(57)【要約】  本発明は、神経幹細胞を用いた血管形成誘導方法に関し、本発明によるヒト脳組織に由来する神経幹細胞は、単球走化性タンパク質−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１； ＭＣＰ−１）またはＧｒｏを分泌することにより血管を形成する効果を有し、本発明の神経幹細胞にＣｏＣｌ２を注入する場合及び神経幹細胞をｈｙｐｏｘｉａ  ｃｈａｍｂｅｒに培養する場合にｈｙｐｏｘｉａ条件が誘導されてＭＣＰ−１及びＧｒｏの分泌量が増加することを確認したところ、本発明のヒト脳組織に由来する神経幹細胞を用いて血管形成を誘導できる。【選択図】図１ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）神経幹細胞を低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）の条件で培養する段階と、
（ｂ）前記培養された神経幹細胞を対象体に注入する段階と、
を含む、血管形成を誘導する方法。
【請求項２】
前記神経幹細胞は、ヒト脳組織から由来したことを特徴とする、請求項１に記載の血管形成を誘導する方法。
【請求項３】
前記（ａ）段階は、神経幹細胞に塩化コバルト（ＩＩ）（Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＣｏＣｌ２）を処理する段階または神経幹細胞を低酸素チャンバー（ｈｙｐｏｘｉａ  ｃｈａｍｂｅｒ）で培養する段階を含むことを特徴とする、請求項１に記載の血管形成を誘導する方法。
【請求項４】
前記（ｂ）段階は、血管内皮細胞を前記神経幹細胞とともに対象体に注入することを特徴とする、請求項１に記載の血管形成を誘導する方法。
【請求項５】
前記培養された神経幹細胞は、単球走化性タンパク質−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１；ＭＣＰ−１）または成長関連がん遺伝子（ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ；Ｇｒｏ）を分泌することを特徴とする、請求項１に記載の血管形成を誘導する方法。
【請求項６】
前記神経幹細胞を低酸素チャンバー（ｈｙｐｏｘｉａ  ｃｈａｍｂｅｒ）で培養する段階は、１２〜７２時間の間行われることを特徴とする、請求項３に記載の血管形成を誘導する方法。
【請求項７】
前記ＣｏＣｌ２は、１００〜５００ｕＭの濃度で処理することを特徴とする、請求項３に記載の血管形成を誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経幹細胞を用いた血管形成誘導方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）は、自己増殖が可能であり、様々な細胞に分化可能である。幹細胞の起源は、胚や胎児から由来することができ、成体の組織においても幹細胞が存在し、外部的損傷時に組織を再生することが知られている。成体幹細胞としては、中間葉幹細胞がよく知られており、世界的に臨床研究で最も進んでいる。
【０００３】
神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）は、自己増殖が可能であり、神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）、星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、希突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）に分化可能であるため、神経系疾患（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）の治療において重要な意味を持つ幹細胞である。げっ歯類であるマウスで初めて明らかになり、脳の特定部位に存在することが知られてきた。その後、ヒトの脳にも神経幹細胞が存在することが知られ、胎児の脳組織を使用して大量培養が可能な神経幹細胞が臨床試験に使用されてきた。近年、成人脳組織にも神経幹細胞が存在すると報告されており、球培養（ｓｐｈｅｒｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ）方法ではなく、接着培養（ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｃｕｌｔｕｒｅ）方法を用いて大量培養が可能であることが知られている。
【０００４】
血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、新たな血管の成長であって、主に毛細血管内皮細胞による移動、増殖及び管形成に依存する過程である。血管形成は、傷の治癒においてがんを包括する生理学的及び病理学的状態で血管を形成しうる。血管形成の調節は、部位及び刺激依存的であり、それぞれの場合に調節分子の固有の組み合わせを伴うことができる。血管形成の間に内皮細胞は、自身の静止期状態から抜け出して急速に増殖する。
【０００５】
一方、マトリゲルは、ＥＨＳ（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ）マウスの肉腫細胞から抽出されたタンパク質複合体であって（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社の製品名）、ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）のような細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）と繊維芽細胞成長因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓt  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）、上皮細胞成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＥＦＧ）、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＩＧＦ）、形質転換成長因子−ベータ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ、ＴＧＦ−β）、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）のような成長因子を含有する。マトリゲルをなしている複合体は、多くの組織で発見される複雑な細胞外環境を提供することにより、細胞培養のための基質として用いられている。
【０００６】
マトリゲルは、虚血性動物モデル（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ）から移植された心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｃｅｌｌ）と内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）の生存を強化するために使用されたことがあり、胚性幹細胞は、自己再生能（ｓｅｌｆｒｅｎｅｗａｂｉｌｉｔｙ）と多分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）があるため、マウスとヒトの胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、ＥＳＣ）を体外培養するときにマトリゲルが使用されてきた。
【０００７】
そこで、本発明者らは、近年、様々な機能を有しており、医薬品及び化粧料等の商業的利用価値が上昇している幹細胞の中でも、ヒト脳組織から由来した神経幹細胞がＭＣＰ−１及びＧｒｏを分泌して血管形成効果を有することをマトリゲルを用いた実験で確認し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、従来の神経幹細胞の機能として知られている神経細胞への分化以外の機能について研究した結果、ヒト脳組織から由来した神経幹細胞がＭＣＰ−１及びＧｒｏを分泌することにより、血管形成効果を有することを確認したところ、これに基づいて本発明を完成した。
【０００９】
そこで、本発明の目的は、（ａ）神経幹細胞を低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）の条件で培養する段階と、
（ｂ）前記培養された神経幹細胞を対象体に注入する段階と、
を含む、血管形成を誘導する方法を提供するものである。
【００１０】
しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていないもう一つの課題は、下記の記載から本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者に明確に理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記ような目的を達成するため、本発明は、（ａ）神経幹細胞を低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）の条件で培養する段階と、
（ｂ）前記培養された神経幹細胞を対象体に注入する段階と、
を含む、血管形成を誘導する方法を提供する。
【００１２】
本発明の一具現例として、前記神経幹細胞は、ヒト脳組織から由来したものであってもよい。
【００１３】
本発明の他の具現例として、前記（ａ）段階は、神経幹細胞に塩化コバルト（ＩＩ）（Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＣｏＣｌ２）を処理する段階または神経幹細胞を低酸素チャンバー（ｈｙｐｏｘｉａ  ｃｈａｍｂｅｒ）で培養する段階を含んでもよい。
【００１４】
本発明のさらに他の具現例として、前記（ｂ）段階は、血管内皮細胞を前記神経幹細胞とともに対象体に注入するものであってもよい。
【００１５】
本発明のさらに他の具現例として、前記培養された神経幹細胞は、単球走化性タンパク質−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１；ＭＣＰ−１）または成長関連がん遺伝子（ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ；Ｇｒｏ）を分泌しうる。
【００１６】
本発明のさらに他の具現例として、前記神経幹細胞を低酸素チャンバー（ｈｙｐｏｘｉａ  ｃｈａｍｂｅｒ）で培養する段階は、１２〜７２時間の間行われてもよい。
【００１７】
本発明のさらに他の具現例として、前記ＣｏＣｌ２は、濃度が１００〜５００ｕＭであってもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によるヒト脳組織から由来した神経幹細胞は、単球走化性タンパク質−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１；ＭＣＰ−１）または成長関連がん遺伝子（Ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ；Ｇｒｏ）を分泌することにより、血管を形成する効果を有し、本発明の神経幹細胞にＣｏＣｌ２を注入する場合及び神経幹細胞をｈｙｐｏｘｉａ  ｃｈａｍｂｅｒで培養する場合、ｈｙｐｏｘｉａ条件が誘導されてＭＣＰ−１及びＧｒｏの分泌量が増加することを確認したところ、本発明のヒト脳組織由来の神経幹細胞を用いて血管形成を誘導できるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１ａ〜１ｃは、本発明の一具現例によるマトリゲルプラグアッセイによる神経幹細胞の新生血管形成効果を確認したもので、図１ａは、マトリゲルプラグアッセイ実験の概要を示す図であり、図１ｂは、神経幹細胞及び血管内皮細胞を混合して、移植後３日目に新生血管形成の有無を赤血球細胞の浸透による色分けにより示した図であり、図１ｃは、マトリゲルプラグをＨ＆Ｅ染色で確認した結果を示した図である。
【図２】図２ａ及び２ｂは、本発明の一具現例によるサイトカインアレイ（図２ａ）及びＥＬＩＳＡ方法（図２ｂ）を用いた神経幹細胞の血管形成有効性因子の定性及び定量分析結果を示した図である。
【図３】図３は、本発明の一具現例によるＭＣＰ−１及びＧｒｏ抑制抗体による新生血管形成抑制効果を確認して示した図である。
【図４】図４は、本発明の一具現例による神経幹細胞において、ＣｏＣｌ２処理によるＨｙｐｏｘｉａ条件によって分泌される新生血管再生効果に関連したＭＣＰ−１及びＧｒｏの発現が増加する信号伝達体系を示した図である。
【図５】図５は、ＣｏＣｌ２を濃度別に処理してＨｙｐｏｘｉａ条件を誘導した後、神経幹細胞から分泌されるＭＣＰ−１とＧｒｏαの発現を確認する実験計画を示した図である。
【図６】図６ａは、ＣｏＣｌ２を濃度別に処理した後、ＭＣＰ−１の濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した結果を示した図である。図６ｂは、ＣｏＣｌ２を濃度別に処理した後、Ｇｒｏαの濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した結果を示した図である。
【図７】図７は、神経幹細胞をＨｙｐｏｘｉａ  ｃｈａｍｂｅｒで培養してＨｙｐｏｘｉａ条件を誘導した後、神経幹細胞から分泌されるＭＣＰ−１とＧｒｏαの発現を確認する実験計画を示した図である。
【図８】図８は、神経幹細胞をＨｙｐｏｘｉａ  ｃｈａｍｂｅｒで培養した後、時間ごとのＭＣＰ−１及びＧｒｏαの濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した結果を示した図である。
【発明を行うための最良の形態】
【００２０】
本発明は、（ａ）神経幹細胞を低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）の条件で培養する段階と、
（ｂ）前記培養された神経幹細胞を対象体に注入する段階と、
を含む、血管形成を誘導する方法を提供する。
【００２１】
本発明の前記神経幹細胞は、ヒト脳組織から由来したものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００２２】
本発明において、前記対象体は、血管形成誘導を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒトまたは非−ヒトである霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、イヌ、ネコ、ウマ、及びウシなどの哺乳類を意味する。
【００２３】
本発明において、前記低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）の条件は、酸素分圧が１％〜５％である細胞培養条件であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００２４】
本発明において、前記（ａ）段階は、神経幹細胞に塩化コバルト（ＩＩ）（Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＣｏＣｌ２）を処理する段階または神経幹細胞を低酸素チャンバー（ｈｙｐｏｘｉａ  ｃｈａｍｂｅｒ）で培養する段階を含んでもよいが、これに制限されるものではない。
【００２５】
本発明において、前記（ｂ）段階は、血管内皮細胞を前記神経幹細胞とともに対象体に注入するものであってもよい。
【００２６】
本発明において、前記神経幹細胞を低酸素チャンバー（ｈｙｐｏｘｉａ  ｃｈａｍｂｅｒ）で培養する場合、ｈｙｐｏｘｉａ条件が誘導されてＭＣＰ−１及びＧｒｏの分泌量が増加することができ、前記培養は、１２〜７２時間の間行われてもよく、本発明の具体的な実施例によれば、４８〜７２時間の間培養するときにＭＣＰ−１及びＧｒｏαの発現量が高いので、好ましいが、前記培養時間に制限されるものではない。
【００２７】
また、前記培養された神経幹細胞は、単球走化性タンパク質−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１； ＭＣＰ−１）または成長関連がん遺伝子（ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ；Ｇｒｏ）を分泌して血管を形成できるが、これに制限されるものではない。
【００２８】
このとき、前記「単球走化性タンパク質−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１；ＭＣＰ−１）」は、単球や血管内皮、神経膠腫細胞株などを生産する単球走化性因子であって、ケモカインのβ亜科に属するタンパク質である。ＭＣＰ−１は、単核細胞に対して強力な走化性効果を有し、Ｔリンパ球、肥満細胞及び号塩基性白血球に対しても効果を示す。ＭＣＰ−１は、様々な形態の細胞によって作られ、（白血球、血小板、繊維芽細胞、内皮細胞及び平滑筋細胞）、単核細胞及び大食細胞に対して最も高い特異性を示し、走化性因子だけでなく活性化刺激を構成し、その結果、多数の炎症性因子（超過酸化物、アラキドン酸及び誘導体、サイトカイン／ケモカイン）を作る過程を誘導し、食細胞の作用を増幅させる。
【００２９】
また、前記「成長関連がん遺伝子（ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ；Ｇｒｏ）」は、ＭＧＳＡ（ｍｅｌａｎｏｍａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）ともいい、ＧＲＯα（ＭＧＳＡα、ＣＸＣＬ１）とＧＲＯβ（ＭＧＳＡβ、ＣＸＣＬ２）とＧＲＯγ（ＭＧＳＡγ、ＣＸＣＬ３）の３種類が存在し、ＣＸＣケモカインに属する。最初の２つのシステイン残基がＣＸＣ構造であり、また、ＥＬＲ（グルタミン酸−ロイシン−アルギニン）モチーフを備える。
【００３０】
前記神経幹細胞にＣｏＣｌ２を注入する場合、ｈｙｐｏｘｉａ条件が誘導されてＭＣＰ−１及びＧｒｏの分泌量が増加することができ、このとき、ＣｏＣｌ２は、濃度が１００〜５００ｕＭであってもよく、本発明の具体的な実施例によれば、前記神経幹細胞にＣｏＣｌ２を５００ｕＭの濃度で処理し、２４時間培養、または１００ｕＭの濃度で処理し、２４時間培養して培地を交換した後、再び２４時間培養する場合、ＭＣＰ−１及びＧｒｏの分泌量が高いので、好ましいが、前記濃度に制限されるものではない。
【００３１】
本発明の一実施例では、マトリゲルプラグアッセイ及びＨ＆Ｅ染色を用いた組織学的分析により、神経幹細胞の血管形成誘導効果を確認した（実施例１〜２参照）。
【００３２】
本発明の他の実施例では、サイトカインアレイ及びＥＬＩＳＡを用いて神経幹細胞から分泌されるＭＣＰ−１及びＧｒｏの量を確認した（実施例３参照）。
【００３３】
本発明のさらに他の実施例では、ＭＣＰ−１及びＧｒｏそれぞれの中和抗体（ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いて、ＭＣＰ−１及びＧｒｏの血管形成効果を確認した（実施例４参照）。
【００３４】
本発明のさらに他の実施例では、神経幹細胞でＣｏＣｌ２の濃度別処理によるＭＣＰ−１及びＧｒｏαの発現量を確認した（実施例５参照）。
【００３５】
本発明のさらに他の実施例では、神経幹細胞をｈｙｐｏｘｉａ  ｃｈａｍｂｅｒで培養した後、ＭＣＰ−１及びＧｒｏαの発現量を確認した（実施例６参照）。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下、本発明の理解を助けるために、好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、下記の実施例により、本発明の内容が限定されるものではない。
【００３７】
実施例１．マトリゲルプラグアッセイ（Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｐｌｕｇ  ａｓｓａｙ）
血管形成能力を検証するため、実験群をマトリゲル単独群、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）単独群、成人多能性神経細胞（ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌ、ａｈＭＮＣ）単独群、胎児神経幹細胞（ｆｅｔａｌ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、ｆＮＳＣ）とＨＵＶＥＣ混合群、及びａｈＭＮＣとＨＵＶＥＣ混合群から構成して実験した。
【００３８】
検証しようとする細胞（ａｈＭＮＣ及び陰性対照群であるｆＮＳＣ）とヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を１：１の割合で総２Ｘ１０６細胞になるようにして２００ｕＬのマトリゲルと混合した後、注射器で免疫不全マウスの皮下に移植した。移植後３日目に移植されたマトリゲルを分離して、血管形成の有無を赤血球細胞の浸透による色で分別した。その結果、図１ｂに示すように、ａｈＭＮＣとＨＵＶＥＣ混合群において赤色であることが示された。
【００３９】
したがって、前記結果から神経幹細胞と血管内皮細胞をともに移植したとき、血管が形成されることが分かった。
【００４０】
実施例２．組織学的分析
前記実施例１のマトリゲルプラグを４％ＰＦＡで固定した後、ブロックを作製した。Ｈ＆Ｅ染色のために５ｕｍの厚さで組織切片を作製した後、スライドに載せてジパラピン過程を経た後、Ｈ＆Ｅ染色を行った。
【００４１】
その結果、図１ｃに示すように、ａｈＭＮＣとＨＵＶＥＣ混合群で血管が形成されることを確認した。
【００４２】
したがって、前記結果から神経幹細胞と血管内皮細胞をともに移植したとき、血管が形成されることが分かった。
【００４３】
実施例３．サイトカインアレイ（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｒｒａｙ）及びＥＬＩＳＡを用いたＭＣＰ−１及びＧｒｏの定量
神経幹細胞の新生血管形成効果を確認するため、神経幹細胞から分泌される成長因子やサイトカインを定性及び定量的に分析した。
【００４４】
互いに異なる３つの神経幹細胞ＮＳ１４−００１ＴＬ、ＮＳ１４−００８ＴＬ、ＮＳ１４−０１５ＴＬを１００ｍｍ  ｄｉｓｈに接種した後に３〜４日培養し、培養皿に７０％程度満たされるようにｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙで満たして培養した後、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で２回洗浄後、培養液をＤＭＥＭ／Ｆ１２に変えて２４時間培養した。その後に上澄み液（条件培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ））を回収した。サイトカインアレイは、Ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｒｒａｙ（ＲａｙＢｉｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙ  Ｃ  Ｓｅｒｉｅｓ１０００、Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）を使用して行った。
【００４５】
その結果、図２ａに示すように、ＭＣＰ−１、Ｇｒｏ、ＩＬ−８などの様々な成長因子またはサイトカインが分泌されることが確認できた。
【００４６】
また、サイトカインアレイで発掘されたＭＣＰ−１とＧｒｏの定量のため、前記サイトカインアレイで互いに異なる３つの神経幹細胞ＮＳ１４−００１ＴＬ、ＮＳ１４−００８ＴＬ、ＮＳ１４−０１５ＴＬを培養して回収した条件培地を用いて、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔｓ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）でＥＬＩＳＡ分析を行った。
【００４７】
その結果、図２ｂに示すように、対照群であるｆｈＮＳＣに比べて、前記三つの神経幹細胞は、全てＭＣＰ−１及びＧｒｏαの発現が増加した。
【００４８】
実施例４．ＭＣＰ−１及びＧｒｏの血管形成効果確認
ＭＣＰ−１とＧｒｏの血管形成効果を確認するため、それぞれに対する中和抗体（ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）をマトリゲルと混合して移植して血管形成抑制を確認した。
【００４９】
その結果、図３に示すように、ＭＣＰ−１及びＧｒｏの機能を妨げる抗体をマトリゲルプラクにともに移植する場合、血管形成が殆ど行われなかった。したがって、ＭＣＰ−１とＧｒｏの機能を妨げる抗体をともに混合する場合、シナジーの血管形成抑制効果が現れることを確認した。
【００５０】
実施例５．神経幹細胞におけるＣｏＣｌ２処理によるＭＣＰ−１及びＧｒｏの発現量確認
図４に示すように、Ｈｙｐｏｘｉａ条件を反映するため、ＣｏＣｌ２を１００、２００、３００、４００、５００ｕＭで濃度別に処理し、細胞内のＨＩＦ−１ａｌｐｈａの安定化により転写因子として機能させて信号伝達下位段階にあるＭＣＰ−１及びＧｒｏの発現が増加するようにした。
【００５１】
５−１．神経幹細胞へのＣｏＣｌ２処理
ヒトの成体神経幹細胞を１００ｍｍ培養皿に培養した後、２〜３日後に７０〜８０％程度のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙに到達させた。以後、Ｈｙｐｏｘｉａ条件を反映するため、ＣｏＣｌ２を１００、２００、３００、４００、５００ｕＭで濃度別に処理した後、２４時間後に条件培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）を回収し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２のみに交換した後、再び２４時間後に条件培地を回収して分析を行った。前記過程は、図５に図式化して示した。
【００５２】
５−２．ＥＬＩＳＡを用いたＭＣＰ−１とＧｒｏαの定量
前記実施例５−１で回収した上澄み液においてＭＣＰ−１及びＧｒｏαの定量のためにＱｕａｎｔｉｋｉｎe  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＥＬＩＳＡ分析を行った。
【００５３】
その結果、図６ａに示すように、ＣｏＣｌ２処理してから２４時間後のＭＣＰ−１の量は、処理したＣｏＣｌ２の濃度に比例して増加したが、その後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に培地を変えた後、再び２４時間が経過した後には、１００ｕＭのＣｏＣｌ２を処理したときにＭｃｐ−１の発現量が最も高く、ＣｏＣｌ２の濃度が３００ｕＭ以上のときは、１００、２００ｕＭで処理したときよりもＭＣＰ−１の量が減少することが確認できた。
【００５４】
また、図６ｂに示すように、ＣｏＣｌ２処理してから２４時間後のＧｒｏαの量は、処理したＣｏＣｌ２の濃度が３００ｕＭ以上のとき、濃度に比例して増加して５００ｕＭのときに最も高かったが、その後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に培地を変えた後、再び２４時間が経過した後には、Ｇｒｏαの量が１００ｕＭのＣｏＣｌ２濃度で最も高く、ＣｏＣｌ２の濃度が２００ｕＭ以上のときには、１００ｕＭで処理したときよりもＧｒｏαの量が減少することが確認できた。
【００５５】
実施例６．ｈｙｐｏｘｉａ  ｃｈａｍｂｅｒに培養した神経幹細胞においてＭＣＰ−１及びＧｒｏαの発現量確認
６−１．ｈｙｐｏｘｉａ  ｃｈａｍｂｅｒにおける神経幹細胞培養
神経幹細胞のｈｙｐｏｘｉａ条件を誘導するため、ｈｙｐｏｘｉａ  ｃｈａｍｂｅｒに１２、２４、４８、７２時間の間神経幹細胞を培養した後に条件培地を回収し、分泌されるＭＣＰ−１及びＧｒｏαの量を測定した。
【００５６】
具体的には、ヒトの成体神経幹細胞を１００ｍｍの培養皿で培養した後、２〜３日後に７０〜８０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙに到達させた。以後、新しい培養液に交換した後、ｈｙｐｏｘｉａ  ｃｈａｍｂｅｒで１２、２４、４８、７２時間の間培養した後、条件培地を回収してＥＬＩＳＡ分析方法を行った。前記過程は、図７に図式化して示した。
【００５７】
６−２．ＥＬＩＳＡを用いたＭＣＰ−１とＧｒｏαの定量
前記実施例６−１で回収した上澄み液においてＭＣＰ−１及びＧｒｏαの定量のためにＱｕａｎｔｉｋｉｎe  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＥＬＩＳＡ分析を行った。
【００５８】
その結果、図８に示すように、培養時間が経つにつれてＭＣＰ−１の発現量は増加したが、Ｇｒｏαの発現量は、対照群に比べて増加し、ほぼ一定に維持されることを確認した。
【００５９】
前述の本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることを理解できるであろう。したがって、以上で記述した実施例は、全ての面で例示的なものであり、限定的ではないと理解しなければならない。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の神経幹細胞にＣｏＣｌ２を注入する場合、及び神経幹細胞をｈｙｐｏｘｉａ  ｃｈａｍｂｅｒで培養する場合、ｈｙｐｏｘｉａ条件が誘導されてＭＣＰ−１及びＧｒｏの分泌量が増加することを確認したところ、本発明によるヒト脳組織由来神経幹細胞をｈｙｐｏｘｉａ条件下で培養して血管形成を誘導するのに利用でき、前記神経幹細胞から分泌されるタンパク質または酵素は、条件培地精製、エクソソーム開発などのような新生血管形成に関連した開発に利用できる。また、本発明の神経幹細胞は、退行性神経系疾患において血管形成が回復機序として知られている脳卒中、脊髄損傷、アルツハイマー病などの疾患に対して神経幹細胞治療剤として利用できるだけでなく、退行性神経系疾患以外にも血管形成が回復機序として知られている様々な疾患に対する神経幹細胞治療剤及び副産物を活用した治療剤の開発などに利用できることが期待される。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年11月12日(2020.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）神経幹細胞を低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）の条件で培養する段階と、
（ｂ）前記培養された神経幹細胞を対象体に注入する段階と、
を含む、血管形成を誘導する方法。
【請求項２】
前記神経幹細胞は、ヒト脳組織から由来したことを特徴とする、請求項１に記載の血管形成を誘導する方法。
【請求項３】
前記（ａ）段階は、神経幹細胞に塩化コバルト（ＩＩ）（Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＣｏＣｌ２）を処理する段階または神経幹細胞を低酸素チャンバー（ｈｙｐｏｘｉａ  ｃｈａｍｂｅｒ）で培養する段階を含むことを特徴とする、請求項１に記載の血管形成を誘導する方法。
【請求項４】
前記（ｂ）段階は、血管内皮細胞を前記神経幹細胞とともに対象体に注入することを特徴とする、請求項１に記載の血管形成を誘導する方法。
【請求項５】
前記培養された神経幹細胞は、単球走化性タンパク質−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１；ＭＣＰ−１）または成長関連がん遺伝子（ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ；Ｇｒｏ）を分泌することを特徴とする、請求項１に記載の血管形成を誘導する方法。
【請求項６】
前記神経幹細胞を低酸素チャンバー（ｈｙｐｏｘｉａ  ｃｈａｍｂｅｒ）で培養する段階は、１２〜７２時間の間行われることを特徴とする、請求項３に記載の血管形成を誘導する方法。
【請求項７】
前記ＣｏＣｌ２は、１００〜５００ｕＭの濃度で処理することを特徴とする、請求項３に記載の血管形成を誘導する方法。
【請求項８】
低酸素の条件で培養された神経幹細胞を有効成分として含有する、血管形成を誘導するための組成物。
【請求項９】
前記神経幹細胞は、ヒトの脳組織から由来したことを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記低酸素の条件は、神経幹細胞に塩化コバルト（ＩＩ）（ＣｏＣｌ２）を処理すること、または、神経幹細胞を低酸素チャンバーで培養することを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
さらに血管内皮細胞を含有することを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
前記培養された神経幹細胞は、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）または成長関連がん遺伝子（Ｇｒｏ）を分泌することを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
前記神経幹細胞を低酸素チャンバーで培養することは、１２〜７２時間の間行われることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＣｏＣｌ２は、１００〜５００ｕＭの濃度で処理することを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【国際調査報告】
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