(57)【要約】キヌレニナーゼ活性を有するタンパク質の使用に関係する方法及び組成物を記載する。例えば、ある態様において、キヌレニンを分解することが可能な修飾キヌレニナーゼを開示することができる。更に、本発明のある態様においては、開示されるタンパク質又は核酸を使用した、キヌレニン枯渇による癌の治療のための組成物及び方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された修飾ヒトキヌレニナーゼ酵素であって、配列番号：１のヒトキヌレニナーゼ酵素に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、かつＬ８Ｐ、Ｋ３８Ｅ、Ｙ４７Ｌ、Ｉ４８Ｆ、Ｋ５０Ｑ、Ｉ５１Ｍ、Ｓ６０Ｎ、Ｋ６４Ｎ、Ｄ６５Ｇ、Ｅ６６Ｋ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ６７Ｐ、Ｄ６７Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｔ、Ａ６８Ｖ、Ｆ７１Ｌ、Ｆ７１Ｍ、Ｌ７２Ｎ、Ｋ８４Ｅ、Ｅ８８Ｎ、Ｅ８９Ｋ、Ｅ８９Ｓ、Ｅ９０Ｑ、Ｄ９２Ｅ、Ｋ９３Ｎ、Ｋ９３Ｔ、Ａ９５Ｈ、Ａ９５Ｑ、Ｋ９６Ｎ、Ｉ９７Ｈ、Ｉ９７Ｌ、Ｉ９７Ｖ、Ａ９８Ｇ、Ａ９９Ｇ、Ａ９９Ｉ、Ａ９９Ｒ、Ａ９９Ｓ、Ａ９９Ｔ、Ａ９９Ｖ、Ｙ１００Ｎ、Ｙ１００Ｓ、Ｙ１００Ｔ、Ｇ１０１Ａ、Ｈ１０２Ｗ、Ｅ１０３Ｆ、Ｅ１０３Ｈ、Ｅ１０３Ｎ、Ｅ１０３Ｑ、Ｅ１０３Ｒ、Ｅ１０３Ｖ、Ｅ１０３Ｗ、Ｖ１０４Ｄ、Ｖ１０４Ｅ、Ｖ１０４Ｆ、Ｖ１０４Ｈ、Ｖ１０４Ｋ、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｒ、Ｇ１０５Ａ、Ｇ１０５Ｈ、Ｇ１０５Ｓ、Ｇ１０５Ｔ、Ｅ１０６Ｄ、Ｋ１０６Ｄ、Ｋ１０６Ｅ、Ｋ１０６Ｈ、Ｋ１０６Ｎ、Ｒ１０７Ｐ、Ｒ１０７Ｓ、Ｐ１０８Ｒ、Ｉ１１０Ａ、Ｉ１１０Ｆ、Ｉ１１０Ｌ、Ｉ１１０Ｍ、Ｉ１１０Ｔ、Ｔ１１１Ｄ、Ｔ１１１Ｈ、Ｔ１１１Ｎ、Ｔ１１１Ｒ、Ｇ１１２Ａ、Ｇ１１２Ｃ、Ｇ１１２Ｄ、Ｇ１１２Ｋ、Ｇ１１２Ｌ、Ｇ１１２Ｍ、Ｇ１１２Ｑ、Ｇ１１２Ｒ、Ｇ１１２Ｓ、Ｇ１１２Ｔ、Ｇ１１２Ｙ、Ｎ１２７Ｋ、Ｉ１３１Ｖ、Ａ１３２Ｖ、Ｌ１３３Ｖ、Ａ１３６Ｔ、Ｌ１３７Ｔ、Ｔ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｈ１４２Ｑ、Ｑ１４Ｒ、Ｙ１５６Ｈ、Ｋ１６３Ｔ、Ｄ１６８Ｅ、Ｈ１６９Ｒ、Ｑ１７５Ｌ、Ｉ１８３Ｆ、Ｉ１８３Ｌ、Ｉ１８３Ｐ、Ｉ１８３Ｓ、Ｅ１８４Ａ、Ｅ１８４Ｄ、Ｅ１８４Ｒ、Ｅ１８４Ｔ、Ｅ１８４Ｖ、Ｅ１８５Ｔ、Ｍ１８７Ｌ、Ｍ１８９Ｉ、Ｋ１９１Ａ、Ｋ１９１Ｇ、Ｋ１９１Ｈ、Ｋ１９１Ｍ、Ｋ１９１Ｎ、Ｋ１９１Ｒ、Ｋ１９１Ｓ、Ｋ１９１Ｔ、Ｋ１９１Ｗ、Ｅ１９７Ａ、Ｅ１９７Ｄ、Ｅ１９７Ｆ、Ｅ１９７Ｋ、Ｅ１９７Ｍ、Ｅ１９７Ｑ、Ｅ１９７Ｓ、Ｅ１９７Ｔ、Ｅ１９７Ｖ、Ｉ２０１Ｃ、Ｉ２０１Ｅ、Ｉ２０１Ｆ、Ｉ２０１Ｈ、Ｉ２０１Ｌ、Ｉ２０１Ｓ、Ｉ２０１Ｔ、Ｉ２０１Ｖ、Ｈ２０３Ｋ、Ｌ２１９Ｍ、Ｌ２１９Ｗ、Ｆ２２０Ｌ、Ｖ２２３Ｉ、Ｆ２２５Ｙ、Ｈ２３０Ｆ、Ｈ２３０Ｌ、Ｈ２３０Ｙ、Ｎ２３２Ｓ、Ｙ２４６Ｆ、Ｆ２４９Ｗ、Ｄ２５０Ｅ、Ｓ２７４Ａ、Ｓ２７４Ｃ、Ｓ２７４Ｇ、Ｓ２７４Ｎ、Ｓ２７４Ｔ、Ｌ２７８Ｍ、Ａ２８０Ｇ、Ａ２８０Ｓ、Ａ２８０Ｔ、Ｇ２８１Ｓ、Ａ２８２Ｍ、Ａ２８２Ｐ、Ｇ２８４Ｎ、Ｉ２８５Ｌ、Ｖ３０３Ｌ、Ｖ３０３Ｓ、Ｆ３０６Ｗ、Ｆ３０６Ｙ、Ｓ３１１Ｎ、Ｋ３１５Ｅ、Ｄ３１７Ｅ、Ｄ３１７Ｋ、Ｉ３３１Ｃ、Ｉ３３１Ｌ、Ｉ３３１Ｎ、Ｉ３３１Ｓ、Ｉ３３１Ｔ、Ｉ３３１Ｖ、Ｎ３３３Ｔ、Ｐ３３４Ｎ、Ｐ３３５Ｔ、Ｌ３３７Ｔ、Ｌ３３８Ａ、Ｌ３３８Ｑ、Ｓ３４１Ｉ、Ｋ３７３Ｅ、Ｋ３７３Ｎ、Ｎ３７５Ａ、Ｎ３７５Ｈ、Ｙ３７６Ｃ、Ｙ３７６Ｆ、Ｙ３７６Ｌ、Ｋ３７８Ｇ、Ｋ３７８Ｐ、Ｋ３７８Ｑ、Ｋ３７８Ｒ、Ｋ３８０Ｇ、Ｋ３８０Ｓ、Ａ３８２Ｇ、Ａ３８２Ｒ、Ａ３８２Ｔ、Ｔ３８３Ｓ、Ｋ３８４Ｇ、Ｋ３８４Ｎ、Ｐ３８６Ｋ、Ｐ３８６Ｓ、Ｖ３８７Ｌ、Ｎ３８９Ｅ、Ｉ４０５Ｌ、Ｆ４０７Ｙ、Ｓ４０８Ｄ、Ｓ４０８Ｎ、Ｎ４１１Ｒ、Ｄ４１３Ｓ、Ｄ４１３Ｖ、Ｑ４１６Ｔ、Ｅ４１９Ａ、Ｅ４１９Ｌ、Ｋ４２０Ｅ、Ｒ４２１Ｎ、Ｖ４２４Ｉ、Ｋ４２７Ｍ、Ｎ４２９Ｅ、Ｇ４３２Ａ、及びＡ４３６Ｔからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含む、前記修飾ヒトキヌレニナーゼ酵素。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、表１のポリペプチドのうちのいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも９０％同一である、請求項１に記載の酵素。
【請求項３】
（ａ）Ａ２８２、Ｆ３０６、又はＦ２４９における置換；
（ｂ）Ｆ３０６Ｗ置換；
（ｃ）Ｌ７２Ｎ置換；
（ｄ）Ｈ１０２Ｗ及びＮ３３３Ｔ置換；
（ｅ）Ａ９９における置換；
（ｆ）Ｇ１１２における置換；
（ｇ）Ｅ１０３における置換；
（ｈ）Ｖ１０４における置換；
（ｉ）Ｓ４０８における置換；
（ｊ）Ｉ１８３Ｐ置換；
（ｋ）Ｒ１０７Ｐ置換；並びに／又は
（ｌ）Ａ４３６Ｔ置換
を含む、請求項１に記載の酵素。
【請求項４】
Ｌ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ、及びＮ３３３Ｔから選択される少なくとも１つの置換を含み、任意で、Ｌ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ、及びＮ３３３Ｔから選択される少なくとも２つ、３つ、４つ、又は５つの置換を含む、請求項１に記載の酵素。
【請求項５】
置換Ｌ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ、及びＮ３３３Ｔを含む、請求項４に記載の酵素。
【請求項６】
少なくとも８０００Ｍ−１ｓ−１の、キヌレニン（ＫＹＮ）に対する触媒活性（ｋｃａｔ／ｋＭ）を有し、任意で、約８０００Ｍ−１ｓ−１〜４００００Ｍ−１ｓ−１；１００００Ｍ−１ｓ−１〜４００００Ｍ−１ｓ−１；２００００Ｍ−１ｓ−１〜４００００Ｍ−１ｓ−１；又は２５０００Ｍ−１ｓ−１〜３５０００Ｍ−１ｓ−１の、ＫＹＮに対する触媒活性を有する、請求項５に記載の酵素。
【請求項７】
前記アミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であり、任意で、前記アミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一である、請求項１に記載の酵素。
【請求項８】
異種ペプチドセグメントを更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項９】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合しており、任意で、１つ以上のＬｙｓ又はＣｙｓ残基にてＰＥＧと結合している、請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、任意で、細菌、菌類、昆虫、又は哺乳類での発現のためにコドン最適化されている、前記核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の核酸又は請求項１１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞であって、任意で、前記宿主細胞が細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、又は哺乳類細胞であり、任意で、前記哺乳類細胞が哺乳類免疫エフェクター細胞であり、任意で、前記哺乳類免疫エフェクター細胞がＮＫ細胞又はＴ細胞である、前記宿主細胞。
【請求項１３】
薬学上許容される担体の中に請求項１〜９のいずれか一項に記載の酵素を含む、医薬製剤。
【請求項１４】
腫瘍を有する対象に、有効量の、請求項１〜９のいずれか一項に記載の酵素又は請求項１３に記載の製剤を投与することを含む、腫瘍を有する対象の治療方法。
【請求項１５】
腫瘍を有する対象の治療に使用するための、有効量の、請求項１〜９のいずれか一項に記載の酵素又は請求項１３に記載の製剤を含む、組成物。
【請求項１６】
前記対象が、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、又はＴＤＯを発現する腫瘍を有するものとして同定されており、任意で、
（ａ）前記腫瘍が充実性腫瘍又は血液腫瘍であり；
（ｂ）前記対象がヒト患者であり；
（ｃ）前記酵素又は製剤が、腫瘍内に、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、眼内に、鼻孔内に、硝子体内に、腟内に、直腸内に、筋肉内に、皮下に、結膜下に、膀胱内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、経口で、吸入により、注射により、注入により、連続注入により、標的細胞を直接浸す局所潅流により、カテーテルを介して、又は洗浄により投与され；かつ／又は
（ｄ）前記酵素又は製剤が、少なくとも第２の抗癌治療法と共に投与され、任意で、前記第２の抗癌治療法が放射線治療、外科治療、免疫療法、又は第２の抗癌性化合物であり、任意で、
（ｉ）前記第２の抗癌性化合物が免疫チェックポイント阻害剤であり、任意で、前記免疫チェックポイント阻害剤が抗体又は抗体薬物コンジュゲートであり、任意で、前記抗体が抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体であり；かつ／又は
（ｉｉ）前記免疫療法が、免疫エフェクター細胞又は免疫原性組成物を投与することを含み、任意で、前記免疫原性組成物が癌細胞抗原を含み、かつ／又は前記免疫エフェクター細胞がＮＫ細胞、Ｔ細胞、又はＣＡＲ  Ｔ細胞を含む、
請求項１４に記載の方法又は請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の発現されたキヌレニナーゼ酵素を含む、トランスジェニックＴ細胞であって、任意で、
（ａ）前記トランスジェニックＴ細胞が、発現されたキメラ抗原Ｔ細胞受容体（ＣＡＲ）又は組換えされたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を更に含み；
（ｂ）前記トランスジェニックＴ細胞がヒトトランスジェニックＴ細胞であり；
（ｃ）前記ＣＡＲ及び前記キヌレニナーゼをコードするＤＮＡが、前記細胞のゲノムに組み込まれており；かつ／又は
（ｄ）前記ＣＡＲが癌細胞抗原に対して標的化され、任意で、前記癌細胞抗原がＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、又はＧＤ２である、
前記トランスジェニックＴ細胞。
【請求項１８】
腫瘍を有するヒト対象に、有効量の請求項１７に記載のトランスジェニック細胞を投与することを含む、腫瘍を有するヒト対象におけるＴ細胞応答を促進する方法。
【請求項１９】
腫瘍を有する対象の治療で使用するための、有効量の請求項１７に記載のトランスジェニック細胞を含む組成物であって、任意で、
（ａ）前記トランスジェニック細胞が自己由来である；又は
（ｂ）前記トランスジェニック細胞が異種由来である、
前記組成物。
【請求項２０】
腫瘍の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキヌレニナーゼ酵素又は請求項１０に記載の核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年４月１６日に出願された、米国特許仮出願第６２／６５８，２６１号の利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって認可された助成金番号Ｒ０１  ＣＡ１５４７５４のもとで、政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
１．発明の分野
本発明は概して、分子生物学及び腫瘍学の分野に関する。より具体的には、本発明は、改変キヌレニナーゼ酵素及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
２．先行技術の記載
キヌレニンは、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）又はトリプトファン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）のいずれかの作用を介して生成されるアミノ酸、トリプトファンの代謝産物である。キヌレニンは細胞生理学に対して複数の効果を発揮し、その最も重要なものの１つは、Ｔ細胞応答のモジュレータとしてのものである。多数の腫瘍細胞はＩＤＯ及び／又はＴＤＯ酵素の合成を調節してキヌレニンの局所濃度を高め、それにはトリプトファンの枯渇が伴う。多量のキヌレニンは転じて、別様において腫瘍を攻撃することになる、腫瘍に浸潤するＴ細胞の機能を阻害する強力な方法として役立つ。
【０００５】
癌におけるキヌレニン産生の重要性は十分に認識されており、キヌレニン生成酵素であるＩＤＯ及びＴＤＯの阻害剤の開発をもたらした。これらの化合物のうちの少なくとも１つが、現在第二相試験臨床評価を現在受けている。しかし、ＩＤＯ又はＴＤＯ阻害は、以下の理由により、癌治療に対しては問題がある：（１）ＩＤＯの２つのアイソフォームが存在し、ＴＤＯと共に、現在における、キヌレニン生成のためのあらゆる可能性のある経路を阻害するには、複数の低分子阻害剤の生成が必要であり、（２）阻害への耐性が生じる可能性がある。
【０００６】
ヒトキヌレニナーゼは、３’０Ｈキヌレニンに対して強力な偏好を有し、３’０Ｈキヌレニンは、キヌレニン分解に対して示されるものより約１，０００倍高い触媒効率（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）にて分解される。対照的に、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来の酵素などの、いくつかの細菌酵素は、３’ＯＨキヌレニンよりもキヌレニンに強力な偏好を有する。治療目的のために、ヒトにおけるインビボ用途のための、必須の薬理学的性質を有する作用物質（即ち、治療用酵素）を有するのが不可欠である。必須の薬理学的性質としては、（ｉ）キヌレニンに対する高い触媒活性、（ｉｉ）単回投与注射の際に、血清及び組織中でキヌレニンの枯渇の持続を達成するための、血清中での脱活性化に対する向上した安定性が挙げられる。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の態様は、逆免疫応答の誘発を回避するために、ヒト酵素と高度な配列同一性を有し、癌治療のために、所望により血清中で好ましい薬学動態を示す、Ｌ−キヌレニン分解が可能である改変ポリペプチド配列を含む酵素を提供することにより、当該技術分野における主要な欠乏を克服する。ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５３４３７において、発明者らは、野生型ヒト酵素に対して、ＫＹＮ分解に関する触媒効率が最大２４倍高い、変異体ヒトキヌレニナーゼ（当該明細書においては、ｈ−ＫＹＮａｓｅ又はＨｓＫＹＮとも呼ばれる）酵素を開示した。ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５３４３７に開示されている酵素よりも高い触媒活性及び安定性を有する、変異ｈ−ＫＹＮａｓｅ酵素の発見が必要とされている。本出願の態様は、この必要性に対処し、野生型ｈ−ＫＹＮａｓｅよりも高い触媒効率を有する変異体酵素、及び高い触媒活性を有する変異体酵素、加えて、血清安定性が向上した酵素もまたを開示する。
【０００８】
第１の実施形態において、本発明は、単離された修飾ヒトキヌレニナーゼ酵素であって、配列番号：１、２、３、又は表１に示すポリペプチドのうちの１つのヒトキヌレニナーゼ酵素に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＬ８Ｐ、Ｋ３８Ｅ、Ｙ４７Ｌ、Ｉ４８Ｆ、Ｋ５０Ｑ、Ｉ５１Ｍ、Ｓ６０Ｎ、Ｋ６４Ｎ、Ｄ６５Ｇ、Ｅ６６Ｋ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ６７Ｐ、Ｄ６７Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｔ、Ａ６８Ｖ、Ｆ７１Ｌ、Ｆ７１Ｍ、Ｌ７２Ｎ、Ｋ８４Ｅ、Ｅ８８Ｎ、Ｅ８９Ｋ、Ｅ８９Ｓ、Ｅ９０Ｑ、Ｄ９２Ｅ、Ｋ９３Ｎ、Ｋ９３Ｔ、Ａ９５Ｈ、Ａ９５Ｑ、Ｋ９６Ｎ、Ｉ９７Ｈ、Ｉ９７Ｌ、Ｉ９７Ｖ、Ａ９８Ｇ、Ａ９９Ｇ、Ａ９９Ｉ、Ａ９９Ｒ、Ａ９９Ｓ、Ａ９９Ｔ、Ａ９９Ｖ、Ｙ１００Ｎ、Ｙ１００Ｓ、Ｙ１００Ｔ、Ｇ１０１Ａ、Ｈ１０２Ｗ、Ｅ１０３Ｆ、Ｅ１０３Ｈ、Ｅ１０３Ｎ、Ｅ１０３Ｑ、Ｅ１０３Ｒ、Ｅ１０３Ｖ、Ｅ１０３Ｗ、Ｖ１０４Ｄ、Ｖ１０４Ｅ、Ｖ１０４Ｆ、Ｖ１０４Ｈ、Ｖ１０４Ｋ、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｒ、Ｇ１０５Ａ、Ｇ１０５Ｈ、Ｇ１０５Ｓ、Ｇ１０５Ｔ、Ｅ１０６Ｄ、Ｋ１０６Ｄ、Ｋ１０６Ｅ、Ｋ１０６Ｈ、Ｋ１０６Ｎ、Ｒ１０７Ｐ、Ｒ１０７Ｓ、Ｐ１０８Ｒ、Ｉ１１０Ａ、Ｉ１１０Ｆ、Ｉ１１０Ｌ、Ｉ１１０Ｍ、Ｉ１１０Ｔ、Ｔ１１１Ｄ、Ｔ１１１Ｈ、Ｔ１１１Ｎ、Ｔ１１１Ｒ、Ｇ１１２Ａ、Ｇ１１２Ｃ、Ｇ１１２Ｄ、Ｇ１１２Ｋ、Ｇ１１２Ｌ、Ｇ１１２Ｍ、Ｇ１１２Ｑ、Ｇ１１２Ｒ、Ｇ１１２Ｓ、Ｇ１１２Ｔ、Ｇ１１２Ｙ、Ｎ１２７Ｋ、Ｉ１３１Ｖ、Ａ１３２Ｖ、Ｌ１３３Ｖ、Ａ１３６Ｔ、Ｌ１３７Ｔ、Ｔ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｈ１４２Ｑ、Ｑ１４Ｒ、Ｙ１５６Ｈ、Ｋ１６３Ｔ、Ｄ１６８Ｅ、Ｈ１６９Ｒ、Ｑ１７５Ｌ、Ｉ１８３Ｆ、Ｉ１８３Ｌ、Ｉ１８３Ｐ、Ｉ１８３Ｓ、Ｅ１８４Ａ、Ｅ１８４Ｄ、Ｅ１８４Ｒ、Ｅ１８４Ｔ、Ｅ１８４Ｖ、Ｅ１８５Ｔ、Ｍ１８７Ｌ、Ｍ１８９Ｉ、Ｋ１９１Ａ、Ｋ１９１Ｇ、Ｋ１９１Ｈ、Ｋ１９１Ｍ、Ｋ１９１Ｎ、Ｋ１９１Ｒ、Ｋ１９１Ｓ、Ｋ１９１Ｔ、Ｋ１９１Ｗ、Ｅ１９７Ａ、Ｅ１９７Ｄ、Ｅ１９７Ｆ、Ｅ１９７Ｋ、Ｅ１９７Ｍ、Ｅ１９７Ｑ、Ｅ１９７Ｓ、Ｅ１９７Ｔ、Ｅ１９７Ｖ、Ｉ２０１Ｃ、Ｉ２０１Ｅ、Ｉ２０１Ｆ、Ｉ２０１Ｈ、Ｉ２０１Ｌ、Ｉ２０１Ｓ、Ｉ２０１Ｔ、Ｉ２０１Ｖ、Ｈ２０３Ｋ、Ｌ２１９Ｍ、Ｌ２１９Ｗ、Ｆ２２０Ｌ、Ｖ２２３Ｉ、Ｆ２２５Ｙ、Ｈ２３０Ｆ、Ｈ２３０Ｌ、Ｈ２３０Ｙ、Ｎ２３２Ｓ、Ｙ２４６Ｆ、Ｆ２４９Ｗ、Ｄ２５０Ｅ、Ｓ２７４Ａ、Ｓ２７４Ｃ、Ｓ２７４Ｇ、Ｓ２７４Ｎ、Ｓ２７４Ｔ、Ｌ２７８Ｍ、Ａ２８０Ｇ、Ａ２８０Ｓ、Ａ２８０Ｔ、Ｇ２８１Ｓ、Ａ２８２Ｍ、Ａ２８２Ｐ、Ｇ２８４Ｎ、Ｉ２８５Ｌ、Ｖ３０３Ｌ、Ｖ３０３Ｓ、Ｆ３０６Ｗ、Ｆ３０６Ｙ、Ｓ３１１Ｎ、Ｋ３１５Ｅ、Ｄ３１７Ｅ、Ｄ３１７Ｋ、Ｉ３３１Ｃ、Ｉ３３１Ｌ、Ｉ３３１Ｎ、Ｉ３３１Ｓ、Ｉ３３１Ｔ、Ｉ３３１Ｖ、Ｎ３３３Ｔ、Ｐ３３４Ｎ、Ｐ３３５Ｔ、Ｌ３３７Ｔ、Ｌ３３８Ａ、Ｌ３３８Ｑ、Ｓ３４１Ｉ、Ｋ３７３Ｅ、Ｋ３７３Ｎ、Ｎ３７５Ａ、Ｎ３７５Ｈ、Ｙ３７６Ｃ、Ｙ３７６Ｆ、Ｙ３７６Ｌ、Ｋ３７８Ｇ、Ｋ３７８Ｐ、Ｋ３７８Ｑ、Ｋ３７８Ｒ、Ｋ３８０Ｇ、Ｋ３８０Ｓ、Ａ３８２Ｇ、Ａ３８２Ｒ、Ａ３８２Ｔ、Ｔ３８３Ｓ、Ｋ３８４Ｇ、Ｋ３８４Ｎ、Ｐ３８６Ｋ、Ｐ３８６Ｓ、Ｖ３８７Ｌ、Ｎ３８９Ｅ、Ｉ４０５Ｌ、Ｆ４０７Ｙ、Ｓ４０８Ｄ、Ｓ４０８Ｎ、Ｎ４１１Ｒ、Ｄ４１３Ｓ、Ｄ４１３Ｖ、Ｑ４１６Ｔ、Ｅ４１９Ａ、Ｅ４１９Ｌ、Ｋ４２０Ｅ、Ｒ４２１Ｎ、Ｖ４２４Ｉ、Ｋ４２７Ｍ、Ｎ４２９Ｅ、Ｇ４３２Ａ、及びＡ４３６Ｔからなる群から選択される少なくとも１つの置換（配列番号：１の配列に対する）を含む、酵素を提供する。いくつかの態様では、アミノ酸配列は、配列番号：１、２、又は３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である、あるいは、表１の１つの酵素に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である。特定の態様において、酵素は、Ａ２８２における置換（例えばＡ２８２Ｍ若しくはＡ２８２Ｐ）、Ｆ３０６における置換（例えばＦ３０６Ｗ若しくはＦ３０６Ｙ）、又はＦ２４９における置換、例えばＦ２４９Ｗを含むことができる。更なる態様において、酵素はＬ７２Ｎ置換を含むことができる。また更なる態様において、酵素はＦ３０６Ｗ置換を含むことができる。特定の態様において、酵素はＨ１０２Ｗ及びＮ３３３Ｔ置換を含むことができる。別の態様において、酵素はＡ９９における置換を含むことができる。いくつかの態様では、酵素はＧ１１２における置換を含むことができる。ある種の特定の態様において、酵素はＥ１０３における置換を含む。別の態様において、酵素はＶ１０４における置換を含む。更なる態様において、酵素はＳ４０８における置換を含むことができる。いくつかの態様では、酵素はＩ１８３Ｐ置換を含むことができる。いくつかの特定の態様において、酵素はＲ１０７Ｐ置換を含むことができる。別の特定の態様において、酵素はＡ４３６Ｔ置換を含むことができる。
【０００９】
また更なる態様において、酵素は、Ｌ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ、及びＮ３３３Ｔから選択される少なくとも１つの置換を含むことができる。特定の態様において、酵素は、Ｌ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ、及びＮ３３３Ｔから選択される少なくとも２つ、３つ、４つ、又は５つの置換を含む。いくつかの態様では、酵素は置換Ｌ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ、及びＮ３３３Ｔを含むことができる。更なる態様では、酵素は、少なくとも８０００Ｍ−１ｓ−１の、ＫＹＮに対する触媒活性（ｋｃａｔ／ｋＭ）を有する。別の態様において、酵素は、約８０００Ｍ−１ｓ−１〜４００００Ｍ−１ｓ−１；１００００Ｍ−１ｓ−１〜４００００Ｍ−１ｓ−１；２００００Ｍ−１ｓ−１〜４００００Ｍ−１ｓ−１；又は２５０００Ｍ−１ｓ−１〜３５０００Ｍ−１ｓ−１の、ＫＹＮに対する触媒活性（ｋｃａｔ／ｋＭ）を有する。
【００１０】
また更なる態様において、ポリペプチドは、表１のポリペプチドのうちの１つのアミノ酸配列に、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様において、ポリペプチドは、表１のポリペプチドのうちの１つに１００％同一であるアミノ酸配列を含む。また依然として更なる態様では、ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様において、ポリペプチドは、配列番号：２に１００％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様において、アミノ酸配列は、配列番号：３のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である。特定の態様において、ポリペプチドは、配列番号：３に１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１１】
更なる態様において、本実施形態のキヌレニナーゼ酵素は、国際公開第２０１５／０３１７７１号、同第／２０１６／０３３４８８号、又は同第／２０１７／１５１８６０号（これらそれぞれの全体が本明細書に参照により組み込まれている）に開示されているアミノ酸置換の１つを更に含む。
【００１２】
更なる態様において、ＫＹＮの分解が可能な、天然又は修飾ヒト又は霊長類キヌレニナーゼのいずれかを含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは生理的条件下でＫＹＮを分解することが可能である。例えば、ポリペプチドは、少なくとも、又は約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０４、１０５、１０６Ｍ−１ｓ−１、又はこれらで導出可能な任意の範囲の、ＫＹＮに対する触媒効率（ｋｃａｔ／ＫＭ）を有する。
【００１３】
上述した修飾ポリペプチドは、非修飾ポリペプチド（例えば、配列番号：１のヒトキヌレニナーゼなどの天然ポリペプチド）、又は本明細書にて開示した任意のポリペプチド配列と比較して、特定の割合の同一性を有することを特徴としてよい。例えば、非修飾ポリペプチドは、天然キヌレニナーゼの、少なくとも、又は最大で、約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は４６５残基（又はこれらで導出可能な任意の範囲の残基）を含んでもよい。同一性の割合は、修飾ポリペプチドと非修飾ポリペプチドとの間で、又は比較における任意の２つの配列の間で、およそ、多くても、又は少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％（又はこれらで導出可能な任意の範囲）であってよい。上述の同一性の割合は、ポリペプチドの非修飾領域と比較したポリペプチドの特定の修飾領域に関し得ることもまた企図される。例えば、ポリペプチドは、同じ種に由来する又は種を交差した非修飾又は変異体のキヌレニナーゼに対するキヌレニナーゼの修飾された又は変異体の基質認識部位のアミノ酸配列の同一性に基づいて特徴付けることができるキヌレニナーゼの、修飾された又は変異体の基質認識部位を含有してもよい。例えば、非修飾キヌレニナーゼに対して少なくとも９０％の同一性を有することを特徴とする修飾又は変異体ヒトポリペプチドとは、その修飾又は変異体ヒトポリペプチド内のアミノ酸の少なくとも９０％が、非修飾ポリペプチド内のアミノ酸と同一であることを意味する。
【００１４】
そのような非修飾ポリペプチドは、天然キヌレニナーゼ、特にヒトのアイソフォーム又は他の霊長類のアイソフォームであってもよい。例えば、天然ヒトキヌレニナーゼは配列番号：１の配列を有してもよい。他の霊長類の天然キヌレニナーゼの非限定例としては、Ｐｏｎｇｏ  ａｂｅｌｉｉキヌレニナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＸＰ＿００９２３５９６２．１，ＧＩ：６８６７０８６５６）、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓキヌレニナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＥＨＨ５４８４９．１，ＧＩ：３５５７５０５２２）、及びＰａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓキヌレニナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＸＰ＿００３３０９３１４．１，ＧＩ：３３２８１４５２１）が挙げられる。例示的な天然ポリペプチドとしては、配列番号：１の、最大で、又は少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性（又はこれらで導出可能な任意の範囲の同一性）を有する配列が挙げられる。例えば、天然ポリペプチドは、配列番号：１の配列の少なくとも、又は最大で約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は４６５残基（又はこれらで導出可能な任意の範囲の残基）を含んでもよい。
【００１５】
いくつかの態様では、実施形態のポリペプチドは、異種アミノ酸配列に結合したキヌレニナーゼを含む。例えば、キヌレニナーゼは、融合タンパク質として異種アミノ酸配列に結合してよい。特定の実施形態では、キヌレニナーゼは、インビボでの半減期を増加させるために、ＩｇＧ  Ｆｃ、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、又はＸＴＥＮポリペプチドなどのアミノ酸配列に結合する。
【００１６】
血清の持続を増加させるために、キヌレニナーゼは１つ以上のポリエーテル分子に結合され得る。特定の実施形態では、ポリエーテルはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリペプチドは、リジン又はシステインなどの特定のアミノ酸残基を介してＰＥＧに結合（例えば共有結合）してよい。治療投与のために、キヌレニナーゼを含むそのようなポリペプチド薬学上許容される担体に分散されてもよい。
【００１７】
いくつかの態様では、そのようなキヌレニナーゼをコードする核酸が企図されている。いくつかの実施形態において、核酸は、細菌での発現のためにコドン最適化されている。特定の実施形態では、細菌はＥ．ｃｏｌｉである。他の態様では、核酸は菌類（例えば酵母菌）、昆虫、又は哺乳類での発現のためにコドン最適化されている。更なる態様において、そのような核酸を含有するベクター、例えば発現ベクターを提供する。特定の実施形態では、キヌレニナーゼをコードする核酸は、異種プロモーターを含むがこれに限定されないプロモーターに作用可能に結合している。一実施形態では、キヌレニナーゼはベクター（例えば遺伝子治療ベクター）により標的細胞に送達される。そのようなウイルスは組換えＤＮＡ技術により修飾され、標的細胞内でキヌレニナーゼをコードする核酸の発現を可能にすることができる。これらのベクターは、非ウイルス（例えばプラスミド）、又はウイルス（例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、若しくはワクシニアウイルス）起源のベクターに由来してもよい。非ウイルスベクターは、作用物質と複合体を形成し、細胞膜を通ってＤＮＡが流入するのを容易にするのが好ましい。このような非ウイルスベクター複合体の例としては、ＤＮＡの縮合を促進するポリカチオン性作用物質、及び脂質ベースのデリバリーシステムとの、製剤が挙げられる。脂質ベースのデリバリーシステムの例としては、核酸のリポソームベースの送達が挙げられる。
【００１８】
また更なる態様において、本発明は更に、このようなベクターを含む宿主細胞を企図する。宿主細胞は、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、真菌細胞（例えば、酵母菌）、昆虫細胞、又は哺乳類細胞であってよい。
【００１９】
一部の実施形態では、ベクターはキヌレニナーゼを発現させるために宿主細胞に導入される。タンパク質は、任意の好適な方法で発現することができる。一実施形態では、タンパク質は宿主細胞内で、タンパク質がグリコシル化されるように発現される。別の実施形態において、タンパク質は宿主細胞内で、タンパク質が非グリコシル化されるように発現される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、癌はキヌレニンの枯渇に対して感受性のある任意の癌である。一実施形態では、本発明は、このようなポリペプチドを含む製剤を投与することを含む、腫瘍細胞又は癌患者の治療方法を企図する。いくつかの実施形態において、投与は、癌細胞の少なくとも一部が殺傷されるような条件下にて発生する。別の実施形態において、製剤は、生理学的条件にてキヌレニン分解活性を有するキヌレニナーゼを含み、更に、結合したポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態においては、製剤は、上述のキヌレニナーゼのいずれか、及び薬学上許容される賦形剤を含む医薬製剤である。そのような薬学上許容される賦形剤は、当業者には周知である。上記キヌレニナーゼの全てが、ヒトの治療法において有用であると企図され得る。
【００２１】
更なる実施形態において、キヌレニン分解活性を有する非細菌性（哺乳類、例えば霊長類若しくはマウス）キヌレニナーゼ、又はそれをコードする核酸を含む製剤を投与することを含む腫瘍細胞の治療方法もまた、提供することができる。
【００２２】
本発明の特定の態様に従うと、キヌレニナーゼを含有するそのような製剤は、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、滑液包内に、気管内に、鼻孔内に、硝子体内に、腟内に、直腸内に、腫瘍内に、筋肉内に、皮下に、結膜下に、膀胱内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、眼内に、経口で、局所に、吸入により、注入により、連続注入により、局所潅流により、カテーテルを介して、洗浄により、脂質組成物（例えばリポソーム）内で、若しくは他の方法、又は当業者に知られている前述の組み合わせにより投与されることができる。
【００２３】
更なる実施形態において、本方法は、対象に、少なくとも第２の抗癌治療法を投与することもまた含む。第２の抗癌治療法は外科治療法、化学療法、放射線治療、凍結治療、ホルモン療法、免疫療法又はサイトカイン治療法であってよい。特定の態様において、第２の抗癌治療法は、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ３、抗ＴＩＭ−３、抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ４０、抗ＫＩＲ、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＧＩＴＲ、又は抗ＯＸ４０治療法などの、免疫チェックポイント阻害治療法であることができる。更なる態様において、第２の抗癌治療法は、抗体薬物コンジュゲートと組み合わせるなどの、抗体治療法であることができる。また更なる態様において、第２の抗癌治療法は、免疫エフェクター細胞又は免疫原性組成物を投与するなどの免疫療法である。例えば、免疫原性組成物は癌細胞抗原、及び任意でアジュバントを含むことができる。いくつかの態様では、免疫エフェクター細胞はＮＫ細胞、Ｔ細胞（例えばＣＡＲ  Ｔ細胞）、又はＮＫ／Ｔ細胞を含むことができる。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本実施形態のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びキヌレニナーゼ酵素を含むＴ細胞の、癌を有する対象の治療での使用が企図される。いくつかの態様では、細胞は、ＣＡＲ及びキヌレニナーゼ、かつ、場合によってはトランスポゼースをコードするＤＮＡによりトランスフェクションされてよい。
【００２５】
ＣＡＲは、例えばＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＧＤ２を含む、目的の任意の癌細胞抗原を標的化し得る。抗原結合領域又はドメインは、米国特許第７，１０９，３０４号（その全体が本明細書に参照により組み込まれる）に記載されているものなどの、特定のヒトモノクローナル抗体に由来する、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のＶＨ及びＶＬ鎖の断片を含むことができる。断片はまた、ヒト抗原特異的抗体の、任意数の異なる抗原結合ドメインを含むこともできる。より具体的な実施形態では、断片は、ヒト細胞において発現するためのヒトコドンの使用に最適化された配列によってコードされる、抗原特異的ｓｃＦｖである。ＣＡＲの更なる例については、例えば国際公開第２０１２／０３１７４４号、同第２０１２／０７９０００号、同第２０１３／０５９５９３号、及び米国特許第８，４６５，７４３号（これら全ての明細書の全体が、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００２６】
キヌレニナーゼは、本明細書にて開示した任意のキヌレニナーゼであってよい。細胞をトランスフェクションする方法は、当該技術分野において周知であるが、特定の態様においては、電気穿孔法等の、非常に効率的なトランスフェクション方法が用いられる。例えば、ヌクレオフェクション装置を使用して核酸を細胞内に導入することができる。好ましくは、トランスフェクション工程は、細胞にウイルスを感染させるか又は形質導入することを伴わず、これにより、遺伝毒性を引き起こすことができ、かつ／又は治療した対象におけるウイルス配列を含有する細胞に対する免疫応答を導くことができる。
【００２７】
広範囲のＣＡＲ構築物、及びその発現ベクターが当技術分野において周知であり、本明細書において更に詳細に記述される。例えば、いくつかの態様では、ＣＡＲ発現ベクターは、プラスミド、線形発現ベクター又はエピソーム等のＤＮＡ発現ベクターである。いくつかの態様では、ベクターは、ＣＡＲの発現を促進する配列などの追加の配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリ−Ａシグナル、及び／又は１つ以上のイントロンを含む。好ましい態様において、ＣＡＲコード配列は、トランスポゼースが存在することにより、コード配列がトランスフェクト細胞のゲノム内に組み込まれることが可能となるとなるように、トランスポゾン配列に隣接する。
【００２８】
特定の態様において、細胞は更に、トランスフェクト細胞のゲノム内へのＣＡＲコード配列の組み込みを促進するトランスポゼースにより、トランスフェクションされる。いくつかの態様では、トランスポゼースはＤＮＡ発現ベクターとして提供される。しかし、好ましい態様においては、トランスポゼースは、トランスポゼースの長期間にわたる発現がトランスジェニック細胞内で生じないように、発現可能なＲＮＡ又はタンパク質として提供される。実施形態に従い任意のトランスポゼースシステムを使用してよい。他の態様では、細胞をレンチウイルスで感染させ、ＣＡＲコード配列及びキヌレニナーゼコード配列の、細胞のゲノム内への組み込みを促進することができる。
【００２９】
一実施形態では、キヌレニナーゼ、又はキヌレニナーゼをコードする核酸を含む組成物を、対象における腫瘍の治療に使用するために提供する。別の実施形態では、腫瘍の治療のための薬剤の製造におけるキヌレニナーゼ又はキヌレニナーゼをコードする核酸の使用が提供される。キヌレニナーゼは、実施形態の任意のキヌレニナーゼであってよい。
【００３０】
本発明の方法及び／又は組成物の文脈で論じられる実施形態は、本明細書で記載される任意の他の方法又は組成物と共に使用することができる。したがって、一方法又は組成物に関する実施形態を、本発明の他の方法又は組成物に同様に適用することができる。
【００３１】
本明細書で使用する場合、具体的な構成成分の観点における「本質的に含まない」は、具体的な構成成分が、組成物に意図的に配合されていないか、及び／又は混入物質として、若しくは痕跡量のみが存在することを意味するために、本明細書で使用される。組成物の任意の意図しない汚染によりもたらされる、明記した構成成分の総量は、０．０１％未満であるのが好ましい。最も好ましいのは、具体的な構成成分の量が標準的な分析方法を用いて分析できない組成物である。
【００３２】
本明細書で使用する場合、明細書及び特許請求の範囲において、「ａ」又は「ａｎ」は、１つ以上を意味することができる。本明細書で使用する場合、明細書及び特許請求の範囲において、単語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と共に使用する場合、単語「ａ」又は「ａｎ」は、１つ、又は２つ以上を意味し得る。本明細書で使用する場合、明細書及び特許請求の範囲において、「別の」又は「更なる」とは、少なくとも「第２の、又はそれ以上」を意味することができる。
【００３３】
本明細書で使用する場合、明細書及び特許請求の範囲において、用語「約」は、ある値が、その値、又は研究用対象間で存在する差を測定するのに用いたデバイス、方法に関しての、固有の誤差変動を含むことを意味するように用いられる。
【００３４】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。しかし、詳細な説明及び具体例は、本発明の特定実施形態を示しているが、単なる具体例として与えられていることが理解されるべきである。本発明の精神及び範囲内の種々の変更及び改変が、この詳細な説明から当業者には明らかになるからである。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
添付の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様を更に示すために含まれている。本発明は、本明細書に提示する具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これら１つ以上の図面を参照することによって、よりよく理解されるだろう。
【図１】図１Ａ〜Ｃは、ＨｓＫＹＮタンパク質改変の成功した結果を示す。Ａ）ヒトバリアントが、Ｋｙｎに対して５００倍を超える触媒活性（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）の増加を達成した（細菌ツールＫｙｎａｓｅに相当）。Ｂ）ヒトバリアントは、インビトロでの、ヒト血清中での触媒安定性を大いに改善した。Ｃ）本明細書の表１に記載するとおり、ヒトバリアント（６８）及び（１５３）はマウスにて、単回静脈内投与後に、持続したＫｙｎ分解を示した。
【図２】図２Ａ及びＢは、ＨｓＫＹＮバリアントのインビボ有効性を示す。Ａ）抗ＰＤ−１と組み合わせたタンパク質（６８）は、ＣＴ２６モデルにおいて、エパカドスタット（Ｅｐａｃａｄｏｓｔａｔ）より優れた、著しい腫瘍増殖阻害／生残効果を示した。Ｂ）完全奏功子（ＣＲ）をＣＴ２６と共に再度抗原投与すると、ＣＲのいずれもが、腫瘍を進展させなかった。これにより、ＣＴ２６に対する抗腫瘍記憶が確認される。対照的に、ＣＴ２６を播種した未処置マウスでは腫瘍が進展した。
【図３】図３Ａ及びＢは、ＣＴ２６腫瘍保持マウスにおけるタンパク質（６８）の免疫プロファイリングを示す。Ａ）Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇを用いる多重遺伝子発現分析により、ＨｓＫＹＮ＋／−抗ＰＤ１処置の際に、ＩＦＮγ遺伝子シグネチャーの上方制御が明らかとなった。Ｂ）ＨｓＫＹＮ処理により、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ及びＭ１／Ｍ２マクロファージ比率が増加したことが、ＦＡＣ分析により示された。
【図４】図４Ａ〜Ｃは、毒性種におけるタンパク質（１５３）のＰＤ／ＰＫプロファイルを示す。Ａ）タンパク質（１５３）は、ラットにおいて、１０ｍｇ／ｋｇを単回、そして繰り返し毎週静脈内投与した後、ロバストで永続的な血漿Ｋｙｎ枯渇を示した。Ｂ）タンパク質（１５３）は、カニクイザルにて、単回静脈内投与の７日後までに、５０％以上の血漿Ｋｙｎを分解した。Ｃ）６日を超えて好ましいＴ１／２を有する、タンパク質（１５３）サルＰＫプロファイル。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
例示的な実施形態の記載
Ｉ．本実施形態
特定の実施形態において、本開示は、Ｋｙｎ枯渇酵素であるキヌレニナーゼ（Ｋｙｎａｓｅ）を提供する。特に、本願は、野生型ヒトキヌレニナーゼ酵素と比較して、キヌレニン分解に少なくとも１００倍高い触媒活性を示す、ひとまとまりのヒトキヌレニナーゼバリアントを提供する。いくつかの態様では、本明細書において提供するキヌレニナーゼバリアントは、血清中で、脱活性化に対して増加した耐性を更に有する。したがって、これらの酵素は、これらの酵素を、癌の治療などの、治療のための病気への介入に理想的なものにする、著しく改善された性質を有する。いくつかの態様では、酵素（又は酵素をコードする配列）を使用して、ＩＤＯ１及び／又はＴＤＯ２を発現する腫瘍を有する癌患者などの、癌患者を治療することができる。
【００３７】
本研究において、ＷＴ酵素を上回る、Ｋｙｎに対する非常に改善された触媒活性及び安定性を示すために、ヒトＫｙｎａｓｅ（ｈ−ＫＹＮａｓｅ）を上手く組換えられており、マウスにて、永続的な血漿Ｋｙｎ枯渇が達成された。単剤及びＰＤ１との組み合わせの有効性も、優れたＩＤＯ１阻害剤のエパカドスタットよりも優れて、ＣＴ２６及びＢ１６−ＩＤＯモデルにて示され、もたらされる完全奏功（ＣＲ）は、腫瘍の再抗原投与に対して耐性を有した。腫瘍免疫プロファイリングにより、ＨｓＫＹＮ＋／−ＰＤ１治療の際の、ＩＦＮｇシグネチャー遺伝子発現及びＭ１／Ｍ２マクロファージ比率の上方制御が明らかとなった。優れたＨｓＫＹＮバリアントは、ラット及び非ヒト霊長類にて好ましいＫｙｎ分解及びＰＫプロファイルを示し、ＩＤＯ１及び／又はＴＤＯ２経路が免疫抑制の役割を果たす癌などの癌の治療に、使用することができる。
【００３８】
ＩＩ．定義
本明細書で使用する場合、用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」とは、ペプチド結合を介して結合したアミノ酸を含む化合物を意味し、これらは同じ意味で用いられる。
【００３９】
本明細書で使用する場合、用語「融合タンパク質」とは、非天然的に作用可能に結合したタンパク質又はタンパク質断片を含有するキメラタンパク質を意味する。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ、１／２−ｌｉｆｅ）」とは、例えば哺乳類への注射の後で、インビトロ又はインビボで、タンパク質のポリペプチドの濃度が半分にまで低下するのに必要な時間を意味する。
【００４１】
用語「作用可能な組み合わせで」「作用可能な順番で」及び「作用可能に結合した」とは、記載した構成成分が、意図した方法で機能することを可能にする関係にある結合、例えば、所与の遺伝子の転写及び／若しくは所望のタンパク質分子の合成を指令することが可能な核酸分子となるような核酸配列の結合、又は、融合タンパク質が作製されるようなアミノ酸配列の結合を意味する。
【００４２】
用語「リンカー」とは、分子架橋として作用し、２つの異なる分子を作用可能に結合するように機能する化合物又は部分を意味し、ここでは、リンカーの一部分が第１の分子に作用可能に結合し、リンカーの別の部分が第２の分子に作用可能に結合した化合物を指す。
【００４３】
用語「ＰＥＧ化」とは、その生体適合性の高さ及び修飾の容易性を考慮して薬剤担体として幅広く使用されている、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とのコンジュゲートを意味する。ＰＥＧは、ＰＥＧ鎖の末端のヒドロキシ基を介して、化学的方法により活性薬剤とカップリング（例えば共有結合）することが可能であるが、ＰＥＧそのものは、１分子あたり多くても２つの活性薬剤に制限されている。異なるアプローチにおいては、ＰＥＧとアミノ酸とのコポリマーは、ＰＥＧの生体適合性を維持するものの、１分子あたりで多数の結合点を有するという更なる利点を有し（したがって、より多くの薬剤使用量をもたらし）、かつ、合成により、多様な用途に適するように設計されることができる新規のバイオマテリアルとして見出されている。
【００４４】
用語「遺伝子」とは、ポリペプチド、又はその前駆体の作製に必要な調節配列及びコード配列を含むＤＮＡ配列を意味する。ポリペプチドは、完全長コード配列、又は所望の酵素活性が維持されるようなコード配列の任意の部分によりコードされることができる。
【００４５】
用語「天然」とは、天然源から単離した場合の、遺伝子、遺伝子産物、又はその遺伝子若しくは遺伝子産物の特性の典型的形態を意味する。天然形態は、天然集団にて最も頻繁に見られ、したがって恣意的に通常形態又は野生型形態と呼ばれるものである。対照的に、用語「修飾した」「バリアント」又は「変異体」とは、天然の遺伝子又は遺伝子産物と比較した場合に、配列及び機能的性質において改変（すなわち、変化した特性）を示す遺伝子又は遺伝子産物を意味する。
【００４６】
用語「ベクター」とは、複製可能な細胞内への導入のために核酸配列を挿入可能な担体核酸分子を指すために使用される。核酸配列は「外来性」であることができ、これは、ベクターが導入される細胞に対して外来であるか、又は、配列が細胞内の配列に対して相同であるが、配列が通常発見されない宿主細胞核酸内の位置にあることを意味する。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、並びに人工染色体（例えばＹＡＣ）が挙げられる。当業者は、標準的な組換え技術によりベクターを構築するのに十分な装備を有するであろう。
【００４７】
用語「発現ベクター」とは、転写可能なＲＮＡをコードする核酸を含む任意の種類の遺伝子構築物を意味する。場合によっては、ＲＮＡ分子は次いで、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに翻訳される。他の場合、例えば、アンチセンス分子又はリボザイムの産生において、これらの配列は翻訳されない。発現ベクターは、種々の「調節配列」を含有することができ、「調節配列」とは、特定の宿主細胞内で作用可能に結合したコード配列での転写、及び場合により翻訳に必要な核酸配列を意味する。転写及び翻訳を司る調節配列に加えて、ベクター及び発現ベクターは他の機能を果たす核酸配列を含有してよく、これらは以下に記載する。
【００４８】
用語「治療上有効な量」は本明細書で使用されるとき、治療効果を達成するのに方法で採用される細胞及び／又は治療用組成物（例えば、治療用ポリヌクレオチド及び／又は治療用ポリペプチド）の量を指す。「治療上の利益」又は「治療上有効な」の用語は、本明細書全体で使用される場合、この状態の医学的治療に関し、対象の良好な状態を促進するか、又は向上させるあらゆるものを指す。これには、病気の徴候又は症状の頻度又は重症度の減少が含まれるが、これらに限定されない。例えば、癌の治療は、例えば、腫瘍の大きさの減少、腫瘍の侵襲性の低下、癌の成長速度の減少、又は転移の予防を伴うことができる。癌の治療は、癌を有する対象の生存を延長することも意味することができる。
【００４９】
本明細書で使用する場合、用語「ＫＭ」とは、酵素に対するミカエリス・メンテン定数を意味し、所与の酵素が、酵素触媒反応における最大速度の半分となる、特異的基質の濃度として定義される。本明細書で使用する場合、用語「ｋｃａｔ」とは、ターンオーバー数、即ち、各酵素部位が単位時間あたりで産生物に転換し、酵素が最大効率で作用する、基質分子の数を意味する。本明細書で使用する場合、用語「ｋｃａｔ／ＫＭ」は特異性定数を意味し、これは、酵素がどれほど効率的に、基質を生成物に転換するかの尺度である。
【００５０】
本明細書で使用する場合、用語「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、人工のＴ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、又はキメラ免疫受容体を指していてもよく、例えば、特定の免疫エフェクター細胞に人工の特異性を付与する操作された受容体を包含する。ＣＡＲは、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に付与するために使用されてもよく、例えば、養子細胞療法での使用のために、それにより多数の特異的なＴ細胞を生成することが可能になる。特定の実施形態では、ＣＡＲは、例えば、細胞の特異性を腫瘍関連抗原に向ける。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞内活性化ドメインと、膜貫通ドメインと、腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインとを含む。特定の態様において、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ膜貫通及びエンドドメインに融合したモノクローナル抗体（米国特許第７，１０９，３０４号（その全体が本明細書に参照により組み込まれる）に記載されているものなど）に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合を含む。ＣＡＲ設計の特異性は、受容体のリガンド（例えば、ペプチド）に由来していてもよく、又はパターン認識受容体、例えば、デクチンに由来していてもよい。特定の実施形態では、Ｂ系列分子であるＣＤ１９に対して特異的なＣＡＲを使用することにより、Ｔ細胞の特異性を向け直すことで、悪性Ｂ細胞を標的化することができる。特定の場合に、抗原認識ドメインの間隔は、活性化誘導細胞死を減らすように修飾されてもよい。特定の場合において、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ、ＦｃＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０、及び／又はＯＸ４０などの更なる同時刺激シグナル伝達のためのドメインを含む。場合によっては、分子は、同時刺激分子、イメージング（例えば陽電子放出断層撮影）用のレポーター遺伝子、プロドラッグを加える際にＴ細胞を条件的に取り除く遺伝子産物、ホーミング受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、及びサイトカイン受容体を含むＣＡＲにより同時発現することができる。
【００５１】
「治療」及び「治療すること」とは、疾患又は健康に関係する状態の治療的効果を得る目的のために、対象に治療薬を投与すること若しくは適用すること、又は対象において手順若しくは様式を実施することを意味する。例えば、治療は、薬学的に有効な量のキヌレニナーゼを投与することを含むことができる。
【００５２】
「対象」及び「患者」とは、ヒト又は非ヒト（例えば霊長類、哺乳類、及び脊椎動物）のいずれかを意味する。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【００５３】
ＩＩＩ．キヌレニナーゼポリペプチド
いくつかの実施形態は、修飾タンパク質及びポリペプチドに関する。特定の実施形態は、未修飾版に相当する少なくとも１つの機能活性、好ましくはキヌレニン分解活性を示す修飾タンパク質又はポリペプチドに関する。更なる態様において、タンパク質又はポリペプチドを更に修飾して、血清安定性を増加させることができる。したがって、本出願が「修飾タンパク質」又は「修飾ポリペプチド」の機能又は活性を意味する場合、当業者は、この言葉は、例えば、非修飾タンパク質又はポリペプチドを超える更なる利点、例えばキヌレニン分解活性又は熱力学的活性を有するタンパク質又はポリペプチドを含むことを理解するであろう。
【００５４】
活性の測定は、当業者に知られている、特にタンパク質の活性に関するアッセイを使用して達成可能であり得、比較の目的のために、修飾又は非修飾タンパク質又はポリペプチドのいずれかの天然及び／又は組換え版を使用することを含んでよい。
【００５５】
特定の実施形態において、修飾キヌレニナーゼなどの修飾ポリペプチドは、キヌレニンの増加に基づいて識別することができる。例えば、非修飾ポリペプチドの基質の基質認識部位が識別されてよい。この識別は、構造分析又は相同性分析に基づくことができる。このような基質認識部位の修飾に関与する変異体の集団を生成することができる。更なる実施形態において、キヌレニン分解活性が増加した変異体が、変異体集団から選択されてよい。所望の変異体の選択としては、キヌレニン分解による副産物又は生成物の検出といった方法を挙げることができる。
【００５６】
修飾タンパク質はアミノ酸の欠失及び／又は置換を有し得る。したがって、欠失を有するタンパク質、置換を有するタンパク質、及び、欠失と置換を有するタンパク質は、修飾タンパク質である。いくつかの実施形態において、これらの修飾タンパク質は、例えば融合タンパク質又はリンカーを有するタンパク質と同様に、挿入又は追加のアミノ酸を更に含んでもよい。「修飾欠失タンパク質」は、天然タンパク質の１つ以上の残基を欠いているが、天然タンパク質の特異性及び／又は活性を有することができる。「修飾欠失タンパク質」は、低下した免疫原性又は抗原性を有することもできる。修飾欠失タンパク質の例は、少なくとも１つの抗原領域、すなわち、修飾タンパク質が投与され得る生物の種類などの、特定の生物において抗原性であると判定されるタンパク質の領域から欠失されたアミノ酸残基を有するものである。
【００５７】
置換又は置き換えバリアントは通常、タンパク質内の１つ以上の部位において、あるアミノ酸の別のアミノ酸との交換を含有し、ポリペプチドの１つ以上の性質、特にエフェクター機能及び／又は生物学的利用能を制御するように設計されてよい。置換は、保存的、すなわち、あるアミノ酸が類似の形状及び電荷のアミノ酸で置き換えられているものであっても、又はなくてもよい。保存的置換は当該技術分野において周知であり、例えば、アラニンのセリンへの；アルギニンのリジンへの；アスパラギンのグルタミン又はヒスチジンへの；アスパルテートのグルタメートへの；システインのセリンへの；グルタミンのアスパラギンへの；グルタメートのアスパルテートへの；グリシンのプロリンへの；ヒスチジンのアスパラギン又はグルタミンへの；イソロイシンのロイシン又はバリンへの；ロイシンのバリン又はイソロイシンへの；リジンのアルギニンへの；メチオニンのロイシン又はイソロイシンへの；フェニルアラニンのチロシン、ロイシン、又はメチオニンへの；セリンのスレオニンへの；スレオニンのセリンへの；トリプトファンのチロシンへの；チロシンのトリプトファン又はフェニルアラニンへの；及び、バリンのイソロイシン又はロイシンへの変更が挙げられる。
【００５８】
欠失又は置換に加えて、修飾タンパク質は残基の挿入を有してよく、これは通常、ポリペプチドへの少なくとも１つの残基の添加を伴う。挿入は、標的化ペプチド若しくはポリペプチド、又は単純に１つの残基の挿入を含んでよい。融合タンパク質と呼ばれる末端付加を以下で論じる。
【００５９】
用語「生物学的に機能が等価な」は当該技術分野において十分に理解されおり、本明細書で更に詳細を規定する。したがって、タンパク質の生物活性が維持される場合、対照ポリペプチドのアミノ酸に同一又は機能的に等価なアミノ酸の約７０％〜約８０％、又は約８１％〜約９０％、又は更に約９１％〜約９９％を有する配列が含まれる。修飾タンパク質は、特定の態様において、相当する天然のタンパク質に生物学的に機能が等価であり得る。
【００６０】
アミノ酸及び核酸配列は、追加の残基、例えば追加のＮ若しくはＣ末端アミノ酸、又は５’若しくは３’配列を含み得、かつ、配列が、タンパク質発現が関係する生物学的タンパク質活性の維持を含む、上述の基準を満たす限り、依然として、本明細書にて開示した配列の１つで説明されるものと事実上同じであることもまた理解されよう。末端配列の付加は特に、例えば、コード領域の５’若しくは３’部分のいずれかに隣接する種々の非コード配列を含み得るか、又は、遺伝子内で発生することが知られている種々の内部配列、すなわちイントロンを含み得る核酸配列に適用される。
【００６１】
特定の実施形態において、本実施形態に従ったキヌレニナーゼは、配列番号：１、２、又は３のキヌレニナーゼに、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。また更なる態様において、キヌレニナーゼは、配列番号：１、２、又は３のキヌレニナーゼに、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であり、Ｌ８Ｐ、Ｋ３８Ｅ、Ｙ４７Ｌ、Ｉ４８Ｆ、Ｋ５０Ｑ、Ｉ５１Ｍ、Ｓ６０Ｎ、Ｋ６４Ｎ、Ｄ６５Ｇ、Ｅ６６Ｋ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ６７Ｐ、Ｄ６７Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｔ、Ａ６８Ｖ、Ｆ７１Ｌ、Ｆ７１Ｍ、Ｌ７２Ｎ、Ｋ８４Ｅ、Ｅ８８Ｎ、Ｅ８９Ｋ、Ｅ８９Ｓ、Ｅ９０Ｑ、Ｄ９２Ｅ、Ｋ９３Ｎ、Ｋ９３Ｔ、Ａ９５Ｈ、Ａ９５Ｑ、Ｋ９６Ｎ、Ｉ９７Ｈ、Ｉ９７Ｌ、Ｉ９７Ｖ、Ａ９８Ｇ、Ａ９９Ｇ、Ａ９９Ｉ、Ａ９９Ｒ、Ａ９９Ｓ、Ａ９９Ｔ、Ａ９９Ｖ、Ｙ１００Ｎ、Ｙ１００Ｓ、Ｙ１００Ｔ、Ｇ１０１Ａ、Ｈ１０２Ｗ、Ｅ１０３Ｆ、Ｅ１０３Ｈ、Ｅ１０３Ｎ、Ｅ１０３Ｑ、Ｅ１０３Ｒ、Ｅ１０３Ｖ、Ｅ１０３Ｗ、Ｖ１０４Ｄ、Ｖ１０４Ｅ、Ｖ１０４Ｆ、Ｖ１０４Ｈ、Ｖ１０４Ｋ、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｒ、Ｇ１０５Ａ、Ｇ１０５Ｈ、Ｇ１０５Ｓ、Ｇ１０５Ｔ、Ｅ１０６Ｄ、Ｋ１０６Ｄ、Ｋ１０６Ｅ、Ｋ１０６Ｈ、Ｋ１０６Ｎ、Ｒ１０７Ｐ、Ｒ１０７Ｓ、Ｐ１０８Ｒ、Ｉ１１０Ａ、Ｉ１１０Ｆ、Ｉ１１０Ｌ、Ｉ１１０Ｍ、Ｉ１１０Ｔ、Ｔ１１１Ｄ、Ｔ１１１Ｈ、Ｔ１１１Ｎ、Ｔ１１１Ｒ、Ｇ１１２Ａ、Ｇ１１２Ｃ、Ｇ１１２Ｄ、Ｇ１１２Ｋ、Ｇ１１２Ｌ、Ｇ１１２Ｍ、Ｇ１１２Ｑ、Ｇ１１２Ｒ、Ｇ１１２Ｓ、Ｇ１１２Ｔ、Ｇ１１２Ｙ、Ｎ１２７Ｋ、Ｉ１３１Ｖ、Ａ１３２Ｖ、Ｌ１３３Ｖ、Ａ１３６Ｔ、Ｌ１３７Ｔ、Ｔ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｈ１４２Ｑ、Ｑ１４Ｒ、Ｙ１５６Ｈ、Ｋ１６３Ｔ、Ｄ１６８Ｅ、Ｈ１６９Ｒ、Ｑ１７５Ｌ、Ｉ１８３Ｆ、Ｉ１８３Ｌ、Ｉ１８３Ｐ、Ｉ１８３Ｓ、Ｅ１８４Ａ、Ｅ１８４Ｄ、Ｅ１８４Ｒ、Ｅ１８４Ｔ、Ｅ１８４Ｖ、Ｅ１８５Ｔ、Ｍ１８７Ｌ、Ｍ１８９Ｉ、Ｋ１９１Ａ、Ｋ１９１Ｇ、Ｋ１９１Ｈ、Ｋ１９１Ｍ、Ｋ１９１Ｎ、Ｋ１９１Ｒ、Ｋ１９１Ｓ、Ｋ１９１Ｔ、Ｋ１９１Ｗ、Ｅ１９７Ａ、Ｅ１９７Ｄ、Ｅ１９７Ｆ、Ｅ１９７Ｋ、Ｅ１９７Ｍ、Ｅ１９７Ｑ、Ｅ１９７Ｓ、Ｅ１９７Ｔ、Ｅ１９７Ｖ、Ｉ２０１Ｃ、Ｉ２０１Ｅ、Ｉ２０１Ｆ、Ｉ２０１Ｈ、Ｉ２０１Ｌ、Ｉ２０１Ｓ、Ｉ２０１Ｔ、Ｉ２０１Ｖ、Ｈ２０３Ｋ、Ｌ２１９Ｍ、Ｌ２１９Ｗ、Ｆ２２０Ｌ、Ｖ２２３Ｉ、Ｆ２２５Ｙ、Ｈ２３０Ｆ、Ｈ２３０Ｌ、Ｈ２３０Ｙ、Ｎ２３２Ｓ、Ｙ２４６Ｆ、Ｆ２４９Ｗ、Ｄ２５０Ｅ、Ｓ２７４Ａ、Ｓ２７４Ｃ、Ｓ２７４Ｇ、Ｓ２７４Ｎ、Ｓ２７４Ｔ、Ｌ２７８Ｍ、Ａ２８０Ｇ、Ａ２８０Ｓ、Ａ２８０Ｔ、Ｇ２８１Ｓ、Ａ２８２Ｍ、Ａ２８２Ｐ、Ｇ２８４Ｎ、Ｉ２８５Ｌ、Ｖ３０３Ｌ、Ｖ３０３Ｓ、Ｆ３０６Ｗ、Ｆ３０６Ｙ、Ｓ３１１Ｎ、Ｋ３１５Ｅ、Ｄ３１７Ｅ、Ｄ３１７Ｋ、Ｉ３３１Ｃ、Ｉ３３１Ｌ、Ｉ３３１Ｎ、Ｉ３３１Ｓ、Ｉ３３１Ｔ、Ｉ３３１Ｖ、Ｎ３３３Ｔ、Ｐ３３４Ｎ、Ｐ３３５Ｔ、Ｌ３３７Ｔ、Ｌ３３８Ａ、Ｌ３３８Ｑ、Ｓ３４１Ｉ、Ｋ３７３Ｅ、Ｋ３７３Ｎ、Ｎ３７５Ａ、Ｎ３７５Ｈ、Ｙ３７６Ｃ、Ｙ３７６Ｆ、Ｙ３７６Ｌ、Ｋ３７８Ｇ、Ｋ３７８Ｐ、Ｋ３７８Ｑ、Ｋ３７８Ｒ、Ｋ３８０Ｇ、Ｋ３８０Ｓ、Ａ３８２Ｇ、Ａ３８２Ｒ、Ａ３８２Ｔ、Ｔ３８３Ｓ、Ｋ３８４Ｇ、Ｋ３８４Ｎ、Ｐ３８６Ｋ、Ｐ３８６Ｓ、Ｖ３８７Ｌ、Ｎ３８９Ｅ、Ｉ４０５Ｌ、Ｆ４０７Ｙ、Ｓ４０８Ｄ、Ｓ４０８Ｎ、Ｎ４１１Ｒ、Ｄ４１３Ｓ、Ｄ４１３Ｖ、Ｑ４１６Ｔ、Ｅ４１９Ａ、Ｅ４１９Ｌ、Ｋ４２０Ｅ、Ｒ４２１Ｎ、Ｖ４２４Ｉ、Ｋ４２７Ｍ、Ｎ４２９Ｅ、Ｇ４３２Ａ、及びＡ４３６Ｔからなる群から選択されるアミノ酸置換のうちの、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個を含む。更なる態様において、キヌレニナーゼは、表１に記載するキヌレニナーゼのうちの１つに、少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である。特定の態様において、キヌレニナーゼは、表１に記載するもののうちの１つから選択される。いくつかの態様では、例えば表１に従ったキヌレニナーゼは、ＰＥＧ化されていてもよいし、又はＰＥＧ化されていなくてもよい。
【００６２】
下表１は、本開示の組成物及び方法と組み合わせて使用可能な、様々なキヌレニナーゼ酵素について記載する。表１には明示的に列挙しないものの、本明細書における「タンパク質（１）」とは、野生型ヒトキヌレニナーゼを意味し、そのアミノ酸配列は配列番号：１に記載されている。
【００６３】
（表１）実施形態の例示的なキヌレニナーゼ酵素
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【００６４】
ＩＶ．治療法のための酵素によるキヌレニン分解
特定の態様では、ポリペプチドは、キヌレニンを枯渇させる酵素による治療と共に、キヌレニンの枯渇に感受性である癌を含む病気に使用され、腫瘍が媒介する寛容原性の効果を妨げ、代わりに腫瘍除去型の炎症誘発性反応に介在する。特定の態様では、キヌレニナーゼは、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２及び／又はＴＤＯを発現している腫瘍を治療することにおける使用について企図される。
【００６５】
本発明の特定の態様は、腫瘍のような病気を治療するための修飾キヌレニナーゼを提供する。特に、修飾ポリペプチドはヒトポリペプチド配列を有してよく、したがって、ヒト患者にてアレルギー反応を防止し、反復投薬が可能となり、治療効果を増加させる。
【００６６】
本発明の方法が有用である腫瘍としては、任意の悪性細胞型、例えば、充実性腫瘍又は血液腫瘍にみられるものが挙げられる。例示的な充実性腫瘍としては、限定されないが、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭部、頸部、卵巣、腎臓、咽頭、肉腫、肺、膀胱、黒色腫、前立腺及び乳房からなる群から選択される臓器の腫瘍を挙げることができる。例示的な血液腫瘍としては、骨髄の腫瘍、Ｔ細胞又はＢ細胞の悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、芽腫、骨髄腫などが挙げられる。本明細書において提供する方法を使用して治療され得る癌の更なる例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、白血病、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌など）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（胃腸癌及び消化管間質腫瘍など）、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮体又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌又は腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、様々な種類の頭頸癌、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫、結節型黒色腫、及びＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ性ＮＨＬ；高悪性度小型非分割細胞ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳに伴うリンパ腫；及びワルデンストレームマクログロブリン血症、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、毛様細胞性白血病、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）並びに慢性骨髄芽球性白血病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
癌は特に、以下の組織学的種類を有していてもよいが、これらに限定されない。新生物、悪性；癌腫；癌腫、未分化；巨細胞及び紡錘細胞癌腫；小細胞癌腫；乳糖癌腫；扁平上皮細胞癌腫；リンパ上皮癌腫；基底細胞癌腫；石灰化上皮癌腫；移行細胞癌腫；乳糖移行細胞癌腫；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌腫；肝細胞癌腫；肝細胞がん胆管細胞がんの混合型；索状腺癌；腺様嚢胞癌腫；腺腫性ポリープ中の腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス；固形癌腫；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支−肺胞腺癌；乳糖腺癌；色素嫌性癌腫；好酸性癌腫；好酸性腺癌；好塩基性癌腫；明細胞腺癌；顆粒細胞癌腫；濾胞状腺癌；乳糖及び濾胞状腺癌；非被包性硬化性癌腫；副腎皮質癌腫；類内膜癌腫；皮膚付属器癌腫；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘膜表皮癌腫；嚢胞腺癌；乳糖嚢胞腺癌；乳糖漿液性嚢胞腺癌；粘液嚢胞腺癌；粘液腺癌；印環細胞癌腫；浸潤性導管癌腫；髄様癌腫；小癌腫；炎症性癌腫；ページェット病、乳房；腺房細胞癌腫；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生随伴腺癌；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；卵胞膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫瘍、悪性；男性胚腫、悪性；セルトリ細胞癌腫；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑中の悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胎児性癌腫；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌腫；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管周囲細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨ユーイング肉腫の巨細胞腫瘍；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽腫；乏突起膠腫；乏突起膠腫；未分化神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅神経腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞状；菌状息肉腫；他の特定の非ホジキンリンパ腫；ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；マスト細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；ヘアリー細胞白血病；及びヘアリー細胞白血病。
【００６８】
キヌレニナーゼは、腫瘍組織からキヌレニン及び／若しくはキヌレニン由来の代謝産物を枯渇させる種々のモダリティにて、又は癌の哺乳類の循環にて、又はその枯渇が望ましいとみなされる場合のキヌレニンの枯渇のために抗腫瘍剤として本明細書で使用されてもよい。
【００６９】
枯渇は、哺乳類の循環においてインビボで、組織培養又は他の生物学的培地におけるキヌレニン及び／又はキヌレニン由来の代謝産物の枯渇が望まれる場合インビトロで、及び生物学的な流体、細胞又は組織がエクスビボで操作され、その後患者哺乳類の体に戻される生体外処置にて実施することができる。血液循環、培養培地、生物学的流体、又は細胞からキヌレニンを枯渇させることにより、治療される物質に到達可能なキヌレニンの量が低下し、それ故、この操作は、接触している物質にて周囲にあるキヌレニンを分解するためのキヌレニンを枯渇させる条件下において、キヌレニンを枯渇させる量のキヌレニナーゼを、物質と接触させることを含む。
【００７０】
枯渇は、細胞用の栄養源に向けられてよく、必ずしも細胞そのものに向けられる必要はない。したがって、インビボ用途において、腫瘍細胞を治療することは、腫瘍細胞の集団のための栄養媒体をキヌレニナーゼと接触させることを含む。本実施形態において、媒体は血液、リンパ液、脊髄液、及びキヌレニンの枯渇が望まれる類似の体液であることができる。
【００７１】
キヌレニン及び／又はキヌレニン由来の代謝産物枯渇の有効性は、用途に応じて広く変化することができ、通常、物質に存在するキヌレニンの量、枯渇の所望の速度、及びキヌレニナーゼへの暴露についての物質の耐性に左右される。物質内でのキヌレニン及びキヌレニン代謝産物の量、またそれ故、物質からのキヌレニン及びキヌレニン代謝産物の枯渇速度は、当該技術分野において周知の種々の化学的及び生化学的手法により速やかに監視されることができる。例となるキヌレニン枯渇の量は本明細書で更に記載され、処理される物質のミリリットル（ｍＬ）当たり０．００１〜１００ユニット（Ｕ）のキヌレニナーゼ、好ましくは約０．０１〜１０Ｕ、更に好ましくは約０．１〜５Ｕのキウレニナーゼの範囲であり得る。典型的な用量は、体重に基づいて投与されることが可能であり、約５〜１０００Ｕ／キログラム（ｋｇ）／日、好ましくは約５〜１００Ｕ／ｋｇ／日、より好ましくは約１０〜５０Ｕ／ｋｇ／日、及びより好ましくは約２０〜４０Ｕ／ｋｇ／日の範囲である。
【００７２】
キヌレニンを枯渇させる条件は、キヌレニナーゼの生物活性に適合する緩衝液及び温度条件であり、適度な温度、塩、及び酵素と適合するｐＨ条件（例えば生理学的条件）が挙げられる。例示的条件としては、約４〜４０℃、約０．０５〜０．２ＭのＮａＣｌに等しいイオン強度、及び約５〜９のｐＨが挙げられるが、生理学的条件も含まれる。
【００７３】
特定の実施形態では、本発明は、キヌレニナーゼを抗腫瘍剤として使用する方法を企図し、それ故、腫瘍細胞を阻害するのに十分な時間、腫瘍細胞の集団を治療上有効な量のキヌレニナーゼと接触させることを含む。
【００７４】
治療上有効な量のキヌレニナーゼは、所望の効果、すなわち、腫瘍組織又は患者の血液循環中のキヌレニンを枯渇させることにより、腫瘍を切除するプロ炎症性応答を媒介することを達成するために計算された、所定の量である。したがって、本発明のキヌレニナーゼの投与のための用量範囲は、腫瘍細胞の分裂及び細胞周期の症状が減少する所望の効果を生み出すのに十分大きな範囲である。用量は、過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全、神経学的効果などの副作用を引き起こすほど大きなものであってはならない。通常、用量は、患者の年齢、状態、性別、及び病気の程度により変化し、当業者により決定することができる。合併症の場合、用量は個々の医師により調節することが可能である。
【００７５】
キヌレニナーゼは注射、又は時間の経過と共に徐々に注入することにより非経口投与されることができる。キヌレニナーゼは、静脈内、腹腔内、経口、筋肉内、皮下、腔内、経皮、皮膚投与することができ、蠕動手段によって送達することができ、腫瘍細胞を含有する組織に直接注射することができ、又はキヌレニン用の有望なバイオセンサーを含有し得るカテーテルに接続したポンプによって投与することができる。
【００７６】
キヌレニナーゼを含有する治療用組成物は例えば、単位用量を注射することにより従来的に静脈内投与される。用語「単位用量」とは、治療用組成物に関して使用する場合、対象にとって一体型用量として好適な物理的に個別の単位であって、各単位が、必要な希釈剤、すなわち担体又はビヒクルと合わせて、所望の治療効果をもたらすように計算された、所定の量の活性物質を含有する単位を意味する。
【００７７】
組成物は、投与製剤に適合した方法で、治療上有効な量で投与される。投与される量は、治療される対象、活性成分を利用する、対象の全身の能力、及び、所望の治療効果の程度に左右される。投与されるのに必要な活性成分の正確な量は、施術者の判断に応じて変わり、各個体で固有である。しかし、全身適用のための好適な用量範囲が本明細書にて開示され、この範囲は投与経路に応じて変化する。初期投与及び追加投与に好適なレジメンもまた企図され、これらは初期投与、続いて後続の注射又は他の投与により１時間以上の間隔で繰り返される反復投薬により典型的に表される。例示的な複数の投与が本明細書で記載され、これらは特に、キヌレニナーゼの血清での濃度及び組織での濃度を持続的に高く維持し、キヌレニンの血清及び組織での濃度を逆に低く維持するのが好ましい。あるいは、インビボ治療のために指定した範囲に血液内での濃度を十分に維持するための連続的静脈内注入が企図される。
【００７８】
Ｖ．コンジュゲート
本発明の組成物及び方法は、例えば、異種ペプチド断片又はポリマー（例えばポリエチレングリコール）とコンジュゲートを形成することによる修飾キヌレニナーゼを伴う。更なる態様において、キヌレニナーゼをＰＥＧに結合させ、酵素の流体力学的半径を増加させることにより血清持続性を増加させることができる。特定の態様において、開示したポリペプチドは、腫瘍細胞の外部受容体又は結合部位に特異的に、かつ安定して結合する能力を有するリガンドなどの任意の標的化作用物質（米国特許出願公開第２００９／０３０４６６６号）に抱合することができる。
【００７９】
Ａ．融合タンパク質
本発明の特定の実施形態は、融合タンパク質に関する。これらの分子は、Ｎ又はＣ末端にて異種ドメインに結合した、天然又は修飾キヌレニナーゼを有してよい。例えば、融合には他の種からのリーダー配列もまた用いて、異種宿主におけるタンパク質の組換え発現を可能にすることができる。別の有用な融合としては、タンパク質親和性タグ（例えば血清アルブミン親和性タグ若しくは６個のヒスチジン残基）、又は、好ましくは切断可能であり、融合タンパク質の精製を促進する免疫活性ドメイン（例えば抗体エピトープ）の付加が挙げられる。非限定的な親和性タグとしては、ポリヒスチジン、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられる。
【００８０】
特定の実施形態では、キヌレニナーゼは、インビボでの半減期を増大させるペプチド、例えばＸＴＥＮポリペプチド（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、アルブミン、又はアルブミン結合ペプチドに結合してよい。
【００８１】
融合タンパク質を生成する方法は、当業者には周知である。このようなタンパク質は、例えば、完全な融合タンパク質の新規合成、又は、異種ドメインをコードするＤＮＡ配列の結合、そしてそれに続く、インタクトな融合タンパク質の発現により、作製することができる。
【００８２】
親タンパク質の機能活性を回復させる融合タンパク質の作製は、一列に接続したポリペプチドの間でスプライシングされたペプチドリンカーをコードする架橋ＤＮＡセグメントに遺伝子を接続することにより促進され得る。リンカーは、得られる融合タンパク質の適切な折り畳みを可能にするのに十分な長さである。
【００８３】
Ｂ．ＰＥＧ化
本発明の特定の態様では、キヌレニナーゼのＰＥＧ化に関する方法及び組成物が開示される。例えば、本明細書で開示される方法に従いキヌレニナーゼをＰＥＧ化することができる。
【００８４】
ＰＥＧ化は、ポリ（エチレングリコール）ポリマー鎖の、別の分子（通常、薬剤又は治療用タンパク質）への共有結合プロセスである。ＰＥＧ化は、標的巨大分子によるＰＥＧの反応性誘導体のインキュベーションによりルーチン的に達成される。ＰＥＧを薬剤又は治療用タンパク質に共有結合することにより、宿主免疫系（免疫原性及び抗原性が低下）から作用物質を「マスク」することができるか、又は作用物質流体力学的サイズ（溶液中でのサイズ）を増加させることができ、これにより、腎クリアランスを低下させることにより循環時間を延ばす。ＰＥＧ化はまた、疎水性薬剤及びタンパク質に水溶性を付与することもできる。
【００８５】
ＰＥＧ化の第１工程は、ＰＥＧポリマーの一端又は両端を好適に官能基化することである。各末端が同じ反応性部位で活性化されたＰＥＧは「ホモ二官能性」として知られる一方、存在する官能基が異なる場合、ＰＥＧ誘導体は「ヘテロ二官能性」又は「ヘテロ官能性」と呼ばれる。ＰＥＧポリマーの化学的に活性な、又は活性化された誘導体は、ＰＥＧに所望の分子を付加して調製される。
【００８６】
ＰＥＧ誘導体での好適な官能基の選択は、ＰＥＧに結合する分子において利用可能な反応性基の種類に基づく。タンパク質に関して、典型的な反応性アミノ酸としては、リジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、及びチロシンが挙げられる。Ｎ末端アミノ基及びＣ末端カルボン酸もまた使用可能である。
【００８７】
第１世代のＰＥＧ誘導体の形成に使用する技術は通常、ＰＥＧポリマーをヒドロキシル基、通常は無水物、酸塩化物、クロロホルメート、及び炭酸塩と反応する基と反応させることである。第２世代のＰＥＧ化化学では、より効率的な官能基、例えばアルデヒド、エステル、アミドなどが、抱合に利用可能となる。
【００８８】
ＰＥＧ化の用途はより一層発達し洗練されているため、コンジュゲート用のヘテロ二官能性ＰＥＧの必要性が増加している。親水性で柔軟、かつ生体適合性のスペーサーが必要とされる場合において、これらのヘテロ二官能性ＰＥＧは２つの構成要素を結合するのに非常に有用である。ヘテロ二官能性ＰＥＧに対する好ましい末端基は、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アミン、カルボン酸、及びＮＨＳエステルである。
【００８９】
最も一般的な修飾剤、即ちリンカーは、メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）分子をベースにする。これらの活性は、アルコール末端へのタンパク質修飾基の付加に依存する。場合によっては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧジオール）を前駆体分子として使用する。ジオールはその後、ヘテロ又はホモ二量体ＰＥＧ結合分子を作製するために、両端が修飾される。
【００９０】
タンパク質は通常、求核性部位、例えば非プロトン化チオール（システイニル残基）又はアミノ基にてＰＥＧ化される。システイニル特異的修飾剤の例としては、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧヨードアセテート、ＰＥＧチオール、及びＰＥＧビニルスルホンが挙げられる。これら４つ全ては、穏やかな条件下にて非常にシステイニル特異的であり、中性からわずかにアルカリ性のｐＨであるが、それぞれ、いくつかの欠点を有する。マレイミドを用いて形成されるチオエーテルは、アルカリ性条件下で幾分不安定となり得、これにより、このリンカーを用いる製剤化オプションには若干の制限が存在し得る。ヨードＰＥＧを用いて形成したカルバモチオエート結合はより安定しているが、遊離ヨウ素がいくつかの条件下でチロシン残基を修飾する可能性がある。ＰＥＧチオールはタンパク質チオールとジスルフィド結合を形成するが、この結合もまた、アルカリ性条件下にて不安定となり得る。ＰＥＧ−ビニルスルホン反応性は、マレイミド及びヨードＰＥＧと比較して遅いが、形成されるチオエーテル結合は極めて安定している。この、より遅い反応速度によってもまた、ＰＥＧ−ビニルスルホン反応の制御を一層容易にすることができる。
【００９１】
天然システイニル残基における部位特異的ＰＥＧ化は、これらの残基が通常、ジスルフィド結合の形態をとっているか、又は生物活性のために必要とされるため、滅多に行われない。他方では、部位特異的突然変異誘発を使用して、チオール特異的リンカーのためにシステイニルＰＥＧ化部位を組み込むことができる。システイン変異は、ＰＥＧ化試薬が到達可能であり、かつＰＥＧ化後も依然として生物学的に活性であるように設計されなければならない。
【００９２】
アミン特異的修飾試薬としては、ＰＥＧ  ＮＨＳエステル、ＰＥＧトレシレート、ＰＥＧアルデヒド、ＰＥＧイソチオシアネート、及びいくつかの他の試薬が挙げられる。これらは全て、穏やかな条件下で反応し、アミノ基に対して非常に特異的である。ＰＥＧ  ＮＨＳエステルはおそらく、より反応性の高い試薬の１つであるが、その高反応性により、大規模ではＰＥＧ化反応の制御が困難となり得る。ＰＥＧアルデヒドはアミノ基と共にイミンを形成し、これが次に、シアノ水素化ホウ素ナトリウムにより二級アミンに還元される。ホウ化水素ナトリウムとは異なり、シアノ水素化ホウ素ナトリウムはジスルフィド結合を還元しない。しかし、この化学物質は非常に毒性があり、特に揮発性となる低ｐＨにおいては、注意深く取り扱われなければならない。
【００９３】
大部分のタンパク質に存在する複数のリジン残基により、部位特異的ＰＥＧ化は困難であり得る。幸運なことに、これらの試薬は、非プロトン化アミノ基と反応するため、低いｐＨにて反応を実施することにより、ＰＥＧ化を低ｐＫアミノ基に向けることが可能である。一般的に、αアミノ基のｐＫは、リジン残基のεアミノ基よりも１〜２ｐＨ単位低い。ｐＨ７以下で分子をＰＥＧ化することにより、Ｎ末端に対する高選択性を頻繁に得ることができる。しかし、このことは、タンパク質のＮ末端部分が生物活性のために必要とされない場合にのみ実行可能である。依然として、ＰＥＧ化による薬物動態上の利点は頻繁に、インビトロ生物活性の著しい損失よりも優り、ＰＥＧ化化学反応に関係なく、はるかに大きいインビボ生物活性を有する生成物をもたらす。
【００９４】
ＰＥＧ化手順を開発する際には、考えるべきいくつかのパラメータが存在する。幸運なことに、鍵となるパラメータは通常、４個又は５個以下である。ＰＥＧ化条件の最適化のための「実験の設計」アプローチは、非常に有用であることができる。チオール特異的ＰＥＧ化反応に関しては、考慮するパラメータとしては、タンパク質濃度、タンパク質に対するＰＥＧの比率（モル基準）、温度、ｐＨ、反応時間、及び場合によっては、酸素の除外が挙げられる。（酸素は、タンパク質による分子間ジスルフィド形成に寄与することができ、これにより、ＰＥＧ化生成物の収率が低下する。）ｐＨが、特にＮ末端アミノ基を標的化する場合には更に一層重要となり得ることを除いて、アミン特異的改変についても同じ因子（酸素は除外）が考慮されなければならない。
【００９５】
アミン特異的及びチオール特異的修飾の両方に関して、反応条件はタンパク質の安定性に影響を及ぼし得る。これは温度、タンパク質濃度、及びｐＨを制限し得る。加えて、ＰＥＧリンカーの反応性は、ＰＥＧ化反応を開始する前に知られていなければならない。例えば、ＰＥＧ化剤が７０％しか活性でない場合、使用するＰＥＧの量は、活性ＰＥＧ分子のみが、タンパク質−ＰＥＧ反応化学量論で確実に数えられなければならない。
【００９６】
ＶＩ．タンパク質及びペプチド
ある種の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのタンパク質又はペプチド、例えばキヌレニナーゼを含む新規組成物に関する。これらのペプチドは、融合タンパク質に含まれるか、又は上述の作用物質に抱合されてよい。
【００９７】
本明細書で使用する場合、タンパク質又はペプチドは一般に、遺伝子から翻訳された完全長配列までの、約２００個のアミノ酸より大きいタンパク質；約１００個のアミノ酸より大きいポリペプチド；及び／又は約３〜約１００個のアミノ酸のペプチドを意味するが、これらに限定されない。便宜上、用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、又は「ペプチド」は、本明細書では同じ意味で用いられる。
【００９８】
本明細書で使用する場合、「アミノ酸残基」とは、任意の自然に生じるアミノ酸、任意のアミノ酸誘導体、又は、当該技術分野において公知の任意のアミノ酸模倣物を意味する。特定の実施形態において、タンパク質又はペプチドの残基は、アミノ酸残基の配列を中断する、あらゆる非アミノ酸が存在せず、連続している。別の実施形態において、配列は、１つ以上の非アミノ酸部分を含んでよい。特定の実施形態では、タンパク質又はペプチドの残基の配列は、１つ以上の非アミノ酸部位により中断されてよい。
【００９９】
したがって、用語「タンパク質又はペプチド」は、自然に生じるタンパク質に見出される、２０種類の共通のアミノ酸のうち少なくとも１つ、又は、少なくとも１種の修飾若しくは普通でないアミノ酸を含むアミノ酸配列を包含する。
【０１００】
タンパク質又はペプチドは、標準的な分子生物学技術による、タンパク質、ポリペプチド、若しくはペプチドの発現、タンパク質若しくはペプチドの天然源からの単離、又は、タンパク質若しくはペプチドの化学合成を含む、当業者に既知の任意の技術により作製することができる。様々な遺伝子に対応するヌクレオチド及びタンパク質、ポリペプチド、並びにペプチド配列は以前に開示されており、当業者に知られている、コンピュータ化されたデータベースにて発見することができる。このようなあるデータベースは、国立生物工学情報センターのＧｅｎｂａｎｋ及びＧｅｎＰｅｐｔデータベース（ワールドワイドウェブのｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／で利用可能）である。既知の遺伝子のコード領域を、本明細書にて開示した技術、又は当業者に既知の技術を使用して増幅及び／又は発現することができる。あるいは、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドの様々な商業的調製が、当業者に既知である。
【０１０１】
ＶＩＩ．核酸及びベクター
ある種の本発明の態様において、キヌレニナーゼをコードする核酸配列、又はキヌレニナーゼを含有する融合タンパク質が開示され得る。使用する発現系に応じて、核酸配列を、従来の方法に基づいて選択することができる。例えば、キヌレニナーゼがヒトキヌレニナーゼに由来し、Ｅ．ｃｏｌｉでは滅多に利用されない複数のコドンを含有する場合、このキヌレニナーゼは発現を妨げ得る。したがって、対応する遺伝子又はそのバリアントは、Ｅ．ｃｏｌｉの発現に最適化されたコドンであってよい。種々のベクターもまた使用して、目的のタンパク質を発現させることができる。例示的なベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾン、又はリポソーム系ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
ＶＩＩＩ．宿主細胞
宿主細胞は、キヌレニナーゼとそのコンジュゲートの発現及び分泌を可能にするよう形質転換され得る任意の宿主細胞であってよい。宿主細胞は細菌、哺乳類細胞、酵母菌、又は糸状菌であってよい。様々な細菌としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ及びＢａｃｉｌｌｕｓが挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、又はＰｉｃｈｉａ属に属する酵母菌が、適切なものとしての使用が見出される。
【０１０３】
ＩＸ．医薬組成物
新規のキヌレニナーゼは、腫瘍細胞の増殖を阻害するため、そしてより好ましくは、局所的に進行した、又は転移性癌を患う癌患者における癌細胞を殺傷するために、全身的に、又は局所的に投与することができると企図されている。これらは、静脈内投与、髄腔内投与、及び／又は腹腔内投与することができる。これらは単独で、又は抗増殖剤と共に投与することができる。一実施形態では、これらは手術、又は他の手技の前に、患者の癌の負荷を減らすために投与される。あるいは、これらを手術後に投与して、残っていたいかなる癌（例えば、手術で除去できなかった癌）も生存していないことを確かめることができる。
【０１０４】
本発明が、治療用調製物の特定の性質により限定されることを意図するものではない。例えば、このような組成物は、生理学的に許容される液体、ゲル、又は固体担体、希釈剤、及び賦形剤と共に製剤中に提供することができる。これらの治療用調製物は、他の治療薬に類似の方法で、獣医学用の哺乳類（例えば家庭用動物）、及び、ヒトでの臨床的用途で投与することができる。一般に、治療効果のために必要な用量は、使用の種類及び投与方法、並びに、個々の対象での特定の必要条件に従い変化する。
【０１０５】
このような組成物は通常、注射液として、溶液又は懸濁液として調製される。好適な希釈剤及び賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールなど、及びこれらの組み合わせである。加えて、所望する場合、組成物は、微量の補助物質、例えば湿潤剤若しくは乳化剤、安定化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有してよい。
【０１０６】
臨床用途を企図する場合、目的の用途に適切な形態でタンパク質、抗体、及び薬剤を含む医薬組成物を調製することが必要であり得る。通常、医薬組成物は、薬学上許容される担体中に溶解又は分散した、有効量の１つ以上のキヌレニナーゼ又は追加の作用物質を含んでよい。語句「薬学上又は薬理学上許容される」とは、動物、例えばヒトに適切に投与された場合に、副反応、アレルギー反応、又は他の副作用を生み出さない、分子要素及び組成物を意味する。本明細書にて開示した方法で単離した少なくとも１つのキウレニナーゼ、又は追加の活性成分を含有する医薬組成物の調製は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，１９９０（参照により本明細書に組み込まれている）に例示されているように、本開示の観点から当業者に既知である。更に、動物（例えば、ヒト）投与に関して、調製物は、生物学規格のＦＤＡオフィスにより必要とされる、生殖不能性、発熱原性、一般的な安全性、及び純度規格を満たさなければならないことが理解されよう。
【０１０７】
本明細書で使用する場合、「薬学上許容される担体」としては、当業者に既知の全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌物質、抗カビ剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬剤、薬剤安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香料、染料、このような類似の材料及びこれらの組み合わせが挙げられる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，１９９０を参照のこと：参照により本明細書に組み込まれている）。任意の従来の担体が活性成分と非相溶性である場合を除いて、医薬組成物での使用が企図される。
【０１０８】
本発明の特定の実施形態は、固体、液体、又はエアゾール形態のどれで投与されるのか、そして、注射などの投与経路に対して滅菌する必要があるのか否かに応じて、異なる種類の担体を含んでよい。組成物は、吸入（例えばエアゾール吸入）により、注射により、注入により、連続注入により、標的細胞を直接浸す局所潅流により、カテーテルにより、洗浄により、脂質組成物（例えばリポソーム）内で、若しくはその他の方法によって、又は当業者に既知の前述の方法の任意の組み合わせにより、静脈内、皮内、経皮、髄腔内、動脈内、腹腔内、鼻孔内、腟内、直腸内、筋肉内、皮下、粘膜、経口、局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、局所（ｌｏｃａｌｌｙ）投与されることができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，１９９０を参照のこと：参照により本明細書に組み込まれている）。
【０１０９】
修飾ポリペプチドを製剤化して、遊離塩基、中性、又は塩形態の組成物にすることができる。薬学上許容される塩としては、酸付加塩、例えば、タンパク様組成物の遊離アミノ基と形成したもの、又は、無機酸、例えば、塩酸若しくはリン酸、若しくは、有機酸（酢酸、シュウ酸、酒石酸、若しくはマンデル酸）と形成したものが挙げられる。遊離カルボキシル基と形成した塩もまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、若しくは水酸化第二鉄などの無機塩基、又は、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、若しくはプロカインなどの有機塩基に由来することができる。製剤化の際、溶液は、投与製剤と適合性のある方法で、そして、治療上有効な量で投与される。製剤は、様々な投薬形態で容易に投与される、例えば、非経口的投与用に、例えば、注射可能な溶液、若しくは肺送達用のエアゾールに製剤化される、又は、消化管投与用に、例えば薬物放出カプセルなどに製剤化される。
【０１１０】
本発明の特定の態様に更に従うと、投与に好適な組成物は、不活性希釈剤と共に、又は不活性希釈剤無しで、薬学上許容される担体中に提供されてよい。担体は同化可能でなければならず、液体、半固体（即ち、ペースト）、又は固体担体を含む。任意の従来の媒体、作用物質、希釈剤、又は担体が、レシピエント、又はこれらの中に含有される組成物の治療効果に有害作用を及ぼす場合を除いて、本方法を実施するのに用いるために、投与可能な組成物中でのこれらを使用することは適切なことである。担体又は希釈剤の例としては、脂肪、油類、水、食塩水、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、フィラーなど、又はこれらの組み合わせが挙げられる。組成物は、１種以上の構成成分の酸化を遅延させるための、様々な酸化防止剤もまた含むことができる。更に、微生物の作用の防止を、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、又はこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、様々な抗菌及び抗カビ剤などの防腐剤によりもたらすことができる。
【０１１１】
本発明の特定の態様に従うと、組成物を、任意の従来の、そして実践的な方法で、即ち、溶解、懸濁、乳化、混合、封入、吸収などにより、担体と組み合わせる。このような手順は、当業者には日常的なものである。
【０１１２】
本発明の特定の実施形態においては、組成物を、半固体又は固体担体と、完全に組み合わせる、又は混合する。任意の従来の方法、例えば粉砕により、混合を実施することができる。治療活性の喪失、即ち胃での変性から組成物を保護するために、安定化剤もまた、混合プロセスで添加することができる。組成物中で使用するための安定剤の例としては、緩衝剤、アミノ酸（グリシン及びリジンなど）、炭化水素（例えば、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マニトールなど）が挙げられる。
【０１１３】
更なる実施形態では、本発明は、キヌレニナーゼ、１種以上の脂質、及び水性溶媒を含む薬剤用脂質ビヒクル組成物の使用に関することができる。本明細書で使用する場合、用語「脂質」は、性質的に非水溶性であり、有機溶媒で抽出可能な、広範囲の物質のいずれかを含むように定義される。この広い分類の化合物は当業者に公知であり、用語「脂質」を本明細書で使用する場合、これは任意の特定の構造に限定されない。例としては、長鎖脂肪族炭化水素及びその誘導体を含有する化合物が挙げられる。脂質は、天然に存在する、又は合成であることができる（即ち、人により設計されてよい、若しくは作製されてよい）。しかし、脂質は通常、生物学的物質である。生物学的脂質は当該技術分野において周知であり、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、グリコスフィンゴリピド、糖脂質、サルファタイド、エーテル及びエステル結合脂肪酸を有する脂質、重合性脂質、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。もちろん、当業者により脂質として理解される、本明細書で具体的に記載するもの以外の化合物もまた、組成物及び方法により包含される。
【０１１４】
当業者は、脂質ビヒクル中に組成物を分散させるのに使用可能な技術の範囲に精通しているであろう。例えば、キヌレニナーゼ又はその融合タンパク質は、脂質を含有する溶液に分散するか、脂質と共に溶解させるか、脂質と共に乳化するか、脂質と混合するか、脂質と組み合わせるか、脂質に共有結合させるか、脂質中に懸濁液として含有させるか、ミセル若しくはリポソームと共に含有させるか若しくは複合体を形成するか、又は別様では、当業者に既知の任意の方法により、脂質若しくは脂質構造体と会合させてよい。分散体はリポソームの形成をもたらしても、もたらさなくてもよい。
【０１１５】
動物患者に投与される組成物の、実際の投与量は、物理的及び生理学的因子、例えば、体重、状態の深刻度、治療中の疾患の種類、以前又は同時発生の治療的介入、患者の突発性疾患、及び投与経路により決定することができる。用量及び投与経路に応じて、好ましい用量の投与数及び／又は有効量は、対象の応答によって変化し得る。投与の責任を負う施術者はいずれにせよ、組成物中での活性成分の濃度、及び、個体対象に対する適切な投与量を決定する。
【０１１６】
特定の実施形態において、医薬組成物は例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含んでよい。別の実施形態において、活性化合物は、例えば、単位の体重の約２％〜約７５％、又は約２５％〜約６０％、そして、これらの中のあらゆる範囲変数を占めてよい。自然には、治療上有用な各組成物の活性化合物の量は、好適な用量が、化合物の任意の所与の単位用量で得られるように準備してよい。溶解度、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、生成物の貯蔵寿命、及び他の薬理学的考慮などの因子が、このような薬学製剤を調製する当業者により企図され、そのために、様々な用量及び治療レジメンが望ましい場合がある。
【０１１７】
別の非限定例において、用量はまた、１回の投与あたり、約１μｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重、約１０μｇ／ｋｇ／体重、約５０μｇ／ｋｇ／体重、約１００μｇ／ｋｇ／体重、約２００μｇ／ｋｇ／体重、約３５０μｇ／ｋｇ／体重、約５００μｇ／ｋｇ／体重、約１ｍｇ／ｋｇ／体重、約５ｍｇ／ｋｇ／体重、約１０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約２００ｍｇ／ｋｇ／体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５００ｍｇ／ｋｇ／体重、から約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重まで、又はそれ以上、及びこれらの中の任意の範囲変数を含んでよい。本明細書で列挙する数から誘導可能な範囲の非限定例において、上記の数に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ／体重などの範囲を投与することができる。
【０１１８】
Ｘ．併用治療
特定の実施形態において、本実施形態の組成物及び方法は、キヌレニナーゼを第２又は追加の治療法と組み合わせて投与することを伴う。そのような治療法は、キヌレニンの依存性に関係する任意の病気の治療に適用することができる。例えば、疾患は癌であってもよい。
【０１１９】
併用療法を含む方法及び組成物は、治療若しくは予防効果を高め、かつ／又は、別の抗癌若しくは抗増殖過剰療法の治療効果を増加させる。治療及び予防方法、及び組成物は、癌細胞の殺傷及び／又は細胞の過剰増殖の阻害といった所望の効果を達成するのに効果的な組み合わせた量で提供されることができる。本プロセスは、キヌレニナーゼ及び第２の治療法を投与することを伴ってよい。第２の治療法は直接的な細胞毒性効果を有していても、有していなくてもよい。例えば、第２の治療法は、直接的な細胞毒性効果を有することなく免疫系を上方制御する作用物質であることができる。組織、腫瘍、又は細胞を、１つ以上の作用物質（例えばキヌレニナーゼ若しくは抗癌剤）を含む１つ以上の組成物又は薬理学的配合物に曝すことが可能であり、又は、組織、腫瘍、及び／若しくは細胞を２種以上の異なる組成物若しくは配合物に曝すことが可能であり、ここで、ある組成物は、１）キヌレニナーゼ、２）抗癌剤、又は３）キヌレニナーゼと抗癌剤の両方、を提供する。また、そのような併用療法は、化学療法、放射線治療、外科的療法、又は免疫療法と共に使用することができると考えられている。
【０１２０】
細胞に適用される場合、用語「接触した」及び「曝された」は、本明細書において、治療用構築物及び化学療法薬又は放射線治療薬が標的細胞に送達されるプロセスが、標的細胞に直接近い位置に配置されることを説明するために使用される。殺傷を達成するために、例えば、両方の作用物質が、細胞を殺傷するか、又は細胞が分裂することを防止するのに有効な組み合わせた量で細胞に送達される。
【０１２１】
キヌレニナーゼは、癌治療に対して前、間、後、又は種々の組み合わせにて投与されてよい。投与は、同時から、数分から数日間、また数週間までの範囲の間隔でされてもよい。キヌレニナーゼが抗癌剤とは別に患者に提供される実施形態においては、かなりの時間の有効性が、各送達時間の間にて切れないように確実にすることで、２つの化合物が依然として、有利に組み合わせた効果を患者に発揮することが可能となる。このような例において、患者に、キヌレニナーゼ及び抗癌治療法を、互いに約１２〜２４、又は７２時間、及びより詳細には、互いに約６〜１２時間以内に投与してよいと企図されている。ある状況では、それぞれの投与の間に数日間（２、３、４、５、６又は７日間）から数週間（１、２、３、４、５、６、７又は８週間）が経過するように治療のための期間を顕著に延ばすことが望ましい場合がある。
【０１２２】
特定の実施形態において、治療の過程は、１〜９０日、又はそれ以上続く（このような範囲には間の日も含む）。ある作用物質は、１日目〜９０日目（このような範囲には間の日も含む）のいずれかの日、又はこれらの任意の組み合わせに投与されてよく、別の作用物質は、１日目〜９０日目（このような範囲には間の日も含む）の任意の日、又はこれらの任意の組み合わせに投与されると企図されている。１日（２４時間）以内に、患者は作用物質を１回、又は複数回投与されてよい。更に、一連の治療の後で、抗癌剤が投与されない期間が存在すると企図される。この期間は、患者の状態、例えば予後、強度、健康状態などに応じて、１〜７日、及び／又は１〜５週間、及び／又は１〜１２ヶ月、又はそれ以上（このような範囲には間の日も含む）続き得る。治療サイクルは必要に応じて繰り返されると予想される。
【０１２３】
種々の組み合わせが使用されてもよい。以下の例に関して、キヌレニナーゼが「Ａ」であり、癌治療法が「Ｂ」である。
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【０１２４】
患者に対する本発明の実施形態の任意の化合物又は治療法の投与は、もし存在する場合には作用物質の毒性を考慮して、このような化合物の投与についての一般的なプロトコルに従う。したがって、いくつかの実施形態では、併用療法に起因する毒性を監視する工程が存在する。
【実施例】
【０１２５】
ＸＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。後に続く実施例で開示した技術は、発明者により発見された技術が、本発明の実施に際して十分機能することを示し、それ故、その実施のための好ましい方式を構成すると考えることができるということが、当業者により理解されなければならない。しかし、当業者は、本開示の観点で、開示される具体的な実施形態において、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、同じ又は同様の結果が依然として得られる多くの変更をなし得ることを理解するべきである。
【０１２６】
実施例１−ヒトＫｙｎａｓｅ（ｈ−ＫＹＮａｓｅ）の開発及び特性決定
本研究には、ｈ−ＫＹＮａｓｅバリアントの組換えを伴い、バリアントを、広範囲の腫瘍に対する治療薬として開発する。多数のヒトバリアントを組換え、細菌ツールＫｙｎａｓｅに匹敵するＫｙｎに対する、これらの触媒活性（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）を測定した（以下の図１Ａ及び表２）。バリアントを、触媒活性の増加に対して、及び、インビトロでの９０％ヒト血清内での脱活性化への耐性に対して、最適化した（一定時間の、血清中でのインキュベーション後の残留活性として表現）。組換えヒトバリアントは、インビトロにて、ヒト血清での触媒安定性を大幅に改善したことが見出された（図１Ｂ及び表２）。
【０１２７】
タンパク質（６８）及び（１５３）などのヒトバリアントは、マウスにて、単回静脈内投与後に、持続するＫｙｎ分解を示した（図１Ｃ）。これらの研究のために、ＢＡＬＢ／ｃメスマウス（６〜８週、重量は約１８〜２０ｇ）を、ビヒクル（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）又は１０ｍｇ／ｋｇ（６８）／（１５３）のいずれかと共に、静脈内投与した。投与後６、２４、４８、７２、及び１２０時間にて、マウスを定期的に採血し（一時点あたりでマウスはｎ＝４）、血漿サンプルをすぐさま、内標準（ＩＳ）溶液含有の酸にてクエンチしてキヌレニンのＬＣ／ＭＳ分析のために処理した。
【０１２８】
（表２）選択された酵素バリアントに対する触媒活性及び血清安定性
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【０１２９】
実施例２−ＨｓＫＹＮの有効性及び抗腫瘍記憶
次に、ＨｓＫＹＮバリアントのインビボ有効性を、ＣＴ２６マウスモデル及びＢ１６−ＩＤＯモデルで試験した。６〜８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスに、１００μＬのＰＢＳ内の５００，０００  ＣＴ２６細胞を、右下脇腹に皮下移植した。細胞播種の４日後に投与を開始した。タンパク質（６８）を、３回投与で、１０ｍｇ／ｋｇのＱ６Ｄにて皮下投与した。エパカドスタットを、３００ｍｇ／ｋｇのＱＤにて経口投与した（５日投与し、２日は非投与）。抗ＰＤ−１を５回投与で、１０ｍｇ／ｋｇのＱ３Ｄにて腹腔内投与した。デジタルキャリパーで、１週間に３回腫瘍を測定し、式：体積＝（Ｌ×Ｗ×Ｔ）×Ｐｉ／６を使用して、腫瘍体積を計算した。腫瘍が２，０００ｍｍ３を超えたときに、動物を犠牲にした（図２Ａ）。（Ａ）からの最後の完全奏功（ＣＲ）が現れてから１００日後に、未処理のＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣＲに、左下脇腹に皮下移植したＣＴ２６で再度抗原投与した。上記のとおりに腫瘍体積を測定し、結果を図２Ｂに示す。
【０１３０】
実施例３−ＨｓＫＹＮ腫瘍免疫プロファイリング
（６８）の免疫プロファイリングを、ＣＴ２６腫瘍を有するマウスにて実施した。６〜８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃに、１００μＬのＰＢＳ内の５００，０００  ＣＴ２６細胞を、右下脇腹に皮下移植した。細胞播種の４日後に投与を開始した。デジタルキャリパーで、１週間に３回腫瘍を測定し、式：体積＝（Ｌ×Ｗ×Ｔ）×Ｐｉ／６を使用して、腫瘍体積を計算した。最後の投与の２４時間後に動物を犠牲にし、更なる分析のために腫瘍を収集した。タンパク質（６８）を、２回投与で、１０ｍｇ／ｋｇのＱ６Ｄにて皮下投与した。抗ＰＤ−１を３回投与で、１０ｍｇ／ｋｇのＱ３Ｄにて腹腔内投与した。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙキットを使用してＲＮＡを抽出し、ＰａｎＣａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｐａｎｅｌを使用して、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析のために１００ｎｇのＲＮＡを使用した（図３Ａ）。図３Ｂの研究のために、（６８）を２回投与で、１０ｍｇ／ｋｇのＱ６Ｄにて皮下投与した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ製の腫瘍解離キットを用いて、腫瘍を消化した。標識した抗体で単一細胞懸濁液を染色し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ：ＣＤ８（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４−）；Ｔｒｅｇ（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋）；Ｍ１マクロファージ（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ２０６−）；Ｍ２マクロファージ（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ２０６＋）を使用して分析した。
【０１３１】
実施例４−ラット及びＮＨＰにおける、優れたＨｓＫＹＮバリアントＰＤ及びＰＫプロファイル
オスＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（２００〜３００ｇ）に、尾静脈を通すゆっくりとした注射により、１０ｍｇ／ｋｇの（１５３）を、単回投与又は３週間投与のいずれかで静脈内投与した。投与の２４時間前（−２４時間）、１回目、２回目、又は３回目の投与の６、２４、４８、７２、又は１２０時間後に、血液を収集した（１時点あたりのマウスはｎ＝４）。図１Ｃに記載のとおりに血漿サンプルを処理し、キヌレニン量をＬＣ／ＭＳにより分析した（図４Ａ）。次に、一匹のオス、及び一匹のメスカニクイザル（２年齢以上）に、橈側皮静脈を通すゆっくりとした注射により、１０ｍｇ／ｋｇ（１５３）を単回投与で、静脈内投与した。投与前（０時間）、投与後０．２５、６、２４、４８、７２、１２０、１６８、２４０、及び３３６時間にて、血液を収集した。血漿サンプルを２つの部分に分けた：１つの部分は、キヌレニンＬＣ／ＭＳ分析のために、図１Ｃに記載のとおりに処理し（図４Ｂ）、他方の部分は、ＰＥＧ化タンパク質のＥＬＩＳＡ分析に通した（抗ＰＥＧ抗体（Ａｂｃａｍ番号ａｂ５１２５７）捕捉、及びビオチン化抗ＰＥＧ抗体（Ａｂｃａｍ番号ａｂ５３４４９）検出）。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアプログラムを使用する非区画アプローチにより、血漿濃度対時間のデータを分析し、Ｃ０、Ｃｍａｘ、Ｔ１／２、ＡＵＣ０−ｌａｓｔ、ＡＵＣ０−ｉｎｆを有する薬物動態学パラメータを計算した。
【０１３２】
したがって、Ｋｙｎａｓｅによるキヌレニン分解は、ＩＤＯ及びＴＤＯ発現腫瘍の両方に、広範囲にわたって適用可能であることを、本研究は示した。ＨｓＫＹＮタンパク質組換えにより、５００倍を超える触媒活性の増加、及び大幅に改善された触媒安定性が達成され、インビボでの、ロバストで永続的なＫｙｎ枯渇がもたらされる。エパカドスタットと比較して、ＨｓＫＹＮバリアントは優れた単剤及びＰＤ１との組み合わせの有効性を示し、抗腫瘍記憶を維持した。ＩＦＮｇの増加は、Ｔ細胞炎症性シグネチャー遺伝子発現と関係し、Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比率は、ＨｓＫＹＮ＋／−ＰＤ１が媒介する腫瘍の有効性の根底にあるメカニズムの可能性がある。最後に、症状発現前の毒性種における好ましいＰＫ／ＰＤプロファイルは、優れたＨｓＫＹＮバリアントの臨床開発を更に支持する。
【０１３３】
本明細書に開示され、特許請求される全ての方法は、本開示の観点で過度な実験を行うことなく、なされ、実行されてもよい。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態の観点で記載されてきたが、本発明の概念、精神及び範囲を逸脱することなく、本明細書に記載の方法、工程又は工程の順序に変化が加えられてもよいことは当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的及び生理学的に関連する特定の作用物質を、同じ結果又は同様の結果が達成されつつ、本明細書に記載される作用物質に交換されてもよいことは明らかであろう。当業者に明らかな全てのこのような同様の代替物及び改変は、添付の特許請求の範囲に定義されるような本発明の精神、範囲及び概念の範囲内であると考えられる。
【０１３４】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に示されるものに対して補助的に例示的な手順又は他の詳細を与える程度まで、本明細書に参照により組み込まれる。
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【０１３５】
本開示を、以下の付番した実施形態で更に説明する：
実施形態１。単離された修飾ヒトキヌレニナーゼ酵素であって、上記修飾酵素が、配列番号：１のヒトキヌレニナーゼ酵素に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、Ｌ８Ｐ、Ｋ３８Ｅ、Ｙ４７Ｌ、Ｉ４８Ｆ、Ｋ５０Ｑ、Ｉ５１Ｍ、Ｓ６０Ｎ、Ｋ６４Ｎ、Ｄ６５Ｇ、Ｅ６６Ｋ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ６７Ｐ、Ｄ６７Ｓ、Ａ６８Ｆ、Ａ６８Ｔ、Ａ６８Ｖ、Ｆ７１Ｌ、Ｆ７１Ｍ、Ｌ７２Ｎ、Ｋ８４Ｅ、Ｅ８８Ｎ、Ｅ８９Ｋ、Ｅ８９Ｓ、Ｅ９０Ｑ、Ｄ９２Ｅ、Ｋ９３Ｎ、Ｋ９３Ｔ、Ａ９５Ｈ、Ａ９５Ｑ、Ｋ９６Ｎ、Ｉ９７Ｈ、Ｉ９７Ｌ、Ｉ９７Ｖ、Ａ９８Ｇ、Ａ９９Ｇ、Ａ９９Ｉ、Ａ９９Ｒ、Ａ９９Ｓ、Ａ９９Ｔ、Ａ９９Ｖ、Ｙ１００Ｎ、Ｙ１００Ｓ、Ｙ１００Ｔ、Ｇ１０１Ａ、Ｈ１０２Ｗ、Ｅ１０３Ｆ、Ｅ１０３Ｈ、Ｅ１０３Ｎ、Ｅ１０３Ｑ、Ｅ１０３Ｒ、Ｅ１０３Ｖ、Ｅ１０３Ｗ、Ｖ１０４Ｄ、Ｖ１０４Ｅ、Ｖ１０４Ｆ、Ｖ１０４Ｈ、Ｖ１０４Ｋ、Ｖ１０４Ｌ、Ｖ１０４Ｒ、Ｇ１０５Ａ、Ｇ１０５Ｈ、Ｇ１０５Ｓ、Ｇ１０５Ｔ、Ｅ１０６Ｄ、Ｋ１０６Ｄ、Ｋ１０６Ｅ、Ｋ１０６Ｈ、Ｋ１０６Ｎ、Ｒ１０７Ｐ、Ｒ１０７Ｓ、Ｐ１０８Ｒ、Ｉ１１０Ａ、Ｉ１１０Ｆ、Ｉ１１０Ｌ、Ｉ１１０Ｍ、Ｉ１１０Ｔ、Ｔ１１１Ｄ、Ｔ１１１Ｈ、Ｔ１１１Ｎ、Ｔ１１１Ｒ、Ｇ１１２Ａ、Ｇ１１２Ｃ、Ｇ１１２Ｄ、Ｇ１１２Ｋ、Ｇ１１２Ｌ、Ｇ１１２Ｍ、Ｇ１１２Ｑ、Ｇ１１２Ｒ、Ｇ１１２Ｓ、Ｇ１１２Ｔ、Ｇ１１２Ｙ、Ｎ１２７Ｋ、Ｉ１３１Ｖ、Ａ１３２Ｖ、Ｌ１３３Ｖ、Ａ１３６Ｔ、Ｌ１３７Ｔ、Ｔ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｈ１４２Ｑ、Ｑ１４Ｒ、Ｙ１５６Ｈ、Ｋ１６３Ｔ、Ｄ１６８Ｅ、Ｈ１６９Ｒ、Ｑ１７５Ｌ、Ｉ１８３Ｆ、Ｉ１８３Ｌ、Ｉ１８３Ｐ、Ｉ１８３Ｓ、Ｅ１８４Ａ、Ｅ１８４Ｄ、Ｅ１８４Ｒ、Ｅ１８４Ｔ、Ｅ１８４Ｖ、Ｅ１８５Ｔ、Ｍ１８７Ｌ、Ｍ１８９Ｉ、Ｋ１９１Ａ、Ｋ１９１Ｇ、Ｋ１９１Ｈ、Ｋ１９１Ｍ、Ｋ１９１Ｎ、Ｋ１９１Ｒ、Ｋ１９１Ｓ、Ｋ１９１Ｔ、Ｋ１９１Ｗ、Ｅ１９７Ａ、Ｅ１９７Ｄ、Ｅ１９７Ｆ、Ｅ１９７Ｋ、Ｅ１９７Ｍ、Ｅ１９７Ｑ、Ｅ１９７Ｓ、Ｅ１９７Ｔ、Ｅ１９７Ｖ、Ｉ２０１Ｃ、Ｉ２０１Ｅ、Ｉ２０１Ｆ、Ｉ２０１Ｈ、Ｉ２０１Ｌ、Ｉ２０１Ｓ、Ｉ２０１Ｔ、Ｉ２０１Ｖ、Ｈ２０３Ｋ、Ｌ２１９Ｍ、Ｌ２１９Ｗ、Ｆ２２０Ｌ、Ｖ２２３Ｉ、Ｆ２２５Ｙ、Ｈ２３０Ｆ、Ｈ２３０Ｌ、Ｈ２３０Ｙ、Ｎ２３２Ｓ、Ｙ２４６Ｆ、Ｆ２４９Ｗ、Ｄ２５０Ｅ、Ｓ２７４Ａ、Ｓ２７４Ｃ、Ｓ２７４Ｇ、Ｓ２７４Ｎ、Ｓ２７４Ｔ、Ｌ２７８Ｍ、Ａ２８０Ｇ、Ａ２８０Ｓ、Ａ２８０Ｔ、Ｇ２８１Ｓ、Ａ２８２Ｍ、Ａ２８２Ｐ、Ｇ２８４Ｎ、Ｉ２８５Ｌ、Ｖ３０３Ｌ、Ｖ３０３Ｓ、Ｆ３０６Ｗ、Ｆ３０６Ｙ、Ｓ３１１Ｎ、Ｋ３１５Ｅ、Ｄ３１７Ｅ、Ｄ３１７Ｋ、Ｉ３３１Ｃ、Ｉ３３１Ｌ、Ｉ３３１Ｎ、Ｉ３３１Ｓ、Ｉ３３１Ｔ、Ｉ３３１Ｖ、Ｎ３３３Ｔ、Ｐ３３４Ｎ、Ｐ３３５Ｔ、Ｌ３３７Ｔ、Ｌ３３８Ａ、Ｌ３３８Ｑ、Ｓ３４１Ｉ、Ｋ３７３Ｅ、Ｋ３７３Ｎ、Ｎ３７５Ａ、Ｎ３７５Ｈ、Ｙ３７６Ｃ、Ｙ３７６Ｆ、Ｙ３７６Ｌ、Ｋ３７８Ｇ、Ｋ３７８Ｐ、Ｋ３７８Ｑ、Ｋ３７８Ｒ、Ｋ３８０Ｇ、Ｋ３８０Ｓ、Ａ３８２Ｇ、Ａ３８２Ｒ、Ａ３８２Ｔ、Ｔ３８３Ｓ、Ｋ３８４Ｇ、Ｋ３８４Ｎ、Ｐ３８６Ｋ、Ｐ３８６Ｓ、Ｖ３８７Ｌ、Ｎ３８９Ｅ、Ｉ４０５Ｌ、Ｆ４０７Ｙ、Ｓ４０８Ｄ、Ｓ４０８Ｎ、Ｎ４１１Ｒ、Ｄ４１３Ｓ、Ｄ４１３Ｖ、Ｑ４１６Ｔ、Ｅ４１９Ａ、Ｅ４１９Ｌ、Ｋ４２０Ｅ、Ｒ４２１Ｎ、Ｖ４２４Ｉ、Ｋ４２７Ｍ、Ｎ４２９Ｅ、Ｇ４３２Ａ、及びＡ４３６Ｔからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含む、修飾ヒトキヌレニナーゼ酵素。
実施形態２。アミノ酸配列が、表１のポリペプチドのうちのいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも９０％同一である、実施形態１に記載の酵素。
実施形態３。Ａ２８２、Ｆ３０６、及び／又はＦ２４９における置換を含む、実施形態１又は２に記載の酵素。
実施形態４。Ｆ３０６Ｗ置換を含む、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の酵素。
実施形態５。Ｌ７２Ｎ置換を含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の酵素。
実施形態６。Ｈ１０２Ｗ及び／又はＮ３３３Ｔ置換を含む、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の酵素。
実施形態７。Ａ９９における置換を含む、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の酵素。
実施形態８。Ｇ１１２における置換を含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の酵素。
実施形態９。Ｅ１０３における置換を含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の酵素。
実施形態１０。Ｖ１０４における置換を含む、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の酵素。
実施形態１１。Ｓ４０８における置換を含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の酵素。
実施形態１２。Ｉ１８３Ｐ置換を含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の酵素。
実施形態１３。Ｒ１０７Ｐ置換を含む、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の酵素。
実施形態１４。Ａ４３６Ｔ置換を含む、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の酵素。
実施形態１５。Ｌ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ、及びＮ３３３Ｔから選択される少なくとも１つの置換を含む、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の酵素。
実施形態１６。Ｌ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ、及びＮ３３３Ｔから選択される少なくとも２、３、４、又は５個の置換を含む、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の酵素。
実施形態１７。置換Ｌ７２Ｎ、Ｈ１０２Ｗ、Ａ２８２Ｐ、Ｆ３０６Ｗ、Ｉ３３１Ｓ、及びＮ３３３Ｔを含む、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の酵素。
実施形態１８。酵素が、少なくとも８０００Ｍ−１ｓ−１の、ＫＹＮに対する触媒活性（ｋｃａｔ／ｋＭ）を有する、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の酵素。
実施形態１９。酵素が、約８０００Ｍ−１ｓ−１〜４００００Ｍ−１ｓ−１；１００００Ｍ−１ｓ−１〜４００００Ｍ−１ｓ−１；２００００Ｍ−１ｓ−１〜４００００Ｍ−１ｓ−１；又は２５０００Ｍ−１ｓ−１〜３５０００Ｍ−１ｓ−１の、キヌレニン（ＫＹＮ）に対する触媒活性（ｋｃａｔ／ｋＭ）を有する、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の酵素。
実施形態２０。アミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一である、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の酵素。
実施形態２１。アミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一である、実施形態２０に記載の酵素。
実施形態２２。アミノ酸配列が配列番号：３のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一である、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の酵素。
実施形態２３。アミノ酸配列が配列番号：３のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一である、実施形態２２に記載の酵素。
実施形態２４。異種ペプチドセグメントを更に含む、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の酵素。
実施形態２５。酵素がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合している、実施形態１〜２４のいずれか１つに記載の酵素。
実施形態２６。酵素が、１つ以上のＬｙｓ又はＣｙｓ残基を介してＰＥＧに結合している、実施形態２５に記載の酵素。
実施形態２７。実施形態１〜２６のいずれか１つに記載の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
実施形態２８。核酸が、細菌、菌類、昆虫、又は哺乳類での発現に最適化されたコドンである、実施形態２７に記載の核酸。
実施形態２９。実施形態２７又は２８に記載の核酸を含む発現ベクター。
実施形態３０。実施形態２７若しくは２８に記載の核酸又は実施形態２９に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
実施形態３１。宿主細胞が細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、又は哺乳類細胞である、実施形態３０に記載の宿主細胞。
実施形態３２。宿主細胞が細菌細胞である、実施形態３１に記載の宿主細胞。
実施形態３３。宿主細胞が哺乳類細胞であり、任意で、哺乳類細胞が免疫エフェクター細胞である、実施形態３１に記載の宿主細胞。
実施形態３４。免疫エフェクター細胞がＮＫ細胞又はＴ細胞である、実施形態３３に記載の宿主細胞。
実施形態３５。薬学上許容される担体の中に実施形態１〜２６のいずれか１つに記載の酵素を含む、医薬製剤。
実施形態３６。腫瘍を有する対象に、有効量の、実施形態１〜２６のいずれか１つに記載の酵素又は実施形態３５に記載の製剤を投与することを含む、腫瘍を有する対象の治療方法。
実施形態３７。腫瘍を有する対象の治療に使用するための、有効量の、実施形態１〜２６のいずれか１つに記載の酵素又は実施形態３５に記載の製剤を含む組成物。
実施形態３８。対象が、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、又はＴＤＯを発現する腫瘍を有するものとして同定されている、実施形態３６に記載の方法又は実施形態３７に記載の組成物。
実施形態３９。腫瘍が充実性腫瘍である、実施形態３６若しくは３８に記載の方法又は実施形態３７若しくは３８に記載の組成物。
実施形態４０。腫瘍が血液腫瘍である、実施形態３６若しくは３８に記載の方法又は実施形態３７若しくは３８に記載の組成物。
実施形態４１。対象がヒト患者である、実施形態３６及び３８〜４０のいずれか１つに記載の方法又は実施形態３７〜４０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態４２。酵素又は製剤が、腫瘍内に、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、眼内に、鼻孔内に、硝子体内に、腟内に、直腸内に、筋肉内に、皮下に、結膜下に、膀胱内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、経口で、吸入により、注射により、注入により、連続注入により、標的細胞を直接浸す局所潅流により、カテーテルを介して、又は洗浄により投与される、実施形態３６及び３８〜４１のいずれか１つに記載の方法又は実施形態３７〜４１のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態４３。少なくとも第２の抗癌治療法を投与することを更に含む、実施形態３６及び３８〜４２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４４。第２の抗癌治療法が放射線治療、外科治療、免疫療法、又は第２の抗癌性化合物である、実施例４３に記載の方法。
実施形態４５。第２の抗癌性化合物が免疫チェックポイント阻害剤である、実施形態４４に記載の方法。
実施形態４６。第２の抗癌性化合物が抗体である、実施形態４４又は４５に記載の方法。
実施形態４７。第２の抗癌性化合物が、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む、実施形態４４〜４６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４８。第２の抗癌性化合物が抗体薬物コンジュゲートである、実施形態４４〜４７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４９。免疫療法が、免疫エフェクター細胞又は免疫原性組成物を投与することを含む、実施形態４４〜４８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５０。免疫原性組成物が癌細胞抗原を含む、実施形態４９に記載の方法。
実施形態５１。免疫エフェクター細胞がＮＫ細胞又はＴ細胞を含む、実施形態４９又は５０に記載の方法。
実施形態５２。免疫エフェクター細胞がＣＡＲ  Ｔ細胞を含む、実施形態４９〜５１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５３。実施形態１〜２６のいずれか１つに従った発現されたキヌレニナーゼ酵素を含む、トランスジェニックＴ細胞。
実施形態５４。発現されたキメラ抗原Ｔ細胞受容体（ＣＡＲ）又は組換えされたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を更に含む、実施形態５３に記載の細胞。
実施形態５５。細胞がヒトＴ細胞である、実施形態５３又は５４に記載の細胞。
実施形態５６。ＣＡＲ及びキヌレニナーゼをコードするＤＮＡが、細胞のゲノムに組み込まれている、実施形態５４又は５５に記載の細胞。
実施形態５７。ＣＡＲが癌細胞抗原に標的化されている、実施形態５４〜５６のいずれか１つに記載の細胞。
実施形態５８。癌細胞抗原がＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、又はＧＤ２である、実施形態５７に記載の細胞。
実施形態５９。腫瘍を有するヒト対象におけるＴ細胞応答を提供する方法であって、有効量の実施形態５３〜５８のいずれか１つに記載のトランスジェニック細胞を対象に投与することを含む、方法。
実施形態６０。腫瘍を有する対象の治療で使用するための、有効量の実施形態５３〜５８のいずれか１つに記載のトランスジェニック細胞を含む、組成物。
実施形態６１。トランスジェニック細胞が自己由来である、実施形態５９に記載の方法又は実施形態６０に記載の組成物。
実施形態６２。トランスジェニック細胞が異種由来である、実施形態５９に記載の方法又は実施形態６０に記載の組成物。
実施形態６３。腫瘍の治療のための薬剤の製造における、実施形態１〜２６のいずれか１つに記載のキヌレニナーゼ酵素、実施形態２７若しくは２８に記載の核酸、又は、実施形態２９に記載の発現ベクターの使用。
【０１３６】
配列添付
配列番号：１：野生型ヒトＫＹＮａｓｅ
2021521777.tif 000026
配列番号：２：
タンパク質１６８：
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配列番号：３
タンパク質１５３：
2021521777.tif 000028
【図１】
2021521777.tif 000029
【図２】
2021521777.tif 000030
【図３】
2021521777.tif 000031
【図４】
2021521777.tif 000032
【配列表】
2021521777000001.app
【国際調査報告】
2021521777.tif 000033
2021521777.tif 000034
2021521777.tif 000035
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