(57)【要約】  本発明は、新規なビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株及びそれを含むがんの予防または治療のための組成物に関する。具体的に、本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、がん細胞増殖の抑制、がん細胞移動性の低下、血管新生の抑制、抗がん免疫反応の増加効果を有し、かつ、これと同時に、炎症因子の発現を減少させることにより、がんまたは炎症性疾患を予防または治療する効果を奏する。また、本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、化学抗がん剤または免疫抗がん剤と併用される場合、なお一層優れた抗がん効果を示す。さらに、本発明は、新規なラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株及びそれを含むがんの予防または治療のための組成物に関する。具体的に、本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、直接的ながん細胞増殖の抑制及び免疫増進効果を示して、がんを予防または治療する効果を奏する。特に、前記菌株は、腸内定着過程において抗がん効果を有する代謝産物を分泌することで優れた抗がん効果を奏する。また、本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、化学抗がん剤または免疫抗がん剤と併用される場合、なお一層優れた抗がん効果を示す。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株（ＫＣＴＣ１３４５２ＢＰ）。
【請求項２】
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株（ＫＣＴＣ１３４５２ＢＰ）を含む、がんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項３】
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株（ＫＣＴＣ１３４５２ＢＰ）を含み、前記ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株が、抗がん、抗炎症、抗酸化及び免疫増進効果を示すことを特徴とする、がんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項４】
前記がんは、黒色腫、扁平細胞癌腫、乳がん、頭頚部がん、甲状腺がん、軟部組織肉腫、骨肉腫、精巣がん、前立腺がん、卵巣がん、膀胱がん、皮膚がん、脳腫瘍、血管肉腫、肥滿細胞腫、白血病、リンパ腫、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、胃がん、腎臓がん、大腸がん、造血器腫瘍、神経芽細胞腫、類表皮癌腫及びその転移がんからなる群から選ばれるいずれか一種以上であることを特徴とする、請求項２に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項５】
前記がんは、肺がん、大腸がん、胃がん、乳がん及び肝臓がんからなる群から選ばれるいずれか一種以上であることを特徴とする、請求項２に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項６】
前記ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株が、がん細胞の移動性を低下させることにより、抗がん効果を示すことを特徴とする、請求項２に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項７】
前記ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株が、血管増殖因子であるＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、Ａｎｇ１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ１）及びＡｎｇ２（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ２）の発現を抑えることにより、抗がん効果を示すことを特徴とする、請求項２に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項８】
前記ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株が、ＴＮＦ−αの発現を抑えることを特徴とする、請求項３に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項９】
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株（ＫＣＴＣ１３４５２ＢＰ）を含み、化学抗がん剤または免疫抗がん剤をさらに含むことを特徴とする、がんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項１０】
前記化学抗がん剤は、オキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、ペメトレキセド（Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）及びドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）からなる群からいずれか一種以上が選ばれることを特徴とする、請求項９に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項１１】
前記免疫抗がん剤は、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ、抗Ｔｉｍ３及び抗ＬＡＧ３からなる群からいずれか一種以上が選ばれることを特徴とする、請求項９に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項１２】
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株と化学抗がん剤または免疫抗がん剤は、単一の剤形として同時に投与されるか、あるいは、別個の剤形として同時または逐次に投与されることを特徴とする、請求項９に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項１３】
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株（ＫＣＴＣ１３４５２ＢＰ）を含む、がんの予防または改善のための食品組成物。
【請求項１４】
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株（ＫＣＴＣ１３４５２ＢＰ）を含む、がんの予防または改善のための動物用の飼料組成物。
【請求項１５】
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株（ＫＣＴＣ１３６８４ＢＰ）。
【請求項１６】
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株（ＫＣＴＣ１３６８４ＢＰ）を含む、がんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項１７】
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株（ＫＣＴＣ１３６８４ＢＰ）を含み、前記ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株が抗がん及び免疫増進効果を示すことを特徴とする、がんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項１８】
前記がんは、黒色腫、扁平細胞癌腫、乳がん、頭頚部がん、甲状腺がん、軟部組織肉腫、骨肉腫、精巣がん、前立腺がん、卵巣がん、膀胱がん、皮膚がん、脳腫瘍、血管肉腫、肥滿細胞腫、白血病、リンパ腫、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、胃がん、腎臓がん、大腸がん、造血器腫瘍、神経芽細胞腫、類表皮癌腫及びその転移がんからなる群から選ばれるいずれか一種以上であることを特徴とする、請求項１６に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項１９】
前記ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株が、ガングリオシドＧＭ３（Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ＧＭ３）を増加させることを特徴とする、請求項１６に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項２０】
前記ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株が、ＩＦＮ−γの生成を増加させることを特徴とする、請求項１７に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項２１】
前記ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株が、ＩＬ−１５またはＩＬ−７の発現を増加させることを特徴とする、請求項１７に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項２２】
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株（ＫＣＴＣ１３６８４ＢＰ）を含み、化学抗がん剤または免疫抗がん剤をさらに含むことを特徴とする、がんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項２３】
前記化学抗がん剤は、オキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、ペメトレキセド（Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）及びドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）からなる群からいずれか一種以上が選ばれることを特徴とする、請求項２２に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項２４】
前記免疫抗がん剤は、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ、抗Ｔｉｍ３及び抗ＬＡＧ３からなる群からいずれか一種以上が選ばれることを特徴とする、請求項２２に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項２５】
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株と化学抗がん剤または免疫抗がん剤は、単一の剤形として同時に投与されるか、あるいは、別個の剤形として同時または逐次に投与されることを特徴とする、請求項２２に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項２６】
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株（ＫＣＴＣ１３６８４ＢＰ）を含む、がんの予防または改善のための食品組成物。
【請求項２７】
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株（ＫＣＴＣ１３６８４ＢＰ）を含む、がんの予防または改善のための動物用の飼料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんを予防または治療する上で優れた効果を奏する新規なビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株及びラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株に関する。
【０００２】
具体的に、本発明の新規なビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、がん細胞の増殖を抑える効果を奏するだけではなく、がん細胞の移動性を低下させ、血管新生に関与する遺伝子の発現を調節する効果をも併せ持つことにより、従来のビフィドバクテリウム・ビフィダム菌株に比べて格段に優れた効果を奏する。のみならず、本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、抗炎症、抗酸化及び免疫増強効果を奏する。
【０００３】
また、本発明の新規なラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、がん細胞そのものの増殖を抑える効果を奏するだけではなく、免疫活性を増進させて従来のラクトコッカス・ラクティス菌株に比べて格段に優れた効果を奏する。具体的に、本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、腸内定着過程において抗がん効能を有する代謝産物を分泌することで優れた抗がん効果を奏する。
【背景技術】
【０００４】
人体の腸は、多種多様な細菌の共生により、飲食物の消化による栄養素を吸収し、かつ、体内の不要な物質を対外に排出する重要な機能を有する。また、腸内細菌による環境の変化は、腸の免疫にも直接的につながり、これは、結果的に、体内免疫力にも影響を及ぼす。このような腸内の健康に有益であると言われている微生物への研究がこの数年間にわたって次から次へと行われてきており、これに伴い、乳酸菌の腸機能、免疫力及び体内代謝活動への関与に関する研究結果が全世界的に盛んに発表されている。生きている微生物体といわれるプロバイオティックス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）は、消化器官内の不釣り合いを改善し、有害菌を抑える他、自然防御効果を強化させて体内免疫反応を向上させる機能をする。これまで、腸の免疫機能の向上のためのプロバイオティックスの機能に対する研究は、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などを用いて種（ｓｐｅｃｉｅｓ）と属（ｇｅｎｕｓ）の分類学的な形態に応じて行われてきた。
【０００５】
乳酸菌に対する研究は、１９００年代にメチニコフ（Ｍｅｃｈｎｉｋｏｖ）が乳酸菌による寿命延長効果を発表したことをきっかけに始まり、１９４６年にストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）とセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎ）を、骨肉腫（Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）患者を対象として腫瘍内に直接的に注入したときに一部の患者に腫瘍の治療反応が現れることに基づいて、乳酸菌による抗がん治療に対する研究が本格的に行われ、多くの前臨床研究がこれまでも盛んに行われている。
【０００６】
２０１６年にＥｌ−Ｎｅｚａｍｉ研究チームは、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧ，Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７及び熱処理を施したＶＳＬ＃３を一定の割合にて混ぜ合わせてマウス同種腫瘍モデルに経口投与したとき、抗がん剤であるシスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）に比べて血管新生過程の抑制による抗がん効果が発揮されることを判明させた。なお、抗がん剤を投与したグループは、抗がん剤の毒性によるマウスの体重減少が現れたのに対し、プロバイオティックスを投与したグループではマウスの体重減少が現れないことを立証することにより、プロバイオティックスが抗がん治療剤としての機能を有し得ることを立証した。但し、前記研究において用いられたプロバイオティックスは、複数種の複合微生物が含有されているものであり、微生物の一つ一つへの機能的な研究については、未だ十分に行われていないのが現状である。
【０００７】
がん（癌）は、通常の細胞とは異なり、細胞の増殖能力が無限であり、その増殖速度もまた速い他、がん細胞を囲んでいる血管、リンパ管及び繊維芽細胞などを用いて腫瘍微細環境を形成して、他の組織への転移及び通常の細胞の機能の喪失などを引き起こすことにより死に至らせる恐ろしい疾病の一つである。
【０００８】
このようながんを治療すべく、全世界の研究員らががん細胞の細胞内信号機序及び転移、薬物の副作用などに関する様々な主題について数多くの研究を行っており、毎年新薬が開発されて大勢のがん患者に治療効果を期待させる臨床試験が行われている。
【０００９】
手術による腫瘍組織の除去と放射線治療の他に、抗がん治療に用いられている現在の抗がん剤は、各がん種に応じて異ならせて適用している。一般に、がん患者に処方されている化学抗がん剤は、がん細胞を標的とするものではないため、がん細胞を殺す効果を有してはいるものの、正常細胞にも影響を及ぼして患者に脱毛、下痢、発熱、免疫力の低下などの副作用が生じている。その後、がんに関する遺伝的な研究などに基づいて、各がん種において生じる遺伝変異をターゲットとする標的抗がん剤が開発されて従来の化学抗がん剤により生じる副作用は大幅に改善されたものの、環境への適応が非常に早いがん細胞が標的抗がん剤の攻撃から逃げるために抗がん剤耐性を引き起こしてしまい、その結果、標的抗がん剤による持続的ながん治療効果を１００％期待することができないという不具合がある。
【００１０】
最近には、抗がん剤と腫瘍微細環境に対する研究が盛んに行われており、これに伴い、抗がん効果は保ちながらも、患者の免疫力を調節する様々な免疫関門抑制剤に対する免疫抗がん剤が開発されて患者に治療剤として用いられている。中でも、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１に対する治療は、皮膚がん、肺がんなどの患者に高い治療反応を示すことが知られている。このような免疫抗がん剤は、腫瘍微細環境下において免疫細胞の機能を調節することにより、がん細胞の増殖の抑制及び免疫細胞の活性を高める機能を有している。しかしながら、免疫抗がん剤もまた、すべての患者に同じ抗がん効果を示すことはできず、免疫抗がん剤に対するバイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）がはっきりと判明しておらず、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ遺伝子変異による抗がん剤耐性が生じたり、抗体合成物の特性による自己免疫疾患を招いたりする虞があり、高価な治療費用が生じるなどの不具合が存在する。
【００１１】
これらの研究結果に基づいて、本発明者らは、実質的にがん患者に治療効果の改善を示し得る微生物に対する研究を行っており、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株とラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株のそれぞれががん細胞の増殖の抑制などに優れた効果を示すことを見出すことにより、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、抗がん及び抗炎症効果を示すプロバイオティックスまたはそのエキスを新規な抗がん剤、炎症性疾患治療剤または免疫疾患治療剤などの開発に活用するためのものである。
【００１３】
従って、本発明の一つの目的は、優れたがんの予防または治療効果を奏するビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株を含むがんの予防または治療のための薬学組成物を提供することである。
【００１５】
また、本発明は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株を含むがんの予防または改善するための食品組成物または動物用の飼料組成物を提供することを目的とする。
【００１６】
さらに、本発明は、優れたがんの予防または治療効果を奏する新規なラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株を提供することを目的とする。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株を含むがんの予防または治療のための薬学組成物を提供することである。
【００１８】
さらにまた、本発明は、ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株を含むがんの予防または改善するための食品組成物または動物用の飼料組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
前記諸目的を達成するために、本発明は、新規なビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株を提供する。前記菌株は、２０１８年１月４日付けで韓国生命工学研究院生物資源センターに受託番号ＫＣＴＣ１３４５２ＢＰとして寄託された。
【００２０】
また、本発明は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株を含むがんの予防または治療のための薬学組成物を提供する。具体的に、前記ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、菌株そのもの、菌株の培養液、または菌株を破砕して得られた細胞質分画物（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）を含むものを意味することができる。
【００２１】
本発明は、有効量のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株をがんの予防または治療を必要とする対象体（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与することを含む、前記対象体においてがんを予防または治療する方法を提供する。本発明における「対象体」には、ヒト及び非ヒト動物が含まれる。非ヒト動物には、哺乳類、非哺乳類などのあらゆる脊椎動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ウマなどが含まれる。なお、本発明は、がんの予防または治療のためのビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株の用途を提供する。
【００２２】
特に、本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、抗がん、抗炎症、抗酸化及び免疫増進効果をいずれも示すことを特徴とする。
【００２３】
本発明において、がんは、黒色腫、扁平細胞癌腫、乳がん、頭頚部がん、甲状腺がん、軟部組織肉腫、骨肉腫、精巣がん、前立腺がん、卵巣がん、膀胱がん、皮膚がん、脳腫瘍、血管肉腫、肥滿細胞腫、白血病、リンパ腫、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、胃がん、腎臓がん、大腸がん、造血器腫瘍、神経芽細胞腫、類表皮癌腫またはその転移がんであってもよく、これに制限されない。好ましくは、本発明において、がんは、肺がん、大腸がん、胃がん、乳がんまたは肝臓がんであってもよい。
【００２４】
本発明において、炎症性疾患は、骨関節炎、関節リウマチ、痛風、強直性脊椎炎、腱炎、腱膜炎、リウマチ熱、ループス、線維筋痛、乾癬性関節炎、喘息、アトピー、クローン病または潰瘍性大腸炎であってもよく、これに制限されない。
【００２５】
本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、がん細胞の増殖を阻害し、がん細胞の移動性を低下させることにより、抗がん効果を示すことができる。また、本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、血管増殖因子であるＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、Ａｎｇ１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ１）、Ａｎｇ２（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ２）の発現を抑えることにより、抗がん効果を示すことができる。
【００２６】
また、本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株がＴＮＦ−αの発現を抑えることにより、抗炎症または抗がん効果を示すことができる。ＴＮＦ−αは、人体内感染、外傷、敗血症、関節リウマチなどのような慢性または急性の炎症反応時に免疫細胞から分泌されるサイトカインであり、ＴＮＦ−αの濃度が高くなると、細胞内脂質及び糖代謝過程に損傷を与えてしまう。ＴＮＦ−αは、細胞の壊死を誘導するサイトカインであることが知られているが、持続的なＴＮＦ−αの刺激が細胞に伝わると、むしろ細胞内代謝に及ぼした影響により腫瘍形成遺伝子が発生し、細胞の異常な増殖が生じることにより、がんの誘発を促してしまうという研究結果が報告されている。
【００２７】
本発明は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株、及び化学抗がん剤または免疫抗がん剤を含むことを特徴とする、がんの予防または治療のための薬学組成物に関する。また、本発明は、有効量のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株を化学抗がん剤または免疫抗がん剤と併用して、がんの予防または治療を必要とする対象体に投与することを含む、前記対象体においてがんを予防または治療する方法を提供する。
【００２８】
前記化学抗がん剤は、オキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、ペメトレキセド（Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）であってもよいが、これに制限されない。
【００２９】
さらに、前記免疫抗がん剤は、免疫関門抑制機能を有する抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ、抗Ｔｉｍ３、抗ＬＡＧ３であってもよいが、これに制限されない。
【００３０】
本発明において、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株、及び化学抗がん剤または免疫抗がん剤は、逐次または同時に、これを必要とする患者に投与されてもよい。
【００３１】
さらにまた、本発明は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株を含むがんの予防または改善のための食品組成物または動物用の飼料組成物に関する。
【００３２】
前記食品組成物は、保健機能食品、乳製品、発酵製品または食品添加物であってもよく、これに制限されない。
【００３３】
本発明は、新規なラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株を提供する。前記ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、２０１８年１０月２５日付けで韓国生命工学研究院生物資源センターに受託番号ＫＣＴＣ１３６８４ＢＰとして寄託された。
【００３４】
また、本発明は、ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株を含むがんの予防または治療のための薬学組成物を提供する。具体的に、前記ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株は、菌株そのもの、菌株の培養液、または菌株を破砕して得た細胞質分画物（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）を含んでいてもよい。
【００３５】
本発明は、有効量のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株をがんの予防または治療を必要とする対象体（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与することを含む、前記対象体においてがんを予防または治療する方法を提供する。なお、本発明は、がんの予防または治療のためのラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株の用途を提供する。
【００３６】
特に、本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、抗がん効果及び免疫増進効果を両方とも示すことを特徴とする。
【００３７】
前記がんは、黒色腫、扁平細胞癌腫、乳がん、頭頚部がん、甲状腺がん、軟部組織肉腫、骨肉腫、精巣がん、前立腺がん、卵巣がん、膀胱がん、皮膚がん、脳腫瘍、血管肉腫、肥滿細胞腫、白血病、リンパ腫、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、胃がん、腎臓がん、大腸がん、造血器腫瘍、神経芽細胞腫、類表皮癌腫またはその転移がんであってもよく、これに制限されない。
【００３８】
本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、がん細胞の増殖を直接的に阻害し、免疫細胞を活性化させることにより、抗がん効果を示すことができる。なお、本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、腸内への定着に伴い、代謝産物を調節することにより、抗がん効果を示すことができる。
【００３９】
具体的に、本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、ガングリオシドＧＭ３（Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ＧＭ３；ｍｏｎｏｓｉａｌｏｄｉｈｅｘｏｓｙｌｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）を増加させることができる。ガングリオシドＧＭ３は、下記の一般式Ｉの構造を有する化合物であって、［（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−｛［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−２−｛［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−６−｛［（２Ｓ，３Ｒ）−２−ｄｏｃｏｓａｎａｍｉｄｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｄｅｃｙｌ］ｏｘｙ｝−４，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｏｘａｎ−３−ｙｌ］ｏｘｙ｝−３，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−６−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｏｘａｎ−４−ｙｌ］ｏｘｙ｝−５−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−［（１Ｒ，２Ｒ）−１，２，３−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ］ｏｘａｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ］である。
【００４０】
【化１】
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…Ｉ
【００４１】
スフィンゴ糖脂質（Ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ）の一つであるガングリオシドＧＭ３は、細胞膜の構成成分であり、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を抑えることにより、血管新生を防ぎ、リンパ球のアラキドン酸カスケード（Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｃａｓｃａｄｅ）を調節することにより、免疫作用の調節を通じて抗がん効能を示すことが知られている。さらに、ガングリオシドＧＭ３は、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）を処理した場合、がん細胞においてアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）をさらに増加させることが知られている。
【００４２】
従って、本発明は、前記ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株がガングリオシドＧＭ３を増加させることを特徴とする、がんの予防または治療のための薬学組成物に関する。
【００４３】
また、本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、メモリーＴ細胞の活性に伴うＩＦＮ−γの生成を増加させ、Ｔ細胞の活性化を引き起こすＩＬ−１５とＩＬ−７の発現を増加させることにより、抗がん及び免疫増強効果を示すことができる。
【００４４】
従って、本発明は、前記ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株がＩＦＮ−γの生成を増加させることを特徴とする、がんの予防または治療のための薬学組成物に関する。
【００４５】
さらに、本発明は、前記ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株がＩＬ−１５またはＩＬ−７の発現を増加させることを特徴とする、がんの予防または治療のための薬学組成物に関する。
【００４６】
本発明は、ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株、及び化学抗がん剤または免疫抗がん剤を含むことを特徴とする、がんの予防または治療のための薬学組成物に関する。また、本発明は、有効量のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株を化学抗がん剤または免疫抗がん剤と併用して、がんの予防または治療を必要とする対象体に投与することを含む、前記対象体においてがんを予防または治療する方法を提供する。
【００４７】
前記化学抗がん剤は、オキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、ペメトレキセド（Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）などであってもよいが、これに制限されない。
【００４８】
さらにまた、前記免疫抗がん剤は、免疫関門の抑制機能を有する抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ、抗Ｔｉｍ３、抗ＬＡＧ３免疫抗がん剤であってもよいが、これに制限されない。
【００４９】
本発明において、ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株、及び化学抗がん剤または免疫抗がん剤は、逐次または同時に、これを必要とする患者に投与されてもよい。
【００５０】
また、本発明は、ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株を含むがんの予防または改善のための食品組成物または動物用の飼料組成物に関する。
【００５１】
前記食品組成物は、保健機能食品、乳製品、発酵製品または食品添加物であってもよく、これに制限されない。
【発明の効果】
【００５２】
本発明の新規なビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、様々ながん細胞株に対して増殖抑制効果を奏する。また、本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、がん細胞の移動性を減少させ、血管新生を抑える効果もまた併せ持つことにより、従来知られている他のビフィドバクテリウム・ビフィダムに比べて格段に優れた効果を奏する。
【００５３】
また、本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、抗炎症、抗酸化または免疫増強効果を奏することにより、炎症疾患または免疫疾患にも用いられ得る。
【００５４】
特に、本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、単独で投与したときに優れた抗がん効果を示すだけではなく、化学抗がん剤または免疫抗がん剤と併用して投与したときに、これらを単独で投与したときに比べて格段に優れた抗がん効果を奏する。
【００５５】
本発明の新規なラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、様々ながん細胞株に対して増殖を抑える効果を奏するだけではなく、免疫活性を示して、従来のラクトコッカス・ラクティス菌株に比べて格段に優れた効果を奏する。
【００５６】
特に、本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、単独で投与したときに優れた抗がん効果を示すだけではなく、化学抗がん剤または免疫抗がん剤と併用して投与したときに、これらを単独で投与したときに比べて格段に優れた抗がん効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】１５４名の健常人と１２５名の肺がん患者の糞便における腸内微生物の組成を分析するために、患者の病理学的な疾病状態に応じた分類及び治療反応に応じた分類を示す模式図である。
【図２】健常人と肺がん患者の腸内微生物の組成を１６ｓ配列分析で分析して示す図である。
【図３】肺がん患者のうち、抗がん剤の治療反応に応じて、反応群と非反応群の患者の腸内微生物の組成を示す図である。
【図４】腸内微生物のうち、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの有無に応じた肺がん患者の治療反応を示す結果である。
【図５】ヒト由来のがん細胞株において、ＭＧ７３１の処理に伴う細胞増殖の抑制をグラフで示す図である。
【図６Ａ】ＭＧ７３１によるがん細胞株の移動性低下を示す結果である。
【図６Ｂ】ＭＧ７３１によるがん細胞株の移動性低下を示す結果である。
【図７】ＭＧ７３１が血管新生に関わる因子であるＶＥＧＦの発現を阻害したことを示す図である。
【図８Ａ】ＶＥＧＦ以外の血管新生に関わる因子であるＡｎｇ１、Ａｎｇ２の発現を阻害したＭＧ７３１の効能を確認した結果である。
【図８Ｂ】ＶＥＧＦ以外の血管新生に関わる因子であるＡｎｇ１、Ａｎｇ２の発現を阻害したＭＧ７３１の効能を確認した結果である。
【図９】ＭＧ７３１がＬＰＳによる炎症反応誘発因子のうち、ＴＮＦ−αの発現を阻害したことを示す図である。
【図１０】ＭＧ７３１の濃度別の処理に伴う活性酸素種の減少を示す図である。
【図１１】化学抗がん剤（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ、Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）とＭＧ７３１の併用処理に伴うがん細胞の増殖抑制効果を示す結果である。
【図１２】図１１において染色された細胞を脱染色化し、がん細胞の増殖抑制効果を数値化して示す図である。
【図１３】ヒトの血液とがん細胞株を用いたＭＧ７３１と免疫抗がん剤（抗ＰＤ１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ４）の併用処理に伴うがん細胞死滅の効能を示す図である。
【図１４】マウス同種移植モデルを用いた化学抗がん剤（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）とＭＧ７３１の併用投与に伴う腫瘍の増殖抑制効果を示す図である。
【図１５】マウス同種移植モデルを用いた免疫抗がん剤（抗ＰＤ１）とＭＧ７３１の併用投与に伴う腫瘍の増殖抑制効果を示す図である。
【図１６】化学抗がん剤（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）とＭＧ７３１の併用投与に伴う、マウス同種移植モデルの腫瘍組織内に浸透した免疫細胞の分布を分析した図である。
【図１７】免疫抗がん剤（抗ＰＤ１）とＭＧ７３１の併用投与に伴う、マウス同種移植モデルの腫瘍組織内に浸透した免疫細胞の分布を分析した図である。
【図１８】ＧＥＮ３０３３菌株による免疫活性のバイオマーカーでＩＦＮ−γの生成の増加効果を確認した図である。
【図１９】マウス腫瘍モデルにＧＥＮ３０３３菌株を投与して腫瘍の増殖抑制効果を確認した図である。
【図２０】ＧＥＮ３０３３菌株を投与したマウス腫瘍モデルの大腸と腫瘍組織におけるＩＬ−１５の発現を測定した結果である。
【図２１】ＧＥＮ３０３３菌株を投与したマウス腫瘍モデルの大腸と腫瘍組織におけるＩＬ−７の発現を測定した図である。
【図２２】マウス大腸がんモデルにＧＥＮ３０３３菌株を投与した場合、免疫抗がん剤（抗ＰＤ１）を投与した場合及びこれらを併用投与した場合における腫瘍の増殖抑制効果を示す図である。
【図２３】ＧＥＮ３０３３菌株と免疫抗がん剤（抗ＰＤ１）を単独投与、またはこれらを併用投与したマウスの血清における代謝産物を分析した結果を示す図である。
【図２４】ＧＥＮ３０３３菌株と免疫抗がん剤（抗ＰＤ１）を単独投与、またはこれらを併用投与したマウスの血清における代謝産物を分析した結果を示す図である。
【図２５】ＧＥＮ３０３３菌株と免疫抗がん剤（抗ＰＤ１）を単独投与、またはこれらを併用投与したマウスの血清における代謝産物を分析した結果を示す図である。
【図２６】マウス肺がんモデルへの免疫抗がん剤（抗ＰＤ１）とＧＥＮ３０３３の併用投与に伴う腫瘍の増殖抑制効果を示す図である。
【図２７】がん細胞株に対するＧＥＮ３０３３菌株と化学抗がん剤（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ、５−Ｆｕ、Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）の併用処理に伴うがん細胞の死滅効能を示す図である。
【図２８】がん細胞株に対するＧＥＮ３０３３菌株と化学抗がん剤（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ、５−Ｆｕ、Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）の併用処理に伴うがん細胞の死滅効能を示す図である。
【図２９】がん細胞株に対するＧＥＮ３０３３菌株と化学抗がん剤（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ、５−Ｆｕ、Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）の併用処理に伴うがん細胞の死滅効能を示す図である。
【図３０】がん細胞株に対するＧＥＮ３０３３菌株と化学抗がん剤（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ、５−Ｆｕ、Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）の併用処理に伴うがん細胞の死滅効能を示す図である。
【図３１】がん細胞株に対するＧＥＮ３０３３菌株と化学抗がん剤（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ、５−Ｆｕ、Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）の併用処理に伴うがん細胞の死滅効能を示す図である。
【図３２】マウスの血液とがん細胞株とを用いた、ＧＥＮ３０３３菌株と免疫抗がん剤（抗ＰＤＬ１）のがん細胞の死滅効能を示す図である。
【図３３】ヒトの血液とがん細胞株を用いた、ＧＥＮ３０３３と免疫抗がん剤（抗ＰＤ１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ４）の併用処理に伴うがん細胞の死滅効能を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本発明者らは、優れた抗がん治療または予防効果を有するプロバイオティックスを探るために研究した結果、新規なビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株及びラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株が優れた抗がん効果を奏することを見出して本発明を完成するに至った。
【００５９】
驚くべきことに、ＭＧ７３１菌株は、肺がん、大腸がん、胃がん、乳がん及び肝臓がんなどの様々ながん細胞株に対して優れたがん細胞の増殖抑制効果を奏する。
【００６０】
また、がん細胞株にＭＧ７３１菌株を処理した場合、がん細胞の移動性が格段に低下する。がん細胞は、正常細胞とは異なり、たとえ細胞に損傷が生じたとしても、増殖しながら移動するという特徴があり、がん細胞の移動性が減少することは、がん転移の可能性が低くなることを意味するため、ＭＧ７３１菌株は、がん転移の抑制効果を奏する。
【００６１】
さらに、ＭＧ７３１菌株は、血管の生成に関わる主な因子であるＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、Ａｎｇ１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ１）及びＡｎｇ２（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ２）の発現をいずれも抑えることができる。血管新生は、がん細胞の特徴の一つであり、これを抑えて血管を介したがん細胞への栄養分の供給を阻害することにより、がん細胞の増殖を抑えることができる。
【００６２】
炎症性疾患においてはっきりと現れる様相の一つは、活性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ；ＲＯＳ）の増加である。中間ほどの活性酸素種の濃度は、細胞信号伝達系統の調節により効果を発揮するが、実際に高い濃度の活性酸素種に長時間晒されると、タンパク質、脂質及び核酸に非特異的な損傷を招いてしまう。活性酸素種は、タンパク質リン酸化、イオンチャンネル及び転写因子の酸化還元調節などといった正常的な生理的過程において重要な役割を果たし、甲状腺ホルモンの生成及び細胞外基質の架橋結合をはじめとする生合成過程にも主な機能を有している。なお、ほとんどのがん細胞においてもこのような活性酸素種が高い活性を有することにより、異常な細胞の増殖を引き起こすことが広く知られている。従って、本発明のＭＧ７３１菌株は、活性酸素種を減少させてがん細胞の増殖を抑え、色々な疾病の発病を予防する効果を奏する。
【００６３】
また、本発明のＭＧ７３１菌株が腫瘍細胞の増殖を抑える機能を有する細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ（ＣＤ８＋  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ））及びＮＫ細胞（Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ）を腫瘍組織内にさらに多く浸透するように誘導し、細胞傷害性Ｔ細胞の機能を阻害する制御性Ｔ細胞（Ｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ）の数を減らすことにより、免疫細胞の機能を調節し、優れた抗がん効果を示す。
【００６４】
様々ながん細胞株にＭＧ７３１菌株、及び公知の化学抗がん剤または免疫抗がん剤をそれぞれ別々に処理したり併用処理したりする場合、ＭＧ７３１が処理されたがん細胞株は、抗がん剤が処理されたがん細胞株よりも優れた細胞の増殖抑制効果を有し、ＭＧ７３１及び抗がん剤と併用処理されたがん細胞株は、ＭＧ７３１または抗がん剤のみが処理されたがん細胞株よりも優れた細胞の増殖抑制効果を有することから、ＭＧ７３１は、従来の抗がん剤と併用投与したときにさらに高い抗がん効果を有する。
【００６５】
従って、本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、がん細胞の増殖抑制、がん細胞の移動性の低下及び血管新生の抑制効果を同時に示して優れた抗がん剤として活用されることが可能であり、従来の化学抗がん剤または免疫抗がん剤と併用投与されてもよい。
【００６６】
本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、前記化学抗がん剤または免疫抗がん剤と単一の製剤として同時に投与され得るか、あるいは、別個の製剤として同時または逐次に投与されてもよい。
【００６７】
また、炎症誘発因子であるＬＰＳにより誘導されたＴＮＦ−αの発現を各段に減少させて、ＭＧ７３１菌株は、炎症性疾患及びがんを同時に予防または治療することができる。
【００６８】
本発明は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株を体内に投与してがん、炎症性疾患、免疫疾患などを予防または治療する方法を提供する。
【００６９】
本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株を含む組成物は、医薬品、保健機能食品、乳製品、発酵製品、食品添加物または動物用の飼料などに使用可能である。
【００７０】
さらに、本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、様々ながん細胞株に対して優れた増殖抑制効果を奏する。
【００７１】
本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株を処理した場合、がん細胞の増殖が直接的に低下し、メモリーＴ細胞の活性に伴うＩＦＮ−γの生成が増加し、Ｔ細胞の活性化を引き起こすＩＬ−１５とＩＬ−７の発現が増加することにより、抗がん及び免疫増強効果が奏される。
【００７２】
さらにまた、本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、腸内への定着に伴い代謝産物を調節することにより、抗がん効果を示す。特に、ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、ＶＥＧＦを抑えることにより、血管新生を防ぎ、リンパ球のアラキドン酸カスケードを調節することにより、免疫作用の調節によって抗がん効能を示すと知られているガングリオシドＧＭ３を増加させて優れた抗がん効果を示すことができる。また、ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、マクロファージ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）を活性化させて免疫反応を調節するホスファチジルイノシトール（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ；ＰＩ）１８：１及び２０：４を増加させる。さらに、ＧＥＮ３０３３の単独投与または免疫抗がん剤の単独投与で、細胞膜の損傷と炎症反応を示すマーカーとして知られているアラキドノイルチオホスホリルコリン（Ａｒａｃｈｉｄｏｎｏｙｌｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）及びＰＣ１６：０／２２：６には影響を及ぼさないが、ＧＥＮ３０３３及び免疫抗がん剤を併用投与したときにアラキドノイルチオホスホリルコリン及びＰＣ１６：０／２２：６を増加させて抗がん効能を示す。
【００７３】
様々ながん細胞株にＧＥＮ３０３３菌株、及び公知の化学抗がん剤または免疫抗がん剤をそれぞれ別々に処理したり併用処理したりする場合、ＧＥＮ３０３３が抗がん剤と併用処理されたがん細胞株は、ＧＥＮ３０３３または抗がん剤のみが処理されたがん細胞株よりもなお一層優れた細胞の増殖抑制効果を奏することから、ＧＥＮ３０３３は、従来の抗がん剤と併用投与したときにさらに高い抗がん効果を示す。
【００７４】
従って、本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、がん細胞の増殖抑制効果と免疫増進効果を同時に示して、優れた抗がん剤として活用されることが可能になり、従来の化学抗がん剤または免疫抗がん剤と併用投与されてもよい。
【００７５】
本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、前記化学抗がん剤または免疫抗がん剤と単一の製剤として同時に投与されてもよく、あるいは、別個の製剤として同時または逐次に投与されてもよい。
【００７６】
本発明は、ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株を体内に投与してがん、炎症性疾患、免疫疾患などを予防または治療する方法を提供する。
【００７７】
本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株を含む組成物は、医薬品、保健機能食品、乳製品、発酵製品、食品添加物または動物用の飼料などに使用可能である。
【００７８】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７９】
［実施例１］
臨床患者の糞便を用いた腸内微生物の組成の分析
健常人１５４名と肺がん患者１２５名から糞便を供されて、腸内微生物の組成に関する研究を行うために、１６ｓシーケンス分析を行った。分析結果に対する患者の病理学的な分類による腸内微生物の分析を行うべく、患者のチャートに従う分類を行った。１２５名の患者の腫瘍組織において、最も頻繁に生じる非小細胞肺がん（Ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇｃ  ａｎｃｅｒ）に属する肺がん２種である扁平上皮がん（Ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）と腺がん（Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）患者のサンプルのみを分類した後、患者が抗がん剤の治療を受けた記録を追跡して抗がん剤の反応に応じて腫瘍の大きさの変化を測定した数値を基準として治療反応具合（ＰＲ；Ｐａｒｔｉａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、ＳＤ；Ｓｔａｂｌｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ；Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ）に応じた患者のサンプルを分類した。
【００８０】
前記基準に従い、非小細胞肺がんに属していない肺がん患者と、治療反応結果の追跡が不可能な患者に属する４９名のサンプルは分析から除外された。これに関する医薬用語及び詳しい説明は、図１に模式図にて表記する。
【００８１】
健常人と肺がん患者の腸内微生物環境において、健常人の腸内にビフィドバクテリウム属菌株がさらに多く分布されていることが分かり、これに関するデータは、図２に示す。
【００８２】
また、肺がん患者の抗がん治療に応じて反応群と非反応群に分類したとき、抗がん剤の治療反応がある患者の腸内微生物にビフィドバクテリウム・ビフィダムが属していることを確認し、これに対する分析結果は、図３に示す。
【００８３】
これに加えて、抗がん治療剤に応じた患者の治療現況を臨床学的分類で表記したとき、ビフィドバクテリウム・ビフィダムが腸内微生物の組成に多ければ多いほど、患者の治療反応がさらに良好であることを確認することができ、これは図４に表記する。
【００８４】
これらの臨床患者の腸内微生物の分析により、ビフィドバクテリウム・ビフィダムが抗がん治療反応に関連していることが分かる。
【００８５】
［実施例２］
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１の分離及び培養
ＭＧ７３１は、健康な乳児の糞便からビフィドバクテリウム種（ｓｐｐ．）に対する選択培地を用いて菌株を分離した。
【００８６】
寄せ集めた糞便試料を０．８５％ＮａＣｌに１０倍段階希釈して５０ｍｇ／Ｌのリチウムムピロシン（Ｌｉｔｈｉｕｍ  ｍｕｐｉｒｏｃｉｎ）を添加したＴＯＳ−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ  ａｇａｒ（ＭｅｒｃｋＫ  ＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に塗抹し、３７℃の温度で４８時間かけて嫌気培養した後、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）の形状が互いに異なる菌株を選び抜いた。選び抜かれた菌株は、ＢＬブロス（ｂｒｏｔｈ）において継代培養した後、２０％のグリセロールが含有されているＢＬブロスにおいて−８０℃で凍結保管した。
【００８７】
得られた菌株に対するｒＲＮＡの塩基配列を分析して配列番号１に示し、これを同定したところ、ＭＧ７３１は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）であることを確認した。前記ＭＧ７３１菌株は、２０１８年１月４日付けで韓国生命工学研究院生物資源センターに受託番号ＫＣＴＣ１３４５２ＢＰとして寄託された。
【００８８】
この実験において用いようとするビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１をＭＲＳブロス（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ）に接種し、３７℃及び嫌気性の条件下で培養しながら乳酸菌の増殖がＯＤ＝１となるときに培養を終了した。培養終了した培養物は、遠心分離によって菌体を回収し、回収された菌体はＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳに懸濁して超音波粉砕方法で菌体を粉砕した。粉砕された菌体は、遠心分離によって上澄み液を得て０．４２μｍのフィルターを介してろ過することにより、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１のエキスを製造した。
【００８９】
［実施例３］
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株の腫瘍の増殖抑制効果
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１が様々ながん細胞株において抗がん効能を示すか否かを確認するために、ヒト由来のがん細胞株を用いてＭＴＴアッセイを行った。
【００９０】
ＭＴＴアッセイに用いられたがん細胞株としては、肺がん（Ａ５４９、Ｈ１９７５、ＨＣＣ８２７、Ｈ１２９９、ＳＷ９００）、大腸がん（ＨＣＴ１１６、ＬｏＶｏ、ＳＮＵ−Ｃ２Ａ、ＳＮＵ−Ｃ１、Ｃｏｌｏ２０５）、胃がん（ＳＮＵ２１６、ＡＧＳ、ＭＫＮ−２８、ＭＫＮ−１、ＳＮＵ−６０１、ＳＮＵ−１）、乳がん（Ｈｓ５７８Ｔ、ＢＴ２０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ７）、肝臓がん（ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ）であり、合計で５種類のがん種を用いて実験を行った。
【００９１】
がん細胞株を９６ウェルプレートに１〜５×１０3細胞／ウェルになるように分注し、２４時間後に乳酸菌試料を１％（１％＝１２．１４７μｇ，ＢＣＡ分析によってエキスの濃度を測定する）で添加して７２時間かけて培養した後、それぞれのウェルにＭＴＴ（３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ  ｔｈｉａｚｏｌｙｌ  ｂｌｕｅ）試薬を処理して２時間かけて反応させた。
【００９２】
次いで、生きている細胞のミトコンドリアに反応して黄色のＭＴＴが紫色に変わる過程を経た。それから、ＭＴＴが入っている培養液はすべて除去し、１００μｌのＤＭＳＯを各ウェルに添加して紫色の濃度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）装備を用いて５４０ｎｍの吸光度において測定し、ヒト由来のがん細胞株に対する実験結果を図５に示す。
【００９３】
［実施例４］
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株のがん細胞の移動性の低下効果
がん細胞は、正常細胞とは異なり、たとえ細胞に損傷が生じたとしても、増殖しながら移動するという特徴があるため、ＭＧ７３１菌株によりがん細胞の移動性が低下するか否かを確認するために、創傷治癒アッセイ（Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）を行った。Ａ５４９（５×１０5細胞）及びＨＣＴ１１６（６×１０5細胞）菌株を６ウェルプレートに付着して細胞が９０〜９５％増殖した状態になると、チップ（ｔｉｐ）を用いて一定の間隔にて細胞に損傷を加えた。ＰＢＳまたはＭＧ７３１菌株を２４時間かけて処理して細胞の移動性の有無を顕微鏡で観察し、その結果を図６に示す。
【００９４】
図６に示すように、細胞に損傷を加えたＡ５４９（図６Ａ）とＨＣＴ１１６（図６Ｂ）細胞株の０時間帯の細胞の状態を基準としたとき、２４時間後に、Ａ５４９は６５．３１±１．６９％、ＨＣＴ１１６は３３．８２±５．８６％だけがん細胞の移動性が盛んに示されたのに対し、ＭＧ７３１を処理したＡ５４９とＨＣＴ１１６においてはそれぞれ４２．５９±４．０１％及び２２．６３±３．１１％であって、細胞の移動性が低下することを確認することができた。
【００９５】
要するに、ＭＧ７３１菌株は、がん転移を抑えて、優れた抗がん効果を奏することが分かる。
【００９６】
［実施例５］
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株の血管新生抑制効果
がん細胞の特徴の一つである血管新生過程をＭＧ７３１菌株が抑えるか否かを確認するために、血管新生に関わる因子に対する発現試験を下記のようにして行った。
【００９７】
ＨＣＴ１１６細胞株にＭＧ７３１を２４時間処理した後、ＲＮＡを得てｃＤＮＡを合成し、これを用いて、血管増殖因子であるＶＥＧＦの発現は通常のＰＣＲを、Ａｎｇ１とＡｎｇ２の発現はリアルタイムＰＣＲを用いて確認し、その結果を図７及び図８にそれぞれ示す。
【００９８】
図７に示すように、ＭＧ７３１の処理群において、対照群に比べてＶＥＧＦの１２１アイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）及び１６５アイソフォームの発現が著しく減ったことを確認した。
【００９９】
また、図８に示すように、ＶＥＧＦの他にも、血管新生に関与する因子Ａｎｇ１（図８Ａ）及びＡｎｇ２（図８Ｂ）の発現を比較したとき、Ａｎｇ１とＡｎｇ２の発現は、ＭＧ７３１の処理群において、対照群と比較したときに発現率が７０％以上著しく低下したことを確認した。
【０１００】
要するに、ＭＧ７３１が血管新生を抑えて血管を介したがん細胞への栄養分の供給を阻害することにより、異常ながん細胞の増殖抑制に優れた効果を奏することが分かる。
【０１０１】
［実施例６］
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株の抗炎症効果
ＭＧ７３１菌株の抗炎症効果を確認するために、マウス大食細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞にＭＧ７３１菌株を１８時間処理した後、炎症誘発因子であるＬＰＳ１００ｎｇ／ｍｌを６時間処理してＲＮＡを得た。
【０１０２】
前記ＲＮＡ１μｇでｃＤＮＡを合成し、これによって、炎症因子として知られているＴＮＦ−αの発現有無を、リアルタイムＰＣＲを用いて確認し、その結果を図９に示す。
【０１０３】
図９に示すように、ＬＰＳによりＴＮＦ−αの発現が増加した度合いを相対指数１としたとき、ＭＧ７３１を処理した群は、ＴＮＦ−αの発現が増加した度合いが０．５以下であることを確認した。ＴＮＦ−αは、がんを誘発する因子としても知られているため、ＭＧ７３１によりＴＮＦ−αの発現が著しく減ったことから、ＭＧ７３１が抗炎症及び抗がん機能を併せ持つことが分かる。
【０１０４】
［実施例７］
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株の抗酸化活性効果
ＭＧ７３１の抗酸化活性を確認するために、Ａ５４９がん細胞株にＭＧ７３１を２４時間処理した後、Ｈ2Ｏ2  ０．５μＭを４時間処理し、ＤＣＦＤＡ蛍光染料を用いてＦＡＣｓ装備で細胞内の活性酸素の量を測定し、その結果を図１０に示す。
【０１０５】
図１０に示すように、ＰＢＳのみを処理した群は、４．６６％の活性酸素の量を示し、Ｈ2Ｏ2のみを処理した群は６４．８％であって、活性酸素が増加したことが分かる。これに対し、０．１、０．５、１％のＭＧ７３１をそれぞれ処理した群は、活性酸素の量が５７．８％、３９．３％及び３２．５％に減った。従って、ＭＧ７３１が活性酸素の量を減少させる効果を示し、ＭＧ７３１の濃度が高くなると、活性酸素を阻害する効果もまた増加することを確認した。
【０１０６】
要するに、前記実験結果から、ＭＧ７３１は抗酸化効果を奏することが分かる。すなわち、正常細胞では、活性酸素による細胞の損傷を保護する役割を果たすことができ、がん細胞では、異常な活性酸素の濃度を減少させてミトコンドリアの異常な機能を制御する役割を果たすことができる。
【０１０７】
［実施例８］
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株と抗がん剤の併用処理に伴うがん細胞の増殖抑制効果（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験）
Ａ５４９、ＨＣＴ１１６において、ＭＧ７３１と抗がん剤の併用処理に伴うがん細胞の増殖抑制実験を行った。抗がん剤として、オキサリプラチンまたはペメトレキセドを用いて、下記の方法に従って実験を行った。
【０１０８】
前記２種類のがん細胞株を６ウェルプレートの各ウェルに１〜２×１０3となるように希釈した後に分注して２４時間かけて付着した後、乳酸菌と抗がん剤をウェルごとに処理し、２〜３日おきに培地を交換しながら７日間細胞の増殖を誘導した。
【０１０９】
プレートを４％のホルマリンで３０分間処理して細胞を固定して細胞の増殖を止めた後、２回のＰＢＳによる洗浄過程を経てクリスタルバイオレット（Ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ）溶液で５分間染色した後、蒸留水で洗浄して細胞の増殖有無を観察した。その結果を図１１に示す。
【０１１０】
図１１に示すように、ＭＧ７３１菌株と抗がん剤を併用処理したがん細胞株において、ＭＧ７３１または抗がん剤のみを処理したがん細胞株よりもさらに優れた細胞の増殖抑制効果が現れることが分かる。
【０１１１】
また、染色された細胞のコロニーに対する数値は、酢酸でクリスタルバイオレットを溶かしてマイクロプレートリーダー機器を用いて濃度を測定し、その結果を図１２に示す。図１２においても、図１１と同じ効果が現れることを確認した。
【０１１２】
［実施例９］
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株と免疫抗がん剤の併用投与に伴う抗腫瘍増進効果（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験）
ヒトの血液からＦｉｃｏｌｌを用いてＰＢＭＣ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ）を収集した後、赤血球溶解緩衝液（ＲＢＣ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いて赤血球を除去して生きている細胞の数を数えて乳酸菌（６×１０5／５０μｌ／ウェル）が入っている丸底の９６ウェルプレートにウェルごとにＰＢＭＣ  ３×１０4細胞／５０μｌずつ添加して２４時間培養した。
【０１１３】
結腸がん細胞株ＨＣＴ１１６は、ＦＢＳが含まれていないＲＰＭＩ培地において５μＭのＣＦＳＥ（Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）と混合し、３７℃で５分間反応させた後、ＦＢＳを含んでいるＲＰＭＩ  １６４０培地を添加し、１０分間アイス（ｉｃｅ）で保管した。上澄み液を遠心分離により除去した後、得られた細胞に１０％ＦＢＳが含有されているＲＰＭＩ  １６４０と混合した後、細胞の数を数えて前記用意した９６ウェルプレートのウェルごとに３×１０4個／１００μｌずつ添加した。
【０１１４】
次いで、がん細胞が添加されたウェルごとに各抗体ＰＤ１（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ，Ａ２００５，Ｓｅｌｌｅｃｋｅｍ）、ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ，Ａ２００４，Ｓｅｌｌｅｃｋｅｍ）、ＣＴＬＡ−４（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ，Ａ２００１，Ｓｅｌｌｅｃｋｅｍ）を２０〜３０μｇ／ｍＬの濃度範囲内で処理し、２４時間かけて培養した後、ＰＢＭＣ及びがん細胞株の混合物において溶菌された細胞を確認するために、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で細胞を染色した。ＦＡＣＳＤｉＶａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＣＦＳＥ及び７−ＡＡＤに対する染色を測定することにより、がん細胞株へのＰＢＭＣの細胞溶解能を確認してその結果を図１３に示す。
【０１１５】
ＰＢＭＣによるがん細胞死滅（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を１００％としたとき、ＭＧ７３１単独によるがん細胞死滅（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）は２０４．４％増加、臨床に用いられている免疫抗がん剤である抗ＰＤ１は１２２．４％、抗ＰＤ−Ｌ１は１３３．６％、抗ＣＴＬＡ−４は１０８％のがん細胞の死滅を誘発することが判明した。これに対し、前記の免疫抗がん剤とＭＧ７３１を併用処理した場合、抗ＰＤ１は２４３．２％、抗ＰＤ−Ｌ１は２２１．６％、抗ＣＴＬＡ−４は２１４．４％のがん細胞の死滅を誘発することが確認された。
【０１１６】
要するに、単独投与したときのがん細胞の死滅効果と比較して、併用投与したときにがん細胞の死滅効果の方がはるかに優れていることが分かる。
【０１１７】
［実施例１０］
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株と抗がん剤の併用投与に伴う腫瘍の増殖抑制効果（ｉｎ  ｖｉｖｏ実験）
腫瘍モデルを築くに先立ち、マウスに乳酸菌試料を２週間投与して腸内への定着力及び免疫力を高めた後、１群当たりにＣ５７ＢＬ／６マウス８匹の右側の尻部近くに２×１０5  ＭＣ３８がん細胞を皮下注射することにより、腫瘍誘発モデルを築いた。腫瘍細胞の注入と同時に、３週間（月曜日から土曜日にかけて）乳酸菌試料を前記動物モデルに経口投与した。投与した乳酸菌の試料は、１匹あたりにＣＦＵ１×１０9となるように２００μｌのＰＢＳに希釈して経口投与した。抗がん剤としてオキサリプラチン（３ｍｇ／ｋｇ，Ｓｅｌｌｅｋｃｈｅｍ）または抗ＰＤ１（２ｍｇ／ｋｇ，ＢｉｏＸＣｅｌｌ）をがん誘発後に毎週月曜日と木曜日に腹腔注射した。
【０１１８】
乳酸菌のみを処理した群、オキサリプラチンまたは抗ＰＤ１のみを処理した群、及び両方とも処理した群に対して腫瘍抑制効果を観察した後、図１４及び図１５に示す。
【０１１９】
図１４及び図１５に示すように、ＭＧ７３１を単独で投与した場合の方が、オキサリプラチンまたは抗ＰＤ１を単独で投与した場合よりも腫瘍抑制効果に優れており、ＭＧ７３１をオキサリプラチンまたは抗ＰＤ１と併用投与した場合には、腫瘍抑制効果がさらに優れていることを確認した。
【０１２０】
［実施例１１］
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株と抗がん剤の併用投与に伴う抗腫瘍免疫反応の増進効果（ｉｎ  ｖｉｖｏ実験）
前記実施例１０の結果を踏まえて、腫瘍内に浸透した免疫細胞の分布を確認するために、ＦＡＣｓ実験を行うべく、次のような動物実験を行った。
【０１２１】
実施例１０の方法と同様にして、腫瘍誘発モデルを築き、乳酸菌試料及び抗がん剤を投与した後、腫瘍と脾臓を分離してマウスの免疫細胞の分布度を確認すべく組織を破砕して免疫細胞を分離した。分離された免疫細胞は、各機能に応じた免疫細胞のマーカーに相当する蛍光抗体を用いて反応させた後、ＦＡＣｓ装備を用いて確認した。前記実験結果は、図１６と図１７に示す。
【０１２２】
図１６及び図１７に示すように、ＭＧ７３１を投与したグループにおいて抗がん免疫反応に重要な機能を示すＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、ＣＤ８エフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）Ｔ細胞の分布が対照群であるＩｇＧもしくはＰＢＳに比べて１．５〜２倍以上増加したことを確認し、Ｔ細胞の機能を調節する制御性Ｔ細胞の数は著しく減ったことが分かる。
【０１２３】
また、ＭＧ７３１と抗がん剤が併用投与されたグループにおいては、抗がん剤を単独で投与したグループよりもＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、ＣＤ８エフェクターＴ細胞の分布が有意的に増加し、Ｔ細胞の機能を調節する制御性Ｔ細胞の数は有意的に減った結果から、ＭＧ７３１が抗がん剤と併用投与されると、抗がん剤を単独処理したときよりも抗腫瘍免疫反応がはるかに増加することが分かる。
【０１２４】
前記の結果から、ＭＧ７３１による免疫細胞機能の調節が腫瘍増殖の抑制にも影響を及ぼすことが分かる。
【０１２５】
［実施例１２］
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株の分離及び同定
ＧＥＮ３０３３菌株を分離するために、年齢４１才の健常人の女性から糞便を供された。寄せ集めた新鮮な糞便試料約４ｇをＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）溶液８０ｍｌに添加してボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）した後、再懸濁（ｒｅ−ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）した。均質化されたサンプルは、同じ溶液に１０倍ずつ連続して希釈し、これらの中で、１０-5、１０-6、１０-7、１０-8倍希釈されたサンプル２００μｌを乳酸菌選択培地であるＤｅ  Ｍａｎ  Ｒｏｇｏｓａ，Ｓｈａｒｐｅ  ａｇａｒ（ＭＲＳブロス；Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ）培地に塗抹し、３７℃の温度下、かつ、好気性の条件下で４８時間培養した。固体培地において生成されたそれぞれのコロニーから増幅された１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（１．５ｋｂ）を、コロニーＰＣＲ方法を用いて取得した。ＰＣＲサンプルを精製した後、シーケンシングによって得られた各１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列をＮＣＢＩ  ｂｌａｓｔプログラムに代入して近縁種を探索した。
【０１２６】
これらの中で、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスストレイン（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ  ｓｔｒａｉｎ）４１ＭｏＱｕｅｓｉｌｌｏと高い類似度を有する菌株（１４４８／１４４８  ｂｐ，１００％）をＧＥＮ３０３３と命名し、純粋な分離のために固体培地においてコロニーの再画線培養（ｒｅｓｔｒｅａｋｉｎｇ）作業を６回行った後、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を再確認する作業を行った。選び抜かれたＧＥＮ３０３３菌株は、液体培養後に２０％のグリセロールを添加して−８０℃で凍結保管した。
【０１２７】
得られた菌株に対するｒＲＮＡの塩基配列を分析して配列番号２に示し、これを同定したところ、ＧＥＮ３０３３はラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）であることを確認した。前記ＧＥＮ３０３３菌株は、２０１８年１０月２５日付けで韓国生命工学研究院生物資源センターに受託番号ＫＣＴＣ１３６８４ＢＰとして寄託された。
【０１２８】
１．糖発酵特性の確認
ＧＥＮ３０３３菌株に対してＡＰＩＣＨＬキット（ＢｉｏＭｅｔｒｉｅｕｘ  Ｃｏ．Ｆｒａｎｃｅ）を用いて糖発酵特性を調べ、その結果を下記表１に示す。
【０１２９】
【表１】
2021522866.tif 000004
【０１３０】
２．酵素活性の確認
ＧＥＮ３０３３菌株の生化学的特性を調べるために、ＡＰＩＺＹＭキット（ＢｉｏＭｅｔｒｉｅｕｘ  Ｃｏ．Ｆｒａｎｃｅ）を用いて酵素活性特性を調べ、その結果を下記表２に示す。
【０１３１】
【表２】
2021522866.tif 000005
【０１３２】
［実施例１３］
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株の免疫細胞活性効果
ＧＥＮ３０３３の免疫活性を確認するために、メモリーＴ細胞の活性に伴うＩＦＮ−γの分泌の変化を下記の方法に従って実験した。
【０１３３】
Ｆｉｃｏｌｌを用いてヒトの血液からＰＢＭＣを分離した後、赤血球溶解緩衝液（ＲＢＣ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）で赤血球を除去し、ＬＳカラムとＭＡＣＳ緩衝液を用いて単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）を分離した。ＧＥＮ３０３３が分注された９６ウェルプレートに単球を１ウェルあたりに５×１０3となるように入れてＧＥＮ３０３３が単球をマクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）に分化させるように２時間かけて反応させた。
【０１３４】
単球とＧＥＮ３０３３とが反応をする間に、ＭＡＣＳ緩衝液とＬＳカラムを用いて余分のＰＢＭＣ細胞からＣＤ４及びＣＤ８が発現されるＴ細胞を分離し、前記分離されたＴ細胞は、５×１０4細胞となるように１００μｌのＲＰＭＩ培地で希釈して単球とＧＥＮ３０３３がある前記ウェルに分注した後、４８時間かけて免疫活性が起こるように培養した。所定の時間が経った後、各ウェルの細胞培養液を１．５ｍｌのチューブにすべて取り、上澄み液のみを分離して、ＩＦＮ−γの生成度を、ＥＬＩＳＡキットを用いて測定して、その結果を図１８に示す。
【０１３５】
図１８に示すように、単球及びＴ細胞しかないウェルはＩＦＮ−γが生成されないのに対し、Ｅ．ｃｏｌｉを反応させたウェルは５０ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを、ＧＥＮ３０３３を反応させたウェルは約２１０ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを生成することを確認した。
【０１３６】
すなわち、ＧＥＮ３０３３がマクロファージを活性化させることにより、メモリーＴ細胞を刺激してＩＦＮ−γの生成を誘導することを確認した。要するに、ＧＥＮ３０３３がメモリーＴ細胞の活性を著しく増加させて、優れた免疫活性を誘発するということが分かる。
【０１３７】
［実施例１４］
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３の抗腫瘍効果（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
ＧＥＮ３０３３が様々ながん細胞株において抗がん効能を示すか否かを確認するために、ヒト由来のがん細胞株１１種を用いてＣＣＫ−８アッセイを行った。
【０１３８】
がん細胞株を９６ウェルプレートに１〜５×１０3細胞／ウェルとなるように分注し、２４時間安定化させた後、破砕した乳酸菌試料を１％（１％＝４．９６５μｇ，ＢＣＡ分析を用いてエキスの濃度を測定する）で添加して７２時間培養し、ＣＣＫ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ，ＵＳＡ）を用いて確認したがん細胞生存率を下記表３に示す。
【０１３９】
【表３】
2021522866.tif 000006
【０１４０】
前記表３に示すように、がん細胞が有する特性に応じて、ＧＥＮ３０３３による細胞生存率の違いが現れるとはいえ、ＧＥＮ３０３３が処理されたすべての細胞株において未処理の対照群（１００％の細胞生存率）に比べて細胞生存率が減るという共通点を確認した。
【０１４１】
［実施例１５］
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株の腫瘍の増殖抑制効果（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
同種のマウス腫瘍モデルは、短時間で腫瘍が急速度で生じて腫瘍の壊死による正確な効能を確認することができないため、腫瘍モデルを築く前に２週間マウスに乳酸菌試料を投与してＧＥＮ３０３３の腸内への定着に伴う免疫活性を誘導した。
【０１４２】
次いで、２×１０5のＭＣ３８がん細胞株をマウスの右脚に皮下注射して腫瘍の移植を行い、この後にも、３週間（月曜日から土曜日にかけて）乳酸菌試料を前記動物モデルに経口投与し、投与した乳酸菌の試料は、１匹あたりにＣＦＵ  １×１０9となるように２００μｌのＰＢＳに希釈した。次いで、マウスにおける腫瘍の大きさを測定して、これを図１９に示す。
【０１４３】
図１９に示すように、陰性対照群であるＰＢＳを投与したグループは、時間が経つにつれて、腫瘍が高速で増加するのに対し、ＧＥＮ３０３３を投与したグループは、前記対照群と比較して、腫瘍の増殖速度が著しく減ることを確認することができた。要するに、ＧＥＮ３０３３が抗腫瘍治療効果を示すことが分かる。
【０１４４】
［実施例１６］
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株の免疫因子の発現効果
マクロファージと樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）が刺激を受けてＴ細胞の活性化を引き起こすＩＬ−１５とＩＬ−７を分泌する。従って、前記実施例１４のマウスの大腸と腫瘍組織から、Ｔ細胞の活性を引き起こすＩＬ−１５とＩＬ−７の発現を、ｑＰＣＲを用いて確認した。その結果を図２０及び図２１に示す。
【０１４５】
図２０及び図２１に示すように、ＧＥＮ３０３３を投与したグループのマウスにおいては、腫瘍と大腸組織の両方ともにおいてＩＬ−１５とＩＬ−７の発現が陰性対照群よりも増加することを確認した。
【０１４６】
また、腫瘍よりも大腸組織の方において免疫因子の発現がさらに高く現れることを確認することができ、これは、腸内に定着したＧＥＮ３０３３が大腸組織の免疫細胞を活性化させ、腫瘍微細環境内の免疫細胞の浸透に関与することを裏付けている。
【０１４７】
［実施例１７］
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株と免疫抗がん剤の併用投与
ＧＥＮ３０３３と免疫抗がん剤である抗ＰＤ１を併用投与したとき、腫瘍の増殖抑制効果を確認するために、次のようにして実験を行った。
【０１４８】
実施例１４の腫瘍モデルを対象として、抗ＰＤ１及びＧＥＮ３０３３に対する陰性対照群としてＩｇＧ（腹腔投与）とＰＢＳ（経口投与）を投与したグループ、ＧＥＮ３０３３を投与したグループ、抗ＰＤ１を投与したグループ、抗ＰＤ１とＧＥＮ３０３３を併用投与したグループに分けてその効能を確認し、抗ＰＤ１（２ｍｇ／ｋｇ，ＢｉｏＸＣｅｌｌ）をがん誘発後に３、７、１０、１４、１７、２１日目に腹腔注射した。各実験群に対する腫瘍の増殖速度を図２２に示す。
【０１４９】
図２２に示すように、ＧＥＮ３０３３を投与したグループと抗ＰＤ１を投与したグループは、陰性対照群と比較して腫瘍の増殖速度が減少したことを確認した。なお、抗ＰＤ１及びＧＥＮ３０３３を併用投与したグループの腫瘍の増殖速度は、それぞれの単独投与グループと比較して増殖速度がさらに減少したことを確認した。
【０１５０】
要するに、ＧＥＮ３０３３は、単独で腫瘍増殖を抑えるだけではなく、抗ＰＤ１と併用投与した場合、抗ＰＤ１を単独投与した場合に比べてはるかに高い腫瘍の増殖抑制効果を示すことが分かる。
【０１５１】
［実施例１８］
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３の代謝物の調節
乳酸菌は、腸内への定着により、消化器官において分解される飲食物の分解と吸収を助けて体内の各臓器へ栄養分を供給する。従って、ＧＥＮ３０３３による代謝物の変化を確認するために、実施例１６の腫瘍モデルにおいて確保したマウスの血清を次のような方法に従って分析した。
【０１５２】
ＧＥＮ３０３３を投与したマウスの血清内に存在する代謝物を分析するために、Ｃｏｒｔｅｘ  Ｃ１８＋（２．１ｍｍ×１００ｍｍ，２．７μｍ）カラムから構成されたＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム（ＤＩＯＮＥＸ  ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００，Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用い、カラムにおいて分離された物質を検出するために、Ｔｒｉｐｌｅ  ＴＯＦ  ５６００＋（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ，ＵＳＡ）を用いた。移動相として０．１％ギ酸水溶液と０．１％のギ酸アセトニトリルを用い、全てのサンプルに対しては、２種類のイオン転移に対して分析する多重反応モニタリング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ；ＭＲＭ）モードで分析を行い、その結果を図２３から図２５に示す。
【０１５３】
図２３に示すように、対照群と比較して、ＧＥＮ３０３３を投与した群は、ピセアタンノール４’−ガロイルグルコシド（Ｐｉｃｅａｔａｎｎｏｌ  ４’−ｇａｌｌｏｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）、ガングリオシドＧＭ３、ペルラクトン（Ｐｅｒｕｌａｃｔｏｎｅ）、オクチルオクタノエート（Ｏｃｔｙｌ  ｏｃｔａｎｏａｔｅ）が著しく増加することを確認した。
【０１５４】
図２４に示すように、抗ＰＤ１を投与した群の場合、対照群と比較して、ペルラクトン、ピセアタンノール４’−ガロイルグルコシド、オクチルオクタノエート、ピロカテコールサルフェート（Ｐｙｒｏｃａｔｅｃｈｏｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）、ガングリオシドＧＭ３が増加する様相を示す。
【０１５５】
また、図２５に示すように、ＧＥＮ３０３３と抗ＰＤ１を併用投与した群の場合、対照群と比較して、ペルラクトン、ガングリオシドＧＭ３、ピセアタンノール４’−ガロイルグルコシド、オクチルオクタノエートが同様に増加する様相を示す。また、ＧＥＮ３０３３を単独投与した群と比較して、アラキドノイルチオホスホリルコリン、ＰＣ  １６：０／２２：６が増加することを確認した。なお、抗ＰＤ１を単独投与した群と比較して、ドデシルサルフェート、アラキドノイルチオホスホリルコリン、ＰＣ  １６：０／２２：６が増加することを確認した。
【０１５６】
さらに、ステロイドの一種であるペルラクトン、食品添加物として主として用いられるジュバニンＣ（Ｊｕｂａｎｉｎｅ  Ｃ）、ピセアタンノール４’−ガロイルグルコシド、オクチルオクタノエートの場合、対照群と比較して、ＧＥＮ３０３３を単独投与した群、抗ＰＤ１を単独投与した群、ＧＥＮ３０３３と抗ＰＤ１を併用投与した群において同様に高く測定された。
【０１５７】
特に、ガングリオシドＧＭ３は、抗ＰＤ１を単独投与した群と比較して、ＧＥＮ３０３３を単独投与した群及びＧＥＮ３０３３と抗ＰＤ１を併用投与した群において格段に増加することを確認した。
【０１５８】
ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）１８：１及び２０：４の場合、ＧＥＮ３０３３を単独投与した群（対照群に比べて１．３２倍）とＧＥＮ３０３３と抗ＰＤ１を併用投与した群において増加したが、前記ＰＩ  ２０：４は、マクロファージを活性化させて免疫反応を調節するのに寄与することが知られている。また、健常人と比較して、がん患者において前記ＰＩ  １８：１、ＰＩ  ２０：４、ＰＩ  ２０：２の３種類のホスファチジルイノシトールの血中含量が低く現れることが報告されている。従って、前記ホスファチジルイノシトールは、健常人とがん患者とを区別する重要なバイオマーカーとなり得る。アラキドノイルチオホスホリルコリンとＰＣ  １６：０／２２：６は、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）に属する代謝物であり、炎症反応のような刺激が起こる場合、コリン代謝に異常が生じて細胞膜の損傷が引き起こされることにより、リン脂質の数値の減少が起こるため、このようなアラキドノイルチオホスホリルコリン及びＰＣ  １６：０／２２：６の減少は、細胞膜の損傷と炎症反応を示すマーカーであることが知られている。
【０１５９】
図２５に示すように、ＧＥＮ３０３３と抗ＰＤ１を併用投与した場合、対照群に比べて、アラキドノイルチオホスホリルコリン及びＰＣ  １６：０／２２：６の数値が著しく増加し、これは、ＧＥＮ３０３３と抗ＰＤ１の併用投与が細胞内の炎症反応を緩和させることを意味する。
【０１６０】
このような代謝物の分析により、ＧＥＮ３０３３の腸内への定着に伴う代謝物の変化が免疫反応及び抗がん効能に重要な作用をすることが分かる。
【０１６１】
［実施例１９］
免疫抗がん剤耐性肺がんモデルにおけるラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株の腫瘍の増殖抑制効果（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
実施例１７における結果を踏まえて、免疫抗がん剤が効く大腸がんモデルにおいてＧＥＮ３０３３と免疫抗がん剤である抗ＰＤ１を併用投与したとき、腫瘍の増殖抑制効果を向上させたことを確認した。これに基づいて、免疫抗がん剤に耐性がある肺がんモデルにおいても、ＧＥＮ３０３３及び抗ＰＤ１を併用投与したときに抗がん効能が向上するか否かを確認するために、下記の実験を行った。
【０１６２】
ＬＬＣ１肺がんを移植した腫瘍モデルを対象として、実施例１７において行った方法と同様にして試験を行った。抗ＰＤ１及びＧＥＮ３０３３に対する陰性対照群としてＩｇＧ（腹腔投与）とＰＢＳ（経口投与）を投与したグループ、ＧＥＮ３０３３を投与したグループ、抗ＰＤ１を投与したグループ、抗ＰＤ１及びＧＥＮ３０３３を併用投与したグループに分けてその効能を確認した。抗ＰＤ１（２ｍｇ／ｋｇ，ＢｉｏＸＣｅｌｌ）をがん誘発後に１０、１４、１７、２１、２３日目に腹腔注射した。各実験群に対する腫瘍の増殖速度を測定して図２６に示す。
【０１６３】
図２６に示すように、ＧＥＮ３０３３を投与したグループと抗ＰＤ１を投与したグループは、陰性対照群と比較して腫瘍の増殖速度が減少したことを確認した。また、抗ＰＤ１及びＧＥＮ３０３３を併用投与したグループの腫瘍の増殖速度は、それぞれの単独投与グループと比較して増殖速度がさらに減少したことを確認した。
【０１６４】
要するに、免疫抗がん剤に耐性がある肺がんモデルにおいても、ＧＥＮ３０３３は単独で腫瘍の増殖を抑えるだけではなく、抗ＰＤ１と併用投与した場合、抗ＰＤ１を単独投与した場合に比べてはるかに高い腫瘍の増殖抑制効果を示すことが分かる。
【０１６５】
［実施例２０］
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３と化学抗がん剤または免疫抗がん剤の併用投与に伴う効能の確認
ＧＥＮ３０３３が、抗ＰＤ１以外の化学抗がん剤または免疫抗がん剤との併用処理においても抗腫瘍効果が著しく増加するか否かをさらに確認するために、下記の実験を行った。
【０１６６】
化学抗がん剤としては、シスプラチン、オキサリプラチン、５−Ｆｕ、シクロホスファミド、パクリタキセルを用い、大腸がん細胞株であるＨＣＴ１１６において各濃度の抗がん剤と０．５％濃度のＧＥＮ３０３３を併用投与したときの細胞生存率を確認した結果を図２７から図３１に示す。
【０１６７】
図２７に示すように、シスプラチン７μＭを単独処理した場合に比べて、ＧＥＮ３０３３を併用処理した場合に、細胞生存率が著しく減ることが分かる。また、図２８から図３１に示すように、ＨＣＴ１１６において９０％以上の細胞生存率を示す各濃度のオキサリプラチン、５−Ｆｕ、シクロホスファミド及びパクリタキセルを単独処理した場合に比べて、ＧＥＮ３０３３を併用処理した場合にがん細胞の死滅がはるかに高く現れることが確認された。
【０１６８】
すなわち、ＧＥＮ３０３３は、化学抗がん剤の併用投与に当たってがん細胞生存率を著しく減少させて、さらに高い抗がん効果を有することが分かる。
【０１６９】
また、他の免疫抗がん剤である抗ＰＤＬ１との併用処理による免疫細胞の活性及びそれに伴う腫瘍細胞の生存率の低下を確認するために、下記の実験を行った。マウスの脾臓と骨髄からＰＢＭＣ及びＴ細胞を分離し、ＰＢＭＣは、ＧＥＮ３０３３との反応によってマクロファージの分化を誘導した後、Ｔ細胞の活性を刺激した。活性化された免疫細胞の上澄み液を分離して抗ＰＤＬ１とともにＭＣ３８腫瘍細胞に入れ、２４時間反応させた後、ＭＣ３８の生存率をＦＡＣｓ装備で確認した。その結果を図３２に示す。
【０１７０】
図３２に示すように、免疫抗がん剤を処理しなくても、ＧＥＮ３０３３との反応に応じて、がん細胞株の生存率が１２．８２％、２２．０２％減ったことを確認した。また、抗ＰＤＬ１（１ｍｇ／ｍＬ）の単独によりがん細胞株の生存率が１８．３３％減ったのに対し、抗ＰＤＬ１（１ｍｇ／ｍＬ）とＧＥＮ３０３３を併用処理したときにがん細胞株の生存率が２５．４４％、４１．２３％減ったことを確認した。そのことから、抗ＰＤ１の他に、抗ＰＤＬ１などの他の免疫抗がん剤との併用投与においてもＧＥＮ３０３３が優れた抗がん効能を有することを確認することができる。
【０１７１】
［実施例２１］
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株と免疫抗がん剤の併用投与に伴う抗腫瘍増進効果（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験）
ヒトの血液からＦｉｃｏｌｌを用いてＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ）を収集した後、赤血球溶解緩衝液（ＲＢＣ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いて赤血球を除去して生きている細胞の数を数えて乳酸菌（３×１０5／５０μｌ／ウェル）が入っている丸底の９６ウェルプレートにウェルごとにＰＢＭＣ  ３×１０4細胞／５０μｌずつ添加して２４時間培養した。
【０１７２】
結腸がん細胞株ＨＣＴ１１６は、ＦＢＳ非含有ＲＰＭＩ培地において５μＭのＣＦＳＥ（Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）と混合し、３７℃で５分間反応させた後、ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ  １６４０培地を添加し、１０分間アイスで保管した。上澄み液を遠心分離により除去した後、得られた細胞に１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ  １６４０と混合した後、細胞の数を数えて前記用意した９６ウェルプレートのウェルごとに３×１０4個／１００μｌずつ添加した。
【０１７３】
次いで、がん細胞が添加されたウェルごとに各抗体ＰＤ１（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ，Ａ２００５，Ｓｅｌｌｅｃｋｅｍ）、ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ，Ａ２００４，Ｓｅｌｌｅｃｋｅｍ）、ＣＴＬＡ−４（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ，Ａ２００１，Ｓｅｌｌｅｃｋｅｍ）を２０〜３０μｇ／ｍＬの濃度範囲内で処理し、２４時間かけて培養した後、ＰＢＭＣ及びがん細胞株の混合物において溶菌された細胞を確認するために７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で細胞を染色した。ＦＡＣＳＤｉＶａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＣＦＳＥ及び７−ＡＡＤに対する染色を測定することにより、がん細胞株へのＰＢＭＣの細胞溶解能を確認して図３３に示す。
【０１７４】
図３３に示すように、ＰＢＭＣによるがん細胞死滅（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を１００％としたとき、ＧＥＮ０３３３単独によるがん細胞死滅（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）は１０７．０％増加、臨床に用いられている免疫抗がん剤である抗ＰＤ１は１１３．９％、抗ＰＤ−Ｌ１は１２３．５％、抗ＣＴＬＡ−４は１１６．０％のがん細胞死滅を引き起こすことが示された。これに対し、前記免疫抗がん剤とＧＥＮ３０３３を併用処理した場合、抗ＰＤ１は１５６．７％、抗ＰＤ−Ｌ１は１５４．０％、抗ＣＴＬＡ−４は１２８．３％のがん細胞死滅を引き起こすことが確認された。
【０１７５】
要するに、単独処理したときのがん細胞死滅効果と比較して、併用処理したときのがん細胞死滅効果の方が著しく増加することが分かる。
【０１７６】
［受託番号］
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）
寄託機関名：韓国生命工学研究院生物資源センター
受託番号：ＫＣＴＣ１３４５２ＢＰ
受託日：２０１８年１月４日
【０１７７】
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）
寄託機関名：韓国生命工学研究院生物資源センター
受託番号：ＫＣＴＣ１３６８４ＢＰ
受託日：２０１８年１０月２５日
【０１７８】
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【０１７９】
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【０１８０】
2021522866.tif 000009
【０１８１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2021522866.tif 000014
【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2021522866.tif 000033
【図２２】
2021522866.tif 000034
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年1月19日(2021.1.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株（ＫＣＴＣ１３４５２ＢＰ）。
【請求項２】
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株（ＫＣＴＣ１３４５２ＢＰ）を含む、がんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項３】
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株（ＫＣＴＣ１３４５２ＢＰ）を含み、前記ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株が、抗がん、抗炎症、抗酸化及び免疫増進効果を示すことを特徴とする、がんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項４】
前記がんは、黒色腫、扁平細胞癌腫、乳がん、頭頚部がん、甲状腺がん、軟部組織肉腫、骨肉腫、精巣がん、前立腺がん、卵巣がん、膀胱がん、皮膚がん、脳腫瘍、血管肉腫、肥滿細胞腫、白血病、リンパ腫、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、胃がん、腎臓がん、大腸がん、造血器腫瘍、神経芽細胞腫、類表皮癌腫及びその転移がんからなる群から選ばれるいずれか一種以上であることを特徴とする、請求項２に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項５】
前記がんは、肺がん、大腸がん、胃がん、乳がん及び肝臓がんからなる群から選ばれるいずれか一種以上であることを特徴とする、請求項２に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項６】
前記ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株が、がん細胞の移動性を低下させることにより、抗がん効果を示すことを特徴とする、請求項２に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項７】
前記ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株が、血管増殖因子であるＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、Ａｎｇ１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ１）及びＡｎｇ２（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ２）の発現を抑えることにより、抗がん効果を示すことを特徴とする、請求項２に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項８】
前記ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株が、ＴＮＦ−αの発現を抑えることを特徴とする、請求項３に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項９】
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株（ＫＣＴＣ１３４５２ＢＰ）を含み、化学抗がん剤または免疫抗がん剤をさらに含むことを特徴とする、がんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項１０】
前記化学抗がん剤は、オキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、ペメトレキセド（Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）及びドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）からなる群からいずれか一種以上が選ばれることを特徴とする、請求項９に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項１１】
前記免疫抗がん剤は、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ、抗Ｔｉｍ３及び抗ＬＡＧ３からなる群からいずれか一種以上が選ばれることを特徴とする、請求項９に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項１２】
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株と化学抗がん剤または免疫抗がん剤は、単一の剤形として同時に投与されるか、あるいは、別個の剤形として同時または逐次に投与されることを特徴とする、請求項９に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項１３】
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株（ＫＣＴＣ１３４５２ＢＰ）を含む、がんの予防または改善のための食品組成物。
【請求項１４】
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株（ＫＣＴＣ１３４５２ＢＰ）を含む、がんの予防または改善のための動物用の飼料組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2021522866.tif 000057
【図１１】
2021522866.tif 000058
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんを予防または治療する上で優れた効果を奏する新規なビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株及びラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株に関する。
【０００２】
具体的に、本発明の新規なビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、がん細胞の増殖を抑える効果を奏するだけではなく、がん細胞の移動性を低下させ、血管新生に関与する遺伝子の発現を調節する効果をも併せ持つことにより、従来のビフィドバクテリウム・ビフィダム菌株に比べて格段に優れた効果を奏する。のみならず、本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、抗炎症、抗酸化及び免疫増強効果を奏する。
【０００３】
また、本発明の新規なラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、がん細胞そのものの増殖を抑える効果を奏するだけではなく、免疫活性を増進させて従来のラクトコッカス・ラクティス菌株に比べて格段に優れた効果を奏する。具体的に、本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、腸内定着過程において抗がん効能を有する代謝産物を分泌することで優れた抗がん効果を奏する。
【背景技術】
【０００４】
人体の腸は、多種多様な細菌の共生により、飲食物の消化による栄養素を吸収し、かつ、体内の不要な物質を対外に排出する重要な機能を有する。また、腸内細菌による環境の変化は、腸の免疫にも直接的につながり、これは、結果的に、体内免疫力にも影響を及ぼす。このような腸内の健康に有益であると言われている微生物への研究がこの数年間にわたって次から次へと行われてきており、これに伴い、乳酸菌の腸機能、免疫力及び体内代謝活動への関与に関する研究結果が全世界的に盛んに発表されている。生きている微生物体といわれるプロバイオティックス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）は、消化器官内の不釣り合いを改善し、有害菌を抑える他、自然防御効果を強化させて体内免疫反応を向上させる機能をする。これまで、腸の免疫機能の向上のためのプロバイオティックスの機能に対する研究は、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などを用いて種（ｓｐｅｃｉｅｓ）と属（ｇｅｎｕｓ）の分類学的な形態に応じて行われてきた。
【０００５】
乳酸菌に対する研究は、１９００年代にメチニコフ（Ｍｅｃｈｎｉｋｏｖ）が乳酸菌による寿命延長効果を発表したことをきっかけに始まり、１９４６年にストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）とセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎ）を、骨肉腫（Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）患者を対象として腫瘍内に直接的に注入したときに一部の患者に腫瘍の治療反応が現れることに基づいて、乳酸菌による抗がん治療に対する研究が本格的に行われ、多くの前臨床研究がこれまでも盛んに行われている。
【０００６】
２０１６年にＥｌ−Ｎｅｚａｍｉ研究チームは、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧ，Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７及び熱処理を施したＶＳＬ＃３を一定の割合にて混ぜ合わせてマウス同種腫瘍モデルに経口投与したとき、抗がん剤であるシスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）に比べて血管新生過程の抑制による抗がん効果が発揮されることを判明させた。なお、抗がん剤を投与したグループは、抗がん剤の毒性によるマウスの体重減少が現れたのに対し、プロバイオティックスを投与したグループではマウスの体重減少が現れないことを立証することにより、プロバイオティックスが抗がん治療剤としての機能を有し得ることを立証した。但し、前記研究において用いられたプロバイオティックスは、複数種の複合微生物が含有されているものであり、微生物の一つ一つへの機能的な研究については、未だ十分に行われていないのが現状である。
【０００７】
がん（癌）は、通常の細胞とは異なり、細胞の増殖能力が無限であり、その増殖速度もまた速い他、がん細胞を囲んでいる血管、リンパ管及び繊維芽細胞などを用いて腫瘍微細環境を形成して、他の組織への転移及び通常の細胞の機能の喪失などを引き起こすことにより死に至らせる恐ろしい疾病の一つである。
【０００８】
このようながんを治療すべく、全世界の研究員らががん細胞の細胞内信号機序及び転移、薬物の副作用などに関する様々な主題について数多くの研究を行っており、毎年新薬が開発されて大勢のがん患者に治療効果を期待させる臨床試験が行われている。
【０００９】
手術による腫瘍組織の除去と放射線治療の他に、抗がん治療に用いられている現在の抗がん剤は、各がん種に応じて異ならせて適用している。一般に、がん患者に処方されている化学抗がん剤は、がん細胞を標的とするものではないため、がん細胞を殺す効果を有してはいるものの、正常細胞にも影響を及ぼして患者に脱毛、下痢、発熱、免疫力の低下などの副作用が生じている。その後、がんに関する遺伝的な研究などに基づいて、各がん種において生じる遺伝変異をターゲットとする標的抗がん剤が開発されて従来の化学抗がん剤により生じる副作用は大幅に改善されたものの、環境への適応が非常に早いがん細胞が標的抗がん剤の攻撃から逃げるために抗がん剤耐性を引き起こしてしまい、その結果、標的抗がん剤による持続的ながん治療効果を１００％期待することができないという不具合がある。
【００１０】
最近には、抗がん剤と腫瘍微細環境に対する研究が盛んに行われており、これに伴い、抗がん効果は保ちながらも、患者の免疫力を調節する様々な免疫関門抑制剤に対する免疫抗がん剤が開発されて患者に治療剤として用いられている。中でも、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１に対する治療は、皮膚がん、肺がんなどの患者に高い治療反応を示すことが知られている。このような免疫抗がん剤は、腫瘍微細環境下において免疫細胞の機能を調節することにより、がん細胞の増殖の抑制及び免疫細胞の活性を高める機能を有している。しかしながら、免疫抗がん剤もまた、すべての患者に同じ抗がん効果を示すことはできず、免疫抗がん剤に対するバイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）がはっきりと判明しておらず、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ遺伝子変異による抗がん剤耐性が生じたり、抗体合成物の特性による自己免疫疾患を招いたりする虞があり、高価な治療費用が生じるなどの不具合が存在する。
【００１１】
これらの研究結果に基づいて、本発明者らは、実質的にがん患者に治療効果の改善を示し得る微生物に対する研究を行っており、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株とラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株のそれぞれががん細胞の増殖の抑制などに優れた効果を示すことを見出すことにより、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、抗がん及び抗炎症効果を示すプロバイオティックスまたはそのエキスを新規な抗がん剤、炎症性疾患治療剤または免疫疾患治療剤などの開発に活用するためのものである。
【００１３】
従って、本発明の一つの目的は、優れたがんの予防または治療効果を奏するビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株を含むがんの予防または治療のための薬学組成物を提供することである。
【００１５】
また、本発明は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株を含むがんの予防または改善するための食品組成物または動物用の飼料組成物を提供することを目的とする。
【００１６】
さらに、本発明は、優れたがんの予防または治療効果を奏する新規なラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株を提供することを目的とする。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株を含むがんの予防または治療のための薬学組成物を提供することである。
【００１８】
さらにまた、本発明は、ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株を含むがんの予防または改善するための食品組成物または動物用の飼料組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
前記諸目的を達成するために、本発明は、新規なビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株を提供する。前記菌株は、２０１８年１月４日付けで韓国生命工学研究院生物資源センターに受託番号ＫＣＴＣ１３４５２ＢＰとして寄託された。
【００２０】
また、本発明は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株を含むがんの予防または治療のための薬学組成物を提供する。具体的に、前記ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、菌株そのもの、菌株の培養液、または菌株を破砕して得られた細胞質分画物（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）を含むものを意味することができる。
【００２１】
本発明は、有効量のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株をがんの予防または治療を必要とする対象体（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与することを含む、前記対象体においてがんを予防または治療する方法を提供する。本発明における「対象体」には、ヒト及び非ヒト動物が含まれる。非ヒト動物には、哺乳類、非哺乳類などのあらゆる脊椎動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ウマなどが含まれる。なお、本発明は、がんの予防または治療のためのビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株の用途を提供する。
【００２２】
特に、本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、抗がん、抗炎症、抗酸化及び免疫増進効果をいずれも示すことを特徴とする。
【００２３】
本発明において、がんは、黒色腫、扁平細胞癌腫、乳がん、頭頚部がん、甲状腺がん、軟部組織肉腫、骨肉腫、精巣がん、前立腺がん、卵巣がん、膀胱がん、皮膚がん、脳腫瘍、血管肉腫、肥滿細胞腫、白血病、リンパ腫、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、胃がん、腎臓がん、大腸がん、造血器腫瘍、神経芽細胞腫、類表皮癌腫またはその転移がんであってもよく、これに制限されない。好ましくは、本発明において、がんは、肺がん、大腸がん、胃がん、乳がんまたは肝臓がんであってもよい。
【００２４】
本発明において、炎症性疾患は、骨関節炎、関節リウマチ、痛風、強直性脊椎炎、腱炎、腱膜炎、リウマチ熱、ループス、線維筋痛、乾癬性関節炎、喘息、アトピー、クローン病または潰瘍性大腸炎であってもよく、これに制限されない。
【００２５】
本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、がん細胞の増殖を阻害し、がん細胞の移動性を低下させることにより、抗がん効果を示すことができる。また、本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、血管増殖因子であるＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、Ａｎｇ１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ１）、Ａｎｇ２（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ２）の発現を抑えることにより、抗がん効果を示すことができる。
【００２６】
また、本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株がＴＮＦ−αの発現を抑えることにより、抗炎症または抗がん効果を示すことができる。ＴＮＦ−αは、人体内感染、外傷、敗血症、関節リウマチなどのような慢性または急性の炎症反応時に免疫細胞から分泌されるサイトカインであり、ＴＮＦ−αの濃度が高くなると、細胞内脂質及び糖代謝過程に損傷を与えてしまう。ＴＮＦ−αは、細胞の壊死を誘導するサイトカインであることが知られているが、持続的なＴＮＦ−αの刺激が細胞に伝わると、むしろ細胞内代謝に及ぼした影響により腫瘍形成遺伝子が発生し、細胞の異常な増殖が生じることにより、がんの誘発を促してしまうという研究結果が報告されている。
【００２７】
本発明は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株、及び化学抗がん剤または免疫抗がん剤を含むことを特徴とする、がんの予防または治療のための薬学組成物に関する。また、本発明は、有効量のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株を化学抗がん剤または免疫抗がん剤と併用して、がんの予防または治療を必要とする対象体に投与することを含む、前記対象体においてがんを予防または治療する方法を提供する。
【００２８】
前記化学抗がん剤は、オキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、ペメトレキセド（Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）であってもよいが、これに制限されない。
【００２９】
さらに、前記免疫抗がん剤は、免疫関門抑制機能を有する抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ、抗Ｔｉｍ３、抗ＬＡＧ３であってもよいが、これに制限されない。
【００３０】
本発明において、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株、及び化学抗がん剤または免疫抗がん剤は、逐次または同時に、これを必要とする患者に投与されてもよい。
【００３１】
さらにまた、本発明は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）菌株を含むがんの予防または改善のための食品組成物または動物用の飼料組成物に関する。
【００３２】
前記食品組成物は、保健機能食品、乳製品、発酵製品または食品添加物であってもよく、これに制限されない。
【００３３】
本発明は、新規なラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株を提供する。前記ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、２０１８年１０月２５日付けで韓国生命工学研究院生物資源センターに受託番号ＫＣＴＣ１３６８４ＢＰとして寄託された。
【００３４】
また、本発明は、ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株を含むがんの予防または治療のための薬学組成物を提供する。具体的に、前記ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株は、菌株そのもの、菌株の培養液、または菌株を破砕して得た細胞質分画物（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）を含んでいてもよい。
【００３５】
本発明は、有効量のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株をがんの予防または治療を必要とする対象体（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与することを含む、前記対象体においてがんを予防または治療する方法を提供する。なお、本発明は、がんの予防または治療のためのラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株の用途を提供する。
【００３６】
特に、本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、抗がん効果及び免疫増進効果を両方とも示すことを特徴とする。
【００３７】
前記がんは、黒色腫、扁平細胞癌腫、乳がん、頭頚部がん、甲状腺がん、軟部組織肉腫、骨肉腫、精巣がん、前立腺がん、卵巣がん、膀胱がん、皮膚がん、脳腫瘍、血管肉腫、肥滿細胞腫、白血病、リンパ腫、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、胃がん、腎臓がん、大腸がん、造血器腫瘍、神経芽細胞腫、類表皮癌腫またはその転移がんであってもよく、これに制限されない。
【００３８】
本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、がん細胞の増殖を直接的に阻害し、免疫細胞を活性化させることにより、抗がん効果を示すことができる。なお、本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、腸内への定着に伴い、代謝産物を調節することにより、抗がん効果を示すことができる。
【００３９】
具体的に、本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、ガングリオシドＧＭ３（Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ＧＭ３；ｍｏｎｏｓｉａｌｏｄｉｈｅｘｏｓｙｌｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）を増加させることができる。ガングリオシドＧＭ３は、下記の一般式Ｉの構造を有する化合物であって、［（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−｛［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−２−｛［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−６−｛［（２Ｓ，３Ｒ）−２−ｄｏｃｏｓａｎａｍｉｄｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｄｅｃｙｌ］ｏｘｙ｝−４，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｏｘａｎ−３−ｙｌ］ｏｘｙ｝−３，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−６−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｏｘａｎ−４−ｙｌ］ｏｘｙ｝−５−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−［（１Ｒ，２Ｒ）−１，２，３−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ］ｏｘａｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ］である。
【００４０】
【化１】
2021522866.tif 000077
…Ｉ
【００４１】
スフィンゴ糖脂質（Ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ）の一つであるガングリオシドＧＭ３は、細胞膜の構成成分であり、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を抑えることにより、血管新生を防ぎ、リンパ球のアラキドン酸カスケード（Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｃａｓｃａｄｅ）を調節することにより、免疫作用の調節を通じて抗がん効能を示すことが知られている。さらに、ガングリオシドＧＭ３は、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）を処理した場合、がん細胞においてアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）をさらに増加させることが知られている。
【００４２】
従って、本発明は、前記ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株がガングリオシドＧＭ３を増加させることを特徴とする、がんの予防または治療のための薬学組成物に関する。
【００４３】
また、本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、メモリーＴ細胞の活性に伴うＩＦＮ−γの生成を増加させ、Ｔ細胞の活性化を引き起こすＩＬ−１５とＩＬ−７の発現を増加させることにより、抗がん及び免疫増強効果を示すことができる。
【００４４】
従って、本発明は、前記ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株がＩＦＮ−γの生成を増加させることを特徴とする、がんの予防または治療のための薬学組成物に関する。
【００４５】
さらに、本発明は、前記ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株がＩＬ−１５またはＩＬ−７の発現を増加させることを特徴とする、がんの予防または治療のための薬学組成物に関する。
【００４６】
本発明は、ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株、及び化学抗がん剤または免疫抗がん剤を含むことを特徴とする、がんの予防または治療のための薬学組成物に関する。また、本発明は、有効量のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株を化学抗がん剤または免疫抗がん剤と併用して、がんの予防または治療を必要とする対象体に投与することを含む、前記対象体においてがんを予防または治療する方法を提供する。
【００４７】
前記化学抗がん剤は、オキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、ペメトレキセド（Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）などであってもよいが、これに制限されない。
【００４８】
さらにまた、前記免疫抗がん剤は、免疫関門の抑制機能を有する抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ、抗Ｔｉｍ３、抗ＬＡＧ３免疫抗がん剤であってもよいが、これに制限されない。
【００４９】
本発明において、ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株、及び化学抗がん剤または免疫抗がん剤は、逐次または同時に、これを必要とする患者に投与されてもよい。
【００５０】
また、本発明は、ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株を含むがんの予防または改善のための食品組成物または動物用の飼料組成物に関する。
【００５１】
前記食品組成物は、保健機能食品、乳製品、発酵製品または食品添加物であってもよく、これに制限されない。
【発明の効果】
【００５２】
本発明の新規なビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、様々ながん細胞株に対して増殖抑制効果を奏する。また、本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、がん細胞の移動性を減少させ、血管新生を抑える効果もまた併せ持つことにより、従来知られている他のビフィドバクテリウム・ビフィダムに比べて格段に優れた効果を奏する。
【００５３】
また、本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、抗炎症、抗酸化または免疫増強効果を奏することにより、炎症疾患または免疫疾患にも用いられ得る。
【００５４】
特に、本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、単独で投与したときに優れた抗がん効果を示すだけではなく、化学抗がん剤または免疫抗がん剤と併用して投与したときに、これらを単独で投与したときに比べて格段に優れた抗がん効果を奏する。
【００５５】
本発明の新規なラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、様々ながん細胞株に対して増殖を抑える効果を奏するだけではなく、免疫活性を示して、従来のラクトコッカス・ラクティス菌株に比べて格段に優れた効果を奏する。
【００５６】
特に、本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、単独で投与したときに優れた抗がん効果を示すだけではなく、化学抗がん剤または免疫抗がん剤と併用して投与したときに、これらを単独で投与したときに比べて格段に優れた抗がん効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ヒト由来のがん細胞株において、ＭＧ７３１の処理に伴う細胞増殖の抑制をグラフで示す図である。
【図２Ａ】ＭＧ７３１によるがん細胞株の移動性低下を示す結果である。
【図２Ｂ】ＭＧ７３１によるがん細胞株の移動性低下を示す結果である。
【図３】ＭＧ７３１が血管新生に関わる因子であるＶＥＧＦの発現を阻害したことを示す図である。
【図４Ａ】ＶＥＧＦ以外の血管新生に関わる因子であるＡｎｇ１、Ａｎｇ２の発現を阻害したＭＧ７３１の効能を確認した結果である。
【図４Ｂ】ＶＥＧＦ以外の血管新生に関わる因子であるＡｎｇ１、Ａｎｇ２の発現を阻害したＭＧ７３１の効能を確認した結果である。
【図５】ＭＧ７３１がＬＰＳによる炎症反応誘発因子のうち、ＴＮＦ−αの発現を阻害したことを示す図である。
【図６】ＭＧ７３１の濃度別の処理に伴う活性酸素種の減少を示す図である。
【図７】化学抗がん剤（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ、Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）とＭＧ７３１の併用処理に伴うがん細胞の増殖抑制効果を示す結果である。
【図８】図７において染色された細胞を脱染色化し、がん細胞の増殖抑制効果を数値化して示す図である。
【図９】ヒトの血液とがん細胞株を用いたＭＧ７３１と免疫抗がん剤（抗ＰＤ１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ４）の併用処理に伴うがん細胞死滅の効能を示す図である。
【図１０】マウス同種移植モデルを用いた化学抗がん剤（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）とＭＧ７３１の併用投与に伴う腫瘍の増殖抑制効果を示す図である。
【図１１】マウス同種移植モデルを用いた免疫抗がん剤（抗ＰＤ１）とＭＧ７３１の併用投与に伴う腫瘍の増殖抑制効果を示す図である。
【図１２】化学抗がん剤（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）とＭＧ７３１の併用投与に伴う、マウス同種移植モデルの腫瘍組織内に浸透した免疫細胞の分布を分析した図である。
【図１３】免疫抗がん剤（抗ＰＤ１）とＭＧ７３１の併用投与に伴う、マウス同種移植モデルの腫瘍組織内に浸透した免疫細胞の分布を分析した図である。
【図１４】ＧＥＮ３０３３菌株による免疫活性のバイオマーカーでＩＦＮ−γの生成の増加効果を確認した図である。
【図１５】マウス腫瘍モデルにＧＥＮ３０３３菌株を投与して腫瘍の増殖抑制効果を確認した図である。
【図１６】ＧＥＮ３０３３菌株を投与したマウス腫瘍モデルの大腸と腫瘍組織におけるＩＬ−１５の発現を測定した結果である。
【図１７】ＧＥＮ３０３３菌株を投与したマウス腫瘍モデルの大腸と腫瘍組織におけるＩＬ−７の発現を測定した図である。
【図１８】マウス大腸がんモデルにＧＥＮ３０３３菌株を投与した場合、免疫抗がん剤（抗ＰＤ１）を投与した場合及びこれらを併用投与した場合における腫瘍の増殖抑制効果を示す図である。
【図１９】ＧＥＮ３０３３菌株と免疫抗がん剤（抗ＰＤ１）を単独投与、またはこれらを併用投与したマウスの血清における代謝産物を分析した結果を示す図である。
【図２０】ＧＥＮ３０３３菌株と免疫抗がん剤（抗ＰＤ１）を単独投与、またはこれらを併用投与したマウスの血清における代謝産物を分析した結果を示す図である。
【図２１】ＧＥＮ３０３３菌株と免疫抗がん剤（抗ＰＤ１）を単独投与、またはこれらを併用投与したマウスの血清における代謝産物を分析した結果を示す図である。
【図２２】マウス肺がんモデルへの免疫抗がん剤（抗ＰＤ１）とＧＥＮ３０３３の併用投与に伴う腫瘍の増殖抑制効果を示す図である。
【図２３】がん細胞株に対するＧＥＮ３０３３菌株と化学抗がん剤（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ、５−Ｆｕ、Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）の併用処理に伴うがん細胞の死滅効能を示す図である。
【図２４】がん細胞株に対するＧＥＮ３０３３菌株と化学抗がん剤（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ、５−Ｆｕ、Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）の併用処理に伴うがん細胞の死滅効能を示す図である。
【図２５】がん細胞株に対するＧＥＮ３０３３菌株と化学抗がん剤（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ、５−Ｆｕ、Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）の併用処理に伴うがん細胞の死滅効能を示す図である。
【図２６】がん細胞株に対するＧＥＮ３０３３菌株と化学抗がん剤（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ、５−Ｆｕ、Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）の併用処理に伴うがん細胞の死滅効能を示す図である。
【図２７】がん細胞株に対するＧＥＮ３０３３菌株と化学抗がん剤（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ、５−Ｆｕ、Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）の併用処理に伴うがん細胞の死滅効能を示す図である。
【図２８】マウスの血液とがん細胞株とを用いた、ＧＥＮ３０３３菌株と免疫抗がん剤（抗ＰＤＬ１）のがん細胞の死滅効能を示す図である。
【図２９】ヒトの血液とがん細胞株を用いた、ＧＥＮ３０３３と免疫抗がん剤（抗ＰＤ１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ４）の併用処理に伴うがん細胞の死滅効能を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本発明者らは、優れた抗がん治療または予防効果を有するプロバイオティックスを探るために研究した結果、新規なビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株及びラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株が優れた抗がん効果を奏することを見出して本発明を完成するに至った。
【００５９】
驚くべきことに、ＭＧ７３１菌株は、肺がん、大腸がん、胃がん、乳がん及び肝臓がんなどの様々ながん細胞株に対して優れたがん細胞の増殖抑制効果を奏する。
【００６０】
また、がん細胞株にＭＧ７３１菌株を処理した場合、がん細胞の移動性が格段に低下する。がん細胞は、正常細胞とは異なり、たとえ細胞に損傷が生じたとしても、増殖しながら移動するという特徴があり、がん細胞の移動性が減少することは、がん転移の可能性が低くなることを意味するため、ＭＧ７３１菌株は、がん転移の抑制効果を奏する。
【００６１】
さらに、ＭＧ７３１菌株は、血管の生成に関わる主な因子であるＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、Ａｎｇ１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ１）及びＡｎｇ２（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ２）の発現をいずれも抑えることができる。血管新生は、がん細胞の特徴の一つであり、これを抑えて血管を介したがん細胞への栄養分の供給を阻害することにより、がん細胞の増殖を抑えることができる。
【００６２】
炎症性疾患においてはっきりと現れる様相の一つは、活性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ；ＲＯＳ）の増加である。中間ほどの活性酸素種の濃度は、細胞信号伝達系統の調節により効果を発揮するが、実際に高い濃度の活性酸素種に長時間晒されると、タンパク質、脂質及び核酸に非特異的な損傷を招いてしまう。活性酸素種は、タンパク質リン酸化、イオンチャンネル及び転写因子の酸化還元調節などといった正常的な生理的過程において重要な役割を果たし、甲状腺ホルモンの生成及び細胞外基質の架橋結合をはじめとする生合成過程にも主な機能を有している。なお、ほとんどのがん細胞においてもこのような活性酸素種が高い活性を有することにより、異常な細胞の増殖を引き起こすことが広く知られている。従って、本発明のＭＧ７３１菌株は、活性酸素種を減少させてがん細胞の増殖を抑え、色々な疾病の発病を予防する効果を奏する。
【００６３】
また、本発明のＭＧ７３１菌株が腫瘍細胞の増殖を抑える機能を有する細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ（ＣＤ８＋  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ））及びＮＫ細胞（Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ）を腫瘍組織内にさらに多く浸透するように誘導し、細胞傷害性Ｔ細胞の機能を阻害する制御性Ｔ細胞（Ｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ）の数を減らすことにより、免疫細胞の機能を調節し、優れた抗がん効果を示す。
【００６４】
様々ながん細胞株にＭＧ７３１菌株、及び公知の化学抗がん剤または免疫抗がん剤をそれぞれ別々に処理したり併用処理したりする場合、ＭＧ７３１が処理されたがん細胞株は、抗がん剤が処理されたがん細胞株よりも優れた細胞の増殖抑制効果を有し、ＭＧ７３１及び抗がん剤と併用処理されたがん細胞株は、ＭＧ７３１または抗がん剤のみが処理されたがん細胞株よりも優れた細胞の増殖抑制効果を有することから、ＭＧ７３１は、従来の抗がん剤と併用投与したときにさらに高い抗がん効果を有する。
【００６５】
従って、本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、がん細胞の増殖抑制、がん細胞の移動性の低下及び血管新生の抑制効果を同時に示して優れた抗がん剤として活用されることが可能であり、従来の化学抗がん剤または免疫抗がん剤と併用投与されてもよい。
【００６６】
本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株は、前記化学抗がん剤または免疫抗がん剤と単一の製剤として同時に投与され得るか、あるいは、別個の製剤として同時または逐次に投与されてもよい。
【００６７】
また、炎症誘発因子であるＬＰＳにより誘導されたＴＮＦ−αの発現を各段に減少させて、ＭＧ７３１菌株は、炎症性疾患及びがんを同時に予防または治療することができる。
【００６８】
本発明は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株を体内に投与してがん、炎症性疾患、免疫疾患などを予防または治療する方法を提供する。
【００６９】
本発明のビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株を含む組成物は、医薬品、保健機能食品、乳製品、発酵製品、食品添加物または動物用の飼料などに使用可能である。
【００７０】
さらに、本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、様々ながん細胞株に対して優れた増殖抑制効果を奏する。
【００７１】
本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株を処理した場合、がん細胞の増殖が直接的に低下し、メモリーＴ細胞の活性に伴うＩＦＮ−γの生成が増加し、Ｔ細胞の活性化を引き起こすＩＬ−１５とＩＬ−７の発現が増加することにより、抗がん及び免疫増強効果が奏される。
【００７２】
さらにまた、本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、腸内への定着に伴い代謝産物を調節することにより、抗がん効果を示す。特に、ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、ＶＥＧＦを抑えることにより、血管新生を防ぎ、リンパ球のアラキドン酸カスケードを調節することにより、免疫作用の調節によって抗がん効能を示すと知られているガングリオシドＧＭ３を増加させて優れた抗がん効果を示すことができる。また、ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、マクロファージ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）を活性化させて免疫反応を調節するホスファチジルイノシトール（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ；ＰＩ）１８：１及び２０：４を増加させる。さらに、ＧＥＮ３０３３の単独投与または免疫抗がん剤の単独投与で、細胞膜の損傷と炎症反応を示すマーカーとして知られているアラキドノイルチオホスホリルコリン（Ａｒａｃｈｉｄｏｎｏｙｌｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）及びＰＣ１６：０／２２：６には影響を及ぼさないが、ＧＥＮ３０３３及び免疫抗がん剤を併用投与したときにアラキドノイルチオホスホリルコリン及びＰＣ１６：０／２２：６を増加させて抗がん効能を示す。
【００７３】
様々ながん細胞株にＧＥＮ３０３３菌株、及び公知の化学抗がん剤または免疫抗がん剤をそれぞれ別々に処理したり併用処理したりする場合、ＧＥＮ３０３３が抗がん剤と併用処理されたがん細胞株は、ＧＥＮ３０３３または抗がん剤のみが処理されたがん細胞株よりもなお一層優れた細胞の増殖抑制効果を奏することから、ＧＥＮ３０３３は、従来の抗がん剤と併用投与したときにさらに高い抗がん効果を示す。
【００７４】
従って、本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、がん細胞の増殖抑制効果と免疫増進効果を同時に示して、優れた抗がん剤として活用されることが可能になり、従来の化学抗がん剤または免疫抗がん剤と併用投与されてもよい。
【００７５】
本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株は、前記化学抗がん剤または免疫抗がん剤と単一の製剤として同時に投与されてもよく、あるいは、別個の製剤として同時または逐次に投与されてもよい。
【００７６】
本発明は、ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株を体内に投与してがん、炎症性疾患、免疫疾患などを予防または治療する方法を提供する。
【００７７】
本発明のラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株を含む組成物は、医薬品、保健機能食品、乳製品、発酵製品、食品添加物または動物用の飼料などに使用可能である。
【００７８】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７９】
［実施例２］
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１の分離及び培養
ＭＧ７３１は、健康な乳児の糞便からビフィドバクテリウム種（ｓｐｐ．）に対する選択培地を用いて菌株を分離した。
【００８０】
寄せ集めた糞便試料を０．８５％ＮａＣｌに１０倍段階希釈して５０ｍｇ／Ｌのリチウムムピロシン（Ｌｉｔｈｉｕｍ  ｍｕｐｉｒｏｃｉｎ）を添加したＴＯＳ−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ  ａｇａｒ（ＭｅｒｃｋＫ  ＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に塗抹し、３７℃の温度で４８時間かけて嫌気培養した後、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）の形状が互いに異なる菌株を選び抜いた。選び抜かれた菌株は、ＢＬブロス（ｂｒｏｔｈ）において継代培養した後、２０％のグリセロールが含有されているＢＬブロスにおいて−８０℃で凍結保管した。
【００８１】
得られた菌株に対するｒＲＮＡの塩基配列を分析して配列番号１に示し、これを同定したところ、ＭＧ７３１は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）であることを確認した。前記ＭＧ７３１菌株は、２０１８年１月４日付けで韓国生命工学研究院生物資源センターに受託番号ＫＣＴＣ１３４５２ＢＰとして寄託された。
【００８２】
この実験において用いようとするビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１をＭＲＳブロス（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ）に接種し、３７℃及び嫌気性の条件下で培養しながら乳酸菌の増殖がＯＤ＝１となるときに培養を終了した。培養終了した培養物は、遠心分離によって菌体を回収し、回収された菌体はＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳに懸濁して超音波粉砕方法で菌体を粉砕した。粉砕された菌体は、遠心分離によって上澄み液を得て０．４２μｍのフィルターを介してろ過することにより、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１のエキスを製造した。
【００８３】
［実施例３］
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株の腫瘍の増殖抑制効果
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１が様々ながん細胞株において抗がん効能を示すか否かを確認するために、ヒト由来のがん細胞株を用いてＭＴＴアッセイを行った。
【００８４】
ＭＴＴアッセイに用いられたがん細胞株としては、肺がん（Ａ５４９、Ｈ１９７５、ＨＣＣ８２７、Ｈ１２９９、ＳＷ９００）、大腸がん（ＨＣＴ１１６、ＬｏＶｏ、ＳＮＵ−Ｃ２Ａ、ＳＮＵ−Ｃ１、Ｃｏｌｏ２０５）、胃がん（ＳＮＵ２１６、ＡＧＳ、ＭＫＮ−２８、ＭＫＮ−１、ＳＮＵ−６０１、ＳＮＵ−１）、乳がん（Ｈｓ５７８Ｔ、ＢＴ２０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ７）、肝臓がん（ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ）であり、合計で５種類のがん種を用いて実験を行った。
【００８５】
がん細胞株を９６ウェルプレートに１〜５×１０3細胞／ウェルになるように分注し、２４時間後に乳酸菌試料を１％（１％＝１２．１４７μｇ，ＢＣＡ分析によってエキスの濃度を測定する）で添加して７２時間かけて培養した後、それぞれのウェルにＭＴＴ（３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ  ｔｈｉａｚｏｌｙｌ  ｂｌｕｅ）試薬を処理して２時間かけて反応させた。
【００８６】
次いで、生きている細胞のミトコンドリアに反応して黄色のＭＴＴが紫色に変わる過程を経た。それから、ＭＴＴが入っている培養液はすべて除去し、１００μｌのＤＭＳＯを各ウェルに添加して紫色の濃度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）装備を用いて５４０ｎｍの吸光度において測定し、ヒト由来のがん細胞株に対する実験結果を図１に示す。
【００８７】
［実施例４］
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株のがん細胞の移動性の低下効果
がん細胞は、正常細胞とは異なり、たとえ細胞に損傷が生じたとしても、増殖しながら移動するという特徴があるため、ＭＧ７３１菌株によりがん細胞の移動性が低下するか否かを確認するために、創傷治癒アッセイ（Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）を行った。Ａ５４９（５×１０5細胞）及びＨＣＴ１１６（６×１０5細胞）菌株を６ウェルプレートに付着して細胞が９０〜９５％増殖した状態になると、チップ（ｔｉｐ）を用いて一定の間隔にて細胞に損傷を加えた。ＰＢＳまたはＭＧ７３１菌株を２４時間かけて処理して細胞の移動性の有無を顕微鏡で観察し、その結果を図２に示す。
【００８８】
図２に示すように、細胞に損傷を加えたＡ５４９（図２Ａ）とＨＣＴ１１６（図２Ｂ）細胞株の０時間帯の細胞の状態を基準としたとき、２４時間後に、Ａ５４９は６５．３１±１．６９％、ＨＣＴ１１６は３３．８２±５．８６％だけがん細胞の移動性が盛んに示されたのに対し、ＭＧ７３１を処理したＡ５４９とＨＣＴ１１６においてはそれぞれ４２．５９±４．０１％及び２２．６３±３．１１％であって、細胞の移動性が低下することを確認することができた。
【００８９】
要するに、ＭＧ７３１菌株は、がん転移を抑えて、優れた抗がん効果を奏することが分かる。
【００９０】
［実施例５］
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株の血管新生抑制効果
がん細胞の特徴の一つである血管新生過程をＭＧ７３１菌株が抑えるか否かを確認するために、血管新生に関わる因子に対する発現試験を下記のようにして行った。
【００９１】
ＨＣＴ１１６細胞株にＭＧ７３１を２４時間処理した後、ＲＮＡを得てｃＤＮＡを合成し、これを用いて、血管増殖因子であるＶＥＧＦの発現は通常のＰＣＲを、Ａｎｇ１とＡｎｇ２の発現はリアルタイムＰＣＲを用いて確認し、その結果を図３及び図４にそれぞれ示す。
【００９２】
図３に示すように、ＭＧ７３１の処理群において、対照群に比べてＶＥＧＦの１２１アイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）及び１６５アイソフォームの発現が著しく減ったことを確認した。
【００９３】
また、図４に示すように、ＶＥＧＦの他にも、血管新生に関与する因子Ａｎｇ１（図４Ａ）及びＡｎｇ２（図４Ｂ）の発現を比較したとき、Ａｎｇ１とＡｎｇ２の発現は、ＭＧ７３１の処理群において、対照群と比較したときに発現率が７０％以上著しく低下したことを確認した。
【００９４】
要するに、ＭＧ７３１が血管新生を抑えて血管を介したがん細胞への栄養分の供給を阻害することにより、異常ながん細胞の増殖抑制に優れた効果を奏することが分かる。
【００９５】
［実施例６］
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株の抗炎症効果
ＭＧ７３１菌株の抗炎症効果を確認するために、マウス大食細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞にＭＧ７３１菌株を１８時間処理した後、炎症誘発因子であるＬＰＳ１００ｎｇ／ｍｌを６時間処理してＲＮＡを得た。
【００９６】
前記ＲＮＡ１μｇでｃＤＮＡを合成し、これによって、炎症因子として知られているＴＮＦ−αの発現有無を、リアルタイムＰＣＲを用いて確認し、その結果を図５に示す。
【００９７】
図５に示すように、ＬＰＳによりＴＮＦ−αの発現が増加した度合いを相対指数１としたとき、ＭＧ７３１を処理した群は、ＴＮＦ−αの発現が増加した度合いが０．５以下であることを確認した。ＴＮＦ−αは、がんを誘発する因子としても知られているため、ＭＧ７３１によりＴＮＦ−αの発現が著しく減ったことから、ＭＧ７３１が抗炎症及び抗がん機能を併せ持つことが分かる。
【００９８】
［実施例７］
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株の抗酸化活性効果
ＭＧ７３１の抗酸化活性を確認するために、Ａ５４９がん細胞株にＭＧ７３１を２４時間処理した後、Ｈ2Ｏ2  ０．５μＭを４時間処理し、ＤＣＦＤＡ蛍光染料を用いてＦＡＣｓ装備で細胞内の活性酸素の量を測定し、その結果を図６に示す。
【００９９】
図６に示すように、ＰＢＳのみを処理した群は、４．６６％の活性酸素の量を示し、Ｈ2Ｏ2のみを処理した群は６４．８％であって、活性酸素が増加したことが分かる。これに対し、０．１、０．５、１％のＭＧ７３１をそれぞれ処理した群は、活性酸素の量が５７．８％、３９．３％及び３２．５％に減った。従って、ＭＧ７３１が活性酸素の量を減少させる効果を示し、ＭＧ７３１の濃度が高くなると、活性酸素を阻害する効果もまた増加することを確認した。
【０１００】
要するに、前記実験結果から、ＭＧ７３１は抗酸化効果を奏することが分かる。すなわち、正常細胞では、活性酸素による細胞の損傷を保護する役割を果たすことができ、がん細胞では、異常な活性酸素の濃度を減少させてミトコンドリアの異常な機能を制御する役割を果たすことができる。
【０１０１】
［実施例８］
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株と抗がん剤の併用処理に伴うがん細胞の増殖抑制効果（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験）
Ａ５４９、ＨＣＴ１１６において、ＭＧ７３１と抗がん剤の併用処理に伴うがん細胞の増殖抑制実験を行った。抗がん剤として、オキサリプラチンまたはペメトレキセドを用いて、下記の方法に従って実験を行った。
【０１０２】
前記２種類のがん細胞株を６ウェルプレートの各ウェルに１〜２×１０3となるように希釈した後に分注して２４時間かけて付着した後、乳酸菌と抗がん剤をウェルごとに処理し、２〜３日おきに培地を交換しながら７日間細胞の増殖を誘導した。
【０１０３】
プレートを４％のホルマリンで３０分間処理して細胞を固定して細胞の増殖を止めた後、２回のＰＢＳによる洗浄過程を経てクリスタルバイオレット（Ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ）溶液で５分間染色した後、蒸留水で洗浄して細胞の増殖有無を観察した。その結果を図７に示す。
【０１０４】
図７に示すように、ＭＧ７３１菌株と抗がん剤を併用処理したがん細胞株において、ＭＧ７３１または抗がん剤のみを処理したがん細胞株よりもさらに優れた細胞の増殖抑制効果が現れることが分かる。
【０１０５】
また、染色された細胞のコロニーに対する数値は、酢酸でクリスタルバイオレットを溶かしてマイクロプレートリーダー機器を用いて濃度を測定し、その結果を図８に示す。図８においても、図７と同じ効果が現れることを確認した。
【０１０６】
［実施例９］
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株と免疫抗がん剤の併用投与に伴う抗腫瘍増進効果（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験）
ヒトの血液からＦｉｃｏｌｌを用いてＰＢＭＣ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ）を収集した後、赤血球溶解緩衝液（ＲＢＣ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いて赤血球を除去して生きている細胞の数を数えて乳酸菌（６×１０5／５０μｌ／ウェル）が入っている丸底の９６ウェルプレートにウェルごとにＰＢＭＣ  ３×１０4細胞／５０μｌずつ添加して２４時間培養した。
【０１０７】
結腸がん細胞株ＨＣＴ１１６は、ＦＢＳが含まれていないＲＰＭＩ培地において５μＭのＣＦＳＥ（Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）と混合し、３７℃で５分間反応させた後、ＦＢＳを含んでいるＲＰＭＩ  １６４０培地を添加し、１０分間アイス（ｉｃｅ）で保管した。上澄み液を遠心分離により除去した後、得られた細胞に１０％ＦＢＳが含有されているＲＰＭＩ  １６４０と混合した後、細胞の数を数えて前記用意した９６ウェルプレートのウェルごとに３×１０4個／１００μｌずつ添加した。
【０１０８】
次いで、がん細胞が添加されたウェルごとに各抗体ＰＤ１（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ，Ａ２００５，Ｓｅｌｌｅｃｋｅｍ）、ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ，Ａ２００４，Ｓｅｌｌｅｃｋｅｍ）、ＣＴＬＡ−４（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ，Ａ２００１，Ｓｅｌｌｅｃｋｅｍ）を２０〜３０μｇ／ｍＬの濃度範囲内で処理し、２４時間かけて培養した後、ＰＢＭＣ及びがん細胞株の混合物において溶菌された細胞を確認するために、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で細胞を染色した。ＦＡＣＳＤｉＶａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＣＦＳＥ及び７−ＡＡＤに対する染色を測定することにより、がん細胞株へのＰＢＭＣの細胞溶解能を確認してその結果を図９に示す。
【０１０９】
ＰＢＭＣによるがん細胞死滅（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を１００％としたとき、ＭＧ７３１単独によるがん細胞死滅（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）は２０４．４％増加、臨床に用いられている免疫抗がん剤である抗ＰＤ１は１２２．４％、抗ＰＤ−Ｌ１は１３３．６％、抗ＣＴＬＡ−４は１０８％のがん細胞の死滅を誘発することが判明した。これに対し、前記の免疫抗がん剤とＭＧ７３１を併用処理した場合、抗ＰＤ１は２４３．２％、抗ＰＤ−Ｌ１は２２１．６％、抗ＣＴＬＡ−４は２１４．４％のがん細胞の死滅を誘発することが確認された。
【０１１０】
要するに、単独投与したときのがん細胞の死滅効果と比較して、併用投与したときにがん細胞の死滅効果の方がはるかに優れていることが分かる。
【０１１１】
［実施例１０］
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株と抗がん剤の併用投与に伴う腫瘍の増殖抑制効果（ｉｎ  ｖｉｖｏ実験）
腫瘍モデルを築くに先立ち、マウスに乳酸菌試料を２週間投与して腸内への定着力及び免疫力を高めた後、１群当たりにＣ５７ＢＬ／６マウス８匹の右側の尻部近くに２×１０5  ＭＣ３８がん細胞を皮下注射することにより、腫瘍誘発モデルを築いた。腫瘍細胞の注入と同時に、３週間（月曜日から土曜日にかけて）乳酸菌試料を前記動物モデルに経口投与した。投与した乳酸菌の試料は、１匹あたりにＣＦＵ１×１０9となるように２００μｌのＰＢＳに希釈して経口投与した。抗がん剤としてオキサリプラチン（３ｍｇ／ｋｇ，Ｓｅｌｌｅｋｃｈｅｍ）または抗ＰＤ１（２ｍｇ／ｋｇ，ＢｉｏＸＣｅｌｌ）をがん誘発後に毎週月曜日と木曜日に腹腔注射した。
【０１１２】
乳酸菌のみを処理した群、オキサリプラチンまたは抗ＰＤ１のみを処理した群、及び両方とも処理した群に対して腫瘍抑制効果を観察した後、図１０及び図１１に示す。
【０１１３】
図１０及び図１１に示すように、ＭＧ７３１を単独で投与した場合の方が、オキサリプラチンまたは抗ＰＤ１を単独で投与した場合よりも腫瘍抑制効果に優れており、ＭＧ７３１をオキサリプラチンまたは抗ＰＤ１と併用投与した場合には、腫瘍抑制効果がさらに優れていることを確認した。
【０１１４】
［実施例１１］
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１菌株と抗がん剤の併用投与に伴う抗腫瘍免疫反応の増進効果（ｉｎ  ｖｉｖｏ実験）
前記実施例１０の結果を踏まえて、腫瘍内に浸透した免疫細胞の分布を確認するために、ＦＡＣｓ実験を行うべく、次のような動物実験を行った。
【０１１５】
実施例１０の方法と同様にして、腫瘍誘発モデルを築き、乳酸菌試料及び抗がん剤を投与した後、腫瘍と脾臓を分離してマウスの免疫細胞の分布度を確認すべく組織を破砕して免疫細胞を分離した。分離された免疫細胞は、各機能に応じた免疫細胞のマーカーに相当する蛍光抗体を用いて反応させた後、ＦＡＣｓ装備を用いて確認した。前記実験結果は、図１２と図１３に示す。
【０１１６】
図１２及び図１３に示すように、ＭＧ７３１を投与したグループにおいて抗がん免疫反応に重要な機能を示すＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、ＣＤ８エフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）Ｔ細胞の分布が対照群であるＩｇＧもしくはＰＢＳに比べて１．５〜２倍以上増加したことを確認し、Ｔ細胞の機能を調節する制御性Ｔ細胞の数は著しく減ったことが分かる。
【０１１７】
また、ＭＧ７３１と抗がん剤が併用投与されたグループにおいては、抗がん剤を単独で投与したグループよりもＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、ＣＤ８エフェクターＴ細胞の分布が有意的に増加し、Ｔ細胞の機能を調節する制御性Ｔ細胞の数は有意的に減った結果から、ＭＧ７３１が抗がん剤と併用投与されると、抗がん剤を単独処理したときよりも抗腫瘍免疫反応がはるかに増加することが分かる。
【０１１８】
前記の結果から、ＭＧ７３１による免疫細胞機能の調節が腫瘍増殖の抑制にも影響を及ぼすことが分かる。
【０１１９】
［実施例１２］
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株の分離及び同定
ＧＥＮ３０３３菌株を分離するために、年齢４１才の健常人の女性から糞便を供された。寄せ集めた新鮮な糞便試料約４ｇをＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）溶液８０ｍｌに添加してボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）した後、再懸濁（ｒｅ−ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）した。均質化されたサンプルは、同じ溶液に１０倍ずつ連続して希釈し、これらの中で、１０-5、１０-6、１０-7、１０-8倍希釈されたサンプル２００μｌを乳酸菌選択培地であるＤｅ  Ｍａｎ  Ｒｏｇｏｓａ，Ｓｈａｒｐｅ  ａｇａｒ（ＭＲＳブロス；Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ）培地に塗抹し、３７℃の温度下、かつ、好気性の条件下で４８時間培養した。固体培地において生成されたそれぞれのコロニーから増幅された１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（１．５ｋｂ）を、コロニーＰＣＲ方法を用いて取得した。ＰＣＲサンプルを精製した後、シーケンシングによって得られた各１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列をＮＣＢＩ  ｂｌａｓｔプログラムに代入して近縁種を探索した。
【０１２０】
これらの中で、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスストレイン（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ  ｓｔｒａｉｎ）４１ＭｏＱｕｅｓｉｌｌｏと高い類似度を有する菌株（１４４８／１４４８  ｂｐ，１００％）をＧＥＮ３０３３と命名し、純粋な分離のために固体培地においてコロニーの再画線培養（ｒｅｓｔｒｅａｋｉｎｇ）作業を６回行った後、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を再確認する作業を行った。選び抜かれたＧＥＮ３０３３菌株は、液体培養後に２０％のグリセロールを添加して−８０℃で凍結保管した。
【０１２１】
得られた菌株に対するｒＲＮＡの塩基配列を分析して配列番号２に示し、これを同定したところ、ＧＥＮ３０３３はラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）であることを確認した。前記ＧＥＮ３０３３菌株は、２０１８年１０月２５日付けで韓国生命工学研究院生物資源センターに受託番号ＫＣＴＣ１３６８４ＢＰとして寄託された。
【０１２２】
１．糖発酵特性の確認
ＧＥＮ３０３３菌株に対してＡＰＩＣＨＬキット（ＢｉｏＭｅｔｒｉｅｕｘ  Ｃｏ．Ｆｒａｎｃｅ）を用いて糖発酵特性を調べ、その結果を下記表１に示す。
【０１２３】
【表１】
2021522866.tif 000078
【０１２４】
２．酵素活性の確認
ＧＥＮ３０３３菌株の生化学的特性を調べるために、ＡＰＩＺＹＭキット（ＢｉｏＭｅｔｒｉｅｕｘ  Ｃｏ．Ｆｒａｎｃｅ）を用いて酵素活性特性を調べ、その結果を下記表２に示す。
【０１２５】
【表２】
2021522866.tif 000079
【０１２６】
［実施例１３］
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株の免疫細胞活性効果
ＧＥＮ３０３３の免疫活性を確認するために、メモリーＴ細胞の活性に伴うＩＦＮ−γの分泌の変化を下記の方法に従って実験した。
【０１２７】
Ｆｉｃｏｌｌを用いてヒトの血液からＰＢＭＣを分離した後、赤血球溶解緩衝液（ＲＢＣ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）で赤血球を除去し、ＬＳカラムとＭＡＣＳ緩衝液を用いて単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）を分離した。ＧＥＮ３０３３が分注された９６ウェルプレートに単球を１ウェルあたりに５×１０3となるように入れてＧＥＮ３０３３が単球をマクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）に分化させるように２時間かけて反応させた。
【０１２８】
単球とＧＥＮ３０３３とが反応をする間に、ＭＡＣＳ緩衝液とＬＳカラムを用いて余分のＰＢＭＣ細胞からＣＤ４及びＣＤ８が発現されるＴ細胞を分離し、前記分離されたＴ細胞は、５×１０4細胞となるように１００μｌのＲＰＭＩ培地で希釈して単球とＧＥＮ３０３３がある前記ウェルに分注した後、４８時間かけて免疫活性が起こるように培養した。所定の時間が経った後、各ウェルの細胞培養液を１．５ｍｌのチューブにすべて取り、上澄み液のみを分離して、ＩＦＮ−γの生成度を、ＥＬＩＳＡキットを用いて測定して、その結果を図１４に示す。
【０１２９】
図１４に示すように、単球及びＴ細胞しかないウェルはＩＦＮ−γが生成されないのに対し、Ｅ．ｃｏｌｉを反応させたウェルは５０ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを、ＧＥＮ３０３３を反応させたウェルは約２１０ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを生成することを確認した。
【０１３０】
すなわち、ＧＥＮ３０３３がマクロファージを活性化させることにより、メモリーＴ細胞を刺激してＩＦＮ−γの生成を誘導することを確認した。要するに、ＧＥＮ３０３３がメモリーＴ細胞の活性を著しく増加させて、優れた免疫活性を誘発するということが分かる。
【０１３１】
［実施例１４］
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３の抗腫瘍効果（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
ＧＥＮ３０３３が様々ながん細胞株において抗がん効能を示すか否かを確認するために、ヒト由来のがん細胞株１１種を用いてＣＣＫ−８アッセイを行った。
【０１３２】
がん細胞株を９６ウェルプレートに１〜５×１０3細胞／ウェルとなるように分注し、２４時間安定化させた後、破砕した乳酸菌試料を１％（１％＝４．９６５μｇ，ＢＣＡ分析を用いてエキスの濃度を測定する）で添加して７２時間培養し、ＣＣＫ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ，ＵＳＡ）を用いて確認したがん細胞生存率を下記表３に示す。
【０１３３】
【表３】
2021522866.tif 000080
【０１３４】
前記表３に示すように、がん細胞が有する特性に応じて、ＧＥＮ３０３３による細胞生存率の違いが現れるとはいえ、ＧＥＮ３０３３が処理されたすべての細胞株において未処理の対照群（１００％の細胞生存率）に比べて細胞生存率が減るという共通点を確認した。
【０１３５】
［実施例１５］
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株の腫瘍の増殖抑制効果（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
同種のマウス腫瘍モデルは、短時間で腫瘍が急速度で生じて腫瘍の壊死による正確な効能を確認することができないため、腫瘍モデルを築く前に２週間マウスに乳酸菌試料を投与してＧＥＮ３０３３の腸内への定着に伴う免疫活性を誘導した。
【０１３６】
次いで、２×１０5のＭＣ３８がん細胞株をマウスの右脚に皮下注射して腫瘍の移植を行い、この後にも、３週間（月曜日から土曜日にかけて）乳酸菌試料を前記動物モデルに経口投与し、投与した乳酸菌の試料は、１匹あたりにＣＦＵ  １×１０9となるように２００μｌのＰＢＳに希釈した。次いで、マウスにおける腫瘍の大きさを測定して、これを図１５に示す。
【０１３７】
図１５に示すように、陰性対照群であるＰＢＳを投与したグループは、時間が経つにつれて、腫瘍が高速で増加するのに対し、ＧＥＮ３０３３を投与したグループは、前記対照群と比較して、腫瘍の増殖速度が著しく減ることを確認することができた。要するに、ＧＥＮ３０３３が抗腫瘍治療効果を示すことが分かる。
【０１３８】
［実施例１６］
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株の免疫因子の発現効果
マクロファージと樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）が刺激を受けてＴ細胞の活性化を引き起こすＩＬ−１５とＩＬ−７を分泌する。従って、前記実施例１４のマウスの大腸と腫瘍組織から、Ｔ細胞の活性を引き起こすＩＬ−１５とＩＬ−７の発現を、ｑＰＣＲを用いて確認した。その結果を図１６及び図１７に示す。
【０１３９】
図１６及び図１７に示すように、ＧＥＮ３０３３を投与したグループのマウスにおいては、腫瘍と大腸組織の両方ともにおいてＩＬ−１５とＩＬ−７の発現が陰性対照群よりも増加することを確認した。
【０１４０】
また、腫瘍よりも大腸組織の方において免疫因子の発現がさらに高く現れることを確認することができ、これは、腸内に定着したＧＥＮ３０３３が大腸組織の免疫細胞を活性化させ、腫瘍微細環境内の免疫細胞の浸透に関与することを裏付けている。
【０１４１】
［実施例１７］
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株と免疫抗がん剤の併用投与
ＧＥＮ３０３３と免疫抗がん剤である抗ＰＤ１を併用投与したとき、腫瘍の増殖抑制効果を確認するために、次のようにして実験を行った。
【０１４２】
実施例１４の腫瘍モデルを対象として、抗ＰＤ１及びＧＥＮ３０３３に対する陰性対照群としてＩｇＧ（腹腔投与）とＰＢＳ（経口投与）を投与したグループ、ＧＥＮ３０３３を投与したグループ、抗ＰＤ１を投与したグループ、抗ＰＤ１とＧＥＮ３０３３を併用投与したグループに分けてその効能を確認し、抗ＰＤ１（２ｍｇ／ｋｇ，ＢｉｏＸＣｅｌｌ）をがん誘発後に３、７、１０、１４、１７、２１日目に腹腔注射した。各実験群に対する腫瘍の増殖速度を図１８に示す。
【０１４３】
図１８に示すように、ＧＥＮ３０３３を投与したグループと抗ＰＤ１を投与したグループは、陰性対照群と比較して腫瘍の増殖速度が減少したことを確認した。なお、抗ＰＤ１及びＧＥＮ３０３３を併用投与したグループの腫瘍の増殖速度は、それぞれの単独投与グループと比較して増殖速度がさらに減少したことを確認した。
【０１４４】
要するに、ＧＥＮ３０３３は、単独で腫瘍増殖を抑えるだけではなく、抗ＰＤ１と併用投与した場合、抗ＰＤ１を単独投与した場合に比べてはるかに高い腫瘍の増殖抑制効果を示すことが分かる。
【０１４５】
［実施例１８］
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３の代謝物の調節
乳酸菌は、腸内への定着により、消化器官において分解される飲食物の分解と吸収を助けて体内の各臓器へ栄養分を供給する。従って、ＧＥＮ３０３３による代謝物の変化を確認するために、実施例１６の腫瘍モデルにおいて確保したマウスの血清を次のような方法に従って分析した。
【０１４６】
ＧＥＮ３０３３を投与したマウスの血清内に存在する代謝物を分析するために、Ｃｏｒｔｅｘ  Ｃ１８＋（２．１ｍｍ×１００ｍｍ，２．７μｍ）カラムから構成されたＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム（ＤＩＯＮＥＸ  ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００，Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用い、カラムにおいて分離された物質を検出するために、Ｔｒｉｐｌｅ  ＴＯＦ  ５６００＋（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ，ＵＳＡ）を用いた。移動相として０．１％ギ酸水溶液と０．１％のギ酸アセトニトリルを用い、全てのサンプルに対しては、２種類のイオン転移に対して分析する多重反応モニタリング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ；ＭＲＭ）モードで分析を行い、その結果を図１９から図２１に示す。
【０１４７】
図１９に示すように、対照群と比較して、ＧＥＮ３０３３を投与した群は、ピセアタンノール４’−ガロイルグルコシド（Ｐｉｃｅａｔａｎｎｏｌ  ４’−ｇａｌｌｏｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）、ガングリオシドＧＭ３、ペルラクトン（Ｐｅｒｕｌａｃｔｏｎｅ）、オクチルオクタノエート（Ｏｃｔｙｌ  ｏｃｔａｎｏａｔｅ）が著しく増加することを確認した。
【０１４８】
図２０に示すように、抗ＰＤ１を投与した群の場合、対照群と比較して、ペルラクトン、ピセアタンノール４’−ガロイルグルコシド、オクチルオクタノエート、ピロカテコールサルフェート（Ｐｙｒｏｃａｔｅｃｈｏｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）、ガングリオシドＧＭ３が増加する様相を示す。
【０１４９】
また、図２１に示すように、ＧＥＮ３０３３と抗ＰＤ１を併用投与した群の場合、対照群と比較して、ペルラクトン、ガングリオシドＧＭ３、ピセアタンノール４’−ガロイルグルコシド、オクチルオクタノエートが同様に増加する様相を示す。また、ＧＥＮ３０３３を単独投与した群と比較して、アラキドノイルチオホスホリルコリン、ＰＣ  １６：０／２２：６が増加することを確認した。なお、抗ＰＤ１を単独投与した群と比較して、ドデシルサルフェート、アラキドノイルチオホスホリルコリン、ＰＣ  １６：０／２２：６が増加することを確認した。
【０１５０】
さらに、ステロイドの一種であるペルラクトン、食品添加物として主として用いられるジュバニンＣ（Ｊｕｂａｎｉｎｅ  Ｃ）、ピセアタンノール４’−ガロイルグルコシド、オクチルオクタノエートの場合、対照群と比較して、ＧＥＮ３０３３を単独投与した群、抗ＰＤ１を単独投与した群、ＧＥＮ３０３３と抗ＰＤ１を併用投与した群において同様に高く測定された。
【０１５１】
特に、ガングリオシドＧＭ３は、抗ＰＤ１を単独投与した群と比較して、ＧＥＮ３０３３を単独投与した群及びＧＥＮ３０３３と抗ＰＤ１を併用投与した群において格段に増加することを確認した。
【０１５２】
ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）１８：１及び２０：４の場合、ＧＥＮ３０３３を単独投与した群（対照群に比べて１．３２倍）とＧＥＮ３０３３と抗ＰＤ１を併用投与した群において増加したが、前記ＰＩ  ２０：４は、マクロファージを活性化させて免疫反応を調節するのに寄与することが知られている。また、健常人と比較して、がん患者において前記ＰＩ  １８：１、ＰＩ  ２０：４、ＰＩ  ２０：２の３種類のホスファチジルイノシトールの血中含量が低く現れることが報告されている。従って、前記ホスファチジルイノシトールは、健常人とがん患者とを区別する重要なバイオマーカーとなり得る。アラキドノイルチオホスホリルコリンとＰＣ  １６：０／２２：６は、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）に属する代謝物であり、炎症反応のような刺激が起こる場合、コリン代謝に異常が生じて細胞膜の損傷が引き起こされることにより、リン脂質の数値の減少が起こるため、このようなアラキドノイルチオホスホリルコリン及びＰＣ  １６：０／２２：６の減少は、細胞膜の損傷と炎症反応を示すマーカーであることが知られている。
【０１５３】
図２１に示すように、ＧＥＮ３０３３と抗ＰＤ１を併用投与した場合、対照群に比べて、アラキドノイルチオホスホリルコリン及びＰＣ  １６：０／２２：６の数値が著しく増加し、これは、ＧＥＮ３０３３と抗ＰＤ１の併用投与が細胞内の炎症反応を緩和させることを意味する。
【０１５４】
このような代謝物の分析により、ＧＥＮ３０３３の腸内への定着に伴う代謝物の変化が免疫反応及び抗がん効能に重要な作用をすることが分かる。
【０１５５】
［実施例１９］
免疫抗がん剤耐性肺がんモデルにおけるラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株の腫瘍の増殖抑制効果（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
実施例１７における結果を踏まえて、免疫抗がん剤が効く大腸がんモデルにおいてＧＥＮ３０３３と免疫抗がん剤である抗ＰＤ１を併用投与したとき、腫瘍の増殖抑制効果を向上させたことを確認した。これに基づいて、免疫抗がん剤に耐性がある肺がんモデルにおいても、ＧＥＮ３０３３及び抗ＰＤ１を併用投与したときに抗がん効能が向上するか否かを確認するために、下記の実験を行った。
【０１５６】
ＬＬＣ１肺がんを移植した腫瘍モデルを対象として、実施例１７において行った方法と同様にして試験を行った。抗ＰＤ１及びＧＥＮ３０３３に対する陰性対照群としてＩｇＧ（腹腔投与）とＰＢＳ（経口投与）を投与したグループ、ＧＥＮ３０３３を投与したグループ、抗ＰＤ１を投与したグループ、抗ＰＤ１及びＧＥＮ３０３３を併用投与したグループに分けてその効能を確認した。抗ＰＤ１（２ｍｇ／ｋｇ，ＢｉｏＸＣｅｌｌ）をがん誘発後に１０、１４、１７、２１、２３日目に腹腔注射した。各実験群に対する腫瘍の増殖速度を測定して図２２に示す。
【０１５７】
図２２に示すように、ＧＥＮ３０３３を投与したグループと抗ＰＤ１を投与したグループは、陰性対照群と比較して腫瘍の増殖速度が減少したことを確認した。また、抗ＰＤ１及びＧＥＮ３０３３を併用投与したグループの腫瘍の増殖速度は、それぞれの単独投与グループと比較して増殖速度がさらに減少したことを確認した。
【０１５８】
要するに、免疫抗がん剤に耐性がある肺がんモデルにおいても、ＧＥＮ３０３３は単独で腫瘍の増殖を抑えるだけではなく、抗ＰＤ１と併用投与した場合、抗ＰＤ１を単独投与した場合に比べてはるかに高い腫瘍の増殖抑制効果を示すことが分かる。
【０１５９】
［実施例２０］
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３と化学抗がん剤または免疫抗がん剤の併用投与に伴う効能の確認
ＧＥＮ３０３３が、抗ＰＤ１以外の化学抗がん剤または免疫抗がん剤との併用処理においても抗腫瘍効果が著しく増加するか否かをさらに確認するために、下記の実験を行った。
【０１６０】
化学抗がん剤としては、シスプラチン、オキサリプラチン、５−Ｆｕ、シクロホスファミド、パクリタキセルを用い、大腸がん細胞株であるＨＣＴ１１６において各濃度の抗がん剤と０．５％濃度のＧＥＮ３０３３を併用投与したときの細胞生存率を確認した結果を図２３から図２７に示す。
【０１６１】
図２３に示すように、シスプラチン７μＭを単独処理した場合に比べて、ＧＥＮ３０３３を併用処理した場合に、細胞生存率が著しく減ることが分かる。また、図２４から図２７に示すように、ＨＣＴ１１６において９０％以上の細胞生存率を示す各濃度のオキサリプラチン、５−Ｆｕ、シクロホスファミド及びパクリタキセルを単独処理した場合に比べて、ＧＥＮ３０３３を併用処理した場合にがん細胞の死滅がはるかに高く現れることが確認された。
【０１６２】
すなわち、ＧＥＮ３０３３は、化学抗がん剤の併用投与に当たってがん細胞生存率を著しく減少させて、さらに高い抗がん効果を有することが分かる。
【０１６３】
また、他の免疫抗がん剤である抗ＰＤＬ１との併用処理による免疫細胞の活性及びそれに伴う腫瘍細胞の生存率の低下を確認するために、下記の実験を行った。マウスの脾臓と骨髄からＰＢＭＣ及びＴ細胞を分離し、ＰＢＭＣは、ＧＥＮ３０３３との反応によってマクロファージの分化を誘導した後、Ｔ細胞の活性を刺激した。活性化された免疫細胞の上澄み液を分離して抗ＰＤＬ１とともにＭＣ３８腫瘍細胞に入れ、２４時間反応させた後、ＭＣ３８の生存率をＦＡＣｓ装備で確認した。その結果を図２８に示す。
【０１６４】
図２８に示すように、免疫抗がん剤を処理しなくても、ＧＥＮ３０３３との反応に応じて、がん細胞株の生存率が１２．８２％、２２．０２％減ったことを確認した。また、抗ＰＤＬ１（１ｍｇ／ｍＬ）の単独によりがん細胞株の生存率が１８．３３％減ったのに対し、抗ＰＤＬ１（１ｍｇ／ｍＬ）とＧＥＮ３０３３を併用処理したときにがん細胞株の生存率が２５．４４％、４１．２３％減ったことを確認した。そのことから、抗ＰＤ１の他に、抗ＰＤＬ１などの他の免疫抗がん剤との併用投与においてもＧＥＮ３０３３が優れた抗がん効能を有することを確認することができる。
【０１６５】
［実施例２１］
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株と免疫抗がん剤の併用投与に伴う抗腫瘍増進効果（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験）
ヒトの血液からＦｉｃｏｌｌを用いてＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ）を収集した後、赤血球溶解緩衝液（ＲＢＣ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いて赤血球を除去して生きている細胞の数を数えて乳酸菌（３×１０5／５０μｌ／ウェル）が入っている丸底の９６ウェルプレートにウェルごとにＰＢＭＣ  ３×１０4細胞／５０μｌずつ添加して２４時間培養した。
【０１６６】
結腸がん細胞株ＨＣＴ１１６は、ＦＢＳ非含有ＲＰＭＩ培地において５μＭのＣＦＳＥ（Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）と混合し、３７℃で５分間反応させた後、ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ  １６４０培地を添加し、１０分間アイスで保管した。上澄み液を遠心分離により除去した後、得られた細胞に１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ  １６４０と混合した後、細胞の数を数えて前記用意した９６ウェルプレートのウェルごとに３×１０4個／１００μｌずつ添加した。
【０１６７】
次いで、がん細胞が添加されたウェルごとに各抗体ＰＤ１（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ，Ａ２００５，Ｓｅｌｌｅｃｋｅｍ）、ＰＤ−Ｌ１（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ，Ａ２００４，Ｓｅｌｌｅｃｋｅｍ）、ＣＴＬＡ−４（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ，Ａ２００１，Ｓｅｌｌｅｃｋｅｍ）を２０〜３０μｇ／ｍＬの濃度範囲内で処理し、２４時間かけて培養した後、ＰＢＭＣ及びがん細胞株の混合物において溶菌された細胞を確認するために７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で細胞を染色した。ＦＡＣＳＤｉＶａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＣＦＳＥ及び７−ＡＡＤに対する染色を測定することにより、がん細胞株へのＰＢＭＣの細胞溶解能を確認して図２９に示す。
【０１６８】
図２９に示すように、ＰＢＭＣによるがん細胞死滅（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を１００％としたとき、ＧＥＮ０３３３単独によるがん細胞死滅（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）は１０７．０％増加、臨床に用いられている免疫抗がん剤である抗ＰＤ１は１１３．９％、抗ＰＤ−Ｌ１は１２３．５％、抗ＣＴＬＡ−４は１１６．０％のがん細胞死滅を引き起こすことが示された。これに対し、前記免疫抗がん剤とＧＥＮ３０３３を併用処理した場合、抗ＰＤ１は１５６．７％、抗ＰＤ−Ｌ１は１５４．０％、抗ＣＴＬＡ−４は１２８．３％のがん細胞死滅を引き起こすことが確認された。
【０１６９】
要するに、単独処理したときのがん細胞死滅効果と比較して、併用処理したときのがん細胞死滅効果の方が著しく増加することが分かる。
【０１７０】
［受託番号］
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＭＧ７３１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＭＧ７３１）
寄託機関名：韓国生命工学研究院生物資源センター
受託番号：ＫＣＴＣ１３４５２ＢＰ
受託日：２０１８年１月４日
【０１７１】
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）
寄託機関名：韓国生命工学研究院生物資源センター
受託番号：ＫＣＴＣ１３６８４ＢＰ
受託日：２０１８年１０月２５日
【０１７２】
2021522866.tif 000081
【０１７３】
2021522866.tif 000082
【０１７４】
2021522866.tif 000083
【０１７５】
2021522866.tif 000084
【手続補正書】
【提出日】令和3年2月12日(2021.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株（ＫＣＴＣ１３６８４ＢＰ）。
【請求項２】
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株（ＫＣＴＣ１３６８４ＢＰ）を含む、がんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項３】
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株（ＫＣＴＣ１３６８４ＢＰ）を含み、前記ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株が抗がん及び免疫増進効果を示すことを特徴とする、がんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項４】
前記がんは、黒色腫、扁平細胞癌腫、乳がん、頭頚部がん、甲状腺がん、軟部組織肉腫、骨肉腫、精巣がん、前立腺がん、卵巣がん、膀胱がん、皮膚がん、脳腫瘍、血管肉腫、肥滿細胞腫、白血病、リンパ腫、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、胃がん、腎臓がん、大腸がん、造血器腫瘍、神経芽細胞腫、類表皮癌腫及びその転移がんからなる群から選ばれるいずれか一種以上であることを特徴とする、請求項２に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項５】
前記ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株が、ガングリオシドＧＭ３（Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ＧＭ３）を増加させることを特徴とする、請求項２に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項６】
前記ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株が、ＩＦＮ−γの生成を増加させることを特徴とする、請求項３に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項７】
前記ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株が、ＩＬ−１５またはＩＬ−７の発現を増加させることを特徴とする、請求項３に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項８】
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株（ＫＣＴＣ１３６８４ＢＰ）を含み、化学抗がん剤または免疫抗がん剤をさらに含むことを特徴とする、がんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項９】
前記化学抗がん剤は、オキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、ペメトレキセド（Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）及びドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）からなる群からいずれか一種以上が選ばれることを特徴とする、請求項８に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項１０】
前記免疫抗がん剤は、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ、抗Ｔｉｍ３及び抗ＬＡＧ３からなる群からいずれか一種以上が選ばれることを特徴とする、請求項８に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項１１】
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３菌株と化学抗がん剤または免疫抗がん剤は、単一の剤形として同時に投与されるか、あるいは、別個の剤形として同時または逐次に投与されることを特徴とする、請求項８に記載のがんの予防または治療のための薬学組成物。
【請求項１２】
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株（ＫＣＴＣ１３６８４ＢＰ）を含む、がんの予防または改善のための食品組成物。
【請求項１３】
ラクトコッカス・ラクティスＧＥＮ３０３３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧＥＮ３０３３）菌株（ＫＣＴＣ１３６８４ＢＰ）を含む、がんの予防または改善のための動物用の飼料組成物。
【国際調査報告】
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