(57)【要約】  本発明は病原性細菌に関し、特に新規な抗生物質組成物を使用して細菌感染症を治療、予防、または改善することに関する。本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属等のＢａｃｉｌｌｕｓおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ種の感染症を治療するために特に有用である。本発明は、そのような製剤を含む医薬組成物に及ぶ。本発明はまた、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ等の他の細菌に対して抗菌活性を示す好気性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属を同定する方法、およびこれらの好気性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属から活性な抗菌組成物を単離するための方法に及ぶ。【選択図】図２０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）抗生物質、好ましくはクロロテタイン、ならびに（ｉｉ）サーファクチンファミリーのメンバー、イツリンファミリーのメンバー、およびフェンギシンファミリーのメンバーからなる群から選択されるリポペプチド、またはこれらのリポペプチドのいずれかの活性誘導体を含む、抗生物質組成物。
【請求項２】
前記抗生物質が、クロロテタイン、ポリケチド、バシリシン、ホスラクトマイシン、またはその活性誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の抗生物質組成物。
【請求項３】
前記抗生物質がクロロテタインである、請求項１に記載の抗生物質組成物。
【請求項４】
前記組成物が糖脂質をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗生物質組成物。
【請求項５】
前記組成物がミセルを形成する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗生物質組成物。
【請求項６】
前記ミセルが、１ｎｍ〜５００ｎｍ、または１ｎｍ〜３００ｎｍ、または１ｎｍ〜１６０ｎｍの平均直径を有する、請求項５に記載の抗生物質組成物。
【請求項７】
前記ミセルが、３ｎｍ〜１６０ｎｍの平均直径を有する、請求項５に記載の抗生物質組成物。
【請求項８】
前記糖脂質が、ラムノリピッドもしくはその活性誘導体、および／またはソホロリピッドもしくはその活性誘導体である、請求項４〜７のいずれか一項に記載の抗生物質組成物。
【請求項９】
前記糖脂質がラムノリピッドであり、前記ラムノリピッドがモノラムノリピッドまたはジラムノリピッドであり、任意選択的に、前記ラムノリピッドが、Ｃ８、Ｃ８：２、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１２：２、Ｃ１４またはＣ１４：２アイソフォームである、請求項８に記載の抗生物質組成物。
【請求項１０】
前記ラムノリピッドが、Ｃ１２アイソフォームである、請求項９に記載の抗生物質組成物。
【請求項１１】
前記ポリケチドが、アミクマシンＣ、ジフィシジン、オキシジフィシジン、およびサリニピロンＡ、またはその活性誘導体からなる群から選択され、任意選択的に、前記ポリケチドはジフィシジンまたはオキシジフィシジンである、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の抗生物質組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、サーファクチンファミリーのメンバー；ラムノリピッドおよび／またはソホロリピッド；ならびにクロロテタインまたはその活性誘導体を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、サーファクチンファミリーのメンバー；ラムノリピッドおよび／またはソホロリピッド；ならびにジフィシジンまたはオキシジフィシジンを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、ジ−О−アセテートラクトンをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗生物質組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、マイコスブチリン；モジャベンシンＡ；およびクルスタキンからなる群から選択されるさらなるリポペプチド、またはこれらのリポペプチドのいずれかの活性誘導体を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記リポペプチドが、イツリンファミリーのメンバーまたはその活性誘導体、およびサーファクチンファミリーのメンバーまたはその活性誘導体であり、任意選択的に、前記イツリンファミリーのメンバーまたはその活性誘導体、およびサーファクチンファミリーのメンバーまたはその活性誘導体が、１：１０〜１０：１、または１：５〜５：１、または１：３〜３：１、または１：２〜２：１の比で使用される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記イツリンファミリーのメンバーが、イツリンＡ［配列番号１］、イツリンＡＬ［配列番号２］、イツリンＣ［配列番号３］、マイコスブチリン［配列番号：４］、またはバシロマイシンＤ［配列番号：５］、バシロマイシンＦ［配列番号：６］、バシロマイシンＬ［配列番号：７］、バシロマイシンＬＣ［配列番号８］、およびバシロペプチンＡ、ＢまたはＣ［配列番号１７］からなる群から選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記イツリンファミリーのメンバーが、イツリンＡ［配列番号１］、またはその活性誘導体であり、任意選択的に、前記活性誘導体が、Ｃ１４、Ｃ１５またはＣ１６アイソフォームである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記サーファクチンファミリーのメンバーが、エスペリン［配列番号９］、リケニシン［配列番号１０］、プミラシジン［配列番号１１］、およびサーファクチン［配列番号１２］からなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記サーファクチンファミリーのメンバーが、サーファクチン［配列番号１２］であり、任意選択的に、その活性誘導体が、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、またはＣ１７アイソフォームである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記抗生物質組成物が、イツリンＡのＣ１５アイソフォーム、およびサーファクチンのＣ１５アイソフォームを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
食料または栄養補助食品としての、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗生物質組成物の使用。
【請求項２３】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗生物質組成物を含む、栄養補助食品または食料。
【請求項２４】
治療に使用するための、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２３に記載の栄養補助食品もしくは食料。
【請求項２５】
細菌感染症の治療、予防、または改善に使用するための、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２３に記載の栄養補助食品もしくは食料。
【請求項２６】
治療、予防、または改善される前記細菌感染症が、グラム陽性菌感染症である、請求項２５に記載の使用のための組成物。
【請求項２７】
前記グラム陽性細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属(Clostridium spp.)、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属(Bacillus spp.)、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属(Listeria spp.)、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属(Mycobacterium spp.)、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属(Staphylococcus spp.)、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属(Streptococcus spp.)、およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属(Enterococcus spp.)を含む、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門(phylum Firmicutes)に属するものを含む、請求項２６に記載の使用のための組成物。
【請求項２８】
前記細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、好ましくはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである、請求項２７に記載の使用のための組成物。
【請求項２９】
前記細菌が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、好ましくはＳ．ａｕｒｅｕｓである、請求項２７に記載の使用のための組成物。
【請求項３０】
治療、予防、または改善される前記細菌感染症が、グラム陰性菌感染症である、請求項２５に記載の使用のための組成物。
【請求項３１】
前記グラム陰性細菌が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属(Salmonella spp.)およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属(Escherichia spp.)等の腸内細菌科(Enterobaceriaceae)、ならびにＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属(Campylobacter spp.)、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属(Pseudomonas spp.)、およびＶｉｂｒｉｏ属(Vibrio spp.)を含む、請求項３０に記載の使用のための組成物。
【請求項３２】
前記細菌が、Ｖｉｂｒｉｏ属、好ましくはＶ  ｈａｒｖｅｙｉまたはＶ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓである、請求項３１に記載の使用のための組成物。
【請求項３３】
治療、予防、または改善される前記細菌感染症が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属(Mycobacterium spp.)感染症である、請求項２５に記載の使用のための組成物。
【請求項３４】
前記Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅであり、最も好ましくはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓである、請求項３３に記載の使用のための組成物。
【請求項３５】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の治療、予防、または改善に使用するための、クロロテタインまたはその誘導体もしくは類似体。
【請求項３６】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を治療、予防、または改善する方法であって、そのような治療を必要とする対象に、治療有効量のクロロテタインまたはその誘導体もしくは類似体を投与することまたは投与したことを含む、方法。
【請求項３７】
細菌感染症を治療、予防、または改善する方法であって、そのような治療を必要とする対象に、治療有効量の、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗生物質組成物、または請求項２３に記載の栄養補助食品もしくは食料を投与することまたは投与したことを含む、方法。
【請求項３８】
治療、予防、または改善される前記細菌感染症が、請求項２６〜３４のいずれか一項に定義される通りである、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原性細菌に関し、特に新規な抗生物質製剤を使用して細菌感染症を治療、予防、または改善することに関する。本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属等のＢａｃｉｌｌｕｓおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ種の感染症を治療するために特に有用である。本発明は、そのような製剤を含む医薬組成物に及ぶ。本発明はまた、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ等の他の細菌に対して抗菌活性を示す好気性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属を同定する方法、およびこれらの好気性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属から活性のある抗菌組成物を単離するための方法に及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症（ＣＤＩ）は、主に高齢者および若年層に発症する院内感染症である。しかしながら、研究により、抗生物質の使用歴のない若年層および健康な個体におけるＣＤＩの増加率が示されている（１）。クリンダマイシン耐性は、歴史的にヒトおよび動物のＣＤＩの発症における最大の要因の１つであった（２）。ＣＤＩの発症率は、米国および英国等の先進国で高いが、抗生物質は開発途上国でより多く使用されている。おそらく、強毒性株の分布ならびに食習慣および衛生状態の多様性が、このＣＤＩの発症率における違いに寄与しているのであろう。
【０００３】
便微生物移植（ＦＭＴ）は、再発性ＣＤＩの治療に非常に効果的であることが示されている。１回の治療で８５〜９０％の症例が回復し、２回の治療では最大１００％の症例が回復することが確実に示されている（３−６）。ＦＭＴの科学的根拠は、腸内毒素症の患者が健康な微生物叢を失った、または微生物叢がその正常な機能を維持することができないという２つの仮定に基づいている。従来のＦＭＴ技術は、健康なドナーからの便調製物に含有される、安定で生存能力のある多様な微生物コミュニティを移植することを目的としている。治療的に活性な物質（複数可）は、細菌、糞便水の成分（例えば、ビローム）、またはドナーのヒト細胞の潜在的な産物を含み得る。（７）。
【０００４】
ＦＭＴの潜在的な長期安全性の懸念から（８、９）、ドナーの糞便に由来する細菌の定義された混合物の使用（すなわち、細菌療法）へと移行した。マウスを使用した萌芽的研究において、感染したマウスのＣＤＩを抑制した健康な動物の糞便から腸内細菌のカクテルが単離された（１０）。興味深いことに、治療された動物の腸内微生物叢は、細菌の多様性が増加した健康な動物の腸内微生物叢へと移行することが示された。６つの種が、４つの主要な腸内微生物叢の門のうち３つを代表する偏性嫌気性菌および通性嫌気性菌の種を含んでいた（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ新種、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ新種、およびＥｎｔｅｒｏｒｈａｂｄｕｓ新種）。この研究では、オートクレーブ処理された糞便、糞便濾液、および個々の株は感染を抑制できず、これらの細菌が競合によってＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ集団に取って代わったという結論に至った。しかしながら、抗生物質を併用せずにＣＤＩの一次治療薬として用いた場合、ＦＭＴが効果的であることは未だに示されていない。
【０００５】
上記の研究は、糞便細菌の定義されたまたは混合された集団を使用する他の研究と一緒に（１１、１２）、ＣＤＩの抑制機序としての競合的排除と、細菌画分から活性物質が生じることを示唆している。したがって、細菌に由来する１つ以上の成分から活性が生じることが可能である。例えば、抗菌性化合物、または移植された細菌によって産生される代謝産物、または細菌ゲノムに組み込まれたバクテリオファージ（プロファージ）は、患者への移植後に活性化および放出される。ＦＭＴを使用すると、糞便水と細菌が一緒に患者に移植されるため、この画分自体が細菌の残骸、タンパク質、抗菌性化合物、代謝産物、およびオリゴヌクレオチド／ＤＮＡに富んでいる。糞便濾液のみを使用したところ、無菌濾液の経鼻空腸移植後に慢性再発性感染症を呈する５人の患者においてＣＤＩの症状が消失した（７）。移植後６か月間症状が解消されたことから、無菌糞便水が再発性ＣＤＩを消失させ得ることが確認された。糞便水中に存在する活性物質は依然としてよく理解されておらず、タンパク質候補は同定されなかった。２つの説明が提案された：第一に、有益な細菌の増殖を促進するように宿主の免疫系を（パターン認識受容体を介して）刺激する可能性がある細菌の細胞壁またはＤＮＡの断片である。第二に、バクテリオファージビリオンの移植または溶原バクテリオファージの誘導によって、直接的または間接的にＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの増殖を抑制することである。
【０００６】
ヒトの微生物叢は、１００〜１０００程度の細菌種を含んでおり、個体間でかなりの多様性がある（１３、１４）。この集団は厳密な嫌気性菌に支配されているため、それらが個体間でどのように移動するかということが重要な問題である。今では、このことは、ヒトの消化管に見られる属の約６０％が、腸内微生物叢全体の３０％を占める芽胞形成細菌であるという驚くべき発見によって部分的に説明され得る（１５）。この研究では、ヒトの糞便から分離された芽胞形成細菌を嫌気的に培養し、次いで、１６Ｓ  ｒＲＮＡの分析を使用して同定した。明らかに、芽胞（内生芽胞）は宿主の外で無期限に生存する能力を有するため、他のヒトへの移植に適している。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、先行技術に関連する問題を克服しようとする発明者らの研究から生まれた。
【０００８】
芽胞形成細菌には、好気性菌種および嫌気性菌種の２種類がある。消化管は無酸素状態であると考えられているため、嫌気性細菌が優勢であり、したがって、好気性細菌よりも重要であると長い間考えられてきた。本明細書に記載されるように、本発明者らは、好気性芽胞形成細菌がヒトおよび動物の消化管に存在し、それらは環境から獲得されるため、いわゆる「異所性」集団を形成すると考えたことを認識している。芽胞形成菌の好気性コミュニティは、主にＢａｃｉｌｌｕｓ種である。これらの好気性芽胞形成菌は、芽胞として存在することが多いため、細菌検出のためのマイクロバイオームに基づく方法を用いてもほとんど気付かれず、したがって抽出方法に反応しない。代わりに、それらは培養に基づく方法を用いると最もよく検出される。したがって、本発明者らは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症（ＣＤＩ）に関して重要なのは、実際には嫌気性コホートではなく、好気性コホートであることを示した。
【０００９】
特定の抗生物質が好気性Ｂａｃｉｌｌｕｓ（および他の細菌）を死滅させることが分かっており、実施例に記載されるように、抗生物質クリンダマイシンがＣＤＩに特に適しているため使用される。したがって、クリンダマイシンの使用は、ＣＤ芽胞が発芽して成長する機会を提供する、すなわち、ニッチが提供される。本発明者らは、いくつかのＢａｃｉｌｌｕｓ種が、バイオサーファクタント活性および／または抗菌活性を示し、かつ驚くべきことにＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅだけでなく、医学的または獣医学的に重要な他の細菌（例えば、エビ等の動物に感染するもの）も溶解することができる、新規な抗菌組成物（ＡｍｙＣｉｄｅ（商標）またはＡｍｙＣｉｄｉｎ（商標））を大量に産生することを示した。
【００１０】
したがって、本発明の第１の態様では、細菌感染症の治療、予防、または改善に使用するための、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓおよび／またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの生存もしくは死滅芽胞、または生存もしくは死滅栄養細胞、または生存細胞によって産生される細胞外物質、または破壊細胞ホモジネートが提供される。
【００１１】
有利なことに、本発明者らは、これらの細菌が予防的および治療的に使用され得ることを示した。驚くべきことに、また好ましくは、（嫌気性の自発性細菌ではなく）異所性細菌の使用は、細菌感染症に効果的に対抗するために用いることができる。
【００１２】
一実施形態では、細菌感染症に対抗するためにＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓおよび／またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの生存芽胞が使用されることが好ましい。別の実施形態では、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓおよび／またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの死滅芽胞が使用されることが好ましい。さらに別の実施形態では、細菌感染症に対抗するためにＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓおよび／またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの死滅細胞が使用される。当業者は、細菌の芽胞または細胞を死滅させるまたは生存不能にすることができるいくつかの方法、例えば、照射（例えば、γ線）または加熱（例えば、低温殺菌）があることを理解するであろう。死滅細胞は、破損または破壊された細胞、すなわち、例えば、超音波処理またはリゾチーム等の酵素によって機械的または物理的に破壊された細胞を含み得る。この実施形態では、破壊細胞の外皮および菌体外多糖（ＥＰＳ）等が抗菌活性を示す。したがって、さらなる実施形態では、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓおよび／またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞の破壊細胞ホモジネートが使用されることが好ましい。
【００１３】
しかしながら、最も好ましい実施形態では、感染症に対抗するために、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓおよび／もしくはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの生存栄養細胞、または生存細胞によって産生される細胞外物質が使用される。実施例に記載されるように、本発明者らは、上清抽出物（栄養細胞または芽胞を含まない、すなわち無細胞試料）が驚くべきことに抗菌活性を示すことを示した。したがって、別の好ましい実施形態では、細菌感染症に対抗するために、生存栄養細胞によって産生される細胞外物質または破壊細胞ホモジネートを含む無細胞試料（例えば、上清）が使用される。
【００１４】
好ましくは、使用されるＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株は、ＳＧ１８、ＳＧ５７、ＳＧ１３７、ＳＧ１３６、ＳＧ１８５、ＳＧ２７７およびＳＧ２９７からなる群から選択される。最も好ましくは、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株はＳＧ２７７またはＳＧ２９７である。
【００１５】
好ましくは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株は、ＳＧ１７、ＳＧ８３およびＳＧ１４０からなる群から選択される。最も好ましくは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株はＳＧ１４０である。
【００１６】
一実施形態では、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓの１つ以上の株、または細胞によって産生される細胞外物質または破壊細胞ホモジネートが使用される。換言すると、ＳＧ１８、ＳＧ５７、ＳＧ１３７、ＳＧ１３６、ＳＧ１８５、ＳＧ２７７およびＳＧ２９７からなる群から選択される任意のＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株を使用することができる。代替的に、別の実施形態では、ＳＧ１８、ＳＧ５７、ＳＧ１３７、ＳＧ１３６、ＳＧ１８５、ＳＧ２７７およびＳＧ２９７からなる群から選択される１つより多くのＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株が使用されてもよい。例えば、ＳＧ２７７とＳＧ２９７が同時に使用され得る、またはＳＧ１８とＳＧ５７が同時に使用され得る等である。
【００１７】
別の実施形態では、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの１つ以上の株、または細胞によって産生される細胞外物質または破壊された細胞ホモジネートが使用される。換言すると、ＳＧ１７、ＳＧ８３およびＳＧ１４０からなる群から選択される任意のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株を使用することができる。代替的に、別の実施形態では、ＳＧ１７、ＳＧ８３およびＳＧ１４０からなる群から選択される１つより多くのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株が使用されてもよい。例えば、ＳＧ１７とＳＧ８３が同時に使用され得る、またはＳＧ１７とＳＧ１４０が同時に使用され得る等である。
【００１８】
さらに別の実施形態では、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓの１つ以上の株を、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの１つ以上の株、または対応する細胞によって産生される細胞外物質もしくはそこから破壊された細胞ホモジネートと組み合わせて使用することができる。例えば、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株ＳＧ２７７がＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株ＳＧ１７とともに使用され得る、またはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株ＳＧ２９７がＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株ＳＧ１４０とともに使用され得る等である。
【００１９】
本発明者らは、様々なＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株とＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株との組み合わせを含む新規な抗菌製剤を調製した。
【００２０】
したがって、第２の態様では、１つ以上のＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株および／または１つ以上のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株の生存もしくは死滅芽胞、または生存もしくは死滅栄養細胞、または生存細胞によって産生される細胞外物質、または破壊細胞ホモジネートと、任意選択的に、薬学的に許容される担体またはビヒクルと、を含む抗菌製剤が提供される。
【００２１】
好ましくは、１つ以上のＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株は、ＳＧ１８、ＳＧ５７、ＳＧ１３７、ＳＧ１３６、ＳＧ１８５、ＳＧ２７７およびＳＧ２９７からなる群から選択される。ＳＧ２７７およびＳＧ２９７が最も好ましい株である。
【００２２】
好ましくは、１つ以上のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株は、ＳＧ１７、ＳＧ１８３、およびＳＧ１４０からなる群から選択される。ＳＧ１４０が最も好ましい株である。
【００２３】
好ましくは、第２の態様の抗菌製剤は、少なくとも１つのＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株および少なくとも１つのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株の生存もしくは死滅芽胞、または生存もしくは死滅栄養細胞、または生存細胞によって産生される細胞外物質、またはそれに由来する破壊細胞ホモジネートを含む。好ましくは、抗菌製剤は、複数のＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株および複数のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株の生存もしくは死滅芽胞、または生存もしくは死滅栄養細胞、または生存細胞によって産生される細胞外物質、またはそれに由来する破壊細胞ホモジネートを含む。
【００２４】
好ましくは、第１または第２の態様による、生存芽胞、死滅芽胞、または生存栄養細胞もしくは死滅細胞、または生存細胞によって産生される細胞外物質、またはそれに由来する破壊細胞ホモジネートは、抗菌組成物を含む。本発明者らは、示された驚くべき抗菌活性に関与しているのは、この抗菌組成物であると考える。
【００２５】
好ましくは、抗生物質組成物は、（ｉ）サーファクチンファミリーのメンバー、またはその活性誘導体を含む。
【００２６】
好ましくは、抗生物質組成物は、（ｉｉ）イツリンファミリーのメンバー、またはその活性誘導体を含む。
【００２７】
本発明者らは、驚くべきことに、リポペプチドと抗生物質との相乗効果を実証した。本発明者らは、リポペプチドがミセルの形成を促進すると考える。このプロセスは、有利には、抗生物質を濃縮し、それらを安定化し、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ等の細菌の死滅を可能にする。本発明者らのデータは、これが多くのＢａｃｉｌｌｉ（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の普遍的な戦略であることを示しており、基本的な機序はミセルの形成および抗生物質の濃縮の機序であり、この相乗効果が腸内病原体を含む病原体の死滅を促進すると考えられる。
【００２８】
したがって、本発明の第３の態様では、（ｉ）抗生物質、ならびに（ｉｉ）サーファクチンファミリー(Surfactin family)のメンバー、イツリンファミリー(Iturin family)のメンバー、およびフェンギシンファミリー(Fengycin family)のメンバーからなる群から選択されるリポペプチド、またはこれらのリポペプチドのいずれかの活性誘導体を含む抗生物質組成物が提供される。
【００２９】
当業者は、抗生物質という用語が抗菌化合物に関連することを理解するであろう。
【００３０】
第４の態様では、治療に使用するための、第３の態様による抗生物質組成物が提供される。
【００３１】
第５の態様では、細菌感染症の治療、予防、または改善に使用するための、第３の態様による抗生物質組成物が提供される。
【００３２】
本発明の第６の態様では、細菌感染症を治療、予防、または改善する方法が提供され、該方法は、そのような治療を必要とする対象に、以下のいずれかの治療有効量を投与することを含む：
（ｉ）Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓおよび／またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの生存もしくは死滅芽胞、または生存もしくは死滅栄養細胞、または生存細胞によって産生される細胞外物質、または破壊細胞ホモジネート、あるいは
（ｉｉ）（ｉ）抗生物質、ならびに（ｉｉ）サーファクチンファミリーのメンバー、イツリンファミリーのメンバー、およびフェンギシンファミリーのメンバーからなる群から選択されるリポペプチド、またはこれらのリポペプチドのいずれかの活性誘導体を含む抗生物質組成物。
【００３３】
本発明の第７の態様では、食料または栄養補助食品としての第３の態様による抗生物質組成物の使用が提供される。
【００３４】
本発明の第８の態様では、第３の態様による抗生物質組成物を含む栄養補助食品または食料が提供される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、組成物は、例えば、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓおよび／またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの生存芽胞または生存栄養細胞と組み合わせて送達される場合、プロバイオティックであり得る。食料は、飲料であってもよい。
【００３６】
別の実施形態では、食料は、医療用の食料、または「医療食」であり得る。当業者は、「医療食」という用語が、それに関連する健康強調表示を有する食料を指すことを理解するであろう。
【００３７】
本明細書で使用される「抗生物質組成物」という用語は、第１の態様による、生存芽胞、死滅芽胞、または生存栄養細胞もしくは死滅細胞、または生存細胞によって産生される細胞外物質、または破壊細胞ホモジネート、あるいは第２の態様の製剤、あるいは第３の態様の組成物のいずれかによって示される抗菌活性、および本明細書に記載の使用または方法のいずれかに関与することを理解されたい。本発明の任意の態様に従って治療、予防、または改善され得る細菌感染症は、グラム陽性またはグラム陰性菌感染症であり得る（表７を参照）。
【００３８】
好ましくは、治療、予防、または改善され得る細菌感染症は、グラム陽性菌感染症である。対抗することができるグラム陽性菌の例としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属(Clostridium spp.)、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属(Bacillus spp.)、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属(Listeria spp.)、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属(Mycobacterium spp.)、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ(Lactobacillus)、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属(Staphylococcus spp.)、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属(Streptococcus spp.)、およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属(Enterococcus spp.)を含むＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門(phylum Firmicutes)に属するものが挙げられる。細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属(Bacillus spp.)、好ましくはＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓまたはＢ．ｃｅｒｅｕｓまたはＢ．ｐｕｍｉｌｉｓまたはＢ．ｃｌａｕｓｉｉまたはＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍまたはＢ．ｆｉｒｍｕｓまたはＢ．ａｑｕｉｍａｒｉｓであり得る。細菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属(Staphylococcus spp.)、好ましくはＳ．ａｕｒｅｕｓまたはＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓであり得る。細菌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属(Listeria spp.)、好ましくはＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓであり得る。細菌はＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属(Enterococcus spp.)、好ましくはＥ．ｆａｅｃａｌｉｓであり得る。細菌はＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓであってもよい。細菌はＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓであってもよい。細菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、好ましくはＬ．ｍｕｃｏｓａｅまたはＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍまたはＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓであり得る。
【００３９】
好ましくは、細菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属(Clostridium spp.)またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属(Staphylococcus spp.)であり、好ましくはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅまたはＳ．ａｕｒｅｕｓである。
【００４０】
しかしながら、最も好ましくは、細菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属(Clostridium spp.)であり、また最も好ましくはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである。
【００４１】
本発明者らは、驚くべきことに、クロロテタイン(Chlorotetaine)がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して抗菌活性を有することを実証した。したがって、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の治療、予防、または改善に使用するための、クロロテタイン、またはその誘導体もしくは類似体にも及ぶ。本発明はまた、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の治療、予防、または改善に使用するための、クロロテタイン、またはその誘導体もしくは類似体を含む薬学的組成物にも及ぶ。
【００４２】
したがって、別の態様では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を治療、予防、または改善する方法が提供され、該方法は、そのような治療を必要とする対象に、治療有効量のクロロテタインまたはその誘導体もしくは類似体を投与することまたは投与したことを含む。
【００４３】
本発明者らはまた、本発明の組成物がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属(Mycobacterium spp.)に対して活性があることも示した。したがって、好ましくは、治療、予防、または改善され得る細菌感染症は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属感染症である。
【００４４】
好ましくは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属(Mycobacterium spp.)は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓまたはＭ．ｌｅｐｒａｅであり、最も好ましくはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓである。
【００４５】
対抗することができるグラム陰性菌の例としては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属(Salmonella spp.)およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属(Escherichia spp.)等の腸内細菌科(Enterobaceriaceae)、ならびにＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属(Campylobacter spp.)、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属(Pseudomonas spp.)、およびＶｉｂｒｉｏ属(Vibrio spp.)が挙げられる。細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属(Enterobacter spp.)、好ましくはＥ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓであり得る。細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属(Escherichia spp.)、好ましくはＥ．ｃｏｌｉであり得る。細菌は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属(Salmonella spp.)、好ましくはＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍであり得る。細菌は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属(Pseudomonas spp.)、好ましくＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａであってもよい。好ましくは、細菌はＶｉｂｒｉｏ属(Vibrio spp.)、好ましくはＶ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓまたはＶ．ｈａｒｖｅｙｉである。
【００４６】
本発明者らは、グラム陽性菌に対して観察された抗菌活性が殺菌性、また場合によっては溶菌性であるのに対し、グラム陰性菌に対して観察された活性は静菌性であることを認識した。したがって、好ましくは、本発明のＢａｃｉｌｌｕｓ株によって産生される抗生物質組成物は、殺菌性または溶菌性の特性を示す。
【００４７】
リポペプチドがイツリンファミリー、またはその活性誘導体である場合、イツリンファミリーのメンバー、またはその活性誘導体は、イツリンＡ、イツリンＡＬ、イツリンＣ、マイコスブチリン、バシロマイシンＤ、バシロマイシンＦ、バシロマイシンＬ、バシロマイシンＬＣ、およびバシロペプチンからなる群から選択され得る。
【００４８】
一実施形態では、イツリンファミリーのメンバーまたはその活性誘導体の一般式は、以下の式Ｉに示される通りであり得、式中、Ｒ１〜Ｒ５は任意のアミノ酸であり、好ましくは、Ｒ１はＡｓｎまたはＡｓｐであり、Ｒ２はＰｒｏ、ＧｌｎまたはＳｅｒであり、Ｒ３はＧｌｕ、ＰｒｏまたはＧｌｎであり、Ｒ４はＳｅｒまたはＡｓｎであり、Ｒ５はＴｈｒ、ＳｅｒまたはＡｓｎである：
【００４９】
【化１】
2021515031.tif 000003
【００５０】
イツリンファミリーのメンバー、またはその活性誘導体は、イツリンＡ［配列番号１］、イツリンＡＬ［配列番号２］、イツリンＣ［配列番号３］、マイコスブチリン［配列番号４］、またはバシロマイシンＤ［配列番号５］、バシロマイシンＦ［配列番号６］、バシロマイシンＬ［配列番号７］、バシロマイシンＬＣ［配列番号８］、バシロペプチンＡ、バシロペプチンＢまたはバシロペプチンＣ［配列番号１７］であってもよく、その配列を以下に示す：
【００５１】
【化２】
2021515031.tif 000004
【００５２】
好ましくは、イツリンファミリーのメンバーは、イツリンＡ、またはその活性誘導体である。イツリンＡがリポペプチドであることは理解されよう。イツリンＡ、またはその活性誘導体は、Ｃ１４、Ｃ１５またはＣ１６アイソフォームであり得る。したがって、イツリンＡの活性誘導体は、Ｃ１４、Ｃ１５またはＣ１６アイソフォームのいずれかを含み得る。最も好ましくは、イツリンＡ、またはその活性誘導体は、Ｃ１５イツリンアイソフォームである。
【００５３】
一実施形態では、イツリンＡは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し得る：
【００５４】
【化３】
2021515031.tif 000005
【００５５】
サーファクチンファミリーのメンバーは環状リポペプチドであることは理解されよう。リポペプチドがサーファクチンファミリーのメンバーである一実施形態では、サーファクチンファミリーのメンバーの一般式は、以下の式ＩＩに示すことができ、式中、Ｒ１〜Ｒ４は任意のアミノ酸であり、好ましくは、Ｒ１はグルタミンまたはグルタミン酸であり、Ｒ２はロイシンまたはバリンであり、Ｒ３はバリン、ロイシンまたはアラニンであり、Ｒ４はロイシンまたはバリンである。
【００５６】
【化４】
2021515031.tif 000006
【００５７】
サーファクチンファミリーのメンバーは、エスペリン［配列番号９］、リケニシン［配列番号１０］、プミラシジン［配列番号１１］およびサーファクチン［配列番号１２］からなる群から選択され得る。
【００５８】
【化５】
2021515031.tif 000007
【００５９】
式中、ＸＬ１はＧｌｎまたはＧｌｕであり；ＸＬ２はＬｅｕまたはＩｌｅであり；ＸＬ４およびＸＬ７はＶａｌまたはＩｌｅであり、
ＸＰ７はＶａｌまたはＩｌｅであり、
ＸＳ２はＶａｌ、Ｌｅｕ、またはＩｌｅであり；ＸＳ４はＡｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅであり；ＸＳ７はＶａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅである。
【００６０】
好ましくは、サーファクチンファミリーのメンバーは、サーファクチン、またはその活性誘導体である。一実施形態では、サーファクチンは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有し得る：
【００６１】
【化６】
2021515031.tif 000008
【００６２】
したがって、サーファクチンの活性誘導体は、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、またはＣ１７アイソフォームのいずれかを含み得る。好ましくは、サーファクチンはＣ１６アイソフォームである。サーファクチン、またはその活性誘導体は、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、またはＣ１７アイソフォームであってもよい。最も好ましくは、サーファクチン、またはその活性誘導体は、Ｃ１５アイソフォームである。
【００６３】
一実施形態では、サーファクチンは、式ＩＩＩに示される構造を有し得る：
【００６４】
【化７】
2021515031.tif 000009
【００６５】
実施例に記載されるように、イツリンおよびサーファクチンファミリーのメンバーは、互いに相乗的に作用して、驚くべき抗菌活性を生み出す。したがって、好ましくは、組成物は、イツリンファミリーのメンバー、またはその活性誘導体、およびサーファクチンファミリーのメンバー、またはその活性誘導体を含む。好ましくは、イツリンファミリーのメンバー、またはその活性誘導体、およびサーファクチンファミリーのメンバー、またはその活性誘導体は、１：１０〜１０：１、より好ましくは１：５〜５：１、さらにより好ましくは１：３〜３：１、より好ましくは１：２〜２：１の比、最も好ましくは約１：１の比で使用される。
【００６６】
第３の態様の抗生物質組成物、あるいは第１の態様の、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓおよび／またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの生存もしくは死滅芽胞、または生存もしくは死滅栄養細胞、または生存細胞によって産生される細胞外物質、または破壊細胞ホモジネートによって示される抗菌活性に寄与する抗生物質組成物、あるいは第２の態様の製剤は、イツリンＡのＣ１５アイソフォームおよびサーファクチンのＣ１５アイソフォームを含むことが特に好ましい。
【００６７】
実施例および上記に記載されるように、本発明者らは、バイオサーファクタント（リポペプチド）および抗生物質を含む組成物について驚くべき相乗効果を実証した。本発明者らはまた、抗生物質組成物中の糖脂質等の別のバイオサーファクタントの存在が特に有利であり得ると考える。
【００６８】
したがって、好ましい実施形態では、第３の態様の抗生物質組成物は、糖脂質をさらに含む。好ましくは、糖脂質は、ラムノリピッド(Rhamnolipid)もしくはその活性誘導体、および／またはソホロリピッド(Sophorolipid)もしくはその活性誘導体である。
【００６９】
好ましくは、糖脂質はラムノリピッドである。ラムノリピッドは、モノラムノリピッド(Mono Rhamnolipid)またはジラムノリピッド(Di Rhamnolipid)であり得る。
【００７０】
好ましくは、ラムノリピッドは、Ｃ８、Ｃ８：２、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１２：２、Ｃ１４またはＣ１４：２アイソフォームである。
【００７１】
好ましくは、ラムノリピッドはＣ１２アイソフォームである。
【００７２】
一実施形態では、ラムノリピッドは、式ＶＩＩＩに示される一般式を有する：
【００７３】
【化８】
2021515031.tif 000010
【００７４】
式中、Ｒ１、Ｒ２およびｎ１は、各アイソフォームについて以下の表に示す通りである：
【００７５】
【表１】
2021515031.tif 000011
【００７６】
一実施形態では、ソホロリピッドは、式ＩＸに示される一般式を有する：
【００７７】
【化９】
2021515031.tif 000012
【００７８】
上記および実施例に記載されるように、本発明者らは、リポペプチドと糖脂質との組み合わせを含む組成物が溶菌性であることを示した。
【００７９】
本発明者らはまた、驚くべきことに、本発明の組成物が抗生物質因子と組み合わせて使用されると相乗効果をもたらし、その結果、ポリケチド(polyketide)等の細菌細胞の成長および増殖を単に停止することによって作用する通常は静菌性である因子が、本発明の抗生物質組成物中に存在する場合は殺菌活性を示すことも示した。当業者は、殺菌性という用語が、存在する全ての細菌を死滅させることができる、最も好ましい組成物を指すことを理解するであろう。
【００８０】
いずれか特定の理論に拘束されることはないが、本発明者らは、リポペプチドが、好ましくは糖脂質と一緒になって、抗生物質等の他の分子を組み込んでまたは吸収して、相乗的な抗菌効果を有する混合ミセルを生成すると考える。そのため、別々に静菌性または溶菌性である組成物は、組み合わせて使用されると改善された殺菌特性を有する。
【００８１】
好ましくは、抗生物質は、クロロテタインまたはポリケチド、バシリシン(Bacilysin)、ホスラクトマイシン(Phoslactomycin)またはそれらの活性誘導体である。
【００８２】
好ましくは、抗生物質は、クロロテタインまたはポリケチドである。最も好ましくは、抗生物質はクロロテタインである。
【００８３】
一実施形態では、抗生物質はクロロテタインではない。
【００８４】
当業者は、クロロテタイン（Ｃｈｌｏｒｏｔｅｔａｉｎｅ）がクロロテタイン（Ｃｈｌｏｒｏｔｅｔａｉｎ）と称されてもよいことを理解するであろう。
【００８５】
一実施形態では、クロロテタインは、式ＸＩＩに示される構造を有する：
【００８６】
【化１０】
2021515031.tif 000013
【００８７】
したがって、好ましい実施形態では、第３の態様の抗生物質組成物は、リポペプチドおよびクロロテタインを含む。
【００８８】
好ましくは、第３の態様の抗生物質組成物は、サーファクチンファミリーのメンバーおよびクロロテタインを含む。
【００８９】
一実施形態では、抗生物質はポリケチドである。ポリケチドは、アミクマシン(Amicoumacin)、ジフィシジン(Difficidin)、オキシジフィシジン(Oxydifficidin)およびサリニピロンＡ(Salinipyrone A)またはこれらのポリケチドのいずれか１つの活性誘導体からなる群から選択され得る。好ましくは、ポリケチドは、ジフィシジン、オキシジフィシジンおよびアミクマシンからなる群から選択される。
【００９０】
アミクマシンは、アミクマシンＡ、ＢまたはＣであってもよい。一実施形態では、アミクマシンは、式Ｘに示される構造を有する：
【００９１】
【化１１】
2021515031.tif 000014
【００９２】
好ましくは、ポリケチドは、ジフィシジンまたはオキシジフィシジンである。
【００９３】
一実施形態では、ジフィシジンまたはオキシジフィシジンは、式ＸＩに示される構造を有する：
【００９４】
【化１２】
2021515031.tif 000015
【００９５】
したがって、好ましい実施形態では、第３の態様の抗生物質組成物は、サーファクチンファミリーのメンバー、およびジフィシジンまたはオキシジフィシジンを含む。
【００９６】
別の実施形態では、第３の態様の抗生物質組成物は、サーファクチンファミリーのメンバー、およびジフィシジンまたはオキシジフィシジンを含む。
【００９７】
抗生物質組成物は、フェンギシンファミリーのメンバーを含み得る。一実施形態では、フェンギシンファミリーのメンバーの一般式は、以下の式ＩＶに示すことができ、式中、Ｒ１〜Ｒ３は任意のアミノ酸であり、好ましくは、Ｒ１はＬまたはＤ  Ｔｙｒであり、Ｒ２はＡｌａまたはＶａｌであり、Ｒ３はＬまたはＤ  Ｔｙｒである：
【００９８】
【化１３】
2021515031.tif 000016
【００９９】
フェンギシンファミリーのメンバーは、フェンギシンＡ［配列番号１３］、フェンギシンＢ［配列番号１４］、プリパスタチンＡ(Plipastatin A)［配列番号１５］およびプリパスタチンＢ(Plipastatin B)［配列番号１６］からなる群から選択され得る。
【０１００】
【化１４】
2021515031.tif 000017
【０１０１】
好ましくは、フェンギシンファミリーのメンバーは、フェンギシンＡ、またはその活性誘導体を含む。フェンギシンＡ、またはその活性誘導体は、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７またはＣ１８アイソフォームであり得る。最も好ましくは、フェンギシンＡは、Ｃ１５フェンギシンＡアイソフォームである。フェンギシンＡ、またはその活性誘導体は、アセチル化され得る。
【０１０２】
一実施形態では、フェンギシンＡは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有し得る：
【０１０３】
【化１５】
2021515031.tif 000018
【０１０４】
好ましくは、フェンギシンファミリーのメンバーは、フェンギシンＢ、またはその活性誘導体を含む。フェンギシンＢ、またはその活性誘導体は、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５またはＣ１６アイソフォームであり得る。最も好ましくは、フェンギシンＢはＣ１５フェンギシンＢアイソフォームである。フェンギシンＢ、またはその活性誘導体は、アセチル化され得る。
【０１０５】
一実施形態では、フェンギシンＢは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有し得る：
【０１０６】
【化１６】
2021515031.tif 000019
【０１０７】
好ましくは、本発明による抗生物質組成物は、マイコスブチリン(Mycosubtilin)；モジャベンシンＡ(Mojavensin A)；およびクルスタキン(Kurstakin)からなる群から選択されるさらなるリポペプチド、またはこれらのリポペプチドのいずれかの活性誘導体を含む。
【０１０８】
マイコスブチリン、またはその活性誘導体は、Ｃ１７アイソフォームであり得る。一実施形態では、マイコスブチリンは、式Ｖに示される構造を有し得る：
【０１０９】
【化１７】
2021515031.tif 000020
【０１１０】
モジャベンシンＡ、またはその活性誘導体は、Ｃ１６アイソフォームであり得る。一実施形態では、モジャベンシンＡは、式ＶＩに示される構造を有し得る：
【０１１１】
【化１８】
2021515031.tif 000021
【０１１２】
クルスタキン、またはその活性誘導体は、Ｃ１３アイソフォームであり得る。好ましくは、クルスタキンは、Ｃ１５クルスタキンアイソフォームである。一実施形態では、クルスタキンは、式ＶＩＩに示される構造を有し得る：
【０１１３】
【化１９】
2021515031.tif 000022
【０１１４】
好ましくは、リポペプチドはフェンギシンＡであり、好ましい実施形態では、抗生物質組成物はリポペプチドであるイツリンＡ、サーファクチンおよびフェンギシンＡを含む。
【０１１５】
好ましくは、抗生物質組成物は、リポペプチドであるイツリンＡおよびサーファクチン、ならびにフェンギシンＡ；フェンギシンＢ；マイコスブチリン；モジャベンシンＡ；およびクルスタキンからなる群から選択される少なくとも２つのさらなるリポペプチド、またはこれらのリポペプチドのいずれかの活性誘導体を含む。
【０１１６】
好ましくは、抗生物質組成物は、リポペプチドであるイツリンＡおよびサーファクチン、ならびにフェンギシンＡ；フェンギシンＢ；マイコスブチリン；モジャベンシンＡ；およびクルスタキンからなる群から選択される少なくとも３つのさらなるリポペプチド、またはこれらのリポペプチドのいずれかの活性誘導体を含む。
【０１１７】
好ましくは、抗生物質組成物は、リポペプチドであるイツリンＡおよびサーファクチン、ならびフェンギシンＡ；フェンギシンＢ；マイコスブチリン；モジャベンシンＡ；およびクルスタキンからなる群から選択される少なくとも４つのさらなるリポペプチド、またはこれらのリポペプチドのいずれかの活性誘導体を含む。
【０１１８】
しかしながら、最も好ましい実施形態では、抗生物質組成物は、リポペプチドであるイツリンＡ、サーファクチン、フェンギシンＡ、フェンギシンＢ、マイコスブチリン、モジャベンシンＡおよびクルスタキン、またはそれらの活性誘導体を含む。実施例に記載されるように、これらの化合物の間には驚くべき相乗効果が存在する。実際、これまでに合計１５のリポペプチドが同定されており、抗菌活性は個々の和より大きい。
【０１１９】
好ましくは、抗生物質組成物は、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、または６０ｋＤａより大きい分子量を有する複合体を形成する。より好ましくは、抗生物質組成物は、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、または１００ｋＤａを超える分子量を有する複合体を形成する。
【０１２０】
本発明者らは、驚くべきことに、抗菌活性が水溶性であることを見出した。ほとんどのリポペプチド（サーファクチン等）は水溶性ではないが、本発明者らは、界面活性剤（例えば、サーファクチン、イツリン、および／またはフェンギシン等）と糖脂質（例えば、ラムノリピッド）の組み合わせが、抗菌活性を水溶性にし、より具体的にはリポペプチドを水溶性にするという仮説を立てた。本発明者らは、組み合わせた場合、活性抗生物質組成物のこの高分子量複合体が個々のモノマーのそれよりも高く、それによってミセルが好ましく形成されることが示唆されることを示した（図２０を参照）。有利には、これらのミセルは細胞溶解を促進するように作用する。
【０１２１】
したがって、好ましくは、抗生物質組成物はミセルを形成する。ミセルの平均直径は、１ｎｍ〜５００ｎｍ、１ｎｍ〜３００ｎｍ、１ｎｍ〜２００ｎｍ、１ｎｍ〜１６０ｎｍ、１ｎｍ〜１００ｎｍ、１ｎｍ〜５０ｎｍ、１ｎｍ〜１５ｎｍ、２ｎｍ〜５００ｎｍ、２ｎｍ〜３００ｎｍ、２ｎｍ〜２００ｎｍ、２ｎｍ〜１６０ｎｍ、２ｎｍ〜１００ｎｍ、２ｎｍ〜５０ｎｍ、２ｎｍ〜１５ｎｍ、３ｎｍ〜５００ｎｍ、３ｎｍ〜３００ｎｍ、３ｎｍ〜２００ｎｍ、３ｎｍ〜１６０ｎｍ、３ｎｍ〜１００ｎｍ、３ｎｍ〜５０ｎｍ、３ｎｍ〜１５ｎｍ、５ｎｍ〜５００ｎｍ、５ｎｍ〜３００ｎｍ、５ｎｍ〜２００ｎｍ、５ｎｍ〜１６０ｎｍ、５ｎｍ〜１００ｎｍ、５ｎｍ〜５０ｎｍ、または５ｎｍ〜１５ｎｍ、１０ｎｍ〜５００ｎｍ、１０ｎｍ〜３００ｎｍ、１０ｎｍ〜２００ｎｍ、１０ｎｍ〜１６０ｎｍ、１０ｎｍ〜１００ｎｍ、１０ｎｍ〜５０ｎｍ、または１０ｎｍ〜１５ｎｍであってもよい。好ましくは、ミセルの平均直径は３ｎｍ〜１６０ｎｍ、最も好ましくは３ｎｍ〜１５ｎｍである。
【０１２２】
有利には、これらのミセルは、ナノ構造に凝集し、より安定であり、分解に対して耐性があり、高い溶解性を有し、モノマー形態よりも高い抗菌活性を保持することが示されている。本発明者らは、これらのミセルが、栄養細胞粘液を包む豊富な菌体外多糖(exopolysaccharide)（ＥＰＳ）中で安定化または封入されると考える。本明細書に記載される「活性」株は、大量のバイオフィルムおよびムコイドコロニーを産生するが、どちらの属性も大量の細胞外多糖の産生を必要とする。
【０１２３】
本明細書に記載される抗菌組成物の抗菌活性は、組成物を産生するＢａｃｉｌｌｕｓ株の細胞エンベロープに関連すると考えられる。好ましくは、抗生物質組成物は、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓおよび／またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの細胞表面に付着し、細菌、好ましくはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを死滅させる。好ましくは、抗生物質組成物は、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓおよび／またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの細胞壁、細胞壁外皮またはそれらの粘液と結合または連結する。例えば、抗生物質組成物は外膜小胞に付着し得る。例えば、グラム陽性菌に対抗する場合、細胞エンベロープはリポテイコ酸が豊富なペプチドグリカンの厚い層である。グラム陽性菌は大量の粘液を産生することが知られており、最外層に結合した菌体外多糖（ＥＰＳ）およびポリグルタミン酸の可能性を有すると考えられる。したがって、本発明者らは、いかなる仮説にも拘束されることを望むものではないが、外層のＥＰＳは、活性抗菌分子が埋め込まれる「接着剤」として機能すると考える。さらに、本発明者らは、このＥＰＳ物質が細胞壁から解離し得るという、無細胞物質（すなわち、上清）で活性が検出される理由を説明し得る仮説を立てた。加えて、いくつかのＢａｃｉｌｌｕｓ種は、ペプチドグリカンの上にあるＳ層を形成することができ、それらは本質的に結晶性である自己組織化層である。そのため、本発明者らは、いくつかのＢａｃｉｌｌｕｓ株、例えば、Ｓｉｄｈｕ＆Ｏｌｓｅｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４３：１０３９−１０５２に記載されるようにＢ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓがＳ層を有するため、これらの株がＳ層を有すると考える。
【０１２４】
したがって、好ましくは、本発明の抗生物質組成物は、菌体外多糖をさらに含む。例えば、適切な菌体外多糖は、ガラクトース、フルクトースまたはグルコースであり得る単糖を含み得る。菌体外多糖はまた、アラビノースを含み得る。これらのモノマーの各々は、試験した試料中で検出可能であった。
【０１２５】
好ましくは、抗生物質組成物は、実質的に非タンパク質性である（ただし、リポペプチドが存在することを理解されたい）。
【０１２６】
好ましくは、抗生物質組成物は、γ−ポリグルタミン酸を含む。本発明者らは、好ましい株であるＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ(B. amyloliquefaciens)のＳＧ２７７およびＳＧ２９７のゲノム配列が両方とも、γ−ポリグルタミン酸の生合成に関与する遺伝子を有することを確認した。
【０１２７】
したがって、総合すると、本発明の抗生物質組成物は、好ましくは、細胞表面粘液に由来する菌体外多糖とγ−ＰＧＡとの組み合わせを有する、高分子量かつ非タンパク質性の複合体を含む。
【０１２８】
本発明による抗生物質組成物および製剤は、細菌感染症、最も好ましくはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ(C. difficile)等のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属(Clostridium spp.)感染症を治療、改善または予防するための単剤療法（すなわち、（ｉ）Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ(B. amyloliquefaciens)および／またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ(B. subtilis)の生存もしくは死滅芽胞、または栄養細胞(vegetative cell)、または前記細胞によって産生される細胞外物質、または破壊細胞ホモジネート、あるいは（ｉｉ）本発明の抗生物質組成物の単独使用）において使用され得ることを理解されたい。代替的に、そのような本発明による抗生物質組成物および製剤は、細菌感染症、例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属(Clostridium spp.)またはＢａｃｉｌｌｕｓ属(Bacillus spp.)感染症を治療、改善、または予防するための既知の治療法の補助剤として、またはそれと組み合わせて使用することができる。例えば、薬剤は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属(Clostridium spp.)感染を治療するための既知の薬剤と組み合わせて使用されてもよい。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ(C. difficile)に使用される抗生物質は、クリンダマイシン、バンコマイシン、およびメトロジナゾールを含む。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ(C. difficile)に使用されるプロバイオティクスは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ属(Lactobacilli spp.)、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属(Saccharomyces spp.)、およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ属(Bifidobacteria spp.)を含む。
【０１２９】
本発明による抗生物質組成物および製剤は、特に組成物が使用される様式に応じて、数多くの異なる形態を有する組成物に組み合わせることができる。したがって、例えば、組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液剤、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液、または治療を必要とするヒトもしくは動物に投与され得る任意の他の適切な形態であり得る。本発明による薬物のビヒクルは、それが与えられる対象によって良好な忍容性が示されるものであるべきことを理解されたい。
【０１３０】
本発明の抗生物質組成物および製剤は、多数の方法で使用され得る。例えば、経口投与が必要とされる場合があり、その場合、薬剤は、例えば、錠剤、カプセルまたは液剤の形態で経口的に摂取され得る組成物内に含まれてもよく、それは食物または飲料中に存在する組成物の送達を含み得る。本発明の抗生物質組成物および製剤は、吸入により（例えば、鼻腔内に）投与され得る。組成物はまた、局所的使用のために製剤化されてもよい。例えば、クリームまたは軟膏が皮膚に塗布され得る。代替的に、舌下投与によって組成物を送達してもよい。
【０１３１】
本発明による抗生物質組成物および製剤はまた、徐放性または遅延放出デバイスに組み込まれてもよい。そのようなデバイスは、例えば、皮膚の上または下に挿入され得、薬物が数週間またはさらには数ヶ月にわたって放出され得る。デバイスは、治療部位に少なくとも隣接して配置され得る。そのようなデバイスは、本発明に従って使用される薬剤による長期治療が必要とされ、通常頻繁な投与（例えば、少なくとも毎日の投与）を必要とする場合に、特に有利であり得る。
【０１３２】
好ましい実施形態では、本発明による抗生物質組成物および製剤は、血流中に注射によって対象に投与され得るか、または治療を必要とする部位に直接投与され得る。注射は、静脈内（ボーラスもしくは注入）、または皮下（ボーラスもしくは注入）、または皮内（ボーラスもしくは注入）であり得る。
【０１３３】
必要とされる抗生物質組成物および製剤の量は、その生物学的活性および生物学的利用能によって決定され、それらは投与方法、抗生物質組成物および製剤の生理化学的特性、ならびにそれが単独療法としてまたは併用療法において使用されるかどうかに応じて決定されることを理解されたい。投与頻度は、治療される対象における抗生物質組成物および製剤の半減期によっても影響を受ける。投与される最適投与量は、当業者によって決定されてもよく、使用される特定の抗生物質組成物および製剤、薬学的組成物の強度、投与方法、ならびに細菌感染症の進行によって変化する。対象の年齢、体重、性別、食事、および投与期間を含む、治療される特定の対象に応じた付加的要因によって、投与量を修正する必要が生じるであろう。
【０１３４】
一般に、どの抗生物質組成物または製剤が使用されるかに応じて、０．００１μｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の１日用量の本発明による抗生物質組成物または製剤が、細菌感染症を治療、改善、または予防するために使用され得る。より好ましくは、１日用量は、０．０１μｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは約０．１μｇ／ｋｇ体重〜１０μｇ／ｋｇ体重である。
【０１３５】
抗生物質組成物または製剤は、細菌感染症の発症前、発症中または発症後に投与することができる。１日用量は、単回投与（例えば、１日１回の注射、または経口投与）として与えられてもよい。代替的に、抗生物質組成物または製剤は、１日に２回以上の投与を必要とし得る。一例として、抗生物質組成物または製剤は、２回（または治療される細菌感染症の重症度に応じてそれ以上）の０．０７μｇ〜７００ｍｇの１日用量（すなわち、体重が７０ｋｇと仮定して）として投与されてもよい。治療を受けている患者は、起床時に最初の用量を服用し、次に夕方に（２回投与計画の場合）またはその後３〜４時間間隔に２回目の用量を服用することができる。代替的に、徐放性デバイスを使用して、反復用量を投与する必要なく、本発明による抗生物質組成物または製剤の最適用量を患者に提供することができる。
【０１３６】
患者は入院して抗生物質を服用しているときにＣＤＩに罹患する傾向があることを理解されたい。したがって、本発明の抗生物質組成物または製剤は、入院前に（例えば、店頭で処方されたように）、次いで入院中、および退院後数日間または数週間投与されることが好ましい。したがって、抗生物質組成物または製剤を使用して、細菌感染症の再発を防止することができる。
【０１３７】
製薬業界で慣用されているもの（例えば、インビボ実験、臨床試験等）等の既知の手順を用いて、本発明による抗生物質組成物の特定の製剤および正確な治療計画（例えば、抗生物質組成物または製剤の１日用量および投与頻度等）を作成することができる。
【０１３８】
本発明はまた、第９の態様において、第２の態様による製剤を作製するプロセスを提供し、該プロセスは、治療有効量の１つ以上のＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株(B. amyloliquefaciens strains)および／または１つ以上のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ株(Bacillus subtilis strains)の生存もしくは死滅芽胞、または生存もしくは死滅栄養細胞、または前記細胞によって産生される細胞外物質、または破壊細胞ホモジネートと、薬学的に許容されるビヒクルまたは担体とを組み合わせることを含む。
【０１３９】
好ましくは、使用されるＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株(B. amyloliquefaciens strain)は、ＳＧ１８、ＳＧ５７、ＳＧ１３７、ＳＧ１３６、ＳＧ１８５、ＳＧ２７７およびＳＧ２９７からなる群から選択される。最も好ましくは、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株(B. amyloliquefaciens strain)はＳＧ２７７またはＳＧ２９７である。好ましくは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株(B. subtilis strain)は、ＳＧ１７、ＳＧ８３およびＳＧ１４０からなる群から選択される。
【０１４０】
好ましくは、製剤は、（ｉ）抗生物質、ならびに（ｉｉ）サーファクチンファミリーのメンバー、イツリンファミリーのメンバー、およびフェンギシンファミリーのメンバーまたはこれらのリポペプチドのいずれかの活性誘導体を含む。好ましくは、製剤は、糖脂質をさらに含む。好ましくは、製剤は、サーファクチンファミリーのメンバーおよびクロロテタインを含む。より好ましくは、製剤は、サーファクチンファミリーのメンバー；ラムノリピッドおよび／またはソホロリピッド；ならびにクロロテタインを含む。
【０１４１】
好ましくは、製剤は、抗生物質；イツリン（好ましくはイツリンＡ）；サーファクチン；ならびにフェンギシンＡ、フェンギシンＢ、マイコスブチリン、モジャベンシンＡ、およびクルスタキンからなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つのさらなるリポペプチド、またはこれらのリポペプチドのいずれかの活性誘導体を含む。最も好ましくは、製剤は、抗生物質；イツリンＡ；サーファクチン；フェンギシンＡ；フェンギシンＢ；マイコスブチリン；モジャベンシンＡ；およびクルスタキン、またはこれらのリポペプチドのいずれかの活性誘導体を含む。
【０１４２】
「対象」は、脊椎動物、哺乳動物、または家畜であり得る。したがって、本発明による薬物は、任意の哺乳動物、例えば家畜（例えばウマ）、ペットを治療するために使用されてもよい、または他の獣医学的用途に使用されてもよい。最も好ましくは、対象は、ヒトである。
【０１４３】
１つ以上のＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株および／または１つ以上のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株の生存もしくは死滅芽胞、または生存もしくは死滅栄養細胞、または生存細胞によって産生される細胞外物質の「治療有効量」は、対象に投与されたときに感染を治療するまたは所望の効果をもたらすのに必要な薬物の任意の量である。
【０１４４】
例えば、治療有効量は、約０．００１μｇ〜約１ｍｇ、好ましくは約０．０１μｇ〜約１００μｇであり得る。薬剤の量は、約０．１μｇ〜約１０μｇであることが好ましく、最も好ましくは約０．５μｇ〜約５μｇである。
【０１４５】
本明細書で言及される「薬学的に許容されるビヒクル」は、薬学的組成物を製剤化するのに有用であることが当業者に知られている、任意の既知の化合物または既知の化合物の組み合わせである。
【０１４６】
一実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルは固体であってもよく、組成物は散剤または錠剤の形態であってもよい。固体の薬学的に許容されるビヒクルは、香味剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁剤、染料、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤、不活性結合剤、甘味剤、防腐剤、染料、コーティング剤、または錠剤崩壊剤としても作用し得る、１つ以上の物質を含み得る。ビヒクルはまた、封入材料であってもよい。散剤において、ビヒクルは、本発明による微粉化された活性物質と混合された微粉化固体である。錠剤において、活性物質を、必要な圧縮特性を有するビヒクルと適切な割合で混合し、所望の形状およびサイズに圧縮することができる。散剤および錠剤は、好ましくは、最大９９％の活性物質を含有する。適切な固体ビヒクルとして、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックス、およびイオン交換樹脂が挙げられる。別の実施形態では、薬学的ビヒクルはゲルであってもよく、組成物はクリーム等の形態であってよい。
【０１４７】
しかしながら、薬学的ビヒクルは液体であってもよく、薬学的組成物は溶液の形態である。液体ビヒクルは、溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、および加圧組成物を調製するのに使用される。本発明による活性物質は、水、有機溶媒、それら両方の混合物、または薬学的に許容される油もしくは脂肪等の薬学的に許容される液体ビヒクル中に溶解または懸濁することができる。液体ビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、甘味剤、香味剤、懸濁剤、増粘剤、着色剤、粘度調整剤、安定剤、または浸透圧調整剤などの他の適切な薬学的添加剤を含有することができる。経口および非経口投与のための液体ビヒクルの適切な例として、水（上記の添加剤、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を部分的に含有する）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコールを含む）、およびそれらの誘導体、ならびに油（例えば分別ヤシ油およびラッカセイ油）が挙げられる。非経口投与の場合、ビヒクルは、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピル等の油性エステルであってもよい。滅菌液体ビヒクルは、非経口投与用の滅菌液体形態の組成物において有用である。加圧組成物用の液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される噴霧剤であり得る。
【０１４８】
滅菌溶液または懸濁剤である液体の薬学的組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内、および特に皮下注射によって用いられる。薬剤は、滅菌水、食塩水、または他の適切な滅菌注射用媒体を使用して投与時に溶解または懸濁することができる滅菌固体組成物として調製することができる。
【０１４９】
本発明の薬剤および組成物は、他の溶質または懸濁剤（例えば、溶液を等張にするのに十分な食塩水もしくはグルコース）、胆汁酸塩、アカシア、ゼラチン、ソルビタンモノレート、ポリソルベート８０（ソルビトールのオレイン酸エステルおよびエチレンオキシドと共重合したその無水物）等を含有する、滅菌溶液もしくは懸濁液の形態で経口投与され得る。本発明に従って使用される薬剤はまた、液体または固体いずれかの組成物の形態で経口投与されてもよい。経口投与に適した組成物は、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、および散剤等の固体形態、ならびに液剤、シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁剤等の液体形態を含む。非経口投与に有用な形態は、滅菌溶液、乳剤、および懸濁剤を含む。
【０１５０】
本発明の薬剤および組成物は、例えば、徐放性フィルム、ウエハまたはカプレットの形態で舌下投与され得る。
【０１５１】
今日まで、科学界は、抗菌活性を同定するために、好気性菌ではなく嫌気性菌に焦点を当てていた。界面活性剤分子は、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）より高い濃度でミセルを形成することが知られている。さらに、酸沈殿および限外濾過は、ＣＭＣ界面活性剤が精製され得るよりも高い濃度で嫌気性菌から抗菌バイオサーファクタントを精製および濃縮するために現在使用されている。実施例に記載されるように、本発明者らは、抗菌活性の同定のために他の病原体（ヒトまたは動物）に使用することができる新しい方法を開発した。本発明者らは、硫酸アンモニウムを使用して抗菌複合体を含む高分子量画分を沈殿させることにより、抗菌活性を示す好気性細菌を同定することが可能であることを示した。本発明者らは、例えば、限外濾過を使用する従来技術の方法では、高分子量抗菌化合物を単離することができないと考える。
【０１５２】
したがって、本発明の第１０の態様では、抗菌活性を示す好気性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属を同定するための方法が提供され、該方法は、
（ｉ）好気性芽胞形成細菌を単離することと、
（ｉｉ）単離した好気性芽胞形成細菌を培地で好気的に培養することと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の培養培地から好気性細菌を継代培養することと、
（ｉｖ）抗菌活性を示す好気性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属を同定するために、ステップ（ｉｉｉ）からの継代培養培地を使用して細菌細胞増殖の阻害についてのアッセイを行うことと、を含む。
【０１５３】
好ましくは、ステップ（ｉ）は、糞便、最も好ましくは均質化された糞便から好気性芽胞形成細菌を単離することを含む。例えば、これは寒天プレートに播種し、約３０〜４２℃程度で約１〜４日間インキュベートすることによって達成することができる。
【０１５４】
好ましくは、ステップ（ｉｉ）は、単離された細菌のコロニーを（好ましくは液体富栄養培地で）、約６〜２４時間（好ましくは振盪しながら、例えば、約３０〜４２℃で）好気的に培養することを含む。
【０１５５】
好ましくは、ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉｉ）からの培養物を（好ましくは液体富栄養培地で）約１２〜３６時間（好ましくは振盪しながら、好ましくは約３０〜４２℃で）好気的に継代培養することを含む。
【０１５６】
好ましくは、該方法は、ステップ（ｉｖ）を行う前に、ステップ（ｉｉｉ）の培養物から上清を得るステップを含む。好ましくは、このステップは、遠心分離によって増殖培地から細胞を除去して上清を得ることを含む。例えば、遠心分離は、少なくとも８０００×ｇで少なくとも１０分間行うことができる。上清は、例えば、０．４５μｍのメンブレン等の適切な濾過メンブレンを通して滅菌濾過することができる。
【０１５７】
ステップ（ｉｖ）は、ステップ（ｉｉｉ）からの継代培養培地が細菌細胞増殖を阻害するかどうかを決定するのに有用な任意の既知のアッセイを含み得る。
【０１５８】
好ましくは、細菌細胞増殖の阻害をアッセイするステップに続いて、該方法は、抗菌組成物を含む高分子量画分を沈殿させるために培養物を処理する最終ステップを含む。
【０１５９】
一実施形態では、この最終ステップは、生培養物または上清のいずれかをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはエタノール、またはエタノール−水の組み合わせと接触させて、抗菌組成物を含む高分子量画分を沈殿させることを含み得る。しかしながら、好ましい実施形態では、この最後のステップは、生培養物または上清のいずれかをＡｍＳＯ４と接触させることを含む。好ましくは、５〜５０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは１０〜３０％（ｖ／ｖ）、さらにより好ましくは１５〜２５％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは１８〜２３％（ｖ／ｖ）のＡｍＳＯ４の最終濃度が用いられる。
【０１６０】
本発明者らは、抗菌組成物を沈殿させること自体が本発明の重要な態様であり、抗菌活性の単離を可能にするものであると考える。
【０１６１】
したがって、本発明の第１０の態様では、抗菌活性を示す好気性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属から抗菌組成物を単離するための方法が提供され、該方法は、
（ｉ）増殖培地でＢａｃｉｌｌｕｓ属細胞を好気的に培養することと、
（ｉｉ）抗菌組成物を含む高分子量画分を沈殿させるためにステップ（ｉ）の培養物を処理することと、を含む。
【０１６２】
一実施形態では、第１０の態様の方法は、適切な細菌学的アッセイを用いて、ステップ（ｉｉ）で沈殿させた高分子量画分を細菌に対する抗菌活性について試験することを含む。しかしながら、好ましくは、第１０の態様の方法は、第１０の態様の方法の後に行われる（すなわち、有用な抗菌性株が同定された後の活性抗菌化合物の単離）。
【０１６３】
好ましくは、第１０および第１１の態様の方法は、ヒトおよび動物において、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属等の腸内病原菌に対して抗菌活性を有する好気性Ｂａｃｉｌｌｕｓ菌から抗菌活性を同定および単離するために使用される。
【０１６４】
好ましくは、第１０の態様の方法のステップ（ｉ）は、ＢＨＩＢブロス等の適切な増殖培地で好気性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細胞を培養することを含む。好ましくは、細胞は、約３７℃で一晩培養される。
【０１６５】
一実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、生培養物または上清のいずれかをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはエタノール、またはエタノール−水の組み合わせと接触させて、抗菌組成物を含む高分子量画分を沈殿させることを含み得る。しかしながら、好ましい実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、生培養物または上清のいずれかをＡｍＳＯ４と接触させることを含む。好ましくは、５〜５０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは１０〜３０％（ｖ／ｖ）、さらにより好ましくは１５〜２５％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは１８〜２３％（ｖ／ｖ）のＡｍＳＯ４の最終濃度が用いられる。
【０１６６】
第１０および第１１の態様の方法で沈殿させられる高分子量画分は、少なくとも１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、または６０ｋＤａの分子量を有し得る。より好ましくは、沈殿させられる高分子量画分は、少なくとも７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、または１００ｋＤａの分子量を有する。さらにより好ましくは、沈殿させられる高分子量画分は、少なくとも１５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、１５０ｋＤａ、または３００ｋＤａの分子量を有する。
【０１６７】
第１０および第１１の態様の方法は、好ましくは、
抗菌組成物の沈殿物を、好ましくは遠心分離によって得ることを含む。
【０１６８】
例えば、遠心分離は、少なくとも８０００×ｇで少なくとも１５分間行うことができる。
【０１６９】
好ましくは、方法は、
好ましくはＰＢＳ等の適切な緩衝液に抗菌組成物の沈殿物を再懸濁することを含む。
【０１７０】
好ましくは、方法は、
例えば透析を用いて、過剰な硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、エタノール、またはエタノールと水の組み合わせを除去し、好ましくはＰＢＳ等の適切な緩衝液に抗菌組成物を再懸濁することを含む。
【０１７１】
好ましくは、方法は、
クロマトグラフィー、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、より好ましくは変性条件下で、抗菌組成物を分画することを含む。
【０１７２】
本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）に記載される全ての特徴、および／またはそのように開示される任意の方法もしくはプロセスの全てのステップは、そのような特徴および／またはステップの少なくともいくつかが相互に排他的である組み合せを除いて、任意の組み合わせで上記態様のいずれかと組み合わせてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
本発明をよりよく理解するために、また本発明の実施形態がどのように実施され得るかを示すために、例として添付の図面を参照する。
【図１−１】図１Ａは、どのようにマウスの群にクリンダマイシンおよびマウスの消化管から単離したＢａｃｉｌｌｕｓの懸濁液を投与し、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０(C. difficile strain 630)の芽胞でチャレンジし、次いで剖検して盲腸試料を採取したかを示しており；図１Ｂは、盲腸試料において決定された毒素Ａのレベルを示すグラフであり；図１Ｃは、盲腸試料において決定されたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＣＦＵのレベルを示すグラフである。
【図１−２】図１Ａは、どのようにマウスの群にクリンダマイシンおよびマウスの消化管から単離したＢａｃｉｌｌｕｓの懸濁液を投与し、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０(C. difficile strain 630)の芽胞でチャレンジし、次いで剖検して盲腸試料を採取したかを示しており；図１Ｂは、盲腸試料において決定された毒素Ａのレベルを示すグラフであり；図１Ｃは、盲腸試料において決定されたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＣＦＵのレベルを示すグラフである。
【図２−１】図２Ａは、従来のケージ（ＣＣ）または個別換気ケージ（ＩＶＣ）のいずれかに収容されたマウスから採取した糞便試料中で同定された好気性細菌の総数を示すグラフであり；図２Ｂは、同じ糞便試料で同定された耐熱性好気性芽胞数を示すグラフである。
【図２−２】図２Ａは、従来のケージ（ＣＣ）または個別換気ケージ（ＩＶＣ）のいずれかに収容されたマウスから採取した糞便試料中で同定された好気性細菌の総数を示すグラフであり；図２Ｂは、同じ糞便試料で同定された耐熱性好気性芽胞数を示すグラフである。
【図３−１】図３Ａは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのヒト分離株（ＳＧ１７、ＳＧ８３、ＳＧ１４０）およびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ分離株（ＳＧ１８、ＳＧ５７、ＳＧ１３７、ＳＧ１３６、ＳＧ１８５、ＳＧ２４６、ＳＧ２７７、ＳＧ２９７）の一晩培養物からの無細胞上清を濾過滅菌し、微量希釈アッセイに使用して、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０に対する阻害活性のレベルを定量化したことを示す。ｙ軸は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの増殖を阻害するために必要とされる細胞外物質のＣ．希釈液の増殖を阻害するために必要とされる細胞外物質の最大希釈度を示す。ＳＧ３７８は、活性を有しないＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株であり、陰性対照として機能し；図３Ｂは、共培養アッセイを示す。ＳＧ２７７の無細胞の無菌濾液を、ＣＤ６３０の指数関数的に増殖する培養物（ＯＤ６００＝約０．５）に加えた。添加時間は矢印で示される。増殖を継続させ、ＯＤ６００および生菌数（ＣＦＵ／ｇ）を決定した。記号：〇  ＣＤ６３０未処理ＣＦＵ、●  ＣＤ６３０＋ＳＧ２７７濾液、□  ＣＤ６３０  ＯＤ６００、および■  ＣＤ６３０＋ＳＧ２７７濾液ＯＤ６００。
【図３−２】図３Ａは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのヒト分離株（ＳＧ１７、ＳＧ８３、ＳＧ１４０）およびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ分離株（ＳＧ１８、ＳＧ５７、ＳＧ１３７、ＳＧ１３６、ＳＧ１８５、ＳＧ２４６、ＳＧ２７７、ＳＧ２９７）の一晩培養物からの無細胞上清を濾過滅菌し、微量希釈アッセイに使用して、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０に対する阻害活性のレベルを定量化したことを示す。ｙ軸は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの増殖を阻害するために必要とされる細胞外物質のＣ．希釈液の増殖を阻害するために必要とされる細胞外物質の最大希釈度を示す。ＳＧ３７８は、活性を有しないＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株であり、陰性対照として機能し；図３Ｂは、共培養アッセイを示す。ＳＧ２７７の無細胞の無菌濾液を、ＣＤ６３０の指数関数的に増殖する培養物（ＯＤ６００＝約０．５）に加えた。添加時間は矢印で示される。増殖を継続させ、ＯＤ６００および生菌数（ＣＦＵ／ｇ）を決定した。記号：〇  ＣＤ６３０未処理ＣＦＵ、●  ＣＤ６３０＋ＳＧ２７７濾液、□  ＣＤ６３０  ＯＤ６００、および■  ＣＤ６３０＋ＳＧ２７７濾液ＯＤ６００。
【図４−１】図４Ａは、異なる温度／保存条件における凍結乾燥形態のＡｍｙＣｉｄｅ（商標）（ＡｍｙＣｉｄｉｎ（商標））の安定性を示し；図４Ｂは、ＳＧ２７７がＢＨＩＢ培地でどのように増殖したかを示すグラフであり；図４Ｃは、（図４Ｂから）１時間ごとに採取したＳＧ２７７の試料について微量希釈アッセイを用いて決定したＣＤ６３０に対する活性がどのように変化したかを示すグラフである。阻害活性の増加は、アッセイにおけるより高い希釈係数と相関している。定常期における活性の合成は、抗生物質としての活性を定義する。
【図４−２】図４Ａは、異なる温度／保存条件における凍結乾燥形態のＡｍｙＣｉｄｅ（商標）（ＡｍｙＣｉｄｉｎ（商標））の安定性を示し；図４Ｂは、ＳＧ２７７がＢＨＩＢ培地でどのように増殖したかを示すグラフであり；図４Ｃは、（図４Ｂから）１時間ごとに採取したＳＧ２７７の試料について微量希釈アッセイを用いて決定したＣＤ６３０に対する活性がどのように変化したかを示すグラフである。阻害活性の増加は、アッセイにおけるより高い希釈係数と相関している。定常期における活性の合成は、抗生物質としての活性を定義する。
【図５】図５Ａは、ＣＤ６３０菌叢を含む寒天プレートを示し；図５Ｂは、ＣＤ６３０溶解菌叢を含むプレートを示す。
【図６−１】図６Ａは、図１Ａに示されるスケジュールを用いた異なる予防的治療薬を５回（胃内（ｉ．ｇ．））投与されたマウスの群（ｎ＝１０）から採取した盲腸試料中に見られたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＣＦＵを示すグラフであり；図６Ｂは、盲腸試料中の毒素Ａレベルを示すグラフであり；図６Ｃは、盲腸試料中の毒素Ｂレベルを示すグラフである。治療薬は次の通りである：細胞上清に懸濁したＳＧ２７７一晩培養物（２７７−ＳＵＰ）；ＰＢＳに懸濁したＳＧ２７７一晩培養物（２７７−ＰＢＳ）；一晩増殖させたＳＧ２７７の無菌無細胞上清（ＳＵＰ）；ＳＧ２７７の精製芽胞（ＳＰＯＲＥＳ）；無菌無細胞上清に懸濁したＳＧ３７８の一晩培養物（３７８）；およびＰＢＳ緩衝液を投与した動物（ｎａｉｖｅ）。
【図６−２】図６Ａは、図１Ａに示されるスケジュールを用いた異なる予防的治療薬を５回（胃内（ｉ．ｇ．））投与されたマウスの群（ｎ＝１０）から採取した盲腸試料中に見られたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＣＦＵを示すグラフであり；図６Ｂは、盲腸試料中の毒素Ａレベルを示すグラフであり；図６Ｃは、盲腸試料中の毒素Ｂレベルを示すグラフである。治療薬は次の通りである：細胞上清に懸濁したＳＧ２７７一晩培養物（２７７−ＳＵＰ）；ＰＢＳに懸濁したＳＧ２７７一晩培養物（２７７−ＰＢＳ）；一晩増殖させたＳＧ２７７の無菌無細胞上清（ＳＵＰ）；ＳＧ２７７の精製芽胞（ＳＰＯＲＥＳ）；無菌無細胞上清に懸濁したＳＧ３７８の一晩培養物（３７８）；およびＰＢＳ緩衝液を投与した動物（ｎａｉｖｅ）。
【図７−１】図７Ａは、ＣＤ６３０の芽胞１０２個によるチャレンジの前と後に、異なる予防的治療薬を（ｉ．ｇ．）投与されたハムスターの群（ｎ＝６）の生存曲線を示す（方法）。治療薬は、２７７−ＳＵＰ、２７７−ＰＢＳ、ＳＵＰ、ＳＰＯＲＥＳ、３７８、およびｎａｉｖｅであった。ＣＤ６３０チャレンジは、（ｉ．ｇ．）処置の３日後に行われ、その後、動物の症状をモニタリングした。症状を示した動物を剖検した；図７Ｂは、盲腸試料中のＣＤ６３０のＣＦＵレベルを示すグラフであり；図７Ｂは、盲腸試料中のＣＤ６３０のＣＦＵレベルを示すグラフであり；図７Ｃは、盲腸試料中の毒素ＡおよびＢのレベルを示すグラフである。
【図７−２】図７Ａは、ＣＤ６３０の芽胞１０２個によるチャレンジの前と後に、異なる予防的治療薬を（ｉ．ｇ．）投与されたハムスターの群（ｎ＝６）の生存曲線を示す（方法）。治療薬は、２７７−ＳＵＰ、２７７−ＰＢＳ、ＳＵＰ、ＳＰＯＲＥＳ、３７８、およびｎａｉｖｅであった。ＣＤ６３０チャレンジは、（ｉ．ｇ．）処置の３日後に行われ、その後、動物の症状をモニタリングした。症状を示した動物を剖検した；図７Ｂは、盲腸試料中のＣＤ６３０のＣＦＵレベルを示すグラフであり；図７Ｂは、盲腸試料中のＣＤ６３０のＣＦＵレベルを示すグラフであり；図７Ｃは、盲腸試料中の毒素ＡおよびＢのレベルを示すグラフである。
【図８−１】図８Ａは、２０％、７０％カット、または２０％の後に７０％（２Ｘ）を使用したＡｍＳＯ４沈殿を示す。沈殿物を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、クマシーで染色した。白色のゴーストバンド（ＧＢ）が低分子量(dye front)側近くに観察された。ウェル拡散アッセイを用いると、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅおよびバイオサーファクタント活性に対して２０％カットのみが活性を有していた；図８Ｂは、クマシーブルー（ＣＢ）、アルシアンブルー（ＡＢ）、オイルレッド（ＯＲ）で染色されたＡｍＳＯ４沈殿および非染色のＡｍＳＯ４沈殿（ＵＳ）を示す；ゴーストバンドが矢印で示されている。図８Ｃは、水に可溶化し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲル濾過カラムに流したＡｍＳＯ４（２０％）沈殿のタンパク質濃度および活性（１／希釈係数）を示すグラフであり；図８Ｄは、３つのバンド（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３）が観察された、ＳＧ２７７無菌濾液画分のＰＥＧ沈殿のＣｓＣｌ勾配遠心分離を示す。
【図８−２】図８Ａは、２０％、７０％カット、または２０％の後に７０％（２Ｘ）を使用したＡｍＳＯ４沈殿を示す。沈殿物を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、クマシーで染色した。白色のゴーストバンド（ＧＢ）が低分子量(dye front)側近くに観察された。ウェル拡散アッセイを用いると、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅおよびバイオサーファクタント活性に対して２０％カットのみが活性を有していた；図８Ｂは、クマシーブルー（ＣＢ）、アルシアンブルー（ＡＢ）、オイルレッド（ＯＲ）で染色されたＡｍＳＯ４沈殿および非染色のＡｍＳＯ４沈殿（ＵＳ）を示す；ゴーストバンドが矢印で示されている。図８Ｃは、水に可溶化し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲル濾過カラムに流したＡｍＳＯ４（２０％）沈殿のタンパク質濃度および活性（１／希釈係数）を示すグラフであり；図８Ｄは、３つのバンド（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３）が観察された、ＳＧ２７７無菌濾液画分のＰＥＧ沈殿のＣｓＣｌ勾配遠心分離を示す。
【図８−３】図８Ａは、２０％、７０％カット、または２０％の後に７０％（２Ｘ）を使用したＡｍＳＯ４沈殿を示す。沈殿物を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、クマシーで染色した。白色のゴーストバンド（ＧＢ）が低分子量(dye front)側近くに観察された。ウェル拡散アッセイを用いると、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅおよびバイオサーファクタント活性に対して２０％カットのみが活性を有していた；図８Ｂは、クマシーブルー（ＣＢ）、アルシアンブルー（ＡＢ）、オイルレッド（ＯＲ）で染色されたＡｍＳＯ４沈殿および非染色のＡｍＳＯ４沈殿（ＵＳ）を示す；ゴーストバンドが矢印で示されている。図８Ｃは、水に可溶化し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲル濾過カラムに流したＡｍＳＯ４（２０％）沈殿のタンパク質濃度および活性（１／希釈係数）を示すグラフであり；図８Ｄは、３つのバンド（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３）が観察された、ＳＧ２７７無菌濾液画分のＰＥＧ沈殿のＣｓＣｌ勾配遠心分離を示す。
【図９】図９Ａは、ＣｓＣｌ勾配による遠心分離後の活性画分の凝集体（図８ＤのＢ２）の電子顕微鏡画像であり；図９Ｂは、サイズ排除クロマトグラフィー後の凝集体の電子顕微鏡画像であり、サイズマーカーは１００ｎｍである。
【図１０−１】図１０Ａは、ＳＧ２７７バイオサーファクタントのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。ＡｍＳＯ４沈殿およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の後、試料をＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。各画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析して活性成分を同定し、イツリンＡ（画分１〜５）、サーファクチン（画分１０〜１５）、フェンギシンＡおよびＢ（画分７〜９）、ならびにマイコスブチリン（画分６）の異なるアイソフォームを明らかにした；図１０Ｂは、微量希釈アッセイを用いたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する活性を示す。ＳＥＣ画分は、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析前の粗ＳＥＣ材料の活性（１／１２８）である。個々の画分の和＝正のピークの数学的合計（１／１２５）。正のピークの合計＝＋ｖｅの活性を有する画分を合わせ、蒸発させて試験したところ、１／３２０の活性が得られた。全ピークの合計＝画分１〜１５を合わせ、蒸発させ、抗ＣＤ活性について試験した（１／６４０）。負のピークの合計＝全ての負の画分を合わせ、抗ＣＤ活性について試験した（１／１０）。
【図１０−２】図１０Ａは、ＳＧ２７７バイオサーファクタントのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。ＡｍＳＯ４沈殿およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の後、試料をＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。各画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析して活性成分を同定し、イツリンＡ（画分１〜５）、サーファクチン（画分１０〜１５）、フェンギシンＡおよびＢ（画分７〜９）、ならびにマイコスブチリン（画分６）の異なるアイソフォームを明らかにした；図１０Ｂは、微量希釈アッセイを用いたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する活性を示す。ＳＥＣ画分は、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析前の粗ＳＥＣ材料の活性（１／１２８）である。個々の画分の和＝正のピークの数学的合計（１／１２５）。正のピークの合計＝＋ｖｅの活性を有する画分を合わせ、蒸発させて試験したところ、１／３２０の活性が得られた。全ピークの合計＝画分１〜１５を合わせ、蒸発させ、抗ＣＤ活性について試験した（１／６４０）。負のピークの合計＝全ての負の画分を合わせ、抗ＣＤ活性について試験した（１／１０）。
【図１１】図１１は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＧ１７対Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＳＧ２７７におけるバイオサーファクタントＡｍｙＣｉｄｅ（商標）のＲＰ−ＨＰＬＣ比較である。
【図１２】図１２は、ＳＧ２７７のＡｍＳＯ４で沈殿させた無細胞上清からのＳＥＣ画分がどのように処理されたか、および得られた試料の活性を示す。
【図１３】図１３Ａは、ＳＧ２７７のＡｍＳＯ４で沈殿させた無細胞上清からのＳＥＣ画分の体積サイズ分布（ＤＬＳ分析による）を示す；図１３Ｂは、図１０Ａの画分３（Ｃ１５イツリン）の体積サイズ分布（ＤＬＳ分析による）を示す；図１３Ｃは、図１０Ａの画分１３（Ｃ１５サーファクチン）の体積サイズ分布（ＤＬＳ分析による）を示す。
【図１４】図１４は、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＳＧ２７７対ＳＧ２９７のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルの比較である。
【図１５】図１５は、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＳＧ２７７対Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＧ８３およびＳＧ１４０のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルの比較である。
【図１６】図１６は、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＳＧ２７７対Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＳＧ１３０のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルの比較である。
【図１７】図１７は、粗ＳＥＣ材料のＳＥＣ−ＨＰＬＣ画分１〜４を示す。
【図１８−１】図１８は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析からの個々の画分のＲＰ−ＨＰＬＣカラムのプロファイルを示し、図１８Ａは、そのクロマトグラフィープロファイルがＳＧ２７７のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルに存在するサーファクチンのピークと一致するため、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ画分１がサーファクチンであることを示し、図１８Ｂは、そのクロマトグラフィープロファイルがＳＧ２７７のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルに存在するイツリンおよびフェンギシンのピークと一致するため、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ画分２がイツリンとフェンギシンとの混合物であることを示し、図１８Ｃは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ画分３には２２０ｎｍで吸収が見られないことを示している（タンパク質成分が存在しない可能性が高い）。
【図１８−２】図１８は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析からの個々の画分のＲＰ−ＨＰＬＣカラムのプロファイルを示し、図１８Ａは、そのクロマトグラフィープロファイルがＳＧ２７７のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルに存在するサーファクチンのピークと一致するため、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ画分１がサーファクチンであることを示し、図１８Ｂは、そのクロマトグラフィープロファイルがＳＧ２７７のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルに存在するイツリンおよびフェンギシンのピークと一致するため、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ画分２がイツリンとフェンギシンとの混合物であることを示し、図１８Ｃは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ画分３には２２０ｎｍで吸収が見られないことを示している（タンパク質成分が存在しない可能性が高い）。
【図１８−３】図１８は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析からの個々の画分のＲＰ−ＨＰＬＣカラムのプロファイルを示し、図１８Ａは、そのクロマトグラフィープロファイルがＳＧ２７７のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルに存在するサーファクチンのピークと一致するため、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ画分１がサーファクチンであることを示し、図１８Ｂは、そのクロマトグラフィープロファイルがＳＧ２７７のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルに存在するイツリンおよびフェンギシンのピークと一致するため、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ画分２がイツリンとフェンギシンとの混合物であることを示し、図１８Ｃは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ画分３には２２０ｎｍで吸収が見られないことを示している（タンパク質成分が存在しない可能性が高い）。
【図１９】図１９は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ画分３の詳細な分析である。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の画分３（図１７から）をＲＰ−ＨＰＬＣにより分画し、得られた画分を抗ＣＤ６３０活性について調べた（行＝ＳＥＣ３）。並行して、ＳＧ２７７からのＳＥＣ粗材料をＲＰ−ＨＰＬＣにより調べ、画分も抗ＣＤ活性について調べた（行＝ＳＧ２７７）。活性を示した画分は＋と表示を付けられる。
【図２０】図２０は、ＳＥＣ材料の２つの独立した試料のＣｒｙｏ−ＥＭ分析を示す。
【図２１】図２１Ａは、ＳＥＣ画分の動的光散乱（ＤＬＳ）分析を示し、図２１Ｂは、Ｃ１４サーファクチン（ＲＰ−ＨＰＬＣの画分１３）の動的光散乱を示す。
【図２２】図２２Ａは、試験物質（試料）の添加前および添加後のＯＤ６００測定値を示し、図２２Ｂは、試験物質の添加前および添加後のＣＦＵ測定値を示す。
【図２３−１】図２３は、イツリン（Ｉ）、フェンギシン（Ｆ）、サーファクチン（Ｓ）、または組み合わせ（Ｉ＋Ｆ＋Ｓ）のＲＰ−ＨＰＬＣ画分における粒径のＤＬＳ評価を示す。
【図２３−２】図２３は、イツリン（Ｉ）、フェンギシン（Ｆ）、サーファクチン（Ｓ）、または組み合わせ（Ｉ＋Ｆ＋Ｓ）のＲＰ−ＨＰＬＣ画分における粒径のＤＬＳ評価を示す。
【図２４】図２４は、内部タンパク質マーカー（ＢＳＡおよびリゾチーム）を使用したＡｍＳＯ４沈殿物のＳＥＣ分析を示す。
【図２５】図２５は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ画分１〜３の単独または組み合わせでのＣＤ６３０に対する活性を示す。
【図２６】図２６は、ＲＰ−ＨＰＬＣ分画からの画分と、抗ＣＤ活性に関する単独または組み合わせでのイツリン、フェンギシンおよびサーファクチンの市販の試料との比較を示す。
【図２７】図２７は、マイクロプレートアッセイを用いてタンパク質濃度（Ａ２８０ｎｍ）および抗ＣＤ６３０活性を決定することにより行った、ＰＢＳまたはＰＢＳ＋０．１％ＳＤＳを用いたＳＥＣによるＡｍＳＯ４沈殿物の分析を示す。
【図２８】図２８は、薬剤感受性のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ(M. tuberculosis H37RV)の化合物のＭＩＣを決定するＲＥＭＡプレートを示す。レサズリン（青）からレゾルフィン（ピンク）への変換は、マイコバクテリアの増殖を示す。増殖がないことを示す最初の青いウェルがＭＩＣを決定する。
【図２９】図２９は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する化合物の活性を示す。様々なＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株の無菌濾液を、指数関数的に増殖するＳ．ａｕｒｅｕｓの培養物に加えた。細胞増殖は、光学密度測定値によって監視した。
【図３０】図３０は、Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ  ＳＧ５２７のＯＤ６００測定値に対する化合物の活性を示す。矢印は、ＳＧ２７７の上清が添加された時間を示している。白丸＝上清なし、黒丸＝＋ＳＧ２７７。
【図３１】図３１は、Ｖ．ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＳＧ５２９のＯＤ６００測定値に対する化合物の活性を示す。矢印は、ＳＧ２７７の上清が添加された時間を示している。白丸＝上清なし、黒丸＝＋ＳＧ２７７。
【図３２】図３２は、凍結乾燥状態のＡｍｙＣｉｄｅ（商標）を用いて行われたマウスの試験の投与計画を示す。
【図３３】図３３は、２４時間後のマウスの盲腸におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａのレベルを示す。治療薬は次の通りである：一晩増殖させたＳＧ２７７の無菌無細胞上清（ＳＵＰ）；ＳＧ２７７芽胞および栄養細胞（ＳＰ＋ＶＣ）；凍結乾燥したＳＧ２７７芽胞および栄養細胞（ＳＰ＋ＶＣ）；粗サイズ排除画分（ＳＵＰＳＥＣ）；ＰＢＳ緩衝液（ｎａｉｖｅ）。
【図３４】図３４は、２４時間後のマウスの盲腸におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂのレベルを示す。
【図３５】図３５は、２４時間後のマウスの盲腸におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞数をＣＦＵ／ｇで示す。
【図３６】図３６は、「ＳＥＣ−ＨＰＬＣ画分３」の質量分析プロファイルを示す。ピークの同一性がｍ／ｚ値とともに示される。
【発明を実施するための形態】
【０１７４】
材料および方法
一般的な方法
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株をグリセロールストックとして保存し、ＢＨＩＳ寒天または培地（０．１％（ｗ／ｖ）システインおよび５ｍｇ  ｍｌ−１酵母エキスを添加した脳心臓注入培地(Brain heart infusion medium)（７６））でルーチン的に増殖させた。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの全ての培養は嫌気性チャンバー（８０％Ｎ２、１０％Ｈ２、１０％ＣＯ２：Ｄｏｎ  Ｗｈｉｔｌｅｙ，ＵＫ）内で行われた。
【０１７５】
株
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ株
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ６３０(C. difficile 630)（エリスロマイシン耐性）は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症（ＣＤＩ）の流行中に偽膜性大腸炎の患者から単離した（７７）。強毒性株Ｒ２０２９１および高毒素産生株ＶＰＩ  １０４６３を含むＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの他の株は実験室株であった。
【０１７６】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ株
２０１８年２月１５日付で、以下の株をＮＣＩＭＢ，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２１  ９ＹＡに寄託した。
【０１７７】
寄託番号：ＮＣＩＭＢ  ４２９７１、本明細書では、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＳＧ２７７(B. amyloliquefaciens SG277)と称される。
【０１７８】
寄託番号：ＮＣＩＭＢ  ４２９７２、本明細書では、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＳＧ２９７(B. amyloliquefaciens SG297)と称される。
【０１７９】
寄託番号：ＮＣＩＭＢ  ４２９７３、本明細書では、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＳＧ１８５(B. amyloliquefaciens SG185)と称される。
【０１８０】
寄託番号：ＮＣＩＭＢ  ４２９７４、本明細書では、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＧ１４０(B. subtilis SG140)と称される。
【０１８１】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの増殖および芽胞の調製
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの芽胞は、すでに記載されている（３６）ようにして嫌気性インキュベーター（Ｄｏｎ  Ｗｈｉｔｌｅｙ，ＵＫ）を使用してＳＭＣ寒天プレート上で増殖させることにより調製した。（３６）。３７℃で７日間増殖させた後、芽胞を採取し、他の文献に記載される（８５）ようにして、２０％〜５０％のＨｉｓｔｏｄｅｎｚ勾配(Histodenz gradient)（Ｓｉｇｍａ）による遠心分離を用いて芽胞ペレットをさらに精製した。芽胞のＣＦＵは、加熱処理（６０℃、２０分）によって、ならびにＢＨＩＳＳ寒天プレート（０．１％（ｗ／ｖ）  Ｌ−システイン、５ｍｇ／ｍｌ  酵母エキス、および芽胞発芽誘導剤  タウロコール酸ナトリウム（０．１％ｗ／ｖ）を含む脳心臓注入寒天）に播種することによって決定した。
【０１８２】
マウスおよびハムスターにおける腸内芽胞形成菌の特徴付け
４匹／ケージの群で飼育されたＣ５７ＢＬ／６マウス（６週齢、雌）にクリンダマイシン（３０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。クリンダマイシン処理前および処理後２４時間に、新たに排泄された糞便を回収し、次いでＰＢＳでホモジナイズし、加熱処理し（６８℃、１時間）、段階希釈して、ＤＳＭ（Ｄｉｆｃｏ芽胞形成培地；（−８６））、またはヒト腸内微生物叢の培養に使用されるタウロコール酸ナトリウム（１ｇ／Ｌ）およびＬ−システイン（１ｇ／Ｌ）を添加したＢＨＩ寒天に播種した（８７）。プレートを３７℃で２日間好気的または嫌気的にインキュベートした。５００個のコロニーを無作為に選び、リストリークした(restreaked)。コロニー内の芽胞の存在を顕微鏡で確認し、必要に応じて好気性または嫌気性条件を用いて、各コロニーを液体培養（２ｍｌ）において３７℃で１２時間増殖させた後、同じ条件で一晩継代培養した（１／１００）。次いで、遠心分離および０．４５μｍのシリンジフィルタを通した濾過を用いて無細胞上清を得た。ＣＤ６３０に対する活性は、微量希釈アッセイを用いて決定した（以下を参照）。バイオサーファクタント活性は、油置換アッセイ(oil displacement assay)を用いて決定した（８８）。ｇｙｒＡシーケンシングは、Ｂａｃｉｌｌｕｓについて以前に記載されたプロトコルおよびプライマーを使用した（４０）。抗生物質の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、ＣＬＩＳ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）によって規定されている微量希釈法を用いて得た（８９）。
【０１８３】
抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ活性のインビトロ分析
ａ）寒天拡散アッセイ(Agar diffusion assay)
好気性Ｂａｃｉｌｌｕｓ株は、３７℃で１６〜１８時間ＬＢ培地で増殖させ、嫌気性芽胞形成菌は、嫌気性チャンバー内でＢＨＩ＋システイン＋タウロコール酸ナトリウム中で一晩増殖させた。試料を遠心分離し（微量遠心管(microfuge)、８，０００ｒｐｍ、１０分）、上清を濾過滅菌（０．４５μｍのシリンジフィルタ）し、使用するまで氷上で保存した。ＴＧＹ寒天プレートを予め還元して(pre-reduce)おき、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ一晩培養物（約１００μｌ）を広げた後に３０分間乾燥させ、その後、プレート当たり４〜６ウェルを切り離した。ＴＧＹ培地は、１リットル当たり、トリプシン大豆ブロス（３０ｇ）、グルコース（２０ｇ）、酵母エキス（１０ｇ）、Ｌ−システイン（１ｇ）、レサズリン（１ｍｇ）および寒天（１５ｇ）である。使用前に、嫌気性チャンバー内でプレートを４時間還元した(reduced)。ポテトボーラー(potato borer)を使用して、ＴＧＹ寒天プレートに直径５ｍｍのウェルを設けた。表示を付けたウェルに５０μｌのＢａｃｉｌｌｕｓ上清を適用し、嫌気性チャンバー内でプレートを３７℃で４８時間インキュベートし、阻害ゾーン（直径）を測定したところ、典型的には９〜２０ｍｍであった。
【０１８４】
ｂ）微量希釈アッセイ(Microdilution assay)
インジケーター培養物(Indicator culture)：関連するＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株の単一コロニーを１０ｍｌのＢＨＩＳに接種し、嫌気性チャンバー内で、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、一晩培養物をＢＨＩＳに１：１００で継代培養し（典型的には０．１ｍｌを１０ｍｌのＢＨＩＳに入れる）、３７℃で６時間インキュベートした後、培養物が使用できるようになる。
【０１８５】
プレート準備(Plate set up)：１８０μｌの滅菌ＢＨＩＳを９６ウェルのＵ底マイクロプレート（Ｓｉｇｍａ  ＣＬＳ３７９９）の最初の列にピペットで入れ、１００μｌを後続の各列に入れた。試験する２０μｌの試料（滅菌濾過、０．４５μｍ）を最初の列にピペットで入れ（１：１０希釈係数）、マイクロプレートの最後の列（１：１２８０希釈係数）まで２倍希釈系列で連続希釈する。１回の段階希釈では、「培地のみ」の対照も最初のカラムの単一ウェルにピペットで入れる。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの６時間「インジケーター培養物」１０μｌを各ウェルにピペットで入れ、プレートを嫌気性チャンバー内で、３７℃で一晩インキュベートする。一晩増殖させた後、マイクロプレートの内容物を回転式プレート振盪機にて２分間２００ｒｐｍで撹拌し、その後、マイクロプレートプレートリーダーを使用してＯＤ６００を測定した。陽性阻害活性は、ＣＤ６３０対照のＯＤ６００＜５０％として定義した。
【０１８６】
ｃ）共培養アッセイ(Co-culture assays)
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株を、嫌気性条件下３７℃で一晩、ＢＨＩＳ培地で増殖させた。翌日、５ｍｌのＢＨＩＳに０．５ｍｌの一晩培養物を接種し、光学密度が約０．２〜０．３  Ａ６００ｎｍに達するまで３７℃でインキュベートした。この時点で、新たに調製した（滅菌濾過、０．４５μｍ）上清１ｍｌを増殖ＣＤ培養物に無菌的に加え、増殖を再開した。
【０１８７】
予防的治療薬の調製(Preparation of prophylactic treatments)：ＳＧ２７７（またはＳＧ２９７またはＳＧ３７８）を２５ｍｌのＢＨＩＢで一晩（１８時間、３７℃）増殖させ、遠心分離後、ペレットを２ｍｌの上清に懸濁した。上清を使用するために、アリコートを濾過滅菌した（０．４５μｍ）。芽胞のためにＳＧ２７７をＤＳＭ（Ｄｉｆｃｏ芽胞形成培地；（８５））寒天で、３７℃で７２時間増殖させた。セルスクレーパーを使用してプレートから芽胞塊を採取し、滅菌水で３回洗浄し、次いで加熱処理して残留栄養細胞を死滅させた。芽胞を２．５×１０１０芽胞／ｍｌの濃度になるように水に懸濁した。
【０１８８】
マウスのコロニー形成実験(Mouse colonisation experiments)：動物（Ｃ５７ＢＬ／６、雌、６〜７週齢）にクリンダマイシン（（クリンダマイシン−２−リン酸、Ｓｉｇｍａ；３０ｍｇ／ｋｇ））を胃内投与し、２４時間後にＣＤ６３０の１０２芽胞でチャレンジした。図１Ａに示すスケジュールを使用して、ＣＤ６３０によるチャレンジの前および後に動物群に予防的治療薬を投与した（０．２ｍｌ、ｉ．ｇ．）。コロニー形成（ＣＦＵおよび毒素）の分析のために、感染後２４時間で盲腸を除去した。
【０１８９】
ハムスター：ゴールデンシリアンハムスター（雌）は１６〜１８週齢であった（Ｈａｒｌａｎ  ＵＫ  Ｌｔｄ．）。ハムスターのチャレンジのために、動物群（ｎ＝６）にクリンダマイシン（３０ｍｇ／ｋｇ体重）を（ｉ．ｇ．）投与し、次いで、３日後にＣＤ６３０の１０２芽胞でチャレンジした。ＣＤ６３０チャレンジの前および後に、上記の治療薬を動物に投与した（ｉ．ｇ．、２ｍｌ／投与）。治療レジメンは、ＣＤ６３０チャレンジの前に６回投与（−４８時間、−３６時間、−２４時間、−１２時間、−４時間、および−１時間）、次いで、チャレンジ後１２日間は３回／日であった。動物を疾患進行の徴候についてモニタリングし、臨床的エンドポイントに達したときに処分した。ＣＤＩの症状は、重度／臨床的エンドポイント（ウエットテイル(wet tail)＞２ｃｍ、非常に嗜眠的(lethargy)）、軽度（ウエットテイル＜２ｃｍ）または健康とスコア化した。盲腸を除去し、ＣＤ６３０のＣＦＵならびに毒素ＡおよびＢについて分析した。
【０１９０】
コロニー形成の相関要因の測定
糞便および／または盲腸における細菌のＣＦＵおよび毒素の存在は、コロニー形成の測定を提供する。ＣＦＵの決定のために、チャレンジの２日後に糞便を回収し、７０％エタノールでホモジナイズし、一晩インキュベートし、滅菌水中に段階希釈して、ＣｈｒｏｍＩＤプレート（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）に播種した。プレートを２日間嫌気的に（３７℃）インキュベートした後でカウントした。毒素ＡおよびＢは、糞便（チャレンジ後２４時間で回収）または盲腸試料（死亡した動物から）から、抽出緩衝液（２％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ｐ４３３３；１０ｍｌ／Ｌ）およびＰｉｅｒｃｅプロテアーゼ阻害剤錠剤(Pierce protease inhibitor tablets)（Ｔｈｅｒｍｏ  ８８２６５）を含むＰＢＳ）中に１／５（ｗ／ｖ）希釈で回収した。木製の棒を使用して、抽出緩衝液中で試料をホモジナイズし、４℃で２時間インキュベートした。遠心分離（１４，０００ｇ、５分）後に上清を集め、濾過（０．２μｍ）して直ちに使用した。チャレンジの２４時間後に糞便を回収した。ウサギ抗毒素Ａおよび毒素Ｂ（「社内」試薬(‘in house’ reagents)）を使用してＥＬＩＳＡプレートをコーティングし（１／６，０００）、室温で一晩放置した。この後、２％ＢＳＡを用いて３７℃で１時間、プレートをブロックした。糞便抽出試料を室温で２時間インキュベートした。複製試料を陰性対照（免疫前の糞便抽出物）と一緒に使用した。トキソイドＡおよびＢの段階希釈液を基準として使用した。検出抗体は、マウス抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ（社内試薬、１／１０００）であり、３０℃で１時間インキュベートした。ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ；１／２０００）を室温で１時間インキュベートした。反応物をＴＭＢ基質を使用して発色させ、２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４により停止し、４５０ｎｍでＯＤを測定した。
【０１９１】
統計分析
ウェルチの不等分散ｔ検定(Welch’s f-test for unequal variance)を使用して、統計分析を計算し、有意性を決定した（ｐ＜０．０５）。全ての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して行った。
【０１９２】
ＰＥＧ沈殿とＣｓＣｌ遠心分離
ＢＨＩＢ中の培養物１Ｌを単一コロニーから３７℃で一晩増殖させ、８，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上清を回収した。次いで、上清を０．４５μｍのメンブレンで滅菌濾過した。飽和ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液（Ｓｉｇｍａ、８１２６０）を、８％の最終濃度になるまで無菌上清に加え、４℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、溶液を遠心分離し（４℃、１０，０００×ｇで３０分間）、ペレットを１０ｍｌのＳＭ緩衝液（リットル当たり；ＮａＣｌ  ５．８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、５０ｍＬ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５）に懸濁した。次いで、４ｍｌの１．３ｇ／ｃｍ３  ＣｓＣｌ、４ｍｌの１．４ｇ／ｃｍ３  ＣｓＣｌ、および４ｍｌの１．５ｇ／ｃｍ３  ＣｓＣｌからこの順序で構成されるＣｓＣｌ勾配の上に４ｍｌの濾液を重ねた。この勾配を、ＳＷ３２ローターを備えたＯｐｔｉｍａ  ＸＰＮ−９０  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で遠心分離した（１５０，０００×ｇ、１８時間、４℃）。遠心分離後、ピペットを使用してバンドを注意深く除去した。
【０１９３】
活性分子の抽出および精製
３７℃でＢＨＩＢブロスで細胞を一晩培養した後、８０００×ｇで１０分間遠心分離することにより上清から細菌細胞を除去し、上清を０．４５μｍのメンブレンで滅菌濾過した。次いで、飽和ＡｍＳＯ４溶液（６ｍｌ）を使用して、無菌上清（２４ｍｌ）を４℃で４時間、硫酸アンモニウム（ＡｍＳＯ４）で沈殿させ、２０％の最終濃度を得た。８０００×ｇで１５分間遠心分離した後、上清を除去し、沈殿物を５ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。過剰なＡｍＳＯ４を除去するために、濾液を一晩４℃で透析した。透析後、ＰＢＳ中の０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ  １ｍｌを得られた濾液に加え、２．５ｍｌをＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（Ｌ×Ｉ．Ｄ．３０ｃｍ×１０ｍｍ）に適用し、泳動用緩衝液としてＰＢＳ／０．１％  ＳＤＳを用いて、変性条件下でサイズ排除クロマトグラフィーにより分画した。微量希釈アッセイを使用して、ＣＤ６３０に対する活性について画分を試験し、陽性画分を一晩４℃で透析し、残りのＳＤＳを除去した。活性を示す画分をｕＢｏｎｄａｐａｃｋ  Ｐｈｅｎｙｌ、１２５μｍ  ３０ｃｍｘ３．９ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）にロードし、６００ポンプとＡＢＩ  Ｋｒａｔｏｓ  ７５７吸光度検出器を備えたＷａｔｅｒｓ  ６００Ｅシステムコントローラを使用してＲＰ−ＨＰＬＣにより分離した。移動相成分は、（Ａ）６０％（ｖ／ｖ）メタノール中の０．５％酢酸、および（Ｂ）９５％（ｖ／ｖ）メタノール中の０．５％（ｖ／ｖ）酢酸であった。画分を緩衝液Ａに注入し、０％から１００％（６０分間）まで増加させた溶媒Ｂの直線勾配で、０．５ｍｌ／分の流速で生成物を溶出した。２２０ｎｍでの吸光度を決定することにより溶出パターンをモニタリングし、ＥＺ−２  Ｇｅｎｅｖａｃ遠心エバポレーターを使用して得られた画分を濃縮し、次いで、微量希釈アッセイを使用してＣＤ６３０に対する活性を試験するか、または質量分析を使用して同定した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析では、ＲＰ−ＨＰＬＣ画分を、ＴＦＡ（０．０１％（ｗ／ｖ）最終濃度）で酸性化したα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸マトリックス溶液（Ａｇｉｌｅｎｔ）と予め混合し、光沢のあるＭＡＬＤＩステンレス鋼プレート３８４(384 polished stainless steel MALDI plate)（Ｂｒｕｋｅｒ）上にスポットした。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析はＢｒｕｋｅｒ  Ａｕｔｏｆｌｅｘ  ＩＩＩ  Ｓｍａｒｔｂｅａｍ質量分析計を使用して行われた。機器は、少なくとも３０ｐｐｍの質量精度に較正した。
【０１９４】
ＡｍＳＯ４沈殿の場合、ＡｍＳＯ４（１１３ｇ／Ｌ）を無菌濾液に加えて２０％ｗ／ｖ溶液を得、４℃で一晩インキュベートした。次いで、溶液を遠心分離し、ペレットを３０倍の濃度でＰＢＳに懸濁した（３０ｍｌの初期培養物＝１ｍｌ  ＡｍＳＯ４  ｐｐｔ）。ＡｍＳＯ４  ｐｐｔをＰＢＳ中で一晩（４℃で）透析して、過剰なＡｍＳＯ４を除去した。ＡｍＳＯ４  ｐｐｔの活性＝１／５１２０。活性種をさらに精製するために、ＰＢＳ＋０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）中でＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（１０，０００Ｄａ〜６００，０００Ｄａ）を使用してＡｍＳＯ４沈殿物を分離した。これにより高分子量種の粗分離が可能になった。ＳＤＳを加えて不要なタンパク質を変性させ／直線化することで、より高純度の分離を得た。
【０１９５】
マイコバクテリアに対する化合物のＭＩＣ試験
化合物の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、レサズリンマイクロタイターアッセイ法(resazurin microtitre assay method)（ＲＥＭＡ）を使用して決定した。ＳＧ２７７の濾過滅菌した上清を硫酸アンモニウム（２０％）で沈殿させ、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）に供した。ＳＥＣ画分１〜２０をＭ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する活性について調べた。
【０１９６】
簡単に述べると、９６ウェルのＵ底プレート中のＭＢ７Ｈ９／ＡＤＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）培地間で各化合物の段階希釈を行った。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖおよび多剤耐性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ペルー分離株）（ＭＤＲ−ＴＢ）を対数期（ＯＤ６００＝１．０）まで増殖させ、１０４細胞を全てのウェルに加えた。その後、プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で１０日間インキュベートした。陰性（培地のみ）対照に加えて、４、２、１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６３μｇ／ｍｌの濃度範囲の第一選択の結核治療薬(first line TB drugs)であるイソニアジド（ＩＮＨ）およびリファンピシン（ＲＩＦ）の標準化された段階希釈液を用いてプレートを内部制御した。ＭＩＣは、完全な増殖阻害を示す最初の希釈度として決定された。これは、観察された色の変化を記録することによって視覚的に決定された。
【０１９７】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対する活性のインビトロ試験
Ｂａｃｉｌｌｕｓ株によって産生される細胞外物質の無菌濾液は、ＢＨＩＢ（脳心臓注入ブロス）中３７℃（２５０ｍｌ  Ｂｅｌｌｃｏフラスコ）で各株の一晩（１８時間）培養物を増殖させることにより作製した。培養物を遠心分離し（９０００×ｇ、２０分）、上清を濾過滅菌した（０．４５μｍ）。濾液を使用するまで氷上に置き、５時間以内に使用した。
【０１９８】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの培養物は、２５ｍｌのＬＢ培地において（２５０ｍｌフラスコ内）３７℃で増殖させることにより、単一コロニーから新しく調製する。培養物が約１．０のＯＤ６００に達したときに、２００μｌの各培養物を乾燥ＬＢ寒天プレートに播種した（培養物当たり２〜４プレート）。接種材料が乾燥した後、滅菌したポテトボーラー（または同様のもの）を使用して、プレートに５ｍｍの円形のウェルを設けた（プレート当たり４〜５個の穴）。無菌細胞外濾液１００μｌをウェルに加え、次いでプレートを３７℃で２日間インキュベートし（プレートを上にして反転させない）、１日または２日後に阻害ゾーンを測定した（阻害ゾーンの直径または半径）。各プレートは、対照（滅菌ＰＢＳまたは滅菌水）と、各試験株に使用される複製を保持していた。
【０１９９】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対する活性のインビボ試験
同じ日にＳ．ａｕｒｅｕｓ株を使用してＬＢ培地に接種した。培養物を対数増殖中期（約０．２〜０．８  ＯＤ６００）まで３７℃で増殖させた。次いで、培養物を分割し、１つのフラスコに無菌細胞外濾液（１／１０希釈）を加えた。３７℃で増殖を維持し、ＯＤ６００測定値を１時間ごとに測定した（図２９）。
【０２００】
Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉおよびＶｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓに対する活性の試験
株
ＳＧ５２７  Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ  １６．６
ＳＧ５２８  Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ  ２７．４
ＳＧ５２９  Ｖ．ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ
ＳＧ５３０  Ｖ．ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ。
【０２０１】
Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ  ＳＧ５２７をＬＢ＋２％ＮａＣｌ中、一晩２８℃で増殖させた。翌日、１／５００希釈液を新鮮なＬＢ＋２％ＮａＣｌ中で継代培養し、２００ｒｐｍの振盪水浴中２８℃でインキュベートした。光学密度（６００ｎｍ）および生菌数を１時間ごとに測定した。ＯＤが０．６に達したら、培養物を２分割し、ＳＧ２７７の濾過滅菌培養上清を加えて１／１０の最終濃度を得、その後ＯＤ測定を行った。
【０２０２】
Ｖ．ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＳＧ５２９をＬＢ＋２％ＮａＣｌ中、一晩２８℃で増殖させた。翌日、１／５００希釈液を新鮮なＬＢ＋２％ＮａＣｌ中で継代培養し、２００ｒｐｍの振盪水浴中２８℃でインキュベートした。光学密度（６００ｎｍ）および生菌数を１時間ごとに測定した。ＯＤが０．４８１に達してから、培養物を２分割し、ＳＧ２７７の濾過滅菌培養上清を加えて１／１０の最終濃度を得、その後ＯＤ測定を行った。
【０２０３】
凍結乾燥形態でのＡｍｙＣｉｄｅ（商標）の安定性試験
ＳＧ２７７を調製し（ＢＨＩＢ中３７℃で一晩増殖）、細菌を遠心分離し、一部を凍結乾燥した。湿潤材料および凍結乾燥材料の一部を、室温で、４℃で、および、凍結させて保存し、マイクロプレートアッセイを使用した抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ活性の分析のためにアリコートを採取した。
【０２０４】
凍結乾燥形でのＡｍｙＣｉｄｅ（商標）の安定性試験
マウスの群（ｎ＝８／ｇｐ）に、異なる形態の試験物質を投与した（経口、胃内（ｉ．ｇ．）、ｉ．ｇ．、０．２ｍｌ／投与）。ＣＤ６３０（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０；芽胞１００個）によるチャレンジの４時間前に材料を最初に経口投与する使用したレジメンを以下に示す。動物はＩＶＣ（個別換気ケージ）に個別に収容した。ＣＤＩの基本的な動物モデルは、ＣＤＩの症状は発生しないが、コロニー形成は盲腸または糞便中のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素および細菌のＣＦＵの存在によって示される「コロニー形成モデル」である［３−５］。
【０２０５】
動物群
群１  ＳＧ２７７  ＳＰ＋ＶＣ
ＳＧ２７７の細胞を、２５ｍｌのＢＨＩＢ（脳心臓注入ブロス）中３７℃で１６時間増殖させた。細胞を１００ｍｌの培養物（４つのフラスコ）から採取し、ペレットを２ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。１回の用量＝０．２ｍｌおよび芽胞からなる約５×１０９ＣＦＵ（約７０〜１００％）。
【０２０６】
群２  フリーズドライしたＳＧ２７７  ＳＰ＋ＶＣ（ＳＧ２７７  ＳＰ＋ＶＣＬＹＯ）
ＳＧ２７７の細胞を２５ｍｌのＢＨＩＢ中３７℃で１６時間増殖させた。次いで、細胞ペレットを凍結させ、一晩凍結乾燥させた。使用日に、材料を２ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。１回の用量＝０．２ｍｌおよび芽胞からなる約５×１０９ＣＦＵ（約７０〜１００％）。
【０２０７】
群３  ＳＧ２７７  ＳＵＰ
ＳＧ２７７をＢＨＩＢ中３７℃で一晩増殖させた。１８時間後、遠心分離により細胞を除去し、上清（ＳＵＰ）を０．４５μｍのフィルタによる濾過により滅菌した。使用するまで−２０℃で保存した。１回の用量＝０．２ｍｌ。
【０２０８】
群４  ＳＧ２７７のＳＥＣ画分（ＳＧ２７７  ＳＵＰＳＥＣ）
ＳＧ２７７の無菌上清を２０％硫酸アンモニウムで沈殿させ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で精製し、抗ＣＤ６３０活性を保持する画分をプールした（インビトロ微量希釈アッセイを使用して決定）。試料アリコートを−２０℃で保存し、使用日に解凍した。１回の用量＝０．２ｍｌ  群５  ナイーブ（Ｎａｉｖｅ）
１回の用量＝０．２ｍｌのＰＢＳ。
【０２０９】
結果
実施例１：嫌気性芽胞形成菌ではなく、腸内好気性芽胞形成細菌がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを阻害する
実験開始の１０日前に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、オートクレーブ処理した水、ＵＶ処理した食餌、および滅菌した寝床を備えた個別換気ケージ(independently ventilated cage)（ＩＶＣ）で飼育した。ケージは毎日交換した。クリンダマイシンによる処理の前および後に、マウスから糞便試料を採取した。胃内（ｉ．ｇ．）胃管栄養(intra-gastric (i.g.) gavage)によって投与されたクリンダマイシンは、ＣＤＩを誘発するのに十分な濃度（３０ｍｇ／ｋｇ）で使用されたが、ここでは動物はＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅでチャレンジされなかった。ホモジナイズした糞便を、栄養細胞を死滅させるために加熱処理し、寒天プレート上で段階希釈し、好気的または嫌気的にインキュベートした。結果として得られたコロニーは、発芽した耐熱性芽胞から生じたものであり、好気性または嫌気性プレートからの合計５００個のコロニーを、さらなる分析のためにコロニー精製した。
【０２１０】
最初に、本発明者らは、培養細菌の無細胞上清からの活性を測定する寒天拡散アッセイを使用して、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０（ＣＤ６３０）の増殖を阻害したコロニーの数を決定し、その結果を表１に示す。
【０２１１】
【表２】
2021515031.tif 000023
【０２１２】
驚くべきことに、本発明者らは、クリンダマイシン処理前または処理後のいずれにおいても、ＣＤ６３０を阻害できる嫌気性分離株を見つけられなかった。一方、好気性の芽胞形成分離株の８％（ｎ＝４０）が細胞外物質中に抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ活性を有していたが、クリンダマイシン処理後には、抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ活性を有する分離株のパーセンテージは０．８％（ｎ＝４）に減少した。興味深いことに、本発明者らは、１６Ｓメタゲノムシーケンスを使用してマウスの糞便試料中にＢａｃｉｌｌｕｓ種を検出することができなかった。これはおそらく、最近のマウスの研究と一致して、糞便試料は主にＢａｃｉｌｌｕｓ芽胞のみを含有するが、栄養細胞は含有しない可能性を示唆している（３９）。
【０２１３】
次に、本発明者らは、抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ活性を有する好気性分離株を特徴付け、その結果を表２に示す。
【０２１４】
【表３】
2021515031.tif 000024
【０２１５】
１６Ｓ  ｒＲＮＡシーケンシングよりも有益なｇｙｒＡシーケンスを使用して（４０）、本発明者らは、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（ｎ＝２２）、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｎ＝１０）およびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ｎ＝１２）の３つのＢａｃｉｌｌｕｓ種のみが存在することを実証した。バイオサーファクタント活性のアッセイを使用して、本発明者らは、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（ｎ＝２２）およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｎ＝１０）の分離株が全て、それらの無細胞上清においてバイオサーファクタント活性を有し、粘液性であり、クリンダマイシンに感受性であることを実証した（表２を参照）。しかしながら、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓの分離株（ｎ＝１２）は全てクリンダマイシンに耐性があり、バイオサーファクタント活性を保持していなかった。
【０２１６】
本発明者らはまた、表３に示すように、ハムスター（ゴールデンシリア）を使用して同様の研究を行ったところ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する活性を保持する好気性芽胞形成菌の２６％に同様の現象が観察され、これはクリンダマイシン処理後１１％に減少した。
【０２１７】
【表４】
2021515031.tif 000025
【０２１８】
実施例２：Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対するインビトロ活性を有するマウスの消化管から単離されたＢａｃｉｌｌｕｓ芽胞形成菌は、インビボでＣＤＩを阻害する
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対するインビトロ活性がインビボでの阻害につながるかどうかを判断するために、本発明者らは、２群のマウス（ｎ＝４）に表１に示すクリンダマイシン前の糞便試料から分離された細菌の懸濁液を投与した（胃内、ｉ．ｇ．）。群１には、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して活性を示した３つのＢａｃｉｌｌｕｓ種（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の混合物を投与し、群２には、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対してインビトロ活性を示さなかった３つのＢａｃｉｌｌｕｓ分離株（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓの各１つの分離株）を投与した。各群の経口用量は、試験した各分離株の１×１０９個の細菌からなる合計３×１０９個の細菌で構成されていた。３番目の群は、ＰＢＳのみを投与したナイーブ（ｎａｉｖｅ）動物で構成されていた。図１Ａに示すように、最初にクリンダマイシン（ｉ．ｇ．、３０ｍｇ／ｋｇ）をマウスに投与し、次いで細菌懸濁液またはＰＢＳを５回投与した。２回目の投与後、マウスをＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０の１０２個の芽胞でチャレンジした。１日後、全ての動物を剖検し、盲腸試料を採取した。
【０２１９】
群１の全ての動物は、盲腸試料に毒素ＡまたはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＣＦＵが存在しないことから分るように、ＣＤＩの証拠を示さなかった（それぞれ、図１Ｂおよび１Ｃを参照）。対照的に、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対してインビトロ活性を示さないＢａｃｉｌｌｉを投与された動物は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅコロニー形成の明らかな兆候、すなわちナイーブ（ｎａｉｖｅ）マウスと同等の高レベルの毒素ＡおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＣＦＵを示した（それぞれ図１Ｂおよび１Ｃを参照）。
【０２２０】
実施例３：好気性芽胞形成菌の腸内コホートは異所性集団を表す
本発明者らは、ケージ当たり３匹の動物を使用して、従来のケージ（ＣＣ）または個別換気ケージ（ＩＶＣ）のいずれかにマウスの群を収容した。ＩＶＣはＨＥＰＡ濾過を備えており、動物が空中浮遊菌に曝露されるのを防ぐ。動物に滅菌された食餌と水を与えるとともに、滅菌した寝床を定期的に交換した。１０日ごとに、好気性インキュベーション後に総ＣＦＵおよび耐熱性ＣＦＵ（細菌芽胞を表す）を含む好気性細菌の存在について糞便を検査した。
【０２２１】
図２Ａに示すように、経時的に、糞便試料中で同定された好気性菌数は、約１０５〜１０６ＣＦＵ／ｇで一定のままであった。糞便中の芽胞レベル（１０３〜１０４／ｇ）は、ヒトの糞便中の予測濃度とほぼ一致していた（２４）。注目すべきことに、ＩＶＣに収容された動物では、芽胞数は一時的に著しい減少を示し、４０日後には芽胞は検出されなかった（ｎ．ｂ．、１０２のＣＦＵが検出限界）（図２Ｂを参照）。この好気性芽胞数の減少は、従来のケージに収容されたマウスには観察されなかったことから、芽胞形成菌の好気性集団は異所性であり(allochthonous)、環境から獲得されたことが示唆される。
【０２２２】
実施例４：抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ活性を有するＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのヒト分離株
本発明者らは、以前に、ヒトの糞便から単離されたＢａｃｉｌｌｕｓ種を特徴付けている（１９）。それらの一連のヒト分離株から、寒天拡散アッセイを使用して、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（ＣＤ６３０）に対する細胞外活性を有する株をスクリーニングした。強力な活性を有する多数のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株を同定することができ、よりロバストな微量希釈アッセイを使用して、細胞外阻害活性のレベルを定量化した（図３Ａを参照）。全ての株はバイオサーファクタント活性を有しており、クリンダマイシン感受性であった。これらの分離株のコロニーは著しく粘液性であり、特にＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓではそうであった。全ての株は、いくつかのＢａｃｉｌｌｉの特徴であるが、特に家畜化されていない株の特徴である、ロバストで広範なバイオフィルムを生成した（１９、４１）。
【０２２３】
最も高いレベルの阻害活性を示したＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株ＳＧ２７７およびＳＧ２９７をさらに調べた。共培養アッセイを使用して、本発明者らは、ＳＧ２７７またはＳＧ２９７の無菌上清を異なるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株の対数培養に加え、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ培養物の迅速かつ完全な溶解をもたらす明らかな殺菌効果を明らかにした（ＳＧ２７７によって媒介されるＣＤ６３０の溶解を示す図３Ｂを参照）。
【０２２４】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ培養物を３７℃で１０時間、ＢＨＩＳ中で増殖させた。１８０μｌのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ培養物をマイクロプレートウェルに加え、続いて２０μｌの無菌ＳＧ２７７濾液を加えた。プレートを３７℃で１８時間嫌気的にインキュベートし、その後ＯＤ６００を測定した。ＳＧ２７７無菌濾液も対照として一晩インキュベートしたが、増殖を示さなかった。表４に示すように、本発明者らは、ＳＧ２７７濾液が多数の異なるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅリボタイプに対して活性を有することを示した。
【０２２５】
【表５】
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【０２２６】
微量希釈アッセイを使用してＳＧ２７７およびＳＧ２９７上清の細胞外活性を特徴付け、ＣＤ株６３０に対する阻害活性を測定した。Ｂａｃｉｌｌｕｓの上清を濾過滅菌し（０．４５μｍ）、様々な処理条件に曝露した。処理した試料に対して阻害活性を示した最も高い希釈係数を表５に示す。全てのアッセイは、同じ日に同じ濾液を用いて行われた。
【０２２７】
様々な処理条件は次の通りである。
【０２２８】
・加熱：選択した温度のオーブンで濾液（０．５ｍｌ）を３０分間インキュベートし、アッセイの前に室温まで冷却した。
【０２２９】
・オートクレーブ：濾液を１２１℃および２０ｐｓｉで２０分間オートクレーブした。
【０２３０】
・模擬胃液（ＳＧＦ）：ｐＨを調整するために、ＨＣｌを使用してｐＨ２、３、および４の３つの溶液を作製した。上清（０．５ｍｌ）を等しい体積のＳＧＦ（０．２％ｗ／ｖ  ＮａＣｌ、３．５ｍｇ／ｍｌペプシン）とともにインキュベートし、アッセイ前に３７℃で１時間インキュベートした。
【０２３１】
・酵素：上清（０．５ｍｌ）を、最終濃度１μｇ／ｍｌの以下の酵素（全てＳｉｇｍａ製）とアッセイ前に３７℃で１時間インキュベートした：リゾチーム（Ｌ７６５１）、リパーゼ（Ｌ３１２６）、アミラーゼ（Ａ３１７６）。プロテアーゼ、プロナーゼ（Ｐ５１４７）、トリプシン（Ｔ８００３）、およびプロテイナーゼＫ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＥＯ０４９１）の場合、酵素の最終濃度は１ｍｇ／ｍｌとした。
【０２３２】
・溶媒：濾液（０．５ｍｌ）を０．５ｍｌの溶媒とともに１分間ボルテックスした。
【０２３３】
・０．１Ｍ  ＮａＯＨまたは０．１％ＳＤＳ：濾液（０．５ｍｌ）を０．２Ｍ  ＮａＯＨまたは０．２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの０．５ｍｌ溶液と混合して、０．１Ｍ  ＮａＯＨまたは０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む試料を作製し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０２３４】
・０．１％〜１．０％グルタルアルデヒド：濾液（０．５ｍｌ）を、モル比１：１０のグリシンで中和した０．２％、０．５％、１．０％または２．０％グルタルアルデヒドの溶液（ｖ／ｖ）の０．５ｍｌ溶液と混合して、０．１％、０．２５％、０．５％または１．０％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒドを含む試料を得、３７℃で２時間インキュベートした。
【０２３５】
【表６】
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【０２３６】
表５に示すように、ＳＧ２７７およびＳＧ２９７上清の無細胞活性は、有機溶媒、プロテアーゼ、模擬胃液（ＳＧＦ）、および特に加熱（１００℃に部分抵抗性）を含むいくつかの処理に対して耐性であることが示された。
【０２３７】
さらに、ＳＧ２７７の無菌上清の安定性を５０日間にわたって測定したところ、図４Ａに示すように、４℃で４５日間保存した後も４０％の安定性が保持された。図４Ｂおよび図４Ｃに示すように、増殖する培養物において、定常期の間にＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する活性が生じたことから、それが二次代謝産物、すなわち抗生物質であったことが示唆される。
【０２３８】
ＳＧ２７７細胞を繰り返し洗浄し、次いでＣＤ６３０と混合し（１：１）、半軟質寒天に塗布し、嫌気的に一晩インキュベートすると、菌叢の明確な溶解が明らかになった（図５Ｂを参照）。逆に、図５Ａは、ＳＧ２７７細胞をＣＤ６３０に適用せず、ＣＤ６３０が大量に増殖した菌叢が明白であった対照プレートを示す。本明細書に記載されるＳＧ２７７ならびに実際に全てのＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ分離株は通性好気性菌であるため、活性はおそらく細胞エンベロープから生じたことを実証している。最後に、また驚くべきことに、本発明者らは、加熱処理（８０℃、３０分）によってＳＧ２７７細胞を死滅させ、細胞がなおもＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを溶解できることを確認した。これは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する活性が、無細胞上清に存在する一方で、細胞表面上にも存在していたことを示している。したがって、本発明者らは、細菌を（例えば、加熱、γ線照射、オートクレーブ等によって）死滅させた形態で使用できると考える。結果を以下の表６に示す。
【０２３９】
【表７】
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【０２４０】
表７に示すように、ＳＧ２７７およびＳＧ２９７無菌濾液の活性を、一連のグラム陽性菌およびグラム陰性菌に対するそれらの活性スペクトルについて評価した。活性は寒天拡散法を使用して決定した。ＳＧ２４７は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して活性を有しないことが示されたＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓの株であり、対照として使用された。
【０２４１】
【表８】
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【０２４２】
活性は「＋」＝１〜３ｍｍ、「＋＋」＝４〜５ｍｍ、および「＋＋＋」＞５ｍｍで表される。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉおよびＶ．ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓの活性は静菌性であり、阻害は微量希釈アッセイを使用して実証し、増殖を阻害するために必要とされた最も高い希釈係数を括弧内に示す。
【０２４３】
いくつかの重要な病原菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌に対する活性が見つかった。いくつかの例外を除いて、本発明者らはグラム陰性菌に対する活性をあまり観察しなかった。これらの例外は全て、殺菌性ではなく静菌性の阻害を示した。当然、ＳＧ２７７とＳＧ２９７の両方が増殖を阻害できる他の抗菌剤を産生することも可能であるが、阻害を示した株がいくつかの重要な病原体（Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ、Ｖ．ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓおよびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含んでいたことは注目に値する。
【０２４４】
結論として、本発明者らは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓの分離株が、細胞表面に関連する強力なバイオサーファクタントを産生する可能性があることを示す。本発明者らは、このバイオサーファクタントを「ＡｍｙＣｉｄｅ（商標）」と称する。
【０２４５】
実施例５：インビボでのＣＤＩの阻害
本発明者らは、マウスおよびハムスターを使用して、バイオサーファクタントであるＡｍｙＣｉｄｅ（商標）が、例としてＳＧ２７７を用いた場合にＣＤＩを防止することができるかどうかを決定した。本発明者らは、いくつかの異なる投与を検討した。最初に、無菌無細胞上清（ＳＵＰ）を使用し、次に芽胞の懸濁液（ＳＰＯＲＥＳ）を使用し、最後に（ｉ）ＰＢＳで洗浄して懸濁するか（２７７−ＰＢＳ）、または（ｉｉ）上清に懸濁するか（２７７−ＳＵＰ）のいずれかのＳＧ２７７培養物の懸濁液を使用した。後者のアプローチには、本発明者らは、栄養細胞と芽胞との混合物を含むことが分かったＳＧ２７７の一晩培養物を使用した。対照は、ＰＢＳ緩衝液（ナイーブ(Naive)）を使用して、無菌無細胞上清に懸濁したＳＧ３７８の一晩培養物（３７８）によって提供された。
【０２４６】
マウスにおける評価のために、本発明者らは、２つの属性を使用してコロニー形成、毒素ＡおよびＢの存在、ならびに盲腸におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＣＦＵを定義するＣＤＩのモデルを使用した（４２）。図１Ａに示すレジメンを使用して、動物に４つの異なるＳＧ２７７調製物を投与した。ナイーブ(Naive)群に加え、本発明者らは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対してインビトロ阻害を示さず、陰性対照として機能したＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＳＧ３７８細胞（それらの上清に懸濁）を投与した群も含めた。その結果を図６に示すが、これは、盲腸に細菌のＣＦＵならびに毒素ＡおよびＢが存在しないことによって示されるように、２７７−ＳＵＰまたは２７７−ＰＢＳの５回の投与がＣＤ６３０のコロニー形成を妨げたことを示している（それぞれ、図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃを参照）。ＳＧ２７７に由来する無細胞上清（ＳＵＰ）を使用すると、盲腸内のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＣＦＵおよび毒素のレベルが低い１匹のマウスにおいて、コロニー形成のほぼ完全な停止が達成された。驚くべきことに、ＳＰＯＲＥＳはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのコロニー形成に影響を及ぼさず、ＳＧ３７８およびナイーブ群に類似していた。全体として、本発明者らは、ＳＧ２７７のＣＤＩ予防能を評価する８つのマウス実験を行い、またＳＧ２９７を使用する試験も行ったところ、同一の結論に至った（示されてはいない）。
【０２４７】
ハムスターは、ＣＤＩの評価のための「最も信頼できる基準(gold-standard)」と見なされている（４３）。本発明者らは、それらを使用して、マウスについて上述したのと同じＳＧ２７７処理がＣＤＩを予防する能力を評価した。方法の項で説明したように、本発明者らの投与戦略は、処理当たり６匹のハムスターの群を使用する各治療薬の複数回投与を含んでいた。ＣＤＩの症状を示す動物を剖検し、群の生存曲線を図７Ａに示す。２７７−ＳＵＰは、ＣＤ６３０による致死的チャレンジに対して１００％の保護を提供したことに留意されたい。さらに、２７７−ＰＢＳは６匹のハムスターのうち５匹を保護し、ＳＵＰは６匹のハムスターのうち２匹を保護し、ＳＰＯＲＥＳは６匹のハムスターのうち１匹を保護した。ナイーブ動物およびＳＧ３７８細胞を投与した動物は保護を示さなかった。
【０２４８】
図７Ｂおよび図７Ｃは、盲腸試料におけるＣＤ６３０のＣＦＵおよび毒素のレベルをそれぞれ示している。
【０２４９】
本発明者らが他の３つのハムスター試験を行ったところ、同様の結果が得られ、マウスのデータと合わせると、これは２７７−ＳＵＰまたは２７７−ＰＢＳの懸濁液がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅコロニー形成を防止することを明確に示していた。
【０２５０】
さらに２つの点を挙げることができる。第一に、ＳＰＯＲＥＳ（すなわち、ＳＧ２７７芽胞のみの懸濁液）の有効性は限られているため、本発明者は、バイオサーファクタントである、ＡｍｙＣｉｄｅ（商標）を分泌するには不十分な数の芽胞が消化管で発芽する可能性があると想定しなければならない。第二に、インビトロデータにもかかわらず、無細胞上清は細胞と組み合わせた場合ほど効果的ではなかった。上記に示すように、本発明者らは、ＡｍｙＣｉｄｅ（商標）が細胞エンベロープに部分的に付着した状態で残り、おそらく細胞壁に結合した場合により有効性が高いと予測するため、この有効性への寄与は重要である可能性が高い。加えて、本発明者らは、細胞が消化管で一過性に増殖し、ＡｍｙＣｉｄｅ（商標）のレベルをさらに高めると予測する。示されていないデータにおいて、本発明者らは、単回投与としてマウスに投与されたＳＧ２７７が、投与後最大１０日間持続することを発見した（糞便排出により決定される）。
【０２５１】
実施例６：活性化合物の同定
表８に示すように、本発明者らは、異なる分子量（ｍｗｔ．）カットオフの遠心濃縮器を用いて、濾過滅菌（０．４５μｍ）したＳＧ２７７の上清中に含まれるＡｍｙＣｉｄｅ（商標）のおよその分子量を決定した。
【０２５２】
【表９】
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【０２５３】
全活性の約５０％が３０〜１００ｋＤａ画分に存在し、さらに約５０％が＞１００ｋＤａ画分に存在していたことから、ＡｍｙＣｉｄｅ（商標）が複合体として存在し、物理的に不安定であり、いくつかの活性を保持しながら解離する可能性があることが示唆される。
【０２５４】
２０％硫酸アンモニウム（ＡｍＳＯ４）を使用して、本発明者らは、沈殿物がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する活性だけでなくバイオサーファクタント活性も有することを見出した。驚くべきことに、機能的に活性なＡｍｙＣｉｄｅ（商標）調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、分子量範囲５〜２００ｋＤａではクマシー染色されたタンパク質バンドは生じなかったが、約１ｋＤａの推定分子量で、バンドに似た単一の白色の特徴が見られた（ＧＢと表示される）。タンパク質は、２０％〜７０％の沈殿物を合わせた後にのみ明らかになった。ゲルからＳＤＳが溶出された場合、同じバンド（ＧＢと表示される）に対応するＣＤ６３０の生細菌に対する機能的活性が観察された（図８Ａを参照）。このバンドは「オイルレッドＯ」（脂質）では弱く染色されたが、アルシアンブルーでは明確に染色された（図８Ｂを参照）。２０％ＡｍＳＯ４は高分子量または疎水性の分子のみを沈殿させるはずであるため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけの低分子量は、ＡｍＳＯ４沈殿とは一致しなかった。以下に示すように、分子量は活性部分の分子量に対応するが、本発明者らは、白色バンドも複合体の構造に関連する異常な移動を表す可能性があると推測する。
【０２５５】
２０％ＡｍＳＯ４沈殿物のゲル濾過によっても、活性な「ＡｍｙＣｉｄｅ（商標）」成分がタンパク質画分に対応しなかったことが確認された（図８Ｃを参照）。最後に、本発明者らは、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を使用してＡｍｙＣｉｄｅ（商標）を沈殿させることができ、ＣｓＣｌ勾配による遠心分離後、３つの明確なバンドが存在し、そのうちバンドＢ２のみがＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する機能的活性を有することを見出した（図８Ｄを参照）。
【０２５６】
無菌濾液に対するＡｍＳＯ４沈殿も行った。この方法により、（ＭＷＣＯ実験で明らかなように）機能的活性に関与する高分子量種の沈殿が可能になり、それらと同時に共精製されるタンパク質の量を減少させることができた。活性種を高分子量種の粗分離によってさらに精製した。図２７は、活性種を含む溶出画分からのタンパク質のＳＤＳ除去を示している。マイクロプレートアッセイを使用して、画分をＣＤ６３０に対する活性（希釈係数として示される）について試験し、活性な画分を合わせ、洗浄して、過剰なＳＤＳを除去した。図２４は、内部マーカー（ＢＳＡとリゾチーム）を使用した同様の分析を示す。この分析は、活性がタンパク質である可能性が低いことを示している。
【０２５７】
電子顕微鏡により、ＣｓＣｌ勾配遠心分離およびサイズ排除クロマトグラフィーの両方の後に、活性画分に存在する明確な凝集体が明らかになった（図９Ａおよび９Ｂを参照）。興味深いことに、この分析により、直径約２０〜３０ｎｍの球状の顆粒のクラスターが明らかになった。アルシアンブルー染色は多糖成分を意味していたため、これは菌体外多糖が豊富な外側細胞壁に関連する粘液に対応していた可能性があり、これらの株がムコイドコロニーおよびロバストなバイオフィルムを形成する能力と一致する。
【０２５８】
本発明者らはまた、ＡｍＳＯ４沈殿物中のγ−ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）の存在、ならびにＳＧ２７７およびＳＧ２９７ゲノム上のγ−ＰＧＡ生合成遺伝子の存在も確認した。総合すると、ＡｍｙＣｉｄｅ（商標）は、細胞表面粘液に由来する菌体外多糖とγ−ＰＧＡの組み合わせを担持する、高分子量の、主に非タンパク質性の複合体を構成しなければならない。
【０２５９】
ＡｍｙＣｉｄｅ（商標）をさらに特徴付けるために、本発明者らは、微量希釈アッセイを使用したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて活性画分を同定し、次いでそれらをＲＰ−ＨＰＬＣによりさらに分析した。ＲＰ−ＨＰＬＣにより１５の明確な画分が得られ（図１０Ａを参照）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦを使用して、これらをリポペプチドの異なるアイソフォーム、イツリンＡ、フェンギシン、サーファクチン、およびマイコスブチリンとして同定した（表９を参照）。
【０２６０】
【表１０−１】
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【０２６１】
【表１０−２】
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【０２６２】
イツリン、フェンギシン、およびサーファクチンの同一性も、ＮＭＲを使用して確認した（示されていない）。加えて、本発明者らは、２つのさらなるリポペプチド、モハベンシンＡ（４４）およびクルスタキン（４５）の証拠も観察した。図１０Ａおよび図１０Ｂならびに表９に示すように、微量希釈アッセイを使用して、８つの画分（全てイツリンＡおよびサーファクチンのアイソフォーム）が、低い活性ではあるが、抗ＣＤ６３０活性を有することを見出した。
【０２６３】
ＳＧ２７７の無菌濾液をＡｍＳＯ４で沈殿させ、サイズ排除クロマトグラフィーに供し、活性画分（５ｍｇ）を凍結乾燥し、次いで、水、ＰＢＳ、または５０％メタノールのいずれかに懸濁し、室温で１時間インキュベートした。本発明者らは、メタノールが複合体を解離させ、イツリンＡ、サーファクチン、フェンギシンおよびミコサブチリンの既知の分子量と一致する５ｋＤａ未満の低分子量化合物に活性をシフトできることを実証した（表１１を参照）（４６、４７）。しかしながら、イツリンＡおよびサーファクチンの商業的供給源を使用した場合、本発明者らは、単独であろうと組み合わせであろうと、ＣＤ３６０に対するいかなる活性も示すことができなかった。
【０２６４】
【表１１】
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【０２６５】
興味深いことに、本発明者らは、７つの陽性ＲＰ−ＨＰＬＣ画分を組み合わせると、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する活性が、個々の画分の累積活性と比較してほぼ３倍増加することを発見した。ＲＰ−ＨＰＬＣ画分１〜１５を再構成した場合、抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ活性は、個々のＲＰ−ＨＰＬＣ画分の累積活性よりも少なくとも４倍高かった（図１０Ｂを参照）。総合すると、これにより個々の部分の強力な相乗効果だけでなく、単独では活性を有しない画分（すなわち、活性を示さない陰性画分）の寄与も示唆された。
【０２６６】
したがって、本発明者らは、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓによって産生されるＡｍｙＣｉｄｅ（商標）が、細胞エンベロープと結合する水溶性複合体であり、イツリンＡ、サーファクチン、マイコスブチリン、フェンギシンＡおよびＢの異なるアイソフォームを含むことを示した。本発明者らは、組み合わせると、活性画分の見かけの分子量は個々のモノマーの分子量よりも高く、多くのバイオサーファクタントの特徴であるミセルが形成されることが示唆されることを示した（４９）。有利には、これらのミセルは、ナノ構造に凝集し、より安定であり、分解に対して耐性があり、高い溶解性を有し、モノマー形態よりも高い抗菌活性を保持することが示されている（５０〜５２）。いずれか特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、ＡｍｙＣｉｄｅ（商標）が、特定のＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株においてミセルを形成するのに十分な濃度で産生されるリポペプチドを含む、異なる因子の混合物である可能性が高いと推測する。
【０２６７】
混合ミセルが形成されている可能性がある。ミセルは「実験室ベース」の現象と見なされる場合があるが、ＳＥＣに従って取得された球状顆粒の凝集体のＳＥＭ画像は、合成で生成されたミセルに似ている（５３）。本発明者らは、ＡｍｙＣｉｄｅ（商標）ミセルが、何らかの方法で、栄養細胞粘液を包む豊富な菌体外多糖中で安定化または封入されると考える。ここで調べた「活性な」株は、大量のバイオフィルムおよびムコイドコロニーを産生したが、どちらの属性も、大量の細胞外多糖類の生成を必要とする（５４）。
【０２６８】
界面活性剤分子は、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）よりも高い濃度でミセルを形成する（４９）。本発明者らのＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株によって十分に高い濃度で界面活性剤が産生された場合、このことは、活性が高分子量画分とどのように関連していたかを説明できる。限外濾過は、ＣＭＣ界面活性剤よりも高い濃度で精製できるバイオサーファクタントを精製および濃縮するために使用されている（５８）。
【０２６９】
図１２Ａに示すように、ＳＧ２７７のＡｍＳＯ４で沈殿させた無細胞上清からのＳＥＣ画分から開始して、本発明者らは３０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）フィルタを通して試料を遠心分離（８，０００×ｇ、１５分）し、測定される活性が５ｋＤａ超の分子量のミセルに関するものであることを確実にした。図１２Ｂに示すように、高分子量ミセルを含む保持液を回収し、ＭｅＯＨを５０％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで加え、室温で１時間インキュベートした。得られた混合物を、５ｋＤａのＭＷＣＯフィルタを使用して上記と同じ条件下で遠心分離し、低分子量バイオサーファクタント分子を含む濾液を回収し、等しい体積で２つの別々のエッペンドルフにアリコートし、真空蒸発させた。残ったペレットをｄＨ２０（図１２Ｃ）または５０％ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）（図１２Ｄ）のいずれかに再懸濁し、５ｋＤａまたは３０ｋＤａのＭＷＣＯフィルタを使用して、両方とも上記と同じ条件下で遠心分離した。保持物(retentate)および濾液を回収した。全ての画分を体積で正規化し、微量希釈アッセイを使用してＣＤ６３０に対する活性について試験した。
【０２７０】
その結果、本発明者らは、メタノール（５０％）がこの活性を妨害することができることを示し、活性を５ｋＤａ未満の分子量と相関させることができた。次いで濾液を水に溶解すると、活性の分子量は＞５ＫＤａ（および＞３０ｋＤａ）に戻った。これは、抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ活性の見かけの高い分子量が界面活性剤ミセルの形成に対応することを示唆している。界面活性剤は、これらの細菌によって十分に高いレベルで産生され、個々の界面活性剤または混合集団のいずれかからなるミセルを形成することができる。
【０２７１】
動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、本発明者らはｄＨ２０中のＳＧ２７７  ＡｍＳＯ４沈殿物のＳＥＣ画分を調べ、微量の凝集体とともに、３ｎｍ（±１ｎｍ、図１３Ａを参照）の平均サイズを有する、ミセルである可能性が高い１つの大きな集団を明らかにした。ｄＨ２０に懸濁したＲＰ−ＨＰＬＣ画分を調べると、画分３（Ｃ１５イツリンＡ）のみが直径７ｎｍのミセルを有していた（図１３Ｂを参照）。Ｃ１５サーファクチンに対応する、画分１３については、７０〜１１００ｎｍの凝集体のみが観察された（図１３Ｃを参照）。このデータは、Ｃ１５イツリンＡが水に溶解してミセルを形成できることを示している。ＳＥＣ画分中に存在するミセルはより小さいが、約６５ｋＤａの球状タンパク質と同等であり、活性なＳＥＣ画分が３０ｋＤａのＭＷＣＯフィルタを通過できないことと一致する。Ｃ１５イツリンＡが７ｎｍの粒子を示したのに対し、なぜＳＥＣ画分が３ｎｍ未満の粒子を有していたのかは明らかではないが、他の研究（５９）でサイズの違いが報告されており、いずれか特定の理論に拘束されることを望むものではないが、おそらくミセルのサイズは、リポペプチドの相対濃度および混合ミセル（Ｃ１５イツリンＡを含み得る）の形成に関連している可能性が高い。
【０２７２】
Ｃ１５イツリンＡはミセルを形成できるリポペプチドの一例であり、水溶性である。本発明者らは、Ｃ１５イツリンＡが他のリポペプチドを水に可溶化させることができ、潜在的に混合ミセルを形成してそれらに細菌細胞を標的とさせることができる可能性があると推測する。これを試験するために、本発明者らは、水溶化されたＣ１５イツリンＡを市販のサーファクチン（Ｓｉｇｍａ  Ｓ３５２３；Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来およびＣ１３−Ｃ１５サーファクチンの混合物）と混合した。市販のサーファクチンは水溶性ではなく、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して活性を示さなかったが、Ｃ１５イツリンＡはマイクロプレートアッセイを使用すると１／４０の機能的活性を示した。これらの仮説を裏付けるように、組み合わされたＣ１５イツリンＡ＋Ｃ１５サーファクチンはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対してより高い活性（１／１６０）を示した。これは、ひいては、本発明者らが仮説を立てたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する活性に関する可能な機序を明らかにするものである。Ｃ１５イツリンＡが存在すると、Ｃ１５サーファクチンを水に可溶化することができ、おそらくＳＧ２７７および他のＢａｃｉｌｌｕｓ種の細胞壁の中または上に存在する他のリポペプチドの全てまたは多くを可溶化することができる。活性のための重要な要件は、生成されるリポペプチドの濃度である（ミセルは臨界閾値を超えるレベルでのみ形成され得るため）。形成されたミセルは混合ミセル（すなわち、異なるリポペプチド種を有するが、全てがＣ１５イツリンＡを有する）である可能性が最も高い（少なくともＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓの場合）。
【０２７３】
ＳＥＣ画分中の水溶性ミセルの３ｎｍサイズは、ミセルがＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの細胞エンベロープとどのように接触することができるかについても説明できるため、重要であると考えられる。バイオサーファクタントとして、分子はＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（または他の感受性の細菌）のリン脂質二重層と相互作用しなければならない。
【０２７４】
Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＳＧ２７７およびＳＧ２９７からのＲＰ−ＨＰＬＣ画分の比較（図１４を参照）は、ＳＧ２９７とはやや異なるプロファイルを示し、新しいイツリン種（スキャンで１３００〜１６００）を示した。
【０２７５】
ＳＧ２７７と２つのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ陽性株（ＳＧ８３およびＳＧ１４０）との比較により、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株がイツリンを産生しなかったことが示され（図１５）、これから、ｉ）これらのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの（ＳＧ２７７およびＳＧ２９７と比較して）低下した活性がイツリンＡの不在によって説明され得る可能性が示唆され、また、ｉｉ）イツリンＡ以外のリポペプチドが可溶化に寄与していることから、リポペプチドの複雑な化学量論関係が活性に寄与することが示唆される。
【０２７６】
最後に、「陽性」のＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ株（ＳＧ１３０）はバイオサーファクタントを産生しないことが示され（図１６を参照）、本発明者らの本来の観察と一致した（実施例１を参照）。
【０２７７】
実施例１で報告された元のマウス実験に戻ると、本発明者らは、第一に、サーファクチンおよびイツリンがマウスの糞便および腸ホモジネート（空腸、回腸、盲腸）中で検出可能であったこと、第二に、３つのマウス−Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ株（ＳＧ１７、ＳＧ８３、ＳＧ１４０）がサーファクチンを産生したことを確認した。図１１は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＧ１７のＲＰ−ＨＰＬＣ画分を示す。興味深いことに、ＳＧ１７（ＳＧ８３およびＳＧ１４０等）にはイツリンが含まれていないようであったが、フェンギシンおよびサーファクチンは豊富だった。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対するこの株の活性はＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株よりも低かったため（図３Ａを参照）、本発明者らは、活性がＡｍｙＣｉｄｅ（商標）中のリポペプチドの存在量と相関しており、より強力な活性のために、イツリンをフェンギシンおよびサーファクチンと組み合わせることでより高い効果が生じると考える。加えて、後述するように、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株は、特定の抗生物質、特に、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓにおいてより豊富（またはより安定）なクロロテタインの産生にはあまり適していないようである。このことはまた、マウス由来のＢａｃｉｌｌｕｓ株がＣＤＩを制御する能力は、おそらく抗生物質と組み合わせたＡｍｙＣｉｄｅ（商標）バイオサーファクタントによるものであったことを示唆している。
【０２７８】
実施例７：溶菌活性と静菌活性
粗ＳＥＣ活性画分の構成種をさらに調べるために、ＳＥＣ−ＨＰＬＣカラムを使用して分離を行った（図１７）。このカラムは、２００〜３，０００Ｄａの範囲の分子を分離する。上記と同じ変性条件を提供するイソクラティック緩衝液(isocratic buffer)として、アセトニトリルを使用した。４つの画分を回収して、ＣＤ６３０に対する活性を試験し、ＭＳにより分析した。
【０２７９】
細胞増殖の対数期（ＯＤ６００  約０．３）に試験物質を加えることにより、画分１〜３がＣＤ６３０の培養物の増殖を阻害する能力について分析した。試験する各試料が同じ活性／体積を有するように、試験物質をｄＨ２０中で希釈して正規化した。１２０ｍｌの希釈した試験物質を１ｍｌのＣＤ６３０培養物に加え、ＯＤ６００測定のために０．２ｍｌを毎時間除去した。この試験では、試験物質は表１２に示す通りであった。
【０２８０】
【表１２】
2021515031.tif 000034
【０２８１】
光学密度（ＯＤ６００）は、試験物質の添加前および添加後に測定した。ＯＤ６００の減少は溶菌活性を示し、ＯＤ６００の増加の失速は、静菌性または殺菌性のいずれかの増殖を示す。一方、ＣＦＵ／ｍｌの低下は、溶菌活性および／または殺菌活性の両方を示す。（図２２Ａおよび図２２Ｂならびに表１３）。
【０２８２】
【表１３】
2021515031.tif 000035
【０２８３】
各画分の基本的な同一性を以下の表１４に示す。
【０２８４】
【表１４】
2021515031.tif 000036
【０２８５】
画分１（サーファクチン）は溶菌性であったが、画分３は殺菌性であった。ＳＥＣ粗画分は部分的な溶菌活性を示した。いずれか特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、これは、ＡｍＳＯ４沈殿物からのＳＥＣ画分の調製に使用されたＳＤＳがミセルを破壊し、ひいては活性を破壊したためであると考える。総合すると、これは、ＡｍｙＣｉｄｅ（商標）複合体の機能が分子組成に依存しており、個々の成分の濃度の変動が活性に影響を与えることを示唆している。興味深いことに、本発明者らは、画分３が有意に減少し、また時にはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株に存在しないことを観察しており、それがＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する活性の低下を説明すると思われる。
【０２８６】
画分１〜３に対してさらなる分析を行い、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析からの個々の画分を、今度はＲＰ−ＨＰＬＣカラムに流した（図１８Ａ〜図１８Ｃ）。並行して、本発明者らは、比較のためにＳＧ２７７のＳＥＣ活性画分（上記の図１０と同じ）も流した。見て分かるように、画分１はサーファクチンに対応し、画分２はイツリンおよびフェンギシンに対応し、画分３は吸収を示さなかったことから、ペプチド成分がないことが示唆される。
【０２８７】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ画分３をＲＰ−ＨＰＬＣカラムに適用し、３６の画分を抗ＣＤ６３０活性について分析した。並行して、ＳＧ２７７の全粗ＳＥＣ画分をＲＰ−ＨＰＬＣに流し、３６の画分を調べた（図１９）。
【０２８８】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ画分３の画分１〜５はＣＤ６３０に対して明らかな活性を示し、これらの画分のＭＳ分析を表１５に示す。
【０２８９】
並行してＲＰ−ＨＰＬＣに流したＳＧ２７７の場合、ＳＧ２７７粗ＳＥＣの画分４および画分３０〜３２が活性を示した。画分３０〜３２はサーファクチンであり、質量分析を使用した画分４の同一性を下記表１６に示す。イツリン画分には低い活性が見られたこともあるが、ここに示す分析では見られなかったことに留意されたい。画分４で明確に識別できる種は、抗生物質クロロテタインであった。これは、ＡｍｙＣｉｄｅ（商標）がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅをどのように死滅させるかを理解するための重要な唯一の化合物であった。
【０２９０】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ画分３の画分１〜９は、２２０ｎｍで吸収しないため、活性な画分（１〜９）がタンパク質性またはリポペプチドである可能性は低い。しかしながら、サーファクチンはまた、複合体を示唆するＣＤを阻害する際の成分でもある。
【０２９１】
【表１５】
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【０２９２】
【表１６】
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【０２９３】
ＳＥＣ画分に対してＣｒｙｏ−ＥＭ分析を行ったところ、１０ｎｍ未満のサイズで密に詰まった小さなディスク状の物体が示された。また、約１６０ｎｍの直径の大きなディスクが時折見られた。これらの物体は、サイズが１０ｎｍ未満および約１６０ｎｍのミセルに似ていた（図２０）。イツリンＡ（１〜３）フェンギシン（７〜９）およびサーファクチン（１０〜１４）に対応する個々のＲＰ−ＨＰＬＣ画分はミセルを示さなかったが、代わりに棒状のフィラメント／ファイバーを示した。
【０２９４】
ＤＬＳ分析（動的光散乱）は、ＳＥＣ画分がｃｒｙｏ−ＥＭ分析（図２１）と一致する３ｎｍの粒子を呈することを示し、Ｃ１４サーファクチン（ＲＰ−ＨＰＬＣの画分１３）は、ｃｒｙｏ−ＥＭ分析を使用するとファイバーに対応する大きな粒子を示した（示されない）。
【０２９５】
本発明者らはまた、ＤＬＳを使用して、同定された因子の相乗効果も評価した（図２３）。この分析により、イツリン、フェンギシン、およびサーファクチンの画分の粒径が明らかになった。イツリン、フェンギシン、およびサーファクチンの組み合わせは、粒径を変化させ、協同性(cooperativity)とより大きな複合体の構築を示す。
【０２９６】
同様の研究において、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのリポペプチドは、組み合わせるとミセルサイズが変化することが示されている（Ｊａｕｒｅｇｉ、Ｃｏｕｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。例えば、サーファクチン（５〜１０５ｎｍ）とマイコスブチリン（８〜１８ｎｍ）とを組み合わせると、８ｎｍの混合ミセルが作られる。これは、本発明者らが観察したものと同様である。
【０２９７】
本発明者らはまた、微量希釈アッセイを使用して、ＣＤ６３０に対する活性も評価した（表１７）。
【０２９８】
【表１７】
2021515031.tif 000039
【０２９９】
分子量カットオフは、分子のサイズ（上記の表）が３０ｋＤａ超であることを示しているが、全てのリポペプチドは、普遍的に小さいサイズ（４００〜１．５ｋＤａ）のサイズ範囲を示す。ＳＥＣカラムで分離すると、分子の溶出は、タンパク質標準と比較して、＞２０ｋＤａのサイズを示唆する（図２４）。
【０３００】
いずれか特定の理論に拘束されることを望むものではないが、これらの２つの観察は、これらの成分が溶液中ではモノマーであるが、互いに相互作用して、ＳＥＣ分離中に同じ画分に溶出する単一の複合体をもたらすことを意味している。興味深いことに、メタノールをＳＥＣ溶液に加えると、成分間の全ての相互作用が壊れ、モノマーとしてのリポペプチドのサイズである５ｋＤａ未満に分子量が減少する。メタノールを溶液に加えると、溶液の疎水性が高まり、界面活性剤分子のより疎水性の高い溶媒と疎水性の尾の間の分子間力が増加するため、その結果としてミセルが溶解する。Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるリポペプチドと糖脂質の同様のブレンドの例を提供している（Ｃｈｅｎｇ、Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。低分子量(dye front)側に沿って流れるＳＤＳ−ｐａｇｅゲルに見られる活性のバンドと比較して大きな分子量を意味するＣｓＣｌ２超遠心分離を考慮すると、サイズの不一致も観察されることに留意されたい。ＳＤＳ−ｐａｇｅは、複合体を個々のより小さな成分に分離すると考えられる。
【０３０１】
異なる因子の組み合わせの評価を行った。図２５に示すように、ＳＥＣ−ＨＰＬＣの画分１〜３（図１７）を単独でまたは組み合わせてＣＤ６３０に対する活性について調べた。全ての試料／画分は、組み合わせる前に正規化した。
【０３０２】
画分１＝サーファクチン
画分２＝イツリンおよびフェンギシン
画分３＝クロロテタイン。
【０３０３】
画分１＋２＋３の添加は、１、２、もしくは３のいずれか単独または１＋２、１＋３もしくは２＋３よりも高い活性を示した（１／６４０）。この場合、元のＳＥＣ画分は１／１２８０であった（合計）。
【０３０４】
図に示すように、ＲＰ−ＨＰＬＣ分画からの画分（図２６を参照）を一緒に合わせた。
【０３０５】
この分析では、イツリン（Ｉ）、フェンギシン（Ｆ）、およびサーファクチン（Ｓ）の市販の（ＳＩＧＭＡ）試料を使用したが、ＣＤ６３０単独または組み合わせに対する活性を示したものはなかった。
【０３０６】
画分１〜３＝イツリンＡ
画分７〜９＝フェンギシン
画分１０〜１４＝サーファクチン。
【０３０７】
ＲＰ−ＨＰＬＣ画分の場合、イツリンおよびフェンギシンは低い活性を示し、サーファクチンよりも低かった（画分１０〜１４）。個々のピークの和は１／３２０であり、イツリン（画分１〜３）をフェンギシン（画分７〜９）およびサーファクチン（画分１０〜１４）と組み合わせると、活性は１／６４０に増加したが、全ＳＥＣ画分よりは依然として低かった（１／１２８０）。
【０３０８】
総合すると、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣ画分に関するこのデータは、個々の活性画分を組み合わせた場合に、数学的な和よりも大きな相乗効果を示している。
【０３０９】
実施例８：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する活性
ＳＧ２７７からのＡｍＳＯ４材料をＳＥＣクロマトグラフィーに供し、２０の画分をＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する活性について分析した。前述のＳＥＣ画分の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を、薬剤感受性および薬剤耐性のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ増殖の阻害について決定し、抗生物質と比較した。両方のマイコバクテリア培養物について、画分１、２、３、１５および１６で高い阻害活性が観察された（表１８および図２８）。画分１５および１６はまた、インビトロ微量希釈アッセイを使用するとＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０に対する活性を示した。
【０３１０】
【表１８】
2021515031.tif 000040
【０３１１】
リファマイシンは結核治療の標準と考えられている。このデータは、ＲＰ−ＨＰＬＣ画分、特に画分１〜３ならびに１５および１６がＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する活性を有していたことを示している。
【０３１２】
実施例９：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対する活性
インビトロ活性
インビトロアッセイを使用してＳ．ａｕｒｅｕｓ（ＤＬ１０６５）に対する活性を評価した。Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して細胞外活性を示し、かつＡｍｙＣｉｄｅ（商標）複合体を有する全ての株であった。ＳＧ３７８は、抗ＣＤ活性を示さなかったＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株であった。その結果を表１９に示す。
【０３１３】
【表１９】
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【０３１４】
インビボ活性
本発明者らはまた、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する活性を評価するために、上記の方法の項に記載されるようなインビボアッセイを行った。
【０３１５】
様々なＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株の無菌濾液を、指数関数的に増殖するＳ．ａｕｒｅｕｓの培養物に加えた。細胞増殖は、光学密度測定値によって監視した（図２９）。ＳＥＣ（サイズ排除画分）を使用すると、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの静菌性阻害も観察された。
【０３１６】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する細胞外活性は、３つのＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株、ＳＧ１８５、ＳＧ２７７およびＳＧ２９７に明らかに存在していた。
【０３１７】
実施例１０：Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉおよびＶ．ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓに対する活性
ＳＧ２７７およびＳＧ２９７の培養上清を、Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉおよびＶ．ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓの培養物に最終濃度１／１０で加えた。
【０３１８】
ＳＧ２７７およびＳＧ２９７の両方の上清が、両方のＶｉｂｒｉｏ株（Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉおよびＶ．ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）に対して活性を示した（図３０および図３１）。
【０３１９】
実施例１１：凍結乾燥形態のＡｍｙＣｉｄｅ（商標）の安定性および活性の試験
凍結乾燥したＳＧ２７７の安定性を様々な温度で試験し、新鮮なＳＧ２７７６と比較した。図４は、ＳＧ２７７が凍結乾燥形態で安定であることを強調している。
【０３２０】
凍結乾燥した細菌（芽胞と栄養細胞の混合物）は、ＣＤＩを予防する細菌の有効性を損なわない。１００％の保護が達成される（図３２〜図３５）。これは、活性物質が凍結乾燥を生き延びる(survive)こと、また最終製品としての使用が奨励されることを示す。
【０３２１】
上清材料の投与は６６％の保護を示し、ＳＥＣで精製した材料は３３％の保護を示す。ＣＤが依然として定着している動物でさえ、ＣＤのＣＦＵレベルが低下する。これは、１００％の保護が得られないことは、おそらく投薬量および／または配合に起因することを示唆している。すなわち、より高い用量を使用することにより１００％の保護が与えられるはずである。
【０３２２】
考察
標的とする腸内微生物叢の修復は、ＣＤＩの治療に効果的であることが証明されているが、作用機序は依然としてよく理解されておらず、腸内微生物叢の再均衡化、競合的排除、および捕食性バクテリオファージの寄与が含まれる（１０〜１２）。本発明者らは、これらの方法が、ＣＤＩの制御のための好気性芽胞形成菌の寄与を見落としていたと考えられることを示す。これにはいくつかの理由がある。第一に、方法は、細菌療法の候補を特定するためにシーケンスまたはメタゲノムベースの方法を用いてきた。第二に、以前の方法は全て嫌気性細菌に焦点を当てており、少数の細菌集団が腸内感染の制御において重要な役割を果たす可能性は低いと考えている。
【０３２３】
対照的に、本発明者らのアプローチは、嫌気性細菌ではなく好気性芽胞形成細菌に焦点を当てることと同時に、機能的活性を有する細菌の同定のための従来の微生物学的方法に焦点を当ててきた。ＣＤＩをモデル胃腸病原体として使用すると、本発明者らの研究からの好気性芽胞形成菌のコホートは主にＢａｃｉｌｌｕｓ種であり、当然、これらは通常、標準的なメタゲノムまたはシーケンスベースのアプローチを使用してもほとんど検出不能であろう。これらの細菌は異所性集団を構成し、それは本発明者らの好気性芽胞形成菌への曝露がＣＤＩの制御において重要な役割を果たすことを意味する。
【０３２４】
ＣＤＩの発生率は工業先進国で最も高く、最も顕著なのが米国であり、英国がそれに続いており（６２、６３）、加工食品の増加と環境由来細菌への曝露の減少が、これらの国々で発生率が非常に高い理由の重要な要因であるかもしれないと言える。衛生仮説は、感染症の減少をもたらした先進工業国の生活習慣の変化と、アレルギー性疾患および自己免疫疾患の同時発生とを結びつけようとする（６４〜６７）。本発明者らは、広くは、同じ現象が、米国および英国で観察されるＣＤＩの高い発生率の根底にある要因であると考える（６８、６９）。例えば、食事および抗生物質の使用量の増加による環境微生物への曝露の減少は、Ｂａｃｉｌｌｉへの曝露を低下させると予想することができ、部分的にＣＤＩの発生率増加を説明し得る。他者によって指摘されるように、根本的な原因は多元的である可能性が高いが（７０）、本発明者らは、環境微生物への曝露の寄与がこれまで見過ごされてきたと考える。徹底的または適切な診断の欠如は、発展途上国におけるＣＤＩの低い発生率を部分的に説明し得るが、これらが抗生物質の乱用および過剰使用の経歴を持つのと同じ国であることは興味深い（７１）。また、ＣＤＩは現在、多くの開発途上国で、生活水準、衛生状態、および栄養の改善と並行して出現し始めているということも興味深い（７２，７３）。本発明者らは、環境由来細菌への曝露がＣＤＩの制御および他の胃腸疾患においても重要な役割を果たすと推測する。
【０３２５】
Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを含むＢａｃｉｌｌｕｓ種が抗菌剤を産生する能力は周知であり、非リボソーム的に産生される環状リポペプチド（イツリンおよびサーファクチンおよびフェンギシン）は特に強力なバイオサーファクタントと見なされている（４７、７４〜７８）。これらの多くは、植物病害を防除するための抗真菌剤として商業的に使用されている（７９〜８１）。本発明者らは、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓによって産生される、本明細書において「ＡｍｙＣｉｄｅ（商標）」と称される機能性バイオサーファクタントまたは「抗生物質」が、細胞エンベロープと結合し、クロロテタインとともにリポペプチドバイオサーファクタントを含む大きな複合体であることをここに示す。バイオサーファクタントの組み合わせは相乗的であり、高濃度ではミセル、おそらく混合ミセルを形成する。これらのＡｍｙＣｉｄｅ（商標）ミセルの主な組成はサーファクチンであるが、他のリポペプチド（イツリンＡ、サーファクチン、マイコスブチリン、ならびにフェンギシンＡおよびＢ）または糖脂質が、同様のミセルを生成するために高濃度で取って代わることもできる。これらのミセルは、バチルス種(Bacillus species) て産生される抗菌剤、特にクロロテタインを組み合わせるまたは濃縮する独自の能力を備えた複合体を形成すると考えられる。クロロテタインはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して明らかに殺菌性であるが、リポペプチドはそれ自体が溶菌性であり、いずれか特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、リポペプチドとクロロテタインとの複合体が、おそらく一方または両方の成分（リポペプチドおよび／またはクロロテタイン）の安定性を高めることによって、または結合力、すなわち殺傷率を増加させることによって、より大きな活性を促進すると考える。例えば、いずれか特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、バイオサーファクタントのミセルの存在下でまたは複合体として、抗生物質、すなわちクロロテタインは、安定性が向上するか、または密度が高くなり、したがって、より標的化された活性を有すると考える。クロロテタインは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓによって一般的に産生される抗生物質である、バシリシン(Bascilysin)に類似した、非リボソーム的に合成されるジペプチド抗生物質である（Ｐｈｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｉｌｙｓｉｎ，ｃｈｌｏｒｏｔｅｔａｉｎｅ，ａｎｄ  ｉｔｕｒｉｎ  ａ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＣＳ９３  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐｏｚｏｌ，ａ  Ｍｅｘｉｃａｎ  ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ  ｍａｉｚｅ  ｄｏｕｇｈ”，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７０（１）：６３１−６３４）。本明細書に記載されるＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株は全てバシリシンを産生し、それらは同じまたは改変された生合成経路を使用する可能性が高い。バシリシンは、Ｌ−アラニンおよびＬ−アンチカプシンで構成されるジペプチドであり、「トロイの木馬抗生物質(Trojan Horse antibiotic)」として知られている。感受性の高い細胞はジ���プチドパーミアーゼを使用してバシリシンを運び入れ、その後ペプチダーゼが細胞内でアンチカプシンを放出する。アンチカプシンは、グルタミンの類似体として、グルコサミンシンターゼを阻害することができる。グルコサミンシンターゼの不可逆的な阻害は、細菌または真菌細胞の溶解をもたらす。クロロテタインは、Ｌ−アラニンに融合した珍しい塩素含有アミノ酸（３’−クロロ−４’−オキソ−２’−シクロヘキセニル）アラニンを有するジペプチドであるが、おそらくバシリシンと同様の作用機序を有する。
【０３２６】
ＡｍｙＣｉｄｅ（商標）は、複合体を形成し、細胞壁に結合する、リポペプチドと抗生物質の混合物を含むため、特に珍しい。本発明者らは、栄養細胞を粘液で包む豊富な菌体外多糖によって凝集が起こると推測する。この多糖成分はまた、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓの粘液に典型的に存在するγ−ＰＧＡを含む（８２）。
【０３２７】
ムコイドコロニーおよび菌体外多糖の産生は、多くのＢａｃｉｌｌｕｓ株に特徴的であり（５４）、おそらくはバイオフィルムの形成の助けとなる。本発明者らは、バイオサーファクタントの封入にさらなる役割があると推測している。本明細書に示されるように、個々の部分として、それらの活性が大幅に低下するため、バイオサーファクタントの凝集は、これらの抗生物質の性能も向上させるはずである。本発明者らは、これらのバイオサーファクタントの活性は、組み合わせたときに大幅に増加することを観察している。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは細胞を包む保護タンパク質性Ｓ層を有するため、ＡｍｙＣｉｄｅ（商標）がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅをどのように溶解するかは興味深い問題である（６０）。Ｓ層コーティングは細胞壁を完全に覆うことができない可能性がある、または代替的に、自己組織化Ｓ層タンパク質のアレイがＡｍｙＣｉｄｅ（商標）によって破壊または変性される可能性がある。Ｓ層タンパク質の規則正しいアレイによって形成される細孔は、直径が約３０Åであり（６１）、したがって、ＡｍｙＣｉｄｅ（商標）がこの障壁を透過することは可能である。
【０３２８】
結論
結論として、本発明者らは、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して驚くべき活性を有し、これは、バイオサーファクタントおよびクロロテタイン、ならびにｉ）ミセルを形成する、ｉｉ）相乗的に作用する、およびｉｉｉ）他の抗生物質を濃縮するまたは安定させるそれらの能力に起因し得ることを示した。これらのバイオサーファクタントは、サーファクチン、イツリン、フェンギシン等の異なるアイソフォームを含む（図１０、図１４、および図１５、ならびに表９を参照のこと）。本発明者らは、アイソフォームは株間で多少異なるため、正確なアイソフォームは重要ではない場合があるが（図１４を参照）、それらの化学量論および濃度が重要であり得、使用または生成されるバイオサーファクタントが多いほど、抗菌活性と相関していると考えられることを示した（図１０Ｂを参照）。本発明者らは、驚くべきことに、均質または不均質な混合物にかかわらず、より高い濃度のバイオサーファクタントがミセルの形成をもたらし、おそらく細胞外物質中に存在する顆粒状化合物に対応することを観察した（図９を参照）。バイオサーファクタントは水とメタノールに可溶性である。最も強力な活性を有するＳＧ２９７およびＳＧ２７７の場合、サーファクチン、イツリン、およびフェンギシンは、クロロテタインと合わせると最大の活性を示す。抗ＣＤ活性を有するＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ株は、他の分子または機序をもたらすはずであるが、活性はおそらくバイオサーファクタントによるものではない。
【０３２９】
最高レベルの活性は常にＳＥＣ画分に対応し、個々の成分はより低い活性を有するため、複合体の安定化における細胞外多糖の役割が考慮されなければならない。Ｃ１５イツリンＡはミセル（直径〜７ｎｍ）を形成し得る水溶性リポペプチドであり、混合ミセル（直径〜３ｎｍ）の形成による他のリポペプチドの可溶化において役割を果たす。ＳＧ２９７のプロファイルは異なるが、本発明者らは同じ概念が適用されると考える。
【０３３０】
本発明者らは、異なる株が、こうして生成されたリポペプチドおよびミセルの濃度に依存して異なる活性をもたらすと考える。より低い活性を有するがＣ１５イツリンＡを含まないＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株を説明するために、本発明者らは、リポペプチドの可溶化において役割を果たす他のリポペプチドが存在するが、Ｃ１５イツリンが効果的であると提案する。
【０３３１】
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１５．Ｂｒｏｗｎｅ  ＨＰ，Ｆｏｒｓｔｅｒ  ＳＣ，Ａｎｏｎｙｅ  ＢＯ，Ｋｕｍａｒ  Ｎ，  Ｎｅｖｉｌｌｅ  ＢＡ，Ｓｔａｒｅｓ  ＭＤ，Ｇｏｕｌｄｉｎｇ  Ｄ，Ｌａｗｌｅｙ  ＴＤ．２０１６．Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  ｏｆ’ｕｎｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ’ｈｕｍａｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｎｏｖｅｌ  ｔａｘａ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ５３３：５４３−５４６．
１６．Ｌａｇｉｅｒ  ＪＣ，Ａｒｍｏｕｇｏｍ  Ｆ，Ｍｉｌｌｉｏｎ  Ｍ，Ｈｕｇｏｎ  Ｐ，Ｐａｇｎｉｅｒ  Ｉ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃ，Ｂｉｔｔａｒ  Ｆ，Ｆｏｕｒｎｏｕｓ  Ｇ，Ｇｉｍｅｎｅｚ  Ｇ，Ｍａｒａｎｉｎｃｈｉ  Ｍ，Ｔｒａｐｅ  ＪＦ，Ｋｏｏｎｉｎ  ＥＶ，Ｌａ  Ｓｃｏｌａ  Ｂ，Ｒａｏｕｌｔ  Ｄ．２０１２．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｕｌｔｕｒｏｍｉｃｓ：ｐａｒａｄｉｇｍ  ｓｈｉｆｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ｓｔｕｄｙ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  １８：１１８５−１１９３．
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１９．Ｈｏｎｇ  ＨＡ，Ｋｈａｎｅｊａ  Ｒ，Ｔａｍ  ＮＭ，Ｃａｚｚａｔｏ  Ａ，Ｔａｎ  Ｓ，Ｕｒｄａｃｉ  Ｍ，Ｂｒｉｓｓｏｎ  Ａ，Ｇａｓｂａｒｒｉｎｉ  Ａ，Ｂａｒｎｅｓ  Ｉ，Ｃｕｔｔｉｎｇ  ＳＭ．２００９．Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ．Ｒｅｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １６０：１３４−１４３．
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２１．Ｈｏｎｇ  ＨＡ，Ｔｏ  Ｅ，Ｆａｋｈｒｙ  Ｓ，Ｂａｃｃｉｇａｌｕｐｉ  Ｌ，Ｒｉｃｃａ  Ｅ，  Ｃｕｔｔｉｎｇ  ＳＭ．２００９．Ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｈａｂｉｔａｔ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｅｒｓ．Ｒｅｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １６０：３７５−３７９．
２２．Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ＷＬ．２００２．Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｎｄｏｓｐｏｒｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５９：４１０−４１６．
２３．Ｃａｓｕｌａ  Ｇ，  Ｃｕｔｔｉｎｇ  ＳＭ．２００２．Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ：ｓｐｏｒｅ  ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ．Ａｐｐ  Ｅｎｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６８：２３４４−２３５２．
２４．Ｔａｍ  ＮＫ，  Ｕｙｅｎ  ＮＱ，  Ｈｏｎｇ  ＨＡ，  Ｄｕｃ  ｌｅ  Ｈ，  Ｈｏａ  ＴＴ，  Ｓｅｒｒａ  ＣＲ，  Ｈｅｎｒｉｑｕｅｓ  ＡＯ，  Ｃｕｔｔｉｎｇ  ＳＭ．２００６．Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｌｉｆｅ  ｃｙｃｌｅ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｓｅ  ｒｅｌａｔｉｖｅｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８８：２６９２−２７００．
２５．Ｃａｒｔｍａｎ  ＳＴ，Ｌａ  Ｒａｇｉｏｎｅ  ＲＭ，Ｗｏｏｄｗａｒｄ  ＭＪ．２００８．Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｐｏｒｅｓ  ｇｅｒｍｉｎａｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７４：５２５４−５２５８．
２６．Ｇｈｅｌａｒｄｉ  Ｅ，Ｃｅｌａｎｄｒｏｎｉ  Ｆ，Ｓａｌｖｅｔｔｉ  Ｓ，Ｇｕｅｙｅ  ＳＡ，Ｌｕｐｅｔｔｉ  Ａ，  Ｓｅｎｅｓｉ  Ｓ．２０１５．Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｏｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ａｓ  ｓｐｏｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １１９：５５２−５５９．
２７．Ｎａｋａｎｏ  ＭＭ，Ｚｕｂｅｒ  Ｐ．１９９８．Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ａ”ｓｔｒｉｃｔ  ａｅｒｏｂｅ”（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５２：１６５−１９０．
２８．Ｍａｒｔｅｙｎ  Ｂ，Ｓｃｏｒｚａ  ＦＢ，Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ  ＰＪ，Ｔａｎｇ  Ｃ．２０１１．Ｂｒｅａｔｈｉｎｇ  ｌｉｆｅ  ｉｎｔｏ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ：  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｏｘｙｇｅｎ  ｏｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ．Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １３：１７１−１７６．
２９．Ｈｏｎｇ  ＨＡ，  Ｄｕｃ  ｌｅ  Ｈ，  Ｃｕｔｔｉｎｇ  ＳＭ．２００５．Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｐｏｒｅ  ｆｏｒｍｅｒｓ  ａｓ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２９：８１３−８３５．
３０．Ｉｌｉｎｓｋａｙａ  ＯＮ，Ｕｌｙａｎｏｖａ  ＶＶ，Ｙａｒｕｌｌｉｎａ  ＤＲ，Ｇａｔａｕｌｌｉｎ  ＩＧ．２０１７．Ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｂａｃｉｌｌｉ：Ａ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｇｕａｒｄ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ．Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８：１６６６．
３１．Ｚｈａｏ  Ｘ，Ｋｕｉｐｅｒｓ  ＯＰ．２０１６．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｎｏｗｎ  ａｎｄ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａ  ｗｉｄｅ  ｖａｒｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １７：８８２．
３２．Ａｂｒｉｏｕｅｌ  Ｈ，Ｆｒａｎｚ  ＣＭ，Ｂｅｎ  Ｏｍａｒ  Ｎ，Ｇａｌｖｅｚ  Ａ．２０１１．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｓ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ３５：２０１−２３２．
３３．Ｓｔｅｉｎ  Ｔ．２００５．Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，  ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５６：８４５−８５７．
３４．Ａｙｅｄ  ＨＢ，Ｍａａｌｅｊ  Ｈ，Ｈｍｉｄｅｔ  Ｎ，  Ｎａｓｒｉ  Ｍ．２０１５．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ−ｌｉｋｅ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  Ａｎ６．Ｊ  Ｇｌｏｂ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｒｅｓｉｓｔ  ３：２５５−２６１．
３５．Ｃｏｌｅｎｕｔｔ  Ｃ，Ｃｕｔｔｉｎｇ  ＳＭ．２０１４．Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＰＸＮ２１  ｓｐｏｒｅｓ  ｆｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  ３５８：１５４−１６１．
３６．Ｐｅｒｍｐｏｏｎｐａｔｔａｎａ  Ｐ，Ｈｏｎｇ  ＨＡ，Ｐｈｅｔｃｈａｒａｂｕｒａｎｉｎ  Ｊ，Ｈｕａｎｇ  ＪＭ，Ｃｏｏｋ  Ｊ，Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ  ＮＦ，Ｃｕｔｔｉｎｇ  ＳＭ．２０１１．Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｏｘｉｎ  Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｏｘｉｎｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ．  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７９：２２９５−２３０２．
３７．Ｈｏｎｇ  ＨＡ，Ｈｉｔｒｉ  Ｋ，Ｈｏｓｓｅｉｎｉ  Ｓ，Ｋｏｔｏｗｉｃｚ  Ｎ，Ｂｒｙａｎ  Ｄ，Ｍａｗａｓ  Ｆ，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ＡＪ，  ｖａｎ  Ｂｒｏｅｋｈｏｖｅｎ  Ａ，Ｋｅａｒｓｅｙ  Ｊ，  Ｃｕｔｔｉｎｇ  ＳＭ．２０１７．Ｍｕｃｏｓａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃ  Ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｏｆ  Ｔｏｘｉｎ  Ａ  Ｐｒｅｖｅｎｔ  Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ８５．
３８．Ｇｅｅｒａｅｒｔｓ  Ｓ，  Ｄｕｃａｔｅｌｌｅ  Ｒ，  Ｈａｅｓｅｂｒｏｕｃｋ  Ｆ，  Ｖａｎ  Ｉｍｍｅｒｓｅｅｌ  Ｆ．２０１５．Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ａｓ  ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ３０：１２７５−１２８０．
３９．Ｇｕ  Ｓ，Ｃｈｅｎ  Ｄ，Ｚｈａｎｇ  ＪＮ，  Ｌｖ  Ｘ，  Ｗａｎｇ  Ｋ，  Ｄｕａｎ  ＬＰ，Ｎｉｅ  Ｙ，Ｗｕ  ＸＬ．２０１３．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８：ｅ７４９５７．
４０．Ｃｈｕｎ  Ｊ，  Ｂａｅ  ＫＳ．２０００．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔａｘａ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｐａｒｔｉａｌ  ｇｙｒＡ  ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ  ７８：１２３−１２７．
４１．Ｏ’Ｔｏｏｌｅ  Ｇ，Ｋａｐｌａｎ  ＨＢ，Ｋｏｌｔｅｒ  Ｒ．２０００．Ｂｉｏｆｉｌｍ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５４：４９−７９．
４２．Ｈｏｎｇ  ＨＡ，Ｆｅｒｒｅｉｒａ  ＷＴ，Ｈｏｓｓｅｉｎｉ  Ｓ，Ａｎｗａｒ  Ｓ，Ｈｉｔｒｉ  Ｋ，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ＡＪ，Ｖａｈｊｅｎ  Ｗ，Ｚｅｎｔｅｋ  Ｊ，Ｓｏｌｏｖｉｅｖ  Ｍ，Ｃｕｔｔｉｎｇ  ＳＭ．２０１７．Ｔｈｅ  Ｓｐｏｒｅ  Ｃｏａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＣｏｔＥ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  Ｈｏｓｔ  Ｃｏｌｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｉｎｆｄｉｓ／ｊｉｘ４８８．
４３．Ｓａｍｂｏｌ  ＳＰ，Ｔａｎｇ  ＪＫ，Ｍｅｒｒｉｇａｎ  ＭＭ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｓ，Ｇｅｒｄｉｎｇ  ＤＮ．２００１．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈａｍｓｔｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １８３：１７６０−１７６６．
４４．Ｍａ  Ｚ，Ｗａｎｇ  Ｎ，Ｈｕ  Ｊ，Ｗａｎｇ  Ｓ．２０１２．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｉｔｕｒｉｎｉｃ  ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ，  ｍｏｊａｖｅｎｓｉｎ  Ａ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａ  ｍａｒｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ  Ｂ０６２１Ａ．Ｊ  Ａｎｔｉｂｉｏｔ  （Ｔｏｋｙｏ）６５：３１７−３２２．
４５．Ｂｅｃｈｅｔ  Ｍ，Ｃａｒａｄｅｃ  Ｔ，Ｈｕｓｓｅｉｎ  Ｗ，Ａｂｄｅｒｒａｈｍａｎｉ  Ａ，  Ｃｈｏｌｌｅｔ  Ｍ，Ｌｅｃｌｅｒｅ  Ｖ，Ｄｕｂｏｉｓ  Ｔ，Ｌｅｒｅｃｌｕｓ  Ｄ，Ｐｕｐｉｎ  Ｍ，Ｊａｃｑｕｅｓ  Ｐ．２０１２．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｋｕｒｓｔａｋｉｎｓ，ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９５：５９３−６００．
４６．Ｍｅｅｎａ  ＫＲ，Ｋａｎｗａｒ  ＳＳ．２０１５．Ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｆｏｏｄ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ  ２０１５：４７３０５０．
４７．Ｄｕｉｔｍａｎ  ＥＨ，  Ｈａｍｏｅｎ  ＬＷ，Ｒｅｍｂｏｌｄ  Ｍ，  Ｖｅｎｅｍａ  Ｇ，  Ｓｅｉｔｚ  Ｈ，Ｓａｅｎｇｅｒ  Ｗ，Ｂｅｒｎｈａｒｄ  Ｆ，Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ  Ｒ，Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｍ，Ｕｌｌｒｉｃｈ  Ｃ，Ｓｔｅｉｎ  Ｔ，Ｌｅｅｎｄｅｒｓ  Ｆ，ＶａｔｅｒＪ．１９９９．Ｔｈｅ  ｍｙｃｏｓｕｂｔｉｌｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ６６３３：ａ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｙｂｒｉｄ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，  ａｎ  ａｍｉｎｏ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ａｎｄ  ａ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９６：１３２９４−１３２９９．
４８．Ｒａｚａｆｉｎｄｒａｌａｍｂｏ  Ｈ，Ｐｏｐｉｎｅａｕ  Ｙ，Ｄｅｌｅｕ  Ｍ，Ｈｂｉｄ  Ｃ，  Ｊａｑｕｅｓ  Ｐ，Ｔｈｏｎａｒｔ  Ｐ，Ｐａｑｕｏｔ  Ｍ．１９９７．Ｓｕｒｆａｃｅ−ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｔｉｎ／Ｉｔｕｒｉｎ  Ａ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １３：６０２６．
４９．Ｃｕｉ  Ｘ，Ｍａｏ  Ｓ，Ｌｉｕ  Ｍ，Ｙｕａｎ  Ｈ，Ｄｕ  Ｙ．２００８．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｍｉｃｅｌｌｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２４：１０７７１０５．
５０．Ｍａｋｏｖｉｔｚｋｉ  Ａ，Ｂａｒａｍ  Ｊ，Ｓｈａｉ  Ｙ．２００８．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ｐａｌｍｉｔｏｙｌ  Ｄｉ−ａｎｄ  ｔｒｉｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｔｏ  ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ａｎｄ  ａ  ｐｌａｕｓｉｂｌｅ  ｍｏｄｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７：１０６３０−１０６３６．
５１．Ｈｏｒｎ  ＪＮ，Ｒｏｍｏ  ＴＤ，Ｇｒｏｓｓｆｉｅｌｄ  Ａ．２０１３．Ｓｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｌ−ａｔｏｍ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５２：５６０４−５６１０．
５２．Ｈｏｒｎ  ＪＮ，Ｓｅｎｇｉｌｌｏ  ＪＤ，  Ｌｉｎ  Ｄ，Ｒｏｍｏ  ＴＤ，Ｇｒｏｓｓｆｉｅｌｄ  Ａ．２０１２．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｖｉａ  ｃｏａｒｓｅ−ｇｒａｉｎｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８１８：２１２−２１８．
５３．Ｐｏｐｉｏｌｓｋｉ  ＴＭ，  Ｏｔｓｕｋａ  Ｉ，  Ｈａｌｉｌａ  Ｓ，  Ｍｕｎｉｚ  ＥＣ，  Ｓｏｌｄｉ  Ｖ，  Ｂｏｒｓａｌｉ  Ｒ．２０１６．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｍｉｃｅｌｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｏｘｉｄｅ−ｂ−Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ）  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｌａｖｅｎｄｅｒ  Ｏｉｌ．Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：１３５６−１３６５．
５４．Ｍａｌｉｃｋ  Ａ，Ｋｈｏｄａｅｉ  Ｎ，Ｂｅｎｋｅｒｒｏｕｍ  Ｎ，Ｋａｒｂｏｕｎｅ  Ｓ．２０１７．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｂｙ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｒａｉｎｓ：Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｄｉａ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｔｏ  ｍａｘｉｍｉｚｅ  ｔｈｅ  ｙｉｅｌｄ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ  １０２：５３９−５４９．
５５．Ｌｅｅ  ＮＲ，Ｇｏ  ＴＨ，Ｌｅｅ  ＳＭ，Ｊｅｏｎｇ  ＳＹ，Ｐａｒｋ  ＧＴ，Ｈｏｎｇ  ＣＯ，Ｓｏｎ  ＨＪ．２０１４．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙ−ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｄ７．Ｓａｕｄｉ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  ２１：１５３−１５８．
５６．Ｉｎｂａｒａｊ  ＢＳ，Ｋａｏ  ＴＨ，Ｔｓａｉ  ＴＹ，Ｃｈｉｕ  ＣＰ，Ｋｕｍａｒ  Ｒ，  Ｃｈｅｎ  ＢＨ．２０１１．Ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）−ｃｏａｔｅｄ  ｍａｇｎｅｔｉｔｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２：０７５１０１．
５７．Ｏｒｓｏｄ  Ｍ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｍ，Ｈｕｙｏｐ  Ｆ．２０１２．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ａｓｉａｎ  ｓｅａ  ｂａｓｓ（Ｌａｔｅｓ  ｃａｌｃａｒｉｆｅｒ）．Ｍａｌａｙｓｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８：１７０．
５８．Ｉｓａ  ＭＨＭ，Ｃｏｒａｇｌｉａ  ＤＥ，Ｆｒａｚｉｅｒ  ＲＡ，Ｊａｕｒｅｇｉ  Ｐ．２００７．Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｔｉｎ  ｆｒｏｍ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｂｒｏｔｈ  ｂｙ  ａ  ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５１−５７．
５９．Ｊａｕｒｅｇｉ  Ｐ，Ｃｏｕｔｔｅ  Ｆ，Ｃａｔｉａｕ  Ｌ，Ｌｅｃｏｕｔｕｒｉｅｒ  Ｄ，Ｊａｃｑｕｅｓ  Ｐ．２０１３．Ｍｉｃｅｌｌｅ  ｓｉｚｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０４：１７５−１８２．
６０．Ｆａｇａｎ  ＲＰ，Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ  ＮＦ．２０１４．Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓ−ｌａｙｅｒｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １２：２１１−２２２．
６１．Ｂａｒａｎｏｖａ  Ｅ，Ｆｒｏｎｚｅｓ  Ｒ，  Ｇａｒｃｉａ−Ｐｉｎｏ  Ａ，Ｖａｎ  Ｇｅｒｖｅｎ  Ｎ，  Ｐａｐａｐｏｓｔｏｌｏｕ  Ｄ，Ｐｅｈａｕ−Ａｒｎａｕｄｅｔ  Ｇ，Ｐａｒｄｏｎ  Ｅ，Ｓｔｅｙａｅｒｔ  Ｊ，Ｈｏｗｏｒｋａ  Ｓ，Ｒｅｍａｕｔ  Ｈ．２０１２．ＳｂｓＢ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｌａｔｔｉｃｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｕｎｖｅｉｌ  Ｃａ２＋ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  Ｓ−ｌａｙｅｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８７：１１９−１２２．
６２．Ｌｅｓｓａ  ＦＣ，Ｍｕ  Ｙ，Ｂａｍｂｅｒｇ  ＷＭ，Ｂｅｌｄａｖｓ  ＺＧ，Ｄｕｍｙａｔｉ  ＧＫ，Ｄｕｎｎ  ＪＲ，Ｆａｒｌｅｙ  ＭＭ，Ｈｏｌｚｂａｕｅｒ  ＳＭ，Ｍｅｅｋ  ＪＩ，  Ｐｈｉｐｐｓ  ＥＣ，Ｗｉｌｓｏｎ  ＬＥ，Ｗｉｎｓｔｏｎ  ＬＧ，Ｃｏｈｅｎ  ＪＡ，Ｌｉｍｂａｇｏ  ＢＭ，Ｆｒｉｄｋｉｎ  ＳＫ，Ｇｅｒｄｉｎｇ  ＤＮ，ＭｃＤｏｎａｌｄ  ＬＣ．２０１５．Ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７２：８２５−８３４．
６３．Ｂａｕｅｒ  ＭＰ，Ｎｏｔｅｒｍａｎｓ  ＤＷ，ｖａｎ  Ｂｅｎｔｈｅｍ  ＢＨ，Ｂｒａｚｉｅｒ  ＪＳ，Ｗｉｌｃｏｘ  ＭＨ，Ｒｕｐｎｉｋ  Ｍ，  Ｍｏｎｎｅｔ  ＤＬ，  ｖａｎ  Ｄｉｓｓｅｌ  ＪＴ，Ｋｕｉｊｐｅｒ  ＥＪ．２０１１．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｕｒｏｐｅ：ａ  ｈｏｓｐｉｔａｌ−ｂａｓｅｄ  ｓｕｒｖｅｙ．Ｌａｎｃｅｔ  ３７７：６３−７３．
６４．Ｋｅｌｌｙ  Ｄ，Ｋｉｎｇ  Ｔ，Ａｍｉｎｏｖ  Ｒ．２００７．Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｕｔ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｌｉｆｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ  ６２２：５８−６９．
６５．Ｅｇｅ  ＭＪ，Ｍａｙｅｒ  Ｍ，Ｎｏｒｍａｎｄ  ＡＣ，Ｇｅｎｕｎｅｉｔ  Ｊ，Ｃｏｏｋｓｏｎ  ＷＯ，  Ｂｒａｕｎ−Ｆａｈｒｌａｎｄｅｒ  Ｃ，Ｈｅｅｄｅｒｉｋ  Ｄ，Ｐｉａｒｒｏｕｘ  Ｒ，  ｖｏｎ  Ｍｕｔｉｕｓ  Ｅ，Ｇｒｏｕｐ  ＧＴＳ．２０１１．Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ａｓｔｈｍａ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６４：７０１−７０９．
６６．Ｌｏｐｅｚ−Ｓｅｒｒａｎｏ  Ｐ，Ｐｅｒｅｚ−Ｃａｌｌｅ  ＪＬ，Ｐｅｒｅｚ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ＭＴ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｆｏｎｔ  ＪＭ，Ｂｏｉｘｅｄａ  ｄｅ  Ｍｉｇｕｅｌ  Ｄ，  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ＣＭ．２０１０．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｇｉｅｎｅ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ：ａ  Ｓｐａｎｉｓｈ  ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｔｕｄｙ．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ４５：１４６４−１４７１．
６７．Ｓｔｒａｃｈａｎ  ＤＰ．１９８９．Ｈａｙ  ｆｅｖｅｒ，ｈｙｇｉｅｎｅ，ａｎｄ  ｈｏｕｓｅｈｏｌｄ  ｓｉｚｅ．ＢＭＪ  ２９９：１２５９−１２６０．
６８．Ｌｅｓｓａ  ＦＣ，Ｇｏｕｌｄ  ＣＶ，ＭｃＤｏｎａｌｄ  ＬＣ．２０１２．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ５５  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ６５−７０．
６９．Ｇｕｐｔａ  Ａ，Ｋｈａｎｎａ  Ｓ．２０１４．Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｐｕｂｌｉｃ  ｈｅａｌｔｈ  ｔｈｒｅａｔ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ  ７：６３−７２．
７０．Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ  ＳＦ，Ｒｏｏｋ  ＧＡ，Ｓｃｏｔｔ  ＥＡ，Ｓｈａｎａｈａｎ  Ｆ，  Ｓｔａｎｗｅｌｌ−Ｓｍｉｔｈ  Ｒ，Ｔｕｒｎｅｒ  Ｐ．２０１６．Ｔｉｍｅ  ｔｏ  ａｂａｎｄｏｎ  ｔｈｅ  ｈｙｇｉｅｎｅ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ：  ｎｅｗ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ，ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ，ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｈｙｇｉｅｎｅ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  １３６：２１３−２２４．
７１．Ａｙｕｋｅｋｂｏｎｇ  ＪＡ，Ｎｔｅｍｇｗａ  Ｍ，Ａｔａｂｅ  ＡＮ．２０１７．Ｔｈｅ  ｔｈｒｅａｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ：ｃａｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｒｅｓｉｓｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ６：４７．
７２．Ｂｕｒｋｅ  ＫＥ，Ｌａｍｏｎｔ  ＪＴ．２０１４．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ａ  ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇｕｔ  Ｌｉｖｅｒ  ８：１−６．
７３．Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＤＡ，Ｈａｗｋｅｙ  ＰＭ，Ｒｉｌｅｙ  ＴＶ．２０１３．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｓｉａ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｒｅｓｉｓｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ２：２１．
７４．ＶａｔｅｒＪ．１９８６．Ｌｉｐｏｐｅｔｉｄｅｓ，ａｎ  ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ．Ｐｒｏｇ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｐｏｌｙｍ  Ｓｃｉ  ７２：１２−１８．
７５．Ｍｎｉｆ  Ｉ，  Ｇｈｒｉｂｉ  Ｄ．２０１５．Ｒｅｖｉｅｗ  ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ：Ｍｅａｎ  ｃｌａｓｓｅｓ  ａｎｄ  ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  １０４：１２９−１４７．
７６．Ｚｈｉ  Ｙ，Ｗｕ  Ｑ，Ｘｕ  Ｙ．２０１７．Ｇｅｎｏｍｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｔｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＭＴ４５．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ７：４０９７６．
７７．Ｘｕ  Ｚ，Ｓｈａｏ  Ｊ，Ｌｉ  Ｂ，Ｙａｎ  Ｘ，Ｓｈｅｎ  Ｑ，Ｚｈａｎｇ  Ｒ．２０１３．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ  Ｄ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＳＱＲ９  ｔｏ  ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７９：８０８−８１５．
７８．Ｄｅｌｅｕ  Ｍ，Ｐａｑｕｏｔ  Ｍ，Ｎｙｌａｎｄｅｒ  Ｔ．２００８．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆｅｎｇｙｃｉｎ，ａ  ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，ｏｎ  ｍｏｄｅｌ  ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ９４：２６６７−２６７９．
７９．Ｋｉｍ  ＰＩ，  Ｂａｉ  Ｈ，  Ｂａｉ  Ｄ，  Ｃｈａｅ  Ｈ，  Ｃｈｕｎｇ  Ｓ，  Ｋｉｍ  Ｙ，  Ｐａｒｋ  Ｒ，  Ｃｈｉ  ＹＴ．２００４．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ＣＭＢ２６．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ９７：９４２−９４９．
８０．Ｋｌｉｃｈ  ＭＡ，Ａｒｔｈｕｒ  ＫＳ，Ｌａｘ  ＡＲ，Ｂｌａｎｄ  ＪＭ．１９９４．Ｉｔｕｒｉｎ  Ａ：  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｎｅｗ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ  ｆｏｒ  ｓｔｏｒｅｄ  ｇｒａｉｎｓ．Ｍｙｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉａ  １２７：１２３−１２７．
８１．Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｓ，Ｈｉｒａｄａｔｅ  Ｓ，Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ  Ｔ，Ｈａｔａｋｅｄａ  Ｋ，  Ｓｈｉｒａｔａ  Ａ．２００１．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｆｉｌｔｒａｔｅ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＲＣ−２  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｍｕｌｂｅｒｒｙ  Ｌｅａｖｅｓ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ９１：１８１−１８７．
８２．Ｌｉｕ  Ｊ，Ｈｅ  Ｄ，Ｌｉ  ＸＺ，  Ｇａｏ  Ｓ，Ｗｕ  Ｈ，  Ｌｉｕ  Ｗ，Ｇａｏ  Ｘ，  Ｚｈｏｕ  Ｔ．２０１０．Ｇａｍｍａ−ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  （ｇ−ＰＧＡ）  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  Ｃ０６  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｉｔｓ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｆｒｕｉｔ  ｓｕｒｆａｃｅ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １４２：１９０−１９７．
８３．Ｓｍｉｔｈ  ＣＪ，Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ  ＳＭ，Ｍａｃｒｉｎａ  ＦＬ．１９８１．Ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  １９：９９７−１００３．
８４．Ｗｕｓｔ  Ｊ，Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＮＭ，Ｈａｒｄｅｇｇｅｒ  Ｕ，Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＴＤ．１９８２．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｕｔｂｒｅａｋ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｂｙ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｔｙｐｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １６：１０９６−１１０１．
８５．Ｐｈｅｔｃｈａｒａｂｕｒａｎｉｎ  Ｊ，Ｈｏｎｇ  ＨＡ，Ｃｏｌｅｎｕｔｔ  Ｃ，Ｂｉａｎｃｏｎｉ  Ｉ，Ｓｅｍｐｅｒｅ  Ｌ，Ｐｅｒｍｐｏｏｎｐａｔｔａｎａ  Ｐ，  Ｓｍｉｔｈ  Ｋ，  Ｄｅｍｂｅｋ  Ｍ，Ｔａｎ  Ｓ，Ｂｒｉｓｓｏｎ  ＭＣ，Ｂｒｉｓｓｏｎ  ＡＲ，Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ  ＮＦ，Ｃｕｔｔｉｎｇ  ＳＭ．２０１４．Ｔｈｅ  ｓｐｏｒｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢｃｌＡ１  ａｆｆｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ  ｔｏ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ９２：１０２５−１０３８．
８６．Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ＷＬ，Ｓｅｔｌｏｗ  Ｐ．１９９０．Ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ，ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ．，ｐ３９１−４５０．Ｉｎ  Ｈａｒｗｏｏｄ．ＣＲ，Ｃｕｔｔｉｎｇ．ＳＭ（ｅｄ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，  ＵＫ．
８７. Ｌａｕ  ＪＴ，Ｗｈｅｌａｎ  ＦＪ，Ｈｅｒａｔｈ  Ｉ，Ｌｅｅ  ＣＨ，Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＳＭ，  Ｂｅｒｃｉｋ  Ｐ，Ｓｕｒｅｔｔｅ  ＭＧ．２０１６．Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄ  ８：７２．
８８．Ｙｏｕｓｓｅｆ  ＮＨ，Ｄｕｎｃａｎ  ＫＥ，Ｎａｇｌｅ  ＤＰ，Ｓａｖａｇｅ  ＫＮ，Ｋｎａｐｐ  ＲＭ，ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ  ＭＪ．２００４．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５６：３３９−３４７．
８９．ＣＬＳＩ．２０１０．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｋ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｏｒ  ｆａｓｔｉｄｉｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉａ；ａｐｐｒｏｖｅｄ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ−Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ  Ｍ４５−Ａ２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＣａＬＳ，ＵＳＡ．
９０．ＥＦＳＡ．２０１２．Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ．ＥＦＳＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １０：２７４０．
【図１−１】
2021515031.tif 000042
【図１−２】
2021515031.tif 000043
【図２−１】
2021515031.tif 000044
【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
2021515031.tif 000050
【図６−１】
2021515031.tif 000051
【図６−２】
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【図７−１】
2021515031.tif 000053
【図７−２】
2021515031.tif 000054
【図８−１】
2021515031.tif 000055
【図８−２】
2021515031.tif 000056
【図８−３】
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【図９】
2021515031.tif 000058
【図１０−１】
2021515031.tif 000059
【図１０−２】
2021515031.tif 000060
【図１１】
2021515031.tif 000061
【図１２】
2021515031.tif 000062
【図１３】
2021515031.tif 000063
【図１４】
2021515031.tif 000064
【図１５】
2021515031.tif 000065
【図１６】
2021515031.tif 000066
【図１７】
2021515031.tif 000067
【図１８−１】
2021515031.tif 000068
【図１８−２】
2021515031.tif 000069
【図１８−３】
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【図１９】
2021515031.tif 000071
【図２０】
2021515031.tif 000072
【図２１】
2021515031.tif 000073
【図２２】
2021515031.tif 000074
【図２３−１】
2021515031.tif 000075
【図２３−２】
2021515031.tif 000076
【図２４】
2021515031.tif 000077
【図２５】
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【図２６】
2021515031.tif 000079
【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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