(57)【要約】  本出願は、疾患について対象をスクリーニングする(および/または対象を処置する)方法に関する。本出願は、疾患を決定するための細胞およびキットにさらに関する。また、疾患における対象の閾値を決定する個人仕様の細胞モデルシステムおよびその個人仕様の処置に基づくものを含めた処置も企図される。
2021521888.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患について対象をスクリーニングする方法であって、
a)対象からゲノムDNAを得る工程と、
b)目的の遺伝子をゲノムDNAから同定する工程と、
c)遺伝子を、直鎖状DNAである構築体内に挿入する工程と、
d)目的の遺伝子の相同遺伝子を有する試験細胞を提供する工程であって、相同遺伝子が試験細胞からノックアウトされている、工程と、
e)構築体を試験細胞内に導入する工程と、
f)試験細胞を、1つのアミノ酸を欠いている培地中での細胞成長について評価する工程であって、試験細胞の成長を、相同遺伝子を有する対照細胞と比較し、試験細胞の成長が対照細胞のそれに匹敵する場合、これは目的の遺伝子が機能的タンパク質をコードしていることを示し、試験細胞の成長が対照細胞と比較した場合に遅い場合、これは目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示し、疾患を示す、工程と
を含む、方法。
【請求項２】
対象が胎児、新生児、青少年、または成人である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
細胞および対照細胞が酵母細胞である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
アミノ酸がセリンである、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
対象が妊娠中である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子が、3-PGDH、PSAT1、またはPSPHをコードしている、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
細胞成長を液体培養物の光学密度、固形培地上に成長中の細胞のコロニーのピクセル数によって測定する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
評価する工程が、0.5、2、4、6、8、10、12、24、36、72、96、もしくは120時間、または任意の2つの前述の値によって定義される範囲の間の任意数の時間の間、細胞成長を測定する工程を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
試験細胞の細胞成長が、自動画像解析による対照細胞のそれに匹敵し、試験細胞が、対照細胞の成長値の少なくとも90%である光学密度を有する、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
試験細胞の細胞成長が対照細胞と比較して遅く、細胞が、対照細胞の光学密度の79%以下である光学密度を有する、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
目的の遺伝子が、単一ヌクレオチド多型性についてさらに分析される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
単一ヌクレオチド多型性が、目的の遺伝子によってコードされているタンパク質の機能喪失または機能低下に関連するものとして同定される、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
t検定を試験細胞と対照細胞との間で行って有意な成長差を検査し、t検定のp値<0.0001が、試験細胞と対照細胞との間の有意な成長差を示す、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
有意な成長差が、目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示し、疾患を示す、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
疾患がNLS、セリン欠損症候群、または網膜神経障害である、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
対象においてアミノ酸欠損を決定する方法であって、
a)ゲノムDNAを対象から単離する工程と、
b)アミノ酸合成経路の酵素をコードしている遺伝子をゲノムDNAから検出する工程と、
c)遺伝子を構築体内に挿入する工程と、
d)構築体を試験細胞内に導入する工程と、
e)アミノ酸が非存在の培地中で細胞を成長させる工程と、
f))培養物中の試験細胞の成長を分析する工程であって、試験細胞の成長を対照細胞と比較し、試験細胞の成長を対照細胞と比較した場合に、対照細胞はアミノ酸合成が欠損しておらず、試験細胞の細胞成長が対照細胞のそれに匹敵することは、遺伝子が機能的酵素をコードしていることを示し、試験細胞の細胞成長が対照細胞と比較して遅いことは、遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示し、請求項1に記載の方法を示し、対象が胎児、新生児、青少年、または成人である工程と
を含む、方法。
【請求項１７】
細胞および対照細胞が酵母細胞である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
アミノ酸がセリンである、請求項16または17に記載の方法。
【請求項１９】
対象が妊娠中である、請求項16から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
遺伝子が、3-PGDH、PSAT1、またはPSPHをコードしている、請求項16から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
細胞成長を液体培養物の光学密度、固形培地上に成長中の細胞のコロニーのピクセル数によって測定する、請求項16から20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
分析工程が、0.5、2、4、6、8、10、12、24、36、72、96、もしくは120時間、または任意の2つの前述の値によって定義される範囲の間の任意数の時間の間、細胞成長を測定する工程を含む、請求項16から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
試験細胞の細胞成長が、自動画像解析による対照細胞のそれに匹敵し、試験細胞が、対照細胞の成長値の少なくとも90%である光学密度を有する、請求項16から22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
試験細胞の細胞成長が対照細胞と比較して遅く、細胞が、対照細胞の光学密度の79%以下である光学密度を有する、請求項16から23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
目的の遺伝子が、単一ヌクレオチド多型性についてさらに分析される、請求項16から24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
単一ヌクレオチド多型性が、目的の遺伝子によってコードされているタンパク質の機能喪失または機能低下に関連するものとして同定される、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
t検定を試験細胞と対照細胞との間で行って有意な成長差を検査し、t検定のp値<0.0001が、試験細胞と対照細胞との間の有意な成長差を示す、請求項16から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
有意な成長差が、目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示し、疾患を示す、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
疾患が、対象におけるNLS、セリン欠損症候群、網膜神経障害、またはアミノ酸欠損である、請求項16から28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
分析工程が、遺伝子中の少なくとも1つの突然変異を同定することをさらに含む、請求項16から29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
a)ゲノムDNAを対象から単離する工程と、
b)アミノ酸合成経路の酵素をコードしている遺伝子をゲノムDNAから検出する工程であって、対象が遺伝子の2つの異なる対立遺伝子を有する、工程と、
c)遺伝子を、直鎖状DNAである構築体内に挿入する工程と、
d)構築体を試験細胞内に導入する工程と、
e)試験細胞をアミノ酸が非存在の培地中で成長させる工程と、
f)試験細胞を、1つのアミノ酸を欠いている培地中での細胞成長について評価する工程であって、試験細胞の成長を、相同遺伝子を有する対照細胞と比較し、試験細胞の成長が対照細胞のそれに匹敵することは、目的の遺伝子が機能的タンパク質をコードしていることを示し、試験細胞の細胞成長が対照細胞と比較して遅いことは、目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示し、対象がアミノ酸欠乏性障害の保因者であることを示す、工程と
を含む、アミノ酸欠乏性障害の保因者を決定する方法。
【請求項３２】
アミノ酸欠乏性障害がNLSである、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
アミノ酸欠損を有する対象を処置する方法であって、
a)アミノ酸欠乏性障害の対象または保因者を決定する工程であって、
アミノ酸合成経路の酵素をコードしている遺伝子をゲノムDNAから検出することと、
遺伝子を、直鎖状DNAである構築体内に挿入することと、
構築体を試験細胞内に導入することと、
試験細胞をアミノ酸が非存在の培地中で成長させることと、
試験細胞を、1つのアミノ酸を欠いている培地中での細胞成長について評価することであって、試験細胞の成長を、相同遺伝子を有する対照細胞と比較し、試験細胞の細胞成長が対照細胞と比較して遅いことは、目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示し、対象がアミノ酸欠乏性障害の保因者であることを示す、評価することと
を含む、工程と、
b)十分な量のアミノ酸サプリメントを対象に提供する工程と
を含む、方法。
【請求項３４】
アミノ酸サプリメントがセリンである、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
遺伝子が、3-PGDH、PSAT1、またはPSPHをコードしている、請求項33または34に記載の方法。
【請求項３６】
対象が胎児であり、胎児の母親に十分な量のアミノ酸サプリメントを提供する、請求項33から35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
評価する工程が、試験細胞の成長を第2の対照細胞と比較する工程であって、第2の対照細胞はセリン生合成が欠損している、工程をさらに含む、請求項33から36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
アミノ酸欠乏性障害がNLSである、請求項33から37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
a)ゲノムDNAを女性および男性の対象から得る工程と、
b)同じ目的の遺伝子を女性および男性の対象のゲノムDNAから同定する工程であって、対象が、遺伝子についてホモ接合性またはヘテロ接合性である、工程と、
c)女性からの第1の目的の遺伝子変異体を、直鎖状DNAである第1の構築体内に挿入する工程と、
d)男性からの第2の目的の遺伝子変異体を、直鎖状DNAである第2の構築体内に挿入する工程と、
e)目的の遺伝子の相同遺伝子を有する第1の細胞を提供する工程であって、相同遺伝子が細胞からノックアウトされている、工程と、
f)目的の遺伝子の相同遺伝子を有する第2の細胞を提供する工程であって、相同遺伝子が細胞からノックアウトされている、工程と、
g)直鎖状DNAである第1の構築体を第1の細胞内に導入する工程と、
h)直鎖状DNAである第2の構築体を第2の細胞内に導入する工程と、
i)第1および第2の細胞を、1つのアミノ酸を欠いている培地中での細胞成長について評価する工程であって、第1および第2の細胞の細胞成長を、相同遺伝子を有する対照細胞と比較し、第1および/または第2の細胞の細胞成長が対照細胞のそれに匹敵することは、第1および第2の目的の遺伝子が機能的タンパク質をコードしていることを示し、第1および第2の細胞の細胞成長が対照細胞と比較して遅いことは、第1および第2の目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示し、男性および/または女性がアミノ酸欠損の疾患の保因者であることを示す、工程と
を含む、アミノ酸欠損の出生前予測の方法。
【請求項４０】
第1および第2の目的の遺伝子を含む第3の細胞の二倍体株を作製する工程と、第3の細胞を、1つのアミノ酸を欠いている培地中での細胞成長について評価する工程であって、第3の細胞の細胞成長を、相同遺伝子を有する対照細胞と比較し、第3の細胞の細胞成長が対照細胞のそれに匹敵することは、第1および第2の目的の遺伝子が機能的タンパク質をコードしていることを示し、第3の細胞の細胞成長が対照細胞と比較して遅いことは、第1および第2の目的の遺伝子が一緒になってアミノ酸欠損を有する予測される胎児を示すことを示す、工程とをさらに含む、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
第1、第2、および第3の細胞からのデータを参照表中に保管し、参照表は疾患予測のために作成されている、請求項39または40に記載の方法。
【請求項４２】
アミノ酸欠損の疾患がNLSである、請求項39から41のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
a)ゲノムDNAを女性および男性の対象から得る工程と、
b)同じ目的の遺伝子を女性および男性の対象のゲノムDNAから同定する工程であって、対象が、遺伝子についてホモ接合性またはヘテロ接合性である、工程と、
c)女性からの第1の目的の遺伝子を第1の構築体内に挿入する工程と、
d)男性からの第2の目的の遺伝子を第2の構築体内に挿入する工程と、
e)目的の遺伝子の相同遺伝子を有する第1の細胞を提供する工程であって、相同遺伝子が細胞からノックアウトされている、工程と、
f)目的の遺伝子の相同遺伝子を有する第2の細胞を提供する工程であって、相同遺伝子が細胞からノックアウトされている、工程と、
g)第1および第2の目的の遺伝子を含む第3の細胞の二倍体株を作製する工程と
h)直鎖状DNAである第1の構築体を第1の細胞内に導入する工程と、
i)直鎖状DNAである第2の構築体を第2の細胞内に導入する工程と、
j)第1、第2、および第3の細胞を、1つのアミノ酸を欠いている培地中での細胞成長について評価する工程であって、第1および第2の細胞の細胞成長を、相同遺伝子を有する対照細胞と比較し、第1、第2、および第3の細胞の細胞成長が対照細胞のそれに匹敵することは、第1および第2の目的の遺伝子が機能的タンパク質をコードしていることを示し、第1、第2、および第3の細胞の細胞成長が対照細胞と比較して遅いことは、第1および第2の目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示し、子孫のアミノ酸欠損を予測する、工程と
を含む、少なくとも一方の親が遺伝子突然変異を有する、アミノ酸欠損の出生前予測の方法。
【請求項４４】
第1の目的の遺伝子または第2の目的の遺伝子が遺伝子突然変異を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
目的の遺伝子がPSATをコードしている、請求項43または44に記載の方法。
【請求項４６】
目的の遺伝子が、アミノ突然変異A99V、S179L、T156M、G78A、R213C、またはR222のうちの少なくとも1つを有するPSAT1をコードしている、請求項43から45のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
第1、第2、および第3の細胞からのデータを参照表中に保管し、参照表は疾患予測のために作成されている、請求項43から46のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
アミノ酸欠損がNLSによって引き起こされる、請求項43から47のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
アミノ酸欠損または疾患の指標であり得る遺伝子または遺伝子の組合せを示す参照表と、
少なくともG78A、R213C、T156M、またはR222が含まれる、PSAT中の1つまたは複数の突然変異を検出するための1つまたは複数の核酸プローブと
を含む、アミノ酸欠損を決定するためのキット。
【請求項５０】
セリン欠損を患っている対象を処置するために十分な量のセリンサプリメントをさらに含む、請求項49に記載のキット。
【請求項５１】
疾患の指標である遺伝子または遺伝子の組合せを含む参照表を提供する工程と、
目的の遺伝子を対象から単離する工程と、
遺伝子に参照表中の1つまたは複数の突然変異が含まれるかどうかを決定する工程と、
対象における疾患の確率を決定する工程と
を含む、対象がアミノ酸欠損を患っているかどうかを決定する方法。
【請求項５２】
参照表が、突然変異G78A、R213C、T156M、またはR222を含むPSATをコードしているPSATの遺伝子が含まれる遺伝子の組合せを含む、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
参照表が、請求項43に記載の方法によって決定された突然変異のリストを含み、前記方法は、対象がアミノ酸欠損を有する確率が50%より高い場合に、アミノ酸欠損を処置するために対象にアミノ酸サプリメントを投与する工程をさらに含む、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
アミノ酸欠損を有する対象を処置する方法であって、
a)対象がG78、R213、T156、またはR222に位置するPSAT中の少なくとも1つの突然変異を有するかどうかを決定する工程と、
b)対象が少なくとも1つの突然変異を有する場合に、十分な量のセリンサプリメントを対象に提供する工程と
を含む、方法。
【請求項５５】
少なくとも1つの突然変異が、G78A、R213C、T156M、またはR222であり、対象が、少なくとも1つの突然変異の存在について試験する母親の、まだ生まれていない子供である、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
アミノ酸欠損の原因またはマーカーとしての点突然変異を同定する方法であって、
a)ゲノムDNAを、アミノ酸欠損を有する対象から得る工程と、
b)3-PGDH、PSAT1、またはPSPHのうちの少なくとも1つにおけるゲノムDNA中の点突然変異を同定する工程と、
c)試験酵母細胞を提供する工程であって、3-PGDH、PSAT1、またはPSPHのうちの少なくとも1つの相同遺伝子が試験酵母細胞からノックアウトされている、工程と、
d)点突然変異を有する遺伝子を試験酵母細胞内に導入する工程と、
e)試験酵母細胞を、1つのアミノ酸を欠いている培地中での細胞成長について評価する工程であって、試験酵母細胞の成長を、相同遺伝子を有する対照細胞と比較し、試験酵母細胞の成長が対照細胞のそれに匹敵する場合、これは点突然変異が依然として機能的タンパク質を可能にすることを示し、試験酵母細胞の成長が対照細胞と比較して遅い場合、これは点突然変異が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をもたらすことを示し、それによって点突然変異がアミノ酸欠損の原因またはマーカーとして同定される工程と
を含む、方法。
【請求項５７】
疾患の危険性にある対象を決定するための、個人仕様の酵母モデルを調製する方法であって、
a)対象からゲノムDNAを得る工程と、
b)ゲノムDNAから少なくとも2つの対立遺伝子中の目的の遺伝子を同定する工程と、
c)遺伝子を、直鎖状DNAである構築体内に挿入する工程と、
d)目的の遺伝子の相同遺伝子を有する試験細胞を提供する工程であって、相同遺伝子が試験細胞からノックアウトされている、工程と、
e)構築体を試験細胞内に導入する工程と、
f)試験細胞を、1つのアミノ酸を欠いている培地中での細胞成長について評価する工程であって、試験細胞の成長を、相同遺伝子を有する対照細胞と比較し、試験細胞の成長が対照細胞のそれに匹敵する場合、これは目的の遺伝子が機能的タンパク質をコードしていることを示し、試験細胞の成長が対照細胞と比較した場合に遅い場合、これは目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示し、疾患を示す、工程と、
g)参照表のデータを作成する工程と、
h)対象の1つまたは複数の個人仕様の疾患寛解の推奨を作成する工程と、疾患管理のための対象の個人仕様の疾患防止プランにおいて、対象の1つまたは複数の個人仕様の疾患防止の推奨を提示する工程と
を含む、方法。
【請求項５８】
a)第2のゲノムDNAを第2の対象から得る工程であって、第2の対象は、対象の2つの対立遺伝子に関連する、第2の構築体中に配置されている第2の目的の遺伝子を有する2つの対立遺伝子の第2の組を有する、工程と、b)第2の構築体を第2の試験細胞内に導入し、第2の試験細胞を、1つのアミノ酸を欠いている培地中での細胞成長について評価する工程であって、試験細胞の成長を、相同遺伝子を有する対照細胞と比較し、第2の試験細胞の成長が対照細胞のそれに匹敵する場合、これは目的の遺伝子が機能的タンパク質をコードしていることを示し、試験細胞の成長が対照細胞と比較した場合に遅い場合、これは目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示す、工程とをさらに含む、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
第2のゲノムDNAを第2の対象から得る工程と、ゲノムDNAから少なくとも2つの対立遺伝子中の第2の目的の遺伝子を同定する工程と、第2の遺伝子のうちの少なくとも1つを第2の構築体内に挿入する工程と、第2の構築体を第2の試験細胞内に導入する工程と、第2の細胞を第1の細胞と接合させて子孫細胞を生じさせる工程とをさらに含む、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
子孫細胞を、1つのアミノ酸を欠いている培地中での細胞成長について評価する工程であって、試験細胞の成長を、相同遺伝子を有する対照細胞と比較し、子孫細胞の成長が対照細胞のそれに匹敵する場合、これは目的の遺伝子が機能的タンパク質をコードしていることを示し、子孫細胞の成長が対照細胞と比較して遅い場合、これは目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示し、疾患を示す、工程とをさらに含む、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
評価する工程が、固体寒天プレート上に成長中の酵母を写真撮影し、カスタムソフトウェアを使用して画像解析を行うことによって、細胞成長を定量する工程をさらに含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
先行出願の参考としての組み込み
本出願は、すべての目的のためにその全体で本明細書中に参考として組み込まれる、2018年4月18日に出願された「アミノ酸欠損を検出する方法」という名称の米国仮特許出願第62/659,307号の優先権を主張するものである。
【０００２】
電子形式の配列表および表
本出願は、電子形式の配列表と共に出願する。配列表は、13,175バイトのサイズの、2019年4月16日に作成のファイル名SequenceListingPNDRI008のファイルとして提供する。配列表の電子形式中の情報は、その全体で本明細書中に参考として組み込まれる。
【０００３】
発育中の胎児または無症候性の対象などの対象においてアミノ酸欠損を決定する方法。代謝性疾患の確率に向けられた、子孫の遺伝的結果を予測する方法も企図される。また、治療方法およびキットも提供する。
【背景技術】
【０００４】
セリン生合成を司っている3つの代謝遺伝子のうちの任意のものにおいて、ホモ接合性または複合ヘテロ接合性の機能喪失型突然変異を有する個体は、先天性小頭症、難治性癲癇発作、および重篤な精神運動遅滞を呈する重篤な神経発達症候群を有し得る。
【０００５】
ニュー-ラクソバ(Neu-Laxova)症候群(NLS)は、常染色体劣勢形質として遺伝する稀な遺伝子障害である。この症候群は、出生前に起こる重篤な成長遅延によって特徴づけられている。子宮内成長遅延、低い出生時体重および身長、ならびに頭部および顔面(頭蓋顔面)の領域の独特な異常が、この障害の症状の一部である。他の特徴には、頭部が著しく小さいこと(小頭症)、額が傾斜していること、眼の間隔が広いこと(両眼隔離症)、および他の形成異常が含まれる場合があり、その結果、独特な顔面の外見がもたらされる。全身にわたる組織内の異常な体液蓄積(全身性浮腫)、複数の関節の永久屈曲および不動(屈曲拘縮)、肢形成異常、ならびに/または脳、皮膚、生殖器、腎臓、および/または心臓の異常も、ニュー-ラクソバ症候群(NLS)を患っている者において見つかり得る。(Scottら、Am J Med Genet. 1981年;9:165〜75頁、参考として含まれる)
【０００６】
新生児では、生殖器の発達不十分、腎臓のうちの1つの非存在(片側腎非形成)もしくは他の腎欠損、肺の発達不十分(肺形成不全)、または心臓の構造的異常(先天性心臓欠損)などの、さらなる物理的異常も存在し得る。先天性心臓形成異常には、心臓の上側もしくは下側の心房心室を隔てる線維性隔壁(中隔)における異常な開口(心房もしくは心室の中隔欠損)、心臓から現れる2つの主幹動脈(大動脈、肺動脈)の間の胎児性開口の持続(動脈管開存)、および/または大動脈および肺動脈が互いの正常位置にある心臓欠損が含まれ得る。NLSを有する乳児は、死産であるか、または生後間もない時期に生命にかかわる合併症を発症し得る。
【０００７】
NLSは常染色体劣勢形質として遺伝する。したがって、どちらも劣性障害の保因者であるカップルが疾患を子供に遺伝する危険性は25パーセントである。その子供の50パーセントは、疾患の保因者であるが、一般に障害の症状を示さない危険性がある。その子供の25パーセントは、それぞれの親から1つずつの両方正常な遺伝子を受け、遺伝学的に正常となり得る(その特定の形質について)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Scottら、Am J Med Genet. 1981年;9:165〜75頁
【非特許文献２】Scerriら、Nat Genet. 2017年4月;49(4):559〜567頁
【非特許文献３】de Koningら、2003年
【非特許文献４】Klompら、2000年
【非特許文献５】Pindら、2002年
【非特許文献６】de KoningおよびKlomp、2004年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
代謝性疾患が初期に診断される場合、栄養補助食品により疾患症状を軽減またはさらには排除することができる。出生前診断に続き、妊娠初期に開始する母親へ、および出生以降から患者へのセリン補充により、症状の発症が防止または寛解され得る。
【００１０】
本明細書中に記載のアッセイは、セリン生合成遺伝子の対立遺伝子のうちのどちらが中性であるか病原性であるかを決定することによって、より早期に使用できる、遺伝子配列決定に基づく診断(発育中の胎児または無症候性の親が含まれる)を容易にすると予想される。これは、胎児の遺伝的結果を決定するために使用することができるか、または、この情報を、2人の対象の将来の子孫の遺伝的結果を決定するために使用し得る。また、対立遺伝子を使用して、個別化治療を開発し得る、または、疾患の症状を寛解させるための介入、たとえば、疾患に関連する罹患率および/もしくは死亡率を低下させ得るもしくは防止し得るアミノ酸サプリメントを導き得る。
【００１１】
セリンを生成する生化学的経路は、ヒトと酵母との間でほぼ同一である。ヒトにおいて3つのセリン生合成遺伝子のうちの任意のものにおける機能喪失型突然変異がセリン欠損症候群を引き起こす。酵母では、酵母酵素の機能喪失型は、定量的かつ容易に測定される形質である、セリンサプリメントの非存在下での成長不良を生じさせる。本明細書における実施形態では、PSAT1遺伝子のヒトタンパク質コード配列が、酵母中の対応するSER1遺伝子を機能的に置き換えることができることが示されている。したがって、特定の患者中に見つかるPSAT1遺伝子変異体の活性を測定するための、実施形態中に記載の酵母に基づくアッセイを、ゲノムワイド関連研究(GWAS)、または全人口に使用し得る。
【００１２】
第1の態様では、疾患について対象をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、対象からゲノムDNAを得る工程と、目的の遺伝子をゲノムDNAから同定する工程と、遺伝子を、直鎖状DNAである構築体内に挿入する工程と、目的の遺伝子の相同遺伝子を有する試験細胞を提供する工程であって、相同遺伝子が試験細胞からノックアウトされている、工程と、構築体を試験細胞内に導入する工程と、試験細胞を、1つのアミノ酸を欠いている培地中での細胞成長について評価する工程であって、試験細胞の成長を、相同遺伝子を有する対照細胞と比較し、試験細胞の成長が対照細胞のそれに匹敵する場合、これは目的の遺伝子が機能的タンパク質をコードしていることを示し、試験細胞の成長が対照細胞と比較した場合に遅い場合、これは目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示し、疾患を示す、工程を含む。一部の実施形態では、対象は、胎児、新生児、青少年、または成人である。一部の実施形態では、細胞および対照細胞は酵母細胞である。一部の実施形態では、アミノ酸はセリンである。一部の実施形態では、対象は妊娠中である。一部の実施形態では、遺伝子は、3-PGDH、PSAT1、またはPSPHをコードしている。一部の実施形態では、細胞成長は、液体培養物の光学密度、または固形培地上に成長中の細胞のコロニーのピクセル数によって測定する。一部の実施形態では、評価する工程は、0.5、2、4、6、8、10、12、24、36、72、96、もしくは120時間、または任意の2つの前述の値によって定義される範囲の間の任意数の時間の間、細胞成長を測定する工程を含む。一部の実施形態では、試験細胞の成長は、自動画像解析による対照細胞のそれに匹敵し、試験細胞は、対照細胞の成長値の少なくとも90%である成長値を有する。一部の実施形態では、試験細胞の細胞成長は対照細胞と比較して遅く、細胞は、対照細胞の成長値の79%以下である光学密度を有する。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、単一ヌクレオチド多型性についてさらに分析される。一部の実施形態では、単一ヌクレオチド多型性は、目的の遺伝子によってコードされているタンパク質の機能喪失または機能低下に関連するものとして同定される。一部の実施形態では、t検定を試験細胞と対照細胞との間で行って有意な
成長差を検査し、t検定のp値<0.0001が、試験細胞と対照細胞との間の高度に有意な成長差を示す。一部の実施形態では、有意な成長差は、目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示し、疾患を示す。一部の実施形態では、疾患はNLS、セリン欠損症候群、または網膜神経障害である。一部の実施形態では、評価は、固体寒天プレート上に成長中の酵母を写真撮影し、カスタムソフトウェアを使用して画像解析を行うことによって、細胞成長を定量する工程をさらに含む。
【００１３】
第2の態様では、対象においてアミノ酸欠損を決定する方法を提供する。この方法は、ゲノムDNAを対象から単離する工程と、アミノ酸合成経路の酵素をコードしている遺伝子をゲノムDNAから検出する工程と、遺伝子を構築体内に挿入する工程と、構築体を試験細胞内に導入する工程と、アミノ酸が非存在の培地中で細胞を成長させ、培養物中の試験細胞の成長を分析する工程であって、試験細胞の成長を対照細胞と比較し、試験細胞の成長を対照細胞と比較した場合に、対照細胞はアミノ酸合成が欠損しておらず、試験細胞の細胞成長が対照細胞のそれに匹敵することは、遺伝子が機能的酵素をコードしていることを示し、試験細胞の細胞成長が対照細胞と比較して遅いことは、遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示しており、請求項1に記載の方法を示し、対象が胎児、新生児、青少年、または成人である、工程を含む。一部の実施形態では、細胞および対照細胞は酵母細胞である。一部の実施形態では、アミノ酸はセリンである。一部の実施形態では、対象は妊娠中である。一部の実施形態では、遺伝子は、3-PGDH、PSAT1、またはPSPHをコードしている。一部の実施形態では、細胞成長は光学密度によって測定する。一部の実施形態では、分析工程は、0.5、2、4、6、8、10、12、24、36、72、96、もしくは120時間、または任意の2つの前述の値によって定義される範囲の間の任意数の時間の間、細胞成長を測定する工程を含む。
【００１４】
一部の実施形態では、試験細胞の細胞成長は、自動画像解析による対照細胞のそれに匹敵し、試験細胞は、対照細胞の成長値の少なくとも90%である成長値を有する。一部の実施形態では、試験細胞の細胞成長は対照細胞と比較して遅く、細胞は、対照細胞の光学密度の79%以下である成長値を有する。
【００１５】
一部の実施形態では、目的の遺伝子は、単一ヌクレオチド多型性についてさらに分析される。一部の実施形態では、単一ヌクレオチド多型性は、目的の遺伝子によってコードされているタンパク質の機能喪失または機能低下に関連するものとして同定される。
【００１６】
一部の実施形態では、t検定を試験細胞と対照細胞との間で行って有意な成長差を検査し、t検定のp値<0.0001が、試験細胞と対照細胞との間の高度に有意な成長差を示す。一部の実施形態では、有意な成長差は、目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示し、疾患を示す。
【００１７】
一部の実施形態では、疾患は、対象におけるNLS、セリン欠損症候群、もしくは網膜神経障害、またはアミノ酸欠損である。
【００１８】
一部の実施形態では、分析工程は、遺伝子中の少なくとも1つの突然変異を同定することをさらに含む。
【００１９】
第3の態様では、アミノ酸欠乏性障害の保因者を決定する方法を提供する。この方法は、ゲノムDNAを対象から単離する工程と、アミノ酸合成経路の酵素をコードしている遺伝子をゲノムDNAから検出する工程であって、対象が遺伝子の2つの異なる対立遺伝子を有する、工程と、遺伝子を、直鎖状DNAである構築体内に挿入する工程と、構築体を試験細胞内に導入する工程と、試験細胞をアミノ酸が非存在の培地中で成長させる工程と、試験細胞を、1つのアミノ酸を欠いている培地中での細胞成長について評価する工程であって、試験細胞の成長を、相同遺伝子を有する対照細胞と比較し、試験細胞の成長が対照細胞のそれに匹敵することは、目的の遺伝子が機能的タンパク質をコードしていることを示し、試験細胞の細胞成長が対照細胞と比較して遅いことは、目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示し、対象がアミノ酸欠乏性障害の保因者であることを示す、工程を含む。一部の実施形態では、アミノ酸欠乏性障害はNLSである。
【００２０】
第4の態様では、アミノ酸欠損を有する対象を処置する方法を提供する。この方法は、アミノ酸欠乏性障害の対象または保因者を決定する工程を含み、決定する工程は、アミノ酸合成経路の酵素をコードしている遺伝子をゲノムDNAから検出することと、遺伝子を、直鎖状DNAである構築体内に挿入することと、構築体を試験細胞内に導入することと、試験細胞をアミノ酸が非存在の培地中で成長させることと、試験細胞を、1つのアミノ酸を欠いている培地中での細胞成長について評価することであって、試験細胞の成長を、相同遺伝子を有する対照細胞と比較し、試験細胞の細胞成長が対照細胞と比較して遅いことは、目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示し、対象がアミノ酸欠乏性障害の保因者であることを示す、評価することと、十分な量のアミノ酸サプリメントを対象に提供することを含む。一部の実施形態では、アミノ酸サプリメントはセリンである。一部の実施形態では、酵素は、遺伝子が3-PGDH、PSAT1、またはPSPHをコードしているものである。一部の実施形態では、対象は胎児であり、胎児の母親に十分な量のアミノ酸サプリメントを提供する。一部の実施形態では、評価する工程は、試験細胞の成長を第2の対照細胞と比較する工程であって、第2の対照細胞はセリン生合成が欠損している、工程をさらに含む。一部の実施形態では、アミノ酸欠乏性障害はNLSである。
【００２１】
第5の態様では、アミノ酸欠損の出生前予測の方法を提供する。この方法は以下の工程を含む:ゲノムDNAを女性および男性の対象から得る工程と、同じ目的の遺伝子を女性および男性の対象のゲノムDNAから同定する工程であって、対象が、遺伝子についてホモ接合性またはヘテロ接合性である、工程と、女性からの第1の目的の遺伝子変異体を、直鎖状DNAである第1の構築体内に挿入する工程と、男性からの第2の目的の遺伝子変異体を、直鎖状DNAである第2の構築体内に挿入する工程と、目的の遺伝子の相同遺伝子を有する第1の細胞を提供する工程であって、相同遺伝子が細胞からノックアウトされている、工程と、目的の遺伝子の相同遺伝子を有する第2の細胞を提供する工程であって、相同遺伝子が細胞からノックアウトされている、工程と、直鎖状DNAである第1の構築体を第1の細胞内に導入する工程と、直鎖状DNAである第2の構築体を第2の細胞内に導入する工程と、第1および第2の細胞を、1つのアミノ酸を欠いている培地中での細胞成長について評価する工程であって、第1および第2の細胞の細胞成長を、相同遺伝子を有する対照細胞と比較し、第1および/または第2の細胞の細胞成長が対照細胞のそれに匹敵することは、第1および第2の目的の遺伝子が機能的タンパク質をコードしていることを示し、第1および第2の細胞の細胞成長が対照細胞と比較して遅いことは、第1および第2の目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示し、男性および/または女性がアミノ酸欠損の疾患の保因者であることを示す、工程。一部の実施形態では、この方法は、第1および第2の目的の遺伝子を含む第3の細胞の二倍体株を作製する工程と、第3の細胞を、1つのアミノ酸を欠いている培地中での細胞成長について評価する工程であって、第3の細胞の細胞成長を、相同遺伝子を有する対照細胞と比較し、第3の細胞の細胞成長が対照細胞のそれに匹敵することは、第1および第2の目的の遺伝子が機能的タンパク質をコードしていることを示し、第3の細胞の細胞成長が対照細胞と比較して遅いことは、第1および第2の目的の遺伝子が一緒になってアミノ酸欠損を有する予測される胎児を示すことを示す、工程をさらに含む。一部の実施形態では、第1、第2、および第3の細胞からのデータを参照表中に保管し、参
照表は疾患予測のために作成されている。一部の実施形態では、アミノ酸欠損の疾患はNLSである。
【００２２】
第6の態様では、少なくとも一方の親が遺伝子突然変異を有する、アミノ酸欠損の出生前予測の方法を提供する。この方法は、ゲノムDNAを女性および男性の対象から得る工程と、同じ目的の遺伝子を女性および男性の対象のゲノムDNAから同定する工程であって、対象が、遺伝子についてホモ接合性またはヘテロ接合性である、工程と、女性からの第1の目的の遺伝子を第1の構築体内に挿入する工程と、男性からの第2の目的の遺伝子を第2の構築体内に挿入する工程と、目的の遺伝子の相同遺伝子を有する第1の細胞を提供する工程であって、相同遺伝子が細胞からノックアウトされている、工程と、目的の遺伝子の相同遺伝子を有する第2の細胞を提供する工程であって、相同遺伝子が細胞からノックアウトされている、工程と、第1および第2の目的の遺伝子を含む第3の細胞の二倍体株を作製する工程と、直鎖状DNAである第1の構築体を第1の細胞内に導入する工程と、直鎖状DNAである第2の構築体を第2の細胞内に導入する工程と、第1、第2、および第3の細胞を、1つのアミノ酸を欠いている培地中での細胞成長について評価する工程であって、第1および第2の細胞の細胞成長を、相同遺伝子を有する対照細胞と比較し、第1、第2、および第3の細胞の細胞成長が対照細胞のそれに匹敵することは、第1および第2の目的の遺伝子が機能的タンパク質をコードしていることを示し、第1、第2、および第3の細胞の細胞成長が対照細胞と比較して遅いことは、第1および第2の目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示し、子孫のアミノ酸欠損を予測する、工程を含む。一部の実施形態では、第1の目的の遺伝子または第2の目的の遺伝子は遺伝子突然変異を含む。一部の実施形態では、目的の遺伝子はPSATをコードしている。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、アミノ突然変異A99V、S179L、T156M、G78A、R213C、またはR222のうちの少なくとも1つを有するPSAT1をコードしている。一部の実施形態では、第1、第2、および第3の細胞からのデータを参照表中に保管し、参照表は疾患予測のために作成されている。一部の実施形態では、アミノ酸欠損はNLSによって引き起こされる。
【００２３】
第7の態様では、アミノ酸欠損を決定するためのキットを提供する。キットは、アミノ酸欠損または疾患の指標であり得る遺伝子または遺伝子の組合せを示す参照表と、少なくともG78A、R213C、T156M、またはR222が含まれる、PSAT中の1つまたは複数の突然変異を検出するための1つまたは複数の核酸プローブとを含む。一部の実施形態では、キットは、セリン欠損を患っている対象を処置するために十分な量のセリンサプリメントを含む。
【００２４】
第8の態様では、対象がアミノ酸欠損を患っているかどうかを決定する方法を提供する。この方法は、疾患の指標である遺伝子または遺伝子の組合せを含む参照表を提供する工程と、目的の遺伝子を対象から単離する工程と、遺伝子に参照表中の1つまたは複数の突然変異が含まれるかどうかを決定する工程と、対象における疾患の確率を決定する工程を含む。一部の実施形態では、参照表が、突然変異G78A、R213C、T156M、またはR222を含むPSATをコードしているPSATの遺伝子が含まれる遺伝子の組合せを含む。一部の実施形態では、参照表は、請求項43に記載の方法によって決定された突然変異のリストを含み、前記方法は、対象がアミノ酸欠損を有する確率が50%より高い場合に、アミノ酸欠損を処置するために対象にアミノ酸サプリメントを投与する工程をさらに含む。
【００２５】
第9の態様では、アミノ酸欠損を有する対象を処置する方法を提供する。この方法は、対象がG78、R213、T156、またはR222に位置するPSAT中の少なくとも1つの突然変異を有するかどうかを決定する工程と、対象が少なくとも1つの突然変異を有する場合に、十分な量のセリンサプリメントを対象に提供する工程を含む。一部の実施形態では、少なくとも1つの突然変異は、G78A、R213C、T156M、またはR222であり、対象は、少なくとも1つの突然変異の存在について試験する母親の、まだ生まれていない子供である。
【００２６】
第10の態様では、アミノ酸欠損の原因またはマーカーとしての点突然変異を同定する方法を提供する。この方法は、ゲノムDNAを、アミノ酸欠損を有する対象から得る工程と、3-PGDH、PSAT1、またはPSPHのうちの少なくとも1つにおけるゲノムDNA中の点突然変異を同定する工程と、試験酵母細胞を提供する工程であって、3-PGDH、PSAT1、またはPSPHのうちの少なくとも1つの相同遺伝子が試験酵母細胞からノックアウトされている、工程と、点突然変異を有する遺伝子を試験酵母細胞内に導入する工程と、試験酵母細胞を、1つのアミノ酸を欠いている培地中での細胞成長について評価する工程であって、試験酵母細胞の成長を、相同遺伝子を有する対照細胞と比較し、試験酵母細胞の成長が対照細胞のそれに匹敵する場合、これは点突然変異が依然として機能的タンパク質を可能にすることを示し、試験酵母細胞の成長が対照細胞と比較して遅い場合、これは点突然変異が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をもたらすことを示し、それによって点突然変異がアミノ酸欠損の原因またはマーカーとして同定される工程を含む。
【００２７】
第11の態様では、疾患の危険性にある対象を決定するための、個人仕様の酵母モデルを調製する方法を提供する。この方法は、対象からゲノムDNAを得る工程と、ゲノムDNAから少なくとも2つの対立遺伝子中の目的の遺伝子を同定する工程と、遺伝子を、直鎖状DNAである構築体内に挿入する工程と、目的の遺伝子の相同遺伝子を有する試験細胞を提供する工程であって、相同遺伝子が試験細胞からノックアウトされている、工程と、構築体を試験細胞内に導入する工程と、試験細胞を、1つのアミノ酸を欠いている培地中での細胞成長について評価する工程であって、試験細胞の成長を、相同遺伝子を有する対照細胞と比較し、試験細胞の成長が対照細胞のそれに匹敵する場合、これは目的の遺伝子が機能的タンパク質をコードしていることを示し、試験細胞の成長が対照細胞と比較した場合に遅い場合、これは目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示し、疾患を示す、工程と、参照表のデータを作成する工程と、対象の1つまたは複数の個人仕様の疾患寛解の推奨を作成する工程と、疾患管理のための対象の個人仕様の疾患防止プランにおいて、対象の1つまたは複数の個人仕様の疾患防止の推奨を提示する工程を含む。一部の実施形態では、この方法は以下をさらに含む:a)第2のゲノムDNAを第2の対象から得る工程であって、第2の対象は、対象の2つの対立遺伝子に関連する、第2の構築体中に配置されている第2の目的の遺伝子を有する2つの対立遺伝子の第2の組を有する、工程と、b)第2の構築体を第2の試験細胞内に導入し、第2の試験細胞を、1つのアミノ酸を欠いている培地中での細胞成長について評価する工程であって、試験細胞の成長を、相同遺伝子を有する対照細胞と比較し、第2の試験細胞の成長が対照細胞のそれに匹敵する場合、これは目的の遺伝子が機能的タンパク質をコードしていることを示し、試験細胞の成長が対照細胞と比較した場合に遅い場合、これは目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示す、工程。一部の実施形態では、この方法は、第2のゲノムDNAを第2の対象から得る工程と、ゲノムDNAから少なくとも2つの対立遺伝子中の第2の目的の遺伝子を同定する工程と、第2の遺伝子のうちの少なくとも1つを第2の構築体内に挿入する工程と、第2の構築体を第2の試験細胞内に導入する工程と、第2の細胞を第1の細胞と接合させて子孫細胞を生じさせる工程をさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、子孫細胞を、1つのアミノ酸を欠いている培地中での細胞成長について評価する工程であって、試験細胞の成長を、相同遺伝子を有する対照細胞と比較し、子孫細胞の成長が対照細胞のそれに匹敵する場合、これは目的の遺伝子が機能的タンパク質をコードしていることを示し、子孫細胞の成長が対照細胞と比較して遅い場合、これは目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示し、疾患を示す、工程をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図1は、セリン生合成経路に関連づけられているタンパク質のタンパク質機能をアッセイするためのユニバーサル細胞種を示す模式図である。示すように、酵母およびヒトは、セリン生合成経路に関連づけられているタンパク質について相同体を有する。これらの酵素は酵母とヒトの間で保存的である。
【図２】図2は、酵母細胞を、セリンを欠く培地中で成長させる、PSAT1の機能の例示的な定量的酵母アッセイを示す図である。転写調節配列、ならびにヒトコード配列に隣接する5'および3'非翻訳領域(UTR)を含む核酸の構築体を示す。本明細書における実施形態では、ヒトコード配列は、代謝経路に関連づけられている酵母タンパク質配列の相同体である。下の棒グラフには、対照遺伝子(酵母遺伝子SER1)、ser1欠失、PSAT1遺伝子、PSAT1変異体1、およびPSAT1変異体2を発現する酵母細胞の成長の測定を示し、変異体1および2は既知の疾患対立遺伝子である。
【図３】図3は、セリン非存在におけるPSAT1の機能の定量的酵母アッセイを示す図である。野生型基準株(「酵母遺伝子」)、ser1欠失(「遺伝子なし」)、またはヒトPSAT1コード配列もしくは2つのヒト疾患遺伝子変異体(それぞれA99VおよびS179L)を有する株の、外因的に供給したセリンの非存在下における成長である。「酵母遺伝子」と「ヒト遺伝子」との成長の間のt検定は有意差なし(N.S.)であった。変異体1および2によって与えられる成長(疾患対立遺伝子はヒト遺伝子のそれよりも有意に低かった(t検定のp値<0.0001、***)。遺伝子欠失と変異体2との間に有意差はなく、これは変異体2が完全機能喪失型に等価であることを示唆している。
【図４】図4は、酵素突然変異体のコンピューター分析と酵素突然変異体の定量的酵母アッセイとの間の比較を示す図である。示すように、コンピューター方法は、機能的結果の予測の出来が悪い。左パネルは、いくつかのPSAT突然変異を発現する酵母細胞の成長の測定を示す棒グラフである:1)K110Q、2)V149M、3)T156M、4)R222*、5)N236H、6)V250A。右パネルには、PSATタンパク質の機能のコンピューター予測を含む表を示す:1)K110Q、2)V149M、3)T156M、4)R222*、5)N236H、6)V250A。
【図５】図5は、疾患に関連する可能性があるいくつかのPSAT1対立遺伝子の文献検索の一例を示す図である。患者は、それを記載している出版物の第1著者の苗字で標識付けしている。標識とは、これらの出版物中で使用されている患者の識別子、たとえば「患者1」または「DDD4K.03775」をいう。
【図６】疾患対立遺伝子を個々に試験する定性的アッセイを示す図である。ヒトPSAT1コード配列を保有する株(PSAT1)、3つの既知のヒト疾患遺伝子変異体(A99V、D100A、S179L)、または(G78AおよびR213C)として分類された疑われる病原性変異体の、セリン非存在における成長。S179LおよびG78Aはヌル対立遺伝子に匹敵する成長を有する。
【図７】図7は、罹患した個体および保因者である親の個人仕様の酵母モデルのアッセイの一例を示す図である。ヒトPSAT1を保有する二倍体株(PSAT1/PSAT1)、保因者である親の対立遺伝子(PSAT1/A99VもしくはPSAT1/S179L)、または文献からの罹患した患者の複合ヘテロ接合性(AV99V/S179L)の、セリン非存在における成長。9つすべての患者遺伝子型の「トリオ」の構築およびアッセイを行うことができる。
【図８】図8は、PSAT1遺伝子の神経閾値および病原性閾値の予測の一例を示す図である。また、この時点で病原性を正確に評価することができない、中性と病原性との間の領域も計算している(不確定な有意性の変異体(VUS)と標識)。
【図９】図9は、それぞれのバーの上に記載したPSAT1変異体を含有する一倍体株の、セリン非存在におけるいくつかの一倍体の成長値を示す図である。左から右へ、PSAT(対照)、A15V、A99V、c.delG107、D100A、D145Mfs*49、G78A、R213C、R342Dfs*6、S179L、およびS43Rである。Nは反復回数である。Yは成長値の中央値である。NSまたはアスタリスクは、変異体とPSAT1(対照)との間のt検定の結果を示す。これらはすべて、文献中で疾患に関連づけられている対立遺伝子である。A15V、A99V、c.delG107、D100A、D145Mfs*49、およびS179Lは文献中で病原性であるとみなされており、G78A、R213C、およびS43Rは不確定な有意性の変異体(VUS)として注記されている。
【図１０】図10は、罹患した患者(4)、保因者であるその親(2および3)(PSAT×D100Aおよびc.delG107×D100A)、ならびに参照用の野生型(1)の、「個人仕様の酵母モデル」を示す図である。これらは、図5に記載したものと同じ患者であることに注意されたい(Hartら)。ファイル名は患者を記載しており、たとえば、01-Hart_1_2はHart1およびHart2に対応する(どちらも同じ親および遺伝子型を有する)。株は二倍体である。以前の図と同様に、PSAT1変異体をそれぞれのバーの上に記載してある。Nは反復回数である。Yは成長値の中央値である。NSまたはアスタリスクは、変異体とPSAT1(保因者、2および3)との間のt検定の結果を示す。両方の親が同じ保因者遺伝子型を有していた事例も存在することに注意されたい。これらの事例の場合、バーが1つだけ存在する。図10に示すように、子孫は、機能が低下したタンパク質をもたらす2つのPSAT対立遺伝子(delG107×D100A)を有する。
【図１１】図11は、罹患した患者(3)、保因者であるその親(2)、および参照用の野生型(1)の、「個人仕様の酵母モデル」を示す図である。保因者である親はどちらもArg342Aspfs*6×PSAT1である。これらは、図5に記載したものと同じ患者であることに注意されたい(Acuna-Hidalgoら)。株は二倍体である。以前の図と同様に、PSAT1変異体をそれぞれのバーの上に記載してある。Nは反復回数である。Yは成長値の中央値である。NSまたはアスタリスクは、変異体とPSAT1(2)との間のt検定の結果を示す。両方の親が同じ保因者遺伝子型を有していた事例も存在することに注意されたい。これらの事例の場合、バーが1つだけ存在する。図11に示すように、子孫(3)は、機能喪失型を有するタンパク質をもたらす2つのPSAT対立遺伝子(Arg342Aspfs*6×Arg342Aspfs*6)を有する。
【図１２】図12は、罹患した患者(3)、保因者であるその親(2)、および参照用の野生型(1)の、「個人仕様の酵母モデル」を示す図である。これらは、図5に記載したものと同じ患者であることに注意されたい(Acuna-Hidalgoら)。株は二倍体である。以前の図と同様に、PSAT1変異体をそれぞれのバーの上に記載してある。どちらの親もA99V×PSAT1である。Nは反復回数である。Yは成長値の中央値である。NSまたはアスタリスクは、変異体とPSAT1(2)との間のt検定の結果を示す。この特定の事例のように、両方の親が同じ保因者遺伝子型を有していた事例も存在することに注意されたい。これらの事例の場合、オレンジ色のバーが1つだけ存在する。図12に示すように、子孫(3)は、機能が低下したタンパク質をもたらす2つのPSAT1対立遺伝子(A99V×A99V)を有する。
【図１３】図13は、罹患した患者(3)、保因者であるその親(2)、および参照用の野生型(1)の、「個人仕様の酵母モデル」を示す図である。これらは、図5に記載したものと同じ患者であることに注意されたい(Acuna-Hidalgoら)。株は二倍体である。親はどちらもPSAT×S179Lである。以前の図と同様に、PSAT1変異体をそれぞれのバーの上に記載してある。Nは反復回数である。Yは成長値の中央値である。NSまたはアスタリスクは、変異体とPSAT1(2)との間のt検定の結果を示す。この特定の事例のように、両方の親が同じ保因者遺伝子型を有していた事例も存在することに注意されたい。これらの事例の場合、バーが1つだけ存在する。図13に示すように、子孫(3)は、完全機能喪失型を有するタンパク質をもたらす2つのPSAT1対立遺伝子(S179L×S179L)を有する。
【図１４】図14は、罹患した患者(4)、保因者であるその親(2および3)、ならびに参照用の野生型(1)の、「個人仕様の酵母モデル」を示す図である。これらは、図5に記載したものと同じ患者であることに注意されたい(Acuna-Hidalgoら)。株は二倍体である。親はPSAT1×S179LおよびA99V×PSAT1である。以前の図と同様に、PSAT1変異体をそれぞれのバーの上に記載してある。Nは反復回数である。Yは成長値の中央値である。NSまたはアスタリスクは、変異体とPSAT1(保因者、2および3)との間のt検定の結果を示す。両方の親が同じ保因者遺伝子型を有していた事例も存在することに注意されたい。これらの事例の場合、バーが1つだけ存在する。図14に示すように、子孫(4)は、機能が低下したタンパク質をもたらす2つのPSAT対立遺伝子(A99V×S179L)を有する。
【図１５】図15は、罹患した患者(3)、保因者であるその親(2)、および参照用の野生型(1)の、「個人仕様の酵母モデル」を示す図である。これらは、図5に記載したものと同じ患者であることに注意されたい(Brassierら)。株は二倍体である。どちらの親もS43R×PSAT1である。以前の図と同様に、PSAT1変異体をそれぞれのバーの上に記載してある。Nは反復回数である。Yは成長値の中央値である。NSまたはアスタリスクは、変異体とPSAT1(2)との間のt検定の結果を示す。この特定の事例のように、両方の親が同じ保因者遺伝子型を有していた事例も存在することに注意されたい。これらの事例の場合、バーが1つだけ存在する。図15に示すように、子孫(3)は、比較的親と同じように機能的であるタンパク質をもたらす2つのPSAT1対立遺伝子(S43R×S43R)を有する。
【図１６】図16は、罹患した患者(3)、保因者であるその親(2)、および参照用の野生型(1)の、「個人仕様の酵母モデル」を示す図である。これらは、図5に記載したものと同じ患者であることに注意されたい(Moniesら)。株は二倍体である。どちらの親もG78A×PSAT1である。以前の図と同様に、PSAT1変異体をそれぞれのバーの上に記載してある。Nは反復回数である。Yは成長値の中央値である。NSまたはアスタリスクは、変異体とPSAT1(2)との間のt検定の結果を示す。この特定の事例のように、両方の親が同じ保因者遺伝子型を有していた事例も存在することに注意されたい。これらの事例の場合、オレンジ色のバーが1つだけ存在する。図16に示すように、子孫(3)は、親および野生型と比較して完全機能喪失型を有するタンパク質をもたらす2つのPSAT1対立遺伝子(G78A×G78A)を有する。
【図１７】図17は、罹患した患者(3)、保因者であるその親(2)、および参照用の野生型(1)の、「個人仕様の酵母モデル」を示す図である。これらは、図5に記載したものと同じ患者であることに注意されたい(McRaeら)。株は二倍体である。どちらの親もR213C×PSAT1である。以前の図と同様に、PSAT1変異体をそれぞれのバーの上に記載してある。Nは反復回数である。Yは成長値の中央値である。NSまたはアスタリスクは、変異体とPSAT1(2)との間のt検定の結果を示す。この特定の事例のように、両方の親が同じ保因者遺伝子型を有していた事例も存在することに注意されたい。これらの事例の場合、オレンジ色のバーが1つだけ存在する。図17に示すように、子孫(3)は、親および野生型と比較して機能が低下したタンパク質をもたらす2つのPSAT1対立遺伝子(R213C×R213C)を有する。
【図１８】図18は、罹患した患者(4)、保因者であるその親(2および3)、ならびに参照用の野生型(1)の、「個人仕様の酵母モデル」を示す図である。これらは、図5に記載したものと同じ患者であることに注意されたい(Glintonら)。株は二倍体である。親はPSAT1×A15VおよびD145Mfs*49×PSAT100)である。以前の図と同様に、PSAT1変異体をそれぞれのバーの上に記載してある。Nは反復回数である。Yは成長値の中央値である。NSまたはアスタリスクは、変異体とPSAT1(保因者、2および3)との間のt検定の結果を示す。両方の親が同じ保因者遺伝子型を有していた事例も存在することに注意されたい。これらの事例の場合、バーが1つだけ存在する。図18に示すように、子孫(4)は、野生型と比較して機能が低下したタンパク質をもたらす2つのPSAT対立遺伝子(D145Mfs*49×A15V)を有する。しかし、子孫は、親のうちの一方(バー3)と類似のタンパク質特徴を有する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
定義
別段に定義しない限りは、本明細書中ですべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００３０】
本明細書中で使用する「a」または「an」とは、1つまたは複数を意味し得る。
【００３１】
測定可能な値に言及する場合に本明細書中で使用する「約」とは、指定した値から±20%または±10%、より好ましくは±5%、さらにより好ましくは±1%、さらにより好ましくは±0.1%の変動を包含することを意味する。
【００３２】
本明細書中に記載する「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって作製された断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のうちの任意のものによって作製された断片などの、「核酸」または「核酸分子」をいう。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド(DNAおよびRNAなど)もしくは天然に存在するヌクレオチドの類似体(たとえば天然に存在するヌクレオチドの鏡像異性体)、または両者の組合せである単量体から構成することができる。修飾ヌクレオチドは、糖部分中および/またはピリミジンもしくはプリン塩基部分中に変更を有することができる。糖修飾には、たとえば、1つもしくは複数のヒドロキシル基をハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基で置き換えることが含まれる、または、糖をエーテルもしくはエステルとして官能化することができる。さらに、糖部分全体を、アザ糖および炭素環糖類似体などの立体的かつ電子的に類似の構造で置き換えることができる。塩基部分中の修飾の例には、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、または他の周知の複素環置換基が含まれる。核酸単量体は、リン酸ジエステル結合またはそのような連結の類似体によって連結することができる。リン酸ジエステル連結の類似体には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホロアミデートなどが含まれる。また、用語「核酸分子」には、ポリアミド主鎖に付着した天然に存在するまたは修飾された核酸塩基を含む、いわゆる「ペプチド核酸」も含まれる。核酸は一本鎖または二本鎖のどちらかであることができる。一部の代替では、融合タンパク質をコードしている核酸配列を提供する。一部の代替では、核酸はRNAまたはDNAである。
【００３３】
「発現構築体」または「構築体」とは、調節要素を有する細胞内に異種核酸を導入して、細胞中の異種核酸の発現をもたらすために使用する核酸である。本明細書中に記載の構築体には、それだけには限定されないが、プラスミド、ミニサークル、酵母、およびウイルスゲノムが含まれる。
【００３４】
構築体の単一コピーを酵母ゲノム内(欠失させた酵母遺伝子と同じ位置、ゲノム中の中性の位置、たとえばHO座位のいずれか)に安定挿入する。本明細書における実施形態では、構築体は、相同組換えによって酵母の核ゲノムまたはミトコンドリアゲノム内に組み込むことができる「直鎖状DNA分子(二本鎖または一本鎖)である。これらの構築体は、市販の遺伝子合成企業(たとえばTwist Biosciences社またはIDT社)によってin vitroで合成し得る。したがって、核酸配列は、同じタンパク質配列をコードしている、ヒト配列または酵母に最適化したバージョンであることができる。
【００３５】
「コーディングしている」または「コードしている」とは、本明細書に鑑みて読んだ際にその単純かつ通常の意味を有しており、それだけには限定されないが、たとえば、遺伝子、cDNA、またはmRNAなどの、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定配列の、定義されたアミノ酸の配列などの他の高分子を合成するための鋳型として役割を果たす特性が含まれ得る。したがって、ある遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳が、細胞または他の生物系においてタンパク質を生じる場合に、その遺伝子はそのタンパク質をコードしている。
【００３６】
セリン欠損症候群/ニュー-ラクソバ症候群(NLS)とは、セリン生合成を司っている3つの代謝遺伝子のうちの任意のものにおいて、ホモ接合性または複合ヘテロ接合性の機能喪失型突然変異を有する個体の疾患をいい、先天性小頭症、難治性癲癇発作、および重篤な精神運動遅滞を呈する重篤な神経発達症候群を引き起こす(図1を参照)。本明細書中に記載するセリン欠損症候群およびニュー-ラクソバ症候群(NLS)は互換性があるように使用される。ニュー-ラクソバ症候群(NLS)は非常に重篤な障害であり、死産、新生児死亡、または重篤な発達遅延をもたらす。しかし、初期に診断された場合は、栄養補助食品により疾患症状を軽減またはさらには排除することができる。1つの事例調査では、出生前診断に続き、妊娠初期に開始し(母親へ)、出生以降から患者へのセリン補充により、症状の発症が完全に防止された。セリン源は、セリン欠損を患っている者では600/mg/kg/日で、1日に4〜6回の用量で摂取することができる。
【００３７】
NLSは、セリン生合成経路に関与しており細胞増殖に必須であるPHGDH、PSAT1、およびPSPH遺伝子におけるホモ接合性または複合ヘテロ接合性の突然変異によって引き起こされる、不均一代謝障害である。3つの遺伝子すべてにおける突然変異が、セリン欠損症候群の原因として以前に同定されている。疾患のより緩和な形態も存在する。NLSは5000件の出生につき1件で見つかる。
【００３８】
「網膜神経障害」とは、視覚障害を引き起こし得る、眼の網膜への任意の損傷である。網膜症とは、しばしば、網膜血管疾患、または異常な血流によって引き起こされる網膜への損傷をいう。加齢黄斑変性症は、厳密には包括的用語である網膜症の下に含まれるが、多くの場合は別々の実体として議論される。網膜症、または網膜血管疾患は、増殖性および非増殖性の型に広く分類される。一部の事例では、網膜神経障害はセリンなどのアミノ酸の欠損によって引き起こされ得る。本明細書中の一部の実施形態では、対象は網膜神経障害を発生する危険性にあり、処置のために適切な量のセリンを受けるよう選択される。
【００３９】
さらに、セリン欠損のより緩和な形態が報告されている。これらのセリン欠損のより緩和な形態は、成人発症疾患に関連すると予測されている。限定的ではないが、いくつかの疾患が関連する可能性がある。本発明者らは網膜疾患に数回言及するが、セリン欠損(または他のアミノ酸障害)のより緩和な形態が成人発症疾患に関連する可能性がある事実を導入することが良いと予想される。一例はScerriら(その全体で本明細書中に参考として組み込まれるScerriら、Nat Genet. 2017年4月;49(4):559〜567頁)中にある。Scerriらは、40〜60歳の年齢で顕在化するセリン欠損、黄斑毛細血管拡張症2型(MacTel)を記載しており、MacTelに罹患した対象は異常な直角の近傍小窩毛細血管および傍中小窩毛細血管拡張症を患う。MacTelでは、いくつかの対立遺伝子における突然変異が疾患に関連づけられており、これがグリシンおよびセリンの代謝経路における問題をもたらす。
【００４０】
本明細書における実施形態に記載した対象は、胎児、新生児、青少年、または成人であり得る。「胎児」とは、本明細書に鑑みて読んだ際にその単術かつ通常の意味を有しており、それだけには限定されないが、たとえば、その胚状態とその出生との間の出生前のヒトが含まれ得る。「新生児」とは、生まれたばかりの子供をいう。「青少年」とは、確立されている18歳の年齢未満の人をいう。「成人」とは、18歳を超える年齢の任意の人をいう。
【００４１】
「参照表」とは、本明細書に鑑みて読んだ際にその単術かつ通常の意味を有しており、それだけには限定されないが、たとえば、致命的な結果を予測し得る遺伝子の組合せを用いて作成した表が含まれ得る。本明細書における実施形態では、参照表は、セリン依存性の網膜疾患、NLS、またはアミノ酸欠損などの代謝性疾患を予測し得る。また、様々な疾患について対立遺伝子の組合せの様々な閾値が存在するため、参照表上のデータは、タンパク質の機能を決定するための様々な予測閾値も提供する。
【００４２】
「細胞成長」は「成長値」ともいい、液体培養物の光学密度によって測定する。一部の実施形態では、細胞成長、また「成長値」は、固形培地上に成長中の細胞の「パッチ」もしくは「スポット」の面積、固形培地上に成長中の細胞の「パッチ」もしくは「スポット」のピクセル数、固形培地上に成長中の細胞の「パッチ」もしくは「スポット」のピクセルの輝度、これらのパラメータのうちの任意のものの経時的な変化、または前述のパラメータのうちの任意のものの組合せによって測定する。
【００４３】
詳細な説明
ヒトでは、セリンは栄養的には非必須アミノ酸である。必須アミノ酸の主な供給源は食事からであるが、非必須アミノ酸は通常、共通の中間体からヒトおよび他の哺乳動物によって合成される。図1に示すように、セリンは、解糖中間体である3-ホスホグリセリン酸(3-PG)から、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ(3-PGDH)、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ(PSAT)、およびホスホセリンホスファターゼ(PSP)の酵素を含む3工程の方法で生合成される。
【００４４】
また、セリンは、グリシンからの可逆的反応において、タンパク質およびリン脂質の分解によって、ならびに食事摂取によっても由来することができる。そのため、NLSは通常、セリンおよびグリシンの両方を用いた栄養補助食品によって処置する。十分なセリン濃度を維持する主要な経路は、de Koningら、2003年(de Koningら、2003年)によって記載されているように、組織型および発達段階に依存する可能性が高い。
【００４５】
セリンは、細胞の成長および発達において機能的な役割を果たす。たとえば、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼによるセリンからグリシンへの変換は、プリン塩基であるアデニンおよびグアニンの合成に必要な単一炭素単位の形成をもたらす。これらの塩基は五炭糖のリン酸エステルに連結していてよく、DNAおよびRNAの必須成分であり、エネルギー生成代謝経路の最終産物はATPおよびGTPである。さらに、酵素的経路によるグリシンへのセリン変換は、ピリミジンヌクレオチドの生成に必要な単一炭素単位であるデオキシチミジン一リン酸を提供し、これもDNAの必須成分である。
【００４６】
また、セリンは、神経伝達物質であるグリシンおよびD-セリンの前駆体として、およびL-システインを通して間接的に神経伝達物質タウリンの前駆体としての役割も果たす。グリシンはセリンから合成することができ、阻害性の神経伝達物質であり、シナプス後膜上のグリシン受容体に、またはグルタメートと一緒になって共作用剤として結合し得る。セリンから作製することができる必須成分には、NMDA受容体の作用剤であるD-セリン、およびセリンからトランス硫化経路によって形成することができるシステインが含まれる。これは、タンパク質の前駆体、グルタチオン、タウリン、補酵素A、および無機硫酸塩をもたらす。タウリンは阻害性の神経伝達物質として機能し、中枢神経系の出生前および出生後の発達において役割を果たす可能性が高い。したがって、セリンは細胞成長経路などの複数の経路において非常に必要とされている。
【００４７】
セリン欠損は、セリン生合成の稀な遺伝性の代謝障害である。現在までに文献中で報告されている事例の大多数は、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ(3-PGDH)活性の減少を示し、低い絶食血清およびCSFのセリンレベルをもたらしている。セリン欠損を有する先天性小頭症を呈する小児は、重篤な精神運動遅滞および難治性癲癇発作を発生し得る。
【００４８】
いくつかの突然変異が、1番染色体上に位置するヒト3-PGDHをコードしている遺伝子において同定されている(1p12または1q12)。突然変異のいくつかの例がKlompら、2000年およびPindら、2002年に記載されている。一部の突然変異は、報告されているほとんどの事例において酵素の位置490でのバリンからメチオニンへの置換(V490M)をもたらし、または1つの報告事例ではV425Mの置換をもたらす(Klompら、2000年、Pindら、2002年)。
【００４９】
セリン欠損をもって生まれたほぼすべての小児は先天性小頭症を有する。加えて、セリン欠損の特徴的な徴候には、重篤な精神運動遅滞、癲癇発作、痙性四肢麻痺が含まれ、一部の患者では、眼振、巨赤芽球性貧血、白内障、および性腺機能低下症が含まれる。
【００５０】
セリン欠損を持って生まれた小児では、脳脊髄液(CSF)中の低レベルのセリンが、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ(3-PGDH)および3-ホスホセリンホスファターゼ(3-PSP)欠損の両方の、最も信頼性のある指標である。すべてではないが一部の事例では、CSFのグリシンレベルは正常より低かった。空腹状態では、血漿セリン、および、より低い程度で血漿グリシンレベルは、正常レベルより低い。尿アミノ酸レベルは正常である。(de KoningおよびKlomp、2004年)。セリン生合成を司っている3つの代謝遺伝子のうちの任意のものにおいて、ホモ接合性または複合ヘテロ接合性の機能喪失型突然変異を有する個体は、先天性小頭症、難治性癲癇発作、および重篤な精神運動遅滞を呈する重篤な神経発達症候群を引き起こし得る。したがって、機能喪失型を有する酵素をもたらす突然変異は、セリン生合成の制限的工程をもたらすと予想される。
【００５１】
現在許容されているセリン欠損の診断は脳脊髄液からのセリンレベルを測定することであり、これは、発達遅延などの症状の多くが不可逆的となる出生後まで行うことができない。したがって、疾患の徴候の前に処置を提供するために、胎児において疾患を発生する可能性を決定する方法が必要である。記載したアッセイは、セリン生合成遺伝子の対立遺伝子のうちのどちらが中性であるか病原性であるかを決定することによって、より早期に使用できる、遺伝子配列決定に基づく診断(発育中の胎児または無症候性の親が含まれる)を容易にすると予想される。
【００５２】
有害タンパク質を決定するアッセイの開発
本明細書中に提供するように、代謝経路において機能する有害タンパク質を決定するためのアッセイを開発した。図1に示すように、セリンは、セリンを3-ホスホグリセリン酸から作製する3工程の経路で生成する。ヒトでは、これは3つのタンパク質、3-PGDH、PSAT1、およびPSPHに依存し、これらは酵母における保存的相同体でもある(SER3、SER33、SER1、およびSER2)。PSAT1をノックアウトし、酵母中でヒト相同体と置き換えることができることが示されている。3-PGD-HおよびPSPHのノックアウトも、そのヒト相同体で置き換えることができることが予測される。さらに、本明細書中に提供するように、この修飾酵母をその後、さらなる試験のモデル生物として使用することができる。
【００５３】
ヒト変異体をコードしている構築体を、酵母相同体をノックアウトした酵母システムにおける発現に使用することができる。たとえば、酵母を、遺伝子SER1がノックアウトされるように遺伝子操作することができる。その後、酵母を遺伝子操作して、図1に示すようにPSAT1を核酸から発現させる。酵母の発現構築体は当業者に知られており、強力な酵母プロモーター/ターミネーターを有していてよく、酵母選択マーカーカセットを含んでいてよい。
【００５４】
その後、アッセイを実行して、野生型SER1を発現する酵母細胞または突然変異を有さないPSAT1遺伝子を発現する酵母細胞と比較した酵母細胞の成長を決定することができる。セリンを生成する生化学的経路はヒトと酵母との間で高度に保存されているため、酵母がモデル生物として十分役割を果たすことを可能にする。ヒトにおいて3つのセリン生合成遺伝子のうちの任意のものにおける機能喪失型突然変異がセリン欠損症候群を引き起こす。酵母では、酵母酵素の機能喪失型は、定量的かつ容易に測定される形質である、セリンサプリメントの非存在下での成長不良を生じる。
【００５５】
キットおよびシステム
また、本明細書中に提供および記載した細胞、発現構築体、およびタンパク質配列、ならびにそれを作製および使用するための書面の指示が含まれる、キットおよびシステムも本明細書中で提供する。したがって、たとえば、本明細書中に記載のタンパク質配列、本明細書中に記載の発現構築体、および/または本明細書中に記載の細胞のうちの1つまたは複数を含むキットを、本明細書中で提供する。また、本明細書中に記載の細胞において遺伝子の組合せをアッセイするための二倍体株を調製するためのシステムであって、細胞が発現構築体を含み、構築体が本明細書中に記載のタンパク質配列をコードしている核酸を含むシステムも提供する。
【００５６】
また、有害な組合せを示し得る遺伝子の組合せを評価するための、システムと共に使用するための参照表も提供する。参照表とは、データの一形態を別の形態と相関させる表、データの1つもしくは複数の形態を、表現型もしくは形質などのデータが関連する予測される結果へと相関させる表である。たとえば、参照表は、代謝経路に関与している少なくとも1つのタンパク質の対立遺伝子データと、その特定の対立遺伝子データを含む個体が表示する可能性が高い、またはその特定の対立遺伝子データを含まない個体よりも表示する可能性が高い、特定の疾患診断などの特定の形質または表現型との間の相関を含むことができる。参照表は多次元的であることができ、たとえば、限定的ではないが、特定のタンパク質もしくは複数のタンパク質の複数の対立遺伝子に関する情報を同時に含有することができるか、または、突然変異変異体などの複数のタンパク質変異体に関する情報を含有することができ、また、疾患の診断、治療方法、または特定の疾患について使用する薬物に関する詳細などの他の要因も含み得る。一部の実施形態では、参照表は、少なくとも1つの対立遺伝子と疾患との間の相関を含む。一部の実施形態では、参照表は複数の疾患についての相関を含む。すべてのシナリオにおいて、対立遺伝子とセリン欠損などの代謝性疾患との間の相関の指標を与える参照表を参照することによって、試料が由来する個体において疾患または予測される子孫を同定することができる。一部の実施形態では、相関は統計的測度として報告する。統計的測度は、相対的リスク(RR)、絶対的リスク(AR)またはオッズ比(OR)などのリスク測度として報告し得る。また、これらは、タンパク質の病原性閾値、神経閾値を有するものとして、または未知の可変性としても報告することができる。
【００５７】
参照表は、対立遺伝子の個々の評価によって、または正常な遺伝子についてホモ接合性である細胞と試験する遺伝子の突然変異形態を有する細胞とを交雑させることによって作製した二倍体細胞の研究によって、作成し得る。
【００５８】
アミノ酸欠損または疾患の指標であり得る遺伝子または遺伝子の組合せを示す参照表と、少なくともG78A、R213C、T156M、R222が含まれる、PSAT中の1つまたは複数の突然変異を検出するための1つまたは複数の核酸プローブとを提供する、キットを使用することができる。一部の実施形態では、キットはサプリメントを含む。一部の実施形態では、サプリメントは、セリン欠損を患っている対象を処置するために十分な量のセリンである。
【実施例１】
【００５９】
PSATの変異体機能を決定するためのアッセイ
図2に示すように、PSAT1遺伝子のヒトタンパク質コード配列が、酵母中の対応するSER1遺伝子を機能的に置き換えることができる。この単一コピーを、転写、翻訳、およびmRNA安定性のためのネイティブ酵母調節配列の制御下で、図2に示す配列を含む核酸と共にゲノム内に安定に組み込むことができる。
【００６０】
PSAT1配列を、酵母中での発現のためにコドンを最適化した(配列番号1: ATGGACGCGCCAAGACAGGTTGTGAATTTCGGACCTGGGCCAGCTAAATTGCCTCACTCTGTTTTGTTGGAAATCCAGAAAGAGTTATTAGATTATAAAGGTGTAGGTATATCAGTCTTGGAAATGTCTCACCGTTCGTCTGATTTCGCCAAAATAATTAATAACACCGAGAACTTAGTTAGGGAACTGCTAGCCGTTCCTGACAACTATAAAGTGATTTTTTTGCAAGGTGGTGGCTGCGGTCAATTTTCTGCCGTTCCTTTAAATTTGATAGGTTTAAAAGCGGGTAGATGTGCCGACTATGTCGTCACCGGTGCGTGGTCTGCTAAAGCCGCTGAAGAGGCAAAGAAATTCGGTACTATCAACATTGTTCATCCAAAGTTGGGCTCTTACACTAAAATTCCGGATCCATCCACATGGAATTTAAATCCCGATGCATCATACGTGTACTACTGTGCTAATGAAACTGTTCATGGTGTTGAATTTGACTTTATTCCAGATGTTAAGGGTGCTGTTTTGGTTTGCGACATGTCCAGCAACTTCTTGTCTAAGCCAGTTGACGTTTCTAAATTCGGTGTCATCTTTGCAGGCGCCCAAAAAAACGTTGGTTCTGCAGGCGTAACCGTGGTTATTGTCAGAGATGACTTACTTGGTTTTGCGTTAAGAGAATGCCCTTCTGTTTTAGAGTATAAGGTGCAGGCCGGTAACTCATCACTGTATAATACACCACCATGCTTCTCTATATATGTTATGGGTCTCGTGTTAGAATGGATTAAGAATAATGGTGGTGCAGCTGCGATGGAGAAATTGTCTTCTATTAAGTCTCAGACGATATATGAGATAATAGATAACTCACAGGGTTTTTACGTTTGCCCAGTGGAACCACAGAATAGATCAAAAATGAATATCCCATTCCGTATAGGTAACGCGAAGGGCGATGACGCCCTTGAAAAGAGGTTTCTAGATAAGGCACTTGAGTTAAATATGCTGTCTTTGAAAGGACATCGTTCAGTTGGTGGGATCAGAGCCTCCTTGTATAACGCGGTGACGATCGAAGACGTACAAAAGTTGGCCGCTTTTATGAAGAAATTTTTGGAGATGCACCAGTTATAA)
【００６１】
フレームシフト突然変異には、最適化した配列を突然変異まで使用した。SNP後に、ヒトcDNA配列、配列番号2を使用した。(配列番号2: ATGGACGCCCCCAGGCAGGTGGTCAACTTTGGGCCTGGTCCCGCCAAGCTGCCGCACTCAGTGTTGTTAGAGATACAAAAGGAATTATTAGACTACAAAGGAGTTGGCATTAGTGTTCTTGAAATGAGTCACAGGTCATCAGATTTTGCCAAGATTATTAACAATACAGAGAATCTTGTGCGGGAATTGCTAGCTGTTCCAGACAACTATAAGGTGATTTTTCTGCAAGGAGGTGGGTGCGGCCAGTTCAGTGCTGTCCCCTTAAACCTCATTGGCTTGAAAGCAGGAAGGTGTGCGGACTATGTGGTGACAGGAGCTTGGTCAGCTAAGGCCGCAGAAGAAGCCAAGAAGTTTGGGACTATAAATATCGTTCACCCTAAACTTGGGAGTTATACAAAAATTCCAGATCCAAGCACCTGGAACCTCAACCCAGATGCCTCCTACGTGTATTATTGCGCAAATGAGACGGTGCATGGTGTGGAGTTTGACTTTATACCCGATGTCAAGGGAGCAGTACTGGTTTGTGACATGTCCTCAAACTTCCTGTCCAAGCCAGTGGATGTTTCCAAGTTTGGTGTGATTTTTGCTGGTGCCCAGAAGAATGTTGGCTCTGCTGGGGTCACCGTGGTGATTGTCCGTGATGACCTGCTGGGGTTTGCCCTCCGAGAGTGCCCCTCGGTCCTGGAATACAAGGTGCAGGCTGGAAACAGCTCCTTGTACAACACGCCTCCATGTTTCAGCATCTACGTCATGGGCTTGGTTCTGGAGTGGATTAAAAACAATGGAGGTGCCGCGGCCATGGAGAAGCTTAGCTCCATCAAATCTCAAACAATTTATGAGATTATTGATAATTCTCAAGGATTCTACGTTTGTCCAGTGGAGCCCCAAAATAGAAGCAAGATGAATATTCCATTCCGCATTGGCAATGCCAAAGGAGATGATGCTTTAGAAAAAAGATTTCTTGATAAAGCTCTTGAACTCAATATGTTGTCCTTGAAAGGGCATAGGTCTGTGGGAGGCATCCGGGCCTCTCTGTATAATGCTGTCACAATTGAAGACGTTCAGAAGCTGGCCGCCTTCATGAAAAAATTTTTGGAGATGCATCAGCTATGA)
GTCCAAGCCAGTGGATGTTTCCAAGTTTGGTGTGATTTTTGCTGGTGCCCAGAAGAATGTTGGCTCTGCTGGGGTCACCGTGGTGATTGTCCGTGATGACCTGCTGGGGTTTGCCCTCCGAGAGTGCCCCTCGGTCCTGGAATACAAGGTGCAGGCTGGAAACAGCTCCTTGTACAACACGCCTCCATGTTTCAGCATCTACGTCATGGGCTTGGTTCTGGAGTGGATTAAAAACAATGGAGGTGCCGCGGCCATGGAGAAGCTTAGCTCCATCAAATCTCAAACAATTTATGAGATTATTGATAATTCTCAAGGATTCTACGTTTGTCCAGTGGAGCCCCAAAATAGAAGCAAGATGAATATTCCATTCCGCATTGGCAATGCCAAAGGAGATGATGCTTTAGAAAAAAGATTTCTTGATAAAGCTCTTGAACTCAATATGTTGTCCTTGAAAGGGCATAGGTCTGTGGGAGGCATCCGGGCCTCTCTGTATAATGCTGTCACAATTGAAGACGTTCAGAAGCTGGCCGCCTTCATGAAAAAATTTTTGGAGATGCATCAGCTATGA)(PSAT1 cDNA、Genbank受託番号:CV023706)
【００６２】
一部の実施形態では、PSAT1は、配列番号3に記載の配列を含む遺伝子によってコードされている。
【００６３】
細胞を、セリンを含有する液体リッチ酵母培地(YPD)ブロス中で成長させた。野生型SER1(PSAT1の酵母相同体)、遺伝子なし、PSAT1、PSAT1突然変異体A99V、PSAT1突然変異体S179Lを発現する細胞を使用して、セリンを欠く酵母最少培地(SD)を含有する調製固体寒天プレートを接種した(レプリカピニングによる)。PSAT1変異体または対照(たとえば、酵母SER1遺伝子もしくはser1欠失)を含有するそれぞれの株の成長を、固体寒天プレート上で成長している酵母を写真撮影し、カスタムソフトウェア(本発明者らによって書かれたもの)を使用して画像解析を行うことによって定量した。アッセイには技術的および生物学的の複製が含まれる。示すように、酵母酵素の機能喪失型は、定量的かつ容易に測定される形質である、セリンサプリメントの非存在下での成長不良を生じる。以下の例では、PSAT1遺伝子のヒトタンパク質コード配列が、酵母中の対応するSER1遺伝子を機能的に置き換えることができることを示す。これにより、特定の患者、ゲノムワイド関連研究(GWAS)、または全人口中に見つかるPSAT1遺伝子変異体の活性を測定するための酵母に基づくアッセイが得られる(図3)。野生型基準株(「酵母遺伝子」)、SER1欠失(「遺伝子なし」)、またはヒトPSAT1コード配列もしくは2つのヒト疾患遺伝子変異体(それぞれA99VおよびS179L)を有する株の、セリン非存在における成長を示す。「酵母遺伝子」と「ヒト遺伝子」との成長の間のt検定は有意差なし(N.S.)であった。変異体1および2によって与えられる成長(疾患対立遺伝子はヒト遺伝子のそれよりも有意に低かった(t検定のp値<0.0001、***)。遺伝子欠失と変異体2との間に有意差はなく、これは変異体2が完全機能喪失型に等価であることを示唆している。酵母株に対する試験は、寒天プレート上または液体培地中のどちらかで行い得る。
【００６４】
アッセイを行って、コンピューター方法によって機能的または非機能的のどちらかであると決定された遺伝子の機能を評価した(図4)。以下の突然変異を有するPSATタンパク質に対して試験を行った:1)K110Q、2)V149M、3)T156M、4)R222*、5)N236H、6)V250A。表中に示すように(図4、右パネル)、突然変異K110QおよびV149Mを有するPSATタンパク質は有害タンパク質であると決定された。突然変異N236HおよびV250Aを有するPSATタンパク質は「中性」であるとみなされた一方で、T156MおよびR222はそれぞれ有害または未確定の機能を有すると予測された。
【００６５】
PSAT1タンパク質機能のアッセイを、突然変異1)K110Q、2)V149M、3)T156M、4)R222、5)N236H、6)V250Aを有するPSAT1タンパク質に対して行って、コンピューター方法によって決定された予測されたタンパク質特徴と比較したタンパク質機能を決定した(図4、右パネル)。図4の左パネルに示すように、突然変異体K110Q、V149M、N236H、およびV250Aは野生型PSAT1タンパク質の成長に匹敵する成長を有することが示された。突然変異T156MおよびR222を有するPSATタンパク質は、この方法によって有害であることが示された。したがって、このアッセイは、コンピューター分析によって予測することができないタンパク質の機能性を示すための素早い診断を提供する。
【００６６】
このアッセイは、個々の対立遺伝子に対する試験を行うためにも使用することができる。図6に示すように、追加の突然変異体も、セリンを欠く培地中でのその性能について試験した。示すように、G78AおよびR213Cの突然変異を有するPSAT突然変異体を、PSAT1(対照)、A99V、D100、およびS179を発現する細胞の成長と比較した。これらのタンパク質は以前に未知の可変性であると予測されていた。3つの既知のヒト疾患遺伝子変異体(A99V、D100A、およびS179L)の成長データ、ならびに可変性結果の株として分類された疑われる病原性変異体(S179LおよびG78A)を示す。示すように、S179LおよびG78A突然変異体はヌル対立遺伝子に匹敵する成長を有する。
【００６７】
細胞成長は「成長値」という場合もあり、液体培養物の光学密度によって測定し得る。一部の実施形態では、細胞成長、また「成長値」は、固形培地上に成長中の細胞の「パッチ」もしくは「スポット」の面積、固形培地上に成長中の細胞の「パッチ」もしくは「スポット」のピクセル数、固形培地上に成長中の細胞の「パッチ」もしくは「スポット」のピクセルの輝度、これらのパラメータのうちの任意のものの経時的な変化、または前述のパラメータのうちの任意のものの組合せによって測定する。
【実施例２】
【００６８】
罹患した個体および保因者用の個人仕様の酵母モデルのアッセイ
PSAT1/PSAT1、PSAT1/A99V、およびPSAT1/S179Lを保有する二倍体株を調製した。これらの二倍体株は、それぞれが2つの変異体、たとえばA99VおよびS179Lのうちの1つを含有する一倍体細胞を接合させることによって調製した。生じる二倍体細胞は2つの変異体についてヘテロ接合性である。ホモ接合性の二倍体株、ならびに遺伝子の野生型および突然変異型についてヘテロ接合性である株、たとえばPSAT1/A99Vを、同じ様式で作製する。その後、酵母細胞を、セリンを欠いたYPD培地中での成長について分析した。この試験は、細胞成長を評価するために寒天プレートまたは液体培地中でも行い得る。図8に示すように、二倍体細胞PSAT1/A99VおよびPSAT1/S179Lは病原性閾値より高く機能することが示され、これは、タンパク質は機能的であると予測されるが、タンパク質はPSAT1/PSAT1ホモ接合性と比較して活性が低下していることを示す。病原性閾値を様々なヘテロ接合体について計算し得る。細胞を交雑させてヘテロ接合性A99V/S179Lの作製を行って、ヘテロ接合体を、セリンを欠く培地中での成長について試験した。グラフに示すように、ヘテロ接合性A99V/S179LはPSAT1機能が低下したタンパク質を生じ、これは、A99VおよびS179L遺伝子をどちらも保有する子孫において病原性の表現型をもたらすと予測された。したがって、アッセイから作成されたデータを使用して、疾患の閾値を決定し得る、ならびに疾患の個人仕様のデータ予測、疾患の成人発症の予測、および2人の対象の子孫の疾患の予測を作成し得る。個人仕様の試験の一例を図7に示す。図7に二倍体株の試験を示す。対照はPSAT1についてホモ接合性である。2人の親はPSAT1/A99VおよびPSAT1/179Lについてヘテロ接合性である。示すように、子孫はA99VおよびS179L突然変異の保因者である。子孫によって発現されたタンパク質は、親株および対照細胞と比較して機能が低下している。
【００６９】
細胞成長は「成長値」という場合もあり、液体培養物の光学密度によって測定し得る。一部の実施形態では、細胞成長、また「成長値」は、固形培地上に成長中の細胞の「パッチ」もしくは「スポット」の面積、固形培地上に成長中の細胞の「パッチ」もしくは「スポット」のピクセル数、固形培地上に成長中の細胞の「パッチ」もしくは「スポット」のピクセルの輝度、これらのパラメータのうちの任意のものの経時的な変化、または前述のパラメータのうちの任意のものの組合せによって測定する。
【実施例３】
【００７０】
個人仕様のモデルシステムのためのPSAT突然変異を保有する二倍体酵母株の評価
図9は、それぞれのバーの上に記載したPSAT1変異体を含有する一倍体株の、セリン非存在におけるいくつかの一倍体の成長値を示す。培地が必須アミノ酸であるセリンを欠く、既に記載した方法において細胞を成長させる。左から右へ、PSAT(対照)、A15V、A99V、c.delG107、D100A、D145Mfs*49、G78A、R213C、R342Dfs*6、S179L、およびS43Rである。Nは反復回数である。Yは成長値の中央値である。NSまたはアスタリスクは、変異体とPSAT1(対照)との間のt検定の結果を示す。これらはすべて、文献中で疾患に関連づけられている対立遺伝子である。A15V、A99V、c.delG107、D100A、D145Mfs*49、およびS179Lは文献中で病原性であるとみなされており、G78A、R213C、およびS43Rは不確定な有意性の変異体(VUS)として注記されている。示すように、突然変異体PSAT1遺伝子を保有する一倍体細胞は機能が低下しており、機能の顕著な欠如が突然変異体c.delG107、D145Mfs*49、G78A、R342Dfs*6、およびS179Lで示されている。
【００７１】
その後、二倍体株中に少なくとも1つの突然変異を保有し得る子孫細胞を検査するために、二倍体株に対する試験を行った。図10〜図18に示すように、図5に記載の突然変異体を使用して、無セリン培地中での細胞の成長に影響を与えることが示された劣性遺伝子を1つまたは2つのどちらか有することの効果を検査した。
【００７２】
図10に、罹患した患者および保因者である親(PSAT×D100Aおよびc.delG107×D100A)の個人仕様の酵母モデルを示す。図10に示すように、子孫は、機能が低下したタンパク質をもたらす2つのPSAT対立遺伝子(delG107×D100A)を有する。したがって、この遺伝子型を有する患者には、正常な細胞機能を有するためにアミノ酸の補充を含む治療を提供する必要があり得る。
【００７３】
図11に、どちらも野生型PSAT1遺伝子の対立遺伝子およびArg342Aspfs遺伝子を有する保因者である親を持つ、罹患した患者の個人仕様の酵母モデルを示す。示すように、子孫(3)は、機能喪失型を有するタンパク質をもたらす2つのPSAT対立遺伝子(Arg342Aspfs*6×Arg342Aspfs*6)を有する。したがって、この遺伝子型を有する患者には、正常な細胞機能を有するためにアミノ酸の補充を含む治療を提供する必要があり得る。この試験は出産を控えた個体に対して行い得るため、この遺伝子型を有する胎児が決定された場合、胎児において正常な細胞機能を有するために、アミノ酸の補充を含む妊娠中の対象の治療を提供する必要があり得る。
【００７４】
図12に、どちらもA99Vの対立遺伝子および野生型PSAT1遺伝子を有する保因者である親を持つ、罹患した患者の個人仕様の酵母モデルを示す。示すように、子孫(3)は、機能が低下したタンパク質をもたらす2つのPSAT1対立遺伝子(A99V×A99V)を有する。したがって、この遺伝子型を有する患者には、正常な細胞機能を有するためにアミノ酸の補充を含む治療を提供する必要があり得る。
【００７５】
図13に、どちらも対立遺伝子PSAT1遺伝子およびS179L突然変異を有するPSAT1の遺伝子を有する保因者である親を持つ、罹患した患者の個人仕様の酵母モデルを示す。図13に示すように、子孫(3)は、完全機能喪失型を有するタンパク質をもたらす2つのPSAT1対立遺伝子(S179L×S179L)を有する。この試験は出産を控えた個体に対して行い得るため、この遺伝子型を有する胎児が決定された場合、胎児において正常な細胞機能を有するために、アミノ酸の補充を含む妊娠中の対象の治療を提供する必要があり得る。また、この試験は、代謝性疾患を有する子供を持つその確率を決定するために、カップルの遺伝子検査にも行い得る。
【００７６】
図14に、どちらも野生型PSAT1および劣性PSAT1突然変異遺伝子についてヘテロ接合性である保因者である親(PSAT1×S179LおよびA99V×PSAT1)を持つ、罹患した患者の個人仕様の酵母モデルを示す。示すように、子孫(4)は、機能が低下したタンパク質をもたらす2つのPSAT対立遺伝子(A99V×S179L)を有する。したがって、この遺伝子型を有する患者には、正常な細胞機能を有するためにアミノ酸の補充を含む治療を提供する必要があり得る。
【００７７】
図15に、どちらも野生型PSAT1および劣性PSAT1突然変異遺伝子についてヘテロ接合性である保因者である親(両方の親:S43R×PSAT1)を持つ、罹患した患者の個人仕様の酵母モデルを示す。図15に示すように、子孫(3)は、比較的親と同じように機能的であるタンパク質をもたらす2つのPSAT1対立遺伝子(S43R×S43R)を有する。したがって、セリンサプリメントが必要かどうかを決定するために、患者の健康の評価を評価する必要がある。
【００７８】
また、個人仕様の酵母モデルを、G78A突然変異を有するPSAT1の対立遺伝子および野生型PSAT1を有する親についても行った。図16に示すように、子孫(3)は、親および野生型と比較して完全機能喪失型を有するタンパク質をもたらす2つのPSAT1対立遺伝子(G78A×G78A)を有する。
【００７９】
また、個人仕様の酵母モデルを、R213C突然変異を有するPSAT1の対立遺伝子および野生型PSAT1を有する親についても行った。図17に示すように、子孫(3)は、親および野生型と比較して機能が低下したタンパク質をもたらす2つのPSAT1対立遺伝子(R213C×R213C)を有する。
【００８０】
図18に示すように、個人仕様の酵母モデルを、PSAT1×A15VおよびD145Mfs*49×PSAT100の対立遺伝子を有する2人のヘテロ接合性の親についても行った。子孫(4)は、野生型と比較して機能が低下したタンパク質をもたらす2つのPSAT対立遺伝子(D145Mfs*49×A15V)を有する。しかし、子孫は、親のうちの一方(バー3)と類似のタンパク質特徴を有しており、これは、一方の突然変異体が他方よりも優位であることを示す可能性がある。
【００８１】
個人仕様の試験に鑑みて、子供がその親から受けると予想される対立遺伝子の型、ならびにそれぞれの事例の結果を予測することができると予想されることが想定される。たとえば、特定の突然変異が別のものよりも優位であるかどうかを予測することができると予想される(図18に示す例など)。これは、2つの劣性の対立遺伝子を有する小児よりも多くの機能を有するタンパク質をもたらす可能性がある(図16および図17に示す)。したがって、両方のPSAT1野生型遺伝子、ならびに2つの劣性の突然変異遺伝子、およびヘテロ接合体の結果の可能性を有する子供を持つ確率を知らせると予想される、親になろうとする人についてのモデルを作成することができる。したがって、新生児の問題を防止するまたは疾患の成人発症を防止するために、治療を開発するまたはサプリメントを用いた食事計画などの初期介入を準備することが可能にあると予想される。
【００８２】
追加の実施形態
固体寒天プレート上での酵母の分析
第1の態様では、疾患について対象をスクリーニングする方法を提供する。この方法は以下対象からゲノムDNAを得る工程と、目的の遺伝子をゲノムDNAから同定する工程と、遺伝子を、直鎖状DNAである構築体内に挿入する工程と、目的の遺伝子の相同遺伝子を有する試験細胞を提供する工程であって、相同遺伝子が試験細胞からノックアウトされている、工程と、構築体を試験細胞内に導入する工程と、試験細胞を、1つのアミノ酸を欠いている培地中での細胞成長について評価する工程であって、試験細胞の成長を、相同遺伝子を有する対照細胞と比較し、試験細胞の成長が対照細胞のそれに匹敵する場合、これは目的の遺伝子が機能的タンパク質をコードしていることを示し、試験細胞の成長が対照細胞と比較した場合に遅い場合、これは目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示し、疾患を示す、工程を含む。一部の実施形態では、培地は固体寒天である。一部の実施形態では、評価する工程は、固体寒天プレート上に成長中の酵母を写真撮影し、カスタムソフトウェアを使用して画像解析を行うことによって、細胞成長を定量する工程をさらに含む。
【００８３】
分析は、たとえば、3日間から5日間にわたって12時間ごとに写真を撮影することによって行い得る。あるいは、寒天プレートの写真を3日間にわたって30分ごとに撮影してもよい。これらの事例の場合、細胞成長の経時的な変化を計算するために、その時間経過中の少なくとも1つの時点(エンドポイント分析)を使用し得るか、またはいくつかの時点を使用し得る。
【００８４】
一部の実施形態では、培地は液体培地である。一部の実施形態では、対象は、胎児、新生児、青少年、または成人である。一部の実施形態では、細胞および対照細胞は酵母細胞である。一部の実施形態では、アミノ酸はセリンである。一部の実施形態では、対象は妊娠中である。一部の実施形態では、遺伝子は、3-PGDH、PSAT1、またはPSPHをコードしている。一部の実施形態では、細胞成長は光学密度によって測定する。一部の実施形態では、評価する工程は、0.5、2、4、6、8、10、12、24、36、72、96、もしくは120時間、または任意の2つの前述の値によって定義される範囲の間の任意数の時間の間、細胞成長を測定する工程を含む。一部の実施形態では、試験細胞の細胞成長は、自動画像解析による対照細胞のそれに匹敵し、試験細胞は、対照細胞の成長値の少なくとも90%である光学密度を有する。一部の実施形態では、試験細胞の細胞成長は対照細胞と比較して遅く、細胞は、対照細胞の光学密度の79%以下である光学密度を有する。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、単一ヌクレオチド多型性についてさらに分析される。一部の実施形態では、単一ヌクレオチド多型性は、目的の遺伝子によってコードされているタンパク質の機能喪失または機能低下に関連するものとして同定される。一部の実施形態では、t検定を試験細胞と対照細胞との間で行って有意な成長差を検査し、t検定のp値<0.0001は、試験細胞と対照細胞との間の有意な成長差を示す。一部の実施形態では、有意な成長差は、目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示し、疾患を示す。一部の実施形態では、疾患はNLS、セリン欠損症候群、または網膜神経障害である。一部の実施形態では、評価する工程は、固体寒天プレート上に成長中の酵母を写真撮影し、カスタムソフトウェアを使用して画像解析を行うことによって、細胞成長を定量する工程をさらに含む。
【００８５】
参照表の方法および作成。
また、子孫の出生前予測を作成するために参照表を準備する方法も企図される。胎児、新生児、青少年、および成人である対象において疾患を予測するためのデータは、本明細書中に記載の方法によって得られ得る。このデータは、両親の個人仕様の酵母モデルに基づいて胎児の表現型の結果を予測するための参照表において使用してよく、また、網膜神経障害等の成人発症の代謝欠損などの将来の健康問題を決定するために、任意の年齢のヒトに対して使用してもよい。本発明の方法は、目的の遺伝子を有する対立遺伝子の一方または両方のどちらを試験したいかに応じて、一倍体細胞または二倍体細胞のどちらかについての試験において目的の遺伝子を分析するために、1人または2人の対象からゲノムDNAを得る工程を提供する。したがって、単一遺伝子の機能、または野生型遺伝子および突然変異による劣性ならびに二重劣性を有する効果を予測することができる。その後、結果を分析して、遺伝子の特定の組合せを疾患に相関させるための表を作成することができ、これを使用して、個人仕様の酵母モデルの結果に基づいた治療を開発し得る。
【００８６】
細胞成長の測定
一部の実施形態では、細胞成長は「成長値」という場合もあり、液体培養物の光学密度によって測定する。一部の実施形態では、細胞成長、また「成長値」は、固形培地上に成長中の細胞の「パッチ」もしくは「スポット」の面積、固形培地上に成長中の細胞の「パッチ」もしくは「スポット」のピクセル数、固形培地上に成長中の細胞の「パッチ」もしくは「スポット」のピクセルの輝度、これらのパラメータのうちの任意のものの経時的な変化、または前述のパラメータのうちの任意のものの組合せによって測定する。固形培地中での細胞成長の測定は、固体寒天プレート上に成長中の酵母を写真撮影し、カスタムソフトウェアを使用して画像解析を行うことによって測定し得る。
【００８７】
疾患についての対象のスクリーニング
疾患についてまたは疾患の保因者であることについて対象をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、対象からゲノムDNAを得る工程と、目的の遺伝子をゲノムDNAから同定する工程と、遺伝子を、直鎖状DNAである構築体内に挿入する工程と、目的の遺伝子の相同遺伝子を有する試験細胞を提供する工程であって、相同遺伝子が試験細胞からノックアウトされている、工程と、構築体を試験細胞内に導入する工程と、試験細胞を、1つのアミノ酸を欠いている培地中での細胞成長について評価する工程であって、試験細胞の成長を、相同遺伝子を有する対照細胞と比較し、試験細胞の成長が対照細胞のそれに匹敵する場合、これは目的の遺伝子が機能的タンパク質をコードしていることを示し、試験細胞の成長が対照細胞と比較した場合に遅い場合、これは目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示し、疾患を示す、工程を含む。一部の実施形態では、対象は、胎児、新生児、青少年、または成人である。一部の実施形態では、細胞および対照細胞は酵母細胞である。一部の実施形態では、アミノ酸はセリンである。一部の実施形態では、対象は妊娠中である。一部の実施形態では、遺伝子は、3-PGDH、PSAT1、またはPSPHをコードしている。一部の実施形態では、細胞成長、本明細書中以降「成長値」は、液体培養物の光学密度によって測定する。一部の実施形態では、細胞成長、また「成長値」は、固形培地上に成長中の細胞の「パッチ」もしくは「スポット」の面積、固形培地上に成長中の細胞の「パッチ」もしくは「スポット」のピクセル数、固形培地上に成長中の細胞の「パッチ」もしくは「スポット」のピクセルの輝度、これらのパラメータのうちの任意のものの経時的な変化、または前述のパラメータのうちの任意のものの組合せによって測定する。一部の実施形態では、評価する工程は、0.5、2、4、6、8、10、12、24、36、72、96、もしくは120時間、または任意の2つの前述の値によって定義される範囲の間の任意数の時間の間、細胞成長を測定する工程を含む。一部の実施形態では、試験細胞の成長は、自動画像解析による対照細胞のそれに匹敵し、試験細胞は、対照細胞の成長値の少なくとも90%である成長値を有する。一部の実施形態では、試験細胞の細胞成長は対照細胞と比較し
て遅く、細胞は、対照細胞の成長値の79%以下である光学密度または成長値を有する。測定は、固形培地上での細胞成長を分析することによって行ってよく、したがって、測定は、固形培地上に成長中の細胞の「パッチ」または「スポット」中のピクセル、これらのパラメータのうちの任意のものの経時的な変化の分析によって行う。この細胞成長は、野生型PSAT1遺伝子を保有している対照細胞に対して測定することができる。成長は、代謝性疾患の重篤な形態(たとえばNLS)の閾値を見つけるために測定する。成人発症疾患などの疾患のより緩和な形態は、疾患の重篤な形態を患っている者とは異なる閾値を有する可能性が高い。
【００８８】
一部の実施形態では、目的の遺伝子は、単一ヌクレオチド多型性についてさらに分析される。一部の実施形態では、単一ヌクレオチド多型性は、目的の遺伝子によってコードされているタンパク質の機能喪失または機能低下に関連するものとして同定される。一部の実施形態では、t検定を試験細胞と対照細胞との間で行って有意な成長差を検査し、t検定のp値<0.0001が、試験細胞と対照細胞との間の高度に有意な成長差を示す。一部の実施形態では、有意な成長差は、目的の遺伝子が非機能的タンパク質または機能が低下したタンパク質をコードしていることを示し、疾患を示す。一部の実施形態では、疾患はNLS、セリン欠損症候群、または網膜神経障害である。一部の実施形態では、評価は、固体寒天プレート上に成長中の酵母を写真撮影し、カスタムソフトウェアを使用して画像解析を行うことによって、細胞成長を定量する工程をさらに含む。
【００８９】
細胞成長は「成長値」という場合もあり、液体培養物の光学密度によって測定し得る。一部の実施形態では、細胞成長、また「成長値」は、固形培地上に成長中の細胞の「パッチ」もしくは「スポット」の面積、固形培地上に成長中の細胞の「パッチ」もしくは「スポット」のピクセル数、固形培地上に成長中の細胞の「パッチ」もしくは「スポット」のピクセルの輝度、これらのパラメータのうちの任意のものの経時的な変化、または前述のパラメータのうちの任意のものの組合せによって測定する。
【００９０】
追加の配列
【００９１】
PSAT1_コドン_最適化した組込みプラスミド
【００９２】
1〜1342=pUC19ベクター主鎖
【００９３】
1336〜1343および4759〜4764(太字)=SapIおよびSnaBI制限部位を使用して構築体を組込み用に自由にする
【００９４】
1343〜1438(斜体)=組込みを指示するためのSER1開始コドンの5'配列
【００９５】
1439〜2551(下線)=出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)中での発現用に最適化されたコドンを有するPSAT1オープンリーディングフレーム。
【００９６】
2552〜3014(太字斜体)=SER1ターミネーター配列が含まれるSER1ストップコドンの3'配列
【００９７】
3015〜4520(小文字)=kanMX薬物マーカー
【００９８】
4521〜4761(斜体)=組込みを指示するためのSER1ターミネーターの3'配列
【００９９】
4762〜6097(大文字)=pUC19ベクター主鎖
【０１００】
AB481またはpAS19-PSAT1-K配列(配列番号3)
【化１Ａ】
2021521888.tif 000003
【化１Ｂ】
2021521888.tif 000004
【化１Ｃ】
2021521888.tif 000005
【０１０１】
当分野の技術者には、一般に、本明細書中および特に添付の特許請求の範囲(たとえば特許請求の範囲の本文)において使用する用語は、一般に「オープンな」用語として意図することが理解されると予想される(たとえば、用語「含まれること」は「それだけには限定されないが〜が含まれること」として解釈されるべきであり、用語「有する」は「少なくとも〜を有する」と解釈されるべきであり、用語「含まれる」は「それだけには限定されないが〜が含まれる」と解釈されるべきである、など)。さらに、当分野の技術者には、具体的な数の導入された特許請求の範囲の記載を意図する場合は、そのような意図は特許請求の範囲中に明確に記載され、そのような記載の非存在下では、そのような意図は存在しないことが理解されると予想される。たとえば、理解を助けるものとして、以下の添付の特許請求の範囲は、特許請求の範囲の記載を導入するために導入語句「少なくとも1つ」および「1つまたは複数」の使用を含有し得る。しかし、そのような語句の使用は、不定冠詞「a」または「an」による特許請求の範囲の記載の導入が、そのような導入された特許請求の範囲の記載を含有する任意の特定の特許請求の範囲を、1つのみのそのような記載を含有する実施形態に限定することを暗示すると解釈されるべきでなく、同じ特許請求の範囲に導入語句「1つもしくは複数」または「少なくとも1つ」および「a」または「an」などの不定冠詞が含まれる場合でさえもそうである(たとえば、「a」および/または「an」は、「少なくとも1つ」または「1つもしくは複数」を意味すると解釈されるべきである)。同じことが、特許請求の範囲の記載を導入するために使用する定冠詞の使用に関しても当てはまる。さらに、具体的な数の導入された特許請求の範囲の記載が明確に記載されている場合でも、当業者には、そのような記載は少なくとも記載した数を意味すると解釈されるべきことが理解されると予想される(たとえば、他の修飾語句のない裸の記載「2つの記載」とは、少なくとも2つの記載、または2つ以上の記載を意味する)。さらに、「A、B、およびCのうちの少なくとも1つなど」に類似の慣習を使用する事例では、一般に、そのような構成は当業者が慣習を理解すると予想される意味で意図する(たとえば、「A、B、およびCのうちの少なくとも1つを有するシステム」には、それだけには限定されないが、A単独、B単独、C単独、AとBを一緒に、AとCを一緒に、BとCを一緒に、および/またはAとBとCを一緒に有するシステムなどが含まれると予想される)。「A、B、またはCのうちの少なくとも1つなど」に類似の慣習を使用する事例では、一般に、そのような構成は当業者が慣習を理解すると予想される意味で意図する(たとえば、「A、B、またはCのうちの少なくとも1つを有するシステム」には、それだけには限定されないが、A単独、B単独、C単独、AとBを一緒に、AとCを一緒に、BとCを一緒に、および/またはAとBとCを一緒に有するシステムなどが含まれると予想される)。さらに、当分野の技術者には、説明、特許請求の範囲、または図面中かにかかわらず、事実上任意の離接語および/または2つ以上の代替用語を提示する語句には、用語のうちの一方、用語のうちのどちらか、または両方の用語が含まれる可能性が企図されると理解されるべき��あることが理解されると予想される。たとえば、語句「AまたはB」には、「A」または「B」または「AおよびB」の可能性が含まれることが理解されると予想される。
【０１０２】
さらに、本開示の特長または態様をマーカッシュ群に関して記載した場合、当業者には、それにより本開示がマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの部分群に関しても記載されているものと理解されると予想される。
【０１０３】
第1から第11の態様の実施形態の特長のうちの任意のものが、本明細書中で同定したすべての態様および実施形態に適用される。さらに、第1から第11の態様の実施形態の特長のうちの任意のものを、部分的にまたは全体的に、本明細書中に記載の他の実施形態と任意の様式で独立して組み合わせることができ、たとえば、1つ、2つ、もしくは3つまたはそれより多くの実施形態を全体でまたは部分的に組み合わせ得る。さらに、第1から第11の態様の実施形態の特長のうちの任意のものを、他の態様または実施形態に対して任意選択可能にし得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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