(57)【要約】  【解決手段】  Ｓｔａｕｆｅｎ１に関連したＲＮＡ代謝の調節障害を最小化する方法は、調節障害を最小化するのに十分な量のＳｔａｕｆｅｎ１−調節剤を標的細胞に導入する工程を含み得る。Ｓｔａｕｆｅｎ１−誘導性ＲＮＡ代謝異常に関連する神経変性状態を治療するための治療用組成物は、治療上有効な量のＳｔａｕｆｅｎ１−調節剤と、薬学的に許容可能な担体とを含み得る。  【選択図】    図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｔａｕｆｅｎ１−誘導性ＲＮＡ代謝異常に伴う神経変性疾患を治療するための治療剤であって、
配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２０、配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２、配列ＩＤ番号：２３、配列ＩＤ番号：２４、配列ＩＤ番号：２５、配列ＩＤ番号：２６、配列ＩＤ番号：２７、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：２９、配列ＩＤ番号：３０、配列ＩＤ番号：３１、配列ＩＤ番号：３２、配列ＩＤ番号：３３、配列ＩＤ番号：３４、配列ＩＤ番号：３５、配列ＩＤ番号：３６、配列ＩＤ番号：３７、配列ＩＤ番号：３８、配列ＩＤ番号：３９、および配列ＩＤ番号：４０の１つまたはそれ以上の１０の中間ヌクレオチドと少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む、治療剤。
【請求項２】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２０、配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２、配列ＩＤ番号：２３、配列ＩＤ番号：２４、配列ＩＤ番号：２５、配列ＩＤ番号：２６、配列ＩＤ番号：２７、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：２９、配列ＩＤ番号：３０、配列ＩＤ番号：３１、配列ＩＤ番号：３２、配列ＩＤ番号：３３、配列ＩＤ番号：３４、配列ＩＤ番号：３５、配列ＩＤ番号：３６、配列ＩＤ番号：３７、配列ＩＤ番号：３８、配列ＩＤ番号：３９、配列ＩＤ番号：４０またはそれらの組み合わせの１０の中間ヌクレオチドを含む、治療剤。
【請求項３】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：１の１０の中間ヌクレオチド、またはそれと少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項４】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：２の１０の中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項５】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：３の１０の中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項６】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：４の１０の中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項７】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：５の１０の中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項８】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：６の１０の中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項９】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：７の１０の中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項１０】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：８の１０の中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項１１】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：９の１０の中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項１２】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：１０の１０の中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項１３】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：１１の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項１４】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：１２の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項１５】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：１３の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項１６】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：１４の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項１７】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：１５の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項１８】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：１６の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項１９】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：１７の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項２０】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：１８の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項２１】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：１９の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項２２】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：２０の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項２３】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：２１の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項２４】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：２２の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項２５】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：２３の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項２６】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：２４の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項２７】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：２５の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項２８】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：２６の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項２９】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：２７の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項３０】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：２８の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項３１】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：２９の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項３２】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：３０の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項３３】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：３１の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項３４】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：３２の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項３５】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：３３の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項３６】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：３４の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項３７】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：３５の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項３８】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：３６の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項３９】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：３７の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項４０】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：３８の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項４１】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：３９の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項４２】
請求項１記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：４０の１０中間ヌクレオチド、または少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、治療剤。
【請求項４３】
請求項１記載の治療剤において、前記ＡＳＯは、酸素置換のための硫黄、２'−ＯＨ修飾、２'−Ｏ−メチル修飾、２'−フルオロ修飾、２'−Ｏ−メトキシエチル修飾、ロック核酸（ＬＮＡ）修飾、架橋核酸（ＢＮＡ）修飾、ペプチド核酸（ＰＮＡ）修飾、モルホリノ修飾、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）修飾、中央ホスホジエステル修飾、中央ホスホロチオエート修飾、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１またはそれ以上の修飾をさらに含む、治療剤。
【請求項４４】
Ｓｔａｕｆｅｎ１−誘導性ＲＮＡ代謝異常に伴う神経変性疾患を治療するための治療剤であって、
配列ＩＤ番号：４１または配列ＩＤ番号：４２と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を有する小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、治療剤。
【請求項４５】
請求項４４記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：４１と少なくとも８５％同一である、治療剤。
【請求項４６】
請求項４４記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：４１の少なくとも１０の連続したヌクレオチドを有する、治療剤。
【請求項４７】
請求項４４記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：４２と少なくとも８５％同一である、治療剤。
【請求項４８】
請求項４４記載の治療剤において、前記ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：４２の少なくとも１０の連続したヌクレオチドを有する、治療剤。
【請求項４９】
請求項４４の治療剤において、前記ｓｉＮＲＮＡは、２'−糖修飾、変化した環状構造、核酸塩基修飾、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１またはそれ以上の修飾をさらに含む、治療剤。
【請求項５０】
神経疾患を治療するための治療用組成物であって、
Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤の投与前または投与しない場合のＳｔａｕｆｅｎ１のレベルと比較して、効果的な投与レジメンで投与した場合に、標的細胞内のＳｔａｕｆｅｎ１を少なくとも３０％減少させるのに十分な量のＳｔａｕｆｅｎ１−調節剤と、薬学的に許容可能な担体と、を含む組成物。
【請求項５１】
請求項５０記載の組成物において、前記Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小分子、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、またはそれらの組み合わせを含む、組成物。
【請求項５２】
請求項５０の組成物において、Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤は、Ｓｔａｕｆｅｎ１の発現を減少させ、Ｓｔａｕｆｅｎ１活性を減少させ、Ｓｔａｕｆｅｎ１とｍＲＮＡとの相互作用を減少または遮断させることによってｍＲＮＡの発現または豊富さを変化させる、またはそれらの組み合わせである、組成物。
【請求項５３】
請求項５０の組成物において、前記Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤は、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２０、配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２、配列ＩＤ番号：２３、配列ＩＤ番号：２４、配列ＩＤ番号：２５、配列ＩＤ番号：２６、配列ＩＤ番号：２７、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：２９、配列ＩＤ番号：３０、配列ＩＤ番号：３１、配列ＩＤ番号：３２、配列ＩＤ番号：３３、配列ＩＤ番号：３４、配列ＩＤ番号：３５、配列ＩＤ番号：３６、配列ＩＤ番号：３７、配列ＩＤ番号：３８、配列ＩＤ番号：３９、配列ＩＤ番号：４０、配列ＩＤ番号：４１、配列ＩＤ番号：４２、またはそれらの組み合わせの１０の中間ヌクレオチドと少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、組成物。
【請求項５４】
請求項５０の組成物において、前記Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤は、約１ピコモル（ｐＭ）〜約１００ミリモル（ｍＭ）の濃度で製剤中に存在する、組成物。
【請求項５５】
請求項５０の組成物において、前記Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤は、約０．００１μｇ／ｇ〜約２００ｍｇ／ｇの濃度で製剤中に存在する、組成物。
【請求項５６】
請求項５０の組成物であって、標的細胞への前記Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤の送達を容易にするための送達ベクターをさらに含む、組成物。
【請求項５７】
請求項５６の組成物において、前記送達ベクターは、ウイルスベクターである、組成物。
【請求項５８】
請求項５７の組成物において、前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびそれらの組み合わせからなる群のメンバーである、組成物。
【請求項５９】
請求項５６の組成物において、前記送達ベクターは、アプタマー、抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ビタミン、低分子有機分子、ポリカチオン性ペプチド、ポリマー、デンドリマー、脂質、リソソソーム担体、リポソーム、ミセル、量子ドット、ナノ粒子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される非ウイルス性担体である、組成物。
【請求項６０】
請求項５０の組成物において、前記薬学的に許容可能な担体は、注射、経腸投与、経皮投与、経粘膜投与、吸入、または移植による投与のために製剤化される、組成物。
【請求項６１】
請求項５０の組成物において、前記薬学的に許容可能な担体は、水、可溶化剤、強壮剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、防腐剤、キレート剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、増粘剤、分散剤、乳化剤、エモリエント剤、またはそれらの組み合わせを含む、組成物。
【請求項６２】
請求項５０の組成物であって、さらに補助的な治療剤を含む、組成物。
【請求項６３】
請求項６２の組成物において、前記補助的な治療剤は、ドーパミン作動剤、コリンエステラーゼ阻害剤、抗精神病剤、鎮痛剤、抗炎症剤、オートファジー誘導剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーである、組成物。
【請求項６４】
Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子、ＴＤＰ−４３遺伝子、ＨＴＴ遺伝子、ＰＳＥＮ１遺伝子、ＭＡＰＴ遺伝子、またはそれらの組み合わせの変異に伴う神経学的状態を治療する方法であって、
ＲＮＡ代謝のＳｔａｕｆｅｎ１−誘導性異常を最小化するのに十分な量のＳｔａｕｆｅｎ１調節剤を標的細胞に導入する工程を含む、方法。
【請求項６５】
請求項６４の方法において、前記導入する工程は、非ウイルス性ベクターを用いて前記標的細胞にＳｔａｕｆｅｎ１−調節剤を導入する工程を含む、方法。
【請求項６６】
請求項６４の方法において、前記導入する工程は、ウイルスベクターを用いて前記標的細胞にＳｔａｕｆｅｎ１−調節剤を導入する工程を含む、方法。
【請求項６７】
請求項６４の方法において、前記導入する工程は、送達ベクターなしでＳｔａｕｆｅｎ１−調節剤を導入する工程を含む、方法。
【請求項６８】
請求項６４の方法において、前記Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤の量は、Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤を導入する前または導入しない場合の前記レベルと比較して、前記標的細胞におけるＰＣＰ２  ｍＲＮＡレベル、前記標的細胞におけるＣＡＬＢ１  ｍＲＮＡレベル、またはその両方を増加させる、方法。
【請求項６９】
請求項６４の方法において、前記Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤の量は、前記Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤を導入する前または導入しない場合の前記標的細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１レベルと比較して、前記標的細胞における前記Ｓｔａｕｆｅｎ１レベルを少なくとも３０％減少させる、方法。
【請求項７０】
請求項６４の方法において、前記Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤は、Ｓｔａｕｆｅｎ１発現を減少させ、Ｓｔａｕｆｅｎ１活性を減少させ、Ｓｔａｕｆｅｎ１とｍＲＮＡとの相互作用を減少または遮断させることによってｍＲＮＡの発現または豊富さを変化させる、方法。
【請求項７１】
請求項６４の方法において、前記Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小分子、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、またはそれらの組み合わせを含む、方法。
【請求項７２】
請求項６４の方法において、前記Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤は、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２０、配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２、配列ＩＤ番号：２３、配列ＩＤ番号：２４、配列ＩＤ番号：２５、配列ＩＤ番号：２６、配列ＩＤ番号：２７、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：２９、配列ＩＤ番号：３０、配列ＩＤ番号：３１、配列ＩＤ番号：３２、配列ＩＤ番号：３３、配列ＩＤ番号：３４、配列ＩＤ番号：３５、配列ＩＤ番号：３６、配列ＩＤ番号：３７、配列ＩＤ番号：３８、配列ＩＤ番号：３９、配列ＩＤ番号：４０、配列ＩＤ番号：４１、配列ＩＤ番号：４２、またはそれらの組み合わせの１０の中間ヌクレオチドと少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年６月１４日に出願された米国仮特許出願番号６２／６８５，２６９の利益を主張し、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患は、脳や末梢神経系の神経細胞が時間の経過とともに機能を失い、最終的に死滅することで生じる。また、一般的に神経細胞は自分自身で再生したり、入れ替わったりすることはない。神経変性疾患に罹患するリスクは、年齢とともに増加する。神経変性疾患に関連する身体的または精神的症状の一部を治療によって緩和することができるかもしれないが、現在のところ治療法はない。神経変性疾患の非限定的な例としては、末梢神経障害、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、プリオン病、運動ニューロン病（ＭＮＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、および脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）などが挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
本発明の性質および利点の完全な理解のために、参照は、好ましい実施形態の以下の詳細な説明、および添付の図面との関連で行われる：
【図１Ａ】図１Ａは、ＡＴＸＮ２およびＳｔａｕｆｅｎ１がストレス条件下でストレス顆粒中に共局在する画像を示す。ＨＥＫ−２９３細胞を４３．５℃で１時間ヒートショックで処理した。固定した細胞をＡＴＸＮ２、Ｓｔａｕｆｅｎ１、ＴＩＡ−１（ストレス顆粒マーカー）抗体で免疫染色した。内在性ＡＴＸＮ２（赤）とＳｔａｕｆｅｎ１（緑）、またはＡＴＸＮ２（緑）とＴＩＡ−１（赤）の共局在を示す代表的な細胞をマージ画像（黄色信号）で凝集体として示した。ＡＴＸＮ２とＳｔａｕｆｅｎ１の共局在は、非ストレス下（３７℃）では見られない。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＳＣＡ２由来の皮膚線維芽細胞におけるストレス顆粒状凝集体におけるＡＴＸＮ２およびＳｔａｕｆｅｎ１の共局在を示す画像を示す。正常およびＳＣＡ２線維芽細胞を、抗ＡＴＸＮ２抗体（緑）および抗Ｓｔａｕｆｅｎ１抗体（赤）で免疫染色した。ＡＴＸＮ２（緑）およびＳｔａｕｆｅｎ１（赤）シグナルの凝集がＳＣＡ２線維芽細胞の細胞質に見られる。黄色のシグナルがＡＴＸＮ２がＳｔａｕｆｅｎ１と共局在していることを示すように、緑と赤のシグナルの融合画像が観察される。
【図１Ｃ】図１Ｃは、正常線維芽細胞対ＳＣＡ２線維芽細胞における細胞あたりの凝集体の数を示すグラフである。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ストレス条件下でのＳＣＡ２線維芽細胞における顆粒の増加を示す画像である。正常およびＳＣＡ２線維芽細胞を、４３．５℃で１時間のヒートショック後、ＡＴＸＮ２およびＳｔａｕｆｅｎ１抗体で免疫染色した。内因性ＡＴＸＮ２（赤）とＳｔａｕｆｅｎ１（緑）の顆粒を示す代表的な細胞は、マージ画像（黄色の信号）で凝集体として表示される。核はＤＡＰＩで染色した。
【図１Ｅ】図１Ｅは、正常対ＳＣＡ２線維芽細胞における細胞あたりの顆粒の数のグラフである。
【図１Ｆ】図１Ｆは、Ｓｔａｕｆｅｎ１がｉｎ  ｖｉｖｏでＡＴＸＮ２と相互作用することを示す３つの独立した実験の代表的なブロットを示す。フラッグタグ付きＡＴＸＮ２−（Ｑ２２またはＱ１０８）を発現するＨＥＫ−２９３全細胞抽出物を、非ＲＮａｓｅまたはＲＮａｓｅ処理したＨＥＫ−２９３全細胞抽出物を、Ｆｌａｇ  ｍＡｂビーズを用いた免疫沈降に供した。結合したタンパク質複合体をＦｌａｇペプチド競合により溶出し、ウエスタンブロットにより解析した。Ｓｔａｕｆｅｎ１は、野生型および変異型ＡＴＸＮ２とのＲＮＡ依存性相互作用を示した。免疫沈降物はまた、両方のＡＴＸＮ２インタラクターであるＤＤＸ６およびＰＡＢＰＣ１のｃｏ−ＩＰを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、生後６週齢の野生型マウスの小脳のＳｔａｕｆｅｎ１抗体免疫染色の代表的な顕微鏡写真である。小脳でのＳｔａｕｆｅｎ１の発現が観察される（２０倍率）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｓｔａｕｆｅｎ１のサイレンシングが達成された代表的なブロットである。Ｓｔａｕｆｅｎ１抗体は、ヒトおよびマウス内在性Ｓｔａｕｆｅｎ１に対して特異性を示す。ヒトＨＥＫ−２９３細胞またはマウスＮ２ａ神経芽腫細胞を、対照ｓｉＲＮＡまたはヒトまたはマウスＳｔａｕｆｅｎ１に対して指示されたｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ヒトｓｉＳｔａｕｆｅｎ１については、トランスフェクション後４日目にＨＥＫ−２９３細胞を採取した。タンパク質抽出物をウエスタンブロットで分析し、Ｓｔａｕｆｅｎ１のサイレンシングを測定した。ブロットは、内部ローディングコントロールとしてβ−アクチンについて再プロービングした。ブロットは、３つの独立した実験のうちの１つを表す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、Ｓｔａｕｆｅｎ１について達成されたサイレンシングの代表的なブロットである。Ｓｔａｕｆｅｎ１抗体は、ヒトおよびマウス内在性Ｓｔａｕｆｅｎ１に対して特異性を示す。ヒトＨＥＫ−２９３細胞またはマウスＮ２ａ神経芽腫細胞を、対照ｓｉＲＮＡまたはヒトまたはマウスＳｔａｕｆｅｎ１に対して指示されたｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。マウスｓｉＳｔａｕｆｅｎ１については、トランスフェクション後４日目にＮ２ａ細胞を採取した。タンパク質抽出物をウエスタンブロットで分析し、Ｓｔａｕｆｅｎ１のサイレンシングを測定した。ブロットは、内部ローディングコントロールとしてβ−アクチンについて再プロービングした。ブロットは、３つの独立した実験のうちの１つを表す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＳＣＡ２患者由来の皮膚線維芽細胞のウエスタンブロット分析を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、リンパ芽球体Ｂ（ＬＢ）細胞抽出物のウエスタンブロット分析を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＢＡＣ−Ｑ７２小脳抽出物（２４週齢）のウエスタンブロット分析を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＨＥＫ−２９３細胞におけるＦｌａｇタグ付きＡＴＸＮ３−Ｑ５６の過剰発現が、野生型ＡＴＸＮ３と比較してＳｔａｕｆｅｎ１レベルの変化のないことを示すウエスタンブロット分析を示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ＳＣＡ２細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１の増加したアバンダンスが、野生型ＡＴＸＮ２欠損とは無関係であることを示すウエスタンブロット分析を示す。ＨＥＫ−２９３細胞をｓｉＡＴＸＮ２  ＲＮＡでトランスフェクションし、トランスフェクション後４日目にウエスタンブロットで分析した。ＡＴＸＮ２レベルの減少は、対照ｓｉＲＮＡと比較して、Ｓｔａｕｆｅｎ１定常状態レベルの変化をもたらさない。
【図３Ｆ】図３Ｆは、デンシトメトリックに決定されたウエスタンブロット上の豊富さの定量化のグラフである。
【図３Ｇ】図３Ｇは、ＳＣＡ２＋／＋マウス（８週齢）と比較して、ＳＣＡ２−／−マウス小脳のＳｔａｕｆｅｎ１転写物レベルが変化していないことを示す小脳ＲＮＡのｑＰＣＲ分析のグラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、細胞をプラスミドでトランスフェクションしたウエスタンブロット分析を示す。Ｑ２２またはＱ５８またはＱ１０８リピートを含むフラグタグ付きＡＴＸＮ２、およびＳｔａｕｆｅｎ１定常状態レベルを測定するために、トランスフェクション後４８時間で収穫された細胞からのタンパク質抽出物を含む細胞をトランスフェクトした場合のウェスタンブロット分析を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＳＣＡ２線維芽細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１の安定性を示すブロットを示す。正常およびＳＣＡ２線維芽細胞をＣＨＸ（２５μｇ／ｍｌ）に０〜２４時間曝露し、タンパク質抽出物を各時間点についてＳｔａｕｆｅｎ１について免疫ブロットした。Ｓｔａｕｆｅｎ１レベルは０時点のパーセンテージとして計算され、実験的対照としてｐ２１  Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１タンパク質量が測定され、ＣＨＸによるタンパク質合成阻害を検証した。Ｓｔａｕｆｅｎ１タンパク質の安定性は、正常な線維芽細胞と比較して、ＳＣＡ２線維芽細胞において延長される。
【図４Ｃ】図４Ｃは、デンシトメトリックに決定されたウエスタンブロット上のＳｔａｕｆｅｎ１の定量のグラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、ＳＣＡ２−ＬＢ細胞が減少したＰＣＰ２転写物を示すグラフであり、ＳＣＡ２−ＬＢ細胞から合成されたｃＤＮＡのｑＰＣＲ分析は、正常なＬＢ細胞と比較して、ＰＣＰ２  ｍＲＮＡアバンダンスの有意な減少を示す。ＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡレベルは、正常細胞およびＳＣＡ２−ＬＢ細胞の両方において変化していない。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ヒト細胞培養におけるＳｔａｕｆｅｎ１レベルの増加が、独立してＰＣＰ２およびＣＡＬＢ１  ｍＲＮＡ残量の減少を誘導することを示すブロットである。ＨＥＫ−２９３細胞を、フラグタグ付きＳｔａｕｆｅｎ１構築物でトランスフェクションし、トランスフェクション後４８時間で２つのアリコートとして採取した。一方のアリコートからのタンパク質抽出物は、Ｆｌａｇ−Ｓｔａｕｆｅｎ１の相対的な発現を測定するためにイムノブロットした。
【図５Ｃ】図５Ｃは、対照トランスフェクションと比較してＰＣＰ２およびＣＡＬＢ１転写物が減少したことを示す第２のアリコートから合成されたｃＤＮＡのｑＰＣＲ分析のグラフである。ＡＴＸＮ２転写物は、Ｓｔａｕｆｅｎ１の過剰発現により変化しなかった。データは、平均値±ＳＤ、＊＊ｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）である。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ＭＹＣタグ付きＰＣＰ２  ｃＤＮＡ［（５'＋３'）ＵＴＲ］（ｉ）およびＰＣＰ２  ｃＤＮＡ（＋５'ＵＴＲ）（ｉｉ）の模式図を示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、Ｓｔａｕｆｅｎ１レベルの増加がＰＣＰ２タンパク質合成の抑制を誘導することを示すブロットである。ＭＹＣタグ付き−ＰＣＰ２  ｃＤＮＡ［（５'＋３'ＵＴＲｓ］（５Ｄｉ）ＰＣＰ２  ｃＤＮＡ（＋５'ＵＴＲ）（５Ｄｉｉ）をＣＭＶプロモーターの下でクローニングし、Ｆｌａｇ−Ｓｔａｕｆｅｎ１を発現する短期ハイグロマイシン選択ＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後にウエスタンブロット解析を行ったところ、ＭＹＣタグ付きＰＣＰ２  ｃＤＮＡ［（５'＋３'）ＵＴＲｓ］（５Ｄｉ）をトランスフェクションしたＦｌａｇ−Ｓｔａｕｆｅｎ１発現細胞では、外因性ＰＣＰ２レベルが対照と比較して有意に低下することがわかった。逆に、Ｓｔａｕｆｅｎ１レベルの増加は、対照と比較して、ＭＹＣタグ付きＰＣＰ２  ｃＤＮＡ［（−３'ＵＴＲ）］（５Ｄｉｉ）の発現に有意な調節効果を示さなかった。
【図５Ｆ】図５Ｆは、密度測定的に決定されたウエスタンブロット上のＭＹＣタグ付きＰＣＰ２の定量のグラフである。均等なトランスフェクションをコントロールするために、ＭＹＣタグ付きＰＣＰ２プラスミド中の独立したカセットとして発現されるネオマイシンレベルを測定した。ブロットは、内部ローディングコントロールとしてβ−アクチンについて再プロービングした。データは、平均±ＳＤ、＊＊ｐ＜０．０１（スチューデントのｔ検定）である。
【図６Ａ】図６Ａは、ＦｌａｇまたはＦｌａｇ−Ｓｔａｕｆｅｎ１を発現する非ＲＮａｓｅ処理したＨＥＫ−２９３全細胞抽出物をＦｌａｇ  ｍＡｂビーズで免疫沈降させたブロットである。結合したタンパク質−ＲＮＡ複合体をＦｌａｇペプチド競合により溶出させ、ＩＰ産物を２つの部分に等分してウエスタンブロット分析およびＲＴ−ＰＣＲ／ｑＰＣＲ分析に供した。溶出したタンパク質のウエスタンブロット解析では、内在性ＡＴＸＮ２とＦｌａｇ−Ｔａｕｆｅｎ１の共ＩＰが確認された。２番目のアリコートのＲＴ−ＰＣＲ解析では、Ｆｌａｇ−ｓｔａｕｆｅｎ１はＰＣＰ２とＣＡＬＢ１のｍＲＮＡをプルダウンするが、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡはプルダウンしないことが示された。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＤＩＧ標識されたヒトＰＣＰ２転写物の概略図を示す。ＰＣＰ２［（５'＋３'）ＵＴＲ］（ｉ）、ＰＣＰ２（３'ＵＴＲ）（ｉｉ）およびＰＣＰ２（５'ＵＴＲ）（ｉｉｉ）である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、Ｈｉｓタグ付き−Ｓｔａｕｆｅｎ１、−ＧＦＰまたはｐＥＴを含むｐＥＴベクターで形質転換したＢＬ２１＜ＤＥ３＞細菌からの抽出物のブロットであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で実行し、クーマシーブリリアントブルーで染色するか、または抗Ｈｉｓ抗体（ブロット１）でウエスタンブロットしたものである。ノースウェスタンブロットアッセイのために、細菌のタンパク質抽出物：ｐＥＴ、Ｈｉｓ−ＧＦＰまたはＨｉｓ−Ｓｔａｕｆｅｎ１をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で実行し、ＰＶＤＦ膜に転写した。メンブレンを再変性し、示されているようにＤＩＧ標識されたＰＣＰ２  ＲＮＡプローブとハイブリダイズした。抗ＤＩＧ抗体染色後、シグナルはウェスタンケミルミネッセンス法により検出された。結果は、Ｓｔａｕｆｅｎ１がＰＣＰ２  ＲＮＡs：（５'＋３'ＵＴＲ）ＵＴＲ（ｉ）（ブロット２）または（３'ＵＴＲ）（ｉｉ）（ブロット３）には直接結合するが、ＰＣＰ２（５'ＵＴＲ）ＲＮＡには結合しないことが示された（ブロット４）。Ｈｉｓ−ＧＦＰは、ＰＣＰ２  ＲＮＡプローブとの相互作用を示さない。ブロットは、３つの独立した実験のうちの１つを表す。
【図７Ａ】図７Ａは、ｓｉＳＴＡＵ１でエレクトロポレーションし、４日後のエレクトロポレーション後にタンパク質およびＲＮＡ分析のために２つのアリコートとして収穫した、正常細胞（ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／２２）およびＳＣＡ２−ＬＢ（ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５２）細胞のブロットである。一方のアリコートからのタンパク質抽出物は、Ｓｔａｕｆｅｎ１のために免疫ブロットされた。
【図７Ｂ】図７Ｂは、正常ＬＢ細胞およびＳＣＡ２−ＬＢ細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１／Ａｃｔｉｎの密度測定によるウエスタンブロット定量のグラフである。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＰＣＰ２転写物レベルを測定するためにｑＰＣＲ分析を受けた第２のアリコートからの単離されたＲＮＡのグラフである。Ｓｔａｕｆｅｎ１枯渇はＳＣＡ２−ＬＢ細胞におけるＰＣＰ２転写産物の発現欠損を防止するが、対照ｓｉＲＮＡと比較した場合、正常細胞においては有意なＰＣＰ２転写産物の変化を示さないことがわかる。
【図７Ｄ】図７Ｄは、Ｓｔａｕｆｅｎ１をサイレンシングしても、正常細胞およびＳＣＡ２−ＬＢ細胞において、ｑＰＣＲ解析により判断したＡＴＸＮ２転写物定常レベルの変化を示さないことを示すグラフである。
【図７Ｅ】図７Ｅは、用量依存的にｓｉＡＴＸＮ２をトランスフェクションまたはエレクトロポレーションしたＳＣＡ２−線維芽細胞（ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／４２）のブロットであり、トランスフェクション／エレクトロポレーション後４日後のタンパク質およびＲＮＡ分析のために２つのアリコートとして収穫された細胞である。一方のアリコートからのタンパク質抽出物は、ＡＴＸＮ２とＳｔａｕｆｅｎ１についてイムノブロットされ、対照ｓｉＲＮＡと比較して、ＡＴＸＮ２の用量を減少させるとＳｔａｕｆｅｎ１のアバンダンスが有意に減少することが示された。
【図７Ｆ】図７Ｆは、デンシトメトリックに決定された図７Ｅのウエスタンブロットの定量化のグラフである。
【図７Ｇ】図７Ｇは、第２のアリコートから合成したｃＤＮＡのｑＰＣＲ分析であり、対照ｓｉＲＮＡと比較して、ＡＴＸＮ２用量を枯渇させた場合に、ＳＣＡ２−線維芽細胞におけるＰＣＰ２転写物レベルの有意な増加を示す。
【図７Ｈ】図７Ｈは、用量依存的にｓｉＡＴＸＮ２でトランスフェクションまたはエレクトロポレーションされたＳＣＡ２−ＬＢ（ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５２）細胞のブロットであり、トランスフェクション／エレクトロポレーション後４日後にタンパク質およびＲＮＡ分析のために２つのアリコートとして収穫された。一方のアリコートからのタンパク質抽出物は、ＡＴＸＮ２およびＳｔａｕｆｅｎ１についてイムノブロットされ、対照ｓｉＲＮＡと比較して、ＡＴＸＮ２の用量を減少させると、Ｓｔａｕｆｅｎ１のアバンダンスが有意に減少することを示した。
【図７Ｉ】図７Ｉは、デンシトメトリックに決定された図７Ｈのウエスタンブロットの定量化のグラフである。
【図７Ｊ】図７Ｊは、第２のアリコートから合成されたｃＤＮＡのｑＰＣＲ分析であり、対照ｓｉＲＮＡと比較して、ＡＴＸＮ２用量を枯渇させた場合、ＳＣＡ２−ＬＢ細胞におけるＰＣＰ２転写物レベルの有意な増加を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、ＳＴＡＵＦＥＮ１枯渇が、ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８ノックイン細胞におけるオートファジー経路タンパク質を回復させたことを示すブロットである。細胞をＳＴＡＵ１  ＲＮＡｉでトランスフェクトし、ウエスタンブロットにより分析した。評価されたオートファジータンパク質には、オートファジーの阻害剤であるラパマイシンの総（ＭＴＯＲ）および活性化（ｐＭＴＯＲ）メカニスティックターゲット、ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２、またはオートファゴソームを標的とするタンパク質と結合するｓｅｃｋｅｓｔｏｓｏｍｅ−１が含まれた。オートファジー機能の一般的なマーカーであるＬＣ３。ＬＣ３−Ｉは細胞質に存在する一方で、より高い移動性を持つ切断形態である。ＬＣ３−ＩＩ、オートファゴソームに局在する。ＬＣ３−ＩＩの量は、オートファゴソームの量の指標であり、オートファジーが欠損している場合には通常増加する。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＳＴＡＵＦＥＮ１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が、ＨＥＫ−２９３−ＡＴＸＮ２［Ｑ２２／Ｑ２２］細胞におけるＳＴＡＵＦＥＮ１の発現を低下させることを示すブロットである。ＳＴＡＵ１  ＡＳＯ−Ａ（５'−ＴＣＴＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＴＴＡＴＡＧＧ−３'）を指示された用量で使用すると、ウエスタンブロットによって決定されたＳＴＡＵ１レベルが減少した。アクチンに対する相対的な発現。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＳＴＡＵＦＥＮ１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が、ＨＥＫ−２９３−ＡＴＸＮ２［Ｑ２２／Ｑ２２］細胞におけるＳＴＡＵＦＥＮ１の発現を低下させることを示すブロットである。ＳＴＡＵ１  ＡＳＯ−Ｂ（５'−ＣＴＧＧＡＡＡＧＡＴＴＡＧＣＣＡＧＴＴＧ−３'）を指示された用量で使用すると、ウエスタンブロットによって決定されたＳＴＡＵ１レベルが減少した。アクチンに対する相対的な発現。
【図９Ａ】図９Ａは、共局在化した顆粒の量と大きさを示すヒストグラムである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＡＴＸＮ２Ｑ１２７マウス小脳ＰＣ（２４週齢）で検出された変異型ＡＴＸＮ２とＳｔａｕｆｅｎ１の共局在の画像を示す。Ｓｔａｕｆｅｎ１（赤）とＡＴＸＮ２（緑）の複合二重染色は、ＡＴＸＮ２Ｑ１２７マウスにおける凝集体（白矢印）の存在を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、正常な対照と比較してＳｔａｕｆｅｎ１レベルの増加を示すＳＣＡ２線維芽細胞のウエスタンブロット分析を示す。ＤＤＸ６レベルは変化していない。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、正常な対照と比較してＳｔａｕｆｅｎ１レベルが増加したＬＢＣのウエスタンブロット分析を示す。ＤＤＸ６レベルは変化なし。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、２４週齢のＡＴＸＮ２Ｑ１２７マウスの小脳抽出物におけるＳｔａｕｆｅｎ１レベルの増加を示すウエスタンブロット分析を示す。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、２４週齢のＢＡＣ−Ｑ７２マウスの小脳抽出物におけるＳｔａｕｆｅｎ１レベルの増加を示すウエスタンブロット解析である。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、生後８週齢のＴＤＰ−４３Ｔｇ／＋ヘミ接合性マウスからの小脳抽出物のウエスタンブロット分析を、野生型のリターメイトと比較して示す。
【図１０Ｆ】図１０Ｆは、ＴＤＰ−４３Ｔｇ／＋ヘミ接合性マウスからの脊髄抽出物のウエスタンブロット分析を、野生型リターメイトと比較して、生後８週齢で示す。
【図１０Ｇ】図１０Ｇは、ＴＤＰ−４３Ｇ２９８Ｓ変異に起因するＡＬＳ患者からの脊髄抽出物中のＳｔａｕｆｅｎ１の増加を示すウエスタンブロット分析を示す。
【図１０Ｈ】図１０Ｈは、ヒ素誘発ストレスの結果、ＨＤおよびＳＣＡ３  ＦＢにおけるＳＴＡＵ１レベルが過度に増加することを示すウエスタンブロット分析を示す。ＳＣＡ２、ＨＤおよびＳＣＡ３  ＦＢは、免疫ブロット法により、０、３および６時間、亜ヒ酸ナトリウム（１．０ｍＭ）で処理した。β−アクチンをローディングコントロールとして使用し、３つの独立した実験の代表的なブロットを示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、対照細胞と比較した場合にＳＣＡ２−ＦＢｓで観察される定常状態のＳｔａｕｆｅｎ１タンパク質レベルの差にＳｔａｕｆｅｎ１転写物レベルが対応していないことを示すグラフである。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、対照細胞と比較した場合のＳＣＡ２−ＬＢＣｓで観察される定常状態のＳｔａｕｆｅｎ１タンパク質レベルの差にＳｔａｕｆｅｎ１転写物レベルが対応していないことを示すグラフである。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ＡＴＸＮ２Ｑ１２７マウスからの小脳ＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示したグラフであり、２４週齢の野生型と比較して、Ｓｔａｕｆｅｎ１転写物レベルが変化していないことを示す。遺伝子発現レベルをＡｃｔｂに正規化した。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、２４週齢で野生型と比較してＳｔａｕｆｅｎ１転写レベルが変化していないことを示したＢＡＣ−Ｑ７２マウスの小脳ＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ解析を示すグラフである。遺伝子発現レベルはＡｃｔｂに正規化した。
【図１２】図１２は、正常およびＳＣＡ２  ＦＢを０から２４時間までの異なる時間、ＣＨＸ（２５μｇ／ｍｌ）に曝露し、タンパク質抽出物をＳｔａｕｆｅｎ１について免疫ブロットしたウエスタンブロット分析である。Ｓｔａｕｆｅｎ１レベルは、０時点の値のパーセンテージとして定量され、ｐ２１  Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１タンパク質レベルは、ＣＨＸ阻害を検証するために示される。Ｓｔａｕｆｅｎ１タンパク質の安定性は、正常ＦＢと比較してＳＣＡ２  ＦＢにおいて延長された。負荷コントロール、β−アクチンは、治療期間にわたって不変であることが判明した。３つの独立した実験の代表的なブロットを示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、処理されたＬＣ３−ＩＩのレベルの増加によって示されるように、オートファジーがＳＣＡ２  ＦＢで障害されることを示すウエスタンブロット分析である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、フラグタグ付きＳＴＡＵＦＥＮ１を発現するＨＥＫ−２９３細胞抽出物（非ＲＮＡｓｅ  Ａ処理）のフラグ免疫沈降を例示するプロットである。Ｆｌａｇ−ＳＴＡＵＦＥＮ１は、ウエスタンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲ上でＡＴＸＮ２タンパク質、およびＰＣＰ２およびｍＴＯＲ  ｍＲＮＡを引き下げた。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集によるＨＥＫ−２９３細胞への拡張されたＡＴＸＮ２対立遺伝子の導入の結果、ＳＴＡＵ１の増加およびオートファジー機能不全を示すウエスタンブロット解析である。差動的に制御されている小脳転写物ＰＣＰ２は、この細胞モデルでは減少する。β−アクチンをローディングコントロールとして使用した。
【図１４Ａ】図１４Ａは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列（緑）、ＰＡＭ配列（ＮＧＧＧ）（赤）、およびＣａｓ９切断部位（赤矢印）が示される模式図である。Ｃａｓ９はｓｇＲＮＡの誘導の助けを借りて標的部位のＤＮＡを切断する。標的ドナーの左右の腕は、ＨＤＲを介してＣＡＧ５８リピートをＡＴＸＮ２遺伝子座に挿入する。指示されたプライマーを用いて、ＡＴＸＮ２−ＣＡＧ２２／５８［ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８］ノックイン陽性クローンのためのＲＴ−ＰＣＲスクリーニング。ＨＥＫ−２９３細胞を、直線化ドナーベクターとシングルガイドＲＮＡ  ｐｇＲＮＡ−Ｃａｓ９ベクターで共トランスフェクトした。プロマイシンで選択した細胞を、９６ウェルプレート中で１セル／ウェルで滴定し、次いで、ノックイン陽性細胞を同定するためのＰＣＲスクリーニングのために拡大して維持した。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、いくつかの同定されたＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８ノックインクローンのＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で編集されたＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８  ＫＩ細胞が、Ｓｔａｕｆｅｎ１のアバンダンス（図１３Ｂ；ウエスタンブロット）およびＳＣＡ２に関連する転写物（ＰＣＰ２、ＣＡＣＮＡ１ＧおよびＩＴＰＲ１）の調節異常を含むＳＣＡ２の表現型をミラーリングすることを示すグラフであり、ｑＲＴ−ＰＣＲで解析したｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＣＡ２に関連する転写物（ＰＣＰ２、ＣＡＣＮＡ１ＧおよびＩＴＰＲ１）の調節異常を示す。データは、平均値±ＳＤ、＊＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、ＡＴＸＮ２とＳｔａｕｆｅｎ１がＳＧ様凝集体に共局在することを示す画像を示す。野生型およびＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８  ＫＩ細胞からの代表的な免疫組織化学的画像は、Ｓｔａｕｆｅｎ１（緑）およびＡＴＸＮ２（赤）に対する抗体で染色され、ＡＴＸＮ２およびＳｔａｕｆｅｎ１の両方に陽性のＳＧ様構造の存在を示す。それぞれの抗体についてのすべての画像は、同じ露光時間で撮影した。スケールバー＝１００μＭである。
【図１５Ａ】図１５Ａは、変異型ＡＴＸＮ２過剰発現ＨＥＫ−２９３細胞のウエスタンブロット分析であり、Ｓｔａｕｆｅｎ１、Ｐ−ｍＴＯＲ、ｐ６２および処理されたＬＣ３−ＩＩの増加したレベルを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、バフィロマイシンＡ１がＳｔａｕｆｅｎ１クリアランスを低下させることを示すウエスタンブロット分析である。ＨＥＫ−２９３およびＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８ノックイン細胞を、６時間Ｂａｆで用量的に処理し、ウエスタンブロットにより分析した。Ｂａｆ処理は、無処理細胞と比較して、両細胞型ともに、処理されたＬＣ３−ＩＩ、およびｐ６２とＳｔａｕｆｅｎ１のレベルが用量的に増加したことを示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、Ｓｔａｕｆｅｎ１を過剰発現させたＨＥＫ−２９３細胞抽出物のウエスタンブロット分析であり、ＰＣＰ２タンパク質レベル（小脳転写因子Ｐｃｐ２）の減少、およびＰ−ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲ、ｐ６２およびＬＣ３−ＩＩレベルの増加を示す。β−アクチンをローディングコントロールとして使用し、３つの独立した実験の代表的なブロットを示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＳＴＡＵＦＥＮ１枯渇がＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８  ＫＩ細胞におけるオートファジー経路タンパク質を回復することを示すウエスタンブロット分析である。細胞をＳＴＡＵ１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、ウエスタンブロットにより分析した。ＳＴＡＵＦＥＮ１欠損ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８  ＫＩ細胞は、ＡＴＸＮ２定常状態レベルに影響を与えることなく、オートファジー経路タンパク質の回復を示した。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ＡＴＸＮ２  ｓｉＲＮＡが、ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８  ＫＩ細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１のアバンダンスを低下させ、オートファジー経路タンパク質を正常化することを示すウエスタンブロット分析である。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、生後８、１２、１６および２０週齢のロータロッド行動によって決定されるＡＴＸＮ２Ｑ１２７マウスの異常な運動行動を、Ｓｔａｕ１ハプロイン不全が改善することを示すグラフである。ＡＴＸＮ２Ｑ１２７；Ｓｔａｕ１＋／−マウス（緑）は、ＡＴＸＮ２Ｑ１２７マウス（赤）と比較して、生後１２週齢から２０週齢の時点でロタロド行動が改善された。値は平均値±ＳＥを示す。有意性は、一般化推定式（ＧＥＥ）を用いて決定した。ＮＳ、有意でない、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１６Ｄ】図１６Ｄは、２０週齢で正常および５０％Ｓｔａｕｆｅｎ１減少を有する野生型およびトランスジェニック動物からの小脳抽出物のウエスタンブロット分析である。ＰＣタンパク質は、２つのＳＣＡ２マウスモデルにおける疾患の進行と密接に相関する。リン酸化されたｍＴｏｒ、総ｍＴｏｒ、ｐ６２、ＬＣ３−ＩＩはオートファゴソーム機能のマーカーである。各レーンは、個々のマウスからの小脳抽出物を表す。β−アクチンは、ローディングコントロールとして使用され、ブロットは、３つの複製実験からのものである。
【図１６Ｅ】図１６Ｅは、図１６Ｄおよび図２０に示すウエスタンブロットの定量分析のグラフである。１６Ｄおよび２０である。データは、平均±ＳＤ、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定。
【図１６Ｆ】図１６Ｆは、図１６Ｄおよび２０に示されたウェスタンブロットの定量分析のグラフである。１６Ｄおよび２０のグラフである。データは、平均±ＳＤ、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ＨＥＫ−２９３およびＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８  ＫＩ細胞をラパマイシンで２４時間用量別に処理した後、ウエスタンブロットを行ったウエスタンブロット分析である。その結果、ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８ＫＩ  細胞のＳｔａｕｆｅｎ１、ｐ６２、ＬＣ３−ＩＩの上昇量は、対照のＨＥＫ−２９３細胞では減少したが、対照のＨＥＫ−２９３細胞では減少しなかった。β−アクチンをローディングコントロールとして使用し、３つの独立した実験の代表的なブロットを示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ＲＮＡｉ媒介のｍＴＯＲ枯渇がＳｔａｕｆｅｎ１を低下させ、オートファジーマーカータンパク質を改善することを示すウエスタンブロット分析である。ＨＥＫ−２９３およびＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８  ＫＩ細胞をｍＴＯＲ  ＲＮＡｉでトランスフェクションし、細胞をトランスフェクション後４日目にウエスタンブロットによって分析した。ｍＴＯＲ  ＲＮＡｉ媒介ｍＴＯＲおよびｐｈｏｓｐｈｏ−ｍＴＯＲ枯渇は、対照ＨＥＫ−２９３細胞におけるそれらのレベルに影響を与えることなく、ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８  ＫＩ細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１およびオートファジー経路タンパク質成分のレベルを低下させたことを示す。β−アクチンをローディングコントロールとして使用し、３つの独立した実験の代表的なブロットを示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、正常（ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／２２）およびＳＣＡ２（ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５２）ＬＢＣをＳＴＡＵ１  ＲＮＡｉでエレクトロポレーションし、エレクトロポレーション後４日後にＳｔａｕｆｅｎ１レベルをウエスタンブロットにより決定したウエスタンブロット分析である。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、図１８Ａのブロットの定量のグラフである。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、Ｓｔａｕｆｅｎ１の枯渇がＳＣＡ２−ＬＢＣｓにおけるＰＣＰ２転写物レベルの増加と関連することを示すグラフであり、ＰＣＰ２転写物レベルを測定するために一致した培養物をｑＲＴ−ＰＣＲ分析に使用した場合のグラフである。ＰＣＰ２  ｍＲＮＡは、正常ＬＢＣではＳｔａｕｆｅｎ１ノックダウンに反応しなかった。Ｓｔａｕｆｅｎ１サイレンシングは、正常ＬＢＣおよびＳＣＡ２−ＬＢＣにおいてＡＴＸＮ２転写物の定常レベルを変化させなかった。β−アクチンおよびＧＡＰＤＨ  ＲＮＡは、それぞれウエスタンブロットおよびｑＲＴＰＣＲ解析の内部コントロールとして使用した。アクチンに対する豊富さは、密度測定により決定した。３つの独立した実験からの結果を示す。データは、平均±ＳＤ、＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。
【図１９Ａ】図１９Ａは、Ｓｔａｕｆｅｎ１過剰発現がＰＣＰ２のｍＲＮＡ量を減少させたことを示すグラフである。全ＲＮＡを、フラグタグ付きＳｔａｕｆｅｎ１を過剰発現させたＨＥＫ−２９３細胞（図１５Ｃ）の１アリコートから単離し、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析に供した。Ｓｔａｕｆｅｎ１を過剰発現させた細胞は、ＰＣＰ２のｍＲＮＡが減少したが、ＡＴＸＮ２のｍＲＮＡは減少しなかった。遺伝子発現レベルはＧＡＰＤＨに正規化した。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、ルシフェラーゼ活性の低下を示し、ＰＣＰ２の３'ＵＴＲがルシフェラーゼ発現プラスミドの下流にクローニングされたＳＨＳＹ５Ｙ細胞におけるルシフェラーゼ−ＰＣＰ２−３'ＵＴＲおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発現プラスミドとのフラグタグ付きＳＴＡＵ１の共トランスフェクションのグラフである。ルシフェラーゼ発現は、トランスフェクションの均等性を制御するために、レニラ・ルシフェラーゼ発現で正規化した。データは、平均値±ＳＤ、＊＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定。
【図２０】図２０は、Ｃａｌｂ１、Ｐｃｐ２、Ｐｃｐ４、Ｒｇｓ８、Ｈｏｍｅｒ３、Ｆａｍ１０７ｂおよびオートファジー経路タンパク質の回復を示す１８週齢で交配されたＡＴＸＮ２Ｑ１２７；Ｓｔａｕ１−／−からの小脳抽出物のウエスタンブロット分析である。各レーンは、個々のマウスからの小脳抽出物を表し、β−アクチンをローディングコントロールとして使用し、ブロットは３つの複製ブロットからのものである。図１６Ｅ〜１６Ｆに示すウエスタンブロットの定量分析。１６Ｅ〜１６Ｆ。
【図２１Ａ】図２１Ａは、ＴＤＰ−４３  Ｇ２９８Ｓ変異（２回負荷）を有する患者線維芽細胞株においてＳＴＡＵ１が上昇することを示すウエスタンブロット分析である。ＳＣＡ２  ＦＢはポジティブコントロールとして機能する。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、非変異型ＴＤＰ−４３または切断されたＴＤＰ−２５を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞においてＳＴＡＵ１が上昇することを示すウエスタンブロット分析である。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、変異型ＴＤＰ−４３を過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞においてＳＴＡＵ１が上昇することを示すウエスタンブロット解析である。
【図２１Ｄ】図２１Ｄは、非変異体または変異体ＴＤＰ−４３をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において、ＳＴＡＵ１およびＬＣ３−ＩＩＩが増加することを示すウエスタンブロット分析である。
【図２２Ａ】図２２Ａは、拡張Ｃ９ＯＲＦ７２を有する３つの異なる患者線維芽細胞（１  ＰＤ、２&３  ＦＴＤ）と３つの異なる対照系統との比較においてＳＴＡＵ１が上昇することを示すウエスタンブロット分析である。ＳＴＡＵ１の上昇は、タウ（ＭＡＰＴ）変異を有するＰＤ患者線維芽細胞においても見られる。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、正常リピートＣ９ＯＲＦ７２を過剰発現したＨＥＫ２９３細胞において、ＳＴＡＵ１およびＬＣ３−ＩＩＩが上昇することを示すウエスタンブロット分析である。ＴＤＰ−４３をポジティブコントロールとして含まれた。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞におけるＴａｕ（Ｐ３０１Ｌ）またはＡＰＰ（Ｓｗｅ／Ｉｎｄ変異）の過剰発現がＳＴＡＵ１レベルを上昇させたことを示すウエスタンブロット分析である。上側のブロットは、ＧＦＰ、ＦＬＡＧ、およびアクチン抗体で検出された。ＴＤＰ−４３はポジティブコントロールとして含まれた。
【図２３Ａ】図２３Ａは、正常な対照と比較してＳＴＡＵ１レベルの増加を示すＴＤＰ−４３を有するＡＬＳ  ＦＢからの抽出物のウエスタンブロット分析を示す。全てのＦＢ抽出物は、対照ＦＢと比較して、ｍＴＯＲおよびＰ−ｍＴＯＲレベルの増加、ｐ６２およびＬＣ３−ＩＩレベルの増加を示す。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、正常な対照と比較してＳＴＡＵ１レベルの増加を示すＣ９ｏｒｆ７２変異を有するＡＬＳ  ＦＢからの抽出物のウエスタンブロット分析を示す。全てのＦＢ抽出物は、対照ＦＢと比較して、ｍＴＯＲおよびＰ−ｍＴＯＲレベルの増加、ｐ６２およびＬＣ３−ＩＩレベルの増加を示す。
【図２３Ｃ】図２３Ｃは、正常な対照と比較して増加したＳＴＡＵ１レベルを示すＨＤ  ＦＢからの抽出物のウエスタンブロット分析を示す。すべてのＦＢ抽出物は、対照ＦＢと比較して、ｍＴＯＲおよびＰ−ｍＴＯＲレベルの増加、およびｐ６２およびＬＣ３−ＩＩレベルの増加を示す。
【図２３Ｄ】図２３Ｄは、ＡＤ  ＦＢ［（ＰＳＥＮ１変異：Ｍ１４６Ｉ、Ｅ１８４ＤおよびＩｎｔｒｏｎ４  Ｖａｒ）およびＭＡＰＴ変異：（Ｎ２７９Ｋ）］からの抽出物のウエスタンブロット分析が、正常なコントロールと比較して増加したＳＴＡＵ１レベルを示すことを示す。すべてのＦＢ抽出物は、コントロールＦＢと比較して増加したｍＴＯＲおよびＰ−ｍＴＯＲレベル、および増加したｐ６２およびＬＣ３−ＩＩレベルを示す。β−アクチンをローディングコントロールとして使用し、３つの独立した実験の代表的なブロットを示す。
【図２３Ｅ】図２３Ｅは、正常なコントロールと比較して増加したＳＴＡＵ１レベルを示すＳＣＡ２  ＦＢからの抽出物のウエスタンブロット分析を示す。すべてのＦＢ抽出物は、コントロールＦＢと比較して、ｍＴＯＲおよびＰ−ｍＴＯＲレベルの増加、およびｐ６２およびＬＣ３−ＩＩレベルの増加を示した。
【図２４Ａ】図２４Ａは、ＡＬＳ、ＡＤ、ＨＤおよびＳＣＡ２  ＦＢのｑＲＴ−ＰＣＲ分析が、対照細胞と比較してＳＴＡＵ１のｍＲＮＡレベルが変化していないことを明らかにしたことを示す。遺伝子発現レベルはＡｃｔｉｎに正規化した。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、ＡＬＳ、ＡＤ、ＨＤおよびＳＣＡ２  ＦＢのｑＲＴ−ＰＣＲ解析により、対照細胞と比較してｍＴＯＲのｍＲＮＡレベルが変化していないことを示す。遺伝子発現レベルはＡｃｔｉｎに正規化した。
【図２４Ｃ】図２４Ｃは、ＡＴＸＮ２Ｑ１２７マウス（２４週齢、１群３匹）の小脳（ＣＢ）および脊髄（ＳＣ）ＲＮＡ由来のＳｔａｕ１およびｍＴｏｒ  ｍＲＮＡを野生型マウスと比較したｑＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。
【図２４Ｄ】図２４Ｄは、野生型と比較したＴＤＰ−４３Ｔｇ／＋ヘミ接合性マウス（８週齢、１群３匹）の小脳（ＣＢ）および脊髄（ＳＣ）ＲＮＡからのＳｔａｕ１およびｍＴｏｒ  ｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。
【図２５Ａ】図２５Ａは、ウエスタンブロット上でＳＴＡＵ１、ｍＴＯＲレベルおよびｍＴＯＲ活性の増加（Ｐ−ｍＴＯＲ、Ｐ−Ｓ６およびＰ−４Ｅ−ＢＰ１レベルの増加）を示すＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９編集されたＡＴＸＮ２−Ｑ５８  ＫＩ細胞のウエスタンブロット分析を示す。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、外因性野生型ＴＤＰ−４３を発現するプラスミド構築物で４８時間トランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞のウエスタンブロット分析を示す。β−アクチンをローディングコントロールとして使用し、３つの独立した実験の代表的なブロットを示す。
【図２５Ｃ】図２５Ｃは、外因性変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ２９８Ｓ，Ａ３８２Ｔ，Ｇ３４８Ｃ，ＣＴＦ）を発現させたプラスミド構築物を４８時間かけてトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞のウエスタンブロット解析を示す。
【図２５Ｄ】図２５Ｄは、外因性ＴＡＵを発現するプラスミド構築物で４８時間トランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞のウエスタンブロット分析を示す。β−アクチンをローディングコントロールとして使用し、３つの独立した実験の代表的なブロットを示す。
【図２６Ａ】図２６Ａは、ＡＴＸＮ２Ｑ１２７マウス小脳抽出物のウエスタンブロット分析を示す（２４週齢；グループあたり３匹）。各レーンは、個々のマウスを表しています。β−アクチンは、負荷コントロールとして使用され、ブロットは、３つの複製実験から得られたものである。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、ＴＤＰ−４３Ｔｇ／＋ヘミ接合マウス（８週齢；各群３匹）からのＡＴＸＮ２Ｑ１２７マウス小脳抽出物のウエスタンブロット分析を示し、野生型リターメイト対照と比較してＳｔａｕ１、ｍＴｏｒｒおよびＰ−ｍＴｏｒ、ｐ６２およびＬＣ３−ＩＩＩレベルが増加したことを示す。各レーンは、個々のマウスを表す。β−アクチンをローディングコントロールとして使用し、ブロットは３つの実験からのものである。
【図２６Ｃ】図２６Ｃは、ＴＤＰ−４３Ｔｇ／＋ヘミ接合マウス（８週齢；各群３匹）からのＡＴＸＮ２Ｑ１２７マウス脊髄抽出物のウエスタンブロット分析を示し、野生型リターメイトコントロールと比較して、Ｓｔａｕ１、ｍＴｏｒｒおよびＰ−ｍＴｏｒ、ｐ６２およびＬＣ３−ＩＩＩレベルが増加したことを示す。各レーンは、個々のマウスを表す。β−アクチンをローディングコントロールとして使用し、ブロットは３つの実験からのものである。
【図２６Ｄ】図２６Ｄは、ＡＴＸＮ２Ｑ１２７マウス小脳抽出物のウエスタンブロット分析を示す（２０週齢；５匹／群）ＢＡＣ−Ｃ９ｏｒｆ７２マウス小脳抽出物のウエスタンブロット分析を示す（２０週齢；５匹／群）野生型対照と比較して、Ｓｔａｕ１、ｍＴｏｒおよびＰ−ｍＴｏｒ、ｐ６２およびＬＣ３−ＩＩＩレベルが増加していることを示す。各レーンは、個々のマウスを表す。
【図２７Ａ】図２７Ａは、外因性にフラグタグ付きＳＴＡＵ１を発現したＨＥＫ−２９３細胞のウエスタンブロット分析を示しており、トランスフェクションの４８時間後に分析され、ｍＴＯＲ、Ｐ−ｍＴＯＲ、ｐ６２およびＬＣ３−ＩＩレベルの増加を示す。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、トランスフェクション４８時間後に変化のないｍＴＯＲ  ｍＲＮＡレベルを示すｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ＲＮＡ発現レベルをＡＣＴＢに正規化した。
【図２７Ｃ】図２７Ｃは、ＦｌａｇまたはＦｌａｇ−ＳＴＡＵ１を発現する非ＲＮａｓｅ  Ａ処理したＨＥＫ−２９３全細胞抽出物をＦｌａｇ  ｍＡｂビーズで免疫沈降させた解析を示す。Ｆｌａｇ−ＳＴＡＵ１は、ＲＴ−ＰＣＲ分析によりｍＴＯＲ  ＲＮＡを引き下げた。
【図２７Ｄ】図２７Ｄは、５'ＵＴＲおよび３'ＵＴＲ配列を有するＤＩＧ標識ヒトｍＴＯＲ  ＲＮＡプローブの概略図である。
【図２７Ｅ】図２７Ｅは、ＳＴＡＵ１がｍＴＯＲ−５'ＵＴＲ  ＲＮＡ（ブロット２）と直接相互作用するが、ｍＴＯＲ−３'ＵＴＲ  ＲＮＡ（ブロット３）とは相互作用しないことを示すブロットである。細菌発現したＨｉｓ−ＳＴＡＵ１、Ｈｉｓ−ＧＦＰ、または対照の細菌ライセートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色したか、または抗Ｈｉｓ抗体（ブロット１）でウエスタンブロットした。タンパク質ブロットは、ＤＩＧ標識ｍＴＯＲ  ＲＮＡプローブとハイブリダイズした後、抗ＤＩＧ抗体で染色した。Ｈｉｓ−ＧＦＰは相互作用を示さない。
【図２７Ｆ】図２７Ｆは、ｍＴＯＲ−５'ＵＴＲ−ＬＵＣおよびＰＣＰ２−５'ＵＴＲ−ＬＵＣ（コントロール）レポーターの概略図である。
【図２７Ｇ】図２７Ｇは、ＳＴＡＵ１の外因性発現を示すウエスタンブロット分析を示す。
【図２７Ｈ】図２７Ｈは、外因性ＳＴＡＵ１発現が、ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、ｍＴＯＲ−５'ＵＴＲ−ＬＵＣ構築物の増加した発現を誘導するが、ＰＣＰ２−５'ＵＴＲ−ＬＵＣ（ＳＭＤのためのＰＣＰ２−３'ＵＴＲ基質）の増加した発現を誘導しないことを示すデータを示す。
【図２７Ｉ】図２７Ｉは、ＲＢＤ３を除いたＳＴＡＵ１および変異ＳＴＡＵ１（ＳＴＡＵ１［ＲＢＤ△３］）の概略図である。
【図２７Ｊ】図２７Ｊは、ＳＴＡＵ１構築物を単独でトランスフェクトしたまたはｍＴＯＲ−５'ＵＴＲ−ＬＵＣレポーター構築物を共トランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞のウエスタンブロット分析を示す。大幅に増加した内因性ｍＴＯＲレベルは、唯一のＲＢＤ３を保持するＳＴＡＵ１コンストラクトを介して達成された。
【図２７Ｋ】図２７Ｋは、ＳＴＡＵ１単独でトランスフェクトしたまたはｍＴＯＲ−５'ＵＴＲ−ＬＵＣレポーターコンストラクトを共トランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞のデータを示す。有意に増加したルシフェラーゼ活性は、唯一のＲＢＤ３を保持してＳＴＡＵ１コンストラクトを介して達成された。
【図２８Ａ】図２８Ａは、ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎで処理したＨＥＫ−２９３細胞のウエスタンブロット分析を示す。処置は、ＳＴＡＵ１、ｍＴＯＲおよびＰ−ｍＴＯＲレベルを増加させ、オートファジー活性を減少させた（ｐ６２およびＬＣ３−ＩＩレベルの増加）。β−アクチンをローディングコントロールとして使用した。３つの独立した実験の代表的なブロットを示す。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、チュニカマイシンで処理したＨＥＫ−２９３細胞のウエスタンブロット分析を示す。処置は、ＳＴＡＵ１、ｍＴＯＲおよびＰ−ｍＴＯＲレベルを増加させ、オートファジー活性を減少させた（ｐ６２およびＬＣ３−ＩＩレベルの増加させた）。β−アクチンをローディングコントロールとして使用した。３つの独立した実験の代表的なブロットを示す。
【図２８Ｃ】図２８Ｃは、アイオノマイシンで処理したＨＥＫ−２９３細胞のウエスタンブロット分析を示す。処置は、ＳＴＡＵ１、ｍＴＯＲおよびＰ−ｍＴＯＲレベルを増加させ、オートファジー活性を減少させた（ｐ６２およびＬＣ３−ＩＩレベルを増加させた）。β−アクチンをローディングコントロールとして使用した。３つの独立した実験の代表的なブロットを示す
【図２８Ｄ】図２８Ｄは、亜ヒ酸ナトリウムで処理したＨＥＫ−２９３細胞のウエスタンブロット分析を示す。処置は、ＳＴＡＵ１、ｍＴＯＲおよびＰ−ｍＴＯＲレベルを増加させ、オートファジー活性を低下させた（ｐ６２およびＬＣ３−ＩＩレベルの増加）。β−アクチンをローディングコントロールとして使用した。３つの独立した実験の代表的なブロットを示す。
【図２８Ｅ】図２８Ｅは、ハイパーサーミアで処理したＨＥＫ−２９３細胞のウエスタンブロット分析を示す。処置は、ＳＴＡＵ１、ｍＴＯＲおよびＰ−ｍＴＯＲレベルを増加させ、オートファジー活性を低下させた（ｐ６２およびＬＣ３−ＩＩレベルを増加させた）。β−アクチンをローディングコントロールとして使用した。３つの独立した実験の代表的なブロットを示す。
【図２８Ｆ】図２８Ｆは、マウスの皮質ニューロンをタプシガルギンで処理したデータを示し、Ｓｔａｕ１、ｍＴｏｒ、Ｐ−ｍＴｏｒ、ｐ６２、およびＬＣ３−ＩＩの増加も示した（左）が、Ｓｔａｕ１をヌルにしたニューロンは、タプシガルギンが媒介するこれらの遺伝子の誘導に抵抗性である（右）。３つの独立した実験の代表的なブロットを示す。
【図２９Ａ】図２９Ａは、ＳＴＡＵ１枯渇がｍＴＯＲ標的と同時にｍＴＯＲ活性を低下させ、ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８  ＫＩ細胞におけるオートファジー経路タンパク質を回復させることを示すデータを示す。細胞をＳＴＡＵ１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、ウエスタンブロットにより解析した。ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８  ＫＩ細胞でＳＴＡＵ１を欠失させると、ｍＴＯＲレベル、ｍＴＯＲ活性（Ｐ−ｍＴＯＲ、Ｐ−Ｓ６、Ｐ−４Ｅ−ＢＰ１レベルの低下）、ｐ６２およびＬＣ３−ＩＩレベルが低下し、オートファジー活性が回復したことが示された。β−アクチンは、ローディングコントロールとして使用され、ブロットは、３つの複製実験からのものである。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、フラグタグ付き野生型または変異型ＴＤＰ−４３または空ベクターを発現したＨＥＫ−２９３細胞のウエスタンブロットを示し、その後ＳＴＡＵ１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクションを行った。ＳＴＡＵ１の枯渇は、ＴＤＰ−４３を発現した細胞において、ｍＴＯＲレベルを低下させ、オートファジー経路タンパク質を回復させる。β−アクチンをローディングコントロールとして使用し、ブロットは３つのレプリケート実験からのものである。
【図２９Ｃ】図２９Ｃは、ＳＴＡＵ１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＡＬＳ−Ｃ９ｏｒｆ７２  ＦＢのデータを示し、ウエスタンブロット法で分析した。ＳＴＡＵ１枯渇は、Ｃ９ｏｒｆ７２変異を有する細胞において、ｍＴＯＲレベルを低下させ、オートファジー経路タンパク質を回復させる。β−アクチンをローディングコントロールとして使用し、ブロットは３回の実験からのものである。
【図３０】図３０は、ＳＴＡＵ１枯渇細胞がＴＤＰ−４３によるｍＴＯＲ活性化に抵抗性であることを示すデータを示す。ＨＥＫ−２９３細胞をＳＴＡＵ１  ｓｉＲＮＡで７２時間処理した後、フラグタグ付き野生型または変異型ＴＤＰ−４３で４８時間トランスフェクトし、その後ウエスタンブロットを行った。ＳＴＡＵ１欠損細胞は、対照細胞と比較して、疾患関連遺伝子の過剰発現に伴うｍＴＯＲ活性化に対して抵抗性を示した。β−アクチンをローディングコントロールとして使用し、ブロットは３回の複製実験から得たものである。
【図３１Ａ】図３１Ａは、Ｓｔａｕ１の減少は、ＡＴＸＮ２Ｑ１２７マウスにおけるｍＴｏｒ活性を減少させ、オートファジー経路タンパク質を回復させることを示すデータを示す。ＡＴＸＮ２Ｑ１２７とＳｔａｕ１＋／−マウス（３４週齢）の交配からの小脳抽出物のウェスタンブロットは、ｍＴｏｒ活性の減少およびｉｎ  ｖｉｖｏでのオートファジー経路タンパク質の正常化を示す。各レーンは、個々のマウスからの抽出物を表す。β−アクチンは、ローディングコントロールとして使用され、ブロットは、３つの複製実験からのものである。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、Ｓｔａｕ１の減少は、ＡＴＸＮ２Ｑ１２７マウスにおけるｍＴｏｒ活性を減少させ、オートファジー経路タンパク質を回復させることを示すデータを示す。ＡＴＸＮ２Ｑ１２７；Ｓｔａｕ１−／−マウス（２０週齢）からの小脳抽出物のウェスタンブロットは、ｍＴｏｒ活性の低下およびｉｎ  ｖｉｖｏでのオートファジー経路タンパク質の正常化を示す。各レーンは、個々のマウスからの抽出物を表す。β−アクチンは、ローディングコントロールとして使用され、ブロットは、３つの複製実験から得られたものである。
【図３１Ｃ】図３１Ｃは、ＳＴＡＵ１のためのハプロインテンシブなＴＤＰ−４３Ｔｇ／＋ヘミ接合性マウス（２２週齢）からの脊髄抽出物のウエスタンブロットを示し、ｍＴｏｒ活性の低下とオートファジー経路タンパク質の正常化を示す。各レーンは、個々のマウスからの抽出物を表す。β−アクチンは、ローディングコントロールとして使用され、ブロットは、３つのレプリケート実験からのものである。
【図３１Ｄ】図３１Ｄは、図３１Ａおよび３１Ｂに示されたウエスタンブロットの定量分析を示す。３１Ａおよび３１Ｂに示されたウエスタンブロットの定量分析を示す。データは、平均値±ＳＤ、＊＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ−検定。
【図３１Ｅ】図３１Ｅは、図３１Ｃに示されたウエスタンブロットの定量分析を示す。データは、平均±ＳＤ、＊＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ−検定。
【図３２Ａ】図３２Ａは、指示されたＡＳＯの２５０ｎＭまたはネガティブコントロールとしてのリン酸緩衝生理食塩水でトランスフェクションしたマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞についてのデータのグラフであり、Ｓｔａｕ１発現は、トランスフェクション後４日後に、エクソン４を標的とするプライマーを用いた定量的ＰＣＲによって決定された。すべてのＳｔａｕｆｅｎＡＳＯは、ヒトおよびマウスの両方のＳｔａｕｆｅｎ１配列を標的とし、５−１０−５  ＭＯＥギャップマーケミストリーを有した。
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、指示されたＡＳＯの２５０ｎＭまたはリン酸緩衝生理食塩水またはｓｉＲＮＡでトランスフェクションし、４日後にＳｔａｕｆｅｎ１発現をウエスタンブロッティングによって決定したマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞のデータのグラフである。すべてのＳｔａｕｆｅｎＡＳＯは、ヒトおよびマウスの両方のＳｔａｕｆｅｎ１配列を標的とし、５−１０−５  ２'−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）ギャップマーケミストリーを有した。
【図３２Ｃ】図３２Ｃは、指示されたＡＳＯまたはリン酸緩衝生理食塩水の指示された濃度でトランスフェクトし、４日後にＳＴＡＵ１発現を定量的ＰＣＲによって決定したＳＣＡ２患者由来皮膚細胞線維芽細胞（ＳＣＡ２−０３［Ｑ２２／Ｑ３５］）についてのデータのグラフである。すべてのＳｔａｕｆｅｎ  ＡＳＯは、ヒトおよびマウスの両方のＳｔａｕｆｅｎ１配列を標的とし、５−１０−５  ２'−ＭＯＥギャップマーケミストリーを有した。
【図３２Ｄ】図３２Ｄは、２５０ｍｇの示されたＡＳＯまたは生理食塩水を脳室内注射によって治療されたＴＤＰ−４３＋／−トランスジェニックマウスのデータを示す。１５日の処置後、脊髄を除去し、Ｓｔａｕ１発現を定量的ＰＣＲによって決定した。すべてのＳｔａｕｆｅｎＡＳＯは、ヒトおよびマウスの両方のＳｔａｕｆｅｎ１配列を標的とし、５−１０−５  ２'−ＭＯＥギャップマーケミストリーを有した。値は平均および標準偏差である。Ｎ数マウスは、５（ＰＢＳ）、４（ＵＵＵ００１８１）、１（ＵＵＵ００１８６）、２（ＵＵＵ００４５）、４（ＵＵＵ００１９３）、５（ＵＵＵ００１９９）であった。
【図３２Ｅ】図３２Ｅは、Ａｉｆ１発現を決定することによって評価された微小グリア症のデータを示し、対照と比較してＡｉｆ１発現が増加していないこと、または微小グリア症の証拠がないことを明らかにした。すべてのＳｔａｕｆｅｎＡＳＯは、ヒトおよびマウスの両方のＳｔａｕｆｅｎ１配列を標的とし、５−１０−５  ２'−ＭＯＥギャップマーケミストリーを有した。値は平均および標準偏差である。Ｎ数マウスは、５（ＰＢＳ）、４（ＵＵＵ００１８１）、１（ＵＵＵ００１８６）、２（ＵＵＵ００４５）、４（ＵＵＵ００１９３）、５（ＵＵＵ００１９９）であった。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
以下の詳細な説明は、図示の目的のために多くの具体的な内容を含んでいるが、当技術分野の通常の当業者であれば、以下の詳細な内容に対する多くの変形および変更が可能であり、本明細書に含まれると考えられることを理解するだろう。したがって、以下の実施形態は、一般性を損なうことなく、また、記載された請求項に限定を課すことなく、記載される。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのためのものであり、限定することを意図しないことを理解されたい。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する当技術分野の通常の熟練者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。
【０００５】
本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうでないことを指示しない限り、複数の参照語を明示的に支持することを含む。したがって、例えば、「ポリマー」への参照は、そのようなポリマーの複数を含むことができる。
【０００６】
本明細書で使用されるように、「被験体」は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤での処置から利益を得ることができる哺乳動物を指す。被験体が、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤が治療的に有効な治療または予防手段である疾患または状態を有するか、または発症する危険性がある場合、利益を得ることができる。いくつかの局面では、そのような対象はヒトであっても良い。
【０００７】
本明細書で使用されるように、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、または「治療の（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、組成物およびその投与形態を含む、ＳＴＡＵ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）などのＳｔａｕｆｅｎ１調節剤の投与と関連して使用される場合、無症候性または症候性のいずれかである被験者への投与を指す。言い換えれば、「治療する（ｔｒｅａｔ」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、または「治療の（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、対象に存在する状態に関連する症状を軽減、改善、または除去することができ、または予防的であり得る（すなわち、対象における症状の発生を予防または軽減することができる）。そのような予防的治療は、状態の予防とも呼ばれ得る。治療結果は、予想されるものであっても良いし、予想外のものであっても良い。ある特定の側面において、治療の結果は、疾患もしくは状態、またはその徴候もしくは症状の発生もしくは発症の遅延であり得る。別の側面では、治療は、対象者が悩まされる状態からの救済（すなわち、緩和）を対象者に提供すること、またはその状態の徴候または症状からの救済を提供することであり得る。
【０００８】
本明細書で使用されるように、「治療剤」とは、適切な量または効果的な量で対象者に投与されたときに、対象者に有益なまたは肯定的な効果をもたらすことができる薬剤を意味する。
【０００９】
本明細書で使用されるように、用語「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」または「阻害の（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」は、様々な阻害技術を参照するために使用される。例えば、「「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」または「阻害の（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」という用語は、転写前および／または転写後の阻害を指すことができる。転写前の阻害に関して、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」または「阻害の（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」という用語は、永久的、半永久的、または一過性であるかどうかにかかわらず、遺伝子の転写を防止または減少させること、遺伝子の改変された転写を誘導すること、および／または遺伝子の転写速度を減少させることを意味することができる。したがって、いくつかの例では、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」または「阻害の（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」は、ＤＮＡに対する恒久的な変化を指すことができ、他の例では、ＤＮＡに対する恒久的な変化は行われない。転写後の阻害に関して、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」または「阻害の（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」は、恒久的、半恒久的、または一過性のいずれであっても、タンパク質への遺伝的配列の翻訳を阻止または減少させること、改変されたタンパク質への遺伝的配列の改変された翻訳を誘導すること（例えば、ミスフォールドされたタンパク質などとして）、および／またはタンパク質への遺伝的配列の翻訳速度を減少させることを指すことができる。いくつかの特定の例において、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」または「阻害の（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」は、転写前の阻害を指すことができる。他の特定の例では、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」または「阻害の（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」は、転写後の阻害を指すことができる。もちろん、阻害のタイプは、採用される阻害剤（複数可）または治療剤（複数可）の特定のタイプ（複数可）に依存し得る。したがって、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」または「阻害の（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」は、転写前または転写後、部分的または完全なものであるかどうかにかかわらず、ネイティブ発現と比較して遺伝子の発現が減少することを含むことができる。
【００１０】
本明細書で使用されるように、用語「製剤」および「組成物」は互換的に使用され、２つ以上の化合物、元素、または分子の混合物を指す。いくつかの局面では、「製剤」および「組成物」という用語は、担体または他の賦形剤と１種以上の活性剤との混合物を指すために使用され得る。組成物は、固体、液体（すなわち溶液）、または気体を含む、ほぼすべての物理的状態をとり得る。さらに、「投与形態」という用語は、被験体への投与のための形態で提供される１つ以上の製剤（複数可）または組成物（複数可）を含むことができる。
【００１１】
活性成分の「有効量」、「治療的に有効な量」、または「治療的に有効な率」という表現は、薬剤が送達される疾患または状態の治療において治療的結果を達成するために、毒性はないが、活性成分または治療剤の十分な量または送達率を意味する。様々な生物学的要因が、意図されたタスクを実行するための物質の能力に影響を与え得ることが理解される。したがって、「有効量」、「治療的に有効な量」、または「治療的に有効な率（複数可）」は、いくつかの実施例において、そのような生物学的要因に依存する可能性がある。さらに、治療効果の達成は、当技術分野で知られる評価を使用して、医師または他の資格を有する医療従事者によって測定されても良いが、個人差および治療に対する応答が、治療効果の達成を主観的な決定にしても良いことが認識される。治療的に有効な量または送達率の決定は、薬学および医学の分野における通常の技術の範囲内で十分に可能である。例えば、Ｍｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｔｏｎａｓｃｉａ，"Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ．デザイン、実施、および分析、"Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ  ｉｎ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．８（１９８６）を参照のこと。
【００１２】
本明細書で使用されるように、「投与レジメン」または「治療投与レジメン」または「予防投与レジメン」のような「レジメン」とは、意図された治療または効果を達成するために、組成物の投与量をどのように、いつ、どのくらいの量、およびどのくらいの期間、被験者に投与することができるか、または投与すべきかを指す。
【００１３】
本明細書で使用されるように、「担体」および「薬学的に許容される担体」は互換的に使用され、任意の液体、ゲル、軟膏、溶媒、液体、希釈剤、液体軟膏基剤、リポソーム、ミセル、ジャイアントミセル、またはそのようなもの、または治療剤を標的細胞（例えば、神経細胞）へおよび／または標的細胞内へ送達するのに適した任意の他の適切な担体を指す。例えば、神経細胞）に送達するのに適しており、有害な生理学的応答を引き起こすことなく、被験体または被験体の組織と接触して使用するのに適しており、かつ組成物の他の成分と劇症的な方法で相互作用しない。
【００１４】
本出願において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびそのような用語は、米国特許法においてそれらに内接する意味を有し得、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、およびそのような意味を有し得、一般的にはオープンエンドの用語であると解釈される。「からなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」という用語は、閉鎖的な用語であり、そのような用語に関連して具体的に記載された構成要素、構造、工程、またはそのようなもの、および米国特許法に従ったもののみを含む。「から本質的になる（Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「から本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、米国特許法によって一般的にそれらに帰結される意味を有する。特に、このような用語は一般的に閉ざされた用語であり、それに関連して使用される項目の基本的かつ新規な特徴または機能に実質的に影響を与えない追加の項目、材料、構成要素、工程、または要素を含むことを認める例外を除いて、一般的に閉ざされた用語である。例えば、組成物中に存在するが、組成物の性質または特性に影響を与えない微量元素は、そのような用語に続く項目のリストに明示的に記載されていなくても、「本質的にからなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という言葉の下に存在する場合には許容されるであろう。本明細書において、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」や「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」のようなオープンエンドの用語を使用する場合には、明示的に述べられているかのように「から本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」言語と同様に「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」言語にも直接的な支持が与えられるべきであり、またその逆もまた然りであることが理解されよう。
【００１５】
本明細書および特許請求の範囲における「第一」、「第二」、「第三」、「第四」などの用語は、類似の要素を区別するために使用されており、必ずしも特定の順序または年代順を記述するために使用されているわけではない。そのように使用される任意の用語は、本明細書に記載された実施形態が、例えば、図示されているか、または別の方法で本明細書に記載されているものとは別の順序で動作可能であるような適切な状況下で互換性があることが理解されるだろう。同様に、方法が一連の工程からなるものとして本明細書に記載されている場合、本明細書に記載されているような工程の順序は、必ずしもそのような工程が実行され得る唯一の順序ではなく、記載される工程の一部が省略される可能性があり、および／または本明細書に記載されていない他の特定の工程が方法に追加される可能性がある。
【００１６】
本明細書で使用されるように、用語「実質的に」とは、行為、特性、特性、性質、状態、構造、項目、または結果の完全なまたはほぼ完全な範囲または程度を意味する。例えば、「実質的に」囲まれる物体は、その物体が完全に囲まれるか、またはほぼ完全に囲まれることを意味する。絶対的完全性からの正確な許容される逸脱の程度は、場合によっては特定の文脈に依存することがある。しかし、一般的には、完成の近さは、絶対的な完全な完成が得られた場合と同様の全体的な結果が得られるようになる。「実質的に」の使用は、ある作用、特性、特性、性質、状態、構造、項目、または結果の完全なまたは完全に近い欠如を指すために否定的な意味合いで使用される場合にも同様に適用可能である。例えば、「実質的に粒子を含まない」組成物は、完全に粒子を欠いているか、またはほぼ完全に粒子を欠いているので、効果は完全に粒子を欠いている場合と同じだろう。言い換えれば、成分または要素を「実質的に含まない」組成物は、測定可能な効果がない限り、そのような項目を実際に含んでいても良い。
【００１７】
本明細書で使用されるように、「約」という用語は、所与の値が終点を「少し上」または「少し下」にしても良いことを提供することによって、数値範囲の終点に柔軟性を提供するために使用される。別段の記載がない限り、特定の数値または数値範囲に応じて「約」という用語を使用することは、「約」という用語を使用せずに、そのような数値用語または数値範囲のサポートを提供することも理解されるべきである。例えば、便宜上および簡潔さのために、「約５０ミリグラム〜約８０ミリグラム」の数値範囲は、「５０ミリグラム〜８０ミリグラム」の範囲の支持を提供することも理解されるべきである。さらに、本明細書では、「約」という用語が使用されている場合でも、実際の数値のサポートが提供されることを理解されるべきである。例えば、「約」３０の暗唱は、３０の少し上の値および少し下の値の支持を提供するだけでなく、同様に３０の実際の数値の支持を提供するものと解釈されるべきである。
【００１８】
本明細書で使用されるように、複数の項目、構造要素、構成要素、および／または材料が、便宜上、共通のリストで提示されても良い。しかしながら、これらのリストは、リストの各メンバーが個々に個別の固有のメンバーとして識別されているかのように解釈されるべきである。したがって、このようなリストのいかなる個々のメンバーも、それとは反対のことを示すことなく、共通のグループ内でのそれらの提示にのみ基づいて、同じリストの他のメンバーの事実上の等価なものとして解釈されるべきではない。
【００１９】
濃度、量、およびその他の数値データは、本明細書では、範囲の形式で表現または表示されても良い。このような範囲の形式は、単に便宜上および簡潔さのために使用され、したがって、範囲の限界として明示的に言及された数値だけでなく、各数値およびサブ範囲が明示的に言及されているかのように、その範囲内に包含されるすべての個々の数値またはサブ範囲を包含するように柔軟に解釈されるべきであることが理解されるべきである。例示として、「約１〜約５」という数値範囲は、「約１〜約５」という明示的に暗唱された数値だけでなく、指示された範囲内に包含される個々の数値やサブレンジも含むと解釈されるべきである。したがって、この数値範囲には、２、３、４などの個別の値と、１〜３、２〜４、３〜５などのサブレンジ、および１、２、３、４、５などの個別の値が含まれる。
【００２０】
この原則は、最小値または最大値として１つの数値のみを記載した範囲にも適用される。さらに、このような解釈は、範囲の幅や記載されている特性に関係なく適用されるべきである。
【００２１】
本願では、「改善された」または「強化された」性能を提供する組成物、システム、または方法について言及しても良い。別段の記載がない限り、そのような「改善」または「強化」は、先行技術における組成物、システムまたは方法との比較に基づいて得られる利益の尺度であることが理解されるべきである。さらに、改善または強化された性能の程度は、開示された実施形態の間で変化し得ること、および改善または強化の量、程度、または実現における均等性または一貫性が、普遍的に適用可能であると仮定されないことが理解されるべきである。
【００２２】
本明細書全体を通して「実施例において」と言及することは、実施例に関連して記載された特定の特徴、構造、または特性が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書中の様々な場所での「例示的な」という表現の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を参照しているわけではない。
【実施例】
【００２３】
例示的な実施形態
本発明の実施形態の最初の概要が以下に提供され、その後、特定の実施形態がさらに詳細に説明される。この初期概要は、読者が技術的概念をより迅速に理解するのを助けることを意図するが、その重要なまたは本質的な特徴を特定することを意図しておらず、また、請求された主題の範囲を限定することを意図していない。
【００２４】
神経学的障害は、先天的異常、環境因子、遺伝的障害、感染症、傷害、生活習慣、および／または栄養不良などの様々な原因に起因し得る。
【００２５】
一例として、常染色体優性小脳失調症（ＡＤＣＡｓ）は、小脳、脳幹、および脊髄の進行性変性によって特徴づけられる神経変性疾患の不均一なグループである。退化は細胞レベルで起こり、特定のサブタイプでは細胞死に至る。細胞死または機能不全は、中枢神経系から体内の標的筋肉への通信ラインを妨害することがある。
【００２６】
臨床的には、ＡＤＣＡは、３つのタイプ（ＡＤＣＡタイプＩ、ＩＩＩ、およびＩＩＩ）に分けられており、これらはさらに様々なサブタイプに分けられる。これらのタイプやサブタイプはそれぞれ、様々な悪影響を及ぼす可能性がある。タイプＩのＡＤＣＡ、サブタイプ１の状態は、典型的には、ポリグルタミンをコードするＤＮＡ中のＣＡＧヌクレオチドリピートによって特徴付けられる。これらのポリグルタミンセグメントは、タンパク質レベルで変性効果を引き起こし得る。非限定的な例として、ＡＤＣＡタイプＩ、サブタイプ１の状態は、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ１７、およびＤＲＰＬＡなどを含むことができる。しかしながら、多くの神経変性疾患は、ＣＡＧヌクレオチドリピート以外の他のトリヌクレオチドリピート拡張、または他の遺伝的リピート拡張と関連する可能性がある。
【００２７】
神経変性疾患の一例として、スピノ小脳性失調症２型（ＳＣＡ２）は、小脳プルキンエ細胞（ＰＣ）の進行性変性、および脳幹および脊髄内のニューロンの選択的損失によって特徴づけられる常染色体優性小脳性失調症である。前述のように、ＳＣＡ２の遺伝的欠損は、ＡＴＸＮ２遺伝子のエクソン１におけるＣＡＧリピート（ポリグルタミンをコードする）の拡大である。ポリグルタミンが過剰になった変異型アタキシン−２（ＡＴＸＮ２）タンパク質は、機能の獲得を獲得し、ＳＣＡ２脳内で凝集を示す。ＡＴＸＮ２の凝集と小脳ＰＣの変性、およびＲＮＡ発現の変化は、ＳＣＡ２細胞における拡大したＣＡＧリピート発現の病理学的結果である。
【００２８】
ＡＴＸＮ２は哺乳類の神経系で広く発現する。ＡＴＸＮ２はＥＧＦ受容体であるイノシトール１，４，５−三リン酸受容体（ＩＰ３Ｒ）の制御に関与しており、トランスレーショナルコントロールや胚発生にも関与する。ＡＴＸＮ２は、ＲＮＡスプライシング因子Ａ２ＢＰ１／Ｆｏｘ１、ｐｏｌｙＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  （ＰＡＢＰ１）、ＤＤＸ６、Ｔａｒ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−４３（ＴＤＰ−４３）などの複数のＲＮＡ結合タンパク質と相互作用し、ＲＮＡ代謝に特異的な役割を果たすことを示す。さらに、ＡＴＸＮ２はストレス顆粒（ＳＧ）やＰ−ｂｏｄｙなどの細胞内構成要素の構成タンパク質であり、ストレス時のｍＲＮＡの隔離やタンパク質の翻訳制御にも関与していることが明らかになった。
【００２９】
さらに、二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質であるＳＴＡｕｆｅｎ１（ＳＴＡＵ１）やＳＴＡｕｆｅｎ−２（ＳＴＡＵ２）は、脳オリゴデンドロサイトなどの培養細胞の細胞質内包物にリクルートされ、ストレス顆粒のダイナミクスを調節することができる。Ｓｔａｕｆｅｎ１は、細胞ストレス下でＲＮＡ顆粒に局在するタンパク質であるだけでなく、ｍＲＮＡの輸送や分解など、多くのＲＮＡ関連機能を果たすことができる。Ｓｔａｕｆｅｎ１は、脊椎動物の卵母細胞と体細胞の両方でｍＲＮＡ輸送に関連するが、Ｓｔａｕｆｅｎ１は様々な細胞タイプのＲＮＡ代謝調節に関与する多機能タンパク質である。さらに、Ｓｔａｕｆｅｎ１は５'ＵＴＲを介してｍＲＮＡの翻訳効率を制御し、３'ＵＴＲを介して転写物の安定性を制御することができ、そのメカニズムはシュタウフェン媒介ＲＮＡ崩壊（ＳＭＤ）と言及される。
【００３０】
翻訳、輸送、貯蔵、分解を含むＲＮＡ代謝は、健康と疾患の両方において細胞機能に重要な役割を担うことが指摘される。ストレス顆粒は、細胞ストレス時に翻訳を調節し、ＲＮＡ顆粒はｍＲＮＡの輸送や局所的な発現制御を調節することができるため、ＲＮＡ代謝に重要な役割を果たす。ＳＧは、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡのほか、細胞ごとに異なるタンパク質の特定の補体で構成される。
【００３１】
このことを考慮すると、ＡＴＸＮ２は、ＰＡＢＰ１、Ａ２ＢＰ１／Ｆｏｘ１、ＤＤＸ６およびＴＤＰ−４３を含む複数のＲＮＡ結合タンパク質と相互作用することができ、ＲＮＡ代謝におけるＡＴＸＮ２のユニークな役割を示唆する。さらに、Ｓｔａｕｆｅｎ１はＡＴＸＮ２のＲＮＡ依存性インタラクターである。タンパク質−タンパク質相互作用の強さは、野生型および変異型ＡＴＸＮ２については差がないようであるが、変異型ＡＴＸＮ２の存在下では、定常状態のＳｔａｕｆｅｎ１レベルは、ＳＣＡ２患者由来細胞において大幅に増加することができる。したがって、本明細書中でさらに詳細に記載されるように、いくつかの実施形態では、変異型ＡＴＸＮ２タンパク質中のポリグルタミン領域の拡張、またはポリヌクレオチド拡張を有する他のタンパク質は、ＳＣＡ２患者由来細胞中のＳｔａｕｆｅｎ１レベルの増加を促進することができる。さらにまた、神経細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１のレベルの増加は、ＡＤＣＡ（例えば、ＡＤＣＡタイプＩ、サブタイプ１など）および他の神経変性疾患の劇症的効果において重要な役割を果たし得る。
【００３２】
いくつかの追加の例として、ヒト第９染色体オープンリーディングフレーム７２（ｃ９ｏｒｆ７２）は、遺伝子ｃ９ｏｒｆ７２によってエンドコードされるタンパク質である。しかしながら、Ｃ９ｏｒｆｆ７２の変異は、少なくとも家族性前頭側頭葉性痴呆症（ＦＴＤ）と筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）との間の遺伝的関連性であることが確認される。より詳細には、Ｃ９ｏｒｆ７２の変異は、６文字列のヌクレオチドＧＧＧＧＧＣＣのヘキサヌクレオチドリピート拡大である。通常、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子中に存在するこれらのヘキサヌクレオチドリピートは約２０〜３０個以下である。しかしながら、Ｃ９ｏｒｆ７２変異が存在する場合、このヘキサヌクレオチドリピートは、３０回を超える頻度で（例えば、１００回を超える頻度で）発生し得る。この変異は、Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質の正常な発現を阻害し得る。
【００３３】
また、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ−４３）は、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子によってコードされるタンパク質である。しかしながら、ＴＡＲＤＢＰ遺伝子および／またはＴＤＰ−４３における変異は、ＴＤＰ−４３の病原性形態を引き起こし得、これは、例えば、前頭側頭型認知症の特定の形態、ＡＬＳ、慢性外傷性脳症、アルツハイマー病の特定のサブセットなどの多くの神経疾患と関連し得る。
【００３４】
さらに、タウタンパク質は、微小管関連タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）として指定された単一の遺伝子からの代替スプライシングの産物である。しかしながら、ＭＡＰＴおよび／またはタウタンパク質における特定の変異は、タウの病原性フロムをもたらし、これは、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、および他の様々な神経学的障害などの多くの神経学的障害に関連し得る。
【００３５】
さらに、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）は、ニューロンのシナプスに集中している膜タンパク質である。しかしながら、ＡＰＰおよび／またはＡＰＰの変異は、アルツハイマー病の家族性感受性と関連し得る。
【００３６】
このように、様々な変異が神経疾患に関与し得る。しかしながら、非限定的な例として、Ｓｔａｕｆｅｎ１レベルは、ＡＸＴＮ２におけるＣＡＧリピートエクスポジションを有する細胞において、Ｃ９ｏｒｆ７２におけるヘキサヌクレオチドリピートエクスポジションを有する細胞において、ＴＤＰ−４３変異を有する細胞において、ＭＡＰＴ変異を有する細胞において、およびＡＰＰ変異を有する細胞において、増加させることができる。これは、本明細書でさらに詳細に記載されるように、Ｓｔａｕｆｅｎ１が直接または間接的に標的化されているかどうかにかかわらず、Ｓｔａｕｆｅｎ１が様々な神経疾患の治療において貴重な治療標的となり得ることを示す追加の証拠である。
【００３７】
従って、本開示は、標的細胞（例えば、神経細胞）におけるＳｔａｕｆｅｎ１のレベルまたは活性を正常化または制御するための組成物および方法を記載する。一つの非限定的な例として、Ｓｔａｕｆｅｎ１関連ＲＮＡ代謝の調節障害を最小化する方法が記載されている。方法は、調節異常を最小化するのに十分な量のＳｔａｕｆｅｎ１調節剤を標的細胞に導入する工程を含むことができる。
【００３８】
Ｓｔａｕｆｅｎ１活性を制御する方法も記載される。方法は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤を導入する前または導入しない前のＳｔａｕｆｅｎ１活性と比較して、Ｓｔａｕｆｅｎ１活性を低下させるのに十分な量のＳｔａｕｆｅｎ１調節剤を標的細胞に導入する工程を含むことができる。
【００３９】
さらに、標的細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１蓄積を制御する方法が記載される。方法は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤を導入する前または導入しない前の標的細胞内の濃度と比較し、標的細胞内のＳｔａｕｆｅｎ１の濃度を低下させるのに十分な量のＳｔａｕｆｅｎ１調節剤を標的細胞に導入する工程を含むことができる。
【００４０】
さらにまた、Ｓｔａｕｆｅｎ１誘導性ＲＮＡ代謝異常に関連する神経変性疾患を治療する方法が記載される。方法は、治療上有効な量のＳｔａｕｆｅｎ１調節剤を被験者の標的細胞に投与する工程を含むことができる。
【００４１】
ＲＮＡ代謝のＳｔａｕｆｅｎ１誘発性調節障害に関連する神経変性疾患を治療するための治療剤または組成物も記載される。治療剤は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤であり得る。治療用組成物は、治療上有効な量のＳｔａｕｆｅｎ１調節剤と、薬学的に許容される担体とを含むことができる。
【００４２】
本開示において、様々な方法、治療剤、および治療用組成物を議論する際に、これらの議論の各々は、その例の文脈で明示的に議論されるか否かにかかわらず、これらの例の各々に適用可能であると考えられることに留意されたい。したがって、例えば、方法そのものについての詳細な議論において、そのような議論はまた、本明細書に記載された他の方法、治療剤、治療用組成物、治療用投与量および形態、およびその逆も参照する。
【００４３】
さらに詳細には、本開示は、Ｓｔａｕｆｅｎ１関連ＲＮＡ代謝の調節障害を最小化する方法を記載する。上述したように、Ｓｔａｕｆｅｎ１は、例えば、ｍＲＮＡ輸送および分解などの多くのＲＮＡ関連機能を実行することができる。したがって、いくつかの例では、標的細胞において上昇したＳｔａｕｆｅｎ１レベルを有することは、Ｓｔａｕｆｅｎ１関連ＲＮＡ代謝の調節障害をもたらし得る。さらに、いくつかの例では、標的細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１のレベルの上昇は、様々な細胞成分の望ましくない加速された分解をもたらすことができる。従って、方法は、ＲＮＡ代謝のＳｔａｕｆｅｎ１関連の調節障害を最小化するために、十分な量のＳｔａｕｆｅｎ１調節剤を標的細胞に導入することを含むことができる。
【００４４】
種々のＳｔａｕｆｅｎ１調節剤が、本明細書に記載された方法において採用され得る。Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤をそれ自体で論じる場合、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、Ｓｔａｕｆｅｎ１と直接相互作用することなく、Ｓｔａｕｆｅｎ１を調節するように作用または機能し得ることが理解されるべきであることに留意されたい。例えば、いくつかの例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、Ｓｔａｕｆｅｎ１を調節するためにＳｔａｕｆｅｎ１から上流に作用する薬剤であり得る。非限定的な例として、いくつかの実施例において、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、変異体ＡＴＸＮ２の発現を阻害する治療剤であり得る。このようにして、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、Ｓｔａｕｆｅｎ１タンパク質またはＳＴＡＵ１遺伝子と直接相互作用することなく、むしろ、寿命、滞留時間、結合利用可能性、安定性、細胞蓄積などの特性または挙動を含むＳｔａｕｆｅｎ１タンパク質に直接または間接的に影響を与える細胞成分または遺伝子との間で、Ｓｔａｕｆｅｎ１の調節を促進することができる。したがって、いくつかの例では、有効なＳｔａｕｆｅｎ１調節剤はまた、Ｓｔａｕｆｅｎ１の調節を促進するために変異対立遺伝子を野生型対立遺伝子に改変するためのような遺伝子治療剤を含むことができる。
【００４５】
非限定的な例として、いくつかの実施形態では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、Ｓｔａｕｆｅｎ１阻害剤であるか、またはそれを含むことができる。Ｓｔａｕｆｅｎ１阻害剤は、標的細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１の転写または翻訳を完全にまたは部分的に阻害する任意の剤を含むことができる。いくつかの追加の例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、Ｓｔａｕｆｅｎ１不活性化剤であるか、またはそれを含むことができる。Ｓｔａｕｆｅｎ１不活性化剤は、標的細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１タンパク質のＲＮＡ代謝（例えば、ＲＮＡ輸送、ＲＮＡ分解など）機能を低下または排除するように、Ｓｔａｕｆｅｎ１タンパク質に結合、分解などを行う任意の剤を含むことができる。いくつかの例において、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、Ｓｔａｕｆｅｎ１とｍＲＮＡとの相互作用を減少させるかまたは遮断することができ、その結果、ｍＲＮＡの発現または豊富さが変化することができる。
【００４６】
いくつかの例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、変異ＡＴＸＮ２阻害剤（または過剰なヌクレオチドリピートを有する別の変異遺伝子の阻害剤）であるか、またはそれを含むことができる。変異ＡＴＸＮ２阻害剤は、標的細胞における変異ＡＴＸＮ２（例えば、３２個以上のポリグルタミンリピートを有するＡＴＸＮ２）の転写または翻訳を阻害する任意の剤であり得る。いくつかの例では、変異ＡＴＸＮ２阻害剤は、変異ＡＴＸＮ２の転写または翻訳を部分的にまたは完全に沈黙させることができる薬剤であるか、またはそれを含むことができる。いくつかのさらなる例では、ＡＴＸＮ２阻害剤は、変異型ＡＴＸＮ２遺伝子を編集して、変異型対立遺伝子を野生型配列に改変することができる（例えば、約２１〜約３１まで、約２１〜約２５まで、または約２２〜約２３までのポリグルタミンリピートを含むように、３２以上のポリグルタミンリピートを含むように）薬剤であるか、またはそれを含むことができる。当技術分野に熟練した者によって認識されるように、他の神経変性疾患は、通常のリピート数が上記の範囲から変化し得るＡＴＸＮ２以外の遺伝子上の過剰なポリヌクレオチドリピートによって影響を受け得る。このような場合、変異遺伝子は、野生型の範囲内のポリヌクレオチドリピートを含むように編集することができる。いくつかの例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、変異体ＡＴＸＮ２不活性化剤であるか、またはそれを含むことができる。変異ＡＴＸＮ２不活性化剤は、変異ＡＴＸＮ２タンパク質（または過剰なヌクレオチドリピートを有する別の変異タンパク質）に結合し、分解し、または別の方法で不活性化するか、または標的細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１の過剰な蓄積を最小化する方法で変異ＡＴＸＮ２タンパク質とＳｔａｕｆｅｎ１との相互作用を防止または減少させる任意の剤を含むことができる。
【００４７】
例えば、いくつかの実施形態では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、変異ｃ９ｏｒｆ７２阻害剤（または過剰なヌクレオチドリピートを有する別の変異遺伝子の阻害剤）であるか、またはそれを含むことができる。突然変異ｃ９ｏｒｆ７２阻害剤は、標的細胞における突然変異ｃ９ｏｒｆ７２（例えば、３０回以上のＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピートを有するｃ９ｏｒｆ７２（例えば、１００回以上のＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピートを有するｃ９ｏｒｆ７２））の転写または翻訳を阻害する任意の剤であり得る。いくつかの例では、変異ｃ９ｏｒｆ７２阻害剤は、変異ｃ９ｏｒｆ７２の転写または翻訳を部分的にまたは完全に沈黙させることができる薬剤であるか、またはそれを含むことができる。いくつかのさらなる例において、変異型ｃ９ｏｒｆ７２阻害剤は、変異型ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子を編集して、変異型対立遺伝子を野生型配列に改変することができる（例えば、約２０〜３０ＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピートを含むように、またはそれ以下の配列に改変することができる）薬剤であるか、またはそれを含むことができる。いくつかの例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、変異体ｃ９ｏｒｆ７２不活性化剤であるか、またはそれを含むことができる。変異型ｃ９ｏｒｆ７２不活性化剤は、変異型ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質（または過剰なヌクレオチドリピートを有する別の変異型タンパク質）に結合し、分解し、または別の方法で不活性化するか、または標的細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１の過剰な蓄積を最小化する方法で変異型ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質とＳｔａｕｆｅｎ１との相互作用を防止または減少させる任意の剤を含むことができる。
【００４８】
いくつかの追加の例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、変異型ＴＤＰ−４３−阻害剤であるか、またはそれを含むことができる。変異型ＴＤＰ−４３阻害剤は、標的細胞における変異型ＴＤＰ−４３の転写または翻訳を阻害する任意の剤であり得る。いくつかの例では、変異ＴＤＰ−４３阻害剤は、変異ＴＤＰ−４３の転写または翻訳を部分的にまたは完全に沈黙させることができる剤であるか、またはそれを含むことができる。いくつかのさらなる例において、ＴＤＰ−４３阻害剤は、変異型ＴＡＲＤＢＰ遺伝子を編集して、変異型対立遺伝子を野生型配列に改変することができる剤であるか、またはそれを含むことができる。いくつかの例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、変異型ＴＤＰ−４３−不活性化剤であるか、またはそれを含むことができる。変異ＴＤＰ−４３−不活性化剤は、変異ＴＤＰ−４３タンパク質に結合、分解、またはその他の方法で変異ＴＤＰ−４３タンパク質を不活性化するか、または標的細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１の過剰な蓄積を最小化する方法で変異ＴＤＰ−４３タンパク質とＳｔａｕｆｅｎ１との相互作用を防止または減少させる任意の剤を含むことができる。
【００４９】
いくつかのさらなる例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、変異タウ阻害剤であるか、またはそれを含むことができる。変異タウ阻害剤は、標的細胞における変異タウの転写または翻訳を阻害する任意の剤であり得る。いくつかの例では、変異タウ阻害剤は、変異タウの転写または翻訳を部分的にまたは完全に沈黙させることができる剤であるか、またはそれを含むことができる。いくつかのさらなる例では、タウ阻害剤は、変異型ＭＡＰＴ遺伝子を編集して、変異型対立遺伝子を野生型配列に改変することができる剤であるか、またはそれを含むことができる。いくつかの例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、変異タウ不活性化剤であるか、またはそれを含むことができる。変異タウ不活性化剤は、変異タウタンパク質に結合、分解、またはその他の方法で変異タウタンパク質を不活性化するか、または標的細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１の過剰な蓄積を最小化する方法で変異タウタンパク質とＳｔａｕｆｅｎ１との相互作用を防止または減少させる任意の剤を含むことができる。
【００５０】
さらに他の例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、変異ＡＰＰ阻害剤であるか、またはそれを含むことができる。変異ＡＰＰ阻害剤は、標的細胞における変異ＡＰＰの転写または翻訳を阻害する任意の剤であり得る。いくつかの例では、変異ＡＰＰ阻害剤は、変異ＡＰＰの転写または翻訳を部分的にまたは完全に沈黙させることができる薬剤であるか、またはそれを含むことができる。いくつかのさらなる例では、ＡＰＰ阻害剤は、変異ＡＰＰ遺伝子を編集して変異アリールを野生型配列に改変することができる薬剤であるか、またはそれを含むことができる。いくつかの例において、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、変異型ＡＰＰ不活性化剤であり得るか、またはそれを含むことができる。変異ＡＰＰ不活性化剤は、変異ＡＰＰタンパク質に結合し、分解し、または別の方法で変異ＡＰＰタンパク質を不活性化するか、または標的細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１の過剰な蓄積を最小化する方法で変異ＡＰＰタンパク質とＳｔａｕｆｅｎ１との相互作用を防止または減少させる任意の剤を含むことができる。
【００５１】
遺伝子の１コピーのみが変異し、その遺伝子が野生型表現型を産生するために機能的に重要である場合に、特定の変異遺伝子の発現を阻害することは、必ずしも望ましいことではないかもしれないことに留意されたい。例えば、いくつかの場合には、ある遺伝子の機能的に重要な単一のコピーで野生型の表現型を産生するのに十分であるかもしれない。対照的に、変異遺伝子の発現を阻害すると、変異していない遺伝子の発現も阻害され、野生型表現型を産生するのに十分な発現が得られない場合がある。しかし、このような懸念がある場合には、場合によっては、変異体遺伝子の発現阻害が望ましい野生型表現型を産生するのに十分な量で、外因性発現ベクターを介して野生型対立遺伝子を発現させることができる場合がある。
【００５２】
いくつかの実施例において、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、ラパマイシン（ｍＴＯＲ）阻害剤の機械的標的であり得る。ｍＴＯＲ阻害剤は、標的細胞におけるｍＴＯＲの転写または翻訳を阻害する任意の剤であり得る。いくつかのさらなる例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、ｍＴＯＲ不活性化剤であり得る。ｍＴＯＲ不活性化剤は、ｍＴＯＲタンパク質に結合、分解等して、Ｓｔａｕｆｅｎ１タンパク質との相互作用を防止または最小化することができる任意の剤であり得る。
【００５３】
したがって、これらの機能のうちの１つ以上を実行するために採用され得る様々なＳｔａｕｆｅｎ１調節剤が存在する。Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の非限定的な例としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ホスホロチオエート塩基対連結、２'−メトキシエチル、２'−Ｏ−メチル、２'−フルオロ、２'−（３−ヒドロキシ）−プロピル、ロック核酸（ＬＮＡ）を含むケミストリを含む）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、混合物、キメラまたはギャップマーを含む組み合わせ）、リボザイム、ペプチド核酸、モルホリノ、小分子、そのようなもの、またはそれらの組み合わせなどを含むことができる。
【００５４】
いくつかの特定の例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であり得る。いくつかの側面において、ＡＳＯは、酸素置換のための硫黄などの１つまたは複数の好適な修飾（例えばホスホロチオエート連結の導入）、２'−ＯＨ修飾、２'−Ｏ−メチル修飾、２'−フルオロ修飾、２'−Ｏ−メトキシエチル修飾、ロック核酸（ＬＮＡ）修飾、架橋核酸（ＢＮＡ）修飾、ペプチド核酸（ＰＮＡ）修飾、モルホリノ修飾、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）修飾、中心ホスホジエステル残基またはホスホロチオエート残基の導入（例えば、「ギャップマー」を形成するため）などの修飾、またはそれらの組み合わせなどを含むことができる。
【００５５】
いくつかの例では、ＡＳＯは、Ａｘ−Ｇｎ−Ａｘギャップマーなどのギャップマーであり得、ここで、Ａは人工ヌクレオチドモノマーを表し、ｘは２から７までの整数であり、Ｇは天然アンチセンスヌクレオチドモノマーのギャップまたはブロックを表し、ｎは８から１２までの整数である。ＡＳＯがギャップマーである場合、５'ウイングおよび３'ウイングには、上述したような種々の人工ヌクレオチドモノマーを使用することができる。例えば、非限定的な例としては、２'−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）、２'，４'−架橋核酸（ＢＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、Ｎ−メアミノオキシＢＮＡ、２'−Ｎ−（メチル）−４'−Ｃ−アミノオキシメチレン２'，４'−架橋核酸、Ｎ−メアミノオキシ２'，４'−架橋核酸、２'−Ｎ−（メチル）−４'−Ｃ−アミノオキシメチレン２'，４'−架橋核酸、２'，４'−ＢＮＡＮＣ［ＮＭｅ］、２'−Ｏ，４'−Ｃ−（Ｎ−メチル）アミノメチレン２'，４'−架橋核酸、２'，４'−ＢＮＡＮＣ、２'−Ｏ，４'−Ｃ−アミノメチレン２'，４'−架橋核酸、またはそれらの組み合わせなどが挙げられる。いくつかの特定の例では、ガパーは、ＭＯＥガパーであり得る。他の特定の例では、ガパーは、ＬＮＡガパーであり得る。いくつかのさらなる例では、ガパーは、５−８−５ガパー、５−１０−５ガパー、または５−１２−５ガパーであり得る。いくつかのさらなる例では、ガパーは、４−８−４ガパー、４−１０−４ガパー、または４−１２−４ガパーであり得る。まだ追加の例では、ガパーは、３−８−３ガパー、３−１０−３ガパー、または３−１２−３ガパーであり得る。
【００５６】
表１は、本明細書に記載されるような治療用組成物に含有され得るＡＳＯの非限定的な例を示す。
【表１】
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【００５７】
いくつかの非限定的な実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２０、配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２、配列ＩＤ番号：２３、配列ＩＤ番号：２４、配列ＩＤ番号：２５、配列ＩＤ番号：２６、配列ＩＤ番号：２７、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：２９、配列ＩＤ番号：３０、配列ＩＤ番号：３１、配列ＩＤ番号：３２、配列ＩＤ番号：３３、配列ＩＤ番号：３４、配列ＩＤ番号：３５、配列ＩＤ番号：３６、配列ＩＤ番号：３７、配列ＩＤ番号：３８、配列ＩＤ番号：３９、配列ＩＤ番号：４０、またはそれらの組み合わせのヌクレオチド配列を含む。いくつかの追加の実施例では、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２０、配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２、配列ＩＤ番号：２３、配列ＩＤ番号：２４、配列ＩＤ番号：２５、配列ＩＤ番号：２６、配列ＩＤ番号：２７、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：２９、配列ＩＤ番号：３０、配列ＩＤ番号：３１、配列ＩＤ番号：３２、配列ＩＤ番号：３３、配列ＩＤ番号：３４、配列ＩＤ番号：３５、配列ＩＤ番号：３６、配列ＩＤ番号：３７、配列ＩＤ番号：３８、配列ＩＤ番号：３９、または配列ＩＤ番号：４０、またはその中間の８、１０、または１２ヌクレオチドであるか、または少なくとも９５％同一である１またはそれ以上のヌクレオチド配列を含む。さらにいくつかの追加の実施例では、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２０、配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２、配列ＩＤ番号：２３、配列ＩＤ番号：２４、配列ＩＤ番号：２５、配列ＩＤ番号：２６、配列ＩＤ番号：２７、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：２９、配列ＩＤ番号：３０、配列ＩＤ番号：３１、配列ＩＤ番号：３２、配列ＩＤ番号：３３、配列ＩＤ番号：３４、配列ＩＤ番号：３５、配列ＩＤ番号：３６、配列ＩＤ番号：３７、配列ＩＤ番号：３８、配列ＩＤ番号：３９、または配列ＩＤ番号：４０、またはその中間の８、１０、または１２ヌクレオチドであるか、または少なくとも９０％同一である１またはそれ以上のヌクレオチド配列を含む。さらにいくつかの追加の実施例では、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２０、配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２、配列ＩＤ番号：２３、配列ＩＤ番号：２４、配列ＩＤ番号：２５、配列ＩＤ番号：２６、配列ＩＤ番号：２７、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：２９、配列ＩＤ番号：３０、配列ＩＤ番号：３１、配列ＩＤ番号：３２、配列ＩＤ番号：３３、配列ＩＤ番号：３４、配列ＩＤ番号：３５、配列ＩＤ番号：３６、配列ＩＤ番号：３７、配列ＩＤ番号：３８、配列ＩＤ番号：３９、または配列ＩＤ番号：４０、またはその中間の８、１０、または１２ヌクレオチドであるか、または少なくとも８５％同一である１またはそれ以上のヌクレオチド配列を含む。。さらにいくつかの追加の実施例では、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２０、配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２、配列ＩＤ番号：２３、配列ＩＤ番号：２４、配列ＩＤ番号：２５、配列ＩＤ番号：２６、配列ＩＤ番号：２７、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：２９、配列ＩＤ番号：３０、配列ＩＤ番号：３１、配列ＩＤ番号：３２、配列ＩＤ番号：３３、配列ＩＤ番号：３４、配列ＩＤ番号：３５、配列ＩＤ番号：３６、配列ＩＤ番号：３７、配列ＩＤ番号：３８、配列ＩＤ番号：３９、または配列ＩＤ番号：４０、またはその中間の８、１０、または１２ヌクレオチドであるか、または少なくとも８０％同一である１またはそれ以上のヌクレオチド配列を含む。
【００５８】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２０、配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２、配列ＩＤ番号：２３、配列ＩＤ番号：２４、配列ＩＤ番号：２５、配列ＩＤ番号：２６、配列ＩＤ番号：２７、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：２９、配列ＩＤ番号：３０、配列ＩＤ番号：３１、配列ＩＤ番号：３２、配列ＩＤ番号：３３、配列ＩＤ番号：３４、配列ＩＤ番号：３５、配列ＩＤ番号：３６、配列ＩＤ番号：３７、配列ＩＤ番号：３８、配列ＩＤ番号：３９、または配列ＩＤ番号：４０の少なくとも６つの連続したヌクレオチドを有する１またはそれ以上のヌクレオチド配列であるかそれらを含む。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、記載されたヌクレオチド配列の６つの中間ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２０、配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２、配列ＩＤ番号：２３、配列ＩＤ番号：２４、配列ＩＤ番号：２５、配列ＩＤ番号：２６、配列ＩＤ番号：２７、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：２９、配列ＩＤ番号：３０、配列ＩＤ番号：３１、配列ＩＤ番号：３２、配列ＩＤ番号：３３、配列ＩＤ番号：３４、配列ＩＤ番号：３５、配列ＩＤ番号：３６、配列ＩＤ番号：３７、配列ＩＤ番号：３８、配列ＩＤ番号：３９、または配列ＩＤ番号：４０の少なくとも８つの連続したヌクレオチドを有する１またはそれ以上のヌクレオチド配列であるかそれらを含む。いくつかの実施例では、８つの連続したヌクレオチドは、記載されたヌクレオチド配列の８つの中間ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２０、配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２、配列ＩＤ番号：２３、配列ＩＤ番号：２４、配列ＩＤ番号：２５、配列ＩＤ番号：２６、配列ＩＤ番号：２７、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：２９、配列ＩＤ番号：３０、配列ＩＤ番号：３１、配列ＩＤ番号：３２、配列ＩＤ番号：３３、配列ＩＤ番号：３４、配列ＩＤ番号：３５、配列ＩＤ番号：３６、配列ＩＤ番号：３７、配列ＩＤ番号：３８、配列ＩＤ番号：３９、または配列ＩＤ番号：４０の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを有する１またはそれ以上のヌクレオチド配列であるかそれらを含む。いくつかの例では、１０個の連続したヌクレオチドは、記載されたヌクレオチド配列の１０個の中間ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２０、配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２、配列ＩＤ番号：２３、配列ＩＤ番号：２４、配列ＩＤ番号：２５、配列ＩＤ番号：２６、配列ＩＤ番号：２７、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：２９、配列ＩＤ番号：３０、配列ＩＤ番号：３１、配列ＩＤ番号：３２、配列ＩＤ番号：３３、配列ＩＤ番号：３４、配列ＩＤ番号：３５、配列ＩＤ番号：３６、配列ＩＤ番号：３７、配列ＩＤ番号：３８、配列ＩＤ番号：３９、または配列ＩＤ番号：４０の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを有する１またはそれ以上のヌクレオチド配列であるかそれらを含む。いくつかの例では、１２個の連続したヌクレオチドは、記載されたヌクレオチド配列の１２個の中間ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施例では、１４個の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２０、配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２２、配列ＩＤ番号：２３、配列ＩＤ番号：２４、配列ＩＤ番号：２５、配列ＩＤ番号：２６、配列ＩＤ番号：２７、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：２９、配列ＩＤ番号：３０、配列ＩＤ番号：３１、配列ＩＤ番号：３２、配列ＩＤ番号：３３、配列ＩＤ番号：３４、配列ＩＤ番号：３５、配列ＩＤ番号：３６、配列ＩＤ番号：３７、配列ＩＤ番号：３８、配列ＩＤ番号：３９、または配列ＩＤ番号：４０の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを有する１またはそれ以上のヌクレオチド配列であるかそれらを含む。いくつかの例では、１４個の連続したヌクレオチドは、記載されたヌクレオチド配列の１４個の中間ヌクレオチドであり得る。
【００５９】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１に対して少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかのさらなる例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかの実施例では、配列ＩＤ番号：１の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：１の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：１の連続したヌクレオチドは、中間の１０ヌクレオチド（すなわち、ＴＧＴＴＡＧＴＴ）を含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００６０】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２に対して少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかのさらなる例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかの実施例では、配列ＩＤ番号：２の連続するヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：２の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：２の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００６１】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３に対して少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができ、いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３の少なくとも６、８、１０、１２、または１４個の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかの実施例では、配列ＩＤ番号：３の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：３の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：３の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００６２】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：４に対して少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：４の少なくとも６、８、１０、１２、または１４個の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例では、配列ＩＤ番号：４の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：４の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：４の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：４の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００６３】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：５に対して少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：５の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかの実施例では、配列ＩＤ番号：５の連続するヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：５の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：５の連続するヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：５の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００６４】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：６に対して少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかのさらなる例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：６の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかの実施例では、配列ＩＤ番号：６の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：６の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：６の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：６の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００６５】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：７に対して少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかのさらなる例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：７の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例では、配列ＩＤ番号：７の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：７の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：７の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつか実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：７の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。
【００６６】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：８と少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができ、いくつかのさらなる例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：８の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかの具体例において、配列ＩＤ番号：８の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：８の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができ、いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：８の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：８の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００６７】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：９の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：９の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例では、配列ＩＤ番号：９の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：９の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：９の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：９の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００６８】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１０の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１０の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例では、配列ＩＤ番号：１０の連続するヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：１０の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：１０の連続するヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１０の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００６９】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１１の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１１の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例において、配列ＩＤ番号：１１の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：１１の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：１１の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１１の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００７０】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１２の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１２の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例において、配列ＩＤ番号：１２の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：１２の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：１２の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１２の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。
【００７１】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１３の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１３の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例において、配列ＩＤ番号：１３の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：１３の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：１３の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１３の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００７２】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１４の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１４の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例では、配列ＩＤ番号：１４の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：１４の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：１４の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１４の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００７３】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１５と少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１５の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかの実施例において、配列ＩＤ番号：１５の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：１５の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：１５の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１５の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００７４】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１６の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１６の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例において、配列ＩＤ番号：１６の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：１６の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：１６の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１６の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００７５】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１７の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１７の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例において、配列ＩＤ番号：１７の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：１７の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：１７の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１７の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００７６】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１８の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１８の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例において、配列ＩＤ番号：１８の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：１８の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：１８の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１８の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００７７】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１９の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１９の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例では、配列ＩＤ番号：１９の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：１９の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：１９の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：１９の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００７８】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２０の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２０の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例において、配列ＩＤ番号：２０の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：２０の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：２０の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２０の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００７９】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２１と少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２１の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかの実施例において、配列ＩＤ番号：２１の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：２１の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：２１の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２１の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００８０】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２２の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２２の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例において、配列ＩＤ番号：２２の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：２２の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：２２の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２２の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。
【００８１】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２３の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２０の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例において、配列ＩＤ番号：２３の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：２３の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、、配列ＩＤ番号：２３の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２３の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００８２】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２４に対して少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２４の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかの実施例では、配列ＩＤ番号：２４の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：２４の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：２４の連続したヌクレオチドは、中間の１０ヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２４の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００８３】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２５の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２５の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例において、配列ＩＤ番号：２５の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：２５の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：２５の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２５の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。
【００８４】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２６の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２６の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例において、配列ＩＤ番号：２６の連続するヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：２６の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：２６の連続するヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２６の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００８５】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２７の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２７の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例において、配列ＩＤ番号：２７の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：２７の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：２７の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２７の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００８６】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２８と少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２８の少なくとも６、８、１０、１２、または１４個の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかの実施例において、配列ＩＤ番号：２８の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：２８の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：２８の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２８の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００８７】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２９の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができ、いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２９の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例において、配列ＩＤ番号：２９の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：２９の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：２９の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：２９の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。
【００８８】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３０に対して少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３０の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかの実施例では、配列ＩＤ番号：３０の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：３０の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：３０の連続したヌクレオチドは、中間の１０ヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３０の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００８９】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３１の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができ、いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３１の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例において、配列ＩＤ番号：３１の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：３１の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：３１の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３１の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００９０】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３２に対して少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３２の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかの実施例では、配列ＩＤ番号：３２の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：３２の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：３２の連続したヌクレオチドは、中間の１０ヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３２の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００９１】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３３の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３３の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例において、配列ＩＤ番号：３３の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：３３の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：３３の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３３の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００９２】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３４の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３４の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例では、配列ＩＤ番号：３４の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：３４の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：３４の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３４の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。
【００９３】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３５と少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３５の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかの実施例では、配列ＩＤ番号：３５の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：３５の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の例では、配列ＩＤ番号：３５の連続したヌクレオチドは、中間の１０ヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３５の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００９４】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３６の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３６の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例において、配列ＩＤ番号：３６の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：３６の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：３６の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３６の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００９５】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３７の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３７の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例において、配列ＩＤ番号：３７の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：３７の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：３７の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３７の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００９６】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３８の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３８の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例において、配列ＩＤ番号：３８の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：３８の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：３８の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３８の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００９７】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３９の少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３９の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、または含むことができる。いくつかの実施例において、配列ＩＤ番号：３９の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：３９の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：３９の連続したヌクレオチドは、中間の１０のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：３９の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００９８】
いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：４０に対して少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：４０の少なくとも６、８、１０、１２、または１４の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。いくつかの実施例では、配列ＩＤ番号：４０の連続したヌクレオチドは、配列ＩＤ番号：４０の中間の６、８、１０、１２、または１４のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの特定の実施例では、配列ＩＤ番号：４０の連続したヌクレオチドは、中間の１０ヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施例では、ＡＳＯは、配列ＩＤ番号：４０の中間１０ヌクレオチドと少なくとも９０％、８０％、または７０％の相同性を有するヌクレオチド配列であるか、またはそれを含むことができる。
【００９９】
いくつかの追加の特定の実施例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり得る。いくつかの実施例では、ｓｉＲＮＡは、２'−糖修飾、改変された環構造、核酸塩基修飾、そのようなもの、またはそれらの組み合わせなどの１つ以上の適切な修飾を含むことができる。ｓｉＲＮＡは、任意の適切な３'ヌクレオチドオーバーハングを含むことができることがさらに記載される。いくつかの特定の実施例では、ｓｉＲＮＡは、ガイド／アンチセンス鎖上に５'−ＣＣＵＡＵＡＡＣＵＡＣＡＡＣＡＵＧＡＧｄＴｄＴ−３'（配列ＩＤ番号：４１）、５'−ＧＡＧＣＣＵＵＧＵＧＡＵＣＣＵＡＡ−３'（配列ＩＤ番号：４２）などのヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、ｓｉＲＮＡは、ガイド／アンチセンス鎖上の配列ＩＤ番号：４１に対して少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの他の実施例では、ｓｉＲＮＡは、配列ＩＤ番号：４１の少なくとも１０、１２、１４、１６、または１８の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含むことができ、いくつかのさらなる例では、ｓｉＲＮＡは、配列ＩＤ番号：４２に対して少なくとも９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの他の実施例では、ｓｉＲＮＡは、配列ＩＤ番号：４２から少なくとも１０、１２、１４、１６、または１８の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含むことができる。
【０１００】
いくつかの実施例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、Ｓｔａｕｆｅｎ１タンパク質またはＳＴＡＵ１遺伝子と直接相互作用しない遺伝子治療剤（例えば、変異ＡＴＸＮ２阻害剤、変異ｃ９ｏｒｆ７２阻害剤、変異ＴＤＰ−４３阻害剤、変異タウ阻害剤、および／または変異ＡＰＰ阻害剤など）であり得る。そのような実施例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、遺伝子治療（例えば、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集など）に使用し、変異ＡＴＸＮ２（または過剰なＣＡＧリピートまたは他のポリヌクレオチドリピートを含む他の類似遺伝子）、変異Ｃ９ｏｒｆ７２、変異ＴＡＲＤＢＰ、変異ＭＡＰＴ、および／または変異ＡＰＰの発現を阻止するためにＤＮＡを恒久的に変化させることができる。いくつかの特定の実施例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを採用することができる。例えば、合成ガイドＲＮＡと複合化したＣａｓ９ヌクレアーゼを標的細胞に送達することにより、細胞のゲノムを所望の位置で切断することができ、既存の遺伝子を除去すること、および／または改変された遺伝子を追加することができる。したがって、いくつかの実施例では、神経変性疾患を有する個体にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを投与して、変異ＡＴＸＮ２遺伝子変異Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子、変異ＴＡＲＤＢＰ遺伝子、変異ＭＡＰＴ遺伝子、および／または変異ＡＰＰ遺伝子を除去または編集し、それを遺伝子の野生型バージョンに置き換えることができる。
【０１０１】
Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、様々な方法で標的細胞に導入することができる。いくつかの実施例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤は、送達ベクターまたはビヒクルに結合されておらず、または送達ベクターまたはビヒクルによって運ばれていない「遊離した」Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤として標的細胞に導入することができる。しかしながら、当業者によって認識されるように、特定のタイプの治療剤のインビボ送達には多くの課題がある。このように、他の実施例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、送達ベクターまたはビヒクルを介して標的細胞に導入することができる。例えば、いくつかの場合で、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、標的細胞への導入を容易にするために、特定の細胞表面受容体を標的とする細胞ターゲティング剤に結合されているか、または担持されることができる。そのような細胞標的化剤は、アプタマー、抗体／フラグメント、ポリペプチド（例えば、ファージディスプレイライブラリーに由来するポリペプチド）、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ビタミン、小有機分子、そのようなもの、またはそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの実施例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、標的細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１調節剤の膜貫通を促進するために、細胞貫通剤に結合されているか、または細胞貫通剤によって運ばれることができる。そのような細胞浸透剤は、ポリカチオン化ペプチド（例えば、アルギンおよび／またはリジンを豊富に含むポリカチオン性ペプチド、他の細胞浸透ペプチドなど）、ポリマー（例えば、ＰＥＧ化ポリカチオン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、カチオン性ブロック共重合体など）、デンドリマー（例えば、オクタグアニジンデンドリマー、ＰＥＩベースのデンドリマーなど）、脂質（例えば、カチオン性脂質、コレステロールなど）、リソソーム担体、リポソーム、ミセル、量子ドット、ナノ粒子など、またはそれらの組み合わせを含み得る。まだ他の例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、ウイルスベクターを介して標的細胞に導入することができる。採用され得るウイルスベクターの非限定的な実施例としては、レトロウイルス、レンチウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかのさらなる実施例において、ウイルスベクターは、標的細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１調節剤の長期発現のために使用することができる。したがって、いくつかの実施例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、ウイルスベクターを介して標的細胞に導入することができる。他の例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、非ウイルス性ベクターを介して標的細胞に導入することができる。さらに他の実施例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、送達ベクターまたはビヒクルなしで標的細胞に導入することができる。いくつかのさらなる実施例では、それらの任意の適切な組み合わせを採用することができる。
【０１０２】
標的細胞に導入されるＳｔａｕｆｅｎ１調節剤の量は、当業者であれば理解されるように、採用される特定のＳｔａｕｆｅｎ１調節剤、状態のタイプおよび重症度、投与レジメン、送達ベクターのタイプ（採用される場合）などの様々な要因に依存し得る。したがって、標的細胞に導入されるＳｔａｕｆｅｎ１調節剤の量を、標的細胞に対する量の効果によって記述することは、より効果的であり得る。例えば、有効量のＳｔａｕｆｅｎ１調節剤は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤を導入する前または導入しない前のこれらのｍＲＮＡのレベルと比較して、標的細胞におけるＰＣＰ２  ｍＲＮＡのレベル、標的細胞におけるＣＡＬＢ１  ｍＲＮＡのレベル、Ｓｔａｕｆｅｎ１関連代謝を介して代謝される標的細胞における他のｍＲＮＡのレベル、またはそれらの組み合わせを回復／増加させることができる。いくつかの実施例では、これらのｍＲＮＡの１つ以上のレベルは、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤を導入する前のレベルまたは導入しない前のレベルと比較して、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の導入を介して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％またはそれ以上増加することができる。
【０１０３】
いくつかの実施例において、標的細胞に導入されるＳｔａｕｆｅｎ１調節剤の量は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤を導入する前または導入しない前の標的細胞に存在するＳｔａｕｆｅｎ１の量と比較して、標的細胞に存在するＳｔａｕｆｅｎ１の量を減少させることができる。いくつかの特定の実施例において、標的細胞中に存在するＳｔａｕｆｅｎ１の量は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の導入前または導入なしのＳｔａｕｆｅｎ１の量と比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％減少させることができる。
【０１０４】
さらに別の実施例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤が変異ＡＴＸＮ２阻害剤である場合、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の量は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の投与前または投与なしに、変異ＡＴＸＮ２レベルと比較して、標的細胞における変異ＡＴＸＮ２レベル（または細長いポリグルタミン管または類似の拡張管を含む別のタンパク質のレベル）を減少させることができる。いくつかの特定の実施例では、標的細胞中に存在する変異体ＡＴＸＮ２（または伸長ポリグルタミン管または類似の拡張管を含む他のタンパク質）の量は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の導入前または導入なしの変異体ＡＴＸＮ２レベルと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％減少させることができる。
【０１０５】
さらに別の実施例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤が変異ｃ９ｏｒｆ７２阻害剤である場合、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の量は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の投与前または投与しない前の変異ｃ９ｏｒｆ７２レベルと比較して、標的細胞中の変異ｃ９ｏｒｆ７２レベル（または伸長ヌクレオチド拡張管を含む他のタンパク質のレベル）を減少させることができる。いくつかの特定の実施例では、標的細胞中に存在する変異体ｃ９ｏｒｆ７２（または細長いヌクレオチド拡張管を含む他のタンパク質）の量は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の導入前または導入なしの変異体ｃ９ｏｒｆ７２レベルと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％減少させることができる。
【０１０６】
さらなる実施例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤が変異ＴＤＰ−４３阻害剤である場合、Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤の量は、Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤の投与前または投与せずに、変異ＴＤＰ−４３レベルと比較して、標的細胞内の変異ＴＤＰ−４３レベルを減少させることができる。いくつかの特定の実施例では、標的細胞中に存在する変異型ＴＤＰ−４３の量は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の導入前または導入せずに、変異型ＴＤＰ−４３レベルと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％減少させることができる。
【０１０７】
まだ他の実施例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤が変異タウ阻害剤である場合、Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤の量は、Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤の投与前または投与せずに、変異タウレベルと比較して、標的細胞内の変異タウレベルを減少させることができる。いくつかの特定の実施例では、標的細胞中に存在する変異タウの量は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の導入前または導入なしの変異タウレベルと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％減少させることができる。
【０１０８】
まだ他の実施例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤が変異ＡＰＰ阻害剤である場合、Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤の量は、Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤の投与前または投与しない前の変異ＡＰＰレベルと比較して、標的細胞内の変異ＡＰＰレベルを減少させることができる。いくつかの特定の実施例では、標的細胞中に存在する変異ＡＰＰの量は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の導入前または導入なしの変異ＡＰＰレベルと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％減少させることができる。
【０１０９】
標的細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１活性を制御、調節、または正常化する方法は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤を導入する前または導入しない前のＳｔａｕｆｅｎ１活性と比較してＳｔａｕｆｅｎ１活性を低下させるのに十分な量のＳｔａｕｆｅｎ１調節剤を標的細胞に導入することを含むことができる。この特定の方法では、標的細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１活性を制御し、正常化し、または最小化するために、標的細胞に存在するＳｔａｕｆｅｎ１の量を減少させる必要はないことに留意されたい。しかしながら、これもまた、標的細胞における減少したＳｔａｕｆｅｎ１活性を達成するための１つのメカニズムである。他の実施例では、（例えば、変異ＡＴＸＮ２不活性化剤または変異ＡＴＸＮ２阻害剤、または他の上流の不活性化剤または阻害剤を介して）Ｓｔａｕｆｅｎ１活性は、標的細胞中に存在する変異ＡＴＸＮ２（または細長いポリグルタミントラクトまたは類似の拡張トラクトを含む他のタンパク質、または上述のような他の変異タンパク質）を減少させることによって低減させることができる。これは、変異ＡＴＸＮ２遺伝子（または細長いポリグルタミントラクトもしくは類似の拡張トラクト、または神経障害に関連する他の変異遺伝子を含む他のタンパク質）の発現を阻害すること、変異ＡＴＸＮ２遺伝子（または細長いポリグルタミントラクトもしくは類似の拡張トラクト、または神経障害に関連する他の変異遺伝子を含む他のタンパク質、上述したようなもの）を野生型配列に編集すること、またはそれらの組み合わせなど、多くの方法によって達成することができる。まだ他の実施例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１に結合し、分解し、等することができるＳｔａｕｆｅｎ１調節剤を導入することにより、Ｓｔａｕｆｅｎ１の活性を低下させることができる。Ｓｔａｕｆｅｎ１に結合し、分解するなどして、標的細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１の代謝機能を不活性化するか、またはその他の方法で妨害することができる。さらに他の例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、変異体ＡＴＸＮ２（または細長いポリグルタミントラクトまたは類似の拡張トラクトを含む他のタンパク質、または上述のような神経疾患に関連する他の変異体タンパク質）に結合、分解などして、Ｓｔａｕｆｅｎ１の凝集、Ｓｔａｕｆｅｎ１の安定化、またはそれらの組み合わせを最小化することができる。いくつかの追加の例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤は、Ｓｔａｕｆｅｎ１とｍＲＮＡとの相互作用を減少させるかまたはブロックすることができ、その結果、ｍＲＮＡの発現または豊富さが変化し得る。
【０１１０】
本明細書の上で述べられているＳｔａｕｆｅｎ１調節剤と同じ種類のものを、標的細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１活性を制御する方法にも同様に採用することができる。さらに、本明細書上に記載されているＳｔａｕｆｅｎ１調節剤を標的細胞に導入する方法も同様に、Ｓｔａｕｆｅｎ１活性を制御する方法に採用することができる。さらに、Ｓｔａｕｆｅｎ１活性を制御する方法には、特定の患者、状態の種類および重症度、投与レジメン、採用されるＳｔａｕｆｅｎ１調節剤などに応じて、本明細書に記載されているのと同じ量または類似の量を採用することができる。
【０１１１】
標的細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１蓄積を制御する方法は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤を導入する前または導入しない前の標的細胞における濃度と比較して、標的細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１の濃度を低下させるのに十分な量のＳｔａｕｆｅｎ１調節剤を標的細胞に導入することを含むことができる。この特定の方法において、標的細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１の蓄積量は、様々な方法で制御、正規化、または最小化することができる。いくつかの例では、標的細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１の蓄積は、Ｓｔａｕｆｅｎ１の発現を阻害することによって制御することができる。いくつかのさらなる例において、Ｓｔａｕｆｅｎ１蓄積を制御することは、例えば、変異ＡＴＸＮ２遺伝子（または細長いポリグルタミントラクトまたは類似の拡張トラクトを含む他のタンパク質、または上述のような神経障害に関連する他の変異タンパク質）の発現を阻害することによって、標的細胞内に存在する変異ＡＴＸＮ２遺伝子（または細長いポリグルタミントラクトまたは類似の拡張トラクトを含む他のタンパク質）を減少させることによって達成され得る。または上述のような神経障害に関連する他の変異タンパク質）、変異ＡＴＸＮ２遺伝子（または細長いポリグルタミン管または類似の拡張管を含む他の遺伝子、または上述のような神経障害に関連する他の変異遺伝子）を野生型配列に編集すること、等、またはそれらの組み合わせによって達成することができる。他の実施例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１蓄積を制御することは、変異体ＡＴＸＮ２（または細長いポリグルタミントラクトもしくは類似の拡張トラクトを含む他のタンパク質、または上述のような神経障害に関連する他の変異体タンパク質）に結合、分解等して、Ｓｔａｕｆｅｎ１のそれに対する凝集を最小化すること、Ｓｔａｕｆｅｎ１の安定化、等、またはそれらの組み合わせによって達成することができる。
【０１１２】
本明細書の上で述べたＳｔａｕｆｅｎ１調節剤と同じ種類のＳｔａｕｆｅｎ１調節剤を、標的細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１の蓄積を制御する方法にも採用することができる。さらに、本明細書に記載されるＳｔａｕｆｅｎ１調節剤を標的細胞に導入する方法と同様の方法を、標的細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１蓄積を制御する方法に用いることができる。さらに、標的細胞へのＳｔａｕｆｅｎ１蓄積を制御する方法においては、特定の患者、病態の種類と重症度、投与レジメン、使用するＳｔａｕｆｅｎ１調節剤等に応じて、本明細書に記載される量と同量または類似の量を採用することができる。
【０１１３】
ＲＮＡ代謝のＳｔａｕｆｅｎ１誘発性調節障害に関連する神経変性状態を治療する方法は、治療上有効な量のＳｔａｕｆｅｎ１調節剤を被験体に投与することを含むことができる。治療上有効な量のＳｔａｕｆｅｎ１調節剤の投与を介して治療され得る神経変性状態が多数存在することに留意されたい。非限定的な実施例としては、スピノ小脳失調症１型、スピノ小脳失調症２型、スピノ小脳失調症３型（マチャド−ジョセフ病）、スピノ小脳失調症６型、スピノ小脳失調症７型、脊髄小脳失調症８型、脊髄小脳失調症１７型、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、脆弱性Ｘ症候群、ミトン性ジストロフィーなど、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【０１１４】
本発明のＳｔａｕｆｅｎ１調節剤は、多くの方法で投与することができる。非限定的な実施例としては、注射（例えば、静脈内、髄腔内など）、経口／経口投与、経粘膜投与、経皮投与、移植、またはそれらの組み合わせによる投与が挙げられる。
【０１１５】
投与の様式、採用される特定のＳｔａｕｆｅｎ１調節剤、状態の種類および重症度、投与されるＳｔａｕｆｅｎ１調節剤の量などに応じて、投与は、様々な頻度で実施され得る。いくつかの実施例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤を１日に１回以上（例えば、１日に１回、２回、３回、または４回）投与することが有利であり得る。他の実施例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤を２日に１回〜７日に１回まで、１週間に１回〜２週間に１回まで、２週間に１回〜６週間に１回まで、１ヶ月に１回〜１２ヶ月に１回まで、６ヶ月に１回〜１８ヶ月に１回まで、またはそれらの組み合わせで投与することが有利であり得る。
【０１１６】
投与されるＳｔａｕｆｅｎ１調節剤の量は、同様に、治療される特定の対象、採用される特定のＳｔａｕｆｅｎ１調節剤、状態の種類および重症度、投与様式などに応じて変化し得る。いくつかの実施例では、治療上有効な量または用量は、体重１ｋｇあたり約０．００１μｇ〜体重１ｋｇあたり約１００ｇまでの量であり得る。いくつかの追加の実施例では、治療上有効な量または用量は、体重１ｋｇあたり約０．００１μｇ〜体重１ｋｇあたり約０．１μｇまでの量であり得る。他の実施例では、治療上有効な量または用量は、体重１ｋｇあたり約０．１μｇ〜体重１ｋｇあたり約１０ｍｇまでの量であり得る。さらに他の実施例では、治療上有効な量または用量は、体重１ｋｇあたり約１ｍｇ〜体重１ｋｇあたり約５０ｍｇまでであり得る。さらなる実施例では、治療上有効な量または用量は、体重１ｋｇあたり約５０ｍｇ〜体重１ｋｇあたり約５００ｍｇまでであり得る。さらなる実施例では、治療上有効な量または用量は、体重１ｋｇあたり約５００ｍｇ〜体重１ｋｇあたり約１０００ｍｇまでであり得る。さらなる実施例では、治療上有効な量または用量は、体重１ｋｇあたり約１００００ｍｇ〜体重１ｋｇあたり約１０ｇまでであり得る。さらなる実施例では、治療上有効な量または用量は、体重１ｋｇあたり約１０ｇ〜体重１ｋｇあたり約１００ｇまでであり得る。いくつかの特定の実施例では、治療上有効な量または用量は、約０．１ｍｇ〜約１ｍｇまで、約１ｍｇ〜約１５ｍｇまで、約１５ｍｇ〜約５０ｍｇまで、約５０ｍｇ〜約１００ｍｇまで、または約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇまでの量であり得る。これらの量は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤自体に基づくものであり、いかなるリガンド、送達ベクター等も考慮に入れないことに留意されたい。
【０１１７】
いくつかの実施例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤がウイルスベクターを介して投与される場合、治療上有効な量は、約１×１０１〜約１×１０２０のウイルス粒子であり得る。他の実施例では、治療上有効な量は、約１×１０５〜約１×１０１０のウイルス粒子を含むことができる。他の例では、治療上有効な量は、約１×１０７〜約１×１０１２ウイルス粒子を含むことができる。さらに他の実施例では、治療上有効な量は、約１×１０９〜約１×１０１５ウイルス粒子を含むことができる。さらなる実施例では、治療上有効な量は、約１×１０１４〜約１×１０２０ウイルス粒子を含むことができる。
【０１１８】
Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の治療上有効な量は、投与様式、治療される対象、状態の種類および重症度、採用される特定のＳｔａｕｆｅｎ１調節剤（複数可）などに依存し得る。いくつかの実施例では、治療上有効なＳｔａｕｆｅｎ１調節剤の量は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤を導入する前または導入しない前のこれらのｍＲＮＡのレベルと比較して、標的細胞内のＰＣＰ２  ｍＲＮＡレベル、標的細胞内のＣＡＬＢ１  ｍＲＮＡレベル、Ｓｔａｕｆｅｎ１関連代謝を介して代謝される標的細胞内の他のｍＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを増加させるのに十分な量とすることができる。いくつかの実施例では、治療上有効な量は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の投与前または投与なしのレベルと比較して、これらのｍＲＮＡの１つ以上を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上増加させるのに十分な量であり得る。いくつかの実施例において、治療上有効なＳｔａｕｆｅｎ１調節剤の量は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の投与前または投与せずに、標的細胞内に存在するＳｔａｕｆｅｎ１の量と比較して、標的細胞内に存在するＳｔａｕｆｅｎ１の量を減少させるのに十分な量であり得る。いくつかの特定の実施例において、治療上有効な量は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の投与前または投与せずに、標的細胞中のＳｔａｕｆｅｎ１の量と比較して、標的細胞中のＳｔａｕｆｅｎ１を少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％減少させるのに十分な量であり得る。
【０１１９】
まだ他の実施例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の治療的に有効な量は、変異ＡＴＸＮ２レベル（または細長いポリグルタミントラクトまたは類似の拡張トラクトを含む別のタンパク質、または神経障害に関連する他の変異タンパク質のレベル）を低下させるのに十分な量であり得る。例えば、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の投与前または投与しない前の変異ＡＴＸＮ２レベル（または変異ｃ９ｏｒｆ７２レベル、または変異ＴＤＰ−４３レベル、または変異ＴＡＵレベル、または変異ＡＰＰレベル、例えば上述のような）と比較して、標的細胞内の変異ＡＴＸＮ２レベル（または変異ｃ９ｏｒｆ７２レベル、または変異ＴＤＰ−４３レベル、または変異ＴＡＵレベル、または変異ＡＰＰレベル）を低減する。いくつかの特定の実施例では、治療上有効な量は、変異ＡＴＸＮ２（または細長いポリグルタミントラクトまたは類似の拡張トラクトを含む他のタンパク質、または神経障害に関連する他の変異タンパク質）を減少させるのに十分な量であり得る。例えば、上記に記載されたような）を、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤（例えば、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤が、変異ＡＴＸＮ２レベル（または変異ｃ９ｏｒｆ７２レベル、または変異ＴＤＰ−４３レベル、または変異タウレベル、または変異ＡＰＰレベル）の投与前または投与しない場合と比較して、標的細胞内で少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％の割合で投与する。例えば、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤が、例えば、変異ＡＴＸＮ２阻害剤、変異ｃ９ｏｒｆ７２阻害剤、変異ＴＤＰ−４３阻害剤、変異タウ阻害剤、および／または変異ＡＰＰ阻害剤である場合）。）さらに、いくつかのさらなる例において、治療的に有効な量は、対象の運動性能のさらなる枯渇を最小化するのに十分な量、以前に枯渇した運動性能の一部を回復するのに十分な量、またはその両方であり得る。
【０１２０】
ＲＮＡ代謝のＳｔａｕｆｅｎ１誘発性調節障害に関連する神経変性状態を治療するためのＳｔａｕｆｅｎ１調節剤などの治療用組成物は、本明細書の他の場所に記載されたものを含むことができる。ＲＮＡ代謝のＳｔａｕｆｅｎ１誘発性調節障害に関連する神経変性状態を治療するための治療用組成物は、治療上有効な量のＳｔａｕｆｅｎ１調節剤と、薬学的に許容される担体とを含むことができる。ここでも、治療用組成物中のＳｔａｕｆｅｎ１調節剤は、本明細書の他の場所に記載されたものを含むことができる。
【０１２１】
Ｓｔａｕｆｅｎ１−調節剤の治療上有効な量は、投与様式、治療される対象、状態の種類および重症度、採用される特定のＳｔａｕｆｅｎ１−調節剤（複数可）などに依存することができる。いくつかの実施例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の治療上有効な量は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の投与前または投与しない場合のこれらのｍＲＮＡのレベルと比較して、有効な投与レジメンで投与された場合に、標的細胞内のＰＣＰ２  ｍＲＮＡレベル、標的細胞内のＣＡＬＢ１  ｍＲＮＡレベル、Ｓｔａｕｆｅｎ１関連代謝を介して代謝される標的細胞内の他のｍＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを増加させるのに十分な量とすることができる。いくつかの実施例では、治療上有効な量は、有効な投与レジメンで投与されたときに、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の投与前または非投与時のレベルと比較して、これらのｍＲＮＡの１つ以上を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、またはそれ以上増加させるのに十分な量であり得る。いくつかの実施例において、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の治療上有効な量は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の投与前または投与せずに標的細胞内に存在するＳｔａｕｆｅｎ１の量と比較して、有効な投与レジメンで投与されたときに標的細胞内に存在するＳｔａｕｆｅｎ１の量を減少させるのに十分な量であり得る。いくつかの特定の実施例において、治療上有効な量は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の投与前または投与せずに、Ｓｔａｕｆｅｎ１レベルと比較して、有効な投与レジメンで投与されたときに、標的細胞中のＳｔａｕｆｅｎ１を少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％減少させるのに十分な量であり得る。
【０１２２】
まだ他の実施例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の治療的に有効な量は、変異ＡＴＸＮ２レベル（または細長いポリグルタミントラクトまたは類似の拡張トラクトを含む別のタンパク質、または神経障害に関連する他の変異タンパク質のレベル）を低下させるのに十分な量であり得る。Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の投与に先立って、または投与しないで、変異ＡＴＸＮ２レベル（または変異ｃ９ｏｒｆ７２レベル、または変異ＴＤＰ−４３レベル、または変異タウレベル、または変異ＡＰＰレベル、例えば）と比較して、有効な投与レジメンで投与した場合に、標的細胞内のＡＴＸＮ２レベル（または変異ｃ９ｏｒｆ７２レベル、または変異ＴＤＰ−４３レベル、または変異タウレベル、または変異ＡＰＰレベル、例えば、上述のような）を減少させることができる。いくつかの特定の例では、治療上有効な量は、標的細胞中のＡＴＸＮ２（または細長いポリグルタミントラクトまたは類似の拡張トラクトを含む他のタンパク質、または上述のような神経障害に関連する他の変異タンパク質）を少なくとも３０％減少させるのに十分な量であり得る。Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤の投与に先立って、または投与しないで、ＡＴＸＮ２レベル（または変異ｃ９ｏｒｆ７２レベル、または変異ＴＤＰ−４３レベル、または変異タウレベル、または変異ＡＰＰレベル、例えば）と比較して、有効な投与レジメンで投与された場合、４０％、５０％、６０％、または７０％の量が得られる。
【０１２３】
いくつかの特定の実施例では、治療上有効な量は、約１ピコモル（ｐＭ）〜約１００ミリモル（ｍＭ）までの量であり得る。いくつかの他の実施例では、治療上有効な量は、約１ピコモル（ｐＭ）〜約１００ピコモル（ｍＭ）までの量であり得る。まだ他の実施例では、治療上有効な量は、約５０ｐＭ〜約５００ｐＭまでの量であり得る。さらに他の実施例では、治療上有効な量は、約３００ｐＭ〜約１０００ｐＭまでの量であり得る。さらなる実施例では、治療上有効な量は、約１ナノモル（ｎＭ）〜約５０ｎＭまでの量であり得る。さらなる追加の実施例では、治療上有効な量は、約１０ｎＭ〜約５００ｎＭまでの量であり得る。さらなる実施例では、治療上有効な量は、約４００ｎＭ〜約１ｍＭまでの量であり得る。さらなる実施例では、治療上有効な量は、約７００ｎＭ〜約１０ｍＭまでの量であり得る。
【０１２４】
他のいくつかの特定の実施例では、治療上有効な量は、治療用組成物（μｇ／ｇ）のグラム（ｇ）あたりのＳｔａｕｆｅｎ１調節剤の約０．００１μｇ〜治療用組成物（ｍｇ／ｇ）のグラム（ｇ）あたりのＳｔａｕｆｅｎ１調節剤の約２００ｍｇまでの量とすることができる。他の実施例では、治療上有効な量は、治療用組成物中の約０．０１μｇ／ｇ〜約１μｇ／ｇのＳｔａｕｆｅｎ１調節剤であり得る。いくつかの他の実施例では、治療上有効な量は、治療用組成物中の約０．１μｇ／ｇ〜約１０μｇ／ｇＳｔａｕｆｅｎ１−調節剤であり得る。さらに他の実施例では、治療上有効な量は、治療用組成物中の約１μｇ／ｇ〜約１００μｇ／ｇＳｔａｕｆｅｎ１−調節剤であり得る。さらに別の実施例では、治療上有効な量は、治療用組成物中の約１０μｇ／ｇ〜約１ｍｇ／ｇＳｔａｕｆｅｎ１−調節剤であり得る。いくつかのさらなる実施例では、治療上有効な量は、治療用組成物中の約１００μｇ／ｇ〜約１０ｍｇ／ｇＳｔａｕｆｅｎ１調節剤であり得る。いくつかのさらなる実施例では、治療上有効な量は、治療用組成物中の約１ｍｇ／ｇ〜約１００ｍｇ／ｇＳｔａｕｆｅｎ１調節剤であり得る。本明細書に開示される治療上有効な量は、特に指定されない限り、一般に、関連するリガンド、送達ビヒクル等を含まないＳｔａｕｆｅｎ１調節剤自体の量に基づくことに再び留意されたい。
【０１２５】
いくつかの追加の特定の実施例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤がウイルスベクターによって担持される場合、治療上有効な量は、治療用組成物の１グラム当たり約１×１０５〜約１×１０１５のウイルス粒子を含むことができる。いくつかの実施例では、治療上有効な量は、治療用組成物の１グラムあたり約１×１０５〜約１×１０７のウイルス粒子を含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、治療上有効な量は、治療用組成物の１グラムあたり約１×１０７〜約１×１０９のウイルス粒子を含むことができる。いくつかの他の実施例では、治療上有効な量は、治療用組成物の１グラムあたり約１×１０９〜約１×１０１１ウイルス粒子を含むことができる。さらに他の実施例では、治療上有効な量は、治療用組成物の１グラムあたり約１×１０１１〜約１×１０１３のウイルス粒子を含むことができる。さらに別の実施例では、治療上有効な量は、治療用組成物の１グラムあたり約１×１０１３〜約１×１０１５ウイルス粒子を含むことができる。
【０１２６】
製薬学的に許容される担体は、様々な投与様式のために配合することができる。例えば、薬学的に許容される担体は、注射（例えば、静脈内、髄腔内など）、経口／経口投与、経皮投与、経粘膜投与、吸入、移植などを介してＳｔａｕｆｅｎ１調節剤を投与するために配合することができる。
【０１２７】
いくつかの実施例では、薬学的に許容される担体は、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、髄腔内注射、またはそのようなもののような注射を介して投与するための治療用組成物を提供するように配合することができる。そのような実施例では、薬学的に許容される担体は、水、可溶化剤、分散剤、強壮剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、防腐剤、キレート剤、増量剤、そのようなもの、またはそれらの組み合わせなどの様々な成分を含むことができる。
【０１２８】
いくつかの実施例では、注射可能な治療用組成物は、可溶化剤または分散剤を含むことができる。可溶化剤または分散剤の非限定的な実施例としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、レシチン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体、プロピレングリコール、グリセリン、エタノール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、ジメチルアセトアミド、ポリエトキシル化ヒマシ油、Ｎ−ラクタミド、シクロデキストリン、カボキシメチルセルロース、アカシア、ゼラチン、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。
【０１２９】
いくつかの実施例では、注射可能な治療用組成物は、強壮剤を含むことができる。強壮剤の非限定的な実施例としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、グリセリン、プロピレングリコール、エタノール、トレハロース、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ、Ａｌｓｅｖｅｒの溶液、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、水、ＨａｎｋのＢＳＳ、ＥａｒｌｅのＢＳＳ、ＧｒｅｙのＢＳＳ、ＰｕｃｋのＢＳＳ、ＳｉｍｍのＢＳＳ、ＴｙｒｏｄｅのＢＳＳ、およびＢＳＳ  Ｐｌｕｓなどのバランス塩溶液（ＢＳＳ）、またはそれらの組み合わせを含み得る。強壮剤は、治療用組成物の適切な強壮性を提供するために使用することができる。一つの側面において、治療用組成物の強壮剤は、約２５０から約３５０ミリオスモール／リットル（ｍＯｓｍ／Ｌ）であり得る。別の側面において、治療用組成物の強直性は、約２７７〜約３１０ｍＯｓｍ／Ｌであり得る。
【０１３０】
いくつかの実施例では、注射可能な治療用組成物は、ｐＨ調整剤または緩衝剤を含むことができる。ｐＨ調整剤または緩衝剤の非限定的な実施例としては、塩酸、リン酸、クエン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン（ＴＲＩＳ）緩衝剤などの多数の酸、塩基、およびそれらの組み合わせを含み得る。典型的には、治療用組成物のｐＨは、約５〜約９、または約６〜約８であり得るが、他の好適なｐＨもまた好ましい。
【０１３１】
いくつかの実施例では、注射可能な治療用組成物は、防腐剤を含むことができる。防腐剤の非限定的な実施例としては、アスコルビン酸、アセチルシステイン、重亜硫酸塩、メタ重亜硫酸塩、モノチオグリセロール、フェノール、メタクレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ブチル化ヒドロキシルトルエン、塩化ミリスチルγ−ピコリミウム、２−フェノキシエタノール、硝酸フェニル水銀、クロロブタノール、チメロサール、トコフェロール等、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【０１３２】
いくつかの実施例では、注射可能な治療用組成物は、キレート剤を含み得る。キレート剤の非限定的な実施例としては、エチレンジアミン四酢酸、カルシウム、カルシウム二ナトリウム、バーセタミド、カルテリドール、ジエチレントリアミンペンタ酢酸等、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【０１３３】
いくつかの実施例では、注射可能な治療用組成物は、増量剤を含むことができる。増量剤の非限定的な実施例は、ショ糖、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、グルコース、ラフィノース、グリシン、ヒスチジン、ポリビニルピロリドン等、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１３４】
さらに他の実施例では、薬学的に許容される担体は、固体経口投与形態または液体経口投与形態を介してのような、経腸投与のための治療用組成物を提供するために配合することができる。固体経口投与形態の場合、薬学的に許容される担体は、カプセル、錠剤などを形成するのに適した様々な成分を含むことができる。液体経口投与形態の場合、薬学的に許容される担体は、分散液、懸濁液、シロップ、エリキシル、またはそのようなものを形成するのに適した様々な成分を含むことができる。
【０１３５】
いくつかの特定の実施例では、治療用組成物は、錠剤として製剤化することができる。そのような実施例では、治療用組成物は、典型的にはバインダーを含むことができる。結合剤の非限定的な例としては、ラクトース、リン酸カルシウム、ショ糖、コーンスターチ、微結晶セルロース、ゼラチン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１３６】
治療用組成物が錠剤として製剤化される場合、いくつかの実施例では、治療用組成物はまた、崩壊剤を含むことができる。崩壊剤の非限定的な実施例としては、架橋ＰＶＰ、架橋ＣＭＣ、変性デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、そのようなもの、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１３７】
いくつかの実施例では、錠剤はまた、充填剤を含むことができる。充填剤の非限定的な実施例は、ラクトース、リン酸二カルシウム、ショ糖、微結晶セルロース、そのようなもの、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１３８】
いくつかのさらなる実施例では、錠剤はコーティングを含むことができる。そのようなコーティングは、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、シェラック、ゼイン、種々の多糖類、種々のエンターチックス、そのようなもの、またはそれらの組み合わせなどの種々の材料で形成することができる。
【０１３９】
いくつかの実施例では、錠剤は、所望により、抗付着剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）、着色剤、滑沢剤（例えば、ヒュームドシリカ、タルク、炭酸マグネシウム）、滑沢剤（例えば、タルク、シリカ、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸）、防腐剤、乾燥剤、および／または他の適切な錠剤賦形剤などの様々な他の成分を含むことができる。
【０１４０】
いくつかの他の実施例では、治療用組成物は、カプセルとして製剤化することができる。そのような例では、カプセル自体は、典型的には、ゼラチン、ヒプロメロース、ＨＰＭＣ、ＣＭＣ、そのようなもの、またはそれらの組み合わせを含むことができる。様々な賦形剤もまた、カプセル内に、例えば錠剤に関して上述したような、結合剤、崩壊剤、充填剤、滑沢剤、防腐剤、コーティング剤、そのようなもの、またはそれらの組み合わせなどを含むことができる、または他の適切なバリエーションを含むことができる。
【０１４１】
いくつかの実施例では、治療用組成物は、液体経口投与形態として製剤化することができる。液体経口投与形態は、液体ビヒクル、可溶化剤、増粘剤もしくは分散剤、防腐剤、強壮剤、ｐＨ調整剤もしくは緩衝剤、甘味料、そのようなもの、またはそれらの組み合わせなどの様々な賦形剤を含むことができる。液体ビヒクルの非限定的な例としては、水、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、そのようなもの、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。可溶化剤の非限定的な例としては、塩化バンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、ドクセートナトリウム、ノノノキシノール−９、オクトキシノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体、ポリオキシルヒマシ油、ポリオキシル水添ヒマシ油などを挙げることができる。ポリオキシルオレイルエーテル、ポリオキシルセチルステアリルエーテル、ポリオキシルステアレート、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、チロキサポールなど、またはそれらの組み合わせ。増粘剤または分散剤の非限定的な例としては、アルギン酸ナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ＨＰＭＣ、ＣＭＣ、微結晶セルロース、トラガント、キサンタンガム、ベントナイト、カラギーナン、グアーガム、コロイダル二酸化ケイ素など、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。防腐剤、強壮剤、ｐＨ調整剤または緩衝剤は、典型的には、注射可能な製剤に関して上述したもの、または他の適切な防腐剤、強壮剤、ｐＨ調整剤または緩衝剤のいずれであっても良い。甘味料は、天然および／または人工甘味料、例えば、ショ糖、グルコース、フルクトース、ステビア、エリスリトール、キシリトール、アスパルテーム、スクラロース、ネオテーム、アセスルファムカリウム、サッカリン、アドバンテーム、ソルビトールなどの甘味料、またはそれらの組み合わせを含んでも良い。
【０１４２】
さらに別の実施例では、薬学的に許容される担体は、皮膚を介して、鼻腔を介して、または同様に、またはそれらの組み合わせを介して、経皮投与または経粘膜投与のための治療用組成物を提供するように配合することができる。治療用組成物が経皮または経粘膜投与用に製剤化される場合、薬学的に許容される担体は、懸濁液、分散液、ローション、クリーム、軟膏、ゲル、泡、パッチ、粉末、ペースト、スポンジ、そのようなもの、またはそれらの組み合わせを形成するのに適した様々な成分を含むことができる。非限定的な実施例としては、可溶化剤、乳化剤、分散剤、増粘剤、エモリエント剤、ｐＨ調整剤、強壮剤、防腐剤、接着剤、浸透促進剤など、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。可溶化剤および／または乳化剤の非限定的な実施例としては、水、エタノール、プロピレングリコール、エチレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール、塩化バンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、ドクセートナトリウム、ノノノキシノール−９、オクトキシノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体などを挙げることができる。ポリオキシルヒマシ油、ポリオキシル水添ヒマシ油、ポリオキシルオレイルエーテル、ポリオキシルセチルステアリルエーテル、ポリオキシルステアレート、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、チロキサポールなど、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。いくつかの実施例では、可溶化剤はまた、炭化水素または脂肪物質、例えば、ペトロラタム、マイクロクリスタリンワックス、パラフィンワックス、鉱物油、セレシ、ヤシ油、ミツロウ、オリーブ油、ラノリン、落花生油、スペルマセティワックス、ゴマ油、アーモンド油、水添ヒマシ油などを含むことができる。綿実油、大豆油、コーン油、水添硫酸化ヒマシ油、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、ラウリン酸、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。いくつかの実施例では、可溶化剤は、ケイ素、例えば、ポリジメチルシロキサン、メチコン、ジメチルプロピルシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、ジメチルポリシロキサンのステリルエステル、エトキシル化ジメチコン、エトキシル化メチコン、そのようなもの、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１４３】
いくつかのさらなる実施例では、治療用組成物は、分散剤および／または増粘剤、例えばポリアクリル酸（例えばカルボポール）、ゼラチン、ペクチン、トラガカンス、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ＨＰＭＣ、ＣＭＣ、アルギン酸、デンプン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンの共重合体、ポリエチレングリコール、そのようなもの、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１４４】
いくつかの実施例では、治療用組成物は、アロエベラ、ラノリン、尿素、ペトロラタム、シアバター、ココアバター、鉱物油、パラフィン、蜜蝋、スクワレン、ホホバ油、ココナッツ油、セサミ油、アーモンド油、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オリーブ油、オレイン酸、トリエチルヘキサノイン、グリセロール、ソルビトール、プロピレングリコール、シクロメチコン、ジメチコン等のエモリエント剤、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１４５】
いくつかの実施例では、治療用組成物は、接着剤、例えばアクリル系接着剤、ポリイソブチレン系接着剤、シリコン系接着剤、ヒドロゲル系接着剤等、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１４６】
いくつかの実施例では、治療用組成物は、エタノール、プロピレングリコール、オレイン酸および他の脂肪酸、アゾン、テルペン、テルペノイド、胆汁酸、ミリスチン酸イソプロピルおよび他の脂肪酸エステル、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチル−２−ピロリドンおよび他のピロリドンなどの浸透促進剤、そのようなもの、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１４７】
局所、経皮、または経粘膜治療用組成物中のｐＨ調整剤、強直剤、および防腐剤は、一般に、上記のｐＨ調整剤および緩衝剤、強直剤、および防腐剤、または特定の製剤および／またはその使用に適した他の任意のｐＨ調整剤、緩衝剤、強直剤、または防腐剤を含むことができる。いくつかの例では、治療用組成物はまた、ヒュームドシリカ、マイカ、タルク、二酸化チタン、カオリン、グリシン酸アルミニウム、エチレンジアミン四酢酸、香料、着色剤、上記のような他の成分、同様のもの、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１４８】
いくつかの追加の実施例では、薬学的に許容される担体は、吸入を介して投与するために製剤化することができる。いくつかの実施例では、そのような製剤は、ヒドロフルオロアルカン、例えばＨＦＡ１３４ａ、ＨＦＡ２２７、または他の適切な推進剤を含むことができる。さらに他の実施例では、治療用組成物は、ネブライゼーションを介して投与するために製剤化することができる。いずれの場合も、治療用組成物はまた、上述のような種々の可溶化剤を含むことができる。他の実施例では、治療用組成物は、乾燥粉末エアロゾルとして製剤化することができる。いくつかの実施例では、治療用組成物は、粒子状担体および／または他の粒子状賦形剤、例えば、ラクトース、マンニトール、他の結晶性糖、ヒュームドシリカ、ステアリン酸マグネシウム、アミノ酸、そのようなもの、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１４９】
まだ追加の実施例では、薬学的に許容される担体は、被験体への移植のための生分解性マトリックスとして配合することができる。適当なマトリックス材料の特定の非限定的な実施例としては、ＰＬＧＡ（乳酸とグリコリド含有量の異なる比率、および酸またはエステル末端などの末端基）、ＰＶＡ、ＰＥＧ、ＰＬＡ、ＰＧＡ、ＨＰＭＣ、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クロスカメロースナトリウム、ポリカプロラクトン、ヒアルロン酸、アルブミン、それらの塩化ナトリウムブロックコポリマーなどの生分解性ポリマーを含むことができ、これらの組み合わせが挙げられる。ポリ乳酸−ポリグリコール酸ブロック共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリグリコール酸−ポリビニルアルコールブロック共重合体（ＰＧＡ／ＰＶＡ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリカプロラクトン−ポリエチレングリコールブロック共重合体、クロスカルメロース等の特定の共重合体が特に有効であり得る。ある側面において、活性剤マトリックスは、約４５〜８０％のＰＬＡおよび約６５％のＰＬＡおよび約３５％のＰＧＡのような約５５〜２０％のＰＧＡを有するＰＬＧＡであり得る。
【０１５０】
いくつかの実施例では、生分解性マトリックスは、約１週間〜約２週間の期間にわたって生分解するように構成され得る。さらに他の実施例では、生分解性マトリックスは、約２週間〜約４週間の期間にわたって生分解するように構成することができる。さらに他の実施例では、生分解性マトリックスは、約４週間〜約６週間またはそれ以上の期間にわたって生分解するように構成することができる。
【０１５１】
いくつかの実施例では、治療用組成物は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤に加えて、治療剤（例えば、補助的な治療剤）を含むことができる。非限定的な実施例としては、ドーパミン作動薬、コリンエステラーゼ阻害薬、抗精神病薬、鎮痛薬、抗炎症薬、オートファジー誘導薬（例えば、シロリムス、エベロリムス、タクロリムスなど）、同様のもの、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１５２】
本開示はまた、被験体における神経学的障害または状態を治療する方法を含む。方法は、生体液中のＳｔａｕｆｅｎ１のレベルを同定すること、生体液中のＳｔａｕｆｅｎ１のレベルが、対象者が神経学的障害または状態を有するかまたは有する可能性が高いことを示すかどうかを決定すること、および神経学的障害または状態を有するかまたは有する可能性が高い対象者にＳｔａｕｆｅｎ１調節剤を投与することを含むことができる。生体液は、脳脊髄液、血液血清、血漿など、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１５３】
したがって、Ｓｔａｕｆｅｎ１は、Ｓｔａｕｆｅｎ１調節剤によるその後の治療のために、対象者における神経学的障害または状態の存在または可能性を検出するために、生物学的流体中の抗原またはバイオマーカーとして使用することができる。さらに、Ｓｔａｕｆｅｎ１は、様々な神経学的障害または状態を有する個体において高度に上昇し得るので、Ｓｔａｕｆｅｎ１は、容易に検出可能であり、広いダイナミックレンジを有し、複数の障害または状態のマーカーとなり得る。
【０１５４】
様々な分析技術を用いて、Ｓｔａｕｆｅｎ１の有無を識別し、生体液中のＳｔａｕｆｅｎ１レベルを定量することができる。非限定的な実施例としては、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、メソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）アッセイなど、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。
【０１５５】
本開示はまた、生物学的流体中のＳｔａｕｆｅｎ１を検出するためのキットを記載する。いくつかの実施例では、キットは、上述したように、被験体における神経疾患または状態を治療する方法のうちの１つ以上を採用することができる。いくつかの実施例において、キットは、Ｓｔａｕｆｅｎ１捕捉抗体、Ｓｔａｕｆｅｎ１検出抗体、またはそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかのさらなる実施例では、Ｓｔａｕｆｅｎ１捕捉抗体およびＳｔａｕｆｅｎ１検出抗体のうちの１つまたは複数を標識することができる。いくつかの実施例では、キットは、Ｓｔａｕｆｅｎ１捕捉抗体を含むことができる。いくつかの実施例では、キットはＳｔａｕｆｅｎ１検出抗体を含むことができる。いくつかの実施例では、キットは、Ｓｔａｕｆｅｎ１捕捉抗体およびＳｔａｕｆｅｎ１検出抗体の両方を含むことができる。さらなる実施例では、キットは、生物学的試料中のＳｔａｕｆｅｎ１の検出を容易にするために、１つまたは複数の適切な試薬、緩衝剤、またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。
【０１５６】
さらなる実施例では、キットは、生物学的試料中のＳｔａｕｆｅｎ１を検出する方法に関する指示を含むことができる。指示は、採用された特定のタイプの分析方法、採用された装置などに応じて異なる。
【実施例１】
【０１５７】
実施例１−ＳＣＡ２線維芽細胞におけるＡＴＸＮ２およびＳｔａｕｆｅｎ１の共局在化とその物理的相互作用
脳オリゴデンドロサイトやその他の培養細胞では、Ｓｔａｕｆｅｎ１とＳＧｓとの関連が報告される。ＡＴＸＮ２はＳＧｓの構成成分であることから、ストレス条件下でＡＴＸＮ２とＳｔａｕｆｅｎ１が共局在しているかどうかを調べた。ＨＥＫ−２９３細胞に熱ショックを与え、ＡＴＸＮ２とＳｔａｕｆｅｎ１の細胞内局在を調べた。生理的条件下では、ＡＴＸＮ２とＳｔａｕｆｅｎ１の免疫染色により、ＡＴＸＮ２とＳｔａｕｆｅｎ１の両方がＨＥＫ−２９３細胞の細胞質全体に分布していることが示された（図１Ａ）。しかし、熱ショックにさらされた細胞では、ＡＴＸＮ２とＳｔａｕｆｅｎ１の共局在化がＳＧに似た細胞質の病巣で観察された（図１Ａ）。追加の共局在化研究は、ＳＧのタンパク質マーカーであるＴＩＡ−１抗体を用いて実施した。ＡＴＸＮ２とＴＩＡ−１は、熱ショック処理時に細胞内のＳＧに共局在した（図１Ａ）。このように、ＡＴＸＮ２とＳｔａｕｆｅｎ１の両方がストレス条件下（熱ショック）でＳＧに共局在した。
【０１５８】
ＡＴＸＮ２の凝集はＳＣＡ２脳で明らかであるので、正常およびストレス条件下でのＳＣＡ２線維芽細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１のリクルートを調べた。正常（ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／２２）とＳＣＡ２線維芽細胞（ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／４２）をＡＴＸＮ２抗体とＳｔａｕｆｅｎ１抗体で染色したところ、ＳＣＡ２線維芽細胞では変異体ＡＴＸＮ２とＳｔａｕｆｅｎ１の共局在が見られたが、正常線維芽細胞ではストレスグラニュール様の凝集体は見られなかった。ＩｍａｇｅＪでは、集合体あたりの平均面積は、野生型細胞よりもＳＣＡ２細胞の方が約１５％高いことがわかった（図１Ｂ−１Ｃ）。興味深いことに、ストレス条件下では、ＡＴＸＮ２とＳｔａｕｆｅｎ１を共局在化した顆粒の数が正常細胞とＳＣＡ２線維芽細胞で増加したが、ＳＣＡ２細胞では顆粒の数がより顕著であった（図１Ｄおよび１Ｅ）。
【０１５９】
ＡＴＸＮ２とＳｔａｕｆｅｎ１がＳＣＡ２細胞の  ＳＧ状凝集体に共局在していることから、これら２つのタンパク質の生体内での物理的相互作用が予測される。この考えを検証するために、−Ｑ２２リピートまたは−Ｑ１０８リピートを含むフラグタグ付きＡＴＸＮ２を過剰発現させたＨＥＫ−２９３培養細胞を用いて、タンパク質免疫沈降（ＩＰ）実験を行った。全細胞抽出物（ＲＮａｓｅ  Ａ処理の有無にかかわらず）をＦｌａｇ  ｍＡｂビーズを用いて免疫沈降を行い、溶出した結合タンパク質複合体をウエスタンブロットで解析した。溶出したタンパク質のウエスタンブロット解析を行ったところ、Ｆｌａｇ−ＡＴＸＮ２タンパク質の発現が認められ、内因性Ｓｔａｕｆｅｎ１とＦｌａｇ−ＡＴＸＮ２−Ｑ２２またはＦｌａｇ−ＡＴＸＮ２−Ｑ１０８とのＲＮＡ依存的な相互作用が認められた（図１Ｆ）。免疫沈降物はまた、生体内でＡＴＸＮ２と相互作用し得るＰＡＢＰＣ１（ＲＮＡ依存性）およびＤＤＸ６（ＲＮＡ−および非ＲＮＡ依存性の両方）のｃｏ−ＩＰを示した。さらに、これらのＩＰ産物をタンデム質量分析法で解析し、ＡＴＸＮ２とＳｔａｕｆｅｎ１との相互作用の真偽を確認した。これらのデータは、これらのデータを合わせ、ＳＣＡ２細胞におけるストレスグラニュール様凝集体におけるＡＴＸＮ２とＳｔａｕｆｅｎ１の物理的相互作用および共局在化を示す。
【実施例２】
【０１６０】
実施例２−マウス小脳におけるＳｔａｕｆｅｎ１の発現
ＳＣＡ２では小脳の変性が顕著であることから、野生型マウスの小脳切片におけるＳｔａｕｆｅｎ１の発現を調べた。抗Ｓｔａｕｆｅｎ抗体を用いた免疫染色により、小脳にＳｔａｕｆｅｎ１が発現していることが確認された（図２Ａ）。このことから、ヒト蛋白質アトラスでは、小脳で有意な発現レベルを持つＳｔａｕｆｅｎ１が広く発現していることが明らかになった。抗Ｓｔａｕｆｅｎ抗体の特異性は、ヒトＨＥＫ−２９３細胞またはマウスＮ２ａ神経芽腫細胞をヒトまたはマウスＳｔａｕｆｅｎ１に対して指示されたｓｉＲＮＡで処理した細胞抽出物を用いたウエスタンブロット分析において、内因性Ｓｔａｕｆｅｎ１レベルを測定することによって確認された（図２Ｂおよび２Ｃ）。
【実施例３】
【０１６１】
実施例３−定常状態のＳｔａｕｆｅｎ１レベルは、ＳＣＡ２患者細胞株およびＢＡＣ−ＳＣＡ２マウスセレベラにおいて増加する。
Ｓｔａｕｆｅｎ１はＡＴＸＮ２と相互作用し、ＳＣＡ２線維芽細胞において変異ＡＴＸＮ２と凝集体を形成するため、ＳＣＡ２線維芽細胞および−リンパ芽細胞Ｂ（ＬＢ）細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１の定常状態レベルを測定した。使用した細胞は、（ａ）Ｑ２２２リピートを有する正常皮膚線維芽細胞４個、（ｂ）Ｑ３５、Ｑ３５、Ｑ４２、Ｑ４５リピートを有するＳＣＡ２皮膚線維芽細胞５個、（ｃ）Ｑ２２リピートを有する正常ＬＢ細胞２個、（ｄ）ＡＴＸＮ２遺伝子のＱ４０、Ｑ４６、Ｑ５２リピートを有するＳＣＡ２−ＬＢ細胞３個であった。収穫した細胞からＬａｅｍｍｌｉ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを用いて全細胞抽出物を調製し、ウエスタンブロットにより分析し、Ｓｔａｕｆｅｎ１定常状態レベルを測定した。５５−ＫＤ  Ｓｔａｕｆｅｎ１アイソフォームの定常状態レベルは、正常線維芽細胞４個と比較して、５個のＳＣＡ２線維芽細胞で〜４．０倍、〜４．８倍、〜４．５倍、〜３．６倍、〜４．９倍上昇した。同様に、３つのＳＣＡ２−ＬＢ細胞は、２つの正常ＬＢ細胞と比較して、Ｓｔａｕｆｅｎ１のレベルが〜３．７、〜３．２、及び〜４．１倍に増加したことを示した（図３Ａ−３Ｂ）。別のＡＴＸＮ２インタラクターであるＤＤＸ６タンパク質のレベルは、正常細胞と比較して、ＳＣＡ２−線維芽細胞または−ＬＢ細胞では有意な変化は見られなかった。Ｓｔａｕｆｅｎ１レベルが変異型ＡＴＸＮ２によってｉｎ  ｖｉｖｏで特異的に影響を受けるかどうかを決定するために、生後２４週齢のＢＡＣ−ＳＣＡ２マウスモデルの小脳抽出物を用いて、Ｓｔａｕｆｅｎ１の相対レベルをウエスタンブロット法で測定した。ＢＡＣ−Ｑ７２マウスではＳｔａｕｆｅｎ１の発現量の増加が観察された（〜１．８１倍および〜２．０１倍）が、ＢＡＣ−Ｑ２２マウスでは野生型マウスと比較して変化しなかった（図３Ｃ）。逆に、ＳＣＡ３患者線維芽細胞または変異ＡＴＸＮ３（Ｆｌａｇ−ＡＴＸＮ３−Ｑ５６）を発現するＨＥＫ−２９３細胞では、対照と比較して、Ｓｔａｕｆｅｎ１レベルの有意な変化は観察されなかった（図３Ａ−３Ｂおよび３Ｄ）。これらの結果から、ＳＣＡ２病ではＳｔａｕｆｅｎ１のレベルが上昇していることが明らかになった。Ｓｔａｕｆｅｎ１の上昇は、複数の細胞株およびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて一貫した。
【０１６２】
次に、ｓｉＡＴＸＮ２によりＡＴＸＮ２レベルを低下させたＨＥＫ−２９３細胞とＡｔｘｎ２ノックアウトマウス（８週齢）のセレベラを用いて、タンパク質およびｍＲＮＡレベルでのＳｔａｕｆｅｎ１の定常状態をｑＰＣＲにより測定した。これらの実験では、ＡＴＸＮ２レベルが低下したＨＥＫ−２９３細胞およびＡｔｘｎ２ノックアウトマウスでは、Ｓｔａｕｆｅｎ１定常タンパク質およびｍＲＮＡレベルは変化しなかった（図３Ｅ−３Ｇ）。したがって、ＳＣＡ２におけるＳｔａｕｆｅｎ１の豊富さの増加は、アタクシン−２の機能的損失に起因するものではなかった。
【実施例４】
【０１６３】
実施例４−ＨＥＫ−２９３細胞における変異体ＡＴＸＮ２の発現は、Ｓｔａｕｆｅｎ１の増加したアバンダンスを再現し、Ｓｔａｕｆｅｎ１タンパク質の安定性はＳＣＡ２線維芽細胞において増加する。
Ｓｔａｕｆｅｎ１レベルの上昇が長いポリＱトラクトを持つＡＴＸＮ２を発現させた場合に再発現するかどうかを調べるために、フラグタグ付きＡＴＸＮ２−Ｑ２２、−Ｑ５８、−Ｑ１０８を発現させたＨＥＫ−２９３細胞の全細胞抽出物を用いて、Ｓｔａｕｆｅｎ１レベルの定常状態を測定した。ウェスタンブロット分析は、ＡＴＸＮ２−Ｑ２２およびコントロールと比較し、ＡＴＸＮ２−Ｑ５８または−Ｑ１０８の発現は、Ｓｔａｕｆｅｎ１レベルの増加（〜２．２および〜２．７倍）をもたらすのに十分であることを示した（図４Ａ）。Ｓｔａｕｆｅｎ１レベルの増加がＡＴＸＮ２−Ｑ５８または−Ｑ１０８発現の選択的細胞毒性の結果ではないかどうかをアッセイするために、内因性ＰＡＢＰＣ１およびＤＤＸ６レベルをウエスタンブロットによってこれらの細胞抽出物中で測定した。ＡＴＸＮ２−Ｑ２２、−Ｑ５８または−Ｑ１０８を発現したＨＥＫ−２９３細胞では、ＰＡＢＰＣ１およびＤＤＸ６のレベルは変化しなかった（図４Ａ）。このように、これらのデータは、ＨＥＫ−２９３細胞における変異型ＡＴＸＮ２発現の結果として、Ｓｔａｕｆｅｎ１の増加が特異的に起こることを示す。
【０１６４】
ＡＴＸＮ２  ｐｏｌｙＱ拡張が介在するＳｔａｕｆｅｎ１の豊富さの基礎的なメカニズムを同定するために、正常およびＳＣＡ２線維芽細胞においてＳｔａｕｆｅｎ１転写物レベルを調べた。ｑＰＣＲ  データの結果、Ｓｔａｕｆｅｎ１  トランスクリプトレベルにはほとんど差がないことが示され（データ表示なし）、ＡＴＸＮ２  ｐｏｌｙＱの拡張がＳｔａｕｆｅｎ１タンパク質レベルに影響を与えている可能性が示唆された。このことを検証するために、Ｓｔａｕｆｅｎ１の比較タンパク質安定性を、正常線維芽細胞およびＳＣＡ２線維芽細胞におけるシクロヘキシミド（ＣＨＸ）−チェイスアッセイによって測定した。収穫した正常およびＳＣＡ２線維芽細胞抽出物からＳｔａｕｆｅｎ１の相対的なレベルを分析した。図４Ｂおよび４Ｃ）。ウェスタンブロット分析は、正常線維芽細胞においてＣＨＸ処理の４時間後にＳｔａｕｆｅｎ１レベルが減少したことを実証した。また、実験的対照としてｐ２１  Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１レベルを測定したところ、正常線維芽細胞およびＳＣＡ２線維芽細胞の両方において、ＣＨＸ処理後４時間後にｐ２１  Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１レベルが９０％程度まで低下したことが示された。したがって、これらのデータは、ＳＣＡ２細胞における変異型ＡＴＸＮ２の存在がＳｔａｕｆｅｎ１タンパク質の安定性を増加させることを示唆する。
【実施例５】
【０１６５】
実施例５−Ｓｔａｕｆｅｎ１のレベルの上昇は、ＲＮＡ標的の異常な処理をもたらす
ＳＣＡ２で観察される異常な遺伝子発現パターンの発生におけるＳｔａｕｆｅｎ１の役割を調べるために、ＨＥＫ−２９３細胞におけるＰＣＰ２およびＣＡＬＢ１遺伝子発現に対するＳｔａｕｆｅｎ１投与量の変化の影響を評価し、その結果をＳＣＡ２−ＬＢ細胞で観察された結果と比較した。まず、ＳＣＡ２−ＬＢ（ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５２）細胞において、ＰＣＰ２  ｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲを用いて測定した。ＣＡＬＢ１  ｍＲＮＡは発現量が検出されなかったため、解析できなかった。ＰＣＰ２  ｍＲＮＡのレベルは、正常ＬＢ（ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／２２）細胞と比較して、ＳＣＡ２−ＬＢ細胞において４５．４±７．７％減少した（図５Ａ）。対照的に、正常およびＳＣＡ２−ＬＢ細胞では、ＡＴＸＮ２転写物レベルの変化は観察されなかった。別個の実験では、ＨＥＫ−２９３細胞におけるＰＣＰ２およびＣＡＬＢ１  ｍＲＮＡアバンダンスに対するＳｔａｕｆｅｎ１レベルの増加の役割を評価した。Ｓｔａｕｆｅｎ１タンパク質は、ＳＣＡ２−線維芽細胞または−ＬＢ細胞で観察される変化を模倣する範囲で過剰発現した。Ｓｔａｕｆｅｎ１の発現亢進は、ＰＣＰ２およびＣＡＬＢ１のｍＲＮＡレベルをそれぞれ４０．８±７．９％および３２．８±８．５％減少させることを誘導した。Ｓｔａｕｆｅｎ１過剰発現の選択的細胞毒性を除外するために、内因性ＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡレベルを測定した。その結果、Ｓｔａｕｆｅｎ１を過剰発現させたＨＥＫ−２９３細胞ではＡＴＸＮ２転写物のレベルは変化しなかった（図５Ｂおよび５Ｃ）。このように、これらのデータは、ＳＣＡ２細胞における異常な遺伝子発現パターンが細胞培養モデルで再現され得ることを実証する。
【０１６６】
次に、Ｓｔａｕｆｅｎ１レベルの上昇に伴うＰＣＰ２タンパク質の豊富さを分析した。内因性ＰＣＰ２タンパク質は（検出不可能な発現レベルのため）解析できなかったが、外因性ＭＹＣタグ付きＰＣＰ２は、フラグタグ付きＳｔａｕｆｅｎ１を発現した短期ハイグロマイシン選択ＨＥＫ−２９３細胞において発現され、Ｓｔａｕｆｅｎ１レベルの増加が外因性ＭＹＣタグ付きＰＣＰ２発現に及ぼす調節効果を試験した。５'および３'ＵＴＲ（ｉ）を含む、または３'ＵＴＲ（ｉｉ）を含まないＭＹＣタグ付きＰＣＰ２  ｃＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターの転写制御下でクローニングした。トランスフェクションの４８時間後にウエスタンブロット分析を行ったところ、ＭＹＣタグ付きＰＣＰ２  ｃＤＮＡ［（５'＋３'ＵＴＲ］］（ｉ）をトランスフェクションしたＳｔａｕｆｅｎ１発現細胞では、外因性のＰＣＰ２レベルが対照と比較して有意に低下した。しかしながら、Ｓｔａｕｆｅｎ１レベルの増加は、コントロールと比較して、ＭＹＣタグ付きＰＣＰ２  ｃＤＮＡ［（＋５'ＵＴＲ）］（ｉｉ）の発現に対する抑制効果を示さなかった（図５Ｄ〜５Ｆ）。均等なトランスフェクションをコントロールするために、ＭＹＣタグ付きＰＣＰ２プラスミド中で独立したカセットとして発現されたネオマイシンタンパク質レベルをモニターした。したがって、これらのデータは、Ｓｔａｕｆｅｎ１がその３'ＵＴＲを介してＰＣＰ２の発現を調節することを示唆する。
【実施例６】
【０１６７】
実施例６−Ｓｔａｕｆｅｎ１はＰＣＰ２およびＣＡＬＢ１  ＲＮＡと相互作用する
ＰＣＰ２とＣＡＬＢ１のｍＲＮＡ  が減少し、Ｓｔａｕｆｅｎ１の上昇によりＰＣＰ２のタンパク質発現が抑制されたことから、Ｓｔａｕｆｅｎ１は一部のｍＲＮＡと相互作用し、その発現を制御している可能性が示唆された。Ｓｔａｕｆｅｎ１の標的を同定するために、Ｆｌａｇタグ付きＳｔａｕｆｅｎ１を過剰発現させたＨＥＫ−２９３細胞を用いて、タンパク質−ＲＮＡ  免疫沈降（ＩＰ）実験を行った。非ＲＮａｓｅ  Ａ処理した全細胞抽出物をＦｌａｇ  ｍＡｂビーズで免疫沈降し、溶出した蛋白質−ＲＮＡ複合体を２つのアリコートに分割してウエスタンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。Ｆｌａｇ−Ｓｔａｕｆｅｎ１はＡＴＸＮ２のｃｏ−ＩＰを示した（図６Ａ）。２番目のアリコートからのＲＴ−ＰＣＲ解析では、Ｆｌａｇ−ｓｔａｕｆｅｎ１はＰＣＰ２とＣＡＬＢ１のｍＲＮＡをプルダウンしたが、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡをコントロールしなかったことが明らかになった（図６Ａ）。
【０１６８】
Ｓｔａｕｆｅｎ１とその標的との間の直接的な結合を確認するために、バクテリアで発現された組換えＨｉｓタグ付きＳｔａｕｆｅｎ１タンパク質およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＤＩＧ標識ＰＣＰ２  ＲＮＡプローブを用いて、ノースウェスタンブロッティング実験を実施した。ＰＣＰ２  ＲＮＡのどの部分がＳｔａｕｆｅｎ１と相互作用するかを調べることができるように、いくつかのプローブを作製した。使用したプローブは以下の通りである。ＤＩＧ−ＰＣＰ２［（５'＋３'ＵＴＲ）］（ｉ）、ＤＩＧ−ＰＣＰ２（３'ＵＴＲ）（ｉｉ）、およびＤＩＧ−ＰＣＰ２（５'ＵＴＲ）（ｉｉｉ）であった（図６Ｂ）。Ｓｔａｕｆｅｎ１は、ＰＣＰ２［（５'＋３'ＵＴＲ）］（ｉ）またはＰＣＰ２（３'ＵＴＲ）（ｉｉ）ＲＮＡには結合したが、ＰＣＰ２（５'ＵＴＲ）（ｉｉｉ）ＲＮＡには結合せず、それによって相互作用の特異性を示した（図６Ｃ）。これらの結果を合わせて、これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で、Ｓｔａｕｆｅｎ１が３'ＵＴＲを介してＰＣＰ２  ｍＲＮＡと相互作用することを示す。
【実施例７】
【０１６９】
実施例７−Ｓｔａｕｆｅｎ１または変異体ＡＴＸＮ２のサイレンシングは、ＳＣＡ２細胞におけるＰＣＰ２  ｍＲＮＡレベルを回復する。
本研究で使用したｓｉＲＮＡは以下の通りである。Ａｌｌ  Ｓｔａｒ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．ＵＳＡ；Ｃａｔ＃１０２７２８０）、ｓｉＡＴＸＮ２［Ｈｓ＿ＡＴＸＮ２＿２＿２、（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．ＵＳＡ；Ｃａｔ＃ＳＩ００３０８１９６）、ヒトｓｉＳＴＡＵ１：５'  ＣＣＵＡＵＡＡＣＵＡＣＡＡＣＡＵＧＡＧｄＴｄＴ−３'およびマウスｓｉＳｔａｕ１：５'−ＣＡＡＣＵＧＵＡＣＵＡＣＣＵＵＣＣ  ＡｄＴｄＴ−３'を使用した。Ｓｔａｕｆｅｎ１  ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．により合成された。オリゴヌクレオチドを脱保護し、相補鎖をアニーリングした。
【０１７０】
ＳＣＡ２−線維芽細胞または−ＬＢ細胞は、Ｓｔａｕｆｅｎ１の増加した豊富さを実証した（図３Ａ〜３Ｇ）。ＢＡＣ−ＳＣＡ２マウスモデルまたは細胞培養モデルにおける変異体ＡＴＸＮ２の発現によるＳｔａｕｆｅｎ１レベルの増加の再現、および細胞培養におけるＳｔａｕｆｅｎ１の過剰発現によるＲＮＡ処理の調節障害（図４Ａ−４Ｃおよび５Ａ−５Ｆ）は、Ｓｔａｕｆｅｎ１のサイレンシングがＳｔａｕｆｅｎ１を標的とするＲＮＡの正常レベルの回復につながることを予測する。
【０１７１】
これをテストするために、Ｓｔａｕｆｅｎ１に対するｓｉＲＮＡによってＳｔａｕｆｅｎ１レベルを減少させたＳＣＡ２−ＬＢ（ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５２）細胞におけるＰＣＰ２  ｍＲＮＡレベルの影響を研究した。ｑＰＣＲ分析は、ＳＣＡ２−ＬＢ細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１の枯渇（〜８３％）がＰＣＰ２  ｍＲＮＡレベルを、コントロールｓｉＲＮＡで処理した正常ＬＢ細胞で見られたレベルと同様のレベルまで回復させることを明らかにした（図７Ａ−７Ｃ）。しかしながら、正常ＬＢ細胞におけるＳｔａｕｆｅｎ１のサイレンシング（〜８１％）は、コントロールｓｉＲＮＡで処理した正常ＬＢ細胞と比較して、ＰＣＰ２  ｍＲＮＡレベルの有意な変化を示さなかった（図７Ａ〜７Ｃ）。注目すべきことに、Ｓｔａｕｆｅｎ１のサイレンシングは、正常ＬＢ細胞またはＳＣＡ２−ＬＢ細胞におけるＡＴＸＮ２転写物レベルには何の影響も示さない（図７Ｄ）。したがって、Ｓｔａｕｆｅｎ１のサイレンシングは、ＳＣＡ２で観察された異常なＲＮＡ代謝に対する変異体ＡＴＸＮ２の効果を救済した。
【０１７２】
次に、変異体ＡＴＸＮ２を、ＳＣＡ２−線維芽細胞（ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／４２）または−ＬＢ（ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５２）細胞において、用量依存的にｓｉＡＴＸＮ２  ＲＮＡを用いて枯渇させた。ＡＴＸＮ２  ｓｉＲＮＡでの処理は、両方の細胞型において、用量依存的に変異型ＡＴＸＮ２の減少をもたらした（図７Ｅ、７Ｆ、７Ｈ、および７Ｉ）。ＡＴＸＮ２を枯渇させると、対照ｓｉＲＮＡと比較して、ＳＣＡ２−ＬＢ細胞および線維芽細胞において、Ｓｔａｕｆｅｎ１アバンダンスの有意な減少およびＰＣＰ２  ｍＲＮＡレベルの有意な増加が観察された（図７Ｅ−７Ｊ）。このように、ＡＴＸＮ２の段階的な損失は、増加したｓｔａｕｆｅｎ１のアバンダンスを低下させ、ＳＣＡ２細胞におけるＰＣＰ２  ｍＲＮＡレベルの回復をもたらした。
【実施例８】
【０１７３】
実施例８−Ｓｔａｕｆｅｎ１を標的とするＡＳＯはＳｔａｕｆｅｎ１レベルを低下させる
ＡＴＸＮ２  ＣＡＧ２２リピートを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ＨＤＲ（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ−ｒｅｐａｉｒ）技術を用いて、ＨＥＫ−２９３細胞においてＡＴＸＮ２遺伝子座のＣＡＧ５８リピートに編集した。ヒトＡＴＸＮ２遺伝子座は、１つのＡＴＸＮ２対立遺伝子においてＣＡＧ２２をＣＡＧ５８リピートで置換するように設計された。遺伝子座特異的な０．６Ｋｂの左右相同腕（ＨＡ）を持つ修飾ＣＡＧ５８リピートをドナーベクターにクローニングした。ＡＴＸＮ２を標的としたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をｈＳｐＣａｓ９−２Ａ−Ｐｕｒｏ（ＰＸ４５９）ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ＃６２９８８）にクローニングした。ＨＥＫ−２９３細胞を、リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、１．０μｇの直線化ドナーベクターと１．０μｇのｓｇＲＮＡおよびｐｇＲＮＡ−Ｃａｓ９ベクターでトランスフェクトした。この細胞を１．０μｇ／ｍｌのピュロマイシンで７〜１０日間培養した。プロマイシン耐性細胞を、ウェルが細胞と〜８０％コンフルエントになるまで、９６ウェルプレート中で１セル／ウェルでプレーティングし、培養した。次いで、ノックイン陽性細胞を同定するために、細胞を拡大し、ＰＣＲスクリーニングのために維持した。
【０１７４】
ＨＥＫ−２９３細胞を、１０％ＦＢＳおよび１Ｘペニシリン／ストレプトマイシンを５％ＣＯ２中に添加した標準的なＤＭＥＭ中で培養した。ＳＴＡＵ１  ｓｉＲＮＡまたはＳＴＡＵ１  ＡＳＯのトランスフェクションは、標準的な条件でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬を用いて行った。細胞は、３−５日後のトランスフェクションを収穫した。
【０１７５】
細胞ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー）に懸濁し、５分間煮沸することにより、タンパク質抽出物を調製した。同量の抽出物をウェスタンブロット分析に供し、指示された抗体を用いてタンパク質の定常レベルを測定した。タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解し、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｐ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳ中の５％スキムミルクでブロッキングした後、膜を０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳ中の５％スキムミルク中の一次抗体で室温で２時間、または４℃で一晩インキュベートした。０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳで数回洗浄した後、膜を０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳ中の５％スキムミルク中のＨＲＰと共役した対応する二次抗体で室温で２時間インキュベートした。０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳで３回の洗浄を行った後、製造元のプロトコルに従って、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｎｃ．，米国；ｃａｔ＃  ＷＢＫＬＳＯ１００）を用いてシグナルを検出した。使用した抗体としては、ＡＴＸＮ２  ｍＡｂ［（１：３０００），ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）；ｃａｔ＃６１１３７８］、ウサギ抗Ｓｔａｕｆｅｎ抗体（Ｎｏｖｕｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，ＮＢＰ１−３３２０２）、ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃５１１４）、ＬＣ３Ｂ抗体（Ｎｏｖｕｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，ＮＢ１００−２２２０）、ｍＴＯＲ３Ｂ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｎｃ．ＮＢ１００−２２２０）、ｍＴＯＲ抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃２９７２）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｍＴＯＲ（Ｓｅｒ２４４８）抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃２９７１）、β−Ａｃｔｉｎ  ｍＡｂ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＲＰ［（１：１０，０００），Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．］（Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．；ｃａｔ＃  Ａ３８５８）を用いた。二次抗体は、馬抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＰＩ−２０００）、およびヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＰＩ−１０００）であった。
【０１７６】
図８Ａに示すように、ＳＴＡＵＦＥＮ１枯渇は、ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８ノックイン細胞においてオートファジー経路タンパク質を回復させた。細胞をＳＴＡＵ１  ＲＮＡｉでトランスフェクトし、ウエスタンブロットにより分析した。評価されたオートファジータンパク質には、オートファジーの阻害剤であるラパマイシンの総（ＭＴＯＲ）および活性化（ｐＭＴＯＲ）メカニスティックターゲット、ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２、またはオートファゴソームを標的とするタンパク質と結合するｓｅｃｋｅｓｔｏｓｏｍｅ−１が含まれた。オートファジー機能の一般的なマーカーであるＬＣ３。ＬＣ３−Ｉは細胞質に存在する一方で、より高い移動性を持つ切断形態である。ＬＣ３−ＩＩ、オートファゴソームに局在する。ＬＣ３−ＩＩの量は、オートファゴソームの量の指標であり、オートファジーが欠損しているときに典型的に増加する。
【０１７７】
さらに、図８Ｂおよび図８Ｃに示されるように、アンチシスは、オートファゴソームに局在する。８Ｂおよび８Ｃは、ＳＴＡＵＦＥＮ１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、ＨＥＫ−２９３−ＡＴＸＮ２［Ｑ２２／Ｑ２２］細胞におけるＳＴＡＵＦＥＮ１の発現を低下させる。ＳＴＡＵ１  ＡＳＯ−Ａ（５'−ＴＣＴＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＴＴＡＴＡＧＧ−３'）（８Ｂ）（配列ＩＤ番号：１）またはＳＴＡＵ１  ＡＳＯ−Ｂ（５'−ＣＴＧＧＡＡＡＧＡＴＡＧＴＣＣＡＧＴＴＧ−３'）（８Ｃ）（配列ＩＤ番号：２）を指示された用量で使用すると、ウエスタンブロット法により決定されたＳＴＡＵ１のレベルが低下した。アクチンに対する発現。
【実施例９】
【０１７８】
実施例９−Ｓｔａｕｆｅｎ１は神経変性におけるＲＮＡストレス顆粒とオートファジーをリンクさせる。
ＤＮＡコンストラクト。ＳＴＡＵ１（ＮＭ＿００１０３７３２８）のヒトｃＤＮＡ配列をＮＣＢＩ  ＤＮＡデータベースから得て、ＨＥＫ−２９３細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーからコーディング配列をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計するために使用した。拡張されたＣＡＧリピートを有するＡＴＸＮ２を含むすべてのｃＤＮＡを、その後、適切なベクター；ｐｃＤＮＡ３．１／Ｆｌａｇ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，米国）プラスミドにクローニングした。インビトロＲＮＡ結合アッセイのために、ヒトＳｔａｕｆｅｎ１およびＧＦＰコード化配列をＰＣＲ増幅し、ｐＥＴ−Ｈｉｓ  プラスミドにクローニングした。すべての構築物は、配列決定によって確認された。
【０１７９】
ｓｉＲＮＡ。本研究で使用したｓｉＲＮＡは以下の通りである。Ａｌｌ  Ｓｔａｒ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．ＵＳＡ；Ｃａｔ＃１０２７２８０）、ヒト  ｓｉＡＴＸＮ２［Ｈｓ＿ＡＴＸＮ２＿２（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．ＵＳＡ；Ｃａｔ＃ＳＩ００３０８１９６）］、ヒトｓｉＳＴＡＵ１：５'−ＣＣＵＡＵＡＡＣＵＡＣＡＡＣＡＵＧＡＧＡＧｄＴｄＴ−３'（配列ＩＤ番号：４１）、およびｓｉｍＴＯＲ：５'−ＧＡＧＣＣＵＵＧＵＧＡＵＣＣＵＵＡＡ−３'（配列ＩＤ番号：４２）。Ｓｔａｕｆｅｎ１およびｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．オリゴヌクレオチドを脱保護し、相補鎖をアニーリングした。
【０１８０】
細胞培養およびトランスフェクション。つの正常皮膚線維芽細胞（ＣＡＧ２２を有するＡＴＸＮ２）および５つのＳＣＡ２患者由来皮膚ＦＢ（ＣＡＧリピートを有するＡＴＸＮ２；３５、３５、４２および４５）を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中で維持した。２つの正常（ＣＡＧ２２を有するＡＴＸＮ２）および３つのＳＣＡ２患者由来（拡張ＣＡＧリピートを有するＡＴＸＮ２；４０、４６および５２）エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）不死化ＬＢＣを、１５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地中に維持した。すべての被験者は、書面による同意を与え、すべての手順は、ユタ大学の機関審査委員会によって承認された。以下の一次ヒト線維芽細胞を、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（米国、ニュージャージー州、カムデン）から入手した。ＡＬＳ患者（ＴＤＰ−４３Ｇ２９８Ｓ変異）（ＮＤ３２９４７）、ハンチントン病（ＨＤ）患者（ＮＤ３３３９２）、およびＳＣＡ３（Ｍａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ病、ＭＪＤ）患者（ＧＭ０６１５３）。ＴＤＰ−４３Ｇ２９８Ｓ、ＨＤ、ＳＣＡ３、およびＨＥＫ−２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中で維持された。
【０１８１】
組換えタンパク質の過剰発現のために、ＨＥＫ−２９３細胞を１００ｍｍまたは６ウェルディッシュ上に播種し、一晩インキュベートした。その後、細胞をプラスミドＤＮＡでトランスフェクションし、トランスフェクションの４８時間後に収穫し、タンパク質およびＲＮＡ分析のために２つのアリコートとして処理した。ｓｉＲＮＡ実験のために、細胞をリポフェクタミン２０００を用いてｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、リンパ芽細胞Ｂ細胞（１Ｘ１０６）を製造業者のプロトコルに従ってＮｅｏｎトランスフェクションシステム（米国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｓｉＲＮＡでエレクトロポレーションし、６ウェルプレートに播種した。事前の標準化実験は、最大サイレンシングがトランスフェクション／エレクトロポレーションの４〜５日後に達成されたことを示した。
【０１８２】
ＨＥＫ−２９３−ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８ノックイン（ＫＩ）細胞の生成。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子編集を、公表されたプロトコールに従って実施した。ヒトＡＴＸＮ２遺伝子座を、ＡＴＸＮ２を含むＢＡＣクローン（米国、Ｅｍｐｉｒｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．）中のＡＴＸＮ２エキソン−１のＣＡＧ２２をＣＡＧ５８リピートで置換するように改変した。フランキング遺伝子座特異的な０．６  Ｋｂの左右相同腕（ＨＡ）を有する改変ＣＡＧ５８リピートをドナーベクターにクローニングした。ＡＴＸＮ２遺伝子座を標的とするｓｇＲＮＡオリゴヌクレオチドをアニーリングし、ｈＳｐＣａｓ９−２Ａ−Ｐｕｒｏ（ＰＸ４５９）ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ＃６２９８８）にクローニングした。ＨＥＫ−２９３細胞を、リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、線状化ドナーベクターおよびシングルガイドＲＮＡ  ｐｇＲＮＡ−Ｃａｓ９ベクターでトランスフェクトした。細胞を１．０μｇ／ｍｌのピュロマイシンで〜７〜１０日間培養した。プロマイシン耐性細胞を、ほとんどのウェルが細胞と〜８０％コンフルエントになるまで、９６ウェルプレート中で１セル／ウェルでプレーティングし、培養した。次いで、ノックイン陽性細胞を同定するためのＰＣＲスクリーニングのために細胞を拡大し、維持した。
【０１８３】
マウス。Ｂ６；Ｄ２バックグラウンドのＡＴＸＮ２Ｑ１２７（Ｐｃｐ２−ＡＴＸＮ２［Ｑ１２７］）マウス、およびＦＶＢバックグラウンドのＢＡＣ−ＳＣＡ２マウス（ＢＡＣ−Ｑ２２およびＢＡＣ−Ｑ７２）を使用した。Ｓｔａｕ１ｔｍ１Ａｐａ（−／−）（Ｓｔａｕ１−／−）マウスは、ドイツ・ミュンヘンのルートヴィヒ・マクシミリアン大学のＭｉｃｈａｅｌ  Ａ．Ｋｉｅｂｌｅｒ教授からの寛大な贈り物であり、Ｂ６バックグラウンドで維持された。ＴＤＰ−４３トランスジーン［Ｂ６；ＳＪＬ−Ｔｇ（Ｔｈｙ１−ＴＡＲＤＢＰ）４Ｓｉｎｇｈ／Ｊ］ＡＬＳマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｓｔｏｃｋ  ｎｏ．０１２８３６）から購入し、Ｂ６バックグラウンドで維持した。動物のジェノタイピングは、公表されたプロトコールに従った。すべてのマウスは、国立衛生研究所のガイドラインに準拠した標準的な条件で飼育および維持され、承認されたユタ大学のＩＡＣＵＣプロトコルに準拠した。
【０１８４】
抗体。ウェスタンブロッティングおよび免疫組織化学に使用した抗体およびそれらの希釈は以下の通りであった：マウス抗アタキシン−２抗体（クローン２２／アタキシン−２）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．６１１３７８）、ウサギ抗ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＣ１１３）、ウサギ抗Ｓｔａｕｆｅｎ抗体（Ｎｏｖｕｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．ＮＢ２００−１９１）、ＲＧＳ８抗体（１：５０００）（Ｎｏｖｕｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＮＢＰ２−２０１５３）、ＬＣ３Ｂ抗体（Ｎｏｖｕｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．、ＮＢ１００−２２２０）、モノクローナル抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．Ｆ３１６５）、モノクローナル抗カルビンジン−Ｄ−２８Ｋ抗体［（１：５００００）、Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．、Ｃ９８４８］、モノクローナル抗β−アクチンペルオキシダーゼ抗体（クローンＡＣ−１５）（Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．、Ａ３８５４）、ヤギ抗ＴＩＡ−１抗体（Ｃ−２０）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｉｎｃ．、ｓｃ−１７５１）、ＰＣＰ−２抗体（Ｆ−３）［（１：３０００），Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｉｎｃ．，ｓｃ−１３７０６４］，Ｈｏｍｅｒ−３抗体（Ｅ−６）［（１：２０００），Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｉｎｃ．ｓｃ−３７６１５５］、抗ＰＣＰ４抗体［（１：５０００）Ａｂｃａｍ  Ｉｎｃ．、ａｂ１９７３７７］、抗ＦＡＭ１０７Ｂ抗体（１：５０００）（Ａｂｃａｍ  Ｉｎｃ．、ａｂ１７５１４８）、ウサギ抗ＰＡＢＰ抗体（Ａｂｃａｍ  Ｉｎｃ．、ａｂ１５３９３０）、ｐ２１抗体［（１：５０００）Ａｂｃａｍ  Ｉｎｃ．、ａｂ１９７３７７］。ａｂ１５３９３０）、ｐ２１  Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１（１２Ｄ１）ウサギｍＡｂ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２９４７）、ｍＴＯＲ抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃２９７２）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｍＴＯＲ（Ｓｅｒ２４４８）抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃２９７１）、ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．＃＃５１１４）、抗ｃ−Ｍｙｃエピトープタグモノクローナル抗体、ＨＲＰコンジュゲート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒ９５１−２１）、６ｘ−Ｈｉｓエピトープタグモノクローナル抗体、ＨＲＰコンジュゲート（ＨＩＳ．Ｈ８）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．ＭＡ１−２１３１５−ＨＲＰ）、およびヒツジ抗ジゴキシゲニン−ＰＯＤ、Ｆａｂフラグメント（Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１１２０７７３３９１０）を用いた。二次抗体は、馬抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＰＩ−２０００）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＰＩ−１０００）、馬抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＰＩ−９５００）であった。蛍光二次抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体ＤｙＬｉｇｈｔ−４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．８４５４０）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ＤｙＬｉｇｈｔ−５４９（Ｈ&Ｌ）抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３５５５５７）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体、ＤｙＬｉｇｈｔ−４８８���Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．、３５５５５２）、およびロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体、ＤｙＬｉｇｈｔ−５５０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．、ＳＡ５−１００８７）。
【０１８５】
免疫蛍光。ＡＴＸＮ２およびＳｔａｕｆｅｎ１の共局在化を決定するために、免疫蛍光研究を行った。簡潔に言うと、ＳＣＡ２線維芽細胞およびＨＥＫ−２９３−ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８  ＫＩ細胞をカバースライド上に一晩プレートし、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定した。ストレス顆粒中のＳｔａｕｆｅｎ１とＡＴＸＮ２の局在を決定するために、ＨＥＫ−２９３細胞をカバースライド上で一晩培養し、１時間４３．５℃で熱ショックを与えた。細胞を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、０．１％トリトンＸ−１００で透過させ、対応する一次抗体および蛍光二次抗体を用いた免疫染色のために処理した。核は、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、０１００−０１）でマウントした後、ＤＡＰＩで染色した。細胞は、共焦点顕微鏡（ニコンＥｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ顕微鏡）を使用して画像化し、ニコンＥＺ−Ｃ１ソフトウェアを使用して分析した。ＩｍａｇｅＪの共焦点化プラグインを使用して、強度ベースの閾値を介して共焦点化された領域を定義した。次に、Ａｎａｌｙｚｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓツールを使用して、４ピクセル（ベースライン）以上の共局在領域の数をカウントした。分離された小脳を４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに埋め込んだ。切片は、標準的な条件を用いて脱パラフィン化し、ＰＢＳ中の５％ロバ血清０．３％トリトンＸ−１００でブロックし、免疫染色のために処理した。一次抗体：カスタムデザインされたＡＴＸＮ２ウサギポリクローナル抗体［ＳＣＡ２−２８０（１：２５０）］、ＳＴＡＵ１抗体（Ｃ−４）［（１：２５０）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｉｎｃ．、ｓｃ−３９０８２０］、および対応する蛍光二次抗体を使用した。画像は共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて取得し、Ｎｉｋｏｎ  ＥＺ−Ｃ１ソフトウェアで解析した。
【０１８６】
タンパク質ライセートの調製およびウエスタンブロット分析。細胞抽出物は、シングルステップライシス法により調製した。収穫した細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー［Ｌａｅｍｍｌｉ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．；ｃａｔ＃１６１−０７３７）］に懸濁し、５分間煮沸した。同量の抽出物をウエスタンブロット分析に使用した。小脳タンパク質抽出物は、抽出バッファー［２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．６、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、２  ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５Ｍ尿素およびプロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．；ｃａｔ＃Ｐ−８３４０）］でマウス小脳をホモジナイズすることにより調製した。上清のみをウエスタンブロッティングに使用した。タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｐ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ中の５％スキムミルクでブロッキングした後、対応する一次抗体および二次抗体を用いて免疫染色のために膜を処理した。シグナルは、製造業者のプロトコルに従って、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ；ｃａｔ＃ＷＢＫＬＳＯ１００）を用いて検出した。タンパク質の強度をＩｍａｇｅＪソフトウェア解析システムを用いて決定し、相対的なタンパク質量をβ−アクチンに対する比として表した。
【０１８７】
免疫沈降。タンパク質−タンパク質またはタンパク質−ＲＮＡ相互作用を決定するために、Ｆｌａｇ−ＡＴＸＮ２−Ｑ２２およびＦｌａｇ−ＡＴＸＮ２−Ｑ１０８またはＦｌａｇ−Ｓｔａｕｆｅｎ１を発現するＨＥＫ−２９３細胞を用いて、タンパク質−ＲＮＡ免疫沈降（ＩＰ）実験を行った。全細胞抽出物の調製およびＩＰ法は、以前に公表された方法に従った。まず、細胞を細胞質抽出バッファー［２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  ＮＰ４０、２ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．；Ｃａｔ＃Ｐ−８３４０）］で溶解し、細胞質抽出物を１４，０００  ＲＰＭで２０分間遠心分離した。次に、得られたペレットを核溶解緩衝液または高塩溶解緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、プロテアーゼ阻害剤）に懸濁し、核抽出物を１４，０００ＲＰＭで２０分間遠心分離した。次いで、核抽出物を細胞質抽出物と組み合わせ、全細胞抽出物と表記した。具体的には、細胞質抽出物と核抽出物を組み合わせる際には、ｉｎ  ｖｉｖｏでの相互作用を保存するために、ＮａＣｌ濃度を生理的緩衝条件（〜１５０ｍＭ）に調整した。非ＲＮＡ媒介の相互作用を同定するために、全細胞抽出物を１．０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，米国）で３７℃で１５分間処理した後、ＩＰ処理を行った。細胞抽出物の９０％は、ＡＴＸＮ２またはＳｔａｕｆｅｎ１相互作用するタンパク質−ＲＮＡ複合体を免疫沈降させるために、Ｆｌａｇモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＩＰ（Ａｎｔｉｃａｔｉ−ＦｌａｇＭ２  Ａｆｆｉｎｉｔｉｏｎ  Ｇｅｌｌ，Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．全細胞抽出物の残りの１０％は、ウエスタンブロッティングおよびＲＴ−ＰＣＲ分析のための入力コントロールとして保存した。ＩＰを２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液で洗浄し、結合したタンパク質−タンパク質またはタンパク質−ＲＮＡ複合体を、Ｆｌａｇペプチド競合（１００μｇ／ｍｌ）でビーズから溶出させた。溶出した画分を２つの等しい部分に分割した。一方の部分は、ＡＴＸＮ２とＳｔａｕｆｅｎ１との間の相互作用を決定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いてウエスタンブロッティングによって分析した。ＲＮＡを他の画分から単離し、ＲＴ−ＰＣＲ分析を行い、Ｓｔａｕｆｅｎ１に結合したＲＮＡを同定した。
【０１８８】
インビトロＲＮＡ結合（ノースウェスタン）アッセイ。ノースウェスタンブロットアッセイは、いくつかの変更を加えた公表されたプロトコルに従って実施した。Ｈｉｓ−Ｓｔａｕｆｅｎ１、Ｈｉｓ−ＧＦＰおよび空のｐＥＴベクターを担持したＢＬ２１＜ＤＥ３＞細胞を対数中期まで増殖させた。収穫された細胞からの全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で実行し、ハイボンドＰ膜上にエレクトロブロットした。転送されたタンパク質は、次のように再変性された：ブロットは、最初に室温で５分間１ｍＭ  ＤＴＴと６  Ｍ尿素と結合緩衝液（０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．９、０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．１  Ｍ  ＫＣｌ、０．５μＭ  ＺｎＳＯ４）でインキュベートされた。ブロットは、その後、結合バッファーが尿素なしで１ｍＭ  ＤＴＴになるまで継続的なインキュベーションステップを持つ結合バッファー／１ｍＭ  ＤＴＴと尿素の５つのシリアル２倍希釈を通し、それぞれ、５分間インキュベートした。ブロットプレハイブリダイゼーションは、室温で１時間のためのバインディングバッファー（１ｍＭ  ＤＴＴ、５％ＢＳＡ、１μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ）で行った。ブロットは、その後、４℃で一晩バインディングバッファー（１ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５％ＢＳＡ、１μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ）でＤＩＧ標識ＲＮＡプローブとハイブリダイズした。０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳでいくつかの洗浄後、膜は室温で２時間０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳで５％スキムミルク中の抗ＤＩＧ−ＰＯＤ抗体でインキュベートした。０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳで３回の洗浄を行った後、製造元のプロトコルに従い、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを用いてシグナルを検出した。
【０１８９】
定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡ発現解析。マウスをイソフルランで深く麻酔した。マウス小脳を除去し、直ちに液体窒素中に沈めた。組織は処理時まで−８０℃で保存した。全ＲＮＡは、ＲＮａｅａｓｙミニキットを製造元のプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、米国）に従って使用して、マウス小脳および採取した細胞から抽出した。ＤＮＡｓｅ  Ｉで処理したＲＮＡを使用して、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．、米国）を使用してｃＤＮＡを合成した。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  １２Ｋ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．；米国）で、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．；米国）を使用して実行した。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  １２Ｋ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；米国）を用いて、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．；米国）を用いて行った。ＰＣＲ反応混合物は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、合成したｃＤＮＡおよび０．５ｐｍｏｌプライマーを含み、ＰＣＲ増幅は、９５℃で１０秒間の変性、６０℃で１０秒間のアニーリング、および７２℃で４０秒間の伸長という４５サイクルで実施した。各サンプルのしきい値サイクルは、線形範囲から選択し、プライマーの各セットについて同じプレート上で実行した標準曲線から補間することにより、開始量に変換した。すべての遺伝子発現レベルを、ＡＣＴＢまたはＧＡＰＤＨまたはＡｃｔｂ  ｍＲＮＡレベルに正規化した。ｑＲＴ−ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲのために設計されたプライマー対を、それぞれフォワードおよびリバースとして与え、以下の表２に列挙する。
【表２】
2021527649.tif 000004
2021527649.tif 000005
【０１９０】
ロタロッド試験。ジェノタイピングの後、マウスを性に応じて無作為にケージに割り当て、各可能な遺伝子型が各ケージで表現されることを確認した。５日間の試験の間に、マウスは別の試験室に連れて行かれ、１時間のために慣らすために許可された。試験は毎日同じ時間に開始され、同じ技術者によって完了された。技術者は、各ケージに入っているマウスの遺伝子型を盲検化した。１日目にマウスを１匹につき２分間処理した。２日目にマウスを加速ロータロッド装置（Ｒｏｔａｍｅｘ−５，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国、オハイオ州、コロンバス）の上に置き、最初は４ＲＰＭで２分間回転させた。３−５日目には、マウスを加速ロタロド上で０ｒｐｍから、５１ｒｐｍの最高速度に達するまで、９秒ごとに１ｒｐｍずつ加速した（最大時間４５９秒）。マウスが回転バーから落下した時間（落下までの潜伏時間）を記録した。回転棒データの統計的比較は、Ｓｔａｔａ１２を用いた独立相関オプションを用いた一般化推定方程式（ＧＥＥ）の方法を用いて決定した（手順ｘｔｓｅｔに続いてｘｔｇｅｅ）。
【０１９１】
統計解析。ウェスタンブロット分析については、実験を３回実施し、適切な場合はどこでも、ゲルをスキャンし、画像の反転後にＩｍａｇｅＪ分析によってバンド強度を定量した。グループ間の差が有意であるかどうかを判定するために、ペアワイズスチューデントのｔ検定を用いてＰ値を算出した。有意性のレベルは、Ｐ≦０．０５とした。図中、シングルアスタリスクはＰ＜０．０５、ダブルアスタリスクはＰ＜０．０１、トリプルアスタリスクはＰ＜０．００１、ｎｓはＰ＞０．０５（Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）を示す。
【０１９２】
結果。ＲＮＡ代謝の障害は、それぞれのタンパク質の変異を介して直接の原因として、またはＲＮＡストレス顆粒の形成とこれらの顆粒へのタンパク質の隔離を介して寄与しているとして、最近注目される。このように、ＲＮＡ結合タンパク質であるＴａｒ  ＤＮＡ結合タンパク質−４３（ＴＤＰ−４３）の変異は、ＡＬＳおよびＡＬＳ／前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）を引き起こすが、他の遺伝的または非遺伝的形態のＡＬＳもまた、脊髄運動ニューロンおよび皮質ニューロンにおけるＴＤＰ−４３の蓄積を示す。
【０１９３】
ＳＣＡ２とＴＤＰ４３が媒介する運動ニューロン死におけるストレス応答異常の構成要素をさらに特定するために、ＡＴＸＮ２タンパク質複合体を精製した。上述したように、ＨＥＫ−２９３細胞におけるＡＴＸＮ２複合体の中で著名なタンパク質はＳＴＡＵ１であり、共免疫沈降法により野生型または変異型ＡＴＸＮ２とのＲＮＡ依存性の相互作用を示した（図１Ｆ）。ＳＴＡＵ１は、よく特徴づけられた二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質であり、ＲＮＡストレス顆粒（ＳＧ）の構成要素である。上述したように、熱ストレスを受けたＨＥＫ−２９３細胞は、ＡＴＸＮ２およびＳＴＡＵ１の両方に陽性のＳＧを産生した（図１Ａ）。ＳＣＡ２患者線維芽細胞（ＦＢ）では、ＳＣＡ２（ＡＴＸＮ２Ｑ１２７）マウスのプルキンエ細胞と同様に、ストレスがない場合でもＡＴＸＮ２／ＳＴＡＵ１  ＳＧが構成的に存在していることが観察された（図１Ｂ−１Ｃおよび図９Ａ−９Ｂ）。ＳＣＡ２患者ＦＢおよびリンパ芽球細胞（ＬＢＣ）におけるタンパク質のレベルを確認したところ、ＳＴＡＵ１レベルは、内因性変異体ＡＴＸＮ２の存在下で有意に増加することが指摘された（図１０Ａ−１０Ｂ）。この観察はまた、ＳＣＡ２の２つの動物モデル（ＡＴＸＮ２Ｑ１２７およびＢＡＣ−Ｑ７２）からの小脳抽出物の分析によっても確認された（図１０Ｃ〜１０Ｄ）。
【０１９４】
細胞ストレスに対するＳＴＡＵ１の感受性は、この経路が他の神経変性状態においても活性であるかどうかの検討を促した。ＡＬＳのマウスモデルである野生型ＴＤＰ−４３を過剰発現させた動物の小脳および脊髄からタンパク質抽出物を調製した。これらの実験には、表現型の発現が１５ヶ月と遅いヘミ接合体のトランスジェニック動物を用いた。小脳と脊髄の両方でＳｔａｕ１と野生型Ａｔｘｎ２の有意な増加が見られた（図１０Ｅ−１０Ｆ）、野生型Ａｔｘｎ２を治療的に減少させることでＴＤＰ−４３マウスの生存率が改善されたことと一致した。ＳＴＡＵ１レベルは、ＴＤＰ−４３Ｇ２９８Ｓ変異を有するＡＬＳ患者ＦＢにおいても増加した（図１０Ｇ）。次に、ハンチントン病（ＨＤ）またはＳＣＡ３患者の細胞株でＳＴＡＵ１レベルを測定した。生理的条件下では、正常な線維芽細胞と比較して、ＨＤおよびＳＣＡ３線維芽細胞においてＳＴＡＵ１レベルに差はなかった。しかし、培養物に亜ヒ酸ナトリウムを添加した場合には、明らかな違いが現れた。亜ヒ酸塩への応答でのみ緩やかなＳＴＡＵ１の増加が検出され、６時間の処理後にのみ認められたが、患者の細胞は、これらの細胞におけるＳＴＡＵ１経路の過敏性を示す亜ヒ酸塩への早期かつ誇張された応答を示した（図１０Ｈ）。
【０１９５】
ストレス顆粒はオートファジーによって分解されるので、ＳＴＡＵ１レベルの増加がターンオーバーの低下によるものかどうかを調べた。ＳＴＡＵ１  ｍＲＮＡレベルは、患者細胞株およびげっ歯類小脳ではｑＲＴ−ＰＣＲ（図１１Ａ〜１１Ｄ）によって増加しなかったが、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）パルスチェース実験（図１２および図４Ｃ）によって決定されたＳＴＡＵ１の分解は遅くなった。実際、ＳＣＡ２患者細胞のオートファジーフラックスの分析は、変異体ＡＴＸＮ２の存在下でオートファジーが損なわれていることを示した（図１３Ａ）。オートファジーにおけるＳＴＡＵ１を直接調べるために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集を使用して、ヒトＨＥＫ−２９３細胞の１つのＡＴＸＮ２対立遺伝子に拡張ＣＡＧ５８（Ｑ５８）リピートを導入した。これらの細胞をＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８ノックイン（ＫＩ）細胞と命名した。ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８  ＫＩ細胞は、ＳＴＡＵ１のアバンダンスが上昇し、ＡＴＸＮ２／ＳＴＡＵ１  ＳＧが増加した（図１３Ｃおよび図１４Ａ−１４Ｄ）。先行研究では、小脳ＰＣＰ２、ＣＡＣＮＡ１Ｇ、およびＩＴＰＲ１  ｍＲＮＡの発現量の減少を含む、ＳＣＡ２マウスモデルにおいて重要なトランスクリプトームの変化が同定された。これらの変化は、ＨＥＫ−２９３ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８ＫＩ細胞において、１つの変異型ＡＴＸＮ２対立遺伝子の存在下で再現された（図１４Ａ−１４Ｄ）。
【０１９６】
野生型ＨＥＫ−２９３細胞と比較して、内因性変異体ＡＴＸＮ２の存在は、ラパマイシンの活性な機械論的標的（ｍＴＯＲ）、シークエストソーム１（ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２）、および処理されたＬＣ３−ＩＩ（ＬＣ３−Ｉの脂質化アイソフォーム）のアバンダンスを有意に増加させた（図１３Ｃ）。Ｑ５８およびＱ１０８リピートを有するＡＴＸＮ２を過剰発現させたＨＥＫ−２９３細胞では、Ｑ２２ではなくＱ５８およびＱ１０８リピートを有するＡＴＸＮ２を過剰発現させた後に、ＳＴＡＵ１アバンダンスを含む同様のオートファジーの変化が起こることが確認された（図１５Ａ）。オートファジーの阻害と一致して、オートファゴソーム−リソソーム融合の阻害剤であるバフィロマイシンＡ１（Ｂａｆ）で処理したＨＥＫ−２９３細胞は、ｐ６２を発現し、ＡＴＸＮ２−Ｑ５８を発現した細胞と同様にＬＣ３−ＩＩＩを処理したことを示した（図１５Ｂ）。しかしながら、Ｂａｆ処理によるＬＣ３−ＩＩのわずかな上昇は、ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８ＫＩ細胞において部分的なオートファジー能力が持続していることを示唆した。
【０１９７】
オートファジーの変化が主にＳＴＡＵ１レベルの上昇によるものかどうかを調べるために、ＳＴＡＵ１をＨＥＫ−２９３細胞で外因的に発現させた。この結果、活性化されたＰ−ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲ、ｐ６２およびＬＣ３−ＩＩの発現が増加し、ＳＴＡＵ１の標的であるＰＣＰ２タンパク質が減少した（図１５Ｃ）。ラパマイシンまたはラパログ誘発性ｍＴＯＲシグナル伝達阻害は、オートファジーを誘導し、ＨＤモデルにおけるポリグルタミン毒性および運動障害を減少させ、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）をモデル化したマウスにおける運動表現型を改善することが示される。実際、ＳＴＡＵ１レベルおよび活性化されたＰ−ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲ、ｐ６２およびＬＣ３−ＩＩの異常レベルは、ラパマイシン処理によって、またＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８ＫＩ細胞におけるＲＮＡｉによるＳＴＡＵ１、ＡＴＸＮ２またはｍＴＯＲのいずれかを低下させることによっても回復することが実証された（図１６Ａ−１６Ｂおよび図１７Ａ−１７Ｂ）。これらの実験はまた、ＡＴＸＮ２−ＲＮＡｉがＳＴＡＵ１を減少させたが、ＳＴＡＵ１−ＲＮＡｉはＡＴＸＮ２レベルを変化させなかったので、ＳＴＡＵ１がＡＴＸＮ２の下流で作用することを示した。さらに、ＳＴＡＵ１とｍＴＯＲは相互作用しており、どちらか一方へのＲＮＡ導入により他方のタンパク質のレベルを正常化することができた。
【０１９８】
ＳＴＡＵ１の機能の一つは、ＳＴＡＵ１媒介ＲＮＡ崩壊（ＳＭＤ）と呼ばれるナンセンス媒介崩壊に似たメカニズムを介して、分解のためにｍＲＮＡのサブセットを標的とすることである。ＳＣＡ２動物モデルを用いたゲノムワイドなトランスクリプトーム解析では、多くのｍＲＮＡの存在量が著しく減少することが明らかになった。これらのＲＮＡの中には、ｈｉＣＬＩＰによりＳＴＡＵ１インタラクターとして同定されたものもあった。あるｍＲＮＡのＳＭＤは、ＳＴＡＵ１がそれぞれのｍＲＮＡの３'ＵＴＲに結合していることを予測する。
【０１９９】
ＰＣＰ２  ｍＲＮＡのＳＭＤをテストするために、ＳＴＡＵ１がＰＣＰ２に直接結合することが示され、その結合は３'ＵＴＲを欠いたｍＲＮＡでは廃止された（図１３Ｂおよび図６Ｂ−６Ｃ）。これは、ＲＮＡｉを介してＳＴＡＵ１を減少させた後のＳＣＡ２患者ＬＢＣにおけるＰＣＰ２発現の回復、およびＰＣＰ２  ３'ＵＴＲとの相互作用を介してＰＣＰ２発現を低下させるＳＴＡＵ１の能力によってさらに支持される（図１８Ａ−１８Ｃおよび図１９Ａ−１９Ｂ）。ＳＭＤは、ＳＴＡＵ１がそれぞれのｍＲＮＡの３'ＵＴＲに結合することによって、ＳＣＡ２患者細胞および動物モデルにおいて同定されたｍＲＮＡのサブセットに対するＲＮＡの増加を説明することができるかもしれない。また、ＳＴＡＵ１は５'ＵＴＲとポリソーム結合３を介して翻訳効率を制御する。このことから、ＳＴＡＵ１と５'ＵＴＲ−ｍＴＯＲ  ＲＮＡとの相互作用がＳＴＡＵ１免疫沈降法で示され（図１３Ｂ）、ｍＴＯＲ翻訳におけるＳＴＡＵ１の役割を裏付けることがわかった。
【０２００】
Ｓｔａｕ１を生体内で標的とした試験を行うために、我々はＰＣに変異ＡＴＸＮ２Ｑ１２７を発現させた小脳神経変性モデルを用いた。ＡＴＸＮ２Ｑ１２７マウスは、８週齢で発症し、進行性の行動障害とプロテオーム障害を発症する。我々はこれらのマウスを、Ｓｔａｕ１対立遺伝子を１つ欠損したマウス系統と交配させた。Ｓｔａｕ１の投与量を５０％削減すると、ＡＴＸＮ２Ｑ１２７マウスの運動機能障害が有意に改善された（図１６Ｃ）。Ｓｔａｕ１の減少は生殖細胞に存在したため、症状の発症前には存在したが、運動性能への効果は８週間後にのみ明らかになった。このことは、Ｓｔａｕｆｅｎ１の減少が慢性的なストレスを経験しているニューロンにおいて主要な効果を発揮することを示唆するかもしれない。ＡＴＸＮ２Ｑ１２７マウスでは、主要なプルキンエ細胞のｍＲＮＡの有意かつ漸進的な減少と、それぞれのコードされたタンパク質（Ｃａｌｂ１、Ｐｃｐ２、Ｐｃｐ４、Ｒｇｓ８、Ｈｏｍｅｒ３、Ｆａｍ１０７ｂ）のより大きな減少が報告される。生体内でＳｔａｕ１の発現を５０％減少させると、これら６つのタンパク質のレベルは正常化に向かって有意に増加した。ＡＴＸＮ２Ｑ１２７マウスでＳｔａｕ１を完全に遺伝子的にアブレーションすると、これらのタンパク質のレベルは正常に戻った（図１６Ｄ−１６Ｆおよび図２０）。
【０２０１】
注目すべきは、我々のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究と同様に、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＴＡＵ１アブレーションは野生型動物では最小限の影響しかなかったことである。変異トランスジェニック動物のＳＴＡＵ１欠失によって有意に影響を受けるタンパク質のレベルは、野生型動物では変化しなかった。オートファジーのマーカーについても同様であった（図１６Ｄ−１６Ｆおよび図２０）。このことは、ＳＴＡＵ１が細胞ストレスのセンサーとして機能し、一度関与すると、ｍＴＯＲおよびオートファジーに対する相互作用を介して信号の迅速な増幅を示すことを示唆する。ストレスがない場合、ＳＴＡＵ１レベルの変化は、少なくとも本研究で測定されたパラメータの範囲内では、比較的軽微な影響を及ぼすようである。
【実施例１０】
【０２０２】
実施例１０−ＡＬＳ細胞およびアルツハイマー病およびその関連する認知症（ＡＤ／ＡＤＲＤ）におけるＳＴＡＵ１。
ＴＤＰ−４３（Ｇ２９８Ｓ）変異を有するＡＬＳ患者線維芽細胞は、ＳＴＡＵ１を増加させた（図２１Ａ）。ＴＤＰ−４３またはＴＤＰ−４３の変異体［ＴＤＰ−４３（Ｇ２９８Ｓ）、ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）およびＴＤＰ−４３（Ａ３８２Ｔ）または切断されたＴＤＰ−２５］をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞は、ＳＴＡＵ１およびＬＣ３−ＩＩレベルを増加させた（図２１Ｂ−２１Ｄ）。
【０２０３】
ＳＴＡＵ１のアバンダンスもまた、Ｃ９ＯＲＦ７２−ＡＬＳのＧＧＧＧＣＣリピート拡張を有する細胞において上昇した（図２２Ａ）。別の実験では、非変異体Ｃ９ＯＲＦ７２を過剰発現させ、ＳＴＡＵ１およびＬＣ３−ＩＩの上昇が観察された（図２２Ｂ）。また、ＭＡＰＴ（Ｎ２７９Ｋ）変異を有するＰＤ患者の線維芽細胞においてＳＴＡＵ１の過剰発現が観察され（図２２Ａ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の原因となるＰ３０１Ｌ変異を有するＧＦＰ−ＴＡＵ、および家族性ＡＤの原因となるＳｗｅｄｉｓｈ／Ｉｎｄｉａｎａ変異を有するアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を過剰発現したＨＥＫ２９３細胞においてもＳＴＡＵ１の過剰発現が観察された（図２２Ｃ）。
【実施例１１】
【０２０４】
実施例１１−Ｓｔａｕｆｅｎとオートファジーの関係
方法
ＤＮＡコンストラクト。この研究で使用したプラスミド構築物は、３ＸＦｌａｇタグ付きＳＴＡＵ１または野生型ＴＤＰ−４３、Ｈｉｓ−タグ付きＳＴＡＵ１またはＧＦＰ、およびｐＲＫ５−ＥＧＦＰ−ＴＡＵ（Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド＃４６９０４）であった。変異型ＴＤＰ−４３ｃＤＮＡ（ＴＤＰ−４３Ｇ２９８ＳおよびＴＤＰ−４３Ａ３８２Ｔ）を、ＴＤＰ−４３変異（Ｇ２９８Ｓ＃ＮＤ３２９４７およびＡ３８２Ｔ＃ＮＤ４１００３）を有するＡＬＳ患者ＦＢのｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅した（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙｓ、米国、ニュージャージー州、カムデン）。ＴＤＰ−４３Ｇ３４８Ｃ、ＴＤＰ−４３のＣ末端フラグメント（ＴＤＰ−４３ＣＴＦ）およびＳＴＡＵ１のＲＮＡ結合ドメイン３欠失（ＳＴＡＵ１［ＲＢＤ△３］）コンストラクトを、それぞれＴＤＰ−４３およびＳＴＡＵ１のｃＤＮＡをテンプレートとして使用して生成した。ＰＣＲ産物をｐＣＭＶ−３ＸＦｌａｇプラスミド（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）にクローニングした。すべての構築物は、シーケンシングによって確認された。３ＸＦｌａｇは、本文および図中でＦｌａｇと呼ぶ。
【０２０５】
ｓｉＲＮＡおよび試薬。本研究で使用したｓｉＲＮＡは以下の通りである。オールスターネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ＃１０２７２８０）およびヒトｓｉＳＴＡＵ１：５'−ＣＣＵＡＵＡＡＣＵＡＣＡＡＣＡＵＧＡＧＡＧｄＴｄＴ−３'。Ｓｔａｕｆｅｎ１  ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国）により合成された。オリゴヌクレオチドを脱保護し、相補鎖をアニーリングした。タプシガルギン（Ｔｏｃｒｉｓ  米国、Ｃａｔ＃１１３８）、チュニカマイシン（Ｔｏｃｒｉｓ  米国、Ｃａｔ＃３５１６）、イオノマイシン（Ｔｏｃｒｉｓ  米国、Ｃａｔ＃１７０４）および亜ヒ酸ナトリウム溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ＃１０６２７７１０００）を使用した。
【０２０６】
細胞培養およびトランスフェクション。５つのＳＣＡ２患者由来皮膚ＦＢ（ＣＡＧリピートを有するＡＴＸＮ２；３５、３５、３５、４２、および４５）を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中で維持した。すべての被験者は書面による同意を与え、すべての手順はユタ大学の機関審査委員会（ＩＲＢ）によって承認された。以下の一次ヒト線維芽細胞を、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（米国、ニュージャージー州、カムデン）から入手した。正常ＦＢ（＃ＮＤ２９５１０、＃ＮＤ３４７６９および＃ＮＤ３８５３０）、ＴＤＰ−４３変異を有する２人のＡＬＳ患者（Ｇ２９８Ｓ＃ＮＤ３２９４７およびＡ３８２Ｔ＃ＮＤ４１００３）、Ｃ９ｏｒｆ７２変異を有する３人のＡＬＳ患者（＃ＮＤ４００６９。＃ＮＤ４２５０４および＃ＮＤ４２５０６）、ハンチントン病（ＨＤ）患者３名（Ｑ４４＃ＮＤ３１０３８、Ｑ５７＃ＮＤ３３３９２およびＱ６６＃ＮＤ４０５３６）、アルツハイマー病（ＡＤ）患者４名［（ＰＳＥＮ１変異。Ｍ１４６Ｉ  ＃ＮＤ３４７３０、Ｅ１８４Ｄ  ＃ＮＤ３４７３２およびＩｎｔｒｏｎ４  Ｖａｒ  ＃ＮＤ４１００１）およびＭＡＰＴ変異。Ｎ２７９Ｋ  ＃ＮＤ４００７４］。本研究で使用したＨＥＫ−２９３−ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８ノックイン（ＫＩ）細胞３を含むすべてのＦＢは、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中で維持した。
【０２０７】
組換えタンパク質の過剰発現のために、ＨＥＫ−２９３細胞を６ウェルディッシュに播種し、一晩インキュベートした。その後、細胞をプラスミドＤＮＡでトランスフェクションし、トランスフェクションの４８時間後に収穫し、タンパク質およびＲＮＡ分析のために２つのアリコートとして処理した。ｓｉＲＮＡ実験のために、リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造者のプロトコルに従って細胞をｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。事前の標準化実験では、最大サイレンシングはトランスフェクションの４〜５日後に達成されたことが示された。
【０２０８】
細胞株の認証。本研究で使用した細胞株（ＨＥＫ−２９３細胞またはヒト線維芽細胞などとして）を、ＧｅｎｅＰｒｉｎｔ  ２４システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を使用して、性識別のためのアメロジェニンを含む２４の遺伝子座を評価するアプローチであるショートタンデムリピート（ＳＴＲ）解析によって認証した。患者由来の細胞における変異の存在を確認するために、ＰＣＲシークエンスも使用された。これは、生物医学的研究の実施における科学的厳密さに関するＮＩＨガイドライン（ＮＯＴ−ＯＤ−１５−１０３）への対応の一部である。
【０２０９】
マウス。ＡＴＸＮ２Ｑ１２７（Ｐｃｐ２−ＡＴＸＮ２［Ｑ１２７］）マウスを、Ｂ６Ｄ２Ｆ１／Ｊバックグラウンドで維持した。Ｓｔａｕ１ｔｍ１Ａｐａ（−／−）（Ｓｔａｕ１−／−）マウスは、ドイツ、ミュンヘンのルートヴィヒ・マクシミリアン大学のＭｉｃｈａｅｌ  Ａ．Ｋｉｅｂｌｅｒ教授からの寛大な贈り物であり、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドで維持された。
【０２１０】
ＡＴＸＮ２Ｑ１２７マウスをＳｔａｕ１−／−マウスと交配し、ＡＴＸＮ２Ｑ１２７；Ｓｔａｕ１＋／−マウスおよびＡＴＸＮ２ＷＴ；Ｓｔａｕ１＋／−マウスを作製した。次に、これらのマウスを交配して、ＡＴＸＮ２Ｑ１２７；Ｓｔａｕ１−／−マウスおよびＡＴＸＮ２ＷＴ；Ｓｔａｕ１−／−マウスを作製した。これらのマウスは、Ｂ６Ｄ２Ｆ１／Ｊ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの混合バックグラウンドであった。Ｂ６；ＳＪＬ−Ｔｇ（Ｔｈｙ１−ＴＡＲＤＢＰ）４Ｓｉｎｇｈ／Ｊ（株０１２８３６）をジャクソンラボラトリーズから購入した。ジャクソン・ラボラトリーズのＢ６ＳＪＬＦ１／Ｊマウス（ストック番号１０００１２）を、Ｓｔａｕ１−／−マウスに交配する前に、Ｃ５７ＢＬ／６ＪにＮ２まで逆交配した。動物のジェノタイピングは、公開されたプロトコルに従って達成された。すべてのマウスを飼育し、国立衛生研究所のガイドラインと一致する標準的な条件の下で維持し、ユタ州ＩＡＣＵＣプロトコルの承認された大学に準拠した。野生型およびＢＡＣ−Ｃ９ｏｒｆ７２マウス脳抽出物は、ローラＰ．Ｗ．ラヌム、神経学、フロリダ大学、ゲインズビル、フロリダ州、フロリダ州３２６１０、米国の大学の学科によって提供された。
【０２１１】
大脳皮質ニューロンの一次培養。大脳皮質ニューロンの一次培養を、新生児野生型またはＳｔａｕ１−／−マウス（Ｓｔａｕ１ｔｍ１Ａｐａ（−／−））から調製した。６〜７匹の動物から脳皮質を単離し、１．０ｍＭのＬ−システインおよび０．５ｍＭのＥＤＴＡを含むアールの平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）中で５０ユニットのパパイン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、米国）を用いて３７℃で１５分間インキュベートし、次いでＥＢＳＳ中で洗浄し、機械的なトリチュレーションを行った。残りの組織は、５０μｍのストレーナー（ファルコン）を通したろ過により除去した。神経細胞を、２％のＢ２７プラスサプリメントを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｐｌｕｓ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）中でポリ−Ｌ−オルニチンおよびラミニンでコーティングされたプレート上に、５０×１０３／ｃｍ２で播種した。２日目には、グリア細胞の増殖を防ぐために１０μＭのシトシンアラビノシドを２４時間添加し、以後２〜３日ごとに７５％の培地容量を補充した。実験は、タプシガルギンまたはビヒクル（ＤＭＳＯ）を含む新鮮な培地ですべての培地を交換することにより、９〜１０日目に実施し、１８時間後にタンパク質溶解物を標準的な手順に従って調製した。
【０２１２】
抗体。ウェスタンブロットに使用した抗体およびその希釈は以下の通りであった：マウス抗Ａｔａｘｉｎ−２抗体（クローン２２／Ａｔａｘｉｎ−２）［（１：４０００），ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ＃６１１３７８］，ウサギ抗Ｓｔａｕｆｅｎ抗体［（１：５０００），Ｎｏｖｕｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＮＢＰ１−３３２０２］，ＬＣ３Ｂ抗体［（１．８０００）、Ｎｏｖｕｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＮＢ１００−２２２０］、ＴＤＰ−４３抗体［（１：８０００）、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、Ｃａｔ＃１０７８２−２−ＡＰ］、モノクローナル抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体［（１：１０，０００）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ３１６５］、モノクローナル抗β−アクチンペルオキシダーゼ抗体（クローンＡＣ−１５）［（１．３０，０００），Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ａ３８５４］、ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２抗体［（１：４０００），Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｃａｔ＃５１１４］，ｍＴＯＲ抗体［（１：４０００），Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｃａｔ＃２９７２］，Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｍＴＯＲ（Ｓｅｒ２４４８）抗体［（１：３０００），Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｃａｔ＃２９７１］，ｐ７０  Ｓ６キナーゼ抗体［（１：４０００），Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｃａｔ＃２９７１］，ｐ７０  Ｓ６キナーゼ抗体［（１：１．４０００），Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｃａｔ＃９２０２］、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ７０  Ｓ６  キナーゼ（Ｔｈｒ３８９）抗体［（１：３０００），Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｃａｔ＃９２０５］，４Ｅ−ＢＰ１  抗体［（１：３０００），Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｃａｔ＃９２０５］，４Ｅ−ＢＰ１  抗体［（１．４０００），Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  Ｃａｔ＃９４５２］、Ｐｈｏｓｐｈｏ−４Ｅ−ＢＰ１（Ｔｈｒ３７／４６）（２３６Ｂ４）ウサギ  ｍＡｂ  ［１：３０００），Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｃａｔ＃２８５５］、６ｘ−Ｈｉｓ  Ｔａｇ  モノクローナル抗体（ＨＩＳ．Ｈ８），ＨＲＰ［（１：３０００），  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｃａｔ＃９２０５］。Ｈ８）、ＨＲＰ［（１：１０，０００）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ１−２１３１５−ＨＲＰ）］、およびヒツジ抗ジゴキシゲニン−ＰＯＤ、Ｆａｂフラグメント［（１：１０，０００）、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ＃１１２０７７３３９１０］を用いた。二次抗体は以下の通りであった。ペルオキシダーゼ標識馬抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体［（１：５００００）、ベクター研究所、ＰＩ−２０００］およびペルオキシダーゼ標識アフィニピュアヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体［（１：５００００）、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１１−０３５−１４４］であった。
【０２１３】
タンパク質溶解物の調製、ウエスタンブロッティングおよびインビトロＲＮＡ結合アッセイ。細胞抽出物は、一段階溶解法により調製した。収穫した細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー［Ｌａｅｍｍｌｉ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｃａｔ＃１６１−０７３７）］に懸濁し、その後５分間煮沸した。同量の抽出物をウエスタンブロット分析に使用した。
【０２１４】
小脳または脊髄タンパク質抽出物は、抽出バッファー［２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．６、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５Ｍ  尿素およびプロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ−８３４０）］中のマウス組織のホモジナイズに続いて、４℃で２０分間、１４，０００ＲＰＭで遠心分離することによって調製した。上清のみをウエスタンブロッティングに使用した。タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｐ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）に移し、次いで、我々の公表されたプロトコルに従ってウエスタンブロッティングのために処理した。シグナルは、製造者のプロトコルに従って、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＷＢＫＬＳＯ１００）を使用して検出した。ブロット画像をスキャンし、画像の反転後にＩｍａｇｅＪソフトウェア解析によりバンド強度を定量し、相対的なタンパク質量をβ−Ａｃｔｉｎに対する比として表した。既述のプロトコルを用いて、ＳＴＡＵ１およびｍＴＯＲ−５'ＵＴＲ相互作用を決定するために、インビトロＲＮＡ結合（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ）アッセイを実施した。
【０２１５】
免疫沈降。タンパク質−ＲＮＡ相互作用を決定するために、タンパク質−ＲＮＡ免疫沈降（ＩＰ）実験を、Ｆｌａｇ−ＳＴＡＵ１を発現するＨＥＫ−２９３細胞を用いて行った。全細胞抽出物の調製およびＩＰ法は、これまでに公表されている方法に従った。まず、細胞を細胞質抽出バッファー［２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  ＮＰ４０、２ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、プロテアーゼ阻害剤］で溶解し、細胞質抽出物を１４，０００  ＲＰＭで２０分間遠心分離した。次に、得られたペレットを核溶解緩衝液または高塩溶解緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、プロテアーゼ阻害剤）に懸濁し、核抽出物を１４，０００  ＲＰＭで２０分間遠心分離した。次いで、核抽出物を細胞質抽出物と組み合わせ、全細胞抽出物と表記した。具体的には、細胞質抽出物と核抽出物を結合させながら、ＮａＣｌ濃度を生理的緩衝条件（〜１５０ｍＭ）に調整し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの相互作用を保存した。細胞抽出物の９０％は、ＳＴＡＵ１相互作用タンパク質−ＲＮＡ複合体を免疫沈降させるために、フラグモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＩＰ（Ａｎｔｉ−ＦｌａｇＭ２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ２２２０−１ＭＬ）を受けた。全細胞抽出物の残りの１０％は、ウエスタンブロッティングおよびＲＴ−ＰＣＲ分析のための入力コントロールとして保存した。ＩＰを２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液で洗浄し、結合したタンパク質−ＲＮＡ複合体を、Ｆｌａｇペプチド競合（１００μｇ／ｍｌ）（Ｆｌａｇペプチド、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ３２９０−４ＭＧ）を用いてビーズから溶出させた。溶出した画分を２等分した。一方の部分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いてウエスタンブロットにより分析し、ＳＴＡＵ１発現を決定した。他方の画分からＲＮＡを単離し、ＳＴＡＵ１に結合したＲＮＡを同定するためにＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。
【０２１６】
定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡ発現解析。マウスをイソフルランで深く麻酔した後、首を切断した。マウスの小脳または脊髄を除去し、直ちに液体窒素中に沈めた。組織は処理時まで−８０℃で保存した。製造者のプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、米国）に従って、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ−Ｋｉｔを用いて、マウス組織からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、細胞を採取した。ＤＮＡｓｅ  Ｉ処理したＲＮＡを、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、米国）を用いてｃＤＮＡを合成した。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  １２Ｋ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）を用いて、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を用いて、ユタ大学ゲノミクスコアラボを用いて行った。ＰＣＲ反応混合物は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、合成したｃＤＮＡおよび０．５ｐｍｏｌプライマーを含み、ＰＣＲ増幅は、９５℃で１０秒間の変性、６０℃で１０秒間のアニーリング、および７２℃で４０秒間の伸長という４５サイクルで行った。各サンプルのしきい値サイクルは、線形範囲から選択し、プライマーの各セットについて同じプレート上で実行した標準曲線から補間することにより、開始量に変換した。市販のＴａｑＭａｎアッセイ（Ｃａｔ＃  ４３３１１８２。ＳＴＡＵ１プローブのためのＨｓ００２４４９９９＿ｍ１およびＡＣＴＢプローブのためのＨｓ０１０６０６６５＿ｇ１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＳＴＡＵ１を検出した。すべての遺伝子発現レベルは、ＡＣＴＢまたはＧＡＰＤＨまたはＡｃｔｂ  ｍＲＮＡレベルに正規化した。ＲＴ−ＰＣＲおよびｑＲＴ−ＰＣＲのために設計されたプライマー対は、それぞれフォワードおよびリバースとして与えられ、以下の表３に列挙される。
【表３】
2021527649.tif 000006
【０２１７】
統計的分析。スチューデントのｔ検定を用いて、群間の差が有意であるかどうかを判定した。有意水準はＰ≦０．０５とした。＊Ｐ≦０．０５，＊＊Ｐ≦０．０１，＊＊＊Ｐ≦０．００１，ｎｓ＝Ｐ＞０．０５．平均値±ＳＤは、特に指定のない限り、全体を通して示す。
【０２１８】
結果
ＳＴＡＵ１過剰発現は神経変性疾患患者由来の細胞株でよく見られる。ＳＴＡＵ１の過剰発現が、変異型疾患タンパク質やその他の慢性ストレス因子の存在によってストレスを受けた細胞のより一般的な反応であるかどうかを決定するために、さらなる研究が行われた。様々なＴＤＰ−４３変異を持つＡＬＳ患者、またはＣ９ｏｒｆ７２のリピート拡張を持つＡＬＳ患者、ハンチンチン（ＨＴＴ）ポリＱ拡張を持つＨＤ患者、ＰＳＥＮ１またはＭＡＰＴ変異を持つアルツハイマー病患者からＦＢを取得した。定量的ウエスタンブロット分析により、ＳＴＡＵ１はすべての患者細胞株において有意に増加した（図２３Ａ−Ｅ）。しかし、ＳＴＡＵ１のｍＲＮＡレベルは変化しなかった（図２４Ａ−Ｄ）。
【０２１９】
ＳＴＡＵ１の過剰発現はオートファジー機能不全と関連する。上述したように、先行研究では、ＳＴＡＵ１は主にオートファゴソームを介して分解されることが判明しており、おそらくＲＮＡ顆粒との関連に起因すると考えられる。ここでは、内因性にＳＴＡＵ１が上昇している細胞でオートファジーが障害されるかどうか、また、疾患に関連した変異タンパク質の外因性発現がＳＴＡＵ１の過剰とオートファジーの障害につながるかどうかを調べるために、さらなる試験を行った。オートファジーのマスターレギュレーターはｍＴＯＲであり、一旦リン酸化されるとＰ−ｍＴＯＲはリボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ（Ｓ６Ｋ１）や真核生物の開始因子４Ｅ結合タンパク質（４Ｅ−ＢＰ１）を含むいくつかの標的のキナーゼとして機能する。ＳＣＡ２患者から得られたＦＢはすべて、総ｍＴＯＲおよび活性Ｐ−ｍＴＯＲレベルの増加、およびｐ６２およびＬＣ３−ＩＩレベルの増加を示し、オートファジーフラックスの減少を示した（図２３Ｅ）。ｍＴＯＲの活性化は、ＡＬＳ、ＨＤおよびＡＤ患者の細胞においても明らかであった（図２３Ａ−Ｄ）。これらのＦＢにおけるＳＴＡＵ１およびｍＴＯＲレベルの増加は、転写変化の結果ではなかった（図２４Ａ−Ｄ）。
【０２２０】
患者由来の細胞は、それぞれの原因となるメンデル変異に加えて、他の未知の変異を含んでいる可能性がある。したがって、２つの独立したアプローチを用いて、疾患タンパク質からオートファゴソーム機能不全へのＳＴＡＵ１の過剰供給への因果関係を確立した。まず、ＨＥＫ−２９３細胞にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて疾患の原因となる変異を導入した。その結果、ＡＴＸＮ２−Ｑ２２／５８ＫＩに内因性変異を導入したＨＥＫ−２９３細胞では、野生型ＨＥＫ−２９３細胞と比較して、ＳＴＡＵ１、ｍＴＯＲ、Ｐ−ｍＴＯＲのレベルが上昇した。過剰なＰ−ｍＴＯＲの存在下で予想されるように、ｍＴＯＲシグナル伝達の下流エフェクターも同様に増加した豊富さおよびリン酸化を示した（Ｐ−Ｓ６およびＰ−４Ｅ−ＢＰ１）（図２５Ａ）。
【０２２１】
第二に、疾患原因タンパク質をＨＥＫ−２９３細胞で外因的に発現させ、それらがＳＴＡＵ１の過剰発現およびｍＴＯＲ活性化を再現しているかどうかを決定した。これには、野生型または変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ２９８Ｓ、Ａ３８２ＴおよびＧ３４８Ｃ）、ＴＤＰ−４３のＣ末端フラグメント（ＣＴＦ）、およびＭＡＰＴ変異が含まれた。疾患関連タンパク質の外因性発現は、ｍＴＯＲ活性の増加をもたらした（図２５Ｂ−Ｄ）。これらの結果は、変異型疾患関連タンパク質の存在がＳＴＡＵ１の過剰発現とオートファジー障害に直接関係していることを示唆する。
【０２２２】
神経変性のマウスモデルでは、ＳＴＡＵ１は過剰に存在する。ＳＴＡＵ１の過剰発現とオートファジー障害は、様々な神経変性疾患患者の多くの細胞株で見られたが、今回の解析では分裂が活発な細胞を用いた。生体内の分裂後の神経細胞におけるＳＴＡＵ１レベルを調べるために、ヒト変異体タンパク質を発現した多くのマウスモデルの脳タンパク質抽出物を用いて評価した。前述したように、ＳＣＡ２マウスの小脳抽出物ではＳＴＡＵ１が過剰に存在した。オートファジーの状態をこれらのマウスで追加的に評価したところ、ｉｎ  ｖｉｖｏでの結果はＳＣＡ２細胞株を用いて得られた結果と同じであることがわかった（図２６Ａ）。
【０２２３】
さらに、野生型ＴＤＰ−４３を発現するマウス株と、変異型Ｃ９ｏｒｆ７２リピートを持つヒトＢＡＣを発現するマウス株にも解析を拡張した。ウェスタンブロット分析により、ＴＤＰ−４３Ｔｇ／＋ヘミ接合マウスとＢＡＣ−Ｃ９ｏｒｆ７２マウスの両方で、ＡＴＸＮ２Ｑ１２７マウスで見られたものと同様のＳｔａｕ１レベルの大幅な上昇を示した（図２６Ｂ−Ｄ）。Ｓｔａｕ１の上昇に関連して、オートファジー経路の構成要素が変化し、非効率的なオートファゴソーム−リソソーム融合によるフラックスの減少を予測することが判明した。これには、全リン酸化されたｍＴｏｒ、ｐ６２、ユビキチン化基質分解のための選択的オートファジー受容体として機能するＬＣ３−ＩＩなどが含まれた（図２６Ａ−Ｄ）。
【０２２４】
ＳＴＡＵ１はｍＴＯＲの５'ＵＴＲと直接相互作用し、翻訳を促進する。さらに、ＨＥＫ−２９３細胞においてＳＴＡＵ１を外因的に発現させることで、神経変性疾患に関連した変異を持つ細胞で見られたのと同様の変化が得られるかどうかを調べた。ＳＴＡＵ１の発現は、ｍＴＯＲ、Ｐ−ｍＴＯＲ、ｐ６２およびＬＣ３−ＩＩレベルの増加をもたらした（図２７Ａ）。ｍＴＯＲ転写物のレベルは変化しなかった（図２７Ｂ）。これらの結果は、ＳＴＡＵ１が過剰に存在することでオートファジー機能不全を誘導するのに十分であることを示唆する。
【０２２５】
ＳＴＡＵ１は５'ＵＴＲに結合してｍＲＮＡの翻訳を増強することができるので、ＳＴＡＵ１がｍＴＯＲ  ＲＮＡに結合することができるかどうか、およびこの相互作用がｍＴＯＲ  ｍＲＮＡの翻訳を増強するかどうかをさらに試験した。ＳＴＡＵ１とｍＴＯＲ  ＲＮＡとの相互作用を確立するために、２つの独立したアプローチを用いた。第一に、フラグタグ付きＳＴＡＵ１を発現したＨＥＫ−２９３細胞におけるタンパク質−ＲＮＡ免疫沈降（非ＲＮａｓｅ  Ａ処理）後のＲＴ−ＰＣＲにより、フラグ−ＳＴＡＵ１はｍＴＯＲ  ｍＲＮＡをプルダウンさせるが、コントロールＧＡＰＤＨはプルダウンさせないことが示された（図２７Ｃ）。第二に、細菌学的に発現された組換えＨｉｓタグ付きＳＴＡＵ１タンパク質およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＤＩＧ標識ｍＴＯＲ  ＲＮＡプローブを用いて、ｍＴＯＲ−５'ＵＴＲへのＳＴＡＵ１の相互作用を、北西ブロット分析によってマッピングした（図２７Ｄ−Ｅ）。
【０２２６】
ＳＴＡＵ１のｍＴＯＲ  ＲＮＡへの結合の影響をテストするために、ｍＴＯＲ−５'ＵＴＲをルシフェラーゼの上流に挿入した。外因性ＳＴＡＵ１の存在下では、翻訳は大幅に増加した（図２７Ｆ−Ｈ）。ＳＴＡＵ１とＵＴＲ配列との相互作用の特異性は、ＰＣＰ２がその５'ＵＴＲによって媒介されないＳＭＤを受けることのみが知られているので、ｍＴＯＲ−５'ＵＴＲをＰＣＰ２−５'ＵＴＲで置換することによってさらに試験された。外因性ＳＴＡＵ１は、ｍＴＯＲ−５'ＵＴＲ−ＬＵＣ構築物（図２７Ｆ−Ｈ）からのみルシフェラーゼ活性の有意な誘導をもたらした。ＳＴＡＵ１の二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン３（ｄｓＲＢＤ３）は、標的ＲＮＡとの相互作用のための主要な機能ドメインとして機能する。翻訳の増加はこのドメインの存在に依存しており、その欠失は翻訳に対するＳＴＡＵ１の効果を無効にしていた（図２７Ｉ−Ｋ）。これらのデータはｍＴＯＲの増加を説明し、相互作用をｍＴＯＲ  ＲＮＡの５'ＵＴＲとＳＴＡＵ１のｄｓＲＢＤ３ドメインにマッピングする。
【０２２７】
ＳＴＡＵ１は様々なストレス因子に応答する。さらに、疾患関連遺伝子の発現以外の様々なストレスに細胞を曝露することで、ＳＴＡＵ１とオートファジー機能に影響を与えるかどうかを検証した。具体的には、ＨＥＫ−２９３細胞を小胞体（ＥＲ）ストレス因子（タプシガルギンまたはツニカマイシン）、カルシウムイオノフォア（イオノマイシン）、酸化ストレス因子（ツニカマイシン）、金属ストレス因子（亜ヒ酸ナトリウム）、温度ストレス因子（ハイパーサーミア）に曝露した後、ウエスタンブロッティングを行った。異なる形態のストレスはすべて、ＳＴＡＵ１の過剰発現、ｍＴＯＲの上昇、およびｍＴＯＲターゲットのリン酸化の増加を誘導した（図２８Ａ−Ｅ）。この経路の活性化におけるＳＴＡＵ１の関与を確認するために、野生型およびＳｔａｕ１−／−マウスの皮質ニューロンの初代培養を行った。野生型ニューロンでは、タプシガルギンを投与することにより、ＳＴＡＵ１の過剰発現とｍＴｏｒの活性化が誘導され、ｐ６２とＬＣ３−ＩＩのレベルが上昇した。対照的に、Ｓｔａｕ１−／−のニューロンでは、ｔａｐｓｉｇａｒｇｉｎに対する反応は最小限であり（図２８Ｆ）、ｍＴＯＲとその下流の標的の活性化はＳＴＡＵ１に依存していることが示唆された。正確なシグナル伝達経路はまだ知られていないが、これらの知見は、ＳＴＡＵ１がいくつかの細胞ストレス経路の交差点に位置することを示す。
【０２２８】
過剰なＳＴＡＵ１の減少はオートファジーを正常化する。外因性のＳＴＡＵ１発現は、上記のように、オートファジーのフラックスを変化させるのに十分であった。したがって、ＳＴＡＵ１が必要かどうかをさらに決定した。これを試験するために、ＳＴＡＵ１を、インビトロおよびインビボで、変異型疾患タンパク質の存在下でノックダウンした。ＡＴＸＮ２−Ｑ５８  ＫＩ細胞においてＳＴＡＵ１をＳＴＡＵ１  ＲＮＡｉにより枯渇させると、ｍＴＯＲレベルは正常化された。ｍＴＯＲ活性の低下は、Ｐ−ｍＴＯＲ、Ｐ−Ｓ６、およびＰ−４ＥＢＰ１レベルの低下、およびｐ６２およびＬＣ３−ＩＩターンオーバーの回復によって確認された（図２９Ａ）。このように、ＳＴＡＵ１レベルを低下させることは、ＳＣＡ２細胞におけるオートファジーのフラックスを救済するのに十分であった。
【０２２９】
さらに、ＳＴＡＵ１レベルを低下させることがＡＬＳ細胞モデルにおいてオートファジーフラックスを回復させることができるかどうかを調べた。ＡＴＸＮ２−ＫＩ細胞と同様に、ＡＬＳ−ＴＤＰ−４３またはＣ９ｏｒｆ７２細胞モデルにおいても、ＲＮＡｉによりＳＴＡＵ１レベルを低下させると、オートファジーのフラックスが回復した（図２９Ｂ−Ｃ）。注目すべきことに、ＳＴＡＵ１のサイレンシングはＴＤＰ−４３タンパク質レベルに影響を与えなかった。これらのデータは、ＳＴＡＵ１のノックダウンは、細胞ストレスに対する不適応応答を防ぐために有用である可能性があることを示す。
【０２３０】
ＳＴＡＵ１レベルを低下させることは、ＳＣＡ２、ＴＤＰ−４３、およびＣ９ｏｒｆ７２変異に関連した異常なオートファジーを正常化することができるので、ＳＴＡＵ１レベルを低下させることが病理学的ストレスの保護につながるかどうかについて、さらに試験を行った。具体的には、ＨＥＫ−２９３細胞をＳＴＡＵ１  ＲＮＡｉで処理した後、野生型または変異型ＴＤＰ−４３をトランスフェクションした。いずれの場合も、ＳＴＡＵ１を低下させると、ｍＴＯＲシグナル伝達とオートファジーが正常化された（図３０）。これらの結果は、ＳＴＡＵ１が様々な病理学的ストレス因子から細胞を保護する上で重要な役割を果たすことを証明する。
【０２３１】
インビボでの結果。ＳＴＡＵ１機能喪失対立遺伝子を有するマウスの利用可能性は、遺伝的相互作用を用いてＳＴＡＵ１減少の効果を決定することを可能にした。ＳＣＡ２またはＴＤＰ−４３マウス系統を、Ｓｔａｕ１タンパク質レベルが５０％または０％のＳｔａｕ１  ＫＯマウスを生成する動物と交配させた。前述のように、Ｓｔａｕ１の減少がＳＣＡ２マウスの運動行動とプロテオミクスを改善することは以前に観察される。野生型動物では、Ｓｔａｕ１の投与量を変化させても、オートファジーマーカー蛋白質の変化は認められなかった。対照的に、ＳＣＡ２マウスで病的に上昇したＳｔａｕ１の投与量を減少させると、オートファジーのマーカーが用量依存的に改善され、すべてのタンパク質のレベルが正常に近いレベルに戻った（図３１Ａ、Ｂ、Ｄ）。ＳＣＡ２マウスと同様に、ＴＤＰ−４３Ｔｇ／＋マウスでもＳｔａｕ１の投与量を５０％減少させると、ｍＴＯＲ活性が低下し、オートファジー経路のタンパク質が回復した（図３１Ｃ、Ｅ）。
【０２３２】
これらの結果は、オートファジーを制御するメカニズムの基礎的な理解と、神経変性の治療のための新規なターゲットの同定に意味を持つ。オートファジーに関する現在の理解では、キナーゼカスケードによる制御、およびオートファジーに関与する主要遺伝子の転写変化による制御が強調される。本研究では、ＲＮＡ結合タンパク質が関与し、既に転写されたｍＲＮＡの翻訳に急性的に影響を与えるＳＧを形成するという新たな制御機構を明らかにした。二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質ＳＴＡＵ１はｍＴＯＲ−ｍＲＮＡと直接相互作用し、その翻訳を促進する。ＳＴＡＵ１はそれ自体がオートファジーによって分解されるため、オートファジー阻害の増幅機構が確立される。また、ＳＴＡＵ１はＲＮＡの崩壊にも重要な役割を果たしており、その過剰発現はオートファジーに加えて、細胞機能やシグナル伝達カスケードに関与するＲＮＡネットワークに影響を与えている可能性が高い。
【実施例１２】
【０２３３】
実施例１２−ＳＴＡＵＦＥＮ１を標的とする様々なＡＳＯの効果の比較
表４に示すＡＳＯを調製し、Ｓｔａｕｆｅｎ１を標的とするための潜在的な治療薬として評価した。
表４−ＡＳＯ配列
【表４】
2021527649.tif 000007
【０２３４】
マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞を表４に示す２５０ｎＭのＡＳＯ、または陰性対照としてリン酸緩衝生理食塩水でトランスフェクションした。トランスフェクションの４日後、Ｓｔａｕ１発現は、エクソン４を標的とするプライマーを用いた定量的ＰＣＲによって決定された。すべてのＳｔａｕｆｅｎＡＳＯは、ヒトおよびマウスの両方のＳｔａｕｆｅｎ１配列を標的とし、５−１０−５  ＭＯＥギャップマー化学を有していた。いくつかのＡＳＯの結果は、図ＸＸに示されている。さらに、Ｓｔａｕ１発現をウエスタンブロッティングによって決定した。ウェスタンブロットの結果のいくつかは、図３２Ａに示されている。
【０２３５】
ＳＣＡ２患者由来の皮膚細胞線維芽細胞（ＳＣＡ２−０３［Ｑ２２／Ｑ３５］）もまた、様々なＡＳＯまたはリン酸緩衝生理食塩水の２００ｎＭまたは３００ｎＭの量のいずれかでトランスフェクトした。４日後、ＳＴＡＵ１発現を定量的ＰＣＲにより決定した。いくつかの結果を図３２Ｂに示す。
【０２３６】
さらに、ＴＤＰ−４３±トランスジェニックマウスを、２５０ｍｇの様々なＡＳＯまたは生理食塩水で脳静脈内注射した。１５日の治療後、脊髄を除去し、Ｓｔａｕ１の発現を定量的ＰＣＲ（図３２Ｃ）によって決定した。微小グリア症もまた、Ａｉｆ１発現を測定することによって評価され、対照と比較してＡｉｆ１発現の増加は認められなかったか、または微小グリア症の証拠は認められなかった（図３２Ｄ−Ｅ）。値は平均および標準偏差である。Ｎ数マウスは、５（ＰＢＳ）、４（ＵＵＵ００１８１）、１（ＵＵＵ００１８６）、２（ＵＵＵ００４５）、４（ＵＵＵ００１９３）、５（ＵＵＵ００１９９）であった。
【０２３７】
上述の方法は、本発明のいくつかの実施形態の例示に過ぎないことが理解されるべきである。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多数の改変および代替的な配置が、当技術分野に熟練した者によって考案されてもよく、添付の特許請求の範囲は、そのような改変および配置をカバーすることを意図する。したがって、本発明は、本発明の最も実用的で好ましい実施形態であると現時点で考えられるものに関連し、上述で特定かつ詳細に説明されたが、本明細書に記載された原理および概念から逸脱することなく、本発明を含む、バリエーションがなされ得ることは、当技術分野の通常の当業者には明らかだろう。
【図１Ａ】
2021527649.tif 000008
【図１Ｂ】
2021527649.tif 000009
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
2021527649.tif 000011
【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
2021527649.tif 000024
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
2021527649.tif 000027
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2021527649.tif 000030
【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
2021527649.tif 000033
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2021527649.tif 000037
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
2021527649.tif 000041
【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
2021527649.tif 000044
【図７Ｊ】
2021527649.tif 000045
【図８Ａ】
2021527649.tif 000046
【図８Ｂ】
2021527649.tif 000047
【図８Ｃ】
2021527649.tif 000048
【図９Ａ】
2021527649.tif 000049
【図９Ｂ】
2021527649.tif 000050
【図１０Ａ】
2021527649.tif 000051
【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
2021527649.tif 000053
【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１１Ａ】
2021527649.tif 000059
【図１１Ｂ】
2021527649.tif 000060
【図１１Ｃ】
2021527649.tif 000061
【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
2021527649.tif 000064
【図１３Ｂ】
2021527649.tif 000065
【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
2021527649.tif 000067
【図１４Ｂ】
2021527649.tif 000068
【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
2021527649.tif 000070
【図１５Ａ】
2021527649.tif 000071
【図１５Ｂ】
2021527649.tif 000072
【図１５Ｃ】
2021527649.tif 000073
【図１６Ａ】
2021527649.tif 000074
【図１６Ｂ】
2021527649.tif 000075
【図１６Ｃ】
2021527649.tif 000076
【図１６Ｄ】
2021527649.tif 000077
【図１６Ｅ】
2021527649.tif 000078
【図１６Ｆ】
2021527649.tif 000079
【図１７Ａ】
2021527649.tif 000080
【図１７Ｂ】
2021527649.tif 000081
【図１８Ａ】
2021527649.tif 000082
【図１８Ｂ】
2021527649.tif 000083
【図１８Ｃ】
2021527649.tif 000084
【図１９Ａ】
2021527649.tif 000085
【図１９Ｂ】
2021527649.tif 000086
【図２０】
2021527649.tif 000087
【図２１Ａ】
2021527649.tif 000088
【図２１Ｂ】
2021527649.tif 000089
【図２１Ｃ】
2021527649.tif 000090
【図２１Ｄ】
2021527649.tif 000091
【図２２Ａ】
2021527649.tif 000092
【図２２Ｂ】
2021527649.tif 000093
【図２２Ｃ】
2021527649.tif 000094
【図２３Ａ】
2021527649.tif 000095
【図２３Ｂ】
2021527649.tif 000096
【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
2021527649.tif 000098
【図２３Ｅ】
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【図２４Ａ】
2021527649.tif 000100
【図２４Ｂ】
2021527649.tif 000101
【図２４Ｃ】
2021527649.tif 000102
【図２４Ｄ】
2021527649.tif 000103
【図２５Ａ】
2021527649.tif 000104
【図２５Ｂ】
2021527649.tif 000105
【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ａ】
2021527649.tif 000108
【図２６Ｂ】
2021527649.tif 000109
【図２６Ｃ】
2021527649.tif 000110
【図２６Ｄ】
2021527649.tif 000111
【図２７Ａ】
2021527649.tif 000112
【図２７Ｂ】
2021527649.tif 000113
【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
2021527649.tif 000115
【図２７Ｅ】
2021527649.tif 000116
【図２７Ｆ】
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【図２７Ｇ】
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【図２７Ｈ】
2021527649.tif 000119
【図２７Ｉ】
2021527649.tif 000120
【図２７Ｊ】
2021527649.tif 000121
【図２７Ｋ】
2021527649.tif 000122
【図２８Ａ】
2021527649.tif 000123
【図２８Ｂ】
2021527649.tif 000124
【図２８Ｃ】
2021527649.tif 000125
【図２８Ｄ】
2021527649.tif 000126
【図２８Ｅ】
2021527649.tif 000127
【図２８Ｆ】
2021527649.tif 000128
【図２９Ａ】
2021527649.tif 000129
【図２９Ｂ】
2021527649.tif 000130
【図２９Ｃ】
2021527649.tif 000131
【図３０】
2021527649.tif 000132
【図３１Ａ】
2021527649.tif 000133
【図３１Ｂ】
2021527649.tif 000134
【図３１Ｃ】
2021527649.tif 000135
【図３１Ｄ】
2021527649.tif 000136
【図３１Ｅ】
2021527649.tif 000137
【図３２Ａ】
2021527649.tif 000138
【図３２Ｂ】
2021527649.tif 000139
【図３２Ｃ】
2021527649.tif 000140
【図３２Ｄ】
2021527649.tif 000141
【図３２Ｅ】
2021527649.tif 000142
【配列表】
2021527649000001.app
【国際調査報告】
2021527649.tif 000143
2021527649.tif 000144
2021527649.tif 000145
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