(57)【要約】本発明は、心血管イベントのリスクが増加している選択された対象を治療するための方法を特徴とし、ここで対象は、上昇した血小板FcγRIIaを有するとして選択される。2021522478.tif 000009
2021522478.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心血管イベントのリスクが増加している選択された対象を治療する方法であって、該対象に抗炎症剤を投与する工程を含み、リファレンスと比べた、該対象由来の血小板上のFcγRIIaの増加したレベルを検出することにより、該対象が選択される、前記方法。
【請求項２】
前記心血管イベントが、心筋梗塞、卒中、冠血行再建、脳血管障害、死、または別の心血管エンドポイントである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
全身性炎症を有する選択された対象を治療する方法であって、該対象に抗炎症剤を投与する工程を含み、リファレンスと比べた、該対象由来の血小板上のFcγRIIaの増加したレベルを検出することにより、該対象が選択される、前記方法。
【請求項４】
前記剤が、メトトレキサートまたはカナキヌマブである、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
心血管イベントのリスクが増加している対象を特定する方法であって、
該対象由来の血小板上のFcγRIIaのレベルを決定する工程、および
該血小板上のFcγRIIaのレベルを、リファレンス値と比較する工程であって、ここで該リファレンス値と比較して増加したレベルが、該対象の心血管イベントのリスクが増加していることを示す、工程
を含む、前記方法。
【請求項６】
前記心血管イベントが、心筋梗塞、卒中、冠血行再建、脳血管障害、死、または別の心血管エンドポイントである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
対象を全身性炎症を有すると特定する方法であって、
該対象由来の血小板上のFcγRIIaのレベルを決定する工程、および
該血小板上のFcγRIIaのレベルを、リファレンス値と比較する工程であって、ここで該リファレンス値と比較して増加したレベルが、該対象が全身性炎症を有することを示す、工程
を含む、前記方法。
【請求項８】
IL-1ベータ、TNF-アルファ、IL-6、C反応性タンパク質（CRP）、および／または血清アミロイドAのレベルについて、前記対象の生体試料の特徴を決定する工程をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記FcγRIIaのレベルが、FcγRIIa特異性試薬を用いて決定される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記FcγRIIa特異性試薬が、抗体またはその抗原結合性断片である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
前記血小板FcγRIIaのレベルが、フローサイトメトリー、イムノアッセイ、ELISA、ウエスタンブロッティング、およびラジオイムノアッセイからなる群より選択されるアッセイを用いて決定される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記FcγRIIaのレベルが、蛍光定量または比色アッセイを用いて決定される、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
前記FcγRIIaのレベルが、フローサイトメトリーを用いて決定される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記リファレンス値が、無疾患の対象由来の血小板上のFcγRIIaのレベルを表す、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
前記増加したレベルが、少なくとも約1.5倍、2倍、3倍、4倍、または5倍増加したものである、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
前記血小板FcγRIIa発現のリファレンスレベルが、約1万1000／血小板よりも少ない、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
前記血小板FcγRIIa発現のリファレンスレベルが、約7500、8000、9000、1万、または1万500コピーのFcγRIIa／血小板よりも少ない、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記血小板FcγRIIa発現の増加したレベルが、約1万1000コピーのFcγRIIa／血小板よりも多い、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
前記増加したレベルが、約1万1000〜2万コピーのFcγRIIa／血小板である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記増加したレベルが、約1万1000〜1万5000コピーのFcγRIIa／血小板である、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
前記選択された対象に抗血栓療法を施す工程をさらに含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項２２】
前記抗血栓療法が、プラスグレル、チカグレロル、クロピドグレル、およびボパクサールのうちの1つまたは複数である、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
前記選択された対象に抗凝固薬療法を施す工程をさらに含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項２４】
前記抗凝固薬が、リバーロキサバンまたはワルファリンである、請求項23記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は2018年4月20日に出願された米国特許仮出願第62/660,627号の恩典を主張するものであり、その全文が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
複数のアッセイで特定された増加した血小板反応性が、後の心血管イベントのより大きいリスクと関連付けられている。増加した血小板反応性とより大きいリスクとの一貫した関連にもかかわらず、血小板機能検査をもとに個別化された抗血小板療法により後の心血管イベントのリスクが低下することは示されていない。経皮的冠動脈インターベンション（PCI）を受けている高オントリートメント血小板反応性を有する患者をランダム化して高用量のクロピドグレルを与えても、心血管イベントの発生率は標準用量のクロピドグレルの患者と変わらなかった。その後の研究で、高オントリートメント血小板反応性を有する患者をランダム化してさらに強力な抗血小板療法を与え、血小板機能の抑制が確認されたが、高オントリートメント血小板反応性の患者における抗血小板療法の増強により、後の心血管イベントのリスクが低下することは、実証されなかった。
【０００３】
高血小板反応性の特定に用いられるアッセイには、血小板のインビトロの活性化が必要である。瀉血の方法、抗凝固薬、およびアゴニスト濃度といった調製手順が、血小板反応性の評価に影響する。そのうえ、血小板機能検査は、1日のうちでも大幅な個体内変動を示す。個体内の血小板機能の変動、そしてそれが高血小板反応性を示す患者の選別に影響し得ることが、血小板機能検査の結果に基づき個別化された抗血小板療法に関する有効性の欠如の潜在的な要因と特定されている。心血管イベントのリスクがある対象を特定するための、そして適切な療法を選択するための改良法が、至急必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
以下に記載するように、本発明は、心血管イベントのリスクを増加させる上昇した血小板FcγRIIaを有すると特定された対象を治療する方法、ならびにそのような治療を必要とする対象を特定する方法を特徴とする。
【０００５】
一局面では、本発明は、広くは、心血管イベント（たとえば心筋梗塞、卒中、冠血行再建、脳血管障害、死、または別の心血管エンドポイント）のリスクが増加している選択された対象（たとえばヒト）を治療する方法を提供し、該方法は、該対象に抗炎症剤を投与する工程を含み、該対象は、リファレンスと比べた、該対象由来の血小板上のFcγRIIaの増加したレベルを検出することにより、選択される。
【０００６】
別の局面では、本発明は、全身性炎症を有する選択された対象を治療する方法を提供し、該方法は、該対象に抗炎症剤を投与する工程を含み、該対象は、リファレンスと比べた、該対象由来の血小板上のFcγRIIaの増加したレベルを検出することにより、選択される。
【０００７】
別の局面では、本発明は、心血管イベントのリスクが増加している対象を特定する方法を提供し、該方法は、
該対象由来の血小板上のFcγRIIaのレベルを決定する工程、および
該血小板上のFcγRIIaのレベルを、リファレンス値と比較する工程であって、ここで該リファレンス値と比較して増加したレベルが、該対象の心血管イベントのリスクが増加していることを示す、工程
を含む。
【０００８】
別の局面では、本発明は、心血管イベントのリスクが増加している対象を特定する方法を提供し、該方法は、
該対象由来の血小板上のFcγRIIaのレベルを決定する工程、および
該血小板上のFcγRIIaのレベルを、リファレンス値と比較する工程であって、ここで該リファレンス値と比較して増加したレベルが、該対象の心血管イベントのリスクが増加していることを示す、工程
を含む。
【０００９】
別の局面では、本発明は、対象を全身性炎症を有すると特定する方法を提供し、該方法は、
該対象由来の血小板上のFcγRIIaのレベルを決定する工程、および
該血小板上のFcγRIIaのレベルを、リファレンス値と比較する工程であって、ここで該リファレンス値と比較して増加したレベルが、該対象が全身性炎症を有することを示す、工程
を含む。
【００１０】
上記のいずれかの局面のさまざまな態様では、方法は、IL-1ベータ、TNF-アルファ、IL-6、C反応性タンパク質（CRP）、および／または血清アミロイドAのレベルについて、対象の生体試料の特徴を決定する工程を、さらに含む。上記のいずれかの局面のさまざまな態様では、FcγRIIaのレベルは、FcγRIIa特異性試薬（たとえば、抗体またはその抗原結合性断片）を用いて決定される。他の態様では、血小板FcγRIIaのレベルは、フローサイトメトリー、イムノアッセイ、ELISA、ウエスタンブロッティング、またはラジオイムノアッセイであるアッセイを用いて決定される。他の態様では、FcγRIIaのレベルは、蛍光定量または比色アッセイを用いて決定される。他の態様では、FcγRIIaのレベルは、フローサイトメトリーを用いて決定される。他の態様では、リファレンス値は、無疾患の対象由来の血小板上のFcγRIIaのレベルを表す。他の態様では、増加したレベルは、少なくとも約1.5倍、2倍、3倍、4倍、または5倍増加したものである。他の態様では、血小板FcγRIIa発現のリファレンスレベルは、約1万1000／血小板よりも少ない。他の態様では、血小板FcγRIIa発現のリファレンスレベルは、約7500、8000、9000、1万、または1万500コピーのFcγRIIa／血小板よりも少ない。他の態様では、血小板FcγRIIa発現の増加したレベルは、約1万1000コピーのFcγRIIa／血小板よりも多い。他の態様では、増加したレベルは、約1万1000〜2万コピーのFcγRIIa／血小板である。他の態様では、増加したレベルは、約1万1000〜1万5000コピーのFcγRIIa／血小板である。上記の局面の他の態様では、方法は、選択された対象に抗血栓療法（たとえばプラスグレル、チカグレロル、クロピドグレル、およびボパクサール）を施す工程をさらに含む。上記の局面の他の態様では、方法は、選択された対象に抗凝固薬療法（たとえばリバーロキサバンまたはワルファリン）を施す工程をさらに含む。上記の局面のさまざまな態様では、心血管イベントは、心筋梗塞、卒中、冠血行再建、脳血管障害、死、または別の心血管エンドポイントである。上記の局面のさまざまな態様では、剤は、メトトレキサートまたはカナキヌマブである。上記の局面のさまざまな態様では、心血管イベントは、心筋梗塞、卒中、冠血行再建、脳血管障害、死、または別の心血管エンドポイントである。
【００１１】
本発明のその他の特徴および利点は、詳細な説明および請求項から明らかになろう。
【００１２】
定義
別途定義しない限り、本明細書におけるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解する意味をもつ。次の参照文献は、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991);およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で使用する場合、以下の用語は、別途明記しない限り、以下に記す意味をもつ。
【００１３】
「心血管イベント」とは、心血管に関連するあらゆる急性の病態を意味する。心血管イベントとしては、限定ではないが、心筋梗塞、冠血行再建、脳血管障害、および死が挙げられる。
【００１４】
「炎症」とは、炎症性サイトカインおよび／または他の炎症マーカー、たとえばIL-1ベータ、TNF-アルファ、IL-6、C反応性タンパク質（CRP）、および／または血清アミロイドAの増加に関連する状態を意味する。
【００１５】
「血小板反応性」とは、血小板の、活性化および凝固に対する感受性を意味する。
【００１６】
「FcγRIIa」とは、低親和性免疫グロブリンガンマFc領域受容体II-aを意味する。FcγRIIaの例示的なアミノ酸配列が、GenBankアクセッション番号NP_001129691.1：
2021522478.tif 000003
に提供されている。
【００１７】
FcγRIIaをコードする例示的な核酸配列が、GenBankアクセッション番号NM_001136219.1：
2021522478.tif 000004
に提供されている。
【００１８】
「FcγRIIa特異的作用物質」とは、FcγRIIaに特異的に結合するあらゆる小分子化合物、抗体、核酸分子、もしくはポリペプチド、またはその断片を意味する。
【００１９】
「プロテアーゼ活性化受容体（PAR）」とは、その細胞外ドメインの一部分の切断により活性化する、Gタンパク質共役受容体を意味する。PARは、血小板で多く発現し、トロンビン受容体PAR1、PAR3、およびPAR4が含まれる。PARは、（たとえばPAR1、3、および4を活性化させる）トロンビンなどのセリンプロテアーゼの作用により活性化する。この受容体のN末端の切断により、テザードリガンド（SFLLRN）が生じてアゴニストとして作用し、生理反応を生じさせる。トロンビンの細胞効果は、プロテアーゼ活性化受容体（PAR）により媒介される。血小板におけるトロンビンシグナリングによって、止血および血栓がもたらされる。トロンビン受容体アンタゴニストとしては、PAR1アンタゴニストであるボラパクサール（SCH530348）が挙げられる。
【００２０】
「アデノシン二リン酸（ADP）受容体」とは、ヌクレオチドのアデノシン二リン酸（ADP）に刺激されるプリン作動性Gタンパク質共役受容体を意味する。ADP受容体としては、血栓を調節するP2Y12が挙げられる。アデノシン二リン酸（ADP）受容体アンタゴニストは、アデノシン二リン酸受容体を阻害する作用物質である。P2Y12は、プラスグレル、クロピドグレル、および他のチエノピリジンなどの抗血小板薬物の標的である。
【００２１】
「クロピドグレル」とは、強力な血小板凝集阻害剤である、(+)-(S)-メチル2-(2-クロロフェニル)-2-(6,7-ジヒドロチエノ[3,2-c]ピリジン-5(4H)-イル)アセタートを意味する。
【００２２】
「プラスグレル」とは、強力な血小板凝集阻害剤である、(RS)-5-[2-シクロプロピル-1-(2-フルオロフェニル)-2-オキソエチル]-4,5,6,7-テトラヒドロチエノ[3,2-c]ピリジン-2-イルアセタートを意味する。
【００２３】
「チカグレロル」とは、強力な血小板凝集阻害剤である、(1S,2S,3R,5S)-3-[7-[(1R,2S)-2-(3,4-ジフルオロフェニル)シクロプロピルアミノ]-5-(プロピルチオ)-3H-[1,2,3]チアゾロ[4,5-d]ピリミジン-3-イル]-5-(2-ヒドロキシエトキシ)シクロペンタン-1,2-ジオールを意味する。
【００２４】
「ボラパクサール」とは、強力な血小板凝集阻害剤である、エチルN-[(3R,3aS,4S,4aR,7R,8aR,9aR)-4-[(E)-2-[5-(3-フルオロフェニル)-2-ピリジル]ビニル]-3-メチル-1-オキソ-3a,4,4a,5,6,7,8,8a,9,9a-デカヒドロ-3H-ベンゾ[f]イソベンゾフラン-7-イル]カルバマートを意味する。
【００２５】
「抗血栓療法」とは、対象の体内で血小板の凝集を阻害するために用いられるあらゆる治療を意味する。
【００２６】
「作用物質」とは、あらゆる小分子化学物質、抗体、核酸分子、もしくはポリペプチド、またはその断片を意味する。特定の態様では、作用物質は、炎症、特に心血管イベント関連の炎症を阻害する作用物質、または血小板凝集を阻害する作用物質である。一態様では、作用物質は、メトトレキサートまたはカナキヌマブである。そのような抗炎症性の作用物質は、単独で、または抗血栓療法と組み合わせて、用いることができる。
【００２７】
「寛解させる」とは、疾患の発生または進行の減少、抑制、減衰、減弱、停止、または安定化を意味する。本発明の方法を用いる治療に適した疾患としては、炎症性心血管疾患（たとえば、心筋梗塞、卒中、冠血行再建、脳血管障害、死、または他の心血管エンドポイント）が挙げられる。
【００２８】
「変化」とは、本明細書に記載される方法などの当技術分野で公知の標準的な方法により検出される、分析物（たとえばマーカー遺伝子またはポリペプチド）の発現レベルまたは活性の変化（増加または減少）を意味する。本明細書で使用する場合、変化には、発現レベルの10%の変化、好ましくは発現レベル25%の変化、より好ましくは40%の変化、最も好ましくは50%以上の変化が含まれる。
【００２９】
「分析物」とは、分析法を用いて調査される任意の物質を意味する。
【００３０】
「分析物結合性コンジュゲート」とは、調査対象の化合物に結合する検出可能な分子を意味する。
【００３１】
本開示では、「含む（comprises, comprising）」、「含有する」、および「有する」等は、米国特許法に準ずる意味を持つことができ、「含む（includes）」、「含んでいる（including）」等を意味することができ、「本質的に〜からなる」または「本質的に〜で構成される」等は、米国特許法に準ずる意味を持つことができ、かつオープンエンドであり、記載のものの基本のまたは新しい特徴が、記載以外のものの存在によって変えられない限りは、記載以外のものの存在も許容するが、先行技術の態様は含まない。
【００３２】
「対照コンジュゲート」とは、調査対象の化合物に実質的に結合しない、検出可能な分子を意味する。
【００３３】
「検出する」は、検出すべき分析物の存在、不存在、または量を特定することを指す。
【００３４】
「検出可能な標識」とは、関心対象の分子と結合すると、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的な手段により、該分子を検出可能とする組成物を意味する。たとえば、有用な標識としては、放射活性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（たとえばELISAで一般的に使用されるような酵素）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンが挙げられる。
【００３５】
「疾患」とは、細胞、組織、または器官の正常な機能を損じるか妨げる任意の状態または障害を意味する。疾患の例としては、全身性炎症または心血管炎症のほか、望ましくない血小板反応性の増加および／または虚血性イベントをもたらす血栓などの血栓の形成に関連する血栓性疾患が挙げられる。
【００３６】
「有効量」とは、疾患の症状を無治療の患者と比べて改善させるのに必要な作用物質の量を意味する。疾患治療のために本発明を実施するのに用いられる活性化合物の有効量は、投与の仕方、対象の年齢、体重、および総合的な健康状態によって変わる。最終的には、担当の医師または獣医師が適切な量および用量レジメンを決めることになる。そのような量を「有効」量と呼ぶ。一態様では、有効量は、全身性炎症を軽減し、かつ／または疾患マーカー（たとえば、IL-1、IL-6、CRPなどの炎症マーカー、またはFcγRIIaなどの心血管リスクのマーカー）のレベルを低下させる。
【００３７】
本発明は、本明細書に記述される方法により特徴決定される（たとえば望ましくない血小板反応性の増加を特徴とする）心血管疾患または障害の治療のための高特異性薬物の開発に有用ないくつかの標的を提供する。また、本発明の方法は、対象に使用しても安全な療法を特定する手軽な手段を提供する。また、本発明の方法は、疾患を治療するのみならず、化合物を事実上いくつでも、本明細書に記載される心血管疾患に対する効果について、高量の収率、高感度、および低複雑性で分析する道筋を提供する。
【００３８】
「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部分を意味する。この部分は、好ましくは、リファレンス核酸分子またはポリペプチドの全体長の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%を含有する。1断片は、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000ヌクレオチドまたはアミノ酸を含有し得る。
【００３９】
「単離（された）ポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が由来する生物の天然のゲノムにおいてその遺伝子に隣接している遺伝子を含まない、核酸（たとえばDNA）を意味する。したがってこの用語には、たとえば、ベクターに、または自己複製プラスミドもしくはウイルスに、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換えDNA、あるいは他の配列とは関係ない別個の分子として存在するもの（たとえば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化により生産されたcDNAまたはゲノムもしくはcDNA断片）が含まれる。また、この用語には、DNA分子から転写されたRNA分子、ならびに追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAも含まれる。
【００４０】
「単離（された）ポリペプチド」とは、本来それに伴う成分から分離されている、本発明のポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、本来付随するタンパク質および天然有機分子を少なくとも60重量%含まない場合、単離されている。好ましくは、調製物は、少なくとも75重量%、より好ましくは少なくとも90重量%、最も好ましくは少なくとも99重量%が本発明のポリペプチドである。単離された本発明のポリペプチドは、たとえば、天然ソースからの抽出、そのようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現、またはタンパク質の化学合成により、得ることができる。任意の適切な方法、たとえばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析により、純度を測定することができる。
【００４１】
「マーカー」とは、疾患または障害と関連付けられる発現レベルまたは活性の変化を有する任意のタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。一態様では、マーカーは、FcγRIIaのレベル、活性、リン酸化、または発現であり、こうしたマーカーの増加は、心血管イベント（たとえば心筋梗塞、卒中、冠血行再建、脳血管障害、死、または他の心血管エンドポイント）、全身性炎症、および／または増加した血小板反応性を有する傾向が増加していることと関連付けられる。他の態様では、マーカーは、炎症マーカー（たとえばIL-1ベータ、TNF-アルファ、IL-6、C反応性タンパク質（CRP）、および／または血清アミロイドA）である。
【００４２】
「（一）部分」とは、全体の一部の断片を意味する。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「作用物質を得る」のような「得る」には、その作用物質を合成すること、購入すること、またはそれ以外に入手することが含まれる。
【００４４】
「低下する」とは、あるパラメーターの少なくとも10%、25%、50%、75%、または100%の負の変化を意味する。
【００４５】
「リファレンス」とは、標準または対照条件を意味する。
【００４６】
「リファレンス配列」は、配列比較の基準として用いられる所定の配列である。リファレンス配列は、特定の配列のサブセットでも全体でもよく、たとえば全長cDNAもしくは遺伝子配列のセグメントであっても、完全cDNAもしくは遺伝子配列であってもよい。ポリペプチドの場合、リファレンスのポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約16アミノ酸、好ましくは少なくとも約20アミノ酸、より好ましくは少なくとも約25アミノ酸、さらに好ましくは約35アミノ酸、約50アミノ酸、または約100アミノ酸となる。核酸の場合、リファレンスの核酸配列の長さは、一般に、少なくとも約50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約60ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約75ヌクレオチド、さらに好ましくは約100ヌクレオチド、または約300ヌクレオチドとなるか、その周辺もしくはそれらの間の任意の整数となる。
【００４７】
「特異的に結合する」とは、試料中、たとえば本発明のポリペプチドをもともと含む生体試料中、本発明のポリペプチドを認識し結合するが、他の分子は実質的に認識も結合もしない、化合物または抗体を意味する。
【００４８】
本発明の方法に有用な核酸分子としては、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードするあらゆる核酸分子が挙げられる。そのような核酸分子は、内在性核酸配列と100%同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を示す。内在性配列に対し「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも1本の鎖とハイブリダイズすることができる。本発明の方法に有用な核酸分子としては、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードするあらゆる核酸分子が挙げられる。そのような核酸分子は、内在性核酸配列と100%同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を示す。内在性配列に対し「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも1本の鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」とは、相補的ポリヌクレオチド配列（たとえば本明細書に記載される遺伝子）またはその一部分同士が、さまざまなストリンジェンシー条件下で二本鎖分子を形成する対合を意味する（たとえばWahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507参照）。
【００４９】
たとえば、ストリンジェントな塩濃度は、普通は約750 mM NaClおよび75mM クエン酸三ナトリウムよりも低く、好ましくは約500 mM NaClおよび50 mMクエン酸三ナトリウムよりも低く、より好ましくは約250 mM NaClおよび25 mMクエン酸三ナトリウムよりも低い。低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、有機溶媒、たとえばホルムアミドの非存在下で得ることができるが、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、少なくとも約35%のホルムアミド、より好ましくは少なくとも約50%のホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、普通は少なくとも約30℃、より好ましくは少なくとも約37℃、最も好ましくは少なくとも約42℃の温度を含む。ハイブリダイゼーションの時間、洗剤、たとえばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の濃度、および担体DNAを含むか含まない、といったさらなるパラメーターを変えることは、当業者には周知である。さまざまなストリンジェンシーレベルが、こうしたさまざまな条件を必要に応じて組み合わせることにより実現する。好ましい態様では、ハイブリダイゼーションは、30℃で、750 mM NaCl、75 mMクエン酸三ナトリウム、および1% SDS中で生じる。より好ましい態様では、ハイブリダイゼーションは、37℃で、500 mM NaCl、50 mMクエン酸三ナトリウム、1% SDS、35% ホルムアミド、および100.mu.g/ml変性サケ精子DNA（ssDNA）中で生じる。最も好ましい態様では、ハイブリダイゼーションは、42℃で、250 mM NaCl、25 mMクエン酸三ナトリウム、1% SDS、50% ホルムアミド、および200 μg/ml ssDNA中で生じる。これらの条件の有用なバリエーションは、当業者には容易に明らかになる。
【００５０】
ほとんどの用途で、ハイブリダイゼーションに続く洗浄ステップも、ストリンジェンシーはさまざまである。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度および温度により定められ得る。上記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を下げることにより、または温度を上げることにより、上げることができる。たとえば、洗浄ステップのためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約30mM NaClおよび3 mMクエン酸三ナトリウムよりも低く、最も好ましくは約15 mM NaClおよび1.5 mMクエン酸三ナトリウムよりも低い。洗浄ステップのためのストリンジェントな温度条件は、普通は、少なくとも約25℃、より好ましくは少なくとも約42℃、さらに好ましくは少なくとも約68℃の温度を含む。好ましい態様では、洗浄ステップは、25℃で、30 mM NaCl、3 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中で行う。より好ましい態様では、洗浄ステップは、42℃で、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中で行う。より好ましい態様では、洗浄ステップは、68℃で、15mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中で行う。これらの条件のさらなるバリエーションは、当業者には容易に明らかになる。ハイブリダイゼーション技法は当業者には周知であり、たとえばBenton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York);およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されている。
【００５１】
「実質的に同一」とは、リファレンスのアミノ酸配列（たとえば本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか1つ）または核酸配列（たとえば本明細書に記載される核酸配列のいずれか1つ）に対し、少なくとも50%の同一性を示す、ポリペプチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、そのような配列は、比較に用いられる配列に対し、アミノ酸レベルまたは核酸レベルで、少なくとも60%、より好ましくは80%、または85%、より好ましくは90%、95%、または99%同一である。
【００５２】
配列同一性は、典型的には、配列分析ソフトウェア（たとえば53705 ウィスコンシン州マディソン ユニバーシティアベニュー, 1710, ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンターのGenetics Computer GroupのSequence Analysis Software Package、BLAST、BESTFIT、GAP、またはPILEUP/PRETTYBOXプログラム）を用いて測定する。そのようなソフトウェアは、さまざまな置換、欠失、および／または他の修飾に相同度を割り当てることにより、同一または類似の配列をマッチさせる。保存的置換には、典型的には、次の群内の置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一度を決定するための例示的なアプローチでは、BLASTプログラムを使用する場合があり、e-3〜e-100の確率スコアが、関連性の高い配列を示す。
【００５３】
「対象」とは、哺乳類を意味し、限定ではないが、ヒトまたは非ヒト哺乳類、たとえばウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、またはネコを含む。
【００５４】
本明細書に提供される範囲は、その範囲内の全値を略したものと理解される。たとえば、1〜50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50からなる群の任意の数、数の組み合わせ、または下位範囲を含むものと理解される。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「治療する」、「治療すること」、「治療」等の用語は、障害および／またはそれに関する症状の軽減または寛解を指す。なお、障害または状態を治療することは、その障害、状態、またはそれらに関する症状が完全になくなることを除くものではないが、必ずしも必要としないことを理解されたい。
【００５６】
特に断らない限り、または文脈から明白でない限り、本明細書で使用する場合、「または（もしくは）」という用語は、包括的であると理解される。特に断らない限り、または文脈から明白でない限り、本明細書で使用する場合、「ある（a）」、「ある（an）」、および「その（the）」という用語は、単数形または複数形と理解される。
【００５７】
特に断らない限り、または文脈から明白でない限り、本明細書で使用する場合、「約」という用語は、当技術分野における通常の許容範囲内と理解され、たとえば平均から2標準偏差以内である。約は、記載値の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、または0.01%以内と理解され得る。特記しないかぎり、本明細書に提供されるすべての数値は、約という用語により修飾される。
【００５８】
本明細書における変数の任意の定義における化学基の列挙の記述は、列挙した基の任意の単一基または組み合わせとしてのその変数の定義を含む。本明細書の変数または局面の態様の記述は、任意の単一の態様としての、または任意の他の態様もしくはその一部分との組み合わせとしての、該態様を含む。
【００５９】
本明細書に提供されるいずれの組成物または方法も、本明細書に提供される他の組成物および方法のいずれか1つまたは複数と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１Ａ】図1Aは、本明細書に記載される結果を表すフローチャートである。
【図１Ｂ】図1Bは、心血管イベント（心筋梗塞、冠血行再建、脳血管障害、および死）回避率のカプラン・マイヤー曲線を示す。FcγRIIaの血小板発現を、フローサイトメトリーを用いて定量化した。平均フォローアップ期間は20カ月であった（6〜29カ月の幅）。
【図２】図2は、ベースラインと6カ月との間のFcγRIIaの血小板発現の変化を示す棒グラフである。FcγRIIaの血小板発現の平均は、ベースライン時点（n=197）では1万1479／血小板であり、6カ月時点（n=114）では1万643／血小板であった。FcγRIIaの血小板発現の個別の変化を、全患者の平均に対するパーセンテージとして定量化した。相対変化の分布を示す。
【図３】図3は、ベースライン時点と6カ月時点との間のFcγRIIaの血小板発現の関係を示す散布図である。FcγRIIaの血小板発現を、フローサイトメトリーを用いて定量化した。FcγRIIaのベースラインの発現は、6カ月時点の発現を予測した（r=0.67、p<0.001）。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
発明の詳細な説明
本発明は、心血管イベント（たとえば心筋梗塞、卒中、冠血行再建、脳血管障害、死、または他の心血管エンドポイント）のリスクが増加している選択された対象の治療に有用な組成物および方法、ならびにそのような患者を選択する方法を特徴とする。特定の態様では、増加したFcγRIIaを有する対象が、強力な抗血小板剤、抗凝固薬、および抗炎症剤で治療される。
【００６２】
本発明は、増加したFcγRIIaの血小板発現が、後の心血管イベントのリスクがより大きい患者を特定するという知見、およびFcγRIIaの血小板発現が全身性炎症と増加した血小板反応性との確かな関連性を提供するという知見に、少なくとも部分的に基づく。以下でさらに詳しく報告するが、心筋梗塞（MI）後かつ退院前の患者197名が登録した。登録時および6±1カ月時点で、フローサイトメトリーを用いてFcγRIIaの血小板発現を定量化した。CV（MI、冠血行再建、脳血管障害[CVA]、および死）のほか出血も、6カ月後、1年後、および試験終了時に評価した。
【００６３】
FcγRIIaの血小板発現が1万1000／血小板を上回る患者は、増加したCV発生率を有していた（17.3%対6.5%、オッズ比[OR]3.2、95%信頼区間[CI] 1.23〜8.51、p=0.017）。CVの増加は、MI、CVA、および死のより高い発生率によりもたらされた（3.2%対12.5%、OR 4.3、95% CI 1.18〜15.6、p=0.027）。出血は、2群で同様であった。全患者をアスピリンで治療し、かつクロピドグレル（およそ64%）およびチカグレロル（およそ36%）での治療は、FcγRIIaの血小板発現が高い患者と低い患者とのバランスをとった。Cox多変量解析は、年齢、糖尿病、および過去の血行再建を共変数として含めると、FcγRIIaの血小板発現>1万1000のハザード比3.0（p=0.02）を示した。
【００６４】
したがって、本発明は、心血管イベントを有するリスクを増加させる上昇した血小板FcγRIIaを有する選択された対象を治療する方法を提供する。対象は、対象の生体試料における血小板反応性を決定することにより、治療のために選択される。具体的には、FcγRIIaの増加は、カナキヌマブまたはメトトレキサートなどの抗炎症での治療の恩恵を受け得る対象を特定するのに有用である。そのような抗炎症療法は、単独で施してもよいし、抗血小板剤、たとえばボラパクサール、クロピドグレル、プラスグレル、もしくはチカグレロル、および／または抗凝固薬、たとえばリバーロキサバンもしくはワルファリンと組み合わせて投与してもよい。
【００６５】
治療方法
本発明は、心血管イベント（たとえば、心筋梗塞、冠血行再建、脳血管障害、および死）のリスクを増加させる上昇した血小板FcγRIIaを有するとして選択された対象の治療を特徴とする。具体的には、この方法は、抗炎症剤（たとえばカナキヌマブまたはメトトレキサート）を、増加したFcγRIIaのレベルを有するとして選択された対象に投与することを提供する。FcGの血小板発現は炎症により増加するので、心血管イベントのリスクが増加している患者を特定する上昇した血小板FcγRIIaは、抗炎症療法の恩恵を受け得る患者も特定することになる。
【００６６】
FcγRIIaの測定
FcγRIIaを測定する方法は、当技術分野では公知であり、本明細書にも記載されている。一態様では、血小板FcγRIIaのレベルは、対象の試料中で測定され、該対象の心血管リスクを特徴決定するのに用いられる。任意の好適な方法を用いて、対象の生体試料中の血小板FcγRIIaを検出することができる。生体試料としては、体液（たとえば血液、血液血清、血漿、および唾液）が挙げられ、これらは血小板FcγRIIaを検出しかつ／または定量化する、ほぼあらゆる方法によって分析される。そのような方法としては、さまざまな様式のイムノアッセイ（たとえば、フローサイトメトリー、ELISA）が挙げられ、これらは固相に捕捉された分析物を検出する、普及している方法である。そのような方法は、典型的には、FcγRIIa特異性抗体の使用を含む。
【００６７】
血小板FcγRIIaのレベルは、当技術分野で周知の、フローサイトメトリー、イムノアッセイ、ELISA、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ、免疫細胞化学、磁気および／または抗体被覆ビーズとの結合、インサイチューハイブリダイゼーション、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）、フローチャンバー接着アッセイ、マイクロアレイ分析、または比色アッセイなどの手順により比較される。方法は、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)n、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF-MS）、表面エンハンス型レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（SELDI-TOF-MS）、シリコンを用いる脱離／イオン化（DIOS）、二次イオン質量分析（SIMS）、四重極飛行時間型質量分析（Q-TOF）、大気圧化学イオン化質量分析（APCI-MS）、APCI-MS/MS、APCI-(MS)n、大気圧光イオン化質量分析（APPI-MS）、APPI-MS/MS、およびAPPI-(MS)n、四重極質量分析、フーリエ変換質量分析（FTMS）、ならびにイオントラップ質量分析の1つまたは複数をさらに含む場合があり、ここでnはゼロよりも大きい整数である。
【００６８】
検出方法は、バイオチップアレイの使用を含み得る。本発明に有用なバイオチップアレイとしては、タンパク質およびポリヌクレオチドアレイが挙げられる。1つまたは複数のマーカーがバイオチップアレイ上に捕捉され、試料中のマーカーのレベルを検出する分析に供される。
【００６９】
血小板FcγRIIaは、バイオチップ、マルチウェル・マイクロタイター・プレート、樹脂、またはニトロセルロース膜などの固相に固定されたキャプチャー試薬により捕捉し、後にマーカーの存在またはレベルを調べることができる。クロマトグラフ表面または生体分子特異的表面で捕捉することができる。たとえば、血清などのマーカーを含む試料を用いて、これを十分に結合できる時間だけバイオチップの活性表面に接触させることができる。未結合の分子を、リン酸緩衝食塩水などの好適な溶離液を用いて表面から洗い流す。一般に、溶離液がよりストリンジェントであるほど、タンパク質は、洗浄後に保持されるよう、よりしっかりと結合していなければならない。
【００７０】
バイオチップ上で捕捉後、分析物を、さまざまな検出方法、たとえば気相イオン分光法、光学的方法、電気化学的方法、原子間力顕微鏡法、および無線周波数法から選択される方法により、検出することができる。一態様では、質量分析、特にSELDIが用いられる。光学的方法としては、たとえば、蛍光、発光、化学発光、吸光、反射、透過、複屈折、または屈折率の検出が挙げられる（たとえば、表面プラズモン共鳴、偏光解析、レゾナントミラー法、格子カプラウェーブガイド法、または干渉法）。光学的方法としては、顕微鏡法（共焦点および非共焦点の両方）、画像法、および非画像法が挙げられる。電気化学的方法としては、電圧測定法および電流測定法が挙げられる。無線周波数法としては多重極共鳴分光法が挙げられる。
【００７１】
質量分析（MS）は化学物質を分析する周知のツールである。したがって、一態様では本発明の方法は、マーカーを測定するために定量的MSを実施する工程を含む。方法は、自動式（Villanueva, et al., Nature Protocols (2006) 1(2):880-891）または半自動式に実施され得る。これは、たとえばMSを液体クロマトグラフィー装置（LC-MS/MSまたはLC-MS）またはガスクロマトグラフィー装置（GC-MSまたはGC-MS/MS）に機能的に連結して実現することができる。MSを実施する方法は、当分野では公知であり、たとえば米国特許出願公報第20050023454号;同第20050035286号;USP 5,800,979に、およびそれらに開示されている参照文献に、開示されている。
【００７２】
タンパク質断片は、それらがタンパク質の主鎖由来のペプチドであれ、側鎖の残基であれ、収集層で収集される。それらは次に、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（MALDI）またはエレクトロスプレーイオン化（ESI）に基づく分光法により分析され得る。好ましい手順は、飛行時間(TOF)を用いるMALDI分析であり、MALDI-TOF MSとして公知である。これには、たとえば文献に記載されているように、特定の波長を用いると入射光を強力に吸収する作用物質を用いて膜上にマトリックスを形成することが含まれる。MALDI質量分析計で、試料をUVまたはIRレーザー光で励起して気相にする。気化によってイオンが生じ、イオンプルームが形成される。イオンは電場で加速され、所与の距離を移動した時間によって分けられ、非常に正確かつ高感度の質量／電荷（m/z）リーディングを与える。MALDI分光計は、PerSeptive Biosystems, Inc.（米国マサチューセッツ州フレーミングハム（Frazingham））が市販しており、上記した、たとえばM. Kussmann and P. Roepstorffにも記載されている。
【００７３】
他の態様では、FcγRIIaのレベルは、1つまたは複数の追加のマーカー（たとえば、炎症マーカー、たとえばIL-1ベータ、TNF-アルファ、IL-6、C反応性タンパク質（CRP）、および／または血清アミロイドA）と組み合わせて検出される。個々のマーカーは有用な診断マーカーであるが、いくつかの例では、マーカーの組み合わせが、1種類のマーカーだけよりも高い的中率を提供する。試料中の複数のマーカーの検出（または場合によっては不存在）は、真陽性および真陰性の診断のパーセンテージを増加させ得、そして偽陽性または偽陰性の診断のパーセンテージを減少させ得る。したがって、本発明の方法は、2つ以上のマーカーまたは臨床パラメーターの測定を提供する。
【００７４】
複数のマーカーの使用によって、検査の的中率が増加し、かつ診断、毒物学、患者層別化、および患者のモニタリングにさらなる有用性が提供される。「パターン認識」と呼ばれる方法は、複数のマーカーにより形成されるパターンを検出する。追加のマーカーを含めることで、患者の心血管イベント（たとえば、心筋梗塞、卒中、冠血行再建、脳血管障害、死、または他の心血管エンドポイント）のリスクの決定における感度および特異性が向上し得る。臨床試料のデータの微妙なばらつきは、タンパク質レベルまたは発現（たとえばFcγRIIaレベル）の特定のパターンが、対象が心血管イベントを有するリスクを予測することを示す。FcγRIIaのレベルが上昇している患者、たとえば約1万1000コピー／血小板を上回る患者は、メトトレキサートまたはカナキヌマブ単独での、あるいはより強力な抗血小板剤、たとえばプラスグレルもしくはチカグレロル、および／または抗凝固薬（たとえばリバーロキサバン、ワルファリン）との組み合わせでの治療の恩恵を受ける。
【００７５】
FcγRIIaに特異的に結合する抗体、または当技術分野で公知の任意の他の方法を用いて、血小板FcγRIIaの発現をモニターすることができる。正常なリファレンス試料と比べた変化の検出は、全身性炎症の診断指標として用いることができる。特定の態様では、血小板FcγRIIaのレベルの2倍、3倍、4倍、5倍、または6倍の変化は、全身性炎症を示す。
【００７６】
一態様では、血小板FcγRIIaのレベルは、少なくとも2つの異なる状況で測定され、正常なリファレンスと比べた時間経過に伴うレベルの変化を、血小板反応性の、または心血管イベントを有する傾向の指標として用いる。一般に、血小板FcγRIIaのレベルは、健常な対象では低レベルで存在する（約8000コピー／血小板よりも少ないか、約1万1000コピー／血小板よりも少ない（たとえば5000、6000、7000、8000、9000、1万コピー／血小板））。一態様では、血小板当たり約1万1000コピー以上（たとえば、1万1000、1万2000、1万3000、1万4000、1万5000、1万6000、1万7000、1万8000、1万9000、または2万コピー／血小板）の、血小板FcγRIIaの上昇したレベルは、全身性炎症および／または心血管イベントのリスクを示す。別の態様では、増加したレベルは、約1万1100、1万1200、1万1300、1万1400、1万1500、1万1600、1万1700、または約1万1000〜1万5000コピー／血小板である。一態様では、FcγRIIaコピー／血小板は、FACS分析により測定される。
【００７７】
相関は、（たとえば正常な対象の、または血小板反応性が検出されない対象の）血小板FcγRIIaの対照量と比較した試料中の血小板FcγRIIaの量を考慮に入れてもよい。対照は、たとえば正常な対象の比較試料中に存在する血小板FcγRIIaの平均量または中央量であり得る。対照量は、被験量の測定と同じか実質的に同じ実験条件で測定する。その結果、対照を正常な表現型が既知のリファレンス標準として用いることができ、また、対照をやり直さずに各結果をこの標準と比べることができる。
【００７８】
したがって、対象試料からマーカープロファイルを得ることができ、そしてリファレンス集団から得られたリファレンス値と比べることができ、したがって対象がこのリファレンス集団に属するか否かを分類することが可能になる。相関は、被験試料中のマーカーの存在または不存在、および同じマーカーが対照で検出される頻度を考慮に入れてもよい。相関は、癌の状態の決定を容易にするために、これらの要因を両方とも考慮に入れてもよい。
【００７９】
特定の態様では、方法は、抗炎症療法を選択する工程をさらに含む。たとえば、リファレンスと比べて2〜5倍、5〜10倍、もしくは10〜25倍の血小板FcγRIIaレベルの増加、または約1万1000コピー／血小板を上回るレベルは、メトトレキサートまたはカナキヌマブ単独での、あるいは抗血小板剤、たとえばプラスグレルもしくはチカグレロルを用いた治療、および／または抗凝固薬、たとえばリバーロキサバンもしくはワルファリンを用いた治療との組み合わせでの治療の恩恵を受け得る患者を特定する。本発明は、治療後に再度血小板FcγRIIaが測定される方法も提供する。
【００８０】
抗体
本明細書で報告するように、FcγRIIaに特異的に結合する抗体は、診断だけでなく治療方法としても有用である。たとえば、血小板FcγRIIaアンタゴニストとして作用する抗体（たとえばIV.3 Fab）は、本発明の方法に特に有用である。特定の態様では、本発明は、抗血小板FcγRIIa抗体を血小板反応性の阻害に用いる方法を提供する。IV.3は、モノクローナル抗FcγRIIa抗体であり、血小板活性化中に血小板FcγRIIaのリン酸化を阻害する。
【００８１】
本発明に有用な他の抗体は、血小板FcγRIIaシグナリングを減衰させるものである。抗体を調製する方法は、免疫化学の当業者には周知である。本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、インタクトな抗体分子だけでなく、免疫原結合能を保持している抗体分子の断片も意味する。そのような断片も当技術分野で周知であり、インビトロでもインビボでも常用されている。したがって、本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、インタクトな免疫グロブリン分子だけでなく、周知の活性断片、F(ab')2およびFabも意味する。インタクトな抗体のFc断片をもたないF(ab')2およびFab断片は、血行からより早く排出され、かつインタクトな抗体よりも非特異的組織結合が少なくなり得る（Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)）。本発明の抗体は、全ネイティブ抗体、二特異性抗体；キメラ抗体；Fab、Fab’、単鎖V領域断片（scFv）、融合ポリペプチド、および非従来型抗体を含む。
【００８２】
非従来型抗体としては、限定ではないが、ナノボディ、直鎖状抗体（Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062,1995）、単ドメイン抗体、単鎖抗体、および多価を有する抗体（たとえばジアボディ、トリボディ、テトラボディ、およびペンタボディ）が挙げられる。ナノボディは、自然に存在する重鎖抗体の最小断片であり、軽鎖の非存在下で完全に機能すべく進化している。ナノボディは従来型抗体の親和性および特異性をもつが、大きさは単鎖Fv断片の半分しかない。この独特な構造のおかげで、そしてその極度の安定性およびヒト抗体フレームワークとの高相同度と相まって、ナノボディは、従来型抗体ではアクセスできない治療標的に結合することができる。多価の組換え抗体断片は、癌細胞に対する高結合アビディティーおよび独特な標的特異性を提供する。およそ60〜100 kDaの大きさの小分子はより速い血液クリアランスおよび高速の組織吸収を提供するため、これらのマルチマーscFv（たとえばジアボディ、テトラボディ）は親抗体の改善をもたらす。Power et al., （Generation of recombinant multimeric antibody fragments for tumor diagnosis and therapy. Methods Mol Biol, 207, 335-50, 2003）;およびWu et al. （Anti-carcinoembryonic antigen (CEA) diabody for rapid tumor targeting and imaging. Tumor Targeting, 4, 47-58, 1999）を参照されたい。
【００８３】
非従来型抗体を作る、そして使用するさまざまな技法が記載されている。ロイシンジッパーを用いて生産される二特異性抗体がKostelny et al. （J. Immunol. 148(5):1547-1553, 1992）に記載されている。ジアボディ技術は、Hollinger et al. （Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993）に記載されている。単鎖Fv（sFv）ダイマー（diners）を使用して二特異性抗体断片を作る別のストラテジーがGruber et al. （J. Immunol. 152:5368, 1994）に記載されている。三特異性抗体がTutt et al. （J. Immunol. 147:60, 1991）に記載されている。単鎖Fvポリペプチド抗体は、Huston, et al. （Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988）に記載されるように、共有結合したVH::VLヘテロダイマーを含み、これは直接結合しているかペプチドをコードするリンカーにより結合しているVHコード配列とVLコード配列とを含む核酸から発現し得る。米国特許第5,091,513号、同第5,132,405号、および同第4,956,778号;ならびに米国特許公開公報第20050196754号および同第20050196754号も参照されたい。
【００８４】
一態様では、血小板FcγRIIaに結合する抗体はモノクローナルである。あるいは、抗血小板FcγRIIa抗体は、ポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体の調製および使用も、当業者には公知である。本発明はハイブリッド抗体も包含しており、この抗体は、重鎖と軽鎖の1対が第1の抗体から得られ、もう1対の重鎖と軽鎖が別の第2の抗体から得られる。そのようなハイブリッドは、ヒト化重鎖および軽鎖を用いて形成することもできる。そのような抗体はしばしば「キメラ」抗体と呼ばれる。
【００８５】
一般に、インタクトな抗体は「Fc」領域および「Fab」領域を含むと言われる。Fc領域は、補体活性化に関与し、抗原結合には関与しない。Fc’領域が酵素切断されているか、Fc’領域なしで生産されている抗体は、「F(ab’)2」断片と呼ばれ、インタクトな抗体の両方の抗原結合部位を保持している。同様に、Fc領域が酵素切断されているか、Fc領域なしで生産されている抗体は、「Fab'」断片と呼ばれ、インタクトな抗体の一方の抗原結合部位を保持している。Fab断片は、共有結合した抗体軽鎖と抗体重鎖の一部分とからなり、「Fd」と呼ばれる。Fd断片は抗体特異性の主要な決定因子である（1つのFd断片は、抗体特異性を変えることなく、最大10の軽鎖と結合し得る）。単離されたFd断片は、免疫原性エピトープに特異的に結合する能力を保持している。
【００８６】
抗体は、可溶性ポリペプチドまたはその免疫原性断片を免疫原として用いて、当技術分野で公知の任意の方法で作ることができる。抗体を得る一つの方法は、好適な宿主動物を免疫原で免疫化し、そしてポリクローナルまたはモノクローナル抗体生産の標準的な手順を踏むことである。免疫原は、細胞表面の免疫原の呈示を促す。好適な宿主の免疫化は、いくつかの方法で実行することができる。ヒトFcγRIIaまたはその免疫原性断片をコードする核酸配列を送達ビヒクルに入れて宿主に与えることができ、それが宿主の免疫細胞に吸収される。すると細胞はヒトFcγRIIaを発現し、それによって免疫原性反応が宿主内で生じる。あるいは、ヒトFcγRIIaまたはその免疫原性断片をコードする核酸配列を、インビトロで細胞内で発現させることもでき、次いでヒトFcγRIIaを単離し、FcγRIIaを好適な宿主に投与して、宿主内で抗体を生じさせる。
【００８７】
あるいは、血小板FcγRIIaに対する抗体は、所望であれば、抗体ファージディスプレイ・ライブラリーに由来してもよい。バクテリオファージは、細菌内で感染し繁殖する能力があり、ヒト抗体遺伝子と組み合わせると、ヒト抗体タンパク質を提示するよう改変することができる。ファージディスプレイは、ファージの表面にヒト抗体タンパク質を「提示」させるプロセスである。ヒト抗体遺伝子ライブラリー由来の遺伝子を、ファージ集団に挿入する。各ファージは異なる抗体の遺伝子を担持するので、その表面に異なる抗体を提示する。
【００８８】
当技術分野で公知の任意の方法で作った抗体を、次に、宿主から精製することができる。抗体精製法としては、塩沈殿（たとえば硫酸アンモニウムを用いる）、イオン交換クロマトグラフィー（たとえば、陽イオンまたは陰イオン交換カラムを好ましくは中性pHで運転し、イオン強度を上昇させるステップグラジエントで溶離）、ゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル濾過HPLCを含む）、およびプロテインA、プロテインG、ヒドロキシアパタイト、および抗免疫グロブリンなどの親和性樹脂のクロマトグラフィーを挙げることができる。
【００８９】
抗体は、該抗体を発現するように改変されたハイブリドーマ細胞から便利に生産することができる。ハイブリドーマを作る方法は、当技術分野で周知である。ハイブリドーマ細胞を好適な培地で培養し、使った培地を抗体源として用いることができる。すると抗体を産生するハイブリドーマから関心対象の抗体をコードするポリヌクレオチドを得ることができ、次にこれらのDNA配列から合成または組み換えにより抗体を生産することができる。大量の抗体を作る場合、一般には、腹水を得るほうが便利である。腹水を作る方法は一般に、ハイブリドーマ細胞を、免疫学的にナイーブな組織適合性または免疫寛容性哺乳類、特にマウスに注入することを含む。哺乳類に好適な組成物（たとえばプリスタン）を前もって投与することにより、腹水生産を刺激してもよい。
【００９０】
本発明の方法により生産されたモノクローナル抗体（Mab）は、当技術分野で公知の方法により「ヒト化」されている場合がある。「ヒト化」抗体は、配列の少なくとも一部をその当初の形態から変化させて、よりヒト免疫グロブリンらしくした抗体である。抗体をヒト化する技法は、非ヒト動物（たとえばマウス）抗体を作る場合に特に有用である。マウス抗体をヒト化する方法は、米国特許第4,816,567号、同第5,530,101号、同第5,225,539号、同第5,585,089号、同第5,693,762号、および同第5,859,205号に提供されている。
【００９１】
キット
本発明は、心筋梗塞、卒中、冠血行再建、脳血管障害、死、もしくは他の心血管エンドポイントなどの心血管疾患、障害、またはその症状のリスクが増加している、上昇した血小板FcγRIIaを有する選択された患者の治療または予防のためのキットも提供する。一態様では、キットは、単位剤形のメトトレキサートまたはカナキヌマブなどの有効量の化合物を、心血管疾患または障害、たとえば心筋梗塞、卒中、冠血行再建、脳血管障害、死、もしくは他の心血管エンドポイント、またはその症状に苦しんでいるか、その素因のある対象を選択するための説明書とともに含む。そのような対象は、FcγRIIaの増加したレベルを決定することにより、治療のために選択される。任意で、そのようなキットは、ボラパクサール、クロピドグレル、プラスグレル、またはチカグレロルを含む。任意で、そのようなキットは、リバーロキサバンまたはワルファリンも含む。他の態様では、キットは、化合物を収容する滅菌容器を含み、そのような容器は、箱、アンプル、瓶、バイアル、チューブ、袋、パウチ、ブリスター包装、または当技術分野で公知の他の好適な容器の形態であり得る。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属フォイル、または医薬の収容に好適な他の材料で作ることができる。説明書は一般に、心血管イベントを有するかそのリスクを有する選択された患者の治療のためのメトトレキサートまたはカナキヌマブの使用に関する情報を含む。他の態様では、説明書は、化合物の説明；心血管性のものを含む疾患もしくは障害またはその症状の治療のための投与計画および投与；注意；警告；適応；禁忌；過量情報；有害反応；動物薬理；臨床試験；ならびに／あるいは参照の少なくとも1つを含む。説明書は、（あれば）容器に直接印字しても標識として容器に取り付けてもよく、あるいは容器の中にまたは容器と一緒に別の紙、パンフレット、カード、またはフォルダーとして供給してもよい。
【００９２】
本発明の実施では、特に断らない限り、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技法を使い、それらは当業者には周知である。そのような技法は、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition (Sambrook, 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (Gait, 1984); “Animal Cell Culture” (Freshney, 1987); “Methods in Enzymology” “Handbook of Experimental Immunology” (Weir, 1996); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (Miller and Calos, 1987); “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel, 1987); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis, 1994); “Current Protocols in Immunology” (Coligan, 1991)などの文献に十分説明されている。こうした技法は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産に応用でき、したがって本発明の実践および実施で検討され得る。特定の態様に特に有用な技法については、次のセクションで論じる。
【００９３】
以下の実施例は、当業者に、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療方法をいかにして実践し使用するかの完全な開示および説明を提供することを目的とするものであって、本発明者らが考える本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００９４】
実施例1：FcγRIIaおよび臨床イベント
若い健康な人のFcγRIIaの血小板発現は、<8000／血小板であり、粥状動脈硬化患者の血小板発現は、>8000／血小板であることが見出された。この試験に登録した患者では、FcγRIIaの血小板発現の平均（±SD）は、ベースラインで1万1479±2405（中央値1万1211）であった。血小板当たり1万1000を上回るFcγRIIaの血小板発現によって、後の心血管イベントのリスクが増加している患者が判別されると予想した。異なる閾値の虚血性イベントのオッズ比を決定した（表1）。
【００９５】
（表１）FcγRIIaの血小板発現に基づく心血管イベント（心筋梗塞、脳血管障害、血行再建、および死）発生のオッズ比
2021522478.tif 000005
【００９６】
評価した閾値それぞれのオッズ比は似ていた。しかし、この分析によって、1万1000が、FcγRIIaの血小板発現に基づき心血管イベントの高リスクおよび低リスクの患者を最も特定する閾値であることが確認された。
【００９７】
FcγRIIaの血小板発現が1万1000を上回る患者の心血管イベントのリスクがより大きいことは、6カ月後に明らかになった（図1）。心血管による死の発生率の差は、死、MI、およびCVA（表2）のより高い発生率によりもたらされ、血行再建は2群で同程度であった。出血の発生率は低く、2群で同程度であった（表2）。
【００９８】
（表２）FcγRIIaが1万1000を上回る患者の臨床イベント
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CVA=脳血管障害、MI=心筋梗塞、Revasc=血行再建、BARC=Bleeding Academic Research Consortium
【００９９】
実施例2：臨床特徴
FcγRIIaの血小板発現が1万1000／血小板を上回る患者は、年配者で、糖尿病および過去の血行再建を有する傾向が高かった（表3）。
【０１００】
（表３）患者の特徴
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MI=心筋梗塞、STEMI=ST上昇型心筋梗塞、NSTEMI=非ST上昇型心筋梗塞、LVEF=左室駆出率、HTN=高血圧、DM=糖尿病、CABG=冠動脈バイパス術、PCI=経皮的冠動脈インターベンション、PAD=抹消動脈疾患、CVA=脳血管障害、GFR=糸球体濾過率、ESRD=末期腎疾患、COPD=慢性閉塞性肺疾患、ASA=アスピリン、CCB=カルシウムチャネルブロッカー、ACEI=アンギオテンシン変換酵素阻害剤、ARB=アンギオテンシン受容体ブロッカー
【０１０１】
Cox回帰分析を実施して、これらの潜在的交絡変数の影響を評価した（表4）。
【０１０２】
（表４）Cox回帰分析
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CI-信頼区間、plt=血小板、DM=真性糖尿病、revasc=血行再建
【０１０３】
1万1000を上回るFcγRIIaの血小板発現は、なおも有意であり（ハザード比3.0、p=0.02）、年齢、糖尿病、および過去の血行再建について調節した後も、心血管イベントのより大きいリスクと関連があった。全患者をアスピリンで治療し、かつおよそ36%をチカグレロルで治療した。クロピドグレルおよびチカグレロルでの治療は、2群で同様であった。利尿剤での治療はまれであったが（全患者の11%）、FcγRIIaが1万1000／血小板を上回る患者でより多かった。
【０１０４】
実施例3：FcγRIIaの血小板発現の変化
114名の患者の第2の血液試料を得てFcγRIIaの血小板発現を定量化した。特に意外ではないが、FcγRIIaの血小板発現は、数名の患者で時間とともに変化した（図2）。大半の患者（71%）で変化は小さかった（平均発現の20%未満)。ベースライン時点のFcγRIIaの血小板発現は、6カ月時点の発現の強力な予測因子であった（図3）。
【０１０５】
FcγRIIaは、血小板の活性化を増幅させる。この所見と一致して、FcγRIIaの血小板発現が高いときは、複数のアゴニストに応答して血小板がより活性化することが見出された。本試験では、FcγRIIaの血小板発現が高いこと（>1万1000／血小板）は、後の心血管イベントのより大きいリスク（オッズ比3.2）と関連付けられた。Wismanらがメタ分析を実施し、高血小板反応性の臨床的意味について評価したところ、血小板反応性を変え得る血小板の調製に関連する問題を防ぐオッズ比2.09が見出された（Schneider et al., Circulation 1997;96:2877-83 -7, Madsen et al., Am J Cardiol 2007;100:722-7, Lippi et al., Blood Coagul Fibrinolysis 2013;24:666-9）。さらに、血小板FcγRIIaは活性化を増幅させるので（Boylan et al., Blood 2008;112:2780-6, Lova et al. J Biol Chem 2002;277:12009-15）、より高いFcγRIIa発現は、多様なアゴニストに応答してのさらなる活性化を反映すると考えられ、血小板反応性の評価に用いるべき適切なアゴニストおよび濃度に関する懸念が払拭される。さらに、FcγRIIaの発現は、現在利用可能な抗血小板剤に直接影響を受けるとは考えられず、したがって治療に左右されず高血小板反応性および後の心血管イベントのより大きいリスクを反映することが期待できる。この所見と一致して、FcγRIIaの血小板発現は現治療の妥当性を評価するものではなく、治療効果の実証が必要であれば血小板機能試験と一緒に実施する必要がある。
【０１０６】
FcγRIIaの血小板発現は、インターフェロンγにより増加する巨核球の産生を反映している。したがって、FcγRIIaの血小板発現は、全身性炎症を反映して変化すると考えられよう。この試験ではFcγRIIaの血小板発現の変化が予測され、見届けられたが、そうした変化が明らかになるには数週間から数カ月かかるであろう。現在利用できる血小板反応性の測定法は、一個体内で1日のうちでも大幅に変化する血小板機能の、高感度マーカーである。したがって、現在利用可能なアッセイを用いた血小板反応性の測定は、ランダムグルコース測定に類似のものである。FcγRIIaの血小板発現は、HbA1Cに類似し得、より長時間にわたる血小板反応性を反映する。どちらの測定法も有用であるが、FcγRIIaの血小板発現のほうが、長期治療を導くのに有用であり得る。
【０１０７】
より高いFcγRIIaの血小板発現は、年配者、ならびに糖尿病および過去の血行再建の患者で観測された。これらの観測は、過去の報告と一致する。粥状動脈硬化の拡大と増加したFcγRIIaの血小板発現との関連は、粥状動脈硬化に関連したインターフェロンγのより高い発現、およびインターフェロンγに誘導される巨核球のFcγRIIa産生の増大と一致する。同様に、糖尿病はFcγRIIaのより高い発現と関連がある。したがって、FcγRIIaの血小板発現は、全身性炎症と増加した血小板反応性との確かな関連性を提供する。
【０１０８】
要約すると、増加したFcγRIIaの血小板発現は、後の心血管イベントのリスクがより大きい患者を特定した。FcγRIIaは、血小板反応性を増大させるので（Boylan et al., Blood 2008;112:2780-6, Lova et al. J Biol Chem 2002;277:12009-15）、増加した心血管イベントのリスクを特定できる、増加した血小板反応性の新しいマーカーである。血行再建の発生率は、FcγRIIaの血小板発現が高い患者も低い患者も同様であったこと、また、心血管イベントの差は、心筋梗塞、脳血管障害、および死（表2）のより高い発生率によりもたらされたことは、特筆に値する。
【０１０９】
実施例4：FcγRIIaなどの血小板表面タンパク質の評価は、アッセイを簡略化する利点を有する
現在利用できる血小板反応性の測定法は、一個体内で1日のうちでも大幅に変化する血小板機能の、高感度マーカーである。したがって、現在利用可能なアッセイを用いた血小板反応性の測定は、ランダムグルコース測定に類似のものである。FcγRIIaの血小板発現は、HbA1Cに類似し得、より長時間にわたる血小板反応性を反映する。どちらの測定法も有用であるが、FcγRIIaの血小板発現のほうが、長期治療を導くのに有用であり得る。
【０１１０】
より高いFcγRIIaの血小板発現は、年配者、ならびに糖尿病および過去の血行再建の患者で観測された。粥状動脈硬化の拡大と増加したFcγRIIaの血小板発現との関連は、粥状動脈硬化に関連したインターフェロンγのより高い発現、およびインターフェロンγに誘導される巨核球のFcγRIIa産生の増大と一致する。同様に、糖尿病はFcγRIIaのより高い発現と関連がある（Williams et al., Curr Diab Rep 2007;7:242-248）。したがって、FcγRIIaの血小板発現は、全身性炎症と増加した血小板反応性との確かな関連性を提供する。
【０１１１】
要約すると、増加したFcγRIIaの血小板発現は、後の心血管イベントのリスクがより大きい患者を特定することが見いだされた。FcγRIIaは、血小板反応性を増大させるので（Boylan et al., Blood 2008;112:2780-6, Lova et al. J Biol Chem 2002;277:12009-15）、増加した心血管イベントのリスクを特定できる、増加した血小板反応性の新しいマーカーとなる。血行再建の発生率は、FcγRIIaの血小板発現が高い患者も低い患者も同様であったこと、また、心血管イベントの差は、MI、CVA、および死（表2）のより高い発生率によりもたらされたことは、特筆に値する。FcγRIIaなどの血小板表面タンパク質の評価は、アッセイ条件を簡略化する利点を有し、現在の機能的アッセイを潜在的に複雑化する、かつ抗血小板治療に鈍感な、アーチファクトの（artefactual）血小板活性化を排除する。FcγRIIaの血小板発現は、時間経過に伴い増加する血小板反応性のより一貫性のあるマーカーとなり得るので、個別化された抗血小板療法を導くのに有用であり得る。したがって、FcγRIIaの血小板発現が抗血小板療法を導くのに使用できるかどうかを決定する追加の試験が待たれる。
【０１１２】
上述した結果は、以下の方法および材料を用いて得られた。
【０１１３】
患者
患者は全員、バーモント大学臨床試験審査委員会に承認されたプロトコルに参加する旨、書面のインフォームド・コンセントを提出した。選択基準は、臨床症状と関連する0.034 ng/mlを上回るトロポニンIの上昇により実証されるMIの診断、および診断用血管造影または灌流撮像での冠動脈疾患の実証であった。ST上昇MI（STEMI）および非ST上昇MI（NSTEMI）の両方を含めた。除外基準には、癌の有効診断、感染症または全身性炎症状態、ならびに抗凝固薬での長期治療予定が含まれた。
【０１１４】
プロトコル
患者には、MIによる入院の退院当日に登録してもらった。臨床特徴を記録し、また、血液試料を採取してFcγRIIaの血小板発現を判定した。6±1カ月後、1年後、および本試験終了時に患者と接触し、試験エンドポイントについて質問した（その後の入院記録の閲覧も含む）。6±1カ月時点で、患者に第2の血液試料を採取させてもらった（遠方の患者数名には、2度目の来院を断られた）。患者の治療がこの試験への参加により変わることはなかった。21ゲージの翼状針で瀉血を実施し、圧迫帯を90秒未満使用し、最初の血液3 mlを廃棄した。血液をクエン酸三ナトリウム（3.2%、1:10 v/v）で抗凝固処置した。
【０１１５】
臨床エンドポイント
心血管エンドポイントは、MI、CVA、冠血行再建、および死（出血とは関係ない）を含んだ。MIは、臨床症状と、0.034 ng/mlを上回るトロポニンIの上昇とを組み合わせて診断した。CVAは、一過性または長期の症状と、血管閉塞のエビデンスの撮像および／または脳撮像での虚血性傷害の臨床所見（頭蓋内出血は出血イベントとみなした）との組み合わせにより診断した。冠血行再建には、PCIおよび冠動脈バイパス術（CABG）が含まれる。患者に、医学的対応を要する出血エピソードについて質問した。出血の重症度をBleeding Academic Research Consortium（BARC）基準（17）にしたがい定量化した。すべての臨床エンドポイントを、指名に応じてくれた2名の医師に別々に見てもらった。医師らは、臨床イベントを裁定する間、FcγRIIaの血小板発現について盲検とした。
【０１１６】
FcγRIIaの血小板発現
FcγRIIaの血小板発現を、フローサイトメトリーを用いて定量化した。全血を、フィコエリスリン（phycoerythin）標識化抗CD32を含有するHEPES-Tyrodeバッファー（Becton Dickinson Biosciences）に添加した。血小板を固定し、Optilyse-C（Beckman Coulter）を用いて赤血球を溶解させた。試料をHEPES-Tyrodeバッファーで希釈して、個々の血小板上のFcγRIIaの表面発現を評価できるようにした。フローサイトメトリー分析を、Beckman Coulter Epics Elite装置（フロリダ州マイアミ）を用いて実施した。血小板はサイズに基づき特定した（前方および側方散乱）。定量化を可能にするための較正を、Quantum Simply Cellular抗マウスビーズ（インディアナ州フィッシャーズのBangs Laboratories）を用いて行った。FcγRIIaの血小板発現を、Bangs laboratoriesのQuickCalソフトウェアを用いて定量化した。
【０１１７】
統計学的分析
虚血性エンドポイントの総イベント率をおよそ10%と予測した。この試験は、FcγRIIaの血小板発現が高い患者を低い患者と比較して虚血性イベント発生率の2倍の差を識別するように設計された。200名の患者の登録により、α<0.05、95%の検定力が提供されると推定した。200名の患者が登録したが、3名をフォローアップできず、参加者は197名となった。
【０１１８】
全測定について記述統計をとった。FcγRIIaの高いおよび低い血小板発現の比較は2x2コンティンジェンシー表法を用いて行い、そして二項対立測定にフィッシャーの正確確率検定を、2x2コンティンジェンシー表に尤度比法を、および連続測定に2標本t検定を用いた。臨床アウトカムの発生率の比較を、ロジスティック回帰法を用いて調べた。Cox回帰分析を用いて潜在的に交絡する測定値を調節した。有意性はp<0.05とした。
【０１１９】
他の態様
以上の記載から、本明細書に記載される発明に変形および変更を加えて、さまざまな用途および条件に採用できることが明白になろう。そのような態様も以下の請求項の範囲内である。
【０１２０】
本明細書における変数の任意の定義における要素の列挙の記述は、列挙した要素の任意の単一要素または組み合わせ（または下位組み合わせ）としてのその変数の定義を含む。本明細書におけるある態様の記述は、任意の単一の態様としての、または任意の他の態様もしくはその一部分との組み合わせとしての、該態様を含む。
【０１２１】
本明細書で言及したすべての特許および公報は、あたかもそれぞれの独立した特許および公報が具体的かつ個別に参照により組み入れられると記されたかのように、参照により本明細書に組み入れられる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年1月5日(2021.1.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021522478000001.app
【国際調査報告】
2021522478.tif 000014
2021522478.tif 000015