(57)【要約】  本発明は、ロッキングドメインによって安定化された新規ナノ粒子提示ワクチン組成物を提供する。ＨＩＶ−１およびエボラウイルス免疫原のようなウイルス免疫原ならびに細菌、寄生生物および哺乳類種に由来する免疫原のような非ウイルス免疫原を含む種々の免疫原がワクチン組成物の製造において使用されうる。本発明はまた、種々の治療用途における、例えばウイルス感染の予防または治療のための、そのようなワクチン組成物の使用方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己組織化ナノ粒子の表面上に提示されたポリペプチド免疫原を含むワクチン組成物であって、ロッキングドメインがナノ粒子の内部に包埋されており、自己組織化ナノ粒子のサブユニットに連結されており、ロッキングドメインが、界面における非共有相互作用により溶液中の近くのナノ粒子サブユニットに結合した別のロッキングドメインと二量体を自然に形成しうるタンパク質サブユニットである、ワクチン組成物。
【請求項２】
ロッキングドメインが、別の同一タンパク質ドメインとホモ二量体を形成するタンパク質ドメインである、請求項１記載のワクチン組成物。
【請求項３】
ロッキングドメインのサブユニットが、配列番号１〜９のいずれか１つに示されているアミノ酸配列、その保存的修飾変異体または実質的に同一の配列を含む、請求項２記載のワクチン組成物。
【請求項４】
ロッキングドメインがナノ粒子のサブユニットに共有結合している、請求項１記載のワクチン組成物。
【請求項５】
ロッキングドメインのＮ末端がリンカー配列を介してナノ粒子サブユニットのＣ末端に融合している、請求項４記載のワクチン組成物。
【請求項６】
汎反応性Ｔ細胞エピトープを更に含む、請求項１記載のワクチン組成物。
【請求項７】
Ｔ細胞エピトープのＮ末端がロッキングドメインのＣ末端に融合している、請求項６記載のワクチン組成物。
【請求項８】
ワクチン組成物が、免疫原とナノ粒子サブユニットとの間に挿入されたネック領域を更に含み、ネック領域が、ナノ粒子の表面から更に遠くへ免疫原を上昇させる３ヘリックスタンパク質ドメインを含む、請求項１記載のワクチン組成物。
【請求項９】
ワクチン組成物が、免疫原とナノ粒子サブユニットとの間に挿入されたタンパク質ドメインを更に含み、タンパク質ドメインが免疫原ポリペプチドを安定化させる、請求項１記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
ナノ粒子が、回転対称性を有する球形のナノ粒子である、請求項１記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
回転対称性が３回軸および／または５回軸を有する、請求項１１記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
ナノ粒子が二十面体構造のものである、請求項１１記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
ポリペプチド免疫原がウイルス免疫原である、請求項１記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
ポリペプチド免疫原が、クラスＩ融合メカニズムを利用するウイルスからのウイルス免疫原である、請求項１３記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
ウイルスが、ＨＩＶ−１ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、アレナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）およびコロナウイルスからなる群から選択される、請求項１４記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
ポリペプチド免疫原が、クラスＩＩ融合メカニズムを利用するウイルスからのウイルス免疫原である、請求項１３記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
ウイルスがＨＣＶまたはジカウイルスである、請求項１６記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
ポリペプチド免疫原が非ウイルス免疫原である、請求項１３記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
ポリペプチド免疫原が、熱帯熱マラリア原虫［プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）］由来の抗原、結核菌［マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）］（ＴＢ）由来の抗原またはヒトタンパク質プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）である、請求項１８記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
ポリペプチド免疫原がＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来三量体タンパク質である、請求項１記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
ロッキングドメインのＮ末端が、ＧＧＧＧＳ（配列番号１７）のタンデムコピーの１以上を含むリンカー配列を介してナノ粒子サブユニットのＣ末端に融合している、請求項２０記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
汎反応性Ｔ細胞エピトープを更に含む、請求項２０記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
Ｔ細胞エピトープのＮ末端がロッキングドメインのＣ末端に融合している、請求項２２記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
Ｔ細胞エピトープが配列ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号１８）を含む、請求項２２記載のワクチン組成物。
【請求項２５】
ＨＩＶ−１三量体タンパク質のサブユニットのＣ末端がナノ粒子のサブユニットのＮ末端に共有結合している、請求項２０記載のワクチン組成物。
【請求項２６】
ＨＩＶ−１三量体タンパク質サブユニットがリンカー配列を介してナノ粒子サブユニットに融合している、請求項２０記載のワクチン組成物。
【請求項２７】
リンカー配列が配列（ＧａＳｂ）ｎ（ここで、ａは１〜５の整数であり、ｂは１〜２の整数であり、ｎは１〜５の整数である）を含む、請求項２６記載のワクチン組成物。
【請求項２８】
自己組織化ナノ粒子が三量体配列を含む、請求項２０記載のワクチン組成物。
【請求項２９】
自己組織化ナノ粒子のサブユニットが、配列番号２１（Ｅ２ｐ）、配列番号２２（Ｉ３−０１）、配列番号２５（Ｉ３−０１変異体）もしくは配列番号２６（フェリチン）に示されているポリペプチド、その保存的修飾変異体または実質的に同一の配列を含む、請求項２０記載のワクチン組成物。
【請求項３０】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来三量体タンパク質がｇｐ１４０に由来する、請求項２０記載のワクチン組成物。
【請求項３１】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来三量体タンパク質が未切断融合前最適化（ＵＦＯ）ｇｐ１４０三量体である、請求項２０記載のワクチン組成物。
【請求項３２】
ＵＦＯ  ｇｐ１４０三量体が、ＨＩＶ−１株ＢＧ５０５からの修飾ｇｐ４１ＥＣＴＯドメインを含むキメラ三量体である、請求項３１記載のワクチン組成物。
【請求項３３】
ＵＦＯ  ｇｐ１４０三量体のサブユニットが、配列番号２３に示されている配列、その保存的修飾変異体または実質的に同一の配列を含む、請求項３１記載のワクチン組成物。
【請求項３４】
配列番号２３に示されているＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来ＵＦＯ  ｇｐ１４０三量体サブユニット、配列番号２１（Ｅ２ｐ）に示されている自己組織化ナノ粒子サブユニット、配列番号１（ＬＤ４）に示されているロッキングドメインおよびＴ細胞エピトープＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号１８）を、Ｎ末端からＣ末端への方向に含むサブユニット配列を有する、請求項３１記載のワクチン組成物。
【請求項３５】
ｇｐ１４０三量体サブユニットとナノ粒子サブユニットとの間の第１リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号２４）、および／またはナノ粒子サブユニットとロッキングドメインとの間の第２リンカー配列ＧＧＧＧＳ（配列番号１７）を更に含む、請求項３４記載のワクチン組成物。
【請求項３６】
配列番号２３に示されているＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来ＵＦＯ  ｇｐ１４０三量体サブユニット、配列番号２２または２５（Ｉ３−０１）に示されている自己組織化ナノ粒子サブユニット、配列番号２（ＬＤ７）に示されているロッキングドメインおよびＴ細胞エピトープＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号１８）を、Ｎ末端からＣ末端への方向に含むサブユニット配列を有する、請求項３１記載のワクチン組成物。
【請求項３７】
ｇｐ１４０三量体サブユニットとナノ粒子サブユニットとの間の第１リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号２４）、および／またはナノ粒子サブユニットとロッキングドメインとの間の第２リンカー配列ＧＧＧＧＳ（配列番号１７）を更に含む、請求項３６記載のワクチン組成物。
【請求項３８】
請求項１記載のワクチン組成物と薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項３９】
Ｎ末端の免疫原ポリペプチド、自己組織化ナノ粒子サブユニットおよびロッキングドメインのサブユニットを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ロッキングドメインが、界面における非共有相互作用により溶液中の近くのナノ粒子サブユニットに結合した別のロッキングドメインと二量体を自然に形成しうるタンパク質サブユニットである、ポリヌクレオチド。
【請求項４０】
請求項２０記載のＨＩＶ−１ワクチン組成物の治療的有効量を含む医薬組成物を対象に投与し、それにより、対象におけるＨＩＶ−１感染を治療または予防することを含む、対象におけるＨＩＶ−１感染の治療または予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規構造成分を含有するナノ粒子ワクチンに関する。
【０００２】
関連出願に対する相互参照
本特許出願は米国仮特許出願第６２／６８４，２２９号（２０１８年６月１３日付け出願；現在係属中）に基づく優先権の利益を主張するものである。該優先権出願の全開示の全体をあらゆる目的で参照により本明細書に組み入れることとする。
【０００３】
米国政府の援助に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により授与された助成金番号Ｒ０１  ＡＩ１２９６９８−０２およびＲ５６  ＡＩ１２５０７８−０１に基づく米国政府の援助によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
ウイルスのような種々の病原体の感染に対処するためのワクチンの設計において相当な進歩がもたらされている。ＨＩＶ−１ワクチン分野において最近確立された新規技術および合理的なワクチン設計戦略は他のウイルス病原体および非ウイルス性疾患標的に対するワクチン開発のための可能な解決策を提供する。合理的なワクチン設計戦略は、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）の特定、ｂＮＡｂ−抗原複合体の構造解析、ならびに構造に基づく免疫原の設計および試験からなる。免疫原の設計に関しては、幾つかのウイルスのエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質の安定化および再設計において、ならびにウイルス様粒子（ＶＬＰ）または類似形状のナノ粒子上の最適化Ｅｎｖタンパク質の多価提示において、飛躍的進歩が見られる。ＶＬＰは、そのサイズが大きく、表面抗原が高密度で提示されるため、強力で長期持続性の免疫応答を誘導しうる。ＶＬＰは、成功を収めた同族ウイルス用ワクチン（ヒトパピローマウイルスに対するＧａｒｄａｓｉｌ（登録商標））として、または外来抗原のための担体として開発されている。Ｂ細胞活性化のための最適抗原間隔は、少なくとも２０〜２５個のエピトープが５〜１０ｎｍの間隔で隔てられたものであると決定されている。したがって、有効なＶＬＰ型ワクチンの開発のために多様な抗原が提示されるように、ＶＬＰの分子特性（球形、１０〜１００ナノメートルなど）を有する自己組織化（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ、自己集合性）ナノ粒子が再設計されうる。
【０００５】
幾つかのウイルスに関するＥｎｖタンパク質の安定化および再設計において、著しい進歩がもたらされている。例えば、ｂＮＡｂおよびＥｎｖの構造に関して蓄積された情報の豊富さゆえに、ＨＩＶ−１ワクチンの研究は、現在、抗原の選択および評価に焦点を合わせている。ＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０三量体からの有望な初期データに基づいて、望ましいワクチンプラットフォームとして天然様三量体が浮上している。ｓｃ−ｇｐ１４０およびＮＦＬのような他のｇｐ１４０設計も天然様三量体を生成した。しかし、全てのこれらの設計は、非ＢＧ５０５  Ｅｎｖに適用された場合、三量体の収量、純度および安定性の有意な低下を被り、天然様三量体を得るためには追加的なＥｎｖ安定化突然変異および複雑な精製方法を要するであろう。Ｅｎｖ準安定性の主要原因、すなわち、ｇｐ４１外部ドメイン（ｇｐ４１  ＥＣＴＯ）におけるＨＲ１ベンド（アミノ酸５４７〜５６９）が合理的再設計により特定され直接的に標的化されたのは最近のことである。得られた三量体構築物は「未切断融合前最適化（ｕｎｃｌｅａｖｅｄ  ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ−ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）（ＵＦＯ）」設計と称される。また、ｇｐ４１ＥＣＴＯがＥｎｖ準安定性の唯一の原因であること、ならびにＵＦＯ設計のＢＧ５０５  ｇｐ４１ＥＣＴＯを使用して、相当な三量体収量、純度および安定性で多様なＨＩＶ−１亜型を安定化させて、三量体に基づくＨＩＶ−１ワクチン設計のための簡便で一般的で有効な戦略がもたらされうることが実証されたのも、最近のことである。
【０００６】
また、特に個々の抗原に関して観察された低い免疫原性を考慮して、ワクチン候補としてのＥｎｖ抗原を提示するための自己組織化ナノ粒子の使用においても、著しい進歩がもたらされている。例えば、野生型（ＷＴ）マウス、ヒトＩｇノックインマウス、ウサギおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＳＯＳＩＰおよびＮＦＬに関して、ＨＩＶ−１三量体の免疫原性が試験されており、ウサギおよびＮＨＰにおいては自己ティア（ｔｉｅｒ）２  ＮＡｂ応答が観察されたが、ＷＴマウスにおいては観察されなかった。そのようなティア２  ＮＡｂ応答の誘導は６〜１２か月の免疫化を要することが多く、このことは、可溶性三量体が最適ワクチン形態ではない可能性があることを示唆している。一貫して、より最近の研究は、固有の安定性および純度を有するＵＦＯ三量体が、高収量かつ高純度で、２４量体フェリチン（ＦＲ）、６０量体Ｅ２ｐおよび６０量体Ｉ３−０１を含む３つのナノ粒子上で提示されうることを示した。Ｈｅら，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．７：１２０４１，２０１６を参照されたい。そのようなナノ粒子は、８週間後にマウスにおいて、顕著なティア２  ＨＩＶ−１中和抗体応答を初めて誘導したが、全ての可溶性三量体は誘導できなかった。そのようなナノ粒子の１つは、６週間後にウサギにおいて、顕著なティア２  ＨＩＶ−１中和抗体応答を誘導したが、可溶性三量体は、そのような応答を生成するためには更に８週間（第１４週）を要した。Ｈｅら，Ｓｃｉ．Ａｄｖ．４（１１）：ｅａａｕ６７６９，２０１８を参照されたい。
【０００７】
ワクチン設計における相当な進歩にもかかわらず、例えば種々のウイルス病原体または非ウイルス病原体の感染（例えば、ＨＩＶ−１感染）を予防するために、より有効かつ強力なワクチン免疫原が医学分野において尚も必要とされている。本発明は当技術分野における未だ満たされていない要求に対処するものである。
【発明の概要】
【０００８】
発明の概括
１つの態様においては、本発明は、（１）自己組織化ナノ粒子の表面上に提示されたポリペプチド免疫原と、（２）ナノ粒子の内部に包埋され、自己組織化ナノ粒子のサブユニットに連結されたロッキング（ｌｏｃｋｉｎｇ）ドメインとを含有するワクチン組成物を提供する。これらのワクチン組成物においては、ロッキングドメインは、界面における非共有相互作用により溶液中の近くのナノ粒子サブユニットに結合した別のロッキングドメインと二量体を自然に形成しうるタンパク質サブユニットである。幾つかの実施形態においては、使用されるロッキングドメインは、別の同一タンパク質ドメインまたはサブユニットとホモ二量体を形成するタンパク質ドメインまたはサブユニットである。これらの実施形態の幾つかにおいては、使用されるロッキングドメインのサブユニットは、配列番号１〜９のいずれか１つに示されているアミノ酸配列、それらの保存的修飾変異体または実質的に同一の配列を有する。
【０００９】
本発明の幾つかのワクチン組成物においては、ロッキングドメインはナノ粒子のサブユニットに共有結合している。これらの実施形態の幾つかにおいては、ロッキングドメインのＮ末端はリンカー配列を介してナノ粒子サブユニットのＣ末端に融合している。本発明の幾つかのワクチン組成物は汎反応性Ｔ細胞エピトープを更に含有しうる。これらの実施形態の幾つかにおいては、Ｔ細胞エピトープのＮ末端はロッキングドメインのＣ末端に融合している。本発明の幾つかのワクチン組成物は、免疫原とナノ粒子サブユニットとの間に挿入されたネック（ｎｅｃｋ）領域を更に含有しうる。これらの実施形態においては、ネック領域は、ナノ粒子の表面から更に遠くへ免疫原を上昇させる３ヘリックスタンパク質ドメインでありうる。ナノ粒子を内部から安定化させるロッキングドメインに加えて、本発明の幾つかのワクチン組成物は、免疫原ポリペプチドを更に安定化させるための、免疫原とナノ粒子サブユニットとの間に挿入されたタンパク質ドメインを更に含有しうる。幾つかの好ましい実施形態においては、本発明のワクチン組成物を構築するために利用されるナノ粒子は、回転対称性を有する球形のナノ粒子である。これらの実施形態の幾つかにおいては、回転対称性は３回対称軸および／または５回対称軸を有する。これらの実施形態の幾つかにおいては、使用されるナノ粒子は二十面体構造のものである。
【００１０】
本発明の幾つかのワクチン組成物においては、ナノ粒子上に提示されたポリペプチド免疫原はウイルス免疫原である。これらの実施形態の幾つかにおいては、提示ポリペプチド免疫原は、クラスＩ融合メカニズムを利用するウイルスからのウイルス免疫原である。例えば、免疫原はＨＩＶ−１ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、アレナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）およびコロナウイルスに由来しうる。幾つかの他の実施形態においては、提示ポリペプチド免疫原は、クラスＩＩ融合メカニズムを利用するウイルスからのウイルス免疫原である。例えば、免疫原はＨＣＶまたはジカウイルスに由来しうる。更に幾つかの他の実施形態においては、提示ポリペプチド免疫原は非ウイルス免疫原である。例えば、提示免疫原は、熱帯熱マラリア原虫［プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）］由来の抗原、結核菌［マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）］（ＴＢ）由来の抗原またはヒトタンパク質プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）でありうる。
【００１１】
本発明の幾つかのワクチン組成物は、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来三量体タンパク質を提示するＨＩＶ−１ワクチンである。これらの実施形態の幾つかにおいては、ロッキングドメインのＮ末端は、ＧＧＧＧＳ（配列番号１７）のタンデムコピーの１以上を含有するリンカー配列を介してナノ粒子サブユニットのＣ末端に融合している。幾つかの実施形態においては、ワクチン組成物は汎反応性Ｔ細胞エピトープを更に含有しうる。これらの実施形態の幾つかにおいては、Ｔ細胞エピトープのＮ末端はロッキングドメインのＣ末端に融合している。これらの実施形態の幾つかにおいては、Ｔ細胞エピトープは配列ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号１８）を有する。幾つかの実施形態においては、ＨＩＶ−１三量体タンパク質のサブユニットのＣ末端はナノ粒子のサブユニットのＮ末端に共有結合している。幾つかの実施形態においては、ＨＩＶ−１三量体タンパク質サブユニットはリンカー配列を介してナノ粒子サブユニットに融合している。種々の実施形態においては、使用されるリンカー配列は配列（ＧａＳｂ）ｎ（ここで、ａは１〜５の整数であり、ｂは１〜２の整数であり、ｎは１〜５の整数である）を有しうる。
【００１２】
本発明の幾つかのワクチン組成物においては、自己組織化ナノ粒子は、三量体を構成する三量体配列を有する。これらの実施形態の幾つかにおいては、自己組織化ナノ粒子のサブユニットは、配列番号２６（フェリチン）、配列番号２１（Ｅ２ｐ）、配列番号２２（Ｉ３−０１）または配列番号２５（Ｉ３−０１変異体）に示される配列、それらの保存的修飾変異体または実質的に同一の配列を有するポリペプチドである。幾つかのＨＩＶ−１ワクチン組成物においては、提示ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来三量体タンパク質はｇｐ１４０に由来する。幾つかの実施形態においては、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来三量体タンパク質は未切断融合前最適化（ＵＦＯ）ｇｐ１４０三量体である。これらの実施形態の幾つかにおいては、ＵＦＯ  ｇｐ１４０三量体は、ＨＩＶ−１株ＢＧ５０５からの修飾ｇｐ４１ＥＣＴＯドメインを含有するキメラ三量体である。幾つかの実施形態においては、ＵＦＯ  ｇｐ１４０三量体のサブユニットは、配列番号２３に示されているアミノ酸配列、その保存的修飾変異体または実質的に同一の配列を有する。
【００１３】
幾つかの特定のＨＩＶ−１ワクチン組成物は、Ｎ末端からＣ末端への方向に以下のものを含有するサブユニット配列から構成される：配列番号２３に示されているＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来ＵＦＯ  ｇｐ１４０三量体サブユニット、配列番号２１（Ｅ２ｐ）に示されている自己組織化ナノ粒子サブユニット、配列番号１（ＬＤ４）に示されているロッキングドメイン、およびＴ細胞エピトープＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号１８）。これらの実施形態の幾つかにおいては、サブユニット配列は、ｇｐ１４０三量体サブユニットとナノ粒子サブユニットとの間の第１リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号２４）、および／またはナノ粒子サブユニットとロッキングドメインとの間の第２リンカー配列ＧＧＧＧＳ（配列番号１７）を更に含有しうる。幾つかの他の特定のＨＩＶ−１ワクチン組成物は、Ｎ末端からＣ末端への方向に以下のものを含有するサブユニット配列から構成される：配列番号２３に示されているＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来ＵＦＯ  ｇｐ１４０三量体サブユニット、配列番号２２または２５（Ｉ３−０１）に示されている自己組織化ナノ粒子サブユニット、配列番号２（ＬＤ７）に示されているロッキングドメイン、およびＴ細胞エピトープＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号１８）。これらの実施形態の幾つかにおいては、サブユニット配列は、サブユニット配列は、ｇｐ１４０三量体サブユニットとナノ粒子サブユニットとの間の第１リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号２４）、および／またはナノ粒子サブユニットとロッキングドメインとの間の第２リンカー配列ＧＧＧＧＳ（配列番号１７）を更に含有しうる。
【００１４】
関連態様においては、本発明は、本明細書に記載されているワクチン組成物を含有する医薬組成物を提供する。該医薬組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体をも含有する。幾つかの実施形態においては、該医薬組成物はアジュバントをも含有しうる。
【００１５】
もう１つの態様においては、本発明は、Ｎ末端の免疫原ポリペプチド、自己組織化ナノ粒子サブユニットおよびロッキングドメインのサブユニットを含有する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。融合タンパク質におけるロッキングドメインは、界面における非共有相互作用により溶液中の近くのナノ粒子サブユニットに結合した別のロッキングドメインと二量体を自然に形成しうるタンパク質サブユニットである。本発明の幾つかのポリヌクレオチドにおいては、コードされる融合タンパク質におけるロッキングドメインは、別の同一タンパク質サブユニットとホモ二量体を形成するタンパク質サブユニットである。幾つかの実施形態においては、コードされる融合タンパク質における免疫原ポリペプチドはナノ粒子サブユニットのＮ末端に融合している。幾つかの実施形態においては、コードされる融合タンパク質における免疫原ポリペプチドは多量体タンパク質のサブユニットである。幾つかの実施形態においては、コードされる融合タンパク質におけるロッキングドメインはナノ粒子サブユニットのＣ末端に位置する。幾つかの実施形態においては、コードされる融合タンパク質はＣ末端にＴ細胞エピトープを更に含有する。幾つかの実施形態においては、コードされる融合タンパク質における免疫原ポリペプチドはＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来三量体タンパク質のサブユニットである。これらの実施形態の幾つかにおいては、コードされる融合タンパク質は該タンパク質の異なる成分の間に１以上のリンカー配列を更に含有しうる。これらの実施形態の幾つかにおいては、コードされる融合タンパク質は、免疫原ポリペプチドとナノ粒子サブユニットとの間の第１リンカー配列、および／またはナノ粒子サブユニットとロッキングドメインとの間の第２リンカー配列を含有しうる。種々の実施形態においては、使用されるリンカー配列は、それぞれ独立して、（ＧａＳｂ）ｎ（ここで、ａは１〜４の整数であり、ｂは１〜２の整数であり、ｎは１〜６の整数である）の配列を有しうる。
【００１６】
本発明の幾つかの特定のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されているＨＩＶ−１ポリペプチドワクチン組成物をコードしている。これらの実施形態の幾つかにおいては、コードされる融合タンパク質はＮ末端からＣ末端への方向に以下のものを含有する：配列番号２３に示されているＵＦＯ  ｇｐ１４０三量体サブユニット、配列番号２１（Ｅ２ｐ）に示されている自己組織化ナノ粒子サブユニット、およびＴ細胞エピトープＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号１８）。幾つかの実施形態においては、コードされる融合ポリペプチドは、ｇｐ１４０三量体サブユニットとナノ粒子サブユニットとの間の第１リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号２４）、および／またはナノ粒子サブユニットとロッキングドメインとの間の第２リンカー配列ＧＧＧＧＳ（配列番号１７）を更に含有しうる。幾つかの他の実施形態においては、コードされる融合タンパク質はＮ末端からＣ末端への方向に以下のものを含有する：配列番号２３に示されているＵＦＯ  ｇｐ１４０三量体サブユニット、配列番号２２または２５（Ｉ３−０１）に示されている自己組織化ナノ粒子サブユニット、配列番号２（ＬＤ７）に示されているロッキングドメイン、およびＴ細胞エピトープＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号１８）。幾つかの実施形態においては、コードされる融合ポリペプチドは、ｇｐ１４０三量体サブユニットとナノ粒子サブユニットとの間の第１リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号２４）、および／またはナノ粒子サブユニットとロッキングドメインとの間の第２リンカー配列ＧＧＧＧＳ（配列番号１７）を更に含有しうる。
【００１７】
幾つかの関連実施形態においては、本発明は、本明細書に記載されているポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを提供する。幾つかの関連実施形態においては、本発明は、本明細書に記載されているポリヌクレオチドの１以上を含有するベクターを提供する。幾つかの他の関連実施形態においては、本発明は、本明細書に記載されているポリヌクレオチドまたはベクターの１以上を含有する医薬組成物を提供する。
【００１８】
もう１つの態様においては、本発明は、対象におけるＨＩＶ−１感染の治療または予防方法を提供する。これらの方法は、本明細書に記載されているＨＩＶ−１ポリペプチドワクチン組成物の治療的有効量を含有する医薬組成物を対象に投与することを含む。これらの実施形態の幾つかにおいては、投与されるＨＩＶ−１ワクチン組成物はＮ末端からＣ末端への方向に以下のものを含有する：配列番号２３に示されているＵＦＯ  ｇｐ１４０三量体サブユニット、配列番号２１（Ｅ２ｐ）に示されている自己組織化ナノ粒子サブユニット、配列番号１（ＬＤ４）に示されているロッキングドメイン、およびＴ細胞エピトープＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号１８）。幾つかの他の実施形態においては、投与されるＨＩＶ−１ワクチン組成物はＮ末端からＣ末端への方向に以下のものを含有する：配列番号２３に示されているＵＦＯ  ｇｐ１４０三量体サブユニット、配列番号２２または２５（Ｉ３−０１）に示されている自己組織化ナノ粒子サブユニット、配列番号２（ＬＤ７）に示されているロッキングドメイン、およびＴ細胞エピトープＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号１８）。幾つかの関連実施形態においては、本発明は、本明細書に記載されているポリヌクレオチドまたは発現ベクターの治療的有効量を含有する医薬組成物を対象に投与することによる、対象におけるＨＩＶ−１感染の治療または予防方法を提供する。これらの実施形態の幾つかにおいては、投与されるポリヌクレオチドまたはベクターは、Ｎ末端からＣ末端への方向に以下のものを含有する融合タンパク質をコードしている：配列番号２３に示されているＵＦＯ  ｇｐ１４０三量体サブユニット、配列番号２１（Ｅ２ｐ）に示されている自己組織化ナノ粒子サブユニット、配列番号１（ＬＤ４）に示されているロッキングドメイン、およびＴ細胞エピトープＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号１８）。幾つかの他の実施形態においては、投与されるポリヌクレオチドまたはベクターは、Ｎ末端からＣ末端への方向に以下のものを含有する融合タンパク質をコードしている：配列番号２３に示されているＵＦＯ  ｇｐ１４０三量体サブユニット、配列番号２２または２５（Ｉ３−０１）に示されている自己組織化ナノ粒子サブユニット、配列番号２（ＬＤ７）に示されているロッキングドメイン、およびＴ細胞エピトープＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号１８）。
【００１９】
本発明の性質および利点の更なる理解は、本明細書の残りの部分および特許請求の範囲を参照することにより実現されうる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１はＨＩＶ−１  ＵＦＯ  ｇｐ１４０ナノ粒子ワクチンの構造を示す。
【図２】図２は、本明細書に記載されているロッキングドメイン安定化ＨＩＶ−１ナノ粒子免疫原の一例を発現するＣＭＶベクターの構造を図示する。
【図３】図３は幾つかのアッセイによるＣＨＯ／ＥｘｐｉＣＨＯ産生ナノ粒子タンパク質の品質評価の結果を示す。
【図４】図４は２つのロッキングドメイン安定化ＨＩＶ−１ナノ粒子免疫原の抗原および構造分析のインビトロ評価を示す。
【図５】図５はマウスおよびウサギにおける２つの例示ロッキングドメイン安定化ＨＩＶ−１ナノ粒子免疫原の免疫原性活性のインビボ研究を示す。
【図６】図６は、種々のロッキングドメインで安定化されたＨＩＶ−１ナノ粒子免疫原の構築物設計、ならびにＥｘｐｉＣＨＯ細胞において一過性に発現されたワクチン免疫原の収量および純度を示すサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルを示す。
【図７】図７は、種々のロッキングドメインで安定化されたＨＩＶ−１ナノ粒子免疫原のブルー・ネイティブ・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＢＮ−ＰＡＧＥ）分析、および幾つかの良好に形成されたナノ粒子のネガティブ染色電子顕微鏡（ＥＭ）イメージを示す。
【図８】図８は、分子モデル、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびエボラＧＰΔＭｕｃ三量体提示ナノ粒子のネガティブ染色ＥＭイメージ、ならびにそれに続く設計概念および分子モデル、生化学的および生物物理学的分析、例えばＳＥＣおよびブルー・ネイティブ・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＢＮ−ＰＡＧＥ）、および抗原性の特徴づけ、例えば種々のロッキングドメインを含有するエボラＧＰΔＭｕｃ三量体提示ナノ粒子に関するＥＬＩＳＡを示す。Ｅ２ｐと組合されたＬＤ１−ＬＤ７に関する、およびＩ３−０１と組合されたＬＤ４−ＬＤ９に関するＳＥＣプロファイルを示し、これらは全て、エボラＧＰΔＭｕｃ−ＵＦＯｇ三量体を提示している。
【図９】図９は、ラッサウイルス（ＬＡＳＶ）ＧＰＣ三量体提示ナノ粒子の分子モデル、ならびに２４量体フェリチンナノ粒子および６０量体Ｅ２ｐナノ粒子（ロッキングドメインＬＤ４およびＴ細胞エピトープＰＡＤＲＥを含有するもの）におけるＧＰＣ三量体のネガティブ染色ＥＭイメージを示す。
【図１０】図１０はヒト呼吸器合抱体ウイルス（ｈＲＳＶ）Ｆ三量体提示ナノ粒子の分子モデル、ならびに２４量体フェリチンナノ粒子、６０量体Ｅ２ｐナノ粒子（ロッキングドメインＬＤ４およびＴ細胞エピトープＰＡＤＲＥを含有するもの）および６０量体Ｉ３−０１ナノ粒子（ロッキングドメインＬＤ７およびＰＡＤＲＥを含有するもの）におけるｈＲＳＶ  Ｆ三量体のネガティブ染色ＥＭイメージを示す。
【図１１】図１１はＭＥＲＳコロナウイルスＳ三量体提示ナノ粒子の分子モデル、ならびに２４量体フェリチンナノ粒子、６０量体Ｅ２ｐナノ粒子（ロッキングドメインＬＤ４およびＴ細胞エピトープＰＡＤＲＥを含有するもの）および６０量体Ｉ３−０１ナノ粒子（ロッキングドメインＬＤ７およびＰＡＤＲＥを含有するもの）におけるＭＥＲＳコロナウイルスＳ三量体パイクのネガティブ染色ＥＭイメージを示す。
【図１２】図１２はワクチン概念、分子モデル、生化学的および生物物理学的分析、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ブルー・ネイティブ・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＢＮ−ＰＡＧＥ）ならびにネガティブ染色ＥＭイメージ、ならびに抗原の特徴づけ、例えばＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質Ｅ２コア提示ナノ粒子（ロッキングドメインを含有するもの及び含有しないもの）に対するＥＬＩＳＡ結合を示す。
【図１３】図１３はジカウイルス（ＺＩＫＶ）ＤＩＩＩ−１０ＧＳ−Ｉ３−０１ナノ粒子の分子モデル、ならびにそれに続く生化学的および生物物理学的特徴づけ、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ブルー・ネイティブ・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＢＮ−ＰＡＧＥ）、および２４量体フェリチンナノ粒子、６０量体Ｅ２ｐナノ粒子および６０量体Ｉ３−０１ナノ粒子（ロッキングドメインＬＤ７およびＴ細胞エピトープＰＡＤＲＥを含有するもの）上に提示されたＤＩＩＩドメインに関するネガティブ染色ＥＭ分析を示す。
【図１４】図１４は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）（マラリア）抗原Ｐｆｓ２５およびそれと公知中和抗体との複合体の構造、ネックドメインを含有するＰｆｓ２５ナノ粒子の設計概念、ならびに２４量体フェリチンナノ粒子、６０量体Ｅ２ｐナノ粒子（ロッキングドメインＬＤ４およびＴ細胞エピトープＰＡＤＲＥを含有するもの）および６０量体Ｉ３−０１（ロッキングドメインＬＤ７およびＰＡＤＲＥを含有するもの）（全て、Ｐｆｓ２５とナノ粒子との間に挿入されたネックドメインを含有する）におけるＰｆｓ２５のネガティブ染色ＥＭイメージを示す。
【図１５】図１５は、熱帯熱マラリア原虫（マラリア）抗原スポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）の組成概要、ＧＳＫ  ＲＴＳ，Ｓワクチンの組成概要、ＣＳＰに基づくナノ粒子ワクチンを設計するための段階的戦略、６０量体フェリチンおよび６０量体Ｉ３−０１ナノ粒子（ロッキングドメインＬＤ７およびＴ細胞エピトープＰＡＤＲＥを含有するもの）における抗原ＣＳＰの種々の成分のネガティブ染色ＥＭイメージ、ならびにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルを示す。
【図１６】図１６はプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）の構造、ネックドメインを含有するＰＣＳＫ９ナノ粒子の設計概念、ならびに２４量体フェリチンナノ粒子および６０量体Ｉ３−０１ナノ粒子（ロッキングドメインＬＤ７およびＴ細胞エピトープＰＡＤＲＥを含有するもの）（全て、ＰＣＳＫ９とナノ粒子との間に挿入されたネックドメインを含有する）におけるネガティブ染色ＥＭイメージを示す。
【００２１】
詳細な説明
Ｉ．概要
本発明は、部分的には、種々のウイルス性または非ウイルス性標的（例えば、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ、エボラＧＰ、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質または結核菌抗原）に対する新規ワクチン免疫原の、ならびに安定性および活性の改善を示すナノ粒子提示免疫原（すなわち、ワクチン組成物）の、本発明者らの開発に基づく。典型的には、本発明のワクチンまたはワクチン組成物は、自己組織化ナノ粒子またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）上に提示された免疫原ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来三量体タンパク質）を含有する。ナノ粒子ワクチンは、本明細書に記載されている１以上の新規構造成分をも含有する。これらの追加的構造成分は、ナノ粒子の表面上の免疫原の提示を促進させるように、および／または提示免疫原の安定性を増強するように、および／または自己組織化タンパク質ワクチンの収量および純度を改善するように機能する。幾つかの実施形態においては、本発明のナノ粒子ワクチンは、ナノ粒子を安定化させるロッキングドメインを含有する。本明細書の実施例に詳細に記載されているとおり、ロッキングドメインはナノ粒子を内部から安定化させ、その結果、免疫原ポリペプチド（例えば、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来三量体タンパク質）を提示するナノ粒子は製造、ワクチン製剤化および免疫化において無傷のままとなりうる。このようにして構築された新規ワクチン免疫原は、有意に増強した安定性を有する。また、ロッキングメカニズムはナノ粒子プラットフォームには左右されない。本明細書に例示されているとおり（例えば、ＨＩＶ−１ワクチン）、それは、異なるナノ粒子、例えば６０量体Ｉ３−０１およびＥ２ｐナノ粒子に適用可能であり、ＳＥＣ、ＢＮ−ＰＡＧＥ、ＤＳＣ、ネガティブ染色ＥＭおよび抗原プロファイリングにより示されるとおり、ほぼ同じ結果をもたらす。
【００２２】
ワクチンをコードする構築物は、ロッキングドメイン以外に、追加的または代替的に、種々の他の構造成分を含有しうる。例えば、Ｔ４フィブリチンの三量体化モチーフ（「フォールドン」）のように、免疫原ポリペプチドを安定化させるのに役立つ、または３ヘリックスバンドル（「ネックドメイン」）のように、ナノ粒子表面から免疫原ポリペプチドを上昇させるのに役立つ、または既知結合抗体を含有するタンパク質ドメインのように、免疫親和性精製を促進させるのに役立つタンパク質ドメインのコード配列が、免疫原ポリペプチド配列とナノ粒子サブユニット配列との間に付加されうる。化学的コンジュゲート化のための活性部位として働くポリペプチド断片またはモチーフのコード配列が、適切な位置において、構築物内に挿入されうる。ＣＤ４＋  ＴヘルパーエピトープまたはＣＤ８＋  Ｔ細胞エピトープのような追加的構造成分も、本明細書に記載されているとおり、適切な位置において構築物内に挿入されうる。本明細書に例示されているとおり、構築物における種々の構造成分を連結するために、１以上のリンカー（リンカー配列、モチーフまたは部分）が使用されうる。
【００２３】
本明細書に詳細に記載されているとおり、本発明のワクチン組成物は、本明細書に記載されている構造成分の機能的に連結されたコード配列を含有する構築物から発現され、自己組織化される。該構築物においては、免疫原ポリペプチドをコードする配列は、そのＣ末端において、ナノ粒子サブユニットをコードする配列のＮ末端に直接的または間接的に融合している。その他の構造成分をコードする配列は、本明細書に記載されている適切な位置において構築物内に挿入される。例えば、ロッキングドメインが使用される場合、ロッキングドメインをコードする配列は、ナノ粒子サブユニットをコードする配列のＣ末端に直接的または間接的に融合されうる。
【００２４】
本明細書に例示されているナノ粒子ワクチン構築物は、天然様抗原構造が表面上に提示されていて、高い収量、高い純度および高い安定性を示し、天然様抗原プロファイルを向上させ、動物における免疫原性を増強した。例えば、ＨＩＶ−１ナノ粒子ワクチンは野生型マウスおよびウサギにおいて６〜８週以内にティア２自己中和抗体応答を誘導したが、可溶性三量体は単独でマウスにおいてティア２中和抗体を全く誘導できず、抗体誘導には少なくとも２〜３か月を要した。したがって、本発明の改善されたＨＩＶ−１ワクチン免疫原は、ワクチン製造に、より適しており、ワクチン接種において、より良好な免疫応答を可能にする。
【００２５】
本明細書中に特に示されていない限り、本発明のワクチン免疫原、コード化ポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞ならびに関連治療用途は全て、本明細書に例示されている方法または当技術分野でよく知られている常套的に実施されている方法に従い作製され、実施されうる。例えば、以下のものを参照されたい：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２８９：Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊ．Ｎ．Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｍ．Ｉ．Ｓｉｍｏｎ，Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９７）（ＩＳＢＮ−１３：９７８−０１２１８２１９０６）；米国特許第４，９６５，３４３号および第５，８４９，９５４号；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，（３ｒｄ  ｅｄ．，２０００）；Ｂｒｅｎｔら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ｒｉｎｇｂｏｕ編，２００３）；Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９８６）；またはＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｖｏｌ．１５２，Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ａ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｒｌ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ（１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ）（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＣＢ）（Ｊｕａｎ  Ｓ．Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、およびＣｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｒ．Ｉａｎ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ；５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５），Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５７，Ｊｅｎｎｉｅ  Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＤａｖｉｄ  Ｂａｒｎｅｓ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９８）。以下の節は、本発明の組成物および方法を実施するための追加的な指針を提供する。
【００２６】
ＩＩ．定義
特に示されていない限り、本明細書中で用いられる全ての科学技術用語は、本発明が関連する当業者に一般的に理解されているのと同じ意味を有する。以下の参考文献は、本発明で用いられる用語の多くの一般的定義を当業者に示すものである：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｒｒｉｓ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１ｓｔ  ｅｄ．，１９９２）；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｍｉｔｈら（編），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄ．，２０００）；Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉｃ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ（編），Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら（編），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（３ｒｄ  ｅｄ．，２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈｕｎｔ（編），Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ（１ｓｔ  ｅｄ．，１９９９）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｈｌｅｒ（編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｔｅｌｏｓ（１９９４）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＫｕｍａｒおよびＡｎａｎｄａｎｄ（編），Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；ならびにＡ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐａｐｅｒｂａｃｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ），ＭａｒｔｉｎおよびＨｉｎｅ（編），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（４ｔｈ  ｅｄ．，２０００）。これらの用語が本発明に具体的に適用される場合のこれらの用語の幾つかの更なる説明が本明細書に示されている。
【００２７】
本明細書中で用いる単数形は、文脈に明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を意味する。例えば、「Ｅｎｖ由来三量体」は単一または複数の両方のＥｎｖ由来三量体分子を意味することが可能であり、「少なくとも１つのＥｎｖ由来三量体」なる表現と同等であると見なされうる。
【００２８】
本明細書中で用いる「抗原」または「免疫原」なる語は、対象において免疫応答を誘導しうる物質、典型的にはタンパク質を意味するものとして互換的に用いられる。この用語はまた、（対象に直接的に投与することにより、または該タンパク質をコードするヌクレオチド配列またはベクターを対象に投与することにより）対象に投与すると、そのタンパク質に対する体液性および／または細胞性免疫応答を誘導しうる点で免疫学的に活性なタンパク質をも意味する。特に示されていない限り、「ワクチン免疫原」なる語は「タンパク質抗原」または「免疫原ポリペプチド」と互換的に用いられる。
【００２９】
「保存的修飾変異体」なる語はアミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。個々の核酸配列に関して、保存的修飾変異体は、同一または実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、あるいは核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合には、実質的に同一の配列を意味する。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与タンパク質をコードする。ポリペプチド配列の場合には、「保存的修飾変異体」は、保存的なアミノ酸置換を有する変異体を意味し、この場合、アミノ酸残基は、類似電荷を有する側鎖を有する他のアミノ酸残基により置換されている。類似電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において定められている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
【００３０】
エピトープは抗原決定基を意味する。これらは、特異的免疫応答を誘導するように抗原性である、分子上の特定の化学基またはペプチド配列であり、例えば、エピトープは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原領域である。エピトープは、連続的アミノ酸、またはタンパク質の三次フォールディングにより並置された不連続的アミノ酸の両方から形成されうる。
【００３１】
ワクチンまたは他の物質の有効量は、所望の応答、例えば、エイズのような病態または疾患の徴候または症状の低減または排除をもたらすのに十分な量である。例えば、これは、ウイルス複製を抑制するのに、またはＨＩＶ−１感染の場合のＴ細胞数の増加のようなウイルス感染の表面的症状を、測定可能な様態で変化させるのに必要な量でありうる。一般に、この量は、ウイルス（例えば、ＨＩＶ）の複製または感染性を、測定可能な様態で抑制するのに十分である。対象に投与される場合、ウイルス複製のインビトロ抑制を達成することが示されている目標組織濃度（例えば、リンパ球におけるもの）を達成する投与量が一般に使用される。幾つかの実施形態においては、「有効量」は、例えばＨＩＶ−１感染を治療するために、障害または疾患のいずれかの１以上の症状および／または根本原因を治療（予防を含む）する量である。幾つかの実施形態においては、有効量は治療的有効量である。幾つかの実施形態においては、有効量は、特定の疾患または病態の徴候または症状の１以上、例えば、エイズに関連する徴候または症状の１以上の発生を予防する量である。
【００３２】
本明細書中で用いる融合タンパク質は、単一タンパク質を生成するようにペプチド結合を介して互いに連結された少なくとも２つの無関係なタンパク質からの組換えタンパク質含有アミノ酸配列である。無関係なアミノ酸配列は互いに直接的に連結可能であり、あるいはそれらは、リンカー配列を使用して連結可能である。本明細書中で用いるタンパク質が無関係であると言えるのは、それらのアミノ酸配列がそれらの天然環境（例えば、細胞内）においてペプチド結合を介して互いに連結されたものとしては通常見出されない場合である。例えば、ビー・ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ジヒドロリポイルアシルトランスフェラーゼ（Ｅ２ｐ）のような細菌酵素のアミノ酸配列、およびＨＩＶ−１  ｇｐ１２０またはｇｐ４１糖タンパク質のアミノ酸配列は、ペプチド結合を介して互いに連結されたものとしては通常見出されない。
【００３３】
ヘプタッド反復（７アミノ酸繰り返し）（ＨＲ）は、７個のアミノ酸：ａｂｃｄｅｆｇＨＰＨＣＰＣ［ここで、Ｈは疎水性残基を表し、Ｃは典型的には荷電残基を表し、Ｐは極性（したがって親水性）残基を表す］の反復パターンからなる構造モチーフを意味する。
【００３４】
ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（ｅｎｖ）は、最初は、ｇｐ１６０と称される、８４５〜８７０アミノ酸のサイズの、より長い前駆体タンパク質として合成される。ｇｐ１６０はホモ三量体を形成し、ゴルジ装置内でグリコシル化を受ける。インビボでは、ｇｐ１６０糖タンパク質はエンドタンパク質分解的にプロセシングされて成熟エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０およびｇｐ４１となり、これらはウイルス表面上で複合体として互いに非共有結合する。ｇｐ１２０表面タンパク質は、ＨＩＶの主要受容体であるヒトＣＤ４に対する高親和性結合部位、ならびにケモカイン受容体ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４のような融合補助受容体と相互作用するドメインを含有する。ｇｐ４１タンパク質はウイルス膜にわたって広がり、そのアミノ末端に、ウイルス膜と細胞膜との融合に重要なアミノ酸の配列を含有する。ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質複合体の天然融合可能形態は、３つのｇｐ１２０サブユニットおよび３つのｇｐ４１サブユニットから構成される三量体構造である。受容体結合（ＣＤ４および補助受容体）部位はｇｐ１２０部分に存在し、一方、融合ペプチドはｇｐ４１成分に位置する。野生型ｇｐ１６０ポリペプチドの例示的配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、例えばアクセッション番号ＡＡＢ０５６０４およびＡＡＤ１２１４２として示されている。
【００３５】
ｇｐ１４０は、ｇｐ１２０および全ｇｐ４１外部ドメインの全てを含有するＨＩＶエンベロープタンパク質のオリゴマー形態を意味する。本明細書中で用いるＨＩＶ−１  ｇｐ１４０三量体免疫原は、典型的には、ｇｐ１４０ドメインおよびｇｐ１４０の修飾または再設計外部ドメイン（ｇｐ４１ＥＣＴＯ）を含有する。
【００３６】
ｇｐ１２０はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のエンベロープタンパク質である。ｇｐ１２０はＨＩＶエンベロープ糖タンパク質複合体の外部表面露出ドメインの大部分を含有し、細胞ＣＤ４受容体と細胞ケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ５）との両方に結合するのはｇｐ１２０である。成熟ｇｐ１２０野生型ポリペプチドは一次配列において約５００アミノ酸を有する。ｇｐ１２０は高度にＮ−グリコシル化されていて、１２０ｋＤの見掛け分子量を有する。該ポリペプチドは、５つの保存領域（Ｃ１〜０５）と、高可変性の５つの領域（Ｖ１〜Ｖ５）とから構成される。その三次構造においては、ｇｐ１２０糖タンパク質は３つの主要構造ドメイン（外部ドメイン、内部ドメインおよび架橋シート）と可変ループとから構成される。例えば、Ｗｙａｔｔら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９３，７０５−７１１，１９９８；およびＫｗｏｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９３，６４９−５９，１９９８を参照されたい。内部ドメインはｇｐ４１エンベロープ糖タンパク質と相互作用すると考えられており、一方、外部ドメインは構築エンベロープ糖タンパク質三量体上に露出している。
【００３７】
ｇｐ１２０の可変領域１および可変領域２（Ｖ１／Ｖ２ドメイン）は、ＨＩＶ−１の最高可変性部分の２つ（Ｖ１ループおよびＶ２ループ）を含有する約５０〜９０個の残基から構成され、Ｖ１／Ｖ２ドメインの残基の１０個中１個はＮ−グリコシル化されている。
【００３８】
ｇｐ４１の前駆体ＨＩＶエンベロープタンパク質のタンパク質分解産物である。それはＮ末端融合ペプチド（ＦＰ）、膜貫通ドメイン、および融合ペプチドと膜貫通ドメインとを連結する外部ドメインを含有する。ｇｐ４１は三量体形態のままであり、ｇｐ１２０と非共有結合的に相互作用する。例示的なｇｐ４１のアミノ酸配列がＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＣＡＤ２０９７５に記載されている。
【００３９】
ＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０は、クレードＡ株ＢＧ５０５からのｇｐ１４０三量体を使用して開発されたＨＩＶ−１  Ｅｎｖ免疫原である。それは、切断されたｇｐ１２０とｇｐ４１ＥＣＴＯとの間に、操作されたジスルフィド結合（ＳＯＳと称される）による共有結合を含有する。また、それは、ｇｐ４１の融合後コンホメーションを不安定化させるＩ５５９Ｐ突然変異（ＩＰと称される）、そしてまた、可溶性を改善するための、残基６６４における膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）のトランケーションを有する。このＨＩＶ−１免疫原は優れた抗原プロファイルと、天然スパイクの優れた構造模倣性とを有する。ＳＯＳＩＰ三量体を選別プローブとして使用して、新規ｂＮＡｂが特定され、特徴づけされている。ＳＯＳＩＰ設計は他のＨＩＶ−１株にも拡張されており、追加的な安定化突然変異の組み込みを可能にしている。最近、ウサギおよび非ヒト霊長類におけるＳＯＳＩＰ三量体の免疫原性が報告され、ヒトワクチン試験への道が開かれた。
【００４０】
免疫原は、病原体に感染した哺乳動物またはそのリスクを有する哺乳動物のような哺乳動物において免疫応答を誘導しうるタンパク質またはその一部である。免疫原の投与は目的の病原体に対する防御免疫および／または予防免疫をもたらしうる。
【００４１】
免疫応答は、Ｂ細胞、Ｔ細胞または単球のような免疫系細胞の、刺激に対する応答を意味する。幾つかの実施形態においては、応答は特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。幾つかの実施形態においては、免疫応答はＴ細胞応答、例えばＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答である。幾つかの他の実施形態においては、応答はＢ細胞応答であり、特異的抗体の産生をもたらす。
【００４２】
免疫原性組成物は、免疫原性ポリペプチドを発現するウイルスに対する測定可能なＣＴＬ応答を誘導する又は免疫原性ポリペプチドに対する測定可能なＢ細胞応答（例えば、抗体の産生など）を誘導する免疫原性ポリペプチドを含む組成物を意味する。
【００４３】
２以上の核酸配列または２以上のアミノ酸配列間の配列同一性または類似性は配列間の同一性または類似性に関して表される。配列同一性は同一性の割合（％）として測定可能であり、その割合が高ければ高いほど、配列はより同一である。２つの配列が、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用する測定または手動アライメントおよび目視検査による測定で、比較ウィンドウまたは指定領域にわたって最大の一致が得られるように比較されアライメント（整列）された場合に、特定の割合（すなわち、特定された領域にわたる、または特定されていない場合には配列全体にわたる６０％の同一性、所望により、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性）の同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する場合、２つの配列は「実質的に同一」である。場合によっては、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド長（または１０アミノ酸長）の領域にわたって、またはより好ましくは１００〜５００または１０００以上のヌクレオチド長（または２０、５０、２００以上のアミノ酸長）の領域にわたって存在する。
【００４４】
核酸またはアミノ酸配列のホモログまたはオルソログは、標準的な方法を用いてアライメントされた場合、比較的高い度合の配列同一性／類似性を有する。比較のための配列のアラインメントの方法は当技術分野においてよく知られている。種々のプログラムおよびアライメントアルゴリズムがＳｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ，７３：２３７−４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０，１９８８；Ｈｕａｎｇら  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｓ．ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８，１５５−６５，１９９２；およびＰｅａｒｓｏｎら，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２４：３０７−３１，１９９４に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０は配列アライメント方法およびホモロジー計算の詳細な考察を記載している。
【００４５】
「対象」なる語は、哺乳動物、例えばヒト、および非ヒト哺乳動物として分類される任意の動物を意味する。非ヒト動物の例には、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどが含まれる。特に示されていない限り、「患者」または「対象」なる語は本明細書においては互換的に用いられる。好ましくは、対象はヒトである。
【００４６】
「治療」または「緩和」なる語は、疾患（例えば、ＨＩＶ感染）の症状、合併症または生化学的徴候の発生開始を予防し又は遅延させるために対象に化合物または物質を投与すること、症状を緩和すること、あるいは疾患、状態または障害の更なる進行を阻止または抑制することを含む。治療を要する対象は、疾患または障害に既に罹患している対象、および障害を発生するリスクを有する対象を含む。治療は（疾患の発生開始を予防し又は遅延させるための、あるいはその臨床的または亜臨床的症状の発現を予防するための）予防的抑制、または疾患の発現の後の症状の治療的抑制もしくは緩和でありうる。
【００４７】
未切断融合前最適化（ＵＦＯ）三量体は、より安定化したＨＩＶ−１  ｇｐ１４０三量体を与えるｇｐ４１ＥＣＴＯドメインとｇｐ１２０タンパク質とにより形成されるＨＩＶ−１  ｇｐ１４０三量体タンパク質を意味する（図１）。再設計ｇｐ４１ＥＣＴＯドメインは原型ＨＩＶ−１株ＢＧ５０５（および原型ｇｐ１４０三量体ＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０）に基づいており、野生型ＢＧ５０５  ｇｐ４１ＥＣＴＯ配列と比較して１以上の修飾を含有する。これらの修飾には、（１）融合前ｇｐ１４０構造を安定化させるために、ＨＲ１の２１残基Ｎ末端（残基５４８〜５６８）を、より短いループ配列で置換すること、および（２）ｇｐ１２０とｇｐ４１との間のフューリン切断部位（残基５０８〜５１１）を、柔軟なリンカー配列、例えばＧＧＧＧＳ（配列番号１７）モチーフのタンデムリピートで置換することが含まれる。幾つかの実施形態においては、ＵＦＯ三量体はｇｐ１２０とｇｐ４１との間の操作されたジスルフィド結合および／またはｇｐ４１における安定化突然変異を更に含有しうる。例えば、ＨＩＶ−１株ＢＧ５０５に基づくＵＦＯ三量体は残基Ａ５０１ＣとＴ６０５Ｃとの間に操作されたジスルフィド結合を含有しうる。ＵＦＯ三量体の詳細な説明は、例えば、Ｋｏｎｇら，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．７：１２０４０，２０１６に記載されている。ＢＧ５０５株配列に基づくＵＦＯ三量体に加えて、操作されたｇｐ４１ＥＣＴＯドメインを使用して、多数の異なるＨＩＶ−１株または亜型からのｇｐ１２０ポリペプチドとペア形成させて「キメラ」ｇｐ１４０三量体を形成させることが可能である。そのようなキメラ三量体は、本明細書に例示されているとおり、「ＵＦＯ−ＢＧ」または「ＵＦＯ２−ＢＧ」と称される。ＵＦＯ−ＢＧおよびＵＦＯ２−ＢＧ三量体の詳細な説明は、例えば、Ｈｅら，Ｓｃｉ  Ａｄｖ．４（１１）：ｅａａｕ６７６９，２０１８に記載されている。
【００４８】
ワクチンは、対象において予防的または治療的免疫応答を誘導する医薬組成物を意味する。幾つかの場合には、免疫応答は防御免疫応答である。典型的には、ワクチンは、病原体の抗原、例えばウイルス病原体、または病理学的状態と相関する細胞成分に対する抗原特異的免疫応答を誘導する。ワクチンは、ポリヌクレオチド（例えば、開示されている抗原をコードする核酸）、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、開示されている抗原）、ウイルス、細胞または１以上の細胞成分を含みうる。本発明の幾つかの実施形態においては、ワクチンまたはワクチン免疫原またはワクチン組成物は融合構築物から発現され、表面上に免疫原ポリペプチドまたはタンパク質を提示するナノ粒子へと自己組織化する。
【００４９】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、幾つかのウイルスのいずれかに由来する非複製性ウイルス殻を意味する。ＶＬＰは、一般に、１以上のウイルスタンパク質、例えば、キャプシド、コート（外被）、殻、表面および／またはエンベロープタンパク質と称されるタンパク質（これらに限定されるものではない）、あるいはこれらのタンパク質に由来する粒子形成性ポリペプチドから構成される。ＶＬＰは適切な発現系におけるタンパク質の組換え発現に際して自発的に生成しうる。特定のＶＬＰの製造方法は当技術分野で公知である。ウイルスタンパク質の組換え発現後のＶＬＰの存在は、当技術分野で公知の通常の技術、例えば電子顕微鏡法、生物物理学的特徴づけなどを用いて検出されうる。例えばＢａｋｅｒら（１９９１）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６０：１４４５−１４５６；およびＨａｇｅｎｓｅｅら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：４５０３−４５０５を参照されたい。例えば、ＶＬＰは密度勾配遠心分離により単離可能であり、および／または特徴的密度バンディングにより特定可能である。あるいは、極低温電子顕微鏡法が、問題のＶＬＰ調製物のガラス化水性サンプルに対して実施可能であり、適切な曝露条件下でイメージが記録されうる。
【００５０】
自己組織化ナノ粒子は、ＶＬＰに類似した外観を有するナノ粒子へと自然に集合（組織化）しうる非ウイルス性タンパク質の同一コピーにより形成された明らかな表面幾何学的形状および数十ナノメートルの直径を有する球形のタンパク質殻を意味する。公知例には、フェリチン（ＦＲ）（これは種間で保存されており、２４量体を形成する）、ビー・ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ジヒドロリポイルアシルトランスフェラーゼ（Ｅ２ｐ）、アクイフェクス・エオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）ルマジンシンターゼ（ＬＳ）およびサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）エンカプスリン（ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）（これらは全て、６０量体を形成する）が含まれる。適切な発現系におけるタンパク質の組換え発現に際して自己組織化ナノ粒子は自然に形成しうる。ナノ粒子の製造、検出および特徴づけのための方法は、ＶＬＰ用に開発されたものと同じ技術を用いて行われうる。
【００５１】
ＩＩＩ．ワクチン組成物を製造するための免疫原ポリペプチドまたはタンパク質
いずれかのポリペプチド免疫原または多量体タンパク質が本発明のワクチン設計において使用されうる。これらには、免疫応答の誘導が望まれうる病原体に由来する任意のタンパク質またはポリペプチドが含まれる。したがって、本発明のワクチン組成物は、任意のウイルス、細菌または他の病原性生物に由来する免疫原ポリペプチドを使用しうる。本発明のための適切な免疫原ポリペプチドはまた、ヒトタンパク質を含む非病原性種であって、それに対する免疫応答の誘導が治療効果をもたらし、疾患症状を軽減し、または全身健康状態を改善しうる非病原性種に由来しうる。一般に、免疫原ポリペプチドは、少なくとも約１０個のアミノ酸残基を含有する任意の構造的または機能的ポリペプチドまたはペプチドでありうる。幾つかの実施形態においては、免疫原ポリペプチドは、長さが約１０〜約１０，０００アミノ酸の残基を含有する。幾つかの実施形態においては、免疫原ポリペプチドは、長さが約２５〜約２０００アミノ酸の残基を含有する。幾つかの実施形態においては、免疫原ポリペプチドは、長さが約５０〜約５００アミノ酸の残基を含有する。したがって、本発明に適した免疫原ポリペプチドまたはタンパク質は１ｋＤａ〜約１，０００ｋＤａ、好ましくは約２．５ｋＤａ〜約２５０ｋＤａの分子量を有しうる。幾つかのより好ましい実施形態においては、使用される免疫原ポリペプチドは約５ｋＤａ〜約２５ｋＤａまたは５０ｋＤａの分子量を有する。
【００５２】
幾つかの実施形態においては、本発明のワクチン組成物において使用される免疫原ポリペプチドまたはタンパク質はウイルス表面またはコアタンパク質（標的ポリペプチド）に由来しうる。宿主細胞のウイルス感染に重要な多数の公知ウイルスタンパク質が存在する。具体例には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：ＨＩＶの糖タンパク質（または表面抗原、例えばＧＰ１２０およびＧＰ４１）およびキャプシドタンパク質（または構造タンパク質、例えばＰ２４タンパク質）；Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型またはＥ型肝炎ウイルスの表面抗原またはコアタンパク質［例えば、小さなＢ型肝炎ウイルス表面抗原（Ｓ−ＨＢｓＡｇ）およびＣ型肝炎ウイルスのコアタンパク質、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５抗原］；エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）の糖タンパク質ｇｐ３５０／２２０、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の糖タンパク質（Ｇタンパク質）または融合タンパク質（Ｆタンパク質）；単純ヘルペスウイルスＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の表面およびコアタンパク質（例えば、ＨＳＶ−２からの糖タンパク質Ｄ）、ポリオウイルスの表面タンパク質（例えば、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＨおよびｇＬ）、麻疹ウイルス（ＭＶ）のエンベロープ糖タンパク質ヘマグルチニン（Ｈ）および融合タンパク質（Ｆ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質Ｇ、アデノウイルスのファイバーおよびペントンベースタンパク質、コロナウイルスのＳスパイク、フラビウイルス、例えばデングウイルス、黄熱ウイルスおよびジカウイルスのエンベロープ（Ｅ）タンパク質、ならびにピコルナウイルスの無エンベロープキャプシドタンパク質。
【００５３】
幾つかの実施形態においては、本発明に適したウイルス免疫原は、感染のためにクラスＩ融合メカニズムを利用するウイルスに由来しうる。クラスＩウイルス融合タンパク質は、細胞侵入中に劇的なコンホメーション変化を受ける三量体である。ウイルスタンパク質における特定の領域は完全にリフォールディングして膜融合を促進させうる。本明細書に例示されているとおり、クラスＩ融合メカニズムを利用するウイルスの免疫原の例には、ＨＩＶ−１、出血熱を引き起こすウイルス、例えばフィロウイルス（例えば、エボラウイルスおよびマールブルグウイルス）およびアレナウイルス（例えば、ラッサウイルス）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ならびにコロナウイルス、例えばＭＥＲＳ−ＣｏＶおよびＳＡＲＳ−ＣｏＶから得られる構造タンパク質またはポリペプチドが含まれる。本明細書に例示されているとおり、適切な免疫原は、ＨＩＶ−１  ＵＦＯ三量体、エボラＧＰ外部ドメイン、ＬＡＳＶ糖タンパク質複合体（ＧＰＣ）、ＲＳＶ糖タンパク質ＦおよびＭＥＲＳ−  ＣｏＶスパイクタンパク質Ｓに由来する任意のタンパク質およびポリペプチドでありうる。これらの免疫原、またはクラスＩ融合メカニズムを利用する他のウイルスの構造タンパク質に由来する免疫原はいずれも、全て、本発明のワクチン設計において使用されうる。
【００５４】
幾つかの実施形態においては、本発明に適したウイルス免疫原は、感染のクラスＩＩ融合メカニズムを利用するウイルスに由来しうる。クラスＩＩウイルス融合タンパク質はヘテロ二量体（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）またはホモ二量体（例えば、デング熱ウイルスおよびジカウイルス）の形態で存在し、それらは膜融合前にリフォールディングして三量体スパイクを形成する。本明細書に例示されているとおり、適切な免疫原は、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質（例えば、Ｅ２）、ジカウイルスＥタンパク質（例えば、ＤＩＩＩドメイン）、またはクラスＩＩ融合メカニズムを利用する他のウイルスの任意の構造タンパク質に由来する任意のタンパク質およびポリペプチドでありうる。これらの免疫原のいずれも、全て、本発明のワクチン設計において容易に使用されうる。
【００５５】
幾つかの実施形態においては、本発明のワクチン組成物において使用される免疫原ポリペプチドまたはタンパク質は非ウイルス標的に由来しうる。これらには、任意の非ウイルス性病原体（例えば、細菌病原体）から、およびヒトのような哺乳動物宿主内の寄生生物から得られうる免疫原が含まれる。幾つかの実施形態においては、細菌感染に重要な細菌タンパク質は、本発明のワクチン設計における免疫原ポリペプチドを得るのに適している。適切な免疫原は、例えば結核菌（ＴＢ）に関して本明細書に例示されているＡｇ８５複合体およびＭｔｂ７２のような、細菌の構造タンパク質に由来する任意のタンパク質およびポリペプチドでありうる。幾つかの実施形態においては、寄生生物の伝染、宿主における繁殖および生活環に重要な寄生生物タンパク質が、本発明のワクチン設計における免疫原ポリペプチドを得るのに適している。適切な免疫原は、例えば本明細書に例示されている熱帯熱マラリア原虫（マラリア）のＰｆｓ２５、スポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）および細網細胞結合タンパク質ホモログ５（ＰｆＲＨ５）のような、寄生生物の構造タンパク質に由来する任意のタンパク質およびポリペプチドでありうる。
【００５６】
幾つかの実施形態においては、使用される免疫原ポリペプチドは、免疫応答の誘導が望まれる哺乳動物宿主（例えば、ヒト）からの内因性タンパク質でありうる。これらには、例えば、本明細書に例示されているコレステロールレベルを調節するためのＰＣＳＫ９、および食欲を制御するためのグレリンが含まれる。本発明の設計に従いワクチンを構築するための適切な免疫原ポリペプチドを得るために、種々の他の哺乳動物タンパク質も使用されうる。幾つかの実施形態においては、ワクチン設計のための非ウイルス標的は、ヒトの疾患に関与する他のタンパク質でありうる。これらには、癌の発生に関与するタンパク質が含まれる。癌関連免疫原の例には、非突然変異自己抗原、例えばＭＡＧＥ−Ａ３、Ｍｅｌａｎ−Ａ／Ｍａｒｔ１、ｇｐ１００、Ｈｅｒ２／ＮｅｕおよびＮＹ−ＥＳＯ−１も含まれる。幾つかの追加的な実施形態においては、本発明のワクチン組成物における使用のための免疫原ポリペプチドまたはタンパク質には、他の慢性ヒト疾患または障害に関与するタンパク質が含まれる。そのようなヒト標的の例には、例えば、高血圧に対するＡｎｇ−ＩＩ、炎症に対するＴＮＦ−α、病原体誘発性好酸球増加症に対するＩＬ−９、喘息に対するＩＬ−５、脳卒中に対するＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体−１、およびホルモンレベルを低下させるためのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）が含まれる。
【００５７】
ＩＶ．ロッキングドメイン
前記のとおり、本発明の幾つかのナノ粒子ワクチンまたは免疫原は、本発明者らにより開発されたロッキングメカニズムを利用する。ロッキングメカニズムは、免疫原タンパク質またはポリペプチド（例えば、Ｅｎｖ由来ＨＩＶ−１三量体タンパク質）を提示する際にナノ粒子を内部から安定化させるように機能するタンパク質ドメイン（「ロッキングドメイン」）に関するものである。一般に、ロッキングドメインは、二量体を形成しうる任意のタンパク質でありうる。種々の実施形態においては、ロッキングドメインは、界面での非共有結合相互作用により溶液中で別のタンパク質サブユニットと二量体を自然に形成しうるタンパク質サブユニットである。幾つかの好ましい実施形態においては、それらの２つのタンパク質サブユニットは配列が同一であることが可能であり、ホモ二量体を形成しうる。幾つかの他の場合においては、それらの２つのタンパク質サブユニットは、界面での非共有結合相互作用により溶液中でヘテロ二量体を形成しうる異なるタンパク質、または操作により誘導された単一タンパク質の、２つの異なるドメインでありうる。典型的には、ロッキングドメインは、免疫原ポリペプチド（例えば、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来三量体タンパク質のサブユニット）が連結されているナノ粒子サブユニットに共有結合により融合している。幾つかの好ましい実施形態においては、ロッキングドメインは、それがナノ粒子殻内に封入されうるように、約５００個以下のアミノ酸を含有する二量体タンパク質から選択される。幾つかの実施形態においては、ロッキングドメインは、約４００、３００、２５０、２００、１５０個以下のアミノ酸を含有する二量体タンパク質に由来する。幾つかの実施形態においては、ロッキングドメインは、約３０〜約１００個のアミノ酸を含有する二量体タンパク質に由来する。本明細書に記載されているとおり、ロッキングドメインは、疎水性（ファンデルワールス）接触、水素結合および／または塩橋のような特定の相互作用により界面を形成しうる任意の二量体タンパク質でありうる。幾つかの実施形態においては、ロッキングドメインは、ヘリックス、シート、ループまたは前記構造要素の任意の組合せの相互作用により界面を形成しうる任意の二量体タンパク質でありうる。幾つかの実施形態においては、ロッキングドメインは、共有結合、例えばジスルフィド結合または特定の化学的架橋が操作されうる界面を形成しうる任意の二量体タンパク質でありうる。種々の実施形態においては、二量体の２つのサブユニット間のアフィニティは、熱および化学的処理のような外的変動に抵抗するのに十分に強力であり、そうでなければ、そのようなロッキングドメインを欠く野生型（ＷＴ）ナノ粒子は該外的変動に耐えられないであろう。
【００５８】
当技術分野で公知の多数のタンパク質が本発明の実施においてロッキングドメインとして使用されうる。これらには、例えば、本明細書中の後記実施例に例示される２つのロッキングドメインＬＤ４（配列番号１）およびＬＤ７（配列番号２）が含まれる。本発明に適した幾つかの他の例示的なロッキングドメインは配列番号３〜１６に示されている。ＨＩＶ−１ワクチンに関して本明細書に例示されているとおり、ロッキングドメインＬＤ４またはＬＤ７によって安定化されたＨＩＶ−１ナノ粒子ＵＦＯ三量体ワクチンは、驚くほど強力な免疫原性を示した。これらの例示配列のいずれかを有するロッキングドメインに加えて、保存的修飾変異体または実質的に同一の配列を有する変異体も使用されうる。
【００５９】
適切なロッキングドメインはタンパク質データベース（ＰＤＢ）の公知タンパク質から容易に特定されうる。例えば、二量体タンパク質は、「ホモ二量体」のようなキーワードまたは「タンパク質化学量論Ａ２」のような検索条件を使用して、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／）または他のデータベースから見つけられうる。これらの二量体タンパク質は、それらのサイズ（特に３０〜１００アミノ酸）に基づいて更にフィルタリングされうる。残りのタンパク質は、小型構造フォールドまたは他の望ましい特性を有するものを特定するために視覚的に検査されうる。本明細書に例示されているとおり、これらの手順を用いて、幾つかの二量体タンパク質を特定し、後記に詳細に記載されているとおり必要に応じて修飾した。このようにして特定された約２０個の二量体タンパク質のうち、９個を、６０量体ナノ粒子Ｅ２ｐおよびＩ３−０１を安定化させるロッキングドメインとして試験した。試験した９個のロッキングドメインの配列を以下に示す。それらの元の配列と比較して、実際に使用されるロッキングドメインの配列（配列番号１〜９）は、操作目的で、柔軟なＮ末端および／またはＣ末端における数個の残基のトランケーションを含有しうる。操作されたＬＤ９（配列番号９）の場合、元の配列のＮ末端およびＣ末端におけるトランケーションに加えて、それは残基４２におけるＳからＡへの突然変異をも含有する。
【００６０】
ＬＤ１  １ＮＩ８＿Ａ：
ＳＥＡＬＫＩＬＮＮＩＲＴＬＲＡＱＡＲＥＣＴＬＥＴＬＥＥＭＬＥＫＬＥＶＶＶＮＥＲＲ（配列番号３）
ＬＤ２  ４ＡＹＡ＿Ｂ：
ＭＮＤＣＹＳＫＬＫＥＬＶＰＳＩＰＱＮＫＫＶＳＫＭＥＩＬＱＨＶＩＤＹＩＬＤＬＱＩＡＬＤＳＨ（配列番号４）
ＬＤ３  １ＯＶＸ＿Ａ：
ＬＬＹＣＳＦＣＧＫＳＱＨＥＶＲＫＬＩＡＧＰＳＶＹＩＣＤＥＣＶＤＬＣＮＤＩＩＲＥＥＩＫＥＶＡＰＨＲＥＲ（配列番号５）
ＬＤ４  ２ＭＧ４＿Ａ：
ＦＳＥＥＱＫＫＡＬＤＬＡＦＹＦＤＲＲＬＴＰＥＷＲＲＹＬＳＱＲＬＧＬＮＥＥＱＩＥＲＷＦＲＲＫＥＱＱＩＧＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１）
ＬＤ５  ２ＪＶ７＿Ａ：
ＤＱＰＳＶＧＤＡＦＤＫＹＮＥＡＶＲＶＦＴＱＬＳＳＡＡＮＣＤＷＡＡＣＬＳＳＬＳＡＳＳＡＡＣＩＡＡＶＧＥＬＧＬＤＶＰＬＤＬＡＣＡＡＴＡＴＳＳＡＴＥＡＣＫＧＣＬＷ（配列番号６）
ＬＤ６  １ＪＲ５＿Ａ：
ＫＮＩＤＴＶＲＥＩＩＴＶＡＳＩＬＩＫＦＳＲＥＤＩＶＥＮＲＡＮＦＩＡＦＬＮＥＩＧＶＴＨＥＧＲＫＬＮＱＮＳＦＲＫＩＶＳＥＬＴＱＥＤＫＫＴＬＩＤＥＦＮＥＧＦＥＧＶＹＲＹＬＥＭＹＴＮＫ（配列番号７）
ＬＤ７  １ＰＺＱ＿Ａ：
ＳＰＡＶＤＩＧＤＲＬＤＥＬＥＫＡＬＥＡＬＳＡＥＤＧＨＤＤＶＧＱＲＬＥＳＬＬＲＲＷＮＳＲＲＡＤ（配列番号２）
ＬＤ８  １Ｒ２Ａ＿Ａ：
ＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＤＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＲ（配列番号８）
ＬＤ９  ２ＪＲＸ＿Ａ：
ＹＳＤＥＱＶＥＱＬＬＡＥＬＬＮＶＬＥＫＨＫＡＰＴＤＬＳＬＭＶＬＧＮＭＶＴＮＬＩＮＴＡＩＡＰＡＱＲＱＡ  ＩＡＮＳＦＡＲＡＬＱＳＳＩＮＥ（配列番号９）
試験したこれらのＬＤに加えて、類似した構造的特徴を有する他の二量体タンパク質も、ナノ粒子表面を安定化させるために使用されうる。そのような追加的配列の例には以下のものが含まれる。
【００６１】
１Ｌ６Ｅ＿Ａ：
ＨＭＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＤＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＲ（配列番号１０）  
１ＰＺＲ＿Ａ：
ＡＳＤＤＥＬＦＳＭＬＤＱＲＦＧＧＧＥＤＬＬＭＳＧＤＮＧＭＴＥＥＫＬＲＲＹＬＫＲＴＶＴＥＬＤＳＶＴＡＲＬＲＥＶＥＨＲＡＧＥ（配列番号１１）
１Ｒ０５＿Ａ：
ＭＡＤＫＲＡＨＨＮＡＬＥＲＫＲＲＤＨＩＫＤＳＦＨＳＬＲＤＳＶＰＳＬＱＧＥＫＡＳＲＡＱＩＬＤＫＡＴＥＹＩＱＹＭＲＲＫＶＨＴＬＱＱＤＩＤＤＬＫＲＱＮＡＬＬＥＱＱＶＲＡＬＥＧＳＧＣ（配列番号１２）
１ＴＫＶ＿Ａ：
ＭＮＫＮＩＤＴＶＲＥＩＩＴＶＡＳＩＬＩＫＦＳＲＥＤＩＶＥＮＲＡＮＦＩＡＦＬＮＥＩＧＶＴＨＥＧＲＫＬＮＱＮＳＦＲＫＩＶＳＥＬＴＱＥＤＫＫＴＬＩＤＥＦＮＥＧＦＥＧＶＹＲＹＬＥＭＹＴＮＫ（配列番号１３）
２ＤＳＭ＿Ａ：
ＭＶＥＮＰＭＶＩＮＮＷＨＤＫＬＴＥＴＤＶＱＩＤＦＹＧＤＥＶＴＰＶＤＤＹＶＩＤＧＧＥＩＩＬＲＥＮＬＥＲＹＬＲＥＱＬＧＦＥＦＫＮＡＱＬＥ（配列番号１４）
２ＪＰＱ＿Ａ：
ＭＰＩＴＳＫＹＴＤＥＱＶＥＫＩＬＡＥＶＡＬＶＬＥＫＨＡＡＳＰＥＬＴＬＭＩＡＧＮＩＡＴＮＶＬＮＱＲＶＡＡＳＱＲＫＬＩＡＥＫＦＡＱＡＬＭＳＳＬＥＴＰＫＴＨＬＥ（配列番号１５）
２Ｋ０１＿Ａ：
ＧＭＫＰＶＳＬＳＹＲＣＰＣＲＦＦＥＳＨＶＡＲＡＮＶＫＨＬＫＩＬＮＴＰＮＣＡＣＱＩＶＡＲＬＫＮＮＮＲＱＶＣＩＤＰＫＬＫＷＩＱＥＹＬＥＫＣＬＮＫ（配列番号１６）
これらの特定のＬＤおよび二量体タンパク質に加えて、既に存在する又はタンパク質データバンク（ＰＤＢ）から容易に誘導されうる、前記基準に合致する他のタンパク質も、本発明におけるロッキングドメインとして使用されうる。更に、大きな二量体タンパク質の界面形成部分またはドメインは、それが前記の構造的および機能的要件に合致する場合には、単独で働くロッキングドメインとして使用されうる。
【００６２】
Ｖ．追加的な構造成分またはモチーフ
ロッキングドメイン以外に、本発明のナノ粒子提示免疫原ワクチン構築物および得られるワクチン組成物は、追加的または代替的に、他の構造成分またはモチーフを含有しうる。幾つかの実施形態においては、本発明のロッキングドメイン安定化ナノ粒子ワクチンは、強力なＴ細胞応答を促進させるための、およびＢ細胞発生をｂＮＡｂへと誘導するためのＴ細胞エピトープを含有する。Ｔ細胞エピトープは、ナノ粒子表面上の免疫原ポリペプチドの提示に影響を及ぼさない限り、その他の構造成分に対して任意の位置に位置しうる。したがって、幾つかの実施形態においては、Ｔ細胞エピトープは、例えば、Ｔ細胞エピトープのＮ末端をナノ粒子サブユニットのＣ末端に融合させることにより、ナノ粒子サブユニットのＣ末端に位置する。幾つかの他の実施形態においては、Ｔ細胞エピトープは免疫原ポリペプチドのＣ末端とナノ粒子サブユニットのＮ末端との間に位置する。当技術分野で公知の任意のＴ細胞エピトープ配列またはペプチドが本発明の実施において使用されうる。それらは、ＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有する任意のポリペプチド配列であって、免疫化に際してＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を有効に活性化しうるポリペプチド配列（例えば、ＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞を活性化するＴヘルパーエピトープ）を含む。例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １，７５１−７６１，１９９４；Ａｈｌｅｒｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：１６７７−１６８５，２００１；Ｆｒａｓｅｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ  ３２，２８９６−２９０３，２０１４；Ｄｅ  Ｇｒｏｏｔら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：２５５−２６９，２００２；およびＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２１：２２５−２３２，２０１４を参照されたい。幾つかの好ましい実施形態においては、使用されるＴヘルパーエピトープは普遍的な汎反応性Ｔ細胞エピトープペプチドＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号１８）（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １，７５１−７６１，１９９４）である。適切なＴ細胞エピトープの他の例には、ペプチドＱＳＩＡＬＳＳＬＭＶＡＱＡＩＰ（配列番号１９）およびＩＬＭＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＰＭＧＬＰＱＳＩＡＬＳＳＬＭＶＡＱ（配列番号２０）、またはこれらの例示Ｔ細胞エピトープペプチドのいずれかの保存的修飾変異体もしくは実質的に同一（例えば、少なくとも９０％、９５％または９９％同一）の配列が含まれる。
【００６３】
本明細書に記載されているロッキングドメインおよび他の構造成分の代わりに又はそれらに加えて、本発明の幾つかのナノ粒子ワクチンは、ナノ粒子の表面上の免疫原の提示を促進させるネック領域またはドメインを含有する。マラリアワクチン用のＰＣＳＫ９ワクチンおよび熱帯熱マラリア原虫免疫原Ｐｆｓ２５に関して本明細書に例示されているとおり、ネック領域は、ウイルスタンパク質に由来する３ヘリックスバンドルを構成する。典型的には、ネックドメインは免疫原とナノ粒子サブユニットとの間に挿入され、それにより、免疫原ポリペプチドをナノ粒子表面から上昇させる。所望により、ネックドメインの挿入のために、リンカー配列（例えば、１０ＧＳリンカー）が使用される。ネックドメインのための適切なタンパク質の例には、本明細書に例示されているヘンドラウイルスドメイン（ＰＤＢ  ＩＤ：４ＨＥＯ）および麻疹ウイルスドメイン（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＯＫＳ）に由来するヘリックスバンドルが含まれる。示されているとおり、そのような構造設計は、得られるナノ粒子ワクチンの収量および純度を更に改善しうる。
【００６４】
本明細書に記載されているロッキングドメインおよび他の構造成分の代わりに又はそれらに加えて、本発明の幾つかのナノ粒子ワクチンは、免疫原ポリペプチドを安定化させるように働くタンパク質ドメインを含有しうる。幾つかの実施形態においては、この目標を達成するために使用されるタンパク質ドメインは、当技術分野でよく知られているＴ４フィブリチン（フォールドン）のＣ末端三量体化モチーフでありうる。このフォールドンドメインは、バクテリオファージＴ４からの三量体タンパク質フィブリチンのＣ末端の３０アミノ酸残基を構成し、フィブリチンのフォールディングおよび三量体化を促進させるように機能する。例えば、Ｐａｐａｎｉｋｏｌｏｐｏｕｌｏｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：８９９１−８９９８，２００４；およびＧｕｔｈｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３７：９０５−９１５，２００４を参照されたい。ＭＥＲＳ−ＣｏＶワクチン用のＳスパイク三量体に関して本明細書に例示されているとおり、このタンパク質ドメインはＳスパイクサブユニットとナノ粒子サブユニットとの間に容易に挿入されうる。所望により使用されうるリンカー（例えば、１０ＧＳリンカー）が挿入に使用されうる。ナノ粒子サブユニットのＣ末端に挿入されるロッキングドメインとは異なり、このタンパク質ドメイン（フォールドン）はナノ粒子サブユニットのＮ末端に挿入される。ＭＥＲＳ−ＣｏＶワクチンに関して本明細書に示されているとおり、そのような構造成分（例えば、フォールドン）は、単独で、またはロッキングドメインと組合せて使用された場合、ナノ粒子の表面上に提示される免疫原の安定性を増強しうる。
【００６５】
種々の実施形態においては、本明細書に記載されている免疫原ポリペプチドまたはタンパク質のいずれか（例えば、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来三量体免疫原）を提示するナノ粒子は、免疫原ポリペプチドまたは多量体免疫原タンパク質（例えば、三量体免疫原）のサブユニットをナノ粒子のサブユニット（例えば、Ｅ２ｐまたはＩ３−０１サブユニット）およびロッキングドメインならびに本明細書に記載されているその他の随意的（すなわち、所望により使用されうる）または代替的成分に融合させることにより構築されうる。本発明のナノ粒子提示融合ワクチン免疫原を構築するためには、連結を容易にし、異なる成分の構造的完全性を維持するために、１以上のリンカーモチーフまたは部分が使用されうる。したがって、幾つかの実施形態においては、免疫原ポリペプチド（例えば、ＨＩＶ−１三量体タンパク質サブユニット）のＣ末端をナノ粒子サブユニットのＮ末端に連結するために、リンカーモチーフが使用されうる。追加的または代替的に、ナノ粒子サブユニットのＣ末端（または免疫原ポリペプチドのＣ末端）をロッキングドメインのＮ末端に連結するために、第２のリンカーモチーフが使用されうる。幾つかの他の実施形態においては、Ｔ細胞エピトープを連結するために、例えば、ロッキングドメインのＣ末端をＴ細胞エピトープのＮ末端に連結するために、またはＴ細胞エピトープのＣ末端をロッキングドメインのＮ末端に連結するために、第３のリンカーモチーフが使用されうる。本明細書に例示されているとおり、ネックドメインまたはフォールドンドメインをナノ粒子ワクチン構築物内に挿入するためにも、リンカーが使用されうる。典型的には、リンカーモチーフは短いペプチド配列を含有する。種々の実施形態においては、リンカーまたはリンカーモチーフは、２つのタンパク質ドメインを、それらの機能を妨げることなく連結する任意の柔軟なペプチドでありうる。例えば、該構築物において使用されるこれらのリンカーはいずれも、（ＧａＳｂ）ｎ（ここで、ａは約１〜５の整数であり、ｂは約０〜２の整数であり、ｎは約１〜５の整数である）の配列を有する、ＧＣに富むペプチドでありうる。幾つかの他の実施形態においては、Ｔ細胞エピトープは、免疫原ポリペプチドのＣ末端とナノ粒子サブユニットのＮ末端との間のリンカーまたはリンカーの一部として使用されうる。
【００６６】
本明細書に記載されている本発明の新規構造成分（例えば、ロッキングドメインで安定化されたＨＩＶ−１三量体免疫原）含有するワクチン組成物は、本明細書（例えば、実施例１〜１５）に記載されている方法および／または当技術分野で記載されている他の方法［Ｈｅら，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．７，１２０４１，２０１６；Ｋｏｎｇら，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．７，１２０４０，２０１６；およびＨｅら，Ｓｃｉ  Ａｄｖ．４（１１）：ｅａａｕ６７６９，２０１８］に従い組換え法により構築されうる。例示として、２つの特定のＨＩＶ−１ナノ粒子ワクチン構築物が本明細書に記載されている。第１の構築物は、Ｎ末端からＣ末端への方向に以下のものを含有する融合ポリペプチドを発現する：ＨＩＶ−１  ＵＦＯ  ＢＧ５０５．ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０サブユニット、Ｅ２ｐサブユニット（例えば、配列番号２１）、前記のリンカーモチーフ（ＧａＳｂ）ｎ［例えば、（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号２４）］、配列番号１（ＬＤ４）に示されているロッキングドメイン、およびＴ細胞エピトープ（例えば、配列番号１８に示されているＰＡＤＲＥエピトープ）。所望により、免疫原ポリペプチド（例えば、ＨＩＶ−１ワクチンのためのｇｐ１４０サブユニット）は、リンカー配列、例えば、ＧＧＧＧＳ（配列番号１７）または（ＧＧＧＧＳ）２（例えば、配列番号２４）を介してナノ粒子サブユニット（例えば、Ｅ２ｐ）に連結されうる。第２の構築物は、Ｎ末端からＣ末端への方向に以下のものを含有する融合ポリペプチドを発現する：ＨＩＶ−１  ＵＦＯ  ＢＧ５０５．ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０、リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号２４）、Ｉ３−０１サブユニット（例えば、配列番号２２または２５）、前記の第２のリンカー（ＧａＳｂ）ｎ［例えば、ＧＧＧＧＳ（配列番号１７）］、配列番号２（ＬＤ７）に示されているロッキングドメイン、およびＴ細胞エピトープ（例えば、配列番号１８に示されているエピトープ）。所望により、本発明のワクチン構築物のいずれかにおいて、ロッキングドメインとＴ細胞エピトープとの間にジペプチドリンカーＧＳが挿入されうる。ワクチン免疫原（例えば、ＨＩＶ−１ナノ粒子免疫原）の抗原性および構造的完全性は、標準的なアッセイ、例えば抗体結合アッセイおよびネガティブ染色電子顕微鏡法（ＥＭ）によって容易に分析されうる。本明細書に例示されているとおり、融合分子は全て、Ｅｎｖ由来三量体（例えば、ｇｐ１４０）の免疫原性エピトープを提示するナノ粒子へと自己組織化しうる。頑強な三量体特異的ｂｎＡｂを誘導することにより、本発明のナノ粒子ワクチンは、本明細書に例示されている広範なウイルス（例えば、ＨＩＶ−１、エボラ、ラッサおよびＨＣＶウイルス）に対して個体にワクチン接種するのに有用である。
【００６７】
ＶＩ．提示スキャフォールド
本発明のワクチンの構築において免疫原タンパク質またはポリペプチド（例えば、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ三量体タンパク質）を提示するために、任意の異種スキャフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）が使用されうる。これには、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、例えばバクテリオファージＱβ  ＶＬＰおよびナノ粒子が含まれる。幾つかの好ましい実施形態においては、三量体ＨＩＶ−１タンパク質を提示またはディスプレイするための異種スキャフォールドは自己組織化ナノ粒子である。本発明のワクチン組成物を製造する際に、種々のナノ粒子プラットフォームが使用されうる。一般に、本発明で使用されるナノ粒子は単一サブユニットの複数コピーにより形成される必要がある。ナノ粒子は典型的には球形であり、および／または回転対称性（例えば、３回軸および５回軸）を有し、例えば、本明細書に例示されている二十面体構造を有する。追加的または代替的に、粒子サブユニットのアミノ末端は露出している必要があり、３回軸に接近している必要があり、３つのアミノ末端の間隔は種々のＨＩＶ−１三量体成分のカルボキシオール末端の間隔と厳密に一致している必要がある。幾つかの好ましい実施形態においては、免疫原は、約２０ｎｍ以下の直径（通常は１２、２４または６０個のサブユニットから構成される）および粒子表面上の３回軸を有する自己組織化ナノ粒子を含む。そのようなナノ粒子は、本明細書に例示されているとおり、多価ＨＩＶ−１三量体ワクチンを製造するための適切な粒子プラットフォームを提供する。
【００６８】
幾つかの好ましい実施形態においては、免疫原タンパク質またはポリペプチド（例えば、ＨＩＶ−１三量体タンパク質）は、自己組織化ナノ粒子、例えば、本明細書に例示されているフェリチン（ＦＲ）、Ｅ２ｐおよびＩ３−０１に由来する自己組織化ナノ粒子上で提示される。Ｅ２ｐはバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のジヒドロリポイルアシルトランスフェラーゼの再設計変異体であり、これは熱安定性６０量体ナノ粒子へと自己組織化することが示されている。例えば、Ｈｅら，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．７：１２０４１，２０１６を参照されたい。同様に、Ｉ３−０１は、超安定性ナノ粒子へと自己組織化しうる操作されたタンパク質である。例えば、Ｈｓｉａら，Ｎａｔｕｒｅ  ５３５，１３６−１３９，２０１６を参照されたい。これらのタンパク質のサブユニットの配列は当技術分野で公知である。例えば、ＷＯ２０１７／１９２４３４を参照されたい。本明細書に例示されているＥ２ｐおよびＩ３−０１ナノ粒子サブユニットのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２１および２２に示されている。元の配列と比較して、配列番号２１に示されているＥ２ｐ配列は、以下の配列において強調表示されているとおり、残基９２にＡｌａ置換を含有する。配列番号２２に示されているＩ３−０１サブユニット配列に加えて、配列番号２５に示されている再設計Ｉ３−０１サブユニット配列も本発明の実施において使用されうる。種々の実施形態においては、本発明のＨＩＶ−１ナノ粒子ワクチンは、これらの公知ナノ粒子のいずれか、およびそれらの保存的修飾変異体または実質的に同一（例えば、少なくとも９０％、９５％または９９％同一）の配列を有する変異体を使用しうる。
【００６９】
Ｅ２ｐサブユニット配列（配列番号２１）
ＡＡＡＫＰＡＴＴＥＧＥＦＰＥＴＲＥＫＭＳＧＩＲＲＡＩＡＫＡＭＶＨＳＫＨＴＡＰＨＶＴＬＭＤＥＡＤＶＴＫＬＶＡＨＲＫＫＦＫＡＩＡＡＥＫＧＩＫＬＴＦＬＰＹＶＶＫＡＬＶＳＡＬＲＥＹＰＶＬＮＴＡＩＤＤＥＴＥＥＩＩＱＫＨＹＹＮＩＧＩＡＡＤＴＤＲＧＬＬＶＰＶＩＫＨＡＤＲＫＰＩＦＡＬＡＱＥＩＮＥＬＡＥＫＡＲＤＧＫＬＴＰＧＥＭＫＧＡＳＣＴＩＴＮＩＧＳＡＧＧＱＷＦＴＰＶＩＮＨＰＥＶＡＩＬＧＩＧＲＩＡＥＫＰＩＶＲＤＧＥＩＶＡＡＰＭＬＡＬＳＬＳＦＤＨＲＭＩＤＧＡＴＡＱＫＡＬＮＨＩＫＲＬＬＳＤＰＥＬＬＬＭ
Ｉ３−０１サブユニット配列（配列番号２２）
ＭＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＫＫＫＡＬＡＶＦＬＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＥＬＳＦＬＫＥＭＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＣＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＣＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤＮＶＣＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＰＶＥＶＡＥＫＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧＣＴＥ
Ｉ３−０１−ｊｚ９変異体配列（配列番号２５）
ＭＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＫＭＫＡＬＡＶＦＶＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＥＬＳＦＬＫＥＬＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＣＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＣＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤＮＶＣＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＩＡＥＶＡＡＫＡＡＡＦＶＥＫＩＲＧＣＴＥ
フェリチン配列（配列番号２６）
ＭＬＳＫＤＩＩＫＬＬＮＥＱＶＮＫＥＭＮＳＳＮＬＹＭＳＭＳＳＷＣＹＴＨＳＬＤＧＡＧＬＦＬＦＤＨＡＡＥＥＹＥＨＡＫＫＬＩＩＦＬＮＥＮＮＶＰＶＱＬＴＳＩＳＡＰＥＨＫＦＥＧＬＴＱＩＦＱＫＡＹＥＨＥＱＨＩＳＥＳＩＮＮＩＶＤＨＡＩＫＳＫＤＨＡＴＦＮＦＬＱＷＹＶＡＥＱＨＥＥＥＶＬＦＫＤＩＬＤＫＩＥＬＩＧＮＥＮＨＧＬＹＬＡＤＱＹＶＫＧＩＡＫＳＲＫＳ
これら例示ナノ粒子配列に加えて、当技術分野で公知の多数の他のナノ粒子またはＶＬＰも本発明の実施において使用されうる。これらには、例えば、アキフェックス・エオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）ルマジンシンターゼ、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  Ｍａｒｉｔｉｍａ）エンカプスリン（ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）、ミキソコッカス・ザンサス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓ）エンカプスリン、バクテリオファージＱベータウイルス粒子、フロックハウスウイルス（ＦＨＶ）粒子、ＯＲＳＡＹウイルス粒子および伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）粒子が含まれる。
【００７０】
前記のとおり、本発明のワクチンの設計においては多数のワクチン免疫原が使用されうる。これらには、種々のウイルス免疫原および非ウイルスタンパク質が含まれる。ＨＩＶ−１ワクチンの場合、任意のＥｎｖ由来ＨＩＶ−１三量体タンパク質がナノ粒子提示ワクチン組成物において使用されうる。Ｅｎｖ由来三量体タンパク質は種々のＨＩＶ−１株から得られうる。幾つかの実施形態においては、ナノ粒子は、天然三量体形態の、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖに基づく糖タンパク質またはドメイン、例えばｇｐ１４０、ｇｐ１２０またはＶ１Ｖ２ドメインを提示する。幾つかの実施形態においては、使用されるＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来三量体タンパク質は未切断融合前最適化（ＵＦＯ）ｇｐ１４０三量体である。幾つかの実施形態においては、Ｅｎｖ由来三量体はＨＩＶ−１株ＢＧ５０５、例えばＢＧ５０５．ＳＯＳＩＰ．６６４ｇｐ１４０三量体に由来する。幾つかの実施形態においては、ナノ粒子は、修飾されたｇｐ１４０三量体免疫原、例えば、Ｋｏｎｇら，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．７，１２０４０，２０１６に記載されているＨＲ１修飾ｇｐ１４０三量体（「ＵＦＯ三量体」）を提示する。このＨＲ１修飾ｇｐ１４０三量体タンパク質のサブユニットのアミノ酸配列は配列番号２３に示されている。幾つかの実施形態においては、本発明において使用されるＨＩＶ−１三量体免疫原はＵＦＯ２−ＢＧ三量体でありうる。ＵＦＯ２−ＢＧ三量体は、（１）再設計されたＨＲ１  Ｎ末端ベンドと切断部位リンカーとを有するＢＧ５０５  ｇｐ４１ドメイン（Ｋｏｎｇら，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．７，１２０４０，２０１６に記載されているとおり）と、（２）他の多様なＨＩＶ−１株または亜型の１つからのｇｐ１２０タンパク質とを含有するキメラｇｐ１４０三量体である。ＢＧ５０５株由来の再設計ｇｐ４１ＥＣＴＯドメインに加えて、本発明に適したキメラｇｐ１４０三量体におけるｇｐ４１ドメインも、ＨＩＶ−１配列データベースから誘導されるコンセンサスｇｐ４１ＥＣＴＯドメインでありうる。また、本発明のＨＩＶ−１ナノ粒子ワクチンを構築する際には、本明細書に記載されている種々のＨＩＶ−１三量体タンパク質の保存的修飾変異体またはその実質的に同一の配列を有する変異体が使用されうる。
【００７１】
ＨＲ１修飾ｇｐ１４０三量体の配列（配列番号２３）
ＡＥＮＬＷＶＴＶＹＹＧＶＰＶＷＫＤＡＥＴＴＬＦＣＡＳＤＡＫＡＹＥＴＥＫＨＮＶＷＡＴＨＡＣＶＰＴＤＰＮＰＱＥＩＨＬＥＮＶＴＥＥＦＮＭＷＫＮＮＭＶＥＱＭＨＴＤＩＩＳＬＷＤＱＳＬＫＰＣＶＫＬＴＰＬＣＶＴＬＱＣＴＮＶＴＮＮＩＴＤＤＭＲＧＥＬＫＮＣＳＦＮＭＴＴＥＬＲＤＫＫＱＫＶＹＳＬＦＹＲＬＤＶＶＱＩＮＥＮＱＧＮＲＳＮＮＳＮＫＥＹＲＬＩＮＣＮＴＳＡＩＴＱＡＣＰＫＶＳＦＥＰＩＰＩＨＹＣＡＰＡＧＦＡＩＬＫＣＫＤＫＫＦＮＧＴＧＰＣＰＳＶＳＴＶＱＣＴＨＧＩＫＰＶＶＳＴＱＬＬＬＮＧＳＬＡＥＥＥＶＭＩＲＳＥＮＩＴＮＮＡＫＮＩＬＶＱＦＮＴＰＶＱＩＮＣＴＲＰＮＮＮＴＲＫＳＩＲＩＧＰＧＱＡＦＹＡＴＧＤＩＩＧＤＩＲＱＡＨＣＮＶＳＫＡＴＷＮＥＴＬＧＫＶＶＫＱＬＲＫＨＦＧＮＮＴＩＩＲＦＡＮＳＳＧＧＤＬＥＶＴＴＨＳＦＮＣＧＧＥＦＦＹＣＮＴＳＧＬＦＮＳＴＷＩＳＮＴＳＶＱＧＳＮＳＴＧＳＮＤＳＩＴＬＰＣＲＩＫＱＩＩＮＭＷＱＲＩＧＱＡＭＹＡＰＰＩＱＧＶＩＲＣＶＳＮＩＴＧＬＩＬＴＲＤＧＧＳＴＮＳＴＴＥＴＦＲＰＧＧＧＤＭＲＤＮＷＲＳＥＬＹＫＹＫＶＶＫＩＥＰＬＧＶＡＰＴＲＣＫＲＲＶＶＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＶＧＩＧＡＶＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＡＳＭＴＬＴＶＱＡＲＮＬＬＳＧＮＰＤＷＬＰＤＭＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＶＬＡＶＥＲＹＬＲＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣＣＴＮＶＰＷＮＳＳＷＳＮＲＮＬＳＥＩＷＤＮＭＴＷＬＱＷＤＫＥＩＳＮＹＴＱＩＩＹＧＬＬＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＤＬＬＡＬＤ
ＶＩＩ．ポリヌクレオチドおよび発現構築物
本発明のワクチン組成物は、典型的には、まず、本明細書に記載されている種々の構造成分の機能的連結コード配列を含有する発現構築物（すなわち、発現ベクター）を作製することにより製造される。したがって、幾つかの関連態様においては、本発明は、本明細書に記載されている新規構造成分（例えば、ロッキングドメインで安定化されたＨＩＶ−１  Ｅｎｖ三量体提示ナノ粒子）を含有するナノ粒子提示免疫原をコードする実質的に精製されたポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含有する発現ベクター（例えば、本明細書に例示されているＣＭＶベクター）、およびワクチン免疫原を製造するための宿主細胞（例えば、本明細書に例示されているＥｘｐｉＣＨＯ細胞）を提供する。該ポリヌクレオチドによりコードされる、または該ベクターから発現される融合ポリペプチドも、本発明に含まれる。本明細書に記載されているとおり、そのようなポリペプチドは、表面上に免疫原ポリペプチドまたはタンパク質を提示するナノ粒子ワクチンへと自己組織化する。
【００７２】
ポリヌクレオチドおよび関連ベクターは、標準的な分子生物学的技術または本明細書に例示されている方法を用いて容易に作製されうる。例えば、クローニング、トランスフェクション、一過性遺伝子発現および安定なトランスフェクト化細胞系の入手のための一般的なプロトコルは当技術分野において例えば以下のものに記載されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，（３ｒｄ  ｅｄ．，２０００）；およびＢｒｅｎｔら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ｒｉｎｇｂｏｕ  ｅｄ．，２００３）。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への突然変異の導入は、例えば以下のものに記載されているとおりに行われうる：ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ（編），Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９２；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓら（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０；Ｍａｔｔｉｌａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：９６７，１９９１；およびＥｃｋｅｒｔら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：１７，１９９１。
【００７３】
個々のベクターの選択は、融合ポリペプチドの意図される用途に左右される。例えば、選択されたベクターは、所望の細胞型において、その細胞型が原核生物であろうと真核生物であろうと、融合ポリペプチドの発現を駆動しうるものでなければならない。多数のベクターは、機能的に連結された遺伝子配列の原核生物ベクター複製と真核生物発現との両方を可能にする配列を含有する。本発明に有用なベクターは自律複製可能であり、すなわち、該ベクターは染色体外に存在し、その複製は宿主細胞のゲノムの複製に必ずしも直接関連しているわけではない。あるいは、ベクターの複製は宿主の染色体ＤＮＡの複製に関連づけられることが可能であり、例えば、ベクターは、レトロウイルスベクターにより、および安定にトランスフェクトされた細胞系において達成されるように、宿主細胞の染色体内に組み込まれうる。哺乳類宿主細胞内で免疫原を製造するためには、ウイルスに基づく発現ベクターおよび非ウイルス発現ベクターの両方が使用されうる。非ウイルスベクターおよび系には、プラスミド、エピソームベクター、（典型的には、タンパク質またはＲＮＡを発現させるための発現カセットを含有する）およびヒト人工染色体が含まれる（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：３４５，１９９７を参照されたい）。有用なウイルスベクターには、レンチウイルスまたは他のレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、乳頭腫ウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルス、ワクシニアウイルスおよびセムリキフォレストウイルス（ＳＦＶ）に基づくベクターが含まれる。Ｂｒｅｎｔら，前掲；Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：８０７，１９９５；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ  ６８：１４３，１９９２を参照されたい。
【００７４】
融合ポリペプチドを発現させるために使用される具体的なベクターに応じて、種々の公知の細胞または細胞系が本発明の実施に使用されうる。宿主細胞は、本発明の融合体を含有する組換えベクターが導入されうる任意の細胞であることが可能であり、ここで、該ベクターは融合ポリペプチドの発現を駆動することを可能にし、本発明において有用である。それは幾つかの細菌株のいずれかのような原核生物であることが可能であり、あるいは酵母または他の真菌細胞、昆虫もしくは両生類細胞または例えばげっ歯類、サルまたはヒト細胞を含む哺乳類細胞のような真核生物であることが可能である。本発明の融合ポリペプチドを発現する細胞は初代培養細胞であることが可能であり、あるいは樹立細胞系であることが可能である。したがって、本明細書に例示されている細胞系（例えば、ＣＨＯ細胞）に加えて、当技術分野でよく知られている多数の他の宿主細胞系も本発明の実施において使用されうる。これらには、例えば、種々のＣｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３、ＡｔＴ２０、ＢＶ２およびＮ１８細胞、骨髄腫細胞系、形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマが含まれる。
【００７５】
ポリペプチドを発現する哺乳類組織細胞培養の使用は、例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．，１９８７において全般的に考察されている。融合ポリペプチド発現ベクターは、当業者に公知の多数の適切な方法のいずれかにより、選択された宿主細胞内に導入されうる。哺乳類細胞内への融合ポリペプチドコード化ベクターの導入のためには、用いられる方法はベクターの形態に左右されるであろう。プラスミドベクターの場合には、融合ポリペプチド配列をコードするＤＮＡは、例えば脂質媒介性トランスフェクション（「リポフェクション」）、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーションまたはリン酸カルシウム沈殿を含む多数のトランスフェクション方法のいずれかにより導入されうる。これらの方法は、例えばＢｒｅｎｔ，前掲に詳細に記載されている。多種多様な形質転換細胞および非形質転換細胞または初代細胞の一過性トランスフェクションに適したリポフェクション試薬および方法が広範に利用可能であり、したがって、リポフェクションは、真核生物、特に培養内の哺乳類細胞内に構築物を導入するための魅力的な方法となっている。例えば、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＬｉｐｏＴａｘｉ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）キットが利用可能である。リポフェクション用の試薬および方法を提供している他の企業には、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＬＯＮＴＥＣＨ、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＪＢＬ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、ＰａｎＶｅｒａ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＷａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡが含まれる。
【００７６】
組換え融合ポリペプチドの長期間にわたる高収量製造のためには、安定な発現が好ましい。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用する代わりに、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択マーカーにより制御される融合ポリペプチドコード化配列で宿主細胞を形質転換することが可能である。組換えベクターにおける選択マーカーは選択に対する耐性を付与し、細胞がその染色体にベクターを安定して組み込むことを可能にする。一般に使用される選択マーカーには、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１，１９８１）、およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら，Ｇｅｎｅ，３０：１４７，１９８４）が含まれる。適切な選択により、トランスフェクトされた細胞は、融合ポリペプチドをコードする配列の組み込みコピーを含有しうる。
【００７７】
ＶＩＩＩ．医薬組成物および治療用途
もう１つの態様においては、本発明は、本明細書に記載されている新規構造成分（例えば、ロッキングドメイン）を含有するナノ粒子ワクチン組成物を使用する医薬組成物および関連治療方法を提供する。幾つかの実施形態においては、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ三量体ワクチン組成物は、ＨＩＶ−１感染を予防および治療するために使用されうる。種々の他の実施形態においては、本明細書に記載されている種々のウイルス性または非ウイルス性免疫原を含有するナノ粒子ワクチンは、対応する疾患、例えば、種々の病原体により引き起こされる感染症を予防または治療するために使用されうる。本発明の幾つかの実施形態は、エボラウイルス感染を予防または治療するためのＥＢＯＶワクチンの使用に関する。本発明の幾つかの実施形態は、ラッサウイルス感染を予防または治療するためのＬＡＳＶワクチンの使用に関する。本発明の幾つかの他の実施形態は、ＲＳＶ感染を予防または治療するための、本明細書に記載されているＲＳＶワクチンの使用に関する。本発明の幾つかの他の実施形態は、ＨＣＶ感染を予防または治療するための、本明細書に記載されているＨＣＶワクチンの使用に関する。本発明の更に幾つかの他の実施形態は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染を予防または治療するための、本明細書に記載されているＣｏＶワクチンの使用に関する。幾つかの他の実施形態においては、本発明は、ジカウイルス感染を予防または治療するための、ＺＩＫＶワクチンの使用方法を提供する。幾つかの他の実施形態においては、本発明は、マラリアを予防または治療するための、熱帯熱マラリア原虫免疫原（例えば、Ｐｆｓ２５）由来のワクチンの使用方法を提供する。幾つかの他の実施形態においては、本発明は、結核を予防または治療するための、結核菌免疫原Ａｇ８５ＡまたはＭｔｂ７２由来のワクチンの使用方法を提供する。更に幾つかの他の実施形態においては、本発明は、ヒト対象においてＬＤＬコレステロールを低下させるための、ＰＣＳＫ９ワクチンの使用方法を提供する。
【００７８】
本発明の種々の治療法の実施においては、疾患または病態（例えば、ＨＩＶ−１感染症またはマラリア）の予防または治療を要する対象に、本明細書に記載されている対応ナノ粒子ワクチン、免疫原ポリペプチドまたはコード化ポリペプチドを投与する。典型的には、本明細書に開示されているナノ粒子ワクチン、免疫原ポリペプチドまたはコード化ポリヌクレオチドは医薬組成物中に含まれる。該医薬組成物は治療用製剤または予防用製剤のいずれかでありうる。典型的には、該組成物は更に、１以上の薬学的に許容されるビヒクル、そして所望により、他の治療成分（例えば、抗生物質または抗ウイルス薬）を含む。種々の薬学的に許容される添加物も該組成物において使用されうる。
【００７９】
したがって、本発明の医薬組成物の幾つかはワクチン組成物である。ワクチン組成物においては、適切なアジュバントが追加的に配合されうる。適切なアジュバントの例には、例えば、水酸化アルミニウム、レシチン、フロイントアジュバント、ＭＰＬ（商標）およびＩＬ−１２が含まれる。幾つかの実施形態においては、本明細書に開示されているワクチン組成物またはナノ粒子免疫原（例えば、ＨＩＶ−１ワクチンまたはマラリアワクチン組成物）は制御放出（コントロールリリース）または徐放性製剤として製剤化されうる。これは、徐放性ポリマーを含有する組成物において、またはマイクロカプセル化送達系もしくは生体接着性ゲルにより達成されうる。種々の医薬組成物は、当技術分野でよく知られた標準的な方法に従い製造されうる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９５；Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８）；米国特許第４，６５２，４４１号および第４，９１７，８９３号；米国特許第４，６７７，１９１号および第４，７２８，７２１号；ならびに米国特許第４，６７５，１８９号を参照されたい。
【００８０】
本発明の医薬組成物は、対象においてＨＩＶ−１感染を治療するために又はＨＩＶ−１に対する免疫応答を惹起するために、種々の治療用途または予防用途において、例えば、対象においてＨＩＶ−１感染またはマラリアを治療するために、または対象においてＨＩＶ−１または熱帯熱マラリア原虫に対する免疫応答を誘導するために容易に使用されうる。種々の実施形態においては、ワクチン組成物は、ナノ粒子ワクチンにおける提示免疫原ポリペプチドが由来する病原体により引き起こされる感染症を治療または予防するために使用されうる。したがって、本発明のワクチン組成物は、種々のウイルス（例えば、ＨＩＶ−１、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ラッサウイルス、ＲＳＶ、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、ＨＣＶ、デングウイルスまたはジカウイルス）または他の病原体［例えば、結核菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））のような細菌および熱帯熱マラリア原虫（プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ））のような寄生生物］により引き起こされる感染症を治療または予防するための多様な臨床状況において使用されうる。それらはまた、哺乳動物対象（例えば、ヒト）における内因性標的に対する所望の免疫応答を誘導するために、例えば、ＰＣＳＫ９またはグレリンに対する抗体応答を誘導するために使用されうる。特に示されていない限り、ＨＩＶ−１ワクチン組成物の治療用途を例示するために本明細書に記載されている開示は、いずれかの他のウイルス性または非ウイルス性免疫原を提示するナノ粒子ワクチンに同様に適用されうる。
【００８１】
例示として、ＨＩＶ−１ナノ粒子ワクチン組成物は、ＨＩＶ−１に対する免疫応答を誘導するために、例えば、ＨＩＶ−１に対する広域中和抗体の産生を誘導するために、対象に投与されうる。ＨＩＶ感染の発生のリスクを有する対象には、本発明のワクチン組成物を投与して、ウイルス感染に対する予防的防御をもたらすことが可能である。本明細書に記載されているその他の免疫原に由来するワクチンの治療的適用および予防的適用が同様に実施されうる。具体的な対象および病態に応じて、本発明の医薬組成物は、当業者に公知の種々の投与方法により、例えば、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、関節内、腹腔内または非経口経路により対象に投与されうる。一般に、医薬組成物は、選択された疾患もしくは病態またはその１以上の症状を予防、抑制および／または改善するのに十分な時間にわたり、およびそれらのための十分な条件下で、そのような治療を要する対象に投与される。免疫原性組成物は、ＨＩＶ−１に対する免疫応答を誘導するのに十分な量で投与される。治療用途には、該組成物は、本明細書に記載されているＨＩＶ−１ナノ粒子免疫原の治療的有効量を含有すべきである。予防用途には、該組成物は、本明細書に記載されているＨＩＶ−１ナノ粒子免疫原の予防的有効量を含有すべきである。免疫原の適切な量は、治療または予防される具体的な疾患または病態、重症度、対象の年齢、および具体的な対象の他の個人的属性（例えば、対象の健康の全般的状態および対象の免疫系の頑健性）に基づいて決定されうる。有効投与量の決定は更に、動物モデル研究、およびそれに続く、ヒトでの臨床試験により導かれ、対象における標的疾患症状または病態の発生頻度または重症度を有意に低減する投与プロトコールにより導かれる。
【００８２】
予防用途には、免疫原性組成物は、いずれかの症状に先立って、例えば、感染に先立って投与される。免疫原性組成物の予防投与は、いずれかの後の感染を予防または改善するのに役立つ。したがって、幾つかの実施形態においては、治療される対象は、例えばウイルス（例えば、ＨＩＶ感染）に対する曝露または曝露の可能性ゆえに、感染（例えば、ＨＩＶ感染）を有する者または感染の発生リスクを有する者である。開示されている治療用組成物の治療的有効量の投与の後、対象は、感染（例えば、ＨＩＶ−１感染）、感染（例えば、ＨＩＶ−１感染）に関連する症状またはその両方に関してモニターされうる。
【００８３】
治療用途には、免疫原性組成物は、疾患または感染の発生開始時または発生開始後、例えば、感染（例えば、ＨＩＶ−１感染）の症状の発生の後または感染の診断の後に投与される。したがって、免疫原性組成物は、感染および／または関連疾患症状の予想される重症度、持続時間または度合を低減するために、ＨＩＶウイルスへの予想される曝露の前に、またはウイルスへの曝露の後もしくは該曝露が疑われた後、または感染の実際の開始の後に投与されうる。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、関連病原体による感染（例えば、ＨＩＶ感染）を治療または予防するための当技術分野で公知の他の物質と組合されうる。再びＨＩＶ−１感染を例示として用いると、これらの公知物質には、例えば抗体、または他の抗ウイルス剤、例えばヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、例えばアバカビル（ａｂａｃａｖｉｒ）、ＡＺＴ、ジダノシン（ｄｉｄａｎｏｓｉｎｅ）、エムトリシタビン（ｅｍｔｒｉｃｉｔａｂｉｎｅ）、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）、スタブジン（ｓｔａｖｕｄｉｎｅ）、テノホビル（ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ）、ザルシタビン（ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）、ジドブジン（ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ）など、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、例えばデラビルジン（ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ）、エファビレンツ（ｅｆａｖｉｒｅｎｚ）、ネビラピン（ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ）、プロテアーゼインヒビター、例えばアンプレナビル（ａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）、アタザナビル（ａｔａｚａｎａｖｉｒ）、インジナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）、ロピナビル（ｌｏｐｉｎａｖｉｒ）、ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ）、オサムプレナビル（ｏｓａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）、リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）、サキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ）、チプラナビル（ｔｉｐｒａｎａｖｉｒ）など、および融合タンパク質インヒビター、例えばエンフビルチド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）などが含まれる。該医薬組成物および該公知抗ＨＩＶ剤の投与は同時または連続的でありうる。
【００８５】
本発明に記載されている新規構造成分を含有するナノ粒子ワクチン組成物（例えば、ロッキングドメインで安定化されたＨＩＶ−１ワクチン）または本発明の医薬組成物はキットの成分として提供されうる。所望により、そのようなキットは、追加的成分、例えばパッケージング、説明、ならびに種々の他の試薬、例えばバッファー、基質、抗体またはリガンド、例えば対照抗体もしくはリガンド、および検出試薬を含みうる。所望により含まれうる説明書が更に、キットにおいて提供されうる。
【００８６】
実施例
以下の実施例は本発明を例示するために記載されており、本発明を限定するものではない。
【００８７】
実施例１  種々のＬＤを含有するＢＧ５０５  ｇｐ１４０ナノ粒子の収量および純度
表面上に提示されたＨＩＶ−１  ＢＧ５０５  ＵＦＯ三量体を含有する６０量体Ｅ２ＰおよびＩ３−０１ナノ粒子に関して、種々のロッキングドメイン（ＬＤＳ）の有用性を検証した。構築物の設計を図６に図示する。ＬＤ含有ナノ粒子を１００ｍＬのＥｘｐｉＣＨＯ細胞において一過性に発現させ、ついで２Ｇ１２またはＰＧＴ１４５抗体カラムを使用して精製した。ついでスーパーロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）６  １０／３００  ＧＬカラムでのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、ナノ粒子サンプルをそれらの収量および純度に関して特徴づけした。ＳＥＣプロファイルは、ほとんどのＬＤがＨＩＶ−１  ＢＧ５０５  ＵＦＯ  ｇｐ１４０ナノ粒子を種々の度合の収量および純度で安定化させうることを示した。Ｅ２ｐの場合には、ＬＤ４およびＬＤ５は、高品質ＢＧ５０５  ＵＦＯ  ｇｐ１４０ナノ粒子を他のＬＤより高い収量で与え、一方、Ｉ３−０１の場合には、ＬＤ４、ＬＤ５およびＬＤ７はナノ粒子の収量および純度の点で他のＬＤより優れていた。注目すべきことに、Ｅ２ｐ−ＬＤｘナノ粒子は２Ｇ１２抗体カラムにより精製され、これは部分的組織化ナノ粒子および単一三量体をも上清から抽出し、一方、Ｉ３−０１−ＬＤｘナノ粒子はＰＧＴ１４５抗体カラムにより精製され、これは完全組織化ナノ粒子に非常に特異的である。したがって、Ｅ２ｐ−ＬＤｘとＩ３−０１−ＬＤｘとの間の純度の差異は、ナノ粒子プラットフォームやＬＤ設計によってではなく、精製に使用された抗体カラムによって生じたものである。
【００８８】
実施例２  種々のＬＤを含有するＢＧ５０５  ｇｐ１４０ナノ粒子の構造組織化
ＬＤ含有ＨＩＶ−１  ＢＧ５０５  ｇｐ１４０ナノ粒子の組織化（集合、ａｓｓｅｍｂｌｙ）を更に検証するために、まず、ブルー・ネイティブ・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＢＮ−ＰＡＧＥ）によりＥ２ｐ−ＬＤｘおよびＩ３−０１−ＬＤｘナノ粒子を分析した。結果を図７に示す。ナノ粒子は大きなサイズおよび高い分子量を有するため、予想通り、ＢＮ−ＰＡＧＥは低分子量バンドを何ら示さず、全てのサンプルがレーン最上部のウェル内に捕捉されることを証明した。選択されたＥ２ｐ−ＬＤｘおよびＩ３−０１−ＬＤｘ構築物をネガティブ染色電子顕微鏡法（ＥＭ）により分析し、これは、良好に形成されたナノ粒子を示した。ＥＭ生イメージにおいては、より低いストリンジェンシーの抗体カラムを使用したため、Ｅ２ｐ−ＬＤｘナノ粒子は単一三量体または部分的組織化ナノ粒子と時々混合していた。それでも、ＢＮ−ＰＡＧＥおよびネガティブ染色ＥＭ分析は、ロッキングドメインが、天然様ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０三量体を提示するための２つの大きなナノ粒子プラットフォームを有効に安定化させうることを示した。
【００８９】
実施例３  ロックメカニズムを有するＨＩＶ−１ナノ粒子ワクチンの設計
２つの構築物を第１世代ワクチン構築物として選択した。それぞれはＢＧ５０５  ＵＦＯ．６６４  ｇｐ１４０、１０アミノ酸ＧＳリンカー（Ｉ３−０１専用）、ナノ粒子サブユニット（Ｅ２ｐまたはＩ３−０１のいずれか）、５アミノ酸ＧＳリンカー、自己組織化に際してナノ粒子バックボーンを安定化させるロッキングドメイン（ＬＤ）、およびＢ細胞発生をｂＮＡｂへと導く強力な濾胞性Ｔヘルパー（Ｔｆｈ）応答を誘導する汎反応性Ｔ細胞エピトープ（ＰＡＤＲＥエピトープ）をコードしている。哺乳類発現に一般に使用されるＣＭＶベクターに基づいてＤＮＡプラスミドを設計し、この場合、「抗原」遺伝子をベクター内に挿入した（図２）。これらの２つのナノ粒子構築物は「ＵＦＯ−Ｅ２ｐ−ＬＤ４−ＰＡＤＲＥ」および「ＵＦＯ−１０ＧＳ−Ｉ３−０１−ＬＤ７−ＰＡＤＲＥ」と称される。ロッキングメカニズムが図２の右隅に図示されている。簡潔に説明すると、二量体ＬＤタンパク質のＮ末端はナノ粒子サブユニットのＣ末端に融合している。自己組織化中に、２つのナノ粒子サブユニットが一緒になって二量体界面を形成すると、それらはそれらの結合ＬＤを接近させて、第２の遥かに強力な界面をナノ粒子殻の直下に形成し、これはその安定性を有意に増強する。
【００９０】
実施例４  ロッキングメカニズムを有するナノ粒子ワクチンの製造
ワクチンは精製ナノ粒子タンパク質であり、これは液相中でアジュバントと混合される。該タンパク質物質は一過性ＥｘｐｉＣＨＯ細胞または安定化ＣＨＯ−Ｓ細胞のいずれかにおいてＧＭＰ施設で製造されうる。製造プロセスは、３つの工程、すなわち、ＣＨＯ細胞における発現、ＰＧＴ１４５アフィニティーカラムによる精製および品質管理（ＱＣ）を含む。
【００９１】
実験室規模の製造においては、ＵＦＯ  ｇｐ１４０ナノ粒子をＥｘｐｉＣＨＯの細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）において一過性に発現さる。簡潔に説明すると、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞を解凍し、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）と共に３７℃、１３５ｒｐｍ、８％  ＣＯ２でシェーカーインキュベーター内でインキュベートする。細胞が１０×１０６ｍｌ−１の密度に達したら、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地を添加して、トランスフェクションのために細胞密度を６×１０６ｍｌ−１に減少させる。製造業者の説明に従いＥｘｐｉＣＨＯ細胞における１００ｍｌのトランスフェクションのためにＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ複合体を調製する。合計１００μｇのプラスミドおよび３２０μｌＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬を７．７ｍｌの冷ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）内で混合する。第１日の最初の供給（フィード）の後、Ｍａｘ  Ｔｉｔｅｒプロトコルに従いＥｘｐｉＣＨＯ細胞を３２℃、１２０ｒｐｍ、８％  ＣＯ２でシェーカーインキュベーター内で培養し、第５日に追加的な供給を行う（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。トランスフェクションの１３〜１４日後に培養上清を回収し、４０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により清澄化し、０．４５μｍのフィルター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ）を使用して濾過する。ナノ粒子は、ＰＧＴ１４５抗体アフィニティーカラムを使用して培養上清から抽出されうる。プラスミドＤＮＡシード（ｓｅｅｄ）は本発明者らの研究室で作製可能であり、契約者のＧＭＰ製造施設における大規模製造のための契約者に提供可能である。
【００９２】
実施例５  ロッキングメカニズムを有するナノ粒子ワクチンの品質管理
ＣＨＯ／ＥｘｐｉＣＨＯ製造ナノ粒子タンパク質の品質は、（１）収量および純度に関してはＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３００  ＧＬカラムおよびブルー・ネイティブ・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＢＮ−ＰＡＧＥ）により、（２）熱安定性に関してはＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ−キャピラリー熱量計（Ｍａｌｖｅｒｎ）での示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により、（３）抗原性に関してはＯｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６、定量バイオセンサーおよびｂＮＡｂと非ＮＡｂとのパネルを使用するバイオレイヤー（ｂｉｏ−ｌａｙｅｒ）干渉法（ＢＬＩ）により、ならびに（４）ナノ粒子組織化および構造的完全性に関してはネガティブ染色電子顕微鏡法（ＥＭ）により評価されうる。ＱＣプロセスは、選択されたナノ粒子構築物に関して本発明者らの研究室において検証されている（後記を参照されたい）。注目すべきことに、ＱＣ工程（１）〜（２）は、タンパク質の発現、製造および精製の後、任意のＧＭＰ施設の現場で容易に行われうる。
【００９３】
１００ｍｌのＥｘｐｉＣＨＯ細胞における一過性発現およびＰＧＴ１４５抗体アフィニティーカラムを使用する細胞上清からの精製の後、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３００  ＧＬカラムでのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりナノ粒子を分析した（図３Ａ）。ＳＥＣプロファイルで８ｍｌにおける単一の鋭いピークが観察され、これは両方の構築物に関する高い純度を示している。更に、ＵＶ２８０値はＥ２ｐ系構築物およびＩ３−０１系構築物に関してそれぞれ約４５０および約３５０に達し、これは、１５〜２０ｍｇ／Ｌと推定される、両方の構築物に関する高い収量を示している。特に注目すべきことに、ロッキングメカニズムは安定性だけでなく、純粋なナノ粒子の収量をもＩ３−０１およびＥ２ｐに関して２〜３倍改善しうる。また、ＳＥＣ前のナノ粒子サンプルをＢＮ−ＰＡＧＥにより分析した。これは、ゲル上の低分子量種に対応するバンドを示さず、ナノ粒子は大きなサイズおよび高い分子量を有するため、全てのサンプルがレーン最上部のウェル内に捕捉された（図３Ｂ）。したがって、ＢＮ−ＰＡＧＥは、ＳＥＣ分析において認められた高い純度を証明した。
【００９４】
ついで、精製されたナノ粒子を、熱安定性を測定するためにＤＳＣにより評価した。それは、Ｅ２ｐ系構築物およびＩ３−０１系構築物に関して、それぞれ６９．５２および６８．２６℃の融解温度（Ｔｍ）を示し、これは、ＢＧ５０５  ＵＦＯ三量体の場合（Ｔｍ＝６８．２４℃）と比較して高度の熱安定性を示している（図３Ｃ）。したがって、ロッキングメカニズムにより、Ｔｍはナノ粒子プラットフォームには左右されず、提示抗原（この場合はＵＦＯ  ｇｐ１４０三量体）の熱安定性のみにより決定される。前記の選択された２つのナノ粒子構築物は化学物質に対して耐性であり、−８０℃から４℃までの広い温度範囲で安定であることも判明している。例えば、凍結融解サンプルまたは４℃で数週間保存されたサンプルをネガティブ染色ＥＭにより分析したところ、温度変化による分解は観察されなかった。
【００９５】
ＧＭＰ製造ナノ粒子の構造および抗原性を後記のとおりに更に特徴づけした。
【００９６】
実施例６  抗原性および免疫原性の評価
簡便で頑強な製造プロセスならびに優れた生化学的および生物物理学的特性に加えて、更なるインビトロおよびインビボ評価は、ロッキングメカニズムを有するこれらのＵＦＯ  ｇｐ１４０ナノ粒子が遥かに最も有望なＨＩＶ−１ワクチン候補となりうることを示した。
【００９７】
インビトロ評価−抗原分析および構造解析（またはＱＣ工程３および４）：  前記の２つの選択されたナノ粒子を、ＢＬＩおよび５つのｂＮＡｂ（図４Ａ）と４つの非ＮＡｂ（図４Ｂ）とのパネルを使用して、抗体結合に関して評価した。ＵＦＯ三量体を対照として含めた。全体的に、両方のナノ粒子は、Ｖ２頂部、Ｎ３３２スーパーサイトおよびＣＤ４ｂを認識するｂＮＡｂへの有意に増強（３〜４倍増強）した結合を示したが、３５Ｏ２２によるｇｐ１２０−ｇｐ４１界面への結合を低減した。これは、ナノ粒子表面上のこの部位への接近が妨げられたことによるものである可能性が高い。ナノ粒子提示は、１９ｂ結合の中等度の増強を示したＶ３頂部を除き、ＣＤ４ｂ、ＣＤ４ｉ部位および免疫優性ｇｐ４１エピトープへの非ＮＡｂ結合を増強しないことも注目に値する。
【００９８】
また、前記の２つの選択されたナノ粒子をネガティブ染色ＥＭによって構造的に分析した。これは、表面から突出する天然様ＵＦＯ  ｇｐ１４０三量体の高密度層を有する良好に形成された均一ナノ粒子を示した（図４Ｃ）。注目すべきことに、ほとんどの場合、ナノ粒子殻内のロッキングドメイン（ＬＤ）はこの低解像度では視認できなかった。しかし、ＬＤタンパク質に対応する、ナノ粒子表面から内側に突出する構造が時折認識可能であった。
【００９９】
小動物モデルにおけるインビボ評価：  本発明者らはマウスおよびウサギにおいてＵＦＯ三量体およびナノ粒子のサブセットを評価している。マウスにおいては、全ての三量体（スキャフォールド付きｇｐ１４０．６８１構築物を除く）は自己ティア２  ＮＡｂを誘導できなかった。フェリチンナノ粒子とＩ３−０１ナノ粒子設計の初期形態（「ＵＦＯ−ＰＡＤＲＥ−Ｉ３−０１」と称される）とは第８週に自己ティア２  ＮＡｂを誘導し、Ｉ３−０１において、より強力な応答が観察された（図５Ａ）。マウス血清における非特異的抗ウイルス活性を排除するために精製ＩｇＧを使用して、ＴＺＭ−ｂｌ  ＨＩＶ中和アッセイを行った。注目すべきことに、これはＷＴマウスにおけるＥｎｖ誘導性ティア２  ＮＡｂ応答の最初の観察であるが、以前の研究では、ＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ三量体は１６週間の免疫化の後でＷＴマウスにおいて自己ティア２  ＮＡｂ応答を誘導できなかった。また、ＵＦＯ三量体およｂフェリチンナノ粒子の免疫原性をウサギにおいて評価し、抗体応答を長期的に測定した。フェリチンナノ粒子は第８週に自己ティア２  ＮＡｂを誘導するが、ＢＧ５０５  ＵＦＯ三量体はそのようなティア２  ＮＡｂ応答を誘導するためには更に２か月を要することを、結果は示した（図５Ｂ）。最近の研究において、Ｚｈｕの研究室は、最終的なナノ粒子構築物の１つであるＵＦＯ−Ｅ２ｐ−ＬＤ４−ＰＡＤＲＥでＷＴマウスを免疫した。試験した８匹のマウスのうち、１匹は他のマウスより遥かに強力なティア２  ＮＡｂ応答を示したが、全ての動物は、第１１週に１ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度で５０〜９５％の中和を伴うティア２  ＮＡｂ応答を示した（データ非表示）。したがって、ロックメカニズムを有する最終的なナノ粒子ワクチン構築物がインビボでは未だ評価されていないとしても、該インビボデータは本発明者らのＵＦＯ  ｇｐ１４０ナノ粒子のワクチンの可能性を明確に示している。これらの２つのナノ粒子構築物は、それらのティア２分離体に対する、より広域で強力な中和抗体応答を誘導すると予想される。
【０１００】
実施例７  クラスＩ融合を利用する他のウイルス（フィロウイルス）に対するワクチン
本発明者らはフィロウイルスに対するナノ粒子ワクチンを開発した。エボラウイルス（ＥＢＯＶ）およびマールブルグウイルスのようなフィロウイルスはヒトおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において致命的な出血熱を引き起こしうる。フィロウイルスはヒトの疾患の突発を過去に引き起こしているが、エボラウイルスは２０１３〜２０１６年の史上最大の突発の唯一の原因であり、これはアフリカの９カ国に広がり、２８，６００の症例および１１，３２５人の死亡をもたらした。現在、コンゴ民主共和国（ＤＲＣ）でエボラ出血熱の突発が続いており、６００人以上の命を奪っている。フィロウイルス糖タンパク質（ＧＰ）は、付着および膜融合を開始させることにより細胞侵入をもたらし、ワクチン設計の主要標的である。ＧＰは、ヒト生存者および免疫化動物から単離された中和抗体により認識されうる（Ｓａｐｈｉｒｅら，Ｃｅｌｌ  １７４（４）：９３８−９５２，２０１８を参照されたい）。
【０１０１】
本発明者らの研究においては、ＧＰの外部ドメイン（アミノ酸３３〜６３２）を含有するが非構造化ムチン様ドメイン（ＭＬＤ；アミノ酸３１３〜４６３）を欠失している種々のＧＰの融合構築物（したがって、ＧＰΔＭｕｃと称される）を設計するために、エボラウイルスのザイール株（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ ０６６２４６  ）のアミノ酸配列を使用した。ＧＰのＧＰΔＭｕｃ形態は構造研究に広範に使用されているため（Ｌｅｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ４５４（７２０１）：１７７−１８２，２００８）、それはフィロウイルスワクチン設計のための合理的な基礎を提供する。本発明者らはフェリチン、Ｅ２ｐおよびＩ３−０１ナノ粒子プラットフォーム上に野生型（ＷＴ）ＧＰΔＭｕｃおよびＧＰΔＭｕｃの一般的ＵＦＯ（ＵＦＯｇ）形態を提示させた（図８Ａ）。ＥｘｐｉＣＨＯ細胞における一過性発現の後、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３００カラムでの精製の前に、ＭＡｂ１００抗体カラム（フェリチンおよびＥ２ｐの場合）またはＭＡｂ１１４抗体カラム（Ｉ３−０１の場合）を使用して融合タンパク質を上清から抽出した。全体として、ＳＥＣプロファイルにより示されるとおり、ＧＰΔＭｕｃ−ＵＦＯｇを提示するナノ粒子において、ＷＴ  ＧＰΔＭｕｃを提示するものより大きな収量および純度が認められた（図８Ｂ）。フェリチンの場合、ＧＰΔＭｕｃ−ＵＦＯｇ−フェリチンは、ＷＴ  ＧＰΔＭｕｃ−フェリチンより顕著な、ナノ粒子のピークを示した。Ｅ２ｐの場合、ＷＴ  ＧＰΔＭｕｃ−Ｅ２ｐはナノ粒子および未組織化タンパク質のピークを示し、一方、ＧＰΔＭｕｃ−ＵＦＯｇ−Ｅ２Ｐは主にナノ粒子の高いピークを示した。Ｉ３−０１の場合、両方の融合構築物はナノ粒子組織化に問題があるようであり、ＳＥＣプロファイルにおいて、１５〜１６ｍｌにおける未組織化融合タンパク質の高いピークが示された。それでも、ネガティブ染色ＥＭは、ＷＴ  ＧＰΔＭｕｃ三量体およびＧＰΔＭｕｃ−ＵＦＯｇ三量体を提示する良好に形成されたフェリチン、Ｅ２ＰおよびＩ３−０１ナノ粒子を示した（図８Ｃ）。
【０１０２】
これまでに、本発明者らはＨＩＶ−１  ＵＦＯ三量体提示Ｅ２ｐおよびＩ３−０１ナノ粒子のためのロッキングドメインを体系的にスクリーニングしている。本研究においては、エボラＧＰΔＭｕｃ−ＵＦＯｇ三量体提示Ｅ２ｐおよびＩ３−０１ナノ粒子のためのロッキングドメインを体系的にスクリーニングした。ロッキングメカニズムは概要図において例示されうる（図８Ｄ、左）。ロッキングドメインを有する６０量体ナノ粒子の構造を可視化するために、Ｅ２ｐナノ粒子に関する原子モデルを構築し、ロッキングドメイン（ＬＤ４）およびＴ細胞エピトープ（ＰＡＤＲＥ）を該モデル内に段階的に組み込んだ（図８Ｄ、右）。本発明者らの研究においては、７個のＧＰΔＭｕｃ−ＵＦＯｇ−Ｅ２ｐ−ＬＤｎ構築物（ｎ  ＝１〜７）および５個のＧＰΔＭｕｃ−ＵＦＯｇ−１０ＧＳ−Ｉ３−０１−ＬＤｎ構築物（ｎ＝４／５／７／８／９）をＥｘｐｉＣＨＯ細胞において一過性に発現させた。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３００カラムでの精製の前に、Ｍａｂ１００抗体カラム（フェリチンおよびＥ２ｐ用）またはＭａｂ１１４抗体カラム（Ｉ３−０１用）のいずれかを使用して、ＧＰΔＭｕｃ融合タンパク質を上清から抽出した。全てのＥ２ｐ系構築物のうち、ＬＤ４およびＬＤ７が最高の収量および純度を示し、全てのＩ３−０１系構築物のうち、ＬＤ７およびＬＤ８が最良のの結果を示した（図８Ｅ）。これはＨＩＶ−１  ＵＦＯ  ｇｐ１４０ナノ粒子に関する本発明者らの過去の知見とほぼ一致しており、該知見においては、ＬＤ４およびＬＤ７がそれぞれＥ２ｐおよびＩ３−０１に最も適合しているようであった。したがって、ＬＤ４と組合されたＥ２ｐおよびＬＤ７と組合されたＩ３−０１が、提示される免疫原には無関係に、ワクチン開発のための２つの一般的なナノ粒子プラットフォームとして使用されうる。
【０１０３】
ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０ナノ粒子に関する本発明者らの観察に一致するもう１つの知見は、ロッキングドメインのＣ末端へのＴ細胞エピトープの付加が、得られるナノ粒子（この場合はＧＰΔＭｕｃ−ＵＦＯｇナノ粒子）の収量および純度を顕著に改善するというものであった（図８Ｆ）。これは、中空ナノ粒子の中心に疎水性Ｔ細胞エピトープクラスターが形成されることにより説明されうるであろう（図８Ｄ、右）。ＢＮ−ＰＡＧＥは、ゲル上に高分子量のバンドを示すことにより、ナノ粒子組織化を更に証明した（図８Ｇ）。しかし、全てのＧＰΔＭｕｃ−Ｉ３−０１融合構築物が未組織化二量体および単量体種を示した。最後に、３個のＷＴ  ＧＰΔＭｕｃナノ粒子および３個のＧＰΔＭｕｃ−ＵＦＯｇナノ粒子の抗原性プロファイルを、ＥＬＩＳＡにおいて、それらのそれぞれのＧＰΔＭｕｃ三量体と比較した（図８Ｈ）。全体として、ＧＰΔＭｕｃナノ粒子は、ＧＰΔＭｕｃ三量体より遥かに強力な、中和抗体への結合を示した。
【０１０４】
実施例８  クラスＩ融合を利用する他のウイルス（アレナウイルス）に対するワクチン
同じ設計戦略に基づいて、本発明者らはアレナウイルスに対するナノ粒子ワクチンを開発した。アレナウイルスもヒトにおいて重度の出血熱を引き起こすことが公知である。ラッサマンマレナウイルス（ＬＡＳＶ）はラッサ熱の原因因子であり、西アフリカにおける重大な公衆衛生問題である。ＬＡＳＶ糖タンパク質複合体（ＧＰＣ）は、受容体結合サブユニットＧＰ１と膜貫通型融合媒介性サブユニットＧＰ２とをそれぞれが含有するヘテロ二量体の三量体である。ＨＩＶ−１  ｇｐ１６０およびエボラＧＰのような他のクラスＩ融合タンパク質と同様に、ＬＡＳＶ  ＧＰＣは細胞侵入をもたらし、中和抗体応答のための主要標的となる。現在、ＬＡＳＶ感染を予防するために利用可能なワクチンは存在しない。最近、ヒト中和抗体と複合体形成したＬＡＳＶ  ＧＰＣの結晶構造が報告された（Ｈａｓｔｉｅら，３５６（６３４１）：９２３−９２８，２０１７を参照されたい）。
【０１０５】
本発明者らの研究においては、ＬＡＳＶ株（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ ６９４８７０）の外部ドメインのアミノ酸配列に基づいてＧＰＣ融合構築物を設計した。ＬＡＳＶ  ＧＰＣおよびナノ粒子のタグ非利用精製のために、中和抗体３７．７Ｈ（Ｈａｓｔｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５６（６３４１）：９２３−９２８，２０１７を参照されたい）に基づく抗体カラムをパックした。２つの融合構築物（ＧＰＣ−１０ＧＳ−ＦＲおよびＧＰＣ−５ＧＳ−Ｅ２ｐ−ＬＤ４−ＰＡＤＲＥ）を、それぞれ２６．３ｎｍおよび３７．６ｎｍの直径を有するナノ粒子を与えるＬＡＳＶナノ粒子ワクチンの概念を試験するために設計した（図９Ａ）。これらの２つの融合構築物をＥｘｐｉＣＨＯ細胞において一過性に発現させ、３７．７Ｈ抗体カラムを使用して精製した。３７．７ＨはＬＡＳＶ  ＧＰＣ三量体のＧＰ２に基部において結合するため、ナノ粒子表面上のＧＰ２への接近の制限ゆえに、それはＧＰＣナノ粒子の精製に最適でないかもしれない。これは、両方の構築物で観察された低い収量を説明するものである。それでも、３７．７Ｈ精製タンパク質をネガティブ染色ＥＭにより分析したところ、それは、未組織化タンパク質と混合した良好に形成されたナノ粒子を示した（図９Ｂ）。ＧＰＣとフェリチンナノ粒子との間の長い柔軟なリンカーゆえに、ＧＰＣスパイクはフェリチンナノ粒子表面上で認識され得なかった（図９Ｂ、左）。これとは対照的に、ＧＰＣ−５ＧＳ−Ｅ２ｐ−ＬＤ４−ＰＡＤＲＥのＥＭイメージの拡大図はＥ２ｐナノ粒子表面上にＧＰＣ三量体の層を示した（図９Ｂ、右）。総合すると、本発明者らの研究が証明したところによると、より有効な抗体カラムがＧＰＣナノ粒子の純度を更に改善する可能性はあるものの、ＬＡＳＶ  ＧＰＣは、ロッキングドメインを含有する６０量体ナノ粒子上で提示されうる。
【０１０６】
実施例９  クラスＩ融合メカニズムを利用する他のウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチン
本発明者らは更に、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するナノ粒子ワクチンを開発した。ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ｈＲＳＶ）感染は乳児、幼児および高齢者における細気管支炎および入院の主要原因である。融合糖タンパク質（Ｆ）は細胞侵入をもたらし、ワクチン設計の主要標的である。Ｆは、感染ドナーから単離された中和抗体により認識されうる。ＨＩＶ−１  ｇｐ１６０、エボラＧＰおよびラッサＧＰＣと同様に、ｈＲＳＶ  ＦはクラスＩ膜貫通表面タンパク質であり、Ｎ末端にシグナルペプチド（アミノ酸１〜２５）を有し、Ｃ末端付近に膜アンカーを有する。Ｆは最初に不活性前駆体タンパク質Ｆ０として合成され、これはフューリンまたはフューリン様細胞エンドプロテアーゼによるトランスゴルジ複合体における切断による活性化に際してホモ三量体へと組織化する。該切断はＮＨ２−Ｆ２−Ｆ１−ＣＯＯＨの形態の２つのジスルフィド結合サブユニットを与える。Ｆ１のＮ末端は、該切断の結果として、融合ペプチド（アミノ酸１３７〜１５４）を含有し、これは、宿主細胞膜内に直接挿入されて融合を誘発する疎水性ペプチドである。Ｆ１サブユニットは、ヘプタッド反復（７アミノ酸繰り返し）（ＨＲ）の、２つの領域をも含有し、これらは融合中に結合し、ウイルス膜と細胞膜とを接近させる。中和抗体と複合体形成した融合前Ｆの結晶構造は原子分解能で決定されている（ＭｃＬｅｌｌａｎら，３４０（６１３６）：１１１３−１１１７，２０１３を参照されたい）。
【０１０７】
本発明者らの研究においては、フェリチン、Ｅ２ｐおよびＩ３−０１ナノ粒子上に融合前ｈＲＳＶ  Ｆを提示させ、Ｅ２ｐおよびＩ３−０１  ６０量体において種々のロッキングドメインおよびリンカーを試験した。分子モデリングは、ｈＲＳＶ  Ｆ  ＦＲナノ粒子が３３．９ｎｍ以上のサイズを有し、ｈＲＳＶ  Ｆ  Ｅ２ｐ（またはＩ３−０１）が少なくとも４５．２ｎｍの直径を有することを示した（図１０Ａ）。本発明者らは、融合前Ｆ特異的ヒト中和抗体Ｄ２５を使用して、ｈＲＳＶ  ＦおよびＦ提示ナノ粒子のタグ非利用精製のための抗体カラムをパックした（ＭｃＬｅｌｌａｎら，３４０（６１３６）：１１１３−１１１７，２０１３を参照されたい）。全てのｈＳＶ  Ｆ融合構築物をＥｘｐｉＣＨＯ細胞において一過性に発現させた。Ｆ融合タンパク質を、Ｄ２５抗体カラムを使用して上清から抽出し、ネガティブ染色ＥＭにより分析した。ＦのＣ末端とフェリチンのＮ末端との間に１０アミノ酸の（Ｇ４Ｓ）２リンカーを含有するＦ−１０ＧＳ−ＦＲ構築物は、分子モデリング（図１０Ａ）に一致する、視認可能な「親指様」融合前Ｆ三量体をフェリチン表面上に含有するナノ粒子を形成した（図１０Ｂ）。ついで、ロッキングドメイン（ＬＤ４）とＴ細胞エプトープ（ＰＡＤＲＥ）とを含有するＥ２ｐナノ粒子上に融合前Ｆを提示させた。ＦのＣ末端とＥ２ｐサブユニットのＮ末端との間に１０アミノ酸の（Ｇ４Ｓ）２リンカーを含有する及び含有しない２つの構築物を試験した。長いリンカーの非存在下では、融合前Ｆ三量体はＥ２ｐナノ粒子表面上に粒状突起として現れたが（図１０Ｃ、左）、長いリンカーの存在下では、一連の「親指様」融合前Ｆ三量体がＥ２ｐナノ粒子表面上で認識可能であった（図１３Ｃ、右）。最後に、ロッキングドメイン（ＬＤ７）とＰＡＤＲＥとを含有するＩ３−０１ナノ粒子上に融合前Ｆを提示させた。Ｔ細胞エピトープ（ＰＡＤＲＥ）がＦとＥ２ｐとの間に挿入され（外部）、ＬＤ７のＣ末端に結合している（内部）２つの構築物を作製して、ロッキングドメインの存在下のナノ粒子組織化に対するＴ細胞エピトープの位置の影響を調べた。前者（Ｆ−５ＧＳ−ＰＡＤＲＥ−Ｉ３−０１−ＬＤ７）に関しては、良好に形成されたナノ粒子が観察されたが、ナノ粒子表面上に融合前Ｆスパイクは認識され得なかった（図１１Ｄ、左）。後者（Ｆ−１０ＧＳ−Ｉ３−０１−ＬＤ７−ＰＡＤＲＥ）に関しては、未組織化Ｆ三量体が存在するにもかかわらず、「親指様」融合前Ｆ三量体の層で修飾された良好に形成されたナノ粒子が観察された（図１１Ｄ、右）。
【０１０８】
総合すると、本発明者らの結果は、ロッキングドメインを含有するＥ２ｐおよびＩ３−０１ナノ粒子上にｈＲＳＶ  Ｆが提示されうることを実証し、種々の長さのリンカーの使用および種々の位置におけるＴ細胞エピトープの配置の具体例を提供した。
【０１０９】
実施例１０  クラスＩ融合メカニズムを利用する他のウイルス（ＣｏＶ）に対するワクチン
本発明者らはまた、コロナウイルス（ＣｏＶ）に対するナノ粒子ワクチンを開発した。ＣｏＶは、プラス鎖ＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスである。２００２年のアジアにおける重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の突発は新たなコロナウイルスの発見につながり、それは後にＳＡＲＳ−ＣｏＶと命名された。ＳＡＲＳ−ＣｏＶは突発中に８０００人以上に感染し、致死率は約１０％であった。２０１２年に、コロナウイルスの新種である中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）が特定され、それ以来、該ウイルスは２７か国で２０００人以上に感染し、致死率は約３５％であった。どちらのコロナウイルスにおいても、ウイルスゲノムはスパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）およびヌクレオカプシド（Ｎ）構造タンパク質をコードし、そのうちのＳタンパク質はＳ１サブユニットにおける受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を介した宿主受容体への結合ならびにそれに続く膜融合およびウイルス侵入をもたらす。ＲＢＤはコアサブドメインおよび受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）を含有する。コアサブドメインはそれらの２つのコロナウイルス間で非常に類似しているが、それらのＲＢＭは、異なる受容体特異性を示す。すなわち、ＳＡＲＳ−ＣｏＶはアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を認識し、一方、ＭＥＲＳ−ＣｏＶはジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）に結合する。どちらのコロナウイルスの場合も、Ｓタンパク質が感染をもたらし、したがって、ワクチン設計の主要標的となる。
【０１１０】
本発明者らの研究においては、フェリチン、Ｅ２ＰおよびＩ３−０１ナノ粒子（Ｅ２ｐおよびＩ３−０１構築物内にはロッキングドメインが組み込まれている）上にＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｓ三量体（Ｐａｌｌｅｓｅｎら，ＰＮＡＳ，１１４：Ｅ７３４８−Ｅ７３５７およびＰＤＢ  ＩＤ：５Ｗ９Ｋを参照されたい）を提示させた。Ｓ構築物は特定のＭＥＲＳ−ＣｏＶ株（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＸ８６９０５９）に由来する。分子モデリングは、ＭＥＲＳ  Ｓ  ＦＲナノ粒子が３４．０ｎｍ以上のサイズを有し、ＭＥＲＳ  Ｓ  Ｅ２ｐ（またはＩ３−０１）が少なくとも４５．２ｎｍの直径を有することを示した（図１１Ａ）。本発明者らは、ＲＢＤ特異的中和抗体ＭＣＡ１を使用して、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  ＳおよびＳナノ粒子のタグ非利用精製のための抗体カラムを開発した。ＥｘｐｉＣＨＯ細胞における一過性発現の後、Ｓ融合タンパク質を、ＭＣＡ１抗体カラムを使用して上清から抽出し、ネガティブ染色ＥＭにより直接分析した。ＳのＣ末端とフェリチンサブユニットのＮ末端との間に１０アミノ酸のＧＳリンカー（配列番号２４）を含有するＭＥＲＳ  Ｓ−１０ＧＳ−ＦＲは、表面上に視認可能な大きなＳスパイクを含有するナノ粒子を形成した（図１１Ｂ、左）。ＭＥＲＳ  Ｓ−１０ＧＳ−Ｅ２ｐ−ＬＤ４−ＰＡＤＲＥ（図１１Ｂ、中央）およびＳ−１０ＧＳ−Ｉ３−０１−ＬＤ７−ＰＡＤＲＥ（図１１Ｂ、右）は、表面上に２０個のＳスパイクが提示された、より大きなナノ粒子を形成した。しかし、ＥＭイメージは未組織化Ｓ融合タンパク質をも示した。
【０１１１】
ナノ粒子上のＳタンパク質の安定性を改善するために、Ｓとナノ粒子サブユニットとの間に「Ｔ４フィブリチンのＣ末端三量体化モチーフ」、すなわちフォールドンを挿入した。Ｓ−フォールドン−１０ＧＳ−ＦＲ（図１１Ｃ、左）およびＳ−フォールドン−１０ＧＳ−Ｉ３−０１−ＬＤ４−ＰＡＤＲＥ（図１１Ｃ、右）により形成されたナノ粒子上に、ＳスパイクがＥＭイメージにおいて明らかに認識可能であった。このことは、追加的な構造成分が、ロッキングドメインを含有するナノ粒子内に組み込まれうることを証明している。
【０１１２】
実施例１１  クラスＩＩ融合メカニズムを利用するウイルス（ＨＣＶ）に対するワクチン
本発明者らは更に、ＨＣＶ  Ｅ２コアナノ粒子ワクチンの開発において、同じワクチン設計戦略を適用した。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）はフラビウイルス科ヘパシウイルス属の小さな包膜一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。世界人口の１〜２％が感染しているＨＣＶは重大な健康問題であり、年間約５０万人の死亡および毎年推定１５０〜２００万人の新たに感染を引き起こしている。ＨＣＶは高い遺伝的多様性を有し、７個の主要遺伝子型および８６個の亜型に分類されうる。ＨＣＶは迅速な突然変異を受けることがあり、これは感染個体内にウイルス準種を生じさせて、宿主免疫系から逃れさせる。しかし、急性感染患者の２０〜３０％における自発的ウイルスクリアランスは、ＨＣＶ感染が、ワクチン接種により誘導される有効な免疫応答で予防可能であることを示唆している。Ｅ１およびＥ２エンベロープ糖タンパク質は、宿主肝細胞内へのウイルス侵入をもたらすＨＣＶエンベロープ上のヘテロ二量体を形成する。Ｅ２は、受容体結合タンパク質として、宿主細胞受容体ＣＤ８１およびＳＲ−Ｂ１と直接相互作用し、主にＣＤ８１相互作用を遮断することによりＨＣＶを中和する中和抗体の主要標的である。構造解析を容易にするために、高可変領域１（ＨＶＲ１）ならびに可変領域２および３（ＶＲ２／３）（Ｅ２コアと称される）にトランケーションを含有するＥ２構築物を開発した。広域中和抗体ＡＲ３Ｃと複合体形成した分離株Ｈ７７（遺伝子型１ａ）由来Ｅ２コアの結晶構造（Ｋｏｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４２（６１６２）：１０９０−１０９４，２０１３を参照されたい）、および中和抗体２Ａ１２に結合した分離株Ｊ６（遺伝子型２ａ）由来トランケート化Ｅ２の結晶構造（Ｋｈａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，５０９（７５００）：３８１−３８４，２０１４）は、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質の免疫認識に対する最初の洞察を提供した。しかし、現在、ＨＣＶ感染を予防するために利用可能な認可されたワクチンは存在しない。
【０１１３】
本発明者らの研究においては、ＨＣＶワクチンとしてＥ２コアナノ粒子を設計した。２４〜６０個のＥ２コアをそれぞれが表面上に提示するナノ粒子は、保存されたＥ２エピトープに対する有効な中和抗体応答を誘導可能であり、したがって、有望なＨＣＶワクチン候補となりうると仮定した（図１２Ａ）。この仮定を検証するために、３つのナノ粒子プラットフォーム、すなわち、２４．５〜３７．５ｎｍのＥ２コアナノ粒子を与える２４量体フェリチン（ＦＲ）ならびに６０量体Ｅ２ｐおよびＩ３−０１を試験した（図１２Ｂ）。本発明者らの研究で使用したＥ２コア構築物は、２つの分離株Ｈ７７（遺伝子型１ａ）およびＨＫ６ａ（遺伝子型６ａ）のＥ２のアミノ酸配列に由来するものであった。本発明者らの設計において、Ｅ２コアのＣ末端を、１０−ＧＳリンカー（配列番号２４）を介してナノ粒子サブユニットのＮ末端に遺伝的に融合させた。Ｅ２コア融合構築物をＥｘｐｉＣＨＯまたは２９３Ｆ細胞において一過性に発現させ、ＡＲ３Ｃ抗体カラムで精製し、ついで、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３００  ＧＬカラムを使用するＳＥＣにより精製した（図１２Ｃ）。Ｈ７７分離株由来の構築物の場合、ＳＥＣプロファイルは全てのＥ２コアナノ粒子に関して高収量および高純度を示し、２４量体と６０量体とで異なるパターンが観察された。Ｅ２−コア−１０ＧＳ−ＦＲは、凝集体に対応する８〜９ｍｌにおけるピークを示したが、Ｅ２−コア−１０ＧＳ−Ｅ２ｐおよびＩ３−０１構築物は共に、ナノ粒子のピークから尾引きする１５〜２０ｍｌにおけるピークを示した（図１２Ｃ）。ＨＫ６ａ分離株由来の構築物の場合、粒子の収量および純度の低下は低分子量種の増加を伴っていた。ＳＥＣにより精製されたＥ２コア融合タンパク質をＢＮ−ＰＡＧＥおよびネガティブ染色ＥＭで分析したところ、それは、それぞれ、高分子量バンドおよび均質ナノ粒子を示した（図１２Ｄおよび１２Ｅ）。最も広域中和性の抗体のＥＣ５０における最大１００倍の変化により示されるとおり、Ｅ２コアナノ粒子に対する抗体結合の増強が観察された（図１２Ｆ）。抗原性に対する多価提示の効果を更に調べるために、オクテット（Ｏｃｔｅｔ）および小パネル抗体を使用して、Ｈ７７由来Ｅ２コアナノ粒子およびＨＫ６ａ由来Ｅ２コアナノ粒子をそれらのそれぞれのＥ２コアに対して試験した（図１２Ｇ）。ピーク抗体結合シグナルと抗原価との間の相関性がＨ７７由来ナノ粒子およびＨＫ６ａ由来ナノ粒子の両方で観察された：６０量体＞２４量体＞単量体。
【０１１４】
最後に、Ｅ２コアナノ粒子におけるロッキングドメインの使用を検討した。この目的のために、ＨＣＶ  Ｈ７７分離株由来の構築物Ｅ２−コア−１０ＧＳ−Ｅ２ｐ−ＬＤ４−ＰＡＤＲＥおよびＥ２−コア−１０ＧＳ−Ｉ３−０１−ＬＤ７−ＰＡＤＲＥを試験した。ネガティブ染色ＥＭは、どちらの構築物においても、綺麗な均質ナノ粒子を示した（図１２Ｈ）。注目すべきことに、Ｅ２−コア−１０ＧＳ−Ｅ２ｐ−ＬＤ４−ＰＡＤＲＥは、ＬＤ４およびＰＡＤＲＥにより形成される高密度内部殻ゆえに、ＥＭイメージにおいて硬質表面を示したが、ＬＤ４およびＰＡＤＲＥを含有しないその対応物は中空であるようであった。それでも、本発明者らの結果は、ＨＣＶ  Ｅ２コアが、ロッキングドメインを含有するナノ粒子上に提示されうることを証明した。
【０１１５】
実施例１２  クラスＩＩ融合メカニズムを利用するウイルス（ＺＩＫＶ）に対するワクチン
本発明者らはまた、本明細書に記載されているワクチン設計戦略をジカウイルス（ＺＩＫＶ）ＤＩＩＩナノ粒子ワクチンの開発のために適用した。ＺＩＫＶはフラビウイルス科のプラス鎖ＲＮＡウイルスであり、デング熱（ＤＥＮＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）および黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）をも含む。ＺＩＫＶゲノムは３つの構造タンパク質（キャプシド、ｐｒＭおよびエンベロープ）および７つの非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２ａ／ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ／ｂおよびＮＳ５）をコードする。２０１５年および２０１６年のＺＩＫＶの突発は世界的な公衆衛生上の危機を引き起こしている。ＺＩＫＶは、主にヤブカ（Ａｅｄｅｓ）属の蚊により伝染し、成人におけるギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）および新生児における小頭症を引き起こしうる。エンベロープ（Ｅ）に基づく幾つかのワクチン候補がマウスおよびＮＨＰにおいてＺＩＫＶ感染を予防することが報告されている。しかし、既存の抗フラビウイルス免疫による、ＺＩＫＶの感染および発病の抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）は、現在のワクチン戦略に関する安全性の懸念を招いている。ＺＩＫＶ感染を予防するのに利用可能な、より有効で安全な他のワクチンは存在しない。
【０１１６】
ＺＩＫＶ  Ｅタンパク質は３つの構造ドメインＤＩ、ＤＩＩおよびＤＩＩＩからなる。これらの３つのドメインのうち、細長い指様ＤＩＩはＥ二量体化をもたらし、ウイルス膜と宿主細胞膜との融合によるｐＨ依存的侵入を誘発する保存された融合ループ（ＦＬ）を含有する。ＤＩＩＩは、ウイルスの付着に寄与するＣ末端免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを形成する。多数の中和抗体および非中和抗体が、ＤＥＮＶへの過去の曝露の有無にかかわらず、ＺＩＫＶ感染ドナーから特定されている。一般に、ＤＩＩＩに対する抗体はＺＩＫＶに特異的である傾向にあり、ＤＩ／ＩＩに対する抗体より強力に中和する傾向にある。後者は、しばしば、ＤＥＮＶと交差反応し、中和が不十分であり、場合によっては、インビボでウイルス感染を著しく増強する。
【０１１７】
本発明者らの研究においては、潜在的なＺＩＫＶワクチン候補として、２４量体フェリチン（ＦＲ）ならびに６０量体Ｅ２ｐおよびＩ３−０１に基づいてＤＩＩＩナノ粒子を設計した。ＤＩＩＩ融合構築物は、アフリカ株ＭＲ７６６（ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＫ１０５９７５）およびアジア株ＢｅＨ８１８９９５（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＵ３６５７７７）のＥタンパク質に由来するＤＩＩＩのアミノ酸配列に基づくものであった。また、ＤＩＩＩに対する中和抗体ＺＫ２Ｂ１０を使用するＤＩＩＩナノ粒子のタグ非利用精製のための抗体カラムを開発した（Ｙｕら，ＪＣＩ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  ２（１２）：９３０４２，２０１７を参照されたい）。該ＤＩＩＩ−ＦＲ融合構築物の全てをＥｘｐｉＣＨＯ細胞において一過性に発現させ、ＺＫ２Ｂ１０抗体カラムにより精製した。分子モデリングは、ＤＩＩＩの層を表面上に有する６０量体Ｉ３−０１が約３５ｎｍのナノ粒子を与えることを示している（図１３Ａ、左）。ＳＥＣプロファイルにおいては、良好に形成されたＤＩＩＩ−フェリチンナノ粒子に対応する高いピークが観察された（図１３Ａ、右）。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３００  ＧＬカラムで１４ｍｌにおいて溶出したＳＥＣ画分をＢＮ−ＰＡＧＥにより分析したところ、それは、ＦＲナノ粒子に特徴的な高分子量バンドを示した（図１３Ｂ）。ネガティブ染色ＥＭは、良好に形成されたＤＩＩＩナノ粒子を示した（図１３Ｃ、左）。しかし、ＤＩＩＩのサイズが小さく、柔軟な１０ＧＳリンカーを使用したため、ナノ粒子表面上にＤＩＩＩを認めることはできなかった。同じプロトコルに従い、Ｉ３−０１およびＥ２ｐ融合タンパク質を製造し、ネガティブ染色ＥＭにより、それらのナノ粒子組織化を評価した（図１３Ｃ、中央および右）。ＤＩＩＩ−１０ＧＳ−Ｉ３−０１ナノ粒子はＥＭイメージにおいて容易に認めることができたが、Ｅ２ｐはナノ粒子組織化が困難であるらしく、低い収量を示した。
【０１１８】
最後に、ロッキングメカニズムがＩ３−０１ナノ粒子上のＤＩＩＩ提示を更に改善しうるかどうかを調べた。実際、ネガティブ染色ＥＭは、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞において高収量および高純度で製造された均質なＤＩＩＩ−１０ＧＳ−Ｉ３−０１−ＬＤ７−ＰＡＤＲＥナノ粒子を示した（図１３Ｄ）。要約すると、本発明者らは、ロッキングドメインＬＤ７とＴ細胞エピトープＰＡＤＲＥとを含有するＩ３−０１ナノ粒子構築物で観察された最適な特性を有する種々のナノ粒子プラットフォーム上にＺＩＫＶ  ＤＩＩＩを提示させることに成功した。
【０１１９】
実施例１３  非ウイルス標的に対するワクチンの開発（マラリアワクチン）
本発明者らは更に、熱帯熱マラリア原虫［プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）］（マラリア）および結核菌［マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）］（ＴＢ）のような細胞内病原体、ならびにプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）のようなヒトタンパク質へと、本発明者らのワクチン研究を拡張した。本発明者らの主な仮説は、ナノ粒子の提示が細胞内病原体に対する免疫応答を増強し、ヒトタンパク質に対する免疫寛容を破壊するというものである。抗体およびＴ細胞の応答は主な免疫学的測定値として測定される。
【０１２０】
マラリアワクチン。熱帯熱マラリア原虫［プラスモジウム（ピー）・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（Ｐ．）  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）は、生命を脅かす疾患であるマラリアをヒトにおいて引き起こす単細胞原虫寄生生物である。熱帯熱マラリア原虫は、感染した雌ハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）に刺されることによりヒトに伝染しうる。２０１７年に、熱帯熱マラリア原虫は８７か国において推定２億１９００万人に感染し、約４３５，０００人のマラリア関連死をもたらした。現在、マラリアは治療可能であるものの、熱帯熱マラリア原虫感染を予防するための認可されたワクチンは存在しない。本発明者らの研究においては、この寄生生物の生活環に重要な３つの抗原、すなわち、Ｐｆｓ２５、スポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）および網状細胞結合タンパク質ホモログ５（ＰｆＲＨ５）に基づいて、マラリアナノ粒子ワクチンを開発した。
【０１２１】
第１の抗原であるＰｆｓ２５は、寄生生物の接合体およびオーキネート形態の表面上で発現される２５ｋＤａの有性段階の抗原である。抗Ｐｆｓ２５抗体は、媒介動物である蚊の中腸における熱帯熱マラリア原虫オーシストの発生を阻止しうる。現在、Ｐｆｓ２５は、最も開発された伝染阻止ワクチン（ＴＢＶ）候補であり、ヒトの臨床試験において試験されている。アジュバントであるモンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）ＩＳＡ  ５１における可溶性Ｐｆｓ２５でのヒトへのクチン接種により誘導される抗Ｐｆｓ２５抗体は標準的膜フィーディングアッセイ（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）（ＳＭＦＡ）において機能的であり、熱帯熱マラリア原虫の実験室分離株および野外分離株の両方の発生を阻止する。ヒト化マウスから単離されたモノクローナル抗体と複合体形成したＰｆｓ２５の構造が決定されており（Ｓｃａｌｌｙら，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ，８：１５６８，２０１７を参照されたい）、合理的なワクチン設計のための基礎を提供している（図１４Ａ）。
【０１２２】
本発明者らは、２つの抗Ｐｆｓ２５抗体、すなわち、Ｆａｂ１２６０とＦａｂ１２６９（図１４Ｂ）を、細胞上清からＰｆｓ２５を精製するそれらの能力に関して試験した。ＥＬＩＳＡデータに基づいて、Ｐｆｓ２５ナノ粒子のタグ非利用精製用の抗体カラムにパック（充填）するためにＦａｂ１２６０を選択した。また、平坦なＬ字構造を有するＰｆｓ２５の、ナノ粒子表面上の多価提示を促進させるために、「ネック（ｎｅｃｋ）」領域を設計した（図１４Ｃ）。より詳細には、ウイルスタンパク質に由来する３ヘリックスバンドルを、リンカーの存在下または非存在下、Ｐｆｓ２５とナノ粒子サブユニットとの間に挿入した（図１４Ｃ）。ヘンドラウイルスドメイン（ＰＤＢ  ＩＤ：４ＨＥＯ）および麻疹ウイルスドメイン（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＯＫＳ）に由来する２つのヘリックスバンドル（ネックおよびネック２と称される）を、種々のナノ粒子プラットフォームと組合せて試験した。全ての融合構築物をＥｘｐｉＣＨＯ細胞において発現させ、ついで、Ｆａｂ１２６０抗体カラムを使用して精製した。Ｆａｂ１２６０で精製された融合タンパク質をネガティブ染色ＥＭにより特徴づけしたところ、それはネック１含有構築物のみに関するナノ粒子を示した（図１４Ｄ）。特に、Ｐｆｓ２５−ネック１−１０ＧＳ−ＦＲナノ粒子は、ＥＭにより示されるとおり、最高の収量および純度を示した（図１４Ｄ、左）。Ｐｆｓ２５−ネック１−Ｅ２ｐ−ＬＤ４−ＰＡＤＲＥ構築物は、良好に形成されたナノ粒子と凝集体との混合物を生成したようであった（図１４Ｄ、中央）。Ｐｆｓ２５−ネック１−１０ＧＳ−Ｉ３−０１−ＬＤ７−ＰＡＤＲＥ構築物は、フェリチン構築物と同様に高純度であるが僅かに低い収量のナノ粒子を生成した（図１４Ｄ、右）。この結果は、各３回軸を囲むＩ３−０１のＮ末端が５ｎｍの大きな間隔を有するという事実に一致し、これは、不規則な形状の大きなタンパク質、例えばＰｆｓ２５を提示するのに適している。要約すると、Ｐｆｓ２５は、ロッキングドメインとＴ細胞エピトープとを含有する６０量体ナノ粒子上で提示されうる。
【０１２３】
第２の抗原であるスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）は、プラスモジウム寄生生物のスポロゾイト段階の分泌タンパク質であり、スポロゾイト機能および肝細胞侵入に重要である。ＣＳＰは、ヒトでの臨床試験が現在行われているＲＴＳ，Ｓワクチン（Ｍｏｓｑｕｉｒｉｘ（商標））に使用されている抗原である。最も臨床的に進んだワクチン候補として、ＲＴＳ，Ｓ／ＡＳ０１（ＲＴＳ，Ｓ）は小児におけるマラリアに対する部分的防御をもたらすことが示されている。ＣＳＰは、シグナルペプチド配列と、ヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合し、保存されたタンパク質分解切断部位を有する領域Ｉとを含むＮ末端領域；４アミノ酸モチーフＮＡＮＰまたはＮＶＤＰの多数の反復を含有する中央領域；および領域ＩＩ［トロンボスポンジン（ＴＳＰ）様ドメイン］と標準的なグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー付加配列とを含有するＣ末端領域を含む（図１５Ａ、上）。ＲＴＳ，Ｓワクチンは、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に結合した、最後の１８個のＮＡＮＰ反復と、ＧＰＩアンカー付加配列を除くＣ末端とを含む、ＣＳＰ由来の１８９アミノ酸（アミノ酸１９９〜３８７）を含有する（図１５Ａ、下）。
【０１２４】
本発明者らの研究においては、ロッキングドメインを含有するＣＳＰナノ粒子ワクチンを設計するための段階的な戦略を用いた（図１５Ｂ）。すなわち、最小Ｂ細胞エピトープ（工程１）、完全長Ｂ細胞エピトープ（工程２）、完全長Ｂ細胞エピトープ＋Ｃ末端Ｔ細胞エピトープ（工程３）、およびナノ粒子上のＣＳＰタンパク質のＲＴＳ，Ｓ抗原（工程４）を提示させた。タグ非利用精製を可能にするために、Ｆａｂ１４５０を使用して抗体カラムをパックした。Ｆａｂ１４５０に関しては、ＮＡＮＰ（配列番号２７）反復との複合体構造が決定されている（図１５Ａ、左下）。全てのＣＳＰ融合構築物を２５ｍｌのＥｘｐｉＣＨＯ細胞において一過性に発現させ、ついでＦａｂ１４５０精製およびネガティブ染色ＥＭ分析を行った。工程１においては、最小Ｂ細胞エピトープである５つのＮＡＮＰ反復（ＮＡＮＰ５）を２つのナノ粒子上に提示させた。試験した全ての構築物で非常に高い収量が観察された。ネガティブ染色ＥＭは、他のタンパク質種を含まない高純度のＮＡＮＰ５−５ＧＳ−ＦＲおよびＮＡＮＰ５−１０ＧＳ−ＦＲナノ粒子を示した（図１５Ｃ、左および中央）。また、ＮＡＮＰ５−５ＧＳ−ＰＡＤＲＥ−Ｉ３−０１−ＬＤ７構築物を発現させた。これは高収量および高純度で均質ナノ粒子を形成した（図１５Ｃ、右）。したがって、本発明者らの結果は、ロッキングドメインの存在下および非存在下のＮＡＮＰ５ナノ粒子組織化体およびＦａｂ１４５０抗体カラムの有用性を証明した。工程２においては、ネガティブ染色ＥＭ分析のために、３つのナノ粒子プラットフォーム上にＲＴＳ，Ｓワクチン抗原ＮＡＮＰ１９における完全長Ｂ細胞エピトープを提示させた（図１５Ｄ）。ＮＡＮＰ反復の数の有意な増加にもかかわらず、全ての構築物は高収量および高純度で均質ナノ粒子を形成した。したがって、本発明者らの結果はロッキングドメインの存在下および非存在下のＮＡＮＰ１９ナノ粒子組織化を証明した。
【０１２５】
工程３においては、完全長Ｂ細胞エピトープＮＡＮＰ１９とＣ末端Ｔ細胞エピトープαＴＳＲドメイン［それらの間に５ＧＳリンカー（配列番号１７）が存在する］とを全てが含有する６つの融合構築物を設計し、特徴づけした。ネガティブ染色ＥＭは、ＮＡＮＰ１９−５ＧＳ−αＴＳＲがロッキングドメインの存在下および非存在下の全３個のナノ粒子プラットフォーム上に成功裏に提示されうることを証明した（図１５Ｅ）。ＮＡＮＰ１９−５ＧＳ−αＴＳＲは、ＲＴＳ，Ｓ抗原における構造的および機能的に定められた成分の全てを含有し、リンカーにおいて異なるだけであるため、それらの２つの抗原は同一特性を共有するはずである。
【０１２６】
本発明者らは更に、２５ｍｌのＥｘｐｉＣＨＯ細胞において製造されたこれらのＮＡＮＰ１９−５ＧＳ−αＴＳＲナノ粒子の収量および純度をＳＥＣにより評価した（図１５Ｆ）。ＥＭデータと一致し、ＳＥＣプロファイルにおける単一ピークにより示されるとおり、ＮＡＮＰ１９−５ＧＳ−αＴＳＲナノ粒子は高純度を示した。収量に関しては、ナノ粒子特異的パターンが観察された：ＦＲ＞Ｅ２ｐ＞Ｉ３−０１。総合すると、本発明者らは、ＣＳＰの構造成分および抗原成分（それらの全ては、ロッキングドメインを含有する６０量体ナノ粒子上に提示されうる）の種々の組合せに基づいて一連のマラリアワクチン候補を開発した。
【０１２７】
第３の抗原である熱帯熱マラリア原虫網状赤血球結合タンパク質ホモログ５（ＰｆＲＨ５）は、赤血球侵入に必要なメロゾイトアドヘシンである。ＰｆＲＨ５は、赤血球表面タンパク質バシジン（ＣＤ１４７およびＥＭＭＰＲＩＮとしても公知である）とのその相互作用により、全ての試験された株において赤血球侵入に必要であることが実証された唯一のメンバーである（Ｗｏｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ５６５：１１８−１２１，２０１９を参照されたい）。ＰｆＲＨ５の結晶構造は決定されている（Ｗｒｉｇｈｔら，Ｎａｔｕｒｅ  ５１５：４２７−４３０，２０１４を参照されたい）。本発明者らは、抗体９ＡＤ４およびＱＡ１に基づいて、ＰｆＲＨ５およびＰｆＲＨ５ナノ粒子のタグ非利用精製のための抗体カラムを開発した。本発明者らは、ロッキングドメインの存在下および非存在下のナノ粒子上にＰｆＲＨ５を提示させるための融合構築物を設計した。
【０１２８】
実施例１４  非ウイルス標的に対するワクチン（結核ワクチン）の開発
結核（ＴＢ）は、主に肺に感染するマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）細菌により引き起こされる潜在的に重篤な感染症である。ＴＢは世界人口の２５％に感染しており、２０１７年には最大１０００万の症例を引き起こして、１３０万人の死亡をもたらした。カルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）ワクチンが、ＴＢがよく見られる国々で広く使用されているが、それはＴＢに対する完全な防御をもたらさない。結核菌に対する幾つかの新規ＴＢワクチン候補が開発されており、現在、ヒト臨床試験に付されている（Ｋｈｏｓｈｎｏｏｄら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１２０：１８０−１８８，２０１８を参照されたい）。
【０１２９】
本発明者らの研究において、２つのＴＢ抗原をナノ粒子上に提示させた。第１の抗原であるＡｇ８５複合体は、細胞壁のアラビノガラクタンへのミコール酸の転移を触媒することにより、およびトレハロースジミコラート（コードファクター）の合成により、細胞壁の完全性を維持させる。Ａｇ８５は高免疫原性であり、強力なＴ細胞応答および抗体応答を誘導しうる。最近のワクチン試験はＢＣＧワクチン接種後の乳児におけるＡｇ８５Ａに対する抗体価の上昇を報告しており、更に重要なことに、Ａｇ８５Ａ特異的ＩｇＧはＴＢのリスク低下と関連していた。本発明者らは、Ａｇ８５Ａ、ＢおよびＣを個々にＨＥＫ２９３Ｆ細胞において発現させ、Ａｇ８５ＡおよびＢに関しては、十分にフォールディングした単量体を観察したが、Ａｇ８５Ｃに関しては三量体タンパク質を観察した。本発明者らは、ロッキングドメインの存在下および非存在下のナノ粒子上にＡｇ８５Ａ、ＢおよびＣを提示させるための融合構築物を設計した。Ａｇ８５に対する抗体は報告されていないため、ファージ提示技術を利用して、Ａｇ８５Ａ、ＢおよびＣナノ粒子のタグ非利用精製のためのＡｇ８５結合抗体を特定した。
【０１３０】
第２の抗原であるＭｔｂ７２は、Ｍｔｂ３２とＭｔｂ３９とからなる融合タンパク質である。Ｍｔｂ７２はＧＳＫアジュバントＡＳ０１と組合せて使用されており、臨床試験で５４．０％の有効性を示した（Ｋｈｏｓｈｎｏｏｄら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１２０：１８０−１８８，２０１８を参照されたい）。本発明者らはＭｔｂ３２およびＭｔｂ３９を別々の抗原としてＨＥＫ２９３Ｆ細胞において発現させ、比較的低い収量を観察した。ロッキングドメインの存在下および非存在下のナノ粒子上に提示されるＭｔｂ３２およびＭｔｂ３９を使用して、融合構築物を設計した。ファージライブラリースクリーニングを行って、抗体カラムのパッキングのための抗体を選択した。これらのＴＢ抗原は、ＨＣＶ  Ｅ２およびＺＩＫＶ  ＤＩＩＩに類似した単量体（Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５ＢおよびＭｔｂ３２）、またはＨＩＶ−１  ＥｎｖおよびエボラＧＰに類似した三量体（Ａｇ８５ＣおよびＭｔｂ３９）のいずれかであるため、得られたＴＢナノ粒子はほぼ同様の特性を示した。
【０１３１】
実施例１５  非ウイルス標的に対するワクチン（ＰＣＳＫ９ワクチン）の開発
２種類のリポタンパク質、すなわち、低密度リポタンパク質（またはＬＤＬ）および高密度リポタンパク質（またはＨＤＬ）が、細胞から、そして細胞へと、コレステロールを運搬する。ＬＤＬは動脈内の脂肪蓄積に寄与するため、ＬＤＬコレステロールは「悪玉」コレステロールと見なされる。血中のＬＤＬコレステロールレベルの上昇は、西欧諸国における早死の一般的原因である心血管疾患のリスクの増加に関連づけられている。プロタンパク質転換酵素スブチリシン・ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）は、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬ−Ｒ）の分解を制御することにより、血清ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）を調節する。ＰＣＳＫ９は７４ｋＤａのセリンプロテアーゼであり、以下の３つのドメインを含有する：Ｎ末端プロドメイン、スブチリシン様触媒ドメインおよびＣ末端システイン／ヒスチジンリッチドメイン（ＣＴＤ）（図１６Ａ）。ＰＣＳＫ９は自己触媒的切断を受けるが、１４ｋＤａのプロドメインは触媒ドメインに非共有結合したままであり、プロテアーゼを不活性にする。機能喪失型ＰＣＳＫ９突然変異はＬＤＬコレステロール濃度の低下および心疾患のリスク低下に関連していることが判明している。これらの機能喪失型突然変異は有害な副作用を引き起こさないため、ワクチン誘導性抗体によるＰＣＳＫ９阻害は、ＬＤＬコレステロール濃度を低下させるための魅力的な治療戦略となる。種々のリガンドと複合体形成した完全長ＰＣＳＫ９およびトランケート化ＰＣＳＫ９の結晶構造が解明されており、ワクチン設計のための合理的な基礎を提供している（図１６Ａ）。
【０１３２】
本発明者らの研究においては、ロッキングドメインの存在下または非存在下の全３個のナノ粒子プラットフォーム上でＰＣＳＫ９を提示させた。ＰＣＳＫ９はサイズが大きく、形状が不規則であるため、Ｐｆｓ２５ナノ粒子で使用したのと同様の「ネック」設計を採用した（図１６Ｂ）。簡潔に説明すると、ウイルス由来の３ヘリックスバンドル（ヘンドラウイルスドメイン）を構築物においてＰＣＳＫ９とナノ粒子サブユニットとの間に挿入した。ＰＣＳＫ９およびＰＣＳＫ９ナノ粒子のタグ非利用精製のために、ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ）により開発された強力な抗ＰＣＳＫ９抗体であるＪ１６（Ｌｉａｎｇら，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ，３４０（２）：２２８−２３６，２０１２を参照されたい）を使用して、抗体カラムをパックした。ＥｘｐｉＣＨＯ細胞における一過性発現の後、融合タンパク質をＪ１６抗体カラムにより上清から抽出し、ネガティブ染色ＥＭにより分析した。最初に、ネック設計を有さない２つの融合構築物を試験した（図１６Ｃ）。ＰＣＳＫ９−１０ＧＳ−ＦＲは均質ナノ粒子を形成したが（図１６Ｃ、左）、ＰＣＳＫ９−５ＧＳ−ＰＡＤＲＥ−Ｉ３−０１−ＬＤ７は、おそらくＰＣＳＫ９の大きなサイズおよび不規則な形状ゆえに、組織化できなかった（図１６Ｃ、右）。ついで、ネック１を含有するナノ粒子構築物を発現させた（図１６Ｄ）。どちらのフェリチン構築物もナノ粒子を形成したが、ネック１とフェリチンとの間に、より長いリンカーを有するもの、すなわち、ＰＣＳＫ９−１０ＧＳ−ネック１−１０ＧＳ−ＦＲは、より高い収量および純度でナノ粒子を生成した（図１６Ｄ、パネル１および２）。外部に提示されておりロッキングドメイン（ＬＤ７）のＣ末端に融合しているＰＡＤＲＥを含有する２つのＩ３−０１構築物は、両方のＥＭイメージにおいて未組織化融合タンパク質が観察されたものの、若干異なる形態のナノ粒子を形成した（図１６Ｄ、パネル３および４）。
【０１３３】
要約すると、ＰＣＳＫ９は、ネックドメイン、ロッキングドメインおよびＴ細胞エピトープＰＡＤＲＥを含有する６０量体Ｉ３−０１および２４量体フェリチン上に提示可能であり、ナノ粒子は自己寛容を破壊し、高い力価の抗体応答を誘導しうるため、ＰＣＳＫ９より有効なワクチン候補が提供されうる。
【０１３４】
このように、本発明は広く開示されており、前記の代表的な実施形態に関して例示されている。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に種々の修飾が施されうると理解される。
【０１３５】
本明細書中に引用されている全ての刊行物、配列アクセッション番号、特許および特許出願の全体を、それぞれが本明細書中に組み入れられると個々に示されている場合と同様に、あらゆる目的で明示的に本明細書中に組み入れることとする。参照により組み入れられるテキストに含まれている定義は、それらが本開示における定義と矛盾する場合には除外される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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