(57)【要約】糸状真菌宿主細胞によって発現された組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ、組換え菌株の構築方法、組換え酵素の生産方法及びその使用、並びに異なる組換え糸状真菌宿主細胞に適用される培地配合を提供する。【選択図】図１３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状真菌宿主細胞によって組換え発現された組換えシュウ酸デカルボキシラーゼであって、当該組換えシュウ酸デカルボキシラーゼにおけるグリコシル化修飾の形式及び程度はオリジナルの宿主細胞によって発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼとは異なり、当該組換えシュウ酸デカルボキシラーゼは糸状真菌宿主細胞に固有するグリコシル化修飾の形式及び程度を有する
ことを特徴とする組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ。
【請求項２】
前記組換えシュウ酸デカルボキシラーゼは、ｐＨ値１．５〜７．０においてその酵素活性が全て又は一部保持され、且つ、ｐＨ値１．５〜２．５において至適ｐＨおけるその酵素活性が１０％以上保持され、ｐＨ値２．５〜４．５において至適ｐＨにおけるその酵素活性が５０％以上保持され、ｐＨ値４．５〜７．０において至適ｐＨにおけるその酵素活性が２５％以上保持される
請求項１に記載の組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ。
【請求項３】
前記組換えシュウ酸デカルボキシラーゼの至適ｐＨ値は２．５〜３．５である
請求項１に記載の組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ。
【請求項４】
前記組換えシュウ酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子は真核生物に由来し、前記真核生物は、チャジュタケ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ  ａｅｇｉｒｉｔ）、ヤナギマツタケ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ  Ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）、エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）、カワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、褐色腐朽菌（Ｐｏｓｔｉａ  ｐｌａｃｅｎｔａ）、アスペルギルス・リュウキュウエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、ツクリタケ（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、又はキシメジ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ  Ｌｏｂａｙｅｎｓｃ  Ｈｅｉｍ）等真菌である
請求項１に記載の組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ。
【請求項５】
前記組換えシュウ酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列は配列番号１又は配列番号５における２０〜４７０位のアミノ酸配列、又は配列番号２における２５〜４７２位のアミノ酸配列、又は配列番号３における２０〜４５５位のアミノ酸配列、又は配列番号４における２１〜４４７位のアミノ酸配列、又は配列番号６における２１〜４５５位のアミノ酸配列、又は配列番号７における２５〜４４０位のアミノ酸配列、配列番号８における２４〜４７２位のアミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性を有し、好ましくは少なくとも６５％の相同性、少なくとも７０％の相同性、少なくとも７５％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、又は少なくとも９５％の相同性を有する
請求項１ないし４のいずれかに記載の組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ。
【請求項６】
前記組換えシュウ酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１又は配列番号５の２０〜４７０位のアミノ酸配列、又は配列番号２における２５〜４７２位のアミノ酸配列、又は配列番号３における２０〜４５５位のアミノ酸配列、又は配列番号４における２１〜４４７位のアミノ酸配列、又は配列番号６における２１〜４５５位のアミノ酸配列、又は配列番号７における２５〜４４０位のアミノ酸配列、配列番号８における２４〜４７２位のアミノ酸配列からなる
請求項１ないし５のいずれかに記載の組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ。
【請求項７】
染色体ＤＮＡは、請求項１ないし６のいずれかに記載のシュウ酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子配列を含む
ことを特徴とする組換え糸状真菌宿主細胞。
【請求項８】
前記糸状真菌は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、コリオラス属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、プレロータス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ペシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ブジェルカンデラ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、スキゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、コプリヌス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ネオカリマスティクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、トリポクラディウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、又はトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）等真菌である
請求項７に記載の組換え糸状真菌宿主細胞。
【請求項９】
前記糸状真菌は、アスペルギルス属のクロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ニホンコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、又はアワモリコウジカビ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）の菌株である
請求項７に記載の組換え糸状真菌宿主細胞。
【請求項１０】
前記糸状真菌は、トリコデルマ属のトリコデルマ・ハルチアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔ．ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）の菌株である
請求項７に記載の組換え糸状真菌宿主細胞。
【請求項１１】
前記糸状真菌は、トリコデルマ・リーセイである
請求項７に記載の組換え糸状真菌宿主細胞。
【請求項１２】
前記シュウ酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列で少なくとも１０％の塩基は、糸状真菌宿主細胞のコドンの選好度に基づきコドンの最適化が行われている
請求項７ないし１１のいずれかに記載の組換え糸状真菌宿主細胞。
【請求項１３】
前記ヌクレオチド配列は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６の塩基配列から選ばれるか、又は配列番号９〜１６のいずれかと少なくとも５０％の相同性を有し、好ましくは少なくとも６０％の相同性、少なくとも７０％の相同性、少なくとも８０％の相同性又は少なくとも９０％の相同性を有する配列から選ばれる
請求項１２に記載の組換え糸状真菌宿主細胞。
【請求項１４】
前記組換え糸状真菌宿主細胞はそのゲノムに組み込まれたシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットの１つ以上のコピーを含み、前記シュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットはプロモーター、シグナルペプチドコード配列、シュウ酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びターミネーターを含み、
選択マーカー遺伝子発現カセット及びシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットを含む少なくとも１つの組込み型発現ベクターを構築する、ステップＳ１と、
組込み型発現ベクターによる糸状真菌宿主細胞の形質転換後、選別してシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットの１つ以上のコピーを含む組換え糸状真菌宿主細胞を得る、ステップＳ２とを含む
請求項７ないし１２のいずれかに記載の組換え糸状真菌宿主細胞の構築方法
【請求項１５】
ステップＳ２に記載の糸状真菌宿主細胞は人工的に構築された栄養要求性細胞であり、前記組込み型発現ベクターは前記糸状真菌宿主細胞ゲノムに組み込まれると当該タイプの栄養要求性を修復できる
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
糸状真菌宿主細胞の形質転換後、前記組込み型発現ベクターは非相同組換えにより糸状真菌宿主細胞ゲノムにランダムに組み込まれる
請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記組込み型発現ベクターは糸状真菌宿主細胞ゲノムにおける特異性遺伝子座の所定の長さのヌクレオチド配列と相同の５’末端ホモロジーアーム及び３’末端ホモロジーアームを含み、これによって糸状真菌宿主細胞の形質転換後に前記組込み型発現ベクターは相同組換えの方式によりゲノムの特定部位に組み込まれ、好ましくは細胞外タンパク質をコードする遺伝子に組み込まれ、より好ましくは細胞外プロテアーゼ類又は細胞外グリコシドヒドロラーゼ類をコードする遺伝子に組み込まれ、最も好ましくはＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１、又はＥＧ２遺伝子に組み込まれる
請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法により製造された宿主細胞の培養に適用され、組成は、グルコース  ３〜８ｇ／Ｌ、微結晶セルロース  １０〜２５ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー  ５〜１５ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．５〜５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．５６ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２  ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ２〜８ｇ／Ｌ、尿素  ０〜１ｇ／Ｌ、ふすま粉  ０．２〜２ｇ／Ｌ、Ｍａｎｄｅｌｓ微量元素（１０００×）  １ｍｌ、ＭｎＣｌ２  ０．５〜５ｍＭであり、ｐＨは３．０〜４．５である
ことを特徴とする培地。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法により製造された宿主細胞の培養に適用され、組成は、グルコース  ３〜６ｇ／Ｌ、ラクトース  ３０〜４０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー  ７〜１０ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．５〜１ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．５６ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２  ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ２〜４ｇ／Ｌ、尿素  ０〜１ｇ／Ｌ、ふすま粉  １０〜２０ｇ／Ｌ、Ｍａｎｄｅｌｓ微量元素（１０００×）  １ｍｌ、ＭｎＣｌ２  ０．５〜５ｍＭであり、ｐＨは３．５〜４．０である
ことを特徴とする培地。
【請求項２０】
プロモーター、シグナルペプチドコード配列、シュウ酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びターミネーターを含むシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットを構築し、発現ベクターにより糸状真菌宿主細胞に導入して、宿主細胞ゲノムに１つ以上のシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットを組み込み、宿主細胞を培養してシュウ酸デカルボキシラーゼを発現させ、最後に宿主細胞培養基質から発現産物を分離して精製する
ことを特徴とする組換えシュウ酸デカルボキシラーゼの生産方法。
【請求項２１】
薬物及び食品の製造における、請求項１ないし６のいずれかに記載の組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ、又は請求項７ないし１３のいずれかに記載の組換え糸状真菌宿主細胞の培養後に分泌発現された
ことを特徴とするシュウ酸デカルボキシラーゼの適用。
【請求項２２】
前記薬物は泌尿器系結石を予防及び／又は治療する薬物である
請求項２１に記載の適用。
【請求項２３】
尿中シュウ酸過剰に関連する疾患の予防又は治療に用いられる薬物組成物であって、請求項２０に記載の方法により製造されたシュウ酸デカルボキシラーゼを含む
ことを特徴とする薬物組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
「関連出願の相互参照」
本願は、特許文献１の優先権を主張し、当該出願の全ての内容が参照により本願に援用される。
【０００２】
本発明は遺伝子工学技術の分野に関し、具体的に言えば、シュウ酸デカルボキシラーゼを高発現できる組換え糸状真菌宿主細胞、及び組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ、組換えシュウ酸デカルボキシラーゼの生産方法及びその適用に関する。
【背景技術】
【０００３】
シュウ酸（ｏｘａｌｉｃ  ａｃｉｄ）はエタン二酸とも称され、生物体におけるひとつの代謝産物であり、シュウ酸塩の形で植物、動物及び真菌体に幅広く存在している。ヒトとその他の哺乳動物の様々な食物、例えば、ホウレンソウ、イチゴ、テンサイ、カカオ、サトイモ、サツマイモ、ダイオウ及び茶などは、いずれもシュウ酸塩の含有量が高い。ヒト及びその他の哺乳動物において、体内にシュウ酸塩の分解に関連する酵素がないため、シュウ酸塩は代謝の終産物になり、食物から吸収された外因性シュウ酸塩及び生理的な代謝により生成された内因性シュウ酸塩は主に腎臓によって尿に排泄される。ヒトとその他の哺乳動物はシュウ酸塩の含有量が高い食物を食べる時、ヒトの血液と尿でシュウ酸塩の濃度上昇が生じやすく、カルシウムイオンと結合すると不溶性のシュウ酸カルシウムが生成され、シュウ酸カルシウムは泌尿器系の結石における主な成分である。また、高濃度のシュウ酸塩は、高シュウ酸尿症、心臓伝導障害、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）及び消化器不調などその他の様々な疾患にも関係する。従って、体外又は体内環境で食物に由来するシュウ酸塩を分解し、体内におけるシュウ酸塩の吸収を軽減させることにより、尿路結石をはじめとする関連疾患が発生するリスクを低減することができる。
【０００４】
近年、酵素を用いてシュウ酸を分解することでシュウ酸カルシウム結石症等の関連する疾患を予防・治療することに関する研究は盛んに行われている。現在、生物界に存在するシュウ酸分解機能を有する酵素として、シュウ酸デカルボキシラーゼ、シュウ酸オキシダーゼ及びオキサリルＣｏＡデカルボキシラーゼが知られている。シュウ酸デカルボキシラーゼは活性中心にマンガンイオンを含有し、シュウ酸を触媒分解してギ酸と二酸化炭素を生産できる酵素である。現在発見されているシュウ酸デカルボキシラーゼは主に一部の植物、細菌及び真菌、例えば、クロコウジカビ、コニオチリウム・ミニタンス（Ｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍ  ｍｉｎｉｔａｎｓ）、エノキタケ、白色腐朽菌（Ｔ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、ツクリタケ、褐色腐朽菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）等に存在する。しかしながら、上記各種の天然種の中でも、シュウ酸デカルボキシラーゼの収率も収量も極めて低いため、生産コスト及び価格が高くなるだけでなく、商品化された適用及び普及は難しい。
【０００５】
従って、シュウ酸デカルボキシラーゼを組換え発現により生産し、その生産コストを削減することで、その商品化された適用を可能にすることは、必然的な選択になる。従来、原核細胞で細菌に由来するシュウ酸デカルボキシラーゼの組換え発現が実現されている、例えば、枯草菌ＹｖｒＫ遺伝子に由来するシュウ酸デカルボキシラーゼを得ているものの、細菌に由来するシュウ酸デカルボキシラーゼは低ｐＨ（ｐＨ値３．０未満）において不安定になり活性を持たず、ヒトの胃でｐＨは常に３．０より低く、細菌に由来するシュウ酸デカルボキシラーゼがペプシンの作用により消化されて活性を失いやすいため、その適用範囲、分野及び有効性は大いに制限されている。細菌に由来するシュウ酸デカルボキシラーゼの使用性能を改善するために、オーレナ・ファーマシューティカルズ社はタンパク質結晶としてのシュウ酸デカルボキシラーゼ（特許文献２）を製造し、グルタルアルデヒドで架橋させることでその安定性を向上させ、これらの結晶を胃と腸中のシュウ酸塩を分解するための経口剤として製造するという試みを行っていた。臨床試験によって証明されるように、重度の高シュウ酸尿症の患者の場合、当該酵素製剤を高用量で経口投与しても、尿中シュウ酸を１３％低減できる程度にとどまる。Ｏｘｔｈｅｒａ社は当該シュウ酸デカルボキシラーゼを酸不溶ポリマーと混合し、噴霧乾燥により微粒子を製造する（商品名：Ｏｘａｚｙｍｅ、Ｏｘｔｈｅｒａ社製）ことにより別の剤形の製剤を製造しているが、臨床試験により、Ｏｘａｚｙｍｅには尿中シュウ酸を低減する効果がないことは証明されていた。
【０００６】
真菌に由来するシュウ酸デカルボキシラーゼは低ｐＨにおいて優れた安定性及びペプシンに対する優れた耐性を有するため、シュウ酸を分解させる経口酵素製剤として特に好適である。これまでにたくさんの鋭意検討と試みがなされたにも関わらず、現在公開されている報告によれば、真菌に由来するシュウ酸デカルボキシラーゼは原核発現系を用いる場合でも真核発現系を用いる場合でも、その組換え発現の結果はいずれも理想的とはいえない。中でも最も多くの研究がなされているのはエノキタケに由来するシュウ酸デカルボキシラーゼで、Ｍｅｅｎｕら（非特許文献１）はタバコを用いてその組換え発現を行っていたが、発現結果を検出したところ活性が確認されていたが、発現量は極めて低く、他にも原核（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））による発現が行われていたが、酵素活性は確認されていない。Ｍｏｈａｍｍａｄら（非特許文献２）は出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及び分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）においてその組換え発現を行っていたが、出芽酵母では酵素活性が検出されず、分裂酵母では酵素活性が検出されているが、発現量が極めて低いため、商品化された適用は不可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】２０１７年３月７日出願、中国特許出願２０１７１０１３０９９９．５、「真核微生物によるシュウ酸デカルボキシラーゼの発現に用いられる発現カセット、菌株、方法及びその適用」
【特許文献２】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７５０９１
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Meenu Kesarwani,et.al,Oxalate Decarboxylase from Collybia velutipes,THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,2000
【非特許文献２】Mohammad Azam,et.al,A Secretion Signal Is Present in the Collybia velutipesOxalate Decarboxylase Gene,doi:10.1006/bbrc.2001.6049
【非特許文献３】Jeffrey L.Smithら.Curr Genet,1991,19:27-23
【非特許文献４】An,G.et.al Binary vectors,in Plant Molecular Biology Manual,1988
【非特許文献５】Analytical Biochemistry,59(2016)79-81
【非特許文献６】Matthias G.Steiger,APPLIED AND ENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,Jan.2011,p.114-121
【非特許文献７】Matthias G.Steiger,APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,Jan.2011,p.114-121
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
真菌に由来するシュウ酸デカルボキシラーゼは効果的な組換え発現を実現できないという従来技術における課題を解決するために、本発明は、事前に長期にわたる大量の試験と鋭意検討を重ね、様々な発現系において検証し、様々なバイオテクノロジー的方法を利用することにより、真菌に由来するシュウ酸デカルボキシラーゼの効果的な組換え発現を実現させようとする。原核発現系に関して発明者は、異なる種類の大腸菌発現細胞、枯草菌細胞、バチルス・リケニフォルミス細胞、バチルス・プミルス細胞、ラクトバシラス細胞等原核細胞において、発現に関するたくさんの試みや発現要素及び発現方法の最適化作業を行っていたが、いずれも効果的な組換え発現が得られなかった。真核発現系に関して発明者は、植物としてタバコ及びエンドウにおいて一過性発現及び安定な形質転換発現を行い、タバコ細胞を用いる浮遊培養発現も、昆虫細胞、出芽酵母細胞及びピキア・パストリス細胞等サッカロミケス属細胞を用いる発現、発現要素及び発現方法の最適化も行っていたが、酵素活性が検出されなかったか、発現量が極めて低い結果であったため、いずれも産業化された生産の可能性がない。長期にわたる鋭意検討と関連研究を行い、各プロセスを組み合わせその最適化を行った結果、発明者は最終的に糸状真菌において効果的な組換え発現を実現している。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、組換えシュウ酸デカルボキシラーゼを提供することを目的とし、前記組換えシュウ酸デカルボキシラーゼは糸状真菌宿主細胞によって組換え発現されるものであり、これによって組換えシュウ酸デカルボキシラーゼにおけるグリコシル化修飾の形式及び程度はオリジナルの宿主細胞によって発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼとは異なり、前記組換えシュウ酸デカルボキシラーゼは糸状真菌宿主細胞に固有するグリコシル化修飾の形式及び程度を有する。
【００１１】
前記組換えシュウ酸デカルボキシラーゼはｐＨ値１．５〜７．０においてその酵素活性が全て又は一部保持され、且つ、ｐＨ値１．５〜２．５において至適ｐＨおけるその酵素活性が１０％以上保持され、ｐＨ値２．５〜４．５において至適ｐＨにおけるその酵素活性が５０％以上保持され、ｐＨ値４．５〜７．０において至適ｐＨにおけるその酵素活性が２５％以上保持される。
【００１２】
任意選択的に又は好ましくは、前記組換えシュウ酸デカルボキシラーゼの至適ｐＨ値が２．５〜３．５である。
【００１３】
任意選択的に又は好ましくは、前記組換えシュウ酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が真核生物に由来し、前記真核生物はチャジュタケ、ヤナギマツタケ、エノキタケ、カワラタケ、褐色腐朽菌、アスペルギルス・リュウキュウエンシス、ツクリタケ又はキシメジ等真菌である。
【００１４】
任意選択的に又は好ましくは、前記組換えシュウ酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列が配列番号１又は配列番号５における２０〜４７０位のアミノ酸配列、又は配列番号２における２５〜４７２位のアミノ酸配列、又は配列番号３における２０〜４５５位のアミノ酸配列、又は配列番号４における２１〜４４７位のアミノ酸配列、又は配列番号６における２１〜４５５位のアミノ酸配列、又は配列番号７における２５〜４４０位のアミノ酸配列、配列番号８における２４〜４７２位のアミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性を有し、好ましくは少なくとも６５％の相同性、少なくとも７０％の相同性、少なくとも７５％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、又は少なくとも９５％の相同性を有する。
【００１５】
好ましくは、前記組換えシュウ酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列が配列番号１又は配列番号５における２０〜４７０位のアミノ酸配列、又は配列番号２における２５〜４７２位のアミノ酸配列、又は配列番号３における２０〜４５５位のアミノ酸配列、又は配列番号４における２１〜４４７位のアミノ酸配列、又は配列番号６における２１〜４５５位のアミノ酸配列、又は配列番号７における２５〜４４０位のアミノ酸配列、配列番号８における２４〜４７２位のアミノ酸配列からなる。
【００１６】
本発明は、シュウ酸デカルボキシラーゼの新規な発現方法を提供することをもう一つの目的とし、当該方法は、シュウ酸デカルボキシラーゼ遺伝子を高発現することができ、発現量及び酵素活性はいずれも従来の発現方法をはるかに上回り、実際に適用することができる。
【００１７】
上述した目的を達成するために、本発明の第１の態様として、組換え糸状真菌宿主細胞を提供し、前記組換え糸状真菌宿主細胞の染色体ＤＮＡは上記いずれかの組換えシュウ酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子配列を含む。
【００１８】
具体的に、当該宿主細胞は、そのゲノムに組み込まれたシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットの１つ以上のコピーを含み、前記シュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットはプロモーター、シグナルペプチドコード配列、シュウ酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びターミネーターを含む。
【００１９】
発明者は大量の研究を行ったところ、シュウ酸デカルボキシラーゼが糸状真菌宿主細胞において効果的に組換え・分泌発現されることを見出した。糸状真菌宿主細胞において組換え発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼに対し、各種の翻訳後加工、例えば、グリコシル化修飾等を行うことができ、組換え発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼは天然宿主細胞において製造されたシュウ酸デカルボキシラーゼに類似する酵素学的性質を有する。シュウ酸デカルボキシラーゼの５’末端に分泌誘導においてコードするためのシグナルペプチド配列を添加することにより、組換え発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼを培養基質に効果的に分泌することができ、これによって後続の分離精製が容易になり、生産コストが低減される。
【００２０】
前記シグナルペプチドコード配列とは、シュウ酸デカルボキシラーゼが細胞の特定区画又は分泌チャネルに入るよう誘導できるシグナルペプチドコーディング領域を指し、それはシュウ酸デカルボキシラーゼに由来するオリジナルシグナルペプチド、トリコデルマに由来するセロビオースヒドロラーゼＩ、トリコデルマに由来するセロビオースヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマに由来するエンドグルカナーゼＩ、トリコデルマに由来するエンドグルカナーゼＩＩ、クロコウジカビに由来する中性アミラーゼ、クロコウジカビに由来するグルコアミラーゼ、ニホンコウジカビに由来するタカアミラーゼ、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）に由来するセルラーゼ、フミコーラ・インソレンスに由来するエンドグルカナーゼＶ、フミコーラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）に由来するリパーゼ及びリゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）に由来するアスパラギン酸プロテアーゼ等遺伝子から得たシグナルペプチドコード配列とすることができるが、これらに限定されるものではなく、シュウ酸デカルボキシラーゼを糸状真菌宿主細胞の分泌経路に誘導できるシグナルペプチドコーディング領域であればいずれも本発明に用いることができる。いくつかの実施形態において、好ましくはシグナルペプチドコード配列がトリコデルマ・リーセイに由来するセロビオースヒドロラーゼＩ遺伝子（ｃｂｈ１）から得たシグナル配列である。
【００２１】
前記プロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼとの結合に関与し、シュウ酸デカルボキシラーゼ遺伝子の発現における転写及び翻訳を仲介できる制御配列を含有するものを指す。プロモーターは所定の宿主細胞で転写活性を有するあらゆるヌクレオチド配列とすることができ、宿主細胞と相同又は非相同のタンパク質をコードする遺伝子に由来するものとすることができる。プロモーターは誘導型プロモーター又は構成型プロモーターとすることができる。
【００２２】
本発明においてシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットの糸状真菌宿主細胞における転写を仲介するために用いられるプロモーターの例として、ＳＶ４０、ｈＣＭＶ、ＣａＭＶ  ３５Ｓ、アスペルギルス・ニデュランスに由来するアセトアミダーゼ、ニホンコウジカビに由来するアルカリプロテアーゼ、ニホンコウジカビに由来するトリオースリン酸イソメラーゼ、ニホンコウジカビに由来するタカアミラーゼ、クロコウジカビに由来する中性α−アミラーゼ、クロコウジカビに由来する酸安定性α−アミラーゼ、クロコウジカビ又はアワモリコウジカビに由来するグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、リゾムコール・ミーヘイに由来するリパーゼ、トリコデルマに由来するピルビン酸デカルボキシラーゼ、トリコデルマに由来するβ−グルコシダーゼ、トリコデルマに由来するセロビオースヒドロラーゼＩ、トリコデルマに由来するセロビオースヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマに由来するエンドグルカナーゼＩ、トリコデルマに由来するエンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマに由来するエンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマに由来するエンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマに由来するエンドグルカナーゼＶ、トリコデルマに由来するキシラナーゼＩ、トリコデルマに由来するキシラナーゼＩＩ、又はトリコデルマに由来するβ−キシロシダーゼ等酵素の遺伝子から得たプロモーター、及び前記遺伝子から得たプロモーターに突然変異、短縮又はハイブリダイゼーションが行われた同じ機能を有する配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
いくつかの好ましい実施形態において、プロモーターはトリコデルマ・リーセイに由来するセロビオースヒドロラーゼＩ遺伝子に由来するプロモーター（Ｐｃｂｈ１）であり、いくつかの好ましい実施形態において、プロモーターはトリコデルマ・リーセイに由来するピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子に由来するプロモーター（Ｐｐｄｃ）である。
【００２４】
前記ターミネーターとは、糸状真菌宿主細胞によって認識されると転写を終結できる配列を指す。宿主細胞の中で機能できるターミネーターであればいずれも本発明に用いることができる。本発明においてシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットの糸状真菌宿主細胞における転写終結を仲介するために用いられるターミネーターの例として、アスペルギルス・ニデュランスに由来するアセトアミダーゼ、ニホンコウジカビに由来するアルカリプロテアーゼ、ニホンコウジカビに由来するトリオースリン酸イソメラーゼ、ニホンコウジカビに由来するタカアミラーゼ、クロコウジカビに由来する中性α−アミラーゼ、クロコウジカビに由来する酸安定性α−アミラーゼ、クロコウジカビ又はアワモリコウジカビに由来するグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、リゾムコール・ミーヘイに由来するリパーゼ、トリコデルマに由来するピルビン酸デカルボキシラーゼ、トリコデルマに由来するβ−グルコシダーゼ、トリコデルマに由来するセロビオースヒドロラーゼＩ、トリコデルマに由来するセロビオースヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマに由来するエンドグルカナーゼＩ、トリコデルマに由来するエンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマに由来するエンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマに由来するエンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマに由来するエンドグルカナーゼＶ、トリコデルマに由来するキシラナーゼＩ、トリコデルマに由来するキシラナーゼＩＩ、トリコデルマに由来するβ−キシロシダーゼ等酵素の遺伝子から得たターミネーターとすることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
いくつかの好ましい実施形態において、ターミネーターはトリコデルマ・リーセイに由来するセロビオースヒドロラーゼＩ遺伝子に由来するターミネーター（Ｔｃｂｈ１）であり、いくつかの好ましい実施形態において、ターミネーターはトリコデルマ・リーセイに由来するピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子に由来するターミネーター（Ｔｐｄｃ）である。
【００２６】
任意選択的に又は好ましくは、上記組換え糸状真菌宿主細胞において、前記糸状真菌がアスペルギルス属、コリオラス属、ムコール属、フレビア属、アクレモニウム属、クリプトコッカス属、フザリウム属、フミコーラ属、ミセリオフトラ属、アウレオバシジウム属、トラメテス属、プレロータス属、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、ペシロマイセス属、ファネロカエテ属、ブジェルカンデラ属、セリポリオプシス属、チエラビア属、クリソスポリウム属、スキゾフィルム、コプリヌス属、マグナポルテ属、ネオカリマスティクス属、トリポクラディウム属、タラロマイセス属、サーモアスカス属又はトリコデルマ属等の真菌である。
【００２７】
任意選択的に又は好ましくは、上記組換え糸状真菌宿主細胞において、前記糸状真菌がアスペルギルス属のクロコウジカビ、アスペルギルス・ニデュランス、ニホンコウジカビ又はアワモリコウジカビの菌株である。
【００２８】
任意選択的に又は好ましくは、上記組換え糸状真菌宿主細胞において、前記糸状真菌がトリコデルマ属のトリコデルマ・ハルチアナム、トリコデルマ・コニンギイ、トリコデルマ・リーセイ、トリコデルマ・ロンギブラキアタム又はトリコデルマ・ビリデの菌株である。
【００２９】
より好ましくは、糸状真菌宿主細胞がトリコデルマ・リーセイ細胞であり、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）受託番号５６７６５、ＡＴＣＣ受託番号１３６３１、ＡＴＣＣ受託番号２６９２１、ＡＴＣＣ受託番号５６７６４、ＡＴＣＣ受託番号５６７６７及びＮＲＲＬ（ノーザンリージョナルリサーチラボラトリー）受託番号１５７０９等のトリコデルマ・リーセイ株細胞を含むが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、前記糸状真菌宿主細胞はトリコデルマ・リーセイ株Ｒｕｔ−Ｃ３０細胞である。いくつかの実施形態において、糸状真菌宿主細胞はトリコデルマ・リーセイ株Ｒｕｔ−Ｃ３０の変異細胞とすることができ、遺伝子改変により、トリコデルマ・リーセイ宿主細胞における、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ｐｙｒ４）及び非相同組換えプロセスに関与する遺伝子（ｍｕｓ５３）を含む様々な天然遺伝子がノックアウトされたものを含む。オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼをコードする前記遺伝子がノックアウトされた菌株はウラシル栄養要求性株（ｐｙｒ４−）であり、ｐｙｒ４遺伝子に基づく栄養要求性選別マーカーが効果的なものであることは既に証明されており、様々な真核微生物での適用にも成功していた（Long et al.2008;Weidner et al.1998）。非相同組換えプロセスに関与する前記遺伝子をノックアウトすれば、トリコデルマ・リーセイ宿主細胞における非相同組換えの頻度を顕著に低減し、相同組換えに対する選別を容易にすることができる。
【００３０】
任意選択的に又は好ましくは、上記組換え糸状真菌宿主細胞において、前記シュウ酸デカルボキシラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列で少なくとも１０％の塩基は糸状真菌宿主細胞のコドンの選好度に基づきコドンの最適化が行われている。最適化された遺伝子はシュウ酸デカルボキシラーゼタンパク質をコードするか、又は少なくともその一部をコードする。ここで、その一部をコードするとは、一部アミノ酸配列が削除された後、依然としてシュウ酸デカルボキシラーゼの機能を有することを指す。
【００３１】
任意選択的に又は好ましくは、上記ヌクレオチド配列は配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６のヌクレオチド配列から選ばれるか、又は配列番号９〜１６のいずれかと少なくとも５０％の相同性を、好ましくは少なくとも６０％の相同性、少なくとも７０％相同性、少なくとも８０％相同性を有するもしくは少なくとも９０％の相同性を有する配列から選ばれる。
【００３２】
当然ながら、当業者が理解できることだろうが、上記組換え糸状真菌宿主細胞を製造するプロセスにおいて、シュウ酸デカルボキシラーゼ遺伝子の発現ベクターを構築しておく必要があり、発現ベクターはシュウ酸デカルボキシラーゼ遺伝子発現カセットを含有する他に、選択マーカーをコードする遺伝子発現カセットをも含有する。
【００３３】
前記選択マーカーとは、形質転換された宿主細胞に対する単純選択を提供できるマーカー遺伝子を指す。適切な選択マーカーの例として、ハイグロマイシン及びｂａｒ等耐性遺伝子を含むが、これらに限定されるものではない。また、栄養選択性マーカー、例えば、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ａｒｇＢ）及びオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ等を使用することもできる。
【００３４】
選択マーカーをコードする発現カセットの５’フランキング領域及び３’フランキング領域に３５０〜５００ｂｐの同方向反復配列を有し、逆方向選択圧において自発的なＤＮＡ分子内相同組換えにより除去することができる。一つの実施形態において、選択マーかーはｐｙｒ４遺伝子であり、栄養要求性選別マーカーであるオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼはウリジンを合成するための鍵酵素であり、当該遺伝子の欠失によりウリジンの合成が阻害されるため、当該酵素が決失した栄養要求性株はウラシル／ウリジンを添加しないと成長できない。ｐｙｒ４遺伝子のｐｙｒ４遺伝子欠失株への形質転換に成功すると、当該遺伝子の発現により受容菌自体がウラシル／ウリジンを合成できるため、ウラシル／ウリジンを添加しなくても成長できるようになり、正方向選別の役割が果たされる。また、５−フルオロオロチン酸（５’−ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃａｃｉｄ、略称５’−ＦＯＡ）はウラシル合成前駆体のアナログであり、ｐｙｒ４が作用すると細胞毒性物質が生成されるため、野生型株は５’−ＦＯＡの存在下において成長できないが、ｐｙｒ４遺伝子欠失菌に変わると５’−ＦＯＡ耐性を有し、逆方向選別が実現される（非特許文献３）。これにより、形質転換された宿主細胞に対する単純選択を提供する。
【００３５】
上記シュウ酸デカルボキシラーゼ遺伝子の発現ベクターは、ランダム組込み型発現ベクター及び部位特異性の組込み型発現ベクターを含む。例えば、ランダム組込み型発現ベクターがアグロバクテリウムの仲介によりトリコデルマ・リーセイを形質転換させると、シュウ酸デカルボキシラーゼの発現カセットはトリコデルマ・リーセイゲノムにランダムに組み込まれ、そして、Ｔａｉｌ−ＰＣＲ法によりゲノムに組み込まれたその位置及びコピー数を分析する。一つの実施例において、２回の形質転換及び選別により組込み部位及びコピー数が異なる形質転換株を得ることができ、振盪フラスコを用いる発酵により酵素の生成状況を比較することで、一連の遺伝子組換え菌株を選別し、そのコピー数及びトリコデルマ・リーセイゲノムに組み込まれたその部位を分析する。部位特異性の組込み発現ベクターはシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットの両端に５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームとして、トリコデルマ・リーセイの特定部位と同一のＤＮＡ配列セグメントを含有し、部位特異性の組込み発現ベクターを用いれば、シュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットを特定部位に導入するとともにこれらの特定部位における遺伝子をノックアウトすることができる。一つの実施例において、部位特異性の組込み部位として、トリコデルマ・リーセイの細胞外分泌タンパク質に占める主な成分のいくつかのセルラーゼ遺伝子（ＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１及びＥＧ２）を選択し、シュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットに組み込むとともにこれらの遺伝子をコードするカセットをノックアウトすることにより、４コピー発現株を構築し、当該菌株が発酵条件において組換え・分泌発現したシュウ酸デカルボキシラーゼの細胞外総タンパクにおける含有量は、９０％以上に達する。
【００３６】
本発明の第２の態様として、上記いずれかの組換え糸状真菌宿主細胞の構築方法（ランダム組込み法）を提供し、前記組換え糸状真菌宿主細胞はそのゲノムに組み込まれたシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットの１つ以上のコピーを含み、前記シュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットはプロモーター、シグナルペプチドコード配列、シュウ酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びターミネーターを含み、当該方法は、
選択マーカー遺伝子発現カセット及びシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットを含む少なくとも１つの組込み型発現ベクターを構築する、ステップＳ１と、
組込み型発現ベクターによる糸状真菌宿主細胞の形質転換後、選別してシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットの１つ以上のコピーを含有する組換え糸状真菌宿主細胞を得る、ステップＳ２とを含む。
【００３７】
任意選択的に又は好ましくは、上記方法において、ステップＳ２に記載の糸状真菌宿主細胞が人工的に構築された栄養要求性細胞であり、前記組込み型発現ベクターが前記糸状真菌宿主細胞ゲノムに組み込まれると当該タイプの栄養要求性を修復できる。
【００３８】
任意選択的に又は好ましくは、上記方法において、糸状真菌宿主細胞の形質転換後、前記組込み型発現ベクターは非相同組換えにより糸状真菌宿主細胞ゲノムにランダムに組み込まれる。
【００３９】
任意選択的に又は好ましくは、上記方法において、前記組込み型発現ベクターは糸状真菌宿主細胞ゲノムにおける特異性遺伝子座の所定の長さのヌクレオチド配列と相同の５’末端ホモロジーアーム及び３’末端ホモロジーアームを含み、これによって糸状真菌宿主細胞の形質転換後に前記組込み型発現ベクターは相同組換えの方式によりゲノムの特定部位に組み込まれ、好ましくは細胞外タンパク質をコードする遺伝子に組み込まれ、より好ましくは細胞外プロテアーゼ類又は細胞外グリコシドヒドロラーゼ類をコードする遺伝子に組み込まれ、最も好ましくはＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１又はＥＧ２遺伝子に組み込まれる。
【００４０】
一つの実施例（ランダム組込み法）において、親株は人工的に構築されたｐｙｒ４遺伝子欠失型トリコデルマ・リーセイであり、当該方法は、以下のステップを含む。
少なくとも１つのランダム組込み発現ベクターを構築し、凍結融解法によりアグロバクテリウム・ツメファシェンスＡＧＬ−１形質転換受容性細胞に導入することにより、上記ランダム組込み発現ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシェンスＡＧＬ−１細胞を得て、当該細胞の感染液を製造してｐｙｒ４遺伝子が欠失されたトリコデルマ・リーセイと共培養し、選別してシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットの１つ以上のコピーを含有するトリコデルマ・リーセイ株、すなわち目的宿主細胞を得る。
【００４１】
本発明の第３の態様として、上記方法（ランダム組込み法）により製造された宿主細胞の培養に適用される培地を提供し、当該培地の組成は、グルコース  ３〜８ｇ／Ｌ、微結晶セルロース  １０〜２５ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー  ５〜１５ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．５〜５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．５６ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２  ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ２〜８ｇ／Ｌ、尿素  ０〜１ｇ／Ｌ、ふすま粉  ０．２〜２ｇ／Ｌ、Ｍａｎｄｅｌｓ微量元素（１０００×）  １ｍｌ、ＭｎＣｌ２  ０．５〜５ｍＭであり、ｐＨは３．０〜４．５である。
【００４２】
本発明の第４の態様として、上記いずれかの組換え糸状真菌宿主細胞のもう一つの構築方法（部位特異性組込み法）を提供し、一つの実施例において、当該方法は、以下のステップ（１）〜ステップ（３）を含む。
（１）トリコデルマ・リーセイのＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１、ＥＧ２の４つの遺伝子座部位をターゲットとするシュウ酸デカルボキシラーゼ発現ベクターをそれぞれ構築する。
（２）ｐｙｒ４及びｍｕｓ５３遺伝子が欠失されたトリコデルマ・リーセイ株において、部位特異性組込みノックインの方式によりＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１及びＥＧ２部位ゲノムにステップ（１）の各部位に対応する発現ベクターにおける発現カセットを組み込む。これらの部位に部位特異的に組み込まれた後、細胞外分泌総タンパクにおける夾雑タンパク質の含有量が極めて少なく、ほぼ全てが目的タンパク質であるため、当該方法により生産されたシュウ酸デカルボキシラーゼ発酵液の後続の処理はより簡単で且つ経済的である。ｍｕｓ５３遺伝子がノックアウトされると部位特異的組込みの確率は大幅に向上するため、後続の部位特異性組込み株の選別は容易になる。
（３）ｐｙｒ４及びｍｕｓ５３遺伝子修復ベクターを用いて、ステップ（２）で得た菌株に対しｍｕｓ５３及びｐｙｒ４遺伝子の修復を行う。修復が成功した菌株はすなわち目的宿主細胞である。ｐｙｒ４遺伝子が修復されると、発酵中に培地にさらにウラシル又はウリジンを加える必要がなく、宿主細胞は固有する代謝平衡を保持できるため、発酵コストが上がらない。また、ｍｕｓ５３遺伝子が修復されると、宿主細胞は固有する安定性を保持し、ｍｕｓ５３遺伝子の欠失がもたらすゲノムが不安定になる要因を解消することができる。
【００４３】
本発明の第５の態様として、上記方法（部位特異性組込み法）により製造された宿主細胞の培養に適用されるもう一つの培地を提供し、当該培地の組成は、グルコース  ３〜６ｇ／Ｌ、ラクトース  ３０〜４０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー  ７〜１０ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．５〜１ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．５６ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２  ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ２〜４ｇ／Ｌ、尿素  ０〜１ｇ／Ｌ、ふすま粉  １０〜２０ｇ／Ｌ、Ｍａｎｄｅｌｓ微量元素（１０００×）  １ｍｌ、ＭｎＣｌ２  ０．５〜５ｍＭであり、ｐＨは３．５〜４．０である。
【００４４】
本発明の第６の態様として、シュウ酸デカルボキシラーゼの生産方法を提供し、すなわち、プロモーター、シグナルペプチドコード配列、シュウ酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びターミネーターを含むシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットを構築し、発現ベクターにより糸状真菌宿主細胞に導入して、宿主細胞ゲノムに１つ以上のシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットを組み込み、宿主細胞を培養してシュウ酸デカルボキシラーゼを発現させ、最後に宿主細胞培養基質から発現産物を分離して精製する。
【００４５】
本発明の第７の態様として、薬物、食品の製造における上記いずれかの組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ又は組換え糸状真菌宿主細胞の培養後に分泌発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼの適用を提供する。
【００４６】
任意選択的に又は好ましくは、上記適用において、前記薬物が泌尿器系結石を予防及び／又は治療する薬物である。
【００４７】
本発明の第８の態様として、薬物組成物を提供し、当該薬物組成物は、尿中シュウ酸過剰に関連する疾患の予防又は治療に用いられ、上記方法により製造されたシュウ酸デカルボキシラーゼを含む。
【発明の効果】
【００４８】
従来技術と比べ、本発明は以下の有益な効果を有する。
本発明は、真菌に由来するシュウ酸デカルボキシラーゼが効果的な組換え発現を実現できないという技術的課題を解決し、糸状真菌宿主細胞によって組換え発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼに対し、各種の翻訳後加工を行うことができ、効果的に分泌発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼは天然宿主細胞において製造されたシュウ酸デカルボキシラーゼに類似する酵素学的性質を有する。当該宿主細胞の培養は簡単であり、シュウ酸デカルボキシラーゼの分泌量が多く酵素活性が高い。本発明による２種の培地の配合はそれぞれ２種の組換え糸状真菌宿主細胞に適用され、収量を効果的に向上させることができる。シュウ酸デカルボキシラーゼの生産において、発現カセットの構築、ベクター構築、宿主細胞の構築及び培地配合の最終的な調整により、収率及び製品の酵素活性はいずれも大幅に向上し、シュウ酸デカルボキシラーゼの人力生産は大規模な産業化を実現できず、酵素学的特性が不安定であり、生産コストが高いという従来技術における課題を効果的に解決できる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、ベクターｐＭＤＴ０５の構築を示す図である。
【図２】図２は、トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０株ｐｙｒ４遺伝子ノックアウトベクターｐＭＤＴ０５−ｐｙｒ４ＫＯの構築を示す図である。
【図３】図３は、トリコデルマ・リーセイランダム組込み誘導型発現ベクターｐＭＧＵ−ｃｂｈ１−ＴＲＡ２の構築を示す図である。
【図４】図４は、トリコデルマ・リーセイランダム組込み構成型発現ベクターｐＤＧＵ−ｐｄｃ−ＴＲＡ２の構築を示す図である。
【図５】図５は、トリコデルマ・リーセイ形質転換体ｐｙｒ４遺伝子修復ベクターｐＭＤＴ０５−ｐｙｒ４ＫＩの構築を示す図である。
【図６】図６は、発酵１４４時間及び１６８時間における発酵液上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す図であり、矢印の箇所は組換えシュウ酸デカルボキシラーゼを示すバンドである。
【図７】図７は、ｍｕｓ５３遺伝子ノックアウトベクターの構築を示す図である。
【図８】図８は、ＣＢＨ１部位における部位特異的組込みノックインベクターの構築を示す図である。
【図９】図９は、ＣＢＨ２部位における部位特異的組込みノックインベクターの構築を示す図である。
【図１０】図１０は、ＥＧ１部位における部位特異的組込みノックインベクターの構築を示す図である。
【図１１】図１１は、在ＥＧ２部位における部位特異的組込みノックインベクターの構築を示す図である。
【図１２】図１２は、ｍｕｓ５３遺伝子修復ベクターの構築を示す図である。
【図１３】図１３は、７Ｌ発酵タンクにおける発酵活性の変化を示す図である。
【図１４】図１４は、７Ｌ発酵タンク発酵における１３６時間及び１６０時間の試料が１０倍希釈されたもののＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す図である。
【図１５】図１５は、１６０時間の試料が２００倍及び５００倍希釈されたもののウエスタンブロッティング検出分析結果を示す図である。
【図１６】図１６は、ｐＨ値１．５〜７．０におけるシュウ酸デカルボキシラーゼの相対活性を示す図である。
【図１７】図１７は、３種類の発現系により発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼのＳＤＡ−ＰＡＧＥ結果を示す図であり、レーン１及びレーン２はトリコデルマ・リーセイによって発現された組換えシュウ酸デカルボキシラーゼで、レーン３及びレーン４は天然宿主のチャジュタケによって発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼで、レーン５及びレーン６は原核発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼである。
【図１８】図１８は、トリコデルマ・リーセイによって発現された組換えシュウ酸デカルボキシラーゼのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。
【図１９】図１９は、トリコデルマ・リーセイによって発現された組換えシュウ酸デカルボキシラーゼのトリプシン消化後のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。
【図２０】図２０は、天然宿主のチャジュタケによって発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼのトリプシン消化後のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。
【図２１】図２１は、原核発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼのトリプシン消化後のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明は、チャジュタケに由来するシュウ酸デカルボキシラーゼの糸状真菌トリコデルマ・リーセイにおける組換え発現を具体的な実施例として説明し、これによって当業者は本発明の理解を深め実施に付することができるが、挙げられる実施例は本発明を限定するためのものではない。
【００５１】
特段の説明がない限り、本明細書に出現する技術用語はいずれも当業者同士の間でよく使用される用語である。本明細書において、具体的な条件が示されない実験方法はいずれも通常の実験方法である。また、本明細書で使用される試験材料、試薬は、特段の説明がない限りいずれも市販されている製品であり、各種試薬及び培地の成分及び調製方法は実験マニュアルに記載の通常操作を参照できる。
【００５２】
本発明において使用されるトリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０（ＡＴＣＣ受託番号：５６７６５）は広東微生物菌種寄託センターから購入したものである。
【００５３】
本発明において使用されるクロコウジカビ（ＣＩＣＣ寄託番号：２４３９）は中国工業微生物菌種寄託センターから購入したものである。
【００５４】
実施例１：シュウ酸デカルボキシラーゼ（ＯＸＤＣ）遺伝子のコドン最適化及び人工合成
【００５５】
発明者は大量の実験と研究を行ったところ、糸状真菌発現系によって発現される真核生物に由来するシュウ酸デカルボキシラーゼは、チャジュタケ、ヤナギマツタケ、エノキタケ、カワラタケ、褐色腐朽菌、アスペルギルス・リュウキュウエンシス、ツクリタケ及びキシメジ等真菌に由来するシュウ酸デカルボキシラーゼが好ましいということを見出した。
【００５６】
シュウ酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子はチャジュタケに由来するものとすることができ、前記シュウ酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列は配列番号１に示されるアミノ酸配列であり、ただし前記シュウ酸デカルボキシラーゼのシグナルペプチド配列は配列番号１に示される１〜１９位のアミノ酸配列であり、成熟ペプチド配列は配列番号１に示される２０〜４７０位のアミノ酸配列である。
【００５７】
チャジュタケに由来するＯＸＤＣ遺伝子に対し、トリコデルマ・リーセイコドンの選好度（Codon Usage Database:Hypocrea jecorina）を参照してそれぞれ最適化を行うことにより、新規なシュウ酸デカルボキシラーゼの成熟ペプチドのＤＮＡコード配列の人工設計及び合成を実現した。最適化されたＯＸＤＣ配列は最適化前と比べ、ＣＡＩ（Ｃｏｄｏｎ  Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）が０．５１から０．９９に、Ｇ＋Ｃの含有量が５３．０９％から６９．２３％に変化し、最適化された配列は配列番号１７に示すとおりである。最適化されたチャジュタケのＯＸＤＣ遺伝子における成熟ペプチドのＤＮＡコード配列をＴＲＡ２と新たに命名した。
【００５８】
実施例２：トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０（ｐｙｒ４−）栄養要求性株の構築
【００５９】
真核系で真核に由来するＯＸＤＣを発現するために用いられる糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルス属、コリオラス属、ムコール属、フレビア属、アクレモニウム属、クリプトコッカス属、フザリウム属、フミコーラ属、ミセリオフトラ属、アウレオバシジウム属、トラメテス属、プレロータス属、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、ペシロマイセス属、ファネロカエテ属、ブジェルカンデラ属、セリポリオプシス属、チエラビア属、クリソスポリウム属、スキゾフィルム、コプリヌス属、マグナポルテ属、ネオカリマスティクス属、トリポクラディウム属、タラロマイセス属、サーモアスカス属又はトリコデルマ属の細胞、又はこれらの有性型又は異名同種型の細胞から選ばれ、ただしこれらに限定されるものではない。
【００６０】
トリコデルマ属宿主細胞は、トリコデルマ・ハルチアナム、トリコデルマ・コニンギイ、トリコデルマ・リーセイ、トリコデルマ・ロンギブラキアタム及びトリコデルマ・ビリデであり、好ましくはトリコデルマ・リーセイ及びトリコデルマ・ビリデである。次に、トリコデルマ・リーセイを例に本発明を説明する。
【００６１】
１．トリコデルマ・リーセイゲノムの抽出
トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０（ＡＴＣＣ寄託番号：５６７６５）をＰＤＡ培地に接種し、２８℃の恒温で胞子が成熟するまで７日培養した。無菌水で胞子を溶出させて、適量の胞子懸濁液を調製し、液体培地２０ｍｌに接種し、２８℃で１７０ｒｐｍの条件において３６〜４８時間培養した。吸引濾過により菌糸体を収集し、脱イオン水で２回洗浄し、液体窒素冷凍において菌糸体を微粉に粉砕し、上海Ｓａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製のＥｚｕｐ型カラム型真菌ゲノムＤＮＡ抽出キットを使用してゲノムＤＮＡを分離した。
【００６２】
なお、上記ＰＤＡ培地は以下のように調製した。皮を剥いたジャガイモ薄片２００ｇに水１０００ｍｌを加えて煮沸させ、３０分継続し、８重ガーゼで濾過し、濾液にグルコース２０ｇを加え、水を補足して１Ｌとし、ｐＨを調節せず、そのまま２％寒天末を加えた。１１５℃で３０分滅菌した。
【００６３】
上記液体培地は以下のように調製した。グルコース１５ｇ、酵母抽出物２０ｇ、硫酸アンモニウム２．５ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．８ｇ及び無水塩化カルシウム１．０ｇを混合した後、蒸留水で溶解し１Ｌに定容し、ｐＨを４．８に調節した。
【００６４】
２．ベクターｐＭＤＴ０５の構築
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００プラスミドをテンプレートとして、次の表１に示すプライマーｐＭＤＴ０５−Ｆ１及びｐＭＤＴ０５−Ｒ１を使用してＰＣＲ増幅を行い、１％アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を分離し、ゲルから約６．８ｋｂの断片を切り出し、ｏｍｅｇａ社提供のゲル抽出キットを用いて回収し、回収した断片を精製して制限酵素ＸｈｏＩ及びＸｂａＩを用いて１時間消化し、消化完了後、ｏｍｅｇａ社提供のＰＣＲ産物回収キットを用いて精製・回収を行った。
【００６５】
上述したように抽出されたトリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、表１に示すプライマーＨｙｇ−Ｐｇｐｄ−Ｆ及びｐＭＤＴ０５−Ｒ２を使用してプロモーターＰｇｐｄを増幅した（約１．４ｋｂ）。ｐＣＡＭＢＩＡ１３００プラスミドをテンプレートとして、表１に示すプライマーｐＭＤＴ０５−Ｆ２及びＰｇｐｄ−Ｈｙｇ−Ｒを使用してｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ遺伝子を増幅した（約１ｋｂ）。上述したように増幅して得たプロモーターＰｇｐｄ断片及びｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ遺伝子をモル比１：１で混合してテンプレートとし、プライマーｐＭＤＴ０５−Ｆ２及びｐＭＤＴ０５−Ｒ２をフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してＳＯＥ−ＰＣＲ増幅を行う（増幅条件は９４℃、１０分；９８℃、１０秒、６０℃、３０秒、６８℃、１分２０秒、３０サイクル；６８℃、１０分）ことにより約２．４ｋｂの融合断片を得て、１％アガロースゲル電気泳動により融合断片を分離し、ゲルから約２．４ｋｂの断片を切り出し、ｏｍｅｇａ社提供のゲル回収キットを用いて回収を行い、回収した断片を精製して制限酵素ＸｈｏＩ及びＸｂａＩを用いて１時間消化し、消化完了後、ｏｍｅｇａ社提供のＰＣＲ産物回収キットを用いて精製・回収を行った。
【００６６】
上述したように消化後の６．８ｋｂ及び２．４ｋｂの断片をモル比１：３で混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ及びリガーゼ緩衝液を加え、２２℃で３時間ライゲーションさせ、ライゲーションされた産物で大腸菌ＴＯＰ１０形質転換受容性細胞を形質転換し、５０μｇ／ｍＬカナマイシン耐性プレートに塗布してクローンを選別し、プライマーｐＭＤＴ０５−Ｆ２及びｐＭＤＴ０５−Ｒ２を使用してＰＣＲ検証及びシークエンシング検証を行い、シークエンシング検証して正しく構築されているプラスミドベクターをｐＭＤＴ０５と命名し、図１はベクターｐＭＤＴ０５の構築を示す。
【００６７】
【表１】
2021514679.tif 000003
【００６８】
３．トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０株ｐｙｒ４遺伝子ノックアウトベクターの構築
公開文献に記載されたトリコデルマ・リーセイｐｙｒ４遺伝子（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子）の情報（非特許文献３）を参照し、ＢＬＡＳＴＮプログラムを利用してトリコデルマ・リーセイのゲノムデータベースでｐｙｒ４遺伝子の位置における遺伝子座配列情報を検索した（http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html）。上述したように抽出されたトリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、表２に示すプライマーｐｙｒ４−３Ｆ／ｐｙｒ４−３Ｒ及びｐｙｒ４−５Ｆ／ｐｙｒ４−５Ｒを使用してそれぞれ増幅することにより約１．３ｋｂのｐｙｒ４遺伝子の上流ホモロジーアーム断片及び約１．３ｋｂのｐｙｒ４遺伝子の下流ホモロジーアーム断片を得た。ｐｙｒ４遺伝子の上流ホモロジーアーム断片及びｐｙｒ４遺伝子の下流ホモロジーアーム断片をモル比１：１の比率で混合してテンプレートとし、ｐｙｒ４−３Ｆ及びｐｙｒ４−５Ｒをフォワードプライマー及びリバースプライマーとし、ＳＯＥ−ＰＣＲ増幅することにより約２．６ｋｂのｐｙｒ４遺伝子ノックアウトカセットを得た。
【００６９】
ｐＭＤＴ０５ベクター及び上記２．６ｋｂのｐｙｒ４遺伝子ノックアウトカセットを制限酵素ＸｂａＩ及びＢｇｌＩＩで１時間消化し、ｏｍｅｇａ社提供のゲル抽出キットを用いて消化された断片をそれぞれ回収し、ゲル精製されたＸｂａＩ／ＢｇｌＩＩ消化後のｐＭＤＴ０５ベクター及び消化された２．６ｋｂの断片をモル比１：３で混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ及びリガーゼ緩衝液を加え、２２℃で３時間ライゲーションさせ、大腸菌ＴＯＰ１０形質転換受容性細胞を形質転換し、検証及びシークエンシングを行って正しく構築されているベクターをｐＭＤＴ０５−ｐｙｒ４ＫＯと命名し、図２はトリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０株ｐｙｒ４遺伝子ノックアウトベクターｐＭＤＴ０５−ｐｙｒ４ＫＯの構築を示す。
【００７０】
４．アグロバクテリウム・ツメファシェンスの仲介によるトリコデルマ・リーセイｐｙｒ４遺伝子欠失突然変異株の構築
凍結融解法（非特許文献４）により上記ノックアウトベクターｐＭＤＴ０５−ｐｙｒ４ＫＯをアグロバクテリウム・ツメファシェンスＡＧＬ−１形質転換受容性細胞に導入し、２８℃で３〜４時間活性化させた後、適量の菌液を採取してｋａｎ（５０μｇ／ｍＬ）及びＧｅｎｔ（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢプレート培地に塗布し、２８℃で４８〜７２時間倒置培養した後、モノクローナルをピッキングしてｋａｎ（５０μｇ／ｍＬ）及びＧｅｎｔ（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ液体培地に接種し、振盪培養機を用いて２８℃で２２０ｒｐｍにおいて２４時間培養し、少量の菌液を採取してコロニーのＰＣＲ検証を行うことにより陽性形質転換体を選別した。
【００７１】
形質転換用アグロバクテリウム・ツメファシェンスの製造：上述したように検証された陽性形質転換体をｋａｎ（５０μｇ／ｍＬ）及びＧｅｎｔ（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ液体培地に接種し、振盪培養機を用いて２８℃で２２０ｒｐｍにおいて２０〜２４時間培養し、菌体を収集し、ＩＭ培地で２回洗浄し、ＩＭ培地でＯＤ６００＝０．１５〜０．２０になるよう希釈し、アセトシリンゴンを加え終濃度を２００μｍｏｌ／Ｌとし、２８℃で２２０ｒｐｍにおいて、ＯＤ６００＝０．６〜０．８になるよう約６〜１０時間培養した。
【００７２】
トリコデルマ・リーセイ形質転換受容体の製造：無菌水４〜５ｍｌを用いて６〜７日培養されたＰＤＡプレートからトリコデルマ・リーセイの胞子を溶出させ、綿栓濾過して胞子懸濁液を得て、遠心分離して胞子を収集し、ＩＭ培地で２回洗浄し、ＩＭ培地で再懸濁して胞子濃度を１０７個／ｍｌに調整し、２８℃で３〜４時間培養して発芽させた。
【００７３】
アグロバクテリウム・ツメファシェンスとトリコデルマ・リーセイの共培養：調製されたアグロバクテリウム・ツメファシェンス菌液を１００μｌ採取して発芽処理後の胞子懸濁液１００μｌと混合し、ＩＭ固体培地プレートのセロファンに塗布し、２４℃で３６時間暗所培養した。セロファンを剥がし裏返して、５−ＦＯＡを５ｍｇ／ｍｌ、セファロスポリンを３００μｇ／ｍＬ、ウリジンを１０ｍＭ含有する固体ＭＭ一次選別培地プレートに敷き、形質転換体が確認されるまで２８℃で４〜６日培養した。
【００７４】
形質転換体の二次選別：ハイグロマイシンを１００μｇ／ｍＬ含有するＰＤＡ固体プレート、及び５−ＦＯＡを５ｍｇ／ｍｌ、ウリジンを１０ｍＭ含有する固体ＭＭ培地プレートに形質転換体をそれぞれスポットし、２８℃で２〜３日培養し、ハイグロマイシンを１００μｇ／ｍＬ含有するＰＤＡ固体プレートでは成長できず５−ＦＯＡを５ｍｇ／ｍｌ、ウリジンを１０ｍＭ含有する固体ＭＭ培地プレートで正常に成長する形質転換体をピッキングし、二次選別された形質転換体ゲノムＤＮＡを抽出し、上流ホモロジーアーム及び下流ホモロジーアームの両末端外側のゲノムのプライマーｐｙｒ４−ＣＸ−Ｆ及びｐｙｒ４−ＣＸ−Ｒを用いて（配列は表２に示す）ＰＣＲ検証を行い、ｐｙｒ４遺伝子がノックアウトされた場合、増幅して得た断片は約２．８ｋｂで、ノックアウトがされなかった場合、増幅して得た断片は約４．２ｋｂのはずである。
【００７５】
本実施例において合計で２３の形質転換体（番号１＃〜２３＃）が選別され、ＰＣＲ検証した結果全ての二次選別された形質転換体はいずれも増幅後に約２．８ｋｂだけの断片を得た、このうちに、ハイグロマイシンを１００μｇ／ｍＬ含有するＰＤＡ固体プレートにおいても５−ＦＯＡを５ｍｇ／ｍｌ、ウリジンを１０ｍＭ含有する固体ＭＭ培地プレートにおいても正常に成長する形質転換体は１つであり、当該形質転換体は相同組換えと共にランダム組込み挿入が発生しているため除去し、従ってｐｙｒ４遺伝子の有効ノックアウト率は９５．６％に達する。
【００７６】
単胞子の分離・精製：上記２３の形質転換体のうち番号８＃のノックアウト株の菌糸体を、ウリジンを１０ｍＭ含有するＰＤＡ培地プレートに接種し、胞子が成熟するまで２８℃で７日培養した。無菌水４〜５ｍｌで成熟した胞子を溶出させ、無菌水で勾配希釈し、ウリジンを１０ｍＭ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−１００を含有するＰＤＡ培地プレートに塗布し、２８℃で３日培養し後、ピッキングして単胞子コロニーを分離させ、ウリジンを１０ｍＭ含有するＰＤＡ培地プレートに再接種し、２８℃で分生子の培養を行った。上述したように分離された単胞子コロニーをＰＣＲ検出し、依然として陽性であった菌株をウラシル栄養要求性株とし、Ｒｕｔ−Ｃ３０（ｐｙｒ４−）と命名した。
【００７７】
【表２】
2021514679.tif 000004
【００７８】
実施例３：シュウ酸デカルボキシラーゼのランダム組込み型組換え発現ベクターの構築
【００７９】
１．ランダム組込み誘導型発現ベクターｐＭＧＵ−ｃｂｈ１−ＴＲＡ２の構築
【００８０】
ベクターｐＭＧＵの構築：
実施例２で製造されたプラスミドベクターｐＭＤＴ０５をテンプレートとして、表３に示すプライマーＦ１及びＲ１をフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してＰＣＲ増幅することにより約６．６ｋｂのベクター骨格断片を得て、ゲルを用いて当該断片を回収後、制限酵素ＤｐｎＩで３時間消化し、目的断片を回収しておく。
【００８１】
実施例２に記載のトリコデルマ・リーセイゲノムの抽出方法を参照して、クロコウジカビ（ＣＩＣＣ寄託番号：２４３９）ゲノムＤＮＡを抽出し、当該ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、表３に示すプライマーｐｙｒＧ−Ｆ及びｐｙｒＧ−Ｒを使用して増幅することにより約２．９ｋｂのクロコウジカビｐｙｒＧ遺伝子発現カセットを得て、目的断片をゲル回収しておく。トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、表２に示すプライマーＰｃｂｈ−ＤＲ−Ｆ及びＰｃｂｈ−ＤＲ−Ｒを使用してＣＢＨ１遺伝子プロモーターＰｃｂｈ１を増幅することによりサイズが０．４ｋｂの断片を得て、ゲル回収しておく。２．９ｋｂのクロコウジカビｐｙｒＧ遺伝子発現カセット及びＰｃｂｈ１の０．４ｋｂの断片をモル比１：１で混合してテンプレートとし、プライマーＰｃｂｈ−ＤＲ−Ｆ及びｐｙｒＧ−Ｒをフォワードプライマー及びリバースプライマーとして、ＳＯＥ−ＰＣＲ増幅を行い、増幅条件は、９４℃、１０分；９８℃、１０秒、６０℃、３０秒、６８℃、１分５０秒、３０サイクル；６８℃、１０分とし、約３．３ｋｂの融合断片を得て、当該目的断片をゲル回収しておく。
【００８２】
ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＩＩによるワンステップ法クローニングキットを用いて、上述したように消化後のベクター骨格断片及びＳＯＥ−ＰＣＲ増幅後に回収された３．３ｋｂの断片を組み立て、大腸菌ＴＯＰ１０形質転換受容性細胞を形質転換し、プレートに塗布し、検証及びシークエンシングを行って正しく構築されているベクターをｐＭＧＵと命名した。
【００８３】
誘導型発現カセットｐＵＣ１９−Ｐｃｂｈ１−ｓｉｇ−ＴＲＡ２−Ｔｃｂｈ１の構築：
トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、表３に示すプライマーＰｃｂｈ１−Ｆ及びＰｃｂｈ１−Ｒをフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してＣＢＨ１遺伝子のプロモーター及びＣＢＨ１遺伝子のシグナルペプチドコード配列Ｐｃｂｈ１−ｓｉｇをＰＣＲ増幅し、トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、表３に示すプライマーＴｃｂｈ１−Ｆ及びＴｃｂｈ１−Ｒをフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してＣＢＨ１遺伝子のターミネーター配列Ｔｃｂｈ１をＰＣＲ増幅した。Ｐｃｂｈ１−ｓｉｇ断片及びＴｃｂｈ１断片をモル比１：１で混合してテンプレートとし、プライマーＰｃｂｈ１−Ｆ及びＴｃｂｈ１−Ｒをフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してＰＣＲ増幅することにより、約３．３ｋｂの融合断片Ｐｃｂｈ１−ｓｉｇ−Ｔｃｂｈ１を得て、目的断片を回収しＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで当該断片を消化し、ゲル回収しておく。プラスミドｐＵＣ１９に対して同様に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで３時間消化し、ベクター骨格断片をゲル回収し、消化・回収後のＰｃｂｈ１−ｓｉｇ−Ｔｃｂｈ１断片とＴ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションさせて、大腸菌ＴＯＰ１０形質転換受容性細胞を形質転換し、検証及びシークエンシングを行って正しく構築されているベクターをｐＵＣ１９−Ｐｃｂｈ１−ｓｉｇ−Ｔｃｂｈ１と命名した。
【００８４】
プラスミドｐＵＣ１９−Ｐｃｂｈ１−ｓｉｇ−Ｔｃｂｈ１をテンプレートとして、表３に示すプライマーＷＦ−ＣＢＨ−Ｒ及びＷＦ−ＣＢＨ−Ｆをフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してＰＣＲ増幅することにより、約５．８ｋｂのベクター骨格断片を得て、ＤｐｎＩで３時間消化してゲル回収しておく。合成されたＴＲＡ２遺伝子を含有するプラスミドｐＵＣ５７−ＴＲＡ２（遺伝子合成分野会社提供）をテンプレートとして、表３に示すプライマーＷＦ−ＴＲＡ２−Ｆ及びＷＦ−ＴＲＡ２−Ｒをフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してＴＲＡ２遺伝子の成熟ペプチドをコードする配列をＰＣＲ増幅した。ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＩＩによるワンステップ法クローニングキットを用いて、消化・回収後のベクター骨格断片及びＴＲＡ２断片を組み立て、大腸菌ＴＯＰ１０形質転換受容性細胞を形質転換し、検証及びシークエンシングを行って正しく構築されているベクターをｐＵＣ１９−Ｐｃｂｈ１−ｓｉｇ−ＴＲＡ２−Ｔｃｂｈ１と命名した。
【００８５】
ランダム組込み誘導型発現ベクターｐＭＧＵ−ｃｂｈ１−ＴＲＡ２の構築：
制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで、上述したように製造されたベクターｐＭＧＵを３時間消化し、ベクター骨格断片をゲル回収しておく。上述したように製造されたベクターｐＵＣ１９−Ｐｃｂｈ１−ｓｉｇ−ＴＲＡ２−Ｔｃｂｈ１をテンプレートとして、表３に示すプライマーＦ２及びＲ２をフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してＰｃｂｈ１−ｓｉｇ−ＴＲＡ２−Ｔｃｂｈ１断片をＰＣＲ増幅し、当該目的断片をゲル回収しておく。制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩでｐＭＧＵを消化して回収したベクター骨格及びＰｃｂｈ１−ｓｉｇ−ＴＲＡ２−Ｔｃｂｈ１断片を、ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＩＩによるワンステップ法クローニングキットを用いて組み立て、大腸菌ＴＯＰ１０形質転換受容性細胞を形質転換し、検証及びシークエンシングを行って正しく構築されているベクターをｐＭＧＵ−ｃｂｈ１−ＴＲＡ２と命名し、図３はトリコデルマ・リーセイのランダム組込み誘導型発現ベクターｐＭＧＵ−ｃｂｈ１−ＴＲＡ２の構築を示す。
【００８６】
２．ランダム組込み構成型発現ベクターｐＤＧＵ−ｐｄｃ−ＴＲＡ２の構築
【００８７】
ベクターｐＤＧＵの構築：
実施例２で製造されたベクターｐＭＤＴ０５をテンプレートとして、表３に示すプライマーＦ１及びＲ１を使用してＰＣＲ増幅することにより６．６ｋｂのベクター骨格を得て、当該断片をゲル回収して制限酵素ＤｐｎＩで３時間消化し、目的断片を回収しておく。
【００８８】
クロコウジカビ（ＣＩＣＣ寄託番号：２４３９）のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、表３に示すプライマーｐｄｃＤＲ−ｐｙｒＧ−Ｆ及びｐｙｒＧ−Ｒを使用して増幅することにより２．９ｋｂのクロコウジカビｐｙｒＧ遺伝子の発現カセットを得て、目的断片をゲル回収しておく。トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、表３に示すプライマーＰｐｄｃ−ＤＲ−Ｆ及びｐｙｒＧ−ｐｄｃＤＲ−Ｒでｐｄｃ遺伝子プロモーターＰｐｄｃの５’末端を増幅することにより０．４ｋｂの断片を得て、ゲル回収しておく。２．９ｋｂのクロコウジカビｐｙｒＧ遺伝子発現カセット及びＰｐｄｃの５’末端の０．４ｋｂ断片をモル比１：１で混合してテンプレートとし、プライマーＰｐｄｃ−ＤＲ−Ｆ及びｐｙｒＧ−Ｒをフォワードプライマー及びリバースプライマーとして、ＳＯＥ−ＰＣＲ増幅することにより３．３ｋｂの断片を得て、当該目的断片をゲル回収しておく。
【００８９】
ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＩＩによるワンステップ法クローニングキットを用いて、上述したように消化後の６．６ｋｂｐのベクター骨格断片、及び９４℃、１０分；９８℃、１０秒、６０℃、３０秒、６８℃、１分５０秒、３０サイクル；６８℃、１０分の条件でＳＯＥ−ＰＣＲ増幅し回収して得た３．３ｋｂの断片を組み立て、大腸菌ＴＯＰ１０形質転換受容性細胞を形質転換し、プレートに塗布し、検証及びシークエンシングを行って正しく構築されているベクターをｐＤＧＵと命名した。
【００９０】
構成型発現カセットベクターｐＵＣ１９−Ｐｐｄｃ−ｓｉｇ−ＴＲＡ２−Ｔｐｄｃの構築：
【００９１】
トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、表３に示すプライマーＮｄｅＩ−Ｐｄｃ−Ｆ及びＰｐｄｃ−Ｒをフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してＰＣＲ増幅することにより、約１．４ｋｂのＰＤＣ遺伝子のプロモーター配列Ｐｐｄｃを得て、トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、表２に示すプライマーＴｐｄｃ−Ｆ及びＰｓｔＩ−Ｔｐｄｃ−Ｒをフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してＰＣＲ増幅することにより、約１．０ｋｂのＰＤＣ遺伝子のターミネーター配列Ｔｐｄｃを得た。このように得たＰｐｄｃ断片及びＴｐｄｃ断片をモル比１：１で混合してテンプレートとし、プライマーＮｄｅＩ−Ｐｄｃ−Ｆ及びＰｓｔＩ−Ｔｐｄｃ−Ｒをフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してＰＣＲ増幅することにより、約２．５ｋｂの融合断片Ｐｐｄｃ−Ｔｐｄｃを得て、目的断片を回収してＮｄｅＩ及びＰｓｔＩで当該断片を消化し、ゲル回収しておく。プラスミドｐＵＣ１９に対して同様にＮｄｅＩ及びＰｓｔＩで消化し、ベクター骨格をゲル回収して、消化・回収後のＰｐｄｃ−Ｔｐｄｃ断片とライゲーションさせて、大腸菌ＴＯＰ１０形質転換受容性細胞を形質転換し、検証及びシークエンシングを行って正しく構築されているベクターをｐＵＣ１９−Ｐｐｄｃ−Ｔｐｄｃと命名した。
【００９２】
プラスミドｐＵＣ１９−Ｐｐｄｃ−Ｔｐｄｃをテンプレートとして、表３に示すプライマーＷＦ−ｐｄｃ−Ｒ及びＷＦ−ｐｄｃ−Ｆをフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してＰＣＲ増幅することにより約５．０ｋｂのベクター骨格断片を得て、ＤｐｎＩで３時間消化後にゲル回収しておく。プラスミドｐＵＣ１９−Ｐｃｂｈ１−ｓｉｇ−ＴＲＡ２−Ｔｃｂｈ１をテンプレートとして、表３に示すプライマーＷＦ−ＴＲＡ２−Ｆ２及びＷＦ−ＴＲＡ２−Ｒ２をフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してＰＣＲ増幅することにより、約１．４ｋｂのｓｉｇ−ＴＲＡ２配列を得た。ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＩＩによるワンステップ法クローニングキットを用いて、消化・回収後の約５．０ｋｂのベクター骨格断片及びｓｉｇ−ＴＲＡ２断片を組み立て、大腸菌ＴＯＰ１０形質転換受容性細胞を形質転換し、検証及びシークエンシングを行って正しく構築されているベクターをｐＵＣ１９−Ｐｐｄｃ−ｓｉｇ−ＴＲＡ２−Ｔｐｄｃと命名した。
【００９３】
ランダム組込み構成型発現ベクターｐＤＧＵ−ｐｄｃ−ＴＲＡ２の構築：
上述したように製造されたベクターｐＤＧＵを制限酵素ＸｂａＩで３時間消化切断し、次に制限酵素ＥｃｏＲＩを加えて５分消化切断して不完全消化を行い、サイズが大きなベクター骨格断片をゲル回収しておく。プラスミドｐＵＣ１９−Ｐｐｄｃ−ｓｉｇ−ＴＲＡ２−Ｔｐｄｃをテンプレートとして、表３に示すプライマーＦ３及びＲ３をフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用して、Ｐｐｄｃ−ｓｉｇ−ＴＲＡ２−Ｔｐｄｃ断片をＰＣＲ増幅し、目的断片をゲル回収しておく。ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＩＩによるワンステップ法クローニングキットを用いて、上記ｐＤＧＵを消化・回収後のベクター骨格断片及びＰｐｄｃ−ｓｉｇ−ＴＲＡ２−Ｔｐｄｃ断片を組み立て、大腸菌ＴＯＰ１０形質転換受容性細胞を形質転換し、検証及びシークエンシングを行って正しく構築されているベクターをｐＤＧＵ−ｐｄｃ−ＴＲＡ２と命名し、これは即ちトリコデルマ・リーセイのランダム組込み構成型発現ベクターｐＤＧＵ−ｐｄｃ−ＴＲＡ２であり、図４はその構築を示す図である。
【００９４】
【表３】
2021514679.tif 000005
【００９５】
実施例４：ランダム組込みによるトリコデルマ・リーセイに由来するシュウ酸デカルボキシラーゼ発現株の構築、及び形質転換体の選別と分子同定
【００９６】
凍結融解法により、実施例３における上記２種のランダム組込み組換え発現ベクターｐＭＧＵ−ｃｂｈ１−ＴＲＡ２及びｐＤＧＵ−ｐｄｃ−ＴＲＡ２をアグロバクテリウム・ツメファシェンスＡＧＬ−１形質転換受容性細胞にそれぞれ導入した。実施例２の方法を利用して、ＰＣＲ検証を行って正しく構築されている陽性クローンで形質転換用のアグロバクテリウム・ツメファシェンス菌液を調製した。
【００９７】
トリコデルマ・リーセイ形質転換受容体の製造：無菌水４〜５ｍｌを用いて、６〜７日培養されたＰＤＡ（ウリジンを１０ｍＭ含有する）プレートからトリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０（ｐｙｒ４−）株の胞子を溶出させ、綿栓濾過して胞子懸濁液を得て、遠心分離して胞子を収集し、ＩＭ培地で２回洗浄し、ＩＭ培地（終濃度１０ｍＭのウリジンを加えた）で再懸濁して胞子濃度を１０７個／ｍｌに調整し、２８℃で３〜４時間培養して発芽させた。
【００９８】
アグロバクテリウム・ツメファシェンスとトリコデルマ・リーセイの共培養：調製されたアグロバクテリウム・ツメファシェンス菌液を１００μｌ採取して発芽処理後の胞子懸濁液１００μｌと混合し、固体ＩＭ培地プレートのセロファンに塗布し、２４℃で３６時間暗所培養した。セロファンを剥がし裏返して、セファロスポリンを３００μｇ／ｍＬ含有する固体ＭＭ一次選別培地プレートに敷き、形質転換体が確認されるまで２８℃で４〜６日培養した。本実施例において、組換え発現ベクターｐＭＧＵ−ｃｂｈ１−ＴＲＡ２の、実施例２で製造されたトリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０（ｐｙｒ４−）株への形質転換を３ロット行って、２３０の形質転換株を得て、組換え発現ベクターｐＤＧＵ−ｐｄｃ−ＴＲＡ２によるトリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０（ｐｙｒ４−）株の形質転換では１ロット当たり７３の形質転換株を得た。
【００９９】
形質転換体の二次選別：上述したように得た形質転換株を、セファロスポリンを３００μｇ／ｍＬ含有する固体ＭＭ培地プレートにスポットし、２８℃で２〜３日培養し、成長スピード及び形態が正常であった形質転換体をピッキングし、ＰＤＡプレートに移して２８℃で７日分生子の培養を行った。胞子が成熟すると、無菌水で胞子を溶出させて胞子懸濁液を調製し、勾配希釈を行い、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−１００を含有するＰＤＡ培地に塗布して単胞子株の分離を行い、２８℃で３日培養し、単胞子がコロニーに成長したら、それぞれ３つの単胞子分離株をピッキングしてＰＤＡ培地に移して２８℃で３日培養し、少量の菌糸をピッキングして無菌水２０μｌに入れ、９８℃で１０分加熱し、遠心分離して上清を採取してプライマーＴＲＡ２−Ｆ及びＴＲＡ２−Ｒを用いてＰＣＲ同定を行い、それぞれの形質転換体に対してＰＣＲ同定を行って陽性形質転換体であった単胞子分離株を胞子が成熟するまで引き続き７日培養した。
【０１００】
ＰＣＲ同定用プライマー配列（５’−３’）：
ＴＲＡ２−Ｆ：ＡＴＧＴＡＴＣＧＧＡＡＧＴＴＧＧＣＣＧＴＣＡＴＣ
ＴＲＡ２−Ｒ：ＴＴＡＧＧＣＡＧＧＧＣＣＧＡＣＧＡＣＡＡＴＡＧＧ
【０１０１】
上記ＩＭ培地の配合は、Ｋ２ＨＰＯ４  １０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  １０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＣｌ  ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２ｍｍｏｌ／Ｌ、ＣａＣｌ２  ０．７ｍｍｏｌ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ４ｍｍｏｌ／Ｌ、グルコース  １０ｍｍｏｌ／Ｌ、グリセリン  ０．５％、ＡＳ  ２００μｍｏｌ／Ｌ、Ｍａｎｄｅｌｓ微量元素（１０００×）  １ｍｌであり、ｐＨは５．３である。
【０１０２】
上記ＭＭ培地の配合（ｇ／Ｌ）は、グルコース  ２０、ペプトン  ２、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ５、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．６、ＣａＣｌ２  ０．６、ＫＨ２ＰＯ４  １５、Ｍａｎｄｅｌｓ微量元素（１０００×）  １ｍｌ／Ｌであり、ｐＨは４．５〜５．５である。
【０１０３】
上記Ｍａｎｄｅｌｓ微量元素（１０００×）の配合は、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ５ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４１．６ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．７ｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ・６Ｈ２Ｏ  ３．７ｇ／Ｌである。
【０１０４】
実施例５：トリコデルマ・リーセイに由来するランダム組込み形質転換体の振盪フラスコにおける発酵発現及び選別
【０１０５】
無菌水４〜５ｍｌで、実施例４における上記分離株の成熟した胞子を溶出させ、１％の接種量でトリコデルマ・リーセイ液体シード培地に接種し、２４時間培養後に１０％の接種量で異なるタイプのプロモーターに用いられるトリコデルマ・リーセイ形質転換体発現培地に移し、２８℃で１７０ｒｐｍにおいて１６８時間培養後に、発酵液上清におけるシュウ酸デカルボキシラーゼの活性を分析した。
【０１０６】
上記トリコデルマ・リーセイ液体シード培地の配合は、グルコース  １５ｇ／Ｌ、ペプトン  ２ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．８ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２  １．０ｇ／Ｌ、クエン酸緩衝液（ｐＨ＝４．５）  ５０ｍＭ、尿素  ０．３ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ２ｇ／Ｌ、Ｍａｎｄｅｌｓ微量元素（１０００×）  １ｍｌ／Ｌ、ポリソルベート８０  １〜２ｇ／Ｌである。
【０１０７】
本実施例において、誘導型プロモーターでシュウ酸デカルボキシラーゼを発現するトリコデルマ・リーセイ形質転換体発現培地の配合は、ラクトース  １８ｇ／Ｌ、微結晶セルロース  １０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー  １２ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２  １．０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ６ｇ／Ｌ、ふすま粉  ２ｇ／Ｌ、Ｍａｎｄｅｌｓ微量元素（１０００×）  １ｍｌ、ＭｎＣｌ２  ５ｍＭであり、ｐＨは４．５である。
【０１０８】
上記Ｍａｎｄｅｌｓ微量元素（１０００×）の配合は、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ５ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４１．６ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．７ｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ・６Ｈ２Ｏ  ３．７ｇ／Ｌである。
【０１０９】
本実施例において、構成型プロモーターでシュウ酸デカルボキシラーゼを発現するトリコデルマ・リーセイ形質転換体発現培地の配合は、グルコース  ５０ｇ／Ｌ、ペプトン  ４．５ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １．４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．３ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２  ０．４ｇ／Ｌ、クエン酸緩衝液（ｐＨ＝４．５）  ５０ｍＭ、尿素  ０．３ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ２ｇ／Ｌ、Ｍａｎｄｅｌｓ微量元素（１０００×）  １ｍｌ、ポリソルベート８０  １〜２ｇ／Ｌであり、ｐＨは４．５である。
【０１１０】
シュウ酸を基質として、所定の条件（３７℃、ｐＨ３．０）において１分間にシュウ酸１μｍｏｌを分解する又は１分間にギ酸１μｍｏｌを生成するのに必要な酵素量を１つの活性ユニット（ＩＵ）に定義する。振盪フラスコ発酵により全ての形質転換体を選別し、誘導型プロモーターでシュウ酸デカルボキシラーゼを発現するトリコデルマ・リーセイ形質転換体は１６８時間の発酵における最大酵素活性が１７９４０ＩＵ／Ｌに達する。構成型プロモーターでシュウ酸デカルボキシラーゼを発現するトリコデルマ・リーセイ形質転換体は１６８時間の発酵における最大酵素活性が８８００ＩＵ／Ｌに達する。
【０１１１】
実施例６：トリコデルマ・リーセイ形質転換体の振盪フラスコ発酵条件の最適化
【０１１２】
本実施例において、初期培地における異なる炭素源成分、初期濃度及び窒素源成分、初期濃度が誘導型組換え菌株によるシュウ酸デカルボキシラーゼの発現に与える影響について最適化を行って、発酵した結果、最適化前の発酵培地（組成：ラクトース  １８ｇ／Ｌ、微結晶セルロース  １０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー  １２ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．５６ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２  ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ６ｇ／Ｌ、ふすま粉  ２ｇ／Ｌ、Ｍａｎｄｅｌｓ微量元素（１０００×）  １ｍｌ、ＭｎＣｌ２  ５ｍＭ、ｐＨ＝４．０）を使用して１６８時間発酵後の発酵液上清におけるシュウ酸デカルボキシラーゼの活性は３０００ＩＵ／Ｌ前後であることが判明した。最適化後の培地を使用すると、そのグルコース初期濃度が８ｇ／Ｌで、微結晶セルロースが２３ｇ／Ｌである場合に発現効果が最良であった。振盪フラスコによる１６８時間発酵発現後における上清発酵液中のシュウ酸デカルボキシラーゼの活性は５０８７６ＩＵ／Ｌに達する。好ましくは、培地組成が、グルコース  ３〜８ｇ／Ｌ、微結晶セルロース  １０〜２５ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー  ５〜１５ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．５〜５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．５６ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２  ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ２〜８ｇ／Ｌ、尿素  ０〜１ｇ／Ｌ、ふすま粉  ０．２〜２ｇ／Ｌ、Ｍａｎｄｅｌｓ微量元素（１０００×）  １ｍｌ、ＭｎＣｌ２  ０．５〜５ｍＭであり、ｐＨは３．０〜４．５である。
【０１１３】
実施例７：トリコデルマ・リーセイのランダム組込み形質転換体の挿入部位におけるフランキング領域配列分析
【０１１４】
実施例２に記載の方法を利用してトリコデルマ・リーセイ形質転換体菌株のゲノムＤＮＡを抽出し、Ｓｏｎｇ  Ｇａｏら（非特許文献５）によるＴＤ−ＴＡＩＬ  ＰＣＲ（Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ  ＴＡＩＬ−ＰＣＲ、以下タッチダウンＰＣＲという）方法を採用してトリコデルマ・リーセイ形質転換体Ｔ−ＤＮＡ（即ちシュウ酸デカルボキシラーゼ発現カセットを含有する形質転換ＤＮＡ断片）の挿入部位におけるフランキング領域配列を分析した。本実施例においてランダムプライマー（ＬＡＤ１〜ＬＡＤ５）及び特異的プライマーＡＣ１、ＲＢ−１、ＲＢ−２、Ｔａｉｌ−ＣＸ−Ｆを採用した（表４参照）。ただし、プライマー配列で略記された部分として、ＶはＡ／Ｇ／Ｃを、ＮはＡ／Ｇ／Ｃ／Ｔを、ＢはＧ／Ｃ／Ｔを、ＤはＡ／Ｇ／Ｔを、ＨはＡ／Ｃ／Ｔを表す。
【０１１５】
まず、ｄｄＨ２Ｏでトリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡを２０〜３０ｎｇ／μｌに希釈し、これを予備増幅ＰＣＲ反応（Ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のテンプレートとし、ＬＡＤ１〜ＬＡＤ５をそれぞれランダムプライマーとして、特異的プライマーＲＢ−１とともに予備増幅ＰＣＲを行い、次に予備増幅ＰＣＲ反応の産物を５０倍に希釈してタッチダウンＰＣＲのテンプレートとし、タッチダウンＰＣＲ増幅の産物に対し１％アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルを切って比較的単純で明度が高いバンドを回収して表３に示すＴａｉｌ−ＣＸ−Ｆプライマーでシークエンシング分析を行った。シークエンシングして得た結果配列に対し、トリコデルマ・リーセイのゲノムデータベースにおいてＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて検索し、その挿入されたゲノム部位を分析した。
【０１１６】
【表４】
2021514679.tif 000006
【０１１７】
予備増幅反応系（２０μｌ）：ゲノムＤＮＡ  ２０〜３０ｎｇ、ＬＡＤプライマー  １．０μＭ、ＲＢ−１プライマー  ０．３μＭ、ｄＮＴＰ  ２μｌ、１０×緩衝液  ２μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ  ０．５Ｕとし、ｄｄＨ２Ｏを補足して２０μｌとした。
【０１１８】
予備増幅ＰＣＲ反応条件：
９３℃、１２０秒；
９５℃、６０秒；
９４℃、３０秒；６０℃、６０秒；７２℃、１８０秒；１０サイクル；
９４℃、３０秒；２５℃、１２０秒；１５０秒以内に、７２℃に均一昇温；７２℃、１８０秒；
９４℃、２０秒；５８℃、６０秒；７２℃、１２０秒；２５サイクル；
最後に７２℃、３００秒。
【０１１９】
タッチダウンＰＣＲ反応系（５０μｌ）：予備増幅ＰＣＲ反応の産物を５０倍に希釈、ＡＣ１プライマー  ０．３μＭ、ＲＢ−１プライマー  ０．３μＭ、ｄＮＴＰ  ５μｌ、１０×緩衝液  ５μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ  １Ｕとし、ｄｄＨ２Ｏを補足して５０μｌとした。
【０１２０】
タッチダウンＰＣＲ反応条件：
９４℃、１２０秒；
９４℃、２０秒；６８℃（−１℃／サイクル）、６０秒；７２℃、１８０秒；１５サイクル；
９４℃、２０秒；５３℃、６０秒；７２℃、１８０秒；１５サイクル；
最後に７２℃、３００秒。
【０１２１】
本実施例において合計で、振盪フラスコによる発酵発現において酵素活性が２５０００〜６５０００ＩＵ／Ｌであるトリコデルマ・リーセイ形質転換体３５株を選択してＴ−ＤＮＡ挿入部位におけるフランキング領域配列分析を行い、得られた全てのＴ−ＤＮＡフランキング領域配列のうち、６本にはＲＢ境界外の約０．５ｋｂのベクター配列が同定され、ゲノムにおけるその挿入位置は同定されておらず、４２本にはＴ−ＤＮＡフランキング領域配列のゲノムにおける対応する位置が同定された。４２本のＴ−ＤＮＡフランキング領域配列のうち、８本には完全なＲＢ境界配列が保持され、３４本のＴ−ＤＮＡには右境界配列に欠失の現象が発生した。
【０１２２】
トリコデルマ・リーセイ形質転換体３５株に対し、複数回のＰＣＲを行ってさらに分析したところ、２５株が単一コピーＴ−ＤＮＡの挿入であり、５株が同一部位に同方向反復の形式で２つのコピーが存在し、３株が同一部位に逆方向反復の形式で２つのコピーが存在し、２株が２つの異なる部位にそれぞれ１つのコピーの挿入が存在すると推定した。
【０１２３】
選択された３５株のトリコデルマ・リーセイ形質転換体のうち、２コピーの形質転換体の振盪フラスコ発酵における酵素活性は単一コピーより６０％〜１００％高くなることから、優れた遺伝子量の関係性が判明された。後続の単胞子の分離・精製及び並行発酵実験において、同一部位に同方向反復の形式で２つのコピーが存在する菌株は不安定であり、同一形質転換体から分離された単胞子同士の間に発酵発現における酵素活性に大きな差があり、同一の発酵条件において、大半は母体発現による酵素活性より低かった。同一部位に逆方向反復の形式で２コピーが存在する形質転換体から分離された単胞子同士の間に、発酵発現における酵素活性に優れた並行性が確認され、同一の発酵条件において母体発現による酵素活性に相当する。
【０１２４】
このうち、発酵発現における酵素活性が高い（５００００ＩＵ／Ｌより大きい）、且つ、同一部位に逆方向反復の形式で２つのコピーが存在する１つの分離株をＢ４−６と命名した。分析したところ、分離株Ｂ４−６の挿入部位はＴｒｉｒｅ２｜ｓｃａｆｆｏｌｄ＿１２：１０２９２４〜１０５３３３にあることが判明した。
【０１２５】
実施例８：トリコデルマ・リーセイ形質転換体選別マーカー遺伝子ｐｙｒＧの削除
【０１２６】
実施例７におけるＢ４−６株を、ＰＤＡ培地（ウリジンを１０ｍＭ含有する）に接種し、胞子が成熟するまで２８℃で７日培養し、無菌水４〜５ｍｌで胞子を溶出させて胞子懸濁液を調製し、適量の胞子懸濁液を採取して５−ＦＯＡを５ｍｇ／ｍｌ、０．１％Ｔｒｉｎｔｏｎ−１００を含有し、ウリジンを１０ｍＭ含有するＰＤＡ培地に塗布し、単一コロニーが確認されるまで２８℃で４〜５日培養した。５−ＦＯＡ耐性を有する約１００の分離株を得た。５−ＦＯＡ耐性を有する分離株を５つ選択してウリジンを１０ｍＭ含むＰＤＡ培地に移し、胞子が成熟するまで２８℃で７日培養した。プライマーｐｙｒＧ−Ｆ２及びｐｙｒＧ−Ｒ２を使用してＰＣＲを行うことにより相同組換えが発生しｐｙｒＧ発現カセットが除去されたコロニーを同定し、その結果、５つの胞子分離株にはいずれもｐｙｒＧ発現カセットが除去されたことが判明した。上記プライマー配列は、ｐｙｒＧ−Ｆ２：５’−ＴＴＡＴＡＧＴＡＴＴＡＧＴＴＴＴＣＣＧＣＣＧＡＣ−３’、ｐｙｒＧ−Ｒ２：５’−ＡＴＧＴＣＣＴＣＣＡＡＧＴＣＧＣＧＡＴＴＧＡＣ−３’である。このうちのｐｙｒＧ発現カセットが除去された１つの分離株をＢ４−６（ｐｙｒ４−）と命名した。
【０１２７】
実施例９：ランダム組込み組換え発現ベクターｐＭＧＵ−ｃｂｈ１−ＴＲＡ２によるトリコデルマ・リーセイＢ４−６（ｐｙｒ４−）株の形質転換による多コピー形質転換体の構築
【０１２８】
実施例４に記載の方法及びそのステップを利用して、アグロバクテリウム仲介による形質転換の方法により発現ベクターｐＭＧＵ−ｃｂｈ１−ＴＲＡ２でトリコデルマ・リーセイＢ４−６（ｐｙｒ４−）株を形質転換することにより、４２の形質転換体を得た。各形質転換体をそれぞれ、セファロスポリンを３００μｇ／ｍＬ含有する固体ＭＭ培地プレートに移して二次選別を行い、２８℃で３日培養し、このうちの二次選別された３９の形質転換体を選別してＰＤＡプレートに移し、２８℃で７日培養した。
【０１２９】
プライマーｐｙｒＧ−Ｆ３及びプライマーＷＦ−ＣＢＨ−Ｒを使用してＰＣＲを行って、全ての３９の形質転換体に対し選別することにより、初期のコピー数からコピーの追加があるかを確認した。
【０１３０】
各形質転換体に対し、３日培養されたＰＤＡプレートから少量の菌糸体を抽出して無菌水２０μｌに加え、９８℃で１０分加熱し、遠心分離して上清を採取してプライマーｐｙｒＧ−Ｆ３及びＷＦ−ＣＢＨ−ＲでＰＣＲ同定を行って、増幅後に約２．３ｋｂの断片を得るのは陽性形質転換体である。上記プライマー配列は、ｐｙｒＧ−Ｆ３：５’−ＴＴＡＣＴＴＧＴＧＧＴＧＴＴＣＴＣＡＧＣＴＴＧ−３’であり、プライマーＷＦ−ＣＢＨ−Ｒの配列は表２に示すとおりである。
【０１３１】
実施例６で最適化された培地を使用して発酵を行って全ての形質転換体に対して選別し、７２時間より酵素活性を測定し、２４時間が経過するごとに測定し、１６８時間の発酵終了まで継続した結果、２６＃形質転換体の活性が最大で、１６８時間発酵における酵素活性は１０３９５１ＩＵ／Ｌに達することが判明した。１４４時間及び１６８時間における発酵液上清試料をそれぞれ５倍希釈して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行って検出し、電気泳動結果を図６に示す。図６において、レーン１及びレーン２はそれぞれ１４４時間及び１６８時間発酵における発酵液上清であり、ローディング量は発酵液上清１０μｌである。実施例７に記載の方法を利用して活性最大の形質転換体における新規コピーの挿入部位を分析し、シークエンシング分析した結果、当該形質転換体は２つの異なる部位にそれぞれ１つの新規コピーが挿入され、挿入部位はそれぞれＴｒｉｒｅ２｜ｓｃａｆｆｏｌｄ＿７：１２８８３２０〜１２８８３２１及びＴｒｉｒｅ２｜ｓｃａｆｆｏｌｄ＿１：１１２９１３４〜１１２９１５７であることが判明した。実施例８に記載の方法を利用して選別マーカー遺伝子ｐｙｒＧを除去し、当該形質転換体をＨＨ０３−２６−８（ｐｙｒ４−）と命名した。
【０１３２】
実施例１０：トリコデルマ・リーセイ形質転換体ＨＨ０３−２６−８（ｐｙｒ４−）におけるｐｙｒ４遺伝子の修復
【０１３３】
トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーｐｙｒ４−Ｆ１及びｐｙｒ４−Ｒ１をフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してｐｙｒ４の完全な発現カセット及びｐｙｒ４遺伝子の両側のホモロジーアーム断片をＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ増幅の産物に対し１％アガロースゲル電気泳動を行って分離し、約４．０ｋｂのバンドを除去し、ゲル抽出キットを用いて回収・精製し、制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩで１時間消化後、ＰＣＲ産物回収キットを用いて目的断片を回収しておく。ベクターｐＭＤＴ０５は同様に制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩで３時間消化後、ゲル抽出キットでベクター断片を回収・精製し、これを消化回収後の４．０ｋｂの断片とモル比１：３で混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを加えて２２℃で３時間ライゲーションさせ、ライゲーション産物で大腸菌ＴＯＰ１０形質転換受容性細胞を形質転換し、ＰＣＲを行って陽性クローンを選別し、シークエンシングして検証を行った。シークエンシングして検証を行って正しく構築されているベクターをｐＭＤＴ０５−ｐｙｒ４  ＫＩと命名し、図５はその構築を示す。上記プライマー配列は以下のとおりである。
ｐｙｒ４−Ｆ１：５’−ＴＣＡＧＡＴＣＴＡＧＴＧＴＴＴＧＡＴＧＣＴＣＡＣＧＣＴＣＧＧＡＴ−３’；
ｐｙｒ４−Ｒ１：５’−ＴＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＴＡＡＧＧＴＧＴＣＡＧＣＡ−３’。
【０１３４】
実施例４に記載の方法及びそのステップを利用して、アグロバクテリウム仲介による形質転換の方法により発現ベクターｐＭＤＴ０５−ｐｙｒ４ＫＩでトリコデルマ・リーセイＨＨ０３−２６−８（ｐｙｒ４−）株を形質転換することにより、１５３の形質転換体を得た。形質転換体を固体ＭＭ培地にスポットし、菌糸体が外側に成長して直径が約１ｃｍのプラークが確認されるまで、２８℃で４８時間培養した。ＭＭプレートにおける全ての形質転換体に番号をつけ、それぞれ一部菌糸体をピッキングしてハイグロマイシンを１００μｇ／ｍＬ含有するＰＤＡ固体プレートにスポットし、２８℃で４８時間培養した。ハイグロマイシンを１００μｇ／ｍＬ含有するＰＤＡ固体プレートにおいて成長できない形質転換体の番号を記録して、３５の当該形質転換体を得た。ＭＭ固体プレートから対応する番号の形質転換体の菌糸体をピッキングしてＰＤＡプレートに移し、２８℃で培養し、３日培養後、少量の菌糸体をピッキングして無菌水２０μｌに加え、９８℃で１０分加熱し、遠心分離して上清を採取してプライマーｐｙｒ４−Ｆ２及びｐｙｒ４−Ｒ２でＰＣＲを行って検証した。上記プライマー配列は、ｐｙｒ４−Ｆ２：５’−ＣＡＡＡＣＧＡＡＣＡＣＡＴＣＡＣＴＴＴＣＡＡＡＧ−３’；ｐｙｒ４−Ｒ２：５’−ＧＴＧＧＧＣＴＴＣＣＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＡＣＣ−３’である。ｐｙｒ４遺伝子部位に相同組換えが発生してｐｙｒ４発現カセットが修復された場合、ＰＣＲ増幅バンドは約４．２ｋｂであり、相同組換えが発生せずに増幅した場合、バンドは約２．７ｋｂである。ＰＣＲ分析により、３５の形質転換体のうち、２８の形質転換体には増幅後に約４．２ｋｂの断片が得られ、７つの形質転換体には増幅後に約２．７ｋｂの断片が得られ、この７つの形質転換体はｐｙｒ４遺伝子座以外のその他の位置にもランダム挿入の発生とともにハイグロマイシン耐性を失ったと推定した。
【０１３５】
実施例１１：トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０（ｐｙｒ４−）株におけるｍｕｓ５３遺伝子ノックアウト
【０１３６】
公開された文献報告（非特許文献６Matthias G.Steiger,APPLIED AND ENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,Jan.2011,p.114-121）によると、ｍｕｓ５３遺伝子（ヒトＬｉｇ４遺伝子と相同である）は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機能に必要とされており、その機能が欠損すると、１００％近くの相同組換え効率がもたらされる。本実施例において、後続の部位特異的組込みノックイン実施例の準備として、トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０（ｐｙｒ４−）株におけるｍｕｓ５３遺伝子をノックアウトしておく。
【０１３７】
１．ｍｕｓ５３遺伝子ノックアウトベクターｐＭＤＴ０５−ｍｕｓ５３ＫＯの構築
公開文献に記載のトリコデルマ・リーセイｍｕｓ５３遺伝子（タンパク質Ｉｄ：５８５０９）の情報（非特許文献７）を参照して、トリコデルマ・リーセイゲノムデータベースにおけるｍｕｓ５３遺伝子の位置の遺伝子座配列情報を検索した（http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html）。
【０１３８】
トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、表５に示すプライマーｍｕｓ５３−３Ｆ／ｍｕｓ５３−３Ｒ及びｍｕｓ５３−５Ｆ／ｍｕｓ５３−５Ｒを使用してそれぞれ増幅することにより約１．４ｋｂのｍｕｓ５３遺伝子の上流ホモロジーアームアップ断片及び約１．３ｋｂのｍｕｓ５３遺伝子の下流ホモロジーアームダウン断片を得て、プライマーｍｕｓ５３−ｍｉｄ−Ｆ／ｍｕｓ５３−ｍｉｄ−Ｒでｍｕｓ５３遺伝子座を増幅することにより約１．３ｋｂのミドル断片を得た。
【０１３９】
トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーｐｙｒ４−ＴｐｒＣ−Ｆ／ｐｙｒ４−Ｒを使用して増幅することにより約１．５ｋｂのｐｙｒ４遺伝子コーディング領域及びそのターミネーターを得て、プラスミドｐＢＡＲＧＰＥ１をテンプレートとして、プライマーｐｙｒ４−Ｆ／ｐｙｒ４−ＴｒｐＣ−Ｒを使用してＰｔｒｐＣプロモーターを３８６ｂｐ増幅した。
【０１４０】
ｏｍｅｇａ社提供のゲル回収キットを用いて、ＰＣＲ増幅して得た上記５つの断片を回収し、回収後に等モル比で混合してＰＣＲ増幅用テンプレートとし、プライマーｍｕｓ５３−３Ｒ／ｍｕｓ５３−ｍｉｄ−Ｆをフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してＳＯＥ−ＰＣＲ増幅することにより約６．１ｋｂの融合断片を得て、ｏｍｅｇａ社提供のゲル回収キットを用いて目的断片の回収を行った。
【０１４１】
制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩでプラスミドｐＭＤＴ０５を３時間消化し、ベクター骨格断片をゲル回収し、ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＩＩによるワンステップ法クローニングキットを用いて回収された６．１ｋｂの断片と組み立て、大腸菌ＴＯＰ１０形質転換受容性細胞を形質転換し、検証及びシークエンシングを行って正しく構築されているベクターをｐＭＤＴ０５−ｍｕｓ５３ＫＯと命名し、当該ベクターの構築は図７に示すとおりである。
【０１４２】
２．トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０（ｐｙｒ４−）におけるｍｕｓ５３遺伝子ノックアウト
実施例４に記載の方法及びステップを利用して、アグロバクテリウム仲介による形質転換の方法によりｍｕｓ５３遺伝子ノックアウトベクターｐＭＤＴ０５−ｍｕｓ５３ＫＯでトリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０（ｐｙｒ４−）株を形質転換することにより、２９４の形質転換体を得て、各形質転換体を固体ＭＭ培地（セファロスポリン３００μｇ／ｍＬ及びハイグロマイシン２００μｇ／ｍＬ）プレート及び固体ＭＭ培地（セファロスポリン３００μｇ／ｍＬ）プレートにそれぞれスポットして二次選別を行い、２８℃で３日培養して、ハイグロマイシン耐性を有しない４４の形質転換体を得て、このうちの３１の形質転換体を選択してＰＤＡプレートに移し、２８℃で７日培養した。
【０１４３】
プライマーＭＵＳ−Ｆ／ＴｒｐＣ−ＣＸ−Ｆ及びｐｙｒ４−ＬＢ−Ｒ／ＭＵＳ−Ｒを使用してＰＣＲを行って全ての３１の形質転換体に対し選別を行うことにより、ｍｕｓ５３遺伝子座部位においてアップ領域及びミドル領域によって相同組換えが発生したか否かを決定した。プライマーＲＢ−ＹＺ−ＦとプライマーＲＢ−ＹＺ−Ｒを使用してＰＣＲ増幅して形質転換体を選別することにより、ｍｕｓ５３遺伝子座部位以外にランダム組込みが発生したか否かを決定した。
【０１４４】
本実施例において、各形質転換体に対し、３日培養されたＰＤＡプレートから少量の菌糸体を抽出して無菌水２０μｌに加え、９８℃で１０分加熱し、遠心分離し上清を採取してテンプレートとし、プライマーＭＵＳ−Ｆ／ＴｒｐＣ−ＣＸ−Ｆ及びｐｙｒ４−ＬＢ−Ｒ／ＭＵＳ−Ｒを使用して増幅するとそれぞれ約３．１ｋｂ及び１．６ｋｂの断片を得る場合、対応する領域には予期された形式の相同組換えが発生したことが示され、またプライマーＲＢ−ＹＺ−Ｆ及びプライマーＲＢ−ＹＺ−Ｒで増幅すると４２５ｂｐの断片を得ない場合、ランダム組込みが発生しなかったが示され、本実施例においてこれらの条件を全て満たす陽性形質転換体として１５株が選別された。このうちの１つの陽性形質転換体をＰＤＡ培地（ウリジンを１０ｍＭ含有する）に接種し、胞子が成熟するまで２８℃で７日培養し、無菌水４〜５ｍｌで胞子を溶出させて胞子懸濁液を調製し、適量の胞子懸濁液を採取して５−ＦＯＡを５ｍｇ／ｍｌ、０．１％Ｔｒｉｎｔｏｎ−１００を含有し、ウリジンを１０ｍＭ含むＰＤＡ培地に塗布し、単一コロニーが確認されるまで２８℃で４〜５日培養し、このうちの３つのコロニーを選択してウリジンを１０ｍＭ含有するＰＤＡ培地に移し、胞子が成熟するまで２８℃７日培養した。プライマーＭＵＳ−Ｆ／ＭＵＳ−Ｒを使用してＰＣＲを行うことにより相同組換えが発生しｐｙｒ４発現カセットが除去されたコロニーを同定し、相同組換えが発生しｐｙｒ４が除去されたものを増幅すると約２．９ｋｂの断片を得ることから、３つのコロニーはいずれもｐｙｒ４発現カセットが除去されていることが判明した。検証後の陽性株をＲｕｔ−Ｃ３０（ｐｙｒ４−、ｍｕｓ５３−）と命名した。プライマー配列は表５に示すとおりである。
【０１４５】
【表５】
2021514679.tif 000007
【０１４６】
実施例１２：部位特異的組込み発現ベクターの構築
【０１４７】
１．ＣＢＨ１部位に対する部位特異的組込み発現ベクターｐＭＤＴ０５−ＣＢＨ１−ＴＲＡ２（ＫＩ）の構築
キーワード検索により、トリコデルマ・リーセイゲノムデータベース（http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html）からＣＢＨ１（Ｃｅｌ７Ａ）遺伝子座に対応するＤＮＡ配列情報を取得した。
【０１４８】
プラスミドｐＭＧＵ−ｃｂｈ１−ＴＲＡ２をテンプレートとして、プライマーＣＢＨ１−Ｆ１及びＣＢＨ１−Ｒ１を使用してＰｃｂｈ１の一部を含むＰｃｂｈ１−ＴＲＡ２−Ｔｃｂｈ１断片を増幅し、１１１５ｂｐの一部Ｐｃｂｈ１を５’末端ホモロジーアーム配列とした。トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＣＢＨ１−Ｆ２及びＣＢＨ１−Ｒ２を使用してＴｃｂｈ１ターミネーター後の５００ｂｐの配列セグメントを増幅して反復配列（ＤＲ）とした。プラスミドｐＭＤＴ０５−ｍｕｓ５３ＫＯをテンプレートとして、プライマーＣＢＨ１−Ｆ３及びＣＢＨ１−Ｒ３を使用してｐｙｒ４発現カセットを増幅した。トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＣＢＨ１−Ｆ４及びＣＢＨ１−Ｒ４を使用してＴｃｂｈ１ターミネーター後の１０４１ｂｐの配列を増幅して３’末端ホモロジーアーム配列とした。
【０１４９】
ＰＣＲ増幅して得た全ての断片はｏｍｅｇａ社提供のゲル回収キットを用いて回収し、回収された断片を等モル比で混合してＰＣＲ増幅用テンプレートとし、プライマーＣＢＨ１−Ｆ１及びＣＢＨ１−Ｒ４をフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してＳＯＥ−ＰＣＲ増幅することにより約７ｋｂの融合断片を得た。プライマーｐＭＤＴ−ＳｐｅＩ−Ｒ及びｐＭＤＴ−ＸｂａＩ−Ｆを使用して増幅することにより線形化されたベクターｐＭＤＴ−０５を得て、ＤｐｎＩで増幅産物を３時間消化した。ｏｍｅｇａ社提供のゲル回収キットを用いて上記２断片の回収を行い、ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＩＩによるワンステップ法クローニングキットを用いて回収された目的断片を組み立て、大腸菌ＴＯＰ１０形質転換受容性細胞を形質転換し、検証及びシークエンシングを行って正しく構築されているベクターをｐＭＤＴ０５−ＣＢＨ１−ＴＲＡ２（ＫＩ）と命名し、その構築は図８に示すとおりである。プライマー配列は表６に示すとおりである。
【０１５０】
２．ＣＢＨ２部位に対する部位特異的組込み発現ベクターｐＭＤＴ０５−ＣＢＨ２−ＴＲＡ２（ＫＩ）の構築
キーワード検索によりトリコデルマ・リーセイゲノムデータベース（http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html）からＣＢＨ２（Ｃｅｌ６Ａ）遺伝子座に対応するＤＮＡ配列情報を取得した。
【０１５１】
トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＣＢＨ２−Ｆ１及びＥｃｏＲＩ−ＣＢＨ２−ＵＲを使用してその５’末端ホモロジーアーム配列を増幅した（１０８７ｂｐ）。プラスミドｐＭＤＴ０５−ｍｕｓ５３ＫＯをテンプレートとして、プライマーＥｃｏＲＩ−ＣＢＨ２−ＴｒｐＣ−Ｆ及びＣＢＨ２−Ｄ−ＴＵ−Ｒを使用してｐｙｒ４発現カセットを増幅した。トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＴｐｙｒ４−ＣＢＨ２−Ｄ−Ｆ及びＣＢＨ２−Ｒ３を使用してその３’末端ホモロジーアーム配列を増幅した（１１８７ｂｐ）。
【０１５２】
ＰＣＲ増幅して得た全ての断片はｏｍｅｇａ社提供のゲル回収キットを用いて回収し、回収された断片を等モル比で混合してＰＣＲ増幅用テンプレートとし、プライマーＣＢＨ２−Ｆ１及びＣＢＨ２−Ｒ３をフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してＳＯＥ−ＰＣＲ増幅することにより約４．２ｋｂの融合断片を得た。プライマーｐＭＤＴ−ＳｐｅＩ−Ｒ及びｐＭＤＴ−ＸｂａＩ−Ｆを使用して増幅することにより線形化されたベクターｐＭＤＴ−０５を得て、ＤｐｎＩで増幅産物を３時間消化した。ｏｍｅｇａ社提供のゲル回収キットを用いて上記２断片の回収を行い、ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＩＩによるワンステップ法クローニングキットを用いて回収された目的断片を組み立て、大腸菌ＴＯＰ１０形質転換受容性細胞を形質転換し、検証及びシークエンシングを行って正しく構築されているベクターをｐＭＤＴ０５−ＣＢＨ２−ｐｙｒ４と命名し、これは図９に示すとおりである。
【０１５３】
プラスミドｐＭＧＵ−ｃｂｈ１−ＴＲＡ２をテンプレートとして、プライマーＥ−ＣＢＨ２−ＰＣＢＨ−Ｆ及びＣＢＨ２−ＤＲ−Ｒ２を使用して発現カセットＰｃｂｈ１−ＴＲＡ２−Ｔｃｂｈ１を約４．７ｋｂ増幅した。トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＣＢＨ−ＤＲ−Ｆ及びＥ−ＣＢＨ２−ＤＲ−Ｒを使用して増幅することにより４３７ｂｐの配列を得て反復配列（ＤＲ）とした。
【０１５４】
ｏｍｅｇａ社提供のゲル回収キットを用いて上記２つのＰＣＲ断片の回収を行い、回収された断片を等モル比で混合してＰＣＲ増幅用テンプレートとし、プライマーＥ−ＣＢＨ２−ＰＣＢＨ−Ｆ及びＥ−ＣＢＨ２−ＤＲ−Ｒをフォワードプライマー及びリバースプライマーとしてＳＯＥ−ＰＣＲ増幅することにより約５．１ｋｂの融合断片を得て、ｏｍｅｇａ社提供のゲル回収キットを用いて目的断片の回収を行った。ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＩＩによるワンステップ法クローニングキットを用いて、回収された断片及びＥｃｏＲＩ消化後のベクターｐＭＤＴ０５−ＣＢＨ２−ｐｙｒ４（ＥｃｏＲＩ）を組み立て、大腸菌ＴＯＰ１０形質転換受容性細胞を形質転換し、検証及びシークエンシングを行って正しく構築されているベクターをｐＭＤＴ０５−ＣＢＨ２−ＴＲＡ２（ＫＩ）と命名した。プライマー配列は表６に示すとおりである。
【０１５５】
３．ＥＧ１部位に対する部位特異的組込み発現ベクターｐＭＤＴ０５−ＥＧ１−ＴＲＡ２（ＫＩ）の構築
キーワード検索によりトリコデルマ・リーセイゲノムデータベース（http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html）からＥＧ１（Ｃｅｌ７Ｂ）遺伝子座に対応するＤＮＡ配列情報を取得した。
【０１５６】
トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＷＦ−ＥＧ１−ＵＦ１及びＰ−ＥＧ１−Ｒを使用してその５’末端ホモロジーアーム配列を増幅した（１１４９ｂｐ）。プラスミドｐＭＤＴ０５−ｍｕｓ５３ＫＯをテンプレートとして、プライマーＥＧ１−ｐｙｒ４−Ｆ及びＣＢＨ２−Ｒ６を使用してｐｙｒ４発現カセットを増幅した。トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＣＢＨ２−Ｆ５及びＥＧ１−ＴＲＡ２−Ｒを使用して増幅することにより５０１ｂｐの配列を得て反復配列（ＤＲ）とした。トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＥＧ１−ＤＷ−Ｆ及びＥＧ１−ＤＷ−Ｒを使用してその３’末端ホモロジーアーム配列を増幅した（１２１１ｂｐ）。
【０１５７】
ＰＣＲ増幅して得た全ての断片はｏｍｅｇａ社提供のゲル回収キットを用いて回収し、回収された断片を等モル比で混合してＰＣＲ増幅用テンプレートとし、プライマーＷＦ−ＥＧ１−ＵＦ１及びＥＧ１−ＤＷ−Ｒをフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してＳＯＥ−ＰＣＲ増幅することにより約４．８ｋｂの融合断片を得た。プライマーｐＭＤＴ−ＳｐｅＩ−Ｒ及びｐＭＤＴ−ＸｂａＩ−Ｆを使用して増幅することにより線形化されたベクターｐＭＤＴ−０５を得て、ＤｐｎＩで増幅産物を３時間消化した。ｏｍｅｇａ社提供のゲル回収キットを用いて上記２断片の回収を行い、ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＩＩによるワンステップ法クローニングキットを用いて回収された目的断片を組み立て、大腸菌ＴＯＰ１０形質転換受容性細胞を形質転換し、検証及びシークエンシングを行って正しく構築されているベクターをｐＭＤＴ０５−ＥＧ１−ｐｙｒ４と命名した。
【０１５８】
プラスミドｐＭＧＵ−ｃｂｈ１−ＴＲＡ２をテンプレートとして、プライマーＥＧ１−ＴＲＡ２−Ｆ及びＣＢＨ２−Ｒ２２を使用して発現カセットＰｃｂｈ１−ＴＲＡ２−Ｔｃｂｈ１を約４．７ｋｂ増幅した。プラスミドｐＭＤＴ０５−ＥＧ１−ｐｙｒ４をテンプレートとして、プライマーＣＢＨ２−Ｆ６６及びＰ−ＥＧ１−Ｒを使用して増幅することにより線形化されたベクターを得て、ＤｐｎＩで増幅後の産物を３時間消化した。ｏｍｅｇａ社提供のゲル回収キットを用いて上記２つの断片の回収を行い、ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＩＩによるワンステップ法クローニングキットを用いて回収された断片を組み立て、大腸菌ＴＯＰ１０形質転換受容性細胞を形質転換し、検証及びシークエンシングを行って正しく構築されているベクターをｐＭＤＴ０５−ＥＧ１−ＴＲＡ２（ＫＩ）と命名し、これは図１０に示すとおりである。プライマー配列は表６に示すとおりである。
【０１５９】
４．ＥＧ２部位に対する部位特異的組込み発現ベクターｐＭＤＴ０５−ＥＧ２−ＴＲＡ２（ＫＩ）の構築
キーワード検索によりトリコデルマ・リーセイゲノムデータベース（http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html）からＥＧ２（Ｃｅｌ５Ｂ）遺伝子座に対応するＤＮＡ配列情報を取得した。
【０１６０】
トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＷＦ−ＥＧ２−ＵＦ１及びＰ−ＥＧ２−Ｒを使用してその５’末端ホモロジーアーム配列を増幅した（１１００ｂｐ）。プラスミドｐＭＤＴ０５−ｍｕｓ５３ＫＯをテンプレートとして、プライマーＥＧ２−ｐｙｒ４−Ｆ及びＣＢＨ２−Ｒ６を使用してｐｙｒ４発現カセットを増幅した。トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＣＢＨ２−Ｆ５及びＥＧ２−ＴＲＡ２−Ｒを使用して増幅することにより５０１ｂｐの配列を得て反復配列（ＤＲ）とした。トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＥＧ２−ＤＷ−Ｆ及びＥＧ２−ＤＷ−Ｒを使用してその３’末端ホモロジーアーム配列を増幅した（１０９８ｂｐ）。
【０１６１】
ＰＣＲ増幅して得た全ての断片はｏｍｅｇａ社提供のゲル回収キットを用いて回収し、回収された断片を等モル比で混合してＰＣＲ増幅用テンプレートとし、プライマーＷＦ−ＥＧ２−ＵＦ１及びＥＧ２−ＤＷ−Ｒをフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してＳＯＥ−ＰＣＲ増幅することにより約４．６ｋｂの融合断片を得た。プライマーｐＭＤＴ−ＳｐｅＩ−Ｒ及びｐＭＤＴ−ＸｂａＩ−Ｆを使用して増幅することにより線形化されたベクターｐＭＤＴ−０５を得て、ＤｐｎＩで増幅産物を３時間消化した。ｏｍｅｇａ社提供のゲル回収キットを用いて上記２断片の回収を行い、ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＩＩによるワンステップ法クローニングキットを用いて回収された目的断片を組み立て、大腸菌ＴＯＰ１０形質転換受容性細胞を形質転換し、検証及びシークエンシングを行って正しく構築されているベクターをｐＭＤＴ０５−ＥＧ２−ｐｙｒ４と命名した。
【０１６２】
プラスミドｐＭＧＵ−ｃｂｈ１−ＴＲＡ２をテンプレートとして、プライマーＥＧ２−ＴＲＡ２−Ｆ及びＣＢＨ２−Ｒ２２を使用して発現カセットＰｃｂｈ１−ＴＲＡ２−Ｔｃｂｈ１を約４．７ｋｂ増幅した。プラスミドｐＭＤＴ０５−ＥＧ２−ｐｙｒ４をテンプレートとして、プライマーＣＢＨ２−Ｆ６６及びＰ−ＥＧ２−Ｒを使用して増幅することにより線形化されたベクターを得て、ＤｐｎＩで増幅産物を３時間消化した。ｏｍｅｇａ社提供のゲル回収キットを用いて上記２つの断片の回収を行い、ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＩＩワンステップ法クローニングキットを用いて回収された断片を組み立て、大腸菌ＴＯＰ１０形質転換受容性細胞を形質転換し、検証及びシークエンシングを行って正しく構築されているベクターをｐＭＤＴ０５−ＥＧ２−ＴＲＡ２（ＫＩ）と命名し、これは図１１に示すとおりである。プライマー配列は表６に示すとおりである。
【０１６３】
【表６】
2021514679.tif 000008
2021514679.tif 000009
【０１６４】
実施例１３：４コピー部位特異的組込み発現株の構築
【０１６５】
トリコデルマ・リーセイセルラーゼによる誘導発現において、その細胞外セルラーゼ系でＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１及びＥＧ２が細胞外総タンパクに占める割合は７５％以上である。誘導型プロモーターＰｃｂｈ１は目的遺伝子ＴＲＡ２の発現を誘導するとともに、大量のセルラーゼ系遺伝子の発現も誘導するため、発酵液上清において夾雑タンパク質として多くのセルラーゼ系成分が存在し、下流処理が不利になる要素をもたらすとともに、一部の原料はこれらのセルラーゼ系成分の合成に消費される。本実施例において、Ｒｕｔ−Ｃ３０（ｐｙｒ４−、ｍｕｓ５３−）株を元に、部位特異的組込みノックインの方法によりＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１及びＥＧ２部位のゲノムに合計で４コピーの目的遺伝子発現カセットを組み込んでいた。
【０１６６】
１．ＣＢＨ１部位に対する部位特異的組込み発現株の構築
実施例４に記載の方法及びステップを利用して、アグロバクテリウム仲介による形質転換の方法により、ＣＢＨ１部位に対する部位特異的組込み発現ベクターｐＭＤＴ０５−ＣＢＨ１−ＴＲＡ２（ＫＩ）でトリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０（ｐｙｒ４−、ｍｕｓ５３−）株を形質転換し、３６の形質転換体をピッキングして固体ＭＭ培地（セファロスポリン３００μｇ／ｍＬ）プレートにスポットして二次選別を行い、２８℃で３日培養し、このうちから２０をピッキングして成長状態が良好な形質転換体菌糸をＰＤＡプレートにスポットし、２８℃で７日分生子の培養を行った。
【０１６７】
プライマーＮｄｅＩ−Ｐｃｂｈ１−Ｆ２／ＴＲＡ２−ＣＸ−Ｒ１及びｐｙｒ４−ＬＢ−Ｒ／ＣＢＨ−ｄｏｗｎ−Ｒを使用してＰＣＲすることによりこの２０の形質転換体に対して選別することにより、ＣＢＨ１遺伝子座部位において５’末端ホモロジーアーム及び３’末端ホモロジーアームによって相同組換えが発生したか否かを決定した。プライマーＲＢ−ＹＺ−Ｆ及びプライマーＲＢ−ＹＺ−Ｒ（表５参照）を使用してＰＣＲ増幅して形質転換体を選別することにより、ＣＢＨ１遺伝子座部位以外にランダム組込みが発生したか否かを決定した。本実施例において、各形質転換体に対し、３日培養されたＰＤＡプレートから少量の菌糸体を抽出して無菌水２０μｌに加え、９８℃で１０分加熱し、遠心分離して上清を採取してテンプレートとし、プライマーＮｄｅＩ−Ｐｃｂｈ１−Ｆ２／ＴＲＡ２−ＣＸ−Ｒ１及びｐｙｒ４−ＬＢ−Ｒ／ＣＢＨ−ｄｏｗｎ−Ｒで増幅するとそれぞれ約２．７ｋｂ及び１．３ｋｂの断片を得る場合、対応する領域に予期された形式の相同組換えが発生したことが示され、プライマーＲＢ−ＹＺ−Ｆ及びプライマーＲＢ−ＹＺ−Ｒで増幅すると４２５ｂｐの断片を得ない場合、ランダム組込みが発生しなかったことが示され、本実施例においてこれらの条件を全て満たす陽性形質転換体として１４株が選別された。このうちから１つの陽性形質転換体を選択し、実施例１１に記載の方法を利用してｐｙｒ４遺伝子発現カセットを削除し、プライマーＨＣ２−ＪＤ−Ｆ２及びＣＢＨ１−ＪＤ−Ｒ２を使用して検証を行い、削除が発生したのは増幅して６９８ｂｐの断片が得られ、検証して陽性であった菌株をＬＹＨ−Ｄ１（ｐｙｒ４−、ｍｕｓ５３−）と命名した。プライマー配列は表７に示すとおりである。
【０１６８】
２．ＣＢＨ２部位に対する部位特異的組込み発現株の構築
菌株ＬＹＨ−Ｄ１（ｐｙｒ４−、ｍｕｓ５３−）を元に、上述したＣＢＨ１部位に対する部位特異的組込みノックインの方法及びステップを利用して、アグロバクテリウム仲介による形質転換の方法によりＣＢＨ２部位に対する部位特異的組込み発現ベクターｐＭＤＴ０５−ＣＢＨ２−ＴＲＡ２（ＫＩ）でトリコデルマ・リーセイＬＹＨ−Ｄ１（ｐｙｒ４−、ｍｕｓ５３−）株を形質転換することにより、２コピーの部位特異的組込み株ＬＹＨ−Ｄ２（ｐｙｒ４−、ｍｕｓ５３−）を得た。
【０１６９】
本実施例において、プライマーＣＢＨ２−Ｆ／Ｐｃｂｈ１−ＣＸ及びｐｙｒ４−ＬＢ−Ｒ／ＣＢＨ２−Ｒを使用してＰＣＲして形質転換体を選別することにより、ＣＢＨ２遺伝子座部位において５’末端ホモロジーアーム及び３’末端ホモロジーアームによって相同組換えが発生したか否かを決定した。プライマーＲＢ−ＹＺ−Ｆ及びプライマーＲＢ−ＹＺ−Ｒ（表５参照）を使用してＰＣＲ増幅して形質転換体を選別することにより、ＣＢＨ２遺伝子座部位以外にランダム組込みが発生したか否かを決定した。プライマーＴｃｂｈ１−ＣＸ−Ｆ及びＣＢＨ２−Ｒ２を使用してｐｙｒ４遺伝子発現カセットが削除されたか否かを検証した。プライマー配列は表７に示すとおりである。
【０１７０】
３．ＥＧ１部位に対する部位特異的組込み発現株の構築
菌株ＬＹＨ−Ｄ２（ｐｙｒ４−、ｍｕｓ５３−）を元に、上述したＣＢＨ１部位に対する部位特異的組込みノックインの方法及びステップを利用して、アグロバクテリウム仲介による形質転換の方法によりＥＧ１部位に対する部位特異的組込み発現ベクターｐＭＤＴ０５−ＥＧ１−ＴＲＡ２（ＫＩ）でトリコデルマ・リーセイＬＹＨ−Ｄ２（ｐｙｒ４−、ｍｕｓ５３−）株を形質転換することにより、３コピーの部位特異的組込み株ＬＹＨ−Ｄ３（ｐｙｒ４−、ｍｕｓ５３−）を得た。
【０１７１】
本実施例において、プライマーＥＧ１−ＵＦ１／Ｐｃｂｈ１−ＣＸ及びｐｙｒ４−ＬＢ−Ｒ／ＥＧ１−Ｒを使用してＰＣＲして形質転換体を選別することにより、ＥＧ１遺伝子座部位において５’末端ホモロジーアーム及び３’末端ホモロジーアームによって相同組換えが発生したか否かを決定した。プライマーＲＢ−ＹＺ−Ｆ及びプライマーＲＢ−ＹＺ−Ｒ（表５参照）を使用してＰＣＲ増幅して形質転換体を選別することにより、ＥＧ１遺伝子座部位以外にランダム組込みが発生したか否かを決定した。プライマーＴｃｂｈ１−ＣＸ−Ｆ及びＥＧ１−ＤＲ１を使用してｐｙｒ４遺伝子発現カセットが削除された否かを検証した。プライマー配列は表７に示すとおりである。
【０１７２】
４．ＥＧ２部位に対する部位特異的組込み発現株の構築
菌株ＬＹＨ−Ｄ３（ｐｙｒ４−、ｍｕｓ５３−）を元に、上述したＣＢＨ１部位に対する部位特異的組込みノックインの方法及びステップを利用して、アグロバクテリウム仲介による形質転換の方法によりＥＧ２部位に対する部位特異的組込み発現ベクターｐＭＤＴ０５−ＥＧ２−ＴＲＡ２（ＫＩ）でトリコデルマ・リーセイＬＹＨ−Ｄ３（ｐｙｒ４−、ｍｕｓ５３−）株を形質転換することにより、４コピーの部位特異的組込み株ＬＹＨ−Ｄ４（ｐｙｒ４−、ｍｕｓ５３−）を得た。
【０１７３】
本実施例において、プライマーＥＧ２−ＵＦ１／Ｐｃｂｈ１−ＣＸ及びｐｙｒ４−ＬＢ−Ｒ／ＥＧ２２−Ｒを使用してＰＣＲして形質転換体を選別することにより、ＥＧ２遺伝子座部位において５’末端ホモロジーアーム及び３’末端ホモロジーアームによって相同組換えが発生したか否かを決定した。プライマーＲＢ−ＹＺ−Ｆ及びプライマーＲＢ−ＹＺ−Ｒ（表５参照）を使用してＰＣＲ増幅して形質転換体を選別することにより、ＥＧ１遺伝子座部位以外にランダム組込みが発生したか否かを決定した。プライマーＴｃｂｈ１−ＣＸ−Ｆ及びＥＧ２−ＤＲ１を使用してｐｙｒ４遺伝子発現カセットが削除されたか否かを検証した。プライマー配列は表７に示すとおりである。
【０１７４】
【表７】
2021514679.tif 000010
【０１７５】
実施例１４：トリコデルマ・リーセイｍｕｓ５３遺伝子修復ベクターｐＭＤＴ０５−ｍｕｓ５３（ＫＩ）の構築
【０１７６】
トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーｍｕｓ５３−ｕｐ−Ｆ及びｍｕｓ５３−ｕｐ−Ｒを使用してその５’末端ホモロジーアーム配列及び反復配列（ＤＲ）を含む断片を増幅した（２２０９ｂｐ）。プラスミドｐＭＤＴ０５−ｍｕｓ５３ＫＯをテンプレートとして、プライマーｍｕｓ５３−ｐｙｒ４−Ｆ及びｍｕｓ５３−ｐｙｒ４−Ｒを使用してｐｙｒ４発現カセットを増幅した。ｏｍｅｇａ社提供のゲル回収キットを用いて上記２つのＰＣＲ増幅断片の回収を行い、回収された断片を等モル比で混合してＰＣＲ増幅用テンプレートとし、プライマーｍｕｓ５３−ｕｐ−Ｆ及びｍｕｓ５３−ｐｙｒ４−Ｒをフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用してＳＯＥ−ＰＣＲ増幅することにより約４．０ｋｂの融合断片を得た。使用プライマーｐＭＤＴ−ＳｐｅＩ−Ｒ及びｐＭＤＴ−ＸｂａＩ−Ｆを使用して増幅することにより線形化されたベクターｐＭＤＴ−０５を得て、ＤｐｎＩで増幅産物を３時間消化した。ｏｍｅｇａ社提供のゲル回収キットを用いて上記２つの断片の回収を行い、ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＩＩによるワンステップ法クローニングキットを用いて回収された目的断片を組み立て、大腸菌ＴＯＰ１０形質転換受容性細胞を形質転換し、検証及びシークエンシングを行って正しく構築されているベクターをｐＭＤＴ０５−ｍｕｓ５３−ｐｙｒ４と命名した。
【０１７７】
トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ｍｕｓ５３−ｄｏｗｎ−Ｆ及びｍｕｓ５３−ｄｏｗｎ−Ｒを使用してその３’末端ホモロジーアーム及びｍｕｓ５３修復領域を含む断片を増幅した（４３４３ｂｐ）。制限酵素ＥｃｏＲＩを使用してベクターｐＭＤＴ０５−ｍｕｓ５３−ｐｙｒ４を３時間消化した。ｏｍｅｇａ社提供のゲル回収キットを用いて上記ＰＣＲ増幅断片及び消化後の線形化されたｐＭＤＴ０５−ｍｕｓ５３−ｐｙｒ４（ＥｃｏＲＩ）ベクターの回収を行い、ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＩＩによるワンステップ法クローニングキットを用いて回収された目的断片を組み立て、大腸菌ＴＯＰ１０形質転換受容性細胞を形質転換し、検証及びシークエンシングを行って正しく構築されているベクターをｐＭＤＴ０５−ｍｕｓ５３（ＫＩ）と命名し、図１２はその構築を示す。
【０１７８】
実施例１５：４コピー菌株ＬＹＨ−Ｄ４（ｐｙｒ４−、ｍｕｓ５３−）におけるｍｕｓ５３及びｐｙｒ４遺伝子の修復
【０１７９】
トリコデルマ・リーセイＬＹＨ−Ｄ４（ｐｙｒ４−、ｍｕｓ５３−）株においてトリコデルマ・リーセイｍｕｓ５３遺伝子の修復を行い、実施例４に記載の方法及びステップを利用して、アグロバクテリウム仲介による形質転換の方法によりｍｕｓ５３遺伝子修復ベクターｐＭＤＴ０５−ｍｕｓ５３（ＫＩ）でトリコデルマ・リーセイＬＹＨ−Ｄ４（ｐｙｒ４−、ｍｕｓ５３−）株を形質転換し、２７の形質転換体をピッキングして固体ＭＭ培地（セファロスポリン３００μｇ／ｍＬ）プレートにスポットして二次選別を行い、２８℃で３日培養し、このうちから１５をピッキングして成長状態が良好な形質転換体菌糸をＰＤＡプレートにスポットし、２８℃で７日分生子の培養を行った。
【０１８０】
プライマーＭＵＳ−Ｆ／ＴｒｐＣ−ＣＸ−Ｆ及びＭＵＳ−ＹＺ−Ｆ２／ＭＵＳ−Ｒを使用してＰＣＲして１５の形質転換体を選別することにより、ｍｕｓ５３遺伝子座部位においてその５’末端ホモロジーアーム及び３’末端ホモロジーアームによって相同組換えが発生したか否かを決定した。プライマーＲＢ−ＹＺ−ＦとプライマーＲＢ−ＹＺ−Ｒを使用してＰＣＲ増幅して形質転換体を選別することにより、ｍｕｓ５３遺伝子座部位以外にランダム組込みが発生したか否かを決定した。実施例１１に記載の方法を利用してｐｙｒ４遺伝子発現カセットを削除し、プライマーｍｕｓ３−ＹＺ−Ｆ及びＭＵＳ−ＹＺ−Ｒ２を使用して検証を行うことによりｐｙｒ４遺伝子発現カセットが削除されたか否を決定し、ｍｕｓ５３遺伝子が修復された陽性菌株をＬＹＨ−Ｄ４（ｐｙｒ４−）と命名した。検証用プライマー配列は以下のとおりである（一部表５参照）。
ＭＵＳ−ＹＺ−Ｆ２：ＧＴＧＣＴＧＧＧＡＧＡＣＧＡＴＧＴＧＡＴＧ
ｍｕｓ３−ＹＺ−Ｆ：ＣＡＧＣＡＧＣＧＡＣＧＣＧＡＴＴＣＣＴＴＣ
ＭＵＳ−ＹＺ−Ｒ２：ＣＴＧＣＴＴＣＡＧＡＡＴＧＡＴＧＣＧＧＡＴＧ
【０１８１】
ｍｕｓ５３遺伝子が修復されると、実施例１０に記載の方法及びステップを利用して、ｐｙｒ４遺伝子修復ベクターｐＭＤＴ０５−ｐｙｒ４ＫＩでＬＹＨ−Ｄ４（ｐｙｒ４−）におけるｐｙｒ４遺伝子を修復し、最終的に得られた陽性菌株をＬＹＨ−Ｄ４と命名した。
【０１８２】
実施例１６：部位特異的組込み４コピー菌株ＬＹＨ−Ｄ４の振盪フラスコ発酵の最適化
【０１８３】
トリコデルマ・リーセイＬＹＨ−Ｄ４株における４つの主なセルラーゼ遺伝子がノックアウトされているため、微結晶セルロースを誘導物質及び炭素源として使用することができず、実施例６においてランダム組込み形質転換株の最適化のために用いられる培地はトリコデルマ・リーセイＬＹＨ−Ｄ４株に適用されない。
【０１８４】
本実施例において、培地成分に対する一連の一因子実験、ＰＢ実験及び応答曲面法実験を行って培地の配合を最適化し、トリコデルマ・リーセイＬＹＨ−Ｄ４株の単位体積の発酵活性を向上させて、最適化した結果により、最適化前の発酵培地（組成：ラクトース  ３０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー  １２ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．５６ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２  ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ６ｇ／Ｌ、ふすま粉  ２ｇ／Ｌ、Ｍａｎｄｅｌｓ微量元素（１０００×）  １ｍｌ、ＭｎＣｌ２  ５ｍＭ、ｐＨ＝４．０）を使用する場合、１６８時間発酵における発酵液上清中のシュウ酸デカルボキシラーゼ活性は６８００ＩＵ／Ｌ前後であり、最適化された培地を使用する場合、振盪フラスコ発酵による１６８時間発現後における上清発酵液中のシュウ酸デカルボキシラーゼ活性は２６５００ＩＵ／Ｌに達することが判明した。好ましくは、培地の組成が、グルコース  ３〜６ｇ／Ｌ、ラクトース  ３０〜４０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー  ７〜１０ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．５〜１ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．５６ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２  ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４２〜４ｇ／Ｌ、尿素  ０〜１ｇ／Ｌ、ふすま粉  １０〜２０ｇ／Ｌ、Ｍａｎｄｅｌｓ微量元素（１０００×）  １ｍｌ、ＭｎＣｌ２  ０．５〜５ｍＭであり、ｐＨは３．５〜４．０である。
【０１８５】
実施例１７：発酵タンクによる部位特異的組込み４コピー株ＬＹＨ−Ｄ４の発酵
【０１８６】
１．シード培養液の調製
組換えトリコデルマ・リーセイ菌ＬＹＨ−Ｄ４の菌糸を複数のＰＤＡ固体斜面培地に接種し、２８℃で７日培養し、分生子が成長して緑色になると、無菌水で洗い流して胞子懸濁液を収集し、胞子濃度を１．０×１０８個／ｍｌ前後に調整し、１％の接種量でＭＭ液体培地５００ｍＬに接種し、２８℃で２４〜３６時間暗所振盪（１７０ｒｐｍ）して培養し、これを７Ｌ発酵タンクによる発酵のシード培養液とした。
【０１８７】
２．７Ｌ発酵タンクにおけるトリコデルマ・リーセイ株ＬＹＨ−Ｄ４の発酵
トリコデルマ・リーセイの発酵プロセスは以下の２つ段階に分かれる。第１段階の菌糸体成長段階（０〜７２時間）：７Ｌ発酵タンク（上海保興生物設備工程有限公司提供）に基礎発酵培地（グルコース  ２０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー  ７ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ４ｇ／Ｌ、尿素  １ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム  ２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２  １ｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２  １ｍＭ、Ｍａｎｄｅｌｓ微量元素（１０００×）  １ｍｌ／Ｌ、ｐＨ＝４．０）４．５Ｌを加え、１０％の比率で調製されたトリコデルマ・リーセイのシード培養液に接種し、２８℃で約７２時間通気攪拌しながら培養し、溶存酸素量を３０％以上に保持し、攪拌回転数は溶存酸素量に基づき調整し、一般に２５０〜５００ｒｐｍに制御し、ｐＨは３．５〜４．０前後に保持した。菌糸体成長段階において、トリコデルマ・リーセイ菌体が成長するにつれて、一般に２４〜２８時間経過後にグルコースがほぼ完全に消費され、このとき、１２ｍｌ／時間のスピードで２５０ｇ／Ｌのラクトース溶液を補足した。約７２時間培養後に菌体の乾燥重量は１５〜１８ｇ／Ｌに達する。第２段階の誘導発現段階（７２〜１６８時間）：発酵開始後７２時間に、蠕動運動ポンプを用いて２５０ｇ／Ｌのラクトース溶液を流加し、作業環境濃度を常に２ｇ／ｌ以下、溶存酸素量を常に２０％より大きくし、２８℃で接種後約１６８時間まで通気攪拌培養し、ｐＨは４．０前後に保持した。２４時間経過するごとに発酵液上清をサンプリングしてシュウ酸デカルボキシラーゼ活性を検出し、約１６０時間発酵後における発酵液上清の活性は２７１７５６Ｕ／Ｌに達する（図１３参照）。１３６時間及び１６０時間発酵液上清を採取して１０倍希釈してＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出を行うと、分子量が約６０ＫＤａの目的タンパク質バンドは明確に確認された（図１４参照）。１６０時間発酵液試料を２００倍及び５００倍希釈してウエスタンブロッティング検出分析を行った（図１５参照）。
【０１８８】
実施例１８：組換えシュウ酸デカルボキシラーゼの回収及び抽出
【０１８９】
常温で、５０００ｒｐｍで発酵液を１５分遠心分離し、上清を取得した。孔径１００ｎｍのセラミック膜（三達膜環境技術股▼ふん▲有限公司提供）で発酵液上清を濾過し、透過液を収集し、透過液を清澄化させた後、攪拌しながら濃度１０％のタンニン酸を加え、タンニン酸の終濃度を１％前後とし、室温で１時間静置し、次に常温で、８０００ｒｐｍで１５分遠心分離し、シュウ酸デカルボキシラーゼとタンニン酸が生成した錯体沈殿を収集した。透過液の体積の１／２の無菌水で当該錯体沈殿を充分に再懸濁させて洗浄し、８０００ｒｐｍで１５分遠心分離して、錯体沈殿を取得し、このようにして１回繰り返した。当該錯体沈殿に清澄液の体積の２／５のポリエチレングリコール溶液（ポリエチレングリコールの使用量は清澄液の体積の０．３〜０．５％）を加え、常温で継続的に４時間攪拌し、ポリエチレングリコールとタンニン酸とのより強い結合作用を利用してタンニン酸のタンパク質錯体の中からシュウ酸デカルボキシラーゼを析出させた。次に室温で、８０００ｒｐｍで１５分遠心分離してタンニン酸のポリエチレングリコールポリマーを除去し、上清を取得し、当該上清はすなわち２．５倍濃縮された濃縮酵素液である。最後に、濃縮酵素液に糖類用活性炭を２％加えて脱色させて、淡黄色のシュウ酸デカルボキシラーゼ液を得て、酵素回収率は９０〜９５％に達した。分画分子量が１０ＫＤａの限外濾過膜で脱色されたシュウ酸デカルボキシラーゼ液を１０〜３０倍濃縮させ、濃縮後、噴霧乾燥して粉末シュウ酸デカルボキシラーゼを得た。
【０１９０】
実施例１９：組換えシュウ酸デカルボキシラーゼの性質及び対照分析
【０１９１】
トリコデルマ・リーセイ糸状真菌宿主細胞によって発現された組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ及び天然宿主のチャジュタケによって誘導発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼに対し、ｐＨ値１．５〜７．０において相対酵素活性を測定し、結果を図１６に示す。異なるｐＨ値において、組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ及び天然宿主のチャジュタケによって誘導発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼは類似する相対酵素活性を有する。組換えシュウ酸デカルボキシラーゼはｐＨ値１．５〜７．０においてその酵素活性が全て又は一部保持され、且つ、ｐＨ値１．５〜２．５において至適ｐＨおけるその酵素活性が１０％以上保持され、ｐＨ値２．５〜４．５において至適ｐＨにおけるその酵素活性が５０％以上保持され、ｐＨ値４．５〜７．０において至適ｐＨにおけるその酵素活性が２５％以上保持され、至適ｐＨ値は２．５〜３．５である。
【０１９２】
トリコデルマ・リーセイ糸状真菌宿主細胞によって発現された組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ、天然宿主のチャジュタケによって誘導発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼ及び原核発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼに対し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行い、結果を図１７に示す。トリコデルマ・リーセイによって発現された組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ及びチャジュタケによって発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼは、グリコシル化修飾の形式及び程度が異なるため、見かけの分子量に差異があり、天然宿主のチャジュタケによって発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼの分子量は７０ｋＤａ前後で、トリコデルマ・リーセイによって発現された組換えシュウ酸デカルボキシラーゼの分子量は６０ｋＤａ前後であり、両者のいずれもグリコシル化修復なしの原核発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼの分子量より大きく、原核発現されたグリコシル化修飾なしのシュウ酸デカルボキシラーゼの分子量は５０ｋＤａ前後であった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを利用して、トリコデルマ・リーセイによって発現された組換えシュウ酸デカルボキシラーゼの分子量分析を行い、図１８に示すように、その真分子量は５７．１ｋＤａであった。
【０１９３】
上記３種類の発現系によって発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼをＴＰＣＫ処理後のトリプシン酵素でそれぞれ分解消化した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、そのマススペクトルを図１９、図２０及び図２１に示す。当該３種類の発現系によって発現されたシュウ酸デカルボキシラーゼはグリコシル化修飾の形式及び程度が異なるため、トリプシン酵素による分解消化後のマススペクトルに差異性が認められ、しかもこのような差異性は宿主細胞特異性を有する。
【０１９４】
本発明に記載の配列番号１０〜１６の配列でトリコデルマ・リーセイにおいて単一コピー組換え発現を行うと、配列番号９の場合と類似する実験結果を得ることができる。
【０１９５】
上述した実施例は本発明を説明するために挙げられる好ましい実施例に過ぎず、本発明の保護範囲はこれに限定されるものではない。当業者が本発明に対して行う同等な置換又は変換は、いずれも本発明の保護範囲に含まれる。本発明の保護範囲は特許請求の範囲に準拠する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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