(57)【要約】微生物学分野におけるマイクロバイオーム分析を実施するための方法及びキットが本明細書に開示されている。より詳細には、分析が検査室で試料に実施され得るような、遠隔の試料収集及び試料保存のための方法及びキットが本明細書に開示されている。【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸シーケンシングプロセスにおける試料収集器具の使用であって、前記試料収集器具が、（ｉ）容器；（ｉｉ）支持体と収集部を備える収集要素；及び（ｉｉｉ）試料乾燥剤を含む、使用。
【請求項２】
核酸シーケンシングプロセスが全ゲノムシーケンシングを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
対象から得られた試料に全ゲノムシーケンシングを実施するためのキットの製造における試料収集器具の使用であって、前記試料が核酸材料を含み、かつ前記キットが（ｉ）容器；（ｉｉ）支持体と収集部を備える収集要素；及び（ｉｉｉ）試料乾燥剤を含む、使用。
【請求項４】
核酸材料が、対象のマイクロバイオーム（例えば、腸マイクロバイオーム）に存在する微生物に由来する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記支持体が長手伸長部を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記試料乾燥剤が、少なくとも部分的に、容器内に位置する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記試料乾燥剤が、活性アルミナ、エアロゲル、ベンゾフェノン、ベントナイト粘土、塩化カルシウム、酸化カルシウム、硫酸カルシウム、塩化コバルト（ＩＩ）、硫酸銅（ＩＩ）、塩化リチウム、臭化リチウム、硫酸マグネシウム、過塩素酸マグネシウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、シリカ、ナトリウム、塩素酸ナトリウム、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム、ショ糖、及び硫酸から選択される組成物を含む、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記試料乾燥剤がシリカで実質的に構成される、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記試料乾燥剤が小袋又は小さな包みの中に収納されている、請求項７又は８に記載の使用。
【請求項１０】
前記収集部が複数の長い繊維を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記繊維が合成材料又は人工材料で実質的に構成される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記合成材料又は人工材料が、ナイロン、レーヨン、ポリエステル、ポリアミド、カーボンファイバー、アルギン酸塩、又はそれらの混合物から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記繊維が天然材料で実質的に構成される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１４】
前記天然材料が綿、絹、又はそれらの混合物から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記繊維が親水性を有する、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記繊維が、実質的に均一な厚さを有する層として配置されている、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記繊維が、非吸収性表面に垂直な繊維の規則正しい配置にフロック加工することにより、収集部に置かれている、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記試料収集器具が、糞便試料、唾液試料、皮膚試料、口腔試料、生殖器試料、鼻試料、眼試料、及び耳試料を含む群から選択される試料を収集するために構成されている、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
前記試料収集器具を用いて収集された試料が、対象に存在する微生物を特徴づけるために用いられる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
前記試料収集器具を用いて収集された試料が、対象のマイクロバイオームを完全に又は少なくとも部分的に特徴づけるために用いられる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
ａ．遠隔場所における対象へ試料採取キットを提供するステップであって、前記試料採取キットが、（ｉ）対象の収集部位から試料を受け入れるように構成された容器；（ｉｉ）支持体と収集部を備える収集要素；及び（ｉｉｉ）試料乾燥剤を含む、ステップ；
ｂ．対象由来の試料を含む試料容器を受け取るステップであって、前記試料が乾燥状態で受け取られる、ステップ
を含む、核酸試料を調製する方法。
【請求項２２】
核酸シーケンシング（例えば、全ゲノム核酸シーケンシング）をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
核酸材料が前記試料内の少なくとも１つの微生物に由来する、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料が、糞便試料、唾液試料、皮膚試料、口腔試料、生殖器試料、鼻試料、眼試料、及び耳試料からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１つの微生物が対象の腸マイクロバイオームに存在する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記支持体が、任意選択で非吸収性表面と共に、長手伸長部を含む、それからなる、又は実質的になる、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記試料乾燥剤が、少なくとも部分的に、前記容器内に位置する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料乾燥剤が、活性アルミナ、エアロゲル、ベンゾフェノン、ベントナイト粘土、塩化カルシウム、酸化カルシウム、硫酸カルシウム、塩化コバルト（ＩＩ）、硫酸銅（ＩＩ）、塩化リチウム、臭化リチウム、硫酸マグネシウム、過塩素酸マグネシウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、シリカ、ナトリウム、塩素酸ナトリウム、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム、ショ糖、及び硫酸から選択される組成物を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料乾燥剤がシリカで実質的に構成される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料乾燥剤が小袋又は小さな包みの中に収納されている、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記収集部が複数の長い繊維を含む、請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記繊維が親水性を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記繊維が、実質的に均一な厚さを有する層として配置されている、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記繊維が、非吸収性表面に垂直な繊維の規則正しい配置にフロック加工することにより、先端部に置かれている、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料採取キットが、糞便試料、唾液試料、皮膚試料、口腔試料、生殖器試料、鼻試料、眼試料、及び耳試料から選択される試料を対象から収集するために構成されている、請求項２１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料採取キットを用いて収集された試料が、対象の腸マイクロバイオームを特徴づけるように用いられる、請求項２１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ａ．遠隔場所における対象へ試料採取キットを提供するステップであって、前記試料採取キットが試料収集器具を含み、前記試料収集器具が（ｉ）対象の収集部位から試料を受け入れるように構成された容器；（ｉｉ）支持体と収集部を備える収集要素；及び（ｉｉｉ）試料乾燥剤を含む、ステップ；
ｂ．試料を試料乾燥剤で乾燥させるステップ；並びに
ｃ．試料シーケンシング施設で前記試料を受け取るステップ
を含む、核酸シーケンシングのための試料を調製する方法。
【請求項３８】
ａ．遠隔場所における対象へ試料採取キットを提供するステップであって、前記試料採取キットが試料収集器具を含み、前記試料収集器具が（ｉ）対象の収集部位から試料を受け入れるように構成された容器；（ｉｉ）支持体と収集部を備える収集要素；及び（ｉｉｉ）試料乾燥剤を含む、ステップ；
ｂ．対象由来の試料を含む試料容器を受け取るステップ；並びに
ｃ．前記試料をバッファー中に再懸濁するステップ
を含む、核酸シーケンシングのための試料を調製する方法。
【請求項３９】
ａ．遠隔場所における対象へ試料採取キットを提供するステップであって、前記試料採取キットが試料収集器具を含み、前記試料収集器具が（ｉ）対象の収集部位から試料を受け入れるように構成された容器；（ｉｉ）支持体と収集部を備える収集要素；及び（ｉｉｉ）試料乾燥剤を含む、ステップ；
ｂ．対象由来の試料を含有する試料容器を受け取るステップ；
ｃ．前記試料の微生物部分由来の核酸材料をシーケンシングして、マイクロバイオーム配列データセットを作成するステップ；
ｄ．前記試料の微生物部分に存在する１組の微生物を前記マイクロバイオーム配列データセットに基づいて同定するステップ；
ｅ．前記試料の微生物部分に存在する前記１組の微生物に基づいて分析を生成するステップ；並びに
ｆ．前記分析を前記対象へ伝達するステップ
を含む、対象におけるマイクロバイオームの組成を特徴づける方法。
【請求項４０】
前記マイクロバイオームが腸マイクロバイオームである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
核酸シーケンシングが全ゲノム核酸シーケンシングである、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
核酸材料が、対象由来のマイクロバイオームに存在する微生物に由来する、請求項３７〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
試料が糞便試料であり、かつ微生物が対象の腸マイクロバイオームに存在する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記試料収集器具が、非吸収性表面を有する先端部で終わるロッドを含む、それからなる、又はそれから本質的になるスワブである、請求項３７〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記試料乾燥剤が、少なくとも部分的に、容器内に位置する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記試料乾燥剤が、活性アルミナ、エアロゲル、ベンゾフェノン、ベントナイト粘土、塩化カルシウム、酸化カルシウム、硫酸カルシウム、塩化コバルト（ＩＩ）、硫酸銅（ＩＩ）、塩化リチウム、臭化リチウム、硫酸マグネシウム、過塩素酸マグネシウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、シリカ、ナトリウム、塩素酸ナトリウム、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム、ショ糖、及び硫酸から選択される組成物を含む、請求項３７〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記試料乾燥剤が小袋又は小さな包みの中に収納されている、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記収集部が複数の長い繊維を含む、請求項３７〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記繊維が親水性を有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記繊維が、実質的に均一な厚さを有する層として配置されている、請求項４８又は４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記繊維が、非吸収性表面に垂直な繊維の規則正しい配置にフロック加工することにより、先端部に置かれている、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記試料収集器具が、糞便試料、唾液試料、皮膚試料、口腔試料、生殖器試料、鼻試料、眼試料、及び耳試料から選択される試料を収集するために構成されている、請求項３７〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記試料収集器具を用いて収集された試料が、糞便試料であり、かつマイクロバイオーム（例えば、腸マイクロバイオーム）を特徴づけるために用いられる、請求項３７〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
試料収集器具を含む、マイクロバイオーム特徴づけキットであって、前記試料収集器具が、
（ａ）容器；
（ｂ）支持体と収集部を備える収集要素；及び
（ｃ）試料乾燥剤
を含み、前記容器が、いかなる試料処理試薬又は化学物質も含まず、かつ対象の収集部位から試料を受け入れるように構成されている、キット。
【請求項５５】
対象に存在するマイクロバイオーム由来の微生物を含む試料を収集するための使用説明書をさらに含む、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
試料を核酸シーケンシング施設へ返送するための返送封筒又は小包をさらに含む、請求項５４又は５５に記載のキット。
【請求項５７】
ａ．遠隔場所における対象へ試料採取キットを提供するステップであって、前記試料採取キットが、（ｉ）対象の収集部位から試料を受け入れるように構成された容器；（ｉｉ）支持体と収集部を備える収集要素；及び（ｉｉｉ）試料乾燥剤を含む試料収集器具を備える、ステップ；
ｂ．対象の収集部位由来の試料を含む試料容器を受け取るステップ；
ｃ．前記試料に存在する少なくとも１つの微生物の核酸内容物をシーケンシングすることに基づいて、マイクロバイオーム配列データセットを作成するステップ；
ｄ．マイクロバイオーム配列データセットの各部分へのマッピング操作の実施に基づいて、微生物部分に表現される１組の微生物を同定するステップ；
ｅ．前記微生物部分に関係した１組の特徴に基づいて分析を生成するステップ；並びに
ｆ．前記分析から導かれた情報を前記対象に送信するステップ
を含む、対象のマイクロバイオームを分析するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]この発明は、一般的に、微生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、微生物学の分野においてマイクロバイオーム分析を実施するための方法及びキットに関する。加えて、本発明はまた、分析が検査室において試料へ実施され得るような、遠隔の試料収集及び試料保存のための方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]任意の既知の事項又は先行刊行物（又はそれに由来した情報）へのこの明細書におけるいかなる言及も、その既知の事項、先行刊行物、又はそれに由来した任意の情報が、当技術分野におけるありふれた一般的な知識の一部を形成するという認識でも承認でも示唆でもない。
【０００３】
[0003]マイクロバイオームは、細菌、古細菌、真菌、ウイルス、及び原生生物を含む、片利共生の、相利共生の、及び病原性の微生物の生態学的群落である。ヒト身体は、ヒト細胞の１１０％を超える微生物細胞を含むと報告されている（Ｓｅｎｄｅｒら、２０１６参照）。しかしながら、ヒトマイクロバイオームの特徴づけのための技術及び方法は、試料処理技術、遺伝子分析技術、及び大量のデータを処理するための資源における限界により、まだ初期段階にある。伝統的な特徴づけ技術は、一般的に、古典的な表現型技術に限定されている（Ｃｌａｒｒｉｄｇｅ、２００４；及びＨｕｓｅ、２０１０参照）。
【０００４】
[0004]ハイスループットのシーケンシングテクノロジーの向上で、個々に生物体を培養する必要なしに、複雑な微生物群落をプロファイリングする能力が劇的に増加している。高度に保存された１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子を利用するシーケンシング研究は、系統発生及び微生物多様性の我々の理解を実質的に変化させた。このテクノロジーは、土壌から、ヒトマイクロバイオームを含むヒトまで、微生物群落及びそれらの存在量をプロファイリングするための中心となっている。しかしながら、１６Ｓ  ｒＲＮＡ方法は、限界がないわけではない；群落プロファイルはプライマー選択によりバイアスを受け、分類学的アノテーションは、存在する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子断片の、配列の実験特異的クラスター由来の代表的な配列との配列類似性（操作的分類単位（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｕｎｉｔ）（ＯＴＵ）と名づけられている）に基づいている。１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列は、それらの遍在性のため、良いバイオマーカーであるが、ＯＴＵは、典型的には、それらの高い保存により科又は属レベルで分析され、種又は株に渡っては同一であり得る。加えて、群落由来の機能性遺伝子は、直接的にシーケンシングされず、むしろ、近縁型の株類縁体からの既知の知識に基づいて帰属される。したがって、遺伝子水平伝播及び実質的な遺伝子含量の違いを有する多数の細菌株の存在により、いかなる直接的な遺伝子同定も行わないことは、マイクロバイオームの我々の理解を制限している可能性がある（Ｐｏｒｅｔｓｋｙ、２０１４；Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｉｓ、２００７；及びＫｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｉｓ、２０１３参照）。
【０００５】
[0005]いくつかの製品は、カスタマーが、マイクロバイオーム試料を収集し、それらの腸マイクロバイオームの組成に関する情報を得るために検査室へ送ることを可能にするのに利用可能である。しかしながら、カスタマーが試料を収集する時点と試料が検査室によって受け取られる時点との間に、典型的には、少なくとも数日に及ぶ。この時間の間に、重要な核酸材料が分解し始めて、結果を処理に適さないもの、又は最善でも、信頼できないものにする。典型的には、液体の処理及び前処理試薬が試料収集容器に含まれており、カスタマーが、反応（細胞溶解及び核酸安定化）を開始して、試料内の核酸材料の完全性を保存するために、試料をその試薬と混合する。
【０００６】
[0006]試料処理試薬（例えば、溶解バッファー）の含有が、一般的には当技術分野において、重要な機能をもつと考えられているが、そのような処理試薬へ収集される時の消費者コンプライアンスは相対的に低い。すなわち、多くの返送された試料は、核酸シーケンシングプロセス中の品質管理（ＱＣ）で不合格になっている。
【０００７】
[0007]さらに、本発明者らによって観察された他の問題には、小さいチューブサイズが一般的に、扱いが難しいことが見出されており、悪評が知れ渡るほど、実験用試料収集キットを除く多くが漏れていることが挙げられる。したがって、遠隔の試料収集のための市販のキットは、一般的に、そのような漏れから保護するために２つの容器を含み、そのことは、分析される試料あたりの全体的な費用をさらに増加させる。
【０００８】
[0008]加えて、試料中の細胞を溶解させるために化学製品を用いることは、カスタマーへ追加の化学品安全性危険性として提示される。加えて、これらの方法は、チューブ破損又は漏出に関係した場合には、試料の輸送により高いリスクを与える。
【０００９】
[0009]明確に定義された試薬対試料比が必要とされるため、技術的視点からの問題もある。いったん処理反応がすでに開始され、かつ試料が液体の形で提供されることになっているならば、その試料が検査室で受け取られた後で試料量を可溶化液中で変更することはできないため、不十分な核酸材料が試料中に提供されていることに対処する方法はない。
【００１０】
[0010]さらに、より高い性能をもつ試料処理試薬及びＤＮＡ安定化化学物質は非常に高価であり、試料キットへかなりの費用を加算する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
[0011]本発明は、処理施設への輸送の前又は間にマイクロバイオーム試料を乾燥させることが核酸シーケンシング前の試料処理の向上を可能にするという、本発明者らによる認識に少なくとも一部、基づいている。
【００１２】
[0012]この点で、一態様において、本発明は、核酸シーケンシングプロセスにおける試料収集器具の使用であって、前記試料収集器具が、（ｉ）容器；（ｉｉ）支持体と収集部を備える試料収集要素；及び（ｉｉｉ）試料乾燥剤を含む、使用を提供する。好ましくは、支持体は、長手伸長部を備える。長手伸長部の長さは、典型的には、約２ｃｍ〜約２０ｃｍの間；約３ｃｍ〜約１８ｃｍの間；及び約６ｃｍ〜約１６ｃｍの間から選択される。長手伸長部は、一般的に、約０．５ｍｍ〜約５ｍｍの間；約１ｍｍ〜約３ｍｍの間；又は約１．５ｍｍ〜約２．５ｍｍの間を含む、厚さ、又はその中心軸に垂直である横断面における直径を有する。
【００１３】
[0013]好ましくは、試料乾燥剤は、少なくとも部分的に容器内に位置する。
【００１４】
[0014]いくつかの好ましい実施形態において、容器は、いかなる処理試薬（例えば、溶解バッファー、ＰＣＲバッファー、保存剤など）も含まない。
【００１５】
[0015]典型的には、核酸シーケンシングプロセスは、全ゲノムシーケンシング方法を含む。
【００１６】
[0016]いくつかの実施形態において、収集部は、複数の長い繊維を含む。長い繊維は、適切な合成若しくは人工材料、又はそれらの組合せで実質的に構成される。
【００１７】
[0017]いくつかの実施形態において、合成材料は、ナイロン、レーヨン、ポリエステル、ポリアミド、カーボンファイバー、アルギン酸塩、及びそれらの混合物のうちの少なくとも１つから選択される。いくつかの好ましい実施形態において、合成材料は、ナイロンから実質的に構成される。
【００１８】
[0018]いくつかの代替の実施形態において、長い繊維が天然材料で実質的に構成される。適切な天然材料の非限定的例には、綿、絹、及び／又はそれらの混合物が挙げられる。
【００１９】
[0019]いくつかの実施形態において、長い繊維は親水性を有する。
【００２０】
[0020]いくつかの実施形態において、複数の繊維は、実質的に均一な厚さを有する層として配置される。
【００２１】
[0021]いくつかの実施形態において、繊維は、収集部の非吸収性表面に垂直な繊維の規則正しい配置にフロック加工することにより、デバイスの収集部に置かれる。
【００２２】
[0022]いくつかの実施形態において、試料収集器具は、対象から糞便試料を収集する（例えば、使用されたトイレットペーパーから大便を収集する）ために構成される。いくつかの代替の実施形態において、対象から収集される試料は、糞便試料、唾液試料、血液試料、皮膚試料、血漿／血清試料、口腔試料、生殖器試料、鼻試料、眼試料、及び耳試料から選択され得る。
【００２３】
[0023]いくつかの実施形態において、前記デバイスを用いて収集された試料は、腸マイクロバイオームを特徴づけるために使用される。
【００２４】
[0024]別の態様において、本発明は、対象のマイクロバイオーム試料において核酸材料を分析する、又は別法で調べるためのキットの製造における、試料乾燥剤を含む試料収集器具の使用を提供する。
【００２５】
[0025]典型的には、核酸材料は、対象のマイクロバイオームに存在する微生物に由来する。
【００２６】
[0026]別の態様において、本発明は、以下のステップを含む、核酸シーケンシングのための試料を調製する方法を提供する：
[0027]遠隔場所における対象へ試料採取キットを提供するステップであって、前記試料採取キットが、（ｉ）容器；（ｉｉ）支持体と収集部を備える収集要素；及び（ｉｉｉ）試料乾燥剤を含む試料収集器具を含む、ステップ；
[0028]対象由来の試料を含む容器を受け取るステップ；並びに
[0029]試料における核酸の少なくとも一部分をシーケンシングするステップ。
【００２７】
[0030]いくつかの実施形態において、容器は、いかなる試料処理試薬及び／又は化学物質（例えば、溶解バッファー、ＰＣＲバッファー、保存剤など）も含まず、対象の収集部位から試料を受け入れるように構成される。
【００２８】
[0031]いくつかの実施形態において、核酸シーケンシングは、全ゲノムシーケンシング方法を含む。
【００２９】
[0032]典型的には、核酸は、試料内の少なくとも１つの微生物に由来する。
【００３０】
[0033]いくつかの好ましい実施形態において、試料は糞便試料であり、微生物は対象の腸マイクロバイオームに存在している。
【００３１】
[0034]典型的には、デバイスの支持体は長手伸長部を含む。
【００３２】
[0035]好ましくは、試料乾燥剤は、容器内に少なくとも部分的に位置する。いくつかの実施形態において、試料乾燥剤は、容器内に存在する試料を乾燥させる、又は除湿するように機能する。本発明の試料乾燥剤は、典型的には、吸湿性物質で実質的に構成される。いくつかの実施形態では試料乾燥剤は、固体の形をとるが、他の形もまた構想される（及び、水分子の化学的結合などの他の原理を通して働き得る）。実例として、試料乾燥剤は、以下から選択される組成物で実質的に構成され得る：活性アルミナ、エアロゲル、ベンゾフェノン、ベントナイト粘土、塩化カルシウム、酸化カルシウム、硫酸カルシウム、塩化コバルト（ＩＩ）、硫酸銅（ＩＩ）、塩化リチウム、臭化リチウム、硫酸マグネシウム、過塩素酸マグネシウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、シリカ、ナトリウム、塩素酸ナトリウム、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム、ショ糖、及び硫酸。いくつかの好ましい実施形態において、試料乾燥剤は、シリカで実質的に構成される。いくつかの実施形態において、試料乾燥剤は、小袋、袋、又は網目の織物で供給される。典型的には、試料乾燥剤は、容器の内側に又は別の有用な位置に、完全に又は少なくとも部分的に、収納される。例えば、いくつかの実施形態において、試料乾燥剤（例えば、シリカゲルの小袋）は、容器の蓋に収納され、デバイスの試料収集部と流体連通している。
【００３３】
[0036]いくつかの実施形態において、収集部は、複数の長い繊維を含む。適切には、繊維は親水性を有する。いくつかの実施形態において、複数の繊維は、実質的に均一な厚さを有する層として配置される。長い繊維は、典型的には、非吸収性表面に垂直な繊維の規則正しい配置にフロック加工することにより、収集部に置かれる。
【００３４】
[0037]いくつかの好ましい実施形態において、試料収集器具は、対象から糞便試料を収集するために構成される。典型的には、そのデバイスを用いて収集された試料は、マイクロバイオームを特徴づけるために使用される。
【００３５】
[0038]さらに別の態様において、本発明は、以下のステップを含む、核酸シーケンシングのための試料を調製する方法を含む：
[0039]遠隔場所における対象へ試料採取キットを提供するステップであって、前記試料採取キットが、（ｉ）容器；（ｉｉ）支持体と収集部を備える試料収集要素；及び（ｉｉｉ）試料を乾燥させるのに十分である、試料乾燥剤を含む試料収集器具を含む、ステップ；並びに
[0040]前記乾燥した試料を含む容器を、試料シーケンシング施設で受け取るステップ。
【００３６】
[0041]さらになお別の態様において、本発明は、以下のステップを含む、核酸シーケンシングのための試料を調製する方法を含む：
[0042]遠隔場所における対象へ試料採取キットを提供するステップであって、前記試料採取キットが、（ｉ）容器；（ｉｉ）支持体と収集部を備える試料収集要素；及び（ｉｉｉ）試料乾燥剤を含む試料収集器具を含む、ステップ；
[0043]前記対象由来の試料を含む前記試料容器を受け取るステップ；並びに
[0044]前記試料をバッファー中に再懸濁するステップ。
【００３７】
[0045]さらになお別の態様において、本発明は、以下のステップを含む、対象におけるマイクロバイオームの組成物を特徴づける方法を含む：
[0046]遠隔場所における対象へ試料採取キットを提供するステップであって、前記試料採取キットが、（ｉ）容器；（ｉｉ）支持体と収集部を備える収集要素；及び（ｉｉｉ）試料乾燥剤を含む試料収集器具を含む、ステップ；
[0047]前記対象由来の試料を含有する前記試料容器を受け取るステップ；
[0048]前記試料の微生物部分由来の核酸内容物をシーケンシングして、マイクロバイオーム配列データセットを作成するステップ；
[0049]前記試料の微生物部分に存在する１組の微生物を前記マイクロバイオーム配列データセットに基づいて同定するステップ；
[0050]前記試料の微生物部分に存在する前記１組の微生物に基づいて分析を生成するステップ；並びに
[0051]前記分析を前記対象へ伝達するステップ。
【００３８】
[0052]好ましくは、容器は、いかなる試料処理試薬及び／又は化学物質（例えば、溶解バッファー、ＰＣＲバッファー、保存剤など）も含まない。
【００３９】
[0053]いくつかの実施形態において、マイクロバイオームは腸マイクロバイオームである。
【００４０】
[0054]いくつかの好ましい実施形態において、核酸シーケンシングは、全ゲノム核酸シーケンシングを含む。その同じ実施形態及び他の実施形態のうちのいくつかにおいて、核酸材料は微生物由来である。
【００４１】
[0055]いくつかの好ましい実施形態において、試料は糞便試料であり、微生物は対象の腸マイクロバイオームに存在する。
【００４２】
[0056]さらになお別の態様において、本発明は、以下を含む、マイクロバイオーム特徴づけキットを提供する：
[0057]（ｉ）いかなる試料処理試薬及び／又は化学物質（例えば、溶解バッファー、ＰＣＲバッファー、保存剤など）も含まない容器；（ｉｉ）支持体と収集部を備える試料収集要素；及び（ｉｉｉ）試料乾燥剤を含む試料収集器具。
【００４３】
[0058]いくつかの実施形態において、キットは、対象の腸マイクロバイオームに由来した微生物を含む試料を収集するための使用説明書をさらに含む。この型のいくつかの実施形態において、キットはまた、ブリストル大便チャート（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｓｔｏｏｌ  Ｃｈａｒｔ）を含有する。
【００４４】
[0059]好ましくは、キットは、試料を核酸シーケンシング施設へ返送するための返送用封筒又は小包をさらに含む。
【００４５】
[0060]以下のステップを含む、対象のマイクロバイオームを分析するための方法：
[0061]遠隔場所における対象へ試料採取キットを提供するステップであって、前記試料採取キットが、（ｉ）いかなる試料処理試薬及び／又は化学物質（例えば、溶解バッファー、ＰＣＲバッファー、保存剤など）も含まない容器；（ｉｉ）支持体と収集部を備える収集要素；及び（ｉｉｉ）試料乾燥剤を含む、ステップ；
[0062]前記対象の収集部位由来の試料を含む前記試料容器を受け取るステップ；
[0063]前記試料に存在する少なくとも１つの微生物の核酸内容物をシーケンシングすることに基づいて、マイクロバイオーム配列データセットを作成するステップ；
[0064]マイクロバイオーム配列データセットの各部分へのマッピング操作の実施に基づいて、前記微生物部分において表現される１組の微生物を同定するステップ；
[0065]前記微生物部分に関係した１組の特徴に基づいて分析を生成するステップ；並びに
[0066]前記分析から導かれた情報を前記対象に送信するステップ。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
[0067]本発明の例が、ここで添付の図面を参照して記載される。
【図１】本明細書に記載されたプロセスを示すフローチャートである。
【図２】ヘリンガー（Ｈｅｌｌｉｎｇｅｒ）変換された種プロファイルの主成分分析プロットのグラフ表示である。各対象由来の試料は、固有の色を割り当てられ、各安定化技術は固有の形を割り当てられている。緑色：対象１；黄色：対象２；紫色：対象３；オレンジ色：対象４；青色：対象５。
【図３】５つの対象の種プロファイルのグラフ表示である。異なる色は、６個全てのレプリケート試料に渡って決定された種の平均存在量に対応する。各棒プロットの下部における明るい青色及び暗い青色の棒は、それぞれ、マッピングされなかった、及び割り当てられなかった読み取りの平均パーセンテージを示す。種は、ベースライン「凍結」試料に基づいた最大存在量から最小存在量へソートされている。各棒プロットの上部における明るい灰色棒は、最大平均存在量が全安定化技術に渡って０．５％未満である種を示す。対象間での同じ色は、必ずしも同じ種に対応するわけではない。対象４及び５のみが、ＤＮＡ／ＲＮＡシールド条件下で分析された。
【図４】各レプリケート試料について明確に示された５つの対象についての種プロファイルのグラフ表示である。色は、図２のものと同じである。
【図５】５人の参加者についての種プロファイルを示すバブルプロット表示である。（Ａ）相対的存在量、及び（Ｂ）相対的存在量−凍結試料対照における平均種存在量が示されている。円サイズは、分類群の相対的存在量を表す。対象はＰ１〜Ｐ５として描写されている。（Ｂ）凍結試料における平均存在量より多い存在量を有する全ての試料が円として示されている。負の値（凍結試料における平均存在量より少ない存在量を有する試料）は示されていない。
【図６】５つ全ての対象に渡って集計された、異なる安定化技術及び対照凍結試料についてのレプリケート種プロファイルの多様性のグラフ表示である。箱髭図は、下位及び上位四分位点を箱として、平均値を箱内の線として、四分位範囲の１．５倍を髭として、異常値を×印として示している。
【図７】５人の参加者のそれぞれについての異なる安定化技術及び時間ゼロに凍結された試料についての、（Ａ）ブレイ・カーチス（Ｂｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ）多様性；（Ｂ）ハミング（Ｈａｍｍｉｎｇ）距離；及び（Ｃ）ソーレンセン（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ）多様性を含む、レプリケート種プロファイルの多様性のグラフ表示である。
【図８】時点ゼロで取得された対照凍結試料からのプロファイルと比較した、異なる安定化技術についての種プロファイルの多様性のグラフ表示である。結果は、５つ全ての対象に渡って集計されている。
【図９】時間ゼロで取得された凍結試料からのプロファイルと比較した、異なる安定化技術についての種プロファイルの多様性のグラフ表示である。結果は、５つの対象のそれぞれについて示されている。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
[0077]以下の本発明の実施形態の説明では、本発明をこれらの実施形態に限定することが意図されず、むしろ、当業者がこの発明を作製しかつ使用するのを可能にすることが意図される。
【００４８】
１．定義
[0078]他に規定がない限り、本明細書で用いられた全ての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと類似した又は等価の任意の方法及び材料を、本発明の実践又は試験に用いることができるが、好ましい方法及び材料が記載されている。本発明のために、以下の用語が下記で定義される。
【００４９】
[0079]冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、その冠詞の文法的目的語の１つ又は１つより多い（すなわち、少なくとも１つ）を指すように本明細書で用いられる。例として、「１つの試料」は、１つの試料又は１つより多い試料を意味する。したがって、例えば、用語「糞便試料」はまた、複数の糞便試料を含む。
【００５０】
[0080]本明細書で用いられる場合、「及び／又は」は、その関連の列挙された項目のうちの１つ又は複数のありとあらゆる可能な組合せを指し、かつ包含し、加えて、二者択一（ｏｒ）に解釈される時は組合せを欠く。
【００５１】
[0081]さらに、本明細書で用いられる場合、量、用量、時間、温度、活性、レベル、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、位置、長さなどの測定可能な値を指す時の用語「約」は、その特定された量、用量、時間、温度、活性、レベル、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、位置、長さなどの±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、又はさらに±０．１％の変動を包含することを意図される。
【００５２】
[0082]値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値と下限値の間の、文脈が明らかに他に指示しない限りその下限値という単位の１０分の１までの、それぞれ介在する値、及びその提示された範囲内の任意の他の提示された又は介在する値が本発明内に包含されると理解される。より小さい範囲に非依存的に含まれ得る、これらのより小さい範囲の上限値及び下限値もまた、その提示された範囲における任意の特定的に排除された限界値次第で、本発明内に包含される。提示された範囲が、その限界値の１つ又は両方を含む場合、それらの含まれる限界値の一方又は両方を排除する範囲もまた、本発明に含まれる。
【００５３】
[0083]この明細書を通して、文脈上、他の意味に解釈されるべき場合を除き、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、提示されたステップ又は要素又はステップ若しくは要素の群の包含を意味するが、任意の他のステップ又は要素又はステップ若しくは要素の群の排除を意味しないと理解される。したがって、用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの使用は、その列挙された要素が必要とされる、又は必須であることを示すが、他の要素は任意であり、存在しても存在しなくてもよいことを示す。「からなる」とは、句「からなる」に続くのは何でも含み、かつそれらに限定されることを意味する。したがって、句「からなる」は、列挙された要素が必要とされる、又は必須であること、かつ他の要素が存在し得ないことを示す。「から本質的になる」とは、その句の後に列挙された任意の要素、及びその列挙された要素についての開示において特定された活性又は作用に干渉又は寄与しない他の要素に限定された任意の要素を含むことを意味する。したがって、句「から本質的になる」は、列挙された要素が必要とされる、又は必須であることを示すが、他の要素は任意であり、かつそれらが、列挙された要素の活性又は作用に影響するかどうかに依存して、存在する場合もあるし、存在しない場合もあることを示す。
【００５４】
[0084]本明細書で用いられる場合、用語「乾燥させること（ｄｒｙｉｎｇ）」は、「除湿すること」及び「乾燥させること（ｄｅｓｉｃｃａｔｉｎｇ）」と同義語であり、典型的には保存のために、環境からの湿気の除去を指す。
【００５５】
[0085]本明細書で用いられる場合、用語「マイクロバイオーム」は、腸マイクロバイオームを指す。腸マイクロバイオーム（又はヒト腸マイクロバイオーム）は、ヒトの胃腸管内の表面上に住む微生物の集合体として理解され得る。ヒトマイクロバイオームは、細菌、真菌、ウイルス、及び古細菌で構成される。これらの生物体の少なくとも一部は、ヒト宿主に有用である仕事をする。正常な（すなわち、健康な）状況下で、これらの微生物は、ヒト宿主へ疾患をもたらさず、それどころか、健康を維持するのに関与する。したがって、この生物体集団は、しばしば、「正常フローラ」と呼ばれる。
【００５６】
[0086]本明細書で用いられる場合、用語「試料」は、特徴づけられる又は同定されるべき核酸成分を含有すると思われる任意の供給源を意味するように用いられる。試料は、「正味（ｎｅａｔ）」であり得、又は適切なバッファー若しくは溶媒で希釈することができる。現在好ましい試料には、核酸成分を含むと思われる任意の生物学的検体が挙げられるが、それらに限定されない。特許請求された本発明での使用に適した試料には、糞便試料が挙げられるが、それに限定されない。本明細書で用いられる場合、用語「成分」は、任意の同定可能な若しくは検出可能な物質、又は試料中の他の物質から分離されやすい物質を意味するように意図される。好ましい成分には、核酸、タンパク質、及びペプチドなどの化学的及び生化学的部分が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５７】
[0087]本明細書で交換可能に用いられる、用語「対象」、「宿主」、又は「個体」は、治療又は予防が望まれる、任意の対象、特に脊椎動物対象、さらに特に哺乳動物対象を指す。本発明の範囲内に入る適切な脊椎動物には、脊索動物門の任意のメンバーが挙げられるが、それらに制限されず、脊索動物門には、霊長類（例えば、ヒト、サル、及び類人猿であり、マカク属（Ｍａｃａｃａ）（例えば、マカク・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）などのカニクイザル、及び／又はアカゲザル（マカク・ムラッタ（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ））、及びヒヒ（パピオ・ウルシヌス（Ｐａｐｉｏ  ｕｒｓｉｎｕｓ））、加えて、マーモセット（カリスリックス（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）属由来の種）、リスザル（リスザル属（Ｓａｉｍｉｒｉ）由来の種）、及びタマリン（ｔａｍａｒｉｎ）（タマリン属（Ｓａｇｕｉｎｕｓ）由来の種）由来などのサルの種、加えてチンパンジー（パン・トログロダイテス（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ））などの類人猿の種が挙げられる）、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット）、ウサギ目（ｌａｇｏｍｏｒｐｈｓ）（例えば、ウサギ、ノウサギ）、ウシ属（ｂｏｖｉｎｅｓ）（例えば、畜牛）、ヒツジ属（ｏｖｉｎｅｓ）（例えば、ヒツジ）、ヤギ属（ｃａｐｒｉｎｅｓ）（例えば、ヤギ）、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅｓ）（例えば、ブタ（ｐｉｇｓ））、ウマ科（ｅｑｕｉｎｅｓ）（例えば、ウマ（ｈｏｒｓｅｓ））、イヌ科（ｃａｎｉｎｅｓ）（例えば、イヌ）、ネコ属（ｆｅｌｉｎｅｓ）（例えば、ネコ）、鳥類（ａｖｉａｎｓ）（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガン、コンパニオンバード、例えば、カナリア、セキセイインコなど）、海洋哺乳類（例えば、イルカ、クジラ）、爬虫類（例えば、ヘビ、カエル、トカゲなど）、及び魚類が挙げられる。好ましい対象はヒトである。
【００５８】
[0088]多数のバリエーション及び改変が明らかになるだろうことを当業者は認識しているだろう。当業者に明らかになる全てのそのようなバリエーション及び改変は、記載される前に、幅広く、本発明の趣旨及び範囲内に入ると考えられるべきである。
【００５９】
[0089]したがって、例えば、上記の異なる例からの特徴が、適切な場合、交換可能に用いられ得ることは認識されているだろう。
【００６０】
２．試料収集器具
[0090]本明細書に記載された核酸シーケンシングプロセス及び方法は、典型的には、試料収集器具の使用を必要とする。試料収集器具は、典型的には、（ｉ）容器；（ｉｉ）支持体と収集部を備える試料収集要素；及び（ｉｉｉ）試料乾燥剤を含む。
【００６１】
[0091]試料収集器具は、好ましくは、侵襲的及び／又は非侵襲的様式で対象からの試料の収容を容易にするように構成される。
【００６２】
[0092]いくつかの実施形態において、容器は、対象の身体の領域から試料を受け入れるように構成されているバイアル、チューブ、若しくは袋、及び／又は任意の他の適切な試料収容要素を含む。いくつかの実施形態において、容器は、実質的に円筒状の試験管を含む。
【００６３】
[0093]適切には、容器の上部の開口端は、密閉手段を受けるためのカラーを有する。いくつかの実施形態において、密閉手段は、選択的に容器を閉めるために、アクセス開口部に取り外し可能に装着できる密閉用キャップ又は栓を含む。典型的には、キャップ又は栓は、それが、容器のカラーと、例えば、スナップ嵌めにより、嵌め込むことができるように形作られる。いくつかの好ましい実施形態において、密閉用キャップ又は栓は、試料収集要素の支持体へ、収集部の反対端に取り付けられる。
【００６４】
[0094]容器、密閉用キャップ、及び／又は支持体は、それぞれ、プラスチック材で作製することができる。適切な材料には、ポリスチロール、ポリスチレン、若しくはポリプロピレン、及び／又は収集されるべき特定の試料との使用に適した、若しくは生物学的材料若しくは生物学的起源の材料と用いるのに一般的に適している任意の他の材料が挙げられる（ただし、それらに限定されない）。いくつかの好ましい実施形態において、容器、密閉用キャップ、及び／又は支持体は、滅菌することができる。
【００６５】
[0095]収集器具は、容器、密閉用キャップ又は栓、及び試料収集要素が、試料を収集することにおける使用の前に、収納することができる、密封包装材をさらに含み得る。
【００６６】
[0096]好ましくは、支持体は、長手伸長部を含む。長手伸長部の長さは、典型的には、約２ｃｍ〜約２０ｃｍの間；約３ｃｍ〜約１８ｃｍの間；及び約６ｃｍ〜約１６ｃｍの間から選択される。長手伸長部は、一般的に、約０．５ｍｍ〜約５ｍｍの間；約１ｍｍ〜約３ｍｍの間；又は約１．５ｍｍ〜約２．５ｍｍの間に含まれる、厚さ、又はその中心軸に垂直である横断面における直径を示す。いくつかの実施形態において、長手伸長部は、合成材料（例えば、プラスチック）で実質的に構成される。
【００６７】
[0097]典型的には、収集部は、支持体の一端に位置する。いくつかの好ましい実施形態において、収集部は、収集されるべき試料の型に適した任意の形を示す。いくつかの実施形態において、支持体は、長手伸長部の２つの端の間の中間位置に本体自体を選択的に裂くのを容易にするための、中間にある弱くなった部分を提供することができる。この構造は、輸送又は輸送後の処理のために、収集部の容器への挿入を可能にする。
【００６８】
[0098]収集部は、一般的に、スワブとして適合する。いくつかの実施形態において、収集部は、分析されるべき生物学的試料（例えば、マイクロバイオーム試料）を収集するための、例えば、繊維の層を含む吸収性材料部分を含む。この型のいくつかの実施形態において、収集部は、本体の試料収集端に複数の繊維をフロック加工することによって、フロック加工されている。試料収集端にフロック加工された繊維は、親水性又は非親水性材料で作ることができるが、収集部は全体的な繊維構造の毛管効果によって親水性である。収集部は、典型的には、規則正しい配置を有する複数の繊維の実質的に連続的でかつ実質的に均一な層を含み、各繊維が、（流動性、半流動性、又は固体の試料を収集するのに適した）実質的に吸収性の材料、又は非吸収性材料で作られている。繊維は、支持体のあらゆる箇所において実質的に垂直であり、隣接する繊維と実質的に平行である。繊維は、規則正しい複数の毛管間隔で配置されているため、その中に、予め決定された量の試料、例えば、液体試料が、例えば吸水により、保持され得る。典型的には、先端部は、Ｓ字曲線に類似した円形形状に形作られる。フロック加工プロセスのため、繊維は、一般的に、均一の厚さの実質的に連続的な層として配置される。例えば、繊維は、典型的には、親水性を有し、フロック加工によって配置される。フロック加工された層を形成する繊維は、一般的に、配向様式で配置され、先端の表面に固定され、接着剤により保持される。用いられる任意の接着剤は、好ましくは、水性である：いったんそれが乾燥したならば、それは、繊維をスワブへと安定した方法で固定させ、かつ耐摩耗性にすることを可能にする。
【００６９】
[0099]フロック加工された収集部は、例えば、約５０μｇ〜約５００ｍｇの間、約１００μｇ〜約２５０ｍｇの間、約１５０μｇ〜２００ｍｇの間、又は約２００μｇ〜約４００μｇの間に含まれる試料の量を収集するように構成され、そのような寸法に形作られる。繊維は、実質的に規則正しい様式で、かつ収集部に実質的に連続的な層を形成するような様式で、支持体に配置することができ、及び／又は液体試料を毛管作用により吸着するように定められた複数の毛管間隔を規定するような様式で収集部に配置することができる。
【００７０】
[0100]いくつかの好ましい実施形態において、繊維数（すなわち、単一の繊維の直線１００メートルあたりのグラム重量）は、約１Ｄｔｅｘ〜１０Ｄｔｅｘの間、約１．７Ｄｔｅｘ〜３．３Ｄｔｅｘの間から選択され得、及び／又は繊維は、０．６ｍｍ〜３ｍｍの間に含まれる長さを示し得る。例えば、約０．６ｍｍの長さ及び１．７Ｄｔｅｘの繊維を適用して、フロック加工により、細かいけばを得ることができ、長さが３ｍｍ及び３．３Ｄｔｅｘまでの繊維を適用して、長いけばを得ることができる。繊維は、支持体の収集部上に、例えば、表面の１ｍｍ２あたり約５０本の繊維〜１ｍｍ２あたり約５００本の繊維の間、又は１ｍｍ２あたり約１００本の繊維〜１ｍｍ２あたり約２００本の繊維の間に含まれる表面密度で、フロック加工することにより配置され得る。
【００７１】
[0101]繊維の層は、例えば、支持体の表面の１ｍｍ２あたり少なくとも約０．５μＬ、又は１ｍｍ２あたり少なくとも約０．６μＬ、又は１ｍｍ２あたり少なくとも約０．７μＬ、又は１ｍｍ２あたり少なくとも約０．７５μＬの吸収能を規定することができる。
【００７２】
[0102]いくつかの実施形態において、繊維は、試料を収集するための使用の前に、例えば、試料収集器具の製造中に、表面活性剤で処理される。表面活性剤は、陽イオン性、陰イオン性、非イオン性、又は両性であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、表面活性剤は陽イオン性であり、例えば、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ又は塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウムすなわちＡＤＢＡＣ）である。あるいは、陽イオン性表面活性剤は、少なくとも、四級アンモニア基を有する炭素原子鎖によって構成される正部を有する塩であり得、及び／又は四級アンモニア塩であり得、又はアンモニア塩の混合物を含み得る。陽イオン性表面活性剤は、アルキルベンジルジメチルの塩化物の混合物であり得る。陽イオン性表面活性剤は、アルキルベンジルジメチルアンモニウムの塩化物の混合物であり得、前記アルキル基は、オクチル基（Ｃ８Ｈ１７−）からオクタデシル基（Ｃ１８Ｈ３７−）まで様々である。いくつかの代替の実施形態において、陽イオン性表面活性剤は、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ又は臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム）であり得る。さらなる代替の実施形態において、陽イオン性表面活性剤は、塩化ベンゼトニウム、塩化セタルコニウム、臭化ラウルトリモニウム（ｌａｕｒｔｒｉｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｎｅ）、臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム、セトリミド、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、又は塩化ステアラルコニウムであり得るが、それらに限定されない。
【００７３】
[0103]いくつかの他の実施形態において、収集部は、ウィキングペーパー（例えば、ＦＴＡカード）を含む。
【００７４】
[0104]典型的には、試料乾燥剤は、周囲（例えば、閉環境）から湿気を除去するように機能する、化学的組成物、有機組成物、又は無機組成物を含む。この型の実施形態の実例として、乾燥要素は、シリカゲルを含有する小袋、小さな包み、又は袋を含み得る。典型的には、試料乾燥剤は、容器内に、又は対象由来の試料を含む閉環境内の別の有用な場所内に、少なくとも部分的に収納される。いくつかの実施形態において、試料乾燥剤は、その環境から湿気を吸収する任意の化学的組成物を含む。いくつかの好ましい実施形態において、試料乾燥剤は、容器の密閉用キャップ又は栓内に収納され、容器の内部積部と流体連通する。
【００７５】
[0105]いくつかの実施形態において、試料採取キットは、１つ又は複数の試料を信頼できる様式で用意することにおいて遠隔の対象をガイドするために、試料前処理のいくつかの態様を実施する（例えば、対象の同意を以て、対象の同意なしの内密の様式で）ことにおいて遠隔の対象をガイドするために提供される使用説明書をさらに含む。例えば、試料の用意についての使用説明書は、以下のうちの少なくとも１つを含み得る：対象の身体の１組の収集部位のうちの１つ又は複数に特異的な使用説明書；対象により用意されることになっている試料の量に関する使用説明書；試料を用意するべき１日の（１つ又は複数の）回数に関連する使用説明書；試料用意の前及び間に避けるべきである行動に関連する使用説明書；試料用意の前及び／又は間に奨励される行動に関連する使用説明書；不適切に用意された試料の訂正に関する使用説明書；シーケンシング施設への送付前の試料の保管に関する使用説明書（例えば、試料を保管するべき温度範囲、試料容器の向きなどに関して）；試料の試料シーケンシング施設への送付に関する使用説明書；並びに試料用意に関係する任意の他の適切な使用説明書。使用説明書は、試料汚染を避けるための使用説明書を含み得る。この型のいくつかの実施形態において、使用説明書はまた、対象のマイクロバイオームを乱し得る、消毒薬、抗菌性石鹸及びローションとの接触、並びに行動に対する追加のアドバイスも含み得る。使用説明書はまた、（例えば、小荷物配達サービスを用いる）シーケンシング施設への送付前の収集された試料を含む試料容器の包装に関する使用説明書、及び不適切に使用した場合の応急処置の使用説明書も含み得る。
【００７６】
[0106]いくつかの実施形態において、試料収集器具は、マイクロバイオームから導かれた洞察を対象へ提供するように構成されたオンライン結果プラットフォーム内のユーザーアカウントの作成に関する使用説明書をさらに含む。そのような使用説明書は、対象が、オンライン結果プラットフォーム内にユーザーアカウントを設定することができるウェブサイトアドレスを提供することを含み得る。アドレスの提供は、メッセージングクライアント（例えば、テキストメッセージングクライアント、ｅメールメッセージングクライアントなど）を用いて、試料採取キット内に提供された文章に基づく使用説明書を用いて、機械解読可能なタグ（例えば、ＱＲコード、バーコード、近距離通信ＮＦＣデバイスに関連したアンテナ）を用いて、及び／又は任意の他の適切な様式で実施することができる。使用説明書は、アカウントセキュリティ（例えば、ユーザー名及びパスワードを提供することによる）に関する使用説明書、個人情報の提供に関する使用説明書、ユーザーアカウントを試料キットの識別面（例えば、登録ＩＤ）と関連づけることに関する使用説明書、及び任意の他の適切な使用説明書をさらに含み得る。ユーザーアカウントを設定することにおいて対象から必要とされる情報は、対象により直接、（例えば、対象に関連づけられた電子デバイスの入力デバイスを用いて）入力することができ、追加として又は代替として、対象に関連づけられた情報データベースにアクセスすることによって自動的に追加することができる。例として、ユーザーアカウントを設定することにおいて必要とされる情報は、対象からの許可を得ることで、対象に関連づけられた電子健康記録及び／又はソーシャルネットワークアカウント（例えば、Ｆａｃｅｂｏｏｋアカウント、ＬｉｎｋｅｄＩｎアカウント、Ｔｗｉｔｔｅｒアカウントなど）のアクセスによって追加することができる。
【００７７】
[0107]提供される任意の使用説明書は、以下のうちの１つ又は複数を含み得る：文章に基づく指示提供；画像に基づく指示提供；映像に基づく指示提供；音声に基づく指示提供；及び任意の他の適切な形の指示提供、接触／触覚に基づく指示提供。
【００７８】
[0108]好ましくは、試料収容のための試料採取キットの部分（例えば、試料容器）は、試料取り扱いネットワークへ返送されるように構成され、試料採取キットは、試料取り扱い施設への配達のための送料を含む又は含まない、梱包用入れ物（例えば、バブルメーラー、封筒、小包など）をさらに含み得る。その同じ実施形態及び他の実施形態のうちのいくつかにおいて、試料採取キットの部分は、試料取り扱い施設と特定的に関係がある宅配便サービスによりピックアップされる（例えば、対象からの試料がピックアップされる準備ができた時に連絡を取れるように設定された宅配便業者のスタッフを用いて）ように構成することができ、その対象は、試料の用意が完了したらすぐに、その宅配便サービスと連絡を取るように指示を与えられる。しかしながら、試料配達プロセスは、任意の他の適切な様式での試料採取キットにより容易にすることができる。
【００７９】
[0109]試料採取キットの識別標識は、以下のうちの１つ又は複数を含み得る：文字の登録コード（例えば、英数字）、生物学的識別子（例えば、特定の配列及び／又は特定の濃度を有する核酸マーカー）、機械可読タグ（例えば、ＱＲコード、バーコード、近距離通信デバイスを用いて検出可能なアンテナなど）、及び／又は任意の他の適切な識別子。試料採取キットの要素のバリエーションは、印刷物及び／若しくはデジタル的に記憶された情報（例えば、メモリに記憶された情報）を含み得、並びに／又はデジタル的に記憶された情報へのリンク、コード、若しくは参照（例えば、プログラム、ファイル、又はアプリケーションへのリンク）を含み得る。その同じ実施形態及び他の実施形態のうちのいくつかにおいて、試料採取キットは、対象に関連づけられた電子デバイスを通して、指示提供を容易にするように構成され得る。例として、試料採取キットのＱＲコードは、対象の電子デバイスを用いてスキャンすることができ、そのＱＲコードは、試料用意についての文章及び視覚による使用説明書を含むアドレスにリンクしている。その同じ実施形態及び他の実施形態のうちのいくつかにおいて、試料採取キットにおける印刷カードが、試料用意についての使用説明書が対象に提供されるウェブサイトを含み得る。いくつかの実施形態において、指示カードは、試料容器と一体である（すなわち、その部分を形成している）。
【００８０】
３．マイクロバイオーム試料の受け取り
[0110]ステップ１１０に示されているように、試料採取キットは、典型的には、個体へ提供される。好ましくは、試料採取キットは、核酸シーケンシング施設から遠隔の場所に位置する対象へ提供される。有利には、これは、対象がマイクロバイオーム試料を対象自身の自宅（又は他の遠隔場所）から取り得る便利な手段を提供する。試料採取キットの提供は、典型的には、試料採取キットの対象への配布を容易にする試料取り扱い施設によって実行される。したがって、試料取り扱い施設は、試料採取キットを、シーケンシング施設から遠隔である対象へ配布することができ、かつ対象由来の試料を含む試料収集容器を、処理及び分析のために返送することができるプラットフォームとして機能する。そのような実施形態は、有利であり、対象が、対象と、生物学的試料取り扱いのために訓練された人材が配属された臨床又は検査室ベースの中間施設との間の直接的な接触を必要とすることなく、試料を試料取り扱い施設へ直接、送ることを可能にする。いくつかの実施形態において、試料取り扱い施設及びシーケンシング施設は、同じ構成体、部門、及び／又はチームの部分である。例えば、試料取り扱い施設及びシーケンシング施設は、同一場所に位置し得る。他の実施形態において、試料取り扱い施設及びシーケンシング施設は、別々の構成体若しくは部門であり得、及び／又は異なる地理的場所に位置し得る。
【００８１】
[0111]試料採取キットを提供することは、好ましくは、シーケンシング施設に利用しやすい小荷物配達サービス（例えば、郵便サービス、運送サービス、郵送サービスなど）を用いて実施され、シーケンシング施設が、１つ又は複数の試料採取キットを１つ又は複数の対象へ小荷物配達サービスを通じて提供することができる。試料採取キットは、追加として又は代替として、シーケンシング施設と関係がある構成体を通して直接的に提供され得、その構成体もまた、対象からの試料受領を円滑にするように訓練されている。この型の実施形態において、その構成体は、試料採取キットの対象への提供を円滑にし、又は試料採取キットを通しての試料の対象からの受領を円滑にすることができる、臨床技師、検査技師、医療専門家（例えば、医師、看護師など）、栄養士、及び任意の他の適切な構成体から選択され得る。しかしながら、（１つ又は複数の）試料採取キットの（１つ又は複数の）対象への提供は、任意の他の適切な方法で実施することができる。
【００８２】
[0112]好ましくは、試料採取キットは、生物学的試料の対象からの侵襲的又は非侵襲的様式で収容を容易にするように構成される。いくつかの実施形態において、対象からの試料収容の非侵襲的様式は、本明細書における上記及び他の箇所に記載された試料収集器具の使用を含む。
【００８３】
[0113]対象から得られた生物学的試料は、少なくとも１つの微生物由来の核酸材料を含むマイクロバイオーム部分を含む。いくつかの実施形態において、対象由来の試料は、糞便試料、唾液試料、血液試料、皮膚試料、（例えば、無細胞ＤＮＡの抽出を可能にするために）血漿／血清試料、口腔試料、生殖器試料、鼻試料、眼試料、及び耳試料のうちの１つ又は複数を含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、試料は、腸マイクロバイオームに関連している。この型のいくつかの実施形態において、使用されたトイレットペーパーをスワブで拭き取って（例えば、スワブの色を変化させる、又はスワブを脱色させるのに十分な）少量の糞便を収集することによる試料用意についての使用説明書。したがって、いくつかの好ましい実施形態において、対象由来の試料は糞便試料である。
【００８４】
[0114]いくつかの実施形態において、試料は、別の構成体（例えば、対象と関係がある介護者、医療専門家、自動又は半自動試料収集装置など）による促しなしに、対象の身体から得ることができ、又は代替として、別の構成体の援助を受けて対象の身体から取得することができる。いくつかの例において、試料が、試料抽出プロセスにおいて別の構成体による促しなしに対象の身体から取得される場合、試料採取キットは、対象へ提供することができる。そのような例において、キットは、試料獲得のための１つ又は複数の試料収集器具、保管のために（１つ又は複数の）スワブを受け入れるように構成された１つ又は複数の容器、試料用意及びユーザーアカウントの設定についての使用説明書、（１つ又は複数の）試料を対象と関連づけるように形成された要素（例えば、バーコード識別子、タグなど）、並びに対象由来の（１つ又は複数の）試料が試料処理へ（例えば、郵便配達システムにより）配達されるのを可能にする入れ物を含み得る。別の例において、試料が、別の構成体の助けを受けてユーザーから抽出される場合、１つ又は複数の試料は、対象から臨床又は研究設定において（例えば、外来予約の間に）収集することができる。
【００８５】
[0115]いくつかの実施形態において、複数の試料が、１つ又は複数の対象から受け取られる。
【００８６】
[0116]典型的には、対象の収集部位からの試料を含む試料容器は、試料取り扱い施設で受け取られ、その施設は、対象及び／又は対象集団についてのマイクロバイオームに基づいた洞察が導かれ得るデータの作成を可能にするように機能する。上記で述べられているように、試料容器の受領は、小荷物配達サービス及び宅配便サービスのうちの１つ又は複数を用いて容易にされ得、又は代替として、試料容器に関連づけられた対象による試料取り扱い施設への試料容器の配達で直接的に可能にされ得る。好ましくは、試料取り扱い施設によって受け取られた試料は、試料容器に含まれる試料乾燥剤によって乾燥している。
【００８７】
[0117]いくつかの好ましい実施形態において、試料の集合セットは、試料取り扱い施設を通じて対象へ提供された試料採取キットの集合セットを用いて、幅広い種類の対象から受け取られる。好ましくは、幅広い種類の対象は、以下のうちの１つ又は複数の対象を含む：異なる人口統計学データ（例えば、ジェンダー、年齢、結婚歴、民族性、国籍、社会経済的地位、性的指向など）、異なる健康状態（例えば、健康及び病態（精神的健康状態を含む））、異なる生活状況（例えば、独り暮らし、ペットとの暮らし、パートナーとの暮らし、子どもとの暮らしなど）、異なる食習慣（例えば、雑食性、ベジタリアン、ビーガン、糖摂取量、酸摂取量、グルテン摂取量、乳糖なし、乳製品なしなど）、異なる行動傾向（例えば、身体活動のレベル、薬物使用、アルコール使用など）、異なるレベルの移動性（例えば、所定の期間内に移動した距離に関係した）、異なる投薬計画、及びマイクロバイオーム組成へ効果を生じる任意の他の適切な特質。そのようなものとして、対象の数が増加するにつれて、方法の次のブロックにおいて生み出される洞察力が、様々な対象の、対象のマイクロバイオームに基づいた特徴づけに関して増加する。その同じ実施形態及び他の実施形態のうちのいくつかにおいて、受け取られた試料は、人口統計学的特質、健康状態、生活状況、食習慣、行動傾向、移動性のレベル、及びマイクロバイオーム組成へ効果を生じる任意の他の適切な特質のうちの１つ又は複数における類似した対象のターゲット群から生物学的試料を受け取ることを含み得、その結果、方法の次のステップにおいて生み出される洞察は、対象の特定の群にターゲットされた洞察である。好ましくは、試料が受け取られる対象セットは、特定の研究訓練、臨床訓練、及び／又は検査訓練を受けていない対象を含み、その結果、試料はまた、試料を信頼できる様式で用意する方法を教えられている、非訓練対象を表す。
【００８８】
[0118]いくつかの他の実施形態において、試料を含む試料容器の受領は、対象からの試料抽出及び抽出された試料の試料シーケンシング施設への送付において訓練されたスタッフを有する検査室ベース又は臨床ベースの中間施設を用いて円滑にすることができる。しかしながら、試料の試料シーケンシング施設における受領は、任意の他の適切な様式で可能にされ得る。
【００８９】
４．試料処理及び核酸シーケンシング
[0119]本発明の方法は、一般的に、試料の微生物部分由来の核酸内容物をシーケンシングすることに基づいて、マイクロバイオーム配列データセットを作成するステップを含む。この関連において、受け取られた各試料は、対象のレベル及び／又は対象集団のレベルでのマイクロバイオーム組成面を決定するように処理される。マイクロバイオーム組成面は、微生物レベルでの組成面を含み得、その組成面には、門、綱、目、科、属、種、及び／又は株の異なる分類群に渡る微生物の分布に関するパラメータ（例えば、各群の総存在量、各群の相対的存在量、表現される群の総数などにおいて測定されるような）が挙げられる。その同じ実施形態及び他の実施形態のうちのいくつかにおいて、方法は、遺伝子レベルでの組成面を含み得る。したがって、そのようなシーケンシングの出力は、対象及び対象集団のマイクロバイオームを特徴づけるために用いることができる、関心目的となる特徴を同定するために用いることができ、その特徴は、微生物ベース（例えば、細菌の属の存在）、遺伝子ベース（例えば、特定の遺伝子領域及び／又は配列の表現に基づいた）、機能ベース（例えば、特定の遺伝子経路の表現に基づいた）であり得、及び／又は任意の他の適切な尺度に基づき得る。
【００９０】
[0120]試料に関連したマイクロバイオーム組成を特徴づけることは、一般的に、対象由来の試料に関連したマイクロバイオームを定量的及び／又は定性的に特徴づけるための、試料処理技術（例えば、湿式検査技術）及びコンピュータによる技術（例えば、バイオインフォマティクス）の組合せを含む。
【００９１】
[0121]いくつかの実施形態において、試料処理は、以下のうちの任意の１つ又は複数を含み得る：試料を溶解すること；細胞膜を破壊すること；望ましくない要素（例えば、タンパク質）の試料からの分離；対象のマイクロバイオームに由来した核酸材料及び対象の核酸材料を含む核酸試料を作製するための試料中の核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）の精製；核酸試料の核酸材料の増幅；並びに核酸試料の増幅された核酸のシーケンシング。
【００９２】
[0122]いくつかの実施形態において、試料を溶解する、及び／又は試料の細胞膜を破壊する方法には、好ましくは、細胞溶解／膜破壊の物理的方法（例えば、ビーズビーティング、窒素減圧、ホモジナイゼ−ション、超音波処理）が挙げられ、その物理的方法は、シーケンシングの際にある特定の微生物群の表現にバイアスを生じるある特定の試薬を省く。その同じ実施形態及び他の実施形態のうちのいくつかにおいて、膜を溶解又は破壊することは、化学的方法（例えば、界面活性剤を用いること、溶媒を用いること、表面活性剤を用いることなど）を含み得る。いくつかの実施形態において、望ましくない要素の試料からの分離は、ヌクレアーゼを用いる核酸の除去、及び／又はプロテアーゼを用いるタンパク質の除去を含み得る。バリエーションにおいて、核酸試料を作製するための試料中の核酸の精製は、以下のうちの１つ又は複数を含み得る：生物学的試料からの核酸の沈殿（例えば、アルコールベースの沈殿法を用いる）；液液ベースの精製技術（例えば、フェノールクロロホルム抽出）；クロマトグラフィーベースの精製技術（例えば、カラム吸着）；核酸を結合するように構成され、かつ（例えば、溶出溶液を有する、ｐＨシフトを与える、温度シフトを与えるなどの）溶出環境の存在下で核酸を放出するように構成された、結合性部分を結合した粒子の使用を含む精製技術（例えば、磁気ビーズ、浮揚性ビーズ、サイズ分布を有するビーズ、超音波応答性ビーズなど）；及び任意の他の適切な精製技術。いくつかの実施形態において、核酸単離及び／又は精製は、キアゲンＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡａｍｐ）キットを用いて実施される。
【００９３】
[0123]核酸ライブラリーにおいてまれな配列を濃縮するためのテクノロジー。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションによる低存在量配列を見出すこと（Ｆｉｎｄｉｎｇ  Ｌｏｗ  Ａｂｕｎｄａｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、すなわち「ＦＬＡＳＨ」と一般的に呼ばれる方法が、シーケンシング前に実施される。ＦＬＡＳＨ方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などの配列特異的ヌクレアーゼを用いて、シーケンシング前にＤＮＡライブラリー又は他の試料において関心目的となる特定の部位を切断する。そのような方法の一つの利点は、それが、低存在量配列についての濃縮を可能にすることである。ＦＬＡＳＨ方法は、全体として参照により本明細書に組み入れられている国際公開第２０１８／０３５０６２号に詳細に記載されている。
【００９４】
[0124]その同じ実施形態及び他の実施形態のうちのいくつかにおいて、核酸断片化は、当技術分野における標準技術（例えば、機械的断片化、酵素断片化）を用いて実施され得る。
【００９５】
[0125]バリエーションにおいて、核酸試料由来の核酸の増幅は、好ましくは、以下のうちの１つ又は複数を含む：ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＰＣＲ）に基づいた技術（例えば、固相ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、多重ＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ、ナノＰＣＲ、ネスティッドＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲなど）、ヘリカーゼ依存性増幅（ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＨＤＡ）、ループ介在等温増幅（ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＬＡＭＰ）、自家持続配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（３ＳＲ）、核酸配列に基づいた増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）、ローリングサークル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＲＣＡ）、リガーゼ鎖反応（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＬＣＲ）、及び任意の他の適切な増幅技術。精製された核酸の増幅において、用いられるプライマーは、増幅バイアスを防ぐ又は最小にするように選択され得、加えて、分類学的及び系統学的に情報価値がある核酸領域／配列を増幅するように構成され得る。したがって、増幅バイアスを回避するように構成されたユニバーサルプライマーを、増幅に用いることができる。その同じ実施形態及び他の実施形態のうちのいくつかにおいて、プライマーは、下記でさらに詳細に記載されているような、各生物学的試料に特異的なバーコード配列を組み入れ、そのことにより、増幅後の生物学的試料の同定を容易にすることができる。いくつかの実施形態に用いられるプライマーは、追加として又は代替として、相補的アダプターを含むシーケンシング技術（例えば、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）シーケンシング）と協同するように構成されたアダプター領域を含み得る。いくつかの実施形態において、用いられるプライマーは、追加として又は代替として、１つ又は複数の不安定な領域（例えば、変異を起こしやすい領域）に隣接する安定な核酸領域（例えば、保存領域）をターゲットするように構成され得る。しかしながら、増幅に用いられるプライマーは、任意の他の適切な代替様式で構成され得る。
【００９６】
[0126]いくつかの特定の実施形態において、試料由来の核酸の増幅及びシーケンシングには以下が挙げられる：オリゴアダプターを有する基質上での生物学的試料のＤＮＡ断片のブリッジ増幅を含む固相ＰＣＲであって、増幅が、フォワードインデックス配列（例えば、ＭｉＳｅｑ／ＨｉＳｅｑプラットフォームについてのイルミナフォワードインデックス配列に対応する）、フォワードバーコード配列、トランスポザーゼ配列（例えば、ＭｉＳｅｑ／ＨｉＳｅｑプラットフォームについてのトランスポザーゼ結合部位に対応する）、リンカー（例えば、均一性を低下させ、かつ配列結果を向上させるように構成されたゼロ塩基、１塩基、又は２塩基の断片）、追加のランダム塩基、定義済みの領域をターゲットするための配列、リバースインデックス配列（例えば、ＭｉＳｅｑ／ＨｉＳｅｑプラットフォームについてのイルミナリバースインデックスに対応する）、及びリバースバーコード配列を有するプライマーを含む。この型の例において、シーケンシング方法は、合成によるシーケンシング技術を用いるイルミナシーケンシング（例えば、ＨｉＳｅｑプラットフォームを用いた、及び／又はＭｉＳｅｑプラットフォームを用いた）を含む。
【００９７】
[0127]いくつかの実施形態において、核酸増幅は、等温増幅により実施される。その同じ実施形態のうちのいくつか及びいくつかの他の実施形態において、シーケンシングは、イルミナＮｏｖａＳｅｑプラットフォームを用いて実施される。
【００９８】
[0128]その同じ実施形態及び他の実施形態のうちのいくつかにおいて、試料中のＤＮＡ断片をランダムにシーケンシングする全ゲノムシーケンシング方法を用いることができる。
【００９９】
５．マイクロバイオーム特徴づけ
[0129]本発明の方法は、典型的には、処理システムのステップ、マイクロバイオーム配列データセットの各部分へのマッピング操作の実施に基づいて試料の微生物部分に表現される１組の核酸を同定することを含む。分析されていないマイクロバイオーム配列データの入力を、試料内の表現される微生物を特徴づける出力へ変換するようにコンピュータによる処理技術が実行される。したがって、出力は、対象のマイクロバイオーム内の微生物群の相対的分布、対象のマイクロバイオーム内の微生物群の存在量、対象のマイクロバイオーム内の表現される遺伝子マーカーに関するパラメータ、及び／又は下でさらに記載されているような、任意の他の適切なパラメータの値を導くために用いることができる。いくつかの実施形態において、コンピュータによる処理は以下のうちの任意の１つ又は複数を含み得る：（ヒト配列及び夾雑物に対立するものとして）微生物部分と関連した配列を同定すること、並びに微生物部分に関連した配列のアラインメント及びマッピング（例えば、シングルエンドアラインメント、ギャップなしアラインメント、ギャップありアラインメント、ペアリングのうちの１つ又は複数を用いる断片化配列のアラインメント）を実施すること。
【０１００】
[0130]微生物部分に関連した配列を同定することは、ヒトゲノム由来の配列を除去するために、試料処理からの配列データの、（例えば、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍにより提供された）ヒト参照ゲノムへのマッピングを含み得る。追加として、微生物部分に関連した配列を同定することは、（例えば、Ｑスレッド又はＰスレッド品質スコアの使用による）読み取りの品質フィルタリングを実施するように形成された処理システムのモジュールにおいて不明朗な及び／又は低品質の読み取りに関連した配列を捨てることを含み得、その結果、非ヒトで高品質の読み取り（例えば、Ｑスレッド又はＰスレッドスコアに関してある特定の品質スコア閾値より上の読み取り）のみが残る。しかしながら、微生物部分に関連した配列を同定することは、任意の他の適切な様式で実施することができる。
【０１０１】
[0131]その後、配列データのヒト参照ゲノムへのマッピング後に残る任意の同定されていない配列は、配列類似性及び／又は（例えば、ＶＡＭＰＳを用いる、ＭＧ−ＲＡＳＴを用いる、ＱＩＩＭＥデータベースを用いる）参照に基づいたアプローチに基づいた操作的分類単位（ＯＴＵ）へさらにクラスター形成され、他の読み取りとの重複に基づいてアセンブルされ、参照配列とアラインメントされ得る。アラインメントは、以下のうちの１つ又は複数を用いて、複数の相で実施することができる：シングルエンドアラインメント、ギャップなしアラインメント、ギャップありアラインメント、ペアードアラインメント（例えば、配列のフォワードとリバースのペアを用いる）、及び任意の他の適切な相のアラインメント。さらに、処理システムで実行されるアラインメントアルゴリズムは、配列長に基づいてアラインメント処理の効率を増加させるために、読み取り長の範囲の特定の読み取り長について構成することができる。アラインメントアルゴリズムは、大きな連続したシード及び／又は適応停止技術を有するハッシュアプローチを実行することができ、それにより、読み取りは、１組の読み取りアラインメント候補に渡る最良の読み取りアラインメントの決定、及び考慮される読み取りアラインメント候補の数に基づいてアラインメントされていると考えられる。アラインメントアルゴリズムは、追加として又は代替として、同じ長さの２つの文字列（例えば、参照読み取りと配列読み取り）間のいくらかのミスマッチを比較する文字列比較アルゴリズムを含み得る。さらに、いくつかの実施形態において、アラインメントアルゴリズムは、例えば、ＳＳＵアラインアルゴリズムを用いて、プロファイル確率文脈自由文法（例えば、共分散モデルを実行する）を用いることができる。任意の他の適切な型のアラインメントアルゴリズムを用いることができる。
【０１０２】
[0132]いくつかの実施形態において、（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより提供される）参照細菌ゲノムへのアラインメント及びマッピングは、２つの読み取り（例えば、シーケンシング読み取りと参照読み取り）のグローバルアラインメントを、グローバルアラインメントのスコアリング（例えば、挿入、欠失、マッチ、ミスマッチに関して）に基づいた停止条件で実施するアラインメントアルゴリズム；２つの読み取り（例えば、シーケンシング読み取りと参照読み取り）のローカルアラインメントを、２つの読み取り（例えば、シーケンシング読み取りと参照読み取り）のグローバルアラインメントのスコアリング、ローカルアラインメントのスコアリング（例えば、挿入、欠失、マッチ、ミスマッチに関して）で実施するスミス・ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズム；配列（例えば、シーケンシング読み取りと参照読み取り）間のローカル類似性の領域を同定するベーシックローカルアラインメント検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（ＢＬＡＳＴ）ＦＰＧＡ高速化アラインメントツール；ＢＷＡツールを用いたＢＷＴインデキシング；ＳＯＡＰツールを用いたＢＷＴインデキシング；Ｂｏｗｔｉｅツールを用いたＢＷＴインデキシング；ワークハッシュ及び動的計画法を用いて核酸シーケンシング読み取りをゲノム参照シーケンシングへマッピングする、ハッシュアルゴリズムによる配列検索アラインメント（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｂｙ  Ｈａｓｈｉｎｇ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）（ＳＳＡＨＡ２）；並びに任意の他の適切なアラインメントアルゴリズムを用いて実施することができる。同定されていない配列のマッピングは、対象のマイクロバイオームのウイルス及び／又は真菌成分をさらに同定するために、参照のウイルスゲノム、真菌ゲノム、及び／又は寄生虫ゲノムへのマッピングをさらに含み得る。さらに、重複読み取り（例えば、ペアエンドシーケンシングにより発生した）は、アラインメントアルゴリズムの出力に基づいてアセンブルすることができ、又はアラインメントされた配列読み取りを、（例えば、隠れマルコフモデルバンド技術を用いて、Ｄｕｒｂｉｎ−Ｈｏｌｍｅｓ技術を用いて）参照配列と合併させることができる。しかしながら、アラインメント及びマッピングは、任意の他の適切なアルゴリズム又は技術を実行することができる。
【０１０３】
[0133]しかしながら、コード化配列の参照配列へのマッピングは、任意の他の適切な様式で実施することができる。
【０１０４】
[0134]処理システムは、適切には、シーケンシング施設と直接通信する。いくつかの実施形態において、シーケンシング施設は、配列データを出力として、処理システムのモジュールへ提供するように構成することができる。その同じ実施形態のうちのいくつか及びいくつかの他の実施形態において、処理システムは、試料シーケンシング施設の出力からの入力を受信するように構成することができる。処理システムは、好ましくは、１つ又は複数のコンピューティングシステムにより実行され、その（１つ又は複数の）コンピューティングシステムは、少なくとも一部、クラウドにより及び／又は、コンピュータ可読命令を記憶するコンピュータ可読媒体を受けるように構成された機械（例えば、コンピューティング機械、サーバーなど）として、実行され得る。この型のいくつかの実施形態において、処理システムは、本明細書における上記及び／又は他の箇所に記載された方法のブロックを実施するための命令を含む、クラウドにより及び／又は機械として実行される、１つ又は複数の処理モジュールを含み得る。実例として、処理システムは、シーケンシング施設の出力に由来したデータを受信するように構成された第１のモジュール、上記のような第１のモジュールからのシーケンシングされたデータをアライメント及びマッピングするように構成された第２のモジュール、並びに下記のように、特徴を生成しかつ洞察を導くために、第２のモジュールの出力を受信するように構成された第３のモジュールを含み得る。
【０１０５】
[0135]試料同定。いくつかの実施形態において、試料を処理して、試料からマイクロバイオーム配列データセットを作成する開示された方法は、試料シーケンシング施設において受け取られた１組の試料に関連づけられる各試料内の又は各個体についての１つ又は複数の核酸インデックス配列を組み合わせる同定ステップを含む。したがって、インデックス配列の使用は、特定の個体に関連した試料の同定を可能にし、試料の汚染（例えば、相互汚染）の検出を可能にし、多重様式で処理される試料において所定の配列と関連した読み取りの定量化を促進するように機能することができる。
【０１０６】
[0136]上記で述べられているように、インデックス配列は、増幅プロセス中に実行されたプライマーと関連づけることができ、又は別な方法で、任意の他の適切な様式で試料と組み合わせることができる。
６．マイクロバイオーム洞察
[0137]本出願の方法に一般的に適用される別のステップには、試料の微生物部分に関係した１組の特徴に基づいて分析を生成することが挙げられる。そのような分析は、典型的には、出力を、アルゴリズム的に処理され得る特徴へ変換して、対象レベル及び対象集団レベルにおいてマイクロバイオームに基づいた洞察を決定するように機能する。これは、試料に関連したマイクロバイオームの組成面から導かれた特徴に基づいて分析を生成することを含み得る。
【０１０７】
[0138]上記のマッピング及びアラインメント操作に基づいた、試料に関連したマイクロバイオームの表現される微生物群の同定により、試料に関連したマイクロバイオームの組成面から導かれる特徴を生成することが実施され得る。いくつかの実施形態において、特徴を生成することは、微生物のある特定の分類群の存在若しくは非存在、及び／又は特定の微生物種若しくは株の相対的存在量を記載する特徴を生成することを含み得る。その同じ実施形態及び他の実施形態のうちのいくつかにおいて、特徴を生成することは、アラインメントされ、マッピングされ、及び／又は合併された読み取りに関連した系統的形質を推論することを含み得、その推論することは、微生物の参照系統樹における配列の配置を決定することを含み得る。その同じ実施形態及び他の実施形態のうちのいくつかにおいて、特徴を生成することは、表現された分類群の量を記載する特徴を生成することを含み得る。追加として又は代替として、特徴を生成することは、異なる微生物群の多様性及び異なる微生物群の相対的存在量を記載する特徴を生成することを含み得る。特徴を生成することは、例として、配列類似性データを用いて、１つ又は複数の微生物群の相対的存在量の最大尤度推定を実施するゲノム相対的存在量及び平均サイズ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ａｎｄ  Ａｖｅｒａｇｅ  ｓｉｚｅ）（ＧＡＡＳ）アプローチ及び／又は混合モデル理論を用いるゲノム相対的存在量（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ｕｓｉｎｇ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｔｈｅｏｒｙ）（ＧＲＡＭＭｙ）アプローチを用いて、異なる微生物群の多様性及び異なる微生物群の相対的存在量及び異なる微生物群の相対的存在量を記載する特徴を生成することを含み得る。その同じ実施形態及び他の実施形態のうちのいくつかにおいて、特徴を生成することは、存在量評価基準から導かれるような、分類学的変動の統計的測定値を生成することを含み得る。追加として又は代替として、特徴を生成することは、単独での及び／又は組合せでの、１つ又は複数の分類群の存在を記載する定性的特徴の生成を含み得る。追加として又は代替として、特徴を生成することは、生物学的試料に関連したマイクロバイオームの微生物を特徴づける遺伝子マーカーに関係した特徴の生成を含み得る。
【０１０８】
[0139]その同じ実施形態のうちのいくつか及びいくつかの代替の実施形態において、特徴を生成することは、特定の代謝機能又は一群の代謝機能を実施する微生物又は微生物群落の潜在能力に関する存在量情報の定量化を含み得る。存在量情報は、他の微生物と相対的、又は他の微生物群落と相対的であり得る。
【０１０９】
７．補足情報
[0140]特徴生成により、特徴の生成に基づいて分析を生成することが実施され得る。分析を生成することにおいて、分析に含まれる相関及び／又は予測を増強し得る補足データが実行され得る。したがって、いくつかの実施形態において、方法は、対象及び対象集団のうちの少なくとも１つからの人口統計学情報及び行動情報を含む補足データセットを受け取ることをさらに含む。補足データセットは、好ましくは、調査由来データを含む。しかしながら、この型のいくつかの実施形態において、補足データは、追加として又は代替として、以下のうちの任意の１つ又は複数を含む：センサーから引き出された状況データ、医学的データ、及び任意の他の適切な型のデータ（例えば、血液試験、代謝分析、ヒトＤＮＡ試験など）。
【０１１０】
[0141]いくつかの実施形態において、補足データの受領は、調査由来データの受領を含む。好ましくは、調査由来データは、好ましくは、対象に関連した生理学的データ、人口統計学データ、及び行動情報を提供する。生理学的情報は、生理学的特徴（例えば、身長、体重、体格指数、体脂肪率、体毛レベルなど）に関係した情報を含み得る。人口統計学情報は、人口統計学的特徴（例えば、ジェンダー、年齢、民族性、結婚歴、兄弟姉妹の数、社会経済的地位、性的指向など）に関係した情報を含み得る。行動情報は、以下のうちの１つ又複数に関係した情報を含み得る：健康状態（例えば、非限定的に精神的健康状態を含む、健康及び病態）；生活状況（例えば、独り暮らし、ペットとの暮らし；パートナーとの暮らし；子どもとの暮らしなど）；食習慣（例えば、雑食性、ベジタリアン、ビーガン、糖摂取量、酸摂取量、食物繊維摂取量、脂肪摂取量など）；行動傾向（例えば、運動のレベル、薬物使用、アルコール使用など）；異なるレベルの移動性（例えば、所定の期間内に移動した距離に関係した）；異なるレベルの性的行為（例えば、パートナーの数及び性的指向に関係した）；及び任意の他の適切な行動情報。一例において、補足データセットの作成を促進するように構成された調査は、対象の身長、対象の体重、対象の食事、対象のアルコール摂取量、及びダイエット飲料摂取量に関係した質問を含む。したがって、調査由来データは、定量的データ及び／又は（例えば、重症度の尺度、定性的応答の定量化スコアへのマッピングなどを用いた）定性的データを含み得る。
【０１１１】
[0142]調査由来データの受領を促進することにおいて、対象又は対象に関連した構成体（例えば、医療提供者、介護者、配偶者、親戚など）へ１つ又は複数の調査を提供することを含み得る。調査データは、対面で（例えば、試料提供及び対象からの受領と連携して）、電子的に（例えば、対象によるアカウント設定の間、対象の電子デバイスにおいて実行されたアプリケーションにおいて）、及び／又は任意の他の適切な様式で、提供され得る。
【０１１２】
[0143]その同じ実施形態及び他の実施形態のうちのいくつかにおいて、補足データセットの一部分は、対象に関連したセンサー（例えば、ウェアラブルコンピューティングデバイスにおけるセンサー、モバイルデバイスにおけるセンサー、ユーザーに関連づけられたバイオメトリックセンサーなど）から引き出され得る。このデータの提供は、以下のうちの１つ又は複数を受け取ることを含み得る：身体的活動又は身体的行為に関連したデータ（例えば、対象のモバイルデバイス又はウェアラブル電子デバイスからの加速度計及びジャイロスコープのデータ）；環境データ（例えば、温度データ、標高データ、気候データ、光パラメータデータなど）；患者栄養又は食事関連のデータ（例えば、食料品店チェックインからのデータ、分光光度分析からのデータなど）；バイオメトリックデータ（例えば、患者のモバイルコンピューティングデバイス内のセンサーを通して記録されたデータ、患者のモバイルコンピューティングデバイスと通信するウェアラブル又は他の周辺デバイスを通して記録されたデータ、位置エリア（例えば、ＧＰＳ要素を用いる）；及び任意の他の適切なデータ。その同じ実施形態及び他の実施形態のうちのいくつかにおいて、特徴（又は特徴から導かれたパラメータの値）と補足データセット由来の情報との間の関連づけの生成、マイクロバイオームに基づいた特徴（又は特徴から導かれたパラメータの値）と、補足データに由来した行動の又は人口統計学的な特徴づけとの間の相関強度の信頼度評価基準又は尺度の生成、及び任意の他の適切な洞察。いくつかの実施形態において、分析の一部分は、対象のマイクロバイオーム組成に基づいて（例えば、行動特質に関して、医学的状態に関して、人口統計学的特質に関して）、対象を特徴づけることができる、並びに／又は対象のマイクロバイオーム組成を予測することができる、並びに／又は対象の行動特質、医学的状態、人口統計学的特質、及び任意の他の適切な特質のうちの１つ若しくは複数に基づいて対象のマイクロバイオーム組成を予測することができる診断ツールを支持する、又は提供することができる。
【０１１３】
[0144]分析の一部分は、機械学習に基づいた技術から導くことができ、それにより、生成された特徴に由来した入力データは、分類モデルを与えるように（例えば、補足データセットに由来した）候補分類とリンクされた特徴、マイクロバイオームに基づいた特徴（又は特徴から導かれたパラメータの値）、及び補足データセットに由来した行動上の若しくは人口統計学的特性、並びに／又は任意の他の適切な洞察を有する訓練データセットを用いて処理することができる。いくつかの実施形態において、分析の一部分は、対象のマイクロバイオーム組成に基づいて（例えば、行動特質に関して、医学的状態に関して、人口統計学的特質に関してなど）、対象を特徴づけ、並びに／又は対象のマイクロバイオーム組成を、対象の行動特質、医学的状態、人口統計学的特質、及び任意の他の適切な特質のうちの１つ若しくは複数に基づいて予測することができる、診断ツールを支持する、又は提供することができる。
【０１１４】
[0145]分析の一部分は、機械学習に基づいた技術から導くことができ、それにより、生成された特徴に由来した入力データは、マイクロバイオームに基づいた特徴を対象の他の特性とリンクさせる分類モデルを与えるために、（例えば、補足データセットから導かれた）候補分類とリンクされた特徴を有する訓練データセットを用いて処理することができる。いくつかの実施形態において、分類モデルは、対象の分類を正確に予測することにおける高度（又は低度）の予測力を有するマイクロバイオームに基づいた特徴及び／又は特徴組合せを同定するように訓練することができる。そのようなものとして、訓練データセットでの分類モデルの緻密化は、対象の特定の分類と高い相関を有する（例えば、個体の特徴の、特徴の組合せの）特徴セットを同定する。
【０１１５】
[0146]特徴選択アプローチには、相関特徴選択（ＣＦＳ）方法、一貫性方法、軽減方法、情報利得方法、対称不確実性方法、及び／又は特徴選択の任意の他の適切な方法が挙げられ得る。一つのバリエーションにおいて、特徴ベクトルは、以下のうちの１つ又は複数に関係した特徴を含み得る：（例えば、分類群に渡る分布に関する、細菌、ウイルス、及び／又は真菌群に渡る分布に関する）マイクロバイオーム多様性評価基準、ある者のマイクロバイオームにおける分類群の存在、ある者のマイクロバイオームにおける特定の遺伝子配列の表現、（例えば、補足データセットから決定された撹乱に応答した）マイクロバイオーム回復力評価基準、並びにマイクロバイオーム多様性データセット及び／又は補足データセットに由来した任意の他の適切な特徴。追加として、特徴の組合せは、特徴ベクトルに用いることができ、その場合、特徴は、群であり得、及び／又は特徴セットの一部として組み合わされた特徴を提供することにおいて重みづけされ得る。
【０１１６】
[0147]いくつかの実施形態において、分類分子の生成は、機械学習分類器を用いて実施され、分類モデルは、バギング（すなわち、ブートストラップアグリゲーション）と訓練データセットからの特徴のランダムセットの選択を組み合わせて、特徴のランダムセットに関連づけられた１組の決定木、Ｔを構築する、ランダムフォレスト予測器（ＲＦＰ）アルゴリズムにより生成され、かつ訓練され得る。ランダムフォレストアルゴリズムを用いることにおいて、決定木のサブセットを作成する代わりに決定木のセット由来のＮ個の事例がランダムにサンプリングされて、各ノードについて、ｍ個の予測特徴が、評価のために予測特徴の全部から選択される。（例えば、目的関数により）ノードにおける最良の分割を提供する予測特徴を用いて、その分割を（例えば、ノードにおける二分岐として、ノードにおける三分岐として）実施する。大きなデータセットから何度もサンプリングすることにより、分類を予測する際に強い特徴を同定することにおける、分類分子の強さが、実質的に増加され得る。この実施形態において、バイアス（例えば、サンプリングバイアス）を防ぐ、及び／又はバイアスの量を説明するためのマニュレ（ｍａｎｕｒｅ）が、モデルのロバストを増加させるために、処理中に含まれ得る。
【０１１７】
[0148]機械学習のランダムフォレスト方法は上記のバリエーションにおいて記載されているが、任意の他の適切な機械学習アルゴリズムも、分類モデルを形成及び／又は訓練することにおいて同等に適用可能である。いくつかの実施形態において、（１つ又は複数の）機械学習アルゴリズムは、以下のうちの任意の１つ又は複数を含む学習スタイルによって特徴づけることができる：教師あり学習（例えば、ロジスティック回帰を用いる、誤差逆伝搬ニューラルネットワークを用いる）、教師なし学習（例えば、アプリオリ（Ａｐｒｉｏｒｉ）アルゴリズムを用いる、Ｋ平均クラスタリングを用いる）、半教師あり学習、強化学習（例えば、Ｑ学習アルゴリズムを用いる、時間差学習を用いる）、及び任意の他の適切な学習スタイル。さらに、機械学習アルゴリズムは、以下のうちの任意の１つ又は複数を実行することができる：回帰アルゴリズム（例えば、普通の最小二乗法、ロジスティック回帰、段階的回帰、多変量適応的回帰スプライン、局所推定散布図平滑化（ｌｏｃａｌｌｙ  ｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｓｃａｔｔｅｒｐｌｏｔ  ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ）など）、例に基づいた方法（例えば、ｋ最近傍（ｋ−ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ）、学習ベクトル量子化、自己組織化マップなど）、正則化法（例えば、リッジ回帰、最小絶対縮小（ｌｅａｓｔ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｓｈｒｉｎｋａｇｅ）及び選択演算子（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｐｅｒａｔｏｒ）、弾性ネット（ｅｌａｓｔｉｃ  ｎｅｔ）など）、決定木学習法（例えば、分類木及び回帰木、反復二分３（ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｃｈｏｔｏｍｉｓｅｒ  ３）、Ｃ４．５、カイ二乗自動相互作用検出（ｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅｄ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）、決定株、ランダムフォレスト、多変量適応的回帰スプライン、勾配ブースティング機械など）、ベイズ法（例えば、ナイーブベイズ、ＡＯＤＥ（ａｖｅｒａｇｅｓ  ｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｅｓｔｉｍａｔｏｒｓ）、ベイジアンビリーブフットワーク（Ｂａｙｅｓｉａｎ  ｂｅｌｉｅｖｅ  ｆｏｏｔｗｏｒｋ）など）、カーネル法（例えば、サポートベクターマシン、放射基底関数、線形判別分析など）、クラスタリング法（例えば、ｋ平均クラスタリング、期待値最大化など）、相関ルール学習アルゴリズムなど）、人工ニューラルネットワークモデル（例えば、パーセプトロン法、バックプロパゲーション法、ホップフィールドネットワーク法、自己組織化マップ法、学習ベクトル量子化法など）、深層学習アルゴリズム（例えば、制限ボルツマンマシン；ディープビリーブネットワーク法（ｄｅｅｐ  ｂｅｌｉｅｖｅ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｍｅｔｈｏｄ）、畳み込みネットワーク法、スタックドオートエンコーダ法（ｓｔａｃｋｅｄ  ａｕｔｏ−ｅｎｃｏｄｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）など）、次元削減法（例えば、主成分分析、部分最小二乗回帰、サモンマッピング（Ｓａｍｍｏｎ  ｍａｐｐｉｎｇ）、多次元尺度構成法、射影追跡など）、アンサンブル法（例えば、ブースティング、ブートストラップアグリゲーション、アダブースト（ＡｄａＢｏｏｓｔ）、スタッキング（ｓｔａｃｋｅｄ  ｇｅｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）、勾配ブースティングマシン法（ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ｍａｃｈｉｎｅ  ｍｅｔｈｏｄ）、ランダムフォレスト法など）、及び任意の適切な型の機械学習アルゴリズム（それらのいくつかの型は、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｍａｒｋｅｒｓ」という名称で２０１４年５月１４日に出願された米国特許出願第６１／９５３，６８３号に記載されている）。
【０１１８】
[0149]その同じ実施形態及び他の実施形態のうちのいくつかにおいて、分析の一部分は、以下のうちの１つ又は複数を含む統計的方法及びツールを用いて生成され得る：基礎統計学、散布図分析、主成分分析（ＰＣＡ）、エッジ（ｅｄｇｅ）ＰＣＴ、（例えば、同定された微生物群落間の距離を、系統学的情報を用いて計算するための）ＵｎｉＦｒａｃ分析、多変量分析、分散分析、クラスター分析、Ｋａｎｔｏｒｏｖｉｃｈ−Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ評価基準、及び任意の他の適切な統計的方法。
【０１１９】
[0150]本発明の方法はまた、パラメータセットの値から導かれた情報を対象へ送信するステップを含み、そのステップは、本明細書における上記及び他の箇所に記載された分析から導かれた洞察を１つ又は複数の対象と共有するように機能する。情報を対象へ送信することは、情報が、対象の電子デバイス（例えば、パーソナルコンピュータ、スマートフォン、頭部装用型ウェアラブルコンピューティングデバイス、手首装用型ウェアラブルコンピューティングデバイス、タブレット、ラップトップ、ノートブックなど）でアクセス可能であるように、上記のように設定された対象についてのユーザーアカウントを通して容易にすることができる。追加として又は代替として、情報は、印刷された報告書、電子文書（例えば、ＰＤＦ）の形で、生データとして、及び／又は任意の他の適切な形で、対象へ提供され得る。
【０１２０】
[0151]いくつかの実施形態において、情報は、以下のうちの１つ又は複数を示し得る：対象のマイクロバイオームにおける１つ又は複数の微生物の存在、対象のマイクロバイオームにおける１つ又は複数の微生物の非存在；対象のマイクロバイオームにおける１つ又は複数の微生物の存在量（例えば、相対的存在量又は絶対的存在量）；及び任意の生理学的分類、人口統計学的分類、又は行動分類に基づいた１つ又は複数の対象亜集団又は対象集団に対する、ある対象のマイクロバイオーム組成の比較。情報は、適切には、平均範囲、典型的範囲、又は健康な範囲に照らして、提供され得る。いくつかの実施形態において、対象に提供される情報は、対象集団からの、示された型の微生物の量の平均範囲及び示された型の微生物についての量の全範囲を参照して、対象由来の試料に存在する、示された型の微生物の量を描写することができる。
【０１２１】
[0152]提供される情報は、異なる使用レベルへ組織化することができ、各ユーザーレベルは、異なるデータ、分析、及び／又は他のツールにアクセスできる。例として、ユーザーレベルは、専門的職業（例えば、科学者、研究者、臨床医、医療提供者など）、立場（例えば、消費者、患者）、及びユーザーレベルの任意の他の分類のうちの１つ又は複数に従って組織化することができる。例えば、例として、科学者／研究者は、調査又は研究データをアップロードし、調査又は研究データを他の調査又は研究データと比較し、異なる対象亜集団からの調査又は研究データを比較し、及び予備的研究の結果からより大きい研究の結果を予測することを許可され得る。別の例において、臨床医は、患者情報を見ることを許可され得、患者は臨床医と情報を共有することを許可され得る。
【０１２２】
[0153]情報は、分類学的データ（例えば、ドメイン、界、門、綱、目、科、属、種、亜種、及び／又は株の関係を示すグラフィックス及び／又は表）についての視覚化ツール、系統樹、分岐図、樹状図、円グラフ、棒グラフ、散布図、ツリープロット（ｔｒｅｅｐｌｏｔ）、及び任意の他の適切な視覚化ツールを用いて、電子ディスプレイに提供され（例えば、電子報告書、印刷された報告書などにおいて）、又はレンダリングされ得る。さらに、ユーザーアカウントと関連づけられたユーザーインターフェースは、対象へ提供される詳細のレベルを調整するための、対象に提供される比較情報の型を調整するための、及び／又は対象に提供される情報に関する任意の他の適切なパラメータを調整するための制御手段を提供し得る。
【０１２３】
[0154]提供される情報は、以下のうちの１つ又は複数を含む（しかし、それらに限定されない）任意の適切な形でディスプレイにレンダリングされ得る：散布図、ネットワークチャート、円グラフ、表、ツリーマップ、１つ又は複数の対象亜集団と比較した対象のマイクロバイオーム組成特徴の１組比較図、及び１つ又は複数の対象亜集団と比較した対象のマイクロバイオーム組成特徴の１組の比較マトリックス。一例において、グラフ表示は、対象由来の試料についてのマイクロバイオーム組成情報を示すチャートを、表示されたマイクロバイオーム成分を説明するレジェンドと共に、レンダリングすることを含み得る。別の例において、グラフ表示は、分類学的レベル（例えば、属レベル）において、対象由来の１つの試料のマイクロバイオーム組成を、対象から提供された全試料の平均と、又は対象集団から提供された全試料の平均値と比較する１組のチャートを、対象が、対象によるユーザーインターフェースでの入力の受信により、他の分類学的レベル（例えば、ドメインレベル、門レベル、綱レベル、目レベル、科レベル、属レベル、種レベル、亜種レベル）での情報を受信することを可能にするユーザーインターフェースと協調して、レンダリングすることを含み得る。さらに別の例において、グラフ表示は、対象由来の試料のマイクロバイオーム組成を、健康な雑食動物の亜集団についての平均マイクロバイオーム組成、ベジタリアンの亜集団についての平均マイクロバイオーム組成、及び分析された全対象集団についての平均マイクロバイオーム組成と比較することを含み得る。
【０１２４】
８．最良方法
[0155]いくつかの実施形態において、本発明の方法は、対象が試料採取キットを受け取る１１０、対象が試料採取キットとやり取りする１１５、及び試料採取キットのコンポーネントを用いることにより分析のために試料を提供する、ワークフロー１００を含む。そのワークフローにおいて、対象由来の（１つ又は複数の）試料が受け取られ１２０、処理され１３０、分析され１４０、対象へ情報を提供するために用いられる１６０。
【０１２５】
[0156]対象は、試料採取キットを受け取り１１０、１つ又は複数の収集部位からの１つ又は複数の試料を試料採取キットの試料容器へ入れ１１５、試料採取キットに含まれる梱包用入れ物を用いて試料取り扱い施設へ前記試料容器を返送する１２０。試料採取キット及び（１つ又は複数の）試料収集容器と関連づけられた登録コード（例えば、バーコード）が、追跡のために、試料取り扱い施設で記録される。その後、対象由来の試料は、シーケンシング設備及び処理システムを実行する自動試料取り扱いワークフローへ導入され、前記試料由来の核酸が、精製、増幅、タグ付け、及びシーケンシングされる１４０。その後、シーケンシングされた核酸から導かれたデータは、識別子（例えば、インデックス配列、タグなど）に基づいて試料と関連づけられ、マイクロバイオーム情報を導くように分析される１５０。その後、対象のマイクロバイオームに関する情報は、グラフ、チャート、及び対象由来の各試料のマイクロバイオームと、関連した対象亜集団、関連した評価基準範囲、及び／又は関連したマイクロバイオームに基づいた研究との比較のレンダリングを提供する対話型ウェブサイトを通して対象へ提示される１６０。
【０１２６】
[0157]実施形態の方法及び／又はシステムは、少なくとも一部、コンピュータ可読命令を記憶するコンピュータ可読媒体を受けるように構成された機械として、具現化及び／又は実行され得る。命令は、アプリケーション、アプレット、ホスト、サーバー、ネットワーク、ウェブサイト、通信サービス、通信インターフェース、患者のハードウェア／ファームウェア／ソフトウェア要素、又はコンピュータ若しくはモバイルデバイス、又はそれらの任意の適切な組合せと統合されたコンピュータ実行可能コンポーネントにより実行され得る。実施形態の他のシステム及び方法は、少なくとも一部、コンピュータ可読命令を記憶するコンピュータ可読媒体を受けるように構成された機械として、具現化及び／又は実行され得る。命令は、上記の型の装置及びネットワークと統合されたコンピュータ実行可能コンポーネントにより統合されたコンピュータ実行可能コンポーネントにより実行され得る。コンピュータ可読媒体は、任意の適切なコンピュータ可読媒体、例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュメモリ、ＥＥＰＲＯＭ、光ディスク（ＣＤ又はＤＶＤ）、ハードドライブ、フロッピードライブ、又は任意の適切なデバイスに記憶され得る。コンピュータ実行可能コンポーネントは、プロセッサであり得るが、任意の適切な専用ハードウェアデバイスが、代替として又は追加として、命令を実行することができる。
【０１２７】
[0158]その同じ実施形態及び他の実施形態のうちのいくつかにおいて、方法は、ハイブリダイゼーションによる大量配列の除去（Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｂｕｎｄａｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（「ＤＡＳＨ」）の追加のステップを含む。この型の実施形態において、シーケンシングライブラリーは、切断のために望ましくない種をターゲットするガイドＲＮＡのライブラリーと複合体化された組換えＣａｓ９タンパク質を用いて「ＤＡＳＨ」され得、したがって、その望ましくない種がシーケンシングスペースを消費することを防ぐ。本発明の方法に用いることができる適切なＤＡＳＨ方法は、当技術分野において記載されており、全体として参照により本明細書に組み入れられている米国特許出願公開第２０１８／００５１３２０号に含まれている。
【実施例】
【０１２８】
実施例１
安定化技術内群落多様性（INTRA-STABILIZATION OFCOMMUNITY DIVERSITY）
[0159]提案された試料収集器具及び抽出方法の試料安定化性質を評価するために、本発明者らは、一般的に用いられる試料安定化技術及び遠隔試料検査製品に関する比較研究を実施した。
【０１２９】
[0160]５つの対象由来のレプリケート試料を、以下の６つの試料安定化技術で４週間保存した後、シーケンシングした：
溶解／処理バッファーなしで、かつ活性乾燥システムを有するスワブ（「乾燥スワブ（Ｄｒｙ  Ｓｗａｂ）」）；
ＢＢＬ培養スワブＥＺ（ＢＢＬ  ＣｕｌｔｕｒｅＳｗａｂ  ＥＺ）（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）；
ＯＭＮＩ遺伝子−腸（ＯＭＮＩｇｅｎｅ−ＧＵＴ）（ＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｅｋ）；
ＲＮＡｌａｔｅｒ安定化溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；
ライフガード保存溶液（ＬｉｆｅＧｕａｒｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｑｉａｇｅｎ）；及び
ＤＮＡ／ＲＮＡシールド（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
【０１３０】
[0161]各対象由来の試料をまた、対照の時間ゼロのベースラインとしてすぐに凍結させた。質の悪い読み取り及びヒト関連読み取りを除去し、かつ７百万個のペアへサブサンプリングした後、マイクロバ群落プロファイラー（Ｍｉｃｒｏｂａ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ）（ＭＣＰ  ｖ１）データ処理を用いて、全ての試料についての種プロファイルを取得した。その後、これらのプロファイルを比較して、上記で列挙された安定化条件のそれぞれについての群落安定性を決定した。
【０１３１】
[0162]全試料の概要は、ヘリンガー変換された種プロファイルの主成分分析プロットとして提供されている（図２）。対象２と４の間に明確な分離はないが、試料は、対象によりかなりクラスター形成している。驚くべきことに、異なるスワブ安定化技術が、種プロファイルへ著しい影響を生じている。とりわけ、対象２由来のＢＢＬスワブ試料は異常値であるように見える。
【０１３２】
[0163]６つのレプリケートに渡って平均化された種プロファイルを、各対象及び安定化技術について決定した（図３）。ベースライン「凍結」試料と比べての実質的な異常発生が顕著である。ベースライン試料において観察されていない、ＢＢＬスワブ試料における非常に大量の集団は、対象１〜４についての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、及び対象５についてのエシェリキアｓｐ２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐ２）である。
【０１３３】
[0164]個々の種プロファイルは、レプリケート間で妥当な変動性を示している（図４及び５）。ある場合には、レプリケート間に実質的な変動性を観察することができる。特に、ＢＢＬスワブ試料について観察された大腸菌異常値は、全てのレプリケートに存在するわけではない。
【０１３４】
[0165]β多様性を、以下の分析を用いて測定した：
ブレイ・カーチス（Ｂｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ）  個々の種の存在量を考慮する；
ハミング（Ｈａｍｍｉｎｇ）及びソーレンセン（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ）  種の存在／非存在のみを考慮する。ハミング距離は、２つの試料の間で異なる種の数である。
【０１３５】
ソーレンセンは、どれくらいの数の種が２つの試料に含有されるのかについて説明するためにハミング距離を正規化する。
【０１３６】
[0166]特定の安定化技術を用いた全試料についての集計された結果は図６に示されている。個体ごとに分割された結果は、図７に示されている。
【０１３７】
[0167]ＢＢＬ培養スワブ技術で得られた群落プロファイルは、いくつかの個体について（図７）の極めて高い多様性（図６）を示している。各参加者由来の試料が一般的に一緒にクラスター形成しているため、これが試料標識問題のせいではないことを試料の試験は確認している。
【０１３８】
実施例２
安定化技術間群落多様性（INTER-STABILIZATION COMMUNITYDIVERSITY）
[0168]  上記で示されているように、溶解／処理薬剤／バッファーを含まず、むしろ活性乾燥剤を含むスワブの性能を確証した後、本発明者らは、異なる安定化技術下での種プロファイルと、時間ゼロに得られた種プロファイルとの間の比較研究を実施した（図８及び９参照）。驚くべきことに、これらの結果は、乾燥スワブを用いることが、時間ゼロで得られたものと最も近い種プロファイルを生じることを示唆している（図８参照）。
【０１３９】
材料及び方法
[0169]５人の参加者は、１０グラム（ｇ）より多い糞便試料を提供した。各試料をホモジナイズし、以下の安定化技術の間で等しく分けた（３連で）：
急速凍結；
ＲＮＡレイター（ＲＮＡ  Ｌａｔｅｒ）（０．５ｇ試料は、約２．５ｍＬのＲＮＡレイター溶液を必要とする）；
ライフガード（ＬｉｆｅＧｕａｒｄ）（Ｑｉａｇｅｎ）（１グラムあたりライフガード土壌保存溶液（ＬｉｆｅＧｕａｒｄ  Ｓｏｉｌ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）の２〜２．５体積）。
【０１４０】
[0170]試料を、シーケンシングされる前に４週間、保存した。
【０１４１】
[0171]対象から収集された大便試料を作製し、すぐに試料処理へ進めた。
【０１４２】
[0172]全大便試料の少なくとも１０ｇを、滅菌容器に保存し、滅菌スパチュラで２分間、撹拌することによりホモジナイズする。その後、大便試料を３３個の１００ｍｇアリコートへ分けた。
【０１４３】
[0173]６個のアリコートを、ドライアイス上で２ｍＬエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブへ移し、すぐに−２０℃フリーザーへ入れた。
【０１４４】
[0174]６個のアリコートを、１ｍＬ  ＲＮＡレイターを含有する２ｍＬエッペンドルフチューブへ移した。その試料を、室温で１週間放置し、その後−２０℃で３週間凍結させた。
【０１４５】
[0175]６個のアリコートを、１ｍＬのライフガードを含む２ｍＬエッペンドルフチューブへ移した。その試料を、室温で１週間放置し、その後−２０℃で３週間凍結させた。
【０１４６】
[0176]６個のアリコートをコパンＦＬＯＱスワブ（Ｃｏｐａｎ  ＦＬＯＱＳｗａｂ）スワブへ加え、室温で合計４週間、保持した。
【０１４７】
[0177]６個のアリコートをＢＤ  ＢＢＬ培養スワブＥＺ滅菌スワブ（ＢＤ  ＢＢＬ  ＣｕｌｔｕｒｅＳｗａｂ  ＥＺ  Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｓｗａｂｓ）へ加えた。その試料を、室温で１週間放置し、その後−２０℃で３週間凍結させた。
参考文献
【図１】
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【図２】
2021527232.tif 000004
【図３】
2021527232.tif 000005
【図４】
2021527232.tif 000006
【図５Ａ】
2021527232.tif 000007
【図５Ｂ】
2021527232.tif 000008
【図６】
2021527232.tif 000009
【図７】
2021527232.tif 000010
【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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