(57)【要約】  本明細書中で、腸上皮細胞において発現される陰イオン（Ｃｌ−、ＨＣＯ３−、シュウ酸塩）交換体であるＳＬＣ２６Ａ３の阻害剤が、提供される。ＳＬＣ２６Ａ３阻害剤は、慢性突発性便秘（ＣＩＣ）、オピオイド誘導性便秘（ＯＩＣ）、便秘型優位性過敏性腸症候群（ＩＢＳ−Ｃ）、嚢胞性繊維症関連便秘、胎便性イレウス、遠位腸閉塞症候群、シュウ酸カルシウム尿路結石、腸内高シュウ酸尿症及び原発性高シュウ酸尿症を含む便秘の治療のための利用可能性を有する。
2021522255.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理学的に許容される賦形剤及び式（Ｉ）の化合物又はその医薬として許容される塩、同位体形態、立体異性体もしくはプロドラッグを含む、医薬組成物：
【化１】
2021522255.tif 000039
［式中、
Ｒ１は、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ６アルケニル、任意選択的に置換されたＣ３−Ｃ６シクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ３−Ｃ６シクロアルキルアルキル、任意選択的に置換されたアルコキシアルキル、カルボキシＣ１−Ｃ３アルキル、任意選択的に置換されたヘテロアリールアルキル、−Ｓ（Ｏ）２アリール（ここで、アリールは、任意選択的に置換されている）、又は任意選択的に置換されたアリールアルキルであり、
Ｒ２は、カルボキシＣ１−Ｃ３アルキルであり、
Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、
Ｒ４は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、
但し、Ｒ２がカルボキシエチルである場合、Ｒ１は置換されたベンジルであり、又はＲ２がカルボキシメチルである場合、Ｒ３及びＲ４は、各々メチルであり、Ｒ１はベンジルではない］。
【請求項２】
Ｒ１が、任意選択的に置換されたベンジルである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
Ｒ１が、以下の構造：
【化２】
2021522255.tif 000040
を有し、式中、
Ｘが、アルキル、Ｃ３−Ｃ５シクロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、ＮＯ２、又はハロアルコキシであり、
ｎが、１、２、３、４又は５である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
Ｘが、ブロモ、クロロ、フルオロ、ヨード、シクロプロピル、ＣＦ３、メチル、ＮＯ２又はメトキシであり、ｎが、１又は２である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
Ｒ１が、以下の構造：
【化３】
2021522255.tif 000041
の１つを有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
Ｒ２が、以下の構造：
【化４】
2021522255.tif 000042
の１つを有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
Ｒ３が、メチルであり、Ｒ４が、メチルである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記化合物が、式（Ｉａ）：
【化５】
2021522255.tif 000043
によって表され、
式中、Ｘが、アルキル、Ｃ３−Ｃ５シクロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、ＮＯ２、又はハロアルコキシであり、ｎが、１、２、又は３である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記化合物が、以下の構造：
【化６】
2021522255.tif 000044
2021522255.tif 000045
2021522255.tif 000046
2021522255.tif 000047
の１つを有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
生理学的に許容される賦形剤及び式（ＩＩ）の化合物又はその医薬として許容される塩、同位体形態、立体異性体もしくはプロドラッグを含む医薬組成物：
【化７】
2021522255.tif 000048
［式中、  Ｒ７は、任意選択的に置換されたアリールであり、
Ｒ８は、任意選択的に置換されたアリールである］。
【請求項１１】
Ｒ１が、任意選択的に置換されたフェニルである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
Ｒ７が、以下の構造：
【化８】
2021522255.tif 000049
を有し、式中、
Ｘが、水素、アルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ又はハロアルコキシであり、及び
ｎが、０、１、２、３、４又は５である、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
Ｘが、水素、クロロ、ブロモ、メチル、又はメトキシであり、ｎが、１又は２である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
Ｒ８が、任意選択的に置換されたフェニルである、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
Ｒ８が、以下の構造：
【化９】
2021522255.tif 000050
を有し、式中、
Ｘが、アルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ又はハロアルコキシであり、
ｎが、１、２、３、４又は５である、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
Ｘが、クロロ、ブロモ、メチル、又はメトキシであり、ｎが、１又は２である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記化合物が、以下の構造：
【化１０】
2021522255.tif 000051
2021522255.tif 000052
2021522255.tif 000053
の１つを有する、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
生理学的に許容される賦形剤及び式（Ｉ）の化合物又はその医薬として許容される塩、同位体形態、立体異性体もしくはプロドラッグを含む、ＳＬＣ２６Ａ３媒介Ｃｌ−、ＨＣＯ３−、又はシュウ酸塩交換に関連する症状、疾患又は障害の治療又は予防における使用のための医薬組成物：
【化１１】
2021522255.tif 000054
［式中、
Ｒ１は、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ６アルケニル、任意選択的に置換されたＣ３−Ｃ６シクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ３−Ｃ６シクロアルキルアルキル、任意選択的に置換されたアルコキシアルキル、カルボキシＣ１−Ｃ３アルキル、任意選択的に置換されたヘテロアリールアルキル、−Ｓ（Ｏ）２アリール（ここで、アリールは、任意選択的に置換されている）、又は任意選択的に置換されたアリールアルキルであり、
Ｒ２は、カルボキシＣ１−Ｃ３アルキルであり、
Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、
Ｒ４は、Ｃ１−Ｃ４アルキルである］。
【請求項１９】
前記使用は、便秘又は高シュウ酸尿症を予防又は治療するための使用を含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記使用は、慢性突発性便秘（ＣＩＣ）、オピオイド誘導性便秘（ＯＩＣ）、便秘型過敏性腸症候群（ＩＢＳ−Ｃ）、尿路結石、ＣＦ関連便秘、胎便性イレウス、遠位腸閉塞症候群、シュウ酸カルシウム尿路結石、腸内高シュウ酸尿症、又は原発性高シュウ酸尿症を予防又は治療するための使用を含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記化合物が、式（Ｉａ）：
【化１２】
2021522255.tif 000055
によって表され、式中Ｘが、アルキル、Ｃ３−Ｃ５シクロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、ＮＯ２、又はハロアルコキシであり、ｎが、１、２、又は３である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記化合物が、
【化１３】
2021522255.tif 000056
である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記化合物が、ＮＨＥ３阻害剤と組み合わされる、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記ＮＨＥ３阻害剤が、テナパノールであり、前記使用が、難治性便秘を治療するためである、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
尿中シュウ酸排出の低減を必要とする対象において尿中シュウ酸排出を低減する使用のための医薬組成物であって、方法は、治療有効量の式（Ｉ）の化合物又はその医薬として許容される塩、同位体形態、立体異性体もしくはプロドラッグを対象に投与することを含む、医薬組成物
【化１４】
2021522255.tif 000057
［式中、  Ｒ１は、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ３アルケニル、任意選択的に置換されたＣ３−Ｃ６シクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ３−Ｃ６シクロアルキルアルキル、任意選択的に置換されたアルコキシアルキル、カルボキシＣ１−Ｃ３アルキル、任意選択的に置換されたヘテロアリールアルキル、−Ｓ（Ｏ）２アリール（ここで、アリールは、任意選択的に置換されている）又は任意選択的に置換されたアリールアルキルであり、
Ｒ２は、カルボキシＣ１−Ｃ３アルキルであり、
Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、
Ｒ４は、Ｃ１−Ｃ４アルキルである］。
【請求項２６】
前記尿中シュウ酸排出の低減を必要とする対象は、腸内高シュウ酸尿症、原発性高シュウ酸尿症又はシュウ酸カルシウム尿路結石に罹患している、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記化合物は、式（Ｉａ）：
【化１５】
2021522255.tif 000058
によって表される構造を有し、式中Ｘは、アルキル、Ｃ３−Ｃ５シクロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、ＮＯ２、又はハロアルコキシであり、ｎは、１、２、又は３である、請求項２５又は２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記化合物は、
【化１６】
2021522255.tif 000059
又はその医薬として許容される塩、同位体形態、立体異性体もしくはプロドラッグである、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
以下の構造：
【化１７】
2021522255.tif 000060
の１つを有する化合物又はその医薬として許容される塩、同位体形態、立体異性体もしくはプロドラッグ。
【請求項３０】
生理学的に許容される賦形剤及び式（ＩＩ）の化合物又はその医薬として許容される塩、同位体形態、立体異性体もしくはプロドラッグを含む、ＳＬＣ２６Ａ３媒介Ｃｌ−、ＨＣＯ３−、又はシュウ酸塩交換に関連する症状、疾患又は障害の治療又は予防における使用のための医薬組成物：
【化１８】
2021522255.tif 000061
［式中、
Ｒ７は、任意選択的に置換されたアリールであり、
Ｒ８は、任意選択的に置換されたアリールである］。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の利益に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた助成金番号ＤＫ０９９８０３  及びＤＫ０７２５１７の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に対し一定の権利を有する。
【０００２】
技術分野
本開示は、結腸における陰イオン交換体の選択的阻害剤及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の記載
便秘は、米国人口における推定有病率が約１５％である、一般的な問題である。最も一般的なタイプの慢性便秘としては、慢性突発性便秘（ＣＩＣ）、オピオイド誘導性便秘（ＯＩＣ）、及び便秘型優位性過敏性腸症候群（ＩＢＳ−Ｃ）が挙げられる。慢性便秘についての現行の治療アプローチとしては、生活様式及び食餌の変更、市販の緩下剤（例えば、腸収縮の刺激剤、浸透圧剤）及び腸液分泌を促進する近年認可された処方薬が挙げられる。Ｃｌチャネルを活性化する３種の分泌促進薬が、認可されている：嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）及び塩素チャネル２（ＣｌＣ−２）を間接的に活性化するプロスタグランジン誘導体であるルビプロストン；ＣＦＴＲを間接的に活性化するグアニル酸シクラーゼＣのペプチドアゴニストであるリナクロチド；及び、やはりグアニル酸シクラーゼＣ受容体のアゴニストとして作用するウログアニリンアナログであるプレカナチド。ＣＦＴＲアクチベーターは、顕著な分泌促進作用及びルビプロストン及びリナクロチドを超える改善された効力を有することが、便秘の実験動物モデルにおいて示されている。Ｃｉｌ  Ｏ，Ｐｈｕａｎ  Ｐ−Ｗ，Ｌｅｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．ＣＦＴＲ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌｉｚｅｓ  ｓｔｏｏｌ  ｏｕｔｐｕｔ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃｏｎｓｔｉｐａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｒｏｌ  ２０１６；２：３１７−２７．Ｃｉｌ  Ｏ，Ｐｈｕａｎ  Ｐ−Ｗ，Ｓｏｎ  ＪＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｅｎｙｌｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｏｎｅ  ＣＦＴＲ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｉｐａｔｉｏｎ．Ｔｒａｎｓｌ  Ｒｅｓ  ２０１６；１８２：１４−２６．ｅ４．Ｓｏｎ  ＪＨ，Ｚｈｕ  ＪＳ，Ｐｈｕａｎ  Ｐ−Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈ−ｐｏｔｅｎｃｙ  ｐｈｅｎｙｌｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｏｎｅ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ（ＣＦＴＲ）ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１７；６０：２４０１−２１０を参照されたい。
【０００４】
腸液吸収の阻害は、便への加水を増加して便秘を治療する分泌促進メカニズムを表す。阻害剤であるテナパノール（ｔｅｎａｐａｎｏｒ）のＩＢＳ−Ｃに対する第３相臨床試験における近年の評価は、限定された効果を示し、治療群について２７％対偽薬群について１８．７％の、疼痛及び便の複合パターン応答割合を有した。ＮＨＥ３は、小腸及び近位結腸において発現されるが、遠位結腸においては発現されない。したがって、ＮＨＥ３阻害の便秘に対する臨床的有効性は限定的であり、遠位結腸において下流の液体吸収が損傷を受けないことに起因する可能性がある。Ｂｈａｒｕｃｈａ  ＡＥ，Ｗｏｕｔｅｒｓ  ＭＭ，Ｔａｃｋ  Ｊ．Ｅｘｉｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  ｍａｎａｇｉｎｇ  ｃｏｎｓｔｉｐａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉａｒｒｈｅａ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２０１７；３７：１５８−６６。
【０００５】
尿路結石は、米国において男性で１２％を超え、女性で６％を超える生涯有病率を有する、一般的な問題である。尿路結石の再発率は非常に高く、３０〜４０％の患者対象が、少なくとも１つの別の結石を５年以内に形成する。尿中シュウ酸の増大（高シュウ酸尿症）は、シュウ酸カルシウム腎結石についての主要な危険因子であり、腎結石対象のおよそ６５％が罹患する最も一般的なタイプの腎結石である。シュウ酸カルシウム結石の発生は、尿中シュウ酸排出を低下させることによって減少し得たことが、わかっている（例えば、食餌によるシュウ酸塩摂取又はビタミンＣ消費の減少）。Ｈｏｌｍｅｓ  ＲＰ，Ｋｎｉｇｈｔ  Ｊ，Ａｓｓｉｍｏｓ  ＤＧ．Ｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｏｘａｌａｔｅ  ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  ｔｏ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｏｘａｌａｔｅ  ｓｔｏｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｕｒｏｌｉｔｈｉａｓｉｓ  ２０１６；４４：２７−３２。しかし、シュウ酸塩の吸収及び排出を生物学的に制御することが明らかにできておらず、吸収されたシュウ酸塩のほぼ全てが尿中に排出されるという最終結果があることに起因して、現在、シュウ酸カルシウム尿路結石に対する有効な治療は存在しない。
【０００６】
上昇した尿中シュウ酸塩レベルは、腸内高シュウ酸尿症（ｅｎｔｅｒｉｃ  ｈｙｐｅｒｏｘａｌｕｒｉａ）及び原発性高シュウ酸尿症の主な病理であり、この両方が、最終的に腎臓病をもたらす。現在、原発性高シュウ酸尿症についての認可薬は存在せず、対象は、人工透析、肝移植及び腎移植で間に合わせている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｉｌ  Ｏ，Ｐｈｕａｎ  Ｐ−Ｗ，Ｌｅｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．ＣＦＴＲ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌｉｚｅｓ  ｓｔｏｏｌ  ｏｕｔｐｕｔ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃｏｎｓｔｉｐａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｒｏｌ  ２０１６；２：３１７−２７
【非特許文献２】Ｃｉｌ  Ｏ，Ｐｈｕａｎ  Ｐ−Ｗ，Ｓｏｎ  ＪＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｅｎｙｌｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｏｎｅ  ＣＦＴＲ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｉｐａｔｉｏｎ．Ｔｒａｎｓｌ  Ｒｅｓ  ２０１６；１８２：１４−２６．ｅ４．
【非特許文献３】Ｓｏｎ  ＪＨ，Ｚｈｕ  ＪＳ，Ｐｈｕａｎ  Ｐ−Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈ−ｐｏｔｅｎｃｙ  ｐｈｅｎｙｌｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｏｎｅ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ（ＣＦＴＲ）ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１７；６０：２４０１−２１０．
【非特許文献４】Ｂｈａｒｕｃｈａ  ＡＥ，Ｗｏｕｔｅｒｓ  ＭＭ，Ｔａｃｋ  Ｊ．Ｅｘｉｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  ｍａｎａｇｉｎｇ  ｃｏｎｓｔｉｐａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉａｒｒｈｅａ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２０１７；３７：１５８−６６．
【非特許文献５】Ｈｏｌｍｅｓ  ＲＰ，Ｋｎｉｇｈｔ  Ｊ，Ａｓｓｉｍｏｓ  ＤＧ．Ｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｏｘａｌａｔｅ  ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  ｔｏ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｏｘａｌａｔｅ  ｓｔｏｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｕｒｏｌｉｔｈｉａｓｉｓ  ２０１６；４４：２７−３２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、便秘、高シュウ酸尿症及び腎結石のための改善された治療法の需要が、当該分野において存在し続けている。
【０００９】
簡潔な要旨
本明細書中で、結腸における主要な陰イオン（Ｃｌ−、ＨＣＯ３−、シュウ酸塩）交換体である、ＳＬＣ２６Ａ３の阻害剤が、提供される。ＳＬＣ２６Ａ３を選択的に標的することにより、本明細書中で開示される化合物及び組成物は、腸液吸収及びシュウ酸塩吸収の阻害において効果的であることが示された。本明細書中で開示される実施形態にしたがう化合物及び組成物は、阻害効力及び代謝安定性を提供する。
【００１０】
詳細には、腸液吸収の阻害は、マウスにおいて閉塞した腸係蹄において実証され、及び効力は、便秘の実験モデルにおいて実証されている。その上、ＳＬＣ２６Ａ３阻害及びＮＨＥ３阻害は、相加効果又は相乗効果を提供すると考えられる。これは、難治性便秘の治療に非常に有効であり得る。
【００１１】
さらに、ＳＬＣ２６Ａ３阻害は、尿中に排出されるシュウ酸塩の量を減少させることにより、高シュウ酸尿症及び腎不全を予防又は治療するための有効な治療法であることが、本明細書中で実証される。これは、シュウ酸塩の腸吸収を阻害しそして吸収されなかったシュウ酸塩を、尿ではなく便を通じて排除することによって、達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、１つの実施形態は、医薬として許容される賦形剤及び式（Ｉ）の化合物又はその医薬として許容される塩、同位体形態、立体異性体もしくはプロドラッグを含む、医薬組成物を提供する。
【００１３】
【化１】
2021522255.tif 000003
［式中、
Ｒ１は、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ６アルケニル、任意選択的に置換されたＣ３−Ｃ６シクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ３−Ｃ６シクロアルキルアルキル、任意選択的に置換されたアルコキシアルキル、カルボキシＣ１−Ｃ３アルキル、任意選択的に置換されたヘテロアリールアルキル、−Ｓ（Ｏ）２アリール（ここで、アリールは、任意選択的に置換されている）、又は任意選択的に置換されたアリールアルキルであり、
Ｒ２は、カルボキシＣ１−Ｃ３アルキルであり、
Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、
Ｒ４は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、
但し、Ｒ２がカルボキシエチルである場合、Ｒ１は、置換されたベンジルであり、又はＲ２がカルボキシメチルである場合、Ｒ３及びＲ４は、各々メチルであり、Ｒ１はベンジルではない］。
【００１４】
別の実施形態は、生理学的に許容される賦形剤及び式（ＩＩ）の化合物又はその医薬として許容される塩、同位体形態、立体異性体もしくはプロドラッグを含む医薬組成物を、提供する。
【００１５】
【化２】
2021522255.tif 000004
［式中、
Ｒ７は、任意選択的に置換されたアリールであり、
Ｒ８は、任意選択的に置換されたアリールである］。
【００１６】
他の実施形態は、ＳＬＣ２６Ａ３媒介型陰イオン（Ｃｌ−、ＨＣＯ３−、シュウ酸塩）交換に関連する症状、疾患又は障害、例えば、慢性突発性便秘（ＣＩＣ）、オピオイド誘導性便秘（ＯＩＣ）、及び便秘型優位性過敏性腸症候群（ＩＢＳ−Ｃ）、ＣＦ関連便秘、胎便性イレウス、遠位腸閉塞症候群、シュウ酸カルシウム尿路結石、腸内高シュウ酸尿症及び原発性高シュウ酸尿症を治療又は予防するための方法を提供する。この方法は、治療又は予防を必要とする対象に、治療有効量の式（Ｉ）の化合物又はその医薬として許容される塩、同位体形態、立体異性体もしくはプロドラッグを投与することを含む。
【００１７】
【化３】
2021522255.tif 000005
［式中、
Ｒ１は、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ６アルケニル、任意選択的に置換されたＣ３−Ｃ６シクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ３−Ｃ６シクロアルキルアルキル、任意選択的に置換されたアルコキシアルキル、カルボキシＣ１−Ｃ３アルキル、任意選択的に置換されたヘテロアリールアルキル、−Ｓ（Ｏ）２アリール（ここで、アリールは、任意選択的に置換されている）、又は任意選択的に置換されたアリールアルキルであり、
Ｒ２は、カルボキシＣ１−Ｃ３アルキルであり、
Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、
Ｒ４は、Ｃ１−Ｃ４アルキルである］。
【００１８】
特に好ましい実施形態において、式（Ｉ）の化合物は：
【００１９】
【化４】
2021522255.tif 000006
化合物Ａ１（ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２５０）；
【００２０】
【化５】
2021522255.tif 000007
ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２６０；又は
【００２１】
【化６】
2021522255.tif 000008
ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０である。
【００２２】
別の実施形態において、本方法は、治療を必要とする対象に治療有効量の式（ＩＩ）の化合物又はその医薬として許容される塩、同位体形態、立体異性体もしくはプロドラッグを投与することを含む。
【００２３】
【化７】
2021522255.tif 000009
［式中、
Ｒ７は、任意選択的に置換されたアリールであり、
Ｒ８は、任意選択的に置換されたアリールである］。
【００２４】
本発明のこれら及び他の態様は、以下の詳細な説明を参照して明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＳＬＣ２６Ａ３阻害剤のハイスループット同定のためのアッセイ。Ａ．アッセイ概説図。Ｉ−含有溶液の細胞外添加は、ＳＬＣ２６Ａ３媒介型Ｃｌ−／Ｉ−交換を駆動し、ＹＦＰ蛍光クエンチングをもたらす。Ｂ．ビヒクル対照ならびに不活性化合物及び活性化合物についての、非トランスフェクト細胞、及びｓｌｃ２６ａ３トランスフェクト細胞の代表的蛍光時間経過データ。Ｃ．一般的なセカンドメッセンジャー及び膜脱分極による、ｓｌｃ２６ａ３調節の非存在。対照条件下及びｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｃａ２＋、又はホルボールエステルシグナル伝達、又は脱分極を活性化させるための細胞処理後の、ｓｌｃ２６ａ媒介型Ｃｌ−／Ｉ−−交換についての蛍光時間経過データ（上）及び概要（下）（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝４、差異は有意ではない）。
【図２】ハイスループットスクリーニングによって同定されたマウスｓｌｃ２６ａ３阻害剤。Ａ．（左パネル）阻害百分率を示す、１８、０００化合物についての２５μＭでの一次スクリーニングデータのドットプロット。（右パネル）スクリーニングからの結果のまとめ。Ｂ．一次スクリーニングにおいて同定された４つの化学分類の活性化合物の構造。Ｃ．スクリーニングにおいて同定された分類Ａ（Ｃｌａｓｓ）及び分類Ｂの化合物ならびにニフルミン酸についてのｓｌｃ２６ａ３阻害の濃度依存性（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝６）。単一部位阻害モデルについての近似曲線。
【図３】分類Ａ及び分類Ｂのｓｌｃ２６ａ３阻害剤についての構造−活性の関係性。Ａ．分類Ａ。（左パネル）分類Ａ阻害剤のコア構造は、四角で囲われている；活性及び不活性の置換基を、列挙する。（右パネル）化合物Ａ１（ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２５０ともいう）を含む選択された分類Ａ化合物についての濃度依存性測定。Ｂ．分類Ｂ。活性及び不活性置換基を有するコア構造（左パネル）及び濃度依存性測定値（右パネル）を示す。Ｃ．化合物Ａ１の合成経路。
【図４】化合物Ａ１作用の性質決定。Ａ．ＳＬＣ２６Ａ３媒介型Ｃｌ−／ＨＣＯ３−交換の化合物Ａ１阻害の濃度依存性（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝６）。（挿入）Ｃｌ−／ＨＣＯ３−交換についての元のＢＣＥＣＦ蛍光曲線。Ｂ．ＳＬＣ２６Ａ３媒介型Ｃｌ−／ＳＣＮ−交換の化合物Ａ１阻害の濃度依存性（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝６）。Ｃ．ＳＬＣ２６Ａ３媒介型Ｃｌ−／Ｉ−交換の化合物Ａ１（１μＭ）阻害の時間経過（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝４）。（挿入）ＳＬＣ２６Ａ３媒介型Ｃｌ−／Ｉ−交換の化合物Ａ１（１μＭ）阻害の可逆性（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝４）。Ｄ．ＨＥＫ細胞における（ヒト）ＳＬＣ２６Ａ３媒介型Ｃｌ−／Ｉ−交換の阻害。ＹＦＰ蛍光の線（上）及びまとめデータ（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝１２〜２６個の個々の細胞を分析した）（挿入）。
【図５】化合物Ａ１選択性。Ａ．ペンドリン（ｓｌｃ２６ａ４）、ＰＡＴ−１（ｓｌｃ２６ａ６）、ｓｌｃ２６ａ９、ＣＦＴＲ（ホルスコリン刺激性）、及びＴＭＥＭ１６Ａ（ＡＴＰ刺激性）についてのＣｌ−／Ｉ−−交換アッセイにおけるＹＦＰ蛍光の時間経過（１０μＭ化合物Ａ１の非存在下（黒色線）及び存在下（灰色線））。Ｂ．研究についてのまとめデータを、対照条件に対して正規化したデータ（白色バー）と共にパネルＡに示す（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、プレートリーダーアッセイについてｎ＝４、及び単一細胞アッセイについてｎ＝１４〜２９、差異は有意ではない）。Ｃ．（左パネル）気体−液体境界にて生長させた十分に分化したＨＢＥ細胞における短絡電流（Ｉｓｃ）。研究を、１０μＭ化合物Ａ１の非存在下（黒色線）及び存在下（灰色線）で行った。示される場合、アミロリド（２０μＭ）、ホルスコリン（２０μＭ）、ＣＦＴＲｉｎｈ−１７２（１０μＭ）及びＡＴＰ（１００μＭ）を加えた。（右パネル）調節因子の添加についてのＩｓｃにおける変化（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝３、差異は有意ではない）。
【図６】化合物Ａ１は、マウス遠位結腸において腸液吸収を阻害するが空腸において阻害しない。Ａ．化合物Ａ１（１０μＭ）及びテナパノール（１０μＭ）の効果、個々に及び共に、腸係蹄重量／長さ比において（上）及び内腔ｐＨにおいて（下）、マウス遠位結腸の閉塞した腸係蹄において（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝４腸係蹄／群）。Ｂ．化合物Ａ１（１０μＭ）及びテナパノール（１０μＭ）の効果、個々に及び共に、腸係蹄重量／長さ比において（上）及び内腔ｐＨにおいて（下）、マウス空腸中部（ｍｉｄ−ｊｅｊｕｎａｌ）の閉塞した腸係蹄（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝５−９腸係蹄／群）．＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意でない、事後ニューマン−コイルス多重比較検定による一元配置分散分析。ＤＲＡｉｎｈ：化合物Ａ１、Ｔｅｎ：テナパノール。
【図７】経口化合物Ａ１は、野生型マウス及び嚢胞性繊維症マウスにおいてロペラミド誘導性便秘を軽減する。Ａ．ロペラミドによって作製した便秘のマウスモデル。Ｂ．ロペラミド処理野生型マウスにおける化合物Ａ１（５ｍｇ／ｋｇ）及びテナパノール（５ｍｇ／ｋｇ）の効果、個々に及び共に、３時間糞便重量、ペレットの数、及び糞便水分含量（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝５−７マウス／群）、比較のために示されるビヒクル対照と共に。Ｃ．パネルＡの研究は、機能的ＣＦＴＲを欠損した嚢胞性繊維症マウスにおいてなされた（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝５マウス／群）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意でない；事後ニューマン−コイルス多重比較検定による一元配置分散分析。
【図８】Ａ．空腸及び遠位結腸における吸収メカニズム。矢印の大きさは、液体吸収における相対的な重要性を表す。Ｂ．化合物Ａ１及びテナパノールについての提唱された作用部位及びメカニズム。
【図９】化合物Ａ１（ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２５０）及びＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０にｋついてのＳＬＣ２６Ａ３媒介型Ｃｌ−／Ｉ−−交換に対する濃度−阻害曲線。ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０は、化合物Ａ１と比較して、４倍の改善された効力（約５０ｎＭ  ＩＣ５０）を有する。
【図１０】単回用量の腹腔内又は経口投与後の、ＤＲＡ阻害剤の薬物動態。Ａ．５ｍｇ／ｋｇ投与後の化合物Ａ１（ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２５０）の血清濃度。Ｂ．５ｍｇ／ｋｇ投与後のＤＲＡｉｎｈ−Ａ２６０の血清濃度。Ｃ．１０ｍｇ／ｋｇ投与後のＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０の血清濃度。
【図１１】マウスにおけるロペラミド誘導性便秘モデルでのＤＲＡ阻害剤の効力。Ａ．実験プロトコール。Ｂ．ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２６０は、ロペラミド処理マウスにおける３時間糞便重量、ペレット数及び水分含量を改善する（ｎ＝４〜６マウス／群）。Ｃ．ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０効果の用量依存性（ｎ＝５−８マウス／群）。比較を、一元配置分散分析ｗｉｔｈ事後ニューマン−コイルス多重比較検定で行った。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意でない。ｉｐ：腹腔内、ｐｏ：経口、Ａ２７０：ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０．
【図１２】シュウ酸ナトリウム経口投与によって誘導される急性高シュウ酸尿症における化合物Ａ１（ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２５０）の効力（ｎ＝３〜４マウス／群）。
【図１３】シュウ酸ナトリウム経口投与によって誘導される急性高シュウ酸尿症におけるＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０の効力。Ａ．実験プロトコール．Ｂ．マウスにおける尿シュウ酸塩／クレアチニン比（経口シュウ酸ナトリウム処理の前及び後）ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０又はビヒクルで処理した（ｎ＝４−５マウス／群）。比較を、事後ニューマン−コイルス多重比較検定による一元配置分散分析によって行った。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｎｓ：有意でない。ｉｐ：腹腔内、ｐｏ：経口、Ａ２７０：ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０、Ｖｅｈ：ビヒクル。
【図１４】マウスにおいてシュウ酸塩腎症モデルを誘導するための実験プロトコール。
【図１５】化合物Ａ１（ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２５０）処理は、シュウ酸塩腎症モデルにおいて、尿沈殿物を大幅に減らす。ビヒクル処理マウス及び化合物Ａ１処理マウスにおける不溶性尿沈殿物（丸で囲う）をシュウ酸塩腎症モデルの１４日目に示す代表写真（４〜５マウス／群の代表）。
【図１６】シュウ酸塩腎症モデルにおいて化合物Ａ１（ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２５０）処理は、腎臓損傷を予防する。Ａ及びＢ。シュウ酸塩腎症モデルにおける１４日目のビヒクル処理マウスは、顕著な腎臓損傷を有した（炎症−暗い領域、壊死−丸で囲った領域、尿細管円柱−矢印で示した領域）（５匹のマウスの代表）、Ａ及びＢそれぞれにおいて４×及び１０×倍率。Ｃ及びＤ。化合物Ａ１処理マウスは、有意な損傷のない正常に見える腎臓を有する（ｎ＝４マウスの代表）、Ｃ及びＤそれぞれにおいて４×及び１０×倍率。
【図１７】化合物Ａ１処理は、シュウ酸塩腎症モデルにおいて腎臓結晶堆積を予防する。Ａ．腎臓全体（破線内）、ビヒクル処理マウスにおいて１４日目に偏光下で調べた（４×倍率）、白い点は腎臓結晶堆積を表す（ｎ＝５マウスの代表）。Ｂ．腎臓全体（破線内）、化合物Ａ１処理マウスにおいて、１４日目に偏光下で調べた（４×倍率）、白い点は腎臓結晶堆積を表す（ｎ＝４マウスの代表）。
【図１８】ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０は、シュウ酸塩腎症モデルにおいて、体重減少、高シュウ酸尿症及び腎不全を防ぐ。Ａ．実験プロトコール。Ｂ．ビヒクル又はＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０で処理したマウスにおける０日目と比較した体重変化百分率（ｎ＝４〜１０マウス／群／時点）。Ｃ．ビヒクル又はＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０で処理したマウスにおける０日目及び７日目の３時間尿シュウ酸塩／クレアチニン比（１０マウス／群／時点）。Ｄ．ビヒクル又はＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０で処理したマウスにおける７日目及び１４日目の血清クレアチニン（ｎ＝４〜６マウス／群／時点）。比較は、事後ニューマン−コイルス多重比較検定を用いた一元配置分散分析にてなされた。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意でない。ｉｐ：腹腔内、Ａ２７０：ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０、Ｖｅｈ：ビヒクル。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
詳細な説明
最初にＤＲＡ（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ａｄｅｎｏｍａ（腺腫において下方制御される））と名付けられたＳＬＣ２６Ａ３は、腸上皮細胞の内腔膜において発現しここで、電気的に中性のＮａＣｌ吸収及びシュウ酸塩吸収を促進する、陰イオン（Ｃｌ−、ＨＣＯ３−、シュウ酸塩）交換体である。ヒト又はマウスにおけるＤＲＡ機能欠損は、塩化物喪失性下痢を引き起こす。ＳＬＣ２６Ａ３はまた、シュウ酸塩の吸収を促進するための胃における主要な輸送体でもある。ＤＲＡノックアウトマウスは、６０％低い血清シュウ酸塩レベル及び７０％低い尿シュウ酸塩レベルを有する。したがって、本開示の実施形態は、便秘、高シュウ酸尿症及び腎結石疾患を治療又は予防するための抗吸収療法として有効な選択的ＳＬＣ２６Ａ３阻害剤を同定しそして最適化することを目指す。
【００２７】
ＳＬＣ２６Ａ３
ＳＬＣ２６Ａ３は、陰イオンチャネル及び輸送体のＳＬＣ２６遺伝子ファミリーのメンバーである。最も近いＳＬＣ２６Ａ３ホモログであるＳＬＣ２６Ａ４（ペンドリン；４５％アミノ酸同一性）は、内耳、甲状腺、炎症を起こした気道及び腎臓における陰イオン交換体である。特定の低分子ペンドリン阻害剤は、気道上皮細胞培養物において気道表面液の深度を増大し、マウスにおいて利尿応答を起こすことが公知であり、炎症性肺障害、例えば、ＣＦ及び喘息における、及び容積過負荷浮腫（ｖｏｌｕｍｅ−ｏｖｅｒｌｏａｄ  ｅｄｅｍａ）における、潜在的な治療有用性を示唆している。例えば、ＷＯ２０１７／１４７５２３を参照されたい。二番目に近く関連しているＳＬＣ２６Ａ３ホモログであるＳＬＣ２６Ａ６（ＰＡＴ−１、推定陰イオン輸送体−１；３４％アミノ酸同一性）もまた、小腸における頂端膜で発現される陰イオン交換体であり、ＳＬＣ２６Ａ３と共に電気的に中性のＮａＣｌ吸収を促進する。
【００２８】
ＳＬＣ２６Ａ３は、結腸及び小腸における腸細胞の管腔に面する原形質膜において発現される陰イオン交換体である。ＳＬＣ２６Ａ３は、種々の一価の陰イオン（Ｃｌ−、ＨＣＯ３−及びチオシアネート（ＳＣＮ−）を含む）ならびに二価の陰イオンであるシュウ酸塩の交換を促進する。ＳＬＣ２６Ａ３媒介型Ｃｌ−／ＨＣＯ３−交換は、電気的に中性のＮａＣｌ吸収に関与し、これは、結腸及び小腸における水分吸収を駆動する。ＳＬＣ２６Ａ３における機能喪失突然変異は、ヒトにおいて先天的な塩化物喪失性下痢（ＣＬＤ）を引き起こし、これは、子宮において始まる重篤な下痢によって特徴づけられる。マウスにおいて、ｓｌｃ２６ａ３のノックアウトは、ＣＬＤを繰り返し、下痢及び代謝アルカローシスをもたらす。ＳＬＣ２６Ａ３阻害は、したがって、腸液吸収を遮断することによって便秘を治療する、潜在的なアプローチであり、これは、オピオイド誘導性便秘を含む便秘の主要な種類において、及び、分泌促進性嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）Ｃｌ−チャネルが損傷している嚢胞性繊維症（ＣＦ）に関連する便秘において、有用であり得る。
【００２９】
腸には、Ｎａ＋及びＣｌ−の吸収のための少なくとも３つの経路が存在する：栄養素共役型Ｎａ＋吸収、電気的に中性のＮａＣｌ吸収、及び起電性Ｎａ＋吸収。小腸における栄養素共役型Ｎａ＋吸収は、ナトリウム−グルコース輸送体（ＳＧＬＴ）及びＮａ−アミノ酸共輸送体を含み、ここでは、Ｃｌ−が傍細胞経路を介して吸収される。小腸及び近位結腸における電気的に中性のＮａＣｌ吸収は、Ｎａ＋／Ｈ＋交換体（ＮＨＥ２／ＳＬＣ９Ａ２及びＮＨＥ３）ならびにＣｌ−／ＨＣＯ３−交換体（ＳＬＣ２６Ａ３及びＳＬＣ２６Ａ６）を含み、これらは、直接で機能してＮａＣｌを吸収すると考えられる。遠位結腸における起電性Ｎａ＋吸収は、上皮ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）を含む。
【００３０】
ＳＬＣ９Ａ３突然変異は、軽度の代謝アシドーシスを伴う先天的なＮａ＋下痢を引き起こし、そしてｓｌｃ９ａ３−／−マウスは、内腔液アルカリ化を伴う軽度の下痢を有する。しかし、ｓｌｃ９ａ３−／−マウスの遠位結腸における補償的なＥＮａＣ活性の増大は、下痢の重篤度を制限すると考えられる。ＳＬＣ２６Ａ３は、遠位結腸及び十二指腸において主に発現されそして空腸及び回腸において低い発現を有し、他方で、ＳＬＣ２６Ａ６は、主に小腸で発現される。
【００３１】
ＣＦ対象において、胃腸関連の問題は、一般的であり、胎便性イレウス（新生児において約１５％の発症率）、便秘（４７％以下の生涯有病率）及び遠位腸閉塞症候群（約１５％の生涯有病率）を含む。分泌促進ＣＦＴＲＣｌ−チャネルの機能損傷は、これらの障害の病因であると考えられている。経口投与されたＣＦＴＲアクチベーターは、便秘の実験的マウスモデルにおいて有効であるが、機能的ＣＦＴＲを欠損するＣＦマウスにおいては有効ではないことが、公知である。
【００３２】
ＳＬＣ２６Ａ３はまた、シュウ酸塩の吸収を促進する、胃における主な輸送体である。これは、特定の食品に含まれそしてまた代謝最終産物として肝臓において産生される。シュウ酸塩の大部分は尿中に排出され（９０％）、１０％が糞便中に排出される。尿中シュウ酸の増大は、シュウ酸カルシウム腎結石（腎結石対象の約６５％）の主な危険因子である。
【００３３】
シュウ酸カルシウム尿路結石において、主な病理は、尿中の高いシュウ酸塩レベルであり、これにより、最終的に腎臓疾患がもたらされる。高められた尿中シュウ酸塩排出（高シュウ酸尿症）は、腸内高シュウ酸尿症又は原発性高シュウ酸尿症に起因し得る。腸内高シュウ酸尿症は、種々の胃腸疾患（肥満手術、腸切除、炎症性腸疾患及び膵臓不全を含む）に起因する、結腸における病理学的なシュウ酸塩の超吸収によって特徴づけられる。腸内高シュウ酸尿症は、シュウ酸カルシウム腎結石を形成する危険性を劇的に増大する。原発性高シュウ酸尿症は、シュウ酸塩代謝経路における酵素をコードする遺伝子における突然変異（ＡＧＸＴ、ＧＲＨＰＲ、ＨＯＧＡ１）によって引き起こされ、高い血漿及び尿中シュウ酸塩レベルによって特徴づけられる。原発性高シュウ酸尿症は、最終的に、シュウ酸カルシウム結石及び腎臓におけるシュウ酸カルシウム堆積の再発に起因する腎不全をもたらす。
【００３４】
ＳＬＣ２６Ａ３標的化
ＳＬＣ２６Ａ３は、結腸において高く発現され、陰イオン交換を媒介することが知られている。ＳＬＣ２６Ａ３を標的化することは、液体吸収を阻害することにより便秘を治療又は予防するための有効な治療法であることが、本明細書中で実証される同様に、ＳＬＣ２６Ａ３を標的化することは、本明細書中でシュウ酸塩吸収を媒介するか又は阻害することにより、高シュウ酸尿症及び尿路結石の予防において有効であることが示される。
【００３５】
本開示の全体を通してより詳細に記載されるように、５０、０００の合成低分子のスクリーニングを、マウスｓｌｃ２６ａ３及び遺伝的にコードされるハロゲン化物センサーを同時発現する細胞において実施した。構造−活性の関係性研究の結果は、強力かつ選択的なｓｌｃ２６ａ３阻害剤を同定し、これを、細胞ならびに便秘のマウスモデル及び高シュウ酸塩食によって誘発されるシュウ酸塩腎症のマウスモデルにおいて性質決定した。
【００３６】
したがって、１つの実施形態において、ＳＬＣ２６Ａ３の阻害は、新規な便秘の抗吸収治療法を提供する。理論に縛られることを望むものではないが、ＳＬＣ２６Ａ３の阻害は、単独で又は代替の抗吸収メカニズムもしくは分泌促進メカニズムに作用する薬物と一緒で、難治性便秘の治療に非常に有効であり得ると考えられる。
ＳＬＣ２６Ａ３の阻害は、腸Ｎａ＋吸収のブロッカー、ＮＨＥ３阻害剤であるテナパノール、ならびに同時投与された場合のＳＬＣ２６Ａ３及びＮＨＥ３阻害剤に匹敵する効力で便秘の兆候を低減し、完全に便秘を克服させる。
【００３７】
ハイスループットスクリーニングは、ＳＬＣ２６Ａ３阻害剤のいくつかの分類を同定し、以下の構造−活性分析及び最適化により、特定の４、８−ジメチルクマリン化合物を産生した。詳細には、ＳＬＣ２６Ａ３媒介型陰イオン交換の阻害について１００〜２００ｎＭのＩＣ５０を有する化合物Ａ１（ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２５０）、ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２６０及びＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０である。マウスにおける研究は、これらの化合物の効力を便秘のロペラミドモデルにおいて実証し、そして腸液吸収のメカニズムを明らかにする新奇なデータを提供した。重要なことに、本開示の化合物（例えば、化合物Ａ１）は、ｓｌｃ２６ａ３についての選択性を示し、そして相同なｓｌｃ２６ａ−ファミリー陰イオン交換体又は関連する腸輸送体を阻害しないことを示した。
【００３８】
ＳＬＣ２６Ａ３の標的化は、したがって、便秘を治療するための有効な抗吸収アプローチを提供している。本明細書中で開示されるＳＬＣ２６Ａ３阻害剤は、便秘のマウスモデルにおけるテナパノに匹敵する効力を有することが示される。理論的には、ＳＬＣ２６Ａ３阻害は、糞便が最終形態まで脱水される遠位結腸において吸収を遮断するため、便秘治療法のためのＮＨＥ３阻害よりもより有効であり得る。ロペラミド誘導性便秘の予防におけるＮＨＥ３及びＳＬＣ２６Ａ３阻害剤の相加作用又は相乗作用は、驚くべき発見であった。この結果は、ＳＬＣ２６Ａ３阻害剤が、種々の種類の便秘のための単独治療法として単独で有効に使用されてもよいこと、又は単独治療法に適切に応答しない対象において、ＮＨＥ３阻害剤（例えば、テナパノール）と組み合わせて使用されてもよいことを、支持する。
【００３９】
便秘治療法としてのＳＬＣ２６Ａ３阻害剤の効力はまた、本明細書中で、便秘のロペラミドモデルにおいてＣＦマウスで実証され、このことは、腸ＳＬＣ２６Ａ３機能は、ＣＦにおいて損傷を受けないという結論を支持する。ＳＬＣ２６Ａ３阻害治療法は、したがって、便への加水を促進しそしてヒトＣＦ対象における便秘を治療することにおいて有益であり得、そして、新生児期における胎便性イレウスを予防又は治療する可能性を有する。
【００４０】
これらの知見に一致して、マウス空腸においてｓｌｃ２６ａ３阻害は効果を有さなかった一方でＮＨＥ３阻害は液体吸収を遮断した。同時に、マウス遠位結腸において、ｓｌｃ２６ａ３阻害は吸収を遮断したがＮＨＥ３阻害剤は効果を有さなかったことが、本明細書中で開示される。これらの結果は、Ｓｌｃ２６ａ６が主要なＣｌ−／ＨＣＯ３−交換体である可能性が高いマウス小腸において、ｓｌｃ２６ａ３がＮａＣｌ吸収にわずかな役割しか果たさないか又は全く役割を果たさないことの薬理学的証拠を提供し、このことは、先行研究と一致する。
【００４１】
ノックアウトマウスを使用した研究から得られた腸ＮａＣｌ吸収の現在の多くの理解を通して、ノックアウトは、交絡した二次表現型を産生し得ることが、遺伝子発現パターン又は器官発生の変化からわかる。例えば、ｓｌｃ２６ａ４（ペンドリン）により、本出願人は、ｓｌｃ２６ａ４−／−マウスと比較して、薬理学的阻害による腎臓の生理学において、顕著な違いを見出した。ヒト又はノックアウトマウスにおけるＳＬＣ２６Ａ３機能欠損は、目立った下痢を伴うＣＬＤを起こすが、本研究の阻害剤は、便秘のマウスモデルにおいて部分的な効力しか有さなかった。この相違は、この阻害剤の部分的効力に起因し得るか、又は、おそらくはノックアウトマウスにおける二次表現型である可能性がより高い。ｓｌｃ２６ａ３阻害は、液体吸収を遠位結腸でのみ遮断することが、本明細書中で見出され、このことは、後者の可能性を支持し、ｓｌｃ２６ａ３阻害剤及びテナパノールの同時投与に対する相加効果を支持する。さらに寄与する因子は、ＮＨＥ３、Ｓｌｃ２６ａ３及びＣＦＴＲの間の調節相互作用であり得、これは、ＮＨＥ調節因子（ＮＨＥＲＦ）、ＳＬＣ２６スルフェート輸送体アンチシグマ（ＳＴＡＳ）ドメイン、及びＣＦＴＲ調節ドメインを含み得る。多くのＣＬＤ関連ＳＬＣ２６Ａ３突然変異がＳＴＡＳドメインにおいて起こるので、重度のＣＬＤ表現型は、ＳＬＣ２６Ａ３吸収の欠損とＮＨＥ３及びＣＦＴＲ活性の調節不全との両方の結果であり得る。ＣＬＤを有する対象及びｓｌｃ２６ａ３−／−マウスにおける先行研究は、空腸における液体吸収を損傷し、他方で、閉塞した腸係蹄の研究は、本明細書で、ｓｌｃ２６ａ３は液体吸収における有用性が最小限であることを支持した。
【００４２】
本明細書中で開示される結果は、便への加水の促進におけるＳＬＣ２６Ａ３阻害の治療有用性を支持する。それにもかかわらず、ＳＬＣ２６Ａ３阻害と腫瘍原性との間の理論的相関性が存在することが、腺腫におけるＳＬＣ２６Ａ３下方調節についての元の知見、ならびにｓｌｃ２６ａ３−／−マウスにおける結腸上皮増殖帯域の拡張及び表面粘膜過形成の兆候に基づき、さらに観察された。しかし、特筆すべきことに、ＳＬＣ２６Ａ３突然変異を有するＣＬＤ対象は、胃腸がんの発生の増加を示さない。低減したＳＬＣ２６Ａ３活性は、潰瘍性大腸炎において観察され、ＳＬＣ２６Ａ３における１ヌクレオチド多型は、潰瘍性大腸炎の発症の危険因子であり得る。しかし、ＳＬＣ２６Ａ３機能の欠損は、腸炎症を発症せず、ＣＬＤ対象の６％のみにしか、クローン病又は比特異性大腸炎の兆候は報告されない。腎不全は、ＣＬＤ対象の約２５％において観察されるが、これは、診断の遅れ及びその結果としての慢性の体液量及び塩の枯渇からもたらされる可能性がある。ＳＬＣ２６Ａ３突然変異はまた、雄性不妊にも関連するが、得られ得る証拠は、ＳＬＣ２６Ａ３−ＣＦＴＲ相互作用の不全及び結果としてのＣＦＴＲ活性不全が、原因であることを示唆する。一般に、適切な塩置換療法により、ＣＬＤにおける長期の健康は良好になり、このことは、ＳＬＣ２６Ａ３突然変異による有意な腫瘍及び胃腸ではない問題が存在しないことを示唆する。
【００４３】
別の実施形態において、ＳＬＣ２６Ａ３の阻害は、シュウ酸塩吸収を低減し、それによって腎臓を、高シュウ酸尿症の有害な効果から守っている。Ｓｌｃ２６ａ３−／−マウスは、胃におけるシュウ酸塩吸収の損傷に起因して、血中（６０％低下）及び尿中（７０％低下）のシュウ酸塩を大きく減少させる。Ｆｒｅｅｌ  ＲＷ、Ｗｈｉｔｔａｍｏｒｅ  ＪＭ、Ｈａｔｃｈ  Ｍ。マウス腸における経細胞シュウ酸塩及びＣｌ−吸収は、ＤＲＡ陰イオン交換体Ｓｌｃ２６ａ３によって媒介され、そしてＤＲＡ欠失は、尿中シュウ酸を減少させる。Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２０１３；３０５：Ｇ５２０−Ｇ５２７。
【００４４】
したがって、ＳＬＣ２６Ａ３阻害は、尿の代わりに糞便を通したシュウ酸塩の大部分を除去することを促進することにより、腎結石、特にシュウ酸カルシウム腎結石に関する腎結石（特に、シュウ酸カルシウム腎結石）を予防し、腸内高シュウ酸尿症を治療し、原発性高シュウ酸尿症を管理する、新規かつ強制的なアプローチである。これは、本明細書中で開示されるインビボ動物データによって支持される。高シュウ酸塩食によって誘発されたシュウ酸塩腎症のマウスモデルにおいて、ｓｌｃ２６ａ３阻害が、経口シュウ酸ナトリウム負荷によって誘発された高シュウ酸尿症；腎不全の発症、及び腎臓血漿の堆積を予防したことが見いだされた。これらの結果は、ＳＬＣ２６Ａ３阻害剤が、高シュウ酸尿症の治療において有用であり得ることの薬理学的証拠（シュウ酸カルシウム尿路結石、腸内高シュウ酸尿症及び原発性高シュウ酸尿症において見られる）を提供する。
【００４５】
したがって、種々の実施形態が、クマリン誘導体を含む強力なＳＬＣ２６Ａ３阻害剤を指向する。種々の実施形態にしたがうＳＬＣ２６Ａ３阻害剤は、便秘、高シュウ酸尿症又は腎結石を治療又は予防するための、有効な治療法である。
【００４６】
化学定義
「アルキル」は、直鎖又は分枝鎖の、非環状の、不飽和又は部分的に不飽和の、１〜１２の炭素原子を含む脂肪族炭化水素を意味する。低級アルキルは、１〜６の間の任意の数の炭素原子を有するアルキル（すなわち、Ｃ１―Ｃ６アルキル）をいう。代表的な飽和直鎖アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ―ペンチル、ｎ−ヘキシル、などが挙げられ、他方で、飽和分枝鎖アルキルとしては、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ヘプチル、ｎ−オクチル、イソぺンチル、２−エチルヘキシルなどが挙げられる。アルキルは、本明細書中で定義される１つ以上の置換基によって、任意選択的に置換されでもよい。
【００４７】
「アルケニル」は、炭素及び水素原子のみを含み、１つ以上の炭素−炭素二重結合を含む、不飽和の、直鎖又は分枝鎖の、単結合によって分子の残りに結合している２〜１２の炭素原子（Ｃ２−Ｃ１２アルケニル）、好ましくは１〜２の炭素原子ｓ（Ｃ２−Ｃ８アルケニル）又は２〜６の炭素原子（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）を有する、炭化水素鎖ラジカルをいい、例えば、エテニル、プロパ−１−エニル、ブタ−１−エニル、ペンタ−１−エニル、ペンタ−１，４−ジエニル、などである。本明細書中で特に別段に言及されていない限り、アルケニル基は、任意選択的に置換されている。
【００４８】
「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキルのラジカルをいう。アルコキシの例としては、メトキシ、エトキシ、などが挙げられる。アルコキシのアルキル部分は、本明細書中で定義される１つ以上の置換基によって、任意選択的に置換されてもよい。
【００４９】
「アルコキシアルキル」は、式―ＲｂＯＲａのラジカルをいい、ここで、Ｒａは、上で定義されたアルキルラジカルであり、Ｒｂは、アルキレン鎖である。
【００５０】
「カルボキシアルキル」は、−ＣＯ２Ｈによって置換されている、直鎖もしくは分枝鎖のアルキルラジカルをいう。アルキルラジカルの長さは、カルボキシ部分の炭素を除く炭素原子の数によって同定され得る。例えば、カルボキシＣ１−Ｃ３アルキルは、−ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、などを含む。
【００５１】
「シクロアルキル」は、炭素及び水素原子のみを含み、縮合又は架橋した環系を含み得る、飽和もしくは不飽和であり単結合によって分子の残りに結合している３〜１５の炭素原子、好ましくは３〜１０の炭素原子、又は好ましくは３〜６の（Ｃ３−Ｃ６）炭素原子を有し、安定的な非芳香族単環式又は多環式炭素環ラジカルをいう。単環式ラジカルとしては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルが挙げられる。
【００５２】
「シクロアルキルアルキル」は、Ｒｂが上で定義したアルキレン鎖であり、Ｒｃが上で定義したシクロアルキルラジカルである、式―ＲｂＲｃのラジカルをいう。
【００５３】
「アリール」は、フェニル又はナフチル（すなわち、ナフタレニル）（１−もしくは２−ナフチル）又はアントラセニル（例えば、２−アントラセニル）などの、芳香族炭素環部分を意味する。
【００５４】
「アリールアルキル」（例えば、フェニルアルキル）は、アリール部分と置き換えられた少なくとも１つのアルキル水素原子を有するアルキルを意味し、例えば、−ＣＨ２−フェニル（すなわち、ベンジル）、−ＣＨ＝ＣＨ−フェニル、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ−フェニル、などである。
【００５５】
「ヘテロアリール」は、水素原子、１〜１３の環炭素原子、窒素、酸素及び硫黄からなる群から選択される１〜６の環ヘテロ原子及び少なくとも１つのヘテロ原子含有芳香族環を含む、５―〜１４―員の環系ラジカルをいう。本開示の実施形態の目的について、ヘテロアリールラジカルは、単環式、二環式、三環式又は四環式環系であってもよく、縮合又は架橋した環系を含んでもよい；及びヘテロアリールラジカルにおける窒素、炭素又は硫黄原子は、任意選択的に酸化されていてもよい；窒素原子は、任意選択的に、四級化されていてもよい。例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：アゼピニル、アクリジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾインドリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキセピニル、１，４―ベンゾジオキサニル、ベンゾナフトフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキシニル、ベンゾピラニル、ベンゾピラノニル、ベンゾフラニル、ベンゾフラノニル、ベンゾチエニル（ベンゾチオフェニル）、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ［４，６］イミダゾ［１，２―ａ］ピリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、ジベンゾフラニル、ジベンゾチオフェニル、フラニル、フラノニル、イソチアゾリル、イミダゾリル、インダゾリル、インドリル、インダゾリル、イソインドリル、インドリニル、イソインドリニル、イソキノリル、インドリジニル、イソキサゾリル、ナフチリジニル、オキサジアゾリル、２―オキソアゼピニル、オキサゾリル、オキシラニル、１−オキシドピリジニル、１―オキシドピリミジニル、１−オキシドピラジニル、１−オキシドピリダジニル、１―フェニル―１Ｈ―ピロリル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピロリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、キノリニル、キヌクリジニル、イソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、チアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、及びチオフェニル（すなわち、チエニル）。
【００５６】
「ヘテロアリールアルキル」は、式―ＲｂＲｄのラジカルをいい、ここで、Ｒｂは、上で定義されたアルキレン鎖であり、及びＲｄは、上で定義されたヘテロアリールラジカルである。
【００５７】
「ハロゲン」又は「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードを意味する。
【００５８】
「ハロアルキル」は、ハロ置換されたアルキル、すなわち、少なくとも１つの水素原子がハロゲンと置き換わっているアルキルをいう。「ペルハロアルキル」は、全ての水素がハロゲンに置き換えられているハロアルキルをいう。ハロアルキルの例としては、トリフルオメチル（ｔｒｉｆｌｕｏｍｅｔｈｙｌ）、ジフルオロブロモメチル、ジフルオロクロロメチル、１，１，２，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロピルなどが挙げられる。特定の実施形態において、ハロアルキル又はペルハロアルキルのハロ置換基は、同じであってもよく（例えば、全てのハロ置換基がフルオロである）又は異なっていてもよい（例えば、ハロ置換基が、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードの２以上の混合物であってもよい）。ハロアルキルのアルキル部分は、本明細書中で定義される１つ以上の置換基によって、任意選択的に置換されていてもよい。
【００５９】
「ハロアルコキシ」は、置換されたアルコキシをいい、ハロゲンと置き換えられた少なくとも１つの水素原子を有するアルコキシ部分を意味する（例えば、クロロメトキシなど）。
【００６０】
上記の全ての基は、「任意選択的に置換され」ており、すなわち、置換されたか又は置換されていないかのどちらであってもよい。用語「置換された」は、本明細書中で使用される場合、上記の基のいずれかを意味し（すなわち、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル及び／又はトリフルオロアルキル）、さらに官能性付与されていてもよく、ここで、少なくとも１つの水素原子は、非水素原子置換基への結合によって置き換えられている。本明細書中で特に言及されない限り、置換された基は、以下から選択される１つ以上の置換基を含み得る：オキソ、―ＣＯ２Ｈ、ニトリル、ニトロ、―ＣＯＮＨ２、ヒドロキシル、チオオキシ、アルキル、アルキレン、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキルカルボニル、アルキルオキシカルボニル、アリール、アラルキル、アリールカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルキルカルボニル、アラルキルオキシカルボニル、アリールオキシ、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルキルカルボニル、シクロアルキルアルキルカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ジアルキルアミン、アリールアミン、アルキルアリールアミン、ジアリールアミン、Ｎ−オキシド、イミド、及びエナミン；トリアルキルシリル基、ジアルキルアリールシリル基、アルキルジアリールシリル基、チオアルキルトリアリールシリル基、ペルフルオロアルキル又はペルフルオロアルコキシ、例えば、トリフルオロメチル又はトリフルオロメトキシなどの基の中のケイ素原子。「置換された」はまた、１つ以上の水素原子がヘテロ原子へのより高級な結合（例えば、二重結合又は三重結合）によって置き換わっている任意の上記の基を含む（例えば、オキソ、カルボニル、カルボキシル、及びエステル基における酸素；及び例えば、イミン、オキシム、ヒドラゾン、及びニトリル基における窒素）。例えば、「置換された」は、１つ以上の水素原子が胃かと置き換わっている上記のいずれかの基を含む：―ＮＲｇＣ（＝Ｏ）ＮＲｇＲｈ、―ＮＲｇＣ（＝Ｏ）ＯＲｈ、―ＮＲｇＳＯ２Ｒｈ、―ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲｇＲｈ、―ＯＲｇ、―ＳＲｇ、―ＳＯＲｇ、―ＳＯ２Ｒｇ、―ＯＳＯ２Ｒｇ、―ＳＯ２ＯＲｇ、＝ＮＳＯ２Ｒｇ、及び―ＳＯ２ＮＲｇＲｈ。「置換された」はまた、１つ以上の水素原子が―Ｃ（＝Ｏ）Ｒｇ、―Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｇ、―ＣＨ２ＳＯ２Ｒｇ、―ＣＨ２ＳＯ２ＮＲｇＲｈ、−ＳＨ、―ＳＲｇ又は―ＳＳＲｇと置き換わっている上記の基のいずれかを意味する。上記において、Ｒｇ及びＲｈは、同じであるか又は異なっており、独立して、水素、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノ、チオアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ヘテロシクリル、Ｎ−ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、Ｎ−ヘテロアリール及び／又はヘテロアリールアルキルである。さらに、上記の置換基の各々は、上記の置換基の１つ以上と任意選択的に置換されてもよい。
【００６１】
医薬組成物
１つの実施形態は、生理学的に許容される賦形剤及び式（Ｉ）の化合物又はその医薬として許容される塩、同位体形態、立体異性体もしくはプロドラッグを含む、医薬組成物を提供する：
【００６２】
【化８】
2021522255.tif 000010
［式中、
Ｒ１は、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ３アルケニル、任意選択的に置換されたＣ３−Ｃ６シクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ３−Ｃ６シクロアルキルアルキル、任意選択的に置換されたアルコキシアルキル、カルボキシＣ１−Ｃ３アルキル、任意選択的に置換されたヘテロアリールアルキル、−Ｓ（Ｏ）２アリール（ここで、アリールは、任意選択的に置換されている）もしくは任意選択的に置換されたアリールアルキルであり、
Ｒ２は、カルボキシＣ１−Ｃ３アルキルであり、
Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、
Ｒ４は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、
但し、Ｒ２がカルボキシエチルである場合、Ｒ１は、置換されたベンジルであり、又はＲ２がカルボキシメチルである場合、Ｒ３及びＲ４は、各々メチルであり、Ｒ１は、ベンジルではない］。
【００６３】
特定の実施形態において、Ｒ１は、任意選択的に置換されたベンジルである。いくつかのより特定の実施形態において、Ｒ１は、以下の構造：
【００６４】
【化９】
2021522255.tif 000011
を有し、式中、
Ｘは、アルキル、Ｃ３−Ｃ５シクロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、ＮＯ２、又はハロアルコキシであり、及び
ｎは、１、２、３、４又は５である。
【００６５】
より特定の実施形態において、ｎは、１又は２であり、Ｘは、ブロモ、クロロ、フルオロ、ヨード、シクロプロピル、ＣＦ３、メチル、ＮＯ２又はメトキシである。
【００６６】
より特定の実施形態において、ｎは１であり、そしてＸは、メタ位のハロゲン（Ｂｒ又はＩ）である。
【００６７】
いくつかの他の実施形態において、Ｒ１は、以下の構造の１つを有する：
【００６８】
【化１０】
2021522255.tif 000012
【００６９】
特定の実施形態において、Ｒ２は、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、又は―ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨである：
【００７０】
【化１１】
2021522255.tif 000013
【００７１】
いくつかの実施形態において、Ｒ３は、メチルである。特定の実施形態において、Ｒ４は、メチルである。
【００７２】
好ましい実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、以下の式（Ｉａ）で表される：
【００７３】
【化１２】
2021522255.tif 000014
式中、Ｘは、アルキル、Ｃ３−Ｃ５シクロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、ＮＯ２、又はハロアルコキシであり、ｎは、１、２、又は３である。
【００７４】
より特定の実施形態は、式（Ｉａ）の化合物を提供し、式中、ｎは、１又は２であり、Ｘは、ブロモ、クロロ、フルオロ、ヨード、シクロプロピル、ＣＦ３、メチル、ＮＯ２又はメトキシであり、及びＲ３及びＲ４は、各々メチルである。
【００７５】
より特定の実施形態において、式（Ｉ）又は（Ｉａ）の化合物は、以下の構造の１つを有する。
【００７６】
【化１３】
2021522255.tif 000015
2021522255.tif 000016
2021522255.tif 000017
2021522255.tif 000018
【００７７】
一般に、クマリン類（例えば、式（Ｉ）又は（Ｉａ）の化合物）は、広範な炎症性、抗腫瘍、抗細菌及び抗真菌特性を有する植物由来の天然製品である。化合物Ａ１（ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２５０）の生理化学特性としては、複数の水素結合アクセプターの存在、４１７Ｄａの分子量、４．６のｌｏｇＰ値、及び７３A２のトポロジカル極性表面責が挙げられ、これらのそれぞれは、経口バイオアベイラビリティを含む薬物様特性と一致する。さらに、３−酢酸−クマリンスキャフォールドは、汎アッセイ干渉化合物分子として知られる無差別結合剤に属さない。
【００７８】
化合物Ａ１において見出された７−ベンゾキシ−４、８−ジメチル−３−酢酸−クマリンスキャフォールドの他の生物学的特性に対して、数件の先行報告が存在する。類似のクマリン類は、バシラス・アンシラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）複製ＤＮＡヘリカーゼの阻害剤として報告されている。Ｌｉ  Ｂ、Ｐａｉ  Ｒ、Ｄｉ  Ｍ、ｅｔａｌ．Ｃｏｕｍａｒｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１２；５５：１０８９６−９０８。別の３−酢酸−クマリンは、リン酸化Ｓｔａｔ３の核トランスロケーションを阻害することにより、オンコジーンシグナル伝達因子及び転写（Ｓｔａｔ３）活性化のアクチベーターを阻害することが報告されている。Ｘｕ  Ｘ−Ｌ，Ｋａｓｅｍｂｅｌｉ  ＭＭ，Ｊｉａｎｇ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｂｅｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｌｙ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｖｔｉｖｅｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔ  Ｓｔａｔ３  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２００９：４（３）：ｅ４７８３。
【００７９】
合成的に、３−酢酸−クマリンスキャフォールドは、標的のアナログの容易な合成を可能にする市販の開始材料から、３〜５工程で調製可能である。反応スキーム１は、式（Ｉ）又は（Ｉａ）の特定の化合物（例えば、式（Ｉ）のＲ１基に−ＣＨ２−Ｒ基が対応する化合物）を調製するための合成経路を表す。
【００８０】
反応スキーム１
【００８１】
【化１４】
2021522255.tif 000019
【００８２】
より具体的には、硫酸条件下での２−メチルレゾルシノールのジエチルアセチルスクシネートとのペックマン反応は、（ａ）４、８−ジメチル−７−ヒドロキシクマリンエステル（上記２）を定量的にもたらした。２のアルキルブロミドとの反応は、（ｂ）７−アルコキシ−４、８−ジメチルクマリン化合物を８０〜９０％の収率でもたらした。２の置換されたベンジルブロミドとの反応は、置換されたベンジルオキシ−４、８−ジメチルクマリン化合物を５０〜９６％の収率でもたらした。工程（ｂ）及び（ｃ）から得られた化合物を、メタノール中の１Ｎ水酸化ナトリウム溶液で加水分解し（２ｃ）、代表的な分類Ａ化合物を６０〜９０％で得た。
【００８３】
いくつかの他の実施形態は、生理学的に許容される賦形剤及び式（ＩＩ）の化合物又はその医薬として許容される塩、同位体形態、立体異性体もしくはプロドラッグを含む医薬組成物を提供する。
【００８４】
【化１５】
2021522255.tif 000020
［式中、
Ｒ７は、任意選択的に置換されたアリールであり、
Ｒ８は、任意選択的に置換されたアリールである］。
【００８５】
これらの実施形態のいくつかにおいて、Ｒ７は、任意選択的に置換されたフェニルである。より特定の実施形態において、Ｒ７は、以下の構造：
【００８６】
【化１６】
2021522255.tif 000021
を有し、式中、
Ｘは、水素、アルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ又はハロアルコキシであり、及び
ｎは、０、１、２、３、４又は５である。
【００８７】
いくつかの実施形態において、Ｘは、水素、クロロ、ブロモ、メチル、又はメトキシであり、ｎは、１又は２である。
【００８８】
いくつかの実施形態において、Ｒ７は、任意選択的に置換されたフェニルである。特定の特別な実施形態において、Ｒ８は、以下の構造：
【００８９】
【化１７】
2021522255.tif 000022
を有し、式中、
Ｘは、アルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ又はハロアルコキシであり、
ｎは、１、２、３、４又は５である。
【００９０】
いくつかの実施形態において、Ｘは、クロロ、ブロモ、メチル、又はメトキシであり、ｎは、１又は２である。
【００９１】
いくつかの特定の実施形態において、式（ＩＩ）の化合物は、以下の構造の１つを有する。
【００９２】
【化１８】
2021522255.tif 000023
2021522255.tif 000024
【００９３】
本明細書中で使用される場合、医薬組成物は、本明細書中で記載される化合物と他の化学的構成要素（例えば、担体、安定化剤、希釈剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤、及び／又は賦形剤）の混合物をいう。特定の実施形態において、医薬組成物は、化合物の生物への投与を容易にする。いくつかの実施形態において、本明細書中で提供される治療又は使用の方法の実施は、治療有効量の本明細書中で提供される化合物が、治療される疾患、障害又は医学症状を有する哺乳動物に、医薬組成物中で投与される。特定の実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。特定の実施形態において、治療有効量は、疾患の重篤度、対象の年齢及び相対的健康、使用される化合物の効力及び他の因子に依存して変動する。本明細書中で記載される化合物は、単独で使用されるか、又は混合物の構成要素として１つ以上の治療剤と組み合わせて使用される。
【００９４】
医薬組成物は、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液又はエマルジョンであってもよい。これは、生理学的に許容される賦形剤（医薬として許容される又は好適な賦形剤もしくは担体とも呼ばれる）（すなわち、活性成分の活性に干渉しない非毒性物質）をさらに含む。このような組成物は、固体、液体又は気体（エアロゾル）の形態であってもよい。
【００９５】
１つの実施形態において、１つ以上の化合物が、水溶液中に調剤される。特定の実施形態において、水溶液は、例示でしかないが、生理学的に適合性の緩衝液、例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理食塩水緩衝液から選択される。特定の実施形態において、有用な水性懸濁液は、１つ以上のポリマーを懸濁化剤として含む。有用なポリマーとしては、水溶性ポリマー類、例えば、セルロースポリマー類（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、及び非水溶性ポリマー類（例えば、架橋カルボキシル含有ポリマー類）が挙げられる。本明細書中で記載される特定の医薬組成物は、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボマー（アクリル酸ポリマー）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリアクリルアミド、ポリカルボフィル、アクリル酸／ブチルアクリレートコポリマー、アルギン酸ナトリウム及びデキストランから選択される粘膜接着性ポリマーを含む。
【００９６】
別の実施形態において、本明細書中で記載される化合物は、経口投与のために調剤される。本明細書中で記載される化合物は、活性化合物を、例えば、医薬として許容される担体又は賦形剤と組み合わせることによって調剤される。種々の実施形態において、本明細書中で記載される化合物は、例示でしかないが、丸剤、散剤、錠剤、ドラジェ、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、エリキシル、スラリー、懸濁液などを含む経口投薬形態で調剤される。
【００９７】
特定の実施形態において、治療有効量の少なくとも１つの本明細書中で記載される化合物は、他の経口投薬形態に調剤される。経口投薬形態としは、ゼラチンで作られたプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチン及び可塑剤（例えば、グリセロール又はソルビトール）で作られた軟質の密封カプセルが挙げられる。特定の実施形態において、プッシュフィットカプセルは、活性成分を、１つ以上のフィラーと混合して含む。フィラーとしては、例示でしかないが、ラクトース、結合剤（例えば、デンプン類）、及び／又は滑沢剤（例えば、タルク又はステアリン酸マグネシウム）、及び任意選択的に、安定化剤が挙げられる。他の実施形態において、軟質カプセルは、好適な液体に溶解するか又は懸濁される１つ以上の活性化合物を含む。好適な液体としては、例示でしかないが、１つ以上の脂肪油、液体パラフィン、又は液体ポリエチレングリコ−ルが挙げられる。さらに、安定化剤が、任意選択的に加えられる。
【００９８】
なお他の実施形態において、化合物は、直腸組成物（例えば、カカオバター又は他のグリセリド類などの従来の坐剤基材ならびに例えばポリビニルピロリドン、ＰＥＧ、などの合成ポリマーを含む、浣腸、直腸ゲル、直腸泡剤、直腸エアロゾル、坐剤、ゼリー状坐剤、又は停留浣腸）として調剤される。組成物の坐剤形態において、低融点ワックス（例えば、任意選択的にカカオバターと組み合わせられた脂肪酸グリセリド類の混合物であるが、これに限定されない）が、最初に融解する。
【００９９】
本明細書中で記載される化合物を含む組成物の調製のための方法は、本化合物を１つ以上の不活性な医薬として許容される賦形剤又は担体と共に調剤して、固体、半固体又は液体を形成することを含む。固体組成物としては、散剤、丸剤、分散可能顆粒、カプセル、カシェ及び坐剤が挙げられるが、これらに限定されない。液体組成物としては、化合物が溶解している溶液、化合物を含むエマルジョン、又は本明細書中で開示される化合物を含むリポソーム、ミセルもしくはナノ粒子を含む溶液が挙げられる。半固体組成物としては、ゲル、懸濁液及びクリームが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で記載される医薬組成物の形態としては、液体の溶液又は懸濁液、使用前に液体中に溶解するか又は懸濁するために好適な固体形態又はエマルジョンが挙げられる。これらの組成物はまた、任意選択的に、少量の非毒性の補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、などを含む。
【０１００】
有用な医薬組成物はまた、任意選択的に、本明細書中で記載される化合物の可溶性を補助する可溶化剤を含む。用語「可溶化剤」は、一般に、薬剤のミセル溶液又は真の溶液の形成をもたらす薬剤を含む。特定の受け入れ可能な非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０は、可溶化剤として有用であり、眼科的に受け入れ可能なグリコール、ポリグリコール、例えばポリエチレングリコール４００及びグリコールエーテルである。
【０１０１】
さらに、有用な医薬組成物は、任意選択的に１つ以上のｐＨ調整剤又は緩衝化剤（酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸及び塩酸などの酸；水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム及びｔｒｉｓ−ヒドロキシメチルアミノメタンなどの塩基；及びシトレート／できストロース、重炭酸ナトリウム及び塩化アンモニウムなどの緩衝液が挙げられる）を含む。このような酸、塩基及び緩衝液は、組成物のｐＨを適切な範囲に維持するために必要な量で含まれる。
【０１０２】
さらに、有用な組成物はまた、任意選択的に、組成物の浸透性を適切な範囲にするために必要な量で、１つ以上の塩を含む。このような塩としては、ナトリウム、カリウム又はアンモニウムの陽イオン及び塩素、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、重炭酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩又は重亜硫酸塩の陰イオンを含むものが挙げられ、好適な塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、チオ硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム及び硫酸アンモニウムが挙げられる。
【０１０３】
使用及び治療方法
本明細書中ではまた、（ａ）ＳＬＣ２６Ａ３を発現する細胞と（ｂ）式（Ｉ）の化合物を有効量で含む医薬組成物とを、ＳＬＣ２６Ａ３媒介型陰イオン（Ｃｌ−、ＨＣＯ３−、シュウ酸塩）交換を阻害するために十分な条件下でかつ十分な時間にわたって接触させる工程を含む、ＳＬＣ２６Ａ３を阻害する方法が提供され、式中、式（Ｉ）の化合物は、以下の構造を有する：
【０１０４】
【化１９】
2021522255.tif 000025
又はその医薬として許容される塩、同位体形態、立体異性体もしくはプロドラッグであり、式中、
Ｒ１は、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ３アルケニル、任意選択的に置換されたＣ３−Ｃ６シクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ３−Ｃ６シクロアルキルアルキル、任意選択的に置換されたアルコキシアルキル、カルボキシＣ１−Ｃ３アルキル、任意選択的に置換されたヘテロアリールアルキル、−Ｓ（Ｏ）２アリール（ここで、アリールは、任意選択的に置換されている）又は任意選択的に置換されたアリールアルキルであり、
Ｒ２は、カルボキシＣ１−Ｃ３アルキルであり、
Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、
Ｒ４は、Ｃ１−Ｃ４アルキルである。
【０１０５】
特定の実施形態において、細胞は、上皮細胞である。詳細な実施形態において、上皮細胞は、腸上皮細胞又は肺上皮細胞である。
【０１０６】
特定の実施形態において、化合物は、式（Ｉａ）によって表される構造を有する：
【０１０７】
【化２０】
2021522255.tif 000026
式中、、Ｘは、アルキル、Ｃ３−Ｃ５シクロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、ＮＯ２、又はハロアルコキシであり、ｎは、１、２、又は３である。
【０１０８】
より特定の実施形態において、化合物は、化合物Ａ１（ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２５０）、ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２６０又はＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０であり、その代表的な構造を、以下に示す：
【０１０９】
【化２１】
2021522255.tif 000027
【０１１０】
別の実施形態は、ＳＬＣ２６Ａ３媒介型陰イオン（Ｃｌ−、ＨＣＯ３−、シュウ酸塩）交換に関連する症状、疾患又は障害を予防又は治療する方法を提供し、この方法は、予防又は治療を必要とする対象に、ＳＬＣ２６Ａ３媒介型陰イオン（Ｃｌ−、ＨＣＯ３−、シュウ酸塩）交換を阻害するために有効な量の式（Ｉ）の化合物を投与することを含み、ここで、式（Ｉ）の化合物は、以下の構造を有する：
【０１１１】
【化２２】
2021522255.tif 000028
もしくはその医薬として許容される塩、同位体形態、立体異性体もしくはプロドラッグであり、［式中、
Ｒ１は、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ３アルケニル、任意選択的に置換されたＣ３−Ｃ６シクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ３−Ｃ６シクロアルキルアルキル、任意選択的に置換されたアルコキシアルキル、カルボキシＣ１−Ｃ３アルキル、任意選択的に置換されたヘテロアリールアルキル、−Ｓ（Ｏ）２アリール（ここで、アリールは、任意選択的に置換されている）又は任意選択的に置換されたアリールアルキルであり、
Ｒ２は、カルボキシＣ１−Ｃ３アルキルであり、
Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、
Ｒ４は、Ｃ１−Ｃ４アルキルである］。
【０１１２】
１つの実施形態において、疾患又は障害は、便秘（例えば、ＣＩＣ、ＯＩＣ、及び／又はＩＢＳ−Ｃ）、ＣＦ関連便秘、胎便性イレウス、遠位腸閉塞症候群、シュウ酸カルシウム尿路結石、腸内高シュウ酸尿症又は原発性高シュウ酸尿症である。
【０１１３】
特定の実施形態において、化合物は、式（Ｉａ）によって表される構造を有する：
【０１１４】
【化２３】
2021522255.tif 000029
式中、Ｘは、アルキル、Ｃ３−Ｃ５シクロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、ＮＯ２、又はハロアルコキシであり、ｎは、１、２、又は３である。
【０１１５】
より特定の実施形態において、化合物は、化合物Ａ１（ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２５０）、ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２６０又はＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０である。
【０１１６】
さらなる実施形態は、便秘を治療する方法を提供し、この方法は、治療を必要とする対象に、治療有効量の式（Ｉ）、（Ｉａ）又は（ＩＩ）の化合物を投与することを含む。
【０１１７】
特定の実施形態において、便秘は、慢性突発性便秘（ＣＩＣ）、オピオイド誘導性便秘（ＯＩＣ）、便秘型優位性過敏性腸症候群（ＩＢＳ−Ｃ）、ＣＦ関連便秘、胎便性イレウス、遠位腸閉塞症候群を含む慢性便秘である。
【０１１８】
特定の実施形態において、化合物は、式（Ｉａ）によって表される構造を有する：
【０１１９】
【化２４】
2021522255.tif 000030
ここで、Ｘは、アルキル、Ｃ３−Ｃ５シクロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、ＮＯ２、又はハロアルコキシでありｎは、１、２、又は３である。
【０１２０】
より特定の実施形態において、化合物は、化合物Ａ１、ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２６０又はＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０である。
【０１２１】
さらなる実施形態において、この方法は、式（Ｉ）の化合物と同時に又は連続的に、ＮＨＥ３阻害剤を投与することを、さらに含む。
【０１２２】
より特定の実施形態において、ＮＨＥ３阻害剤は、テナパノールであり、症状又は障害は、難治性便秘である。
【０１２３】
別の実施形態は、尿中シュウ酸排出の低減を必要とする対象において尿中シュウ酸排出を低減する方法を提供し、この方法は、治療有効量の式（Ｉ）の化合物又はその医薬として許容される塩、同位体形態、立体異性体もしくはプロドラッグを対象に投与することを含む：
【０１２４】
【化２５】
2021522255.tif 000031
［式中、：
Ｒ１は、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ３アルケニル、任意選択的に置換されたＣ３−Ｃ６シクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ３−Ｃ６シクロアルキルアルキル、任意選択的に置換されたアルコキシアルキル、カルボキシＣ１−Ｃ３アルキル、任意選択的に置換されたヘテロアリールアルキル、−Ｓ（Ｏ）２アリール（ここで、アリールは、任意選択的に置換されている）又は任意選択的に置換されたアリールアルキルであり、
Ｒ２は、カルボキシＣ１−Ｃ３アルキルであり、
Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、
Ｒ４は、Ｃ１−Ｃ４アルキルである］。
【０１２５】
より特定の実施形態において、尿中シュウ酸排出の低減を必要とする対象は、腸内高シュウ酸尿症又は原発性高シュウ酸尿症に罹患している。
【０１２６】
特定の実施形態において、化合物は、式（Ｉａ）：
【０１２７】
【化２６】
2021522255.tif 000032
によって表される構造を有し
式中、Ｘは、アルキル、Ｃ３−Ｃ５シクロアルキル、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、ＮＯ２、又はハロアルコキシであり、ｎは、１、２、又は３である。
【０１２８】
より特定の実施形態において、化合物は、化合物Ａ１、ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２６０又はＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０である。
【０１２９】
なお別の実施形態は、腎結石を予防又は治療する方法を提供し、この方法は、治療を必要とする対象に、治療有効量の以下の構造を有する式（Ｉ）の化合物又はその医薬として許容される塩、同位体形態、立体異性体もしくはプロドラッグを投与することを含む。
【０１３０】
【化２７】
2021522255.tif 000033
［式中、
Ｒ１は、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ３アルケニル、任意選択的に置換されたＣ３−Ｃ６シクロアルキル、任意選択的に置換されたＣ３−Ｃ６シクロアルキルアルキル、任意選択的に置換されたアルコキシアルキル、カルボキシＣ１−Ｃ３アルキル、任意選択的に置換されたヘテロアリールアルキル、−Ｓ（Ｏ）２アリール（ここで、アリールは、任意選択的に置換されている）又は任意選択的に置換されたアリールアルキルであり、
Ｒ２は、カルボキシＣ１−Ｃ３アルキルであり、
Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、
Ｒ４は、Ｃ１−Ｃ４アルキルである］。
【０１３１】
より特定の実施形態において、腎結石は、シュウ酸カルシウム腎結石である。
【０１３２】
特定の実施形態において、化合物は、式（Ｉａ）によって表される構造を有する。
【０１３３】
より特定の実施形態において、化合物は、化合物Ａ１（ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２５０）、ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２６０又はＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０である。
【０１３４】
他の実施形態において、上記の方法及び使用は、式（ＩＩ）の化合物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【実施例】
【０１３５】
略号
ＣＦＴＲ、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子；ＤＣＭ、ジクロロメタン；４−ＤＭＡＰ、Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノピリジン；ＤＭＦ、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＥＤＣＩ−ＨＣｌ、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド；ＦＰＲ、蛍光プレートリーダー；ＦＲＴ、フィッシャーラット甲状腺；ＰＢＳ、リン酸緩衝化生理食塩水；ＲＴ、室温；ＴＬＣ、薄層クロマトグラフィー；ＴＭＥＭ１６Ａ、膜貫通メンバー１６Ａ；ＹＦＰ、黄色蛍光タンパク質。
【０１３６】
一般的実験
別段に示されない限り、全ての反応溶媒は、無水であり、購入される。ジフルオロヨード酢酸を、Ｓｙｎｑｕｅｓｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｌａｃｈｕａ、ＦＬ）から購入した。全ての他の試薬を、入手した状態で使用した。
【０１３７】
購入した全ての材料及び溶媒を、さらなる精製なしで用いた。１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを、Ａｖａｎｃｅ  ３００ＭＨｚ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）にて実施した。化学シフトを、百万分率（ｐｐｍ）で得た。ＬＣ−ＭＳ分析を、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＱ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを２６９５  ＨＰＬＣ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）と共に用いて行った。試験した化合物は、ＬＣ／ＭＳにより９５％を超える純度を有した。
【０１３８】
ＦＲＴ−ＹＦＰ−ｓｌｃ２６ａ３細胞を用いたｓｌｃ２６ａ３阻害剤を同定するためのハイスループットスクリーニングを、半自動化したＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）プラットフォームをＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＭＥＧＡプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）と共に用い、本質的にペンドリン阻害剤の発見について記載された通りに行った。最初のスクリーニングを、約５０、０００薬物様合成低分子（ＣｈｅｍＤｉｖ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）について、２５μＭの濃度で、Ｃｌ−／Ｉ−交換プロトコールを用いて行い、ｓｌｃ２６ａ３機能をアッセイした。最初のスクリーニングの後、化合物アナログを購入し（ＣｈｅｍＤｉｖ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、構造−活性データを作成した。主なｓｌｃ２６ａ３阻害剤は、再合成され、そして１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲによって確認され、９５％を超える純度をＬＣ−ＭＳによって確認した。
【０１３９】
スクリーニングのために、ＦＲＴ−ＹＦＰ−ｓｌｃ２６ａ３細胞を、９６ウェル黒色壁透明底部組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）内でプレート培養し、２０、０００細胞／ウェルの密度にて４８時間にわたりコンフルーエントまで培養した。スクリーニングのために、細胞を、ＰＢＳ中で２回洗浄し、そしてｓｌｃ２６ａ３機能のアッセイの前に、１０分間にわたって試験化合物を含む１００μｌ  ＰＢＳ中でインキュベートした。アッセイを、ｄｏｎｅｕｓｉｎｇａＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＭＥＧＡプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて、１２秒間にわたって行い、最初の蛍光を１秒間記録した後、１００μｌのＮａＩ−置換されたＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌが１３７ｍＭ  ＮａＩによって置き換えられている）を添加し、Ｃｌ−／Ｉ−交換を駆動した。Ｃｌ−／Ｉ−交換の初期速度を、単一指数回帰によって、蛍光強度から決定した。全てのプレートは、陰性対照ウェル（１％  ＤＭＳＯ）及び陽性対照ウェル（３５０μＭ  ニフルミン酸）のを含んだ。最初のスクリーニングの後、活性化合物のアナログを購入して（ＣｈｅｍＤｉｖ）、構造−活性の関係性データを作成した。
【０１４０】
動物実験は、ＵＣＳＦ施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって認可を受けた。閉塞腸係蹄モデル及び便秘のロペラミド誘導性モデルを、文献に公知の技術を用いて、マウスにおいて行った。マウスを、標準的げっ歯類食及び水を自由に得られるようにして、市販のケージに入れた。野生型ＣＤ１マウスとΔＦ５０８−ＣＦＴＲホモ接合体マウスとを、ＵＣＳＦ実験動物リソースセンターにおいて交配した。
【０１４１】
実施例１
Ｓｌｃ２６ａ３阻害剤を同定するためのハイスループットスクリーニング
スクリーニングを、マウスｓｌｃ２６ａ３及びハロゲン化物感受性黄色蛍光タンパク質を安定的に発現するＦＲＴ細胞株（ＦＲＴ−ＹＦＰ−ｓｌｃ２６ａ３細胞）を用いて行った。ＦＲＴ細胞は、ｓｌｃ２６ａ３によって運ばれる陰イオンに対し固有の浸透性を有するがゆえに、及びコーティングしていないプラスチック上に良好に接着し迅速に増殖するがゆえに、これを使用した。図１Ａにおいて表にした通り、ＳＬＣ２６Ａ３媒介型輸送を、Ｃｌ−／Ｉ−交換を駆動するＩ−の細胞外添加に応答するＹＦＰ蛍光クエンチングの動態からアッセイした；輸送阻害は、蛍光減少の速度を低下する。図１Ｂは、代表的なスクリーニングにおいて試験した不活性及び活性な化合物からの蛍光データを、ビヒクル（ＤＭＳＯ）対照からのデータ及びｓｌｃ２６ａ３を発現しない細胞からのデータと共に示した。スクリーニングのために、ｓｌｃ２６ａ３を３５０μＭにて強力に阻害する非選択的塩素チャネルブロッカーであるニフルミン酸を、陽性対照として使用した。ｓｌｃ２６ａ３スクリーニングアッセイについてのＺ’因子は、約０．７であった。
【０１４２】
トランスフェクトされたＦＲＴ細胞においてセカンドメッセンジャーがｓｌｃ２６ａ３活性を調節するか否かを試験するために実験を行い、ここで、ＦＲＴ−ＹＦＰ−ｓｌｃ２６ａ３細胞を、ホルスコリン（２０μＭ；ｃＡＭＰを上昇させるために）、８−ブロモグアノシン３’，５’−環状モノホスフェート（１００μＭ；８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ；細胞浸透性ｃＧＭＰアナログ）、ＡＴＰ（１００μＭ；細胞質Ｃａ２＋を上昇させるため）、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（１００ｎＭ；ＰＭＡ）、又は２０ｍＭ塩化カリウム（高Ｋ＋、脱分極膜電位まで）と共に事前インキュベートした。これらの手段は、電気的に中性のｓｌｃ２６ａ３媒介型Ｃｌ−／Ｉ−交換を実質的に変化させない（図１Ｃ）。したがって、スクリーニングにおいて同定した阻害剤は、シグナル伝達メカニズムの上流に作用するよりもむしろ、ｓｌｃ２６ａ３交換を直接的に阻害する可能性が高い。
【０１４３】
２５μＭにて５０、０００の合成低分子のスクリーニングは、ｓｌｃ２６ａ３を７５％を超えて阻害する１３６の活性化合物を、同定した。化合物は、４、８−ジメチルクマリン類、アセトアミド−チオイミダゾール類、トリアゾールアミド類、及びチアゾール−チオフェンスルホンアミド類（それぞれ、分類Ａ〜Ｄ）を含むいくつかの化合物分類に分かれる（図２Ａ〜Ｂ）。スクリーニングした化合物のサブセットについての阻害百分率をスクリーニングした順に示す散布図（図２Ａ、左）は、化合物プレートにおける化学スキャフォールドを分けた結果として、活性化合物のクラスターを明らかにした。再試験において、３６の化合物が、１０μＭにて、ｓｌｃ２６ａ３を５０％を超えて阻害した（図２Ａ、右）。これは、複数の分類Ａ及び分類Ｂ化合物を含む。図２Ｃは、一次スクリーニングにおいて見出した、選択した分類Ａ（ＩＣ５０  約４μＭ）及び分類Ｂ（ＩＣ５０  約９μＭ）化合物についての、ＳＬＣ２６Ａ３媒介型Ｃｌ−／Ｉ−−交換の阻害についての濃度依存性測定値を、ニフルミン酸（ＩＣ５０  約６０μＭ）についてのデータと共に示す。
【０１４４】
実施例２
構造−活性の関係性（ＳＡＲ）研究
効力データ及び構造考察に基づき、分類Ａ及び分類Ｂの化合物について、さらなる研究のために優先順位をつけた。全部で１７６の市販の分類Ａアナログ及び１７５の分類Ｂアナログを、試験した。図３Ａ及び３Ｂは、分類Ａ及び分類Ｂの化合物についての活性の構造的決定因子を（左パネルｓ）、選択したアナログの濃度依存性データと共に（右パネルｓ）まとめた。分類Ａ化合物は、４−及び８−位にてメチル基で置換されたクマリンである。構造−活性分析は、３−位（Ｒ１）の酢酸部分が、活性のために有益であるが、対応する酢酸エステルは不活性であることを示した。酢酸とプロピオン酸との置き換えは、活性を大きく低減し、アルキル及びベンジルを含む非酸性置換基は、不活性である。大きな効力が、クマリンの７−位におけるヒドロキシル化について見いだされ、ベンジル環（Ｒ２）により、ならびに３−クロロ、３−フルオロ及び３−ブロモ置換基により、最も大きな効力が得られる。
【０１４５】
分類Ｂ化合物は、イミダゾール（Ｒ１）環において及びアセトアミドリンカー（Ｒ２）において置換基を有する、アセトアミド−チオイミダゾールである。Ｒ１基について、フェニルは、最もよい活性を与え、ベンゾフラン、ベンジル、メチル及びアセテートは、活性を低下させた。非置換のフェニルは、最も大きな効力を与えるが、４−メトキシ及び４−クロロもまた活性であり、他方で、２−位上の置換基は活性を低下させた。Ｒ２について、いくつかの置換されたアニリンは活性であり、他方で非アニリンの、アルキル、ベンジル及びアリル基は、活性を低下させた。３−クロロ−４−メチルで置換されたアニリンは、最も活性であった。アニリン環上の他の置換基（４−ハロゲン化物、４−メチル及び４−メトキシを含む）は、活性であった。一般に、３，４−二重置換され、そして及び３，４−二重置換は、活性を低下させた。
【０１４６】
表１及び２は、それぞれ選択した活性分類Ａ及び分類Ｂの化合物についてのＩＣ５０値を列挙する。化合物Ａ１は、０．１５μＭのＩＣ５０を有する最も強力な分類Ａ化合物であった（図３Ａ、右パネル）。いくつかの他の分類Ａアナログもまた、一次スクリーニングにおいて同定された元の化合物であるＤＲＡｉｎｈ−Ａ０１よりも強力であることが、見いだされた。分類Ｂについて、多くのアナログが、元の活性化合物（ＤＲＡｉｎｈ−Ｂ０１、ＩＣ５０  約９μＭ）よりも高い効力を示し、化合物Ｂ１（ＤＲＡｉｎｈ−Ｂ６０１）は、最も低い約１．５μＭＩＣ５０を有した（図３Ｂ、右パネル）。
【０１４７】
電気的中性群又は電気供与群と４−置換されたアニリンが最良であり、他方で、４−ＮＯ２及び３，４−分布は、活性を低下させた。
【０１４８】
【表１】
2021522255.tif 000034
【０１４９】
【表２】
2021522255.tif 000035
【０１５０】
実施例３
化合物Ａ１（ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２５０）の合成
さらなる研究のために、化合物Ａ１を、２−メチルレゾルシノールのジメチルアセチルスクシネートとのペックマン濃縮によって再合成し、（図３Ｃ）７−ヒドロキシクマリン（中間体１）を得、これをさらに３−ブロモベンジルブロミドによってアルキル化して、クマリンエステル（中間体２）を得た。クマリンエステルの加水分解により、対応する３−酢酸−クマリン化合物Ａ１を、良好な収率で得た（図３Ｃ）。
【０１５１】
無水メタノール（４０ｍＬ）中の２−メチルレゾルシノール（２．００ｇ、１６．０９ｍｍｏｌ）及びジメチル２−アセチルスクシネート（３．０３ｇ、１６．１ｍｍｏｌ）を、無水ＨＣｌで０℃にて処理した。次いで、反応混合物を、室温にて２４時間にわたり撹拌し、この混合物を、水中に注いだ。得られた沈殿物を、ろ過によって集め、水で洗浄し、乾燥させて、所望の生成物（中間体１）のオフホワイト固体を得た（３．０２ｇ、７２％収率）。１Ｈ  ＮＭＲ，３００  ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）δ  ７．５１，ｄｄ，Ｊ＝８．７，０．４５  Ｈｚ，１Ｈ），６．８６，ｄ，Ｊ＝８．７  Ｈｚ，１Ｈ），３．７２８，ｓ，２Ｈ），３．７２０，ｓ，３Ｈ），２．４１，ｓ，３Ｈ），２．２７，ｓ，３Ｈ）；ＬＣ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ２６２，Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１５２】
アセトン（１０ｍＬ）中の７−ヒドロキシクマリン（中間体１）（２００ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）、３−ブロモベンジルブロミド（２６７ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）、及び炭酸カリウム（２１１ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）の混合物を、一晩灌流まで加熱した。溶媒を蒸発させ、残留物を氷水中に注いだ。得られた沈殿物を、ろ過によって集め、メタノールで洗浄し、そして乾燥させて、２９０ｍｇ（９０％）のクマリンエステル（中間体２）ａを、白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．６１（ｂｒｓ，１Ｈ），７．５１−７．４８（ｍ，１Ｈ），７．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９  Ｈｚ），７．３９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０  Ｈｚ），７．２９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８  Ｈｚ），６．８７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９  Ｈｚ），３．７５（ｂｒｓ，２Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），２．３９（ｂｒｓ，６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １７０．９，１６１．８，１５８．６，１５１．６，１４９．０，１３８．８，１３１．２，１３０．２，１３０．０，１２５．５，１２２．７６，１２２．７２，１１６．５，１１４．５，１１４．４，１０８．１，６９．５，５２．２，３２．７，１５．３，８．４；ＬＣ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４３１（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１５３】
エステル中間体２（１８０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）のメタノール（８ｍＬ）中溶液に、水（２ｍＬ）中ＮａＯＨ（２５ｍｇ、０．６２６ｍｍｏｌ）を加え、溶液を１時間にわたり灌流まで加熱し、室温まで冷まし、水で希釈して、ｐＨ７．０まで１Ｎ  ＨＣｌで中性化した。得られた沈殿物を、ろ過によって集め、水で洗浄し、そして乾燥させて、化合物Ａ１を白色粉末として得た（１０５ｍｇ、６０％収率）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ７．７３（ｂｒｓ，１Ｈ），７．６６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．１  Ｈｚ），７．５７−７．５４（ｍ，２Ｈ），７．４２−７．３７（ｍ，１Ｈ），７．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９  Ｈｚ），５．３４（ｓ，２Ｈ），３．７３（ｓ，２Ｈ），２．４５（ｓ，３Ｈ），２．３３（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  １６５．８，１６１．４，１５８．４，１５１．１，１４９．１，１４４．１，１４０．１，１３１．２，１３０．４，１２６．７，１２４．０，１２２．２，１１７．８，１１４．４，１１２．９，１０９．２，６９．３，３３．６，１５．５，８．５  ；ＬＣ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４１７（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０１５４】
実施例４
化合物Ａ１性質決定
ｃ２６ａ３の生理学的関連している活性である、Ｃｌ−及びＨＣＯ３−のＳＬＣ２６Ａ３媒介型交換の阻害についての濃度依存性測定値を、細胞質ｐＨセンサーとしてＢＣＥＣＦで標識したｓｌｃ２６ａ３発現ＦＲＴ細胞を用いて測定した。標識細胞を、まず、Ｃｌ−含有ＨＣＯ３−緩衝溶液中でインキュベートし、そして細胞質アルカリ化を伴うＨＣＯ３−流入／Ｃｌ−流出を、グルコネート含有ＨＣＯ３−緩衝溶液の添加によって起こした。細胞質ｐＨ（約０．０５ｐＨ単位／分）の上昇を、化合物Ａ１がＩＣ５０  約０．１μＭにて阻害した（図４Ａ）。ＳＬＣ２６Ａ３媒介型Ｃｌ−／ＳＣＮ−交換の阻害についての濃度依存性測定値は、約０．３μＭのＩＣ５０を出した（図４Ｂ）。化合物Ａ１阻害の動態を、Ｃｌ−／Ｉ−交換のインキュベーションの前に、ＦＲＴ−ＹＦＰ−ｓｌｃ２６ａ３細胞を１μＭの化合物Ａ１と共に異なる時間の間にわたってインキュベーションすることによって測定し、約３０秒間の阻害についてのｔ１／２を得た（図４Ｃ）。完全な可逆性を確認するため、ＦＲＴ−ＹＦＰ−ｓｌｃ２６ａ３細胞を、１μＭの化合物Ａ１と共に１０分間インキュベートし、次いで、３回洗浄した後にアッセイＣｌ−／Ｉ−交換を行った（図４Ｃ、挿入）。
【０１５５】
化合物Ａ１による（ヒト）ＳＬＣ２６Ａ３の阻害をも、ＳＬＣ２６Ａ３及びＹＦＰを発現するＨＥＫ細胞モデルを用いて試験した。ＳＬＣ２６Ａ３媒介型Ｃｌ−／Ｉ−交換を、化合物Ａ１によって約０．２５μＭのＩＣ５０で阻害し、より高い化合物Ａ１濃度で完全に阻害した（図４Ｄ）。
【０１５６】
実施例５
化合物Ａ１選択性
化合物Ａ１選択性を調べるために、輸送アッセイを、ＳＬＣ２６−ファミリーホモログ、他の関連上皮イオン輸送体及びチャネルのパネル上で行った。細胞と１０μＭの化合物Ａ１との事前インキュベーションは、（マウス）ペンドリン（ｓｌｃ２６ａ４）、ＰＡＴ−１（ｓｌｃ２６ａ６）又はｓｌｃ２６ａ９のＣｌ−／Ｉ−−交換活性を変えなかったことを、元の蛍光時間経過データ（図５Ａ）及びまとめデータ（図５Ｂ）に示す。１０μＭの化合物Ａ１はまた、チャネルであるＣＦＴＲ及びＴＭＥＭ１６Ａの活性も変えなかった。別の実験において、ヒト上皮における化合物Ａ１の複数のイオン輸送体及びチャネルの作用の可能性を調べるために、ヒト気管支上皮（ＨＢＥ）細胞を、アミロリド（上皮ナトリウムチャネルＥＮａＣを遮断するため）、ホルスコリン、ＣＦＴＲｉｎｈ−１７２（ＣＦＴＲを遮断するため）、及びＡＴＰ（Ｃａ２＋−活性化型塩素チャネル、ＣａＣＣを活性化させるため）を連続的に転嫁し、短絡電流によって調べた（図５Ｃ）。２０分間、１０μＭの化合物Ａ１による事前処理は、短絡電流応答を変化させなかった。このことは、化合物Ａ１は、ＥＮａＣ、ＣＦＴＲ又はＣａＣＣ活性、又はそれらの活性を支持するために必要なＫ＋チャネル及びＮａ−Ｋ−Ｃｌ共輸送体を含む他の輸送体活性を変えなかったことを示している。
【０１５７】
実施例６
閉塞腸係蹄研究
雌ＣＤ１マウス（８〜１０週齢）に、ペディアライト（１リットルあたり：Ｎａ＋  ４５ｍＥｑ、Ｃｌ−  ３５ｍＥｑ、Ｋ＋  ２０ｍＥｑ、デキストロース２５ｇ；Ａｂｂｏｔｔ、Ａｂｂｏｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を自由に摂取させたが、実験の４８時間前からは固形食を与えなかった。この間、マウスを、１日１回直腸にて５００μＬの鉱物油で処理し（最終回は手術の１２時間前）、結腸を空にした。閉塞した腸係蹄を、記載のように取り出した。マウスを、イソフルランで麻酔し、加温パッドを用いて手術の間体温を３６〜３８℃に維持した。それぞれのマウスにおいて、小さく腹部切開し、遠位結腸を暴き、１つの閉塞遠位結腸腸係蹄（長さ１．５〜２ｃｍ）を取り出して、縫合した。腸係蹄に、１００μＬリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ：７．４、１ｍＭ中：１３７  ＮａＣｌ、２．７  ＫＣｌ、８  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８  ＫＨ２ＰＯ４、１  ＣａＣｌ２、０．５  ＭｇＣｌ２）を、１０μＭ化合物Ａ１及び／又は１０μＭテナパノール（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、Ｍｏｎｍｏｕｔｈ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ、ＮＪ）を加えるか又は加えずに、注入した。腹部切開を、縫合によって閉じ、そしてマウスを麻酔から回復させた。結腸腸係蹄を、（別のマウスにおいて）０〜６０分間で取り出し、腸係蹄の長さ及び重量を、液体吸収を定量するために測定した。内腔液を、シリンジで空にし、ＡＢ１５  ｐＨ  Ｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を用いてｐＨを直ちに測定した。別の研究において、空腸中部腸係蹄（長さ２〜３ｃｍ、マウス１匹あたり３〜４の腸係蹄）を、上述のように取り出し、１００μＬ  ＰＢＳを、１０μＭ化合物Ａ１及び／又は１０μＭテナパノールを加えるか又は加えずに注入し、０〜３０分間で取り出し、腸係蹄の長さ及び重量を測定した。
【０１５８】
実施例７
マウスの遠位結腸における液体吸収の阻害
マウスにおける閉塞した腸係蹄研究を行い、化合物Ａ１の液体吸収に対する効果を調べた。取り出された遠位結腸腸係蹄における化合物Ａ１の直接投与は、６０分にて、腸係蹄重量／長さ比の低下を完全に妨げた。これは、液体吸収の直接指標である（図６Ａ、上パネル）。内腔ｐＨの変化をも、ｓｌｃ２６ａ３促進型ＨＣＯ３−分泌／Ｃｌ−吸収の反転量的測定として決定し、ｓｌｃ２６ａ３阻害は、内腔液アルカリ化を低下することを予測した。これらの実験について、ＨＣＯ３−／ＣＯ２非含有のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を使用して、交絡した内腔炭酸脱水酵素の効果を回避した。化合物Ａ１は、６０分にて遠位結腸腸係蹄における内腔液のアルカリ化を低下させ、このことは、Ｃｌ−／ＨＣＯ３−交換の阻害と一致した（図６Ａ、下パネル）。ＮＨＥ３（Ｎａ＋／Ｈ＋交換体３）阻害剤であるテナパノールの投与は、遠位結腸腸係蹄において、重量／長さ比又は内腔ｐＨに効果を有さなかった。化合物Ａ１とテナパノールとの同時投与の結果は、化合物Ａ１単独投与の効果と類似であった。これらの結果は、ｓｌｃ２６ａ３はマウス遠位結腸における優勢な吸収促進性輸送体であし、他方で、ＮＨＥ３は、このセグメントにおける液体吸収に実質的に寄与していないという結論を支持した。
【０１５９】
実施例８
Ｓｌｃ２６ａ３阻害によって変わらなかった空腸液体吸収
化合物Ａ１の空腸中部腸係蹄への投与は、腸係蹄の重量／長さ比に有意な変化をもたらさなかったが、他方で、液体吸収は、テナパノール処理腸係蹄においてなくなった（図６Ｂ、上パネル）。化合物Ａ１は、３０分にて空腸駅の酸性化を変えなかったが、テナパノールは、酸性化を防ぎそしてわずかにアルカリ化をもたらした（図６Ｂ、下パネル）。化合物Ａ１及びテナパノールを同時投与された腸係蹄は、テナパノール単独での処理類似した腸係蹄の重量／長さ比及び内腔液ｐＨを示した。これらの結果は、マウス空腸での液体吸収におけるｓｌｃ２６ａ３の重要な役割に対する証拠を提示し、ＮＨＥ３はこのセグメントにおける優勢な吸収促進性輸送体であるという結論を支持した。
【０１６０】
実施例９
ＷＴ及び嚢胞性繊維症マウスにおけるロペラミド誘導性便秘の軽減
雌ＣＤ１マウス（８〜１０週齢）に、ロペラミド（０．３ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を投与し、便秘を起こした。化合物Ａ１（ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２５０）（５ｍｇ／ｋｇ、ビヒクル（５％  ＤＭＳＯ及び１０％  Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  ＨＳ  １５；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）含有生理食塩水中）、テナパノール（５ｍｇ／ｋｇ、ビヒクル中）の両化合物（５ｍｇ／ｋｇ各々、ビヒクル中）又はビヒクル単独を、強制経口投与によって、ロペラミドの１時間前に与えた。ロペラミド注入後、マウスを個別に代謝ケージ内に入れ、食餌及び水を自由に与えた。糞便サンプルを、３時間にわたって集め、糞便総重量及び糞ペレットの数を定量した。糞便水分含量を測定するため、糞便サンプルを、８０℃にて２４時間にわたって乾燥させ、そして水分含量を、［湿重量−乾燥重量］／湿重量として計算した。類似の研究を、機能的ＣＦＴＲを欠く嚢胞性繊維症（ＣＦ）マウス（ΔＦ５０８ホモ接合体）において行った。
【０１６１】
５ｍｇ／ｋｇで経口投与された化合物Ａ１は、野生型マウスにおける糞便重量、ペレット数及び水分含量のロペラミド誘導性減少を、部分的に妨げた（図７Ａ及び７Ｂ）。５ｍｇ／ｋｇで経口投与されたテナパノールもまた、糞便重量、ペレット数及び水分含量のロペラミド誘導性減少を、部分的に妨げた。これらの応答の強さは、非常に高い用量の認可薬リナクロチドによって見られるものと類似であった。注目すべきことに、化合物Ａ１及びテナパノールの同時投与は、ロペラミド誘導性便秘を完全に防いだ。このことは、ｓｌｃ２６ａ３及びＮＨＥ３阻害の便への加水への相加効果を示唆する（図７Ｂ）。重要なことに、化合物Ａ１はまた、分泌促進性Ｃｌ−チャネルＣＦＴＲの機能欠損を有するＣＦマウスにおけるロペラミド誘導性便秘モデルにおいても、有効であった（図７Ｃ）。
【０１６２】
図８（Ａ及びＢ）は、観察された結果に裏打ちされた可能性のあるメカニズムを模式的に図示する。図８Ａは、空腸及び遠位結腸における主要な吸収経路を図解する。ＮＨＥ３及びＮＨＥ２は、小腸及び近位結腸において発現される；ＮＨＥ３（ＳＬＣ９Ａ３）は、優勢なＮａ＋／Ｈ＋交換体であり、ＮＨＥ２の欠損を補填し得る。表記は、以下の意味を有する。ＤＲＡ：腺腫において下方調節された（Ｓｌｃ２６ａ３）、ＰＡＴ−１：推定陰イオン輸送体−１（Ｓｌｃ２６ａ６）、ＮＨＥ３：Ｎａ＋／Ｈ＋交換体３、ＥＮａＣ：上皮ナトリウムチャネル。ＳＧＬＴ：Ｎａ＋−グルコース輸送体、ＳＡＡＣＴ：Ｎａ＋−アミノ酸共輸送体。
【０１６３】
図８Ｂは、化合物Ａ１及びテナパノールについての可能性のある作用部位及びメカニズムを示す。上向きの垂直矢印は、吸収を表し、水平な矢印の大きさ及び厚さは、内腔含有物及び糞便排出物の水和を表す。
【０１６４】
実施例１０
ベクター発現
ｓｌｃ２６ａ３、ＳＬＣ２６Ａ３、ｓｌｃ２６ａ６、及びｓｌｃ２６ａ９についての相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含むベクターを、Ｏｒｉｇｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入し、標準的技術を用いて捜査した。スクリーニングのための細胞株を作製するため、ｓｌｃ２６ａ３を、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）内にサブクローニングした。ヒトＳＬＣ２６Ａ３を、ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）内にサブクローニングし、他のｓｌｃ２６ファミリーメンバーを、ハロゲン化物感受性ＥＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑ／Ｉ１５２Ｌ／Ｆ４６Ｌ（ＹＦＰ）を同時発現するように作製されたベクターにサブクローニングした。
【０１６５】
特に、ｓｌｃ２６ａ３発現ベクターを作製するために、ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＯｒｉｇｅｎｅプラスミド（開始コドン及び約１．７ｋｂのコード配列を有する）から切り出し、カルボキシ末端ｓｌｃ２６ａ３領域及び５’−ＥｃｏＲＩ／３’−ＢｓｔＸＩ／ＸｈｏＩ制限部位をコードする合成ＤＮＡ断片（ｇＢＬＯＣＫ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）、約０．６ｋｂ）を使用して、ｓｌｃ２６ａ３をｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏ（＋）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＳｏｕｔｈＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）中に再生させた。その後、ＢｇｌＩＩ及びＢｓｔＸＩで切り出したｓｌｃ２６ａ３  ｃＤＮＡを、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）のＢａｍＨＩ及びＢｓｔＸＩ部位内にサブクローニングした。
【０１６６】
ＳＬＣ２６Ａ３について、ａＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ断片をＯｒｉｇｅｎｅプラスミド（開始コドン及び約１．９ｋｂのコード配列を含む）から切り出し、カルボキシ末端ＳＬＣ２６Ａ３領域ならびに５’−ＰｓｔＩ及び３’−ＮｏｔＩ制限部位をコードする約０．６ｋｂのｇＢＬＯＣＫを使用して、ＳＬＣ２６Ａ３をｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏ（＋）中に再生させた。その後、ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩで切り出したＳＬＣ２６Ａ３  ｃＤＮＡを、ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＳｐｅＩ及びＮｏｔＩ部位内にサブクローニングした。
【０１６７】
ｓｌｃ２６ａ９及びハロゲン化物感受性ＥＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑ／Ｉ１５２Ｌ／Ｆ４６Ｌ（ＹＦＰ）を同時発現するプラスミドを作製するために、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３をＡｐａＩ及びＸｍａＩで切り出し、ピューロマイシン耐性遺伝子（Ｐｕｒｏｒ）をＹＦＰで置き換えたｇＢＬＯＣＫによって再生し、得られたベクターをｐＩＲＥＳ−ＹＦＰと名付けた。その後、ｓｌｃ２６ａ９を、ｐＩＲＥＳ−ＹＦＰ内に、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片としてクローニングした。ｓｌｃ２６ａ６及びＹＦＰを同時発現するレンチウイルスベクターを作製するために、ｇＢＬＯＣＫｓを使用して、Ｐｕｒｏｒの上流かつフレーム内にＹＦＰ−Ｔ２Ａコード配列を有するｐＬＶＸ−Ｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を再生して、得られたベクターをｐＬＶＸ−ＹＦＰ−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏと名付けた。ＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ断片を、Ｏｒｉｇｅｎｅ  ｓｌｃ２６ａ６プラスミド（約２ｋｂの３’領域を含む）から切り出し、そしてアミノ末端ｓｌｃ２６ａ６  ｃＤＮＡ領域及び開始コドンならびに５’−ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ及び３’−ＫｐｎＩ制限部位をコードする約０．５ｋｂのｇＢＬＯＣＫを使用して、ｓｌｃ２６ａ６をｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏ（＋）内にて再生した。その後、完全長ｓｌｃ２６ａ６を、ｐＬＶＸ−ＹＦＰ−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏ内に、ＥｃｏＲＩ〜ＸｂａＩ断片としてサブクローニングした。全ての構築物を、配列決定法によって確認した。
【０１６８】
実施例１１
細胞培養及びトランスフェクション
フィッシャーラット甲状腺（ＦＲＴ）上皮細胞、ＨＥＫ細胞及びヒト気管支上皮細胞培養物を、当該分野で公知の標準的方法を用いて培養した。ｓｌｃ２６ａ３阻害剤スクリーニングのために、ＹＦＰを発現するようにウイルス形質導入したＦＲＴ細胞株を、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３−ｓｌｃ２６ａ３でトランスフェクトし、０．１５μｇ／ｍｌピューロマイシンを用いて選別し、そしてクローン細胞株（ＦＲＴ−ＹＦＰ−ｓｌｃ２６ａ３と呼ぶ）を単離した。具体的に、フィッシャーラット甲状腺（ＦＲＴ）細胞を、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１８μｇ／ｍＬミオイノシトール及び４５μｇ／ｍＬアスコルビン酸を補充したＫａｉｇｎ’ｓ改変Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地中で、当該分野で公知の技術を用いて培養した。
【０１６９】
ｓｌｃ２６ａ３阻害剤を同定するためのスクリーニングのために、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｇａｒｒｙ  Ｎｏｌａｎによって寄託される、プラスミド＃１７２８）から入手可能なＦＥＬＩＸ第３世代ネコ免疫不全レンチウイルス系を用いて作製されたＹＦＰを発現するＦＲＴ細胞を、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３−ｓｌｃ２６ａ３でリポフェクタミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を用いてトランスフェクトし、０．１５ｍｇ／ｍＬのピューロマイシンを用いて選別し、クローナル細胞株（ＦＲＴ−ＹＦＰ−ｓｌｃ２６ａ３と呼ぶ）を、読み出しとしてＹＦＰクエンチングによるＣｌ−／Ｉ−−交換プロトコールを用いた機能的評価によって、単離した。
【０１７０】
ＹＦＰ及びｓｌｃ２６ａ４（ペンドリン）又はＣＦＴＲを発現するＦＲＴ細胞は、当該分野で公知である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、４．５ｇ／Ｌグルコース、０．１１ｇ／Ｌピルビン酸ナトリウム、０．５８４ｇ／Ｌグルタミン、１０％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養し、ＮａｎｏＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ａｌｓｔｅｍ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を製造業者の指示に従って用いてトランスフェクトした。ＦＲＴ細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）でトランスフェクトし、そしてＨＥＫ細胞を、ＮａｎｏＦｅｃｔ（Ａｌｓｔｅｍ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）でトランスフェクトした。
【０１７１】
ＳＬＣ２６Ａ３の発現のために富化した細胞株を作製するために、ＨＥＫ２９３細胞を、ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＳＬＣ２６Ａ３輸送ベクターで作製したレンチウイルス粒子で形質導入し、次いで、トランスフェクトして、ＹＦＰを発現させた。
【０１７２】
ｓｌｃ２６ａ６及びＹＦＰの発現のため富化した細胞株を作製するために、ＨＥＫ２９３細胞を、ｐＬＶＸ−ＹＦＰ−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏ−ｓｌｃ２６ａ６輸送ベクターによって作製したレンチウイルスで感染させ、０．２ｍｇ／ｍＬピューロマイシンを用いて選別した。ヒト免疫不全ウイルスベースのレンチウイルス粒子を、ＨＥＫ２９３細胞において、ｐＭＤ２．Ｇ、ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ、及びｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥパッケージングベクターＡｄｄｇｅｎｅ（Ｄｉｄｉｅｒ  Ｔｒｏｎｏにより寄託される、プラスミド＃１２２５１、＃１２２５３、及び＃１２２５９）で標準的手順を用いて作製した。気体−液体境界で生長させた十分に分化したヒト気管支上皮（ＨＢＥ）細胞を、当該分野で公知の技術を用いて培養した。
【０１７３】
実施例１２
選択性研究
ＣＦＴＲ、ペンドリン及びＴＭＥＭ１６ＡのＹＦＰベースのアッセイは、記載の通りであった。ＹＦＰ及びＳＬＣ２６Ａ３、ｓｌｃ２６ａ６又はｓｌｃ２６ａ９を発現するようにトランスフェクトさせたＨＥＫ細胞を、Ｃｌ−／Ｉ−交換プロトコールを用いて機能的にアッセイした。Ｃｌ−／ＨＣＯ３−交換のアッセイを、ＢＣＥＣＦを細胞間ｐＨ指示薬として用いて、ペンドリンについて記載されたように行った。十分に分化したＨＢＥ細胞培養物中の短絡電流（ＩＳＣ）測定を、当該分野で公知の技術を用いて行った。
【０１７４】
ｐＩＲＥＳ−ＹＦＰ−ｓｌｃ２６ａ９でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェル黒色壁透明底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）をＦＮＣ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｍｉｘ（ＡｔｈｅｎａＥＳ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）でコーティングした後に、これでプレート培養した。ＰＢＳで２回洗浄し、１０μＭの化合物Ａ１を含む１００μＬ  ＰＢＳ中で１０分間インキュベートした後、細胞を、Ｃ９１００  ＥＭ−ＣＣＤ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、ＣＡ）、Ｎｉｋｏｎ２０´Ｎ．Ａ．０．７５  Ｓ  Ｆｌｕｏｒ対物レンズ、ならびにそれぞれ緑色及び赤色を発色するフルオロフォアの画像化のためのＢ−２Ｅ／Ｃ及び３１００２フィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ、Ｂｅｌｌｏｗｓ  Ｆａｌｌｓ、ＶＴ）を備えたＴＥ２０００顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）のステージに移した。ｓｌｃ２６ａ９媒介型陰イオン交換のアッセイを、最初にＹＦＰ蛍光を記録し、その後１００μＬのＮａＩ−置換されたＰＢＳを添加してウェルを試験し、単一指数回帰によって蛍光強度から推定されるＣｌ−／Ｉ−交換の初期速度と共にウェルを試験した。ｓｌｃ２６ａ６活性のアッセイを、ｐＬＶＸ−ＹＦＰ−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏ−ｓｌｃ２６ａ６ベクターから作製したレンチウイルス粒子で形質導入したＨＥＫ細胞を用いて、類似の様式で行った。ＳＬＣ２６Ａ３機能をアッセイするために、ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＳＬＣ２６Ａ３輸送ベクターから作製したレンチウイルス粒子で形質導入したＨＥＫ２９３細胞を、上述のように、Ｃｌ−／Ｉ−交換アッセイについてＹＦＰを発現させるようにトランスフェクトした；赤色蛍光画像を得、細胞におけるＳＬＣ２６Ａ３発現を確認した。ＣＦＴＲ機能、ペンドリン媒介型Ｃｌ−／Ｉ−交換、及びＴＭＥＭ１６Ａ活性を、当該分野で公知の技術を用いてアッセイした。十分に分化したＨＢＥ細胞培養物中の短絡電流（ＩＳＣ）測定もまた、化合物選択性を評価するために行った。ＨＢＥ細胞を、Ｃｏｓｔａｒ  Ｓｎａｐｗｅｌｌ透明透過性支持体（１２ｍｍ径、０．４μｍポリエステル膜；Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）上で気体−液体境界において培養し、短絡電流を、対称ＨＣＯ３−緩衝溶液（１ｍＭ中：１２０ＮａＣｌ、５ＫＣｌ、１ＭｇＣｌ２、１ＣａＣｌ２、５Ｈｅｐｅｓ、２５ＮａＨＣＯ３；ｐＨ７．４；９５％  Ｏ２／５％  ＣＯ２平衡；３７℃）を頂端側と側底川との両方に浴溶液を加えたイオン輸送モジュレーターと共に用いて、当該分野で公知の技術を用いて測定した。
【０１７５】
要約すると、式Ｉ（例えば、化合物Ａ１）の化合物を含む組成物の特定の実施形態が、ＨＣＯ３−、Ｉ−及びＳＣＮ−によるＳＬＣ２６Ａ３媒介型Ｃｌ−交換を、約０．２μＭのＩＣ５０で完全にかつ可逆的に阻害したことを見出した。１０μＭにて、化合物Ａ１は、相同な陰イオン交換体であるｓｌｃ２６ａ４（ペンドリン）又はｓｌｃ２６ａ６（ＰＡＴ−１）を阻害せず、他の関連タンパク質又は腸イオンチャネルの活性を変えることもなかった。．マウスにおいて、内腔内の化合物Ａ１は、閉塞結腸腸係蹄において液体吸収を遮断したが、空腸腸係蹄においては遮断せず、他方で、ＮＨＥ３／ＳＬＣ９Ａ３阻害剤であるテナパノールは、空腸における吸収を遮断したが、結腸腸係蹄において遮断しなかった。経口の化合物Ａ１及びテナパノールロペラミド処理マウスにおいて便秘の兆候を同等に低減し、同時投与においては相加効果が見られた。化合物Ａ１はまた、ロペラミド処理嚢胞性繊維症マウスにおいても有用である。
【０１７６】
これらの研究は、結腸液体吸収におけるＳＬＣ２６Ａ３の主要な役割を支持し、嚢胞性繊維症関連の便秘を含む便秘におけるＳＬＣ２６Ａ３阻害の治療有用性を示唆する。
【０１７７】
実施例１３
さらなるＤＲＡ阻害剤ナログのＳＡＲ研究
さらなるＳＡＲ分析のために、７−ヒドロキシ位において置換された種々のベンジルアナログを、反応スキーム１にしたがって合成した。
【表３】
2021522255.tif 000036
2021522255.tif 000037
2021522255.tif 000038
【０１７８】
図９は、２つの代表的な化合物、すなわち、ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２５０及びＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０の濃度−阻害曲線を示す。ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０は、ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２５０と比較して、４倍の改善された効力を有する（約５０ｎＭ  ＩＣ５０）。上の表３は、式（Ｉ）のさらなる化合物をそのＩＣ５０と共に示す。
【０１７９】
実施例１４
薬物動態研究
化合物Ａ１（ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２５０）及びアナログ（ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２６０及びＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０）の薬物動態を、マウスにおいて決定した。単回用量の腹腔内又は経口投与（化合物Ａ１及びＤＲＡｉｎｈ−Ａ２６０について５ｍｇ／ｋｇ、ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０について１０ｍｇ／ｋｇ）の後、後眼窩穿刺を介して異なる時点で血液サンプルを採取し、そして血清を、遠心分離によって分離した。化合物濃度を、ＬＣ／ＭＳを用いて血清において測定した。図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃは、０時点での単回経口又は腹腔内投与後の化合物Ａ１（図１０Ａ）、ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２６０（図１０Ｂ）及びＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０（図１０Ｃ）の代表的な血清濃度を示す（ｎ＝３マウス／化合物／投与経路）。化合物Ａ１は、単回用量の経口又は腹腔内投与の少なくとも２４時間後、予測された治療レベルを有した。ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２６０は、単回用量の経口又は腹腔内投与後の最初は、高い血清レベルを有した。しかし、濃度は、持続的ではなく、１６時間において血清からほぼ完全に化合物が消失した。ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０は、単回用量の経口又は腹腔内投与後の数日間は、予測治療濃度を有し、ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０の血清濃度は、単回用量の経口又は腹腔内投与後の７２時間毎に、およそ１μＭであった。これらの条件下で、経口バイオアベイラビリティは、化合物Ａ１について５４％、ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２６０について１６％、及びＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０について３９％であった。（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）：化合物Ａ１について５３．９±６．５％、ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２６０について１６．４±６．６％、及びＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０について３９．３±３．５％。
【０１８０】
実施例１５
マウス便秘モデルにおける効能研究
マウスにおける便秘モデルＤＲＡｉｎｈ−Ａ２６０及びＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０を、マウスにおけるロペラミド誘導性便秘モデルにおいて試験した。雌ＣＤ１マウス（８〜１０週齢）に、ロペラミド（０．３ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、ＰＢＳ中５％エタノール中、０．１ｍｇ／ｍＬの最終濃度）を投与して便秘を起こし、対照マウスにおいてビヒクルを投与した。ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２６０（５ｍｇ／ｋｇ、５％ＤＭＳＯ及び１０％  Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  ＨＳ  １５含有生理食塩水中）又はＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０（１、３又は１０ｍｇ／ｋｇ、５％ＤＭＳＯ及び２０％（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン含有ＰＢＳ中）又はビヒクル単独を、強制経口投与によってロペラミドの１時間前に投与した（図１１Ａ）。ロペラミド注射後、マウスを、個別に代謝ケージ内に入れ、食餌及び水を自由に与えた。糞便サンプルを、３時間にわたり回収して、糞便総重量及び糞ペレットの数を定量した。糞便水分含量を測定するため、サンプルを８０℃で２４時間にわたり乾かし、そして水分含量を［湿重量−乾燥重量］／湿重量として計算した。
【０１８１】
図１１Ｂは、ロペラミド処理マウスにおけるＤＲＡｉｎｈ−Ａ２６０の糞面重量、ペレット数及び水分含量における改善の効能を示す（ｎ＝４−６マウス／群、事後ニューマン−コイルス多重比較検定を用いた一元配置分散分析によって比較した、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意でない）。
【０１８２】
図１１Ｃは、ロペラミド処理マウスにおける糞便重量及びペレット数、及び水分含量の正規化においてＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０用量依存性を示す（ｎ＝５−８マウス／群、ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓｍａｄｅｗｉｔｈ一元配置分散分析ｗｉｔｈ事後ニューマン−コイルス多重比較検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意でない）。
【０１８３】
図１１Ｃはまた、ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０が、（ロペラミドで処理していない）対照マウスにおいて糞便パラメーターに影響しないか又は高用量に（１０ｍｇ／ｋｇ）おいて下痢を起こしたことを示す。これらの結果はロペラミドによって誘発した便秘のマウスモデルにおけるＤＲＡｉｎｈ−Ａ２６０及びＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０の効能を実証し、低い用量であってもＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０は糞便水分含量を正規化することを示す。
【０１８４】
実施例１６
急性高シュウ酸尿症モデルにおける効能研究
化合物Ａ１（ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２５０）及びＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０の効能を、マウスにおける急性高シュウ酸尿症及びシュウ酸塩腎症のモデルにおいて試験した。急性高シュウ酸尿症を誘発するために、マウスにシュウ酸ナトリウム（１μｍｏｌ／ｋｇ）を、５ｍｇ／ｋｇ化合物Ａ１を含むか又はむくめずに、強制経口投与にとって０時点で投与し、尿をその後４時間にわたって代謝ケージ内で採取した。マウスの群を、対照として使用してビヒクルのみで処理し（シュウ酸ナトリウム又はＤＲＡ阻害剤なし）、その尿を、その後４時間にわたって同様に代謝ケージ内で採取した。４時間分の尿サンプルを用い、尿シュウ酸塩／クレアチニン比を決定して、尿中シュウ酸排出を定量した。図１２は、経口シュウ酸ナトリウム処理が、尿シュウ酸塩／クレアチニン比を２倍より大きく増大させ、したがって高シュウ酸尿症を発症させることを示す；化合物Ａ１による処理は、このモデルにおいて、高シュウ酸尿症を大いに予防した。
【０１８５】
類似の実験を、ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０について、急性高シュウ酸尿症モデルにおいて実施した。これらの実験のために、マウスを、まず代謝内に入れて、何も処理せず４時間にわたって尿を採取した。この最初の採取後、マウスをｈＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０（１０ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクルで腹腔内処理し、シュウ酸ナトリウム（２．５μｍｏｌ／ｋｇ、水中）を、強制経口投与にとって０時点で与えた。尿をその後の４時間にわたって、代謝ケージ内で採取した。図１３Ａは、実験プロトコールを示し、図１３Ｂは、これらの実験的条件下でのマウスにおける４時間の尿シュウ酸塩／クレアチニン比を示す。経口シュウ酸ナトリウムは、尿シュウ酸塩／クレアチニン比を平均で２倍より大きく増大させ、ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０による処理は、このモデルにおいて高シュウ酸尿症を大きく予防した。
【０１８６】
実施例１７
シュウ酸塩腎症モデルにおける効能研究
シュウ酸塩腎症を誘発するために、記載されるとおり、マウスに高シュウ酸塩（０．６７％）かつ低カルシウム（０．０１％未満）食を与えた（Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３１０：Ｆ７８５−Ｆ７９５、２０１６）。図１４は、実験プロトコールを示す。マウスに、高シュウ酸塩食を０日目にて開始させ、化合物Ａ１（５ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクルで強制経口投与による１日２回の処理を、０日目に開始した。１４日目、尿を、代謝ケージ内で２４時間にわたって採取し、遠心分離して尿沈殿物を調べ、次いで、マウスを安楽死させて、腎臓を組織学分析に用いた。図１５は、ｓｈｏｗｓｔｈａｔビヒクル処理マウスが、大量の不溶性沈殿物を有したが、化合物Ａ１によって処理されたマウスにおいて大きく減少したことを示す。
【０１８７】
腎臓を１４日目に回収し、Ｈ＆Ｅ染色を用いて腎臓損傷について、及び偏光顕微鏡検査を用いて結晶堆積について調べた。図１６Ａ及び１６Ｂは、明らかな腎臓損傷をビヒクル処理マウスにおいて示し、及び図１６Ｃ及び１６Ｄは、化合物Ａ１処理による腎臓損傷の予防を示す。図１７Ａは、ビヒクル処理マウスの腎臓において広範に広がった結晶堆積を示し、図１７Ｂは、化合物Ａ１処理による結晶堆積の予防を示す。
【０１８８】
シュウ酸塩腎症モデルにおける類似の実験を、ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０を用いて実施した。これらの実験のために、マウスに、３時間の尿採取を０、７及び１４日目に行った。最初の尿採取後に、高シュウ酸塩食を０日目にて開始し、マウスにＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０又はビヒクルを腹腔内投与で１日に２回、１４日間にわたって与えた。図１８Ａは、実験プロトコールを示す。図１８Ｂは、ビヒクル処理マウスが０日目と比較して有意な体重減少（疾患重篤度の兆候）を、７日目及び１４日目に有したことを示す；ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０処理マウスは、その体重を、実験の間中、より良く維持した。図１８Ｃは、ビヒクル処理マウスが、０日目と比較して、７日目に尿シュウ酸塩／クレアチニン比のおよそ７倍の増大を有したことを示す；ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０処理は、高シュウ酸尿症の発症を大いに予防した。図１８Ｄは、１４日目のビヒクル処理マウスが、有意に高い血清クレアチニンレベルを有したことを示す（腎臓機能損傷を示唆する）；ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０処理マウスは、正常な血清クレアチニンを有し、したがって、正常な腎臓機能を有していた。これらの結果全体は、ＤＲＡｉｎｈ−Ａ２７０処理が、腎不全ｉｎマウスにおける高シュウ酸塩食誘導性シュウ酸塩腎症モデルの発症を予防することを示唆する。
【０１８９】
要約すると、これらの結果は、ＤＲＡ阻害剤が高シュウ酸尿症を種々のマウスモデルにおいて予防することを示唆し、シュウ酸カルシウム腎結石の予防及び腸内高シュウ酸尿症（胃のバイパス手術、腸切除、炎症性腸疾患、膵臓不全又は他の吸収不良症候群）及び原発性高シュウ酸尿症を含む種々の症状に関連する高シュウ酸尿症の治療におけるＤＲＡ阻害剤の効能を支持する。
【０１９０】
上述の種々の実施形態は、さらなる実施形態と組み合わせ得る。本明細書中で引用された全ての米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許文献は、本明細書中でその全体が参考として組み込まれる。実施形態の態様は、必要な場合に改変されて、種々の特許、出願及び刊行物の概念を使用し、なおさらなる実施形態を提供することができる。
【０１９１】
これら及び他の変更が、上述の記載の観点から、実施形態に対してなされ得る。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、請求の範囲を本明細書及び請求の範囲に開示される特定の実施形態に限定すると解釈されるべきではなく、特許請求の範囲が与える均等物の全ての範囲に沿った全ての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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