(57)【要約】  本発明は、癌患者を処置する方法であって、Ｚｎ（ＩＩ）剤又はＺｎ（ＩＩ）剤／免疫腫瘍剤の組合せを投与して、該癌患者に治療上の利益を提供するステップを含む方法に関する。該方法は、固形腫瘍及び血液系の癌性細胞を含む広範囲のヒト癌を処置する際に有用である。特定の実施形態において、該処置方法は、遺伝的不安定性突然変異を特徴とする癌タイプを対象とする。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を有する患者を処置する方法であって、前記患者に、治療上有効な量のＺｎ（ＩＩ）剤を投与するステップを含む方法。
【請求項２】
腫瘍を有する患者を処置する方法であって、前記患者に、治療上有効な量のＺｎ（ＩＩ）剤を、免疫腫瘍剤と組み合わせて投与するステップを含む方法。
【請求項３】
前記免疫腫瘍剤が、免疫チェックポイント阻害剤である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）抗体若しくはＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４活性を阻害するその抗原結合部分、又はプログラム細胞死−１（ＰＤ−１）抗体若しくはＰＤ−１受容体に特異的に結合し、ＰＤ−１活性を阻害するその抗原結合部分である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記腫瘍は、遺伝的不安定性突然変異及び／又は遺伝子過剰発現に起因した遺伝的不安定性を有する腫瘍細胞を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝的不安定性突然変異が、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＰＡＸＩＰ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＷＲＮ、ＲＦＣ１、ＲＰＡ１、ＥＲＣＣ１、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ６、ＭＧＭＴ、ＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ２、ＮＥＩＬ３、ＸＲＣＣ１、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＴＰ５３、ＣＲＥＢＢＰ、ＪＡＫ１、ＮＦＫＢ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、及びＭＬＨ３から選択される１つ又は複数の遺伝子における機能障害性突然変異である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
患者における腫瘍においてＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤性白血球集団を増加させる方法であって、前記腫瘍を有する前記患者に、治療上有効な量のＺｎ（ＩＩ）剤を投与するステップを含む方法。
【請求項８】
患者における腫瘍においてＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤性白血球集団を増加させる方法であって、前記腫瘍を有する前記患者に、治療上有効な量のＺｎ（ＩＩ）剤を、免疫腫瘍剤と組み合わせて投与するステップを含む方法。
【請求項９】
前記免疫腫瘍剤が、免疫チェックポイント阻害剤である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）抗体若しくはＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４活性を阻害するその抗原結合部分、又はプログラム細胞死−１（ＰＤ−１）抗体若しくはＰＤ−１受容体に特異的に結合し、ＰＤ−１活性を阻害するその抗原結合部分である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｚｎ（ＩＩ）剤が、Ｚｎ（ＩＩ）／γ−ポリグルタミン酸及び／又はＺｎ（ＩＩ）／α−ポリグルタミン酸を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
患者において腫瘍を処置する方法であって、治療上有効な量の（ｉ）Ｚｎ（ＩＩ）／ポリグルタミン酸剤を、（ｉｉ）Ｔリンパ球マーカー、マクロファージマーカー、又はナチュラルキラー細胞マーカーを標的とする免疫腫瘍剤と組み合わせて投与するステップを含む方法。
【請求項１３】
Ｔリンパ球マーカーが、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｔリンパ球マーカーが、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有分子３（ＴＩＭ−３）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
Ｔリンパ球マーカーが、Ｔ細胞免疫グロブリン及びＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
Ｔリンパ球マーカーが、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
Ｔリンパ球マーカーが、Ｔ細胞活性化のＶドメイン含有Ｉｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
Ｔリンパ球マーカーが、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
Ｔリンパ球マーカーが、ＣＤ２７である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
Ｔリンパ球マーカーが、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
マクロファージマーカーが、ＣＤ４７である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
マクロファージマーカーが、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
ナチュラルキラー細胞マーカーが、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
ナチュラルキラー細胞マーカーが、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｚｎ（ＩＩ）／ポリグルタミン酸剤が、腫瘍標的化部分及び／又は電荷運搬部分にコンジュゲートされているポリグルタミン酸を含む、請求項１２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
腫瘍標的化部分及び／又は電荷運搬部分にコンジュゲートされている前記ポリグルタミン酸が、γ−ポリグルタミン酸である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリグルタミン酸の分子量が、約２．５ｋＤａ〜約６０ｋＤａの範囲内である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記過剰発現に起因した遺伝的不安定性が、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂの過剰発現によって引き起こされる、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年６月２２日に出願されたシンガポール特許出願第１０２０１８０５４１２Ｔ号、及び２０１８年１２月２４日に出願されたシンガポール特許出願第１０２０１８１１５７７Ｔ号の利益及び優先権を主張し、これらの出願は、本明細書において、それらの全体が参照により援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、対象において癌を処置する方法であって、対象に、有効な量のＺｎ（ＩＩ）剤を含むか、又は有効な量のＺｎ（ＩＩ）剤及び免疫腫瘍剤（ｉｍｍｕｎｅ−ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ａｇｅｎｔ）を含む医薬組成物を投与するステップを含む方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
癌は、複雑な疾患であり、ここで、その臨床所見、症状、及びその疫学は、性別、人種、民族性、年齢層等の各患者の遺伝的要因に従って、並びに収入レベル、教育レベル、生活様式、食事等の環境要因によって多種多様である。癌の複雑性及び不均一性は、長い間認識されているが、疾患の定義は、医学界の理解の歴史的発展を反映しており、ここで、疾患は、その生理学的な位置、組織学的な外見、及び系譜に従って分類される。
【０００４】
多くのハイスループットＤＮＡ／ＲＮＡ／プロテオミクス特徴付け技法、バイオインフォマティクスの導入、及び免疫腫瘍（Ｉ／Ｏ）薬の出現以来、癌の薬学的定義は、遺伝的プロファイル及び／又はエピジェネティック的プロファイルによって、より良好に定義され得る。癌細胞の特定のシグナル伝達経路又は生化学的経路を標的とし、更に部位非依存的な様式で作用する、高精度の癌細胞の癌免疫療法薬、例えばイマチニブ、スニチニブ及びペムブロリズマブの臨床的成果は、癌の病理学的定義におけるこの変化を反映する例示的な進歩である。かかる一例では、アメリカ食品医薬品局は、病理学の部位とは無関係に、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ）又はミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）として既知の遺伝的欠陥を特徴とする癌タイプに対するペムブロリズマブ及びニボルマブの適応を認可した。
【０００５】
これは、臨床腫瘍学の新時代の合図となり、それにより、癌の生理組織学的特色ではなく、癌の分子生物学によって癌を定義することで、疾患を、治療剤の治療上の利益を送達する能力と併せて並べられる。しかしながら、認可されたＩ／Ｏ薬は、全ての癌タイプに対して首尾よいとは分かっていない。例えば、頭頸部扁平上皮癌に関するペムブロリズマブ単剤療法の治験（ＫＥＹＮＯＴＥ−０４０）は、１つ又は複数の白金含有全身処置に応答しなかった５００名の患者の研究において、標準的なケアと比較して、全生存期間を大幅には改善しなかった。ニボルマブは、非小細胞肺癌を有する患者に対する第一選択処置としては失敗した。アテゾリブマブは迅速認可を受けたにもかかわらず、尿路上皮癌に関する第３相臨床試験で失敗した。同様に、他の免疫活性剤とのＩ／Ｏ薬の併用療法に関する多くの治験が失敗に終わっている。
【０００６】
第１の認可されたＩ／Ｏ薬治療は、おそらく適応免疫系を活性化させることによって、患者における永続的な応答をもたらし、長期の生存期間につながる一方で、患者の大部分が、耐性を示すと同時に、患者によっては、最初に応答した後に再発している。Ｉ／Ｏ治療に関与するメカニズムの十分な理解が未だ限られているため、この応答プロファイルに関する基礎は理解されていない。それにもかかわらず、免疫学的相互作用に関与する多数の受容体及びリガンドが存在すること、また腫瘍の微小環境が、動的であり、且つ進化的であることが認識されている。動的且つ進化的環境の結末の１つは、患者の免疫系状態が、経時的に変化して、Ｉ／Ｏ薬に対する耐性を発現し得ることである。
【０００７】
上記で言及する認可されたＩ／Ｏ薬の他に、Ｔリンパ球、マクロファージ、及びナチュラルキラー細胞において見出されるマーカーが、新たな免疫療法剤の開発の標的として定義されている。目標は、固形癌及び造血癌に対する患者の免疫応答を活性化して、免疫療法に対する耐性を回避又は克服する新たな作用物質を見出すことである。
【０００８】
したがって、既知のＩ／Ｏ薬処置方法を上回って、癌の処置の結末にとって補完的であり、及び／又は癌の処置の結末を更に改善させる組成物及び／又は処置方法を見出す必要性は依然として満たされていない。
【０００９】
先の出願は、２０１６年１１月１日に出願されたシンガポール特許出願第１０２０１６０９１３１Ｙ号、及び２０１７年１０月３０日に出願されたシンガポール特許出願第１０２０１７０８８８６Ｒ号において、消化可能なポリマー−亜鉛キレート複合体（それぞれ、亜鉛γ−ポリグルタメート［Ｚｎ−γＰＧＡ］及び亜鉛α−ポリグルタメート［Ｚｎ−αＰＧＡ］）の抗癌有効性を開示した。出願はともに、本明細書において、それらの全体が参照により援用される。
【００１０】
これらのＺｎ（ＩＩ）剤は、殺腫瘍剤としてそれら自身が活性であってもよく、また癌細胞に対するＩ／Ｏ剤の活性にとって補完的であり得ることを認識して、本発明者らは、本分野において体系的な研究を実施して、単剤療法として、また癌免疫療法剤（免疫腫瘍剤、又はＩ／Ｏ剤）と組み合わせて、Ｚｎ（ＩＩ）複合体の配合物を、固形腫瘍癌及び血液癌を含む広範囲の癌タイプに対して試験して、かかる配合物が、強力な殺腫瘍効果及び免疫療法効果を有することを見出し、したがって、本明細書中に記載するような本発明者らの発明を完成させた。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書中に開示する本発明は、亜鉛及びα−ポリグルタミン酸（α−ＰＧＡ）の複合体が、様々なヒト及びマウス癌細胞株において壊死様細胞死を誘導し得るという驚くべき観察に基づく。理論によって拘束されないが、詳細な検討により、細胞死は、ネクロプトーシス的メカニズムの特徴を有し、Ｚｎ（ＩＩ）特異的なＰＡＲＰ−１過剰活性化の誘発に起因するようであることが示唆される。
【００１２】
一態様において、本発明は、ヒト患者において、例えば固形腫瘍を含む固形癌細胞又は造血癌細胞に対して治療上の利益を提供するＺｎ（ＩＩ）とポリグルタミン酸との複合体（本明細書中では一般に使用する場合、（「Ｚｎ（ＩＩ）剤」））を提供する。Ｚｎ（ＩＩ）剤は、シスプラチンよりも一貫し、且つより広範の細胞傷害性を実証すると同時に、従来の薬物耐性突然変異に対して感受性が劣ることも示す。Ｚｎ（ＩＩ）剤はまた、汎免疫刺激性効果を誘発する。
【００１３】
別の態様において、Ｚｎ（ＩＩ）剤で使用されるポリグルタミン酸は、腫瘍標的化リガンドとコンジュゲートされて、治療上の有効性を更に増強する。コンジュゲートされようと、されまいと、幾つかの実施形態において、ポリグルタミン酸は、ポリマーのガンマ（γ）形態であるのに対して、他の実施形態では、ポリグルタミン酸は、アルファ（α）形態である。
【００１４】
別の態様において、本発明は、固形癌又は造血癌を有する患者を処置する方法を提供する。別の態様において、本発明は、癌を有する患者を、免疫腫瘍学処置と組み合わせてＺｎ（ＩＩ）剤で処置することによって、かかる患者の免疫腫瘍学処置を増強する方法を提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、遺伝的不安定性突然変異及び／又は遺伝子過剰発現に起因した遺伝的不安定性を有する腫瘍細胞を含む腫瘍を有する患者を処置する方法を提供する。幾つかの実施形態において、本明細書中に記載する腫瘍細胞の遺伝的不安定性突然変異は、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＰＡＸＩＰ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＷＲＮ、ＲＦＣ１、ＲＰＡ１、ＥＲＣＣ１、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ６、ＭＧＭＴ、ＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ２、ＮＥＩＬ３、ＸＲＣＣ１、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＴＰ５３、ＣＲＥＢＢＰ、ＪＡＫ１、ＮＦＫＢ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、及びＭＬＨ３から選択される１つ又は複数の遺伝子における機能障害性突然変異である。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＡＴＭ遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＡＴＲ遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＰＡＸＩＰ１遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＢＲＣＡ１遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＢＲＣＡ２遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＷＲＮ遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＲＦＣ１遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＲＰＡ１遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＥＲＣＣ１遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＥＲＣＣ４遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＥＲＣＣ６遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＭＧＭＴ遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＰＡＲＰ１遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＰＡＲＰ２遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＮＥＩＬ３遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＸＲＣＣ１遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＭＬＨ１遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＰＭＳ２遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＴＰ５３遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＪＡＫ１遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＮＦＫＢ１遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＭＳＨ２遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＭＳＨ３遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＭＳＨ６遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＭＬＨ３遺伝子中に存在する。
【００１６】
したがって、幾つかの実施形態において、治療上有効な量のＺｎ（ＩＩ）剤は、単剤療法の処置方法で投与される。
幾つかの実施形態において、治療上有効な量の本明細書中に記載するＺｎ（ＩＩ）剤のいずれかは、併用処置方法で治療上有効な量の免疫腫瘍剤と組み合わせて投与される。患者において腫瘍を処置する方法の一実施形態は、治療上有効な量の（ｉ）Ｚｎ（ＩＩ）／γ−ポリグルタミン酸組成物及び／又はＺｎ（ＩＩ）／α−グルタミン酸組成物を、（ｉｉ）Ｔリンパ球マーカー、マクロファージマーカー、又はナチュラルキラー細胞マーカーを標的とする免疫腫瘍剤と組み合わせて投与することを含む。
【００１７】
様々な実施形態において、免疫腫瘍剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例として、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤が挙げられる。免疫調節性阻害剤の更なる非限定的な例として、ＬＡＧ−３阻害剤、ＴＩＭ−３阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、Ｂ７−Ｈ３阻害剤、ＶＩＳＴＡ阻害剤、ＩＣＯＳ阻害剤、ＣＤ２７阻害剤、ＧＩＴＲ阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＫＩＲ阻害剤、及びＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ阻害剤が挙げられる。
【００１８】
本発明の更なる実施形態は、本明細書中に開示するＺｎ（ＩＩ）剤のいずれかと、２つの免疫療法剤とを含む併用療法を提供する。幾つかの実施形態において、第１の免疫療法剤及び第２の免疫療法剤はそれぞれ独立して、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤、ＬＡＧ−３阻害剤、ＴＩＭ−３阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、Ｂ７−Ｈ３阻害剤、ＶＩＳＴＡ阻害剤、ＩＣＯＳ阻害剤、ＣＤ２７阻害剤、及びＧＩＴＲ阻害剤から選択される。多くの実施形態において、上記の第１の免疫療法剤及び第２の免疫療法剤は、異なる種類の阻害剤に由来し、即ち、これらは異なるマーカーを標的とする。
【００１９】
２つ免疫療法剤を使用する他の実施形態において、第１の作用物質は、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤、ＬＡＧ−３阻害剤、ＴＩＭ−３阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、Ｂ７−Ｈ３阻害剤、ＶＩＳＴＡ阻害剤、ＩＣＯＳ阻害剤、ＣＤ２７阻害剤、及びＧＩＴＲ阻害剤から選択され、第２の作用物質は、ＣＤ４７阻害剤及びＩＤＯ阻害剤から選択される。２つ免疫療法剤を使用する他の実施形態において、第１の作用物質は、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤、ＬＡＧ−３阻害剤、ＴＩＭ−３阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、Ｂ７−Ｈ３阻害剤、ＶＩＳＴＡ阻害剤、ＩＣＯＳ阻害剤、ＣＤ２７阻害剤、及びＧＩＴＲ阻害剤から選択され、第２の作用物質は、ＫＩＲ阻害剤及びＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ阻害剤から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明によるＺｎ（ＩＩ）剤の或る特定の実施形態を示す図である。
【図２】図２Ａは、Ｚｎ（ＩＩ）剤の或る特定の実施形態によるＨｅＬａ細胞の処置時の細胞生存度アッセイの結果を示す図である。図２Ｂは、Ｚｎ（ＩＩ）剤の或る特定の実施形態によるＨｅＬａ細胞の処置時の細胞生存度アッセイの結果を示す図である。
【図３】図３Ａは、Ｚｎ（ＩＩ）剤の或る特定の実施形態に関してＩＣ５０値を決定するアッセイの結果を示す図である。図３Ｂは、Ｚｎ（ＩＩ）剤の或る特定の実施形態に関してＩＣ５０値を決定するアッセイの結果を示す図である。
【図４】図４Ａは、Ｚｎ（ＩＩ）剤の或る実施形態による細胞の処置時に観察される細胞死メカニズムを示す実験の結果を示す図である。図４Ｂは、Ｚｎ（ＩＩ）剤の或る実施形態による細胞の処置時に観察される細胞死メカニズムを示す実験の結果を示す図である。図４Ｃは、Ｚｎ（ＩＩ）剤の或る実施形態による細胞の処置時に観察される細胞死メカニズムを示す実験の結果を示す図である。図４Ｄは、Ｚｎ（ＩＩ）剤の或る実施形態による細胞の処置時に観察される細胞死メカニズムを示す実験の結果を示す図である。図４Ｅは、Ｚｎ（ＩＩ）剤の或る実施形態による細胞の処置時に観察される細胞死メカニズムを示す実験の結果を示す図である。
【図５Ａ】実施例６に記載する５０個の細胞株研究に関する用量応答曲線を示す図である。
【図５Ｂ】実施例６に記載する５０個の細胞株研究に関する用量応答曲線を示す図である。
【図５Ｃ】実施例６に記載する５０個の細胞株研究に関する用量応答曲線を示す図である。
【図５Ｄ】実施例６に記載する５０個の細胞株研究に関する用量応答曲線を示す図である。
【図５Ｅ】実施例６に記載する５０個の細胞株研究に関する用量応答曲線を示す図である。
【図５Ｆ】実施例６に記載する５０個の細胞株研究に関する用量応答曲線を示す図である。
【図５Ｇ】実施例６に記載する５０個の細胞株研究に関する用量応答曲線を示す図である。
【図５Ｈ】実施例６に記載する５０個の細胞株研究に関する用量応答曲線を示す図である。
【図５Ｉ】実施例６に記載する５０個の細胞株研究に関する用量応答曲線を示す図である。
【図６】実施例６に記載する５０個の細胞株研究に関する各細胞型に関するＩＣ５０スクリーニングデータ及び定義された突然変異遺伝子の表を示す図である。
【図７】図７Ａは、実施例６に記載する５０個の細胞株研究における処置に対する応答の分析を示す図である。図７Ｂは、実施例６に記載する５０個の細胞株研究における処置に対する応答の分析を示す図である。
【図８】実施例６に記載する５０個の細胞株研究における薬物感受性に対する単一遺伝子突然変異の効果を示す図である。
【図９Ａ】実施例６に記載する５０個の細胞株研究における処置に対する応答の分析を示す図である。
【図９Ｂ】実施例６に記載する５０個の細胞株研究における処置に対する応答の分析を示す図である。
【図９Ｃ】実施例６に記載する５０個の細胞株研究における処置に対する応答の分析を示す図である。
【図９Ｄ】実施例６に記載する５０個の細胞株研究における処置に対する応答の分析を示す図である。
【図９Ｅ】実施例６に記載する５０個の細胞株研究における処置に対する応答の分析を示す図である。
【図９Ｆ】実施例６に記載する５０個の細胞株研究における処置に対する応答の分析を示す図である。
【図１０−１】実施例６に記載する５０個の細胞株研究における薬物感受性に対する同義遺伝子突然変異の効果を示す図である。
【図１０−２】実施例６に記載する５０個の細胞株研究における薬物感受性に対する同義遺伝子突然変異の効果を示す図である。
【図１０Ｍ】実施例６に記載する５０個の細胞株研究における薬物感受性に対する同義遺伝子突然変異の効果を示す図である。
【図１０Ｎ】実施例６に記載する５０個の細胞株研究における薬物感受性に対する同義遺伝子突然変異の効果を示す図である。
【図１０Ｏ】実施例６に記載する５０個の細胞株研究における薬物感受性に対する同義遺伝子突然変異の効果を示す図である。
【図１０Ｐ】実施例６に記載する５０個の細胞株研究における薬物感受性に対する同義遺伝子突然変異の効果を示す図である。
【図１１】図１１Ａは、Ｃ００４及びシスプラチンに関するＡＰＯＢＥＣ３Ｂ遺伝子突然変異及びＩＣ５０値分布に対するその過剰発現の効果を示す図である。図１１Ｂは、Ｃ００４及びシスプラチンに関するＡＰＯＢＥＣ３Ｂ遺伝子突然変異及びＩＣ５０値分布に対するその過剰発現の効果を示す図である。図１１Ｃは、Ｃ００４及びシスプラチンに関するＡＰＯＢＥＣ３Ｂ遺伝子突然変異及びＩＣ５０値分布に対するその過剰発現の効果を示す図である。図１１Ｄは、Ｃ００４及びシスプラチンに関するＡＰＯＢＥＣ３Ｂ遺伝子突然変異及びＩＣ５０値分布に対するその過剰発現の効果を示す図である。
【図１２Ａ】候補バイオマーカーを示す図である。
【図１２Ｂ】候補バイオマーカーを示す図である。
【図１２Ｃ】候補バイオマーカーを示す図である。
【図１３】Ｃ００４の反復毒性試験の結果を示す図である。
【図１４】図１４Ａは、Ｃ００５Ｄの投与の結果を示す図である。図１４Ｂは、Ｃ００５Ｄの投与の結果を示す図である。
【図１５】Ｃ００５Ｄ単剤療法及びＣ００５Ｄ／抗ＰＤ−１  ｍＡｂの併用療法の処置の結果を示す図である。
【図１６】実施例１０に記載する処置研究に関するｉｎ  ｖｉｖｏ免疫特徴付けに関するゲーティング戦略を示す図である。
【図１７Ａ】実施例１０に記載する処置の免疫学的効果の分析を示す図である。
【図１７Ｂ】実施例１０に記載する処置の免疫学的効果の分析を示す図である。
【図１７Ｃ】実施例１１に記載するＨＣＣ  ＰＤＸ−ＨｕＭｉｃｅモデル試験及びＴＩＬ分析の結果を示す図である。
【図１７Ｄ】実施例１１に記載するＨＣＣ  ＰＤＸ−ＨｕＭｉｃｅモデル試験及びＴＩＬ分析の結果を示す図である。
【図１７Ｅ】実施例１１に記載するＨＣＣ  ＰＤＸ−ＨｕＭｉｃｅモデル試験及びＴＩＬ分析の結果を示す図である。
【図１７Ｆ】実施例１１に記載するＨＣＣ  ＰＤＸ−ＨｕＭｉｃｅモデル試験及びＴＩＬ分析の結果を示す図である。
【図１７Ｇ】実施例１１に記載するＨＣＣ  ＰＤＸ−ＨｕＭｉｃｅモデル試験及びＴＩＬ分析の結果を示す図である。
【図１８】本発明の実施形態によるＺｎ（ＩＩ）剤のＰＡＲＰ−１オーバードライブ媒介性の壊死性細胞傷害性のメカニズムを示す図である。
【図１９】本発明の実施形態によるＺｎ（ＩＩ）剤の推測される殺腫瘍性（ｔｕｍｏｒｉｃａｌ）メカニズムの模式図を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
例示的な実施形態
本発明の実施形態として、下記が挙げられるが、これらに限定されない：
１．腫瘍を有する患者を処置する方法であって、前記患者に、治療上有効な量のＺｎ（ＩＩ）剤を投与するステップを含む方法。
【００２２】
２．腫瘍を有する患者を処置する方法であって、前記患者に、治療上有効な量のＺｎ（ＩＩ）剤を、免疫腫瘍剤と組み合わせて投与するステップを含む方法。
３．前記免疫腫瘍剤が、免疫チェックポイント阻害剤である、実施形態２に記載の方法。
【００２３】
４．前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）抗体若しくはＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４活性を阻害するその抗原結合部分、又はプログラム細胞死−１（ＰＤ−１）抗体若しくはＰＤ−１受容体に特異的に結合し、ＰＤ−１活性を阻害するその抗原結合部分である、実施形態３に記載の方法。
【００２４】
５．前記腫瘍は、遺伝的不安定性突然変異及び／又は遺伝子過剰発現に起因した遺伝的不安定性を有する腫瘍細胞を含む、実施形態１〜４のいずれか一つに記載の方法。
６．前記遺伝的不安定性突然変異が、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＰＡＸＩＰ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＷＲＮ、ＲＦＣ１、ＲＰＡ１、ＥＲＣＣ１、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ６、ＭＧＭＴ、ＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ２、ＮＥＩＬ３、ＸＲＣＣ１、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＴＰ５３、ＣＲＥＢＢＰ、ＪＡＫ１、ＮＦＫＢ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、及びＭＬＨ３から選択される１つ又は複数の遺伝子における機能障害性突然変異である、実施形態５に記載の方法。
【００２５】
７．患者における腫瘍においてＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤性白血球集団を増加させる方法であって、前記腫瘍を有する前記患者に、治療上有効な量のＺｎ（ＩＩ）剤を投与するステップを含む方法。
【００２６】
８．患者における腫瘍においてＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤性白血球集団を増加させる方法であって、前記腫瘍を有する前記患者に、治療上有効な量のＺｎ（ＩＩ）剤を、免疫腫瘍剤と組み合わせて投与するステップを含む方法。
【００２７】
９．前記免疫腫瘍剤が、免疫チェックポイント阻害剤である、実施形態８に記載の方法。
１０．前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）抗体若しくはＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４活性を阻害するその抗原結合部分、又はプログラム細胞死−１（ＰＤ−１）抗体若しくはＰＤ−１受容体に特異的に結合し、ＰＤ−１活性を阻害するその抗原結合部分である、実施形態８に記載の方法。
【００２８】
１１．前記Ｚｎ（ＩＩ）剤が、Ｚｎ（ＩＩ）／γ−ポリグルタミン酸及び／又はＺｎ（ＩＩ）／α−ポリグルタミン酸を含む、実施形態１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
１２．患者において腫瘍を処置する方法であって、治療上有効な量の（ｉ）Ｚｎ（ＩＩ）／ポリグルタミン酸剤を、（ｉｉ）Ｔリンパ球マーカー、マクロファージマーカー、又はナチュラルキラー細胞マーカーを標的とする免疫腫瘍剤と組み合わせて投与するステップを含む方法。
【００２９】
１３．Ｔリンパ球マーカーが、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）である、実施形態１２に記載の方法。
１４．Ｔリンパ球マーカーが、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有分子３（ＴＩＭ−３）である、実施形態１２に記載の方法。
【００３０】
１５．Ｔリンパ球マーカーが、Ｔ細胞免疫グロブリン及びＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）である、実施形態１２に記載の方法。
１６．Ｔリンパ球マーカーが、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）である、実施形態１２に記載の方法。
【００３１】
１７．Ｔリンパ球マーカーが、Ｔ細胞活性化のＶドメイン含有Ｉｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）である、実施形態１２に記載の方法。
１８．Ｔリンパ球マーカーが、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）である、実施形態１２に記載の方法。
【００３２】
１９．Ｔリンパ球マーカーが、ＣＤ２７である、実施形態１２に記載の方法。
２０．Ｔリンパ球マーカーが、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）である、実施形態１２に記載の方法。
【００３３】
２１．マクロファージマーカーが、ＣＤ４７である、実施形態１２に記載の方法。
２２．マクロファージマーカーが、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）である、実施形態１２に記載の方法。
【００３４】
２３．ナチュラルキラー細胞マーカーが、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）である、実施形態１２に記載の方法。
２４．ナチュラルキラー細胞マーカーが、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａである、実施形態１２に記載の方法。
【００３５】
２５．前記Ｚｎ（ＩＩ）／ポリグルタミン酸剤が、腫瘍標的化部分及び／又は電荷運搬部分にコンジュゲートされているポリグルタミン酸を含む、実施形態１２〜２４のいずれか一つに記載の方法。
【００３６】
２６．前記腫瘍標的化部分及び／又は電荷運搬部分にコンジュゲートされているポリグルタミン酸が、γ−ポリグルタミン酸である、実施形態２５に記載の方法。
２７．前記ポリグルタミン酸の分子量が、約２．５ｋＤａ〜約６０ｋＤａの範囲内である、実施形態２５に記載の方法。
【００３７】
２８．前記過剰発現に起因した遺伝的不安定性が、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂの過剰発現によって引き起こされる、実施形態５に記載の方法。
２９．前記遺伝子がＡＴＭである、実施形態６に記載の方法。
【００３８】
３０．前記遺伝子がＡＴＲである、実施形態６に記載の方法。
３１．前記遺伝子がＰＡＸＩＰ１である、実施形態６に記載の方法。
３２．前記遺伝子がＢＲＣＡ１である、実施形態６に記載の方法。
【００３９】
３３．前記遺伝子がＢＲＣＡ２である、実施形態６に記載の方法。
３４．前記遺伝子がＷＲＮである、実施形態６に記載の方法。
３５．前記遺伝子がＲＦＣ１である、実施形態６に記載の方法。
【００４０】
３６．前記遺伝子がＲＰＡ１である、実施形態６に記載の方法。
３７．前記遺伝子がＥＲＣＣ１である、実施形態６に記載の方法。
３８．前記遺伝子がＥＲＣＣ４である、実施形態６に記載の方法。
【００４１】
３９．前記遺伝子がＥＲＣＣ６である、実施形態６に記載の方法。
４０．前記遺伝子がＭＧＭＴである、実施形態６に記載の方法。
４１．前記遺伝子がＰＡＲＰ１である、実施形態６に記載の方法。
【００４２】
４２．前記遺伝子がＰＡＲＰ２である、実施形態６に記載の方法。
４３．前記遺伝子がＮＥＩＬ３である、実施形態６に記載の方法。
４４．前記遺伝子がＸＲＣＣ１である、実施形態６に記載の方法。
【００４３】
４５．前記遺伝子がＭＬＨ１である、実施形態６に記載の方法。
４６．前記遺伝子がＰＭＳ２である、実施形態６に記載の方法。
４７．前記遺伝子がＴＰ５３である、実施形態６に記載の方法。
【００４４】
４８．前記遺伝子がＣＲＥＢＢＰである、実施形態６に記載の方法。
４９．前記遺伝子がＪＡＫ１である、実施形態６に記載の方法。
５０．前記遺伝子がＮＦＫＢ１である、実施形態６に記載の方法。
【００４５】
５１．前記遺伝子がＭＳＨ２である、実施形態６に記載の方法。
５２．前記遺伝子がＭＳＨ３である、実施形態６に記載の方法。
５３．前記遺伝子がＭＳＨ６である、実施形態６に記載の方法。
【００４６】
５４．前記遺伝子がＭＬＨ３である、実施形態６に記載の方法。
発明の詳細な説明
本明細書中で使用する略号の意味は、下記の通りである：「ｋＤａ」は、キロダルトンを意味し、「ｗｔ％」は、重量パーセントを意味する。
Ｚｎ（ＩＩ）剤
Ｚｎ（ＩＩ）剤は、ポリグルタミン酸と複合体形成されたＺｎ（ＩＩ）（即ち、Ｚｎ２＋）からなる。Ｚｎ（ＩＩ）剤の実施形態の一般的構造を図１に示す。ポリグルタミン酸（「ＰＧＡ」）は、グルタミン酸の縮合ポリマーであり、グルタミン酸は、２つのカルボン酸を含有するため、２つの立体配置で生じ得る。α−カルボキシレート部分を介した縮合により、α−ポリグルタミン酸が得られ、γ−カルボキシレート部分を介した縮合により、γ−ポリグルタミン酸が得られる。Ｚｎ（ＩＩ）剤は、α−ＰＧＡ、γ−ＰＧＡ、又はα−ＰＧＡ及びγ−ＰＧＡの両方を用いて調製されてもよく、任意のかかる組成物はまた、「ＺｎＰＧＡ」とも称され得る。形態（α−又はγ−）が指定されない場合、別記しない限り、いずれかの形態が別々に、又は両方の形態が任意の比のブレンドとして、推測され得ることが理解されるべきである。遊離Ｚｎ（ＩＩ）イオン並びにＺｎ陽イオンに対する本来の対イオンがプロセスにおいて除去されるように、ＺｎＰＧＡ組成物は、一般的に精製される。
【００４７】
Ｚｎ（ＩＩ）剤を調製するのに使用される亜鉛塩は、Ｚｎ（ＩＩ）塩（即ち、Ｚｎ２＋塩）であり、ここで、対イオン（陰イオン）は、医薬製品の製造における使用に適した任意の無機又は有機陰イオンであり得る。適切な陰イオンは、無毒性であるものを含む、ヒト身体によって許容されるものである。概して、亜鉛塩は、式Ｚｎ２＋Ｘ２−又はＺｎ２＋（Ｘ−）２又は更にはＺｎ２＋（Ｘ−）（Ｙ−）（式中、Ｘ及びＹは、適切な陰イオンである）によって表され得る。陰イオンは、ＦＤＡにより認可された医薬製品の構成成分である陰イオンの群から選択され得る。幾つかの実施形態において、亜鉛（ＩＩ）塩は、薬学的に許容可能な亜鉛塩である。亜鉛塩の例として、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、クエン酸亜鉛、酢酸亜鉛、ピコリン酸亜鉛、グルコン酸亜鉛、グリシン酸亜鉛又は当該技術分野において既知の使用される他のアミノ酸等のアミノ酸−亜鉛キレートが挙げられる。
【００４８】
アルファ−ポリグルタミン酸（或いは、α−ポリグルタミン酸又はα−ＰＧＡ）は、アミノ酸であるグルタミン酸のポリマーであり、ここで、ポリマー骨格は、アミノ酸側鎖におけるカルボキシル基ではなく、α−炭素でアミノ基及びカルボキシル基を結合するペプチド結合（タンパク質において形成される典型的なペプチド結合）によって形成される。α−ＰＧＡは、グルタミン酸のＬ異性体、Ｄ異性体、又はＤＬラセミ体から形成され得る。これらの形態のいずれかが使用されてもよく、２つ又はそれ以上の異なる形態が、任意の比率で一緒に使用されてもよい。α−ＰＧＡの様々な異性体形態は、合成的であってもよく、又は天然供給源に由来してもよい。生物は通常、Ｌ異性体のみからポリ（アミノ酸）を産生する一方で、α−ＰＧＡを産生する或る特定の細菌酵素は、一方の異性体又は両方の異性体からポリマーを産生することができる。
【００４９】
ガンマ−ポリグルタミン酸（或いは、γ−ポリグルタミン酸又はγ−ＰＧＡ）は、アミノ酸であるグルタミン酸のポリマーであり、ここで、ポリマー骨格は、アミノ酸側鎖において（γ−炭素で）アミノ基及びカルボキシル基を結合するペプチド結合によって形成される。γ−ＰＧＡは、グルタミン酸のＬ異性体、Ｄ異性体、又はＤＬラセミ体から形成され得る。これらの形態のいずれかが使用されてもよく、２つ又はそれ以上の異なる形態が、任意の比率で一緒に使用されてもよい。γ−ＰＧＡの様々な異性体形態は、合成的であってもよく、又は天然供給源に由来してもよい。γ−ＰＧＡは、例えば、日本の納豆及び海藻中に見出される。生物は通常、Ｌ異性体のみからポリ（アミノ酸）を産生する一方で、γ−ＰＧＡを産生する或る特定の細菌酵素は、一方の異性体又は両方の異性体からポリマーを産生することができる。
【００５０】
様々な大きさ及び様々なポリマー分散度のα−ＰＧＡ及びγ−ＰＧＡが使用されてもよく、同じ考察がそれぞれに当てはまる。ＰＧＡのポリマー分子量は、一般的に少なくとも約１ｋＤａ、多くても約１００ｋＤａである。幾つかの実施形態において、ＰＧＡのポリマー分子量は、少なくとも約１ｋＤａ、又は少なくとも約２．５ｋＤａ、又は少なくとも約５ｋＤａ、又は少なくとも約１０ｋＤａ、又は少なくとも約２０ｋＤａ、又は少なくとも約３０ｋＤａ、又は少なくとも約３５ｋＤａ、又は少なくとも約４０ｋＤａ、又は少なくとも約５０ｋＤａである。幾つかの実施形態において、ＰＧＡのポリマー分子量は、多くても約１００ｋＤａ、又は多くても約９０ｋＤａ、又は多くても約８０ｋＤａ、又は多くても約７０ｋＤａ、又は多くても約６０ｋＤａである。許容可能なポリマー分子量範囲は、上記で示したポリマー分子量値のいずれかから選択され得る。或る実施形態において、ポリマー分子量は、約２．５ｋＤａ〜約５０ｋＤａの範囲内である。或る実施形態において、ポリマー分子量は、約５０ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲内である。一実施形態において、ポリマー分子量は、約５０ｋＤａである。ポリマー分子量は通常、ゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）による測定に基づく数平均分子量（Ｍｎ）として付与される。上記ポリマー質量は、Ｍｎとして言及され、他の測定技法を使用して、例えば質量（重量）平均分子量（Ｍｗ）を決定することができ、任意の所与のポリマーの規格は、各種ポリマー質量表示間で変換され得る。
【００５１】
ＰＧＡは、腫瘍標的化部分を含み得る。かかる部分は、葉酸、Ｎ５，Ｎ１０−ジメチルジテトラヒドロフォレート（ＤＭＴＨＦ）、及びＲＧＤペプチドから選択され得る。前記部分はそれぞれ、任意の組合せ及び比でポリグルタミン酸に共有結合されて、例えば、ＰＧＡのフォレートコンジュゲート及び／又はＤＭＴＨＦコンジュゲート及び／又はＲＧＤペプチドコンジュゲートを形成し得る。
【００５２】
フォレート受容体タンパク質は、多くのヒト腫瘍で発現される場合が多い。フォレートは必然的に、フォレート受容体に対して高い親和性を有し、更に結合時に、フォレート及び結合されたコンジュゲートは、エンドサイトーシスによって細胞へ輸送され得る。このようにして、葉酸で修飾されたＺｎＰＧＡは、腫瘍細胞を標的として、腫瘍細胞で蓄積し、亜鉛（ＩＩ）を、腫瘍細胞の近傍へ、及び／又は腫瘍細胞の内側に送達し得る。
【００５３】
ＤＭＴＨＦもまた、フォレート受容体に対して高い親和性を有することが知られている。ＤＭＴＨＦの調製は、Ｌｅａｍｏｎ，Ｃ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３，１２００−１２１０に記載されている。更に、フォレート受容体（ＦＲ）の２つの主なアイソフォームであるＦＲ−α及びＦＲ−βが存在し、ＤＭＴＨＦは、ＦＲ−βを上回ってＦＲ−αに対してより高い親和性を有することがわかっている（Ｖａｉｔｉｌｉｎｇａｍ，Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５３，  １１２７−１１３４．）。これは、ＦＲ−αが多くの悪性細胞型において過剰発現される一方で、ＦＲ−βは、炎症性疾患と関連付けられるマクロファージで過剰発現されるため、腫瘍細胞を標的化するのに有益である。したがって、ＤＭＴＨＦをＰＧＡにコンジュゲートすることにより、腫瘍細胞によって発現されるフォレート受容体に選択的に結合し得るコンジュゲートが提供される。
【００５４】
同様に、ＲＧＤペプチドは、腫瘍性内皮細胞上で、並びに幾つかの腫瘍細胞上で発現されるα（Ｖ）β（３）インテグリンに強力に結合することが知られている。したがって、ＲＧＤコンジュゲートは、抗腫瘍剤を腫瘍部位へと標的化及び送達するのに使用され得る。
【００５５】
本発明で企図されるように、ＰＧＡは、これらの腫瘍標的化剤のいずれか１つ若しくは２つ、又は全てとコンジュゲート（即ち、共有結合）されてもよく、２つ又はそれ以上が存在する場合、これらの作用物質の相対比は、特に限定されない。例えば、ＰＧＡ担体は、ＰＧＡと、（ａ）葉酸、（ｂ）ＤＭＴＨＦ、（ｃ）ＲＧＤ、（ｄ）葉酸及びＤＭＴＨＦ、（ｅ）葉酸及びＲＧＤ、（ｆ）ＤＭＴＨＦ及びＲＧＤ、又は（ｇ）葉酸、ＤＭＴＨＦ、及びＲＧＤとのコンジュゲートを含み得る。当業者に既知の他の類似した腫瘍標的化部分もまた、本発明の範囲内である。
【００５６】
α−ＰＧＡは、各グルタミン酸単位のγ−炭素で遊離カルボン酸基を有し、γ−ＰＧＡは、葉酸及びＲＧＤペプチドとコンジュゲートを形成するのに使用され得る各グルタミン酸単位のα−炭素で遊離カルボン酸基を有する。葉酸は、グルタミン酸の遊離カルボン酸基とカップリングされ得る環外アミン基を有して、２つを結合するアミド結合を形成する。葉酸中と同じ環外アミン基は、ＤＭＴＨＦにおいてアミド結合形成に利用可能である。ＲＧＤコンジュゲートもまた、当該技術分野で周知であり、同様に、例えば、ＲＧＤにおける遊離α−アミノ基を介して遊離カルボン酸基に共有結合され得る。或いは、いずれかの部分が、例えばポリエチレングリコールアミン等のスペーサー基を介して、ＰＧＡにコンジュゲートされ得る。α−ＰＧＡのγ−炭素カルボキシレート基と、アミノ基との間のコンジュゲーション反応の例は、Ｂａｉらの米国特許第９，６３６，４１１号に見出すことができ、アミノ基及び水酸基とのコンジュゲーション反応は、Ｖａｎらの米国特許付与前出願公開第２００８／０２７９７７８号に見出すことができる。葉酸及びクエン酸のコンジュゲーション反応を含む、γ−ＰＧＡへのコンジュゲーション反応の例は、国際公開第２０１４／１５５１４２号（２０１４年１０月２日に公開）に見出すことができる。
【００５７】
ＰＧＡは、電荷修飾部分を含み得る。かかる部分は、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７，１０−テトラシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、及びジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）から選択され得る。前記部分の任意の組合せは、上記で論述するように、更に遊離カルボン酸で、ポリグルタミン酸に共有結合され得る。クエン酸は、エステル結合を形成することによって、ＰＧＡの遊離カルボン酸基にコンジュゲートされ得る。（例えば、γ−ＰＧＡのα−炭素に関与する反応に関しては、国際公開第２０１４／１５５１４２号を参照）。ＥＤＴＡ、ＤＯＴＡ、及びＤＴＰＡは、例えば、スペーサー基を使用してＰＧＡに結合させて、これらの部分のアミンをＰＧＡの遊離カルボン酸基に結合し得る。多数の選択肢が、当業者に利用可能である。電荷修飾部分は、Ｚｎ（ＩＩ）イオンをキレート化するための部位として使用することができ、電荷修飾はまた、ＺｎＰＧＡ複合体の輸送及び溶解度に影響を及ぼし、したがって、担体及びＺｎＰＧＡ複合体の薬学的効果を調整するのに使用することができる。
【００５８】
ＰＧＡは、腫瘍標的化部分及び電荷修飾部分の両方を含んでもよく、その結果、両タイプの部分の利益及び機能性が、ＰＧＡ担体、及びＺｎ（ＩＩ）剤に付与され得る。腫瘍標的化部分及び電荷修飾部分の任意の組合せを、ＰＧＡにコンジュゲートしてもよく、部分の相対比は、特に限定されない。
【００５９】
本発明によるＺｎ（ＩＩ）剤における亜鉛イオンの量は、亜鉛対グルタミン酸単位（「ＧＡＵ」）の比として表され得る。グルタミン酸単位当たりで提供されるキレート部位の平均数の関係性により、キレート剤がＰＧＡにコンジュゲートされる場合、同じ概念が使用され得る。比は、Ｚｎ：ＧＡＵ  １：１と高い可能性があり得るが、これは名目上、コンジュゲートされた腫瘍標的化部分又は電荷修飾部分を排除する。１：２、１：５、１：１０、１：２０のより低い比が企図され、更に低い比が可能であるが、亜鉛（ＩＩ）の適切な用量を送達するのに必要とされる投与量に含まれるＰＧＡの量は増加する。投与量と、非亜鉛構成成分の量との間の適切なバランスは、当業者によって決定され得る。一実施形態において、比は、Ｚｎ：ＧＡＵ  約１：２〜約１：１０の任意の値である。別の実施形態において、比は、約１：３〜約１：６の任意の値である。別の実施形態において、比は、約１：４．５である。
【００６０】
Ｚｎ（ＩＩ）剤における腫瘍標的化部分及び電荷修飾部分の数は通常、ＰＧＡポリマー１つ当たりのコンジュゲートされた部分の平均数として表す。ポリマー鎖１本当たりの結合された部分の平均数を決定するための分析技法は、当業者に既知である。ポリマー鎖１本当たりの部分の所望の数は、平均ポリマーサイズ、したがって、利用可能なモノマー単位の数、Ｚｎ：ＧＡＵの所望の比、種々のタイプの部分の所望の数等の間のバランスを反映する。ポリマー鎖１本当たりの任意の単一部分の約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、又は約８：１の比が企図される。より高い比もまた企図されるが、より多くの部分が添加される場合に、獲得される利益はより少ない場合が多いことが、当業者に認識される。
【００６１】
ＺｎＰＧＡ組成物は概して、まず、所望の平均分子量、多分散性、コンジュゲートされた部分等を有するＰＧＡポリマーを得ること、又は調製することによって調製される。また、例えば、より広範囲のポリマーサイズを提供するため、種々の標的化能力を提供するため、などの互いの特徴が異なるＰＧＡポリマーの混合物を使用してもよい。続いて、ＰＧＡポリマーは、緩衝水溶液中で亜鉛塩と組み合わせられ、本明細書中に開示する処置方法で使用され得るＺｎ（ＩＩ）剤である薬学的に許容可能な配合組成物を調製するために適切に処理される。ＺｎＰＧＡ組成物及びＺｎ（ＩＩ）剤（配合物）を調製する例示的な方法は、本明細書中の実施例において提供される。
【００６２】
液体投薬形態の組成物又は配合物中に提供される亜鉛の濃度は、一般的に約１μｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの亜鉛（亜鉛（ＩＩ）イオン）の範囲内に存在する。これは、約０．０００１ｗｔ％〜約１０ｗｔ％の亜鉛の範囲に相当する。Ｚｎ（ＩＩ）の濃度は、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、又は少なくとも約０．１ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬであり得るか、或いはＺｎ（ＩＩ）の濃度に関する範囲は、これらの例示的な濃度のいずれか２つ内に収まり得る。一実施形態において、濃度は、約１００μｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの範囲内に存在し得る。別の実施形態において、濃度は、約２００μｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬの範囲内に存在し得る。
【００６３】
投薬形態で提供される液体の量が、総投薬量を決定する。例えば、１００ｍＬ量の液体は、上記第１の例示的な範囲に関して約１０ｍｇ〜約５００ｍｇのＺｎ（ＩＩ）を、第２の範囲に関して約２０ｍｇ〜約２００ｍｇのＺｎ（ＩＩ）を提供する。液体配合物の、使用するのに適した濃度及び量は概して、患者の体重に依存する。適切な投薬レジメンは概して、１日につき患者の体重当たり（例えば、１ｋｇ当たり）の亜鉛の量として提供され、したがって、Ｚｎ  ｍｇ／ｋｇ／日の数として表される。
【００６４】
適切な液体配合物として、液体溶液、液体懸濁液、シロップ、及び経口スプレーが挙げられる。液体溶液は、経口投与され得るか、或いは注射によって、例えば、静脈内に、皮内に、筋内に、クモ膜下腔内に、若しくは皮下的に、又は腫瘍に、若しくは腫瘍の近傍に直接投与され得るのに対して、液体懸濁液、シロップ及びスプレーは、一般的に経口投与に適している。
【００６５】
液体投薬形態を調製する方法は、所望の量の（ｉ）亜鉛塩（複数可）及びＰＧＡ担体及び／又は（ｉｉ）ＺｎＰＧＡ複合体を、適切な賦形剤と共に一緒に混合することを含む。幾つかの実施形態は、配合物中に胃耐性結合剤及び／又はコーティングを更に含む。
【００６６】
液体溶液配合物は、適切な担体、希釈剤、緩衝液、防腐剤、又は投与の形態に関して適切に選択される他の賦形剤を用いて調製され得る。例えば、静脈内配合物は、適切なｐＨで、また等張剤を用いて緩衝されて調製され得る。
【００６７】
注射又は経口送達に適した液体配合物の実施形態は、亜鉛（ＩＩ）塩、ＰＧＡ担体（上述するような未修飾ＰＧＡ及び／又は任意の形態の修飾ＰＧＡ）、及び水を含む。更なる実施形態において、液体配合物は、緩衝液及び／又は塩、例えば、塩化ナトリウムを更に含み得る。緩衝剤が含まれる場合、好ましい緩衝ｐＨは、約ｐＨ４〜約ｐＨ９の範囲内である。注射される場合、好ましくは溶液は、それが注射されるべき溶液と等張性であり、適切なｐＨを有する。一実施形態において、硫酸亜鉛七水和物、α−ＰＧＡ、及び塩化ナトリウムは、水中で組み合わせられ、ここで、亜鉛（ＩＩ）の濃度は、１ｍｇ／ｍＬであり、γ−ＰＧＡは、１０ｍｇ／ｍＬである。γ−ＰＧＡのポリマー分子量は、上述の範囲のいずれかから選択され得る。一実施形態において、γ−ＰＧＡのポリマー分子量は、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲内であり、他の実施形態において、γ−ＰＧＡのポリマー分子量は、約２．５ｋＤａ〜約５０ｋＤａの範囲内である。任意の実施形態において、γ−ＰＧＡの１つ又は複数のポリマー分子量形態が含まれ得る。
【００６８】
幾つかの実施形態において、亜鉛塩及びＰＧＡ担体は、ＺｎＰＧＡ複合体として調製され得る。概して、ＺｎＰＧＡ複合体を形成するために、亜鉛塩（複数可）及びＰＧＡ担体は、例えば実施例１、実施例２及び実施例１２〜実施例２３に記載するように、組み合わせられて、精製される。得られたＺｎＰＧＡ複合体の溶液は、希釈されてもよく、又は実質的に乾燥されて、液体投薬形態を調製する手順における使用のためのより濃縮された形態で再構成されてもよい。ＺｎＰＧＡ複合体は、注射可能な溶液として、又は液体懸濁液、シロップ、若しくはスプレーとして配合され得る。
【００６９】
実施例９で開示されるように、マウスは、注射によって、Ｃ００４Ｚｎ（ＩＩ）剤の溶液で処置されて、０．５ｍｇ／体重ｋｇ／日、１．０ｍｇ／体重ｋｇ／日、又は２．５ｍｇ／体重ｋｇ／日の生理学的に重要な用量のＺｎ（ＩＩ）を受容し、又は、注射によって、Ｃ００５ＤＺｎ（ＩＩ）剤の溶液で処置されて、０．５ｍｇ／体重ｋｇ／日、１．０ｍｇ／体重ｋｇ／日、又は２．０ｍｇ／体重ｋｇ／日の生理学的に重要な用量のＺｎ（ＩＩ）を受容した。
【００７０】
実施例１０で開示されるように、マウスは、静脈内に、単独で又は併用療法の処置で抗ヒトＰＤ−１抗体と併用して、２ｍｇ／体重ｋｇ／日のＣ００５Ｄ溶液で処置された。
幾つかの実施形態において、Ｚｎ（ＩＩ）剤は、固体投薬形態として配合される。単一固体投薬形態に含まれる亜鉛の量は、一般的に約１ｍｇ〜約１００ｍｇの亜鉛（亜鉛（ＩＩ）イオン）の範囲内である。したがって、塩の量が対イオンの重量に相当しなくてはならないので、配合組成物において使用される亜鉛塩（複数可）の特定の量はより高い。亜鉛（ＩＩ）のみを考慮すると、投薬形態で提供される量は、最大約１００ｍｇ、最大約７５ｍｇ、最大約５０ｍｇ、最大約２５ｍｇ、最大約１０ｍｇの亜鉛、又は最大約５ｍｇであり得る。固体投薬形態で提供される亜鉛（ＩＩ）の量は、一般的に少なくとも約１ｍｇである。比較の目的で、一般的に入手可能なサプリメントは、例えば、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、及び更には１００ｍｇの亜鉛を提供する。提供される量が、生理学的に過剰なレベルの亜鉛を吸収させない限りは、この範囲の、又は更にはより高い任意の量の亜鉛が許容可能である。しかしながら、過剰なレベル及びそれに由来するリスクとみなされ得るものは、腫瘍を処置することによって獲得される治療上の利益とバランスが保たれるべきである。ほとんどの成体における亜鉛の許容可能な上限摂取レベルは、約４０ｍｇ／日（子供に関しては、許容可能な上限摂取レベルは、より低い）であるが、経口的に取り込まれる固体投薬形態における亜鉛全てが、吸収される可能性は低く、亜鉛全ての幾らかが、吸収されずに身体を通り抜けることが認識されるべきである。吸収される亜鉛の量もまた、配合物によって変化するので、特定の配合物中の亜鉛含有量に関する上限は、当業者に既知の方法によって試験されて、配合物によって提供される取込みのレベルを決定することができ、続いて、配合物を投与することによって得られる処置における任意の治療上の利益を考慮して、それに応じて所与の投薬形態又は配合物に関して投与される量を調節し得る。
【００７１】
他の実施形態において、亜鉛（ＩＩ）はまた、液体中に懸濁される固体から提供され得る。亜鉛（ＩＩ）の量及び提供される懸濁液の容量は、固体及び液体投薬形態に関する上述のガイダンスに従う。
【００７２】
液体投薬形態中に含まれるＰＧＡの量は、一般的に約０．０１ｗｔ％〜約１０ｗｔ％の範囲内である。幾つかの実施形態において、量は、約０．１ｗｔ％又は約１ｗｔ％である。
【００７３】
使用される量は概して、亜鉛と、ポリグルタミン酸モノマー単位との間での所望のモル比、担体ＰＧＡの性質（即ち、未修飾であるか、或いは腫瘍標的化部分及び／又は電荷修飾部分で修飾されるかどうか）、及び担体ＰＧＡとのＺｎ（ＩＩ）複合体の形成の度合いに基づく。例えば、実施例１２及び実施例１３で説明するように、ＺｎＰＧＡ複合体は、およそ１ｗｔ％  ＰＧＡと、およそ４００μｇ／ｍＬの複合体形成された亜鉛とを含む溶液として得られた。
【００７４】
固体投薬形態中に含まれるＰＧＡの量は、一般的に約１０ｗｔ％〜約４０ｗｔ％の範囲内である。幾つかの実施形態において、量は、約２０ｗｔ％又は約３０ｗｔ％である。使用される量は概して、亜鉛と、ポリグルタミン酸モノマー単位との間での所望のモル比、亜鉛塩の質量（対イオンの重量に相当する）、及び許容可能な配合投薬形態を提供するのに必要とされる賦形剤の量に基づく。例えば、使用するＰＧＡ及び亜鉛塩の量が多いほど、所与の全体的な投薬形態サイズに関して添加され得る賦形剤の量は少ない。当業者は、安定な投薬形態を得るのに必要とされる賦形剤の量及びタイプに対して、有効成分の量のバランスを容易に保つことができる。亜鉛とＰＧＡとの間の所望の比はまた、亜鉛のミリグラム対投薬形態１つ当たりのＰＧＡのｗｔ％の比として表すことができる。例示的な比として、５ｍｇ：１０ｗｔ％、５ｍｇ：２０ｗｔ％、５ｍｇ：４０ｗｔ％、３０ｍｇ：１０ｗｔ％、３０ｍｇ：２０ｗｔ％、３０ｍｇ：４０ｗｔ％、又は更には１００ｍｇ：１０ｗｔ％、１００ｍｇ：２０ｗｔ％、１００ｍｇ：４０ｗｔ％、或いは各成分に関して引用される値から明らかな値の任意の他の組が挙げられる。
【００７５】
有効な量のＺｎ（ＩＩ）塩及びポリグルタミン酸担体を有する適切な固体又は液体組成物及び薬学的に許容可能な配合物に達するために、ＰＧＡ及び亜鉛の相対量並びに各々の濃度を、本開示に従って当業者によって容易に調節することができる。
【００７６】
本明細書中に記載する投薬形態は、治療上有効な量の亜鉛（ＩＩ）を提供するように投与されて、対象において所望の生物学的応答を達成し得る。治療上有効な量は、Ｚｎ（ＩＩ）、ＰＧＡ、及びＰＧＡに対する任意の修飾の複合効果、任意のＺｎＰＧＡ複合体の形態、及び／又は投薬形態の送達効率等により治療を必要とする患者に送達される亜鉛の量が、所望の生物学的応答を達成することを意味する。治療上有効な量はまた、患者が免疫腫瘍剤も受容している併用療法の処置方法でも異なり得る。相乗効果が得られる場合、亜鉛（ＩＩ）剤の治療上有効な量は、単剤療法の処置方法よりも低い可能性がある。
【００７７】
所望の生物学的応答として、対象、例えば哺乳動物における、例えばヒト（患者とも称され得る）における腫瘍若しくは癌の発症又は発達の防止、腫瘍若しくは癌の進行の部分的若しくは総合的な防止、遅延又は阻害、或いは腫瘍若しくは癌の再発の防止、遅延又は阻害が挙げられる。処置方法の臨床上の利益は、他覚的奏効率、腫瘍サイズ、応答の持続期間、処置の失敗に至る時間、無増悪生存、並びに臨床用途で評価される他の一次及び二次エンドポイントによって評価され得る。
【００７８】
本明細書中に開示する処置方法は、固形若しくは造血癌又は腫瘍等の広範囲のヒト癌の処置に使用され得る。例えば、本明細書中に開示する方法及び処置は、遺伝的不安定性突然変異及び／又は遺伝子過剰発現に起因した遺伝的不安定性を有する腫瘍細胞を含む腫瘍を有する患者を処置するのに使用され得る。幾つかの実施形態において、本明細書中に記載する腫瘍細胞の遺伝的不安定性突然変異は、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＰＡＸＩＰ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＷＲＮ、ＲＦＣ１、ＲＰＡ１、ＥＲＣＣ１、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ６、ＭＧＭＴ、ＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ２、ＮＥＩＬ３、ＸＲＣＣ１、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＴＰ５３、ＣＲＥＢＢＰ、ＪＡＫ１、ＮＦＫＢ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、及びＭＬＨ３から選択される１つ又は複数の遺伝子における機能障害性突然変異である。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＡＴＭ遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＡＴＲ遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＰＡＸＩＰ１遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＢＲＣＡ１遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＢＲＣＡ２遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＷＲＮ遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＲＦＣ１遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＲＰＡ１遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＥＲＣＣ１遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＥＲＣＣ４遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＥＲＣＣ６遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＭＧＭＴ遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＰＡＲＰ１遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＰＡＲＰ２遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＮＥＩＬ３遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＸＲＣＣ１遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＭＬＨ１遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＰＭＳ２遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＴＰ５３遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＣＲＥＢＢＰ遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＪＡＫ１遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＮＦＫＢ１遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＭＳＨ２遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＭＳＨ３遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＭＳＨ６遺伝子中に存在する。幾つかの実施形態において、機能障害性突然変異は、ＭＬＨ３遺伝子中に存在する。
【００７９】
更に、ＰＡＲＰ１媒介性壊死に対して感受性のある腫瘍タイプ全てが、本明細書中に開示する処置方法に従って処置され得る適応症であることが企図される。様々な例により、開示する組成物及び医薬配合物の実施形態を使用して、開示する方法の実施形態に従って、処置の有効性が実証される。結果により、ヒト化免疫性マウスを含むマウスモデルにおける、ｉｎ  ｖｉｖｏでのマウス癌細胞及びヒト癌細胞の有効な処置が実証される。
【００８０】
治療上有効な量の達成は、配合物の特徴に依存し、いずれも、各個体の性別、年齢、状態、及び遺伝子の構成によって異なる。例えば、遺伝的原因又は吸収不良若しくは厳しい食事制限の他の原因に起因して不十分な亜鉛を有する個体は、一般的に十分なレベルの亜鉛を有する個体と比較して、治療効果に対して異なる量を要し得る。
【００８１】
対象は概して、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜最大約５ｍｇ／ｋｇ／日の量の亜鉛が投与される。幾つかの実施形態において、投与される亜鉛の量は、約１．０ｍｇ／ｋｇ／日〜約３ｍｇ／ｋｇ／日である。多重投薬形態は、その日に一緒に又は別々に取り込まれ得る。経口投薬形態は一般的に、食事時間に関係なく投与され得る。処置は概して、所望の治療効果が達成されるまで継続する。本明細書中に記載する組成物及び配合物の低い投薬レベルもまた、腫瘍が、その再発を防止するか、遅延させるか、若しくは阻害する目的で、退縮するか、又は阻害している場合に、本発明の実施形態による処置として継続され得るか、又は予防的処置として使用され得る。
免疫腫瘍剤
上述のＺｎ（ＩＩ）剤との併用療法における使用に関して企図される免疫腫瘍剤は、任意の癌免疫療法剤であり得る。「免疫腫瘍剤」、「癌免疫療法用剤」、及び「Ｉ／Ｏ剤」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。理論によって拘束されず、これらの作用物質は、腫瘍に対する免疫応答に関与し、それにより免疫調節に関与する天然のメカニズムを妨害する、患者の免疫系における、若しくは腫瘍によって提示される受容体又はリガンドを標的とする。かかる受容体又はリガンドに対して結合する作用物質によって一般的に引き起こされる妨害は、他の場合では患者において起きるであろう天然免疫応答を活性化し得るか、刺激し得るか、抑制し得るか、又は阻害し得る。免疫腫瘍剤は、小分子薬、又は近年より一般的であるように、抗体のいずれかであり得る。
【００８２】
免疫腫瘍剤は、Ｔ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、若しくは他の抗原提示細胞、又は腫瘍細胞上に出現する受容体又はリガンドを標的とし得る。幾つかの受容体又はリガンドは、１つよりも多い細胞型で出現してもよく、したがって、特定の細胞型上に出現するような受容体又はリガンドに対する任意の言及は、利便性のためであり、本開示又は本発明の範囲を限定すると意図されない。
【００８３】
腫瘍（例えば、癌）を処置するための併用療法におけるＺｎ（ＩＩ）剤を用いた使用に適した免疫腫瘍剤として、標的とされている免疫構成成分に関して便宜上以下で記載する下記作用物質が挙げられるが、これらに限定されない。Ｉ／Ｏ剤の開発の現況に関する更なる情報は、Ｂｕｒｕｇｕ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ＳＥＭＩＮＡＲＳ  ＩＮ  ＣＡＮＣＥＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ２０１８，５２，３９−５２において提供される。
【００８４】
或る特定の実施形態において、免疫腫瘍剤は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）阻害剤である。例えばニボルマブ、ペムブロリズマブ、ＭＥＤＩ０６８０（以前は、ＡＭＰ−５１４）、ＡＭＰ−２２４、又はＢＧＢ−Ａ３１７のような薬物に関する情報を含む、ＰＤ−１阻害剤の組成物、調製方法、配合物、投薬及び投与を含むＰＤ−１阻害剤に関する情報は、記載される通りであり、公表されている。
【００８５】
或る特定の実施形態において、免疫腫瘍剤は、プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）阻害剤である。例えばアテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、ＣＫ−３０１、ＺＫＡＢ００１、及びｆａｚ０５３のような薬物に関する情報を含む、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の組成物、調製方法、配合物、投薬及び投与を含むＰＤ−Ｌ１阻害剤に関する情報は、記載される通りであり、公表されている。
【００８６】
或る特定の実施形態において、免疫腫瘍剤は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）阻害剤である。例えばイピリムマブのような薬物に関する情報を含む、ＣＴＬＡ−４阻害剤の組成物、調製方法、配合物、投薬及び投与を含むＣＴＬＡ−４阻害剤に関する情報は、記載される通りであり、公表されている。
【００８７】
免疫チェックポイント阻害剤の第１の組としてのＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及びＣＴＬＡ−４阻害剤は多くの場合、それ自体に対して言及されるが、この表示は、群を限定又は定義するものとみなされるべきである。多くの他の免疫チェックポイントが、以下で記載するように阻害剤又は刺激剤に対する標的として開発中である。それにもかかわらず、認可された製品の第１の群は、当業者の理解にとって重要である。これらのＩ／Ｏ剤の状況に関する更なるバックグラウンドは、Ｃｈａｅ，Ｙ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｕａｌ  ａｎｔｉ−ＣＴＬＡ−４  ａｎｄ  ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１  ｂｌｏｃｋａｇｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ，ＪＯＵＲＮＡＬ  ＦＯＲ  ＩＭＭＵＮＯＴＨＥＲＡＰＹ  ＯＦ  ＣＡＮＣＥＲ  ２０１８，６，３９に提供される。
【００８８】
或る特定の実施形態において、免疫腫瘍剤は、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）阻害剤である。ＬＡＧ−３（ＣＤ２２３）は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び樹状細胞で発現される阻害性受容体である。アップレギュレーションは、顕性活性化を制御して、自己免疫を防止するのに必要とされるが、腫瘍微小環境における持続性抗原曝露は、能力が低減された表現型の消耗をもたらすことが報告されている。目下開発中のＩ／Ｏ剤として、ＲＥＧＮ３７６７、ＩＭＰ３２１、ＢＭＳ−９８６０１６、ＬＡＧ５２５、及びＭＫ−４２８０−００１が挙げられる。受容体及び臨床試験の論述は、Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｌ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）  ａｓ  ａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｔａｒｇｅｔ，  ＩＭＭＵＮＯＬ．ＲＥＶ．２０１７，２７６（１），８０−９６に提供される。
【００８９】
或る特定の実施形態において、免疫腫瘍剤は、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有分子３（ＴＩＭ−３）阻害剤である。ＴＩＭ−３は、共阻害性免疫受容体である。その発現は、Ｔ細胞活性化後に増加すると報告されており、一般的に、腫瘍微小環境においてＴ細胞の最も機能障害性の集団を指し示す。目下開発中のＩ／Ｏ剤として、ＴＳＲ−０２２、ＬＹ３３２１３６７、Ｓｙｍ０２３、及びＭＢＧ４５３が挙げられる。
【００９０】
或る特定の実施形態において、免疫腫瘍剤は、Ｔ細胞免疫グロブリン及びＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）阻害剤である。ＴＩＧＩＴは、Ｔｒｅｇ、活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＮＫ細胞で発現される。ＴＩＧＩＴを遮断することにより、抗ＰＤ１療法を受けたマウスにおいて、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性が改善されることが報告されている。目下開発中のＩ／Ｏ剤として、ＯＭＰ−３１３Ｍ３２、ＢＭＳ−９８６２０７、ＭＴＩＧ７１９２Ａ／ＲＧ６０５８が挙げられる。
【００９１】
或る特定の実施形態において、免疫腫瘍剤は、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）阻害剤である。目下開発中のＩ／Ｏ剤として、ＭＧＡ２７１、ＭＧＤ００９（二重親和性再標的化タンパク質）が挙げられる。
【００９２】
或る特定の実施形態において、免疫腫瘍剤は、Ｔ細胞活性化のＶ−ドメイン含有Ｉｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）阻害剤である。目下開発中のＩ／Ｏ剤として、ＪＮＪ−６１６１０５８８及びＣＡ−１７０（小分子薬）が挙げられる。ＶＩＳＴＡの免疫チェックポイント阻害は、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生の活性化をもたらすと報告されている。
【００９３】
或る特定の実施形態において、免疫腫瘍剤は、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）阻害剤である。ＩＣＯＳは、Ｂ７−結合タンパク質のＣＤ２８ファミリーにおける受容体であり、主に活性化されたＴ細胞によって発現される。Ｔ細胞活性化及びエフェクター機能を維持すると同時にＴｒｅｇ抑制性活性にも関与することのその二重の役割により、ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳ−Ｌは、免疫腫瘍療法にとって適切な標的となる。目下開発中のＩ／Ｏ剤として、アゴニスト及びアンタゴニスト抗体の両方を含むＪＴＸ−２０１１、ＢＭＳ−９８６２２６、ＭＥＤＩ−５７０及びＧＳＫ３３５９６０９が挙げられる。
【００９４】
或る特定の実施形態において、免疫腫瘍剤は、ＣＤ２７阻害剤である。ＣＤ２７は、そのリガンドであるＣＤ７０への結合により細胞活性化、増殖、エフェクター機能、及び細胞生存を媒介する細胞内シグナルを誘導するＴ細胞上の共刺激性分子である。刺激が、Ｔ細胞活性化及び抗腫瘍活性をもたらすと報告されている。目下開発中のＩ／Ｏ剤として、ＣＤ２７のアゴニストであるＣＤＸ−１１２７（バルリルマブ（Ｖａｒｌｉｌｕｍａｂ））が挙げられる。そのリガンドであるＣＤ７０を標的とするＩ／Ｏ剤として、ＡＲＧＸ−１１０、ＢＭＳ−９３６５６１、及びボルセツズマブマホドチンが挙げられる。
【００９５】
或る特定の実施形態において、免疫腫瘍剤は、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）阻害剤である。ＧＩＴＲは、Ｔｒｅｇで構成的に発現されて、活性化されたＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞で誘導される。そのリガンド（ＧＩＴＲ−Ｌ）への結合が、エフェクターＴ細胞を刺激する。目下開発中のＩ／Ｏ剤として、ＴＲＸ５１８、ＭＥＤＩ１８７３、ＧＷＮ３２３、及びＩＮＣＡＧＮ０１８７６が挙げられる。更なるバックグラウンドは、Ｋｎｅｅ，Ｄ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ｆｏｒ  ａｎｔｉ−ＧＩＴＲ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ＥＵＲＯ．Ｊ．ＣＡＮＣＥＲ  ２０１６，６７，１−１０に提供される。
【００９６】
或る特定の実施形態において、免疫腫瘍剤は、ＣＤ４７阻害剤である。ＣＤ４７の過剰発現は、ほとんどの癌で観察されており、悪性細胞による免疫監視からの回避の理由であると考えられる。目下開発中のＩ／Ｏ剤として、Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４、ＣＣ−９０００２、及びＴＴＩ−６２１が挙げられる。更なるバックグラウンドは、Ｈｕａｎｇ，Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＣＤ４７：ｔｈｅ  ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｃｅｒｎｓ  ｏｆ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｊ．ＴＨＯＲＡＣ．ＤＩＳＥＡＳＥ  ２０１７，９（２），Ｅ１６８−Ｅ１７４に提供される。
【００９７】
或る特定の実施形態において、免疫腫瘍剤は、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤である。ＩＤＯは、免疫抑制性腫瘍微小環境を創出するトリプトファンを代謝する免疫調節性酵素である。ＩＤＯの阻害は、免疫細胞の増殖及び活性化を支持して、トリプトファン代謝産物の免疫抑制効果を相殺する。目下開発中のＩ／Ｏ剤として、ＢＭＳ−９８６２０５及びエパカドスタット、Ｐｆ−０６８４０００３、ＧＤＣ−０９１９、及びＮＬＧ８０２（小分子）が挙げられる。
【００９８】
或る特定の実施形態において、免疫腫瘍剤は、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）阻害剤である。この受容体を遮断することにより、ＮＫ細胞の活性化、最終的には腫瘍細胞破壊が引き起こされる。目下開発中のＩ／Ｏ剤として、ＩＰＨ２１０１、ＩＰＨ４１０２、及びリリルマブが挙げられる。
【００９９】
或る特定の実施形態において、免疫腫瘍剤は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ阻害剤である。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａは、ＨＬＡ−Ｅを結合する阻害性受容体である。このリガンドは通常、腫瘍細胞上でアップレギュレート及び発現されて、活性化、したがって、腫瘍微小環境においてこの結合を遮断する阻害性Ｉ／Ｏ剤により、ＮＫ及び細胞傷害性Ｔ細胞応答が起きることが可能となる。目下開発中のＩ／Ｏ剤として、モナリズマブ（ＩＰＨ２２０１）が挙げられる。
キット
本発明は更に、Ｚｎ（ＩＩ）剤、及び幾つかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤、抗ＰＤ−１抗体、又は開示する処置方法を実施するための本明細書中に開示する任意の他の免疫腫瘍剤等のＩ／Ｏ剤を含むキットを企図する。
【０１００】
キットは通常、キットの内容物の使用目的を示すラベル及び使用説明書を含む。ラベルは、キット上に、若しくはキットとともに供給されるか、又はそうでなければキットに添付した任意の書面又は記録材料を含む。したがって、本開示は、癌を患う対象を処置するためのキットを提供し、該キットは、（ａ）有効用量のＺｎ（ＩＩ）剤及び（ｂ）Ｚｎ（ＩＩ）剤を使用するための説明書を含む。
【０１０１】
他の実施形態において、本開示は、併用療法を用いて、癌を患う対象を処置するためのキットを提供し、該キットは、（ａ）有効用量のＺｎ（ＩＩ）剤及び有効用量の免疫腫瘍剤、並びに（ｂ）本明細書中に開示する方法に従って免疫腫瘍剤と組み合わせてＺｎ（ＩＩ）剤を使用するための説明書を含む。
【０１０２】
他の実施形態において、本開示は、併用療法を用いて、癌を患う対象を処置するためのキットを提供し、該キットは、（ａ）有効用量のＺｎ（ＩＩ）剤及び有効用量の２つの免疫腫瘍剤、並びに（ｂ）本明細書中に開示する方法に従って免疫腫瘍剤と組み合わせてＺｎ（ＩＩ）剤を使用するための説明書を含む。
【０１０３】
他の実施形態において、本開示は、癌を患う対象を処置するためのキットを提供し、該キットは、（ａ）有効用量のＺｎ（ＩＩ）剤及び有効用量の抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合部分、並びに（ｂ）本明細書中に開示する方法のいずれかにおいて抗ＰＤ−１抗体と組み合わせてＺｎ（ＩＩ）剤を使用するための説明書を含む。
【０１０４】
幾つかの実施形態において、Ｚｎ（ＩＩ）剤及びＩ／Ｏ剤は、単位投薬形態で同時包装され得る。ヒト患者を処置する或る特定の実施形態において、キットは、本明細書中に開示する抗ヒトＰＤ−１抗体、例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ＭＥＤＩ０６８０（以前は、ＡＭＰ−５１４）、ＡＭＰ−２２４、又はＢＧＢ−Ａ３１７を含む。或る特定の実施形態において、キットは、各組合せが別々に本明細書中に含まれるかのように、上述のＩ／Ｏ剤のいずれかの１つ又は複数を含む。
【０１０５】
本発明の主題は、下記の実施例によって更に説明される。
【実施例】
【０１０６】
実施例１：Ｚｎ（ＩＩ）剤Ｃ００４の調製
Ｚｎ（ＩＩ）剤Ｃ００４（構造に関しては図１Ａを参照、４５ｋＤａのγ−ＰＧＡの亜鉛塩（コンジュゲートされていない））を、下記の通りに調製及び配合した。塩化ナトリウム、及び水。硫酸亜鉛七水和物及び４５ｋＤａのγ−ＰＧＡ（多分散）を、塩化ナトリウムを含有する水溶液中で組み合わせて、トロメタモール（ｔｒｏｍｅｔｈａｍｏｌ）及び水をその容量に添加して、必要に応じてｐＨを７．０に調節し、ここで、各構成成分の濃度は、Ｚｎ／グルタメートモノマーのモル比１：４．５で、１ｍｇ／ｍＬの亜鉛（ＩＩ）、１０ｍｇ／ｍＬのγ−ＰＧＡ、及び１ｍＭトロメタモール、１ｍＭ塩化ナトリウムである。
【０１０７】
実施例２：Ｚｎ（ＩＩ）剤Ｃ００５Ｄの調製
Ｚｎ（ＩＩ）剤Ｃ００５Ｄ（構造に関しては図１Ａを参照、フォレート−ＰＥＧ４−ＮＨ２及びｃＲＧＤｆＫ−ＰＥＧ４−ＮＨ２にコンジュゲートされた４５ｋＤａのγ−ＰＧＡの亜鉛塩）を、下記の通りに調製及び配合した。まず、Ｂｏｃ−ＮＨ２−ＰＥＧ４−ＮＨ２を、葉酸の尾部カルボキシル基に、ＥＤＣカップリング反応を介してカップリングすること、続くＴＦＡ脱保護によって、フォレート−ＰＥＧ４−ＮＨ２を調製した。同様に、２ＨＮ−ＰＥＧ４−ＣＯＯＨを、ｃＲＧＤｆＫのリジンアミンに、ＥＤＣカップリングによってカップリングすることによって、ｃＲＧＤｆＫ−ＰＥＧ４−ＮＨ２を調製した。次に、完全にプロトン化した４５ｋＤａのγ−ＰＧＡ（多分散）を、フォレート−ＰＥＧ４−ＮＨ２及びｃＲＧＤｆＫ−ＰＥＧ４−ＮＨ２に、ワンポットＥＤＣカップリング反応で１：３：３の比でコンジュゲートして、ここで、フォレート及びｃＲＧＤｆＫ部分の１００％が、γ−ＰＧＡに首尾よく結合された。続いて、得られたγ−ＰＧＡコンジュゲートを、溶媒交換によって精製し、生理食塩水中で、亜鉛：グルタメートモノマー＝１：４．５のモル比で、硫酸亜鉛とともに添加して、ｐＨをおよそ６に調節して、Ｚｎ（ＩＩ）剤Ｃ００５Ｄを得た。
【０１０８】
実施例３：ＨｅＬａ細胞に対するＺｎ（ＩＩ）剤の細胞傷害性
ＨｅＬａに対する、Ｃ００４（実施例１を参照）及び種々の分子量のコンジュゲートされていないＰＧＡポリマーを含む類似したＺｎ（ＩＩ）剤の細胞傷害性を、亜鉛（ＩＩ）濃度の関数として試験した。具体的な試験条件及び結果を、図２Ａ〜図２Ｂに示す。図２Ａでは、Ｚｎ（ＩＩ）イオンの供給源は、硫酸亜鉛又は塩化亜鉛であった。図２Ｂでは、Ｚｎ：ＡＵＴの比は、１：４．５又は１：１であった。
【０１０９】
ＨｅＬａ細胞の細胞培養物調製。ＡＴＣＣのガイドラインに従って、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  Ｒ．，ＣＵＬＴＵＲＥ  ＯＦ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬＳ  （６ｔｈ  ｅｄ．）ｖｏｌ．３４６（２０１０）によって記載されるように、細胞培養物を調製した。簡潔に述べると、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）を、完全成長培地（ＣＧＭ）として使用した。３７℃及び５％ＣＯ２で成長させた新鮮な接着細胞を、０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン−ＥＤＴＡ（０．５３ｍＭ）溶液で完全にすすいで、全ての微量のトリプシン阻害剤を除去した。細胞層分散のために、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液３．０ｍＬを、すすいだフラスコに、１５分間添加することによって、細胞を剥離及び脱凝集させて、その後、更なる細胞解離のために、ＣＧＭ  ７．０ｍＬを、穏やかにピペッティングして添加した。継代培養用に、又は細胞株実験の調製用に、解離させた細胞懸濁液を、１：４の比で新たな培養容器へ分取して、続いて、３７℃でインキュベートした。
【０１１０】
細胞生存度試験。製造業者の説明書に従って、ＣＣＫ−８試験を実施した。簡潔に述べると、対象の培養細胞を、９６ウェルプレートにおいて、特定の時間、特定の処置剤とともにインキュベートした。目的の条件で、ＷＳＴ−８溶液１０μＬを、３７℃で１時間のインキュベーションのために添加した。次に、細胞生存度定量化のために、４６０ｎｍで吸光度について、プレートを測定した。
【０１１１】
図２Ａ〜図２Ｂに報告する研究は、Ｚｎ（ＩＩ）剤が、試験したポリマー分子量の中間で最大細胞傷害性を示し、また下端と比較して上端ではあまり傷害性を示さないことを示した。また、Ｚｎ：ＧＡＵ比１：４．５の比は、１００ｋＤａ未満の全てのγ−ＰＧＡに関して、一貫して１：１の比の作用物質よりも細胞傷害性が高かった。
【０１１２】
実施例４：ＨｅＬａ細胞におけるＣ００４及びＣ００５ＤのＩＣ５０決定。
ＨｅＬａ細胞におけるＣ００４（実施例１を参照）及びＣ００５Ｄ（実施例２を参照）に関するＩＣ５０値を決定した。実施例３に記載する試験方法を使用して、結果を図３Ａ〜図３Ｂに示す。
【０１１３】
図３Ａに示すように、ＨｅＬａに対するＣ００４に関するＩＣ５０は、２４時間及び４８時間で、それぞれ、Ｚｎ  １５．１８μｇ／ｍＬ及びＺｎ  １５．３０μｇ／ｍＬであった。図３Ｂに示すように、Ｃ００５Ｄに関するＩＣ５０は、２４時間で、Ｚｎ  ４μｇ／ｍＬであった。
【０１１４】
実施例５：細胞死メカニズムの分析
ＨｅＬａ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣ００４に曝露することにより、６時間後にポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリマー（ＰＡＲポリマー）の時間及び用量依存的蓄積が誘導され、これは、凝縮した核を示す壊死性細胞の外観と合致した（図４Ａ及び図４Ｂ）。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）及びアネキシン−Ｖ−Ｄ−６３４（ＡｎｘＶ）を使用した死のモードのフローサイトメトリー的な特徴付けは、壊死性細胞死の裏付けとなるパターンを示し、それにより、瀕死の細胞は、Ｚｎ  ２２μｇ／ｍＬのＣ００４での６時間のインキュベーション後に、ＰＩ及びＡｎｘＶの両方の同時取込みを示し、漏出性の核及び細胞膜を示した（図４Ｃ）。他方で、時間分解乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイは、同じ条件下で２４時間後のみ、壊死性漏出を示した（図４Ｅを参照）。
【０１１５】
パータナトスに特徴的であると報告されている事象（Ａｎｄｒａｂｉ，  Ｓ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．１１１，ｐ．１０２０９−１０２１４（２０１４）を参照）と合致して、この細胞死は、２時間の処置後に細胞性ＮＡＤ＋及びＡＴＰの用量依存的欠乏が先行した（図４Ｄ）。特異的なＰＡＲＰ−１阻害剤ＰＪ３４とともにＣ００４を２４時間共インキュベートすることが、ＬＤＨ放出アッセイによって評価した場合に、壊死性死の抑制をもたらした（図４Ｅ）。同様に、図４Ｅにも示すように、シクロスポリンＡ（ＭＰＴＰ形成）、ネクロスタチン−１（ＲＩＰ１）、３−ＭＡ（ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１）、及びピフィスリン−μ（ｐ５３及びｐ６２／ＳＱＳＴＭ１の二重阻害）を含むパータナトスにおける重要な下流酵素の幾つかの阻害剤はまた、ＨｅＬａ細胞における壊死性細胞傷害性の抑制をもたらした。それとは反対に、ＰＤＴＣによるＪＮＫ活性化からのｐ６２／ＳＱＳＴＭ１のアゴニズムは、ＩＣ５０壊死性細胞傷害性における変化を引き起こさなかった。最後に、特異的なＰＡＲＧ阻害剤ＰＤＤ  ０００１７２７３もまた、壊死性細胞傷害性を抑制し、これは、パータナトス中に細胞傷害性決定因子としてＰＡＲＰ１−ＰＡＲＧ  ＮＡＤ＋異化サイクルを示唆した。これらの見解により、Ｃ００４誘発性パータナトスの主要な下流細胞傷害性メカニズムとして、これまで提唱されたＲＩＰ１及びｐ６２／ＳＱＳＴＭ１同調ネクロプトーシスが集約的に示唆された（図１８）。Ｇｏｏｄａｌｌ，Ｍ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．３７，３３７−３４９（２０１６）を参照のこと。
【０１１６】
実施例６：５０個の癌細胞株における細胞生存度に対するＺｎ／γ−ＰＧＡ剤Ｃ００４の効果
この研究では、細胞生存度に対するＺｎ（ＩＩ）剤の潜在的効果を、５０個の癌細胞株において検討した。種々の濃度の活性剤とのインキュベーション後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存度アッセイを使用して、癌細胞株において５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を決定した。各細胞株を、活性Ｚｎ（ＩＩ）剤、参照対照としての標準的な化学療法薬、及びビヒクル対照としての培養培地で処置した。
【０１１７】
この実施例で使用する略号：ＣＴＧ：ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ、ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド、ＦＢＳ：ウシ胎児血清、ＩＣ５０：５０％阻害濃度、ＩＤ：アイデンティティ、Ｌｕｍ：発光、ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水、ＲＴ：室温。
【０１１８】
細胞株。細胞株は全て、１０％〜１５％ＦＢＳを補充した培地中で、温度３７℃で、５％ＣＯ２、及び湿度９５％で培養した。全ての細胞株に関する参照対照薬物はシスプラチンであり、ゲノム分析に使用した。試験した細胞株、起源の組織を以下で表１に示す：
【０１１９】
【表１】
2021527707.tif 000003
【０１２０】
材料及び試薬。
一般的な細胞培試薬及びプラスチック。
ＦＢＳ、（Ｃａｔ＃ＦＮＤ５００、ＥｘＣｅｌｌ  Ｂｉｏ．−２０℃で保管）
ＦＢＳ、（Ｃａｔ＃１００９１１４８、Ｇｉｂｃｏ．−２０℃で保管）
９６−ウェルフラットクリアボトム黒ポリスチレンＴＣ処置マイクロプレート（Ｃａｔ＃３３４０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）。
【０１２１】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存度アッセイ（Ｃａｔ＃Ｇ７５７２、Ｐｒｏｍｅｇａ．−２０℃で保管）
基質は、９６ウェルプレートにおいて、アッセイ１回につき１００μＬで１，０００回のアッセイにとって十分である。
【０１２２】
１×１００ｍＬ    ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）緩衝液
１×バイアル      ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）基質（凍結乾燥）
試薬調製
ａ．ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ緩衝液を解凍して、使用前に室温に平衡化する。便宜上、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ緩衝液を解凍して、使用前に最大４８時間室温で保管してもよい。
【０１２３】
ｂ．凍結乾燥したＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ基質を、使用前に室温に平衡化する。
ｃ．適切な容量（１００ｍＬ）のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ緩衝液を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ基質を含有するコハクの瓶に移して、凍結乾燥した酵素／基質混合物を再構成する。これにより、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬が形成される。
【０１２４】
注釈：ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ緩衝液の瓶の液体容量全体を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ基質バイアルに添加し得る。
ｄ．内容物を穏やかにボルテックスすること、内容物を旋回させることによって、又は内容物を反転させることによって混合して、均質な溶液を得る。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ基質は、１分以内に容易に溶液になるはずである。
【０１２５】
Ｚｎ（ＩＩ）剤及び参照対照薬物。
Ｚｎ（ＩＩ）剤被験物質は、下記であった：
【０１２６】
【表２】
2021527707.tif 000004
【０１２７】
化合物のストック溶液を、分取量に分割して、これらは、４℃の冷凍庫で保管した。亜鉛（ＩＩ）剤Ｃ００４組成物は、下記であった：
【０１２８】
【表３】
2021527707.tif 000005
【０１２９】
参照対照薬物は、下記であった：
【０１３０】
【表４】
2021527707.tif 000006
【０１３１】
機器：ＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉ  Ｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ  ２１０４−００１０Ａ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（ＵＳＡ）、Ｅｑｕｉｐ  ＩＤ：ＴＡＲＥＡ００２０；Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ、Ｉｎｎｏ−Ａｌｌｉａｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ＵＳＡ）、Ｅｑｕｉｐ  ＩＤ：ＢＥＡＮＡ００２０；Ｆｏｒｍａ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ  Ｗａｔｅｒ  Ｊａｃｋｅｔ  ＣＯ２  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）、Ｅｑｕｉｐ  ＩＤ：ＢＥＩＮＣ０１９０／ＢＥＩＮＣ０２００／ＢＥＩＮＣ０２２０／ＢＥＩＮＣ０２６０；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｆｅｔｙ  Ｃａｂｉｎｅｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）、Ｅｑｕｉｐ  ＩＤ：ＢＥＢＳＣ０１７０／ＢＥＢＳＣ０１８０／ＢＥＢＳＣ０２５０／ＢＥＢＳＣ０２７０；クリーンベンチ、ＨＤＬ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ（中国）、Ｅｑｕｉｐ  ＩＤ：ＢＡＣＬＢ０３９０；Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸＰ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ、ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ（ＵＳＡ）、Ｅｑｕｉｐ  ＩＤ：ＢＥＳＴＡ００１０；倒立顕微鏡、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＣＫＸ４１ＳＦ（日本）、Ｅｑｕｉｐ  ＩＤ：ＢＥＭＩＣ０１９０；Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ  ｃｏｍｂｉ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）、Ｅｑｕｉｐ  ＩＤ：  ＢＥＰＦＬ００１０。
【０１３２】
最大半量阻害濃度ＩＣ５０決定に関する手順
１．対数増殖期中に細胞を収集し、Ｃｏｕｎｔ−ｓｔａｒを使用して細胞数を計数した。
【０１３３】
２．各々の培養培地を用いて、細胞濃度を４．４４×１０４個の細胞／ｍＬに調節した。
３．細胞懸濁液９０μＬを、最終細胞密度４×１０３個の細胞／ウェルで２つの９６ウェルプレート（プレートＡ及びプレートＢ）に添加した。（細胞濃度は、データベース又は密度最適化アッセイに従って調節した。）
４ａ．翌日：Ｔ０読取りのプレートに関して：
１）Ｔ０読取りのため、培養培地１０μＬを、プレートＡの各ウェルに添加した。
【０１３４】
２）室温でおよそ３０分間、プレート及びその内容物を平衡化した。
３）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬５０μＬを各ウェルに添加した。
４）内容物を５分間、オービタルシェーカーで混合して、細胞溶解を誘導した。
【０１３５】
５）プレートを室温で２０分間インキュベートさせて、発光シグナルを安定化した。
６）ＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉ  Ｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒを使用して、発光（Ｔ０）を記録した。
【０１３６】
４ｂ．試験読取りのプレートに関して。
１）Ｚｎ（ＩＩ）剤被験物質の１０倍溶液を調製した。最高作業濃度：２／２．５倍段階希釈で５０μｇ／ｍＬ濃度、２５μｇ／ｍＬ濃度、１０μｇ／ｍＬ濃度、５μｇ／ｍＬ濃度、２．５μｇ／ｍＬ濃度、１μｇ／ｍＬ濃度、０．５μｇ／ｍＬ濃度、０．２５μｇ／ｍＬ濃度、及び０μｇ／ｍＬ濃度の９個の用量レベルのＺｎ（ＩＩ）剤を達成するように培地中５０μｇ／ｍＬの被験物質。
【０１３７】
２）１０倍参照対照溶液シスプラチンを調製した。最高作業濃度：３．１６倍段階希釈で１００μＭ濃度、３１．６μＭ濃度、１０μＭ濃度、３．１６μＭ濃度、１μＭ濃度、３１６ｎＭ濃度、１００ｎＭ濃度、３１．６ｎＭ濃度、及び１０ｎＭ濃度の９個の用量レベルのシスプラチンを達成するように培地中１００μＭ。
【０１３８】
３）プレートＢの各ウェル中に被験物質及び参照対照の両方の１０μＬ（１０倍）薬物溶液を分注した（各薬物濃度に関して三重反復）。
４）５％ＣＯ２を有する３７℃の加湿インキュベーター中で、試験プレートＢを９６時間インキュベートした後、ＣＴＧアッセイを用いて測定した。
【０１３９】
５）プレート及びその内容物を室温でおよそ３０分間平衡化した。
６）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬５０μＬを各ウェルに添加した。
７）内容物をオービタルシェーカーで５分間混合して、細胞溶解を誘導した。
【０１４０】
８）プレートを室温で２０分間インキュベートさせて、発光シグナルを安定化させた。
９）発光を記録した。
データ分析
１０）データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０を使用してグラフで表示した。
【０１４１】
１１）絶対ＩＣ５０（ＥＣ５０）を算出するために、非線形回帰モデルを使用して用量−応答曲線をシグモイド用量応答とフィットさせた。生存率を算出するための式を以下に示し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０によって作成した用量−応答曲線に従って、絶対ＩＣ５０（ＥＣ５０）を算出した。
【０１４２】
１２）生存率（％）＝（被験物質の発光−培地対照の発光）／（未処置の発光−培地対照の発光）×１００％。
結果。
【０１４３】
【表５】
2021527707.tif 000007
【０１４４】
【表６】
2021527707.tif 000008
【０１４５】
【表７】
2021527707.tif 000009
【０１４６】
各細胞株に関する用量応答曲線を、図５Ａ〜図５Ｉに示す。
実施例７：遺伝的不安定性突然変異（ＧＩＭ）分析
Ｃ００４のパータナトスメカニズムを考慮すると、遺伝的不安定性突然変異は、より高いＰＡＲ化能を付与することによって、Ｃ００４に対する癌感受性を高めるはずである。したがって、スクリーニング結果を使用して、相同組換え修復、ヌクレオチド除去修復、直接的な反転、塩基除去修復、ミスマッチ修復、ＤＮＡ損傷シグナル、及び他の関連機能を取り囲む単一突然変異効果の分析を試験した。細胞株に集積されたゲノム情報の品質を保証すること、及びそれらの生物学的意義の有意義な解釈のために、シスプラチンデータを、陽性対照として使用し、シスプラチンデータは、ＭＳＨ２ｍｔに対するシスプラチン耐性、ＢＲＣＡ１ｍｔに対する感受性（図８を参照）、ＰＡＲＧｍｔによって付与されるアポトーシス耐性、ＡＴＭ及びＢＲＣＡ１等のほとんどのＤＮＡ修復遺伝子の組合せ間での多くの合成致死性の例（図１０Ｆ）、及びＢＲＣＡ１ＷＴを伴うＣＲＥＢＢｍｔ＋ＫＲＡＳｍｔに対する耐性（図１０Ｄ）の関連を含んでいた。Ｃ００４のＩＣ５０分布に対する同じゲノム情報の適用により、ＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ２、ＴＰ５３、ＭＧＭＴ、ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ１、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ６、ＲＦＣ１、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＸＩＰ１及びＷＲＮを含む試験したほとんどのＤＮＡ修復遺伝子の突然変異に対する薬物感受性の関連が実証された。ＪＡＫ１ｍｔ、ＣＲＥＢＢＰｍｔ、ＮＥＩＬ３ｍｔ、及びＮＦＫＢ１ｍｔもまた、感受性の増加と関連付けられた（図８及び図１０Ｆ〜図１０Ｌ）。突然変異誘発の最も普及しているドライバーの１つであるＡＰＯＢＥＣ３Ｂ過剰発現の効果を研究することによる、突然変異的負荷に対する増強されたＣ００４の有効性の仮説に対する更なる実験もまた、そのｓｓＲＮＡコピー数と、Ｃ００４のＩＣ５０値分布との間の逆相関を示すことによって一貫した結果を示した（図１１Ａ〜図１１Ｄ）。まとめると、これらの観察は全て、Ｃ００４の細胞傷害性が、パータナトスメカニズムに関与するという決定を支持する。
【０１４７】
更に、このメカニズムの裏付けとして、ＰＡＲＧ（ＰＡＰＲ１−ＰＡＲＧ  ＮＡＤ＋異化サイクル）、ＮＥＩＬ１又はＮＥＩＬ２（塩基除去修復の開始）等のＮＡＤ＋欠乏に対する効率的なＰＡＲＰ１の活性に関する必須パートナーにおける突然変異は、弱いが、一貫した許容度で観察された（図８）のに対して、それらの組合せは、Ｃ００４有効性の著しい減弱に至った（図１０Ｂ〜図１０Ｃ及び図１０Ｊ〜図１０Ｋ）。シスプラチンに対して強力な耐性を示すＣＲＥＢＢＰｍｔ−ＫＲＡＳｍｔ−ＢＲＣＡ１ＷＴの組合せもまた、より劣るが、Ｃ００４に対する著しい耐性と関連付けられ、潜在的な耐性メカニズムとしての突然変異コンボを認めた。最後に、ＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤（ＪＡＫ１  ２４）、アポトーシス（ＴＰ５３、ＢＡＫ１）、並びに各種抗腫瘍薬に対する耐性及び多剤耐性（ＴＰ５３  ２５、２６、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＰＭＳ２  ２７及びＮＦＫＢ１）の発現に関する既知の突然変異的ドライバーの検査により、Ｃ００４細胞傷害性が、重要ではなく（ＢＡＫ１、ＭＳＨ２）、これらの薬物耐性ドライバー突然変異に対してせいぜい活性がある（ＪＡＫ１、ＴＰ５３、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＮＦＫＢ１）ことが示された（図８、図１０）。
【０１４８】
実施例６に記載する５０個の細胞株スクリーニング試験（ＯｍｎｉＳｃｒｅｅｎ（商標））後に、ＯｎｃｏＥｘｐｒｅｓｓ（商標）データベース（Ｃｒｏｗｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、サンタクララ、データ受入日２０１８年５月１８日〜２０１８年５月３０日）を参考にすることで、各細胞株を、下記の遺伝子における突然変異の存在に関して分類した（有り又は無し）。
【０１４９】
・ＭＬＨ１（欠乏性ミスマッチ修復−ｄＭＭＲ−突然変異群の一部）
・ＭＳＨ２（欠乏性ミスマッチ修復−ｄＭＭＲ−突然変異群の一部）
・ＰＭＳ２（欠乏性ミスマッチ修復−ｄＭＭＲ−突然変異群の一部）
・ＰＡＲＰ１
・ＢＲＣＡ１（ＢＲＣＡ１／ＢＲＣＡ２突然変異群の一部）
・ＢＲＣＡ２（ＢＲＣＡ１／ＢＲＣＡ２突然変異群の一部）
・ＴＰ５３
これらの遺伝子はそれぞれ、重要なＤＮＡ修復酵素の幾つかをコードし、したがって、これらの遺伝子のいずれか１つ又は組合せにおいて突然変異を保有する細胞株が、遺伝的不安定性を有すると予想され得る。
【０１５０】
Ｚｎ／γ−ＰＧＡ及びシスプラチンＩＣ５０値、並びに選択した５０個の細胞株にわたる細胞株遺伝子突然変異データの総合データ表を図６に示す。続いて、Ｅｘｃｅｌ（登録商標）ソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、シアトル）を使用して、総合データを分析した。簡潔に述べると、或る特定の突然変異を保有する細胞株の分類に際して、また各群におけるＩＣ５０分布の更なる分析において、Ｅｘｃｅｌ（登録商標）ソフトウェアのソートアルゴリズムを使用した。
【０１５１】
次に、或る特定の遺伝子突然変異を共有する細胞株群間のＩＣ５０分布を、統計学的有意性に関して分析した。
統計分析は、ＪＭＰ  １３（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．、ケーリー、ＮＣ、ＵＳＡ）又はＯｒｉｇｉｎ  ９（Ｏｒｉｇｉｎ  Ｌａｂ  Ｃｏｒｐ．、ノーザンプトン、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して実施した。データは全て、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表し、マン・ホイットニーＵ検定又は分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、統計学的有意性に関して試験した。０．０５未満のｐ値を、統計学的に有意であると解釈した。
【０１５２】
結果及び分析。
細胞株パネル構造を層別化して、５０個の細胞株には、３０個の血液癌（白血病細胞株１７個及びリンパ腫細胞株１３個）及び乳癌細胞株（３個）、子宮頸癌細胞株（１個）、結腸直腸癌細胞株（１個）、肝臓癌細胞株（４個）、肺癌細胞株（４個）、卵巣癌細胞株（２個）、膵臓癌細胞株（２個）、前立腺癌細胞株（２個）、及び子宮癌細胞株（１個）を含む固形腫瘍癌２０個が含まれた。
【０１５３】
広域スペクトル化学療法であるシスプラチンに関する現在の処置の至適基準（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）に対して、Ｚｎ（ＩＩ）剤に関して得られる結果を比較して、シスプラチンに関する３９個のみの（５０個のうちの）細胞株における９９％を超える根絶、及び４５個の細胞株における９７％を超える根絶に対して、Ｚｎ（ＩＩ）剤は、４８個の（５０個のうちの）細胞株における９９％を超える根絶、及び５０個の細胞株における９７％を超える根絶を示した。逆に、シスプラチンは、２個の細胞株において９０％未満の根絶という乏しい応答を示した一方で、Ｚｎ（ＩＩ）剤を用いた場合、細胞株はいずれも、乏しい応答を示さなかった。
【０１５４】
Ｚｎ（ＩＩ）剤を用いた処置に関する奏効率１００％及び低いＺ値の広がり（図６を参照）は、様々な癌タイプ全てにわたってＺｎ（ＩＩ）剤に関する広範囲の適用性を実証する。特に、データにより、Ｚｎ（ＩＩ）剤が、下記ＤＮＡ修復遺伝子：ｄＭＭＲ（ＭＬＨ１／ＭＳＨ２／ＰＭＳ２）、ＰＡＲＰ１、ＢＲＣＡ１／ＢＲＣＡ２、及びＴＰ５３の１つ又は複数における突然変異を宿主する（ｈｏｓｔ）癌細胞型に対して、現在認可されている処置の至適基準よりも有効であることが実証される。相当部分の癌細胞が、これらの遺伝子の１つ又は複数において突然変異を保有し（推定は、癌全てのおよそ９０％〜９５％である）、したがって、本明細書中に開示する方法が、癌に対する広範囲の治療法であることを示す。
【０１５５】
血液癌対固形癌に関する細胞株の全組に関するデータ分析、及び突然変異によって層別化した場合の細胞株に関するデータ分析を、図９Ａ〜図９Ｆ及び図１０Ｍ〜図１０Ｐに示す。
【０１５６】
実施例８：５０個の細胞株スクリーンに基づくバイオマーカーの発見
発現及び突然変異は、ＲＮＡｓｅｑデータに由来した。５０個の細胞株のＲＮＡｓｅｑ生データは、ＣＣＬＥデータベース及びＳＲＡデータベース（ＨｅＬａ細胞株に関してはＳＲＲ６７９９７７３）からダウンロードした。遺伝子コピー数の結果は、ＣＣＬＥウェブサイトからダウンロードした。ドライバー突然変異は、ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｅｒデータベース（ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅｉｎｔｅｒｐｒｅｔｅｒ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅ）で予測され、ここでは、ドライバー突然変異のみを、突然変異分析に使用した。欠失／増幅／突然変異した遺伝子と、野生型細胞株との間で平均ｌｏｇ２（ＩＣ５０）を比較するのに、また重要な遺伝子を定義する際にウェルチのｔ検定を使用した。スピアマン相関検定を使用して、遺伝子発現レベルと、ｌｏｇ２（ＩＣ５０）との間の相関を確認した。Ｒのボルタパッケージを使用して、重要な遺伝子からシグネチャー遺伝子を選択した。形式ＬＰＳ（Ｘ）＝ΣａｊＸｊの各細胞株に関する線形予測因子スコア（ＬＰＳ）を算出した。式中、Ｘｊは、遺伝子ｊの遺伝子発現を表し、ａｊは、感受性細胞株と、非感受性細胞株との間のｔ−検定によって作成されるｔ統計学である。感受性群及び非感受性群におけるＬＰＳ分布の平均値及び分散を推定し、
【０１５７】
【数１】
2021527707.tif 000010
【０１５８】
となるようにベイズの定理を適用することによって、どちらかの群（感受性又は非感受性）における細胞株の尤度が推定された。
式中、Φ（ｘ；μ、σ２）は、平均値μ及び分散σ２での正規の密度関数を表し、μ１、σ１２、μ２、σ２２は、それぞれ、群１及び群２内のＬＰＳの観察される平均値及び分散である。統計分析は全て、Ｒを用いて行った。
【０１５９】
ＲＮＡ配列ベースのコンピューター処理バイオインフォマティクスアプローチによるスクリーニングデータを使用した初期バイオマーカー検索により、Ｃ００４感受性に関する潜在的なバイオマーカーとしてＡＤＡＭ６ｄｅｌ、ＣＲＥＢＢＰｍｔ及びＰＩＫ３ＣＡＷＴを得た（図１２Ａ〜図１２Ｃ）。
【０１６０】
実施例９：Ｚｎ（ＩＩ）剤のｉｎ  ｖｉｖｏ試験。
Ｚｎ（ＩＩ）剤Ｃ００４：Ｚｎ最大２．５ｍｇ／ｋｇ／日の用量でＣ００４の毎日の静脈内注射を用いて、６日反復毒性試験を行った。ＢＡＬＢ／ｃマウスを保有するＣＴ２６腫瘍における毒性は観察されなかったのに対して、有意な治療活性（ｐ＝０．０７２）は記録されなかった（図１３）。
【０１６１】
Ｚｎ（ＩＩ）剤Ｃ００５Ｄ：Ｚｎ  １ｍｇ／ｋｇ／日又はＺｎ  ２ｍｇ／ｋｇ／日の毎日の注射用量に関して、保有するＮＳＧマウスの免疫不全ｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおけるヒト患者駆動型肝細胞癌（ＨＣＣ  ＰＤＸ−ＮＳＧ）に対する有意な治療活性が観察された（＊ｐ＜０．０５）（図１４Ａ）。更に、Ｚｎ  ２ｍｇ／ｋｇ／日のヒト化免疫マウス（ＨＣＣ−ＰＤＸ−ＨｕＭｉｃｅ）におけるＨＣＣ  ＰＤＸに対してＣ００５Ｄを投与することにより、２０日の処置期間の終わりに、著しい腫瘍抑制効果が得られ、２匹の動物では完全な腫瘍の退縮が観察された（図１４Ｂ）。
【０１６２】
実施例１０：単剤療法及び免疫腫瘍剤併用療法並びに免疫療法相互作用。
ＣＴ２６マウス癌を保有する免疫担当ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１４日の処置、続く１０日の観察のプロトコルで、ＰＤ−１阻害剤、ａＰＤ１（５ｍｇ／ｋｇ、週に１回、静脈内）又はＣ００５Ｄ（Ｚｎ  ２ｍｇ／ｋｇ、毎日、静脈内）の単剤療法アーム、及びより少ない投与量のＣ００５Ｄ（Ｚｎ  ０．５ｍｇ／ｋｇのＣ００５Ｄ、毎日、静脈内＋５ｍｇ／ｋｇのａＰＤ１、週に１回、静脈内）を使用する併用療法アームで処置した。プロトコルの概要、各アームに関する腫瘍成長動態及びエンドポイントの腫瘍サイズを図１５に提供する。
【０１６３】
ａＰＤ１（５ｍｇ／Ｋｇ、週に１回、静脈内）又はＣ００５Ｄ（Ｚｎ  ２ｍｇ／Ｋｇ、毎日、静脈内）の単剤療法アームはいずれも、統計学的に有意な腫瘍成長抑制効果を生じなかった。しかしながら、末梢血試料及び収集した腫瘍からの終点免疫特徴付けにより、２つの単剤療法アーム間で免疫性の明白な差が明らかとなった。免疫特徴付けに関するゲーティング戦略を図１６に示す。具体的には、ａＰＤ１単剤療法の有意な（＊ｐ＜０．０５）免疫刺激性効果は、腫瘍内空間に限定され、それにより、ＮＫ細胞、Ｌｙ６Ｃ＋単球（ＭＮ）、樹状細胞、並びに全ての研究したＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットが上昇した。（図１７Ａ〜図１７Ｂを参照）。他方で、Ｃ００５Ｄ単剤療法は、末梢血区画、及び程度は劣るが、腫瘍内空間の両方において、免疫性の著しい上昇をもたらした。
【０１６４】
しかしながら、併用処置アームは、いずれかの単剤療法アームよりも、末梢区画及び腫瘍内区画の両方において、免疫性のより広汎性で有意な（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）増大をもたらした。併用アームに特異的に、メモリー細胞ＥＭ  ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＭ  ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍内レベルは、マウスの腫瘍負荷に対して逆相関を示したのに対して、完全な腫瘍退縮の２つの事例もまた、同じ群で認められた。
【０１６５】
試行の結果により、Ｚｎ（ＩＩ）剤併用療法は、免疫刺激及びＰＤ１遮断との相乗作用をもたらすことが示される。更に、これらの結果により、ａＰＤ１及びＣ００５Ｄの併用が、腫瘍クリアランスに必要とされる特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞メモリーの形成を加速し得ることが示唆される。
【０１６６】
Ｚｎ（ＩＩ）剤Ｃ００５Ｄが投与される場合の腫瘍細胞で見られると考えられる事象の模式図を図１９に示す。Ｚｎ（ＩＩ）剤から放出される亜鉛（ＩＩ）イオンは、ＰＡＲＰ−１を過剰に駆動する（ｏｖｅｒｄｒｉｖｅ）と同時にカスパーゼ−３からのＰＡＲＰ−１防御を付与することによって、ＰＡＲポリマー蓄積を誘発する。続いて、ＰＡＲポリマー産生及び蓄積により、ＡＩＦ媒介性核壊死、ＭＬＫＬ媒介性ミトコンドリア壊死、及びＭＰＴＰ媒介性ミトコンドリア壊死を含む多重壊死死滅モードに至ることが可能になる。図の右側に続いて、ＰＡＲＰ−１オーバードライブ由来の壊死は、ＤＡＭＰ放出を介してＣＤ８＋Ｔ細胞殺腫瘍活性をプライミングすることによって、二次的な免疫療法効果を付与する。表示した事象は、本明細書中の開示と一致するが、本発明の組成物、配合物、及び処置方法は、図に取り入れた理論によって拘束又は限定されない。
【０１６７】
実施例１１：ヒト化マウス実験及び腫瘍浸潤性リンパ球分析における肝細胞癌患者由来の異種移植片。
実験薬物。
【０１６８】
ペムブロリズマブ２５ｍｇ／ｍＬ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ（登録商標）ＫＧａ）は、Ｍｅｒｃｋ（登録商標）から購入した。等張性硫酸亜鉛ガンマ−ポリグルタメート溶液を、１ｍｇ／ｍＬの元素亜鉛濃度及び１０ｍｇ／ｍＬのガンマ−ポリグルタメート濃度で、Ｔｒｉｓ緩衝液（１ｍＭ）を使用してｐＨ７．０で調製した。
【０１６９】
ＮＳＧ及びＨｕｍｉｃｅ。
マウスを用いた操作及び手順は全て、Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａ＊ＳＴＡＲ）Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって認可された。提供する食餌は、照射済のＴＥＫＬＡＤ  ＧＬＯＢＡＬ  １８％  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ（２９１８）であった。マウスは、滅菌環境に収容して、ＢＳＬ２フード下のみで接近した。マウスには、食物を与え、水を付与して、健康に関して毎日モニタリングし、ケージは、週に１回交換した。ＮＳＧマウスは、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、Ａ＊ＳＴＡＲ、シンガポールのｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＢＲＣ）にある特定の病原体を含まない施設で繁殖させた。１日齢〜３日齢のＮＳＧの仔に、１．１Ｇｙに等しい５５秒の曝露で照射して、肝内注射によって、１×１０５個のＣＤ３４＋ヒト胎児肝臓細胞を移植した。マウスを、移植の８週後に出血させて、ヒト免疫細胞再構成の画分を決定した。再構成は、［％ｈＣＤ４５＋／（％ｈＣＤ４５＋％ｍＣＤ４５＋）］によって算出した。２０％〜５０％のヒトＣＤ４５＋細胞で再構成させた８週齢〜１０週齢のヒト化マウスを生着に使用した。
【０１７０】
ＨＣＣ−ＰＤＸ腫瘍維持及び異種移植片。
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＨＣＣ−ＰＤＸ皮下ヒト化モデル樹立のために、患者ＨＣＣ腫瘍を、ＨＣＣ外科的検体から収集した。手術前に、患者全てに、患者のＨＣＣ試料が研究に使用されるのに書面によるインフォームドコンセントを提出した。適切な臨床組織を採取した後、ＨＣＣの残りは、ＰＤＸが樹立されるところまで、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトアビジンを含有するＤＭＥＭで構成される培地を用いて氷上に移す。４時間以内に、ＨＣＣ断片を、滅菌手術器具を使用して約３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ片に切断した。マウスに麻酔をして、皮下配置のために剃毛して、鉗子を使用して皮膚を持ち上げて、腹膜侵害を確実になくしたら、ハサミで皮膚に小さな１ｃｍの切開を作った。皮下を探って、ポケットを創出し、組織をポケット内部に置いて、皮膚を、接着剤、縫合又はクリップで閉じる。
【０１７１】
ＮＳＧマウスにおいてＨＣＣ−ＰＤＸ腫瘍を維持するために、第一世代のマウス（Ｐ１）から得られたＨＣＣを、次のコホートのマウス（Ｐ２及びＰ３）に順次移植した。樹立されたＰＤＸから収集したＨＣＣを、層流キャビネットにおいて滅菌手術器具を使用して約３ｍｍ３×３ｍｍ３×３ｍｍ３片に切断した。片を、９５％ＦＣＳ／５％ＤＭＳＯ１．５ｍＬを含有する滅菌クライオチューブに移した。クライオチューブをＣｏｏｌＣｅｌｌ溶液（Ｂｉｏｃｉｓｉｏｎ）に入れて、−８０℃の冷凍庫に一晩置き、翌日、液体窒素保管に移した。解凍するために、融解するまでクライオチューブを水浴（３７℃）で保持した。
【０１７２】
腫瘍サイズの決定
腫瘍体積は、ノギスを使用して二次元（長さ及び幅）で測定し、腫瘍体積は、式を使用して算出した。腫瘍サイズ＝（長さ２×幅）×１／２。
【０１７３】
血液、脾臓、骨髄及びＨＣＣ−ＰＤＸ腫瘍からの白血球の単離。
血液１５０μｌ〜２００μｌを、頬の出血によりＥＤＴＡカリウムＭｉｎｉＣｏｌｌｅｃｔ（登録商標）チューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、４５０４７５）中に収集した。処理及びデータ収集に先立って、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）２０μｌと混合した血液３０μｌを、９６ウェルＶ底プレートに室温で蒔いた。新鮮な脾臓をマウスから切除して、氷上でＰＢＳ中に入れた。結合組織のみが残されるまで、シリンジプランジャーを使用して、１００μｍの細胞濾過器（Ｆａｌｃｏｎ）に通して脾臓を粉砕する。骨髄細胞単離に関しては、脛骨、大腿骨、臀部及び脊椎をマウスから切断した。清潔な骨を、培地（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で乳鉢及び乳棒を用いて粉砕した。各マウスから得られた細胞混合物は、別々に保持され、１００μｍの細胞濾過器（Ｆａｌｃｏｎ）に通して濾過した。試料は全て、収集の１時間以内に処理した。ＨＣＣからＴＩＬを単離するために、脂肪及び結合組織を切り落とした後に、腫瘍を１ｍｍ２〜２ｍｍ２断片に切り、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ヒト腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で脱凝集させた。細胞懸濁液を、１００μｍの細胞濾過器（Ｆａｌｃｏｎ）に通して濾過した。細胞懸濁液を、不連続な４０％Ｐｅｒｃｏｌｌ（登録商標）Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｍｅｄｉａ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、続く８０％Ｐｅｒｃｏｌｌ（登録商標）Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｍｅｄｉａ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に重ねた。白血球は、４０％Ｐｅｒｃｏｌｌと、８０％Ｐｅｒｃｏｌｌとの間の界面に位置する。続いて、濃縮されたＴＩＬをＤ−ＰＢＳ、１％ＢＳＡで洗浄した後、記載するように処理した。
【０１７４】
フローサイトメトリー。
血液、脾臓、骨髄及び腫瘍からの細胞混合物を、塩化アンモニウム−カリウム（ＡＣＫ）溶解緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に懸濁させて、穏やかに混合しながら室温で１０分間インキュベートし、混入している赤血球（ＲＢＣ）を溶解させた。表面染色に関して、白血球を蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）緩衝液［リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋２％ＢＳＡ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ＋０．１％アジ化ナトリウム］中で二回洗浄して、Ｆｃブロッキング試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）とともにインキュベートして、直接コンジュゲートされた抗体で染色した。細胞内染色に関して、血液白血球は、上述するように表面マーカーで標識した後、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標））で固定及び維持した（ｐｅｒｍ）。５個の抗体パネルをこの研究に使用した。ヒトＴ細胞パネル（１５色）：ｈＣＤ４−ＢＵＶ３９５、ｈＣＤ８−ＢＵＶ３７３、ｈＣＤ１８３−ＢＶ４２１、ｈＣＤ１９７−ＢＶ５１０、ｈＣＤ２５−ＢＶ６０５、ｈＣＤ１９６−ＢＶ６５０、ｈＣＤ３８−ＢＶ７１１、ｈＣＤ４５ＲＯ−ＢＶ７８５、ｈＣＤ４５ＲＡ−ＦＩＴＣ、ｈＣＤ１２７−ＰＥ、ｈＣＤ１９４−ＰＥ−ＣＦ５９４、ｈＣＤ３−ＰＥＲＣＰ５．５、ｈＣＤ１８５−ＰＥ−ＣＹ７、ｈＣＣＲ１０−ＡＰＣ及びｈＨＬＡ−ＤＲＡＰＣ−ＣＹ７。ヒト非Ｔ細胞パネル（１５色）：ｈＣＤ４５−ＢＵＶ３９５、ｈＣＤ１９−ＢＵＶ３７３、ｈＣＤ５６−ＢＶ４２１、ｈＩｇＤ−ＢＶ５１０、ｈＣＤ１１ｃ−ＢＶ６０５、ｈＣＤ２７−ＢＶ６５０、ｈＣＤ３８−ＢＶ７１１、ｈＣＤ１６ＢＶ７８５、ｈＣＤ１２３−ＦＩＴＣ、ｈＣＤ２０−ＰＥ、ｈＣＤ２４−ＰＥ−ＣＦ５９４、ｈＣＤ６６ｂ−ＰＥＲＣＰ５．５、ｈＣＤ３−ＰＥ−ＣＹ７、ｈＣＤ１４−ＡＰＣ及びｈＨＬＡ−ＤＲ−ＡＰＣ−ＣＹ７。ヒトＴｅｘ細胞パネル（１５色）：ｈＣＤ４−ＢＵＶ３９５、ｈＣＤ８−ＢＵＶ３７３、ｈＣＤ２７２−ＢＶ４２１、ｈＣＤ１９７−ＢＶ５１０、ｈＫＬＲＧ−１−ＢＶ６０５、ｈＣＤ２８−ＢＶ６５０、ｈＣＤ２７９−ＢＶ７１１、ｈＣＤ３６６−ＢＶ７８５、ｈＣＤ４５ＲＡ−ＦＩＴＣ、ｈＣＤ５７−ＰＥ、ｈＣＤ１５２−ＰＥ−ＣＦ５９４、ｈＣＤ１６０−ＰＥＲＣＰ５．５、ｈＴＩＧＩＴ−ＰＥ−ＣＹ７、ｈＣＤ２２３−ＡＰＣ及びｈＣＤ２４４−ＡＰＣ−ＣＹ７。ヒトＴｃ細胞パネル（１１色）：ｈＣＤ４−ＢＵＶ３９５、ｈＣＤ８−ＢＵＶ３７３、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ−ＢＶ４２１、ｈＣＤ１９７ＢＶ５１０、ｈＩＦＮ−γ−ＢＶ６０５、ｈＴＮＦ−α−ＢＶ６５０、ｈＣＤ３−ＢＶ７８５、ｈＣＤ４５ＲＡ−ＦＩＴＣ、グラニュリシン−ＰＥ、グランザイムＡ−ＰＥＲＣＰ５．５、パーフォリン−ＡＰＣ及びｈＩＬ−２−ＡＰＣ−ＣＹ７。ＴＡＭ及びＭＤＳＣパネル（１３色）：ｈＣＤ４５−ＢＵＶ３９５、ｈＣＤ１１ｂ−ＢＶ４２１、ｈＣＤ８６−ＢＶ６０５、ｈＣＤ１５−ＢＶ６５０、ｈＣＤ２０４−ＢＶ７１１、ｈＣＤ１６−ＢＶ７８５、ｈＣＤ３３−ＦＩＴＣ、系譜（ｈＣＤ３、ｈＣＤ１９及びｈＣＤ５６）−ＰＥ、ｈＣＤ６８−ＰＥ−ＣＦ５９４、ｈＣＤ１６３−ＰＥＲＣＰ５．５、ｈＣＤ１２４−ＰＥ−ＣＹ７、ｈＣＤ１４−ＡＰＣ及���ｈＨＬＡ−ＤＲ−ＡＰＣ−ＣＹ７。ＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の添加で、死滅細胞の排除を行った。
【０１７５】
ヒト多重サイトカイン分析。
ＢｉｏｌｅｇｅｎｄのＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（商標）ヒトＴｈサイトカインパネル（１３重）アレイキット、ヒトサイトカインパネル２（１３重）アレイキット及びヒトＣＤ８／ＮＫパネルアッセイキット（１３重）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、血漿サイトカインを分析した。ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターでデータを収集して、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（商標）ソフトウェアバーション７．０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して分析した。
【０１７６】
対照及び実験薬物処置。
ＨＣＣ−ＰＤＸ異種移植片が、ヒト化ＮＳＧマウスで適切な腫瘍体積１００ｍｍ３で樹立されたら、対照及び実験薬物処置を開始した。腫瘍体積は、研究の終結（最初の処置の２１日後［ｄｐｆ］）まで２日毎に測定した。処置スケジュールは、下記の通りであった。
【０１７７】
・生理食塩水処置（対照群）：毎日、尾静脈により生理食塩水１００μＬを注射。
・ペムブロリズマブのみ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ群）：０ｄｐｆのみに尾静脈により５ｍｇ／ｋｇでボーラス注射。
【０１７８】
・ＸＹＬＯＮＩＸ  Ｚｎ−γＰＧＡ処置（Ｘｙｌｏｎｉｘ群）：尾静脈によりＺｎ  ２ｍｇ／Ｋｇ／日の用量で毎日注射。
・ペムブロリズマブ＋Ｘｙｌｏｎｉｘ（コンボ群）：上記２つの処置レジメンの組合せ。
【０１７９】
統計分析
統計分析は、ＪＭＰ  １３（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．、ケーリー、ＮＣ、ＵＳＡ）又はＯｒｉｇｉｎ  ９（Ｏｒｉｇｉｎ  Ｌａｂ  Ｃｏｒｐ．、ノーザンプトン、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して実施した。データは全て、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表し、マン・ホイットニーＵ検定又は分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、統計学的有意性に関して試験した。０．０５未満のｐ値を、統計学的に有意であると解釈した。
【０１８０】
結果及び分析。
成長動態研究は、生理食塩水、ペムブロリズマブモノ（開始時にボーラス）、又はペムブロリズマブとのその組合せよりも、Ｚｎ−γＰＧＡモノ（毎日静脈内）の優れた抗腫瘍有効性を明らかに示した。ＴＩＬ分析の見解は、Ｚｎ−γＰＧＡ単剤療法が、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を刺激することを示すことによって成長動態を支持したのに対して、ペムブロリズマブモノ又はコンボの有効性は、専らＣＤ８＋Ｔ細胞に依存した。
【０１８１】
総腫瘍浸潤性白血球（ＴＩＬ）分析を図１７Ｃ〜図１７Ｇに示す。下記式を使用して算出した免疫細胞活性指数は、図１７Ｆ及び図１７Ｇにおける各種免疫細胞型に関して示される。
【０１８２】
【数２】
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【０１８３】
患者由来の異種移植片は、原発性腫瘍の遺伝子パターンを忠実に保存することが知られており、研究により、本明細書中に示すタイプのスクリーニング研究が、患者の結末と相関し、したがって、モデルにより、臨床上の利益を有する処置が実証されることが示された。
【０１８４】
下記の実施例は、Ｚｎ（ＩＩ）塩及びガンマ−ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）又はアルファ−グルタミン酸（α−ＰＧＡ）のいずれかから調製されるＺｎ（ＩＩ）剤を示す。
実施例１２：未結合の過剰な亜鉛を除去するためのリン酸沈殿方法を使用したｐＨ７．０でのＺｎ／γ−ＰＧＡの調製及び特徴付け。
【０１８５】
Ｚｎ／γ−ＰＧＡを調製するために、ＰＧＡ（分子量５０，０００Ｄａ）５５ｍｇを、１０ｍＭ  ＺｎＳＯ４を含有する１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０  ５ｍＬ中に室温で溶解し、続いて、氷上に置きながら１０分間、超音波処理した。次に、２００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０  ０．５ｍＬをこの溶液に添加して、遊離亜鉛イオンを沈殿させて、混合物を、０．２μｍのシリンジ滅菌フィルターに通して濾過した。ＩＣＰ−ＭＳを使用して、また４−（２−ピリジルアゾ）−レゾルシノールアッセイによって、亜鉛含有量を測定した。最終的なストックＺｎ／γ−ＰＧＡは、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＧＡ及び４００μｇ／ｍＬの結合亜鉛イオンを含有した。ストックＺｎ／γ−ＰＧＡ溶液は、投与当日に新鮮な状態で調製した。
【０１８６】
実施例１３：未結合の過剰な亜鉛を除去するための透析方法を使用したｐＨ７．０でのＺｎ／γ−ＰＧＡの調製及び特徴付け。
ＺｎＰＧＡを調製するために、ＰＧＡ（分子量５０，０００Ｄａ）５５ｍｇを、１０ｍＭ  ＺｎＳＯ４を含有する１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０  ５ｍＬ中に室温で溶解し、続いて、氷上に置きながら１０分間、超音波処理した。次に、溶液を１０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ７．０  １Ｌに対して氷上で２時間、連続して３回、６時間にわたって総計３倍容量で透析した。回収した溶液を、０．２μｍのシリンジ滅菌フィルターに通して濾過した。ＩＣＰ−ＭＳを使用して、また４−（２−ピリジルアゾ）−レゾルシノールアッセイによって、亜鉛含有量を測定した。最終的なストックＺｎ／γ−ＰＧＡは、０．９％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＧＡ及び３８０μｇ／ｍＬの結合亜鉛イオンを含有した。ストックＺｎ／γ−ＰＧＡ溶液は、投与当日に新鮮な状態で調製した。
【０１８７】
実施例１４：液体配合物。
例えば注射に適した液体配合物の例示的な実施形態の組成物は、亜鉛（ＩＩ）塩、γ−ＰＧＡ、塩化ナトリウム、及び水を含む。組成物は、硫酸亜鉛七水和物、γ−ＰＧＡ（カリウム塩、１００ｋＤａ以下）、塩化ナトリウムを組み合わせることと、その容量に水を添加することとによって調製され、ここで、各構成成分の濃度は、１ｍｇ／ｍＬの亜鉛（ＩＩ）、１０ｍｇ／ｍＬのγ−ＰＧＡ、及び６．５ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウムである。およそ２７６ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧及びｐＨ５．６８の得られた組成物は、ヒト患者における注射に適している。
【０１８８】
実施例１５：γ−ポリグルタミン酸−亜鉛液体組成物。
或る実施形態による本発明を実施するのに有用な組成物を表３に示す。組成物は、ワックスでコーティングされた粒子を含む液体懸濁液配合物として１００ｇ当たりＺｎ（Ｚｎ２＋イオン）０．６８ｍｇを提供する。配合物を調製する方法は、表に従う。この組成物は、対象となる本発明に有用な多くの組成物の１つを単に示すに過ぎない。
【０１８９】
【表８】
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【０１９０】
Ａ．コーティングされたＺｎ／γ−ＰＧＡミクロスフェア（ｃＺＰＭ）の調製。スクロース（５％ｗ／ｖ）１０ｇ、γ−ＰＧＡ  ４５ｍｇ、及び硫酸亜鉛七水和物１９．７９ｍｇ（元素Ｚｎとしては４．５ｍｇ）を含有する水２００ｍＬを調製して、凍結乾燥させた。次に、得られた粉末を、最大５％のコンスターチを含有する微細スクロースと１：４の比で研和（ｔｒｉｔｕｒａｔｅ）して、５０番のＵ．Ｓ．標準ステンレススチールふるい（４８メッシュ）に通して圧力をかけた。続いて、この粉末を、４００ｍＬのビーカー中で白色パラフィン油２００ｍＬ中に懸濁させた。ハイトルクスターラーを装着した４４ｍｍのポリエチレンの３枚刃パドル（Ｔｙｐｅ  ＲＸＲ１、Ｃａｆｒａｍｏ、ワイアトン、オンタリオ州）を用いて２６０ｒｐｍで攪拌することによって、混合物を分散させた。懸濁液に、アセトン−９５％エタノール（９：１）中の１０％（ｗ／ｖ）ヒドロキシプロピルメチルセルロース−フタレート（ＨＰＭＣ−Ｐ）２０ｍＬを添加した。攪拌を５分間続けて、それによりミクロスフェアが生じ、続いて、クロロホルム７５ｍＬを添加した。懸濁培地をデカントし、ミクロスフェアをクロロホルム７５ｍＬ中に手短に再懸濁させて、外気温で風乾した。乾燥時に、ミクロスフェアをカルナウバワックスでコーティングした。具体的には、カルナウバワックス１ｇを、白色パラフィン油２００ｍＬ中に７０℃で溶解させて、４５℃未満に冷却した。この冷却したワックス−パラフィン溶液に、調製したミクロスフェアを添加して、一定に攪拌しながら１５分間懸濁させた。次に、ワックス溶液をデカントして、ミクロスフェアを濾紙上に収集して、過剰なワックス溶液を吸収させて、コーティングされたＺｎ／γ−ＰＧＡミクロスフェア（ｃＺＰＭ）を得た。
【０１９１】
Ｂ．コーティングされたＺｎ／γ−ＰＧＡミクロスフェア（ｃＺＰＭ）の液体懸濁液溶液の調製。下記構成成分：キサンタンガム（例えば、懸濁用ポリマーとして）０．３ｇ、グアーガム（例えば、粘性剤として）０．３ｇ、キシリトール（例えば、甘味料として）１０ｇ、クエン酸緩衝液（例えば、緩衝液として）０．５ｇ、リモネン（例えば、香味料として）０．１ｇ、ソルビン酸カリウム（例えば、防腐剤として）０．０２５ｇを水７８．７ｍＬ中に溶解した。水溶液のｐＨをｐＨ４．５に調節した後、ｃＺＰＭ  １０ｇを水溶液中に懸濁させて、ｃＺＰＭ液体懸濁液を得た。
【０１９２】
実施例１６；γ−ポリグルタミン酸−亜鉛組成物。
或る実施形態による本発明を実施するのに有用な組成物を表４に示す。組成物は、錠剤１個当たりＺｎ（Ｚｎ２＋イオン）２５ｍｇを提供する。錠剤を調製する方法は、表に従う。この組成物は、対象となる本発明に有用な多くの組成物の１つを単に示すに過ぎない。
【０１９３】
【表９】
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【０１９４】
表２に示す組成物を有するコーティングされた錠剤は、湿式造粒技法を使用して調製され得る。まず、硫酸亜鉛及びγ−ポリグルタミン酸を乾燥状態で一緒に混合する。微結晶セルロース、デンプン、及び二酸化ケイ素を更に添加して、乾燥構成成分を全て、一緒に混合する。混合した構成成分を造粒機に移して、適切な量のエタノール水を添加して、造粒を実行する。得られた造粒混合物を５０℃〜７０℃で乾燥させて、約５％未満の含水量を有する造粒組成物を得る。ステアリン酸マグネシウムを造粒組成物に添加して、造粒組成物と混合する。得られた混合物を錠剤へと圧縮する。最終的に、当業者に既知であるように、標準的な技法を使用して、錠剤を酢酸フタル酸セルロースでコーティングする。
【０１９５】
実施例１７；γ−ポリグルタミン酸−亜鉛組成物。
或る実施形態による本発明を実施するのに有用な組成物を表５に示す。組成物は、錠剤１個当たりＺｎ（Ｚｎ２＋イオン）３０ｍｇを提供する。錠剤を調製する方法は、表に従う。この組成物は、対象となる本発明に有用な多くの組成物の１つを単に示すに過ぎない。
【０１９６】
【表１０】
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【０１９７】
表３に示す組成物を有するコーティングされた錠剤は、下記の通りに調製され得る。まず、硫酸亜鉛、γ−ポリグルタミン酸、微結晶セルロース，ＨＰＭＣ−Ｐ（ヒドロキシメチルセルロースフタレート）、マルトデキストリン、及びカルボキシメチルセルロース−カルシウムを乾燥状態で一緒に混合した。混合した構成成分を造粒機に移して、適切な量の７０％エタノール水を添加して、湿式造粒を実行した。得られた造粒混合物を最大約６０℃で乾燥させて、約３％未満のＬＯＤ（乾燥時の損失）を有する造粒組成物を得た。シリカ（例えば、Ａｅｒｏｓｉｌ（登録商標））及びステアリン酸マグネシウムを造粒組成物に添加して、造粒組成物と混合した。得られた混合物を錠剤へと圧縮した。当業者に既知であるように、標準的な技法を使用して、錠剤を、まずＨＰＭＣ−Ｐのイソプロピルアルコール溶液を使用してコーティングして、続いて、第２のステップで、ＨＰＭＣの水溶液を使用してコーティングした。
【０１９８】
実施例１８：未結合の過剰な亜鉛を除去するためのリン酸沈殿方法を使用したｐＨ７．０でのＺｎ／α−ＰＧＡの調製及び特徴付け。
Ｚｎ／α−ＰＧＡを調製するために、α−ＰＧＡ、ナトリウム塩、平均分子量６０ｋＤａ（単分散）（Ａｌａｍａｎｄａ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、ハンツビル、ＡＬ）５５ｍｇを、１０ｍＭ  ＺｎＳＯ４を含有する１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０  ５ｍＬ中に室温で溶解し、続いて、氷上に置きながら１０分間、超音波処理する。次に、２００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０  ０．５ｍＬをこの溶液に添加して、遊離亜鉛イオンを沈殿させて、混合物を、０．２μｍのシリンジ滅菌フィルターに通して濾過する。ＩＣＰ−ＭＳを使用して、また４−（２−ピリジルアゾ）−レゾルシノールアッセイによって、亜鉛含有量を測定する。例えば１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＧＡ及び４００μｇ／ｍＬの結合亜鉛イオンを含有するＺｎ／α−ＰＧＡのストック溶液は、経口投与用に調製及び使用され得る。
【０１９９】
実施例１９：未結合の過剰な亜鉛を除去するための透析方法を使用したｐＨ７．０でのＺｎ／α−ＰＧＡの調製及び特徴付け。
Ｚｎ／α−ＰＧＡを調製するために、α−ＰＧＡ５５ｍｇ、ナトリウム塩、平均分子量６０ｋＤａ（単分散）（Ａｌａｍａｎｄａ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、ハンツビル、ＡＬ）を、１０ｍＭ  ＺｎＳＯ４を含有する１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０  ５ｍＬ中に室温で溶解し、続いて、氷上に置きながら１０分間、超音波処理する。次に、溶液を１０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ７．０  １Ｌに対して氷上で２時間、連続して３回、６時間にわたって総計３倍容量で透析する。回収した溶液は、０．２μｍのシリンジ滅菌フィルターに通して濾過する。ＩＣＰ−ＭＳを使用して、また４−（２−ピリジルアゾ）−レゾルシノールアッセイによって、亜鉛含有量を測定する。例えば１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＧＡ及び４００μｇ／ｍＬの結合亜鉛イオンを含有するＺｎ／α−ＰＧＡのストック溶液は、経口投与用に調製及び使用され得る。
【０２００】
実施例２０：液体配合物。
例えば注射に適した液体配合物の例示的な実施形態の組成物は、亜鉛（ＩＩ）塩、α−ＰＧＡ、塩化ナトリウム、及び水を含む。組成物は、硫酸亜鉛七水和物、α−ＰＧＡナトリウム塩、平均分子量６０ｋＤａ（単分散）（Ａｌａｍａｎｄａ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、ハンツビル、ＡＬ）、塩化ナトリウムを組み合わせることと、その容量に水を添加することとによって調製され、ここで、各構成成分の濃度は、１ｍｇ／ｍＬの亜鉛（ＩＩ）、１０ｍｇ／ｍＬのα−ＰＧＡ、及び６．５ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウムである。およそ２７６ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧及びｐＨ５．６８の得られた組成物は、ヒト患者における注射に適している。
【０２０１】
実施例２１：α−ポリグルタミン酸−亜鉛液体組成物。
或る実施形態による本発明を実施するのに有用な組成物を表６に示す。組成物は、ワックスでコーティングされた粒子を含む液体懸濁液配合物として、１００ｇ当たりＺｎ（Ｚｎ２＋イオン）０．６８ｍｇを提供する。配合物を調製する方法は、表に従う。この組成物は、対象となる本発明に有用な多くの組成物の１つを単に示すに過ぎない。
【０２０２】
【表１１】
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【０２０３】
Ａ．コーティングされたＺｎ／α−ＰＧＡミクロスフェア（ｃＺＰＭ）の調製。スクロース（５％ｗ／ｖ）１０ｇ、α−ＰＧＡ  ４５ｍｇ、及び硫酸亜鉛七水和物１９．７９ｍｇ（元素Ｚｎとしては４．５ｍｇ）を含有する水２００ｍＬを調製して、凍結乾燥させる。得られた粉末を、最大５％のコンスターチを含有する微細スクロースと１：４の比で研和して、５０番のＵ．Ｓ．標準ステンレススチールふるい（４８メッシュ）に通して圧力をかける。この粉末を、４００ｍＬのビーカー中で白色パラフィン油２００ｍＬ中に懸濁させる。ハイトルクスターラーを装着した４４ｍｍのポリエチレンの３枚刃パドル（Ｔｙｐｅ  ＲＸＲ１、Ｃａｆｒａｍｏ、ワイアトン、オンタリオ州）を用いて２６０ｒｐｍで攪拌することによって、混合物を分散させる。懸濁液に、アセトン−９５％エタノール（９：１）中の１０％（ｗ／ｖ）ヒドロキシプロピルメチルセルロース−フタレート（ＨＰＭＣ−Ｐ）２０ｍＬを添加する。攪拌を５分間続けて、それによりミクロスフェアが生じ、続いて、クロロホルム７５ｍＬを添加する。懸濁培地をデカントし、ミクロスフェアをクロロホルム７５ｍＬ中に手短に再懸濁させて、外気温で風乾する。乾燥時に、ミクロスフェアをカルナウバワックスでコーティングする。具体的には、カルナウバワックス１ｇを、白色パラフィン油２００ｍＬ中に７０℃で溶解させて、４５℃未満に冷却する。この冷却したワックス−パラフィン溶液に、調製したミクロスフェアを添加して、一定に攪拌しながら１５分間懸濁させる。ワックス溶液をデカントして、ミクロスフェアを濾紙上に収集して、過剰なワックス溶液を吸収させて、コーティングされたＺｎ／α−ＰＧＡミクロスフェア（ｃＺＰＭ）を得る。
【０２０４】
Ｂ．コーティングされたＺｎ／α−ＰＧＡミクロスフェア（ｃＺＰＭ）の液体懸濁液溶液の調製。下記構成成分：キサンタンガム（例えば、懸濁用ポリマーとして）０．３ｇ、グアーガム（例えば、粘性剤として）０．３ｇ、キシリトール（例えば、甘味料として）１０ｇ、クエン酸緩衝液（例えば、緩衝液として）０．５ｇ、リモネン（例えば、香味料として）０．１ｇ、ソルビン酸カリウム（例えば、防腐剤として）０．０２５ｇを水７８．７ｍＬ中に溶解する。水溶液のｐＨをｐＨ４．５に調節して、ｃＺＰＭ  １０ｇを水溶液中に懸濁させて、ｃＺＰＭ液体懸濁液を得る。
【０２０５】
実施例２２；α−ポリグルタミン酸−亜鉛組成物。
或る実施形態による本発明を実施するのに有用な組成物を表７に示す。組成物は、錠剤１個当たりＺｎ（Ｚｎ２＋イオン）２５ｍｇを提供する。錠剤を調製する方法は、表に従う。この組成物は、対象となる本発明に有用な多くの組成物の１つを単に示すに過ぎない。
【０２０６】
【表１２】
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【０２０７】
表２に示す組成物を有するコーティングされた錠剤は、湿式造粒技法を使用して調製され得る。まず、硫酸亜鉛及びα−ポリグルタミン酸を乾燥状態で一緒に混合する。微結晶セルロース、デンプン、及び二酸化ケイ素を更に添加して、乾燥構成成分を全て、更に一緒に混合する。混合した構成成分を造粒機に移して、適切な量のエタノール水を添加して、造粒を実行する。得られた造粒混合物を５０℃〜７０℃で乾燥させて、約５％未満の含水量を有する造粒組成物を得る。ステアリン酸マグネシウムを造粒組成物に添加して、造粒組成物と混合する。得られた混合物を錠剤へと圧縮する。最終的に、当業者に既知であるように、標準的な技法を使用して、錠剤を酢酸フタル酸セルロースでコーティングする。
【０２０８】
実施例２３；α−ポリグルタミン酸−亜鉛組成物。
或る実施形態による本発明を実施するのに有用な組成物を表８に示す。組成物は、錠剤１個当たりＺｎ（Ｚｎ２＋イオン）３０ｍｇを提供する。錠剤を調製する方法は、表に従う。この組成物は、対象となる本発明に有用な多くの組成物の１つを単に示すに過ぎない。
【０２０９】
【表１３】
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【０２１０】
表３に示す組成物を有するコーティングされた錠剤は、下記の通りに調製され得る。まず、硫酸亜鉛、α−ポリグルタミン酸、微結晶セルロース、ＨＰＭＣ−Ｐ（ヒドロキシメチルセルロースフタレート）、マルトデキストリン、及びカルボキシメチルセルロース−カルシウムを乾燥状態で一緒に混合する。混合した構成成分を造粒機に移して、適切な量の７０％エタノール水を添加して、湿式造粒を実行した。得られた造粒混合物を最大約６０℃で乾燥させて、約３％未満のＬＯＤ（乾燥時の損失）を有する造粒組成物を得る。シリカ（例えば、Ａｅｒｏｓｉｌ（登録商標））及びステアリン酸マグネシウムを造粒組成物に添加して、造粒組成物と混合する。得られた混合物を錠剤へと圧縮する。当業者に既知であるように、標準的な技法を使用して、錠剤を、まずＨＰＭＣ−Ｐのイソプロピルアルコール溶液を使用してコーティングして、続いて、第２のステップで、ＨＰＭＣの水溶液を使用してコーティングする。
【０２１１】
本発明は、特定の実施形態に関して本明細書中で記載されているが、説明、実施例及び図示は、本発明を限定すると解釈されるべきではない。様々な修正及び変更は、それでもなお本発明の範囲内であることが、当業者には理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０Ｍ】
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【図１０Ｎ】
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【図１０Ｏ】
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【図１０Ｐ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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