(57)【要約】  本発明は、ＩＬ−６に結合するアンタゴニスト抗体、ＶＥＧＦトラップとのその融合タンパク質、およびそのいずれかのコンジュゲート、およびそれを使用する方法を提供する。抗ＩＬ−６抗体は、単独でまたは疾患に対する他の治療法と組み合わせて治療的に使用され得る。
2021514656.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーに共役したＩＬ−６に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体。
【請求項２】
配列番号７〜１３、１９〜２７、８９、９０、２５６〜２６２の少なくとも１つの配列を有する重鎖を含む重鎖アミノ酸可変領域、および
配列番号９１〜９３、２８〜３０の少なくとも１つの配列を有する軽鎖を含む軽鎖アミノ酸可変領域
を含む、単離されたアンタゴニストＩＬ−６抗体。
【請求項３】
配列番号２５６に列記されるＣＤＲからのアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域：重鎖可変領域（ＶＨ）（ＣＤＲ１）、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号９１〜９３に列記されるＣＤＲの群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、単離されたアンタゴニストＩＬ−６抗体。
【請求項４】
ＩＬ−６に結合する単離されたアンタゴニスト抗体であって、ＥＵナンバリングに基づいて以下の変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａの少なくとも１つを含む、単離されたアンタゴニスト抗体。
【請求項５】
ＩＬ−６に結合する単離されたアンタゴニスト抗体であって、
配列番号１７２のＣＤＲＨ１であるＣＤＲＨ１、
配列番号１７３のＣＤＲＨ２であるＣＤＲＨ２、
配列番号１７４のＣＤＲＨ３であるＣＤＲＨ３、
配列番号１９９のＣＤＲＬ１であるＣＤＲＬ１、
配列番号２００のＣＤＲＬ２であるＣＤＲＬ２、
配列番号２０１のＣＤＲＬ３であるＣＤＲＬ３、
以下の変異（ＥＵナンバリング）：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａの少なくとも１つ、ならびに
以下の変異（ＥＵナンバリング）：Ｑ３４７ＣまたはＬ４４３Ｃの少なくとも１つ
を含む、単離されたアンタゴニスト抗体。
【請求項６】
約１０ｐＭ〜約１ｎＭの親和性でヒトＩＬ−６に結合する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離されたアンタゴニスト抗体。
【請求項７】
重鎖定常ドメインが、組換えＤＮＡ技術により導入されたシステイン残基をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離されたアンタゴニスト抗体。
【請求項８】
システイン残基が、Ｑ３４７ＣおよびＬ４４３Ｃ（ＥＵナンバリング）からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離されたアンタゴニスト抗体。
【請求項９】
システイン残基がＬ４４３Ｃ（ＥＵナンバリング）である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離されたアンタゴニスト抗体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離されたアンタゴニスト抗体、および
ＶＥＧＦトラップ
を含む、融合タンパク質。
【請求項１１】
前記ＶＥＧＦトラップが、
１．ＩＬ−６  ＶＨを含む重鎖のＮ末端、または
２．ヒンジ領域とＩＬ−６  ＶＨを含む重鎖のＣＨ１ドメインの後ろとの間
のいずれかに位置する、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記ＶＥＧＦトラップが、ＩＬ−６  ＶＨを含む前記重鎖のＮ末端にある、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記ＶＥＧＦトラップが、前記ヒンジ領域とＩＬ−６  ＶＨを含む前記重鎖のＣＨ１ドメインの後ろとの間にある、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
ＶＥＧＦ結合ドメインがＶＥＧＦＲ１ドメイン２およびＶＥＧＦＲ２ドメイン３を含む、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記ＶＥＧＦ結合ドメインが配列番号１１４の配列からなる、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記ＶＥＧＦ結合ドメインがＶＥＧＦトラップとして働いて、ＶＥＧＦが細胞に発現されたＶＥＧＦ受容体に結合することを防止する、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
（ａ）請求項１〜９に記載の単離されたアンタゴニスト抗体のいずれか、および
（ｂ）前記抗体に共有結合的に取り付けられているポリマー
を含む、コンジュゲート。
【請求項１８】
前記ポリマーがホスホリルコリン含有ポリマーを含む、請求項１７に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
前記ポリマーが双性イオンモノマーを含み、前記双性イオンモノマーが、ＨＥＭＡ−ホスホリルコリン、ＰＥＧ、生体適合性の脂肪酸およびその誘導体、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（Ｇｌｙｘ−Ｓｅｒｙ）（ＨＡＰ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパロサンポリマー（ＨＥＰ）、フレキシマー、デキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、Ｆｃドメイン、トランスフェリン、２５アルブミン、エラスチン様（ＥＬＰ）ペプチド、ＸＴＥＮポリマー、ＰＡＳポリマー、ＰＡポリマー、アルブミン結合ペプチド、ＣＴＰペプチド、ならびにＦｃＲｎ結合ペプチドからなる群から選択される、請求項１７に記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質、および
前記融合タンパク質に共有結合的に取り付けられているポリマー
を含む、コンジュゲート。
【請求項２１】
前記ポリマーがホスホリルコリン含有ポリマーを含む、請求項２０に記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
前記ポリマーが双性イオンモノマーを含み、前記双性イオンモノマーが、ＨＥＭＡ−ホスホリルコリン、ＰＥＧ、生体適合性の脂肪酸およびその誘導体、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（Ｇｌｙｘ−Ｓｅｒｙ）（ＨＡＰ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパロサンポリマー（ＨＥＰ）、フレキシマー、デキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、Ｆｃドメイン、トランスフェリン、２５アルブミン、エラスチン様（ＥＬＰ）ペプチド、ＸＴＥＮポリマー、ＰＡＳポリマー、ＰＡポリマー、アルブミン結合ペプチド、ＣＴＰペプチド、ならびにＦｃＲｎ結合ペプチドからなる群から選択される、請求項２０に記載のコンジュゲ
ート。
【請求項２３】
前記ポリマーが２（メタクリロイルオキシ）エチル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート（ＭＰＣ）モノマーを含む、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項２４】
前記ポリマーが、サイズ排除クロマトグラフィー−多角光散乱（以下「ＳＥＣ−ＭＡＬＳ」）により測定される３００，０００〜１，７５０，０００ダルトンのピーク分子量を有する、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項２５】
前記ポリマーが、ＳＥＣ−ＭＡＬＳにより測定される５００，０００〜１，０００，０００ダルトンのピーク分子量を有する、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項２６】
前記ポリマーが、ＳＥＣ−ＭＡＬＳにより測定される６００，０００〜８００，０００ダルトンのピーク分子量を有する、請求項２２に記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
前記ポリマーが２つまたはそれ以上のアームを有する、請求項１７〜２６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
前記ポリマーが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のアームを有する、請求項１７〜２７のいずれか１項のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項２９】
前記ポリマーが９個のアームを有する、請求項２８に記載のコンジュゲート。
【請求項３０】
前記抗体がＩｇＧである、請求項１７〜２９のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３１】
前記ポリマーが、ＩｇＧ重鎖上のシステイン残基からのスルフヒドリル基に共有結合している、請求項３０に記載のコンジュゲート。
【請求項３２】
前記抗体が、位置３４７または４４３（ＥＵナンバリング）においてシステイン残基を含む、請求項１７〜３１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３３】
前記ポリマーが、位置３４７または４４３（ＥＵナンバリング）におけるシステイン残基からのスルフヒドリル基に共有結合している、請求項３２に記載のコンジュゲート。
【請求項３４】
前記抗体が、ポリマーにさらに共役してバイオコンジュゲートを形成しており、かつ、前記バイオコンジュゲートが約３５０，０００〜１，９００，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１７〜３３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３５】
多分散指数（ＰＤＩ）が１．５に等しいまたは１．５未満である、請求項１７〜３４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３６】
前記ポリマーが９個のアームを有し、かつ、
前記ポリマーが約６００，０００〜約９００，０００Ｄａの分子量を有する、
請求項１７〜３５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３７】
以下の構造：
【化１】
2021514656.tif 000103
を含み、
前記抗ＩＬ−６抗体の各重鎖は文字Ｈにより表され、かつ、前記抗ＩＬ−６抗体の各軽鎖は文字Ｌにより表され、
前記ポリマーが、Ｃ４４３（ＥＵナンバリング）のスルフヒドリルを通じて前記抗体に結合しており、前記結合は、前記重鎖の１つに示され、
ＰＣは、
【化２】
2021514656.tif 000104
（式中、曲線は前記ポリマーの残部への結合点を示す）であり、Ｘ＝ａ）ＯＲ（式中、Ｒ＝Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル）、ｂ）Ｈ、またはｃ）Ｂｒを含む、任意のハロゲン化物であり、かつ、
ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９は同一または異なり、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９の和は、２５００プラスまたはマイナス１５％であり、
前記コンジュゲートがＶＥＧＦトラップを含む場合、前記ＶＥＧＦトラップが、
ａ）前記重鎖のＮ末端、または
ｂ）前記重鎖のヒンジ領域とＦａｂ領域との間（ＣＨ１ドメインの後）に
融合している、
請求項１７〜３６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３８】
前記コンジュゲートがＶＥＧＦトラップを含む場合、それがＶＥＧＦＲ１ドメイン２および次にＶＥＧＦＲ２−ドメイン３をこの順序で含む、請求項３７に記載のコンジュゲート。
【請求項３９】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離されたアンタゴニスト抗体または請求項１０
〜１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質を産生する、単離された細胞株。
【請求項４０】
ＣＨＯ、ｋ１ＳＶ、ＸＣｅｅｄ、ＣＨＯＫ１ＳＶ、およびＧＳ−ＫＯからなる群から選択される、請求項３９に記載の単離された細胞株。
【請求項４１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離されたアンタゴニスト抗体または請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、単離された核酸。
【請求項４２】
請求項４１に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項４３】
請求項４２に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４４】
ＩＬ−６アンタゴニスト抗体またはその融合タンパク質を製造する方法であって、１〜９のいずれか１項に記載の単離されたアンタゴニスト抗体または請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質を組換えにより産生する細胞株を前記抗体が産生される条件下で培養すること、および前記抗体を回収することを含む、方法。
【請求項４５】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離されたアンタゴニスト抗体または請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質および／または請求項１７〜３８のいずれか１項に記載のコンジュゲート、ならびに薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項４６】
液体であり、かつ約０．２ＥＵ／ｍｌ未満のエンドトキシンレベルを有する、請求項４５に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
液体であり、かつ約２．０、１、０．５、または０．２ＥＵ／ｍｌ未満のエンドトキシンレベルを有する、請求項４６に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
それを必要とする患者における疾患の治療または予防方法であって、前記患者に請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離されたアンタゴニスト抗体または請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質および／または請求項１７〜３８のいずれか１項に記載のコンジュゲートを投与することを含む、方法。
【請求項４９】
それを必要とする患者における疾患の治療または予防方法であって、
ＩＬ−６および／またはＶＥＧＦ過剰活性を有する患者を同定すること、ならびに
前記患者に請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離されたアンタゴニスト抗体または請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質および／または請求項１７〜３８のいずれか１項に記載のコンジュゲートを投与すること
を含む、方法。
【請求項５０】
前記疾患が眼障害である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記眼障害が、滲出型または新生血管黄斑変性症、滲出型または新生血管加齢黄斑変性症、乾燥型加齢黄斑変性症、網膜浮腫を伴うまたは伴わない目およびまたは網膜血管の静脈、動脈または他の閉塞、前部および後部ぶどう膜炎、ぶどう膜炎黄斑浮腫、糖尿病網膜症、非増殖性糖尿病網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、非増殖性糖尿病性黄斑浮腫、眼科炎症性疾患強膜炎ならびに眼内腫瘍の少なくとも１つである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記単離された抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲートが、１か月に１回以下の頻度で投与される、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記単離された抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲートが、２か月に１回以下の頻度で投与される、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記単離された抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲートが、３か月に１回以下の頻度で投与される、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記単離された抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲートが、１年に１回から２か月に１回までの頻度で投与される、請求項４９〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
ＩＬ−６  ＶＨ
ＩＬ−６  ＶＬ
ＩＬ−６  Ｆｃ、
ＶＥＧＦトラップ
を含み、
前記ＶＥＧＦトラップが、以下の方式：
１．ＩＬ−６  ＶＨを含む重鎖のＮ末端、または
２．ヒンジ領域とＩＬ−６  ＶＨを含む重鎖のＣＨ１ドメインの後ろとの間
の１つにおいてＩＬ−６に融合している、
融合タンパク質。
【請求項５７】
前記コンジュゲートがＶＥＧＦトラップを含む場合、それがＶＥＧＦＲ１ドメイン２および次にＶＥＧＦＲ２−ドメイン３をこの順序で含む、請求項５６に記載の融合タンパク質。
【請求項５８】
前記ＶＥＧＦトラップ配列中の位置９４において変異を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５９】
前記ＶＥＧＦトラップ配列中の位置９５において変異を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６０】
前記ＶＥＧＦトラップ配列中にＴ９４Ｉおよび／またはＨ９５Ｉの変異を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６１】
ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤であって、前記ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤が、抗ＩＬ−６抗体と抗ＶＥＧＦトラップ（ＶＥＧＦＲ１／２）とのトラップ抗体融合物を含み、前記二重阻害剤が、ＶＥＧＦＲタンパク質の切断を低減するためのＶＥＧＦＲ配列内の少なくとも１つの点変異を含む、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤。
【請求項６２】
前記ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤の分子量が１．０ＭＤａである、請求項６１に記載のＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤。
【請求項６３】
炎症性網膜疾患に対する療法を提供する、請求項６１に記載のＶＥＧＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤。
【請求項６４】
重鎖定常、軽鎖定常、抗原結合断片、結晶化可能断片（Ｆｃ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、可変重鎖、および可変軽鎖領域を含む、請求項６１に記載のＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤。
【請求項６５】
前記抗ＩＬ−６重鎖可変領域配列が、配列番号７〜１３、８９、９０、および／または２５６〜２６２の選択肢から選択される、請求項６４に記載のＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二
重阻害剤。
【請求項６６】
前記ＶＥＧＦトラップ配列が、配列番号１４５、１５、１６、または１７の少なくとも１つから選択される、請求項６４〜６５のいずれか１項に記載のＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤。
【請求項６７】
リンカー配列が配列番号１８である、請求項６４〜６６のいずれか１項に記載のＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤。
【請求項６８】
抗ＩＬ−６分子の重鎖配列が、配列番号１９〜２７の少なくとも１つから選択されまたは配列番号８９、９０、２５６〜２６２の１つの配列を少なくとも含む、請求項６４〜６７のいずれか１項に記載のＶＥＧＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤。
【請求項６９】
抗ＩＬ−６分子の軽鎖配列が、配列番号７６〜８４の少なくとも１つからの少なくとも１、２、または３つの軽鎖ＣＤＲを含む、請求項６４〜６８のいずれか１項に記載のＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤。
【請求項７０】
抗ＩＬ−６分子の重鎖配列が、配列番号４９〜７５の少なくとも１つからの少なくとも１、２、または３つの重鎖ＣＤＲを含む、請求項６４〜６９のいずれか１項に記載のＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤。
【請求項７１】
配列番号８５〜８８の少なくとも１つからのＶＥＧＦＲ−Ｆｃ配列を含む、請求項６４〜７０のいずれか１項に記載のＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤。
【請求項７２】
配列番号７〜１３、１４５、１５〜１７、１８〜８４のいずれか１つまたはそれ以上の配列の１つまたはそれ以上を含む、請求項６４〜７１のいずれか１項に記載のＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤。
【請求項７３】
ＩＬ−６  ＶＨ、
ＩＬ−６  ＶＬ、
ＩＬ−６  Ｆｃ、
ＶＥＧＦトラップ、および
リンカー
を含む、請求項７２に記載のＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤。
【請求項７４】
前記ＩＬ−６  ＶＨが、配列番号１９〜２７、３１〜３９、８９、９０、または２５６〜２６２のいずれか１つのＩＬ６  ＶＨ配列からの配列を含む、請求項７３に記載のＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤。
【請求項７５】
前記ＩＬ−６  ＶＬが、配列番号２８〜３０または９１〜９３のいずれか１つのＩＬ６
ＶＬ配列からの配列を含む、請求項７３または７４に記載のＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤。
【請求項７６】
前記Ｆｃが、配列番号４０〜４８のいずれか１つのＦｃ配列からの配列を含む、請求項７３〜７５のいずれか１項に記載のＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤。
【請求項７７】
前記ＶＥＧＦトラップが、配列番号１４５、１５、１６、または１７のいずれか１つのＶＥＧＦトラップ配列からの配列を含む、請求項７３〜７６のいずれか１項に記載のＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤。
【請求項７８】
少なくとも３つの重鎖ＣＤＲ、
少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ、
ＶＥＧＦトラップ配列、および
リンカー配列
を含み、
前記配列のそれぞれが、図１８〜２５中の対応する配列から選択される、
タンパク質構築物。
【請求項７９】
ＩＬ−６  ＶＨ、
ＩＬ−６  ＶＬ、
ＩＬ−６  Ｆｃ、および
ＶＥＧＦトラップ
を含み、
ＨＵＶＥＣ増殖を変化させる、
融合タンパク質。
【請求項８０】
ＨＵＶＥＣ増殖を変化させることが、ＶＥＧＦ／ＩＬ６媒介性増殖を阻害することである、請求項７９に記載の融合タンパク質。
【請求項８１】
配列番号２６３に対して少なくとも８０％同一および配列番号１１７に対して少なくとも８０％同一の配列を含み、ポリマーにさらに共役している、融合タンパク質。
【請求項８２】
配列番号２６３に対して少なくとも９５％同一および配列番号１１７に対して少なくとも９５％同一である、請求項８１に記載の融合タンパク質。
【請求項８３】
ａ）配列番号１７２、１７３、１７４、１９９、２００、および２０１、またはｂ）配列番号１７２、１７３、１７４、１９９、２００、および／もしくは２０１内の１、２、もしくは３つのアミノ酸の置換を少なくとも含み、前記置換が保存的置換である、請求項８１または８２に記載の融合タンパク質。
【請求項８４】
ａ）配列番号１６９および１７０のアミノ酸配列またはｂ）配列番号１６９に対して少なくとも８０％同一および配列番号１７０に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８５】
ａ）配列番号１６９および１７０のアミノ酸配列またはｂ）配列番号１６９に対して少なくとも８０％同一および配列番号１７０に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１０〜１６、５６〜６０、または７９〜８２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８６】
ａ）配列番号１６９および１７０のアミノ酸配列またはｂ）配列番号１６９に対して少なくとも８０％同一および配列番号１７０に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１７〜３８のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項８７】
ａ）配列番号１６９および１７０のアミノ酸配列またはｂ）配列番号１６９に対して少なくとも８０％同一および配列番号１７０に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項６１〜７７のいずれか１項に記載のＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤。
【請求項８８】
ａ）配列番号１６９および１７０のアミノ酸配列またはｂ）配列番号１６９に対して少なくとも８０％同一および配列番号１７０に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項７８に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
あらゆる優先権出願の参照による組込み
本出願と共に提出される出願データシートにおいて外国または国内優先権主張が同定される任意および全ての出願は、参照することにより３７  ＣＦＲ  §１．５７の下で本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、電子フォーマットにおいて配列表と共に提出される。配列表は、３９５，４３０バイトのサイズの２０１９年３月１日に作成されたＫＤＩＡＫ０４４．ｔｘｔというタイトルのファイルとして提供される。配列表の電子フォーマットにおける情報は、参照することにより全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
生物学的試料の寄託に関する声明
一部の実施形態では、 に第 号の下でブダペスト条約にしたがってＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託された抗ＩＬ−６抗体、その融合物、およびコンジュゲートが提供される。
【０００４】
これらの寄託は、特許手続きの目的とその下の規制のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の規定の下で為された。これは、寄託日から３０年にわたる寄託物の維持を保証する。寄託物は、ブダペスト条約の条項の下でＡＴＣＣにより利用可能とされ、出願人とＡＴＣＣとの間の合意に供され、この合意により、関連する米国特許の発行時にまたは任意の米国もしくは外国特許出願のいずれか最先の公開時に公衆への寄託物の永久的かつ非制限的な利用可能性が保証され、かつ、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．  §１２２およびそれによる米国特許商標庁長官の規則（３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．  §１．１４を含む）にしたがって権利が与えられることが長官により決定された者に対する寄託物の利用可能性が保証される。寄託された生物学的材料の利用可能性は、任意の政府の権限の下でその特許法にしたがって付与される権利に違反して本発明を実施するための認可として解釈されるべきではない。
【０００５】
本発明は、概しては、ＩＬ−６および／またはＶＥＧＦに結合する融合構築物に関する。
【背景技術】
【０００６】
血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）は、内皮細胞の生存、増殖、遊走、および細胞間透過性などの血管新生促進機能（pro-angiogenic function）を媒介するシグナルタンパ
ク質である。その活性は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）および糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）における脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）などの網膜疾患の進行を促進することが示されている。ＶＥＧＦ−Ａシグナル伝達の阻害は、新生血管性網膜疾患の進行を停止させるための効果的な手段であることが証明されている（Ferrara et al, Retina, 2006）。ＶＥＧＦ機
能を阻害するために様々な治療用分子が開発されてきた。これらのうち、ラニビズマブおよびベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体は、病理学的血管新生に対する安全かつ効果的な治療であることが示されている。より最近では、ＶＥＧＦ「トラップ」として作用するアフリベルセプト（アイリーア（Eylea））およびコンベルセプト（チャイ
ナ（China））などの組換えにより作製されたＶＥＧＦＲ融合タンパク質は、その抗体競
合物より効果的かつより長く持続することが証明されつつある。
【０００７】
炎症は、網膜疾患の病理発生に関係があるとされており、ステロイドなどの抗炎症療法
は、ぶどう膜炎および糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）の治療において効果的であった。目における炎症および感染症の詳細な研究は、炎症促進性サイトカイン、インターロイキン−６（ＩＬ−６）は難治性／慢性ぶどう膜炎患者の眼液中で有意に上昇しており、動物モデルにおけるＩＬ−６の阻害はぶどう膜炎の発病を阻害することを示した。ＩＬ−６の高い眼液レベルもまた、ＤＭＥおよび網膜静脈閉塞症を有する患者において見出される。追加的に、慢性炎症細胞が新生血管ＡＭＤを有する目においてブルッフ膜の表面に見られており、ＡＭＤを有する患者は、ＩＬ−６の増加した血清レベルを有することが報告されている。興味深いことに、ＩＬ−６はまた、欠陥性血管新生を刺激することが観察されている。関節リウマチなどの自己免疫障害に加えて、抗ＩＬ−６治療は、ぶどう膜炎およびぶどう膜炎黄斑浮腫を効果的に治療することが示されている。
【発明の概要】
【０００８】
一部の態様では、ポリマーに共役したＩＬ−６に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体が提供される。
【０００９】
一部の態様では、単離されたアンタゴニスト抗体が提供される。抗体は、表１Ａの重鎖を構成する重鎖アミノ酸可変領域、および表１Ｂの軽鎖を構成する軽鎖アミノ酸可変領域重鎖を含む。
【００１０】
一部の態様では、単離されたアンタゴニスト抗体が提供される。抗体は、表１ＡのＣＤＲからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）のＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに表１ＢのＣＤＲからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）のＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
【００１１】
一部の態様では、ＩＬ−６に結合する単離されたアンタゴニスト抗体が提供される。抗体は、ＥＵナンバリングに基づいて以下の変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａの少なくとも１つを含む。
【００１２】
一部の態様では、ＩＬ−６に結合する単離されたアンタゴニスト抗体が提供される。抗体は、表１ＡのＣＤＲＨ１であるＣＤＲＨ１、表１ＡのＣＤＲＨ２であるＣＤＲＨ２、表１ＡのＣＤＲＨ３であるＣＤＲＨ３、表１ＢのＣＤＲＬ１であるＣＤＲＬ１、表１ＢのＣＤＲＬ２であるＣＤＲＬ２、表１ＢのＣＤＲＬ３であるＣＤＲＬ３、以下の変異（ＥＵナンバリング）：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａの少なくとも１つ、ならびに以下の変異（ＥＵナンバリング）：Ｑ３４７ＣまたはＬ４４３Ｃの少なくとも１つを含む。
【００１３】
一部の態様では、単離されたアンタゴニスト抗体、およびＶＥＧＦ結合タンパク質の断片を含む、融合タンパク質が提供される。
【００１４】
一部の態様では、本明細書における任意の単離されたアンタゴニスト抗体およびポリマーを含む、コンジュゲートが提供される。ポリマーは、抗体に共有結合的に取り付けられている。
【００１５】
一部の態様では、コンジュゲートが提供される。コンジュゲートは、本明細書において提供されるような融合タンパク質およびポリマーを含み、ポリマーは、融合タンパク質に共有結合的に取り付けられている。
【００１６】
一部の態様では、単離されたアンタゴニスト抗体または融合タンパク質を産生する単離された細胞株が提供される。
【００１７】
一部の態様では、単離されたアンタゴニスト抗体または融合タンパク質をコードする単離された核酸が提供される。
【００１８】
一部の態様では、組換え発現ベクターが提供される。ベクターは、本明細書において提供されるこれらの構築物のいずれかをコードする核酸を含む。
【００１９】
一部の態様では、本明細書において提供されるような発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００２０】
一部の態様では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体またはその融合タンパク質を製造する方法が提供される。方法は、単離されたアンタゴニスト抗体または融合タンパク質を組換えにより産生する細胞株を、抗体が産生される条件下で培養すること、および抗体を回収することを含む。
【００２１】
一部の態様では、医薬組成物が提供される。それは、本明細書において提供されるような単離されたアンタゴニスト抗体または融合タンパク質および／またはコンジュゲート、ならびに薬学的に許容される担体を含む。
【００２２】
一部の態様では、それを必要とする患者における疾患の治療または予防方法が提供される。方法は、患者に本明細書において提供されるような単離されたアンタゴニスト抗体または融合タンパク質および／またはコンジュゲートを投与することを含む。
【００２３】
一部の態様では、それを必要とする患者における疾患の治療または予防方法が提供される。方法は、ＩＬ−６および／またはＶＥＧＦ過剰活性を有する患者を同定すること、ならびに患者に本明細書において提供されるような単離されたアンタゴニスト抗体または融合タンパク質および／またはコンジュゲートを投与することを含む。
【００２４】
一部の態様では、ＩＬ−６  ＶＨ、ＩＬ−６  ＶＬ、ＩＬ−６  Ｆｃ、およびＶＥＧＦトラップを含む、融合タンパク質であって、ＶＥＧＦトラップが、以下の方式：１）ＩＬ−６  ＶＨを含む重鎖のＮ末端、または２）ヒンジ領域とＩＬ−６  ＶＨを含む重鎖のＣＨ１ドメインの後ろとの間の１つにおいてＩＬ−６に融合している、融合タンパク質が提供される。
【００２５】
一部の態様では、配列番号７〜１３、１９〜２７、８９、９０、２５６〜２６２の少なくとも１つの配列を有する重鎖を含む重鎖アミノ酸可変領域、および配列番号９１〜９３、２８〜３０の少なくとも１つの配列を有する軽鎖を含む軽鎖アミノ酸可変領域を含む、単離されたアンタゴニストＩＬ−６抗体が提供される。
【００２６】
一部の態様では、配列番号２５６に列記されるＣＤＲからのアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域：重鎖可変領域（ＶＨ）（ＣＤＲ１）、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号９１〜９３に列記されるＣＤＲの群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、単離されたアンタゴニストＩＬ−６抗体が提供される。
【００２７】
一部の態様では、ＩＬ−６に結合する単離されたアンタゴニスト抗体が提供される。抗体は、ＥＵナンバリングに基づいて以下の変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａの少なくとも１つを含む。
【００２８】
一部の実施形態では、ＩＬ−６に結合する単離されたアンタゴニスト抗体が提供され、
該抗体は、配列番号１７２のＣＤＲＨ１であるＣＤＲＨ１、配列番号１７３のＣＤＲＨ２であるＣＤＲＨ２、配列番号１７４のＣＤＲＨ３であるＣＤＲＨ３、配列番号１９９のＣＤＲＬ１であるＣＤＲＬ１、配列番号２００のＣＤＲＬ２であるＣＤＲＬ２、配列番号２０１のＣＤＲＬ３であるＣＤＲＬ３、以下の変異（ＥＵナンバリング）：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａの少なくとも１つ、ならびに以下の変異（ＥＵナンバリング）：Ｑ３４７ＣまたはＬ４４３Ｃの少なくとも１つを含む。
【００２９】
一部の態様では、本明細書において提供されるいずれか１つの単離されたアンタゴニスト抗体（その断片を含む）およびＶＥＧＦトラップを含む、融合タンパク質が提供される。
【００３０】
一部の態様では、本明細書において提供される単離されたアンタゴニスト抗体（断片を含む）のいずれか、およびポリマーを含む、コンジュゲートであって、ポリマーが、抗体に共有結合的に取り付けられている、コンジュゲートが提供される。
【００３１】
一部の態様では、本明細書において提供されるような融合タンパク質、およびポリマーを含む、コンジュゲートであって、ポリマーが、融合タンパク質に共有結合的に取り付けられている、コンジュゲートが提供される。
【００３２】
一部の態様では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤が提供される。ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤は、抗ＩＬ−６抗体と抗ＶＥＧＦトラップ（ＶＥＧＦＲ１／２）とのトラップ抗体融合物を含み、二重阻害剤は、ＶＥＧＦＲタンパク質の切断を低減するためのＶＥＧＦＲ配列内の少なくとも１つの点変異を含む。
【００３３】
一部の態様では、少なくとも３つの重鎖ＣＤＲ、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ、ＶＥＧＦトラップ配列、およびリンカー配列を含む、タンパク質構築物であって、各配列が、図１８〜２５内の対応する配列または本明細書中の表（例えば、０．１Ａ、０．１Ｂ、１Ａ、１Ｂ、０．２Ａ、および０．２Ｂを含む）からの対応する配列から選択される、タンパク質構築物。
【００３４】
一部の態様では、ＩＬ−６  ＶＨ、ＩＬ−６  ＶＬ、ＩＬ−６  Ｆｃ、およびＶＥＧＦトラップを含む、融合タンパク質であって、ＨＵＶＥＣ増殖を変化させる、融合タンパク質が提供される。一部の実施形態では、ＨＵＶＥＣ増殖を変化させることは、ＶＥＧＦ／ＩＬ６媒介性増殖を阻害することである。
【００３５】
一部の態様では、配列番号２６３に対して少なくとも８０％同一および配列番号１１７に対して少なくとも８０％同一の配列を含む、融合タンパク質であって、ポリマーにさらに共役している、融合タンパク質が提供される。
【００３６】
一部の態様では、ＩＬ−６に結合する単離されたアンタゴニスト抗体が提供される。抗体は、ＥＵナンバリングに基づいて以下の変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａの少なくとも１つを含む。
【００３７】
一部の態様では、ＩＬ−６に結合する単離されたアンタゴニスト抗体であって、配列番号１７２のＣＤＲＨ１であるＣＤＲＨ１、配列番号１７３のＣＤＲＨ２であるＣＤＲＨ２、配列番号１７４のＣＤＲＨ３であるＣＤＲＨ３、配列番号１９９のＣＤＲＬ１であるＣＤＲＬ１、配列番号２００のＣＤＲＬ２であるＣＤＲＬ２、配列番号２０１のＣＤＲＬ３であるＣＤＲＬ３、以下の変異（ＥＵナンバリング）：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａの少なくとも１つ、ならびに以下の変異（ＥＵナンバリング）：Ｑ３４７ＣまたはＬ４４３Ｃの少なくとも１つを含む、抗体が提供される。
【００３８】
一部の態様では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤は、配列番号７〜１３、８９、９０、および／または２５６〜２６２から選択される抗ＩＬ−６重鎖可変領域配列を含む。
【００３９】
一部の態様では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤は、配列番号１４５、１５、１６、または１７の少なくとも１つから選択されるＶＥＧＦトラップ配列を有する。
【００４０】
一部の態様では、リンカー配列は配列番号１８である。
【００４１】
一部の態様では、配列番号１９〜２７の少なくとも１つから選択されまたは配列番号８９、９０、２５６〜２６２の１つの配列を少なくとも含む、抗ＩＬ−６分子の重鎖配列が提供される。
【００４２】
一部の態様では、配列番号７６〜８４の少なくとも１つからの少なくとも１、２、または３つの軽鎖ＣＤＲを含む、抗ＩＬ−６分子の軽鎖配列が提供される。
【００４３】
一部の態様では、配列番号４９〜７５の少なくとも１つからの少なくとも１、２、または３つの重鎖ＣＤＲを含む、抗ＩＬ−６分子の重鎖配列が提供される。
【００４４】
一部の態様では、配列番号８５〜８８の少なくとも１つからのＶＥＧＦＲ−Ｆｃ配列を含む、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤が提供される。
【００４５】
一部の態様では、配列番号７〜１３、１４５、１５〜１７、１８〜８４のいずれか１つまたはそれ以上の配列の１つまたはそれ以上を含む、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤が提供される。
【００４６】
態様の実施形態では、ＩＬ−６  ＶＨ、ＩＬ−６  ＶＬ、ＩＬ−６  Ｆｃ、ＶＥＧＦトラップ、およびリンカーを含む、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤が提供される。一部の実施形態では、ＩＬ−６  ＶＨは、配列番号１９〜２７、３１〜３９、８９、９０、または２５６〜２６２のいずれか１つのＩＬ６  ＶＨ配列からの配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−６  ＶＬは、配列番号２８〜３０または９１〜９３のいずれか１つのＩＬ６  ＶＬ配列からの配列を含む。一部の実施形態では、Ｆｃは、配列番号４０〜４８のいずれか１つのＦｃ配列からの配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＧＦトラップは、配列番号１４５、１５、１６、または１７のいずれか１つのＶＥＧＦトラップ配列からの配列を含む。
【００４７】
一部の態様では、ＩＬ−６  ＶＨ、ＩＬ−６  ＶＬ、ＩＬ−６  Ｆｃ、およびＶＥＧＦトラップを含む、融合タンパク質であって、ＨＵＶＥＣ増殖を変化させる、融合タンパク質が提供される。一部の実施形態では、ＨＵＶＥＣ増殖を変化させることは、ＶＥＧＦ／ＩＬ６媒介性増殖を阻害することである。
【００４８】
一部の態様では、配列番号２６３に対して少なくとも８０％同一および配列番号１１７に対して少なくとも８０％同一の配列を含む、融合タンパク質が提供される。融合タンパク質は、ポリマーにさらに共役している。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２６３に対して少なくとも９５％同一および配列番号１１７に対して少なくとも９５％同一である。一部の実施形態では、タンパク質は、ａ）配列番号１７２、１７３、１７４、１９９、２００、および２０１、またはｂ）配列番号１７２、１７３、１７４、１９９、２００、および／もしくは２０１内の１、２、もしくは３つのアミノ酸の置換を少なくとも含み、置換は保存的置換である。
【００４９】
一部の態様では、本明細書において提供されるいずれか１つの抗体は、ａ）配列番号１６９および１７０のアミノ酸配列またはｂ）配列番号１６９に対して少なくとも８０％同一および配列番号１７０に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。
【００５０】
一部の態様では、本明細書において提供されるいずれか１つの融合タンパク質は、ａ）配列番号１６９および１７０のアミノ酸配列またはｂ）配列番号１６９に対して少なくとも８０％同一および配列番号１７０に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。
【００５１】
一部の態様では、本明細書において提供されるいずれか１つのコンジュゲートは、ａ）配列番号１６９および１７０のアミノ酸配列またはｂ）配列番号１６９に対して少なくとも８０％同一および配列番号１７０に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。
【００５２】
一部の態様では、本明細書において提供されるいずれか１つのＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤は、ａ）配列番号１６９および１７０のアミノ酸配列またはｂ）配列番号１６９に対して少なくとも８０％同一および配列番号１７０に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。
【００５３】
一部の態様では、本明細書において提供されるいずれか１つのタンパク質は、ａ）配列番号１６９および１７０のアミノ酸配列またはｂ）配列番号１６９に対して少なくとも８０％同一および配列番号１７０に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１はＩＬ−６の配列を示す。
【図２Ａ】図２Ａは化合物Ｌを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは化合物Ｋを示す。
【図２Ｃ】図２ＣはＲ３７０７からのＯＧ１８０２の合成を示す。
【図２Ｄ】図２ＤはＯＧ１７８６を示す。
【図２Ｅ】２ＥはＯＧ１５５０からのＯＧ１５４６の合成を示す。
【図２Ｆ】図２ＦはＯＧ１５４６およびＯＧ１５６３からのＯＧ１７８４の合成を示す。
【図２Ｇ】図２ＧはＯＧ１７８４からのＯＧ１４０５の合成を示す。
【図２Ｈ】図２ＨはＯＧ１４０５からのＯＧ１７８５の合成を示す。
【図２Ｉ】図２ＩはＯＧ１７８５からのＯＧ１７８６の合成を示す。
【図２Ｊ】図２ＪはＯＧ１８０１を示す。
【図２Ｋ】図２ＫはＯＧ１８０２を示す。
【図２Ｌ】図２Ｌは化合物Ｅを示す。
【図３】図３は、抗体の選択および最適化のフローチャートを示す。
【図４】図４は、抗ＩＬ−６  ｍＡｂはＩＬ−６に結合するが、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に結合しないこと、およびＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体形成は抗ＩＬ−６  ｍＡｂにより阻害されることを示すＥＬＩＳＡデータを示す。
【図５】図５は、ＩＬ−６−Ａｂの重鎖および軽鎖可変領域の一部の実施形態を示す。ＣＤＲの実施形態を囲った領域中に示す。これらの配列はまた、ＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ融合構築物において用いられ得る。
【図６】図６は、ＩＬ−６−ＶＥＧＦトラップ融合タンパク質の一部の実施形態を示す。ＶＥＧＦトラップドメインは、可変ドメインに直ちに先行してＮ末端において配置されているか（左）、または抗体のＦａｂ領域とヒンジ領域との間に配置されている（右）。
【図７】図７は、二重阻害剤分子ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６および抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦＲは抗ＶＥＧＦ抗体ＯＧ１９５０およびアイリーアと類似の親和性でＶＥＧＦ−Ａに結合することを実証するセンサーグラムおよび表を示す。そのため、ＶＥＧＦトラップの位置は、標的に対する親和性を変化させない。
【図８】図８は、二重阻害剤への独立したまたは組合せのＶＥＧＦ−ＡおよびＩＬ−６の結合のセンサーグラムを示す。混合標的のＩＬ−６センサーグラムを理論曲線（個々のＩＬ−６およびＶＥＧＦ−Ａセンサーグラムの和）と比較した。結果は、理論曲線および実験曲線は重なり合うことを示し、これは、両方の標的は互いの結合に影響を及ぼすことなく二重阻害剤分子に結合できることを定性的に示す。
【図９】図９は、様々なＥＬＩＳＡ  ＩＬ−６アッセイからのＯＤ４５０ｎｍの結果を示す。ブリッジングＥＬＩＳＡ（上）において、両方の二重阻害剤はｂｔＶＥＧＦをＩＬ−６にブリッジさせ、両方の配置は両方の標的に結合できることを示唆する。ＥＣ５０  ＶＥＧＦトラップ−抗ＩＬ−６＝０．０７９ｎＭ、抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦトラップ＝０．０２６ｎＭ。アイリーアおよび抗ＩＬ−６は陰性対照として用いられた。図９はまた、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体ＥＬＩＳＡの結果を示す（中央）。二重阻害剤および抗ＩＬ−６は同じ程度までＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体形成を阻害した。ＩＣ５０値：抗ＩＬ−６＝０．３６ｎＭ、ＶＥＧＦトラップ−抗ＩＬ−６＝０．４７ｎＭ、抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦトラップ＝０．３２ｎＭ。アイリーアは陰性対照として用いられた。図９はまた、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ競合ＥＬＩＳＡの結果を示す（下）。二重阻害剤、アイリーア、およびＯＧ１９５０は、異なる程度までＶＥＧＦＲへのＶＥＧＦの結合を阻害した。アイリーアおよび抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦトラップ構築物は同等であり（４．２４ｎＭ対４．５３ｎＭ）、ＶＥＧＦトラップ−抗ＩＬ−６構築物は約２倍良好であり（１．７４ｎＭ）、ＯＧ１９５０は他の阻害剤より優れた最大阻害を示した（１．５５ｎＭ）。
【図１０】図１０は、抗体コンジュゲートを調製する方法の一部の実施形態を示す（Ａｂ−トラップまたはトラップ−Ａｂコンジュゲートにも応用され得る）。抗体として示したが、本出願の文脈において、図１０のＡｂの描写は（図６に示されるような）トラップ融合物と交換できることを当業者は理解する。単純化のために、本出願において示される包括的な抗体は、（当然ながら、融合物として既に示されていなければ）抗体としてのオプションおよび融合トラップの文脈において融合物アレンジメント（fusionarrangement）としてのオプションの両方を表す。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜Ｂは、ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２標準物質、抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦＲ、およびＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６のＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドを示す。図１１Ｃは、ホスホリルコリンベースのポリマーと共役した抗ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦＲ１／２）と抗ＩＬ−６との融合物である、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６のコンジュゲート構築物を示す。
【図１１Ｂ】同上。
【図１１Ｃ】同上。
【図１２−１】図１２は、ＰＶＤＦ膜への転写、Ｎ末端エドマンシークエンシングの結果を示し、これは、切断生成物は同じＮ末端配列（ＬＴＨＲＱＴ）を共有することを示し、これは、切断部位はＶＥＧＦトラップ領域に位置することを示す。
【図１２−２】同上。
【図１２−３】同上。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜Ｂは、ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２標準物質および１９のＶＥＧＦトラップ構築物のＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドを示す。
【図１３Ｂ】同上。
【図１３Ｃ−Ｅ】図１３Ｃ〜１３Ｅは、ＶＥＧＦ＿トラップ＿バリアント＿１、ＶＥＧＦ＿トラップ＿バリアント＿２、およびＶＥＧＦ＿トラップ＿バリアント＿３の配列表を示す。
【図１３Ｆ】図１３Ｆ〜１３Ｇは、ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２標準物質、ならびに、二重点変異Ｔ９４ＩおよびＨ９５Ｉを有するＶＥＧＦＲ＿バリアント＿３を含む４つのＶＥＧＦトラップバリアントのＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドを示す。
【図１３Ｇ】同上。
【図１４Ａ−Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｆは、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイの結果およびＶＥＧＦ−Ａに対する親和性の測定値を示す。
【図１４Ｃ−Ｄ】同上。
【図１４Ｅ−Ｆ】同上。
【図１５】図１５は、細胞ベースのＶＥＧＦ刺激性ＶＥＧＦＲレポーターアッセイを示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＶＥＧＦ／ＩＬ６媒介性ヒト臍静脈内皮細胞（「ＨＵＶＥＣ」）細管形成の阻害のアッセイを示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂ〜１６Ｃは、異なるパラメーターを用いた細管形成アッセイの統計を示す。
【図１６Ｃ】同上。
【図１７】図１７は、ＨＵＶＥＣ増殖アッセイの結果を示す。
【図１８】図１８は、抗ＩＬ−６重鎖可変領域配列の実施形態を示す。ＣＤＲに下線を引いている。
【図１９】図１９は、ＶＥＧＦトラップ配列の様々な実施形態を示す。配列間で異なるセクションを太字とし、下線を引いている。
【図２０】図２０は、リンカー（ＧＳ）配列の実施形態の一部の実施形態を示す。それは、二重反復Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー（ＧＳ）として示され得る。
【図２１Ａ】図２１は、抗ＩＬ−６分子の重鎖配列の一部の実施形態を示す。ＣＤＲに下線を引いている。図２１は図２１Ａおよび図２１Ｂの両方を含み、これらは、記載された配列内のＣＤＲの様々な実施形態を提供する。
【図２１Ｂ−１】同上。
【図２１Ｂ−２】同上。
【図２２Ａ】図２２は、抗ＩＬ−６分子の軽鎖配列の一部の実施形態を示す。ＣＤＲに下線を引いている。図２２は図２２Ａおよび図２２Ｂの両方を含み、これらは、記載された配列内のＣＤＲの様々な実施形態を提供する。
【図２２Ｂ】同上。
【図２３Ａ】図２３は、抗ＩＬ−６分子の重鎖配列の一部の実施形態を示す。ＣＤＲに下線を引いている。図２３は図２３Ａおよび図２３Ｂの両方を含み、これらは、記載された配列内のＣＤＲの様々な実施形態を提供する。
【図２３Ｂ−１】同上。
【図２３Ｂ−２】同上。
【図２４Ａ−Ｂ】図２４Ａ〜２４Ｂは、図２１〜２３のＣＤＲの組合せの一部の実施形態を示す。
【図２５】図２５は、ＶＥＧＦＲ−Ｆｃ配列バリアントの一部の実施形態を示す。配列間で異なるセクションを太字とし、下線を引いている。
【図２６Ａ−Ｃ】図２６Ａ〜２６Ｃは親和性結合データを示す。
【図２７】図２７は、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６配列の一部の実施形態の配列を示す。ＣＤＲ（Ｋａｂａｔによる定義）に下線を引いている。灰色セクションはＶＥＧＦＲ構築物を示唆する。太字はリンカーセクションを示唆する。変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７ＡおよびＬ４４３Ｃ（ＥＵナンバリング）に二重下線を引いている。これらの各セクションは、本出願において提供される他の対応するセクション（例えば、選択的なリンカーまたはＣＤＲなど）に交換することができる。
【図２８】図２８は、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６（Ｃｙｓ−キャップ除去）反応生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーンは以下の通りである：１．ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６；２．ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６  −  完全還元（ＴＣＥＰ）；３．Ｎｏｖｅｘ  ｓｈａｒｐ予備染色タンパク質標準物質；４．ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６＋３０×ＴＣＥＰ、開始時点；５．ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６＋３０×ＴＣＥＰ、３０分後；６．ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６＋３０×ＴＣＥＰ、６０分後；７．ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６  ＴＣＥＰ処理、緩衝液交換；８．ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６＋１５×ｄＨＡＡ、開始時点；９．ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６＋１５×ｄＨＡＡ、３０分後；１０．ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６＋１５×ｄＨＡＡ、６０分後；１１．ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６、キャップ除去；１２．ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６、キャップ除去、完全還元（ＴＣＥＰ）、ゲル：ＮｕＰＡＧＥビス−トリス４〜１２％、タンパク質量：４μｇ／レーン、３０×ＴＣＥＰ＝３０倍モル過剰のＴＣＥＰ、１５×ｄＨＡＡ＝１５倍モル過剰のｄＨＡＡ
【図２９】図２９は、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２コンジュゲートＣＥＸクロマトグラフィーのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。非還元ゲル：ＮｕＰＡＧＥビス−トリス４〜１２％。緩衝液Ａ：２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５。緩衝液Ｂ：２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、５００ｍＭのＮａＣｌ。レーンは以下の通りである：１．ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６；２．ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２（ロード）；３．Ｎｏｖｅｘ  ｓｈａｒｐ予備染色タンパク質標準物質；４．フロースルー；５．チェイス；６．  ３０％の緩衝液Ｂ−アリコート１；７．  ３０％の緩衝液Ｂ−アリコート２；８．  ３０％の緩衝液Ｂ−アリコート３；９．  ３０％の緩衝液Ｂ−アリコート；１０．  ４０％の緩衝液Ｂ−アリコート１；１１．  ４０％の緩衝液Ｂ−アリコート２；１２．  ４０％の緩衝液Ｂ−アリコート３；１３．  ４０％の緩衝液Ｂ−アリコート４；１４．  ６０％の緩衝液Ｂ−アリコート１；１５．  ６０％の緩衝液Ｂ−アリコート２；１６．  ６０％の緩衝液Ｂ−アリコート３；１７．  １００％の緩衝液Ｂ−ストリップ。レーン６〜１３はタンパク質共役材料を示し、コンジュゲートは大きいサイズに起因してゲルを透過できない。レーン１４〜１７は、凝集した共役および非共役タンパク質材料を場合により含有するタンパク質混合物を示す。
【図３０】図３０は、タンパク質−ポリマーコンジュゲート対非コンジュゲートタンパク質材料のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ゲル分析は、バイオコンジュゲート（レーン３）をＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６参照標準物質（レーン２）と比較した場合に５７％の重鎖および９６％の軽鎖バンド強度比を実証し、これは、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６分子当たり１つのＯＧ１８０２ポリマーの存在を示唆する。還元ゲル：ＮｕＰＡＧＥビス−トリス４〜１２％。還元ゲル：ＮｕＰＡＧＥビス−トリス４〜１２％。
【図３１】図３１は、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２のＳＥＣ−ＭＡＬＳを示す。一体化されたサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｈｏｄｅｘ−ＳＢ８０６Ｍ−ＨＱ）および光散乱（ＭＡＬＳ）を用いてＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６コンジュゲートの分子量を決定した。上パネル．クロマトグラムは単一の溶出ピークの存在を示す。追加のピークおよびショルダーの非存在は凝集物がないことを示唆し、分解した材料が共役およびその後のＣＥＸ分離ステップ後に存在した。下パネル．選択されたピークのタンパク質コンジュゲート分析は、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２バイオコンジュゲートについて９８３ｋＤａの実験的に測定された平均分子量（Ｍｗ）を示した。この値は、１つのＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６分子（Ｍｗ約１８９ｋＤａ）および１つのＯＧ１８０２ポリマー（Ｍｗ約７９４ｋＤａ）の共役の結果としてもたらされる。
【図３２】図３２は、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６  ＣＥＸクロマトグラフィーの結果を示す。ゲル：Ｎｏｖｅｘ  ８〜１６％トリス−グリシン（還元条件）、Ｍ＝ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２標準物質。レーンＤ１２〜Ｆ１１は、クロマトグラムに示唆されるような異なる緩衝液Ｂ濃度においてアリコート化した試料に対応する。インタクト（Ｉ）および切断（Ｃ）重鎖を示唆する。Ｃｏｌｕｍｎ  Ｐｏｒｕｓ  ＸＳにおいて、緩衝液Ａは２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６であり、緩衝液Ｂは２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６、１ＭのＮａＣｌである。
【図３３】図３３は、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６  ＨＩＣクロマトグラフィーの結果を示す。ゲル：Ｎｏｖｅｘ  ８〜１６％トリス−グリシン／還元条件、Ｍ＝ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２標準物質。Ｌ＝ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６インタクトおよび切断混合物（ロード）。残りのレーンは、クロマトグラムに示唆されるような異なる緩衝液Ｂ濃度においてアリコート化した試料に対応する。インタクト（Ｉ）および切断（Ｃ）重鎖を示唆する。Ｃｏｌｕｍｎ  Ｈｉ  Ｔｒａｐ  Ｂｕｔｌｙ  ＨＰにおいて、緩衝液Ａは２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６、１Ｍの硫酸アンモニウムである。緩衝液Ｂは２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６である。
【図３４】図３４は、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ競合ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図３５】図３５は、ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図３６】図３６は、細胞ベースのＶＥＧＦ刺激性ＶＥＧＦＲレポーターアッセイの結果を示す。
【図３７】図３７は、ＨＵＶＥＣにおけるリポ多糖刺激性細管形成を示す。
【図３８】図３８は、ＨＵＶＥＣにおけるリポ多糖刺激性細管形成を示す。
【図３９】図３９は、ＨＵＶＥＣにおけるリポ多糖刺激性細管形成を示す。
【図４０Ａ】図４０Ａは、ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ／ＩＬ６媒介性増殖の阻害を示す。
【図４０Ｂ】図４０Ｂは、ウェル当たりの細胞数の増加と共にＨＵＶＥＣ増殖の阻害を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
新生血管性網膜病理の発生を推進する同時発生的な炎症および欠陥性血管新生を直接的に低減するために、炎症促進性サイトカインＩＬ−６および血管新生促進シグナルタンパク質ＶＥＧＦの機能を同時に遮断する設計された分子が本明細書において提供される。これらの分子は、（２）ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）の２つのＶＥＧＦ結合ドメインに融合した（１）抗ＩＬ−６モノクローナル抗体を含む。抗ＩＬ−６部分はＩＬ−６に特異的に結合し、ＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）とのその相互作用を阻害する。ＶＥＧＦトラップ部分は、ＶＥＧＦトラップとして働く２つのＶＥＧＦ結合ドメイン（ＶＥＧＦＲ１ドメイン２、ＶＥＧＦＲ２ドメイン３）の融合物を含み、ＶＥＧＦがＶＥＧＦ受容体に結合することを防止する。追加的に、一部の実施形態では、これらの二重阻害剤分子のそれぞれは、半減期延長性のホスホリルコリンベースのバイオポリマーと共役し得るそのＣ末端において対形成していないシステインを備えている。
【００５６】
本明細書において提供される様々な実施形態は、他に示唆されなければ、当該技術分野の技術的範囲内である、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を用いる。そのような技術は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic
Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and
Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR:  The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies:  a practical approach (D. Catty., ed., IRL
Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies:  a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies:  a laboratory
manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)
などの文献において充分に説明されている。
【００５７】
以下の用語は、他に示唆されなければ、以下の意味を有するものとして理解される：「単離された分子」という用語は、その起源または供給源のために、（１）その天然の状態においてそれと一緒にある天然に関連付けられる成分と関連付けられておらず、（２）同じ供給源、例えば、種、それが発現される細胞、ライブラリーなどからの他の分子を実質的に含まず、（３）異なる種からの細胞により発現され、または（４）天然に存在しない、分子（分子は、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体である）を指す。そのため、化学合成された、またはそれが天然に起源とするシステムとは異なる細胞システムにおいて発現された分子は、その天然に関連付けられる成分から「単離され」ている。分子はまた、当該技術分野において周知の精製技術を使用して、単離により天然に関連付けられる成分を実質的に含まないものとされてもよい。分子の純度または均質性は、当該技術分野において周知の多数の手段によりアッセイすることができる。例えば、ポリペプチド試料の純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および当該技術分野において周知の技術を使用してポリペプチドを可視化するためのゲルの染色を使用してアッセイされてもよい。ある特定の目的のために、ＨＰＬＣまたは精製のために当該技術分野において周知の他の手段を使用することによってより高い分離度が提供されてもよい。
【００５８】
本明細書において使用される場合、他に指定されなければ、「ＩＬ−６」または「ＩＬ６」という用語はヒトＩＬ−６を指す。一部の実施形態では、他の形態のＩＬ−６が想定され、他の生物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシへの特定の参照により指定される。１つの例示的なヒトＩＬ−６はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０５２３１として見出される。
【００５９】
本明細書に記載の抗ＩＬ−６抗体または他の生物学的製剤は、典型的には、単離された形態において提供される。これは、抗体は、典型的には、その製造または精製から生じる干渉性タンパク質および他の夾雑物から少なくとも５０％ｗ／ｗ純粋であるが、抗体がその使用を促進する意図の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせられる可能性を除外しないことを意味する。場合により、抗体は、製造または精製からの干渉性タンパク質および夾雑物から少なくとも６０、７０、８０、９０、９５または９９％ｗ／ｗ純粋である。多くの場合に、抗体（または抗体コンジュゲート）は、その精製後に残存する主要な高分子種である。
【００６０】
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を通じて、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、該用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、他に指定されなければ、特異的結合のためにインタクトな抗体と競合するその任意の抗原結合部分、抗原結合部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された構成を包含する。抗原結合部分としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ、例えば、サメおよびラクダ科動物抗体）、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む断片、単鎖可変断片抗体（ｓｃＦｖ）、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖ、ならびにポリペプチドへの特異的な抗原結合を付与するために充分な免疫グロブリンの少なくとも一部分を含有するポリペプチドが挙げられる。抗体としては、任意のクラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそのサブクラス）の抗体が挙げられ、抗体は任意の特定のクラスである必要はない。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分割することができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、アルファ、デルタ、
イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元配置は周知である。
【００６１】
抗体の「可変領域」は、単独または組合せのいずれかの、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。当該技術分野において公知のように、重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域としても公知の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により接続された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなり、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。対象可変領域のバリアント、特に、ＣＤＲ領域の外部（すなわち、フレームワーク領域中）のアミノ酸残基において置換を有するバリアントが所望される場合、対象可変領域を、対象可変領域と同じカノニカル（canonincal）なクラスのＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列を含有する他の抗体の可変領域と比較することにより、適切なアミノ酸置換、好ましくは、保存的アミノ酸置換が同定され得る（Chothia and Lesk, J Mol Biol 196(4): 901-917, 1987）。
【００６２】
ある特定の実施形態では、ＣＤＲの確定的記述および抗体の結合部位を含む残基の同定は、抗体の構造を解明することおよび／または抗体−リガンド複合体の構造を解明することにより達成される。ある特定の実施形態では、それは、Ｘ線結晶学などの、当業者に公知の様々な技術のいずれかにより達成され得る。ある特定の実施形態では、ＣＤＲ領域を同定しまたは見積もるために様々な解析方法が用いられ得る。そのような方法の例としては、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、ＩＭＧＴアプローチ（Lefranc et al., 2003) Dev Comp Immunol. 27:55-77）、Ｐａｒａｔｏｍｅなどのコンピュータプログラム（Kunik et al., 2012, Nucl Acids Res. W521-4）、ＡｂＭの定義、および立体構造の定義が挙げられるがそれに限定されない。
【００６３】
Ｋａｂａｔの定義は、抗体中の残基のナンバリングのための標準であり、典型的には、ＣＤＲ領域を同定するために使用される。例えば、Johnson & Wu, 2000, Nucleic Acids Res., 28: 214-8を参照。Ｃｈｏｔｈｉａの定義はＫａｂａｔの定義に類似するが、Ｃｈ
ｏｔｈｉａの定義はある特定の構造的ループ領域の位置を考慮に入れる。例えば、Chothia et al., 1986, J. Mol. Biol., 196: 901-17; Chothia et al., 1989, Nature, 342: 877-83を参照。ＡｂＭの定義は、抗体構造をモデル化するＯｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ  Ｇｒｏｕｐにより製造された一体化された一連のコンピュータープログラムを使用する。例えば、Martin et al., 1989, Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272; “AbMTM, A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies,” Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd.を参照。ＡｂＭの定義は、Samudrala et al., 1999, “Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach,” in PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3:194-198により記載されるものなどの、ナレッジデータベースとａｂ  ｉｎｉｔｉｏ法との組合せを使用して一次配列から抗体の三次構造をモデル化する。コンタクト定義（contact definition）は、利用可能な複合体結晶構造の解析に基づく。例えば、MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 5:732-45を参照。ＣＤＲの「立体構造の定義」と本明細書において称される別のアプローチ
では、ＣＤＲの位置は、抗原結合にエンタルピー的に寄与する残基として同定され得る。例えば、Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166を参
照。さらに他のＣＤＲの境界定義は、上記のアプローチの１つに厳密には従わないことがあるが、それにもかかわらずＫａｂａｔ  ＣＤＲの少なくとも一部分と重なり合う。但し、それは、特定の残基または残基群が抗原結合に顕著に影響しないという予測または実験的発見に照らして短縮または拡大されることがある。本明細書において使用される場合、ＣＤＲは、アプローチの組合せを含む、当該技術分野において公知の任意のアプローチにより定義されるＣＤＲを指すことができる。本明細書において使用される方法は、これらのアプローチのいずれかにしたがって定義されるＣＤＲを利用してもよい。１つより多くのＣＤＲを含有する任意の所与の実施形態のために、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈ
ｉａ、拡張（extended）、ＩＭＧＴ、Ｐａｒａｔｏｍｅ、ＡｂＭ、および／もしくは立体構造の定義のいずれか、または上記のいずれかの組合せにしたがって定義されてもよい。
【００６４】
当該技術分野において公知のように、抗体の「定常領域」は、単独または組合せのいずれかの、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指す。
【００６５】
本明細書において使用される場合、「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る起こり得る天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を標的とする。さらには、異なる決定因子（エピトープ）を標的とする異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定因子を標的とする。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均質な集団から得られるという抗体の特徴を示唆し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明にしたがって使用されるモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495により
最初に記載されたハイブリドーマ法により製造されてもよく、または米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるものなどの組換えＤＮＡ法により製造されてもよい。モノクローナル抗体はまた、例えば、McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554に記載され
る技術を使用して生成されるファージライブラリーから単離されてもよい。本明細書において使用される場合、「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２もしくは抗体の他の抗原結合部分配列）である非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。好ましくは、ヒト化抗体は、レシピエントのＣＤＲからの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基により置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもインポートされるＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されないが、抗体性能をさらに精密化および最適化するために含められる残基を含んでもよい。
【００６６】
「ヒト抗体」は、ヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し、かつ／または本明細書に開示されるようなヒト抗体を製造するための任意の技術を使用して製造された抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００６７】
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列が１つの種に由来しかつ定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来しかつ定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指すことが意図される。「エピトープ」という用語は、抗体の抗原結合領域の１つまたはそれ以上において抗体により認識および結合されることができる分子の部分を指す。エピトープは、多くの場合に、アミノ酸または糖側鎖などの分子の表面グルーピングからなり、特定の三次元構造的特徴の他に特定の電荷的特徴を有する。一部の実施形態では、エピトープはタンパク質エピトープであり得る。タンパク質エピトープは線形（linear）または立体構造（conformational）であり得る。線形エピトープでは、タンパク質と相互作用分子（例えば、抗体）との間の相互作用点の全てはタンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線状に起こる。「非線形エピトープ」または「立体構造エピトープ」は、エピトープに特異的な抗体が結合する抗原タンパク質内の非連続のポリペプチド（またはアミノ酸）を含む。本明細書において使用される「抗原エピトープ」という用語は、当該技術分野において周知の任意の方法により、例えば、従来のイムノアッセイにより決定されるような、抗体が特異的に結合することができる抗原の部分として定義される。抗原上の所望のエピトープが決定されたら、例えば、本明細書に記載の技術を使用して、そのエピトープに対する抗体を生成することができる。代替的に、創薬プロセス（di
scovery process）の間に、抗体の生成および特徴付けにより望ましいエピトープに関す
る情報が解明されることがある。この情報から次に、同じエピトープに結合するための抗体を競合的にスクリーニングすることができる。これを達成するためのアプローチは、ＩＬ−６への結合について互いに競合または相互競合する抗体、例えば、抗原への結合について競合する抗体を見出すための競合および交差競合研究を行うことである。
【００６８】
「競合する」という用語は、抗体に関して本明細書において使用される場合、そのコグネイトエピトープとの第１の抗体の結合の結果が、第２の抗体の非存在下での第１の抗体の結合と比較して、第２の抗体の存在下で検出可能に減少するように、第１の抗体、またはその抗原結合部分が、第２の抗体、またはその抗原結合部分の結合に充分に類似した方式においてエピトープに結合することを意味する。そのエピトープへの第２の抗体の結合もまた第１の抗体の存在下で検出可能に減少するという選択肢が該当し得るが、その必要はない。すなわち、第２の抗体がその各々のエピトープへの第１の抗体の結合を阻害することなく、第１の抗体はそのエピトープへの第２の抗体の結合を阻害し得る。しかしながら、同じ、より高い、またはより低い程度のいずれであれ、各抗体がそのコグネイトエピトープまたはリガンドとの他の抗体の結合を検出可能に阻害する場合、抗体は、各々のエピトープの結合について互いに「相互競合する」と言われる。競合的抗体および交差競合的抗体の両方が本発明により包含される。そのような競合または交差競合が起こる機序（例えば、立体障害、立体構造変化、または共通のエピトープ、もしくはその部分への結合）にかかわらず、当業者は、本明細書において提供される教示に基づいて、そのような競合的および／または交差競合的抗体が包含され、本明細書に開示される方法のために有用であり得ることを理解する。
【００６９】
本明細書において使用される場合、抗体は、平衡解離定数が２０ｎＭに等しいまたはそれ未満、好ましくは約６ｎＭ未満、より好ましくは約１ｎＭ未満、最も好ましくは約０．７５ｎＭ未満である場合にＩＬ−６と「相互作用」する。一部の実施形態では、抗体の親和性は、４００〜８００ｐＭ、例えば、４５０〜７００、または５００〜６００ｐＭである。
【００７０】
ＩＬ−６アンタゴニスト抗体は、ＩＬ−６Ｒへの結合、ｇｐ１３０へのＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体の結合、Ｓｔａｔ３のリン酸化および活性化、細胞増殖、ならびにＩＬ−６媒介性の炎症性または血管新生促進経路の刺激などのＩＬ−６の生物学的活性を（有意な程度を含む任意の程度まで）遮断し、アンタゴナイズし、抑制しまたは低減する抗体を包含する。本開示の目的のために、「ＩＬ−６アンタゴニスト抗体」という用語は、ＩＬ−６自体、ＩＬ−６の生物学的活性、または生物学的活性の帰結が、任意の意味のある程度において、実質的に無化され、減少し、または中和される、全ての以前に同定された用語、タイトル、ならびに機能的な状態および特徴を包含することが明示的に理解される。一部の実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体はＩＬ−６に結合する。ＩＬ−６アンタゴニスト抗体の例は本明細書において提供される。
【００７１】
エピトープに「優先的に結合する」または「特異的に結合する」（本明細書において交換可能に使用される）抗体は当該技術分野においてよく理解された用語であり、そのような特異的または優先的な結合を決定する方法もまた当該技術分野において周知である。分子は、代替的な細胞または物質よりも特定の細胞または物質とより頻繁に、かつ／またはより迅速に、かつ／またはより長い継続期間でかつ／またはより高い親和性で反応または会合する場合に、「特異的結合」または「優先的結合」を呈すると言われる。抗体は、それが他の物質に結合するよりも高い親和性で、かつ／またはアビディティで、かつ／またはより容易に、かつ／またはより長い継続期間で結合する場合に標的に「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。例えば、ＩＬ−６エピトープに特異的または優先的に結合する抗体は、それが他のＩＬ−６エピトープまたは非ＩＬ−６エピトープに結合する
よりも高い親和性で、かつ／またはアビディティで、かつ／またはより容易に、かつ／またはより長い継続期間でこのエピトープに結合する抗体である。例えば、第１の標的に特異的または優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）は第２の標的に特異的または優先的に結合してもよくまたは結合しなくてもよいこともまたこの定義を読むことにより理解される。そのため、「特異的結合」または「優先的結合」は、排他的な結合を必ずしも必要としない（但し、それを含み得る）。必ずしもそうではないが、概しては、結合への言及は優先的な結合を意味する。
【００７２】
本明細書において使用される場合、「実質的に純粋」は、少なくとも５０％純粋（すなわち、夾雑物を含まない）、より好ましくは少なくとも９０％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、さらにより好ましくは少なくとも９８％純粋、最も好ましくは少なくとも９９％純粋な材料を指す。
【００７３】
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチド挿入物の組込み用のベクターのレシピエントであり得るまたは該レシピエントであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞としては単一の宿主細胞の子孫が挙げられ、子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な変異に起因して元の親細胞と必ずしも完全に同一（形態またはゲノムＤＮＡ相補体（complement）において）でなくてもよい。宿主細胞としては、本発明のポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞が挙げられる。
【００７４】
当該技術分野において公知のように、「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域またはバリアントＦｃ領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、位置Ｃｙｓ２２６、またはＰｒｏ２３０のアミノ酸残基から、そのカルボキシル末端まで広がるものとして定義される。Ｆｃ領域中の残基のナンバリングは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスのものである。Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991。免疫グロブリンのＦｃ領域は、概しては、２つの定常ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。当該技術分野において公知のように、Ｆｃ領域は、二量体または単量体形態で存在し得る。
【００７５】
当該技術分野において使用される場合、「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載する。好ましいＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、これらの受容体のアリルバリアントおよび選択的スプライシング形態を含む、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が挙げられる。ＦｃγＲＩＩ受容体としては、主にその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が挙げられる。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, 1991,  Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34;およびde Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41において総説されている。「ＦｃＲ」としてはまた、新生児受容体、ＦｃＲｎが挙げ
られ、これは母系ＩｇＧの胎児への移行に関与する（Guyer et al., 1976, J. Immunol.,
117:587;およびKim et al., 1994, J. Immunol., 24:249）。
【００７６】
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を有する。例示的な「エフェクター機能」としては、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節などが挙げられる。そのようなエフェクター機能は、概しては、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わせられるＦｃ領域を必要とし、そのような抗体エフェクター機能を評価するための当該技術分野において公知の様々なアッセイを
使用して評価され得る。
【００７７】
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然において見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸改変により天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含むが、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を保持する。好ましくは、バリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列Ｆｃ領域中または親ポリペプチドのＦｃ領域中の約１〜約１０アミノ酸の置換、好ましくは約１〜約５アミノ酸の置換を有する。本明細書におけるバリアントＦｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列同一性を有し、最も好ましくはそれと少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくはそれと少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。
【００７８】
本明細書において使用される場合、「治療」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。
【００７９】
本明細書において使用される場合、「ＩＬ−６および／またはＶＥＧＦ関連障害」は、例えば、眼障害および全身障害を含む。眼障害としては、眼障害、例えば、眼科炎症性疾患強膜炎、非増殖性糖尿病網膜症、増殖性糖尿病網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫の予防、増殖性糖尿病網膜症の予防、滲出型加齢黄斑変性症、滲出型加齢黄斑変性症の予防、乾燥型加齢黄斑変性症、網膜浮腫を伴うまたは伴わない目およびまたは網膜血管の静脈、動脈または他の閉塞、前部および後部ぶどう膜炎、ぶどう膜炎黄斑浮腫、ならびに眼内腫瘍が挙げられる。ＩＬ−６関連障害としてはまた、ＩＬ−６Ｒまたは可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＩＬ−６Ｒ）と相互作用するＩＬ−６に起因してＩＬ−６活性のレベルが上昇する障害が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書において提供される融合タンパク質のいずれか１つもしくはそれ以上および／または本明細書において提供されるコンジュゲートのいずれか１つもしくはそれ以上は、ＩＬ−６および／またはＶＥＧＦ関連障害のいずれか１つまたはそれ以上の治療または予防のために使用され得る。一部の実施形態では、障害は、グレーブス病もしくは視神経脊髄炎などの目に影響する全身性疾患、または多発性硬化症、関節リウマチなどの目に影響しない全身性疾患を含む。一部の実施形態では、障害は、ＣＡＲ−Ｔまたは類似の免疫腫瘍学的治療後のサイトカイン放出症候群を含む。
【００８０】
追加的に、抗ＩＬ６分子は、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１分子を用いた治療後に観察されるＩＬ−６発現の誘導を妨げる（Tsukamoto et al, Cancer Res; 2018 78(17); 5011-22）
。ＶＥＧＦシグナル伝達の遮断は、抗ＰＤ−Ｌ１治療を向上させ得ることも示されている（Allen et al, Sci Transl Med 2017 April 12: 9(385)）。そのため、これらの二重阻
害剤は、がんを相乗的に治療するために、ＰＤ−１／ＰＤＬ−１モジュレーターおよび／または他の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用され得る。他の障害としては、抗ＩＬ６療法が抗ＶＥＧＦ治療に対して追加の利益を示し得る膠芽腫における脳浮腫を挙げることができる。他の障害としては、固形腫瘍を伴うものが挙げられる。
【００８１】
本明細書において使用される場合、「寛解させる」は、ＩＬ−６抗体、ＩＬ−６抗体−ＶＥＧＦトラップ融合物、ＩＬ−６抗体のコンジュゲート、および／またはＩＬ−６抗体−ＶＥＧＦトラップ融合物のコンジュゲートを投与しない場合と比較して１つまたはそれ以上の症状を縮小または改善させることを意味する。「寛解させる」はまた、症状の継続期間の短縮または低減を含む。
【００８２】
本明細書において使用される場合、「ＶＥＧＦトラップ」または類似の用語は、ＶＥＧ
Ｆ結合ドメイン（ＶＥＧＦＲ１ドメイン２、ＶＥＧＦＲ２ドメイン３）を表す。この断片は、タンパク質がＶＥＧＦトラップとして働いて、細胞に発現されたＶＥＧＦ受容体にＶＥＧＦが結合することを防止する。この配列の例は、表１Ｃに見出すことができる。一部の実施形態では、ＶＥＧＦトラップは、ＶＥＧＦＲ１ドメイン２、ＶＥＧＦＲ２ドメイン３のみを含む。トラップタンパク質の様々な実施形態は当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許出願公開第２０１５０３７６２７１号に見出すことができ、その全体は、様々なＶＥＧＦトラップの実施形態（ＶＥＧＦＲタンパク質またはその断片である）およびその融合物に関して、参照することにより本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、「ＶＥＧＦトラップ」という用語または類似の用語は、少なくとも１つのＶＥＧＦとＶＥＧＦＲとのシグナル伝達をアンタゴナイズできる全長細胞外領域もしくはその任意の部分、または異なるＶＥＧＦ受容体からの部分の組合せを指す。
【００８３】
本明細書において使用される場合、「ＩＬ−６抗体−ＶＥＧＦトラップ融合物」、「ＩＬ−６抗体−ＶＥＧＦトラップ」、「Ａｂ  ＩＬ−６−ＶＥＧＦトラップ」、「抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦトラップ」、「ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６」、「ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６」、「ＶＥＧＦトラップ−抗ＩＬ６抗体融合物（ＴＡＦ）」、「ＶＥＧＦトラップ−ＩＬ６」、「ＶＥＧＦＲ  ＩＬ−６」、「ＩＬ６−ＶＥＧＦＲ」または類似の用語または逆転した用語（例えば、「ＶＥＧＦトラップ−ＩＬ−６  Ａｂ」、「ＶＥＧＦトラップ−ＩＬ−６抗体融合物」など）は、ＩＬ−６抗体とＶＥＧＦトラップとの融合物を表す。実施形態は図６において示される。一般的に使用される場合、２つの用語の順序は取り替えられ得る。具体的に使用される場合、２つの用語の順序は構築物中の成分の相対位置を表す。「Ａｂ−トラップ」、「ＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ」「Ａｂ  ＩＬ−６  ＶＥＧＦトラップ」または「Ａｂ  ＩＬ−６−トラップ」または「抗ＩＬ−６  ＶＥＧＦトラップ」、「トラップ−Ａｂ」、抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦＲ、抗ＩＬ６−ＶＥＧＦＲという用語または他の類似の用語または逆転した用語（例えば、「ＶＥＧＦトラップ−ＩＬ−６  Ａｂ」、「ＶＥＧＦトラップ−ＩＬ−６抗体融合物」など）は、ＶＥＧＦトラップを提供するようにＶＥＧＦ結合タンパク質の関連するドメインに融合したＡｂのアレンジメントを表す。上述したように、ＶＥＧＦ結合タンパク質のこのセクションは、ＶＥＧＦがＶＥＧＦ受容体に結合するのを防止するものである。本明細書に記載されるように、トラップおよび抗体セクションのアレンジメント（順序）は変更され得る。そのため、他に明示的にまたは文脈により表されない限り、Ａｂ−トラップ（またはＩｌ−６／ＶＥＧＦトラップなど）融合物に関して本明細書において使用される語句は、抗体およびトラップの配置についての全ての開示される実施形態を表す。そのため、他に説明されなければ、Ａｂ−トラップ（またはＩｌ−６／ＶＥＧＦトラップなど）の語句は、図６における左の実施形態、および図６における右の実施形態、および図６における両方の実施形態を表す。そのため、一般的表現は、簡便性のために３つ全てのオプションを開示するものとして表される。配向性が特に表される場合、それは、例えば、「アレンジメント」は、トラップ−Ａｂ、トラップＩＬ−６  Ａｂ、ＶＥＧＦトラップＡｂ  ＩＬ−６、ＶＥＧＦトラップＡｂ  ＩＬ６の１つであり得ることを記載することにより表され得る。同様に、本明細書の実施例の一部の文脈は、実施例の文脈により表される、分子の特定の配向性またはアレンジメントであることが理解されるであろう。両方のアレンジメント（選択的におよび組合せで）が、本明細書において提供される融合タンパク質の全ての議論のために明示的に想定される。追加的に、順序に起因して、ＩＬ−６  Ａｂという語句は、融合タンパク質の文脈において使用される場合、図６の左側の抗体が連続するオプション、およびトラップがＡｂ「内」に配置されるオプション（図６の右側）の両方を含むことが理解される。また、「Ａｂ」または「抗体」という用語（または他の類似の用語）は、融合タンパク質の文脈において使用される場合、他���記載されなければ、３つ全てのオプション（図６の左側、図６の右側、および両方のオプション）を包含する。一部の実施形態では、ＶＥＧＦトラップは、以下の方式：ＩＬ−６  ＶＨを含む重鎖のＮ末端、またはヒンジ領域とＩＬ−６  ＶＨを含む重鎖のＣＨ１ドメインの後ろとの間の１つにおいてＩＬ−６に融合している。抗体
またはその断片を指定するための名称において使用される場合のＡｂ、抗体、「抗」または他の類似の用語の呼称の間に差異はない。「Ｉｌ−６」または「ＩＬ６」または「ＩＬ−６」の呼称の間に差異はない。ＩＬ−６との融合構築物に言及する場合に本明細書において使用される場合、「ＶＥＧＦ」、「ＶＥＧＦＲ」、「ＶＥＧＦトラップ」、「ＶＥＧＦＲトラップ」という用語は交換可能に使用される。該用語は、ＩＬ−６融合物のアレンジメントとは別々に使用される場合に異なる意味を有することがあり、それは問題とする用語の文脈に依存する。
【００８４】
本明細書において使用される場合、「バイオポリマー」という用語は、ポリマーが目的のタンパク質に連結されていることを表す。該用語はまた、タンパク質の「共役」形態として記載され得る。これは、本明細書に記載のタンパク質の全てについて為され得る。そのため、ＩＬ−６  ＡｂバイオポリマーおよびＩＬ−６抗体−ＶＥＧＦトラップバイオポリマーは、本明細書において提供される全てのそのようなＩＬ−６  ＡｂおよびＩＬ−６抗体−ＶＥＧＦトラップについて想定される。追加的に、ＶＥＧＦトラップバイオポリマーもまた提供される。
【００８５】
本明細書において使用される場合、「アンタゴニスト抗体」は、抗体が結合する分子の１つまたはそれ以上の機能または活性を遮断する抗体を表す。
【００８６】
本明細書において使用される場合、薬物、化合物、または医薬組成物の「有効投与量」または「有効量」は、いずれか１つまたはそれ以上の有益なまたは所望の結果をもたらすために充分な量である。より特定の態様では、有効量は、疾患の症状を予防し、緩和しもしくは寛解させ、かつ／または治療されている対象の生存を長期化させる。予防的使用のために、有益なまたは所望の結果としては、疾患の生化学的、組織学的および／もしくは行動的症状、その合併症ならびに疾患の発生の間に現れる中間的な病理学的表現型を含む、疾患のリスクを除去もしくは低減すること、重篤度を減少させること、または開始を遅延させることが挙げられる。治療的使用のために、有益なまたは所望の結果としては、疾患、例えば、ＡＭＤ（非限定的に例えば、萎縮型ＡＭＤ（dry ＡＭＤ）および滲出型ＡＭＤ（wetＡＭＤ）を含む）などの１つもしくはそれ以上の症状を低減すること、疾患を治
療するために必要とされる他の医薬の用量を減少させること、別の医薬の効果を増進すること、および／または患者においてＡＭＤの進行を遅延させることなどの臨床結果が挙げられる。有効投与量は、１つまたはそれ以上の投与において投与され得る。本発明の目的のために、薬物、化合物、または医薬組成物の有効投与量は、直接的または間接的のいずれかにおいて予防的または治療的処置を達成するために充分な量である。臨床的文脈において理解されるように、薬物、化合物、または医薬組成物の有効投与量は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と組み合わせて達成されてもよく、またはそうでなくてもよい。そのため、「有効投与量」は、１つまたはそれ以上の治療剤を投与する文脈において考えられてもよく、単一の剤は、１つまたはそれ以上の他の剤と組み合わせて、望ましい結果が達成され得るまたは達成される場合に、有効量において与えられると考えられてもよい。
【００８７】
抗ＩＬ−６抗体は、効果的なレジーム、すなわち、発症を遅延させ、重篤度を低減し、さらなる劣化を阻害し、かつ／または障害の少なくとも１つの徴候もしくは症状を寛解させる投与量、投与経路および投与頻度において投与される。患者が障害を既に患っている場合、レジームは治療有効レジームと称され得る。患者が一般的集団と比べて障害の上昇したリスクがあるが症状を未だ経験していない場合、レジームは予防有効レジームと称され得る。一部の事例では、治療的または予防的有効性は、既存対照または同じ患者における過去の経験と比べて個々の患者において観察され得る。他の事例では、治療的または予防的有効性は、治療されていない患者の対照集団と比べて治療された患者の集団において前臨床または臨床試験において実証され得る。
【００８８】
抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦトラップは、効果的なレジーム、すなわち、発症を遅延させ、重篤度を低減し、さらなる劣化を阻害し、かつ／または障害の少なくとも１つの徴候もしくは症状を寛解させる投与量、投与経路および投与頻度において投与される。患者が障害を既に患っている場合、レジームは治療有効レジームと称され得る。患者が一般的集団と比べて障害の上昇したリスクがあるが症状を未だ経験していない場合、レジームは予防有効レジームと称され得る。一部の事例では、治療的または予防的有効性は、既存対照または同じ患者における過去の経験と比べて個々の患者において観察され得る。他の事例では、治療的または予防的有効性は、治療されていない患者の対照集団と比べて治療された患者の集団において前臨床または臨床試験において実証され得る。
【００８９】
物質の「生物学的半減期」は、生物への物質の導入後に生物から物質の半分が除去されるために必要とされる時間を指定する薬物動態パラメーターである。
【００９０】
「予防すること」または「予防する」という用語は、（ａ）障害が起こらないままにすること、（ｂ）障害の発症もしくは障害の症状の発症を遅延させること、または（ｃ）既存の状態の進行を緩慢化させることを指す。他に表されなければ、「予防すること」は、事象が起こることを絶対的に差し止めることを必要としない。
【００９１】
「個体」または「対象」は、哺乳動物または鳥、より好ましくは、ヒトである。哺乳動物としてはまた、農用動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリなど）、競技動物、愛玩動物、霊長動物、ウマ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットが挙げられるがそれに限定されない。
【００９２】
本明細書において使用される場合、「ベクター」は、宿主細胞に目的の１つまたはそれ以上の遺伝子または配列を送達し、かつ好ましくは、該細胞中でそれを発現させることができる、構築物を意味する。ベクターの例としては、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、陽イオン性縮合剤と会合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中に封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、およびある特定の真核細胞、例えばプロデューサー細胞が挙げられるがそれに限定されない。
【００９３】
本明細書において使用される場合、「発現制御配列」は、核酸の転写を指令する核酸配列を意味する。発現制御配列は、プロモーター、例えば構成的もしくは誘導性プロモーター、またはエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写される核酸配列に作動可能に連結される。
【００９４】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」または「薬学的な許容される賦形剤」は、活性成分と組み合わせられた場合に、該成分が生物学的活性を保持することを可能としかつ対象の免疫系と非反応性である任意の材料を含む。例としては、標準的な薬学的担体のいずれか、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルション、例えば、油／水エマルション、様々な種類の湿潤剤、界面活性剤、例えば、凝集を予防するためのポリソルベート２０、および糖、例えば、凍結保護剤としてのスクロースが挙げられるがそれに限定されない。エアロゾルまたは非経口投与のための好ましい希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または生理食塩水（０．９％）である。そのような担体を含む組成物は、周知の従来法により配合される（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990;およびRemington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000を参照）。
【００９５】
「ｋｏｎ」という用語は、本明細書において使用される場合、抗原への抗体（またはバイオコンジュゲート）の会合の速度定数を指す。特に、速度定数（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）ならびに平衡解離定数は、全長抗体および／またはＦａｂ抗体断片（すなわち、１価）ならびにＩＬ−６を使用して測定される。
【００９６】
「ｋｏｆｆ」という用語は、本明細書において使用される場合、抗体／抗原複合体からの抗体（またはバイオコンジュゲート）の解離の速度定数を指す。
【００９７】
「ＫＤ」という用語は、本明細書において使用される場合、抗体−抗原（またはバイオコンジュゲート−抗原）相互作用の平衡解離定数を指す。
【００９８】
本明細書における「約」の値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーター自体を対象とする実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」を指す記載は、「Ｘ」の記載を含む。数値範囲は、範囲を定義する数を含む。
【００９９】
「患者」という用語は、予防的処置または治療的処置のいずれかを与えられるヒトおよび他の対象（哺乳動物を含む）を含む。
【０１００】
保存的または非保存的としてアミノ酸置換を分類する目的のために、アミノ酸は以下のようにグループ分けされる：群Ｉ（疎水性側鎖）：ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；群ＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；群ＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；群ＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；群Ｖ（鎖配向に影響を及ぼす残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および群ＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換は、同じクラスのアミノ酸の間の置換を伴う。非保存的置換は、これらの１つのクラスのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを構成する。
【０１０１】
配列同一性パーセンテージは、可変領域についてＫａｂａｔのナンバリング規則または定常領域についてＥＵナンバリングにより最大にアライメントされた抗体配列を用いて決定される。アライメント後に、対象抗体領域（例えば、重鎖または軽鎖の成熟可変領域全体）が参照抗体の同じ領域と比較される場合、対象抗体領域と参照抗体領域との配列同一性パーセンテージは、対象抗体領域および参照抗体領域の両方において同じアミノ酸により占有された位置の数を、ギャップをカウントせずに、２つの領域のアライメントされた位置の総数で割り、１００を掛けてパーセンテージに変換したものである。他の配列の配列同一性は、デフォルトのギャップパラメーターを使用して、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ中のＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムを使用して配列をアライメントすることにより、または検査、および最良のアライメント（すなわち、比較ウィンドウにわたり配列類似度の最高のパーセンテージを結果としてもたらす）により決定され得る。配列同一性のパーセンテージは、比較のウィンドウにわたり２つの最適にアライメントされた配列を比較し、両方の配列において同一の残基が起こる位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較のウィンドウ中の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）により割り、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出される。
【０１０２】
「抗体依存性細胞傷害」、またはＡＤＣＣという用語は、溶解活性を有する免疫細胞（エフェクター細胞とも称される）との抗体コーティング標的細胞（すなわち、結合した抗体を有する細胞）の相互作用に依存する細胞死を誘導する機構である。そのようなエフェクター細胞としては、ナチュラルキラー細胞、単球／マクロファージおよび好中球が挙げ
られる。ＡＤＣＣは、細胞に結合した抗体のＦｃ領域と、好中球、マクロファージおよびナチュラルキラー細胞などの免疫エフェクター細胞上のＦｃγ受容体、特にＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩとの相互作用により誘発される。標的細胞は、媒介性エフェクター細胞の種類に依存して、食作用または溶解により除去される。抗体コーティング標的細胞の死は、エフェクター細胞活性の結果として起こる。
【０１０３】
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体からのＣＤＲがヒト「アクセプター」抗体配列にグラフトされた遺伝子操作された抗体である（例えば、Ｑｕｅｅｎ、ＵＳ５，５３０，１０１および５，５８５，０８９；Ｗｉｎｔｅｒ、ＵＳ５，２２５，５３９、Ｃａｒｔｅｒ、ＵＳ６，４０７，２１３、Ａｄａｉｒ、ＵＳ５，８５９，２０５  ６，８８１，５５７、Ｆｏｏｔｅ、ＵＳ６，８８１，５５７を参照）。アクセプター抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、そのような配列の複合物、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、または生殖細胞系列領域配列であり得る。そのため、ヒト化抗体は、ドナー抗体からの一部または全てのＣＤＲを全体的または実質的に有し、かつ、ヒト抗体配列からの可変領域フレームワーク配列および存在する場合は定常領域を全体的または実質的に有する抗体である。同様に、ヒト化重鎖は、ドナー抗体重鎖からの少なくとも１、２および通常は３つ全てのＣＤＲを全体的または実質的に有し、かつヒト重鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列からの重鎖可変領域フレームワーク配列および存在する場合は重鎖定常領域を実質的に有する。同様に、ヒト化軽鎖は、ドナー抗体軽鎖からの少なくとも１、２および通常は３つ全てのＣＤＲを全体的または実質的に有し、かつヒト軽鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列からの軽鎖可変領域フレームワーク配列および存在する場合は軽鎖定常領域を実質的に有する。ナノボディおよびｄＡｂ以外のヒト化抗体は、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を含む。ヒト化抗体中のＣＤＲは、対応する残基（Ｋａｂａｔによる定義）の少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％が各々のＣＤＲ間で同一である場合に実質的に非ヒト抗体中の対応するＣＤＲからのものである。抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域は、Ｋａｂａｔにより定義される対応する残基の少なくとも８５、９０、９５または１００％が同一である場合に実質的にそれぞれヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域からのものである。
【０１０４】
ヒト化抗体は多くの場合にマウス抗体からの６つ全てのＣＤＲ（好ましくはＫａｂａｔにより定義される）を組み込んでいるが、それはまた、全てより少ないＣＤＲ（例えば、マウス抗体からの少なくとも３、４、または５つのＣＤＲ）を有するように製造され得る（例えば、Pascalis et al, J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36: 1079-1091, 1999; Tamura et al, Journal of Immunology, 164: 1432-1441 , 2000）。
【０１０５】
キメラ抗体は、非ヒト抗体（例えば、マウス）の軽鎖および重鎖の成熟可変領域がヒト軽鎖および重鎖定常領域と組み合わせられた抗体である。そのような抗体は、マウス抗体の結合特異性を実質的または全体的に保持し、ヒト配列の約３分の２である。
【０１０６】
ベニヤ化抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲの一部および通常は全てならびに非ヒト可変領域フレームワーク残基の一部を保持するが、ＢまたはＴ細胞エピトープに寄与し得る他の可変領域フレームワーク残基、例えば露出した残基（Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991）をヒト抗体配列の対応する位置からの残基により置換したヒト化抗体の一種である。結果物は、ＣＤＲが全体的または実質的に非ヒト抗体からのものでありかつ非ヒト抗体の可変領域フレームワークが置換によってよりヒト様とされた抗体である。ヒト抗体は、ヒトから単離され得るか、または他に（例えば、トランスジェニックマウスにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでもしくはファージディスプレイにより）ヒト免疫グロブリン遺伝子の発現の結果としてもたらされ得る。ヒト抗体を製造する方法としては、Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983)；Ｏｅｓｔｂｅｒｇ、米国特許第４，６３４，６６４号；および
Ｅｎｇｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，６３４，６６６号のトリオーマ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスの使用（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｗ０９３／１２２２７（１９９３）；ＵＳ５，８７７，３９７、ＵＳ５，８７４，２９９、ＵＳ５，８１４，３１８、ＵＳ５，７８９，６５０、ＵＳ５，７７０，４２９、ＵＳ５，６６１，０１６、ＵＳ５，６３３，４２５、ＵＳ５，６２５，１２６、ＵＳ５，５６９，８２５、ＵＳ５，５４５，８０６、Nature 148, 1547-1553 (1994)、Nature Biotechnology 14, 826 (1996)、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、ＷＯ９１／１０
７４１（１９９１）を参照、ならびにファージディスプレイ法（例えば、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ９１／１７２７１およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ９２／０１０４７、ＵＳ５，８７７，２１８、ＵＳ５，８７１，９０７、ＵＳ５，８５８，６５７、ＵＳ５，８３７，２４２、ＵＳ５，７３３，７４３およびＵＳ５，５６５，３３２を参照、が挙げられる。
【０１０７】
「ポリマー」は、多くの繰返しサブユニットから構成される分子である。「モノマー」と称されることもあるサブユニットは同じまたは異なるものであり得る。天然ポリマーおよび合成ポリマーの両方がある。ＤＮＡ、タンパク質および複合炭水化物は天然ポリマーの例である。ポリスチレンおよびポリアクリルアミドは合成ポリマーの例である。単一のモノマーの繰返し単位から構成されるポリマーはホモポリマーと呼ばれる。２つまたはそれ以上のモノマーから構成されるポリマーは、コポリマーまたは場合によりヘテロポリマーと呼ばれる。ある特定のモノマー種がクラスター化されて一緒になったコポリマーは、ブロックコポリマーと呼ばれることがある。ポリマーは直鎖状または分岐鎖状であり得る。ポリマーが分岐している場合、共通の起源を有するポリマー鎖はポリマーアームと称されることがある。
【０１０８】
「開始剤」は、本明細書に記載されるようなモノマーまたはコモノマーを使用する１つまたはそれ以上の重合が起こり得る基質として用いられることができる化合物である。重合は、従来のフリーラジカル重合または好ましくは制御／「リビング」ラジカル重合、例えば、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加断片化終結（Reversible Addition-Fragmentation-Termination、ＲＡＦＴ）重合またはニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）
であり得る。重合は、交換移動（degenerative transfer）などの「擬似」制御重合であ
り得る。ＡＴＲＰのために好適な開始剤は１つまたはそれ以上の不安定な結合を含有し、該結合はホモリティックに切断されて、ラジカル重合を開始させることができるラジカルである開始剤断片Ｉ、および、成長するポリマー鎖のラジカルと反応して重合を可逆的に終結させるラジカルスカベンジャーＩ’を形成し得る。ラジカルスカベンジャーＩ’は典型的にはハロゲンであるが、ニトリルなどの有機部分でもあり得る。本発明の一部の実施形態では、開始剤は、ＡＴＲＰを介する重合のための部位として１つまたはそれ以上の２−ブロモイソブチレート基を含有する。
【０１０９】
「化学的リンカー」は、２つの基を連結して一緒にする化学的部分、例えば、半減期延長部分およびタンパク質を指す。リンカーは、切断可能または切断不可能なものであり得る。切断可能なリンカーは、特に、加水分解可能、酵素切断可能、ｐＨ感受性、光解離性、またはジスルフィドリンカーであり得る。他のリンカーとしては、ホモ二官能性およびヘテロ二官能性リンカーが挙げられる。「連結基」は、生物活性剤への１つまたはそれ以上の結合からなる共有結合連結を形成することができる官能基である。非限定的な例としては、ＷＯ２０１３０５９１３７（参照することにより組み込まれる）の表１に示されるものが挙げられる。
【０１１０】
「反応性基」という用語は、別の化学基と反応して共有結合を形成することができる、すなわち、好適な反応条件下で共有結合的に反応性である基を指し、概しては、別の物質のための結合点を表す。反応性基は、マレイミドまたはスクシンイミジルエステルなどの
部分であり、異なる部分上の官能基と化学的に反応して共有結合連結を形成することができる。反応性基としては、概しては、求核剤、求電子剤および光活性化可能基が挙げられる。
【０１１１】
本明細書において使用される場合、「ＰＣ」としても表される「ホスホリルコリン」は、以下：
【化１】
2021514656.tif 000003
【０１１２】
（式中、＊は結合点を表す）を指す。ホスホリルコリンは双性イオン基であり、その塩（例えば、分子内塩）、ならびにプロトン化および脱プロトン化形態を含む。
【０１１３】
本明細書において使用される場合、「ホスホリルコリンベースのポリマー」は、ホスホリルコリンを含有するポリマーである。「双性イオン含有ポリマー」は、双性イオンを含有するポリマーを指す。
【０１１４】
ポリ（アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）含有ポリマーは、モノマーとして２−（アクリロイルオキシ）エチル−２−（トリメチルアンモニウム）エチルホスフェートを含有するポリマーを指す。
【０１１５】
ポリ（メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）含有ポリマーは、モノマーとして２−（メタクリロイルオキシ）エチル−２−（トリメチルアンモニウム）エチルホスフェートを含有するポリマーを指す。
【０１１６】
本明細書において使用される場合、ポリマーの文脈における「分子量」は、数平均分子量、または重量平均分子量またはピーク分子量のいずれかとして表現され得る。他に示唆されなければ、本明細書における分子量への全ての言及はピーク分子量を指す。これらの分子量の決定、数平均（Ｍｎ）、重量平均（Ｍｗ）およびピーク（Ｍｐ）は、サイズ排除クロマトグラフィーまたは他の液体クロマトグラフィー技術を使用して測定され得る。数平均分子量を決定するための末端基分析の使用もしくは束一的特性（例えば、凝固点降下、沸点上昇、もしくは浸透圧）の測定、または重量平均分子量を決定するための光散乱技術、超遠心分離もしくは粘度測定の使用などの分子量値を測定する他の方法もまた使用され得る。本発明の好ましい実施形態では、分子量はＳＥＣ−ＭＡＬＳ（サイズ排除クロマトグラフィー−多角光散乱）により測定される。本発明のポリマー試薬は、典型的には、多分散である（すなわち、ポリマーの数平均分子量および重量平均分子量は等しくない）。多分散指数（ＰＤＩ）は、混合物中でのポリマーの分散度の指標を提供する。ＰＤＩは式Ｍｗ／Ｍｎにより与えられる。これに関して、均質なタンパク質は１．０のＰＤＩを有する（ＭｎはＭｗと同じである）。典型的には、ポリマーのＰＤＩは１．０より高い。本発明によるポリマーは、好ましくは、例えばＳＥＣ−ＭＡＬＳにより判断される、例えば約１．５未満の比較的低い多分散度（ＰＤＩ）値を有する。他の実施形態では、多分散度（ＰＤＩ）は、より好ましくは約１．４〜約１．２の範囲内、さらにより好ましくは約１．１５未満、さらにより好ましくは約１．１０未満、さらによりいっそう好ましくは約１．０５未満、最も好ましくは約１．０３未満である。
【０１１７】
本明細書において使用される場合、「保護された」、「保護された形態」、「保護基」（protecting group）および「保護基」（protective group）は、ある特定の反応条件下での分子中の特定の化学的に反応性の官能基の反応を防止または遮断する基（すなわち、保護基）の存在を指す。保護基は、保護される化学的に反応性の基の種類の他に、用いら
れる反応条件および存在する場合は分子中の追加の反応性基または保護基の存在に依存して異なる。好適な保護基としては、Greene et al., “Protective Groups In Organic Synthesis,” 3rd Edition, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999による専門書に
おいて見出されるようなものが挙げられる。
【０１１８】
本明細書において使用される場合、「アルキル」は、示唆される炭素原子の数を有する直鎖または分岐鎖の、飽和した、脂肪族ラジカルを指す。例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシルなどが挙げられるがそれに限定されない。他のアルキル基としては、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどが挙げられるがそれに限定されない。アルキルは、任意の数の炭素、例えば、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、３〜４、３〜５、３〜６、４〜５、４〜６および５〜６個の炭素を含み得る。
【０１１９】
有機ラジカルまたは化合物との関連において上記および下記において言及される「低級」という用語は、７個以下、好ましくは４個以下および（非分岐の場合）１または２個の炭素原子を有する分岐または非分岐であり得る化合物またはラジカルをそれぞれ定義する。
【０１２０】
本明細書において使用される場合、「アルキレン」は、少なくとも２つの他の基を連結する、すなわち、二価炭化水素ラジカルの、上記に定義されるようなアルキル基を指す。アルキレンに連結される２つの部分は、アルキレンの同じ原子または異なる原子に連結され得る。例えば、直鎖アルキレンは、−（ＣＨ２）ｎ（ｎは１、２、３、４、５または６である）の二価ラジカルであり得る。アルキレン基としては、メチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、ペンチレンおよびヘキシレンが挙げられるがそれに限定されない。
【０１２１】
アルキル、アルケニル、アルキレン、ヘテロアルキル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルラジカルの置換基は、１〜（２ｍ’＋１）（ｍ’はそのようなラジカル中の炭素原子の総数である）の範囲内の数の、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２から選択されるがそれに限定されない様々な基の１つまたはそれ以上であり得る。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’のそれぞれは、独立して、水素、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、例えば、１〜３個のハロゲンで置換されたアリール、置換または非置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に結合している場合、それらは窒素原子と組み合わさって５、６、または７員環を形成し得る。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むがそれに限定されないことが意図される。
【０１２２】
本明細書において使用される場合、「アルコキシ」は、酸素原子に結合したアルキル基を指し、ラジカル−Ｏ−Ｒ（Ｒはアルキルである）を形成する。アルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ブトキシ、２−ブトキシ、ｉｓｏ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシなどが挙げられる。アルコキシ基は、本明細書に記載の様々な置換基でさらに置換され
得る。例えば、アルコキシ基は、ハロゲンで置換されて「ハロアルコキシ」基を形成し得る。
【０１２３】
本明細書において使用される場合、「カルボキシアルキル」は、カルボキシ基で置換されたアルキル基（本明細書において定義される）を意味する。「カルボキシシクロアルキル」という用語は、カルボキシ基で置換されたシクロアルキル基（本明細書において定義される）を意味する。アルコシキアルキルという用語は、アルコキシ基で置換されたアルキル基（本明細書において定義される）を意味する。本明細書において用いられる「カルボキシ」という用語は、カルボン酸およびそのエステルを指す。
【０１２４】
本明細書において使用される場合、「ハロアルキル」は、水素原子の一部または全てがハロゲン原子で置換された上記に定義されるようなアルキルを指す。ハロゲン（ハロ）は、好ましくは、クロロまたはフルオロを表すが、ブロモまたはヨードであってもよい。例えば、ハロアルキルとしては、トリフルオロメチル、フルオロメチル、１，２，３，４，５−ペンタフルオロ−フェニルなどが挙げられる。「パーフルオロ」という用語は、全ての利用可能な水素がフッ素で置換された化合物またはラジカルを定義する。例えば、パーフルオロフェニルは１，２，３，４，５−ペンタフルオロフェニルを指し、パーフルオロメチルは１，１，１−トリフルオロメチルを指し、パーフルオロメトキシは１，１，１−トリフルオロメトキシを指す。ハロアルキルはまた、フルオロ置換アルキルなどのハロ置換アルキルとも称され得る。
【０１２５】
本明細書において使用される場合、本発明の文脈における「サイトカイン」は、免疫および炎症応答における細胞間コミュニケーションに参加し得るタンパク質シグナル伝達分子の群のメンバーである。サイトカインは、典型的には、約８〜３５ｋＤａの質量を有する小さい水溶性の糖タンパク質である。
【０１２６】
本明細書において使用される場合、「シクロアルキル」は、約３〜１２、３〜１０、３〜７、または３〜６個の炭素原子を含有する飽和した単環式または多環式の脂肪族環系を指す。シクロアルキル基が２つまたはそれ以上の環から構成される場合、環は、縮合環またはスピロ環構造を有して連結されていてもよい。シクロアルキル基が３つまたはそれ以上の環から構成される場合、環はまた、連結して一緒になって架橋環構造を形成してもよい。単環式環としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロオクチルが挙げられる。二環式および多環式環としては、例えば、ビシクロ［１．１．１］ペンタン、ビシクロ［２．１．１］ヘプタン（bicyclco[2.1.1]heptane）、ノルボルナン、デカヒドロナフタレンおよびアダマンタンが挙げられる。例えば、Ｃ３〜８シクロアルキルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロオクチル、およびノルボルナンが挙げられる。
【０１２７】
本明細書において使用される場合、「環内」は、シクロ環構造の部分を構成する原子または原子群を指す。
【０１２８】
本明細書において使用される場合、「環外」は、結合しているがシクロ環構造を定義しない原子または原子群を指す。
【０１２９】
本明細書において使用される場合、「環状アルキルエーテル」は、３もしくは４つの環内炭素原子および１つの環内酸素もしくは硫黄原子を有する４もしくは５員の環状アルキル基（例えば、オキセタン、チエタン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン）、または１もしくは２つの環内酸素もしくは硫黄原子を有する６〜７員の環状アルキル基（例えば、テトラヒドロピラン、１，３−ジオキサン、１，４−ジオキサン、テトラヒドロチオピラン、１，３−ジチアン、１，４−ジチアン、１，４−オキサチアン）を指す。
【０１３０】
本明細書において使用される場合、「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を有する、直鎖または分岐鎖のいずれかの、２〜６個の炭素原子の炭化水素を指す。アルケニル基の例としては、ビニル、プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブテニル、ブタジエニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、イソペンテニル、１，３−ペンタジエニル、１，４−ペンタジエニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、１，３−ヘキサジエニル、１，４−ヘキサジエニル、１，５−ヘキサジエニル、２，４−ヘキサジエニル、または１，３，５−ヘキサトリエニルが挙げられるがそれに限定されない。アルケニル基はまた、２〜３、２〜４、２〜５、３〜４、３〜５、３〜６、４〜５、４〜６および５〜６個の炭素を有し得る。
【０１３１】
本明細書において使用される場合、「アルケニレン」は、少なくとも２つの他の基を連結する、すなわち、二価炭化水素ラジカルの、上記に定義されるようなアルケニル基を指す。アルケニレンに連結される２つの部分は、アルケニレンの同じ原子または異なる原子に連結され得る。アルケニレン基としては、エテニレン、プロペニレン、イソプロペニレン、ブテニレン、イソブテニレン、ｓｅｃ−ブテニレン、ペンテニレンおよびヘキセニレンが挙げられるがそれに限定されない。
【０１３２】
本明細書において使用される場合、「アルキニル」は、少なくとも１つの三重結合を有する、直鎖または分岐鎖のいずれかの、２〜６個の炭素原子の炭化水素を指す。アルキニル基の例としては、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、イソブチニル、ｓｅｃ−ブチニル、ブタジイニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、イソペンチニル、１，３−ペンタジイニル、１，４−ペンタジイニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、１，３−ヘキサジイニル、１，４−ヘキサジイニル、１，５−ヘキサジイニル、２，４−ヘキサジイニル、または１，３，５−ヘキサトリイニルが挙げられるがそれに限定されない。アルキニル基はまた、２〜３、２〜４、２〜５、３〜４、３〜５、３〜６、４〜５、４〜６および５〜６個の炭素を有し得る。
【０１３３】
本明細書において使用される場合、「アルキニレン」は、少なくとも２つの他の基を連結する、すなわち、二価炭化水素ラジカルの、上記に定義されるようなアルキニル基を指す。アルキニレンに連結される２つの部分は、アルキニレンの同じ原子または異なる原子に連結され得る。アルキニレン基としては、エチニレン、プロピニレン、ブチニレン、ｓｅｃ−ブチニレン、ペンチニレンおよびヘキシニレンが挙げられるがそれに限定されない。
【０１３４】
本明細書において使用される場合、「シクロアルキレン」は、少なくとも２つの他の基を連結する、すなわち、二価炭化水素ラジカルの、上記に定義されるようなシクロアルキル基を指す。シクロアルキレンに連結される２つの部分は、シクロアルキレンの同じ原子または異なる原子に連結され得る。シクロアルキレン基としては、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、およびシクロオクチレンが挙げられるがそれに限定されない。
【０１３５】
本明細書において使用される場合、「ヘテロシクロアルキル」は、３つの環員〜約２０の環員ならびにＮ、ＯおよびＳなどの１〜約５個のヘテロ原子を有する環系を指す。Ｂ、Ａｌ、ＳｉおよびＰが挙げられるがそれに限定されない追加のヘテロ原子もまた有用であり得る。ヘテロ原子はまた酸化されてもよく、これは例えば、−Ｓ（Ｏ）−および−Ｓ（Ｏ）２−であるがそれに限定されない。例えば、複素環としては、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、モルホリノ、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、ピペリジニル、インドリニル、キヌクリジニルおよび１，４−ジオキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デカ
−８−イルが挙げられるがそれに限定されない。
【０１３６】
本明細書において使用される場合、「ヘテロシクロアルキレン」は、少なくとも２つの他の基を連結する、上記に定義されるようなヘテロシクロアルキル（heterocyclalkyl）
基を指す。ヘテロシクロアルキレンに連結される連結される２つの部分は、ヘテロシクロアルキレンの同じ原子または異なる原子に連結され得る。
【０１３７】
本明細書において使用される場合、「アリール」は、６〜１６個の炭素原子を含有する単環式または多環式（例えば、縮合二環式、三環式またはより多い）芳香環アセンブリを指す。例えば、アリールは、フェニル、ベンジルまたはナフチルであってもよく、好ましくはフェニルである。アリール基は、いずれも例えば上記において定義されるようにさらに置換されていてもよい、アルキル、アルコキシ、アリール、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、アミノ、アミノ−アルキル、トリフルオロメチル、アルキレンジオキシおよびオキシ−Ｃ２〜Ｃ３−アルキレンから選択される１、２もしくは３つのラジカルにより一、二もしくは三置換されていてもよく、または１−もしくは２−ナフチル、または１−もしくは２−フェナントレニルであり得る。アルキレンジオキシは、フェニルの２つの隣接する炭素原子に結合した二価置換基であり、例えば、メチレンジオキシまたはエチレンジオキシである。オキシ−Ｃ２〜Ｃ３−アルキレンもまた、フェニルの２つの隣接する炭素原子に結合した二価置換基であり、例えば、オキシエチレンまたはオキシプロピレンである。オキシ−Ｃ２〜Ｃ３−アルキレン−フェニルの例は、２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イルである。
【０１３８】
アリールとして好ましいものとしては、ナフチル、フェニル、またはアルコキシ、フェニル、ハロゲン、アルキルもしくはトリフルオロメチルにより一もしくは二置換されているフェニル、特に、フェニルまたはアルコキシ、ハロゲンもしくはトリフルオロメチルにより一もしくは二置換されているフェニル、特に、フェニルである。
【０１３９】
Ｒとしての置換フェニル基の例は、例えば、複素環式環中で置換されていてもよい、４−クロロフェン−１−イル、３，４−ジクロロフェン−１−イル、４−メトキシフェン−１−イル、４−メチルフェン−１−イル、４−アミノメチルフェン−１−イル、４−メトキシエチルアミノメチルフェン−１−イル、４−ヒドロキシエチルアミノメチルフェン−１−イル、４−ヒドロキシエチル−（メチル）−アミノメチルフェン−１−イル、３−アミノメチルフェン−１−イル、４−Ｎ−アセチルアミノメチルフェン−１−イル、４−アミノフェン−１−イル、３−アミノフェン−１−イル、２−アミノフェン−１−イル、４−フェニル−フェン−１−イル、４−（イミダゾール−１−イル）−フェニル、４−（イミダゾール−１−イルメチル）−フェン−１−イル、４−（モルホリン−１−イル）−フェン−１−イル、４−（モルホリン−１−イルメチル）−フェン−１−イル、４−（２−メトキシエチルアミノメチル）−フェン−１−イルおよび４−（ピロリジン−１−イルメチル）−フェン−１−イル、４−（チオフェニル）−フェン−１−イル、４−（３−チオフェニル）−フェン−１−イル、４−（４−メチルピペラジン−１−イル）−フェン−１−イル、および４−（ピペリジニル）−フェニルおよび４−（ピリジニル）−フェニルである。
【０１４０】
本明細書において使用される場合、「アリーレン」は、少なくとも２つの他の基を連結する、上記に定義されるようなアリール基を指す。アリーレンに連結される２つの部分は、アリーレンの異なる原子に連結される。アリーレン基としてはフェニレンが挙げられるがそれに限定されない。
【０１４１】
本明細書において使用される場合、「アリーレン−オキシ」は、アリーレンに連結された部分の１つが酸素原子を通じて連結されている、上記に定義されるようなアリーレン基
を指す。アリーレン−オキシ基としてはフェニレン−オキシが挙げられるがそれに限定されない。
【０１４２】
同様に、アリールおよびヘテロアリール基の置換基は様々であり、０から芳香環系上の開放原子価の総数までの範囲内の数において、−ハロゲン、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＲ’Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、パーフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、およびパーフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択され、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルおよびヘテロアルキル、非置換アリールおよびヘテロアリール、（非置換アリール）−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、ならびに（非置換アリール）オキシ−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから独立して選択される。
【０１４３】
アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の２つは、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−Ｕ−（式中、ＴおよびＵは、独立して、−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−または単結合であり、ｑは０〜２の整数である）の置換基で置換されていてもよい。代替的に、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の２つは、式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−（式中、ＡおよびＢは、独立して、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合であり、ｒは１〜３の整数である）の置換基で置換されていてもよい。そのように形成された新たな環の単結合の１つは、二重結合で置換されていてもよい。代替的に、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の２つは、式−（ＣＨ２）ｓ−Ｘ−（ＣＨ２）ｔ−（式中、ｓおよびｔは独立して０〜３の整数であり、Ｘは、−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である）の置換基で置換されていてもよい。−ＮＲ’−および−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−における置換基Ｒ’は、水素または非置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択される。
【０１４４】
本明細書において使用される場合、「ヘテロアリール」は、５〜１６個の環原子を含有する単環式または縮合二環式もしくは三環式の芳香環アセンブリであって、環原子の１〜４個がそれぞれＮ、ＯまたはＳのヘテロ原子であるものを指す。例えば、ヘテロアリールとしては、例えば、アルキル、ニトロもしくはハロゲンにより置換された、特に一もしくは二置換された、ピリジル、インドリル、インダゾリル、キノキサリニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、フラニル、ピロリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チエニル、または任意の他のラジカルが挙げられる。ピリジルは、２−、３−または４−ピリジル、有利には、２−または３−ピリジルを表す。チエニルは、２−または３−チエニルを表す。キノリニルは、好ましくは、２−、３−または４−キノリニルを表す。イソキノリニルは、好ましくは、１−、３−または４−イソキノリニルを表す。ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニルは、好ましくは、３−ベンゾピラニルまたは３−ベンゾチオピラニルをそれぞれ表す。チアゾリルは、好ましくは、２−または４−チアゾリル、最も好ましくは、４−チアゾリルを表す。トリアゾリルは、好ましくは、１−、２−または５−（１，２，４−トリアゾリル）である。テトラゾリルは、好ましくは、５−テトラゾリルである。
【０１４５】
好ましくは、ヘテロアリールは、置換された、特に一または二置換された、ピリジル、インドリル、キノリニル、ピロリル、チアゾリル、イソキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チエニル、フラニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、イソキノリニル、ベンゾチエニル、オキサゾリル、インダゾリル、または任意
のラジカルである。
【０１４６】
「ヘテロアルキル」という用語は、１〜３個のヘテロ原子、例えば、Ｎ、ＯおよびＳを有するアルキル基を指す。Ｂ、Ａｌ、ＳｉおよびＰが挙げられるがそれに限定されない追加のヘテロ原子もまた有用であり得る。ヘテロ原子はまた酸化されてもよく、これは例えば、−Ｓ（Ｏ）−および−Ｓ（Ｏ）２−であるがそれに限定されない。例えば、ヘテロアルキルとしては、エーテル、チオエーテル、アルキル−アミンおよびアルキル−チオールを挙げることができる。
【０１４７】
「ヘテロアルキレン」という用語は、少なくとも２つの他の基を連結する、上記に定義されるようなヘテロアルキル基を指す。ヘテロアルキレンに連結される２つの部分は、ヘテロアルキレンの同じ原子または異なる原子に連結され得る。
【０１４８】
本明細書において使用される場合、「求電子剤」は、求電子中心、すなわち、求核剤と反応することができる、電子を求める中心を有する、イオン、またはイオン性であってもよい原子もしくは原子の集まりを指す。求電子剤（または求電子試薬）は、その反応パートナー（求核剤）からの両方の結合電子を受け入れることによりその反応パートナーへの結合を形成する試薬である。
【０１４９】
本明細書において使用される場合、「求核剤」は、求核中心、すなわち、求電子中心を求めるまたは求電子剤と反応することができる中心を有する、イオン、またはイオン性であってもよい原子もしくは原子の集まりを指す。求核剤（または求核試薬）は、両方の結合電子を供与することによりその反応パートナー（求電子剤）への結合を形成する試薬である。「求核基」は、反応性基と反応した後の求核剤を指す。非限定的な例としては、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシ、およびハロアルコキシなどが挙げられる。
【０１５０】
本明細書において使用される場合、「マレイミド」は、構造：
【化２】
2021514656.tif 000004
【０１５１】
を有するピロール−２，５−ジオン−１−イル基を指し、これは、スルフヒドリル（例えば、チオアルキル）との反応により、構造：
【化３】
2021514656.tif 000005
【０１５２】
（式中、「・」はマレイミド基の結合点を示唆し、「
【化４】
2021514656.tif 000006
」は、元のスルフヒドリル含有基の残余へのチオールの硫黄原子（the sulfur atom the thiol）の結合点を示唆する）を有する−Ｓ−マレイミド基を形成する。
【０１５３】
本開示の目的のために、タンパク質およびポリペプチド中に見出される「天然に存在するアミノ酸」は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、およびまたはＬ−バリンである。タンパク質中に見出される「天然に存在しないアミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸として記載したもの以外の任意のアミノ酸である。天然に存在しないアミノ酸としては、天然に存在するアミノ酸のＤ異性体、および天然に存在するアミノ酸のＤ異性体とＬ異性体との混合物が挙げられるがそれに限定されない。他のアミノ酸、例えば、４−ヒドロキシプロリン、デスモシン、イソデスモシン、５−ヒドロキシリジン、イプシロン−Ｎ−メチルリジン、３−メチルヒスチジンは、天然に存在するタンパク質中に見出されるが、概しては、ｍＲＮＡのリボソーム翻訳以外の手段により導入されるので、本開示の目的のために、タンパク質中に見出される天然に存在しないアミノ酸であると考えられる。
【０１５４】
本明細書において使用される場合、ポリマーの幾何学形状、構築または全体構造に関する「直鎖（linear）」は、単一のポリマーアームを有するポリマーを指す。
【０１５５】
本明細書において使用される場合、ポリマーの幾何学形状、構築または全体構造に関する「分岐鎖（branched）」は、開始剤内に含有されるコア構造から伸長した２つまたはそれ以上のポリマー「アーム」を有するポリマーを指す。開始剤は、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）反応において用いられてもよい。分岐鎖状ポリマーは、２つのポリマー鎖（アーム）、３つのポリマーアーム、４つのポリマーアーム、５つのポリマーアーム、６つのポリマーアーム、７つのポリマーアーム、８つのポリマーアーム、９つのポリマーアームまたはそれ以上を有してもよい。各ポリマーアームはポリマー開始部位から伸長する。各ポリマー開始部位は、モノマーの付加によるポリマー鎖の成長のための部位となることができる。非限定的に例えば、ＡＴＲＰを使用して、開始剤上のポリマー開始の部位は、典型的には、ハロゲン化第一銅などの遷移金属化合物により触媒される可逆的なレドックスプロセスを受ける有機ハロゲン化物である。好ましくは、ハロゲン化物は臭素である。
【０１５６】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される賦形剤」は、本発明の組成物中に含まれ得る、患者に対して顕著な有害な毒物学的効果を引き起こさずかつ特にヒトにおける治療的使用のためにＦＤＡにより承認されたまたは承認可能な賦形剤を指す。薬学的に許容される賦形剤の非限定的な例としては、水、ＮａＣｌ、生理食塩液、乳酸リンゲル液、通常の（normal）スクロース、および通常のグルコースなどが挙げられる。
【０１５７】
本明細書において使用される場合、「ＯＧ１７８６」は、図２Ｄに示される構造を有するポリマー合成のために使用される９アーム開始剤であり、図２Ｄはトリフルオロ酢酸（trifluororacetic acid）とのＯＧ１７８６の塩形態を示す。ＯＧ１７８６は、他の塩ま
たは遊離塩基として本発明にしたがって使用されてもよい。
【０１５８】
本明細書において使用される場合、「ＯＧ１８０１」は、モノマーＨＥＭＡ−ＰＣを使用するＡＴＲＰ合成のための開始剤としてＯＧ１７８６を使用して製造される約（＋／−１５％）７５０ｋＤａのポリマー（ＭｎまたはＭｐのいずれかによる）である。ＯＧ１８０１の構造を図２Ｊに示す。
【０１５９】
本明細書において使用される場合、「ＯＧ１８０２」は、マレイミド官能性（maleimide functionality）を付加したＯＧ１８０１であり、図２Ｋに示される構造を有し、ｎ１
、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９のそれぞれは、ポリマーの総分子量が（Ｍｗ）７５０，０００±１５％ダルトンとなるような（正の）整数（０から約３
０００まで）である。ＯＧ１８０２という用語がタンパク質の用語（例えば、ＶＥＧＦトラップまたは抗ＩＬ−６抗体）を修飾するために使用される場合、それは、タンパク質が共役タンパク質であることを示す。
【０１６０】
他に定義されなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾がある場合、定義を含めて本明細書が優先される。本明細書および特許請求の範囲の全体を通じて、「含む（comprise）」という語または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」などのバリエーションは、記載された整数または整数の群を含むが任意の他の
整数または整数の群を排除しないことを含意することが理解される。文脈により他に必要とされなければ、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数を含む。「例えば（e.g.）」または「例えば（for example）」という用語に後続するいずれの例も、網羅的または
限定的であることは意図されない。
【０１６１】
「ａ」または「ａｎ」実体（entity）という語句は、その実体の１つまたはそれ以上を指し、例えば、化合物（a compound）は、１つもしくはそれ以上の化合物または少なくとも１つの化合物を指す。そのため、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたはそれ以上」、および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書において交換可能に使用され得る。
【０１６２】
本明細書において使用される場合、「約」は、異なる機器、試料、および試料調製物の間で得られる測定値において見られ得る変動を意味する。
【０１６３】
本明細書において使用される場合、ＣＤＲの位置は、記載された場合の可変ドメイン中の出現の順序に従う。例えば、重鎖の位置は、Ｓ３５ＨまたはＧ６６Ｄとして記載され得る。本明細書において使用される場合、Ｆｃの位置は、記載された場合またはＥＵナンバリングであると注記された場合にＥＵナンバリングに従う。例えば、抗体の変異は、ＥＵナンバリングにしたがって、Ｌ２３４ＡまたはＬ２３５Ａとして記載され得る。位置はまた、本明細書において提供される特定の配列番号または配列内の指定された位置にしたがって定義されてもよい。
【０１６４】
多角光散乱（ＭＡＬＳ）は、レーザー光が分子に衝突し、光の振動電場がその中で振動双極子を誘導する、高分子を分析する技術である。この振動双極子は光を再放射し、Ｗｙａｔｔ  ｍｉｎｉＤａｗｎ  ＴＲＥＯＳなどのＭＡＬＳ検出器を使用して測定され得る。放射光の強度は高分子中で誘導される双極子の大きさに依存し、そしてそれは高分子の分極率に比例し、誘導される双極子が大きくなればなる程、散乱光の強度は大きくなる。したがって、そのような高分子の溶液からの散乱を分析するために、周囲媒体（例えば、溶媒）に対するその分極率を知るべきである。これは、Ｗｙａｔｔ  Ｏｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＸ示差屈折計を使用してｄｎ／ｄｃ（＝Δｎ／Δｃ）値を測定することにより分子濃度変化Δｃと共に溶液の屈折率ｎの変化Δｎの測定値から決定されてもよい。ＭＡＬＳ決定で用いられる２つのモル重量パラメーターは数平均分子量（Ｍｎ）および重量平均分子量（Ｍｗ）であり、多分散指数（ＰＤＩ）はＭｗをＭｎで割ったものに等しい。ＳＥＣはまた、ＳＥＣにおける最高ピークの分子量として定義されるピーク分子量Ｍｐの別の平均分子量決定を可能とする。
【０１６５】
ＰＤＩは、多分散性バイオポリマー（例えば、ＯＧ１８０２）への別々のタンパク質の共役に由来するポリマーおよびバイオコンジュゲートの分子量分布の広さの指標として使用される。タンパク質試料について、それは溶液中のあらゆるタンパク質分子がほぼ同じ長さおよびモル質量を有することが予期される翻訳生成物であるという事実に起因して、その多分散性は１．０に近い。対照的に、様々な長さのポリマー鎖が重合プロセスの間に合成されるバイオポリマーの多分散的性質に起因して、分子量の狭い分布のためにその品
質属性の１つとして試料のＰＤＩを決定することは非常に重要である。
【０１６６】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、溶液中の分子がそのサイズにより分離されるクロマトグラフィー技術である。典型的には、水性溶液が適用されて、様々な孔径の樹脂を充填されたカラムに試料が通される。樹脂は、カラムを通過する時にアナライトに対して不活性であることが期待され、アナライトは、その固有の大きさおよび選択されたカラムの孔径の特性に基づいて互いに分離する。
【０１６７】
ＭＡＬＳとのＳＥＣの連結またはＳＥＣ／ＭＡＬＳは、ＳＥＣ校正標準物質のセットに依拠するのではなくモル質量およびサイズ（二乗平均平方根半径）の正確な分布を提供する。この種類のアレンジメントは、伝統的なカラム校正方法に対して多くの利点を有する。光散乱および濃度が各溶出画分について測定されるので、モル質量およびサイズは溶出位置とは独立して決定され得る。これは、バイオポリマー（ＯＧ１８０２）またはバイオコンジュゲートなどの非球形の高分子を有する種のために特に関連し、そのような種は、典型的には、カラム校正標準物質のセットにより記述され得る方式において溶出しない。
【０１６８】
一部の実施形態では、ＳＥＣ／ＭＡＬＳ分析は、Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５溶媒送達モジュールを有するＷａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣシステムおよびＳｈｏｄｅｘ  ＳＥＣ−ＨＰＬＣカラム（７．８×３００ｍｍ）を備えたＷａｔｅｒｓ  ２９９６  Ｐｈｏｔｏｄｉｏｌｅ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを含む。これは、Ｗｙａｔｔ  ｍｉｎｉＤａｗｎ  ＴＲＥＯＳおよびＷｙａｔｔ  Ｏｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＸ示差屈折計とオンラインで接続される。ＷａｔｅｒｓのＥｍｐｏｗｅｒソフトウェアを使用してＷａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣシステムを制御することができ、ＷｙａｔｔのＡＳＴＲＡ  Ｖ  ６．１．７．１６ソフトウェアを使用して、Ｗｙａｔｔ  ｍｉｎｉＤａｗｎ  ＴＲＥＯＳからＭＡＬＳデータ、Ｔ−ｒＥＸ検出器からｄｎ／ｄｃデータ、およびＷａｔｅｒｓ  ２９９６  Ｐｈｏｔｏｄｉｏｌｅ  Ａｒｒａｙ  ＤｅｔｅｃｔｏｒからのＡ２８０吸光度シグナルを使用して質量復元データを取得することができる。ＳＥＣは、ｐＨ７．４の１×ＰＢＳ中１ｍｌ／分の試料注入で実行することができ、ＭＡＬＳおよびＲＩシグナルは、絶対モル質量（Ｍｐ、Ｍｗ、Ｍｎ）および多分散指数（ＰＤＩ）の決定のためにＡＳＴＲＡソフトウェアにより解析され得る。追加的に、算出はまた、それぞれ０．１４２および０．１８３として、ポリマーおよびタンパク質のインプットｄｎ／ｄｃ値を伴う。バイオコンジュゲートｄｎ／ｄｃ値について、ｄｎ／ｄｃは、以下の式：
コンジュゲートｄｎ／ｄｃ＝０．１４２×［ＭＷポリマー／（ＭＷポリマー＋ＭＷタンパク質）］＋０．１８３×［ＭＷタンパク質／（ＭＷポリマー＋ＭＷタンパク質）］
を使用してポリマーおよびタンパク質の重量ＭＷに基づいて約０．１４８であると算出される。
【０１６９】
ＳＥＣ−ＭＡＬＳにより測定されたＯＧ１８０２のＭＷポリマーが約８００ｋＤａであり、かつＳＥＣ−ＭＡＬＳにより測定された抗ＩＬ−６のＭＷタンパク質が約１４５ｋＤａである場合、ＳＥＣ−ＭＡＬＳにより測定されるバイオコンジュゲートの予想される総分子量は約１０００ｋＤａである。抗ＩＬ−６  ＶＥＧＦトラップまたはＶＥＧＦトラップ−抗ＩＬ−６のＭＷタンパク質は約１９２ｋＤａであり、バイオコンジュゲートの予想される総分子量は１０００〜１１００ｋＤａである。
【０１７０】
例示的な方法および材料が本明細書に記載されるが、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料もまた、本発明の実施または試験において使用することができる。材料、方法、および実施例は実例的なものに過ぎず、限定的であることは意図されない。
【０１７１】
Ｉ．ＩＬ−６アンタゴニスト抗体、ＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップおよび／または
そのコンジュゲート
ＩＬ−６により媒介される下流の事象を含む、ＩＬ−６の生物学的活性を遮断し、抑制しまたは低減する（有意に低減する、を含む）抗ＩＬ−６抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体は、本明細書において提供されるＣＤＲ配列の１つまたはそれ以上を有する。
【０１７２】
一部の実施形態では、単離されたアンタゴニスト抗体はＩＬ−６に特異的に結合する。
【０１７３】
一部の実施形態では、抗体は、好ましくは、ＩＬ−６シグナル伝達機能を阻害する方式でＩＬ−６と反応する。一部の実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体は霊長動物ＩＬ−６に特異的に結合する。
【０１７４】
本発明において有用な抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヘテロ共役抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質（例えば、ドメイン抗体）、ヒト化抗体、ならびに、抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、および共有結合的に改変された抗体を含む、必要とされる特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変構成を包含し得る。抗体は、マウス、ラット、ヒト、または任意の他の起源（キメラもしくはヒト化抗体を含む）であってもよい。一部の実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体はモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体はヒトまたはヒト化抗体である。
【０１７５】
一部の実施形態では、抗体は、表１Ａ、表１Ｂ、表０．１および／または表０．２または図５に示されるような重鎖アミノ酸可変領域を含む。一部の実施形態では、単離されたアンタゴニスト抗体は、表１Ａ、表１Ｂ、表０．１および／または表０．２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）のＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに、該表に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）のＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
【０１７６】
一部の実施形態では、単離されたアンタゴニスト抗ＩＬ−６抗体が提供される。抗体は、エフェクター機能を低減するための１つまたはそれ以上の変異を含む重鎖定常ドメインを含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の変異は、補体カスケードに関する抗体のエフェクター機能を低減し、例えば、補体カスケードの活性化を低減する。一部の実施形態では、エフェクター機能の低減は少なくとも約５０％である。
【０１７７】
一部の実施形態では、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＩＬ−６に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体であって、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ（ＥＵナンバリングに基づく）を含む、抗体が提供される。一部の実施形態では、単離されたアンタゴニスト抗体は、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａを含む。一部の実施形態では、変異を有する単離されたアンタゴニスト抗体は、ＦＣガンマ受容体またはＣ１ｑへの最小化された結合を有する。一部の実施形態では、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａを有する単離されたアンタゴニスト抗体は、ＦＣガンマ受容体またはＣ１ｑへの最小化された結合を有する。一部の実施形態では、単離されたアンタゴニスト抗ＩＬ−６抗体であって、変異が、以下のアミノ酸位置（ＥＵナンバリング）：Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ａ３２７、Ａ３３０、およびＰ３３１の１つまたはそれ以上に位置する、抗体が提供される。一部の実施形態では、単離されたアンタゴニスト抗ＩＬ−６抗体であって、変異が、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓからなる群から選択される、抗体が提供される。
【０１７８】
一部の実施形態では、単離されたアンタゴニスト抗ＩＬ−６抗体が提供される。重鎖定常ドメインは、組換えＤＮＡ技術により導入されたシステイン残基をさらに含む。一部の実施形態では、システイン残基は、Ｑ３４７ＣおよびＬ４４３Ｃ（ＥＵナンバリング）からなる群から選択される。一部の実施形態では、システイン残基はＬ４４３Ｃ（ＥＵナンバリング）である。
【０１７９】
一部の実施形態では、抗体は、以下の変異（ＥＵナンバリング）：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａの３つ全てを含み、かつ、抗体は、Ｌ４４３Ｃ（ＥＵナンバリング）を含む。一部の実施形態では、抗体はヒトＩｇＧ１であり、かつ、抗体の重鎖定常ドメインは、免疫媒介性のエフェクター機能を低減する１つまたはそれ以上の変異を含む。
【０１８０】
一部の実施形態では、単離されたアンタゴニスト抗体であって、表１Ａおよび表１Ｂ、および／または表１１．３のいずれか１つまたはそれ以上のアミノ酸配列を含む抗体により認識されるエピトープと同じまたはそれと重なり合うヒトＩＬ−６上のエピトープに結合する、抗体が提供される。一部の実施形態では、ｃｙｓを有しかつそのシステインを通じてポリマーに連結されたＩＬ−６抗体が提供される（本明細書中、式１７に示される）。
【０１８１】
一部の実施形態では、ＩＬ−６に結合する単離されたアンタゴニスト抗体が提供される。一部の実施形態では、ＩＬ−６に結合する単離されたアンタゴニスト抗体は、Ｃ末端リジンを有するまたは有しない、表１Ａ、表１Ｂ、表０．１および／または表０．２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに、表１Ａ、表１Ｂ、表０．１および／または表０．２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０１８２】
一部の実施形態では、ＩＬ−６に結合する単離されたアンタゴニスト抗体が提供される。抗体は、表１Ａ、表１Ｂ、表０．１および／もしくは表０．２に示されるアミノ酸配列、またはＣＤＲ内ではない残基中のアミノ酸置換を有する、それに対して少なくとも９０％同一の配列を含むＶＨを含む。一部の実施形態では、抗体は、図５のＨＣＤＲ１、図５のＨＣＤＲ２、図５のＨＣＤＲ３、図５のＬＣＤＲ１、図５のＬＣＤＲ２、図５のＬＣＤＲ３の１つまたはそれ以上、例えば、１、２、３、４、５、または６つ全てのＣＤＲを含む。
【０１８３】
一部の実施形態では、ＩＬ−６に結合する抗体であって、表１Ａ、表１Ｂ、表０．１および／または表０．２のＣＤＲＨ１であるＣＤＲＨ１、表１Ａ、表１Ｂ、表０．１および／または表０．２のＣＤＲＨ２であるＣＤＲＨ２、表１Ａ、表１Ｂ、表０．１および／または表０．２のＣＤＲＨ３であるＣＤＲＨ３、表１Ａ、表１Ｂ、表０．１および／または表０．２のＣＤＲＬ１であるＣＤＲＬ１、表１Ａ、表１Ｂ、表０．１および／または表０．２のＣＤＲＬ２であるＣＤＲＬ２、表１Ａ、表１Ｂ、表０．１および／または表０．２のＣＤＲＬ３であるＣＤＲＬ３、ＥＵナンバリングに基づいて以下の変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａの少なくとも１つ、ならびにＥＵナンバリングに基づいて以下の変異：Ｑ３４７ＣまたはＬ４４３Ｃの少なくとも１つを含む、抗体が提供される。
【０１８４】
一部の実施形態では、単離されたアンタゴニスト抗ＩＬ−６抗体が提供される。抗体の重鎖可変領域は、表１Ａに示されるアミノ酸配列を含む３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。一部の実施形態では、単離されたアンタゴニスト抗ＩＬ−６抗体であって、抗体の軽鎖可変領域が、表１Ｂに示されるアミノ酸配列を含む３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体が提供される。一部の実施形態では、抗体は、図５において同定される配列の１つまたはそれ以上、例えば、ＣＤＲの１つもしくはそれ以上（囲ったＣＤＲの２、３、４、５もしくは６つを含む）ならびに／または重鎖および軽鎖可変領域の全体を含有
する抗体である。
【０１８５】
一部の実施形態では、単離されたアンタゴニスト抗ＩＬ−６抗体は、表１Ａに示されるアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、かつ、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）は、表１Ｂに示されるアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを含む。
【０１８６】
一部の実施形態では、単離されたアンタゴニスト抗ＩＬ−６抗体が提供される。ＶＨは、表１Ａに示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体の軽鎖可変領域は、表１Ｂに示されるアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを含む。
【０１８７】
一部の実施形態では、単離されたアンタゴニスト抗ＩＬ−６抗体であって、表１Ｂに示されるアミノ酸配列を含むＶＬ、またはＣＤＲ内ではないアミノ酸中の１つのアミノ酸置換を有するそのバリアントを含む、抗体が提供される。一部の実施形態では、単離されたアンタゴニスト抗ＩＬ−６抗体であって、表１Ａに示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、またはＣＤＲ内ではないアミノ酸中の数個のアミノ酸置換を有するそのバリアントを含む、抗体が提供される。
【０１８８】
一部の実施形態では、単離されたアンタゴニスト抗体であって、Ｃ末端リジンを有する、表１Ａに示されるアミノ酸配列を含む重鎖、および表１Ｂに示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗体が提供される。一部の実施形態では、単離されたアンタゴニスト抗体であって、Ｃ末端リジンを有しない、表１Ａに示されるアミノ酸配列を含む重鎖、および表１Ｂに示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗体が提供される。
【０１８９】
ＩＬ−６アンタゴニスト抗体は、当該技術分野において公知の任意の方法により製造されてもよい。ヒトおよびマウス抗体の製造のための一般技術は当該技術分野において公知であり、かつ／または本明細書に記載されている。
【０１９０】
ＩＬ−６アンタゴニスト抗体は、当該技術分野において公知の方法を使用して同定しまたは特徴付けることができ、それにより、ＩＬ−６の生物学的活性の低減、寛解、または中和が検出および／または測定される。一部の実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体は、候補抗体をＩＬ−６と共にインキュベートし、ＩＬ−６Ｒへの結合もしくはｇｐ１３０へのＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒの結合および／またはＩＬ−６の生物学的活性の付随的な低減もしくは中和をモニターすることにより同定される。結合アッセイは、例えば、精製されたＩＬ−６ポリペプチドを用いて、またはＩＬ−６ポリペプチドを天然に発現する（例えば、様々な株）、もしくは発現するようにトランスフェクトされた細胞を用いて行われてもよい。一実施形態では、結合アッセイは競合結合アッセイであり、該アッセイでは、ＩＬ−６結合について既知のＩＬ−６アンタゴニスト抗体と競合する候補抗体の能力が評価される。アッセイは、ＥＬＩＳＡフォーマットを含む、様々なフォーマットにおいて行われてもよい。
【０１９１】
初期同定後、候補ＩＬ−６アンタゴニスト抗体の活性は、標的化された生物学的活性を試験するために公知のバイオアッセイによりさらに確認および精密化され得る。一部の実施形態では、候補ＩＬ−６アンタゴニスト抗体をさらに特徴付けるためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞アッセイが使用される。
【０１９２】
ＩＬ−６アンタゴニスト抗体は、当該技術分野において周知の方法を使用して特徴付けられてもよい。例えば、１つの方法は、それが結合するエピトープを同定すること、または「エピトープマッピング」である。例えば、Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999のChapter 11に記載されるような、抗体−抗原複合体の結晶構造の解明、競合
アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドベースのアッセイを含む、タンパク質上のエピトープの位置をマッピングおよび特徴付けするための当該技術分野において公知の多くの方法がある。追加の例では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体が結合する配列を決定するためにエピトープマッピングが使用され得る。ＩＬ−６アンタゴニスト抗体のエピトープマッピングは、例えば、Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ  １５、８２１９  ＰＨ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）といった様々な供給元から商業的に利用可能である。エピトープは、線形エピトープ、すなわち、アミノ酸の単一のストレッチ中に含有されるもの、または、単一のストレッチ中に必ずしも含有されていなくてもよいアミノ酸の三次元相互作用により形成される立体構造エピトープであり得る。様々な長さ（例えば、少なくとも４〜６アミノ酸の長さ）のペプチドが単離または合成され（例えば、組換えによる）、かつＩＬ−６アンタゴニスト抗体を用いる結合アッセイのために使用され得る。別の例では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体が結合するエピトープは、ＩＬ−６配列に由来するオーバーラップペプチドを使用し、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体による結合を決定することにより体系的スクリーニングにおいて決定され得る。遺伝子断片発現アッセイによれば、ＩＬ−６をコードするオープンリーディングフレームは、ランダムにまたは特定の遺伝子構成により断片化され、試験される抗体とのＩＬ−６の発現された断片の反応性が決定される。遺伝子断片は、例えば、ＰＣＲにより製造された後に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されかつ放射性アミノ酸の存在下でタンパク質に翻訳されてもよい。放射性標識されたＩＬ−６断片への抗体の結合が次に免疫沈降およびゲル電気泳動により決定される。ある特定のエピトープはまた、ファージ粒子（ファージライブラリー）または酵母（酵母ディスプレイ）の表面上に提示されたランダムなペプチド配列の大きいライブラリーを使用することにより同定され得る。代替的に、オーバーラップペプチド断片の定義されたライブラリーが単純な結合アッセイにおいて試験抗体への結合について試験され得る。追加の例では、エピトープ結合のために必要とされる、充分な、かつ／または必要な残基を同定するために、抗原の変異誘発、ドメインスワッピング実験およびアラニンスキャニング変異誘発が行われ得る。例えば、アラニンスキャニング変異誘発実験は、ＩＬ−６ポリペプチドの様々な残基がアラニンにより置換された変異体ＩＬ−６を使用して行われ得る。変異体ＩＬ−６への抗体の結合を評価することにより、抗体結合に対する特定のＩＬ−６残基の重要性が評価され得る。
【０１９３】
一部の実施形態では、単離されたアンタゴニスト抗ＩＬ−６抗体であって、約０．０１ｐＭ〜約１０ｎＭの親和性でヒトＩＬ−６に結合する、抗体が提供される。一部の実施形態では、単離されたアンタゴニスト抗ＩＬ−６抗体であって、約０．１ｐＭ〜約２ｎＭの親和性でヒトＩＬ−６に結合する、抗体が提供される。一部の実施形態では、単離されたアンタゴニスト抗ＩＬ−６抗体であって、約０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｐＭの親和性でヒトＩＬ−６に結合する、抗体が提供される。
【０１９４】
ＩＬ−６へのＩＬ−６アンタゴニスト抗体の結合親和性（ＫＤ）は約０．００１〜約２００ｎＭであり得る。一部の実施形態では、結合親和性は、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約２ｐＭ、または約１ｐＭのいずれかである。一部の実施形態では、結合親和性は、約２５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約２ｐＭ、約１ｐＭ、約０．５ｐＭ、約０．１ｐＭ、約０．０５ｐＭ、約０．０１ｐＭ、約０．００５ｐＭ、または約０．００１ｐＭのいずれか未満である。
【０１９５】
一部の実施形態では、単離されたアンタゴニスト抗ＩＬ−６抗体であって、３７度において少なくとも５．０Ｅ−０３であるｋｏｆｆでヒトＩＬ−６に結合する、抗体が提供される。一部の実施形態では、ｋｏｆｆは５Ｅ−０４である。一部の実施形態では、単離されたアンタゴニスト抗ＩＬ−６抗体であって、３７度において５．０Ｅ−０４より良好なｋｏｆｆでヒトＩＬ−６に結合する、抗体が提供される。
【０１９６】
一部の実施形態では、結合親和性は、会合定数（ｋａ）、解離定数（ｋｄ）、および最大半値結合能力を達成するアナライト濃度（ＫＤ）の１つまたはそれ以上の観点で定義され得る。一部の実施形態では、ｋａは約０．５０Ｅ＋０５〜約５．００Ｅ＋０８の範囲内であり得る。一部の実施形態では、ｋｄは約０．５０Ｅ−０６〜約５．００Ｅ−０３の範囲内であり得る。一部の実施形態では、ＫＤは約０．５０Ｅ−１２〜約０．５０Ｅ−０７の範囲内であり得る。
【０１９７】
一部の実施形態では、本明細書に開示される抗体のいずれかを含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態では、本明細書に開示されるコンジュゲートのいずれかを含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態では、医薬組成物は、１つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は液体である。一部の実施形態では、医薬組成物は、約０．２ＥＵ／ｍｌ未満のエンドトキシンレベルを有する。一部の実施形態では、医薬組成物は液体であり、かつ約０．２ＥＵ／ｍｌ未満のエンドトキシンレベルを有する。一部の実施形態では、医薬組成物は液体であり、かつ約２．０、１、０．５、０．２ＥＵ／ｍｌ未満のエンドトキシンレベルを有する。例えば硝子体内注射における、一部の実施形態では、エンドトキシン限度は０．０１〜０．０２ＥＵ／注射／目である。
【０１９８】
一部の実施形態は、以下のいずれか、または表１Ａおよび表１Ｂに見出されるような部分的な軽鎖配列および部分的な重鎖配列を有する抗体、もしくはそのバリアントを含む組成物（医薬組成物を含む）を提供する。表１Ａおよび表１Ｂにおいて、下線を引いた配列は、本明細書において提供されるようなＣＤＲ配列の一部の実施形態である。
【表１】
2021514656.tif 000007
【表２】
2021514656.tif 000008
【０１９９】
一部の実施形態では、抗体は、表１Ｅ（表１Ｅ１、表１Ｅ２、および／または表１Ｅ３を含む）の以下のＣＤＲの１つもしくはそれ以上を有しない（またはいずれも有しない）。
【表３】
2021514656.tif 000009
【表４】
2021514656.tif 000010
【表５】
2021514656.tif 000011
【０２００】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるような組成物は、表１Ａ、表１Ｂ、表０．１および／または表０．２において提供されるオプションのいずれかからの部分的もしくは完全な軽鎖配列および部分的もしくは完全な重鎖配列を有する抗体、またはそのバリアントを含む。一部の実施形態では、抗体（またはその結合断片）は、表１Ａ、表１Ｂ、表０．１および／または表０．２において提供されるＣＤＲの任意の１つまたはそれ以上を含み得る。一部の実施形態では、抗体（またはその結合断片）は、表１Ａ、表１Ｂ、表０．１および／または表０．２において提供されるＣＤＲの任意の３つまたはそれ以上を含み得る。一部の実施形態では、抗体（またはその結合断片）は、表１Ａ、表１Ｂ、表０．１および／または表０．２において提供されるＣＤＲの任意の６つ全てを含み得る。一部の実施形態では、重鎖および／または軽鎖は、例えば、図５、図１８、および／または図２１〜２４ならびに表０．１、表０．２、表１Ａ、および／または表１Ｅにおいて提供されるものを含む、本明細書において提供される他の抗体構築物の任意の１つまたはそれ以上であり得る。
【０２０１】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるような組成物は、表１Ａ、表１Ｂ、表０．１および／または表０．２において提供されるオプションのいずれかからの部分的または完全な軽鎖ＣＤＲ配列および部分的または完全な重鎖ＣＤＲ配列を有する抗体を含む。
【０２０２】
一部の実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体のＣＤＲ部分もまた提供される。ＣＤＲ領域の決定は充分に当該技術分野の技術的範囲内である。一部の実施形態では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴ  ＣＤＲとＰａｒａｔｏｍｅ  ＣＤＲとの組合せ（「組合せ型ＣＤＲ」（combined CDR）または「拡張型ＣＤＲ」（extended CDR）とも称される）であり得ることが理解される。ＣＤＲの決定は充分に当該技術分野の技術的範囲内である。一部の実施形態では、ＣＤＲはＩＭＧＴ  ＣＤＲである。他の実施形態では、ＣＤＲはＰａｒａｔｏｍｅ  ＣＤＲである。他の実施形態では、ＣＤＲは、拡張型、ＡｂＭ、立体構造、Ｋａｂａｔ、またはＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲである。１つより多くのＣＤＲを有する実施形態では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴ、Ｐａｒａｔｏｍｅ、拡張型、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、立体構造ＣＤＲ、またはその組合せのいずれかであってもよい。一部の実施形態では、他のＣＤＲ定義もまた使用され得る。一部の実施形態では、上記の定義の２、３、４、５、６、または７つの間で共通する残基のみが使用される（より短い鎖配列を結果としてもたらす）。一部の実施形態では、上記の定義の２、３、４、５、６、または７つのいずれかの任意の残基が使用され得る（より長い配列を結果としてもたらす）。
【０２０３】
一部の実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体は、表１Ａ、表１Ｂ、表０．１および／または表０．２に示される重鎖可変領域のいずれか１つの３つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗体は、表１Ａ、表１Ｂ、表０．１および／または表０．２に示される軽鎖可変領域のいずれか１つの３つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗体は、表１Ａに示される重鎖可変領域のいずれか１つの３つのＣＤＲ、および表１Ｂに示される軽鎖可変領域のいずれか１つの３つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、ＣＤＲは、以下の表０．１（表０．１Ａおよび／もしくは表０．１Ｂを含む）または表０．２（表０．１Ａおよび／もしくは表０．１Ｂを含む）において示されるものの１つまたはそれ以上である。
【表６】
2021514656.tif 000012
【表７】
2021514656.tif 000013
【表８】
2021514656.tif 000014
【表９】
2021514656.tif 000015
【０２０４】
一部の実施形態では、ＩＬ−６への結合のために使用される抗体は、表１Ａ、表１Ｂ、表０．１および／または表０．２の配列の１つまたはそれ以上を含むものであり得る。一部の実施形態では、ＩＬ−６への結合のために使用される抗体は、表１Ａ、表１Ｂ、表０．１および／または表０．２の配列の３つまたはそれ以上を含むものであり得る。一部の実施形態では、ＩＬ−６への結合のために使用される抗体は、表１Ａ、表１Ｂ、表０．１および／または表０．２のいずれか１つの配列の６つを含むものであり得る。一部の実施形態では、ＩＬ−６に結合する抗体は、表１Ａ、表１Ｂ、表０．１および／または表０．２のいずれか１つに指定されるＣＤＲの６つを含む抗体と結合について競合するものであり得る。
【０２０５】
一部の実施形態では、抗体は、ＶＥＧＦトラップ配列に連結または融合され得る。一部の実施形態では、このトラップ配列は表１Ｃに示される通りであり得る。一部の実施形態では、配列は、表１Ｃに示されるものに対して少なくとも８０％同一、例えば、１Ｃに示されるものに対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％同一である。一部の実施形態では、米国特許出願公開第２０１５０３７６２７１号におけるＶＥＧＦトラップ分子のいずれかが本発明において用いられ得る。一部の実施形態では、ＶＥＧＦトラップ配列は、以下の方式：ＩＬ−６  ＶＨを含む重鎖のＮ末端（図６左）、またはヒンジ領域とＩＬ−６  ＶＨを含む重鎖のＣＨ１ドメインの後ろとの間（図６右）の１つにおいてＩＬ−６に融合している。他に指定されなければ、選択的および同時の両方のオプションが、任意のＡｂ−トラップ融合物が議論される本明細書において提供される実施形態のために想定される。一部の実施形態では、「トラップ」という用語は、少なく
とも１つのＶＥＧＦとＶＥＧＦＲとのシグナル伝達をアンタゴナイズし得る異なるＶＥＧＦ受容体からの全長細胞外領域またはその任意の部分、または部分の組合せを指す。好ましくは、細胞外トラップセグメントは、ＶＥＧＦＲ−１、−２または−３の１つからの少なくとも１つのドメイン、より好ましくは、少なくとも２つの連続するドメイン、例えば、Ｄ２およびＤ３を含む。任意に、細胞外ドメインは、少なくとも２つの異なるＶＥＧＦＲからの少なくとも１つのドメインを含む。好ましい細胞外ドメインは、ＶＥＧＦＲ−１のＤ２およびＶＥＧＦＲ−２のＤ３を含むまたはから本質的になる。
【表１０】
2021514656.tif 000016
【０２０６】
一部の実施形態では、ＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップ構築物は、表１Ｄにおいて提供される配列のいずれかを有し得る。一部の実施形態では、構築物は少なくとも、例えば、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９またはより高く、表１Ｄの配列に対して同一であり得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、抗体ＩＬ−６ドメインが表１ＥのＣＤＲの１つまたはそれ以上を含有しないという例外と共に、それらのパーセンテージと合致したものであり得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、図５において同定される配列の１つまたはそれ以上、例えば、ＣＤＲの１つより多く（one of more
）（囲ったＣＤＲの２、３、４、５もしくは６を含む）および／または重鎖および軽鎖可変領域の全体を、ＶＥＧＦトラップ配列（例えば、表１Ｃ）と共に含有するものである。一部の実施形態では、配列は、互いに直接的に融合され得る。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の柔軟な連結配列またはセクションが使用され得る。連結配列は、Ａｂ配列とＶＥＧＦトラップ配列との間に配置され得る。これらの配列は５〜３０アミノ酸の長さであり得る。一部の実施形態では、連結配列は、約４：１の比でＧおよびＳを含み得る。一部の実施形態では、リンカーは、以下の配列：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１５）を含む。一部の実施形態では、任意の柔軟性リンカーが用いられ得る。一部の実施形態では、Ｉｌ−６  ＡｂのＦｃ部分はＩｇＧ１である。
【表１１−１】
2021514656.tif 000017
【表１１−２】
2021514656.tif 000018
【表１１−３】
2021514656.tif 000019
【表１１−４】
2021514656.tif 000020
【表１１−５】
2021514656.tif 000021
【表１１−６】
2021514656.tif 000022
【表１１−７】
2021514656.tif 000023
【表１１−８】
2021514656.tif 000024
【表１１−９】
2021514656.tif 000025
【０２０７】
本明細書において提供される抗ＩＬ−６抗体および／またはＩＬ−６  ＶＥＧＦトラップを発現させるために、記載されるＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡ断片が最初に得られ得る。様々な改変、例えば、変異、欠失、および／または付加もまた、当業者に公知の標準的な方法を使用してＤＮＡ配列に導入され得る。例えば、変異誘発は、変異したヌクレオチドがＰＣＲプライマーに組み込まれ、それにより、ＰＣＲ生成物が所望の変異を含有するＰＣＲ媒介変異誘発、または部位特異的変異誘発などの標準的な方法を使用して実行され得る。
【０２０８】
本発明は、本明細書に示される可変領域に対する改変を包含する。例えば、本発明は、その特性に顕著に影響しない機能的に同等の可変領域およびＣＤＲを含む抗体の他に、増進または減少した活性および／または親和性を有するバリアントを含む。例えば、アミノ酸配列は、ＩＬ−６に対して所望の結合親和性を有する抗体を得るために変異されてもよい。ポリペプチドの改変は当該技術分野においてルーチンの実施であり、本明細書において詳細に記載される必要はない。改変ポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換、機能的活性を顕著に有害に変化させない、もしくはそのリガンドに対するポリペプチドの親和性を成熟させる（増進する）アミノ酸の１つもしくはそれ以上の欠失もしくは付加、または化学的なアナログの使用を伴うポリペプチドが挙げられる。
【０２０９】
アミノ酸配列挿入としては、１残基から１００またはそれ以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲内のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合の他に、単一ま
たは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体またはエピトープタグに融合した抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントとしては、酵素または血液循環中の抗体の半減期を増加させるポリペプチドの、抗体のＮまたはＣ末端への融合物が挙げられる。
【０２１０】
置換バリアントは、除去された抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基およびその場所に挿入された異なる残基を有する。置換変異誘発のための最大の関心となる部位としては超可変領域が挙げられるが、フレームワークの変更もまた想定される。保存的置換は、「保存的置換」の見出しの下に表０．４に示される。そのような置換が生物学的活性の変化を結果としてもたらす場合、表０．４において「例示的置換」と称される、またはアミノ酸クラスに関してさらに以下に記載されるようなより実質的な変化が導入され、生成物がクリーニングされてもよい。
【表１２】
2021514656.tif 000026
【０２１１】
抗体の生物学的特性の実質的な改変は、（ａ）例えば、β−シートもしくはらせん立体構造としての、置換の区画におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクの維持に対する効果が顕著に異なる置換を選択することにより達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて群に分割される：
【０２１２】
（１）非極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
【０２１３】
（２）非荷電極性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
【０２１４】
（３）酸性（負荷電）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
【０２１５】
（４）塩基性（正荷電）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
【０２１６】
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、および
【０２１７】
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。
【０２１８】
非保存的置換は、これらの１つのクラスのメンバーを別のクラスと交換することにより為される。
【０２１９】
為され得る１つの種類の置換は、例えば、化学的に反応性であってもよい抗体中の１つまたはそれ以上のシステインを、非限定的にアラニンまたはセリンなどの別の残基に変化させることである。例えば、非標準的なシステインの置換が為され得る。置換は、抗体の可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域中または定常領域中で為され得る。一部の実施形態では、システインは、標準的なものである。抗体の適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基もまた、分子の酸化安定性を向上させかつ異常な架橋を防止するために、概してはセリンで、置換されてもよい。反対に、特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合に、その安定性を向上させるために、システイン結合が抗体に付加されてもよい。
【０２２０】
抗体はまた、例えば、抗体の結合特性を変化させるために、例えば、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインにおいて改変されてもよい。可変領域の変化は、結合親和性および／または特異性を変化させ得る。一部の実施形態では、１〜５個以下の保存的アミノ酸置換がＣＤＲドメイン内で為される。他の実施形態では、１〜３個以下の保存的アミノ酸置換がＣＤＲドメイン内で為される。例えば、変異は、ＩＬ−６に対する抗体のＫＤを増加もしくは減少させるため、ｋｏｆｆを増加もしくは減少させるため、または抗体の結合特異性を変化させるためにＣＤＲ領域の１つまたはそれ以上において為されてもよい。部位特異的変異誘発の技術は当該技術分野において周知である。例えば、上掲のSambrook et al.およびAusubel et al.を参照。
【０２２１】
一態様によれば、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体のＩｇＧドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であり得る。別の態様によれば、ＩｇＧドメインは、定常領域が上記のアイソタイプの１つより多くから形成される複合物（例えば、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４からのＣＨ１領域、ヒンジ、ＩｇＧ１からのＣＨ２およびＣＨ３領域）であり得る。アイソタイプの選択において、ヒトアイソタイプ（isotopes）ＩｇＧｌおよびＩｇＧ３は補体媒介性細胞傷害性を有する一方、ヒトアイソタイプＩｇＧ２およびＩｇＧ４は乏しい補体媒介性細胞傷害性を有するまたはそれを有しないことが当該技術分野において公知である。一部の実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体アイソタイプはＩｇＧ１である。
【０２２２】
軽鎖定常領域は、ヒトラムダまたはカッパのいずれかであり得る。一部の実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体はヒトカッパ軽鎖定常領域を有する。
【０２２３】
ヒト定常領域は、異なる個体間でアロタイプ変異およびイソアロタイプ変異を示し、すなわち、定常領域は、異なる個体において１つまたはそれ以上の多型位置で異なり得る。イソアロタイプは、イソアロタイプを認識する血清が１つまたはそれ以上の他のアイソタイプの非多型領域に結合するという点でアロタイプとは異なる。ヒト定常領域への言及は、任意の天然のアロタイプまたは天然のアロタイプ中の多型位置を占有する残基の任意の置換（permutation）または以下に記載されるようにエフェクター機能を低減もしくは増
加させるための最大３、５もしくは１０個の置換を有する定常領域を含む。
【０２２４】
重鎖のＣ末端リジンなどの軽鎖および／または重鎖のアミノまたはカルボキシ末端における１または数個のアミノ酸は、分子の一部または全てにおいて欠失または誘導化されていてもよい。
【０２２５】
置換は、補体媒介性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
などのエフェクター機能を低減もしくは増加させるため（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，６２４，８２１号；Ｔｓｏ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，８３４，５９７号；およびLazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006を参
照）、またはヒトにおける半減期を長期化させるため（例えば、Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004を参照）に定常領域において為され得る。
【０２２６】
一部の実施形態では、本明細書において提供されるＩＬ−６アンタゴニスト抗体は、補体媒介性細胞傷害性を低減する１つより多く（one more）の置換を含む。補体媒介性細胞傷害性の低減は、変異の性質に依存してＦｃ受容体結合の低減と共にまたは伴わずに達成され得る。低減された補体媒介性細胞傷害性を有するがＦｃ受容体の低減をほとんどまたは全く有しない抗体は、副作用に寄与し得る補体の活性化なしにｉＣ３ｂのＦｃ媒介性食作用の所望の効果を可能とする。ヒト定常領域における補体媒介性細胞傷害性を低減することが公知の例示的な変異としては、ＥＵナンバリングによる位置２４１、２６４、２６５、２７０、２９６、２９７、３２２、３２９および３３１における変異が挙げられる。位置３１８、３２０、および３２２における変異は、マウス抗体において補体活性化を低減することが報告されている。アラニンは、変異された定常領域においてこれらの位置を占有するための好ましい残基である。使用されてきた一部の例示的なヒト変異としては、ヒトＩｇＧ３におけるＦ２４１Ａ、Ｖ２６４Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｖ２９６Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｋ３２２Ａ、およびＰ３３１ＳならびにヒトＩｇＧｌにおけるＤ２７０ＡまたはＥ、Ｎ２９７Ｑ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９Ａ、およびＰ３３１Ｓ（ＥＵナンバリング）が挙げられる。
【０２２７】
ここでは、他の箇所のように、ＥＵナンバリングスキームが、抗体の定常領域中のアミノ酸をナンバリングするために使用される。可変領域中の残基が本明細書で参照される場合、（他に指定されなければ）残基ナンバリングは可変ドメイン（または、指定された場合は配列番号）による。位置２３４、２３５、２３６および／または２３７のいずれかまたは全てにおける置換は、Ｆｃγ受容体、特にＦｃγＲＩ受容体に対する親和性を低減し、補体結合および活性化も低減する（例えば、ＵＳ６，６２４，８２１、ＷＯ／２００９／０５２４３９を参照）。位置２３４、２３５および２３７におけるアラニン置換は、特にヒトＩｇＧｌの文脈において、エフェクター機能を低減する。任意に、Ｆｃ受容体結合を低減するために、ヒトＩｇＧ２における位置２３４、２３６および／または２３７はアラニンで置換され、位置２３５はグルタミンで置換される（例えば、ＵＳ５，６２４，８２１を参照）。半減期を増加させる例示的な置換としては、位置２５０におけるＧｌｎおよび／または位置４２８におけるＬｅｕが挙げられる。提供される抗ＩＬ−６抗体がヒトＩｇＧ１アイソタイプを有する本発明の一態様によれば、抗体は定常領域中に少なくとも１つの変異を有することが好ましい。好ましくは、変異は、定常領域による補体結合または活性化を低減する。本発明の特に好ましい態様では、抗体は、ＥＵナンバリングによる位置Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ａ３２７、Ａ３３０およびＰ３３１において１つまたはそれ以上の変異を有する。さらにより好ましくは、変異は、ＥＵナンバリングによる以下：Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓの１つまたはそれ以上を構成する。最も好ましい実施形態では、ヒトＩｇＧ１は、ＥＵナンバリングによる以下の変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａを有する。
【０２２８】
コンジュゲート
ＩＬ−６アンタゴニスト抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップの半減期は、「半減期延長部分」または「半減期延長基」の取付けにより延長させることができ、これらの用語は本明細書において交換可能に使用され、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨ２、または１つもしくはそれ以上のＮ−および／もしくはＯ−グリカン構造などの１つまたはそれ以上のアミノ酸部位鎖官能性に取り付けられ、かつタンパ
ク質／ペプチドに共役した場合にこれらのタンパク質／ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期を増加させ得る、１つまたはそれ以上の化学基を指す。半減期延長部分の例としては、本明細書に記載のポリマー、特に双性イオンモノマー、例えば、ＨＥＭＡ−ホスホリルコリン、ＰＥＧ、生体適合性の脂肪酸およびその誘導体、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、例えば、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（Ｇｌｙｘ−Ｓｅｒｙ）（ＨＡＰ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパロサンポリマー（ＨＥＰ）、フレキシマー（Fleximers）、デキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ
）、Ｆｃドメイン、トランスフェリン、２５アルブミン、エラスチン様（ＥＬＰ）ペプチド、ＸＴＥＮポリマー、ＰＡＳポリマー、ＰＡポリマー、アルブミン結合ペプチド、ＣＴＰペプチド、ＦｃＲｎ結合ペプチドならびにその任意の組合せのポリマーが挙げられる。
【０２２９】
一部の実施形態では、抗体はホスホリルコリン含有ポリマーと共役している。一部の実施形態では、抗体は、ポリ（アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）含有ポリマー、例えば、少なくとも１つのアクリロイルオキシエチルホスホリルコリンモノマー、例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（すなわち、２−メタクリロイル−２’−トリメチルアンモニウムエチルホスフェート）を含有するアクリル酸のポリマーと共役している。
【０２３０】
一部の実施形態では、抗体および／または抗体ＶＥＧＦトラップ融合物は、水中で可溶性のポリマーを指す水溶性ポリマーと共役している。水溶性ポリマーの溶液は、濾過後の同じ溶液により伝達される光の少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９５％を伝達してもよい。重量を基準にして、水溶性ポリマーまたはそのセグメントは、水中に少なくとも約３５％、少なくとも約５０％、約７０％、約８５％、約９５％または１００％（乾燥ポリマーの重量による）可溶性であってもよい。
【０２３１】
一実施形態では、半減期延長部分は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを使用してタンパク質の遊離アミノ基を介してＩＬ−６アンタゴニスト抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップに共役され得る。アミン基への共役を標的化する試薬は、リジンのε−アミン基、Ｎ末端アミノ酸のα−アミン基、およびヒスチジンのδ−アミン基にランダムに反応し得る。
【０２３２】
しかしながら、本発明のＩＬ−６アンタゴニスト抗体は、ポリマー共役のために利用可能な多くのアミン基を有する。そのため、遊離アミノ基へのポリマーの共役は、エピトープに結合する抗体の能力に負に影響する可能性がある。
【０２３３】
別の実施形態では、半減期延長部分は、任意の適切なチオール反応化学を使用して１つまたはそれ以上の遊離ＳＨ基に連結され、該反応化学としては、マレイミド化学、以前の酸化後のＩＬ−６アンタゴニスト抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップの炭水化物部分へのポリマーヒドラジドまたはポリマーアミンの連結が挙げられるがそれに限定されない。マレイミドカップリングの使用は本発明の特に好ましい実施形態である。連結は、好ましくは、天然に存在するまたは遺伝子操作を介して導入されたシステインにおいて為される。
【０２３４】
一部の実施形態では、ポリマーは、部位特異的変異誘発によりＩＬ−６アンタゴニスト抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップに導入されたシステイン残基に共有結合的に取り付けられる。一部の実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップのＦｃ部分におけるシステイン残基が使用され得る。一部の実施形態では、システイン残基をＦｃ領域に導入するための部位は、ＷＯ２０１３／０９３８０９、ＵＳ７，５２１，５４１、ＷＯ２００８／０２０８２７、ＵＳ８，００８，４５３、ＵＳ８，４５５，６２２およびＵＳ２０１２／０２１３７０５（参照
することにより全ての目的のために本明細書に組み込まれる）に提供される。一部の実施形態では、システイン変異は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによりヒトＩｇＧ重鎖を参照してＱ３４７ＣおよびＬ４４３Ｃである。一部の実施形態では、その後のポリマー取付けのために特異的変異誘発により付加されるシステインはＬ４４３Ｃである。一部の実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体対ポリマーの化学量論は１：１であり、換言すれば、コンジュゲートは、ポリマーの１分子に共役したＩＬ−６アンタゴニスト抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップの１分子をそれぞれ含む分子から本質的になる。一部の実施形態では、連結は、１つまたはそれ以上のリジンにおいて為され得る。
【０２３５】
一部の実施形態では、コンジュゲートは、ＩＬ−６に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体を含み、または、ＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップはポリマーに共役している。一部の実施形態では、ポリマーは双性イオンモノマーを含む。一部の実施形態では、双性イオンモノマーは、非限定的に、ＨＥＭＡ−ホスホリルコリン、ＰＥＧ、生体適合性の脂肪酸およびその誘導体、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、例えば、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（Ｇｌｙｘ−Ｓｅｒｙ）（ＨＡＰ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパロサンポリマー（ＨＥＰ）、フレキシマー、デキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、Ｆｃドメイン、トランスフェリン、２５アルブミン、エラスチン様（ＥＬＰ）ペプチド、ＸＴＥＮポリマー、ＰＡＳポリマー、ＰＡポリマー、アルブミン結合ペプチド、ＣＴＰペプチド、またはＦｃＲｎ結合ペプチドである。一部の実施形態では、双性イオンモノマーを含むポリマーは半減期延長部分である。
【０２３６】
一部の実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップは、取り付けられた半減期延長部分を有し得る。一部の実施形態では、半減期延長部分は双性イオンポリマーであるが、ＰＥＧまたは以下において議論される他の半減期延長剤が代替的に使用され得る。一部の実施形態では、双性イオンポリマーは、ホスホリルコリン基を有するモノマーから形成される。一部の実施形態では、モノマーは２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートである。一部の実施形態では、モノマーは２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートである（ＨＥＭＡ−ＰＣ）。
【０２３７】
一部の実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップに共役したポリマーは、少なくとも２または３またはそれ以上のアームを有する。一部のポリマーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のアームを有する。一部の実施形態では、ポリマーは、３、６または９個のアームを有する。一部の実施形態では、ポリマーは９個のアームを有する。一部の実施形態では、ポリマーのピーク分子量は３００，０００〜１，７５０，０００Ｄａである。一部の実施形態では、ポリマーは、５００，０００〜１，０００，０００Ｄａのピーク分子量を有する。一部の実施形態では、ポリマーは、６００，０００〜８００，０００Ｄａのピーク分子量を有する。
【０２３８】
一部の実施形態では、アンタゴニスト抗ＩＬ−６抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップとポリマーとのコンジュゲートが提供される。一部の実施形態では、ポリマーは、サイズ排除クロマトグラフィー−多角光散乱（以下「ＳＥＣ−ＭＡＬＳ」）により測定される３００，０００〜１，７５０，０００ダルトンのピーク分子量を有する。一部の実施形態では、ポリマーは、ＳＥＣ−ＭＡＬＳにより測定される５００，０００〜１，０００，０００ダルトンのピーク分子量を有する。一部の実施形態では、ポリマーは、ＳＥＣ−ＭＡＬＳにより測定される６００，０００〜８００，０００ダルトンのピーク分子量を有する。
【０２３９】
一部の実施形態では、半減期延長部分は、本明細書において提供されるＩＬ−６アンタゴニスト抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップの天然に存在するシステイン残基に共役していてもよい。一部の実施形態では、半減期延長部分は、部位特異的変異誘発を介して付加されたシステインに共役している。一部の実施形態では、システインは、組換えＤＮＡ技術を使用して軽鎖または重鎖のいずれかのＣ末端にペプチドＳＧＧＧＣまたはＣＡＡを付加することにより付加される。一部の実施形態では、ペプチドは重鎖に付加される。一部の実施形態では、組換えＤＮＡ技術を介して導入されるシステイン残基は、（ＥＵナンバリングで）Ｑ３４７ＣおよびＬ４４３Ｃからなる群から選択される。
【０２４０】
本発明の別の態様によれば、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップならびに薬学的に許容される賦形剤を有する医薬組成物が提供される。
【０２４１】
ＩＬ−６アンタゴニスト抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップ（または本明細書において提供される他の構築物）は、（ｉ）遺伝子操作による組換えＤＮＡの製造、（ｉｉ）非限定的に例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションによる原核または真核細胞への組換えＤＮＡの導入、（ｉｉｉ）形質転換細胞の培養、（ｉｖ）例えば構成的なまたは誘導による、抗ＩＬ−６抗体の発現、（ｖ）例えば、培養培地からのまたは形質転換細胞を回収することによる、抗ＩＬ−６抗体の単離、ならびにそれにより（ｖｉ）精製された抗ＩＬ−６抗体を得ることを含む組換え発現により製造され得る。
【０２４２】
一部の実施形態では、抗ＩＬ−６抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップおよびポリマーを含むコンジュゲート（ならびにバイオコンジュゲートなどの本明細書において提供される他の構築物）が提供される。抗体および／またはＡｂ−トラップは、本明細書に開示される抗体および／またはトラップのいずれか１つである。一部の実施形態では、抗体はＩｇＧである。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭである。一部の実施形態では、ポリマーは、スルフヒドリル基に共有結合している。一部の実施形態では、ポリマーは、システイン残基からのスルフヒドリル基に共有結合している。一部の実施形態では、ポリマーは、重鎖上のシステイン残基からのスルフヒドリル基に共有結合している。一部の実施形態では、ポリマーは、ＩｇＧの重鎖上のシステイン残基からのスルフヒドリル基に共有結合している。一部の実施形態では、抗体は、位置３４７または４４３（ＥＵナンバリング）においてシステイン残基を含む。一部の実施形態では、ポリマーは、位置３４７または４４３（ＥＵナンバリング）におけるシステイン残基からのスルフヒドリル基に共有結合している。
【０２４３】
ＩＬ−６アンタゴニスト抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップは、薬理学的に許容される抗ＩＬ−６抗体分子を産生することにより特徴付けられる好適な原核または真核宿主システムにおける発現により製造され得る。真核細胞の例は、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｉｐ、およびＨｅｐＧ２である。他の好適な発現システムは、原核（例えば、ｐＥＴ／ＢＬ２１発現システムを有するＥ．コリ（E. coli））、酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）および／またはピキア・パストリス（Pichia pastoris）のシステム）、ならびに昆虫細胞である。一部の実施形態では、本明細書に開示される抗体および／またはＡｂ−トラップのいずれかを産生する単離された細胞株が提供される。一部の実施形態では、単離された細胞株は、非限定的に、ＣＨＯ、ｋ１ＳＶ、ＸＣｅｅｄ、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＧＳ−ＫＯの１つまたはそれ以上から選択される。
【０２４４】
一部の実施形態では、本明細書に開示される抗体および／またはＡｂ−トラップのいずれかをコードする単離された核酸が提供される。一部の実施形態では、単離された核酸を
含む組換え発現ベクターが提供される。一部の実施形態では、宿主細胞は発現ベクターを含む。
【０２４５】
多様なベクターをＩＬ−６アンタゴニスト抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップの調製のために使用することができ、それは真核および原核発現ベクターから選択されてもよい。原核発現用のベクターの例としては、非限定的に、プリセット（preset）、ｐｅｔ、およびｐａｄなどのプラスミドが挙げられ、原核発現ベクターにおいて使用されるプロモーターは、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、またはａｒａＢＡＤの１つまたはそれ以上を含むがそれに限定されない。真核発現用のベクターの例としては、（ｉ）酵母での発現のために、非限定的に、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、またはＡＵＧ１などのプロモーターを使用する、非限定的に、ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、またはｐＭＥＴなどのベクター、（ｉｉ）昆虫細胞での発現のために、非限定的に、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、またはｐｏｌｈなどのプロモーターを使用する、非限定的に、ｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、またはｐＢＡＣなどのベクター、ならびに（ｉｉｉ）哺乳動物細胞での発現のために、非限定的に、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、およびベータアクチンなどのプロモーターを使用する、非限定的に、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、またはｐＢＰＶなどのベクター、および、一態様では、非限定的に、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはレトロウイルスなどのウイルスシステムに由来するベクターが挙げられる。
【０２４６】
一部の実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップを製造する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、抗体が産生および回収される条件下で本明細書に開示される抗体および／またはＡｂ−トラップのいずれかを組換えにより産生する細胞株を培養することを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップを製造する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップが産生および回収される条件下で表１Ａに示されるアミノ酸配列を含む重鎖および表１Ｂに示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体および／またはＡｂ−トラップをコードする核酸を含む細胞株を培養することを含む。一部の実施形態では、抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップの重鎖および軽鎖は、別々のベクター上にコードされる。一部の実施形態では、抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップの重鎖および軽鎖は、同じベクター上にコードされる。
【０２４７】
本発明の別の態様によれば、双性イオンポリマー−ＩＬ−６アンタゴニスト抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップコンジュゲートを合成する方法であって、コンジュゲートが、１つまたはそれ以上の機能性剤および１つまたはそれ以上のポリマーアームを有し、ポリマーアームのそれぞれが１つまたはそれ以上のモノマー単位を有し、単位の少なくとも１つが双性イオンを有する、方法が提供される。例えば、そのような方法は、以下のステップを有し得る：
ａ．モノマー重合のための１つまたはそれ以上の部位を有する開始剤およびアミン基を有する第１のリンカーを提供するステップであって、開始剤がトリフルオロ酢酸塩である、ステップ、
ｂ．重合のために好適な１つまたはそれ以上のモノマーを提供するステップであって、モノマーの少なくとも１つが双性イオンである、ステップ、
ｃ．モノマーを開始剤と反応させて、それぞれがモノマー重合のための部位に対応する１つまたはそれ以上のポリマーアームを形成させ、アミン基を有する第１のリンカーを有する開始剤−ポリマーコンジュゲートを提供するステップ、
ｄ．少なくとも第２および第３の反応性基を有する第２のリンカーを提供するステップ、
ｅ．開始剤−ポリマーコンジュゲートの第１のリンカーのアミン基に第２のリンカーの第２および第３の反応性基の１つを連結して、連結ステップにおいて使用されなかった１つまたはそれ以上の反応性基を有するリンカー−開始剤−ポリマーコンジュゲートを提供するステップ、ならびに
ｆ．リンカー−開始剤−ポリマー部分の未反応の反応性基の１つまたはそれ以上に１つまたはそれ以上の機能性剤を連結して、ポリマー−機能性剤コンジュゲートを提供するステップ。
【０２４８】
一部の実施形態では、ＩＬ−６に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップならびにホスホリルコリン含有ポリマーを含むコンジュゲートが提供される。一部の実施形態では、ポリマーは、抗体および／またはＡｂ−トラップに共有結合している。一部の実施形態では、ポリマーは、抗体および／またはＡｂ−トラップに非共有結合的に結合している。
【０２４９】
一部の実施形態では、抗ＩＬ−６抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップならびにホスホリルコリン含有ポリマーを含むコンジュゲートが提供される。一部の実施形態では、ポリマーは、抗体の可変領域の外部において抗体に共有結合している。一部の実施形態では、抗ＩＬ−６抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップならびにホスホリルコリン含有ポリマーを含むコンジュゲートが提供される。ポリマーは、抗体の可変領域の外部のシステインにおいて抗体に共有結合している。一部の実施形態では、抗ＩＬ−６抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップならびにホスホリルコリン含有ポリマーを含むコンジュゲートであって、ポリマーが、抗体の可変領域の外部のシステインにおいて抗体に共有結合しており、前記システインが、組換えＤＮＡ技術を介して付加されたものである、コンジュゲートが提供される。コンジュゲートの一部の実施形態では、ポリマーは、２（メタクリロイルオキシ）エチル（２−（トリメチルアンモニオ）エチル）ホスフェート（ＭＰＣ）モノマーを含む。
【０２５０】
本発明の別の態様によれば、共役基（例えば、マレイミド）がポリマー合成後に付加される方法が提供される。これは、「スナップオン戦略」または「ユニバーサルポリマー戦略」と称されることがある。例えば、米国特許出願第１４／９１６，１８０号（米国特許出願公開第２０１６０１９９５０１号として公開）（参照することにより全体が本明細書に組み込まれる）を参照。一部の実施形態では、単一の開始剤部分が大規模ポリマー合成のために使用され得る。そのため、スケールアップされた最適なポリマー合成のための条件が開発され得る。そのようなポリマーは次に、様々な種類のリンカーに「スナップオン」することにより様々な種類の機能性剤に適合され得る。例えば、より大きい機能性剤をＦａｂ断片の抗体などの本発明のポリマーに共役させることが所望される場合、より長いリンカー配列がポリマーにスナップオンされ得る。対照的に、より小さい機能性剤は、比較的より短いリンカー配列を要求することがある。
【０２５１】
方法の一部の実施形態では、開始剤は、ポリマー開始のための約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２の部位を有する。一部の実施形態では、開始剤は、ポリマー開始のための約３、約６、または約９の部位を有する。
【０２５２】
本発明の別の態様によれば、第２のリンカーは、第２、第３、第４、第５、および第６の反応性基を有する。より好ましくは、第２のリンカーは、第２および第３の反応性基のみを有する。
【０２５３】
本発明の一態様によれば、各ポリマーアームは約２０〜約２０００のモノマー単位を有する。好ましくは、各アームは、約１００〜５００のモノマー単位または約５００〜１０００のモノマー単位または約１０００〜１５００のモノマー単位または約１５００〜２０
００のモノマー単位を有する。
【０２５４】
本発明の一態様によれば、ポリマー−機能性剤コンジュゲートのピーク分子量は約１００，０００〜１，５００，０００Ｄａである。好ましくは、ポリマー−機能性剤コンジュゲートのピーク分子量は、約２００，０００〜約３００，０００Ｄａ、約４００，０００〜約６００，０００Ｄａまたは約６５０，０００〜約８５０，０００Ｄａである。
【０２５５】
本発明の別の態様によれば、第１のリンカーは、好ましくは、アルキル、置換アルキル、アルキレン、アルコキシ、カルボキシアルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、環状アルキルエーテル、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、アリール、アリーレン、アリーレン−オキシ、ヘテロアリール、アミノ、アミドまたはその任意の組合せである。より好ましくは、第１のリンカーは、式：
【化５】
2021514656.tif 000027
（式中、ｍは１〜１０である）を有する。一部の実施形態では、第１のリンカーは上記の式（式（１））を有し、かつ、ｍは４である。
【０２５６】
一部の実施形態では、開始剤は、好ましくは、
【化６】
2021514656.tif 000028
【化７】
2021514656.tif 000029
【化８】
2021514656.tif 000030
（式中、Ｘは、ＮＣＳ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択される）からなる群から選択される構造を含む。より好ましくは、式（２）、式（３）および／または式（４）におけるＸはＢｒである。
【０２５７】
一部の実施形態では、モノマーは、
【化９】
2021514656.tif 000031
【化１０】
2021514656.tif 000032
【化１１】
2021514656.tif 000033
【化１２】
2021514656.tif 000034
【化１３】
2021514656.tif 000035
（式中、Ｒ７はＨまたはＣ１〜６アルキルであり、かつ、ｔは１〜６である）からなる群から選択される。
【０２５８】
より好ましくは、モノマーは、２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェート（ＨＥＭＡ−ＰＣ）および２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートからなる群から選択される。
【０２５９】
最も好ましくは、モノマーは、２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートである。
【０２６０】
第２のリンカー部分は、好ましくは、構造：
【化１４】
2021514656.tif 000036
（式中、Ｒ８は、
【化１５】
2021514656.tif 000037
からなる群から選択され、かつ、Ｒ９は、
【化１６】
2021514656.tif 000038
（式中、ｐは１〜１２である）である）を有する活性化エステルを含む。
【０２６１】
本発明のより好ましい実施形態では、ポリマーは９個のアームを有し、ｍは２〜４であり、Ｒ９は、
【化１７】
2021514656.tif 000039
（式中、ｐは４〜１５である）である。さらにより好ましくは、ｍは４であり、かつ、ｐは１２である。
【０２６２】
一部の実施形態では、ラジカル重合可能なモノマーは、
【化１８】
2021514656.tif 000040
（式中、Ｒ１はＨまたはＣ１〜６アルキルであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は同一または異なってＨまたはＣ１〜４アルキルであり、かつ、ＸおよびＹは同一または異なって１〜６の整数である）である。一部の実施形態では、式（１２）においてＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれメチルであり、かつ、ＸおよびＹはそれぞれ２である。
【０２６３】
一部の実施形態では、ラジカル重合可能なモノマーは、
【化１９】
2021514656.tif 000041
（式中、Ｒ１はＨまたはＣ１〜６アルキルであり、Ｒ２およびＲ３は同一または異なってＨまたはＣ１〜４アルキルであり、Ｒ４はＰＯ４−、ＳＯ３−またはＣＯ２−であり、かつ、ＸおよびＹは同一または異なって１〜６の整数である）である。一部の実施形態では、式（１３）においてＲ１、Ｒ２およびＲ３はメチルであり、Ｒ４はＰＯ４−であり、かつ、ＸおよびＹはそれぞれ２である。
【０２６４】
一部の実施形態では、モノマーは、
【化２０】
2021514656.tif 000042
（式中、Ｒ１はＨまたはＣ１〜６アルキルであり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は同一または異なってＨまたはＣ１〜４アルキルであり、Ｒ５はＰＯ４−、ＳＯ３−またはＣＯ２−であり、かつ、ＸおよびＹは同一または異なって１〜６の整数である）である。一部の実施形態では、式（１４）においてＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はメチルであり、Ｒ５はＰＯ４−であり、かつ、ＸおよびＹは２である。
【０２６５】
ポリマーがシステイン（または他の指定された残基）を介して共役する場合、ポリマーは、残基に直接的または間接的に連結され得る（例えば、介在する開始剤、およびまたはスペーサーなどが用いられる）。
【０２６６】
一部の実施形態では、ホスホリルコリン含有ポリマーは、以下：
【化２１】
2021514656.tif 000043
に示されるような２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウム）エチルホスフェート（ＭＰＣ）モノマーを含み、ポリマーは、以下の繰返し単位：
【化２２】
2021514656.tif 000044
（式中、ｎは１〜３０００の整数であり、かつ、波線はポリマー中のモノマー単位間の結合点を示唆する。）を含む。
【０２６７】
一部の実施形態では、ポリマーは３つもしくはそれ以上のアームを有し、または３つもしくはそれ以上のポリマー開始部位を含む開始剤を用いて合成される。一部の実施形態では、ポリマーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２個のアームを有し、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２個のポリマー開始部位を含む開始剤を用いて合成される。より好ましくは、ポリマーは、３、６、もしくは９個のアームを有し、または３、６、もしくは９個のポリマー開始部位を含む開始剤を用いて合成される。一部の実施形態では、ポリマーは９個のアームを有し、または９個のポリマー開始部位を含む開始剤を用いて合成される。
【０２６８】
一部の実施形態では、付加されるポリマーは約３００，０００〜約１，７５０，０００Ｄａ（ＳＥＣ−ＭＡＬｓ）の分子量を有する。一部の実施形態では、ポリマーは約５００，０００〜約１，０００，０００Ｄａの分子量を有する。一部の実施形態では、ポリマーは約６００，０００〜約９００，０００Ｄａの分子量を有する。一部の実施形態では、ポリマーは約７５０，０００〜約８５０，０００Ｄａの分子量を有する。一部の実施形態では、ポリマーは約８００，０００〜約８５０，０００Ｄａの分子量を有する。一部の実施形態では、ポリマーは約７５０，０００〜約８００，０００Ｄａの分子量を有する。
【０２６９】
一部の実施形態では、本明細書に記載の任意の抗体および／またはＡｂ−トラップは、ポリマーにさらに共役してバイオコンジュゲートを形成し得る。バイオコンジュゲートの分子量（合計、ＳＥＣ−ＭＡＬｓ）は、約３５０，０００〜２，０００，０００ダルトン、例えば、約４５０，０００〜１，９００，０００ダルトン、約５５０，０００〜１，８００，０００ダルトン、約６５０，０００〜１，７００，０００ダルトン、約７５０，０００〜１，６００，０００ダルトン、約８５０，０００〜１，５００，０００ダルトン、約９００，０００〜１，４００，０００ダルトン、約９５０，０００〜１，３００，０００ダルトン、約９００，０００〜１，０００，０００ダルトン、約１，０００，０００〜１，３００，０００ダルトン、約８５０，０００〜１，３００，０００ダルトン、約８５０，０００〜１，０００，０００ダルトン、および約１，０００，０００〜１，２００，０００ダルトンであり得る。一部の実施形態では、バイオコンジュゲートは約３５０，０００〜１，９００，０００ダルトンの分子量を有する。
【０２７０】
一部の実施形態では、抗体および／またはＡｂ−トラップコンジュゲートは精製される。一部の実施形態では、抗体および／またはＡｂ−トラップコンジュゲートの態様におけるポリマーは多分散であり、すなわち、ポリマーのＰＤＩは１．０ではない。一部の実施形態では、ＰＤＩは１．５未満である。一部の実施形態では、ＰＤＩは１．４未満である。一部の実施形態では、ＰＤＩは１．３未満である。一部の実施形態では、ＰＤＩは１．２未満である。一部の実施形態では、ＰＤＩは１．１未満である。一部の実施形態では、コンジュゲートのＰＤＩは１．５に等しいまたは１．５未満である。
【０２７１】
一部の実施形態では、抗体および／またはＡｂ−トラップコンジュゲートは、ポリマーに結合した抗ＩＬ−６免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を有し、ポリマーはＭＰＣモノマーを含み、抗ＩＬ−６重鎖の配列は表１Ａ中のものであり、かつ、抗ＩＬ−６軽鎖の配列は表１Ｂ中のものであり、かつ、抗体および／またはＡｂ−トラップはＣ４４２においてのみポリマーに結合している。一部の実施形態では、ポリマーは９個のアームを有し、かつ約６００，０００〜約１，０００，０００Ｄａの分子量を有する。
【０２７２】
一部の実施形態では、抗体および／またはＡｂ−トラップコンジュゲートは、ポリマーに結合した抗ＩＬ−６免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を有し、ポリマーはＭＰＣモノマーを含み、抗ＩＬ−６重鎖の配列は表１Ａ中のものを含み、かつ、抗ＩＬ−６軽鎖の配列は表１Ｂ中のものを含み、かつ、抗体はＣ４４３（ＥＵナンバリングにおいてのみポリマーに結合している。一部の実施形態では、ポリマーは９個のアームを有し、かつ約６００，０００〜約１，０００，０００Ｄａの分子量を有する。一部の実施形態では、コンジュゲートは、９個のアームを有するポリマーを含み、かつ、ポリマーは約６００，０００〜約９００，０００Ｄａの分子量を有する。
【０２７３】
一部の実施形態では、抗体コンジュゲートは、以下の構造：
【化２３】
2021514656.tif 000045
を有し、抗ＩＬ−６抗体の各重鎖は文字Ｈにより表され、かつ、抗ＩＬ−６抗体の各軽鎖は文字Ｌにより表され（一部の実施形態では、図６に示されるように、Ａｂ−トラップアレンジメントにさらに連結され得る）、
ポリマーは、Ｃ４４３（ＥＵナンバリング）のスルフヒドリルを通じて抗ＩＬ−６抗体（および／またはＡｂ−トラップ）に結合しており、結合は、重鎖の１つに接して示されており、ＰＣは、
【化２４】
2021514656.tif 000046
（式中、曲線はポリマーの残部への結合点を示唆する）であり、Ｘ＝ａ）ＯＲ（Ｒ＝Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル）、ｂ）Ｈ、またはｃ）Ｂｒを含む、任意のハロゲン化物であり、かつ、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９は同一または異なり、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９の和は、２５００プラスまたはマイナス１０％である。一部の実施形態では、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９は同一または異なって０〜３０００の整数である。一部の実施形態では、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９は同一または異なって０〜５００の整数である。一部の実施形態では、Ｘ＝ＯＲ（式中、Ｒは、糖、アミノアルキル、以下の残基：飽和Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、不飽和
Ｃ２〜Ｃ２４アルケニルまたはＣ２〜Ｃ２４アルキニル、アシル、アシルオキシ、アルキルオキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボニルオキシ（aminocarboyloxy）、ニトロ、アジド、フェニル、ヒドロキシ、アルキ
ルチオ、アリールチオ、オキシスルホニル、カルボキシ、シアノ、およびポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、−−ＣＯ−−Ｏ−−Ｒ７、カルボニル−−ＣＣＯ−−Ｒ７、−−ＣＯ−−ＮＲ８Ｒ９、−−（ＣＨ２）ｎ−−ＣＯＯＲ７、−−ＣＯ−−（ＣＨ）ｎ−−ＣＯＯＲ７、−−（ＣＨ２）ｎ−−ＮＲ８Ｒ９、エステル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニルの一置換、複数置換または非置換のバリアントであり、ｎは１〜６の整数であり、各Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は別々に、水素原子、ハロゲン原子、以下の残基：飽和Ｃ１〜Ｃ２４アルキル、不飽和Ｃ２〜Ｃ２４アルケニルまたはＣ２〜Ｃ２４アルキニル、アシル、アシルオキシ、アルキルオキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボニルオキシ、ニトロ、アジド、フェニル、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、オキシスルホニル、カルボキシ、シアノ、およびポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、５員環、および６員環の一置換、複数置換または非置換のバリアントからなる群から選択される。一部の実施形態では、式１７は、ＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップ融合タンパク質を作るように、表１Ｃの配列の一部または全てをさらに含む、融合タンパク質の部分であり得る。一部の実施形態では、図２７の融合物を式１７において使用することができ、融合物は、示された抗体に置き換える。
【０２７４】
一部の実施形態では、抗体コンジュゲートは、以下の構造：
【化２５】
2021514656.tif 000047
を有し、抗体の各重鎖は文字Ｈにより表され、かつ、抗ＩＬ−６抗体の各軽鎖は文字Ｌにより表され（一部の実施形態では、図６に示されるように、Ａｂ−トラップアレンジメントにさらに連結され得る）、
ポリマーは、Ｃ４４３（ＥＵナンバリング）のスルフヒドリルを通じて抗体に結合しており、結合は、重鎖の１つに接して示されており、
ＰＣは、
【化２６】
2021514656.tif 000048
（式中、曲線はポリマーの残部への結合点を示唆する）であり、Ｘ＝ａ）ＯＲ（Ｒ＝Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル）、ｂ）Ｈ、またはｃ）Ｂｒを含む、任意のハロゲン化物であり、かつ、
ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９は同一または異なり、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９の和は、２５００プラスまたはマイナス１５％である。一部の実施形態では、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９の和は、約１５００〜約３５００プラスまたはマイナス約１０％〜約２０％である。一部の実施形態では、図２７の融合物を式１７において使用することができ、融合物は、示された抗体に置き換える。
【０２７５】
一部の実施形態では、抗体および／またはＡｂ−トラップコンジュゲートは液体製剤中に存在する。一部の実施形態では、抗体および／またはＡｂ−トラップコンジュゲートは、薬学的に許容される担体と合わせられる。
【０２７６】
一部の実施形態では、抗ＩＬ−６抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）重鎖のアイソタイプはＩｇＧ１であり、かつＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有する。一部の実施形態では、軽鎖アイソタイプはカッパである。
【０２７７】
一部の実施形態では、抗ＩＬ−６抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）のＩｇＧ１ドメインは、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣなどのエフェクター機能をモジュレートするための１つまたはそれ以上の変異を有する。一部の実施形態では、ＩｇＧ１変異はエフェクター機能を低減する。一部の実施形態では、エフェクター機能の変異のために使用するためのアミノ酸としては、（ＥＵナンバリングで）Ｅ２３３Ｘ、Ｌ２３４Ｘ、Ｌ２３５Ｘ、Ｇ２３６Ｘ、Ｇ２３７Ｘ、Ｇ２３６Ｘ、Ｄ２７０Ｘ、Ｋ３２２Ｘ、Ａ３２７Ｘ、Ｐ３２９Ｘ、Ａ３３０Ｘ、Ａ３３０Ｘ、Ｐ３３１Ｘ、およびＰ３３１Ｘが挙げられ、Ｘは任意の天然または非天然アミノ酸である。一部の実施形態では、変異は、以下：Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ（ＥＵナンバリング）の１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、抗ＩＬ−６重鎖は、以下の変異（ＥＵナンバリング）：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａを有する。一部の実施形態では、天然ヒトＩｇＧ１配列と比べたエフェクター機能の変異の数は１０以下である。一部の実施形態では、天然ヒトＩｇＧ１配列と比べたエフェクター機能の変異の数は、５、４、３、２または１以下である。一部の実施形態では、抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）は、減少したＦｃガンマ結合および／または補体Ｃ１ｑ結合を有し、それにより、エフェクター機能を結果としてもたらす抗体の能力は減少している。これは、眼科適応症／障害のために特に有利であり得る。
【０２７８】
一部の実施形態では、抗ＩＬ−６抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）は、以下のアミノ酸変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、およびＬ４４３Ｃ（ＥＵナンバリング、または図２７の二重下線に示されるように、配列番号１７０における４５１Ａ、４５２Ａ、および４５４Ａ、および６６０Ｃ）の１つまたはそれ以上を含む。
【０２７９】
一部の実施形態では、抗ＩＬ−６抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップ）は、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ１）またはその部分である。
【０２８０】
一部の実施形態では、ＩＬ−６抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）は、免疫媒介性のエフェクター機能を低減する１つまたはそれ以上の変異を含む重鎖定常ドメインを含む。
【０２８１】
一部の実施形態では、抗ＩＬ−６重鎖は、半減期延長部分を共役するために使用され得る組換えＤＮＡ技術により変異として付加されたシステイン残基を有する。一部の実施形態では、変異はＱ３４７Ｃ（ＥＵナンバリング）および／またはＬ４４３Ｃ（ＥＵナンバリング）である。一部の実施形態では、変異はＬ４４３Ｃ（ＥＵナンバリング）である。一部の実施形態では、抗体対ポリマーの化学量論は１：１であり、換言すれば、コンジュゲートは、ポリマー１分子に共役した抗体１分子を有する。
【０２８２】
抗ＩＬ−６抗体の半減期は、「半減期延長部分」または「半減期延長基」の取付けにより延長され得る。半減期延長部分としては、問題とする生物学的薬物とインフレームで発
現され得る（または状況に依存して化学的に共役され得る）ペプチドおよびタンパク質、ならびに１つまたはそれ以上のアミノ酸側鎖または末端官能性、例えば、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨ２、または１つもしくはそれ以上のＮ−および／もしくはＯ−グリカン構造に取付けまたは共役され得る様々なポリマーが挙げられる。半減期延長部分は、概しては、生物学的薬物のｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期を増加させるように作用する。
【０２８３】
ペプチド／タンパク質半減期延長部分の例としては、Ｆｃ融合物（Capon DJ, Chamow SM, Mordenti J, et al. Designing CD4 immunoadhesions for AIDS therapy. Nature. 1989. 337:525-31）、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）融合物（Yeh P, Landais D, Lemaitre
M, et al. Design of yeast-secreted albumin derivatives for human therapy: biological and antiviral properties of a serum albumin-CD4 genetic conjugate. Proc Natl Acad Sci USA. 1992. 89:1904-08）、カルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）融合物（Fares FA, Suganuma N. Nishimori K, et al. Design of a long-acting follitropin agonist by fusing the C-terminal sequence of the chorionic gonadotropin beta subunit to the follitropin beta subunit. Proc Natl Acad Sci USA. 1992. 89:4304-08）、不
正確反復ペプチド配列（non-exact repeat peptide sequence）（ＸＴＥＮ）融合物の遺
伝子融合物（Schellenberger V, Wang CW, Geething NC, et al. A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner.
Nat Biotechnol. 2009. 27:1186-90）、エラスチン様ペプチド（ＥＬＰ化）（MCpherson
DT, Morrow C, Minehan DS, et al. Production and purification of a recombinant elastomeric polypeptide, G(VPGVG19-VPGV, from Escheriachia coli. Biotechnol Prog.
1992. 8:347-52）、ヒトトランスフェリン融合物（Prior CP, Lai C-H, Sadehghi H et al. Modified transferrin fusion proteins、特許ＷＯ２００４／０２０４０５、２００４）、プロリン−アラニン−セリン（ＰＡＳ化）（Skerra A, Theobald I, Schlapsky M.
Biological active proteins having increased in vivo and/or vitro stability、特
許ＷＯ２００８／１５５１３４Ａ１、２００８）、ホモ−アミノ酸ポリマー（ＨＡＰ化）（Schlapschy M, Theobald I, Mack H, et al. Fusion of a recombinant antibody fragment with a homo-amino acid polymer: effects on biophysical properties and prolonged plasma half-life. Protein Eng Des Sel. 2007. 20:273-84）およびゼラチン様タ
ンパク質（ＧＬＫ）融合物（Huang Y-S, Wen X-F, Zaro JL, et al. Engineering a pharmacologically superior form of granulocyte-colony-stimulating-factor by fusion with gelatin-like protein polymer. Eur J. Pharm Biopharm. 2010. 72:435-41）が挙げられる。
【０２８４】
ポリマー半減期延長部分の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ；Ｃｏｖｅｎｔｒｙ、ＵＫ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン（hydroxylethyl starch；ＨＥＳ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、炭水化物、多糖、プルラン（pullulane）、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、
デルマタン硫酸、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレン酸化物（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物（polyethylene-co-maleic acid anyhydride）、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチエチレンヒドロキシメチルホルマール）（poly(1-hydroxymethyethylene hydroxymethylformal、ＰＨＦ）、
双性イオンポリマー、ホスホリルコリン含有ポリマーおよびＭＰＣを含むポリマー、ポリ（Ｇｌｙｘ−Ｓｅｒｙ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパロサンポリマー（ＨＥＰ）、フレキシマー、デキストラン、およびポリシアル酸（ＰＳＡ）が挙げられる。
【０２８５】
一実施形態では、半減期延長部分は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを使用してタンパク質の遊離アミノ基を介して抗体に共役され得る。アミン基への共役を標的化する試薬は、リジンのε−アミン基、Ｎ末端アミノ酸のα−アミン基、およびヒスチジンのδ−アミン基にランダムに反応し得る。
【０２８６】
しかしながら、本明細書に開示される抗ＩＬ−６抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）は、ポリマー共役のために利用可能な多くのアミン基を有する。そのため、遊離アミノ基へのポリマーの共役は、ＩＬ−６（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）に結合する抗体タンパク質の能力に負に影響する可能性がある。
【０２８７】
一部の実施形態では、半減期延長部分は、任意の適切なチオール反応化学を使用して１つまたはそれ以上の遊離ＳＨ基に連結され、該反応化学としては、マレイミド化学、または以前の酸化後の抗体の炭水化物部分へのポリマーヒドラジドもしくはポリマーアミンの連結が挙げられるがそれに限定されない。一部の実施形態では、マレイミドカップリングが使用される。一部の実施形態では、連結は、天然に存在するまたは遺伝子操作を介して導入されたシステインにおいて為される。
【０２８８】
一部の実施形態では、抗体と半減期延長剤として用いられる高ＭＷポリマーとのコンジュゲートが提供される。一部の実施形態では、コンジュゲートは、双性イオンポリマーに連結した抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）を含み、ポリマーは１つまたはそれ以上のモノマー単位から形成され、かつ、少なくとも１つのモノマー単位は双性イオン基を有するものが提供される。一部の実施形態では、双性イオン基はホスホリルコリンである。
【０２８９】
一部の実施形態では、モノマー単位の１つはＨＥＭＡ−ＰＣである。一部の実施形態では、ポリマーは、ＨＥＭＡ−ＰＣである単一のモノマーから合成される。
【０２９０】
一部の実施形態では、一部の抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップ）コンジュゲートは、２、３、またはそれ以上のポリマーアームを有し、それにおいてモノマーはＨＥＭＡ−ＰＣである。一部の実施形態では、コンジュゲートは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のポリマーアームを有し、それにおいてモノマーはＨＥＭＡ−ＰＣである。一部の実施形態では、コンジュゲートは、３、６または９個のアームを有する。一部の実施形態では、コンジュゲートは９個のアームを有する。
【０２９１】
一部の実施形態では、ポリマー−抗体（および／またはポリマー−ＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）コンジュゲートは、１００，０００〜１，５００，０００Ｄａの分子量を有するポリマー部分を有する。一部の実施形態では、コンジュゲートは、５００，０００〜１，０００，０００Ｄａの分子量を有するポリマー部分を有する。一部の実施形態では、コンジュゲートは、６００，０００〜８００，０００Ｄａの分子量を有するポリマー部分を有する。一部の実施形態では、コンジュゲートは、６００，０００〜８５０，０００Ｄａの分子量を有するポリマー部分を有し、かつ９個のアームを有する。分子量がポリマーに共役した抗体について与えられる場合、分子量は、それと会合した任意の炭水化物部分を含む、タンパク質の分子量と、ポリマーの分子量との和である。
【０２９２】
一部の実施形態では、抗ＩＬ−６抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップ）は、約１００ｋＤａ〜１６５０ｋＤａのＭｗにより測定される分子量を有するＨＥＭＡ−ＰＣポリマーを有するものが提供される。一部の実施形態では、Ｍｗにより測定されるポリマーの分子量は約５００ｋＤａ〜１０００ｋＤａである。一部の実施形態では、
Ｍｗにより測定されるポリマーの分子量は約６００ｋＤａ〜約９００ｋＤａである。一部の実施形態では、Ｍｗにより測定されるポリマーの分子量は７５０または８００ｋＤａプラスまたはマイナス１５％である。
【０２９３】
一部の実施形態では、ポリマーは、１つまたはそれ以上のポリマー開始部位を有するＡＴＲＰのために好適な開始剤から製造される。一部の実施形態では、ポリマー開始部位は２−ブロモイソブチレート部位を有する。一部の実施形態では、開始剤は３つまたはそれ以上のポリマー開始部位を有する。一部の実施形態では、開始剤は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のポリマー開始部位を有する。一部の実施形態では、開始剤は、３、６または９個のポリマー開始部位を有する。一部の実施形態では、開始剤は９個のポリマー開始部位を有する。一部の実施形態では、開始剤はＯＧ１７８６である。
【０２９４】
抗ＩＬ−６抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）は、（ｉ）遺伝子操作による組換えＤＮＡの製造、（ｉｉ）非限定的に例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションによる原核または真核細胞への組換えＤＮＡの導入、（ｉｉｉ）形質転換細胞の培養、（ｉｖ）例えば構成的なまたは誘導による、抗体の発現、（ｖ）例えば、培養培地からのまたは形質転換細胞を回収することによる、抗体の単離、ならびにそれにより（ｖｉ）精製された抗体を得ることを含む組換え発現により製造され得る。
【０２９５】
抗ＩＬ−６抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）は、薬理学的に許容される抗体分子を産生することにより特徴付けられる好適な原核または真核宿主システムにおける発現により製造され得る。真核細胞の例は、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｉｐ、およびＨｅｐＧ２である。他の好適な発現システムは、原核（例えば、ｐＥＴ／ＢＬ２１発現システムを有するＥ．コリ）、酵母（サッカロミセス・セレビシエおよび／またはピキア・パストリスのシステム）、ならびに昆虫細胞である。
【０２９６】
多様なベクターを本明細書に開示される抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）の調製のために使用することができ、それは真核および原核発現ベクターから選択される。原核発現用のベクターの例としては、非限定的に、プリセット、ｐｅｔ、およびｐａｄなどのプラスミドが挙げられ、原核発現ベクターにおいて使用されるプロモーターは、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、またはａｒａＢＡＤの１つまたはそれ以上を含むがそれに限定されない。真核発現用のベクターの例としては、（ｉ）酵母での発現のために、非限定的に、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、またはＡＵＧ１などのプロモーターを使用する、非限定的に、ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、またはｐＭＥＴなどのベクター、（ｉｉ）昆虫細胞での発現のために、非限定的に、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、またはｐｏｌｈなどのプロモーターを使用する、非限定的に、ｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、またはｐＢＡＣなどのベクター、ならびに（ｉｉｉ）哺乳動物細胞での発現のために、非限定的に、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、およびベータアクチンなどのプロモーターを使用する、非限定的に、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、またはｐＢＰＶなどのベクター、および、一態様では、非限定的に、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはレトロウイルスなどのウイルスシステムに由来するベクターが挙げられるがそれに限定されない。
【０２９７】
一部の実施形態では、タンパク質当たり少なくとも１つのポリマーである。一部の実施形態では、タンパク質対ポリマーの比は１：４〜１：６である。一部の実施形態では、タンパク質（Ａｂ）対ポリマーの比は１：５のモル比である。一部の実施形態では、タンパ
ク質の量は、５、４、３、２、または約２．４ｍｇ／ｍｌである。
【０２９８】
一部の実施形態では、ポリマーおよび抗体を組み合わせた後の精製は陽イオン交換カラムをさらに含む。
【０２９９】
一部の実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップに取り付けられたポリマーの存在は、ポリマー自体の存在に起因してより深い効力を提供し得る。一部の実施形態では、ポリマーの存在は、（例えば、ＶＥＧＦにおいて）ヘパリン結合ドメインと組み合わせて使用された場合に、より深い効力を有するコンジュゲート分子を結果としてもたらす。一部の実施形態では、以下の実施例において提供されるＨＵＶＥＣデータに示されるように、分子は血管新生において優れている。一部の実施形態では、これは、（例えば、非コンジュゲート分子とコンジュゲート分子を比較して）単純に程度の差異ではなく、コンジュゲート分子の性質の差異である。さらには、以下の実施例におけるＨＵＶＥＣ増殖アッセイに示されるように、一部の実施形態では、ポリマーの存在は相乗的な阻害を提供する。
【０３００】
追加的に、一部の実施形態では、細胞密度が増加するにつれて（例えば、４，０００から６，０００へ）、コンジュゲートの効力もまた向上し得る。
【０３０１】
一部の実施形態では、使用されるコンジュゲートの量（タンパク質の重量による）は５０ｍｇ／ｍｌより多い。それは、例えば、５５、６０、６５、７０またはそれ以上のｍｇ／ｍｌ（共役前のタンパク質の重量による）であり得る。
【０３０２】
タンパク質をポリマーに共役させる方法
一部の実施形態では、治療用タンパク質−半減期延長部分コンジュゲートを調製する方法であって、組換えＤＮＡ技術を介して付加されたシステイン残基を有する治療用タンパク質を、マレイミド、ビニルスルホン、オルトピリジル−ジスルフィド、およびヨードアセトアミドからなる群から選択されるスルフヒドリル特異的反応基を有する半減期延長部分に共役させて、治療用タンパク質−半減期延長部分コンジュゲートを提供するステップを有する、方法が提供される。
【０３０３】
一部の実施形態では、抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）コンジュゲートを調製する方法が提供される。図１０に示されるように、方法は、３０×モル過剰のＴＣＥＰ還元剤を用いてタンパク質を還元することを含む（図１０）。還元後、抗体は酸化されてキャップ除去された抗体が生成され、該抗体では、抗体中に天然に存在する軽鎖および重鎖の間および内部のジスルフィド結合が形成されているが、重鎖位置Ｌ４４３Ｃ（ＥＵナンバリング）上の操作されたシステインはキャップ除去されないままである（図１０）。抗体は次に、賦形剤の添加および２〜１０×モル過剰のマレイミドバイオポリマーの添加により共役される。（図１０）。バイオポリマーは、共有結合性チオールエーテル連結を通じて抗体に連結する（図１０）。共役後、抗体コンジュゲートは精製され、非共役抗体およびポリマーの両方は除去される（図１０）。タンパク質がＡｂ−トラップである実施形態では、抗体上の同じ位置を使用し、かつ同じアプローチを用いることができる。
【０３０４】
上記のタンパク質および方法もまた変更され得る。そのため、一部の実施形態では、共役タンパク質（抗体または抗ＩＬ−６抗体である必要はない）を調製する方法が提供される。方法は、タンパク質中の１つまたはそれ以上のシステインを還元して溶液中にキャップ除去タンパク質を形成させることを含む。１つまたはそれ以上のシステインの還元後、キャップ除去タンパク質は再酸化されて還元タンパク質中に少なくとも１つのジスルフィド連結を回復させると共に、タンパク質中の操作されたシステイン残基が遊離チオール形
態のままであることにより溶液中に再酸化されたキャップ除去タンパク質が形成することを確実にする。少なくとも１つの賦形剤が次に溶液に添加される。賦形剤は、ポリマー誘導性のタンパク質沈殿を低減する。賦形剤が添加された後、ポリマーが溶液に添加され、それが再酸化されたキャップ除去タンパク質に操作されたシステイン残基において共役して共役タンパク質を形成させる。
【０３０５】
一部の実施形態では、モル過剰の還元剤は、機能する任意の量に変更され得る。一部の実施形態では、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０×モル過剰の還元剤（全ての実施形態においてＴＣＥＰである必要はない）が用いられ得る。一部の実施形態では、還元剤は、３，３’，３’’−ホスフィントリイルトリス（ベンゼン−１−スルホン酸）三ナトリウム（ＴＰＰＴＳ）であり得る。一部の実施形態では、任意の抗体（治療的またはその他）が用いられ得る。一部の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５×モル過剰のマレイミドバイオポリマーが用いられ得る。一部の実施形態では、ポリマーに対してキャップ除去タンパク質は過剰である。一部の実施形態では、還元されるタンパク質の量はポリマーの量より少ない。一部の実施形態では、還元されるタンパク質の量は、ポリマーの量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％である。一部の実施形態では、タンパク質の１０〜１５倍のポリマーが使用される。一部の実施形態では、還元される抗体の量はポリマーの量より多い。一部の実施形態では、ポリマーの量は還元される抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）の量より多い。
【０３０６】
一部の実施形態では、精製ステップは任意である。
【０３０７】
一部の実施形態では、抗体コンジュゲート（および／またはＡｂ−トラップ）を製造する方法は、抗ＩＬ−６抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）をホスホリルコリン含有ポリマーに共役させることを含む。一部の実施形態では、方法は、抗ＩＬ−６抗体をホスホリルコリン含有ポリマーに共役させるステップを含む。抗ＩＬ−６抗体は、組換えＤＮＡ技術を介して付加されたアミノ残基（amino residue）を含む。一部
の実施形態では、付加されるアミノ酸残基はシステイン残基である。一部の実施形態では、システイン残基は抗体の可変領域の外部において付加される。システイン残基は、抗体の重鎖または軽鎖のいずれかに付加され得る。
【０３０８】
一部の実施形態では、ポリマーはホスホリルコリン含有ポリマーを含むまたはからなる。一部の実施形態では、ホスホリルコリン含有ポリマーは、マレイミド、ビニルスルホン、オルトピリジル−ジスルフィド、およびヨードアセトアミドからなる群から選択されるスルフヒドリル特異的反応基を含む。一部の実施形態では、ホスホリルコリン含有ポリマー上のスルフヒドリル特異的反応基は、抗ＩＬ−６抗体上のシステイン残基と反応して抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧＦトラップ）コンジュゲートを生成する。
【０３０９】
一部の実施形態では、共役されるタンパク質は、抗体、抗体タンパク質融合物（例えば、ＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）、またはその結合断片であり得る。一部の実施形態では、タンパク質は、抗体ではなく、酵素、リガンド、受容体、または他のタンパク質またはその変異体もしくはバリアントである。一部の実施形態では、天然タンパク質は、少なくとも１つのジスルフィド結合および少なくとも１つの非天然システインを含有する。
【０３１０】
一部の実施形態では、賦形剤は酸または塩基であり得る。一部の実施形態では、賦形剤は、界面活性剤、糖、または荷電性アミノ酸である。一部の実施形態では、賦形剤は、ポリマーへの共役の間にタンパク質を溶液中に保つことを補助する。一部の実施形態では、
賦形剤は、タンパク質を含有する溶液へのポリマーの添加の前に、タンパク質を含有する溶液に添加される。
【０３１１】
一部の実施形態では、反応は、約ｐＨ５〜約ｐＨ９の水性条件下で起こる。一部の実施形態では、反応は、６．０〜８．５、６．５〜８．０または７．０〜７．５において起こる。
【０３１２】
一部の実施形態では、ポリマーは、２〜３７℃においてタンパク質に共役される。一部の実施形態では、共役は、０〜４０℃、５〜３５℃、１０〜３０℃、および１５〜２５℃において起こる。
【０３１３】
一部の実施形態では、本明細書に記載の共役タンパク質は、精製のため（非共役物から共役物を取り出すため）にイオン交換媒体または疎水性相互作用クロマトグラフィーもしくはアフィニティークロマトグラフィー媒体に接触させられ得る。一部の実施形態では、イオン交換媒体、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および／またはアフィニティークロマトグラフィー媒体は、非共役遊離ポリマーおよび非共役再酸化キャップ除去タンパク質から共役タンパク質を分離する。
【０３１４】
一部の実施形態では、本明細書に記載されかつ図１０に概説される方法は、溶解性システムを促進および／または維持することができる賦形剤を伴う。一部の実施形態では、方法は、相互作用することが意図される２つの成分の溶解性を溶液が維持することを可能とする。これは、タンパク質およびポリマー、そしてまた最終コンジュゲートの溶解性を含み得る。一部の実施形態では、賦形剤アプローチがない場合、問題となるのは、タンパク質は可溶性であるが、バイオポリマーが添加された場合に、溶液（例えば、タンパク質）の溶解性が低下し、溶液からクラッシュアウト／沈殿することであり得る。当然、タンパク質がクラッシュアウトする場合、それはバイオポリマーと効率的に共役するために利用可能ではない。そのため、バイオポリマーの存在下でタンパク質の溶解性を維持することにより２つが連結してタンパク質コンジュゲート（または図１０に示されるように、抗体コンジュゲート）が形成され得るように賦形剤が用いられ得る。これはまた、コンジュゲートの溶解性が維持されることを可能とする。
【０３１５】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリマーは、以下：双性イオン、ホスホリルコリン、またはマレイミド官能基にポリマー分岐点の中心をブリッジするＰＥＧリンカーの１つまたはそれ以上を含み得る。一部の実施形態では、本明細書において提供される任意のポリマーは、本明細書において提供される方法を介してタンパク質に付加され得る。
【０３１６】
一部の実施形態では、本明細書において提供される任意のタンパク質は、本明細書において提供される方法の１つまたはそれ以上を介して本明細書において提供される任意のポリマーに共役され得る。
【０３１７】
一部の実施形態では、本明細書において提供される方法は、タンパク質および／または抗体コンジュゲートを製造および精製するためのより大規模の加工を可能とする。一部の実施形態では、用いられる体積は、少なくとも１リットル、例えば、１、１０、１００、１，０００、５，０００、１０，０００リットルまたはそれ以上である。一部の実施形態では、製造および／または精製される抗体コンジュゲートの量は、０．１、１、１０、１００、１０００、またはそれ以上のグラムであり得る。
【０３１８】
一部の実施形態では、治療用タンパク質は、組換えＤＮＡ技術を介して付加されたシステイン残基を有する本明細書に記載の任意の抗ＩＬ−６抗体（および／またはＩＬ−６  
Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）であってもよい。一部の実施形態では、抗ＩＬ−６抗体重鎖は、以下のＣＤＲ：表１ＡのＣＤＲＨ１、表１ＡのＣＤＲＨ２、および表１ＡのＣＤＲＨ３を有する。重鎖はまた、位置８４（逐次的なナンバリングを介して）においてアルギニン（Ｒ）を有し得る。一部の実施形態では、抗ＩＬ−６軽鎖は、以下のＣＤＲ：表１ＢのＣＤＲＬ１、表１ＢのＣＤＲＬ２、および表１ＢのＣＤＲＬ３を有する。
【０３１９】
一部の実施形態では、抗ＩＬ−６抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）はＩｇＧ１を含む。一部の実施形態では、重鎖は、エフェクター機能をモジュレートするための１つまたはそれ以上の変異を有する。一部の実施形態では、変異は、以下のアミノ酸位置（ＥＵナンバリング）：Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ａ３２７、Ａ３３０、およびＰ３３１の１つまたはそれ以上に対するものである。一部の実施形態では、変異は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ（ＥＵナンバリング）からなる群から選択される。一部の実施形態では、変異は、（ＥＵナンバリングで）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａである。
【０３２０】
一部の実施形態では、組換えＤＮＡ技術を介して治療用タンパク質に付加されるシステイン残基は、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合対形成に関与するべきではない。これに関して、治療用タンパク質は二量体であってもよい。その場合、例えば、インタクトな抗ＩＬ−６抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）は、２つの軽鎖および２つの重鎖を有する。Ｃｙｓ残基が例えば重鎖に導入される場合、インタクトな抗体は、同一の位置において２つのそのような導入されたシステインを有し、これらのシステイン残基が鎖内ジスルフィド結合を形成する可能性が存在する。導入されたシステイン残基がＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を形成しまたはその傾向を有する場合、その導入されたＣｙｓ残基は共役のために有用でない。鎖内ジスルフィド対形成を生じさせる重鎖および軽鎖中の位置を回避する方法は当該技術分野において公知である。例えば、米国特許出願第２０１５／０１５８９５２号を参照。
【０３２１】
一部の実施形態では、組換えＤＮＡ技術を介して導入されるシステイン残基は、（ＥＵナンバリングで）Ｑ３４７ＣおよびＬ４４３Ｃからなる群から選択される。一部の実施形態では、システイン残基はＬ４４３Ｃ（ＥＵナンバリング）である。一部の実施形態では、抗体の重鎖（the heavy chain the antibody）は表１Ａに示されるアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖は表１Ｂのアミノ酸配列を有する。
【０３２２】
一部の実施形態では、スルフヒドリル（sulfhydral）特異的反応基はマレイミドである。
【０３２３】
一部の実施形態では、半減期延長部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ；Ｃｏｖｅｎｔｒｙ、ＵＫ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、炭水化物、多糖、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレン酸化物（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、双性イオンポリマー、ホスホリルコリン含有ポリマーおよび２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）を含むポリマーからなる群から選択される。
【０３２４】
一部の実施形態では、半減期延長部分は双性イオンポリマーである。一部の実施形態では、双性イオンはホスホリルコリン、すなわち、ホスホリルコリン含有ポリマーである。一部の実施形態では、ポリマーはＭＰＣ単位から構成される。
【０３２５】
一部の実施形態では、ＭＰＣポリマーは３つまたはそれ以上のアームを有する。一部の実施形態では、ＭＰＣポリマーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のアームを有する。一部の実施形態では、ＭＰＣポリマーは、３、６、または９個のアームを有する。一部の実施形態では、ＭＰＣポリマーは９個のアームを有する。一部の実施形態では、ポリマーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上のポリマー開始部位を含む開始剤を用いて合成される。
【０３２６】
一部の実施形態では、ＭＰＣポリマーは、約３００，０００〜１，７５０，０００Ｄａの分子量を有する。一部の実施形態では、ＭＰＣポリマーは、約５００，０００〜１，０００，０００Ｄａまたは約６００，０００〜９００，０００Ｄａの分子量を有する。
【０３２７】
一部の実施形態では、治療用タンパク質−半減期延長部分コンジュゲートを調製する方法は、還元されたシステインスルフヒドリル基を生成する条件下で治療用タンパク質をチオール還元剤と接触させる追加のステップを有する。上記で議論したように、組換えＤＮＡ技術を介して付加されたシステイン残基は対形成していない、すなわち、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ鎖内ジスルフィド結合に関与せずかつそのような結合に実質的に関与しないことが好ましい。しかしながら、そのようなＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合形成に関与せずかつ共役のために遊離のＣｙｓ残基は、培養培地中で遊離システインと反応してジスルフィド付加体を形成することが公知である。例えば、ＷＯ２００９／０５２２４９を参照。そのように誘導体化されたシステインは共役のために利用可能でない。新たに付加されたシステインをジスルフィド付加体から遊離させるために、精製後のタンパク質は、還元剤、例えば、ジチオトレイトールを用いて処理される。しかしながら、還元剤を用いるそのような処理は、その多くが鎖間および鎖内Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合に関与する天然のシステインを含む、治療用タンパク質中のシステイン残基の全てを還元する。天然のＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィドは、概しては、タンパク質安定性および活性のために極めて重要であり、再形成されるべきである。一部の実施形態では、全ての天然（例えば、間および内部）のＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィドは再形成される。
【０３２８】
天然の鎖間および鎖内ジスルフィド残基を再形成させるために、システインジスルフィド付加体を除去するための還元後に、治療用タンパク質は、定められた期間、例えば、オーバーナイトで酸化性条件および／または酸化剤に曝露される。一部の実施形態では、天然のジスルフィド結合の再形成を達成するためにオーバーナイトの周囲空気曝露が使用され得る。一部の実施形態では、天然のジスルフィドを復元するために酸化剤が用いられる。一部の実施形態では、酸化剤は、水性ＣｕＳＯ４およびデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）からなる群から選択される。一部の実施形態では、酸化剤はＤＨＡＡである。一部の実施形態では、使用されるＤＨＡＡの範囲は、５〜３０当量の範囲内である。一部の実施形態では、範囲は１０〜３０当量である。一部の実施形態では、範囲は１５当量である。
【０３２９】
一部の実施形態では、チオール還元剤は、３，３’，３’’−ホスファントリイルトリプロピオン酸（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、塩酸システイン、３，３’，３’’−ホスフィントリイルトリス（ベンゼン−１−スルホン酸）三ナトリウム（ＴＰＰＴＳ）およびシステインからなる群から選択される。一部の実施形態では、チオール還元剤は
ＴＣＥＰである。
【０３３０】
一部の実施形態では、チオール還元剤濃度は、治療用タンパク質濃度と比べて１〜１００倍モル過剰である。一部の実施形態では、チオール還元剤濃度は、治療用タンパク質濃度と比べて２０〜５０倍モル過剰である。一部の実施形態では、チオール還元剤は、治療用タンパク質とのインキュベーション後に治療用タンパク質の酸化の前に除去される。
【０３３１】
一部の実施形態では、治療用タンパク質を半減期延長部分に共役させる方法は、共役後に治療用タンパク質コンジュゲートを精製するさらなるステップを有する。一部の実施形態では、治療用タンパク質コンジュゲートは、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーまたはその組合せからなる群から選択される技術を使用して精製される。
【０３３２】
一部の実施形態では、治療用タンパク質コンジュゲートは、非共役の治療用タンパク質と比べて少なくとも２０％の生物学的活性を保持する。一部の実施形態では、治療用タンパク質コンジュゲートは、非共役の治療用タンパク質と比べて少なくとも５０％の生物学的活性を保持する。一部の実施形態では、治療用タンパク質コンジュゲートは、天然の治療用タンパク質と比べて少なくとも９０％の生物学的活性を保持する。
【０３３３】
一部の実施形態では、治療用タンパク質コンジュゲートは、非共役の治療用タンパク質と比べて増加した半減期を有する。一部の実施形態では、治療用タンパク質コンジュゲートは、非共役の治療用タンパク質と比べて半減期の少なくとも１．５倍の増加を有する。一部の実施形態では、治療用タンパク質コンジュゲートは、非共役の治療用タンパク質と比べて半減期の少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５または５倍の増加を有する。
【０３３４】
一部の実施形態では、治療用タンパク質を半減期延長部分に共役させる方法の双性イオンポリマーは、双性イオン基（zwitterionc group）を有するラジカル重合可能なモノマ
ーであり、かつ、方法は、重合媒体中で遊離のラジカル重合可能な双性イオンモノマーを重合させてポリマーを提供するさらなるステップを有し、媒体は、ラジカル重合可能な双性イオンモノマー、遷移金属触媒Ｍｔ（ｑ−１）＋（Ｍｔは遷移金属であり、ｑは金属のより高い酸化状態であり、かつ、ｑ−１は金属のより低い酸化状態であり、金属触媒は、形態Ｍｔ（ｑ−１）＋Ｘ’（ｑ−１）（Ｘ’は対イオンもしくは基である）の塩として供給され、または、遷移金属触媒は、遷移金属を酸化された不活性状態から還元された活性状態へと還元することができる還元剤と共にそのより高い酸化状態Ｍｔｑ＋Ｘ’ｑにおいて不活性金属塩を提供することによりｉｎ  ｓｉｔｕで供給される）、リガンド、および開始剤を含む。
【０３３５】
ＡＴＲＰ遷移金属触媒として機能するために、遷移金属は、１つの電子により分離された少なくとも２つの容易にアクセス可能な酸化状態、より高い酸化状態およびより低い酸化状態を有するべきである。ＡＴＲＰにおいて、可逆的なレドックス反応は、遷移金属触媒がより高い酸化状態とより低い酸化状態との間でサイクルすることを結果としてもたらし、それと共にポリマー鎖は、成長する鎖末端を有することと休止状態の鎖末端を有することとの間でサイクルする。例えば、米国特許第７，８９３，１７３号を参照。
【０３３６】
一部の実施形態では、ラジカル重合可能な双性イオンモノマーは、
【化２７】
2021514656.tif 000049
【化２８】
2021514656.tif 000050
【化２９】
2021514656.tif 000051
【化３０】
2021514656.tif 000052
（式中、Ｒ１はＨまたはＣ１〜６アルキルであり、ＺＷは双性イオンであり、かつ、ｎは１〜６の整数である）からなる群から選択される。
【０３３７】
一部の実施形態では、ラジカル重合可能なモノマーは、
【化３１】
2021514656.tif 000053
（式中、Ｒ１はＨまたはＣ１〜６アルキルであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は同一または異なってＨまたはＣ１〜４アルキルであり、かつ、ＸおよびＹは同一または異なって１〜６の整数である）である。一部の実施形態では、式（１２）においてＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれメチルであり、かつ、ＸおよびＹはそれぞれ２である。
【０３３８】
一部の実施形態では、ラジカル重合可能なモノマーは、
【化３２】
2021514656.tif 000054
（式中、Ｒ１はＨまたはＣ１〜６アルキルであり、Ｒ２およびＲ３は同一または異なってＨまたはＣ１〜４アルキルであり、Ｒ４はＰＯ４−、ＳＯ３−またはＣＯ２−であり、かつ、ＸおよびＹは同一または異なって１〜６の整数である）である。一部の実施形態では、式（１３）においてＲ１、Ｒ２およびＲ３はメチルであり、Ｒ４はＰＯ４−であり、かつ、ＸおよびＹはそれぞれ２である。
【０３３９】
一部の実施形態では、モノマーは、
【化３３】
2021514656.tif 000055
（式中、Ｒ１はＨまたはＣ１〜６アルキルであり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は同一または異なってＨまたはＣ１〜４アルキルであり、Ｒ５はＰＯ４−、ＳＯ３−またはＣＯ２−であり、かつ、ＸおよびＹは同一または異なって１〜６の整数である）である。一部の実施形態では、式（１４）においてＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はメチルであり、Ｒ５はＰＯ４−であり、かつ、ＸおよびＹは２である。
【０３４０】
一部の実施形態では、遷移金属Ｍｔは、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ、Ｍｎ、Ｒｈ、Ｒｅ、Ｃｏ、Ｖ、Ｚｎ、Ａｕ、およびＡｇからなる群から選択される。一部の実施形態では、金属触媒は、形態Ｍｔ（ｑ−１）＋Ｘ’（ｑ−１）の塩として供給される。Ｍｔ（ｑ−１）＋は、Ｃｕ１＋、Ｆｅ２＋、Ｒｕ２＋、Ｃｒ２＋、Ｍｏ２＋、Ｗ２＋、Ｍｎ３＋、Ｒｈ３＋、Ｒｅ２＋、Ｃｏ＋、Ｖ２＋、Ｚｎ＋、Ａｕ＋、およびＡｇ＋からなる群から選択され、かつ、Ｘ’は、ハロゲン、Ｃ１〜６アルコキシ、（ＳＯ４）１／２、（ＰＯ４）１／３、（Ｒ７ＰＯ４）１／２、（Ｒ７２ＰＯ４）、トリフレート、ヘキサフルオロホスフェート（hexaluorophosphate）、メタンスルホネート、アリールスルホネート、ＣＮおよびＲ７ＣＯ２（式中、Ｒ７は、Ｈまたはハロゲンで１〜５回置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖のＣ１〜６アルキル基である）からなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｍｔ（ｑ−１）＋はＣｕ１＋であり、かつ、Ｘ’はＢｒである。
【０３４１】
一部の実施形態では、Ｍｔ（ｑ−１）＋はｉｎ  ｓｉｔｕで供給される。一部の実施形態では、Ｍｔｑ＋ＸｑはＣｕＢｒ２である。一部の実施形態では、還元剤は無機化合物である。一部の実施形態では、還元剤は、低い酸化レベルの硫黄化合物、亜硫酸水素ナトリウム、金属イオンを含む無機塩、金属、ヒドラジン水和物およびそのような化合物の誘導体からなる群から選択される。一部の実施形態では、還元剤は金属である。一部の実施形態では、還元剤はＣｕ０である。
【０３４２】
一部の実施形態では、還元剤は有機化合物である。一部の実施形態では、有機化合物は、アルキルチオール、メルカプトエタノール、または容易にエノール化され得るカルボニル化合物、アスコルビン酸、アセチルアセトネート、カンファースルホン酸（camphosulfonic acid）、ヒドロキシアセトン、還元糖、単糖、グルコース、アルデヒド、およびそ
のような有機化合物の誘導体からなる群から選択される。
【０３４３】
一部の実施形態では、リガンドは、２，２’−ビピリジン、４，４’−ジ−５−ノニル−２，２’−ビピリジン、４，４−ジノニル−２，２’−ジピリジル、４，４’，４’’−トリス（５−ノニル）−２，２’：６’，２’’−テルピリジン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
，Ｎ’’−ペンタメチルジエチレントリアミン、１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラミン、トリス（２−ジメチルアミノエチル）アミン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ピリジルメチル）オクタデシルアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ［（２−ピリジル）メチル］エチレンジアミン（N,N,N',N'-tetra[(2-pyridal)methyl]ethylenediamine）、トリス［（２−ピリジル）メチル］アミン、トリス（２−アミノエチル）アミン
、トリス（２−ビス（３−ブトキシ−３−オキソプロピル）アミノエチル）アミン、トリス（２−ビス（３−（２−エチルヘキソキシ）−３−オキソプロピル）アミノエチル）アミンおよびトリス（２−ビス（３−ドデコキシ−３−オキソプロピル）アミノエチル）アミンからなる群から選択される。一部の実施形態では、リガンドは２，２’−ビピリジンである。
【０３４４】
一部の実施形態では、開始剤は、構造：
【化３４】
2021514656.tif 000056
（式中、Ｒ１は求核性の反応性基であり、Ｒ２はリンカーを含み、かつ、Ｒ３は、構造：
【化３５】
2021514656.tif 000057
（式中、Ｒ４およびＲ５は同一または異なって、アルキル、置換アルキル、アルキレン、アルコキシ、カルボキシアルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、環状アルキルエーテル、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、アリール、アリーレン、アリーレン−オキシ、ヘテロアリール、アミノ、アミドまたはその任意の組合せからなる群から選択され、ＺはハロゲンまたはＣＮであり、かつ、ｓは１〜２０の整数である）を有するポリマー合成開始剤部分を含む）を有する。
【０３４５】
一部の実施形態では、式（２３）においてＺはＢｒであり、かつ、Ｒ４およびＲ５はそれぞれメチルである。一部の実施形態では、式（２２）においてＲ１は、ＮＨ２−、ＯＨ−、およびＳＨ−からなる群から選択される。
【０３４６】
一部の実施形態では、式（２２）においてＲ２は、アルキル、置換アルキル、アルキレン、アルコキシ、カルボキシアルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、環状アルキルエーテル、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、アリール、アリーレン、アリーレン−オキシ、ヘテロアリール、アミノ、アミドまたはその任意の組合せである。一部の実施形態では、式（２２）においてＲ２は、
【化３６】
2021514656.tif 000058
（式中、ＸおよびＹは同一または異なって１〜２０の整数である）である。一部の実施形態では、ＸおよびＹはそれぞれ４である。
【０３４７】
一部の実施形態では、式（２２）においてＲ３は、
【化３７】
2021514656.tif 000059
（式中、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は同一または異なって、
【化３８】
2021514656.tif 000060
【化３９】
2021514656.tif 000061
【化４０】
2021514656.tif 000062
（式中、Ｚは、ＮＣＳ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）からなる群から選択される。一部の実施形態では、式（２６）、式（２７）および／または式（２８）においてＺはＢｒであり、かつ、式（２５）においてＲ６、Ｒ７およびＲ８はそれぞれ、
【化４１】
2021514656.tif 000063
である。
【０３４８】
一部の実施形態では、開始剤は、構造：
【化４２】
2021514656.tif 000064
（式中、ＡおよびＢは同一または異なって２〜１２の整数であり、かつ、Ｚは任意のハロゲン化物、例えばＢｒである）を有する。一部の実施形態では、式（３０）においてＡおよびＢはそれぞれ４である。
【０３４９】
一部の実施形態では、方法は、ポリマーをマレイミド試薬と反応させて末端マレイミドを有するポリマーを提供するステップをさらに有する。一部の実施形態では、マレイミド化合物は、
【化４３】
2021514656.tif 000065
である。
【０３５０】
修飾または変異はまた、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）の半減期を増加させるためにフレームワーク領域または定常領域中で為されてもよい。例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ００／０９５６０を参照。フレームワーク領域または定常領域中の変異はまた、抗体の免疫原性を変化させるため、別の分子への共有結合もしくは非共有結合のための部位を提供するため、または補体結合、ＦｃＲ結合および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性などの特性を変化させるために為され得る。一部の実施形態では、１〜５個以下の保存的アミノ酸置換がフレームワーク領域または定常領域内で為される。他の実施形態では、１〜３個以下の保存的アミノ酸置換がフレームワーク領域または定常領域内で為される。本発明によれば、単一の抗体は、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域のいずれか１つもしくはそれ以上または定常領域において変異を有してもよい。
【０３５１】
修飾としてはまた、グリコシル化および非グリコシル化ポリペプチドの他に、例えば、異なる糖を用いるグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化などの他の翻訳後修飾を有するポリペプチドが挙げられる。抗体は、その定常領域中の保存された位置においてグリコシル化される（Jefferis and Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright and Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖はタンパク質の機
能（Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe and Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180）および糖タンパク質の部分の間の分子内相互作用に影響し、後者は
、糖タンパク質の立体構造および提示される三次元表面に影響し得る（上掲のJefferis and Lund; Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416）。オリゴ糖はまた、特定の認識構造に基づいて所与の糖タンパク質をある特定の分子に標的化するために用いることができる。抗体のグリコシル化はまた、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響することが報告されている。特に、バイセクティングＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）のテトラサイクリン調節発現を用いてＣＨＯ細胞により産生される抗体は、向上したＡＤＣＣ活性を有することが報告された（Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180）。
【０３５２】
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の取付けを指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−スレオニン、およびアスパラギン−Ｘ−システイン（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的取付けのための認識配列である。そのため、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を生じさせる。Ｏ結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１つの取付けを指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた使用され得る。
【０３５３】
抗体（および／またはＡｂ−トラップ）へのグリコシル化部位の付加は、好都合には、上記のトリペプチド配列の１つまたはそれ以上を含有するようにアミノ酸配列を変更することにより達成される（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）。変更はまた、元の抗体の配列に１つまたはそれ以上のセリンまたはスレオニン残基を付加すること、またはそれにより置換することにより為されてもよい（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）。
【０３５４】
抗体（および／またはＡｂ−トラップ）のグリコシル化パターンはまた、基礎となるヌクレオチド配列を変更することなく変更されてもよい。グリコシル化は、概ね、抗体を発現するために使用される宿主細胞に依存する。潜在的な治療法としての組換え糖タンパク質、例えば、抗体の発現のために使用される細胞種が天然細胞であることは稀なので、抗体のグリコシル化パターンにおいて変異が予期され得る（例えば、Hse et al., 1997, J.
Biol. Chem. 272:9062-9070を参照）。
【０３５５】
宿主細胞の選択に加えて、抗体（および／またはＡｂ−トラップ）の組換え製造の間のグリコシル化に影響する要因としては、増殖モード、培地配合物、培養密度、酸素負荷、ｐＨ、および精製スキームなどが挙げられる。オリゴ糖産生に関与するある特定の酵素の導入または過剰発現を含む、特定の宿主生物において達成されるグリコシル化パターンを変化させるための様々な方法が提案されてきた（米国特許第５，０４７，３３５号、同第５，５１０，２６１号および同第５，２７８，２９９号）。グリコシル化、またはある特定の種類のグリコシル化は、例えば、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）、Ｎ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３を使用して、糖タンパク質から酵素的に除去され得る。追加的に、組換え宿主細胞は、ある特定の種類の多糖の加工において欠陥のあるように遺伝子操作され得る。これらおよび類似の技術は当該技術分野において周知である。
【０３５６】
本明細書において提供される一部の実施形態は、炎症性網膜疾患および／または炎症成分を伴う網膜小胞性疾患の治療剤として用いられ得る。血管新生に加えて、炎症はこれらの網膜疾患の病理発生に関係があるとされてきた。ステロイドなどの抗炎症療法は、ぶどう膜炎（定義する特徴として眼内炎症を伴う一連の疾患）および糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）の両方の治療において効果的であった。同様に、ＩＬ−６における遺伝性の多型は、２型糖尿病を有する患者におけるより高いＰＤＲ発生率と関連付けられてきた。さらに、ＡＭＤ、ＤＲおよびＲＶＯにおける疾患進行は、ＩＬ−６の増加した血清および／または眼内レベルと関連付けられることが報告されている。追加的に、慢性炎症細胞は、新生血管ＡＭＤを有する目におけるブルッフ膜の表面に見られている。ＩＬ−６は、ＤＭＥ患者における抗ＶＥＧＦ治療に対する抵抗性に関係があるとされてきた。これは、部分的に、ＶＥＧＦ発現のＩＬ−６媒介性の上方調節［参考文献］の他に、ＶＥＧＦ阻害剤の存在下で起こるＩＬ−６シグナル伝達により媒介されるより直接的なＶＥＧＦから独立した血管新生機能の間接的な結果であると考えられる。一部の実施形態では、これらの状態のいずれか１つまたはそれ以上が、本明細書において提供される組成物の１つまたはそれ以上により治療および／または予防され得る。
【０３５７】
図１１Ｃは、ホスホリルコリンベースのバイオポリマーと共役したＶＥＧＦトラップ（ＶＥＧＦＲ１／２）および抗ＩＬ−６抗体のトラップ−抗体融合物（ＴＡＦ）である、バイオコンジュゲートの構築物の一部の実施形態を示す。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ−６バイオコンジュゲートは、一部の実施形態では、６．０ｍｇの臨床用量と共に、１．０ＭＤａの分子量を有し得る。バイオコンジュゲート中の抗ＶＥＧＦ部分の同等のモル用量は、臨床的なラニビズマブ用量の６倍であり得るが、眼内半減期はラニビズマブの３〜５倍であり得る。ＣＨは重鎖定常（constant heavy）を表し、ＣＬは軽鎖定常（constant light）を表し、Ｆａｂは抗原結合断片を表し、Ｆｃは結晶化可能断片を表し、ＶＥＧＦＲは血管内皮増殖因子受容体を表し、ＶＨは重鎖可変（variable heavy）を表し、ＶＬは軽鎖可変（variable light）を表し、＊はＣＤＲ領域である。同等値（equivalent value）は、ラニビズマブと比べた倍数変化として示される。
【０３５８】
抗ＩＬ−６抗体／ＶＥＧＦトラップ（ＶＥＧＦＲ１／２）の様々な配列アレンジメントが、異なるアレンジメントにおいて用いられまたは提供され得る。図２１は、可能な抗ＩＬ−６重鎖可変領域配列の一部の実施形態を示す。ＣＤＲに下線を引いている。
【０３５９】
ＶＥＧＦトラップバリアントおよび向上した抗ＩＬ−６パラトープを用いた結果に基づいて、図１９、図２０、図２１、図２２および図２３に示されるような配列の組合せを含む２つの異なる構成における２１６の分子を設計および調製した。第１の構成（ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６）について、図１９の配列１Ａ〜１Ｄにより示されるようなＶＥＧＦトラ
ップがタンパク質の開始位置に配置され、続いて図２０の配列２Ａにより示されるようなＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー（ＧＳ）の二重反復が配置され、これは、図２１の配列３Ａ〜３Ｉにより示されるように、抗ＩＬ−６重鎖のＮ末端にトラップを接続する。これらの構築物は、図２２の配列４Ａ〜４Ｃとして列記される軽鎖と対形成し得る。一部の実施形態では、（図１９からの）ＶＥＧＦトラップは、本明細書において提供される図面または表のいずれかにおいて示される任意の抗ＩＬ−６軽鎖および／または重鎖（heavy chaings）と組み合わせられ得る。
【０３６０】
一部の実施形態では、本明細書において提供される任意のＶＥＧＦトラップバリアントは、本明細書において提供されるＩＬ−６抗体の重鎖および軽鎖配列のいずれかと対形成することができ、かつ本明細書において提供される任意のポリマーによりさらに改変され得る。一部の実施形態では、本明細書において提供される任意のＶＥＧＦトラップバリアントは、本明細書において提供されるＩＬ−６抗体の重鎖および軽鎖可変配列のいずれかと対形成することができ、かつ本明細書において提供される任意のポリマーによりさらに改変され得る。一部の実施形態では、本明細書において提供される任意のＶＥＧＦトラップバリアントは、本明細書において提供されるＩＬ−６抗体の重鎖および軽鎖の３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）のいずれかと対形成することができ、かつ本明細書において提供される任意のポリマーによりさらに改変され得る。一部の実施形態では、ＩＬ−６−ＶＥＧＦトラップ融合物は図２７の成分を含む。
【０３６１】
一部の実施形態では、抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦトラップ（またはその二重阻害剤、融合タンパク質、もしくはコンジュゲート）の配列は、リンカーを介してＶＥＧＦＲトラップに融合した、軽鎖として配列番号１６９、重鎖として配列番号１７０を含む。一部の実施形態では、抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦトラップ（またはその二重阻害剤、もしくは融合タンパク質もしくはコンジュゲート）の配列は、例えば、配列番号１７０および１６９の組合せに対する少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、またはより高い同一性を含む、配列番号１６９および１７０を含む分子に対して少なくとも８０％同一である。一部の実施形態では、抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦトラップ（またはそのコンジュゲート）の配列は、例えば、配列番号１７０に対する少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％、またはより高い同一性および１６９に対する少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％、またはより高い同一性を含む、配列番号１６９を含む分子に対して少なくとも８０％同一でありかつ配列番号１７０を含む分子に対して少なくとも８０％同一である。一部の実施形態では、ＣＤＲは、抗ＩＬ−６抗体について本明細書において提供される任意のＣＤＲ（配列番号１７０および１６９のものを含む）において示されるままであり、配列の残余（重鎖および軽鎖、重鎖および軽鎖可変領域、ならびに／または全体融合配列（例えば、配列番号１６９および１７０）は、全体配列が元となる配列に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、またはより高い同一性であるように変化することが許容される。一部の実施形態では、ＣＤＲは、１、２、または３つの保存的変更により変化することができ、配列の残余（重鎖および軽鎖、重鎖および軽鎖可変領域、ならびに／または全体融合配列（例えば、配列番号１６９および１７０）は、全体配列が元となる配列に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、またはより高い同一性であるように変化することが許容される。一部の実施形態では、トラップ配列（図２７において灰色で、または図１９において示されるもの）は、少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、またはより高い同一性パーセントを保持することができ、かつ、ＣＤＲは、１、２、または３つの保存的変更により変化することができ、配列の残余（重鎖および軽鎖、重鎖および軽鎖可変領域、ならびに／または全体融合配列（例えば、配列番号１６９および１７０）は、全体配列が元となる配列に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、またはより高い同一性であるように変化することが許容される。
【０３６２】
一部の実施形態では、融合タンパク質（または二重阻害剤）またはそのコンジュゲートは、本明細書において提供されるＣＤＲの１、２、３、４、５、または６つ全てを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質またはそのコンジュゲートは、少なくとも配列番号４９、５０、および５１（または１、２、もしくは３つの保存的置換を有するバリアント）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質（または二重阻害剤）またはそのコンジュゲートは、少なくとも配列番号１７２、１７３、および１７４（または１、２、もしくは３つの保存的置換を有するバリアント）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質またはそのコンジュゲートは、少なくとも配列番号４９、５０、および５１（または１、２、もしくは３つの保存的置換を有するバリアント）ならびに少なくとも配列番号１７２、１７３、および１７４（または１、２、もしくは３つの保存的置換を有するバリアント）を含む。一部の実施形態では、これらの６つのＣＤＲ（またはそのバリアント）はヒト抗体フレームワーク領域内に含有される。一部の実施形態では、ＣＤＲは、本明細書において提供される任意の抗体のフレームワーク領域、または、重鎖について表１Ａおよび軽鎖について表１Ｂのものが挙げられるがそれに限定されない、本明細書において提供される重鎖および／もしくは軽鎖可変領域に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、もしくはより高い同一性パーセントであるそのバリアント内にある。一部の実施形態では、融合タンパク質（または二重阻害剤）またはそのコンジュゲートは、少なくとも配列番号４９、５０、および５１（または１、２、もしくは３つの保存的置換を有するバリアント）ならびに少なくとも配列番号１７２、１７３、および１７４（または１、２、もしくは３つの保存的置換を有するバリアント）を含み、かつ、これらのＣＤＲ（バリアントを含む）は、表１Ｄの配列の１つもしくはそれ以上の中、または表１Ｄ内のバリアントの中のＣＤＲを置換する（表１ＤのＣＤＲを無視して、残りの配列は、表１Ｄの重鎖含有セクションおよび軽鎖セクションに対して少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５またはより高い同一性パーセントである）。そのため、一部の実施形態では、これらの６つのＣＤＲ（およびそのバリアント）は、表１に記載の配列のＣＤＲだけではなく、そのバリアントを置換し得る。一部の実施形態では、表１Ｅ（１Ａ１、１Ｅ２、および１Ｅ３を含む）において提供されるＣＤＲは、可能なＣＤＲのバリアント内のオプションとして除外される。一部の実施形態では、抗体（その断片を含む）は、図２７の特定のＣＤＲを維持しながら（そのため、この実施形態ではＣＤＲセクション内に変異はない）、図２７において示される重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体に対して少なくとも８０％同一のものである。
【０３６３】
一部の実施形態では、単離されたアンタゴニストＩＬ−６抗体が提供される。それは、配列番号７〜１３、１９〜２７、８９、９０、２５６〜２６２の少なくとも１つの配列を有する重鎖を構成する重鎖アミノ酸可変領域、および配列番号９１〜９３、２８〜３０の少なくとも１つの配列を有する軽鎖を構成する軽鎖アミノ酸可変領域を含み得る。
【０３６４】
一部の実施形態では、単離されたアンタゴニストＩＬ−６抗体であって、配列番号２５６に列記されるＣＤＲからのアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域：重鎖可変領域（ＶＨ）（ＣＤＲ１）、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに配列番号９１〜９３に列記されるＣＤＲの群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、抗体が提供される。
【０３６５】
一部の実施形態では、ＩＬ−６に結合する単離されたアンタゴニスト抗体が提供される（is provide）。抗体は、ＥＵナンバリングに基づいて以下の変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａの少なくとも１つを含む。
【０３６６】
一部の実施形態では、ＩＬ−６に結合する単離されたアンタゴニスト抗体であって、配
列番号１７２のＣＤＲＨ１であるＣＤＲＨ１、配列番号１７３のＣＤＲＨ２であるＣＤＲＨ２、配列番号１７４のＣＤＲＨ３であるＣＤＲＨ３、配列番号１９９のＣＤＲＬ１であるＣＤＲＬ１、配列番号２００のＣＤＲＬ２であるＣＤＲＬ２、配列番号２０１のＣＤＲＬ３であるＣＤＲＬ３、以下の変異（ＥＵナンバリング）：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａの少なくとも１つ、ならびに以下の変異（ＥＵナンバリング）：Ｑ３４７ＣまたはＬ４４３Ｃの少なくとも１つを含む、抗体。
【０３６７】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤は、配列番号７〜１３、８９、９０、および／または２５６〜２６２から選択される抗ＩＬ−６重鎖可変領域配列を含む。
【０３６８】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤は、配列番号１４５、１５、１６、または１７の少なくとも１つから選択されるＶＥＧＦトラップ配列を有する。
【０３６９】
一部の実施形態では、リンカー配列は配列番号１８である。
【０３７０】
一部の実施形態では、抗ＩＬ−６分子の重鎖配列は、配列番号１９〜２７の少なくとも１つから選択されまたは配列番号８９、９０、２５６〜２６２の１つの配列を少なくとも含む。
【０３７１】
一部の実施形態では、抗ＩＬ−６分子の軽鎖配列は、配列番号７６〜８４の少なくとも１つからの少なくとも１、２、または３つの軽鎖ＣＤＲを含む。
【０３７２】
一部の実施形態では、抗ＩＬ−６分子の重鎖配列は、配列番号４９〜７５の少なくとも１つからの少なくとも１、２、または３つの重鎖ＣＤＲを含む。
【０３７３】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤は、配列番号８５〜８８の少なくとも１つからのＶＥＧＦＲ−Ｆｃ配列を含む。
【０３７４】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤は、配列番号７〜１３、１４５、１５〜１７、１８〜８４のいずれか１つまたはそれ以上の配列の１つまたはそれ以上を含む。
【０３７５】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤は、ＩＬ−６  ＶＨ、ＩＬ−６  ＶＬ、ＩＬ−６  Ｆｃ、ＶＥＧＦトラップ、およびリンカーを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−６  ＶＨは、配列番号１９〜２７、３１〜３９、８９、９０、または２５６〜２６２のいずれか１つのＩＬ６  ＶＨ配列からの配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−６  ＶＬは、配列番号２８〜３０または９１〜９３のいずれか１つのＩＬ６  ＶＬ配列からの配列を含む。一部の実施形態では、Ｆｃは、配列番号４０〜４８のいずれか１つのＦｃ配列からの配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＧＦトラップは、配列番号１４５、１５、１６、または１７のいずれか１つのＶＥＧＦトラップ配列からの配列を含む。
【０３７６】
一部の実施形態では、ＩＬ−６  ＶＨ、ＩＬ−６  ＶＬ、ＩＬ−６  Ｆｃ、およびＶＥＧＦトラップを含む、融合タンパク質であって、ＨＵＶＥＣ増殖を変化させる、融合タンパク質が提供される。一部の実施形態では、ＨＵＶＥＣ増殖を変化させることは、ＶＥＧＦ／ＩＬ６媒介性増殖を阻害することである。
【０３７７】
一部の実施形態では、配列番号２６３に対して少なくとも８０％同一および配列番号１１７に対して少なくとも８０％同一の配列を含む、融合タンパク質が提供される。融合タンパク質は、ポリマーにさらに共役している。一部の実施形態では、融合タンパク質は、
配列番号２６３に対して少なくとも９５％同一および配列番号１１７に対して少なくとも９５％同一である。一部の実施形態では、タンパク質は、ａ）配列番号１７２、１７３、１７４、１９９、２００、および２０１、またはｂ）配列番号１７２、１７３、１７４、１９９、２００、および／もしくは２０１内の１、２、もしくは３つのアミノ酸の置換を少なくとも含み、置換は保存的置換である。
【０３７８】
一部の実施形態では、本明細書において提供される任意の構築物は、ＶＥＧＦＲ配列の位置９４および／または９５において１つまたはそれ以上の変異を含み得る。一部の実施形態では、変異はＴ９４ＩおよびＨ９５Ｉであり得る。一部の実施形態では、これは、ＶＥＧＦＲタンパク質の任意の切断を低減する（以下の実施例において詳述される）。
【０３７９】
一部の実施形態では、抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦＲの方向の場合）、図２３の重鎖−Ｆａｂ、配列５Ａ〜５Ｉにより示される重鎖の可変および定常ドメインは、図２０の配列２Ａにより示されるＧＳリンカーを介して、図１９の配列１Ａ〜１Ｄにより示されるＶＥＧＦトラップに接続され、次に、図２３の重鎖−Ｆｃ、配列５Ａ〜５Ｉにより示されるＦｃドメインは、ＶＥＧＦトラップのＣ末端に融合される。そのため、ＶＥＧＦトラップは、抗体ＦａｂとＦｃ領域との間に挟まれる。一部の実施形態では、これらの構築物は、図２２の配列４Ａ〜４Ｃにおいて列記される軽鎖と対形成し得る。
【０３８０】
図１９は、ＶＥＧＦトラップ配列の一部の実施形態を示す。配列間の変異に下線を引き、太字で強調している。一部の実施形態では、本明細書において提供される任意の融合構築物は、これにおいて、または本出願の図面のいずれかにおいて提供される強調および太字とした任意の変異を含み得る。
【０３８１】
図２０は、二重反復Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー（ＧＳ）配列の一部の実施形態を示す。一部の実施形態では、配列の１つより多くの単位が用いられ得る（例えば、二重反復のために２つ、３つまたはそれ以上が用いられ得る）。一部の実施形態では、他のリンカー配列が用いられ得る。一部の実施形態では、代替的なリンカー配列が用いられ得る。
【０３８２】
図２１は、抗ＩＬ−６分子の一部の実施形態の重鎖配列を示す。ＣＤＲに下線を引いている。一部の実施形態では、本明細書における任意の配列は、本明細書における融合構築物の部分である他の重鎖配列の代わりに使用され得る。
【０３８３】
図２２は、抗ＩＬ−６分子の軽鎖配列の一部の実施形態を示す。ＣＤＲに下線を引いている。一部の実施形態では、本明細書における任意の配列は、本明細書における融合構築物の部分である他の軽鎖配列の代わりに使用され得る。
【０３８４】
図２３は、抗ＩＬ−６分子の重鎖（ＦａｂおよびＦｃに分離される）配列の一部の実施形態を示す。ＣＤＲに下線を引いている。一部の実施形態では、本明細書における任意の配列は、本明細書における融合構築物の部分である他の重鎖配列の代わりに使用され得る。
【０３８５】
図２４Ａ〜２４Ｂは、図２１〜２３からのＣＤＲの組合せを示す。図２４Ａは、図２１および図２３において定義されるような重鎖ＣＤＲ配列を示す。図２４Ｂは、図２２において定義されるような軽鎖ＣＤＲ配列を示す。一部の実施形態では、重鎖および／または軽鎖可変領域の全体が構築物において使用されるのではなく、本出願において提供される図面の１つまたはそれ以上からのＣＤＲのみが用いられ得る。
【０３８６】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−Ｆｃトラップ融合物は、操作されたＩｇＧ１フレー
ムワークの部分である。ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６および抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦＲ構築物に加えて、上記のような切断抵抗性バリアントを有するＶＥＧＦトラップ、および図２５の配列６Ａ〜６Ｄに示されるような操作されたＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦＲ−Ｆｃ）分子が提供され得る。これらの分子のＦｃドメインは、エフェクター機能を最小化するＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａの置換、ならびに半減期延長性ホスホリルコリンベースのバイオポリマーとの部位特異的な共役を可能とするＬ４４３Ｃを含有し得る（残基位置はＥＵナンバリングに従う）。図２５は、ＶＥＧＦＲ−Ｆｃ配列バリアントの一部の実施形態を示す。配列の変異に下線を引き、太字で強調している。これらの変異および／または組合せは、療法において現在使用されている他の化合物よりさらに優れたかつ／またはその代替となる生物学的製剤を提供し得る（can provided）ことが留意される。
【０３８７】
図２６Ａ〜２６Ｃに示されるように、ＶＥＧＦＲ−Ｆｃおよびアイリーアは、類似の親和性でＶＥＧＦに結合する。図２６Ａは、ＶＥＧＦＲ−ＦｃのＢｉａｃｏｒｅアッセイを示す。図２６Ｂは、アイリーアのＢｉａｃｏｒｅアッセイを示す。図２６Ｃは、ＶＥＧＦＲ−Ｆｃおよびアイリーアの実験結果（Ｋａ、Ｋｄ、ＫＤおよびＲｍａｘ）を示す。
【０３８８】
一部の実施形態では、図１８〜２３、および図２５のいずれか１つまたはそれ以上の指定されたアミノ酸配列についての配列のいずれか１つまたはそれ以上は、本明細書において提供される他の任意の実施形態の対応する構造にスワップされ得るか、または本明細書において提供される任意の他の配列と交換され得る。例えば、図１３Ｃ〜１３Ｅ、図１９、または図２５内の任意の配列は、図１８、図２１、または図２３からの任意のＩＬ−６重鎖、本出願（例えば、図２０）において提供される任意のリンカー、任意の軽鎖（図２２）と共に使用され得る。一部の実施形態では、構築物はＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６構成であり、かつ、それは、リンカー（例えば、図２０、配列２Ａ）に連結された、重鎖ＩＬ−６配列（例えば、図２１、配列３Ａまたは３Ｂ）に連結された、軽鎖配列（例えば、図２２、配列４Ａ）に連結された、配列１Ａ〜１Ｄ（図１９）の１つの組合せを含む。一部の実施形態では、配列１Ａ〜１Ｄ（図１９）のいずれか１つは、リンカー（図２０）と、重鎖抗ＩＬ−６配列（図２１、配列３Ａ〜３Ｉ）と、および軽鎖抗ＩＬ−６配列（図２２、配列４Ａ〜４Ｃ）と組み合わせられ得る。一部の実施形態では、本明細書において提供される構築物の任意の特定の単位のための他の対応する任意の配列は、これらの単位のいずれか１つにスワップされ、またはその代わりとなり得る。
【０３８９】
一部の実施形態では、二重阻害剤は、１つまたはそれ以上の相乗的な結果を提供する。一部の実施形態では、二重阻害剤は、単剤療法（例えば、ＩＬ−６療法およびＶＥＧＦ療法の組合せ）として投与される各セクションより相乗的に良好である。一部の実施形態では、組み合わせたＶＥＧＦＲ−ＩＬ−６構築物は、増殖アッセイの結果（例えば、二重阻害剤は、血管新生の重要な成分であるＨＵＶＥＣ増殖に対して明確な効果を有するが、アイリーアおよび抗ＩＬ−６のいずれもいかなる変化も達成しない）に示されるように、相乗的な結果を提供する。そのため、一部の実施形態では、本明細書において提供されるようなＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６構築物が用いられる、ＨＵＶＥＣ増殖を制御する方法が提供される。
【０３９０】
他の実施形態では、融合構築物は単純に、ＶＥＧＦトラップの結果および抗ＩＬ−６の結果の両方を達成することにより追加的な利益を提供する。
【０３９１】
一部の実施形態では、本明細書において提供される表のいずれか１つより多く（any one of more）の成分のいずれか１つまたはそれ以上は、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６構築物が
製造されるようにまたは抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦＲ構築物が製造されるように組み合わせて一緒にされ得る。一部の実施形態では、構築物はまた、Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態
では、Ｆｃ領域はヒトＦｃ領域であり得る。
【０３９２】
一部の実施形態では、ＣＤＲは単独（任意の特定のフレームワークセクションありまたはなし）で、抗体セクションとして用いられ得る。そのため、各鎖または鎖のペア（重鎖および軽鎖）内のＣＤＲのいずれか１つまたはそれ以上（例えば、３つまたは６つ）は、任意の他の成分（ＶＥＧＦＲおよび／またはリンカー）と組み合わせて、本明細書において提供される任意の表または図から使用され得る。本明細書において提供される任意のＩＬ−６構築物からのＣＤＲおよび／または１、２、もしくは３つの重鎖ＣＤＲ）は、本明細書において提供されるＶＥＧＦＲ配列のいずれか１つまたはそれ以上と組み合わせられ得る。一部の実施形態では、本明細書において提供される任意のＩＬ−６構築物からの任意の重鎖および／または軽鎖可変領域は、本明細書において提供されるＶＥＧＦＲ配列のいずれか１つまたはそれ以上と組み合わせられ得る。一部の実施形態では、任意のリンカーもまた最終構築物内に提供され得る。
【０３９３】
一部の実施形態では、本明細書において提供されるアミノ酸配列のいずれか１つより多く（any one of more）をコードする任意の核酸配列もまた提供され得る（例えば、単離
されて、ベクター内で、または細胞中になど）。
【０３９４】
一部の実施形態では、バイオコンジュゲートを形成するための共役用のポリマーのいずれか１つまたはそれ以上は、本明細書において提供される任意のＶＥＧＦＲ−ＩＬ６構築物と組み合わせられ得る。
【０３９５】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６の組合せは、ＶＥＧＦＲのための配列１Ａ〜１Ｄ（図１９）がリンカー（図２０の２Ａ）に連結され、リンカーが重鎖（図２１の３Ａまたは３Ｂ）に連結され、重鎖が図２２からの軽鎖４Ａと会合したものである。
【０３９６】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６の組合せは、ＶＥＧＦＲのための配列１Ａ（図１９）がリンカー（図２０の２Ａ）に連結され、リンカーが重鎖（図２１の３Ａ）に連結され、重鎖が図２２からの軽鎖４Ａと会合したものである。一部の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６の組合せは、ＶＥＧＦＲのための配列１Ｂ（図１９）がリンカー（図２０の２Ａ）に連結され、リンカーが重鎖（図２１の３Ａ）に連結され、重鎖が図２２からの軽鎖４Ａと会合したものである。一部の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６の組合せは、ＶＥＧＦＲのための配列１Ｃ（図１９）がリンカー（図２０の２Ａ）に連結され、リンカーが重鎖（図２１の３Ａ）に連結され、重鎖が図２２からの軽鎖４Ａと会合したものである。一部の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６の組合せは、ＶＥＧＦＲのための配列１Ｄ（図１９）がリンカー（図２０の２Ａ）に連結され、リンカーが重鎖（図２１の３Ａ）に連結され、重鎖が図２２からの軽鎖４Ａと会合したものである。
【０３９７】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６の組合せは、ＶＥＧＦＲのための配列１Ａ（図１９）がリンカー（図２０の２Ａ）に連結され、リンカーが重鎖（図２１の３Ｂ）に連結され、重鎖が図２２からの軽鎖４Ａと会合したものである。一部の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６の組合せは、ＶＥＧＦＲのための配列１Ｂ（図１９）がリンカー（図２０の２Ａ）に連結され、リンカーが重鎖（図２１の３Ｂ）に連結され、重鎖が図２２からの軽鎖４Ａと会合したものである。一部の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６の組合せは、ＶＥＧＦＲのための配列１Ｃ（図１９）がリンカー（図２０の２Ａ）に連結され、リンカーが重鎖（図２１の３Ｂ）に連結され、重鎖が図２２からの軽鎖４Ａと会合したものである。一部の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６の組合せは、ＶＥＧＦＲのための配列１Ｄ（図１９）がリンカー（図２０の２Ａ）に連結され、リンカーが重鎖（図２１の３Ｂ）に連結され、重鎖が図２２からの軽鎖４Ａと会合したものである。
【０３９８】
一部の実施形態では、任意のＩＬ−６抗体配列は、本明細書において提供される任意のＶＥＧＦＲ配列と共に用いられ得る。一部の実施形態では、任意の１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲ（１、２、または３つの軽鎖および１、２、または３つの重鎖）の抗ＩＬ−６配列は、任意のＶＥＧＦＲアレンジメントと共に用いられ得る。
【０３９９】
一部の実施形態では、任意の抗ＩＬ−６抗体の軽鎖および／または重鎖は、表１８．１〜１８．４のいずれか１つより多く（any one of more）において提供される点変異のい
ずれか１つまたはそれ以上と共に用いられ得る。一部の実施形態では、融合構築物は、表１８．１〜１８．４のいずれか１つまたはそれ以上において同定される位置のいずれか１つまたはそれ以上において点変異を有する抗ＩＬ−６構築物を用いる。一部の実施形態では、変更される位置は、変化した残基を示すものとして関連する図において下線および太字とされたものである。一部の実施形態では、構築物は、重鎖における変化が、Ｓ３５Ｈ、Ｇ６６Ｄ、Ｌ１００Ａ、またはＬ１００Ｓの１つまたはそれ以上を含み、かつ、軽鎖における変化が、Ｍ３２Ｌ、Ｍ５０Ｄ、Ｎ５２ＳまたはＭ８８Ｑの１つまたはそれ以上を含むものである。ＣＤＲの位置は、記載された場合の可変ドメインにおける登場の順序に従う（例えば、Ｓ３５Ｈ、Ｇ６６Ｄ・・・）。Ｆｃの位置は、記載された場合のＥＵナンバリングに従う（例えば、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ・・・）。一部の実施形態では、構築物（例えば、Ｉｌ−６に対する抗体、および／またはＩＬ−６  ＶＥＧＦトラップ、および／または（本明細書において提供されるバイオポリマーの１つもしくはそれ以上への）ＩＬ−６  ＶＥＧＦトラップバイオコンジュゲート）は、重鎖および軽鎖における以下の１、２、３、４、５、６、７、または８つを含む：重鎖におけるＳ３５Ｈ、Ｇ６６Ｄ、Ｌ１００Ａ、および／またはＬ１００Ｓならびに軽鎖におけるＭ３２Ｌ、Ｍ５０Ｄ、Ｎ５２Ｓおよび／またはＭ８８Ｑ。一部の実施形態では、これらの点変異は、本明細書において提供されるＩｌ−抗体またはＩｌ−６抗体を含有する構築物のいずれか１つにおいて使用され得る。
【０４００】
当業者により理解されるように、様々な構築物が本明細書において提供される。概しては、これらの構築物は、Ｉｌ−６に対する抗体、および／または抗ＩＬ−６  ＶＥＧＦトラップ（抗体とＶＥＧＦトラップとの融合物）、および／またはＩＬ−６  ＶＥＧＦトラップバイオコンジュゲート（本明細書において提供されるバイオポリマーの１つもしくはそれ以上との融合物）、および／またはＶＥＧＦトラップ構築物、および／またはＶＥＧＦトラップバイオポリマーにグループ分けされ得る。そのため、本明細書において提供される任意の別々の成分（およびそのバリアント）は、別々にまたは互いに組み合わせて使用され得る。一部の実施形態では、これらの任意のグループ分けの構築物（Ｉｌ−６に対する抗体、および／または抗ＩＬ−６  ＶＥＧＦトラップ（抗体とＶＥＧＦトラップとの融合物）、および／またはＩＬ−６  ＶＥＧＦトラップバイオコンジュゲート（本明細書において提供されるバイオポリマーの１つもしくはそれ以上との融合物）、および／またはＶＥＧＦトラップ構築物、および／またはＶＥＧＦトラップバイオポリマー）は、本明細書において提供される任意の方法または他の組成物のために使用され得る。例えば、これらの任意のオプションは、ＩＬ−６  ＶＥＧＦトラップ療法、および／またはＩＬ−６療法、および／またはＩＬ−６  ＶＥＧＦトラップバイオコンジュゲートに関して記載される任意の治療方法のために使用され得る。理解されるように、各構築物の特徴および特性は、本明細書に詳述される成分の特性と合致して、各治療のために異なり得る。そのため、例えば、細胞株、核酸、療法、および他の実施形態に関して本明細書において提供される記載は、抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦトラップおよび／またはそのバイオコンジュゲートのためだけではなく、抗ＩＬ−ＶＥＧＦトラップおよび／またはバイオコンジュゲートとは別々の抗体（および、例えば、その断片）、抗体−バイオコンジュゲート、ならびにＶＥＧＦトラップ構築物のためにも特に想定される。例えば、一部の実施形態では、ＩＬ−６についての任意の点変異（またはその組合せ）は、抗体およびＶＥＧＦトラップベースのアレンジメントの代わりに、単純に抗体ベースのアレンジメントの治療のための抗体（ま
たはその結合断片）において使用され得る。そのため、ＶＥＧＦトラップおよびＩＬ−６抗体についての点変異は、融合物アレンジメントの文脈に限定されず（但し、それを提供する）、融合物アレンジメントとは別々のそのような構築物（ならびにその使用および製造方法）も記載する。全てのそのような実施形態を別々に繰り返すのではなく、アレンジメント（Ｉｌ−６に対する抗体、および／または抗ＩＬ−６  ＶＥＧＦトラップ（抗体とＶＥＧＦトラップとの融合物）、および／またはＩＬ−６  ＶＥＧＦトラップバイオコンジュゲート（本明細書において提供されるバイオポリマーの１つもしくはそれ以上との融合物）、および／またはＶＥＧＦトラップ構築物、および／またはＶＥＧＦトラップバイオポリマー）の１つについての任意のそのような記載は、他のそのようなアレンジメント（Ｉｌ−６に対する抗体、および／または抗ＩＬ−６  ＶＥＧＦトラップ（抗体とＶＥＧＦトラップとの融合物）、および／またはＩＬ−６  ＶＥＧＦトラップバイオコンジュゲート（本明細書において提供されるバイオポリマーの１つもしくはそれ以上との融合物）、および／またはＶＥＧＦトラップ構築物、および／またはＶＥＧＦトラップバイオポリマー）の全てに適用され、そのためのオプションを同定することが留意される。
【０４０１】
一部の実施形態では、任意のＶＥＧＦトラップ構築物が、例えば、本明細書において提供される実施形態の図１３Ｃ〜１３Ｅ、図１９、および図２５のものを含む、組成物、成分、または療法として使用するために想定される。
【０４０２】
一部の実施形態では、任意の抗ＩＬ−６抗体構築物が、例えば、本明細書において提供される実施形態の表１Ａおよび表１Ｅならびに図５、図１８、図２１、図２２、図２３、および図２４のものを含む、組成物、成分、または療法として使用するために想定される。
【０４０３】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＶＥＧＦトラップ配列中の位置９４、ＶＥＧＦトラップ配列中の位置９５、またはＶＥＧＦトラップ配列中のＴ９４ＩおよびＨ９５Ｉにおいて変異を含む。
【０４０４】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤が提供される。ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤は、抗ＩＬ−６抗体とＶＥＧＦ（ＶＥＧＦＲ１／２）トラップとのトラップ抗体融合物を含み、二重阻害剤は、ＶＥＧＦＲ配列の切断を低減するためにＶＥＧＦＲ配列内に少なくとも１つの点変異を含む。一部の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤は１．０ＭＤａの分子量を有する。
【０４０５】
一部の実施形態では、ＶＥＧＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤は、炎症性網膜疾患に対する療法を提供する。
【０４０６】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤は、重鎖定常、軽鎖定常、抗原結合断片、結晶化可能断片（Ｆｃ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、重鎖可変、軽鎖可変およびＣＤＲ領域を含む。
【０４０７】
一部の実施形態では、抗ＩＬ−６重鎖可変領域配列は、図１８のオプションＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、またはＸＩＩから選択され得る。
【０４０８】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦトラップ配列は、図１９のオプション１Ａ、１Ｂ、１Ｃまたは１Ｄの少なくとも１つから選択され得る。
【０４０９】
ＶＥＧＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤の一部の実施形態では、抗ＩＬ−６分子の重鎖配列は、図２１のオプション３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、３Ｇ、３Ｈ、または３Ｉの少なくとも１つから選択され得る。
【０４１０】
ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤の一部の実施形態では、抗ＩＬ−６分子の軽鎖配列は、図２４Ｂのオプション４Ａ、４Ｂ、または４Ｃの少なくとも１つからの少なくとも１、２、または３つの軽鎖ＣＤＲを含む。
【０４１１】
ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤の一部の実施形態では、抗ＩＬ−６分子の重鎖配列は、図２４Ａのオプション５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅ、５Ｆ、５Ｇ、５Ｈ、または５Ｉの少なくとも１つからの少なくとも１、２、または３つの重鎖ＣＤＲを含む。
【０４１２】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤は、図２５のオプション６Ａ、６Ｂ、６Ｃまたは６Ｄの少なくとも１つからのＶＥＧＦＲ−Ｆｃ配列を含む。
【０４１３】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤は、図１８〜２５の配列の１つまたはそれ以上を含む。
【０４１４】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６二重阻害剤は、ＩＬ−６  ＶＨ、ＩＬ−６  ＶＬ、ＩＬ−６  Ｆｃ、ＶＥＧＦトラップ、およびリンカーを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−６  ＶＨは、図２１または図２３のＩＬ６  ＶＨ配列からの配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−６  ＶＬは、図２２のＩＬ６  ＶＬ配列からの配列を含む。一部の実施形態では、Ｆｃは、図２３のＦｃ配列からの配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＧＦトラップは、ＶＥＧＦトラップ配列からの配列を含む。
【０４１５】
一部の実施形態では、少なくとも３つの重鎖ＣＤＲ、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ、ＶＥＧＦトラップ配列、およびリンカー配列を含み、各配列が図１８〜２５内の配列から選択される、タンパク質構築物が提供される。
【０４１６】
一部の実施形態では、ＩＬ−６  ＶＨ、ＩＬ−６  ＶＬ、ＩＬ−６  Ｆｃ、ＶＥＧＦトラップを含み、かつＨＵＶＥＣ増殖を変化させる、融合タンパク質が提供される。一部の実施形態では、各配列は図１８〜２５内の配列から選択される。
【０４１７】
ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
本発明はまた、本明細書に記載の抗体断片および改変抗体を含む、任意の抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）をコードするポリヌクレオチドを提供する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載の任意のポリヌクレオチドを製造する方法を提供する。ポリヌクレオチドは、当該技術分野において公知の手順により製造および発現され得る。したがって、本発明は、本明細書において提供される任意のＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）をコードする、ポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含む、医薬組成物を含む組成物を提供する。
【０４１８】
任意のそのような配列に相補的なポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コーディングもしくはアンチセンス）または二本鎖であってもよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子としては、イントロンを含有しかつ１対１の方式でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子が挙げられる。追加のコーディングまたは非コーディング配列は、その必要はないが、本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよく、ポリヌクレオチドは、その必要はないが、他の分子および／または支持体材料に連結されていてもよい。
【０４１９】
ポリヌクレオチドは、天然配列（すなわち、抗体もしくはその断片をコードする内因性配列）を含んでもよく、またはそのような配列のバリアントを含んでもよい。ポリヌクレ
オチドバリアントは、コードされるポリペプチドの免疫反応性が天然の免疫反応性分子と比べて減少しないように、１つまたはそれ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含有する。コードされるポリペプチドの免疫反応性に対する効果は、概しては、本明細書に記載されるように評価されてもよい。バリアントは、天然抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列に対して、好ましくは少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性を呈する。
【０４２０】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が以下に記載されるように最大一致のためにアライメントされた場合に同じである場合に、「同一」であるといわれる。２つの配列間の比較は、典型的には、比較ウィンドウにわたり配列を比較して配列類似度の局所領域を同定および比較することにより行われる。本明細書において使用される「比較ウィンドウ」は、配列が同じ数の連続する位置の参照配列に対して、２つの配列が最適にアライメントされた後に比較され得る、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、または４０〜約５０の連続する位置のセグメントを指す。
【０４２１】
比較用の配列の最適アライメントは、バイオインフォマティクスソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅ（登録商標）スイートにおけるＭｅｇＡｌｉｇｎ（登録商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標），Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用し、デフォルトのパラメーターを使用して実行されてもよい。このプログラムは、以下の参考文献：Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and
Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W.,
1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730に記載されるいくつかのアライメントスキームを具現化している。
【０４２２】
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０の位置の比較のウィンドウにわたり２つの最適にアライメントされた配列を比較することにより決定され、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適アライメントのために参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０パーセントもしくはそれ未満、通常５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に起こる位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を参照配列中の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出される。
【０４２３】
バリアントは、追加的または代替的に、天然遺伝子、またはその部分もしくは相補体に実質的に相同的であってもよい。そのようなポリヌクレオチドバリアントは、天然抗体をコードする天然に存在するＤＮＡ配列（または相補的配列）に適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。
【０４２４】
好適な「適度にストリンジェントな条件」は、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予備洗浄、５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣでの
オーバーナイトのハイブリダイズ、続いて０．１％のＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×の各ＳＳＣを用いた６５℃で２０分間の２回の洗浄を含む。
【０４２５】
本明細書において使用される場合、「高いストリンジェントな条件」または「高いストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度および高温、例えば、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で用いる、（２）ハイブリダイゼーションの間に変性剤、例えば、ホルムアミド、例えば、５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミドを、ｐＨ６．５において０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％のフィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液と共に用い、それと共に４２℃において７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを用いる、または（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％の硫酸デキストランを４２℃において用い、４２℃での０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中および５５℃での５０％のホルムアミド中の洗浄の後、５５℃でのＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高いストリンジェンシー洗浄を用いるものである。当業者は、プローブ長さなどの因子に適合させるための必要に応じて温度、イオン強度などを調整する方法を認識する。
【０４２６】
遺伝コードの縮重の結果として、本明細書に記載されるようなポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列があることが当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン頻度の差異に起因して変化するポリヌクレオチドが本発明により特に想定される。さらに、本明細書において提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子のアリルは本発明の範囲内である。アリルは、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換などの、１つまたはそれ以上の変異の結果として変化した内因性遺伝子である。結果として生じるｍＲＮＡおよびタンパク質は、その必要はないが、変化した構造または機能を有してもよい。アリルは、標準技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較）を使用して同定されてもよい。
【０４２７】
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え法、またはＰＣＲを使用して得られ得る。化学的なポリヌクレオチド合成の方法は当該技術分野において周知であり、本明細書において詳細に記載される必要はない。当業者は、所望のＤＮＡ配列を製造するために本明細書において提供される配列および商用のＤＮＡ合成装置を使用することができる。
【０４２８】
組換え法を使用してポリヌクレオチドを調製するために、所望の配列を含むポリヌクレオチドを好適なベクターに挿入することができ、次いでベクターを、本明細書においてさらに議論されるように、複製および増幅のために好適な宿主細胞に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当該技術分野において公知の任意の手段により宿主細胞に挿入されてもよい。細胞は、直接的な取込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ接合（F-mating）またはエレクトロポレーションにより外因性ポリヌクレオチドを導入することにより形質転換される。外因性ポリヌクレオチドが導入されると、それは非組込み型ベクター（例えば、プラスミド）として細胞内に維持され、または宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。そのようにして増幅されたポリヌクレオチドは、当該技術分野において周知の方法により宿主細胞から単離され得る。例えば、Sambrook et al., 1989を参照。
【０４２９】
代替的に、ＰＣＲはＤＮＡ配列の複製を可能とする。ＰＣＲ技術は当該技術分野において周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，７５４，０６５号および同第４，６８３，２０２号の他に、PCR:  The Polymerase Chain
Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994に記載されている。
【０４３０】
ＲＮＡは、適切なベクター中の単離されたＤＮＡを使用し、それを好適な宿主細胞に挿入することにより得られ得る。細胞が複製されかつＤＮＡがＲＮＡに転写されると、ＲＮＡは次に、例えば上掲のSambrook et al., 1989に記載されるような当業者に周知の方法
を使用して単離され得る。
【０４３１】
好適なクローニングベクターは、標準技術にしたがって構築されてもよく、または当該技術分野において利用可能な多数のクローニングベクターから選択されてもよい。選択されるクローニングベクターは使用が意図される宿主細胞にしたがって異なり得るが、有用なクローニングベクターは、概しては、自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼのための単一の標的を有してもよく、かつ／またはベクターを含有するクローンの選択において使用することができるマーカー用の遺伝子を有してもよい。好適な例としては、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ  ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにシャトルベクター、例えば、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８が挙げられる。これらおよび多くの他のクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの商業ベンダーから入手可能である。
【０４３２】
発現ベクターがさらに提供される。発現ベクターは、概しては、本発明によるポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターは、エピソームとしてまたは染色体ＤＮＡの組み込まれた部分として宿主細胞中で複製可能でなければならないことが含意される。好適な発現ベクターとしては、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミド、およびＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２において開示される発現ベクターが挙げられるがそれに限定されない。ベクター成分は、概しては、以下：シグナル配列、複製起点、１つまたはそれ以上のマーカー遺伝子、好適な転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーおよびターミネーター）の１つまたはそれ以上を含んでもよいがそれに限定されない。発現（すなわち、翻訳）のために、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および終止コドンなどの１つまたはそれ以上の翻訳制御エレメントもまた通常必要とされる。
【０４３３】
目的のポリヌクレオチドを含有するベクターは、多数の適切な手段のいずれかにより宿主細胞に導入することができ、該手段としては、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、または他の物質を用いるトランスフェクション、微粒子銃、リポフェクション、および感染（例えば、ベクターがワクシニアウイルスなどの感染性因子である場合）が挙げられる。ベクターまたはポリヌクレオチドの導入の選択は、多くの場合に、宿主細胞の特徴に依存する。
【０４３４】
本発明はまた、本明細書に記載の任意のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。異種ＤＮＡを過剰発現することができる任意の宿主細胞が、目的の抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的のために使用され得る。哺乳動物宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞が挙げられるがそれに限定されない。ＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２も参照。好適な非哺乳動物宿主細胞としては、原核生物（例えば、Ｅ．コリまたはＢ．スブチリス（B. subtillis））および酵母（例えば、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisae）、Ｓ．ポンべ（S. pombe）、またはＫ．ラクチス（K. lactis））が挙げられる。好ましくは、宿主細胞は、宿主細胞中の、存在す
る場合は対応する内因性の目的の抗体またはタンパク質のレベルよりも、約５倍高い、より好ましくは１０倍高い、よりいっそう好ましくは２０倍高いレベルにおいてｃＤＮＡを発現する。ＩＬ−６への特異的な結合についての宿主細胞のスクリーニングは、イムノア
ッセイまたはＦＡＣＳによりもたらされる。目的の抗体またはタンパク質を過剰発現する細胞が同定され得る。
【０４３５】
発現ベクターは、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）の発現を指令するために使用され得る。当業者は、ｉｎ  ｖｉｖｏで外因性タンパク質の発現を得るための発現ベクターの投与に精通している。例えば、米国特許第６，４３６，９０８号、同第６，４１３，９４２号および同第６，３７６，４７１号を参照。発現ベクターの投与は、注射、経口投与、粒子銃またはカテーテル投与、および局所（topical）投与を含む、局所（local）または全身投与を含む。別の実施形態では、発現ベクターは、交感神経幹もしくは神経節に直接的に、または冠動脈、心房、心室、もしくは心膜中に投与される。
【０４３６】
発現ベクター、またはサブゲノムポリヌクレオチドを含有する治療用組成物の標的化された送達もまた使用され得る。受容体媒介性のＤＮＡ送達技術は、例えば、Findeis et al., Trends Biotechnol., 1993, 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics:  Methods And Applications Of Direct Gene Transfer, J.A. Wolff, ed., 1994; Wu et al., J. Biol. Chem., 1988, 263:621; Wu et al., J. Biol. Chem., 1994, 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem., 1991, 266:338に記載されている。ポリヌクレオチドを含有する治療用組成物は、遺伝子療法プロトコールにおいて局所投与のために約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲内で投与される。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡの濃度範囲もまた遺伝子療法プロトコールの間に使用され得る。治療ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して送達され得る。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルスまたは非ウイルス起源のものであり得る（概しては、Jolly, Cancer Gene Therapy, 1994, 1:51; Kimura, Human Gene Therapy, 1994, 5:845; Connelly, Human Gene Therapy, 1995, 1:185;およびKaplitt, Nature
Genetics, 1994, 6:148を参照）。そのようなコーディング配列の発現は、内因性の哺乳動物または異種プロモーターを使用して誘導され得る。コーディング配列の発現は、構成的または調節性のいずれかであり得る。
【０４３７】
所望の細胞における所望のポリヌクレオチドの送達および発現用のウイルスベースのベクターは当該技術分野において周知である。例示的なウイルスベースのビヒクルとしては、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９４／０３６２２、ＷＯ９３／２５６９８、ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９３／１１２３０、ＷＯ９３／１０２１８、ＷＯ９１／０２８０５、米国特許第５、２１９，７４０号および同第４，７７７，１２７号、英国特許第２，２００，６５１号、およびＥＰ特許第０３４５２４２号を参照）、アルファウイルスベースのベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０、ＡＴＣＣ  ＶＲ  １２４９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））、ならびにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５を参照）が挙げられるがそれに限定されない。Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147に記載されるような殺傷されたアデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与もまた用いられ得る。
【０４３８】
非ウイルスの送達ビヒクルおよび方法もまた用いることができ、これには、単独の殺傷されたアデノウイルスに連結させたまたは非連結のポリカチオン性凝縮ＤＮＡ（例えば、Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147を参照）、リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Wu, J.
Biol. Chem., 1989, 264:16985を参照）、真核細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特
許第５，８１４，４８２号、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０７９９４、ＷＯ９６／１７０７２、ＷＯ９５／３０７６３、およびＷＯ９７／４２３３８を参照）、ならびに核電荷の中和または細胞膜との融合が含まれるがそれに限定されない。ネイキッドＤＮＡもまた用いられ得る。例示的なネイキッドＤＮＡ導入方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９４／２３６９７、ＷＯ９１／１４４４５、およびＥＰ０５２４９６８に記載されている。追加のアプローチは、Philip, Mol. Cell Biol., 1994, 14:2411およびWoffendin, Proc. Natl. Acad. Sci., 1994, 91:1581に記載されている。
【０４３９】
組成物
本発明はまた、本明細書に記載の有効量のＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）コンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。そのような組成物の例の他に、配合方法もまた本明細書に記載される。一部の実施形態では、組成物は、１つまたはそれ以上のＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／もしくはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）ならびに／または抗体（および／もしくはＡｂ−トラップ）コンジュゲートを含む。他の実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）はヒトＩＬ−６を認識する。他の実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体はヒト抗体である。他の実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体はヒト化抗体である。一部の実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体は、抗体媒介性の溶解またはＡＤＣＣなどの、望まないまたは望ましくない免疫応答を誘発しない定常領域を含む。他の実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニスト（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）は、抗体の１つまたはそれ以上のＣＤＲ（例えば、１、２、３、４、５、または、一部の実施形態では、６つ全てのＣＤＲ）を含む。
【０４４０】
組成物は、１つより多くのＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）（例えば、ＩＬ−６の異なるエピトープを認識するＩＬ−６抗体の混合物）を含み得ることが理解される。他の例示的な組成物は、同じエピトープを認識する１つより多くのＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／もしくはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）、またはＩＬ−６の異なるエピトープに結合するＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／もしくはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）の異なる種を含む。一部の実施形態では、組成物は、ＩＬ−６の異なるバリアントを認識するＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）の混合物を含む。追加的に、一部の実施形態では、組成物はまた、または代替的に、１つより多くのＶＥＧＦトラップを含み得る。これらの代替的なＶＥＧＦトラップセクションは、セクションが本明細書に記載されるような同じまたは類似の機能性を有する限り、ＶＥＧＦトラップセクションの異なる配列を含み得る。
【０４４１】
本発明において使用される組成物は、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で、薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤をさらに含み得る（Remington:  The Science and practice of Pharmacy 20th Ed., 2000, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K.
E. Hoover）。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、投与量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、かつリン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロ
ブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン；単糖、二糖、および、グルコース、マンノース、もしくはデキストランを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含んでもよい。薬学的に許容される賦形剤は本明細書にさらに記載されている。
【０４４２】
非経口投与のために適合された医薬組成物としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および製剤を意図されるレシピエントの血液と実質的に等張にする溶質を含有してもよい水性および非水性無菌注射溶液；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含んでもよい水性および非水性無菌懸濁液が挙げられる。注射可能な溶液のために使用されてもよい賦形剤としては、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油が挙げられる。組成物は、単位用量または複数用量容器、例えば、密封されたアンプルおよびバイアル中に提供されてもよく、使用直前に、無菌の液体、例えば注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態において貯蔵されてもよい。即席注射溶液および懸濁液が無菌粉末、顆粒および錠剤から調製されてもよい。医薬組成物は実質的に等張であり得、これは約２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ水の重量オスモル濃度を含意する。
【０４４３】
医薬組成物は、防腐剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、臭気剤、塩（本発明の物質はそれ自体が薬学的に許容される塩の形態で提供されてもよい）、緩衝剤、コーティング剤または酸化防止剤を含有してもよい。それはまた、本発明の物質に加えて治療活性剤を含有してもよい。本発明の医薬組成物は、１つまたはそれ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて用いられてもよい。そのような賦形剤としては、生理食塩液、緩衝生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、デキストロース、リポソーム、水、グリセロール、エタノールおよびその組合せを挙げることができるがそれに限定されない。
【０４４４】
本発明のＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）コンジュゲート、ならびに医薬組成物は、単独で、または他の化合物、例えば、治療用化合物もしくは分子、例えば、抗炎症性薬物、鎮痛剤もしくは抗生物質と組み合わせて用いられ得る。他の化合物とのそのような投与は、同時、別々または逐次的であってもよい。成分は、適宜に指示を含んでもよいキットの形態で用意されてもよい。
【０４４５】
眼障害を予防または治療する方法
一部の実施形態では、抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）ならびに抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）コンジュゲートは、治療的処置方法が挙げられるがそれに限定されない様々な応用において有用である。
【０４４６】
一部の実施形態では、例えばＡＭＤなどの眼疾患を治療する方法が提供される。一部の実施形態では、対象においてＡＭＤを治療する方法は、それを必要とする対象に本明細書に記載されるような抗ＩＬ−６抗体またはＩＬ６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップのいずれかを含む有効量の組成物（例えば、医薬組成物）を投与することを含む。本明細書において使用される場合、ＡＭＤとしては、萎縮型ＡＭＤおよび滲出型ＡＭＤが挙げられる。一部の実施形態では、対象においてＡＭＤを治療する方法であって、それを必要とする対象に本明細書に記載されるようなＩＬ−６アンタゴニスト抗体またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップまたはそのコンジュゲートを含む有効量の組成物を投与することを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ＩＬ−６抗体および／またはＩＬ−６  Ａｂ  ＶＥＧ
Ｆトラップおよび／またはそのコンジュゲートは、滲出型または新生血管黄斑変性症、滲出型または新生血管加齢黄斑変性症、乾燥型加齢黄斑変性症、網膜浮腫を伴うまたは伴わない目およびまたは網膜血管の静脈、動脈または他の閉塞、前部および後部ぶどう膜炎、ぶどう膜炎黄斑浮腫、糖尿病網膜症、増殖性糖尿病網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、非増殖性糖尿病性黄斑浮腫、ならびに眼内腫瘍を治療および／または予防および／またはそのリスクを低減するために使用され得る。一部の実施形態では、抗体、またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップは、（ｉ）ＶＥＧＦ療法抵抗性患者、（ｉｉ）線維症、創傷治癒、および萎縮などの追加の基礎病理の進行に起因して抗ＶＥＧＦ剤に対する有効性を喪失した患者ならびに／または（ｉｉｉ）頻繁な硝子体内注射の必要性に起因する処置不充分のために使用され得る。
【０４４７】
一部の実施形態では、全身性疾患などの眼疾患を治療する方法が提供される。一部の実施形態では、グレーブス病もしくは視神経脊髄炎などの目に影響する全身性疾患、または多発性硬化症、関節リウマチなどの目に影響しない全身性疾患が、本明細書において提供される方法および組成物を介して治療され得る。
【０４４８】
一部の実施形態では、本明細書において提供される組成物は、腫瘍学的適応症のためにＰＤ−１／ＰＤＬ−１などの免疫モジュレーターと組み合わせて使用され得る。
【０４４９】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、療法の１つまたはそれ以上の追加の形態を用いて対象を治療するステップをさらに含む。一部の実施形態では、療法の追加の形態は、ＶＩＳＵＤＹＮＥ（登録商標）、レーザー光凝固、または例えば、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）、ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）、ＥＹＬＥＡ（登録商標）、ＯＺＵＲＤＥＸ（登録商標）、ＩＬＵＶＩＥＮ（登録商標）、ＴＲＩＥＳＥＮＣＥ（登録商標）、もしくはＴＲＩＶＡＲＩＳ（登録商標）の硝子体内注射が挙げられるがそれに限定されない追加のＡＭＤ療法である。
【０４５０】
本明細書に記載の全ての方法に関して、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）への言及はまた、１つまたはそれ以上の追加の剤を含む組成物を含む。これらの組成物は、当該技術分野において周知である、緩衝剤を含む薬学的に許容される賦形剤などの、好適な賦形剤をさらに含んでもよい。本発明は、単独でまたは他の治療方法と組み合わせて使用され得る。
【０４５１】
一部の実施形態では、それを必要とする患者における疾患の治療または予防方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、患者に本明細書に開示される任意の単離されたアンタゴニスト抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）を投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、患者に本明細書に開示される任意のコンジュゲートを投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、患者に本明細書に開示される任意の組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、ＩＬ−６過剰活性を有する患者を同定することおよび患者に本明細書に開示される任意の単離されたアンタゴニスト抗体を投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、ＩＬ−６過剰活性を有する患者を同定することおよび患者に本明細書に開示される任意のコンジュゲートを投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、ＩＬ−６過剰活性を有する患者を同定することおよび患者に本明細書に開示される任意の組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、患者は、上昇したＩＬ−６活性の代わりに、またはそれに加えて、上昇したＶＥＧＦ活性を有する。
【０４５２】
一部の実施形態では、障害は、滲出型または新生血管黄斑変性症、滲出型または新生血管加齢黄斑変性症、乾燥型加齢黄斑変性症、網膜浮腫を伴うまたは伴わない目およびまたは網膜血管の静脈、動脈または他の閉塞、前部および後部ぶどう膜炎、ぶどう膜炎黄斑浮
腫、糖尿病網膜症、増殖性糖尿病網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、非増殖性糖尿病性黄斑浮腫、ならびに眼内腫瘍からなる群から選択される。
【０４５３】
一部の実施形態では、単離された抗体（および／もしくはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）、コンジュゲート（および／もしくはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップコンジュゲート）、組成物またはその組合せは、１か月に１回以下の頻度で投与される。一部の実施形態では、単離された抗体、コンジュゲート、組成物またはその組合せは、２か月に１回以下の頻度で投与される。一部の実施形態では、単離された抗体（および／もしくはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）、コンジュゲート（および／もしくはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）コンジュゲート、組成物またはその組合せは、３か月に１回以下の頻度で投与される。一部の実施形態では、単離された構築物（例えば、ポリマーを有するまたは有しない、ＡｂまたはＡｂ−トラップ）は、１年に１回から２か月に１回までの頻度で投与される。一部の実施形態では、治療は、抗体の単回の適用であり得る。一部の実施形態では、治療は、アウトカムのために必要なまたは所望されるだけ多くの抗体の適用であり得る。
【０４５４】
ＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）またはそのコンジュゲートは、任意の好適な経路を介して対象に投与され得る。本明細書に記載の例は限定的であることは意図されず、利用可能な技術の実例であることが意図されることは当業者に明らかなはずである。したがって、一部の実施形態では、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）は、公知の方法にしたがって対象に投与され、該方法は、例えば、静脈内投与、例えば、ボーラスとしてもしくはある期間にわたる連続注入によるもの、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、経皮、皮下、関節内、舌下、滑液嚢内、ガス注入（insufflation）を介する、髄腔内、経口、吸入または局所の経路によるものである。投与は、全身性、例えば、静脈内投与、または局所性であり得る。ジェットネブライザーおよび超音波ネブライザーを含む、液体製剤用の商業的に利用可能なネブライザーは投与のために有用である。液体製剤は直接的に噴霧され得、凍結乾燥粉末は再構成後に噴霧され得る。代替的に、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）は、フルオロカーボン製剤および計量用量吸入器を使用してエアロゾル化され得、または凍結乾燥およびミーリング加工された粉末として吸入され得る。
【０４５５】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）コンジュゲート、ならびに医薬組成物は、眼疾患または状態の予防または治療のために使用される。そのように使用される場合、コンジュゲートは、典型的には、眼、眼内、および／もしくは硝子体内注射、ならびに／または強膜近傍注射、ならびに／またはサブテノン注射、ならびに／または上脈絡膜注射ならびに／または点眼剤および／もしくは軟膏の形態での局所投与のために配合され、それにより投与される。そのようなＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）コンジュゲート、ならびに組成物は、例えば、Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton, and Pearson, editors, Taylor & Francis (March 2006)などの参考文献に記載されるものを含む、硝子体への化合物の徐放を可能とするデバイスおよび／またはデポーとして硝子体内に、様々な方法により送達され得る。一例では、デバイスは、最小および／またはマトリックスおよび／または受動拡散システムおよび／または長期間にわたり化合物を放出するカプセル化細胞の形態であってもよい（Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton, and Pearson, editors, Taylor & Francis (March 2006)。療法においてまたは予防剤として、活性剤は、好ましくは等張または実質的に等張の、注射可能な組成物、例えば無菌水性分散体として、個体に投与されてもよい。
【０４５６】
眼、眼内または硝子体内投与用の製剤は、当該技術分野において公知の方法により当該技術分野において公知の成分を使用して調製され得る。目への適切な透過は、効率的な治療のために望ましい。薬物が局所で送達され得る、目の前部の疾患と異なり、網膜疾患はより部位特異的なアプローチの利点を享受する。点眼剤および軟膏が目の背部に透過することは稀であり、血液−眼バリアは眼組織への全身投与された薬物の透過を妨げる。一部の実施形態では、ＡＭＤおよびＣＮＶなどの網膜疾患を治療するための薬物送達のために選択される方法は、直接的な硝子体内注射である。一部の実施形態では、硝子体内注射は、患者の状態、ならびに送達される薬物の特性および半減期に依存する間隔で繰り返される。
【０４５７】
哺乳動物、特にヒトへの投与のために、活性剤の投与量は、全身投与のために、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から典型的には約１ｍｇ／ｋｇであることが予期される。局所投与（例えば、硝子体内、上脈絡膜（supracoroidal）、眼周囲など）を必要とする眼疾患のため
に、投与量は、典型的には、０．１ｍｇ／目／用量〜１０ｍｇ／目／用量またはそれ以上である。一部の実施形態では、投与量は１００ｕｌ／用量／目である。一部の実施形態では、投与量を投与するために針が使用され得る。針は、例えば、３０ゲージ１／２インチ針または２７Ｇもしくは２９Ｇの１／２インチ針であり得る。医師は、個体にとって最も好適な実際の投与量を決定することができ、該投与量は、個体の年齢、体重、性別および応答、治療されている疾患または障害ならびに治療されている個体の年齢および状態を含む要因に依存する。上記の投与量は平均的な症例の例示的なものである。当然、より高いまたはより低い投与量が利点を享受する事例があり得る。
【０４５８】
この投与量は、適切なだけ頻繁（例えば、週毎、隔週毎、月毎、季毎）に繰り返されてもよい。副作用が発生する場合、投与の量および／または頻度は、通常の臨床プラクティスにしたがって低減され得る。一実施形態では、医薬組成物は、１〜３０日毎に１回投与されてもよい。
【０４５９】
本発明のＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）は、患者におけるｉｎ  ｖｉｖｏでのそのようなポリペプチドの発現、すなわち、遺伝子療法により、本発明にしたがって、用いられてもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ
ｖｉｖｏという、患者の細胞中に核酸（任意にベクターに含有される）を入れるための２つの主要なアプローチがある。ｉｎ  ｖｉｖｏ送達のために、核酸は、通常は治療用タンパク質が必要とされる部位において、すなわち、治療用タンパク質の生物学的活性が必要とされる部位において、患者に直接的に注射される。ｅｘ  ｖｉｖｏ治療のために、患者の細胞が取り出され、核酸がこれらの単離された細胞に導入され、改変された細胞が患者に直接的にまたは、例えば、患者に埋め込まれる多孔性膜内にカプセル化されて投与される（例えば、米国特許第４，８９２，５３８号および同第５，２８３，１８７号を参照）。生存細胞に核酸を導入するために利用可能な様々な技術がある。核酸がｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養細胞に移入されるのか、それとも意図される宿主の細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで移入されるのかに依存して技術は異なる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの哺乳動物細胞への核酸の移入のために好適な技術としては、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などの使用が挙げられる。形質導入は、複製欠陥性の組換えウイルス（好ましくはレトロウイルス）粒子を細胞受容体と会合させた後、粒子により含有される核酸を細胞に導入することを伴う。遺伝子のｅｘ  ｖｉｖｏでの送達のために一般的に使用されるベクターはレトロウイルスである。
【０４６０】
現在好ましいｉｎ  ｖｉｖｏ核酸移入技術としては、ウイルスまたは非ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、またはアデノ
随伴ウイルス（ＡＡＶ））ならびに脂質ベースのシステム（遺伝子の脂質媒介性の移入のために有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、およびＤＣ−Ｃｈｏｌである；例えば、Tonkinison et al., Cancer Investigation, 14(1): 54-65 (1996)を参照）を用いるトランスフェクションが挙げられる。遺伝子療法において使用するための最も好ましいベクターは、ウイルス、最も好ましくは、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス、またはレトロウイルスである。レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターは、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサーまたは遺伝子座定義エレメント、または、選択的スプライシング（alternate splicing）、核ＲＮＡ輸送、もしくはメッセンジャーの翻訳後修飾などの他の手段により遺伝子発現を制御する他のエレメントを含む。追加的に、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターは、治療用タンパク質をコードする遺伝子の存在下で転写される場合にそれに作動可能に連結されて翻訳開始配列として作用する核酸分子を含む。そのようなベクター構築物はまた、パッケージングシグナル、長鎖末端反復（ＬＴＲ）またはその部分、ならびに使用されるウイルスにとって適切な正および負鎖プライマー結合部位を含む（これらがウイルスベクター中に既に存在しない場合）。追加的に、そのようなベクターは、典型的には、それが置かれる宿主細胞からのプロポリペプチドの分泌のためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は哺乳動物シグナル配列であり、最も好ましくは、治療用タンパク質のための天然のシグナル配列である。任意に、ベクター構築物はまた、ポリアデニル化を指令するシグナルの他に、１つまたはそれ以上の制限部位および翻訳終結配列を含んでもよい。例として、そのようなベクターは、典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成起点、および３’ＬＴＲまたはその部分を含む。陽イオン性脂質、ポリリジン、およびデンドリマーなどの、非ウイルス性の他のベクターを使用することができる。
【０４６１】
一部の状況では、細胞表面膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上の受容体のリガンドなどの、標的細胞を標的化する剤を核酸供給源に提供することが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスと関連付けられる細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質が、標的化のためおよび／または取込みを促進するために使用されてもよく、これは例えば、特定の細胞種に向性（tropic）のキャプシドタンパク質またはその断片、循環的に内部移行を起こすタンパク質に対する抗体、および細胞内局在性を標的化しかつ細胞内半減期を増進するタンパク質である。受容体媒介性のエンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu et al., J. Biol. Chem .,262: 4429-4432 (1987);およ
びWagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414(1990)に記載されている。現在公知の遺伝子マーキングおよび遺伝子療法プロトコールの総説について、Anderson
et al., Science, 256: 808-813 (1992)を参照。ＷＯ９３／２５６７３およびそれにお
いて参照される参考文献も参照。
【０４６２】
好適な遺伝子療法ならびにレトロウイルス粒子および構造タンパク質を製造する方法は、例えば、米国特許第５，６８１，７４６号に見出すことができる。
【０４６３】
一部の態様によれば、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）をコードする核酸分子が投与される、哺乳動物における眼疾患の治療または予防方法が提供される。
【０４６４】
一部の実施形態では、これらのＩＬ６／ＶＥＧＦ二重阻害剤分子は、眼科炎症性疾患強膜炎、非増殖性糖尿病網膜症、増殖性糖尿病網膜症（ＰＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫の予防、増殖性糖尿病網膜症の予防、滲出型加齢黄斑変性症、滲出型加齢黄斑変性症の予防、ぶどう膜炎、およびぶどう膜炎黄斑浮腫など、眼障害を治療するために使用され得る。
【０４６５】
ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６治療法はまた、グレーブス病もしくは視神経脊髄炎などの目に影響する全身性疾患、または多発性硬化症、関節リウマチなどの目に影響しない全身性疾患を治療するために使用され得る。
【０４６６】
これらの分子はまた、ＣＡＲ−Ｔまたは類似の免疫腫瘍学的治療後のサイトカイン放出症候群を治療するために使用され得る。追加的に、抗ＩＬ６分子は、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１分子を用いた治療後に観察されるＩＬ−６発現の誘導を妨げる（Tsukamoto et al, 2018）。追加的に、ＶＥＧＦシグナル伝達の遮断はまた、抗ＰＤ−Ｌ１治療を向上させ得
る（Allen et al, 2017）。そのため、これらの二重阻害剤は、がんを相乗的に治療する
ために免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１／ＰＤＬ−１モジュレーター）と組み合わせて使用され得る。ＶＥＧＦ阻害は、これに加えて追加の利益を提供する。これの別の応用は、抗ＩＬ６療法が抗ＶＥＧＦ治療に対して追加の利益を示すことがある膠芽腫における脳浮腫に使用され得る。バイオポリマーはまた、組織分布の増加を可能とすることがあり、これは固形腫瘍の透過のために有益である。
【０４６７】
一部の実施形態では、コンジュゲート（または様々なタンパク質）は、本明細書において提供される障害のいずれか１つまたはそれ以上の予防のために有用である。
【０４６８】
製剤
本発明にしたがって使用されるＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／またはＩＬ−６
Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）ならびにＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）コンジュゲートの治療用製剤は、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態において、任意な薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤（Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000）と所望の程度の純度を有する抗体を混合することにより貯蔵のために調製される。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、用いられる投与量および濃度においてレシピエントにとって非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤；塩化ナトリウムなどの塩；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含んでもよい。
【０４６９】
ＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／もしくはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）ならびに／またはＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／もしくはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）コンジュゲートを含有するリポソームは、Epstein, et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030
(1980)、ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号な
どに記載されるような、当該技術分野において公知の方法により調製される。増進した循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法によ
り生成され得る。リポソームは、所望の直径を有するリポソームをもたらすために、定義された孔径のフィルターを通して押し出される。
【０４７０】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によりもしくは界面重合により調製されるマイクロカプセル中に、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）中に、またはマクロエマルション中に捕捉されてもよい。そのような技術は、Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)に開示されている。
【０４７１】
持続放出調製物が調製されてもよい。持続放出調製物の好適な例としては、成形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態の、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸と７エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリド酢酸塩から構成される注射可能なマイクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、スクロース酢酸イソブチル、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０４７２】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与のために使用される製剤は無菌でなければならない。これは、例えば、無菌濾過膜を通じた濾過により、容易に達成される。治療的なＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／もしくはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）ならびに／または抗体（および／もしくはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）コンジュゲート組成物は、概しては、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針により貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルに入れられる。一部の実施形態では、抗体および／または抗体コンジュゲート組成物は、シリンジに入れられて事前充填シリンジを提供する。
【０４７３】
一部の実施形態では、組成物は、エンドトキシンおよび／または関連する発熱性物質を実質的に含まない発熱物質非含有組成物である。エンドトキシンは、微生物内部に限局し、微生物が破壊または死亡した場合にのみ放出される毒素を含む。発熱性物質としてはまた、細菌および他の微生物の外膜からの発熱誘導性の熱安定性物質が挙げられる。これらの物質の両方は、ヒトに投与された場合に発熱、低血圧およびショックを引き起こし得る。潜在的な有害効果に起因して、少量のエンドトキシンであっても、静脈内に投与される薬学的薬物溶液から除去されなければならない。ＩＶまたはＩＰなどの全身注射のために、食品医薬品局（「ＦＤＡ」）は、静脈内薬物適用のために単一の１時間の期間において体重１キログラム当たり５エンドトキシン単位（ＥＵ）／用量の上限を設定した（The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)）。
目的のタンパク質（例えば、抗体）について起こり得るように、治療用タンパク質が体重１キログラム当たり数百または数千ミリグラムの量で投与される場合、微量の有害かつ危険なエンドトキシンであっても除去されなければならない。一部の実施形態では、組成物中のエンドトキシンおよび発熱物質レベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満、または５ＥＵ／ｍｇ未満、または１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、本明細書において提供される組成物または方法は０．１ＥＵ／目／注射を許容する。一部の実施形態では、本明細書において提供される組成物または方法は０．０５ＥＵ／目／注射を許容する。一部の実施形態では、本明細書において提供される組成物または方法は０．０２ＥＵ／目
／注射を許容する。一部の実施形態では、本明細書において提供される組成物または方法は０．０１ＥＵ／目／注射を許容する。
【０４７４】
本発明による組成物は、経口、非経口もしくは直腸投与、または吸入もしくはガス注入による投与のための、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、顆粒、溶液または懸濁液、または坐剤などの単位投与形態であってもよい。
【０４７５】
錠剤などの固体組成物を調製するために、主要な活性成分は、薬学的担体、例えば、従来の錠剤化成分、例えば、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガム、および他の薬学的希釈剤、例えば、水と混合されて、本発明の化合物、またはその非毒性の薬学的に許容される塩の均質な混合物を含有する固体予備処方組成物を形成する。これらの予備処方組成物が均質であると言及される場合、活性成分が組成物全体に均一に分散することにより、組成物を錠剤、丸剤およびカプセルなどの同等に効果的な単位投与形態に容易にさらに分割できることが意味される。この固体予備処方組成物は次に、約０．１〜約５００ｍｇの本発明の活性成分を含有する上記の種類の単位投与形態にさらに分割される。新規の組成物の錠剤または丸剤は、長期化した作用の利点をもたらす投与形態を提供するためにコーティングまたは他に配合され得る。例えば、錠剤または丸剤は、内部投与量および外部投与量成分を含むことができ、後者は前者の上のエンベロープの形態である。２つの成分を腸溶性層により分離することができ、腸溶性層は、胃の中での崩壊に抵抗するために用いられ、かつ内部成分がインタクトなまま十二指腸に通過することまたはその放出の遅延を可能とし得る。そのような腸溶性層またはコーティングのために様々な材料を使用することができ、そのような材料としては、多数のポリマー酸ならびにシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースなどの材料とのポリマー酸の混合物が挙げられる。
【０４７６】
好適な表面活性剤としては、特に、非イオン性剤、例えば、ポリソルベートまたはポリオキシエチレンソルビタン（例えば、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）および他のソルビタン（例えば、Ｓｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）が挙げられる。表面活性剤を有する組成物は、好都合には、０．０１％〜５％の表面活性剤を含み、０．０１〜０．０２％または０．１〜２．５％（ポリソルベート２０または８０）であり得る。必要な場合、他の成分、例えば、マンニトールまたは他の薬学的に許容されるビヒクルが添加されてもよいことが理解される。
【０４７７】
好適なエマルションは、商業的に利用可能な脂質エマルション、例えば、ＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤ（商標）、ＬＩＰＯＳＹＮ（商標）、ＩＮＦＯＮＵＴＲＯＬ（商標）、ＬＩＰＯＦＵＮＤＩＮ（商標）およびＬＩＰＩＰＨＹＳＡＮ（商標）を使用して調製されてもよい。活性成分は、予備混合されたエマルション組成物に溶解されてもよく、または代替的に、油（例えば、大豆油、サフラワー油、綿実油、ゴマ油、コーン油もしくはアーモンド油）ならびにリン脂質（例えば、卵リン脂質、大豆リン脂質もしくは大豆レシチン）および水との混合により形成されるエマルションに溶解されてもよい。エマルションの張度を調整するために、他の成分、例えば、グリセロールまたはグルコースが添加されてもよいことが理解される。好適なエマルションは、典型的には、最大２０％、例えば、５〜２０％の油を含有する。脂質エマルションは、０．１〜１．０μｍ、特に０．１〜０．５μｍの脂質小滴を含むことができ、かつ５．５〜８．０の範囲内のｐＨを有し得る。
【０４７８】
エマルション組成物は、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／またはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）をＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）またはその成分（大豆油、卵リン脂質、グリセロールおよび水）と混合することにより調製されるものであり得る。
【０４７９】
吸入またはガス注入用の組成物としては、薬学的に許容される水性または有機溶媒、またはその混合物中の溶液および懸濁液、ならびに粉末が挙げられる。液体または固体組成物は、上記に示されるような好適な薬学的に許容される賦形剤を含有してもよい。一部の実施形態では、組成物は、局所的なまたは全身性の効果のために経口または経鼻呼吸器経路により投与される。好ましくは無菌の薬学的に許容される溶媒中の組成物は、気体の使用により噴霧されてもよい。噴霧された溶液は、噴霧デバイスから直接的に吸入されてもよく、または噴霧デバイスは、フェイスマスク、テントもしくは間欠的陽圧呼吸器に取り付けられてもよい。溶液、懸濁液または粉末組成物は、適切な方式で製剤を送達するデバイスから、好ましくは経口的または経鼻的に、投与されてもよい。
【０４８０】
キット
本発明はまた、本明細書に記載の抗体のいずれかまたは全てを含むキットを提供する。本発明のキットは、本明細書に記載のＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／もしくはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）またはコンジュゲートならびに本明細書に記載の発明の任意の方法にしたがって使用するための指示を含む１つまたはそれ以上の容器を含む。概しては、これらの指示は、上記の治療的処置のためのＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／もしくはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）またはコンジュゲートの投与の説明を含む。一部の実施形態では、キットは、単回用量投与単位を生成するために提供される。ある特定の実施形態では、キットは、乾燥タンパク質を有する第１の容器および水性製剤を有する第２の容器の両方を含有し得る。ある特定の実施形態では、単一および複数チャンバー事前充填シリンジ（例えば、液体シリンジおよび凍結乾燥シリンジ）を含有するキットが含まれる。
【０４８１】
一部の実施形態では、抗体はヒト抗体である。一部の実施形態では、抗体はヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。ＩＬ−６アンタゴニスト抗体（および／もしくはＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ）またはコンジュゲートの使用に関する指示は、概しては、意図される治療のための投与量、投与スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数用量パッケージ）または部分単位用量であってもよい。本発明のキットにおいて供給される指示は、典型的には、ラベルまたはパッケージ挿入物（例えば、キットに含まれる紙シート）上の書面指示であるが、機械読取り可能な指示（例えば、磁気または光学ストレージディスク上の指示）もまた許容される。
【０４８２】
本発明のキットは、好適なパッケージング中にある。好適なパッケージングとしては、バイアル、ボトル、ジャー、および柔軟性パッケージング（例えば、密封マイラーまたはプラスチックバック）などが挙げられるがそれに限定されない。事前充填シリンジ、吸入器、経鼻投与デバイス（例えば、アトマイザー）またはミニポンプなどの注入デバイスなどの特定のデバイスと組み合わせて使用するためのパッケージもまた想定される。キットは無菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、皮下注射針により貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。容器もまた無菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、皮下注射針により貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体またはコンジュゲートである。容器は、第２の薬学的に活性の剤をさらに含んでもよい。
【０４８３】
キットは、任意に、緩衝液および説明情報などの追加の成分を提供してもよい。一部の実施形態では、キットは、投与シリンジのバックフィルのために使用される追加のシリンジおよび針を含み得る。通常、キットは、容器および容器上または容器に付属するラベルまたはパッケージ挿入物を含む。
【０４８４】
以下の例は、実例的な目的のためにのみ与えられ、いかなる意味でも本発明の範囲を限定することは意図されない。実際、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の様々な改変が以上の記載から当業者に明らかとなり、それは添付の請求項の範囲に含まれる。
【実施例】
【０４８５】
新生血管性網膜疾患の治療のための抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）生物学的薬物の治療的成功にもかかわらず、（ｉ）ＶＥＧＦ療法抵抗性患者、（ｉｉ）線維症、創傷治癒、および萎縮などの追加の基礎病理の進行に起因して抗ＶＥＧＦ剤に対する有効性を喪失した患者、（ｉｉｉ）頻繁な硝子体内注射の必要性に起因する処置不充分、に起因して満たされていない必要性が依然として存在する。以下は、ＶＥＧＦおよびＩＬ−６の両方を阻害するために設計された新規の二重特異性生物学的薬剤に関する結果である。
【０４８６】
方法  二重阻害剤を設計し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によりその各々の標的に対する結合親和性について特徴付けを行った。分子の機能的な態様を、（１）その各々の受容体への各標的の競合的な遮断を標的化するＥＬＩＳＡアッセイ、（２）ＶＥＧＦおよび／またはＩＬ−６刺激性の初代ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＶＥＣ）増殖アッセイを実行可能であること、ならびに（３）血管新生出芽の阻害を評価する三次元初代細胞共培養アッセイを実行可能であることにより試験した。
【０４８７】
ＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップ構築物は、ｐＭの親和性でＶＥＧＦおよびＩＬ−６に結合した。各標的の結合速度論は他方の存在から独立しており、両方の標的は干渉なしに同時に結合できることを示唆した。その各標的へのこれらの分子の結合は、その各々のコグネイト受容体との相互作用を阻害する。
【０４８８】
バイオポリマーコンジュゲートプラットフォーム内で組み合わせた場合、これらの二重阻害剤分子は、網膜疾患の次世代の治療および予防のためのさらなる治療剤を提供する。
【０４８９】
実施例１−抗体の生成およびスクリーニング
方法／結果：
抗ＩＬ−６
本実施例は、抗ＶＥＧＦトラップに融合した操作されたヒトＩｇＧ１フレームワークおよびＩｇＧ１  Ｆｃドメイン中にＩＬ−６抗体を含有する抗ＩＬ−６および抗ＶＥＧＦ二重阻害剤分子の構築を概説する。これらの分子のＦｃドメインは、エフェクター機能を最小化するＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａの置換、ならびに半減期延長性ホスホリルコリンベースのバイオポリマーとの部位特異的な共役を可能とするＬ４４３Ｃを含有する（残基位置はＥＵナンバリングに従う）。
【０４９０】
操作されたヒトＩｇＧ１フレームワーク中の抗ＩＬ−６パラトープを、Ｅ．コリにおけるライブラリースキャニング変異誘発およびその後の哺乳動物システムにおける部位特異的変異誘発の組合せを使用して親和性成熟させた。抗ＩＬ−６  ＣＤＲ配列を有する重鎖および軽鎖Ｆａｂを含有する二重発現プラスミドシステムの構築をＥ．コリ中で達成した。図３は方法のフローチャートを示し、これは図５の抗体重鎖および軽鎖可変領域を結果としてもたらした。
【０４９１】
これらのアミノ酸と関連付けられる化学的ライアビリティーに起因してＣｙｓ、ＭｅｔおよびＡｓｎへの置換を除いて、７１全てのＣＤＲ位置についてランダム単一点変異を含有するＦａｂライブラリーを構築した。９６ウェルプレートフォーマットにおける小規模発現をＦａｂライブラリーのスクリーニングのために利用した。ランダムの単一点変異を含有するＥ．コリのコロニー（ＴＧ１細胞、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を選んで９６
ウェルプレート（１．５ｍＬ）に入れ、ＬＢ  Ａｍｐ＋２％のグルコース中３０℃でオーバーナイトで生育した。１００μＬの培養物を除去し、１００μＬの３０％のグリセロールを添加することにより別々の９６ウェルプレートを翌日に作製した後、−８０℃で貯蔵した。残りの培養物を２０分間遠心沈降した後、３０℃でのタンパク質発現の誘導のために１ｍＭのＩＰＴＧを含有する１．５ｍＬのＬＢ  Ａｍｐに再懸濁した。５時間後に細胞を遠心沈降し、５００μＬのＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液に再懸濁し、１回の凍結／解凍サイクルにより溶解した。溶解液を３０分間遠心分離し、Ｂｉａｃｏｒｅ分析のために丸底９６ウェルプレートに真空濾過（２００μＬ）した。
【０４９２】
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して２５℃で抗ＩＬ−６  Ｆａｂの親和性を決定した。ＥＤＣおよびＮＨＳを用いてＣＭ５チップを活性化させ、組換えヒトＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をｐＨ５の１０ｍＭの酢酸ナトリウムに０．１ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈し、活性化されたチップに注入した。各チップチャネルについて可変の流れ時間を使用することにより抗原密度の３つの範囲（１００〜１５０ＲＵ、３００〜４００ＲＵ、４００〜６００ＲＵ）を得た後、エタノールアミンを用いてブロッキングした。９６ウェルの濾過された培養溶解液の上清を５０μＬ／分で１２０秒間注入した。単一指数関数の分解曲線への解離曲線（３００秒）のフィッティングを解離速度（ｋｏｆｆ）の決定のために使用した。試料の結合および解離の各サイクル後に５０μＬ／分で６０秒間ｐＨ１．７の１０ｍＭのグリシン溶液を注入してチップ表面を再生した。野生型と比較して類似のまたは向上したｋｏｆｆ値を示したクローンを変異同定のためのＤＮＡシークエンシングに供した。
【０４９３】
計７１のＣＤＲ残基位置からのスクリーニングデータは、１５の残基がＩＬ−６結合のために不可欠であり、いかなる他のアミノ酸によっても置換できないことを示した。許容可能な位置における置換は、親分子と類似のｋｏｆｆ値を結果としてもたらした（表１．１）。これらの単一置換のほとんどを、哺乳動物発現ベクター中にクローニングした全体重鎖および軽鎖の遺伝子に後に導入し、該ベクターをタンパク質製造のためにＥｘｐｉ２９３細胞の３ｍｌの培養物に共トランスフェクトした。５日目にこれらの培養物を遠心分離し、分泌された抗体を含有する上清を回収し、ＨＢＳ−ＥＰ＋ランニングバッファー中に希釈した（１：２０の比）。点変異体を表１．１〜１．６に示す。
【表１３】
2021514656.tif 000066
【０４９４】
表は、定義されたＣＤＲ（define CDR）内のあらゆる許容可能な置換についてのｋｏｆｆ値（ｓ−１）を示す。全体的に変異体は親分子に類似のｋｏｆｆを示す（４．９４Ｅ−０３±７．６７Ｅ−０４）。ＩＬ−６結合に不可欠かつ置換を許容しなかった残基を「ｃｒｉｔ」として示す。
【表１４】
2021514656.tif 000067
【０４９５】
表は、定義されたＣＤＲ内のあらゆる許容可能な置換についてのｋｏｆｆ値（ｓ−１）を示す。全体的に変異体は親分子に類似のｋｏｆｆを示す（４．９４Ｅ−０３±７．６７Ｅ−０４）。ＩＬ−６結合に不可欠かつ置換を許容しなかった残基を「ｃｒｉｔ」として示す。
【表１５】
2021514656.tif 000068
【０４９６】
表は、定義されたＣＤＲ内のあらゆる許容可能な置換についてのｋｏｆｆ値（ｓ−１）を示す。全体的に変異体は親分子に類似のｋｏｆｆを示す（４．９４Ｅ−０３±７．６７Ｅ−０４）。ＩＬ−６結合に不可欠かつ置換を許容しなかった残基を「ｃｒｉｔ」として示す。
【表１６】
2021514656.tif 000069
【０４９７】
表は、定義されたＣＤＲ内のあらゆる許容可能な置換についてのｋｏｆｆ値（ｓ−１）を示す。全体的に変異体は親分子に類似のｋｏｆｆを示す（４．９４Ｅ−０３±７．６７Ｅ−０４）。ＩＬ−６結合に不可欠かつ置換を許容しなかった残基を「ｃｒｉｔ」として
示す。
【表１７】
2021514656.tif 000070
【０４９８】
表は、定義されたＣＤＲ内のあらゆる許容可能な置換についてのｋｏｆｆ値（ｓ−１）を示す。全体的に変異体は親分子に類似のｋｏｆｆを示す（４．９４Ｅ−０３±７．６７Ｅ−０４）。ＩＬ−６結合に不可欠かつ置換を許容しなかった残基を「ｃｒｉｔ」として示す。
【表１８】
2021514656.tif 000071
【０４９９】
表は、定義されたＣＤＲ内のあらゆる許容可能な置換についてのｋｏｆｆ値（ｓ−１）を示す。全体的に変異体は親分子に類似のｋｏｆｆを示す（４．９４Ｅ−０３±７．６７Ｅ−０４）。ＩＬ−６結合に不可欠かつ置換を許容しなかった残基を「ｃｒｉｔ」として示す。
【０５００】
ＩＬ−６に対するこれらの単一変異体分子の結合速度論をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００を使用して２５℃で測定した。１：２０希釈の細胞上清を１０μＬ／分で６０秒間注入することにより抗体をプロテインＡチップ（ＧＥ）に捕捉させた。５つの濃度（０．５６、１．６７、５、１５および４５ｎＭ）のＩＬ−６を捕捉された抗体上に３０μＬ／分の流速で６０秒間流し、単一サイクル速度論のＢｉａｃｏｒｅアッセイフォーマットにおいて１８０秒間解離させた。５０μＬ／分の流速でのｐＨ１．７の１０ｍＭのグリシンの６０秒の注入によりセンサーチップを再生させた。適用可能な場合、類似のアッセイセットアップを使用して、３７℃での精製された抗体試料とＩＬ−６との相互作用をモニターした。このセットアップのために、１μｇ／ｍＬの精製された抗体を１０μＬ／分で２５〜２８秒間プロテインＡチップ上に注入した。上清および精製された試料のデータ解析はＢＩＡ
ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ）を使用して行った。全てのセンサーグラムを二重参照サブトラクションし、１：１ラングミュア結合モデルを使用してフィッティングした。
【０５０１】
試験した全ての単一点変異（表１．７）から、重鎖ＣＤＲ２（抗体可変ドメインの逐次的なナンバリング）のＧ６６Ｄ変異は顕著な親和性増強を結果としてもたらした（野生型と比べてＫＤの約２倍の減少：それぞれ６．９５×１０−１１Ｍ対１．５８×１０−１０Ｍ）。Ｇ６６Ｄを保持し、関連する化学的ライアビリティーを生成する可能性がある残りの重鎖および軽鎖ＣＤＲ残基（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ）を変異誘発した。この前提に基づいて、三重変異（表１．９）：Ｉ）Ｍ３４Ｉ／Ｇ６６Ｄ／Ｉ１０８Ｖ、ＩＩ）Ｍ３４Ｗ／Ｇ６６Ｄ／Ｉ１０８Ｖを含む２つの重鎖バリアントならびに三重および四重変異（表１．１０）：ＩＩＩ）Ｍ３２Ｌ／Ｍ５０Ｄ／Ｎ５２Ｓ／Ｍ８８Ｑ、ＩＶ）Ｍ３２Ｌ／Ｍ５０Ａ／Ｎ５２Ｓ／Ｍ８８Ｑ、Ｖ）Ｍ３２Ｌ／Ｍ５０Ｄ／Ｍ８８Ｑ（残基位置は抗体可変重鎖の逐次的なナンバリングに従う）を含む３つの軽鎖バリアントを生成した。単一点変異について記載したものと同じＢｉａｃｏｒｅアッセイセットアップを使用してこれらのバリアントの間の全ての可能な組合せへのＩＬ−６結合を評価した。我々の発見は、これらの変異はＩＬ−６への親和性を親ＣＤＲ配列により近く保ちながら単一点Ｇ６６Ｄ変異の効果に対抗することを実証した（表１．８）。これらの結果に基づいて、これらの改変されたＣＤＲを抗ＩＬ−６およびＩＬ−６  Ａｂ−ＶＥＧＦトラップの設計に組み込んだ。
【表１９−１】
2021514656.tif 000072
【表１９−２】
2021514656.tif 000073
【表１９−３】
2021514656.tif 000074
【表１９−４】
2021514656.tif 000075
【表１９−５】
2021514656.tif 000076
【０５０２】
抗ＩＬ−６単一点変異についてのＢｉａｃｏｒｅ速度論。２５℃の精製前（ｓｕｐ）および３７℃の精製後の試料についてデータを得た。最終的なＣＤＲの組合せに存在することが選択された変異（表４）を斜体にしている。細菌スクリーニングにおいて変異を許容しなかったＣＤＲ位置を不可欠（critical）として示す。
【表２０】
2021514656.tif 000077
【０５０３】
抗ＩＬ−６  ＣＤＲバリアントについてのＢｉａｃｏｒｅ速度論的データ。２５℃の細胞培養上清（ｓｕｐ）および３７℃の精製された試料から速度論的データを得た。重鎖および軽鎖ＣＤＲ変異をそれぞれ左側および右側（重／軽）に示す。捕捉、ｋｏｎ（ｋａ）、ｋｏｆｆ（ｋｄ）速度および解離定数を表に列記する。
【表２１】
2021514656.tif 000078
【表２２】
2021514656.tif 000079
【０５０４】
実施例２
抗ＩＬ−６  ＡＢ  ＶＥＧＦトラップ分子の設計および構築
ＩＬ−６Ａｂ−ＶＥＧＦトラップのＶＥＧＦ結合部分は、ＶＥＧＦＲ１ドメイン２とＶＥＧＦＲ２ドメイン３との融合物からなるものであった（表２．０）。この融合物はＶＥＧＦトラップとして働き、ＶＥＧＦが細胞ＶＥＧＦ受容体に結合することを防止する。
【表２３】
2021514656.tif 000080
【０５０５】
２つの別個の構成においてＶＥＧＦトラップを含有する１２の構築物を試験した（表２．１）。第１の構成では、ＶＥＧＦトラップはタンパク質の開始位置に配置され、続いてＶＥＧＦトラップを抗ＩＬ−６重鎖のＮ末端に接続する重複系列のＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー（ＧＳ）がある（ＶＥＧＦトラップ−抗ＩＬ−６；表２．１、分子Ａ〜Ｆ）。第２の構成では、重鎖の可変および定常ドメイン（Ｆａｂ領域）がＧＳリンカーを介してＶＥＧＦトラップに接続され、次にＦｃドメインがＶＥＧＦトラップのＣ末端に融合している。そのため、この構成では、ＶＥＧＦトラップは、抗体ＦａｂとＦｃ領域との間に挟まれている（抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦトラップ；表２．１、分子Ｇ〜Ｌ）。
【表２４−１】
2021514656.tif 000081
【表２４−２】
2021514656.tif 000082
【表２４−３】
2021514656.tif 000083
【表２４−４】
2021514656.tif 000084
【表２４−５】
2021514656.tif 000085
【表２４−６】
2021514656.tif 000086
【表２４−７】
2021514656.tif 000087
【０５０６】
Ｂｉａｃｏｒｅ（先行するセッションに記載されるようなセットアップ）速度論的データは、全てのバリアントの間でＫＤ値は同等であるが、上清試料の捕捉値において変異があることを示した（表２．２）。このパラメーターは溶液中に存在する抗体の量に感受性であり、異なるＣＤＲ組成に起因するこれらの分子間のタンパク質発現レベル（level protein expression）の変異を示唆した。他方、試験した２つのＶＥＧＦトラップ位置は、速度論的データに顕著な影響を示さなかった。発現レベルをモニターする実験（データ示さず）は、ＩＬ−６−ＶＥＧＦトラップ構成はＶＥＧＦトラップ−抗ＩＬ−６構成と比較して約２０％高い発現収率を有することを示した。予備的Ｂｉａｃｏｒｅデータもまた、抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦトラップ構成はＶＥＧＦホモログ、胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）によ
り緊密に結合することを示唆する（データ示さず）。
【０５０７】
表２．２
ＩＬ−６に結合する二重阻害剤バリアントＡ〜ＬのＢｉａｃｏｒｅ速度論的データ。２５℃の細胞培養上清（ｓｕｐ）試料および３７℃の精製された試料から速度論的データを得た。捕捉、ｋｏｎ（ｋａ）、ｋｏｆｆ（ｋｄ）速度および解離定数を列記する。
【表２５】
2021514656.tif 000088
【０５０８】
実施例３
Ｂｉａｃｏｒｅを介するＶＥＧＦへの二重阻害剤の結合
ＶＥＧＦに対する異なる二重阻害剤構成の結合速度論を評価するために、一連のＢｉａｃｏｒｅアッセイを行ってこれらの分子間の親和性を測定した。１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有する緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ＋中３７℃で結合速度論を測定した。抗ＶＥＧＦ剤（ＶＥＧＦトラップ−抗ＩＬ−６（５μｇ／ｍＬ）、抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦトラップ（５μｇ／ｍＬ）、ＯＧ１９５０（１μｇ／ｍＬ）およびアイリーア（０．５μｇ／ｍＬ））を１０μＬ／分で２５秒間プロテインＡチップ（ＧＥ）に捕捉させ、５つの濃度のＶＥＧＦ−Ａ１６５（０．１９、０．５６、１．６７、５、１５ｎＭ）を３０μＬ／分で１２０秒間捕捉させた抗体に流し、３０分間解離させた。センサーチップ表面を５０μｌ／分の流速でのｐＨ１．７の１０ｍＭのグリシンの６０秒間の注入により再生させた。全てのセンサーグラムを二重参照サブトラクションし、１：１ラングミュア結合モデルを使用してフィッティングした。
【０５０９】
データは、二重阻害剤分子中のＶＥＧＦトラップ成分は構成とは独立してＶＥＧＦ−Ａに緊密に結合することを示す。二重阻害剤分子は別のＶＥＧＦトラップベースの分子（アイリーア）のＶＥＧＦ親和性と類似の親和性を示すので、抗ＩＬ−６分子成分はＶＥＧＦトラップへのＶＥＧＦ−Ａの結合に影響を及ぼさないようであった。（図７）
【０５１０】
二重阻害剤分子へのＩＬ−６およびＶＥＧＦ−Ａの結合
ＩＬ−６およびＶＥＧＦ−Ａの二重の結合を直接的にモニターするためにＢｉａｃｏｒｅアッセイを実施した。二重阻害剤分子（２μｇ／ｍＬ）を１０μＬ／分で２５秒間プロテインＡチップ（ＧＥ）に捕捉させ、５つの濃度のＩＬ−６および／またはＶＥＧＦ−Ａ１６５（０．１９、０．５６、１．６７、５、１５ｎＭ）を個々にまたは混合して３０μＬ／分で１２０秒間捕捉させた抗体に流し、３０分間解離させた。センサーチップ表面を５０μｌ／分の流速でのｐＨ１．７の１０ｍＭのグリシンの６０秒間の注入により再生させた。全てのデータを二重参照サブトラクションし、個々のＩＬ−６およびＶＥＧＦ−Ａセンサーグラムの和を使用して理論曲線を作製し、それを混合試料のセンサーグラムと比較した。
【０５１１】
結果は、理論曲線および実験曲線はほぼ重なることを実証し、両方の標的がその各々の相互作用に影響することなく二重阻害剤分子に結合するというモデルを強く支持する。（図８）
【０５１２】
ＩＬ−６／ＩＬ−６−Ｒ複合体への抗ＩＬ−６の結合のＥＬＩＳＡ
ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体は膜結合受容体ｇｐ１３０に結合することができ、この三量体複合体は、ＶＥＧＦの増殖および上方調節などのＩＬ−６シグナル伝達を刺激する。ＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結合またはｇｐ１３０へのＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒの結合のいずれかの阻害は、ＩＬ−６媒介性の下流のシグナル伝達経路を遮断する。抗ＩＬ−６抗体がこれらの結合事象のいずれかを遮断するかどうかを決定するために、最初にＥＬＩＳＡを確立して、ＩＬ−６受容体と複合体化しながらのＩＬ−６にそれらが結合できるかどうかを評価した。
【０５１３】
Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡを１μｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−６Ｒ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）１００μｌで、オーバーナイトでコーティングした。１０ｎＭのＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を３倍希釈系列の抗ＩＬ−６（３０ｎＭから減少して１０ｐＭの最終濃度）と混合した。ブロッキングおよび洗浄後、混合物をＩＬ−６Ｒコーティングプレートに添加した。このアッセイは、最初にＩＬ−６Ｒコーティングプレートを１０ｎＭのＩＬ−６とインキュベートし、洗浄し、次に抗ＩＬ−６抗体を添加することによっても行った。両方の方法について、結合した抗体／ＩＬ−６複合体を抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰ抗体を用いて検出し、ＴＭＢ（ＫＰＬ）を用いて１０分間発色させた。４５０ｎＭでの吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して抗体の濃度に対してプロットし、非線形回帰曲線を用いてフィッティングした。
【０５１４】
Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡを１μｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）１００μｌで、オーバーナイトでコーティングした。抗ＩＬ−６の３倍希釈系列（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、３０ｎＭから減少して１０ｐＭの最終濃度）を行い、溶液を添加してＩＬ−６コーティングプレートをブロッキングした。抗体／ＩＬ−６複合体を抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰ抗体を用いて検出し、ＴＭＢ（ＫＰＬ）を用いて１０分間発色させた。４５０ｎＭでの吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して抗体の濃度に対してプロットし、非線形回帰曲線を用いてフィッティングした。
【０５１５】
試験した条件下で、ここに記載した抗ＩＬ−６抗体はＩＬ−６に特異的に結合するが、それがＩＬ−６受容体と複合体化している場合にはそうではなく、抗体およびＩＬ−６ＲはＩＬ−６上の共通のエピトープを共有することを示唆する。結果を図４に示す。
【０５１６】
競合的なＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ  ＥＬＩＳＡ
抗ＩＬ−６抗体および二重ＩＬ−６／ＶＥＧＦ阻害剤はＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結合を遮断するかどうかを決定するためのＥＬＩＳＡを次に行った。
【０５１７】
Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡを１μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ  ＤｕｏＳｅｔ）１００μｌで、オーバーナイトでコーティングした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）中の２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で２時間ブロッキングした。ブロッキングの間に、６ｎＭのＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１ｎＭのＩＬ−６Ｒ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、および二重阻害剤または単一アーム対照の８点の３倍希釈系列（３０ｎＭで開始）を室温でインキュベートした。この混合物を次に洗浄ステップ後にＥＬＩＳＡプレートに添加した。１時間後、プレートを洗浄し、ビオチン化抗ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｄｕｏｓｅｔ）とインキュベートした。ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体をストレプトアビジン（Steptravidin）−ＨＲＰ（１：２０００希釈、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出し、ＴＭＢ試薬（ＫＰＬ）を使用して１０分間発色させた。４５０ｎＭでの
吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して抗体の濃度に対してプロットし、非線形回帰曲線を用いてフィッティングした。
【０５１８】
これらの条件下で、抗ＩＬ−６抗体および二重ＩＬ−６／ＶＥＧＦ阻害剤は、ＩＬ−６への結合についてＩＬ−６Ｒと効果的に競合し、したがってＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を阻害する。二重阻害剤分子のＩＣ５０値は同等であり（抗ＩＬ−６＝０．３６ｎＭ、ＶＥＧＦトラップ−抗ＩＬ−６＝０．４７ｎＭ、および抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦトラップ＝０．３２ｎＭ）、分子の構成はＩＬ−６の結合または阻害に影響を及ぼさないことを示唆する。アイリーアは陰性対照として用いられた。（図９）
【０５１９】
競合的なＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ  ＥＬＩＳＡ
ＶＥＧＦトラップの機能を評価するために、その受容体（ＶＥＧＦＲ）へのＶＥＧＦの結合を遮断する二重ＩＬ−６／ＶＥＧＦ阻害剤の能力を競合ＥＬＩＳＡにより試験した。
【０５２０】
Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡを１μｇ／ｍｌの組換えヒトＶＥＧＦＲ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）１００μｌで、オーバーナイトでコーティングした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）中の２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で２時間ブロッキングした。ブロッキングの間に、１００ｐＭのビオチン化ＶＥＧＦ（ｂｔＶＥＧＦ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を増加性濃度の抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦトラップ、ＶＥＧＦトラップ−抗ＩＬ−６、または二価抗ＶＥＧＦ抗体ＯＧ１９５０とインキュベートした。結合したｂｔ−ＶＥＧＦをストレプトアビジン−ＨＲＰ（１：２０００希釈、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出し、ＴＭＢ試薬（ＫＰＬ）を使用して１０分間発色させた。４５０ｎＭでの吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して抗体の濃度に対してプロットし、非線形回帰曲線を用いてフィッティングした。
【０５２１】
これらの条件下で、二重ＩＬ−６／ＶＥＧＦ阻害剤はＶＥＧＦに結合し、その受容体へのＶＥＧＦの結合を阻害する。ＶＥＧＦトラップが抗ＩＬ−６抗体のＮ末端に位置する場合、ＶＥＧＦ阻害は、ＶＥＧＦトラップが抗ＩＬ−６抗体のＦａｂドメインとＦｃドメインとの間に位置する分子より約２．５倍強力であり（ＩＣ５０はそれぞれ１．７４ｎＭ対４．５３ｎＭ）、これは２つの結合部位から１つの結合部位への価数の変化に起因する可能性がある。結果を図９に示す。
【０５２２】
実施例４
ＩＬ−６−ＶＥＧＦブリッジングＥＬＩＳＡ
二重阻害剤がＩＬ−６およびＶＥＧＦの両方に同時に結合できることを確実にするために、それらを、最初にプレート結合ＩＬ−６と相互作用させた後にビオチン化ＶＥＧＦ（ｂｔＶＥＧＦ）とインキュベートするブリッジングＥＬＩＳＡに供した。ストレプトアビジンＨＲＰによるｂｔＶＥＧＦの検出は、ＩＬ−６結合分子はｂｔＶＥＧＦにも結合できることを示唆する。
【０５２３】
Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡを１μｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−６（Ｔｏｎｂｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）１００μｌで、オーバーナイトでコーティングした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）中の２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で２時間ブロッキングした。ブロッキングの間に、１００ｐＭのｂｔＶＥＧＦ）を増加性濃度の抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦトラップ、ＶＥＧＦトラップ−抗ＩＬ−６、または陰性対照としての二価抗ＶＥＧＦ抗体ＯＧ１９５０とインキュベートした。結合したｂｔＶＥＧＦをストレプトアビジン−ＨＲＰ（１：２０００希釈、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出し、ＴＭＢ試薬（ＫＰＬ）を使用して１０分間発色させた。４５０ｎＭでの吸光度をＳｐｅｃ
ｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して抗体の濃度に対してプロットし、非線形回帰曲線を用いてフィッティングした。
【０５２４】
このアッセイは、二重ＩＬ−６／ＶＥＧＦ阻害剤はＩＬ−６およびｂｔＶＥＧＦに同時に結合することを裏付けた。抗ＩＬ−６およびＶＥＧＦトラップの配向は、わずかに変異性の結合を有し、これらの条件下において抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦトラップの配向がより好都合であった（ＥＣ５０はＶＥＧＦトラップ−抗ＩＬ−６＝０．０７９ｎＭおよび抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦトラップ＝０．０２６ｎＭ）。アイリーアおよび抗ＩＬ−６は陰性対照として用いられた。結果を図９に示す。
【０５２５】
実施例５
ＯＧ１８０２の経路１の合成
ＯＧ１８０２の合成のための第１の経路は以下の通りである。最初に、図２Ａに示される構造を有するＴＦＡ／アミン塩開始剤（化合物Ｌ）を以下のように合成した。
【０５２６】
最初に、図２Ｂに示される構造を有する化合物Ｋを以下のように合成した。窒素下の２００ｍＬの丸底フラスコに化合物Ｊ（ＯＧ１５６３）（１．９ｇ、２．６７ｍｍｏｌ、３．３当量）
【化４４】
2021514656.tif 000089
および化合物Ｅ（０．５２５ｇ、０．８１ｍｍｏｌ、１．０当量）（図２Ｌを参照）、続いてジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）、次にジイソプロピルエチルアミン（２．５ｍＬ、１４．６ｍｍｏｌ、１８当量）を入れた。氷浴を使用してフラスコを０℃に冷却した。これに約６分にわたりプロピルホスホン酸無水物溶液（酢酸エチル中５０重量％、２．５ｍＬ、４．０４ｍｍｏｌ、５当量）を添加した。
【０５２７】
反応液を室温に温め、１５分間撹拌した。水（２０ｍＬ）、飽和水性重炭酸ナトリウム（２０ｍＬ）および酢酸エチル（１００ｍＬ）を添加することにより反応を停止させた。酢酸エチル（７５ｍＬ）を用いて有機層を分離し、水性層を抽出した。合わせた有機層を飽和水性重炭酸ナトリウム（３０ｍＬ）、０．５Ｍの水性クエン酸（４０ｍＬ）、水（２５ｍＬ）、および飽和水性塩化ナトリウム（４０ｍＬ）を用いて洗浄し、次に乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濾過し、真空下で濃縮した。さらなる精製なしで使用した残留物は２．０ｇ（０．８０ｍｍｏｌ、９９％）の化合物Ｋを結果としてもたらした。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１．３６（ｓ、９Ｈ、ＯＣＣＨ
３）、１．９０（ｓ、５４Ｈ、ＣＣ（ＣＨ３）２Ｂｒ）、２．３１（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、６Ｈ、ＣＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）、２．９８（ｄ、Ｊ＝５．６Ｈｚ、６Ｈ、ＣＣＨ２ＮＨ）、３．０４（ｑ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）、３．１８（ｓ、２Ｈ、ＯＣＨ２Ｃ）、３．３−３．３７（ｍ、８Ｈ、ＣＨ２）、３．４７−３．５５（ｍ、１２Ｈ、ＣＨ２）、３．５８（ｓ、６Ｈ、ＯＣＨ２Ｃ）、３．８７（ｓ、６Ｈ、Ｏ＝ＣＣＨ２Ｏ）、４．２７（ｓ、１８Ｈ、ＣＣＨ２ＯＣ＝Ｏ）、６．７４（ｂｒ  ｔ、１Ｈ、ＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ）、７．６９（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ）、７．８４（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ、ｍ／ｚ）：（Ｃ８４Ｈ１３６Ｂｒ９Ｎ７Ｏ３３＋２Ｈ−Ｂｏｃ）／２の［（Ｍ＋２Ｈ−ｂｏｃ）／２］＋計算値＝１１９６．６、実測値１１９６．６。
【０５２８】
次に化合物Ｌ（図２Ａ）を以下のように合成した：窒素下の１００ｍＬの丸底に化合物Ｋ（２．０ｇ、０．８ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（１０ｍＬ）、続いてトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を添加した。反応液を室温で３０分間撹拌した。反応液を真空下で濃縮した。反応液を、ジクロロメタン（１０ｍＬ）を使用して希釈し、真空下で濃縮した。アセトニトリル（１０ｍＬ）を使用して残留物を溶解し、シリンジフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ  ＣＲ２５、ＰＮ  ４２２５Ｔ）を通じて濾過し、分取ＨＰＬＣカラムに流し、水中の６０％のアセトニトリル（０．１％のトリフルオロ酢酸を含む）から９８％のアセトニトリル（０．１％のトリフルオロ酢酸を含む）までを用いて溶出した。生成物を含有するチューブをプールし、真空下で濃縮し、凍結し、凍結乾燥器に入れた。これは白色粉末として９９０ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ、２ステップで５０％）の化合物Ｌを結果としてもたらした。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１．９０（ｓ、５４Ｈ、ＣＣ（ＣＨ３）２Ｂｒ）、２．３１（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、６Ｈ、ＣＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）、２．９７−３．０（ｍ、８Ｈ、ＣＣＨ２ＮＨおよびＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）、３．１７（ｓ、２Ｈ、ＯＣＨ２Ｃ）、３．３（ｑ、６Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ）、３．４−３．５９（ｍ、２０Ｈ、ＣＨ２）、３．８７（ｓ、６Ｈ、Ｏ＝ＣＣＨ２Ｏ）、４．２７（ｓ、１８Ｈ、ＣＣＨ２ＯＣ＝Ｏ）、７．６９−７．８４（ｍ、９Ｈ、ＣＨ２ＮＨＣ＝ＯおよびＮＨ３＋の両方）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ、ｍ／ｚ）：（Ｃ８４Ｈ１３６Ｂｒ９Ｎ７Ｏ３３＋２Ｈ）／２の［（Ｍ＋２Ｈ）／２］＋計算値＝１１９６．６、実測値１１９７．４。
【０５２９】
次に、化合物Ｌ（図２Ａ）を開始剤として使用してＭＰＣポリマーを合成した。開始剤は、典型的には、約１００ｍｇ／ｍＬのＤＭＦ中のストック溶液として調製される。開始剤およびリガンド（２，２’−ビピリジル）をシュレンクチューブに導入した。結果として生じた溶液をドライアイス／アセトン混合物を使用して−７８℃に冷却し、真空下で１０分間脱気した。チューブをアルゴンおよび触媒（他に示唆されなければＣｕＢｒ）下で再充填し、アルゴン下に保ち、シュレンク（Schlenck）チューブに導入した（開始剤の臭素原子／触媒（ＣｕＢｒ）／リガンドのモル比を１／１／２に保った）。溶液は直ちに暗茶色になった。シュレンクチューブを密封し、短いサイクルの真空／アルゴンを適用することにより直ちにパージした。窒素下に保ったグローブボックス中で調製した定義された量のモノマーを２００プルーフの脱気したエタノールと混合することによりＨＥＭＡ−ＰＣの溶液を調製した。モノマー溶液をシュレンクチューブに（カニューレを介して）滴下で添加（および軽い撹拌によりホモジナイズ）した。温度を−７８℃に維持した。溶液からの発泡が中止するまで徹底的な真空を反応混合物に少なくとも１０〜１５分間適用した。チューブを次にアルゴンで再充填し、室温に温めた。溶液を撹拌し、重合が進行するにつれて溶液は粘性となった。３〜８時間後にまたは単にオーバーナイトで放置し、Ｃｕ（Ｉ）をＣｕ（ＩＩ）に酸化させるための空気への直接的な曝露により反応を停止させたところ、混合物は青緑色となり、銅触媒を除去するためにそれをシリカカラムに通過させた。収集した溶液を回転蒸発により濃縮し、結果として得られた混合物を、テトラヒドロフ
ランを用いて沈殿させ、または水に対して透析し、続いてフリーズドライを行うことにより自由に流れる白色粉末を得た。以下の表５．０は、開始剤として化合物Ｌを用いたポリマーについてのポリマーデータを示す。
【表２６】
2021514656.tif 000090
【０５３０】
次に、マレイミドＭａｌ−ＰＥＧ４−ＰＦＰエステルを上記に言及した７５０ｋＤａのポリマーに（図２Ｃに示されるように）スナップオンしてＯＧ１８０２を得た。２０ｍＬのバイアルにポリマーＲ３７０７（開始剤としてＬを使用して作製した７５０ｋＤａのポリマー、５１５ｍｇ）を入れ、４０分間の撹拌後にエタノール（４．０ｍＬ）を使用して溶解させた。これにアセトニトリル（２２ｕＬ）中の４−メチルモルホリノの１％の溶液を添加した。別々のバイアル中にアセトニトリル（１．０ｍＬ）中のＭａｌ−ＰＥＧ４−ＰＦＰ（１．９７ｍｇ）を溶解し、この溶液を約２分にわたり室温でポリマー溶液に添加し、結果として得られた溶液をオーバーナイトで撹拌した。反応液を０．１％の水性トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）（ｐＨ約５）、続いて水（約１２ｍＬ）を用いて希釈し、シリンジフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ  Ｓｕｐｏｒ、ＰＮ  ４６１２）を通じて濾過し、３つのＡｍｉｃｏｎ遠心分離膜透析チューブ（３０，０００ｍｗｃｏ）に均等に入れた。チューブを、水（各約５ｍＬ）を用いて希釈および混合し、遠心分離器（ｒｐｍ  ３２００）に２５分間入れた。濾液を分析のために除去し、残余物（retentate）を、水（約１０ｍ
Ｌ／チューブ）を用いて希釈および混合する。遠心分離手順をさらに５回繰り返した後、残余物を除去してバイアルに入れる。Ａｍｉｃｏｎ膜チューブを水（各チューブにつき２×約２ｍＬ）でそそぎ、これを残余物と合わせた。残余物溶液をシリンジフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ  Ｓｕｐｏｒ、ＰＮ  ４６１２）を通じて濾過し、凍結し、凍結乾燥器に入れた。これは白色粉末として４８５ｍｇを結果としてもたらした。
【０５３１】
実施例６−開始剤ＯＧ１７８６の合成
ＯＧ１７８６は、ＯＧ１８０２の合成における前駆体として使用されるポリマー合成のための９アーム開始剤である。各アームは、ＡＴＲＰ下で重合を開始させることができる２−ブロモイソブチレートを末端に持つ。図２Ｄに示されるように、ＯＧ１７８６はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の塩である。ＯＧ１７８６は以下のように調製される。最初に、図２Ｅに示されるようにＯＧ１５５０をＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）と反応させてＯＧ１５４６を製造する。
【０５３２】
磁気撹拌棒および添加用漏斗を備えた１Ｌの丸底フラスコ中にＯＧ１５５０（１４．８ｇ）、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）（３５０ｍｌ）および水（３０ｍｌ）を添加した。混合物を撹拌してＯＧ１５５０を溶解し、次に氷浴中で冷却した。この混合物に水（９０ｍｌ）中のトリフルオロ酢酸（４．９ｍｌ）の溶液を滴下で９０分にわたり添加した。添加が完了した後に混合物をさらに１５分撹拌し、次に氷浴から除去し、室温に温めた。ｔｌｃが約５％の出発材料の残存を示し、水性液のｐＨが３〜４（ｐＨ紙）となるまで、（氷浴からの除去後に）混合物をさらに４〜５時間撹拌した。
【０５３３】
混合物を分配した。ＭＴＢＥ層を、水（３０ｍｌ）を用いて洗浄した。水性層を合わせ、次に水性液を、ＭＴＢＥ（１５０ｍｌ）を用いて抽出した。この第２のＭＴＢＥ相を、水（３０ｍｌ）を用いて洗浄した。合わせた水性層をＭＴＢＥの第３の部分（１００ｍｌ）を用いて洗浄した。第３のＭＢＴＥ相を、水（２５ｍｌ）を用いて洗浄した。水性層を再び合わせた（約２５０ｍｌ、ｐＨ紙によりｐＨ約４）。
【０５３４】
生成物を凍結乾燥により収集した。１１．５ｇの白色固体を得た。この材料は極めて吸湿性であるため、窒素下での取扱いが最良である。生成物をＬＣＭＳにより確認した。
【０５３５】
（図２Ｆに示されるように）調製されたＯＧ１５４６を次にＯＧ１５６３と反応させてＯＧ１７８４を得た。
【０５３６】
撹拌棒を備えた窒素下の２５０ｍｌのフラスコ中にＯＧ１５４６（吸湿性、９．０ｇ）、続いてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１１０ｍｌ）を添加した。全てのＯＧ１５４６が溶解するまで（約１５分）混合物を室温で撹拌し、次にＯＧ１５６３（２９．９ｇ）を添加し、ＯＧ１５６３もまた溶解するまで混合物をさらに３分攪拌した。結果として得られた溶液を氷浴中で冷却し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３７．６ｍｌ）を３分にわたり添加し、続いて酢酸エチル（３４．５ｍｌ）中の５０％のプロピルホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）を滴下で５分にわたり添加した（Ｔ３Ｐの添加は発熱性である）。Ｔ３Ｐの添加が完了した後、フラスコを冷却浴から除去し、室温に到達させた。試料を次にＬＣＭＳ分析のために５分間隔で採取した。反応液は非常に薄い黄色／黄褐色（tan color
）を示した。
【０５３７】
２０分後に反応液を再び氷浴中で冷却し、５ｍｌの水を添加した。混合物を次に冷却浴から除去し、さらなる５０ｍｌの水部分を添加し、続いて５０ｍｌの０．５Ｍのクエン酸、次にイソプロピルアセテート（３００ｍｌ）を添加した。混合物を分配した。水性相（約３００ｍｌ）を追加の酢酸イソプロピル（１５０ｍｌ）を用いて抽出した。水性相はＨＰＬＣ試験のためにＡＱ１であった。合わせた有機液を水性クエン酸（１１５ｍｌ、６５ｍＭ、１５ｍｌの０．５Ｍのクエン酸と１００ｍｌの水との混合物）を用いて洗浄し、水性相はＡＱ２（ｐＨ約３）であった。有機相を水／飽和塩化ナトリウム（１００ｍｌ／２５ｍｌ）を用いて洗浄し、水性相はＡＱ３（ｐＨ約３）であった。有機相を、最後に飽和塩化ナトリウム（１００ｍｌ）を用いて洗浄し、水性相はＡＱ４であった。ＡＱ画分のいずれもいかなる顕著な生成物を含有しなかった（データ提供せず）。有機相はＬＣＭＳを介して生成物が確認された。生成物を硫酸ナトリウム（８０ｇ）上で乾燥させ、濾過し、酢酸イソプロピル（７５ｍｌ）を用いてすすぎ、ロータリーエバポレーターで濃縮して黄褐色の油（３３．２ｇ）とした。粗生成物を窒素下で、オーバーナイトで貯蔵した。
【０５３８】
翌日、粗生成物を室温にさせ、次にアセトニトリル／水（４６ｍｌ／１２ｍｌ）に溶解し、ＨＰＬＣフィルターディスク（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ  ＰＴＦＥ  ０．２μｍ、製品番号０２９１５−２０）を使用して濾過した。濾液を３つの均等部分に分け、精製を３回行った。
【０５３９】
５０％のアセトニトリル／水を用いて平衡化したＲｅｄｉＳｅｐ  Ｒｆ  Ｇｏｌｄ  Ｃ１８カラム（２７５ｇ、ＳＮ  ６９−２２０３−３３９、ロット＃  ２４１２６−６１１Ｙ）に濾液を流した。以下の勾配（溶媒Ａ：水、溶媒Ｂ：アセトニトリル）を使用して１００ｍｌ／分で材料を溶出させた。全ての関連する画分をＨＰＬＣによりチェックした。充分に純粋であると判断された画分をプールし（全３回の実行から）、ロトバップ（rotovap）で濃縮し（浴温度を約２０℃に保った）、次にジクロロメタン（１００ｍｌ）と水
（５ｍｌ）／飽和塩化ナトリウム（２５ｍｌ）との間で分配した。水性液を、ジクロロメタン（２×３０ｍｌ）を用いてさらに２回抽出した。合わせた有機液を硫酸ナトリウム（３５ｇ）上で乾燥し、濾過し、ＤＣＭ（３０ｍｌ）を用いてすすぎ、濃縮した。生成物および純度をＬＣＭＳ法により確認した。Ｒ５１７２およびＲ５２２８ロットの単離された収率および純度を表６．０に示す。
【表２７】
2021514656.tif 000091
【０５４０】
次に、図２Ｇに示されるようにＯＧ１４０５をＯＧ１７８４から調製した。磁気撹拌棒を備えた５００ｍＬの丸底フラスコにＯＧ１７８４（２０．９ｇ）を添加し、続いてジクロロメタン（５０ｍｌ）、次にトリフルオロ酢酸（２０ｍｌ）を添加した。混合物を室温で撹拌したところ、ＨＰＬＣ分析は２３分で完全な脱保護を示した。混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、ジクロロメタン（２５ｍｌ）に再溶解して再濃縮し、次にアセトニトリル（２５ｍｌ）に再溶解して再濃縮した。生成物をＬＣＭＳにより確認した。上記からの材料（ＯＧ１４０５、３４．５ｇ、定量的収量として２１．０ｇを想定）を次のステップにおける粗油として使用した。精製は必要とされない。
【０５４１】
次に、図２Ｈに示されるようにＯＧ１４０５をＯＧ１４０２と反応させてＯＧ１７８５を調製した。撹拌棒を備えた窒素下の５００ｍｌのフラスコにＯＧ１４０２（５．５ｇ）を入れ、続いてアセトニトリル（７０ｍｌ）、次にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２６．３ｍｌ）およびＴ３Ｐ溶液（上記を参照）（７．９ｍｌ）を入れた。溶液を室温で３０分間撹拌し、次に氷水浴中で冷却し、アセトニトリル（７０ｍｌ）中のＯＧ１４０５（上記からの粗油、３４．５ｇ）の溶液を添加した。混合物を室温に温めた。２０分後に反応液を氷水浴中で冷却し、水（５ｍｌ）を用いてクエンチした。混合物を次にロータリーエバポレーターを使用して半分の体積まで真空下で濃縮した。試料をＬＣＭＳのために採取した。
【０５４２】
さらなる水（５０ｍｌ）、続いて０．５Ｍのクエン酸（７５ｍｌ）および酢酸イソプロピル（１７５ｍｌ）を添加した。混合物を５分以内に分配した。水性液を追加の酢酸イソプロピル（５０ｍＬ）を用いて抽出した。合わせた有機液を水性クエン酸（０．１３Ｍ、３０ｍｌ、１０ｍｌの０．５Ｍのクエン酸および２０ｍｌの水からなる）を用いて洗浄した。有機液を次に飽和塩化ナトリウム（２５ｍｌ）と水（２５ｍｌ）との混合物を用いて洗浄し、最後に飽和塩化ナトリウム（２５ｍｌ）を用いて洗浄した。それらを次に硫酸ナトリウム（１２４ｇ）上で乾燥させ、濾過し、酢酸イソプロピル（３０ｍｌ）を用いてすすぎ、ロータリーエバポレーター下で濃縮して黄褐色の油（２７．３ｇ）とした。試料をＬＣＭＳ分析のために採取した。
【０５４３】
油をアセトニトリル／水（３：１、１５ｍｌ／５ｍｌ）に溶解し、ＨＰＬＣフィルターディスク（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ  ＰＴＦＥ膜０．２μｍ、製品番号０２９１５−２０）を通じて濾過し、３つの均等な部分に分け、そのそれぞれを以下のように個々に精製した。
【０５４４】
５０％の溶媒Ｂ（アセトニトリル）／５０％の溶媒Ａ（水）において平衡化したＲｅｄｉ−Ｓｅｐ  Ｇｏｌｄ  Ｃ１８カラム（２７５ｇ、ＳＮ  ６９−２２０３−３３９、ロット２４１２３４−６１１Ｗ）に部分を流した。材料を次に溶媒Ａ：水／溶媒Ｂ：アセトニトリル勾配を用いて逆相ＨＰＬＣにより精製した。適切な画分をプールし、ジクロロメタン（１５０ｍｌ）と水（５ｍｌ）／飽和塩化ナトリウム（２５ｍｌ）との間で分配した。水性液を、ジクロロメタン（２×５０ｍｌ）を用いて２回抽出した。合わせた有機液を硫酸ナトリウム（６０ｇ）上で乾燥させ、濾過し、ジクロロメタン（４０ｍｌ）を用いてす
すぎ、濃縮した。構造および純度を、ＬＣＭＳを含む様々な分析法により確認した。ＯＧ１７８５を泡状固体（Ｒ５３２９、１９．０ｇ、８３％の収率、９５．１％の純度（ａ／ａ  ２１０ｎｍ）として単離し、窒素下４℃で貯蔵した。
【０５４５】
次に、図２Ｉに示されるように、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用してＯＧ１７８５上のｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル保護基を除去してＯＧ１７８６を製造した。
【０５４６】
実施例７−ポリマーＯＧ１８０１の合成
ポリマーＯＧ１８０１を最初に開始剤ＯＧ１７８６から製造する。ＯＧ１８０１は、ポリマー合成の間に（マレイミドよりも）より安定なアミン官能性を有する。ポリマーＯＧ１８０１を合成するために、Ｃｕ（ＩＩ）に金属銅を添加することにより銅種（Ｃｕ（Ｉ））がｉｎ  ｓｉｔｕで生成される改変型のＡＴＲＰを使用する。反応に必要とされる出発材料および試薬は、モノマー（ＨＥＭＡ−ＰＣ）ＯＧ４７のバッチインプットの他に、標的とする分子量（ＭＷ）に基づいて算出される。
【０５４７】
グローブボックス中に５０ｇのモノマーＯＧ４７を秤量し、２００ｍＬの脱気したＥｔＯＨを添加して室温でモノマーを溶解し、モノマー濃度試験のためにサンプリングした。５００ｍＬのフラスコ中にＣｕ（ＩＩ）、Ｂｐｙ、Ｃｕ（０）を秤量し、フラスコにモノマー溶液を添加しながらアルゴンを用いてパージし、ストッパーを用いてフラスコを密封し、泡がなくなるまで２５分間真空化した。反応液は色を薄緑色から暗緑色、次に薄茶色に徐々に変化させた。グローブボックス中に約２００ｍｇの開始剤ＯＧ１７８６を秤量し、室温下で約２０００ｕＬのＤＭＦに溶解して１００ｍｇ／ｍＬのストック溶液を作製し、開始剤濃度および純度試験のためにサンプリングし、アルゴン下でフラスコに開始剤溶液を添加した。反応溶液は暗茶色となり、経時的に濃化し始め、システムを密封して反応を２日にわたり起こさせた。
【０５４８】
ＯＧ１８０１を次にマレイミドの付加のために調製し、触媒（銅）を以下のように除去した：充填済みのＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標）Ｒｆ順相シリカカラムを使用して触媒を除去する。カラムのサイズは、反応混合物中の銅の量に基づいて選択する。例えば、３３０ｇのカラム（カタログ＃  ６９−２２０３−３３０、カラムサイズ３３０ｇ、ＣＶ＝４４３ｍＬ）をＯＧ１８０１の５０ｇのバッチのために使用した。ＥｔＯＨが溶出溶媒であるのでＴｅｆｌｏｎチュービングを全ての接続のために使用する。
【０５４９】
銅の除去後に、全ての画分をバッチ式で丸底フラスコに移し、低減圧力での４５〜５０℃においてロータリーエバポレーターによりＥｔＯＨを乾燥状態まで蒸発させた。このステップにおいて、凝縮から収集したＥｔＯＨ体積をモニターして、ＥｔＯＨ除去が＞９０％であることを確実にした。ポリマーを２５０ｍＬのＷＦＩに溶解し、０．２ｕｍのフィルターを使用して濾過した。それにより約１５０ｍｇ／ｍＬの明黄色〜薄黄色のポリマー溶液が結果として生じた。溶液を使用前に３か月まで２〜８℃で貯蔵することができる。
【０５５０】
実施例８−ポリマーＯＧ１８０２の合成
反応に必要とされる出発材料および試薬は、ＯＧ１８０１のバッチインプットに基づいて算出される。リンカーは、３−マレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステルである。３０ｍｌの０．５Ｍのリン酸ナトリウム（ＷＦＩ中、ｐＨ８）を５０ｇのポリマー溶液（約１５０ｍｇ／ｍＬ）に添加した。１分間撹拌し、ｐＨはｐＨ紙によれば８．０であった。２０４．８ｍｇのリンカーを秤量し、４．１ｍＬのＤＭＦに溶解して５０ｍｇ／ｍＬのストック溶液（stock sln）を作製した。激しい撹拌と共にリンカー溶液をポリマー溶液に８１
５ｕＬ／分で、滴下で添加した。４０９５ｕＬのリンカー溶液の添加に５分を要した。室温で３０分間反応させた。２０ｍＬの５％の酢酸を用いて反応を停止させて最終ｐＨ５を達成した。１Ｌの真空フィルター（０．２ｕｍ）を使用して溶液を濾過した。
【０５５１】
ＯＧ１８０２（図２Ｋに示される）を次に以下のように精製する：Ｍｉｌｉｐｏｒｅクロスフローカセットを水性系中のポリマー精製のために使用する。ポリマー溶液を２５０ｍＬ（約２００ｍｇ／ｍＬ）に濃縮することで開始した。リザーバーからの新鮮なＷＦＩを添加し、新鮮なＷＦＩフィードの流速を浸透物と同じに調整した（約２ｍＬ／分）。ＵＦ／ＤＦをオーバーナイトで２〜８℃に設定した。典型的には、２．５ＬのＷＦＩを使用した（ポリマー溶液に対して１０×の体積比）。残余物（retente）の試料を純度試験の
ために収集した。標的とした純度は＞９８％であった。０．２μＭの１Ｌフィルターボトルによりポリマー溶液を濾過した。ポリマー溶液は、共役前に３か月まで２〜８℃で貯蔵することができる。
【０５５２】
実施例９−代替的なホスホリルコリンポリマー
ＨＥＡ−ＰＣポリマーを以下に記載されるように合成した。上記のメタクリレートＨＥＭＡ−ＰＣとは対照的にアクリレートであるＨＥＡ−ＰＣ（２−（アクリロイルオキシ）エチル−２−（トリメチルアンモニウム）エチルホスフェート）は以下の構造を有する：
【化４５】
2021514656.tif 000092
【０５５３】
化合物Ｌとして実施例５に示される開始剤に対してＨＥＡ−ＰＣを重合させた。
【表２８】
2021514656.tif 000093
【０５５４】
１１μｌの乾燥ＤＭＦに２．２ｍｇの開始剤を溶解することにより２００ｍｇ／ｍＬの開始剤のストック溶液を調製し、２３μＬの乾燥ＤＭＦに４．６ｍｇのＭｅ６ＴＲＥＮを溶解することにより２００ｍｇ／ｍｌのリガンドの溶液を調製した。８．２５μｌの開始剤のストック溶液および１３．６μｌのリガンドをチューブに分配する。−７８℃で５分間脱気し、次にアルゴンで再充填し、１．２ｍｇのＣｕＢｒを添加する。脱気し、アルゴンで再充填する。メタノール中のＨＥＡ−ＰＣのストック溶液（０．４６１ｇのＨＥＡ−ＰＣを秤取し、それを０．５ｍＬのメタノールに溶解する）を−７８℃で反応器の内部の溶液に添加する。２００μｌのメタノールを用いてバイアルをすすぎ、−７８℃で反応器の内部にそれを添加し、次に０．５ｍＬの蒸留水、次にさらに２００μｌの水を添加する。発泡が見られず、かつ全ての不均質性が消失する（固体粒子状物質が溶解または消失する）まで完全に脱気する。４プサイのアルゴンで再充填し、ＲＴで１時間反応を進行させる。反応液は既に粘性であった。反応を約１時間進行させた。メタノール中のビピリジン（bipyrindine）（０．５ｕＬ中５ｍｇ）の溶液を添加した。さらに２〜３ｍｌのメタノ
ールを添加し、触媒により４℃オーバーナイトで酸化させた。１Ｈ  ＮＭＲにより決定した変換は９４％と推定された。
【０５５５】
翌日、ポリマーを透析し、１ｍｌ／分での１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でＳｈｏｄｅｘ
ＳＢ８０６Ｍ＿ＨＱカラム（７．８×３００ｍｍ）を使用するＳＥＣ／ＭＡＬＳ分析に供したところ、１．１５７のＰＤＩ、７２３．５ｋＤａのＭｎ、８２０．４ｋＤａのＭｐおよび８３７．２ｋＤａのＭｗを与えた（透析前にＰＤＩは１．１２、Ｍｎ＝６９５ｋＤａ、Ｍｐ＝７７８ｋＤａ）。次に、タンパク質に共役し得るようにポリマーにマレイミド官能性を付加した。
【０５５６】
次に、実施例２０に示されるように、マレイミドＭａｌ−ＰＥＧ４−ＰＦＰ（上記の実施例２０を参照）エステルをＨＥＡ−ＰＣポリマーにスナップオンした。ＨＥＭＡ−ＰＣポリマーについて本明細書において議論したように、結果として得られたマレイミド官能化ＨＥＡ−ＰＣポリマーを次にスルフヒドリル基に共役させることができる。
【０５５７】
以下の構造：
【化４６】
2021514656.tif 000094
を有するモノマー２−（アクリルアミル）エチル−２−（トリメチルアンモニウム）エチルホスフェート（Ａｍ−ＰＣ）を使用してアクリルアミドＰＣポリマーもまた製造した。
【０５５８】
Ａｍ−ＰＣを、構造：
【化４７】
2021514656.tif 000095
を有する３アーム開始剤（ＴＦＡ塩）を用いる重合のために使用した。
【０５５９】
Ａｍ−ＰＣポリマーの合成は以下のように実行した：
【表２９】
2021514656.tif 000096
【０５６０】
９ｍｇのＭｅ６ＴＲＥＮを４５ｕＬの乾燥ＤＭＦに溶解することにより２００ｍｇ／ｍＬのリガンドのストック溶液を調製した。１９．７ｕＬのストック溶液を反応容器に添加する。６．５ｍｇの材料を３２．５ｕＬのＤＭＦに溶解することにより２００ｍｇ／ｍＬの開始剤のストック溶液を調製する。１１ｕＬの開始剤ストック溶液を上記からのリガンドに添加する。５分間脱気する。１ｍｇのＣｕＢｒを添加する。４ｍｇのＣｕＢｒ２を２０μＬのＤＭＦに溶解することにより２００ｍｇ／ｍＬのＣｕＢｒ２のストック溶液を調製した。０．５ｇのモノマー（ＡｍＰＣ）を１ｍＬのメタノール（溶解を緩慢化させる／粘性溶液）に添加し、続いて１ｕＬのＣｕＢｒ２のストック溶液を添加する。モノマー溶液を滴下で上記の反応混合物に添加する。１ｍＬの水を用いてすすぐ。反応混合物を完全に脱気する（凍結−解凍）。反応を２４時間進行させる。
【０５６１】
その後、Ａｍ−ＰＣポリマーを透析してもよい。上記のポリマーの分子量をＳＥＣ／ＭＡＬＳにより決定した：Ｍｎは２１５ｋＤａ、Ｍｐ：２５０ｋＤａ、ＰＤＩは１．１７である。変換は、１Ｈ  ＮＭＲにより９４％であると推定された。ＨＥＭＡ−ＰＣおよびＨＥＡ−ＰＣについて上記で議論したようにマレイミド官能性をＡｍ−ＰＣポリマーに付加することができる。マレイミド官能化Ａｍ−ＰＣポリマーを上記のようにタンパク質に共役させることができる。
【０５６２】
実施例１０−化合物中の遊離マレイミドを算出するための逆エルマンアッセイ
ポリマーＯＧ１８０１にマレイミド官能性を付加してＯＧ１８０２を形成させた後（上記を参照）、エルマンアッセイを使用して試料中のパーセント関数として表現される機能的なマレイミド（すなわち、共役可能）の量を決定した。チオールは、中性およびアルカリ性ｐＨの水中でエルマン試薬（ＤＴＮＢ）をＴＮＢ−、次にＴＮＢ２−に変換し、それにより黄色が放出される（４１２ｎｍでの測定）。標準曲線を、システインを用いて確立した。マレイミドはチオールと反応するので、このアッセイは実際には残ったチオール（システイン）を測定した。（元のチオール−マレイミドポリマー添加後に残ったチオール）／（元のチオール）のモル濃度比として阻害を算出し、パーセンテージとして表現している。パーセントが高ければ高いほど、マレイミド官能化はより高い。
【０５６３】
アッセイにおいて用いた試薬：６２．５μＭ〜２μＭのシステインを使用して標準曲線を作製した。粉末をｐＨ７．４の１×ＰＢＳ（反応緩衝液）に溶解し、徹底的に混合することによりポリマーストック溶液を調製した。等モルのポリマーおよびシステイン溶液を混合し、２７℃で３０分間反応させた。１５０μＭのＤＴＮＢ溶液をシステイン標準およびポリマー／システイン反応液に添加し、２７℃で５分間発色させた。４１２ｎｍでのＯＤをＳｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダーで読み取り、阻害パーセントをＳｏｆｔｍａ
ｘ  Ｐｒｏソフトウェアおよびシステイン標準曲線を用いて算出した。
【０５６４】
実施例１１−抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦトラップ分子の精製およびキャップ除去
重鎖および軽鎖を発現プラスミドにクローニングし、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトしてもよい。細胞を適切な培地中で生育し、回収することができる。抗体（または代替的にはＡｂ−トラップ）をプロテインＡアフィニティーカラム捕捉および溶出を使用して精製してもよい。抗体（または代替的にはＡｂ−トラップ）の位置４４３のシステイン（Ｌ４４３Ｃ（ＥＵナンバリング））残基は、典型的には、細胞培養培地中で「キャップ付加」または化学物質により酸化されており、共役のために利用可能でない。これに関して、精製された抗体（または代替的にはＡｂ−トラップ）をキャップ除去（すなわち、還元）手順に供してキャップを除去し、遊離（すなわち、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合に関与しない）システイン残基がポリマーのマレイミド官能性に共役することを可能としてもよい。キャップ除去は、精製された抗体（または代替的にはＡｂ−トラップ）タンパク質を周囲温度で１時間、３０×モル過剰の還元剤、例えば、ＴＣＥＰ（３，３’，３’’−ホスファントリイルトリプロピオン酸）、３，３’，３’’−ホスフィントリイルトリス（ベンゼン−１−スルホン酸）三ナトリウム（ＴＰＰＴＳ）、または類似のものと混合することにより行われてもよい。還元反応はＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターされてもよい。還元後、抗体（または代替的にはＡｂ−トラップ）タンパク質は、キャップを除去するためにＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅを使用して２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＴＣＥＰ緩衝液を用いて緩衝液交換されてもよい。ＴＣＥＰ試薬は次に、２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌを用いる同じ緩衝液交換セットアップにおいて除去されてもよい。還元された抗体（または代替的にはＡｂ−トラップ）は次に、周囲温度で１時間１５×モル過剰の酸化剤ＤＨＡＡ（デヒドロキシアスコルビン酸）を使用して再酸化されてもよく、それは再びＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイによりモニターされる。ＤＨＡＡ試薬は次に、２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌを用いる同じ緩衝液交換セットアップにおいて除去されてもよい。
【０５６５】
実施例１２Ａ−ＭＰＣポリマーへの抗体（または代替的にはＡｂ−トラップ）の共役
キャップ除去された抗体（または代替的にはＡｂ−トラップ）をポリマーＯＧ１８０２に共役してバイオコンジュゲートを得てもよい。過剰のＯＧ１８０２が使用される（３〜２０倍モル過剰）。共役は、陽イオン交換体ＨＰＬＣクロマトグラフィーによりモニターし、完了近くまで推進することができる。抗体（または代替的にはＡｂ−トラップ）コンジュゲートは、陽イオン交換体クロマトグラフィーを介して精製され、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）により製剤緩衝液に緩衝液交換されてもよい。抗体（または代替的にはＡｂ−トラップ）コンジュゲートは、上記のようにクロマトグラフィーで精製されてもよい。
【０５６６】
実施例１２Ｂ−−ＯＧ１８０２とのＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６共役反応
ＯＧ１８０２とのＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６共役プロセスは、システインＳ保護基を除去するための初期還元反応（キャップ除去）、これに続いてマレイミド−システイン化学を介するバイオポリマーＯＧ１８０２への共役という、２つのステップを伴う。キャップ除去は、最初に３０×モル過剰の３，３’，３’’−ホスファントリイルトリプロピオン酸（ＴＣＥＰ）を用いてＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６を（３０〜６０分）還元し、続いて２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌに緩衝液交換してシステインキャップおよびＴＣＥＰを除去することにより行った（図２８）。代替として、３’，３’’−ホスファントリイルトリス（ベンゼンスルホン酸）三ナトリウム塩（3',3''-Phosphanetriyltris(benzenesulfonic acid) trisodium salt；ＴＰＰＴＳ）などの他の還元剤もまた、キャップ除去ステップのために使用することができる。
【０５６７】
次に、還元されたＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６を１５×モル過剰のデヒドロ−アスコルビン酸（ｄＨＡＡ）を用いて酸化し（３０〜６０分）、続いて２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌに緩衝液交換して酸化試薬を除去した（図２８）。キャップ除去手順の累積的収率は８９％であった（ＴＣＥＰ還元−９４％、ｄＨＡＡ酸化−９５％）。
【０５６８】
共役プロセスは、２．４ｍｇ／ｍＬ（または１２．５μＭ）の最終濃度のＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６を５×モル過剰のバイオポリマーＯＧ１８０２とｐＨ８．０で混合することにより行った。共役プロセスは２〜８℃で２〜３日の期間にわたり行った。ｐＨ５．５の２０ｍＭの酢酸ナトリウムを含有する緩衝液中の増加性塩濃度（０〜５００ｍＭのＮａＣｌ）のステップ勾配を使用してＰｏｒｏｓ  ＸＳ樹脂を用いる陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）により、共役したＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６を非共役材料から精製した（図２９）。バイオコンジュゲートＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２を含有する画分をプールし、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液に緩衝液交換した。共役効率は約６０％であった（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩｍａｇｅＪ解析により決定）。初期タンパク質材料からバイオコンジュゲートへの累積的収率は約２７％であった。
【０５６９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３０）およびＳＥＣ−ＭＡＬＳ（図３１）分析は、１つのＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６分子（約１８９ｋＤａ）が１つのＯＧ１８０２ポリマー分子（約７９４ｋＤａ）と共役して約９８３ｋＤａのバイオコンジュゲートを結果としてもたらしたことを実証する。光散乱（ｍｉｎｉＤＡＷＮ  ＴＲＥＯＳ）および屈折率（Ｏｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＸ）検出器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と繋いだ、ＰＢＳ緩衝液を用いて予備平衡化したサイズ排除クロマトグラフィーカラム（Ｓｈｏｄｅｘ−ＳＢ８０６Ｍ−ＨＱ）に流速１ｍＬ／分で１０μｇ（タンパク質質量）を注入することによりＳＥＣ−ＭＡＬＳ実験を実行した。データおよびタンパク質コンジュゲート分析はＡＳＴＲＡ  ７（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で行った。
【０５７０】
実施例１３−ＶＥＧＦトラップの切断同定および除去
図１１Ａおよび図１１Ｂに示されるように、ＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ細胞に由来するプロテインＡ精製ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６および抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦＲ還元生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、構築物の配向に依存するサイズを有する予想外のバンドを示した。これらのバンドは、ある比率の二重阻害剤分子は生成の間に切断を起こすことを示唆する。この実施例において、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６は、配列４Ａを含有する軽鎖と対形成した配列１Ａ−２Ａ−３Ｈを含む重鎖分子に対応する。抗ＩＬ−６  ＶＥＧＦＲは、配列４Ａを含有する軽鎖と対形成した配列５Ｈ（Ｆａｂ）−２Ａ−１Ａ−５Ｈ（Ｆｃ）を含む重鎖に対応する。
【０５７１】
図１２に示されるように、これらのタンパク質バンドをＰＶＤＦ膜に転写し、タンパク質バンドの最初の６残基をエドマンＮ末端シークエンシング（Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９４ＨＴ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を通じてシークエンシングした。結果は、切断生成物は同じＮ末端配列（９３ＬＴＨＲＱＴ）を共有し、それはＶＥＧＦトラップ領域におけるＶＥＧＦＲ１ドメイン２内に位置することを示した。
【０５７２】
図１３Ａおよび図１３Ｂは、タンパク質の全体的な安定性およびＶＥＧＦ結合特性を維持しながらタンパク質切断を妨害する切断部位（Ｋ８９ＴＮＹ／ＬＴＨＲ９６）に隣接する領域における変異の結果を示す。それらの変異は配列保存に基づいて選択し、この目的のためにＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）を使用してＶＥＧＦＲ１ドメイン２配列と哺乳綱内のタンパク質ホモログとの間の配列類似度検索およびアライメントを行った。５００の最良ヒットをそのＢＬＡＳＴ  Ｅ値スコアに基づいて選択した。５００の配列を含有するこの初期クラスター（クラスター＿１）から、各個々の種についての最良スコア配列を選択して、１０６の代表配列のセ
ット（クラスター＿２）まで減少させた。クラスター＿２において観察された切断部位隣接領域内の配列変異に基づいて、１６の抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦＲ単一点変異体を生成し、タンパク質切断に関して評価した。抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦＲ構築物は切断生成物とインタクトな生成物との間で分子量の差異（約３５ｋＤａ）に起因してより良好なサイズ分離を示すので、これらの変異は最初に抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦＲ構築物にのみ導入した。
【０５７３】
図１３Ａおよび図１３Ｂは、抗ＩＬ−６  ＶＥＧＦＲ変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、切断部位における改変は切断生成物（矢印により示す）の量を低減する傾向があったことを実証する。変異Ｔ９４ＩおよびＨ９５Ｉ（ＶＥＧＦトラップ配列における位置に基づく残基ナンバリング）は、ＶＥＧＦトラップの切断を顕著に低減した。特に、図１３Ａおよび図１３Ｂは、変異のほとんどはタンパク質切断を低減し、図１３Ｃに示される変異Ｔ９４Ｉ（ＶＥＧＦＲ＿バリアント＿１）、および図１３Ｄに示されるＨ９５Ｉ（ＶＥＧＦＲ＿バリアント＿２）はより顕著な効果を有したことを示す。図１３Ｅに示されるように、単一点変異（Ｔ９４Ｉ、Ｈ９５Ｉ）および二重点変異（Ｔ９４Ｉ／Ｈ９５Ｉ、ＶＥＧＦＲ＿バリアント＿３）をその後にＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６構築物に導入した。図１３ＣはＴ９４Ｉの位置（下線）を示唆する。図１３ＤはＨ９５Ｉの位置（下線）を示唆する。図１３ＥはＴ９４ＩおよびＨ９５Ｉの位置（下線）を示唆する。図１３Ｆおよび図１３Ｇに示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、タンパク質切断における類似の低減が観察され、この効果は二重変異が導入された場合にさらに増進されることを示した。
【０５７４】
実施例１４−Ｂｉａｃｏｒｅを介するＶＥＧＦへの二重阻害剤ＶＥＧＦＲバリアントの結合
図１４Ａ〜１４Ｆは、抗ＶＥＧＦ剤とＶＥＧＦとの親和性を決定するために使用した一連のＢｉａｃｏｒｅアッセイの結果を示す。分子間の結合速度論は、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有する緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ＋中３７℃でＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して測定した。抗ＶＥＧＦ剤（ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６（５μｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦＲ＿バリアント＿１−抗ＩＬ−６（５μｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦＲ＿バリアント＿２−抗ＩＬ−６（５μｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦＲ＿バリアント＿３−抗ＩＬ−６（５μｇ／ｍＬ）およびアイリーア（３μｇ／ｍＬ））をプロテインＡチップ（ＧＥ）に１０μＬ／分で２５秒間捕捉させ、５つの濃度のＶＥＧＦ−Ａ１６５（０．１９、０．５６、１．６７、５、１５ｎＭ）を３０μＬ／分で１２０秒間捕捉させた抗体に流し、６０分間解離させた。センサーチップ表面を５０μｌ／分の流速でのｐＨ１．７の１０ｍＭのグリシンの６０秒間の注入により再生させた。全てのセンサーグラムを二重参照サブトラクションし、１：１ラングミュア結合モデルを使用してフィッティングした。図１４Ａ〜１４Ｆは、単一点変異Ｔ９４Ｉ（ＶＥＧＦＲ＿バリアント＿１−抗ＩＬ−６）、Ｈ９５Ｉ（ＶＥＧＦＲ＿バリアント＿２−抗ＩＬ−６）および二重変異体Ｔ９４Ｉ／Ｈ９５Ｉ（ＶＥＧＦＲ＿バリアント＿３−抗ＩＬ−６）の導入はＶＥＧＦへの結合に最小に影響することを示す。図１４Ｆに見ることができるように、センサーグラム（sensograms）は、二重阻害剤分子ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６およびバリアントはアイリーアのように緊密にＶＥＧＦ−Ａに結合することを実証する。この実施例において、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６分子は、配列４Ａを含有する軽鎖と対形成したＧＳリンカー（配列２Ａ−３Ｈ）を介して抗ＩＬ−６部分に融合したＶＥＧＦＲバリアント（配列１Ａ−１Ｄ）に対応する。
【０５７５】
実施例１５−細胞ベースのＶＥＧＦ刺激性ＶＥＧＦＲレポーターアッセイ
細胞ベースのＶＥＧＦ刺激性ＶＥＧＦＲレポーターアッセイの結果を図１５に提供する。上述したような二重阻害剤ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６は、アイリーアと同じ程度までＶＥＧＦＲへのＶＥＧＦの結合および刺激性の下流のシグナル伝達を遮断するが（ＩＣ５０  ０．１８ｎＭ対０．１１ｎＭ）、抗ＩＬ−６抗体はいかなる効果も有しなかった。
【０５７６】
実験のために、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＫＤＲ／ＶＥＧＦ  ＨＥＫ２９３  ｔｈａｗ−ａｎｄ
−ｕｓｅ  ｃｅｌｌｓ（ＣＳ１８１４０５；Ｐｒｏｍｅｇａ）を解凍し、４．６ｍＬのアッセイ培地（ＤＭＥＭ中の１０％のＦＢＳ）に添加した。２５μＬの細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに移した。ＶＥＧＦ（５００ｐＭの最終濃度）を１００ｎＭ（最終濃度）で開始する、阻害剤の１０点の１：３希釈系列と混合し、３０分間インキュベートした後に、プレーティングされた細胞に５０μＬを添加した。６時間後、７５μＬの調製されたＢｉｏ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を細胞に添加し、室温で３〜１０分間インキュベートした。発光をｉＤ３プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。相対発光単位を各曲線について最低阻害剤濃度に対して正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して抗体の濃度のｌｏｇに対して標準誤差と共に複製物（replicates）の平均としてプロットし、非線形回帰曲線を用いてフィッティングした。この実施例において、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６は、配列４Ａを含有する軽鎖と対形成した配列１Ａ−２Ａ−３Ｈを含む重鎖分子に対応する。
【０５７７】
実施例１６−ＨＵＶＥＣ細管形成アッセイ
図１６Ａ〜１６Ｃは、ＨＵＶＥＣ細管構築アッセイ（HUVEC tubule formulation assay）の結果を示す。
【０５７８】
１×ウシ脳抽出物内皮細胞増殖キット（Bovine Brain Extract endothelial cell growth kit）を添加した血管基礎培地（Vascular Basal Media）（ＡＴＣＣ、増殖培地）中、５％のＣＯ２中３７℃で継代２または３のＨＵＶＥＣ細胞を培養した。細胞が７０％コンフルエントに達したら、トリプシン（０．０５％、ＡＴＣＣ）を使用して細胞をプレートから取り、０．７５×１０＾６の細胞をＴ２５フラスコ中の増殖培地にプレーティングした。培地を翌日にアッセイ培地（血管基礎培地中に２％ＦＢＳ）に取り換えた。６時間後、５μｇ／ｍｌのＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭを培地に直接的に添加し、３７℃で３０分間インキュベートした（incubatet）。同時に、２００μＬの事前解凍したマトリゲル（ｇｒｏ
ｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｄｕｃｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）を８ウェルガラスチャンバースライドの各ウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションの間に、２５ｎＭの各阻害剤（最終濃度）を３ｎＭのＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ）、１２．５ｎＭのＩＬ６（Ｔｏｎｂｏ）、および２５ｎＭのＩＬ６Ｒ（Ｔｏｎｂｏ）と混合した（全て最終濃度）。３０分のＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭのインキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次にトリプシン処理した。回収した細胞を１，５００ｘｇで３分間遠心分離し、５００，０００細胞／ｍＬの密度でアッセイ培地に再懸濁した。１００μＬの細胞を次に１００μＬの調製された阻害剤／複合体溶液と混合し、次にマトリゲルコーティングチャンバースライドに移し、オーバーナイトでインキュベートした。翌日、ＥＶＯＳ蛍光顕微鏡（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で１０×対物レンズおよびＧＦＰフィルターを使用して細管をイメージングした。少なくとも２つの代表的な画像を各条件について撮影し、次に、２０の細管ネットワーク形成パラメーターを評価および定量化するＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｐｌｕｇｉｎ  ｆｏｒ  ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して解析した。
【０５７９】
図１６Ａ〜１６Ｃは、４つの独立した実験からの標準誤差と共に平均としてデータを示す。統計的有意性は、対応のない両側スチューデントｔ検定を使用して４つの独立した実験からの全ての複製物から決定した。図１６Ｃに示されるように、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６は、対照と比較して１７／２０のパラメーターにおいて血管新生パラメーターを有意に阻害した。対照的に、アイリーアは４／２０のパラメーターにおいて阻害し、抗ＩＬ−６は７／２０のパラメーターにおいて阻害した。ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６は、図１６Ｂにおいてアスタリスクにより示唆されるように、１２／２０のパラメーターにおいてアイリーアおよび抗ＩＬ−６より有意に良好であった。さらには、ｔ検定統計を図１６Ｃに提供する。この実施例において、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６は、配列４Ａを含有する軽鎖と対形成した配列１Ａ−２Ａ−３Ｈを含む重鎖分子に対応する。
【０５８０】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６構築物は、特定のリスク集団において有効性および耐久性を向上させるための相乗的な機序を可能とする。リスク集団としては、糖尿病網膜症または１つもしくはそれ以上の炎症性網膜疾患のリスクがあるまたはそれを有すると診断された集団が挙げられる。
【０５８１】
実施例１７−ＨＵＶＥＣ増殖アッセイ
図１７は、ＨＵＶＥＣ増殖アッセイの結果を示す。１×ウシ脳抽出物内皮細胞増殖キットを添加した血管基礎培地（ＡＴＣＣ、増殖培地）中、５％のＣＯ２中３７度でＨＵＶＥＣ細胞（継代２〜５）を培養した。細胞が７０％コンフルエントに達したら、トリプシン（０．０５％、ＡＴＣＣ）を使用して細胞をプレートから取り、９６ウェルゼラチンコーティングプレートの中央の６０ウェル中の１００ｕＬのアッセイ培地（ｌ−グルタミン、アスコルビン酸、ヘパラン硫酸、ヒドロコルチゾン、および１％のＦＢＳを添加した血管基礎培地）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に３，５００細胞／ウェルを播種した。２４時間の飢餓の後、１００ｎＭで開始した阻害剤の１０点の１：３希釈系列と混合したＶＥＧＦ（１．５ｎＭ）、ＩＬ−６（５ｎＭ）、およびＩＬ６Ｒ（１０ｎＭ）を用いて細胞を刺激した。これらの濃度のＶＥＧＦおよびＩＬ−６は、互いから独立して添加された場合に準最大レベルで増殖を誘導するが、組み合わせた場合に相乗的な増殖曲線を実証した。４８時間後に、ｉＤ３プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で製造者の指示にしたがってＣｅｌｌＴｉｔｅｒＢｌｕｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞生存能力を測定した。吸光度測定のためにＡ５７０／Ａ６０５の比を決定し、各複製物についてデータを対照（阻害剤なし）細胞に対して正規化した。各複製物について蛍光測定値（５５５ｅｘ／６０５ｅｍ）を対照細胞に対して正規化した。
【０５８２】
図１７に示されるように、正規化した値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して抗体の濃度に対して標準誤差と共に複製物の平均としてプロットし、非線形回帰曲線を用いてフィッティングした。
【０５８３】
図１７に見ることができるように、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６二重阻害剤は、ＩＬ−６およびＶＥＧＦによるＨＵＶＥＣ増殖の相乗的な刺激を遮断したが、アイリーアおよび抗Ｉｌ−６抗ＩＬ−６（anti-Il-6Anti-IL-6）のいずれもこれらの条件下でＨＵＶＥＣ増殖に影響しなかった。
【０５８４】
実施例１８−向上した抗ＩＬ−６パラトープの生成
向上した抗ＩＬ−６パラトープの生成を本実施例に記載する。Ｂｉａｃｏｒｅ速度論の結果を表１８．１、表１８．２、表１８．３、および表１８．４に示す。
【０５８５】
操作されたヒトＩｇＧ１フレームワーク上に優れた抗ＩＬ−６パラトープを提供するために、Ｇ６６Ｄ（ＣＤＲ２）重鎖変異体を親和性成熟させた。最初に、これらのアミノ酸と関連付けられる化学的ライアビリティーに起因してＣｙｓ、ＭｅｔおよびＡｓｎへの置換を除いて、位置Ｓ３５、Ｉ５１、Ｔ６３およびＴ６５におけるランダム単一点変異を含有するＧ６６Ｄ全体重鎖ライブラリーを構築した。それらの４つの位置は、細菌および哺乳動物スクリーニングにおいて観察されたような変異に対する寛容性に基づいて選択した。重鎖変異を含有する哺乳動物発現ベクターを軽鎖野生型およびバリアントＭ３２Ｌ／Ｍ５０Ｄ／Ｎ５２Ｓ／Ｍ８８Ｑと共にＥｘｐｉ２９３細胞の３ｍＬ培養物に共トランスフェクトし、５日間インキュベートした。これらの培養物を遠心分離し、分泌された抗体を含有する上清を回収し、ＨＢＳ−ＥＰ＋ランニングバッファーに希釈した（１：２０の比）。
【０５８６】
様々な構築物および結果として得られた速度論的特性を以下の表１８．１〜１８．４に
提供する。
【表３０】
2021514656.tif 000097
【表３１】
2021514656.tif 000098
【表３２】
2021514656.tif 000099
【表３３】
2021514656.tif 000100
【０５８７】
ＩＬ−６に対するこれらの変異体分子の結合速度論をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００を使用して３７℃で測定した。１：２０の細胞上清希釈液を１０μＬ／分で６０秒間注入することにより抗体をプロテインＡチップ（ＧＥ）に捕捉させた。５つの濃度（０．５６、１．６７、５、１５および４５ｎＭ）のＩＬ−６を捕捉された抗体上に３０μＬ／分の流速で６０秒間流し、単一サイクル速度論のＢｉａｃｏｒｅアッセイフォーマットにおいて１８０秒間解離させた。５０μＬ／分の流速でのｐＨ１．７の１０ｍＭのグリシンの６０秒の注入によりセンサーチップを再生させた。適用可能な場合、類似のアッセイセットアップを使用して、３７℃での精製された抗体試料とＩＬ−６との相互作用をモニターした。このセットアップのために、１μｇ／ｍＬの精製された抗体を１０μＬ／分で２５秒間プロテインＡチップ上に注入した。５つの濃度（０．５６、１．６７、５、１５および４５ｎＭ）のＩＬ−６を捕捉された抗体上に３０μＬ／分の流速で６０秒間流し、単一サイクル速度論のＢｉａｃｏｒｅアッセイフォーマットにおいて１８００秒間解離させた。５０μＬ／分の流速でのｐＨ１．７の１０ｍＭのグリシンの６０秒の注入によりセンサーチップを再生させた。上清および精製された試料のデータ解析はＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ）を使用して行った。全てのセンサーグラムを二重参照サブトラクションし、１：１ラングミュア結合モデルを使用してフィッティングした。
【０５８８】
表１８．１および表１８．２により示されるように、Ｓ３５Ｈ  Ｇ６６Ｄ二重変異体重鎖は、野生型重鎖と比べて捕捉レベルの約２倍の増加により示唆されるように、タンパク質発現の増強を示した。この変異体はまた、対形成した軽鎖に依存して親和性の小さい増加を示した（野生型：約２倍、Ｍ３２Ｌ／Ｍ５０Ｄ／Ｎ５２Ｓ／Ｍ８８Ｑ：約１．３倍）。表１８．１は、抗ＩＬ−６重鎖二重変異体のＬＣ野生型Ｂｉａｃｏｒｅ速度論のＧ６６Ｄ最適化を示す。共に３７℃の精製前（ｓｕｐ）および精製後の試料についてデータを得た。表１８．２は、変異誘発された軽鎖と対形成した抗ＩＬ−６重鎖二重変異体のＬＣ変異体Ｂｉａｃｏｒｅ速度論のＧ６６Ｄ最適化を示す。共に３７℃の精製前（ｓｕｐ）および精製後の試料についてデータを得た。
【０５８９】
したがって、この二重変異体を別のラウンドのための出発点として選択し、別のラウンドでは、ＣＤＲ３における置換許容位置Ｑ９９およびＬ１００をランダムに変異誘発し、発現させ、Ｇ６６Ｄスクリーニングラウンドについて記載したようにＩＬ−６結合について評価した。表１８．３および表１８．４に示されるように、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、ＬｙｓへのＬ１００置換は、捕捉レベルにより示唆されるように野生型
と比較した場合に優れた発現を示した。したがってこれらの変異体を精製およびＩＬ−６結合評価のために選択した。精製された材料を用いる親和性測定もまた、表１８．３および表１８．４に示されるように、優れたＩＬ−６結合を示した。これらの結果に基づいて、図１８に示されるように、これらの追加の改変されたＣＤＲを抗ＩＬ−６および抗ＶＥＧＦ二重阻害剤分子の設計に組み込んだ。
【０５９０】
表１８．３は、抗ＩＬ−６重鎖三重変異体についてＬＣ野生型と対形成したＧ６６Ｄ／Ｓ３５Ｈ重鎖改変のＢｉａｃｏｒｅ速度論を示す。共に３７℃の精製前（ｓｕｐ）および精製後の試料についてデータを得た。表１８．４は、変異誘発された軽鎖と対形成した抗ＩＬ−６重鎖三重変異体についてＬＣ変異体と対形成したＧ６６Ｄ／Ｓ３５Ｈ重鎖改変のＢｉａｃｏｒｅ速度論を示す。共に３７℃の精製前（ｓｕｐ）および精製後の試料についてデータを得た。
【０５９１】
実施例１９−抗ＩＬ−６抗ＶＥＧＦ二重阻害剤バリアント
ＶＥＧＦトラップバリアントおよび優れた抗ＩＬ−６パラトープを用いた結果に基づいて、図１９、図２０、図２１、図２２および図２３に示されるような配列の組合せを含む２つの異なる構成の２１６分子を設計した。第１の構成（ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ−６）について、図１９の配列１Ａ〜１Ｄにより示されるようなＶＥＧＦトラップが、タンパク質の最初に配置され、続いて図２０の配列２Ａにより示されるようなＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー（ＧＳ）の二重反復があり、これは、図２１の配列３Ａ〜３Ｉにより示されるような抗ＩＬ−６重鎖のＮ末端にトラップを接続する。これらの構築物を、図２２の配列４Ａ〜４Ｃとして列記される軽鎖と対形成させることができる。第２の構成（抗ＩＬ−６−ＶＥＧＦＲ）では、図２３の重鎖−Ｆａｂ、配列５Ａ〜５Ｉにより示される重鎖の可変および定常ドメインが、図２０の配列２Ａにより示されるＧＳリンカーを介して、図１９の配列１Ａ〜１Ｄにより示されるＶＥＧＦトラップに接続され、次に、図２３の重鎖−Ｆｃ、配列５Ａ〜５Ｉにより示されるＦｃドメインがＶＥＧＦトラップのＣ末端に融合している。そのため、ＶＥＧＦトラップは、抗体Ｆａｂ領域とＦｃ領域との間に挟まれている。
【０５９２】
図１９はＶＥＧＦトラップ配列を示す。配列の変異に下線を引き、太字で強調している。図２０は二重反復Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー（ＧＳ）配列を示す。図２１は抗ＩＬ−６分子の重鎖配列を示す。ＣＤＲに下線を引いている。図２２は抗ＩＬ−６分子の軽鎖配列を示す。ＣＤＲに下線を引いている。図２３は抗ＩＬ−６分子の重鎖（ＦａｂおよびＦｃに分離される）配列を示す。ＣＤＲに下線を引いている。
【０５９３】
一部の実施形態では、抗体Ｆａｂ領域とＦｃ領域との間に挟まれている、ＶＥＧＦトラップの任意のオプションは、図２２の配列４Ａ〜４Ｃに列記される軽鎖と対形成させることができる。そのため、一部の実施形態では、図１９（ＶＥＧＦＲ配列）に概略される構築物は、本明細書において提供される任意のＶＥＧＦトラップアレンジメントのために、またはそれ単独で使用することができる。
【０５９４】
実施例２０−ＶＥＧＦＲ−トラップＦｃ融合物とＶＥＧＦとの結合速度論
抗ＩＬ−６抗ＩＬ−６  図２６Ａ〜２６Ｃは、抗ＶＥＧＦ剤とＶＥＧＦとの親和性を決定するために使用したＢｉａｃｏｒｅアッセイの結果を示す。結合速度論は、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有する緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ＋中３７℃でＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００を使用して測定した。ＶＥＧＦＲ−Ｆｃ（１μｇ／ｍＬ）およびアイリーア（１μｇ／ｍＬ）をプロテインＡチップ（ＧＥ）に１０μＬ／分で２５秒間捕捉させ、５つの濃度のＶＥＧＦ−Ａ１６５（０．１９、０．５６、１．６７、５、１５ｎＭ）を３０μＬ／分で１２０秒間捕捉させた抗ＶＥＧＦ分子に流し、３０分間解離させた。センサーチップ表面を５０μｌ／分の流速でのｐＨ１．７の１０ｍＭのグリシンの６０秒間の注入により再生させた。
全てのセンサーグラムを二重参照サブトラクションし、１：１ラングミュア結合モデルを使用してフィッティングした。図２６Ａ〜２６Ｃに示されるように、ＶＥＧＦＲ−Ｆｃおよびアイリーアは類似の親和性でＶＥＧＦに結合する。この実施例において、ＶＥＧＦＲ−Ｆｃは配列６Ａを含有する。
【０５９５】
実施例２１−−切断生成物の除去
実施例１３において議論したように、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６は、ＶＥＧＦトラップ領域のＶＥＧＦＲ１ドメイン２において微小な程度の切断を示す。我々は、プロテインＡ精製ステップ後にインタクトなタンパク質を切断された材料から分離するための２つの直交クロマトグラフィー法、すなわち、ｉ）陽イオン交換（ＣＥＸ）およびｉｉ）疎水性相互作用（ＨＩＣ）を開発した。
【０５９６】
ＣＥＸ法のために、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６プロテインＡ溶出ｐＨ溶液を６に調整し、それを次に、ｐＨ６の２０ｍＭのリン酸ナトリウムを用いて予備平衡化したＰｏｒｏｕｓ  ＸＳカラムに注入した。インタクトなタンパク質は、切断された材料より低いイオン強度で溶出し、増加性イオン強度（０〜１Ｍの塩化ナトリウム）の直線勾配内でほぼ完全に分離される（図３２）。インタクトなタンパク質が濃縮された画分をプールしたところ、全体的な回収効率は約５７％であった。
【０５９７】
ＨＩＣ法のために、切断された材料と共に濃縮されたＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６のインタクトなタンパク質の混合物を、ｐＨ６の２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭ〜１Ｍの硫酸アンモニウムを用いて予備平衡化されたＢｕｔｙｌ  ＨＰカラムに注入した。インタクトなタンパク質および切断されたタンパク質は、減少性イオン強度（１〜０Ｍの硫酸アンモニウム）の直線勾配内で分離され、インタクトなタンパク質は、切断された材料より低いイオン強度で溶出し、プールされた画分に依存して部分的または完全に分離することができた（図３３）。
【０５９８】
実施例２２−−ＫｉｎＥｘＡにより測定されたＩＬ６およびＶＥＧＦ−Ａに対するＶＥＧＦＲ抗ＩＬ６の親和性
Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＫｉｎＥｘＡ（登録商標））３２００  ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｏｉｓｅ、ＩＤ）を使用して、溶液中でのＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６またはＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２（そのタンパク質成分は図２７に示される）とＶＥＧＦまたはＩＬ６との平衡結合親和性および速度論を測定した。ＶＥＧＦまたはＩＬ６でコーティングしたアズラクトンビーズを使用して、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６またはＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２およびＶＥＧＦまたはＩＬ６の平衡化試料からの遊離ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６またはＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２の画分を捕捉した。捕捉された二重阻害剤分子を、蛍光標識ポリクローナル抗ヒト抗体（Ａｌｅｘａ  ６４７ヤギ抗ヒトＩｇＧ）を用いて検出した。
【０５９９】
以下のように列記される増加性二重阻害剤濃度およびその対応するＶＥＧＦ滴定段階希釈（括弧内に示唆する）において二重阻害剤分子とＶＥＧＦとの親和性を２〜３の滴定曲線から決定した：Ｉ）ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６：１ｎＭ（２０ｎＭ、２倍希釈、１２の希釈）３．５時間のインキュベーション；５０ｐＭ（５００ｐＭ、２倍希釈、１４の希釈）２．５時間のインキュベーション；１０ｐＭ（１ｎＭ、２倍希釈、１３の希釈）２３時間のインキュベーション；ＩＩ）ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２：２ｎＭ（３０ｎＭ、２倍希釈、１２の希釈）４５分のインキュベーション；１００ｐＭ（１５ｎＭ、２倍希釈、１４の希釈）６時間のインキュベーション；７．５ｐＭ（１ｎＭ、２倍希釈、１４の希釈）４８時間のインキュベーション。類似の測定を以下の条件下でＩＬ６を用いて行った：ＩＩＩ）ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６：１ｎＭ（２０ｎＭ、２倍希釈、１３の希釈液）７時間
のインキュベーション；１０ｐＭ（１ｎＭ、２倍希釈、１３の希釈）４２時間のインキュベーション；１００ｐＭ（１ｎＭ、２倍希釈、１３の希釈）２．５時間のインキュベーション；ＩＶ）ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２：１ｎＭ（２２．５ｎＭ、２倍希釈、１３の希釈）５．５時間のインキュベーション；１００ｐＭ（２２．５ｎＭ、２倍希釈、１４の希釈）１２時間のインキュベーション。
【０６００】
二重阻害剤分子とＶＥＧＦまたはＩＬ６とのオンレート（ｋｏｎ、Ｍ−１ｓ−１）を速度論的測定実験（各分析されるペアにつき１〜２の曲線）から直接的に決定し、オフレート（ｋｏｆｆ、ｓ−１）を以下の式：ｋｏｆｆ＝Ｋｄ×ｋｏｎに基づいて算出した。ｉ）１００ｐＭのＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６および８６．４ｐＭのＶＥＧＦ、ｉｉ）２１７ｐＭのＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２および２００ｐＭのＶＥＧＦ、ｉｉｉ）１００ｐＭのＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６および８４．３ｐＭのＩＬ６、ｉｖ）１０００ｐＭのＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６および９００ｐＭのＩＬ６を含有する４つの調製物に対して測定を実行した。
【０６０１】
全ての測定は、１×ＰＢＳランニングバッファー（ｐＨ７．４）および１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含む１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に調製した試料を使用して３７℃で行った。データ解析は、ＫｉｎＥｘＡ  Ｐｒｏソフトウェア４．３．１１を使用して行った。
【０６０２】
試験した条件下で、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２はＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６と同等の方式でＶＥＧＦおよびＩＬ６に結合し、Ｋｄ値はＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６およびＶＥＧＦに対して２．１０ｐＭ、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２およびＶＥＧＦに対して１．０２ｐＭ、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６およびＩＬ６に対して２１．１０ｐＭ、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２およびＩＬ６に対して１２．１０ｐＭである（表２２．１および表２２．２を参照）。
【表３４】
2021514656.tif 000101
【表３５】
2021514656.tif 000102
【０６０３】
ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６およびＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２の測定された親和性は、ＩＬ６およびＶＥＧＦの両方について誤差内にあったため、これらの結果は、バイオポリマーはその標的への二重阻害剤の結合に影響しないことを実証する。
【０６０４】
実施例２３−−ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ競合ＥＬＩＳＡ
このアッセイは、実施例３に記載したように行った。このアッセイにおいて、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２（図２７に示される）、およびアイリーアはいずれも、異なる程度でＶＥＧＦＲへのＶＥＧＦの結合を阻害した（図３４）。ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２は、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６（ＩＣ５０＝１．９８ｎ
Ｍ）およびアイリーア（ＩＣ５０＝１．３８ｎＭ）と比較した場合に優れた阻害（ＩＣ５０＝０．９９ｎＭ）を示した。追加的に、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６は、アイリーアよりも優れた最大阻害を示し、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２はよりいっそう著しい最大阻害を有した（ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２＝７９．５％、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６＝６７．０％、これに対してアイリーア＝４９．６％）。これらのデータは、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６へのバイオポリマーＯＧ１８０２の付加は、ＶＥＧＦＲへのＶＥＧＦの結合についての追加の阻害能力を生じさせることを示唆する。バイオポリマーは、したがって、分子の機能を追加する。
【０６０５】
実施例２４−−ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ競合ＥＬＩＳＡ
このアッセイは、実施例３に記載したように行った。
【０６０６】
これらの条件下で、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２はＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６と同等の方式でＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を効果的に遮断し、ＩＣ５０値は、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６について０．２６ｎＭ、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２について０．２３ｎＭであった（図３５）。これらの結果は、バイオポリマーはその受容体へのＩＬ６の結合に対する二重阻害剤の阻害効果を変化させないことを示唆する。アイリーアは陰性対照として用いられた。
【０６０７】
実施例２５−−細胞ベースのＶＥＧＦ刺激性ＶＥＧＦＲレポーターアッセイ：
このアッセイは、実施例１５に記載したように行った。
【０６０８】
試験した条件下で、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２はＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６およびアイリーアと同等の方式でＶＥＧＦ刺激性のＶＥＧＦＲレポーター細胞を阻害し、平均ＩＣ５０値は、それぞれ、０．３５±０．１０ｎＭ、０．５１±０．０７ｎＭ、および０．３５±０．０３ｎＭであった（図３６）。ＶＥＧＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２（図２７に示されるようなタンパク質成分）およびアイリーアはＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６よりもやや有効な傾向の可能性があるが、これは有意な発見ではなく、アッセイの誤差内に入る。バイオコンジュゲートはそのタンパク質前駆体と同様にＶＥＧＦＲ２シグナル伝達を阻害することをこれらのデータから結論付けることができる。
【０６０９】
実施例２６−−ＨＵＶＥＣにおけるリポ多糖刺激性細管形成：
１×ウシ脳抽出物内皮細胞増殖キットを添加した血管基礎培地（ＡＴＣＣ、増殖培地）中、５％のＣＯ２中３７度で継代２のＨＵＶＥＣ細胞を培養した。細胞が７０％コンフルエントに達したら、トリプシン（０．０５％、ＡＴＣＣ）を使用して細胞をプレートから取り、Ｔ２５フラスコ中の増殖培地に０．７５×１０＾６個の細胞をプレーティングした。
【０６１０】
翌日、培地をアッセイ培地（血管基礎培地中に２％ＦＢＳ）に取り換えた。６時間後、５μｇ／ｍｌのＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭを培地に直接的に添加し、３７度で３０分間インキュベートした。
【０６１１】
同時に、２００μｌの事前解凍したマトリゲル（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｄｕｃｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）を８ウェルガラスチャンバースライドの各ウェルに添加し、３７度で３０分間インキュベートした。
【０６１２】
インキュベーションの間に、阻害剤（３７．５ｎＭの最終濃度）をリポ多糖（ＬＰＳ、Ｓｉｇｍａ、１ｕｇ／ｍｌの最終濃度）と混合した。
【０６１３】
３０分のＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭのインキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、
次にトリプシン処理した。回収した細胞を１，５００ｘｇで３分間遠心分離し、５００，０００細胞／ｍｌの密度でアッセイ培地に再懸濁した。１５０μＬの細胞を次に１００μＬの調製された阻害剤／複合体溶液と混合し、次にマトリゲルコーティングチャンバースライドに移し、オーバーナイトでインキュベートした。
【０６１４】
翌日、ＥＶＯＳ蛍光顕微鏡（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で１０×対物レンズおよびＧＦＰフィルターを使用して細管をイメージングした。少なくとも２つの代表的な画像を各条件について撮影し、次に、２０の細管ネットワーク形成パラメーターを評価および定量化するＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｐｌｕｇｉｎ  ｆｏｒ  ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して解析した。
【０６１５】
統計的有意性は、対応のない両側スチューデントｔ検定を使用して独立した実験からの全ての複製物から決定した。
【０６１６】
これらの条件下で、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６は、対照に対して１５／２０の測定した血管新生パラメーターにおいて統計的に有意な阻害を示したが、アイリーアは、対象処理細胞と比べて５／２０を有意に阻害し、抗ＩＬ６は３／２０を阻害した。合わせると、アイリーアまたは抗ＩＬ６により傾向が見られたまたは有意に影響されたパラメーターのうち１つを除く全ては、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６により有意に阻害された。追加的に、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６がアイリーア（７／２０）および抗ＩＬ６（１０／２０）に対して有意により良好な阻害を示したいくつかのパラメーターがあり、そのうちの３つではＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６はアイリーアおよび抗ＩＬ６の両方より有意に良好であった（図３７および図３８および図１１）。
【０６１７】
ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２はＨＵＶＥＣ細管形成を効果的に阻害し、興味深いことに、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２は、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６に対して９／２０のパラメーターにおいて増加した阻害の傾向を示した（図３９）。これは、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２はその非共役対応物よりも利益を加えたことを含意する。
【０６１８】
実施例２７−−ＨＵＶＥＣ増殖アッセイ：
このアッセイは、実施例１７に記載したように行った。
【０６１９】
試験した条件下で、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２（図２７に示されるようなタンパク質成分）は、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６と同等の方式でＶＥＧＦ／ＩＬ６刺激性のＨＵＶＥＣ増殖を阻害したが、アイリーアは効果を有しなかった（図４０Ａ）。
【０６２０】
興味深いことに、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２は、実験の開始時にウェル当たりに異なる密度の細胞を播種した場合にＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６と比べて増加した有効性を示した。図４０Ｂに示されるように、２，０００細胞／ウェルにおいて、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６およびＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２はＨＵＶＥＣ増殖のほぼ同一の阻害を示した。４，０００細胞／ウェルにおいて、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２はＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６よりわずかに良好な最大阻害を示し（それぞれ４０％対３０％）、６，０００細胞／ウェルにおいて、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６−ＯＧ１８０２は対照と比べて２５％だけ増殖を阻害したが、ＶＥＧＦＲ−抗ＩＬ６は効果を有しなかった。
【０６２１】
上記の実施例に示されるように、理論により限定されることは意図しないが、バイオポリマーはプレートの表面および細胞へのそのタンパク質対応物の送達を助けるようである。これは、薬物により、細胞シグナル伝達を活性化させる可能性が最も高いＶＥＧＦおよびＩＬ６のプールを主に阻害することならびに細胞シグナル伝達に影響する可能性がより低い流体相中により高く浮遊したＶＥＧＦおよびＩＬ６が飽和することを回避することを
可能とする。細胞数が増加するにつれて、より多くの細胞に作用するためにより多くの薬物が必要とされるのでこの効果はより顕著になる。そのため、一部の実施形態では、コンジュゲートは、分子の分布を補助できるという点で優れた生成物を提供する。
【０６２２】
上記または下記において参照される全ての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、およびアクセッション番号などは、各個々の項目は参照することにより組み込まれることが具体的および個々に示唆された場合と同じ程度まで参照することにより全ての目的のために全体が組み込まれる。配列の異なるバージョンが異なる時点においてアクセッション番号と関連付けられる場合、本出願の有効出願日におけるアクセッション番号と関連付けられるバージョンが意味される。有効出願日は、実際の出願日または適用可能な場合にアクセッション番号に言及する優先権出願の出願日のうちの最先のものを意味する。同様に、刊行物またはウェブサイトなどの異なるバージョンが異なる時点において刊行されている場合、他に示唆されなければ、本出願の有効出願日において最も近く刊行されたバージョンが意味される。本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様は、特に他に示唆されなければ、任意の他のものと組み合わせて使用され得る。本発明を明確性および理解の目的のために実例および実施例によりある程度の詳細において記載したが、ある特定の変更および改変が添付の請求項の範囲内で実施されてもよいことは明らかである。
【図１】
2021514656.tif 000105
【図２Ａ】
2021514656.tif 000106
【図２Ｂ】
2021514656.tif 000107
【図２Ｃ】
2021514656.tif 000108
【図２Ｄ】
2021514656.tif 000109
【図２Ｅ】
2021514656.tif 000110
【図２Ｆ】
2021514656.tif 000111
【図２Ｇ】
2021514656.tif 000112
【図２Ｈ】
2021514656.tif 000113
【図２Ｉ】
2021514656.tif 000114
【図２Ｊ】
2021514656.tif 000115
【図２Ｋ】
2021514656.tif 000116
【図２Ｌ】
2021514656.tif 000117
【図３】
2021514656.tif 000118
【図４】
2021514656.tif 000119
【図５】
2021514656.tif 000120
【図６】
2021514656.tif 000121
【図７】
2021514656.tif 000122
【図８】
2021514656.tif 000123
【図９】
2021514656.tif 000124
【図１０】
2021514656.tif 000125
【図１１Ａ】
2021514656.tif 000126
【図１１Ｂ】
2021514656.tif 000127
【図１１Ｃ】
2021514656.tif 000128
【図１２−１】
2021514656.tif 000129
【図１２−２】
2021514656.tif 000130
【図１２−３】
2021514656.tif 000131
【図１３Ａ】
2021514656.tif 000132
【図１３Ｂ】
2021514656.tif 000133
【図１３Ｃ−Ｅ】
2021514656.tif 000134
【図１３Ｆ】
2021514656.tif 000135
【図１３Ｇ】
2021514656.tif 000136
【図１４Ａ−Ｂ】
2021514656.tif 000137
【図１４Ｃ−Ｄ】
2021514656.tif 000138
【図１４Ｅ−Ｆ】
2021514656.tif 000139
【図１５】
2021514656.tif 000140
【図１６Ａ】
2021514656.tif 000141
【図１６Ｂ】
2021514656.tif 000142
【図１６Ｃ】
2021514656.tif 000143
【図１７】
2021514656.tif 000144
【図１８】
2021514656.tif 000145
【図１９】
2021514656.tif 000146
【図２０】
2021514656.tif 000147
【図２１Ａ】
2021514656.tif 000148
【図２１Ｂ−１】
2021514656.tif 000149
【図２１Ｂ−２】
2021514656.tif 000150
【図２２Ａ】
2021514656.tif 000151
【図２２Ｂ】
2021514656.tif 000152
【図２３Ａ】
2021514656.tif 000153
【図２３Ｂ−１】
2021514656.tif 000154
【図２３Ｂ−２】
2021514656.tif 000155
【図２４Ａ−Ｂ】
2021514656.tif 000156
【図２５】
2021514656.tif 000157
【図２６Ａ−Ｃ】
2021514656.tif 000158
【図２７】
2021514656.tif 000159
【図２８】
2021514656.tif 000160
【図２９】
2021514656.tif 000161
【図３０】
2021514656.tif 000162
【図３１】
2021514656.tif 000163
【図３２】
2021514656.tif 000164
【図３３】
2021514656.tif 000165
【図３４】
2021514656.tif 000166
【図３５】
2021514656.tif 000167
【図３６】
2021514656.tif 000168
【図３７】
2021514656.tif 000169
【図３８】
2021514656.tif 000170
【図３９】
2021514656.tif 000171
【図４０Ａ】
2021514656.tif 000172
【図４０Ｂ】
2021514656.tif 000173
【配列表】
2021514656000001.app
【国際調査報告】
2021514656.tif 000174
2021514656.tif 000175
2021514656.tif 000176