独立した実験を実施した。
【００６９】
【図２２】ＦＩＴ−ＩｇがＰＰ６３７３−ＯＫＴ３及びＯＫＴ３−ＰＰ６３７３よりも高い熱安定性を有することを示すフローサイトメトリー分析である。全ての二重特異性抗体ＰＰ６３７３−ＯＫＴ３、ＯＫＴ３−ＰＰ６３７３、及びＦＩＴ−Ｉｇを表示した温度で２０分間インキュベートし、１４０００ｇで５分間回転させた後の上清をＪｕｒｋａｔ細胞の染色に使用した。次に、ビオチン化ＳＡ−Ｎ−ＣＤ２４タンパク質をＪｕｒｋａｔ細胞とインキュベートし、ＰＥ−ストレプトアビジンシグナルをフローサイトメトリーで測定した。
【００７０】
【図２３】抗ＣＤ２４−ｓｃＦｖを含むＣａｒＴ構築物の概略図を示す。
【００７１】
【図２４】肺がん細胞株Ａ５４９に対しての、ＣＤ２４  ＣＡＲＴによる細胞傷害性の誘発のプロットを示す。
【００７２】
【図２５】ＩＦＮγの産生によって示される、腫瘍細胞株によるＣＡＲＴ活性化のプロットを示す。
【００７３】
【図２６】様々な腫瘍タイプに対するＣＤ２４  ＣＡＲＴの抗腫瘍活性の棒グラフを示す。示されたデータのＥ／Ｔ比は５である。
【００７４】
【図２７】キメラＰＰ６３７３（ＦＲ：白色、ＣＤＲ：薄灰色）及びｈｕＶＨｖ１ＶＬｖ１（ＦＲ：灰色、ＣＤＲ：濃灰色）の３次元構造アラインメントのリボンダイアグラムを示す。
【００７５】
【図２８】発現及びＣＤ２４−ＧＳＴへの結合に対する様々な抗体ペアの相対的な有効性のプロットを示す。
【００７６】
【図２９】ヒトがん細胞株ＮＣＩ−Ｈ７２７（上）及びＩＭＲ３２（下）に結合するＨ２Ｌ３及びＨ３Ｌ３のプロットを示す。図示したデータは、広範囲の抗体を使用した場合の平均蛍光強度である。
【００７７】
【図３０】低濃度ではＨＬ３３がＰＰ６３７３よりもＡＤＣＣにおいて強力であることを示す細胞死プロットである。肺がん細胞株Ａ５４９を標的として使用し、ヒトＰＢＬをエフェクターとして使用した。使用した抗体の用量は、３μｇ／ｍＬ（上パネル）又は９μｇ／ｍＬ（下パネル）であった。
【００７８】
【図３１】肺がん細胞株Ａ５４９及びＮＣＩ−Ｈ７２７並びに神経芽細胞腫細胞株ＩＭＲ−３２を含む複数の腫瘍細胞株に強力なＡＤＣＣ活性をＨ３Ｌ３が付与することを示す細胞死プロットである。エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを使用した。
【００７９】
【図３２】肺がん細胞株Ａ５４９及びＮＣＩ−Ｈ７２７並びに神経芽細胞腫細胞株ＩＭＲ−３２を含む複数の腫瘍細胞株に対する強力なＡＤＣＣ活性をＨ３Ｌ３が付与することを示す細胞死プロットである。ヒトＰＢＭＣから精製したＮＫ細胞をエフェクター細胞として使用している。
【００８０】
【図３３】糖鎖で遮蔽されているエピトープを認識した抗体がＢ細胞、赤血球を認識せず、好中球との相互作用が不十分であることを示すフローサイトメトリー分析である。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
がん発現エピトープの標的化は、がんの処置に広く採用されているアプローチである。しかし、かかるエピトープの多くは、正常組織でも発現し、毒性の問題を引き起こす可能性があるため、優れた薬剤標的にはならない。理想的な腫瘍特異的抗原（Ｔｕｍｏｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ、ＴＳＡ）は、がんでは幅広い発現を示すが、必須の宿主臓器では発現が最小限であるか、全く発現しない。あまり理想的ではないが同等に機能し得るＴＳＡの属性は、正常組織及びがん組織で発現しているが異なって修飾される属性であり、いわゆる腫瘍関連抗原（Ｔｕｍｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ、ＴＡＡ）である。よく特徴解析されている腫瘍抗原の例は、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＵＣ−１、及びＮＹ−ＥＳＯ１である。
【００８２】
特に腫瘍抗原が現時点で存在しないがんの場合、新しい又はより効果的ながん治療剤の開発における限定因子は、新規なＴＳＡ及びＴＡＡの同定である。ＣＤ２４は、以下の理由から優れたがん標的である：ＣＤ２４は全てのヒトがんの７０％以上で広く過剰発現されており、がんでは異なってグリコシル化されていること、ＣＤ２４は発がん性であるように思われ、様々ながんの予後不良及び患者の生存期間の大幅な短縮に関連していること、そしてＣＤ２４は新たな腫瘍を引き起こすことによって再発や転移を引き起こす可能性のあるがん幹細胞のマーカーであること。本発明者らは、ＣＤ２４への結合が正常細胞で生じるががん細胞では生じないグリコシル化によってブロックされる抗ＣＤ２４抗体を発見した。その結果、前記抗体はがん細胞株及びがん組織に結合するが、様々な正常組織及び造血細胞への反応性は最小限に抑えられる。
【００８３】
本明細書で提供されるのは、抗体及びその抗原結合断片である。前記抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体であり得る。前記抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、又は多重特異性であり得る。前記抗体の抗原結合断片は、ＣＤ２４、特にヒトＣＤ２４に免疫特異的に結合し得るものであり、好ましくは、内部に生じる濃度又はトランスフェクトされた濃度で生細胞の表面に発現される。前記抗原結合断片はＣＤ２４に結合し得る。前記抗体は、検出可能に標識されてもよく、又は結合毒素、薬物、受容体、酵素、又は受容体リガンドを含んでもよい。
【００８４】
免疫系は、直接的に腫瘍を標的とすることに加えて、実験モデル系及び患者におけるがんを認識して排除する能力も有する。その結果、がん免疫治療剤は、がん処置の最も有望な分野の１つとして新興している。能動的がん免疫治療剤には、自然免疫応答を増幅する薬剤（ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＣＴＬＡ−４に対する抗体を含む）、がんと免疫エフェクターＴ細胞とを橋渡しする抗体などの二重特異性分子、又はエクスビボで刺激された腫瘍浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｒ  Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＴＩＬ）、活性化ナチュラルキラー（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ、ＮＫ）細胞、若しくは遺伝子操作されたＴ細胞（キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ）及びＴ細胞受容体（Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）修飾Ｔ細胞）を使用した養子細胞移植（Ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｄｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＡＣＴ）が含まれる。これらの技術の多くは、特異性及び有効性において腫瘍標的化コンポーネントを必要とする。
【００８５】
１．定義
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していない。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるとき、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。数値と関連付けられた「約」という語は、その値の妥当な近似値を示す。ある場合には、「約」はそれが付された特定の値の１０％以内であるものとして解釈されてもよい。例えば、「１００μｍ」という語句は、９０と１１０との間の任意の値を包含する。
【００８６】
本明細書における数値範囲への言及に関して、それらの間に介在する各数値は、同程度の精度で明示的に想定される。例えば、６〜９の範囲に関しては６と９に加えて数字７と８が想定され、６．０〜７．０の範囲に関しては数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が明示的に想定される。
【００８７】
「処置（treatment）」または「処置すること（treating）」は、疾患から動物を守ることを指す場合、疾患を防止（preventing）、抑制（suppressing）、制圧（repressing）、または完全に排除（eliminating）することを意味する。疾患を予防することは、疾患の発症前に本発明の組成物を動物に投与することを含む。疾患を抑制することは、疾患の誘発後であるがその臨床的出現の前に、本発明の組成物を動物に投与することを含む。疾患を抑制することは、疾患の臨床的出現後に本発明の組成物を動物に投与することを含む。疾患を防止することは、疾患の発症前に本発明の組成物を動物に投与することを含む。疾患を抑制することは、疾患の誘発後であるがその臨床的出現の前に、本発明の組成物を動物に投与することを含む。疾患を制圧することは、疾患の臨床的出現後に本発明の組成物を動物に投与することを含む。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、「可変領域」抗原認識部位を有する免疫グロブリン分子を指す。「可変領域」という用語は、抗体によって広く共有されるドメイン（抗体Ｆｃドメインなど）とは異なる免疫グロブリンのドメインを指す。可変領域は、その残基が抗原結合の能力を担う「超可変領域」を含む。超可変領域は、「相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ）」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（すなわち、典型的には軽鎖可変ドメインのおよそ２４〜３４番目（Ｌ１）、５０〜５６番目（Ｌ２）、及び８９〜９７番目（Ｌ３）の残基並びに重鎖可変ドメインのおよそ２７〜３５番目（Ｈ１）、５０〜６５番目（Ｈ２）、及び９５〜１０２番目（Ｈ３）の残基）及び／又は「超可変ループ」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの２６〜３２番目（Ｌ１）、５０〜５２番目（Ｌ２）、及び９１〜９６番目（Ｌ３）の残基並びに重鎖可変ドメインの２６〜３２番目（Ｈ１）、５３〜５５番目（Ｈ２）、及び９６〜１０１番目（Ｈ３）の残基）を含み得る。「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。本明細書に開示される抗体は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、イントラボディ、又は抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体及び抗抗Ｉｄ抗体を含む）。特に、前記抗体は、任意のタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、又はＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、又はＩｇＡ２）又はサブクラスの免疫グロブリン分子であってよい。
【００８９】
本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び所望により抗体の「可変領域」抗原認識部位を含むフレームワーク残基抗体を含み、抗原を免疫特異的に結合する能力を示す、抗体の１又は複数の部分を指す。かかるフラグメントには、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖（ＳｃＦｖ）、及びそれらの変異体、天然に存在するバリアント、並びに抗体の「可変領域」抗原認識部位及び異種タンパク質（例えば、毒素、異なる抗原の抗原認識部位、酵素、受容体、又は受容体リガンドなど）を含む融合タンパク質が含まれる。本明細書中で使用される場合、「フラグメント」という用語は、少なくとも５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも７０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基、又は少なくとも２５０個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドをいう。
【００９０】
ヒト抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体は、ヒトにおけるインビボでの使用に特に好ましいが、マウス抗体又は他の種の抗体は、多くの用途（例えば、インビトロ検出アッセイ又はインサイチュ検出アッセイ、緊急のインビボでの使用など）に有利に使用され得る。
【００９１】
「キメラ抗体（chimeric antibody）」は、抗体の異なる部分（different portions of the antibody）が異なる免疫グロブリン分子に由来する分子であり、例えば非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体などである。非ヒト種由来の１又は複数のＣＤＲとヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域とを含むキメラ抗体は、例えばＣＤＲグラフティング（欧州特許第２３９，４００号、国際公開第９１／０９９６７号、並びに米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、及び第５，５８５，０８９号、これら全ての内容は、参照により本明細書に援用される）、ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）又は表面再仕上げ（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号、欧州特許第５１９，５９６号、これら全ての内容は、参照により本明細書に援用される）、及びチェーンシャフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号、これら全ての内容は、参照により本明細書に援用される）などの当技術分野で公知の様々な技法を使用して製造可能である。
【００９２】
本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒトフレームワーク領域及び非ヒト（通常はマウス又はラット）免疫グロブリンからの１又は複数のＣＤＲを含む免疫グロブリンを指す。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と称され、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と称される。定常領域は存在しなくてもよいが、存在する場合、それらはヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５％〜９０％、好ましくは約９５％以上同一でなければならない。したがって、おそらくＣＤＲを除いて、ヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖免疫グロブリン及びヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。例えば、典型的なキメラ抗体は、キメラ抗体の可変領域全体が非ヒトであるなどのため、ヒト化抗体には包含されないであろう。ドナー抗体が「ヒト化（humanization）」のプロセスによって「ヒト化（humanized）」されたものとされるのは、得られるヒト化抗体がＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合すると予想されるためである。概ね、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、望ましい特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）からの超可変領域残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  Ｒｅｇｉｏｎ（ＦＲ））残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体には見られない残基を含み得る。これらの改変は抗体の性能をさらに向上させるためになされる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み得、超可変領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を所望により含み得、これは、１又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失、又は付加（すなわち、変異）の導入によって変更された、ＦｃγＲＩＩＢポリペプチドに免疫特異的に結合するヒト免疫グロブリンのものであり得る。
【００９３】
２．抗ＣＤ２４抗体組成物
本明細書に記載されるのは、ＣＤ２４のがん特異的グリコフォームを特異的に標的とし得る抗ＣＤ２４抗体である。前記抗ＣＤ２４抗体は、抗体薬物複合体、ＡＤＣＣ強化治療用抗体、二重特異性抗体、ＣＡＲ−Ｔ治療剤、及びＴＣＲ治療剤を含むがこれらに限定されないがん治療剤を開発するために使用され得る。具体的には、前記抗ＣＤ２４抗体又はその抗原結合断片は非がん性細胞上にはないががん細胞上には露出している糖鎖で遮蔽されているエピトープに結合し得る。特に、前記抗ＣＤ２４抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＳＮＳＧＬＡＰＮ（配列番号４８）を含むＣＤ２４ペプチドに結合し得る。
【００９４】
前記抗ＣＤ２４抗体は、配列番号１に示される配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２に示される配列を含む軽鎖可変領域を含み得る、３Ｂ６であり得る。前記抗ＣＤ２４抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３〜１０に示される配列のいずれか１つを含む重鎖可変領域及び配列番号１１〜１６に示される配列のいずれか１つを含む軽鎖可変領域を含み得る、３Ｂ６の親和性成熟バージョンであってよい。前記抗ＣＤ２４抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号６に示される配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６に示される配列を含む軽鎖可変領域を含み得る、ＰＰ６３７３であってよい。ヒトでの治療用途の場合、前記抗ＣＤ２４抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＰＰ６３７３のヒト化バージョンであってよく、配列番号２９〜３２に示される配列のいずれか１つを含む重鎖可変領域及び配列番号３３〜３６に示される配列のいずれか１つを含む軽鎖可変領域を含み得る。特に、前記ヒト化抗ＣＤ２４抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３０に示される配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３５に示される配列を含む軽鎖可変領域を含み得るＨ２Ｌ３、又は配列番号３１に示される配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３５に示される配列を含む軽鎖可変領域を含み得るＨ３Ｌ３であり得る。
【００９５】
３．抗体薬物複合体組成物
腫瘍標的化抗体は、腫瘍の生態に影響を与えることにより、腫瘍増殖を直接的に阻止又は制限するために使用され得る。例えば、ヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体（一般名：ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）；アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ））は、ＶＥＧＦ誘発腫瘍血管新生を阻止することによって腫瘍増殖をブロックする。他の腫瘍標的化抗体は、抗体自体の修飾を通じて腫瘍細胞増殖を阻害したり、がん細胞を死滅させたりするために使用される。例えば、腫瘍を標的とした免疫複合体は、共有結合架橋又は遺伝子融合のいずれかによって結合された抗体とエフェクター部分とからなる。エフェクター部分は、細胞傷害性薬（抗体薬物複合体）、タンパク質毒素（免疫毒素）、又は放射性核種（放射性免疫複合体）でありうる。抗体薬物複合体の例として、ブレンツキシマブベドチン（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  Ｖｅｄｏｔｉｎ）（ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社）が挙げられ、これは３〜５単位の有糸分裂阻害剤モノメチルオーリスタチンＥ（Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ  ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  Ｅ、ＭＭＡＥ（薬剤名の「ベドチン」に反映））に結合したキメラモノクローナル抗体であるブレンツキシマブ（細胞膜タンパク質ＣＤ３０を標的とするｃＡＣ１０）からなる。
【００９６】
前記抗ＣＤ２４抗体又はその抗原結合断片は、抗体薬物複合体、免疫毒素、又は放射性免疫複合体に含まれてよい。かかる組成物の抗ＣＤ２４標的化成分は、正常な細胞及び組織の曝露を制限し、それにより標的外毒性を阻止しながら、がん細胞及び組織へ前記複合体を特異的に送達することを可能にし得る。
【００９７】
４．ＡＤＣＣ抗体組成物
前記抗ＣＤ２４抗体若しくはその抗原結合断片又は前述のうち１つを含む抗体組成物を使用して、抗体介在性細胞傷害（antibody-mediated cellular cytotoxicity）（ＡＤＣＣ）及び抗体介在性細胞貪食（antibody-mediated cellular phagocytosis）（ＡＤＣＰ）のうち少なくとも１つを介したがん細胞死を誘発する（stimulate）ことができる。ＡＤＣＣは免疫防御メカニズムであり、身体の特定の免疫細胞（エフェクター細胞）のセットが標的細胞（例えば、病原体）に積極的に関与して溶解する。ＡＤＣＣは、重要な細胞性自然免疫応答として識別されており、病原体に対する身体の第一線の防御として機能し、感染を制限し封じ込める作用を持つ。ＡＤＣＣプロセスは、非食細胞プロセス（non-phagocytic process）を介して抗体でコーティングされた標的細胞を死滅させるように設計されており、標的を定めた細胞傷害性顆粒の放出又は細胞死誘導分子の発現のいずれかを特徴とする。ＡＤＣＣは典型的には、宿主の特定の抗体（主にＩｇＧクラス）が標的細胞の膜表面抗原を認識して結合し、同時にエフェクター細胞表面のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に関与する時点で開始される。ＡＤＣＣを媒介する最も一般的なエフェクター細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であるが、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、樹状細胞もＡＤＣＣ応答を媒介することができる。ＡＤＣＣはある程度速い応答であるが、有効性は、標的細胞の表面の抗原密度及び抗原抗体相互作用の親和性並びにＦｃ受容体ファミリーの様々なメンバーとの抗体相互作用を決定するＦｃ断片の特性など、いくつかのパラメーターによって異なる。
【００９８】
前記抗体の標的細胞上の特定の細胞表面受容体への結合である、オプソニン作用と呼ばれるプロセスは、ＡＤＣＣプロセスの重要なイベントである。オプソニン作用プロセスは、食細胞を標的細胞に引き付け、食作用を開始することができる。食細胞上のＦｃＲへの抗体Ｆｃ領域の結合は、抗体オプソニン化標的細胞の飲み込みを開始する重要なタンパク質である補体成分３の切断産物であるＣ３ｂの形成も促進する。抗体を介した食作用は、抗体依存性細胞介在性細胞貪食（antibody-dependent cell-mediated phagocytosis）（ＡＤＣＰ）とも称される。ただし、ＡＤＣＣの場合、病原体を貪食して破壊する必要はない。上記のように、細胞傷害性エフェクター細胞の表面のＦｃＲは、ＡＤＣＣを誘発するための鍵となる。ヒトにおいて、ＡＤＣＣを誘発可能な最も重要なＦｃＲクラスは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩｃ（ＣＤ３２）、並びにＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）である。ただし、ＦｃγＲＩＩｂ受容体はＡＤＣＣ応答を抑制する。したがって、ＦｃγＲからの活性化シグナルと抑制性シグナルとのバランスは、ＡＤＣＣ応答の大きさの重要な決定要因となる。標的が認識されると、分化した（specialized）細胞内顆粒（分泌リソソームとも称される）が、カルシウム依存性の分極した細胞外放出プロセスで細胞傷害性エフェクター細胞によって放出される。顆粒から放出される重要な成分はパーフォリン、細胞溶解素、及びグランザイムＢである。パーフォリンは、標的細胞膜内に細孔を挿入及び形成する。このプロセスにはカルシウムが必要である。グランザイムＢは標的細胞のＤＮＡの断片化を引き起こす。ＡＤＣＣによって機能する治療用抗体の例として、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）が挙げられる。トラスツズマブは、多数の乳がんで異常に高レベルで発現し、しばしばＨＥＲ２陽性乳がんと称されるＨＥＲ２を標的とし、宿主にＡＤＣＣを誘導することによりＨＥＲ２陽性乳がんの増殖を抑制する。
【００９９】
ＡＤＣＣ媒介性活性に使用される抗体には、通常、ＡＤＣＣ活性を強化するために何らかの修飾が必要となる。前記抗体のＦｃ領域のオリゴ糖がフコース糖単位を持たないように抗体を改変してＦｃγＩＩＩａ受容体への結合を改善することを通常は含む、いくつかの利用可能な技術がある。抗体がアフコシル化されている場合、抗体依存性細胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity）（ＡＤＣＣ）を増加させる効果がある。例えば、ＢｉｏＷａ社のＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（登録商標）テクノロジーは、ＦＵＴ８遺伝子ノックアウトＣＨＯ細胞株を使用して、１００％アフコシル化抗体を生成するものである。ＦＵＴ８は、複合型オリゴ糖の１，６結合におけるＧＤＰ−フコースからＧｌｃＮＡｃへのフコースの転移を触媒する１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする、唯一の遺伝子である。ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ社は、ＭＡｂ上のフコシル化グリカンの産生が低レベルであるように改変されたＣＨＯ株を開発したが、ＦＵＴノックアウトによるものではない。ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ社のシステムは、細胞によって代謝され得ない糖ヌクレオチドへとデノボフコース合成経路をリダイレクトする細菌酵素を導入するものである。代替のアプローチとして、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社は、ＣＨＯ（及びおそらく他の）細胞株において産生するＭＡｂ上のフコシル化グリカンの産生が低レベルである独自のフィードシステムを所有する。Ｘｅｎｃｏｒ社は、腫瘍や他の病理細胞の免疫系の排除を改善するように設計したＸｍＡｂ  Ｆｃドメインテクノロジーを開発した。このＦｃドメインには２つのアミノ酸変化があり、ＦｃγＲＩＩＩａに対して４０倍の親和性が得られる。また、ＦｃγＲＩＩａとの親和性が高まり、異物を貪食して消化することで免疫における役割を果たすマクロファージなどの他のエフェクター細胞を動員する可能性がある。
【０１００】
前記抗ＣＤ２４抗体又はその抗原結合断片は、ＡＤＣＣを介してがんを死滅させる抗体に組み込まれ得る。かかる組成物の抗ＣＤ２４標的化成分は、正常な細胞及び組織を温存しながら、ＡＤＣＣ媒介性破壊のためのがん細胞の特異的送達標的化を可能にし得る。前記抗ＣＤ２４抗体又はその抗原結合フラグメントのＡＤＣＣ活性は、本明細書に記載の１又は複数の修飾によって増強され得る。
【０１０１】
５．二重特異性抗体組成物
本明細書でさらに提供されるのは、第２の抗体又はその抗原結合断片に架橋された第１の抗体又はその抗原結合断片を含む第１の抗体ドメインを含む二重特異性抗体である。前記第１の抗体ドメインは、本明細書に記載の抗ＣＤ２４抗体又はその抗原結合断片を含み得、前記第２の抗体又はその抗原結合断片は、他の免疫刺激分子に結合し得る。特定の実施形態では、前記第２の抗体ドメインは、抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を含む。この場合、前記二重特異性抗体は、ＣＤ２４のがん特異的グリコフォームを発現する腫瘍細胞を特異的に標的とし、同時に細胞傷害性Ｔ細胞上のＣＤ３に結合し、それによってＴ細胞を腫瘍部位に引き付け、前記Ｔ細胞が腫瘍に浸潤して腫瘍の細胞傷害性を引き起こす。細胞傷害性Ｔ細胞又は他のエフェクター細胞を腫瘍部位に引き付ける目的で二重特異性抗体で使用するためのパートナー抗体の他の例は、当技術分野で公知である。
【０１０２】
前記第２の抗体又はその抗原結合断片は、相補的な（complementary）抗腫瘍経路又はメカニズムを標的とし得る。前記第２の抗体ドメインは、自然の免疫応答を増幅するがん免疫治療剤抗体又はその抗原結合断片を含み得る。このようながん免疫治療剤抗体の例として、抗ＰＤ−１、抗Ｂ７−Ｈ１、抗Ｂ７−Ｈ３、抗Ｂ７−Ｈ４、抗ＬＩＧＨＴ、抗ＬＡＧ３、抗ＴＩＭ３、抗ＴＩＭ４、抗ＣＤ４０、抗ＯＸ４０、抗ＧＩＴＲ、抗ＢＴＬＡ、抗ＣＤ２７、抗ＩＣＯＳ、又は抗４−１ＢＢが挙げられる。かかる抗体は、がんを処置するために使用され得る。前記第２の抗体又はその抗原結合断片は、ＴＣＲ−α鎖、ＴＣＲ−β鎖、ＴＣＲ−γ鎖、又はＴＣＲ−δ鎖に結合し得る。
【０１０３】
前記二重特異性抗体は、配列番号１７及び１８に示される配列、又は配列番号２３〜２７及び３７〜４１に示される配列のうちいずれか１つを含み得る。
【０１０４】
当技術分野で公知の多くの異なる二重特異性抗体技術が存在する。これらのほとんどは、２つの部分が単一の構築物で発現可能であるように、２成分抗体が一本鎖フォーマットである必要がある。好ましい方法は、前記抗体を一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）として発現させることである。二重特異性抗体技術の非限定的な例として、二重特異性Ｔ細胞誘導（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｅｎｇａｇｅｒ、ＢｉＴＥ）法、デュアルアフィニティリターゲティング（Ｄｕａｌ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、ＤＡＲＴ）法、タンデム型Ｆａｂ免疫グロブリン（Ｆａｂｓ−ｉｎ−ｔａｎｄｅｍ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、ＦＩＴ−Ｉｇ）法、及びノブ・イントゥ・ホール（Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅｓ）法が挙げられる。前記抗ＣＤ２４抗体又はその抗原結合断片を含むかかる二重特異性抗体は、本明細書で具体的に企図される。
【０１０５】
６．ＣＡＲ−Ｔ治療剤組成物
キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ）Ｔ細胞治療剤、又はＣＡＲ−Ｔ治療剤は、がん患者のＴ細胞がエクスビボで遺伝子改変されて、ＣＡＲタンパク質を発現し、がん細胞を攻撃する細胞処置の一種である。具体的には、Ｔ細胞が患者の血液（特に患者自身の血液（自家））から採取され、組換えＣＡＲ受容体を発現する遺伝子構築物でトランスフェクトされる。次に、多数のＣＡＲ−Ｔ細胞を実験室で増殖して患者に注入し、患者のがん細胞を標的にして破壊することができる。Ｔ細胞はまた、マッチしたドナーからの、又は、同種異系Ｔ細胞の１又は複数のＴＣＲ遺伝子及びＨＬＡクラスＩ遺伝子座が破壊され、結果として生じるＴ細胞は同種異系抗原を認識できない、ユニバーサルＴ細胞株若しくは「在庫の既製品から入手可能な（off-the-shelf）」Ｔ細胞株に由来する、同種異系Ｔ細胞である。
【０１０６】
ＣＡＲタンパク質構築物は、典型的には、以下のコア成分を含むモジュラー構造を有する：抗体に由来する細胞外一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、これはヒンジ／スペーサーペプチドと膜貫通ドメインに結合し、さらにＴ細胞受容体の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインに連結している。前記ｓｃＦｖは標的化要素（targeting element）であり、ＣＡＲ−Ｔ細胞の表面に発現して、抗原特異性を付与する。前記スペーサーは細胞外の前記標的化要素を膜貫通ドメインに接続し、ＣＡＲ機能及びｓｃＦｖの柔軟性に影響を与える。前記膜貫通ドメインは細胞膜を横断しており、ＣＡＲを細胞表面に固定し、細胞外ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに接続することで、細胞表面でのＣＡＲの発現に影響を与える。共刺激ドメインは、サイトカイン産生を増強するＣＤ２８や４−１ＢＢなどの共刺激タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する。ＣＤ３ζドメインは、Ｔ細胞受容体の細胞内シグナル伝達部分に由来し、Ｔ細胞活性化中に下流のシグナル伝達を媒介する。ＣＡＲ−Ｔ治療剤の例として、Ｂ細胞表面抗原ＣＤ１９（ＪＣＡＲ０１７及びＪＣＡＲ０１４など［Ｊｕｎｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社］）、ＣＴＬ０１９（チサゲンレクロイセル−Ｔ（ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ−Ｔ）（Ｋｙｍｒｉａｈ（商標））［Ｎｏｖａｒｔｉｓ社］）、及びＫＴＥ−Ｃ１９（アキシカブタゲン  シロロイセル（ａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅ  ｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌ）（Ｙｅｓｃａｒｔａ（登録商標））［Ｋｉｔｅ  Ｐｈａｒｍａ社］）、及びＣＤ２２（ＪＣＡＲ０１４［Ｊｕｎｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社］）を標的とするものが挙げられる。ＣＡＲ−Ｔ治療剤の他の例として、Ｌ１−ＣＡＭ（ＪＣＡＲ０２３［Ｊｕｎｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社］）、ＲＯＲ−１（ＪＣＡＲ０２４［Ｊｕｎｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社］）、及びＭＵＣ１６（ＪＣＡＲ０２０［Ｊｕｎｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社］）を標的とするものが挙げられる。
【０１０７】
ＣＡＲのｓｃＦｖ部分は、重要な成分であり、標的外への毒性に関連し、正常細胞に対する活性を防ぎながら、がん細胞に対する特異性を確保する。よって典型的には、がん細胞上で特異的に発現するが他の細胞や組織上では頻度が低いか理想的には全く発現しない標的タンパク質を認識する抗体の部分に、ｓｃＦｖ部分は由来する。したがって、本明細書に記載の抗ＣＤ２４抗体のいずれかに由来するｓｃＦｖ断片は、組換えＣＡＲタンパク質のがん標的化成分（cancer targeting component）として使用され得る。特に、ｓｃＦｖタンパク質は、配列番号２８に示される配列を含み得る。
【０１０８】
ＣＡＲ−Ｔ細胞は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、成人骨髄性白血病（ＡＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、及び多発性骨髄腫（ＭＭ）などの血液腫瘍に対して優れた効果を示している。しかしながら、ＣＡＲ−Ｔ治療剤は、これまで固形腫瘍に対しては限られた効果しか示してこなかった。腫瘍及び正常組織におけるＣＤ２４の特徴的な発現パターンにより、ＣＤ２４ＣＡＲ−Ｔを使用して生成されたデータで実証された標的となり得るがん種としては、脳腫瘍、頭頸部がん、肉腫、肺がん、消化器がん、乳がん、精巣がん、前立腺がん、膵臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、又は血液悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
７．ＴＣＲ治療剤組成物
ＣＡＲ−Ｔ治療剤と同様に、遺伝子改変Ｔ細胞受容体治療剤（ＴＣＲ）は、がん患者のＴ細胞をエクスビボで遺伝子改変して、改変ＴＣＲを発現させ、Ｔ細胞を患者に注入した際にＴ細胞受容体が特定の抗原性細胞抗原を認識して攻撃する能力を向上させる細胞処置の一種である。ただし、表面に発現するタンパク質を認識するＣＡＲ−Ｔ細胞とは異なり、遺伝子改変ＴＣＲを使用したＴ細胞免疫治療剤は、固形腫瘍をより標的としてきた。ＴＣＲは、細胞内部の腫瘍特異的タンパク質を認識し得る。腫瘍特異的タンパク質が断片に分解されると、それらは主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）又はＭＨＣと呼ばれる別のタンパク質と共に細胞表面に現れる。ＴＣＲは、腫瘍特異的タンパク質断片／ＭＨＣの組み合わせを認識するように設計されている。ＴＣＲ改変Ｔ細胞の標的の例として、ＫＩＴＥ−７１８（Ｋｉｔｅ  Ｐｈａｒｍａ社）などＭＡＧＥ−Ａ３を標的とするもの、ＪＴＣＲ０１６  （Ｊｕｎｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）などのウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ−１）、及びＮＹ−ＥＳＯ  １が挙げられる。
【０１１０】
ＴＣＲは、ＴＣＲα及びＴＣＲβの２つのサブユニットからなるヘテロダイマーである。各サブユニットには、Ｔ細胞膜に隣接し、受容体を細胞膜に固定する定常領域と、抗原認識で機能する超可変領域とを含む。したがって、本明細書に記載の抗ＣＤ２４抗体のいずれかに由来するｓｃＦｖ断片は、組換えＴＣＲタンパク質のがん標的化成分として使用され得る。特に、ｓｃＦｖタンパク質は、配列番号２８に示される配列を含み得る。
【０１１１】
８．ペプチド組成物
本明細書に記載の抗ＣＤ２４抗体又はその抗原結合断片は、がん細胞上に露出しているが非がん性細胞上には露出していない、糖鎖で遮蔽されているエピトープに結合し得る。具体的には、前記抗ＣＤ２４抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＳＮＳＧＬＡＰＮ（配列番号４８）を含むＣＤ２４ペプチドに結合し得る。したがって、配列番号４８に示される配列を含むペプチドを使用して、配列番号４８に示される配列のコア配列を含むエピトープに結合する抗ＣＤ２４抗体を中和し得る。これは、中和抗体を検出するための抗薬物抗体アッセイで使用され得る。配列番号４８に示される配列を含むペプチドは、配列番号４８に示される配列のコアを含むエピトープに結合する抗体に関連する潜在的な有害作用を阻害するために使用されうる。前記ペプチドは当技術分野で公知の方法を使用して、インビボ使用のためのより良い安定性のために修飾されてもよく、前記方法としてはＤ−アミノ酸の使用、１又は複数のペプチド結合におけるＯからＳへの置換、溶解性又は半減期を改善するための融合配列の追加（例えば、アルブミン融合）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに別の実施形態では、配列番号４８に示すアミノ酸配列を含む分子は、がんの処置及び予防のためのワクチンとして使用され得る。
【０１１２】
９．処置法
本明細書に記載の抗ＣＤ２４抗体組成物又はかかる抗体組成物を含む細胞治療剤は、がん又は別の異常な増殖性疾患を処置又は予防するために使用され得る。本明細書に提供されるのは、かかる使用を必要とする患者におけるかかる使用の方法であり、抗ＣＤ２４抗体又はその抗原結合断片、あるいは前述の抗体又は断片を含む医薬組成物を、患者に投与することを含み得る。かかる分子及び医薬組成物はまた、がん又は他の異常な増殖性疾患を処置又は予防するための薬剤の製造において使用され得る。本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、細胞の異常な、制御されていない増殖に起因する新生物又は腫瘍を意味する。本明細書で使用される場合、がんには、白血病及びリンパ腫が明示的に含まれる。前記用語は、遠位部位に転移する可能性のある細胞が関与する疾患を意味する。前記患者はヒトであり得る。
【０１１３】
がん又は他の異常な増殖性疾患はまた、以下のうち一種または複数種（がこれらに限定されない）を含みうる：膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺、及び皮膚のがんを含むがん腫；扁平上皮がんを含む；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫を含むリンパ系の造血器腫瘍；急性及び慢性骨髄性白血病並びに前骨髄球性白血病を含む、骨髄系の造血性腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉起源の腫瘍；黒色腫、セミノーマ（精上皮腫）、テラトカルシノーマ（胚性奇型腫）、神経芽細胞腫、神経膠腫を含む他の腫瘍；星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、神経鞘腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫を含む間葉系腫瘍；及び黒色腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ（角化棘細胞腫）、セミノーマ、甲状腺濾胞がん、及びテラトカルシノーマ（奇形がん）を含む他の腫瘍。アポトーシスの異常によって引き起こされるがんもまた、本発明の方法及び組成物によって処置されると考えられる。そのようながんには、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を伴うがん腫、乳房、前立腺、及び卵巣のホルモン依存性腫瘍、家族性腺腫性ポリポーシスなどの前がん性病変、並びに骨髄異形成症候群が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、悪性腫瘍又は増殖異常性変化（化生及び異形成など）、又は過剰増殖性障害は、卵巣、膀胱、乳房、結腸、肺、皮膚、膵臓、又は子宮において本発明の方法及び組成物によって処置又は予防される。前記がんは、肉腫、黒色腫、又は白血病でありうる。
【０１１４】
前記抗ＣＤ２４抗体及びその抗原結合フラグメントは、現在の標準的及び実験的化学治療剤、ホルモン治療剤、生物学的治療剤、免疫治療剤、放射線治療剤、又は手術から選択され得るがこれらに限定されない別の抗腫瘍治療剤と共に使用されてもよい。いくつかの実施形態では、前記抗ＣＤ２４抗体及びその抗原結合フラグメントは、がん、自己免疫疾患、感染症、又は中毒の治療又は予防のために当業者に公知の治療的又は予防的有効量の１又は複数の薬剤、治療用抗体、又は他の薬剤と組み合わせて投与され得る。かかる薬剤には、例えば、上記の生物学的応答修飾因子、細胞毒素、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、有糸分裂阻害剤、又は免疫治療剤のいずれかが含まれる。
【０１１５】
前記抗ＣＤ２４抗体及びその抗原結合フラグメントは、別の抗腫瘍免疫治療剤と共に使用されてもよい。抗腫瘍免疫治療剤は、免疫調節効果を増強するために、代替免疫調節経路（ＴＩＭ３、ＴＩＭ４、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、４−１−ＢＢ、Ｂ７−Ｈ１、ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、又はＬＡＧ３など）を妨害又は増強するか、又はサイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＧＦ−β、ＩＦＮｇ、Ｆｌｔ３、ＢＬｙｓ）及びケモカイン（例えば、ＣＣＬ２１）などのエフェクター分子の活性を調節する分子を含みうる。特定の実施形態は、抗ＰＤ−１（ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））又はニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）））、抗Ｂ７−Ｈ１（アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））又はデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ））、抗Ｂ７−Ｈ３、抗Ｂ７−Ｈ４、抗ＬＩＧＨＴ、抗ＬＡＧ３、抗ＴＩＭ３、抗ＴＩＭ４、抗ＣＤ４０、抗ＯＸ４０、抗ＧＩＴＲ、抗ＢＴＬＡ、抗ＣＤ２７、抗ＩＣＯＳ、又は抗４−１ＢＢと組み合わせて、本明細書に記載される抗ＣＤ２４抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、二重特異性抗体を含む。さらに別の実施形態では、前記抗ＣＤ２４抗体又はその抗原結合フラグメントは、より広範な免疫応答を達成するために、免疫応答の異なる段階又は側面を活性化する分子と組み合わせて投与される。より好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ２４抗体及びその抗原結合フラグメントは、自己免疫副作用を悪化させることなく、抗ＰＤ−１又は抗４−１ＢＢ抗体と組み合わされる。
【０１１６】
１０．産生
前記抗ＣＤ２４抗体又はその抗原結合フラグメントは、真核生物発現系を使用して作製されてもよい。発現系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞におけるベクターからの発現を伴っていてもよい。発現系はまた、真核細胞に感染するために使用され得る複製欠損レトロウイルスベクターなどの、ウイルスベクターであってもよい。前記抗ＣＤ２４抗体又はその抗原結合フラグメントは、細胞ゲノムに組み込まれたベクター又はベクターの一部から前記抗体を発現する安定細胞株から産生されてもよい。安定細胞株は、組み込まれた複製欠損レトロウイルスベクターから前記抗体を発現してもよい。発現系は、ＧＰＥｘ（商標）であってもよい。
【０１１７】
本明細書に記載の抗ＣＤ２４抗体及びその抗原結合フラグメントは、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ＤＥＡＥイオン交換、ゲル濾過、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法を使用して精製できる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドが親和性マトリックス上に捕獲されることを可能にするアミノ酸配列を含む追加のドメインを含むように融合タンパク質を設計してもよい。例えば、免疫グロブリンドメインのＦｃ領域を含む本明細書に記載される抗体は、プロテインＡ又はプロテインＧカラムを使用して、細胞培養上清又は細胞質抽出物から単離されてもよい。さらに、ポリペプチドの精製を補助するために、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン、ポリヒスチジン、又はＦｌａｇ（商標）（Ｋｏｄａｋ社）などのタグを使用することができる。そのようなタグは、カルボキシル基又はアミノ末端のいずれかを含む、ポリペプチド内の任意の位置に挿入可能である。有用であり得る他の融合体としては、アルカリホスファターゼなどの、ポリペプチドの検出を補助する酵素が挙げられる。ポリペプチドの精製には免疫親和性クロマトグラフィーが使用されてもよい。
【０１１８】
ワクチン
患者においてがんを処置する又は本明細書に記載されるがんの予防（prophylaxis）を提供する方法が、本明細書で提供される。前記方法では、がんに対抗して患者に予防接種（vaccinate）してもよい。前記方法は、配列番号４８に示される配列を含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含み得る。前記組成物はまた、抗ＣＤ２４抗体又はＣＤ２４に結合する受容体を発現する細胞の使用を含む治療に関連する有害作用を処置する必要がある患者に投与され得る。前記組成物はまた、がんを処置するための又はがんの予防を提供するための薬剤の製造において使用され得る。
【０１１９】
１１．医薬組成物
治療有効量の上述の抗ＣＤ２４抗体、細胞治療剤、又はペプチド組成物のいずれか、及び生理学的に許容される担体又は添加剤（excipient）を含む医薬組成物が本明細書で提供される。前記医薬組成物は、予防的有効量又は治療的有効量の抗ＣＤ２４抗体又はその抗原結合断片、及び薬学的に許容される担体を含み得る。
【０１２０】
特定の実施形態では、「医薬的に許容される」という用語は、連邦政府又は州政府の規制機関、又は動物、より具体的にはヒトでの使用のために米国薬局方又は他の一般に認められた薬局方によって承認されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全及び不完全））、添加剤、又は媒体を指す。そのような医薬担体は、水や、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物、又は合成起源のものを含む油などの、無菌の液体であり得る。前記医薬組成物が静脈内投与される場合、水は好ましい担体である。生理食塩水、デキストロース水溶液、及びグリセロール溶液も、特に注射剤のための液体担体として使用することができる。適切な医薬添加剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。前記組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含んでいてもよい。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。
【０１２１】
一般に、前記医薬組成物の成分は、例えば、活性剤の量を示すアンプル又は分包などの密閉容器内の乾燥凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別々に又は混合して単位剤形で供給することができる。前記組成物が注入によって投与される場合、無菌の医薬品グレードの水又は生理食塩水を含む注入ボトルを用いて分注可能である。前記組成物が注射により投与される場合、投与前に成分が混合され得るように、注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルが提供されてもよい。
【０１２２】
前記医薬組成物は、中性又は塩の形態として製剤化され得る。医薬的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどのアニオンで形成されたもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどのカチオンで形成されたもの含まれるが、これらに限定されない。
【０１２３】
１２．投与方法
前記組成物及び前記医薬組成物を投与する方法は、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、及び皮下）、硬膜外投与、及び経粘膜投与（例えば、鼻腔内及び経口経路）を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、前記組成物は、筋肉内、静脈内、又は皮下に投与される。前記組成物は、例えば、注入又はボーラス注射、上皮又は粘膜皮膚ライニング（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を介した吸収によってなど、任意の簡便な経路によって投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与してもよい。投与は全身的又は局所的であり得る。
【実施例】
【０１２４】
本開示は、以下の非限定的な実施例によって示されるように、複数の態様を有する。
【０１２５】
実施例１
低グリコシル化ＣＤ２４に対するモノクローナル抗体の生成
腫瘍におけるＮＥＵ１及びＣＤ２４の過剰発現は、グリコシダーゼの調節不全を示唆する。グリコシダーゼの調節不全は、ＭＵＣ１と同様にＣＤ２４が腫瘍で低グリコシル化されている（hypoglycosylated）可能性があることを示唆している。抗体である３Ｂ６の、ＣＤ２４に対する結合は、シアル酸糖鎖によって妨げられる（図１）。ＥＬＩＳＡで検出されるように、市販の抗ＣＤ２４抗体であるＭＬ５（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）と比べて、３Ｂ６は、Ｎ−ＳＡ−ＣＤ２４及びＮ−ＳＡ−Ｏ−ＣＤ２４には強く結合するが、Ｎ−ＣＤ２４又は完全にグリコシル化されたＣＤ２４への結合は弱い。これは、３Ｂ６が結合するエピトープが実際にタンパク質主鎖であり、３Ｂ６の結合がエピトープのグリコシル化によって妨げられていることを示唆した。
【０１２６】
蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）及び免疫蛍光（ＩＦＡ）染色の結果は、３Ｂ６が神経芽細胞腫及び髄芽腫を含む複数のがん細胞株に結合することを示している（図２Ａ〜図２Ｂ）。３Ｂ６は神経芽細胞腫細胞株ＩＭＲ３２、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、及びＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）Ｃに結合するが、ＳＫ−Ｎ−ＡＳには結合していない（図２Ａ）。３Ｂ６はまた、ＩＦＡ染色で評価した患者から得られた髄芽腫腫瘍の４つのうち３つに結合している（図２Ｂ）。これらのデータは、３Ｂ６ががん性細胞株及び腫瘍に結合可能であることを示唆している。
【０１２７】
実施例２
親和性成熟
ＣＤ２４に対する３Ｂ６の結合親和性は、市販の抗体ＭＬ５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）及びＳＮ３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）と比較してかなり低かった。３Ｂ６のその抗原への結合の親和性及び特異性を高めるために、３Ｂ６の親和性成熟を行った。最初に、３Ｂ６抗体の重鎖（ＩｇＨ）及び軽鎖（ＩｇＬ）のクローンを作成し、Ｉｇ可変領域配列を以下のとおりに特定した。
【０１２８】
３Ｂ６のＩｇＨ（配列番号１、ＣＤＲは下線太字表示）
【０１２９】
【化１】
2021526509.tif 000002
【０１３０】
３Ｂ６のＩｇＬ（配列番号２、ＣＤＲは下線太字表示）
【０１３１】
【化２】
2021526509.tif 000003
【０１３２】
親抗体３Ｂ６からのＶＨ断片及びＶＬ断片を、ｓｃＦｖ形式に変換し、ファージディスプレイベクターにクローン化した。ｓｃＦｖはファージ上に一価で提示されたため、より高い親和性を有するファージクローンの選択が可能となった。ｓｃＦｖの提示レベルを検証するために、ｓｃＦｖをＦｌａｇ−６ｘＨｉｓ検出タグと融合させた。ファージＥＬＩＳＡを実施して、ファージディスプレイ形式での抗原への親抗体の結合を検証した。ファージ上清からの結合シグナルは顕著であったため、本企画はライブラリー構築に進んだ。
【０１３３】
選択及びスクリーニングを３ラウンド実施した。スクリーニングにおいて抗原ＣＤ２４−ＧＳＴ及びビオチン化ＣＤ２４−ＧＳＴの濃度を下げて、より高次のバインダークローンを選択した。各ＣＤＲ突然変異誘発ライブラリーから４８個のクローンを選択し、培養し、結合についてアッセイを行って配列決定した。親和性成熟ｓｃＦｖクローンの配列を確認してから、親和性成熟クローンのｓｃＦｖを完全長抗体遺伝子に再フォーマットし、哺乳動物細胞で一過的に発現させた。全てのアフィニティー成熟抗体を、０．０１リットルで小規模産生した。親抗体もまた直接比較するためにスケールアップした。表に示す重鎖及び軽鎖（表１）のプラスミドを、血清の非存在下で既知組成培地を使用して懸濁液ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、抗体を作製した。トランスフェクションの５日後、馴化培地を収集して清澄化した。馴化培地中の全抗体を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ培地（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して精製した。
【０１３４】
【表１】
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【０１３５】
精製した親和性成熟抗体及び親抗体を、抗原に対するそれらの親和性について競合ＥＬＩＳＡによって評価した。抗体ＰＰ６２２６（親３Ｂ６可変領域）を２μｇ／ｍＬでプレートにコーティングした。アフィニティー成熟抗体を最初にＣＤ２４−ＧＳＴとインキュベートし、次にプレートとインキュベートし、続いて二次検出抗体をインキュベートした。図３〜図５に示すように、親クローンと競合する能力が様々である１６個の抗体を生成した。これらの抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号３〜１０（重鎖）及び配列番号１１〜１６（軽鎖）である。
【０１３６】
親和性成熟クローンがＣＤ２４により強く結合するかどうか、及び相互作用が糖鎖で調節される（glycan-regulated）かどうかを判断するために、ＣＤ２４をＮ−グリカナーゼ（Ｎ−ＣＤ２４）、シアリダーゼＮａｎＡ（ＳＡ−ＣＤ２４）、又はその両方（Ｎ−ＳＡ−  ＣＤ２４）で処理した。図３〜図５に記載の１６個のクローンを、ＥＬＩＳＡを使用して試験した。図６に示すように、ＣＤ２４−ＧＳＴに対する有意な親和性にもかかわらず、ＰＰ６２３１及びＰＰ６２３０は、グリコシル化に関係なく、哺乳動物細胞によって発現されるＣＤ２４に結合できなかった。一方、他のほとんどのクローンは、シアリダーゼ及び／Ｎ−グリカナーゼで処理したＣＤ２４への優先的結合を維持していた。しかしながら、抗体結合に対するシアリダーゼ及びＮ−グリカナーゼの相対的な影響はクローンによってかなり異なるため、グリカンによる妨害に対する感受性を決定するためには各クローンを個別に試験する必要がある。
【０１３７】
ＳＡ−Ｎ−ＣＤ２４に強く結合するが、ＣＤ２４への結合が最小限である、６つのクローンを選択し、２つのがん細胞株である肺がん細胞株Ｈ７２７及び神経芽細胞腫細胞株ＩＭＲ３２への結合について試験した。図７に示すように、６つのクローンが示すＳＡ−Ｎ−ＣＤ２４への結合は同様であるにもかかわらず、がん細胞への結合は有意に異なっていた。重要なことに、ＰＰ６３７３は、試験した両方のがん細胞株に対して有意に強い結合を示す。したがって、このクローンをさらなる研究のために選択する。ＰＰ６３７３の重鎖配列を配列番号６に示し、軽鎖配列は配列番号１６に示す。親配列と比較して、重鎖はＣＤＲ２に３つの変異を有し、軽鎖は軽鎖のＣＤＲ３に１つの変異を有する。図８に示すように、これらの変異はＳＡ−Ｎ−ＣＤ２４への結合をほぼ１００倍に増加させるだけでなく、脱シアル化によって相互作用をより厳密に制御する。ＰＰ６３７３が得た、脱グリコシル化を伴わないＣＤ２４への結合能力は、ＳＡ−Ｎ−ＣＤ２４への結合能力の１／１０００レベルであったことも注目される。しかしながら、ＣＨＯ細胞は不完全なグリコシル化を有することが公知であるため、前記結合は、ＣＨＯ細胞から調製された組換えＣＤ２４中のマイナーなグリコフォームを検出する抗体のより高い感度を反映するものであろう。
【０１３８】
実施例３
３Ｂ６及びＰＰ６３７３によって認識される抗原性エピトープ
３Ｂ６及び親和性成熟クローンＰＰ６３７３によって認識される抗原性エピトープを決定するために、成熟ＣＤ２４アミノ酸配列（配列番号４２）をカバーする重複ペプチドを合成して３Ｂ６抗体と事前にインキュベートしてから、Ｎ−Ｏ−ＣＤ２４タンパク質（Ｎ−グリコシダーゼ、ＮａｎＡ、及びＯ−グリコシダーゼで順次前処理したＣＤ２４Ｆｃ）で予めコーティングしたプレートに３Ｂ６を添加した。図９に示すように、試験した５つのペプチド（配列番号４３〜４７）のうち、ペプチド４（配列番号４６）のみが３Ｂ６−ＣＤ２４相互作用の有意なブロッキングを示したことは、ＣＤ２４結合エピトープがこの配列に含まれることを示唆する。ＰＰ６３７３が同じエピトープを認識することを確認するために、５つのペプチドを広い用量範囲で滴定した。図１０に示すように、ペプチド４のみが、ＰＰ６３７３のＳＡ−Ｎ−ＣＤ２４への結合を用量依存的に阻害した。
【０１３９】
最小のＰＰ６３７３結合部位を確定するために、一度に１アミノ酸ずつペプチド４を切り詰め、ＳＡ−Ｎ−ＣＤ２４へのＰＰ６３７３結合の阻害を比較した。図１１に示すように、Ｃ末端から３個のアミノ酸を欠失させると阻害が無効になったが、１又は２個のアミノ酸を欠失させると阻害が大幅に改善された（左パネル）。さらに、ペプチド４のＮ末端からアミノ酸を欠失させると、阻害も無効になった（右パネル）。これらのデータにより、ＳＮＳＧＬＡＰＮ（配列番号４８）がＰＰ６３７３によって認識される最適なエピトープとして同定される。
【０１４０】
抗原性エピトープの同定により、同様の特性を有するさらなる抗体を生成できる。一実施形態では、配列ＳＮＳＧＬＡＰＮ（配列番号４８）を含む合成ペプチドを使用して、当業者は新しい抗体を生成することができるであろう。前記ペプチドは、別の免疫原性タンパク質担体に結合させるか、アジュバントと組み合わせて使用してもよい。別の実施形態では、当業者は前記ペプチドを使用して、同じエピトープを認識する他の抗ＣＤ２４ｍＡｂを同定して、がんの診断及び処置のためのがん特異的抗体を生成することができるであろう。さらに別の実施形態では、前記抗原ペプチドを使用して、配列番号４８のコア配列を含むエピトープに結合する抗体に関連する潜在的な有害作用を中和又は阻害することができる。前記ペプチドは、Ｄ−アミノ酸の使用、１又は複数のペプチド結合におけるＯからＳへの置換、溶解性又は半減期を改善する融合配列の追加（例えば、アルブミン融合）を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の方法を使用して、インビボ使用に向けて安定性をより良くするために修飾され得る。さらに別の実施形態では、配列番号４８のアミノ酸配列を含む分子は、がんワクチンの処置及び予防のためのワクチンとして使用することができる。
【０１４１】
実施例４
正常組織と悪性組織における抗原性エピトープの発現の対比
ＰＰ６３７３によって認識されるエピトープが正常組織に比してがん組織で優先的に提示されるかどうかを判断するために、ビオチン化ＰＰ６３７３を使用した免疫蛍光法による組織結合を分析した。正常組織のデータを表２に要約し、がん組織のデータを表３に要約する。さらに、正常な良性脳腫瘍及び悪性脳腫瘍に対する抗体の結合を評価している。データは表４に要約されている。
【０１４２】
【表２】
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【０１４３】
【表３】
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【０１４４】
【表４】
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【０１４５】
表２に示すように、膵臓及びおそらく脾臓を除いて、ＰＰ６３７３は正常組織を染色しなかった。膵臓の染色のほとんどが細胞内に認められることが注目される。脾臓では、染色を示した細胞が稀な数あった。対照的に、表３に示すように、試験したほとんどのがんはＰＰ６３７３への強い結合を示している。表４に示すように、正常なＣＮＳ組織にはＣＤ２４が全くないが、良性髄膜腫では細胞表面の染色ではなく細胞内に見られる。重要なことに、星状細胞腫、神経膠芽腫、乏突起膠腫などの悪性脳腫瘍は、細胞表面染色を８％〜７０％の範囲で示し、さらに、一部のがん組織は細胞内染色を示した。
【０１４６】
一実施形態では、ＰＰ６３７３を使用して、悪性脳腫瘍を正常又は良性の脳組織から区別することができる。別の実施形態では、ＰＰ６３６７を使用して、肝臓、肺、乳房、及び卵巣などの固形臓器のがん組織を識別することができる。
【０１４７】
実施例５
ＰＰ６３７３はインビボで肺がんの増殖を遅らせる
ＰＰ６３７３がインビボで腫瘍増殖を遅らせることができるかどうかを試験するために、ヌードマウスにヒト肺がん細胞株Ｈ７２７を皮下投与した。腫瘍が触知可能になった時点で、担がんマウスに５ｍｇ／ｋｇのＰＰ６３７３を２回注射した（Ｈ７２７接種の１４日後及び２１日後）。図１２に示すように、ＩｇＧ対照と比較して、ＰＰ６３７３で処理した腫瘍では増殖の速度が大幅に減少していた。これらのデータは、未修飾ＰＰ６３７３がインビボで抗腫瘍活性を示し得ることを示している。
【０１４８】
我々のインビトロ研究では、ＰＰ６３６７が強力な抗体依存性細胞傷害（antibody-dependent cellular cytotoxicity）を媒介することが、図１３におけるように示されており、インビボでの腫瘍増殖遅延と一致する。
【０１４９】
ＡＤＣＣはグリコシル化、特にフコシル化の影響を受けるため、抗体工学を用いて、コアＦＣフコシル化がないＰＰ６３７３（ｄ６３７３）を生成した。図１４に示すように、フコシル化はＰＰ６３７３のＡＤＣＣ活性を増加させた。
【０１５０】
本データは、ＰＰ６３７３ががんの処置に使用され得ることを示す。一実施形態では、ＰＰ６３７３  ＷＴ  ＩｇＧ１は、がん患者に投与されるがん治療抗体として使用され得る。別の実施形態において、前記抗体は、化学的に糖工学により修飾するか、又はフコシルトランスフェラーゼを欠く細胞株で産生することができる。
【０１５１】
実施例６
ＰＰ６３７３及びＯＫＴ３配列に基づく二重特異性抗体
抗ＣＤ２４抗体を兵器化（weaponize）するために、ＣＤ２４及びＣＤ３の両方に結合する二重特異性抗体を作成した。一実施形態では、抗ＣＤ２４抗体及び抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）抗体は、それぞれ、ＣＤ２４及びＣＤ３に対する反応性を有する一本鎖抗体に変換され、可撓性リンカー配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４９）によって連結される。ＰＰ６３７３一本鎖抗体の配列を配列番号１７に示し、ＯＫＴ３一本鎖配列を配列番号１８に示す。
【０１５２】
一実施形態では、二重特異性分子の２つのパートナーがＦｃ領域に相補的突然変異を有し、ノブ・アンド・ホール（ｋｎｏｂ  ａｎｄ  ｈｏｌｅ）を作成して二重特異性ヘテロダイマーの形成を促進するノブ・アンド・ホール技術によって、二重特異性抗体が生成される。ＰＰ６３７３及びＯＫＴ３のノブ・アンド・ホールバリアントの配列を、配列番号１９〜２２に示す。様々なノブ・アンド・ホール構成の二重特異性を評価するために、様々なノブ・アンド・ホール産物のコトランスフェクション（同時形質移入）の産物と共にＪｕｒｋａｔ細胞を染色することからなるアッセイを開発した。簡潔に述べると、ＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ細胞はまず、トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の組織培養上清と共に染色された。未結合の抗体を洗い流した後、細胞をビオチン化ＳＡ−Ｎ−ＣＤ２４と共にインキュベートした。Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＳＡ−Ｎ−ＣＤ２４の量を、ＰＥ−ストレプトアビジンによって検出した。図１５に示すように、ＰＰ６３７３ホールとＯＫＴ３ノブとの組み合わせは、Ｊｕｒｋａｔ細胞へのＣＤ２４結合が最も高く、ＰＰ６３７３ホールとＯＫＴ３ノブとのペアリングがノブ・アンド・ホール戦略に最適であることを示している。
【０１５３】
別の実施形態では、前記二重特異性抗体は、２つの一本鎖結合モチーフのタンデムリピートによって生成される。ここでも、配列番号２３及び２４にそれぞれ示されるように、ＰＰ６３７３−ＯＫＴ３及びＯＫＴ３−ＰＰ６３７３という反対の順序で異なる結合モチーフを持つ２つの構成の活性を比較した。図１６に示すように、Ｎ末端にＰＰ６３７３一本鎖を有する構築物（ＰＰ６３７３−ＯＫＴ３、配列番号２３）は、より高い二重特異性活性を示す。
【０１５４】
前記二重特異性抗体が抗腫瘍細胞活性を有するかどうかを決定するために、肺がん細胞株Ｈ７２７を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で２日間活性化したＴ細胞と共培養した。最初に、がん細胞がサイトカインの産生を特異的に誘発できるかどうかを試験した。図１７に示すように、重要なサイトカインは二重特異性抗体によれば誘導されるが、ＰＰ６３７３−ＦｃのＯＫＴ３−Ｆｃによっては誘導されない。さらに重要なことに、前記二重特異性抗体は、Ｔ細胞及び腫瘍細胞の両方が共存しない限り、サイトカイン産生を誘導しない。これらのデータは、前記二重特異性抗体がＴ細胞及び腫瘍細胞の両方に関与することによってＴ細胞の活性化を引き起こすことを示している。
【０１５５】
サイトカイン放出アッセイと同時に、フローサイトメトリーによって生存色素標識腫瘍細胞をビーズに基づき計数することに基づいて、腫瘍細胞に対する細胞傷害性も評価した。図１８に示すように、前記二重特異性抗体は、Ｔ細胞が存在する場合にのみ腫瘍細胞の喪失を引き起こす。
【０１５６】
さらに別の実施形態として、前記二重特異性抗体は、ＦＩＴ−Ｉｇ技術によって産生され得る。簡潔に述べると、二重特異性抗体は、ＶＬ６３７３−ＣＬ−ＶＨＯＫＴ３−ＣＨ１−Ｆｃ（配列番号２５）、ＶＨ６３７３−ＣＨ１（配列番号２６）、及びＶＬＯＫＴ３−ＣＬ（配列番号２７）をそれぞれコードする３つの構築物の共発現によって形成される。図１９に示すように、ＦＩＴ−Ｉｇ抗体はＯＫＴ３及びＳＡ−Ｎ−ＣＤ２４の両方に対して良好な二重特異性結合活性を示した。結合に加えて、この二重特異性抗体が有意なサイトカイン応答（図２０）及び腫瘍細胞に対する細胞傷害性（図２１）を誘導することも見出された。さらに、この二重特異性抗体（ＦＩＴ−Ｉｇ）は、先の二重特異性抗体ＰＰ６３７３−ＯＫＴ３及びＯＫＴ３−ＰＰ６３７３と比較して高い熱安定性を示した（図２２）。
【０１５７】
実施例７
がん治療のためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）に対するＰＰ６３７３の使用
前記抗ＣＤ２４抗体は広域スペクトルのがん細胞と反応し、キメラ抗原受容体を産生してＴ細胞に抗がん活性を付与するために使用され得る。一実施形態では、ＰＰ６３７３一本鎖Ｆｖ配列（配列番号２８）又は他の抗ＣＤ２４  ｍＡｂ一本鎖（αＣＤ２４ＳＣ）が、図２３に示されるように、当技術分野で公知のＣＡＲ-Ｔベクターに挿入される。続いて、構築物は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、又はアデノウイルスベクターに由来するものを含む、当技術分野で公知の遺伝子ベクターに挿入される。
【０１５８】
ＣＡＲの活性を試験するために、Ｐａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を使用して、健康なドナーからのＰＢＭＣを濃縮してＴ細胞を得た（０日目）。ヒト汎Ｔ細胞を抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で２４時間刺激し、ＩＬ−２で２日間培養した。活性化Ｔ細胞を模擬処理（対照Ｔ）するか、ＣＤ２４−ＣＡＲを担持するレンチウイルスに感染させた（２日目）。ＣＡＲ−Ｔの抗腫瘍活性を試験するために、対照Ｔ細胞又はＣＤ２４  ＣＡＲ−Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）標識腫瘍細胞と一晩共培養した。腫瘍細胞の溶解は、Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ＤｙｅｅＦｌｕｏｒ（商標）６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で染色することにより測定し、下記式で計算した。
【０１５９】
溶解％＝（死細胞％−自己消化細胞％）／（１−自己消化細胞％）
【０１６０】
図２４に示すように、ＣＤ２４  ＣＡＲ−Ｔは、エフェクター細胞とターゲット細胞の比率（Ｅ／Ｔ）の広い範囲内で、肺がん細胞株Ａ５４９に対して強力な細胞傷害性を示す。
【０１６１】
ＣＡＲ−Ｔががん細胞によって活性化されるかどうかを試験するために、４×１０４個のＣＡＲ−Ｔ細胞又は対照Ｔ細胞をＡ５４９腫瘍細胞と一晩インキュベートし、上清中のＩＦＮγを測定した。図２５に示すように、ＣＡＲ−Ｔは、対照Ｔ細胞ではなく、Ａ５４９腫瘍細胞刺激に応答してＩＦＮγを産生した。
ＣＤ２４はがん種の複数の系統間で広く発現している。図２６に示すように、ＣＤ２４  ＣＡＲ−Ｔは、肺がん、乳がん、前立腺がん、子宮頸がん、神経芽細胞腫、及び神経膠腫など、多くのがん種に対して幅広い細胞傷害性を示す。
【０１６２】
まとめると、本開示のデータは、本開示の抗体に基づくＣＤ２４ＣＡＲ−Ｔががん処置に大きな可能性を秘めていることを示している。標的となり得るがん種としては、脳腫瘍、頭頸部がん、肉腫、肺がん、消化器がん、乳がん、精巣がん、前立腺がん、膵臓がん、肝臓がん、又は血液悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６３】
実施例８
がん治療のためのＰＰ６３７３のヒト化
ｐｄｂ４ＰＢ０の構造をモデル構造として用いて、ＰＰ６３７３  Ｆｖホモロジーモデルを構築した。ＶＨ及びＶＬの両方が９０％を超える４ＰＢ０との相同性を共有している。ヒトＩｇデータベースの検索で、ヒト生殖細胞系Ｖ領域配列ＩＧＨＶ３−７３＊０１及びＪ領域配列ＩＧＨＪ４＊０１が適切な構造として特定され、重鎖のＣＤＲ領域（Ｏｎｃ−１  ＶＨ）のヒトアクセプターフレームワークとして使用された。ヒト生殖細胞系Ｖ領域ＩＧＫＶ２−２９＊０２及びＪ領域配列ＩＧＫＪ４＊０１は、軽鎖（Ｏｎｃ−１  ＶＬ）のＣＤＲ領域のヒトアクセプターフレームワークとして適用された。４つのＶＨ配列及び４つのＶＬ配列を設計した（配列番号２９〜３６）。新たな産物は、ヒト化スコアをＶＨにおいて７３％から８３％超に、ＶＬにおいて８０％から８３％超に改善する。ＰＰ６３７３マウスＦｖの構造アラインメント及びヒト化バージョンのＰＰ６３７３のＦｖ（ｈｕ−ＶＨｖ１ＶＬｖ１、配列番号２９及び３３）は、高度の類似性を示した（図２７）。
【０１６４】
ＣＤ２４結合に最適なＨｕＶＨ及びＨｕＶＬの組み合わせを選択するために、様々な組み合わせを２９３細胞に７２時間コトランスフェクトした。次に、発現培地を使用して２つのＥＬＩＳＡを実施した。ＥＬＩＳＡ１：９６ウェルプレートを精製ヤギ抗ヒトポリクローナルＩｇＧ（ＧＡＨ）でコーティングし、ブロッキング後、発現培地又は精製対照ＩｇＧを添加し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰを検出抗体として使用した。ＥＬＩＳＡ２：９６ウェルプレートをＣＤ２４−ＧＳＴタンパク質でコーティングし、ブロッキング後、発現培地又は精製対照ＩｇＧを添加し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰを検出抗体として使用した。キメラＰＰ６３７３抗体の結合が両方のＥＬＩＳＡで１００％であると考えられる場合は、異なる結合度を示す様々なＶＨ及びＶＬの組み合わせをキメラ抗体の組み合わせと比較し、相対結合によってランク付けする（事前スクリーニングから選択したリードは精製後に再度比較する）。第１ラウンドの事前スクリーニングデータを図２８に要約する。この実験のデータは、ａ）Ｌ３は、Ｌ３をリードにする単位タンパク質あたりの結合能力が高いこと、及びｂ）Ｈ１Ｌ３（配列番号２９及び３５）、Ｈ２Ｌ３（配列番号３０及び３５）、Ｈ３Ｌ３（配列番号３１及び３５）、及びＨ４Ｌ３（配列番号３２及び３５）が、ＰＰ６３７３に対する４つのヒト化リードであることを示唆した。
【０１６５】
リード抗体であるＨ２Ｌ３及びＨ３Ｌ３が腫瘍細胞に結合する能力を保持しているかどうかを試験するために、ＰＰ６３７３とともに当該ヒト化抗体をビオチン化した。図２９に示すように、試験した２つのヒトがん細胞への結合はＰＰ６３７３の方が良好であったが、Ｈ２Ｌ３及びＨ３Ｌ３の両方がＩＣ５０がｎＭ範囲内にある強い結合を示している。
【０１６６】
ＰＢＬ（図３０、図３１）又はＰＢＬから精製したＮＫ細胞（図３２）をエフェクターとして使用し、Ａ５４９細胞を標的細胞として使用してＡＤＣＣアッセイを実施した。驚いたことに、Ｈ２Ｌ３及びＨ３Ｌ３は腫瘍細胞への結合が不十分であるが（図２９）、低濃度の抗体を使用した場合は、ＡＤＣＣにおいてより強力なエフェクターとなる（図３０）。予測した通り、脱フコシル化ＰＰ６３７３（ｄ６３７３）はＡＤＣＣにおいてより強力である（図３１、図３２）。
【０１６７】
まとめると、本開示のデータは、ＰＰ６３７３のヒト化クローンがヒトがん細胞への有意な結合と驚くほど強力なＡＤＣＣ活性を示すことを実証した。一実施形態では、がんを処置するために前記抗体を使用しうる。別の実施形態において、前記ヒト化抗体は、二重特異性抗体の重要な成分として使用され得る。この活性を調べるために、Ｈ３及びＬ３を含む２つの構築物を生成して、ＦＩＴ−Ｉｇ技術に基づく二重特異性抗体を産生した。ヒト化ＦＩＴ−Ｉｇ抗体の配列は、配列番号３７及び３８に示されており、配列番号２７と併せて使用される。さらに、ヒト化ＦＩＴ−Ｉｇ配列を最適化するためにいくつかの変異を作成した。それらを配列番号３９〜４１示す。具体的には、３つの配列すべてが、タンパク質の精製と合成のためにＮ末端にシグナル配列を含む。配列番号３９では、ＡＤＣＣを阻止するためにＦｃ領域に変異（ＤからＡへの変異）が導入された。配列番号２７では、構築中に制限酵素部位によってもたらされた（induced）１つの余分なＲが、ＶＬＯＫＴ３とＣＬの間に存在する。配列番号４１では、その余分なＲは欠失していた。
【０１６８】
さらに別の実施形態では、ヒト化抗体は、当技術分野で公知の方法を使用して、がん治療のためのＣＡＲ−Ｔの重要な構成要素として使用されうる。
【０１６９】
実施例９
糖鎖で遮蔽されているエピトープを有する抗ＣＤ２４抗体は、ＣＤ２４を高発現する正常細胞には結合しない
抗体に基づく免疫治療剤の重要な要件は、正常組織に対する反応性が最小限であることである。ＣＤ２４は造血細胞、特に顆粒球、Ｂ細胞、赤血球の一部、単球の一部に豊富に発現しているため、ＰＰ６３７３並びにその２つのヒト化クローンＨ２Ｌ３及びＨ３Ｌ３を従来の抗ＣＤ２４  ｍＡｂであるＭＬ５と比較した。図３３に示すように、ＭＬ５は通常高レベルのＣＤ２４を発現する細胞に強い結合を示すが、Ｈ２Ｌ３及びＨ３Ｌ３はＢ細胞や赤血球には結合せず、顆粒球にはほとんど結合しない。この結果は、マクロファージ及び非Ｂリンパ球の一部などの他の細胞種への結合が最小限であることを示している。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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