(57)【要約】      （修正有）【課題】アミノ酸配列分析装置の反応槽における試料と試薬の反応効率を向上させ、アミノ酸の回収率を改善するアミノ酸配列分析装置を提供する。【解決手段】アミノ酸配列分析装置は、試料のエドマン反応を行うエドマン反応部４と、エドマン反応部に試薬を供給する試薬供給部２，３と、エドマン反応部においてエドマン反応により試料から脱離したアミノ酸の分析を行うアミノ酸分析部１０と、を備える。エドマン反応部は反応槽を含み、その反応槽は、反応空間、試料を保持する主平面を有し、その主平面で反応空間を上下の空間に区切るように反応空間内に配置された試料支持体、反応空間の上側の空間の内壁面に設けられ、試薬供給部からの試薬を流入させる試薬入口及び反応空間の下側の空間の内壁面に設けられ、反応空間内の試薬を回収する試薬出口を備える。試薬入口と試薬出口は、試料支持体の主平面の中心を挟んで互いに反対側の位置にある試料支持体の端部側にそれぞれ設けられる。【選択図】図２
0003185408.tif 000002
【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
試料のエドマン反応を行なうエドマン反応部と、
前記エドマン反応部に試薬を供給する試薬供給部と、
前記エドマン反応部においてエドマン反応により試料から脱離したアミノ酸の分析を行なうアミノ酸分析部と、を備えたアミノ酸配列分析装置において、
前記エドマン反応部は反応槽を含み、
前記反応槽は、反応空間、試料を保持する主平面を有し、その主平面で前記反応空間を上下の空間に区切るように前記反応空間内に配置された試料支持体、前記反応空間の上側の空間の内壁面に設けられ、前記試薬供給部からの試薬を流入させる試薬入口及び前記反応空間の下側の空間の内壁面に設けられ、前記反応空間内の試薬を回収する試薬出口を備えており、
前記試薬入口と前記試薬出口は、前記試料支持体の前記主平面の中心を挟んで互いに反対側の位置にある前記試料支持体の端部側にそれぞれ設けられていることを特徴とするアミノ酸配列分析装置。
【請求項２】
前記試薬入口と前記試薬出口は前記反応空間の内壁面において互いの間の距離が最も長くなる位置に設けられている請求項１に記載のアミノ酸配列分析装置。
【請求項３】
前記試薬出口は前記反応空間の内壁面の最も低い位置に設けられている請求項１又は２に記載のアミノ酸配列分析装置。
【請求項４】
前記反応槽は円柱形状又は角柱形状を有し、上面中心部に前記試薬入口に通じる入口配管接続部、下面中心部に前記試薬出口に通じる出口配管接続部が設けられている請求項１から３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列分析装置。
【考案の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアミノ酸配列分析装置に関し、特に、アミノ酸配列分析装置において試料を保持して試薬と反応させる反応槽の改良に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、蛋白質やペプチドの一次構造、すなわちアミノ酸配列をＮ末端から逐次分析するために用いられる方法としてエドマン反応が知られている。このエドマン反応により試料からアミノ酸を逐次分解して分析するアミノ酸配列分析装置には、試料を反応させるための反応槽が設けられている（特許文献１参照。）。
【０００３】
反応槽には試料を保持させたガラスファイバフィルタやポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜などの試料支持体が設置される。試料支持体の設置された反応槽に所定の試薬が逐次供給されることで、エドマン反応によって試料のＮ末端側からアミノ酸が逐次脱離する。脱離したアミノ酸は高速液体クロマトグラフに導入されてアミノ酸配列の分析が行なわれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平９−０６８５３４号公報
【考案の概要】
【考案が解決しようとする課題】
【０００５】
アミノ酸配列分析装置の反応槽は、試料を浸み込ませた試料支持体がポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜とともに２つのガラスブロックの間に挟み込まれて構成されている。反応槽は２つのガラスブロックの内側に反応空間を備えており、各ガラスブロックには、試薬やガスを反応空間へ流入させる入口流路と反応部の試薬やガスを流出させる出口流路が設けられている。
【０００６】
入口流路から反応空間へ流入した試薬は反応空間において拡散するものの、その流速は入口流路の中心付近が速く、中心から離れるにしたがって遅くなる。そのため、試料支持体を通過する試薬の量は試料支持体の面に対して不均一になり、試料支持体において入口流路の中心から離れた位置に保持されている試料の反応効率が低下し、アミノ酸の回収率を悪くする原因となっている。
【０００７】
そこで、本考案は、アミノ酸配列分析装置の反応槽における試料と試薬の反応効率を向上させ、アミノ酸の回収率を改善することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本考案は、試料のエドマン反応を行なうエドマン反応部と、エドマン反応部に試薬を供給する試薬供給部と、エドマン反応部においてエドマン反応により試料から脱離したアミノ酸の分析を行なうアミノ酸分析部と、を備えたアミノ酸配列分析装置であって、エドマン反応部は反応槽を含み、反応槽は、反応空間、試料を保持する主平面を有し、その主平面で反応空間を上下の空間に区切るように反応空間内に配置された試料支持体、反応空間の上側の空間の内壁面に設けられ、試薬供給部からの試薬を流入させる試薬入口及び反応空間の下側の空間の内壁面に設けられ、反応空間内の試薬を回収する試薬出口を備えており、試薬入口と試薬出口は、試料支持体の主平面の中心を挟んで互いに反対側の位置にある試料支持体の端部側にそれぞれ設けられていることを特徴とするものである。
【０００９】
試薬入口と試薬出口は反応空間の内壁面において互いの間の距離が最も長くなる位置に設けられていてもよい。そうすれば、試薬の流れが反応空間全体に形成され、試料が保持されている試料支持体の主平面全体を試薬が通液しやすくなる。
【００１０】
試薬出口は反応空間の内壁面の最も低い位置に設けられているようにしてもよい。そうすれば、反応空間内に試料と試薬との反応液が溜まりにくくなり、アミノ酸の回収率の向上が図れる。
【００１１】
反応槽は円柱形状又は角柱形状を有し、上面中心部に試薬入口に通じる入口配管接続部、下面中心部に試薬出口に通じる出口配管接続部が設けられていることが好ましい。そうすれば、反応槽に接続する配管を円柱形状又は角柱形状である反応槽の中心軸を基準として位置決めしやすくなり、反応槽への配管の接続が容易になる。
【考案の効果】
【００１２】
本考案のアミノ酸配列分析装置では、反応槽の試薬入口と試薬出口は、試料支持体の主平面の中心を挟んで互いに反対側の位置にある試料支持体の端部側にそれぞれ設けられているので、試料支持体の一端側からその反対側までの試薬の流れが形成され、試料支持体の主平面全体を試薬が通液しやすくなる。これにより、反応槽における試料と試薬の反応効率が向上し、アミノ酸の回収率が改善する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】アミノ酸配列分析装置の一実施例を示す流路構成図である。
【図２】同実施例の制御系統を示すブロック図である。
【図３】同実施例の反応槽の一例を示す断面図である。
【図４】同実施例における分析手順を示すフローチャートである。
【図５】反応槽の他の例を示す断面図である。
【図６】図５の反応槽を構成する上側ブロックと下側ブロックの構造を示す図であり、（Ａ）は上側ブロックの断面図及び下面図、（Ｂ）は下側ブロックの断面図及び平面図である。
【考案を実施するための形態】
【００１４】
図１を用いてアミノ酸配列分析装置の一実施例について説明する。
【００１５】
このアミノ酸配列分析装置は、第１試薬供給部２、第２試薬供給部３、エドマン反応部４及びアミノ酸分析部１０により構成されている。第１試薬供給部２はエドマン反応部４の反応槽６にガスや試薬を供給するものであり、第２試薬供給部３はエドマン反応部４のコンバージョンフラスコ８にガスや試薬を供給するものである。第１試薬供給部２と第２試薬供給部３によって試薬供給部が構成されている。
【００１６】
第１試薬供給部２は第１試薬供給流路１１を介してエドマン反応部４の反応槽６に接続されている。第１試薬供給部２には試薬容器５ａ〜５ｅが設けられている。試薬容器５ａには酢酸エチル、試薬容器５ｂには塩化ｎ−ブチル、試薬容器５ｃにはトリメチルアミン、試薬容器５ｄにはＰＩＴＣ（フェニルイソチオシアネート）のｎ−ヘプタン溶液、試薬容器５ｅにはトリフルオロ酢酸がそれぞれ試薬として収容されている。
【００１７】
試薬容器５ａ〜５ｅは３方電磁弁１２ａ〜１２ｅを介して第１試薬供給流路１１にそれぞれ接続され、また、電磁弁１３ａ〜１３ｅを介してドレインにそれぞれ接続されている。試薬容器５ａ〜５ｅにはガス供給流路７ａ〜７ｅがそれぞれ接続されている。ガス供給流路７ａ〜７ｅ上には各試薬容器５ａ〜５ｅを加圧するためのＮ2ガスの供給を制御する電磁弁９ａ〜９ｅが設けられている。３方電磁弁１２ａ〜１２ｅの切換えにより試薬容器５ａ〜５ｅのいずれかが第１試薬供給流路１１に選択的に接続され、その試薬容器にＮ2ガスが供給されて加圧されることで試薬が反応槽６に供給される。第１試薬供給流路１１上にもＮ2ガスの供給の制御を行なう電磁弁９ｈが設けられている。
【００１８】
第２試薬供給部３は第２試薬供給流路２０を介してエドマン反応部４のコンバージョンフラスコ８に接続されている。第２試薬供給部３には試薬容器５ｆ及び５ｇが設けられている。試薬容器５ｆにはアセトニトリルと水の混合液、試薬容器５ｇにはトリフルオロ酢酸溶液がそれぞれ試薬として収容されている。
【００１９】
試薬容器５ｆ及び５ｇはそれぞれ３方電磁弁１２ｆ，１２ｇを介して第２試薬供給流路２０に接続されている。試薬容器５ｆにはガス供給流路７ｆが、試薬容器５ｇにはガス供給流路７ｇがそれぞれ接続されている。ガス供給流路７ｆと７ｇ上には各試薬容器７ｆと７ｇを加圧するためのＮ2ガスの供給を制御する電磁弁９ｆと９ｇが設けられている。３方電磁弁１２ｆ，１２ｇの切換えにより試薬容器５ｆ，５ｇのいずれかが第２試薬供給流路２０に選択的に接続され、その試薬容器にＮ2ガスが供給されて加圧されることで試薬がコンバージョンフラスコ８に供給される。第２試薬供給流路２０上にもＮ2ガスの供給の制御を行なう電磁弁９ｉが設けられている。
【００２０】
エドマン反応部４において、反応槽６の出口側に流路１４が接続されている。流路１４は３方電磁弁１６を介してドレインとコンバージョンフラスコ８へ通じる流路１８に接続されている。反応槽６の出口側は３方電磁弁１６の切換えによってコンバージョンフラスコ８とドレインのいずれか一方に接続される。
【００２１】
コンバージョンフラスコ８には、反応槽６側からの流路１８のほか、第２試薬供給流路２０、導入流路２２及びドレインが接続されている。コンバージョンフラスコ８のドレインは電磁弁１９によって開閉されるようになっている。導入流路２２はアミノ酸分析部１０の６方バルブ２４の１つのポートに通じている。
【００２２】
試料は反応槽６の内部に設けられた反応空間内に保持される。反応槽６は、試料を保持した試料支持体を試薬が通液する構造となっている。試料支持体を試薬が通液することで、試料のＮ末端側からアミノ酸が切り出され、切り出されたアミノ酸がコンバージョンフラスコ８に導かれる。コンバージョンフラスコ８は導入流路２２を介してアミノ酸分析部１０に接続されており、反応槽６で試料から切り出されたアミノ酸はコンバージョンフラスコ８において転換及び溶解の処理が施された後、アミノ酸分析部１０に導入される。
【００２３】
ここで、反応槽６の一例を図３に示す。
【００２４】
反応槽６は内部に反応空間４２を備えているとともに反応空間４２に通じる入口流路４４及び出口流路４６を備えている。反応槽６は２つの円柱形状のガラスブロック３６，３８が上下に積層されて構成されており、反応空間４２は上側のガラスブロック３６の下面に設けられた凹部４２ａと下側のガラスブロック３８の上面に設けられた凹部４２ｂからなる空間である。この実施例では、凹部４２ａと４２ｂは互いに対称な円錐形状である。
【００２５】
反応空間４２内に試料支持体４８が配置されている。試料支持体４８は主平面を有し、その主平面において試料を保持するとともに試薬を透過させることができる。試料支持体４８の主平面の形状は反応空間４２の平面形状と同じ円形である。試料支持体４８としては、ガラスファイバフィルタやＰＶＤＦ膜を用いることができる。試料支持体４８はその主平面が水平になるようにガラスブロック３６の下面境界部分に配置されている。ガラスブロック３６はガラスブロック３８に対して着脱可能に取り付けられている。ガラスブロック３６をガラスブロック３８から取り外すことにより、反応空間４２へ試料支持体４８を設置したり、取り外したりすることができるようになっている。
【００２６】
ガラスブロック３６と３８の間にＰＴＦＥ膜４０が挟み込まれている。これは、ガラスブロック３６と３８を取り外したときにガラスブロック３６と３８の間にごみや異物が混入する可能性があり、それらの混入物が出口流路４６を通って下流の電磁弁に入って故障の原因となることを防止するためである。
【００２７】
入口流路４４はガラスブロック３６に設けられ、出口流路４６はガラスブロック３８に設けられている。反応空間４２は試料支持体４８によって上下２つの空間に仕切られている。反応空間４２への試薬入口をなす入口流路４４の反応空間４２側の端部の開口は、試料支持体４８によって仕切られた反応空間４２の上側の空間の内壁面に設けられている。反応空間４２からの試薬出口をなす出口流路４６の反応空間４２側の端部の開口は、試料支持体４８によって仕切られた反応空間４２の下側の空間の内壁面に設けられている。試薬入口と試薬出口はともに試料支持体４８の主平面の端部近傍で、試料支持体４８の中心を挟んで互いに反対側の位置に設けられている。これにより、入口流路４４を通じて反応空間４２へ流入した試薬は反応空間４２全体に行き渡るようになり、試料支持体４８の主平面全体が試薬によって通液される。
【００２８】
ガラスブロック３６上面側の入口流路４４の端部はガラスブロック３６の中心軸上に設けられている。ガラスブロック３８下面側の出口流路４６の端部はガラスブロック３８の中心軸上に設けられている。これにより、入口流路４４と出口流路４６に接続する配管の位置決めを反応槽６の中心軸を基準としてすることができ、反応槽６への配管の接続が容易である。
【００２９】
なお、反応槽６の構造は図３のものに限られない。図５及び図６に反応槽６の構造の他の例を示す。
【００３０】
図５及び図６の例では、反応空間４２が中心軸が鉛直方向から傾斜した円柱形状に形成されている。反応空間４２をなす凹部４２ａ及び４２ｂはともに、平底のドリルをガラスブロック３６と３８の凹部形成面に対して傾斜させて一定の深さまで掘り込むことで形成されている。試薬入口をなす入口流路４４の反応空間４２側の端部の開口は凹部４２ａの最深部、すなわち反応空間４２の最上部に設けられ、試薬がさらに反応空間４２全体に行き渡り易くなっている。また、試薬出口をなす出口流路４６の反応空間４２側の端部の開口は凹部４２ｂの最深部、すなわち反応空間４２の最下部に設けられ、反応空間４２内に試薬が溜まりにくくなっている。
【００３１】
図１に戻って説明を続けると、アミノ酸分析部１０は高速液体クロマトグラフである。アミノ酸分析部１０は６方バルブ２４のほか、サンプル滞留流路２６、移動相送液流路２７及び分析流路２８を備えている。サンプル滞留流路２６、移動相送液流路２７及び分析流路２８は６方バルブ２４のそれぞれのポートに接続されており、６方バルブ２４において、導入流路２２−サンプル滞留流路２６−ドレイン間を接続した状態（図の状態）と、移動相送液流路２７−サンプル滞留流路２６−分析流路２８間を接続した状態のいずれかに切り換えられるように構成されている。
【００３２】
サンプル滞留流路２６は導入流路２２から導入されるアミノ酸を一時的に滞留させておくサンプルループ２６ａを備えている。移動相送液流路２７は移動相溶媒を送液するための送液ポンプ３０を備えており、分析流路２８は分析カラム３２及びその下流の検出器３４を備えている。
【００３３】
図２に示されているように、第１試薬供給部２、第２試薬供給部３、エドマン反応部４及びアミノ酸分析部１０の動作は演算制御装置３５により制御されている。また、演算制御装置３５にはアミノ酸分析部１０の検出器３４で得られた検出データが入力され、演算制御装置３５においてアミノ酸の同定や定量、収率計算などが行なわれる。演算制御装置３５は例えばパーソナルコンピュータや専用のコンピュータにより実現される。
【００３４】
次に、図１とともに図４のフローチャートを用いて同実施例におけるアミノ酸配列の分析手順について説明する。
【００３５】
［試料の設置（ステップＳ１）］
試料を保持させたガラスファイバフィルタ（試料支持体）４８をガラスブロック３６と３８の間にＰＴＦＥ膜４０とともに挟み込むことで、反応槽６の反応空間４２内に試料支持体４８を設置する。
【００３６】
［カップリング反応（ステップＳ２）］
電磁弁９ｃを切り替え、Ｎ2ガスをトリメチルアミンの試薬容器５ｃに供給し、試薬容器５ｃの圧力を上げることで、３方電磁弁１２ｃを介して反応槽６に気体のトリメチルアミンを供給して反応槽６内を満たした後、第１試薬供給部２からＰＩＴＣのｎ−ヘプタン溶液を反応槽６に供給し、試料であるタンパク質のＮ末端アミノ基に反応させ、ＰＴＣ（フェニルチオカルバミル）−タンパク質を生成する。その後、第１試薬供給部２から酢酸エチルを反応槽６に供給し、反応槽６内の過剰な試薬や副生成物を洗浄してドレインへ排出する。このカップリング反応は、反応槽６の出口側の流路１４をドレインに接続した状態で行なう。
【００３７】
［切断反応（ステップＳ３）］
第１試薬供給部２からトリフルオロ酢酸を反応槽６に供給し、ＰＴＣ−タンパク質のＮ末端ペプチド結合を切断し、ＡＴＺ（アニリノチアゾリノン）−アミノ酸を形成する。この切断反応も、反応槽６の出口側の流路１４をドレインに接続した状態で行なう。
【００３８】
［抽出（ステップＳ４）］
反応槽６の出口側の流路１４をコンバージョンフラスコ８側へ接続し、第１試薬供給部２から塩化ｎ−ブチルを反応槽６に供給することで、試料から遊離したＡＴＺ−アミノ酸をコンバージョンフラスコ８に抽出する。
【００３９】
［転換反応（ステップＳ５）］
第２試薬供給部３からトリフルオロ酢酸溶液をコンバージョンフラスコ８に供給し、ＡＴＺ−アミノ酸を安定なＰＴＨ（フェニルチオヒダントイン）−アミノ酸へ転換する。
【００４０】
［溶解（ステップＳ６）］
第２試薬供給部３からアセトニトリルと水の混合液をコンバージョンフラスコ８に供給し、アセトニトリルと水の混合液にＰＴＨ−アミノ酸を溶解させる。上記のカップリング反応（ステップＳ２）からこの溶解（ステップＳ６）までの反応がエドマン反応である。
【００４１】
［液体クロマトグラフへの導入（ステップＳ７）］
以上のエドマン反応により得られたＰＴＨ−アミノ酸を高速液体クロマトグラフ１０に導入する。そのために、６方バルブ２４によって導入流路２２−サンプル滞留流路２６−ドレイン間を接続し、コンバージョンフラスコ８に電磁弁９ｉ、１２ｆ及び１２ｇを介してＮ2ガスを供給してコンバージョンフラスコ８内を加圧することで、コンバージョンフラスコ８内のＰＴＨ−アミノ酸を含むアセトニトリルと水の混合液（サンプル溶液）を導入流路２２側へ導出する。導入流路２２側へ導出されたサンプル溶液はサンプル滞留流路２６のサンプルループ２６ａに滞留する。
【００４２】
以上のステップＳ２〜Ｓ７の動作を繰り返し実行し、試料のＮ末端からアミノ酸を順次脱離させて高速液体クロマトグラフ１０でアミノ酸の分離分析を行なう。高速液体クロマトグラフ１０のサンプルループ２６ａに滞留した試料溶液は、６方バルブ２４が移動相送液流路２７−サンプル滞留流路２６−分析流路２８間を接続するように切り換えられることで、移動相送液流路２７からの移動相溶媒によって分析カラム３２に移送されて成分ごとに分離され、検出器３４においてその組成成分が検出される。検出器３４で得られた検出信号は演算制御装置３５に取り込まれ、アミノ酸の同定や定量、収率計算などが行なわれる。
【符号の説明】
【００４３】
２      第１試薬供給部
３      第２試薬供給部
４      エドマン反応部
５ａ〜５ｇ      試薬容器
６      反応槽
７ａ〜７ｇ      ガス供給流路
８      コンバージョンフラスコ
９ａ〜９ｉ，１２ａ〜１２ｇ，１３〜１３ｇ，１６，１９      電磁弁
１０      高速液体クロマトグラフ（アミノ酸分析部）
１１      第１試薬供給流路
１４，１８      反応槽の出口側の流路
２０      第２試薬供給流路
２２      導入流路
２４      ６方バルブ
２６      サンプル滞留流路
２６ａ      サンプルループ
２７      移動相供給流路
２８      分析流路
３０      送液ポンプ
３２      分析カラム
３４      検出器
３５      演算制御装置
３６，３８      ガラスブロック
４０      ＰＴＦＥ膜
４２      反応空間
４２ａ，４２ｂ      凹部
４４      入口流路
４６      出口流路
４８      試料支持体
【図１】
0003185408.tif 000003
【図２】
0003185408.tif 000004
【図３】
0003185408.tif 000005
【図４】
0003185408.tif 000006
【図５】
0003185408.tif 000007
【図６】
0003185408.tif 000008