(57)【要約】本開示は、特定の増殖条件下で形態および／または増殖が変更された糸状真菌細胞の形質転換、スクリーニングおよび選択のための微生物ゲノム操作方法およびシステムを提供する。この方法およびシステムは、所望の形態学的表現型を有する糸状真菌生産株を産生するために高効率（ＨＴＰ）法を使用する。一態様では、親の株に由来する糸状真菌の変異株であって、変異株の細胞が液内培養条件下で増殖させると親の株の細胞と比較して浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子によりコードされた機能タンパク質の減少したもしくは実質的に減少した量および／または活性の低いもしくは実質的に低い型を産生することになる、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子の遺伝的変更を有するため、変異株の細胞が、液内培養で増殖させると親の株の細胞と比較して非菌糸体ペレット形成表現型を有する、変異株が、本明細書で提供される。
2021526799.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親の株に由来する糸状真菌の変異株であって、前記変異株の細胞が液内培養条件下で増殖させると前記親の株の細胞と比較して前記浸透圧応答経路の前記１つまたは複数の遺伝子によりコードされる機能タンパク質の減少した量および／または活性の低い型を産生することになる、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子の遺伝的変更を前記変異株が有するため、前記変異株の細胞が、液内培養で増殖させると前記親の株の細胞と比較して非菌糸体ペレット形成表現型を有する、変異株。
【請求項２】
非液内増殖条件下で増殖させると前記親の株と比較して正常に胞子形成する、請求項１に記載の変異株。
【請求項３】
前記糸状真菌が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される、請求項１または２に記載の変異株。
【請求項４】
前記糸状真菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）またはその完全世代もしくは不完全世代である、請求項１または２に記載の変異株。
【請求項５】
前記浸透圧応答経路の前記１つまたは複数の遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子の糸状真菌オルソログである、請求項１に記載の変異株。
【請求項６】
前記浸透圧応答経路の前記１つまたは複数の遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、請求項４に記載の変異株。
【請求項７】
前記浸透圧応答経路の前記１つまたは複数の遺伝子が、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子から選択される、請求項４に記載の変異株。
【請求項８】
前記浸透圧応答経路の前記１つまたは複数の遺伝子が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＬＮ１遺伝子またはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、請求項４に記載の変異株。
【請求項９】
前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子または前記Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の前記Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログが、配列番号７の核酸配列の非ＳＮＰ含有バージョンである、請求項８に記載の変異株。
【請求項１０】
前記遺伝的変更が、前記１つもしくは複数の遺伝子の天然プロモーターから、前記天然プロモーターと比較して前記１つもしくは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターへの置き換え、前記１つもしくは複数の遺伝子から前記１つもしくは複数の遺伝子の突然変異型への置き換え、前記１つもしくは複数の遺伝子から選択可能なマーカーへの置き換え、またはこれらの組合せから選択される、請求項１に記載の変異株。
【請求項１１】
前記天然プロモーターと比較して前記１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターが、ａｍｙＢプロモーターまたはｍａｎＢプロモーターから選択される、請求項１０に記載の変異株。
【請求項１２】
前記天然プロモーターと比較して前記１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターが、配列番号１もしくは配列番号２から選択される核酸配列を含むか、それから実質的になるか、またはそれからなる、請求項１０または１１に記載の変異株。
【請求項１３】
前記選択可能なマーカーが、栄養要求性マーカー遺伝子、比色分析用マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、または方向マーカー遺伝子から選択される、請求項１０に記載の変異株。
【請求項１４】
前記比色分析用マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子である、請求項１３に記載の変異株。
【請求項１５】
前記栄養要求性マーカー遺伝子が、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される、請求項１３に記載の変異株。
【請求項１６】
前記方向マーカー遺伝子が、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子または硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）から選択される、請求項１３に記載の変異株。
【請求項１７】
前記抗生物質耐性遺伝子が、ｂｌｅ遺伝子であり、前記ｂｌｅ遺伝子が、フレオマイシンに対する耐性を付与する、請求項１３に記載の変異株。
【請求項１８】
浸透ストレス応答経路の１つまたは複数の遺伝子の突然変異型が、一塩基多型を含む、請求項１０に記載の変異株。
【請求項１９】
前記浸透圧応答経路の前記１つまたは複数の遺伝子の突然変異型が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログであり、前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子または前記Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の前記Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログの突然変異型が、配列番号７の核酸配列である、請求項１８に記載の変異株。
【請求項２０】
配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンから選択される１つまたは複数の遺伝子の遺伝的変更をさらに含む、請求項１に記載の変異株。
【請求項２１】
前記遺伝的変更が、前記１つもしくは複数の遺伝子の天然プロモーターから、前記天然プロモーターと比較して前記１つもしくは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターへの置き換え、前記１つもしくは複数の遺伝子から前記１つもしくは複数の遺伝子の突然変異型への置き換え、前記１つもしくは複数の遺伝子から選択可能なマーカーへの置き換え、またはこれらの組合せから選択される、請求項２０に記載の変異株。
【請求項２２】
前記天然プロモーターと比較して前記１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターが、ａｍｙＢプロモーターまたはｍａｎＢプロモーターから選択される、請求項２１に記載の変異株。
【請求項２３】
前記天然プロモーターと比較して前記１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターが、配列番号１もしくは配列番号２から選択される核酸配列を含むか、それから実質的になるか、またはそれからなる、請求項２１または２２に記載の変異株。
【請求項２４】
前記選択可能なマーカーが、栄養要求性マーカー遺伝子、比色分析用マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、または方向マーカー遺伝子から選択される、請求項２１に記載の変異株。
【請求項２５】
前記比色分析用マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子である、請求項２４に記載の変異株。
【請求項２６】
前記栄養要求性マーカー遺伝子が、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される、請求項２４に記載の変異株。
【請求項２７】
前記方向マーカー遺伝子が、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子または硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）から選択される、請求項２４に記載の変異株。
【請求項２８】
前記抗生物質耐性遺伝子が、ｂｌｅ遺伝子であり、前記ｂｌｅ遺伝子が、フレオマイシンに対する耐性を付与する、請求項２４に記載の変異株。
【請求項２９】
前記１つまたは複数の遺伝子の前記突然変異型が、一塩基多型を含む、請求項２１に記載の変異株。
【請求項３０】
前記１つまたは複数の遺伝子の前記突然変異型が、配列番号５、６または８から選択される核酸配列である、請求項２９に記載の変異株。
【請求項３１】
宿主細胞の形態を調節する遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む糸状真菌宿主細胞であって、前記プロモーターが、前記遺伝子にとって異種であり、前記プロモーターが、配列番号１〜４からなる群から選択される核酸配列を有する、糸状真菌宿主細胞。
【請求項３２】
発酵培地において液内培養条件下で増殖させたとき、前記宿主細胞の形態を調節する前記遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを有さない参照糸状真菌宿主細胞と比較して、非菌糸体ペレット形態を有する、請求項３１に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項３３】
前記発酵培地が、少なくとも１４ｐｐｂのマンガンを含む、請求項３２に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項３４】
前記発酵培地が、キレート剤を含まない、請求項３１または３２に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項３５】
前記宿主細胞の形態を調節する前記遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを有さない参照糸状真菌宿主細胞により産生される量と少なくとも同等である量の目的の生成物を産生する、請求項３１に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項３６】
目的の前記生成物が、クエン酸、または目的の酵素である、請求項３５に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項３７】
形態を調節する前記遺伝子が、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子、配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せである核酸配列を有する遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンから選択される、請求項３１に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項３８】
形態を調節する前記遺伝子が、前記遺伝子の野生型または突然変異型である、請求項３１に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項３９】
Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される、請求項３１に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項４０】
Ａ．ｎｉｇｅｒまたはその完全世代または不完全世代である、請求項３１に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項４１】
前記浸透圧応答経路の前記１つまたは複数の遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子の糸状真菌オルソログである、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項４２】
浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、請求項４０に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項４３】
浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子から選択される、請求項４０に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項４４】
浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、請求項４０に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項４５】
前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子または前記Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の前記Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログが、配列番号７の核酸配列の非ＳＮＰ含有バージョンである、請求項４４に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項４６】
前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子または前記Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の前記Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログが、配列番号７の核酸配列である、請求項４４に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項４７】
前記プロモーターが、配列番号１または２の核酸配列から選択される、請求項３１に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項４８】
宿主細胞の浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子の異種改変を含む糸状真菌宿主細胞であって、前記改変された１つまたは複数の遺伝子が、前記宿主細胞の浸透圧応答経路の前記改変された１つまたは複数の遺伝子を欠いている親の糸状真菌宿主細胞と比べて活性の低下および／または発現の減少を有する、糸状真菌宿主細胞。
【請求項４９】
発酵培地において液内培養条件下で増殖させたとき、非菌糸体ペレット形態を有する、請求項４８に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項５０】
Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される、請求項４８または４９に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項５１】
Ａ．ｎｉｇｅｒまたはその完全世代または不完全世代である、請求項４８または４９に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項５２】
前記浸透圧応答経路の前記１つまたは複数の遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子の糸状真菌オルソログである、請求項４８に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項５３】
前記浸透圧応答経路の前記１つまたは複数の遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、請求項５１に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項５４】
前記浸透圧応答経路の前記１つまたは複数の遺伝子が、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子から選択される、請求項５１に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項５５】
前記浸透圧応答経路の前記１つまたは複数の遺伝子が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、請求項５１に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項５６】
前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子または前記Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の前記Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログが、配列番号７の核酸配列の非ＳＮＰ含有バージョンである、請求項５５に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項５７】
前記異種改変が、前記１つもしくは複数の遺伝子の天然プロモーターから、前記天然プロモーターと比較して前記１つもしくは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターへの置き換え、前記１つもしくは複数の遺伝子から前記１つもしくは複数の遺伝子の突然変異型への置き換え、前記１つもしくは複数の遺伝子から選択可能なマーカーへの置き換え、またはこれらの組合せから選択される、請求項４８に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項５８】
前記天然プロモーターと比較して前記１つまたは複数の遺伝子を弱く発現する前記プロモーターが、ａｍｙＢプロモーターまたはｍａｎＢプロモーターから選択される、請求項５７に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項５９】
前記天然プロモーターと比較して前記１つまたは複数の遺伝子を弱く発現する前記プロモーターが、配列番号１もしくは配列番号２から選択される核酸配列を含むか、それから実質的になるか、またはそれからなる、請求項５７または請求項５８に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項６０】
前記選択可能なマーカーが、栄養要求性マーカー遺伝子、比色分析用マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、または方向マーカー遺伝子から選択される、請求項５７に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項６１】
前記比色分析用マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子である、請求項６０に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項６２】
前記栄養要求性マーカー遺伝子が、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される、請求項６０に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項６３】
前記方向マーカー遺伝子が、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子または硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）から選択される、請求項６０に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項６４】
前記抗生物質耐性遺伝子が、ｂｌｅ遺伝子であり、前記ｂｌｅ遺伝子が、フレオマイシンに対する耐性を付与する、請求項６０に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項６５】
浸透ストレス応答経路の１つまたは複数の遺伝子の突然変異型が、一塩基多型を含む、請求項５７に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項６６】
浸透ストレス経路の１つまたは複数の遺伝子が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログであり、前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子または前記Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の前記Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログの突然変異型が、配列番号７の核酸配列である、請求項６５に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項６７】
配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンから選択される１つまたは複数の遺伝子の遺伝的変更をさらに含む、請求項４８に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項６８】
前記遺伝的変更が、前記１つもしくは複数の遺伝子の天然プロモーターから、前記天然プロモーターと比較して前記１つもしくは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターへの置き換え、前記１つまたは複数の遺伝子から前記１つもしくは複数の遺伝子の突然変異型への置き換え、前記１つもしくは複数の遺伝子から選択可能なマーカーへの置き換え、またはこれらの組合せから選択される、請求項６７に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項６９】
前記天然プロモーターと比較して前記１つまたは複数の遺伝子を弱く発現する前記プロモーターが、ａｍｙＢプロモーターまたはｍａｎＢプロモーターから選択される、請求項６８に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項７０】
前記天然プロモーターと比較して前記１つまたは複数の遺伝子を弱く発現する前記プロモーターが、配列番号１もしくは配列番号２から選択される核酸配列を含むか、それから実質的になるか、またはそれからなる、請求項６８または請求項６９に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項７１】
前記選択可能なマーカーが、栄養要求性マーカー遺伝子、比色分析用マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、または方向マーカー遺伝子から選択される、請求項６８に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項７２】
前記比色分析用マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子である、請求項７１に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項７３】
前記栄養要求性マーカー遺伝子が、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される、請求項７１に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項７４】
前記方向マーカー遺伝子が、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子または硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）から選択される、請求項７１に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項７５】
前記抗生物質耐性遺伝子が、ｂｌｅ遺伝子であり、前記ｂｌｅ遺伝子が、フレオマイシンに対する耐性を付与する、請求項７１に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項７６】
前記１つまたは複数の遺伝子の前記突然変異型が、一塩基多型を含む、請求項６８に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項７７】
前記１つまたは複数の遺伝子の前記突然変異型が、配列番号５、６または８から選択される核酸配列である、請求項７６に記載の糸状真菌宿主細胞。
【請求項７８】
少なくとも１４ｐｐｂのマンガンと、非菌糸体ペレット表現型を含む糸状真菌細胞とを含む、発酵ブロスであって、前記ブロスがキレート剤を含まず、前記糸状真菌細胞が、前記糸状真菌細胞の浸透圧応答経路からの１つまたは複数の遺伝的に変更された遺伝子を含む、発酵ブロス。
【請求項７９】
前記浸透圧応答経路からの前記１つまたは複数の遺伝的に変更された遺伝子が、異種プロモーターに作動可能に連結されている、請求項７８に記載の発酵ブロス。
【請求項８０】
前記異種プロモーターが、配列番号１または２から選択される、請求項７９に記載の発酵ブロス。
【請求項８１】
前記浸透圧応答経路からの前記１つまたは複数の遺伝的に変更された遺伝子が、突然変異を含む、請求項７８から８０のいずれか一項に記載の発酵ブロス。
【請求項８２】
突然変異がＳＮＰにおけるものである、請求項８１に記載の発酵ブロス。
【請求項８３】
糸状真菌宿主細胞が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される、請求項７８に記載の発酵ブロス。
【請求項８４】
糸状真菌宿主細胞が、Ａ．ｎｉｇｅｒまたはその完全世代または不完全世代である、請求項７８に記載の発酵ブロス。
【請求項８５】
前記浸透圧応答経路の前記１つまたは複数の遺伝的に変更された遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子の遺伝的に変更された糸状真菌オルソログである、請求項７８に記載の発酵ブロス。
【請求項８６】
前記浸透圧応答経路の前記１つまたは複数の遺伝的に変更された遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子の遺伝的に変更されたＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、請求項８４に記載の発酵ブロス。
【請求項８７】
前記浸透圧応答経路の前記１つまたは複数の遺伝的に変更された遺伝子が、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せから選択される核酸配列を有する遺伝子の遺伝的に変更された型である、請求項８４に記載の発酵ブロス。
【請求項８８】
前記浸透圧応答経路の前記１つまたは複数の遺伝的に変更された遺伝子が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の遺伝的に変更されたＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、請求項８４に記載の発酵ブロス。
【請求項８９】
前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子または前記Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の前記遺伝的に変更されたＡ．ｎｉｇｅｒオルソログが、配列番号７の核酸配列を有する遺伝子である、請求項８８に記載の発酵ブロス。
【請求項９０】
プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ．基本糸状真菌株に対して形態において役割を果たす１つまたは複数の標的遺伝子とプロモーターラダーとを提供するステップであって、前記プロモーターラダーが、前記基本糸状真菌株において異なる発現プロファイルを示す複数のプロモーターを含む、ステップ；および
ｂ．前記基本糸状真菌株のゲノムを操作することによって、複数の個々の糸状真菌株の各々の株内にユニークな遺伝的変異が見られる前記複数の個々の糸状真菌株を含む初期プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーを作出するステップであって、前記ユニークな遺伝的変異の各々が、前記基本糸状真菌株に対する浸透ストレス応答において役割を果たす１つまたは複数の標的遺伝子の１つに作動可能に連結された前記プロモーターラダーからのプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップ
を含む、方法。
【請求項９１】
前記プロモーターラダーが、表２に見出されるプロモーターを含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
形態において役割を果たす前記１つまたは複数の標的遺伝子が、破壊を含む、請求項９０または９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記破壊が、ＳＮＰ、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、欠失および／または挿入である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
形態において役割を果たす前記１つまたは複数の標的遺伝子が、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子、配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せである核酸配列を有する遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンから選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９５】
糸状真菌宿主細胞が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９６】
糸状真菌宿主細胞が、Ａ．ｎｉｇｅｒまたはその完全世代または不完全世代である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９７】
前記浸透圧応答経路の前記１つまたは複数の遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子の糸状真菌オルソログである、請求項９４から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子から選択される、請求項９６に記載の方法。
【請求項１００】
浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０１】
前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子または前記Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の前記Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログが、配列番号７の核酸配列の非ＳＮＰ含有バージョンである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログが、配列番号７の核酸配列である、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０３】
生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法であって、
ａ．基本糸状真菌株に対して形態において役割を果たす複数の標的遺伝子とプロモーターラダーとを提供するステップであって、前記プロモーターラダーが、前記基本糸状真菌株において異なる発現プロファイルを示す複数のプロモーターを含む、ステップ；
ｂ．前記基本糸状真菌株のゲノムを操作することによって、複数の個々の糸状真菌株の各々の株内にユニークな遺伝的変異が見られる前記複数の個々の糸状真菌株を含む初期プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーを作出するステップであって、前記ユニークな遺伝的変異の各々が、前記基本糸状真菌株に対する形態において役割を果たす前記複数の標的遺伝子の１つに作動可能に連結された前記プロモーターラダーからの前記プロモーターの１つまたは複数を含む、ステップ；
ｃ．参照糸状真菌株に対する形態学的表現型改善に関して前記初期プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの個々の糸状真菌株をスクリーニングおよび選択することによって、形態学的表現型改善を付与するユニークな遺伝的変異を識別するステップ；
ｄ．前記ステップでスクリーニングされた少なくとも２つの個々の糸状真菌株に存在する前記遺伝的変異からのユニークな遺伝的変異の組合せを各々が含む、その後の複数の糸状真菌マイクローブを提供することによって、その後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーを作出するステップ；
ｅ．前記参照糸状真菌株に対する形態学的表現型改善に関して前記その後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの個々の糸状真菌株をスクリーニングおよび選択することによって、追加の形態学的表現型改善を付与する遺伝的変異のユニークな組合せを識別するステップ；および
ｆ．糸状真菌株が、前記生産糸状真菌株の形態学的表現型と比較して所望のレベルの改善された形態学的表現型を示すまで、線形または非線形的に、ステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各々その後の反復により微生物株の新しいプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーが作出され、前記新しいライブラリー中の各々の株が、前のライブラリーの少なくとも２つの個々の糸状真菌株の中から選択された遺伝的変異の組合せである遺伝的変異を含む、ステップ
を含む方法。
【請求項１０４】
前記その後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーが、前記初期プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの完全なコンビナトリアルライブラリーである、請求項１０３に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
【請求項１０５】
前記その後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーが、前記初期プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの完全なコンビナトリアルライブラリーのサブセットである、請求項１０３に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
【請求項１０６】
前記その後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーが、前のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの完全なコンビナトリアルライブラリーである、請求項１０３に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
【請求項１０７】
前記その後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーが、前のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの完全なコンビナトリアルライブラリーのサブセットである、請求項１０３に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
【請求項１０８】
前記プロモーターラダーが、表２に見出されるプロモーターを含む、請求項１０３から１０７のいずれか一項に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
【請求項１０９】
形態において役割を果たす前記１つまたは複数の標的遺伝子が、破壊を含む、請求項１０３に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
【請求項１１０】
破壊が、ＳＮＰ、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、欠失および／または挿入である、請求項１０３に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
【請求項１１１】
形態において役割を果たす前記１つまたは複数の標的遺伝子が、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子、配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せである核酸配列を有する遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンから選択される、請求項１０３に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
【請求項１１２】
糸状真菌宿主細胞が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される、請求項１０３に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
【請求項１１３】
糸状真菌宿主細胞が、Ａ．ｎｉｇｅｒまたはその完全世代もしくは不完全世代である、請求項１０３に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
【請求項１１４】
前記浸透圧応答経路の前記１つまたは複数の遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子の糸状真菌オルソログである、請求項１１１から１１３のいずれか一項に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
【請求項１１５】
浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、請求項１１３に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
【請求項１１６】
浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子から選択される、請求項１１３に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
【請求項１１７】
浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、請求項１１３に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
【請求項１１８】
前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子または前記Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の前記Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログが、配列番号７の核酸配列の非ＳＮＰ含有バージョンである、請求項１１７に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
【請求項１１９】
前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子または前記Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の前記Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログが、配列番号７の核酸配列である、請求項１１７に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
【請求項１２０】
前記形態学的表現型改善が、液内培養条件下で増殖させると非菌糸体ペレット形態を形成する能力を付与することを含む、請求項１０３に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型のためのプロモータースワップ法。
【請求項１２１】
前記液内培養条件が、少なくとも１４ｐｐｂのマンガンを含むがキレート剤を含まない培養培地を含む、請求項１２０に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型のためのプロモータースワップ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年６月６日に出願した米国仮出願第６２／６８１，６０４号に基づく優先権の利益を主張するものであり、前記仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
【０００２】
本開示は、様々な増殖条件で真菌細胞の菌糸成長を調節することに関する。菌糸成長の開示される調節は、生産条件下で菌糸成長を制限して真菌生産株を生じさせるために糸状真菌の遺伝子操作を必然的に伴う。結果として生じる真菌生産株は、液内培養での増殖に、例えば、商用用途向けの目的の生成物（例えば、抗生物質、代謝物、タンパク質など）の大規模生産に、よく適している。
配列表に関する記述
【０００３】
本願に関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、これにより参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＺＹＭＲ＿０１５＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは、約３０７ＫＢであり、２０１９年６月６日に作成されたものであり、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出されることになる。
【背景技術】
【０００４】
真核細胞は、ポリペプチドおよび二次代謝物の生産に好ましい生物である。実際、糸状真菌は、天然および異種タンパク質を高レベルに発現することができ、そのため、糸状真菌は、産業、医薬品、動物の健康ならびに食品および飲料用途向けの酵素および他のタンパク質の大規模生産によく適している。しかし、目的の生成物の大規模生産のための糸状真菌の使用は、自動化された機械および装備の使用はもちろん前記真菌の遺伝子操作も必要とすることが多く、糸状真菌の生活環のある特定の態様は、遺伝子操作および取り扱いを困難にし得る。
【０００５】
例えば、真菌に導入されたＤＮＡは、ゲノム内にランダムに組み込まれ、その結果、大部分がランダムな組込みＤＮＡ断片となり、これらの断片は、かなりの頻度で複数のタンデムリピートとして組み込まれ得る（例えば、Casqueiro  et  al.,  1999,  J.  Bacteriol.  181:1181-1188を参照されたい）。発現カセットのこの無制御「アットランダム多重組込み」は、宿主のゲノムの望ましくない改変をもたらすことがある潜在的に有害なプロセスであり得る。
【０００６】
加えて、糸状真菌用のこのトランスフェクションシステムは、事実上、非常に面倒であり（概説については、Fincham,  1989,  Microbiol.  Rev.  53:148-170を参照されたい）、比較的小規模である。これは、プロトプラスト形成、粘稠液の取り扱い（すなわち、ポリエチレングリコール溶液）、ガラス管の１つずつの回旋、および選択的播種を含み得る。さらに、プロトプラスト形成の条件は、決定するのが困難であり得、収率は、多くの場合、かなり低くなり得る。さらに、プロトプラストは、複数の核を含有することがあり、したがって、所望の遺伝子操作の導入は、ホモカリオンのプロトプラストから分離することが困難であり得るヘテロカリオンのプロトプラストの形成につながることがある。
【０００７】
さらに、プロトプラストから誘導されたものを含む、典型的な糸状真菌細胞は、菌糸と呼ばれる長い繊維として増殖し、これらの繊維は、菌糸体と呼ばれる菌糸の密な網目構造を形成し得る。これらの菌糸は、遺伝子型が互いに異なり得る複数の核を含有し得る。菌糸は、分化し、容易に空中に分散し得る無性胞子を形成し得る。菌糸が異なる遺伝子型の核を含有する場合、胞子も核の混合物を含有することになる。真菌増殖のこの態様に起因して、遺伝子操作は、実質的に混合集団を生じさせる結果となり、加えられる遺伝子変化のあらゆる効果を評価するためにはこれらの混合集団を精製して均質にしなければならない。さらに、自動化された環境では、胞子は、装備の汚染の原因となり得、この汚染は、株を精製する能力にマイナス影響を及ぼすことがあり、その装備で行われるあらゆる他の作業の品質を落とす可能性がある。
【０００８】
胞子の空気分散を軽減するために、糸状真菌を液内培養で増殖させることができる。しかし、液内培養での菌糸状糸状真菌増殖により形成される菌糸体は、ブロスのレオロジー特性に影響を与え得る。一般に、ブロスの粘度が高いほど、酸素および栄養素の分布の均一性が低く、培養物を攪拌するために必要とされるエネルギーが多くなる。一部の場合には、菌糸状糸状真菌増殖に起因するブロスの粘度は、酸素および栄養素の溶解に有意に干渉するのに十分なほど高くなり、それによって、真菌の増殖にそして最終的には目的の任意の所望の生成物の生産性に悪影響を与える。
【０００９】
したがって、真菌に関する旧来の株構築プログラムに内在する上述の欠点に悩まされない、かつ、有益な突然変異を発見して確固たるものとするプロセスを大きく加速させる、糸状真菌の新しい操作方法が、当業界で大いに必要とされている。
【００１０】
本発明は、自動化された高効率プラットフォームでの糸状真菌の遺伝子操作に固有の課題の多くを克服する。本明細書で提供される方法は、形質転換体の自動化スクリーニングと組み合わせた自動化同時形質転換を使用することによって性的交配を経ずに２株間の遺伝形質の変化を可能にする、遺伝子変化の組込みにより、所望の形態を有する真菌生産株を生成するように設計される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様では、親の株に由来する糸状真菌の変異株であって、変異株の細胞が液内培養条件下で増殖させると親の株の細胞と比較して浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子によりコードされた機能タンパク質の減少したもしくは実質的に減少した量および／または活性の低いもしくは実質的に低い型を産生することになる、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子の遺伝的変更を有するため、変異株の細胞が、液内培養で増殖させると親の株の細胞と比較して非菌糸体ペレット形成表現型を有する、変異株が、本明細書で提供される。一部の場合には、変異株は、非液内増殖条件下で増殖させると親の株と比較して正常に胞子形成する。一部の場合には、糸状真菌は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される。一部の場合には、糸状真菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）またはその完全世代もしくは不完全世代である。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子は、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子の糸状真菌オルソログである。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子は、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子は、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子から選択される。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＬＮ１遺伝子またはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである。一部の場合には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号７の核酸配列の非ＳＮＰ含有バージョンである。一部の場合には、遺伝的変更は、１つもしくは複数の遺伝子の天然プロモーターから、天然プロモーターと比較して１つもしくは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターへの置き換え、１つまたは複数の遺伝子から１つもしくは複数の遺伝子の突然変異型への置き換え、１つもしくは複数の遺伝子から選択可能なマーカーへの置き換え、またはこれらの組合せから選択される。一部の場合には、天然プロモーターと比較して１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターは、ａｍｙＢプロモーターまたはｍａｎＢプロモーターから選択される。一部の場合には、天然プロモーターと比較して１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターは、配列番号１もしくは配列番号２から選択される核酸配列を含むか、それから実質的になるか、またはそれからなる。一部の場合には、選択可能なマーカーは、栄養要求性マーカー遺伝子、比色分析用マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、または方向マーカー遺伝子から選択される。一部の場合には、比色分析用マーカー遺伝子は、ａｙｇＡ遺伝子である。一部の場合には、栄養要求性マーカー遺伝子は、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される。一部の場合には、方向マーカー遺伝子は、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子または硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）から選択される。一部の場合には、抗生物質耐性遺伝子は、ｂｌｅ遺伝子であり、ｂｌｅ遺伝子は、フレオマイシン（pheomycin）に対する耐性を付与する。一部の場合には、浸透圧ストレス応答経路の１つまたは複数の遺伝子の突然変異型は、一塩基多型を含む。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子の突然変異型は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログであり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの突然変異型は、配列番号７の核酸配列である。一部の場合には、変異株は、配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンから選択される１つまたは複数の遺伝子の遺伝的変更をさらに含む。一部の場合には、遺伝的変更は、１つもしくは複数の遺伝子の天然プロモーターから、天然プロモーターと比較して１つもしくは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターへの置き換え、１つまたは複数の遺伝子から１つもしくは複数の遺伝子の突然変異型への置き換え、１つもしくは複数の遺伝子から選択可能なマーカーへの置き換え、またはこれらの組合せから選択される。一部の場合には、天然プロモーターと比較して１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターは、ａｍｙＢプロモーターまたはｍａｎＢプロモーターから選択される。一部の場合には、天然プロモーターと比較して１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターは、配列番号１もしくは配列番号２から選択される核酸配列を含むか、それから実質的になるか、またはそれからなる。一部の場合には、選択可能なマーカーは、栄養要求性マーカー遺伝子、比色分析用マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、または方向マーカー遺伝子から選択される。一部の場合には、比色分析用マーカー遺伝子は、ａｙ���Ａ遺伝子である。一部の場合には、栄養要求性マーカー遺伝子は、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される。一部の場合には、方向マーカー遺伝子は、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子または硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）から選択される。一部の場合には、抗生物質耐性遺伝子は、ｂｌｅ遺伝子であり、ｂｌｅ遺伝子は、フレオマイシンに対する耐性を付与する。一部の場合には、１つまたは複数の遺伝子の突然変異型は、一塩基多型を含む。一部の場合には、１つまたは複数の遺伝子の突然変異型は、配列番号５、６または８から選択される核酸配列である。
【００１２】
別の態様では、宿主細胞の形態を調節する遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む糸状真菌宿主細胞であって、プロモーターが、遺伝子にとって異種であり、プロモーターが、配列番号１〜４からなる群から選択される核酸配列を有する、糸状真菌宿主細胞が、本明細書で提供される。一部の場合には、糸状真菌宿主細胞は、発酵培地において液内培養条件下で増殖させたとき、宿主の形態を調節する遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを有さない参照糸状真菌宿主細胞と比較して、非菌糸体ペレット形態を有する。一部の場合には、発酵培地は、少なくとも１４ｐｐｂのマンガンを含む。一部の場合には、発酵培地は、キレート剤を含まないか、または実質的に含まない（例えば、目的の生成物、例えばクエン酸など、を産生するための当業界で公知の発酵培地に見出されるキレート剤の量または濃度の５％、４％、３％、２％または１％未満）。一部の場合には、発酵培地は、キレート剤を含まない。一部の場合には、糸状真菌宿主細胞は、宿主細胞の形態を調節する遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを有さない参照糸状真菌宿主細胞により産生される量と少なくとも同等である量の目的の生成物を産生する。一部の場合には、目的の生成物は、クエン酸、または目的の酵素である。一部の場合には、形態を調節する遺伝子は、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子、配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せである核酸配列を有する遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンから選択される。一部の場合には、形態を調節する遺伝子は、遺伝子の野生型または突然変異型である。一部の場合には、糸状真菌宿主細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される。一部の場合には、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒまたはその完全世代または不完全世代である。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子は、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子の糸状真菌オルソログである。一部の���合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子は、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子は、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子から選択される。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである。一部の場合には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号７の核酸配列の非ＳＮＰ含有バージョンである。一部の場合には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号７の核酸配列である。一部の場合には、プロモーターは、配列番号１または２の核酸配列から選択される。
【００１３】
さらに別の態様では、宿主細胞の浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子の異種改変を含む糸状真菌宿主細胞であって、改変された１つまたは複数の遺伝子が、宿主細胞の浸透圧応答経路の改変された１つまたは複数の遺伝子を欠いている親の糸状真菌宿主細胞と比べて活性の低下および／または発現の減少を有する、糸状真菌宿主細胞が、本明細書で提供される。一部の場合には、糸状真菌宿主細胞は、発酵培地において液内培養条件下で増殖させたとき、非菌糸体、ペレット形態を有する。一部の場合には、糸状真菌宿主細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される。一部の場合には、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒまたはその完全世代または不完全世代である。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子は、表７に見出される酵母浸透圧応答経路の糸状真菌オルソログである。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子は、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子は、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子から選択される。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである。一部の場合には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号７の核酸配列の非ＳＮＰ含有バージョンである。一部の場合には、異種改変は、１つもしくは複数の遺伝子の天然プロモーターから、天然プロモーターと比較して１つもしくは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターへの置き換え、１つまたは複数の遺伝子から１つもしくは複数の遺伝子の突然変異型への置き換え、１つもしくは複数の遺伝子から選択可能なマーカーへの置き換��、またはこれらの組合せから選択される。一部の場合には、天然プロモーターと比較して１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターは、ａｍｙＢプロモーターまたはｍａｎＢプロモーターから選択される。一部の場合には、天然プロモーターと比較して１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターは、配列番号１もしくは配列番号２から選択される核酸配列を含むか、それから実質的になるか、またはそれからなる。一部の場合には、選択可能なマーカーは、栄養要求性マーカー遺伝子、比色分析用マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、または方向マーカー遺伝子から選択される。一部の場合には、比色分析用マーカー遺伝子は、ａｙｇＡ遺伝子である。一部の場合には、栄養要求性マーカー遺伝子は、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される。一部の場合には、方向マーカー遺伝子は、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子または硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）から選択される。一部の場合には、抗生物質耐性遺伝子は、ｂｌｅ遺伝子であり、ｂｌｅ遺伝子は、フレオマイシンに対する耐性を付与する。一部の場合には、浸透圧ストレス応答経路の１つまたは複数の遺伝子の突然変異型は、一塩基多型を含む。一部の場合には、浸透圧ストレス経路の１つまたは複数の遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログであり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの突然変異型は、配列番号７の核酸配列である。一部の場合には、糸状真菌宿主細胞は、配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンから選択される１つまたは複数の遺伝子の遺伝的変更をさらに含む。一部の場合には、遺伝的変更は、１つもしくは複数の遺伝子の天然プロモーターから、天然プロモーターと比較して１つもしくは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターへの置き換え、１つまたは複数の遺伝子から１つもしくは複数の遺伝子の突然変異型への置き換え、１つもしくは複数の遺伝子から選択可能なマーカーへの置き換え、またはこれらの組合せから選択される。一部の場合には、天然プロモーターと比較して１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターは、ａｍｙＢプロモーターまたはｍａｎＢプロモーターから選択される。一部の場合には、天然プロモーターと比較して１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターは、配列番号１もしくは配列番号２から選択される核酸配列を含むか、それから実質的になるか、またはそれからなる。一部の場合には、選択可能なマーカーは、栄養要求性マーカー遺伝子、比色分析用マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、または方向マーカー遺伝子から選択される。一部の場合には、比色分析用マーカー遺伝子は、ａｙｇＡ遺伝子である。一部の場合には、栄養要求性マーカー遺伝子は、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される。一部の場合には、方向マーカー遺伝子は、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子または硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）から選択される。一部の場合には、抗生物質耐性遺伝子は、ｂｌｅ遺伝子であり、ｂｌｅ遺伝子は、フレオマイシンに対する耐性を付与する。一部の場合には、１つまたは複数の遺伝子の突然変異型は、一塩基多型を含む。一部の場合には、１つまたは複数の遺伝子の突然変異型は、配列番号５、６または８から選択される核酸配列である。
【００１４】
さらに別の態様では、少なくとも１４ｐｐｂのマンガンと、非菌糸体ペレット表現型を含む糸状真菌細胞とを含む、発酵ブロスであって、ブロスがキレート剤を含まず、または実質的に含まず（例えば、目的の生成物、例えばクエン酸など、を産生するための当業界で公知の発酵ブロスに見出されるキレート剤の量または濃度の５％、４％、３％、２％または１％未満）、糸状真菌細胞が、糸状真菌細胞の浸透圧応答経路からの１つまたは複数の遺伝的に変更された遺伝子を含む、発酵ブロスが、本明細書で提供される。一部の場合には、浸透圧応答経路からの１つまたは複数の遺伝的に変更された遺伝子は、異種プロモーターに作動可能に連結されている。一部の場合には、異種プロモーターは、配列番号１または２から選択される。一部の場合には、浸透圧応答経路からの１つまたは複数の遺伝的に変更された遺伝子は、突然変異を含む。一部の場合には、突然変異はＳＮＰにおけるものである。一部の場合には、糸状真菌宿主細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される。一部の場合には、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒまたはその完全世代または不完全世代である。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝的に変更された遺伝子は、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子の遺伝的に変更された糸状真菌オルソログである。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝的に変更された遺伝子は、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子の遺伝的に変更されたＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝的に変更された遺伝子は、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せから選択される核酸配列を有する遺伝子の遺伝的に変更された型である。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝的に変更された遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の遺伝的に変更されたＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである。一部の場合には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の遺伝的に変更されたＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号７の核酸配列を有する遺伝子である。
【００１５】
一態様では、プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーを生成するための方法であって、ａ．基本糸状真菌株に対して形態において役割を果たす１つまたは複数の標的遺伝子とプロモーターラダーとを提供するステップであって、前記プロモーターラダーが、基本糸状真菌株において異なる発現プロファイルを示す複数のプロモーターを含む、ステップ；およびｂ．基本糸状真菌株のゲノムを操作することによって、複数の個々の糸状真菌株の各々の株内にユニークな遺伝的変異が見られる前記複数の個々の糸状真菌株を含む初期プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーを作出するステップであって、前記ユニークな遺伝的変異の各々が、基本糸状真菌株に対する浸透ストレス応答において役割を果たす１つまたは複数の標的遺伝子の１つに作動可能に連結されたプロモーターラダーからのプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップを含む方法が、本明細書で提供される。一部の場合には、プロモーターラダーは、表２に見出されるプロモーターを含む。一部の場合には、形態において役割を果たす１つまたは複数の標的遺伝子は、破壊を含む。一部の場合には、破壊は、ＳＮＰ、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、欠失および／または挿入である。一部の場合には、形態において役割を果たす１つまたは複数の標的遺伝子は、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子、配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せである核酸配列を有する遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンから選択される。一部の場合には、糸状真菌宿主細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される。一部の場合には、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒまたはその完全世代または不完全世代である。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子は、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子の糸状真菌オルソログである。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子は、表７に見出される酵母浸透圧応答経路���伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子は、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子から選択される。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである。一部の場合には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号７の核酸配列の非ＳＮＰ含有バージョンである。一部の場合には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号７の核酸配列である。
【００１６】
別の態様では、生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法であって、ａ．基本糸状真菌株に対して形態において役割を果たす複数の標的遺伝子とプロモーターラダーとを提供するステップであって、前記プロモーターラダーが、基本糸状真菌株において異なる発現プロファイルを示す複数のプロモーターを含む、ステップ；ｂ．基本糸状真菌株のゲノムを操作することによって、複数の個々の糸状真菌株の各々の株内にユニークな遺伝的変異が見られる前記複数の個々の糸状真菌株を含む初期プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーを作出するステップであって、前記ユニークな遺伝的変異の各々が、基本糸状真菌株に対する形態において役割を果たす複数の標的遺伝子の１つに作動可能に連結されたプロモーターラダーからのプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップ；ｃ．参照糸状真菌株に対する形態学的表現型改善に関して初期プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの個々の糸状真菌株をスクリーニングおよび選択することによって、形態学的表現型改善を付与するユニークな遺伝的変異を識別するステップ；ｄ．前記ステップでスクリーニングされた少なくとも２つの個々の糸状真菌株に存在する遺伝的変異からのユニークな遺伝的変異の組合せを各々が含む、その後の複数の糸状真菌マイクローブを提供することによって、その後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーを作出するステップ；ｅ．参照糸状真菌株に対する形態学的表現型改善に関してその後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの個々の糸状真菌株をスクリーニングおよび選択することによって、追加の形態学的表現型改善を付与する遺伝的変異のユニークな組合せを識別するステップ；およびｆ．糸状真菌株が、生産糸状真菌株の形態学的表現型と比較して所望のレベルの改善された形態学的表現型を示すまで、線形または非線形的に、ステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各々その後の反復により微生物株の新しいプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーが作出され、新しいライブラリー中の各々の株が、前のライブラリーの少なくとも２つの個々の糸状真菌株の中から選択された遺伝的変異の組合せである遺伝的変異を含む、ステップを含む方法が、本明細書で提供される。一部の場合には、その後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーは、初期プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの完全なコンビナトリアルライブラリーである。一部の場合には、その後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーは、初期プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの完全なコンビナトリアルライブラリーのサブセットである。一部の場合には、その後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーは、前のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの完全なコンビナトリアルライブラリーである。一部の場合には、その後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーは、前のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの完全なコンビナトリアルライブラリーのサブセットである。一部の場合には、プロモーターラダーは、表２に見出されるプロモーターを含む。一部の場合には、形態において役割を果たす１つまたは複数の標的遺伝子は、破壊を含む。一部の場合には、破壊は、ＳＮＰ、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、欠失および／または挿入である。一部の場合には、形態において役割を果たす１つまたは複数の標的遺伝子は、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子、配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せである核酸配列を有する遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンから選択される。一部の場合には、糸状真菌宿主細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される。一部の場合には、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒまたはその完全世代または不完全世代である。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子は、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子の糸状真菌オルソログである。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子は、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子は、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子から選択される。一部の場合には、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである。一部の場合には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号７の核酸配列の非ＳＮＰ含有バージョンである。一部の場合には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号７の核酸配列である。一部の場合には、形態学的表現型改善は、液内培養条件下で増殖させたとき非菌糸体ペレット形態を形成する能力を付与することを含む。一部の場合には、液内培養条件は、少なくとも１４ｐｐｂのマンガンを含むがキレート剤を含まないかまた���実質的に含まない（例えば、目的の生成物、例えばクエン酸など、を産生するための当業界で公知の発酵培地に見出されるキレート剤の量または濃度の５％、４％、３％、２％または１％未満）、培養培地を含む。一部の場合には、発酵培地は、キレート剤を含まない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、糸状真菌細胞におけるプロモータースワッピングの手法を例示する。特に、注釈されたプロモーターによる遺伝子のプロモータースワップ設計が示される。
【００１８】
【図２】図２は、本開示のプロモーターラダーによる、ある範囲の調節発現を示す例示的なプロモーターの発現プロファイルを例示する。プロモーターＡ発現は、選択された基質の添加直後にピークに達するが、基質濃度が減少すると、迅速に検出不能レベルに戻る。プロモーターＢ発現は、選択された基質の添加直後にピークに達し、基質の対応する減少と共にゆっくりと検出不能レベルに低下し戻る。プロモーターＣ発現は、選択された基質の添加に際してピークに達し、基質が消散した後でさえも培養全体を通して高発現のままである。
【００１９】
【図３】図３は、４つの異なる株を生成するために標的遺伝子の前に入れた４つの異なるプロモーターを例示する。その後、これらの株を所望の特色についての試験において比較してもよく、理想的な発現レベルを決定してもよい。
【００２０】
【図４】図４は、本発明における使用のための分割マーカー構築物を生成するための融合ＰＣＲの使用を例示する。
【００２１】
【図５−１】図５は、図４において示す通りに生成した分割マーカー構築物の品質管理分析を例示する。
【図５−２】図５は、図４において示す通りに生成した分割マーカー構築物の品質管理分析を例示する。
【００２２】
【図６】図６は、分割マーカーシステムを使用して、ＳＮＰがどのように糸状真菌の特定の遺伝子座にターゲティングされるかを表す。マーカー遺伝子（この例ではｐｙｒＧ）は、遺伝子機能を回復する相同組換えなしでは標的株において突然変異を補完することができない２つの成分に増幅される。これらの断片に隣接してＤＮＡの直列反復配列があり、その各々は、遺伝子座にターゲティングされるＳＮＰを含有する。各構築物の非反復ＤＮＡ配列は、ネイティブ相同組換え経路を通して適切な統合を促進する。
【００２３】
【図７】図７は、マーカー遺伝子に隣接する直列反復配列は不安定であり、直列反復配列間の相同組換えを通したマーカー除去をもたらすことを例示する。実質的に、形質転換ＤＮＡに組み込まれた直列反復配列によって、ループアウトが促進される。実質的に、形質転換ＤＮＡに組み込まれた直列反復配列によって、ループアウトが促進される。選択マーカーについて対抗選択された細胞は、直列反復領域が隣接するループＤＮＡの欠失を含有する。
【００２４】
【図８】図８は、実施例２で説明する通り、表３の各ＳＮＰについての欠失表現型を評価するための欠失構築物の使用を例示する。欠失表現型は、経路分析を行うために使用され得る。
【００２５】
【図９】図９は、形態遺伝子（すなわち、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８；配列番号７）のプロモータースワッピングを例示する。この遺伝子の発現を制御する様々なプロモーターは、形態に影響を及ぼす。ｍａｎＢ融合およびａｍｙＢ融合を含有する株は、１１４１４親株と比較して複数の先端を保持するが、一方で、より高発現のｓｒｐＢおよびｍｂｆＡを伴う株は、複数先端表現型を欠く。株をクエン酸産生培地（１４％ｗ／ｖグルコース、ｐＨ２、Ｍｎ＋＋枯渇）において３０℃で４８時間増殖させた。１６８時間インキュベートした場合、より高発現のプロモーターを伴う株および親対照は全て、長い繊維状菌糸を含有した。プロモーター融合、ａｍｙＢおよびｍａｎＢからのより低い発現レベルを有する株は、ペレット状のままであった。
【００２６】
【図１０】図１０は、本開示の実施形態による、コンピュータシステムの実施形態を図示する。
【００２７】
【図１１】図１１は、基準１０１５株および１１４１４産生株における形態遺伝子標的１８（ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８）のプロモータースワッピングを例示する。ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８と関連付けられる遺伝子産物は、浸透ストレスに応答するシグナル伝達キナーゼである（すなわち、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログ）。この図は、ネイティブプロモーターをより弱いプロモーターで置き換えることによって前記遺伝子の遺伝子発現を減少させた場合、細胞は、本明細書において「ペレット」表現型と呼ばれる、より締まった、あまり引き延ばされていない表現型を維持することを示す（基準１０１５株および１１４１４産生株においてｍａｎＢ（ｐ）ｓｎｐ１８遺伝子を発現する細胞についての右側パネルを参照されたい）。株をクエン酸産生培地（１４％ｗ／ｖグルコース、ｐＨ２、Ｍｎ＋＋枯渇）において３０℃で２４時間増殖させた。このタイプの増殖は、撹拌タンク発酵に好ましい場合がある。
【００２８】
【図１２】図１２は、ｍａｎＢ（ｐ）プロモーター（配列番号１）の制御下のＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８遺伝子（配列番号７）を導入することによる基準株（すなわち、Ａ．ｎｉｇｅｒ  １０１５）におけるＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８遺伝子産物レベルの減少は、基準株遺伝子バックグラウンドにおいて胞子形成不能をもたらすことを例示する。同じ構築物を産生株（すなわち、Ａ．ｎｉｇｅｒ  １１４１４）に導入した場合、この表現型は観察されなかった。
【００２９】
【図１３】図１３は、基準ＳＮＰ１８を含有する株は、低ｐＨ培地においてより速く増殖することを例示する。
【００３０】
【図１４】図１４は、基準ＳＮＰ１８を含有する株は、浸透ストレスを与える培地においてより速く増殖することを例示する。
【００３１】
【図１５】図１５は、基準株と産生株との間のＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８の交換は、胞子形成および肥大成長速度に対して影響を有することを例示する。
【００３２】
【図１６】図１６は、産生株においてＳＮＰ（すなわち、表４のＦｕｎｇｉＳＮＰ）を含有する全てのコード配列の基準株における欠失を例示する。
【００３３】
【図１７】図１７は、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８を含有する遺伝子は、産生株においては胞子形成に必ずしも必要ではないが、基準株においては必要であることを例示する。
【００３４】
【図１８】図１８は、実施例３で説明するＰＲＯＳＷＰ実験を行うために使用される２部構築物の設計および一般スキームを例示する。
【００３５】
【図１９】図１９は、実施例３で使用されるより弱いプロモーターは、形態に影響を及ぼすことを例示する。弱いｍａｎＢプロモーター下のＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８（ＳＮＰ１８）を含有する株は、他のプロモーターの組合せを含有する株よりも締まったコロニー形態を有する。ＳＮＰ１８制御の影響は、低ｐＨ下よりも浸透ストレス下においてより明白である。
【００３６】
【図２０】図２０は、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１２（ｓｎｐ＿１２）のＰＲＯＳＷＰを例示する。ｓｎｐ＿１２に作動可能に連結されたより低強度のプロモーターは、菌糸における黄色色素およびいくらか変更された形態（コロニーの縁において観察される）をもたらす。この黄色色素は、様々な突然変異体において共通しており、代謝ストレスの表れであると考えられる。
【００３７】
【図２１】図２１は、より弱いプロモーターによって駆動された場合、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８（ｓｎｐ＿１８）は、産生株におけるよりも基準株においてより厳密な形態学的表現型を有することを例示する。
【００３８】
【図２２】図２２は、点突然変異（すなわち、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８についての表３のＳＮＰ；配列番号７に対して配列番号７６において示されるコードドメインにおけるＣ＞Ｔヌクレオチド変化）を含有するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属ｎｉｋＡ（２成分システムタンパク質Ｃ（ＴｃｓＣ：Ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ）としても知られる）遺伝子の基準株への導入が、より高いクエン酸産生および適切な浸透圧応答の保持をもたらすことを例示する。図２２は、ｎｉｋＡの欠失が、基準株においてより遅い増殖およびより低いクエン酸産生をもたらすことも示す。
【００３９】
【図２３Ａ】図２３Ａ〜Ｂは、図２２で説明する点突然変異を含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属ｎｉｋＡ遺伝子の基準株への挿入が、振とうフラスコにおいてクエン酸力価を３３％増大することを例示する。図２３Ａは、振とうフラスコ中でクエン酸産生培地において９６時間増殖させた培養物から酵素アッセイ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ；Ｋ−ＣＩＴＲ）を使用して定量したクエン酸の力価を示す。株を三重で増殖させた。エラーバーは、平均値からの１つの標準偏差を示す。図２３Ｂは、一元配置分散分析のグラフを示し、線の点は、９５％信頼区間を示す。全体として、図２３Ａ〜Ｂは、点突然変異を含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属ｎｉｋＡ遺伝子の基準株への導入が、クエン酸力価の３３％増大をもたらしたことを示す。
【図２３Ｂ】図２３Ａ〜Ｂは、図２２で説明する点突然変異を含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属ｎｉｋＡ遺伝子の基準株への挿入が、振とうフラスコにおいてクエン酸力価を３３％増大することを例示する。図２３Ａは、振とうフラスコ中でクエン酸産生培地において９６時間増殖させた培養物から酵素アッセイ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ；Ｋ−ＣＩＴＲ）を使用して定量したクエン酸の力価を示す。株を三重で増殖させた。エラーバーは、平均値からの１つの標準偏差を示す。図２３Ｂは、一元配置分散分析のグラフを示し、線の点は、９５％信頼区間を示す。全体として、図２３Ａ〜Ｂは、点突然変異を含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属ｎｉｋＡ遺伝子の基準株への導入が、クエン酸力価の３３％増大をもたらしたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本開示は、自動化された高効率プラットフォームでの糸状真菌の遺伝子操作に固有の課題の多くを克服する。本明細書で提供される方法は、液内培養でのより効率的な増殖のために、菌糸成長を変更して真菌生産株を生成するように設計される。これらの方法は、形質転換体の自動化スクリーニングと組み合わせた自動化同時形質転換を使用することによって、性的交配を経ずに真菌細胞の増殖および形態に影響する２株間の遺伝形質の変換を可能にする、遺伝子変化の組込みを含む。
【００４１】
定義
以下の用語は当業者によってよく理解されると考えられるが、本開示の主題の説明を容易にするために、以下の定義を記載する。
【００４２】
用語「ａ」または「ａｎ」は、１または複数のその実体を指す、すなわち、複数の指示対象を指してもよい。そのため、用語「ａ」または「ａｎ」、「１または複数（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」および「少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」は、本明細書では互換的に使用される。さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」に対する参照は、文脈が１つおよびただ１つの要素が存在することを明確に必要としない限り、１より多いその要素が存在する可能性を排除しない。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「細胞生物」、「微生物」または「マイクローブ」は、広く取られるべきである。これらの用語は、互換的に使用され、限定されるものではないが、２つの原核生物ドメインである細菌および古細菌、ならびにある特定の真核生物ドメインである真菌および原生生物が挙げられる。一部の実施形態では、本開示は、本開示の中に存在する一覧／表および図面の「微生物」または「細胞生物」または「マイクローブ」を指す。この特徴付けは、表および図面の識別された分類学上の属だけでなく、識別された分類学上の種、ならびに前記表または図面における任意の生物の様々な新規の、および新しく識別または設計された株も指してもよい。同じ特徴付けは、実施例などの明細書の他の部分におけるこれらの用語の記載についても当てはまる。
【００４４】
用語「多核細胞」または「多核細胞生物」は、本明細書で使用される場合、多核性の細胞、または多核性の細胞を含む生物を指すことができる。多核性の細胞は、細胞凝集、続いてのその集団の内部での細胞膜の溶解の結果として生じる融合細胞とは対照的に、付随する細胞質分裂のない複数の核分裂の結果として生じ得る。本明細書で提供される方法、組成物およびシステムに関連する場合の多核細胞生物の例としては、原生生物（例えば、藻類、原生動物、Ｍｙｘｏｇａｓｔｒｉａの生物（粘菌）、アルベオラータ、植物、真菌（例えば、糸状真菌）、および／または後生動物（例えば、Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ  ｓｐｐ）を挙げることができる。
【００４５】
用語「原核生物」は、当業界で認識されており、核も他の細胞オルガネラも含有しない細胞を指す。原核生物は、一般的には、細菌および古細菌の２つのドメインのうちの１つに分類される。古細菌および細菌ドメインの生物間の明確な差異は、１６ＳリボソームＲＮＡにおけるヌクレオチド塩基配列の基本的な差異に基づく。
【００４６】
用語「古細菌」は、典型的には、特異な環境中に見出され、リボソームタンパク質の数および細胞壁におけるムラミン酸の欠如などのいくつかの基準によって、その他の原核生物と区別される、Ｍｅｎｄｏｓｉｃｕｔｅｓ門の生物の分類を指す。ｓｓｒＲＮＡ分析に基づくと、古細菌は、２つの系統発生学的に異なる群：ＣｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａおよびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａからなる。その生理に基づいて、古細菌を、３つの型：メタン細菌（メタンを産生する原核生物）；高度好塩菌（非常に高濃度の塩（ＮａＣｌ）で生存する原核生物）；および高度（超）好熱菌（非常に高い温度で生存する原核生物）に体系化することができる。それらを細菌と区別する統一的な古細菌の特徴（すなわち、細胞壁にムレインを含まない、エステル結合膜脂質を含まないなど）の他に、これらの原核生物は、それらをその特定の生息環境に適合させるユニークな構造的または生化学的特質を示す。Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａは、主に超好熱性硫黄依存性原核生物からなり、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａは、メタン細菌および高度好塩菌を含有する。
【００４７】
「細菌」または「真正細菌」は、原核生物のドメインを指す。細菌は、以下のような少なくとも１１種の異なる群：（１）２つの主要な亜門：（１）高Ｇ＋Ｃ群（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、その他）、（２）低Ｇ＋Ｃ群（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ）が存在するグラム陽性（グラム＋）細菌；（２）プロテオバクテリア、例えば、紅色光合成＋非光合成グラム陰性細菌（多くの「一般」グラム陰性細菌を含む）；（３）シアノバクテリア、例えば、酸素発生型光合成細菌；（４）スピロヘータおよび関連種；（５）プランクトミセス；（６）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ；（７）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ；（８）緑色硫黄細菌；（９）緑色非硫黄細菌（嫌気性光合成細菌）；（１０）放射線耐性ミクロコッカスおよび関連種；（１１）ＴｈｅｒｍｏｔｏｇａおよびＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓを含む。
【００４８】
「真核生物」は、その細胞が、膜内に封入された核および他のオルガネラを含有する任意の生物である。真核生物は、ＥｕｋａｒｙａまたはＥｕｋａｒｙｏｔａ分類群に属する。真核細胞を原核細胞（上記の細菌および古細菌）から区別する決定的な特徴は、それらが、膜に結合したオルガネラ、特に、遺伝物質を含有し、核エンベロープによって封入された核を有することである。
【００４９】
用語「遺伝子改変された宿主細胞」、「組換え宿主細胞」、および「組換え株」は、本明細書では互換的に使用され、本開示のクローニングおよび形質転換方法によって遺伝子改変された宿主細胞を指す。かくして、この用語は、宿主細胞が、それが由来した天然に存在する生物と比較して、変更された、改変された、または異なる遺伝子型および／または表現型を示す（例えば、遺伝子改変が微生物のコード核酸配列に影響する場合）ように、遺伝的に変更、遺伝子改変、または遺伝子操作された宿主細胞（例えば、細菌、酵母細胞、真菌細胞、ＣＨＯ、ヒト細胞など）を含む。一部の実施形態では、この用語は、問題の特定の組換え宿主細胞だけでなく、そのような宿主細胞の子孫または潜在的な子孫も指すと理解される。
【００５０】
用語「野生型微生物」または「野生型宿主細胞」は、天然に存在する細胞、すなわち、遺伝子改変されていない細胞を記載する。
【００５１】
用語「親株」または「親の株」または「親」は、突然変異株が由来する宿主細胞を指してもよい。したがって、「親株」または「親の株」は、１つまたは複数の突然変異株を生成するために当業界で公知のおよび／または本明細書で提供される任意の方法によりゲノムが摂動される、宿主細胞または細胞である。「親株」または「親の株」は、野生型株のものと同一のゲノムを有することもあり、または有さないこともある。
【００５２】
用語「遺伝子操作された」とは、宿主細胞のゲノムの任意の操作（例えば、核酸の挿入、欠失、突然変異、または置き換えによる）を指してもよい。
【００５３】
用語「対照」または「対照宿主細胞」とは、遺伝子改変または実験的処置の効果を決定するための適切な比較用宿主細胞を指す。一部の実施形態では、対照宿主細胞は、野生型細胞である。他の実施形態では、対照宿主細胞は、処置宿主細胞を区別する遺伝子改変を除いて、遺伝子改変された宿主細胞と遺伝的に同一である。一部の実施形態では、本開示は、対照宿主細胞としての親株の使用を教示する。他の実施形態では、宿主細胞は、処置宿主細胞において試験される特定のプロモーターまたはＳＮＰを欠いている、遺伝的に同一の細胞であってもよい。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「対立遺伝子」は、任意の１つまたは複数の代替型の遺伝子を意味し、これらの対立遺伝子は全て、少なくとも１つの形質または特徴に関係する。二倍体細胞では、所与の遺伝子の２つの対立遺伝子は、相同染色体の対の対応する遺伝子座を占有する。本開示は、実施形態では、ＱＴＬ、すなわち、１つまたは複数の遺伝子または調節配列を含み得るゲノム領域、に関するので、一部の事例では、この用語は、より正確には、「対立遺伝子」ではなく「ハプロタイプ」（すなわち、染色体セグメントの対立遺伝子）を指すが、それらの事例では、この用語「対立遺伝子」は、用語「ハプロタイプ」を包含すると理解されたい。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）」（複数形はｌｏｃｉ）は、例えば、遺伝子または遺伝子マーカーが見出される染色体上の特定の場所（１つもしくは複数の）または部位を意味する。
【００５６】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝的に関連する」とは、交配を通して分離することが難しいような、育種中に高率で同時に遺伝する２つまたはそれより多い形質を指す。
【００５７】
本明細書で使用される場合の「組換え」または「組換え事象」とは、染色体交差または独立組合せを指す。用語「組換え」は、組換え事象の結果として生じる新しい遺伝子構造を有する生物を指す。
【００５８】
本明細書で使用される場合、用語「表現型」とは、個々の遺伝子構造（すなわち、遺伝子型）と、環境との相互作用の結果生じる、その個々の細胞、細胞培養物、生物、または生物群の観察可能な特徴を指す。
【００５９】
本明細書で使用される場合、核酸配列またはタンパク質配列を記述する場合の用語「キメラ」または「組換え」とは、単一の大分子中で、少なくとも２つの異種ポリヌクレオチド、もしくは２つの異種ポリペプチドを連結する、または少なくとも１つの自然核酸もしくはタンパク質配列の１つもしくは複数のエレメントを再配置する核酸、またはタンパク質配列を指す。例えば、用語「組換え」は、例えば、化学合成による、または遺伝子操作技法による核酸の単離されたセグメントの操作による、２つのそうでなければ分離されたセグメントの配列の人工的な組合せを指してもよい。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「合成ヌクレオチド配列」または「合成ポリヌクレオチド配列」は、天然に存在することが知られていない、または天然に存在しないヌクレオチド配列である。一般に、そのような合成ヌクレオチド配列は、他の任意の天然に存在するヌクレオチド配列と比較した場合、少なくとも１つのヌクレオチドの相違を含むであろう。
【００６１】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」とは、任意の長さの、ポリマー形態のヌクレオチド、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはそのアナログを指す。この用語は、分子の一次構造を指し、かくして、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを含む。また、それは、メチル化および／またはキャップ付き核酸、改変塩基を含有する核酸、骨格改変などの改変核酸も含む。用語「核酸」および「ヌクレオチド配列」は、互換的に使用される。
【００６２】
本明細書で使用される場合、用語「ＤＮＡ足場」または「核酸足場」は、足場として別の目的で使用される、人工的に産生された配列または天然に存在する配列のいずれかである核酸足場を指す。本開示の一実施形態では、核酸足場は、合成デオキシリボ核酸足場である。合成足場のデオキシリボヌクレオチドは、プリンおよびピリミジン塩基、あるいは他の天然の、化学的にもしくは生化学的に改変された、非天然の、または誘導体化されたデオキシリボヌクレオチド塩基を含んでもよい。本明細書中でより詳細に説明されるように、本開示の核酸足場は、機能的複合体を作出するために生物学的経路に関与する２つまたはそれより多くのタンパク質、すなわち生合成酵素、を空間的におよび時間的に集合させ、固定化するために使用される。各生物学的経路タンパク質の足場上での集合および固定化は、足場のタンパク質結合配列、すなわちタンパク質ドッキング部位、の１つと、キメラ生合成酵素の対応するＤＮＡ結合部分との、結合相互作用によって起こる。したがって、核酸足場は、１つまたは複数のサブユニットを含み、各サブユニットは、２つまたはそれより多くの異なるキメラ生物学的経路タンパク質の結合に対応する２つまたはそれより多くのタンパク質結合配列を含む。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ結合配列」または「ＤＮＡ結合部位」は、本開示のキメラ生合成遺伝子のＤＮＡ結合ドメイン部分により認識され、結合される、特異的核酸配列を指す。多くのＤＮＡ結合タンパク質ドメインおよびそれらの同族結合パートナー認識部位（すなわち、タンパク質結合部位）が、当業界で周知である。例えば、非常に多数のジンクフィンガー結合ドメインおよびそれらの対応するＤＮＡタンパク質結合標的部位が、当業界で公知であり、本開示における使用に好適である。他のＤＮＡ結合ドメインは、限定ではないが、ロイシンジッパー結合ドメインおよびそれらの対応するＤＮＡタンパク質結合部位、ウイングドヘリックス結合ドメインおよびそれらの対応するＤＮＡタンパク質結合部位、ウイングドヘリックス・ターン・ヘリックス結合ドメインおよびそれらの対応するＤＮＡタンパク質結合部位、ＨＭＧボックス結合ドメインおよびそれらの対応するＤＮＡタンパク質結合配列、ヘリックス・ループ・ヘリックス結合ドメインおよびそれらの対応するＤＮＡタンパク質結合配列、ならびにヘリックス・ターン・ヘリックス結合ドメインおよびそれらの対応するＤＮＡタンパク質結合配列を含む。ＤＮＡタンパク質結合配列が公知である他の公知ＤＮＡ結合ドメインは、免疫グロブリンＤＮＡドメイン、Ｂ３  ＤＮＡ結合ドメイン、およびＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。本開示の核酸足場サブユニットは、上述のタンパク質結合部位のいずれか２つまたはそれより多くを含んでもよい。
【００６４】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」とは、生物学的機能と関連するＤＮＡの任意のセグメントを指す。かくして、遺伝子は、限定されるものではないが、コード配列および／またはその発現にとって必要とされる調節配列を含む。遺伝子はまた、例えば、他のタンパク質の認識配列を形成する非発現ＤＮＡセグメントを含んでもよい。遺伝子は、目的の供給源からのクローニングまたは公知の、もしくは予測された配列情報からの合成を含む、様々な供給源から取得することができ、所望のパラメーターを有するように設計された配列を含んでもよい。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「相同」または「ホモログ」または「オルソログ」は、当業界で公知であり、共通の祖先またはファミリーメンバーを共有し、配列同一性の程度に基づいて決定される、関連配列を指す。用語「ホモロジー」、「相同」、「実質的に類似する」および「実質的に一致する」は、本明細書では互換的に使用される。それらは、１つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を媒介するかまたはある特定の表現型をもたらす核酸断片の能力に影響しない、核酸断片を指す。これらの用語はまた、初期の非改変断片と比較して得られる核酸断片の機能特性を実質的に変更しない、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入などの、本開示の核酸断片の改変も指す。したがって、当業者であれば理解できるように、本開示が特定の例示的な配列を超えるものを包含することは理解される。これらの用語は、ある種、亜種、品種、栽培品種または株において見出される遺伝子と、別の種、亜種、品種、栽培品種または株における対応するまたは同等の遺伝子との関係を記載する。本開示の目的のために、相同配列が比較される。「相同配列」または「ホモログ」または「オルソログ」は、機能的に関連することが考えられる、確信される、または公知である。機能的関係は、限定されるものではないが、（ａ）配列同一性の程度および／または（ｂ）同じかもしくは類似する生物学的機能を含む、いくつかの方法のいずれか１つで示すことができる。好ましくは、（ａ）と（ｂ）の両方が示される。ホモロジーを、Current  Protocols  in  Molecular  Biology  (F.M.  Ausubel  et  al.,  eds.,  1987)  Supplement  30,  section  7.718,  Table  7.71で論じられているものなどの、当業界で容易に利用可能なソフトウェアプログラムを使用して、決定することができる。一部のアラインメントプログラムは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．）、ＡＬＩＧＮ  Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）およびＡｌｉｇｎＸ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）である。別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターを使用するＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）である。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「内因性」または「内因性遺伝子」とは、それが宿主細胞ゲノム内に自然に見出される位置における、天然に存在する遺伝子を指す。本開示の文脈では、異種プロモーターを内因性遺伝子に作動可能に連結することは、その遺伝子が自然に存在する位置において、現存の遺伝子の前に異種プロモーター配列を遺伝的に挿入することを意味する。本明細書で記載される内因性遺伝子は、本開示の方法のいずれかに従って突然変異された天然に存在する遺伝子の対立遺伝子を含んでもよい。
【００６７】
本明細書で使用される場合、用語「外因性」は、用語「異種」と互換的に使用され、その天然の供給源以外の何らかの供給源に由来する物質を指す。例えば、用語「外因性タンパク質」または「外因性遺伝子」は、非天然の供給源または場所に由来し、生物システムに人工的に供給された、タンパク質または遺伝子を指す。
【００６８】
本明細書で使用される場合、用語「異種改変」は、特定の生物システム（例えば、本明細書で提供されるような宿主細胞）に固有の供給源以外の供給源に由来する改変を指してもよく、または特定の生物システムに固有であるが非天然の状況／位置／場所で見出される供給源からの改変を指してもよい。したがって、この改変は、前記改変が導入されたまたは導入されることになる生物システム（例えば、本明細書で提供されるような宿主細胞、または宿主細胞内の非天然の状況／位置／場所）に関して、非天然であるか、または天然に存在しない。それ故、異種改変は、生物システム（例えば、本明細書で提供されるような宿主細胞、または宿主内の異種状況／位置／場所）に人工的に導入されると考えてもよい。改変は、遺伝的または後成的変異、破壊または摂動であってもよい。遺伝的変異、破壊または摂動は、例えば、遺伝子の天然プロモーターおよび／もしくはターミネーターから、前記宿主に固有のものでないプロモーターおよび／もしくはターミネーターへの、または非天然の異種状況／位置／場所に移動された宿主生物内からのプロモーターおよび／もしくはターミネーターであってもよいプロモーターおよび／もしくはターミネーターへの置き換えであってもよい。遺伝的変異、破壊または摂動は、天然遺伝子または天然に存在する遺伝子から、例えば選択可能なマーカー遺伝子などの非天然遺伝子または天然に存在しない遺伝子への置き換えであってもよい。または、遺伝的変異、破壊もしくは摂動は、天然遺伝子もしくは天然に存在する遺伝子から、非天然の状況／位置／場所に配置される宿主ゲノム内からの別の天然遺伝子（例えば、プロモーター）への置き換えもしくはスワッピングであってもよい。遺伝的変異、破壊または摂動は、天然遺伝子または天然に存在する遺伝子から、非天然遺伝子または天然に存在しない型の遺伝子への置き換えであってもよい。遺伝子の非天然型または天然に存在しない型は、特定の宿主細胞内に自然に見出されない遺伝子の突然変異型、ならびに／または異種プロモーターおよび／もしくはターミネーターに作動可能に連結された特定の宿主細胞内に自然に見出されない遺伝子の突然変異型であってもよい。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド変化」とは、当業界でよく理解されるように、例えば、ヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入を指す。例えば、突然変異は、サイレントな置換、付加、または欠失をもたらす変更を含有するが、コードされたタンパク質の特性もしくは活性、またはタンパク質が作製される方法を変更しない。
【００７０】
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質改変」とは、当業界でよく理解されるように、例えば、アミノ酸置換、アミノ酸改変、欠失、および／または挿入を指す。
【００７１】
本明細書で使用される場合、核酸またはポリペプチドの用語「少なくとも一部」または「断片」とは、そのような配列の最小サイズの特徴を有する一部、または完全長分子まで、およびそれを含む、完全長分子の任意のより大きい断片を意味する。本開示のポリヌクレオチドの断片は、遺伝子調節エレメントの生物活性部分をコードしてもよい。遺伝子調節エレメントの生物活性部分を、遺伝子調節エレメントを含む本開示のポリペプチドの１つの一部を単離すること、および本明細書に記載の活性を評価することによって調製することができる。同様に、ポリペプチドの一部は、完全長ポリペプチドまでの、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸などであってもよい。使用される部分の長さは、特定の適用に依存するであろう。ハイブリダイゼーションプローブとして有用な核酸の一部は、１２ヌクレオチドほどの短さであってもよく、一部の実施形態では、それは２０ヌクレオチドである。エピトープとして有用なポリペプチドの一部は、４アミノ酸ほどの短さであってもよい。完全長ポリペプチドの機能を実行するポリペプチドの一部は、一般に、４アミノ酸より長い。
【００７２】
バリアントポリヌクレオチドは、ＤＮＡシャッフリングなどの変異原性および組換え手順から誘導される配列も包含する。そのようなＤＮＡシャッフリングのための戦略は、当業界で公知である。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ  （１９９４）  ＰＮＡＳ  ９１：１０７４７−１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ  （１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１；Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １５：４３６−４３８；Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２７２：３３６−３４７；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  ＰＮＡＳ  ９４：４５０４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１；ならびに米国特許第５，６０５，７９３号および同第５，８３７，４５８号を参照されたい。
【００７３】
本明細書に開示されるポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために、目的の任意の生物から抽出されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから対応するＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲ反応における使用のためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。ＰＣＲプライマーおよびＰＣＲクローニングを設計するための方法は、当業界で一般に公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に開示されている。Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  （１９９０）  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｉｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，  ｅｄｓ．  （１９９５）  ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＩｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，  ｅｄｓ．  （１９９９）  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）も参照されたい。公知のＰＣＲ法としては、限定されるものではないが、プライマー対、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分ミスマッチプライマーなどを使用する方法が挙げられる。
【００７４】
本明細書で使用される用語「プライマー」とは、ＤＮＡポリメラーゼの結合を可能にすることによって、プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に置かれた場合、すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの重合のための薬剤の存在下、ならびに好適な温度およびｐＨで、ＤＮＡ合成の開始点として働く増幅標的にアニーリングすることができるオリゴヌクレオチドを指す。（増幅）プライマーは、好ましくは、増幅の最大効率のための一本鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合のための薬剤の存在下で伸長産物の合成を刺激するのに十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度およびプライマーの組成（Ａ／Ｔ対Ｇ／Ｃ含量）を含む多くの因子に依存するであろう。一対の二方向プライマーは、ＰＣＲ増幅などのＤＮＡ増幅の当業界で一般的に使用されるように、１つのフォワードプライマーおよび１つのリバースプライマーからなる。
【００７５】
用語「ストリンジェンシー」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリッドの安定性に影響するハイブリダイゼーション条件、例えば、温度、塩濃度、ｐＨ、ホルムアミド濃度などを指す。これらの条件は、プライマーまたはプローブのその標的核酸配列への特異的結合を最大化し、非特異的結合を最小化するように、経験的に最適化される。これらの用語は、使用される場合、プローブまたはプライマーが、その標的配列と、他の配列より検出可能に高度に（例えば、バックグラウンドより少なくとも２倍多く）ハイブリダイズすることになる、条件への言及を含む。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる環境では異なることになる。長い配列ほど、高温で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、相補的標的配列の５０％が完全一致プローブまたはプライマーにハイブリダイズする（定義されたイオン強度およびｐＨ下での）温度である。典型的に、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で、約１．０Ｍ未満のＮａ＋イオン濃度、典型的には約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋イオン濃度（例えば、他の塩）であり、温度は、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、長いプローブまたはプライマー（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加で達成されることもある。例示的な低ストリンジェント条件または「ストリンジェンシーが低下した条件」は、３７℃で３０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液でのハイブリダイゼーション、４０℃で２×ＳＳＣ中での洗浄を含む。例示的な高ストリンジェンシー条件は、３７℃で５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、６０℃で０．１×ＳＳＣ中での洗浄を含む。ハイブリダイゼーション手順は、当業界で周知であり、例えば、Ausubel  et  al.,  1998およびSambrook  et  al.,  2001により記載されている。一部の実施形態では、ストリンジェントな条件は、４５℃で、１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．５〜２０％ドデシル硫酸ナトリウム、例えば、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％を含有する、０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．２）中でのハイブリダイゼーション、続いて、５５℃〜６５℃で０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムを含有する５×ＳＳＣ中での洗浄である。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」とは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一部の実施形態では、プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントはエンハンサーと呼ばれることが多い。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーターの固有のエレメント、またはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであってもよい。プロモーターは、それらの全体が天然の遺伝子に由来してもよく、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されていてもよく、またはさらには、合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発生段階で、または異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることは、当業者には理解される。本明細書に記載の方法およびシステムにおいて使用するためのプロモーターは、前記プロモーターの制御下にある遺伝子（単数または複数）の発現が特定の薬剤の存在および／または非存在により調節されるように、誘導性であってもよい。誘導性プロモーターは、その転写活性が、例えば、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、金属もしくは当業界で公知の他の化合物などの、化学的もしくは物理的条件の存在もしくは非存在によりまたは光もしくは低温もしくは高温の存在もしくは非存在により調節される、任意のプロモーターであってもよい。多くの場合、調節配列の正確な境界は完全に定義されていないため、一部の変異のＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有していてもよいことがさらに認識される。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「ターミネーター」は、ゲノムＤＮＡ内の遺伝子の末端を示し、転写を停止させることができる、ＤＮＡ配列のセクションを一般に指す。ターミネーターは、それらの全体が天然の遺伝子に由来してもよく、または天然に見出される異なるターミネーターに由来する異なるエレメントから構成されていてもよく、またはさらには、合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。異なるターミネーターが、異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発生段階で、または異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることは、当業者には理解される。
【００７８】
本明細書で使用される場合、語句「組換え構築物」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」、および「組換えＤＮＡ構築物」は、本明細書では互換的に使用される。組換え構築物は、核酸断片の人工の組合せ、例えば、天然に一緒に見出されない調節およびコード配列を含む。例えば、キメラ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが、天然に見出されるものとは異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含んでもよい。そのような構築物を、そのまま使用するか、またはベクターと共に使用することができる。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者には周知の通り、宿主細胞を形質転換するために使用される方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。当業者であれば、本開示の単離された核酸断片のいずれかを含む宿主細胞を上手く形質転換する、選択する、および増殖させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝子エレメントをよく知っている。また、当業者であれば、異なる独立した形質転換事象は、異なる発現レベルおよび発現パターンをもたらし（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８５）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ４：２４１１−２４１８；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８−８６）、かくして、所望の発現レベルおよびパターンを示す細胞系を得るためには、複数の事象をスクリーニングしなければならないことも認識するであろう。そのようなスクリーニングを、特に、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現の免疫ブロッティング分析、または表現型分析によって達成することができる。ベクターは、自律的に複製するか、または宿主細胞の染色体中に組み込まれ得る、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体であってもよい。ベクターはまた、自律的に複製しない、裸のＲＮＡポリヌクレオチド、裸のＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内のＤＮＡとＲＮＡの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリリシンコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチドコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソームコンジュゲートＤＮＡなどであってもよい。本明細書で使用される場合、用語「発現」とは、機能的最終生成物、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質（前駆体もしくは成熟体）の産生を指す。
【００７９】
「作動可能に連結される」とは、この文脈では、さらなるポリヌクレオチドの転写をもたらす、本開示によるプロモーターポリヌクレオチドと、前記さらなるオリゴまたはポリヌクレオチドとの連続的配置を意味する。
【００８０】
用語「目的の生成物」または「生体分子」は、本明細書で使用される場合、供給原料からのマイクローブにより産生される任意の生成物を指す。一部の場合には、目的の生成物は、小分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコールなどであってもよい。例えば、目的の生成物または生体分子は、任意の一次または二次細胞外代謝物であってもよい。一次代謝物は、特に、エタノール、クエン酸、乳酸、グルタミン酸、グルタミン酸塩、リシン、トレオニン、トリプトファンおよび他のアミノ酸、ビタミン、多糖類などであってもよい。二次代謝物は、特に、ペニシリンのような抗生物質化合物、またはシクロスポリンＡのような免疫抑制薬、ジベレリンのような植物ホルモン、ロバスタチンのようなスタチン薬、グリセオフルビンのような殺真菌薬などであってもよい。目的の生成物または生体分子はまた、マイクローブにより産生される任意の細胞内成分、例えば、カタラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、グルコースイソメラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ラクターゼ、ストレプトキナーゼ、およびその他諸々を含む、微生物酵素であってもよい。細胞内成分はまた、組換えタンパク質、例えば、インスリン、Ｂ型肝炎ワクチン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、ストレプトキナーゼなどを含んでもよい。目的の生成物はまた、「目的のタンパク質」を指してもよい。
【００８１】
用語「目的のタンパク質」は、一般に、糸状真菌に発現されることが望まれる任意のポリペプチドを指す。そのようなタンパク質は、酵素、基質結合タンパク質、界面活性タンパク質、構造タンパク質などであってもよく、そのようなタンパク質を高レベルで発現させることができ、そのようなタンパク質は、商業化を目的とするものであってもよい。目的のタンパク質は、変異株および／または親の株に対して内因性遺伝子または外因性遺伝子によりコードされてもよい。目的のタンパク質を、細胞内にまたは分泌タンパク質として発現させることができる。目的のタンパク質が自然に分泌されない場合、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、当業界で公知の技術に従って、シグナル配列を有するように改変することができる。分泌されるタンパク質は、自然に発現されるが異種である場合もある、内因性タンパク質であってもよい。異種は、タンパク質によりコードされた遺伝子が、糸状真菌宿主細胞において天然条件下で産生されないことを意味する。本開示糸状真菌により産生され得る酵素の例は、カルボヒドラーゼ、例えば、セルラーゼ、例えば、エンドグルカナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、セロビオヒドラーゼもしくはベータ−グルコシダーゼ、ヘミセルラーゼ、またはペクチン分解酵素、例えば、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、アラバナーゼ、ガラクツロナーゼ、リアーゼ、またはデンプン分解酵素；ホスファターゼ、例えばフィターゼ、エステラーゼ、例えばリパーゼ、タンパク質分解酵素、オキシドレダクターゼ、例えばオキシダーゼ、トランスフェラーゼ、またはイソメラーゼである。
【００８２】
用語「炭素源」は、一般に、細胞増殖のための炭素の供給源としての使用に好適な物質を指す。炭素源は、限定されるものではないが、バイオマス加水分解物、デンプン、スクロース、セルロース、ヘミセルロース、キシロースおよびリグニン、ならびにこれらの基質の単量体成分を含む。炭素源は、限定されるものではないが、ポリマー、炭水化物、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチドなどを含む、様々な有機化合物を様々な形で含んでもよい。これらは、例えば、グルコース、デキストロース（Ｄ−グルコース）などの様々な単糖類、マルトース、オリゴ糖類、多糖類、飽和もしくは不飽和脂肪酸、コハク酸塩、乳酸塩、酢酸塩、エタノールなど、またはこれらの混合物を含む。光合成生物は、光合成の生成物として炭素源をさらに産生することができる。一部の実施形態では、炭素源をバイオマス加水分解物およびグルコースから選択することができる。
【００８３】
用語「供給原料」は、他の生成物を作製することができる微生物または発酵プロセスに供給される原材料または原材料の混合物と定義される。例えば、バイオマスまたはバイオマスに由来する炭素化合物などの、炭素源は、発酵プロセスで目的の生成物（例えば、小分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど）を産生する微生物のための供給原料である。しかし、供給原料は、炭素源以外の栄養素を含有してもよい。
【００８４】
用語「体積生産性」または「生産率」は、単位時間あたり、培地体積あたりに形成される生成物の量と定義される。体積生産性を、１時間あたり、１リットルあたりのグラム数（ｇ／Ｌ／ｈ）で報告することができる。
【００８５】
用語「比生産性」は、生成物の形成速度と定義される。比生産性は、本明細書では、１時間あたり、細胞乾燥重量（ＣＤＷ）１グラムあたりの生成物のグラム数（ｇ／ｇ  ＣＤＷ／ｈ）での比生産性とさらに定義される。ＣＤＷとＯＤ６００との関係を使用して、所与の微生物比生産性を、１時間あたり、６００ｎｍ（ＯＤ）での培養ブロスの光密度あたり、培養培地１リットルあたりの生成物のグラム数（ｇ／Ｌ／ｈ／ＯＤ）と、表すこともできる。
【００８６】
用語「収率」は、原材料の単位重量あたりに得られる生成物の量と定義され、基質１ｇあたりの生成物のｇ（ｇ／ｇ）と表すことができる。収率を、理論収率のパーセンテージとして表してもよい。「理論収率」は、生成物を作るために使用される代謝経路の化学量論によって決定される基質の所与の量あたりに生成され得る生成物の最大量と定義される。
【００８７】
用語「タイター」または「力価」は、溶液の強度または溶液中の物質の濃度と定義される。例えば、発酵ブロス中の目的の生成物（例えば、小分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど）のタイターは、発酵ブロス１リットルあたりの溶液中の目的の生成物のｇ数（ｇ／Ｌ）として記載される。
【００８８】
用語「総力価」は、限定されるものではないが、溶液中の目的の生成物、該当する場合、気相中の目的の生成物、およびプロセスから除去され、プロセス中の初期体積またはプロセス中の動作体積に対して回収される目的の任意の生成物などの、プロセスにおいて産生される目的の全生成物の合計と定義される。
【００８９】
本明細書で使用される場合、用語「ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリー」または「ライブラリー」は、本開示による遺伝子摂動の収集物を指す。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、ｉ）データベースもしくは他のコンピュータファイル中の配列情報の収集物、ｉｉ）上記の一連の遺伝子エレメントをコードする遺伝子構築物の収集物、またはｉｉｉ）前記遺伝子エレメントを含む宿主細胞株として現れてもよい。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、個々のエレメントの収集物（例えば、ＰＲＯスワップライブラリーのためのプロモーターの収集物、またはＳＴＯＰスワップライブラリーのためのターミネーターの収集物）を指してもよい。他の実施形態では、本開示のライブラリーはまた、プロモーター：：遺伝子の組合せ、遺伝子：ターミネーター組合せ、またはさらにはプロモーター：遺伝子：ターミネーターの組合せなどの、遺伝子エレメントの組合せを指してもよい。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、宿主生物においてライブラリーの各メンバーを適用する効果に関連するメタデータをさらに含む。例えば、本明細書で使用される場合のライブラリーは、プロモーター：：遺伝子配列の組合せの収集物と共に、特定の種における液内培養で増殖させたときの形態の変化などの１つまたは複数の表現型に対してこれらの組合せがもたらす効果を含むことができ、したがって、将来のプロモータースワップにおける前記組合せの使用についての将来の予測値を改善することができる。
【００９０】
本明細書で使用される場合、用語「ＳＮＰ」とは、一塩基多型を指し得る。一部の実施形態では、本開示のＳＮＰは、広く解釈されるべきであり、一塩基多型、配列挿入、欠失、反転、および他の配列置き換えを含む。本明細書で使用される場合、用語「非同義」または「非同義ＳＮＰ」とは、宿主細胞タンパク質におけるコード変化をもたらす突然変異を指す。
【００９１】
ゲノム操作の「高効率（ＨＴＰ）」法は、前記方法の少なくとも１つのステップを実行するための少なくとも１点の自動化装備（例えば、液体ハンドラーまたはプレートハンドラー機器）の使用を含んでもよい。
【００９２】
用語「実質的に減少した」および「実質的に低い」は、本明細書では互換的に使用され、タンパク質または酵素の発現レベルまたは量または活性レベルに言及する場合、前記量または活性についての、前記タンパク質もしくは酵素の対照もしくは参照レベルもしくは活性と比較してのまたはそれに対してのあるパーセンテージまたはあるパーセンテージ範囲の低下を指してもよい。用語「実質的に減少した」および「実質的に低い」は、タンパク質もしくは酵素または酵素の活性の量またはレベルについての、対照もしくは参照（例えば、前記タンパク質もしくは酵素の対照もしくは参照レベルもしくは活性）と比較してまたはそれに対して、少なくとも、最大で、正確にまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％低下を指してもよい。用語「実質的に減少した」および「実質的に低い」は、タンパク質もしくは酵素または酵素の活性（例えば、酵素活性）の量またはレベルについての、対照もしくは参照（例えば、前記タンパク質もしくは酵素の対照もしくは参照レベルもしくは活性）と比較してまたはそれに対して１％〜５％、１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％または９５％〜１００％（これらの端点を含む）低下を指してもよい。用語「実質的に減少した」および「実質的に低い」はまた、タンパク質もしくは酵素または酵素の活性の量が、前記タンパク質もしくは酵素または前記酵素の活性の対照もしくは参照バージョンの量の、少なくとも、最大で、正確にまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であってもよいことを意味してもよい。用語「実質的に減少した」および「実質的に低い」はまた、タンパク質もしくは酵素または酵素の活性の量が、前記タンパク質もしくは酵素または酵素の活性の対照もしくは参照バージョンの量の１％〜５％、１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％または９５％〜１００％（これらの端点を含む）であることを意味してもよい。タンパク質または酵素のレベルまたは量に関して、対照または参照は、対照または参照細胞中の前記タンパク質または酵素のレベルまたは量であってもよい。一実施形態では、参照細胞の対照における被験タンパク質または酵素は、異種改変を有さない。酵素の活性に関して、対照または参照は、対照または参照細胞における前記タンパク質または酵素の活性（acitivity）であってもよい。一実施形態では、参照細胞の対照における被験タンパク質または酵素は、異種改変を有さない。
【００９３】
本明細書で提供されるタンパク質または酵素のレベルまたは活性は、細胞内で測定することができ、または細胞からの抽出および／もしくは単離後に（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで）測定することができる。一部の場合には、目的のタンパク質をコードする遺伝子のレベルまたは量が、測定または決定される。本明細書で提供される遺伝子のレベルまたは量は、細胞内で測定することができ、または細胞からの抽出後に（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで）測定することができる。一部の場合には、本明細書で提供される遺伝子によりコードされた酵素の活性が、測定または決定される。本明細書で提供される遺伝子によりコードされた酵素の活性（例えば、比活性）は、細胞内で測定することができ、または細胞からの抽出後に（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで）測定することができる。本明細書で提供される遺伝子またはタンパク質の発現のレベルまたは量を測定するために使用されるアッセイは、実質的に高効率であり得る。本明細書で提供される遺伝子によりコードされた酵素の活性を測定するために使用されるアッセイは、実質的に高効率であり得る。
【００９４】
本明細書で提供される遺伝子のレベルまたは量は、核酸レベルで遺伝子のレベルまたは量を測定するための当業界で公知の任意のアッセイを使用して測定することができる。核酸（例えば、本明細書で提供される遺伝子）のレベルを決定または測定するために好適なアッセイの例は、マイクロアレイ解析、ＲＴ−ＰＣＲ、例えば定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）、ＲＮＡ−ｓｅｑ、ノーザンブロット、デジタル分子バーコード技術、例えばＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、およびＴａｑＭａｎ定量的ＰＣＲアッセイから選択することができる。ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの、他のｍＲＮＡ検出および定量方法を適用してもよい。ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、増幅系に特異的に結合するそれぞれのｍＲＮＡのためのプローブセットを使用してハイブリダイゼーションシグナルを増幅する、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ＶｉｅｗＲＮＡ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して測定することができ、標準的な蛍光顕微鏡またはイメージングシステムを使用してこれらの増幅シグナルを可視化することができる。このシステムは、例えば、不均一な試料中の転写物レベルを検出および測定することができる。
【００９５】
本明細書で提供される遺伝子によりコードされたタンパク質のレベルまたは量は、タンパク質レベルでレベルまたは量を測定するための当業界で公知の任意のアッセイを使用して測定することができる。タンパク質（例えば、本明細書で提供される遺伝子によりコードされた）のレベルを決定または測定するために好適なアッセイの例は、抗体、例えば標識抗体などの、バイオマーカー検出剤が、本明細書で提供される遺伝子によりコードされたタンパク質に特異的に結合し、例えば、試料または細胞中のタンパク質の量の相対的または絶対的特定を可能にする、例えば、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイなどを含む、定量的質量分析またはイムノアッセイから選択することができる。本明細書で提供されるように異種改変された、本明細書で提供される遺伝子によりコードされた酵素のまたは前記遺伝子自体のレベルまたは量を、本明細書に記載されるように異種改変されていない同じ酵素または遺伝子のレベルまたは量と比較することができ、非改変酵素または遺伝子に対する改変酵素または遺伝子のレベルまたは量のパーセンテージを決定することができる。
【００９６】
本明細書で提供される遺伝子によりコードされた酵素の活性は、酵素活性を測定するための当業界で公知の任意のアッセイを使用して測定することができる。酵素活性（acitivty）を決定するために好適なアッセイの例は、例えば、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから市販されている生化学的キナーゼアッセイ（例えば、ＦＲＥＴに基づくＨＴＲＦアッセイ）、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから市販されている生化学的キナーゼアッセイ（例えば、Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｏｎｅ細胞シグナル伝達アッセイ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている生化学的キナーゼアッセイ（ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎもしくはＯｍｎｉａキナーゼアッセイ）、Ｓｙｍａｎｓｉｓから市販されている生化学的キナーゼアッセイ（例えば、Ｍｕｌｔｉｋｉｎａｓｅアッセイアレイ）、ＡｂｃａｍまたはＰｒｏｍｅｇａから市販されている生化学的キナーゼアッセイ（例えば、ＡＤＰ−Ｇｌｏ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａｓｓａｙ）などの、当業界で公知の任意のキナーゼアッセイであり得る。キナーゼ活性アッセイは、放射測定に基づくアッセイであって、放射性同位体（例えば、λ−３２Ｐ標識ＡＴＰもしくは３２Ｐオルトリン酸塩）の使用を用いることもあり、または発光もしくは蛍光（例えば、フルオロフォアで標識されたＡＴＰ）に基づくアッセイであることもある。一実施形態では、ヒスチジンキナーゼ活性アッセイが、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ｎｉｋＡ遺伝子によりコードされた２成分ヒスチジンキナーゼ（例えば、配列番号７のＳＮＰ含有核酸配列または配列番号１４もしくは７６の非ＳＮＰ含有核酸配列によりコードされたタンパク質）などの、ヒスチジンキナーゼの活性を測定するために使用される。ヒスチジンキナーゼ活性アッセイは、当業界で公知の任意のヒスチジンキナーゼ活性アッセイであってもよい。一例では、本明細書で提供される遺伝子または核酸配列（例えば、配列番号７、４もしくは７６の核酸配列）によりコードされたキナーゼ（例えば、ヒスチジンキナーゼ）の活性を、参照により本明細書に組み込まれる、Sankhe  GD,  Dixit  NM,  Saini  DK.  2018.    Activation  of  bacterial  histidine  kinases:  insights  into  the  kinetics  of  the  cis  autophosphorylation  mechanism.  mSphere  3:e00111-18に記載されているような、放射測定キナーゼ活性アッセイおよび解析（すなわち、液体シンチレーション計数と組み合わせたポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ））を使用して決定することができる。別例では、本明細書で提供される遺伝子または核酸配列（例えば、配列番号７、４もしくは７６の核酸配列）によりコードされたキナーゼ（例えば、ヒスチジンキナーゼ）の活性を、Brown,  J  L  et  al.  "Yeast  Skn7p  functions  in  a  eukaryotic  two-component  regulatory  pathway."  The  EMBO  journal  vol.  13,21  (1994):  5186-94,  Aoyama,  K  et  al.  "Spy1,  a  histidine-containing  phosphotransfer  signaling  protein,  regulates  the  fission  yeast  cell  cycle  through  the  Mcs4  response  regulator."  Journal  of  bacteriology  vol.  182,17  (2000):  4868-74、およびLi,  S  et  al.  "The  yeast  histidine  protein  kinase,  Sln1p,  mediates  phosphotransfer  to  two  response  regulators,  Ssk1p  and  Skn7p."  The  EMBO  journal  vol.  17,23  (1998):  6952-62（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーと��み合わせて放射性同位体標識を使用するリン酸基転移を使用して決定することができる。本明細書で提供されるように異種改変された、本明細書で提供される遺伝子によりコードされている酵素の活性を、本明細書に記載されるように異種改変されていない遺伝子によりコードされている同じ酵素の活性と比較することができ、非改変酵素に対する改変酵素の活性のレベルまたはパーセンテージを決定することができる。
概観
【００９７】
本発明の目的は、目的の生成物用の生産培地で増殖させると所望の形態学的表現型を有する糸状真核生物の株、ならびに糸状真核生物の前記株を生成するための方法を提供することである。所望の形態学的表現型を有する、本明細書で提供される方法を使用して生成される変異株は、親の株または対照株と比較して高い収率、力価または総力価の目的の前記生成物を産生することができる。所望の形態学的表現型を有する、本明細書で提供される方法を使用して生成される変異株は、親の株または対照株より高い生産率で目的の前記生成物を産生することができる。所望の形態学的表現型を有する、本明細書で提供される方法を使用して生成される変異株は、親の株または対照株と比較して高い体積生産性または比生産性で目的の前記生成物を産生することができる。糸状真核生物は、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などの、当業界で公知のおよび／または本明細書で提供される任意の糸状真核生物であってもよい。所望の形態学的表現型は、目的の所望の生成物用の所望の生産培地において液内培養条件下で増殖させると非菌糸体ペレット表現型であり得る。所望の生成物または目的の生成物は、表１に列挙される任意の生成物であってもよい。一実施形態では、目的の所望の生成物は、酵素である。酵素は、遺伝子操作された生物により産生されることが当業界で公知の任意の酵素であってもよい。酵素は、表１に見出される任意の酵素であってもよい。一実施形態では、目的の所望の生成物は、クエン酸であり、所望の生産培地は、クエン酸生産（ＣＡＰ）培地である。一部の場合には、所望の形態学的表現型（例えば、非菌糸体ペレット形態）を含む糸状真核生物株（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）を、例えばマンガンキレート剤などの、キレート剤を含まないまたは実質的に含まない（例えば、例えばクエン酸などの目的の生成物の産生用の当業界で公知の発酵ブロス中に見出されるキレート剤の量または濃度の５％、４％、３％、２％または１％未満である）、マンガン含有ＣＡＰ培地において増殖させることができる。マンガンは、約１３ｐｐｂまたはそれより多い量で存在してもよい。マンガンは、約１４ｐｐｂまたはそれより多い量で存在してもよい。別の実施形態では、所望の形態学的表現型（例えば、非菌糸体ペレット形態）を含む糸状真核生物株（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）である提供される株は、変更または破壊された形態の制御において役割を果たす１つまたは複数の遺伝子を含む。破壊または変更は、遺伝子のコードドメイン内の突然変異であってもよい。破壊または変更は、遺伝子制御エレメント（例えば、プロモーターおよび／またはターミネーター）の変更であってもよい。破壊または変更は、遺伝子制御エレメント（例えば、プロモーターおよび／またはターミネーター）の変更と組み合わせて、遺伝子のコードドメイン内の突然変異であってもよい。遺伝子制御エレメントの変更は、内因性遺伝子制御エレメントから、非天然または異種遺伝子制御エレメントへの置き換えであってもよい。一部の場合には、遺伝子制御エレメントは、プロモーターである。プロモーターは、表２に列挙されるプロモーターから選択することができる。形態の制御において役割を���たす１つまたは複数の遺伝子は、糸状真核生物（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）の形態の制御において役割を果たすことが当業界で公知の任意の遺伝子であってもよい。形態の制御において役割を果たす遺伝子は、細胞の物理的構造の中で機能するタンパク質をコードする遺伝子であってもよく、ならびに細胞の物理的構造の中で機能するタンパク質の発現を直接的にまたは間接的にいずれかで調節または支配する生化学的経路の一部である遺伝子であってもよい。形態の制御において役割を果たす１つまたは複数の遺伝子は、例えば、配列番号５、６、７もしくは８により表されるＳＮＰ含有遺伝子配列または表４からのそのオルソログの、単独でのもの、あるいは前記ＳＮＰ含有遺伝子配列と同じ経路内に見出される１つまたは複数の遺伝子との組合せでのものなどの、本明細書で提供される任意の遺伝子であってもよい。一実施形態では、形態の制御において役割を果たす１つまたは複数の遺伝子は、浸透圧応答または浸透ストレス応答経路からの１つまたは複数の遺伝子である。例えば、１つもしくは複数の遺伝子またはそのオルソログは、表７に示されている浸透圧応答経路遺伝子から選択することができる。一実施形態では、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主細胞（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）の形態の制御において役割を果たす１つもしくは複数の遺伝子は、表７に示されている酵母浸透圧経路遺伝子のうちの１つまたは複数のオルソログである。例えば、酵母浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号９〜３２、７６またはそれらの任意の組合せにより表される核酸配列から選択することができる。目的の生成物用の生産培地で増殖させると所望の形態学的表現型を有する糸状真核生物の株を生成するための方法は、本明細書で提供されるようなＰＲＯスワップ法、ＳＮＰスワップ法、またはＰＲＯスワップ法とＳＮＰスワップ法の組合せを行うことを含み得る。ＳＮＰスワップおよび／またはＰＲＯスワップ法は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年６月６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３６３６０に記載の通りに行うことができる。
【００９８】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
2021526799.tif 000007
【００９９】
本発明のさらなる目的は、宿主細胞の浸透圧応答経路からの遺伝子の異種改変を含む糸状真菌宿主細胞を提供することである。遺伝子は、糸状真菌宿主細胞の浸透圧応答経路からの遺伝子のいずれか１つまたはそれらの組合せであってもよい。浸透圧経路からの改変遺伝子は、遺伝子の非改変バージョンと比較して発現減少を有することがあり、および／または活性の低下を有するタンパク質をコードすることもある。一実施形態では、遺伝子は、表７に列挙される酵母浸透圧応答経路遺伝子のうちの１つの糸状真菌オルソログである。一実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主細胞（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）であり、遺伝子は、表７に示される酵母浸透圧経路遺伝子のうちの１つまたは複数のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである。例えば、酵母浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号９〜３２または７６により表される核酸配列から選択することができる。別の実施形態では、表７に列挙される酵母浸透圧応答経路遺伝子からの複数の糸状真菌オルソログは、糸状真菌宿主細胞において異種改変されている。一実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子の糸状真菌宿主細胞オルソログの異種改変を含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子の改変オルソログは、異種改変を欠いている親の糸状真菌宿主細胞と比べて、発現減少を有することがあり、および／または活性低下を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質のオルソログをコードすることもある。糸状真菌宿主は、非菌糸体ペレット形成表現型を有することもある。このペレット表現型は、糸状真菌宿主細胞が、浸透圧応答経路からの遺伝子または複数の遺伝子（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子のオルソログ）の異種改変を有し、この異種改変に起因して、糸状宿主細胞の細胞が、前記異種改変（単数または複数）を有さない糸状宿主細胞の細胞と比較して糸状宿主細胞の改変された遺伝子または複数の遺伝子の機能的オルソログ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質のオルソログ）の減少したもしくは実質的に減少した量、および／または活性の低いもしくは実質的に低い型のそのような機能的オルソログを産生することになるためである。糸状真菌宿主細胞中の機能タンパク質の量は、親の株または対照株中のそれぞれの機能タンパク質の量と比較して、少なくとも、最大で、正確にまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、��１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％減少され得る。機能タンパク質の量（例えば、モル量）は、例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイ、質量分析および／または定量的ウェスタンブロット解析などの、当業界で公知の任意の方法を使用して測定することができる。糸状真菌宿主細胞中の機能タンパク質の活性（例えば、比活性）は、親の株または対照株中のそれぞれの機能タンパク質の活性と比較して、少なくとも、最大で、正確にまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％低下され得る。機能タンパク質の活性は、例えばキナーゼアッセイなどの当業界で公知の任意の酵素活性方法を使用して測定することができる。酵素活性の測定は、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＡｂｃａｍまたはＰｒｏｍｅｇａから入手可能な市販の生化学的キナーゼ活性アッセイなどの、当業界で公知のおよび／または本明細書で提供される任意の方法を使用して行うことができる。糸状真菌宿主細胞、および前記糸状真菌宿主細胞が由来する任意の親の株は、例えばＡ．ｎｉｇｅｒなどの、当業界で公知のおよび／または本明細書で提供される任意の糸状真菌であってもよい。一実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、異種改変を有する浸透圧応答経路からの遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、表６に列挙されるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログのいずれであってもよい。一実施形態では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｋＡ遺伝子（配列番号１４）である、ｉｄ  ＡＳＰＮＩＤＲＡＦＴ＿３９７３６を有するＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである。別の実施形態では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号７６の核酸配列を有するＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｋＡ遺伝子は、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓ���（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）ｎｉｋ１遺伝子のオルソログまたはホモログである。
【０１００】
一実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、例えば固体培地上などの非液内増殖条件下で増殖させると親の株と比較して正常に胞子形成する。別の実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、表３からのＳＮＰ含有遺伝子またはそれらのオルソログの１つ、全てまたは組合せもまた糸状真菌宿主細胞に発現された場合のみ、例えば固体培地上などの非液内増殖条件下で増殖させると親の株と比較して正常に胞子形成する。一実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、前記Ａ．ｎｉｇｅｒ宿主細胞は、表３からのＳＮＰ含有遺伝子の１つ、全てまたは組合せもまた前記Ａ．ｎｉｇｅｒ宿主細胞に発現された場合のみ、例えば固体培地上などの非液内増殖条件下で増殖させると親の株と比較して正常に胞子形成する。さらに別の実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、表４からのＳＮＰ含有遺伝子のオルソログの１つ、全てまたは組合せもまた糸状真菌宿主細胞に発現された場合のみ、例えば固体培地上などの非液内増殖条件下で増殖させると親の株と比較して正常に胞子形成する。一実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、前記Ａ．ｎｉｇｅｒ宿主細胞は、表４からのＳＮＰ含有遺伝子の１つ、全てまたは組合せもまた前記Ａ．ｎｉｇｅｒ宿主細胞に発現された場合のみ、例えば固体培地上などの非液内増殖条件下で増殖させると親の株と比較して正常に胞子形成する。液内培養条件は、ＣＡＰ培地において変異株を増殖させることを含んでもよい。ＣＡＰ培地は、マンガンを含んでもよく、キレート剤を含まなくてもまたは実質的に含まなくてもよい（例えば、例えばクエン酸などの目的の生成物の産生用の当業界で公知の発酵ブロスに見出されるキレート剤の量または濃度の５％、４％、３％、２％または１％未満）。マンガンは、少なくとも１３ｐｐｂであるかまたはそれより多い量で、存在してもよい。マンガンは、少なくとも１４ｐｐｂであるかまたはそれより多い量で、存在してもよい。
【０１０１】
糸状真菌の浸透圧応答経路からの遺伝子または複数の遺伝子からの各遺伝子の遺伝的変更または異種改変は、遺伝子の野生型から突然変異型への置き換え、遺伝子の天然プロモーターから、前記天然プロモーターと比較して前記遺伝子を弱く発現する異種プロモーターへの置き換え、またはこれらの組合せであってもよい。あるいは、糸状真菌の浸透圧応答経路からの遺伝子または複数の遺伝子からの各遺伝子の遺伝的変更または異種改変は、除去遺伝子（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子のオルソログの遺伝子）、および選択可能なマーカー遺伝子への置き換えであってもよい。糸状真菌の浸透圧応答経路からの遺伝子または複数の遺伝子からの各遺伝子の突然変異型は、ＳＮＰ、ナンセンス突然変異、ミスセンス突然変異、欠失、挿入、またはこれらの任意の組合せを含んでもよい。浸透圧応答経路からの遺伝子または複数の遺伝子からの各遺伝子は、糸状真菌宿主細胞の浸透圧応答経路からの遺伝子のいずれか１つであってもよい。一実施形態では、浸透圧応答経路からの遺伝子または複数の遺伝子からの各遺伝子は、表７に列挙される酵母浸透圧応答経路遺伝子のうちの１つの糸状真菌オルソログである。一実施形態では、浸透圧応答経路からの遺伝子は、酵母Ｙｐｄ１、Ｓｋｎ７、Ｓｓｋ１、Ｓｔｅ１１、Ｂｃｋ１、Ｓｔｅ７、Ｍｋｋ２／２２、Ｐｂｓ２、Ｆｕｓ１／Ｋｓｓ３、Ｍｐｋ１、Ｈｏｇ１、Ｐｈｋ１／２、Ｃｈｋ１、Ｐｈｋ３、Ｓｐｙ１、Ｍｃｓ４、ＳｓｋＡ、Ｐｒｒ１、Ｒｉｍ１５、Ｃｅｋ１、Ｒｉｍ１５およびＳｓｋ２／２２遺伝子またはこれらの任意の組合せのオルソログである。酵母Ｙｐｄ１、Ｓｋｎ７、Ｓｓｋ１、Ｓｔｅ１１、Ｂｃｋ１、Ｓｔｅ７、Ｍｋｋ２／２２、Ｐｂｓ２、Ｆｕｓ１／Ｋｓｓ３、Ｍｐｋ１、Ｈｏｇ１、Ｐｈｋ１／２、Ｃｈｋ１、Ｐｈｋ３、Ｓｐｙ１、Ｍｃｓ４、ＳｓｋＡ、Ｐｒｒ１、Ｒｉｍ１５、Ｃｅｋ１、Ｒｉｍ１５およびＳｓｋ２／２２遺伝子の核酸配列は、配列番号５０〜７５から選択することができる。一実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、酵母ＳＬＮ１、Ｙｐｄ１、Ｓｋｎ７、Ｓｓｋ１、Ｓｔｅ１１、Ｂｃｋ１、Ｓｔｅ７、Ｍｋｋ２／２２、Ｐｂｓ２、Ｆｕｓ１／Ｋｓｓ３、Ｍｐｋ１、Ｈｏｇ１、Ｐｈｋ１／２、Ｃｈｋ１、Ｐｈｋ３、Ｓｐｙ１、Ｍｃｓ４、ＳｓｋＡ、Ｐｒｒ１、Ｒｉｍ１５、Ｃｅｋ１、Ｒｉｍ１５およびＳｓｋ２／２２遺伝子のオルソログは、Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログまたはそれらの突然変異体である。例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号９〜３２または７６により表される核酸配列から選択することができる。一実施形態では、浸透圧応答経路の一部であるＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せにより表される核酸配列から選択することができる。一実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、浸透圧応答経路からの遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである。別の実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、浸透圧応答経路からの遺伝子は、コードされたタンパク質のアミノ酸２７２位のヒスチジンをチロシンに変換するミスセンス突然変��を含む配列番号７の核酸配列を有する。さらに別の実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、浸透圧応答経路からの遺伝子は、コードされたタンパク質のアミノ酸２７２位のヒスチジンをチロシンに変換するミスセンス突然変異を含む配列番号７の核酸配列を有し、配列番号７の核酸配列は、配列番号７の核酸配列をより弱く発現するプロモーターに作動可能に連結されている。さらに別の実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、浸透圧応答経路からの遺伝子は、配列番号１４または７６の核酸配列をより弱く発現するプロモーターに作動可能に連結されている配列番号１４または７６の核酸配列を有する。上記実施形態のいずれかに付け加えて、異種プロモーターを表２に列挙されるプロモーターから選択することができる。一実施形態では、異種プロモーターは、ｍａｎＢまたはａｍｙＢプロモーターである。この実施形態に付け加えて、異種プロモーターは、配列番号１または配列番号２の核酸配列を有していてもよい。一実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターであってもよい。誘導性プロモーターは、胞子形成中にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ｎｉｋＡ遺伝子）のオルソログなどの遺伝子を確実に適切に発現させるように、しかし目的の所望の生成物を産生するために求められる特定の条件下（例えば、発酵条件下）では、そのような条件下での非菌糸体ペレット表現型を促進するために前記遺伝子の発現を確実に減少させるように、使用することができる。ａｍｙＢプロモーターは、そのように使用することができる誘導性プロモーターの例である。選択可能なマーカーは、本明細書で提供されるような、栄養要求性マーカー遺伝子、比色分析用マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子または方向マーカー遺伝子から選択することができる。
【０１０２】
一実施形態では、本明細書で提供される、または本明細書で提供される方法を使用して生成される、糸状真菌宿主細胞は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質の機能的オルソログの減少したもしくは実質的に減少した量および／または活性の低いもしくは実質的に低い型を有し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質のオルソログと同じ経路（すなわち、浸透圧応答経路）の一部である１つまたは複数の追加の遺伝子の遺伝子破壊または遺伝的変更をさらに含む。同じ経路の一部である１つまたは複数の遺伝子は、表７に列挙される酵母浸透圧応答経路からの遺伝子のいずれかについてのオルソログであってもよい。一実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｙｐｄ１、Ｓｋｎ７、Ｓｓｋ１、Ｓｔｅ１１、Ｂｃｋ１、Ｓｔｅ７、Ｍｋｋ２／２２、Ｐｂｓ２、Ｆｕｓ１／Ｋｓｓ３、Ｍｐｋ１、Ｈｏｇ１、Ｐｈｋ１／２、Ｃｈｋ１、Ｐｈｋ３、Ｓｐｙ１、Ｍｃｓ４、ＳｓｋＡ、Ｐｒｒ１、Ｒｉｍ１５、Ｃｅｋ１、Ｒｉｍ１５およびＳｓｋ２／２２遺伝子またはこれらの任意の組合せのオルソログをさらに含む。酵母Ｙｐｄ１、Ｓｋｎ７、Ｓｓｋ１、Ｓｔｅ１１、Ｂｃｋ１、Ｓｔｅ７、Ｍｋｋ２／２２、Ｐｂｓ２、Ｆｕｓ１／Ｋｓｓ３、Ｍｐｋ１、Ｈｏｇ１、Ｐｈｋ１／２、Ｃｈｋ１、Ｐｈｋ３、Ｓｐｙ１、Ｍｃｓ４、ＳｓｋＡ、Ｐｒｒ１、Ｒｉｍ１５、Ｃｅｋ１、Ｒｉｍ１５およびＳｓｋ２／２２遺伝子の核酸配列は、配列番号５０〜７５から選択することができる。一実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１、Ｙｐｄ１、Ｓｋｎ７、Ｓｓｋ１、Ｓｔｅ１１、Ｂｃｋ１、Ｓｔｅ７、Ｍｋｋ２／２２、Ｐｂｓ２、Ｆｕｓ１／Ｋｓｓ３、Ｍｐｋ１、Ｈｏｇ１、Ｐｈｋ１／２、Ｃｈｋ１、Ｐｈｋ３、Ｓｐｙ１、Ｍｃｓ４、ＳｓｋＡ、Ｐｒｒ１、Ｒｉｍ１５、Ｃｅｋ１、Ｒｉｍ１５およびＳｓｋ２／２２遺伝子のオルソログは、Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログまたはそれらの突然変異体である。例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号９〜３２または７６により表される核酸配列から選択することができる。この実施形態に付け加えて、同じ経路（すなわち、浸透圧応答経路）の一部である１つまたは複数の遺伝子は、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せにより表される核酸配列から選択することができる。糸状真菌宿主細胞は、糸状真菌の形態の制御において役割を果たすことが公知であるまたは疑われる異なる経路（単数または複数）の一部である１つまたは複数の遺伝子の遺伝子破壊または遺伝的変更をさらに含んでもよい。異なる経路（単数または複数）の一部である１つまたは複数の遺伝子は、配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せにより表される核酸配列を有する遺伝子のオルソログから選択することができる。一実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、異なる経路（単数または複数）の一部である１つまたは複数の遺伝子は、配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せにより表される核酸配列を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子である。別の実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、異なる経路（単数または複数）の一部である１つ���たは複数の遺伝子は、配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せにより表される核酸配列を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンである。配列番号５、６、８により表される核酸配列を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンは、それぞれ、配列番号７７〜７９の核酸配列であってもよい。
【０１０３】
糸状真菌の形態の制御において役割を果たすことが公知であるまたは疑われる異なる経路（単数または複数）の一部である１つまたは複数の遺伝子に対する遺伝子破壊または遺伝的変更は、遺伝子の野生型から、遺伝子の突然変異型への置き換え、遺伝子の天然プロモーターから、天然プロモーターと比較して遺伝子の発現を変更（例えば、より多くまたはより少なく）する異種プロモーターへの置き換え、またはこれらの組合せであってもよい。プロモーターは、表２に列挙されるプロモーターであってもよい。一実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターであってもよい。あるいは、糸状真菌の形態の制御において役割を果たすことが公知である異なる経路の一部である１つまたは複数の遺伝子に対する遺伝子破壊または遺伝的変更は、遺伝子の除去であってもよく、および選択可能なマーカー遺伝子への置き換えであってもよい。選択可能なマーカーは、本明細書で提供されるような、栄養要求性マーカー遺伝子、比色分析用マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子または方向マーカー遺伝子から選択することができる。
【０１０４】
糸状真菌宿主細胞の浸透圧応答経路の一部である機能タンパク質または複数のタンパク質の減少したもしくは実質的に減少した量および／または活性の低いもしくは実質的に低い型を有する糸状真菌宿主細胞を生成する方法も、本明細書で提供される。一実施形態では、前記糸状真菌宿主細胞は、当業界で公知のおよび／または表７に示される酵母浸透圧応答経路からのタンパク質のオルソログである機能タンパク質または複数のタンパク質の減少したもしくは実質的に減少した量および／または活性の低いもしくは実質的に低い型を有する。一実施形態では、前記糸状真菌宿主細胞は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質またはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１タンパク質のオルソログである機能タンパク質の減少したもしくは実質的に減少した量および／または活性の低いもしくは実質的に低い型を有する。一実施形態では、前記糸状真菌宿主細胞は、表７に示される酵母浸透圧応答経路からの複数の遺伝子の各々についての機能タンパク質の減少したもしくは実質的に減少した量および／または活性の低いもしくは実質的に低い型を有する。一実施形態では、前記糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、前記宿主細胞は、酵母浸透圧応答経路からの複数の遺伝子の各々についてのＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである機能タンパク質の減少したもしくは実質的に減少した量および／または活性の低いもしくは実質的に低い型を有する。前記Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号９〜３２または７６により表される核酸配列から選択することができる。方法は、本明細書で提供されるような、ＰＲＯスワップ法、ＳＮＰスワップ法、またはＰＲＯスワップ法とＳＮＰスワップ法の組合せを含んでもよい。糸状真菌宿主細胞中の機能タンパク質の量は、親の株または対照株中のそれぞれの機能タンパク質の量と比較して、少なくとも、最大で、正確にまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％減少され得る。機能タンパク質の量（例えば、モル量）は、例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイ、質量分析および／または定量的ウェスタンブロット解析などの、当業界で公知の任意の方法を使用して測定することができる。糸状真菌宿主細胞中の機能タンパク質の活性（例えば、比活性）は、親の株または対照株中のそれぞれの機能タンパク質の活性と��較して、少なくとも、最大で、正確にまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％低下され得る。機能タンパク質の活性は、例えばキナーゼアッセイなどの当業界で公知の任意の酵素活性方法を使用して測定することができる。酵素活性の測定は、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＡｂｃａｍまたはＰｒｏｍｅｇａから入手可能な市販の生化学的キナーゼ活性アッセイなどの、当業界で公知のおよび／または本明細書で提供される任意の方法を使用して行うことができる。
【０１０５】
本発明のさらなる目的は、配列番号５、６、８、７７、７８、７９またはこれらの任意の組合せから選択される核酸配列を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子の宿主細胞のオルソログの異種改変を含み、その改変によって、配列番号５、６、８、７７、７８、７９またはこれらの任意の組合せから選択される核酸配列を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子の改変されたオルソログが、異種改変を欠いている親の糸状真菌宿主細胞と比べて活性の低下および／または発現の減少を有する、糸状真菌宿主細胞を提供することである。糸状真菌宿主は、配列番号５、６、８、７７、７８、７９またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログに対する異種改変を有するため、糸状真菌宿主は、液内培養で増殖させると親の株の細胞と比較して非菌糸体ペレット形成表現型を有することができる。配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログを有することによって、宿主細胞の細胞は、液内培養条件下で増殖させると親の宿主細胞の細胞と比較して前記配列番号を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログによりコードされた機能タンパク質の減少したもしくは実質的に減少した量および／または活性の低いもしくは実質的に低い型を産生することができる。糸状宿主細胞、および前記糸状真菌宿主細胞の親の株は、例えばＡ．ｎｉｇｅｒなどの、当業界で公知のおよび／または本明細書で提供される任意の糸状真菌であってもよい。一実施形態では、糸状宿主細胞株は、例えば固体培地上などの非液内増殖条件下で増殖させると親の株と比較して正常に胞子形成する。一部の場合には、配列番号５、６、８、７７、７８または７９を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログは、さらに遺伝的に変更される。さらなる遺伝的変更は、遺伝子の天然プロモーターから、天然プロモーターと比較して遺伝子をより弱く発現する異種プロモーターへの置き換えであってもよい。あるいは、さらなる遺伝的変更は、配列番号５、６、８、７７、７８または７９を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログの除去であってもよく、および選択可能なマーカー遺伝子への置き換えであってもよい。選択可能なマーカーは、本明細書で提供されるような、栄養要求性マーカー遺伝子、比色分析用マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子または方向マーカー遺伝子から選択することができる。異種プロモーターは、表２に列挙されるプロモーターから選択することができる。一実施形態では、異種プロモーターは、ｍａｎＢまたはａｍｙＢプロモーターである。この実施形態に付け加えて、異種プロモーターは、配列番号１または配列番号２の核酸配列を有していてもよい。一実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。液内培養条件は、ＣＡＰ培地において変異株を増殖させることを含んでもよい。ＣＡＰ培地は、マンガンを含んでもよく、キレート剤を、実質的に含まなくても、または含まなくてもよい。マンガンは、少なくとも１３ｐｐｂであるかまたはそれより多い量で、存在してもよい。マンガンは、少なくとも１４ｐｐｂであるかまたはそれより多い量で、存在してもよい。糸状真菌宿主がＡ．ｎｉｇｅｒである実施形態では、配列番号５、６、８またはその野生型バージョン（例えば、配列番号７７〜７９を有する核酸配列）から選択される核酸配列を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子は、本明細書で詳述される異種改変を含んでもよいことを理解されたい。
【０１０６】
配列番号５、６、８、７７、７８または７９から選択される配列を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログによりコードされた機能タンパク質の実質的に減少した量もしくは減少した量および／または活性の実質的に低い型もしくは活性の低い型を有する糸状真菌宿主細胞は、同じ経路の一部である１つまたは複数の遺伝子の遺伝子破壊または遺伝的変更をさらに含んでもよい。糸状真菌宿主細胞は、糸状真菌の形態の制御において役割を果たすことが公知である異なる経路の一部である１つまたは複数の遺伝子の遺伝子破壊または遺伝的変更をさらに含んでもよい。異なる経路の一部である１つまたは複数の遺伝子は、宿主細胞浸透圧応答経路の一部である遺伝子などの、本明細書で提供される遺伝子のいずれであってもよい。糸状真菌の形態の制御において役割を果たすことが公知である、同じ経路の一部であるまたは異なる経路の一部である、１つまたは複数の遺伝子に対する遺伝子破壊または遺伝的変更は、遺伝子の野生型から遺伝子の突然変異型への置き換え、遺伝子の天然プロモーターから、天然プロモーターと比較して遺伝子の発現を変更（例えば、より多くまたはより少なく）する異種プロモーターへの置き換え、またはこれらの組合せであってもよい。プロモーターは、表２に列挙されるプロモーターであってもよい。一実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。あるいは、糸状真菌の形態の制御において役割を果たすことが公知である、同じ経路の一部であるまたは異なる経路の一部である、１つまたは複数の遺伝子に対する遺伝子破壊または遺伝的変更は、遺伝子の除去であってもよく、および選択可能なマーカー遺伝子への置き換えであってもよい。選択可能なマーカーは、本明細書で提供されるような、栄養要求性マーカー遺伝子、比色分析用マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子または方向マーカー遺伝子から選択することができる。
【０１０７】
配列番号５、６、８、７７、７８または７９を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログによりコードされた機能タンパク質の実質的に減少した量もしくは減少した量および／または活性の実質的に低い型もしくは活性の低い型を有する糸状真菌の変異株を生成するための方法も、本明細書で提供される。方法は、本明細書で提供されるような、ＰＲＯスワップ法、ＳＮＰスワップ法、またはＰＲＯスワップ法とＳＮＰスワップ法の組合せを実行することを含んでもよい。変異株中の配列番号５、６、８、７７、７８または７９を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログによりコードされた機能タンパク質の量は、親の株または対照株中のそれぞれの機能タンパク質の量と比較して、少なくとも、最大で、正確にまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％減少され得る。機能タンパク質の量（例えば、モル量）は、例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイ、質量分析および／または定量的ウェスタンブロット解析などの、当業界で公知の任意の方法を使用して測定することができる。変異株中の配列番号５、６、８、７７、７８または７９を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログによりコードされた機能タンパク質の活性（例えば、比活性）は、親の株または対照株中のそれぞれの機能タンパク質の活性と比較して、少なくとも、最大で、正確にまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％低下され得る。機能タンパク質の活性は、例えばキナーゼアッセイなどの当業界で公知の任意の酵素活性方法を使用して測定することができる。酵素活性の測定は、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＡｂｃａｍまたはＰｒｏｍｅｇａから入手可能な市販の生化学的キナーゼ活性アッセイなどの、当業界で公知のおよび／または本明細書で提供される任意の方法を使用して行うことができる。
【０１０８】
本発明のさらに別の目的は、宿主細胞の形態を調節する遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む糸状真菌宿主細胞であって、プロモーターが、遺伝子にとって異種であり、プロモーターが、配列番号１〜４からなる群から選択される核酸配列を有する、糸状真菌宿主細胞を提供することである。糸状真菌宿主細胞は、例えばＡ．ｎｉｇｅｒなどの、当業界で公知のおよび／または本明細書で提供される任意の糸状真菌であってもよい。一部の場合には、真菌宿主細胞は、例えば固体培地上などの、非液内増殖条件下で増殖させると宿主細胞の親の株と比較して正常に胞子形成するが、液内培養条件下で増殖させると非菌糸体ペレット形態を形成する。一部の場合には、宿主細胞は、形態を調節する１つまたは複数の遺伝子であって、１つまたは複数の遺伝子の各々に異種プロモーターが連結されているような、１つまたは複数の遺伝子を含んでもよい。宿主細胞の形態を調節する１つまたは複数の遺伝子は、単独または組合せいずれかでの、例えば配列番号５、６、７もしくは８により表されるＳＮＰ含有遺伝子配列または表４からのそのオルソログなどの、本明細書で提供される任意のそのような遺伝子であってもよい。一部の場合には、配列番号５、６、７もしくは８により表されるＳＮＰ含有遺伝子配列または表４からのそのオルソログは、それぞれのＳＮＰ含有遺伝子配列と同じ経路からの１つまたは複数の遺伝子と組合せでのものであってもよい。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子は、単独または組合せいずれかでの、配列番号５、６、７もしくは８から選択される核酸配列を有する遺伝子（例えば、配列番号７６〜７９の核酸配列）またはそのオルソログの、野生型または非ＳＮＰ含有バージョンである。別の実施形態では、配列番号５、６、７もしくは８から選択される核酸配列を有する遺伝子（例えば、配列番号７６〜７９の核酸配列）またはそのオルソログの、野生型または非ＳＮＰ含有バージョンは、それぞれの野生型または非ＳＮＰ含有遺伝子配列と同じ経路からの１つまたは複数の遺伝子との組合せでのものであってもよい。一実施形態では、宿主細胞の形態を調節する遺伝子は、宿主細胞の浸透圧応答経路からの遺伝子であってもよい。別の実施形態では、宿主細胞の浸透圧応答経路からの複数の遺伝子は、宿主細胞の形態を調節するために組み合わせて使用される。一実施形態では、宿主細胞の形態を調節する遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子のオルソログであってもよく、または表７に示されるような酵母浸透圧応答経路からの遺伝子のオルソログであってもよい。別の実施形態では、表７に示されるような酵母浸透圧応答経路からの複数のオルソログは、宿主細胞の形態を調節するために組み合わせて使用される。一実施形態では、酵母浸透圧応答経路からの遺伝子のオルソログは、酵母Ｙｐｄ１、Ｓｋｎ７、Ｓｓｋ１、Ｓｔｅ１１、Ｂｃｋ１、Ｓｔｅ７、Ｍｋｋ２／２２、Ｐｂｓ２、Ｆｕｓ１／Ｋｓｓ３、Ｍｐｋ１、Ｈｏｇ１、Ｐｈｋ１／２、Ｃｈｋ１、Ｐｈｋ３、Ｓｐｙ１、Ｍｃｓ４、ＳｓｋＡ、Ｐｒｒ１、Ｒｉｍ１５、Ｃｅｋ１、Ｒｉｍ１５およびＳｓｋ２／２２遺伝子またはこれらの任意の組合せのオルソログから選択することができる。一実施形���では、酵母浸透圧応答経路からの遺伝子のオルソログは、配列番号５０〜７５から選択される核酸配列のオルソログである配列を有していてもよい。
【０１０９】
一実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号１〜４からなる群から選択される核酸配列を有するプロモーターに作動可能に連結されている（lniked）。別の実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号１の核酸配列を有するプロモーターに作動可能に連結されている。別の実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号２の核酸配列を有するプロモーターに作動可能に連結されている。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のオルソログは、遺伝子の野生型であってもよく、または突然変異型であってもよい。一実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の突然変異Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号７の核酸配列を有する。一実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の野生型Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号１４または７６の核酸配列を有する。液内培養条件は、ＣＡＰ培地において変異株を増殖させることを含んでもよい。ＣＡＰ培地は、マンガンを含んでもよく、およびキレート剤を含まなくてもまたは実質的に含まなくても（例えば、例えばクエン酸などの目的の生成物の産生用の当業界で公知の発酵培地に見出されるキレート剤の量または濃度の５％、４％、３％、２％または１％未満）または含まなくてもよい。マンガンは、少なくとも１３ｐｐｂであるかまたはそれより多い量で、存在してもよい。マンガンは、少なくとも１４ｐｐｂであるかまたはそれより多い量で、存在してもよい。
【０１１０】
一実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、酵母浸透圧応答経路からの１つまたは複数のオルソログは、配列番号１〜４からなる群から選択される配列を有するプロモーターに作動可能に連結されている。別の実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、酵母浸透圧応答経路からの１つまたは複数のオルソログは、配列番号１の核酸配列を有するプロモーターに作動可能に連結されている。さらに別の実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、酵母浸透圧応答経路からのオルソログの１つまたは複数は、配列番号２の核酸配列を有するプロモーターに作動可能に連結されている。１つまたは複数のオルソログは、表７に列挙されるＡ．ｎｉｇｅｒオルソログから選択することができる。例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号１４〜３２、７６またはこれらの任意の組合せにより表される核酸配列から選択することができる。一実施形態では、１つまたは複数のオルソログは、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せにより表される核酸配列から選択される。液内培養条件は、ＣＡＰ培地において変異株を増殖させることを含んでもよい。ＣＡＰ培地は、マンガンを含んでもよく、およびキレート剤を含まなくてもまたは実質的に含まなくても（例えば、例えばクエン酸などの目的の生成物の産生用の当業界で公知の発酵培地に見出されるキレート剤の量または濃度の５％、４％、３％、２％または１％未満）または含まなくてもよい。マンガンは、少なくとも１３ｐｐｂであるかまたはそれより多い量で、存在してもよい。マンガンは、少なくとも１４ｐｐｂであるかまたはそれより多い量で、存在してもよい。
糸状真核マイクローブ
【０１１１】
一実施形態では、所望のペレット形態を有する糸状真菌宿主細胞または株を生成するための本明細書で提供される方法およびシステムは、糸状真菌に由来する真菌エレメントであって、培養培地中の他のそのようなエレメントから容易に分離することができ、自体を再生する能力がある、真菌エレメントを使用する。例えば、真菌エレメントは、胞子、栄養繁殖体、菌糸断片、プロトプラストまたはマイクロペレットであってもよい。好ましい実施形態では、本明細書で提供されるシステムおよび方法は、糸状真菌に由来するプロトプラストを使用する。好適な糸状真菌宿主細胞は、例えば、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ、ＺｙｇｏｍｙｃｏｔａまたはＦｕｎｇｉ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ門の任意の糸状体を含む。好適な糸状真菌宿主細胞は、例えば、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ亜門の任意の糸状体を含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Hawksworth  et  al.,  In  Ainsworth  and  Bisby's  Dictionary  of  The  Fungi,  8th  edition,  1995,  CAB  International,  University  Press,  Cambridge,  UKを参照されたい）。ある特定の例示的な、しかし非限定的な実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物の細胞であってもよい。一実施形態では、糸状真菌は、Ａ．ｎｉｇｅｒグループのＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｓｏｊａｅおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｉからなる群から選択される。好ましい実施形態では、糸状真菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである。
【０１１２】
一実施形態では、糸状真菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ  ＡＣＭ  ３９９６（＝ＦＲＲ  ３５５８）、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ  Ｇｕｙ−１１またはＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＲＰ７８から選択される生産株である。別の実施形態では、糸状真菌は、当業界で公知のＡ．ｎｉｇｅｒ生産株である。本明細書で提供される方法において使用するためのＡ．ｎｉｇｅｒ生産株の例としては、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ  １１４１４、ＡＴＣＣ  １０１５、ＡＣＭ  ４９９２（＝ＡＴＣＣ  ９１４２）、ＡＣＭ  ４９９３（＝ＡＴＣＣ  １０５７７）、ＡＣＭ  ４９９４（＝ＡＴＣＣ  １２８４６）、ＡＴＣＣ２６５５０、ＡＴＣＣ  １１４１４、Ｎ４０２、ＣＢＳ  ５１３．８８またはＮＲＲＬ３（ＡＴＣＣ  ９０２９、ＣＢＳ  １２０．４９）を挙げることができる。
【０１１３】
別の実施形態では、真菌種の特定の突然変異体が、所望のペレット形態を有する糸状真菌宿主細胞または株を生成するための本明細書で提供される方法およびシステムに使用される。一実施形態では、本明細書で提供される高効率および／または自動化方法およびシステムに好適である、真菌種の特定の突然変異体が使用される。そのような突然変異体の例は、非常によくプロトプラスト形成する株、単一の核を有するプロトプラストを主として産生する株、マイクロタイタープレートで効率的に再生する株、より速く再生する株および／もしくはポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）分子を効率的に取り込む株、ランダム組込みが減少した（例えば、非相同末端結合経路が無効化された）株、またはこれらの組合せであり得る。さらに別の実施形態では、本明細書で提供される方法およびシステムにおいて使用するための特定の突然変異株は、例えばウリジン要求突然変異株などの選択可能なマーカー遺伝子を欠いている株であってもよい。これらの突然変異株は、ｐｙｒＧまたはｐｙｒＥ遺伝子によりそれぞれコードされたオロチジン５リン酸デカルボキシラーゼ（ＯＭＰＤ）またはオロチン酸ｐ−リボシルトランスフェラーゼ（ＯＰＲＴ）のいずれかが欠損していてもよい（T.  Goosen  et  al.,  Curr  Genet.  1987,  11:499  503；J.  Begueret  et  al.,  Gene.  1984  32:487  92）。
【０１１４】
さらに別の実施形態では、所望のペレット形態を有する糸状真菌宿主細胞または株を生成するための本明細書で提供される方法およびシステムにおいて使用するための突然変異株は、それらが相同組換えにおいて極めて効率的であるように、および／またはランダム組込みにおいて極めて非効率的であるように、それらのＤＮＡ修復系が改変される。相同組換えによる宿主細胞のゲノムへの核酸構築物の標的化組込み、すなわち所定の標的遺伝子座への組込み、の効率を、宿主細胞の相同組換え能力の増強および／または非相同組換え能力の低下により、上昇させることができる。相同組換えの増強は、相同組換えに関与する１つまたは複数の遺伝子（例えば、Ｒａｄ５１および／またはＲａｄ５２タンパク質）を過剰発現させることにより達成することができる。本開示の宿主細胞における非相同組換えまたは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の除去、破壊または減少は、当業界で公知の任意の方法により、例えば、非相同組換え（ＮＨＲ）またはＮＨＥＪ経路の構成要素（例えば、酵母ＫＵ７０、酵母ＫＵ８０またはそのホモログ）に対する抗体、そのような構成要素に指向された化学的阻害剤、タンパク質阻害剤、物理的阻害剤、ペプチド阻害剤またはアンチセンスもしくはＲＮＡｉ分子の使用などにより、達成することができる。ＮＨＥＪ経路の阻害は、その内容がこれにより参照により本明細書に組み込まれるArras  SMD,  Fraser  JA  (2016),  "Chemical  Inhibitors  of  Non-Homologous  End  Joining  Increase  Targeted  Construct  Integration  in  Cryptococcus  neoformans"  PloS  ONE  11  (9):  e0163049に記載されているものなどの、化学的阻害剤を使用して達成することができる。ＮＨＥＪ経路の無効化または減少を助長するための化学的阻害剤での処置は、プロトプラストの生成前および／または生成中であってもよい。あるいは、本明細書で提供される方法において使用するための宿主細胞は、ＮＨＲ経路の１つまたは複数の遺伝子（例えば、酵母ｋｕ７０、ｋｕ８０またはそのホモログ）が欠損していてもよい。そのような突然変異体の例は、ＷＯ０５／９５６２４に記載されているような、ｈｄｆＡまたはｈｄｆＢ遺伝子が欠損している細胞である。本明細書で提供される方法において使用するための宿主細胞におけるＮＨＲの阻害に使用するための化学的阻害剤の例は、Arras  SDM  et  al  (2016)  Chemical  Inhibitors  of  Non-Homologous  End  Joining  Increase  Targeted  Construct  Integration  in  Cryptococcus  neoformans.  PloS  One  11(9)に記載されているような、Ｗ７、クロルプロマジン、バニリン、Ｎｕ７０２６、Ｎｕ７４４１、ｍｉｒｉｎ、ＳＣＲ７、ＡＧ１４３６１またはそれらの組合せであり得る。
【０１１５】
一実施形態では、本明細書で提供される方法およびシステムにより産生される糸状真菌細胞の突然変異株は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路が無効化または減少しており、培養（例えば、液内培養）で増殖させると酵母様の非菌糸体形成表現型を有する。液内培養で増殖させたときの酵母様の非菌糸体形成表現型は、本明細書で提供されるような真菌の形態の制御または形態に対する影響において役割を果たすことが示されている１つまたは複数の遺伝子（例えば、配列番号５、６、７または８を有する遺伝子）の破壊に起因する。本明細書で提供される真菌の形態の制御または形態に対する影響において役割を果たすことが示されている１つまたは複数の遺伝子は、浸透ストレスに対する宿主細胞浸透圧応答経路の一部であってもよい。前記突然変異株におけるＮＨＥＪ経路は、化学的阻害剤（例えば、Ｗ７、クロルプロマジン、バニリン、Ｎｕ７０２６、Ｎｕ７４４１、ｍｉｒｉｎ、ＳＣＲ７、ＡＧ１４３６１またはこれらの任意の組合せ）での処置に起因して減少または無効化され得る。一実施形態では、化学的阻害剤は、Ｗ７である。糸状真菌宿主細胞（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）を、宿主株依存性であり得る最小阻害濃度（ＭＩＣ）のＷ７で処置することができる。その後、前記突然変異株を使用して、例えば表１に列挙される生成物のいずれかなどの、目的の所望の生成物を産生することができる。
形態関連遺伝子
【０１１６】
本明細書で提供される方法、株およびシステムにおいて使用するための形態関連遺伝子は、糸状真核マイクローブ（例えば、糸状真菌宿主細胞または株）の形態の制御または形態に対する影響において役割を果たすことが示されているまたは疑われる、当業界で公知の任意の遺伝子であってもよい。宿主細胞の形態を調節する遺伝子は、本明細書で提供されるような任意のそのような遺伝子であってもよい。一実施形態では、宿主細胞の形態において役割を果たすまたは形態を調節する遺伝子は、浸透ストレスに対する前記宿主細胞の応答を支配する宿主細胞経路の一部である任意の遺伝子であってもよい。したがって、遺伝子は、糸状真菌宿主細胞の浸透圧応答経路からの任意の遺伝子または前記遺伝子の組合せであってもよい。一実施形態では、遺伝子は、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｙｐｄ１、Ｓｋｎ７、Ｓｓｋ１、Ｓｔｅ１１、Ｂｃｋ１、Ｓｔｅ７、Ｍｋｋ２／２２、Ｐｂｓ２、Ｆｕｓ１／Ｋｓｓ３、Ｍｐｋ１、Ｈｏｇ１、Ｐｈｋ１／２、Ｃｈｋ１、Ｐｈｋ３、Ｓｐｙ１、Ｍｃｓ４、ＳｓｋＡ、Ｐｒｒ１、Ｒｉｍ１５、Ｃｅｋ１、Ｒｉｍ１５およびＳｓｋ２／２２遺伝子またはこれらの任意の組合せのオルソログなどの、表７に示されるような酵母浸透圧経路からの遺伝子のオルソログである。酵母Ｙｐｄ１、Ｓｋｎ７、Ｓｓｋ１、Ｓｔｅ１１、Ｂｃｋ１、Ｓｔｅ７、Ｍｋｋ２／２２、Ｐｂｓ２、Ｆｕｓ１／Ｋｓｓ３、Ｍｐｋ１、Ｈｏｇ１、Ｐｈｋ１／２、Ｃｈｋ１、Ｐｈｋ３、Ｓｐｙ１、Ｍｃｓ４、ＳｓｋＡ、Ｐｒｒ１、Ｒｉｍ１５、Ｃｅｋ１、Ｒｉｍ１５およびＳｓｋ２／２２遺伝子の核酸配列は、配列番号５０〜７５から選択することができる。一実施形態では、遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のオルソログである。一実施形態では、宿主細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）であり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子のオルソログは、表６に列挙されるＳＬＮ１オルソログから選択してもよく、または配列番号７６の核酸配列であってもよい。一実施形態では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号１４〜１７から選択される核酸配列を有する。一実施形態では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、配列番号７６から選択される核酸配列を有する。一実施形態では、宿主細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）であり、遺伝子は、表７に列挙されるような酵母浸透圧応答経路遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである。一実施形態では、遺伝子は、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）ｎｉｋ１のオルソログである。一実施形態では、宿主細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）であり、Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のオルソログは、表６に列挙されるｎｉｋ１オルソログであってもよい。一実施形態では、宿主細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）であり、遺伝子は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｋＡ遺伝子である。別の実施形態では、形態関連遺伝子は、Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｋＡ遺伝子のオルソログと同じ経路からの任意の遺伝子であってもよい。別の実施形態では、遺伝子は、配列番号５もしくは７７である核酸を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログ、および／または配列番号５もしくは７７である核酸を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子の前記オルソログの同じ生化学的経路における任意の遺伝子である。別の実施形態では、遺伝子は、配列番号６もしくは７８である核酸を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログ、および／または配列番号６もしくは７８である核酸を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子の前記オルソログの同じ生化学的経路における任意の遺伝子である。別の実施形態では、遺伝子は、配列番号８もしくは７９である核酸を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子のオルソログ、および／または配列番号８もしくは７９である核酸を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子の前記オルソログの同じ生化学的経路における任意の遺伝子である。別の実施形態では、宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、遺伝子は、配列番号５もしくは７７である核酸を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子、および／または配列番号５もしくは７７である核酸を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子の同じ生化学的経路における任意の遺伝子である。別の実施形態では、宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、遺伝子は、配列番号６もしくは７８である核酸を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子、および／または配列番号６もしくは７８である核酸を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子の同じ生化学的経路における任意の遺伝子である。別の実施形態では、宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、遺伝子は、配列番号８もしくは７９である核酸を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子、および／または配列番号８もしくは７９である核酸を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子の同じ生化学的経路における任意の遺伝子である。
【０１１７】
【表６】
2021526799.tif 000008
【０１１８】
【表７−１】
2021526799.tif 000009
【表７−２】
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【０１１９】
本明細書で提供される方法、株およびシステムにおいて使用するための形態関連遺伝子は、Ａ．ｎｉｇｅｒの形態の制御または形態に対する影響において役割を果たすことが示されているまたは疑われる、当業界で公知の任意の遺伝子であってもよい。一実施形態では、遺伝子は、配列番号５、６、７または８から選択される核酸配列を有するＳＮＰ含有遺伝子（表４を参照されたい）である。一実施形態では、遺伝子は、複数の遺伝子である。複数の遺伝子は、配列番号５、６、７または８から選択される核酸配列を有するＳＮＰ含有遺伝子の任意の組合せであってもよい。複数の遺伝子は、配列番号５から選択される核酸配列を有するＳＮＰ含有遺伝子と、同じ生化学的経路内に存在する任意の遺伝子との、任意の組合せであってもよい。複数の遺伝子は、配列番号６から選択される核酸配列を有するＳＮＰ含有遺伝子と、同じ生化学的経路内に存在する任意の遺伝子との、任意の組合せであってもよい。複数の遺伝子は、配列番号７から選択される核酸配列を有するＳＮＰ含有遺伝子と、同じ生化学的経路（すなわち、浸透圧応答経路）内に存在する任意の遺伝子との、任意の組合せであってもよい。複数の遺伝子は、配列番号８から選択される核酸配列を有するＳＮＰ含有遺伝子と、同じ生化学的経路内に存在する任意の遺伝子との、任意の組合せであってもよい。一実施形態では、遺伝子は、配列番号５、６、７または８から選択される核酸配列を有する遺伝子（表４を参照されたい）の野生型または非ＳＮＰ含有バージョンである。一実施形態では、遺伝子は、配列番号７６〜７９から選択される核酸配列を有する遺伝子の野生型または非ＳＮＰ含有バージョンである。
【０１２０】
一実施形態では、Ａ．ｎｉｇｅｒ宿主細胞の形態を調節する遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、野生型であってもよく、または突然変異型であってもよい。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの突然変異型は、表３もしくは４からの、または配列番号７の核酸配列を有する、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８であってもよい。別の実施形態では、形態関連遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログと同じ経路（すなわち、浸透圧応答経路）からの任意の遺伝子であってもよい。同じ経路（すなわち、浸透圧応答経路）の一部である遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｙｐｄ１、Ｓｋｎ７、Ｓｓｋ１、Ｓｔｅ１１、Ｂｃｋ１、Ｓｔｅ７、Ｍｋｋ２／２２、Ｐｂｓ２、Ｆｕｓ１／Ｋｓｓ３、Ｍｐｋ１、Ｈｏｇ１、Ｐｈｋ１／２、Ｃｈｋ１、Ｐｈｋ３、Ｓｐｙ１、Ｍｃｓ４、ＳｓｋＡ、Ｐｒｒ１、Ｒｉｍ１５、Ｃｅｋ１、Ｒｉｍ１５およびＳｓｋ２／２２遺伝子またはこれらの任意の組合せのＡ．ｎｉｇｅｒオルソログから選択することができる。酵母Ｙｐｄ１、Ｓｋｎ７、Ｓｓｋ１、Ｓｔｅ１１、Ｂｃｋ１、Ｓｔｅ７、Ｍｋｋ２／２２、Ｐｂｓ２、Ｆｕｓ１／Ｋｓｓ３、Ｍｐｋ１、Ｈｏｇ１、Ｐｈｋ１／２、Ｃｈｋ１、Ｐｈｋ３、Ｓｐｙ１、Ｍｃｓ４、ＳｓｋＡ、Ｐｒｒ１、Ｒｉｍ１５、Ｃｅｋ１、Ｒｉｍ１５およびＳｓｋ２／２２の核酸配列は、配列番号５０〜７５から選択することができる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子（またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子）のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログと同じ経路（すなわち、浸透圧応答経路）の一部である遺伝子は、配列番号１８〜３２から選択される核酸配列を有していてもよい。同じ経路（すなわち、浸透圧応答経路）の一部である遺伝子は、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せにより表される核酸配列から選択することができる。
【０１２１】
形態関連遺伝子は、Dai  et  al.  （"Identification  of  Genes  Associated  with  Morphology  in  Aspergillus  niger  by  Using  Suppression  Subtractive  Hybridization"  Applied  and  Environmental  Microbiology,  Apr.  2004,  p.  2474-2485）で開示されている遺伝子またはそのオルソルグのいずれであってもよく、前記参考文献の内容は、その全体が参照により組み込まれる。形態関連遺伝子は、ｇａｓ１遺伝子、ｓｆｂ３遺伝子、ｓｅｂ１遺伝子、ｍｐｇ１遺伝子、ｃｒｚ１遺伝子およびｔｐｓ２遺伝子から選択することができる。形態関連遺伝子のいずれについての発現も、遺伝子が糸状もしくは菌糸形態またはペレット形態を促進するかどうかに依存して増加または減少され得る。
【０１２２】
本明細書中で説明されるように、本明細書で提供される形態関連遺伝子またはそれらの突然変異体（例えば、表４からのＦｕｎｇｉＳＮＰ  ９、１２、１８もしくは４０）のいずれについての発現も、遺伝子の天然プロモーターを、天然プロモーターとは異なるレベルでの（例えば、より多いまたはより少ない）発現をもたらす異種プロモーターと置き換えることにより、制御することができる。異種プロモーターは、表２にから選択することができる。天然プロモーターの置き換えは、本明細書で提供されるようなＰＲＯスワップ法を使用して行うことができる。
プロモーターラダー
【０１２３】
プロモーターは、遺伝子が転写される速度を調節し、様々な方法で転写に影響し得る。構成的プロモーターは、例えば、内部または外部細胞条件に関係なく、一定の速度でそれらの会合した遺伝子の転写を指令するが、調節性、調整性または誘導性プロモーターは、内部および／または外部細胞条件、例えば、増殖速度、温度、特定の環境化学物質に対する応答などに応じて、遺伝子が転写される速度を増加または減少させる。プロモーターを、それらの通常の細胞状況から単離し、実質的に任意の遺伝子の発現を調節するように操作することができ、その結果、細胞増殖、生成物の収率および／または目的の他の表現型の有効な改変が可能になる。
【０１２４】
プロモーター配列を、本明細書で提供される糸状真菌宿主細胞において発現させるための本明細書で提供される任意の配列（例えば、形態関連遺伝子）の５’末端に、作動可能に連結させることができる。例えば、Ｃ１エンドグルカナーゼ、５５ｋＤａセロビオヒドラーゼ（ＣＢＨ１）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼＡのプロモーター配列、ＣｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍからのＣ．ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ  ＧＡＲＧ  ２７Ｋおよび３０ｋＤａキシラナーゼ（Ｘｙ１Ｆ）プロモーター、ならびに例えば、米国特許第４，９３５，３４９号、同第５，１９８，３４５号、同第５，２５２，７２６号、同第５，７０５，３５８号および同第５，９６５，３８４号ならびにＰＣＴ出願ＷＯ９３／０７２７７に記載されているＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓプロモーターなどの、様々な公知の真菌プロモーターは、本開示の宿主株において機能的である可能性が高い。
【０１２５】
一実施形態では、特定の増殖条件（すなわち、液内培養）下で所望のペレット形態を含む株または宿主細胞を生成するための本明細書で提供される方法およびシステムにおいて使用するためのプロモーターは、誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターは、その転写活性が、例えばアルコール、テトラサイクリン、ステロイド、金属または当業界で公知の他の化合物などの化学物質の存在または非存在により調節される、任意のプロモーターであってもよい。誘導性プロモーターは、その転写活性が光または低温または高温の存在または非存在により調節される、任意のプロモーターであってもよい。一実施形態では、誘導性プロモーターは、ｓｒｐＢ遺伝子、ａｍｙＢ遺伝子、ｍａｎＢ遺伝子またはｍｂｆＡ遺伝子などの、糸状真菌遺伝子から選択される。一実施形態では、誘導性プロモーターは、表２に挙げられるプロモーターから選択される。一実施形態では、誘導性プロモーターは、グルコースにより抑制される異化産物である。グルコースにより抑制される異化産物は、Ａ．ｏｒｙｚａｅからのａｍｙＢプロモーターであってもよい。
【０１２６】
一部の実施形態では、本開示は、糸状真菌増殖および／もしくは形態を制御するならびに／またはその制御において役割を果たす１つまたは複数の遺伝子の発現を制御するためのプロモーターラダーの生成を教示する。一部の実施形態では、本開示のプロモーターラダーは、連続する発現プロファイル範囲を示すプロモーターの収集物を含む。例えば、一部の実施形態では、プロモーターラダーは、刺激に応答してまたは構成的発現によって一定範囲の発現強度を示す自然の、天然の、または野生型のプロモーターを識別することにより作出される（例えば、図２を参照されたい）。これらの識別されたプロモーターを、プロモーターラダーとして一緒にグループ化することができる。
【０１２７】
他の実施形態では、本開示は、異なる条件にわたって一定範囲の発現プロファイルを示すプロモーターラダーの作出を教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、異なる発酵段階を通して拡散した発現ピークを有するプロモーターのラダーの作出を教示する。他の実施形態では、本開示は、特定の刺激に応答して異なる発現ピーク力学を示すプロモーターのラダーの作出を教示する（例えば、図２を参照されたい）。当業者であれば、本開示の調節性プロモーターラダーが任意の１つまたは複数の調節プロファイルを代表し得ることが分かるであろう。
【０１２８】
一部の実施形態では、本開示のプロモーターラダーは、連続する応答範囲にわたって予測可能な様式で遺伝子発現を摂動させるように設計される。一部の実施形態では、プロモーターラダーの連続的性質は、さらなる予測力を株改善プログラムにもたらす。例えば、一部の実施形態では、形態を制御することまたは形態に影響することが示されているまたは疑われる遺伝子のためのプロモーターをスワッピングすることで形態に関する宿主細胞性能曲線を作成することができ、これにより、所望の増殖条件下で所望のペレット形態を有する株または宿主細胞を産生するための特定の遺伝子についての最も最適な発現比またはプロファイルが識別され、その結果、不適切な環境下での不必要な過剰発現または誤発現も回避しながら、標的遺伝子がもはや特定の反応制限因子でも遺伝子カスケードの制限因子でもない株を産生することができる。一部の実施形態では、プロモーターラダーは、所望のプロファイルを示す自然の、天然の、または野生型のプロモーターを識別することによって作出される。他の実施形態では、プロモーターラダーは、天然に存在するプロモーターを突然変異させて複数の突然変異プロモーター配列を導出することによって作出される。これらの突然変異プロモーターのそれぞれは、標的遺伝子発現に対する効果、および得られる形態学的表現型について試験される。一部の実施形態では、編集されたプロモーターは、それぞれのプロモーターバリアントの活性を実証し／特徴付け／注釈し、データベースに保存するために、様々な条件にわたって発現活性について試験される。得られた編集されたプロモーターバリアントは、続いて、それらの発現強度に基づいて配置されたプロモーターラダーに編成される（例えば、上部付近に高度に発現するバリアントがあり、下部付近に減弱された発現があり、このことから「ラダー」という用語となる）。
【０１２９】
一部の実施形態では、本開示は、識別された天然に存在するプロモーターと突然変異バリアントプロモーターの組合せであるプロモーターラダーの生成および／または使用を教示する。
【０１３０】
一部の実施形態では、本開示は、１）構成的プロモーターのラダーに相当する、および２）理想的には１００塩基対未満の、短いＤＮＡ配列によりコードされ得るという、両方の基準を満たした、自然の、天然の、または野生型のプロモーターを識別する方法を教示する。一部の実施形態では、本開示の構成的プロモーターは、２つの選択された増殖条件にわたって（通常は、工業的培養中に経験される条件間で比較して）一定した遺伝子発現を示す。一部の実施形態では、本開示のプロモーターは、約６０塩基対のコアプロモーター、および長さ２６塩基対〜４０塩基対の間の５’ＵＴＲからなることになる。
【０１３１】
一部の実施形態では、１つまたは複数の上記の識別された天然に存在するプロモーター配列が、遺伝子編集のために選択される。一部の実施形態では、自然なプロモーターは、上で説明した突然変異方法のいずれかによって編集される。他の実施形態では、本開示のプロモーターは、所望の配列を有する新しいプロモーターバリアントを合成することによって編集される。
【０１３２】
所望のペレット形態を含む株または宿主細胞を生成するための方法およびシステムにおいて使用するためのプロモーターの非包括的一覧が、表２に提供される。プロモーター配列の各々を、異種プロモーターまたは異種プロモーターポリヌクレオチドと呼ぶことができる。
【表２】
2021526799.tif 000011
【０１３３】
一部の実施形態では、本開示のプロモーターは、上記の表からのプロモーターとの少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、または７５％の配列同一性を示す。
プロモータースワッピング
【０１３４】
一部の実施形態では、本開示は、全体的な宿主株表現型（例えば、所望の増殖条件（すなわち、発酵培地における液内培養）下で非菌糸体ペレット形態）に対して有益な効果を生じさせるために最適な発現特性を有するプロモーターを選択する方法を教示する。
【０１３５】
例えば、一部の実施形態では、本開示は、一定範囲の発現強度（例えば、下で論じられるプロモーターラダー）、または優れた調節特性（例えば、選択された遺伝子に対するより厳重な調節制御）を示す、宿主細胞内の１つもしくは複数のプロモーターを識別する、および／または１つもしくは複数のプロモーターのバリアントを生成する方法を教示する。これらの識別および／または生成されたプロモーターの特定の組合せを、プロモーターラダーとして一緒にグループ化することができる。
【０１３６】
例えば所望のペレット形態などの所望の形質を生じるまたは発現するように糸状真菌細胞を遺伝子操作するためのプロモータースワッピング法も、本明細書で提供される。一般にプロモータースワッピング（すなわち、ＰＲＯスワップ）は、説明したようなプロモーターラダーからのそれぞれのプロモーターを目的の所与の遺伝子と体系的に会合させることを必然的に伴う。したがって、例えば、プロモーターＰ１〜Ｐ８（一定範囲の発現強度を示すことが識別された、および／または示すように生成された、８つのプロモーターを表す）を持っており、マイクローブにおける目的の単一遺伝子とプロモーターラダーを会合させた（すなわち、所与のプロモーターを所与の標的遺伝子に作動可能に連結させることでマイクローブを遺伝子操作した）場合には、操作されたマイクローブが、標的遺伝子と会合した特定のプロモーターを除いてその他は同一の遺伝的背景を有することを前提として、それぞれの組合せ努力から得られる操作された株のそれぞれを特徴付けることにより８つのプロモーターのそれぞれの組合せについての効果を確認することができる。このプロセスによって操作される、得られるマイクローブは、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを形成し得る。
【０１３７】
特定の実施形態では、本明細書で提供されるプロモータースワッピング（ＰＲＯスワップ）法は、表２に示されるプロモーターラダーからのそれぞれのプロモーターと、特定の条件下で増殖させると糸状真菌細胞の形態において役割を果たすまたはそれに影響することが示されているまたは疑われる遺伝子（標的形態学的遺伝子と呼ばれる）とを体系的に会合させることを、必然的に伴う。遺伝子を摂動させることによって、所望の形態学的表現型を生じさせることができる。所望の表現型は、生産培地（例えば、ＣＡＰ培地）の液体培養で増殖させたときの非菌糸体ペレット形態であり得る。したがって、プロモーターＰ１〜Ｐ４（一定範囲の発現強度を示すことが識別された、および／または示すように生成された、表２からの４つのプロモーターを表す）を持っており、マイクローブにおける目的の単一標的形態学的遺伝子とプロモーターラダーを会合させた（すなわち、所与のプロモーターを所与の標的形態学的遺伝子に作動可能に連結させることでマイクローブを遺伝子操作した）場合には、操作されたマイクローブが、特定の標的形態学的遺伝子と会合した特定のプロモーターを除いてその他は同一の遺伝的背景を有することを前提として、それぞれの組合せ努力から得られる操作された株のそれぞれを特徴付けることにより４つのプロモーターのそれぞれの組合せについての効果を確認することができる。このプロセスによって操作される、得られるマイクローブは、ＨＴＰ形態学的遺伝子設計ライブラリーを形成し得る。
【０１３８】
さらに、プロモーターＰ１〜Ｐ４を含む同じプロモーターラダーであって、４つのプロモーターのそれぞれが本明細書で提供されるような複数の異なる形態学的標的遺伝子に作動可能に連結されている、プロモーターラダーを使用して、マイクローブを操作することができる。例えば、複数とは、１０の異なる形態学的標的遺伝子であってもよい。この手順の結果は、目的の標的形態学的遺伝子に作動可能に連結された特定のプロモーターを除いて、その他は遺伝的に同一であると推定される４０のマイクローブとなる。これらの４０のマイクローブを適切にスクリーニングし、特徴付け、別のＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを生じさせることができるだろう。ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリー中の微生物株の特徴付けは、関係型データベース、オブジェクト指向型データベース、または高分配ＮｏＳＱＬデータベースを含む、任意のデータ保存構築物に保存することができる情報およびデータをもたらす。このデータ／情報は、例えば、所与の形態学的遺伝子標的に作動可能に連結された場合の所与のプロモーター（例えば、Ｐ１〜Ｐ４）の効果であり得る。このデータ／情報はまた、所与の形態学的遺伝子標的へのプロモーターＰ１〜Ｐ４のうちの２つまたはそれより多くの作動可能な連結の結果として得られる組合せ効果のより広いセットであってもよい。
【０１３９】
一定範囲の発現強度を示すことに基づいて一緒にグループ化された任意の所与の数のプロモーターと、任意の所与の数の標的形態学的遺伝子とを用いて、この概念を適用することができるので、４つのプロモーターおよび１０の標的遺伝子についての上記の例は、単に例示的なものに過ぎない。当業者であれば、任意の遺伝子標的の前に２つまたはそれより多くのプロモーターを作動可能に連結させることができることも分かるであろう。したがって、一部の実施形態では、本開示は、プロモーターラダーからの１つ、２つ、３つまたはそれより多くのプロモーターが１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結されているプロモータースワップライブラリーを教示する。
【０１４０】
まとめると、生物において様々な遺伝子の発現を駆動するための様々なプロモーターの使用は、目的の形質（例えば、液内培養条件下でのペレット形態）を最適化するための強力なツールである。本明細書に記載のプロモータースワッピングの分子ツールは、少なくとも１つの条件（例えば、ＣＡＰ培地における液内培養）下で少なくとも１つの遺伝子座（例えば、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿９、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１２、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８またはＦｕｎｇｉＳＮＰ＿４０）の発現を変化させることが実証されたプロモーター配列（例えば、表２）のラダーを使用する。次いで、このラダーは、高効率ゲノム操作を使用して、生物における（例えば、本明細書で提供されるようなＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８と同じ経路内の）遺伝子の群に体系的に適用される。遺伝子のこの群は、いくつかの方法のいずれか１つに基づいて目的の形質に影響する尤度が高いと決定される。これらの方法は、公知の機能に基づく選択、または目的の形質（すなわち、形態）に対する影響、または予め決定された有益な遺伝的多様性に基づくアルゴリズム的選択を含むだろう。一部の実施形態では、遺伝子の選択は、所与の宿主における全ての形態学的遺伝子を含んでもよい。他の実施形態では、遺伝子の選択は、所与の宿主における全ての形態学的遺伝子の、無作為に選択されたサブセットであってもよく、または公知のもしくは疑わしい経路機能に基づいて特異的に選択されたサブセットであってもよい。
【０１４１】
次いで、形態学的遺伝子に連結されたプロモーター配列を含有する生物についての得られたＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーを、高効率スクリーニングモデルにおいて性能について評価し、性能の増大をもたらすプロモーター−遺伝子連結を決定し、情報をデータベースに保存する。遺伝子摂動の収集物（すなわち、所与の遺伝子ｙに作動可能に連結された所与のプロモーターｘ）は、微生物操作プロセシングにおいて使用される潜在的な遺伝的変更の供給源として使用することができる「プロモータースワップライブラリー」を形成する。時間と共に、遺伝子摂動のより大きいセットが宿主細胞背景のより大きい多様性に対して実行されるので、それぞれのライブラリーは、実験的に確認されたデータの集大成としてより強力になり、そのデータを使用して、目的の任意の背景に対して標的化された変化をより正確にかつ予測通りに設計することができる。
【０１４２】
生物における遺伝子の転写レベルは、生物の行動への影響に対する制御の重要なポイントである。転写は、翻訳（タンパク質発現）と緊密に共役しており、どのタンパク質がどんな量で発現されるのかによって生物の行動が決定される。細胞は、何千もの異なるタイプのタンパク質を発現し、これらのタンパク質が非常に多数の複雑な方法で相互作用して機能を生じさせる。タンパク質のセットの発現レベルを体系的に変化させることにより、複雑なため予測することが困難である方法で機能は変更され得る。一部の変更は、性能を増大させることができ、その場合、性能を評価するためのメカニズムとそれらの変更を共役させることができ、この技術によって、機能が改善された生物の生成が可能になる。
【０１４３】
一部の実施形態では、本開示のプロモータースワップツールは、選択された形態学的遺伝子標的の最適な発現を識別するために使用される。一部の実施形態では、プロモータースワップの目標は、代謝経路または遺伝子経路のボトルネックを減少させるために標的形態学的遺伝子の発現を増加させることであってもよい。他の実施形態では、プロモータースワップの目標は、標的形態学的遺伝子の発現が必要とされない場合、宿主細胞における不必要なエネルギー消費を避けるために、標的形態学的遺伝子の発現を減少させることであってもよい。
【０１４４】
転写、輸送またはシグナル伝達のような他の細胞システムに関して、様々な合理的な方法を使用して、どのタンパク質が発現変化の標的であるのか、およびその変化がどのようなものであるべきかを、先験的に発見しようとすることがある。これらの合理的な方法は、性能を改善するものを発見するために試験しなければならない摂動の数を減少させるが、大きなコストをかけてそれを行う。遺伝子欠失試験は、その存在が特定の機能にとって重要であるタンパク質を識別し、その結果、重要な遺伝子を過剰発現させることができる。タンパク質相互作用の複雑性のため、これは、性能を増大させるのには無効であることが多い。第１原理から、細胞中のタンパク質レベルの関数として転写またはシグナル伝達挙動を記述するよう試みる異なるタイプのモデルが開発されている。これらのモデルは、発現変化が異なる機能または改善された機能をもたらし得る標的を示唆することが多い。これらのモデルの基礎となる仮定は、あまりにも単純であり、パラメーターは、測定するのが困難であるため、これらのモデルが行う予測は、特に非モデル生物については、不正確であることが多い。遺伝子欠失とモデリングの両方での、ある特定の遺伝子にどのように影響するかを決定するために必要とされる実験は、性能を改善する変化を生じさせるためのその後の研究とは異なる。特定の摂動の重要性を強調する構築された株は、既に、改善された株でもあるため、プロモータースワッピングは、これらの課題を回避する。
【０１４５】
特定の実施形態では、所望のペレット形態を含む糸状真菌株または宿主細胞の生成に使用するためのプロモータースワッピングは、以下のことを含む多段階プロセスである：
【０１４６】
１．「ラダー」として作用する「ｘ」プロモーターのセットを選択すること。理想的には、これらのプロモーターは、複数のゲノム遺伝子座にわたって高度に可変的な発現をもたらすことが示されているが、唯一の要件は、それらが何らかの方法で遺伝子発現を摂動させることである。一実施形態では、ラダーとして作用する「ｘ」プロモーターのセットは、表２におけるプロモーターを含む。
【０１４７】
２．標的とする「ｎ」遺伝子のセットを選択すること。このセットは、形態の制御または形態に対する影響において役割を果たすことが示されている、ゲノム内のあらゆるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、またはＯＲＦのサブセットであってもよい。このサブセットは、機能に関するＯＲＦについての注釈を使用して、以前に実証された有益な摂動（以前のプロモータースワップまたは以前のＳＮＰスワップ）との関係により、以前に生じた摂動間の上位性相互作用に基づくアルゴリズム的選択、標的にとって有益なＯＲＦに関する仮説に基づく他の選択基準により、または無作為な選択によって、選択することができる。一実施形態では、「ｎ」遺伝子のセットは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子もしくはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のオルソログ（例えば、表６に列挙されるＡ．ｎｉｇｅｒオルソログ）、および／または同じ経路の一部である１つもしくは複数の遺伝子（例えば、表７に列挙される浸透圧応答経路遺伝子）のオルソログであってもよい。野生型であってもよい、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子もしくはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のオルソログ（例えば、表６に列挙されるＡ．ｎｉｇｅｒオルソログ）、および／または同じ経路の一部である１つもしくは複数の遺伝子（例えば、表７に列挙される浸透圧応答経路遺伝子）のオルソログは、前記遺伝子の突然変異型である。一実施形態では、糸状真菌株または宿主細胞は、Ａ．ｎｉｇｅｒであり、選択される「ｎ」遺伝子のセットは、表３または表４に見出されるＳＮＰ含有遺伝子である。Ａ．ｎｉｇｅｒが宿主細胞である別の実施形態では、選択される「ｎ」遺伝子のセットは、表３または表４に見出されるＳＮＰ含有遺伝子の非ＳＮＰまたは野生型バージョンである。Ａ．ｎｉｇｅｒが宿主細胞である場合、「ｎ」遺伝子のセットは、同じ経路の一部である１つまたは複数の遺伝子に加えて、表３および４に見出されるＦｕｎｇｉＳＮＰ＿９の遺伝子であってもよい。Ａ．ｎｉｇｅｒが宿主細胞である場合、「ｎ」遺伝子のセットは、同じ経路の一部である１つまたは複数の遺伝子に加えて、表３および４に見出されるＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１２の遺伝子であってもよい。Ａ．ｎｉｇｅｒが宿主細胞である場合、「ｎ」遺伝子のセットは、同じ経路の一部である１つまたは複数の遺伝子に加えて、表３および４に見出されるＦｕｎｇｉＳＮＰ＿４０の遺伝子であってもよい。別の実施形態では、Ａ．ｎｉｇｅｒが宿主細胞である場合、「ｎ」遺伝子のセットは、同じ経路の一部である１つまたは複数の遺伝子（例えば、表７に列挙されるＡ．ｎｉｇｅｒ浸透圧応答経路遺伝子）に加えて、表３および４からのＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８の遺伝子（すなわち、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの突然変異型）であってもよい。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子（またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子）および／または同じ経路内の１つもしくは複数の遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログは、遺伝子（例えば、表７に列挙されるＡ．ｎｉｇｅｒ浸透圧応答経路遺伝子）の野生型であってもよく、突然変異型であってもよい。��．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの突然変異型は、配列番号７を有する型であってもよい。経路内の１つまたは複数の遺伝子は、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｙｐｄ１、Ｓｋｎ７、Ｓｓｋ１、Ｓｔｅ１１、Ｂｃｋ１、Ｓｔｅ７、Ｍｋｋ２／２２、Ｐｂｓ２、Ｆｕｓ１／Ｋｓｓ３、Ｍｐｋ１、Ｈｏｇ１、Ｐｈｋ１／２、Ｃｈｋ１、Ｐｈｋ３、Ｓｐｙ１、Ｍｃｓ４、ＳｓｋＡ、Ｐｒｒ１、Ｒｉｍ１５、Ｃｅｋ１、Ｒｉｍ１５およびＳｓｋ２／２２遺伝子またはこれらの任意の組合せのＡ．ｎｉｇｅｒオルソログであってもよい。酵母Ｙｐｄ１、Ｓｋｎ７、Ｓｓｋ１、Ｓｔｅ１１、Ｂｃｋ１、Ｓｔｅ７、Ｍｋｋ２／２２、Ｐｂｓ２、Ｆｕｓ１／Ｋｓｓ３、Ｍｐｋ１、Ｈｏｇ１、Ｐｈｋ１／２、Ｃｈｋ１、Ｐｈｋ３、Ｓｐｙ１、Ｍｃｓ４、ＳｓｋＡ、Ｐｒｒ１、Ｒｉｍ１５、Ｃｅｋ１、Ｒｉｍ１５およびＳｓｋ２／２２の核酸配列は、配列番号５０〜７５から選択することができる。同じ経路の一部である１つまたは複数の遺伝子は、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せにより表される核酸配列から選択することができる。
【０１４８】
３．以下の遺伝子改変を迅速に、一部の実施形態では、同時に実行するための高効率株操作：天然プロモーターが、形態学的標的遺伝子ｎの前に存在し、その配列が公知である場合、天然プロモーターを、ラダー（例えば、表２に見出されるプロモーターラダー）中のｘプロモーターのそれぞれと置き換える。天然プロモーターが存在しないか、またはその配列が未知である場合、ラダー中のｘプロモーターのそれぞれを、遺伝子ｎの前に挿入する（例えば、図１を参照されたい）。このようにして、ライブラリーのそれぞれのメンバーが、その他は同一の遺伝子状況で、ｎ形態学的標的遺伝子に作動可能に連結されたｘプロモーターの例である、形態学的表現型株の「ライブラリー」（ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーとも呼ばれる）が構築される。前に説明したように、プロモーターの組合せを挿入し、ライブラリーが構築される組合せの可能性の範囲を拡張することができる。
【０１４９】
４．１つまたは複数の測定基準に対するそれらの性能が、最適化されている性能を示す状況での、株のライブラリーの高効率スクリーニング。状況は、例えばクエン酸の産生用のＣＡＰ培地などの、目的の所望の生成物用の培地における液内培養での増殖であってもよい。
【０１５０】
この基本プロセスを拡張して、特に、以下のことより、株性能のさらなる改善を提供することができる：（１）反復プロセスにおいて一度に１つずつ、または単一のステップにおいて複数の変化として、単一の株背景に複数の有益な摂動を併合すること。複数の摂動は、定義された変化の特定のセットであってもよく、または変化の部分的に無作為化されたコンビナトリアルライブラリーであってもよい。例えば、標的のセットが経路内の全ての遺伝子である場合には、株の以前のライブラリーの改善されたメンバー（単数または複数の）への摂動のライブラリーの連続的再生は、どの遺伝子が任意の所与の反復において律速であるかに関係なく、経路内の各遺伝子の発現レベルを最適化することができる；（２）ライブラリーの個々の生成および組合せ生成の結果得られる性能データを、それぞれの摂動の相互作用に基づいて摂動の最適なセットを予測するためにそのデータを使用するアルゴリズムに供給すること；および（３）上記の２つの手法の組合せを実行すること。
【０１５１】
上で論じた分子ツールまたは技術は、プロモータースワッピングとして特徴付けられるが、プロモーターに限定されず、標的のセットの発現レベルを体系的に変化させる他の配列変化を含んでもよい。遺伝子のセットの発現レベルを変化させるための他の方法は、ａ）リボソーム結合部位のラダー（または真核生物におけるＫｏｚａｋ配列）；ｂ）それぞれの標的の開始コドンを他の開始コドンの各々と置き換えること（すなわち、下で論じられる開始／停止コドン交換）；ｃ）様々なｍＲＮＡ安定化または不安定化配列を、転写物の５’もしくは３’末端、または他の任意の位置に結合させること；ｄ）様々なタンパク質安定化または不安定化配列を、タンパク質中の任意の位置に結合させることを含んでもよい。
【０１５２】
この手法は、本開示では工業用微生物を用いて例示されるが、所望の形質が遺伝子突然変異体の集団内で識別され得る任意の生物に適用可能である。例えば、この手法を、ＣＨＯ細胞、酵母、昆虫細胞、藻類、ならびに植物などの多細胞生物の性能を向上させるために、使用することができるだろう。
ＳＮＰスワッピング
【０１５３】
一実施形態では、本明細書で提供される方法およびシステムは、個々のＳＮＰまたはＳＮＰの組合せを有する糸状真菌を含む糸状真菌ライブラリーを生成するためのＳＮＰスワッピングに使用される。ＳＮＰスワッピングは、微生物株を改善するためのランダム突然変異誘発手法ではなく、むしろ、株全体にわたっての個々の一塩基多型ヌクレオチド突然変異（すなわち、ＳＮＰ）の体系的な導入または除去（それ故、「ＳＮＰスワッピング」という名称）を含む。ＳＮＰまたは組合せＳＮＰはそれぞれ、糸状真菌の形態を制御することまたは形態に影響することが示されているまたは疑われる遺伝子に存在し得る。
【０１５４】
このプロセスによって操作される、得られるマイクローブは、ＨＴＰ形態学的遺伝子設計ライブラリーを形成する。ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、それぞれのメンバー株が、その他は同一の遺伝的背景で所与のＳＮＰの存在または非存在を表す、このプロセスによって形成される実際の物理的微生物株収集物を指すこともあり、前記ライブラリーは、「ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリー」と呼ばれる。糸状真菌（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）の特定の文脈では、ライブラリーが「ＳＮＰスワップ糸状真菌株ライブラリー」または「ＳＮＰスワップＡ．ｎｉｇｅｒ株ライブラリー」と呼ばれることもあるが、糸状真菌は、マイクローブまたは多核細胞生物の特定の例であるので、これらの用語は同義語として使用され得る。
【０１５５】
さらに、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、遺伝子摂動の収集物−この場合、所与のＳＮＰが存在するかまたは所与のＳＮＰが非存在である−を指すこともあり、前記収集物は、「ＳＮＰスワップライブラリー」と呼ばれる。本明細書で提供される方法において使用するためのＳＮＰスワップライブラリーは、表３または表４のＳＮＰライブラリーであってもよい。
【０１５６】
【表３】
2021526799.tif 000012
【０１５７】
【表４】
2021526799.tif 000013
【０１５８】
一部の実施形態では、ＳＮＰスワッピングは、有益な性能効果が識別された標的ＳＮＰ「構成要素」の最適な組合せを用いて宿主生物を再構築することを含む。一実施形態では、ＳＮＰスワッピングは、定義された培養条件（例えば、液内培養）で真菌形態の有益な効果が識別された形態学的標的遺伝子の最適な組合せを用いて糸状真菌宿主細胞（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）を再構築することを必然的に伴う。したがって、一部の実施形態では、ＳＮＰスワッピングは、反復プロセスにおいて一度に１つずつ、または単一のステップにおいて複数の変化として、単一の株背景に複数の有益な突然変異を併合することを含む。複数の変化は、定義された変化の特定のセットであってもよく、または突然変異の部分的に無作為化されたコンビナトリアルライブラリーであってもよい。
【０１５９】
他の実施形態では、ＳＮＰスワッピングは、反復プロセスにおいて一度に１つずつ、または単一のステップにおいて複数の変化として、株から有害と識別された複数の突然変異を除去することも含む。一実施形態では、ＳＮＰスワッピングは、所望の形態（例えば、生産培地の液内培養においてペレット形態）を形成する株に有害であると識別される形態学的標的遺伝子の複数の突然変異を除去することを含む。複数の変化は、定義された変化の特定のセットであってもよく、または突然変異の部分的に無作為化されたコンビナトリアルライブラリーであってもよい。一部の実施形態では、本開示のＳＮＰスワッピング法は、有益なＳＮＰの追加と、有害および／または中立突然変異の除去の両方を含む。
【０１６０】
ＳＮＰスワッピングは、目的の形質（例えば、生産培地の液内培養におけるペレット形態）の改善のために突然変異誘発および選択に付される株の系統において有益な突然変異と有害な突然変異の両方を識別し、活用するための、強力なツールである。ＳＮＰスワッピングは、変異原性系統における標的形態学的遺伝子の個々の突然変異の影響を体系的に決定するために高効率ゲノム操作技術を使用する。変異原性系統の１または複数の世代にわたって性能改善が判明している株についてゲノム配列が決定される。次いで、より早期の系統の株の中の改善された株からの突然変異を反復するために、および／またはより後期の株の突然変異をより早期の株の配列に復帰させるために、高効率ゲノム操作が体系的に使用される。次いで、これらの株の性能が評価され、目的の表現型（例えば、生産培地の液内培養におけるペレット形態）の改善に対するそれぞれの個々の突然変異の寄与が決定され得る。上記のような、このプロセスの結果得られる微生物株は、分析され／特徴付けられ、宿主株全体にわたっての微生物株改善を通知することができるＳＮＰスワップ遺伝子設計ライブラリーの基礎を形成する。
【０１６１】
有害な突然変異の除去は、即時性能改善をもたらすことができ、変異原性の過重を被らない株背景での有益な突然変異の併合は、株性能を迅速にかつ大幅に改善することができる。ＳＮＰスワッピングプロセスによって産生される様々な微生物株は、様々な付加／欠失／または併合ＳＮＰを含むがその他は同一の遺伝的背景を有する微生物株である、ＨＴＰ遺伝子設計ＳＮＰスワップライブラリーを形成する。
【０１６２】
前に論じたように、性能改善のためのランダム突然変異誘発およびその後のスクリーニングは、工業用株の改善に一般に使用される技術であり、大規模製造に現在使用されている多くの株は、何年もの、ときには何十年もの期間にわたってこのプロセスを繰り返し使用して開発されてきた。ＵＶ線または化学的突然変異誘発物質、例えばメタンスルホン酸エチル、への曝露などの、ゲノム突然変異を生じさせるためのランダム手法は、１）工業用生物は、遺伝学的または代謝的特徴が明らかでなく、その結果、指向性改善手法のための標的選択が困難にまたは不可能になることがある；２）比較的よく特徴付けられている系であっても、工業的性能改善をもたらす変化は、予測するのが困難であり、未知の機能を有する遺伝子の摂動を必要とすることがある；および３）所与の工業用生物において指向性ゲノム突然変異を生じさせるための遺伝子ツールは、入手不可能である、または非常に遅い、および／または使用が困難である可能性があるため、工業用株改善のために好ましい方法であった。
【０１６３】
しかし、このプロセスの上記の利点に反して、いくつかの不利な点も公知である。有益な突然変異は、比較的稀な事象であり、固定されたスクリーニング能力でこれらの突然変異を見つけるためには突然変異の率が十分に高くなければならない。これは、望ましくない中立突然変異およびある程度有害な突然変異が、有益な変化と共に株に組み込まれる結果となることが多い。時間と共に、この「変異原性の過重」は増大し、その結果、全体的なロバスト性および重要な形質、例えば増殖速度、が不足した株となる。最終的に、「変異原性の過重」は、ランダム突然変異誘発による性能のさらなる改善を、ますます達成困難または達成不可能にする。好適なツールがなければ、株系統の個別分岐および並列分岐に見出される有益な突然変異を併合することは不可能である。
【０１６４】
ＳＮＰスワッピングは、変異原性系統内の株を比較した場合に観察される一部のまたは全ての突然変異を体系的に反復するまたは復帰させることによってこれらの制限を克服するための手法である。このようにして、両方の有益な（「原因となる」）突然変異を識別し、併合することができ、および／または有害な突然変異を識別し、除去することができる。このことにより、さらなるランダム突然変異誘発または標的遺伝子操作により達成することができなかった株性能の迅速な改善が可能になる。
【０１６５】
遺伝的過重の除去、または遺伝的過重のない株への有益な変化の併合によって、さらなる改善を可能にし得る追加のランダム突然変異誘発のための新しいロバストな出発点も得られる。
【０１６６】
加えて、無関係な有益な変化が、変異原性株系統の様々な個別分岐にわたって識別されるので、これらを、よりよい成績を示す株に迅速に併合することができる。これらの突然変異を、変異原性系統の一部でない株、例えば、指向性遺伝子操作により獲得された改善を有する株に、併合することもできる。
【０１６７】
変異原性系統内の株間で突然変異をランダムに組み換えるための他の手法および技術が存在する。これらは、プロトプラスト融合、および突然変異株全体にわたってゲノム組換えを助長する全ゲノムシャッフリングなどの技術を含む。酵母および糸状真菌などの一部の工業用微生物については、自然交配周期をペアワイズゲノム組換えに活用することもできる。このようにして、突然変異体を親株と「戻し交配する」ことにより有害な突然変異を除去し、有益な突然変異を併合することができる。しかし、これらの手法は、多くの制限を受けることになり、そのような制限は、本開示のＳＮＰスワッピング法を使用して回避される。
【０１６８】
例えば、これらの手法は、突然変異をスワップするために比較的少数のランダム組換え交差事象に依拠するので、株性能を最適化するために多くの組換えおよびスクリーニングサイクルを要し得る。加えて、自然組換え事象は、実質的にはランダムであるが、これらもまたゲノム位置の偏りを受けることになり、一部の突然変異は、対処するのが困難であり得る。これらの手法はまた、さらなるゲノム配列決定および分析がなければ、個々の突然変異の影響についての情報をほとんど提供しない。ＳＮＰスワッピングは、ランダム手法ではなく、むしろ株全体にわたっての個々の突然変異の体系的導入または除去であるので、これらの基本的制限を克服する。
【０１６９】
一部の実施形態では、本開示のＳＮＰスワッピング法は、突然変異株において識別された１つまたは複数のＳＮＰを参照株または野生型株に導入するステップ（「ウェーブアップ」）を含む。これは、特定のＳＮＰおよび／またはそれを含有する遺伝子が、所望の形質（例えば、生産培地の液内培養でペレット形態）を示す株に寄与するか否かを決定するために行うことができる。
【０１７０】
他の実施形態では、本開示のＳＮＰスワッピング法は、突然変異株において識別された１つまたは複数のＳＮＰを除去するステップ（「ウェーブダウン」）を含む。これは、特定のＳＮＰおよび／またはそれを含有する遺伝子が、所望の形質（例えば、生産培地の液内培養でペレット形態）を示す株に寄与するか否かを決定するために行うことができる。
【０１７１】
一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＮＰ変化（導入または除去のいずれか）を含むそれぞれの生成された株は、本開示の１つまたは複数の基準（例えば、生産培地の液内培養でのペレット形態）に従って、培養され、分析される。分析された宿主株のそれぞれからのデータは、宿主株に存在する特定のＳＮＰまたはＳＮＰの群と関連付けられまたは相関付けられ、将来の使用のために記録される。かくして、本開示は、微生物の任意の数の目的の遺伝的または表現型形質（例えば、生産培地の液内培養でのペレット形態）に対する所与のＳＮＰの効果を識別することができる、大きい、高度に注釈されたＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの作出を可能にする。これらのＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーに保存された情報は、ＨＴＰゲノム操作プラットフォームの機械学習アルゴリズムを通知し、そのプロセスの将来の反復を指令し、これにより、最終的には、非常に望ましい特性／形質を有する進化した微生物が得られる。
【０１７２】
別の実施形態では、本明細書で提供されるＳＮＰスワッピング法を使用して生成された形態学的標的遺伝子の１つまたは複数のＳＮＰを含む糸状真菌細胞の株を含むＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーは、本明細書で提供されるような遺伝子制御エレメントのライブラリーを用いるスワッピング法に付される。遺伝子制御エレメントは、プロモーターまたはターミネーターであってもよい。プロモーターまたはターミネーターは、プロモーターまたはターミネーターライブラリーの一部であってもよい。一実施形態では、本明細書で提供されるＳＮＰスワッピング法を使用して生成された形態学的標的遺伝子の１つまたは複数のＳＮＰを含む糸状真菌細胞の株を含むＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーは、プロモーターライブラリーを使用する、本明細書で提供されるようなプロモータースワッピング法に付される。プロモーターライブラリーは、表２のプロモーターライブラリーであってもよい。この実施形態に付け加えて、本明細書で提供されるＳＮＰスワッピング法を使用して生成された形態学的標的遺伝子の１つまたは複数のＳＮＰを含む糸状真菌細胞の株を含むＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーを用いて行われるプロモータースワッピング法は、所望の形質（例えば、生産培地の液内培養でのペレット形態）の発現についてスクリーニングすることができる新しいＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーを生成する。
プロトプラスト形成方法
【０１７３】
一実施形態では、所望のペレット形態を有する糸状真菌宿主細胞または株を生成するための本明細書で提供される方法およびシステムは、糸状真菌細胞からのプロトプラストの生成を必要とする。プロトプラストの調製のための好適な手順は、当業界で公知のいずれであってもよく、例えば、ＥＰ２３８，０２３およびYelton  et  al.（1984,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  81:1470-1474）に記載されているものを含む。一実施形態では、プロトプラストは、１つもしくは複数の溶解酵素またはそれらの混合物で糸状真菌細胞の培養物を処置することにより生成される。溶解酵素は、ベータ−グルカナーゼおよび／またはポリガラクツロナーゼであってもよい。一実施形態では、プロトプラストを生成するための酵素混合物は、ＶｉｎｏＴａｓｔｅ濃縮物である。多核細胞生物（例えば、糸状真菌細胞）の培養物を前培養し、その後、それらから本明細書で提供される方法および組成物において使用するためのプロトプラストを生成および使用するために使用されるパラメーターの多くは、変動させることができる。例えば、接種菌量、接種方法、前培養培地、前培養時間、前培養温度、混合条件、洗浄緩衝剤組成、希釈率、溶解酵素処置中の緩衝剤組成、使用される溶解酵素のタイプおよび／または濃度、溶解酵素とのインキュベーション時間、プロトプラスト洗浄手順および／または緩衝剤、実際の形質転換中のプロトプラストおよび／またはポリヌクレオチドおよび／または形質転換試薬の濃度、形質転換中の物理的パラメーター、形質転換後の形質転換体獲得までの手順を変動させることができる。一部の場合には、これらの変動を使用して、プロトプラストの数および形質転換効率を最適化することができる。一実施形態では、多核細胞生物は、本明細書で提供されるような糸状真菌細胞（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）である。この実施形態に付け加えて、前培養培地は、ＹＰＤまたは完全培地であってもよい。前培養培地の体積は、少なくとも、最大でまたは約５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌ、４５０ｍｌ、５００ｍｌ、５５０ｍｌ、６００ｍｌ、６５０ｍｌ、７００ｍｌ、７５０ｍｌ、８００ｍｌ、８５０ｍｌ、９００ｍｌ、９５０ｍｌまたは１０００ｍｌであってもよい。前培養培地の体積は、約５０ｍｌ〜約１００ｍｌ、約１００ｍｌ〜約１５０ｍｌ、約１５０ｍｌ〜約２００ｍｌ、約２００ｍｌ〜約２５０ｍｌ、約２５０ｍｌ〜約３００ｍｌ、約３００ｍｌ〜約３５０ｍｌ、約３５０ｍｌ〜約４００ｍｌ、約４００ｍｌ〜約４５０ｍｌ、約４５０ｍｌ〜約５００ｍｌ、約５００ｍｌ〜約５５０ｍｌ、約５５０ｍｌ〜約６００ｍｌ、約６００ｍｌ〜約６５０ｍｌ、約６５０ｍｌ〜約７００ｍｌ、約７００ｍｌ〜約７５０ｍｌ、約７５０ｍｌ〜約８００ｍｌ、約８００ｍｌ〜約８５０ｍｌ、約８５０ｍｌ〜約９００ｍｌ、約９００ｍｌ〜約９５０ｍｌ、または約９５０ｍｌ〜約１０００ｍｌであってもよい。一部の場合には、複数の培養物が培養され、その後、プロトプラスト形成に付される。複数の培養物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００であっても、またはそれより多くてもよい。一実施形態では、前培養調製物は、１００ｍｌの富栄養培地（例えば、ＹＰＤまたは完全培地）に１０６胞子／ｍｌを接種すること、およびこの前培養調製物を１４〜１８時間の間、３０℃でインキュベートすることにより、調製される。別の実施形態では、前培養調製物は、５００ｍｌの富栄養培地（例えば、Ｙｅａｓｔ  Ｍｏｌｄ  Ｂｒｏｔｈ、ＹＰＤまたは完全培地）に少なくとも１０６胞子／ｍｌを接種すること、およびこの前培養調製物を１４〜１８時間の間、３０℃でインキュベートすることにより、調製される。プロトプラスト形成の前に、例えば遠心分離などの当業界で公知の任意の方法により多核細胞生物を単離することができる。一実施形態では、多核細胞生物は、糸状真菌（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）である。この実施形態に付け加えて、Ｙｅａｓｔ  Ｍｏｌｄ  Ｂｒｏｔｈ（ＹＭＢ）に１０６胞子／ｍｌの糸状真菌細胞が接種され、これが１６時間、３０℃で増殖される。この実施形態にさらに付け加えて、前培養調製で増殖した糸状真菌細胞を遠心分離により単離することができる。本明細書で提供される方法および組成物において使用するための本明細書で提供される前培養調製物は、約０．５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５ｇ、３ｇ、３．５ｇ、４ｇもしくは５ｇの湿潤重量、少なくとも０．５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５ｇ、３ｇ、３．５ｇ、４ｇもしくは５ｇの湿潤重量、または０．５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５ｇ、３ｇ、３．５ｇ、４ｇもしくは５ｇより多い湿潤重量のその後のプロトプラスト形成のための菌糸量を産生することができる。多核細胞生物（例えば、糸状真菌）の前培養／培養は、２０１７年６月６日に出願された６２／５１５，９０７に記載されているものなどの高効率システム（ＨＴＰ）のワークフローの一部であってもよい。ＨＴＰシステムを自動化または半自動化することができる。生物の前培養は、小規模体積（例えば、１００ｍｌ）の胞子形成培地（ＰＤＡ培地）に１０６胞子／ｍｌの生物（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）を接種すること、および１４〜１６時間、３０℃で増殖させることを必然的に伴い得る。前培養中に、ワークフローは、前培養された生物（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）からプロトプラストを生成するための酵素溶液を生成するステップを含むこともある。酵素溶液は、１．２Ｍ  ＭｇＳＯ４を含むリン酸緩衝剤中のＶｉｎｏｔａｓｔｅ  ｐｒｏ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）酵素ミックスからなってもよい。前培養後、菌糸をＭｉｒａｃｌｏｔｈによる濾過後に回収することができ、２．８Ｌフラスコ中の約５００ｍｌの完全培地に１０ｕｌ〜２０ｍｌの回収した菌糸を接種することにより大規模培養物を培養することができる。接種菌量は、前培養ステップから得られる培養物のＯＤに基づいて可変的であり得る。大規模培養物を６〜１８時間、３０℃または１８℃のいずれかで、湿度８０％で、２００ｒｐｍで震盪させながら増殖させることができる。培養後、遠心分離、続いて１回または複数回の洗浄および再懸濁により、培養物を単離することができる。一実施形態では、培養物は、本明細書に記載されるようなプロトプラスト形成緩衝剤に再懸濁され、本明細書に記載されるようなプロトプラスト形成に付される。遠心分離は、５００ｍｌ遠心管の中で、４℃で１０〜１５分間、５５００〜６１００×ｇで行うことができる。１回または複数回の洗浄のそれぞれを１０〜５０ｍｌの洗浄緩衝剤（例えば、１０％グリセロールを含有する水）で行い、その後、４℃で１０〜１５分間、５５００〜６１００×ｇで遠心分離することができる。
【０１７４】
上記のように単離した後、多核細胞生物（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒなどの糸状真菌細胞）を、プロトプラスト形成緩衝剤に再懸濁させることができ、したがって、プロトプラスト形成緩衝剤は、プロトプラストを生成するために、本明細書で提供されるような１つもしくは複数の酵素（例えば、ＶｉｎｏＴａｓｔｅ  ｐｒｏ濃縮物（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ））を含む。一実施形態では、プロトプラスト形成緩衝剤は、高濃度のオスモライト（例えば、１Ｍを超えるまたは１Ｍに等しいオスモライト、例えば、ＭｇＳＯ４）を有する。高いオスモライト濃度（例えば、１．２Ｍ  ＭｇＳＯ４）を有するプロトプラスト形成緩衝剤を使用する実施形態では、酵素（例えば、ＶｉｎｏＴａｓｔｅ  ｐｒｏ濃縮物（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ））による処置のためのインキュベーション時間は、約３０℃で約１４〜１６時間であってもよい。再懸濁に使用されるプロトプラスト形成緩衝剤の体積は、５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌ、４５０ｍｌ、５００ｍｌ、５５０ｍｌ、６００ｍｌ、６５０ｍｌ、７００ｍｌ、７５０ｍｌ、８００ｍｌ、８５０ｍｌ、９００ｍｌ、９５０ｍｌまたは１０００ｍｌであってもよい。再懸濁に使用されるプロトプラスト形成緩衝剤の体積は、約５０ｍｌ〜約１００ｍｌ、約１００ｍｌ〜約１５０ｍｌ、約１５０ｍｌ〜約２００ｍｌ、約２００ｍｌ〜約２５０ｍｌ、約２５０ｍｌ〜約３００ｍｌ、約３００ｍｌ〜約３５０ｍｌ、約３５０ｍｌ〜約４００ｍｌ、約４００ｍｌ〜約４５０ｍｌ、約４５０ｍｌ〜約５００ｍｌ、約５００ｍｌ〜約５５０ｍｌ、約５５０ｍｌ〜約６００ｍｌ、約６００ｍｌ〜約６５０ｍｌ、約６５０ｍｌ〜約７００ｍｌ、約７００ｍｌ〜約７５０ｍｌ、約７５０ｍｌ〜約８００ｍｌ、約８００ｍｌ〜約８５０ｍｌ、約８５０ｍｌ〜約９００ｍｌ、約９００ｍｌ〜約９５０ｍｌ、または約９５０ｍｌ〜約１０００ｍｌであってもよい。一実施形態では、糸状真菌細胞は、５００ｍｌの富栄養培地（例えば、ＹＰＤまたは完全培地）で増殖され、菌糸（湿潤体積約１ｇであってもよい）は、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈにより濾過して１００ｍｌの洗浄緩衝剤（例えば、１．２Ｍ  ＭｇＳＯ４を含有する１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、ｐＨ５．５）ですすぐことにより単離され、１Ｌビンの中のプロトプラスト形成酵素混合物（例えば、ＶｉｎｏＴａｓｔｅ  ｐｒｏ濃縮物（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ））を含む約５００ｍｌのプロトプラスト形成緩衝剤（例えば、１．２Ｍ  ＭｇＳＯ４を含有する１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤  ｐＨ５．５）に再懸濁される。酵素溶液中の菌糸を、顕微鏡検査によってプロトプラスト形成を継続的にモニタリングしながら、１４〜１６時間、３０℃で、１４０ｒｐｍで振とうさせながらインキュベートすることができる。
【０１７５】
一実施形態では、ＮＨＥＪ経路の１つまたは複数の化学的阻害剤は、提供される場合にはプロトプラスト形成緩衝剤に添加される。１つまたは複数の化学的阻害剤は、Ｗ７、クロルプロマジン、バニリン、Ｎｕ７０２６、Ｎｕ７４４１、ｍｉｒｉｎ、ＳＣＲ７、ＡＧ１４３６１またはこれらの任意の組合せから選択することができる。プロトプラスト形成緩衝剤への１つまたは複数の化学的阻害剤の添加は、プロトプラスト形成手順中の任意の時点で行うことができる。一実施形態では、１つまたは複数の化学的阻害剤での処置は、プロトプラスト形成手順全体にわたってである。別の実施形態では、１つまたは複数の化学的阻害剤での処置は、プロトプラスト形成手順全体未満にわたってである。１つまたは複数の化学的阻害剤での処置は、約１、５、１０、１５、２０、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０または３００分間であってもよい。一実施形態では、多核体細胞（例えば、糸状真菌細胞）は、Ｗ−７で処置される。別の実施形態では、多核体細胞（例えば、糸状真菌細胞）は、ＳＣＲ−７で処置される。
【０１７６】
酵素による処置の後、当業界で公知の方法を使用してプロトプラストを単離することができる。プロトプラストの単離の前に、細孔が２０〜１００マイクロメートルの孔径範囲である多孔質バリア（例えば、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ）によって混合物を濾過することにより未消化菌糸断片を除去して、濾過されたプロトプラストの濾液を生じさせることができる。一実施形態では、次いで、濾過されたプロトプラストは、プロトプラストを遠心分離管の底部へペレット化させるために中レベルの求心力で遠心分離される。求心力は、約５００〜１５００×ｇであってもよい。好ましい実施形態では、使用される求心力は、一般に、１０００×ｇ未満（例えば、５分にわたって８００×ｇ）である。別の実施形態では、高濃度のオスモライトを含むプロトプラスト形成緩衝剤中でのプロトプラストの生成後にプロトプラスト（例えば、濾過されたプロトプラスト）の表面に、実質的により低い浸透力の緩衝剤が穏やかに適用される。実質的により低い浸透力の緩衝剤の例としては、１Ｍソルビトール、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．６Ｍ硫酸アンモニウムまたは１Ｍ  ＫＣｌを含む、緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ緩衝剤）が挙げられる。一実施形態では、本明細書で提供される方法において使用するためのより低い浸透力緩衝剤は、０．４Ｍソルビトールを含み、８のｐＨを有する、ソルビトール−Ｔｒｉｓ（ＳＴ）緩衝剤である。次いで、この層状調製物を遠心分離することができ、これは、プロトプラストを管の中で層に堆積させることができ、プロトプラストは、その中に中立浮遊している。次いで、プロトプラストをさらなる処理（例えば、保管および／または形質転換）のためにこの層から単離することができる。さらに別の実施形態では、高濃度のオスモライトを含むプロトプラスト形成緩衝剤（例えば、１．２Ｍ  ＭｇＳＯ４を含有する１００ｍＭリン酸緩衝剤、ｐＨ５．５）中で生成されたプロトプラスト（例えば、濾過されたプロトプラスト）は、細長い回収容器（例えば、メスシリンダー）に移され、本明細書で提供されるようなより低いモル浸透圧濃度の緩衝剤（例えば、０．４Ｍ  ＳＴ緩衝剤、ｐＨ８）でプロトプラスト（例えば、濾過されたプロトプラスト）の表面が覆われて、プロトプラストが中立浮遊している層が生成される。細長い回収容器（例えば、メスシリンダー）内の異なるモル浸透圧濃度の緩衝剤のこの組合せは、細長い回収容器（例えば、メスシリンダー）の表面へのプロトプラストの「浮揚」を助長することができる。回収容器の最上部にあれば、プロトプラストを単離することができる。一実施形態では、本明細書で提供されるように増殖され、プロトプラスト形成に付された多核細胞生物（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒなどの糸状真菌細胞）の５００ｍｌの前培養調製物は、約２５ｍｌのプロトプラストを生じさせる。
【０１７７】
プロトプラスト単離後、残存する酵素含有緩衝剤を、浸透圧緩衝剤（例えば、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、ｐＨ８を使用して緩衝した１Ｍソルビトール）にプロトプラストを再懸濁させることにより除去し、遠心分離により再回収することができる。このステップを反復してもよい。酵素含有緩衝剤の十分な除去後、塩化カルシウムも含有する浸透圧安定化された緩衝剤（例えば、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、ｐＨ８を使用して緩衝した１Ｍソルビトール、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２）で１回または複数回、プロトプラストをさらに洗浄してもよい。
【０１７８】
単離および洗浄後、プロトプラストを浸透圧安定化緩衝剤に再懸濁させることができる。そのような緩衝剤の組成は、種、用途および必要に応じて変わり得る。しかし、通常は、これらの緩衝剤は、０．５〜２Ｍの間の、スクロース、クエン酸塩、マンニトールまたはソルビトールのような有機成分を含有する。より好ましくは、０．７５〜１．５Ｍの間；最も好ましいのは１Ｍである。そうでなければ、これらの緩衝剤は、０．１〜１．５Ｍの間の濃度で、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌまたはＭｇＣｌ２のような無機浸透圧安定成分を含有する。好ましくは０．２〜０．８Ｍの間、より好ましくは０．３〜０．６Ｍの間、最も好ましくは０．４Ｍ。最も好ましい安定化緩衝剤は、ＳＴＣ（ソルビトール、０．８Ｍ；ＣａＣｌ２、２５ｍＭ；Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ；ｐＨ８．０）またはＫＣｌ−クエン酸塩（ＫＣｌ、０．３〜０．６Ｍ；クエン酸塩、０．２％（ｗ／ｖ））である。プロトプラストは、１×１０５〜１×１０１０細胞／ｍｌの間、またはｍｌ当たり１〜３×１０７プロトプラストの間の濃度で使用され得る。好ましくは、濃度は、１×１０６〜１×１０９の間であり、より好ましくは、濃度は、１×１０７〜５×１０８の間であり、最も好ましくは、濃度は、１×１０８細胞／ｍｌである。トランスフェクションの効率を上昇させるために、担体ＤＮＡ（サケ精子ＤＮＡまたは非コードベクターＤＮＡのような）を形質転換混合物に添加してもよい。ＤＮＡは、０．０１〜１０ｕｇの間、好ましくは０．１〜５ｕｇの間、さらにいっそう好ましくは０．２５〜２ｕｇの間、最も好ましくは０．５〜１ｕｇの間の濃度で使用される。
【０１７９】
一実施形態では、生成ならびにその後の単離および洗浄の後、プロトプラストは、１つまたは複数の抗凍結剤と混合される。抗凍結剤は、グリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリオール、糖、２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、メチルセルロース、Ｃ結合型不凍糖タンパク質（Ｃ−ＡＦＧＰ）またはこれらの組合せであってもよい。本明細書で提供される方法およびシステムにおいて抗凍結剤として使用するためのグリコールは、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール（ＰＥＧ）、グリセロールまたはこれらの組合せから選択することができる。本明細書で提供される方法およびシステムにおいて抗凍結剤として使用するためのポリオールは、プロパン−１，２−ジオール、プロパン−１，３−ジオール、１，１，１−ｔｒｉｓ−（ヒドロキシメチル）エタン（ＴＨＭＥ）、および２−エチル−２−（ヒドロキシメチル）−プロパン−１，３−ジオール（ＥＨＭＰ）、またはこれらの組合せから選択することができる。本明細書で提供される方法およびシステムにおいて抗凍結剤として使用するための糖は、トレハロース、スクロース、グルコース、ラフィノース、デキストロースまたはこれらの組合せから選択することができる。一実施形態では、プロトプラストは、ＤＭＳＯと混合される。ＤＭＳＯを、プロトプラストと、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２．５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％もしくは７５％ｗ／ｖもしくはｖ／ｖの、最大で１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２．５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％もしくは７５％ｗ／ｖもしくはｖ／ｖの、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２．５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％もしくは７５％ｗ／ｖもしくはｖ／ｖ未満の、または１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２．５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％もしくは７５％ｗ／ｖもしくはｖ／ｖを超える、または１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２．５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％もしくは７５％ｗ／ｖもしくはｖ／ｖに等しい、または約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２．５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％もしくは７５％ｗ／ｖもしくはｖ／ｖの最終濃度で、混合することができる。プロトプラスト／抗凍結剤（例えば、ＤＭＳＯ）混合物を保管の前にマイクロタイタープレートに分配することができる。プロトプラスト／抗凍結剤（例えば、ＤＭＳＯ）混合物を、本明細書で提供されるような長期保管（例えば、数時間、数日、数週間、数ヶ月、数年）のために、例えば−２０℃または−８０℃などの、本明細書で提供される任意の温度で保管することができる。一実施形態では、追加の抗凍結剤（例えば、ＰＥＧ）が、プロトプラスト／ＤＭＳＯ混合物に添加される。さらに別の実施形態では、追加の抗凍結剤（例えば、ＰＥＧ）が、保管の前にプロトプラスト／ＤＭＳＯ混合物に添加される。ＰＥＧは、本明細書で提供される任意のＰＥＧであってもよく、本明細書で提供されるような任意の濃度（例えば、ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）でＰＥＧを添加することができる。一実施形態では、ＰＥＧ溶液は、ＳＴＣ緩衝剤中４０％ｗ／ｖとして調製される。その場合、この４０％ＰＥＧ−ＳＴＣの２０％ｖ／ｖをプロトプラストに添加することができる。例えば、８００マイクロリットルの１．２５×１０７プロトプラストは、２００マイクロリットルの４０％ＰＥＧ−ＳＴＣを有することになり、これにより１ｍｌの最終体積が得られる。次いで、７０マイクロリットルのＤＭＳＯをこの１ｍｌに添加して、この調製物を７％ｖ／ｖ  ＤＭＳＯにすることができる。
【０１８０】
本明細書で提供される任意の前培養、培養および／またはプロトプラスト形成プロトコールを高効率様式で行うことができる。例えば、前培養、培養およびプロトプラスト形成をワークフローの一部として行うことができ、したがって、前記ワークフローは、２０１７年６月６日に出願された６２／５１５，９０７に記載されているものなどの高効率（ＨＴＰ）プロトコールの一部分に相当する。この高効率プロトコールは、任意のおよび／または全てのステップについて自動化液体ハンドリングを使用することができる。
形質転換方法
【０１８１】
一部の実施形態では、本開示のベクターまたは構築物は、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃またはＴｉ媒介遺伝子移入をはじめとする様々な技術のいずれかを使用して宿主細胞（例えば、糸状真菌細胞またはそれに由来するプロトプラスト）に導入することができる（Christie,  P.J.,  and  Gordon,  J.E.,  2014  "The  Agrobacterium  Ti  Plasmids"  Microbiol  SPectr.  2014;  2(6);  10.1128を参照されたい）。特定の方法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔を含む（Davis,  L.,  Dibner,  M.,  Battey,  I.,  1986  "Basic  Methods  in  Molecular  Biology"）。他の形質転換方法は、例えば、酢酸リチウム形質転換および電気穿孔を含む、例えば、Gietz  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.  27:69-74  (1992)；Ito  et  al.,  J.  Bacterol.153:163-168  (1983)；およびBecker  and  Guarente,  Methods  in  Enzymology  194:182-187  (1991)を参照されたい。一部の実施形態では、形質転換宿主細胞は、組換え宿主株と呼ばれる。
【０１８２】
一部の実施形態では、本開示は、２０１７年６月６日に出願された６２／５１５，９０７に記載されているものなどの９６ウェルプレートロボットプラットフォームおよび液体ハンドリングマシンを使用する細胞の高効率形質転換を教示する。
【０１８３】
一実施形態では、本明細書で提供される方法およびシステムは、本明細書に記載されるような糸状真菌細胞に由来するプロトプラストへの核酸の移入（例えば、異種プロモーターと標的形態学的遺伝子の融合体、または例えば表３もしくは表４からのものなどのＳＮＰ）を必要とする。別の実施形態では、本明細書で提供される方法およびシステムにより使用される形質転換は、実質的に高効率である、および／または本明細書に記載されるように部分的にもしくは完全に自動化される。部分的または完全自動化法は、本明細書で提供されるような１つまたは複数の液体ハンドリングステップにおける自動化液体ハンドリングの使用を必然的に伴い得る。この実施形態に付け加えて、形質転換は、本明細書に記載されるように構築物または発現構築物をマイクロタイタープレートのウェルに添加すること、その後、本明細書で提供される方法により生成されたプロトプラストをマイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに小分けすることにより行われる。プロトプラストの形質転換／トランスフェクションのための好適な手順は、当業界で公知のいずれであってもよく、例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＮＬ９９／００６１８、ＰＣＴ／ＥＰ９９／２０２５１６、Finkelstein  and  Ball  (eds.),  Biotechnology  of  filamentous  fungi,  technology  and  products,  Butterworth-Heinemann  (1992)、Bennett  and  Lasure  (eds.)  More  Gene  Manipulations  in  fungi,  Academic  Press  (1991)、Turner,  in:  Puhler  (ed),  Biotechnology,  second  completely  revised  edition,  VHC  (1992)に記載されているもの、プロトプラスト融合、およびＥＰ６３５５７４Ｂに記載されているようなＣａ−ＰＥＧ媒介プロトプラスト形質転換を含む。あるいは、糸状真菌宿主細胞またはそれらに由来するプロトプラストの形質転換を、例えば、Chakraborty  and  Kapoor,  Nucleic  Acids  Res.  18:6737  (1990)により記載された電気穿孔などの、電気穿孔；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介形質転換；例えば、Christiansen  et  al.,  Curr.  Genet.  29:100  102  (1995)；Durand  et  al.,  Curr.  Genet.  31:158  161  (1997)；およびBarcellos  et  al.,  Can.  J.  Microbiol.  44:1137  1141  (1998)により記載されたものなどの、ＤＮＡのバイオリスティック導入；または米国特許第５，５１６，６７０号および同第５，７５３，４７７号に記載されているものなどの、細胞の「マグネト−バイオリスティック」トランスフェクションにより行うこともできる。一実施形態では、本明細書で提供される方法およびシステムにおいて使用される形質転換手順は、例えばＰＥＧ媒介形質転換などの、本明細書で提供されるように高効率であることおよび／または自動化されることに適応できるものである。
【０１８４】
本明細書に記載の方法を使用して生成されたプロトプラストの形質転換を、当業界で公知の任意の形質転換試薬の使用によって助長することができる。好適な形質転換試薬は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅからの）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）またはＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの）、ＴＲＡＮＳＰＡＳＳ（登録商標）Ｄ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓからの）、ＬＹＰＯＶＥＣ（登録商標）またはＬＩＰＯＧＥＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎからの）から選択することができる。一実施形態では、ＰＥＧは、最も好ましい形質転換／トランスフェクション試薬である。ＰＥＧは、異なる分子量で入手可能であり、異なる濃度で使用することができる。好ましくは、ＰＥＧ  ４０００は、１０％〜６０％の間、より好ましくは２０％〜５０％の間、最も好ましくは４０％で使用される。一実施形態では、ＰＥＧは、本明細書に記載されるように保管の前のプロトプラストに添加される。
選択された配列のルーピングアウト  
【０１８５】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物からＤＮＡの選択された領域をルーピングアウトする方法を教示する。ルーピングアウト法は、Nakashima  et  al.  2014  "Bacterial  Cellular  Engineering  by  Genome  Editing  and  Gene  Silencing."  Int.  J.  Mol.  Sci.15(2),  2773-2793に記載されているようなものであってもよい。一部の実施形態では、本開示は、陽性形質転換体からの選択マーカーのルーピングアウトを教示する。ルーピングアウト欠失技術は、当業界で公知であり、（Tear  et  al.  2014  "Excision  of  Unstable  Artificial  Gene-Specific  inverted  Repeats  Mediates  Scar-Free  Gene  Deletions  in  Escherichia  coli."  Appl.  Biochem.  Biotech.    175:1858-1867）に記載されている。本明細書で提供される方法において使用されるルーピングアウト法は、一回交差相同組換えまたは二回交差相同組換えを使用して行うことができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるような選択された領域のルーピングアウトは、本明細書に記載されるような一回交差相同組換えの使用を必然的に伴い得る。
【０１８６】
先ず、ループアウト構築物が、宿主生物のゲノム内の選択された標的領域に（例えば、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ、または他の遺伝子編集技術によって）挿入される。一実施形態では、図６に描かれているものなどの構築物（単数または複数）を組み込むために、構築物（単数または複数）と宿主細胞ゲノム間の二回交差相同組換えが使用される。挿入される構築物（単数または複数）は、ルーピングアウトおよび欠失が予定されているＤＮＡの領域にダイレクトリピートが隣接するように宿主配列のすぐ近くに存在するまたは導入されるダイレクトリピートである配列を念頭に置いて、設計することができる。一実施形態では、ループアウトプロセスにおいて使用するための構築物は、選択可能なマーカー遺伝子（例えば、図６のｐｙｒＧ遺伝子）に隣接するダイレクトリピート間で分割されている、形態の制御または形態に対する影響において役割を果たすことが示されているまたは疑われる遺伝子の突然変異型を含む。別の実施形態では、ループアウトプロセスにおいて使用するための構築物は、選択可能なマーカー遺伝子（例えば、図６のｐｙｒＧ遺伝子）に隣接するダイレクトリピート間で分割されている、異種プロモーターに作動可能に連結された、形態の制御または形態に対する影響において役割を果たすことが示されているまたは疑われる遺伝子を含む。さらに別の実施形態では、ループアウトプロセスにおいて使用するための構築物は、選択可能なマーカー遺伝子（例えば、図６のｐｙｒＧ遺伝子）に隣接するダイレクトリピート間で分割されている、異種プロモーターに作動可能に連結された、形態の制御または形態に対する影響において役割を果たすことが示されているまたは疑われる遺伝子の突然変異型を含む。これらの実施形態のそれぞれでは、図６に示されているように、ダイレクトリピートに配列を隣接させることができ、これにより、宿主細胞ゲノム内の特定の遺伝子座（例えば、形態の制御または形態に対する影響において役割を果たすことが示されているまたは疑われる遺伝子の遺伝子座）へのその配列の組込みが助長される。形態の制御または形態に対する影響において役割を果たすことが示されているまたは疑われる遺伝子は、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子、Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子またはそのオルソログ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子もしくはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログ）などの、本明細書で提供される任意のそのような遺伝子であってもよい。一実施形態では、ＳＬＮ１／ｎｉｋ１遺伝子またはそのオルソログは、遺伝子摂動を含んでもよい。遺伝子摂動は、例えば一塩基多型（ＳＮＰ）などの、突然変異であってもよい。一実施形態では、この遺伝子の突然変異型は、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８（すなわち、配列番号７）の核酸配列を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＮ．ｃｒａｓｓａ遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログであってもよい。別の実施形態では、形態の制御または形態に対する影響において役割を果たすことが示されているまたは疑われる遺伝子、または複数の遺伝子の各々は、表７に列挙される酵母浸透圧応答経路からの遺伝子（単数または複数）のオルソログ（単数���たは複数）などの、糸状真菌宿主細胞の浸透圧応答経路からの、任意の遺伝子、または遺伝子であってもよい。形態の制御または形態に対する影響において役割を果たすことが示されているまたは疑われる遺伝子の他の例は、配列番号５、６もしくは８の核酸配列を有するＡ．ｎｉｇｅｒ遺伝子（例えば、配列番号７７、７８もしくは７９である核酸）またはそのオルソログの、野生型バージョンであり得る。異種プロモーターは、本明細書で提供される任意のプロモーターであってもよい。一実施形態では、異種プロモーターは、表２から選択される。挿入されると、ループアウト構築物（単数または複数）を含有する細胞を選択領域の欠失（例えば、図７を参照されたい；選択可能なマーカー遺伝子に対する耐性の欠如）について対抗選択することができる。
【０１８７】
当業者であれば、ループアウト手順のこの説明が、ゲノムからの望ましくない領域を欠失させるための例示的方法の１つに過ぎないことが分かるであろう。実際、本開示の方法は、限定されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮＳ、ＦＯＫまたは他のエンドヌクレアーゼによる遺伝子編集を含む、ゲノム欠失のための任意の方法と適合する。当業者であれば、相同組換え技術によってゲノムの望ましくない領域を置き換えることができることも分かるであろう。
形質転換のための構築物
【０１８８】
一実施形態では、本明細書で提供される方法およびシステムは、少なくとも１つの核酸での糸状真菌細胞もしくはそれに由来するプロトプラストの形質転換、または糸状真菌細胞もしくはそれに由来するプロトプラストへの少なくとも１つの核酸のトランスフェクションを必然的に伴う。形質転換またはトランスフェクションは、本明細書に記載の方法および試薬の使用であってもよい。プロトプラストの生成は、本明細書で提供される方法のいずれかを使用して行うことができる。プロトプラスト生成および／または形質転換は、本明細書で提供されるように高効率であり得、および／またはプロトプラスト生成および／または形質転換を、本明細書で提供されるように自動化することができる。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡであってもよい。核酸は、ポリヌクレオチドであってもよい。本明細書で提供される方法およびシステムを使用する糸状真菌細胞またはそれに由来するプロトプラストの形質転換において使用するための核酸またはポリヌクレオチドは、変異株および／または親の株に対して内因性遺伝子または異種遺伝子であってもよい。内因性遺伝子または異種遺伝子は、突然変異を含んでもよく、および／または１つもしくは複数の遺伝子制御もしくは調節エレメントの制御下にあっても、またはそのようなエレメントに作動可能に連結されていてもよい。本明細書で提供される場合の内因性遺伝子または異種遺伝子は、形態の制御または形態に対する影響において役割を果たすことが示されているまたは疑われるタンパク質をコードし得る。例えば、遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子、Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子、もしくはそのオルソログ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子もしくはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログ）、および／または同じ経路内の任意の遺伝子（例えば、表７に見出される浸透圧応答経路遺伝子から選択される任意の遺伝子もしくはそのオルソログ）であってもよい。突然変異は、例えば、挿入、欠失、置換および／または一塩基多型（ＳＮＰ）などの、本明細書で提供される任意の突然変異であってもよい。１つまたは複数の遺伝子制御または調節エレメントは、プロモーター配列および／またはターミネーター配列であってもよい。内因性遺伝子または異種遺伝子は、１つの発現構築物上に存在してもよく、または複数の発現構築物にわたって分割されていてもよい。複数の発現構築物にわたって分割されている場合、内因性遺伝子または異種遺伝子のそれぞれの部分は、突然変異を含んでもよく、および／または１つもしくは複数の遺伝子制御もしくは調節エレメントの制御下にあっても、またはそのようなエレメントに作動可能に連結されていてもよい。一実施形態では、内因性遺伝子または異種遺伝子は、二分されており、この場合、前記内因性遺伝子または異種遺伝子は、２つの部分に、前記２つの部分の各々が別々の構築物上に存在するように、分割されている。一実施形態では、遺伝子は、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿９（配列番号５）、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１２（配列番号６）、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８（配列番号７）またはＦｕｎｇｉＳＮＰ＿４０（配列番号８）である。別の実施形態では、���伝子は、表２からのプロモーターのいずれかに融合または作動可能に連結された、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿９（配列番号５）、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１２（配列番号６）、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８（配列番号７）またはＦｕｎｇｉＳＮＰ＿４０（配列番号８）である。一実施形態では、遺伝子は、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８（配列番号７）である。別の実施形態では、遺伝子は、表２からのｍａｎ８ｐまたはａｍｙ８ｐプロモーターに融合または作動可能に連結されたＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８（配列番号７）である。別の実施形態では、遺伝子は、ｗｔもしくは非ＳＮＰ  ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿９（配列番号７７）、ｗｔもしくは非ＳＮＰ  ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１２（配列番号７８）、ｗｔもしくは非ＳＮＰ  ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８（配列番号７６）またはｗｔもしくは非ＳＮＰ  ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿４０（配列番号７９）である。別の実施形態では、遺伝子は、表２からのプロモーターのいずれかに融合または作動可能に連結された、ｗｔもしくは非ＳＮＰ  ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿９（配列番号７７）、ｗｔもしくは非ＳＮＰ  ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１２（配列番号７８）、ｗｔもしくは非ＳＮＰ  ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８（配列番号７６）またはｗｔもしくは非ＳＮＰ  ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿４０（配列番号７９）である。一実施形態では、遺伝子は、ｗｔまたは非ＳＮＰ  ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８（配列番号１４または７６）である。別の実施形態では、遺伝子は、表２からのｍａｎ８ｐまたはａｍｙ８ｐプロモーターに融合または作動可能に連結されたＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８（配列番号１４または７６）である。
【０１８９】
一実施形態では、糸状真菌細胞から生成されるプロトプラストは、２つまたはそれより多くの核酸またはポリヌクレオチドで同時形質転換される。この実施形態に付け加えて、２つまたはそれより多くのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、プロトプラストが生成された糸状真菌株に対して内因性遺伝子または異種遺伝子であり、２つまたはそれより多くのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、選択可能なマーカーの遺伝子である。本明細書で提供される場合の内因性遺伝子または異種遺伝子は、形態の制御または形態に対する影響において役割を果たすことが示されているまたは疑われるタンパク質をコードし得る。例えば、遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子、Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子、もしくはそのオルソログ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子もしくはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログ）、および／または同じ経路内の任意の遺伝子（例えば、表７に見出される浸透圧応答経路遺伝子から選択される任意の遺伝子もしくはそのオルソログ）であってもよい。選択可能なマーカー遺伝子は、本明細書で提供されるような任意の選択可能なマーカーであってもよい。本明細書中で説明されるように、２つまたはそれより多くの核酸またはポリヌクレオチドのそれぞれを別々の部分に、それぞれの別々の部分が別々の構築物上に存在するように、分割することができる。
【０１９０】
一実施形態では、糸状真菌細胞もしくはそれに由来するプロトプラストの形質転換または糸状真菌細胞もしくはそれに由来するプロトプラストへのトランスフェクションにおいて使用するための核酸またはポリヌクレオチドそれぞれは、形質転換されることになる糸状真菌細胞またはそれに由来するプロトプラストのゲノムの所定の標的遺伝子座に存在するＤＮＡ配列と相同の配列を、核酸またはポリヌクレオチドの５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端の両方のいずれかに含む。核酸またはポリヌクレオチドは、形質転換または選択可能なマーカー遺伝子に使用される糸状真菌細胞に対して内在性遺伝子または異種遺伝子であってもよく、したがって、糸状真菌宿主細胞ゲノムにおける所定の遺伝子座に相同な配列が、内因性遺伝子、異種遺伝子または選択可能なマーカー遺伝子に隣接する。本明細書で提供される場合の内因性遺伝子または異種遺伝子は、形態の制御または形態に対する影響において役割を果たすことが示されているまたは疑われるタンパク質をコードし得る。例えば、遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子、Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子、もしくはそのオルソログ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子もしくはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログ）、および／または同じ経路内の任意の遺伝子（例えば、表７に見出される浸透圧応答経路遺伝子から選択される任意の遺伝子もしくはそのオルソログ）であってもよい。一実施形態では、核酸またはポリヌクレオチドそれぞれは、例えばｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの、当業界で公知の任意の方法を使用して、クローニングベクターにクローニングされる。好適なクローニングベクターは、使用される糸状真菌宿主細胞の染色体内の所定の標的遺伝子座に組み込むことができるものであってもよい。好ましい組込みクローニングベクターは、クローニングベクターの組込みをこの所定の遺伝子座に標的にするために欠失されるまたは置き換えられることになるＤＮＡ配列と相同であるＤＮＡ断片を含んでもよい。標的組込みを促進するために、クローニングベクターを宿主細胞またはそれに由来するプロトプラストの形質転換の前に直線化することができる。好ましくは、直線化は、クローニングベクターの少なくとも一方の、しかし好ましくは両方の末端に、欠失されるまたは置き換えられることになるＤＮＡ配列と相同である配列が隣接するように、行われる。一部の場合には、ＤＮＡの短い相同ストレッチを、組み込まれることになる核酸またはポリヌクレオチドの両側に、例えばＰＣＲによって付加させてもよい。組み込まれることになる核酸またはポリヌクレオチドに隣接する相同配列の長さは、好ましくは２ｋｂ未満、さらに好ましくは１ｋｂ未満、よりいっそう好ましくは０．５ｋｂ未満、よりいっそう好ましくは０．２ｋｂ未満、よりいっそう好ましくは０．１ｋｂ未満、よりいっそう好ましくは５０ｂｐ未満、最も好ましくは３０ｂｐ未満である。組み込まれることになる核酸またはポリヌクレオチド配列に隣接する相同配列の長さは、約３０ｂｐから約１０００ｂｐまで、約３０ｂｐから約７００ｂｐまで、約３０ｂｐから���５００ｂｐまで、約３０ｂｐから約３００ｂｐまで、約３０ｂｐから約２００ｂｐまで、および約３０ｂｐから約１００ｂｐまで様々であってもよい。糸状真菌細胞またはそれに由来するプロトプラストの形質転換において使用される核酸またはポリヌクレオチドは、発現カセットとして存在してもよい。一実施形態では、クローニングベクターは、ｐＵＣ１９である。この実施形態に付け加えて、本明細書で提供されるようなマーカー配列を含有するクローニングベクターは、当業界で公知のギブソンアセンブリを使用することによって構築物を構築することにより、標的化配列と会合させることができる。あるいは、標的化配列を融合ＰＣＲにより付加させることができる。マーカーに連結されていない同時形質転換のための標的化配列を、ゲノムＤＮＡから増幅させてもよい。
【０１９１】
理論上は、糸状真菌ゲノム内の全ての遺伝子座を、本明細書で提供される核酸またはポリヌクレオチドを含む発現カセットの標的組込みに選択することができるだろう。好ましくは、標的化を行うことになる遺伝子座は、この遺伝子座に存在する野生型遺伝子が、発現カセットに含まれる遺伝子により置き換えられると、得られる突然変異体が、例えば本明細書に記載されるような選択／対抗選択スキームなどの所与のアッセイにより検出可能な変化を示すことになるような、遺伝子座である。一実施形態では、本明細書に記載されるような糸状真菌細胞から生成されるプロトプラストは、第１の構築物または発現カセットおよび第２の構築物または発現カセットで同時形質転換され、したがって、第１の構築物または発現カセットは、プロトプラストゲノムの第１の遺伝子座に組み込まれるように設計され、その一方で、第２の構築物または発現カセットは、プロトプラストゲノムの第２の遺伝子座に組み込まれるように設計される。第１の遺伝子座および第２の遺伝子座への組込みを助長するために、第１の構築物または発現カセットは、第１の遺伝子座に相同な配列と隣接しており、その一方で、第２の構築物または発現カセットは、第２の遺伝子座に相同な配列と隣接している。一実施形態では、第１の構築物または発現カセットは、内因性遺伝子の配列を含み、その一方で、第２の構築物は、選択可能なマーカー遺伝子の配列を含む。この実施形態に付け加えて、第２の遺伝子座は、本明細書で提供される方法およびシステムにおいて使用されるプロトプラストゲノムに存在する追加の選択可能なマーカー遺伝子の配列を含有し、その一方で、第１の遺伝子座は、本明細書で提供される方法およびシステムにおいて使用されるプロトプラストゲノムに存在する内因性標的遺伝子の配列を含有する。別の実施形態では、第１の構築物または発現カセットは、内因性遺伝子または異種遺伝子の配列を含み、その一方で、第２の構築物は、第１の選択可能なマーカー遺伝子の配列を含む。この別の実施形態に付け加えて、第２の遺伝子座は、本明細書で提供される方法およびシステムにおいて使用されるプロトプラストゲノムに存在する第２の選択可能なマーカー遺伝子の配列を含有し、その一方で、第１の遺伝子座は、本明細書で提供される方法およびシステムにおいて使用されるプロトプラストゲノムに存在する第３の選択可能なマーカー遺伝子の配列を含有する。上記実施形態の各々では、内因性遺伝子および／または異種遺伝子は、本明細書で提供されるような突然変異（例えばＳＮＰ）および／または遺伝子制御もしくは調節エレメントを含んでもよい。本明細書で提供される場合の内因性遺伝子または異種遺伝子は、形態の制御または形態に対する影響において役割を果たすことが示されているまたは疑われるタンパク質をコードし得る。例えば、遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子、Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子、もしくはそのオルソログ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子もしくはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログ）、および／または同じ経路内の任意の遺伝子（例えば、表７に見出される浸透圧応答経路遺伝子から選択される任意の遺���子もしくはそのオルソログ）であってもよい。
同核性プロトプラストの精製
【０１９２】
当業者であれば理解できるように、糸状真菌に由来するプロトプラストは、１つより多くの核を含有し得ることが多く、したがって、本明細書で提供されるような構築物（例えば、インサートＤＮＡ断片）でのその後の形質転換は、構築物（例えば、インサートＤＮＡ断片）が、プロトプラストに存在する複数の核のサブセットに専ら組み込まれるような、異核性であるプロトプラストを産生し得る。形質転換後の異核性プロトプラストの数またはパーセンテージを減少させるために、例えば、Roncero  et  al.,  1984,  Mutat.  Res.  125:195（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法を使用することなどの、形質転換前に糸状真菌宿主細胞に由来するプロトプラストの集団内の単核プロトプラストのパーセンテージを増加させる戦略を、使用することができる。
【０１９３】
形質転換前に単核プロトプラストの数またはパーセンテージを増加させる戦略を使用することの他にまたはそれに加えて、プロトプラスト（および前記プロトプラストの再生後のそれらに由来するコロニー）を、それらが単核であるか、多核であるかを問わず、形質転換後に同核性であるようにさせる戦略を使用することができる。本明細書中で説明されるように、目的の所望のまたは標的遺伝子（例えば、標的形態学的遺伝子）について同核性であるプロトプラスト（およびそれに由来するコロニー）の数またはパーセンテージを増加させることは、形質転換プロトプラスト、または形質転換プロトプラストの集団に由来するコロニーを、１つまたは複数の選択可能なマーカーの存在および／または非存在に基づく選択および／または対抗選択に付すことを、必然的に含み得る。１つまたは複数の選択可能なマーカーは、本明細書で提供されるような、任意の選択可能なマーカーであってもまたは選択可能なマーカーの組合せであってもよく、選択および／または対抗選択スキームは、本明細書で提供されるような任意のそのようなスキームであってもよい。
同核性形質転換体の識別
【０１９４】
本明細書で提供される方法により産生される同核性形質転換体は、表現型のスクリーニング、配列に基づくスクリーニング、またはこれらの組合せの使用によって識別することができる。言い換えると、表現型のスクリーニング、配列に基づくスクリーニング、またはこれらの組合せを使用して、構築物（例えば、インサートＤＮＡ断片）でのプロトプラストの形質転換後に前記プロトプラストに由来するコロニーにおいて親の遺伝子型の存在または不在を検出することができる。同核性形質転換体の識別または検出は、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子の導入および／または喪失に即して、本明細書で提供されるような選択および／または対抗選択に前記形質転換体を付す前に、および／または付した後に、行うことができる。表現型のスクリーニングは、識別可能な表現型（増殖の変化および／または比色分析の変化）を有する形質転換体を識別するために使用することができ、その一方で、配列に基づくスクリーニングは、本明細書で提供されるような構築物（単数または複数）の形質転換および組込み後に識別可能な表現型があるまたはない形質転換体を識別するために使用することができる。
配列ベーススクリーニング
【０１９５】
本明細書で説明する通り、配列ベーススクリーニングを使用して、形質転換体における所望の構築物または標的構築物の存在または非存在を決定することができる。この様式では、配列ベース配列決定（sequence-based  sequencing）を使用して、特定の形質転換体において所望の遺伝子または構築物の統合が起こったかどうかを評価することができる。配列ベーススクリーニングを使用して、所望の遺伝子、突然変異または構築物を含有する多核細胞または多核細胞集団における核のパーセンテージを決定することができる。さらに、配列ベーススクリーニングを使用して、所望の標的統合を経験した形質転換体集団のパーセンテージを決定することができる。構築物は、本明細書に記載の任意の構築物または複数の構築物であってもよい。一部の場合、配列ベーススクリーニングの結果は、所望の遺伝子、突然変異または構築物を含む核の、前記所望の遺伝子、突然変異または構築物を欠く核に対するパーセンテージまたは比が、ある特定の閾値未満である場合、精製スキーム（例えば、同核共存体精製）を選択するために使用され得る。
【０１９６】
一般的に、配列ベーススクリーニングは、所望の突然変異または構築物を含有し得る形質転換体を単離することを必要とし得る。複数の核のうちの１つまたは各々が、形質転換中に導入された核酸（例えば、突然変異を含む１つまたは複数の構築物または遺伝子）の断片を含有するように、各形質転換体は、１つまたは複数の核を含有し得る。形質転換は、本明細書において提供する特定のＤＮＡ断片（例えば、突然変異を含む１つまたは複数の構築物または遺伝子）によるターゲティングされたプロトプラストの形質転換であってもよい。
【０１９７】
一部の場合、単離後、配列ベーススクリーニングは、標的遺伝子（導入された構築物）および野生型または親の遺伝子の両方を有する核の混合物を含有する形質転換体を、標的遺伝子の純度に影響を及ぼす培地（すなわち、選択培地）または任意の特定の表現型または特色について完全に非選択性であり得る培地において増殖させ、それによって、形質転換体に由来するコロニーを生成することを必要とする。一実施形態では、各単離された形質転換体またはそれに由来するコロニーの一部を、マイクロタイタープレート、例として例えば、寒天を含むＯｍｎｉｔｒａｙのウェルに移すか、またはそれに入れ、そこで、形質転換体またはそれに由来するコロニーの一部は、胞子形成する。マイクロタイタープレートは、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルマイクロタイタープレートであり得る。
【０１９８】
単離単独または増殖と組み合わせた単離後、核酸（例えば、ＤＮＡ）を、形質転換体またはそれに由来するコロニーもしくは胞子から抽出してもよい。核酸単離は、形質転換体に由来する胞子からの単離である場合があり、マイクロタイタープレート形式において行うことができ、自動化液体ハンドリングを利用することができる。核酸の抽出は、当該技術分野で公知の任意の公知の核酸抽出法、および／または市販されているキット、例として例えば、Ｐｒｅｐｍａｎ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行うことができる。一実施形態では、形質転換体に由来する胞子から抽出した核酸は、ＤＮＡの増幅を可能にする沸騰プレップ法（ｂｏｉｌ  ｐｒｅｐ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用して行われる。沸騰プレップ法は、少量の増殖培地への胞子の接種を含み得る。一実施形態では、胞子を、各ウェルが少量の増殖培地を含むＰＣＲに好適なプレート中の９６ウェルに分注する。胞子を、１０〜１６時間の間増殖させてもよく、これにより、胞子がＰＣＲを阻害し得る色素を廃棄することを補助し得る。加えて、また、増殖は、いくつかの回の核分裂を促進する場合があり、これは各ウェルのゲノムＤＮＡ含有量を増大するように働き得る。次に、一晩の「少量培養物」を、その後、細胞溶解を補助し、かつ溶解中に放出されるＤＮＡを安定化する緩衝液で補完してもよい。好適な緩衝液の一例は、ＰｒｅｐＭａｎ  Ｕｌｔｒａ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）であり得る。好適な緩衝液の他の例は、少量のイオン性洗剤を含有するＴｒｉｓ緩衝溶液を含み得る。その後、ｍｉｎ−培養物−緩衝液混合物を、サーモサイクラーにおいて９９℃まで１５分間〜１時間のある範囲のインキュベーション時間のいずれかの間加熱し得る。
【０１９９】
核酸抽出後、導入された標的遺伝子または構築物を含む標的核または突然変異体核の親核（すなわち、非形質転換核）に対するパーセンテージまたは比を評価するために、配列ベーススクリーニングを行ってもよい。配列ベーススクリーニングは、核酸の配列を決定または検出するために使用され得る当該技術分野で公知の任意の方法であり得る。配列ベーススクリーニングを行うために使用される方法は、核酸配列決定法またはハイブリダイゼーションベースアッセイ法から選択され得る。本明細書において提供される方法によって利用される核酸配列決定アッセイまたは技術は、次世代配列決定（ＮＧＳ：ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）システムまたはアッセイであり得る。特定の核酸配列を検出するためのハイブリダイゼーションベースアッセイは、マイクロアレイまたはｎＣｏｕｎｔｅｒシステム（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）の使用を必要とし得る。配列ベーススクリーニングを行う前に、抽出した核酸を、標的遺伝子を対象とするプライマー対（複数可）によるＰＣＲを使用して増幅してもよい。
【０２００】
核酸配列決定法を利用する実施形態では、ＰＣＲにおいて利用されるプライマー対は、アダプター配列を含んでもよく、これは次に、コードされるインデックスプライマーを使用する二次増幅において使用され得る。その後、二次増幅反応によって生成されたアンプリコンは、コードされるインデックスされたプライマーを対象とする配列決定プライマーによる多重配列決定を使用して配列決定され得る。配列決定は、当該技術分野で公知の任意の種類の配列決定を使用して行うことができる。一実施形態では、配列決定は、次世代配列決定（ＮＧＳ）である。ＮＧＳは、当該技術分野で公知の任意の公知のＮＧＳ法、例として例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮＧＳであってもよい。その後、多重配列決定反応からのデータを使用して、標的核の存在または非存在を決定することができる。一部の場合、また、多重配列決定反応からのデータは、標的ウェル内の形質転換体についての親の核の突然変異体核に対する比を決定するために使用され得る。この実施形態にさらに付け加えて、親核の突然変異体核に対するパーセンテージまたは比を定量するために、標準曲線を作成してもよい。標準曲線は、親核の突然変異体核に対する公知の比を含有する株から単離された核酸を増幅および配列決定し、次に、公知の比において現れる親アンプリコンの突然変異体アンプリコンに対する比を使用して試験試料の純度の近似値を決定することによって作成され得る。標準曲線を作成するために使用される株は、試験試料と同じ組のプレートにおいて加工（例えば、単離、増殖および抽出）され得る。
【０２０１】
一実施形態では、配列ベース配列決定は、各形質転換体の同核共存状態を評価または決定するために、選択および／または対抗選択後に使用される。選択および／または対抗選択後の配列ベース配列決定は、本明細書に記載の多重配列決定を使用する場合があり、自動または半自動であり得る。また、選択および／または対抗選択後の配列ベース配列決定は、形質転換体の存在および／または量（例えば、比）が異核共存性であることを決定する手段として、本明細書に記載の標準曲線の作成を利用することができる。
形質転換体の純度を決定するための配列ベーススクリーニングの使用
【０２０２】
本明細書で説明する通り、本明細書で提供される方法、システムおよびワークフローにて多核体宿主細胞（例えば、糸状真菌宿主細胞）から生成したプロトプラストは、多核性であり得る。次に、本明細書で提供される構築物等の１つまたは複数の構築物により形質転換したプロトプラストは、それらのゲノムに統合された特定の構築物（複数可）を伴うそれらの複数の核の一部またはパーセンテージのみを含有し得る。形質転換構築物の性質によって、形質転換プロトプラストに由来するコロニーは、コロニーに存在する混合核集団の存在のために、識別可能な表現型を産生しない場合がある。したがって、配列ベーススクリーニングの使用は、混合核集団における、所望の構築物（複数可）を含有する核の、所望の構築物（複数可）を含有しない核に対するパーセンテージを決定するために重要であり得る。一実施形態では、ＮＧＳベーススクリーニングは、導入された構築物（複数可）を有する核の所望のパーセンテージを含有する形質転換体またはそれに由来する株を識別するために使用される。所望のパーセンテージは、閾値パーセンテージの、または閾値パーセンテージを超える形質転換体またはそれに由来する株が所望の特色（例えば、ペレット形態）をもたらす、閾値パーセンテージであり得る。所望のパーセンテージは、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％であり得る。パーセンテージは、本明細書に記載の標準曲線を利用することによって決定することができる。
表現型スクリーニング
【０２０３】
本明細書で説明する場合、表現型スクリーニングは、配列ベーススクリーニングまたは形質転換体と組み合わせて使用され得る。一部の場合、同核共存形質転換体の単離を確実にするために、配列ベーススクリーニングの結果を使用して、精製スキームを決定してもよい。さらに、表現型スクリーニング／精製によって得られた単離物が同核共存性であるかどうかを評価するために、配列ベーススクリーニングは、表現型スクリーニング／精製後に利用され得る。
【０２０４】
本明細書で提供される方法、組成物またはシステムを使用して生成される形質転換体の表現型スクリーニングは、１つまたは複数の選択可能なマーカーの使用を用いることができる。選択可能なマーカーは多くの場合、非形質転換株にとって外来性の、特定の種類の抵抗性を提供する遺伝子産物をコードし得る。これは、一般的に、重金属、抗生物質または殺生物剤に対する抵抗性であり得る。また、原栄養性は、非抗生物質種の有用な選択可能なマーカーであり得る。栄養要求性マーカーは、宿主細胞において栄養欠乏を生じる場合があり、それらの欠乏を修正する遺伝子が選択に使用され得る。
【０２０５】
当該技術分野における使用には広範な選択可能なマーカーが存在し、これらのうちのいずれかまたは全ては、本明細書で提供される方法およびシステムに適用され得る。本明細書における使用のための選択可能なマーカー遺伝子は、栄養要求性マーカー、原栄養性マーカー、優性マーカー、劣性マーカー、抗生物質抵抗性マーカー、異化作用マーカー、酵素マーカー、蛍光マーカー、発光マーカーまたはこれらの組合せであり得る。これらの例は、ａｍｄＳ（アセトアミド／フルオロアセトアミド）、ｂｌｅ（ベロマイシン（belomycin）−フレオマイシン抵抗性）、ｈｙｇ（ハイグロマイシンＲ）、ｎａｔ（ノーセオトリシンＲ（nourseotricin  R））、ｐｙｒＧ（ウラシル／５ＦＯＡ）、ｎｉａＤ（硝酸塩／塩素酸塩）、ｓｕｔＢ（硫酸塩／セレン酸塩）、ｅＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）および全ての様々な色変異体、ａｙｇＡ（比色マーカー）、ｍｅｔ３（メチオニン／セレン酸塩）、ｐｙｒＥ（オロト酸Ｐ−リボシルトランスフェラーゼ）、ｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、突然変異アセト乳酸シンターゼ（スルホニル尿素抵抗性）およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（アミノグリコシド抵抗性）を含むが、これらに限定されない。
【０２０６】
本開示の別の実施形態は、糸状真菌において活性な２つまたはそれよりも多い選択マーカーの使用を必要とする。使用され得る広範な選択マーカーの組合せが存在し、これらの全ては、本明細書で提供される選択／対抗選択スキームにおいて適用することができる。例えば、選択／対抗選択スキームは、栄養要求性マーカー、原栄養性マーカー、優性マーカー、劣性マーカー、抗生物質抵抗性マーカー、異化作用マーカー、酵素マーカー、蛍光マーカーおよび発光マーカーの組合せを利用し得る。第１のマーカーを使用して、フォワード様式で（すなわち、活性統合が起こったかどうか）選択してもよく、一方で、追加のマーカーを使用して、リバース様式で（すなわち、正しい遺伝子座における活性統合が起こったかどうか）選択してもよい。選択マーカーが、本明細書に記載の内因性遺伝子または異種遺伝子と別々のベクター上に存在し得るか、または同じ核酸断片もしくはベクターに存在し得るように、選択／対抗選択は、共形質転換によって行われ得る。
【０２０７】
一実施形態では、本開示の同核共存プロトプラスト精製スキームは、第１の構築物が、除去または不活性化される標的遺伝子の配列を含むプロトプラストゲノムの第１の遺伝子座を対象とし、一方で、第２の構築物が、第２の選択可能なマーカー遺伝子の配列を含むプロトプラストゲノムの第２の遺伝子座を対象とするように、糸状真菌宿主細胞から生成したプロトプラストを、内因性形態遺伝子または異種形態遺伝子の配列を含む第１の構築物と第１の選択可能なマーカー遺伝子の配列を含む第２の構築物とで共形質転換することを必要とする。一実施形態では、第１の構築物は、内因性遺伝子または異種遺伝子の配列を含み、除去または不活性化される標的遺伝子は、第３の選択可能なマーカー遺伝子についての遺伝子である。別々の実施形態では、第１の構築物は、内因性遺伝子の配列を含み、除去または不活性化される標的遺伝子は、形質転換前にプロトプラストのゲノムに存在する内因性遺伝子のコピーである。本明細書で説明する通り、第１の構築物の内因性遺伝子または異種遺伝子は、突然変異（例えば、ＳＮＰ）および／または遺伝的調節もしくは制御エレメント（例えば、プロモーターおよび／またはターミネーター）を含み得る。第１、第２および／または第３の選択可能なマーカーは、当該技術分野で公知の任意の栄養要求性マーカー、原栄養性マーカー、優性マーカー、劣性マーカー、抗生物質抵抗性マーカー、異化作用マーカー、酵素マーカー、蛍光マーカー、発光マーカー、および／または本明細書に記載の任意の栄養要求性マーカー、原栄養性マーカー、優性マーカー、劣性マーカー、抗生物質抵抗性マーカー、異化作用マーカー、酵素マーカー、蛍光マーカー、発光マーカーであり得る。特定の遺伝子座を対象とするために、構築物の各々に、本明細書に記載のプロトプラストゲノムにおける所望の遺伝子座に相同なヌクレオチドが隣接する。
【０２０８】
一実施形態では、第２の構築物は、再生利用可能なマーカーまたは可逆性マーカーをコードする発現カセットを含む。再生利用可能なマーカーまたは可逆性マーカーは、破壊ｎｅｏ−ｐｙｒＧ−ｎｅｏ発現カセットであり得る。ｎｅｏ−ｐｙｒＧ−ｎｅｏ構築物を、糸状真菌宿主細胞（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）のｕｒａ−株で、上記実施形態で説明する第１の構築物と共に共形質転換してもよく、ウラシル欠乏培地上に播種し、上記に説明する通り、純粋な黄色ウラシル原栄養体を選択することによって、同核共存形質転換体を選択することができる。次に、ｐｙｒＧ選択の使用は、５−ＦＯＡ含有培地上に前記同核共存形質転換体を播種し、前記５−ＦＯＡ培地上で増殖する形質転換体を選択することによって再生することができ、このことは、前記形質転換体が、ｐｙｒＧ遺伝子の切除をもたらすｎｅｏ反復配列間の染色体内組換えを受けたことを示す。
【０２０９】
さらなる実施形態では、本明細書で提供される共形質転換を使用する代わりに、構築物が、除去または不活性化される標的遺伝子の配列を含むプロトプラストゲノムの所望の遺伝子座を対象とするように、本開示の同核共存プロトプラスト精製スキームは、糸状真菌宿主細胞から生成したプロトプラストを、特定の遺伝子の配列を含む欠失構築物で形質転換することを必要とする。特定の遺伝子座を対象とするために、構築物に、本明細書に記載のプロトプラストゲノムにおける所望の遺伝子座に相同なヌクレオチドが隣接する。所望の遺伝子座は、本明細書で提供される形態標的遺伝子またはその突然変異体からの遺伝子座（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１またはその突然変異体のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログ、例として例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１のＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８または任意のオルソログ）であり得る。この種類の構築物／形質転換の使用は、形質転換された宿主細胞または株の形態において特定の遺伝子が果たす役割についての情報を提供するために使用され得る。一実施形態では、欠失構築物のプロトプラストゲノムへの正しい統合の確認は、例として例えば、次世代配列決定（ＮＧＳ）を使用してプロトプラストのゲノムを配列決定することによって確認される。使用されるＮＧＳシステムまたは方法は、当該技術分野で公知の任意のＮＧＳシステムまたは方法、例として例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮＧＳであり得る。ある場合において、糸状真菌宿主細胞は、ｐｙｒＧ陰性であり、欠失構築物は、選択可能なマーカー遺伝子を含み、一方で、標的遺伝子は、本明細書で提供される形態標的遺伝子またはその突然変異体（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１またはその突然変異体のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログ、例として例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１のＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８または任意のオルソログ）である。したがって、同核共存プロトプラスト形質転換体の精製は、前記形質転換体を、ウラシルを欠く最少培地で増殖させることを必要とする。別の場合において、糸状真菌宿主細胞は、ｐｙｒＧ陽性であり、欠失構築物は、ＳＮＰ（例えば、表２のプロモーターと表３または表４のＳＮＰとの間の融合の表３または表４のＳＮＰ）を含み、一方で、標的遺伝子は、選択可能なマーカー遺伝子である。したがって、同核共存プロトプラスト形質転換体の精製は、前記形質転換体を、ＦＯＡを含む最少培地で増殖させることを必要とする。
【０２１０】
また別の実施形態では、突然変異誘発した遺伝子の複数の部分の各々が、別々の構築物に存在するように、突然変異誘発した形態標的遺伝子（例えば、表３または表４のＳＮＰ）は、突然変異誘発した遺伝子の複数の部分の形質転換および統合を介して多核生物（例えば、糸状真菌、例としてＡ．ｎｉｇｅｒ）のゲノムにおける標的遺伝子座（例えば、形態標的遺伝子からの遺伝子座）に統合される。複数の構築物の各々は、突然変異誘発した遺伝子のユニークな部分および突然変異誘発した遺伝子の重複部分を含む場合があり、重複部分は、生物のゲノムにおいて突然変異誘発した遺伝子の機能的コピーを産生する複数の構築物の組換えを促進するために他の複数の構築物の１つにも存在する。突然変異誘発した遺伝子の各部分の、生物の所望の遺伝子座への統合を促進するために、複数の構築物の各々は、構築物における突然変異誘発した遺伝子の部分に隣接する、生物のゲノムにおける所望の遺伝子座に相同なヌクレオチドをさらに含み得る。一部の場合において、突然変異誘発した遺伝子は、２つの構築物にわたり分割され、２つの構築物の２部形質転換を介して生物に導入される。この概念の一例を、図６に示す。図６に示す通り、ｐｙｒＧマーカー遺伝子は、構築物の各々が、ｐｙｒＧのユニークな部分と他の構築物と重複する部分とを含むように、２つの構築物に分割される。さらに、各構築物は、ｐｙｒＧマーカー遺伝子のユニークな部分に隣接する標的形態遺伝子の配列を含む、ターミネーター反復配列（例えば、直列反復配列（ＤＲ：ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔ））に隣接する宿主生物ゲノムにおけるａｙｇＡマーカー遺伝子に相同な配列をさらに含む。標的形態遺伝子は、突然変異体型（例えば、ＳＮＰを含む）または野生型であり得る。標的形態遺伝子は、異種のプロモーター（例えば、表２のプロモーター）に融合され得る突然変異体型（例えば、ＳＮＰを含む）または野生型であり得る。本明細書で提供される方法のいずれかを使用する形質転換後の２つの構築物の組換えは、２つのＤＲを含むｐｙｒＧマーカー遺伝子全体の挿入をもたらす。全体が統合されたｐｙｒＧマーカー遺伝子を含有する形質転換体、およびループアウト（図７に示す）を介してｐｙｒＧマーカー遺伝子を失った形質転換体は、本明細書に記載の選択／対抗選択を介して検出され得る。特に、ループアウトは、ＦＯＡを伴う培地で形質転換体を増殖させることによって選択することができる。
【０２１１】
当業者によって理解され得る通り、図６および７で示される概念を使用して、突然変異（例えば、ＳＮＰ）の組合せを標的遺伝子に導入し、次に、前記組合せの表現型効果を試験することができる。表現型効果は、所望の形態学的表現型を有する株または宿主細胞の発生であり得る。所望の形態学的表現型は、前記株または宿主細胞が、液内培養条件下で産生培地において増殖させた場合、非菌糸体ペレット形態を示すことであり得る。前記株または宿主細胞は、固形培地において増殖させた場合、正常に増殖および胞子形成し得る。さらに、本明細書で説明する通り、特定の突然変異の組合せを含有する株を構築するために、同様の技術を使用してさらなる突然変異を導入し得ることが企図される。
【０２１２】
さらなる実施形態では、真菌（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）における組合せＳＮＰＳＷＰを行い、これによって、各々が誘導性プロモーターおよび分割マーカー遺伝子（多様性ｐｙｒＧ遺伝子）の一部に融合された突然変異を含む２つの別々の構築物の、単一の形質転換における親の遺伝子への統合によって、標的遺伝子の複数の突然変異が、誘導性プロモーターとの様々な組合せでプロトプラストゲノムに導入される。各ｐｙｒＧ遺伝子含有構築物の重複部分の間、および構築物と宿主ゲノムとにおける標的遺伝子の相同部分の間の組換えの成功に際して、ｐｙｒＧ遺伝子全体の各々の発現は、グルコースによるカタボライト抑制を介して制御され得る。したがって、所望の組換えおよび統合事象が起こった形質転換体の増殖が好まれるように、グルコース上で形質転換体を増殖させることによって形質転換体を選択することができる。さらに、ループアウトは、形質転換体を、ＦＯＡを伴う培地で増殖させることによって促進することができる。
【０２１３】
別の実施形態は、突然変異を有する標的遺伝子のコピーと１つまたは複数の選択可能なマーカー（例えば、抗生物質抵抗性遺伝子（ａｍｐＲ）および栄養要求性マーカー遺伝子（ｐｙｒＧ））とを含む構築物とのループイン単一交差事象を使用する、標的遺伝子（例えば、ａｙｇＡ）における突然変異（例えば、ＳＮＰ）の統合を必要とする。
ＨＴＰ自動化システム
【０２１４】
一部の実施形態では、液内培養条件下で所望のペレット形態を有する糸状真菌株または宿主細胞を生成するために本明細書で提供される方法およびシステムは、自動化ステップを含む。例えば、本明細書に記載のプロトプラストの生成、プロトプラストの形質転換、および／または選択／対抗選択を介する同核共存プロトプラストの精製は、自動化され得る。本明細書で説明する通り、方法およびシステムは、液内培養条件下で所望のペレット形態を示す、精製した同核共存形質転換体をスクリーニングするさらなるステップを含有し得る。本開示の自動化法は、ロボットシステムを含み得る。本明細書で概略するシステムは一般的に、９６または３８４ウェルマイクロタイタープレートの使用を対象とし得るが、当業者によって理解される通り、任意の数の様々なプレートまたは形状を使用してもよい。加えて、本明細書で概略するステップのいずれかまたは全てを自動化してもよく；したがって、例えば、システムは、完全に、または部分的に自動化され得る。自動化法およびシステムは、高効率であり得る。本開示の目的のために、高効率スクリーニングとは、１日当たり約１，０００個またはそれよりも多い形質転換体を査定することができる任意の部分的または完全自動化法、特に１日当たり５，０００個またはそれよりも多い形質転換体を査定することができるそれらの方法、さらに特に１日当たり１０，０００個またはそれよりも多い形質転換体を査定することができる方法を指し得る。
【０２１５】
本明細書で説明する通り、本明細書で説明する通りに生成および精製された形質転換体が、液内培地における所望のペレット形態についてスクリーニングまたは試験されるように、本明細書で提供される方法およびシステムは、スクリーニングステップを含み得る。次に、所望のペレット形態を含む生成した株または宿主細胞を使用して、目的の生成物を生成することができる。目的の生成物は、本明細書で提供される任意の目的の生成物、例として例えば、アルコール、医薬、代謝産物、タンパク質、酵素、アミノ酸または酸（例えば、クエン酸）であり得る。したがって、本明細書で提供される方法およびシステムは、目的の生成物の発現および分泌を許容し、かつ次に生成した目的の生成物を回復する条件下で、本発明の方法により精製した所望のペレット形態を含むクローンコロニーまたは培養物を培養することをさらに含み得る。本明細書で説明する通り、目的の生成物は、外因性タンパク質およびまたは異種のタンパク質の発現の結果として産生される外因性および／または異種のタンパク質または代謝産物であり得る。
【０２１６】
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、１つまたは複数のワークモジュールを含む。例えば、一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、ＤＮＡ合成モジュール、ベクタークローニングモジュール、株形質転換モジュール、スクリーニングモジュールおよび配列決定モジュールを含む。
【０２１７】
当業者であれば理解できるように、自動化システムは、限定されるものではないが、液体ハンドラー；１つまたは複数のロボットアーム；マイクロプレートの配置のためのプレートハンドラー；プレートシーラー、プレート穴開け器、非相互汚染プレート上のウェルの蓋を取り外し、置き換えるための自動化蓋ハンドラー；使い捨てチップを用いた試料分配のための使い捨てチップアセンブリ；試料分配のための洗浄可能なチップアセンブリ；９６ウェルのローディングブロック；統合型サーマルサイクラー；冷却された試薬ラック；マイクロタイタープレートピペット位置（必要に応じて冷却される）；プレートおよびチップのためのスタッキングタワー；磁気ビーズプロセシングステーション；濾過システム；プレート振とう器；バーコードリーダーおよびアプリケーター；ならびにコンピュータシステムを含む、様々な構成要素を含んでもよい。
【０２１８】
一部の実施形態では、本開示のロボットシステムは、遺伝子標的化および組換え適用のプロセスにおける全てのステップを実行するための高効率ピペッティングを可能にする自動化液体および粒子ハンドリングを含む。これは、吸引、分注、混合、希釈、洗浄、正確な容量の移動；ピペットチップの回収および廃棄；ならびに単一の試料吸引物からの複数の送達のための同一の容量の反復的ピペッティングなどの液体および粒子の操作を含む。これらの操作は、相互汚染を含まない液体、粒子、細胞、および生物の移動である。機器は、フィルター、膜、および／または娘プレートへのマイクロプレートの試料の自動化された複写、高密度移動、全プレート連続希釈、ならびに大容量運転を実行する。
【０２１９】
自動化システムは、当該技術分野で公知の任意の公知の自動化高効率システムであり得る。例えば、自動化システムは、特開１１−３０４６６６において説明されている自動化微生物ハンドリングツールであり得る。このデバイスは、個々の細胞を含有する微小滴を移行することができ、本発明の真菌株は、それらの形態のために、このデバイスによる個々のクローンの顕微操作を受けることができることが予想される。本開示の方法およびシステムにおける使用のための自動化システムのさらなる例は、Beydon  et  al.,  J.  Biomol.  Screening  5:13  21  (2000)において説明されている自動化微生物高効率スクリーニングシステムである。本明細書における使用のための自動化システムは、カスタマイズした自動化液体ハンドリングシステムであり得る。一実施形態では、本開示のカスタマイズした自動化液体ハンドリングシステムは、ＴＥＣＡＮ機器（例えば、カスタマイズしたＴＥＣＡＮ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  Ｅｖｏ）である。
【０２２０】
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、マルチウェルプレート、ディープウェルプレート、スクエアウェルプレート、試薬トラフ、試験管、ミニチューブ、マイクロ遠心管、クライオバイアル、フィルター、マイクロアレイチップ、光ファイバー、ビーズ、アガロースおよびアクリルアミドゲル、ならびに他の固相マトリックスのためのプラットフォームと適合するか、またはプラットフォームは、アップグレード可能なモジュラーデッキ上に収容される。一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、供給源および出力試料、試薬、試料および試薬希釈液、アッセイプレート、試料および試薬リザーバ、ピペットチップ、ならびに活性チップ洗浄ステーションを配置するためのマルチポジションワーク表面のための少なくとも１つのモジュラーデッキを含有する。
【０２２１】
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、プロトプラストを形質転換するための高効率電気穿孔システムを含む。一部の実施形態では、高効率電気穿孔システムは、９６または３８４ウェルプレートにおいて細胞を形質転換することができる。一部の実施形態では、高効率電気穿孔システムは、ＶＷＲ（登録商標）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＢＴＸ（商標）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＭＸｃｅｌｌ（商標）または他のマルチウェル電気穿孔システムを含む。
【０２２２】
一部の実施形態では、自動化システムは、０℃〜１００℃で試料をインキュベートする正確な温度制御を提供する制御ブロックまたはプラットフォームなどの熱交換器の温度を安定化させるために使用される統合型サーマルサイクラーおよび／または温度調節器を含む。
【０２２３】
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、液体、粒子、細胞、および多細胞生物をロボット操作することができる、単一または複数の磁気プローブ、親和性プローブ、レプリケーターまたはピペッターを含む互換性マシンヘッド（単一または複数チャネル）と適合する。マルチウェルまたはマルチチューブ磁気分離器および濾過ステーションは、単一または複数の試料形式で液体、粒子、細胞、および生物を操作する。
【０２２４】
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、カメラ映像および／または分光光度計システムと適合する。かくして、一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、進行中の細胞培養における色および吸光度の変化を検出および記録することができる。
【０２２５】
一部の実施形態では、所望のペレット形態を有する糸状真菌宿主細胞または株を生成するための本開示の自動化システムは、可撓性であり、システムが複数のアプリケーションを実行するのを可能にする複数のハードウェアアドオンと適合するように設計される。本明細書で提供される方法における使用のための自動化システムは、ソフトウェアプログラムモジュールを含み得る。ソフトウェアプログラムモジュールは、方法の作出、改変、および実行を可能にし得る。システムは、診断モジュールをさらに含み得る。診断モジュールは、設定、機器の配列、およびモーター動作を可能にし得る。システムは、カスタマイズされたツール、実験機器、液体および粒子の移動パターンならびに／またはデータベース（複数可）をまたさらに含み得る。カスタマイズされたツール、実験機器、ならびに液体および粒子の移動パターンは、異なるアプリケーションのプログラム化および実行を可能にし得る。データベースは、方法およびパラメーターの保存を可能にし得る。さらに、システムに存在するロボットおよびコンピュータインターフェースは、機器間の通信を可能にし得る。
【０２２６】
当業者であれば、所望のペレット形態を有する糸状真菌宿主細胞または株を生成するための本開示のＨＴＰ法を実行することができる様々なロボットプラットフォームを認識するであろう。
コンピュータシステムハードウェア
【０２２７】
図１０は、本開示の実施形態に従って非一過性コンピュータ可読媒体（例えば、メモリ）中に保存されたプログラムコードを実行するために使用することができるコンピュータシステム８００の例を示す。コンピュータシステムは、用途に応じて、ヒトユーザーおよび／または他のコンピュータシステムと連動させるために使用することができる、入力／出力サブシステム８０２を含む。Ｉ／Ｏサブシステム８０２は、例えば、キーボード、マウス、グラフィカルユーザーインターフェース、タッチスクリーン、または入力のための他のインターフェース、および例えば、ＬＥＤもしくは他のフラットスクリーンディスプレイ、またはアプリケーションプログラムインターフェース（ＡＰＩ）を含む、出力のための他のインターフェースを含んでもよい。ＬＩＭＳシステムの構成要素などの、本開示の実施形態の他の要素を、コンピュータシステム８００のようなコンピュータシステムに実装することができる。
【０２２８】
プログラムコードを、二次メモリ８１０またはメインメモリ８０８またはその両方の中の永続記憶装置などの非一過性媒体に保存することができる。メインメモリ８０８は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）などの揮発性メモリまたは読出し専用メモリ（ＲＯＭ）などの非揮発性メモリ、ならびに使用説明書およびデータへのより速いアクセスのための様々なレベルのキャッシュメモリを含んでもよい。二次メモリは、ソリッドステートドライブ、ハードディスクドライブまたは光ディスクなどの永続記憶装置を含んでもよい。１つまたは複数のプロセッサー８０４は、１つまたは複数の非一過性媒体からプログラムコードを読み取り、コンピュータシステムが本明細書の実施形態によって実施される方法を達成するのを可能にするコードを実行する。当業者であれば、プロセッサーが、ソースコードを取り込み、ソースコードを、プロセッサー８０４のハードウェアゲートレベルで理解可能であるマシンコードに解釈またはコンパイルすることができることを理解するであろう。プロセッサー８０４は、コンピュータ集約的タスクを取り扱うためのグラフィックスプロセシングユニット（ＧＰＵ）を含んでもよい。特に、機械学習では、１つまたは複数のＣＰＵ  ８０４は、１つまたは複数のＧＰＵ  ８０４に大量のデータのプロセシングをオフロードすることができる。
【０２２９】
プロセッサー８０４は、ネットワークインターフェースカード、ＷｉＦｉ送受信機などの１つまたは複数の通信インターフェース８０７を介して外部ネットワークと通信してもよい。バス８０５は、Ｉ／Ｏサブシステム８０２、プロセッサー８０４、末梢デバイス８０６、通信インターフェース８０７、メモリ８０８、および永続記憶装置８１０を通信接続する。本開示の実施形態は、この代表的なアーキテクチャに限定されない。代替的な実施形態は、異なる配置および種類の構成要素、例えば、入力出力構成要素およびメモリサブシステムのための別々のバスを用いてもよい。
【０２３０】
当業者であれば、本開示の実施形態の要素の一部または全部、およびそれに伴う操作を、コンピュータシステム８００のもののような、１つまたは複数のプロセッサーおよび１つまたは複数のメモリシステムを含む１つまたは複数のコンピュータシステムによって全体的または部分的に実行することができることを理解する。特に、本明細書に記載の任意のロボットおよびその他の自動化システムまたはデバイスを、コンピュータに実装することができる。例えば、一部の要素および機能を、ローカルで実行し、他のものを異なるサーバーを通すネットワーク上での分配様式で、例えば、クライアント−サーバー様式で実行してもよい。特に、サーバー側の操作を、サービス型ソフトウェア（ＳａａＳ）様式で複数のクライアントが利用できるようにすることができる。
【０２３１】
この文脈での構成要素という用語は、ソフトウェア、ハードウェア、またはファームウェア（またはその任意の組合せ）構成要素を広く指す。構成要素は、典型的には、特殊化された入力物を使用して有用なデータまたは他の出力物を生成することができる機能的構成要素である。構成要素は、自己完結型であっても、またはそうでなくてもよい。アプリケーションプログラム（「アプリケーション」とも呼ばれる）は、１つもしくは複数の構成要素を含んでもよいか、または構成要素は、１つもしくは複数のアプリケーションプログラムを含んでもよい。
【０２３２】
一部の実施形態は、他のモジュールまたはアプリケーション構成要素と共に、一部、全部の構成要素を含む、またはいずれの構成要素も含まない。さらにまだ、様々な実施形態は、２つもしくはそれより多いこれらの構成要素を単一のモジュールに組み込む、および／または１つもしくは複数のこれらの構成要素の機能の一部を、異なる構成要素と結合させることができる。
【０２３３】
用語「メモリ」は、情報を保存するために使用される任意のデバイスまたはメカニズムであってもよい。本開示の一部の実施形態によれば、メモリは、限定されるものではないが、揮発性メモリ、非揮発性メモリ、および動的メモリの任意の型を包含することが意図される。例えば、メモリは、ランダムアクセスメモリ、記憶保持デバイス、光メモリデバイス、磁気媒体、フロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、ハードドライブ、ＳＩＭＭ、ＳＤＲＡＭ、ＤＩＭＭ、ＲＤＲＡＭ、ＤＤＲ  ＲＡＭ、ＳＯＤＩＭＭＳ、消去・プログラム可能型読取専用メモリ（ＥＰＲＯＭ）、電気的消去・プログラム可能型読取専用メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）、コンパクトディスク、ＤＶＤ、および／またはその他であってもよい。一部の実施形態によれば、メモリは、１つまたは複数のディスクドライブ、フラッシュドライブ、データベース、ローカルキャッシュメモリ、プロセッサーキャッシュメモリ、関係型データベース、フラットデータベース、サーバー、クラウドベースプラットフォーム、および／またはその他を含んでもよい。さらに、当業者であれば、情報を保存するための多くのさらなるデバイスおよび技術をメモリとして使用することができることを理解するであろう。
【０２３４】
メモリを使用して、プロセッサー上で１つまたは複数のアプリケーションまたはモジュールを実行するための使用説明書を保存することができる。例えば、一部の実施形態では、メモリを使用して、本出願で開示される１つまたは複数のモジュールおよび／またはアプリケーションの機能を実行するのに必要とされる使用説明書の全部または一部を保管することができる。
細胞培養および発酵
【０２３５】
本開示の細胞を、任意の所望の生合成反応または選択のために適切に改変された従来の栄養培地中で培養することができる。一部の実施形態では、本開示は、プロモーターを活性化するための誘導培地中での培養を教示する。一部の実施形態では、本開示は、形質転換体の選択剤（例えば、抗生物質）を含む、選択剤を含む培地、または阻害条件（例えば、高エタノール条件）下での増殖に適した生物の選択を教示する。一部の実施形態では、本開示は、細胞増殖にとって最適化された培地中で細胞培養物を増殖させることを教示する。他の実施形態では、本開示は、生成物収率について最適化された培地中で細胞培養物を増殖させることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、細胞増殖を誘導することができる培地中で培養物を増殖させることを教示し、また、最終生成物の産生のために必要な前駆体（例えば、エタノール産生のための高レベルの糖）も含有する。
【０２３６】
温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞と共に使用するのに好適なものであり、当業者には明らかであろう。上述の通り、細菌、植物、動物（哺乳動物を含む）および古細菌を起源とする細胞を含む、多くの細胞の培養および生産のための多くの参考文献が利用可能である。例えば、Sambrook,  Ausubel（全て、上掲）、ならびにBerger,  Guide  to  Molecular  Cloning  Techniques,  Methods  in  Enzymology  volume  152  Academic  Press,  Inc.,  San  Diego,  CA；およびFreshney  (1994)  Culture  of  Animal  Cells,  a  Manual  of  Basic  Technique,  third  edition,  Wiley-Liss,  New  Yorkおよびそこで引用された参考文献；Doyle  and  Griffiths  (1997)  Mammalian  Cell  Culture:  Essential  Techniques  John  Wiley  and  Sons,  NY；Humason  (1979)  Animal  Tissue  Techniques,  fourth  edition  W.H.  Freeman  and  Company；およびRicciardelle  et  al.,  (1989)  In  Vitro  Cell  Dev.  Biol.  25:1016-1024（全て参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。植物の細胞培養および再生については、Payne  et  al.  (1992)  Plant  Cell  and  Tissue  Culture  in  Liquid  Systems  John  Wiley  &  Sons,  Inc.  New  York,  N.Y.；Gamborg  and  Phillips  (eds)  (1995)  Plant  Cell,  Tissue  and  Organ  Culture；Fundamental  Methods  Springer  Lab  Manual,  Springer-Verlag  (Berlin  Heidelberg  N.Y.)；Jones,  ed.  (1984)  Plant  Gene  Transfer  and  Expression  Protocols,  Humana  Press,  Totowa,  N.J.およびPlant  Molecular  Biology  (1993)  R.  R.  D.  Croy,  Ed.  Bios  Scientific  Publishers,  Oxford,  U.K.  ISBN  0  12  198370  6（全て参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。一般的な細胞培養培地は、Atlas  and  Parks  (eds.)  The  Handbook  of  Microbiological  Media  (1993)  CRC  Press,  Boca  Raton,  Fla.（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。細胞培養に関するさらなる情報は、Sigma-Aldrich,  Inc  (St  Louis,  Mo.)からのThe  Life  Science  Research  Cell  Culture  Catalogue  ("Sigma-LSRCCC")および例えば、これもSigma-Aldrich,  Inc  (St  Louis,  Mo.)からのThe  Plant  Culture  Catalogueおよび補遺("Sigma-PCCS")（全て参照により本明細書に組み込まれる）などの利用可能な商業文献に見出される。
【０２３７】
使用される培養培地は、好適な様式で、各株の要求を満たさなければならない。様々な微生物のための培養培地の説明は、the  American  Society  for  Bacteriologyの"Manual  of  Methods  for  General  Bacteriology"  (Washington  D.C.,  USA,  1981)に示されている。
【０２３８】
本開示は、ａ）本開示による微生物を好適な培地中で培養し、発酵ブロスをもたらすステップと、ｂ）ａ）の発酵ブロスおよび／または微生物細胞中の目的の生成物を濃縮するステップとを含む目的の生成物の発酵調製のためのプロセスをさらに提供する。
【０２３９】
一部の実施形態では、本開示は、産生される微生物が、所望の有機化学化合物を産生する目的のために、例えば、ＷＯ０５／０２１７７２において説明される通り、連続的に、または回分式プロセス（回分式培養）もしくは流加回分式もしくは反復流加回分式プロセスで不連続的に培養され得ることを教示する。公知の培養法についての一般的性質の要約は、Chmiel  (Bioprozesstechnik.  1:  Einfuhrung  in  die  Bioverfahrenstechnik  (Gustav  Fischer  Verlag,  Stuttgart,  1991))による教本またはStorhas  (Bioreaktoren  and  periphere  Einrichtungen  (Vieweg  Verlag,  Braunschweig/Wiesbaden,  1994))による教本において入手可能である。
【０２４０】
一部の実施形態では、本開示の細胞は、回分式または連続発酵条件下で増殖される。
【０２４１】
古典的回分式発酵は、培地の組成が発酵開始に設定され、発酵中に人為的変更に供されない、閉鎖システムである。回分式システムの変形は、これもまた本開示において使用を見出す流加回分式発酵である。この変形では、基質は、発酵が進行するにつれて増加しながら添加される。カタボライト抑制が細胞の代謝を阻害しそうな場合、かつ培地中に限定的な量の基質が存在することが望ましい場合、流加回分式システムは有用である。回分式および流加回分式発酵は、当該技術分野で一般的かつ周知である。
【０２４２】
連続発酵は、規定の発酵培地をバイオリアクターに連続的に添加し、かつ等量の調製済み培地を同時に除去して、所望の目的の生体分子生成物を加工および回収するためのシステムである。一部の実施形態では、連続発酵は一般的に、培養物を、細胞が主に対数期増殖にある一定高密度に維持する。一部の実施形態では、連続発酵は一般的に、培養物を、定常対数期または遅延対数期／定常期増殖に維持する。連続発酵システムは、定常状態増殖条件を維持するように努める。
【０２４３】
連続発酵プロセスのために栄養素および増殖因子を調節するための方法、および生成物形成速度を最大限にするための技術は、微生物産業の分野で周知である。
【０２４４】
例えば、本開示の培養物のための炭素源の非限定的なリストは、糖および炭水化物、例として例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、テンサイまたはサトウキビ加工からのスクロース含有溶液、デンプン、デンプン加水分解産物およびセルロース；油および脂肪、例として例えば、大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油およびココナッツ油脂；脂肪酸、例として例えば、パルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸；アルコール、例として例えば、グリセロール、メタノールおよびエタノール；ならびに有機酸、例として例えば、酢酸または乳酸を含む。
【０２４５】
本開示の培養物のための窒素源の非限定的なリストは、有機窒素含有化合物、例として、ペプトン、酵母抽出物、食肉抽出物、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、大豆粉および尿素；または無機化合物、例として、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムを含む。窒素源は、個々に、または混合物として使用され得る。
【０２４６】
本開示の培養物のためのリン源としての可能性のあるものの非限定的なリストは、リン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩を含む。
【０２４７】
培養培地は、増殖に必要な、例えば、金属、例として例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムおよび鉄の塩化物または硫酸塩の形態の塩、例として例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄をさらに含み得る。
【０２４８】
最後に、上記に挙げる物質に加えて、必須増殖因子、例として、アミノ酸、例えば、ホモセリン、およびビタミン、例えば、チアミン、ビオチンまたはパントテン酸が、使用され得る。
【０２４９】
一部の実施形態では、培養物のｐＨは、非限定的に、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくは水性アンモニア；または酸性化合物、例として、リン酸もしくは硫酸を含む任意の酸もしくは塩基または緩衝塩によって好適な様式で制御され得る。一部の実施形態では、ｐＨは一般的に、６．０〜８．５、好ましくは６．５〜８の値に調節される。
【０２５０】
一部の実施形態では、本開示の培養物は、消泡剤、例として例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルを含み得る。一部の実施形態では、本開示の培養物は、好適な選択物質、例として例えば、抗生物質を添加することによって培養物のプラスミドを安定化するように改変される。
【０２５１】
一部の実施形態では、培養は、好気性条件下で行われる。これらの条件を維持するために、酸素または酸素含有気体混合物、例として例えば、空気が培養物に導入される。同様に、過酸化水素で富化した液体を使用することが可能である。発酵は、必要な場合、高圧で、例えば、０．０３〜０．２ＭＰａの高圧で行われる。培養物の温度は通常、２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃、特に好ましくは３０℃〜３７℃である。回分式または流加回分式プロセスにおいては、培養は好ましくは、所望の目的の生成物（例えば、有機化学化合物）の、回復するのに十分な量が形成されるまで続ける。この目的は通常、１０時間〜１６０時間以内に達成され得る。連続プロセスにおいては、より長い培養時間が可能である。微生物の活性は、発酵培地および／または前記微生物の細胞中の目的の生成物の濃縮（蓄積）をもたらす。
【０２５２】
一部の実施形態では、培養は、嫌気性条件下で行われる。
【０２５３】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法を使用して生成される糸状真菌株または宿主細胞を増殖させるための発酵培地であって、前記糸状真菌株または宿主細胞を、前記発酵培地中で増殖させた場合に、非菌糸体ペレット形態を維持するように、マンガンを含み、かつキレート剤を実質的に含まない（目的の生成物、例として例えば、クエン酸を生成するための当該技術分野で公知の発酵培地中に見られるキレート剤の量または濃度の５％、４％、３％、２％または１％未満である）か、またはキレート剤を含まない発酵培地が本明細書で提供される。発酵培地は、クエン酸産生培地であり得る。マンガンは、約１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、１００、２５０、５００、７５０または１０００ｐｐｂで存在し得る。マンガンは、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、１００、２５０、５００、７５０または１０００ｐｐｂを超えて存在し得る。発酵培地は、キレート剤を含まない場合がある。発酵培地は、通常の発酵培地よりも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％少ないキレート剤を含み得る。キレート剤は、マンガンキレート剤であってもよい。糸状真菌株または宿主細胞は、１つまたは複数の遺伝的変更標的形態遺伝子を含み得る。標的形態遺伝子は、本明細書で提供される任意の形態関連遺伝子であり得る。一実施形態では、標的形態遺伝子は、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ２成分ヒスチジンキナーゼ遺伝子（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ｎｉｋＡ遺伝子；配列番号１４）である。遺伝的変更は、標的形態関連遺伝子の突然変異体型および／またはネイティブプロモーターもしくはターミネーターの異種のプロモーターもしくはターミネーターによる置き換えであり得る。一実施形態では、標的形態遺伝子の突然変異体型は、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿９（配列番号５）、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１２（配列番号６）、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８（配列番号７）またはＦｕｎｇｉＳＮＰ＿４０（配列番号８）である。別の実施形態では、標的形態遺伝子の突然変異体型は、表２のプロモーターのいずれかに融合または作動可能に連結されたＦｕｎｇｉＳＮＰ＿９（配列番号５）、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１２（配列番号６）、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８（配列番号７）またはＦｕｎｇｉＳＮＰ＿４０（配列番号８）である。一実施形態では、標的形態遺伝子は、配列番号７によってコードされるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質またはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１タンパク質のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの突然変異体型である。この実施形態にさらに加えて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの突然変異体型の遺伝子は、ｍａｎ８ｐまたはａｍｙ８ｐプロモーターに融合される。ｍａｎ８ｐプロモーターまたはａｍｙ８ｐプロモーターは、表２のプロモーターであり得る。
【実施例】
【０２５４】
以下の実施例は、本開示の様々な実施形態を例示する目的で与えられるものであり、いかなる様式でも本発明を限定することを意味しない。特許請求の範囲によって定義される、本開示の精神に包含されるその中の変化および他の使用は、当業者によって認識されるであろう。
【０２５５】
単に読み手を補助する目的のために、以下に簡単な内容の表（すなわち、表５）を提供する。この内容の表のいずれも、本出願の実施例または開示の範囲を限定することを意味しない。
【０２５６】
【表５】
2021526799.tif 000014
（実施例１）
糸状真菌のＨＴＰゲノム操作：糸状真菌形態に影響を及ぼす遺伝子の識別
【０２５７】
この実施例は、真菌細胞形態の制御において役割を果たす遺伝子を識別するための、糸状真菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒにおけるＳＮＰＳＷＡＰ法のＳＮＰ  Ｓｗａｐライブラリーの使用を実証する。特に、この実施例は、細胞が、液内培養物中で増殖させた場合、より締まった、あまり引き延ばされていない表現型を維持し、各細胞が複数の先端を有するＡ．ｎｉｇｅｒ突然変異体株において非菌糸体形成ペレット様形態表現型を与える１群の遺伝子の識別を説明する。このタイプの増殖は、撹拌タンク発酵に好ましい場合がある。
【０２５８】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒは、発酵を通したクエン酸のラージスケール産生に使用される糸状真菌の種である。この種の複数の株が単離されており、クエン酸および他の有機酸の産生について様々な能力を有することが示されている。Ａ．ｎｉｇｅｒ株ＡＴＣＣ  １０１５は、２０世紀初頭にクエン酸の産生体として識別された。ＡＴＣＣ  １１４１４と命名されたこの株の単離物は後に、その親に優るクエン酸収率の増大を示すことが分かった。例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ株ＡＴＣＣ  １０１５は、硝酸アンモニウムを含有するが鉄およびマンガンカチオンの両方を欠く培地中で１４０グラムのグルコースから平均して７グラムのクエン酸を産生する。他方で、単離株ＡＴＣＣ  １１４１４は、同じ条件下で１０倍の収率増大（７０グラムのクエン酸）を示す。さらに、株ＡＴＣＣ  １１４１４胞子は、クエン酸産生培地中で株１０１５の胞子よりもよく発芽し、増殖する。
【０２５９】
これらの表現型の差の遺伝的源の可能性を特定するために、ＡＴＣＣ  １０１５およびＡＴＣＣ  １１４１４株の両方のゲノムを配列決定および分析した。得られた分析は、１０１５と１１４１４株とを区別する４３個のＳＮＰを識別した（表３を参照されたい）。これらの４３個のＳＮＰのうち、１８個は、それらの各々の遺伝子のコードドメインに存在することが分かった（表４を参照されたい）。
【０２６０】
様々な培養条件下で糸状真菌の形態／増殖の制御において潜在的役割を果たす遺伝子を識別するために、表３の４３個のＳＮＰを、本明細書に記載のＳＮＰスワッププロセスにおいて使用して、表３の各個々のＳＮＰを基準１０１５株に体系的に導入し、得られる親株と突然変異体株との間の形態学的観点からの表現型の差を調査した。反対に、同じタイプのプロセスを、１１４１４産生株で行い、これによって、１１４１４のゲノムに既に存在する表３のＳＮＰの各々を、各遺伝子の野生型バージョンと体系的に置き換え、親株と突然変異体株との間で生じる任意の形態の差を記録した。
プロトプラストを形質転換するための構築物
【０２６１】
この実施例では、各株（すなわち、１０１５および１１４１４）を２つの構築物（「分割マーカー構築物」）により共形質転換し、ここで、２つの構築物の各々は、図４および５で示す通り、選択可能なマーカー（すなわち、図４および５のｐｙｒＧ）の重複部分を含有し、直列反復配列が隣接していた。融合ＰＣＲを使用して分割マーカー構築物を生成し、図５で示す通り、断片分析器（fragmenta  analyzer）を使用して品質管理を行った（ＱＣ’ｄ）。さらに、これらの構築物の各々は、表３の各ＳＮＰについての各々の標的遺伝子における宿主細胞ゲノムでの統合を方向付けるために各構築物の直列反復部分に隣接する配列をさらに含んだ。１０１５基準株プロトプラストについて、分割構築物の直列反復配列は、表３のＳＮＰの１つを含んだ（図６を参照されたい）。対照的に、１１４１４産生株プロトプラストについて、直列反復配列は、表３のＳＮＰを含まなかった。
【０２６２】
２０１７年６月６日出願の第６２／５１５，９０７号で説明される通り、Ａ．ｎｉｇｅｒ基準株１０１５および産生株１１４１４を培養し、プロトプラストに変換し、形質転換し、スクリーニングした。要約すると、これらのステップの各々は以下の通りであった。
プロトプラストの生成
【０２６３】
Ａ．ｎｉｇｅｒ  １０１５基準株およびＡ．ｎｉｇｅｒ  １１４１４産生株の両方について、５００ミリリットルの完全培地に１０６個の分生胞子／ｍｌを接種し、１５０ｒｐｍで３０℃にて一晩増殖させた。一晩の増殖後、各培養物を、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈを通して濾過することによって、菌糸体を回収した。次に、菌糸体を滅菌水で徹底的にすすいだ。その後、両方の株からの回収および洗浄した菌糸体を各々別々に、ＶｉｎｏＴａｓｔｅ  Ｐｒｏ（ＶＴＰ）酵素カクテルによる酵素消化に供した。
【０２６４】
最初に５０ｍｌのプロトプラスト化緩衝液（１．２Ｍ硫酸マグネシウム、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ５）中の６０ｍｇ／ｍｌのＶＴＰを作ることによって、両方の株についての菌糸体の酵素消化を行った。ＶＴＰを溶解した後、緩衝液を、清浄なＯａｋｒｉｄｇｅ管に入れ、１５，０００×ｇで１５分間回転させた。その後、溶液を、遠心分離後にフィルター滅菌した。作成した後、回収した菌糸体の一部をＶＴＰ溶液に添加し、菌糸体を３０℃で８０ｒｐｍにて約２〜４時間消化した。ＶＴＰ消化中の様々な間隔で、少量の試料を４００×拡大下にてプロトプラスト（すなわち、分生胞子よりも大きく、かつ浸透圧溶解に感受性の巨大円形細胞）の存在について調査した。各株について菌糸体のほとんどまたは全てが消化された時点で、各株の培養物を、滅菌Ｍｉｒａｃｌｏｔｈを通して濾過し、濾過物を、目盛り付きシリンダーに収集した。濾過したプロトプラストを、目盛り付きシリンダーに移し、より低い浸透圧調節物質濃度の緩衝液（５ｍｌの０．４Ｍ  ＳＴ緩衝液（０．４Ｍソルビトール、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８））で静かに覆った。その後、覆った試料を８００×ｇで４℃にて１５分間回転させ、その後、プロトプラストをピペットで除去し、２５ｍｌのＳＴ溶液（１．０Ｍソルビトール、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、Ｐｈ８．０）と静かに混合し、８００×ｇで１０分間再回転させた。プロトプラストは、管の底においてペレット状になるはずである。その後、各株からのプロトプラストを各々別々に、２５ｍｌのＳＴ溶液中に再懸濁し、８００×ｇでの１０分間の遠心分離によって収集した。
プロトプラストの形質転換
【０２６５】
遠心分離後、両方の株からのプロトプラストを最終的に、塩化カルシウムを含有する緩衝液中に再懸濁した。次に、自動化液体ハンドラーを使用して、両方の株からのプロトプラストを、伝統的なＰＥＧカルシウム媒介形質転換に供し、これにより、上述の分割構築物からのＤＮＡを９６ウェル中でプロトプラスト−ＰＥＧ混合物と合わせた。
形質転換体についてのスクリーニング
【０２６６】
上記に説明する通り、この実施例で利用される分割マーカー構築物は、ｐｙｒＧマーカー遺伝子に隣接する直列反復配列を含有し、これは次に、マーカー遺伝子をループアウトするために使用された。その結果、ループアウト構築物を含有する株は、選択領域の欠失について対抗選択された（例えば、図４および図７を参照されたい；ｐｙｒＧ遺伝子の非存在）。本明細書で説明する配列ベーススクリーニングによって、正しい統合をさらに評価した。さらに、本明細書で提供される形質転換体の同核共存性質を評価するために、ＮＧＳを使用して突然変異体株をスクリーニングした。同核共存または実質的同核共存突然変異体株を、様々な補充を伴う（図１３および１４を参照されたい）、または伴わない（図１５を参照されたい）最少培地に播種して、前記株の低ｐＨ（図１３）または浸透ストレス（図１４）下で増殖する能力、または胞子形成する能力（図１５）を評価した。加えて、突然変異体株を、ＣＡＰ培地中の液内培養物として増殖させて、液内産生培地中でのそれらの表現型を評価した。
結果
【０２６７】
表３と４との間で共有されるＳＮＰのうちの４つの、基準Ａ．ｎｉｇｅｒ株１０１５への個々の統合は、形態学的表現型を生成した。特に、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿９（配列番号５）、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１２（配列番号６）、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８（配列番号７）またはＦｕｎｇｉＳＮＰ＿４０（配列番号８）の１０１５ゲノムへの統合は、ＣＡＰ培地中の液内培養物として増殖させた場合、非菌糸体ペレット形態を産生する突然変異体株を生成した。
【０２６８】
真菌形態に影響を及ぼす４つのＳＮＰを含有する遺伝子の役割を、これらの４つのＳＮＰの各々の除去が、観察された形態学的表現型を救済するウェーブダウン（ｗａｖｅ  ｄｏｗｎ）実験でさらに実証した。４つのＳＮＰの配列は付属の配列表で見ることができ、一方で、それらの推定または公知のタンパク質機能は表４で見ることができる。
【０２６９】
図１３で示す通り、基準ＳＮＰ１８を含有する株は、低ｐＨ培地でより速く増殖する。基準株における産生株（１１４１４）からのＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８の存在（すなわち、図１３の基準ｓｎｐ１８産生）は、基準（すなわち、図１３の基準）と比較して、得られるコロニーのｐＨ２培地での肥大成長を減少させた。対照的に、産生株における基準株からのＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８の野生型バージョンの存在（すなわち、図１３の産生ＳＮＰ１８基準）は、図１３の基準株および産生株と比較して、前記株の肥大成長を可能にした。さらに、産生株に存在する他のＳＮＰも、より低い肥大成長に寄与するように見える（図１３のｓｎｐ１８産生よりも小さい産生を参照されたい）。
【０２７０】
図１４で示す通り、基準ＳＮＰ１８（すなわち、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８の野生型バージョン）を含有する株は、浸透ストレスを与える培地でより速く増殖する。基準株における産生株（１１４１４）からのＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８の存在（すなわち、図１４の基準ｓｎｐ１８産生）は、基準（すなわち、図１４の基準）と比較して、得られるコロニーの浸透ストレス下での肥大成長を減少させた。対照的に、産生株における基準株からのＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８の野生型バージョンの存在（すなわち、図１４の産生ＳＮＰ１８基準）は、図１４の基準株および産生株と比較して、前記株の肥大成長を可能にした。さらに、産生株に存在する他のＳＮＰも、より低い肥大成長に寄与するように見える（図１４の基準ｓｎｐ１８産生よりも小さい産生を参照されたい）。
【０２７１】
興味深いことに、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿９、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１２またはＦｕｎｇｉＳＮＰ＿４０の各々を含有する基準株は、液内培養で増殖させなかった場合（例えば、プレート上）、正常に増殖し、正常に胞子形成した。基準株（すなわち、１０１５）においてＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８を発現することは、図１５で示す通り、肥大成長速度（減少した）および胞子形成に対する効果を示さなかった。
（実施例２）
糸状真菌のＨＴＰゲノム操作：特定の遺伝子が糸状真菌形態において果たす役割の確認−特定の形態制御遺伝子の欠失
【０２７２】
この実施例は、真菌形態において役割を果たすと実施例１で特定された４つの遺伝子の役割の確認を行う。特に、この実施例は、本明細書に記載のＨＴＰ法を使用する、Ａ．ｎｉｇｅｒ株１０１５および１１４１４における４つの遺伝子の各々のノックアウトまたは欠失を説明する。
【０２７３】
実施例１で説明する通り、Ａ．ｎｉｇｅｒ基準株１０１５および産生株１１４１４を培養し、プロトプラストに変換し、形質転換し、スクリーニングした。
プロトプラストを形質転換するための構築物
【０２７４】
この実施例では、各株（すなわち、１０１５および１１４１４）からのプロトプラストを、一連の単一の構築物で形質転換し、シリーズの各構築物は、マーカー遺伝子の宿主細胞ゲノムへの統合を方向付けるために、実施例１で識別した目的の４つの遺伝子のうちの１つに隣接するゲノム配列に相補的な配列が隣接する選択可能なマーカー遺伝子（すなわち、ｐｙｒＧ）を含有した。図８で示す通り、マーカー遺伝子の、４つの遺伝子のうちの１つ（１０１５株の４つの野生型遺伝子のうちの１つ、および１１４１４株の４つのＳＮＰのうちの１つ）の遺伝子座への統合は実質的に、各々の株の遺伝子座から前記野生型遺伝子またはＳＮＰ含有遺伝子を除去するように働いた。
【０２７５】
増殖後、ＮＧＳを使用して突然変異体株をスクリーニングして、本明細書で提供される形質転換体の同核共存性質を評価した。同核共存または実質的同核共存突然変異体株を培地に播種して、前記株の、ＣＡＰ培地中の液内培養物として胞子形成または増殖する能力を評価し、液内産生培地中でのそれらの表現型を評価した。
結果
【０２７６】
基準１０１５株および１１４１４産生株からの４つの遺伝子の各々の除去は、前記４つの遺伝子の各々が真菌形態に影響を及ぼすことにおいて明らかに役割を果たす点において、実施例１の結果を確認した。特に、実施例１と同様に、１０１５株におけるＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８を含有する遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンまたは１１４１４株におけるＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８を含有する遺伝子の除去は、最も際立った表現型を産生し、それによって、液内培養条件下で、前記株はペレット様形態を有した。さらに、図１６で示す通り、ＦｕｎｇｉＳＮＰ１８およびＦｕｎｇｉＳＮＰ４０遺伝子の欠失は、全ての条件下で締まった形態をもたらした。このデータは、欠失表現型が、ＳＮＰそれ自体よりも明白であること（形態に対するより強い影響）を考えると、ＳＮＰは機能喪失突然変異ではないことを示し得る。したがって、これらの遺伝子の発現を変更することは、発酵槽における増殖に望ましい様式で形態に影響を及ぼし得るように見える。
【０２７７】
興味深いことに、１０１５株におけるＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８を含有する遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンの欠失は、得られる変異１０１５株において、前記変異１０１５株が胞子形成する能力を失うような陰性胞子形成表現型を産生した（図１７を参照されたい）。この胞子形成の喪失は、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８遺伝子が除去された１１４１４株においては観察されなかった。１１４１４および１０１５株の遺伝的バックグラウンドが、表３および４に示されるＳＮＰは別として、同一であることを考えると、このことは、１１４１４遺伝的バックグラウンドにおける表３または４のＳＮＰのうちの１つ、全部または一部の組合せの存在は、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８が除去された場合に産生される陰性胞子形成表現型を救済するのに十分であることを示唆した。言い換えると、ＳＮＰ１８活性の非存在下で産生株において胞子形成を維持するために上位に作用する他の突然変異（ＳＮＰ）が存在する。
【０２７８】
胞子形成の喪失は、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿９、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１２もしくはＦｕｎｇｉＳＮＰ＿４０またはそれぞれ、それらの非ＳＮＰ含有バージョンを除去することにより産生した変異１１４１４または１０１５株のいずれでも観察されなかったことに留意するべきである。
【０２７９】
この実施例において液内培養条件下で観察された形態学的表現型は、４つの遺伝子の各々について実施例１よりも際立っており、これは、成功した形質転換体が実質的に欠失表現型を示す実験設計のためであり得ることにさらに留意するべきである。さらに、また、１１４１４株の表現型は、より明白であり、これは、１０１５基準株と比較して、この株に存在する他のＳＮＰのうちの１つまたは複数による表現型への寄与のためであり得る。
（実施例３）
糸状真菌のＨＴＰゲノム操作：遺伝子発現を変更することによる、糸状真菌細胞形態の変更
【０２８０】
この実施例は、実施例１および２から識別された、糸状真菌形態の制御において役割を果たすと考えられるＦｕｎｇｉＳＮＰ＿９、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１２、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８およびＦｕｎｇｉＳＮＰ＿４０遺伝子の発現を調節することの効果を試験するための、糸状真菌細胞における自動化ＨＴＰ  ＰＲＯＳＷＰ法の使用を実証する。
【０２８１】
この実施例では、Ａ．ｎｉｇｅｒ  １０１５基準株およびＡ．ｎｉｇｅｒ  １１４１４産生株の両方において、実施例１および２で識別されたＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８遺伝子（すなわち、配列番号７）の発現を、本明細書に記載のＰＲＯＳＷＰ法を使用して、注釈されたネイティブプロモーターを表２の４つのプロモーターのうちの１つで置き換えることによって調節した。より特に、各ＦｕｎｇｉＳＮＰについて株（すなわち、１０１５親株または１１４１４親株）の各々について、１組の（４つの）変異体または突然変異体株を生成し、ここで第１の変異株は、表２に記載のｓｒｐ８ｐプロモーターの制御下で前記ＦｕｎｇｉＳＮＰ候補（ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿９（配列番号５）；＿１２（配列番号６）；＿１８（配列番号７）；＿４０（配列番号８））遺伝子を含む第１の構築物を発現し、第２の変異株は、表２に記載のａｍｙ８ｐプロモーターの制御下の前記ＦｕｎｇｉＳＮＰ候補遺伝子を有し、第３の変異株は、表２に記載のｍａｎ８ｐプロモーターの制御下の前記ＦｕｎｇｉＳＮＰ候補遺伝子を有し、第４の変異株は、表２に記載のｍｂｆＡｐプロモーターの制御下の前記ＦｕｎｇｉＳＮＰ候補遺伝子を有した。変異体を生成するために使用した構築物の各々は、ＦｕｎｇｉＳＮＰ候補遺伝子に隣接する配列と、構築物の各々のＦｕｎｇｉＳＮＰ候補の遺伝子座への統合を方向付けるように働くプロモーターとをさらに含んだ。この実施例で使用した２部構築物設計および統合スキームの一般的説明を、図１８に示す。
【０２８２】
（４つの）変異株を生成するために使用した各ＦｕｎｇｉＳＮＰ候補についての各構築物により個々に、それらの生成後、Ａ．ｎｉｇｅｒ  １０１５基準株およびＡ．ｎｉｇｅｒ  １１４１４産生株の両方について生成したプロトプラストを形質転換した。上記実施例で説明する通り、両方の株のプロトプラストを培養し、プロトプラストに変換し、形質転換し、表現型および／または配列ベーススクリーニングを使用して実質的同核共存プロトプラストについて選択するためにスクリーニングした。したがって、各個々の構築物の形質転換は、概して図３に示す各ＦｕｎｇｉＳＮＰ候補についての親の株の各々についての４つの変異体または突然変異体株の生成をもたらした。その後、これらの株の各々の形態学的表現型を観察し、識別された遺伝子のネイティブプロモーターの制御下の前記遺伝子を含む突然変異体株の形態学的表現型と比較した。その後、識別された遺伝子の各々について、理想的な発現レベルを決定した。
結果
【０２８３】
全体的に、各形態制御遺伝子標的（すなわち、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿９、＿１２、＿１８および＿４０）についての表２の様々なプロモーターによるプロモータースワッピングは、これらの遺伝子の発現の制御が、形態に影響を及ぼすことを明らかにした（図１９を参照されたい）。弱いｍａｎＢプロモーター下のＳＮＰ１８を含有する株は、他のプロモーターの組合せを含有する株よりも締まったコロニー形態を有した。ＳＮＰ１８制御の影響は、低ｐＨ下よりも浸透ストレス下においてより明白であった。さらに、弱いｍａｎＢプロモーター下のＳＮＰ４０を含有する株は、試験した全ての増殖条件下で、他のプロモーターの組合せを含有する株よりもコロニー形態に強烈な効果を有した。
【０２８４】
図２０で示す通り、形態制御遺伝子標的１２（ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１２；配列番号６）の表２の様々なプロモーターによるプロモータースワッピングは、より低強度のプロモーターが、菌糸における黄色色素およびコロニーの縁で観察されるいくらか変更された形態をもたらすことを明らかにした。黄色色素の存在は、変異体または突然変異体株が代謝ストレスを経験していることを示した。
【０２８５】
さらに、形態制御遺伝子標的１８（ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８；配列番号７）の表２の様々プロモーターによるプロモータースワッピングは、この遺伝子の２つのより弱いプロモーターによる発現の制御が、形態に影響を及ぼすことを明らかにした（図９、１１および２１を参照されたい）。例えば、ｍａｎＢ融合およびａｍｙＢ融合を含有する株は、複数先端ペレット表現型を保持したが、一方で、より高発現のｓｒｐＢおよびｍｂｆＡを有する株は、複数先端表現型を欠き、代わりに、異常な膨張を示した（図９を参照されたい）。図１１の画像は、クエン酸産生培地中で３０℃にて２４時間増殖させた株の画像である。図９の画像は、クエン酸産生培地中で３０℃にて４８時間増殖させた親１１４１４株および様々な非ネイティブプロモーター−ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８融合を発現する１１４１４株の画像である。１６８時間インキュベートした場合、より高発現のプロモーターを有する株および親株対照は全て、長い繊維状菌糸を含有した。プロモーター融合、ａｍｙＢおよびｍａｎＢからのより低レベルの発現を有する株は、ペレット状のままであった。図２１で示す通り、より弱いプロモーターによって駆動された場合、ＳＮＰ＿１８は、産生株におけるよりも基準株においてより厳格な形態学的表現型を有することに留意するべきである。
【０２８６】
実施例２の欠失実験の結果と同様に、１０１５株におけるＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８遺伝子の発現の減少は、図１２で示す通り胞子形成の喪失を経験した細胞をもたらした。この胞子形成の喪失は、１１４１４突然変異体株においては観察されなかった。ここでもまた、１１４１４および１０１５株の遺伝的バックグラウンドが、表３および４に示されるＳＮＰは別として、同一であることを考えると、このことは、１１４１４遺伝的バックグラウンドにおける表３または４のＳＮＰのうちの１つ、全部または一部の組合せの存在は、ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８の発現が減少すると産生される陰性胞子形成表現型を救済するのに十分であることを示唆した。
（実施例４）
キレート剤を欠く液内培養における形態突然変異体糸状真菌株の増殖の調査
【０２８７】
この実施例は、より低発現のプロモーター（すなわち、ｍａｎ８ｐプロモーター）の制御下でＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８遺伝子を発現するＡ．ｎｉｇｅｒ株の、液内培養条件下で様々なレベルのマンガンを含み、かつキレート剤を欠くＣＡＰ培地中にてペレット形態で増殖する能力を実証する。
【０２８８】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのクエン酸産生株の形態は、マンガン（Ｍｎ２＋）の濃度を含む様々な因子に感受性である。Ａ．ｎｉｇｅｒ（ＡＴＣＣ  １１４１４）培養物中のＭｎ２＋濃度を１４ｐｐｂまたはそれよりも高く増大すると、形態は、ペレット状から繊維状に転換し、クエン酸産生における迅速な低下が付随する。反対に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒの栄養培地のＭｎ２＋の低濃度および／または削除は、胞子膨張の増大および幅広い球状の菌糸によって特徴付けられる異常な形態学的発達をもたらし得る。その結果、キレート剤は多くの場合、濃度を許容可能な範囲に維持するために産生培地に添加される；しかしながら、キレート剤の存在は多くの場合、所望の最終生成物の産生を限定する場合があり、多くの場合、次に、付加的な追加のコストにより前記キレート剤を除去することが必要である。
【０２８９】
したがって、この実施例では、ｍａｎ８ｐ−ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８融合が、得られる株にＭｎ２＋の存在下でペレット形態を維持する能力を与えるかどうかを決定するために、ｍａｎ８ｐプロモーター（配列番号１）の制御下のＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８遺伝子を含むＡ．ｎｉｇｅｒ  １１４１４および１０１５突然変異体株、ならびにＡ．ｎｉｇｅｒ  １１４１４および１０１５親株を、様々なレベルのＭｎ２＋を含有し、かつキレート剤を欠く培地中で液内培養条件下にて増殖させる。
【０２９０】
ｍａｎ８ｐ−ＦｕｎｇｉＳＮＰ＿１８融合遺伝子を含む突然変異体１１４１４および１０１５株を、上記実施例で説明する通りに生成した。さらに、突然変異体株および親の株を、各株の形態学的発達に対するＭｎ２＋の効果を評価するために、Ｍｎ２＋なしまたは１０ｐｐｂ、１１ｐｐｂ、１２ｐｐｂ、１３ｐｐｂ、１４ｐｐｂ、１５ｐｐｂもしくは１０００ｐｐｂのＭｎ２＋により補充したＣＡＰ培地中で３０℃にて７２時間、２５０ｒｐｍで振とうしながら増殖させる。
（実施例５）
糸状真菌のＨＴＰゲノム操作：糸状真菌形態に影響を及ぼす遺伝子の確認
【０２９１】
この実施例は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｋＡ遺伝子が浸透圧応答経路において役割を果たし、真菌細胞形態に影響を及ぼし、かつクエン酸産生において補助し得ることを確認するための、糸状真菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒにおけるＳＮＰＳＷＡＰ法の使用を実証する。さらに、この実施例を使用して、表４のｆｕｎｇｉＳＮＰ＿１８が、Ｎ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログであるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｋＡであることを確認した。
方法
【０２９２】
この実施例では、実施例１、および本明細書に参照により組み込まれる２０１８年６月６日出願のＷＯ２０１８／２２６９００で説明される通り、Ａ．ｎｉｇｅｒ基準株（すなわち、ＡＴＣＣ  １０１５）および産生株（すなわち、ＡＴＣＣ  １１４１４）からプロトプラストを生成し、形質転換し、ＳＮＰＳＷＰに供した。要約すると、基準株から生成したプロトプラストを、マーカー遺伝子の基準株ゲノムへの統合を方向付けるために基準株においてｎｉｋＡ遺伝子に隣接するゲノム配列に相補的な配列が隣接する選択可能なマーカー遺伝子（すなわち、ｐｙｒＧ）を含有する単一の構築物で形質転換するか、または実施例１に記載の２つの構築物（「分割マーカー構築物」）で共形質転換した。実施例１で説明する通り、２つの構築物の各々は、選択可能なマーカー（すなわち、図４および５のｐｙｒＧ）の重複部分を含有し、かつ図４および５で示される、ＳＮＰ１８点突然変異（すなわち、図２２のｎｉｋＡ産生および図２３Ａ〜Ｂの基準＿ｎｉｋＡ−）を含有する直列反復配列が隣接した。分割マーカー構築物を、融合ＰＣＲを使用して生成し、図５で示す通り、断片分析器を使用して品質管理を行った（ＱＣ’ｄ）。さらに、これらの構築物の各々は、ｎｉｋＡ遺伝子座における基準株ゲノムでの統合を方向付けるための、各構築物の直列反復部分に隣接する配列をさらに含んだ。
【０２９３】
加えて、産生株ゲノムバックグラウンドにおける野生型ｎｉｋＡの効果を調査するために（図２３Ａ〜Ｂを参照されたい）、野生型ｎｉｋＡ遺伝子を、ＳＮＰ１８点突然変異を含まない直列反復配列とｎｉｋＡ遺伝子座における産生株ゲノムでの統合を方向付けるための直列反復部分に隣接する配列とを有する分割マーカー構築物を使用して、産生株（すなわち、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ  １１４１４）から生成したプロトプラストに導入した。
クエン酸産生
【０２９４】
野生型ＡＴＣＣ  １０１５株、ＳＮＰ１８突然変異を有するＡＴＣＣ  １０１５株（すなわち、ｎｉｋＡ産生）またはｎｉｋＡを伴わないＡＴＣＣ  １０１５株（すなわち、ｎｉｋＡΔｐｙｒＧ）、およびｎｉｋＡ点突然変異（すなわち、ＳＮＰ１８；図２３Ａ〜Ｂの産生）または野生型ｎｉｋＡ遺伝子（すなわち、図２３Ａ〜Ｂの産生＿ｎｉｋＡ＋）を有するＡＴＣＣ  １１４１４産生株を、１００ｍＬのクエン酸産生培地（ＣＡＰ；１４０ｇグルコース、３．１ｇ  ＮＨ４ＮＯ３、０．１５ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、０．１５ｇ  ＮａＣｌ、２．２ｇ  ＭｇＳＯ４＿７Ｈ２Ｏ、６．６ｍｇ  ＺｎＳＯ４＿７Ｈ２Ｏ、０．１ｍｇ  ＦｅＣｌ３）中で増殖させて、高レベルのクエン酸産生を誘導した。培養物を三重で、２５０ｍＬのフラスコ中にて毎分２５０回転で振とうしながら３０℃にて９６時間増殖させた。Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；４７５８５５番）を使用して上清から菌糸体を除去し、酵素アッセイ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ；Ｋ−ＣＩＴＲ）を使用して上清からのクエン酸の力価を決定した。
浸透ストレス応答
【０２９５】
顕微鏡検査のために、野生型ＡＴＣＣ  １０１５株、ＳＮＰ１８突然変異を有するＡＴＣＣ  １０１５株（すなわち、ｎｉｋＡ産生）またはｎｉｋＡを伴わないＡＴＣＣ  １０１５株（すなわち、ｎｉｋＡΔｐｙｒＧ）を、寒天培地で覆ったスライド上に１，０００個の胞子で点接種した。使用した培地は、最少培地（ＭＭ；グルコース、窒素源および必要な塩のみを含有する；低浸透ストレス）および１．０Ｍソルビトールを伴うＭＭ（高浸透ストレス）であった。スライドを３０℃で一晩増殖させ、オリンパス正立顕微鏡（ＢＸ５３）を使用して画像化した。画像を４００×拡大下で得た。
【０２９６】
プレートについての浸透ストレス応答の調査のために、野生型ＡＴＣＣ  １０１５株、ＳＮＰ１８突然変異を有するＡＴＣＣ  １０１５株（すなわち、ｎｉｋＡ産生）またはｎｉｋＡを伴わないＡＴＣＣ  １０１５株（すなわち、ｎｉｋＡΔｐｙｒＧ）を、ｐＨの変化を可視化するために使用されるｐＨ指示薬である０．０５ｇ／Ｌのブロモクレゾールグリーン（ＢＧＣ：Ｂｒｏｍｏｃｒｅｓｏｌ  ｇｒｅｅｎ）を伴うＭＭ上に１，０００個の胞子で点接種した。ＢＧＣはｐＨ６．５で青色であり、ｐＨがｐＨ２まで降下するにつれて徐々に黄色に変わる。プレートを３０℃で４８時間増殖させた。プレート中の黄色領域は、寒天断片を抽出することおよび酵素アッセイ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）による分析によって、クエン酸を含有することが確認された。
結果
【０２９７】
顕微鏡により図２２に示す通り、浸透ストレス応答について、ｎｉｋＡ遺伝子の突然変異は、菌糸先端細胞の増大をもたらし、ｎｉｋＡの欠失は、最も大きな増大をもたらす。クエン酸産生に対応するｐＨの降下を可視化することができるｐＨ染料指示薬を伴う最少培地を含有するプレートで調べた株は、驚くべきことに、試験した条件下で、欠失株が最も多くのクエン酸を産生することを示した。このことは、これらの株で観察された菌糸先端細胞の増大のためである可能性が高かった。対照的に、試験した株を浸透ストレスに供した場合（図２２の右側）、欠失株はより小さいコロニーを形成し、クエン酸産生の増大はもはや観察されなかった。興味深いことに、点突然変異は、浸透ストレスに対して応答する能力を維持する一方で、ｎｉｋＡ活性の低下をもたらした。このことは、ｎｉｋＡ活性の低下（遺伝子発現の低下または突然変異による）は、浸透ストレスに対して応答する能力を維持する一方で、形態の望ましい変化をもたらすことを示した。しかしながら、このデータは、ｎｉｋＡの欠失は発酵を改善し得ることも示し、その場合、細胞は浸透ストレス下に置かれない。
【０２９８】
クエン酸産生について、図２３Ａ〜Ｂに示す通り、基準株におけるｎｉｋＡ／ｓｌｎ１遺伝子の点突然変異（すなわち、ＳＮＰ１８；配列番号７）は、発酵の過程にわたりクエン酸力価の３３％増大をもたらすのに十分であった。この増大は、より多い数の菌糸先端細胞をもたらす形態の変化の結果であるように見える。
【０２９９】
本開示のさらなる番号付き実施形態
【０３００】
本開示により企図される他の主題は、以下の番号付き実施形態で示される。
１．親の株に由来する糸状真菌の変異株であって、変異株の細胞が液内培養条件下で増殖させると親の株の細胞と比較してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質またはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１タンパク質の機能的Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログの減少した量および／または活性の低い型を産生することになる、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＬＮ１遺伝子またはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）ｎｉｋ１遺伝子のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）オルソログの遺伝的変更を変異株が有するため、変異株の細胞が、液内培養で増殖させると親の株の細胞と比較して非菌糸体ペレット形成表現型を有する、変異株。
２．非液内増殖条件下で増殖させると親の株と比較して正常に胞子形成する、実施形態１に記載の変異株。
３．遺伝的変更が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログのための天然プロモーターを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質またはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１タンパク質のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの遺伝子を天然プロモーターと比較して弱く発現するプロモーターと置き換えることを含む、実施形態１または２に記載の変異株。
４．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質またはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１タンパク質のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの遺伝子をより弱く発現するプロモーターが、ａｍｙＢプロモーターまたはｍａｎＢプロモーターから選択される、実施形態３に記載の変異株。
５．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質またはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１タンパク質のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの遺伝子をより弱く発現するプロモーターが、配列番号１または配列番号２のプロモーターから選択される、実施形態３または４に記載の変異株。
６．遺伝的変更が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の天然型のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の突然変異Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログと置き換えることを含み、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の突然変異Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質またはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１タンパク質の突然変異Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログをコードする、上記実施形態のいずれか１つに記載の変異株。
７．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の突然変異Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログが、一塩基多型を含む、実施形態６に記載の変異株。
８．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の突然変異Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログが、配列番号７の核酸配列を含む、実施形態６または７に記載の変異株。
９．遺伝的変更が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の天然型のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログを選択可能なマーカー遺伝子に置き換えることによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の天然型Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログを変異株のゲノムから除去することを含む、実施形態１または２に記載の変異株。
１０．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質またはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１タンパク質のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログが構成要素であるシグナル伝達カスケード内の１つまたは複数の遺伝子の破壊をさらに含む、上記実施形態のいずれかに記載の変異株。
１１．１つまたは複数の遺伝子が、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子から選択される、実施形態１０に記載の変異株。
１２．配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンから選択される１つまたは複数の遺伝子の破壊をさらに含む、上記実施形態のいずれか１つに記載の変異株。
１３．破壊が、１つもしくは複数の遺伝子の天然プロモーターから、天然プロモーターと比較して１つもしくは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターへの置き換え、１つもしくは複数の遺伝子から１つもしくは複数の遺伝子の突然変異型への置き換え、１つもしくは複数の遺伝子から選択可能なマーカーへの置き換え、またはこれらの組合せから選択される、実施形態１０〜１２のいずれか１つに記載の変異株。
１４．天然プロモーターと比較して１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターが、ａｍｙＢプロモーターまたはｍａｎＢプロモーターから選択される、実施形態１３に記載の変異株。
１５．天然プロモーターと比較して１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターが、配列番号１または配列番号２のプロモーターから選択される、実施形態１３または１４に記載の変異株。
１６．１つまたは複数の遺伝子の突然変異型が、配列番号５、６または８である核酸配列から選択される、実施形態１３に記載の変異株。
１７．選択可能なマーカーが、栄養要求性マーカー遺伝子、比色分析用マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、または方向マーカー遺伝子から選択される、上記実施形態のいずれか１つに記載の変異株。
１８．比色分析用マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子である、実施形態１７に記載の変異株。
１９．栄養要求性マーカー遺伝子が、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される、実施形態１７に記載の変異株。
２０．方向マーカー遺伝子が、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子または硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）から選択される、実施形態１７に記載の変異株。
２１．抗生物質耐性遺伝子が、ｂｌｅ遺伝子であり、ｂｌｅ遺伝子が、フレオマイシンに対する耐性を付与する、実施形態１７に記載の変異株。
２２．糸状真菌が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される、上記実施形態のいずれか１つに記載の変異株。
２３．糸状真菌が、Ａ．ｎｉｇｅｒまたはその完全世代もしくは不完全世代である、上記実施形態のいずれか１つに記載の変異株。
２４．宿主細胞の形態を調節する遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む糸状真菌宿主細胞であって、プロモーターが、遺伝子にとって異種であり、プロモーターが、配列番号１〜４からなる群から選択される核酸配列を有する、糸状真菌宿主細胞。
２５．発酵培地において液内培養条件下で増殖させたとき、宿主細胞の形態を調節する遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを有さない参照糸状真菌宿主細胞と比較して、非菌糸体ペレット形態を有する、実施形態２４に記載の糸状真菌宿主細胞。
２６．発酵培地が、少なくとも１４ｐｐｂのマンガンを含む、実施形態２５に記載の糸状真菌宿主細胞。
２７．発酵培地が、キレート剤を含まない、実施形態２５または２６に記載の糸状真菌宿主細胞。
２８．宿主細胞の形態を調節する遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを有さない参照糸状真菌宿主細胞により産生される量と少なくとも同等である量の目的の生成物を産生する、実施形態２４〜２７のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
２９．形態を調節する遺伝子が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログ、配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せである核酸配列を有する遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンから選択される、実施形態２４〜２８のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
３０．形態を調節する遺伝子が、遺伝子の野生型または突然変異型である、実施形態２４〜２９のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
３１．形態を調節する遺伝子が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログであり、プロモーターが、配列番号１または２から選択される、実施形態２４〜３０のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
３２．形態を調節する遺伝子が、配列番号７である、実施形態２４〜３０のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
３３．Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される、実施形態２４〜３２のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
３４．Ａ．ｎｉｇｅｒまたはその完全世代または不完全世代である、実施形態２４〜３３のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
３５．少なくとも１４ｐｐｂのマンガンと、非菌糸体ペレット表現型を含む糸状真菌細胞とを含む、発酵ブロスであって、ブロスがキレート剤を含まず、糸状真菌細胞が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の遺伝的に変更されたＡ．ｎｉｇｅｒオルソログを含む、発酵ブロス。
３６．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の遺伝的に変更されたＡ．ｎｉｇｅｒオルソログが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログに作動可能に連結された異種プロモーターを含む、実施形態３５に記載の発酵ブロス。
３７．異種プロモーターが、配列番号１または２から選択される、実施形態３６に記載の発酵ブロス。
３８．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の遺伝的に変更されたＡ．ｎｉｇｅｒオルソログが、突然変異を含む、実施形態３５〜３７のいずれか１つに記載の発酵ブロス。
３９．突然変異がＳＮＰにおけるものである、実施形態３８に記載の発酵ブロス。
４０．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログが、配列番号７の核酸配列を有する、実施形態３８または３９に記載の発酵ブロス。
４１．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質またはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１タンパク質のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログが構成要素であるシグナル伝達カスケード内の１つまたは複数の遺伝子の破壊をさらに含み、１つまたは複数の遺伝子が、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子から選択される、実施形態３５〜４０のいずれか１つに記載の発酵ブロス。
４２．配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の破壊をさらに含む、実施形態３５〜４０のいずれか１つに記載の発酵ブロス。
４３．糸状真菌宿主細胞が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される、実施形態３５〜４２のいずれか１つに記載の発酵ブロス。
４４．糸状真菌宿主細胞が、Ａ．ｎｉｇｅｒまたはその完全世代または不完全世代である、実施形態３５〜４３のいずれか１つに記載の発酵ブロス。
４５．プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ．基本糸状真菌株に対して形態において役割を果たす１つまたは複数の標的遺伝子とプロモーターラダーとを提供するステップであって、前記プロモーターラダーが、基本糸状真菌株において異なる発現プロファイルを示す複数のプロモーターを含む、ステップ；および
ｂ．基本糸状真菌株のゲノムを操作することによって、複数の個々の糸状真菌株の各々の株内にユニークな遺伝的変異が見られる前記複数の個々の糸状真菌株を含む初期プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーを作出するステップであって、前記ユニークな遺伝的変異の各々が、基本糸状真菌株に対する形態において役割を果たす１つまたは複数の標的遺伝子の１つに作動可能に連結されたプロモーターラダーからのプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップ
を含む方法。
４６．プロモーターラダーが、表２に見出されるプロモーターを含む、実施形態４５に記載の方法。
４７．形態において役割を果たす１つまたは複数の標的遺伝子が、破壊を含む、実施形態４５または４６に記載の方法。
４８．破壊が、一塩基多型（ＳＮＰ）、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、欠失および／または挿入である、実施形態４７に記載の方法。
４９．形態において役割を果たす１つまたは複数の標的遺伝子が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログ、配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せである核酸配列を有する遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンから選択される、実施形態４５〜４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．形態において役割を果たす１つまたは複数の標的遺伝子が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、実施形態４５〜４９のいずれか１つに記載の方法。
５１．形態において役割を果たす１つまたは複数の標的遺伝子が、配列番号７により表される遺伝子である、実施形態４５〜５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．糸状真菌株が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される、実施形態４５〜５１のいずれか１つに記載の方法。
５３．糸状真菌株が、Ａ．ｎｉｇｅｒ株である、実施形態４５〜５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法であって、
ａ．基本糸状真菌株に対して形態において役割を果たす複数の標的遺伝子とプロモーターラダーとを提供するステップであって、前記プロモーターラダーが、基本糸状真菌株において異なる発現プロファイルを示す複数のプロモーターを含む、ステップ；
ｂ．基本糸状真菌株のゲノムを操作することによって、複数の個々の糸状真菌株の各々の株内にユニークな遺伝的変異が見られる前記複数の個々の糸状真菌株を含む、初期プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーを作出するステップであって、前記ユニークな遺伝的変異の各々が、基本糸状真菌株に対する形態において役割を果たす標的遺伝子の１つに作動可能に連結されたプロモーターラダーからのプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップ；
ｃ．参照糸状真菌株に対する形態学的表現型改善に関して初期プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの個々の糸状真菌株をスクリーニングおよび選択することによって、形態学的表現型改善を付与するユニークな遺伝的変異を識別するステップ；
ｄ．前記ステップでスクリーニングされた少なくとも２つの個々の糸状真菌株に存在する遺伝的変異からのユニークな遺伝的変異の組合せを各々が含む、その後の複数の糸状真菌マイクローブを提供することによって、その後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーを作出するステップ；
ｅ．参照糸状真菌株に対する形態学的表現型改善に関してその後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの個々の糸状真菌株をスクリーニングおよび選択することによって、追加の形態学的表現型改善を付与する遺伝的変異のユニークな組合せを識別するステップ；および
ｆ．糸状真菌株が、生産糸状真菌株の形態学的表現型と比較して所望のレベルの改善された形態学的表現型を示すまで、線形または非線形的に、ステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各々その後の反復により微生物株の新しいプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーが作出され、新しいライブラリー中の各々の株が、前のライブラリーの少なくとも２つの個々の糸状真菌株の中から選択された遺伝的変異の組合せである遺伝的変異を含む、ステップ
を含む方法。
５５．その後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーが、初期プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの完全なコンビナトリアルライブラリーである、実施形態５４に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
５６．その後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーが、初期プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの完全なコンビナトリアルライブラリーのサブセットである、実施形態５４に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
５７．その後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーが、前記プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの完全なコンビナトリアルライブラリーである、実施形態５４に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
５８．その後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーが、前記プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの完全なコンビナトリアルライブラリーのサブセットである、実施形態５４に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
５９．プロモーターラダーが、表２に見出されるプロモーターを含む、実施形態５４〜５８のいずれか１つに記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
６０．形態において役割を果たす１つまたは複数の標的遺伝子が、破壊を含む、実施形態５４〜５９のいずれか１つに記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
６１．破壊が、ＳＮＰ、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、欠失および／または挿入である、実施形態５４〜６０のいずれか１つに記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
６２．形態において役割を果たす１つまたは複数の標的遺伝子が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログ、配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せである核酸配列を有する遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンから選択される、実施形態５４〜６０のいずれか１つに記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
６３．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログが、配列番号７の配列を含む、実施形態６２に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
６４．糸状真菌株が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される、実施形態５４〜６３のいずれか１つに記載の、生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
６５．糸状真菌株が、Ａ．ｎｉｇｅｒ株である、実施形態５４〜６４のいずれか１つに記載の、生産糸状真菌株の形態学的表現型のためのプロモータースワップ法。
６６．形態学的表現型改善が、液内培養条件下で増殖させると非菌糸体ペレット形態を形成する能力を付与することを含む、実施形態５４〜６５のいずれか１つに記載の、生産糸状真菌株の形態学的表現型のためのプロモータースワップ法。
６７．液内培養条件が、少なくとも１４ｐｐｂのマンガンを含むがキレート剤を含まない培養培地を含む、実施形態６６に記載の、生産糸状真菌株の形態学的表現型のためのプロモータースワップ法。
６８．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の宿主細胞のオルソログの異種改変を含む糸状真菌宿主細胞であって、その改変によって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の改変されたオルソログによりコードされたタンパク質が、異種改変を欠いている親の糸状真菌宿主細胞と比べて活性の低下および／または発現の減少を有する、糸状真菌宿主細胞。
６９．発酵培地において液内培養条件下で増殖させたとき、非菌糸体ペレット形態を有する、実施形態６８に記載の糸状真菌宿主細胞。
７０．異種改変が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のオルソログのための天然プロモーターを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のオルソログを天然プロモーターと比較して弱く発現するプロモーターと置き換えることを含む、実施形態６８または６９に記載の糸状真菌宿主細胞。
７１．異種改変が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のオルソログを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のオルソログの突然変異バージョンと置き換えることを含む、実施形態６８〜７０のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
７２．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のオルソログの突然変異バージョンが、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、実施形態７１に記載の糸状真菌宿主細胞。
７３．異種改変が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のオルソログを選択可能なマーカー遺伝子と置き換えることによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の天然オルソログを糸状真菌宿主細胞のゲノムから除去することを含む、実施形態６８または６９に記載の糸状真菌宿主細胞。
７４．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のオルソログが構成要素である生化学的経路内の１つまたは複数の遺伝子の異種改変をさらに含む、実施形態６８〜７３のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
７５．１つまたは複数の遺伝子が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｓｋ１遺伝子のオルソログ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｓｋ２遺伝子のオルソログ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｙｐｄ１遺伝子のオルソログ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｋｎ７遺伝子のオルソログまたはこれらの任意の組合せから選択される、実施形態７４に記載の糸状真菌宿主細胞。
７６．Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される、実施形態６８または６９に記載の糸状真菌宿主細胞。
７７．Ａ．ｎｉｇｅｒまたはその完全世代または不完全世代である、実施形態６８または６９に記載の糸状真菌宿主細胞。
７８．異種改変が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログのための天然プロモーターを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログを天然プロモーターと比較して弱く発現するプロモーターと置き換えることを含む、実施形態７７に記載の糸状真菌宿主細胞。
７９．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質またはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１タンパク質のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの遺伝子をより弱く発現するプロモーターが、ａｍｙＢプロモーターまたはｍａｎＢプロモーターから選択される、実施形態７８に記載の糸状真菌宿主細胞。
８０．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質またはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１タンパク質のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの遺伝子をより弱く発現するプロモーターが、配列番号１または配列番号２のプロモーターから選択される、実施形態７８に記載の糸状真菌宿主細胞。
８１．異種改変が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの突然変異バージョンと置き換えることを含む、実施形態７７または７８に記載の糸状真菌宿主細胞。
８２．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの突然変異バージョンが、ＳＮＰを含む、実施形態８１に記載の糸状真菌宿主細胞。
８３．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の突然変異Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログが、配列番号７の配列を含む、実施形態８２に記載の糸状真菌宿主細胞。
８４．異種改変が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログを選択可能なマーカー遺伝子と置き換えることによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の天然Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログを糸状真菌宿主細胞のゲノムから除去することを含む、実施形態７７に記載の糸状真菌宿主細胞。
８５．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログが構成要素である生化学的経路内の１つまたは複数の遺伝子の異種改変をさらに含む、実施形態７７に記載の糸状真菌宿主細胞。
８６．１つまたは複数の遺伝子が、配列番号９を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｙｐｄ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログ、配列番号１０を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｓｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログ、配列番号１１もしくは１２を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｋｎ７遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログ、配列番号１３を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｓｋ２遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログまたはこれらの任意の組合せから選択される、実施形態８５に記載の糸状真菌宿主細胞。
８７．配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンから選択される１つまたは複数の遺伝子の破壊をさらに含む、実施形態７７に記載の糸状真菌宿主細胞。
８８．破壊が、１つもしくは複数の遺伝子の天然プロモーターから、天然プロモーターと比較して１つもしくは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターへの置き換え、１つまたは複数の遺伝子から１つもしくは複数の遺伝子の突然変異型への置き換え、１つもしくは複数の遺伝子から選択可能なマーカーへの置き換え、またはこれらの組合せから選択される、実施形態８７に記載の糸状真菌宿主細胞。
８９．天然プロモーターと比較して１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターが、ａｍｙＢプロモーターまたはｍａｎＢプロモーターから選択される、実施形態８８に記載の糸状真菌宿主細胞。
９０．天然プロモーターと比較して１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターが、配列番号１または配列番号２のプロモーターから選択される、実施形態８８に記載の糸状真菌宿主細胞。
９１．１つまたは複数の遺伝子の突然変異型が、配列番号５、６または８から選択される、実施形態８８に記載の糸状真菌宿主細胞。
９２．選択可能なマーカーが、栄養要求性マーカー遺伝子、比色分析用マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、または方向マーカー遺伝子から選択される、実施形態７３、８４または８８に記載の糸状真菌宿主細胞。
９３．比色分析用マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子である、実施形態９２に記載の糸状真菌宿主細胞。
９４．栄養要求性マーカー遺伝子が、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される、実施形態９２に記載の糸状真菌宿主細胞。
９５．方向マーカー遺伝子が、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子または硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）から選択される、実施形態９２に記載の糸状真菌宿主細胞。
９６．抗生物質耐性遺伝子が、ｂｌｅ遺伝子であり、ｂｌｅ遺伝子が、フレオマイシンに対する耐性を付与する、実施形態９２に記載の糸状真菌宿主細胞。
９７．親の株に由来する糸状真菌の変異株であって、変異株の細胞が液内培養条件下で増殖させると親の株の細胞と比較して浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子によりコードされた機能タンパク質の減少した量および／または活性の低い型を産生することになる、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子の遺伝的変更を変異株が有するため、変異株の細胞が、液内培養で増殖させると親の株の細胞と比較して非菌糸体ペレット形成表現型を有する、変異株。
９８．非液内増殖条件下で増殖させると親の株と比較して正常に胞子形成する、実施形態９７に記載の変異株。
９９．糸状真菌が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される、上記実施形態のいずれか１つに記載の変異株。
１００．糸状真菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）またはその完全世代もしくは不完全世代である、上記実施形態のいずれか１つに記載の変異株。
１０１．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子の糸状真菌オルソログである、上記実施形態のいずれか１つに記載の変異株。
１０２．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、実施形態１００に記載の変異株。
１０３．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子から選択される、実施形態１００に記載の変異株。
１０４．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＬＮ１遺伝子またはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、実施形態１００に記載の変異株。
１０５．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログが、配列番号７の核酸配列の非ＳＮＰ含有バージョンである、実施形態１０４に記載の変異株。
１０６．遺伝的変更が、１つもしくは複数の遺伝子の天然プロモーターから、天然プロモーターと比較して１つもしくは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターへの置き換え、１つまたは複数の遺伝子から１つもしくは複数の遺伝子の突然変異型への置き換え、１つもしくは複数の遺伝子から選択可能なマーカーへの置き換え、またはこれらの組合せから選択される、上記実施形態のいずれか１つに記載の変異株。
１０７．天然プロモーターと比較して１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターが、ａｍｙＢプロモーターまたはｍａｎＢプロモーターから選択される、実施形態１０６に記載の変異株。
１０８．天然プロモーターと比較して１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターが、配列番号１もしくは配列番号２から選択される核酸配列を含むか、それから実質的になるか、またはそれからなる、実施形態１０６または１０７に記載の変異株。
１０９．選択可能なマーカーが、栄養要求性マーカー遺伝子、比色分析用マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、または方向マーカー遺伝子から選択される、実施形態１０６に記載の変異株。
１１０．比色分析用マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子である、実施形態１０９に記載の変異株。
１１１．栄養要求性マーカー遺伝子が、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される、実施形態１０９に記載の変異株。
１１２．方向マーカー遺伝子が、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子または硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）から選択される、実施形態１０９に記載の変異株。
１１３．抗生物質耐性遺伝子が、ｂｌｅ遺伝子であり、ｂｌｅ遺伝子が、フレオマイシンに対する耐性を付与する、実施形態１０９に記載の変異株。
１１４．浸透圧ストレス応答経路の１つまたは複数の遺伝子の突然変異型が、一塩基多型を含む、実施形態１０６に記載の変異株。
１１５．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子の突然変異型が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログであり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの突然変異型が、配列番号７の核酸配列である、実施形態１１４に記載の変異株。
１１６．配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンから選択される１つまたは複数の遺伝子の遺伝的変更をさらに含む、上記実施形態のいずれか１つに記載の変異株。
１１７．遺伝的変更が、１つもしくは複数の遺伝子の天然プロモーターから、天然プロモーターと比較して１つもしくは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターへの置き換え、１つまたは複数の遺伝子から１つもしくは複数の遺伝子の突然変異型への置き換え、１つもしくは複数の遺伝子から選択可能なマーカーへの置き換え、またはこれらの組合せから選択される、実施形態１１６に記載の変異株。
１１８．天然プロモーターと比較して１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターが、ａｍｙＢプロモーターまたはｍａｎＢプロモーターから選択される、実施形態１１７に記載の変異株。
１１９．天然プロモーターと比較して１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターが、配列番号１もしくは配列番号２から選択される核酸配列を含むか、それから実質的になるか、またはそれからなる、実施形態１１７または１１８に記載の変異株。
１２０．選択可能なマーカーが、栄養要求性マーカー遺伝子、比色分析用マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、または方向マーカー遺伝子から選択される、実施形態１１７に記載の変異株。
１２１．比色分析用マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子である、実施形態１２０に記載の変異株。
１２２．栄養要求性マーカー遺伝子が、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される、実施形態１２０に記載の変異株。
１２３．方向マーカー遺伝子が、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子または硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）から選択される、実施形態１２０に記載の変異株。
１２４．抗生物質耐性遺伝子が、ｂｌｅ遺伝子であり、ｂｌｅ遺伝子が、フレオマイシンに対する耐性を付与する、実施形態１２０に記載の変異株。
１２５．１つまたは複数の遺伝子の突然変異型が、一塩基多型を含む、実施形態１１７に記載の変異株。
１２６．１つまたは複数の遺伝子の突然変異型が、配列番号５、６または８から選択される核酸配列である、実施形態１２５に記載の変異株。
１２７．宿主細胞の形態を調節する遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む糸状真菌宿主細胞であって、プロモーターが、遺伝子にとって異種であり、プロモーターが、配列番号１〜４からなる群から選択される核酸配列を有する、糸状真菌宿主細胞。
１２８．発酵培地において液内培養条件下で増殖させたとき、宿主細胞の形態を調節する遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを有さない参照糸状真菌宿主細胞と比較して、非菌糸体ペレット形態を有する、実施形態１２７に記載の糸状真菌宿主細胞。
１２９．発酵培地が、少なくとも１４ｐｐｂのマンガンを含む、実施形態１２８に記載の糸状真菌宿主細胞。
１３０．発酵培地が、キレート剤を含まない、実施形態１２７または１２８に記載の糸状真菌宿主細胞。
１３１．宿主細胞の形態を調節する遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを有さない参照糸状真菌宿主細胞により産生される量と少なくとも同等である量の目的の生成物を産生する、実施形態１２７〜１３０のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
１３２．目的の生成物が、クエン酸、または目的の酵素である、実施形態１３１に記載の糸状真菌宿主細胞。
１３３．形態を調節する遺伝子が、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子、配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せである核酸配列を有する遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンから選択される、実施形態１２７〜１３２のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
１３４．形態を調節する遺伝子が、遺伝子の野生型または突然変異型である、実施形態１２７〜１３３のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
１３５．Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される、実施形態１２７〜１３４のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
１３６．Ａ．ｎｉｇｅｒまたはその完全世代または不完全世代である、実施形態１２７〜１３５のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
１３７．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子の糸状真菌オルソログである、実施形態１３３〜１３６のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
１３８．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、実施形態１３６に記載の糸状真菌宿主細胞。
１３９．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子から選択される、実施形態１３６に記載の糸状真菌宿主細胞。
１４０．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、実施形態１３６に記載の糸状真菌宿主細胞。
１４１．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログが、配列番号７の核酸配列の非ＳＮＰ含有バージョンである、実施形態１４０に記載の糸状真菌宿主細胞。
１４２．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログが、配列番号７の核酸配列である、実施形態１４０に記載の糸状真菌宿主細胞。
１４３．プロモーターが、配列番号１または２の核酸配列から選択される、実施形態１２７〜１４２のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
１４４．宿主細胞の浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子の異種改変を含む糸状真菌宿主細胞であって、改変された１つまたは複数の遺伝子によりコードされたタンパク質が、宿主細胞の浸透圧応答経路の改変された１つまたは複数の遺伝子を欠いている親の糸状真菌宿主細胞と比べて活性の低下および／または発現の減少を有する、糸状真菌宿主細胞。
１４５．発酵培地において液内培養条件下で増殖させたとき、非菌糸体ペレット形態を有する、実施形態１４４に記載の糸状真菌宿主細胞。
１４６．Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される、実施形態１４４または１４５に記載の糸状真菌宿主細胞。
１４７．Ａ．ｎｉｇｅｒまたはその完全世代または不完全世代である、実施形態１４４または１４５に記載の糸状真菌宿主細胞。
１４８．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路の糸状真菌オルソログである、実施形態１４４〜１４７のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
１４９．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、実施形態１４７に記載の糸状真菌宿主細胞。
１５０．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子から選択される、実施形態１４７に記載の糸状真菌宿主細胞。
１５１．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、実施形態１４７に記載の糸状真菌宿主細胞。
１５２．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログが、配列番号７の核酸配列の非ＳＮＰ含有バージョンである、実施形態１５１に記載の糸状真菌宿主細胞。
１５３．異種改変が、１つもしくは複数の遺伝子の天然プロモーターから、天然プロモーターと比較して１つもしくは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターへの置き換え、１つまたは複数の遺伝子から１つもしくは複数の遺伝子の突然変異型への置き換え、１つもしくは複数の遺伝子から選択可能なマーカーへの置き換え、またはこれらの組合せから選択される、実施形態１４４〜１５２に記載のいずれか１つの糸状真菌宿主細胞。
１５４．天然プロモーターと比較して１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターが、ａｍｙＢプロモーターまたはｍａｎＢプロモーターから選択される、実施形態１５３に記載の糸状真菌宿主細胞。
１５５．天然プロモーターと比較して１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターが、配列番号１もしくは配列番号２から選択される核酸配列を含むか、それから実質的になるか、またはそれからなる、実施形態１５３または１５４に記載の糸状真菌宿主細胞。
１５６．選択可能なマーカーが、栄養要求性マーカー遺伝子、比色分析用マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、または方向マーカー遺伝子から選択される、実施形態１５３に記載の糸状真菌宿主細胞。
１５７．比色分析用マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子である、実施形態１５６に記載の糸状真菌宿主細胞。
１５８．栄養要求性マーカー遺伝子が、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される、実施形態１５６に記載の糸状真菌宿主細胞。
１５９．方向マーカー遺伝子が、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子または硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）から選択される、実施形態１５６に記載の糸状真菌宿主細胞。
１６０．抗生物質耐性遺伝子が、ｂｌｅ遺伝子であり、ｂｌｅ遺伝子が、フレオマイシンに対する耐性を付与する、実施形態１５６に記載の糸状真菌宿主細胞。
１６１．浸透圧ストレス応答経路の１つまたは複数の遺伝子の突然変異型が、一塩基多型を含む、実施形態１５３に記載の糸状真菌宿主細胞。
１６２．浸透圧ストレス経路の１つまたは複数の遺伝子が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログであり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログの突然変異型が、配列番号７の核酸配列である、実施形態１６１に記載の糸状真菌宿主細胞。
１６３．配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンから選択される１つまたは複数の遺伝子の遺伝的変更をさらに含む、実施形態１４４〜１６２のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
１６４．遺伝的変更が、１つもしくは複数の遺伝子の天然プロモーターから、天然プロモーターと比較して１つもしくは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターへの置き換え、１つもしくは複数の遺伝子から１つもしくは複数の遺伝子の突然変異型への置き換え、１つもしくは複数の遺伝子から選択可能なマーカーへの置き換え、またはこれらの組合せから選択される、実施形態１６３に記載の糸状真菌宿主細胞。
１６５．天然プロモーターと比較して１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターが、ａｍｙＢプロモーターまたはｍａｎＢプロモーターから選択される、実施形態１６４に記載の糸状真菌宿主細胞。
１６６．天然プロモーターと比較して１つまたは複数の遺伝子を弱く発現するプロモーターが、配列番号１もしくは配列番号２から選択される核酸配列を含むか、それから実質的になるか、またはそれからなる、実施形態１６４または１６５に記載の糸状真菌宿主細胞。
１６７．選択可能なマーカーが、栄養要求性マーカー遺伝子、比色分析用マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、または方向マーカー遺伝子から選択される、実施形態１６４に記載の糸状真菌宿主細胞。
１６８．比色分析用マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子である、実施形態１６７に記載の糸状真菌宿主細胞。
１６９．栄養要求性マーカー遺伝子が、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される、実施形態１６７に記載の糸状真菌宿主細胞。
１７０．方向マーカー遺伝子が、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子または硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）から選択される、実施形態１６７に記載の糸状真菌宿主細胞。
１７１．抗生物質耐性遺伝子が、ｂｌｅ遺伝子であり、ｂｌｅ遺伝子が、フレオマイシンに対する耐性を付与する、実施形態１６７に記載の糸状真菌宿主細胞。
１７２．１つまたは複数の遺伝子の突然変異型が、一塩基多型を含む、実施形態１６４に記載の糸状真菌宿主細胞。
１７３．１つまたは複数の遺伝子の突然変異型が、配列番号５、６または８から選択される核酸配列である、実施形態１７２に記載の糸状真菌宿主細胞。
１７４．少なくとも１４ｐｐｂのマンガンと、非菌糸体ペレット表現型を含む糸状真菌細胞とを含む、発酵ブロスであって、ブロスがキレート剤を含まず、糸状真菌細胞が、糸状真菌細胞の浸透圧応答経路からの１つまたは複数の遺伝的に変更された遺伝子を含む、発酵ブロス。
１７５．浸透圧応答経路からの１つまたは複数の遺伝的に変更された遺伝子が、異種プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態１７４に記載の発酵ブロス。
１７６．異種プロモーターが、配列番号１または２から選択される、実施形態１７５に記載の発酵ブロス。
１７７．浸透圧応答経路からの１つまたは複数の遺伝的に変更された遺伝子が、突然変異を含む、実施形態１７４〜１７６のいずれか１つに記載の発酵ブロス。
１７８．突然変異がＳＮＰにおけるものである、実施形態１７７に記載の発酵ブロス。
１７９．糸状真菌宿主細胞が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される、実施形態１７４〜１７８のいずれか１つに記載の発酵ブロス。
１８０．糸状真菌宿主細胞が、Ａ．ｎｉｇｅｒまたはその完全世代または不完全世代である、実施形態１７４〜１７８のいずれか１つに記載の発酵ブロス。
１８１．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝的に変更された遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子の遺伝的に変更された糸状真菌オルソログである、実施形態１７４〜１８０のいずれか１つに記載の発酵ブロス。
１８２．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝的に変更された遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子の遺伝的に変更されたＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、実施形態１８０に記載の発酵ブロス。
１８３．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝的に変更された遺伝子が、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せから選択される核酸配列を有する遺伝子の遺伝的に変更された型である、実施形態１８０に記載の発酵ブロス。
１８４．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝的に変更された遺伝子が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の遺伝的に変更されたＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、実施形態１８０に記載の発酵ブロス。
１８５．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子の遺伝的に変更されたＡ．ｎｉｇｅｒオルソログが、配列番号７の核酸配列を有する遺伝子である、実施形態１８４に記載の発酵ブロス。
１８６．プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ．基本糸状真菌株に対して形態において役割を果たす１つまたは複数の標的遺伝子とプロモーターラダーとを供給するステップであって、前記プロモーターラダーが、基本糸状真菌株において異なる発現プロファイルを示す複数のプロモーターを含む、ステップ；および
ｂ．基本糸状真菌株のゲノムを操作することによって、複数の個々の糸状真菌株の各々の株内にユニークな遺伝的変異が見られる前記複数の個々の糸状真菌株を含む、初期プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーを作出するステップであって、前記ユニークな遺伝的変異の各々が、基本糸状真菌株に対する浸透圧ストレス応答において役割を果たす１つまたは複数の標的遺伝子の１つに作動可能に連結されたプロモーターラダーからのプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップ
を含む、方法。
１８７．プロモーターラダーが、表２に見出されるプロモーターを含む、実施形態１８６に記載の方法。
１８８．形態において役割を果たす１つまたは複数の標的遺伝子が、破壊を含む、実施形態１８６または１８７に記載の方法。
１８９．破壊が、ＳＮＰ、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、欠失および／または挿入である、実施形態１８８に記載の方法。
１９０．形態において役割を果たす１つまたは複数の標的遺伝子が、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子、配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せである核酸配列を有する遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンから選択される、実施形態１８６〜１８９のいずれか１つに記載の方法。
１９１．糸状真菌宿主細胞が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される、実施形態１８０〜１９０のいずれか１つに記載の方法。
１９２．糸状真菌宿主細胞が、Ａ．ｎｉｇｅｒまたはその完全世代または不完全世代である、実施形態１８０〜１９０のいずれか１つに記載の方法。
１９３．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子の糸状真菌オルソログである、実施形態１９０〜１９２のいずれか１つに記載の方法。
１９４．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、実施形態１９２に記載の方法。
１９５．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子から選択される、実施形態１９２に記載の方法。
１９６．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、実施形態１９２に記載の方法。
１９７．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログが、配列番号７の核酸配列の非ＳＮＰ含有バージョンである、実施形態１９６に記載の方法。
１９８．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログが、配列番号７の核酸配列である、実施形態１９２に記載の方法。
１９９．生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法であって、
ａ．基本糸状真菌株に対して形態において役割を果たす複数の標的遺伝子とプロモーターラダーとを供給するステップであって、前記プロモーターラダーが、基本糸状真菌株において異なる発現プロファイルを示す複数のプロモーターを含む、ステップ；
ｂ．基本糸状真菌株のゲノムを操作することによって、複数の個々の糸状真菌株の各々の株内にユニークな遺伝的変異が見られる前記複数の個々の糸状真菌株を含む、初期プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーを作出するステップであって、前記ユニークな遺伝的変異の各々が、基本糸状真菌株に対する形態において役割を果たす複数の標的遺伝子の１つに作動可能に連結されたプロモーターラダーからのプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップ；
ｃ．参照糸状真菌株に対する形態学的表現型改善に関して初期プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの個々の糸状真菌株をスクリーニングおよび選択することによって、形態学的表現型改善を付与するユニークな遺伝的変異を識別するステップ；
ｄ．前記ステップでスクリーニングされた少なくとも２つの個々の糸状真菌株に存在する遺伝的変異からのユニークな遺伝的変異の組合せを各々が含む、その後の複数の糸状真菌マイクローブを提供することによって、その後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーを作出するステップ；
ｅ．参照糸状真菌株に対する形態学的表現型改善に関してその後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの個々の糸状真菌株をスクリーニングおよび選択することによって、追加の形態学的表現型改善を付与する遺伝的変異のユニークな組合せを識別するステップ；および
ｆ．糸状真菌株が、生産糸状真菌株の形態学的表現型と比較して所望のレベルの改善された形態学的表現型を示すまで、線形または非線形的に、ステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各々その後の反復により微生物株の新しいプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーが作出され、新しいライブラリー中の各々の株が、前のライブラリーの少なくとも２つの個々の糸状真菌株の中から選択された遺伝的変異の組合せである遺伝的変異を含む、ステップ
を含む方法。
２００．その後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーが、初期プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの完全なコンビナトリアルライブラリーである、実施形態１９９に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
２０１．その後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーが、初期プロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの完全なコンビナトリアルライブラリーのサブセットである、実施形態１９９に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
２０２．その後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーが、前のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの完全なコンビナトリアルライブラリーである、実施形態１９９に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
２０３．その後のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーが、前のプロモータースワップ糸状真菌株ライブラリーの完全なコンビナトリアルライブラリーのサブセットである、実施形態１９９に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
２０４．プロモーターラダーが、表２に見出されるプロモーターを含む、実施形態１９９〜２０３のいずれか１つに記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
２０５．形態において役割を果たす１つまたは複数の標的遺伝子が、破壊を含む、実施形態１９９〜２０４のいずれか１つに記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
２０６．破壊が、ＳＮＰ、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、欠失および／または挿入である、実施形態１９９〜２０５のいずれか１つに記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
２０７．形態において役割を果たす１つまたは複数の標的遺伝子が、浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子、配列番号５、６、８またはこれらの任意の組合せである核酸配列を有する遺伝子の非ＳＮＰ含有バージョンから選択される、実施形態１９９〜２０５のいずれか１つに記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
２０８．糸状真菌宿主細胞が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはそれらの完全世代もしくは不完全世代およびシノニムもしくは分類学的同等物から選択される、実施形態１９９〜２０７のいずれか１つに記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
２０９．糸状真菌宿主細胞が、Ａ．ｎｉｇｅｒまたはその完全世代もしくは不完全世代である、実施形態１９９〜２０７のいずれか１つに記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
２１０．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子の糸状真菌オルソログである、実施形態２０７〜２０９のいずれか１つに記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
２１１．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、表７に見出される酵母浸透圧応答経路遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、実施形態２０９に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
２１２．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、配列番号９、１０、１１、１２、１３またはこれらの任意の組合せの核酸配列を有する遺伝子から選択される、実施形態２０９に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
２１３．浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログである、実施形態２０９に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
２１４．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログが、配列番号７の核酸配列の非ＳＮＰ含有バージョンである、実施形態２１３に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
２１５．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  ｎｉｋ１遺伝子のＡ．ｎｉｇｅｒオルソログが、配列番号７の核酸配列である、実施形態２１３に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型を改善するためのプロモータースワップ法。
２１６．形態学的表現型改善が、液内培養条件下で増殖させると非菌糸体ペレット形態を形成する能力を付与することを含む、実施形態１９９〜２１５のいずれか１つに記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型のためのプロモータースワップ法。
２１７．液内培養条件が、少なくとも１４ｐｐｂのマンガンを含むがキレート剤を含まない培養培地を含む、実施形態２１６に記載の生産糸状真菌株の形態学的表現型のためのプロモータースワップ法。
２１８．液内培養条件下で増殖させたとき、変異株により産生されるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質またはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１タンパク質の機能的Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログの量が、親の株の細胞により産生されるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質またはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１タンパク質の機能的Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログの量と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％減少される、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の変異株。
２１９．変異株および／または親の株により産生されるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質またはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１タンパク質の機能的Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログの量が、定量的質量分析またはイムノアッセイを使用して測定され、イムノアッセイが、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ、ＥＬＩＳＡまたは定量的ウェスタンブロット解析から選択される、実施形態１〜２３または２１８のいずれか１つに記載の変異株。
２２０．液内培養条件下で増殖させたとき、変異株により産生されるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質またはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１タンパク質の機能的Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログの活性が、親の株の細胞により産生されるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質またはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１タンパク質の機能的Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログの活性と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％低下される、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の変異株。
２２１．変異株および／または親の株により産生されるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１タンパク質またはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１タンパク質の機能的Ａ．ｎｉｇｅｒオルソログの活性が、キナーゼアッセイを使用して測定される、実施形態１〜２３または２２０のいずれか１つに記載の変異株。
２２２．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１遺伝子の改変オルソログによりコードされたタンパク質の発現が、異種改変を欠いている親の糸状真菌宿主細胞におけるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１遺伝子のオルソログによりコードされたタンパク質の発現と比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％減少される、実施形態６８〜９６のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
２２３．糸状真菌宿主細胞および／または異種改変を欠いている親の糸状真菌宿主細胞における、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子もしくはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１遺伝子の改変オルソログまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子もしくはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１遺伝子のオルソログによりコードされたタンパク質の発現が、定量的質量分析またはイムノアッセイを使用して測定され、イムノアッセイが、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ、ＥＬＩＳＡまたは定量的ウェスタンブロット解析から選択される、実施形態６８〜９６または２２２のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
２２４．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１遺伝子の改変オルソログによりコードされたタンパク質の活性が、異種改変を欠いている親の糸状真菌宿主細胞におけるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子またはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１遺伝子のオルソログによりコードされたタンパク質の活性と比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％低下される、実施形態６８〜９６のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
２２５．糸状真菌宿主細胞および／または異種改変を欠いている親の糸状真菌宿主細胞における、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子もしくはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１遺伝子の改変オルソログまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＬＮ１遺伝子もしくはＮ．ｃｒａｓｓａ  Ｎｉｋ１遺伝子のオルソログによりコードされたタンパク質の活性が、キナーゼアッセイを使用して測定される、実施形態６８〜９６または２２４のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
２２６．液内培養条件下で増殖させたとき、変異株により産生される浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子によりコードされた機能タンパク質の量が、親の株により産生される浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子によりコードされた機能タンパク質の量と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％減少される、実施形態９７〜１２６のいずれか１つに記載の変異株。
２２７．変異株および／または親の株により産生される浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子によりコードされた機能タンパク質の量が、定量的質量分析またはイムノアッセイを使用して測定され、イムノアッセイが、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ、ＥＬＩＳＡまたは定量的ウェスタンブロット解析から選択される、実施形態９７〜１２６または２２６のいずれか１つに記載の変異株。
２２８．液内培養条件下で増殖させたとき、変異株により産生される浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子によりコードされた機能タンパク質の活性が、親の株により産生される浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子によりコードされた機能タンパク質の活性と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％低下される、実施形態９７〜１２６のいずれか１つに記載の変異株。
２２９．変異株および／または親の株により産生される浸透圧応答経路の１つまたは複数の遺伝子によりコードされた機能タンパク質の活性が、キナーゼアッセイを使用して測定される、実施形態９７〜１２６または２２８のいずれか１つに記載の変異株。
２３０．改変された１つまたは複数の遺伝子によりコードされたタンパク質の発現が、宿主細胞の浸透圧応答経路の改変された１つまたは複数の遺伝子を欠いている親の糸状真菌宿主細胞における改変された１つまたは複数の遺伝子によりコードされたタンパク質の発現と比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％減少される、実施形態１４４〜１７３のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
２３１．糸状真菌宿主細胞、および／または宿主細胞の浸透圧応答経路の改変された１つもしくは複数の遺伝子を欠いている親の糸状真菌宿主細胞における、改変された１つまたは複数の遺伝子によりコードされたタンパク質の発現が、定量的質量分析またはイムノアッセイを使用して測定され、イムノアッセイが、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ、ＥＬＩＳＡまたは定量的ウェスタンブロット解析から選択される、実施形態１４４〜１７３または２３０のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
２３２．改変された１つまたは複数の遺伝子によりコードされたタンパク質の活性が、宿主細胞の浸透圧応答経路の改変された１つまたは複数の遺伝子を欠いている親の糸状真菌宿主細胞における改変された１つまたは複数の遺伝子によりコードされたタンパク質の活性と比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％低下される、実施形態１４４〜１７３のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
２３３．糸状真菌宿主細胞、および／または宿主細胞の浸透圧応答経路の改変された１つもしくは複数の遺伝子を欠いている親の糸状真菌宿主細胞における、改変された１つまたは複数の遺伝子によりコードされたタンパク質の活性が、キナーゼ活性を使用して測定される、実施形態１４４〜１７３または２３２のいずれか１つに記載の糸状真菌宿主細胞。
【表８−１】
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【表８−２】
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【表８−３】
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【表８−４】
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【表８−５】
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参照による組込み
【０３０１】
本明細書で引用される全ての参考文献、論文、出版物、特許、特許公報および特許出願は、全ての目的についてその全体を参照により組み込む。
【０３０２】
しかしながら、本明細書で引用される任意の参考文献、論文、出版物、特許、特許公報および特許出願の言及は、それらが世界のいずれかの国において正当な先行技術を構成するか、または共通の一般的知識の部分を形成するという承認または任意の形態の示唆ではなく、そのように解釈されるべきではない。
【０３０３】
加えて、以下の特定の出願は、参照により本明細書に組み込む：２０１６年１２月３０日出願の米国出願第１５／３９６，２３０号（米国公開公報第２０１７／０１５９０４５  Ａ１号）；２０１６年１２月７日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５４６５（ＷＯ  ２０１７／１００３７７  Ａ１）；２０１６年４月２７日出願の米国出願第１５／１４０，２９６号（ＵＳ２０１７／０３１６３５３  Ａ１）；２０１７年４月２６日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２９７２５（ＷＯ  ２０１７／１８９７８４  Ａ１）；２０１６年１２月７日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５４６４（ＷＯ  ２０１７／１００３７６  Ａ２）；２０１６年１２月７日出願の米国仮出願第６２／４３１，４０９号；２０１５年１２月７日出願の米国仮出願第６２／２６４，２３２号；および２０１６年７月２９日出願の米国仮出願第６２／３６８，７８６号。加えて、以下の特定の出願は、参照により本明細書に組み込む：２０１７年１２月２９日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６９０８６（ＷＯ  ２０１８／１２６０７）；２０１８年６月６日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３６３６０（ＷＯ  ２０１８／２２６９００）；２０１６年１２月３０日出願の米国仮出願第６２／４４１，０４０号および２０１７年６月６日出願の米国仮出願第６２／５１５，９０７号。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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