(57)【要約】  本発明は、ポリマー試料を分析する方法であって、ポリマー試料のための少なくとも１種の非溶媒（Ｓ１）及び少なくとも１種の溶媒（Ｓ２）の混合物を含む移動相を用いてクロマトグラフィーカラムで液体クロマトグラフィー分析を実施することを含み、移動相におけるＳ２の体積割合が溶出過程で段階的に変化し、ステップが交互に昇降することを特徴とする、方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー試料を分析する方法であって、ポリマー試料のための少なくとも１種の非溶媒（Ｓ１）及び少なくとも１種の溶媒（Ｓ２）の混合物を含む移動相を用いてクロマトグラフィーカラムで液体クロマトグラフィー分析を実施することからなり、移動相におけるＳ２の体積による割合が溶出過程で段階的に変化し、ステップが交互に昇降することを特徴とする、方法。
【請求項２】
ステップが、柱状、台形、ジグザグ又は鋸歯状の形状である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリマー試料がポリマーである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリマー試料が、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリカーボネート、ポリ（メタ）アクリレート、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリビニリデンシアニド、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリエーテル、ポリエステル、ポリアミド、ポリイミド、ポリシロキサン、ポリシラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、及びこれらの誘導体及びコポリマー、並びにセルロース、デンプン、カゼイン、及び天然ゴム等の天然ポリマー、並びにセルロース誘導体、例えばメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、及びカルボキシメチルセルロース等の半合成高分子量化合物からなる群から選択されるポリマーである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリマー試料がポリマー混合物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリマー試料が、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリカーボネート、ポリ（メタ）アクリレート、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリビニリデンシアニド、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリエーテル、ポリエステル、ポリアミド、ポリイミド、ポリシロキサン、ポリシラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、及びこれらの誘導体及びコポリマー、並びにセルロース、デンプン、カゼイン、及び天然ゴム等の天然ポリマー、並びにセルロース誘導体、例えばメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、及びカルボキシメチルセルロース等の半合成高分子量化合物からなる群からの少なくとも２種のポリマーを含むポリマー混合物である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記移動相が非溶媒Ｓ１及び溶媒Ｓ２からなり、移動相の組成が次のように経時的に変化し、
【表１】
2021526640.tif 000017
ここで、パラメータＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは以下の範囲、すなわちＡ：０．０１〜１００％体積％のＳ２及びＢ：０．０１〜１００％体積％のＳ２及びＣ：０〜１００及びＤ：０〜１００及びＥ：０〜１００から自由に選択できる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記移動相が２つの非溶媒Ｓ１及びＳ１’と溶媒Ｓ２とからなり、移動相の組成が次のように経時的に変化し、
【表２】
2021526640.tif 000018
ここで、パラメータＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは以下の範囲、すなわちＡ：０．０１〜１００％体積％のＳ２及びＢ：０．０１〜１００％体積％のＳ２及びＣ：０〜１００及びＤ：０〜１００及びＥ：０〜１００から自由に選択できる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
いずれの場合も前の溶媒を非溶媒として使用し、新たな溶媒を選択することにより、いずれの場合も異なる移動相を用いて少なくとも１回方法を繰り返す、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶媒及び非溶媒が、ＴＨＦ、トルエン、シクロヘキサン、ジエチルエーテル、テトラクロロメタン、ジクロロメタン、クロロホルム、１，４−ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ベンジルアルコール、メチルエチルケトン、酢酸エチル、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ヘキサフルオロイソプロパノール、２−プロパノール、メタノール、水、及びそれらの混合物からなる群から独立して選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
溶媒及び非溶媒が、ＴＨＦ、ヘキサフルオロイソプロパノール、メタノール、アセトン、水、及びそれらの混合物からなる群から独立して選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
パラメータＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥが以下の範囲、すなわち、
Ａ：３．０〜１２．０体積％のＳ２及び
Ｂ：０．２〜１．０％体積％のＳ２及び
Ｃ：０．５〜３．０及び
Ｄ：０．５〜３．０及び
Ｅ：０．１〜２．０
から選択される、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
パラメータＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥが以下の値、すなわち、Ａ：６．０体積％及びＢ：０．２体積％及びＣ：１．０及びＤ：３．０及びＥ：２．０を有する、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマー試料を分析するための方法であって、少なくとも１種の非溶媒（Ｓ１）及びポリマー試料のための少なくとも１種の溶媒（Ｓ２）の混合物を含む移動相を用い、クロマトグラフィーカラムで液体クロマトグラフィー分析を実施することからなり、移動相中のＳ２の体積による割合が溶出過程で段階的に変化し、ステップが交互に昇降することを特徴とする、方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＵＰＡＣは、クロマトグラフィーを次のように定義している。「クロマトグラフィーは、分離されるべき成分が２つの相の間に分配される物理的な分離方法であり、相の１つは固定されているが（固定相）、もう１つ（移動相）は一定の方向に移動する」。
【０００３】
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の場合、ＩＵＰＡＣは、「液体クロマトグラフィーは、移動相が液体である分離方法である。液体クロマトグラフィーは、カラム内又はプレート上のいずれかで行うことができる。」と述べている。液体クロマトグラフィーは、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）、ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）、及びＩＣ（イオンクロマトグラフィー）等の分離方法を含む。
【０００４】
液体クロマトグラフィーは、移動相の組成に従って、アイソクラティック分析及びグラジエント分析にさらに区分けすることができる。
【０００５】
アイソクラティック分析では、移動相の組成は、溶出工程を通じて一定のままであるが、グラジエント分析では、組成を連続的に又は段階的に変化させる。
【０００６】
ポリマーはモノマーから形成される高分子である。このように、連続した構造／個々の繰り返し単位及び対応する反応方法論は、物質の大きさの違いに関して分布を有する高分子をもたらす。化学組成に応じて、化学官能性、モル質量又は構造に関する分布が生じ得る。多分散性は、例えばモル質量分布がどの程度狭いか又は広いかを示す。
【０００７】
ポリマー、特にコポリマー、変性ポリマー又はポリマー混合物の大きな工業的重要性を考慮すると、化学構造に基づく効率的な分離方法は非常に興味深い。既存の方法（例えばサイズ排除クロマトグラフィー、ＳＥＣ）はしばしば平均値のみを提供するため、グラジエント溶出に基づくポリマーＨＰＬＣは現在懸命な研究の中心である。
【０００８】
グラジエント分析によるポリマーの分析のＨＰＬＣ法は、先行技術から知られている。特に、Ｗ．Ｊ．Ｓｔａａｌ（論文、Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、１９９６）は、グラジエント溶出クロマトグラフィー（ＧＥＣ）の起源及び発展の優れた概説を提供する。Ｇｏｔｔｆｒｉｅｄ  Ｇｌｏｅｃｋｎｅｒ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、１９９１）による「Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ＨＰＬＣ  ｏｆ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｃｒｏｓｓ−Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ」では、さらなる概説が与えられる。
【０００９】
ＥＰ３１７０８３６Ａ１号は、段階勾配を伴うＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相）分析法を開示しているが、これはガラティラメルアセテート又は類似の混合物のような複雑なポリペプチド混合物について記載されている。この方法では、溶媒／非溶媒混合物を経時にわたり段階的に変化させる。特定の実施形態では、より極性の低い溶媒を４〜６分毎に２〜４体積％増加させる。このように、ここでのプロファイルはステップ関数に似ている。
【００１０】
Ｋａｊｄａｎら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  １１８９（２００８）１８３−１９５）は、ポリペプチドを分析するためのジグザグ型勾配（「スパイク」勾配）を用いる二次元勾配法を開示する。この方法では、元の組成（１００％移動相Ａ）に戻る前に、移動相の組成を一定期間維持する。しかし、この勾配は第一次元では陽イオン交換に用いられるが、ＲＰ−ＬＣ（逆相ＬＣ）では第二次元において正規直線勾配が用いられる。
【００１１】
Ｓｐｒａｎｇｅｒら（Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７、５１、５０６１−５０７０）は、一次元のＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）及び他次元のＲＰ−ＨＰＬＣを組み合わせた、大気中のＨＵＬＩＳ（フミン様物質）の二次元分析法を開示する。ＲＰ−ＨＰＬＣについては、移動相中の有機溶剤の割合が定期的に増加し、減少し、一定のままである新規なジグザグ型勾配（「スパイク」勾配）を採用する。
【００１２】
しかし、先行技術には以下のような欠点がある。
−  ポリマーの分離、特にオリゴマーの分解能に関して不十分な状態が続くこと
−  長い溶出時間
−  ポリマーについては使用できない方法
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】欧州特許出願公開第３１７０８３６号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｗ．Ｊ．Ｓｔａａｌ（論文、Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、１９９６）
【非特許文献２】Ｇｏｔｔｆｒｉｅｄ  Ｇｌｏｅｃｋｎｅｒ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、１９９１）、「Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ＨＰＬＣ  ｏｆ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｃｒｏｓｓ−Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ」
【非特許文献３】Ｋａｊｄａｎら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  １１８９（２００８）１８３−１９５）
【非特許文献４】Ｓｐｒａｎｇｅｒら（Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７、５１、５０６１−５０７０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、これらの欠点を持たないポリマー又はポリマー混合物を分析するための方法を提供する必要があった。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
この目的は、ポリマー試料を分析する方法であって、ポリマー試料のための少なくとも１種の非溶媒（Ｓ１）及び少なくとも１種の溶媒（Ｓ２）の混合物を含む移動相を用い、クロマトグラフィーカラムで液体クロマトグラフィー分析を実施することからなり、移動相におけるＳ２の体積による割合が溶出過程で段階的に変化し、ステップが交互に昇降することを特徴とする方法によって達成される。
【００１７】
驚くべきことに、今日では、上昇ステップ及び下降ステップを交互に伴う勾配、いわゆる「鋸歯状勾配」が、ポリマー及びポリマー混合物の場合に改善された分離効果を達成し、高分子量ポリマーを良好に分離することも可能であることが見出された。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】台形形状（１Ａ）における２次元ステップ勾配（「鋸歯状勾配」）の概略構造を示す。
【図１Ｂ】ジグザグ形状（１Ｂ）における２次元ステップ勾配（「鋸歯状勾配」）の概略構造を示す。
【図１Ｃ】柱状（１Ｃ）における２次元ステップ勾配（「鋸歯状勾配」）の概略構造を示す。
【図２Ａ】線形勾配で測定したＰＶＣのクロマトグラムを示す。
【図２Ｂ】ステップ勾配で測定したＰＶＣのクロマトグラムを示す。
【図２Ｃ】台形形状の鋸歯状勾配で測定したＰＶＣのクロマトグラムを示す（実施例１参照）。
【図３Ａ】線形勾配で測定したＰＭＭＡのクロマトグラムを示す。
【図３Ｂ】台形形状の鋸歯状勾配で測定したＰＭＭＡのクロマトグラムを示す（実施例３参照）。
【図４Ａ】線形勾配で測定したＰＰＧのクロマトグラムを示す。
【図４Ｂ】台形形状の鋸歯状勾配で測定したＰＰＧのクロマトグラムを示す（実施例３参照）。
【図５Ａ】線形勾配で測定したＰＤＭＳのクロマトグラムを示す。
【図５Ｂ】台形形状の鋸歯状勾配で測定したＰＤＭＳのクロマトグラムを示す（実施例３参照）。
【図６Ａ】台形形状の２次元鋸歯状勾配として測定されたＰＭＭＡ６９０，０００のクロマトグラムを示す。
【図６Ｂ】台形形状の３次元鋸歯状勾配として測定されたＰＭＭＡ６９０，０００のクロマトグラムを示す（実施例４参照）。
【図７】台形形状の鋸歯状勾配で測定した、類似の平均モル質量のＰＤＭＳ、ＰＭＭＡ、及びＰＰＧの混合物のクロマトグラムを示す（実施例５参照）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜定義＞
本発明の目的は、ポリマー試料を分析するための方法であって、ポリマー試料のための少なくとも１種の非溶媒（Ｓ１）及び少なくとも１種の溶媒（Ｓ２）の混合物を含む移動相を用い、クロマトグラフィーカラムで液体クロマトグラフィー分析を実施することからなり、移動相中のＳ２の体積による割合が溶出過程で段階的に変化し、ステップが交互に昇降することを特徴とする方法である。
【００２０】
本発明の目的のために、ポリマー試料は、ポリマー又はポリマー混合物であることができる。
【００２１】
ポリマーは、本発明の目的のために繰り返し構造単位からなり、数千から数百万ｇ／ｍｏｌの範囲内の平均モル質量を有する化学物質を意味すると理解され、これは、ホモポリマー及びコポリマーの両方を包含する。そのようなポリマーの例としては、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリカーボネート、ポリ（メタ）アクリレート、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリビニリデンシアニド、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリエーテル、ポリエステル、ポリアミド、ポリイミド、ポリシロキサン、ポリシラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、及びこれらの誘導体及びコポリマー等の合成有機ポリマー、並びにセルロース、デンプン、カゼイン、及び天然ゴム等の天然ポリマー、並びにセルロース誘導体、例えばメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、及びカルボキシメチルセルロース等の半合成高分子量化合物がある。ポリマー混合物は、好ましくはこの群から少なくとも２種のポリマーを含む。
【００２２】
ポリ（メタ）アクリレートは、本発明の目的のために、ポリアクリレート及びポリメタクリレート、並びにポリアルキルアクリレート及びポリアルキルメタクリレートを意味するものと理解され、アルキルは、好ましくは直鎖状又は分枝状Ｃ１〜Ｃ２０炭化水素基である。ポリ（メタ）アクリレートの例は、ポリメチル（メタ）アクリレート、ポリエチル（メタ）アクリレート、ポリブチル（メタ）アクリレート、及びポリイソブチル（メタ）アクリレートである。
【００２３】
ポリシロキサンは、本発明の目的のために、一般式（Ｉ）の化合物を意味するものと理解される。
（ＳｉＯ４／２）ａ（ＲｘＳｉＯ３／２）ｂ（Ｒｘ２ＳｉＯ２／２）ｃ（Ｒｘ３ＳｉＯ１／２）ｄ（Ｉ）
式中、
Ｒｘは、独立して、水素、非分枝、分枝、非環状又は環状の、飽和又は一不飽和又は多価不飽和のＣ１〜Ｃ２０炭化水素基、ヒドロキシ基、ビニル基、アルコキシ基、アミノ基、ハロゲン又は一般式（ＩＩ）のシリルオキシ基である。
（ＳｉＯ４／２）ｅ（ＲｙＳｉＯ３／２）ｆ（Ｒｙ２ＳｉＯ２／２）ｇ（Ｒｙ３ＳｉＯ１／２）ｈ（ＩＩ）
式中、Ｒｙは、独立して、水素、ハロゲン、非分枝、分岐、直鎖、非環状又は環状の飽和又は多重飽和のＣ１〜Ｃ２０炭化水素基であり、ここで個々の炭素原子は酸素、ハロゲン、窒素又は硫黄で置き換えられてもよく、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、及びｈは、それぞれ独立して、０〜１００，０００の範囲内の整数であり、ここで、ａ、ｂ、ｃ、及びｄの合計及びｅ、ｆ、ｇ及びｈの合計は、いずれの場合も少なくとも１である。好ましい基Ｒｘ及びＲｙは、水素、メチル、エチル、プロピル、フェニル、及び塩素基であり、メチルが最も好ましい。ポリシロキサンの例は、ポリジメチルシロキサン及びアミノポリジメチルシロキサンである。
【００２４】
使用されるポリマーは、通常、１０００〜２，０００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲内の平均モル質量を有する。使用されるポリ塩化ビニルは、通常、２０，０００〜１，０００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲内の平均モル質量を有し、使用されるポリ（メタ）アクリレートは、通常、１５，０００〜２，０００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲内の平均モル質量を有し、使用されるポリシロキサン及びポリシランは、通常、１０００〜５００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲内の平均モル質量を有し、使用されるポリスチレンは、通常、８０００〜２，０００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲内の平均モル質量を有し、使用されるポリプロピレングリコールは、通常、４０００〜３０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲内の平均モル質量を有し、使用されるポリアルコール及びポリ酢酸ビニルは、通常、通常使用される１０００〜１００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲内の平均モル質量を有する。
【００２５】
クロマトグラフィーカラムには一般に制限はない。使用されるクロマトグラフィーカラムは、液体クロマトグラフィーについて当業者に知られている任意のカラム、特に市販のカラム、すなわちＳＥＣカラム、ＨＰＬＣカラム、及びＩＣカラムであることができる。ＳＥＣカラム及びＨＰＬＣカラムが好ましく、ＨＰＬＣカラムが特に好ましい。
【００２６】
液体クロマトグラフィー分析に使用される移動相は、ポリマー試料のための少なくとも１種の溶媒（Ｓ２）及び少なくとも１種の非溶媒（Ｓ１）の混合物を含む。非溶媒は、ポリマー試料の溶解度が溶媒中の溶解度よりも低い全ての液体を意味すると理解される。当業者は、専門家の文献（例えば、ポリマーデータハンドブック、第２版、２００９年、オックスフォード大学プレス）から、各々の場合において、どの液体を、どのポリマー又はポリマー混合物の溶媒又は非溶媒として使用することができるかをはっきりさせることができる。
【００２７】
溶媒及び非溶媒は、例えばテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トルエン、シクロヘキサン、ジエチルエーテル、テトラクロロメタン、ジクロロメタン、クロロホルム、１，４−ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ベンジルアルコール、メチルエチルケトン、酢酸エチル、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ヘキサフルオロイソプロパノール、２−プロパノール、メタノール、水、及びそれらの混合物からなる群から独立して選択され得る。溶媒及び非溶媒は、ＴＨＦ、ヘキサフルオロイソプロパノール、メタノール、アセトン、水、及びそれらの混合物からなる群から独立して選択されることが好ましい。
【００２８】
本発明の目的のために、Ｓ１は非溶媒を示し、Ｓ２は溶媒を示す。溶出開始時に、Ｓ２が体積％である割合を有する混合物を使用し、この割合を開始割合（ＳＰ）と呼ぶ。溶出開始時には、通常１００：０体積％のＳ１：Ｓ２混合物を用いる。
【００２９】
本発明による分析方法は、複数の次元で実施することができ、したがってｎ次元と呼ぶことができ、次元の数は移動相で使用される液体成分の数に関連する。
【００３０】
Ｓ２の体積による割合を段階的に変化させ、ステップは上昇と下降を交互に行う（図１参照）。ステップの形状は、以下に記載するものの様々なパラメータを変更することにより、当業者が所望するように選択することができる。
【００３１】
ステップを記述するために、時間セグメントｔは、勾配の基礎となるカラム容積ｔ’（式１及び式２）から計算される。一般に、ｔ’は０．１ｍＬ〜１．２ｍＬの範囲内で自由に選択できる。
【００３２】
【数１】
2021526640.tif 000003
【００３３】
【数２】
2021526640.tif 000004
【００３４】
【表１】
2021526640.tif 000005
【００３５】
パラメータＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥにより、柱状、台形、ジグザグ、又は「鋸歯」状のステップを定義することが可能である（図１Ａ〜Ｃ参照）。
【００３６】
特定の実施形態（２次元）では、移動相は非溶媒Ｓ１及び溶媒Ｓ２からなり、移動相の組成は次のように経時的に変化する。
【００３７】
【表２】
2021526640.tif 000006
【００３８】
ここで、パラメータＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは以下の範囲から自由に選択できる：Ａ：０．０１〜１００％体積％のＳ２及びＢ：０．０１〜１００％体積％のＳ２及びＣ：０〜１００及びＤ：０〜１００及びＥ：０〜１００。
【００３９】
移動相の組成は、２次元鋸歯状勾配を説明する次式（３−５）を用いて計算する（図１、表２参照）。
【００４０】
Ｌ＝ｔ＋Ｃ・ｔ＋Ｄ・ｔ＋Ｅ・ｔ（３）
【００４１】
【数３】
2021526640.tif 000007
【００４２】
Ｈ＝Ａ＋Ｂ（５）
【００４３】
各ステップｘは時間セグメントｔから始まり、その期間中、Ｓ２の割合はそれぞれのステップの「開始割合」（ＳＰｎ）に保たれ、ＳＰｎ＝ＳＰ＋（ｘ−１）＊Ｂである。
【００４４】
その後の時間セグメントＣ・ｔの間、Ｓ２の割合は割合Ａ（例えば６体積％）だけ減少し、したがって（ＳＰ＋（ｘ−１）＊Ｂ−Ａ）である。
【００４５】
その後の時間セグメントＤ・ｔでは、これらの割合は一定に保たれる。
【００４６】
その後の時間セグメントＥ・ｔの間、Ｓ２の開始割合は割合Ｂ（例えば０．２％体積％)だけ増加し、したがって（ＳＰ＋ｘ＊Ｂ）である。これらの割合は、それぞれのステップの終了値に対応し、同時に次のステップの開始割合に対応する。次いで、次のステップが始まる。Ｓ１の割合はいずれの場合も（１００−Ｓ２）体積％である。
【００４７】
いくつかのステップについては、下降ステップのため、最初はＳ２の割合に対して負の値が計算される。しかし、このような負の値は数学的には不可能であるため、Ｓ２に正の値が計算されるまでは、Ｓ２の開始割合のレベルに設定される。
【００４８】
表２は、最初の２つのステップの数学的例として、組成物のこの変化を再び示している。この計算は、１００体積％のＳ２の割合に達する最終ステップまで継続される。
【００４９】
必要なステップ数は式４から計算できる。
【００５０】
【表３】
2021526640.tif 000008
【００５１】
【表４】
2021526640.tif 000009
【００５２】
２次元の鋸歯状勾配を用いる場合、液体成分はＴＨＦ及びメタノールであることが好ましい。
【００５３】
本実施の形態のさらなる実現では、いずれの場合も前の溶媒を非溶媒として使用し、新たな溶媒を選択することにより、いずれの場合も少なくとも１回は異なる移動相で方法を繰り返す。
【００５４】
この特殊な方法は、ポリマー混合物の分析に特に適している。それぞれの場合に選択される非溶媒は、ポリマー混合物中のポリマーの少なくとも一部のための溶媒として適切なものである。これにより、種々の移動相中でのポリマーの溶解度を変化させることによって、個々のポリマーへのポリマー混合物の分離が達成される。例えば第１の通過では、メタノールを非溶媒として使用し、アセトンを溶媒として使用し、第２の通過では、アセトンを非溶媒として使用し、ＴＨＦを溶媒として使用する。この方法は２次元勾配の特殊な例である。
【００５５】
さらに特定の実施形態（３次元）では、移動相は２種の非溶媒Ｓ１及びＳ１’と溶媒（Ｓ２）とからなり、移動相の組成は次のように経時的に変化する。
【００５６】
【表５】
2021526640.tif 000010
【００５７】
ここで、パラメータＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは以下の範囲から自由に選択できる：Ａ：０．０１〜１００％体積％のＳ２及びＢ：０．０１〜１００％体積％のＳ２及びＣ：０〜１００及びＤ：０〜１００及びＥ：０〜１００。
【００５８】
移動相の組成の変化は、３次元鋸歯状勾配を説明する次式（６）及び（７）を用いて計算する（表４参照）。
【００５９】
Ｌ３Ｄ＝ｔ＋Ｃ・ｔ＋Ｄ・ｔ＋０，０１＋ｔ＋Ｅ・ｔ（６）
【００６０】
【数４】
2021526640.tif 000011
【００６１】
各ステップｘは、時間セグメントｔから始まり、その持続時間中Ｓ１、Ｓ２、及びＳ１’の割合は、それぞれのステップの「開始割合」（ＳＰｎ）に保たれ、ＳＰｎ＝ＳＰ＋（ｘ−１）＊Ｂである。ステップ１では、Ｓ２の割合は開始割合ＳＰに相当する。
【００６２】
その後の時間セグメントＣ・ｔの間、Ｓ２の割合はAだけ減少して（ＳＰ＋（ｘ−１）＊Ｂ−Ａ）となる。Ｓ１の割合は（１００−Ｓ２）体積％である。成分Ｓ１’の割合は０体積％である。
【００６３】
その後の時間セグメントＤ・ｔの間、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ１’の以前の割合は一定に保たれる。
【００６４】
その後の時間セグメントの間、Ｓ２はさらに０．０１秒間一定に保たれる。しかし、Ｓ１’の割合は現在（１００−Ｓ２）体積％であり、Ｓ１の割合は０体積％である。
【００６５】
その後の時間セグメントｔの間、Ｓ１、Ｓ２、及びＳ１’の以前の割合は一定に保たれる。
【００６６】
その後の時間セグメントＥ・ｔの間、Ｓ２の開始割合を割合Ｂ（例えば０．２％体積％）増加させて（ＳＰ＋ｘ＊Ｂ）となる。Ｓ１’の割合は現在（１００−Ｓ２）体積％であり、Ｓ１の割合は０体積％のままである。
【００６７】
これらの割合は、それぞれのステップの終了値に対応し、同時に次のステップの「開始割合」に対応する。
【００６８】
次いで、次のステップが始まる。
【００６９】
いくつかのステップについては、下降ステップのため、最初はＳ２の割合に対して負の値が計算される。しかし、このような負の値は数学的には不可能であるため、Ｓ２に正の値が計算されるまで、Ｓ２の開始割合ＳＰのレベルに設定される。
【００７０】
表４は、最初の２ステップの数学的例として、組成物のこれらの変化を再び示している。この計算は、１００体積％のＳ２の割合に達する最終段階まで継続される。
【００７１】
必要なステップ数は式７から計算できる。
【００７２】
【表６】
2021526640.tif 000012
【００７３】
ここで、パラメータＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは一般に以下の範囲から自由に選択できる。
Ａ：０．０１〜１００％体積％のＳ２及び
Ｂ：０．０１〜１００％体積％のＳ２及び
Ｃ：０〜１００及び
Ｄ：０〜１００及び
Ｅ：０〜１００
【００７４】
ここでの唯一の制限は、潜在的にＬＣ機器及びポンプの技術的な詳細である。値Ｃ、Ｄ及びＥは好ましくは０より大きい。
【００７５】
パラメータＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは好ましくは以下の範囲から選択できる。
Ａ：３．０〜１２．０％体積％のＳ２及び
Ｂ：０．２〜１．０％体積％のＳ２及び
Ｃ：０．５〜３．０及び
Ｄ：０．５〜３．０及び
Ｅ：０．１〜２．０
【００７６】
パラメータＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは特に好ましくは以下の値を有する：Ａ：６．０体積％及びＢ：０．２体積％及びＣ：１．０及びＤ：３．０及びＥ：２．０。
【実施例】
【００７７】
＜使用材料＞
ＨＰＬＣ：１）  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００とバイナリポンプ
２）  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００とクォータナリポンプ
３）  ダイオードアレイ検出器ＨＬ（検出波長２１５ｎｍ）を含むＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｖａｎｑｕｉｓｈ  ＵＨＰＬＣ
検出器：Ａｇｉｌｅｎｔ  ３８５  ＥＬＳＤ
【００７８】
カラム１：Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  Ｃ１８、５０×４．６ｍｍ、２．７μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）
カラム２：Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  Ｃ１８、１００×４．６ｍｍ、２．７μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）
カラム３：Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＢＤＳ  Ｃ１８、１００×４．６ｍｍ、２．４μｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）
カラム４：Ｌｕｎａ  Ｃ１８、１００×４．６ｍｍ、５μｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）
カラム５：Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｇｏｌｄ  Ｃ１８  ａＱ、１００×１０ｍｍ、５μｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）
カラム６：Ａｃｃｕｃｏｒｅ  Ｃ１８、５０×４．６ｍｍ、２．６μｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）
カラム７：Ｐｏｒｅｓｈｅｌｌ  ＨＩＬＩＣ、５０×４．６ｍｍ、２．７μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）
【００７９】
移動相には以下を用いた。
テトラヒドロフラン（安定化されていない、ＨＰＬＣグレード、Ｍｅｒｃｋ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）、メタノール（ＨＰＬＣグレード、Ｍｅｒｃｋ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）、超純水（導電率１８．５ＭＯｈｍ・ｃｍ、ＴＯＣ＜４ｐｐｂ）。
【００８０】
【表７】
2021526640.tif 000013
【００８１】
＜パラメータの最適化のための予備試験＞
使用した被検体はポリスチレン(Ｍｐ＝１９，６００ｇ／ｍｏｌ、多分散性１．０３、メインズのＰＳＳ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ製）である。ポリスチレンをｃ＝２５ｍｇ／ｍｌの濃度でＴＨＦに溶解し、注入量は５μｌである。分析はＨＰＬＣ装置２で行う。
【００８２】
鋸歯状勾配を最適化するためのパラメータは、ＴａｇｕｃｈｉのＬ１６（４５）試験計画設計（「Ｔｈｅ  Ｔａｇｕｃｈｉ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ」、１９８６、ＡＳＱＣ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ；  「Ｔａｇｕｃｈｉ’ｓ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｈａｎｄｂｏｏｋ」、２０１１、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）に基づいて修正され、表２を参照されたい。
【００８３】
最適化された標的変数は、（１）分離したピークの数、（２）分解能、（３）非対称性、（４）半値幅であった。パラメータの変動を表２に示す。さらに、５種類の市販のクロマトグラフィーカラムについて試験シリーズを行った。
【００８４】
ピークの数、したがってポリマー分解能の質は主にパラメータＢの結果であることがわかった。他の標的変数は比較して影響がより少ないことを示した。
【００８５】
最適化されたパラメータを各カラムについて表６に示す。パラメータＡ〜Ｅの最適値は非常に類似しており、従ってカラムに依存しないことが分かった。したがって、一般的に適用可能な最適値が仮定される（表６の最終行参照）。
【００８６】
【表８】
2021526640.tif 000014
【００８７】
【表９】
2021526640.tif 000015
【００８８】
［実施例１］
総実施時間に関しては、有効ステップ高さＢも極めて重要である。実行されるステップが多いほど分解能は良好であるが、総測定時間も長くなる。最小の有効ステップ高さで測定時間を短縮する場合は、有効ステップ長を考慮する必要がある。この変数は、使用されるポンプのグラジエントミキサーの精度を考慮して、それ以上短縮することができない個別の、確固として定義されたサブステップで構成されるため、別の選択肢を見つけなければならない。有効ステップ長の計算に含まれるもう一つの重要なパラメータはＬＣ流量である。
【００８９】
カラム６を用いたＨＰＬＣ装置１
ポリマーの濃度：９０ｍｇ／ｍｌのＰＤＭＳ（Ｍｐ＝３６５００ｇ／ｍｏｌ）
注入量：５μｌ
流量：１ｍｌ／分、２ｍｌ／分、３ｍｌ／分
【００９０】
ｔ＝０．１分
Ａ＝６体積％
Ｂ＝０．２体積％
Ｃ＝１
Ｄ＝３
Ｅ＝１
Ｌ＝０．２分／０．３分／０．６分
Ｈ＝６．２体積％
【００９１】
流量を１ｍＬ／分から３ｍＬ／分に増加させることにより、分解能に悪影響を及ぼすことなく測定時間を３分の１に短縮できることが分かった。
【００９２】
［実施例２］
直線勾配、ステップのみを増加させたステップ勾配、鋸歯状勾配を比較し、ＰＶＣ４５，５００を試験用被検体とする（ＰＶＣ４５，５００ｇ／ｍｏｌ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
【００９３】
カラム６を用いたＨＰＬＣ装置１
ポリマー濃度：１００ｍｇ／ｍｌ
注入量：１μＬ（図２Ａ及び２Ｂ）、３μＬ（図２Ｃ）
流量：１ｍｌ／分
開始条件０％ＴＨＦ／１００％メタノール、終了条件１００％ＴＨＦ／０％メタノール（全ての勾配について）
【００９４】
ｔ＝０．１分
Ａ＝６体積％
Ｂ＝０．２％体積％（ステップ勾配及び鋸歯状勾配はともに有効ステップ高さ０．２％体積％を有する）
Ｃ＝１
Ｄ＝３
Ｅ＝１
Ｌ＝１．５分
Ｈ＝６．２体積％
【００９５】
鋸歯状勾配の分解能は、他の分析手法と比較すると大幅に改善され、これはピーク数の増加から明確に分かる（図２参照）。
【００９６】
［実施例３］
直線勾配及び鋸歯状勾配を異なるカラム上で異なるポリマーで比較した。試験条件を表８に示す。
【００９７】
カラム６又はカラム７を用いたＨＰＬＣ装置１
ポリマー濃度：１５ｍｇ／ｍｌ
注入量：４μｌ
流量：１ｍｌ／分
【００９８】
ｔ＝０．２５分
Ａ＝６体積％
Ｂ＝１体積％
Ｃ＝１
Ｄ＝３
Ｅ＝１
Ｌ＝０．６分
Ｈ＝７体積％
【００９９】
【表１０】
2021526640.tif 000016
【０１００】
全てのポリマーについて、鋸歯状勾配を用いると、分解能は明確な改善を示し、これはピーク数の増加とピーク形状の改善に現れる。これは、例としてカラム６のＰＭＭＡ及びＰＰＧ、及びカラム７のＰＤＭＳについて示されている（図３〜５参照）。
【０１０１】
［実施例４］
ＰＭＭＡ６９０，０００の分離のために、３次元の鋸歯状勾配を用いてＨＰＬＣ分析を行った。移動相の組成の変化は、３次元鋸歯状勾配について前述したように行う（表４）。以下の液体成分を使用する：Ｓ２＝ＴＨＦ、Ｓ１＝水、Ｓ１’＝メタノール。比較のために、２次元の鋸歯状勾配（図６参照）でも同様の分析を行う。
【０１０２】
カラム６を用いたＨＰＬＣ装置２
ポリマー濃度：１５ｍｇ／ｍｌ
注入量：４μｌ
流量：２ｍｌ／分
【０１０３】
ｔ＝０．２５分
Ａ＝６体積％
Ｂ＝１体積％
Ｃ＝１
Ｄ＝３
Ｅ＝１
Ｌ＝０．６分
Ｈ＝７体積％
【０１０４】
［実施例５］
同様の平均モル質量（図７参照）を有する３つのポリマー（ＰＭＭＡ１９，７００、ＰＰＧ１８，０００、ＰＤＭＳ２０，８００）を分離するためのＨＰＬＣ分析を行う。そのためには、異なる移動相を用いて２次元鋸歯状勾配を連続して２回適用する。鋸歯状勾配１を、１００体積％のメタノール（０体積％のアセトン）から１００体積％のアセトン（０体積％のメタノール）まで、３０分間で実行する。これに１００体積％のアセトン（０体積％のＴＨＦ）から１００体積％のＴＨＦ（０体積％のアセトン）まで同様に３０分間実施する鋸歯状勾配２が続く。（全実施時間６０分）
【０１０５】
カラム６を用いたＨＰＬＣ装置２
ポリマーの濃度：いずれの場合も２０ｍｇ／ｍＬ
注入量：５μｌ
流量：２ｍｌ／分
【０１０６】
パラメータ：
ｔ＝０．２５分
Ａ＝６体積％
Ｂ＝１体積％
Ｃ＝１
Ｄ＝３
Ｅ＝１
Ｌ＝０．６分
Ｈ＝７体積％
【０１０７】
実施例１〜５は、本発明による方法が、非常に大きな平均モル質量を有するものであっても、多様なクロマトグラフィーカラムを用いて、多様なポリマーに使用できることを示す。適合性に関する唯一の前提条件は、調査中の被検体がカラムである程度の保持を示すことである。しかし、これは、当業者の一般的な専門家知識の一部を形成するであろう。
【図１Ａ】
2021526640.tif 000019
【図１Ｂ】
2021526640.tif 000020
【図１Ｃ】
2021526640.tif 000021
【図２Ａ】
2021526640.tif 000022
【図２Ｂ】
2021526640.tif 000023
【図２Ｃ】
2021526640.tif 000024
【図３Ａ】
2021526640.tif 000025
【図３Ｂ】
2021526640.tif 000026
【図４Ａ】
2021526640.tif 000027
【図４Ｂ】
2021526640.tif 000028
【図５Ａ】
2021526640.tif 000029
【図５Ｂ】
2021526640.tif 000030
【図６Ａ】
2021526640.tif 000031
【図６Ｂ】
2021526640.tif 000032
【図７】
2021526640.tif 000033
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月22日(2020.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー試料を分析する方法であって、ポリマー試料のための少なくとも１種の非溶媒（Ｓ１）及び少なくとも１種の溶媒（Ｓ２）の混合物を含む移動相を用いてクロマトグラフィーカラムで液体クロマトグラフィー分析を実施することからなり、移動相におけるＳ２の体積による割合が溶出過程で段階的に変化し、ステップが交互に昇降し、
ａ）前記移動相が非溶媒Ｓ１及び溶媒Ｓ２からなり、移動相の組成が次のように経時的に変化し、
【表１】
2021526640.tif 000034
ここで、パラメータＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは以下の範囲、すなわちＡ：０．０１〜１００％体積％のＳ２及びＢ：０．０１〜１００％体積％のＳ２及びＣ：０〜１００及びＤ：０〜１００及びＥ：０〜１００から自由に選択できるか、又は
ｂ）前記移動相が２つの非溶媒Ｓ１及びＳ１’と溶媒Ｓ２とからなり、移動相の組成が次のように経時的に変化し、
【表２】
2021526640.tif 000035
ここで、パラメータＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは以下の範囲、すなわちＡ：０．０１〜１００％体積％のＳ２及びＢ：０．０１〜１００％体積％のＳ２及びＣ：０〜１００及びＤ：０〜１００及びＥ：０〜１００から自由に選択できる、
ことを特徴とする、方法。
【請求項２】
ステップが、柱状、台形、ジグザグ又は鋸歯状の形状である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリマー試料が１つのポリマーである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリマー試料が、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリカーボネート、ポリ（メタ）アクリレート、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリビニリデンシアニド、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリエーテル、ポリエステル、ポリアミド、ポリイミド、ポリシロキサン、ポリシラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、及びこれらの誘導体及びコポリマー、並びにセルロース、デンプン、カゼイン、及び天然ゴム等の天然ポリマー、並びにセルロース誘導体、例えばメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、及びカルボキシメチルセルロース等の半合成高分子量化合物からなる群から選択されるポリマーである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリマー試料がポリマー混合物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリマー試料が、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリカーボネート、ポリ（メタ）アクリレート、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリビニリデンシアニド、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリエーテル、ポリエステル、ポリアミド、ポリイミド、ポリシロキサン、ポリシラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、及びこれらの誘導体及びコポリマー、並びにセルロース、デンプン、カゼイン、及び天然ゴム等の天然ポリマー、並びにセルロース誘導体、例えばメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、及びカルボキシメチルセルロース等の半合成高分子量化合物からなる群からの少なくとも２種のポリマーを含むポリマー混合物である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前の溶媒を非溶媒として使用し、新たな溶媒を選択することにより、いずれの場合も異なる移動相を用いて少なくとも１回方法を繰り返す、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記溶媒及び非溶媒が、ＴＨＦ、トルエン、シクロヘキサン、ジエチルエーテル、テトラクロロメタン、ジクロロメタン、クロロホルム、１，４−ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ベンジルアルコール、メチルエチルケトン、酢酸エチル、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ヘキサフルオロイソプロパノール、２−プロパノール、メタノール、水、及びそれらの混合物からなる群から独立して選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
溶媒及び非溶媒が、好ましくはＴＨＦ、ヘキサフルオロイソプロパノール、メタノール、アセトン、水、及びそれらの混合物からなる群から独立して選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
パラメータＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥが以下の範囲、すなわち、
Ａ：３．０〜１２．０体積％のＳ２及び
Ｂ：０．２〜１．０％体積％のＳ２及び
Ｃ：０．５〜３．０及び
Ｄ：０．５〜３．０及び
Ｅ：０．１〜２．０
から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
パラメータＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥが以下の値、すなわち、Ａ：６．０体積％及びＢ：０．２体積％及びＣ：１．０及びＤ：３．０及びＥ：２．０を有する、請求項１０に記載の方法。
【国際調査報告】
2021526640.tif 000036
2021526640.tif 000037
2021526640.tif 000038
2021526640.tif 000039
2021526640.tif 000040
2021526640.tif 000041