(57)【要約】  本発明は、一酸化窒素感応性を有するアクリルアミド系高分子に関するものであり、さらに詳しくは、アクリルアミド系モノマーと一酸化窒素に感応する架橋剤とを用いて製造されることにより、一酸化窒素の過剰発現によって発症する疾病または疾患を予防または治療することが可能なアクリルアミド系高分子に関するものである。
2021535911.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一酸化窒素感応性アクリルアミド系高分子を含む炎症性疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項２】
前記アクリルアミド系高分子は、
アクリルアミド系モノマーと；
下記化学式１の構造を有する架橋剤と；
ラジカル開始剤と；
触媒とを用いて製造され、
下記化学式２の構造である、請求項１に記載の炎症性疾患の予防または治療用薬学組成物。
【化１】
2021535911.tif 000007
【化２】
2021535911.tif 000008
ここで、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4は、それぞれ独立に水素、Ｃ１〜Ｃ１０の置換または非置換のアルキル基であり、ｎは１〜１０００の整数である。
【請求項３】
前記Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4は、それぞれ独立に水素である、請求項２に記載の炎症性疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項４】
前記アクリルアミド系モノマーは、アクリルアミド、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド、３−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリルアミド、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリルアミド、６−ヒドロキシヘキシル（メタ）アクリルアミド、８−ヒドロキシオクチル（メタ）アクリルアミド、２−ヒドロキシエチルヘキシル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチロール（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチロール（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メトキシメチル（メタ）アクリルアミド及びＮ−プロポキシメチル（メタ）アクリルアミドからなる群から選択された１種以上である、請求項２に記載の炎症性疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項５】
前記高分子は、ハイドロゲルの形態である、請求項１に記載の炎症性疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項６】
前記ハイドロゲルの直径は１０ｎｍ〜５００ｎｍである、請求項５に記載の炎症性疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項７】
前記薬学組成物は注射剤である、請求項１に記載の炎症性疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項８】
前記炎症性疾患は、生体内の一酸化窒素が過剰発現の様相を呈する疾患である、請求項１に記載の炎症性疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項９】
前記炎症性疾患は関節リウマチである、請求項１に記載の炎症性疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１０】
前記薬学組成物は、生体活性物質をさらに含み、
前記一酸化窒素感応性アクリルアミド系高分子は、前記生体活性物質を担持するものである、請求項１に記載の炎症性疾患の予防または治療用薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年８月３０日付の韓国特許出願第１０−２０１８−０１０２６１５号に基づく優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示された全ての内容は、本明細書の一部として含む。
【０００２】
本発明は、一酸化窒素感応性を有するアクリルアミド系高分子を含む炎症性疾患の予防または治療用薬学組成物に関するものであり、さらに詳しくは、アクリルアミド系モノマーと一酸化窒素に感応する架橋剤を用いて製造された高分子を含むことにより、一酸化窒素の過剰発現によって発症する炎症性疾病または疾患を予防または治療することが可能なアクリルアミド系高分子に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
一酸化窒素（Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ）は、数秒以内の短い半減期を有する、反応性の高いラジカル分子であり、人体の様々な細胞で発生し、免疫系では抗がん及び抗微生物作用を示す防御物質として、神経系では神経伝達物質として、循環器系では血管拡張物質として知られている。
【０００４】
そこで、一酸化窒素を抗がん治療などの医薬的用途に使用するために、一酸化窒素を利用目的に応じて、より効率的に放出することができる新しい物質及び方法に関する研究が進められている。
【０００５】
しかし、環境汚染やストレスなどで体の免疫システムが崩れると、過剰活性化されたマクロファージが一酸化窒素を多く分泌して、自己免疫疾患または炎症性疾患を引き起こすことになる。
【０００６】
また、一酸化窒素は高濃度では毒性を有するので、体内全般に多量に放出される場合、関節リウマチ、骨関節炎、炎症性腸疾患のように、むしろ身体に悪影響を及ぼしかねない。
【０００７】
一方、関節リウマチは、多発性関節炎を特徴とする原因不明の慢性炎症性疾患である。初期には関節を取り巻く滑膜に炎症が生じるが、徐々に周りの軟骨と骨に炎症が広がって関節の破壊と変形をもたらすようになる。関節だけでなく、関節外症状として貧血、乾燥症候群、皮下結節、肺線維症、血管炎、皮膚潰瘍など全身を侵し得る疾患である。
【０００８】
関節リウマチの正確な原因はまだ解明されていないが、自己免疫現象が主要な機序として知られている。自己免疫とは、外部から人体を守る免疫系の異常によって、むしろ自分の体を攻撃する現象である。一般的には、遺伝的素因、細菌やウイルスの感染などが関節リウマチの原因として考えられている。身体的または精神的にストレスを受けた後に発症しやすいとされている。また、関節リウマチは、関節の腫脹、炎症、こわばり、疼痛を伴い、全身の多発性関節炎の病像を呈する難治性自己免疫疾患である。即ち、生体自らが自己−非自己の誤認識に起因して、自己をまるで非自己と認識して自己組織を攻撃し、免疫応答の異常を引き起こして結合組織に炎症をきたす全身性疾患である。
【０００９】
これにより、関節リウマチにおける一酸化窒素は、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）によって誘導された破骨細胞の骨吸収を増加させ、関節での細胞死を促進させて悪影響を及ぼす。
【００１０】
従って、自己免疫疾患を悪化させたり、炎症性疾患を悪化させる可能性のある一酸化窒素を感応して、これを捕集させて疾病を緩和または治療することができる新しい治療剤が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、前記の問題を解決するために、一酸化窒素感応性を有するアクリルアミド系高分子を製造し、このような高分子は、ハイドロゲルの形態で一酸化窒素を感応すると同時に、一酸化窒素を捕集することができ、また、前記ハイドロゲルは、ナノサイズのハイドロゲルで、体内に投与する際に容易であり、さらには、高濃度の一酸化窒素によって生じる炎症性疾患を予防または治療することができることを確認して、本発明を完成した。
【００１２】
従って、本発明の目的は、一酸化窒素の過剰発現によって発症する炎症性疾病または疾患を予防または治療することが可能な、一酸化窒素感応性を有するアクリルアミド系高分子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記目的を達成するために、本発明の一実施例によると、一酸化窒素感応性アクリルアミド系高分子を含む炎症性疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００１４】
前記アクリルアミド系高分子は、アクリルアミド系モノマーと；下記化学式１の構造を有する架橋剤と；ラジカル開始剤と；触媒とを用いて製造された下記化学式２の構造であってもよい。
【００１５】
【化１】
2021535911.tif 000003
【００１６】
【化２】
2021535911.tif 000004
【００１７】
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4は、それぞれ独立に水素、Ｃ１〜Ｃ１０の置換または非置換のアルキル基であり、ｎは１〜１０００の整数である。
【００１８】
本発明の一実施例において、前記Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4は、それぞれ独立に水素であってもよい。
【００１９】
前記アクリルアミド系モノマーは、アクリルアミド、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド、３−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリルアミド、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリルアミド、６−ヒドロキシヘキシル（メタ）アクリルアミド、８−ヒドロキシオクチル（メタ）アクリルアミド、２−ヒドロキシエチルヘキシル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチロール（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチロール（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メトキシメチル（メタ）アクリルアミド及びＮ−プロポキシメチル（メタ）アクリルアミドからなる群から選択された１種以上であってもよい。
【００２０】
前記高分子は、ハイドロゲルの形態であってもよく、このとき、前記ハイドロゲルの直径は１０ｎｍ〜５００ｎｍであってもよい。
【００２１】
本発明の一実施例において、前記薬学組成物は、注射剤であってもよい。
【００２２】
前記炎症性疾患は、生体内において一酸化窒素が過剰発現の様相を呈する疾患であり得る。
【００２３】
前記炎症性疾患は、関節リウマチであり得る。
【００２４】
前記薬学組成物は、生体活性物質をさらに含み、前記化学式２の構造を有する一酸化窒素感応性アクリルアミド系高分子は、前記生体活性物質を担持することができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に係る一酸化窒素感応性を有するアクリルアミド系高分子を含む炎症性疾患の予防または治療用薬学組成物は、一酸化窒素を感応すると同時に、捕集することができる。
【００２６】
また、本発明に係る一酸化窒素感応性を有するアクリルアミド系高分子を含む炎症性疾患の予防または治療用薬学組成物は、一酸化窒素の過剰発現によって発症する疾病または疾患を予防または治療することができる。
【００２７】
また、本発明に係る一酸化窒素感応性を有するアクリルアミド系高分子を含む炎症性疾患の予防または治療用薬学組成物は、ナノサイズのハイドロゲルの形態で、体内に投与する際に容易であり、親水性が高くて生体適合性に優れる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の一実施例に係る一酸化窒素−分解可能架橋剤（ＮＯＣＣＬ）に対する反応を示す図である。
【図２】本発明の一実施例に係る一酸化窒素−分解可能架橋剤（ＮＯＣＣＬ）に対する１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図３】本発明の一実施例に係る実施例１及び比較例１に一酸化窒素溶液を処理する前と後のＴＥＭ画像である。
【図４】本発明の一実施例に係る実施例１に一酸化窒素溶液または水を処理した後のＤＬＳ結果である。
【図５】本発明の一実施例に係る一酸化窒素−分解可能架橋剤（ＮＯＣＣＬ）及びＮ，Ｎ’−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｉｓ−ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（ＢＩＳ）に、１００μＭ及び１０μＭの一酸化窒素溶液をそれぞれ処理して一酸化窒素捕集能を確認した結果である。
【図６】本発明の一実施例に係る実施例１、一酸化窒素−分解可能架橋剤（ＮＯＣＣＬ）及びアクリルアミドモノマーに対する溶血現象を評価した結果である。
【図７】本発明の一実施例に係る実施例１、比較例１、デキサメタゾン、及び緩衝溶液を関節リウマチの実験動物に投与して観察した後肢の足裏（図７ａ）と前肢の足裏（図７ｂ）の写真である。
【図８】本発明の一実施例に係る実施例１、比較例１、デキサメタゾン及び緩衝溶液を関節リウマチの実験動物に５週間投与して、時間経過に伴う関節炎症の重症度を評価した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、一酸化窒素感応性アクリルアミド系高分子を含む炎症性疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００３０】
本発明の一実施例において、前記アクリルアミド系高分子は、アクリルアミド系モノマーと；下記化学式１の構造を有する架橋剤と；ラジカル開始剤と；触媒とを用いて製造され、下記化学式２の構造を有する高分子である。
【００３１】
【化３】
2021535911.tif 000005
【００３２】
【化４】
2021535911.tif 000006
【００３３】
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4は、それぞれ独立に水素、Ｃ１〜Ｃ１０の置換または非置換のアルキル基であり、ｎは１〜１０００の整数である。
【００３４】
前記アクリルアミド系モノマーは、二重結合及びアミド官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ）を有する化合物であり、ラジカル重合（ｒａｄｉｃａｌ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を介して重合が可能なモノマーである。
【００３５】
また、前記アクリルアミド系モノマーは、アクリルアミド、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド、３−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリルアミド、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリルアミド、６−ヒドロキシヘキシル（メタ）アクリルアミド、８−ヒドロキシオクチル（メタ）アクリルアミド、２−ヒドロキシエチルヘキシル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチロール（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチロール（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メトキシメチル（メタ）アクリルアミド及びＮ−プロポキシメチル（メタ）アクリルアミドからなる群から選択された１種以上であってもよい。好ましくは、アクリルアミド、（メタ）アクリルアミド、またはこれらの組み合わせであり、さらに好ましくは、アクリルアミドだが、これに限定されない。
【００３６】
前記アクリルアミド系モノマーの化学構造によって、本発明の高分子の物理的及び化学的性質が異なり得る。例えば、ヒドロキシを有するアクリルアミド系モノマーで重合された高分子の場合、アクリルアミドモノマーで重合された高分子に比べてさらに親水性を有するようになって、ハイドロゲルを形成する際、スウェリング（ｓｗｅｌｌｉｎｇ）が容易に行われる上、より多くの水分を吸収することができ、一方、アルキル基を有するアクリルアミド系モノマーで重合された高分子の場合、アクリルアミドモノマーで重合された高分子に比べてさらに疎水性を有するので、よりサイズが小さいハイドロゲルを形成することができる。
【００３７】
前記架橋剤は、一酸化窒素と反応することができる架橋剤（一酸化窒素−分解可能架橋剤）であり、両末端にアクリルアミド基を含み、一酸化窒素と反応してアミド−置換のベンゾトリアゾール中間体を生成し、水性媒質で加水分解可能な化合物であることが好ましい。
【００３８】
また、前記架橋剤は、一酸化窒素と反応することにより、一酸化窒素を感応すると同時に、捕集が可能である。このとき、前記架橋剤は、一酸化窒素と反応するｏ−フェニレンジアミンの部分構造（ｍｏｉｅｔｙ）を含有した化合物が好ましい。
【００３９】
このとき、前記ｏ−フェニレンジアミンの部分構造（ｍｏｉｅｔｙ）を含有した化合物は、一酸化窒素との反応により、アミド置換されたベンゾトリアゾール中間体（ａｍｉｄｅ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）残基を形成することができ、この中間体残基が加水分解されてベンゾトリアゾール残基とカルボン酸残基とにそれぞれ分解され得る。
【００４０】
前記架橋剤は、図１に示すように合成することができる。図１を参照すると、前記架橋剤は、４つのステップの工程を経て合成することができる。出発物質として４−ニトロ−ｏ−フェニレンジアミン（４−ｎｉｔｒｏ−ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）を使用して説明すると、第１のステップは、４−ニトロ−ｏ−フェニレンジアミンのＣ−２のアミノ基をＦｍｏｃ−またはＢｏｃ−のような保護基で保護するステップである。第２のステップは、４−ニトロ−ｏ−フェニレンジアミンから４−ＮＯ2を４−ＮＨ2に還元させるステップである。その次に、第３のステップは、Ｃ−１及びＣ−４の２つのアミノ基をアクリロイルクロリドと結合させて、アクリルアミドに形成させるステップであり、最後に、第４のステップは、Ｃ−２の保護基を除去するステップである。前記４つのステップで使用される溶媒または触媒は、当技術分野で使用されるものであれば特に限定されない。
【００４１】
前記架橋剤は、前記化学式１の構造を有しており、ここで前記Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立に水素、Ｃ１〜Ｃ１０の置換または非置換のアルキル基である。前記アルキル基は、直鎖状、分枝状または環状であってもよい。好ましくは、前記Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立に水素であるが、これに限定されない。
【００４２】
前記ラジカル開始剤は、ラジカルを生成する化合物であり、前記アクリルアミドモノマーの二重結合部分と結合して重合の開始反応を起こす。
【００４３】
前記ラジカル開始剤は、油溶性ラジカル開始剤、水溶性ラジカル開始剤または酸化−還元開始剤であってもよく、好ましくは、水溶性ラジカル開始剤であるが、これに限定されない。このとき、前記水溶性ラジカル開始剤は、過硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ）、過硫酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ）、過硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ）を単独で用いるか、或いは、重硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｓｕｌｆａｔｅ）、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  ｓｕｌｆｏｘｙｌａｔｅ）などの還元剤と共に使用することができる。一方、油溶性ラジカル開始剤は、アミノパースルフェート（ａｍｉｎｏ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ）、過酸化ラウロイル（ｌａｕｒｏｙｌ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ）、過酸化水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ）、過酸化ベンゾイル（ｂｅｎｚｏｙｌ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ）、過酸化アセチル（ａｃｅｔｙｌ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ）、アゾビスイソブチロニトリル（ａｚｏｂｉｓｉｓｏｂｕｔｙｒｏｎｉｔｒｉｌｅ）、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ｔ−ｂｕｔｙｌ  ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ）、ジブチルペルオキシド（ｄｉｂｕｔｙｌ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ）、ベンゾイルヒドロペルオキシド（ｂｅｎｚｏｙｌ  ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ）、過安息香酸（ｐｅｒｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）、過酢酸（ｐｅｒａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）などが用いられ、単独で使用されてもよく、前記した還元剤と共に使用されてもよい。
【００４４】
前記触媒は、ラジカル開始剤からフリーラジカル（ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ）を作る上で、促進剤（ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ）の役割またはフリーラジカルの安定化剤の役割をするものであり、前記触媒は、極性添加剤であってもよい。
【００４５】
ここで、前記極性添加剤は、一例として、塩基であり、別の一例として、アミン基を有する化合物であり、或いはトリメチルアミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、トリプロピルアミン（ｔｒｉｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）、及びテトラメチルエチレンジアミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）からなるグループから選択されたものであり、好ましくは、トリエチルアミンまたはテトラメチルエチレンジアミンであるが、これに限定されない。
【００４６】
本発明に係る高分子は、前記アクリルアミド系モノマー及び架橋剤の繰り返し単位がランダム（ｒａｎｄｏｍ）、交互（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ）または順次（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）に配列された高分子であってもよく、架橋高分子（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ）または分岐高分子（Ｂｒａｎｃｈｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ）であってもよい。
【００４７】
本発明に係る高分子は、前記化学式２のように、アクリルアミド系モノマーは、高分子の骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を形成し、前記架橋剤は、骨格の間にリンカーで化学的に架橋（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）されて形成された高分子である。
【００４８】
前記Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立に水素、Ｃ１〜Ｃ１０の置換または非置換のアルキル基である。前記アルキル基は、直鎖状、分枝状または環状であってもよい。好ましくは、前記Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立に水素であるが、これに限定されない。
【００４９】
前記ｎは１〜１０００の整数であり、好ましくは３０〜５００であるが、これに限定されない。
【００５０】
本発明に係る高分子は、前記アクリルアミド系モノマー、化学式１の構造を有する架橋剤、ラジカル開始剤及び触媒を全て混合して、数分で架橋高分子に製造することができる。このように、前記高分子の製造方法は極めてシンプルであるため、収率が高く、経済的で製造工程の単価が低く、大量生産が可能である。
【００５１】
このとき、前記高分子の製造方法において、混合時の温度は、常温で１５〜２５℃であってもよい。
【００５２】
本発明に係る高分子は、重量平均分子量（Ｍｗ）が２，０００〜５０，０００の範囲内にあってもよい。本出願で重量平均分子量は、例えば、ＧＰＣ（Ｇｅｌ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ）を使用して測定した標準ポリスチレンの換算値であってもよく、別段の定めがない限り、用語の分子量は重量平均分子量を指し得る。前記のような分子量（Ｍｗ）は、例えば、前記高分子が架橋されてハイドロゲルに製造されて、薬学組成物として使用される場合に有用であり得る。前記分子量（Ｍｗ）の範囲で前記高分子を使用することで、一酸化窒素に対する感応性が高まり、多量の一酸化窒素と反応して捕集させることができる。
【００５３】
本発明の一実施例において、前記高分子は、架橋されてハイドロゲルに形成されてもよいが、ここで、ハイドロゲルは、十分な量の水分を保有している親水性高分子の３次元構造を意味するものである。従って、前記高分子は、３次元架橋構造を有する高分子化合物で、水分がある状態で、その水分を吸収して膨張したハイドロゲルの形態であってもよい。
【００５４】
このとき、前記ハイドロゲルは、１００％スウェリング状態でのナノサイズのハイドロゲルであり、このとき、ハイドロゲルの直径は１０ｎｍ〜５００ｎｍであってもよい。好ましくは、２０ｎｍ〜１５０ｎｍであり、さらに好ましくは、３０ｎｍ〜７０ｎｍである。前記ハイドロゲルの直径が１０ｎｍ未満である場合には、一酸化窒素を捕集する効果が低下し、５００ｎｍを超える場合には、体内投与が容易ではなく、体内滞留時間がかなり短くなる虞があり、溶血現象が生じる可能性が高まる虞もある。
【００５５】
また、前記高分子は、アクリルアミド系モノマー及び架橋剤の濃度を調節して、ハイドロゲルのサイズを調節することができる。
【００５６】
また、前記高分子は、前記アクリルアミド系モノマーと架橋剤との混合比率は、製造しようとするハイドロゲルのサイズ、物性などに応じて調節することができる。
【００５７】
前記アクリルアミド系モノマー及び架橋剤の混合比は、１０００：０．３〜１．０のモル比であってもよく、好ましくは、１０００：０．５〜１．０のモル比であるが、これに限定されない。当該範囲での高分子は、ナノサイズのハイドロゲルに形成され得る上、一酸化窒素の感応後に効果的に膨潤されて素早く解離され得る。
【００５８】
前記高分子は、ナノサイズのハイドロゲルの形態で、親水性が非常に高く、薬物やタンパク質を担持することができる。また、従来のマクロ（ｍａｃｒｏ）またはマイクロ（ｍｉｃｒｏ）サイズのハイドロゲルは、創傷部位に手術による移植が必要であるのに対し、本発明に係る高分子は、ナノサイズのハイドロゲルであることから、手術をせずに注射剤で体内に投与することができて容易であるという利点を有する。
【００５９】
また、前記ハイドロゲルは、別の生体活性物質を含んでいなくても、一酸化窒素を捕集することができるため、高濃度の一酸化窒素によって生じた炎症または疾患を緩和させたり、治療することができる。即ち、前記ハイドロゲル自体だけでも治療剤として使用することができる。
【００６０】
一方、前記ハイドロゲルは、生体活性物質をさらに含むことにより、高濃度の一酸化窒素によって生じた炎症または疾患を治療する上で、さらに効果を高めることができる。こうした生体活性物質は、疾病の治療、治癒、予防または診断などに使用される物質を意味し、その例としては、細胞、成長因子、及びホルモンなどのタンパク質またはペプチド、核酸、細胞外マトリックス物質及び医薬的治療機能を持つ薬物などを挙げることができる。ハイドロゲルが生体活性物質を含むように製造するために、生体活性物質は、ある一つの溶液に含まれるように溶液を製造し、別の一つの溶液と混合してハイドロゲルを合成するように進行してもよい。この場合、生体活性物質は、形成される架橋化された高分子ハイドロゲルに担持された形になる。また、生体活性物質が含まれた二つの溶液を注射器に混合させて、注射器を使用して疾病、創傷部位に伝達することにより、時間に応じて生体活性物質が含まれたハイドロゲルの製造を誘導することができる。そのため、本発明の高分子は、ハイドロゲルの形態を有することにより、生体活性物質伝達体、細胞伝達体または薬物伝達体として使用することができる。また、組織工学用支持体または細胞治療剤として使用することができる。
【００６１】
前記ハイドロゲルに担持される生体活性物質として、薬物の例は、抗生剤、抗がん剤、消炎鎮痛剤、抗ウイルス剤、抗菌剤などを挙げることができる。抗生剤としては、テトラサイクリン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、オフロキサシン、レボフロキサシン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、セファクロル、セフォタキシム、イミペネム、ペニシリン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、バンコマイシンなどの誘導体及び混合物から選択される抗生剤を例示することができる。抗がん剤としては、メトトレキサート、カルボプラチン、タキソール、シスプラチン、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、エトポシド、パクリタキセル、カンプトテシン、シトシンアラビノシドなどの誘導体及び混合物から選択される抗がん剤を例示することができる。消炎鎮痛剤としては、インドメタシン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ピロキシカム、フルルビプロフェン、ジクロフェナクなどの誘導体及び混合物から選択される消炎鎮痛剤を例示することができる。抗ウイルス剤としては、アシクロビル、リバビリンなどの誘導体及び混合物から選択される抗ウイルス剤を例示することができる。抗菌剤としては、ケトコナゾール、イトラコナゾール、フルコナゾール、アムホテリシンＢ、グリセオフルビンなどの誘導体及び混合物から選択される抗菌剤を例示することができる。
【００６２】
また、前記ハイドロゲルに担持して生体内に伝達することができるタンパク質、ペプチドとしては、疾病を治療または予防する目的で使用されるホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質、多糖類及び受容体、細胞表面抗原、受容体拮抗物質などの様々な生理活性ペプチド、これらの誘導体及び類似体を例示することができる。具体的には、骨成長因子、肝臓成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモンとペプチド、インターフェロン類とインターフェロン受容体類（例えば、インターフェロン−アルファ、−ベータ及び−ガンマ、水溶性Ｉ型インターフェロン受容体など）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、グルカゴン様ペプチド類（ＧＬＰ−１など）、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、インターロイキン類（例えば、インターロイキン−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９など）とインターロイキン受容体類（例えば、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−４受容体など）、酵素類（例えば、グルコセレブロシダーゼ（ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ｉｄｕｒｏｎａｔｅ−２−ｓｕｌｆａｔａｓｅ）、α−ガラクトシダーゼＡ、アガルシダーゼ−α（ａｇａｌｓｉｄａｓｅ  ａｌｐｈａ）、−β、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ａｌｐｈａ−Ｌ−ｉｄｕｒｏｎｉｄａｓｅ）、キチナーゼ（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）、ブチリルコリンエステラーゼ（ｂｕｔｙｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）、リパーゼ（ｌｉｐａｓｅ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、イミグルセラーゼ（ｉｍｉｇｌｕｃｅｒａｓｅ）、ウリカーゼ（ｕｒｉｃａｓｅ）、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ａｃｅｔｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、中性エンドペプチダーゼ（ｎｅｕｔｒａｌｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、ミエロペルオキシダーゼ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）など）、インターロイキン及びサイトカイン結合タンパク質類（例えば、ＩＬ−１８ｂｐ、ＴＮＦ−結合タンパク質など）、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ）α抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α１−アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン（ａｌｐｈａ−ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ）、アポリポタンパク質Ｅ、エリスロポエチン、高グリコシル化エリスロポエチン、アンジオポエチン類（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ヘモグロビン、トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、トロンビン受容体活性化ペプチド、トロンボモジュリン（ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ）、血液因子、血液因子ａ、血液第ＸIII因子、プラスミノーゲン活性化因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン（ｈｉｒｕｄｉｎ）、タンパク質Ｃ、Ｃ��応性タンパク質、レニン阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、アンジオテンシン（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）、骨形成因子（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン（ｅｌｃａｔｏｎｉｎ）、結合組織活性化因子、組織因子経路インヒビター（ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類（例えば、神経成長因子、毛様体神経栄養因子（ｃｉｌｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、アキソジェネシス因子−１（ａｘｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−１）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ｂｒａｉｎ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、ネトリン（ｎｅｔｒｉｎ）、好中球抑制因子（ｎｅｕｒｏｐｈｉｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｆａｃｔｏｒ）、神経栄養因子、ニュールチュリン（ｎｅｕｔｕｒｉｎ）など）、副甲状腺ホルモン、レラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン（ａｕｔｏｔａｘｉｎ）、ラクトフェリン（ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ）、ミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）、受容体類（例えば、ＴＮＦＲ（Ｐ７５）、ＴＮＦＲ（Ｐ５５）、ＩＬ−１受容体、ＶＥＧＦ受容体、Ｂ細胞活性化因子受容体など）、受容体拮抗物質（例えば、ＩＬ１−Ｒａなど）、細胞表面抗原（例えば、ＣＤ２、３、４、５、７、１１ａ、１１ｂ、１８、１９、２０、２３、２５、３３、３８、４０、４５、６９など）、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片類（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｄ）、ウイルス由来ワクチン抗原などを例示することができる。
【００６３】
前記ハイドロゲルに物理的に担持或いは化学的に結合して、生体内に伝達することができる核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、オリゴヌクレオチドなどを例示することができる。
【００６４】
前記ハイドロゲルに物理的に担持或いは化学的に結合して、生体内に伝達することができる細胞外マトリックス物質としては、コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、ラミニン、ビトロネクチンなどを例示することができる。
【００６５】
前記ハイドロゲルに物理的に担持して、生体内に伝達することができる細胞としては、幹細胞、繊維芽細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経細胞、軟骨細胞、骨細胞、皮膚細胞、シュワン細胞などを例示することができる。
【００６６】
前記炎症性疾患は、生体内の一酸化窒素が過剰発現の様相を呈する疾患であり、好ましくは、関節リウマチ、１型糖尿病または全身性エリテマトーデスから選択されたいずれか一つであり、さらに好ましくは、関節リウマチであるが、これに限定されない。
【００６７】
このとき、関節リウマチは、自己免疫疾患の一つであって、高濃度の一酸化窒素によって発症する疾患である。従って、本発明に係る薬学組成物は、一酸化窒素に対して感応性を有しながら捕集することができる高分子を含むことにより、高濃度の一酸化窒素の環境下で一酸化窒素を捕集してサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）によって誘導された破骨細胞の骨吸収を抑制し、関節での細胞死を防いで関節リウマチを緩和または治療することができる。
【００６８】
また、前記薬学組成物は、前述した生体活性物質をさらに含むことができ、前記化学式２の構造を有する一酸化窒素感応性アクリルアミド系高分子は、前記生体活性物質を担持することができる。
【００６９】
本発明の一実施例において、薬学組成物とは、特定の目的のために投与される組成物のことを意味する。本発明の目的上、本発明の薬学組成物は、一酸化窒素の過剰発現による疾患または疾病を治療する目的で使用され、一酸化窒素感応性を有するアクリルアミド系高分子のものであり、より好ましくは、一酸化窒素に感応性を有しながら、同時に捕集することができる架橋剤を含むアクリルアミド系高分子のものであり、これに関与するタンパク質及び薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含むことができる。
【００７０】
前記の「薬学的に許容可能な」担体または賦形剤は、政府の規制部によって承認されたものであるか、または脊椎動物、そしてより特別には、人間に使用するための、政府またはその他一般的に承認された薬局方に記載されているものを意味する。
【００７１】
非経口投与に適するように、薬学組成物は、油性または水性の担体にある懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態になってもよく、固体または半固体の形態で製造されてもよく、懸濁剤、安定化剤、溶解剤、及び／または分散剤などといった剤形化剤を含むことができる。本形態は、滅菌されてもよく、液体であってもよい。これは、製造及び保存の条件下で安定になり得、そして細菌やカビなどの微生物の汚染作用に対して保存されてもよい。代案としては、薬学組成物は、使用前に適切な担体と再構成のために滅菌粉末の形態であってもよい。薬学組成物は、単位−服用量形態で、マイクロニードルパッチに、アンプルに、またはその他の単位−服用量容器に、または多−服用量容器に存在してもよい。また、薬学的組成物は、単に滅菌液体担体、例えば、使用直前に注射用水の付加を必要とする凍結乾燥した（冷凍乾燥）状態で保管されてもよい。直ちに注射溶液及び懸濁液は、滅菌粉末、グラニュールまたはタブレットに製造されてもよい。
【００７２】
いくつかの非制限的な実施形態において、本発明の薬学組成物は、液体に剤形化されてもよく、または液体中に微粒球の形態で含まれてもよい。ある非制限的な実施形態において、本発明の薬学組成物は、本発明の有効成分を薬学的に許容され得る化合物及び／または混合物を０．００１〜１００，０００Ｕ／ｋｇの間の濃度で含む。また、ある非制限的な実施形態において、本発明の薬学組成物に適した賦形剤は、保存剤、懸濁剤、安定化剤、染料、緩衝剤、抗菌剤、抗真菌剤、及び等張化剤、例えば、砂糖または塩化ナトリウムを含む。ここで使用されたもので、用語「安定化剤」は、保存寿命を延ばすために、本発明の薬学的組成物に選択的に使用された化合物のことを指す。非制限的な実施において、安定化剤は糖、アミノ酸、化合物、またはポリマーであってもよい。薬学的組成物は、１つまたはそれ以上の薬学的に許容され得る担体を含むことができる。担体は、溶媒または分散培地であってもよい。薬学的に許容され得る担体の非制限的な例は、水、食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール）、オイル、及びこれらの適切な混合物を含む。また、非経口用剤形は滅菌されてもよい。滅菌技術の非制限的な例は、細菌−抑制フィルターを通した濾過、ターミナル滅菌化、滅菌製剤の合体、放射線照射、滅菌ガス照射、加熱、真空乾燥及び凍結乾燥を含む。
【００７３】
本発明の一実施例において、投与とは、ある適切な方法で患者に本発明の組成物を導入することを意味し、本発明の組成物の投与経路は、目的の組織に到達することができるものなら、いかなる一般的な経路を通してでも投与することができる。経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与、腔内投与、腹腔内投与、硬膜内投与が行われ得るが、本発明の一酸化窒素感応性アクリルアミド系高分子を含む薬学組成物の場合、ナノサイズのハイドロゲルであることから非経口投与の適用が可能なので、注射剤で投与されてもよい。
【００７４】
本発明の治療方法は、前記薬学組成物を薬剤学的有効量で投与することを含むことができる。本発明で有効量は、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分及び他の成分の種類及び含有量、剤形の種類及び患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、同時に使用される薬物をはじめとする様々な因子に応じて調節することができる。
【００７５】
以下で、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の範疇及び技術思想の範囲内で様々な変更及び修正が可能であることは、通常の技術者にとっては明白なことであり、こうした変更及び修正が、添付された特許請求の範囲に属するのも当然のことである。
【００７６】
［製造例１：一酸化窒素との反応によって分解され得る架橋剤（一酸化窒素−分解可能架橋剤；ＮＯ−Ｃｌｅａｖａｂｌｅ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）合成］
図１のように、一酸化窒素との反応によって分解され得る架橋剤であるＮ，Ｎ−（２−ａｍｉｎｏ−１，４−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ）ｄｉａｃｒｙｌａｍｉｄｅを合成した。具体的には、一酸化窒素−分解可能架橋剤は、下記の４つのステップの工程を経て合成した。
【００７７】
ステップ１は、２５℃で、４−ニトロ−ｏ−フェニレンジアミン（１ｇ、６．５３ｍｍｏｌ）とグアニジン塩酸（１５ｍｏｌ％）をエタノール２０ｍＬに溶解させた反応溶液に、ジ−ｔ−ブチルジカーボネート（２．８５ｍｇ、１３．０６ｍｍｏｌ）を滴下（ｄｒｏｐｐｉｎｇ）した後、３５〜４０℃を維持して、４０時間激しく攪拌した。反応完了後、反応溶液内の有機溶媒を減圧蒸発させ、酢酸エチルで３回抽出して乾燥した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した（収率：７４重量％、１．２２ｇ）。
【００７８】
ステップ２は、窒素雰囲気下で、ステップ１から得られた化合物（０．６ｇ）の溶液（無水テトラヒドロフラン（ｄｒｙ  ＴＨＦ）中、１０ｍＬ）に１０重量％のパラジウムがローディングされた炭素触媒（１０重量％Ｐｄ／Ｃ、６０ｍｇ）を添加した後、窒素の代わりに水素雰囲気（４０ｐｓｉ）に転換して、２５℃で３６時間攪拌した。反応完了後、セライト５４５ＡＷ（Ｃｅｌｉｔｅ  ５４５ＡＷ）を使用してＰｄ／Ｃを濾過除去し、濾過液を乾燥して、追加の精製なしに収得した（収率：９６重量％、４２３ｍｇ）。
【００７９】
ステップ３は、２５℃で、ステップ２から得られた化合物（４００ｍｇ、１．７９ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（７２３．１６ｍｇ、７．１６ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦに溶解させた反応溶液に、アクリロイルクロリド（６４８．０５ｍｇ、７．１６ｍｍｏｌ）を滴下した後、２５℃で２４時間激しく撹拌した。反応完了後、反応溶液内の有機溶媒を減圧蒸発させ、酢酸エチルで３回抽出して乾燥した後、アルミナクロマトグラフィーで精製した（収率：６４重量％、３７９ｍｇ）。
【００８０】
ステップ４は、氷浴（ｉｃｅ  ｂａｔｈ）の下で、化合物３（２００ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）の溶液（無水ＴＨＦ中、３ｍＬ）に４Ｍ  ＨＣｌジオキサン溶液３ｍＬを添加した後、２５℃で２４時間激しく攪拌した。反応完了後、反応溶液内の有機溶媒を減圧蒸発させ、酢酸エチルで３回抽出して乾燥した後、アルミナクロマトグラフィーで精製した（収率：２１重量％、２９．１１ｍｇ）。
【００８１】
出発物質である４−ニトロ−ｏ−フェニレンジアミン（４−ｎｉｔｒｏ−ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）は、一酸化窒素と反応するｏ−フェニレンジアミンの部分構造（ｍｏｉｅｔｙ）を含有している。グアニジン塩酸塩（ｇｕａｎｉｄｉｎｅ  ＨＣｌ）を触媒として使用して、４−ニトロ−ｏ−フェニレンジアミンのＣ−２のアミノ基を選択的にＢｏｃ保護した。次に、４−ニトロ−ｏ−フェニレンジアミンから４−ＮＯ2を４−ＮＨ2に還元させた。その次に、Ｃ−１及びＣ−４の２つのアミノ基をアクリロイルクロリドと結合させてラジカル重合が可能なビニル基を導入した。その後、塩酸を用いて、Ｃ−２のＢｏｃを除去した。このように合成された架橋剤は、１Ｈ−ＮＭＲを通じて構造を確認して、図２に示した。
【００８２】
［製造例２：一酸化窒素に感応するハイドロゲルの製造］
前記製造例１に従って製造された一酸化窒素−分解可能架橋剤０．０３１２ ５％（ｗ／ｖ）１０μＬと、アクリルアミドモノマー２０％（ｗ／ｖ）１０μＬ、開始剤として過硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ）１０％（ｗ／ｖ）１μＬ、触媒としてテトラメチルエチレンジアミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）５％（ｗ／ｖ）１μＬを使用して重合させた。このとき、重合は、２５℃で３分間重合した。重合された高分子は、ナノサイズのハイドロゲルに形成された。
【００８３】
［実施例１：前記製造例２に従って製造されたナノサイズのハイドロゲル］
【００８４】
［比較例１：前記製造例２において、一酸化窒素−分解可能架橋剤の代わりにＮ，Ｎ’−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｉｓ−ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（ＢＩＳ）を加えて重合して製造されたハイドロゲル］
【００８５】
［実験例１：一酸化窒素に感応するハイドロゲルのサイズ及び分布の確認］
ＴＥＭとＤＬＳを用いて、ハイドロゲルのサイズ及び分布を確認した。一酸化窒素−分解可能架橋剤と共に架橋されたハイドロゲルは、２０〜１００ｎｍの直径を有するナノサイズのハイドロゲルであることを確認し、また、実施例１のハイドロゲルに一酸化窒素を追加したとき、ハイドロゲルのサイズが大きくなることをＴＥＭとＤＬＳでそれぞれ確認した（図３及び図４参照）。一方、Ｎ，Ｎ’−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｉｓ−ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（ＢＩＳ）と共に架橋されたハイドロゲルである比較例１は、一酸化窒素を追加してもサイズの変化はなかったが、これは一酸化窒素に感応しないことを意味する。これにより、本発明に係る高分子は、一酸化窒素に感応性を有することを確認した。
【００８６】
［実験例２：一酸化窒素−分解可能架橋剤の一酸化窒素捕集能の確認］
前記製造例１に従って製造された一酸化窒素−分解可能架橋剤（ＮＯＣＣＬ）が、実際に一酸化窒素を捕集することができるか否かについて確認するために、グリース試薬（ｇｒｉｅｓｓ  ｒｅａｇｅｎｔ）を用い、１００μＭ及び１０μＭの一酸化窒素を処理してそれぞれの捕集能を確認した。このとき、比較群として、Ｎ，Ｎ’−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｉｓ−ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（ＢＩＳ）を用い、対照群として水を使用した。その結果を図５に示した。
【００８７】
図５に示すように、比較群に比べて一酸化窒素−分解可能架橋剤が３０％以上、一酸化窒素を捕集することを確認した。特に、一酸化窒素−分解可能架橋剤は、高濃度である１００μＭの一酸化窒素を処理しても５０％以上の捕集能を示した。これにより、本発明に係る高分子は、一酸化窒素を捕集することができる化学構造を含んでいることを確認した。
【００８８】
［実験例３：一酸化窒素に感応するハイドロゲルの溶血現象（Ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）の評価］
体内投与後、一酸化窒素に感応するハイドロゲルが体内安定性を有するか否かを確認するために、まずマウス（ｍｉｃｅ）から採取した血液から赤血球を分離した。用意された赤血球１×１０8個の細胞に１ｍｇ／ｍＬの実施例１、一酸化窒素−分解可能架橋剤（ＮＯＣＣＬ）及びアクリルアミドがそれぞれ含まれているＤＰＢＳ溶液を加えてよく混合した。この溶液を摂氏３７℃恒温槽で４時間放置した。その次に、遠心分離後、上澄み液を９６ウェルプレート（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に移した後、４５０ｎｍで吸光度を測定して溶血の程度を計算した。その結果を図６に示した。
【００８９】
図６に示すように、実施例１及び一酸化窒素−分解可能架橋剤は、溶血現象が起きない反面、アクリルアミドは９９％の溶血現象が起きた。これにより、本発明に係るアクリルアミド系高分子は、生体内で（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の安定性を有することを意味する。
【００９０】
［実験例４：一酸化窒素に感応するハイドロゲルを用いた関節リウマチの治療効果の確認］
まず、動物モデルを準備するために、試験動物は６〜７週齢のオスＤＢＡ／１Ｊ系マウスを使用した。２型コラーゲン（ＣII）を４ｍｇ／ｍｌになるように、０．１Ｎの酢酸溶液に溶かした後、透析緩衝液（ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．２Ｎ  ＮａＣ１）で透析して、Ｍ．ツベルクロシス（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含有する完全フロイントアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＣＦＡ、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ））と同量で混ぜた後、マウスの尾の基部に皮下注射して免疫原を１匹当たり１００μＬ（即ち、２００μｇ／１００μＬ）で注射した（１次注射）。それから２週間後、同一の２型コラーゲンを同量の不完全フロイントアジュバント（Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＩＦＡ、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ））と混ぜた後、１００μＬ（即ち、２００μｇ／１００μＬ）を片側の後肢及び前肢（足裏（ｆｏｏｔ  ｐａｄ））に注射した（２次注射）。２次注射後、７日間隔で計２回０．２５ｍｇ／ｋｇ  ３０μＬ（前肢）、５０μＬ（後肢）容量の実施例１、比較例１、緩衝溶液（Ｓａｌｉｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を、それぞれ異なるマウスの足裏に注射し、７日間隔で計２回０．００２５μｇ／ｋｇ  ３０μＬ（前肢）、５０μＬ（後肢）容量のデキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）を、それぞれ異なるマウスの足裏に注射した。その次に、最初の実施例１を投与した時点から、２週目及び５週目の時、マウスの後肢の足裏及び前肢の足裏を観察した（図７）。
【００９１】
各群は５匹ずつを対象に行い、関節リウマチの評価は５週目まで評価し、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）試験のために、関節炎指数が有意に差がある時期に、各動物を致死させて、血液、関節組織内での関節炎の病気の活性度を調べた。
【００９２】
図７に示すように、実施例１を注射投与時に、足裏の浮腫または発赤が生じなかった半面、比較例１または緩衝溶液を注射投与時には、激しい浮腫と発赤が生じた。一方、すでに関節リウマチの治療剤として知られているデキサメタゾンを注射投与した場合、２週目には足裏の浮腫または発赤がほとんど生じなかったが、５週目には軽い発赤が生じることを確認した。従って、実施例１が、デキサメタゾンよりも関節リウマチを治療または緩和させることにさらに優れた効果があることを確認した。
【００９３】
［実験例５：一酸化窒素に感応するハイドロゲルを用いた関節リウマチの治療効果の確認（２）］
前記実験例４のように用意されたコラーゲン誘導関節炎（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、ＣＩＡ）の動物モデルに、７日間隔で計２回０．２５ｍｇ／ｋｇ  ３０μＬ（前肢）、５０μＬ（後肢）容量の実施例１、比較例１、緩衝溶液（Ｓａｌｉｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を、それぞれ異なるマウスの足裏に注射し、７日間隔で計２回０．００２５μｇ／ｋｇ  ３０μＬ（前肢）、５０μＬ（後肢）容量のデキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）を、それぞれ異なるマウスの足裏に注射した。その次に、最初に投与した時点から、１週間に１回ずつ関節炎症の重症度を評価して、５週目まで観察した。その結果は図８に示した。このとき、関節炎の評価は、Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉｅｃなどによる平均関節炎指数に基づいて、１匹当たり四肢で下記の尺度に従って付けられた医学的スコア（Ｍｅｄｉｃａｌ  ｓｃｏｒｅ）を合計して５で割った平均値を得た。ここで、関節炎の評価による医学的スコアと基準は、次の通りである。
０点：浮腫や腫脹がない。
１点：足または足首の関節に限った軽い浮腫と発赤
２点：足首の関節から中足骨（ｍｅｔａｔａｒｓａｌ）にわたる軽い浮腫と発赤
３点：足首の関節から中足骨にわたる中等度の浮腫と発赤
４点：足首から足全体にわたる浮腫と発赤
【００９４】
１匹当たりの最高の関節炎指数は４点であるため、マウス１匹当たりの最高の疾病指数は１６である。
【００９５】
図８に示すように、実施例１を注射投与時、疾病指数が他の実験群に比べて最も低く、その反面、比較例１または緩衝溶液を注射投与時、疾病指数は時間がたつにつれてさらに高くなることを確認した。一方、すでに関節リウマチの治療剤として知られているデキサメタゾンを注射投与した場合、２週目までは実施例１と同様に、関節リウマチを緩和させることが確認されたが、２週目以降は効果が低下することを確認した。従って、実施例１がデキサメタゾンよりも関節リウマチを治療または緩和させることにさらに優れた効果があることを確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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