(57)【要約】  本発明は、治療有効量のＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤を、肝疾患を患う被験者に投与する工程を含む、該被験者を処置するための方法に関する。本発明者らは、ツニカマイシンにより処置されたＢＩ−１−/−マウスの肝臓では、ＩＲＥ１α依存性ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化、肝細胞死、線維症、及び脂質恒常性の調節不全により、１週間以内に肝不全に至ることを示した。ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性の薬理学的阻害が、ＮＡＳＨへの移行を遮断するかどうかを試験するために、マウスに、３カ月間の高脂肪食の終わりごろに週２回２週間かけて低分子ＳＴＦ−０８３０１０を注射した。ＢＩ−１−/−マウスにおけるＳＴＦ−０８３０１０による処置は、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性を効果的に打ち消し、耐糖能を改善し、ＮＡＳＨから救出した。ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化及びプログラム化細胞死の媒介における、ＩＲＥ１αの肝細胞特異的なリボヌクレアーゼ活性の役割が、ノックダウン実験を通して及びＳＴＦ−０８３０１０を用いて、初代マウス肝細胞において確認された。
2021514365.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量のＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤を、肝疾患を患う被験者に投与する工程を含む、該被験者を処置するための方法。
【請求項２】
肝疾患が、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、線維性ＮＡＳＨ、又は肝癌からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤がペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤がペプチド模倣体である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤が有機低分子である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤がＳＴＦ０８３０１０である、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、肝臓病学の分野にある。より特定すると、本発明は、肝疾患を処置するための方法及び組成物に関する。
【０００２】
発明の背景：
肥満はその合併症と共に、公衆衛生にとって壊滅的な結果を伴う真のパンデミックになる。非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の世界的罹患率は２５％を超えると推定されている１。この肝臓の病態は、メタボリックシンドロームの一成分と考えられ得るが、単純な脂肪肝から、炎症、肝細胞アポトーシス及びしばしば線維症によって特徴付けられるより進行形の非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）まで重症度が異なる。ＮＡＳＨ患者は、脂肪症患者よりも、肝硬変、肝細胞癌腫及び最終的には肝臓に関連した死亡２に進行するより高いリスクを呈するので、この移行の基礎にある機序を理解することが重要である。
【０００３】
小胞体（ＥＲ）は、細胞及び生物の代謝恒常性を維持する上で重要な役割を果たす。肥満に関連した代謝のゆらぎが起こると、小胞体は進化的に保存された小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）をトリガーし、正常な小胞体の恒常性を再確立する３。小胞体ストレス応答の個々の部門は、３つの膜貫通センサー（イノシトール要求酵素１（ＩＲＥ１α）、プロテインキナーゼＲＮＡ様小胞体キナーゼ（ＰＥＲＫ）、及び活性化転写因子６（ＡＴＦ６））からなり、これらは全て、ストレスのかかっていない条件下で腔内においてシャペロンＧＲＰ７８に結合している。長期の小胞体ストレスは、小胞体ストレス応答を適応応答から、Ｃ／ＥＢＰ相同タンパク質（ＣＨＯＰ）によって媒介されるアポトーシス誘発性応答４へとシフトさせる。肥満マウス５，６及びヒト７，８において報告されている悪化した小胞体ストレス応答は、糖尿病及び非アルコール性脂肪性肝疾患において重要な役割を果たすことが判明した９〜１１。
【０００４】
ＮＬＲＰ３インフラマソームは、炎症誘発性サイトカインであるインターロイキン（ＩＬ）−１β及びＩＬ−１８のカスパーゼ１又は１１依存性タンパク質分解的成熟を介して、肥満における炎症及びインシュリン抵抗性に点火する１２。持続的なＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化はまた、プログラム化細胞死の一形態であるピロトーシスをトリガーする。全体的で特異的なＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化の結果としての、ピロトーシスによる肝細胞死は、ＮＡＳＨ進行の原因となる１３，１４。本発明者らは近年、小胞体ストレスが、肝障害におけるＮＬＲＰ３インフラマソーム及び肝細胞死を活性化することを示した１５。
【０００５】
肥満の世界的流行と共に、肝疾患は西洋諸国で増加している。非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、世界中の肝疾患の主因である。現在、ＮＡＦＬＤの具体的な薬物療法は存在しない。健康なライフスタイルの選択をすることは役立ち得、関連する容態（高血圧、糖尿病、及び高コレステロール）又は合併症のための処置が推奨される場合がある。したがって、肝疾患を理解し、肝疾患、特にＮＡＦＬＤを処置するための革新的な治療戦略を発見する必要がある。
【０００６】
発明の要約：
本発明は、治療有効量のＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤を、肝疾患を患う被験者に投与する工程を含む、該被験者を処置するための方法に関する。
【０００７】
発明の詳細な説明：
本発明者らは、ツニカマイシンにより処置されたＢａｘ阻害剤１（ＢＩ−１）−/−マウスの肝臓では、ＩＲＥ１α依存性ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化、肝細胞死、線維症、及び脂質恒常性の調節不全により、１週間以内に肝不全に至ることを示した。本発明者らはまた、ヒトＮＡＦＬＤ肝生検材料を分析し、これにより、ＢＩ−１のダウンレギュレーションが、ＩＲＥ１のαリボヌクレアーゼシグナル伝達のアップレギュレーションと平行することが判明した。ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性の薬理学的阻害が、ＮＡＳＨへの移行を遮断するかどうかを試験するために、マウスに、３カ月間の高脂肪食の終わりごろに週２回２週間かけて低分子ＳＴＦ−０８３０１０を注射した。ＢＩ−１−/−マウスにおけるＳＴＦ−０８３０１０による処置は、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性を効果的に打ち消し、耐糖能を改善し、ＮＡＳＨから救出した。ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化及びプログラム化細胞死の媒介における、ＩＲＥ１αの肝細胞特異的なリボヌクレアーゼ活性の役割が、ノックダウン実験を通して及びＳＴＦ−０８３０１０を用いて、初代マウス肝細胞において確認された。したがって、薬物を用いた又はＢＩ−１を介した、ＩＲＥ１α依存性ＮＬＲＰ３インフラマソームシグナル伝達の標的化は、ＮＡＳＨに対する明確な治療標的の典型であり得る。
【０００８】
したがって、本発明は、治療有効量のＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤を、肝疾患を患う被験者に投与する工程を含む、該疾患を処置するための方法に関する。
【０００９】
本明細書において使用する「処置する」又は「処置」という用語は、予防的又は防止的処置、並びに、治癒的又は疾患修飾的処置（疾患を罹患するリスクのある又は疾患を罹患したと疑われる被験者の処置、並びに、病気であるか又は疾患若しくは医学的容態に罹患していると診断されている被験者の処置を含む）の両方を指し、臨床的再発の抑制も含む。処置は、医学的障害を有しているか又は最終的に障害に罹患する可能性がある被験者に、障害若しくは再発している障害の発症を予防、治癒、遅延するために、その重症度を低減するために、又はその１つ以上の症状を寛解するために、あるいは、このような処置を行なわない場合に予想される生存期間を超えるように被験者の生存期間を延長するために投与され得る。「治療処方計画」によって、病気の処置パターン、例えば、治療中に使用される投薬パターンを意味する。治療処方計画は、誘導処方計画及び維持処方計画を含み得る。「誘導処方計画」又は「誘導期間」という語句は、疾患の初期処置のために使用される治療処方計画（又は治療処方計画の一部）を指す。誘導処方計画の一般的目標は、処置処方計画の初期期間中に被験者に高いレベルの薬物を提供することである。誘導処方計画は（部分的に又は全体的に）「負荷処方計画」を使用し得、これは医師が維持処方計画中に使用するであろうよりも多くの用量の薬物を投与すること、医師が維持処方計画中に投与するであろうよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含み得る。「維持処方計画」又は「維持期間」という語句は、例えば、長期間（数か月又は数年間）にわたり被験者を寛解状態に保つために、病気の処置中に患者の維持のために使用される治療処方計画（又は治療処方計画の一部）を指す。維持処方計画は、連続的療法（例えば、規則的な間隔で、例えば週１回、月１回、年１回などに薬物を投与する）又は断続的療法（例えば、間断的処置、断続的処置、再発時における処置、又は特定の予め決定された基準［例えば疼痛、疾患の顕現など］に到達した場合の処置）を使用し得る。
【００１０】
本明細書において使用する「肝疾患」という用語は、病気を引き起こす肝機能のあらゆる障害を指す。肝臓は、タンパク質の産生及び血液凝固から、コレステロール、ブドウ糖（糖）及び鉄の代謝に至るまで、多くの重要な機能に関与する。肝臓が病気になるか又は損傷されると、そうした機能の消失は、生体に重大な傷害を引き起こし得る。肝疾患は肝臓疾患とも呼ばれる。肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、線維性ＮＡＳＨ、又は肝癌からなる群より選択される。本発明の脈絡において、肝疾患はＮＡＦＬＤである。本明細書において使用する「ＮＡＦＬＤ」は、非アルコール性脂肪性肝疾患を指す。ＮＡＦＬＤは、脂肪が、アルコール過剰摂取以外の他の原因に起因して、典型的には、薬物、ソフトドリンクによって引き起こされて、肝臓に蓄積する場合に起こる。ＮＡＦＬＤは、肝損傷及び代謝変化を引き起こし得、これは肝癌に至る場合がある。ＮＡＦＬＤの範囲は、脂肪肝から、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変及び肝癌（肝細胞癌腫）まで広域である。
【００１１】
本明細書において使用する「脂肪肝」という用語は、良性で非進行的な臨床段階を指す。脂肪肝は、肝細胞へのトリグリセリドの蓄積によって特徴付けられる。本明細書において使用する「ＮＡＳＨ」という用語は、脂肪症、肝細胞死及び炎症を合併した、進行形及び進行した形の非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を指す。脂肪の蓄積が、炎症及び傷害を引き起こす場合、それはＮＡＳＨとして知られ、これにより肝臓の瘢痕に至り得る。肝臓の瘢痕は、肝硬変と呼ばれる生命に危険を及ぼす可能性のある容態である。本明細書において使用する「線維性ＮＡＳＨ」という用語は、脂肪症、炎症及び肝細胞死に加えて、線維症を合併したより危険な段階を指す。
【００１２】
本明細書において使用する「肝癌」という用語は、肝臓癌及び原発性肝臓癌としても知られるが、これは、肝臓内において細胞が制御不能に増殖し始める時に始まる癌を指す。肝癌は、肝硬変を伴う又は伴わないＮＡＳＨ患者において発症することが知られている。肝硬変は、肝細胞の消失及び不可逆的な肝臓の瘢痕を含む、肝疾患の合併症である。化学物質（例えば、アルコール、脂肪、及び特定の薬物など）、ウイルス、有害金属（例えば、遺伝病の結果として、肝臓内に蓄積する鉄及び銅）及び自己免疫性肝疾患をはじめとする、肝硬変の多くの原因がある。
【００１３】
特定の実施態様では、肝癌は血管腫である。血管腫は、良性の肝臓腫瘍であり、血管において始まる。肝臓の大半の血管腫は症状を全く引き起こさず、処置を必要としない。
【００１４】
別の実施態様では、肝癌は肝臓腺腫である。それは肝細胞（肝細胞の主な種類）から始まる良性の腫瘍である。
【００１５】
特定の実施態様では、肝癌は、限局性結節性過形成（ＦＮＨ）である。ＦＮＨは、いくつかの細胞型（肝細胞、胆管細胞、及び結合組織細胞）から構成された腫瘍様増殖である。
【００１６】
別の実施態様では、肝癌は、肝細胞癌腫（肝細胞癌、ＨＣＣとも呼ばれる）である。このタイプの肝癌は、成人において最も一般的な形態の肝癌である。それは、異なる増殖パターンを有する：１）いくつかは、単一腫瘍として始まり、これは増殖してより大きくなり；疾患の後期においてのみ、肝臓の他の部分へと広がる；及び２）第二のタイプは、たった１つの腫瘍でなく、肝臓全体におよぶ多くの小さな癌の小結節として始まるようである。
【００１７】
本明細書において使用する「被験者」という用語は、任意の哺乳動物、例えばげっ歯類、ネコ、イヌ、及び霊長類を指す。特に、本発明において、被験者は、上記のような肝疾患の少なくとも１つに罹患しているか又は罹患し易いヒトである。より特定すると、被験者は、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ又は肝細胞癌腫に罹患しているか又は罹患し易い。
【００１８】
本明細書において使用する「ＩＲＥ１α」という用語は、イノシトール要求酵素１（ＩＲＥ１）を指し、ヒトではＥＲＮ１遺伝子によってコードされている。それは、小胞体（ＥＲ）に存在する膜貫通シグナル伝達タンパク質及び細胞ストレスセンサーである。このタンパク質は、微小環境変化に対する適応応答に必要とされる、細胞質内デュアルキナーゼ／エンドリボヌクレアーゼ活性を有する。本発明の脈絡において、本発明者らは、高脂肪食を給餌されたマウスにおけるＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性の遮断が、ＢＩ−１欠損マウスの肝臓における脂質生成のプライミング、高血糖、及びコラーゲンの蓄積を制限し、通常食の給餌されたマウスにおける肝臓の外見には影響を及ぼさないことを示した。さらに、本発明者らは、ＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性の標的化が、肝臓における、終末の小胞体ストレス応答により駆動される代謝機能不全、非感染性炎症、細胞死、及び線維症から防御することを示した。したがって、本発明者らは、ＮＡＦＬＤ又は肝癌などの肝疾患の処置のために、ＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性を標的化することを提案する。
【００１９】
本明細書において使用する「ＩＲＥ１リボヌクレアーゼ活性」という用語は、特定のＲＮＡ（ｍＲＮＡ又はマイクロＲＮＡ）を分解してその翻訳若しくはその細胞活性（これは、ＲＩＤＤ（調節されたＩＲＥ１依存性ＲＮＡ崩壊）としても知られる活性）を回避するか、又はＸＢＰ１（Ｘボックス結合タンパク質１）ｍＲＮＡのスプライシングに寄与し、リーディングフレームを変化させ、強力で折り畳まれていないタンパク質応答転写活性化因子である新規タンパク質（ＸＢＰ１ｓ）の産生をもたらす、ＩＲＥ１のエンドリボヌクレアーゼドメインの活性を指す。典型的には、ＩＲＥ１エンドヌクレアーゼ活性は、酵母における基質ＨＡＣ１のｍＲＮＡ又は後生動物における基質ＸＢＰ１のｍＲＮＡに２つ見られるＲＮＡステムループ構造の認識に基づく。ＨＡＣ１又はＸＢＰ１のｍＲＮＡの切断は、両方の部位で起こり、その結果、その２つの末端が独特なスプライシング事象でライゲートしているｍＲＮＡ断片が得られる（Ron et al.; Lee et al.）。スプライシングされるＨＡＣ１又はＸＢＰ１のｍＲＮＡは、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）に関与する遺伝子をはじめとする、数多くの標的遺伝子を活性化する転写因子をコードしている。小胞体ストレス応答は、小胞体内へのミスフォールディングされたタンパク質の蓄積に応答して起こる、シグナル伝達カスケードである。
【００２０】
本明細書において使用する「ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＩＲＥ１αの発現又は活性を遮断するか、抑制するか、又は低減させる（有意に低減させることを含む）、任意の天然又は合成の化合物を指す。より特定すると、本発明の脈絡において、該阻害剤は、ＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性阻害剤である。典型的には、このような阻害剤は、ＩＲＥ１αリボヌクレアーゼによって行なわれる特定のＲＮＡ（ｍＲＮＡ又はマイクロＲＮＡ）の分解を阻害する。
【００２１】
特定の実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、ペプチド、ペプチド模倣体、有機低分子、アプタマー、又は単一ドメイン抗体である。
【００２２】
いくつかの実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、ポリペプチド又はその断片である。本明細書において使用する「ポリペプチド」という用語は、少なくとも２アミノ酸残基長、最大で１０アミノ酸残基を有する短いペプチド、オリゴペプチド（１１〜１００アミノ酸残基）、及びより長いペプチド（「ポリペプチド」の通常の解釈、すなわち、１００を超えるアミノ酸残基長）の両方、並びにタンパク質（グリコシル化されることによって、脂質化されることによって、又は補欠分子族を含めることによって化学的に修飾されていてもよい、少なくとも１つのペプチド、オリゴペプチド、又はポリペプチドを含む、機能的実体）を指す。別の実施態様では、該ペプチドは、ＩＲＥ１αと競合する。別の実施態様では、該ペプチドは、ＩＲＥ１αの基質と競合する。
【００２３】
本発明のポリペプチドは、当業者には明らかであろうように、任意の適切な手段によって生成され得る。本発明に従って使用するのに十分な量のポリペプチドを生成するために、発現は簡便には、本発明のポリペプチドを含有している組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって達成され得る。特に、該ポリペプチドは、組換え手段によって、コードされている核酸分子からの発現によって生成される。多種多様な宿主細胞におけるポリペプチドのクローニング及び発現のためのシステムは周知である。組換え型で発現される場合、該ポリペプチドは、特に、宿主細胞においてコードされている核酸からの発現によって生成される。特定のシステムの個々の必要条件に応じて、任意の宿主細胞を使用してもよい。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母及びバキュロウイルスシステムが挙げられる。異種ポリペプチドの発現のために当技術分野において利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、及び多くのその他の細胞が挙げられる。細菌を操作し増殖させることが容易であることから、細菌も、組換えタンパク質の産生にとって好ましい宿主である。一般的で好ましい細菌宿主はＥ．ｃｏｌｉである。本発明のポリペプチド及び本発明によるその断片は、グリコシル化（例えばＮ結合型又はＯ結合型グリコシル化）、ミリスチル化、パルミチル化、アセチル化、及びリン酸化（例えばセリン／トレオニン又はチロシン）を含むがこれらに限定されない、翻訳後修飾を示していてもよい。いくつかの実施態様では、本発明の治療法に使用されるポリペプチドは、その治療効力を改善させるために修飾されていてもよいと考えられる。治療化合物のこのような修飾を使用して、毒性を低減させ、循環時間を延長させ、又は生体内分布を改変させ得る。例えば、重要である可能性のある治療化合物の毒性を、生体内分布を改変させる多種多様な薬物担体ビヒクルと組み合わせることによって有意に低減させることができる。ジペプチドを付加する例では、内因性輸送体を使用することによって、血液網膜関門を通って眼内に循環する薬剤の浸透を改善させることができる。
【００２４】
いくつかの実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤はペプチド模倣体である。本明細書において使用する「ペプチド模倣体」という用語は、それが構造的に基づいているペプチドの活性を有する、ペプチド様分子を意味する。このようなペプチド模倣体としては、化学的に修飾されたペプチド、非天然アミノ酸を含有しているペプチド様分子、及びペプトイドが挙げられ、ペプチド模倣体が由来するペプチドの選択的ホーミング活性などの活性を有する（例えば、Goodman and Ro, Peptidomimetics for Drug Design、“Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery” Vol. 1 (M. E. Wolff編; John Wiley & Sons 1995)、803-861頁参照）。ペプチド模倣体は、ペプチドの安定性、バイオアベイラビリティ、溶解性などを増加させるように設計され得る。
【００２５】
特定の実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、アプタマーである。アプタマーは、分子認識の点で抗体の代替物の典型であるクラスの分子である。アプタマーは、高い親和性及び特異性で実質的に全てのクラスの標的分子を認識することのできる、オリゴヌクレオチド配列又はオリゴペプチド配列である。
【００２６】
特定の実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、有機低分子である。本明細書において使用する「有機低分子」という用語は、医薬品に一般的に使用される有機分子と同等なサイズの分子を指す。該用語は、生物学的巨大分子（例えばタンパク質、核酸など）を除外する。好ましい有機低分子のサイズの範囲は、最大約５０００Ｄａまで、より好ましくは最大２０００Ｄａまで、最も好ましくは最大約１０００Ｄａまでである。
【００２７】
特定の実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤はリボヌクレアーゼドメイン阻害剤である。
【００２８】
特定の実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤はＳＴＦ０８３０１０である。本明細書において使用する「ＳＴＦ０８３０１０」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、Ｎ−［（２−ヒドロキシ−１−ナフタレニル）メチレン］−２−チオフェンスルホンアミドである。この分子のＣａｓ番号は、３０７５４３−７１−１である。
【００２９】
特定の実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、Volkmann et al 2011, JBCに記載のようなサリチルアルデヒド及びその類似体である。
【００３０】
特定の実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、Cross et al 2012, PNASに記載のような、４μ８ｃである。この分子のＣａｓ番号は１４００３−９６−４である。
【００３１】
特定の実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、Mimura et al 2012, Bloodに記載のような、ＭＫＣ−３９４６である。
【００３２】
特定の実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、ＭＫＣ−８８６６である。
【００３３】
特定の実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、Tashiro et al 2012, Blood Cancerに記載のような、トヨカマイシンである。
【００３４】
特定の実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、Ｉ型キナーゼ阻害剤である。
【００３５】
特定の実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、ＩＩ型キナーゼ阻害剤である。
【００３６】
１つの実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性のリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、イレスタチン（Irestatin）である。
【００３７】
１つの実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性のリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、ＭＧ１３２である。
【００３８】
１つの実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性のリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、１７−ＡＡＧである。
【００３９】
１つの実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性のリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、１−ＮＭ−ＰＰ１である。
【００４０】
１つの実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性のリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、ラクタシスチンである。
【００４１】
１つの実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性のリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、３−メトキシ−６−ブロモサリチルアルデヒドである。
【００４２】
１つの実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、スニチニブである。それはスーテントとして市販され、ｃａｓ番号：３４１０３１−５４−７を有する。
【００４３】
１つの実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、ＫＩＲＡ６である。この分子のＣａｓ番号は１５８９５２７−６５−０である。
【００４４】
１つの実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、ＫＩＲＡ８である。
【００４５】
１つの実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、４−フェニル酪酸類似体である（Zhang H et al 2013, Br J Pharmacol）。
【００４６】
いくつかの実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「ＶＨＨ」という用語は、天然的に軽鎖を欠失しているラクダ科哺乳動物に認められ得るタイプの抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。このようなＶＨＨは「ナノボディ（登録商標）」とも呼ばれる。本発明によると、単一ドメイン抗体は特にラクダの単一ドメイン抗体であり得る。
【００４７】
１つの実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、肝疾患の古典的な処置と組み合わせて投与される。
【００４８】
したがって、本発明はまた、ｉ）治療有効量のＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤、及びｉｉ）肝疾患の古典的処置を、肝疾患を患う被験者に投与する工程を含む、該被験者を処置するための方法を指す。
【００４９】
本明細書において使用する「古典的処置」という用語は、肝疾患の処置のために使用される、天然又は合成の任意の化合物を指す。
【００５０】
特定の実施態様では、古典的処置は、放射線療法、抗体療法、又は化学療法を指す。
【００５１】
本発明によると、肝疾患の処置のために使用される化合物は、グリタゾン薬剤（ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、ロベグリタゾンなど）、ビタミンＥ、スタチン、シンバイオティクス、ステロイド系薬物、ウルソデオキシコール酸、ビグアナイド剤（メトホルミンなど）、α−グルコシダーゼ阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、化学療法剤、放射線療法剤からなる群より選択され得る。
【００５２】
本明細書において使用する「化学療法剤」という用語は、腫瘍の増殖を抑制するのに有効である化合物を指す。化学療法剤の例としては、マルチキナーゼ阻害剤、例えばソラフェニブ及びスニチニブ、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド；アルキルスルホネート類、例えばブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン；アジリジン系、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパ；エチレンイミン類及びメチルメラミン類、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチロールメラミン；アセトゲニン類（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン類（合成類似体のトポテカンなど）；ブリオスタチン類；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（例えば、そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（例えば合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢＩ−ＴＭＩなど）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノボエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア類、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシン（１１及びカリケアマイシン２１１、例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186（1994）参照）；ダイネミシン、例えばダイネミシンＡ；エスペラマイシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連したクロモプロテイン系エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カルビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（例えばモルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えばメトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール��シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン、５−ＦＵ；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎薬、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充物質、例えばフォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド、例えばメイタンシン及びアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲンナニウム（spirogennanium）；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベルカリンＡ、ロリジンＡ、及びアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール（登録商標）、Bristol-Myers Squibb Oncology、プリンストン、N.J.州）及びドセタキセル（タキソテア（登録商標）、Rhone-Poulenc Rorer、アントニー、フランス）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロン酸塩；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；カペシタビン；並びに、上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体が挙げられる。またこの定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用するホルモン拮抗剤、例えばエストロゲン拮抗薬、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（フェアストン）；及びアンドロゲン拮抗薬、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びに、上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体も含まれる。
【００５３】
本明細書において使用する「放射線療法」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、電離放射線を用いた癌の処置を指す。電離放射線はエネルギーを付与し、これは細胞の遺伝子材料に傷害を与え、これらの細胞が増殖し続けることを不可能とさせることによって、処置される領域（標的組織）内の細胞を損傷するか又は破壊する。一般的に使用されるある種類の放射線療法は、光子、例えばＸ線を含む。それらが有するエネルギー量に応じて、光線を使用することにより、身体の表面上の又は身体のより深い場所にある癌細胞を破壊することができる。Ｘ線ビームのエネルギーが高ければ高いほど、Ｘ線は標的組織内のより深くに届くことができる。直線加速器及びベータトロンは、漸増するエネルギーのＸ線を発生する。機械を使用して、癌部位上に放射線（例えばＸ線）の焦点を当てることは、外部照射療法と呼ばれる。γ線は、放射線療法に使用される別の形態の光子である。γ線は、特定の元素（例えばラジウム、ウラン、及びコバルト６０）が分解又は減衰するにつれて放射線を放出する時に自然に生じる。いくつかの実施態様では、放射線療法は外部照射療法である。外部照射療法の例としては、従来の外部ビーム放射線療法；様々な方向から腫瘍の形状にぴったり合うように成形されたビームを送達する、３次元原体照射法（３Ｄ−ＣＲＴ）；腫瘍の形状にぴったり合うように放射線ビームを成形し、かつ、腫瘍の形状に応じて放射線量も変化させる、強度変調放射線療法（ＩＭＲＴ）、例えばヘリカルトモセラピー；集束陽子線照射療法；走査と放射線照射技術を組み合わせることにより、腫瘍のリアルタイムな画像を提供し、放射線による処置を誘導する、画像誘導放射線療法（ＩＧＲＴ）；手術中に腫瘍に放射線を直接送達する、術中放射線療法（ＩＯＲＴ）；１回のセッションで小さな腫瘍領域に正確な大用量の放射線を送達する、定位放射線手術；１日あたり１回を超える処置（分割）の放射線療法が被験者に与えられる、多分割放射線療法、例えば連続加速過分割放射線療法（ＣＨＡＲＴ）；並びに、１分割あたりより高い用量の放射線療法が与えられるが分割数がより少ない、少分割放射線療法が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５４】
本明細書において使用する「免疫チェックポイント阻害剤」という用語は、１つ以上の免疫チェックポイントタンパク質を完全に又は部分的に低減するか、阻害するか、干渉するか、又は調節する、分子を指す。
【００５５】
本明細書において使用する「免疫チェックポイントタンパク質」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、シグナルを上げるか（刺激性チェックポイント分子）又はシグナルを下げる（抑制性チェックポイント分子）のいずれかであるＴ細胞によって発現されている分子を指す。
【００５６】
刺激性チェックポイントの例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＩＣＯＳが挙げられる。抑制性チェックポイント分子の例としては、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２７７、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３及びＶＩＳＴＡが挙げられる。
【００５７】
１つの実施態様では、ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤は、ソラフェニブと組み合わせて投与される。
【００５８】
特定の実施態様では、本発明による方法では、ｉ）ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤、及びｉｉ）古典的な処置が、免疫チェックポイント阻害剤による処置に対する応答者として同定された被験者を処置するために、合剤として使用される。
【００５９】
したがって、本発明は、ｉ）ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤、及びｉｉｉ）肝疾患を患う被験者を処置するための合剤として使用される古典的処置に関する。
【００６０】
特定の実施態様では、ｉ）ＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤、及びｉｉ）肝疾患を患う被験者を処置するために同時に、別々に、又は順次使用するための、本発明による合剤としての古典的処置。
【００６１】
本明細書において使用する「併用処置」、「併用療法」又は「療法の組合せ」という用語は、１つを超える薬物療法を使用する処置を指す。併用療法は、デュアル療法又は二重療法（bi-therapy）であり得る。
【００６２】
本明細書において使用する「同時に投与」という用語は、同じ経路による、同時又は実質的に同時の、２つの活性成分の投与を指す。「別々に投与」という用語は、異なる経路による、同時又は実質的に同時の２つの活性成分の投与を指す。「順次投与」という用語は、異なる時点における２つの活性成分の投与を指し、投与経路は同一又は異なる。
【００６３】
本明細書において使用する「投与すること」又は「投与」という用語は、物質（これは体外に存在しているので）（例えばＩＲＥ１α阻害剤）を被験者に、例えば粘膜、皮内、静脈内、皮下、筋肉内送達、及び／又は本明細書に記載されているか若しくは当技術分野において公知である任意の他の物理的送達法によって、被験者に注射するか又は別様に物理的に送達する行為を指す。疾患又はその症状を治療する場合、該物質の投与は典型的には、該疾患又はその症状の発症後に行なわれる。疾患又はその症状を予防する場合、該物質の投与は典型的には、該疾患又はその症状の発症前に行なわれる。
【００６４】
「治療有効量」は、治療利点を被験者に付与するに必要である活性物質の最小量を意味する。例えば、被験者への「治療有効量」は、病的症状、疾患の進行、又は障害に関連した若しくは障害に屈することに対する抵抗に関連した生理学的状態の改善を誘導、寛解、又は別様に引き起こすような量である。本発明の化合物の１日の総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当医師によって決定されるであろうことが理解されるだろう。任意の特定の被験者に対する具体的な治療有効用量レベルは、処置される障害及び障害の重症度；使用される具体的な化合物の活性；使用される具体的な組成、被験者の年齢、体重、全身の健康状態、性別、及び食事；使用される具体的な化合物の投与時刻、投与経路、及び排泄速度；処置期間；使用される具体的な化合物と組み合わせて又は同時に使用される薬物；及び、医学分野において周知である同様な因子をはじめとする、様々な因子に依存するだろう。例えば、所望の治療効果を達成するために必要とされるものよりも低いレベルで該化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を次第に増加させることは、十分に当業者の技能範囲内である。しかしながら、製品の１日の用量は、１日あたり成人１人あたり０．０１〜１，０００mgの幅広い範囲におよび変更されてもよい。典型的には、該組成物は、処置される予定の被験者への症状による用量の調整のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０、及び５００mgの活性成分を含有している。医薬品は典型的には、約０．０１mg〜約５００mgの活性成分、好ましくは１mgから約１００mgの活性成分を含有している。薬物の有効量は通常、１日あたり０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg（体重）、特に１日あたり約０．００１mg/kg〜７mg/kg（体重）の用量レベルで供給される。
【００６５】
上記のようなＩＲＥ１α阻害剤を、薬学的に許容される賦形剤及び場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わせることにより、医薬組成物を形成してもよい。「薬学的に」又は「薬学的に許容される」は、哺乳動物、特にヒトに適宜投与された場合に、有害反応、アレルギー反応、又は他の望ましくない反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、任意の種類の無毒性固体、半固体、又は液体充填剤、希釈剤、封入材料、又は製剤化助剤を指す。経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所、又は直腸投与用の本発明の医薬組成物は、活性成分を単独で又は別の活性成分と組み合わせて、単位投与剤形で、慣用的な薬学的支持体との混合物として、動物及びヒトへと投与され得る。適切な単位投与剤形としては、経口経路剤形、例えば錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤、及び経口用懸濁剤又は液剤、舌下及び頬側投与剤形、エアゾール剤、埋込剤、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、経皮、くも膜下腔内、及び鼻腔内投与剤形、及び直腸投与剤形が挙げられる。典型的には、医薬組成物は、注射することのできる製剤にとって薬学的に許容可能であるビヒクルを含有する。これらは特に、等張の無菌食塩水溶液（リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、若しくは塩化マグネシウムなど、又はこのような塩の混合物）、又は、場合に応じて滅菌水若しくは生理食塩水を添加すると注射液の構成が可能となる乾燥させた、特に凍結乾燥させた組成物であり得る。注射用途に適した剤形としては、無菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び無菌注射溶液又は分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、そしてシリンジが容易に扱える程度に流動性でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、そして細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から防腐されていなければならない。遊離塩基又は薬理学的に許容される塩として本発明の化合物を含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びその混合物中、並びに油中において調製されてもよい。通常の保存及び使用条件下において、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含有する。ポリペプチド（又はそれをコードする核酸）は、中性すなわち塩の形態の組成物へと製剤化されてもよい。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（これはタンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）が挙げられ、これは、例えば塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸を用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導され得る。担体はまた、例えば、水、エ���ノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、適切なその混合物、及び植物油を含有している、溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防御は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射用組成物の延長吸収は、該組成物に、吸収を遅延する物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することによってもたらされ得る。無菌注射液は、必要量の活性ポリペプチドを、適切な溶媒中に、必要であれば上記に列挙されたいくつかの他の成分と共に取り込み、その後、滅菌ろ過することによって調製される。一般的には、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基本分散媒体と上記に列挙された成分の中からの必要とされる他の成分とを含有する無菌ビヒクルに取り込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥技術及び凍結乾燥技術であり、これにより、事前に滅菌ろ過されたその溶液から活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末が生じる。製剤化されると、液剤は、投与製剤に適合した様式で、治療的に有効な量で投与されるだろう。製剤は、上記の種類の注射液などの様々な投与剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用され得る。水溶液での非経口投与のために、例えば、液剤は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤はまず、十分な食塩水又はブドウ糖を用いて等張とされるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用され得る無菌水性媒体は、本開示に鑑みて当業者には公知であろう。例えば、１回量を１mlの等張ＮａＣｌ溶液に溶かし、そして１０００mlの皮下点滴療法用の液体に加え得るか又は提案された注入部位に注射し得る。用量の幾分の変更が、処置される被験者の容態に応じて必然的に行なわれるだろう。投与責任者は、いずれの事象においても、個々の被験者に対する適切な用量を決定するだろう。
【００６６】
スクリーニング法
化合物がＩＲＥ１αエンドリボヌクレアーゼ活性阻害剤であることができるかを決定するための試験は、当業者には周知である。ＩＲＥ１αの阻害は、当技術分野において周知である任意の技術によって決定され得る。例えば、ＩＲＥ１リボヌクレアーゼ活性阻害剤は、以下の工程を実施することによって同定され得る：ｉ）複数の試験物質を準備する工程、ｉｉ）該試験物質が、ＩＲＥ１リボヌクレアーゼ活性阻害剤であるかどうかを決定する工程、及びｉｉｉ）ＩＲＥ１リボヌクレアーゼ活性阻害剤である試験物質を正に選択する工程。正に選択された試験物質を、癌の処置のためのその特性をさらにアッセイすることを考えて、さらなる選択工程にかけ得る。例えば、正に選択された候補化合物を、動物モデルに対するその特性をさらにアッセイすることを考えて、さらなる選択工程にかけ得る。
【００６７】
癌の処置に有用であり得る薬物（ＩＲＥ１リボヌクレアーゼ活性阻害剤）の開発のための試験物質を同定するためのアッセイは、ハイスループットスクリーニング技術を使用して実施され得る。ハイスループットスクリーニング技術は、マルチウェルプレート（例えば９６ウェル、３８９ウェル、又は１５３６ウェルのプレート）を使用して実施され、これにより、自動ロボットシステムを使用した複数のアッセイを実施することができる。したがって、試験物質の大きなライブラリーを、非常に効率的にアッセイし得る。ライブラリー内の化合物は、一度に１つ、マイクロタイター皿のウェルに自動的にアプライされるだろう。ＩＲＥ１リボヌクレアーゼ活性を阻害する試験物質が一旦同定されたら、それらを、さらなる特徴付けのために正に選択することができる。このアッセイは、マイクロタイタープレートフォーマットで容易に実施することができるので、記載のアッセイを、自動ロボットシステムによって実施することができ、これにより多数の試験試料をかなり短い時間枠で試験することが可能となる。アッセイは、以前には試験されていない化合物又は抽出物の活性を評価するための選別として使用され得、この場合、単一の濃度が試験され対照と比較される。これらのアッセイを使用して、例えば１００μMから１μMの範囲内の濃度範囲を試験し、より効率的な濃度を計算することによって、化合物の相対効力を評価することもできる。
【００６８】
本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例及び図面は、いずれにしても、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１Ａ】高脂肪食の摂食の初期の段階で、ＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性を阻害することによって小胞体ストレス応答を制限することにより、脂肪症及び高血糖から防御される。高脂肪食の摂食から２．５カ月後に開始して、ＢＩ−１＋/＋マウス及びＢＩ−１−/−マウスを、屠殺前に週２回、２週間かけてＳＴＦ−０８３０１０（３０mg/kg）又はビヒクル（非処置（ＮＴ）、Kolliphor１６％）を用いて処置した。（Ａ）肝臓における相対的トリグリセリドレベル。（Ｂ）ローディング対照である熱ショックタンパク質９０に関するイムノブロット、及び（Ｃ）定量ＰＣＲによる、小胞体ストレスマーカーの分析、非処置で高脂肪食の給餌されたＢＩ−１＋/＋マウスとＢＩ−１−/−マウスを比較すると、遺伝子に有意（＊ｐ＜０．０５）な発現差がある。ｎ＝６；＊ｐ＜０．０５（処置された対応物と未処置の対応物とを比較した場合）。
【図１Ｂ】高脂肪食の摂食の初期の段階で、ＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性を阻害することによって小胞体ストレス応答を制限することにより、脂肪症及び高血糖から防御される。高脂肪食の摂食から２．５カ月後に開始して、ＢＩ−１＋/＋マウス及びＢＩ−１−/−マウスを、屠殺前に週２回、２週間かけてＳＴＦ−０８３０１０（３０mg/kg）又はビヒクル（非処置（ＮＴ）、Kolliphor１６％）を用いて処置した。（Ａ）肝臓における相対的トリグリセリドレベル。（Ｂ）ローディング対照である熱ショックタンパク質９０に関するイムノブロット、及び（Ｃ）定量ＰＣＲによる、小胞体ストレスマーカーの分析、非処置で高脂肪食の給餌されたＢＩ−１＋/＋マウスとＢＩ−１−/−マウスを比較すると、遺伝子に有意（＊ｐ＜０．０５）な発現差がある。ｎ＝６；＊ｐ＜０．０５（処置された対応物と未処置の対応物とを比較した場合）。
【図１Ｃ】高脂肪食の摂食の初期の段階で、ＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性を阻害することによって小胞体ストレス応答を制限することにより、脂肪症及び高血糖から防御される。高脂肪食の摂食から２．５カ月後に開始して、ＢＩ−１＋/＋マウス及びＢＩ−１−/−マウスを、屠殺前に週２回、２週間かけてＳＴＦ−０８３０１０（３０mg/kg）又はビヒクル（非処置（ＮＴ）、Kolliphor１６％）を用いて処置した。（Ａ）肝臓における相対的トリグリセリドレベル。（Ｂ）ローディング対照である熱ショックタンパク質９０に関するイムノブロット、及び（Ｃ）定量ＰＣＲによる、小胞体ストレスマーカーの分析、非処置で高脂肪食の給餌されたＢＩ−１＋/＋マウスとＢＩ−１−/−マウスを比較すると、遺伝子に有意（＊ｐ＜０．０５）な発現差がある。ｎ＝６；＊ｐ＜０．０５（処置された対応物と未処置の対応物とを比較した場合）。
【図２Ａ】高脂肪食を給餌されたマウスにおけるＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性の遮断は、ＢＩ−１欠損マウスの肝臓における、脂質生成のプライミング、高血糖、及びコラーゲンの蓄積を制限し、通常食の給餌されたマウスにおける肝臓の外見に影響を及ぼさない。（Ａ）高脂肪食を給餌されたＢＩ−１＋/＋マウスとＢＩ−１−/−マウスへのビヒクル（非処置、Kolliphor１６％）又はＳＴＦ−０８３０１０（３０mg/kg）の注射のプロトコールの時間系列。（Ｂ）脂質の合成及び代謝に関与している肝遺伝子の定量ＰＣＲ分析（ｎ＝３）。未処置で高脂肪食の給餌されたＢＩ−１＋/＋マウスとＢＩ−１−/−マウスを比較すると、遺伝子に有意な発現差がある（＊Ｐ＜０．０５）。処置された対応物と未処置の対応物とを比較した場合には、＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）給餌されたＢＩ−１＋/＋マウスとＢＩ−１−/−マウス（ｎ＝６）における血糖濃度。
【図２Ｂ】高脂肪食を給餌されたマウスにおけるＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性の遮断は、ＢＩ−１欠損マウスの肝臓における、脂質生成のプライミング、高血糖、及びコラーゲンの蓄積を制限し、通常食の給餌されたマウスにおける肝臓の外見に影響を及ぼさない。（Ａ）高脂肪食を給餌されたＢＩ−１＋/＋マウスとＢＩ−１−/−マウスへのビヒクル（非処置、Kolliphor１６％）又はＳＴＦ−０８３０１０（３０mg/kg）の注射のプロトコールの時間系列。（Ｂ）脂質の合成及び代謝に関与している肝遺伝子の定量ＰＣＲ分析（ｎ＝３）。未処置で高脂肪食の給餌されたＢＩ−１＋/＋マウスとＢＩ−１−/−マウスを比較すると、遺伝子に有意な発現差がある（＊Ｐ＜０．０５）。処置された対応物と未処置の対応物とを比較した場合には、＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）給餌されたＢＩ−１＋/＋マウスとＢＩ−１−/−マウス（ｎ＝６）における血糖濃度。
【図２Ｃ】高脂肪食を給餌されたマウスにおけるＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性の遮断は、ＢＩ−１欠損マウスの肝臓における、脂質生成のプライミング、高血糖、及びコラーゲンの蓄積を制限し、通常食の給餌されたマウスにおける肝臓の外見に影響を及ぼさない。（Ａ）高脂肪食を給餌されたＢＩ−１＋/＋マウスとＢＩ−１−/−マウスへのビヒクル（非処置、Kolliphor１６％）又はＳＴＦ−０８３０１０（３０mg/kg）の注射のプロトコールの時間系列。（Ｂ）脂質の合成及び代謝に関与している肝遺伝子の定量ＰＣＲ分析（ｎ＝３）。未処置で高脂肪食の給餌されたＢＩ−１＋/＋マウスとＢＩ−１−/−マウスを比較すると、遺伝子に有意な発現差がある（＊Ｐ＜０．０５）。処置された対応物と未処置の対応物とを比較した場合には、＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）給餌されたＢＩ−１＋/＋マウスとＢＩ−１−/−マウス（ｎ＝６）における血糖濃度。
【図３Ａ】ＳＴＦを用いてのＩＲＥ１αリボヌクレアーゼのシグナル伝達の阻害は、肝癌細胞増殖の低減及びアポトーシス誘発の際のソラフェニブの有効性を増強する。（Ａ）肝癌細胞増殖（ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、及びＨｅｐ３Ｂ）に対する及び（Ｂ）アポトーシスの誘導に対する、ソラフェニブ（ＳＯＲＡ、５μM）、ＳＴＦ−０８３０１０（ＳＴＦ、６０μM）、及びそれらの組合せの効果。ＳＴＦ−０８３０１０を、ソラフェニブの１時間前に加えた。刺激を２４時間実施した。処置された対応物と未処置の対応物とを比較した場合には、＊ｐ＜０．０５。結果は、平均値と標準誤差として表現される（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図３Ｂ】ＳＴＦを用いてのＩＲＥ１αリボヌクレアーゼのシグナル伝達の阻害は、肝癌細胞増殖の低減及びアポトーシス誘発の際のソラフェニブの有効性を増強する。（Ａ）肝癌細胞増殖（ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、及びＨｅｐ３Ｂ）に対する及び（Ｂ）アポトーシスの誘導に対する、ソラフェニブ（ＳＯＲＡ、５μM）、ＳＴＦ−０８３０１０（ＳＴＦ、６０μM）、及びそれらの組合せの効果。ＳＴＦ−０８３０１０を、ソラフェニブの１時間前に加えた。刺激を２４時間実施した。処置された対応物と未処置の対応物とを比較した場合には、＊ｐ＜０．０５。結果は、平均値と標準誤差として表現される（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図４】過剰活性ＩＲＥ１αリボヌクレアーゼは、炎症誘発性マーカーの分泌をトリガーする。肝癌細胞増殖（ＨｅｐＧ２）及びアポトーシス誘発に対する、ソラフェニブ（ＳＯＲＡ、５μM）、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫ（ＹＶＡＤ、２５μM）及びそれらの組合せの効果。Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫ（ＹＶＡＤ）を、ソラフェニブの１時間前に加えた。刺激を２４時間実施した。処置された対応物と未処置の対応物とを比較した場合には、＊ｐ＜０．０５。結果は、平均値と標準誤差として表現される（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図５Ａ】ＩＲＥ１αキナーゼ活性を介したアポトーシスを増強する共処置。（Ａ）ＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５（ＳＰ、５０μM）による前処置、又は（Ｂ）ネクロスタチン（Ｎｅｃ−１、５０μM）による前処置を伴う若しくは伴わない、ＨｅｐＧ２細胞増殖に対する、ソラフェニブ（ＳＯＲＡ、５μM）、ＳＴＦ−０８３０１０（ＳＴＦ、６０μM）及びそれらの組合せの効果。刺激を２４時間実施した。処置された対応物と未処置の対応物とを比較した場合には、＊ｐ＜０．０５。結果は、平均値と標準誤差として表現される（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図５Ｂ】ＩＲＥ１αキナーゼ活性を介したアポトーシスを増強する共処置。（Ａ）ＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５（ＳＰ、５０μM）による前処置、又は（Ｂ）ネクロスタチン（Ｎｅｃ−１、５０μM）による前処置を伴う若しくは伴わない、ＨｅｐＧ２細胞増殖に対する、ソラフェニブ（ＳＯＲＡ、５μM）、ＳＴＦ−０８３０１０（ＳＴＦ、６０μM）及びそれらの組合せの効果。刺激を２４時間実施した。処置された対応物と未処置の対応物とを比較した場合には、＊ｐ＜０．０５。結果は、平均値と標準誤差として表現される（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図６Ａ】ＳＴＦを用いてのＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性の阻害は、インビボにおけるソラフェニブの作用を増強する。（Ａ）異種移植片ＨｅｐＧ２細胞を有するマウスへのソラフェニブ（３０mg/kgを腹腔内に１日１回）及び／又はＳＴＦ−０８３０１０（３０mg/kgを腹腔内に週２回）の注射のプロトコールの時間系列。（Ｂ）マウスの腫瘍体積に対する、ＳＯＲＡ、ＳＴＦ、及びそれらの組合せの効果。処置された対応物と未処置の対応物とを比較した場合には、＊ｐ＜０．０５。結果は、平均値と標準誤差として表現される（＊ｐ＜０．０５）。
【図６Ｂ】ＳＴＦを用いてのＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性の阻害は、インビボにおけるソラフェニブの作用を増強する。（Ａ）異種移植片ＨｅｐＧ２細胞を有するマウスへのソラフェニブ（３０mg/kgを腹腔内に１日１回）及び／又はＳＴＦ−０８３０１０（３０mg/kgを腹腔内に週２回）の注射のプロトコールの時間系列。（Ｂ）マウスの腫瘍体積に対する、ＳＯＲＡ、ＳＴＦ、及びそれらの組合せの効果。処置された対応物と未処置の対応物とを比較した場合には、＊ｐ＜０．０５。結果は、平均値と標準誤差として表現される（＊ｐ＜０．０５）。
【００７０】
実施例
材料及び方法
動物の管理及び実験
全ての動物の処置は、実験動物の人道的管理と使用に関するフランスの指針に準拠して実施された。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＢＩ−１＋/＋（野生型）及びＢＩ−１−/−の同腹仔の典型である、ＢＩ−１遺伝子が標的化破壊された雄マウスを、サンフォード・バーナム医学研究所（ラ・ホーヤ、ＣＡ州、米国）のJohn C. Reed博士から入手した１７，１８。１２週令のマウスで実施された実験には、以下が含まれた：１）マウスに、ＴＭ（１mg/kg）又はビヒクルが腹腔内に注射され、処置から４８時間後に屠殺された（特記されない限り）、２）動物に、通常食（Ａ０４−Safe Diet社、オジー、フランス）又は高脂肪食（６０ｋＪ％の脂肪、Ｄ１２４９２−ssniff社、ゾースト、ドイツ）のいずれかが最大９カ月間給餌された、３）３カ月間の通常食又は高脂肪食の終わりごろに、マウスに、屠殺前にＳＴＦ−０８３０１０（３０mg/kg）又はビヒクルを、週２回、２週間注射した。マウスを、水を自由にとれ１２時間の明暗サイクルの制御された環境で飼育した。
【００７１】
組織学的評価
肝組織標本を１０％緩衝化ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、切片化し（５μm厚）、ヘマトキシリン及びエオシン、マッソントリクローム、ミエロペルオキシダーゼ、又はタネル（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社、メラン、フランス）のいずれかを用いて染色した。標本は、肝病理学者によって盲検的に顕微鏡によって評価された。
【００７２】
電子顕微鏡
マウス肝を解剖し、固定剤に浸漬し、支持方法に記載のように処理した。対比させた超極薄切片（７０nm）を、ＭｏｒａｄａオリンパスＣＣＤカメラの具備されたジョエル１４００透過型電子顕微鏡下で分析した。ＩＭＯＤソフトウェアを使用して画像を分析し、主要な細胞構造を描写した。
【００７３】
リアルタイムな定量ＰＣＲ分析
全ＲＮＡを、肝組織又は肝細胞から抽出し、その後、以前に記載のように逆転写した１５。リアルタイム定量ＰＣＲを、製造業者のプロトコールに従って、Ｃ３Ｍゲノム施設で、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７５００/Ｓｔｅｐ−Ｏｎｅ ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステムを使用して実施した。ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイのための支持方法を参照されたい。
【００７４】
イムノブロット分析
全タンパク質を、洗浄剤含有緩衝液中にホモジナイズした瞬間凍結させた肝臓又は初代肝細胞から単離し、タンパク質含量について標準化し（４０μg/組織の試料及び２０μg/細胞の試料）、以前に記載されているようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８〜１５％のゲル）のイムノブロットによって分析した１５。ウェスタンブロット分析を、支持方法に記載の抗体を使用して実施し、増強化学発光法（アマシャム・バイオサイエンシーズ社、ピスカタウェイ、ＮＪ州、米国）を用いて検出した。イムノブロットを走査し、シグナルをＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量した。
【００７５】
生化学分析及びサイトカインの測定
血清中ＡＳＴレベル及びＡＬＴレベルを、ピリドキサールリン酸を用いての活性化後に標準的な紫外線試験を使用して決定し、血清中トリグリセリドレベルを、標準的な酵素比色アッセイ（ロシュ・日立アナライザーＣｏｂａｓ８０００、メラン、フランス）によって決定した。肝内トリグリセリド含量を、トリグリセリドＦＳ１０のキット（ＤｉａＳｙｓ、ホルツハイム、ドイツ）を使用して測定した。サイトカインは、記載のようにフローサイトメトリーによって定量的に測定された１５。
【００７６】
細胞モデル、処置、及び生存率アッセイ
マウス肝由来の肝細胞を、本発明者らが記載しているように１８，２３、２工程のコラゲナーゼ手順によって単離し、支持方法に詳述されている培地中で培養した。指示されている場合には、初代肝細胞に、製造業者の説明書に従って、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、コートアボフ、フランス）を使用して３０ｎMでステルスｓｉＲＮＡ（対応する低度又は中程度のＣＧの対照を用いて、ＢＩ−１、ＩＲＥ１α、ＸＢＰ１、またはＣＨＯＰを標的化する）をトランスフェクトした。トランスフェクトから４８時間後、細胞を、ＴＭ（１μg/ml）又はリポ多糖（１００ng/ml）を用いて所定の時間かけて処置した。ＢＩ−１−/−マウス及び野生型マウスの肝臓から単離された初代肝細胞を、ＳＴＦ−０８３０１０（６０μM）又はＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫ（２５μM）の存在下又は非存在下においてＴＭ又はリポ多糖で処置した。細胞の生存率を、支持方法に詳述されている比色アッセイ（ＭＴＴ）によって決定した。結果は、対照値に対する比率として提示される。
【００７７】
ヒト試験
病的肥満患者：１０人の患者を、消化管外科及び肝移植科（ニースの病院）を通して採用し、そこで患者らは病的肥満のために肥満外科手術を受けた。これらの患者には、肥満外科手術が、フランスの指針に従って必要とされる。遺伝子発現についての試験群の特徴を、表１に記載する。手術前に、空腹時血液試料を入手し、これを使用してアラニン及びアスパラギン酸のトランスアミナーゼ（それぞれＡＬＴ及びＡＳＴ）、血糖値、インシュリン、及びＨｂＡ１ｃを測定した。インシュリン抵抗性を、恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ−ＩＲ）指数を使用して計算した。肝生検材料を手術中に入手し、虚血性プレコンディショニングは全く行なわれなかった。３つの組織病理的特色が半定量的に評価された：脂肪症のグレード（０、５％未満；１、５〜３０％；２、３０〜６０％を超える；３、６０％を超える）、実質の炎症（０、炎症巣なし；１、２００倍の拡大で２個未満の炎症巣；２、２００倍の拡大で２〜４個の炎症巣；３、２００倍の拡大で４個を超える炎症巣、肝細胞風船化（０、なし；１、僅かな風船細胞；２、多くの細胞／傑出した風船化）。
【００７８】
対照参加者：肝組織を、良性腫瘍のために部分肝切除術を受けた５人の痩せている参加者（５人の女性；年齢、４４±９歳；肥満度指数２１±１．９kg/m２）から入手した（４つの腺腫及び１つの限局性結節性過形成に隣接する組織）。３人の参加者が、虚血性プレコンディショニングを行なわずに左葉切除術又は２区域切除術を受け、２人の患者が、虚血性プレコンディショニングを行なった可能性のある右肝切除術を受けた（欠損データ）。肝試料は、脂肪肝、炎症、又は線維症を全く呈さなかった。全ての参加者は、倫理及びヒトを対象とした研究に関するフランスの法律（フリエ・スクラスラット法）に従ってこの試験に参加するために書面によるインフォームドコンセントを提出した。「ニースの生物医学研究被験者保護委員会」は試験を承認した（０７/０４：２００３、０３．０１７番）。
【００７９】
統計
データは、平均値±標準誤差として示される。２群間の平均値の差は、両側スチューデントｔ検定を使用して評価された。さらなる２群間の平均値の差は、１元配置分散分析又は２元配置分散分析によって評価され、それぞれボンフェローニ検定又はシダック事後検定との多重比較のために補正された。全分析は、グラフパッドＰｒｉｓｍ７ソフトウェアを用いて実施された。
【００８０】
結果
ＢＩ−１欠損症により、急性チャレンジ後に回復しない小胞体ストレスにかかりやすくなり、これにより、肝臓への脂質の沈着及び代謝崩壊に至る。
本発明者らは、ＢＩ−１発現の消失が、肝臓における小胞体ストレス応答の大きさを変化させる可能性を調べた。ＴＭの注射から４８時間後、ＢＩ−Ｉ−/−の肝臓は、野生型対照臓器よりもはるかに淡くなった（データは示されていない）。ＴＭで処置されたＢＩ−Ｉ−/−マウスの大半は、大滴性脂肪症及び小滴性脂肪症によって特徴付けられるグレード３の脂肪症を呈し、これは大半がグレード１の小滴性脂肪症を発症したＴＭで処置された野生型マウスとは対照的であった（データは示されていない）。肝内トリグリセリド含量のほぼ３倍の増加が、体重と比較して有意により重い肝重量に一致して（データは示されていない）、ＢＩ−Ｉ−/−ＴＭマウスにおいて観察された（データは示されていない）。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）は、特にＢＩ−Ｉ−/−マウスにおいて、ＴＭの注射後に、肝細胞に蓄積している脂肪滴の数及びサイズがより大きいことを明らかとした（データは示されていない）。脂肪滴マーカーのＡＤＦＰ及びＣＩＤＥＣをコードしている遺伝子、並びに、脂肪酸輸送体タンパク質（ＣＤ３６及びＦＡＴ１）をコードしている遺伝子は、野生型マウスと比較して、ＴＭで処置されたＢＩ−Ｉ−/−マウスにおいて有意にアップレギュレートされていた。しかしながら、超低密度リポタンパク質の分泌に関与している、分泌性アポリポタンパク質であるアポＢ及びミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＴＰ）は両方共ダウンレギュレートされ、このことはおそらく、ＢＩ−Ｉ−/−ＴＭマウスの肝における大量の脂質含量の増大を説明する。脂質及びブドウ糖の代謝に関与する特定の重要な遺伝子は、野生型マウスと比較して、ＢＩ−Ｉ−/−マウスにおいては基礎レベルで僅かにアップレギュレートされていたが、ＴＭの注射後、両方の遺伝子型において大半が有意にダウンレギュレートされ、しかしＢＩ−Ｉ−/−ＴＭマウスでははるかに程度が大きかった（データは示されていない）。対照的に、ｃ−ＪＵＮは、特にＴＭの注射後、ＢＩ−Ｉ−/−マウスにおいてアップレギュレートされた。肝臓において上昇したｃ−ＪＵＮの発現は、Ｃ／ＥＢＰαの欠失から生じ得る２４。Ｃ／ＥＢＰαの崩壊、しかしまたグルコース６リン酸及び脂肪酸合成酵素の崩壊もそれゆえに、ＢＩ−Ｉ−/−ＴＭマウスにおいて見られた。小胞体ストレスによりインシュリン抵抗性がもたらされるという概念を支持して、本発明者らは、ＴＭで処置された野生型マウスにおけるキナーゼＡＫＴのＳｅｒ４７３のリン酸化状態の低下を観察し、これはＢＩ−Ｉ−/−ＴＭマウスにおいてより重度であった。したがって、ＴＭで処置されたＢＩ−Ｉ−/−マウスの悪化した小胞体ストレスは、増強された脂肪酸の取り込み、非効率的なβ酸化、及び脂肪酸遊離減少をおそらく通して、脂肪肝及び代謝崩壊を引き起こす。
【００８１】
透過型電子顕微鏡は、ＴＭの注射が、肝細胞内の小胞体のラメラ構造の膨潤及び破壊を引き起こすことを明らかとしたので、ＢＩ−Ｉ−/−ＴＭマウスの細胞は、小胞体構造の完全性のより大きな消失及びより多くのミトコンドリアに結合した小胞体膜を特色とした。ｓＸＢＰ１、ＣＨＯＰ及びＧＲＰ７８のタンパク質レベルは、ＢＩ−Ｉ−/−ＴＭマウスの肝臓において最も高かった。肝内ｃＡＴＦ６の発現も、ＢＩ−Ｉ−/−ＴＭマウスにおいて増加したが、ＡＴＦ４の発現は変化せず、これはＰＥＲＫのシグナル伝達は攪乱されていないことを反映している。注射から２４時間後に、ＴＭは、ＢＩ−１ｍＲＮＡレベルを顕著に減少させ、逆に、ＸＢＰ１及びＣＨＯＰのｍＲＮＡレベルを増加させ、これは、野生型の肝臓と比較してＢＩ−Ｉ−/−の肝臓においてＴＭから４８時間後に有意に上昇したままであった。したがって、ＢＩ−１欠損症は、特にＩＲＥ１αの分岐を通して、持続するＣＨＯＰのアップレギュレーションを伴い、増強し延長された小胞体ストレスを支持する。
【００８２】
ＢＩ−１の欠失は、ＮＬＲＰ３インフラマソームの過剰活性化を支持し、ＴＭによるチャレンジ後の肝損傷をもたらす。
本発明者らは次に、ＢＩ−１欠損症が、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化を支持するかどうかを調べた。ＴＭの４８時間後、ＢＩ−Ｉ−/−マウスの肝臓は、野生型臓器よりも高いカスパーゼ−１１レベルを含有し、これは増加した量のその基質のＩＬ−１β並びにそのセンサーのＮＬＲＰ３、及び上昇したレベルのチオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）と相関している。インフラマソームの成分（カスパーゼ１/１１、ＮＬＲＰ３）をコードしているｍＲＮＡのレベルは、注射から２４時間後にＢＩ−Ｉ−/−肝において有意にアップレギュレートされ、これらのｍＲＮＡレベルはＢＩ−Ｉ−/−マウスにおいて上昇したままであったが、それらは野生型マウスにおいては注射から４８時間後には基線に戻った。平行して、本発明者らは、野生型マウスと比較して、注射から２４時間後及び４８時間後に、ＢＩ−Ｉ−/−マウスにおいて、炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦα、及びＩＬ−６）、ケモカイン（ＭＣＰ１及びＣＸＣＬ１）をコードしているｍＲＮＡ、及びｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ４）のｍＲＮＡのＴＭにより誘発された増加を発見した。したがって、ＴＭの注射は、ＢＩ−Ｉ−/−マウスにおいて、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、及びＩＬ−６の上昇した循環中レベルを誘発した。ＭＣＰ１及びＣＸＣＬ１の血清中レベルも、ＴＭで処置されたＢＩ−Ｉ−/−マウスにおいて最も高く、このことは、肝臓への好中球の動員を示唆し２５、これは、ヒトＮＡＳＨ患者において報告されているのと同様に、脂質を持った肝細胞に関連したミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）陽性細胞の増加によって確認された２６。
【００８３】
過剰な線維性結合組織が、ＴＭで処置されたＢＩ−Ｉ−/−マウスに存在し、これはマッソントリクローム染色及び透過型電子顕微鏡によって判明した。急性小胞体ストレスは、ＢＩ−Ｉ−/−マウスの線維形成表現型を強めるようであり、これは、メタロプロテイナーゼ阻害剤のＴＩＭＰ１のｍＲＮＡレベルの有意な増加によってさらに示される。肝線維症は、肝細胞死の結果としての過剰な炎症性シグナル伝達に連関している１１，２７。アスパラギン酸（ＡＳＴ）及びアラニン（ＡＬＴ）トランスアミナーゼは、ＢＩ−Ｉ−/−ＴＭ血清中で有意に上昇していた。未処置ＢＩ−Ｉ−/−肝は、野生型対照を上回る、タネル陽性肝細胞の増加をすでに示し、ＴＭの注射は、ＢＩ−Ｉ−/−マウスのアポトーシス及び／又はピロトーシスを受けやすい表現型をさらに悪化させた。イムノブロット及びｍＲＮＡ分析は、おそらくＣＨＯＰのアップレギュレーションの結果としての、野生型対照を上回る、ＴＭで処置されたＢＩ−Ｉ−/−マウスにおける、生存促進性ＢＣＬ２タンパク質に対するアポトーシス促進性ＢＡＸの有意により高い比を明らかとした２８。
【００８４】
本発明者らは次に、ＢＩ−Ｉ−/−マウスの、通常は一過性のＴＭの肝毒性作用から回復する能力を探索した。ＴＭで処置されたマウスは、注射から２４時間後に低下した血清中ブドウ糖レベルを示した。４８時間後に回復し、ＴＭによるチャレンジを生き延びた野生型マウスとは異なり、ＢＩ−Ｉ−/−マウスは、ＴＭの注射から５日間以内に死滅するまで、低血糖を示し続けた。さらに、ＴＭで処置されたＢＩ−Ｉ−/−マウスの肝臓及び腎臓の両方が、注射から７２時間後に淡く変色した外見を呈した。これらの結果は、小胞体ストレスにより誘発される炎症、肝細胞死、線維症、及び肝不全から肝臓を防御する際のＢＩ−１の重要性を強調する。
【００８５】
ＮＡＦＬＤ患者の肝臓では、ＢＩ−１のダウンレギュレーションは、より大きなＩＲＥ１αリボヌクレアーゼシグナル伝達を伴う。
その後、ヒトＮＡＦＬＤの状況におけるＩＲＥ１αのシグナル伝達の関連性を、病的に肥満な患者の小群から得られた肝生検材料において調べた（表１）。ＢＩ−１の肝での発現は、やせた参加者と比較して、正常な肝組織像を有する病的肥満患者において２０％、ＮＡＦＬＤを有する肥満患者において３６％、特異的にダウンレギュレートしていた。対照的に、ＸＢＰ１及びＣＨＯＰのｍＲＮＡレベルの有意な増加が、ＮＡＦＬＤ肥満患者において圧倒的に観察された。
【００８６】
ＢＩ−１欠損症は、マウスにおける慢性的小胞体ストレスの代謝影響を悪化させる。
ＢＩ−１欠損症の影響をさらに、ＮＡＦＬＤの機構をよりそっくりと模倣するために長期間の高脂肪食を給餌されたマウスにおいて調べた。ＢＩ−Ｉ−/−マウスに、通常食（ＮＤ）又は高脂肪食を９カ月間給餌し、これは、野生型マウスにおいて、インフラマソームの活性化及び脂肪肝を誘発すると以前に報告されていた期間である２９。肝切片の組織学的分析は、ＢＩ−Ｉ−/−高脂肪食マウスにおける重要な脂肪症及び上昇した肝内トリグリセリドレベルを明らかとした。主要な代謝マーカー（ＰＥＰＣＫ、ＤＧＡＴ２及びＰＰＡＲα）のｍＲＮＡレベルは、高脂肪食の給餌されたＢＩ−Ｉ−/−マウスの肝臓において有意にアップレギュレートされていた。高脂肪食は、ＢＩ−Ｉ−/−マウス及び野生型マウスにおいて区別ができない体重増加を引き起こしたが、野生型対照と比較した場合、通常食及び高脂肪食の条件の両方のＢＩ−Ｉ−/−マウスにおいて、基線ブドウ糖レベルは有意により高かった。糖尿病の兆候を調べると、高脂肪食の給餌により、耐糖能障害及び弱いインシュリン応答が最も有意にはＢＩ−Ｉ−/−マウスにおいてもたらされた。リン酸化ＡＫＴ及びその標的であるＧＳＫ３は、ＢＩ−Ｉ−/−高脂肪食マウスにおいて有意に減少していた。
【００８７】
小胞体ストレス経路に関して、野生型肝臓よりもＢＩ−Ｉ−/−肝臓の方が、高脂肪食により誘発されるｓＸＢＰ１タンパク質のレベルが高いことは、過剰活性のＩＲＥ１αリボヌクレアーゼを反映しているが、ＡＴＦ６及びＰＥＲＫ経路のタンパク質は、遺伝子型間の発現に有意差はなかった。肝内ＢＩ−１のより低いｍＲＮＡレベルは、野生型マウスと比較してＢＩ−Ｉ−/−高脂肪食マウスにおける有意により高いＸＢＰ１及びＣＨＯＰ／ＧＲＰ７８比のレベルと対照的であった。したがって、ＢＩ−１の欠損症（これにより、ＩＲＥ１α−ＸＢＰ１シグナル伝達は抑制されない）は、２型糖尿病の発症に関連した代謝リスク因子の素因となり得る。
【００８８】
長期の高脂肪食はＮＬＲＰ３インフラマソームを圧倒し、ＢＩ−１欠損マウスにおいてＮＡＳＨを誘発する。
本発明者らは、ＢＩ−１が存在しないことにより、高脂肪食により誘発されるＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化へと向かう脆弱性を悪化させ得、よって炎症及びプログラム化細胞死を促進し得ると判断した。高脂肪食は、ＢＩ−Ｉ−/−マウスの肝臓における活発なカスパーゼ−１/１１及びＩＬ−１βの蓄積を引き起こした。カスパーゼ１、ＮＬＲＰ３、及びＡＳＣの肝内ｍＲＮＡレベルは、野生型マウスと比較して、ＢＩ−Ｉ−/−高脂肪食マウスにおいて有意にアップレギュレートされていた。同様に、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＭＣＰ１、及びＴＬＲ４も、高脂肪食の給餌されたＢＩ−Ｉ−/−マウスにおいて有意に増加した。肝組織分析は、高脂肪食の給餌されたマウスにおける炎症巣の存在を明らかとしたが、野生型マウスと比較してＢＩ−Ｉ−/−マウスにおいてその傾向がより高かった（データは示されていない）。本発明者らは、９カ月間高脂肪食を給餌されたＢＩ−Ｉ−/−マウスが、その肝臓内に増加したコラーゲン沈着を呈したことを発見した。このような肝臓は、ＴＩＭＰ１、Ｃｏｌ６ａ３、及びαＳＭＡをはじめとする線維症マーカーの高いｍＲＮＡレベルを発現していた。ＢＩ−Ｉ−/−高脂肪食マウスは、野生型高脂肪食マウスよりも多くの数のタネル陽性肝細胞を呈し、これは、タンパク質レベル及びｍＲＮＡレベルにおける増強したＢＡＸ／ＢＣＬ２比と相関していた。要約すると、ＢＩ−１欠損症は、高脂肪食により誘発されるインフラマソーム活性化及び炎症、肝細胞死、及び結果としての肝線維症を支持する。
【００８９】
ＢＩ−１の枯渇した肝細胞は、過剰活性化したＩＲＥ１αリボヌクレアーゼのシグナル伝達に因り、代謝の破綻を示す。
ＢＩ−１の寄与の起点を決定するために、本発明者らは、野生型肝を肝実質細胞と肝非実質細胞に分画化した。ＢＩ−１ｍＲＮＡレベルは、肝臓の非実質画分と比較して、肝細胞において有意により高かった。その後、本発明者らは、対照細胞よりも、親油性色素オイルレッドＯで染色されるより多くの小胞を示した初代肝細胞において、ＢＩ−１の無効化の代謝結果を探索した。したがって、ＢＩ−１の発現を欠失した初代肝細胞は、脂質生成に関与する主要な酵素の有意により高いｍＲＮＡレベルを呈した。ＢＩ−１がサイレンス状態の肝細胞は、特にＴＭ又は細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の添加から２４時間後に、ＸＢＰ１及びＣＨＯＰ並びに標的タンパク質のアップレギュレーションによって見られるように、ＩＲＥ１αシグナル伝達活性化の素因があった。対照の肝細胞と比較して、ＢＩ−１がサイレンス状態の細胞はまた、ＴＭ又はリポ多糖で処置された場合、有意により高い炎症誘発性カスパーゼｍＲＮＡレベル、並びにより高いカスパーゼ−１、ＮＬＲＰ３、及びＴＸＮＩＰタンパク質レベルを示した。ＢＩ−１は、ＣＨＯＰ及び／又はＴＸＮＩＰ活性化を通した、初代肝細胞におけるＩＲＥ１α依存性ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化から防御し得る。
【００９０】
本発明者らは、ＩＲＥ１α−ＸＢＰ１−ＣＨＯＰ系の各メンバーをノックダウンすることによって、ＢＩ−Ｉ−/−肝細胞における不均衡な小胞体ストレス応答の根底にあり得る、機序の候補を探索した。ＩＲＥ１αの枯渇は、ＢＩ−Ｉ−/−マウス及び野生型マウスから単離された初代肝細胞においてＸＢＰ１及びＣＨＯＰのｍＲＮＡレベルを低下させたが、それはカスパーゼ−１又はＮＬＫＰ３の肝細胞におけるｍＲＮＡの発現は制限しなかった。ＣＨＯＰをサイレンス状態にすることは、ＢＩ−Ｉ−/−及び野生型の初代肝細胞における、ＩＲＥ１α又はＸＢＰ１のｍＲＮＡレベルには影響を及ぼさなかったが、初代野生型（しかしＢＩ−Ｉ−/−ではない）肝細胞におけるカスパーゼ−１及びＮＬＲＰ３を有意に低下させた。顕著には、ＸＢＰ１をサイレンス状態にすることにより、野生型における小胞体ストレスマーカー及びＮＬＲＰ３インフラマソーム成分をコードしているｍＲＮＡレベルの有意な増加がもたらされ、ＢＩ−Ｉ−/−肝細胞においてはよりその傾向が高かった。したがって、ＸＢＰ１のノックダウンは、ＢＩ−Ｉ−/−マウスから単離された初代肝細胞における、ｐ−ＩＲＥ１α、ＣＨＯＰ、カスパーゼ−１、ＮＬＲＰ３、及びＴＸＮＩＰの蓄積を防いだ。このことは、ＩＲＥ１αリボヌクレアーゼのＸＢＰ１を活性化する機能が、ＢＩ−Ｉ−/−肝細胞表現型に寄与することを示唆する。
【００９１】
ＩＲＥ１αリボヌクレアーゼのシグナル伝達阻害は、初代ＢＩ−Ｉ−/−肝細胞の表現型を修正する。
ＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性の特異的阻害剤であるＳＴＦ−０８３０１０を用いてのＢＩ−Ｉ−/−マウス又は野生型マウスの初代肝細胞の処置は３０，３１、ＢＩ−Ｉ−/−細胞におけるＸＢＰ１ｍＲＮＡレベル及びｓＸＢＰ１タンパク質の減少を引き起こした。リポ多糖で処置されたＢＩ−Ｉ−/−初代肝細胞の活発なカスパーゼ−１１及びＮＬＲＰ３の過剰発現も、ＳＴＦ−０８３０１０による処置後に制限された。初代ＢＩ−Ｉ−/−肝細胞は、野生型細胞よりも、ＴＭ及びリポ多糖により誘発される細胞死に対してより感受性が高かった。ＳＴＦ−０８３０１０が、ＴＭ及びリポ多糖と一緒に共処置された場合、それは、ＢＩ−Ｉ−/−肝細胞の生存率を改善させた。しかしながら、ＳＴＦ−０８３０１０単独では、野生型肝細胞の生存率を損ねた。おそらくこれは、このような細胞は、恒常性を維持するためにいくらかの基礎レベルの小胞体ストレス応答を必要とするからであろう。ＢＩ−Ｉ−/−肝細胞においてＴＭ又はリポ多糖によって引き起こされる細胞死は、カスパーゼ−１/１１阻害剤であるＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫによっても阻害されたが、しかしながら、ＳＴＦ−０８３０１０よりも効率的ではなかった。これらの結果は、ＳＴＦ−０８３０１０によるＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ阻害が、ＢＩ−Ｉ−/−肝細胞の表現型を元に戻し得ることを示唆する。本発明者らは、過剰活性のＮＬＲＰ３インフラマソームが、マクロファージの特性に影響を及ぼし得るかどうかを問う補完的な実験を実施し、ＢＩ−１欠損症が、マクロファージコロニー刺激因子により媒介される骨髄の単球からマクロファージへの分化を変化させなかったことを発見した（データは示されていない）。さらに、Tufanli et al.によって報告されているように、本発明者らは、ＩＲＥ１αが、ｓＸＢＰ１を通して、リポ多糖及び脂質によりストレスのかけられた骨髄由来マクロファージにおいて、ＩＬ−１βの分泌を調節することを確認した；しかしながら、ＢＩ−１の欠損症は、このような刺激に対する感受性を変化させなかった（データは示されていない）３２。
【００９２】
ＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性の阻害は、ＢＩ−１欠損マウスにおけるＮＡＳＨの発症を遮断する。
インビボにおけるＩＲＥ１αを標的化するための治療窓を確立するために、本発明者らは、ＢＩ−Ｉ−/−マウスにおいて高脂肪食により誘発された肝疾患の動態を評価し、短期間の高脂肪食の給餌は、ＢＩ−Ｉ−/−マウスにおいて有意により多い体重増加（上記に詳述されている長期間の高脂肪食後に標準化する）及びより高いＡＬＴレベルをもたらすことを発見した（図２Ａ〜Ｃ）。３カ月間の高脂肪食により、ＢＩ−Ｉ−/−マウスはすでに、耐糖能障害に由来する高血糖、及び野生型マウスと比較して低下したインシュリン感受性を示す。ＢＩ−Ｉ−/−マウスは高脂肪食の開始から２カ月後から３カ月後までの間に、ＮＡＦＬＤの最初の兆候を発症するので、本発明者らは、この期間中に高脂肪食と同時にＳＴＦ−０８３０１０を投与した（図２Ａ）。肉眼的には、ＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ機能の標的化は、３カ月間高脂肪食を給餌されたＢＩ−Ｉ−/−マウスに見られる肝の変色を防いだ。顕微鏡的には、ＢＩ−Ｉ−/−高脂肪食マウスにおけるＳＴＦ−０８３０１０を用いての処置は、炎症の組織学的徴候及びグレード３の脂肪症を抑制した。高脂肪食の給餌されたＢＩ−Ｉ−/−ＳＴＦ−０８３０１０マウスにおける正常化された肝内トリグリセリド含量（図１Ａ）は、脂肪滴肥大の是正に起因することが判明し、肝細胞内の脂肪滴の直径は大きなサイズから平均サイズへとシフトした。代謝主要調節因子（ＳＲＥＢＰ１、ＦＡＳＮ及びｃ−ＪＵＮ）は、未処置で高脂肪食の給餌されたＢＩ−Ｉ−/−マウスにおいてアップレギュレートされたが、ＳＴＦ−０８３０１０で処置されたマウスでは通常のｍＲＮＡレベルの範囲内であった（図２Ｂ）。ＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ機能の阻害により、高脂肪食の給餌されたマウスにおいて血糖濃度は正常化した（図２Ｃ）。ＢＩ−Ｉ−/−マウスの肝臓では、ＳＴＦ−０８３０１０は、ＩＲＥ１αリボヌクレアーゼの標的のｓＸＢＰ１の発現と、タンパク質レベル及びｍＲＮＡレベルでの有害なＣＨＯＰ／ＧＲＰ７８の比を低下させた。高脂肪食の給餌された野生型マウスにおいて、ＳＴＦ−０８３０１０による処置は、ＢＩ−１ｍＲＮＡレベルの１５％増加を誘発し、これはおそらく、ＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性を標的化する有益な影響を強化するのだろう（図１Ｃ）。
【００９３】
ＳＴＦ−０８３０１０による処置は、ＢＩ−Ｉ−/−の高脂肪食の給餌されたマウスにおけるカスパーゼ−１／１１及びＮＬＲＰ３タンパク質の活性化を打ち消し、ＮＬＲＰ３インフラマソーム及び炎症誘発性応答成分のｍＲＮＡレベルを正常化した。ミエロペルオキシダーゼ陽性細胞の有意な減少も、高脂肪食の給餌された未処置マウスと、高脂肪食の給餌されたＳＴＦ−０８３０１０により処置されたマウスとの間で明らかであった。高脂肪食の給餌されたマウスにおけるＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性の制限は、両方の遺伝子型において肝損傷から防御した。ＳＴＦ−０８３０１０による処置は、３カ月間の高脂肪食の後にＢＩ−Ｉ−/−マウスで見られた細胞への浸潤を伴うコラーゲンの蓄積を防ぎ、肝臓におけるＣｏｌ６ａ３のアップレギュレーションを有意に制限した。通常食の給餌されたマウスでは、ＳＴＦ−０８３０１０による処置は、肝臓の外見を変化させなかった。これらのデータは、ＳＴＦ−０８３０１０が、ＢＩ−１欠損マウスがＮＡＳＨを発症する傾向を元に戻すことを示す。
【００９４】
ＩＲＥ１αのシグナル伝達阻害は、肝細胞癌における現在の化学療法の有効性を増強する。
本発明者らは、ＩＲＥ１αリボヌクレアーゼが、肝細胞癌の細胞株及び肝細胞癌の肝生検材料において恒常的に活性化され、腫瘍誘発性因子の基礎的産生の原因であることを観察した（データは示されていない）。実際に肝細胞癌の細胞株及び肝細胞癌の肝生検材料は、恒常的なＩＲＥ１αシグナル伝達及びＢＩ−１のダウンレギュレーションを示す。
【００９５】
ＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性阻害剤のＳＴＦ−０８３０１０は、肝癌細胞増殖を減少させる（図３Ａ）。ＳＴＦ−０８３０１０が、ソラフェニブと一緒に共処置された場合、それは、肝癌細胞増殖の低減（図３Ａ）及び肝細胞癌の細胞株のアポトーシスの誘発（図３Ｂ）におけるそれらの有効性を向上させる。これらのデータは、他のＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性阻害剤であるＭＫＣ６６８８及び４μ８ｃを用いて確認された（データは示されていない）。本発明者らは、過剰活性のＩＲＥ１αリボヌクレアーゼが、カスパーゼ−１、ＩＬ−１β、ＩＬ−６などの炎症誘発性マーカーの分泌をトリガーすることを観察した（データは示されていない）。カスパーゼ１/１１阻害剤であるＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫも、肝癌細胞増殖の低減及びアポトーシスの誘発においてソラフェニブの有効性を増強するが、ＳＴＦ−０８３０１０ほど効率的ではない（図４）。ＲＩＰＫ１キナーゼ阻害剤であるネクロスタチン−１（Ｎｅｃ−１）、及びＪＮＫ阻害剤であるＳＰ６００１２５（ＳＰ）は、ソラフェニブ及びＳＴＦ−０８３０１０の効果を阻害するようである。Ｎｅｃ−１又はＳＰによる前処置後の、ソラフェニブ及び／又はＳＴＦ−０８３０１０の注射を伴う又は伴わない、癌細胞増殖は類似している（図５Ａ及び５Ｂ）。ソラフェニブとＳＴＦ−０８３０１０の共処置は、ＩＲＥ１αのキナーゼ活性を介してアポトーシスを増強する。
【００９６】
肝細胞癌の異種移植片マウスモデルでは、ＳＴＦ−０８３０１０を用いてのＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性の阻害は、ソラフェニブにより媒介される腫瘍の抑制を増加させた（図６Ａ及び６Ｂ）。本発明者らは、最後の世代のＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ活性阻害剤であるＭＫＣ６６８８を用いてのデータを確認し（データは示されていない）、このことは、ＩＲＥ１αリボヌクレアーゼ阻害剤の包含が、現在の化学療法の有効性を増強することができることを示唆する。
【００９７】
参考文献：
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する分野の最新技術を記載している。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。
【００９８】
【表１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【国際調査報告】
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