(57)【要約】本発明は、架橋ヒアルロン酸を合成する新しい方法、架橋ヒアルロン酸組成物、前記組成物を単独含むかまたはＰＲＰ／ＢＭＣと組み合わせて含むチューブおよび注射器、ＰＲＰ／ ＢＭＣ調製のための新しいデバイス、ならびに当該デバイスの、細胞培養、スキンケアおよび関節の保護における使用を提供する。本発明は、特に、少なくとも１つの第１のポリマー（好ましくはヒアルロン酸）から架橋ゲル（好ましくは所望の分子量および／または濃度を有する）を製造するための方法を提供し、当該方法は、以下のステップを含む。viii)   前記第１のポリマーを均質化する、ix)  塩基性溶液中で前記第１のポリマーを水和する、x)    室温よりも高い温度で少なくとも1つの架橋剤を添加することにより、前記塩基性溶液を架橋する、xi)  酸性溶液中で前記塩基性溶液を中和する、xii) 前記溶液を均質化する、xiii)   前記溶液を、補足量の第２のポリマー（好ましくは、前記第１のポリマーと実質的に同じ分子量および／または濃度である第２のポリマー）と混合する、xiv) 前記溶液を精製する。
2021515088.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの第１のポリマー（好ましくはヒアルロン酸）から架橋ゲル（好ましくは所望の分子量および／または濃度を有する）を製造するための方法であって、以下のステップを含む方法。
i)    前記第１のポリマーを均質化する、
ii)   塩基性溶液中で前記第１のポリマーを水和する、
iii)   室温よりも高い温度で少なくとも1つの架橋剤を添加することにより、前記塩基性溶液を架橋する、
iv)  酸性溶液中で前記塩基性溶液を中和する、
v)   前記溶液を均質化する、
vi)  前記溶液を、補足量の第２のポリマー（好ましくは、前記第１のポリマーと実質的に同じ分子量および／または濃度である第２のポリマー）と混合する、
vii) 前記溶液を精製する。
【請求項２】
前記ステップが、連続した一連のプロセスにおいて、中断することなく実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が単一の反応容器内で実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記容器がアンカー攪拌容器である、前記請求項に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が連続気流中で行われる、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項６】
前記第１および／または第２のポリマーが、少なくとも部分的に非架橋であるか、または完全に非架橋である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリマーが繊維、粉末または結晶の形態である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記架橋ゲルが生体適合性ゲルおよび／または均質な二相性ゲルである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記架橋ゲルが均質な二相性ゲルである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記均質化が、所定量の前記ポリマーを用いて行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記均質化が、室温よりも低い温度で、または室温で行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリマー均質化が溶媒を用いて行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリマー均質化が、撹拌しながら行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリマーを溶媒で均質化することが、ポリマーの攪拌下で行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記水和が塩基性溶液中で行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記塩基性溶液がリン酸緩衝液を含むか、またはリン酸緩衝液からなる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記塩基性溶液のｐＨが１０以上である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記水和ステップの後に、または同時に、温度を３０℃〜７０℃、４０℃〜６０℃、４５℃〜５５℃、または約５０℃に上昇させる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記架橋剤が過剰である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記架橋が攪拌下で行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記架橋が、室温よりも高い温度で行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記温度が、一定の期間において、３０℃〜７０℃、４０℃〜６０℃、４５℃〜５５℃の間であるか、または約５０℃である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記期間が、１０分から２４時間、２０分から１２時間、３０分から６時間、１時間から３時間、１．５時間から２．５時間、または約２時間である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記中和が、前記酸性溶液を徐々に添加することによって行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記中和が攪拌しながら行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記酸性溶液が緩衝溶液である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記酸性溶液の体積／量は、前記塩基性溶液の一定の式を有する関数である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記酸性溶液の体積／量により、架橋ゲルの最終濃度が１．５％、２％、２．５％、０．５〜１０％、１％〜５％、１．５〜２．５％の範囲となる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記中和ステップ後、または中和ステップと同時に、温度が０℃〜１０℃、２℃〜６℃、３℃〜５℃、または約４℃に低下する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記中和が、室温よりも低い温度または室温で行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記温度が、一定の期間において、０℃〜２０℃、１℃〜１０℃、２℃〜６℃、３℃〜５℃、または約４℃である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記期間が、１０分から２４時間、２０分から１２時間、３０分から６時間、１時間から３時間、１．５時間から２．５時間、または約２時間である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記中和が攪拌しながら行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記溶液の均質化が、一定の期間において、０℃〜１０℃、２℃〜６℃、３℃〜５℃の間の温度で、または約４℃で行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記期間が１時間から２４時間、４時間から２０時間、６時間から１８時間、８時間から１６時間、１０時間から１４時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、または約訳１３時間である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記溶液の均質化がｐＨ中性で行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記溶液と補足量の第２のポリマーとの混合が、撹拌しながら行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記架橋ゲルを濾過するステップをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記架橋ゲルを収集するステップをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記ろ過が、２２０〜２８０μｍメッシュを有するフィルタを用いて実施される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記架橋ゲルを滅菌することをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記滅菌が蒸気によって行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
架橋を停止するステップが、透析によって実施されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリマーが自然由来であることを特徴とする、前記請求項に記載の方法。
【請求項４５】
前記自然由来のポリマーが、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、セルロースおよびその誘導体、アルギネート、キサンタン、カラゲニン、タンパク質または核酸から選ばれる化合物であることを特徴とする、前記請求項に記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも１つの自然由来のポリマーが、人体に自然に存在しないポリマーであり、セルロースおよびその誘導体、アルギネート、キサンタン、カラゲニン、少なくとも１つの人体に自然に存在するポリマーと架橋するポリマーから選ばれ、前記少なくとも１つの人体に自然に存在するポリマーは、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、タンパク質または核酸から選ばれることを特徴とする、前記請求項に記載の方法。
【請求項４７】
前記架橋剤が、エポキシ化合物、エピハロヒドリンおよびジビニルスルホンから選択される少なくとも１つの二官能性または多官能性分子または架橋剤であることを特徴とする、前記請求項に記載の方法。
【請求項４８】
前記多官能性架橋剤が、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）及びジエポキシオクタンから独立して選ばれる、前記請求項に記載の方法。
【請求項４９】
前記多官能性架橋剤が、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）である、前記請求項に記載の方法。
【請求項５０】
前述の請求項のいずれかに記載の方法によって調製されたゲル。
【請求項５１】
少なくとも１つの分散された活性成分を含むゲルを構成することを特徴とする、前述の請求項に記載のゲル。
【請求項５２】
前述の請求項のいずれかに記載の方法によって得られた架橋ヒアルロン酸。
【請求項５３】
生体組織を分離、置換または充填するため、または前記組織の体積を増加させるため、または生体体液を補充または置換するための、請求項５０から５２のいずれかに記載のゲルの使用。
【請求項５４】
架橋ヒアルロン酸であって、動粘度が約１Ｐａ．ｓ〜約５．２Ｐａ．ｓ、または＜＝６Ｐａ．ｓ．、＜＝５．５Ｐａ．ｓ．、＜＝５．２Ｐａ．ｓ．＜＝５Ｐａ．ｓ．、＜＝４．５Ｐａ．ｓ．、または＜＝４Ｐａ．ｓ．である、架橋ヒアルロン酸。
【請求項５５】
弾性が＜＝１００Ｐａ．ｓ、＜＝７０Ｐａ．ｓ、＜＝６０Ｐａ．ｓ、＜＝５０Ｐａ．ｓ、＜＝４０Ｐａ．ｓ、＜＝３０Ｐａ．ｓ、＜＝２０Ｐａ．ｓまたは＜＝１０Ｐａ．ｓ．である、前記請求項に記載の架橋ヒアルロン酸。  
【請求項５６】
１００ＫＤａから６０００ＫＤａ、５００ＫＤａから２０００ＫＤａの間、または約１３００ＫＤａ、約１４００ＫＤａ、約１５００ＫＤａ、約１６００ＫＤａまたは約１７００ＫＤａの分子量を有する、前記請求項のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸。
【請求項５７】
濃度が、約０．５％から約１０％、約１％から約２．５％、約１．５％または約２％であるの、前述の請求項のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸。
【請求項５８】
約０．５％から約１０％、約１％から約５％、約２％から約４％、約２．５％、、約３％または約３．５％の架橋度を有する、前記請求項のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸。
【請求項５９】
ＢＢＤＥ含有量が＜＝２．５ｐｐｍ、＜＝２ｐｐｍ、＜＝１５ｐｐｍ、または＜＝１ｐｐｍである、前述の請求項のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸。
【請求項６０】
密度が、チキソトロピーゲルの密度よりも低い、前述の請求項のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸。
【請求項６１】
動粘度＜＝５．２Ｐａ．ｓであり、分子量が約１５００ＫＤａである、前述の請求項のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸。
【請求項６２】
動粘度＜＝５．２Ｐａ．ｓであり、濃度が約２％である、前述の請求項のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸。
【請求項６３】
動粘度＜＝５．２Ｐａ．ｓ．であり、分子量が約１５００ＫＤａであり、濃度が約２％であり、架橋度が約３％である、前述の請求項のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸。  。
【請求項６４】
弾性＜＝６０Ｐａ．ｓであり、注射器中で使用される、前述の請求項のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸。
【請求項６５】
血小板濃縮物、多血小板血漿、骨髄濃縮物および／または生体材料と組み合わせた、前述の請求項のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸。
【請求項６６】
前述の請求項のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸を含む容器。
【請求項６７】
前記容器がチューブまたは注射器である、前述の請求項のいずれかに記載の容器。
【請求項６８】
少なくとも１つの抗凝固剤および／または少なくとも１つのチキソトロピーゲルをさらに含む、前述の請求項のいずれかに記載の容器。
【請求項６９】
i)    ２５℃における粘度が１００〜２５０Ｐａ．ｓであること、および
ii)   密度が、約１．０３から約１．０５ｇ／ｃｍ３、約１．０８から約１．０９ｇ／ｃｍ３または約１．０７５から約１．０８ｇ／ｃｍ３から選択されること
を特徴とするチキソトロピーゲルを、唯一の添加剤として含む容器。
【請求項７０】
前記チキソトロピーゲルが、ポリオレフィン系オリゴマー、アクリル樹脂混合物、ＰＥＧ−シリカゲル、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、前述の請求項のいずれかに記載の容器。
【請求項７１】
トロンビン血清の調製のための請求項６９または請求項７０に記載の容器の使用。
【請求項７２】
抗凝固剤を添加剤としてさらに含み、前記チキソトロピーゲルの密度が約１．０３〜約１．０５ｇ／ｃｍ３から選択される、前述の請求項のいずれかに記載の容器。
【請求項７３】
抗凝固剤を添加剤としてさらに含み、前記チキソトロピーゲルの密度が約１．０８〜約１．０９ｇ／ｃｍ３から選択される、前述の請求項のいずれかに記載の容器。
【請求項７４】
前記容器が、前記チキソトロピーゲルおよび前記抗凝固剤からなる２つの添加剤のみを含み、前記チキソトロピーゲルが、前記容器の遠位端からの第１層であり、その後に抗凝固剤からなる第２層が続く、請求項７２または７３に記載の容器。
【請求項７５】
血小板濃縮物（ＰＣ）または骨髄濃縮物（ＢＭＣ）の調製のための、請求項７２〜７４のいずれかに記載の容器の使用。
【請求項７６】
前記抗凝固剤がクエン酸ナトリウムである、前述の請求項のいずれかに記載の容器。
【請求項７７】
生体材料、ポリマー、ヒアルロン酸または請求項５０〜５２または５５〜６５のいずれかに１項に記載のヒアルロン酸を添加剤としてさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の容器。
【請求項７８】
前記ヒアルロン酸が非架橋または架橋されている、前記請求項に記載の容器。
【請求項７９】
前記ヒアルロン酸の分子量が約１５００Ｋｄａであり、約１．５％から約２％である、前記請求項に記載の容器。。
【請求項８０】
前記容器が、前記ヒアルロン酸、前記チキソトロピーゲルおよび前記抗凝固剤からなる３つの添加剤のみを含み、前記ヒアルロン酸が前記容器の遠位端からの第１層であり、その後前記チキソトロピー性ゲルからなる第２層が続き、さらに前記抗凝固剤からなる第３層が続く、前記請求項に記載の容器。
【請求項８１】
前記請求項に記載の容器、ゲルまたはヒアルロン酸であって、
凝固促進剤、トロンビン血清、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）、骨代替物、ヒアルロン酸組成物、グルコン酸カルシウム、サッカリン酸カルシウム、キトサン、フィブロイン、フィブロイン絹タンパク質またはフィブロインタンパク質、成長因子、マンニトール、コラーゲン、アルブミン、アスコルビン酸、クリーム、脂肪細胞、脂肪組織、骨髄濃縮物、ルブリシン、ｃｄ−ゼラチン、ボツリヌス毒素および／または１つ以上の細胞抽出物、必要に応じてまたは好ましくは、ケラチノサイト、骨髄、線維芽細胞、骨膜または角膜細胞、メラノサイトおよびランゲルハンス細胞、脂肪細胞、筋芽細胞および衛星細胞などの筋細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、臍帯細胞、幹細胞、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、前脂肪細胞、前内皮細胞、シュワン細胞またはアキレス腱細胞の抽出物から選択される自己細胞抽出物をさらに含む容器、ゲルまたはヒアルロン酸。
【請求項８２】
ＰＣとＨＡまたはＢＭＣとＨＡを含む組成物を調製するための、請求項７７〜８０のいずれか１項に記載の容器の使用。
【請求項８３】
ＢＭＣおよびＨＡを含む組成物の調製のための、請求項７７から８０のいずれか１項に記載の容器の使用であって、前記チキソトロピーゲルの密度が約１．０８〜約１．０９ｇ／ｃｍ３から選択される、前記容器の使用。
【請求項８４】
前記容器が管または注射器から選択される、前記請求項のいずれか記載の容器。
【請求項８５】
前記チューブが、
ａ．ホウケイ酸塩でできている、および／または
ｂ．シリコーンを含む、および／または
ｃ．発熱物質が除去されている、および／または
ｄ．真空下にある、および／または
ｅ．ストッパー付き
である、前記請求項に記載のチューブ。
【請求項８６】
前述の請求項のいずれかに記載の容器を１つまたは複数含むキット。
【請求項８７】
前記請求項に記載のキットであって、以下から選択されるキット。
i)    ＰＲＰ及びＨＡの調製のための請求項７７〜８０のいずれかによる容器と、トロンビン血清の調製のための請求項６９または請求項７０によるの容器との組み合わせ、または
ii)   ＢＭＣ及びＨＡの調製のための請求項７７〜８０のいずれかによる容器と、トロンビン血清の調製のための請求項６９または請求項７０によるの容器との組み合わせ、または
iii)  ＰＲＰ及びＨＡの調製のための請求項７７〜８０のいずれかによる容器と、ＰＲＰ調製のための請求項７２〜７４のいずれかによるの容器との組み合わせ、または
iv)  ＰＲＰ及びＨＡの調製のための請求項７７〜８０のいずれかによるの容器と、ＢＭＣ調製のための請求項７２〜７４のいずれかによる容器との組み合わせ、または
v)   ＢＭＣ及びＨＡの調製のための請求項７７〜８０のいずれかによる容器と、ＰＲＰ調製のための請求項７２〜７４のいずれかによる容器との組み合わせ、または
vi)  ＢＭＣ及びＨＡ調製のための請求項７７〜８０のいずれかによる容器と、ＢＭＣ調製のための請求項７２〜７４のいずれかによる容器との組み合わせ、または
vii) トロンビン血清の調製のための請求項６９または請求項７０による容器と、ＰＲＰ調製のための請求項７２〜７４のいずれかによる容器と組み合わせ、または
viii)   トロンビン血清の調製のための請求項６９または請求項７０による容器と、ＢＭＣ調製のための請求項７２〜７４のいずれかによる容器と組み合わせ、または
ix)  ＰＲＰ調製のための請求項７２による容器と、ＰＲＰ調製のための請求項７３による容器の組み合わせ、または
x)   ＢＭＣ調製のための請求項７２による容器と、ＰＲＰ調製のための請求項７３による容器との組み合わせ、または
xi)  ＰＲＰ調製のための請求項７２による容器と、ＢＭＣ調製のための請求項７３による容器との組み合わせ、または
xii) ＢＭＣ調製のための請求項７２による容器と組み合わせた、ＢＭＣ調製のための請求項７３による容器、または
xiii)   前記請求項のいずれかに記載の容器と、少なくとも１つの細胞抽出物との組み合わせ、または
xiv) 上記の任意の組み合わせ。
【請求項８８】
前記容器が、トロンビン血清（ＴＳ）、または血小板濃縮物（ＰＣ）または骨髄濃縮物（ＢＭＣ）、あるいはＰＣとＢＭＣの両方、または任意の組成物と生体材料あるいはヒアルロン酸との組み合わせを調製するために用いられる、前記請求項のいずれかに記載の容器またはキット。
【請求項８９】
細胞培養における、前記請求項のいずれかに記載の容器またはキットの使用。
【請求項９０】
細胞培養における、前記請求項のいずれかに記載の容器またはキットによって得られたＰＲＰの使用。
【請求項９１】
前記ＰＲＰが活性化されていない、前記請求項に記載の使用。
【請求項９２】
前記ＰＲＰが自家である、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項９３】
培地において、１０％〜４０％のＰＲＰ、１５％〜２５％のＰＲＰ、または約２０％のＰＲＰが使用される、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項９４】
前記細胞培養が、線維芽細胞、ケラチノサイト、筋芽細胞、衛星細胞、軟骨細胞、関節軟骨細胞、ＭＳＣ、肝細胞、内皮細胞、粘膜細胞、膣粘膜細胞、陰核内皮細胞を培養するためのものである、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、架橋ヒアルロン酸を合成する新しい方法、当該ヒアルロン酸の組成物、当該組成物を単独で又はＰＲＰ／ＢＭＣと組み合わせて含むチューブ及び注射器、ＰＲＰ／ＢＭＣ調製のための新しいデバイス、及びそれらの細胞培養、スキンケア及び関節保護にける使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
架橋ヒアルロン酸（ここではＸＬＨＡとも称する）は、多くの企業により、さまざまなプロセスで製造されている。得られたゲルは、主に皮膚科治療に使用される注射器の調製に用いられる。一般的に、ＢＤＤＥの使用量  及び／又は合成に採用された物理的パラメータに応じて、架橋のパーセンテージが調整され、異なる粘弾性特性及び滞留時間を持つゲルが製造できる。
【０００３】
一般的に、報告されたすべての方法に、次のような共通のステップがある。
１）  粉末または繊維のような物理形状にあるポリマーが緩衝媒体に溶解される、最初の水和ステップ
２）  架橋剤が添加され、特定のｐＨ条件において特定の温度で特定の時間にわたって反応が行われる、架橋ステップ
３）  通常、適用環境が人体であることを考慮した、必要な中和フェーズ
及び
４）  未反応の架橋剤を除去するために必要な最後の精製フェーズ
【０００４】
要求される最終製剤と目的の特性（粘度、滞留時間、使用目的など）に応じて、膨潤や別のポリマー又は麻酔薬の添加などのいくつかの中間フェーズも含まれる。
【０００５】
これらの方法を分析すると、多くの作業が含まれていることは明らかである。実行される操作の重要な数、合成手順の長さ（時間のかかるプロセス）、および製品の爆発を考慮して、架橋ヒアルロン酸を調製する別の方法が提案されており、得られた組成物は、多血小板血小板および骨髄濃縮物と混合可能であるという特徴を有する。
【０００６】
さらに、細胞療法および再生療法の研究は、自家移植療法のための体外培養および幹細胞、前駆細胞、または分化細胞の増殖を意味する。
【０００７】
ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）は、現在体外培養のための栄養素および成長因子の主な供給源として使用されており、いくつかの倫理的懸念（生きている動物からの採血）、安全性の懸念（ウイルス、マイコプラズマ、タンパク質汚染）が発生し、結果、再現性の懸念（バッチ間の組成のばらつき）と経済的懸念（主要なコスト）につながる。これらの理由により、衛生当局は、ヒトの臨床プロトコル設定での細胞治療におけるＦＢＳを排除したいと考えている。したがって、ＦＢＳに代わる媒体と共に、そのような媒体の調製を可能にする医療機器が必要とされている。
【０００８】
最後に、特に、血小板濃縮物（ＰＣ）または骨髄濃縮物（ＢＭＣ）との混合に適したヒアルロン酸組成物が必要とされている。
【０００９】
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＸＬＨＡの形成等のためのＨＡの架橋において使用可能な処理容器を示す。
【図２】ＸＬＨＡの形成等のためのＨＡの架橋において使用可能な処理容器を示す。
【図３】炎症誘発性顆粒球（Ｇｒａｎｕｌｏ）の優先的な枯渇（８７％）を可能にするＭＣ−ＰＲＰデバイスを示す。ＰＲＰと共に濃縮される残りの白血球は、主にリンパ球と単球である。
【図４】栄養素と成長因子の持続放出のためのリザーバーとして機能する血漿中に存在する血小板の存在により、ＭＮＣが持続的に生存できる、ＭＣ−ＰＲＰデバイスを示す。
【図５】患者自身の血液から調製されたＡＴ−ＭＳＣ培養サプリメントが、１０％ＦＢＳで調製された従来の培地と比較して、体外増殖を劇的に増強することを示す。
【図６Ａ】図６（Ａ）に示すように、同じ患者からのＮＨＤＦに対するＰＲＰ増殖効果を示す。ＮＨＤＦは、新鮮な皮膚試料から酵素消化によって分離され、同じ密度で体外培養用に播種されている。
【図６Ｂ】図６（Ｂ）に示すように、５日間の培養後、ＰＲＰの濃度を上げると、細胞増殖が大幅に促進される（光学顕微鏡写真）。バイオレット色素取り込み後の細胞増殖のフローサイトメトリー分析。
【図６Ｃ】図６（Ｃ）に示すように、結果は、誘導倍率で表される。Ｂグラフにプロットされたデータの代表的な密度プロット。
【図７Ａ】一般的な線形ＨＡ（緑と黒）の試料と、試料０４Ｄ１８−Ｄ  ＡＳ（ａ）、１０Ｄ１８−Ｄ  ＡＳ（ｂ）、２６Ｃ１８−Ｄ（ｃ）、およびＡＲＶ−ＨＡ−４０−３  １８Ｄ０４（ｄ）の可溶性画分のマークハウキング曲線。下記実施例１Ｂを参照。
【図７Ｂ】一般的な線形ＨＡ（緑と黒）の試料と、試料０４Ｄ１８−Ｄ  ＡＳ（ａ）、１０Ｄ１８−Ｄ  ＡＳ（ｂ）、２６Ｃ１８−Ｄ（ｃ）、およびＡＲＶ−ＨＡ−４０−３  １８Ｄ０４（ｄ）の可溶性画分のマークハウキング曲線。下記実施例１Ｂを参照。
【図７Ｃ】一般的な線形ＨＡ（緑と黒）の試料と、試料０４Ｄ１８−Ｄ  ＡＳ（ａ）、１０Ｄ１８−Ｄ  ＡＳ（ｂ）、２６Ｃ１８−Ｄ（ｃ）、およびＡＲＶ−ＨＡ−４０−３  １８Ｄ０４（ｄ）の可溶性画分のマークハウキング曲線。下記実施例１Ｂを参照。
【図７Ｄ】一般的な線形ＨＡ（緑と黒）の試料と、試料０４Ｄ１８−Ｄ  ＡＳ（ａ）、１０Ｄ１８−Ｄ  ＡＳ（ｂ）、２６Ｃ１８−Ｄ（ｃ）、およびＡＲＶ−ＨＡ−４０−３  １８Ｄ０４（ｄ）の可溶性画分のマークハウキング曲線。下記実施例１Ｂを参照。
【図８】（周波数に対するＧ’とＧ”）は、さまざまな周波数（Ｈｚ）の関数としてのＧ’とＧ”の値を示すグラフを示す。詳細については、下記実施例１Ｂを参照。
【図９】さまざまな周波数（Ｈｚ）の関数としての複素粘度の値のグラフ。下記実施例１Ｂを参照。
【図１０】ＢＴＨ０．５Ｕ／ｍｌ入りで培養した際に記録された試料２１Ｋ１７−Ｄ  ＡＳ（°）および線形ＨＡ（°）のＭｗを示す。詳細については、下記実施例１Ｂを参照。
【図１１Ａ】Ｍｗ＞５００ｋＤａ（ａ）およびＭＷ  ＜２００ｋＤａ（ｂ）の試料画分（ｗｔ％）の変化を示す。詳細については、下記実施例１Ｂを参照。
【図１１Ｂ】Ｍｗ＞５００ｋＤａ（ａ）およびＭＷ  ＜２００ｋＤａ（ｂ）の試料画分（ｗｔ％）の変化を示す。詳細については、下記実施例１Ｂを参照。
【図１２】文献で報告されているスコアに従って得られた値／パラメーターを示す。詳細については、下記実施例１Ｂを参照。
【図１３】血液とＰＲＰ細胞数を示す。ＣＣ−ＰＲＰデバイスで調製された多血小板血漿（ＰＲＰ）と比較して、全血中の血小板（ＰＬＴ×１０５）、白血球（ＷＢＣ×１０３）、および赤血球（ＲＢＣ×１０６）の数を分析する。（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。Ｎ＝１０人の患者。
【図１４】は、７日間の培養後のＦＢＳ１０％またはＰＲＰ（５〜２０％）存在下でのＮＨＤＦの明視野光学写真を示す。倍率は１０倍である。写真は１人のドナーを代表している。Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（生体色素）を使用したフローサイトメトリーによるＰＲＰ増殖効果の評価。ＦＢＳ１０％と比較して、完全な自家システム（同じ患者からの細胞とＰＲＰ）で７日間培地を変更しなかったＮＨＤＦの増殖に対する、（１〜５０％）ＰＲＰ濃度の増加がもたらす影響（ｎ＝１０人の異なる患者）。
【図１５Ａ】図１５（Ａ）は、ＮＨＤＦにおけるＰＲＰ依存性の細胞周期変調を示す。ＰＲＰ５０％で処理し、４８時間培養した後のＮＨＤＦの描写的な細胞周期データ。ヒストグラムは、「Ｇ２／Ｍ」フェーズ停滞でのセル数の増加と、「ＧＴ」フェーズでのセル数の減少を示す。
【図１５Ｂ】図１５（Ｂ）は、４８時間の処理後、Ｇ１／Ｇ０、Ｓ、およびＧ２／Ｍフェーズにおける細胞数のグラフを示す。
【図１５Ｃ】図１５（Ｃ）は、７日間の処理の場合を示す。
【図１６Ａ】図１６（Ａ）は、さまざまな培地で４８時間培養したＮＨＤＦにおけるＭＴＴホルマザンの細胞内局在を示す代表的な明視野顕微鏡画像を示す。ＦＢＳで処理されたＮＨＤＦは細胞質内の暗い顆粒を示し、ＰＲＰで処理されたＮＨＤＦは押し出されたホルマザン結晶を示す。
【図１６Ｂ】図１６（Ｂ）は、可溶化されたホルマザン（吸光度測定（５７０ｎｍ））を定量化したものを示す。データは平均＋／−ＳＤ＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として表される。
【図１７Ａ】図１７（Ａ）は、長期のＰＲＰ処理（７日間）がＮＨＤＦ細胞の形状変化を促進し、線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化を精密に模倣していることを示す。
【図１７Ｂ】図１７（Ｂ）は、Ｆ−アクチン細胞骨格の再構築を評価した。ＰＲＰ処理細胞の細胞質に沿って、アクチンミクロフィラメントの束が大量に現れた。
【図１８Ａ】図１８（Ａ）は、ＦＢＳ１０％と比較して、４日間のＰＲＰ刺激を行ったＮＨＤＦのα−ＳＭＡ陽性細胞のフローサイトメトリーとヒストグラムのオーバーレイ図を示す。
【図１８Ｂ】図１８（Ｂ）は、培地中にＦＢＳ１０％またはＰＲＰ（２０〜５０％）の存在下で７日間培養した後の、ＮＨＤＦでのビメンチン（上の線）およびα−ＳＭＡ（下の線）の免疫蛍光を示す。核はＤＡＰＩで対比染色した。
【図１９Ａ】図１９（Ａ）に示すように、ラミニンおよびコラーゲンＩへのＮＨＤＦ付着の短期的なＰＲＰ効果を示す。ＮＨＤＦはＦＢＳ１０％またはＰＲＰ１０％で１５分、３０分、または４時間刺激した。付着していない細胞を除去し、付着した細胞をメタノールで固定し、０．１％クリスタルバイオレットで染色した。
【図１９Ｂ】図１９（Ｂ）に示すように、細胞を可溶化し、マイクロプレートリーダー（５９０ｎｍでの光学密度）を使用して放出された色素を定量した。バーは標準エラーを示す。繰り返し回数：各実験条件ごとに１０〜２０ウェル。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図２０Ａ】ＮＨＤＦ培養における細胞遊走に対するＰＲＰ１０％処理の細胞効果の比較を示す。図２０（Ａ）は、ファロイジンにより免疫蛍光染色を８時間行った後に証明されるように、遊走する線維芽細胞によりスクラッチゾーンの幅が狭くなったことを示す。細胞遊走の前沿は、ＦＢＳ１０％に沿って均等に分布しているが、ＰＲＰ１０％処理細胞では均一性が低くなっている。
【図２０Ｂ】図２０（Ｂ）は、ＦＢＳ１０％培養での孤立細胞遊走とＰＲＰ１０％培養での集団細胞遊走を示す拡大写真である。
【図２０Ｃ】図２０（Ｃ）は、創傷治癒評価において、ＰＲＰの濃度を増加させた８時間の処理が、ＮＨＤＦの遊走に対する効果を示す。
【図２１Ａ】は、ＦＢＳ１０％またはＰＲＰ１０％を含む培地で４日間処理したＮＨＤＦのアレイＣＧＨプロファイルを示す。図２１（Ａ）は、ｑ１３．２領域の第４染色体上の同等のホモ接合性欠失の例である。
【図２１Ｂ】図２１（Ｂ）は、ｑ２９領域の第３染色体上の同等の良性ヘテロ接合性欠失である。
【発明の内容】
【００１１】
Ｉ．架橋ヒアルロン酸（ＸＬＨＡ）；  ＸＬ＝ＣＲＯＳＳＬＩＮＫＥＤ（架橋）；  ＨＡ＝ＨＹＡＬＵＲＯＮＩＣ  ＡＣＩＤ（ヒアルロン酸）
【００１２】
ＨＡが化学修飾されて、間の鎖が連結されているポリマーが得られると、架橋ヒアルロン酸（ここではＸＬＨＡとも称する）が得られる。
【００１３】
ＸＬＨＡは、アモルファスネットワークを持つハイドロゲル（親水性ゲル）であり、多数の薬剤を使用して架橋できる。本発明による好ましい架橋剤は、毒性が低いことから、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）である。
【００１４】
本発明は、抗凝固剤、チキソトロピーゲルおよび架橋ＨＡを含む容器、好ましくはチューブを提供する。このようなチューブ（医療デバイス）は、関節痛の症状の治療と関節の可動性改善のための注射の準備に役立つだけでなく、肌の脱水や、外傷性または術後由来の萎縮性瘢痕の修復及び改質のため、及び鼻唇溝のようなから中度〜重度の顔のしわやひだの組織の修復のための、中〜深度の真皮への注射の準備に役立つ。
【００１５】
このような医療デバイスを準備するための重要なポイントは、ＰＲＰとＨＡを混合することである。ＸＬＨＡの粘度が高くても、ゲルは、チューブを２０回反転することでＰＲＰとＨＡの完全で均質な混合物を得るのに適切な粘度を有している必要がある。さらに、ＸＬＨＡは、主な分野で使用される注射器の準備や、同様の治療にも適している必要があり、ゲルが２７Ｇの針を通過するのに適している必要がある。
【００１６】
ＸＬＨＡの滞留時間は、非ＸＬゲルの３０日よりも長い必要があり、例えば、滞留時間は約３か月であり、ＸＬＨＡは３か月の期間で完全に吸収されるが、永続的な治療効果は残る。
【００１７】
架橋の割合を調整することにより、粘度の制限を常に念頭に置いて、滞留時間が変更される。実際には、架橋の割合が高いほど、滞留時間が長くなるが、粘度も高くなる可能性がある。
【００１８】
実験により、得られたヒアルロン酸組成物は、上記の特徴を好適に示すことが実証された。
【００１９】
ＸＬＨＡの合成のための合理化された方法の開発
本方法は、本明細書では「ワンポット」方法と呼ばれる場合がある。「ワンポット」合成は、化学反応の効率を改善するための戦略として定義され、これにより、反応物は１つの反応器だけで連続的な化学反応に供される。特定の一連の反応が同じ反応器内で実行される限り、それは本明細書では「ワンポット」であると見なされる。
【００２０】
本発明の第１の態様は、実施例のセクションに記載されている合成方法である。本発明による方法は、無酸素雰囲気中で行われてもよい。好ましくは、本方法は低湿度レベルで行われる。好ましくは、本方法は、気流下、好ましくは連続した気流下で行われる。空気の代わりに、窒素やアルゴンなどの如何なる不活性ガスも使用できる。連続したガス流の代わりに、本方法は、真空または空気吸引下で行われる。本方法は、単一の反応容器内で、連続したプロセスとして実行される。
【００２１】
本発明はまた、注射可能なヒドロゲルの調製方法を提供する。そのプロセスは、１つ以上のポリマーを均質化するステップと、ポリマーを水和するステップと、ポリマーを架橋してゲルを形成するステップと、ゲルを中和するステップと、ゲルを均質化するステップと、１つ以上のポリマーをゲルに加えてヒドロゲルを生成するステップと、ヒドロゲルを精製するステップとを含み、当該プロセスは、単一の反応容器内で、連続したプロセスとして行われる。好ましくは、本方法は、気流下で、アンカーステラー容器を使用して実施される。好ましくは、架橋ステップは４時間未満、好ましくは約２時間である。好ましくは、中和ステップは、ｐＨ７で約１２時間実行される。好ましくは、中和ステップの後、ゲルを約４℃で一晩放置する。好ましくは、ゲルに加えられる１つ以上のポリマーは、室温で加えられる。好ましくは、ゲルに加えられる１つ以上のポリマーの分子量および濃度は、最初のポリマーと同じである。
【００２２】
前記ポリマーは、ヒドロキシル基、カルボキシル基およびアミン基から選択される１つ以上の反応基を有し得る。前記ポリマーは、多糖類、タンパク質、またはポリ（アクリル酸）およびポリ（ビニルアルコール）からなる群から選択される合成ポリマーであってよい。  多糖類は、ヒアルロン酸、キトサン、アルギン酸、デンプン、デキストラン、またはそれらの塩もしくは水溶性誘導体の中から選択することができる。好ましくは、この方法は中性のｐＨで行われる。好ましくは、架橋反応は、約５０℃の温度で約２時間行われる。好ましくは、架橋反応は、４時間未満、３時間半未満、３時間未満、または２時間半未満の時間にわたって行われる。好ましくは、インペラーは反応容器中で使用されない。代わりに、アンカー攪拌容器が使用される。
【００２３】
ここでいう「約」とは、±１０パーセントという意味であってもよい。ここでは、動的粘度をゼロ剪断粘度と呼ぶ場合がある。
【００２４】
架橋は、エポキシ、エピハロヒドリンおよびジビニルスルホンからなる群の化合物から選択される二官能性または多官能性分子である架橋剤を一定量添加することにより、開始される。好ましいエポキシは、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４−ビス（２，３−エポキシプロポキシ）ブタンとも呼ばれる）、１−（２，３−エポキシプロピル）２，３−エポキシシクロヘキサン及び１，２−エタンジオールジグリシジルエーテルからなる群から選択される化合物である。
【００２５】
本発明の方法では、アルカリ水溶液中に入った、少なくとも２つのエポキシ官能基を有するエポキシ系架橋剤を使用することができる。
【００２６】
少なくとも２つのエポキシ官能基を有するエポキシ系架橋剤は、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＧＥ）、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、ポリテトラメチレングリコールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、トリメチルプロパンポリグリシジルエーテル、１，２−（ビス（２，３−エポキシプロポキシ）エチレン、ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル、およびそれらの任意の組み合わせであってよい。
【００２７】
エタノール含有アルカリ性水溶液は、約５〜約１３％ｗ／ｗのエタノールを含み得る。エタノール含有アルカリ性水溶液は、約５〜約１３％ｗ／ｗのエタノールを含有する約０．７〜１．３％ｗ／ｗの水酸化ナトリウム水溶液であってよい。
【００２８】
本発明の特定の実施形態によれば、架橋を開始するステップは、塩基性媒体中で行われる。塩基性媒体中で行われる架橋反応は、非常に強固なエーテル結合が形成されることを特徴としている。エーテル化による架橋により、生体内での残存期間が長くなりる。
【００２９】
架橋反応は、各ポリマーの鎖の相互の架橋を確実にする反応である。それは、架橋の量を決定することによって定量化することができる。
【００３０】
架橋は、単一のポリマーでまたはポリマーの混合物で行うことができる。
【００３１】
ヒアルロン酸の代わりに、他のポリマーを使用することもできる。好ましくは、ポリマーは自然由来のものである。自然由来のポリマーを使用すると、生体適合性が向上する。つまり、このような使用により、炎症反応のリスクが低下する。
【００３２】
好ましくは、自然由来のポリマーは、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、セルロースおよびその誘導体、アルギン酸塩、キサンタン、カラゲニン、タンパク質または核酸から選択される化合物である。
【００３３】
さらにより望ましくは、少なくとも１つの自然由来のポリマーは、セルロースおよびその誘導体、アルギン酸塩、キサンタン、カラゲニンから選択される、人体に自然には存在しないポリマーであり、当該ポリマーは、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、タンパク質または核酸から選択される人体に自然に存在する少なくとも１つのポリマーと架橋される。
【００３４】
架橋反応に関与するポリマーは合成であってもよいが、好ましくは自然由来である。自然由来のポリマーを使用すると、生体適合性が向上する。つまり、このような使用により、炎症反応のリスクが低下する。
【００３５】
好ましくは、上記の自然由来のポリマーが使用される。
【００３６】
しかしながら、本発明において、上記のポリマーに限定されず、異なる型およびサイズのポリマーを使用できることは明らかである。
【００３７】
補充的なポリマーの添加は、最初の架橋反応の任意のフェーズにおいて行うことができ、好ましくは最初の架橋反応の７５％時に行うことができる。このステップは、ポリマーを連続的または不連続的に添加することにより行うことができる。
【００３８】
補充的なポリマーは、５００，０００Ｄａより大きい分子量を有することができる。  これらはまた、合成または自然であってよい。これらはポリマーの混合物として加えることができる。これらは、最初の架橋ステップで使用されるものと同一または異なる性質またはサイズのものであってよい。望ましくは、追加される補充的なポリマーは、最初に存在するポリマーよりも長い鎖によって構成される。これにより、ゲルの外部の機械的構造が改善され、長い鎖は短い鎖よりも分解されにくくなる。
【００３９】
ヒアルロン酸は、微生物を用いた発酵によって得ることができる。ヒアルロン酸には、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩、またはそれらの任意の混合物が含まれる。
【００４０】
ヒアルロン酸の塩は、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛、ヒアルロン酸コバルト、ヒアルロン酸テトラブチルアンモニウム、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００４１】
均質化／水和ステップの代わりに、ポリマーまたはヒアルロン酸基質を、水溶液である第１液体媒体に溶解する。前記第１液体溶媒は、架橋が行われていない。
【００４２】
均質化／水和ステップの代わりに、ポリマーまたはヒアルロン酸基質を、第２液体媒体にさらすことにより、沈殿させる。前記第２液体溶媒は、１つ以上の第１水溶性有機溶媒を一定量含み、架橋することなく、ヒアルロン酸が沈降する条件を満たす。
【００４３】
本発明において、有機溶媒は使用しない方が好適である。
【００４４】
前記方法またはその一部は、不活性雰囲気下、真空下で行われる。
【００４５】
本発明の目的は、既知の欠点を回避する生体適合性架橋ゲルを提案することであり、前記架橋ゲルは、臨床利用における使用の容易性と寿命の両方の利点を同時に有し、その結果、生体適合性架橋ゲルは、その機能が不要になった時に消失するが、いが十分であるときに消える。医療または外科的介入による投与回数を制限するには十分である。
【００４６】
架橋を停止するステップは、本発明による架橋を停止するステップと同時に、またはそのステップの前にまたはそのステップに続いて、透析によって実施することもできる。
【００４７】
このプロセスにより、二相性、高密度化特性、凝集性、注射可能な性質、および長期残存性といった特性を同時に備えた生体適合性のある架橋ゲルを得ることができる。
【００４８】
凝集性とは、ゲルが再集合し、拡散または分散しない傾向を意味する。したがって、凝集特性は、ゲルが高い適合性および生体内での長い残存性を得ることに寄与する。
【００４９】
高密度化特性とは、ゲル自体における、架橋度の変化を意味する。ゲルの高密度化された特性により、組成物は、小径の針を介して注射が可能であるという利点、およびゲルの生体内でのすべての残存性を得ることができる。
【００５０】
ゲルが長期残存する効果は、医療介入の間隔を空け、それにより患者の生活の質を改善することを可能にする。
【００５１】
本発明の実施により得られるこのような凝集性高密度化単相ゲルは、ゲル内において架橋の量が均一である同じ組成の単相ゲルよりも、注入が容易で、生体内に長く残存することを特徴とする。
【００５２】
本発明はまた、上記の方法により調製されたゲルを提供することを目的とする。
【００５３】
一実施形態では、ゲルは、少なくとも１つの分散された活性成分を含むマトリックスを構成する。そして、ゲルは、ベクターとして使用され、液体またはゲルが注入される生体組織から前記活性成分が徐々放出できるようになる。前記活性成分は、薬理学的に活性な薬剤であり、例えば酸化防止剤であってよい。有効成分は、また、異なる性質のものであってもよい。異なる性質の有効成分の混合物もゲルに分散させることができる。
【００５４】
このゲルは好ましくは注射される。
【００５５】
さらに、本発明は、このゲルの用途を提供することも目的としており、生体組織を分離、置換、または充填するのに用いたり、または例えば治療用途の場合に、前記組織の体積を増加させ（声帯、食道、括約筋、尿道または他の臓器の体積の増加）たり、美容目的のために、しわの充填、瘢痕のマスキング、または唇のボリュームの増加、あるいは体液を補充または交換したりすることができる。また、前記ゲルは例えば自然滑液などの体液を補充または置換することもできる。
【００５６】
本発明はまた、本発明による架橋ヒアルロン酸の組み合わせを提供する。
【００５７】
本発明の組成物は、キトサンと組み合わせることができ、例えばキトサンマイクロビーズまたは未修飾のマクロポーラスキトサンマイクロビーズ等である。このようなキトサンマイクロビーズは、本発明のヒアルロン酸組成物、または架橋ヒアルロン酸と非架橋ヒアルロン酸の組み合わせに均一に分散させることができる。
【００５８】
本発明の架橋ヒアルロン酸組成物は、非架橋組成物と組み合わせることができる。さらに、このような組成物は、血小板濃縮物または骨髄濃縮物と組み合わせることができる。
【００５９】
本発明の組成物は、リドカイン、プリロカイン、ブピバカイン、メピバカインおよびアルチカインを含む、アミド型の注射痛をコントロールするための局所麻酔薬から選択される追加成分をさらに含むことができる。
【００６０】
別の態様において、本発明は以下を提供する。
【００６１】
i）本発明の組成物の２７Ｇまたは３０Ｇの細い針を用いて、真皮深部にまたは皮下に注射することにより、顔の欠陥を矯正する方法。鼻唇溝やマリオネットラインなどの顔の溝やしわの外見を柔らかくしたり、浅い輪郭を強調したり、薄い唇をふっくらさせたり、くぼんだ傷跡の外観を改善したりすることを目的とする。
【００６２】
ii）患者の外見を改善するために、例えば頬の皮下に本発明の組成物（本明細書ではフィラーとも呼ばれる）を十分な量注射して、皮下脂肪萎縮などの消耗性疾病による顔のボリュームロスを治療する方法。
【００６３】
上記のように、本発明はまた、血小板濃縮物（ＰＣ）または骨髄濃縮物（ＢＭＣ）を単独で、または本発明によるヒアルロン酸などの生体材料と組み合わせて、好ましくは大量に調製することを可能にする新しい方法および医療機器にも関する。また、ＰＣおよびＢＭＣとの組み合わせに特に適したヒアルロン酸の新しい製剤にも関する。このようなＨＡは次の特徴を有してよい。
-        動粘度が最大約５Ｐａ．ｓ  （パスカル秒）．
-        １５００ＫＤａ  （５００ＫＤａと２０００ＫＤａの間）、
-        濃度２％（１％から２．５％の間）、
-        架橋度が約３％  
【００６４】
さらに、前記ＨＡの流れが重要である注射器および同様のデバイスに適したＨＡは、ＨＡが２７Ｇ針内で正しく流れるために、６０Ｐａ・ｓまでの弾性を特徴とする。
【００６５】
動粘度と弾性は、濃度％、架橋度、分子量に依存する。適切な粘度を得るためには、これらの要因を調整することができる。
【００６６】
本明細書では、チューブは、遠位端および近位端を有し、近位端は、材料、物質または組成物、例えば全血、骨髄等の物質を収集するための開口部を有することを特徴とする。
【００６７】
別の態様では、本発明は、セルセレクターゲル（例えばチキソトロピーゲル）および抗凝固剤を含むか、またはそれらを予め充填した組成物またはデバイス、好ましくはチューブまたは注射器を提供する。好ましくは、チキソトロープゲルは、チューブの遠位端で抗凝固剤の下に積層される。チューブは、最初の層としてチキソトロープゲルの層、次に２番目の層として抗凝固剤の層、続いて物質（例えば、全血、骨髄または他の物質）を収集するためのオープンスペースを有することを特徴とすることができる。そのようなデバイスは、特にＰＲＰまたはＢＭＣの調製に適している。トロンビン（例えば、自己由来トロンビン血清）は、物質（例えば、全血、骨髄またはその他の物質）の収集の前または後にチューブに収集できる。トロンビンを追加すると、物質（例えば、ＰＲＰまたはＢＭＣ）のゼリー化が可能になる。チキソトロープゲル（本明細書ではセルセレクターゲルまたはＣＳＧとも呼ばれる）の密度は、１．０４〜１．０９ｇ／ｃｍ３、好ましくは１．０４５ｇ／ｃｍ３〜１．０７５ｇ／ｃｍ３である。ゲルの密度は、１．０７５ｇ／ｃｍ３、１．０７ｇ／ｃｍ３、１．０６５ｇ／ｃｍ３、１．０６ｇ／ｃｍ３、１．０５５ｇ／ｃｍ３、１．０５ｇ／ｃｍ３、１．０４５ｇ／ｃｍ３または１．０４ｇ／ｃｍ３であってよい。
【００６８】
別の態様では、本発明は、生体材料および抗凝固剤を含むかまたは予め充填された組成物またはデバイス、好ましくはチューブまたは注射器を提供する。好ましくは、生体材料は、チューブの遠位端で抗凝固剤の下に積層される。チューブは、最初の層として生体材料の層、次に２番目の層として抗凝固剤の層、続いて物質（例えば、全血、骨髄、または他の物質）を収集するためのオープンスペースを有することを特徴とすることができる。生体材料の密度は、赤血球より低く（１．０９〜１．１ｇ／ｃｍ３）、つまり１．０９ｇ／ｃｍ３未満であり、１．０８５ｇ／ｃｍ３未満であり、１．０８ｇ／ｃｍ３未満であり、１．０７５ｇ／ｃｍ３未満であり、１．０７  ｇ／ｃｍ３未満であり、１．０６５ｇ／ｃｍ３未満であり、１．０６ｇ／ｃｍ３未満であり、１．０５５ｇ／ｃｍ３未満であり、１．０５ｇ／ｃｍ３未満であり、１．０４５ｇ／ｃｍ３未満、または１．０４ｇ／ｃｍ３未満である。好適なことに、そのような構成によると、約１ｇ／ｃｍ３から赤血球より低い密度、つまり１ｇ／ｃｍ３以上１．０９ｇ／ｃｍ３未満の重要な密度範囲を有する生体材料の使用が可能になる。このようなデバイスは、生体材料と組み合わせてＰＲＰまたはＢＭＣを調製するのに適している。抗凝固剤と生体材料の混合を回避するために、不活性または疎水性の適切な生体材料を使用することができる。あるいは、抗凝固剤と生体材料の間に物質またはバリアが積層／配置される。トロンビン（例えば、自己由来トロンビン血清）は、物質（例えば、全血、骨髄または他の物質）の収集の前または後にチューブに収集できる。
【００６９】
一態様では、本発明は、ヒアルロン酸、好ましくは本発明のＨＡ組成物、キトサンおよび抗凝固剤を含むかまたは予め充填された組成物またはデバイス、好ましくはチューブまたは注射器を提供する。好ましくは、ＨＡおよびキトサンは、チューブの遠位端で抗凝固剤の下に積層される。チューブは、最初の層としてＨＡまたはキトサンの層、次に２番目の層としてＨＡまたはキトサンの層、そして３番目の層として抗凝固剤の層、そして、物質（例えば、全血、骨髄または他の物質）を収集するためのオープンスペースが続くことを特徴とすることができる。
【００７０】
したがって、本発明は、無菌で非発熱性の容器に係り、好ましくは、ＰＣ（例えば多血小板血小板（ＰＲＰ））またはＢＭＣと、生体材料、例えばヒアルロン酸（ＨＡ）とを、好適に同じ比率で（例えば４ｍＬのＨＡに対して４ｍＬのＰＲＰ）、好適に任意で大量に混合できるチューブに係る。一実施形態では、本発明は、ＰＣまたはＢＭＣを調製するための１本のチューブと、ヒアルロン酸を予め充填した１本のチューブとを含むまたはそれらのチューブを含む医療デバイスに係り、好ましくは、それらのチューブは、ＰＣまたはＢＭＣを、生体材料が予め充填したチューブへ移送できるデバイスによって接続される。好ましくは、そのような移送は、例えば、生体材料を含むチューブ内が真空であることにより、自動的に行われる。本発明の態様および実施形態によると、血小板濃縮物（ＰＣ）または骨髄濃縮物（ＢＭＣ）と、少なくとも３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌまたは１０ｍｌ以上の体積の生体材料または細胞抽出物との組み合わせが調製可能となる。  。
【００７１】
ＰＣ／ＢＭＣチューブ（ＰＣおよび／またはＢＭＣの調製を可能にするチューブ）は、４ｍＬのＰＲＰ／ＢＭＣの調製を可能にし、不活性ポリエステル細胞セレクターゲルと液体抗凝固剤を含むことができる。ＨＡチューブは、ＰＲＰ／ＢＭＣチューブからのＰＲＰ／ＢＭＣの直接移送とヒアルロン酸との混合に用いられる。ＨＡチューブには、約４ｍＬのヒアルロン酸のゲルのみが含まれていてもよい。両チューブは、好ましくは、１回限りの使用に適しており、同じキットで提供される無菌の使い捨て瀉血材料と一緒に使用するように設計されている。
【００７２】
別の態様では、本発明は、骨髄濃縮物（ＢＭＣ）および／または血漿濃縮液（ＰＣ）を調製するための容器を提供し、以下を特徴とする。
a)   上記の容器は、
i)    少なくとも１種の抗凝固剤、および／または
ii)   赤血球（ＲＢＣ）の分離を可能にする少なくとも１つのフィルターおよび／または組成物、好ましくはまたは必要に応じてセルセレクターゲル（ＣＳＧ）、好ましくはまたは必要に応じてチキソトロピーゲル、好ましくはまたは必要に応じて不活性ポリエステルＣＳＧ、および
iii)  必要に応じて、ヒアルロン酸、キトサン、絹タンパク質またはフィブロインから選択される少なくとも１種の生体材料好ましくはまたはそれらの任意の組み合わせ、および
iv)  必要に応じて、少なくとも１種の血液、骨髄、細胞および／または血小板の保存および／または刺激溶液、好ましくはまたは必要に応じて、プラズマライトＡ
を含むかまたは予め充填されており、且つ
b)   必要に応じて、好ましくはまたは必要に応じて安全ロックおよび翼状針である付属品を好ましくまたは必要に応じて備えた収集ホルダーを含むまたは前記収集ホルダーからなる収集デバイスは、血液および/または骨髄を前記容器に収集するため、前記容器に取り付けられてもよく、前記収集は、好ましくはまたは必要に応じて真空により、好ましくはまたは必要に応じて閉回路において、好ましくはまたは必要に応じて自動的に行われ、且つ
c)   必要に応じて、収集デバイスは、トロンビン血清、好ましくはまたは必要に応じて自家トロンビン血清を前記容器に収集するために、前記容器に取り付けられてもよく、前記収集は好ましくはまたは必要に応じて閉回路で、好ましくはまたは必要に応じて自動的に行われ、且つ
d)   必要に応じて、移送デバイスを前記容器に取り付けて、前記ＰＣおよび／または前記ＢＭＣを別の容器に移送することができ、前記容器は、好ましくはまたは必要に応じてチューブまたは注射器であり、好ましくはまたは必要に応じて真空下にあり、前記移送は、好ましくはまたは必要に応じて真空により、好ましくはまたは必要に応じて２つの容器間の直接接触によって、あるいいはデバイスの手段によって、好ましくはまたは必要に応じて閉回路で、好ましくはまたは必要に応じて自動的に行われ、且つ
e)   必要に応じてまたは好ましくはリンパ球に対し、他の血液成分および/または骨髄成分を分離するための少なくとも１つのフィルターまたは物質を必要に応じてさらに含み、
f)    前記容器は必要に応じて真空下にあり、
前記容器は、
i)    骨髄および/または全血を前記容器に収集すること、および
ii)   遠心分離、および
iii)  必要に応じて、前記容器の真空引きおよび/または混合および/または反転
に適しており、且つ、
iv)  前記容器からの前記ＰＣおよび／またはＢＭＣの収集、および／または
v)   前記ＰＣおよび／またはＢＭＣの別の容器への移送
のどちらかまたは両方に適している。
【００７３】
「適している」とは、本明細書において（本発明の任意の態様または実施形態において）「使用されるとき」に置き換えられる。
【００７４】
本発明の当該態様によれば、前記容器は以下のいずれかを含んでよい。
i)    少なくとも１種の抗凝固剤、または
ii)   赤血球（ＲＢＣ）の分離を可能にする少なくとも１つのフィルターおよび／または組成物、好ましくはまたは必要に応じてセルセレクターゲル（ＣＳＧ）、または
iii)  少なくとも１種の抗凝固剤と以下の組み合わせ：
a.   少なくとも１つのフィルター、または
b.   赤血球（ＲＢＣ）の分離を可能にする組成物、好ましくはまたは必要に応じてセルセレクターゲル（ＣＳＧ）、または
c.   少なくとも１つのフィルターと赤血球（ＲＢＣｓ）の分離を可能にする組成物との組み合わせ、好ましくはまたは必要に応じてセルセレクターゲル（ＣＳＧ）。
【００７５】
別の態様では、本発明は、好ましくはまたは必要に応じてヒアルロン酸、キトサン、絹タンパク質またはフィブロイン、細胞抽出物から選択される少なくとも１種の生体材料またはそれらの任意の組み合わせと組み合わせて、ＰＣおよび／またはＢＭＣを調製するための容器を提供し、以下を特徴とする。
a)   前記容器は、好ましくはまたは必要に応じてヒアルロン酸、キトサン、絹タンパク質またはフィブロイン、細胞抽出物から選択される生体材料またはそれらの任意の組み合わせを含むか、または予め充填されており、且つ
b)   必要に応じて、収集装置は、好ましくはまたは必要に応じて収集ホルダーを含み、ＰＣおよび／またはＢＭＣを前記容器に収集するために、前記容器に取り付けられてもよく、且つ
c)   必要に応じて、少なくとも１つの生体材料と組み合わせた前記ＰＣおよび／またはＢＭＣを、好ましくはまたは必要に応じて閉回路で収集することができ、且つ
d)   必要に応じて、前記容器は、好ましくはまたは必要に応じてトロンビン血清、グルコン酸カルシウムおよび／または塩化カルシウムから選択される凝固促進剤をさらに含むか、または予め充填されており、且つ
e)   上記の容器は必要に応じて真空下にあり、
f)    前記容器は必要に応じて２つ以上のチャンバーを含み、各チャンバーは物質、生体材料、細胞抽出物、ＰＣまたはＢＭＣおよび／または凝固活性剤から選択される組成物を含み、前記組成物はそれぞれのチャンバーで互いに分離され、前記組成物は、必要に応じて互いに接触するか、または前記容器の内部または外部で一緒に混合されてよく、前記チャンバーは、化学的または生物学的な物質、膜または他の分離手段によって分離され、このような分離手段は、必要に応じて経時的に崩壊するか、または生分解性であってよく、
前記容器は、
i)    前記移送が必要に応じて閉回路で行われ、好ましくはまたは必要に応じて自動的に、好ましくはまたは必要に応じて真空により、好ましくは必要に応じて２つの容器間の直接の接触または収集デバイスを介して、ＰＣおよび／またはＢＭＣ容器、好ましくはまたは必要に応じて第１の態様の容器からの、ＰＣおよび／またはＢＭＣの収集、及び
ii)   必要に応じて遠心分離、および
iii)  好ましくはまたは必要に応じて注射器、好ましくはまたは必要に応じて閉回路で、好ましくはまたは必要に応じて自動的に行われる、少なくとも１つの生体材料と組み合わせた前記ＰＣおよび／またはＢＭＣの収集または別の装置への移送、および
iv)  必要に応じて混合および／または反転
に適している。
【００７６】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの生体材料と組み合わせてＰＣおよび／またはＢＭＣを調製するための注射器を提供し、前記少なくとも１つの生体材料は、好ましくはまたは必要に応じて、ヒアルロン酸、キトサン、絹タンパク質またはフィブロイン、細胞抽出物またはそれらの任意の組み合わせから選択され、以下を特徴とする。
a)   前記注射器は、好ましくはまたは必要に応じて生体材料を含むか、または予め充填されていることが好ましく、前記生体材料は、ヒアルロン酸、キトサン、フィブロインまたはフィブロイン絹タンパク質、細胞抽出物、またはそれらの任意の組み合わせから選択され、
b)   必要に応じて、収集装置、好ましくは又は必要に応じて収集ホルダーは、ＰＣ及び／又はＢＭＣを前記注射器に収集するために、前記注射器に取り付けることができ、
c)   必要に応じて、前記注射器は、凝固活性剤を含むか、または凝固活性剤で予め充填されており、前記凝固活性剤は、好ましくはまたは必要に応じて、トロンビン血清、グルコン酸カルシウムおよび／または塩化カルシウムから選択され、
d)   前記注射器は、必要に応じて２つ以上のチャンバーを含み、各チャンバーは物質、生体材料、細胞抽出物、ＰＣまたはＢＭＣおよび／または凝固活性剤から選択される組成物を含むことができ、前記組成物は、それぞれのチャンバーで互いに隔離され、前記組成物は、必要に応じて互いに接触するか、または前記注射器の内部または外部で一緒に混合されてもよく、前記チャンバは、化学的または生物学的物質、膜または任意の他の分離手段によって分離され、そのような分離手段は、経時により分解するか、生分解性であってよく、
前記注射器は、
i)   ＰＣおよび／またはＢＭＣ容器からのＰＣおよび／またはＢＭＣの収集であって、好ましくはまたは必要に応じて本発明の第１の態様の容器からの収集であり、前記収集は好ましくはまたは必要に応じて、前記注射器間の直接接触による閉回路で行われ、前記容器または収集装置を介して、好ましくはまたは必要に応じて自動的に行われる収集、および
ii)    必要に応じて反転、および
iii)   少なくとも１つの生体材料と組み合わせた前記ＰＣおよび／またはＢＭＣの、好ましくはまたは必要に応じて閉回路で、好ましくはまたは必要に応じて自動的に行われる、人または動物への適用または注入
に適している。
【００７７】
さらなる実施形態では、本発明は、前述の態様のいずれかによる容器または注射器を提供し、前記容器または注射器は、以下がさらに含まれるか、または充填されている。
i)    少なくとも１つの抗凝固剤、および／または
ii)   赤血球（ＲＢＣ）、好ましくはまたは必要に応じてセルセレクターゲル（ＣＳＧ）、好ましくはまたは必要に応じてチキソトロープゲル、好ましくはまたは必要に応じて不活性ポリエステルＣＳＧの分離を可能にする少なくとも１つのフィルターおよび／または組成物、および／または
iii)  必要に応じて、好ましくはまたは必要に応じてヒアルロン酸、キトサン、絹タンパク質またはフィブロインまたはそれらの任意の組み合わせから選択される、少なくとも１つの生体材料、および／または
iv)  必要に応じて、少なくとも１つのＰＣまたはＢＭＣ保存溶液、必要に応じて、または好ましくはプラズマライトＡ、および／または
v)   必要に応じて、少なくとも１つの凝固促進剤、トロンビン血清、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）、代用骨、ヒアルロン酸組成物、グルコン酸カルシウム、サッカリン酸カルシウム、キトサン、フィブロイン、フィブロイン絹タンパク質またはフィブロインタンパク質、成長因子、マンニトール、コラーゲン、アルブミン、アスコルビン酸、クリーム、脂肪細胞、脂肪組織、骨髄濃縮物、ルブリシン、ｃｄ−ゼラチン、ボツリヌス毒素および／または１つ以上の細胞抽出物、好ましくは、ケラチノサイト、骨髄、線維芽細胞、骨膜または角膜細胞、メラノサイトおよびランゲルハンス細胞、脂肪細胞、筋芽細胞および衛星細胞などの筋肉細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、臍帯細胞、幹細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、前脂肪細胞、脂肪細胞、前内皮細胞、シュワン細胞またはアキレス腱細胞の抽出物から選択される自己細胞抽出物。
【００７８】
さらなる実施形態では、本発明は、前述の態様または実施形態のいずれかによる容器または注射器を提供し、前記容器または注射器は以下をさらに特徴とする。
a)   少なくとも２つの容器、少なくとも１つの容器と１つの注射器、または少なくとも２つの注射器は、物質、材料、ＰＣ、ＢＭＣ、細胞抽出物、または組成物を１つの容器または注射器から他の容器または注射器へ移送できる接続デバイスを介して、一緒に接続されていてよく、
b)   容器がチューブであり、且つ／または
c)   前記チューブまたは注射器は、約１ｍｌ〜約２０ｍｌの全血、骨髄、ＰＣまたはＢＭＣ、好ましくはまたは必要に応じて約２ｍｌ〜約１０ｍｌ、好ましくはまたは必要に応じて約４ｍｌの回収が可能であり、
d)   前記容器および／または注射器は、無菌および／または非発熱性であり、且つ／または
e)   前記容器は、ＰＲＰ、自家ＰＲＰ、ＰＣ、自家ＰＣおよび／または自家ＢＭＣの調製に適しており、且つ／または
f)    前記容器は、約２ｍｌ〜約１０ｍｌ、好ましくはまたは必要に応じて約３ｍｌ〜約６ｍｌ、好ましくはまたは必要に応じて約４ｍｌのＰＲＰ、自家ＰＲＰ、自家ＰＣおよび／または自家ＢＭＣの調製に適しており、且つ／または
g)   前記注射器は、約０．５ｍｌ〜約５ｍｌの生体材料、好ましくはまたは必要に応じて約２ｍｌの生体材料が予め充填されているか、または含まれており、且つ／または
h)   前記容器は、約１ｍｌ〜約４ｍｌのセルセレクターゲル好ましくはまたは必要に応じて約１．５ｍｌ〜約３．５ｍｌ、好ましくはまたは必要に応じて約１．５ｍｌ、約２ｍｌ、約２．５ｍｌまたはセルセレクターゲル約３ｍｌ、が予め充填されているか、またはそれを含み、且つ／または
i)    前記容器は、約０．２ｍｌ〜約１ｍｌの抗凝固剤、好ましくはまたは必要に応じて約０．６ｍｌの抗凝固剤、好ましくはまたは必要に応じてクエン酸ナトリウム、約２％〜約６％、好ましくはまたは必要に応じて約４％が含まれるか、または予め充填されており、および／または
j)    前記容器または注射器は、約１ｍｌ〜約５ｍｌのヒアルロン酸、好ましくはまたは必要に応じて約２ｍｌのヒアルロン酸を含み、且つ／または
k)   前記ヒアルロン酸がゲルの形態であり、且つ／または
l)    前記ヒアルロン酸は、緩衝液、好ましくはまたは必要に応じてリン酸緩衝液に存在しており、前記緩衝液は、好ましくはまたは必要に応じて塩化ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリウムおよび水を含むか、またはこれらからなり、且つ／または
m)  前記ヒアルロン酸は、注射、メソセラピー、および／または塗布に適しており、且つ／または
n)   前記ヒアルロン酸は、容器あたり約４０ｍｇ〜約２００ｍｇ、好ましくはまたは必要に応じて容器あたり約８０ｍｇであり、且つ／または
o)   前記ヒアルロン酸の分子量は、約１０００ＫＤａ〜約２０００ＫＤａ、好ましくはまたは必要に応じて約１５５０ＫＤａであり、且つ／または
p)   前記ヒアルロン酸は、約０．１％〜約３％、好ましくは約１％〜約２％であり、且つ／または
q)   前記ヒアルロン酸は、発酵により得られ、且つ／または
r)   前記容器は、
１．製造プロセス中において、および／または
２．遠心分離前、血液または骨髄を前記容器に収集する前および／または後において、且つ／または
３．少なくとも１つの物質、生体材料、ゲルおよび／または抗凝固剤またはそれらの任意の組み合わせにより、予め充填され、キットまたは医療デバイスに含まれる。
【００７９】
別の態様において、本発明は、以下のいずれかからなるかまたはそれらを含む医療デバイスまたはキットを提供する。
a)   任意の態様または実施形態による少なくとも１つの容器および／または少なくとも１つの注射器。
b)   本発明の第１の態様の少なくとも１つの容器、本発明の第２の態様の少なくとも１つの容器および／または本発明の第３の態様の少なくとも１つの注射器またはそれらの任意の組み合わせ、
c)   本発明の第１の態様の少なくとも１つの容器および本発明の第２の態様の少なくとも１つの容器、
d)   本発明の第１の態様の少なくとも１つの容器および本発明の第３の態様の少なくとも１つの注射器、
e)   本発明の第１の態様の少なくとも１つの容器、本発明の第２の態様の少なくとも１つの容器、および本発明の第３の態様の少なくとも１つの注射器、
f)    本発明の第２の態様の少なくとも１つの容器および本発明の第３の態様の少なくとも１つの注射器、
g)   ＰＣの調製のための本発明の第１の態様の少なくとも１つの容器およびＢＭＣの調製のための本発明の第１の態様の少なくとも１つの容器、
h)   ＰＣの調製のための本発明の第１の態様の少なくとも１つの容器および／またはＢＭＣの調製のための本発明の第１の態様の少なくとも１つの容器、および、細胞抽出物が含まれるか、または予め充填された本発明第２の態様の少なくとも１つの容器、およびヒアルロン酸、キトサン、絹タンパク質、またはフィブロイン、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるかまたは予め充填された本発明第２の態様の少なくとも１つの容器、
i)    ＰＣの調製のための本発明の第１の態様の少なくとも１つの容器および／またはＢＭＣの調製のための本発明の第１の態様の少なくとも１つの容器、および、細胞抽出物が含まれるかまたは予め充填された本発明の第２の態様の少なくとも１つの容器、およびヒアルロン酸、キトサン、絹タンパク質またはフィブロインまたはそれらの任意の組み合わせが含まれるかまたは予め充填された本発明の第３の態様の少なくとも１つの注射器、
j)    ＰＣの調製のための本発明の第１の態様の少なくとも１つの容器および／またはＢＭＣの調製のための本発明の第１の態様の少なくとも１つの容器、および細胞抽出物が含まれるかまたは予め充填された本発明の第３の態様の少なくとも１つの注射器、およびヒアルロン酸、キトサン、絹タンパク質、またはフィブロイン、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるかまたは予め充填された本発明の第２の態様の少なくとも１つの容器。
ここで、前記医療デバイスまたはキットは、必要に応じてさらに以下を含む。
k)   本発明の第１の態様の少なくとも１つの容器、本発明の第２の態様の容器および／または本発明の第３の態様の注射器またはそれらの任意の組み合わせ、および／または
l)    トロンビン血清、好ましくは自家トロンビン血清を調製するための少なくとも１つの容器、および／または
m)  任意の物質、材料、ＰＣ、ＢＭＣ、細胞抽出物、または組成物を１つの容器または注射器から別の容器または注射器に移送できる接続デバイス。
【００８０】
さらなる実施形態において、本発明は、以下を含む医療デバイスまたはキットを提供する。
a)   本発明の第１の態様による容器、および
b)   本発明の第１の態様の容器、本発明の第２の態様の容器、または本発明の第３の態様の注射器、および
c)   必要に応じて、血液または骨髄を収集するための収集デバイスであって、好ましくはまたは必要に応じて、安全ロックおよび蝶針を備えた収集ホルダーを好ましくはまたは必要に応じて含むかまたは当該収集ホルダ―からなる収集デバイス、および
d)   必要に応じて、収集ホルダーと、ＰＣまたはＢＭＣを本発明の第１の態様の前記容器、本発明の第２の態様の前記容器および／または本発明の第３の態様の前記注射器へ移送するための移送デバイスとを含むかまたはそれらからなる収集デバイス、および
e)   必要に応じて付属品および／または使い捨ての瀉血材料。
【００８１】
さらなる実施形態において、本発明は、以下を含む医療デバイスまたはキットを提供する。
a)   真空下約４ｍＬの血液または骨髄を採取してＰＲＰまたはＢＭＣを調製することができるチューブであって、以下を含むチューブ。
ii.    約２．５ｍＬの不活性セルセレクターゲル
iii.  約０．６ｍＬの抗凝固剤、好ましくはまたは必要に応じて約４％のクエン酸ナトリウム、
b)   真空下において、チューブａ）から約４ｍＬのＰＲＰまたはＢＭＣを取り出せるチューブであって、リン酸緩衝液に約２ｍＬのヒアルロン酸ゲルを含み、好ましくはまたは必要に応じて塩化ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリウム、および注射用水を含むチューブ。
c)   安全ロックと蝶針を備えた収集ホルダーからなる、血液および／または骨髄を収集するための収集デバイス。
d)   好ましくはまたは必要に応じて、収集ホルダーと、前記チューブａ）から前記チューブｂ）へＰＣおよび／またはＢＭＣを収集するための移送デバイスとからなる収集デバイス。
【００８２】
さらなる実施形態において、本発明は、以下を含む医療デバイスまたはキットを提供する。
a)   ＰＲＰまたはＢＭＣを真空下で調製するためのチューブであって、以下を含む約４ｍＬの血液または骨髄の採取を可能にするチューブ。
i.  約２．５ｍＬの不活性セルセレクターゲル
ii. 約０．６ｍＬの抗凝固剤、好ましくはまたは必要に応じて約４％のクエン酸ナトリウム、
b)   チューブａ）約４ｍＬのＰＲＰまたはＢＭＣを、からから引き出すことができる注射器であって、リン酸緩衝液に約２ｍＬのヒアルロン酸ゲルを含み、好ましくはまたは必要に応じて塩化ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリウム、および注射用水を含む注射器。
c)   安全ロックと蝶針を備えた収集ホルダーからなる、血液および／または骨髄を収集するための収集デバイス。
d)   好ましくはまたは必要に応じて、収集ホルダーと、前記チューブａ）から前記注射器ｂ）へＰＣおよび／またはＢＭＣを収集するための移送デバイスとからなる収集デバイス。
【００８３】
さらなる実施形態では、本発明は、前述の態様または実施形態のいずれかによる医療デバイスまたはキットであって、組織採取カニューレ、好ましくはまたは必要に応じて脂肪組織採取カニューレ、好ましくはまたは必要に応じて直状または凹面の注射用カニューレ、ピストンストッパー、少なくとも１つの自己付着ディスク、ルアーコネクタ、麻酔液、針や注射器などの注射用付属品、組織採取および混合用の好ましくはまたは必要に応じてルアーロック注射器、少なくとも１つの移送カニューレ、クリップデバイス、ＰＣおよび／またはＢＭＣを分配するためのディスペンサー付きの容器、トロカール、塩化カルシウムまたはグルコン酸カルシウムなどの凝固活性剤のアンプル、ペーパーマスク、ＰＣと、トロンビン血清またはその他ＰＣ、ＢＭＣ、物質、生体材料または凝固活性剤の任意の組み合わせそとを同時に放出するためのデバイスであって、少なくとも１つの注射器、スプレー塗布用のノズル、ダブルピストンストッパー、アプリケーター注射器ホルダーおよび／またはコネクター、またはそれらの任意の組み合わせを含むデバイスをさらに含む、医療デバイスまたはキットを提供する。
【００８４】
別の態様では、本発明は、前述の態様または実施形態のいずれかによる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の容器および／または注射器を提供する。 前記容器および／または注射器は、治療、皮膚科、歯科、整形外科、スポーツ医学、化粧品、美容、外科、眼科、メソセラピー、注射、浸潤、皮下塗布、創傷ケア、ボリュームの嵩増、ボリュームの修正、力学的サポート、および/または関節内補充に用いられる。
【００８５】
別の態様では、本発明は、組成物を提供し、好ましくは、ＰＣおよび／またはＢＭＣと少なくとも１つの生体材料とを必要に応じて組み合わせた組成物を提供し、前記少なくとも１つの生体材料は、好ましくはヒアルロン酸、キトサン、絹タンパク質またはフィブロインまたはそれらの任意の組み合わせから選択され、前記組成物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の、前述の態様または実施形態のいずれかによる容器および／または注射器を用いて得られるか、または前述の態様または実施形態のいずれかによる方法を用いて得られ、前記組成物は、必要に応じて、凝固促進剤、トロンビン血清、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）、代用骨、ヒアルロン酸組成物、グルコン酸カルシウム、サッカリン酸カルシウム、キトサン、フィブロイン、フィブロイン絹タンパク質またはフィブロインタンパク質、成長因子、マンニトール、コラーゲン、アルブミン、アスコルビン酸、クリーム、脂肪細胞、脂肪組織、骨髄濃縮物、ルブリシン、ｃｄ−ゼラチン、ボツリヌス毒素および／または１つ以上の細胞抽出物、必要に応じてまたは好ましくは、ケラチノサイト、骨髄、線維芽細胞、骨膜または角膜細胞、メラノサイトおよびランゲルハンス細胞、脂肪細胞、筋芽細胞および衛星細胞などの筋肉細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、臍帯細胞、幹細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、前脂肪細胞、前内皮細胞、シュワン細胞またはアキレス腱細胞の抽出物から選択される自己細胞抽出物とさらに組み合わされ、前記組成物は、好ましくはまたは必要に応じて、治療、皮膚科、歯科、整形外科、スポーツ医学、化粧品、美容、外科、眼科、メソセラピー、注射、浸潤、皮下塗布、創傷ケア、ボリューム嵩増、ボリューム修正、力学的サポートおよび／または関節内補充に用いられる。
【００８６】
別の態様において、本発明は、創傷または組織の治癒方法や、骨または歯周の成長および／または皮膚、軟骨、筋肉、腱、靭帯、脂肪組織、角膜、末梢神経、脊椎または骨などの骨および／または組織の再生を促進するための治療方法を提供し、前述の態様または実施形態のいずれかによる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の容器および／または注射器を用いる。
【００８７】
別の態様では、本発明は、治療、皮膚科、歯科、整形外科、スポーツ医学、化粧品、美容、外科、眼科、メソセラピー、注射、浸潤、皮下塗布、創傷ケア、ボリューム嵩増、ボリューム修正、力学的サポートおよび/または粘液補充における、前述の態様または実施形態のいずれかによる組成物、方法、医療デバイス、キット、容器または注射器の用途を提供し、創傷、損傷組織、損傷骨または歯周欠損または空洞上に/のため、細胞再生のため、組織付着のため、ヒトまたは動物の創傷または組織における創傷治癒または組織治癒および/またはシーリングおよび/または組織および/または軟骨および/または骨および/または神経の再生を促進するのため、または歯周疾患や歯周再生を必要とする他の状態にある哺乳類の創傷または歯周欠損における歯周再生を誘導するため、または靭帯および/または軟骨再配列のため、または瘢痕またはしわにおける皮膚再生の促進のため、または真皮脂肪移植や脂肪組織再生を必要とする他の状態にある哺乳動物の脂肪組織体積を増加させるため、または心筋不全や心筋再生組織再生を必要とする他の状態にある哺乳動物の心筋再生を誘導するため、または角膜欠損や角膜再生を必要とする他の状態にある哺乳動物の角膜再生を誘導するため、または関節/軟骨欠損や関節/軟骨組織の再生を必要とする他の状態にある哺乳動物の関節/軟骨再生を誘導するため、または瘢痕、しわ、ヒトまたは下等動物の脂肪欠乏症における皮膚再生を促進するため、または末梢神経損傷、神経縫合、脊髄損傷や末梢神経再生を必要とする他の状態にある哺乳動物の末梢神経再生を誘導するため、または骨の損傷、骨の欠損や骨の再生が必要な他の状態にある哺乳類の骨再生を誘導するため、または整形外科用注射および審美用注射のため、または皮膚組織の再生および/または若返りのため、特に皮膚のしわ、深いしわ、にきび、火傷跡、風疹または小痘瘢痕、白斑および脂肪萎縮などの軽減、鼻唇線の改善、および皮膚火傷、カポジ肉腫、皮膚スケロイドまたはデュピュイトラン手掌線維腫などの皮膚の損傷や疾患の治療などの皮膚再生の促進および/または開始、ならびに皮膚および組織の再生に伴う痛みの軽減のため、または創傷または組織の治癒または再生治療のため、特に自然または人工移植片のフィッティングおよび/または保持および/またはシーリングなどの外傷性または外科的創傷の治療;血管炎の治療;糖尿病性神経障害性潰瘍または褥瘡性潰瘍、糖尿病性潰瘍、穿孔性潰瘍または糖尿病性穿孔性潰瘍などの潰瘍、関節炎、変形性関節症、偽関節炎、放射線皮膚炎および閉鎖瘻孔、瘻孔や心疾患において、心不全、慢性心不全、虚血性および非虚血性心不全、および心筋症の治療等における心臓再生、または骨、軟骨、関節障害、軟骨損傷、軟骨および/または骨の負傷、例えば深部軟骨損傷および/またはただれ、および/または関節鏡検査、腱断裂および肩の回旋腱板の治療のため、またはドライアイ症候群などの角膜障害;化学熱傷によって引き起こされる角膜混濁、スティーブンのジョンソン症候群による苦痛;角膜および角膜潰瘍の瘢痕化、または末梢神経損傷、神経縫合および脊髄損傷、糖尿病性創傷、大きな血管創傷、深部注射、皮内注射、関節内浸潤、目薬、洗眼器、関節用、筋肉病変、マス��ポストレーザーとして、ポストピーリング、単剤療法、きらめき、光沢、輝き、または明るさのために用いられる。
【００８８】
一実施形態では、本発明は、以下を含むまたはそれらからなる医療デバイスに関する。
ａ．収集ホルダーと組み立てられた安全ロックバタフライニードル
ｂ．事前に組み立てられた移送デバイス
ｃ．血液を引き出すことができる、真空下におけるチューブであって以下を含む。
ｉ）約２．５ｍＬの不活性セルセレクターゲル、
ｉｉ）約０．６ｍＬの抗凝固剤（例えば、クエン酸ナトリウム４％）、
ｄ．ＰＲＰを回収できる真空下におけるチューブであって、リン酸緩衝液（塩化ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリウム、注射用水）に約２ｍＬのヒアルロン酸ゲルを含み、１つのチューブあたり好ましくは約８０ｍｇのヒアルロン酸を約１５５０ＫＤａで含み、好ましくは発酵から得られる。
【００８９】
本明細書で言及されるすべてのヒアルロン酸は、本発明による任意の方法から得られるヒアルロン酸または本発明による任意のヒアルロン酸組成物に関連し得る。
【００９０】
本発明の容器および注射器は、大きなまたは深い創傷に、または生物学的付着剤として塗布することができる。
【００９１】
生体材料を含む本発明の容器および注射器は、好ましくは湿り蒸気により滅菌され、好ましくは低細菌雰囲気下で包装される。 本発明の他の容器、注射器、または構成要素、例えば、ＰＣ、基本的な瀉血材料を調製するためのチューブは、好ましくはダブルブリスター包装の後に、約２５ｋＧｙのガンマ線照射の最小線量への曝露によって滅菌されることが好ましい。
【００９２】
本明細書では、セルセレクターゲルは、ポリマーまたはチキソトロピーゲルと呼ばれることがある。
【００９３】
本明細書に記載されている他の物質は、本発明の製造方法の１つまたは複数の工程中に組み合わせることができる。
【００９４】
別の態様では、本発明は、制御された真空および容器または採血管の閉塞を含む充填機によって、容器または採血管を自動的に製造する方法を提供する。
【００９５】
一実施形態では、本発明の任意の態様または実施形態による容器または注射器は、寒天、ゲロース、コラーゲン、キトサン、成長因子、アスコルビン酸、アルブミン、フィブロイン、絹タンパク質またはフィブロイン−フィブロインタンパク質から選択される物質またはヒアルロン酸で予め充填される。
【００９６】
寒天、ゲロース、コラーゲン、アスコルビン酸、アルブミン、絹タンパク質またはフィブロイン−フィブロインタンパク質はすべて、本発明の組成物に有用な安定化および／または粘度特性を示すことができる。１つの実施形態において、ヒアルロン酸またはキトサンは、寒天、ゲロース、コラーゲン、アスコルビン酸、アルブミン、フィブロインおよび／または絹タンパク質またはフィブロイン−フィブロインタンパク質によって置換され得るか、またはそれらと組み合わせることができる。好ましくは、ヒアルロン酸またはキトサンは、フィブロインまたは絹タンパク質またはフィブロイン−フィブロインタンパク質によって置換され得るか、またはそれらと組み合わせることができる。一実施形態では、フィブロインまたはシルクタンパク質またはフィブロイン−フィブロインタンパク質は、ＰＣおよび／またはＢＭＣと組み合わせることができる。別の実施形態において、フィブロインまたはシルクタンパク質またはフィブロイン−フィブロインタンパク質は、ＰＣおよび／またはＢＭＣと組み合わせ、キトサンおよび／またはＨＡと組み合わせることができる。別の実施態様において、アルブミンは、ＰＣおよび／またはＢＭＣと組み合わせることができる。別の実施態様において、アルブミンは、ＰＣおよび／またはＢＭＣと組み合わせ、キトサンおよび／またはＨＡと組み合わせることができる。別の実施態様において、アルブミンは、キトサンおよび／またはＨＡ、絹タンパク質またはフィブロイン−フィブロインタンパク質と組み合わせてもよく、さらにＰＣおよび／またはＢＭＣと組み合わせることもできる。
【００９７】
一実施形態において、寒天、ゲロース、コラーゲン、キトサン、成長因子、アスコルビン酸、アルブミン、フィブロイン、絹タンパク質またはフィブロイン−フィブロインタンパク質またはヒアルロン酸、および／またはそれらの任意の組み合わせから選択される物質は、本発明の任意の態様または実施形態による容器または注射器に予め充填されていてよい。
【００９８】
一実施形態では、ヒアルロン酸の代わりに、またはヒアルロン酸と組み合わせて、同様の物質、例えば、ゲロース、寒天、コラーゲンキトサン、アルブミンおよび/またはシルクタンパク質またはフィブロイン-フィブロインタンパク質、および/またはそれらの任意の組み合わせを使用したり、組み合わせたりすることができる。
【００９９】
好ましくは、抗凝固剤はクエン酸塩またはクエン酸ナトリウムである。
【０１００】
好ましくは、ポリマーはチキソトロピーゲルである。
【０１０１】
好ましくは、容器、チューブ、注射器、キットまたはデバイスは、ヒトによる使用のためまたはヒトの治療のためのものである。 一実施形態では、容器、チューブ、注射器、キットまたはデバイスは、動物に使用されるか、または獣医学的使用または動物の治療に適応される。
【０１０２】
好ましくは、前述の態様のいずれかによる製造方法は、層流および／または制御されたバイオバーデン下で実施される。
【０１０３】
容器、チューブまたは注射器は、異なる形状であってよく、クリスタル、ガラス、プラスチックまたは金属で作製され得る。好ましくは、容器、チューブまたは注射器は、プラスチックで作製され、好ましくはＣＯＰまたはＣＯＣで作製され、好ましくはフタル酸エステルを用いずに作製される。
【０１０４】
別の実施形態では、本発明が提供するヒアルロン酸（ＨＡ）は、約１．５％〜約２．５％の濃度で約１０００ＫＤａ〜約２０００ＫＤａ、約１．８％〜約２．２％の濃度で約１４００ＫＤａ〜約１６００ＫＤａ、約１．８％〜約２．２％の濃度、より好ましくは約１．７％〜約２％の濃度で１５５０ＫＤａである。このようなＨＡは、特に、注射または浸潤、皮内注射、皮下塗布、関節内浸潤、瘻孔および／または生物学的付着剤として適応される。
【０１０５】
このようなヒアルロン酸の組成物はまた、血小板濃縮物、好ましくは多血小板血漿（ＰＲＰ）との組み合わせに適応される。ＨＡ組成物のさらなる好適な特徴は、ＰＣおよびＢＭＣとの組み合わせにおいて本明細書に記載されている。
【０１０６】
一実施形態では、本発明は、分子量および濃度が異なる少なくとも２つのヒアルロン酸の組み合わせを含む。
【０１０７】
別の態様では、本発明は、異なる密度を有する異なるチキソトロピックゲルを備えたチューブを含む医療デバイスを提供する。
【０１０８】
別の態様では、本発明は、新しい用途および適用のために目標とする方法で血液成分を分離するのに有用な新しい密度を有するチキソトロピーゲルを備えたチューブを提供する。
【０１０９】
別の態様では、本発明は、細胞培養に特に適応した医療デバイスを提供する。
【０１１０】
定義及び式: 本明細書および/または本発明において/に関して使用されるいくつかの定義
【化１】
2021515088.tif 000003
【０１１１】
構造 １Ａ１ (上記): ヒアルロン酸（ＨＡ）モノマー（Ｎ＝１）および／またはＨＡポリマー（Ｎ＞１）の典型的な構造（Ａｈｍｅｔ  Ｔｅｚｅｌ＆Ｇｌｅｎｎ  Ｈ．Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙから再現）、２００８；１０：３５―４２）。文脈上そうでないことを明確に示さない限り、本明細書で定義される「ポリマー」は、その範囲内に「オリゴマー」を含み、独立して、「ポリ−」はその範囲内に「オリゴ−」を含む。ＨＡポリマーが好ましく（Ｎ＞１、好ましくはＮ＝２〜２５０００以上）、ＨＡモノマーはあまり好ましくない。  上記の化学構造では、ＨＡは、ＨＡの脱プロトン化されたカルボキシレートまたはポリカルボキシレートの形態のナトリウム塩の形態で示されているが、「ＨＡ」という用語でカバーされる構造はこの構造だけではない。
【０１１２】
本明細書で定義される「ヒアルロン酸」（「ＨＡ」）は、上記構造１Ａ１のカルボン酸形態および／またはポリカルボン酸形態を含み、独立して、任意の塩の形態を含み、特に、上記構造１Ａ１の任意のアニオン性（好ましくはポリアニオン性）塩の形態（特に、上記構造１Ａ１の任意の薬学上許容される金属および／またはアンモニウムおよび／または有機アンモニウム塩）、好ましくは、上記構造１Ａ１の薬学上許容されるアルカリ金属塩および／またはアルカリ土類金属塩、より好ましくは上記構造１Ａ１のリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよび／またはマグネシウム塩）を含む。
【０１１３】
好ましくは、本明細書で定義される「ヒアルロン酸」（「ＨＡ」）は、上記構造１Ａ１のカルボン酸形態および／またはポリカルボン酸形態を含み、独立して、上記の構造１Ａ１のカルボン酸および／またはポリカルボン酸および／またはポリアニオンの任意の塩（例えば、上記で挙げた塩のいずれか、より好ましくは、上記の構造１Ａ１のリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、および／またはマグネシウム塩）の形態を含む。
【０１１４】
同様に、本明細書で定義されるように、「架橋ヒアルロン酸」（「ＸＬＨＡ」または「ＸＬ  ＨＡ」）は、例えば本明細書において一般式で定義されるＸＬＨＡ構造（例えば、上記および／または下記の構造１Ａ４（Ａ）および／または１Ａ４（Ｂ）を参照）のカルボン酸形態および／またはポリカルボン酸形態を含み、独立して、例えば本明細書において一般式で定義されるＸＬＨＡ構造（例えば、上記および／または下記の構造１Ａ４（Ａ）および／または１Ａ４（Ｂ）を参照）の任意の塩の形態、特に任意のアニオン性（好ましくはポリアニオン性）塩の形態（例えば、ＨＡについて上記に挙げた塩のいずれか）を含む。
【０１１５】
好ましくは、本明細書で定義される「ＸＬＨＡ」は、例えば本明細書で一般式で定義されるＸＬＨＡ構造のカルボン酸形態および／またはポリカルボン酸形態を含み、、独立して、例えば本明細書で一般式で定義されるＸＬＨＡ構造（例えば、本明細書の構造１Ａ４（Ａ）および／または１Ａ４（Ｂ）を参照）のカルボキシレート形態および／またはポリカルボキシレート形態および／またはポリアニオン性形態の任意の塩（特に、任意の薬学上許容される金属および／またはアンモニウムおよび／または有機アンモニウム塩、好ましくは任意の薬学上許容されるアルカリ金属塩および／またはアルカリ土類金属塩、より好ましくは、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよび／またはマグネシウム塩）の形態を含む。
【０１１６】
ＨＡは、多数の架橋剤、好ましくはジエポキシド架橋剤を用いて架橋されてＸＬＨＡを形成することができる。生物医学用途で最も使用される架橋剤は、毒性が低いことから、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）（Ｊｅｏｎ、Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，７０，（２００７），２５１―２５７を参照）である。ＢＤＤＥの構造を以下に示す。最も重要なのは、この構造には、２つのエポキシド基が含まれており、直鎖状の有機分子の両端にそれぞれ存在する。
【化２】
2021515088.tif 000004
１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）の構造 (上記)
【０１１７】
ジエポキシド架橋剤（架橋剤）の好ましい一般的な構造、好ましくは架橋ＨＡでの使用に適したものを以下に示す。
【化３】
2021515088.tif 000005
【０１１８】
上記の一般的なジエポキシド架橋剤（架橋剤）［構造１Ａ３］において、「［リンカー］」として示される図示されたリンカーは、好ましくは有機リンカー部分であり、および／または好ましくはＨＡポリマーを架橋するのに適した長さおよび／または構造、例えばＨＡポリマーを、その−ＯＨ基で架橋するのに適した長さおよび／または構造である。好ましくは、［リンカー］は、長さが２〜２０原子（好ましくは３〜１２原子、例えば４〜８原子、例えば６原子）の鎖を含む。（鎖は好ましくは直鎖状であるが、必要に応じて分岐させることもできる。）より好ましくは、［リンカー］は、長さが２〜２０（または３〜１２、または４〜８、例えば６）原子の鎖（好ましくは直鎖）を含み、前記鎖状原子は、鎖状炭素原子を含み（例えば、‐ＣＨ２−または‐ＣＨＭｅ−または‐ＣＭｅ２−基（Ｍｅ＝メチル基）として）、必要に応じて、鎖状原子は、１、２、３または４個の鎖状酸素、鎖状硫黄および／または鎖状窒素原子も含む（好ましくは、鎖状原子は、１、２、３または４個、好ましくは１または２個の鎖状酸素原子も含む）。
【化４】
2021515088.tif 000006
【０１１９】
構造１Ａ４（Ａ）および１Ａ４（Ｂ）（上記）：架橋ＨＡ（ＸＬＨＡ）の好ましい一般的な構造。
左側の部分構造１Ａ４（Ａ）は、一般的な架橋鎖（Ａ）を一般式で示しており、ジエポキシ架橋剤（架橋剤）（構造１Ａ３）と、２つのＨＡポリマー鎖の−ＯＨ基との反応によって形成される。
右側の部分構造１Ａ４（Ｂ）は、１つのＨＡまたはＸＬＨＡポリマー鎖のみに連結された一般的な側鎖または基（Ｂ）を一般式で示しており、ｉ）一般的なジエポキシド架橋剤（構造１Ａ３）の１つのエポキシ基と、１つのＨＡポリマー鎖の−ＯＨ基との反応、およびｉｉ）単一のＨＡ結合リンカーの２つ目のエポキシ基の（例えば水または水酸化物による）加水分解によって形成される。
【０１２０】
便宜上、部分構造１Ａ４（Ａ）と１Ａ４（Ｂ）は両方とも、２つの架橋ＨＡチェーンにおいて隣接する位置に存在するように示されているが、これは説明のためのみであり、ＸＬＨＡの一種または多種の構造は、１Ａ４（Ａ）のみ、または１Ａ４（Ｂ）のみ、またはその両方を含んでいてよく、ＡとＢ型のリンカー／基間の相対距離、ＡとＢ型のリンカー／基の相対比率、ならびに架橋の％及び側基の％は、すべて可変である。
【０１２１】
【０１２２】
架橋ＨＡの上記の一般的な構造１Ａ４（Ａ）および１Ａ４（Ｂ）において、「［リンカー］」として示される図示されたリンカーは、好ましくは有機リンカー部分であり、および／または好ましくはＨＡポリマーを架橋するのに適した長さおよび／または構造、例えばＨＡポリマーを、その−ＯＨ基で架橋するのに適した長さおよび／または構造である。  好ましくは、［リンカー］は、長さが２〜２０原子（好ましくは３〜１２原子、例えば４〜８原子、例えば６原子）の鎖を含む。（前記鎖は好ましくは直鎖状であるが、必要に応じて分岐させることもできる。）より好ましくは、［リンカー］は、長さが２〜２０（または３〜１２、または４〜８、例えば６）原子の鎖（好ましくは直鎖）を含み、前記鎖状原子は、鎖状炭素原子を含み（例えば、‐ＣＨ２−または‐ＣＨＭｅ−または‐ＣＭｅ２−基（Ｍｅ＝メチル基）として）、必要に応じて、鎖状原子は、１個、２個、３個または４個の鎖状酸素、鎖状硫黄および／または鎖状窒素原子も含む（好ましくは、鎖状原子は、１個、２個、３個または４個、好ましくは１個または２個の鎖状酸素原子も含む）。
【０１２３】
注：ＸＬＨＡの具体的な形態、および／またはＸＬＨＡの塩の形態（存在する場合）、および／または架橋鎖（例えば上記構造１Ａ４（Ａ）および必要に応じて任意の側鎖（例えば、上記の構造１Ａ４（Ｂ）中）の（ＸＬＨＡポリマー内の）位置、および／または比率またはパーセンテージは、説明目的だけの例示的構造である上記構造に示されている構造と明らかに異なっていてもよい。側鎖（例えば上記の構造１Ａ４（Ｂ）に示されている型など）は任意選択であり、ＸＬＨＡに存在しても存在しなくてもよい。架橋ヒアルロン酸（ＸＬＨＡ）には、架橋鎖（好ましくは上記の構造１Ａ４（Ａ）に示されている型のもの）がに存在する。ＸＬＨＡは、ポリアニオン（ポリカルボキシレート）の形態で、ナトリウム塩として上に表示されている。しかしながら、本発明では、ＸＬＨＡは任意の形態（例えば、ポリアニオンまたは酸またはその他）および／または任意の塩の形態であってよい。
【０１２４】
本発明および明細書において、「滞留時間」とは、好ましくは、ＩＳＯ＿１０９９３−６＿２０１６に開示された方法に従って定義および／または測定される（すなわち、または好ましくは、線形ＨＡは、１ヶ月後に完全に分解される）。 特に、本発明において、例えば、ＸＬＨＡの架橋ネットワークのため、ゲルおよび／またはＸＬＨＡは、好ましくは、非架橋（非ＸＬ）ＨＡゲル（例えば、対応するおよび／または典型的および／または従来の非ＸＬ  ＨＡゲル）の滞留時間（通常、約３０日の滞留時間）よりも長い滞留時間を有する。
【０１２５】
【数１】
2021515088.tif 000007
【０１２６】
数平均分子量Ｍｎ：試料内のすべてのポリマー鎖の統計的な平均分子量であり、
【数２】
2021515088.tif 000008
で定義される。ここでＭｉは鎖の分子量、Ｎｉはその分子量の鎖の数である。  Ｍｎが分子量分布を表す場合、分布内のＭｎの両側の分子数は等しい。
【０１２７】
重量平均分子量Ｍｗは、
【数３】
2021515088.tif 000009
で定義され、Ｍｎと比較して、Ｍｗは平均分子量への寄与を決定する際に鎖の分子量を考慮する。鎖が重いほど、その鎖のＭｗへの寄与は大きい。Ｍｗが分子量分布を表す場合、分布内のＭｗの両側の分子量は等しい。
【０１２８】
すべての多分散性合成ポリマーにおいて、Ｍｎ  ＜  Ｍｗである、
【０１２９】
多分散性指数は、ポリマーの分子量分布の広さを特徴付けるために使用され、次のように定義される。
【０１３０】
【数４】
2021515088.tif 000010
【０１３１】
多分散性指数が大きいほど、分子量は広くなる。すべての鎖長が等しい単分散ポリマー（タンパク質など）はＭｗ／Ｍｎ＝１である。最適に制御された合成ポリマー（キャリブレーションに使用される分子量分布が狭いポリマー）のＭｗ／Ｍｎは１．０２〜１．１０である。逐次重合反応では、通常、Ｍｗ／Ｍｎの値は約２．０となるが、連鎖反応では、Ｍｗ／Ｍｎの値は１．５〜２０となる。
【０１３２】
注：「分子量」が本明細書および/または本発明に関して言及される場合は、特に明記しない限り、常に、重量平均分子量Ｍｗおよび／または数平均分子量Ｍｎを指す。 そして、好ましくは、重量平均分子量Ｍｗを指す。
【０１３３】
固有粘度：溶液中のポリマーが溶液の粘度を高める能力を反映する。
【０１３４】
屈折率の増分ｄｎ／ｄｃ：屈折率の増分は、特定の条件下の試料に適用される。  たとえば、温度、レーザー波長、分子の立体配座、または添加剤は、ｄｎ／ｄｃの絶対値に影響を与える。したがって、完全な静的光散乱実験では、検討中の条件での正確なｄｎ／ｄｃを決定する必要がある。多くの実際的な例では、同様の条件下で取得された以前のデータセットから（または参考文献から）値を取得できる。
【０１３５】
流体力学的半径Ｒｈ：動的光散乱計測により、目的と同じ速度で拡散する同等の剛体球の半径として定義される。実際には、タンパク質とその複合体の溶液は剛体球として存在しないため、測定された流体力学的半径は、溶媒和したタンブリング分子が採用している見かけのサイズをより厳密に反映する。
【０１３６】
Ｍａｒｋ・Ｈｏｕｗｉｎｋ−桜田関係式  ＭＨＳ：分画された試料の固有粘度と分子量を関連付けるためにうまく機能する経験的関係式。特定のポリマーの配座解析を行うために使用される。
【０１３７】
複素粘度：複素剪断弾性率。変形が回復可能（弾性）か回復不可能（粘性）かに関係なく、材料の変形に対する全体的な抵抗。記号Ｇ＊複素粘度＝粘度−ｉＸ弾性
【０１３８】
剪断弾性率：（ひずみの変化から生じる）剪断応力と剪断ひずみの比率。上記と同様の複素的な関係から、次のことが分かる。
【０１３９】
Ｇ＊ ＝ Ｇ’ ＋ ｉＧ’’
【０１４０】
ここで、
Ｇ＊ は複素剪断弾性率
Ｇ’は同相貯蔵弾性率及び
Ｇ’’は異方性損失係数； Ｇ＊ ＝ √（Ｇ’２ ＋ Ｇ’’２）。
【０１４１】
クロスオーバー周波数：これらのパラメーターがクロスオーバーする周波数は、材料に固有な緩和時間（τ）に対応する。
【０１４２】
損失正接：ｔａｎ（δ）＝Ｇ’’／Ｇ’は、エネルギー損失と貯蔵のバランスを数値化する。ｔａｎ（４５°）＝１の場合、ｔａｎ（δ）の値が１より大きい場合は、「液体」特性が高く、１より小さい場合は粘度に関係なく「固体」特性が高いことを示す。
【０１４３】
膨潤度：ポリマーの膨潤の程度。線形寸法の変化または体積変化によって決まる。ほとんどのポリマーは、溶媒（水を含む）の吸収（水和）により膨潤する。
【０１４４】
II.細胞培養
さらに、本発明は、再生目的（細胞療法、免疫療法、神経変性療法など）で患者自身の細胞を培養するためのウシ胎児血清（ＦＢＳ）の代用として使用される、患者自身の血液または骨髄から多血小板血漿、血清または単核細胞の標準化された調製物を製造するための非常に革新的で効率的で迅速かつ再現性のあるＧＭＰ医療デバイスを提供する。
【０１４５】
本発明は、異種遊離状態での細胞療法用途のためのＦＢＳの代わりに細胞培養培地サプリメントとして使用される自家多血小板血漿（ＰＲＰ）または血清を調製するための医療デバイスを提供する。
【０１４６】
治療用途の細胞培養は、ＧＭＰ条件で製造された認定済みデバイスを備えたＧＬＰラボで行う必要がある。本発明の医療デバイスはこれらの条件を満たす。それらは、閉回路システムでの単一ステップの遠心分離により、自家多血小板血漿または血清を迅速に調製できる。１０ｍｌの静脈血から約５．５  ｍｌのＰＲＰまたは４ｍｌの血清が得られるため、収集される血液チューブの数は、最終製品の所望の容量に到達するように調整できる。
【０１４７】
有利なことに、本発明の医療デバイスから得られるＰＲＰまたはＢＭＣは、免疫療法において使用され得る。免疫療法は、患者の免疫系の細胞を使用して、がんなどの病気と闘う治療法である。免疫療法には、さまざまな方法で機能する治療法が含まれる。一部のものは、非常に一般的な方法で体の免疫システムを高める。他のものは、免疫系をトレーニングを助け、癌細胞を特異的に攻撃させる。急速に台頭している免疫療法のアプローチは、養子細胞移入（ＡＣＴ）と呼ばれ、がんを治療するために患者自身の免疫細胞を収集して使用するものである。ＡＣＴにはいくつかの種類があるが、食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された治療法の作成に最も近いものはＣＡＲＴ細胞療法と呼ばれ、白血病及びリンパ腫の治療に希望をもたらしている。手法に関しては、Ｔ細胞は患者から収集され、実験室で再設計される。
【０１４８】
古典的には、患者の血液から単核細胞を分離するために、研究室ではフィコールパック密度勾配培地を使用している。この手法は時間がかかり、いくつかの長い遠心分離を必要とするため、細胞が損傷する可能性があるステップが多いことを意味する。
【０１４９】
本発明の特定の医療デバイスは、患者の血液または骨髄からの血液単核細胞の特異的かつ迅速な分離を可能にする。
【０１５０】
このシステムにより、患者の単核白血球（ＭＮＣ）とともにＰＲＰを準備できる。
【０１５１】
幹細胞と神経変性疾患は、私たちのイノベーションのもう一つの応用分野である。
【０１５２】
この文脈では、患者へ神経幹細胞を移植する前に、神経幹細胞を増幅するために、再生医療に多くの努力が費やされている。規定された培養培地が利用可能であるが、生体内運命とその分化については多くの問題が残った。これらの細胞の体外培養は、ニューロスフェアまたは単層のいずれかにおいて実現できる。ニューロスフェアの場合、壊死と自然発生的な分化の問題が存在するが、単層培養の場合のように、細胞が付着するためのマトリックスを必要としない。これらの２つの問題点について、本発明の細胞培養用デバイスは、単層培養のための置換マトリックスとして、またはニューロスフェア三次元培養のための栄養支持体として作用し得る。
【０１５３】
本発明は、患者の血液または骨髄からのＰＲＰ、血清またはＭＮＣの迅速、効率的かつ信頼できる標準化された調製を目的とする方法およびキットを含む。
【０１５４】
これらのデバイスは、動物の研究や治療にも適している。
【０１５５】
細胞培養に特に適したデバイス（ただし、ＰＣまたはＢＭＣの準備にも依然として使用できる）には、次の共通の特徴を有する。
i）例えばチューブまたは注射器等の容器。 好ましくは、チューブはホウケイ酸塩でできている。好ましくは、チューブはシリコーンを含み、発熱物質が除去されている。 好ましくは、チューブはストッパー付きで真空下にある。
ii）重力による細胞分離のための添加剤としての複合ニュートンポリマー。 好ましくは、複合ニュートンポリマーはチキソトロピーゲルである。 好ましくは、チキソトロピーゲルは、粘度および密度に依存する作用機序を有する大きなポリマー複合体である。 好ましくは、チキソトロピーゲルは、オリゴマーであり、好ましくは、ポリオレフィンハイドロカーボンオリゴマーまたはアクリル樹脂混合物である。チキソトロピーゲルは、ＰＥＧ−シリカゲルであってもよい。
【０１５６】
チキソトロピーゲルは、トリス（２−エチルヘキシル）ベンゼン−１，２，４−トリカルボキシレート、二酸化ケイ素、シラン、ジクロロジメチル反応生成物、および／またはシリカなどの追加の物質を含んでもよい。チキソトロープゲルはさらに、水に不溶であり、アセトンに部分的に溶解し、且つヘキサンに容易に溶解することを特徴とすることができる。さらに、チキソトロピーゲルは、粘度が、１５℃において約４００〜７００Ｐａ．ｓであり、２５℃において１００〜２５０Ｐａ．ｓであり、４５℃において３０〜１００Ｐａ．ｓであり、６５℃で１０〜８０Ｐａ．ｓであることを特徴とすることができる。
【０１５７】
細胞培養を目的として、以下のデバイスが特に適合しており、予期しない効果的な結果が得られることが実験により確認されている。
i)    添加剤として、密度が約１．０３〜約１．０５ｇ／ｃｍ３のチキソトロピーゲルを含むデバイスであり、本明細書では、ＣＣ−ＰＲＰと呼ばれる。このようなデバイスは、「純粋な」ＰＲＰの収集を可能にする。好ましくは、密度は、約１．０４〜約１．０５ｇ／ｃｍ３である。当該デバイスはさらに、添加剤として抗凝固剤、好ましくはクエン酸ナトリウムを、好ましくは０．１Ｍの濃度で含む。好ましくは、当該デバイスはこれらの２つの添加剤、すなわちチキソトロープゲルおよび抗凝固剤のみを含む。チキソトロピーゲルは、好ましくは、デバイスにおいて、例えばチューブの閉じた端から、第１層として存在し、抗凝固剤からなる第２層がこれに続く。有利なことに、このようなデバイスは、ＲＢＣおよび多核細胞を除くＰＣまたはＢＭＣ、単核白血球（ＭＮＣ）のないＰＣまたはＢＭＣ、白血球除去ＰＲＰ、ＰＣまたはＢＭＣの迅速な調製を可能にする。
ii)   添加剤として、密度が約１．０５〜約１．０９５ｇ／ｃｍ３のチキソトロープゲルを含むデバイスであり、ここでは、ＭＣ−ＰＲＰと呼ばれる。有利なことに、そのようなデバイスは、患者の血液または骨髄からの血液単核細胞の特異的かつ迅速な分離を可能にする。有利なことに、そのようなデバイスは、患者の単核白血球（ＭＮＣ）、白血球リッチなＰＣ、ＢＭＣまたはＰＲＰとともに、ＰＲＰ、ＰＣまたはＢＭＣの準備を可能にする。好ましくは、密度は、約１．０８〜約１．０９ｇ／ｃｍ３、または１．０７５〜約１．０９ｇ／ｃｍ３である。最も好ましくは、密度は約１．０７５〜約１．０８ｇ／ｃｍ３である。当該デバイスはさらに、添加剤として抗凝固剤、好ましくはクエン酸ナトリウムを、好ましくは０．１Ｍの濃度で含む。好ましくは、当該デバイスはこれらの２つの添加剤、すなわちチキソトロピーゲルおよび抗凝固剤のみを含む。チキソトロピーゲルは、好ましくは、デバイスにおいて、例えばチューブの閉じた端から、第１の層として存在すし、抗凝固剤からなる第２層がこれに続く。
iii)  添加剤として、密度が約１．０３〜約１．０５ｇ／ｃｍ３のチキソトロピーゲルのみを含むデバイスであり、本明細書では、ＣＣ−Ｓと呼ばれる。有利なことに、このようなデバイスは、トロンビン血清の迅速な調製を可能にする。
iv)  本明細書でＣＣ−ＨＡと呼ばれる、デバイスであり、以下を添加剤として含有するデバイス。
a.   密度が約１．０３〜約１．０５ｇ／ｃｍ３のチキソトロピーゲル、または上記のｉ）で述べたチキソトロピーゲル、
b.   好ましくは０．１Ｍの濃度の抗凝固剤、好ましくはクエン酸ナトリウム、および
c.   ヒアルロン酸。ヒアルロン酸は、架橋されていなくても、架橋されていてもよい。好ましくは、ヒアルロン酸は、約１５００Ｋｄａの分子量を有し、約１．５％〜約２％、好ましくは約２％である。ヒアルロン酸は、本明細書に記載の方法から得られる架橋ヒアルロン酸であってよい。分子量は５００ＫＤａ〜９０００ＫＤａの範囲である。
好ましくは、当該デバイスはこれらの３つの添加剤、すなわちヒアルロン酸、チキソトロピーゲルおよび抗凝固剤のみを含む。ヒアルロン酸は、好ましくは、デバイスにおいて、例えばチューブの閉じた端から、第１層として存在し、チキソトロープゲルからなる２番目の層、抗凝固剤からなる３番目の層がこれに続く。有利なことに、このようなデバイスは、ＨＡと組み合わせたＰＣまたはＢＭＣの迅速な準備を可能にする。ＨＡは別の生体材料に置き換えることができる。
v)   本明細書でＭＣ−ＨＡと呼ばれるデバイスであり、以下を添加剤として含有する。
d.   密度が約１．０５〜約１．０９ｇ／ｃｍ３のチキソトロピーゲル、または上記のポイントｉｉ）で述べたチキソトロピーゲル、
e.   好ましくは０．１Ｍの濃度の抗凝固剤、好ましくはクエン酸ナトリウム、および
f.    ヒアルロン酸。ヒアルロン酸は、架橋されていなくても、架橋されていてもよい。好ましくは、ヒアルロン酸は、約１５００Ｋｄａの分子量を有し、約１．５％〜約２％、好ましくは約２％である。ヒアルロン酸は、本明細書に記載の方法から得られる架橋ヒアルロン酸であってよい。分子量は５００ＫＤａ〜９０００ＫＤａの範囲である。
好ましくは、当該デバイスはこれらの３つの添加剤、すなわちヒアルロン酸、チキソトロピーゲルおよび抗凝固剤のみを含む。ヒアルロン酸は、好ましくは、デバイスにおいて、例えばチューブの閉じた端から、第１層として存在し、チキソトロープゲルからなる２番目の層、抗凝固剤からなる３番目の層がこれに続く。有利なことに、このようなデバイスは、ＨＡと組み合わせたＰＣまたはＢＭＣの迅速な準備を可能にする。ＨＡは別の生体材料に置き換えることができる。
【０１５８】
抗凝固剤は、０．１Ｍとは異なる濃度であってよく、０．０５〜０．１５Ｍの範囲、または好ましくは０．０８Ｍ〜０．１４Ｍの範囲、または０．０８Ｍ超、好ましくは０．０９Ｍ超の濃度であってよい。
【０１５９】
得られる密度（重力と呼ばれる場合もある）は、約２５℃の温度で測定されている。
【０１６０】
これらのデバイスから生成された血液製剤は、単独または組み合わせて使用でき、製品、組成物は、細胞療法の研究／治療に使用できる。
【０１６１】
細胞培養において、上記のデバイスの組み合わせは、特定の利点を備えた予期しない結果をもたらした。
【０１６２】
ＣＣ−Ｓ＋ＣＣ−ＰＲＰ：ＣＣ−Ｓに存在する自家トロンビンは、ＰＲＰ製剤の凝固を再活性化し、血小板が捕捉されたフィブリンマトリックスの形成を可能にする。
ＣＣ−Ｓ＋ＭＣ−ＰＲＰ：ＰＲＰ：ＣＣ−Ｓに存在する自家トロンビンは、ＰＲＰ製剤の凝固を再活性化し、単核細胞と血小板が閉じ込められているフィブリンマトリックスを形成を可能にする。
ＣＣ−ＰＲＰ＋ＭＣ−ＰＲＰ：２つの異なる製剤からのＰＲＰを組み合わせ、ＭＣ−ＰＲＰデバイスにより、特異的に分離された単核細胞とともに、その成長効果を最大化する。
ＣＣ−ＨＡ：細胞培養に適した所定の密度で、同じ製剤におけるＰＲＰとヒアルロン酸を組み合わせることを可能にする、単一のデバイス。
【０１６３】
本発明は、任意の装置またはそれらの組み合わせから得られる血小板溶解物を包含する。
【０１６４】
ＣＣ−ＰＲＰから生成された製剤から、下記プロトコルに従って血小板溶解物を作成できる。調製直後に、ＰＲＰ調製物を、さらなる操作をせずに、少なくとも−２０℃まで凍結する。使用するためには、ヒト血小板溶解物（本明細書ではＨＰＬと呼ばれる）を、氷塊が消えるまで３７℃（ウォーターバス）で解凍する。ＨＰＬは温めない。
【０１６５】
本発明は、血液または骨髄から得られるＣＣ−ＰＲＰ、ＭＣ−ＰＲＰ、ＣＣ−Ｓ、ＣＣ−ＨＡまたはそれらの任意の組み合わせを包含する。
【０１６６】
技術の組み合わせ
本発明は、以下の組み合わせを包含するが、これらに限定されない。
【０１６７】
−血液からのＣＣ−ＰＲＰ＋ＭＣ−ＰＲＰ
−骨髄からのＣＣ−ＰＲＰ＋ＭＣ−ＰＲＰ
−ＣＣ−ＰＲＰ＋同じ患者からの分離細胞（ケラチノサイト、線維芽細胞、骨髄、骨膜または角膜細胞、メラノサイトおよびランゲルハンス細胞、脂肪細胞、筋細胞（筋芽細胞、衛星細胞）、骨芽細胞、軟骨細胞、臍帯細胞、シュワン細胞、腱細胞、異なる起源の間葉系幹細胞）
−ＣＣ−ＰＲＰから取得したＨＰＬ＋血液からのＭＣ−ＰＲＰ
−ＣＣ−ＰＲＰから取得したＨＰＬ＋骨髄からのＭＣ−ＰＲＰ
−ＣＣ−ＰＲＰから取得したＨＰＬ＋同じ患者からの分離細胞（ケラチノサイト、線維芽細胞、骨髄、骨膜または角膜細胞、メラノサイトおよびランゲルハンス細胞、脂肪細胞、筋細胞（筋芽細胞、衛星細胞）、骨芽細胞、軟骨細胞、臍帯細胞、シュワン細胞、腱細胞、異なる起源の間葉系幹細胞）
−血液からのＣＣ−Ｓ＋ＭＣ−ＰＲＰ
−骨髄からのＣＣ−Ｓ＋ＭＣ−ＰＲＰ
−ＣＣ−Ｓ＋同じ患者からの分離細胞（ケラチノサイト、線維芽細胞、骨髄、骨膜または角膜細胞、メラノサイトおよびランゲルハンス細胞、脂肪細胞、筋細胞（筋芽細胞、衛星細胞）、骨芽細胞、軟骨細胞、臍帯細胞、シュワン細胞、腱細胞、異なる起源の間葉系幹細胞）
−血液からのＣＣ−Ｓ＋ＣＣ−ＰＲＰ＋ＭＣ−ＰＲＰ
−骨髄からのＣＣ−Ｓ＋ＣＣ−ＰＲＰ＋ＭＣ−ＰＲＰ
−同じ患者からのＣＣ−Ｓ＋ＣＣ−ＰＲＰ＋分離細胞（ケラチノサイト、線維芽細胞、骨髄、骨膜または角膜細胞、メラノサイトおよびランゲルハンス細胞、脂肪細胞、筋細胞（筋芽細胞、衛星細胞）、骨芽細胞、軟骨細胞、臍帯）臍帯細胞、シュワン細胞、腱細胞、異なる起源の間葉系幹細胞）
−ＣＣ−ＨＡ＋血液からのＭＣ−ＰＲＰ
−ＣＣ−ＨＡ＋骨髄由来のＭＣ−ＰＲＰ
−ＣＣ−ＨＡ＋同じ患者かのら分離細胞（ケラチノサイト、線維芽細胞、骨髄、骨膜または角膜細胞、メラノサイトおよびランゲルハンス細胞、脂肪細胞、筋細胞（筋芽細胞、衛星細胞）、骨芽細胞、軟骨細胞、臍帯細胞、シュワン細胞、腱細胞、異なる起源の間葉系幹細胞）
−血液からのＭＣ−ＨＡ＋ＭＣ−ＰＲＰ
−骨髄からのＭＣ−ＨＡ＋ＭＣ−ＰＲＰ
−ＭＣ−ＨＡ＋同じ患者からの分離細胞（ケラチノサイト、線維芽細胞、骨髄、骨膜または角膜細胞、メラノサイトおよびランゲルハンス細胞、脂肪細胞、筋細胞（筋芽細胞、衛星細胞）、骨芽細胞、軟骨細胞、臍帯細胞、シュワン細胞、腱細胞、異なる起源の間葉系幹細胞）
【０１６８】
細胞培養には、自家または同種のＰＲＰを使用できる。
【０１６９】
さらに、アルブミンゲルは、細胞培養のための支持体またはマトリックスとして使用され得る。アルブミンゲルは、細胞培養培地を中央にして、単層または二層で（サンドイッチ状で）使用することができる。
【０１７０】
これらの製剤を単独または組み合わせて使用できる治療分野の要約：
−細胞療法：疾患の治療のための細胞療法における幹細胞、多能性細胞、またはリプログラむされた成体細胞を使用するには、ｅｘ  ｖｉｖｏ（生体外）条件で細胞を成長させる必要がある。ＣＣ−ＰＲＰとＣＣ−Ｓは、自家細胞療法においてＦＢＳに取って代わる効率的な製品である。治療分野には、再生医療、皮膚、創傷治癒、創傷ケア、組織再生、美容および形成外科処置における皮膚充填、スキンケア、筋骨格（ＭＳＫ）、肝臓再生、ウロギネコロジーおよび血管新生が含まれるが、これらに限定されない。
−組織工学：損傷した組織の再生には、患者自身の細胞が増殖でき、各組織型の生物学的機能を維持できる足場材の作成が必要となる。細胞培養製品（ＣＣ−ＰＲＰとＣＣ−Ｓの組み合わせ）は、細胞増殖と組織再生をサポートする成長因子が豊富な３次元フィブリン足場材を形成する。
−免疫療法：がんと闘う戦うためにリンパ球を使用するには、リンパ球を患者自身の体から採取する必要がある。その後、リンパ球は患者に再注入される前に、生体外で活性化される。ＭＣ−ＰＲＰを使用すると、免疫療法で使用するリンパ球を迅速かつ簡単に分離できる。
【０１７１】
有利なことに、本発明の細胞培養のためのデバイスは、患者の血液または骨髄からの血液単核細胞の特異的かつ迅速な分離を可能にする。即ち、細胞培養チューブ技術である。
【０１７２】
本発明はまた、以下の構成要素を含み得る医療デバイス（キットと呼ばれ得る）を提供する。
ｉ）ＣＣ−ＰＲＰの場合：
キットは６×ＣＣ−ＰＲＰチューブ（１０ｍｌ）
チューブの内容
−セパレーターゲル
−クエン酸ナトリウム（抗凝固剤）
ｉｉ）ＭＣ−ＰＲＰの場合：
６×ＭＣ−ＰＲＰチューブ（１０ｍｌ）
ｉｉｉ）ＣＣ−Ｓの場合：
キットは６×ＣＣ−Ｓチューブ（１０ｍｌ）を含む
【０１７３】
キットには、次の材料がさらに含まれる場合がある。
−採血付属部品セット
−水平ヘッド（スイングバケット）または４５°の固定ローター遠心分離機。
【０１７４】
有利なことに、本発明の装置を用いて以下の結果が得られる。
ＣＣ−ＰＲＰ：血小板回収率：８０％、血小板濃縮係数：１．６ｘ
ＭＣ−ＰＲＰ：血小板回収率：９５％、血小板濃縮係数：１．７ｘ、単核球の回収を含む。
【０１７５】
有利なことに、本発明のデバイスは炎症反応を誘発しない。
【０１７６】
ＣＣ−Ｓの有利な点は、栄養因子をもたらし、自己由来のトロンビンをももたらし、血小板ゲルを作ることである。ＣＣ−Ｓとの組み合わせにより、驚くべきことに、細胞の３Ｄ培養用のマトリックスまたは２Ｄ培養用のディッシュをコーティングするマトリックスが可能となり、細胞付着と細胞型分化が改善される。
【０１７７】
本発明のデバイスは、特に、例えば培養用のマトリックス、支持体または足場材等の形成を伴う３Ｄ培養に適している。
【０１７８】
当該デバイスは、合成コポリマー、セラミックおよびガラス−セラミック、自然および合成材料のバイオ人工ブレンドと置換および／または組み合わせることができる。
【０１７９】
実施例は、本発明を例示するために提案されているが、決して本発明を限定するものではない。
【０１８０】
実施例
実施例１−ヒアルロン酸
本明細書に記載の方法を使用して、架橋ヒアルロン酸（本明細書ではＸＬＨＡとも呼ばれる）は、細菌発酵ＨＡから出発して合成され、以下の仕様の製品が得られた。
１．ＨＡの最大含有率２％
２．最大２０％の架橋
３．複素粘度の最高値として６０Ｐａ．ｓ
４．残留ＢＤＤＥの最大濃度２ｐｐｍ
５．カニューレ２２Ｇ１／２または２７Ｇ１／２で簡単に注射可能
【０１８１】
ＢＤＤＥ汚染の少ないヒアルロン酸を得るために、いくつかの実験が行われた。驚くべきことに、本発明の方法は、以前の既知の方法よりも工程が少なく、はるかに高速で費用効率が良いにもかかわらず、ＢＤＤＥ汚染がほとんどなかった。
【０１８２】
有利なことに、以下の仕様の架橋ＨＡも得られた。
−発酵により得られたＨＡからの架橋ヒアルロン酸。
−架橋率：１０−５０％
−架橋剤：基本的な条件でのＢＤＤＥ
−架橋ＨＡ再吸収時間：３〜４か月（吸収可能な製品の範囲＝３〜６か月）
−ＨＡ濃度：２％
−ＢＤＤＥ残留物：＜２ｐｐｍ
−均質なゲル
−粘弾性ゲル
−カニューレ２２Ｇ１／２または２７Ｇ１／２で簡単に注射可能
−複素粘度：注射器で最大６０Ｐａ．ｓ
−弾性：最大５０％
−局所的過架橋による「きらめき」がない
−架橋ＨＡは、遠心分離後に分離ゲルの上に遊走するために、密度を分離ゲルよりも低くする必要がある
−ＰＲＰ＋ＨＡまたはＢＭＣ＋ＨＡの調製用チューブ（ＨＡはＰＲＰまたはＢＭＣと簡単に混合できる）および注射器２ｍｌおよび３５ｍｌで使用できる
−ＩＳＯ  １０９９３に準拠した生体適合性
−蒸気による滅菌
−非発熱性
−製造プロセスは再現可能で安定している
【０１８３】
ＨＡ繊維とパウダーの両方が非ＸＬＨＡの製造に使用されており、それらの水和のはが異なっていた。
【０１８４】
生成されたバッチごとに、残留ＢＤＤＥの量が決定され、架橋率の計算の分析が必要であった。
【０１８５】
２つの異なる合成は、２つの異なる量のＢＤＤＥを意味するため、２つの異なる最終架橋率％が実行されていた。ＸＬ製品の調製には、自転／公転混和及びポーチが使用されていた。
【０１８６】
ＸＬＨＡを製造するための、プロセスの自動化に適した連続ワンポット法が本明細書に開示されている。有利なことに、この方法は、粘度を調整可能にする。有利なことに、分子量は、最終用途に応じてプロセスの最初に選択されるが、特定の最終値に到達する必要がある濃度についても同様であり、目的の値に到達するために、すべてのプロセスが事前に計画される。
【０１８７】
このプロセスを使用して、いくつかのバッチが作成された。
【０１８８】
図１に示すように、最初のフェーズは繊維／粉末の水和である。
１）ポリマー繊維／粉末は反応器に移され、そして反応器が閉じられる。次に、溶媒を、供給容器を撹拌しながら、濾過しながら加える（２２０μｍ）。別の方法として、反応器がすでに閉じている状態で、固体吹出口を使用して粉末を加え、その後上記のようにして溶媒を加える。
２）混合物を均質化した後、架橋剤を含む塩基性溶液を添加し、ｐＨを測定する。
３）次に、温度を５０℃まで上げる。２時間後、混合物を室温に戻す。
４）中和ステップは酸の添加により行われる。濾過しながら、ＰＢＳ中のＨＣｌ溶液を、供給容器を通して加える。ｐＨをチェックして、生理学的条件に到達したことを確認する。中性のｐＨ下では、ヒドロキシル基のプロトン化が低下し、反応性が低下するため、ＨＡの反応性はすでに低下している。
５）混合物を４℃で一晩撹拌し続け、このフェーズの最後にｐＨを再度チェックする。低温下でも、システムの反応性が低下し、さらなる架橋なしに完全な均質化が可能となる。
６）最後に、混合物を室温に戻し、一定量の非架橋ＨＡを加えて、分離ゲルを維持しＰＲＰと混合するのに必要な粘度を得る。ポリマーは供給容器を通して加えられ、完全に均質化されるまで攪拌される。
７）この時点でゲルはろ過された状態で収集される（２８０μｍ）。
【０１８９】
図1を参照。
このようにして、合成プロセス全体が、ゲルを汚染の可能性にさらすことなく閉鎖環境で実行される。連続したプロセスにより、プロセス全体で合成混合物の均質化が向上し、操作がゼロに削減されるため、時間は常に短くなる。
【０１９０】
プロセスの最終段階は、透析による精製である。この方法は、同じ溶媒に溶解するサイズの異なる分子を分離できるため、広く使用されている。精製中、未反応のＢＤＤＥは透析膜を通過することにより除去されるが、一方で、水が入り、ポリマーがさらに膨潤する。最終濃度に達し、残留ＢＤＤＥはすでに微量に存在するが、滅菌後にさらに減少する。
【０１９１】
実際、残留ＢＤＤＥの量は、さまざまな膜でさまざまな温度で製造および精製され、さらに滅菌または脱気されたすべてのバッチに対してテストされている。
【０１９２】
得られたＸＬＨＡは、ヒアルロン酸と組み合わせてＡ−ＰＲＰを調製するための医療デバイスの製造に有利に使用され得る。
【０１９３】
以下は、本発明による架橋ＨＡを調製する方法の一実施形態である。
【表１】
2021515088.tif 000011
【０１９４】
本発明による架橋ＨＡの調製に使用される材料を要約して図２に示す。
【０１９５】
【表２】
2021515088.tif 000012
【０１９６】
好ましい実施形態では、本発明は、タービュラーの代わりに「ワンポット」システムを使用する。 さらに、アンカー攪拌装置または容器が、インペラの代わりに使用されることが好ましい。 アンカー攪拌器は、ＨＡ組成物の特性を改善する。 驚くべきことに、「ワンポット」溶液は、ヒアルロン酸の調製に使用した場合、以下の多くの利点をもたらすことが分かった。
【表３】
2021515088.tif 000013
【０１９７】
注：プロセス自体において言及される、考慮される時間と操作には、溶媒の調製は含まれず、単純化のために加熱と冷却の時間は等しいと見なされる。
【０１９８】
【表４】
2021515088.tif 000014
【０１９９】
例１Ａ  ―非架橋ＨＡおよびＢＤＤＥを架橋剤として開始する、架橋（ＸＬ）ヒアルロン酸（ＨＡ）の合成
【０２００】
主題：Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＭａｔｒｉｘＴＭ（ＨＡ＋ＰＲＰ）製品の後継としてのＲｅｇｅｎ  ＭａｔｒｉｘＴＭ製品の合成と開発。［ＰＲＰ＋ＸＬＨＡ］混合物（溶液など）の調製、スキンケアおよび関節保護に用いるための、ＯＮＥ  ＰＯＴ反応で合成されたＸＬＨＡを含むＲｅｇｅｎ  ＭａｔｒｉｘＴＭチューブ（および／または注射器）の開発。
【０２０１】
実施例１Ａ：まとめ
架橋ヒアルロン酸（ＸＬＨＡ）は、細菌発酵ヒアルロン酸（ＨＡ）から合成され（この特定の合成では、ＨＡはポリアニオン型であり、ナトリウム塩として存在する）、下記の特定の特性を有する製品が得られる。
ＨＡの最大含有量２％（例えば、ＷＯ２００４／０１４３９９  Ａ１、「無菌の高分子量ヒアルロン酸製剤の調製方法」を参照）；
架橋度最大２０％（例えば、Ｊｅｏｎ、Ｏ．、ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、７０、（２００７）、２５１―２５７を参照）；
複素粘度の最高値として６０Ｐａ．ｓ（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｈｅｏｓｅｎｓｅ．ｃｏｍ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ／ｄｒｕｇ−ｉｎｊｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ、および／またはＮｉｃｈｏｌｌｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ：Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ＭｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌＤｉｓｏｒｄｅｒｓ，（２０１８）、１１、１―５を参照）；
残留ＢＤＤＥの最大濃度２ｐｐｍ（例えば、Ｄｅ  Ｂｏｕｌｌｅ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｕｒｇ．，２０１３；３９：１７５８―１７６６を参照）；
型／ゲージ２２Ｇ１／２または２７Ｇ１／２のカニューレ（針）で簡単に注射可能。
【０２０２】
製剤用に選択されたパラメーターは、ＲｅｇｅｎＬａｂＴＭによってすでに製造されたＣｅｌｌｕｌａｒ  ＭａｔｒｉｘＴＭチューブ、すでに文献で報告されているデータ、およびＲｅｇｅｎｌａｂＴＭ内ですでに実施された非ＸＬＨＡの製造に基づいている。
【０２０３】
この実施例１Ａでは、参考文献、提案された合成装置、および計画及び実行された合成実験や試験に関して、研究開発中に実行されたアクティビティを報告する。
【０２０４】
ＨＡ繊維とＨＡパウダーは、非ＸＬ  ＨＡの製造と異なる水和品質のためにＲｅｇｅｎ  ＬａｂＴＭによってすでに選択されているため、どちらも出発原料として使用される。合成の観点からは、ＨＡ繊維とＨＡ粉末の間にはほとんどまたはまったく差がないと考えられている（ただし、ＨＡ粉末が好ましくはより長い水和時間が必要である場合を除く）。なぜなら、ＭＷが実質的に同じ範囲内にある場合、両者の反応性および試薬間の比率は変化しないと考えられているからである。
【０２０５】
開発を進めている間に、ＨＡ繊維はその入手容易性から、より頻繁に合成に使用されるようになっている。合成を目的として、分子量が実質的に同じ範囲（好ましくは、約１５００ＫＤａ）になり、水和フェーズが完了すると、使用されるＨＡは結果に影響を及ぼさなくなるとが判明した。
【０２０６】
製造されたＸＬ  ＨＡの各バッチについて、ＸＬ  ＨＡ製品中の残留ＢＤＤＥの量（濃度）を決定できるまたは決定されている。そして、ＸＬ  ＨＡ製品の架橋のパーセンテージを計算できるような分析も実行できるまたは実行されている。
【０２０７】
実施例１Ａ：はじめに
ヒアルロン酸（「ＨＡ」、ヒアルロナンとも呼ばれる）は、［Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン］の二糖単位の繰り返し（１、２、３以上）を含む糖類（特にグリコサミノグリカン）（例えば、以下の構造１Ａ１を参照）である。
【０２０８】
生理学的ｐＨでは、ＨＡは通常、ポリアニオン性ポリマー（例えばオリゴマー）として存在し、Ｄ−グルクロン酸部分内のカルボン酸（ＣＯＯＨ）基の一部またはすべて（通常はほとんどまたはすべて、より一般的には実質的にすべて）が脱プロトン化されている（つまり、カルボキシレート基として存在する）。好ましくはおよび／または通常、例えば、生理学的ｐＨおよび／または条件下で、ＨＡは、少なくとも部分的に（典型的にはほとんどが）ナトリウム塩として存在し、典型的には、ＨＡのカルボキシレート／ポリカルボキシレート形態のナトリウム塩として存在する。ＨＡのこの好ましいおよび／または一般的なアニオン／ポリアニオン（例えば、カルボキシレート／ポリカルボキシレート）形態およびそのナトリウム塩は、以下の構造１Ａ１に示す二糖構造として表される（Ａｈｍｅｔ  Ｔｅｚｅｌ＆Ｇｌｅｎｎ  Ｈ．Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎから再現）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２００８；  １０：３５―４２）。
【化５】
2021515088.tif 000015
【０２０９】
構造  １Ａ１： ヒアルロン酸（ＨＡ）モノマー（Ｎ＝１）および／またはＨＡポリマー（Ｎ＞１）の典型的な構造（Ａｈｍｅｔ  Ｔｅｚｅｌ＆Ｇｌｅｎｎ  Ｈ．Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙから再現）、２００８；１０：３５―４２）。文脈上そうでないことを明確に示さない限り、本明細書で定義される「ポリマー」は、その範囲内に「オリゴマー」を含み、独立して、「ポリ−」はその範囲内に「オリゴ−」を含む。ＨＡポリマーが好ましく（Ｎ＞１、好ましくはＮ＝２〜２５０００以上）、ＨＡモノマーはあまり好ましくない。  上記の化学構造では、ＨＡは、ＨＡの脱プロトン化されたカルボキシレートまたはポリカルボキシレートの形態のナトリウム塩の形態で示されているが、「ＨＡ」という用語でカバーされる構造はこの構造だけではない。
【０２１０】
本明細書で定義される「ヒアルロン酸」（「ＨＡ」）は、上記構造１Ａ１のカルボン酸形態および／またはポリカルボン酸形態を含み、独立して、任意の塩の形態を含み、特に、上記構造１Ａ１の任意のアニオン性（好ましくはポリアニオン性）塩の形態（特に、上記構造１Ａ１の任意の薬学上許容される金属および／またはアンモニウムおよび／または有機アンモニウム塩）、好ましくは、上記構造１Ａ１の薬学上許容されるアルカリ金属塩および／またはアルカリ土類金属塩、より好ましくは上記構造１Ａ１のリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよび／またはマグネシウム塩）を含む。
【０２１１】
好ましくは、本明細書で定義される「ヒアルロン酸」（「ＨＡ」）は、上記構造１Ａ１のカルボン酸形態および／またはポリカルボン酸形態を含み、独立して、上記の構造１Ａ１のカルボン酸および／またはポリカルボン酸および／またはポリアニオンの任意の塩（例えば、上記で挙げた塩のいずれか、より好ましくは、上記の構造１Ａ１のリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、および／またはマグネシウム塩）の形態を含む。
【０２１２】
同様に、本明細書で定義されるように、「架橋ヒアルロン酸」（「ＸＬＨＡ」または「ＸＬ  ＨＡ」）は、例えば本明細書において一般式で定義されるＸＬＨＡ構造（例えば、上記および／または下記の構造１Ａ４（Ａ）および／または１Ａ４（Ｂ）を参照）のカルボン酸形態および／またはポリカルボン酸形態を含み、独立して、例えば本明細書において一般式で定義されるＸＬＨＡ構造（例えば、上記および／または下記の構造１Ａ４（Ａ）および／または１Ａ４（Ｂ）を参照）の任意の塩の形態、特に任意のアニオン性（好ましくはポリアニオン性）塩の形態（例えば、ＨＡについて上記に挙げた塩のいずれか）を含む。
【０２１３】
好ましくは、本明細書で定義される「ＸＬＨＡ」は、例えば本明細書で一般式で定義されるＸＬＨＡ構造（例えば、本明細書の構造１Ａ４（Ａ）および／または１Ａ４（Ｂ）を参照）のカルボン酸形態および／またはポリカルボン酸形態を含み、独立して、例えば本明細書で一般式で定義されるＸＬＨＡ構造（例えば、本明細書の構造１Ａ４（Ａ）および／または１Ａ４（Ｂ）を参照）のカルボキシレート形態および／またはポリカルボキシレート形態および／またはポリアニオン性形態の任意の塩（特に、任意の薬学上許容される金属および／またはアンモニウムおよび／または有機アンモニウム塩、好ましくは任意の薬学上許容されるアルカリ金属塩および／またはアルカリ土類金属塩、より好ましくは、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよび／またはマグネシウム塩）の形態を含む。
【０２１４】
生体内では、ＨＡは皮膚、関節の滑液、目の硝子体液、軟骨内の足場など、人体のさまざまな部分に生成され、存在する。
【０２１５】
ＨＡは生理的ｐＨにおいてポリアニオン性ポリマーであるため、高帯電である。非常に溶けやすく、水に広く結合できるのは、まさにこの理由によるものである（例えば、Ｋａｂｌｉｋ、Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｕｒｇ．，２００９；３５：３０２―３１２を参照）。体重７０ｋｇのヒトに存在するＨＡの平均量は約１５ｇであり、その３分の１が毎日分解および／または合成される。分解プロセスは非常に重要であり、ヒアルロヒドラーゼと呼ばれる酵素のクラス、特に細胞膜とリソソームにそれぞれ付着しているＨＹＡＬ  １およびＨＹＡＬ  ２によって実行される。最初に、ＨＹＡＬ  ２は、通常１ＭＤａを超えるポリマーを２０  ＫＤａのフラグメントに分解し、次にＨＹＡＬ  １はフラグメントを四糖に切断する。四糖はさらに加水分解されてモノマーから除去される（例えば、Ｊｅｏｎ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，７０，（２００７），２５１―２５７）。
【０２１６】
ＨＡが化学修飾されて、鎖が相互に接続された（相互接続された）ポリマーが得られた場合、この化学修飾されたポリマーは、「架橋ヒアルロン酸」（ＸＬＨＡ）と呼ばれる（例えば、Ａｈｍｅｄ，ＥＭ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１５）、６、１０５−１２１を参照）i。
【０２１７】
ＸＬＨＡは、アモルファスネットワークを持つハイドロゲル（親水性ゲル）であり、多数の薬剤を用いて架橋できる。生物医学的用途に最も使用されている（Ｊｅｏｎ、Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，７０，（２００７），２５１―２５７を参照）である。ＢＤＤＥの構造を以下に示す。最も重要なのは、この構造には、２つのエポキシド基が含まれており、直鎖状の有機分子の両端にそれぞれ存在する。
【化６】
2021515088.tif 000016
１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）の構造
【０２１８】
ジエポキシド架橋剤（架橋剤）の好ましい一般的な構造、好ましくは架橋ＨＡでの使用に適したものを以下に示す。
【化７】
2021515088.tif 000017
【０２１９】
上記の一般的なジエポキシド架橋剤（架橋剤）［構造１Ａ３］において、「［リンカー］」として示される図示されたリンカーは、好ましくは有機リンカー部分であり、および／または好ましくはＨＡポリマーを架橋するのに適した長さおよび／または構造、例えばＨＡポリマーを、その−ＯＨ基で架橋するのに適した長さおよび／または構造である。好ましくは、［リンカー］は、長さが２〜２０原子（好ましくは３〜１２原子、例えば４〜８原子、例えば６原子）の鎖を含む。（鎖は好ましくは直鎖状であるが、必要に応じて分岐させることもできる。）より好ましくは、［リンカー］は、長さが２〜２０（または３〜１２、または４〜８、例えば６）原子の鎖（好ましくは直鎖）を含み、前記鎖状原子は、鎖状炭素原子を含み（例えば、‐ＣＨ２−または‐ＣＨＭｅ−または‐ＣＭｅ２−基（Ｍｅ＝メチル基）として）、必要に応じて、鎖状原子は、１、２、３または４個の鎖状酸素、鎖状硫黄および／または鎖状窒素原子も含む（好ましくは、鎖状原子は、１、２、３または４個、好ましくは１または２個の鎖状酸素原子も含む）。
【０２２０】
一般的に、エポキシドは、特に適切なアルキル化条件下において、ヒドロキシル（−ＯＨ、アルコール）基などの求核基と反応できるアルキル化剤（および求電子剤）である。
【０２２１】
ｐＨ条件に応じて、ＨＡ分子は異なる挙動を示す。一般的に、ＢＤＤＥは、下記のように、ｐＨに応じて、ＨＡのカルボン酸基よりもＨＡのアルコール基と反応することを好む（Ｌ．Ｋｅｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，９１，（２０１３），４１０−４１８を参照）。
【０２２２】
・ＨＡが高いｐＨ値、特にＨＡのヒドロキシル基のｐＫａ値（ｐＫａは約１０）より高い（好ましくはｐＨ単位が１以上、または２以上、または２．５以上または３以上高い）ｐＨ値（好ましくは約ｐＨ＞１３）に曝されている場合、後者はほとんどすべて脱プロトン化されているため、このようなｐＨにも存在するＨＡの脱プロトン化カルボキシレート基よりも求核性が高くなる。したがって、このような高いｐＨ値では、架橋剤、好ましくはＢＤＤＥのエポキシド基は、ＨＡのヒドロキシル基と優先的に反応してエーテル結合を形成する。
・ｐＨがヒドロキシル基のｐＫａ値よりも低い場合、ＨＡのヒドロキシキル基の脱プロトン化される量または割合は少なくなり、ＨＡのアニオン性カルボキシレート基が、ＨＡの支配的なアニオンになる。これらの条件により、架橋剤のエポキシド基とＨＡの（主に）アニオン性カルボキシレート基が反応し、エステル結合の形成が促進される。
【０２２３】
架橋反応後、ＢＤＤＥは異なる化学状態で存在する可能性がある。以下の構造スキーム１Ａ２に示されるように、特に高ｐＨで、架橋剤（ここでは、ＢＤＤＥ）は、ＨＡ骨格中の第一級アルコール基（すなわち、−ＣＨ２−ＯＨ）と優先的に反応する。最終的な架橋ＨＡ製品にＢＤＤＥが存在する可能性のあるさまざまな状態を以下にまとめる（例えば、Ｊｅｏｎ、Ｏ．、ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、７０、（２００７）、２５１―２５７も参照）。
【０２２４】
・完全に反応した架橋剤：両端がＨＡと反応して二置換ＢＤＰＥ（構造スキーム１Ａ２における構造Ａ）を生成したＢＤＤＥ分子（例えば、Ｊｅｏｎ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，７０，（２００７），２５１―２５７および／またはＫａｂｌｉｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｕｒｇ．，２００９；３５：３０２―３１２を参照）。
・ペンダント架橋剤：一方の端でのみＨＡと反応したＢＤＤＥ分子、即ち、１つのエポキシド基のみが１つのＨＡ鎖と反応（アルキル化）している。ＢＤＤＥのもう一方の端にある２つ目のエポキシド基は、一般的に水または水酸化物と反応する。このようにして、単連結ＢＤＰＥが形成される（構造スキーム１Ａ２における構造Ｂ）（例えばＪｅｏｎ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，７０，（２００７），２５１―２５７および／またはＫａｂｌｉｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｕｒｇ．，２００９；３５：３０２―３１２を参照）。
・不活性化された架橋剤：両端で水または水酸化物と反応して遊離ＢＤＰＥ（完全に加水分解されたＢＤＤＥ）を形成するＢＤＤＥ分子（構造スキーム１Ａ２における構造Ｃ）（例えばＪｅｏｎ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，７０，（２００７），２５１―２５７および／またはＫａｂｌｉｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｕｒｇ．，２００９；３５：３０２―３１２を参照）。
・残留架橋剤：ＨＡまたは水または水酸化物と反応していないＢＤＤＥ分子（構造スキーム１Ａ２における構造Ｄ）。残留架橋剤の存在に関連するリスクは、架橋生成物の精製によりほぼ完全に排除される（例えば、Ｋａｂｌｉｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｕｒｇ．，２００９；３５：３０２―３１２を参照）。
【０２２５】
このようにして得られたＸＬＨＡの精製は、全体のプロセスにおいて重要なポイントである。なぜなら、最終的な（例えば、精製された）ＸＬＨＡ製品中において、未反応の架橋剤（例えば、未反応のＢＤＤＥ）の残留量が２ｐｐｍ未満（即ち、例えば、水性ゲル等の水性溶媒１Ｌあたり２ｍｇ未満）であることが非常に好ましいからである。
【化８】
2021515088.tif 000018
構造スキーム１Ａ２：ヒアルロン酸（ＨＡ）鎖と架橋剤ＢＤＤＥとの架橋反応を示す概略図。上記の構造スキーム１Ａ２では、ＨＡ原料は、ＨＡの一種以上のポリカルボキシナトリウム塩（脱プロトン化および／またはポリアニオン）形態で示されているが、たとえばここで定義されているように、任意の形態のＨＡが使用できる。したがって、任意の形態の架橋ＨＡを形成できる。また、異なる（非ＢＤＤＥ）ジエポキシド架橋剤をＢＤＤＥの代わりにおよび／またはＢＤＤＥと共に使用することができる。ＨＡとジエポキシド架橋剤（好ましくはＢＤＤＥ）の架橋反応中に生成された生成物Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに関して、ジエポキシド（好ましくはＢＤＤＥ）由来の４つの生成物（ＡからＤ）すべての合計は５ｍｇ／ｍＬ未満、または５，０００ｐｐｍ未満であるため、ジエポキシド（好ましくはＢＤＤＥ）の原始形態Ｄの痕跡レベル（痕跡レベルは２ｐｐｍ未満、つまり水性ゲル等の水性溶媒１Ｌあたり２ｍｇ未満））が、架橋反応の生成物（ＡからＤ）の合計において占める割合は非常に小さい。
【０２２６】
好ましい架橋ＨＡの一般的な構造の一つを以下に示すが、当該構造は、一般的なジエポキシ架橋剤（架橋剤）[  
【化９】
2021515088.tif 000019
] （構造１Ａ３であり、「リンカー」は好ましくは本明細書で定義されている）により、ＨＡポリマーを架橋することで、以下に示すような、一般的な架橋されたＨＡの構造（下記）を生成する。
【化１０】
2021515088.tif 000020
構造１Ａ４（Ａ）および１Ａ４（Ｂ）（上記）：架橋ＨＡ（ＸＬＨＡ）の好ましい一般的な構造。左側の部分構造１Ａ４（Ａ）は、一般的な架橋鎖（Ａ）を一般式で示しており、ジエポキシ架橋剤（架橋剤）（構造１Ａ３）と、２つのＨＡポリマー鎖の−ＯＨ基との反応によって形成される。右側の部分構造１Ａ４（Ｂ）は、１つのＨＡまたはＸＬＨＡポリマー鎖のみに連結された一般的な側鎖または基（Ｂ）を一般式で示しており、ｉ）一般的なジエポキシド架橋剤（構造１Ａ３）の１つのエポキシ基と、１つのＨＡポリマー鎖の−ＯＨ基との反応、およびｉｉ）単一のＨＡ結合リンカーの２つ目のエポキシ基の（例えば水または水酸化物による）加水分解によって形成される。
【０２２７】
便宜上、部分構造１Ａ４（Ａ）と１Ａ４（Ｂ）は両方とも、２つの架橋ＨＡチェーンにおいて隣接する位置に存在するように示されているが、これは説明のためのみであり、ＸＬＨＡの一種または多種の構造は、１Ａ４（Ａ）のみ、または１Ａ４（Ｂ）のみ、またはその両方を含んでいてよく、ＡとＢ型のリンカー／基間の相対距離、ＡとＢ型のリンカー／基の相対比率、ならびに架橋の％及び側基の％は、すべて可変である。
【０２２８】
架橋ＨＡの上記の一般的な構造１Ａ４（Ａ）および１Ａ４（Ｂ）において、「［リンカー］」として示される図示されたリンカーは、好ましくは有機リンカー部分であり、および／または好ましくはＨＡポリマーを架橋するのに適した長さおよび／または構造、例えばＨＡポリマーを、その−ＯＨ基で架橋するのに適した長さおよび／または構造である。  好ましくは、［リンカー］は、長さが２〜２０原子（好ましくは３〜１２原子、例えば４〜８原子、例えば６原子）の鎖を含む。（前記鎖は好ましくは直鎖状であるが、必要に応じて分岐させることもできる。）より好ましくは、［リンカー］は、長さが２〜２０（または３〜１２、または４〜８、例えば６）原子の鎖（好ましくは直鎖）を含み、前記鎖状原子は、鎖状炭素原子を含み（例えば、‐ＣＨ２−または‐ＣＨＭｅ−または‐ＣＭｅ２−基（Ｍｅ＝メチル基）として）、必要に応じて、鎖状原子は、１個、２個、３個または４個の鎖状酸素、鎖状硫黄および／または鎖状窒素原子も含む（好ましくは、鎖状原子は、１個、２個、３個または４個、好ましくは１個または２個の鎖状酸素原子も含む）。
【０２２９】
注：ＸＬＨＡの具体的な形態、および／またはＸＬＨＡの塩の形態（存在する場合）、および／または架橋鎖（例えば上記構造１Ａ４（Ａ）および必要に応じて任意の側鎖（例えば、上記の構造１Ａ４（Ｂ）中）の（ＸＬＨＡポリマー内の）位置、および／または比率またはパーセンテージは、説明目的だけの例示的構造である上記構造に示されている構造と明らかに異なっていてもよい。側鎖（例えば上記の構造１Ａ４（Ｂ）に示されている型など）は任意選択であり、ＸＬＨＡに存在しても存在しなくてもよい。架橋ヒアルロン酸（ＸＬＨＡ）には、架橋鎖（好ましくは上記の構造１Ａ４（Ａ）に示されている型のもの）がに存在する。ＸＬＨＡは、ポリアニオン（ポリカルボキシレート）の形態で、ナトリウム塩として上に表示されている。しかしながら、本発明では、ＸＬＨＡは任意の形態（例えば、ポリアニオンまたは酸またはその他）および／または任意の塩の形態であってよい。
【０２３０】
実施例１Ａ：工業生産
ＸＬＨＡは、多くの企業によって、異なるさまざまなプロセスで製造されている。得られたＸＬＨＡゲルは、主に、皮膚科治療で使用するための注射器の調製に用いられている。一般的に、使用される架橋剤（好ましくはＢＤＤＥ）の量および／または合成に採用される物理パラメーターに応じて、架橋のパーセンテージを調整でき、さまざまな粘弾性特性と滞留時間を有するゲルを生産できる。
【０２３１】
ＸＬＨＡの合成に使用されるさまざまな方法を説明したいくつかの記事と特許出願が公開されている。１９６４年にＬａｕｒｅｎｔ、Ｈｅｌｌｓｉｎｇ、およびＧｅｌｏｔｔｅによって、初めてエポキシ架橋剤を使用したＸＬＨＡの合成が報告された（Ｌａｕｒｅｎｔ、Ｔ．、Ｈｅｌｌｓｉｎｇ、Ｋ．，およびＧｅｌｏｔｔｅ、Ｂ．，「ヒアルロン酸の架橋ゲル」、Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ，（１９６４），１８（１），２７４―２７５）。ＭａｌｓｏｎおよびＬｉｎｄｑｖｉｓｔの名で、１９８６年に初めて架橋剤としてのＢＤＤＥの使用を開示した特許出願が公開された（ＷＯ  ８６／０００７９、Ｍａｌｓｏｎ、Ｔ．，およびＬｉｎｄｑｖｉｓｔ、Ｂ．，「硝子体液の代替品として使用するための架橋ヒアルロン酸のゲル」）。それ以来、他の人により、ニーズに応じてＸＬＨＡの合成が適応され、技術と装置の発展に伴って新しい合成方法が開発されてきた。
【０２３２】
例えば、Ｍｅｒｚ−Ａｎｔｅｉｓは、２００５年の特許出願に開示されている方法で合成された凝集性ＸＬＨＡに基づいて一連の製品を製造している。この時、架橋は無酸素雰囲気下で行われている（ＷＯ  ２００５／０８５３２９、Ｌｅｒｍｉｔｔｅ，Ｌ．及び  Ｂｅｎｏｉｔ，Ｏ．，「生体適合性架橋ゲル」
）。
【０２３３】
その後、次の３つの特許出願がＴｅｏｘａｎの名で公開された。
ａ）特許出願その一（ＷＯ  ２０１２／０７７０５４  Ａ１；  Ｍｅｕｎｉｅｒ、Ｓ．およびＢｏｕｒｄｏｎ，Ｆ．；「架橋ゲルの調製方法」）において、押出ステップを含んだＸＬＨＡの合成を説明している。
ｂ）特許出願その二（ＷＯ  ２０１５／０１５４０７  Ａ１；  Ｍｅｕｎｉｅｒ、Ｓ．およびＢｏｕｒｄｏｎ，Ｆ．；「ヒアルロン酸とメピバカインを含む組成物」）において、製剤における麻酔薬の使用を紹介している。
ｃ）特許出願その三（ＷＯ  ２０１０／１３１１７５  Ａ１；  Ｂｏｕｒｄｏｎ、Ｆ  ．；「架橋ゲルの調製方法」）において、変形可能なポーチを使用してゲルを均質化する新たな方法を開示している。
【０２３４】
最後に、資生堂は、回転/攪拌ミキサーを使用する方法を開示している（ＵＳ  ２０１１／００３４６８４  Ａ１、Ｙｏｋｏｋａｗａ，Ｙ．，Ｏｋａ，Ｔ．，Ｍｏｒｉ，Ｙ．及びＵｅｎｏ，Ｎ．、「架橋ヒアルロン酸ゲルの調製プロセス」）。
【０２３５】
一般的に、以前開示された架橋ポリマー（具体的にはＸＬＨＡ）の合成方法のほとんどまたはすべては、以下に示すいくつかの共通のステップを有する。
１．粉末または繊維の物理形態のポリマー（具体的には、ＨＡ）を緩衝媒体、典型的には緩衝水性媒体に溶解する、最初の水和ステップ。
２．架橋剤を添加して、特定のｐＨ条件下、特定の温度で特定の時間反応を行う架橋ステップ。
３．最終的なＸＬＨＡ製品の適用（使用）環境が人体であるという典型的な場合に必須である中和フェーズ。
４．未反応の架橋剤の量（すなわち、モル数または分子数）を除去および／または低減する（好ましくは、５０％以上、または７０％以上、または９０％以上、または９５％以上または、９９％以上を除去および／または低減する）ための精製の最後フェーズ。
【０２３６】
以前開示されたＸＬＨＡの作製方法のいくつかにおいては、例えば、必要とする最終配合と所望の特性（粘度、滞留時間および/または意図する用途などに関する）に応じて、膨潤および／または他のポリマーまたは麻酔剤の添加等の中間フェーズがいくつかの含まれる。
【０２３７】
実施例１Ａ：新製品の開発に使用するＸＬＨＡの合成
医療機器および／または医薬組成物の分野において、Ｒｅｇｅｎ  ＬａｂＴＭは、ヒアルロン酸（ＨＡ）を含む製品（医薬組成物）を製造し、特に皮膚科および／または整形外科の治療および／または予防（好ましくは人体）に用いられることが知られている。特に、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＭａｔｒｉｘＴＭ（例えば、ＷＯ  ２０１３／０６１３０９  Ａ２，Ｔｕｒｚｉ，Ａ．，「Ｎｅｗ  ａ−ｐｒｐ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅ  ＆  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｍａｃｈｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓ」を参照）は、広く使用されている製品であり、その中に含まれる２種類の活性製品、つまりＰＲＰ（多血小板血漿）とヒアルロン酸（ＨＡ）には、皮膚の若返り作用を有する（たとえば、Ｌａｎａ  ＪＦＳＤら，Ｊ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ．，２０１６；１２（２）；および／またはＵｌｕｓａｌ，ＢＧ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１７；１６（１）：１１２−１１９を参照）。
【０２３８】
これにより、本発明によるおよび／または本発明に至るアイデアが生まれ、ＸＬＨＡ（Ｒｅｇｅｎ  ＭａｔｒｉｘＴＭ）が非架橋（非ＸＬ）ＨＡに代替したＣｅｌｌｕｌａｒ  ＭａｔｒｉｘＴＭ製品の変形の開発を試みた。
特に、本発明によるこのような新たなＸＬＨＡおよび／またはＸＬＨＡ含有製品は、好ましくはいずれも次のとおりである。
（ａ）注射可能な医薬組成物の調製に用いられ、関節痛症状および／または関節可動性改善および／または他の関節関連障害（好ましくは人体における）の治療および／または予防に用いられ、好ましくは注射により投与され、より好ましくは前記治療および／または予防を必要とする関節への注射により投与され、および／または
（ｂ）注射可能な医薬組成物の調製に用いられ、真皮中層から真皮深層（好ましくは人体における）への注射により投与され、
好ましくは、
（ｂ１）萎縮性瘢痕（好ましくは外傷性および／または術後に起因する萎縮性瘢痕）の矯正および／または修正に用いられ、好ましくは人体に用いられ、および／または
（ｂ２）皮膚の脱水の治療および／または予防に用いられ、好ましくは人体に用いられ、および／または
（ｂ３）顔面のしわ（好ましくは中程度から重度の顔面のしわ）および／または鼻唇溝などのひだの解剖学的構造の矯正および／または修正に用いられ、好ましくは人体に用いられる。
【０２３９】
特に本発明によるこのような医薬組成物（および／または医療デバイス）の特性および／または調製において重要な点は、（ｉ）ＰＲＰと（ｉｉ）ＨＡ（既知のＣｅｌｌｕｌａｒ  ＭａｔｒｉｘＴＭ製品による）またはより好ましくはＸＬＨＡ（本発明による）との混合物である。
【０２４０】
特に本発明によれば、前記ゲル（好ましくはＸＬＨＡゲルおよび／またはＸＬＨＡ含有ゲル）は、（ｉ）ＰＲＰと（ｉｉ）ゲルおよび／またはＸＬＨＡの効果的および／または均一な混合物が得られる粘度を有することが非常に好ましい。好ましくは、チューブの反転が５０回以内、またはより好ましくはチューブの反転が２０回以内である。
【０２４１】
ＸＬＨＡは、粘度が高いことが知られており、特に非架橋（例えば、線形）ＨＡポリマーおよび／またはゲルの粘度と比較して粘度高いことが知られている。しかしながら、特に本発明によれば、ＸＬＨＡ（典型的にはＸＬＨＡ含有ゲル）の粘度は、ＰＲＰと効果的および／または均一な混合物が得られる範囲内であることが非常に好ましい（たとえば、ＰＲＰとの効果的かつ／または均一な混合物を得るためにチューブの反転回数を増加する（＞５０または＞２０）必要があっても）。
【０２４２】
（特に本発明による）ＸＬＨＡは、好ましくは実質的にＰＲＰとの混合されない（例えば、ＰＲＰと混合されない）場合、主な治療分野（好ましくは皮膚科および／または整形外科の分野における治療および／または予防、好ましくは人体に用いる）ならびに他の類似した治療のために用いるための注射器の調製にも使用できる。この場合、典型的には実質的にＰＲＰが含まれない（例えばＰＲＰが含まれない）か、または使用または混合されないため、特に本発明によるＸＬＨＡの粘度は、ＸＬＨＡ−ＰＲＰ混合物に使用することが意図されるＸＬＨＡの粘度よりも高くなり得る。
【０２４３】
したがって、特に本発明によるＸＬＨＡは、好ましくは、ＸＬＨＡおよびＰＲＰを含む医薬組成物および／またはチューブ（例えば、Ｒｅｇｅｎ  ＭａｔｒｉｘＴＭチューブ）の製造に関与する。特に本発明によるＸＬＨＡは、ＸＬＨＡゲルを含むが実質的にＰＲＰを含まない（例えばＰＲＰを含まない）注射器の製造に関与する可能性も高く、好ましい。
【０２４４】
特に、本発明において、例えば、ＸＬＨＡの架橋ネットワークのために、前記ゲルおよび／またはＸＬＨＡの滞留時間は、非架橋（非ＸＬ）ＨＡゲル（例えば、典型的なおよび／または従来の非ＸＬ  ＨＡゲル）の３０日の滞留時間よりも長いことが好ましい。
【０２４５】
本発明および明細書において、「滞留時間」は、好ましくは、ＩＳＯ＿１０９９３−６＿２０１６に開示された方法に従って定義および／または測定される（すなわち、または好ましくは、線形ＨＡは、１ヶ月後に完全に分解される）。
【０２４６】
特に本発明において、好ましくは本発明によるおよび／または本発明で使用されるＸＬＨＡゲルにおいて、一般的に架橋および／または修飾の％（パーセンテージ）を調節することにより、滞留時間が変更される。例えばＸＬＨＡの最終使用／用途によって設定され得る粘度制限（好ましい粘度範囲）に留意することが望ましい。
【０２４７】
実際、架橋および／または修飾の％が高ければ高いほど、滞留時間は長くなる（多くの場合、その方が望ましい）が、粘度も高くなる可能性がある（ＸＬＨＡの意図する使用目的によっては、粘度が高すぎると好ましくない可能性がある）。
【０２４８】
上記の事実および要因のすべてを考慮すると、本発明においては、ＸＬＨＡ特にチューブにおいて使用するＸＬＨＡは、投与後６ヶ月以内（好ましくは３ヶ月以内）にインビボで実質的に完全に吸収されることが（好ましくは、ＸＬＨＡが投与された人体で実質的に完全に吸収される）好ましく、より好ましくは治療効果が永続的に残る、および／または長期的に（好ましくは、治療効果が３ヶ月を超えてもまたは６ヶ月を超えても）続く。
【０２４９】
本発明において、前記ゲル、典型的にはＸＬＨＡゲルおよび／またはＸＬＨＡ含有ゲルは、（好ましくは、０〜４０℃、好ましくは１０〜３０℃、例えば１５〜２５℃において）２７Ｇ針／カニューレおよび／または２２Ｇ針／カニューレを通過できることが好ましい。これにより、２７Ｇ針および／または２２Ｇ針／カニューレを介した注射によって、ＸＬＨＡ含有ゲルおよび／またはＸＬＨＡ含有医薬組成物を例えば人体へ投与する準備ができる。より好ましくは、ゲル（典型的にはＸＬＨＡゲルおよび／またはＸＬＨＡ含有ゲル）は、好ましくは上記の温度で２２Ｇ１／２針／カニューレおよび／または２７Ｇ１／２針／カニューレ、通過することができる。
【０２５０】
実施例１Ａ：ＸＬＨＡの合成のための「ＯＮＥ  ＰＯＴ」法の開発
本発明において、２種類の異なる量（濃度および／またはモル百分率）のＢＤＤＥを使用して、２種類の異なる合成が行われ、それにより、２つの異なる架橋の最終百分率がもたらされた。
【０２５１】
以前にすでに提案されているように、および本明細書で（例えば上述で）すでに述べられているように、ＸＬ製品（ＸＬＨＡ）の合成において、上記では、自転／公転式混合とポーチが使用されている。これらの方法を分析すると、多くの操作が含まれていることが分かる。最初はこれらの方法を用いて、手順及び得られたゲル（例えばＸＬＨＡゲル）のいくつかのベースラインの根拠を与えた。
【０２５２】
合成プロセスには、異なるステップで実行できる５つの基本的なフェーズがある。
【０２５３】
以前に公開されたＸＬＨＡの作製方法を用いて行われた操作の数、これらの方法を使用した合成手順の長さ、および製品の爆発性（形成された製品の数）を考慮して、本発明では、架橋ＨＡを作る（合成する）代替の方法が提供される。
【０２５４】
反応器は、新しい合成プロセスの開発のために実験室で一般的に使用されている。反応器は、ポリマーおよび／またはＡＰＩ（医薬品有効成分）の調製に使用されることがあり、特に化学および／または製薬産業のパイロットプラントで使用される。
【０２５５】
本発明の一態様によれば、本発明によるＸＬＨＡを製造する連続ワンポット法が開発される。この方法は、便利で効率的であり、うまく機能し、及び／または全体としてプロセスの自動化に適している。好ましくは、前記ＸＬＨＡは化学反応容器内で、特にパイロットプラント型化学反応容器内で生成される。
【０２５６】
本発明のこの連続ワンポットプロセス／方法を使用して、いくつかのバッチが生成された。
【０２５７】
以下のスキーム１Ａ５に示すように、当該連続ワンポットプロセスの最初のフェーズは、ＨＡ繊維またはＨＡ粉末の水和である。
ステップ１．ＨＡポリマー繊維または粉末を反応器に移し、その後反応器を閉じる。続いて、供給容器を通して撹拌しつつ、濾過しながら（好ましくは２２０μｍメッシュフィルターを使用して濾過して）溶媒を添加するか、または濾過した後、溶媒を添加する。別の方法として、反応器がすでに閉じている状態で、固体の投入口を用いてＨＡポリマー粉末を添加し、次に上記のように溶媒を添加する。この時点での温度は、好ましくは室温（典型的には１０〜４０℃、好ましくは１５〜３０℃、より好ましくは１７〜２５℃）である。
ステップ２．前記混合物を攪拌して均質化した後、架橋剤を含む塩基性（アルカリ性）水溶液を加え、ｐＨを測定する。
ステップ３．前記混合物を攪拌しながら、温度を５０℃まで上昇させる。５０℃で２時間攪拌後、反応混合物を冷却するか、または室温（典型的には１０〜４０℃、好ましくは１５〜３０℃、より好ましくは１７〜２５℃）に冷却させる。
ステップ４．次いで、酸、好ましくは酸の水溶液の添加により反応混合物を中和する。好ましくは、例えば供給容器を介して、好ましくは濾過されながら、ＨＣｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）水溶液が反応混合物に添加される。ｐＨをチェックして、生理学的条件（つまり、中性ｐＨ、ｐＨ約７）に到達したことを確認する。中性ｐＨは、高ｐＨ時に比べてＨＡおよび／またはＸＬＨＡのヒドロキシル基の脱プロトン化がはるかに少ないため、ヒドロキシル基の反応性がより低くなり、これにより、残りの架橋剤に対するＨＡおよび／またはＸＬＨＡの反応性を低下させる。
ステップ５．混合物を４℃に冷却または冷却させ、約４〜５℃で一晩（つまり、約８〜２０時間、好ましくは約１０〜１６時間）攪拌し続ける。このフェーズの最後に、混合物のｐＨを再度チェックする。低温もまたシステム（例えば、ＨＡおよび／またはＸＬＨＡ）の反応性を低下させ、および／またはさらなる架橋なしに、完全な均質化および／または実質的な均質化を可能にするはずである。
ステップ６。最後に、混合物を加温するか昇温させ、室温（通常、１０〜４０℃、好ましくは１５〜３０℃、より好ましくは１７〜２５℃）に戻す。望ましい粘度を得るために、（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＭａｔｒｉｘＴＭチューブで一般的に使用される型／グレードの）一定量の非架橋ＨＡ（ほぼ同じ分子量、Ｍ．Ｗ．）を添加する。所望の粘度は、好ましくは、分離ゲルを保持するために必要な粘度、および／または［ＸＬＨＡおよび好ましくはＨＡ］とＰＲＰとの混合物（好ましくは効果的かつ／または均一な混合物）を形成できるために必要な粘度であってよい。好ましくは、供給容器を通して非架橋ＨＡポリマーを前記混合物に添加し、前記反応混合物の完全および／または実質的な均質化が達成されるまで、前記混合物を撹拌し続ける。
ステップ７．この時点で、ゲルが反応器から収集され、（好ましくは２８０μｍメッシュフィルターを使用して）ろ過される。
【０２５８】
スキーム１Ａ５：ＨＡと架橋剤（ＢＤＤＥ）の反応に使用される反応器。番号が付けられた項目は、合成プロセスのステップ１〜７であり、図１に示すとおりである。
このようにして、合成プロセスのほとんどまたはすべて（好ましくは実質的に合成プロセス全体）は、（好ましくは）閉鎖環境で、好ましくはゲルを実質的に汚染の可能性にさらすことなく行われる。
【０２５９】
また、架橋ＸＬＨＡ（好ましくは非ＸＬ  ＨＡを後で追加する）を調製するための連続的および／または「ワンポット」プロセスは、一般的にはプロセス中の合成混合物をより良く均質化でき、既存に公開された方法に比べてプロセス中の操作が減少するため、合成を実行する時間は、一般的に着実に短くなる。
【０２６０】
プロセスの最終段階は、ＸＬＨＡの精製であり、透析による精製が好ましい。この透析法は、共に同じ溶媒に可溶である異なるサイズの分子の分離が可能なため、好ましく使用される。透析による精製中、ＸＬＨＡ含有混合物またはゲルに存在する可能性のある未反応のＢＤＤＥは、透析膜を通過することにより、一般に除去（または減少、通常は大幅に減少）されるが、（好ましくは）同時に、水がＸＬＨＡ含有混合物またはゲルに入り込み、ポリマーがさらに膨潤する。続いて、ポリマー、例えばＸＬＨＡの最終濃度に到達し、残留ＢＤＤＥは痕跡レベルしか存在しないはずであるが、必要に応じて、さらに滅菌プロセスを行い、さらに減少させることができる。
【０２６１】
実際、残留ＢＤＤＥの量（濃度）は、さまざまな透析膜により、および／またはさまざまな温度で生成および精製された、あるいはさらに滅菌または脱気されたＸＬＨＡゲルのほとんどまたはすべてのバッチに対してテストされている。
【０２６２】
そのようにして得られたＸＬＨＡゲルは、その後医療機器（チューブや注射器など）の製造に用いることができるが、それ自体が、Ａ−ＰＲＰの調製に用いることができる。
【０２６３】
ＷＯ２０１１／１１０９４８（Ａ．Ｔｕｒｚｉ）および／またはＷＯ２０１３／０６１３０９Ａ２（Ａ．Ｔｕｒｚｉ；「Ｎｅｗ  ａ−ｐｒｐ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅ  ＆  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｍａｃｈｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓ」）は、［非架橋ＨＡ、チキソトロピープゲルおよび抗凝固剤］を入れたチューブの、ＰＲＰとＨＡの混合物の調製のための用途を開示している。
【０２６４】
（本発明による）ＸＬＨＡとＰＲＰの混合物を調製する際、読者は、ＷＯ２０１１／１１０９４８および／またはＷＯ２０１３／０６１３０９Ａ２における一般的な記述を技術的基礎として使用することができる。
【０２６５】
実施例１Ｂ：ヒアルロン酸（ＨＡ）および／または架橋ヒアルロン酸（ＸＬＨＡ）の試料の物理化学特性
１．はじめに／報告の範囲
上記の実施例１Ａおよび／または以下の実施例１Ｃに開示されるように、ワンポット法とさまざまな量の架橋剤（ＢＤＤＥ）を使用して、架橋ヒアルロン酸（ＸＬＨＡ）の合成を行った。
１０個の試料について、ＳＥＣ−ＴＤＡ（サイズ排除クロマトグラフィーと、光散乱、屈折率測定および粘度測定で構成されたトリプル検出器アレイを組み合わせたもの）により、試料の可溶性画分の定性的および定量的な流体力学的特徴付けに供された。
その後、３つの検証バッチから収集された別の６つの試料（滅菌の前後）が検査に供された。前記バッチはすべて、以前に説明したワンポット法により、塩基性条件下でＢＤＤＥと架橋する１５００ｋＤａのＨＡファイバーを使用して合成されている。
さらに、Ｒｅｇｅｎ  Ｌａｂが作成した線形ＨＡの試料がリファレンスとして検査に供された。ＳＥＣ−ＴＤＡを使用して、新しい試料の可溶性画分について定性的および定量的な流体力学的特徴付けを行った。
さらに、レオロジー研究、酵素分解、凝集性試験及び膨潤を行うことにより、選択された試料に対し、物理化学的観点から特徴付けを行っている。
この研究に関する方法と結果は、ＤＭＳから送信された報告書に従って記述される。
【０２６６】
２．特徴付けの目的
これらの試料の特徴付けは、ＸＬＨＡの合成に使用される合成プロセスで同じ型のゲルを生成できるかどうか、したがって前記プロセスが再現可能かどうか、または使用されるパラメーター間に相関があるかどうかを理解するために必要である。
実行した分析は、３つの検証バッチの可溶性画分の定性的−定量的特徴付け、及び代表的な一つの試料のグループの物理化学的特徴付けに再び焦点を当てた。特に、さまざまな生理学的関連周波数でのゲルのレオロジー挙動を理解するために、無菌試料に対して研究が行われた。
【０２６７】
３．試料の説明
ここでは、分析された試料のリストを含む表が示されて。灰色は以前に可溶性画分が特徴付け及び議論された試料が示されており、黒色は以下に分析を報告する検証バッチが示されている。一部の選択されたバッチの滅菌済み試料のみを、レオロジーの観点から研究している。リストには、バッチが製造順に示され、線形ＨＡの分析に使用される注射器のリファレンスが示されている。
バッチ６、７、および８の合成は、過剰なＢＤＤＥをＨＡの溶液（モル比１：４５３）に添加することによって実行される。
【０２６８】
表１：分析されたバッチの仕様。
【表５】
2021515088.tif 000021
【０２６９】
バッチ６、７、および８の可溶性画分を分析するために、滅菌（１２１℃で少なくとも１５分間実行）前後のゲル試料（ＢＳおよびＡＳで示す）を収集して分析した。  より代表的と考えられるため、バッチ２、３、４、６、７、８、および９の滅菌済試料のみに対してレオロジー研究を行った。試料５は、架橋しなかったため、除外した。
【０２７０】
４．材料と方法
４．１  可溶性画分の抽出
分析は、試料２６Ｃ１８−Ｄ  ＢＳ、２６Ｃ１８−Ｄ  ＡＳ、０４Ｄ１８−Ｄ  ＢＳ、０４Ｄ１８−Ｄ  ＡＳ、１０Ｄ１８−Ｄ  ＢＳ、１０Ｄ１８−Ｄ  ＡＳ、ＡＲＶ−ＨＡ−４０−３  １８Ｄ０４およびＡＲＶ−ＨＡ４０−３  １８Ｄ０４（線形ＨＡを含む最終滅菌製品に対して行った。前記試料は、ｐＨ７．４のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で５倍（最終容量の１．５〜２ｍｌ）に希釈されている。前記懸濁液を３７℃で１８時間振蕩し、１００００ｘｇの速度で５分間遠心分離する。
【０２７１】
試料０４Ｄ１８−Ｄ  ＢＳとＡＲＶ−ＨＡ４０−３  １８Ｄ０４のみが均一化され、他のすべての試料は遠心分離後に分離しており、粘度の異なるが分離できない２つの相の存在が示された。前記試料をさらに２倍に希釈し、その後０．２２μｍフィルターでろ過した。可溶性ＨＡを含む上清に対して分析を行った。
【０２７２】
４．２  ＨＡの可溶性画分の定量分析
ＨＡ含有量（ｍｇ／ｍｌ）は、２つの技術（比色試験とＳＥＣ−ＴＤＡ分析）を使用して測定されています。可溶性ＨＡの含有量は、各試料に対して実行された希釈を考慮して計算されています。
【０２７３】
各試料は少なくとも２回分析され、分析ごとに定量計算を２回実行した。したがって、少なくとも４回の測定後、各試料について得られた可溶性画分の量の値を得た。
【０２７４】
４．３  ＳＥＣ−ＴＤＡを使用した（線形および架橋）ＨＡの可溶性画分の流体力学的特徴付け
各分析試料に含まれるＨＡの可溶性画分の流体力学的パラメーターは、トリプル検出器（ＴＤＡ−光散乱、屈折率測定、および粘度測定）を備えたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定される。上記の段落で説明した方法で調製された試料に対して分析を実行した。
【０２７５】
ＳＥＣ機器（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ、Ｍａｌｖｅｒｎ、イギリス）は、２つのモジュールから構成されている。
１）ＧＰＣｍａｘ  ＶＥ  ２００１：ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）用の専用ポンプおよびオートサンプラーで構成される統合システムであって、管路に接続された溶媒を脱気するためのもの。
２）ＴＤＡ３０５モジュラス（トリプル検出器アレイ）：カラムに用いる恒温オーブンと、屈折率のトリプル検出器（ＲＩ、４つのキャピラリーブリッジを備えた粘度計（ＶＳおよび光散乱（ＬＳ））が含まれ、後者は、非常に優れた信号対雑音比を備えた直角光散乱（ＲＡＬＳ）、および革新的な低角度散乱（ＬＡＬＳ）の２つの部分から構成される。
【０２７６】
ＨＡに使用されるＤｎ／ｄｃ値（屈折率検出器で測定された、分析対象物の濃度の変動に伴う信号強度の微小変動）は、０．１５５ｍｌ／ｇである。
【０２７７】
各試料は少なくとも２つの溶液が調製されており、各溶液に対して少なくとも２回クロマトグラフィー分析が実行される（クロマトグラフィー曲線は付録１に示されている）。重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）、多分散性指数（Ｍｗ／Ｍｎ）、固有粘度（［η］）、および流体力学的半径（Ｒｈ）を表２に示す。
【０２７８】
４．４  レオロジー特性
レオロジー挙動の研究は、Ｌａ  Ｇａｔｔａらiiによって報告された方法を使用して、０．９ｍｍのギャップを有する５０ｍｍのステンレス鋼プレートで構成される計測システムを備えたレオメーターＡｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  Ｐｈｙｓｉｃａ  ３０１により行われた。
値は０．１５９および１５．９０Ｈｚの２つの周波数で測定されている。
【０２７９】
４．５  酵素耐性／分解
試料のうちの１つの酵素分解に焦点を当て、初歩的な動力学研究を行った。この実験は、酵素活性に曝されたときのＨＡの挙動を理解することを目的としている。文献ｉｉｉに記載されている手順に従って、試料３０Ａ１８−ＤとＢＴＨ（ウシ精巣ヒアルロニダーゼ）を共に培養した。
【０２８０】
特に、２２．４ｍｇ／ｍｌの濃度を有する試料３０Ａ１８−Ｄは、ｐＨ７．４のＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌに希釈され、ＢＴＨ  ０．５Ｕ／ｍｌと共に培養した。さまざまな培養時間（２ｈ、３ｈ、６ｈ、２４ｈ）が経過後、試料を１００℃まで加熱し１０分間保持して酵素を失活させ、その後ＳＥＣ−ＴＤＡで特徴付けを行った。劣化は、培養中の流体力学的パラメーターの減少、特にＭＷの減少を測定することによって監視される。
【０２８１】
分解は、実験室で得られる同様のＭＷを有する線形ＨＡのリファレンスと比較した。各時間ごとに、分析を３回実行した。
【０２８２】
４．６  凝集性試験
各試料の凝集性は、ＳｕｎｄａｒａｍとＣｏiが説明する方法を使用して評価される。各試料１ｍｌをトルイジンブルーの１％溶液１０ｍｌで着色し、１ｍｌ注射器に入れ、さらにＭｉｌｌｉＱ水７００ｍｌが入ったビーカーに注入した。ゲルがビーカーの底に触れたときから、溶液を磁気的に攪拌した。試験は、注入から１５インチ、７０インチ、９５インチで撮影したビデオと写真で記録されています。
【０２８３】
４．７  膨潤
試験は、送られて分析されたすべての試料（１２Ｂ１８−Ｄ  ＢＳ、１２Ｂ１８−Ｄ  ＡＳ、２６Ｃ１８−Ｄ  ＢＳおよび１０Ｄ１８−Ｄ  ＡＳ）から選択された明らかな不溶性ＨＡ画分を持つ試料に対して実行された。
【０２８４】
各ゲル０．２ｍｌをＰＢＳで１ｍｌに希釈し、３７℃、８００ｒｐｍで１６時間培養する。０．２ｍｌの各ゲルのアリコートを、ＰＢＳで最終容量１ｍｌまで培養し、その過程で、吸水程度を測定した。次に、試料を１３０００ｇで５分間遠心分離し、上清を水和ゲルから分離した。吸水度は、ゲルが膨潤平衡（水和ゲル８ｇ）／初期ゲル（ｇ）に達した際の体積膨張として測定される。
【０２８５】
５．結果と考察
５．１  可溶性画分
すべての試料に可溶性画分が存在する。バッチ１０Ｄ１８−Ｄ  ＡＳおよび２６Ｃ１８−ＢＳは、他のバッチと比較して、可溶性画分が少なかった。すべてのバッチが同等のＨＡ合計濃度（可溶性＋不溶性）を有することを考慮すると、当該バッチは、不溶性ＨＡ（化学修飾）の割合が高くなっている。一方、試料０４Ｄ１８−Ｄ  ＢＳおよびＡＲＶ−ＨＡ−４０−３  １８Ｄ０４には、高い割合で可溶性ＨＡが含まれており、修飾の程度が低くなっている。この結果は、ＡＲＶ−ＨＡ−４０−３  １８Ｄ０４が線形ＨＡであるという事実と合致している、０４Ｄ１８−Ｄ  ＢＳが同じ結果を有することは、化学修飾が発生していないか、非常に低いことを示している。
【０２８６】
以下の表１は、供された各試料について取得された値を示している。
表１：Ｍｗ、Ｍｎ、Ｍｗ／Ｍｎ、［η］、及びＲｈの結果のまとめ。白色箇所は、滅菌されていない試料（ＢＳ）の結果を表す。青色箇所は、一組目の実験中に得られた滅菌試料（ＡＳ）の結果を表す。緑色箇所は、二組目の実験で得られ、このレポートで議論された結果であり、黄色箇所は線形ＨＡに関する結果である。
【表６】
2021515088.tif 000022
【０２８７】
バッチ２６Ｃ１８−Ｄは、滅菌後の可溶性画分の増加を示し、Ｍｗはそれに伴って減少している。
反対に、バッチ０４Ｄ１８−Ｄは、２０１８年６月５日のレポートｎ°ＨＡＲＥＴ＿  ＣＨＡＲＡＣ＿２０１８＿０６で説明されている試料０２Ｊ１７ですでに観察されているように、可溶性画分の減少とＭｗの増加を示している。
透析後にＢＤＤＥのより高い残留物がバッチに存在したため、滅菌中にも架橋反応が継続した可能性があると推定される。
バッチ１０Ｄ１８−Ｄの場合は状況が異なり、滅菌試料で可溶性画分の明らかな減少が観察されたが、Ｍｗはわずかに減少した。
試料０４Ｄ１８−Ｄおよび０２Ｊ１７も、同じ解釈がなされる。
実際、Ｍｗが１／２減少した試料以外は、観察された変動はいずれも非常に小さく、各数値の誤差の範囲内に収まり、顕著な変化は発生しなかったと言える。
【０２８８】
５．２  流体力学的パラメータ
すべての試料は、いずれもＭｗが７００ｋＤａを超える可溶性画分がある。特に、試料２６Ｃ１８−Ｄ  ＢＳおよび１０Ｄ１８−Ｄ  ＢＳおよびＡＳのＭｗは１１００〜１２００ｋＤａである。多分散性指数は一般に１．４〜１．８である。実際、おそらく架橋中の温度の影響（５０℃で２時間継続）により、試料ＢＳの値の減少がすでに観察されている。
【０２８９】
各試料について、ＳＥＣ−ＴＤＡ分析では、Ｍａｒｋ−Ｈｏｗｋｉｎｇ曲線（ＭＨＳ曲線−ｌｏｇ固有粘度対ｌｏｇ  Ｍｗ）も導出可能である。これらの曲線（図７は、試料０４Ｄ１８−Ｄ  ＡＳ（ａ）、１０Ｄ１８−Ｄ  ＡＳ（ｂ）、および２６Ｃ１８−Ｄ（ｃ）の重ね合わせを示す。）は、ナポリの実験医学科が得られた線形ＨＡ（非修飾）の１つと比較される。すべての試料には、いずれも可溶性画分が存在し、線形ＨＡと比較すると、等しい分子量の場合は、固有粘度の値は低くなる。これは、ＨＡ鎖の配座がよりコンパクトであることを示し、また、配座分析も、可溶性画分中の架橋（または少なくとも修飾された）ＨＡ鎖の存在と互換性があることを意味する。図７ｄは、ＡＲＶ−ＨＡ−４０−３  １８Ｄ０４に係り、当該試料は、ＤＭＳから得られた線形ＨＡと完全に重ね合わせることができる。この重ね合わせは一般に、非修飾ＨＡ、または技術的に目に見える配座変化を何ら引き起こさない、修飾度が極めて低いＨＡで観察される。
以上を鑑みると、分析した試料は、すべて化学修飾されていると言える。
【０２９０】
５．３レオロジー特性
レオロジー研究は、０．１５９〜１５．９Ｈｚのさまざまな周波数で行われた。
ここで、図８のグラフは、さまざまな周波数（Ｈｚ）の関数としてＧ’とＧ’’の値を示す。図９に、異なる周波数（Ｈｚ）の関数としての複素粘度の値のグラフを示す。両グラフは、図に挙げた同じバッチの結果を示す。下の表２に、０．５および２．５ＨｚでのＧ’、複素粘度、およびタンデルタの値を示す。
【０２９１】
図８：Ｇ’とＧ’’ｖｓ周波数。異なる周波数（Ｈｚ）の関数としてＧ’とＧ’’の値を示すグラフ。
図９：Ｇ’とＧ’’ｖｓ周波数。図９に、異なる周波数（Ｈｚ）の関数としての複素粘度の値のグラフを示す。
【０２９２】
表２．  ０．５および２．５ＨｚにおけるＧ’、複素粘度、およびｔａｎδの値。
【表７】
2021515088.tif 000023
【０２９３】
図７で示されたデータは、試料１２Ｂ１８−Ｄ  ＡＳおよび１０Ｄ１８−Ｄ  ＡＳが実質的に弾性的な挙動をすることを表している。これは、これら２つの試料の可溶性画分の数値が最小であることに合致し、共有ネットワークの存在と符合する。測定値によると、他の試料は、より粘稠であり、縺れネットワークである（ＭＨＳ曲線でも確認されたように、化学的に修飾されている）ことを表している。これらの後者の試料は、１５．９  Ｈｚより高い周波数でクロスオーバーが測定された。粘性製剤の間では、試料２６Ｃ１８  ＡＳと０４Ｄ１８−Ｄ  ＡＳのＴａｎδの値は類似しており、２１Ｋ１７  ＡＳ、３０Ａ１８−Ｄ  ＡＳ、およびＡＲＶ−ＨＡ−４０−３  １８Ｄ０４で測定された値よりも低くなっている。
【０２９４】
力学的スペクトルによると、試料１２Ｂ１８−Ｄ  ＡＳおよび１０Ｄ１８−Ｄ  ＡＳの場合、考慮されるすべての範囲において、複素粘度は周波数とともに減少し続ける。試料２１Ｋ１７  ＡＳ、３０Ａ１８−Ｄ  ＡＳ、およびＡＲＶ−ＨＡ−４０−３  １８Ｄ０４は、最初は一定の挙動を示し、その後に減粘する。収集された試料２１Ｋ１７  ＡＳおよび３０Ａ１８−Ｄ  ＡＳのデータに基づくと、粘度変化曲線は、可溶性ＨＡを含むゲルおよびポリマー鎖の異なる配座と符合する。試料２６Ｃ１８−Ｄ  ＡＳと０４Ｄ１８−Ｄの場合、２つのゾーンで中間的な挙動が観察され、複素粘度と周波数の関係が異なる。
【０２９５】
５．４  酵素分解
ＸＬＨＡのヒアルロニダーゼに対する耐性に関する予備情報を得るため、および生体内での可能な滞留時間についての示唆を得るため、ウシ精巣ヒアルロニダーゼの効果を検討した。
【０２９６】
下図（図１０）は、試料２１Ｋ１７−Ｄ  ＡＳ（■）をＢＴＨと共に培養した時に記録されたＭｗの変化を示すグラフであり、線形ＨＡ（ＨＡ）と比較している。
図１０：試料２１Ｋ１７−Ｄ  ＡＳ（■）と線形ＨＡ（□）をＢＴＨ  ０．５Ｕ／ｍｌと共に培養した時に記録されたＭＷ。
図１１は、ＭＷ＞５００ｋＤａおよびＭＷ＜２００ｋＤａの試料画分の変動（ｗｔ％）を示すグラフである。
【０２９７】
データは、両試料がＢＨＴによって触媒される解重合反応に敏感であることを実証している。培養時間に伴うＭｗを示すグラフは、初期Ｍｗが類似している２つの試料の解重合速度が類似していることを示している。試料２１Ｋ１７−Ｄ  ＡＳのＭｗは、培養２時間でのみ高くなる。図１１ａは、各時刻において各試料の５００ＫＤａ画分が同等に減少することを示している。図１１ｂの結果が示すには、酵素との培養時間が進むにつれて、両試料のＭｗが低い画分が増加すると推定される。より詳細には、最大培養時間に達したにもかかわらず、両試料の２００ＫＤａの画分は同等に増加し、３時間および６時間の培養時、試料２１Ｋ１７−Ｄ  ＡＳは同じ画分が高くなる。しかしながら、重要なのは、結果と、分析された画分のＭＷの全体的な分布とは無関係であることを考慮することです。結論として、結果は、酵素分解において、試料間に明らかな差があることを示さなかった。
【０２９８】
結果は、試料２１Ｋ１７−Ｄ  ＡＳの可溶性画分について考慮し、説明することができる。実際、報告された値は試料中のＨＡの総濃度に非常に近く、化学修飾の程度が極めて低いことを表しており、これにより、酵素分解性能が類似していることを説明できる。
図１１：ＭＷ＞５００ｋＤａ（ａ）およびＭＷ＜２００ｋＤａ（ｂ）の試料画分の変動（ｗｔ％）。
【０２９９】
５．５  凝集性試験
以下、図１２に、検証済みの方法による凝集性スコア（文献（Ｓｕｎｄａｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ．２０１５）で報告された凝集性基準に基づいて、３回の異なる演算によって得られた値の平均）を示す。
１完全に分散
２ほぼ分散
３部分的に分散、部分的に凝集
４ほぼ凝集
５完全凝集。
ｎ°１０の試料以外は、一般的には、ゲルはほぼ凝集〜完全に凝集となっている。
【０３００】
図１２：文献で報告されたスコアに従って見出された値。
【０３０１】
５．６  膨潤
テストは、不溶性画分が多い試料（即ち１２Ｂ１８−Ｄ  ＢＳ、１２Ｂ１８−Ｄ  ＡＳ、１０Ｄ１８−Ｄ−ＡＳ、および２６Ｃ１８−Ｄ−ＢＳ）でのみ実行されている。
得られた結果は以下のとおりである。
表３：水和度に対応する数値
【表８】
2021515088.tif 000024
結果により、試料１２Ｂ１８−Ｄ  ＢＳが生理的媒体で平衡状態に達した際、体積が３倍増えることが分かった。すべて滅菌された他の試料は、膨潤値が小さく、沈殿物と上清の分離が非常に困難であった。より正確には、流速が異なり完全には分離できない２つの相が観察され、分離を試みると、粘性のより小さい部分が粘性のより高い部分と混合する傾向があった。膨潤の値は、３つの試料間で同等である。
【０３０２】
６  結論
ＳＥＣ−ＴＤＡ分析により、分析されたすべての試料が可溶性ＨＡを含み、ＡＲＶ−ＨＡ４０−３  １８Ｄ０４を除くすべての試料が、ＭＷが比較的高い（＝１０００  ＫＤａ）の化学修飾されたＨＡを含むことが確認された。
【０３０３】
Ｂｉｏｔｅｋｎｅｔで行われた分析により、分析されたすべての試料に可溶性ＨＡが存在することが確認された。特に、すべての試料の総濃度が約２０ｍｇ／ｍｌ（可溶性＋不溶性）であることを考慮すると、表に示されるデータにより、この研究で分析されたバッチでは、ＨＡの大部分が依然として水性媒体に可溶性であることが分かった。以前のレポートで説明した試料と比較すると、いくつかのバッチは可溶性画分が比較的少なく、化学的修飾度が比較的高かった。
【０３０４】
すべてのバッチのＭｗは、同じ実験室で同じ手法で分析され、主に皮内充填剤として使用された他のすべての市販のＨＡ（表１のＲｅｓｔｙｌａｎｅのデータを参照）よりも高いＭｗを示した。これは、滅菌に対する耐性と保管可能期間に関する重要なデータである。実際、ＨＡは温度と時間とともに解重合して、炎症誘発の可能性がある小さなフラグメントを形成する（＜５０Ｄａ）。この結果により、ゲルが要件ＡＳを満たしており、すでに市販されているものと同じように、相当長い期間（１２〜２４か月）保管できる可能性があることが分かった。
【０３０５】
配座解析は、すべての試料が化学的に修飾されたＨＡを含み、固有粘度が架橋ＨＡの存在と符合することを示しています。
力学的特性を分析すると、１２Ｂ１８−Ｄ  ＡＳと１０Ｄ１８−Ｄ−ＡＳが弾性挙動を示し、これが不溶性画分の値が高いことに関連している可能性があるため、比較的高い修飾度を有すると確認でき、考慮された周波数で１０Ｄ１８−Ｄ−ＡＳはより硬く、粘性がある。粘性挙動のある試料間では、線形である試料ＡＲＶ−ＨＡ４０−３  １８Ｄ０４は、分析範囲でより高い粘度を有する。
【０３０６】
酵素分解に対する耐性について試験が行われた唯一の試料は、（使用された実験条件において）それを線形ＨＡと区別することが可能であるほどの程度の修飾度を示さなかった。
粘性／弾性がより強い試料の可溶性画分の値がより高く、これによって前記結果が実証された。
【０３０７】
５．５項で述べたように、ほとんどの試料は凝集性が高く、文献によれば、組織内、特に真皮内に均一に分布している（Ｓｕｎｄａｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ．２０１５；皮膚のケアのみに使用されるゲルに対する研究）
【０３０８】
最後に、膨潤試験を行ったゲルは、良好な体積膨張を呈し、内部の補水能力が比較的高いことが示された。
３つのバッチ２６Ｃ１８−Ｄ−ＡＳ、０４Ｄ１８＿Ｄ＿ＡＳ、および１０Ｄ１８−Ｄ−ＡＳは同じ方法を使用して合成されたが、それでも可溶性画分とレオロジー挙動は、いくつかの違いがあった。３つの合成に関するレポートを詳細に分析することにより、総架橋時間において違いが観察された。前記総架橋時間とは、５０℃（架橋温度）に到達するために費やされた時間と５０℃に保つために費やされた時間を合わせたものである。
【表９】
2021515088.tif 000025
【０３０９】
これまでの３つの試料で得られた結果を鑑みて、特に不溶性画分を参照して、２６Ｃ１８−Ｄ−ＡＳをモデルとして新しいバッチが合成し、ゲルは５０℃で最大７０分間保持される。
【０３１０】
生体内での本発明のゲルの可能な挙動をよりよく理解するために、同様の合成で得られたすべての修飾度の範囲における代表的な試料として、バッチ２１Ｋ１７−Ｄ  ＡＳ、１０Ｄ１８−Ｄ−ＡＳ、２６Ｃ１８−Ｄ−ＡＳおよびＡＲＶ−ＨＡ４０−３  １８Ｄ０４に対し、より多くの酵素分解に対する耐性試験を行わった（表４）。
【０３１１】
テストは、固定用量のＢＨＴを使用して経時的試験を行い、また、異なる用量の酵素を添加して、２時間消化した後に測定して試験を行った。
表４：バッチと試験のまとめ
※可溶性・不溶性画分の調査。
色は操作の順序を表す。緑（中位の陰影）：第一；黄色（明るい色）：第二；赤（濃い色）：第三。陰影なし：既に実行済み
【表１０】
2021515088.tif 000026
７.  定義と公式
【数５】
2021515088.tif 000027
【０３１２】
数平均分子量Ｍｎ：試料内のすべてのポリマー鎖の統計的な平均分子量であり、
【数６】
2021515088.tif 000028
で定義される。ここでＭｉは鎖の分子量、Ｎｉはその分子量の鎖の数である。  Ｍｎが分子量分布を表す場合、分布内のＭｎの両側の分子数は等しい。重量平均分子量Ｍｗは、
【数７】
2021515088.tif 000029
で定義され、Ｍｎと比較して、Ｍｗは平均分子量への寄与を決定する際に鎖の分子量を考慮する。鎖が重いほど、その鎖のＭｗへの寄与は大きい。Ｍｗが分子量分布を表す場合、分布内のＭｗの両側の分子量は等しい。
【０３１３】
すべての多分散性合成ポリマーにおいて、Ｍｎ  ＜  Ｍｗである、
多分散性指数は、ポリマーの分子量分布の広さの特徴付けのために使用され、次のように定義される。
【０３１４】
【数８】
2021515088.tif 000030
【０３１５】
多分散性指数が大きいほど、分子量は広くなる。すべての鎖長が等しい単分散ポリマー（タンパク質など）はＭｗ／Ｍｎ＝１である。最適に制御された合成ポリマー（キャリブレーションに使用される分子量分布が狭いポリマー）のＭｗ／Ｍｎは１．０２〜１．１０である。逐次重合反応では、通常、Ｍｗ／Ｍｎの値は約２．０となるが、連鎖反応では、Ｍｗ／Ｍｎの値は１．５〜２０となる。
【０３１６】
固有粘度：溶液中のポリマーが溶液の粘度を高める能力を反映する。
【０３１７】
屈折率の増分ｄｎ／ｄｃ：屈折率の増分は、特定の条件下の試料に適用される。  たとえば、温度、レーザー波長、分子の立体配座、または添加剤は、ｄｎ／ｄｃの絶対値に影響を与える。したがって、完全な静的光散乱実験では、検討中の条件での正確なｄｎ／ｄｃを決定する必要がある。多くの実際的な例では、同様の条件下で取得された以前のデータセットから（または参考文献から）値を取得できる。
【０３１８】
流体力学的半径Ｒｈ：動的光散乱計測により、目的分子と同じ速度で拡散する同等の剛体球の半径として定義される。実際には、タンパク質とその複合体の溶液は剛体球として存在しないため、測定された流体力学的半径は、溶媒和したタンブリング分子が採用している見かけのサイズをより厳密に反映する。
【０３１９】
Ｍａｒｋ・Ｈｏｕｗｉｎｋ−桜田関係式  ＭＨＳ：分画された試料の固有粘度と分子量を関連付けるためにうまく機能する経験的関係式。特定のポリマーの配座解析を行うために使用される。
【０３２０】
複素粘度：複素剪断弾性率。変形が回復可能（弾性）か回復不可能（粘性）かに関係なく、材料の変形に対する全体的な抵抗。記号Ｇ＊複素粘度＝粘度−ｉＸ弾性
【０３２１】
剪断弾性率：（ひずみの変化から生じる）剪断応力と剪断ひずみの比率。上記と同様の複素的な関係から、次のことが分かる。
【０３２２】
Ｇ＊ ＝ Ｇ’ ＋ ｉＧ’’
【０３２３】
ここで、
Ｇ＊ は複素剪断弾性率
Ｇ’は同位相の貯蔵弾性率及び
Ｇ’’は異方性損失係数； Ｇ＊ ＝ √（Ｇ’２ ＋ Ｇ’’２）。
【０３２４】
クロスオーバー周波数：これらのパラメーターがクロスオーバーする周波数は、材料に固有な緩和時間（τ）に対応する。
【０３２５】
損失正接：ｔａｎ（δ）＝Ｇ’’／Ｇ’は、エネルギー損失と貯蔵のバランスを数値化する。ｔａｎ（４５°）＝１の場合、ｔａｎ（δ）の値が１より大きい場合は、「液体」特性が高く、１より小さい場合は粘度に関係なく「固体」特性が高いことを示す。
【０３２６】
膨潤度：ポリマーの膨潤の程度。線形寸法の変化または体積変化によって決まる。ほとんどのポリマーは、溶媒（水を含む）の吸収（水和）により膨潤する。
【０３２７】
実施例１Ｃ：架橋ヒアルロン酸（ＸＬＨＡ）の合成のまとめ
６．はじめに／構想
以下のレポートは、架橋ヒアルロン酸（ＸＬＨＡ）の生産のために行われたさまざまな合成をまとめたものである。
【０３２８】
７．材料と方法
すべての試薬はさらなる精製なしに使用した。ＭＷが１５５０ｋＤａのＨＴＬ  ＨＡ繊維を使用した。ＢＤＤＥ（１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）およびペレット状のＮａＯＨはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＨＣｌ１ＮはＣａｒｌ  Ｒｏｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入した。すべての混合物と溶液は、精製プロセスで使用するものと同じＰＢＳを使用して調製した。
【０３２９】
合成は、メカニカルスターラーに接続されたテフロン攪拌ブレードを備えた３口丸底フラスコ（または２口丸底フラスコ）を使用して行った（以下のフラスコの図を参照）。加熱プレートの上に置かれた水浴にフラスコを入れて温度を制御した。加熱ステップの間、水とゲルの温度は両方とも制御され、架橋ステップが終わるま気流を確保した。
【表１１】
2021515088.tif 000031
すべてのバッチの一般的なステップとして、繊維／粉末を容器／フラスコ内に導入し、続いて、ＮａＯＨのＰＢＳ（０．２５Ｍ）溶液を導入し、均質化が完了するまで、混合物を室温で約２時間攪拌した。ＢＤＤＥのＰＢＳ溶液（ＨＡ：ＢＤＤＥの比率は１：４５３）を次に導入し、反応混合物を５０℃で２時間撹拌して、より速い架橋を可能にした（このステップは、合成への空気の連続的な流入を保証するために実行された）。次に、ＨＣｌ（０．０８Ｍ）を添加して、ｐＨを中和し、架橋を停止しつつ、４℃で一晩攪拌した。非架橋ゲルを添加し、完全に均質化するまで混合物を３時間攪拌し続けた。このようにして得られた混合物を真空下で濾過し（２８０μｍフィルター）、分子量カットオフが１２〜１４ｋＤａである膜を使用して、２４時間透析して精製した（別段の説明がない限り）。
【０３３０】
すべてのバッチのｐＨ、浸透圧、粘度を制御した。ＢＤＤＥの残存量の計算については、滅菌後の値が０．８２ｐｐｍ（５Ａ−ＤＩＲ  ０１１  ＰＶ  ２６．０１．２０１８）未満であることが既に評価されているため、滅菌前の残存量は無関係である。
【０３３１】
８．合成
３．１バッチ１２Ｂ１８−Ｄ
６０ｇのＨＡ（ＭＷ  ２８００ｋＤａ）を５７６．１８ｇのＮａＯＨ０．２５Ｍ（ＰＢＳ溶液）に溶解し、均一なゲルが形成されるまで２時間４５分混合した。同時に、５．４５ｇのＢＤＤＥを、１．１７ｇのＮａＯＨ  ０．２５Ｍで希釈した後、ＨＡゲルに添加した。ゲルを室温で３０分間混合した後、４８℃で１時間３４分放置した。その後、１７６４．８６ｇのＨＣｌ溶液１Ｎを添加し、温度を下げて中和を開始した。ゲルを５℃で１７時間４７分混合した。同時に６．２３ｇのＨＡを３００ｇのＮａＯＨ  ０．２５Ｍ（ＰＢＳ溶液）に溶解した後、形成された２６９．０７ｇのゲルを、中和済みのＸＬＨＡに加えた。前記混合物を２時間撹拌した後、透析（カットオフＭＷが２−１４ｋＤａの膜）により得られたゲルを２４時間精製した。
【０３３２】
３．２バッチ２６Ｃ１８−Ｄ
２０ｇのＨＡ（ＭＷ  １５５０ｋＤａ）を１９２．２７ｇのＮａＯＨ  ０．２５Ｍ（ＰＢＳ溶液）に溶解し、均一なゲルが形成されるまで２時間２０分混合した。同時に、１．１１ｇのＢＤＤＥを、３．７１ｇのＮａＯＨ  ０．２５Ｍで希釈した後、ＨＡゲルに添加した。ゲルを室温で４０分間混合した後、４１〜５０℃で７０分間放置した。その後、５８８．３９ｇのＨＣｌ溶液１Ｎを添加し、温度を下げて中和を開始した。ゲルを５℃で１６時間４５分間混合した。同時に３．３９ｇのＨＡを１５０ｇのＮａＯＨ  ０．２５Ｍ（ＰＢＳ溶液）に溶解した後、形成された８９．６４ｇのゲルを、中和済みのＸＬＨＡに加えた。前記混合物を３時間４０分攪拌した後、透析（カットオフＭＷが２５ｋＤａの膜）により得られたゲルを２４時間透析した。
【０３３３】
３．３バッチ１０Ｄ１８−Ｄ
２０ｇのＨＡ（ＭＷ  １５５０ｋＤａ）を１９２．４５ｇのＮａＯＨ  ０．２５Ｍ（ＰＢＳ溶液）に溶解し、均一なゲルが形成されるまで２時間混合した。同時に、１．１３  ｇのＢＤＤＥを３．７０ｇのＮａＯＨ  ０．２５Ｍで希釈した後、ＨＡゲルに添加した。ゲルを室温で２０分間混合した後、５０℃で５５分間放置した。その後、５８８．１８  ｇのＨＣｌ溶液１Ｎを添加し、温度を下げて中和を開始した。ゲルを５℃で１６時間４５分間混合した。同時に、３．３９ｇのＨＡを１５０ｇのＮａＯＨ  ０．２５Ｍ（ＰＢＳ溶液）に溶解した後、形成された８９．５５ｇのゲルを中和済みのＸＬＨＡに加えた。前記混合物を４時間攪拌した後、透析（カットオフＭＷが２５ｋＤａの膜）により２４時間透析した。
【０３３４】
実施例２−細胞培養
本発明により、ＰＲＰ／ＢＭＣの調製のための医療デバイス（容器）を使用して、細胞培養を行い、以下の結果が得られた。
図３を参照。
当該デバイスの主な利点は、ＭＮＣ（単核細胞）の成長を維持する能力（評価は、室温に保たれたＭＣ−ＰＲＰにおいて、体外で行わる）である。上述の条件における血小板の半減期（７日）は、全血における半減期と類似している。
【０３３５】
図４。
【０３３６】
実施例３−細胞培養−ＣＣ−Ｓ
ＣＣ−Ｓを使用した細胞培養のプロトコル
フェーズ１：全血の採取
１．チューブのブリスターパックを開く。
静脈穿刺を行い、必要数のＣＣ−Ｓチューブに全血を入れる。チューブ内を真空にすると、必要な量の血液（約１０ｍｌ）が自動的に収集される。
フェーズ２：遠心分離
２．遠心分離機を起動する前に、正確にバランスを取ることが常に不可欠である。
血液がＣＣ−Ｓチューブに収集されたら、必要に応じて平衡チューブ（別売のＳＦ−８２−ＣＢ−１１０を参照）に、ＣＣ−Ｓチューブの血液と同じ体積に達するまで水を入れ、平衡を取る。
機械のバランスを取るために、充填されたチューブを向かい合わせに遠心分離機に挿入する。
次のように遠心分離値を調整する。
−時間：１０〜２０分
−遠心力（ＲＣＦ）：１５００ｇ（遠心分離機のメーカの指示に応じて、対応するＲＰＭ速度を設定）
フェーズ３：遠心分離の結果
３．遠心分離後、血液は分留され、赤血球と白血球がゲルの下に閉じ込められ、フィブリン塊がセルセレクターゲルの上にある。血塊の液体部分は自家トロンビン血清である。血清は遠心分離の時間を延長するか、または収集注射器に取り付けられたカニューレで血塊を押すと、血塊から血清が抽出される。各チューブから約４．５ｍｌの血清が得られる。
フェーズ４：使用
４．ＣＣ−Ｓは、自家培養サプリメントとして使用され、濃度は５〜２０％ｖ／ｖであり、各細胞株によって決まる。
【０３３７】
実施例４−細胞培養―  ＣＣ−ＰＲＰ
ＣＣ−ＰＲＰを使用した細胞培養のプロトコル
フェーズ１：全血の採取
１ａ．チューブのブリスターパックを開く。
静脈全血、臍帯血または髄質血液穿刺を行い、必要数のＣＣ−ＰＲＰチューブに全血を入れる。チューブ内を真空にすると、必要な量の血液（約１０ｍｌ）が自動的に収集される。
１ｂ．注意深くチューブを上下逆さまに反転させて、血液を抗凝固剤と混合する。
フェーズ２：遠心分離
２．遠心分離機を起動する前に、正確にバランスを取ることが常に不可欠である。
血液がＣＣ−ＰＲＰチューブに収集されたら、必要に応じて平衡チューブ（別売のＳＦ−８２−ＣＢ−１１０を参照）に、ＣＣ−ＰＲＰチューブ内の血液と同じ体積に達するまで水を入れ、平衡を取る。
機械のバランスを取るために、充填されたチューブを向かい合わせに遠心分離機に挿入する。
次のように遠心分離値を調整する。
−時間：５分
−遠心力（ＲＣＦ）：１５００ｇ（遠心分離機のメーカの指示に応じて、対応するＲＰＭ速度を設定）
フェーズ３：遠心分離の結果
３．遠心分離後、血液が分留され、赤血球と白血球がゲルの下に閉じ込められ、血小板がゲルの表面に沈殿する。
フェーズ４：均質化
４．ＣＣ−ＰＲＰチューブを数回静かに反転させ、血小板沈着物を再度血漿上清に懸濁させる。各チューブごとに約５ｍｌのＰＲＰが得られる。
血小板がゲルから完全に分離していることを確認する。上清の透明な血漿は混濁するはずである。血小板凝集体が存在する場合は、それらを血漿とともに収集する必要がある。
フェーズ５：使用
５．  ＣＣ−ＰＲＰは、自己培養サプリメントとして使用され、濃度は５〜２０％ｖ／ｖであり、各細胞株によって決まる。フィブリン塊の形成を回避するには、培養基に２単位／ｍｌのヘパリンを添加する必要がある。
【０３３８】
実施例５−細胞培養−ＭＣ−ＰＲＰ
ＭＣ−ＰＲＰを使用した細胞培養のプロトコル
フェーズ１：全血の採取
１ａ．チューブのブリスターパックを開く。静脈穿刺を行い、必要数のＭＣ−ＰＲＰチューブに全血を入れる。チューブ内の真空にすると、必要な量の血液（約１０ｍｌ）が自動的に収集される。
１ｂ．注意深くチューブを上下逆さまに反転させて、血液を抗凝固剤と混合する。
フェーズ２：遠心分離
２．遠心分離機を始動する前に、正確にバランスを取ることが常に不可欠である。
血液がＭＣ−ＰＲＰチューブに収集されたら、必要に応じて平衡チューブ（別売）に、ＣＣ−ＰＲＰチューブ内の血液と同じ体積に達するまで水を入れ、平衡を取る。
機械のバランスを取るために、充填されたチューブを向かい合わせに遠心分離機に挿入する。
次のように遠心分離値を調整する。
−時間：８分
−遠心力（ＲＣＦ）：１５００ｇ（遠心分離機のメーカの指示に応じて、対応するＲＰＭ速度を設定）
フェーズ３：遠心分離の結果
３．遠心分離後、血液は分留され、赤血球と白血球がゲルの下に閉じ込められ、単核球と血小板がゲルの表面に沈殿する。
フェーズ４：均質化
４ａ−方法１：ＭＣ−ＰＲＰチューブを数回静かに反転させることにより、細胞沈着物を再度上清に懸濁される。各チューブごとに約５ｍｌの細胞懸濁液が得られる。
４ｂ−方法２：より高い細胞濃度を得るために、細胞を再懸濁させる前に、長いカニューレ（未提供）で慎重に、無細胞血漿上清の上層２ｍｌを取り除く。その後チューブを静かに反転させ、細胞沈殿物を再度残りの２ｍｌに懸濁させる。
細胞とゲルが完全に分離していることを確認する。上清の透明な血漿は混濁するはずである。凝集体が存在する場合は、それらを血漿とともに収集する必要がある。
フェーズ５：使用
５．ＭＣ−ＰＲＰは、通常、多血小板血漿における細胞懸濁液が得られ、元々の試料に存在する単核細胞の回収率は７０＋／−１０％である。
【０３３９】
実施例６−ＣＣ−ＨＡを使用した細胞培養
ＣＣ−ＨＡを使用した細胞培養のプロトコル
フェーズ１：全血の採取
１ａ．最初のブリスターパックを開き、続いて２番目のパックを慎重に開きく。
１ｂ．付属品セットから必要な瀉血材料を使用して静脈穿刺を行い、ＣＣ−ＨＡチューブに全血を入れる。チューブ内を真空にすると、必要な量の血液（約６ｍｌ）が自動的に収集される。
１ｃ．チューブを慎重に数回反転させる。
１ｄ．適切な方法を使用して採血針を廃棄し、汚染された血液製剤を除去する。
フェーズ２：遠心分離
遠心分離機を起動する前に、正確にバランスを取ることが常に不可欠である。必要に応じて、平衡チューブ（別売）に、ＣＣ−ＨＡチューブ内の血液と同じレベルになるまで水を入れ、平衡を取る。そして、機械のバランスを取るために、充填されたチューブを向かい合わせに遠心分離機に挿入する。
次のように遠心分離値を調整する。
・時間：５分
・遠心力（ＲＣＦ）：１５００ｇ（遠心分離機のメーカの指示に応じて、対応するＲＰＭ速度を設定）
フェーズ３：遠心分離の結果
遠心分離後、血液が分留され、赤血球がゲルの下に閉じ込められ、細胞要素がゲルの表面に沈殿する。ヒアルロン酸が血漿の上にある。
フェーズ４：均質化
４ａ．チューブを上下逆さまにして垂直にし、ＨＡがチューブの壁から外れて血漿層の上部に浮くまでこの状態を維持する。
４ｂ．血小板が再懸濁するまで、チューブを少なくとも２０回注意深く反転させる、
４ｃ．すべてのＨＡがチューブの壁から離れ、製剤が均一になるまで、二指の間で前記チューブを水平位置に回す。各チューブごとに約５ｍｌのＨＡ／ＰＲＰ混合物が得られる。
４ｄ．ＣＣ−ＨＡチューブからＨＡ／ＰＲＰ混合物を収集するには、付属品セットの移送デバイスを使用する。
フェーズ５：使用
５．ＣＣ−ＨＡは、自家培養サプリメントとして使用され、濃度は１０〜４０％ｖ／ｖであり、各細胞株によって決まる。フィブリン塊の形成を回避するには、培養基に２単位／ｍｌのヘパリンを添加する必要がある。この製剤では、血小板がヒアルロン酸マトリックス中にトラップされている。当該製剤は、単層細胞培養のコーティングマトリックスとして使用でき、具体的には各細胞株によって決まる。
【０３４０】
実施例７  ―  ＣＣ−ＰＲＰデバイスの有効性
この例では、通常のＡＴ−ＭＳＣ（脂肪組織由来の間葉系幹細胞、およびＮＨＤＦ（通常のヒト皮膚線維芽細胞）の培養条件と比較して（図５および６）、本発明のデバイスを用いてＰＲＰを細胞培養に用いた場合に優れた効果が得られることを実証する。
１．  ＡＴ−ＭＳＣ
ＡＴ−ＭＳＣ分離
０．０１％コラゲナーゼＩ型（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）により、純粋な脂肪を、３７℃において穏やかに攪拌しながら４５分間消化した。１４００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、消化されなかった脂肪組織を取り出した。間質血管画分（ＳＶＦ）と呼ばれる、残りのペレットを赤血球溶解バッファーに５分間懸濁した（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）。次に、基礎培地を用いて洗浄した。前記基礎培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）−低糖型であり、１ｇ／Ｌグルコース、ｌ−グルタミン、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、補足成分としてペニシリンとストレプトマイシン１０，０００ｍｇ／ｍＬ（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、Ｓａｌｅｍ、ＮＨ）、および２単位／ｍＬヘパリン（Ｌｉｑｕｅｍｉｎ  ５０００、Ｒｏｃｈｅ、バーゼル、スイス）を含む。
１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、ＳＶＦをＤＭＥＭと補足成分に再懸濁させ、１００ｍｍナイロンセルストレーナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でろ過した。分離されたＳＶＦの平均細胞密度は３０×１０４細胞／ｍＬであった。
【０３４１】
ＡＴ−ＭＳＣ  培養
ＳＶＦ細胞を４８ウェルのプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に５０００セル／ｃｍ２で播種し、異なる培地培養条件で培養した。１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）をコントロールとして、または１％、５％、１０％、２０％、４０％、および６０％のｎＰＲＰまたはｔＰＲＰのいずれかが基礎ＤＭＥＭおよびサプリメントに添加された（各条件はいずれも１ｍＬ培地）。２４〜４８時間の培養後に得られたプラスチック付着細胞集団は、ＡＴ−ＭＳＣとして決定された。細胞は、ＦＢＳおよびＰＲＰ条件の培地を変更せずに、５％ＣＯ２の標準インキュベーター内で３７℃で１０日間培養した。
【０３４２】
ＰＲＰのＡＴ−ＭＳＣに対する増殖効果
すべての条件で、ＡＴ−ＭＳＣは培養期間中、典型的な紡錘線維芽細胞の形状を維持した。１０日間の培養後、異なるｎＰＲＰ濃度で補充したすべての培地は、ＦＢＳ含有培地と比較して、より高いＡＴ−ＭＳＣ数を示した（図３）。ｎＰＲＰのこのようなプラス効果は、用量依存性のベル型の曲線をたどった。培養１０日後、２０％ｎＰＲＰで補充した培地は、最適な条件を提供し、ＡＴ−ＭＳＣ数が１０％ＦＢＳの１３．９倍（ｎ＝１４、ｐ＜０．００１）となった。比較すると、他の条件はあまり効果的ではなかった［たとえば、１０％ＦＢＳと比較した場合（ｎ＝１４、ｐ＜０．００１）、１０％および４０％ｎＰＲＰ培地の場合、ＡＴ−ＭＳＣ数をそれぞれ５．６倍および１０．９倍増加させた］（図３）。
【０３４３】
図５：１０％ＦＢＳで調製された通常の培地と比較して、患者自身の血液から調製されたＡＴ−ＭＳＣ培養サプリメントは、体外増殖を劇的に増強する。
【０３４４】
２．  ＮＨＤＦ
ＮＨＤＦ分離
簡単に言うと、腹部形成術中に採取された組織は、１４単位／ｍＬのリベラーゼＤＬリサーチグレード（Ｒｏｃｈｅ）消化を受け、別々に処理された表皮と真皮の層を分離するするために使用された。ＮＨＤＦは、刻まれた後、１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）および１％抗生物質／抗真菌薬（ＡＢ／ＡＭ、Ｇｉｂｃｏ）を含む０．３％トリプシン／ＰＢＳコラゲナーゼ（Ｇｉｂｃｏ）において消化することにより分離された。次に、ＮＨＤＦをろ過し、遠心分離し、播種した。ＮＨＤＦはそれぞれ予想された丸石状およびスピンドルの形を呈し、汚染の兆候はなかった。１０％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）において、３７℃、５％ＣＯ２で補充し、ＮＨＤＦ細胞を第１代〜第５代まで培養した。すべての細胞を８０％のコンフルエンシーまで増殖させ、ＴｒｙｐｌｅＸ溶液（Ｇｉｂｃｏ）を使用して継代した。
【０３４５】
ＮＨＤＦ培養
ＮＨＤＦを１２ウェルのプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に１０００セル／ｃｍ２で播種し、異なる培地培養条件で培養した。１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）コントロールとして、または１％、５％、１０％、２０％、非活性なＰＲＰ。細胞は、ＦＢＳおよびＰＲＰ条件の培地を変更せずに、５％ＣＯ２の標準インキュベーター内で３７℃で５日間または７日間培養した。
【０３４６】
ＰＲＰのＮＨＤＦに対する増殖効果
すべての条件で、ＮＨＤＦは培養期間中、典型的な紡錘線維芽細胞の形状を維持した。５日間の培養後、異なるｎＰＲＰ濃度で補充したすべての培地は、ＦＢＳ含有培地と比較して、より高いＮＨＤＦ数を示した（図４）。培養５日後、２０％ｎＰＲＰで補充した培地は、最適な条件を提供し、ＮＨＤＦ数が１０％ＦＢＳのほぼ４倍（ｎ＝３、ｐ＜０．００１）となった。７日後、２０％のＰＲＰ増殖効果は、さらに顕著であり、総細胞数が５〜６倍も増加し、フローサイトメトリー分析で示されるように、細胞の半分は高い増殖表現型を呈した。
図６：同じ患者におけるＰＲＰのＮＨＤＦに対する増殖効果。Ａ．ＮＨＤＦは酵素消化により新鮮な皮膚試料から分離され、同じ密度で体外培養用に播種された。培養５日後、ＰＲＰの濃度を増加させると、細胞増殖が大幅に向上する（光学顕微鏡写真）。Ｂ．バイオレット色素取り込み後の細胞増殖のフローサイトメトリー分析。結果は倍数変化で表される。Ｃ．Ｂのグラフにプロットされたデータの代表的な密度プロット。
【０３４７】
実施例８−ＣＣデバイス製品の細胞の特徴付けと、ＰＢＭＣ、ＭＳＣ、および軟骨細胞の培養の可能性の研究
Ｉ．はじめに
本発明による３つの装置について試験を行う。
l  ＭＣ−ＰＲＰ：末梢血、臍帯血、骨髄穿刺から単核細胞を分離できる。
l  ＣＣ−ＰＲＰ：多血小板血漿（ＰＲＰ）が調製でき、前記ＰＲＰは、合成培地において単にまたは添加物として使用され、動物由来の血清に代えて体外での細胞成長を促進する。
l  ＣＣ−Ｓ：血清を取得でき、前記血清は、合成培地の添加物として使用でき、動物由来の血清に代えて体外での細胞成長を促進する。
これらの装置による調製に対応する製品は、それぞれ「ＭＣ−ＰＲＰ製剤」、「ＣＣ−ＰＲＰ製剤」、「ＣＣ−Ｓ製剤」と呼ばれる。
【０３４８】
これらの製剤は、整形外科および皮膚科の用途において、生物学的コーティング用の液体またはゲルの形態に製造されている。注意すべきなのは、合成培地でＣＣ−ＰＲＰおよびＭＣ−ＰＲＰを使用するには、血漿の凝固を防ぐために、ヘパリン（２単位／ｍｌ）等の抗凝固剤を加える必要がある。
【０３４９】
本研究は、一方では３つの製剤内に存在する細胞集団の特徴付けを行うことを目的としており、他方では、ＣＣ−ＰＲＰおよびＣＣ−Ｓ製剤の、いくつかの型の細胞の細胞培養におけるの可能性を評価することを目的としている。
【０３５０】
ＩＩ．目的とサービス
ＩＩ．１．表現型の特徴付けと細胞の生存
この調査の目的は次のとおりである。
―      フローサイトメトリー（Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ＬＳＲＩＩ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、ＭＣ−ＰＲＰ製剤に存在する細胞亜集団の表現型の詳細な特徴付けを実行する
―      ＣＣ−ＰＲＰおよびＣＣ−Ｓデバイスに対し、６色フローサイトメトリーによるＢ、Ｔ、ＮＫ細胞および顆粒球のカウントを実行する
―      ＭＣ−ＰＲＰ、ＣＣ−ＰＲＰおよびＣＣ−Ｓデバイス培養したの細胞の生存状況を研究する
【０３５１】
ＩＩ．１．ａ  ＭＣ−ＰＲＰ製剤中に存在する細胞集団の微細な表現型の特徴付け
免疫亜集団の詳細な表現型分析には以下が含まれる。
・ＣＤ３＋Ｔリンパ球数、ＣＤ１９＋Ｂリンパ球、ＣＤ３−ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋ＮＫリンパ球数
・血中に存在する３つの単球亜集団の頻度のカウント及び分析：炎症性単球ＣＤ１４＋、中間型単球ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋、および非古典的単球ＣＤ１６＋
・血中に存在する３つの樹状細胞の亜集団のカウント：ＤＣ骨髄性：ｍＤＣ１  ＣＤ１ｃ＋；ｍＤＣ２  ＣＤ１４１＋および形質細胞様ＤＣ  ＣＤ１２３＋
・ＮＫリンパ球亜集団（ＣＤ５６−、ＣＤ５６ｄｉｍ、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ）の頻度の計算と分析
・ＴＣＤ４およびＣＤ８リンパ球亜集団（ナイーブ、中央記憶、ＣＤ４５ＲＡ−エフェクター、ＣＤ４５ＲＡ＋記憶エフェクター）の頻度の列挙と分析
・ヘルパーＴリンパ球の亜集団の頻度のカウントと分析（Ｔｈ１  ＣＸＣＲ３＋、Ｔｈ２  ＣＣＲ４＋、Ｔｈ１７／Ｔｈ２２  ＣＣＲ６＋ＣＣＲ４＋、およびＴＦＨ亜集団ＣＸＣＲ５＋）
・制御性Ｔ細胞の亜集団の頻度のカウントと分析（ナイーブＣＤ４５ＲＡ＋、メモリー型ＣＤ４５ＲＡ−ＦｏｘＰ３ｌｏｗ、エフェクター型ＣＤ４５ＲＡ−ＦｏｘＰ３ｈｉｇｈ、および活性化ＨＬＡ−ＤＲ＋）
・Ｂリンパ球亜集団の頻度のカウントと分析（ナイーブＣＤ２７−ＩｇＤ＋、非スイッチＣＤ２７＋ＩｇＤ＋メモリ型、ＣＤ２７＋ＩｇＤ−、ＣＤ２７−ＩｇＤ−、ＣＤ２７−ＩｇＤ−、ダブルネガティブＣＤ２４ｈｉｇｈＣＤ３８ｈｉｇｈ未熟／移行型ＣＤ２７  、ＣＤ２７形質芽細胞＋ＣＤ３８＋ＣＤ１３８−およびＣＤ２７＋ＣＤ３８＋ＣＤ１３８＋形質細胞）
ＭＣ−ＰＲＰデバイスによって取得された細胞の表現型は、同じドナーでフィコール勾配遠心分離後に分離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の表現型と比較される。したがって、フィコール後に「ＭＣ−ＰＲＰ」条件と「ＣＣ−ＰＢＭＣ」条件の２つの条件が存在する。この２つの条件については、表現型分析の前に、前の開梱及びＰＢＭＣのカウントステップを行う必要がある。
【０３５２】
表現型の特徴付けは、２つの条件のそれぞれについて、６〜１５の抗体による８つのチューブに分割される。
・チューブ１：基準となる系統ＬＢ、ＬＴ、ＮＫの番号付け
・チューブ２：３つの単球亜集団の特徴付け：古典型、中間型、非従来型。
・チューブ３：ＬＴ分化の分析であって、マーカーＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７の差次的発現を利用して、ナイーブＣＤ４およびＣＤ８集団、中央記憶型、メモリーエフェクター型およびＥＭＲＡを特徴付けることができる。
・チューブ４：樹状細胞（ＤＣ骨髄性ＣＤ１４１＋およびＣＤ１ｃ＋）およびＤＣ形質細胞様亜集団の分析。ＤＣ活性化のレベルは、ＨＬＡ−ＤＲ分子と共刺激分子の発現レベルによって分析される。
・チューブ５：ヘルパーＴ細胞分析であって、Ｔｈ１（ＣＸＣＲ３＋）、Ｔｈ２（ＣＣＲ４＋）、Ｔｈ１７／２２（ＣＣＲ６＋、ＣＣＲ４＋）、Ｔｈ１／Ｔｈ１７（ＣＸＣＲ３＋、ＣＣＲ６＋）及び濾胞性Ｔ細胞（ＣＸＣＲ５＋）の頻度を特定できる。
・チューブ６：ＣＤ１６およびＣＤ５６マーカーの差次的発現に基づくＮＫ亜集団の特徴付け。
・チューブ７：ＣＤ４５ＲＡおよびＦｏｘＰ３マーカーの発現に基づく制御型ＬＴ亜集団の分析。ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３９、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＴＬＡ−４分子の発現によって活性化が特徴付けられる。
・チューブ８：ＣＤ２７とＩｇＤの相対的発現に基づいてＬＢ亜集団を分析し、ナイーブＢ細胞、非スイッチメモリ型、スイッチメモリ型を特徴付け、形質細胞と移行型Ｂについても特徴付けを行う。
本研究には最低１０〜１２ｍｌの供血が必要である。
【０３５３】
ＩＩ．１．ｂ  ＣＣ−ＰＲＰおよびＣＣ−Ｓ製剤中の細胞の表現型の特徴付け
ＣＣ−ＰＲＰおよびＣＣ−Ｓデバイスに対して：６色フローサイトメトリーによりＢ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞のカウントを行う。
両方の条件（ＭＣ−ＰＲＰとＣＣ−Ｓ）について、いずれも、表現型を決定する前に、開梱してこれらの試料に存在する単核球をカウントする準備ステップが必要である。表現型の特徴付けには、ＬＢ、ＬＴ、およびＮＫ（６つの抗体＋生存率マーカー＋カウントビーズ）という前記２つの条件のそれぞれに対応するチューブが含まれる。
この研究では、細胞汚染レベルを１％程度と想定する場合、最低１０ｍｌの供血が必要である。
オプション：ＣＣ−Ｓデバイスを使用して得られた血清における成長因子とドライチューブで得られた自家血清の成長因子の判定。
ＣＣ−Ｓおよびドライチューブで得られた自家血清における成長因子（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦベーシック、ＩＧＦ−ＩおよヒトＥＧＦ）のＥＬＩＳＡアッセイ。一組１０名のドナーを利用して、統計調査を実施した。
【０３５４】
ＩＩ．１．ｃＭＣ−ＰＲＰ、ＣＣ−ＰＲＰおよびＣＣ−Ｓ製剤からの細胞培養後の細胞生存状況
培養前に単核球、血小板、顆粒球のカウントを行う。このカウント、この研究に必要な血液の量を定義する。さらに、２４時間および４８時間の培養後に、カウント、細胞生存能力評価、およびフローサイトメトリー（Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、骨髄細胞及び顆粒球のカウント用の３つのチューブ）の特徴付けを行う。
培養４８時間後に細胞生存率が７０％を超える場合、７２時間および９６時間においてさらに、同様にカウント、細胞生存能力評価、６色フローサイトメトリーの特徴付けを含む２つのデータを取得する。
初歩的結果では、ＭＮＣを室温でＰＲＰ中に保存すると、倍増時間は６日であることが示された。
【０３５５】
ＩＩ．２．ＣＣ−ＰＲＰおよびＣＣ−Ｓ製剤の細胞生存率に関する評価
この研究の目的は、いくつかの型の細胞の培養に対するＰＲＰ製剤の影響を評価することにある。
−ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）
−ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）
−ヒト軟骨細胞
【０３５６】
ＩＩ．２．ａ．  ＰＢＭＣ
特定の細胞亜集団の優先的な生存を実証するために、４８時間において完全な免疫表現型検査により、ＰＢＭＣ培養に対するＣＣ−ＰＲＰおよびＣＣ−Ｓ製剤の効果を評価した。これは以下を含む。
―    フローサイトメトリーにおいて培養前のすべてのリンパおよび骨髄細胞集団（Ｊ０）に対し表現型の特徴付けを行うことにより、骨髄細胞、ＮＫ細胞、制御性Ｔ細胞、ヘルパーＴリンパ球、メモリー型Ｔ細胞、Ｂリンパ球の分析が可能となる。
―    フローサイトメトリーにおいて、４８時間培養後のすべてのリンパおよび骨髄細胞集団に対し表現型の特徴付けを行うことにより、骨髄細胞、ＮＫ細胞、制御性Ｔ細胞、ヘルパーＴリンパ球、メモリー型Ｔ細胞、Ｂリンパ球の分析が可能となる。
【０３５７】
当該研究は自家で行われる。以下４つの条件に対し試験を行う。
・ドライチューブで収集された血液から得られた自家血清（培地において濃度１０％で使用）
・ＣＣ−Ｓ（培地において濃度１０％で使用）
・ドライチューブで収集された血液から得られた自家血清（濃度１０％＋ヘパリン２Ｕ／ｍｌで使用）。（細胞表現型に対するヘパリンの影響が出ないよう制御する）
・ＣＣ−ＰＲＰ（濃度１０％＋ヘパリン２単位／ｍｌで使用）
フローサイトメトリーによって培養前のすべてのリンパ球および骨髄球集団（Ｊ０−１ポイント）に対して行う精密な表現型の特徴付けは、８本のチューブを含む。
・チューブ１：ＬＢ、ＬＴ、ＮＫのカウント（６抗体＋生存マーカー＋カウントビーズ）。０．５×１０６ＰＢＭＣ／チューブにマーク
・チューブ２：単球亜集団の分析（１３抗体＋生存マーカー＋カウントビーズ）。２×１０６ＰＢＭＣ／チューブにマーク
・チューブ３：ＬＴ分化の分析（１１抗体＋生存マーカー）。１×１０６ＰＢＭＣ／チューブにマーク
・チューブ４：樹状細胞亜集団の分析（１７抗体＋生存マーカー＋カウントビーズ）。２×１０６ＰＢＭＣ／チューブにマーク
・チューブ５：ヘルパーＴ細胞分析（１２抗体＋生存マーカー）。２×１０６ＰＢＭＣ／チューブにマーク
・チューブ６：ＮＫ亜集団の分析（１４抗体＋生存マーカー）。１×１０６ＰＢＭＣ／チューブにマーク
・チューブ７：制御型ＬＴの分析（抗体＋生存マーカー）。１×１０６ＰＢＭＣ／チューブにマーク
・チューブ８：ＬＢ細胞亜集団の分析（１３抗体＋ＤＡＰＩ）２×１０６ＰＢＭＣ／チューブにマーク
フローサイトメトリーによる培養（４８時間、４つのサンプリングサイト）後のすべてのリンパ球および骨髄細胞集団の精密な表現型の特徴付けには、４×８チューブが含まれる。
・チューブ１〜４：ＬＢ、ＬＴ及びＮＫカウント（６抗体＋生存マーカー＋カウントビーズ）。０．５×１０６ＰＢＭＣ／チューブにマーク
・チューブ５〜８：単球亜集団の分析（１３抗体＋生存マーカー＋カウントビーズ）。  ２×１０６ＰＢＭＣ／チューブにマーク
・チューブ９〜１２：ＬＴ分化の分析（１１抗体＋生存マーカー）。１×１０６ＰＢＭＣ／チューブにマーク
・チューブ１３〜１６：樹状細胞の亜集団の分析（１７抗体＋生存マーカー＋カウントビーズ）。２×１０６ＰＢＭＣ／チューブにマーク
・チューブ１７−２０：ヘルパーＴ細胞の分析（１２抗体＋生存マーカー）。２×１０６ＰＢＭＣ／チューブにマーク
・チューブ２１〜２４：ＮＫ亜集団の分析（１４抗体＋生存マーカー）。１×１０６ＰＢＭＣ／チューブにマーク
・チューブ２５〜２８：制御型ＬＴの分析（１５抗体＋生存マーカー）。１×１０６ＰＢＭＣ／チューブにマーク
・チューブ２９〜３２：ＬＢ細胞亜集団の分析（１３抗体＋ＤＡＰＩ）。２×１０６ＰＢＭＣ／チューブにマーク（ヘルパーＴリンパ球、メモリー型Ｔリンパ球、Ｂリンパ球）。
４８時間の代わりに、またはそれに加えて、後の段階で試験が行うことができる。
【０３５８】
ＩＩ．２．ｂ．ヒトＣＳＭ
研究―以下の目的で、新鮮な血液を使用できる。
―     ウシ胎仔血清（陽性対照）と比較して、培養された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の生存および増殖に対するＣＣ−ＰＲＰおよびＣＣ−Ｓ製剤の効果を評価するため。
―     ＭＳＣの軟骨細胞、脂肪細胞、骨芽細胞の３つの系統への分化特性を研究するため。
【０３５９】
研究の最初のステップは、最適なＭＳＣの３継代生存と増殖を実現するために、培養で使用するＣＣ−ＰＲＰおよびＣＣ−Ｓの有効用量（０、５、１０、１５、２０、または２５％）を決定することである。これらの用量が決定したら、従来使用されているウシ胎仔血清を含む陽性対照培地と、最適用量のＣＣ−ＰＲＰまたはＣＣ−Ｓのいずれかを含む培地との間で、ＭＳＣの生存と増殖の比較研究を行う。この研究は、少なくとも２つの異なるＣＳＭの試料と４つの継代で実施される。ＭＳＣの生存と増殖は、各継代においてトリパンブルーカウントによって決定される。
３つの系統（軟骨細胞、脂肪細胞、骨芽細胞）におけるＭＳＣの分化特性の研究は、特定の分化培地で細胞を２１日間培養して対照培地と比較するすることにより行われる。
軟骨細胞分化の場合、分化効率は、一方で２１日目の分化細胞を０日目の未分化細胞と比較し、他方でＭＳＣ軟骨細胞分化誘導因子ＴＧＦＢ３の存在下または非存在下で培養細胞を比較することによって評価される。したがって、ＣＣ−ＰＲＰおよびＣＣ−Ｓが軟骨細胞の分化に及ぼす影響を評価するには、７つの条件が必要である。
【０３６０】
・ＣＳＭ  Ｊ０
・ＣＳＭ＋陽性対照Ｊ２１
・ＣＳＭ＋陽性対照＋ＴＧＦｂ３  Ｊ２１
・ＣＳＭ＋ＣＣ−ＰＲＰ  Ｊ２１
・ＣＳＭ＋ＣＣ−ＰＲＰ＋ＴＧＦｂ３  Ｊ２１
・ＣＳＭ＋ＣＣ−Ｓ  Ｊ２１
・ＣＳＭ＋ＣＣ−Ｓ＋ＴＧＦｂ３  Ｊ２１
細胞が分化転換していないことを確認するために、培養が終了する際に線維芽細胞マーカーが必要になる場合がある。
【０３６１】
脂肪細胞への分化の場合、分化効率は、分化培地または増殖培地のいずれかで２１日間培養された細胞を比較することによって評価される。したがって、ＣＣ−ＰＲＰと血清が脂肪細胞の分化に及ぼす影響を評価するには、６つの条件が必要である。
・ＣＳＭ  ＋陽性対照Ｊ２１、増殖培地
・ＣＳＭ  ＋陽性対照Ｊ２１、分化培地
・ＣＳＭ＋ＣＣ−ＰＲＰ  Ｊ２１、増殖培地
・ＣＳＭ＋ＣＣ−ＰＲＰ  Ｊ２１、分化培地
・ＣＳＭ＋ＣＣ−Ｓ  Ｊ２１、増殖培地
・ＣＳＭ＋ＣＣ−Ｓ  Ｊ２１、分化の中間期
【０３６２】
脂肪細胞への分化について、ＲＴ−ｑＰＣＲ（分化した細胞あたり３つのマーカーのパネル）およびレッドオイル染色によって、各系統に特異的なマーカーの誘導を評価し、これによって、分化を判定する。
【０３６３】
最後に、骨芽細胞への分化にも同じ実験スキームが適用される。分化効率は、分化培地または増殖培地のいずれかにおいて２１日間培養された細胞を比較することによって評価される。骨芽細胞への分化に対するＣＣ−ＰＲＰと血清の効果を評価するには、６つの条件が必要である。
・ＣＳＭ  ＋陽性対照Ｊ２１、増殖培地
・ＣＳＭ  ＋陽性対照Ｊ２１、分化培地
・ＣＳＭ＋ＣＣ−ＰＲＰ  Ｊ２１、増殖培地
・ＣＳＭ＋ＣＣ−ＰＲＰ  Ｊ２１、分化培地
・ＣＳＭ＋ＣＣ−Ｓ  Ｊ２１、増殖培地
・ＣＳＭ＋ＣＣ−Ｓ  Ｊ２１、分化の中間期
骨芽細胞への分化について、ＲＴ−ｑＰＣＲ（分化細胞あたり５つのマーカーのパネル）および組織学的染色によって各系統に特異的なマーカーの誘導を評価し、これによって、分化を判定する。
【０３６４】
ＩＩ．２．Ｃ．ヒト軟骨細胞
ＣＣ−ＰＲＰおよびＣＣ−Ｓチューブで得られた製剤の、ヒト軟骨細胞の生存、増殖および表現型に対する影響。
最初のステップは、最適なヒト軟骨細胞の２継代生存と増殖培養を実現するために、培養で使用するＣＣ−ＰＲＰとＣＣ−Ｓの有効用量（０、５、１０、１５、２０、または２５％）を決定することである。トリパンブルーカウントによって各継代のＭＳＣの生存と増殖が特定される。ＲＴ−ｑＰＣＲにより、軟骨細胞表現型の維持に対するＣＣ−ＰＲＰおよびＣＣ−Ｓの影響を特定し、ＦＣＳを含む陽性対照培地で細胞を培養した後に得られた結果と比較する。第１継代および第２継代において、軟骨細胞の特定マーカー（アグリカン、コラーゲンＩＩＢ、Ｓｏｘ９、コラーゲンＸ、ＭＭＰ１３）の発現について評価する。最終的な特徴付けにおいて、軟骨細胞の脱分化を評価するために、線維芽細胞マーカーが必要になる場合がある。
【０３６５】
ＩＩ．２．ｄ．ヒト肝細胞
ＨｅｐＧ２ヒト肝癌細胞株−Ｃ３ＡおよびＨｕＨ７の２つの細胞モデルを使用した、ヒト肝細胞の分化状態の増殖および維持ならびに成人肝細胞の初代の培養に対するＣＣ−ＰＲＰおよび／またはＣＣ−Ｓ製剤の効果。実験は同種で行われることに注意することが重要である。
１−肝細胞癌株の生存と増殖に対するＰＲＰの影響の研究
最初の一連の実験では、ＣＣ−ＰＲＰおよびＣＣ−Ｓ溶液の毒性をＨｅｐＧ２−Ｃ３ＡおよびＨｕＨ７細胞株で評価します。大用量の効果についてテストされる（５〜２５％）。その後、これらの溶液の増殖に対する影響が評価される。次に、低用量を選択して、いくつかの継代での細胞増殖を分析する。
【０３６６】
実験プロトコル
―     毒性の評価
細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充した培地において、９６ウェルのプレートで培養される。
−１６時間の培養した後、培地は以下のサプリメントを含む基本培地に換えられる。
・２Ｕ／ｍｌのヘパリンが補充された５、１０、１５、２０、または２５％ＣＣ−ＰＲＰ
・２Ｕ／ｍｌのヘパリンが補充された５、１０、１５、２０、または２５％照射ＣＣ−ＰＲＰ
・５、１０、１５、２０、または２５％ＣＣ−Ｓ
・２Ｕ／ｍｌのヘパリン
・１０％ＦＣＳ
・２Ｕ／ｍｌのヘパリンが補充された１０％ＦＣＳ
４８時間の培養後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞生存率が測定される。
【０３６７】
―    第一継代での増殖の評価
細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充した培地において、９６ウェルのプレートで培養される。
−１６時間の培養後、培地は以下のサプリメントを含む基本培地に換えられる。
・２Ｕ／ｍｌのヘパリンが補充された５、１０、１５、２０、または２５％ＣＣ−ＰＲＰまたは照射ＣＣ−ＰＲＰ
・５、１０、１５、２０、または２５％ＣＣ−Ｓ
・２Ｕ／ｍｌのヘパリン
・１０％ＦＣＳ
・２Ｕ／ｍｌのヘパリンを補充した１０％ＦＣＳ
−２４、４８、７２時間の培養後、ＢｒｄＵ（細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ−Ｓｉｇｍａ）の取り込みを測定することによって増殖を評価する。
【０３６８】
第三継代での増殖の評価
細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充した培地において、２４ウェルのプレートで培養される。
−１６時間の培養後、培地は以下のサプリメントを含む基本培地に換えられる。
・２Ｕ／ｍｌのヘパリンが補充されたｘ％、ｙ％ＣＣ−ＰＲＰまたは照射ＣＣ−ＰＲＰ
・ｘ％、ｙ％ＣＣ−Ｓ
・１０％ＦＣＳ
・２Ｕ／ｍｌのヘパリンを補充した１０％ＦＣＳ
−細胞は各継代ごとにカウントされ、生存能力はトリパンブルーで測定される。
各実験ポイントにおいて、試験は３重に行われる（３継代のカウント２回）。結果は、３つの独立した実験に基づいて（したがって３つの異なるバッチのＣＣ−ＰＲＰ、ＣＣ−Ｓを使用して）分析される。
【０３６９】
２−初代ヒト肝細胞の分化状態の増殖と維持に対するＰＲＰの影響の研究
初代ヒト肝細胞は、ＣＣ−ＰＲＰが補充されているかされていない特定の培地（Ｐｉｃｈａｒｄ  Ｌ、Ｒａｕｌｅｔ  Ｅ、Ｆａｂｒｅ  Ｇ、Ｆｅｒｒｉｎｉ  ＪＢ、Ｏｕｒｌｉｎ  ＪＣ、Ｍａｕｒｅｌ  Ｍｏｌｅｔｈ  Ｐ．  Ｍｏｌｏｄｓ  ２００６、３２０：２８３−９３）で培養される。所定の時間が経過後、毒性、増殖、および分化状態の維持について分析される。実験は、３つの異なるバッチのＣＣ−ＰＲＰの初代肝細胞製剤について行われることに注意すべきである。
注意：肝細胞癌系統で得られた結果を考慮して、使用するＣＣ−ＰＲＰのパーセンテージを調整し、この種の照射溶液を使用するかどうかを決定する。
【０３７０】
実験プロトコル
―    毒性の評価
肝細胞は、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充した特定の培地（Ｐｉｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）において、コラーゲンＩをコーティングした９６ウェルプレートで培養する。
−１６時間の培養後、培地は以下のサプリメントを含む基本培地に換えられる。
・２Ｕ／ｍｌのヘパリンが補充された５、１０、１５、２０、または２５％照射ＣＣ−ＰＲＰ
・２Ｕ／ｍｌのヘパリン
・１０％ＦＣＳ
２４時間および９６時間の培養後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞生存率が測定される。
【０３７１】
―   ＢｒｄＵ取り込みの測定による増殖の評価
−肝細胞は、２％ＦＣＳを補充した特定の培地（Ｐｉｃｈａｒｄら、２００６）において、コラーゲンＩをコーティングした９６ウェルプレートで培養される。
１６時間の培養後、培地は以下のサプリメントを含む基本培地に換えられる。
・２Ｕ／ｍｌのヘパリンが補充された５、１０、１５、２０、または２５％ＣＣ−ＰＲＰまたは照射ＣＣ−ＰＲＰ
・２Ｕ／ｍｌのヘパリン
・１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦとＨＧＦおよび２Ｕ／ｍｌのヘパリン
増殖は、ＢｒｄＵの取り込みを測定（細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ−Ｓｉｇｍａ）することにより、２４時間ごとに、７２時間にわたって評価される。
【０３７２】
―    肝細胞の分化状態の維持の評価
−肝細胞は、２％ＦＣＳを補充した特定の培地（Ｐｉｃｈａｒｄら、２００６）において、コラーゲンＩでコーティングされた２４ウェルプレートで培養される。
−１６時間の培養後、培地は以下のサプリメントを含む基本培地に換えられる。
・２Ｕ／ｍｌのヘパリンが補充されたｘ％およびｙ％ＣＣ−ＰＲＰまたは照射ＣＣ−ＰＲＰ
・２Ｕ／ｍｌのヘパリン
約４８時間に。
【０３７３】
次に、細胞を１０μＭリファンピシンまたは１０ｎＭ  ＴＣＤＤ（生体異物代謝の２つの主要なシグナル伝達経路に関与するの原型活性化因子）とともに２４時間培養する。
そして、ＲＴ−ｑＰＣＲによってこれらのシグナル伝達経路の一連の標的遺伝子の発現（ＰＸＲ、ＡｈＲ、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２アルブミン、ＨＮＦ４）を測定することによって、生体異物代謝酵素の発現と誘導性の維持が評価される。
オプション１：２種類の用量のＣＣ−ＰＲＰまたは照射ＣＣ−ＰＲＰを使用して、細胞を培養した後、ウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ）によってＥＲＫ１／２およびＡｋｔシグナル伝達経路を評価する。ＥＧＦは陽性対照に用いる。
オプション２：ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ１Ａ２活性の測定（ＫｉｔｓＰ４５０−Ｇｌｏ）。
オプション３：肝細胞組織のスフェロイド化を促進するために、ＣＣ−ＨＡ（ヒアルロン酸リッチな）を補充した培地で初代肝細胞を培養する。スフェロイドの形成に対するＣＣ−ＰＲＰまたはＣＣ−Ｓの影響を試験することも興味深い。実際、それらの形成は血清の存在に依存する。さらに、スフェロイドの形成は、すべてのバッチの肝細胞に有効でなわけではない。
【０３７４】
実験プロトコル
肝細胞を、９６ウェルプレートＧｒａｖｉｔｙＴＲＡＰ(R)ＵＬＡプレートで定義培地（Ｐｉｃｈａｒｄら、２００６）で培養し、以下を補充する。
・１０％ＳＦＶ
・１０％ＣＣ−ＨＡ
・１０％ＣＣ−ＰＲＰ
・１０％ＣＣ−Ｓ
−７日間経過後、顕微鏡下でスフェロイドの形成が観察された。
スフェロイドにおける肝細胞の生存能力は、カルセイン−ヨウ化プロピジウム標識によって評価される。
２％ＦＣＳを補充した特定の培地において、コラーゲンＩへの細胞の付着について制御（Ｐｉｃｈａｒｄら、２００６）が可能になった。
【０３７５】
６つのウェルについて、各実験ポイントごとに試験を行う。結果は、５つの独立した実験に基づいて（したがって、５つの異なるバッチのＣＣ−ＨＡ、ＣＣ−ＰＲＰ、ＣＣ−Ｓを用いて）分析される。
注意：肝細胞を試験溶液において直接培養するべきであるが、物流上の理由により、実験は、凍結保存された肝細胞で行う。
肝細胞のスフェロイドへの分化に対する異なる溶液の影響は、後で評価できる。この研究の相関性は、一方ではＣＣ−ＰＲＰ、ＣＣ−Ｓ溶液を用いたことによる肝細胞の２Ｄ分化の結果に依存し、他方では、はＣＣ−ＰＲＰ、ＣＣ−Ｓ溶液のスフェロイド形成への影響に依存する。
【０３７６】
実施例９−アルツハイマー病、キャロル・クロゼット、幹細胞および神経変性疾患への、神経および神経幹細胞の適用
第１の目的は、ヒト神経幹細胞（ＮＳＣ）の増殖および分化に対する、本発明のＰＲＰ製剤および異なる細胞培養デバイスの影響を特定することである。ヒト胚性幹細胞に由来するＨ９ＮＳＣ（Ｇｉｂｃｏ）系統、または非病理学性ｉＰＳＣに由来するｉＰＳＣ／ＮＳＣ系統という２つの神経幹細胞株を使用することを提案する。
【０３７７】
２番目の目的は、健康なマウスとＡＤの実験モデルにおいて、ＰＲＰ移植を利用および前処理したＮＳＣ細胞の運命を評価することである。
【０３７８】
最後の目標は、アルツハイマー病（ＡＤ）患者の線維芽細胞から再プログラムされたｉＰＳＣから得られたＮＳＣおよびニューラルネットワークに対する、ＰＲＰの影響を研究することです。
【０３７９】
ＰＲＰとニューラルモデル
神経幹細胞とその神経派生物の移植後の運命ならびにそれらの分化に関して、多くの疑問が提起されている。また、これらの細胞は、ニューロスフェアの形で、または単層で成長することができる。ニューロスフェアでは、壊死と自発的分化の問題を掌握するのが困難である。一方、この型の培養は、単層培養の場合のように、細胞付着のためのマトリックスを必要としない。実際、単層培養では、ＮＳＣの増幅には、事前にマトリゲル、ポリオルニチン＋ラミニン、またはポリオルニチン＋フィブロネクチンでコーティングされた培養皿を使用する必要がありこれらの培養皿は、その由来に問題があった。そのため、単層培養のマトリックス代替物または浮遊培養の栄養サポートとしてのＰＲＰの使用が検討された。
【０３８０】
細胞モデル
ＧＩＢＣＯから販売されているヒト胚性幹細胞のＨ９ＮＳＣ系統の使用および、健康なｉＰＳＣ（異なるプロトコルによって生成）から得られたＮＳＣは以下にように分化する。単層での神経分化（３０日超）、成熟した神経の３Ｄ神経分化（６〜１２週間超）。アルツハイマー病に罹患している患者の線維芽細胞から生成されたｉＰＳＣを使用して、２アルツハイマー病に対して２年間のモデリングを行った。細胞の特性により、患者の細胞は、健康な対照とは異なる表現型を持っていることが示された。その特性とは、増殖の遅いこと、アポトーシスの増加、ＲＯＳ（活性酸素）の生成、およびＡｂｅｔａ４２／４０の比率の増加であり、これらはアルツハイマー病の特徴に合致していた。目的は、アルツハイマー病患者のｉＰＳＣでのＰＲＰをテストし、事前にアルツハイマー病について培養された健康な細胞の移植をテストすることである。アルツハイマー病の実験モデルにおいて、ＰＲＰまたはＰＲＰとの同時注入をもちいる。
【０３８１】
実験計画
１−ＰＲＰの用量の決定
プロジェクトの最初のステップは、ＮＳＣ培養に使用するＰＲＰの適切な用量、つまり細胞死に至らない用量を決定することである。このために、異なる用量の異なるＰＲＰをテストし、第一継代の細胞の生存と増殖を評価して、対照培地と比較することを提案する。
―    毒性／アポトーシスの評価：カスパーゼ３／７キット（Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ(R)３／７アッセイ−プロメガ）を用いてＬＤＨ（ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６(R) Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ−Ｐｒｏｍｅｇａ）の放出と死亡を測定し、ＰＲＰ溶液の毒性を評価する。
―    増殖評価：ＢｒｄＵの取り込みを測定することによって（細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ−Ｓｉｇｍａ）、増殖を評価する。結果は３つの独立した実験に基づいて分析される。
【０３８２】
２−  ＰＲＰが健康なＨ９ＮＳＣまたはｉＰＳＣ／ＮＳＣの生存、増殖、分化に及ぼす影響の研究
Ｈ９ＮＳＣまたはｉＰＳＣ／ＮＳＣ細胞は、ＰＲＰの存在下で４継代にわたって２４時間、４８時間、７２時間培養され、２４時間、４８時間、７２時間における毒性、増殖、アポトーシスについて分析される。ＳｔｅｍＰｒｏＮＳＣ増殖培地で成長した細胞を対照として用いる。
―  毒性／アポトーシスの評価：カスパーゼ３／７キット（Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ(R)３／７アッセイ−プロメガ）を用いてＬＤＨ（ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６(R) Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ−Ｐｒｏｍｅｇａ）の放出と死亡を測定し、ＰＲＰ溶液の毒性を評価する。
―  増殖評価：ＢｒｄＵの取り込みを測定することによって（細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ−Ｓｉｇｍａ）、増殖を評価する。結果は３つの独立した実験に基づいて分析される。
―  分化の評価：単層で３０日、または３Ｄで６週間と１２週間の分化について評価を行う。分化は、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲと９つの細胞系統および細胞機能マーカー（ＮＳＣ、ニューロン、星状細胞、セロトニン作動性、ＧＡＢＡ作動性、アセチルコリン作動性、ドーパミン作動性、グルタミン酸作動性、シナプス活性）の免疫蛍光によって評価する。
【０３８３】
３−ニューロスフィアを維持する健康なＨ９ＮＳＣまたはｉＰＳＣ／ＮＳＣの生存、増殖、分化に対するＰＲＰの影響の研究
Ｈ９ＮＳＣまたはｉＰＳＣまたはＮＳＣｆ細胞は、ＰＲＰの存在下で４継代にわたって２４時間、４８時間、７２時間培養され、２４時間、４８時間、７２時間における毒性、増殖、アポトーシスについて分析される。ＳｔｅｍＰｒｏＮＳＣ増殖培地で成長した細胞を対照として用いる。
―    毒性／アポトーシスの評価：カスパーゼ３／７キット（Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ(R)３／７アッセイ−プロメガ）を用いてＬＤＨ（ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６(R) Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ−Ｐｒｏｍｅｇａ）の放出と死亡を測定し、ＰＲＰ溶液の毒性を評価する。
―  増殖評価：ＢｒｄＵの取り込みを測定することによって（細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ−Ｓｉｇｍａ）、増殖を評価する。結果は３つの独立した実験に基づいて分析される。
―    分化の評価：単層で３０日、または３Ｄで６週間と１２週間の分化について評価を行う。分化は、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲと９つの細胞系統および細胞機能マーカー（ＮＳＣ、ニューロン、星状細胞、セロトニン作動性、ＧＡＢＡ作動性、アセチルコリン作動性、ドーパミン作動性、グルタミン酸作動性、シナプス活性）の免疫蛍光によって評価する。
【０３８４】
４−従来の培地に代わるＰＲＰの、Ｈ９ＮＳＣまたは健康なｉＰＳＣ／ＮＳＣの生存、増殖、分化に与える影響の研究
Ｈ９ＮＳＣ、ｉＰＳＣまたはＮＳＣｆ細胞は、事前にＰＲＰ製剤でコーティングされたプレート上に、単層で２４時間、４８時間、７２時間培養され、２４時間、４８時間、７２時間における毒性、増殖、アポトーシスについて、４継代で分析される。ＳｔｅｍＰｒｏＮＳＣ増殖で成長した細胞を対照として用いる。
―    毒性／アポトーシスの評価：カスパーゼ３／７キット（Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ(R)３／７アッセイ−プロメガ）を用いてＬＤＨ（ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６(R) Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ−Ｐｒｏｍｅｇａ）の放出と死亡を測定し、ＰＲＰ溶液の毒性を評価する。
― ―  増殖評価：ＢｒｄＵの取り込みを測定することによって（細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ−Ｓｉｇｍａ）、増殖を評価する。結果は３つの独立した実験に基づいて分析される。
―    分化の評価：単層で３０日、または３Ｄで６週間と１２週間の分化について評価を行う。分化は、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲと９つの細胞系統および細胞機能マーカー（ＮＳＣ、ニューロン、星状細胞、セロトニン作動性、ＧＡＢＡ作動性、アセチルコリン作動性、ドーパミン作動性、グルタミン酸作動性、シナプス活性）の免疫蛍光によって評価する。
【０３８５】
５−統合性脳システムへの統合に対するＰＲＰの影響の研究
分析は、１セル型のＨ９ＮＳＣまたはｉＰＳＣ／ＮＳＣの健康な細胞により２０週間行うことができます
―  器官培養および細胞運命分析における脳スライスへの細胞移植。
―  Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスへの細胞移植と細胞運命分析。
【０３８６】
６−アルツハイマー病患者のｉＰＳＣ／ＮＳＣ細胞の表現型に対するＰＲＰの影響の研究
アルツハイマー病の３人の患者から３つのｉＰＳＣ系統を生成した。２人の患者は遺伝型のキャリア（ＡＰＰ遺伝子のＤ６９４Ｎ変異またはＰＳＥＮ１遺伝子のＧ２１７Ｄ変異）と散発型の患者であった。これらの細胞には、健康な細胞とは異なる表現型があった。ＰＲＰの作用、特にＰＲＰの細胞死や分化した細胞の表現型の変化を防ぐ能力を評価する。また、ＡＤの２つの主要特徴であるＡβレベルとＴａｕリン酸化を評価する。
―健康なｉＰＳＣ／ＮＳＣを対照として、ｉＰＳＣ／ＮＳＣ  ＭＡの生存、増殖、分化に対するＰＲＰの影響を研究した。
・毒性／アポトーシスの評価：カスパーゼ３／７キット（Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ(R)３／７アッセイ−プロメガ）を用いてＬＤＨ（ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６(R) Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ−Ｐｒｏｍｅｇａ）の放出と死亡を測定し、ＰＲＰ溶液の毒性を評価する。
・増殖評価：ＢｒｄＵの取り込みを測定することによって（細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ−Ｓｉｇｍａ）、増殖を評価する。結果は３つの独立した実験に基づいて分析される。
・分化の評価：単層で３０日、または３Ｄで６週間と１２週間の分化について評価を行う。分化は、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲと９つの細胞系統および細胞機能マーカー（ＮＳＣ、ニューロン、星状細胞、セロトニン作動性、ＧＡＢＡ作動性、アセチルコリン作動性、ドーパミン作動性、グルタミン酸作動性、シナプス活性）の免疫蛍光によって評価する。。
・分化した細胞へのＰＲＰ添加の評価：ｑ−ＲＴ−ＰＣＲと９つの細胞系統および細胞機能マーカー（ＮＳＣ、ニューロン、星状細胞、セロトニン作動性、ＧＡＢＡ作動性、アセチルコリン作動性、ドーパミン作動性、グルタミン酸作動性、シナプス活性）の免疫蛍光によって、分化を評価する。
―  増殖細胞や分化細胞のＡβ分泌レベルとＴａｕリン酸化に対する、ＰＲＰの影響を研究する
・マルチプレックスＥＬＩＳＡによりＡβ４０及びＡβ４２を測定し、Ａβ４０／Ａβ４２比率を評価する
・Ｔａｕ／ｐｈｏｓｐｈｏ  Ｔａｕ用量
【０３８７】
実施例１０  -自家多血小板血漿（ＣＣ−ＰＲＰ）によるヒトの体外線維芽細胞の増殖の安全な促進
概要
今日、皮膚修復における自家線維芽細胞の適用は、臨床的に多くの関心が示されている。ほとんどの場合、体外皮膚細胞培養が必須である。ただし、異種または同種培養培地を使用した細胞増殖には、感染伝播のリスクや細胞増殖の遅延など、いくつかの欠点がある。この研究では、患者自身の多血小板血漿（ＰＲＰ）を用いて体外でヒト皮膚線維芽細胞を増殖させることのできる自己培養システムを開発した。腹部形成術を受けている患者からヒト皮膚線維芽細胞を分離し、ＣＣ−ＰＲＰ医療デバイスを使用して血液を採取し、新鮮なＰＲＰを調製した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）またはＰＲＰのいずれかをサプリメントとして添加した培地を使用して、最長７日間培養した。ＰＲＰを補充した培地で培養した線維芽細胞は、用量に依存する顕著に高い増殖速度（ＰＲＰの２０％で７．７倍と高い増殖速度）を示し、ＦＢＳに比べて、体外創傷治癒における遊走が速くなり、同時に染色体の安定性も維持された。高濃度においては、ＰＲＰは線維芽細胞の形態を変化させ、細胞骨格の再配列とα−ＳＭＡおよびビメンチンの発現の増加を誘発した。これらの発見により、自己由来のＰＲＰが線維芽細胞培養のための効率的で費用効果の高いサプリメントであり、体外細胞増殖のための異種／同種血液誘導体の安全な代替品として検討する必要があることが分かった。
【０３８８】
影響評価
自家皮膚線維芽細胞移植は、皮膚欠損の修復において重要な治療法であるが、ほとんどの場合、体外皮膚細胞培養が必須である。しかし、異種／同種培養培地を使用した細胞増殖には、感染伝播のリスクなど、いくつかの欠点がある。我々は、患者自身の多血小板血漿を用いた自家培養システムが、線維芽細胞培養のための効率的で費用効果が高く安全なサプリメントであることを実証した。優れた製造規範と監督機関の基準を満たしているため、これを異種または同種血液派生物の有力な代替品と見なし、将来的に体外細胞増殖に用いる臨床プロトコルを検証するべきである。
【０３８９】
前書き
再生医療は、年齢、疾患、または外傷によって損傷を受けた組織や臓器を治癒または置換したり、先天性欠損を矯正したりする可能性がある。臨床前および臨床データは、慢性疾患および急性損傷または一部の癌の治療に有望であることを示している。１再生医療の「ツールボックス」では、細胞療法は、自己または同種細胞成分を患者の修復または再生のために患者に供することを目的とし、損傷した組織は生理学的機能を回復するために使用される。２細胞療法において、血液細胞や骨髄細胞、成熟および未成熟の固形組織細胞、成体幹細胞、そして最も論争の的になっている胚性幹細胞などを含む、多種の細胞を使用できる。皮膚は、人間の多機能保護バリアであり、必須の幹細胞集団と、さまざまな細胞型を含み、それらの細胞型は、その構造的完全性と機能の更新及び維持にとって非常に重要である。２治療性創傷の治癒と皮膚の構造と機能の回復は、血管新生と細胞マトリックスおよび細胞間相互作用の調節のための前駆細胞、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分、成長因子及びサイトカインを含む様々な因子に依存する。真皮の主要な細胞型である線維芽細胞は、真皮で主要なＥＣＭタンパク質を生成し、正常な皮膚ホメオスタシスと創傷治癒において細胞機能、遊走、細胞マトリックスおよび細胞間相互作用を調節するラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、弾性繊維、非コラーゲン分子、および成長因子を含む。３真皮線維芽細胞は、皮膚創傷治癒４、組織再生５における治療装置として、または美容および形成外科手術における真皮充填材として、すでに臨床的可能性が示されている。６一部の著者は、線維芽細胞は、間葉系幹細胞よりも実用的であり、潜在的に効果的な細胞療法として再生医療に使用できるとさえ考えている。７
【０３９０】
自己細胞療法は、有害な免疫反応や感染症のリスクを減らすことを目的としている。ほとんどの場合、均質な細胞集団と十分な数量を得るために、処理前に細胞を体外で増殖させる必要がある。近年、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、細胞治療の治験薬新薬申請のうち、８０％以上が製造過程においてウシ胎児血清（ＦＢＳ）を使用していることに気づいた。８しかしながら、この異種添加物は感染と免疫反応の潜在的リスクがあり、細胞の増殖も遅い。したがって、安全で効率的な血清代替物の探索が必要とされている。一部の著者は、培地中のＦＢＳを自家ヒト血清に置き換えて細胞増殖することを提案したが、細胞増殖が遅いため、移植前にやはり長い培養時間（３週間）と数回の細胞継代が必要であった。我々は、自己多血小板血漿（ＰＲＰ）が脂肪由来の間葉系幹細胞の増殖のための安全で効率的かつ費用効果の高い培地として使用できることを実証した。１１  自家ＰＲＰを２０％補充した培地は、細胞の表現型を変えることなく、細胞増殖が１３倍以上増えた。現在、患者自身の血液から得られたＰＲＰは、臨床では、創傷治癒、骨再生、皮膚の再生にすでに効率的に使用されている。１２血小板は、自己増殖因子の自然供給元であり、細胞増殖、分化及び組織再生の主要な制御因子である。生理学的条件下では、血小板が活性化され、そのα顆粒が血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、形質転換成長因子―ー−β（ＴＧＦ−β）と血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）などの成長因子とサイトカインを徐々に分泌することができる。したがって、自己由来のＰＲＰは、現在皮膚線維芽細胞の増殖のための非自己由来の製品に代わる安全で効果的な生物学的代替品として用いることができると仮定している。この研究では、ＣＣ−ＰＲＰデバイスを使用して得られた自家ＰＲＰの効率評価し、従来のＦＢＳ補充培地と比較して、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）増殖の自己システムを限定した。最適なＰＲＰ濃度を検討し、ＰＲＰを補充した培地の、ＮＨＤＦの遊走、付着、分化、ゲノム安定性に対する生物学的営業を評価した。
【０３９１】
材料および方法
細胞分離
ＮＨＤＦは、ジュネーブ大学病院（スイス、ジュネーブ）の形成外科、整形外科および美容外科で腹部形成術を受けている１０人の健康な女性から分離した。手順はヘルシンキ宣言の原則に準拠し、地域の組織倫理委員会（プロトコル＃３１２６）の許可を得た。すべてのドナーからインフォームドコンセントを得た。ＮＨＤＦは、他の箇所１３で述べたように分離され、サプリメントとして１０％ＦＢＳ、１％ＨＥＰＥＳ  １Ｍ緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％非必須アミノ酸混合物１００×（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％Ｌ−グルタミン１００×（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン１００×（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％ピルビン酸ナトリウム１００×（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む完全成長培地（ダルベッコ改変イーグル培地［ＤＭＥＭ］；  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）で培養し、４℃で１か月保存した。手順によって、第１継代または第２継代を使用した。
【０３９２】
ヒト自家ＰＲＰの準備
ＰＲＰは、同じＮＨＤＦドナーの血液から、ＣＣ−ＰＲＰ医療デバイスを使用して調製された。抗凝固剤としてクエン酸ナトリウムを含むこれらの専用のチューブは、特定のセパレーターゲルを介して、血小板と血漿を他の血液成分（例えば、赤血球と白血球）から分離する。具体的には、３０ｍＬのヒト末梢血を３本のＣＣ−ＰＲＰチューブに収集した（１０ｍＬ／チューブあたり）。収集した血液を標準の実験用遠心分離機で１５００ｇにて５分間遠心分離した。その後、赤血球と白血球はセパレーターゲルの下のチューブの底に蓄積したが、血漿と血小板はゲル層の上に残った。５回チューブを反転させることによって血小板を含む血漿は均質化され、６．０ｍＬのＰＲＰが得られ、使用するまで、ポリプロピレンチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国）に採取された。血小板、赤血球、白血球、および全血中の平均血小板量を、遠心分離の前及び培地に添加する前に調製されたＰＲＰについてカウントした（ＫＸ−２１Ｎ；  Ｓｙｓｍｅｘ、リンカンシャー、イリノイ州、ＵＳＡ）。
【０３９３】
細胞増殖測定
細胞増殖は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＴＭバイオレット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム、ＵＳＡ）染色によって評価された。第２継代において、ＮＨＤＦを２４ウェルプレートに、８×１０３細胞／ウェルの密度で播種し、１０％ＦＢＳで培養するか、または一連の濃度範囲（１〜５０％）のＰＲＰで７日間処理した。細胞増殖の定量は、製造元の規定に従って、Ａｔｔｕｎｅアコースティックフォーカスサイトメーター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したフローサイトメトリーによって行われた。細胞周期分析を行うために、ＤＮＡ含有量を測定した。簡単に言えば、ＮＨＤＦを１２ウェルプレートに、ウェルあたり４×１０５個の細胞の密度で播種し、１０％ＦＢＳで培養するか、または一連の濃度範囲（１〜５０％）のＰＲＰで２日間および７日間処理した。Ｔｒｙｐｌｅ  Ｘを使用して細胞をトリプシン処理し、７０％エタノールで固定した。次に細胞を透過処理し、核ＤＮＡの含有分を、室温でＦｘＣｙｃｌｅ  ＰＩ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。試料は、Ａｔｔｕｎｅアコースティックフォーカスサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して運用された。細胞周期分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して行われた。
【０３９４】
細胞形態、α−ＳＭＡおよびビメンチン発現
細胞骨格の再配列を研究するために、０．５％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中に１０５細胞／ｍＬの濃度で、細胞を底が透明な黒色９６ウェルプレート（μＣｌｅａｒ、Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ、オーストリア）に２４時間播種し、その後、一連の濃度範囲（１〜５０％）のＰＲＰで７日間処理した。ＮＨＤＦは４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で５分間、室温で透過処理した。その後、５０μＬの５Ｕ／ｍＬファロイジン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色し、ＰＢＳで２回洗浄し、５０μＬの１μｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩで５分間マーキングした。ビメンチンの発現を評価するために、２．５μｇ／ｍｌのマウスモノクローナル抗ビメンチン抗体ＦＩＴＣ（Ｖ９、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を室温で１時間使用した。α―ＳＭＡの発現を表すために、２μｇ／ｍｌのウサギポリクローナル抗α―ＳＭＡ（Ａｂｃａｍ、ａｂ  ５６９４）を室温で１時間使用した後、２μｇ／ｍｌの二次ヤギ抗ウサギポリクローナルＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５９４（Ａｂｃａｍ、ａｂ  １５００８０）を室温で１時間使用した。Ｃｙｔａｔｉｏｎ３細胞イメージングマルチモードリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して、免疫蛍光染色を可視化した。α−ＳＭＡタンパク質の発現を測定するために、ＮＨＤＦを６ウェルプレートに５×１０５細胞／ウェルの密度で播種し、１０％ＦＢＳで培養するか、または一連の濃度範囲（１〜５０％）のＰＲＰで４日間処理した。細胞をＴｒｙｐｌｅ  Ｘで分離した後、２％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液で１０分間固定した。ＰＢＳで洗浄した後、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で５分間細胞を透過処理した。１０６／ｍｌの単細胞懸濁液と最適濃度の抗αＳＭＡ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ５６９４）とを２μｇ／ｍｌの洗浄緩衝液（２％の正常ヤギ血清ＰＢＳ）で室温で１時間培養し、３回洗浄した。その後、ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ(R)５９４、Ａｂｃａｍ）と１時間培養した。フローサイトメトリーは、Ａｔｔｕｎｅ  Ｎｘｔフローサイトメーター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で行った。対照試料は、一次抗体結合がない細胞で構成されていた。
【０３９５】
ＭＴＴ法による細胞のエキソサイトーシスと代謝活性の評価
テトラゾリウム塩３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の還元は、細胞の酸化還元状態の指標である。ホルマザンの生成量は、細胞質の還元能を示し、したがって細胞生存能力を表す。これは、細胞増殖と細胞毒性を測定するための最も頻繁に使用される方法の１つである。ＭＴＴはエンドサイトーシスによって細胞に吸収され、エンドソーム／リソソームの区画でホルマザンに還元される。ホルマザンは青い顆粒として細胞内に沈着する。１４特定の状況下では、エキソサイトーシスされ、針状のホルマザン結晶を形成する。ＮＨＤＦを９６ウェルプレートに１０４細胞／ウェルの密度で播種し、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで一晩培養した。翌日、一連の濃度範囲（５〜２０％）のＰＲＰで細胞培養物を％）で４８時間処理した後、１０μＬのＭＴＴ（最終濃度５００μｇ／ｍＬ）を３７℃で４時間かけて添加した。倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）で写真（倍率１００倍）を撮影した。続いて、培地を吸引し、溶解してないホルマザン結晶をウェルあたり１００μＬのＤＭＳＯで溶解した。その後、プレートをシェーカーに５分間置いた（１５０ｒｐｍ）。マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）により５９５ｎｍの吸光度を読み取った。
【０３９６】
細胞付着性測定
ラミニンおよびＩ型コラーゲンへの細胞付着性を評価するために、９６ウェルプレートで３回ずつ実験を行った。ＮＨＤＦは、ラミニン（１０μｇ／ｍＬ）とＩ型コラーゲン（５０μｇ／ｍＬ）でプレコートされた９６ウェルプレートに１×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。細胞は、３７℃、１０％ＦＢＳまたは１０％ＰＲＰで３０分、１時間、または４時間付着させた。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、０．１％クリスタルバイオレットで染色し、試料を流水ですすぎ、風乾した。画像は倒立顕微鏡下で撮影した。試料を氷酢酸で溶解し、５７０ｎｍでの光学密度を自動マイクロプレートリーダーを使用して特定した。
【０３９７】
創傷治癒測定
ＮＨＤＦを４×１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、２４時間コンフルエントになるまで増殖させた。１０μＬのピペットチップを使用して、ＮＨＤＦ単層にスクラッチを設けた。ウェルをＰＢＳで２回洗浄して、分離した細胞を除去し、各ウェルの中央で写真を撮った。次に、ＮＨＤＦを１０％ＦＢＳまたは一連の濃度範囲（１〜５０％）のＰＲＰで８時間培養した。培養後、ＮＨＤＦをＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。ハイスループットのＣｙｔａｔｉｏｎ  ３細胞イメージングマルチモードリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）で、ウェルごとに１つの画像（中心位置、時間０と同じ）を取得した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、時間０および８時間での創傷領域を測定することで定量化を行った。
【０３９８】
比較ゲノムハイブリダイゼーションアレイ
ゲノムの安定性は、比較ゲノムハイブリダイゼーションアレイによって特定した。  ＦＢＳ  １０％またはＰＲＰ  １０％で６日間処理したＮＨＤＦを、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）を使用して比較した。ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を使用して、製造元の規定に従ってＤＮＡを抽出した。アレイＣＧＨは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３ヒトＣＧＨマイクロアレイキット４＿１８０Ｋ（デザインＩＤ  ０２２０６０）を使用して実行され、全体の中央プローブ間隔は４３ｋｂ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とした。実際の解像度は約１２９Ｋｂであった。培養されたＮＨＤＦから抽出されたＤＮＡおよび対照ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ男性ＤＮＡ、番号Ｇ１４７１）をプールした。ドナーＤＮＡと性別を一致させたコントロールのＤＮＡ（各１μｇ）をそれぞれＣｙ３−ｄＵＴＰとＣｙ５−ｄＵＴＰでラベリングした（Ｓｕｒｅ  Ｔａｇマークキット、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ラベリングされた製品は、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ３０  Ｋフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）により精製した。ハイブリダイゼーションは、Ａｇｉｌｅｎｔが提供するプロトコルに従って行われた。ドナーとコントロールのＤＮＡをプールし、２ｍｇのヒトＣｏｔ−Ｉ  ＤＮＡと６５℃で２４時間回転させて交雑した。アレイは、ＡｇｉｌｅｎｔのＳｕｒｅＳｃａｎマイクロアレイスキャナーとＡｇｉｌｅｎｔの特徴抽出ソフトウェア（ｖ１１．５）を使用して分析され、結果はＡｇｉｌｅｎｔゲノミックワークベンチ（ｖ．７．０）によって提示された。
【０３９９】
統計分析
各細胞培養実験について、処理は三回ずつまたは四回ずつ行われた。特に明記しない限り、各実験は３回繰り返された。データは平均±ＳＥＭとして表す。１つの独立変数を使用した実験において、一元配置分散分析を用いて複数の比較を行った。Ｄｕｎｎｅｔの検定は、有意な分散分析の事後分析に使用された。両グループ間の平均値の差は、ｐ≦０．０５のときに有意であった。
【０４００】
結果
全血およびＰＲＰにおける血球および血小板のカウント
遠心分離後、ほとんどの血小板は血漿の底にあるゲルセパレーターの上に蓄積した。ゲル上の血小板を血漿全体（平均容量６ｍｌ）に懸濁させ、この懸濁液をＰＲＰとして使用した。ＰＲＰの最終的な平均血小板濃度は、２．５×１０５＋／−１．２１血小板／μＬであった。この濃度は、遠心分離前の全血の１．５３倍（１．６４×１０５＋／−０．６４血小板／μＬ）であった。全血からのＰＲＰの血小板回収率は９６％であった。平均血小板量は、全血とＰＲＰで同等だった（全血で８．７ｆＬ＋／−０．８７、ＰＲＰで８．２ｆＬ＋／−０．８２）。全血と比較すると、ＰＲＰにおける白血球の平均濃度顕著に低かった（それぞれ０．７５×１０３＋／−０．７細胞／μＬ及び６．７５×１０３＋／−２．８８細胞／ｍＬ；ｐ＜０．０５）。平均赤血球濃度も顕著に減少した（それぞれ０．０３×１０６＋／−０．００１細胞／ｍＬおよび４．１７×１０６＋／−０．４９細胞／ｍＬ；ｐ＜０．０５）（ｎ＝１０）（図１３Ａ）。
【０４０１】
ＰＲＰは、用量依存的に増殖の増長と細胞周期の変化を促進する
培地を交換せずに７日間培養した後、異なるＰＲＰ濃度を補充した培地は、ＦＢＳ含有培地と比較してより高い生存ＮＨＤＦ数を示した（図１４）。ＰＲＰのこの増殖効果は、用量依存的な鐘型曲線をたどった。最適な培養条件はＰＲＰ２０％であり、ＮＨＤＦの数はＦＢＳ１０％より７．７倍高かった（ｎ＝１０；ｐ＜０．００１）。４８時間後、ＰＲＰで処理された試料は、ＦＢＳ処理された対照細胞と比較して、有意な細胞周期の変化を示したことが観察された。「Ｇ０／Ｇ１」フェーズの細胞の平均パーセンテージは、ＦＢＳ１０％グループの７４．５％から２０％ＰＲＰグループの６２％に変化した。「Ｓ」フェーズでは、ＦＢＳ１０％グループの９．５％からＰＲＰ２０％グループの１３％に増えた。「Ｇ２／Ｍ」フェーズでは、ＦＢＳ１０％グループの１４％からＰＲＰ２０％グループの２３％まで増えた（図１５ＡおよびＢ）。７日間の処理後、細胞はコンフルエントになり、ＤＮＡ合成と有糸分裂は停止し、細胞は、ＰＲＰを補充した培地で静止状態のＧ０／Ｇ１フェーズに入った（図１５Ｃ）。
【０４０２】
ＭＴＴホルマザンエキソサイトーシス及び代謝活性の向上は、ＰＲＰ処理によって誘発される
細胞をテトラゾリウム塩ＭＴＴと培養すると、前記塩が還元されて紫色の水不溶性ホルマザンになる。この塩の細胞質内還元は、「細胞レドックス活性」の指標と見なされ、ミトコンドリア酵素に関連している。ＦＢＳ処理した培地の顕微鏡検査（図１６Ａ）では、ホルマザン顆粒は細胞内小器官にあった。しかし、細胞をＰＲＰ（５〜２０％）で４８時間処理すると、細胞の表面に、針状の結晶が現れ、エキソサイトーシスされたＭＴＴホルマザンを示した（図１６Ａ）。さらに、光学デンシトメトリーによって溶解したホルマザンの量を定量すると、ＰＲＰ処理細胞の増加が直接細胞代謝活性の向上を反映していることが実証された（図１６Ｂ）。２０％ＰＲＰ処理の細胞はピークに達し、ＦＢＳ１０％で４８時間処理した細胞の３．１２倍であった。
【０４０３】
細胞形状、細胞骨格、ビメンチンおよびα−ＳＭＡ発現に対するＰＲＰの影響の評価
従来のＦＢＳ補充培地で培養されたＮＨＤＦは、規則的な扁平な細胞形状を示したのに対し、ＰＲＰ（１０〜５０％）で処理されたＮＨＤＦはスピンドル形を呈し、３Ｄマトリックス培地または生体内環境に近い形態であった（図２）。７日間のＰＲＰ処理で発生した形態的変化（図１７Ａ）が表現型の変化と関連しているかどうかを調査した。まず、皮質アクチンの局在（ＦＢＳ１０％）から太い細胞間フィラメント（ＰＲＰ２０％）への顕著なＦ−アクチン再構築を実証した（図１７Ｂ）。さらに、フローサイトメトリーと免疫蛍光分析により、ＰＲＰ処理したα−ＳＭＡ発現の変化を評価した（図１８Ａ）。  α−ＳＭＡ発現は、高ＰＲＰ濃度（４０〜５０％）で大幅に増加したが、ＦＢＳおよびＰＲＰ５〜１０％処理細胞は、基底核染色を呈した（図１８Ｂ）。免疫蛍光分析では、ＰＲＰ２０％の存在下においてビメンチン染色が増加したが、高ＰＲＰ濃度（ＰＲＰ５０％）では完全に消失した。
【０４０４】
ＰＲＰ処理は細胞外マトリックスへの細胞付着に影響を与え、線維芽細胞の集団遊走を促進する
ＮＨＤＦ生物学に対するＰＲＰの生物学的効果をさらに特徴付けるために、ラミニンとＩ型コラーゲンの細胞付着に対するＰＲＰ処理の影響を評価した。図１９Ａに示すように、播種の４時間後にＰＲＰは、ラミニンへのＮＨＤＦの全体的な付着を減少させた。この効果は１５分後にすでに発生しており、全体的な細胞付着が２１％減少した。コラーゲンＩマトリックスへのＮＨＤＦ付着でも同じ結果が得られた（図１９Ｂ）（１５分後に全細胞付着の４１％）。ＰＲＰの作用を受けたＮＨＤＦの遊走特性を研究するために、体外スクラッチ試験を実施した（図２０）。２０％ＰＲＰ処理を８時間行うと、ＦＢＳを使用した細胞培養と比較して、スクラッチマージンからスクラッチゾーンへの遊走細胞数が１０％増加した。この遊走の前線は、集団的な細胞遊走であった。逆に、ＦＢＳ１０％の作用を受けたＮＨＤＦは、孤立した細胞遊走の特徴を示した。
【０４０５】
ＰＲＰは細胞のゲノム安定性を変えない
増殖中の遺伝的安定性を記録するために、第２継代のＮＨＤＦを、ＦＢＳ１０％またはＰＲＰ１０％を補充した培地で４日間培養した。２つの異なる培地で処理された細胞のアレイＣＧＨ分析では、不均衡な染色体再配列は見られなかった。ＰＲＰ処理に応じて増加した増殖率はゲノムの不安定性を引き起こさなかった。例を挙げてデータを説明するが、ＦＢＳ１０％またはＰＲＰ１０％で培養されたＮＨＤＦにおいて、第４染色体（領域ｑ１３．２）における良性ホモ接合性欠失とｑ２９領域のｃｈｒ３における良性ヘテロ接合性欠失は互いに重なる（図２１）。
【０４０６】
討論
自己線維芽細胞治療は、さまざまな美容および形成外科手術において潜在的な発展可能性がある。１６自己線維芽細胞療法に対するこの臨床的関心は、動物実験の後に起こったものであるが、動物実験では、成熟皮膚から分離された線維芽細胞が皮内注射の５か月後にも生体内で生存し続け且つ真皮の厚さを増加させたことが示された。１７  ２０１１年以来、初めて、成人の鼻唇襞のひだを改善するための、個人の自己線維芽細胞療法であるＬＡＶＩＶ（Ａｚｆｉｃｅｌ−Ｔ、Ｆｉｂｒｏｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ペンシルバニア州エクストン、ＵＳＡ）が、ＦＤＡに承認された。１８この技術の主な問題点は、注入前の細胞培養のコストと、時間が長いこと（１１〜２２週間）、および細胞を体外で増殖するためにＦＢＳによって供給される成長因子が異種源であることにある。線維芽細胞を用いた細胞治療は、すべて、体外の細胞増殖に依存しているため、例えばＦＢＳを細胞培地における成長と栄養素供給として使用するなど、非ヒト起源によるあらゆる要素を消し去る試みがなされてきた。８以前は、真皮または歯肉組織に由来する線維芽細胞の体外増殖のために、ＦＢＳをＰＲＰに置き換えることを目的とした研究はほとんどなかった。１９−２３しかし、異種ライセートＰＲＰまたは活性化ＰＲＰを使用した実験においては、細胞増殖の効率は制限されていた。Ｋａｋｕｄｏらは、２０％活性化ＰＲＰは増殖を促進しなかったが、５％活性化ＰＲＰで７日間培養した後、ヒト真皮線維芽細胞増殖能力が２．５倍増強したことを実証した。１９  ＮＨＤＦを使用した別の研究では、５％の活性化ＰＲＰを追加した５日後に、増殖が１．５倍しか向上しなかったことが示されている。２０最近、４９人の患者のプールから調製された非活性化ＰＲＰは、７日間の培養後に軽い増殖作用（１．３倍）を奏することが実証された。２３  しかし、この研究では、Ｎｏｈらは、ＦＢＳをＰＲＰに置き換えることはしなかった。彼らは未知の濃度のＰＲＰをＦＢＳを含む培地に加えた。我々の知る限り、本研究は、異なる濃度の自己非活性化ＰＲＰによってＦＢＳを置換し、ＮＨＤＦを増殖することの利点を初めて実証した。他の研究では、トロンビン、カルシウム、またはコラーゲンによるＰＲＰの活性化は、１５分から２４時間までの間のみ、成長因子の即時かつ重要な放出を刺激する。したがって、細胞培養等の用途には、漸進的な血小板脱顆粒からの成長因子の緩やかな放出が必要とされるため、血小板の活性化は望ましくないと考えている。平均血小板体積（ＭＰＶ）は、血小板活性の潜在的なマーカーと見なされ、密度の高い顆粒を含む大きな血小板は、小さな血小板よりも酵素的および代謝的に活性がより高い。２４私たちの研究では、ＭＰＶは、全血とＰＲＰの間で同等だった（全血中８．７ｆＬ、ＰＲＰ中８．２ｆＬ）。ＰＲＰ調剤はＭＶＰを変えなかったので、処理過程において血小板の活性化を引き起こさないことを意味する。非活性化ＰＲＰを含む培地を用いた脂肪由来幹細胞の増殖に関する従来の研究では、ＴＧＦ−Ｂ１とＶＥＧＦは０日目から１０．２５日目まで継続的に分泌し、一方ＰＤＧＦ−ＡＢとＦＧＦの濃度は５日目にピークに達し、１０日以上安定していたことが実証された。こ���は、１０日間の培養後の５０％血小板生存能力と直接関係している。１１さらに、非活性化ＰＲＰによるＧＦは数日間にわたり継続的かつ組織化された分泌を行うため、血小板を含まない他の培地サプリメント（ＦＢＳ、ＰＲＰライセートなど）のように３日ごとに一回交換する必要がなく、７〜１０日後に培養培地を交換すればよいという可能性が見出された。
【０４０７】
ＰＲＰの血小板濃度は、その有効性に影響を与える可能性のある重要な要素である。ＰＲＰは従来は全血より４〜５倍多くの血小板を含む血漿として定義されていたが、現在、高血小板濃度は中程度濃度より良いわけではなく、有害でさえあることが認められている。たとえば、３Ｄ前十字靭帯線維芽細胞培養では、高い血小板濃度に比べて、血小板濃度が全血と同じあるＰＲＰの方が、最も高い細胞代謝と最も低いアポトーシス率を示した。２７経口線維芽細胞を使用した別の研究では、ＰＲＰ中の血小板濃度の上昇（＞２．５×）によって増殖が低下することが示された。２８我々の研究では、ＣＣ−ＰＲＰデバイスにより調製されたＰＲＰは、全血より１．５３倍多い血小板を含んでいた。全血からのＰＲＰの血小板回収率は９６だったが、血小板濃度が相対的に低かったのは、血小板が血漿全体のうちゲルの上に懸濁していたためであった。さらに、ＰＲＰの効果は用量に依存していた。２０％のＰＲＰを補充した培地は最高のＮＨＤＦ増殖率（ＦＢＳ培養培地の７．７倍）を提供したが、４０％ＰＲＰを補充した培地は増殖能力が低かった。これは、他の研究の見解と一致しており、高濃度のＰＲＰを添加した培地は中程度の濃度よりも効果が低いことを示している。Ａｔａｓｈｉら１１人はまた、体外脂肪由来の間葉系幹細胞の増殖に最適なＰＲＰ濃度は、２０％のＰＲＰを補充した培地であると結論付けた。高ＰＲＰ濃度の有害な影響は、より高い成長因子濃度が原因である可能性があり、これは、負のフィードバックループによる細胞受容体のダウンレギュレーションを引き起こす可能性がある。このメカニズムは、一部の適用においては、より多くの成長因子を分泌する活性化ＰＲＰの効率が低下する理由を説明することもできる。この仮説を解明するには、さらなる調査が必要である。自己由来の非活性化ＰＲＰを使用することにより、ＰＲＰはＮＨＤＦの体外増殖に使用される他の細胞培地サプリメントの効率的で安全な代替品となり得ることを示した。ＰＲＰに存在する成長因子は細胞分裂を引き起こすが、線維芽細胞に対して他の多面的な活性も発揮する。我々の培養環境において、初期の創傷治癒に影響を与える細胞機能について評価された。ＰＲＰ処理が細胞の代謝活動と線維芽細胞のエキソサイトーシス能力を加速することを実証した。これは、集団的な細胞移動及び細胞形状の変更と細胞骨格の再構築に関連する。ビメンチンは、線維芽細胞が発現する間葉系マーカーと見なされているが、創傷治癒における増殖コーディネーターとしても新たに認識されている。２９  ２０％ＰＲＰ治療下では、ビメンチン発現が増強され、これはこの濃度で観察される増殖促進作用と直接相関している。α−ＳＭＡ（筋線維芽細胞マーカー）の発現は、高濃度のＰＲＰ（＞４０％）によってのみ誘発された。これは、Ｃｈｅｌｌｉｎｉらの最近の研究と一致しており、ＰＲＰだけでは筋線維芽細胞の表現型の獲得を刺激できなかったことを示している。３０
【０４０８】
長期的なＰＲＰ処理の潜在的な腫瘍誘発効果について科学界ではいくつかの議論がある。３１さらに、いくつかの研究では、大量の細胞増殖中の遺伝的安定性について疑問が投げかけられている。３２したがって、したがって、ＣＧＨを使用して、ＦＢＳとＰＲＰにおいて増殖した細胞間の遺伝的変異を検証し、ＰＲＰ処理による不均衡な染色体再配列がないことを実証した。
この実証は、ＰＲＰで培養されたＮＨＤＦの適用を臨床環境に変換して法的規制要件を満たすために、重大な意義がある。
【０４０９】
培地のサプリメントとして自家ＰＲＰを含む我々の細胞培養プロトコルは、他の細胞型の増殖に使用できます。さらに、この新しい培養環境により、培養時間を短縮し、大規模組織損傷などの大規模な適用のためにより多くの細胞を増殖させることがでる（最大７日間の細胞継代なし）。一連の予備実験（データは示していない）では、ヒト表皮ケラチノサイトに対しても、ＰＲＰは同じく強力な増殖効果があることが実証され、この時ＰＲＰ２０％は、ケラチノサイト増殖を１０倍増加させた。
【０４１０】
結論
この研究では、培地中への安全な生物学的サプリメントとしてＰＲＰを使用したＮＨＤＦ増殖の完全自家モデルを初めて示した。ＰＲＰのさまざまな効果は、濃度及び治療の継続期間に応じて、細胞増殖の加速から、染色体の安定性を変えることなく細胞付着と遊走を調節することにまで及ぶ。この自家技術は、適正製造基準ガイドライン（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）と監督機関の基準を満たしているため、ＰＲＰは線維芽細胞培養の効率的で費用効果が高い安全なサプリメントと見なすべきであり、将来の体外細胞増殖の臨床プロトコルの検証のための異種または同種血液誘導体の代替品と見なすことができる。
【０４１１】
さらなる研究により、他の治療分野での有効性が示されている。
【表１２】
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参考文献
1. Mao, A.S., and Mooney, D.J. Regenerative medicine: Current therapies and future directions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 112, 14452, 2015.
2. Li, Z., and Maitz, P. Cell therapy for severe burn wound healing. Burns & trauma 6, 13, 2018.
3. Stunova, A., and Vistejnova, L. Dermal fibroblasts-A heterogeneous population with regulatory function in wound healing. Cytokine & growth factor reviews 39, 137, 2018.
4. Thangapazham, R.L., Darling, T.N., and Meyerle, J. Alteration of skin properties with autologous dermal fibroblasts. International journal of molecular sciences 15, 8407, 2014.
5. Costa-Almeida, R., Soares, R., and Granja, P.L. Fibroblasts as maestros orchestrating tissue regeneration. Journal of tissue engineering and regenerative medicine 12, 240, 2018.
6. Weiss, R.A. Autologous cell therapy: will it replace dermal fillers? Facial plastic surgery clinics of North America 21, 299, 2013.
7. Ichim, T.E., O'Heeron, P., and Kesari, S. Fibroblasts as a practical alternative to mesenchymal stem cells. Journal of translational medicine 16, 212, 2018.
8. Karnieli, O., Friedner, O.M., Allickson, J.G., Zhang, N., Jung, S., Fiorentini, D., Abraham, E., Eaker, S.S., Yong, T.K., Chan, A., Griffiths, S., Wehn, A.K., Oh, S., and Karnieli, O. A consensus introduction to serum replacements and serum-free media for cellular therapies. Cytotherapy 19, 155, 2017.
9. Eca, L.P., Pinto, D.G., de Pinho, A.M., Mazzetti, M.P., and Odo, M.E. Autologous fibroblast culture in the repair of aging skin. Dermatologic surgery : official publication for American Society for Dermatologic Surgery [et al] 38, 180, 2012.
10. Nilforoushzadeh, M.A., Jaffary, F., Siavash, M., Ansari, N., Siadat, A.H., and Heidari, A. Autologous fibroblast suspension for the treatment of refractory diabetic foot ulcer. Indian journal of dermatology, venereology and leprology 82, 105, 2016.
11. Atashi, F., Jaconi, M.E., Pittet-Cuenod, B., and Modarressi, A. Autologous platelet-rich plasma: a biological supplement to enhance adipose-derived mesenchymal stem cell expansion. Tissue engineering Part C, Methods 21, 253, 2015.
12. Alves, R., and Grimalt, R. A Review of Platelet-Rich Plasma: History, Biology, Mechanism of Action, and Classification. Skin appendage disorders 4, 18, 2018.
13. Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Current protocols in cell biology Chapter 2, Unit 2 1, 2001.
14. Berridge, M.V., Herst, P.M., and Tan, A.S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology annual review 11, 127, 2005.
15. Molinari, B.L., Tasat, D.R., Palmieri, M.A., and Cabrini, R.L. Kinetics of MTT-formazan exocytosis in phagocytic and non-phagocytic cells. Micron 36, 177, 2005.
16. Mehrabani, D., and Manafi, N. Role of cultured skin fibroblasts in aesthetic and plastic surgery. World journal of plastic surgery 2, 2, 2013.
17. Zhao, Y., Wang, J., Yan, X., Li, D., and Xu, J. Preliminary survival studies on autologous cultured skin fibroblasts transplantation by injection. Cell transplantation 17, 775, 2008.
18. Smith, S.R., Munavalli, G., Weiss, R., Maslowski, J.M., Hennegan, K.P., andNovak, J.M. A multicenter, double-blind, placebo-controlled trial of autologous fibroblast therapy for the treatment of nasolabial fold wrinkles. Dermatologic surgery : official publication for American Society for Dermatologic Surgery [et al] 38, 1234, 2012.
19. Kakudo, N., Minakata, T., Mitsui, T., Kushida, S., Notodihardjo, F.Z., and Kusumoto, K. Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts. Plastic and reconstructive surgery 122, 1352, 2008.
20. Kim, D.H., Je, Y.J., Kim, C.D., Lee, Y.H., Seo, Y.J., Lee, J.H., and Lee, Y. Can Platelet-rich Plasma Be Used for Skin Rejuvenation? Evaluation of Effects of Platelet-rich Plasma on Human Dermal Fibroblast. Annals of dermatology 23, 424, 2011.
21. Liu, Y., Kalen, A., Risto, O., and Wahlstrom, O. Fibroblast proliferation due to exposure to a platelet concentrate in vitro is pH dependent. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society 10, 336, 2002.
22. Nguyen, P.A., and Pham, T.A.V. Effects of platelet-rich plasma on human gingival fibroblast proliferation and migration in vitro. Journal of applied oral science : revista FOB 26, e20180077, 2018.
23. Noh, K.C., Liu, X.N., Zhuan, Z., Yang, C.J., Kim, Y.T., Lee, G.W., Choi, K.H., andKim, K.O. Leukocyte- Poor Platelet-Rich Plasma-Derived Growth Factors Enhance Human Fibroblast Proliferation In Vitro. Clinics in orthopedic surgery 10, 240, 2018.
24. Ozer, K., Kankaya, Y., and Colak, O. An important and overlooked parameter in platelet rich plasma preparation: The mean platelet volume. Journal of cosmetic dermatology 2018.
25. Atashi, F.S.-B., V.; Nayernia, Z.; Pittet-Cuenod, B. and Modarressi, A. Platelet Rich Plasma Promotes Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells via Activation of AKT and Smad2 Signaling Pathways Stem Cell Res Ther 52015.
26. Marx, R.E. Platelet-rich plasma (PRP): what is PRP and what is not PRP? Implant dentistry 10, 225, 2001.
27. Yoshida, R., Cheng, M., and Murray, M.M. Increasing platelet concentration in platelet-rich plasma inhibits anterior cruciate ligament cell function in three-dimensional culture. Journal of orthopaedic research : official publication of the Orthopaedic Research Society 32, 291, 2014.
28. Graziani, F., Ivanovski, S., Cei, S., Ducci, F., Tonetti, M., and Gabriele, M. The in vitro effect of different PRP concentrations on osteoblasts and fibroblasts. Clinical oral implants research 17, 212, 2006.
29. Cheng, F., Shen, Y., Mohanasundaram, P., Lindstrom, M., Ivaska, J., Ny, T., and Eriksson, J.E. Vimentin coordinates fibroblast proliferation and keratinocyte differentiation in wound healing via TGF-beta-Slug signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 113, E4320, 2016.
30. Chellini, F., Tani, A., Vallone, L., Nosi, D., Pavan, P., Bambi, F., Zecchi Orlandini, S., and Sassoli, C. Platelet-Rich Plasma Prevents In Vitro Transforming Growth Factor-beta1-Induced Fibroblast to Myofibroblast Transition: Involvement of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)-A/VEGF Receptor-1-Mediated Signaling (dagger). Cells 72018.
31. Omar, N.N., El-Tawdi, A.H., Tash, R.F., Shoukry, Y., Mahmoud, N.A., and El Bakly, W. Tumor potential in rat wounds after short- and long-term administration of platelet-rich plasma. Journal of biological regulators and homeostatic agents 31, 889, 2017.
32. Rajamani, K., Li, Y.S., Hsieh, D.K., Lin, S.Z., Harn, H.J., and Chiou, T.W. Genetic and epigenetic instability of stem cells. Cell transplantation 23, 417, 2014.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【国際調査報告】
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