(57)【要約】  本発明は、神経細胞エキソサイトーシスを阻害する能力を有するペプチドに、かかるペプチドを含む製品、特にしわ、過度の発汗、掻痒、皮膚炎症、皮膚炎、アトピー、乾癬、血管過敏症、酒さ、ニキビ、発毛、創傷治癒、タコ、イボ、または皮膚の潰瘍および病変などの敏感な皮膚状態などの、神経細胞エキソサイトーシスが介在する皮膚の状態、障害および／または疾患を改善するのに有用な、医薬用および化粧用製品に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸の長さが２０個またはそれ未満であり、配列番号１〜５のいずれかの配列を含むか、あるいは配列番号１〜５のいずれかの配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むペプチド、およびその誘導体または塩であって、ここで該誘導体は該ペプチドのＮ−および／またはＣ−末端が有機化合物で化学的に修飾または保護されることを含む、ペプチドおよびその誘導体または塩。
【請求項２】
長さが１５個またはそれ未満のアミノ酸を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号１〜５のいずれかの配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号１〜５のいずれかの配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号１および３〜５のいずれかの配列を含み、長さが１０個またはそれ未満のアミノ酸を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
有機化合物が、ホスホリル、グリコシル、アシル、アルキル、カルボキシル、ヒドロキシル、ビオチニル、ユビキチニル、およびアミド基からなる群より選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
アシル基が、アセチル、ラウロイル、ミリストリル、およびパルミトイル基からなる群より選択される、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
そのＮ−末端がアセチルまたはパルミトイル基で化学的に修飾または保護される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
塩が該ペプチドまたはその誘導体と適切な酸または塩基との塩を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
酸が、塩酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸および乳酸からなる群より選択される、請求項９に記載のペプチド。
【請求項１１】
酸が、塩酸、酢酸およびトリフルオロ酢酸からなる群より選択される、請求項９に記載のペプチド。
【請求項１２】
塩基が、モノ−、ジ−およびトリアルキルアミン、例えばメチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、プロピルアミン、ジプロピルアミン、トリプロピルアミン、エチレンジアミン、モノ−、ジ−およびトリアルカノールアミン、例えば、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンおよびトリエタノールアミン；グアニジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジン、ピペラジン、１−ブチルピペリジン、１−エチル−２−メチルピペリジン、Ｎ−メチルピペラジン、１,４−ジメチルピペラジン、Ｎ−ベンジルフェニルエチルアミン、Ｎ−メチルグルコサミン、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンからなる群より選択される、請求項９に記載のペプチド。
【請求項１３】
配列番号１〜５のいずれかに記載の配列のうちの、下記の表の左欄に列挙される少なくとも１つのアミノ酸が、下記の表の右欄に列挙されるアミノ酸と置換される、ただし、得られる配列は、各々、配列番号１〜５のいずれかの配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載のペプチド。
【表１】
2021527085.tif 000014
【請求項１４】
配列番号１〜５のいずれかに記載の配列のうちの、下記の表の左欄に列挙される少なくとも１つのアミノ酸が、下記の表の右欄に列挙されるアミノ酸と置換される、ただし、得られる配列は、各々、配列番号１〜５のいずれかの配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載のペプチド。
【表２】
2021527085.tif 000015
【請求項１５】
（ｉ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載のペプチド、およびその誘導体または塩、および（ｉｉ）少なくとも１つの美容的に許容される成分を含む、化粧用組成物。
【請求項１６】
（ｉ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載のペプチド、およびその誘導体または塩、および（ｉｉ）少なくとも１つの医薬的に許容される成分を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
神経細胞エキソサイトーシスが介在する皮膚の状態、障害および／または疾患を改善するのに用いるための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のペプチド、およびその誘導体または塩。
【請求項１８】
神経細胞エキソサイトーシスが介在する皮膚の状態、障害および／または疾患が、顔面のしわ、運動筋機能障害、過度の発汗、掻痒、皮膚炎症、皮膚炎、アトピー、乾癬、血管過敏症、酒さ、ニキビ、発毛、創傷治癒、タコ、イボ、または皮膚の潰瘍および病変などの敏感な皮膚状態からなる群より選択される、請求項１７にて用いるためのペプチド。
【請求項１９】
（ｉ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載のペプチド、およびその誘導体または塩、および（ｉｉ）少なくとも１つの医薬的にまたは美容的に許容される成分を含む、医薬組成物または化粧用組成物を局所塗布することを含む、神経細胞エキソサイトーシスが介在する皮膚の状態、障害および／または疾患を改善するための治療または非治療方法。
【請求項２０】
神経細胞エキソサイトーシスが介在する皮膚の状態、障害および／または疾患が、顔面のしわ、運動筋機能障害、過度の発汗、掻痒、皮膚炎症、皮膚炎、アトピー、乾癬、血管過敏症、酒さ、ニキビ、発毛、創傷治癒、タコ、イボ、または皮膚の潰瘍および病変などの敏感な皮膚状態からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞エキソサイトーシスの阻害能を有するペプチドに、およびかかるペプチドを含む製品、特に神経細胞エキソサイトーシスが介在する、皮膚の状態、障害および／または疾患を改善するのに有用な医薬品および化粧品に言及する。
【背景技術】
【０００２】
アセチルコリン（ＡＣｈ）は、神経筋接合部で、自律神経節、腺神経支配にて、ならびに中枢および末梢神経系内にある種々の部位で、即効型のポイント・ツー・ポイント神経伝達物質である。ＡＣｈはシナプス前コリン作動性線維の分泌小胞に含まれ、シナプス後コリン作動性膜受容体に対して作用するシナプス間隙へのエキソサイトに供される。神経細胞エキソサイトーシスは、可溶性Ｎ−エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体（ＳＮＡＲＥ）ファミリータンパク質によって駆動される、電位トリガーの活動であり、かつＣａ２＋依存性プロセスである。ＮＳＦ（Ｎ−エチルマレイミド感受性融合タンパク質）は、すべての細胞内膜輸送工程に不可欠の６量体ＡＴＰａｓｅである。膜輸送におけるその役割において、ＮＳＦはＳＮＡＰ（可溶性ＮＳＦ付着タンパク質）によって膜に補充され、それは、順次、膜融合の間に形成されるＳＮＡＲＥ（ＳＮＡＰ受容体）タンパク質の複合体により補充される。この複合体は、単一小胞のＳＮＡＲＥ、シナプスブレビンまたは小胞結合膜タンパク質（ＶＡＭＰ）、およびシンタキシンとＳＮＡＰ２５と称される２つの標的原形質膜によって形成され、小胞ドッキングおよび原形質膜との膜融合と関連付けられる（Kasaiら、Physiol Rev., (2012), 92: 1915-1964）。
【０００３】
ＳＮＡＲＥタンパク質複合体介在性ドッキングと小胞融合とは、それらが同一の分子機構を共有するため、いずれかの神経伝達物質の分泌を制御する重要な要素である（Purvesら、Neuroscience, 2nd edition, (2001)）。とりわけ、Ａｃｈのように、セロトニン、ヒスタミン、ＧＡＢＡ、グルタミン酸、アスパラギン酸、ＡＴＰ、アドレナリン、ノルアドレナリン、ドーパミン、エピネフリン、ノルエピネフリンまたは神経ペプチド（カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、サブスタンスＰ、ニューロキニン、ＶＩＰ、ニューロトロフィン、エンドルフィン）が、ＳＮＡＲＥ依存性機構を通して放出される。
【０００４】
ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）によるＳＮＡＲＥタンパク質の切断は、小胞の融合および神経伝達物質の放出を妨害する（Binzら、Toxins (Basel), (2010), 2(4):665-682）。分子レベルで、ボツリヌス毒素のＢｏＮＴ／Ａ、／Ｃおよび／ＥはＳＮＡＰ−２５を切断し；ＢｏＮＴ／Ｂ、／Ｄ、／Ｆおよび／ＧはＶＡＭＰを切断する。唯一、ＢｏＮＴ／Ｃが、ＳＮＡＰ２５とシンタキシンの両方を切断しうる（Schiavoら、Physiol Rev. (2000); 80:717-66）。従って、ＳＮＡＲＥタンパク質は、神経伝達物質の放出により引き起こされる状態を治療および／または防止するために使用される、治療および／または化粧用の化合物および／または製品の標的となる。事実、ボツリヌス毒素由来の承認された治療は、主にＳＮＡＰ２５またはＶＡＭＰを介して、ＳＮＡＲＥタンパク質を非活性化することによって神経伝達物質のシナプス前小胞からの放出を遮断する（Zakinら、Toxicon (2018), EP 2318033 A2, EP 1856139 A2, EP 1180524 A1, EP 2123673 A1, WO 97/34620）。
【０００５】
皮膚は末梢神経系と深く相互作用する。神経系が多数の皮膚プロセスと直接関与していることを示す証拠が増えている。例えば、ＡＣｈ放出を阻害することに起因して、ボツリヌス毒素誘導体の主な美容用途は、顔の筋肉を弛緩させる、その周知の抗しわ効果である。それにもかかわらず、皮膚では、コリン作動性線維が、汗腺、毛包、血管、および立毛筋などの筋肉を含む、外皮系内にある他のいくつかの付属構造に神経支配を提供する。実際、ボツリヌス毒素誘導体は、多汗症、瘢痕防止、皮膚炎症、創傷治癒、顔面紅潮、ヘルペス後神経痛、皮脂制御、およびかゆみを含む、多くの皮膚科学的症状において実験的に使用され、成功した結果を収めている（Kimら、Toxins (2017), 9, 403）。これらの新規な適応症の根底にある一般的機構は、ＡＣｈに加えて、サブスタンスＰ、ＣＧＲＰ、グルタミン酸およびヒスタミン放出の阻害を、さらには肥満細胞の活性化を包含する。
【０００６】
例えば、発汗異常性湿疹または炎症性皮膚症などの過度の発汗を伴う皮膚の状態は、典型的な体温調節の異常な発汗に加えて、改善され得る。ＡＣｈ放出の阻害は、汗腺に対する、および汗腺の周りの平滑筋に対するその直接的作用を妨げる（Swartlingら、J. Am. Acad. Dermatol. (2002), 47, 667-671；Wollina, U.、J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. (2002), 16, 40-42）。この点において、ボツリヌス毒素は、皮膚炎または乾癬に対して、局所発汗の減少を通して過度の発汗によって悪化する皮膚の状態に対して有益な効果を示した（Zanchiら、J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. (2008), 22, 431-436）。その上、結果として生じる神経ペプチド放出、サブスタンスＰおよび／またはＣＧＲＰの阻害は、不快を惹起し、徴候を悪化させる、関連する掻痒および血管拡張を減少させる（Hummら、Exp. Neurol. (2000), 161, 361-372；Ishikawa.ら、Jpn. J. Opthalmol. (2000), 44, 106-109）。
【０００７】
神経細胞エキソサイトーシスの阻害は、いくつかの条件で、異なる分子機構を通して、掻痒を減少させて防止する。ＡＣｈはアトピー性皮膚炎などの掻痒性皮膚症状においてかゆみを媒介する（Hallett M.、Ann. Neurol. (2000), 48, 7-8）。サブスタンスＰは、肥満細胞の活性化を介するヒスタミンの放出を通してかゆみおよび発赤と関連付けられるのに対して、ＣＧＲＰは血管拡張を通して関連付けられる。従って、ボツリヌス毒素による対応する神経伝達物質の放出の破壊は、かゆみの感覚、ヒスタミン作動性ならびに非ヒスタミン作動性のタイプを減少させる（Gazeraniら、Br. J. Dermatol. (2009), 161,737-745）。掻痒性かゆみは、皮膚炎症および神経性炎症を減少させる神経細胞エキソサイトーシスの抑制と関連付けられ、それでアトピー性皮膚炎および乾癬におけるかゆみは軽減される（Hanら、Dermatol. Surg. (2017)；Wardら、J. Investig. Dermatol. (2012), 132, 1927-1930；Saberら、Arch. Dermatol. (2011), 147, 629-630；Gilbertら、J. Drugs Dermatol. (2014), 13, 1407-1408；Gazeraniら、Br. J. Dermatol. (2009), 161,737-745；Caoら、Neuroreport. (2017), 28, 518-526；Ramachandranら、Toxins (2018), 10, pii: E134）。同様に、顔面紅潮および紅斑によって特徴付けられる酒さなどの炎症性皮膚病は、皮膚の血管拡張および皮膚の局所炎症が減少するため、ＡＣｈ、サブスタンスＰおよびＣＧＲＰ放出の遮断により改善される（Eshghiら、Acta Med. Iran (2016), 54, 454-457；Bloomら、Dermatol. Surg. (2015), 41 (Suppl. 1), S9-S16；Geddoaら、Int. J. Dermatol. (2013), 52, 1547-1550；Odoら、Dermatol. Surg. 2011, 37, 1579-1583）。
【０００８】
皮脂腺などの皮膚付属器では、ＡＣｈは脂腺細胞での脂質合成を増大させ、ボツリヌス毒素はヒトにおける皮脂産生を有意に低下させる（Minら、Aesthet. Surg. J. (2015), 35, 600-610；Roseら、Dermatol. Surg. (2013), 39, 443-448）。従って、立毛筋および皮脂腺にある局所ムスカリン受容体はＡＣｈ放出の阻害を介して神経調節を制御するための標的である。
【０００９】
最後に、ＡＣｈ放出の阻害は、治癒を妨げ、管理するのに、および／または肥厚性瘢痕の徴候を制御するのに使用され得る。局所でのＡＣｈ放出の減少は治癒組織周辺の筋肉を固定し、皮膚の緊張を軽減する。このプロセスはケロイド中和と関連するかゆみでの神経線維のトラップを軽減する（Uyesugiら、Am J Phys Med Rehabil. (2010), 89(2):153-155）。この点に関して、ボツリヌス毒素は、線維芽細胞の増殖を阻害し、形質転換成長因子ベータ、コラーゲンＩおよびＩＩＩ、ミオシンＩＩ、およびケロイド線維芽細胞にて作用するａ-平滑筋を阻害することが示された（Xiaoら、Aesthet. Plast. Surg. (2011), 35, 802-807；Chenら、Ann. Plast. Surg. 2016, 77, e46-e49；Jeongら、Plast. Reconstr. Surg. (2015), 136, 171e-178e；Wang, Xら、Aesthet. Surg. J. (2014), 34, 154-159）。このことに基づいて、筋肉および線維芽細胞の周辺の瘢痕に対する神経細胞エキソサイトーシスを遮断する効果の可能性は、創傷治癒および瘢痕防止についてのその使用を示唆する。
【００１０】
かくして、全体として、神経伝達物質の放出の阻害および／または調節は、顔面のしわおよび運動筋機能障害についてだけでなく、過度の発汗、掻痒、皮膚炎症、皮膚炎、アトピー、乾癬、血管過敏症、酒さ、ニキビ、発毛、創傷治癒、タコ、イボ、または皮膚の潰瘍および病変などの敏感な皮膚状態などの新規な皮膚関連の状態を予防、治療または治癒するのにも有用である。
【００１１】
ボツリヌス毒素由来の治療は注射を繰り返す必要があり、免疫反応を喪失する効力を惹起しうる。他の副作用は、頭蓋痛、吐き気、麻痺または筋肉低下および呼吸不全である。加えて、反応活性度および医薬製剤の不安定性のため、それらは高コストの治療となる。かくして、それらを置き換えるためにより単純でより安定した分子構造を開発する必要がある。このためには、ＳＮＡＲＥコア複合タンパク質の一次構造より誘導されるペプチドは神経伝達物質の放出の妨害能を有する。
【００１２】
ＳＮＡＰ２５のアミノ末端フラグメントの一次構造に由来する合成ヘキサペプチドは、ＥＰ１１８０５２４Ａ１およびＥＰ２１２３６７３Ａ１において記載されるように、しわの発現の治療および予防にて広く使用される。このペプチドは膜を横切って反転し、ＳＮＡＰ２５を特異的に干渉し、かくしてＳＮＡＲＥ複合体の組み立ておよび神経伝達物質のエキソサイトーシスが損なわれる。
【００１３】
同様に、ＳＮＡＰ２５のカルボキシ末端領域から由来の、あるいはシナプトブレビンまたはシンタキシンから由来のペプチドもまた、ＷＯ９７／３４６２０において記載されるように、神経細胞エキソサイトーシスを阻害するように設計された。しかしながら、活性を最適にするには、それらはアミノ酸の長さが最小で２０個で、最大で２８個である必要がある。従って、その大きさが大きいと生産コストが増加し、化粧品および／または治療薬としてのその後の開発が困難となる。
【００１４】
未知の機構ＳＮＡＲＥコア複合タンパク質から直接的に誘導されていない他のペプチドが、ＷＯ２０１３１５３１９２Ａ１およびＷＯ２０１３０７０８０８Ａ１にて記載されるように、未知の機構で神経細胞エキソサイトーシスを減少させると主張されている。同様に、膜成分のＶ−ＡＴＰａｓｅのサブユニットＣより由来のペプチドが、シナプトブレビンを標的とし、抗しわ効果の可能性を示すことで、神経細胞エキソサイトーシスの阻害剤としてＷＯ２０１１／０４８４４３に記載されている。
【００１５】
米国特許第６,１６９,０７４号（Montalら）は、神経筋接合部のシナプスギャップ内にてＳＮＡＲＥ複合体に干渉するペプチドの組み合わせを開示する。
米国特許第６,８６６,８５６号（Luら）は、骨格筋の神経筋接合部でのアセチルコリン放出を阻害するリモノイド（柑橘系の果物のアルカロイド抽出物）を記載する。
米国特許第７,５６６,４６４号（Belfer）は、ヒトの顔の表情ラインの外観を改善するスキンケア組成物を教示する。この製品は、真皮の強化と、表情ラインに関連する筋肉組織の阻害との相乗効果に基づき、収縮性筋肉要素を迅速に弛緩させ、顔面の表情筋の作用を抑制するオランダセンニチ（Acmella oleracea）の抽出物を含む。
【００１６】
米国特許第７,０１５,１９２号（Blanesら）は、ＳＮＡＲＥ複合体内のタンパク質ＳＮＡＰ２５のＮ−末端より誘導されるペプチドがアセチルコリン放出を阻害することを見出した。その主要分子のアセチルヘキサペプチド−８（正式には、アセチルヘキサペプチド−３またはARGIRELINE（登録商標）とも称される）がボツリヌス毒素の効能と競合すると主張されているが、投与由来のリスクと製造コストを減らす。
【００１７】
神経細胞エキソサイトーシスにも重要な、ＳＮＡＲＥ複合体を制御する別の分子がある。例えば、スナピン（Snapin）は、Ｃａ２＋によって引き起こされるエキソサイトーシスの間に、シナプトタグミン１とＳＮＡＲＥ複合体との間の結合を安定化する、ＳＮＡＰ２５−結合タンパク質である（Ilardiら、Nat Neurosci. (1999)2:119-124；Buxtonら、Biochem. J. (2003) 375, 433-440）。スナピンの欠失は神経伝達物質の放出を完全に排除しないが、興奮性シナプス後電流を７０％減少させ（Panら、Neuron. (2009) 61:412-424）、そのことはスナピンが神経細胞エキソサイトーシスにおける非必須モジュレーターであることを示唆する。組換えスナピンカルボキシ末端はＳＮＡＲＥ複合体のシナプトタグミンとの結合を遮断した。実際、Ｃｔ−スナピン配列より由来のペプチドはＳＮＡＲＥ複合体の組み立てを邪魔し、神経細胞エキソサイトーシスを損なった（Ilardiら、Nat Neurosci. (1999), 2:119-124）。位置１１７〜１３６より由来のＣ−末端コイルドコイルドメインだけに対応する４つの２０量体のペプチドフラグメントだけがエキソサイトーシスを阻害した。従って、スナピンは、恐らくはより強力な治療剤の望ましくない作用を軽減する、完全な阻害剤というよりもエキソサイトーシスのレギュレーターを設計する標的としての可能性がある。
【００１８】
結論において、本発明は、既存の必需品の代替品を提供するものであり、神経細胞エキソサイトーシスを軽減しうる、新規なペプチド配列の同定を包含する。
【発明の概要】
【００１９】
本出願人は、意外にも、神経細胞からの、神経伝達物質、特にアセチルコリン、および神経ペプチドのＣＧＲＰの放出を阻害し得るか、または少なくとも低減し得るペプチドを見出した。
たとえ、正確な分子機構が未だ完全に解明され、確認されておらず、何ら理論に拘束されないとしても、本発明者らはエキソサイトーシスの阻害または軽減が、ＳＮＡＰ２５相互作用の破壊によるＳＮＡＲＥ複合体を形成する間接的な調節に起因し得ると考えている。
【００２０】
本出願人は次の配列番号１〜５のペプチドが、神経細胞エキソサイトーシスを遮断する効果があり、結果的に、そのようなペプチドが、末梢神経の末端からのアセチルコリンの放出を阻害、または少なくとも低減し得ることを見出した。
配列番号１    HYWRELQYR
配列番号２    MQVWLRMWIDYRAT
配列番号３    RRVVLVNNIL
配列番号４    LRVQMVNMFL
配列番号５    WEQEFLRR
【００２１】
本出願人はまた、神経細胞エキソサイトーシスの遮断効果が、長さが２０個以下のアミノ酸の配列で、上記した配列番号１〜５を含む配列、あるいは配列番号１〜５のいずれかの配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する配列でも得られることを見出した。
【００２２】
本出願人はまた、神経細胞エキソサイトーシスの遮断効果が、上記した配列番号１〜５のＮ−末端に、例えば、アセチル基、パルミトイル基またはミリストイル基などのアルキルカルボニル基を連結させ、ならびに上記した配列番号１〜５と、例えば、クロリド、アセテートまたはトリフルオロアセテートなどの適切なアニオンとの塩を形成することにより、調節され得ることを見出した。
【００２３】
従って、本発明の第１の態様は、長さが２０個以下のアミノ酸、好ましくは１５個以下のアミノ酸を有するペプチドであって、配列番号１〜５のいずれか１つを含むか、あるいは配列番号１〜５のいずれかの配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のペプチド、およびその誘導体または塩に関する。
【００２４】
本発明の第２の態様は、（ｉ）長さが２０個以下のアミノ酸、好ましくは１５個以下のアミノ酸を有するペプチドであって、配列番号１〜５のいずれか１つを含むか、あるいは配列番号１〜５のいずれかの配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のペプチド、およびその誘導体または塩、および（ｉｉ）少なくとも１つの医薬的または美容的に許容される成分を含む、医薬または化粧用組成物に関する。
【００２５】
本発明の第３の態様は、神経細胞エキソサイトーシスが介在する皮膚の状態、障害および／または疾患を改善するための、長さが２０個以下のアミノ酸、好ましくは１５個以下のアミノ酸を有するペプチドの使用であって、配列番号１〜５のいずれか１つを含むか、あるいは配列番号１〜５のいずれかの配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のペプチド、およびその誘導体または塩の使用に関する。
【００２６】
本発明の第４の態様は、（ｉ）長さが２０個以下のアミノ酸、好ましくは１５個以下のアミノ酸を有するペプチドであって、配列番号１〜５のいずれか１つを含むか、あるいは配列番号１〜５のいずれかの配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のペプチド、およびその誘導体または塩、および（ｉｉ）少なくとも１つの医薬的または美容的に許容される成分を含む、医薬または化粧用組成物を局所的に塗布することを含む、神経細胞エキソサイトーシスが介在する皮膚の状態、障害および／または疾患を改善するための、治療的または非治療的方法に関する。
【００２７】
より具体的には、神経細胞エキソサイトーシスが介在する皮膚の状態、障害および／または疾患として、しわ、過度の発汗、掻痒、皮膚炎症、皮膚炎、アトピー、乾癬、血管過敏症、酒さ、ニキビ、発毛、創傷治癒、カルス、イボ、あるいは皮膚の潰瘍または病変などの敏感な皮膚状態が挙げられる。
【００２８】
本発明のさらなる態様は、長さが２０個以下のアミノ酸、好ましくは１５個以下のアミノ酸を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号１〜５のいずれか１つを含むか、あるいは配列番号１〜５のいずれかの配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
第１の態様によれば、本発明は、長さが２０個以下のアミノ酸、好ましくは１５個以下のアミノ酸を有するペプチドであって、配列番号１〜５のいずれか１つを含むか、あるいは配列番号１〜５のいずれかの配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のペプチド、およびその誘導体または塩に関する。
【００３０】
好ましくは、本発明は、長さが２０個以下のアミノ酸、好ましくは１５個以下のアミノ酸、より好ましくは１０個以下のアミノ酸を有するペプチドであって、配列番号１を含むか、あるいは配列番号１と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のペプチド、およびその誘導体または塩に関する。
【００３１】
好ましくは、本発明は、長さが２０個以下のアミノ酸、好ましくは１５個以下のアミノ酸を有するペプチドであって、配列番号２を含むか、あるいは配列番号２と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のペプチド、およびその誘導体または塩に関する。
【００３２】
好ましくは、本発明は、長さが２０個以下のアミノ酸、好ましくは１５個以下のアミノ酸、より好ましくは１０個以下のアミノ酸を有するペプチドであって、配列番号３を含むか、あるいは配列番号３と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のペプチド、およびその誘導体または塩に関する。
【００３３】
好ましくは、本発明は、長さが２０個以下のアミノ酸、好ましくは１５個以下のアミノ酸、より好ましくは１０個以下のアミノ酸を有するペプチドであって、配列番号４を含むか、あるいは配列番号４と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のペプチド、およびその誘導体または塩に関する。
【００３４】
好ましくは、本発明は、長さが２０個以下のアミノ酸、好ましくは１５個以下のアミノ酸、より好ましくは１０個以下のアミノ酸を有するペプチドであって、配列番号５を含むか、あるいは配列番号５と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のペプチド、およびその誘導体または塩に関する。
【００３５】
本願の発明者および出願人の知る限りでは、明細書に記載のペプチドはいずれも、本願の優先日の前には当該分野において知られていない。しかしながら、本発明の範囲内にある、本願の優先日の前に当該分野にて知られているペプチドはいずれも、本明細書において適切に否定されるものとする。
【００３６】
本明細書にて使用されるアミノ酸配列の略語は、次の表Ａにて報告されるように、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ命名法に従うものである。
表Ａ
【表１】
2021527085.tif 000002
【００３７】
ペプチド配列に関する「パーセント配列同一性」は、２つの配列において同一である、残基のパーセンテージをいう。パーセント配列同一性（％ＳＩ）は次式：
％ＳＩ＝（ｎｔ−ｎｄ）ｘ１００／ｎｔ
で計算され、ここでｎｔは基本配列中の残基の数であり、ｎｄは最大数のアミノ酸が同一となるようにアライメントされた場合に、対峙する配列での非同一残基の総数である。従って、配列
【化１】
2021527085.tif 000003
は、配列番号３：ＲＲＶＶＬＶＮＮＩＬと８０％の配列同一性を有する（ｎｄ＝２、およびｎｔ＝１０）。
【００３８】
本発明に係るペプチドは、対照となる配列と最適にアライメントされた場合、その配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％および少なくとも９５％の配列同一性を有し得る。配列の最適アライメントは種々の既知の方法、および既知のアルゴリズムのコンピューター化の導入（例えば、Wisconsin Genetics Software Package, Release 7.0, Genetics Computer Group, Madison, WIにあるようなＢＬＡＳＴ、ＴＦＡＳＴＡ、ＢＥＳＴＦＩＴ）により実施され得る。そのソフトウェアが国立バイオテクノロジー情報センター（www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通して入手できるＢＬＡＳＴアルゴリズム（Altschulら、Mol. Biol. (1990), 215, 403-410）も使用できる。
【００３９】
本発明の配列番号１〜５を含むペプチドのアミノ酸配列の変形は、ペプチド活性に影響を及ぼさない、アミノ酸の保存的置換を含む。ペプチド活性を維持し得る置換は、（ａ）シートまたは螺旋状三次元構造などの置換領域におけるペプチド骨格の構造を維持する有効性、（ｂ）標的領域における分子の電荷または疎水性を維持する有効性、または（ｃ）側鎖の大部分を維持する有効性、を基礎として選択される。
【００４０】
アミノ酸は、次の表Ｂにおいて記載されるように、一般的な側鎖の特性に従って分類される。
表Ｂ
【表２】
2021527085.tif 000004
【００４１】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、およびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリンおよびメチオニン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、および小型アミノ酸（グリシン、アラニン、セリンおよびスレオニン）からなる群に属する。
一般に比活性を変化させないアミノ酸置換は本発明の分野において公知である。
【００４２】
最も一般的に生じる変化が、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙであり、およびその反対の変化である。保存的置換のもう一つ別の例を次の表Ｃにて示す。
表Ｃ
【表３】
2021527085.tif 000005
【００４３】
本発明のペプチドは、そのＮ−または／およびＣ−末端が有機化合物で化学的に修飾されているか、または保護されている、修飾ペプチドの形態であってもよい。
本発明のペプチドに関して本明細書にて利用される「誘導体」または「その誘導体」なる語は、そのＮ−および／またはＣ−末端が有機化合物で化学的に修飾または保護されている、ペプチドを意味する。
【００４４】
修飾の例として、リン酸化、グリコシル化、アシル化（アセチル化、ラウロイル化、ミリストイル化、パルミトイル化を含む）、アルキル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、糖化、ビオチニル化、ユビキチニル化、およびアミド化が挙げられる。
好ましくは、本発明のペプチドは、そのＮ−末端で、より好ましくは、アセチル化、ラウロイル化、ミリストイル化、およびパルミトイル化を含む、アシル化によって修飾されてもよい。Ｎ−末端アセチルおよびパルミトイルペプチド誘導体が本発明の好ましい態様である。
【００４５】
本発明のペプチドに関して本明細書にて利用されるような「塩」または「その塩」なる語は、ペプチドの適切な酸または塩基との塩あるいはその誘導体を意味する。
酸の典型例として、例えば、塩酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸および乳酸が挙げられる。
【００４６】
塩基の典型的な例として、例えば、モノ−、ジ−およびトリアルキルアミン、例えばメチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、プロピルアミン、ジプロピルアミン、トリプロピルアミン、エチレンジアミン、モノ−、ジ−およびトリアルカノールアミン、例えば、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンおよびトリエタノールアミン；グアニジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジン、ピペラジン、１−ブチルピペリジン、１−エチル−２−メチルピペリジン、Ｎ−メチルピペラジン、１,４−ジメチルピペラジン、Ｎ−ベンジルフェニルエチルアミン、Ｎ−メチルグルコサミン、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが挙げられる。
【００４７】
ペプチドの酢酸塩またはトリフルオロ酢酸塩、あるいはその誘導体が、好ましくは、本発明の下で利用される。
【００４８】
その長さに応じて、本発明のペプチドは、当該分野において周知の方法により、例えば、自動化ペプチド合成装置によって合成されてもよく、あるいは遺伝子操作技法により生成されてもよい。例えば、本発明の融合パートナーおよびペプチドを含む融合タンパク質をコードする融合遺伝子を、遺伝子操作で調製し、次に宿主細胞に形質転換させ、融合タンパク質を発現させる。その後で、所望のペプチドを産生するのにプロテアーゼまたは化合物を用いて、本発明のペプチドを切断して融合タンパク質から単離する。このために、第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼなどのプロテアーゼ、またはＣＮＢｒまたはヒドロキシルアミンなどの化合物によって切断され得るアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列を、融合パートナーをコードするポリヌクレオチドと、本発明のペプチドとの間に挿入することができる。
【００４９】
本発明のペプチドは、立体異性体、または立体異性体の混合物；例えば、Ｌ−配置、Ｄ−配置を有するか、または相互に独立してラセミであり得る、それらを構成する、アミノ酸として存在し得る。従って、不斉炭素の数、およびどのような異性体または異性体混合物が存在するかに応じて、異性体の混合物、ならびにラセミ体あるいはジアステレオマー混合物または純粋なジアステレオマーもしくはエナンチオマーを得ることが可能である。本発明のペプチドの好ましい構造は、純粋な異性体、すなわち、エナンチオマーまたはジアステレオマーである。本発明のペプチドの最も好ましい構造は、Ｌ−配置を有するアミノ酸を包含する。特記されない限り、１つのアミノ酸がＡｌａであり得ることを示す場合、それはＬ−Ａｌａ−、Ｄ−Ａｌａ−、あるいは両方のラセミまたは非ラセミ混合物より選択されると理解されることを認識する。
【００５０】
本発明の化粧用組成物は、上記した少なくとも１つのペプチドを、少なくとも１種の美容的に許容される成分と一緒に含む。
本発明の医薬組成物は、上記した少なくとも１つのペプチドを、少なくとも１種の医薬的に許容される成分と一緒に含む。
本発明の医薬または化粧用組成物は、０.０００００００１重量％〜２０重量％、好ましくは０.０００００１重量％〜１５重量％、より好ましくは０.０００１重量％〜１０重量％、さらにより好ましくは０.０００１重量％〜５重量％の範囲にある、量のペプチド、あるいはその誘導体および／または塩を含み得る。
【００５１】
本発明の化粧用組成物は、かかる組成物を美容的または審美的により許容可能とするのに、あるいはそれらに付加的な使用上の利点を提供するのに、適する種々の他の任意の成分を含有し得る。そのような従来の任意の成分は当業者に周知である。これらは、Wenninger およびMcEwen編集の、CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, 第７版（The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Inc., Washington, D. C., 1997）に見られる美容的に許容される成分などのいずれの成分も包含する。本明細書にて使用される場合、「美容的に許容される」は、下記に定義されるような、皮膚、毛髪または他の適切な物質と接触して使用するのに適する、材料（例えば、化合物または組成物）を意味する。
【００５２】
本発明において有用な美容的に許容される成分は、美容的に許容される担体、揮発性および非揮発性溶媒、水、および界面活性剤、保存剤、吸収剤、キレート化剤、滑沢剤、保湿剤、撥水剤、酸化防止剤、ＵＶ吸収剤、抗刺激剤、ビタミン、微量金属、抗菌剤、香料、色素および着色成分、および／または構造化剤などの他の付加的な成分を包含する。
【００５３】
本明細書にて使用される「美容的に許容される担体」なる語は、上記にて定義されるような、美容的に許容される１または複数の適合性のある固体または液体の充填剤、希釈剤、増量剤等を意味する。本明細書にて使用される「適合性」なる語は、本発明の組成物の成分が、通常の使用状況下で組成物の効能を実質的に減少させる相互作用がないように、本発明の主たる活性剤と組み合わせることができ、および該成分を相互に組み合わせることができることを意味する。
【００５４】
本発明にて利用される担体の型は、所望する製品の型に依存する。本発明において有用な組成物は多種多様な製品の形態であってもよい。これらは、ローション、クリーム、ゲル、スティック、スプレー、軟膏、ペースト、ムースおよび化粧品（例えば、ファウンデーションを含む、固体、半固体または液体のメイクアップ）を包含するが、これらに限定されない。
これらの製品の形態は、溶液、エアロゾル、エマルジョン（水中油型または油中水型を含む）、ゲル、固体およびリポソームを含むが、これらに限定されない、数種の型の担体を含んでもよい。
【００５５】
本発明の組成物は、その組成物の形態に応じて、水を異なる量で含んでもよい。水の量は、あるとすれば、組成物の全重量に対して１重量％未満から９９重量％を超える範囲とすることができる。本発明の水性組成物は、特に水性ローションとして、または油中水型または水中油型エマルジョンとして、あるいは複数のエマルジョン（油中水中油型または水中油中水型のトリプルエマルジョン）として処方される。かかるエマルジョンは知られており、例えば、C. FOXにより、「Cosmetics and Toiletries」- November 1986 - Vol. 101 - pages 101 - 112に記載されている。
【００５６】
固体組成物、スプレー組成物および油中水型クリームは、通常、組成物の全重量に対して１０重量％未満、より好ましくは５重量％未満の量の水を含む。ロールオン（roll-on）組成物、水性組成物、および防臭剤は、通常、組成物の全重量に対して、約１５％〜約９９％、より好ましくは約３０重量％〜約９０重量％、さらにより好ましくは約５０重量％〜約８０重量％の量の水を含む。
【００５７】
本発明の組成物はまた、シリコーンを含んでもよい。存在するとすれば、シリコーンは、一般に、組成物の全重量に対して、約３０重量％〜約８５重量％、より好ましくは約４０重量％〜約７５重量％、さらにより好ましくは約５０重量％〜約６５重量％のレベルであろう。
【００５８】
本明細書にて有用なシリコーンは、好ましくは、２〜７個のケイ素原子を有する線状または環状シリコーンであり、これらのシリコーンは炭素数１〜１０のアルキルまたはアルコキシ基で所望により置換されてもよい。適切なシリコーンは、ドデカメチルシクロヘキサシロキサン、シクロペンタシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、シクロテトラシロキサン、ヘプタメチルオクチルトリシロキサン、ヘキサメチルジシロキサン、デカメチルテトラシロキサン、ドデカメチルペンタシロキサン、オクタメチルテトラシロキサン、およびその混合物を包含する。
【００５９】
本発明の組成物は１または複数の揮発性溶媒を含んでもよい。含むとすれば、揮発性溶媒またはその混合物は、組成物の全重量に対して、一般に、約１０重量％〜約９０重量％、より好ましくは、約２５重量％〜約７５重量％、さらにより好ましくは、約３５重量％〜約６５重量％のレベルであろう。本明細書にて有用な溶媒は好ましくは有機揮発性溶媒である。
【００６０】
本明細書にて使用される場合、「揮発性」は、当業者によって理解されるように、外界条件下で有意な量の蒸気圧を有する物質をいう。
本明細書において有用な揮発性溶媒は、２５℃で、好ましくは約２ｋＰａ以上、より好ましくは約６ｋＰａ以上の蒸気圧を有するであろう。本明細書において有用な揮発性溶媒は、大気圧（１ａｔｍ）下で、好ましくは約１５０℃未満、より好ましくは約１００℃未満、さらにより好ましくは約９０℃未満、その上さらにより好ましくは約８０℃未満の沸点を有するであろう。
【００６１】
好ましくは、本明細書において有用な揮発性溶媒は、比較的無臭であり、ヒト皮膚に使用するのに相対的に安全であろう。適切な揮発性溶媒は、Ｃ１−Ｃ４アルコール、揮発性シリコーンおよびその混合物を包含するが、これらに限定されない。好ましい揮発性溶媒は、Ｃ１−Ｃ４アルコールおよびその混合物である。本明細書において用いるのにより好ましいのはエタノールである。
【００６２】
本発明の組成物はまた、１または複数の非揮発性溶媒を含んでもよい。含むとすれば、非揮発性溶媒またはその混合物は、組成物の全重量に対して、一般に、約１重量％〜約２０重量％、より好ましくは、約２重量％〜約１０重量％、さらにより好ましくは、約３重量％〜約５重量％のレベルであろう。適切な非揮発性溶媒は、安息香酸ベンジル、セテアリールアルコール、セチルアルコール、フタル酸ジエチル、ミリスチン酸イソプロピル、ジメチコン、カプリリルメチコン、およびその混合物を含むが、これらに限定されない。
【００６３】
他のいくつかの添加成分が本発明の組成物中に存在し得る。これらは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）およびポロキサマーより選択される親水性ポリマー；ベンゾフェノン−３などのＵＶ安定剤；酢酸トコフェロールなどの抗酸化剤；フェノキシエタノール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベンなどの保存剤；乳酸、クエン酸、クエン酸ナトリウム、コハク酸、リン酸、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムなどのｐＨ調整剤；ファルネソール、フェノールスルホン酸亜鉛およびエチルヘキシルグリセリンなどの脱臭剤および抗菌剤；トリベヘニン、グリセリンなどの保湿剤；アラントインなどの皮膚調節剤；トリメチルイソプロピルブタナミドおよびメンソールなどの冷却剤；パンテノール、パンテチン、パントテイン、パンテニルエチルエーテル、およびその組み合わせなどのヘアーコンディショニング成分；プロパン、イソプロパン、ブタンおよびイソブタンなどの噴射剤；一般に、酢酸カリウムおよび塩化ナトリウム、およびその混合物などの塩；香料および染料を包含するが、これらに限定されない。
【００６４】
含むとすれば、これらの添加成分は、組成物の全重量に対して、好ましくは、１０重量％未満、より好ましくは５重量％未満のレベルで存在するであろう。
好ましくは、本発明の医薬組成物は、有効量の上記したペプチドの少なくとも１つと、少なくとも１つの医薬的に許容される成分とを一緒に含む適切な剤形にて製造される。
【００６５】
適切な剤形の例が、経口投与用の錠剤、カプセル、コーティング錠、顆粒、液剤およびシロップ；局所投与用の溶液、ポマードおよび軟膏；経皮投与用の薬用パッチ；経直腸投与用の坐剤、および注射可能な滅菌溶液である。他の適切な剤形が徐放性剤形、ならびに経口、注射または経皮投与用のリポソームを基礎とする剤形である。
【００６６】
本明細書にて記載される場合、本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの上記したペプチドと、本明細書にて使用されるように、所望する特定の剤形に適する、ありとあらゆる溶媒、希釈剤または他のビヒクル、分散または懸濁化助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、固形結合剤、滑沢剤等を含む、医薬的に許容される賦形剤とを含む。
【００６７】
医薬的に許容しうる賦形剤として供し得る材料のいくつかの例として、ラクトース、グルコースおよびシュークロースなどの糖類；コーンスターチおよびポテトスターチなどの澱粉；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；トラガカント粉末；麦芽；セラチン；タルク；カカオバターおよび坐剤脂などの賦形剤；落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油などの油類；プロピレングリコールなどのグリコール類；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル類；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質不含水；等張セイライン；リンガー溶液；エチルアルコール、およびリン酸緩衝液；ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の非毒性適合性滑沢剤；着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、矯味矯臭剤および香料、保存剤および酸化防止剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
「医薬的に許容される」および「生理学的に許容される」なる語は、何ら特定の制限なしに、生物に投与される医薬組成物を製造するのに適するいずれの材料を定義するものとする。
剤形はまた、保存剤、安定剤、界面活性剤、緩衝剤、浸透圧を調節するための塩、乳化剤、甘味剤、着色剤、矯味矯臭剤等などの他の伝統的成分を含有し得る。
【００６９】
本発明の医薬組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、局所的に、経直腸的に、経鼻的に、バッカル的に、経膣的に、あるいは移植リザバーを介して投与されてもよい。本明細書にて使用される非経口的なる語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病変内および頭蓋内の注射または注入技法を包含する。
本発明の医薬組成物はまた、経鼻エアロゾルまたは吸入によって投与されてもよく、移植可能なまたは留置デバイス、例えば、ステントなどの移植操作（例えば、外科的に）送達されてもよい。
【００７０】
本発明の医薬組成物の剤形は、製薬化学者に周知であって、混合、造粒、圧縮、溶解、滅菌化等を含む、技法によって製造され得る。
本発明のペプチドは、神経伝達物質、特にアセチルコリンの放出、および神経ペプチド、ＣＧＲＰの神経細胞からの放出を阻害、または少なくとも軽減することができる。
従って、本発明のさらなる態様は、神経細胞エキソサイトーシスが介在する皮膚の状態、障害および／または疾患を改善するための上記したペプチドおよびその誘導体または塩のうち少なくとも１つの使用に関する。
【００７１】
上記されるように、この特性は、顔のしわや運動筋機能障害の治療のためだけでなく、過度の発汗、掻痒、皮膚の炎症、皮膚炎、アトピー、乾癬、血管過敏症、酒さ、ニキビ、発毛、創傷治癒、タコ、イボ、または皮膚の潰瘍および病変などの敏感な皮膚状態などの、神経小胞の放出が関与する、いくつかの皮膚関連の状態を軽減、防止または治癒するために使用され得る。
【００７２】
言い換えれば、神経細胞エキソサイトーシスが介在する皮膚の状態、障害および／または疾患は、顔のしわ、運動筋機能障害、過度の発汗、掻痒、皮膚の炎症、皮膚炎、アトピー、乾癬、血管過敏症、酒さ、ニキビ、創傷治癒、タコ、イボ、または皮膚の潰瘍および病変などの敏感な皮膚状態等を包含する。
【００７３】
従って、本発明はまた、神経細胞エキソサイトーシスが介在する皮膚の状態、障害および／または疾患を改善するための、特にしわ、過度の発汗、掻痒、皮膚の炎症、皮膚炎、アトピー、乾癬、血管過敏症、酒さ、ニキビ、発毛、創傷治癒、あるいは皮膚の潰瘍および病変などの敏感な皮膚状態を軽減するための治療的または非治療的方法であって、（ｉ）少なくとも１つの上記したペプチド、およびその誘導体または塩、および（ｉｉ）少なくとも１つの医薬的または美容的に許容される成分を含む、医薬組成物または化粧用組成物を局所的に塗布することを含む、方法に関する。
【００７４】
本発明のさらなる態様は、上記した少なくとも１つのペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
上記したポリヌクレオチドは、本発明のペプチドの大量生産を可能とする。例えば、ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ベクターの培養はペプチドの大量生産を可能とする。
【００７５】
ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のいずれかの自発的または人工的なＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る、核酸分子である。核酸分子は、同じ型（例えば、同じヌクレオチド配列を有する型）の１または複数の核酸であるか、異なる型の核酸を有し得る。核酸分子は１または複数のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、デコイＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ＰＮＡ、アンチセンスオリゴマー、プラスミドおよび他の修飾核酸を含むが、それらに限定されない。
【００７６】
次に実施例を用いて本発明をさらに詳しく説明するが、それは発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００７７】
実施例１：化学合成
ペプチドはすべて、標準的なＦｍｏｃ固相法（Perez de la Vegaら、Molecules (2010), 15:4924-4933；Behrendtら、J. Pept. Sci. (2016), 22(1):4-27；Madeら、Beilstein J. Org. Chem. (2014), 10:1197-1212）を用いてアミド化されたＣ末端で合成された。発明のペプチド、混合物および／またはその美容的に許容される塩の合成は、固相ペプチド合成法、酵素合成、またはいずれかの組み合わせ（Bondazkyら、Int. J. Pept. Protein Res. (1993), 42(1):10-3）などの、当該分野にて公知の従来の方法に従って実施され得る。
【００７８】
合成プロセスはすべて、クロマシル（Kromasil）Ｃ１８−ＨＰＬＣ（５μｍ、４.６ｘ２５０ｍｍ）を用いて実施された。その後で、直線勾配のアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）とトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いてペプチドを溶出させた（勾配：２分間で５−５５％Ｂとする、流速：１ｍＬ／分、溶出液Ａ：１００％Ｈ２Ｏ＋０.１％ＴＦＡ；溶出液Ｂ：１００％ＣＨ３ＣＮ＋０.１％ＴＦＡ）。ペプチドの検出は、吸光度を２２０ｎｍで測定することにより行われた。Ｆｍｏｃ基は２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を用いて３０分間反応させて除去された。段階間に洗浄はＤＭＦ（５回）を用いて実施された。すべての合成反応および洗浄は２５℃で行われた。得られたペプチドのＨＰＬＣ分析はあらゆるケースで８０％を超える純度を示した。得られたペプチドの同一性はＥＳＩ−ＭＳで確認された。
【００７９】
Ｎｔ−アセチル基をペプチジル樹脂上に導入する方法：
１ミリモル（１当量）のペプチジル樹脂を、５ｍＬのＤＭＦを溶媒として用い、２５当量のＤＩＥＡの存在下にある、２５当量の予め溶かした無水酢酸で処理した。３０分間反応させた後、ペプチド樹脂をＤＭＦ（１分ｘ５）、ＤＣＭ（１分ｘ４）およびジエチルエーテル（１分ｘ４）で洗浄した。最後に、ペプチジル樹脂を真空下で乾燥させた。
【００８０】
Ｎｔ−パルミトイル基をペプチジル樹脂上に導入する方法：
３ミリモル（３当量）の予め溶かしたパルミチン酸を、３当量のＨＴＢＵおよび６当量のＮＭＭの存在下でペプチジル樹脂上に組み込んだ。それらを、試薬としてＤＭＦを用いて、３０〜６０分間反応させた。その後で、樹脂をＤＭＦで３回洗浄した。
【００８１】
ペプチジル樹脂のポリマー支持体からの切断方法：
乾燥させたペプチジル樹脂をＴＦＡ：ＴＩＳ：Ｈ２Ｏ（９５：２.５：２.５）で２５℃で２時間にわたって振動下で処理した。
【００８２】
実施例２：培養された感覚神経細胞での発明のペプチドによるＣＧＲＰ放出の阻害
カプサイシンによるカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）の放出の誘発が神経細胞エキソサイトーシスを直接測定することを可能とする（Meng J.ら、J. Cell. Sci. (2007) 15;120(Pt 16):2864-74、およびMeng J.ら、Mol. Neurobiol. (2014); 50(2):574-88）。
【００８３】
試験ペプチドを、ペプチド作動性感覚神経細胞でのＣＧＲＰ誘発性放出を阻害する、その能力を測定することで評価した。後根神経節を、ポリ−Ｌ−リジンおよびラミニンを事前に被覆した９６ウェルプレートに播種した（５０,０００細胞／ウェル）。播種から４８時間経過した後、細胞を発明のペプチドを２０、５０または１００μＭで含有するハンク平衡塩溶液（Hank’s Balanced salt solution）と一緒に１時間インキュベートした。次に、細胞を１μＭカプサイシンで３７℃にて１０分間刺激した。ついで、上澄中のＣＧＲＰ含量を、製造業者の指示に従って、比色分析をベースとするＣＧＲＰ  ＥＩＡ（Spi-Bio Inc）を用いて測定した。ビヒクル処理の細胞においてカプサイシン刺激で検出された最大シグナルに関して、吸光度の測定（４０５ｎｍ）を標準化した。ＣＧＲＰ放出の阻害値を、最大シグナルをカプサイシン誘発の放出について、最小を非刺激細胞として考慮することでパーセンテージとして計算した。表Ｄは発明のペプチドについて得られたＭ３活性阻害の阻害値を詳しく記載する。
【００８４】
表Ｄ
【表４】
2021527085.tif 000006
【００８５】
ペプチドは、Ｎｔ−パルミトイル化では２０μＭで１０−５０％、５０μＭで５０−７５％の範囲で、Ｎｔ−アセチル化では１００μＭで４０−７７％の範囲でカプサイシン誘発のＣＧＲＰ放出を阻害した。
【００８６】
実施例３：発明のペプチドによる神経芽腫細胞株でのアセチルコリン放出の阻害
本発明の化合物のアセチルコリン放出に対する効果を測定するために、ヒト神経芽腫細胞株（５０,０００細胞／ウェル）を用いた。細胞を４日間にわたってコリン作動性ニューロン表現型に分化させた。次に、細胞をアセチルまたはパルミトイル型の化合物（０.１〜１００μＭ）と一緒に６０分間にわたってプレインキュベーションに付し、トリフルオロ酢酸塩（ＴＦＡ）または酢酸塩とコンジュゲートさせた。その後で、５０ｍＭ  ＫＣｌと一緒に１５分間インキュベーションすることで引き起こされた膜の脱分極によってアセチルコリン放出を誘発させた。上澄中のアセチルコリン濃度を、アンプレックス（Amplex）（登録商標）Red Acetylcholine Assay Kit（Thermofisher）を用いて製造業者に指示に従って定量した。アセチルコリンをＨ２Ｏ２を生成するように酵素的に変換させ、それにより定量可能な蛍光シグナルがもたらされた。蛍光（Ｅｘ５３０ｎｍ／Ｅｍ５９０ｎｍ）をフルオルスター（FluorStar）装置を用いて測定した。アセチルコリン含量を、ＢＣＡアッセイ（Pierce）を用い、製造業者の指示に従って、総タンパク質含量に対して正規化した。蛍光測定値を、ビヒクル処理細胞にてＫＣｌ刺激で検出された最大シグナルに対して正規化した。本発明の化合物による小胞エキソサイトーシス破壊はアセチルコリン放出の減少をもたらす（表Ｅ）。
【００８７】
表Ｅ
【表５】
2021527085.tif 000007
【００８８】
すべてのペプチドが、神経芽腫細胞株での神経細胞エキソサイトーシス調節の阻害剤であると機能的に検証された。特に、配列番号１、２、４および５のアセチル化形態が、ＡＣｈ放出を、ＴＦＡ塩として１０μＭの濃度で５０〜８７％にて、酢酸塩として０.１μＭで約４０％にて有意に減少させた。パルミトイル化の配列番号４は、１０μＭで約５０％のアセチルコリン放出を有意に減少させた。試験した０.１μＭの最低濃度で活性であったため、最も強力なペプチドはパルミトイル化の配列番号３であった。全体として、すべての効果的なペプチドはマイクロモルの範囲にあった。
【００８９】
実施例４：ヒト表皮ケラチノサイトおよび皮膚線維芽細胞での細胞生存能アッセイ
この実施例は、発明のペプチドの、ヒト表皮ケラチノサイトおよび真皮線維芽細胞に対する効果を評価した。細胞生存能は臭化３−（４,５−ジメチル−２−チアゾリル）−２,５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイで測定された。該ＭＴＴアッセイは、ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ酵素のＭＴＴのテトラゾリウム環を破壊および変換する能力に基づく、比色反応である。表皮ケラチノサイト（ＨＥＫ）を、１００μＬの対応する補足培地にて５０〜６０％のコンフルエンスで予めコーティングされた９６ウェルプレートに播種した。皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）を、１００μＬの補足培地にて７０％のコンフルエンスで９６ウェルプレートに播種された。両方の細胞株で、播種から２４時間経過した後、培地を、ペプチドを０.１〜２００μＭの範囲の濃度で溶かして含有する補足培地と交換した。すべての試験物質を３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。その後で、完全培地にて４時間にわたって、培地を０.５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ溶液と交換した。ついで、培地を注意して取り除き、１５０μＬ／ウェルのＤＭＳＯを添加してホルマザン結晶を可溶化させた。プレートを光から保護し、６０秒間振盪し、６２０ｎｍの対照フィルターを用いて５７０ｎｍで光学密度を測定した。表Ｆは、発明のペプチドの、阻害％として表される、ケラチノサイトおよび線維芽細胞の生存能についての効果を詳述する。
【００９０】
表Ｆ
【表６】
2021527085.tif 000008
【表７】
2021527085.tif 000009
【００９１】
Ｎｔ−アセチル置換の配列番号１、２および５のペプチドは、ヒト表皮ケラチノサイトおよび皮膚線維芽細胞にて２００μＭまで細胞生存能を修飾しなかった。配列番号４のアセチル化およびパルミトイル化したペプチドは、５０μＭ未満で評価した場合に、ケラチノサイト生存能を修飾しなかった。パルミトイル化した配列番号３は１μＭ以下でケラチノサイトおよび線維芽細胞の生存能を修飾しなかった。
【００９２】
実施例５：汗分泌のマウス実験における急性投与に対する発汗抑制作用の評価
この実施例は、パルミトイル化した形態の配列番号１の発明のペプチドの急性作用を、ピロカルピンにより誘発されたインビボでの発汗実験にて評価した。この実験は、１１週齢のＣ５７ＢＬ６／Ｒｃｃの雄マウスにて、ムスカリン受容体の非選択性アゴニストである、ピロカルピンを用いて確立された。試験化合物は、次の配列（配列番号１）：
Ｐａｌｍ−ＨＹＷＲＥＬＱＹＲ−ＮＨ２
を有する本発明のペプチドである。
【００９３】
試験化合物を、発汗刺激を行う３０分前に右後肢に足底内（i.pl.）注射を行った（１０、３０および１００μｇ）。ビヒクルはセイライン溶液であった。
発汗を、ヨウ素／澱粉反応を用い、皮膚表面でのアミラーゼ活性検出を通してモニター観察した。５分間誘発した後にダーク（Dark）発汗滴を定量し、各条件での肢当たりの発汗滴の数を計数した。サンプルは一群に付きｎ＝５〜６の個体とする。データは平均値±標準偏差（ＳＥＭ）で示される。生データは、非注射の刺激個体（対照、１００％）と、セイライン注射の非刺激個体（ビヒクル、０％）とに関するパーセンテージとして正規化された。統計分析は一元配置分散分析（one-way ANOVA）であり、つづいて、各条件を対応する対照群と比較する、ダネットの事後多重比較試験（Dunnett’s post-hoc multiple comparison test）に付した、＊＊＊＊ｐ＜０.０００１、＊＊＊ｐ＜０.００１、＊＊ｐ＜０.０１、＊ｐ＜０.０５。
【００９４】
結果を次の表Ｇにおいて要約する。
表Ｇ
【表８】
2021527085.tif 000010
【００９５】
試験化合物は、１０、３０および１００μｇで発汗を有意に減少させた。
【００９６】
実施例６：汗分泌のマウス実験における慢性投与に対する発汗抑制作用の評価
この実施例は、パルミトイル化した形態の配列番号１の発明のペプチドの慢性作用を、インビボでの発汗実験にて評価した。この実験は、１１週齢のＣ５７ＢＬ６／Ｒｃｃの雄マウスにて、ムスカリン受容体の非選択性アゴニストである、ピロカルピンを用いて確立された。試験化合物を週に３回、４週間にわたって局所投与した（処理）。発汗は、表Ｈに従って、第１、第２および第４週に１回、ピロカルピン（３μｇ／肢）を右後肢に足底内（i.pl.）注射を行うことで誘発された（発汗）。
【００９７】
表Ｈ
【表９】
2021527085.tif 000011
【００９８】
試験化合物は、次の配列（配列番号１）：
Ｐａｌｍ−ＨＹＷＲＥＬＱＹＲ−ＮＨ２
を有する本発明のペプチドである。
試験化合物を、右後肢の足底内（i.pl.）に注射し（１、１０および１００μｇ）、ビヒクルはセイライン溶液であった。
【００９９】
発汗を、ヨウ素／澱粉反応を用い、皮膚表面でのアミラーゼ活性検出を通してモニター観察した。５分間誘発した後にダーク発汗滴を定量し、各条件での肢当たりの発汗滴の数を計数した。サンプルは一群に付きｎ＝５〜６の個体とする。データは平均値±標準偏差（ＳＥＭ）で示される。生データは非注射の刺激個体（対照、１００％）に関するパーセンテージとして正規化された。統計分析は一元配置分散分析であり、つづいて、各条件を対応する対照群と比較する、ダネットの事後多重比較試験に付した、＊＊＊＊ｐ＜０.０００１、＊＊＊ｐ＜０.００１、＊＊ｐ＜０.０１、＊ｐ＜０.０５。
【０１００】
結果を次の表Ｉにおいて要約する。
表Ｉ
【表１０】
2021527085.tif 000012
【０１０１】
Ｐａｌｍ−配列番号１は、１００μｇ／肢で比較した場合に、４週間の処理の間に有意な発汗阻害を示した。
【０１０２】
実施例７：神経細胞感作のためのインビトロ機能アッセイ
この実施例では、敏感肌の状況での侵害受容器感作における配列番号１のパルミトイル化形態のインビトロ作用を評価した。
【０１０３】
ウィスター（Wister）ラット（３〜５日齢）より単離した新生児ラット後根神経節に、ネズミＮＧＦを捕捉したＤＭＥＭグルタマックス（Glutamax）、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓにて微小電極アレイチップを播種した。全ての実験は播種した４８時間後に行われた。
【０１０４】
感覚神経細胞を、ブラジキニン、ヒスタミンおよいＡＴＰを含む炎症誘発性カクテルに急性暴露することで感作させた。刺痛、灼熱感、およびかゆみ感が主にＴＲＰＶ１により惹起されるため、ＴＲＰＶ１介在性興奮を分析した。ＴＲＰＶ１アゴニストのカプサイシンを反復適用（１５回の適用  ５００ｎＭ）に供し、最初の活性化（Ｐ１）に、つづいて脱感作（第２適用）に付した。脱感作の培養物をカクテルで感作させ、第２（Ｐ２）および第３（Ｐ３）のカプサイシンパルス（８分）の間に外部溶液を用いて、興奮性を回復した。細胞の生存能を確認するために、４０ｍＭ  ＫＣｌを最後に適用した。モニター観察する前に試験化合物を０.１、１および１０μＭで１時間インキュベートした。試験化合物は、次式（配列番号１）：
Ｐａｌｍ−ＨＹＷＲＥＬＱＹＲ−ＮＨ２
を有するペプチドである。
【０１０５】
感作は、炎症誘発性カクテルによって誘発される感作応答を示す、Ｐ３とＰ１カプサイシンパルスの間の割合（割合Ｐ３／Ｐ１）として計算された。阻害パーセンテージは１００−感作として算定された。データは平均値±標準偏差（ＳＥＭ）で示される。統計分析は一元配置分散分析であり、つづいて各条件を対応する対照群と比較する、ダネットの事後多重比較試験に付した、＊＊＊＊ｐ＜０.０００１、＊＊＊ｐ＜０.００１、＊＊ｐ＜０.０１、＊ｐ＜０.０５。
【０１０６】
結果を次の表Ｊにおいて要約する。
表Ｊ
【表１１】
2021527085.tif 000013
【０１０７】
３種の濃度の試験化合物は、感作プロセスを同様の効能で有意に阻害した。
【配列表】
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【国際調査報告】
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