(57)【要約】本明細書に記載の方法および組成物は、腫瘍内または腫瘍周囲を特異的にターゲティングしかつ/または腫瘍内または腫瘍周囲に保持されるサイトカインを用いた治療のための組成物および方法を提供し、全身性曝露を限定的にして副作用を少なくすることにより、当技術分野における必要性に対処する。したがって、本開示の諸局面は、細胞外マトリックス（ECM）親和性ペプチドに機能的に連結させた免疫療法用抗体を含む組成物に関する。ECM親和性ペプチドは細胞外マトリックスタンパク質に対する親和性を有するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン結合ドメインを含む細胞外マトリックス（ECM）親和性ペプチドに機能的に連結させたサイトカインポリペプチドを含む、ポリペプチドであって、該ECM親和性ペプチドがフィブロネクチンに特異的に結合しない、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ECM親和性ペプチドが、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）またはデコリンの100〜350個のアミノ酸のコラーゲン結合ドメインを含む、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項３】
vWFペプチドがvWF A1またはA3ペプチドである、請求項2記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドがSEQ ID NO:3;SEQ ID NO:11;SEQ ID NO:13;SEQ ID NO:15またはSEQ ID NO:34と少なくとも85％同一である、請求項2記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドがSEQ ID NO:34を含む、請求項2記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記vWFペプチドが、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:34と少なくとも85％同一であるペプチドまたはその断片を含む、請求項2記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記vWFペプチドがSEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:11またはSEQ ID NO:34を含む、請求項6記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記vWFペプチドが本質的にSEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:11またはSEQ ID NO:34からなる、請求項6記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドがデコリンペプチドを含む、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドがSEQ ID NO:15の10〜200個の連続アミノ酸を含む、請求項9記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドがSEQ ID NO:15と少なくとも85％同一である、請求項9または10記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ペプチドが前記サイトカインに共有結合されている、請求項1〜11のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記ペプチドが前記サイトカインに二官能性クロスリンカーによって架橋されている、請求項1〜12のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記サイトカインが、IL-2、IL-15、IL-15スーパーアゴニスト、IL-21、IL-12 p35、IL-12 p40、CCL4、CCL21、CXCL9、CXCL10、VEGF-C、IFNα2、IFNβ、XCL-1またはその活性断片から選択される、請求項1〜13のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記サイトカインがSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45またはSEQ ID NO:46と少なくとも85％同一である、請求項1〜14のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記サイトカインがIL-2である、請求項13または15記載のポリペプチド。
【請求項１７】
サイトカインに対するペプチドの比が約1:1〜10:1である、請求項1〜16のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１８】
組成物が、vWFペプチドに機能的に連結させたIL-2サイトカインを含む、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項１９】
請求項1〜18のいずれか一項記載のポリペプチドをコードしている異種コード領域を含む、核酸ベクター。
【請求項２０】
薬学的製剤中に含められた請求項1〜18のいずれか一項記載のポリペプチドを含む、組成物。
【請求項２１】
少なくとも1種類の抗がん化合物をさらに含む、請求項20記載の組成物。
【請求項２２】
請求項1〜18のいずれか一項記載の組成物を対象に投与することを含む、対象のがんを処置するための方法。
【請求項２３】
前記組成物が血管内投与されるか、全身投与されるか、または腫瘍内、腫瘍周囲、動脈内もしくは経カテーテル注射によって投与される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
血管内が静脈内である、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
前記ペプチドに機能的に連結させた前記サイトカインの投与用量が、前記ペプチドなしで投与される前記サイトカインの最小有効用量より少ない、請求項22または23または24記載の方法。
【請求項２６】
前記ペプチドに機能的に連結させた前記サイトカインの投与用量が、前記ペプチドなしで投与される前記サイトカインの最小有効用量より少なくとも10％少ない、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
患者が、がん免疫療法で以前に処置されたことがある、請求項22〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
抗がん治療薬を投与することをさらに含む、請求項22〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
前記対象に前記以前のがん治療でグレード2、3または4の副作用が起こった、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
前記対象が、がんと診断されたことがある、請求項22〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
前記がんが黒色腫、結腸がん、肺がん、前立腺がん、卵巣がん、精巣がん、脳のがん、膠芽細胞腫、小児腫瘍、胚細胞腫瘍、直腸がん、胃がん、食道がん、気管のがん、頭頸部がん、膵がん、肝臓がん、乳がん、子宮頸がんおよび外陰がんを含む、請求項22〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
前記がんが黒色腫または結腸がんである、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
前記がんが非血液系である、請求項22〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
前記がんが固形腫瘍を含む、請求項22〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
さらなるがん治療の実施をさらに含む、請求項22〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
前記さらなるがん治療が放射線、ワクチン接種、化学療法、養子T細胞療法、サイトカイン療法、抗CD47抗体、抗GD2抗体または免疫アジュバントを含む、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
請求項1〜18のいずれか一項記載のポリペプチドが、抗がん治療薬の投与の前、該投与の後、該投与中、該投与の前と該投与中、該投与の前と後、または該投与中と該投与の後に投与される、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
前記さらなるがん治療がMUC-1インヒビター、CD40アクチベータ、IDOインヒビターおよびOX86アゴニストのうちの1種類または複数種を含む、請求項35または36記載の方法。
【請求項３９】
前記さらなるがん治療がインドキシモド、GDC-0919、1-メチル-D-トリプトファン、ノルハルマン塩酸塩、ノルハルマン、CAY10581、INCB024360および2-ベンジル-2-チオプソイド尿素塩酸塩のうちの1種類または複数種を含む、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
細胞外マトリックス（ECM）親和性ペプチドに機能的に連結させたサイトカインを含む第2のポリペプチドの投与をさらに含む、請求項22〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
第1のポリペプチドと第2のポリペプチドが一緒に投与される、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
前記第1のポリペプチドと前記第2のポリペプチドが合剤にされている、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
請求項1〜18のいずれか一項記載のポリペプチドを作製する方法であって、宿主細胞内で該ポリペプチドを発現させること、および該宿主細胞により発現された該ポリペプチドを単離することを含む、方法。
【請求項４４】
前記宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリペプチドを単離することがアフィニティカラム精製および/またはサイズ排除カラム精製を含む、請求項43記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2018年3月5日に出願された米国特許仮出願第62/638,520号および2018年9月5日に出願された米国特許仮出願第62/727,156号の優先権の恩典を主張する。前述の特許仮出願はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
I.発明の分野
本発明は概して薬の分野に関する。より詳しくは、本発明は、血管透過性と関連している領域、例えば腫瘍をターゲティングするための、ヌクレオチド構築物およびタンパク質、例えば改変操作型サイトカインを伴う、組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
II.背景
免疫系は、多種多様ながんの病因に極めて重要な役割を果たしている。がんが進行するときは、免疫系が充分に応答できていないか、または適切に応答できていないかのいずれかであり、がん細胞の増殖が可能となっていると広く考えられている。現在、がんに対する標準的な医療処置、例えば化学療法、手術、放射線療法および細胞治療は、有効性および毒性の両方に関して明らかに限界がある。これまで、これらのアプローチで達成される奏効の度合は、がんの型、患者の一般健康状態、診断時の疾患の病期などに応じてさまざまである。標準的な医療処置とがんに対する免疫応答の特異的操作とを組み合わせて併用する改善されたストラテジーにより、がん治療の有効性の向上および毒性の低減のための手段が提供され得よう。
【０００４】
数多くのサイトカインが、腫瘍に対する免疫応答の調節に一定の役割を果たしていることが示されている。しかしながら、サイトカインを全身投与すると、多くの場合、毒性があるため、がん治療のためのサイトカインの直接投与は実用的ではないであろう（例えば、Asher et al.,J.Immunol.146:3227-3234,1991（非特許文献1）;Havell et al.,J.Exp.Med.167:1067-1085,1988（非特許文献2）参照）。より有効で低毒性のがんサイトカイン療法を提供するためのさらなる組成物および方法の必要性が依然として存在している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Asher et al.,J.Immunol.146:3227-3234,1991
【非特許文献２】Havell et al.,J.Exp.Med.167:1067-1085,1988
【発明の概要】
【０００６】
本明細書に記載の方法および組成物は、コラーゲンを特異的にターゲティングするおよび/またはコラーゲンによって保持されるサイトカインを備えていることによって、血管漏出または血管透過性を有する領域内に治療薬をターゲティングするためまたは局在させるための、必要とされている組成物および方法を提供し、これは、全身曝露を限定的にし、該サイトカインと関連している副作用を低減する。一部の特定の態様は、腫瘍の血管透過性に起因して、該腫瘍に局在するがん治療薬の投与に関する。したがって、本開示の諸局面は、細胞外マトリックス（ECM）親和性ペプチド、例えばコラーゲン結合ドメイン（CBD）に機能的に連結させたサイトカインを含む、組成物に関する。ECM親和性ペプチドは、細胞外マトリックスタンパク質、例えばコラーゲンに親和性を有し、細胞外マトリックスタンパク質、例えばコラーゲンに結合するものである。
【０００７】
一態様において、該ECM親和性ペプチドは、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）またはデコリンに由来するペプチドを含む。一態様において、該ECM親和性ペプチドは、vWF A3ドメイン（SEQ ID NO:3）;vWF A1ドメイン（SEQ ID NO:11）;vWF（SEQ ID NO:13）;デコリン（SEQ ID NO:15）またはvWF A3ドメイン（SEQ ID NO:34）の少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも31、少なくとも32、少なくとも33、少なくとも34、少なくとも35、少なくとも36、少なくとも37、少なくとも38、少なくとも39、少なくとも40、少なくとも41、少なくとも42、少なくとも43、少なくとも44、少なくとも45、少なくとも46、少なくとも47、少なくとも48、少なくとも49、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも160、少なくとも170、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも210、少なくとも220、少なくとも230、少なくとも240、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1500、少なくとも2000〜2800個、その間のあらゆる値および範囲を含む個数連続するアミノ酸、vWF A3ドメイン（SEQ ID NO:3）;vWF A1ドメイン（SEQ ID NO:11）;vWF（SEQ ID NO:13）;デコリン（SEQ ID NO:15）またはvWF A3ドメイン（SEQ ID NO:34）の最大5、最大6、最大7、最大8、最大9、最大10、最大11、最大12、最大13、最大14、最大15、最大16、最大17、最大18、最大19、最大20、最大21、最大22、最大23、最大24、最大25、最大26、最大27、最大28、最大29、最大30、最大31、最大32、最大33、最大34、最大35、最大36、最大37、最大38、最大39、最大40、最大41、最大42、最大43、最大44、最大45、最大46、最大47、最大48、最大49、最大50、最大60、最大70、最大80、最大90、最大100、最大110、最大120、最大130、最大140、最大150、最大160、最大170、最大180、最大190、最大200、最大210、最大220、最大230、最大240、最大250、最大300、最大400、最大500、最大600、最大700、最大800、最大900、最大1000、最大1500、最大2000〜2800個、その間のあらゆる値および範囲を含む個数連続するアミノ酸、あるいはvWF A3ドメイン（SEQ ID NO:3）;vWF A1ドメイン（SEQ ID NO:11）;vWF（SEQ ID NO:13）;デコリン（SEQ ID NO:15）またはvWF A3ドメイン（SEQ ID NO:34）の約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45、約46、約47、約48、約49、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200、約210、約220、約230、約240、約250、約300、約400、約500、約600、約700、約800、約900、約1000、約1500、約2000〜2800個、その間のあらゆる値および範囲を含む個数連続するアミノ酸を含む、本質的に、vWF A3ドメイン（SEQ ID NO:3）;vWF A1ドメイン（SEQ ID NO:11）;vWF（SEQ ID NO:13）;デコリン（SEQ ID NO:15）またはvWF A3ドメイン（SEQ ID NO:34）の少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも31、少なくとも32、少なくとも33、少なくとも34、少なくとも35、少なくとも36、少なくとも37、少なくとも38、少なくとも39、少なくとも40、少なくとも41、少なくとも42、少なくとも43、少なくとも44、少なくとも45、少なくとも46、少なくとも47、少なくとも48、少なくとも49、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも160、少なくとも170、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも210、少なくとも220、少なくとも230、少なくとも240、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1500、少なくとも2000〜2800個、その間のあらゆる値および範囲を含む個数連続するアミノ酸、vWF A3ドメイン（SEQ ID NO:3）;vWF A1ドメイン（SEQ ID NO:11）;vWF（SEQ ID NO:13）;デコリン（SEQ ID NO:15）またはvWF A3ドメイン（SEQ ID NO:34）の最大5、最大6、最大7、最大8、最大9、最大10、最大11、最大12、最大13、最大14、最大15、最大16、最大17、最大18、最大19、最大20、最大21、最大22、最大23、最大24、最大25、最大26、最大27、最大28、最大29、最大30、最大31、最大32、最大33、最大34、最大35、最大36、最大37、最大38、最大39、最大40、最大41、最大42、最大43、最大44、最大45、最大46、最大47、最大48、最大49、最大50、最大60、最大70、最大80、最大90、最大100、最大110、最大120、最大130、最大140、最大150、最大160、最大170、最大180、最大190、最大200、最大210、最大220、最大230、最大240、最大250、最大300、最大400、最大500、最大600、最大700、最大800、最大900、最大1000、最大1500、最大2000〜2800個、その間のあらゆる値および範囲を含む個数連続するアミノ酸、あるいはvWF A3ドメイン（SEQ ID NO:3）;vWF A1ドメイン（SEQ ID NO:11）;vWF（SEQ ID NO:13）;デコリン（SEQ ID NO:15）またはvWF A3ドメイン（SEQ ID NO:34）の約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45、約46、約47、約48、約49、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200、約210、約220、約230、約240、約250、約300、約400、約500、約600、約700、約800、約900、約1000、約1500、約2000〜2800個、その間のあらゆる値および範囲を含む個数連続するアミノ酸からなる、あるいはvWF A3ドメイン（SEQ ID NO:3）;vWF A1ドメイン（SEQ ID NO:11）;vWF（SEQ ID NO:13）;デコリン（SEQ ID NO:15）またはvWF A3ドメイン（SEQ ID NO:34）の少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも31、少なくとも32、少なくとも33、少なくとも34、少なくとも35、少なくとも36、少なくとも37、少なくとも38、少なくとも39、少なくとも40、少なくとも41、少なくとも42、少なくとも43、少なくとも44、少なくとも45、少なくとも46、少なくとも47、少なくとも48、少なくとも49、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、少なくとも160、少なくとも170、少なくとも180、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも210、少なくとも220、少なくとも230、少なくとも240、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1500、少なくとも2000〜2800個、その間のあらゆる値および範囲を含む個数連続するアミノ酸、vWF A3ドメイン（SEQ ID NO:3）;vWF A1ドメイン（SEQ ID NO:11）;vWF（SEQ ID NO:13）;デコリン（SEQ ID NO:15）またはvWF A3ドメイン（SEQ ID NO:34）の最大5、最大6、最大7、最大8、最大9、最大10、最大11、最大12、最大13、最大14、最大15、最大16、最大17、最大18、最大19、最大20、最大21、最大22、最大23、最大24、最大25、最大26、最大27、最大28、最大29、最大30、最大31、最大32、最大33、最大34、最大35、最大36、最大37、最大38、最大39、最大40、最大41、最大42、最大43、最大44、最大45、最大46、最大47、最大48、最大49、最大50、最大60、最大70、最大80、最大90、最大100、最大110、最大120、最大130、最大140、最大150、最大160、最大170、最大180、最大190、最大200、最大210、最大220、最大230、最大240、最大250、最大300、最大400、最大500、最大600、最大700、最大800、最大900、最大1000、最大1500、最大2000〜2800個、その間のあらゆる値および範囲を含む個数連続するアミノ酸、あるいはvWF A3ドメイン（SEQ ID NO:3）;vWF A1ドメイン（SEQ ID NO:11）;vWF（SEQ ID NO:13）;デコリン（SEQ ID NO:15）またはvWF A3ドメイン（SEQ ID NO:34）の約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45、約46、約47、約48、約49、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200、約210、約220、約230、約240、約250、約300、約400、約500、約600、約700、約800、約900、約1000、約1500、約2000〜2800個、その間のあらゆる値および範囲を含む個数連続するアミノ酸からなる。一部の特定の局面では、ECM親和性ペプチドが、vWF A3ドメイン（SEQ ID NO:34）のアミノ酸1〜193を含み得る。
【０００８】
ECM親和性ペプチドは、vWF A3ドメイン（SEQ ID NO:3）;vWF A1ドメイン（SEQ ID NO:11）;vWF（SEQ ID NO:13）;デコリン（SEQ ID NO:15）またはvWF A3ドメイン（SEQ ID NO:34）と少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも100％の同一性あるいは約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約100％の同一性を有するペプチド断片またはタンパク質断片:（A）アミノ酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199または200から始まり、アミノ酸10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204または205で終わるセグメントの断片を含むSEQ ID NO:3の断片;（B）アミノ酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180��181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211または212から始まり、アミノ酸10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221または222で終わるセグメントの断片を含むSEQ ID NO:11の断片;（C）SEQ ID NO:13の断片であって、アミノ酸1、10,20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240、1250、1260、1270、1280、1290、1300、1310、1320、1330、1340、1350、1360、1370、1380、1390、1400、1410、1420、1430、1440、1450、1460、1470、1480、1490、1500、1510、1520、1530、1540、1550、1560、1570、1580、1590、1600、1610、1620、1630、1640、1650、1660、1670、1680、1690、1700、1710、1720、1730、1740、1750、1760、1770、1780、1790、1800、1810、1820、1830、1840、1850、1860、1870、1880、1890、1900、1910、1920、1930、1940、1950、1960、1970、1980、1990、2000、2010、2020、2030、2040、2050、2060、2070、2080、2090、2100、2110、2120、2130、2140、2150、2160、2170、2180、2190、2200、2210、2220、2230、2240、2250、2260、2270、2280、2290、2300、2310、2320、2330、2340、2350、2360、2370、2380、2390、2400、2410、2420、2430、2440、2450、2460、2470、2480、2490、2500、2510、2520、2530、2540、2550、2560、2570、2580、2590、2600、2610、2620、2630、2640、2650、2660、2670、2680、2690、2700、2710、2720、2730、2740、2750、2760、2770、2780、2790または2800、その間のあらゆる値および範囲を含むアミノ酸から始まり、アミノ酸10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240、1250、1260、1270、1280、1290、1300、1310、1320、1330、1340、1350、1360、1370、1380、1390、1400、1410、1420、1430、1440、1450、1460、1470、1480、1490、1500、1510、1520、1530、1540、1550、1560、1570、1580、1590、1600、1610、1620、1630、1640、1650、1660、1670、1680、1690、1700、1710、1720、1730、1740、1750、1760、1770、1780、1790、1800、1810、1820、1830、1840、1850、1860、1870、1880、1890、1900、1910、1920、1930、1940、1950、1960、1970、1980、1990、2000、2010、2020、2030、2040、2050、2060、2070、2080、2090、2100、2110、2120、2130、2140、2150、2160、2170、2180、2190、2200、2210、2220、2230、2240、2250、2260、2270、2280、2290、2300、2310、2320、2330、2340、2350、2360、2370、2380、2390、2400、2410、2420、2430、2440、2450、2460、2470、2480、2490、2500、2510、2520、2530、2540、2550、2560、2570、2580、2590、2600、2610、2620、2630、2640、2650、2660、2670、2680、2690、2700、2710、2720、2730、2740、2750、2760、2770、2780、2790、2800 281または2813、その間のあらゆる値および範囲を含むアミノ酸で終わるセグメントの断片;（D）アミノ酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332または333から始まり、アミノ酸10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、1
97、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342または343で終わるSEQ ID NO:15の断片;（E）アミノ酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185または186から始まり、アミノ酸10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195または196で終わるSEQ ID NO:34の断片を含む断片を含み得る。
【０００９】
一部の特定の局面では、任意のポリペプチド、ペプチドまたはその断片が、参照配列識別子（referenced sequence identifier）のすべてのアミノ酸を含んでいる必要はなく、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50個くらいのアミノ酸が除去または欠失されていてもよいが、該ポリペプチドまたはペプチドの少なくとも1つの活性、例えばECM結合性またはコラーゲン結合性を維持している。さらなる局面では、任意のポリペプチドまたはペプチドは、参照配列識別子のアミノ酸配列の末端に、または該アミノ酸配列内部に挿入されたさらなるアミノ酸を含み得、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50個くらいのアミノ酸が、そのアミノ末端、カルボキシ末端に融合されていても、該アミノ酸配列内に挿入されていても、その組み合わせであってもよいが、該ポリペプチドまたはペプチドの少なくとも1つの活性、例えばECM結合性またはコラーゲン結合性を維持している。本明細書に開示の該ECM親和性ペプチドのいずれかが一部の態様から除外される場合があり得ることが具体的に想定される（例えば、P1GF-2およびCXCL-12γペプチド）。一態様において、該ECM親和性ペプチドは、SEQ ID NO:3;SEQ ID NO:11;SEQ ID NO:13;SEQ ID NO:15もしくはSEQ ID NO:34のうちの1つまたはSEQ ID NO:3;SEQ ID NO:11;SEQ ID NO:13;SEQ ID NO:15もしくはSEQ ID NO:34由来のペプチドセグメントもしくはペプチド断片と少なくとも70％、少なくとも72％、少なくとも74％、少なくとも76％、少なくとも78％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも94％、少なくとも96％、少なくとも98％、少なくとも99％もしくは少なくとも100％（あるいはその間の任意の誘導可能な範囲）の同一性または最大70％、最大72％、最大74％、最大76％、最大78％、最大80％、最大82％、最大84％、最大86％、最大88％、最大90％、最大92％、最大94％、最大96％、最大98％、最大99％もしくは最大100％（あるいはその間の任意の誘導可能な範囲）の同一性を有するペプチドを含む。ペプチドセグメントもしくはペプチド断片は、SEQ ID NO:3;SEQ ID NO:11;SEQ ID NO:13;SEQ ID NO:15またはSEQ ID NO:34の10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220個またはそれ以上の連続アミノ酸を含み得る。一部の態様では、該ペプチドがSEQ ID NO:3;SEQ ID NO:11;SEQ ID NO:13;SEQ ID NO:15またはSEQ ID NO:34と少なくとも85％同一である。一部の態様では、該ペプチドが、SEQ ID NO:3;SEQ ID NO:11;SEQ ID NO:13;SEQ ID NO:15もしくはSEQ ID NO:34またはその断片を含むか、あるいはSEQ ID NO:3;SEQ ID NO:11;SEQ ID NO:13;SEQ ID NO:15もしくはSEQ ID NO:34またはその断片からなるか、あるいは本質的にSEQ ID NO:3;SEQ ID NO:11;SEQ ID NO:13;SEQ ID NO:15もしくはSEQ ID NO:34またはその断片からなる。一態様において、該ECM親和性ペプチドはフォン・ヴィレブランド因子（vWF）ペプチドを含む。一部の態様では、該VWFペプチドはvWF A1またはA3ペプチドである。一部の態様では、該VWFペプチドは、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11またはSEQ ID NO:34の全部または一部と少なくとも85％同一であるペプチドを含む。一部の態様では、該VWFペプチドは、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:11またはSEQ ID NO:34を含むか、あるいはその断片である。
【００１０】
一部の態様では、該ECM親和性ペプチドはデコリンペプチドを含む。一部の態様では、該ペプチドは、SEQ ID NO:15の全部または一部と少なくとも85％同一であり、SEQ ID NO:15の5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、75、100、125、15、175、200、225、250、275、300、325〜343個（その間のあらゆる値および範囲を含む個数）連続するアミノ酸を含む。一態様において、該ECM親和性ペプチドは、SEQ ID NO:15またはSEQ ID NO:15のペプチドセグメントと少なくとも70％、少なくとも72％、少なくとも74％、少なくとも76％、少なくとも78％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも94％、少なくとも96％、少なくとも98％、少なくとも99％もしくは少なくとも100％（あるいはその間の任意の誘導可能な範囲）の同一性または最大70％、最大72％、最大74％、最大76％、最大78％、最大80％、最大82％、最大84％、最大86％、最大88％、最大90％、最大92％、最大94％、最大96％、最大98％、最大99％もしくは最大100％（あるいはその間の任意の誘導可能な範囲）の同一性を有するペプチドを含む。一部の態様では、該ペプチドがSEQ ID NO:15と少なくとも85％同一である。一部の態様では、該ペプチドがSEQ ID NO:15またはその断片を含むか、あるいはSEQ ID NO:15またはその断片からなるか、あるいは本質的にSEQ ID NO:15またはその断片からなる。
【００１１】
一部の態様では、該ペプチドは該サイトカインに共有結合されている。一部の特定の局面では、該ペプチドは、サイトカインポリペプチドとのアミノ末端融合体またはカルボキシ末端融合体である。一部の態様では、該ペプチドは、該サイトカインに二官能性クロスリンカーによって架橋されている。
【００１２】
他の態様では、サイトカインペプチドが、hIL-2（SEQ ID NO:37）;mIL-2（SEQ ID NO:37）;hIL-15（SEQ ID NO:16）、mIL-15（SEQ ID NO:17）、hIL-21（SEQ ID NO:18）、mIL-21（SEQ ID NO:19）、hIL-12 p35（SEQ ID NO:20）、hIL-12 p40（SEQ ID NO:21）、mIL-12 p35（SEQ ID NO:22）、mIL-12 p35（SEQ ID NO:23）、hCCL4（SEQ ID NO:24）、mCCL4（SEQ ID NO:25）、hCCL21（SEQ ID NO:26）、mCCL21（SEQ ID NO:27）、hCXCL9（SEQ ID NO:28）、mCXCL9（SEQ ID NO:29）、hCXCL10（SEQ ID NO:30）、mCXCL10（SEQ ID NO:31）、hVEGF-C（SEQ ID NO:32）、mVEGF-C（SEQ ID NO:33）、mIFNβ（SEQ ID NO:39）、hIFNβ（SEQ ID NO:40）、mIFNα2（SEQ ID NO:41）、hIFNα2（SEQ ID NO:42）、mXCL1（SEQ ID NO:43）、hXCL1（SEQ ID NO:44）、mIL-15スーパーアゴニスト（SEQ ID NO:45）またはhIL-15スーパーアゴニスト（SEQ ID NO:46）から選択され得る。ECM親和性ペプチドサイトカインコンジュゲートのサイトカイン部分は、hIL-15（SEQ ID NO:16）、mIL-15（SEQ ID NO:17）、hIL-21（SEQ ID NO:18）、mIL-21（SEQ ID NO:19）、hIL-12 p35（SEQ ID NO:20）、hIL-12 p40（SEQ ID NO:21）、mIL-12 p35（SEQ ID NO:22）、mIL-12 p35（SEQ ID NO:23）、hCCL4（SEQ ID NO:24）、mCCL4（SEQ ID NO:25）、hCCL21（SEQ ID NO:26）、mCCL21（SEQ ID NO:27）、hCXCL9（SEQ ID NO:28）、mCXCL9（SEQ ID NO:29）、hCXCL10（SEQ ID NO:30）、mCXCL10（SEQ ID NO:31）、hVEGF-C（SEQ ID NO:32）、mVEGF-C（SEQ ID NO:33）、mIFNβ（SEQ ID NO:39）、hIFNβ（SEQ ID NO:40）、mIFNα2（SEQ ID NO:41）、hIFNα2（SEQ ID NO:42）、mXCL1（SEQ ID NO:43）、hXCL1（SEQ ID NO:44）、mIL-15スーパーアゴニスト（SEQ ID NO:45）またはhIL-15スーパーアゴニスト（SEQ ID NO:46）の5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150個連続するアミノ酸を含み得る。一態様において、サイトカインペプチドは、hIL-15（SEQ ID NO:16）、mIL-15（SEQ ID NO:17）、hIL-21（SEQ ID NO:18）、mIL-21（SEQ ID NO:19）、hIL-12 p35（SEQ ID NO:20）、hIL-12 p40（SEQ ID NO:21）、mIL-12 p35（SEQ ID NO:22）、mIL-12 p35（SEQ ID NO:23）、hCCL4（SEQ ID NO:24）、mCCL4（SEQ ID NO:25）、hCCL21（SEQ ID NO:26）、mCCL21（SEQ ID NO:27）、hCXCL9（SEQ ID NO:28）、mCXCL9（SEQ ID NO:29）、hCXCL10（SEQ ID NO:30）、mCXCL10（SEQ ID NO:31）、hVEGF-C（SEQ ID NO:32）、mVEGF-C（SEQ ID NO:33）、mIFNβ（SEQ ID NO:39）、hIFNβ（SEQ ID NO:40）、mIFNα2（SEQ ID NO:41）、hIFNα2（SEQ ID NO:42）、mXCL1（SEQ ID NO:43）、hXCL1（SEQ ID NO:44）、mIL-15スーパーアゴニスト（SEQ ID NO:45）もしくはhIL-15スーパーアゴニスト（SEQ ID NO:46）またはhIL-15（SEQ ID NO:16）、mIL-15（SEQ ID NO:17）、hIL-21（SEQ ID NO:18）、mIL-21（SEQ ID NO:19）、hIL-12 p35（SEQ ID NO:20）、hIL-12 p40（SEQ ID NO:21）、mIL-12 p35（SEQ ID NO:22）、mIL-12 p35（SEQ ID NO:23）、hCCL4（SEQ ID NO:24）、mCCL4（SEQ ID NO:25）、hCCL21（SEQ ID NO:26）、mCCL21（SEQ ID NO:27）、hCXCL9（SEQ ID NO:28）、mCXCL9（SEQ ID NO:29）、hCXCL10（SEQ ID NO:30）、mCXCL10（SEQ ID NO:31）、hVEGF-C（SEQ ID NO:32）、mVEGF-C（SEQ ID NO:33）、mIFNβ（SEQ ID NO:39）、hIFNβ（SEQ ID NO:40）、mIFNα2（SEQ ID NO:41）、hIFNα2（SEQ ID NO:42）、mXCL1（SEQ ID NO:43）、hXCL1（SEQ ID NO:44）、mIL-15スーパーアゴニスト（SEQ ID NO:45）もしくはhIL-15スーパーアゴニスト（SEQ ID NO:46）のペプチドセグメントと少なくとも70％、少なくとも72％、少なくとも74％、少なくとも76％、少なくとも78％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも94％、少なくとも96％、少なくとも98％、少なくとも99％もしくは少なくとも100％（あるいはその間の任意の誘導可能な範囲）の同一性または最大70％、最大72％、最大74％、最大76％、最大78％、最大80％、最大82％、最大84％、最大86％、最大88％、最大90％、最大92％、最大94％、最大96％、最大98％、最大99％もしくは最大100％（あるいはその間の任意の誘導可能な範囲）の同一性を有し、サイトカイン活性を保持しているペプチドを含む。一部の態様では、該ペプチドが、hIL-15（SEQ ID NO:16）、mIL-15（SEQ ID NO:17）、hIL-21（SEQ ID NO:18）、mIL-21（SEQ ID NO:19）、hIL-12 p35（SEQ ID NO:20）、hIL-12 p40（SEQ ID NO:21）、mIL-12 p35（SEQ ID NO:22）、mIL-12 p35（SEQ ID NO:23）、hCCL4（SEQ ID NO:24）、mCCL4（SEQ ID NO:25）、hCCL21（SEQ ID NO:26）、mCCL21（SEQ ID NO:27）、hCXCL9（SEQ ID NO:28）、mCXCL9（SEQ ID NO:29）、hCXCL10（SEQ ID NO:30）、mCXCL10（SEQ ID NO:31）、hVEGF-C（SEQ ID NO:32）、mVEGF-C（SEQ ID NO:33）、mIFNβ（SEQ ID NO:39）、hIFNβ（SEQ ID NO:40）、mIFNα2（SEQ ID NO:41）、hIFNα2（SEQ ID NO:42）、mXCL1（SEQ ID NO:43）、hXCL1（SEQ ID NO:44）、mIL-15スーパーアゴニスト（SEQ ID NO:45）またはhIL-15スーパーアゴニスト（SEQ ID NO:46）と少なくとも85％同一である。一部の態様では、該ペプチドは、hIL-15（SEQ ID NO:16）、mIL-15（SEQ ID NO:17）、hIL-21（SEQ ID NO:18）、mIL-21（SEQ ID NO:19）、hIL-12 p35（SEQ ID NO:20）、hIL-12 p40（SEQ ID NO:21）、mIL-12 p35（SEQ ID NO:22）、mIL-12 p35（SEQ ID NO:23）、hCCL4（SEQ ID NO:24）、mCCL4（SEQ ID NO:25）、hCCL21（SEQ ID NO:26）、mCCL21（SEQ ID NO:27）、hCXCL9（SEQ ID NO:28）、mCXCL9（SEQ ID NO:29）、hCXCL10（SEQ ID NO:30）、mCXCL10（SEQ ID NO:31）、hVEGF-C（SEQ ID NO:32）、mVEGF-C（SEQ ID NO:33）、mIFNβ（SEQ ID NO:39）、hIFNβ（SEQ ID NO:40）、mIFNα2（SEQ ID NO:41）、hIFNα2（SEQ ID NO:42）、mXCL1（SEQ ID NO:43）、hXCL1（SEQ ID NO:44）、mIL-15スーパーアゴニスト（SEQ ID NO:45）もしくはhIL-15スーパーアゴニスト（SEQ ID NO:46）またはその断片を含むか、あるいはhIL-15（SEQ ID NO:16）、mIL-15（SEQ ID NO:17）、hIL-21（SEQ ID NO:18）、mIL-21（SEQ ID NO:19）、hIL-12 p35（SEQ ID NO:20）、hIL-12 p40（SEQ ID NO:21）、mIL-12 p35（SEQ ID NO:22）、mIL-12 p35（SEQ ID NO:23）、hCCL4（SEQ ID NO:24）、mCCL4（SEQ ID NO:25）、hCCL21（SEQ ID NO:26）、mCCL21（SEQ ID NO:27）、hCXCL9（SEQ ID NO:28）、mCXCL9（SEQ ID NO:29）、hCXCL10（SEQ ID NO:30）、mCXCL10（SEQ ID NO:31）、hVEGF-C（SEQ ID NO:32）、mVEGF-C（SEQ ID NO:33）、mIFNβ（SEQ ID NO:39）、hIFNβ（SEQ ID NO:40）、mIFNα2（SEQ ID NO:41）、hIFNα2（SEQ ID NO:42）、mXCL1（SEQ ID NO:43）、hXCL1（SEQ ID NO:44）、mIL-15スーパーアゴニスト（SEQ ID NO:45）もしくはhIL-15スーパーアゴニスト（SEQ ID NO:46）またはその断片からなるか、あるいは本質的にhIL-15（SEQ ID NO:16）、mIL-15（SEQ ID NO:17）、hIL-21（SEQ ID NO:18）、mIL-21（SEQ ID NO:19）、hIL-12 p35（SEQ ID NO:20）、hIL-12 p40（SEQ ID NO:21）、mIL-12 p35（SEQ ID NO:22）、mIL-12 p35（SEQ ID NO:23）、hCCL4（SEQ ID NO:24）、mCCL4（SEQ ID NO:25）、hCCL21（SEQ ID NO:26）、mCCL21（SEQ ID NO:27）、hCXCL9（SEQ ID NO:28）、mCXCL9（SEQ ID NO:29）、hCXCL10（SEQ ID NO:30）、mCXCL10（SEQ ID NO:31）、hVEGF-C（SEQ ID NO:32）、mVEGF-C（SEQ ID NO:33）、mIFNβ（SEQ ID NO:39）、hIFNβ（SEQ ID NO:40）、mIFNα2（SEQ ID NO:41）、hIFNα2（SEQ ID NO:42）、mXCL1（SEQ ID NO:43）、hXCL1（SEQ ID NO:44）、mIL-15スーパーアゴニスト（SEQ ID NO:45）もしくはhIL-15スーパーアゴニスト（SEQ ID NO:46）またはその断片からなる。
【００１３】
一部の特定の態様では、該ECM親和性ペプチドサイトカインコンジュゲートのIL-2部分は、SEQ ID NO:35またはSEQ ID NO:37の5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150個連続するアミノ酸を含む。一態様において、該IL-2ペプチドは、SEQ ID NO:35もしくはSEQ ID NO:37またはペプチドセグメントSEQ ID NO:35もしくはSEQ ID NO:37と少なくとも70％、少なくとも72％、少なくとも74％、少なくとも76％、少なくとも78％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも84％、少なくとも86％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも94％、少なくとも96％、少なくとも98％、少なくとも99％もしくは少なくとも100％（あるいはその間の任意の誘導可能な範囲）の同一性または最大70％、最大72％、最大74％、最大76％、最大78％、最大80％、最大82％、最大84％、最大86％、最大88％、最大90％、最大92％、最大94％、最大96％、最大98％、最大99％もしくは最大100％（あるいはその間の任意の誘導可能な範囲）の同一性を有し、IL-2活性を保持しているペプチドを含む。一部の態様では、該ペプチドはSEQ ID NO:35またはSEQ ID NO:37と少なくとも85％同一である。一部の態様では、該ペプチドは、SEQ ID NO:35またはSEQ ID NO:37またはその断片を含むか、あるいはSEQ ID NO:35またはSEQ ID NO:37またはその断片からなるか、あるいは本質的にSEQ ID NO:35またはSEQ ID NO:37またはその断片からなる。以下の配列:
2021514661.tif 000002
を有するHisタグ化マウスIL-2。以下の配列:
2021514661.tif 000003
を有するヒトIL-2。
【００１４】
リンカー、例えばアミノ酸またはペプチド模倣物の配列を、ペプチド配列とサイトカイン配列との間に挿入してもよい。リンカーは1つまたは複数の特性を有し得、該特性としては、柔軟なコンホメーション、規則的な二次構造を形成できないこと、またはいずれかのドメインを増進させ得るか、もしくはいずれかのドメインと相互作用し得る疎水性もしくは荷電性の性質が挙げられる。柔軟性のタンパク質領域に典型的にみられるアミノ酸の例としてはGly、AsnおよびSerが挙げられ得る。また、他のほぼ中性のアミノ酸、例えばThrおよびAlaもリンカー配列に使用され得る。リンカー配列の長さは、該融合タンパク質の機能または活性に有意に影響を及ぼさないさまざまな長さであり得る（例えば、米国特許第6,087,329号を参照のこと）。特定の一局面では、ペプチドとサイトカインを、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24〜約25個のアミノ酸残基を有するペプチド配列によって接合する。また、リンカーの例としては、化学部分およびコンジュゲート剤、例えばスルホ-スクシンイミジル誘導体（スルホ-SMCC、スルホ-SMPB）、スベリン酸ジスクシンイミジル（DSS）、グルタル酸ジスクシンイミジル（DSG）および酒石酸ジスクシンイミジル（DST）も挙げられ得る。リンカーとしては、線状炭素鎖、例えばCN（ここで、N＝1〜100個の炭素原子、例えばC1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8）もさらに挙げられる。一部の態様では、リンカーがジペプチドリンカー、例えばバリン-シトルリン（val-cit）、フェニルアラニン-リシン（phe-lys）リンカー、またはマレイミドカプロン酸-バリン-シトルリン（citruline）-p-アミノベンジルオキシカルボニル（vc）リンカーであり得る。一部の態様では、リンカーがスルホスクシンイミジル-4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート（smcc）である。スルホ-smccコンジュゲーションは、スルフヒドリル（チオール,-SH）と反応するマレイミド基を介して行なわれるが、そのスルホ-NHSエステルは第1級アミン（リシンおよびタンパク質またはペプチドのN末端にみられるような）に対して反応性である。さらに、リンカーはマレイミドカプロイル（mc）であってもよい。
【００１５】
一部の態様では、サイトカインに対するペプチドの比が約1:1〜10:1である。一部の態様では、サイトカインに対するペプチドの比が少なくとも1:1、少なくとも2:1、少なくとも3:1、少なくとも4:1、少なくとも5:1、少なくとも6:1、少なくとも7:1、少なくとも8:1、少なくとも9:1、少なくとも10:1、少なくとも11:1、少なくとも12:1、少なくとも13:1、少なくとも14:1、少なくとも15:1、少なくとも16:1、少なくとも17:1、少なくとも18:1、少なくとも19:1、少なくとも20:1、少なくとも21:1、少なくとも22:1、少なくとも23:1、少なくとも24:1、少なくとも25:1、少なくとも30:1、少なくとも35:1、少なくとも40:1、少なくとも45:1、少なくとも50:1もしくは少なくとも100:1（あるいはその間の任意の範囲）、最大1:1、最大2:1、最大3:1、最大4:1、最大5:1、最大6:1、最大7:1、最大8:1、最大9:1、最大10:1、最大11:1、最大12:1、最大13:1、最大14:1、最大15:1、最大16:1、最大17:1、最大18:1、最大19:1、最大20:1、最大21:1、最大22:1、最大23:1、最大24:1、最大25:1、最大30:1、最大35:1、最大40:1、最大45:1、最大50:1もしくは最大100:1（あるいはその間の任意の範囲）、または約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、約5:1、約6:1、約7:1、約8:1、約9:1、約10:1、約11:1、約12:1、約13:1、約14:1、約15:1、約16:1、約17:1、約18:1、約19:1、約20:1、約21:1、約22:1、約23:1、約24:1、約25:1、約30:1、約35:1、約40:1、約45:1、約50:1もしくは約100:1（あるいはその間の任意の範囲）である。
【００１６】
さらなる局面は、サイトカインとカップリングさせたECM親和性ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む、対象のがんを処置するための方法に関する。一部の態様では、該組成物が、静脈内投与されるか、または腫瘍内、腫瘍周囲、動脈内もしくは経カテーテル注射によって投与される。一部の態様では、本明細書に記載のvWF含有またはデコリン含有ポリペプチド（すなわち、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:34の配列の全部または一部を有する1つまたは複数のペプチドを有するもの）が全身投与される。全身投与は、例えば非経口または静脈内であり得る。
【００１７】
一部の態様では、該ECM親和性ペプチドに機能的に連結させたサイトカインの投与用量が、該ECM親和性ペプチドなしで投与される該サイトカインの最小有効用量より少ない。一部の態様では、該ECM親和性ペプチドに機能的に連結させた該サイトカインの投与用量が、該ECM親和性ペプチドなしで投与される該サイトカインの最小有効用量より少なくとも10％少ない。一部の態様では、該ECM親和性ペプチドに機能的に連結させた該サイトカインの投与用量が、該ECM親和性ペプチドなしで投与される該サイトカインの最小有効用量より少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％または少なくとも80％（あるいはその任意の誘導可能な範囲）少ない。
【００１８】
一部の態様では、該対象は、がんと診断されたことがある。一部の態様では、該がんが黒色腫、結腸がん、肺がん、前立腺がん、卵巣がん、精巣がん、脳のがん、膠芽細胞腫、小児腫瘍、胚細胞腫瘍、直腸がん、胃がん、食道がん、気管のがん、頭頸部がん、膵がん、肝臓がん、乳がん、子宮頸がんおよび外陰がんである。一部の特定の態様では、該がんが黒色腫または結腸がんである。一部の態様では、該がんが非血液系である。一部の態様では、該がんが固形腫瘍を含む。一部の態様では、該がんが遠隔転移のものである。一部の態様では、患者が以前に該がんの処置を受けたことがある。一部の態様では、該対象が該以前のがんの処置に抵抗性であった。一部の態様では、該対象が、該がんの処置に対して低応答群であると判定された。
【００１９】
該方法は、さらなるがん治療を実施することをさらに含んでいてもよい。一部の態様では、該さらなるがん治療は、放射線、ワクチン接種、化学療法、養子T細胞療法、サイトカイン療法、抗CD47抗体、抗GD2抗体または免疫アジュバントを含む。
【００２０】
一部の態様では、該方法が、同じまたは異なるECM親和性ペプチドに機能的に連結させた第2のサイトカインの投与をさらに含む。
【００２１】
用語「サイトカインポリペプチド」は、本明細書で用いる場合、サイトカインまたはその受容体結合ドメインであって、サイトカイン活性の位置に保持されるポリペプチドをいう。
【００２２】
用語「サイトカイン活性」は、本明細書で用いる場合、サイトカインが有する活性またはサイトカインがインビボで奏することができる活性をいい、非限定的に、増殖、免疫グロブリンのクラススイッチおよびB細胞の抗体分泌の促進;メモリーB細胞の分化またはそのアポトーシスの抑制;マクロファージがインターロイキン-12を分泌するのを促進させ、I型ヘルパーT細胞を活性化させるか、またはケモカインを分泌させること;マクロファージが一酸化窒素を産生するのを促進させ、微生物に対する防御能力を増強すること;樹状細胞の成熟および活性化を促進させること;T細胞の成熟および分化の調節;ナチュラルキラー細胞の細胞傷害性およびさまざまな異なるサイトカインの産生の促進;単球およびマクロファージの活性化;ならびにMHCを継続的に発現させるためのT細胞およびB細胞刺激などが挙げられる。
【００２３】
用語「ケモカインポリペプチド」は、本明細書で用いる場合、ケモカインまたはその受容体結合ドメインであるサイトカインポリペプチドをいい、ここで、ケモカインとしては、非限定的に、CXCケモカイン、CCケモカイン、CケモカインおよびCX3Cケモカインが挙げられる。
【００２４】
用語「ケモカイン活性」は、本明細書で用いる場合、ケモカインが有する活性またはケモカインがインビボで奏することができる活性をいい、非限定的に、さまざまな免疫細胞（例えば単球、マクロファージ、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞および好中球など）の走化性が挙げられる。
【００２５】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、アミノ酸のポリマーを構成している遺伝子産物に言及している場合、本明細書において互換的に用いている。
【００２６】
用語「対象」、「哺乳動物」および「患者」は互換的に用いられる。一部の態様では、対象は哺乳動物である。一部の態様では、対象はヒトである。一部の態様では、対象はマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ロバまたは実験用被験動物、例えばショウジョウバエ、ゼブラフィッシュなどである。
【００２７】
方法および組成物は本明細書に記載のいずれかの態様の除外を含むことが想定される。
【００２８】
用語「1つの（a）」および「1つの（an）」は、本開示において明らかにそうでないことが求められない限り1または複数と定義される。
【００２９】
用語「実質的に」は、当業者には理解されるように、主として明記されているものであるが必ずしも完全に明記されているものではない（完全に明記されているものを含む）と定義される。本開示の任意の態様において、用語「実質的に」は、明記されているもの「の［あるパーセンテージ］以内」で置き換えられ得、ここで、パーセンテージとしては0.1、1、5および10パーセントが挙げられる。
【００３０】
用語「〜を含む（comprise）」（およびcompriseの任意の形態、例えば「comprises」および「comprising」）、「〜を有する（have）」（およびhaveの任意の形態、例えば「has」および「having」）、「〜を含む（include）」（およびincludeの任意の形態、例えば「includes」および「including」）ならびに「〜を含む（contain）」（およびcontainの任意の形態、例えば「contains」および「containing」）は非限定の連結動詞である。その結果、1つまたは複数の要素を「含む（comprises）」、「有する（has）」、「含む（includes）」または「含む（contains）」本発明の方法およびシステムは、該1つまたは複数の要素を有するが、該1つまたは複数の要素のみを有することに限定されない。同様に、1つまたは複数の特徴を「含む（comprises）」、「有する（has）」、「含む（includes）」または「含む（contains）」本発明の方法またはシステムの要素は、該1つまたは複数の特徴を有するが、該1つまたは複数の特徴のみを有することに限定されない。
【００３１】
ある態様の1つまたは複数の特徴は、記載または図示されていない場合であっても、本開示または該態様の本質によって明らかに禁じられない限り他の態様にも適用され得る。
【００３２】
本発明の任意の方法またはシステムは、本記載の任意の要素および/または特徴および/または段階を含む（comprise/include/contain）/有するのではなく、これらからなる、またはこれらから本質的になるものであってもよい。したがって、任意の請求項において、用語「〜からなる（consisting of）」または「〜から本質的になる（consisting essentially of）」は、所与の請求項の範囲を、通常なら非限定の連結動詞が使用されるであろう範囲から変えるために、上記の非限定の連結動詞のいずれかで置き換えられ得る。「本質的に」記載の要素「からなる」組成物は、任意のさらなる活性成分を排除するが、薬学的賦形剤、バッファー、構造成分などは排除しない。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
以下の図面は、本明細書の一部を構成し、本発明の一部の特定の局面の実例をさらに示すために含められている。本発明は、この図面の1つまたは複数を本明細書に提示した具体的な態様の詳細説明と併せて参照することによってよりよく理解され得よう。
【００３４】
【図１Ａ】コラーゲン結合ドメイン（CBD）タンパク質融合IL-2はコラーゲンIおよびIIIに高親和性で結合する。（1A）vWF A3組換えタンパク質とIL-2との融合体の模式図。
【図１Ｂ】コラーゲン結合ドメイン（CBD）タンパク質融合IL-2はコラーゲンIおよびIIIに高親和性で結合する。（1B）IL-2およびCBD-IL-2を、還元条件下のSDS-PAGEによりクマシーブルー染色を用いて解析した。
【図１Ｃ】コラーゲン結合ドメイン（CBD）タンパク質融合IL-2はコラーゲンIおよびIIIに高親和性で結合する。（1C）I型コラーゲンおよびIII型コラーゲン、組換えマウス（rm）IL-2Rαに対するIL-2およびCBD-IL-2の親和性（KD値を示す）をELISAによって測定した。N.D.＝シグナルが弱いため測定されず。
【図１Ｄ】コラーゲン結合ドメイン（CBD）タンパク質融合IL-2はコラーゲンIおよびIIIに高親和性で結合する。（1D）[濃度]対[シグナル]のグラフを示す（n＝4）。
【図１Ｅ】コラーゲン結合ドメイン（CBD）タンパク質融合IL-2はコラーゲンIおよびIIIに高親和性で結合する。（1E）CTLL-2細胞をIL-2またはCBD-IL-2の存在下で培養する。48時間の培養後、細胞増殖を解析した。2回の反復実験。統計解析はANOVAをテューキーの検定とともに用いて行なった。**p＜0.01
【図２】CBD融合体はIL-2の処置関連毒性の可能性を低減させる。（2A）8×105のMMTV-PyMT細胞を0日目に接種した。腫瘍体積が500 mm3に達したとき、50μgのDyLight 800標識CBDを静脈内注射した。各臓器の蛍光解析により注射の48時間後のCBDタンパク質の体内分布が示された。（2B）5×105のB16F10細胞を0日目に接種した。CBD-IL-2（12μg）またはIL-2（6μg）を4日目に静脈内注射した。5日目に血清を収集し、IFNγの血清濃度を測定した（平均±SEM）。統計解析はANOVAをテューキーの検定とともに用いて行なった。2回の反復実験。*p＜0.05;N.S.＝有意でない。
【図３】CBD-IL-2処置によりB16F10黒色腫およびCT26結腸がんの増殖速度が低下する。（3A）5×105のB16F10細胞（3B）5×105のCT26細胞を0日目に接種した。CBD-IL-2（12μg）、IL-2（6μg）またはPBSを（3A）4日目または（3B）5日目に静脈内投与した。グラフは、最初にマウスが死亡したときまでの腫瘍体積を示す。腫瘍体積を平均±SEMで示す。（3A）n＝6（3B）n＝6。2回の反復実験。統計解析は、ANOVAをテューキーの検定とともに用いて、腫瘍サイズについて、それぞれの日の値を用いて行なった。*p＜0.05;**p＜0.01
【図４】IL-12とのCBD融合体はα-PD-L1療法を改善させる。5×105のB16F10細胞を0日目に皮内に接種した。25μgのIL-12、25μg（IL-12のモル当量）のCBD-IL-12またはPBSを7日目、17日目および27日目に静脈内投与した。100μgのα-PD-L1またはPBSを8日目、18日目および28日目に腹腔内投与した。（A）腫瘍の増殖速度および（B）生存率を示す。PBSおよびα-PD-L1,n＝7。α-PD-L1＋IL-12およびα-PD-L1＋CBD-IL-12,n＝12。腫瘍体積を平均±SEMで示す。腫瘍の増殖曲線の統計解析は、対応のないマン・ホイットニー検定を用いて行なった（α-PD-L1＋IL-12とα-PD-L1＋CBD-IL-12間）。生存曲線の統計解析はログランク検定を用いて行なった。*p＜0.05,**p＜0.01
【図５】CBD-IL-12はチェックポイント阻害薬とともに相乗的抗腫瘍免疫をもたらす。5×105のB16F10細胞を0日目に皮内に接種した。25μg（IL-12のモル当量）のCBD-IL-12またはPBSを8日目、13日目および18日目に静脈内投与した。α-PD-L1またはα-PD-1＋α-CTLA-4（1回の用量あたりの抗体に対して100μg）を9日目、14日目および19日目に腹腔内投与した。（A）腫瘍の増殖速度および（B）生存率を示す。PBS,α-PD-L1,α-PD-1＋α-CTLA-4,n＝5。CBD-IL-12,α-PD-L1＋CBD-IL-12,n＝10。α-PD-1＋α-CTLA-4＋CBD-IL-12,n＝11。腫瘍体積を平均±SEMで示す。生存曲線の統計解析はログランク検定を用いて行なった。*p＜0.05,**p＜0.01
【図６】CBD-CCL4融合タンパク質はコラーゲンIおよびコラーゲンIIIに結合し、その活性を維持する。（A）WT CCL4およびCBD-CCL4は、SDS-PAGE、続いてクマシーブルー染色によって解析した。（B,C）（B）コラーゲンIおよび（C）コラーゲンIIIに対するCBD-CCL4の親和性をSPRによって測定した。SPRチップをコラーゲンI（約500 RU）およびコラーゲンIII（約700 RU）で機能化し、CBD-CCL4をチップ上に、表示した濃度で流した。曲線は、CBD-CCL4に対して得られた特異的応答（単位:レゾナンスユニット（RU））を示す。実験曲線は、ラングミュアの1:1フィットモデルでフィッティングした。フィッティングした曲線から求められた結合速度論値[解離定数（KD）と速度定数（konおよびkoff）]を示す。（D）ThP1単球におけるWT CCL4およびCBD-CCL4のシグナル伝達を比較するGPCR活性化アッセイ。EC50値は非線形用量応答曲線フィットモデルを用いて算出した。各点はn＝3の平均±SEMを示す。
【図７】CBD-CCL4融合体は、WT CCL4と比べて血漿中循環時間が向上し、腫瘍内局在が改善される。（A）血漿中薬物動態を、B16F10黒色腫において、DyLlight 800で標識したWT CCL4またはCBD-CCL4を用いて解析した。5×105の細胞の皮内接種後4日目、マウスに25μgのWT CCL4または等価モルのCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4）を静脈内注射によって投与した。表示した時点で血液を採取し、血漿を分離し、CCL4濃度について解析した。各点はn＝4の平均±SEMを示す。（B）体内分布を、EMT6乳がんにおいて、DyLlight 647で標識したWT CCL4またはCBD-CCL4を用いて解析した。5×105のEMT6細胞を乳腺脂肪体内に接種した。腫瘍体積が500 mm3に達したら、25μgのWT CCL4または等価モルのCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4）を静脈内注射によって投与した。各腫瘍における蛍光強度を、IVISイメージング・システムを用いて測定し、既知の標準的な希釈列（series）を用いて注射用量に対するパーセントに変換し、腫瘍の重量に対して正規化した。各バーはn＝3の平均±SEMを示す。**p＜0.01
【図８Ａ】CBD-CCL4融合体はB16F10黒色腫においてT細胞、DCを動員し、CPI療法薬の有効性を改善する。マウスに5×105の細胞を皮内注射し;4日後、マウスをWT CCL4（25μgを静脈内注射によって投与）または等価モルのCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4,静脈内注射によって投与）で、100μgずつのαPD-L1とαCTLA4とからなるCPI抗体療法薬の腹腔内注射による投与との組み合わせで処置した。CPI療法薬単独を対照として投与した。（A）腫瘍の増殖を腫瘍接種後10日目まで経時的にモニタリングし、10日目の時点で腫瘍を採取し、フローサイトメトリー解析のために加工処理した。バーはn＝11〜13の平均±SEMを示す。*p＜0.05;**p＜0.01;***p＜0.001;****p＜0.0001
【図８Ｂ】CBD-CCL4融合体はB16F10黒色腫においてT細胞、DCを動員し、CPI療法薬の有効性を改善する。マウスに5×105の細胞を皮内注射し;4日後、マウスをWT CCL4（25μgを静脈内注射によって投与）または等価モルのCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4,静脈内注射によって投与）で、100μgずつのαPD-L1とαCTLA4とからなるCPI抗体療法薬の腹腔内注射による投与との組み合わせで処置した。CPI療法薬単独を対照として投与した。（B〜H）免疫細胞の組成を評価した。ここで、グラフは（B）CD45＋白血球の数を示す。バーはn＝11〜13の平均±SEMを示す。*p＜0.05;**p＜0.01;***p＜0.001;****p＜0.0001
【図８Ｃ】CBD-CCL4融合体はB16F10黒色腫においてT細胞、DCを動員し、CPI療法薬の有効性を改善する。マウスに5×105の細胞を皮内注射し;4日後、マウスをWT CCL4（25μgを静脈内注射によって投与）または等価モルのCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4,静脈内注射によって投与）で、100μgずつのαPD-L1とαCTLA4とからなるCPI抗体療法薬の腹腔内注射による投与との組み合わせで処置した。CPI療法薬単独を対照として投与した。（B〜H）免疫細胞の組成を評価した。ここで、グラフは（C）CD103＋ CD11c＋ MHCIIHi DCの数を示す。バーはn＝11〜13の平均±SEMを示す。*p＜0.05;**p＜0.01;***p＜0.001;****p＜0.0001
【図８Ｄ】CBD-CCL4融合体はB16F10黒色腫においてT細胞、DCを動員し、CPI療法薬の有効性を改善する。マウスに5×105の細胞を皮内注射し;4日後、マウスをWT CCL4（25μgを静脈内注射によって投与）または等価モルのCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4,静脈内注射によって投与）で、100μgずつのαPD-L1とαCTLA4とからなるCPI抗体療法薬の腹腔内注射による投与との組み合わせで処置した。CPI療法薬単独を対照として投与した。（B〜H）免疫細胞の組成を評価した。ここで、グラフは（D）CD8＋ T細胞の数を示す。バーはn＝11〜13の平均±SEMを示す。*p＜0.05;**p＜0.01;***p＜0.001;****p＜0.0001
【図８Ｅ】CBD-CCL4融合体はB16F10黒色腫においてT細胞、DCを動員し、CPI療法薬の有効性を改善する。マウスに5×105の細胞を皮内注射し;4日後、マウスをWT CCL4（25μgを静脈内注射によって投与）または等価モルのCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4,静脈内注射によって投与）で、100μgずつのαPD-L1とαCTLA4とからなるCPI抗体療法薬の腹腔内注射による投与との組み合わせで処置した。CPI療法薬単独を対照として投与した。（B〜H）免疫細胞の組成を評価した。ここで、グラフは（E）NK1.1＋ CD3- NK細胞の数を示す。バーはn＝11〜13の平均±SEMを示す。*p＜0.05;**p＜0.01;***p＜0.001;****p＜0.0001
【図８Ｆ】CBD-CCL4融合体はB16F10黒色腫においてT細胞、DCを動員し、CPI療法薬の有効性を改善する。マウスに5×105の細胞を皮内注射し;4日後、マウスをWT CCL4（25μgを静脈内注射によって投与）または等価モルのCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4,静脈内注射によって投与）で、100μgずつのαPD-L1とαCTLA4とからなるCPI抗体療法薬の腹腔内注射による投与との組み合わせで処置した。CPI療法薬単独を対照として投与した。（B〜H）免疫細胞の組成を評価した。ここで、グラフは（F）全CD11c＋ DCの数を示す。バーはn＝11〜13の平均±SEMを示す。*p＜0.05;**p＜0.01;***p＜0.001;****p＜0.0001
【図８Ｇ】CBD-CCL4融合体はB16F10黒色腫においてT細胞、DCを動員し、CPI療法薬の有効性を改善する。マウスに5×105の細胞を皮内注射し;4日後、マウスをWT CCL4（25μgを静脈内注射によって投与）または等価モルのCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4,静脈内注射によって投与）で、100μgずつのαPD-L1とαCTLA4とからなるCPI抗体療法薬の腹腔内注射による投与との組み合わせで処置した。CPI療法薬単独を対照として投与した。（B〜H）免疫細胞の組成を評価した。ここで、グラフは（G）CD4＋ T細胞の数を示す。バーはn＝11〜13の平均±SEMを示す。*p＜0.05;**p＜0.01;***p＜0.001;****p＜0.0001
【図８Ｈ】CBD-CCL4融合体はB16F10黒色腫においてT細胞、DCを動員し、CPI療法薬の有効性を改善する。マウスに5×105の細胞を皮内注射し;4日後、マウスをWT CCL4（25μgを静脈内注射によって投与）または等価モルのCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4,静脈内注射によって投与）で、100μgずつのαPD-L1とαCTLA4とからなるCPI抗体療法薬の腹腔内注射による投与との組み合わせで処置した。CPI療法薬単独を対照として投与した。（B〜H）免疫細胞の組成を評価した。ここで、グラフは（H）FoxP3＋ CD25＋ Treg（全CD4＋ T細胞のうち）の数を示す。バーはn＝11〜13の平均±SEMを示す。*p＜0.05;**p＜0.01;***p＜0.001;****p＜0.0001
【図９Ａ】CBD-CCL4併用療法では、腫瘍の増殖とCD103＋ DCおよびCD8＋ T細胞の浸潤との間の強い相関が示される。（A〜F）腫瘍浸潤細胞の数を腫瘍体積と比較する回帰分析は、図3で得られた結果を用いて行なった。（A）腫瘍体積とCD103＋ CD11c＋ MHCIIHi DC間の相関。
【図９Ｂ】CBD-CCL4併用療法では、腫瘍の増殖とCD103＋ DCおよびCD8＋ T細胞の浸潤との間の強い相関が示される。（A〜F）腫瘍浸潤細胞の数を腫瘍体積と比較する回帰分析は、図3で得られた結果を用いて行なった。（B）腫瘍体積とCD8＋ T細胞間の相関。
【図９Ｃ】CBD-CCL4併用療法では、腫瘍の増殖とCD103＋ DCおよびCD8＋ T細胞の浸潤間との強い相関が示される。（A〜F）腫瘍浸潤細胞の数を腫瘍体積と比較する回帰分析は、図3で得られた結果を用いて行なった。（C）CD103＋ CD11c＋ MHCIIHi DCとCD8＋ T細胞間の相関。
【図９Ｄ】CBD-CCL4併用療法では、腫瘍の増殖とCD103＋ DCおよびCD8＋ T細胞の浸潤間との強い相関が示される。（A〜F）腫瘍浸潤細胞の数を腫瘍体積と比較する回帰分析は、図3で得られた結果を用いて行なった。（D）腫瘍体積とNK1.1＋ CD3- NK細胞間の相関。
【図９Ｅ】CBD-CCL4併用療法では、腫瘍の増殖とCD103＋ DCおよびCD8＋ T細胞の浸潤間との強い相関が示される。（A〜F）腫瘍浸潤細胞の数を腫瘍体積と比較する回帰分析は、図3で得られた結果を用いて行なった。（E）腫瘍体積と全CD11c＋ DC間の相関。
【図９Ｆ】CBD-CCL4併用療法では、腫瘍の増殖とCD103＋ DCおよびCD8＋ T細胞の浸潤間との強い相関が示される。（A〜F）腫瘍浸潤細胞の数を腫瘍体積と比較する回帰分析は、図3で得られた結果を用いて行なった。（F）腫瘍体積と全CD45＋白血球間の相関。
【図１０Ａ】CBD-CCL4併用処置ではEMT6乳がんにおいてT細胞、DCが動員され、CPI療法薬の有効性が改善される。マウスに5×105の細胞を皮下注射し;接種後6日目および9日目、マウスをWT CCL4（25μgを静脈内注射によって投与）または等価モルのCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4,静脈内注射によって投与）で、100μgずつのαPD-L1とαCTLA4とからなるCPI抗体療法薬の腹腔内注射による投与との組み合わせで処置した。CPI療法薬単独を対照として投与した。（A）腫瘍の増殖を腫瘍接種後10日目まで経時的にモニタリングし、10日目の時点で腫瘍を採取し、フローサイトメトリー解析のために加工処理した。バーはn＝7〜9の平均±SEMを示す。*p＜0.05;**p＜0.01
【図１０Ｂ】CBD-CCL4併用処置ではEMT6乳がんにおいてT細胞、DCが動員され、CPI療法薬の有効性が改善される。マウスに5×105の細胞を皮下注射し;接種後6日目および9日目、マウスをWT CCL4（25μgを静脈内注射によって投与）または等価モルのCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4,静脈内注射によって投与）で、100μgずつのαPD-L1とαCTLA4とからなるCPI抗体療法薬の腹腔内注射による投与との組み合わせで処置した。CPI療法薬単独を対照として投与した。（B〜H）免疫細胞の組成を評価した。ここで、グラフは、（B）CD45＋白血球の数を示す。バーはn＝7〜9の平均±SEMを示す。*p＜0.05;**p＜0.01
【図１０Ｃ】CBD-CCL4併用処置ではEMT6乳がんにおいてT細胞、DCが動員され、CPI療法薬の有効性が改善される。マウスに5×105の細胞を皮下注射し;接種後6日目および9日目、マウスをWT CCL4（25μgを静脈内注射によって投与）または等価モルのCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4,静脈内注射によって投与）で、100μgずつのαPD-L1とαCTLA4とからなるCPI抗体療法薬の腹腔内注射による投与との組み合わせで処置した。CPI療法薬単独を対照として投与した。（B〜H）免疫細胞の組成を評価した。ここで、グラフは、（C）CD103＋ CD11c＋ MHCIIHi DCの数を示す。バーはn＝7〜9の平均±SEMを示す。*p＜0.05;**p＜0.01
【図１０Ｄ】CBD-CCL4併用処置ではEMT6乳がんにおいてT細胞、DCが動員され、CPI療法薬の有効性が改善される。マウスに5×105の細胞を皮下注射し;接種後6日目および9日目、マウスをWT CCL4（25μgを静脈内注射によって投与）または等価モルのCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4,静脈内注射によって投与）で、100μgずつのαPD-L1とαCTLA4とからなるCPI抗体療法薬の腹腔内注射による投与との組み合わせで処置した。CPI療法薬単独を対照として投与した。（B〜H）免疫細胞の組成を評価した。ここで、グラフは、（D）CD8α＋ CD11c＋ MHCIIHi DCの数を示す。バーはn＝7〜9の平均±SEMを示す。*p＜0.05;**p＜0.01
【図１０Ｅ】CBD-CCL4併用処置ではEMT6乳がんにおいてT細胞、DCが動員され、CPI療法薬の有効性が改善される。マウスに5×105の細胞を皮下注射し;接種後6日目および9日目、マウスをWT CCL4（25μgを静脈内注射によって投与）または等価モルのCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4,静脈内注射によって投与）で、100μgずつのαPD-L1とαCTLA4とからなるCPI抗体療法薬の腹腔内注射による投与との組み合わせで処置した。CPI療法薬単独を対照として投与した。（B〜H）免疫細胞の組成を評価した。ここで、グラフは、（E）CD8＋ T細胞の数を示す。バーはn＝7〜9の平均±SEMを示す。*p＜0.05;**p＜0.01
【図１０Ｆ】CBD-CCL4併用処置ではEMT6乳がんにおいてT細胞、DCが動員され、CPI療法薬の有効性が改善される。マウスに5×105の細胞を皮下注射し;接種後6日目および9日目、マウスをWT CCL4（25μgを静脈内注射によって投与）または等価モルのCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4,静脈内注射によって投与）で、100μgずつのαPD-L1とαCTLA4とからなるCPI抗体療法薬の腹腔内注射による投与との組み合わせで処置した。CPI療法薬単独を対照として投与した。（B〜H）免疫細胞の組成を評価した。ここで、グラフは、（F）全CD11c＋ DCの数を示す。バーはn＝7〜9の平均±SEMを示す。*p＜0.05;**p＜0.01
【図１０Ｇ】CBD-CCL4併用処置ではEMT6乳がんにおいてT細胞、DCが動員され、CPI療法薬の有効性が改善される。マウスに5×105の細胞を皮下注射し;接種後6日目および9日目、マウスをWT CCL4（25μgを静脈内注射によって投与）または等価モルのCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4,静脈内注射によって投与）で、100μgずつのαPD-L1とαCTLA4とからなるCPI抗体療法薬の腹腔内注射による投与との組み合わせで処置した。CPI療法薬単独を対照として投与した。（B〜H）免疫細胞の組成を評価した。ここで、グラフは、（G）CD4＋ T細胞の数を示す。バーはn＝7〜9の平均±SEMを示す。*p＜0.05;**p＜0.01
【図１０Ｈ】CBD-CCL4併用処置ではEMT6乳がんにおいてT細胞、DCが動員され、CPI療法薬の有効性が改善される。マウスに5×105の細胞を皮下注射し;接種後6日目および9日目、マウスをWT CCL4（25μgを静脈内注射によって投与）または等価モルのCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4,静脈内注射によって投与）で、100μgずつのαPD-L1とαCTLA4とからなるCPI抗体療法薬の腹腔内注射による投与との組み合わせで処置した。CPI療法薬単独を対照として投与した。（B〜H）免疫細胞の組成を評価した。ここで、グラフは、（H）FoxP3＋ CD25＋ Treg（全CD4＋ T細胞のうち）の数を示す。バーはn＝7〜9の平均±SEMを示す。*p＜0.05;**p＜0.01
【図１１】CBD-CCL4併用処置では、確立されたB16F10黒色腫の増殖が遅滞され、生存期間が有意に長くなる。マウスに5×105の細胞を皮内注射し;7日後、腫瘍体積が50 mm3を超えたら、マウスをCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4,静脈内注射によって投与）で、100μgずつのαPD-L1とαCTLA4とからなるCPI抗体療法薬の腹腔内注射による投与との組み合わせで処置した。CPI療法薬単独を比較として投与した。（A）最初にマウスが死亡したときまでの腫瘍の増殖曲線（B）生存曲線および（C）CPI療法薬単独または（D）CBD-CCL4併用療法での個々の増殖曲線を示す。グラフはn＝5の平均±SEMを示す。**p＜0.01;***p＜0.001;****p＜0.0001
【図１２】CBD-CCL4療法薬はαPD-1免疫療法薬と相乗作用し、CT26結腸がんおよびMC38結腸がんの増殖を遅滞させる。マウスに5×105のCT26細胞またはMC38細胞を皮内注射し;接種後5日目、マウスをWT CCL4（25μgを静脈内注射によって投与）または等価モルのCBD-CCL4（静脈内注射によって投与するCCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4）で、100μgのαPD-1の腹腔内注射による投与との組み合わせで処置した。100μgのαPD-1単独を対照として投与した。グラフは、最初にマウスが死亡したときまでの（A）CT26および（B）MC38腫瘍モデルの増殖曲線を示す。バーはn＝5の平均±SEMを示す。*p＜0.05;**p＜0.01;****p＜0.0001
【図１３】CPI療法薬との組み合わせでのCBD-CCL4は自然発生MMTV-PyMT乳がんの増殖を遅滞させる。MMTV-PyMTマウスを、総腫瘍量が100 mm3に達するまでモニタリングした。この時点で、マウスをCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4,静脈内注射によって投与）で、100μgずつのαPD-L1とαCTLA4とからなるCPI抗体療法薬の腹腔内注射による投与との組み合わせで処置した。CPI療法薬単独を比較として投与した。最初の処置後7日目および14日目に同一の投薬を行なった。（A）最初に2匹のマウスが死亡したときまでの腫瘍の増殖曲線、（B）生存曲線、および（C）CPI療法薬単独または（D）CBD-CCL4併用療法での個々の増殖曲線を示す。グラフはn＝6の平均±SEMを示す。*p＜0.05;**p＜0.01
【発明を実施するための形態】
【００３５】
詳細な説明
サイトカインおよびケモカインは、本明細書において一般的にサイトカインと称し、相当な抗腫瘍活性を示すことが示されているが、以前の試験では狭い治療濃度域および/または処置関連有害事象の事例が報告されている。本明細書に記載の方法および組成物により、腫瘍内または腫瘍周囲に保持されるサイトカインでの局所療法が提供され、全身曝露が限定的になり、一部の場合において治療を中止しなければならないか、または有効用量が得られないかのいずれかであるほど重度であり得る副作用が少なくなる。本明細書に示した実施例により、ECM親和性ペプチドコンジュゲーション後では腫瘍組織内保持が向上して血漿中濃度が低下し、全身性副作用が低減されることを実証している。本明細書に記載の組成物の静脈内（iv）注射により、黒色腫および結腸がんのマウスモデルにおいて対照と比べて腫瘍の増殖が有意に遅延され、生存期間が長くなった。改変操作型ECM結合サイトカインのシンプルで応用可能なこのアプローチはがん治療における新規なアプローチである。
【００３６】
IL-2を、サイトカインをECM親和性ペプチド、例えばコラーゲン結合ドメイン（CBD）によって腫瘍の血管系に局在させるという思想を実証するための代表的なサイトカインとして使用した。インターロイキン-2（IL-2）を用いたサイトカイン免疫療法では、動物モデルおよび臨床において相当な抗腫瘍活性が示されている。本発明者らは、IL-2とフォン・ヴィレブランド因子（vWF）A3ドメイン由来のCBDとの改変操作融合タンパク質によって漏出性血管系をターゲティングするためのCBDの使用を試験した;この融合タンパク質は静脈内投与され得、漏出性血管系を経由して腫瘍微小環境をターゲティングし得る。これにより、腫瘍間質に到達するかかる融合体/コンジュゲートの使用を実証する。以下の実施例において、CBDタンパク質は腫瘍組織に局在することを示す;マウスの黒色腫モデルおよび結腸がんモデルにおいて野生型IL-2と比べて、CBD-IL-2は注射後、低血清濃度を示し;CBD-IL-2は腫瘍の増殖を有意に遅延させた。改変操作型コラーゲン結合サイトカインのシンプルで応用可能なこのアプローチは、がん免疫療法に対する新規なアプローチである。
【００３７】
血管の内側は通常、内皮細胞と称される、不透性バリアを形成する密に連なった細胞で覆われている。血管漏出は、小血管、一般的には毛細血管または細静脈が漏出性になって液を放出する場合に起こる。血管漏出は、さまざまな条件下で、例えば腫瘍微小環境または慢性炎症において起こり得、ほぼすべての血管床に影響を及ぼし得る。慢性炎症関連障害、例えばインスリン抵抗性、糖尿病、心血管疾患、代謝障害およびがんにおける血管透過性の領域の処置またはターゲティングのための方法および組成物が想定される。
【００３８】
血管透過性の亢進と関連している疾患の処置において、本明細書に記載のコラーゲン結合ドメインは、かかる疾患を予防および/または処置するための薬学的組成物として有効に使用され得る。この局面において、血管透過性と関連している疾患を予防および/または処置するための薬学的組成物は、治療薬を血管漏出または血管透過性の領域に局在させることを含み得る。治療薬はペプチド、ポリペプチド、化合物、抗体、遺伝子（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、shRNA、microRNAなど）、アプタマー、治療用細胞、放射性薬学的薬物であり得る。
【００３９】
I.サイトカインおよびケモカイン
サイトカインは、細胞が刺激されると放出する一群のタンパク質である（非常にごくわずかのサイトカインしか細胞膜上に発現されない）。細胞によって産生されるサイトカインは標的細胞近傍で、または血液循環によって非常に低濃度で影響を及ぼし得る。サイトカインは、標的細胞の増殖、分化および活性化の促進に対して広範な機能を有する。多くのサイトカインは免疫細胞をターゲティングして免疫応答において役割を果たし得る。構造および機能の違いに基づいて、サイトカインは、ケモカイン、インターロイキン、増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子およびインターフェロンに大別され得る。
【００４０】
インターロイキンは、白血球（white blood cell/leukocyte）によって発現されることが最初に同定された一群のサイトカインである。免疫系の機能は大部分がインターロイキンに依存する。インターロイキンのほとんどはヘルパーCD4 Tリンパ球ならびに単球、マクロファージおよび内皮細胞によって合成される。一般的に、インターロイキンはTリンパ球およびBリンパ球ならびに造血細胞の発生および分化を促進させる。インターロイキン2（IL-2）はヘマトポエチンファミリーに分類され、このファミリーにはいくつかの細胞増殖関連ホルモンまたは他のサイトカインが含まれる。IL-2の機能としては:T細胞の成熟および分化を調節すること、B細胞の増殖および抗体分泌を刺激すること、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害性を増進させること、ならびに単球およびマクロファージを活性化することが挙げられる。また、IL-2は、MHCを発現させ続けるためにT細胞およびB細胞も刺激し得、いくつかの異なるサイトカイン、例えばTNF-α、IFN-γおよび顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）を産生させるためにナチュラルキラー細胞も刺激し得る。試験により、IL-2は抗腫瘍効果およびワクチン増強効果を有することが示されている。
【００４１】
ケモカインは、白血球を誘引することができる一群のサイトカインである。ケモカインは典型的には、小さい分子量を有する陽性電荷を帯びた分泌タンパク質である。その主な機能は、免疫細胞を組織損傷または病原体感染を有する領域に誘引し、続いて白血球がこの特定の部位で食作用を行なうか、または病原体に対して炎症を誘起するのを可能にすることである。ケモカインによって誘引される白血球としては、自然免疫のものである好中球、単球/マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞および他の白血球;ならびに適応免疫のTリンパ球（T細胞）またはBリンパ球（B細胞）が挙げられ得る。典型的には、ケモカインは、ジスルフィド結合を形成して構造を安定化させている高度に保存された4つのシステイン（C）を有する。最初の2つのシステイン間のアミノ酸の数の違いおよび最初のシステインのプロセッション（procession）の有無に基づいて、CXC（またはα）、CC（またはβ）、C（またはγ）およびCX3Cの4つのサブファミリーに分類され得る。間質細胞由来因子-1（SDF-1）はケモカインのCXCサブファミリーに分類され、CXCリガンド12（CXCL12）としても知られている。
【００４２】
一部の特定の態様では、サイトカインはIL-2である。がん免疫療法は臨床において相当な治療効果が示されている。サイトカイン薬として、インターロイキン-2（IL-2:アルデスロイキン）は、進行期の黒色腫および腎細胞がんの処置に対して米国食品医薬品局（FDA）によって承認されている（Jiang et al.,Oncoimmunology 5:e1163462,2016）。アルデスロイキンは高い奏効率、生存期間の延長を示すが、重度の有害事象が誘発されるため治療濃度域が狭い（Rosenberg et al.,N Engl J Med 313:1485-1492,1985）。IL-2は、主にCD4＋ T細胞から分泌され、程度は低いがCD8＋ T細胞およびナチュラルキラー（NK）細胞からも分泌される（Boyman and Sprent,Nature reviews.Immunology 12:180-190,2012）。IL-2はT細胞、B細胞およびNK細胞の増殖および活性化を誘発する（Boyman and Sprent,Nature reviews.Immunology 12:180-190）。IL-2は高濃度では免疫系を賦活するが、IL-2は低濃度ではその効果を逆転させ、免疫抑制細胞である制御性T細胞（Treg）を誘導して維持する（Jiang et al.,Oncoimmunology 5:e1163462,2016）。血中での半減期が短いため、半減期を長くするためにIL-2融合タンパク質に改変操作することが提案されており、その野生型形態と比べて高い有効性を示す（Zhu et al.,Cancer Cell 27:489-501,2015）。
【００４３】
別の態様では、該サイトカインが、IL-12、IL-15、IL-21、CCl4、CCL21、CXCL9、CXCL10、VEGF-Cまたは抗腫瘍特性を有する他のサイトカインから選択され得る。
【００４４】
ヒトIL-15は
2021514661.tif 000004
のアミノ酸配列を有する。
【００４５】
マウスIL-15は
2021514661.tif 000005
のアミノ酸配列を有する。
【００４６】
ヒトIL-21は
2021514661.tif 000006
のアミノ酸配列を有する。
【００４７】
マウスIL-21は
2021514661.tif 000007
のアミノ酸配列を有する。
【００４８】
ヒトIL-12 p35サブユニットは
2021514661.tif 000008
のアミノ酸配列を有する。
【００４９】
ヒトIL-12 p40サブユニットは
2021514661.tif 000009
のアミノ酸配列を有する。
【００５０】
マウスIL-12 p35サブユニットは
2021514661.tif 000010
のアミノ酸配列を有する。
【００５１】
マウスIL-12 p40サブユニットは
2021514661.tif 000011
のアミノ酸配列を有する。
【００５２】
ヒトCCL4は
2021514661.tif 000012
のアミノ酸配列を有する。
【００５３】
マウスCCL4は
2021514661.tif 000013
のアミノ酸配列を有する。
【００５４】
ヒトCCL21は
2021514661.tif 000014
のアミノ酸配列を有する。
【００５５】
マウスCCL21は
2021514661.tif 000015
のアミノ酸配列を有する。
【００５６】
ヒトCXCL9は
2021514661.tif 000016
のアミノ酸配列を有する。
【００５７】
マウスCXCL9は
2021514661.tif 000017
のアミノ酸配列を有する。
【００５８】
ヒトCXCL10は
2021514661.tif 000018
のアミノ酸配列を有する。
【００５９】
マウスCXCL10は
2021514661.tif 000019
のアミノ酸配列を有する。
【００６０】
ヒトVEGF-Cは
2021514661.tif 000020
のアミノ酸配列を有する。
【００６１】
マウスVEGF-Cは
2021514661.tif 000021
のアミノ酸配列を有する。
【００６２】
マウスIFNβは
2021514661.tif 000022
のアミノ酸配列を有する。
【００６３】
ヒトIFNβは
2021514661.tif 000023
のアミノ酸配列を有する。
【００６４】
マウスIFNα2は
2021514661.tif 000024
のアミノ酸配列を有する。
【００６５】
ヒトIFNα2は
2021514661.tif 000025
のアミノ酸配列を有する。
【００６６】
マウスXCL1は
2021514661.tif 000026
のアミノ酸配列を有する。
【００６７】
ヒトXCL1は
2021514661.tif 000027
のアミノ酸配列を有する。
【００６８】
マウスIL-15スーパーアゴニストは
2021514661.tif 000028
のアミノ酸配列を有する。
【００６９】
ヒトIL-15スーパーアゴニストは
2021514661.tif 000029
のアミノ酸配列を有する。
【００７０】
II.ECM親和性ペプチド
コラーゲンは、正常組織および腫瘍組織の両方において細胞のさまざまな生物学的機能、例えば増殖、分化および接着を調節する細胞外マトリックス（ECM）タンパク質である（Ricard-Blum,Cold Spring Harb Perspect Biol 3:a004978,2011）。コラーゲンは、哺乳動物の体内に最も豊富に存在するタンパク質であり、ほぼすべての組織中に28種類のアイソフォームのうちの1種類または複数種で存在する（Ricard-Blum,Cold Spring Harb Perspect Biol 3:a004978,2011）。血管内皮下層スペースはコラーゲン高含有である。生理学的条件下において不溶性であるため、コラーゲンは血中にはほとんど存在しない（Dubois et al.,Blood 107:3902-06,2006;Bergmeier and Hynes,Cold Spring Harb Perspect Biol 4:a005132,2012）。腫瘍血管系は異常な構造であるため透過性であることが報告されている（Nagy et al.,British journal of cancer 100:865,2009）。したがって、その漏出性血管系により、腫瘍内にコラーゲンが露出する（Liang et al.,Journal of controlled release 209:101-109,2015;Liang et al.,Sci Rep 6:18205,2016;Yasunaga et al.,Bioconjugate chemistry 22:1776-83,2011;Xu et al.The Journal of cell biology 154:1069-80,2001;Swartz and Lund,Nat Rev Cancer 12:210-19）。また、腫瘍組織は、正常組織と比べて増大した量のコラーゲンを含有している（Zhou et al.J Cancer 8:1466-76,2017;Provenzano et al.BMC Med 6:11,2008）。
【００７１】
フォン・ヴィレブランド因子（vWF）は血液凝固因子であり、I型コラーゲンとIII型コラーゲンの両方および血小板上の接着受容体GPIbαに結合する（Lenting et al.,Journal of thrombosis and haemostasis:JTH 10:2428-37,2012;Shahidi Advances in experimental medicine and biology 906:285-306,2017）。ケガをしたとき、内皮細胞下のコラーゲンが血漿に曝露され、vWF-コラーゲン結合によって血栓形成カスケードが開始する（Shahidi Advances in experimental medicine and biology 906:285-306,2017;Wu et al.Blood 99:3623-28,2002）。報告されている非細菌起源のタンパク質/ペプチドの中で、vWF Aドメインがコラーゲンに対して最も高い親和性を有する（Addi et al.,Tissue Engineering Part B:Reviews,2016）。特にAドメイン内で、vWFのA3ドメインがコラーゲン結合ドメイン（CBD）であると報告されている（Ribba et al.Thrombosis and haemostasis 86:848-54,2001）。上記のように、本発明者らは、vWF A3 CBDとの融合タンパク質により、全身注射の場合であっても腫瘍の漏出性血管系によるコラーゲンの露出のため、標的サイトカイン免疫療法が実現され得ると想定した。
【００７２】
本開示の諸態様はECM親和性ペプチドに関する。一部の態様では、該ECM親和性ペプチドがフォン・ヴィレブランド因子（vWF）由来のペプチドである。ヒトvWFの配列は下記のものを含む。
2021514661.tif 000030
2021514661.tif 000031
【００７３】
一部の態様では、該ペプチドはvWF A3ドメインに由来する。vWF A3ドメインはヒト配列の残基1670〜1874（成熟VWFの907〜1111）から得られ、以下の配列:
2021514661.tif 000032
を有する。ペプチドの例は、SEQ ID NO:13の全部もしくは一部（すなわち、セグメント）、またはSEQ ID NO:3の全部もしくは一部を含む。一部の態様では、該ペプチドはvWF A1ドメインに由来する。vWF A1ドメインはヒト配列の残基1237〜1458（成熟vWFの474〜695）から得られ、以下の配列:
2021514661.tif 000033
を有する。
【００７４】
特定の態様では、ECM親和性ペプチドはデコリンアミノ酸配列の全部もしくは一部を含む。デコリンコラーゲン結合ドメインは以下のアミノ酸配列:
ヒトデコリン
2021514661.tif 000034
を有する。
【００７５】
一部の態様では、ECM親和性ペプチドはPlGF-2に由来するペプチドを含む。PlGF-2は以下の配列を有する。
2021514661.tif 000035
【００７６】
例示的なPlGF-2 ECM親和性ペプチドとしては、
2021514661.tif 000036
が挙げられる。
【００７７】
一部の態様では、ECM親和性ペプチドはCXCL-12γに由来するペプチドである。CXCL-12γの配列は以下:CXCL-12γ:
2021514661.tif 000037
である。例示的なペプチドは、SEQ ID NO:12の全部または一部および以下のペプチド:
2021514661.tif 000038
を含む。
【００７８】
ECM親和性ペプチドは、ECMもしくはCBDペプチドまたは上述のペプチドのフラグメントと75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100％の同一性（あるいはその中の任意の導出可能な範囲）を有するペプチドであり得る。該ペプチドまたはポリペプチドは、1つまたは複数の保存的置換または非保存的置換を有していてもよい。置換変異体は、典型的にはタンパク質内の1つまたは複数の部位に、あるアミノ酸から別のアミノ酸への交換を含んでおり、該ポリペプチドの1つまたは複数の特性が、他の機能または特性の低下を伴ってまたは伴わずにモジュレートされるように設計され得る。置換は保存的であり得る、すなわち、あるアミノ酸が同様の形状および電荷のもので置き換えられる。保存的置換は当技術分野において周知であり、例えば、アラニンがセリンに;アルギニンがリシンに;アスパラギンがグルタミンまたはヒスチジンに;アスパラギン酸がグルタミン酸に;システインがセリンに;グルタミンがアスパラギンに;グルタミン酸がアスパラギン酸に;グリシンがプロリンに;ヒスチジンがアスパラギンまたはグルタミンに;イソロイシンがロイシンまたはバリンに;ロイシンがバリンまたはイソロイシンに;リシンがアルギニンに;メチオニンがロイシンまたはイソロイシンに;フェニルアラニンがチロシン、ロイシンまたはメチオニンに;セリンがトレオニンに;トレオニンがセリンに;トリプトファンがチロシンに;チロシンがトリプトファンまたはフェニルアラニンに;およびバリンがイソロイシンまたはロイシンに、という変化が挙げられる。あるいはまた、置換は、ポリペプチドの機能または活性が影響を受けるような非保存的であり得る。非保存的変化は、典型的にはある残基の化学的に異なる残基による置換、例えば、極性または荷電のアミノ酸の無極性または非荷電のアミノ酸による置換、およびその逆の置換を伴う。
【００７９】
本明細書に記載のポリペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個またはそれ以上（あるいはその中の任意の導出導可能な範囲）の変異アミノ酸を、本開示のペプチドまたはポリペプチドの少なくともまたは最大3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000個またはそれ以上の連続アミノ酸内、あるいはその中で導出可能な任意の範囲内に、含み得る。
【００８０】
本明細書に記載のポリペプチドセグメントまたはフラグメントは、本開示のペプチドまたはポリペプチドの3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000個またはそれ以上の連続アミノ酸、あるいはその中で導出可能な任意の範囲を含み得る。
【００８１】
本明細書に記載のポリペプチドは、少なくとも、最大で、または厳密に5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000個またはそれ以上のアミノ酸の固定長（あるいはその中の任意の導出可能な範囲）であり得る。
【００８２】
サイトカイン-ペプチド構築物にリンカー配列が含められ得る。例えば、少なくとも、最大で、または厳密に3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個またはそれ以上のアミノ酸（あるいはその中の任意の導出可能な範囲）を有するリンカーによって該抗体と該ペプチドが隔てられ得る。
【００８３】
本開示のECM親和性ペプチドは、細胞外マトリックスの1種類または複数種の成分、例えばフィブロネクチン、コラーゲン、（I型コラーゲン、III型コラーゲンおよび/またはIV型コラーゲン）、テネイシンC、フィブリノゲンならびにフィブリンに対する親和性を有し得る。特定の局面において、ECM親和性ペプチドはコラーゲンに対する親和性を有する。そして他の局面において、ECM親和性ペプチドはフィブロネクチンに結合しない。
【００８４】
III.核酸
一部の特定の態様において、本開示は、サイトカインまたはケモカインに機能的に連結させた本発明のタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド、例えばECM親和性ペプチドをコードしている組換えポリヌクレオチドに関する。したがって、一部の特定の態様は、サイトカインもしくはその断片と融合させたECM親和性ポリペプチドもしくはその断片および/またはECM親和性ポリペプチドをコードしているヌクレオチドに関する。
【００８５】
本出願において用いる場合、用語「ポリヌクレオチド」は、組換え体であるか、または全ゲノム核酸から単離されているかのいずれかである核酸分子をいう。用語「ポリヌクレオチド」には、オリゴヌクレオチド（長さが100残基以下の核酸）、組換えベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどが包含される。ポリヌクレオチドは、一部の特定の局面では、天然に存在するその遺伝子またはタンパク質コード配列から実質的に分離された調節配列を含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードまたはアンチセンス）であっても二本鎖であってもよく、RNA、DNA（ゲノム、cDNAもしくは合成）、そのアナログ、またはその組み合わせであり得る。さらなるコード配列または非コード配列をポリヌクレオチド内に存在させてもよいが、存在させなくてもよい。
【００８６】
これに関連して、用語「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードしている核酸（適正な転写、翻訳後修飾または局在に必要とされる任意の配列を含む）をいうために用いられる。当業者には理解されるように、この用語は、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質および変異型を発現するか、または発現するように適合され得るゲノム配列、発現カセット、cDNA配列および改変操作された小型核酸セグメントを包含している。ポリペプチドの全部または一部をコードしている核酸は、本明細書に記載または本明細書で参照している1つまたは複数のアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチドの、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000個またはそれ以上のヌクレオチド、ヌクレオシドまたは塩基対（その間のあらゆる値および範囲を含む）の連続核酸配列を含み得る。また、1つの特定のポリペプチドが、わずかに異なる核酸配列を有する多様性を含むが、それでもなお、同じかまたは実質的に同様のタンパク質をコードしている複数の核酸にコードされている場合があり得ることも想定される。
【００８７】
特定の態様において、本発明は、本開示のポリペプチドまたはペプチドをコードしている核酸配列が組み込まれた単離された核酸セグメントおよび組換えベクターに関する。用語「組換え」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとともに使用され得、一般的に、インビトロで作製および/または操作された、あるいはかかる分子の複製産物であるポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。
【００８８】
他の態様において、本発明は、本開示のポリペプチドまたはペプチドをコードしている核酸配列が組み込まれた単離された核酸セグメントおよび組換えベクターに関する。
【００８９】
本開示において使用される核酸セグメントには、他の核酸配列、例えばプロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニングサイト、他のコードセグメントなどが結合され得、そのため、その全長はかなり多様であり得る。したがって、ほぼいかなる長さの核酸断片も使用され得ることが想定され、全長は好ましくは、意図された組換え核酸プロトコルにおける調製および使用の容易性によって制限される。一部の場合では、核酸配列は、例えば、ポリペプチドの精製、輸送、分泌、翻訳後修飾を可能にするため、または治療有益性、例えばターゲティングもしくは有効性のためのさらなる異種コード配列を有するポリペプチド配列をコードし得る。上記に論考しているように、修飾されたポリペプチドコード配列にタグまたは他の異種ポリペプチドを付加してもよく、ここで、「異種」は、修飾された該ポリペプチドとは同じでないポリペプチドをいう。
【００９０】
一部の特定の態様では、本開示により、本明細書に開示の配列と実質的な同一性を有するポリヌクレオチド変異体;本明細書に記載の方法（例えば、標準的なパラメータを用いたBLAST解析）を用いて本開示のポリヌクレオチド配列と比較したとき少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％もしくは99％またはそれより高い配列同一性（その間のあらゆる値および範囲を含む）を含むものを提供する。
【００９１】
また、本開示では、上記のあらゆるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの使用も想定している。
【００９２】
1.ベクター
本開示のポリペプチドは、ベクター内に含められた核酸分子にコードされ得る。用語「ベクター」は、細胞内に導入されて該細胞で複製および発現され得る異種核酸配列が内部に挿入され得る担体核酸分子をいうために用いられる。核酸配列は「異種」であり得、これは、該核酸配列が、ベクターが導入されている細胞にとって、または組み込まれている核酸にとって外来の状況であることを意味し、該細胞または核酸内の配列に相同だが該宿主細胞または核酸において通常はみられない位置にある配列を含む。ベクターとしては、DNA、RNA、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、ならびに人工染色体（例えば、YAC）が挙げられる。当業者であれば、標準的な組換え手法によってベクターを構築するための充分な設備を整えられよう（例えば、Sambrook et al.,2001;Ausubel et al.,1996、ともに参照により本明細書に組み入れられる）。ベクターは、本開示のポリペプチドをコードしていることに加えて、他のポリペプチド配列、例えば1種類または複数種の他の細菌ペプチド、タグまたは免疫原性増強ペプチドをコードしていてもよい。かかる融合タンパク質をコードしている有用なベクターとしては、後の精製および分離または切断のための、pINベクター（Inouye et al.,1985）、ヒスチジン鎖をコードしているベクター、およびグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）可溶性融合タンパク質の作製における使用のためのpGEXベクターが挙げられる。
【００９３】
用語「発現ベクター」は、転写されることが可能な遺伝子産物の少なくとも一部分をコードしている核酸配列を含むベクターをいう。一部の場合では、RNA分子がその後、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。発現ベクターには、さまざまな「制御配列」が含有され得、制御配列は、機能的に連結されたコード配列の、特定の宿主生物体での転写および場合によっては翻訳に必要な核酸配列をいう。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターに、他の機能も果たし、本明細書に記載のものである核酸配列を含有させてもよい。
【００９４】
2.プロモーターおよびエンハンサー
「プロモーター」は制御配列である。プロモーターは典型的には、転写の開始と速度を制御する核酸配列領域である。これは、調節タンパク質および調節分子、例えばRNAポリメラーゼおよび他の転写因子が結合し得る遺伝子エレメントを含有し得る。語句「機能的に配置された」、「機能的に連結された」、「制御下の」および「転写制御下の」は、プロモーターが、核酸配列に対して転写の開始および該配列の発現を制御するのに正しい機能的位置および/または向きであることを意味する。プロモーターは、「エンハンサー」とともに使用してもしなくてもよく、エンハンサーは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列をいう。
【００９５】
当然、発現用に選択した細胞型または生物体におけるDNAセグメントの発現を有効に指令するプロモーターおよび/またはエンハンサーを使用することが重要であり得る。一般的に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサーおよび細胞型の組み合わせの使用は、分子生物学の当業者には公知である（Sambrook et al.,2001参照、参照により本明細書に組み入れられる）。使用されるプロモーターは、構成的、組織特異的または誘導性であり得、一部の特定の態様では、指定の条件下で、例えば組換えタンパク質またはペプチドの大規模生産において、導入されたDNAセグメントの高レベル発現を指令し得る。
【００９６】
種々のエレメント/プロモーターが本発明の状況において遺伝子の発現を調節するために使用され得る。特定の刺激に応答して活性化され得る核酸配列領域であるかかる誘導性エレメントの例としては、非限定的に、免疫グロブリン重鎖（Banerji et al.,1983;Gilles et al.,1983;Grosschedl et al.,1985;Atchinson et al.,1986,1987;Imler et al.,1987;Weinberger et al.,1984;Kiledjian et al.,1988;Porton et al.;1990）、免疫グロブリン軽鎖（Queen et al.,1983;Picard et al.,1984）、T細胞受容体（Luria et al.,1987;Winoto et al.,1989;Redondo et al.;1990）、HLA DQ αおよび/またはDQ β（Sullivan et al.,1987）、βインターフェロン（Goodbourn et al.,1986;Fujita et al.,1987;Goodbourn et al.,1988）、インターロイキン-2（Greene et al.,1989）、インターロイキン-2受容体（Greene et al.,1989;Lin et al.,1990）、MHCクラスII 5（Koch et al.,1989）、MHCクラスII HLA-DRα（Sherman et al.,1989）、β-アクチン（Kawamoto et al.,1988;Ng et al.;1989）、筋肉クレアチンキナーゼ（MCK）（Jaynes et al.,1988;Horlick et al.,1989;Johnson et al.,1989）、プレアルブミン（トランスサイレチン）（Costa et al.,1988）、エラスターゼI（Ornitz et al.,1987）、メタロチオネイン（MTII）（Karin et al.,1987;Culotta et al.,1989）、コラゲナーゼ（Pinkert et al.,1987;Angel et al.,1987）、アルブミン（Pinkert et al.,1987;Tronche et al.,1989,1990）、α-フェトプロテイン（Godbout et al.,1988;Campere et al.,1989）、γ-グロビン（Bodine et al.,1987;Perez-Stable et al.,1990）、β-グロビン（Trudel et al.,1987）、c-fos（Cohen et al.,1987）、c-Ha-Ras（Triesman,1986;Deschamps et al.,1985）、インスリン（Edlund et al.,1985）、神経細胞接着分子（NCAM）（Hirsh et al.,1990）、α1-アンチトリパイン（Antitrypain）（Latimer et al.,1990）、H2B（TH2B）ヒストン（Hwang et al.,1990）、マウスおよび/またはI型コラーゲン（Ripe et al.,1989）、グルコース調節タンパク質（GRP94およびGRP78）（Chang et al.,1989）、ラット成長ホルモン（Larsen et al.,1986）、ヒト血清アミロイドA（SAA）（Edbrooke et al.,1989）、トロポニンI（TN I）（Yutzey et al.,1989）、血小板由来増殖因子（PDGF）（Pech et al.,1989）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Klamut et al.,1990）、SV40（Banerji et al.,1981;Moreau et al.,1981;Sleigh et al.,1985;Firak et al.,1986;Herr et al.,1986;Imbra et al.,1986;Kadesch et al.,1986;Wang et al.,1986;Ondek et al.,1987;Kuhl et al.,1987;Schaffner et al.,1988）、ポリオーマ（Swartzendruber et al.,1975;Vasseur et al.,1980;Katinka et al.,1980,1981;Tyndell et al.,1981;Dandolo et al.,1983;de Villiers et al.,1984;Hen et al.,1986;Satake et al.,1988;Campbell et al.,1988）、レトロウイルス（Kriegler et al.,1982,1983;Levinson et al.,1982;Kriegler et al.,1983,1984a,b,1988;Bosze et al.,1986;Miksicek et al.,1986;Celander et al.,1987;Thiesen et al.,1988;Celander et al.,1988;Choi et al.,1988;Reisman et al.,1989）、パピローマウイルス（Campo et al.,1983;Lusky et al.,1983;Spandidos and Wilkie,1983;Spalholz et al.,1985;Lusky et al.,1986;Cripe et al.,1987;Gloss et al.,1987;Hirochika et al.,1987;Stephens et al.,1987）、B型肝炎ウイルス（Bulla et al.,1986;Jameel et al.,1986;Shaul et al.,1987;Spandau et al.,1988;Vannice et al.,1988）、ヒト免疫不全ウイルス（Muesing et al.,1987;Hauber et al.,1988;Jakobovits et al.,1988;Feng et al.,1988;Takebe et al.,1988;Rosen et al.,1988;Berkhout et al.,1989;Laspia et al.,1989;Sharp et al.,1989;Braddock et al.,1989）、サイトメガロウイルス（CMV）IE（Weber et al.,1984;Boshart et al.,1985;Foecking et al.,1986）、テナガザル白血病ウイルス（Holbrook et al.,1987;Quinn et al.,1989）が挙げられる。
【００９７】
誘導性エレメントとしては、非限定的に、MT II-ホルボールエステル（TFA）/重金属（Palmiter et al.,1982;Haslinger et al.,1985;Searle et al.,1985;Stuart et al.,1985;Imagawa et al.,1987,Karin et al.,1987;Angel et al.,1987b;McNeall et al.,1989）;MMTV（マウス乳腺腫瘍ウイルス）-グルココルチコイド（Huang et al.,1981;Lee et al.,1981;Majors et al.,1983;Chandler et al.,1983;Lee et al.,1984;Ponta et al.,1985;Sakai et al.,1988）;β-インターフェロン-ポリ（rI）x/ポリ（rc）（Tavernier et al.,1983）;アデノウイルス5 E2-ElA（Imperiale et al.,1984）;コラゲナーゼ-ホルボールエステル（TPA）（Angel et al.,1987a）;ストロメリシン-ホルボールエステル（TPA）（Angel et al.,1987b）;SV40-ホルボールエステル（TPA）（Angel et al.,1987b）;マウスMX遺伝子-インターフェロン,ニューカッスル病ウイルス（Hug et al.,1988）;GRP78遺伝子-A23187（Resendez et al.,1988）;α-2-マクログロブリン-IL-6（Kunz et al.,1989）;ビメンチン-血清（Rittling et al.,1989）;MHCクラスI遺伝子H-2κb-インターフェロン（Blanar et al.,1989）;HSP70-ElA/SV40ラージT抗原（Taylor et al.,1989,1990a,1990b）;プロリフェリン-ホルボールエステル/TPA（Mordacq et al.,1989）;腫瘍壊死因子-PMA（Hensel et al.,1989）;および甲状腺刺激ホルモンα遺伝子-甲状腺ホルモン（Chatterjee et al.,1989）が挙げられる。
【００９８】
本発明のペプチドまたはタンパク質コードポリヌクレオチドの発現を制御するために使用される具体的なプロモーターは、該プロモーターが、ターゲティングされる細胞、好ましくは細菌細胞において該ポリヌクレオチドを発現させ得る限り、重要でないと考えられる。ヒト細胞がターゲティングされる場合、該ポリヌクレオチドのコード領域を、ヒト細胞において発現させ得るプロモーターに隣接させて該プロモーターの制御下に配置することが好ましい。一般的にいうと、かかるプロモーターとしては、細菌プロモーター、ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターのいずれかが挙げられ得よう。
【００９９】
3.開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位（IRES）
また、特定の開始シグナルがコード配列の効率的な翻訳のために必要とされる場合があり得る。このようなシグナルとしては、ATG開始コドンまたは隣接配列が挙げられる。外来性の翻訳制御シグナル、例えばATG開始コドンを備える必要があり得る。当業者であれば、これを判断して必要なシグナルを付与することが容易にできよう。
【０１００】
本発明の一部の特定の態様では、内部リボソーム進入部位（IRES）エレメントの使用が、多重遺伝子メッセージまたはポリシストロニックメッセージを生成するために用いられる。IRESエレメントは、5’メチル化Cap依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを回避し、内部部位で翻訳を開始し得る（Pelletier and Sonenberg,1988;Macejak and Sarnow,1991）。IRESエレメントは、異種オープンリーディングフレームと連結され得る。各々がIRESによって隔てられた複数のオープンリーディングフレームが一緒に転写され、ポリシストロニックメッセージが生成され得る。1つのメッセージを転写するための1つのプロモーター/エンハンサーを用いて複数の遺伝子が効率的に発現され得る（米国特許第5,925,565号および第5,935,819号参照、参照により本明細書に組み入れられる）。
【０１０１】
4.選択マーカーおよびスクリーニング可能マーカー
本発明の一部の特定の態様では、本開示の核酸構築物を含む細胞は、スクリーニング可能マーカーまたは選択マーカーを発現ベクターにコードすることによりインビトロまたはインビボで同定され得る。転写されて翻訳されるとマーカーは、該細胞に同定可能な変化を付与し、該発現ベクターを含む細胞の容易な同定を可能にする。一般的に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。陽性選択マーカーは、マーカーの存在によって選択を可能にするものであり、一方、陰性選択マーカーは、その存在によって選択が妨げられるものである。陽性選択マーカーの一例は薬物耐性マーカーである。
【０１０２】
5.宿主細胞
本明細書で用いる場合、用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は互換的に用いられ得る。また、これらの用語はすべて、その任意のあらゆる後続世代の子孫も包含している。意図的または偶発的な変異のため、すべての子孫が同一にはなり得ないことは理解されよう。異種核酸配列の発現との関連において、「宿主細胞」は、原核生物細胞または真核生物細胞をいい、ベクターを複製し得るか、またはベクターにコードされた異種遺伝子を発現し得る任意の形質転換可能な生物体を包含している。宿主細胞は、ベクターまたはウイルスのレシピエントとして使用することができ、使用されている。宿主細胞は「トランスフェクト」または「形質転換」され得、これは、外来性核酸、例えば組換えタンパク質コード配列が該宿主細胞内に移入または導入される過程をいう。形質転換細胞には対象の初代細胞およびその子孫が包含される。
【０１０３】
宿主細胞は、原核生物または真核生物に由来し得、ベクターの複製用または核酸配列（複数可）の一部もしくは全部の発現用の細菌、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞が挙げられる。数多くの細胞株および細胞培養物が宿主細胞としての使用に利用可能であり、これらは、生体培養物および遺伝子材料の保管所としての機能を果たす組織であるAmerican Type Culture Collection（ATCC）から入手できる（www.atcc.org）。
【０１０４】
6.発現系
上記に論考した組成物の少なくとも一部または全部を含む数多くの発現系が存在している。原核生物ベースの系および/または真核生物ベースの系が、核酸配列、またはその対応するポリペプチド、タンパク質およびペプチドを作製するために本発明での使用のために使用され得る。かかる系の多くは市販されており、広く入手可能である。
【０１０５】
昆虫細胞/バキュロウイルス系は、異種核酸セグメントの高レベルのタンパク質発現をもたらし得、例えば米国特許第5,871,986号、第4,879,236号（どちらも参照により本明細書に組み入れられる）に記載されており、例えば、名称MAXBAC（登録商標）2.0でINVITROGEN（登録商標）から、およびBACPAK（商標）BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEMでCLONTECH（登録商標）から購入することができる。
【０１０６】
本開示の本発明の発現系に加えて、発現系の他の例としては、合成エクジソン誘導性受容体を伴うSTRATAGENE（登録商標）のCOMPLETE CONTROL（商標）Inducible Mammalian Expression System、またはそのpET Expression System（大腸菌（E.coli）発現系）が挙げられる。誘導性発現系の別の例はINVITROGEN（登録商標）から入手可能であり、これは、完全長CMVプロモーターが使用される哺乳動物の誘導性発現系であるT-REX（商標）（テトラサイクリン調節型発現）Systemを有する。また、INVITROGEN（登録商標）は、メチロトローフ酵母、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）における組換えタンパク質の高レベル生産のために設計された、Pichia methanolica Expression Systemと呼ばれる酵母発現系も提供している。当業者であれば、核酸配列またはその対応するポリペプチド、タンパク質もしくはペプチドを作製するためにベクター、例えば発現構築物をどのようにして発現させるかがわかるであろう。
【０１０７】
IV.併用療法
本開示の組成物および関連する方法、特に、サイトカインに機能的に連結させたECM親和性ペプチドの投与はまた、追加の治療の実施、例えば本明細書に記載の追加の治療薬の投与と併用して、または当技術分野で公知の他の従来の治療薬と併用して使用され得る。
【０１０８】
本明細書に開示の治療用組成物および処置は別の処置または剤の前、それと同時および/またはその後であり得、数分間から数週間の範囲の間隔があけられ得る。剤が細胞、組織または生物体に別々に適用される態様では、一般的に、治療剤がなお細胞、組織または生物体に対して好都合な併用効果を奏することができ得るように各送達時点同士の間の重要な期間を過ぎないことが確実にされるであろう。例えば、かかる場合では、細胞、組織または生物体が2、3、4種類またはそれ以上の剤または処置と実質的に同時に（すなわち、約1分未満以内に）接触され得ることが想定される。他の局面では、1種類または複数種の治療剤または処置が、別の治療剤の投与または処置の実施の前および/または後の1分、5分、10分、20分、30分、45分、60分、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、22時間、23時間、24時間、25時間、26時間、27時間、28時間、29時間、30時間、31時間、32時間、33時間、34時間、35時間、36時間、37時間、38時間、39時間、40時間、41時間、42時間、43時間、44時間、45時間、46時間、47時間、48時間、1日、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、21日間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間もしくは8週間以内にまたはそれ以上の範囲内で、およびその中で導出可能な任意の範囲内で投与または提供され得る。
【０１０９】
治療剤および処置の種々の併用レジメンが使用され得る。かかる併用の非限定的な例を以下に示すが、ここで、治療剤、例えば本明細書に開示の組成物は「A」であり、本明細書に記載または当技術分野で公知の第2の剤、例えば追加の剤、化学療法薬またはチェックポイント阻害薬は「B」である。
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【０１１０】
一部の態様では、2つ以上の治療過程が使用され得る。複数過程が実施され得ることが想定される。
【０１１１】
1.化学療法薬
用語「化学療法剤」は、とりわけがんを処置するために使用され得る治療用化合物および/または薬物をいう。例えば、化学療法剤としては、非限定的に、細胞分裂を妨害するか、微小管の正常な機能を破壊するか、代謝産物の利用を阻害するか、ヌクレオチドアナログの細胞内DNAへの置き換えを行なうか、またはDNAの複製に必要な酵素を阻害する任意の剤が挙げられ得る。
【０１１２】
化学療法剤の好適な種類としては、（a）アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（例えば、ヘキサメチルメラミン、チオテパ）、アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ロムスチン、クロロゾトシン（chlorozoticin）、ストレプトゾシン）およびトリアジン（例えば、ダカルバジン（dicarbazine））、（b）代謝拮抗薬、例えば葉酸アナログ（例えば、メトトレキサート）、ピリミジンアナログ（例えば、5-フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、アザウリジン）およびプリンアナログならびに関連物質（例えば、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、ペントスタチン）、（c）天然産物、例えばビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシド、テニポシド）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシンおよびミトザントロン）、酵素（例えば、L-アスパラギナーゼ）、および生物学的応答修飾剤（例えば、インターフェロン-α）、ならびに（d）多岐にわたる剤、例えば白金配位錯体（例えば、シスプラチン、カルボプラチン）、置換尿素（例えば、ヒドロキシウレア）、メチルヒドラジン（methylhydiazine）誘導体（例えば、プロカルバジン）、ならびに副腎皮質抑制薬（例えば、タキソールおよびミトタン）が挙げられる。一部の態様では、シスプラチンが特に好適な化学療法剤である。
【０１１３】
他の好適な化学療法剤としては、抗微小管剤、例えば、パクリタキセル（「タキソール」）およびドキソルビシン塩酸塩（「ドキソルビシン」）が挙げられる。
【０１１４】
ナイトロジェンマスタードは本開示の方法において有用な別の好適な化学療法剤である。ナイトロジェンマスタードとしては、非限定的に、メクロレタミン（HN2）、シクロホスファミドおよび/またはイホスファミド、メルファラン（L-サルコリシン）ならびにクロラムブシルが挙げられ得る。シクロホスファミド（CYTOXAN（登録商標）はMead Johnsonから入手可能、NEOSTAR（登録商標）はAdriaから入手可能）は別の好適な化学療法剤である。成人に対する好適な経口用量としては、例えば約1 mg/kg/日〜約5 mg/kg/日が挙げられ、静脈内用量としては、例えば、最初に約40 mg/kg〜約50 mg/kgを分割用量で約2日間〜約5日間にわたって、または約10 mg/kg〜約15 mg/kgを約7日〜約10日毎または約3 mg/kg〜約5 mg/kgを週2回または約1.5 mg/kg/日〜約3 mg/kg/日が挙げられる。胃腸への有害作用のため、静脈内経路が好ましい。また、薬物は、場合によっては筋肉内に、浸潤によって、または体腔内に投与される。
【０１１５】
さらなる好適な化学療法剤としては、ピリミジンアナログ、例えばシタラビン（シトシンアラビノシド）、5-フルオロウラシル（フルオウラシル;5-FU）およびフロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン;FudR）が挙げられる。5-FUは対象に、約7.5〜約1000 mg/m2の間のいずれかの投薬量で投与され得る。さらに、5-FU投薬スケジュールはさまざまな期間、例えば6週間までであり得るか、または本開示に関する当業者によって判断されるとおりであり得る。
【０１１６】
ゲムシタビン二リン酸（GEMZAR（登録商標）,Eli Lilly & Co.,「ゲムシタビン」）は別の好適な化学療法剤であり、進行性および転移性の膵がんの処置に推奨され、したがって本開示において、このようながんに対して同様に有用である。
【０１１７】
患者に送達される化学療法剤の量はいろいろであり得る。好適な一態様では、化学療法が本構築物とともに実施される場合、化学療法剤は、宿主のがんの停止または退縮が引き起こされるのに有効な量で投与され得る。他の態様では、化学療法剤が、該化学療法剤の化学療法有効量の2分の1〜10,000分の1の間のいずれかの量で投与され得る。例えば、化学療法剤は、該化学療法剤の化学療法有効量の約20分の1、約500分の1、またはさらには約5000分の1の量で投与され得る。本開示の化学療法薬はインビボで、本構築物との併用での所望の治療活性について、ならびに有効投薬量の決定のために試験され得る。例えば、かかる化合物は、ヒトでの試験の前に、適当な動物モデル系、例えば非限定的に、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなどで試験され得る。また、本実施例に記載のように、インビトロ試験を用いて適当な組み合わせおよび投薬量を決定してもよい。
【０１１８】
本開示の方法における活性成分の実際の投薬量レベルは、具体的な患者、組成物および投与様式で該患者に対して毒性になることなく所望の治療応答が得られるのに有効な活性成分量が得られるように変更され得る。選択される投薬量レベルは、さまざまな要素、例えば、選択される化学療法剤の活性、投与経路、投与のタイミング、化学療法剤の排出速度、処置の持続期間、他の薬物、具体的な化学療法剤と併用して使用される化合物および/または物質、処置対象の患者の年齢、性別、体重、体調、一般健康状態および既往歴、ならびに医療分野で周知の同様の要素に依存する。
【０１１９】
化学療法の効果と本治療用ポリペプチドの発現とを組み合わせることにより、単独で使用した場合（すなわち、該治療用ポリペプチドが直接投与され、化学療法剤の存在によって誘導されない場合）のこれらの剤の各々の抗腫瘍効果を増強し得ることが想定される。当技術分野における通常の技能を有する医師は、必要とされる本構築物と化学療法剤の有効量を容易に決定し、処方することができよう。例えば、医師であれば、構築物および/または化学療法の用量を、所望の治療効果を得るために必要とされるものより低いレベルで開始し、所望の効果が得られるまで投薬量を漸増することができ得よう。
【０１２０】
2.電離放射線
本明細書で用いる場合、「電離放射線」は、電離（電子の獲得または喪失）をもたらすのに充分なエネルギーを有するか、または電離をもたらすのに充分なエネルギーを核の相互作用によって生じ得る粒子または光子を含む放射線を意味する。例示的な好ましい電離放射線の一例はx線である。x線を標的の組織または細胞に送達するための手段は当技術分野において周知である。
【０１２１】
一部の態様では、電離放射線の量は20グレイより多く、1回投与される。一部の態様では、電離放射線の量は18 Gyであり、3回投与される。一部の態様では、電離放射線の量は少なくとも、最大で、または厳密に2、4、6、8、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、18、19、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または40 Gy（あるいはその中の任意の導出可能な範囲）である。一部の態様では、電離放射線は、少なくとも、最大で、または厳密に1、2、3、4、5、6、7、8、9または10回（あるいはその中の任意の導出可能な範囲）投与される。2回以上投与される場合、各回は約1、4、8、12もしくは24時間または1、2、3、4、5、6、7もしくは8日間または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14もしくは16週間、あるいはその中の任意の導出可能な範囲、あけられ得る。
【０１２２】
一部の態様では、IRの量はIRの総線量として提示され、次いでこれが分割線量で投与され得る。例えば、一部の態様では、総線量は、5 Gyずつの10回分割線量で投与される50 Gyである。一部の態様では、総線量は、2〜3 Gyずつの20〜60回分割線量で投与される50〜90 Gyである。一部の態様では、IRの総線量は、少なくとも、最大で、またはおよそ20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40,41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140または150（あるいはその中の任意の導出可能な範囲）である。一部の態様では、総線量は、少なくとも、最大で、または厳密に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、20、25、30、35、40、45または50 Gy（あるいはその中の任意の導出可能な範囲）の分割線量で投与される。一部の態様では、少なくとも、最大で、または厳密に2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40,41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100回の分割線量（あるいはその中の任意の導出可能な範囲）が投与される。一部の態様では、1日あたり少なくとも、最大で、または厳密に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12回（あるいはその間の任意の誘導可能な範囲）の分割線量が投与される。一部の態様では、1週間あたり少なくとも、最大で、または厳密に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30回（あるいはその中の任意の導出可能な範囲）の分割線量が投与される。
【０１２３】
一部の態様では、IRレジメンおよび/または総IR線量が医者または担当医療従事者によって処方される。医療従事者は、IRの投与全体を通して患者の経過をモニタリングおよび/もしくは入手し得る、ならびに/または医療従事者は、処方されたIR線量の投与終了時に患者をみて、評価に基づいてIRの新たな用量/レジメンを処方し得る。
【０１２４】
3.追加の剤
一部の態様では、本方法は追加の剤の投与をさらに含む。一部の態様では、該追加の剤は免疫賦活薬である。用語「免疫賦活薬」は、本明細書で用いる場合、対象の免疫応答を刺激することができる化合物をいい、アジュバントを含む場合もある。一部の態様では、免疫賦活薬は、特異的抗原を構成しないが抗原に対する免疫応答の強度と長さを増大させることができる剤である。かかる免疫賦活薬としては、非限定的に、パターン認識受容体の刺激薬、例えばToll様受容体、RIG-1およびNOD様受容体（NLR）の刺激薬、鉱物塩、例えばミョウバン、ミョウバンと例えば大腸菌（Escherihia coli）、サルモネラ・ミネソタ（Salmonella minnesota）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）もしくはシゲラ・フレクスナー（Shigella flexneri）などのエンテロバクター属のモノホスホリルリピド（MPL）Aとの組み合わせ、または特に、上記の個々の細菌のMPL AであるMPL.RTM.との組み合わせ（ASO4）、サポニン、例えばQS-21、Quil-A、ISCOM、ISCOMATRIX、乳剤、例えばMF59、Montanide、ISA 51およびISA 720、AS02（QS21＋スクアレン＋MPL.）、リポソームおよびリポソーム製剤、例えばAS01、合成または特別に調製されたマイクロ粒子およびマイクロキャリア、例えば淋菌（N.gonorrheae）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）などの細菌由来外膜小胞（OMV）またはキトサン粒子、デポ形成剤、例えばプルロニックブロックコポリマー、特別に修飾または調製されたペプチド、例えばムラミルジペプチド、アミノアルキルグルコサミニド4-ホスフェート、例えばRC529、またはタンパク質、例えば細菌トキソイドもしくは毒素断片が挙げられ得る。
【０１２５】
一部の態様では、該追加の剤は、パターン認識受容体（PRR）のアゴニスト、例えば非限定的に、Toll様受容体（TLR）、具体的にはTLR 2、3、4、5、7、8、9および/またはその組み合わせのアゴニストを含む。一部の態様では、追加の剤は、Toll様受容体3のアゴニスト、Toll様受容体7および8のアゴニスト、またはToll様受容体9アゴニストを含み;好ましくは、記載の免疫賦活薬は、イミダゾキノリン;例えばR848;アデニン誘導体、例えば米国特許第6,329,381号、米国特許出願公開2010/0075995もしくはWO2010/018132に開示されているもの;免疫賦活性DNA;または免疫賦活性RNAを含む。また、一部の態様では、該追加の剤は、免疫賦活性RNA分子、例えば非限定的に、dsRNA、ポリI:CもしくはポリI:ポリC12U（Ampligen.RTM.として入手可能,ポリI:CおよびポリI:ポリC12UはともにTLR3刺激剤として知られている）、および/またはF.Heil et al.,“Species-Specific Recognition of Single-Stranded RNA via Toll-like Receptor 7 and 8” Science 303（5663）,1526-1529（2004）;J.Vollmer et al.,“Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides”WO2008033432 A2;A.Forsbach et al.,“Immunostimulatory oligoribonucleotides containing specific sequence motif（s） and targeting the Toll-like receptor 8 pathway”WO2007062107 A2;E.Uhlmann et al.,“Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity” 米国特許出願公開US 2006241076;G.Lipford et al.,“Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides and use for treating cancer and infections”WO2005097993 A2;G.Lipford et al.,“Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides,compositions,and screening methods”WO2003086280 A2に開示されているものを含み得る。一部の態様では、追加の剤は、TLR-4アゴニスト、例えば細菌のリポ多糖（LPS）、VSV-Gおよび/またはHMGB-1であり得る。一部の態様では、追加の剤は、TLR-5アゴニスト、例えばフラジェリン、またはその一部分もしくは誘導体、例えば非限定的に、米国特許第6,130,082号、同第6,585,980号および同第7,192,725号に開示されているものを含み得る。
【０１２６】
一部の態様では、追加の剤は、壊死細胞から放出される炎症促進性刺激物質（例えば、尿酸結晶）であり得る。一部の態様では、追加の剤は補体カスケード（例えば、CD21、CD35など）の活性型成分であり得る。一部の態様では、追加の剤は免疫複合体の活性型成分であり得る。また、追加の剤としては、補体受容体アゴニスト、例えば、CD21またはCD35に結合する分子も挙げられる。一部の態様では、補体受容体アゴニストは、補体による合成ナノキャリアの内因性オプソニン化を誘導する。一部の態様では、免疫賦活薬はサイトカインであり、これは、細胞によって放出され、細胞間の相互作用、連絡および他の細胞の挙動に対して特異的効果を有する小型のタンパク質または生物学的因子（5 kDa〜20 kDaの範囲）である。一部の態様では、サイトカイン受容体アゴニストは小分子、抗体、融合タンパク質またはアプタマーである。
【０１２７】
一部の態様では、該追加の剤は抗体-薬物コンジュゲートである。一部の態様では、該抗体-薬物コンジュゲートは、ゲムツズマブオゾガマイシン、ブレンツキシマブベドチンおよびトラスツズマブエムタンシンから選択される。
【０１２８】
一部の態様では、該追加の剤はキメラ抗原受容体（CAR）である。CARは、免疫エフェクター細胞に特異性を付加した人工T細胞受容体である。このような分子の最も一般的な形態は、モノクローナル抗体に由来する単鎖可変領域断片（scFv）をCD3-ζ膜貫通部および細胞内ドメインと融合させた融合体である。かかる分子により、scFvによるその標的の認識に応答してゼータシグナルの伝達がもたらされる。かかる構築物の一例は14g2a-ζであり、これは、ハイブリドーマ14g2a（これはジシアロガングリオシドGD2を認識する）に由来するscFvの融合体である。T細胞がこの分子を発現している場合（通常、オンコレトロウイルスベクターによる形質導入によってなされる）、これは、GD2を発現している標的細胞（例えば、神経芽細胞腫細胞）を認識して死滅させる。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域部分は柔軟性のリンカーによって融合されてscFvが形成される。このscFvは、新生タンパク質を小胞体に向け、続いて表面発現を指令するシグナルペプチド（これは切断される）の前に置かれる。柔軟性のスペーサーにより、scFvが、抗原結合を可能にするいろいろな方向に向くことが可能になる。膜貫通ドメインは、通常、シグナル伝達する細胞内ドメインの元の分子に由来し、該細胞内に陥入して所望のシグナルを伝達する典型的な疎水性のαへリックスである。
【０１２９】
V.治療方法
本方法および組成物は、がんを処置するための方法に関する。一部の態様では、該がんは固形腫瘍を含む。一部の態様では、該がんは非リンパ系である。一部の態様では、該がんは黒色腫または大腸がんである。
【０１３０】
本開示の組成物は、インビボ、インビトロまたはエクスビボでの投与に使用され得る。該組成物の投与経路は、例えば腫瘍内、皮内、皮下、静脈内、リンパ管内および腹腔内投与であり得る。一部の態様では、投与は静脈内または腫瘍内またはリンパ管内または腫瘍周囲である。一部の態様では、該組成物は、がん組織またはリンパ節内に直接投与される。
【０１３１】
「腫瘍」は、本明細書で用いる場合、悪性であれ良性であれ、あらゆる新生細胞の成長および増殖、ならびにあらゆる前がん性およびがん性の細胞および組織をいう。用語「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」および「腫瘍」は、本明細書で言及している場合、相互に排他的でない。
【０１３２】
処置に適したがんとしては、非限定的に、あらゆる型、位置、サイズおよび特徴の腫瘍が挙げられる。本開示の方法および組成物は、例えば以下の処置に適している:黒色腫、大腸がん、膵がん、結腸がん、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん、AIDS関連がん、AIDS関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、小児の小脳または大脳の基底細胞がん、胆管がん、肝外膀胱がん、骨のがん、骨肉腫/悪性線維性組織球腫、脳幹膠腫、脳腫瘍、小脳の星状細胞腫脳腫瘍、大脳の星状細胞腫/悪性膠腫脳腫瘍、上衣細胞腫脳腫瘍、髄芽細胞腫脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉腫瘍脳腫瘍、視覚伝導路および視床下部の膠腫、乳がん、特定の乳がん、例えば非浸潤性乳管がん、浸潤性乳管がん、乳房の管状腺がん、乳房の髄様がん、乳房の粘液性がん腫、乳房の乳頭状がん、乳房の篩状がん、浸潤性小葉がん、炎症性乳がん、非浸潤性小葉がん、男性の乳がん、乳頭のページェット病、乳房の葉状腫瘍、再発性および/または転移性乳がん、ルミナルAまたはB型乳がん、トリプルネガティブ/基底細胞様乳がん、およびHER2過剰型乳がん、リンパ系のがん、気管支腺腫/カルチノイド、気管がん、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、小児のカルチノイド腫瘍、原発不明の胃腸のがん、中枢神経系のリンパ腫、原発性の小脳の星状細胞腫、小児の大脳の星状細胞腫/悪性膠腫、小児の子宮頸がん、小児のがん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、皮膚T細胞性リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣細胞腫、食道がん、ユーイング、小児の性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、目のがん、網膜芽細胞腫、胆嚢がん、胃（gastric/stomach）がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（GIST）、胚細胞腫瘍:頭蓋外、性腺外または卵巣、妊娠性絨毛性腫瘍、脳幹の膠腫、膠腫、小児の大脳の星状細胞腫、小児の視覚伝導路および視床下部の膠腫、胃カルチノイド、ヘアリー細胞白血病、頭頸部がん、心臓のがん、肝細胞（肝）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、視床下部および視覚伝導路の膠腫、小児の眼内黒色腫、膵島細胞がん（内分泌膵）、カポジ肉腫、腎がん（腎細胞がん）、喉頭がん、白血病、急性リンパ芽球性（急性リンパ性白血病とも称される）白血病、急性骨髄性（myeloid）（急性骨髄性（myelogenous）白血病とも称される）白血病、慢性リンパ性（慢性リンパ性白血病とも称される）白血病、慢性骨髄性（myelogenous）（慢性骨髄性（myeloid）白血病とも称される）白血病、ヘアリー細胞口唇および口腔のがん、脂肪肉腫、肝がん（原発性）、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、リンパ腫、AIDS関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚T細胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキン（ホジキン以外のすべてのリンパ腫の古い分類）リンパ腫、中枢神経原発リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨の悪性線維性組織球腫/骨肉腫、小児の髄芽細胞腫、眼内（目の）黒色腫、メルケル細胞がん、成人の悪性中皮腫、小児の中皮腫、転移性頸部扁平上皮（squamous neck）がん、口腔（mouth）がん、多発性内分泌腫瘍症、多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成/骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病、成人の急性骨髄性白血病、小児の急性骨髄性白血病、多���性骨髄腫、慢性骨髄増殖性障害、鼻腔および副鼻腔のがん、鼻咽腔がん、神経芽細胞腫、口腔（oral）がん、口腔咽頭がん、骨肉腫/骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん（表層上皮性・間質性腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵がん、膵島細胞副鼻腔および鼻腔のがん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体の星状細胞腫、松果体胚腫、松果体芽腫およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、小児の下垂体腺腫、形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫、胸膜肺芽細胞腫、中枢神経原発リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん（腎がん）、腎盂および尿管の移行上皮がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、小児の唾液腺がん肉腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、子宮のセザリー症候群肉腫、皮膚がん（非黒色腫）、皮膚がん（黒色腫）、皮膚がん、メルケル細胞小細胞肺がん、小腸のがん、軟部組織肉腫、扁平上皮がん、原発不明の頸部扁平上皮がん、転移性胃がん、テント上原始神経外胚葉腫瘍、小児のT細胞リンパ腫、精巣がん、喉のがん、胸腺腫、小児の胸腺腫、胸腺がん、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、子宮内膜の子宮肉腫、膣がん、視覚伝導路および視床下部の膠腫、小児の外陰がん、ならびにウィルムス腫瘍（腎がん）。
【０１３３】
VI.薬学的組成物および方法
一部の態様では、薬学的組成物が対象に投与される。いろいろな局面が、有効量の組成物を対象に投与することを伴う。一部の態様では、抗がん剤を含む組成物が対象または患者に、がんを処置するため、または腫瘍の大きさを小さくするために投与され得る。さらに、かかる化合物を、追加のがん治療と併用して投与してもよい。
【０１３４】
組成物は非経口投与のために製剤化され得る、例えば、静脈内、経カテーテル注射、動脈内注射、筋肉内、皮下またはさらには腹腔内経路による注射のために製剤化され得る。典型的には、かかる組成物は、液状の液剤または懸濁剤のいずれかとしての注射用剤として調製され得;また、注射前に液体を添加して液剤または懸濁剤を調製するための使用に適した固形形態を調製してもよく;また、該調製物を乳化させてもよい。かかる製剤の調製は、本開示に鑑みると当業者にはわかるであろう。他の投与経路としては、腫瘍内、腫瘍周囲、リンパ管内、がん組織内への注射およびリンパ節内への注射が挙げられる。一部の態様では、投与は全身性である。
【０１３５】
他の投与経路もまた想定される。例えば、本構築物および剤は担体を伴って投与され得る。一部の態様では、担体はナノ粒子またはマイクロ粒子である。一部の態様では、ナノ粒子またはマイクロ粒子は腫瘍指向性ナノ粒子またはマイクロ粒子である。例えば、担体は、該担体を腫瘍に指向するターゲティング部分をさらに含み得る。該ターゲティング部分は、腫瘍細胞を特異的に認識する結合剤（例えば抗体、例えばscFvなど、または他の抗原結合剤）であり得る。一部の態様では、構築物は担体内に封入される。一部の態様では、構築物は担体表面に共有結合または非共有結合される。一部の態様では、担体はリポソームである。
【０１３６】
粒子は、ミクロスフェア、マイクロ粒子、ナノ粒子、ナノスフェアまたはリポソームとして種々の公知のいろいろな寸法の構造を有し得る。かかる微粒状製剤は、構築物の該粒子との共有結合性または非共有結合性カップリングによって形成され得る。
【０１３７】
「粒子」、「マイクロ粒子」、「ビーズ」、「ミクロスフェア」および文法的等価物は、本明細書では、対象に投与可能な小さな離散型粒子を意図する。一部の特定の態様では、粒子は実質的に球状の形状である。用語「実質的に球状の」とは、本明細書で用いる場合、粒子の形状が球体から約10％より大きく外れないことを意味する。
【０１３８】
粒子は典型的には、実質的に球状のコアと任意で1つまたは複数の層からなる。コアはサイズおよび組成がさまざまであり得る。コアに加えて、粒子は、関心対象の用途に適切な機能性をもたらすための1つまたは複数の層を有し得る。層（存在する場合）の厚さは、具体的な用途の必要性に応じてさまざまであり得る。例えば、層は有用な光学特性を付与し得る。
【０１３９】
また、層は、化学的または生物学的機能性を付与し得、本明細書において化学的活性層または生物学的活性層と称し、このような機能性のため、1つまたは複数の該層は典型的には、厚さが約0.001マイクロメートル（1ナノメートル）〜約10マイクロメートルまたはそれ以上（所望の粒子直径に応じて）の範囲であり得、このような層は、典型的には粒子の外面上に適用される。
【０１４０】
コアおよび層の組成はさまざまであり得る。粒子またはコアの好適な材料としては、非限定的に、ポリマー、セラミック、ガラス、鉱物などが挙げられる。例としては、非限定的に、標準ガラスおよび特殊ガラス、シリカ、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、アクリルポリマー、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、フルオロポリマー、シリコーン、セルロース、シリコン、金属（例えば、鉄、金、銀）、鉱物（例えば、ルビー）、ナノ粒子（例えば、金ナノ粒子、コロイド粒子、金属酸化物、金属硫化物、金属セレン化物、および磁性材料、例えば酸化鉄）、ならびにその複合材が挙げられる。コアは、所望される特性に応じて均一な組成であっても、2種類以上の類型の材料の複合材であってもよいであろう。一部の特定の局面では、金属ナノ粒子が使用される。このような金属粒子または金属ナノ粒子はAu、Pt、Pd、Cu、Ag、Co、Fe、Ni、Mn、Sm、Nd、Pr、Gd、Ti、Zr、SiおよびIn、前駆体、その二元合金、その三元合金ならびにその金属間化合物で形成され得る。米国特許第6,712,997号（これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）を参照のこと。
【０１４１】
先に記載のように、粒子はコアに加えて1つまたは複数の層を含み得る。マイクロ粒子に層を含める目的はさまざまであり得る。あるいはまた、粒子表面を直接官能化してもよい。層は、化学結合部位またはカップリング部位のための化学官能部を結合させるのに好適な表面をもたらし得る。
【０１４２】
層はマイクロ粒子上に、当業者に公知のさまざまな様式で作製され得る。例としては、例えばIler（1979）;Brinker and Scherer（1990）に記載のゾル-ゲルケミストリー手法が挙げられる。粒子上に層を作製するためのさらなるアプローチとしては、例えばPartch and Brown（1998）;Pekareket al.（1994）;Hanprasopwattana（1996）;Davies（1998）;およびこれらに記載の参考文献に記載の表面化学および封入の手法が挙げられる。また、蒸着手法も使用され得る;例えば、Golman and Shinohara（2000）;および米国特許第6,387,498号を参照のこと。さらに他のアプローチとしては、例えばSukhorukov et al.（1998）;Caruso et al.（1998）;Caruso et al.（1999）;米国特許第6,103,379号およびこれらに挙げられた参考文献に記載の交互積層法手法が挙げられる。
【０１４３】
粒子は、米国特許第4,589,330号または第4,818,542号に教示されているように、構築物およびポリマーを含む水性相と非水性相とを接触させた後、非水性相をエバポレーションして水性相の粒子の融着を引き起こすことにより形成され得る。かかる調製物のための好ましいポリマーは、ゼラチン寒天、デンプン、アラビノガラクタン、アルブミン、コラーゲン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコリド-L(-)ラクチドポリ（ε-カプロラクトン、ポリ(ε-カプロラクトン-コ-乳酸)、ポリ(ε-カプロラクトン-コ-グリコール酸)、ポリ(β-ヒドロキシ酪酸)、ポリエチレンオキシド、ポリエチレン、ポリ(アルキル-2-シアノアクリレート)、ポリ(ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリアミド、ポリ(アミノ酸)、ポリ(2-ヒドロキシエチルDL-アスパルタミド)、ポリ(エステルウレア)、ポリ(L-フェニルアラニン/エチレングリコール/1,6-ジイソシアナトヘキサン)およびポリ(メチルメタクリレート)からなる群より選択される天然または合成のコポリマーまたはポリマーである。特に好ましいポリマーはポリエステル、例えばポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコリド-L(-)ラクチドポリ（ε-カプロラクトン、ポリ(ε-カプロラクトン-コ-乳酸)およびポリ(ε-カプロラクトン-コ-グリコール酸である。ポリマーを溶解させるために有用な溶媒としては:水、ヘキサフルオロイソプロパノール、メチレンクロライド、テトラヒドロフラン、ヘキサン、ベンゼンまたはヘキサフルオロアセトンセスキ水和物が挙げられる。
【０１４４】
注射用の使用に適した医薬形態としては、滅菌された水性の溶液または分散液;ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む配合物;および滅菌注射用液剤または分散剤の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。すべての場合において、該形態は、滅菌していなければならず、容易に注射され得る程度に流動性でなければならない。また、製造および保存の条件下で安定であるのがよく、微生物、例えば細菌および真菌の汚染作用から保護されていなければならない。
【０１４５】
また、担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコールなど）、その適当な混合物ならびに植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適正な流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンの使用によって、分散剤の場合は必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の抑制は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張性剤、例えば糖類、塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、該組成物中における吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。
【０１４６】
滅菌注射用液剤は、必要とされる量の活性化合物を、上記に列挙した種々のその他の成分を必要に応じて有する適切な溶媒中に組み込んだ後、濾過滅菌することにより調製される。一般的に、分散剤は、種々の滅菌活性成分を、ベースの分散媒および上記に列挙したもののうちの必要とされるその他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことにより調製される。滅菌注射用液剤の調製用の滅菌粉末剤の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥手法であり、これにより、活性成分＋さらなる所望の成分（あれば）の粉末が、先に滅菌濾過したその溶液から得られる。
【０１４７】
本明細書で用いる場合、用語「薬学的に許容される」とは、化合物、物質、組成物および/または投薬形態が、正しい医学的判断の範囲内において、人間および動物の組織との接触に適しており、過度な毒性、刺激、アレルギー応答または問題となる他の合併症がなく、妥当な便益/リスク比と釣り合っていることをいう。用語「薬学的に許容される担体」は、化学剤の担持または輸送に関与する薬学的に許容される物質、組成物または媒体、例えば液状または固形の増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材を意味する。
【０１４８】
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される塩」は、親化合物を、存在している酸部分または塩基部分をその塩形態に変換させることにより修飾した本開示の化合物の誘導体をいう。薬学的に許容される塩の例としては、非限定的に、アミンなどの塩基性残基の鉱酸または有機酸の塩;カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩;などが挙げられる。薬学的に許容される塩としては、例えば非毒性の無機酸または有機酸で形成される親化合物の慣用的な非毒性の塩または第4級アンモニウム塩が挙げられる。薬学的に許容される塩を、塩基性部分または酸性部分を含む親化合物から、慣用的な化学的方法によって合成してもよい。
【０１４９】
対象の体調に応じて投薬量におけるいくらかの変動が必然的に生じる。投与を担う人は、任意の事象において個々の対象に適切な用量を決定する。治療用または予防用組成物の有効量は、意図された目的に基づいて決定される。用語「単位用量」または「投薬量」は、対象における使用に適した物理的に独立した単位をいい、各単位は、その投与、すなわち適切な経路およびレジメンを伴って上記に論考した所望の応答がもたらされるように計算された所定量の該組成物を含む。投与される量は、処置回数および単位用量の両方に従って所望される効果に依存する。また、該組成物の厳密な量は実務者の判断にも依存し、各個体に固有である。用量に影響を及ぼす要素としては、対象の身体の状態および臨床状態、投与経路、意図される処置目的（症状の緩和か治癒か）、ならびに具体的な組成物の効力、安定性および毒性が挙げられる。
【０１５０】
液剤は、製剤化されたら、投薬製剤に適合する様式で、治療的または予防的に有効であるような量で投与される。製剤は、さまざまな剤形で、例えば上記の型の注射用液剤で容易に投与される。
【０１５１】
典型的には、ヒト成人（およそ70キログラムの体重）に対して、約0.1 mg〜約3000 mg（その間のあらゆる値および範囲を含む）、または約5 mg〜約1000 mg（その間のあらゆる値および範囲を含む）、または約10 mg〜約100 mg（その間のあらゆる値および範囲を含む）の化合物が投与される。このような投薬量範囲は一例にすぎないこと、および投与は、当業者に公知の要素に応じて調整され得ることが理解されよう。
【０１５２】
一部の特定の態様では、対象におよそ、少なくとも約、または最大約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7.3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0.19.5、20.0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、410、420、425、430、440、441、450、460、470、475、480、490、500、510、520、525、530、540、550、560、570、575、580、590、600、610、620、625、630、640、650、660、670、675、680、690、700、710、720、725、730、740、750、760、770、775、780、790、800、810、820、825、830、840、850、860、870、875、880、890、900、910、920、925、930、940、950、960、970、975、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000ミリグラム（mg）またはマイクログラム（mcg）またはμg/kgまたはマイクログラム/kg/分またはmg/kg/分またはマイクログラム/kg/時またはmg/kg/時で、あるいはその中で導出可能な任意の範囲で投与される。
【０１５３】
投薬は頓用で行なわれ得るか、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18もしくは24時間毎に（あるいはその中で導出可能な任意の範囲）または1日に1、2、3、4、5、6、7、8、9回もしくはそれ以上（あるいはその中で導出可能な任意の範囲）行なわれ得る。投薬は、病状の徴候の前または後に最初に行なわれてもよい。一部の態様では、患者は、レジメンの初回投薬を、該患者が病状の徴候または症状を起こすかまたは示してから1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12時間後（あるいはその中で導出可能な任意の範囲）または1、2、3、4または5日後（あるいはその中で導出可能な任意の範囲）に行なわれる。患者は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10日間もしくはそれ以上（あるいはその中で導出可能な任意の範囲）、または病状の症状が消失もしくは低減されるまで、または感染の症状が消失もしくは低減してから6、12、18もしくは24時間後または1、2、3、4もしくは5日後まで、処置され得る。
【実施例】
【０１５４】
VII.実施例
以下の実施例は、本開示の好ましい態様を実証するために含めている。当業者には、以下の実施例に開示した手法が、本発明者が、本開示の実施において充分に機能を果たすと見出した手法であり、したがって、その実施のための好ましい形態を構成しているとみなされ得ることが認識されよう。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みると、開示している具体的な態様において、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく多くの変更が行なわれ得るが、それでもなお同様または類似の結果が得られることが認識されるはずである。
【０１５５】
実施例1
改変操作型コラーゲン結合インターロイキン-2は抗腫瘍有効性の向上および有害事象の低減を示す
インターロイキン-2（IL-2）を用いたサイトカイン免疫療法では、動物モデルおよび臨床において相当な抗腫瘍活性が示されている。ここで、本発明者らは、IL-2をフォン・ヴィレブランド因子（vWF）A3ドメイン由来のコラーゲン結合ドメイン（CBD）との融合タンパク質に改変操作した;この融合タンパク質は静脈内投与され得、血中タンパク質が腫瘍間質に到達するのを許容する漏出性血管系を経由して腫瘍微小環境をターゲティングする。ここで、本発明者らは、CBDタンパク質の腫瘍組織内局在を示す。CBD-IL-2は、注射後の血清中において血清炎症性サイトカイン濃度の低減を示した。CBD-IL-2は、野生型IL-2と比べて マウスの黒色腫モデルおよび結腸がんモデルにおいて腫瘍の増殖を有意に遅延させた。改変操作型コラーゲン結合サイトカインのシンプルで応用可能なこのアプローチは、がん免疫療法に対する新規なアプローチである。
【０１５６】
A.結果
CBD融合IL-2はコラーゲンおよびその受容体に結合する
本発明者らはまず、コラーゲンに対するCBD融合IL-2組換えタンパク質（CBD-IL-2）の結合能をインビトロで調べた。CBD融合IL-2を設計し、組換え発現させた（図1A）。SDS-PAGEにより、IL-2の分子量がCBD融合によって増大していることが示された（図1B）。CBD-IL-2はI型およびIII型コラーゲンに強い結合親和性（nM範囲の解離定数（KD）値）で結合した（図1C〜1D）。それと比べ、野生型IL-2は、これらのコラーゲンに結合しなかった。重要なことに、CBD-IL-2はIL-2Rαに野生型IL-2と同様のKD値で結合した。また、CBD-IL-2は、IL-2依存性NK細胞株であるCTLL-2細胞株の細胞増殖を誘導し、野生型形態と同様の効果を有した（図1E）。総合すると、このようなデータにより、CBD-IL-2はコラーゲンに、CBDの標的結合能もIL-2ドメインの標的結合能も損なうことなく結合することが示された。
【０１５７】
CBDタンパク質は腫瘍内に局在した
本発明者らは、CBDが静脈内（i.v.）注射後に内因性コラーゲンに結合することによって腫瘍微小環境内に局在するかどうかを調べるため、インビボ体内分布解析を行なった。MMTV-PyMT乳がんをFVBマウスに接種した。腫瘍体積が500 mm3に達したら、DyLight 800標識CBDタンパク質を注射した。注射後2日目、腫瘍ならびに心臓、肺、腎臓、肝臓、脾臓および胃を含む臓器を採取した。蛍光検出により、CBDタンパク質は腫瘍内に優先的に局在することが示された（図2A）。
【０１５８】
CBD融合体は処置関連有害事象を減少させる
CBDタンパク質が腫瘍内に局在したため、注射後のCBD-IL-2の副作用は、腫瘍による競合および対応する全身曝露の低減のためIL-2と比べて少ないであろうという仮説をたてた。CBD-IL-2およびIL-2をB16F10黒色腫接種後4日目に投与し、次いで血清中のサイトカイン濃度を注射後24時間目に調べた。野生型IL-2投与では血清中のIFNγ濃度が上昇したが、CBD-IL-2では増大しなかった（図2B）。この結果は、CBD融合体によってIL-2の全身毒性が低減され得ることを示す。
【０１５９】
CBD-IL-2はIL-2と比べてB16F10腫瘍およびCT-26腫瘍の増殖を有意に抑制する
本発明者らはCBD-IL-2の抗腫瘍有効性を、B16F10黒色腫およびCT26結腸がんを用いて調べた。B16F10細胞の接種後4日目、6μgのIL-2または12μg（同等のモル濃度）のCBD-IL-2を注射した。この用量で、野生型IL-2処置では明白な抗腫瘍効果は示されず、一方、CBD-IL-2処置では腫瘍サイズの縮小が誘導された（図3A）。CT26細胞の接種後5日目、6μgのIL-2または12μg（同等のモル濃度）のCBD-IL-2を注射した。この場合もCBD-IL-2ではCT26腫瘍の増殖が示されたが、IL-2では示されなかった（図3B）。このような一連のデータにより、CBD-IL-2療法は、その野生型形態と比べて卓越した抗腫瘍効果を有することが示された。
【０１６０】
局在的がん治療のストラテジーは能動的ターゲティングおよび受動的ターゲティングとして分類され得る（Danhier et al.,J Control Release 148:135-46,2010）。抗体-薬物コンジュゲートは能動的ターゲティングの一例である。ターゲティングは、腫瘍特異的または腫瘍細胞特異的である特定のリガンド（例えば、抗体）に対する薬物の結合に基づいたものであり（Chari et al.,Angew Chem Int Ed Engl 53:3796-827,2014）、がんの薬が腫瘍細胞表面に特異的に送達されるのを助長する。受動的ターゲティングの一例はナノ粒子担体内に包埋させた薬物である。ナノ粒子は血中で長い半減期を有し、透過性および保持（EPR）効果の向上により、血管系が漏出性である腫瘍内への蓄積をもたらすことが予測される（Maeda et al.,J Control Release 65:271-84,2000;Swartz and Fleury,Annu Rev Biomed Eng 9:229-56,2007）。したがって、能動的ターゲティングは、薬学的担体の血中での長寿命および変則的な血管系を有する病的部位内への蓄積、したがって蓄積の増大に基づいたものである。
【０１６１】
本出願において提案するコラーゲン結合ドメイン（CBD）ベース薬物ターゲティングアプローチは能動的ターゲティングと同様であるが、腫瘍の血管の漏出性構造も利用する（Nagy et al.,British journal of cancer 100:865,2009;正常組織内ではコラーゲンの露出はごくわずかである（Dubois et al.,Blood 107:3902-06,2006;Bergmeier and Hynes,Cold Spring Harb Perspect Biol 4:a005132,2012）が、腫瘍内ではその漏出性血管系により実際コラーゲンが露出する（Liang et al.,Journal of controlled release 209:101-09,2015;Liang et al.,Sci Rep 6:18205,2016;Yasunaga et al.,Bioconjugate chemistry 22:1776-83,2011;Xu et al.,The Journal of cell biology 154:1069-80,2001;Swartz and Lund,Nat Rev Cancer 12:210-19,2012）。したがって、CBD融合体は腫瘍微小環境特異的であるが、腫瘍内（実際、コラーゲンはほぼ至る箇所に存在している）に特異的に存在する分子をターゲティングすることによるものではなく、腫瘍の漏出性血管系によって露出された分子のみをターゲティングすることによるものである。また、これは、両者の利点を用いたハイブリッドアプローチであり得る。
【０１６２】
vWF A3ドメインとコラーゲンとの会合は血栓形成カスケードの開始因子であり、したがって、この結合はヒトの体内で一般的に起こる（Shahidi、Advances in experimental medicine and biology 906:285-306,2017）。本研究において、本発明者らは、vWF A3ドメインをCBDとして用いてがんの微小環境をターゲティングするがん免疫療法を開発した。
【０１６３】
以前に、腫瘍特異的フィブロネクチンドメインに対する一本鎖抗体断片とサイトカインとを融合させる腫瘍マトリックスターゲティングアプローチが動物モデルおよび臨床試験において試験されている（Carnemolla et al.,Blood 99:1659-65,2002;Eigentler et al.,Clinical cancer research 17:7732-42,2011;Ferrari et al.,Drug Discov Today 21:172-79,2016）。フィブロネクチンのエクストラドメインA（EDA）とEDBドメインは腫瘍では発現されるが正常組織では発現されない（Rybak et al.,Cancer Res 67:10948-957,2007;Villa et al.,Int J Cancer 122:2405-13,2008）。フィブロネクチンのEDAおよびEDBドメインに対する一本鎖抗体は、全身注射後、EDAおよびEDB標的のこの腫瘍特異的存在により腫瘍内に局在する（Carnemolla et al.,Blood 99:1659-65,2002;Rybak et al.,Cancer Res 67:10948-957,2007）。一本鎖抗体とIL-2との融合タンパク質は、マウスモデルにおいて通常のIL-2と比べて向上した抗腫瘍有効性を示した（Carnemolla et al.,Blood 99:1659-65,2002）。
【０１６４】
コラーゲンは、ヒト体内に最も豊富に存在するタンパク質であり（Addi et al.,Tissue Engineering Part B:Reviews,2016;Di Lullo et al.,Journal of Biological Chemistry 277:4223-31,2002）、特に腫瘍は正常組織より多くのコラーゲンを含有している（Zhou et al.,J Cancer 8:1466-76,2017;Provenzano et al.,BMC Med 6:11,2008）。したがって、CBDアプローチにおいて、標的タンパク質は、フィブロネクチンのEDAドメインおよびEDBドメインと比べてより豊富に存在しているはずである。Liang et al.により、コラーゲン結合短鎖ペプチド（TKKLRT（SEQ ID NO:14））を抗上皮成長因子受容体（EGFR）Fabまたは一本鎖抗体と融合させると、腹腔内注射した場合に該抗体の腫瘍組織内局在が、無処理の抗EGFR Fabまたは一本鎖抗体と比べて改善することが報告されている（Liang et al.,Journal of controlled release 209:101-09,2015;Liang et al.,Sci Rep 6:18205,2016）。このTKKLRTペプチドはファージディスプレイによって見出され、I型コラーゲンに対する報告されているKD値または半数効果濃度（EC50）は0.5〜6μMである（Addi et al.,Tissue Engineering Part B:Reviews,2016）。また、TKKLRT-抗EGFR Fabは、無処理の抗EGFR抗体と比べて向上した抗腫瘍有効性を示した。EGFRでは、この機構は、免疫調節ではなくがん細胞の増殖の直接阻害によって媒介される（Martinelli et al.,Clin Exp Immunol 158:1-9,2009）。本発明者らのアプローチでは、体内に天然に存在しており、したがって免疫原性でないCBDタンパク質を使用する。CBDタンパク質、例えばvWF A3タンパク質は、より特異的なリガンド、例えばペプチド、抗体または抗体断片とは違って、多くの型のコラーゲンに結合する。また、vWF A3ドメインタンパク質は、多くの型のコラーゲンに対して高い親和性（nM範囲のKD）を有する（Addi et al.,Tissue Engineering Part B:Reviews,2016）。したがって、このアプローチは、方法論（低親和性ペプチドドメインに対して、体内に天然に存在するタンパク質に由来する高親和性タンパク質ドメイン）および生物学的アプローチ（体内に豊富に存在するが漏出性血管系を経由して腫瘍内にのみ露出したタンパク質をターゲティングする）の両方において新規である。
【０１６５】
本発明者らは、CBD-IL-2融合体は血清中のIFNγ濃度を上昇させないが野生型IL-2は上昇させることを示した。腫瘍ターゲティングがCBD媒介性であることを考慮すると、これは、競合による腫瘍内へのIL-2の隔離のためかもしれない。CBD-IL-2は腫瘍内に局在し、したがって血中循環系内濃度は低下し、かくして免疫細胞の全身性活性化が回避されることによって全身免疫の恒常性が維持される可能性がある。非修飾IL-2では効果を有しなかった低投薬量で腫瘍増殖が遅延することが本発明者らによって観察されたため、CBD融合体によって投与用量の減量すら可能となり得る。このようなデータは、有害事象のためがん免疫療法が中止となった患者の処置に関して励みになる。
【０１６６】
CBD融合IL-2では、2つの腫瘍モデルにおいて野生型形態と比べて高い抗腫瘍効果が実証された。このようなデータは、vWF A3ドメインによるコラーゲンターゲティングアプローチが複数種の腫瘍に一般的に適用可能であることを示唆する。IL-2は、CD8＋ T細胞およびNK細胞を増幅させることによって抗腫瘍効果を有することが公知である。したがって、腫瘍ターゲティングにより、CBD-IL-2では、その非修飾形態と比べて、より効率的に腫瘍浸潤T細胞およびNK細胞の数が増加し得るかもしれない。
【０１６７】
チェックポイント阻害薬は黒色腫患者に対して承認されており、B16F10黒色腫はチェックポイント非奏効性モデルであるため、本発明者らは、CBD-IL-12によってα-PD-L1抗体の抗腫瘍有効性が増大し得るかどうかに興味をもった。マウスを、7日目に開始した10日毎の3回サイクルで処置した。IL-12注射とα-PD-L1注射は連日行ない、IL-12を先に投与した。α-PD-L1単独は腫瘍の増殖に対してほとんど効果を有しなかった（図4A）。IL-12もCBD-IL-12もどちらも、α-PD-L1との組み合わせで、PBS処置群または抗体処置群のいずれかと比べて有意に腫瘍の増殖を低減させたが、CBD-IL-12の方がより有効に低減させた。CBD-IL-12処置マウスでは全生存期間が有意に長くなり（図4B）、12匹のマウスのうち1匹は疾患が完全に治癒した。
【０１６８】
CBD-IL-12がチェックポイントブロック抗体と相乗作用するかどうかを調べるため、CBD-IL-12単独療法を、α-PD-L1単独またはα-PD-1＋α-CTLA-4との組み合わせでのCBD-IL-12と比較した。マウスはα-PD-L1またはα-PD-1＋α-CTLA-4のいずれにも反応しなかったが、CBD-IL-12単独およびチェックポイントブロック抗体との組み合わせでのCBD-IL-12では腫瘍サイズの堅固な退縮が早い時点で観察された（図5A）。しかしながら、全生存期間は、マウスにα-PD-1＋α-CTLA-4との組み合わせでのCBD-IL-12を投与した場合に有意に改善され、11匹のうち6匹で完全奏効がもたらされた（図5B）。CBD-IL-12をα-PD-L1と併用した場合、10匹のマウスのうち4匹で疾患が完全に治癒したが、CBD-IL-12単独療法群では10匹のマウスのうち1匹しか治癒しなかった。
【０１６９】
結論として、本発明者らは、コラーゲン結合特性を組み込むとIL-2の抗腫瘍効果が向上することを見出した。vWF A3 CBDの融合によりIL-2が増強された。CBD-IL-2は多くの腫瘍モデルで腫瘍の増殖を有意に遅延させた。改変操作型コラーゲン結合サイトカイン免疫療法のこのシンプルなアプローチは、標的指向型がん治療として臨床的に応用される可能性を有し得る。
【０１７０】
B.材料および方法
組換えvWF A3ドメインおよびマウスIL-2タンパク質の産生および精製
タンパク質の産生および精製は既報のとおりに行なった（Martino et al.,Science 343:885-88,2014）。GenscriptでヒトvWF A3ドメイン残基Cys1670〜Gly1874（成熟vWFの907〜1111）、マウスIL-2、ヒトvWF A3ドメインとマウスIL-2の融合タンパク質をコードしている配列が合成され、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1（＋）内にサブクローニングされた。組換えタンパク質のさらなる精製のため、6個のHisをコードしている配列をN末端に付加した。懸濁に適合させたHEK-293F細胞を無血清FreeStyle 293 Expression Medium（Gibco）中に常套的に維持した。トランスフェクションの日、新鮮培地中に、1×106細胞/mlの密度で細胞を接種した。2μg/mlのプラスミドDNA、2μg/mlの線状25 kDaポリエチレンイミン（Polysciences）およびOptiPRO SFM培地（4％終濃度,Thermo Fisher）を逐次添加した。培養フラスコを135 rpmでのオービタルシェイキングにより、5％CO2の存在下、37℃でアジテーションした。トランスフェクション後6日目、細胞培養培地を遠心分離によって収集し、0.22μmフィルターに通して濾過した。培養培地を、AKTA pure 25（GE Healthcare）を用いてHisTrap HP 5 ml容カラム（GE Healthcare）にロードした。カラムを洗浄バッファー（20 mMイミダゾール,20 mM NaH2PO4,0.5 M NaCl,pH7.4）で洗浄した後、タンパク質を500 mMイミダゾール（20 mM NaH2PO4,0.5 M NaCl（pH7.4）中）の勾配で溶出した。溶出液をサイズ排除クロマトグラフィーにより、HiLoad Superdex 200PGカラム（GE healthcare）を用いてさらに精製した。精製工程はすべて4℃で行なった。ラミニンLGドメインの発現をウエスタンブロッティングにより抗Hisタグ抗体（BioLegend）を用いて調べ、SDS-PAGEによりタンパク質が＞90％純粋であることを確認した。
【０１７１】
vWF A3ドメインタンパク質:
2021514661.tif 000040
【０１７２】
マウスIL-2:
2021514661.tif 000041
【０１７３】
vWF A3ドメインとマウスIL-2との融合タンパク質:
2021514661.tif 000042
【０１７４】
ドデシル硫酸ナトリウムアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）
測定は既報のとおりに行なう（Ishihara et al.,Sci Transl Med 9:doi:10.1126/scitranslmed.aan0401,2017）。SDS-PAGEは、4％から20％までの勾配のゲル（Bio-Rad）で行なった。電気泳動後、ゲルをSimplyBlue SafeStain（Thermo Fisher Scientific）で、製造業者の使用説明書に従って染色した。ゲルの画像はChemiDoc XRS＋システム（Bio-Rad）を用いて収集した。
【０１７５】
コラーゲンタンパク質に対するCBD-IL-2結合の検出
測定は既報のとおりに行なう（Ishihara et al.,,Sci Transl Med 9:doi:10.1126/scitranslmed.aan0401,2017）。96ウェルELISAプレート（Greiner Bio One）を、PBS中10μg/mLのコラーゲンI（EMD Millipore）、コラーゲンIII（EMD Millipore）または1μg/mLの組換えマウスIL-2Rα（SinoBiological）で37℃にて1時間コートした後、2％のBSAを含む0.05％のTween 20含有PBS（PBS-T）で室温にて1時間ブロックした。次いでウェルをPBS-Tで洗浄し、10μg/mLのCBD-IL-2または非修飾IL-2とともに室温で1時間さらにインキュベートした。PBS-Tでの3回の洗浄後、ウェルを室温で1時間、ラットIgGに対するHRPコンジュゲート抗体（Jackson ImmunoResearch）とともにインキュベートした。洗浄後、結合されたCBD-IL2およびIL-2を、テトラメチルベンジジン基質を用いて450 nmの吸光度を測定し、570 nmの吸光度を差し引くことによって検出した。見かけの解離定数（KD）値を、1つの部位に特異的に結合すると仮定してPrismソフトウェア（v7,GraphPad Software）の非線形回帰分析により得た。
【０１７６】
増殖アッセイ
CTLL-2細胞（ATCC）を、熱不活化ウシ胎仔血清、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウムおよびペニシリン-ストレプトマイシンならびに組換えマウスIL-2（Peprotech）を補給したRPMI 1640（ATCC）中で培養した。細胞を週に2回、10,000細胞/mLの密度まで継代した。増殖アッセイのため、細胞を100,000細胞/mLで播種し、マウスIL-2およびCBD-IL-2を、IL-2ベースで表示した濃度で、100μLの最終容量で添加した。細胞を48時間増殖させた。増殖は、CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit（Invitrogen）を製造業者の使用説明書に従って用いることによって行なった。蛍光を、BioTek Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader（fisher scientific）を用いて測定した。用量応答曲線フィットを非線形回帰により、GraphPad Prism 7ソフトウェア（GraphPad）を用いて実行した。
【０１７７】
マウスおよび細胞株
マウスおよび細胞株は既報のとおりに調製した（Ishihara et al.,Sci Transl Med 9:doi:10.1126/scitranslmed.aan0401,2017）。8〜12週齢のC57BL/6、FVBおよびBalb/cマウスをJackson laboratoriesから入手した。実験は、シカゴ大学の研究施設内動物実験委員会の承認を得て行なった。B16F10細胞およびCT26細胞をAmerican Type Culture Collectionから入手し、使用説明書に従って培養した。細胞株はすべて、マイコプラズマ汚染について病原体試験IMPACT I（IDEXX BioResearch）によって確認した。
【０１７８】
インビボ体内分布試験
vWF A3ドメインタンパク質をDyLight 800 NHSエステル（Thermo Fisher）を用いて蛍光標識し、未反応色素をZebaspinスピンカラム（Thermo Fisher）により、製造業者の使用説明書に従って除去した。50μLのPBS中に再懸濁させた合計8×105のMMTV-PyMT細胞を各FVBマウスの右側の乳腺脂肪体内に皮下注射した。腫瘍が500 mm3に達したら、50μgのDyLight 800標識CBDを静脈内注射した。注射後48時間目にマウスの臓器を取り出し、Xenogen IVIS Imaging System 100（Xenogen）により以下の条件下:エフ/ストップ:2;光学フィルター励起740 nm;励起800 nm;露光時間:5秒;ビニング設定small（small binning）でイメージングした。
【０１７９】
血清サイトカイン濃度解析
測定は既報のとおりに行なう（Ishihara et al.,Sci Transl Med 9:doi:10.1126/scitranslmed.aan0401,2017）。5×105のB16F10黒色腫細胞を12週齢の各C57BL/6マウス（The Jackson Laboratory）の背部の左側に皮内注射した。4日後、マウスに6μgのIL-2および12μgのCBD-IL-2を投与した。5日目、血液試料をチューブ内に収集した後、4℃で一晩インキュベーションした。血清中のサイトカイン濃度をReady-SET-Go! ELISAキット（eBioscience）により製造のプロトコルに従って測定した。
【０１８０】
B16F10腫瘍に対するCBD-IL-2の抗腫瘍有効性
測定は既報のとおりに行なう（Ishihara et al.,Sci Transl Med 9:doi:10.1126/scitranslmed.aan0401,2017）。50μLのPBS中に再懸濁させた合計5×105のB16F10細胞を各C57BL/6マウスの背部の左側の皮内に接種した。4日後、マウスにIL-2（6μg）またはCBD-IL-2（12μg）を静脈内注射した。デジタルキャリパーでの腫瘍の測定を腫瘍接種後4日目に開始し、体積を楕円体として算出した。ここで、V＝4/3×3.14×奥行/2×幅/2×高さ/2。いずれかの腫瘍体積が500 mm3超に達した時点でマウスを致死させた。
【０１８１】
CT26腫瘍に対するCBD-IL-2の抗腫瘍有効性
50μLのPBS中に再懸濁させた合計5×105のCT26細胞を各Balb/cマウスの背部の左側の皮内に接種した。5日後、マウスにIL-2（6μg）またはCBD-IL-2（12μg）を静脈内注射した。上記のとおりのデジタルキャリパーでの腫瘍の測定を腫瘍接種後5日目に開始した。いずれかの腫瘍体積が500 mm3超に達した時点でマウスを致死させた。
【０１８２】
統計解析
実験はすべて、少なくとも2回反復する。動物試験のため、IL-2およびCBD-IL-2の注射の直前にマウスをケージ内の処置群に無作為化し、同様に処置した。B16F10腫瘍およびCT26腫瘍について腫瘍サイズが500 mm3超になったときを生存率エンドポイントとした。統計計算に使用したn値は図の説明に示している。実験群間の統計学的有意差をPrismソフトウェア（v7,GraphPad）を用いて調べた。一元配置ANOVAの後にテューキーのHSD事後検定を使用すると、群間分散はブラウン・フォーサイス検定により同様であることがわかった。単回比較では、スチューデントの両側t-検定を使用した。生存曲線を、ログランク（マンテル・コックス）検定を使用することによって解析した。統計計算に使用したn値は図の説明に示している。記号＊および＊＊は、それぞれ0.05未満および0.01未満のP値を示す;N.S.,有意でない。
【０１８３】
試験対象のさらなるサイトカイン
IL-2以外にも、ケモカインを含むいくつかのサイトカインが抗腫瘍有効性を有することが示されており、現在、臨床試験において試験されている（Tokunaga et al.,Cancer treatment reviews 63:40-47,2017;Lin et al.,Cancers（Basel）6:1098-110,2014;Akdis et al.,The Journal of allergy and clinical immunology 127:701-21,2011;Waldmann,Nature reviews.Immunology 6:595-601,2006）。本発明者らは、CBD配列をサイトカインのN末端またはC末端に付加することによって、本発明者らが先のパートでCBD-IL-2を用いて示したように効率的な腫瘍ターゲティングが可能になると予測する。本発明者らは、T細胞を増殖させるサイトカイン:IFNα、IFNβ、IL-15、IL-15スーパーアゴニスト（IL-15とIL-15Rαの融合タンパク質）およびIL-21またはNK細胞:IL-12（Akdis et al.,The Journal of allergy and clinical immunology 127:701-21,2011;Waldmann,Nature reviews.Immunology 6:595-601,2006）を試験する。また、本発明者らは、リンパ脈管新生を誘導して免疫細胞浸潤の亢進をもたらすサイトカインであるVEGF-C（Fankhauser et al.,Sci Transl Med 9:doi:10.1126/scitranslmed.aal4712,2017;Lund et al.,Cell Rep 1:191-99,2012）も試験する。同様に、本発明者らは、報告によると抗腫瘍免疫細胞を腫瘍微小環境内に動員するケモカイン（例えば、XCL1、CCL4、CCL21、CXCL9およびCXCL10）（Tokunaga et al.,Cancer treatment reviews 63:40-47,2017;Lin et al.,Cancers（Basel）6:1098-110,2014）を試験する。
【０１８４】
試験対象のさらなるCBD
vWF A3ドメイン以外にも、タンパク質（vWF A1ドメイン（SEQ ID NO:11）およびデコリン（SEQ ID NO:15））ならびにペプチド（TKKLRT（SEQ ID NO:14））がコラーゲンに結合することが示されている（Addi et al.,Tissue Engineering Part B:Reviews,2016）。vWF A1ドメインおよびデコリンはvWF A3ドメインタンパク質と同様の分子量のタンパク質であり、vWF A3ドメインと同様の高い結合親和性を示すため、このようなvWF A1ドメインおよびデコリンの配列をサイトカインのN末端またはC末端に付加することによっても、CBD-IL-2で示されたのと同様に腫瘍微小環境がターゲティングされることが予測される。しかしながら、TKKLRT配列をサイトカインのN末端またはC末端に付加しても、その小さい分子量および低いコラーゲン親和性（μM範囲のKD）（Addi et al.,Tissue Engineering Part B:Reviews,2016）のため腫瘍微小環境ターゲティング能は示されないであろうと予想される。したがって、TKKLRT配列を付加してもサイトカインの抗腫瘍活性は改変されないであろう。
【０１８５】
CBD融合サイトカインの産生および精製
上記のCBD-IL-2のパートに記載のように、CBDをコードしている配列は哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1（＋）内にクローニングおよびサブクローニングされる。ヒスチジンタグがタンパク質配列のN末端またはC末端に付加される。このCBD融合サイトカイン組換えタンパク質を、懸濁に適合させたHEK-293F細胞内で無血清FreeStyle 293 Expression Medium中で発現させる。産生された組換えタンパク質は、ヒスチジンタグ化タンパク質精製カラムおよびサイズ排除を用いて精製される。
【０１８６】
腫瘍接種および静脈内注射による免疫調節抗体での処置
腫瘍細胞（例えば、B16F10）を皮内（id）に接種する。腫瘍が視認可能になったら、マウスに尾静脈からCBD-サイトカインまたは野生型サイトカインの静脈内注射を行なう。腫瘍サイズを、安楽死基準に達するまでモニタリングする。ここで、本発明者らは、CBD-サイトカインの静脈内注射により腫瘍微小環境内のコラーゲンとの結合によって腫瘍組織内における局在および保持の向上が示されると予測する。IL-2のパートで上記したのと同様の機構により、CBD融合体は腫瘍微小環境内のサイトカイン濃度を上昇させ、副作用の発生数の低減をもたらし、サイトカイン/ケモカインの抗腫瘍有効性を増強させる。
【０１８７】
実施例2
腫瘍標的指向型ケモカイン送達によるCD103＋ DCの動員によってチェックポイント阻害薬での免疫療法の有効性が増強される
A.結果
CBD-CCL4組換えタンパク質を既報（Ishihara et al.,Sci Transl Med,2019）と同様の哺乳動物タンパク質発現手法を用いて産生させた。産生およびアフィニティ/サイズ排除クロマトグラフィーを用いた精製後、CBD-CCL4を、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を用いて評価した。CBDとの融合により、CCL4の分子サイズは天然状態の（WT）CCL4と比べて、vWFのA3ドメインのサイズと合致するおよそ20 kDa増大した（図6A）。表面プラズモン共鳴（SPR）を使用し、コラーゲンIおよびコラーゲンIIIに対する親和性は、それぞれ33.4 nMおよび14.5 nMと算出された（図6B、6C）。このような結果は、CBD修飾型免疫療法薬での以前のコラーゲン親和性と一致する（Ishihara et al.,Sci Transl Med,2019）。CCL4はGタンパク質共役受容体（GPCR）CCR5を介してシグナル伝達し（Alkhatib,Curr Opin HIV AIDS 4,96-103,2009）、活性化が起こるとカルシウム放出をもたらすため、次に、WT CCL4およびCBD-CCL4の活性をカルシウム流量アッセイを用いて評価した（図6D）。天然状態のCCL4およびCBD-CCL4はどちらも同様のGPCR活性化レベルを示し、CBD融合体はCCR5を介した自身のシグナル伝達能力を改変しないことが強調された。
【０１８８】
次に、WT CCL4およびCBD-CCL4の血漿薬物動態を、B16F10腫瘍担持マウスでの静脈内投与後に評価した。興味深いことに、CBD-CCL4ではWT CCL4と比べてクリアランスの遅延が示された（図7A）。分子の分子サイズの増大により血液からのそのクリアランスが遅滞し得る;これは、血液循環時間の向上が多くの場合、腫瘍への巨大分子の送達を増強させるのに魅力的であるため、腫瘍ターゲティングに対して重要な意味合いを有することもあり得る（Pisal et al.,J Pharm Sci 99,2557-75,2010）。さらに、循環時間の向上により、漏出性の腫瘍微小血管系内に露出したコラーゲンに結合する機会が増えることが可能となり得る（Ruoslahti et al.,J Cell Biol 188,759-68,2010）。CBD融合体はCCL4の腫瘍送達を向上させることを確認するため、静脈内投与後のEMT6乳がん担持マウスにおいて体内分布試験を行なった。重要なことに、投与の30分後、CBD-CCL4融合体は、腫瘍内蓄積の2.4倍の増加を示した（図7B）。このようなデータは、腫瘍微小環境へのCBD-CCL4の有効な送達を実証している。
【０１８９】
次に、本発明者らは、CPI療法薬に対する好成績の奏効が推進される鍵となる要素である腫瘍免疫浸潤が増強され得るかどうかを調べた。後続の実験ではすべて、CCL4ケモカイン療法薬を、臨床において進行期の黒色腫および非小細胞肺がんに対する併用処置ストラテジーであるαCTLA4＋αPD-L1を含むCPI療法薬（Chae et al.,J Immunother Cancer 6,39,2018;Gong et al.,J Immunother Cancer 6,8,2018）とともに共投与した。CPI療法薬単独をベースライン比較のために含めた。CCL4とCPIとの併用療法薬を、CPI療法薬単独に対して低応答群であることが示された（Lechner et al.,J Immunother 36,477-89,2013）腫瘍モデルであるB16F10黒色腫において評価した。図8Aに示されるように、CBD-CCL4（静脈内注射によって投与）とCPI療法薬（腹腔内（i.p.）注射によって投与）の併用のみで腫瘍の増殖速度の有意な低下が示された。WT CCL4は、CPI療法薬との組み合わせで投与したが、なんら腫瘍の増殖速度の低下を示さなかった。このような結果により、CCL4による治療有益性が誘起されるためには標的指向型ケモカイン送達が必要とされることが確認される。
【０１９０】
腫瘍の増殖の有意な遅滞が観察されたため、腫瘍へのCD103＋ DC動員の亢進が抗腫瘍免疫応答に寄与しているかもしれないという仮説をたてた。処置レジメンの実施後6日目、マウスを致死させ、腫瘍を採取し、腫瘍内の浸潤免疫細胞のフローサイトメトリー解析のために加工処理した。CPI療法薬単独およびWT CCL4との組み合わせで投与されたCPIと比較すると、CBD-CCL4とともに投与されたCPI療法薬では腫瘍内のCD45＋ 免疫細胞の数が有意に増加し（図8B）、微小環境がより炎症性であることが示された。免疫細胞の組成を具体的にみると、CBD-CCL4とともに投与されたCPI療法薬が、CD103＋ DC（図8C）、CD8＋ T細胞（図8D）、ナチュラルキラー（NK）細胞（図8E）ならびに全CD11c＋ DC（図8F）を含む抗腫瘍免疫応答の鍵となる駆動因子の最も高度な浸潤をもたらすことが観察された。また、CD4＋ T細胞も、CPI療法薬とWT CCL4との併用と比べて有意に改善された（図8G）。重要なことに、CD4＋ T細胞の制御性T細胞（Treg）分画の増加は観察されず（図8H）、腫瘍炎症の増大もまたTreg動員を有意に改変しないことが示された。
【０１９１】
抗腫瘍免疫の駆動に対する各細胞集団の寄与をはっきり示すため、免疫細胞浸潤と腫瘍の増殖との間の相関分析を行なった。腫瘍体積と細胞浸潤との間の相関は、CD103＋ DCおよびCD8＋ T細胞で最も強く（図9A、9B）、最も多くの浸潤細胞数で最も小さい腫瘍体積がもたらされた。CD103＋ DCはT細胞浸潤に必要なケモカインを腫瘍内に分泌することが以前に示されているため（Spranger et al.,Cancer Cell 31,711-23 e714,2017）、予測どおり、CD103＋ DCとCD8＋ T細胞との間の有意な正相関が観察された（図9C）。低度だがNK細胞とCD11c＋ DCとの間にもその傾向が観察され（図9D、9E）、これらの細胞型も、CD103＋ DCおよびCD8＋ T細胞より重要性は低いが腫瘍の増殖の制御に重要であることがはっきり示された。さらに、全CD45＋ 免疫細胞と腫瘍の増殖との間に、あまり顕著でない相関が観察され（図9F）、完全免疫浸潤単独では抗腫瘍免疫を駆動するのに充分強くないことが示された。そうではなく、治療効果を最大限にするためには、抗腫瘍免疫を駆動する特定の細胞型が動員されなければならない。
【０１９２】
B16F10黒色腫で観察された免疫浸潤応答を引き続き追跡するため、同様の解析をEMT6乳がんモデルにおいて行なった。EMT6モデルは、CPI療法薬に対して中程度に奏効性であるが、免疫排除（excluded）腫瘍モデルに分類されている（Mariathasan et al.,Nature 554,544-48,2018）。したがって、腫瘍標的指向型CCL4送達によってCD103＋ DC動員がさらに増強され、CPI療法薬の有効性がさらに改善され得るのではないかという仮説をたてた。B16F10黒色腫で観察された結果と同様、CPI療法薬とCBD-CCL4との併用のみで腫瘍の増殖の有意な低減が示された（図10A）。CPI療法薬との組み合わせで投与されたWT CCL4ではCPI療法薬単独と比べて有意な改善は示されなかった。フローサイトメトリーを用いた浸潤免疫細胞の詳細な解析により、CPI療法薬との組み合わせでのCBD-CCL4はCD45＋ 免疫細胞の総数の有意な増加が示すことがわかった（図10B）。具体的には、CBD-CCL4併用療法では、CD103＋ DC、CD8α＋クロスプレゼンテーションDCおよびCD8＋ T細胞の最高値の動員が媒介された（図10C〜10E）。また、全CD11c＋ DCの有意な増加も観察された（図10F）。CBD-CCL4療法ではCD4＋ T細胞の動員は亢進せず、CD4＋ T細胞コンパートメントにおけるTreg分画も高まらなかった（図10G、10H）。総合すると、このような結果はこの場合も、CPI療法薬の有効性を増強させるために鍵となる細胞集団の動員における標的指向型CCL4送達の重要性をはっきり示す。
【０１９３】
B16F10黒色腫における併用療法で早期の時点の腫瘍を処置した場合に見られた結果に促され、CBD-CCL4との組み合わせでのCPI療法薬で確立されたB16F10腫瘍の増殖が遅滞され得るかどうかに関してさらなる調査を行なった。腫瘍をその体積が50 mm3より大きくなるまで進行させた後、CPI療法薬単独またはCPI＋CBD-CCL4で腫瘍を処置した。重要なことに、併用療法では単回投与後に腫瘍の増殖が有意に遅滞した;さらに、併用療法によってマウスの生存期間が長くなり、CPI療法薬とCBD-CCL4とを共投与されたマウスは平均22日間生存したのに対して、CPI療法薬単独では14日間であった（図11）。このような結果を拡張し、本発明者らは、CBD-CCL4が、いくつかの適応症、とりわけ例えば黒色腫、非小細胞肺がん、膀胱がん、腎細胞がんおよび肝細胞がんに対して臨床承認されている別の免疫療法薬である抗プログラム細胞死タンパク質1（αPD-1、CD279）（Gong et al.,J Immunother Cancer 6,8,2018）と相乗作用し得るかどうかに関して調べた。2つの同系結腸がんモデルCT26およびMC38を使用し、αPD-1療法薬とCBD-CCL4との併用では、両方のモデルで、媒介する腫瘍の増殖の速度が最も遅く、抗体療法単独またはWT CCL4との併用と比べて有意に治療有益性が増強されることがわかった（図12）。このような結果は、CBD-CCL4が、治療効果を改善するために多くのCPI抗体療法薬と併用できることをはっきり示す。さらに、CBD-CCL4療法で使用したターゲティングアプローチでは、腫瘍細胞の表面上の特異的タンパク質とは対照的に腫瘍細胞外マトリックスを利用するため、この治療法は、CPI療法薬の有効性を改善するためにいくつかの異なる腫瘍モデルに適用することができる。
【０１９４】
最後に、自然発生乳がんモデルにおける併用療法の有効性を調べた。この時点で、CBD-CCL4の抗腫瘍有効性は、多くの移植性腫瘍モデルにおいて実証されている。著しい場合、このようなモデルは急速に進展し、これが腫瘍の微小血管系の漏出性および不規則性に影響を及ぼし得（Nakamura et al.,Bioconjug Chem 27,2225-38,2016）、本発明者らのコラーゲン結合アプローチによるターゲティングをより受けやすくなる。他方、進展が遅い腫瘍は同じような不規則な血管系を示さない場合があり得（Golombek et al.,Adv Drug Deliv Rev 130,17-38,2018）、CBD-CCL4療法の有効性が限定的となり得る。この試験では、生後6〜7週目頃に乳腺脂肪体に浸潤性乳管がんが発生している雌FVB/N-Tg（MMTV-PyVT）634Mul/J（MMTV-PyMT）マウスを使用した（Fantozzi and Christofori,Breast Cancer Res 8,212,2006;Guy et al.,Mol Cell Biol 12,954-61,1992）。また、このモデルはヒト乳がんに組織学的に類似しており（Lin et al.,Am J Pathol 163,2113-26,2003）、CBD-CCL4併用療法の応用可能性を実証するための好適なモデルとなる。この場合も、CPI療法薬との組み合わせでのCBD-CCL4ではCPI療法薬単独と比べて腫瘍の増殖が遅滞された（図13）。生存期間の結果は有意に異ならなかったが、生存期間の時間の中央値は、併用療法での最初の治療後29日間まで増加したのに対して、CPI療法薬単独では23日間であった。このような結果は、CBD標的指向性が、移植性腫瘍モデルに加えて自然発生腫瘍にも適用できることを実証しており、このアプローチの応用可能性をはっきり示す。投薬レジメンのさらなる最適化により、CBD-CCL4併用療法によってもたらされる有益性がさらに最適化され得る。
【０１９５】
本発明者らは、ケモカインCCL4を用いて腫瘍微小環境にCD103＋ DCを動員することによりCPI免疫療法薬（例えば、αPD-1、αPD-L1およびαCTLA-4）の有効性を増強するための新規な方法の実例を示した。CPI療法薬との組み合わせでのCBD-CCL4では、B16F10腫瘍およびEMT6腫瘍の両方において免疫細胞浸潤が有意に向上し、腫瘍の増殖が遅滞されたが、WT CCL4でもCPI療法薬単独でもそうではなかった。腫瘍免疫細胞組成の詳細な特性評価により、CBD-CCL4併用療法後、CD103＋ DCおよびCD8＋ T細胞の有意な増加が起こることが確認された。この方法は、多くのCPI抗体療法薬との併用に適しており、多くの腫瘍型に適用することができ、がん免疫療法の改善のための有意な臨床応用可能性をはっきりと示している。
【０１９６】
B.材料および方法
組換えVWF A3ドメイン-CCL4融合タンパク質の産生および精製
GenscriptでヒトvWF A3ドメイン残基Cys1670〜Gly1874（成熟vWFの907〜1111）、（GGGS）2リンカーおよびマウスCCL4の融合体をコードしている配列が合成され、pcDNA3.1（＋）CMV駆動型哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。下流での組換えタンパク質の精製のため、6×Hisタグをコードしている配列をN末端に付加した。懸濁に適合させたHEK-293F細胞を、無血清FreeStyle293 Expression Medium（商標）（Gibco）中に維持した。タンパク質の産生は、以前のプロトコル（Ishihara et al.,Sci Transl Med,2019;Ishihara et al.,Nat Commun 9,2163,2018）に従って行なった。簡単には、トランスフェクションの日、細胞を新鮮培地中に1×106細胞/mLの密度で移した。1μg/mLのプラスミドDNAを、OptiPRO（商標）SFM培地（Thermo Fisher）で希釈した2μg/mlの線状25kDaのポリエチレンイミン（Polysciences）と混合し、20分間インキュベートし、細胞に滴下した（4％v/v終濃度）。培養フラスコを加湿オービタルシェイキングインキュベータ内で、5％CO2の存在下、37℃にて135 rpmでアジテーションした。トランスフェクション後6日目、細胞培養培地を収集し、遠心分離し、0.22μmフィルターに通して濾過した。培養培地を、AKTA pure 25（GE Healthcare）を用いてHisTrap（商標）HP 5 mL容カラム（GE Healthcare）にロードした。カラムを洗浄バッファー（20 mMイミダゾール,20 mM NaH2PO4,0.5 M NaCl,pH7.4）で洗浄した後、タンパク質を500 mMイミダゾール（20 mM NaH2PO4,0.5 M NaCl,pH7.4中）の勾配で溶出した。溶出されたタンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーにより、HiLoad（商標）Superdex 200PG カラム（GE Healthcare）を用いてさらに精製した。精製工程はすべて4℃で行なった。CBD-CCL4の発現をウエスタンブロッティングにより抗Hisタグ抗体（BioLegend,クローンJ099B12）を用いて調べ、SDS-PAGEによりタンパク質が＞90％純粋であることを確認した。天然状態の形態のマウスCCL4タンパク質は市販品としてBiolegendから購入した。
【０１９７】
マウスCCL4:
2021514661.tif 000043
【０１９８】
ヒトvWF A3ドメインとマウスCCL4との融合タンパク質:
2021514661.tif 000044
【０１９９】
タンパク質の分子量および純度のSDS-PAGE解析
測定は既報のとおりに行なった（Ishihara et al.,Sci Transl Med 9,2017）。SDS-PAGEは4％から20％までの勾配のゲル（Bio-Rad）で、CCL4またはCBD-CCL4をβ-メルカプトエタノールで還元した後に行なった。電気泳動後、ゲルをSimplyBlue SafeStain（商標）（Thermo Fisher Scientific）で、製造業者の推奨に従って染色した。ゲルの画像はChemiDoc XRS＋システム（商標）（Bio-Rad）を用いて収集した。
【０２００】
SPRを用いたCBD-CCL4のコラーゲン結合の測定
SPR測定は、Biacore X100 SPRシステム（商標）（GE Healthcare）を用いて行なった。コラーゲンIまたはコラーゲンIIIをアミンカップリングにより、CM5チップ（GE Healthcare）上に約1000レゾナンスユニット（RU）で製造業者の使用説明書に従って固定化した。CBD-CCL4を90秒間（コラーゲンIの場合）および30秒間（コラーゲンIIIの場合）、ランニングバッファー中漸増濃度で、30μL/分で流した。各サイクルでのセンサーチップの再生は、50 mM NaOHを用いて行なった。コラーゲンに対するCBD-CCL4の特異的結合は、参照としての非機能化チャネルに対する応答を用いて自動計算された。結合曲線のフィッティングは、BIAevalution（商標）ソフトウェア（GE Healthcare）を用いて行なった。CBD-CCL4結合の結果を、Langmuirの結合速度論（1:1結合）を用いてフィッティングした。
【０２０１】
GPCRカルシウム流量シグナル伝達アッセイ
天然状態の形態のCCL4またはCBD-CCL4との相互作用後のGPCRシグナル伝達を、カルシウム流量アッセイ（FLUOFORTE（商標）Calcium Assay Kit,Enzo Life Sciences）を用いて解析した。アッセイは、少し修正を加えて製造業者のプロトコルに従って行なった。試薬を再構成し、指示どおりに混合し、使用前に室温にした。24時間前に、CCR5を発現することが公知（Gouwy et al.,Eur J Immunol 41、963-73,2011）の1.5×105のThP1ヒト単球を組織培養液処理済み96ウェル丸底プレートの各ウェル内にプレーティングした。アッセイの日、細胞を2000 RPMで2分間スピンダウンし、培地を除去し、細胞を100μLのアッセイバッファー中に再懸濁させた。続いて細胞を37℃で45分間、次いで室温で15分間インキュベートした後アッセイした。次に試料をPBS中にて三連で別々に調製し、次いで、細胞に添加する際に1:4に希釈してCCL4を表示したモル濃度にした。化合物の添加後、充分な混合を確実にするために試料をマルチチャネルピペットを用いて数回混合した後、黒色壁のクリアボトム96ウェルプレートに移した。次いで、Cytation（商標）3マルチモードプレートリーダー（BioTek）を励起波長490 nmおよび発光波長525 nm、底面読み取り光学素子の使用、ゲイン設定100で用いて、カルシウムシグナル伝達を測定した。EC50値は、GraphPad Prism（商標）のlog（試験化合物）対応答を比較する非線形用量応答曲線フィッティングモデルを用いて算出した。
【０２０２】
腫瘍細胞株の培養および維持ならびに動物の調達
細胞はすべて、37℃および5％CO2の加湿インキュベータ内に維持した。細胞は、80〜90％コンフルエンスに達したらTrypLE Express（商標）（Thermo Fisher）を用いて常套的に継代した。B16F10黒色腫およびMC38結腸がん細胞を、10％（v/v）ウシ胎仔血清（FBS,認証済,米国産,熱不活化済,Gibco）および500 U/mL（1％v/v）のペニシリン-ストレプトマイシン（P/S,Gibco）を補給したダルベッコ改変イーグル培地（商標）（DMEM）中に維持した。EMT6乳がん、CT26結腸がんおよびThP1単球細胞を、10％（v/v）のFBSおよび1％（v/v）のP/Sを補給したRPMI1640中に維持した。細胞はすべて、MycoAlert Plus（商標）マイコプラズマアッセイ（Lonza）を用いてマイコプラズマフリーであることを確認した。8週齢〜12週齢の雌のC57BL/6マウスおよびBalb/CマウスをJackson Laboratoriesから入手した。4週齢〜6週齢の雌FVB/N-Tg（MMTV-PyVT）634Mul/J（MMTV-PyMT）マウスをJackson Laboratoriesから入手した。MMTV-PyMTマウスを、少なくとも4つの乳腺脂肪体において腫瘍が触知可能になるまで毎週検査した。マウスはすべて、そのケージ内で使用前に72時間馴化させた。ケージ特異的処置効果を最小限にするため、処置はケージ中で無作為化した。動物実験はすべて、シカゴ大学の研究施設内動物実験委員会の承認を得て、そのポリシーに従って行なった。
【０２０３】
血漿中半減期の特性評価
5×105のB16F10黒色腫細胞を各マウスの背部の左側に皮内注射した。WT CCL4およびCBD-CCL4をDylight（商標）800-NHS（Thermo Fisher）を用いて蛍光標識し、未反応色素をZebaspin（商標）スピンカラム（Thermo Fisher）により、製造業者の使用説明書に従って除去した。4日後、マウスに25μgのWT CCL4-DyLight（商標）800または等価モル（CCL4ベースで25μgまたは93μgの総合タンパク質）のCBD-CCL4-DyLight（商標）800を静脈内注射によって注射した。血液試料を、EDTAの入ったチューブ内に顔面からの採血によって、投与の1分後、5分後、10分後および30分後に収集した。次いで試料を2000 rpmで5分間、遠心分離し、血漿を収集した。血漿中のCCL4の濃度を、LI-COR（商標）Infrared Odyssey（商標）Imagerを用いて測定し、濃度は、標識したWT CCL4またはCBD-CCL4の標準的な希釈列から計算した。血漿中半減期は、1フェーズ減衰（one-phase decay）モデルを使用し、GraphPad Prism（商標）ソフトウェア（Version 7）を用いて求めた。
【０２０４】
EMT6腫瘍担持マウスにおける体内分布解析
WT CCL4またはCBD-CCL4タンパク質をDyLight（商標）647 NHSエステル（Thermo Fisher）を用いて蛍光標識し、未反応色素をZebaspin（商標）スピンカラム（Thermo Fisher）により、製造業者の使用説明書に従って除去した。50μLのPBS中に再懸濁させた合計5×105のEMT6細胞を各Balb/Cマウスの右側の乳腺脂肪体内に皮下注射した。腫瘍がおよそ500 mm3に達したら、25μgのDyLight（商標）647標識CCL4または25μgのDyLight（商標）647標識CBD-CCL4（CCL4ベースで6.7μg）を30分間静脈内注射し、注射後、マウスを致死させ、腫瘍を取り出し、Xenogen IVIS Imaging System（商標）100（Xenogen）により以下の条件下:エフ/ストップ:2;光学フィルター励起640 nm;発光670 nm;露光時間:0.5秒;ビニング設定smallでイメージングした。各腫瘍内のCCL4濃度を、DyLight（商標）647で標識したWT CCL4またはCBD-CCL4の標準的な希釈列を基準にして算出し、腫瘍の重量に対して正規化した。
【０２０５】
B16F10黒色腫における抗腫瘍有効性
50μLのPBS中に再懸濁させた合計5×105のB16F10細胞を各C57BL/6マウスの背部の左側の皮内に接種した。4日（または確立された腫瘍の処置試験では7日）後、マウスに、WT CCL4（25μgを静脈内注射によって投与）または等価モルのCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4,静脈内注射によって投与）を、100μgずつのαPD-L1とαCTLA4とからなるCPI抗体療法薬の腹腔内注射による投与との組み合わせで注射した。CPI療法薬単独を対照として投与した。デジタルキャリパーでの腫瘍の測定を腫瘍接種後4日目に開始し、体積を楕円体として算出した。ここで、V＝4/3×π×奥行/2×幅/2×高さ/2。腫瘍体積が500 mm3を超えたとき、またはマウスが健康不良のため早期除外基準を満たしたとき、マウスを致死させた。細胞浸潤解析の場合は、腫瘍接種後10日目にマウスを致死させた。
【０２０６】
EMT6乳がんにおける抗腫瘍有効性
50μLのPBS中に再懸濁させた合計5×105のEMT6細胞を各Balb/Cマウスの右側の乳腺脂肪体内に皮下注射した。腫瘍接種後6日目および9日目、腫瘍にWT CCL4（25μgを静脈内注射によって投与）または等価モルのCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4、静脈内注射によって投与）を、100μgずつのαPD-L1とαCTLA4とからなるCPI抗体療法薬の腹腔内注射による投与との組み合わせで投与した。CPI療法薬単独を対照として投与した。上記のとおりのデジタルキャリパーでの腫瘍の測定を腫瘍接種後4日目に開始した。腫瘍接種後10日目にマウスを致死させ、免疫細胞浸潤を評価した。
【０２０７】
CT26結腸がんおよびMC38結腸がんにおける抗腫瘍有効性
50μLのPBS中に再懸濁させた合計5×105のCT26細胞またはMC38細胞を各Balb/cマウス（CT26の場合）またはC57BL/6マウス（MC38の場合）の背部の左側の皮内に接種した。5日後、マウスに非修飾CCL4（25μgを静脈内注射によって投与）または等価モルのCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4、静脈内注射によって投与）を、100μgのαPD-1抗体療法薬の腹腔内注射による投与との組み合わせで注射した。上記のとおりのデジタルキャリパーでの腫瘍の測定を腫瘍接種後5日目に開始した。腫瘍体積が500 mm3を超えたとき、マウスを致死させた。
【０２０８】
MMTV-PyMT乳がんにおける抗腫瘍有効性
全腫瘍体積がおよそ100 mm3に達したら、マウスをCBD-CCL4（CCL4ベースで25μgまたは93μgのCBD-CCL4、静脈内注射によって投与）で、100μgずつのαPD-L1とαCTLA4とからなるCPI抗体療法薬の腹腔内注射による投与との組み合わせで処置した。最初の治療後7日目および14日目に同一の処置を行なった。腫瘍をデジタルキャリパーで上記のとおりに隔週で測定し、腫瘍体積が1000 mm3を超えたら、またはマウスに腫瘍量による有害効果が起こったとき、マウスを致死させた。
【０２０９】
免疫細胞解析用の組織および単細胞の調製
B16F10腫瘍およびEMT6腫瘍はどちらも、最初の腫瘍接種後10日目に採取した。細胞単離手順はすべて、既報の方法（Ishihara et al.,Sci Transl Med 9,2017;Ishihara et al.,Sci Transl Med,2019）から適合させた。腫瘍を刻んで小片にした後、2％のFBS含有DMEM中2 mg/mLのコラゲナーゼDおよび40μg/mLのDNase I（Roche）からなる酵素的消化を37℃で30分間、穏やかなアジテーション下で行なった。酵素処理済み腫瘍を70μmセルストレーナーに通して穏やかにばらばらにすることによって単細胞懸濁液を得た。赤血球を、ACK溶解バッファー（Quality Biological）を用いて溶解させた後、細胞を遠心分離し、下流解析のため、2％のFBSを含有するPBSからなるフローサイトメトリー用染色バッファー中に再懸濁させた。
【０２１０】
フローサイトメトリー解析および使用した抗体
腫瘍の単細胞懸濁液は上記のとおりに調製した。すべての実験において、以下の分子:抗マウスCD3（145-2C11,BD Biosciences）、抗マウスCD4（RM4-5,BD Biosciences）、抗マウスCD8α（53-6.7,BD Biosciences）、抗マウスCD25（PC61,BD Biosciences）、抗マウスCD45（30-F11,Biolegend）抗マウスCD44（IM7,Biolegend）、抗マウスCD62L（MEL-14,BD Biosciences）、抗マウスPD-1（29F.1A12,Biolegend）、抗マウスNK1.1（PK136,Biolegend）、抗マウスFoxp3（MF23,BD Biosciences）、抗マウスF4/80（BM8,Biolegend）、抗マウスMHCII（M5/114.15.2,BioLegend）、抗マウスCD11b（M1/70,BioLegend）、抗マウスCD11c（N418,Biolegend）、抗マウスCD19（1D3,BD Biosciences）、抗マウスGr-1（RB6-8C5,Biolegend）および抗マウスCD103（M290,BD Biosciences）に対する抗体を使用した。生細胞/死細胞の判別はFixable Viability Dye eFluor 455（eBioscience）を製造業者の使用説明書に従って用いて行なった;また、非特異的抗体結合を最小限にするためにFC受容体ブロック工程（抗マウスCD16/32,クローン93,Biolegend）を含めた。表面染色は氷上で20分間行ない、細胞内染色はFoxP3-転写因子染色キットを製造業者の使用説明書（eBioscience）に従って用いて行なった。そうでない場合は、試料を2％のパラホルムアルデヒド含有PBS中に固定した。フローサイトメトリー解析はすべて、Fortessa（商標）（BD Biosciences）フローサイトメーターを用いて行ない、FlowJo（商標）ソフトウェア（Tree Star）を用いて解析した。
【０２１１】
統計解析
実験群間の統計学的有意差はPrism（商標）ソフトウェア（v7,GraphPad）を用いて評価した。多重比較では、ブラウン・フォーサイス検定によって群間は同様であることがわかった場合、ANOVAの後にテューキーのHSD事後検定を使用した。ノンパラメトリックデータでは、クラスカル・ウォリス検定の後、ダンの多重比較検定を使用した。2つの群間の比較では、スチューデントの両側t-検定を使用した。生存曲線はログランク（マンテル・コックス）検定を用いて解析した。*p＜0.05;**p＜0.01;***p＜0.001;****p＜0.0001。
【０２１２】
一部の特定の態様を、ある程度具体的に、または1つもしくは複数の個々の態様を参照しながら上記に説明したが、当業者であれば、本開示の態様に対して、本発明の範囲を逸脱することなく数多くの変形を行なうことができよう。さらに、同等または異なる特性を有し、同じまたは異なる問題に対処するさらなる実施例を形成するために、適切な場合は上記の任意の実施例の諸局面を記載の任意のその他の実施例の諸局面と組み合わせてもよい。同様に、上記の有益性および利点は一態様に関連していてもよく、いくつかの態様に関連していてもよいことは理解されよう。特許出願公開公報または他の刊行物に対する言及はいずれも、該公開公報/刊行物の開示内容の参照により本明細書に具体的に組み入れられる。特許請求の範囲は、ミーンズ-プラス-ファンクション限定またはステップ-プラス-ファンクション限定を、所与の請求項にそれぞれ、語句（1つまたは複数）「〜のための手段（means for）」または「〜のための工程（step for）」を用いて明示していない限り、かかる限定を含むと解釈されるべきでない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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