(57)【要約】  本開示は、例えば、線維性疾患又は障害を有する対象における、線維症を軽減又は治療するための組成物及び方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における繊維症を軽減するための方法であって、
ａ）ロイシンアミノ酸実体、
ｂ）アルギニンアミノ酸実体、
ｃ）グルタミンアミノ酸実体；及び
ｄ）Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）実体
を含む組成物を有効量で、それを必要とする前記対象に投与し、それによって、前記対象における前記繊維症を軽減することを含み；
ただし：
前記繊維症は肝繊維症でない、方法。
【請求項２】
必要とする対象における線維性疾患又は障害を治療する方法であって、
ａ）ロイシンアミノ酸実体
ｂ）アルギニンアミノ酸実体、
ｃ）グルタミンアミノ酸実体；及び
ｄ）ＮＡＣ実体
を含む組成物を有効量で、前記対象に投与し、それによって、前記線維性疾患又は障害を治療することを含み；
ただし：
前記線維性疾患又は障害は、肝臓の線維性疾患又は障害でない、方法。
【請求項３】
対象における繊維症を軽減するのに使用するための組成物であって、
ａ）ロイシンアミノ酸実体、
ｂ）アルギニンアミノ酸実体、
ｃ）グルタミンアミノ酸実体；及び
ｄ）Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）実体
を含む組成物を有効量で含み；
ただし：
前記繊維症は肝繊維症でない、組成物。
【請求項４】
必要とする対象における線維性疾患又は障害を治療するのに使用するための組成物であって、
ａ）ロイシンアミノ酸実体
ｂ）アルギニンアミノ酸実体、
ｃ）グルタミンアミノ酸実体；及び
ｄ）ＮＡＣ実体
を含む組成物を有効量で含み；
ただし：
前記線維性疾患又は障害は、肝臓の線維性疾患又は障害でない、組成物。
【請求項５】
前記線維性疾患又は障害が、肺の線維性疾患又は障害、心臓又は血管系の線維性疾患又は障害、腎臓の線維性疾患又は障害、膵臓の線維性疾患又は障害、皮膚の線維性疾患又は障害、消化管の線維性疾患又は障害、骨髄又は造血組織の線維性疾患又は障害、神経系の線維性疾患又は障害、眼の線維性疾患又は障害、又はそれらの組合せから選択される、請求項１又は２に記載の方法、又は請求項３又は４に記載の使用のための組成物。
【請求項６】
前記組成物の投与が、
（ａ）組織線維症の形成若しくは沈着；
（ｂ）線維性病変のサイズ、細胞密度、組成、若しくは細胞含有量；
（ｃ）線維性病変のコラーゲン；
（ｄ）線維性病変のコラーゲン若しくはヒドロキシプロリン含有量；
（ｅ）線維形成タンパク質の発現若しくは活性；
（ｆ）炎症反応に関連する線維症；又は
（ｇ）線維症に関連する体重減少
のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はそれ以上（例えば、全て）の軽減又は阻害をもたらす、請求項１、２、又は５のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３〜５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
前記方法が、以下：（ａ）Ｃｏｌ１ａ１；（ｂ）ＦＧＦ−２１；（ｃ）ヒドロキシプロリン含有量；（ｄ）ＩＬ−１β；（ｅ）マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、例えば、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＭＰ−３、若しくはＭＭＰ−１０；（ｆ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端断片（ｐｒｏＣ３）；（ｇ）ＰＩＩＩＮＰ（ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド）；（ｈ）α−平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；（ｉ）ＴＧＦ−β；（ｊ）メタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）；例えば、ＴＩＭＰ１若しくはＴＩＭＰ２；（ｋ）Ａｃｔａ２；又は（ｌ）Ｈｓｐ４７のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又はそれ以上（例えば、全て）のレベルを決定することをさらに含む、請求項１、２、５、又は６のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３〜６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
（ａ）〜（ｄ）の総重量％が、前記組成物（例えば、乾燥形態で）中の他のアミノ酸実体成分、非アミノ酸実体タンパク質成分（例えば、ホエータンパク）、又は非タンパク質成分の１つ、２つ、又は３つの総重量％を超える、請求項１、２、又は５〜７のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３〜７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
前記組成物が、１８以下のアミノ酸実体の組合せを含む、請求項１、２、又は５〜８のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３〜８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、２０を超えるアミノ酸残基長のペプチド（例えば、ホエータンパク）を含まないか、又は２０を超えるアミノ酸残基長のペプチドが存在する場合、前記ペプチドは、前記組成物（例えば、乾燥形態で）のタンパク質成分又は全成分の総重量の１０重量（ｗｔ．）％未満で存在する、請求項１、２、又は５〜９のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３〜９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
メチオニン（Ｍ）、トリプトファン（Ｗ）、バリン（Ｖ）、又はシステイン（Ｃ）の少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つ（例えば、全て）が存在しないか、又は存在する場合、前記組成物（例えば、乾燥形態で）の１０重量％未満で存在する、請求項１、２、又は５〜１０のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３〜１０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
（ａ）〜（ｄ）の少なくとも１つ、２つ、３つ、又はそれ以上（例えば、全て）が、表１から選択される、請求項１、２、又は５〜１１のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３〜１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、（ｅ）イソロイシンアミノ酸実体又は（ｆ）バリンアミノ酸実体の一方又は両方をさらに含む、請求項１、２、又は５〜１２のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３〜１２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
前記ロイシンアミノ酸実体、前記アルギニンアミノ酸実体、前記グルタミンアミノ酸実体、及び前記ＮＡＣ−アミノ酸実体の重量比が、１＋／−２０％：１．５＋／−２０％：２＋／−２０％：０．１５＋／−２０％である、請求項１、２、又は５〜１３のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３〜１３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
前記ロイシンアミノ酸実体、前記イソロイシンアミノ酸実体、前記バリンアミノ酸実体、前記アルギニンアミノ酸実体、前記グルタミンアミノ酸実体、及び前記ＮＡＣ−アミノ酸実体の重量比が、１＋／−２０％：０．５＋／−２０％：０．５＋／−２０％：１．５＋／−２０％：２＋／−２０％：０．１５＋／−２０％である、請求項１３又は１４に記載の方法、又は請求項１３又は１４に記載の使用のための組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、以下を含み、
ａ）以下から選択されるロイシンアミノ酸実体：
ｉ）Ｌ−ロイシン若しくはその塩、
ｉｉ）Ｌ−ロイシンを含むジペプチド若しくはその塩、又はトリペプチド若しくはその塩、又は
ｉｉｉ）β−ヒドロキシ−β−メチルブチレート（ＨＭＢ）若しくはその塩；
ｂ）以下から選択されるアルギニンアミノ酸実体：
ｉ）Ｌ−アルギニン若しくはその塩、
ｉｉ）Ｌ−アルギニンを含むジペプチド若しくはその塩、又はトリペプチド若しくはその塩、
ｉｉｉ）クレアチン若しくはその塩、又は
ｉｖ）クレアチンを含むジペプチド若しくはその塩、又はトリペプチド若しくはその塩；
ｃ）前記グルタミンアミノ酸実体は、Ｌ−グルタミン若しくはその塩又はＬ−グルタミンを含むジペプチド若しくはその塩、又はトリペプチド若しくはその塩であり；及び
ｄ）前記ＮＡＣ実体は、ＮＡＣ若しくはその塩又はＮＡＣを含むジペプチド若しくはその塩である、請求項１、２、又は５〜１５のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３〜１５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、
ｅ）Ｌ−イソロイシン若しくはその塩又はＬ−イソロイシンを含むジペプチド若しくはその塩、又はトリペプチド若しくはその塩；又は
ｆ）Ｌ−バリン若しくはその塩又はＬ−バリンを含むジペプチド若しくはその塩、又はトリペプチド若しくはその塩
のうちの一方又は両方をさらに含む、請求項１、２、又は５〜１６のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３〜１６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１８】
前記組成物が、以下を含み、
ａ）前記ロイシンアミノ酸実体は、Ｌ−ロイシン又はその塩であり；
ｂ）前記アルギニンアミノ酸実体は、Ｌ−アルギニン又はその塩であり；
ｃ）前記グルタミンアミノ酸実体は、Ｌ−グルタミン又はその塩であり；及び
ｄ）前記ＮＡＣ実体は、ＮＡＣ又はその塩である、請求項１、２、又は５〜１７のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３〜１７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１９】
前記組成物が、以下を含み、
ａ）前記ロイシンアミノ酸実体は、Ｌ−ロイシン又はその塩であり；
ｂ）前記アルギニンアミノ酸実体は、Ｌ−アルギニン又はその塩であり；
ｃ）前記グルタミンアミノ酸実体は、Ｌ−グルタミン又はその塩であり；
ｄ）前記ＮＡＣ実体は、ＮＡＣ又はその塩であり；
ｅ）前記イソロイシンアミノ酸実体は、Ｌ−イソロイシン又はその塩であり；及び
ｆ）前記バリンアミノ酸実体は、Ｌ−バリン又はその塩である、請求項１、２、又は５〜１８のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３〜１８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２０】
前記組成物が、薬学的に許容できる担体とともに製剤化される、請求項１、２、又は５〜１９のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３〜１９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２１】
前記組成物が、食品組成物として製剤化される、請求項１、２、又は５〜２０のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３〜２０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２２】
前記食品組成物が、医療食、機能性食品、又は栄養補助食品から選択される、請求項２１に記載の方法、又は請求項２１に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［背景技術］
線維症は、少なくとも部分的に、損傷に対する応答などの修復又は反応過程に起因する、過剰な線維性結合組織の発生によって特徴付けられる深刻な健康問題である。線維症では、細胞外基質タンパク質の異常な蓄積が、罹患組織の瘢痕化及び肥厚をもたらし得る。線維症は、肺、肝臓、心臓、腎臓、膵臓、皮膚、及び脳を含む様々な器官において発生し得る。心筋症、高血圧症、動脈壁の硬化、慢性Ｃ型肝炎感染、クローン病、成人呼吸窮迫症候群、及びサルコイドーシスなどの様々な疾患及び障害が、線維症を伴う。線維性疾患の現在利用可能な治療法は、限られた有効性を有する。
【０００２】
利用可能な治療の制限を考えると、対象における線維症を軽減する抗線維化剤、例えば、食品組成物及び治療薬が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
対象、例えば、線維性疾患又は障害を有する対象における線維症を改善又は軽減するのに有用なアミノ酸実体を含む組成物が、本明細書において提供される。組成物は、それを必要とする対象（例えば、ヒト）における線維症を軽減及び／又は治療する（例えば、食い止める、軽減、改善、又は予防する）方法に使用され得る。本方法は、アミノ酸実体を含む組成物の投与の後、線維症の１つ又は複数の症状の改善について対象を監視することをさらに含み得る。
【０００４】
一態様において、本発明は、対象における線維症を軽減するための方法であって、
ａ）ロイシンアミノ酸実体、
ｂ）アルギニンアミノ酸実体、
ｃ）グルタミンアミノ酸実体；及び
ｄ）Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）実体
を含む組成物（例えば、活性部分）を有効量で、それを必要とする対象に投与し；
それによって、対象における線維症を軽減することを含む方法を特徴とする。
【０００５】
ある実施形態において、線維症は肝線維症でない。
【０００６】
別の態様において、本発明は、必要とする対象における線維性疾患又は障害を治療する方法であって、
ａ）ロイシンアミノ酸実体、
ｂ）アルギニンアミノ酸実体、
ｃ）グルタミンアミノ酸実体；及び
ｄ）ＮＡＣ実体
を含む組成物（例えば、活性部分）を有効量で、対象に投与し；
それによって、線維性疾患又は障害を治療することを含む方法を特徴とする。
【０００７】
ある実施形態において、線維性疾患又は障害は、肝臓の線維性疾患又は障害でない。
【０００８】
別の態様において、本発明は、対象における線維症を軽減するのに使用するための組成物であって、
ａ）ロイシンアミノ酸実体、
ｂ）アルギニンアミノ酸実体、
ｃ）グルタミンアミノ酸実体；及び
ｄ）Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）実体
を含む組成物を有効量で含み；
ただし：
線維症は肝線維症でない、組成物を特徴とする。
【０００９】
別の態様において、本発明は、必要とする対象における線維性疾患又は障害を治療するのに使用するための組成物であって、
ａ）ロイシンアミノ酸実体
ｂ）アルギニンアミノ酸実体、
ｃ）グルタミンアミノ酸実体；及び
ｄ）ＮＡＣ実体
を含む組成物を有効量で含み；
ただし：
線維性疾患又は障害は、肝臓の線維性疾患又は障害でない、組成物を特徴とする。
【００１０】
ある実施形態において、線維性疾患又は障害は、肺の線維性疾患又は障害、心臓又は血管系の線維性疾患又は障害、腎臓の線維性疾患又は障害、膵臓の線維性疾患又は障害、皮膚の線維性疾患又は障害、消化管の線維性疾患又は障害、骨髄又は造血組織の線維性疾患又は障害、神経系の線維性疾患又は障害、眼の線維性疾患又は障害、又はそれらの組合せから選択される。
【００１１】
ある実施形態において、組成物（例えば、活性部分）の投与は、（ａ）組織線維症の形成若しくは沈着；（ｂ）線維性病変のサイズ、細胞密度（ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）、組成、若しくは細胞含有量；（ｃ）線維性病変のコラーゲン；（ｄ）線維性病変のコラーゲン若しくはヒドロキシプロリン含有量；（ｅ）線維形成タンパク質の発現若しくは活性；（ｆ）炎症反応に関連する線維症；又は（ｇ）線維症に関連する体重減少のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はそれ以上（例えば、全て）の軽減又は阻害をもたらす。
【００１２】
ある実施形態において、本方法は、以下：（ａ）Ｃｏｌ１ａ１；（ｂ）ＦＧＦ−２１；（ｃ）ヒドロキシプロリン含有量；（ｄ）ＩＬ−１β；（ｅ）マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、例えば、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＭＰ−３、若しくはＭＭＰ−１０；（ｆ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端断片（ｐｒｏＣ３）；（ｇ）ＰＩＩＩＮＰ（ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロペプチド）；（ｈ）α−平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；（ｉ）ＴＧＦ−β；（ｊ）メタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）；例えば、ＴＩＭＰ１若しくはＴＩＭＰ２；又は（ｋ）Ｈｓｐ４７のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上（例えば、全て）のレベルを決定することをさらに含む。
【００１３】
ある実施形態において、組成物（例えば、活性部分）は、（ｅ）イソロイシンアミノ酸実体又は（ｆ）バリンアミノ酸実体の一方又は両方をさらに含む。
【００１４】
ある実施形態において、（ａ）〜（ｄ）又は（ａ）〜（ｆ）の総重量％は、組成物（例えば、乾燥形態で）中の他のアミノ酸実体成分、非アミノ酸実体タンパク質成分（例えば、ホエータンパク）、又は非タンパク質成分の１つ、２つ、又は３つの総重量％より多く、例えば、（ａ）〜（ｄ）又は（ａ）〜（ｆ）は、組成物（例えば、乾燥形態で）中のアミノ酸実体成分又は全成分の一方又は両方の総重量の少なくとも：５０重量％、７５重量％、又は９０重量％である。
【００１５】
ある実施形態において、１８以下、１５以下、又は１０以下のアミノ酸実体の組合せ、例えば、組成物（例えば、乾燥形態で）中のアミノ酸実体成分又は全成分の総重量の少なくとも：４２重量％、７５重量％、又は９０重量％を含む組合せを含む。
【００１６】
ある実施形態において、組成物は、２０を超えるアミノ酸残基長のペプチド（例えば、ホエータンパク）を含まないか、又は２０を超えるアミノ酸残基長のペプチドが存在する場合、ペプチドは、組成物（例えば、乾燥形態で）の非アミノ酸実体タンパク質成分又は全成分の総重量の１０重量％、１重量％、０．５重量％、０．１重量％、０．０５重量％、０．０１重量％、０．００１重量％未満、又はそれ以下で存在する。
【００１７】
ある実施形態において、メチオニン、トリプトファン、バリン、又はシステインの少なくとも１つ、２つ、３つ、又はそれ以上（例えば、全て）が、組成物に存在しないか、又は存在する場合、例えば、組成物（例えば、乾燥形態で）中の全成分の総重量の１０重量％、１重量％、０．５重量％、０．１重量％、０．０５重量％、０．０１重量％、０．００１重量％未満、又はそれ以下で存在する。ある実施形態において、メチオニン、トリプトファン、バリン、又はシステインの１つ、２つ、３つ、又はそれ以上（例えば、全て）が、存在する場合、遊離形態で存在する。ある実施形態において、メチオニン、トリプトファン、バリン、又はシステインの１つ、２つ、３つ、又はそれ以上（例えば、全て）が、存在する場合、塩形態で存在する。
【００１８】
ある実施形態において、メチオニン、トリプトファン、バリン、又はシステインは、存在する場合、オリゴペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質中で存在してもよく、ただし、タンパク質は、無傷のタンパク質として存在するか又はタンパク質加水分解物として存在するかにかかわらず、ホエー、カゼイン、ラクトアルブミン、又は栄養補給食品、医療食、若しくは同様の製品として使用される任意の他のタンパク質でない。
【００１９】
ある実施形態において、（ａ）〜（ｆ）の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上（例えば、全て）が、表１から選択される。
【００２０】
ある実施形態において、ロイシンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量比は、１＋／−２０％：１．５＋／−２０％：２＋／−２０％：０．１５＋／−２０％である。ある実施形態において、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量比は、１＋／−２０％：０．５＋／−２０％：０．５＋／−２０％：１．５＋／−２０％：２＋／−２０％：０．１５＋／−２０％である。
【００２１】
ある実施形態において、組成物（例えば、活性部分）は、以下を含み、
ａ）以下から選択されるロイシンアミノ酸実体：ｉ）Ｌ−ロイシン若しくはその塩、ｉｉ）Ｌ−ロイシンを含むジペプチド若しくはその塩、又はトリペプチド若しくはその塩、又はｉｉｉ）β−ヒドロキシ−β−メチルブチレート（ＨＭＢ）若しくはその塩；
ｂ）以下から選択されるアルギニンアミノ酸実体：ｉ）Ｌ−アルギニン若しくはその塩、ｉｉ）Ｌ−アルギニンを含むジペプチド若しくはその塩、又はトリペプチド若しくはその塩、ｉｉｉ）クレアチン若しくはその塩、又はｉｖ）クレアチンを含むジペプチド若しくはその塩、又はトリペプチド若しくはその塩；
ｃ）グルタミンアミノ酸実体は、Ｌ−グルタミン若しくはその塩又はＬ−グルタミンを含むジペプチド若しくはその塩、又はトリペプチド若しくはその塩であり；
ｄ）ＮＡＣ実体は、ＮＡＣ若しくはその塩又はＮＡＣを含むジペプチド若しくはその塩である。
【００２２】
ある実施形態において、組成物（例えば、活性部分）は、ｅ）Ｌ−イソロイシン若しくはその塩又はＬ−イソロイシンを含むジペプチド若しくはその塩、又はトリペプチド若しくはその塩；又はｆ）Ｌ−バリン若しくはその塩又はＬ−バリンを含むジペプチド若しくはその塩、又はトリペプチド若しくはその塩のうちの一方又は両方をさらに含む。
【００２３】
ある実施形態において、組成物（例えば、活性部分）は、以下を含み、ａ）ロイシンアミノ酸実体は、Ｌ−ロイシン又はその塩であり；ｂ）アルギニンアミノ酸実体は、Ｌ−アルギニン又はその塩であり；ｃ）グルタミンアミノ酸実体は、Ｌ−グルタミン又はその塩であり；及びｄ）ＮＡＣ実体は、ＮＡＣ又はその塩である。
【００２４】
ある実施形態において、組成物（例えば、活性部分）は、以下を含み、ａ）ロイシンアミノ酸実体は、Ｌ−ロイシン又はその塩であり；ｂ）アルギニンアミノ酸実体は、Ｌ−アルギニン又はその塩であり；ｃ）グルタミンアミノ酸実体は、Ｌ−グルタミン又はその塩であり；ｄ）ＮＡＣ実体は、ＮＡＣ又はその塩であり；ｅ）イソロイシンアミノ酸実体は、Ｌ−イソロイシン又はその塩であり；及びｆ）バリンアミノ酸実体は、Ｌ−バリン又はその塩である。
【００２５】
ある実施形態において、組成物（例えば、活性部分）は、薬学的に許容できる担体とともに製剤化される。
【００２６】
ある実施形態において、組成物（例えば、活性部分）は、食品組成物として製剤化される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】図１：ＳＴＡＭマウスモデル（図１Ａ）及びＦＡＴＺＯマウスモデル（図１Ｂ）において、ＮＡＦＬＤ活動性スコア、肝細胞風船様腫大、及び線維症に対するアミノ酸組成物（アミノ酸組成物Ａ−１）による処理の効果を示すグラフである。
【図１Ｂ】（上記の通り。）
【図２】ＳＴＡＭ及びＦＡＴＺＯマウスへのアミノ酸組成物の投与のための処理計画を示す概略図である。
【図３Ａ】図３：組織学を用いて決定される際の、ＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）、脂肪症、炎症、及び肝線維症に対する、アミノ酸組成物によるＳＴＡＭ及びＦＡＴＺＯマウスの処理の効果を示す一連のグラフ及び画像である。
【図３Ｂ】（上記の通り。）
【図３Ｃ】（上記の通り。）
【図３Ｄ】（上記の通り。）
【図３Ｅ】（上記の通り。）
【図４】線維形成性ＴＧＦ−ｂシグナル伝達経路の抑制を示すＳＴＡＭマウスにおけるアミノ酸組成物による処理の後の肝臓遺伝子発現パターンの遺伝子地図の画像である。
【図５】アミノ酸組成物による処理の後の、Ｃ−Ｃケモカイン受容体２型（ＣＣＲ２）及び５型（ＣＣＲ５）のリガンドであるＭＣＰ−１及びＭＩＰ−１タンパク質レベルを示す一連のグラフである。
【図６】示されるアミノ酸組成物の投与後のＦＡＴＺＯマウスからの肝組織像（コラーゲン沈着のためのＨ＆Ｅ染色又はシリウスレッド染色）を示す一連の顕微鏡画像である。
【図７】示されるアミノ酸組成物の投与後のＦＡＴＺＯマウスからの肝組織像を示す一連の顕微鏡画像である。
【図８】示されるアミノ酸組成物の投与後のＦＡＴＺＯマウスからの固定した肝組織において観察される、ＮＡＦＬＤ活動性スコア（左上のパネル）、シリウスレッド染色（右上のパネル）、脂肪症レベル（左下のパネル）、炎症レベル（下の真ん中のパネル）及び肝細胞風船様腫大（右下のパネル）を示す一連のグラフである。
【図９Ａ】ＰＩＩＩＮＰ及びＴＩＭＰ−１（図９Ｂ）に加えて、ｐｒｏＣ３（図９Ａ）のレベルに対する、アミノ酸組成物でヒト対象を処理する効果を示す一連のグラフである。
【図９Ｂ】（上記の通り。）
【発明を実施するための形態】
【００２８】
１つには、アミノ酸実体を含む組成物（例えば、活性部分）及び有効量の組成物を投与することによって線維症を軽減する方法が、本明細書に記載される。組成物は、それを必要とする対象における線維性疾患又は障害を治療又は予防するために投与され得る。組成物中のアミノ酸実体及びアミノ酸実体の相対量は、例えば、多くの生物学的、細胞、及び分子過程の調整を必要とする対象（例えば、線維性疾患又は障害を有する対象）における線維症を軽減するために、注意深く選択されてきた。組成物は、線維化反応に関与するシグナル伝達経路の調節を最適化し、線維症における細胞外基質の沈着を軽減する（及び再吸収を改善する）ために、組織生理学に対する多経路の有益な効果を可能にする。特に、組成物は、線維形成遺伝子／タンパク質発現を減少させ、線維症に関連する炎症を軽減し、線維症に関連する経路を阻害するように特異的に調整されてきた。
【００２９】
以下に詳細に記載される例において、本発明の組成物は、線維症を改善し、線維形成遺伝子及びタンパク質発現を減少させた。
【００３０】
定義
特許請求の範囲及び本明細書において使用される用語は、特に規定されない限り、以下に記載されるとおりに定義される。
【００３１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される際、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上特に明記されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されなければならない。
【００３２】
本明細書において使用される際、「アミノ酸実体」という用語は、遊離形態若しくは塩形態（又は両方）の左旋性（Ｌ）−アミノ酸、２０未満のアミノ酸残基のペプチド（例えば、オリゴペプチド、例えば、ジペプチド若しくはトリペプチド）のＬ−アミノ酸残基、アミノ酸の誘導体、アミノ酸の前駆体、又はアミノ酸の代謝産物を指す（例えば、表１を参照）。アミノ酸実体は、遊離Ｌ−アミノ酸の生物学的機能性をもたらすことが可能な、アミノ酸の誘導体、アミノ酸の前駆体、アミノ酸の代謝産物、又はアミノ酸の塩形態を含む。アミノ酸実体は、完全な（ｗｈｏｌｅ）又は修飾された形態、例えば、加水分解された形態のいずれかの、２０を超えるアミノ酸残基の天然ポリペプチド又はタンパク質を含まない。
【００３３】
アミノ酸の塩は、任意の摂取可能な塩を含む。医薬組成物については、組成物（例えば、活性部分）中に存在するアミノ酸の塩形態は、薬学的に許容できる塩であるべきである。特定の例において、塩形態は、アミノ酸の塩酸塩（ＨＣｌ）形態である。
【００３４】
ある実施形態において、アミノ酸実体の誘導体は、アミノ酸エステル（例えば、アミノ酸実体のアルキルエステル、例えば、エチルエステル若しくはメチルエステル）又はケト酸を含む。
【００３５】
【表１】
2021527669.tif 000002
【００３６】
「約」及び「およそ」は、一般に、測定の性質又は精度を所与として、測定される量に対する誤差の許容される程度を意味するものである。例示的な誤差の程度は、所与の値又は値の範囲の１５パーセント（％）以内、典型的に、１０％以内、より典型的に、５％以内である。
【００３７】
「アミノ酸」は、アミノ基（−ＮＨ２）、カルボン酸基（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、及び中心の炭素原子を介して結合された側鎖を有する有機化合物を指し、必須及び非必須アミノ酸、並びに天然、非タンパク及び非天然アミノ酸を含む。
【００３８】
本明細書において使用される際、「活性部分」という用語は、全体として、本明細書に記載される生理学的効果、例えば、抗線維症性効果を有する能力を有する４つ以上のアミノ酸実体の組合せを意味する。例えば、活性部分は、疾患又は障害に罹患した対象における代謝機能不全のバランスを調節し直すことができる。本発明の活性部分が、他の生物学的に有効な成分を含有し得る。ある例において、活性部分は、以下に詳細に記載される、４つ以上のアミノ酸実体の定義された組合せを含む。他の実施形態において、活性部分は、以下に詳細に記載される、アミノ酸実体の定義された組合せからなる。
【００３９】
個々のアミノ酸実体が、重量基準の量（例えば、グラムで）、アミノ酸実体の互いの重量比、モル基準の量、組成物の重量パーセント基準の量、組成物のモルパーセント基準の量、カロリー量、組成物へのカロリー寄与率パーセントなどとして示され得る様々な量又は比率で、組成物、例えば、活性部分中に存在する。一般に、本開示は、剤形におけるアミノ酸実体のグラム、組成物の重量に対するアミノ酸実体の重量パーセント、すなわち、組成物中に存在する全てのアミノ酸実体及び任意の他の生物学的に有効な成分の重量を、又は比率で提供する。ある実施形態において、組成物、例えば、活性部分は、薬学的に許容できる製剤（例えば、医薬品）として提供される。
【００４０】
本明細書において使用される際の「有効量」という用語は、治療される症状を軽減及び／又は病態を改善する（例えば、所望の臨床反応をもたらす）のに十分な、本発明の組成物、特に、本発明の医薬組成物における、本発明の有効成分の量を意味する。組成物において使用するための有効成分の有効量は、担当医の知識及び専門知識により、治療される具体的な病態、病態の重症度、治療期間、併用療法の性質、用いられる具体的な有効成分、用いられる具体的な薬学的に許容できる賦形剤及び／又は担体、及び類似の要因により変化するであろう。
【００４１】
本明細書に記載される「医薬組成物」は、少なくとも１つの「活性部分」及び薬学的に許容できる担体又は賦形剤を含む。ある実施形態において、医薬組成物は、治療薬として使用される。医薬品規格（ＧＭＰ；医薬品グレード成分）を満たす必要のない他の組成物が、栄養補給食品、医療食、又は栄養補助食品として使用され得、これらは、「消費者健康（ｃｏｎｓｕｍｅｒ  ｈｅａｌｔｈ）組成物」と呼ばれる。
【００４２】
本明細書において使用される際の「薬学的に許容できる」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、妥当なリスク・ベネフィット比に見合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴わずに、ヒト及び動物の組織と接触した状態で使用するのに好適なアミノ酸、材料、賦形剤、組成物、及び／又は剤形を指す。特定の実施形態において、「薬学的に許容できる」は、検出可能な内毒素を含まないか、又は内毒素レベルが、医薬品中で許容できるレベル未満であることを意味する。
【００４３】
特定の実施形態において、「薬学的に許容できる」は、１つ又は複数の製品品質パラメータが、薬剤、医薬組成物、治療、又は他の治療薬のために許容できる範囲内であることを確実にするために、製薬業界又は製薬業界を規制する機関若しくは事業体（例えば、政府若しくは商業機関若しくは事業体）によって使用される規格を意味する。製品品質パラメータは、組成物；組成物の均一性；投与量；投与量の均一性；存在、非存在、及び／又は汚染物質若しくは不純物のレベル；及び無菌のレベル（例えば、微生物の存在、非存在及び／又はレベル）を含むがこれらに限定されない、製薬業界又は機関若しくは事業体、例えば、政府若しくは商業機関若しくは事業体によって規制される任意のパラメータであり得る。例示的な政府の規制機関としては、アメリカ食品医薬品局（Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）、欧州医薬品庁（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ａｇｅｎｃｙ）（ＥＭＡ）、スイスメディック（ＳｗｉｓｓＭｅｄｉｃ）、中華人民共和国国家食品薬品監督管理局（Ｃｈｉｎａ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＣＦＤＡ）、又は医薬品医療機器総合機構（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ａｇｅｎｃｙ）（ＰＭＤＡ）が挙げられる。
【００４４】
「薬学的に許容できる賦形剤」という用語は、生理学的に適合する、有効成分以外の、医薬製剤の成分を指す。薬学的に許容できる賦形剤としては、限定はされないが、緩衝剤、甘味料、分散促進剤、香味料、苦味マスキング剤、天然着色料、人工着色料、安定剤、溶媒、又は防腐剤が挙げられる。特定の実施形態において、薬学的に許容できる賦形剤は、クエン酸又はレシチンの一方又は両方を含む。
【００４５】
本明細書において使用される際の「非アミノ酸実体タンパク質成分」という用語は、ペプチド（例えば、ポリペプチド又はオリゴペプチド）、その断片、又は分解されたペプチドを指す。例示的な非アミノ酸実体タンパク質成分としては、限定はされないが、ホエータンパク、卵白タンパク質、大豆タンパク質、カゼイン、麻タンパク質、エンドウ豆タンパク質、玄米タンパク質、又はそれらの断片若しく分解されたペプチドのうちの１つ又は複数が挙げられる。
【００４６】
本明細書において使用される際の「非タンパク質成分」という用語は、タンパク質成分以外の組成物の任意の成分を指す。例示的な非タンパク質成分としては、限定はされないが、糖（例えば、単糖（例えば、デキストロース、グルコース、若しくはフルクトース）、二糖、オリゴ糖、若しくは多糖）；脂質（例えば、硫黄含有脂質（例えば、α−リポ酸）、長鎖トリグリセリド、ω３脂肪酸（例えば、ＥＰＡ、ＤＨＡ、ＳＴＡ、ＤＰＡ、若しくはＡＬＡ）、ω６脂肪酸（ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、若しくはＬＡ）、中鎖トリグリセリド、若しくは中鎖脂肪酸）；ビタミン（例えば、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビオチン、若しくはパントテン酸）；ミネラル（亜鉛、セレン、鉄、銅、葉酸、リン、カリウム、マンガン、クロム、カルシウム、若しくはマグネシウム）；又はステロール（例えば、コレステロール）が挙げられる。
【００４７】
組成物、製剤又は生成物は、それが所望の臨床効果を提供する場合「治療薬」である。所望の臨床効果は、疾患の進行を低下させ、及び／又は疾患の１つ又は複数の症状を軽減することによって示され得る。
【００４８】
「単位用量」又は「単位投与量」は、特定の構造（例えば、カプセル殻など）中で、及び特定の用量に分配されて（例えば、複数のスティックパック中で）、有効成分及び非有効成分（賦形剤）の特定の混合物を含む、使用のために市販される形態における１つ又は複数の製剤を含む。
【００４９】
本明細書において使用される際、線維症（例えば線維性疾患又は障害）の「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、線維症を改善すること（例えば、線維症又はその臨床症状の少なくとも１つの発生を遅らせるか、停止させるか、又は軽減すること）；患者によって識別できないものを含む少なくとも１つの物理的パラメータを軽減又は改善すること；及び／又は線維症の開始又は発生又は進行を予防するか又は遅らせることを指す。
【００５０】
アミノ酸実体（例えば、活性部分）を含む組成物
本明細書に記載される本発明の組成物（例えば、活性部分）は、アミノ酸実体、例えば、表１に示されるアミノ酸実体を含む。
【００５１】
特定の実施形態において、ロイシンアミノ酸実体は、Ｌ−ロイシン、β−ヒドロキシ−β−メチルブチレート（ＨＭＢ）、オキソ−ロイシン（α−ケトイソカプロン酸（ＫＩＣ））、イソバレリル−ＣｏＡ、ｎ−アセチル−ロイシン、又はそれらの組合せから選択される。
【００５２】
特定の実施形態において、アルギニンアミノ酸実体は、Ｌ−アルギニン、クレアチン、アルギニノコハク酸、アスパルテート、グルタメート、アグマチン、Ｎ−アセチル−アルギニン、又はそれらの組合せから選択される。
【００５３】
特定の実施形態において、グルタミンアミノ酸実体は、Ｌ−グルタミン、グルタメート、カルバモイル−Ｐ、グルタメート、ｎ−アセチルグルタミン、又はそれらの組合せから選択される。
【００５４】
特定の実施形態において、ＮＡＣ−アミノ酸実体は、ＮＡＣ、アセチルセリン、シスタチオニン、シスタチオニン、ホモシステイン、グルタチオン、又はそれらの組合せから選択される。
【００５５】
特定の実施形態において、イソロイシンアミノ酸実体は、Ｌ−イソロイシン、２−オキソ−３−メチル−吉草酸（α−ケト−β−メチル吉草酸（ＫＭＶ））、メチルブチリル−ＣｏＡ、Ｎ−アセチル−イソロイシン、又はそれらの組合せから選択される。
【００５６】
特定の実施形態において、バリンアミノ酸実体は、Ｌ−バリン、２−オキソ−吉草酸（α−ケトイソ吉草酸（ＫＩＶ））、イソブチリル−ＣｏＡ、Ｎ−アセチル−バリン、又はそれらの組合せから選択される。
【００５７】
特定の実施形態において、セリンアミノ酸実体は、Ｌ−セリン、ホスホセリン、ｐ−ヒドロキシピルビン酸、グリシン、アセチルセリン、シスタチオニン、ホスファチジルセリン、又はそれらの組合せから選択される。ある実施形態において、セリンアミノ酸実体は、Ｌ−セリン又はＬ−グリシンから選択される。一実施形態において、セリンアミノ酸実体は、Ｌ−セリンである。別の実施形態において、セリンアミノ酸実体は、Ｌ−グリシンである。別の実施形態において、セリンアミノ酸実体は、Ｌ−グリシン及びＬ−セリンである（例えば、１：１の重量比におけるＬ−グリシン及びＬ−セリン）。
【００５８】
本明細書に記載される組成物は、Ｌ−セリン、Ｌ−グリシン、クレアチン、又はグルタチオンのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上（例えば、全て）をさらに含み得る。
【００５９】
ある実施形態において、組成物は、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体（例えば、Ｌ−グルタミン又はその塩）、ＮＡＣ実体、及びＬ−セリンを含む。
【００６０】
ある実施形態において、組成物は、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体（例えば、Ｌ−グルタミン又はその塩）、ＮＡＣ実体、及びＬ−グリシンを含む。
【００６１】
ある実施形態において、組成物は、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体（例えば、Ｌ−グルタミン又はその塩）、ＮＡＣ実体、Ｌ−グリシン、及びＬ−セリンを含む。
【００６２】
ある実施形態において、組成物は、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体（例えば、Ｌ−グルタミン又はその塩）、及びＮＡＣ実体を含む。ある実施形態において、（ａ）〜（ｆ）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上（例えば、全て）が、組成物中で遊離アミノ酸形態であり、例えば、アミノ酸実体成分又は全成分の総重量の少なくとも：４２重量％、７５重量％、９０重量％、又はそれ以上が、組成物（例えば、乾燥形態で）中で遊離アミノ酸形態の（ａ）〜（ｆ）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上（例えば、全て）である。
【００６３】
ある実施形態において、（ａ）〜（ｆ）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上（例えば、全て）が、組成物中で塩形態であり、例えば、アミノ酸実体成分又は全成分の総重量の少なくとも：０．０１重量％、０．１重量％、０．５重量％、１重量％、５重量％、若しくは１０重量％、又はそれ以上が、組成物中で塩形態の（ａ）〜（ｆ）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上（例えば、全て）である。
【００６４】
ある実施形態において、（ａ）〜（ｆ）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上（例えば、全て）が、例えば、組成物のアミノ酸実体成分又は全成分の少なくとも：０．０１重量％、０．１重量％、０．５重量％、１重量％、５重量％、若しくは１０重量％、又はそれ以上の量で、ジペプチド又はトリペプチドの一部として提供される。
【００６５】
ある実施形態において、組成物は、
ａ）ロイシンアミノ酸実体、
ｂ）アルギニンアミノ酸実体、
ｃ）グルタミンアミノ酸実体；及び
ｄ）Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）実体
を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。
【００６６】
ある実施形態において、組成物（例えば、活性部分）は、以下を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなり、
ａ）以下から選択されるロイシンアミノ酸実体：ｉ）Ｌ−ロイシン若しくはその塩、ｉｉ）Ｌ−ロイシンを含むジペプチド若しくはその塩、又はトリペプチド若しくはその塩、又はｉｉｉ）β−ヒドロキシ−β−メチルブチレート（ＨＭＢ）若しくはその塩；
ｂ）以下から選択されるアルギニンアミノ酸実体：ｉ）Ｌ−アルギニン若しくはその塩、ｉｉ）Ｌ−アルギニンを含むジペプチド若しくはその塩、又はトリペプチド若しくはその塩、ｉｉｉ）クレアチン若しくはその塩、又はｖ）クレアチンを含むジペプチド若しくはその塩、又はトリペプチド若しくはその塩；
ｃ）グルタミンアミノ酸実体は、Ｌ−グルタミン若しくはその塩又はＬ−グルタミンを含むジペプチド若しくはその塩、又はトリペプチド若しくはその塩であり；
ｄ）ＮＡＣ実体は、ＮＡＣ若しくはその塩又はＮＡＣを含むジペプチド若しくはその塩である。
【００６７】
ある実施形態において、組成物（例えば、活性部分）は、ｅ）Ｌ−イソロイシン若しくはその塩又はＬ−イソロイシンを含むジペプチド若しくはその塩、又はトリペプチド若しくはその塩；又はｆ）Ｌ−バリン若しくはその塩又はＬ−バリンを含むジペプチド若しくはその塩、又はトリペプチド若しくはその塩のうちの一方又は両方をさらに含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。
【００６８】
ある実施形態において、組成物（例えば、活性部分は、ａ）Ｌ−ロイシン又はその塩；ｂ）Ｌ−アルギニン又はその塩；ｃ）Ｌ−グルタミン又はその塩；及びｄ）ＮＡＣ又はその塩を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。
【００６９】
ある実施形態において、組成物（例えば、活性部分）は、線維症を軽減又は予防することが可能である。例えば、線維症の軽減又は阻害の一方又は両方は、コラーゲン、例えば、Ｉ及びＩＩＩ型コラーゲン又はα−平滑筋アクチン（αＳＭＡ）の一方又は両方のレベルを低下させることを含む。
【００７０】
特定の実施形態において、組成物（例えば、活性部分）は、例えば、対照組成物（例えば、ビヒクル対照）と比べて、例えば、実施例１において記載されるように、ヒドロキシプロリンのアッセイ、例えば、抗体に基づく検出アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて検出される際、少なくとも５％、１０％、又は１５％だけ線維症を軽減することが可能であるか、又は軽減する。
【００７１】
特定の実施形態において、組成物（例えば、活性部分）は、例えば、対照組成物（例えば、ビヒクル対照、単一のアミノ酸実体、又はアミノ酸実体の組合せ）と比べて、例えば、実施例３において記載されるように、例えば、核酸増幅法、例えば、ＰＣＲ又はｑＲＴ−ＰＣＲを用いて評価される際、ＬＸ−２細胞、例えば、ＬＸ−２細胞中のＣｏｌ１ａ１、及び／又はＴＩＭＰ２のレベルを用いて検出される際、少なくとも２０％、５０％、又は６５％だけ肝線維症又は肝障害を軽減することが可能であるか、又は軽減する。
【００７２】
ある実施形態において、組成物（例えば、活性部分）は、例えば、対照組成物（例えば、より低い濃度の組成物、ビヒクル対照、単一のアミノ酸実体、又はアミノ酸実体の組合せ）と比べて、例えば、実施例９において記載されるように、例えば、抗体に基づく検出アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて評価される際、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、又は５０％だけ、例えば、線維化マーカー、例えば、プロコラーゲンＩα１、ＭＣＰ−１、ＹＫＬ４０、又はＧＲＯα（ＣＸＣＬ１）のうちの１つ、２つ、３つ、又はそれ以上（例えば、全て）のレベルの変化（例えば、低下）によって検出される際、１つ又は複数の肝細胞型（例えば、肝細胞、肝星細胞、及びマクロファージの三種共培養（ｔｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）における、例えば、肝細胞、肝星細胞、又はマクロファージの１つ、２つ、又は３つ）における線維症を軽減することが可能であるか、又は軽減する。特定の実施形態において、組成物は、
（ｉ）プロコラーゲンＩα１のレベル（例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、又は５０％のプロコラーゲンＩα１のレベルの低下）；
（ｉｉ）ＭＣＰ−１のレベル（例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％のＭＣＰ−１のレベルの低下）；
（ｉｉｉ）ＹＫＬ４０のレベル（例えば、少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％のＹＫＬ４０のレベルの低下）；又は
（ｉｖ）ＧＲＯαのレベル（ＣＸＣＬ１）（例えば、少なくとも１５％、２０％、２５％、又は３０％のＧＲＯα（ＣＸＣＬ１）のレベルの低下）
のうちの１つ、２つ、３つ、又はそれ以上（例えば、全て）の低下をもたらす。
【００７３】
ある実施形態において、組成物（例えば、活性部分）の活性は、１つ又は複数の肝細胞型（例えば、肝細胞、肝星細胞、又はマクロファージの１つ、２つ、又は３つ）、例えば、培養物中で膜（例えば、透過性膜、例えば、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）によって隔てられる肝細胞型（例えば、肝星細胞又はマクロファージの一方又は両方と膜によって隔てられる肝細胞）を、実施例９において記載される条件下で、組成物と接触させることによって評価される。
【００７４】
特定の実施形態において、組成物（例えば、活性部分）は、例えば、対照組成物（例えば、ビヒクル対照（ＰＢＳ）、単一のアミノ酸実体、又はアミノ酸実体の組合せ）と比べて、例えば、実施例１０において記載されるように、例えば、核染色、例えば、ＥｄＵ（５−エチニル−２’−デオキシウリジン）を用いて評価される際、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、又は８０％だけ、肝星細胞の増殖、例えば、肝星細胞におけるＤＮＡ合成のレベルによって検出される際、肝線維症又は肝障害を軽減することが可能であるか、又は軽減する。
【００７５】
ｉ．量
組成物（例えば、活性部分）は、０．５ｇ＋／−２０％〜１０ｇ＋／−２０％のロイシンアミノ酸実体、１ｇ＋／−２０％〜１５ｇ＋／−２０％のアルギニンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−２０％〜２０ｇ＋／−２０％のグルタミンアミノ酸実体、及び０．１ｇ＋／−２０％〜５ｇ＋／−２０％のＮＡＣ実体を含み得る。
【００７６】
例示的な組成物は、１ｇのロイシンアミノ酸実体、０．５ｇのイソロイシンアミノ酸実体、０．５ｇのバリンアミノ酸実体、１．５ｇ又は１．８１ｇのアルギニンアミノ酸実体、２ｇのグルタミンアミノ酸実体、及び０．１５ｇのＮＡＣ実体（例えば、表２に示されるｇ／パケット）を含み得る。
【００７７】
【表２】
2021527669.tif 000003
【００７８】
ある実施形態において、組成物（例えば、活性部分）は、１ｇ＋／−２０％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−２０％のイソロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−２０％のバリンアミノ酸実体、１．５ｇ＋／−２０％のアルギニンアミノ酸実体、２ｇ＋／−２０％のグルタミンアミノ酸実体、及び０．１５ｇ＋／−２０％のＮＡＣ実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−１５％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−１５％のイソロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−１５％のバリンアミノ酸実体、１．５ｇ＋／−１５％のアルギニンアミノ酸実体、２ｇ＋／−１５％のグルタミンアミノ酸実体、及び０．１５ｇ＋／−１５％のＮＡＣ実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−１０％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−１０％のイソロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−１０％のバリンアミノ酸実体、１．５ｇ＋／−１０％のアルギニンアミノ酸実体、２ｇ＋／−１０％のグルタミンアミノ酸実体、及び０．１５ｇ＋／−１０％のＮＡＣ実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−５％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−５％のイソロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−５％のバリンアミノ酸実体、１．５ｇ＋／−５％のアルギニンアミノ酸実体、２ｇ＋／−５％のグルタミンアミノ酸実体、及び０．１５ｇ＋／−５％のＮＡＣ実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇのロイシンアミノ酸実体、０．５ｇのイソロイシンアミノ酸実体、０．５ｇのバリンアミノ酸実体、１．５ｇ又は１．８１ｇのアルギニンアミノ酸実体、２ｇのグルタミンアミノ酸実体、及び０．１５ｇのＮＡＣ実体を含む。
【００７９】
ある実施形態において、組成物（例えば、活性部分）は、１ｇ＋／−２０％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−２０％のイソロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−２０％のバリンアミノ酸実体、１．５ｇ＋／−２０％のアルギニンアミノ酸実体、２ｇ＋／−２０％のグルタミンアミノ酸実体、及び０．３ｇ＋／−２０％のＮＡＣ実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−１５％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−１５％のイソロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−１５％のバリンアミノ酸実体、１．５ｇ＋／−１５％のアルギニンアミノ酸実体、２ｇ＋／−１５％のグルタミンアミノ酸実体、及び０．３ｇ＋／−１５％のＮＡＣ実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−１０％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−１０％のイソロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−１０％のバリンアミノ酸実体、１．５ｇ＋／−１０％のアルギニンアミノ酸実体、２ｇ＋／−１０％のグルタミンアミノ酸実体、及び０．３ｇ＋／−１０％のＮＡＣ実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−５％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−５％のイソロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−５％のバリンアミノ酸実体、１．５ｇ＋／−５％のアルギニンアミノ酸実体、２ｇ＋／−５％のグルタミンアミノ酸実体、及び０．３ｇ＋／−５％のＮＡＣ実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇのロイシンアミノ酸実体、０．５ｇのイソロイシンアミノ酸実体、０．５ｇのバリンアミノ酸実体、１．５ｇ又は１．８１ｇのアルギニンアミノ酸実体、２ｇのグルタミンアミノ酸実体、及び０．３ｇのＮＡＣ実体を含む。
【００８０】
例示的な組成物は、１ｇのロイシンアミノ酸実体、０．５ｇのイソロイシンアミノ酸実体、０．５ｇのバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ又は０．９０５ｇのアルギニンアミノ酸実体、２ｇのグルタミンアミノ酸実体、及び０．１５ｇのＮＡＣ実体（例えば、表３に示されるｇ／パケット）を含み得る。
【００８１】
【表３】
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【００８２】
ある実施形態において、組成物（例えば、活性部分）は、１ｇ＋／−２０％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−２０％のイソロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−２０％のバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ＋／−２０％のアルギニンアミノ酸実体、２ｇ＋／−２０％のグルタミンアミノ酸実体、及び０．１５ｇ＋／−２０％のＮＡＣ実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−１５％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−１５％のイソロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−１５％のバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ＋／−１５％のアルギニンアミノ酸実体、２ｇ＋／−１５％のグルタミンアミノ酸実体、及び０．１５ｇ＋／−１５％のＮＡＣ実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−１０％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−１０％のイソロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−１０％のバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ＋／−１０％のアルギニンアミノ酸実体、２ｇ＋／−１０％のグルタミンアミノ酸実体、及び０．１５ｇ＋／−１０％のＮＡＣ実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−５％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−５％のイソロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−５％のバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ＋／−５％のアルギニンアミノ酸実体、２ｇ＋／−５％のグルタミンアミノ酸実体、及び０．１５ｇ＋／−５％のＮＡＣ実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇのロイシンアミノ酸実体、０．５ｇのイソロイシンアミノ酸実体、０．５ｇのバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ又は０．９０５ｇのアルギニンアミノ酸実体、２ｇのグルタミンアミノ酸実体、及び０．１５ｇのＮＡＣ実体を含む。
【００８３】
ある実施形態において、組成物（例えば、活性部分）は、１ｇ＋／−２０％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−２０％のイソロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−２０％のバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ＋／−２０％のアルギニンアミノ酸実体、２ｇ＋／−２０％のグルタミンアミノ酸実体、及び０．３ｇ＋／−２０％のＮＡＣ実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−１５％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−１５％のイソロイシンアミノ酸実体、０．５＋／−１５％ｇのバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ＋／−１５％のアルギニンアミノ酸実体、２ｇ＋／−１５％のグルタミンアミノ酸実体、及び０．３ｇ＋／−１５％のＮＡＣ実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−１０％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−１０％のイソロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−１０％のバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ＋／−１０％のアルギニンアミノ酸実体、２ｇ＋／−１０％のグルタミンアミノ酸実体、及び０．３ｇ＋／−１０％のＮＡＣ実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−５％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−５％のイソロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−５％のバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ＋／−５％のアルギニンアミノ酸実体、２ｇ＋／−５％のグルタミンアミノ酸実体、及び０．３ｇ＋／−５％のＮＡＣ実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇのロイシンアミノ酸実体、０．５ｇのイソロイシンアミノ酸実体、０．５ｇのバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ又は０．９０５ｇのアルギニンアミノ酸実体、２ｇのグルタミンアミノ酸実体、及び０．３ｇのＮＡＣ実体を含む。
【００８４】
例示的な組成物は、１ｇのロイシンアミノ酸実体、０．５ｇのイソロイシンアミノ酸実体、０．２５ｇのバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ又は０．９０５ｇのアルギニンアミノ酸実体、１ｇのグルタミンアミノ酸実体、及び０．２２５ｇのＮＡＣ実体（例えば、表４に示されるｇ／パケット）を含み得る。
【００８５】
【表４】
2021527669.tif 000005
【００８６】
ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−２０％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−２０％のイソロイシンアミノ酸実体、０．２５ｇ＋／−２０％のバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ＋／−２０％のアルギニンアミノ酸実体、１ｇ＋／−２０％のグルタミンアミノ酸実体、及び０．２２５ｇ＋／−２０％のＮＡＣ実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−１５％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−２０％のイソロイシンアミノ酸実体、０．２５ｇ＋／−２０％のバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ＋／−１５％のアルギニンアミノ酸実体、１ｇ＋／−１５％のグルタミンアミノ酸実体、及び０．２２５ｇ＋／−１５％のＮＡＣ実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−１０％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−２０％のイソロイシンアミノ酸実体、０．２５ｇ＋／−２０％のバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ＋／−１０％のアルギニンアミノ酸実体、１ｇ＋／−１０％のグルタミンアミノ酸実体、及び０．２２５ｇ＋／−１０％のＮＡＣ実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−５％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−２０％のイソロイシンアミノ酸実体、０．２５ｇ＋／−２０％のバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ＋／−５％のアルギニンアミノ酸実体、１ｇ＋／−５％のグルタミンアミノ酸実体、及び０．２２５ｇ＋／−５％のＮＡＣ実体を含む。例示的な組成物は、１ｇのロイシンアミノ酸実体、０．５ｇのイソロイシンアミノ酸実体、０．２５ｇのバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ又は０．９０５ｇのアルギニンアミノ酸実体、１ｇのグルタミンアミノ酸実体、０．２２５ｇのＮＡＣ実体、及び１．５ｇのセリンアミノ酸実体（例えば、表５に示されるｇ／パケット）を含み得る。
【００８７】
【表５】
2021527669.tif 000006
【００８８】
ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−２０％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−２０％のイソロイシンアミノ酸実体、０．２５ｇ＋／−２０％のバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ＋／−２０％のアルギニンアミノ酸実体、１ｇ＋／−２０％のグルタミンアミノ酸実体、０．２２５ｇ＋／−２０％のＮＡＣ−アミノ酸実体、及び１．５ｇ＋／−２０％のセリンアミノ酸実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−１５％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−１５％のイソロイシンアミノ酸実体、０．２５ｇ＋／−１５％のバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ＋／−１５％のアルギニンアミノ酸実体、１ｇ＋／−１５％のグルタミンアミノ酸実体、０．２２５ｇ＋／−１５％のＮＡＣ−アミノ酸実体、及び１．５ｇ＋／−１５％のセリンアミノ酸実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−１０％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−１０％のイソロイシンアミノ酸実体、０．２５ｇ＋／−１０％のバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ＋／−１０％のアルギニンアミノ酸実体、１ｇ＋／−１０％のグルタミンアミノ酸実体、０．２２５ｇ＋／−１０％のＮＡＣ−アミノ酸実体、及び１．５ｇ＋／−１０％のセリンアミノ酸実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−５％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−５％のイソロイシンアミノ酸実体、０．２５ｇ＋／−５％のバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ＋／−５％のアルギニンアミノ酸実体、１ｇ＋／−５％のグルタミンアミノ酸実体、０．２２５ｇ＋／−５％のＮＡＣ−アミノ酸実体、及び１．５ｇ＋／−５％のセリンアミノ酸実体を含む。
【００８９】
例示的な組成物は、１ｇのロイシンアミノ酸実体、０．５ｇのイソロイシンアミノ酸実体、０．２５ｇのバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ又は０．９０５ｇのアルギニンアミノ酸実体、１ｇのグルタミンアミノ酸実体、０．２２５ｇのＮＡＣ実体、及び１．６６７ｇのセリンアミノ酸実体（例えば、表６に示されるｇ／パケット）を含み得る。
【００９０】
【表６】
2021527669.tif 000007
【００９１】
ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−２０％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−２０％のイソロイシンアミノ酸実体、０．２５ｇ＋／−２０％のバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ＋／−２０％のアルギニンアミノ酸実体、１ｇ＋／−２０％のグルタミンアミノ酸実体、０．２２５ｇ＋／−２０％のＮＡＣ−アミノ酸実体、及び１．６６７ｇ＋／−２０％のセリンアミノ酸実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−１５％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−１５％のイソロイシンアミノ酸実体、０．２５ｇ＋／−１５％のバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ＋／−１５％のアルギニンアミノ酸実体、１ｇ＋／−１５％のグルタミンアミノ酸実体、０．２２５ｇ＋／−１５％のＮＡＣ−アミノ酸実体、及び１．６６７ｇ＋／−１５％のセリンアミノ酸実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−１０％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−１０％のイソロイシンアミノ酸実体、０．２５ｇ＋／−１０％のバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ＋／−１０％のアルギニンアミノ酸実体、１ｇ＋／−１０％のグルタミンアミノ酸実体、０．２２５ｇ＋／−１０％のＮＡＣ−アミノ酸実体、及び１．６６７ｇ＋／−１０％のセリンアミノ酸実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１ｇ＋／−５％のロイシンアミノ酸実体、０．５ｇ＋／−５％のイソロイシンアミノ酸実体、０．２５ｇ＋／−５％のバリンアミノ酸実体、０．７５ｇ＋／−５％のアルギニンアミノ酸実体、１ｇ＋／−５％のグルタミンアミノ酸実体、０．２２５ｇ＋／−５％のＮＡＣ−アミノ酸実体、及び１．６６７ｇ＋／−５％のセリンアミノ酸実体を含む。
【００９２】
ｉｉ．比率
例示的な組成物は、１＋／−１５％：０．５＋／−１５％：０．５＋／−１５％：１．５＋／−１５％：２＋／−１５％：０．１５＋／−１５％又は１＋／−１５％：０．５＋／−１５％：０．５＋／−１５％：１．８１＋／−１５％：２＋／−１５％：０．１５＋／−１５％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量（ｗｔ．）比を含み得る。ある実施形態において、組成物は、１＋／−１０％：０．５＋／−１０％：０．５＋／−１０％：１．５＋／−１０％：２＋／−１０％：０．１５＋／−１０％又は１＋／−１０％：０．５＋／−１０％：０．５＋／−１０％：１．８１＋／−１０％：２＋／−１０％：０．１５＋／−１０％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量比を含む。ある実施形態において、組成物は、１＋／−５％：０．５＋／−５％：０．５＋／−５％：１．５＋／−５％：２＋／−５％：０．１５＋／−５％又は１＋／−５％：０．５＋／−５％：０．５＋／−５％：１．８１＋／−５％：２＋／−５％：０．１５＋／−５％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量比を含む。ある実施形態において、組成物は、１：０．５：０．５：１．５：２：０．１５又は１：０．５：０．５：１．８１：２：０．１５の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量比を含む。
【００９３】
例示的な組成物は、１＋／−２０％：０．５＋／−２０％：０．５＋／−２０％：１．５＋／−２０％：２＋／−２０％：０．３＋／−２０％又は１＋／−２０％：０．５＋／−２０％：０．５＋／−２０％：１．８１＋／−２０％：２＋／−２０％：０．３＋／−２０％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量（ｗｔ．）比を含み得る。ある実施形態において、組成物は、１＋／−１５％：０．５＋／−１５％：０．５＋／−１５％：１．５＋／−１５％：２＋／−１５％：０．３＋／−１５％又は１＋／−１５％：０．５＋／−１５％：０．５＋／−１５％：１．８１＋／−１５％：２＋／−１５％：０．３＋／−１５％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量比を含む。ある実施形態において、組成物は、１＋／−１０％：０．５＋／−１０％：０．５＋／−１０％：１．５＋／−１０％：２＋／−１０％：０．３＋／−１０％又は１＋／−１０％：０．５＋／−１０％：０．５＋／−１０％：１．８１＋／−１０％：２＋／−１０％：０．３＋／−１０％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量比を含む。ある実施形態において、組成物は、１＋／−５％：０．５＋／−５％：０．５＋／−５％：１．５＋／−５％：２＋／−５％：０．３＋／−５％又は１＋／−５％：０．５＋／−５％：０．５＋／−５％：１．８１＋／−５％：２＋／−５％：０．３＋／−５％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量比を含む。ある実施形態において、組成物は、１：０．５：０．５：１．５：２：０．３又は１：０．５：０．５：１．８１：２：０．３の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量比を含む。
【００９４】
例示的な組成物は、１＋／−２０％：０．５＋／−２０％：０．５＋／−２０％：０．７５＋／−２０％：２＋／−２０％：０．１５＋／−２０％又は１＋／−２０％：０．５＋／−２０％：０．５＋／−２０％：０．９０５＋／−２０％：２＋／−２０％：０．１５＋／−２０％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量（ｗｔ．）比を含み得る。ある実施形態において、組成物は、１＋／−１５％：０．５＋／−１５％：０．５＋／−１５％：０．７５＋／−１５％：２＋／−１５％：０．１５＋／−１５％又は１＋／−１５％：０．５＋／−１５％：０．５＋／−１５％：０．９０５＋／−１５％：２＋／−１５％：０．１５＋／−１５％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量比を含む。ある実施形態において、組成物は、１＋／−１０％：０．５＋／−１０％：０．５＋／−１０％：０．７５＋／−１０％：２＋／−１０％：０．１５＋／−１０％又は１＋／−１０％：０．５＋／−１０％：０．５＋／−１０％：０．９０５＋／−１０％：２＋／−１０％：０．１５＋／−１０％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量比を含む。ある実施形態において、組成物は、１＋／−５％：０．５＋／−５％：０．５＋／−５％：０．７５＋／−５％：２＋／−５％：０．１５＋／−５％又は１＋／−５％：０．５＋／−５％：０．５＋／−５％：０．９０５＋／−５％：２＋／−５％：０．１５＋／−５％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量比を含む。ある実施形態において、組成物は、１：０．５：０．５：０．７５：２：０．１５又は１：０．５：０．５：０．９０５：２：０．１５の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量比を含む。
【００９５】
例示的な組成物は、１＋／−２０％：０．５＋／−２０％：０．５＋／−２０％：０．７５＋／−２０％：２＋／−２０％：０．３＋／−２０％又は１＋／−２０％：０．５＋／−２０％：０．５＋／−２０％：０．９０５＋／−２０％：２＋／−２０％：０．３＋／−２０％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量（ｗｔ．）比を含み得る。ある実施形態において、組成物は、１＋／−１５％：０．５＋／−１５％：０．５＋／−１５％：０．７５＋／−１５％：２＋／−１５％：０．３＋／−１５％又は１＋／−１５％：０．５＋／−１５％：０．５＋／−１５％：０．９０５＋／−１５％：２＋／−１５％：０．３＋／−１５％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量比を含む。ある実施形態において、組成物は、１＋／−１０％：０．５＋／−１０％：０．５＋／−１０％：０．７５＋／−１０％：２＋／−１０％：０．３＋／−１０％又は１＋／−１０％：０．５＋／−１０％：０．５＋／−１０％：０．９０５＋／−１０％：２＋／−１０％：０．３＋／−１０％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量比を含む。ある実施形態において、組成物は、１＋／−５％：０．５＋／−５％：０．５＋／−５％：０．７５＋／−５％：２＋／−５％：０．３＋／−５％又は１＋／−５％：０．５＋／−５％：０．５＋／−５％：０．９０５＋／−５％：２＋／−５％：０．３＋／−５％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量比を含む。ある実施形態において、組成物は、１：０．５：０．５：０．７５：２：０．３又は１：０．５：０．５：０．９０５：２：０．３の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量比を含む。
【００９６】
例示的な組成物は、１＋／−２０％：０．５＋／−２０％：０．２５＋／−２０％：０．７５＋／−２０％：１＋／−２０％：０．２２５＋／−２０％又は１＋／−２０％：０．５＋／−２０％：０．２５＋／−２０％：０．９０５＋／−２０％：１＋／−２０％：０．２２５＋／−２０％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量（ｗｔ．）比を含み得る。ある実施形態において、組成物は、１＋／−１５％：０．５＋／−１５％：０．２５＋／−１５％：０．７５＋／−１５％：１＋／−１５％：０．２２５＋／−１５％又は１＋／−１５％：０．５＋／−１５％：０．２５＋／−１５％：０．９０５＋／−１５％：１＋／−１５％：０．２２５＋／−１５％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量比を含む。ある実施形態において、組成物は、１＋／−１０％：０．５＋／−１０％：０．２５＋／−１０％：０．７５＋／−１０％：１＋／−１０％：０．２２５＋／−１０％又は１＋／−１０％：０．５＋／−１０％：０．２５＋／−１０％：０．９０５＋／−１０％：１＋／−１０％：０．２２５＋／−１０％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量比を含む。ある実施形態において、組成物は、１＋／−５％：０．５＋／−５％：０．２５＋／−５％：０．７５＋／−５％：１＋／−５％：０．２２５＋／−５％又は１＋／−５％：０．５＋／−５％：０．２５＋／−５％：０．９０５＋／−５％：１＋／−５％：０．２２５＋／−５％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量比を含む。ある実施形態において、組成物は、１：０．５：０．２５：０．７５：１：０．２２５又は１：０．５：０．２５：０．９０５：１：０．２２５の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ−アミノ酸実体の重量比を含む。
【００９７】
アミノ酸実体を含む例示的な組成物は、１＋／−２０％：０．５＋／−２０％：０．２５＋／−２０％：０．７５＋／−２０％：１＋／−２０％：０．２２５＋／−２０％：１．５＋／−２０％又は１＋／−２０％：０．５＋／−２０％：０．２５＋／−２０％：０．９０５＋／−２０％：１＋／−２０％：０．２２５＋／−２０％：１．５＋／−２０％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、ＮＡＣ−アミノ酸実体、及びセリンアミノ酸実体の重量（ｗｔ．）比を含み得る。ある実施形態において、組成物は、１＋／−１５％：０．５＋／−１５％：０．２５＋／−１５％：０．７５＋／−１５％：１＋／−１５％：０．２２５＋／−１５％：１．５＋／−１５％又は１＋／−１５％：０．５＋／−１５％：０．２５＋／−１５％：０．９０５＋／−１５％：１＋／−１５％：０．２２５＋／−１５％：１．５＋／−１５％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、ＮＡＣ−アミノ酸実体、及びセリンアミノ酸実体の重量比を含む。ある実施形態において、組成物は、１＋／−１０％：０．５＋／−１０％：０．２５＋／−１０％：０．７５＋／−１０％：１＋／−１０％：０．２２５＋／−１０％：１．５＋／−１０％又は１＋／−１０％：０．５＋／−１０％：０．２５＋／−１０％：０．９０５＋／−１０％：１＋／−１０％：０．２２５＋／−１０％：１．５＋／−１０％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、ＮＡＣ−アミノ酸実体、及びセリンアミノ酸実体の重量比を含む。ある実施形態において、組成物は、１＋／−５％：０．５＋／−５％：０．２５＋／−５％：０．７５＋／−５％：１＋／−５％：０．２２５＋／−５％：１．５＋／−５％又は１＋／−５％：０．５＋／−５％：０．２５＋／−５％：０．９０５＋／−５％：１＋／−５％：０．２２５＋／−５％：１．５＋／−５％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、ＮＡＣ−アミノ酸実体、及びセリンアミノ酸実体の重量比を含む。ある実施形態において、組成物は、１：０．５：０．２５：０．７５：１：０．２２５：１．５又は１：０．５：０．２５：０．９０５：１：０．２２５：１．５の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、ＮＡＣ−アミノ酸実体、及びセリンアミノ酸実体の重量比を含む。
【００９８】
例示的な組成物は、１＋／−２０％：０．５＋／−２０％：０．２５＋／−２０％：０．７５＋／−２０％：１＋／−２０％：０．２２５＋／−２０％：１．６６７＋／−２０％又は１＋／−２０％：０．５＋／−２０％：０．２５＋／−２０％：０．９０５＋／−２０％：１＋／−２０％：０．２２５＋／−２０％：１．６６７＋／−２０％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、ＮＡＣ−アミノ酸実体、及びセリンアミノ酸実体の重量（ｗｔ．）比を含み得る。ある実施形態において、組成物は、１＋／−１５％：０．５＋／−１５％：０．２５＋／−１５％：０．７５＋／−１５％：１＋／−１５％：０．２２５＋／−１５％：１．６６７＋／−１５％又は１＋／−１５％：０．５＋／−１５％：０．２５＋／−１５％：０．９０５＋／−１５％：１＋／−１５％：０．２２５＋／−１５％：１．６６７＋／−１５％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、ＮＡＣ−アミノ酸実体、及びセリンアミノ酸実体の重量比を含む。ある実施形態において、組成物は、１＋／−１０％：０．５＋／−１０％：０．２５＋／−１０％：０．７５＋／−１０％：１＋／−１０％：０．２２５＋／−１０％：１．６６７＋／−１０％又は１＋／−１０％：０．５＋／−１０％：０．２５＋／−１０％：０．９０５＋／−１０％：１＋／−１０％：０．２２５＋／−１０％：１．６６７＋／−１０％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、ＮＡＣ−アミノ酸実体、及びセリンアミノ酸実体の重量比を含む。ある実施形態において、組成物は、１＋／−５％：０．５＋／−５％：０．２５＋／−５％：０．７５＋／−５％：１＋／−５％：０．２２５＋／−５％：１．６６７＋／−５％又は１＋／−５％：０．５＋／−５％：０．２５＋／−５％：０．９０５＋／−５％：１＋／−５％：０．２２５＋／−５％：１．６６７＋／−５％の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、ＮＡＣ−アミノ酸実体、及びセリンアミノ酸実体の重量比を含む。ある実施形態において、組成物は、１：０．５：０．２５：０．７５：１：０．２２５：１．６６７又は１：０．５：０．２５：０．９０５：１：０．２２５：１．６６７の、ロイシンアミノ酸実体、イソロイシンアミノ酸実体、バリンアミノ酸実体、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、ＮＡＣ−アミノ酸実体、及びセリンアミノ酸実体の重量比を含む。
【００９９】
ある実施形態において、組成物は、１０重量％＋／−１５％〜３０重量％＋／−１５％のロイシンアミノ酸実体、５重量％＋／−１５％〜１５重量％＋／−１５％のイソロイシンアミノ酸実体、５重量％＋／−１５％〜１５重量％＋／−１５％のバリンアミノ酸実体、１５重量％＋／−１５％〜４０重量％＋／−１５％のアルギニンアミノ酸実体、２０重量％＋／−１５％〜５０重量％＋／−１５％のグルタミンアミノ酸実体、及び１重量％＋／−１５％〜８重量％＋／−１５％のＮＡＣ実体を含む。
【０１００】
ある実施形態において、組成物は、１０重量％＋／−１５％〜３０重量％＋／−１５％のロイシンアミノ酸実体を含む。ある実施形態において、組成物は、５重量％＋／−１５％〜１５重量％＋／−１５％のイソロイシンアミノ酸実体を含む。ある実施形態において、組成物は、５重量％＋／−１５％〜１５重量％＋／−１５％のバリンアミノ酸実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１５重量％＋／−１５％〜４０重量％＋／−１５％のアルギニンアミノ酸実体を含む。ある実施形態において、組成物は、２０重量％＋／−１５％〜５０重量％＋／−１５％のグルタミンアミノ酸実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１重量％＋／−１５％〜８重量％＋／−１５％のＮＡＣ実体を含む。
【０１０１】
ある実施形態において、組成物は、１６重量％＋／−１５％〜１８重量％＋／−１５％のロイシンアミノ酸実体、７重量％＋／−１５％〜９重量％＋／−１５％のイソロイシンアミノ酸実体、７重量％＋／−１５％〜９重量％＋／−１５％のバリンアミノ酸実体、２８重量％＋／−１５％〜３２重量％＋／−１５％のアルギニンアミノ酸実体、３１重量％＋／−１５％〜３４重量％＋／−１５％のグルタミンアミノ酸実体、及び１重量％＋／−１５％〜５重量％＋／−１５％のＮＡＣ実体を含む。
【０１０２】
ある実施形態において、組成物は、１６重量％＋／−１５％〜１８重量％＋／−１５％のロイシンアミノ酸実体を含む。ある実施形態において、組成物は、７重量％＋／−１５％〜９重量％＋／−１５％のイソロイシンアミノ酸実体を含む。ある実施形態において、組成物は、７重量％＋／−１５％〜９重量％＋／−１５％のバリンアミノ酸実体を含む。ある実施形態において、組成物は、２８重量％＋／−１５％〜３２重量％＋／−１５％のアルギニンアミノ酸実体を含む。ある実施形態において、組成物は、３１重量％＋／−１５％〜３４重量％＋／−１５％のグルタミンアミノ酸実体を含む。ある実施形態において、組成物は、１重量％＋／−１５％〜５重量％＋／−１５％のＮＡＣ実体を含む。
【０１０３】
ある実施形態において、組成物は、１６．８重量％＋／−１５％のロイシンアミノ酸実体、８．４重量％＋／−１５％のイソロイシンアミノ酸実体、８．４重量％＋／−１５％のバリンアミノ酸実体、３０．４重量％＋／−１５％のアルギニンアミノ酸実体、３３．６重量％＋／−１５％のグルタミンアミノ酸実体、及び２．５重量％＋／−１５％のＮＡＣ実体を含む。
【０１０４】
ｉｉｉ．アミノ酸実体の関係
ある実施形態において、組成物（例えば、活性部分）は、以下の特性の１つ又は複数を有し、
ａ）組成物中のＱ−アミノ酸実体の重量％が、Ｒ−アミノ酸実体の重量％より多く；
ｂ）組成物中のＱ−アミノ酸実体の重量％が、Ｌ−アミノ酸実体の重量％より多く；
ｃ）組成物中のＲ−アミノ酸実体の重量％が、Ｌ−アミノ酸実体の重量％より多く；又は
ｄ）（ａ）〜（ｃ）のうちの２つ又は３つの組合せである。
【０１０５】
ある実施形態において、組成物中のグルタミンアミノ酸実体の重量％は、アルギニンアミノ酸実体の重量％より多く、例えば、組成物中のグルタミンアミノ酸実体の重量％は、アルギニンアミノ酸実体の重量％より少なくとも５％多く、例えば、グルタミンアミノ酸実体の重量％は、アルギニンアミノ酸実体の重量％より少なくとも１０％又は２５％多い。
【０１０６】
ある実施形態において、組成物中のグルタミンアミノ酸実体の重量％は、ロイシンアミノ酸実体の重量％より多く、例えば、組成物中のグルタミンアミノ酸実体の重量％は、ロイシンアミノ酸実体の重量％より少なくとも２０％多く、例えば、組成物中のグルタミンアミノ酸実体の重量％は、ロイシンアミノ酸実体の重量％より少なくとも２５％又は５０％多い。
【０１０７】
ある実施形態において、組成物中のアルギニンアミノ酸実体の重量％は、ロイシンアミノ酸実体の重量％より多く、例えば、組成物中のアルギニンアミノ酸実体の重量％は、ロイシンアミノ酸実体の重量％より少なくとも１０％多く、例えば、組成物中のアルギニンアミノ酸実体の重量％は、ロイシンアミノ酸実体の重量％より少なくとも１５％又は３０％多い。
【０１０８】
ある実施形態において、組成物中のロイシンアミノ酸実体の重量％は、組成物中のイソロイシンアミノ酸実体の重量％より多く、例えば、組成物中のロイシンアミノ酸実体の重量％は、組成物中のイソロイシンアミノ酸実体の重量％より少なくとも２５重量％多い。
【０１０９】
ある実施形態において、組成物中のロイシンアミノ酸実体の重量％は、組成物中のバリンアミノ酸実体の重量％より多く、例えば、組成物中のロイシンアミノ酸実体の重量％は、組成物中のバリンアミノ酸実体の重量％より少なくとも２５重量％多い。
【０１１０】
ある実施形態において、アルギニンアミノ酸実体、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ実体の重量％は、組成物中のアミノ酸実体の少なくとも：５０重量％又は７０重量％であるが、組成物中のアミノ酸実体の９０重量％以下である。
【０１１１】
ある実施形態において、ＮＡＣ実体の重量％は、組成物中のアミノ酸実体成分又は全成分の少なくとも：１重量％又は２重量％であるが、組成物中のアミノ酸実体成分又は全成分の１０重量％以下又はそれ以上である。
【０１１２】
ある実施形態において、組み合わせたイソロイシンアミノ酸実体、及びバリンアミノ酸実体は、組成物中のアミノ酸実体成分又は全成分の少なくとも：１５重量％、又は２０重量％であるが、組成物中のアミノ酸実体成分又は全成分の５０重量％以下である。
【０１１３】
ある実施形態において、グルタミンアミノ酸実体、及びＮＡＣ実体は、組成物中のアミノ酸実体成分又は全成分の少なくとも：４０重量％又は５０重量％であるが、組成物中のアミノ酸実体成分又は全成分の９０重量％以下である。
【０１１４】
ある実施形態において、組成物（例えば、活性部分）は、セリンアミノ酸実体をさらに含み、例えば、セリンアミノ酸実体は、組成物中の任意の他のアミノ酸実体成分より多い量で存在する。ある実施形態において、セリンアミノ酸実体の重量％は、組成物中のアミノ酸実体又は全成分の少なくとも２０重量％又はそれ以上である。
【０１１５】
ｉｖ．組成物から除外又は制限するアミノ酸分子
ある実施形態において、組成物は、卵白タンパク質、大豆タンパク質、カゼイン、麻タンパク質、エンドウ豆タンパク質、又は玄米タンパク質の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上（例えば、全て）から選択されるか又はそれらに由来する２０を超えるアミノ酸残基長のペプチド（例えば、タンパク質補充剤）を含まず、又はペプチドが存在する場合、ペプチドは、組成物（例えば、乾燥形態で）中の非アミノ酸実体タンパク質成分又は全成分の総重量の１０重量（ｗｔ．）５重量％、１重量％、０．１重量％、０．０５重量％、０．０１重量％未満で存在する。
【０１１６】
ある実施形態において、組成物は、３〜１９、３〜１５、又は３〜１０の異なるアミノ酸実体の組合せを含み、例えば、組合せは、組成物（例えば、乾燥形態で）中のアミノ酸実体成分又は全成分の総重量％の少なくとも：４２重量％、７５重量％、又は９０重量％を含む。
【０１１７】
ある実施形態において、ジペプチド若しくはその塩又はトリペプチド若しくはその塩は、組成物（例えば、乾燥形態で）中のアミノ酸実体成分又は全成分の総重量の１０重量％、０．５重量％、０．１重量％、０．０５重量％、０．０１重量％、０．００１重量％未満、又はそれ以下で存在する。
【０１１８】
ある実施形態において、組成物（例えば、乾燥形態で）中のアミノ酸実体成分の全グラムの少なくとも５０％、６０％、７０％、又はそれ以上は、（ａ）〜（ｊ）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、７つ、８つ、９つ又はそれ以上（例えば、全て）からのものである。
【０１１９】
ある実施形態において、組成物（例えば、乾燥形態で）中のアミノ酸実体成分又は全成分からのカロリーの少なくとも：５０％、６０％、７０％、又はそれ以上は、（ａ）〜（ｊ）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、７つ、８つ、９つ又はそれ以上（例えば、全て）からのものである。
【０１２０】
ある実施形態において、炭水化物（例えば、デキストロース、マルトデキストロース、スクロース、デキストリン、フルクトース、ガラクトース、グルコース、グリコーゲン、高フルクトースコーンシロップ、蜂蜜、イノシトール、転化糖、ラクトース、果糖、マルトース、糖蜜、サトウキビ、又はキシロースのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８）が、組成物に存在しないか、又は存在する場合、例えば、組成物（乾燥形態で）の総重量の１０重量％、５重量％、１重量％、０．５重量％、０．１重量％、０．０５重量％、０．０１重量％、０．００１重量％未満、又はそれ以下で存在する。
【０１２１】
ある実施形態において、ビタミン（例えば、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、又はビタミンＤのうちの１、２、３、４、５、６、又は７つ）が、組成物に存在しないか、又は存在する場合、例えば、組成物（乾燥形態で）の総重量の１０重量％、５重量％、１重量％、０．５重量％、０．１重量％、０．０５重量％、０．０１重量％、０．００１重量％未満、又はそれ以下で存在する。
【０１２２】
ある実施形態において、硝酸塩又は亜硝酸塩の一方又は両方が、組成物に存在しないか、又は存在する場合、例えば、組成物（乾燥形態で）の総重量の１０重量％、５重量％、１重量％、０．５重量％、０．１重量％、０．０５重量％、０．０１重量％、０．００１重量％未満、又はそれ以下で存在する。
【０１２３】
ある実施形態において、４−ヒドロキシイソロイシンが、組成物に存在しないか、又は存在する場合、例えば、組成物（乾燥形態で）の総重量の１０重量％、５重量％、１重量％、０．５重量％、０．１重量％、０．０５重量％、０．０１重量％、０．００１重量％未満、又はそれ以下で存在する。
【０１２４】
ある実施形態において、プロバイオティック（例えば、バチルスプロバイオティック（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ））が、組成物に存在しないか、又は存在する場合、例えば、組成物（乾燥形態で）の総重量の１０重量％、５重量％、１重量％、０．５重量％、０．１重量％、０．０５重量％、０．０１重量％、０．００１重量％未満、又はそれ以下で存在する。
【０１２５】
ある実施形態において、酢酸フェニルが、組成物に存在しないか、又は存在する場合、例えば、組成物（乾燥形態で）の総重量の１０重量％、５重量％、１重量％、０．５重量％、０．１重量％、０．０５重量％、０．０１重量％、０．００１重量％未満、又はそれ以下で存在する。
【０１２６】
ある実施形態において、ゼラチン（例えば、ゼラチンカプセル）が、組成物に存在しないか、又は存在する場合、例えば、組成物（乾燥形態で）の総重量の１０重量％、５重量％、１重量％、０．５重量％、０．１重量％、０．０５重量％、０．０１重量％、０．００１重量％未満、又はそれ以下で存在する。
【０１２７】
ある実施形態において、Ｓ−アリルシステイン、Ｓ−アリルメルカプトシステイン、又はフルクトシル−アルギニンのうちの１、２、又は３つが、組成物に存在しないか、又は存在する場合、例えば、組成物（乾燥形態で）の総重量の１０重量％、５重量％、１重量％、０．５重量％、０．１重量％、０．０５重量％、０．０１重量％、０．００１重量％未満、又はそれ以下で存在する。
【０１２８】
使用、例えば、治療の方法
本明細書に記載される本発明の組成物（例えば、活性部分）は、対象における線維症を改善又は軽減する、例えば、線維性疾患又は障害を治療又は予防するために投与され得る。本方法は、対象における線維症を軽減又は阻害するのに十分な量の本明細書に記載される組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。組成物は、例えば、線維性疾患又は障害を有する患者における組織修復を改善するために投与され得る。
【０１２９】
ある実施形態において、対象は、線維症を有するか、又は線維性疾患又は障害であると診断されている。ある実施形態において、線維性疾患又は障害を有する対象はヒトである。ある実施形態において、対象は、組成物による以前の治療を受けたことがない（例えば、未処理の対象）。
【０１３０】
本開示は、線維症を改善又は軽減するための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に開示される組成物（例えば、活性部分）を有効量で投与することを含む方法を特徴とする。組成物は、線維性疾患又は障害を有する対象を治療するために、本明細書に記載される投与計画にしたがって投与され得る。
【０１３１】
ある実施形態において、本明細書に記載される組成物（例えば、活性部分）は、対象（例えば、線維性疾患又は障害を有する対象）における線維症を治療する（例えば、食い止める、軽減、改善、又は予防する）際の薬剤として使用するためのものである。ある実施形態において、本明細書に記載される組成物（例えば、活性部分）は、対象（例えば、線維性疾患又は障害を有する対象）における線維症を治療する（例えば、食い止める、軽減、改善、又は予防する）ための薬剤の製造に使用するためのものである。
【０１３２】
特定の実施形態において、線維症を軽減又は治療することは、組織線維症の形成若しくは沈着；線維性病変のサイズ、細胞密度（例えば、線維芽細胞若しくは免疫細胞数）、組成、若しくは細胞含有量；線維性病変のコラーゲン若しくはヒドロキシプロリン含有量；線維形成タンパク質の発現若しくは活性；炎症反応に関連する線維症；又は線維症に関連する体重減少のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上（例えば、全て）を減少させることを含む。ある実施形態において、線維症を軽減することは、対象の生存期間を延長させる。
【０１３３】
例示的な線維症としては、限定はされないが、多臓器（ｍｕｌｔｉ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ）障害（例えば、全身性硬化症、多巣性線維硬化症、骨髄移植レシピエントにおける強皮症性移植片対宿主病、腎性全身性線維症、又は強皮症）及び器官特異的障害（例えば、肺、心臓、腎臓、膵臓、皮膚、脳、及び他の器官の線維症）が挙げられる。特定の実施形態において、線維性疾患は、肺の線維性疾患、心臓又は血管系の線維性疾患、腎臓の線維性疾患、皮膚の線維性疾患、消化管の線維性疾患、骨髄又は造血組織の線維性疾患、神経系の線維性疾患、眼の線維性疾患、又はそれらの組合せである。
【０１３４】
特定の実施形態において、線維性疾患は、原発性線維症である。一実施形態において、線維性疾患は、特発性である。他の実施形態において、線維性疾患は、疾患（例えば、感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び／又は結合組織疾患）；毒素；傷害（例えば、環境危険（例えば、アスベスト、炭塵、及び／又は多環式芳香族炭化水素）、喫煙、若しくは創傷）；医療処置（例えば、外科的切開、化学療法、若しくは放射線）；又はそれらの組合せに関連する（例えば、それに続発する）。
【０１３５】
特定の実施形態において、線維性疾患は、肺の線維性疾患である。特定の実施形態において、肺の線維性疾患は、肺線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）、間質性肺疾患、特発性線維化性肺胞炎（ＣＦＡ）、気管支拡張症、及び強皮症肺疾患のうちの１つ又は複数から選択される。一実施形態において、肺の線維症は、疾患、毒素、傷害、医療処置、又はそれらの組合せに続発する。
【０１３６】
例えば、肺の線維症は、石綿肺及び珪肺症などの疾患過程；職業上の危険；環境汚染物質；喫煙；自己免疫性結合組織疾患（例えば、関節リウマチ、強皮症及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ））；結合組織疾患（例えば、サルコイドーシス）；又は感染症（例えば、感染症、特に、慢性感染症）のうちの１つ又は複数に関連し得る（例えば、それに続発する）。一実施形態において、肺の線維性疾患は、自己免疫性結合組織疾患（例えば、強皮症又はループス、例えば、ＳＬＥ）に関連している。
【０１３７】
他の実施形態において、肺線維症としては、限定はされないが、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性呼吸窮迫症候群、強皮症、胸膜線維症、慢性喘息、急性肺症候群、アミロイド症、気管支肺異形成症、カプラン症候群、ドレスラー症候群、ヒスチオサイトーシスＸ、特発性肺ヘモジデリン沈着症、リンパ管筋腫症、僧帽弁狭窄、多発性筋炎、肺水腫、肺高血圧症（例えば、特発性肺高血圧症（ＩＰＨ））、塵肺症、放射線治療（例えば、放射線誘導性線維症）、リウマチ様疾患、シェイバー病、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、熱帯性肺好酸球増多症、結節性硬化症、ウェーバー・クリスチャン病、ウェゲナー肉芽腫症、ウィップル病、又は毒素若しくは刺激薬（例えば、アミオダロン、ブレオマイシン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムフェニコール、ヘキサメトニウム、メトトレキサート、メチセルギド、マイトマイシンＣ、ニトロフラントイン、ペニシラミン、ペプロマイシン、若しくはプラクトロールなどの調合薬への曝露；又はタルク若しくは塵、例えば、炭塵、シリカの吸引）に関連する肺線維症が挙げられる。特定の実施形態において、肺線維症は、肺の炎症性疾患、例えば、喘息又はＣＯＰＤの一方又は両方に関連している。
【０１３８】
特定の実施形態において、線維性疾患は、腎臓の線維性疾患である。特定の実施形態において、腎臓の線維性疾患は、腎線維症（例えば、慢性腎線維症）、傷害若しくは線維症の一方又は両方に関連する腎症（例えば、糖尿病（例えば、糖尿病性腎症）に関連する慢性腎症）、ループス、腎臓の強皮症、糸球体腎炎、巣状分節状糸球体硬化症、ヒト慢性腎疾患（ＣＫＤ）に関連するＩｇＡ腎症性線維症、慢性進行性腎症（ＣＰＮ）、尿細管間質性線維症、尿管閉塞、慢性尿毒症、慢性間質性腎炎、放射線腎症、糸球体硬化症、進行性糸球体腎炎（ＰＧＮ）、内皮／血栓性微小血管障害損傷、ＨＩＶ関連腎症、又は毒素、刺激薬、若しくは化学療法剤への曝露に関連する線維症のうちの１つ又は複数から選択される。一実施形態において、腎臓の線維性疾患は、腎臓の強皮症である。ある実施形態において、腎臓の線維性疾患は、移植腎症、糖尿病性腎症、ループス腎炎、巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、内皮／血栓性微小血管障害損傷、又はＨＩＶ関連腎症（ＨＩＶＶＡＮ）である。
【０１３９】
他の実施形態において、線維性疾患は、ハンセン病又は結核に関連している。
【０１４０】
他の実施形態において、本明細書に記載される組成物は、過剰増殖性線維症、例えば、非癌性線維症を治療するのに使用される。一実施形態において、過剰増殖性線維症は、多臓器又は器官特異的である。例示的な過剰増殖性線維症としては、限定はされないが、多臓器障害（例えば、全身性硬化症、多巣性線維硬化症、骨髄移植レシピエントにおける強皮症性移植片対宿主病、腎性全身性線維症、又は強皮症）、及び器官特異的障害（例えば、眼、肺、心臓、腎臓、膵臓、皮膚、及び他の器官の線維症）が挙げられる。
【０１４１】
特定の実施形態において、線維性疾患は、心臓の線維性疾患である。特定の実施形態において、心臓の線維性疾患は、心筋線維症（例えば、放射線心筋炎に関連する心筋線維症、外科手術の合併症（例えば、心筋術後線維症）；感染症（例えば、シャーガス病、細菌性、旋毛虫性、若しくは真菌性心筋炎））；肉芽腫；代謝性貯蔵障害（例えば、心筋症、ヘモクロマトーシス）；発達障害（例えば、心内膜線維弾性症）；動脈硬化症、又は毒素若しくは刺激薬への曝露（例えば、薬剤性心筋症、薬剤性心毒性、アルコール性心筋症、コバルト中毒若しくは曝露）である。特定の実施形態において、心筋線維症は、心臓組織の炎症性疾患（例えば、心筋サルコイドーシス）に関連している。ある実施形態において、線維性疾患は、心筋梗塞に関連する線維性疾患である。ある実施形態において、線維性疾患は、鬱血性心不全に関連する線維性疾患である。
【０１４２】
ある実施形態において、線維性疾患は、強皮症又はループス、例えば、全身性エリテマトーデスから選択される自己免疫疾患に関連している。
【０１４３】
ある実施形態において、線維性疾患は、全身性である。ある実施形態において、線維性疾患は、全身性硬化症（例えば、限局性全身性硬化症、びまん性全身性硬化症、若しくは皮膚硬化を伴わない全身性硬化症）、腎性全身性線維症、嚢胞性線維症、慢性移植片対宿主病、又はアテローム性動脈硬化症である。
【０１４４】
ある実施形態において、線維性疾患は、強皮症である。ある実施形態において、強皮症は、限局性の、例えば、斑状又は線状強皮症である。ある実施形態において、疾患は、全身性硬化症、例えば、限局性全身性硬化症、びまん性全身性硬化症、又は皮膚硬化を伴わない全身性硬化症である。
【０１４５】
他の実施形態において、線維性疾患は、腱、軟骨、皮膚（例えば、皮膚表皮若しくは内皮）、心臓組織、血管組織（例えば、動脈、静脈）、膵臓組織、肺組織、腎臓組織、子宮組織、卵巣組織、神経組織、精巣組織、腹膜組織、結腸、小腸、胆道、腸、骨髄、造血組織、又は眼（例えば、網膜）組織のうちの１つ又は複数から選択される組織を侵す。
【０１４６】
ある実施形態において、線維性疾患は、眼の線維性疾患である。ある実施形態において、線維性疾患は、緑内障、黄斑変性症（例えば、加齢性黄斑変性症）、黄斑浮腫（例えば、糖尿病性黄斑浮腫）、網膜症（例えば、糖尿病性網膜症）、又はドライアイ疾患である。
【０１４７】
特定の実施形態において、線維性疾患は、皮膚の線維性疾患である。特定の実施形態において、皮膚の線維性疾患は、皮膚線維症（例えば、肥厚性瘢痕、ケロイド）、強皮症、腎性全身性線維症（例えば、重度の腎不全の患者における（ＭＲＩのための対照度物質として使用されることが多い）ガドリニウムへの曝露後に起こる）、及びケロイドのうちの１つ又は複数から選択される。
【０１４８】
特定の実施形態において、線維性疾患は、消化管の線維性疾患である。特定の実施形態において、線維性疾患は、強皮症に関連する線維症；放射線誘導性腸線維症；前腸の炎症性疾患（例えば、バレット食道若しくは慢性胃炎）に関連する線維症、及び／又は後腸の炎症性疾患（例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、若しくはクローン病）に関連する線維症のうちの１つ又は複数から選択される。ある実施形態において、消化管の線維性疾患は、強皮症に関連する線維症である。
【０１４９】
一実施形態において、線維性疾患は、慢性線維性疾患又は障害である。特定の実施形態において、線維性疾患は、炎症状態又は炎症性疾患に関連している。
【０１５０】
ある実施形態において、線維性疾患及び／又は炎症状態は、骨髄炎、例えば、慢性骨髄炎である。
【０１５１】
ある実施形態において、線維性疾患は、アミロイド症である。特定の実施形態において、アミロイド症は、慢性骨髄炎に関連している。
【０１５２】
ある実施形態において、線維性疾患又は障害は、肝臓の線維性疾患又は障害である。特定の実施形態において、肝臓の線維性疾患は、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、アルコール性脂肪肝疾患（ＡＦＬＤ）、又はアルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）から選択される。ある実施形態において、肝臓の線維性疾患は、肝硬変、胆汁鬱滞性肝疾患（例えば、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ））、胆管損傷、胆管線維症、又は胆管症から選択される。
【０１５３】
ある実施形態において、線維性疾患又は障害は、肝臓の線維性疾患又は障害でない。ある実施形態において、線維性疾患又は障害は、筋肉の線維性疾患又は障害でない。
【０１５４】
投与計画
組成物（例えば、活性部分）は、線維症を軽減又は治療するために、本明細書に記載される投与計画にしたがって投与され得る。例えば、組成物は、１日に２ｇ＋／−２０％〜１日に９０ｇ＋／−２０％（例えば、１日に７２ｇ＋／−２０％の総アミノ酸実体）の用量で、例えば、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、又はそれより長い治療期間にわたって、対象に投与され得る。
【０１５５】
ある実施形態において、組成物は、単回又は複数回投与計画のいずれかで、線維性疾患又は障害を有する対象に提供され得る。ある実施形態において、用量は、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、又はそれ以上で投与される。特定の実施形態において、組成物は、１日１回、２回、又は３回投与される。ある実施形態において、組成物は、少なくとも２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、又は２週間にわたって投与される。ある実施形態において、組成物は、長期間に（例えば、３０日間超、例えば、３１日間、４０日間、５０日間、６０日間、３ヶ月間、６ヶ月間、９ヶ月間、１年間、２年間、又は３年間）投与される。
【０１５６】
ある実施形態において、組成物は、食事前に投与される。他の実施形態において、組成物は、食事と同時に投与される。他の実施形態において、組成物は、食後に投与される。
【０１５７】
組成物は、対象（例えば、線維性疾患又は障害を有する対象）における線維症を改善又は軽減するために、２時間置き、３時間置き、４時間置き、５時間置き、６時間置き、７時間置き、８時間置き、９時間置き、又は１０時間置きに投与され得る。
【０１５８】
ある実施形態において、組成物は、４つのスティックパックを含み、例えば、各スティックパックは、本明細書に記載される組成物に含まれる各アミノ酸実体の量の２５％＋／−１５％を含む。特定の実施形態において、４つのスティックパックは、１日３回投与される。ある実施形態において、組成物は、３つのスティックパックを含み、例えば、各スティックパックは、本明細書に記載される組成物に含まれる各アミノ酸実体の量の３３．３％＋／−１５％を含む。特定の実施形態において、３つのスティックパックは、１日３回投与される。
【０１５９】
ある実施形態において、組成物は、例えば、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、又は１日６回（例えば、１日３回）、約２ｇ＋／−２０％〜５０ｇ＋／−２０％の総アミノ酸実体の用量で投与される。特定の実施形態において、組成物は、１日３回、２ｇ＋／−２０％〜１０ｇ＋／−２０％の総アミノ酸実体、例えば、１日３回、８ｇ＋／−２０％又は１０ｇ＋／−２０％の総アミノ酸実体の用量で投与される。特定の実施形態において、組成物は、１日３回、１０ｇ＋／−２０％〜２０ｇ＋／−２０％の総アミノ酸実体、例えば、１日３回、１１ｇ＋／−２０％、１２ｇ＋／−２０％、１５ｇ＋／−２０％、１６ｇ＋／−２０％、又は２０ｇ＋／−２０％の総アミノ酸実体の用量で投与される。特定の実施形態において、組成物は、１日３回、２０ｇ＋／−２０％〜３０ｇ＋／−２０％の総アミノ酸実体、例えば、１日３回、２１ｇ＋／−２０％、２２ｇ＋／−２０％、２３ｇ＋／−２０％、又は２４ｇ＋／−２０％の総アミノ酸実体の用量で投与される。
【０１６０】
活性部分及び医薬組成物の製造
本開示は、上記の発明の組成物（例えば、活性部分）を製造又は作製する方法を特徴とする。組成物を作製するのに使用されるアミノ酸実体は、分散及び／又は可溶化を補助するために、凝集され、及び／又はインスタント化され得る（ｉｎｓｔａｎｔｉｚｅｄ）。
【０１６１】
組成物は、以下の供給源からのアミノ酸実体を用いて作製され得るか、又は他の供給源が使用され得る：例えば、ＦＵＳＩ−ＢＣＡＡ（商標）インスタント化ブレンド（Ｉｎｓｔａｎｔｉｚｅｄ  Ｂｌｅｎｄ）（２：１：１の重量比でＬ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−バリン）、インスタント化Ｌ−ロイシン、及び他の酸が、味の素株式会社（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）から入手可能である。医薬品グレードのアミノ酸実体原料が、医薬品アミノ酸実体製品の製造に使用され得る。食品（又は栄養補助食品）グレードのアミノ酸実体原料が、食品アミノ酸実体製品の製造に使用され得る。
【０１６２】
本開示の組成物を製造するために、以下の一般的な工程が使用され得る：出発材料（個々のアミノ酸実体及び賦形剤）が、混合ユニット中で混合され、続いて、混合均一性及びアミノ酸含量が確認され、混合された粉末がスティックパック又は他の単位剤形へと充填され得る。スティックパック又は他の単位剤形の内容物は、経口投与のために使用時に水中に分散され得る。
【０１６３】
本発明の栄養補助食品及び医学的栄養組成物は、経口投与に好適な形態である。
【０１６４】
原料、例えば、医薬品グレードアミノ酸実体及び／又は賦形剤を、組成物に組み合わせるとき、汚染物質が、組成物中に存在し得る。組成物が、汚染物質を実質的に含まない（例えば、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．１、０．０１、又は０．００１％（ｗ／ｗ）未満を含む）場合、組成物は、汚染のレベルの基準を満たす。ある実施形態において、本明細書の方法において記載される組成物は、汚染物質を含まない。汚染物質は、組成物中に意図的に存在しない何らかの物質（例えば、医薬品グレードアミノ酸実体及び賦形剤、例えば、経口投与成分は、意図的に存在し得る）又は組成物の製品品質パラメータ（例えば、対象における副作用、減少した効力、減少した安定性／貯蔵期間、変色、匂い、不快な味、不快な質感／口当たり、又は組成物の成分の分離の増加）に悪影響を与える何らかの物質を含む。ある実施形態において、汚染物質は、微生物、内毒素、金属、又はそれらの組合せを含む。ある実施形態において、例えば、組成物の各部分の金属、レシチン、コリン、内毒素、微生物、又は他の汚染物質（例えば、原料からの汚染物質）による汚染のレベルが、食品中で許容されるレベル未満である。
【０１６５】
賦形剤
本開示のアミノ酸組成物は、１つ又は複数の賦形剤とともに配合又は製剤化され得る。好適な賦形剤の非限定的な例としては、味物質、香料、緩衝剤、保存料、安定剤、結合剤、圧密剤（ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）、潤滑剤、分散促進剤、崩壊剤、香味料、甘味料、及び着色剤が挙げられる。
【０１６６】
ある実施形態において、賦形剤は、緩衝剤を含む。好適な緩衝剤の非限定的な例としては、クエン酸、クエン酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、重炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、及び重炭酸カルシウムが挙げられる。
【０１６７】
ある実施形態において、賦形剤は、保存料を含む。好適な保存料の非限定的な例としては、酸化防止剤、例えばα−トコフェロール及びアスコルベート、並びに抗菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、及びフェノールが挙げられる。
【０１６８】
ある実施形態において、組成物は、賦形剤として結合剤を含む。好適な結合剤の非限定的な例としては、でんぷん、アルファでんぷん、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキソアゾリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｏｘｏａｚｏｌｉｄｏｎｅ）、ポリビニルアルコール、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、サッカリド、オリゴ糖、及びそれらの組合せが挙げられる。
【０１６９】
ある実施形態において、組成物は、賦形剤として潤滑剤を含む。好適な潤滑剤の非限定的な例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、硬化植物油、ステロテックス（ｓｔｅｒｏｔｅｘ）、モノステアリン酸ポリオキシエチレン、タルク、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、及び軽油が挙げられる。
【０１７０】
ある実施形態において、組成物は、賦形剤として分散促進剤を含む。好適な分散剤の非限定的な例としては、でんぷん、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーガム、カオリン、キサンタンガム、ベントナイト、精製木材セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、イソアモルファスシリケート（ｉｓｏａｍｏｒｐｈｏｕｓ  ｓｉｌｉｃａｔｅ）、及び高ＨＬＢ乳化剤界面活性剤としての微結晶性セルロースが挙げられる。
【０１７１】
ある実施形態において、組成物は、賦形剤として崩壊剤を含む。ある実施形態において、崩壊剤は、非発泡性崩壊剤である。好適な非発泡性崩壊剤の非限定的な例としては、でんぷん（トウモロコシでんぷん、ジャガイモデンプン、それらのアルファ化及び加工でんぷんなど）、甘味料、例えばベントナイトなどの粘土、微結晶性セルロース、アルギン酸塩、デンプングリコール酸ナトリウム、ガム（寒天、グアー、イナゴマメ、カラヤ、ペクチン、及びトラガカントなど）が挙げられる。ある実施形態において、崩壊剤は、発泡性崩壊剤である。好適な発泡性崩壊剤の非限定的な例としては、クエン酸と組み合わされた炭酸水素ナトリウム、及び酒石酸と組み合わされた炭酸水素ナトリウムが挙げられる。
【０１７２】
ある実施形態において、賦形剤は、香味料を含む。香味料は、合成香味油及び香味芳香族化合物；天然油；植物、葉、花、及び果実からの抽出物；並びにそれらの組合せから選択され得る。ある実施形態において、香味料は、ケイ皮油；ウインターグリーン油；ペパーミント油；クローバー油；干し草油（ｈａｙ  ｏｉｌ）；アニス油；ユーカリ；バニラ；レモン油、オレンジ油、ブドウ及びグレープフルーツ油などの柑橘類油；並びにリンゴ、モモ、セイヨウナシ、イチゴ、ラズベリー、サクランボ、プラム、パイナップル、及びアンズを含む果実エキスから選択される。
【０１７３】
ある実施形態において、賦形剤は、甘味料を含む。好適な甘味料の非限定的な例としては、グルコース（コーンシロップ）、デキストロース、転化糖、フルクトース、及びそれらの混合物（担体として使用されない場合）；サッカリン及びナトリウム塩などのその様々な塩；アスパルテームなどのジペプチド甘味料；ジヒドロカルコン化合物、グリチルリチン；ステビア（Ｓｔｅｖｉａ  Ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）（ステビオシド）；スクラロースなどのスクロースのクロロ誘導体；及びソルビトール、マンニトール、キシリトールなどの糖アルコールが挙げられる。水素化でんぷん加水分解物及び合成甘味料３，６−ジヒドロ−６−メチル−１，２，３−オキサチアジン−４−オン−２，２−ジオキシド、特に、カリウム塩（アセスルファム−Ｋ）、並びにそのナトリウム塩及びカルシウム塩も考えられる。
【０１７４】
ある実施形態において、組成物は、着色剤を含む。好適な着色剤の非限定的な例としては、食品、医薬品、及び化粧品用着色剤（ＦＤ＆Ｃ）、医薬品及び化粧品用着色剤（Ｄ＆Ｃ）、並びに外用医薬品及び化粧品用着色剤（Ｅｘｔ．Ｄ＆Ｃ）が挙げられる。着色剤は、染料又はそれらの対応するレーキとして使用され得る。
【０１７５】
特定の賦形剤は、クエン酸、レシチン、（例えばＡｌｃｏｌｅｃ  Ｆ１００）、甘味料（例えばスクラロース、微粉化スクラロースＮＦ、アセスルファムカリウム（例えばＡｃｅ−Ｋ））、分散促進剤（例えばキサンタンガム（例えばＴｉｃａｘａｎ  Ｒａｐｉｄ−３））、香味料（例えばバニラカスタード＃４３０６、Ｎａｔ  Ｏｒａｎｇｅ  ＷＯＮＦ  ＃１３２６、ライム８６５．００３２Ｕ、及びレモン８６２．２１６９Ｕ）、苦味マスキング剤（例えば９３６．２１６０Ｕ）、及び天然又は人工着色料（例えばＦＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  ６）のうちの１つ又は複数を含み得る。各スティックパックの例示的な成分含量が、表７に示される。
【０１７６】
【表７】
2021527669.tif 000008
【０１７７】
別の実施形態において、賦形剤は、クエン酸、甘味料（例えば、スクラロース）、キサンタンガム、香料剤（例えば、バニラカスタード＃４０３６）、香味料（例えば、ナットオレンジ（Ｎａｔ  ｏｒａｎｇｅ）ＷＯＮＦ  ＃１３６２）、及び着色剤（例えば、ＦＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  ６）に限定され、例えば、賦形剤は、レシチンを特に除外する（表８）。
【０１７８】
【表８】
2021527669.tif 000009
【０１７９】
食品組成物
アミノ酸実体を含む組成物（例えば、活性部分）は、例えば、医療食、機能性食品、又は栄養補助食品から選択される食品組成物として製剤化され、使用され得る。このような実施形態において、原料及び最終生成物は、食品の基準を満たすべきである。
【０１８０】
本明細書に開示される態様及び実施形態のいずれかの組成物は、例えば、医療食、機能性食品、又は栄養補助食品から選択される食品組成物として使用するためのものであり得る。ある実施形態において、食品組成物は、組成物を対象に投与することを含む方法において使用するためのものである。組成物は、線維症を改善又は軽減する目的のために食品組成物において使用するためのものであり得る。
【０１８１】
ある実施形態において、食品組成物は、医療食、機能性食品、又は栄養補助食品から選択される。ある実施形態において、組成物は、本明細書に記載される組成物を含む、栄養補給食品、食品製剤、機能性食品、医療食、食品、又は飲料の形態である。ある実施形態において、（例えば、炎症状態又は炎症性疾患を有する対象における）線維症の管理に使用するための、本明細書に記載される組成物を含む、栄養補給食品、食品製剤、機能性食品、医療食、食品、又は飲料。
【０１８２】
本開示は、線維症を改善する方法であって、有効量の本明細書に記載される食品組成物を対象に投与することを含む方法を特徴とする。
【０１８３】
本開示は、線維症を有する対象（例えば、線維性疾患又は障害を有する対象）に栄養補給又は栄養補助を提供する方法であって、有効量の本明細書に記載される組成物を対象に投与することを含む方法を特徴とする。
【０１８４】
本開示は、線維症（例えば、線維性疾患又は障害）の管理を助ける栄養補給又は栄養補助を提供する方法であって、有効量の本明細書に記載される組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を特徴とする。
【０１８５】
ある実施形態において、対象は、線維性疾患又は障害であると診断されているか又は診断された。他の実施形態において、対象は、線維性疾患又は障害を有さない。
【０１８６】
さらに、組成物は、対象（例えば、線維症を有さない対象）の食事の管理の方法に使用され得る。
【０１８７】
ある実施形態において、対象は、肺の線維性疾患又は障害を有する。ある実施形態において、対象は、心臓又は血管系の線維性疾患又は障害を有する。ある実施形態において、対象は、腎臓の線維性疾患又は障害を有する。ある実施形態において、対象は、膵臓の線維性疾患又は障害を有する。ある実施形態において、対象は、皮膚の線維性疾患又は障害を有する。ある実施形態において、対象は、消化管の線維性疾患又は障害を有する。ある実施形態において、対象は、骨髄又は造血組織の線維性疾患又は障害を有する。ある実施形態において、対象は、神経系の線維性疾患又は障害を有する。ある実施形態において、対象は、眼の線維性疾患又は障害を有する。
【０１８８】
バイオマーカー
本明細書に開示される方法のいずれかは、本明細書に記載される本発明の組成物（例えば、活性部分）を、線維症を有する対象（例えば、線維性疾患又は障害を有する対象）に投与することの有効性を評価又は監視することを含み得る。本方法は、値が治療の有効性の指標であるように、組成物に有効性の値を取得することを含む。
【０１８９】
ある実施形態において、対象は、例えば、線維症を有さない健常な対象と比べて、増加したレベルのＰｒｏＣ３を示す。ある実施形態において、対象は、例えば、線維症を有さない健常な対象と比べて、増加したレベルのＡＬＴを示す。ある実施形態において、対象は、例えば、線維症を有さない健常な対象と比べて、増加したレベルのＡＳＴを示す。ある実施形態において、対象は、例えば、線維症を有さない健常な対象と比べて、増加したレベルのＴＩＭＰ（例えば、ＴＩＭＰ１若しくはＴＩＭＰ２）を示す。ある実施形態において、対象は、例えば、線維症を有さない健常な対象と比べて、増加したレベルのＣｏｌ１ａ１を示す。ある実施形態において、対象は、例えば、線維症を有さない健常な対象と比べて、増加したレベルのＡｃｔａ２を示す。ある実施形態において、対象は、例えば、線維症を有さない健常な対象と比べて、増加したレベルのＨｓｐ４７を示す。ある実施形態において、対象は、例えば、線維症を有さない健常な対象と比べて、増加したレベルのヒドロキシプロリンを示す。
【０１９０】
ある実施形態において、対象への本明細書に記載される投与計画における組成物（例えば、活性部分）の投与は、以下：（ａ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端断片（ｐｒｏＣ３）；（ｂ）メタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）タンパク質；例えば、ＴＩＭＰ１若しくはＴＩＭＰ２；（ｃ）Ｃｏｌ１ａ１；（ｄ）Ａｃｔａ２；（ｅ）ＡＬＴ；（ｆ）ＡＳＴ；（ｇ）ヒドロキシプロリン；（ｈ）ＴＧＦ−ｂ；（ｉ）ＭＣＰ−１；（ｊ）ＭＩＰ−１；（ｋ）コラーゲン、例えば、Ｉ及びＩＩＩ型コラーゲン；（ｌ）α−平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；（ｍ）ＰＩＩＩＮＰ；（ｎ）Ｈｓｐ４７；（ｏ）プロコラーゲンＩα１；（ｐ）ＹＫＬ４０；又は（ｑ）ＧＲＯα（ＣＸＣＬ１）のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又はそれ以上（例えば、全て）のレベル又は活性を低下させる。
【０１９１】
評価（例えば、スクリーニング）の方法
別の態様において、本明細書に記載される組成物を評価するための方法又はアッセイが、本明細書に開示される。本方法は、（ａ）例えば、培養物中で膜（例えば、透過性膜、例えば、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）によって隔てられる１つ又は複数の肝細胞型（例えば、肝細胞、肝星細胞、及びマクロファージの三種共培養における、例えば、肝細胞、肝星細胞、又はマクロファージの１つ、２つ、又は３つ）（例えば、肝星細胞及びマクロファージの一方又は両方と膜によって隔てられる肝細胞）を、実施例９において記載される条件下で、組成物と接触させること；及び（ｂ）線維化マーカー、例えば、プロコラーゲンＩα１、ＭＣＰ−１、ＹＫＬ４０、又はＧＲＯα（ＣＸＣＬ１））のうちの１つ、２つ、３つ、又はそれ以上（例えば、全て）のレベルを検出することを含む。ある実施形態において、線維化マーカー（例えば、プロコラーゲンＩα１、ＭＣＰ−１、ＹＫＬ４０、又はＧＲＯα（ＣＸＣＬ１）の１つ、２つ、３つ、又はそれ以上（例えば、全て））のレベルの変化（例えば、変化）は、組成物が、線維症を軽減又は治療するのに好適であることを示す。ある実施形態において、組成物は、線維化マーカー（例えば、プロコラーゲンＩα１、ＭＣＰ−１、ＹＫＬ４０、又はＧＲＯα（ＣＸＣＬ１）の１つ、２つ、３つ、又はそれ以上（例えば、全て））のレベルの低下、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又はそれ以上の低下をもたらし、例えば、低下は、組成物が、線維症を軽減又は治療するのに好適であることを示す。特定の実施形態において、組成物は、
（ｉ）プロコラーゲンＩα１のレベル（例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、又は５０％のプロコラーゲンＩα１のレベルの低下）；
（ｉｉ）ＭＣＰ１のレベル（例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％のＭＣＰ１のレベルの低下）；
（ｉｉｉ）ＹＫＬ４０のレベル（例えば、少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％のＹＫＬ４０のレベルの低下）；又は
（ｉｖ）ＧＲＯαのレベル（ＣＸＣＬ１）（例えば、少なくとも１５％、２０％、２５％、又は３０％のＧＲＯα（ＣＸＣＬ１）のレベルの低下）
のうちの１つ、２つ、３つ、又はそれ以上（例えば、全て）の低下をもたらす。
【０１９２】
ある実施形態において、１つ又は複数の肝細胞型（例えば、肝細胞、肝星細胞、及びマクロファージ）、例えば、約１０：２：１の肝細胞対マクロファージ対肝星細胞の比率（例えば、膜（例えば、透過性膜、例えば、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）によって隔てられる肝細胞対肝星細胞対マクロファージの約１０：２：１の比率）で、例えば、培養物中の膜（例えば、透過性膜、例えば、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）によって隔てられる肝細胞型（例えば、肝星細胞又はマクロファージの一方又は両方と膜によって隔てられる肝細胞）が、共培養物中に存在する。
【０１９３】
ある実施形態において、検出工程は、試料、例えば、培養試料、例えば、実施例９において記載されるトランスウェルプレートからの培養試料を取得すること、及び線維症マーカー（例えば、プロコラーゲンＩα１、ＭＣＰ−１、ＹＫＬ４０又はＧＲＯα（ＣＸＣＬ１）の１つ、２つ、３つ又はそれ以上（例えば、全て））のレベルを測定することを含む。
【実施例】
【０１９４】
以下の実施例が、本発明の理解を助けるために記載されるが、決して本発明の範囲を限定することは意図されず、限定するように解釈されるべきではない。
【０１９５】
実施例１：治療的アミノ酸組成物Ａ−１処理が、化学的に誘導された線維症の動物モデルにおいて肝線維症を改善する。
アミノ酸組成物Ａ−１を、化学的に誘導された肝線維症のモデルにおいて肝線維症に作用するその能力について試験した。実験的肝線維症の一般的に使用されるモデルは、四塩化炭素；ＣＣｌ４を用いて、マウスにおいて化学的に誘導される（Ｇｉｄｅｏｎ  Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ；Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１０５，ｐｐ．３７１−４０８）。ＣＣｌ４は、処理の４週間後に線維症、肝細胞損傷、壊死及び線維症、並びに８週間後に肝硬変を引き起こす。四塩化炭素（ＣＣｌ４）によってマウスにおいて誘導される肝線維症は、線維症、再生及び線維形成を含む、ヒト肝炎症の重要な特性に類似している。
【０１９６】
７〜８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスをこの試験に使用した。動物を、１つのケージにつき４匹で飼育し、標準的な１２時間の明サイクルに保持し、水及び標準的なマウスの食事を自由に与えた。食品及び水は、自由に摂取可能であった。
【０１９７】
動物に、典型的に４週間にわたって週に３日、腹腔内（ＩＰ）に５％のＣＣｌ４又はビヒクルを投与した。ＣＣｌ４を毎週配合した。２３ｍｇ／ｍｌ、７６ｍｇ／ｍｌ又は１５３ｍｇ／ｍｌで、１０ｍｌ／ｋｇのアミノ酸組成物Ａ−１を、１日２回、強制経口投与によって投与した。動物を、週２回秤量し、血液を、血清のために週１回、後眼窩洞（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｉｎｕｓ）を介して採取した。４週間後、血液を、血清単離のために採取し、マウスを、頸椎脱臼によって安楽死させた。肝臓の２つの葉を取り出し−左葉を、組織病理学のための１０％のホルマリンを含む管に入れ、右葉を秤量し、２．３ｍｍのジルコニアビーズ及び１：１００プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｐ８３４０）の２×体積を含むビーズ破砕機（ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ）管に入れた。組織試料を、ビーズ破砕機において２分間均質化し、その直後に、４℃で１５分間にわたって３，０００ｒｐｍで沈降させた。血清を、２及び４週目にＡＬＴ／ＡＳＴレベルについて分析した。均質化された肝臓試料を、肝線維症の形成を確認するために、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）含量についてさらに評価した。
【０１９８】
ヒドロキシプロリン（４週目）
ヒドロキシプロリン（４−ヒドロキシプロリン、Ｈｙｐ）は、一般的な非タンパク構成アミノ酸であり、線維症の指標である、存在するコラーゲンの量の間接的な指標として使用される。ＣＣｌ４で処理された動物における肝臓Ｈｙｐ含量レベルは、ビヒクルで処理された動物より有意に高かった。データは、平均±標準偏差（ｓｔｄｅｖ）であり；「組成物Ａ−１」：アミノ酸組成物Ａ−１であり；対応のないＴ検定によってビヒクル対照と比較される＊ｐ＜０．０５。生データが、表９に示される。
【０１９９】
【表９】
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【０２００】
ＡＳＴレベル及びＡＬＴレベル
アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）及びアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）は、肝臓の健康の一般的に測定される臨床的バイオマーカーである。ＡＳＴ及びＡＬＴレベルの両方が、試験の期間全体にわたって、ＣＣｌ４を投与された動物において有意に上昇され、これは、肝障害が起こったことを示唆している。データは、平均±標準偏差（ｓｔｄｅｖ）であり；「組成物Ａ−１」：アミノ酸組成物Ａ−１であり；ｐ値が、片側Ｔ検定によってビヒクル／ＣＣｌ４対照と比較される；ｎ．ｓ．有意差なし。生データが、表２９及び３０に示される。
【０２０１】
【表１０】
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【０２０２】
【表１１】
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【０２０３】
概要
アミノ酸組成物Ａ−１による処理が、コラーゲン産生のマーカーであるヒドロキシプロリンの低下したレベルによって示される、化学的に誘導される繊維症の軽減、及び肝臓酵素ＡＬＴ及びＡＳＴのレベルの低下によって示される、肝障害の臨床的バイオマーカーの改善をもたらした（表１２〜１４）。
【０２０４】
【表１２】
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【０２０５】
【表１３】
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【０２０６】
【表１４】
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【０２０７】
実施例２：前臨床動物モデルにおけるアミノ酸組成物Ａ−１によるＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、及びＨＣＣの治療的処理
アミノ酸組成物Ａ−１及びオベチコール酸（６α−エチル−ケノデオキシコール酸；「ＯＣＡ」）を、ＳＴＡＭ（商標）モデルにおけるＮＡＳＨを治療するそれらの能力について試験した（Ｓｔｅｌｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＆  Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ；Ｓａｉｔｏ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２０１５  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ５：１２４６６）。標準食を与えられた正常なＣ５７ＢＬ／６マウス及びビヒクル処理ＳＴＡＭ（商標）マウスの２つのさらなる群が、対照として含まれていた。処理又はビヒクルを与えられる全ての動物を、６週間から開始して９週齢まで処理した。化合物を、１０ｍｌ／ｋｇの用量体積で、強制経口投与によって投与した。アミノ酸組成物Ａ−１を、１５００ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回投与し、ＯＣＡを、３０ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回投与した。
【０２０８】
ＳＴＡＭ（商標）は、ＳＭＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって開発された、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び肝細胞癌（ＨＣＣ）のモデルであり、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いた薬品及び食事介入の組合せによって作成されている（Ｓａｉｔｏ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２０１５  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ５：１２４６６）。マウスは、出生時に低用量のストレプトゾトシンで処理され、４週間から開始して高脂肪食を与えられる。脂肪肝のエビデンスが、５週間までに存在し、続いて、７週間までにＮＡＳＨ及び９週間までに線維症のエビデンスが存在する。
【０２０９】
出生の２日後の２００μｇのストレプトゾトシン（ＳＴＺ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）溶液の単回皮下注射、及び４週齢後の高脂肪食（ＨＦＤ、５７ｋｃａｌ％の脂肪、Ｃａｔ＃  ＨＦＤ３２、日本クレア（ＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎ）、日本）の供給によって、ＮＡＳＨを、５３匹の雄マウスにおいて誘導した。
【０２１０】
アミノ酸組成物Ａ−１、ＯＣＡ及びビヒクル（後述される）を、１０ｍＬ／ｋｇの体積で経口経路によって投与した。アミノ酸組成物Ａ−１を、脱イオン水中で１５０ｍｇ／ｍｌ（１０倍）になるまで可溶化した。ＯＣＡ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＢｌｏｃｋｓ  Ｉｎｃ．）を、水中０．５％のメチルセルロース中で、３ｍｇ／ｍｌ（１０倍）になるまで再懸濁させた。アミノ酸組成物Ａ−１を、１日２回（９ａｍ及び７ｐｍ）、１５００ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。ＯＣＡを、１日１回（９ａｍ）、３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。
【０２１１】
群２（ビヒクル）、３（アミノ酸組成物Ａ−１）及び４（ＯＣＡ）のマウスからの肝臓試料を、以下のアッセイに使用した。ＨＥ染色のため、ブアン液中で予め固定され、リリー・マイヤーヘマトキシリン液（武藤化学株式会社（Ｍｕｔｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、日本）及びエオシン溶液（和光純薬工業（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ））で染色された肝臓組織のパラフィンブロックから切片を切り取った。ＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）を、Ｋｌｅｉｎｅｒの基準（Ｋｌｅｉｎｅｒ  Ｄ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００５；４１：１３１３）にしたがって計算した。
【０２１２】
試験群
群１：ＳＴＺ：ＳＴＺを前投与された１０匹の新生マウスに、９週齢まで処理なしで通常の食事を自由に与えた。
群２：ビヒクル：１０匹のＮＡＳＨマウスに、６〜９週齢で、１日２回（９ａｍ及び７ｐｍ）、１０ｍＬ／ｋｇの体積のビヒクル（１０％のリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２）を経口投与した。
群３：アミノ酸組成物Ａ−１：１０匹のＮＡＳＨマウスに、６〜９週齢で、１日２回（９ａｍ及び７ｐｍ）、１５００ｍｇ／ｋｇの用量のアミノ酸組成物Ａ−１を補充した潅注用水を経口投与した。
群４：ＯＣＡ：１０匹のＮＡＳＨマウスに、６〜９週齢で、１日１回（９ａｍ）、３０ｍｇ／ｋｇの用量のＯＣＡを補充した０．５％のメチルセルロースを経口投与した。
群５：正常：１０匹の正常なマウスに、９週齢まで処理なしで通常の食事を自由に与えた。
群６：ＨＦＤ：１０匹の正常なマウスに、９週齢まで処理なしで高脂肪食を自由に与えた。
【０２１３】
組織学的結果：ＨＥ染色、ＮＡＦＬＤ活動性スコア及びα−平滑筋アクチン染色
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）活動性スコアを、各動物からのＨ＆Ｅ染色された肝臓切片の組織学的分析及び等級付けによって評価した。このスコアは、脂肪症（０〜３）、炎症（０〜２）、及び肝細胞風船様腫大（０〜２）の程度を等級付けする３つの個々のスコアの合計である。全ての組織を、Ｋｌｅｉｎｅｒらの採点基準（Ｋｌｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００５；４１（６）：１３１３−２１）を用いて等級付けした。結果が、表１５に示される。データは、平均±標準偏差（ｓｔｄｅｖ）である。標準食を与えられた正常なＣ５７ＢＬ／６マウスは、０＋／−０の平均スコアを有していた。ビヒクル処理ＳＴＡＭ（商標）マウスは、４．７＋／−０．６７の平均スコアを有していた。アミノ酸組成物Ａ−１処理マウスは、３．１＋／−０．７４の平均スコアを有していた。ＯＣＡ処理マウスは、２．９＋／−０．７４の平均スコアを有していた。アミノ酸組成物Ａ−１及びＯＣＡの両方は、ダネットの多重比較検定を用いて比較したとき、ＮＡＦＬＤ活動性スコアについてビヒクルと統計的に異なっていた（アミノ酸組成物Ａ−１  ｐ＝０．０００１、ＯＣＡ  ｐ＝０．０００１）。
【０２１４】
同様に、アミノ酸組成物Ａ−１処理マウスは、１．６＋／−０．５２のビヒクル処理ＳＴＡＭ（商標）マウスの平均肝細胞風船様腫大スコア、及び０．３＋／−０．４８のＯＣＡ処理マウスの平均肝細胞風船様腫大スコアと比較して、０．４＋／−０．５２の平均肝細胞風船様腫大スコアを示した。アミノ酸組成物Ａ−１及びＯＣＡの両方は、ダネットの多重比較検定を用いて比較したとき、肝細胞風船様腫大スコアについてビヒクルと統計的に異なっていた（アミノ酸組成物Ａ−１  ｐ＝０．０００１、ＯＣＡ  ｐ＝０．０００１）。生データが、表１５〜１８に示される。
【０２１５】
【表１５】
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【０２１６】
【表１６】
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【０２１７】
【表１７】
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【０２１８】
【表１８】
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【０２１９】
線維症：シリウスレッド染色の結果
線維症を、各動物からの染色された肝臓切片からのシリウスレッド陽性染色細胞面積の分析によって評価した。画像を、線維症の指標として使用される陽性染色面積のパーセントを用いて定量化した。この分析の結果が、表１９に示される。データは、平均±標準偏差（ｓｔｄｅｖ）である。標準食を与えられた正常なＣ５７ＢＬ／６マウスは、０．２８６＋／−０．０９の平均陽性面積を有していた。ビヒクル処理ＳＴＡＭ（商標）マウスは、１．１＋／−０．２６の平均陽性面積を有していた。アミノ酸組成物Ａ−１処理マウスは、０．８２８＋／−０．３３の平均陽性面積を有していた。ＯＣＡ処理マウスは、０．７７６＋／−０．２５の平均スコアを有していた。アミノ酸組成物Ａ−１及びＯＣＡは、ダネットの多重比較検定を用いて比較したとき、ビヒクルと統計的に異なっていた（アミノ酸組成物Ａ−１  ｐ＝０．００４９４、ＯＣＡ  ｐ＜０．０１６）。生データが、表１９に示される。
【０２２０】
【表１９】
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【０２２１】
アミノ酸組成物Ａ−１による処理の後のＳＴＡＭマウスモデルにおけるＮＡＦＬＤ活動性スコア、肝細胞風船様腫大、及び線維症の統計的に有意な改善（図１Ａ）と同様に、アミノ酸組成物Ａ−１による処理の後の高脂肪、高フルクトース及びコレステロール食（ＨＦＦＣ）マウスモデルにおいて、ＮＡＦＬＤ活動性スコア、肝細胞風船様腫大、及び線維症の統計的に有意な改善が決定された（図１Ｂ）。
【０２２２】
α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）染色の結果
全てのマウスの肝臓切片を、活性化された肝星細胞を同定するために、マーカーα−平滑筋アクチン（αＳＭＡ）について染色した。画像を、星細胞活性化の指標として使用される陽性染色面積のパーセントを用いて定量化した。結果が、表２０に示される。データは、平均±標準偏差（ｓｔｄｅｖ）であり；ｐ値が、片側Ｔ検定によって、ビヒクル処理ＳＴＡＭマウス対照と比較される。標準食を与えられた正常なＣ５７ＢＬ／６マウスは、０．６８２＋／−０．２６の平均陽性面積を有していた。ビヒクル処理ＳＴＡＭ（商標）マウスは、２．１２８＋／−０．５０の平均陽性面積を有していた。アミノ酸組成物Ａ−１処理マウスは、１．６５７＋／−０．８４の平均陽性面積を有していた。ＯＣＡ処理マウスは、１．５６２＋／−０．３１の平均スコアを有していた。
【０２２３】
【表２０】
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【０２２４】
アミノ酸組成物Ａ−１による処理が、ＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）の有意な減少（平均ＮＡＳ：２．９＋／−０．７４のＯＣＡ処理マウス平均スコアと比較して、アミノ酸組成物Ａ−１について３．１＋／−０．７４対４．７＋／−０．６７のビヒクル処理ＳＴＡＭ（商標）マウス平均スコア）によって示されるように、ＯＣＡ（ＮＡＳＨの治療について、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．によって現在臨床試験中である）によるファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）阻害と同等のレベルまでＮＡＳＨ重症度を有意に低下させ、肝星細胞活性化（平均αＳＭＡ陽性染色面積：１．５６２＋／−０．３１のＯＣＡ処理マウス平均面積と比較して、アミノ酸組成物Ａ−１について１．６５７＋／−０．８４対２．１２８＋／−０．５０のビヒクル処理ＳＴＡＭ（商標）マウス平均面積）の下方制御によって示されるように、線維症の発生を有意に低下させた。
【０２２５】
【表２１】
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【０２２６】
【表２２】
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【０２２７】
【表２３】
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【０２２８】
【表２４】
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【０２２９】
【表２５】
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【０２３０】
【表２６】
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【０２３１】
実施例３．アミノ酸組成物で処理された肝星細胞における線維形成性遺伝子発現の低下
健常な肝臓中の肝星細胞は、肝細胞と肝類洞内皮細胞との間のディッセ腔内にある。肝障害に応答して、肝星細胞が、活性化され、増殖性及び収縮性になり、αＳＭＡの産生、Ｉ及びＩＩＩ型コラーゲン並びに特定のＭＭＰ及びＴＩＭＰタンパク質の分泌を増加させる。ＬＸ−２細胞を、活性化肝星細胞のモデルとして選択し、特定のアミノ酸組成物がＴＧＦβ１で誘導される線維形成性遺伝子発現を低下させ得るかどうかを試験するのに使用した。
【０２３２】
ＬＸ−２肝星細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、２％の熱で不活性化したウシ胎仔血清（ＨＩ−ＦＢＳ、ＨｙＣｌｏｎｅ）及び０．２％のＰｒｉｍｏｃｉｎ（ＩｎＶｉｖｏＧｅｎ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で、コラーゲンＩ被覆９６ウェルマイクロプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で、ウェル当たり１．６７Ｅ４細胞で、０日目に播種し、３７℃、５％のＣＯ２で一晩インキュベートした。細胞を洗浄し、培地を、Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（１、２、３）に公開されている値に基づいた血液中の平均生理学的濃度に基づいた所定の特別なアミノ酸濃度及び基本的ＨＭＤＢ（Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｗｉｓｈａｒｔ  ＤＳ，Ｔｚｕｒ  Ｄ，Ｋｎｏｘ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，ＨＭＤＢ：ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００７  Ｊａｎ；３５（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ５２１−６．１７２０２１６８））によるアミノ酸濃度で存在する濃度の４０倍の所定のアミノ酸組成物ＬＩＶＲＱ＋Ｎ−アセチルシステイン、ＬＩＶＲＱ、ＲＱ＋Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルシステイン、ＬＩＶ、又は個別に、ＨＭＤＢによる濃度の５０倍のロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、グルタミン又はシステインの用量曲線を含むアミノ酸不含ＤＭＥＭ（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）と交換した。Ｎ−アセチルシステインを含有する組合せを、１０ｍＭで投与した。細胞を、３７℃、５％のＣＯ２で６時間前処理した。前処理の後、ＴＧＦβ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）又はビヒクルを、５ｎｇ／ｍＬの最終濃度になるように各ウェルに添加し、細胞を、３７℃、５％のＣＯ２でさらに１２時間にわたって、この刺激下でインキュベートした。
【０２３３】
１２時間のインキュベーションの後、ＴａｑＭａｎプライマープローブ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｃｏｌ１Ａ１，Ｈｓ．ＰＴ．５８．１５５１７７９５；Ａｃｔｂ，Ｈｓ．ＰＴ．３９ａ．２２２１４８４７；Ａｃｔａ２，Ｈｓ．ＰＴ．５６ａ．２４８５３９６１；Ｔｉｍｐ２，Ｈｓ．ＰＴ．５８．１４７８０５９４）を用いたΔΔＣｔ方法を用いて、β−アクチンハウスキーピング発現に対して正規化されたコラーゲン−１ａ１発現を決定するために、溶解物においてＲＮＡ抽出及び定量ＰＣＲを行った。
【０２３４】
表２７は、ＴＧＦβ１刺激を伴う又は伴わないビヒクルと比較した、アミノ酸の組合せで処理されたＬＸ−２細胞におけるＣｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２、及びＴｉｍｐ２遺伝子発現を示す。ＬＩＶＲＱ＋Ｎ−アセチルシステイン、ＬＩＶＲＱ、ＲＱ＋Ｎ−アセチルシステイン、及びＮ−アセチルシステインは、Ｃｏｌ１ａ１発現及びＴｉｍｐ２発現を低下させた。ＬＩＶＲＱ＋Ｎ−アセチルシステインは、Ｃｏｌ１ａ１、Ａｃｔａ２、及びＴｉｍｐ２遺伝子発現の最も大きい低下を示す。ＬＩＶＲＱ−Ｎ−アセチルシステインは、Ｎ−アセチルシステイン単独、ＲＱ＋Ｎ−アセチルシステイン、及びＬＩＶよりかなり大きくＡｃｔａ２発現を低下させる。ＬＩＶＲＱ＋Ｎ−アセチルシステインは、他の組合せのいずれよりもかなり大きくＴｉｍｐ２発現を低下させる（表２７）。
【０２３５】
【表２７】
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【０２３６】
表２８は、ＨＭＤＢによるアミノ酸濃度の１倍又は５０倍で、ＴＧＦβ１刺激を伴う又は伴わない、個々のアミノ酸のＣｏｌ１ａ１発現を示す。個別に、システインのみが、５０倍でＣｏｌ１ａ１発現の有意な低下を示した。
【０２３７】
【表２８】
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【０２３８】
実施例４：アミノ酸組成物による処理が、脂質代謝及び線維症に影響を与えることによって、２匹のげっ歯類モデルにおけるＮＡＳＨ進行を改善する。
アミノ酸組成物は、ＮＡＳＨを安全且つ有効に治療するために疾患病状の複数の機構を同時に標的にするように製剤化される（表２９）。本明細書に記載されるように、アミノ酸組成物の有効性を、ＮＡＳＨの２匹の確立されたマウスモデルにおいて試験して、ＮＡＳＨ及び関連疾患に関連する兆候及び症状に対するアミノ酸組成物の影響を決定した。
【０２３９】
【表２９】
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【０２４０】
ＳＴＡＭ（商標）マウスは、ＳＭＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって開発された、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び肝細胞癌（ＨＣＣ）のモデルである。脂肪肝のエビデンスが、５週齢までに存在し、続いて、７週齢までにＮＡＳＨ、及び９週齢までに線維症のエビデンスが存在する。出生の２日後に低用量のストレプトゾトシンを投与し、４週齢から開始して高脂肪食（５７％ｋｃａｌの脂肪、ＨＦＤ３２、日本クレア（ＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．））を与えたＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、雄ＳＴＡＭマウスを作成した（全体が参照により本明細書に援用される；Ｓａｉｔｏ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２０１５  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ５：１２４６６）。アミノ酸組成物を、６週齢から開始して３週間にわたって、１日２回、１．６ｍ／ｋｇの用量でＳＴＡＭマウスに投与した。ビヒクル処理ＳＴＡＭマウスの１つの群が、対照として含まれていた。非絶食マウスを、９週齢で安楽死させた。血漿及び肝臓試料を、さらなる分析のために採取した（図２）。
【０２４１】
ＦＡＴＺＯ（商標）マウスは、Ｃｒｏｗｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃによって開発された、肥満、メタボリック・シンドローム、及びＮＡＳＨの、近交系のポリジーンモデルである（全体が参照により本明細書に援用される；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＲＧ．Ｅｔ  ａｌ．，２０１７  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ）。雄ＦＡＴＺＯマウスに、６週齢から開始して、高脂肪、フルクトース、及びコレステロール（ＨＦＦＣ）食（４０％ｋｃａｌの脂肪、Ｄ１２０７９Ｂ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．及び飲料水中５％のフルクトース）を与えて、ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨを誘導した。脂肪肝のエビデンスが、誘導の４週間後までに存在し、続いて、誘導の１６週間後までにＮＡＳＨ及び誘導の２０週間後までに線維症のエビデンスが存在する。設計されたアミノ酸組成物を、誘導の１６週間後から開始して、４週間にわたって１日２回、３．０ｇ／ｋｇの用量で投与した（図２）。ビヒクル処理ＦＡＴＺＯマウスの１つの群が、対照として含まれていた。非絶食マウスを、誘導の２０週間後の時点で安楽死させた。血漿及び肝臓試料を、さらなる分析のために採取した。
【０２４２】
Ａｐｅｒｉｏ  ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＣＳホールスライドデジタルイメージングシステム（Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を、Ｈ＆Ｅ、Ｐｉｃｒｉｃシリウスレッド、ＳＭＡ、Ｆ４／８０におけるイメージングに使用した。画像を、ホールスライドから獲得した。
【０２４３】
肝臓を、ＮＡＳＨ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＲＮ）肝臓組織学的採点システムを用いて、サンプルＩＤを知らされていない獣医病理学者によって評価した（全体が参照により本明細書に援用される、Ｋｌｅｉｎｅｒ  ＤＥ，ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＮＡＳＨ  ＣＲＮ  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍは、脂肪症、小葉炎症、肝細胞風船様腫大、変性、及び線維症の進行を評価する。各事例の肝臓の１つの断面を、ＮＡＳＨスコアシステムを用いて分析した。脂肪症、小葉炎症、及び線維症の進行を、０〜３の尺度で評価した。肝細胞風船様変性を、０〜２の尺度で評価した。
【０２４４】
Ａｐｅｒｉｏ  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｉｍａｇｅ  ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎのＰｏｓｉｔｉｖｅ  Ｐｉｘｅｌ  Ｃｏｕｎｔアルゴリズムを用いて、走査されたスライド画像中に存在する特定の染色のパーセンテージを定量化した。色の範囲（色相及び彩度の範囲）並びに３つの輝度範囲（弱、ポジティブ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、及び強）をマスクし、評価した。アルゴリズムは、３つのさらなる量：平均輝度、強／総数の比率、及び弱いポジティブピクセルの平均輝度とともに、各輝度範囲における数及び輝度の総和を計数した。
【０２４５】
特定のポジティブピクセルアルゴリズムを、シリウスレッド及びオイルレッドＯ肝臓切片をイメージングするのに使用した。ポジティブピクセルアルゴリズムは、オレンジ色と青色を区別するように調節された。通常の「色相値」（０．１〜０．９６）及び「彩度」（０．０４〜０．２９）からの変更が、シリウスレッド評価のためになされた。血管系及び人工物は、分析から除外された。
【０２４６】
肝臓総脂質抽出物を、Ｆｏｌｃｈの方法によって得た（全体が参照により本明細書に援用される；Ｆｏｌｃｈ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９５７；２２６：４９７）。肝臓試料を、クロロホルム−メタノール（２：１、ｖ／ｖ）中で均質化し、室温で一晩インキュベートした。クロロホルム−メタノール−水（８：４：３、ｖ／ｖ／ｖ）での洗浄の後、抽出物を、蒸発乾固させ、イソプロパノールに溶解させた。肝臓トリグリセリド及びコレステロール含量を、それぞれトリグリセリドＥ−試験及びコレステロールＥ−試験によって測定した。
【０２４７】
肝臓ＲＮＡ試料を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｍＲＮＡ試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＃  ＲＳ−１２２−２１０３）を用いてｃＤＮＡライブラリーに変換した。トランスクリプトームを、Ｑ２  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ）において分析した。ＲＮＡ  Ｓｅｑデータを正規化し、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）を用いて分析した。ヒトＮＡＦＬＤに変換可能であるため、経路レベルでのマウス肝臓遺伝子発現に焦点を合わせた（全体が参照により本明細書に援用される、Ｔｅｕｆｅｌ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２０１６）。
【０２４８】
キャピラリー電気泳動飛行時間型質量分析法（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）及びＬＣ−ＴＯＦＭＳプラットフォームの両方に基づいた代謝プロファイルを、ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ（Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（山形、日本）において行った。試料中の代謝産物を、移動時間及びｍ／ｚ比を認証標準と比較することによって同定し、それらのピーク面積を認証標準のものと比較することによって定量化した。
【０２４９】
肝臓におけるＩＬ−１ｂタンパク質のレベルを、多重ＥＬＩＳＡ  Ａｓｓａｙ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いて定量化した。
【０２５０】
アミノ酸組成物は、ＳＴＡＭ及びＦＡＴＺＯマウスの両方において肝細胞風船様腫大及び線維症を改善する。
アミノ酸組成物による処理は、ＳＴＡＭ及びＦＡＴＺＯマウスの両方においてＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）を有意に低下させた（図３Ａ）。アミノ酸組成物による処理はまた、ＳＴＡＭマウスにおいて肝細胞風船様腫大を有意に軽減した（図３Ｂ）。脂肪症及び炎症のスコアは、組織学的指標によれば、アミノ酸組成物によるＳＴＡＭマウスの処理によって変化されなかった。シリウスレッド陽性の、線維症領域は、ＳＴＡＭマウスをアミノ酸組成物で処理することによって有意に低下された一方、オイルレッドＯ領域は、ＳＴＡＭマウスをアミノ酸組成物で処理することによって変化されなかった（図３Ｃ）。肝臓トリグリセリド及びコレステロールレベルは変化されなかった。
【０２５１】
アミノ酸組成物による処理はまた、ＦＡＴＺＯマウスにおいて肝細胞風船様腫大を有意に軽減した（図３Ｄ）。脂肪症及び炎症並びに肝臓トリグリセリド及びコレステロールレベルのスコアは、アミノ酸組成物処理で処理されたＦＡＴＺＯマウスにおいて変化されなかった。シリウスレッド陽性の、線維症領域は、アミノ酸組成物によるＦＡＴＺＯマウスの処理によって有意に低下された一方、オイルレッドＯ領域は、アミノ酸組成物処理によるＦＡＴＺＯマウスの処理によって変化されなかった（図３Ｅ）。
【０２５２】
アミノ酸組成物は、線維成長経路を防止する。
線維症は、代謝調節異常、炎症、及び細胞死などの、いくつかの生物学的過程の中心である。肝細胞内の脂質蓄積及び慢性炎症は、肝星細胞の線維形成性活性化を誘導する（全体が参照により本明細書に援用される、Ｗｏｂｓｅｒ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２００９）。アミノ酸組成物による処理から得られる肝臓遺伝子発現パターンは、線維形成性ＴＧＦ−ｂシグナル伝達経路の抑制と一致していた（図４）。
【０２５３】
増加するエビデンスは、ＣＣＲ２／ＣＣＲ５及びＭＣＰ−１／ＭＩＰ−１を含むそれらのリガンドが、肝臓組織損傷後の線維症の原因となるマクロファージ動員及び肝星細胞活性化を促進することを示唆する（全体が参照により本明細書に援用される、Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１６）。アミノ酸組成物は、減少する肝臓ＴＧＦ−ｂシグナル伝達並びにＭＣＰ−１及びＭＩＰ−１タンパク質によって、ＮＡＳＨのＳＴＡＭモデルにおける強力な抗線維化活性を示した（図５）。
【０２５４】
アミノ酸組成物は、ＮＡＳの改善並びに肝細胞風船様腫大及び線維症の改善を含む、ＮＡＳＨのＳＴＡＭ及びＦＡＴＺＯマウスモデルの両方における一貫した疾患修飾活性を示した。アミノ酸組成物の活性は、少なくとも部分的に、脂肪酸酸化の増加、並びに線維症に関連する転写経路のレベルの低下によって駆動されるようである。
【０２５５】
実施例５．肝星細胞のＴＧＦβ１線維形成性遺伝子発現
初代ヒト肝星細胞を、Ｓａｍｓａｒａ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。細胞を、１０回未満の継代で、Ｔ７５又はＴ１５０フラスコ中で、約８０％コンフルエンスになるまで完全ＨＳＣ培地中で成長させ、滅菌した、コラーゲンＩ被覆された９６ウェル光学的プラスチックマイクロプレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１５２０３６）中に播種し、２％のウシ胎仔血清及び１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むＤＭＥＭ中で、加湿された培養器中で、３７℃、５％のＣＯ２で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、培地±単一のアミノ酸ドロップアウト、１ＸＨＭＤＢ  ＤＭＥＭ±補助的アミノ酸用量で、１０．５時間にわたって前処理した。１０．５時間の前処理の後、３ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１を補充した同じ前処理培地を加え、３７℃、５％のＣＯ２で２４時間インキュベートした。２４時間の刺激の後、上清を除去し、ＲＮＡを抽出し、遺伝子発現を、それ自体の１×ＨＭＤＢ濃度に対して正規化することによって、各単一のアミノ酸ドロップアウト及び補給内でΔΔＣｑ方法を用いて評価した。
【０２５６】
ヒトプロコラーゲンＩα１を、１Ｘ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｒｅａｇｅｎｔ  Ａｎｃｉｌｌａｒｙ  Ｋｉｔ  ２，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）中で、１／１００の希釈で、ＥＬＩＳＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏ−Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ  α  １  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって上清から測定した。
【０２５７】
Ｃｏｌ１ａ１遺伝子発現
表３０、３１、３１−１、３１−２、３１−３、及び３１−４は、３人の異なる健常なドナーからの初代ヒト肝星細胞におけるＣｏｌ１ａ１遺伝子発現の平均倍率変化を示す。ＬＩＶＲＱＮＡＣ及びＬＩＶＲＱＮＡＣ＋Ｓは、３人のドナーのうちの２人において有意に低下されたＣｏｌ１ａ１遺伝子発現を示した。ＬＩＶＲＱＮＡＣ＋Ｇ及びＲＱＮＡＣは、３人全てのドナーにおいて有意に低下されたＣｏｌ１ａ１発現を示した。ＬＩＶＲＱは、１人のみのドナーにおいてＣｏｌ１ａ１遺伝子発現の有意な変化を示した。ＬＩＶ単独は、Ｃｏｌ１ａ１遺伝子発現を有意に変化させなかった。
【０２５８】
ロイシン、イソロイシン、バリン、及びアルギニンのそれぞれが、アミノ酸が単独で投与されたとき、いずれのドナーにおいてもＣｏｌ１ａ１遺伝子発現を有意に変化させなかった。グルタミンは、３人のドナーのうちの２人においてＣｏｌ１ａ１遺伝子発現を低下させた。Ｎ−アセチルシステインは、３人全てのドナーにおいてＣｏｌ１ａ１遺伝子発現を有意に低下させた。
【０２５９】
【表３０】
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【０２６０】
【表３１】
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【０２６１】
【表３２】
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【０２６２】
【表３３】
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【０２６３】
【表３４】
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【０２６４】
【表３５】
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【０２６５】
プロコラーゲンＩα１分泌
表３２、３３、３３−１、３３−２、３３−３、及び３３−４は、それらのそれぞれのベースラインアミノ酸条件に対して正規化された３人の異なる健常なドナーからの初代ヒト肝星細胞におけるプロコラーゲンＩα１の倍率変化を示す。統計的有意性を、各処理群内でダネットの多重比較検定を用いた一元ＡＮＯＶＡによって計算した。組合せＬＩＶは、３人全てのドナーにおいてプロコラーゲンＩα１分泌を有意に増加させた。ＬＩＶの組合せへのアルギニン（Ｒ）及びグルタミン（Ｑ）の添加が、ＬＩＶ単独の線維形成促進作用を抑制した。ＬＩＶＲＱＮＡＣ、ＬＩＶＲＱＮＡＣ＋Ｇ、ＬＩＶＲＱＮＡＣ＋Ｓ及びＲＱＮＡＣは、３人全てのドナーにおいてプロコラーゲンＩα１分泌を有意に減少させた。個別に、Ｎ−アセチルシステインは、３人のドナーのうちの２人においてプロコラーゲンＩα１分泌を有意に減少させることが示された。バリンは、２人のドナーのうちの１人においてのみプロコラーゲンＩα１分泌を有意に増加させた一方、イソロイシン及びアルギニンは、３人のドナーのうちの２人においてプロコラーゲンＩα１分泌を有意に増加させた。言い換えると、個別に投与されるグルタミンは、プロコラーゲンＩα１分泌に対する有意な影響を与えなかった。したがって、ＬＩＶ単独のものと比べた、アルギニン及びグルタミンによるＬＩＶの線維形成促進作用の低下は、個別のアミノ酸処理の効果に基づいて予測されなかった。
【０２６６】
【表３６】
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【０２６７】
【表３７】
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【０２６８】
【表３８】
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【０２６９】
【表３９】
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【０２７０】
【表４０】
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【０２７１】
【表４１】
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【０２７２】
実施例６．アミノ酸組成物による、マウスモデルのＮＡＳＨの処理
マウスでのＮＡＳＨの誘導
一例において、ＦＡＴＺＯマウスモデルにおける肥満、代謝に起因する非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）におけるＬＩＶＲＱＮＡＣ及び関連するアミノ酸組成物の影響を調べた。
【０２７３】
１６週間の誘導期中に、飲料水（ＷＤＦ）中５％のフルクトースを補充した西洋型食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ  ＃  Ｄ１２０７９Ｂ；脂肪４０％ｋｃａｌ、タンパク質１７％ｋｃａｌ、炭水化物４３％ｋｃａｌ）によって、ＮＡＳＨを、６０匹の雄ＦＡＴＺＯマウスにおいて誘導した。食事及び水は、自由に摂取可能であった。同腹子対照雄ＦＡＴＺＯマウスには、対照食（ｎ＝６、Ｐｕｒｉｎａ  ＃  ５００８；脂肪１７％ｋｃａｌ、タンパク質２７％ｋｃａｌ、炭水化物５６％ｋｃａｌ）を与え、滅菌水を、対照目的で提供した。マウスを、マイクロアイソレータを備えたプラスチックのケージ中で飼育した。滅菌した寝床を、週に１回交換した。マウスを、１つのケージにつき３匹飼育し、試験期間を通して１２時間の明サイクルで維持した。室温を毎日監視し、２２〜２５℃に維持した。体重を、誘導期中に毎週記録した。
【０２７４】
１６週間の食事誘導の後、６匹のマウスは、対照食（群１、対照）のままであった一方、６０匹の誘導マウスは、以下の処理への割り当てのために体重及び血漿グルコース（ｆｅｄ）について無作為化された。ＦＡＴＺＯマウスに、４週間にわたる西洋型食ＮＡＳＨ誘導後１６週間の時点から開始して、被験物質を投与した。被験物質を、強制経口投与によって投与した。動物を、西洋型食ＮＡＳＨ誘導後２０週間の時点で安楽死させ、組織を分析のために採取した。
【０２７５】
【表４２】
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【０２７６】
ＬＩＶＲＱＮＡＣ、ＬＩＶＲＱＮＡＣ＋Ｇ、ＬＲＱＮＡＣ、及びＯＣＡ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＢｌｏｃｋｓ，Ｉｎｃ．）、賦形剤（ｉｎｃｉｐｉｅｎｔ）、及び潅注用水を、Ａｘｃｅｌｌａ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃ．によって提供した。０．５％のメチルセルロースは、ＣｒｏｗｎＢｉｏ，Ｉｎｃ．によって提供された。投与溶液を、付属書（Ａｐｐｅｎｄｉｘ）１にしたがって調製した。ＴＡ化合物（アミノ酸組成物）は、潅注用水（Ｂａｘｔｅｒ  ＃  ２７Ｆ７１１４）並びに賦形剤０．１２５％のキサンタンガム、１．５ｍＭのラウリル硫酸ナトリウム及び０．２８％のレシチン中で毎日新たに製剤化されるアミノ酸ブレンドであった。オベチコール酸（ＯＣＡ）を、潅注用水中０．５％のメチルセルロース中で懸濁させた。全ての被験物質を、冷蔵保存した。ＴＡ化合物は、スポンサーによって凍結粉末で提供された。投与を４週間にわたって続けた。
【０２７７】
ＬＩＶＲＱＮＡＣ＋Ｇ及びＬＲＱＮＡＣのロイシン投与量を、ＬＩＶＲＱＮＡＣのものに適合させた。
【０２７８】
【表４３】
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【０２７９】
【表４４】
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【０２８０】
ＬＩＶＲＱＮＡＣ、ＬＩＶＲＱＮＡＣ＋Ｇ、ＬＲＱＮＡＣ、ＯＣＡ及びビヒクルを、試験全体を通して１０ｍＬ／ｋｇの体積で、強制経口投与によって投与した。投与量を、一日体重によって計算した。ＬＩＶＲＱＮＡＣ、ＬＩＶＲＱＮＡＣ＋Ｇ、ＬＲＱＮＡＣ、及びビヒクルを、１日２回（ＢＩＤ）投与した一方、ＯＣＡを、午前中に１日１回（ＱＤ）投与した。マウスは、１日１回（ＱＤ）ＯＣＡ、及び１日１回（ＱＤ）１つのビヒクルを投与されている。用量を、４週間にわたって、強制経口投与によって０７００及び１８００に投与した。
【０２８１】
生存率、臨床兆候及び行動を毎日監視した。体重を、投与期間の間、毎日記録した。血液試料を、グルコース測定（ＳｔａｔＳｔｒｉｐ血糖値測定器）のために、尾切断によって毎週ＡＭ（０７００）に採取した。
【０２８２】
動物に、ＣＯ２吸入により麻酔をかけ、安楽死のために心穿刺によって放血させた。末梢血試料（Ｋ２ＥＤＴＡ）を、終了時に、麻酔された動物において心穿刺によって取得した。試料は、Ａｘｃｅｌｌａ  Ｈｅａｌｔｈに、凍結された状態で提供された。臓器重量（肝臓全体、生殖腺脂肪パッド（ｇｏｎａｄａｌ  ｆａｔ  ｐａｄ））を記録した。膵臓、及び小腸及び生殖腺脂肪パッドを、１０％の緩衝ホルマリン中で固定し、プロトコルにおいて指示どおりに調製した。また、小腸、生殖腺脂肪パッド及び肝臓の切片を、液体窒素中で急速凍結させ、スポンサーに輸送した。
【０２８３】
肝臓組織を、２４時間にわたって４℃で、ブアン液、続いて標準的な濃度のアルコールの浴、次にキシレン中で固定して、パラフィン包埋のための組織を調製した。パラフィンに包埋され、冷却された後、５ミクロンの切片を切断し、慣例的なＨ＆Ｅ及びピクリン酸シリウスレッドで染色した。肝臓の右葉及び左葉の両方の切片を、オイルレッドＯ）染色を用いた脂質含量の分析のためにＯＣＴ中で凍結させた。Ａｐｅｒｉｏホールスライドデジタルイメージングシステム（Ｓｃａｎ  Ｓｃｏｐｅ  ＣＳ，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を、イメージングに使用した。全てのスライドを２０倍でイメージングした。走査時間は、１．５分から２．２５分の最大時間までの範囲であった。全画像を収納し、それらのＳｐｅｃｔｒｕｍソフトウェアシステムに保存し、画像をホールスライドから撮影した。
【０２８４】
肝臓を、採点のためのＮＡＳＨ肝臓基準を用いて評価した。このマウス試験では、各事例の肝臓の１つの断面を、ＮＡＳＨスコアシステムを用いて分析した。公開されたＮＡＳＨ  ＣＲＮ  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍによれば、この採点システムは、ＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）、線維症段階及びパターン認識によるＮＡＳＨの同定を含む。ＮＡＳは、０〜８の範囲であり得、Ｈ＆Ｅ染色された切片からの脂肪症（０〜３）、小葉炎症（０〜３）及び肝細胞風船様腫大（０〜２）のスコアの合計によって計算される。線維症を、ピクロシリウスレッド染色されたスライドから採点した（０〜４）。ＮＡＳＨシステムを、ヒト肝臓１８ゲージ生検に使用した。脂肪症、小葉炎症、肝細胞．肝細胞風船様変性、線維症、ＮＡＳ及びパターン認識によるＮＡＳＨの存在を、組織的に評価した。この試験では、この試験において１匹のマウスにつき肝臓の１つの全断面積を評価した。これは、１８ゲージヒト肝生検のサイズの約１５倍である。病理学的スコアを、０、＋１、＋２、又は＋３として決定した。病変を、場所（門脈周囲、小葉中心、及び中間帯）及び脂肪蓄積（限局性、門脈周囲、及び／又は小葉中心）について採点した。スコアの他の部分は、病変の分布：限局性、多発性及び／又は広範性であった。また、病変の軽度、中等度及び重症度。これらのパラメータが、全ＮＡＳＨスコアを構成していた。
【０２８５】
全ての免疫組織化学的染色工程を、自動免疫染色装置（ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｅｒ）においてＤａｋｏ  ＦＬＥＸ  ＳＹＳＴＥＭを用いて行い；インキュベーションを、室温で行い、トリス緩衝生理食塩水及び０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４（ＴＢＳ−Ｄａｋｏ  Ｃｏｒｐ．）を、全ての洗浄剤及び希釈剤に使用した。十分な洗浄を、各インキュベーション後に行った。一次抗体は、抗マウスＳＭＡ、Ｆ４／８０、Ｍａｃ−２、及びピクリン酸シリウスレッドを含んでいた。対照切片を、一次抗体と同じ濃度を用いてアイソタイプコントロールで処理して、染色特異性を確認した。
【０２８６】
白色脂肪組織（ＷＡＴ）脂肪細胞サイズを、Ｈ＆Ｅで染色された切片から分析した。Ａｐｅｒｉｏ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｃｏｐｅアプリケーションを用いて、各組織標本の３つの局部的な領域（組織の縁部、血管領域を囲んでいない組織、血管領域を囲んでいる組織）を、この領域の大きい順に１０の脂肪細胞の面積を測定することによって評価した。各組織内で、各領域の１０のホットスポットを定量化し（ｕｍ２）、平均した。
【０２８７】
膵臓β島細胞を、免疫組織化学的染色によって同定した。
【０２８８】
Ａｐｅｒｉｏ  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎが、免疫組織化学的染色、オイルレッドＯ、及びシリウスレッド染色のポジティブピクセルを定量化するのに用いられた。Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｐｉｘｅｌ  Ｃｏｕｎｔアルゴリズムを用いて、走査されたスライド画像中に存在する特定の染色のパーセンテージを定量化した。色の範囲（色相及び彩度の範囲）及び３つの輝度範囲（弱、ポジティブ、及び強）をマスクし、評価した。アルゴリズムは、３つのさらなる量：平均輝度、強／総数の比率、及び弱いポジティブピクセルの平均輝度とともに、各輝度範囲における数及び輝度の総和を計数した。ポジティブピクセルアルゴリズムは、オレンジ色と青色を区別するように調節された。通常の「色相値」（０．１〜０．９６）及び「彩度」（０．０４〜０．２９）からの変更が、シリウスレッド評価のためになされた。血管系及び人工物は、分析から除外された。
【０２８９】
肝臓ＩＬ−１ｂタンパク質レベルを、多重ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いて定量化した。
【０２９０】
肝臓組織学的スコアの統計的分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）においてボンフェローニの多重比較検定を用いて行った。Ｐ値＜０．０５は、統計的に有意であると見なされた。結果を、平均±ＳＥＭとして表した。群２（ビヒクル）と、以下の群；群３（ＬＩＶＲＱＮＡＣ  １，５００ｍｇ／ｋｇ）、群４（ＬＩＶＲＱＮＡＣ  ３，０００ｍｇ／ｋｇ）、群５（ＬＩＶＲＱＮＡＣ＋Ｇ、３，８８５ｍｇ／ｋｇ）、及び（ＬＲＱＮＡＣ、２，４６９ｍｇ／ｋｇ）との間で、比較を行った。
【０２９１】
体重及び肝臓重量
１６週間にわたって、フルクトース（ＷＤＦ）を補充した西洋型食を供給することにより、対照を供給された動物と比較して、体重に対する有意な効果を誘発した。試験薬剤の投与の前に、ＷＤＦを供給された動物は、対照食を供給された動物と比較して、有意に重かった（４７．６±０．４５対４３．９±１．０３ｇ；ｐ＜０．０１）。
【０２９２】
体重は、全ての処理群においてベースライン値と比較して減少し；ビヒクルと比較して体重減少の有意差はなかった（対照、ビヒクル、ＬＩＶＲＱＮＡＣ（１５００ｍｇ／ｋｇ）、ＬＩＶＲＱＮＡＣ（３０００ｍｇ／ｋｇ）、ＬＩＶＲＱＮＡＣ＋Ｇ、ＬＲＱＮＡＣ、及びＯＣＡについてそれぞれ、−７．６±０．９、−６．９±１．３、−６．８±１．４、−５．７±１．２、−６．４±１．０、−４．７±１．６及び−３．９±１．５％；ｐ＜０．４９９２）。
【０２９３】
肝臓重量（％体重）は、対照食と比較してＷＤＦを供給されたビヒクル処理動物において有意に多かったが（７．２２±０．３対５．０５±０．２４％；ｐ＜０．０００１）；ＷＤＦを供給された動物において、ビヒクルと比較して有意な効果は、いずれの処理群においても示されなかった（ビヒクル、ＬＩＶＲＱＮＡＣ（１５００ｍｇ／ｋｇ）、ＬＩＶＲＱＮＡＣ（３０００ｍｇ／ｋｇ）、ＬＩＶＲＱＮＡＣ＋Ｇ、ＬＲＱＮＡＣ、及びＯＣＡについてそれぞれ、７．２２±０３、７．１４±０．３、７．１９±０．２６、６．６９±０．１８、７．０２±０．５及び６．８１±０．２；ｐ＜０．７４５０）。
【０２９４】
肝組織像
対照食を供給されたＦＡＴＺＯマウスは、軽度の脂肪症、肝細胞風船様腫大、又は線維症を発症した。（図６）。ＷＤＦを供給され、且つビヒクルで処理されたＦＡＴＺＯマウスは、重篤な脂肪症、肝細胞風船様腫大、及び線維症を発症した。ビヒクル群における主に大滴性（ｍａｃｒｏｖｅｓｉｃｕｌａｒ）脂肪症と対照的に、主に小滴性（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｕｌａｒ）及び低下した大滴性脂肪症の混合が、図７に示されるように、ＬＩＶＲＱＮＡＣ、ＬＩＶＲＱＮＡＣ＋Ｇ及びＬＲＱＮＡＣ群において観察された。
【０２９５】
ＮＡＦＬＤ活動性スコアは、固定した肝組織における脂肪症（０〜３）、及び肝細胞風船様腫大（０〜２）の組織学的採点から計算される。ＷＤＦを供給された動物において、全てのアミノ酸組成物処理は、ビヒクル処理群と比較して、ＮＡＳの有意な軽減をもたらした（図８）。ＬＩＶＲＱＮＡＣ及びアミノ酸組成物処理は、ビヒクルと比較して、肝臓脂肪症を軽減したが、ＬＩＶＲＱＮＡＣ＋Ｇ及びＬＲＱＮＡＣのみが統計的有意性（ｐ＜０．０５）に達した一方、ＬＩＶＲＱＮＡＣは達しなかった（ＬＩＶＲＱＮＡＣ  ３．０ｇ／ｋｇ、ｐ＝０．１２）。全てのアミノ酸組成物処理は、脂肪毒性及び細胞死のバイオマーカーである、肝細胞風船様腫大を有意に緩和した。結論として、肝臓病変のアミノ酸組成物に関連する改善は、主に、肝細胞風船様腫大の緩和に起因している。ビヒクルと比較して、ＮＡＳスコア及びＮＡＳ構成要素に対するＯＣＡの有意な効果はなかった。
【０２９６】
【表４５】
2021527669.tif 000046
【０２９７】
ビヒクル処理動物からの肝臓は、軽度の線維症；０．８±０．１のスコアを示した。ＬＩＶＲＱＮＡＣ（１５００ｍｇ／ｋｇ）で処理された動物からの肝臓のみが、ビヒクル処理群と比較した際に、線維症の有意な軽減（０．２±０．１対０．８±０．１、ｐ＜０．０１）を示したが、ＬＩＶＲＱＮＡＣ（３０００ｍｇ／ｋｇ）、ＬＩＶＲＱＮＡＣ＋Ｇ又はＬＲＱＮＡＣでの処理に関しては示さなかった。シリウスレッドコラーゲン染色は、全てのアミノ酸組成物処理が、ビヒクルと比較して、コラーゲン沈着を有意に低下させたことを示した（ＬＩＶＲＱＮＡＣ  １５００ｍｇ／ｋｇ、ｐ＜０．０１；ＬＩＶＲＱＮＡＣ  ３０００ｍｇ／ｋｇ、ｐ＜０．０１；ＬＩＶＲＱＮＡＣ＋Ｇ、ｐ＝０．０９；ＬＲＱＮＡＣ、ｐ＜０．０５）。ＯＣＡは、肝線維症スコア又はシリウスレッドコラーゲン染色面積に影響を与えなかった。
【０２９８】
【表４６】
2021527669.tif 000047
【０２９９】
肝臓ケモカイン及びサイトカイン
肝臓における炎症性サイトカインＩＬ−１ｂタンパク質レベルは、表３４に示されるように、対照食を供給されたマウスと比較して、ＷＤＦを供給されたマウスにおいて上昇された。
【０３００】
【表４７】
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【０３０１】
概要
臨床的観察に基づいて、ＷＤＦを供給されたＦＡＴＺＯマウスは、対照食を供給されたマウスより体重を増加させた。全ての処理は、ＦＡＴＺＯマウスにおいて良好な忍容性を示した。ＷＤＦを供給されたマウス及び対照食を供給されたマウスは両方とも、治療期間中に体重を減少させ、これは、１日２回の強制経口投与による被験物質又はビヒクルの投与に関連するストレスに起因し得る。
【０３０２】
ＮＡＳは、主に肝細胞風船様腫大スコアに起因して、ビヒクルと比較して、全てのアミノ酸組成物処理群において有意に緩和された。肝細胞風船様腫大は、全てのアミノ酸組成物処理群において有意に軽減された。脂肪症は、ＬＩＶＲＱＮＡＣ＋Ｇ及びＬＲＱＮＡＣ処理群において有意に軽減された。ＬＩＶＲＱＮＡＣも、脂肪症を低下させたが、差は有意でなかった。組織学的及び生化学的データと一致して、デノボ脂質生成酵素ＦＡＳＮ及びＡＣＡＣＡ  ＲＮＡレベルは、アミノ酸組成物処理によって影響されなかった。
【０３０３】
肝細胞脂肪症の特徴は、アミノ酸組成物処理により変化された。ＷＤＦを供給されたマウス（ビヒクル群）の肝臓は、主に、大滴性脂肪症を示した。対照的に、大滴性脂肪症は減少され、全てのアミノ酸組成物処理群において小滴性及び大滴性脂肪症の混合であった。大滴性ないし小滴性脂肪症表現型におけるアミノ酸組成物の生物学的意味及び機構は、さらに調査する価値がある。
【０３０４】
ＮＡＦＬＤのＦＡＴＺＯモデルにおける肝線維症スコアは、高用量ではなく低用量でのＬＩＶＲＱＮＡＣ処理によって有意に緩和された。ＬＩＶＲＱＮＡＣ＋Ｇ及びＬＲＱＮＡＣは、線維症に対する効果を与えなかった。それにもかかわらず、シリウスレッドコラーゲン染色は、ＬＩＶＲＱＮＡＣ、ＬＩＶＲＱＮＡＣ＋Ｇ及びＬＲＱＮＡＣが、肝臓におけるコラーゲン沈着を有意に減少させたことを示した。
【０３０５】
結論として、ＦＡＴＺＯマウスにおいて試験される３つ全てのアミノ酸組成物（ＬＩＶＲＱＮＡＣ、ＬＩＶＲＱＮＡＣ＋Ｇ及びＬＲＱＮＡＣ）は、ＮＡＦＬＤ活動性スコア、肝細胞風船様腫大、及び線維症を緩和する。これらのアミノ酸組成物は、ＮＡＳＨを治療するのに使用され得る。グリシン含有アミノ酸組成物は、経路をさらに軽減することができ、これにより、肝線維症の軽減をもたらす。
【０３０６】
実施例７．アミノ酸組成物による対象の処理
本明細書に記載される試験は、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に罹患した対象への、アミノ酸を含む組成物の投与を特徴とする。このプレＩＮＤ及びＩＲＢ承認試験の目的は、投与の６週間及び１２週間後に、線維症、炎症、インスリン感受性、グルコース及び脂質代謝、及びアポトーシスの様々なマーカーを調べることによって、アミノ酸組成物の安全性及び忍容性並びにヒト生理学の構造及び機能に対するその影響を決定することであった。組成物は、１日３回の４つのスティックパックの投与（例えば、１日に合計で約７２ｇ、又は約２４ｇを１日３回）のために、スティックパケット当たり、約１ｇのＬ−ロイシン、約０．５ｇのＬ−イソロイシン、約０．５ｇのＬ−バリン、約１．５ｇのＬ−アルギニン（又は１．８１ｇのＬ−アルギニンＨＣｌ）、約２．０ｇのＬ−グルタミン、及び約０．１５ｇのＮ−アセチルシステインを含んでいた。
【０３０７】
この試験において、対象に、１２週間にわたって１日３回、アミノ酸組成物を与えた。アミノ酸を、１２オンスの水に溶解されるべき粉末形態で提供した。参加者に、１２週間の試験期間にわたってアミノ酸組成物を与えた。
【０３０８】
この試験の主要評価項目は、安全性及び忍容性であった。二次評価項目は、代謝、炎症及び線維症に関連するバイオマーカーによって、ヒト生理学に対する影響を調べることであった。評価を、ベースライン（１日目）、試験の６週、及び１２週の時点で行った。
【０３０９】
対象を選択するための主要な基準は、以下を含んでいた：１８歳以上７０歳以下の男性又は女性；書面によるインフォームド・コンセントを提供する意思があり、提供できる；スクリーニングの時点で６．５％以上及び１０％未満のＴ２ＤＭ又はヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）の病歴；以下の基準の１つによる脂肪肝疾患の実証：ａ．以下の方法の少なくとも１つによって３か月のスクリーニング中に確認された脂肪症の前歴：８％以上のＰＤＦＦを有するＭＲＩによる肝臓脂肪；３００ｄＢ／ｍ以上の制御減衰パラメータ（Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を有するフィブロスキャン（Ｆｉｂｒｏｓｃａｎ）；グレードＩを超える非ＮＡＳＨ  ＮＡＦＬＤ脂肪症を示す肝臓生検。患者が、（４ａに示されるように）３か月のスクリーニング中に脂肪症のこの実証された前歴を有さない場合、１０％以上の肝臓脂肪スコアが、下式を用いて、スクリーニング時に実証されなければならない：
予測される肝臓脂肪パーセント＝１０＾（−０．８０５＋（０．２８２＊メタボリック・シンドローム［あり＝１／なし＝０］）＋（０．０７８＊２型糖尿病［あり＝２／なし＝０］）＋（０．５２５＊ｌｏｇ１０（インスリンｍＵ／Ｌ））＋（０．５２１＊ｌｏｇ１０（ＡＳＴ  Ｕ／Ｌ））−（０．４５４＊ｌｏｇ１０（ＡＳＴ／ＡＬＴ））３４
注記：インスリン、ＡＬＴ及びＡＳＴは、空腹時の血清試料において測定されるべきである。対象は、大きな体重の変動がなく、スクリーニング前の３か月以内に、運動、食事及び生活様式の一定の習慣がなければならず、すなわち、対象は、スクリーニングの時点で、過去３か月間にわたって体重の±３％以内であるべきである。スクリーニングの時点で３２ｋｇ／ｍ２以上のボディマス指数（ＢＭＩ）。ＭＲＩ機器が４５ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する患者に対応できない部位については、４０〜４５ｋｇ／ｍ２の上限が適用され得る。患者は、スクリーニング前の少なくとも３か月間にわたってグルコースを低下させる薬剤（メトホルミン、スルホニル尿素、ジペプチジルペプチダーゼ−４［ＤＰＰ−４］阻害剤、ナトリウム−グルコース共輸送体２［ＳＧＬＴ２］阻害剤、又は長時間作用型基礎インスリンを含み得る）の一定の用量を継続し、試験期間にわたってそれらの薬剤の予測される用量の調節なしに同じ薬剤を服用し続ける予定でなければならない。除外される糖尿病関連の薬剤の詳細な一覧については、以下のセクション８を参照されたい。対象が、高血圧治療薬（例えば、β遮断薬、ヒドロクロロチアジド、ＡＣＥ阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断薬）、脂質異常症のための薬剤（例えば、スタチン、フィブラート系薬）、及び甲状腺機能低下症のための薬剤（例えば、レボチロキシン）で同時に治療される場合、スクリーニング前の少なくとも３か月間にわたってこれらの薬剤の一定の用量及び投与計画を継続しており、試験期間にわたってそれらの薬剤の予測される用量の調節なしに同じ薬剤を服用し続ける予定である限り、その対象は試験に含まれ得る。対象は、ビタミン補充剤（例えば、マルチビタミン；ビタミンＥ＜４００ＩＵ／日）を服用し続けていてもよい。しかしながら、対象は、試験期間にわたって予測される用量の調節なしにスクリーニング前の少なくとも３か月間にわたってこれらのビタミン補充剤の一定の用量及び投与計画を継続していなければならない。妊娠の可能性がある女性対象は、スクリーニングの時点で血清妊娠検査陰性を有さなければならず、全試験期間中及び治験薬の最後の投与の後３０日間にわたって、異性との性交渉の際に極めて有効な避妊方法に同意し、使用しなければならない。妊娠の可能性は、無月経の期間を有する、子宮摘出、両側卵巣摘出を受けていないか、若しくは卵巣不全が医学的に確認されていない女性対象、又は５０歳未満の女性を指す。
【０３１０】
ＬＩＶＲＱＮＡＣは、１２週の時点で血漿中ｐｒｏ−Ｃ３及び他の主な線維症バイオマーカーを低下させ、これは、線維形成の抑制を裏付けている。血漿中ｐｒｏＣ３、ＰＩＩＩＮＰ及びＴＩＭＰ−１の平均レベルを、ベースライン（１日目）並びに６及び１２週の時点で測定した。図９Ａは、示される数の対象における、経時的なＰｒｏ−Ｃ３の平均（ｎｇ／ｍｌ、＋／−ＳＥＭ）を示す。ＬＩＶＲＱＮＡＣは、１日目と比較して、１２週の時点でｐｒｏ−Ｃ３レベルを有意に（ｐ＜０．０５）低下させた。図９Ｂは、ＬＩＶＲＱＮＡＣが、１日目と比べて、６及び１２週の時点でＰＩＩＩＮＰ及びＴＩＭＰ−１レベル（ｎｇ／ｍｌ、＋／−ＳＥＭ）を低下させる傾向があることを示す。
【０３１１】
この試験からの知見は、アミノ酸組成物が、好ましい安全性及び忍容性プロファイルを有し、線維症に関連するヒト身体の構造及び機能についてのバイオマーカーに影響を与えることを裏付けている。
【０３１２】
実施例８：肝星細胞のＴＧＦβ１線維形成性遺伝子発現
初代ヒト肝星細胞を、ドナーを選択するための以下の基準：成熟年齢（１８〜５０歳）、正常なＢＭＩ（＞１８．５及び＜２５）、及び肝疾患の交絡の非存在に基づいてＳａｍｓａｒａ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。１０回未満の継代で、Ｔ７５又はＴ１５０フラスコ中で、約８０％コンフルエンスになるまで完全ＨＳＣ培地中で成長された細胞を、ウェル当たり６０００個の細胞（ｃｍ２当たり約１２５０個の細胞）で、滅菌した、コラーゲンＩ被覆された９６ウェル光学的プラスチックマイクロプレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１５２０３６）中に播種し、２％のウシ胎仔血清及び１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むＤＭＥＭ中で、加湿された培養器中で、３７℃、５％のＣＯ２で一晩インキュベートした。
【０３１３】
一晩のインキュベーションの後、プレートを、培養器から取り出し、培地を徐々にピペットで取り、ウェル当たり１５０μＬのＤＰＢＳで２回洗浄した。ＤＰＢＳを除去し、前処理培地（±単一のアミノ酸ドロップアウト、１ＸＨＭＤＢ  ＤＭＥＭ＋１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、±補助的アミノ酸用量；培地の組成については実験を参照）を、ウェル当たり１５０μＬで細胞に加えた。プレートを、１０．５時間にわたって培養器に戻した。
【０３１４】
１０．５時間の前処理の後、培地を細胞から除去し、ここで３ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１を補充した同じ前処理培地を加えた。各プレートは、１×ヒト血漿中アミノ酸（ＨＭＤＢ又はＰＡＡ）濃度培地中の３ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１、１ＸＨＭＤＢ中の０ｎｇ／ｍＬ、及び対照として働く１ＸＨＭＤＢ中の３ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１＋２０μＭのＳｉｌｙｂｉｎを含有していた。次に、プレートを、３７℃、５％のＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【０３１５】
２４時間の刺激の後、上清を除去し、２つの別個のアリコートで、−８０℃で凍結させた。次に、細胞を、ウェル当たり１２５μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＦＣＷ（ＦａｓｔＬａｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＮＲ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，２１６７１３）で洗浄した。洗浄緩衝液を直ぐに除去し、５０μＬのＣｅｌｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｍｉｘ（ゲノムＤＮＡ  Ｗｉｐｅｏｕｔ緩衝液を含有する）を加えて、室温で１０分間インキュベートしながら、細胞を溶解させた。次に、ＲＮＡ溶解物を、９６ウェルｑＰＣＲプレートに移し、密閉し、ｇＤＮＡを、５分間にわたって７５℃で、サーマルサイクラーにおいて消化させた。ＲＮＡ溶解物を−８０℃で凍結させた。
【０３１６】
各２０μＬの一工程ＲＴ−ｑＰＣＲ反応は、４μＬのＲＮＡ溶解物を含有していた。Ｈｓｐ４７、及びＧａｐｄｈの遺伝子発現を、市販のプライマー−プローブ混合物（ＩＤＴ製のｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｓｐ４７  Ｐｒｉｍｅｒ−Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ，ＨＥＸ；及びｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇａｐｄｈ  Ｐｒｉｍｅｒ−Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ，ＦＡＭ）とともに、それぞれＨＥＸ、及びＦＡＭ蛍光チャネルを用いて多重化した。遺伝子発現を、それ自体の１×ＨＭＤＢ濃度に対して正規化することによって、各単一のアミノ酸ドロップアウト及び補給内でΔΔＣｑ方法を用いて評価した。
【０３１７】
結果
Ｈｓｐ４７遺伝子発現
表３５、３６、３７、３８、３９、及び４０は、３人の異なる健常なドナーからの初代ヒト肝星細胞におけるＨｓｐ４７遺伝子発現の平均倍率変化を示す。ＬＩＶＲＱＮａｃ、ＬＩＶＲＱＮａｃＧ、ＬＩＶＲＱＮａｃＳ、ＲＱＮａｃ、及びＮ−アセチルシステインは、３人全てのドナーにおいてＨｓｐ４７遺伝子発現を低下させた。ＬＩＶＲＱは、３人のドナーのうちの１人においてのみＨｓｐ４７を低下させ、ＬＩＶは、Ｈｓｐ４７遺伝子発現に対する有意な影響を与えなかった。
【０３１８】
ロイシン、イソロイシン、及びバリンは、アミノ酸が単独で投与されたとき、いずれのドナーにおいてもＨｓｐ４７遺伝子発現を有意に変化させなかった。アルギニンは、アミノ酸が単独で投与されたとき、３人のドナーのうちの２人においてＨｓｐ４７遺伝子発現を有意に増加させた。グルタミンは、単独で投与されたとき、３人のドナーのうちの１人においてＨｓｐ４７遺伝子発現を有意に増加させた。Ｎ−アセチルシステインは、３人全てのドナーにおいてＨｓｐ４７遺伝子発現を有意に低下させた。
【０３１９】
【表４８】
2021527669.tif 000049
【０３２０】
【表４９】
2021527669.tif 000050
【０３２１】
【表５０】
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【０３２２】
【表５１】
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【０３２３】
【表５２】
2021527669.tif 000053
【０３２４】
【表５３】
2021527669.tif 000054
【０３２５】
実施例９．繊維症を調べるために肝臓微小環境を再現するための三種共培養モデル
細胞播種及び維持
肝臓の３つの主要な細胞型（肝細胞、肝臓マクロファージ及び肝星細胞）を含む三種共培養モデルを構築して、繊維症に対するアミノ酸の組合せＬ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、及びＮ−アセチルシステイン（ＬＩＶＲＱＮＡＣ）の影響を評価した。
【０３２６】
９６ウェル又は１２ウェルのトランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）（ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて、健常なドナーから単離された肝細胞、マクロファージ及び肝星細胞を共培養した。Ｓａｍｓａｒａ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手し、Ｔ１５０フラスコ中で約８０％コンフルエンスになるまで完全ＨＳＣ培地中で成長された初代ヒト肝星細胞を、コラーゲンで予め被覆されたトランスウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の膜の下面に播種した。
【０３２７】
肝星細胞を播種した後、初代ヒトＰＢＭＣ由来マクロファージも、膜の下面に加えた。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ中で、両方の細胞を、１０％の熱で不活性化したＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏ）、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、及び０．２％のＰｒｉｍｏｃｉｎ（ＩｎＶｉｖｏＧｅｎ）を補充した肝細胞平板培養培地（ウイリアムＥ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で平板培養し、３７℃、５％のＣＯ２で６時間インキュベートした。
【０３２８】
６時間のインキュベーションの後、健常なヒトドナーからの初代肝細胞を、トランスウェルの上面におけるコラーゲンゲルに播種した。三種共培養を、上述される肝細胞平板培養培地中で、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートした。６時間後、細胞を１回洗浄し、肝細胞平板培養培地中で、３７℃、５％のＣＯ２で一晩インキュベートした。１日目に、細胞を１回洗浄し、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、及び１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を補充した肝細胞用規定培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で、３７℃、５％のＣＯ２で一晩インキュベートした。
【０３２９】
アミノ酸前処理
２日目に、細胞を、ＤＰＢＳ  １×（Ｇｉｂｃｏ）で２回洗浄し、
ａ．１１ｍＭのグルコース（Ｓｉｇｍａ）、０．２７２ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、１×Ｐ／Ｓ（Ｇｉｂｃｏ）を補充した、血液中の平均生理学的濃度に基づいた所定の特別なアミノ酸濃度を含有するアミノ酸不含ＷＥＭ（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）；又は
ｂ．３０倍又は４０倍の所定のアミノ酸組成物ＬＩＶＲＱＮＡＣの１つの濃度を有する、上述される同じ培地
の中で維持した。
【０３３０】
細胞を、３７℃、５％のＣＯ２で２４時間にわたって規定培地（ａ．及びｂ．）中で維持した。
【０３３１】
遊離脂肪酸及び様々なアミノ酸の組合せによる併用治療
２４時間の前処理の後、細胞を、上述される同じ培地中で維持し、１ｎｇ／ｍｌ±ＬＩＶＲＱＮＡＣのＴＮＦ−α（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を補充した２：１（オレエート：パルミテート）の比率を有する２５０ｕＭの遊離脂肪酸（ＦＦＡ）に曝した。３７℃、５％のＣＯ２での２４時間のインキュベーションの後、培地を、トランスウェルの各側から別々に取り出し、細胞を、さらに４８時間にわたって上述されるのと同じ条件でインキュベートした。
【０３３２】
ＥＬＩＳＡによる２４時間後のサイトカイン／ケモカイン及びプロコラーゲンＩα１分析
９６ウェルのトランスウェルプレートの両側からの上清を用いて、被験物質：ＩＬ６、ＩＬ８、ＭＣＰ１、ＩＰ１０、Ｇｒｏ  α及びプロコラーゲンＩα１（ファイアプレックス（ｆｉｒｅｐｌｅｘ）キット、Ａｂｃａｍ）の多重パネルを分析した。ＹＫＬ４０を、ＥＬＩＳＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ  ３−ｌｉｋｅ  １（ＹＫＬ４０）Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）によって、１２ウェルのトランスウェルプレートから収集された上清から測定した。
【０３３３】
プロコラーゲンＩα１分泌
表４１は、（ＦＦＡ  ＴＮＦα）＋ＦＦＡ＋ＴＮＦαベースラインに対して正規化された３０倍のＬＩＶＲＱＮＡＣで処理された肝星細胞によって分泌されるプロコラーゲンＩα１の倍率変化を示す。ｔ検定によって計算された統計的有意性は、ＬＩＶＲＱＮＡＣが、プロコラーゲンＩα１分泌を有意に減少させたことを示す。肝細胞側からのプロコラーゲンＩα１レベルを測定したところ、両方の処理間で差を示さなかった（表４２）。
【０３３４】
【表５４】
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【０３３５】
【表５５】
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【０３３６】
表４３及び４４は、ＦＦＡ＋ＴＮＦα＋ＦＦＡ＋ＴＮＦαベースライン（１倍のＬＩＶＲＱＮＡＣ）に対して正規化された３０倍のＬＩＶＲＱＮＡＣでそれぞれ処理されたマクロファージ及び肝星細胞又は肝細胞側のいずれかによって分泌されるサイトカイン及びケモカインの倍率変化を示す。確立された化学誘引物質特性を有し、ＮＡＳＨ患者において上方制御されることが示されたいくつかの炎症性サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１０及びＧＲＯα（ＣＸＣＬ１））及びケモカイン（ＭＣＰ１）を測定した。ｔ検定によって計算される統計的有意性は、３０倍のＬＩＶＲＱＮＡＣによる処理が、１倍の対照ＬＩＶＲＱＮＡＣと比較して、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＧＲＯα（ＣＸＣＬ１）及びＭＣＰ１レベルを有意に低下させたことを示す。ＩＬ−８レベルも、ＬＩＶＲＱＮＡＣ３０倍で処理されたときに低下されたが、ＬＩＶＲＱＮＡＣ１倍と比較して、統計的有意性を示さなかった。
【０３３７】
【表５６】
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【０３３８】
【表５７】
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【０３３９】
表４５及び４６は、１倍のＬＩＶＲＱＮＡＣに対して正規化された４０倍のＦＦＡ  ＴＮＦα＋ＬＩＶＲＱＮＡＣで処理されたマクロファージ及び肝星細胞又は肝細胞のいずれかによって分泌されるＹＫＬ−４０の倍率変化を示す。
【０３４０】
ＹＫＬ４０（キチナーゼ−３様タンパク質１［ＣＨＩ３Ｌ１］とも呼ばれる）の血漿中レベルは、ＮＡＳＨを含むいくつかの炎症性疾患において増加される。ＹＫＬ４０血漿中レベルが、線維症の進行を有するＮＡＦＬＤ患者において増加されることが示されている。ｔ検定によって計算される統計的有意性は、４０倍のＬＩＶＲＱＮＡＣが、肝細胞ＹＫＬ４０レベルを有意に低下させることを示す。マクロファージ及び肝星細胞側から測定されたＹＫＬ−４０レベルも、ＬＩＶＲＱＮＡＣ４０倍で処理されたときに低下されたが、ＬＩＶＲＱＮＡＣ１倍による処理と比較して、統計的有意性を示さなかった。
【０３４１】
【表５８】
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【０３４２】
【表５９】
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【０３４３】
実施例１０：肝星細胞のＴＧＦβ１誘導性増殖
肝星細胞の増殖は、活性化された肝星細胞の主要な表現型特徴である。初代ヒト肝星細胞を、ドナーを選択するための以下の基準：成熟年齢（１８〜５０歳）、正常なＢＭＩ（＞１８．５及び＜２５）、及び肝疾患の交絡の非存在に基づいてＳａｍｓａｒａ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。３人の異なるドナーからの細胞を、１０回未満の継代で、Ｔ７５又はＴ１５０フラスコ中で、約８０％コンフルエンスになるまで完全ＨＳＣ培地中で成長させ、ウェル当たり６０００個の細胞（ｃｍ２当たり約１２５０個の細胞）で、滅菌した、コラーゲンＩ被覆された９６ウェル光学的プラスチックマイクロプレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１５２０３６）中に播種し、２％のウシ胎仔血清及び１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むＤＭＥＭ中で、加湿された培養器中で、３７℃、５％のＣＯ２で一晩インキュベートした。
【０３４４】
一晩のインキュベーションの後、プレートを、培養器から取り出し、培地を徐々にピペットで取り、ウェル当たり１５０μＬのＤＰＢＳで２回洗浄した。ＤＰＢＳを除去し、前処理培地（１×ＨＭＤＢアミノ酸ＤＭＥＭ＋１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、±ＨＭＤＢアミノ酸濃度の倍数（Ｘ）の補助的処理用量）を、ウェル当たり１５０μＬで細胞に加えた。各処理及び用量を、プレート当たりトリプリケートのウェルで試験した。ビヒクル対照を、プレート当たり６複製ウェルで試験した。プレートを一晩インキュベートした。一晩の前処理の後、培地を細胞から除去し、３ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１を補充した同じ前処理培地を加えた。増殖を評価するために、細胞を、活性ＤＮＡ合成中にＤＮＡに組み込まれる１０μＭのＥｄＵ（５−エチニル−２’−デオキシウリジン）で標識した。次に、プレートを、３７℃、５％のＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【０３４５】
２４時間の刺激の後、上清を除去し、２つの別個のアリコートで、−８０℃で凍結させた。次に、細胞を、ＤＰＢＳで洗浄し、４％のパラホルムアルデヒド溶液で２０分間固定した。細胞を、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理し、ＥｄＵを、製造業者の使用説明書にしたがって、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（商標）ＥｄＵ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）５５５  ＨＣＳ  Ａｓｓａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて標識した。核を、細胞透過性ＤＮＡ結合色素であるＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で標識した。
【０３４６】
細胞を、１０×Ｐｌａｎ  Ａｐｏ対物レンズを用いて、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ  Ｃｏｎｆｏｃａｌハイコンテントイメージャー（ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｉｍａｇｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて撮像した。ウェルごとに１２のフレームを撮像した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）５５５で標識されたＥｄＵ  を、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄチャネル中で検出した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で標識された核を、ＤＡＰＩチャネル中で検出した。ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．２．３．７３３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、画像解析を行った。ＥｄＵ標識（ＥｄＵ＋）について陽性であった核として定義される増殖細胞の数及び総核数を、各条件について決定した。ＥｄＵ陽性細胞パーセンテージ（％ＥｄＵ＋）は、各ウェルについてＥｄＵ陽性核の数を、核の総数で除算した値として求めた。核数及び％ＥｄＵ＋細胞の倍率変化を、３ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１で刺激されるベースラインアミノ酸（１×ＨＭＤＢ）ビヒクル（ＰＢＳ）条件に対して計算した。３ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１で処理されたＰＢＳビヒクルウェルにおける各表現型の測定の平均が、ベースラインとして定義される。各ウェルにおける表現型測定が、このベースラインで除算される。１に等しいスコアは、ベースラインから変化がないことを意味する。１未満又は１を超えるスコアは、それぞれ減少又は増加を意味する。統計的分析（平均、標準偏差の計算及び両側ｔ検定）が、ｌｏｇ２変換されたスコアに対して行われる。
【０３４７】
結果
表４７は、３人の異なるドナーからの初代ヒト肝星細胞におけるＰＢＳビヒクル条件と比べた、活発に増殖しているＥｄＵ陽性細胞のパーセンテージの倍率変化のｌｏｇ２変換を示す。ＬＩＶＲＱＮＡＣは、３ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１ビヒクルと比べて、３人全てのドナーにおいて活発に増殖しているＥｄＵ陽性細胞のパーセンテージを低下させた。表４８は、３人の異なるドナーからの初代ヒト肝星細胞におけるＰＢＳビヒクル条件と比べた、核数の倍率変化のｌｏｇ２変換を示す。ＬＩＶＲＱＮＡＣは、３ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１ビヒクルと比べて試験される３人のドナーのうちの２人において最も高い２つの用量条件で核数を減少させた。
【０３４８】
【表６０】
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【０３４９】
【表６１】
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【０３５０】
本発明は、好ましい実施形態及び様々な代替的な実施形態を参照して、具体的に示され、記載されているが、形態及び詳細の様々な変更が、本発明の趣旨及び範囲を逸脱せずに行われ得ることが、関連技術の当業者によって理解されるであろう。
【０３５１】
本明細書の本文内に引用される全ての参照文献、発行特許及び特許出願は、あらゆる目的のために、全体が参照により本明細書に援用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【国際調査報告】
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