(57)【要約】  本開示は、抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体、例えば抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体ＳＴＥＬＡＲＡ（登録商標）（ウステキヌマブ）、抗体の特定の医薬組成物、及びその抗原結合フラグメントを産生するための製造方法におけるクロマトグラフィカラムの操作方法に関する。この方法は、カラム充填を含むクロマトグラフィカラムの操作中に、カラム出口信号及び累積流量パラメータを、少なくとも１つの移動相遷移フロントの２つ以上の間隔で収集することを含む。モデルガンマ累積分布曲線は、少なくとも１つの移動相遷移フロントについての収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータに基づいて決定される。モデルガンマ累積分布曲線のパラメータを使用して、少なくとも１つの移動相遷移フロントについての理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値を計算し、計算されたＨＥＴＰ値に基づいてクロマトグラフィカラム充填の品質を評価する。ルーチンのカラムモニタリング中に、ＨＥＴＰの有害な傾向が観察されるか、又は管理限界を超えた場合、溶出液の製品品質、カラムプロセス性能、及び／又は不純物除去データを評価して、特定されたバッチの製品品質を確保する必要がある。製品品質又はカラム性能のいずれかが設定された基準に適合しない場合は、カラムのコンディショニング、再充填又は交換などの適切な是正処置を行い、更なる使用のためにリリースする前に品質評価を行う必要がある。
2021522204.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体、前記抗体の特異的医薬組成物、及びその抗原結合フラグメントを産生するための製造方法におけるクロマトグラフィカラムの操作方法であって、前記抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体が、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）、（ｉｉ）配列番号７の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号８の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列、並びに（ｉｉｉ）配列番号１、配列番号２、及び配列番号３の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、並びに配列番号４、配列番号５、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記操作方法が、
カラム充填を含む前記クロマトグラフィカラムの第１の操作中に、カラム出口信号及び累積流量パラメータを、少なくとも１つの移動相遷移フロントの２つ以上の間隔で収集する工程と、
前記少なくとも１つの移動相遷移フロントについての前記収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータに基づいて、上昇遷移フロントについては式Ｉａ又は下降遷移フロントについては式Ｉｂを使用して、モデルガンマ累積分布曲線を決定する工程であって、式Ｉａ又は式Ｉｂは、
【数１】
2021522204.tif 000028
であり、各式中、Ｃは所与のＶのカラム出口信号であり、Ｖはカラム体積で除算された累積流量であり、ｋ、θ、及びＶｉは曲線を画定するために使用される形状、スケール、及びオフセットのパラメータである、モデルガンマ累積分布曲線を決定する工程と、
式ＩＩ及びモデルガンマ累積分布曲線のパラメータｋ、θ、及びＶｉを使用して、前記少なくとも１つの移動相遷移フロントについての理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値を計算する工程であって、式ＩＩは、
【数２】
2021522204.tif 000029
式中、
【数３】
2021522204.tif 000030
である、理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値を計算する工程と、
前記計算されたＨＥＴＰ値に基づいて、前記クロマトグラフィカラム充填の品質を評価する工程とを含む、方法。
【請求項２】
前記評価に基づいて、前記クロマトグラフィカラムのコンディショニング、交換、又は再充填を行うことを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記クロマトグラフィカラム充填について前記１つ又は複数の後続の使用中に、対応する移動相遷移フロントについて、２つ以上の間隔で、カラム出口信号及び累積流量パラメータを収集する工程と、
前記クロマトグラフィカラム充填について１つ又は複数の後続の各使用中に、前記収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータを使用して、前記決定及び前記計算を実行する工程と、
前記実行に基づいて、前記１つ又は複数の後続の各使用中に、前記クロマトグラフィカラム充填のＨＥＴＰ値を決定する工程と、
２つ以上の後続の使用の前記クロマトグラフィカラム充填の前記決定されたＨＥＴＰ値の傾向を収集する工程と、
前記収集された傾向に基づいて、前記クロマトグラフィカラム充填の品質の変化を特定する工程と、を更に含み、前記クロマトグラフィカラムのコンディショニング、交換又は再充填は、前記特定に基づくものとなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記カラム充填の前記１つ又は複数の後続の使用における前記クロマトグラフィカラム充填の前記ＨＥＴＰ値の増加が、前記カラム充填の１つ又は複数の以前の使用における前記クロマトグラフィカラム充填の前記ＨＥＴＰ値と比較して、前記クロマトグラフィカラム充填の品質の低下を特定する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記カラム充填の前記第１の操作中に、２つ以上の異なる移動相遷移フロントのカラム出口信号及び累積流量パラメータを収集し、前記方法が、
前記２つ以上の異なる移動相遷移フロントのそれぞれについて収集された前記カラム出口信号及び累積流量パラメータを使用して、前記決定及び計算を実行する工程であって、前記２つ以上の異なる移動相遷移フロントのそれぞれについてＨＥＴＰ値を独立して計算する、前記決定及び計算を実行する工程と、
２つ以上の計算されたＨＥＴＰ値に基づいて、前記クロマトグラフィカラム充填の品質を評価する工程とを更に含み、それにより、前記クロマトグラフィカラムの前記コンディショニング、交換又は再充填が、前記評価に基づくものとなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記クロマトグラフィカラムが、プロテインＡ親和性クロマトグラフィカラム、陽イオン交換クロマトグラフィカラム、及び陰イオン交換クロマトグラフィカラムからなる群から選択される、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
前記プロテインＡ親和性クロマトグラフィカラムが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡ親和性クロマトグラフィカラムを含み、前記陽イオン交換クロマトグラフィカラムが、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓ（商標）陽イオン交換クロマトグラフィカラム又はＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ陽イオン交換クロマトグラフィカラムを含み、前記陰イオン交換クロマトグラフィカラムが、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ陰イオン交換クロマトグラフィカラムを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記プロテインＡ親和性クロマトグラフィカラムの前記移動相遷移フロントが、抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体の精製中に生成される洗浄フロント、抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体の溶出中に生成されるフロント、グアニジンＨＣｌでのカラムの消毒中に生成されるフロント、消毒後の０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５でのリンス中に生成されるフロントからなる群から選択される１つ又は複数のフロントから生成される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記陽イオン交換クロマトグラフィカラム内の前記移動相遷移フロントが、抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体を含む溶媒／洗剤（Ｓ／Ｄ）処理物質の充填中に生成されるフロント、抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体の溶出中に生成されるフロント、及びカラムストリップ中に生成されるフロントからなる群から選択される１つ又は複数のフロントから生成される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記陰イオン交換クロマトグラフィカラムの前記移動相遷移フロントが、水酸化ナトリウムでのカラムの洗浄中に生成されるフロント及びカラムストリップ中に生成されるフロントからなる群から選択される１つ又は複数のフロントから生成される、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１８年４月２０日に出願された米国特許仮出願第６２／６６０，３４０号に対する優先権を主張するものであり、特許仮出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体、例えば抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体ＳＴＥＬＡＲＡ（登録商標）（ウステキヌマブ）、抗体の特定の医薬組成物、及びその抗原結合フラグメントを産生するための製造方法におけるクロマトグラフィカラムの品質評価方法に関する。
【０００３】
（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、２０１９年４月１７日付で作成された「ＪＢＩ６０８２ＵＳＮＰ１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」というファイル名のＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出され、１４ｋｂのサイズを有する配列表を含む。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
カラムクロマトグラフィは、治療用タンパク質を産生するための精製プロセスにおいて使用される重要な技術である。カラムの性能は、プロセスがベンチトップから製造プラントまでスケールアップされるまで、及びカラム寿命にわたって維持されなければならない。プロセスをスケールアップするために、カラム径、装置、及びバッファ消費量が増加すると、カラム評価手順の困難さ、充填されたベッドの完全性に対する潜在的な変化、及びロジスティックスが発生する可能性がある。
【０００５】
クロマトグラフィカラムの品質評価のための現在の方法は、ピークの最大値から平均値を推定し、半分の高さにおけるピークの幅からの標準偏差を推定することによって、パルス注入後の分散の測定値である理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）を計算する。この方法の主な制限は、ピーク形状がガウス分布から逸脱している場合、分散（すなわち、ＨＥＴＰ）の正確な測定値を提供しないことである。感度の不足を補うために、第２の測定値である非対称性を利用して、ピーク歪度を評価する。この測定値は、最大ピーク高さの１０％でのリーディングピーク幅とテーリングピーク幅とを比較している。この手法の限界は、カラム性能の変化に対する感度の欠如をもたらし、カラム性能は実際には許容可能であるが、カラムの再充填又はコンディショニングをもたらすことが多い。カラムの品質評価のための他の方策が報告されている。これらの方策としては、プロセス遷移をモデル化するためにガウス分布又は非ガウス分布を使用することが含まれる（例えば、Ｌａｒｓｏｎら、「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄａｔａ  ｔｏ  Ａｓｓｅｓｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ−Ｓｃａｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１９：４８５−４９２（２００３年）及びＢｅｌｏｕｓｏｖらの米国特許第９，０４７，４３８号及びＧａｎｇｕｌｙの米国特許第８，４１０，９２８号を参照）。ガウス法は、注入方法に関して上述したように感度に同じ制限を有し、報告された非ガウス法は複雑な計算を必要とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
繰り返し操作中のクロマトグラフィカラム性能の変化を監視し、カラムがその寿命にわたって実行する有効性を評価するために、より感度が高く、より合理的に定義された限界を有する改善された品質評価手順が必要とされる。本発明は、技術分野におけるこの欠点を克服することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
簡単にするために、参照により本明細書に組み込まれる、本明細書に添付の独立及び従属請求項によって、本発明の実施形態がそれぞれ定義される。本発明の様々な態様の他の実施形態、特徴、及び長所は、添付の図面に関連付けられる以下の発明を実施するための形態から明らかになる。
【０００８】
特定の実施形態では、本発明は、抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体、抗体の特定の医薬組成物、及びその抗原結合フラグメントを産生するための製造方法におけるクロマトグラフィカラムの操作方法を提供し、抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体が、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）、（ｉｉ）配列番号７の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号８の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列、並びに（ｉｉｉ）配列番号１、配列番号２、及び配列番号３の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、並びに配列番号４、配列番号５、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。この方法は、カラム充填を含むクロマトグラフィカラムの第１の操作中に、カラム出口信号及び累積流量パラメータを、少なくとも１つの移動相遷移フロントの２つ以上の間隔で収集することを含む。この方法は、少なくとも１つの移動相遷移フロントについての収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータに基づいて、上昇遷移フロントについては式Ｉａ又は下降遷移フロントについては式Ｉｂを使用して、モデルガンマ累積分布曲線を決定することを更に含み、式Ｉａ又は式Ｉｂは、
【０００９】
【数１】
2021522204.tif 000003
であり、各式中、Ｃは所与のＶのカラム出口信号であり、Ｖはカラム体積で除算された累積流量であり、ｋ、θ、及びＶｉは曲線を画定するために使用される形状、スケール、及びオフセットのパラメータである。理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値は、式ＩＩ及びモデルガンマ累積分布曲線のパラメータｋ、θ、及びＶｉを使用して、少なくとも１つの移動相遷移フロントについて計算され、
【００１０】
【数２】
2021522204.tif 000004
【００１１】
クロマトグラフィカラム充填の品質は、計算されたＨＥＴＰ値に基づいて評価される。この評価に基づいて、クロマトグラフィカラムは再利用、コンディショニング、交換、又は再充填される。
【００１２】
本明細書でガンマ分布遷移分析（ＧＤＴＡ）と称される、カラム完全性を評価するための新たな方法が開発された。新しい方法は、カラム操作の規則的なプロセス工程の間に生成される移動相遷移フロントデータを介して曲線に適合するための数学的モデルを使用する。次いで、モデル曲線パラメータを利用して、カラム品質の尺度としてカラムベッド全体の分散を計算する。移動相遷移フロントは、導電率、ｐＨ、及び／又はバッファ成分などの異なる特性を有するプロセスバッファ／洗浄液が使用されるクロマトグラフィ精製プロセス内の別個の工程から生じる。方法は、一般に、通常のカラム処理中に生成される任意の１つ又は複数の移動相遷移フロントに適用することができる。
【００１３】
ＧＤＴＡ法の主要な利点は、ガウスＨＥＴＰ推定法よりもカラムベッド全体の分散をより敏感に測定できることである。ＧＤＴＡを使用することにより、ＧＤＴＡモデルが曲線適合からの分散を正確に測定するため、非対称性を測定する必要はない。加えて、ガンマ分布関数を使用することで、以前に報告された代替の非ガウス法と比較して、フロント遷移の解析が容易になる。クロマトグラフィプロセス中に既に存在する移動相遷移を使用することで、余分なオフラインプロセス工程の必要性を回避する。更に、多くの場合、過去のデータにより、実施前にカラム効率の過去の範囲を確立することができる。最後に、ＧＤＴＡ法を自動化して、一貫した適用を確実にすることができる。
【００１４】
特定の実施形態では、本発明は、抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体、抗体の特定の医薬組成物、及びその抗原結合フラグメントを産生するための製造方法におけるクロマトグラフィカラムの操作方法を提供し、抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体が、（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）、（ｉｉ）配列番号７の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号８の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列、並びに（ｉｉｉ）配列番号１、配列番号２、及び配列番号３の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、並びに配列番号４、配列番号５、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該操作方法が、
カラム充填を含むクロマトグラフィカラムの第１の操作中に、カラム出口信号及び累積流量パラメータを、少なくとも１つの移動相遷移フロントの２つ以上の間隔で収集する工程と、
少なくとも１つの移動相遷移フロントについての収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータに基づいて、上昇遷移フロントについては式Ｉａ又は下降遷移フロントについては式Ｉｂを使用して、モデルガンマ累積分布曲線を決定する工程であって、式Ｉａ又は式Ｉｂは、
【００１５】
【数３】
2021522204.tif 000005
であり、各式中、Ｃは所与のＶのカラム出口信号であり、Ｖはカラム体積で除算された累積流量であり、ｋ、θ、及びＶｉは曲線を画定するために使用される形状、スケール、及びオフセットのパラメータであり、
式ＩＩ及びモデルガンマ累積分布曲線のパラメータｋ、θ、及びＶｉを使用して、少なくとも１つの移動相遷移フロントについての理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値を計算する工程であって、式ＩＩは、
【００１６】
【数４】
2021522204.tif 000006
当該計算されたＨＥＴＰ値に基づいて、クロマトグラフィカラム充填の品質を評価する工程とを含む、方法。
【００１７】
特定の実施形態では、本発明は、以下の工程を更に含む方法を提供する：
当該評価に基づいてクロマトグラフィカラムをコンディショニング、交換、又は再充填する工程。
【００１８】
特定の実施形態では、本発明は、以下の工程を更に含む方法を提供する：
クロマトグラフィカラム充填について１つ又は複数の後続の使用中に、対応する移動相遷移フロントについて２つ以上の間隔でカラム出口信号及び累積流量パラメータを収集する工程と、
クロマトグラフィカラム充填について１つ又は複数の後続の各使用中に、収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータを使用して、当該決定及び当該計算を実行する工程と、
当該実行に基づいて、当該１つ又は複数の後続の各使用中に、クロマトグラフィカラム充填のＨＥＴＰ値を決定する工程と、
２つ以上の後続の使用のクロマトグラフィカラム充填の決定されたＨＥＴＰ値の傾向を収集する工程と、及び
当該収集された傾向に基づいて、当該クロマトグラフィカラム充填の品質の変化を特定する工程であって、当該クロマトグラフィカラムのコンディショニング、交換又は再充填は、当該特定に基づく。
【００１９】
特定の実施形態では、本発明は、当該カラム充填の１つ又は複数の後続の使用におけるクロマトグラフィカラム充填のＨＥＴＰ値の増加が、当該カラム充填の１つ又は複数の以前の使用におけるクロマトグラフィカラム充填のＨＥＴＰ値と比較して、クロマトグラフィカラム充填の品質の低下を特定する方法を提供する。
【００２０】
特定の実施形態では、本発明は、カラム充填の当該第１の操作中に、２つ以上の異なる移動相遷移フロントのカラム出口信号及び累積流量パラメータを収集する方法を提供し、当該方法は、以下の工程を含む：
２つ以上の異なる移動相遷移フロントのそれぞれについて収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータを使用して、当該決定及び計算を実行し、２つ以上の異なる移動相遷移フロントのそれぞれについてＨＥＴＰ値を独立して計算する工程と、
２つ以上の計算されたＨＥＴＰ値に基づいて、クロマトグラフィカラム充填の品質を評価し、それにより、クロマトグラフィカラムの当該コンディショニング、交換又は再充填が、当該評価に基づくものとなる。
【００２１】
特定の実施形態では、本発明は、クロマトグラフィカラムが、プロテインＡ親和性クロマトグラフィカラム、陽イオン交換クロマトグラフィカラム、及び陰イオン交換クロマトグラフィカラムからなる群から選択される方法を提供する。
【００２２】
特定の実施形態では、本発明は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィカラムがＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡ親和性クロマトグラフィカラムを含み、陽イオン交換クロマトグラフィカラムがＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓ（商標）陽イオン交換クロマトグラフィカラム又はＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ陽イオン交換クロマトグラフィカラムを含み、陰イオン交換クロマトグラフィカラムがＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ陰イオン交換クロマトグラフィカラムを含む方法を提供する。
【００２３】
特定の実施形態では、本発明は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィカラムの移動相遷移フロントが、抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体の精製中に生成される洗浄フロント、抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体の溶出中に生成されるフロント、グアニジンＨＣｌでのカラムの消毒中に生成されるフロント、消毒後の０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５でのリンス中に生成されるフロントからなる群から選択される１つ又は複数のフロントから生成される方法を提供する。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明は、陽イオン交換クロマトグラフィカラムの移動相遷移フロントが、抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体を含む溶媒／洗剤（Ｓ／Ｄ）処理物質の充填中に生成されるフロント、抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体の溶出中に生成されるフロント、及びカラムストリップ中に生成されるフロントからなる群から選択される１つ又は複数のフロントから生成される方法を提供する。
【００２５】
特定の実施形態では、本発明は、陰イオン交換クロマトグラフィカラムの移動相遷移フロントが、水酸化ナトリウムでのカラムの洗浄中に生成されるフロント及びカラムストリップ中に生成されるフロントからなる群から選択される１つ又は複数のフロントから生成される方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】例示的なガンマ分布遷移分析曲線適合のグラフを示す。図１Ａは、移動相遷移データへの例示的なガンマ分布遷移分析曲線適合を示すグラフである。図１Ｂは、カラム効率の尺度としての理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）を計算するために使用される、その曲線からのパラメータを有する、移動相転移データへの例示的なガンマ分布遷移分析曲線適合を示すグラフである。
【図１Ｂ】例示的なガンマ分布遷移分析曲線適合のグラフを示す。図１Ａは、移動相遷移データへの例示的なガンマ分布遷移分析曲線適合を示すグラフである。図１Ｂは、カラム効率の尺度としての理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）を計算するために使用される、その曲線からのパラメータを有する、移動相転移データへの例示的なガンマ分布遷移分析曲線適合を示すグラフである。
【図２】本明細書に記載されるクロマトグラフィカラムの品質評価システムを示す図である。
【図３】プロテインＡカラム平衡化フロントの変換なしのＨＥＴＰの確率プロットである。
【図４】プロテインＡカラム平衡化フロントの変換なしの平方和（ＳＳ）の確率プロットである。
【図５】プロテインＡカラム洗浄フロントの変換なしのＨＥＴＰの確率プロットである。
【図６】プロテインＡカラム洗浄フロントの変換なしのＳＳの確率プロットである。
【図７】プロテインＡカラム平衡化フロントの自然対数（λ＝０）変換を伴うＨＥＴＰの確率プロットである。
【図８】プロテインＡカラム平衡化フロントの自然対数（λ＝０）変換を伴うＳＳの確率プロットである。
【図９】プロテインＡカラム洗浄フロントの自然対数（λ＝０）変換を伴うＨＥＴＰの確率プロットである。
【図１０】プロテインＡカラム洗浄フロントの自然対数（λ＝０）変換を伴うＳＳの確率プロットである。
【図１１】プロテインＡカラム平衡化の平均値（Ｖｍ）の確率プロットである。
【図１２】プロテインＡカラム洗浄フロントの平均値（Ｖｍ）の確率プロットである。
【図１３】プロテインＡカラム平衡化のフロントの自然対数（λ＝０）変換を伴うＨＥＴＰの管理図である。ＵＣＬ＝上方管理限界；ＬＣＬ＝下方管理限界である。チャート上の番号付けされた点は、シューハートルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果において明らかな孤立値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。
【図１４】プロテインＡカラム平衡化フロントのＨＥＴＰの時系列プロットである。ＵＣＬは、図１３の変換データから導出される。
【図１５】プロテインＡカラム洗浄フロントの自然対数（λ＝０）変換を伴うＳＳの管理図である。チャート上の番号付けされた点は、シューハートルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果において明らかな孤立値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。
【図１６】プロテインＡカラム平衡化フロントのＳＳの時系列プロットである。ＵＣＬは、図１５の変換データから導出される。
【図１７】プロテインＡカラム平衡化の平均値（Ｖｍ）の管理図である。チャート上の番号付けされた点は、シューハートルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果において明らかな孤立値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。
【図１８】プロテインＡカラム洗浄フロントの自然対数（λ＝０）変換を伴うＨＥＴＰの管理図である。チャート上の番号付けされた点は、シューハートルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果において明らかな孤立値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。
【図１９】プロテインＡカラム洗浄フロントのＨＥＴＰの時系列プロットである。ＵＣＬは、図１８の変換データから導出される。
【図２０】プロテインＡカラム洗浄フロントの自然対数（λ＝０）変換を伴うＳＳの管理図である。チャート上の番号付けされた点は、シューハートルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果において明らかな孤立値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。
【図２１】プロテインＡカラム洗浄フロントのＳＳの時系列プロットである。ＵＣＬは、図２０の変換データから導出される。
【図２２】プロテインＡカラム洗浄フロントの平均値（Ｖｍ）の管理図である。グラフ上の番号付けされた点は、シューハートルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果において明らかな孤立値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。
【図２３】カラム充填によってグループ化された直接生成物捕獲（ＤＰＣ）プロテインＡカラム平衡化フロントのＨＥＴＰ結果の時系列プロットである。
【図２４】カラム充填によってグループ化されたＤＰＣプロテインＡカラム洗浄フロントのＨＥＴＰ結果の時系列プロットである。
【図２５】スキッドによってグループ化されたＤＰＣプロテインＡカラム平衡化フロントのＨＥＴＰ結果の時系列プロットである。
【図２６】スキッドによってグループ化されたＤＰＣプロテインＡカラム洗浄フロントのＨＥＴＰ結果の時系列プロットである。
【図２７】ＤＰＣプロテインＡカラム平衡化の平均流量を示すチャートである。チャート上の番号付けされた点は、シューハートルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果において明らかな孤立値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。
【図２８】平衡化中の平均プレカラム圧力のチャートである。チャート上の番号付けされた点は、シューハートルール則１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果において明らかな孤立値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。
【図２９】ＤＰＣプロテインＡカラム洗浄フロントの平均洗浄流量のチャートである。チャート上の番号付けされた点は、シューハートルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果において明らかな孤立値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。
【図３０】ＤＰＣプロテインＡカラム洗浄フロントの平均洗浄圧力のチャートである。チャート上の番号付けされた点は、シューハートルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果において明らかな孤立値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。
【図３１】洗浄流量を変更する前及び後のＨＥＴＰを示すチャートである。チャート上の番号付けされた点は、シューハートルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果において明らかな孤立値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。
【図３２】４５バッチのＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）（インフリキシマブ）の平衡化フロントで評価した２つの異なるプロテインＡカラム充填のＨＥＴＰの時系列プロットである。
【図３３】ＳＰ−セファロース高性能（ＳＰＨＰ）カラム平衡化フロントのＨＥＴＰの時系列プロットである。管理限界は、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換データから導出される。
【図３４】ＳＰＨＰカラムＷＦＩフラッシュフロントのＨＥＴＰの時系列プロットである。管理限界は、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換データから導出される。
【図３５】ＳＰＨＰカラムストレージフロントのＨＥＴＰの時系列プロットである。管理限界は、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換データから導出される。
【図３６】Ｑ２カラム平衡化フロントのＨＥＴＰの時系列プロットである。管理限界は、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換データから導出される。
【図３７】Ｑ２カラムストリップ平衡化フロントのＨＥＴＰの時系列プロットである。管理限界は、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換データから導出される。
【図３８】Ｑ２カラムストレージフロントのＨＥＴＰの時系列プロットである。管理限界は、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換データから導出される。
【図３９】ウステキヌマブ製造プロセスの１０段階の概要を示す。
【図４０】ＳＴＥＬＡＲＡ（登録商標）（ウステキヌマブ）の精製中に生成される洗浄２フロントの段階３のＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡ親和性クロマトグラフィカラムのＨＥＴＰ結果を示すチャートである。
【図４１】ＳＴＥＬＡＲＡ（登録商標）（ウステキヌマブ）の溶出中に生成されるフロントの段階３のＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡ親和性クロマトグラフィカラムのＨＥＴＰ結果を示すチャートである。
【図４２】ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の溶出中に生成されるフロントの段階３のＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡ親和性クロマトグラフィカラムのＨＥＴＰ結果を示すチャートである。ＤＰＣは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡカラム上のＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の直接生成物捕獲を指す。
【図４３】グアニジンＨＣｌでの消毒中に生成されるフロントの段階３のＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡ親和性クロマトグラフィカラムのＨＥＴＰ結果を示すチャートである。ＤＰＣは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡカラム上のＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の直接生成物捕獲を指す。
【図４４】消毒後の０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５でのリンス中に生成されるフロントの段階３のＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡ親和性クロマトグラフィカラムのＨＥＴＰ結果を示すチャートである。ＤＰＣは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡカラム上のＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の直接生成物捕獲を指す。
【図４５】ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）を含む溶媒／洗剤（Ｓ／Ｄ）処理物質の充填中に生成される段階６のＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓ（商標）陽イオン交換クロマトグラフィカラムフロントのＨＥＴＰ結果を示すチャートである。ＰＳ１は、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓ（商標）カラム上のＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の研磨工程１を指す。
【図４６】ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の溶出中に生成される段階６のＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓ（商標）陽イオン交換クロマトグラフィカラムフロントのＨＥＴＰ結果を示すチャートである。ＰＳ１は、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓ（商標）カラム上のＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の研磨工程１を指す。
【図４７】カラムストリップの間に生成される段階６のＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓ（商標）陽イオン交換クロマトグラフィカラムフロントのＨＥＴＰ結果を示すチャートである。ＰＳ１は、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓ（商標）カラム上のＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の研磨工程１を指す。
【図４８】水酸化ナトリウムでの洗浄の間に生成される段階７のＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ陰イオン交換クロマトグラフィカラムフロントのＨＥＴＰ結果を示すチャートである。ＰＳ２は、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬカラム上のＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の研磨工程２を指す。
【図４９】カラムストリップ中に生成される段階７のＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ陰イオン交換クロマトグラフィカラムフロントのＨＥＴＰ結果を示すチャートである。ＰＳ２は、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬカラム上のＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の研磨工程２を指す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本開示は、抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体、例えば抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体ＳＴＥＬＡＲＡ（登録商標）（ウステキヌマブ）、及び抗体の特定の医薬組成物を産生するための製造方法における、クロマトグラフィカラムの繰り返し操作中の充填されたクロマトグラフィカラムベッドの変化をモニタリングするための改良された品質評価手順に関する。この方法は、スケールとは無関係に、カラムの寿命を通してカラムが性能を発揮する有効性を評価する実用的な手段を提供する。
【００２８】
クロマトグラフィカラム分離効率は、クロマトグラフィの理論プレートモデルを使用して特徴付けられることが多い。この手法を使用して、クロマトグラフィカラムは、多数の段階又は理論プレートからなるものとして認識される。各プレートは、試料成分が移動相と固定相との間の平衡を達成する距離である（Ｖａｎ  Ｄｅｅｍｔｅｒ、Ｚｕｉｄｅｒｗｅｇ及びＫｌｉｎｋｅｎｂｅｒｇ、「Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｍａｓｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｓ  Ｃａｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｎｏｎｉｄｅａｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」、Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇｎｇ．Ｓｃｉ．、５：２７１〜２８９（１９５６年）を参照し、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）。カラム効率は、カラム内の理論プレート数Ｎｐで測定され、カラム内のプレート数が多いほど平衡化が進み、クロマトグラフィバンドの分散が少なくなり、ピークが狭くなり、分離の質が向上することを意味する。所与のカラムのプレートの数が多いほど、プレートの高さは低くなる。したがって、カラム効率は、プレートの高さを計算することによっても測定することができ、これは、「理論段相当高さ」又はＨＥＴＰと呼ばれる。この手法を使用して、ＨＥＴＰ値が小さいほど、カラム分離の効率が高くなる。
【００２９】
ＨＥＴＰは、クロマトグラフィカラムの長さＬを、理論的なプレートの数Ｎｐで割ることによって計算される。
ＨＥＴＰ＝Ｌ／Ｎｐ
【００３０】
カラムが保有する理論プレートの数は、過去にはパルス注入後のクロマトグラフのピークを以下の式で調査することによって決定されてきた：
【００３１】
【数５】
2021522204.tif 000007
式中、ｔＲは保持時間であり、ｗ１／２は半分の高さにおけるピーク幅である。しかし、この手法は、Ｎｐを計算するために使用されるピーク形状がガウス分布から逸脱している場合、カラム効率の正確な測定値を提供しない。この感度の不足を補うために、第２の測定値である非対称性を利用して、ピーク歪度を評価する。この測定値は、最大ピーク高さの１０％でのリーディングピーク幅とテーリングピーク幅とを比較している。上述のように、このモデルは、カラム性能の変化を検出する感度を欠いている。
【００３２】
本明細書に記載される方法は、ルーチンのクロマトグラフィカラム操作中に生じる１つ又は複数の移動相遷移フロント上のガンマ分布に基づく、代替的でより正確なＨＥＴＰの測定を提供する。したがって、本開示は、クロマトグラフィカラムの操作方法を目的とする。この方法は、カラム充填を含むクロマトグラフィカラムの第１の操作中に、カラム出口信号及び累積流量パラメータを、少なくとも１つの移動相遷移フロントの２つ以上の間隔で収集することを含む。この方法は、少なくとも１つの移動相遷移フロントについての収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータに基づいて、上昇遷移フロントについては式Ｉａ又は下降遷移フロントについては式Ｉｂを使用して、モデルガンマ累積分布曲線を決定することを更に含む。
【００３３】
【数６】
2021522204.tif 000008
【００３４】
式Ｉａ及び式Ｉｂを参照すると、Ｃは所与のＶのカラム出口信号であり、Ｖはカラム体積で除算された累積流量であり、ｋ、θ、及びＶｉは曲線を画定するために使用される形状、スケール、及びオフセットのパラメータである。理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値は、式ＩＩ及びモデルガンマ累積分布曲線のパラメータｋ、θ、及びＶｉを使用して、少なくとも１つの移動相遷移フロントについて計算され、
【００３５】
【数７】
2021522204.tif 000009
【００３６】
クロマトグラフィカラム充填の品質は、計算されたＨＥＴＰ値に基づいて評価される。カラム品質の評価に基づいて、クロマトグラフィカラムは、後続の使用が許容可能であると判定されるか、そうでなければ、コンディショニング、交換、又は再充填されなければならない。
【００３７】
本明細書に開示されるカラムの品質評価の方法は、任意のクロマトグラフィカラムに適用することができる。例示的なクロマトグラフィカラムとしては、液体クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、分子排除、超臨界流体クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、二次元クロマトグラフィ、高速タンパク質（ＦＰＬＣ）クロマトグラフィ、向流クロマトグラフィ、キラルクロマトグラフィ、水性順相（ＡＮＰ）、混合モードクロマトグラフィ、及び偽親和性クロマトグラフィに使用されるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例示的なカラム充填剤は、親和性クロマトグラフィ充填剤（例えば、プロテインＡ又はプロテインＧ親和性クロマトグラフィ充填剤）、イオン交換クロマトグラフィ充填剤（例えば、陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）、及び混合モード交換クロマトグラフィ充填剤）、吸着クロマトグラフィ充填剤（例えば、シリカゲル又はアルミナ充填剤）、疎水性相互作用クロマトグラフィ充填剤（例えば、フェニル−セファロース、アザ−アレノフィリン樹脂、又はｍ−アミノフェニルボロン酸充填剤）、金属キレート親和性クロマトグラフィ充填剤（例えば、Ｎｉ（ＩＩ）−及びＣｕ（ＩＩ）−親和性クロマトグラフィ充填剤）、サイズ排除クロマトグラフィ充填剤（例えば、ゲル電気泳動又はキャピラリ電気泳動充填剤）、又は分子排除クロマトグラフィ充填剤（例えば、ポリスチレン）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
本明細書に記載される方法は、ルーチンのクロマトグラフィカラム操作中、例えば、試料中の化学物質又は生物学的物質の単離、精製、又は特定の間に適用することができる。このような化合物としては、例えば、タンパク質（例えば、抗体及びそのフラグメント）、核酸、炭水化物、脂質、有機低分子、無機低分子、ウイルス、リポソーム、及び任意のそのような化合物のハイブリッド又は変異型を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３９】
試験のためにカラムをオフラインにする必要がある、以前のクロマトグラフィカラムの品質評価方法、例えば、パルス注入法とは対照的に、本明細書に記載される法は、ルーチンのカラム操作中に実施される。本方法は、ルーチンのカラム精製プロセス中に生じる、プロセスバッファ及び異なる特性を有する溶液を含む移動相プロセス遷移の利点を有する。
【００４０】
本発明の方法によれば、「移動相」とは、カラムクロマトグラフィにおける液相であって、クロマトグラフィカラム充填の固定クロマトグラフィ材料を取り囲み、移動するものである。クロマトグラフィカラム操作中、移動相の組成及び特性は、各プロセス工程、例えば、平衡化、洗浄などで変化することが多い。移動相の特性の変化は、溶出液、すなわち、固定相を通過した後にカラムから溶出する移動相で検出及び測定することができる。本明細書で使用するとき、「カラム出口信号」は、溶出液がカラムから溶出する際に検出される移動相からの溶出液の物理的又は化学的特性の信号である。カラム出口信号を提供する物理的又は化学的特性は、任意の典型的なクロマトグラフィ検出器を使用して測定することができる、ｐＨ、導電率、光吸収、蛍光、電荷、塩濃度、偏光測定、屈折率、電気化学反応、質量電荷比などの任意の特性であり得る。カラム出口信号を測定するのに好適なクロマトグラフィ検出器としては、質量分析計、赤外分光計、可視分光計、紫外分光計、フーリエ変換赤外分光計、炎イオン化検出器、低角度レーザ光散乱検出器、ダイオードアレイ検出器、蛍光分光計、ｐＨ検出器、導電率検出器、電気化学検出器、及び屈折率検出器などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
カラム出口信号は、溶出液から収集される。更に、カラム出口信号を収集するために、「累積流量」も収集される。「累積流量」は、カラムから経時的に溶出される流体の総体積である。この値をカラム体積で割った値を、カラム体積単位で表す。
【００４２】
遷移フロントは、累積流量に対するカラム出口信号の変化によって生成される。遷移フロントは、１つ又は複数の異なる特性（例えば、導電率、ｐＨなど）を有する異なる移動相の、カラムへの連続的な適用から生じる。本明細書に記載される方法によれば、遷移フロントに対するカラム出口信号は、最大値１及び最小値０を有するように正規化され得る。本明細書で言及されるように、「下降遷移フロント」とは、開始移動相が、順次導入された移動相のカラム出口信号よりも高いカラム出口信号、例えば、導電率を有する移動相遷移のことである。
【００４３】
本明細書で使用されるように、「上昇遷移フロント」とは、開始移動相が、順次導入される移動相のカラム出口信号よりも低いカラム出口信号、例えば、導電率を有する移動相遷移のことである。
【００４４】
遷移フロントは、カラム操作の過程で認定されるカラム充填を含むクロマトグラフィカラムに第１の移動相を添加することによって作成される。第１の移動相の添加の一部の時点で、例えば、第１の移動相が溶出を開始すると、第１の移動相とは異なる検出可能なカラム出口信号を有する第２の移動相が、カラム充填を含むクロマトグラフィカラムに添加される。第１の移動相と第２の移動相との間で遷移する際に、移動相の２つ以上の間隔でカラム出口信号及び累積流量パラメータを収集することにより、遷移フロントを検出する。
【００４５】
一実施形態では、第１及び第２の移動相のカラム出口信号は、信号ノイズを超える量で信号が異なる。一実施形態では、第１の移動相と第２の移動相との間のカラム出口信号の差は、バックグラウンド信号ノイズの５％以上である。別の実施形態では、第１の移動相と第２の移動相との間のカラム出口信号の差は、バックグラウンド信号ノイズの少なくとも１０％以上である。別の実施形態では、別の実施形態では、第１の移動相と第２の移動相との間のカラム出口信号の差は、バックグラウンド信号ノイズの少なくとも１５％以上である。
【００４６】
一実施形態では、遷移フロント上で検出されるカラム出口信号は導電率である。この実施形態では、第１の移動相と第２の移動相との間のカラム出口信号は、好ましくは、少なくとも１μＳ／ｃｍ、少なくとも１０μＳ／ｃｍ、少なくとも１００μＳ／ｃｍ、少なくとも１ｍＳ／ｃｍ、又は１ｍＳ／ｃｍ超異なる。
【００４７】
別の実施形態では、遷移フロント上で検出されるカラム出口信号は、ｐＨである。この実施形態では、第１の移動相と第２の移動相との間のカラム出口信号は、好ましくは、少なくとも０．０５のｐＨ単位、少なくとも０．１のｐＨ単位、少なくとも１のｐＨ単位、少なくとも２のｐＨ単位、又は２を超えるｐＨ単位で異なる。
【００４８】
別の実施形態では、遷移フロント上で検出されるカラム出口信号は、ＵＶ−Ｖｉｓ吸光度である。この実施形態では、第１の移動相と第２の移動相との間のカラム出口信号は、好ましくは少なくとも０．０１の吸光度単位、少なくとも０．１の吸光度単位、少なくとも０．５の吸光度単位、少なくとも０．８の吸光度単位、又は０．８を超える吸光度単位で異なる。
【００４９】
別の実施形態では、遷移フロント上で検出されるカラム出口信号は、赤外吸光度である。この実施形態では、第１の移動相と第２の移動相との間のカラム出口信号は、好ましくは、少なくとも１パーセントの透過率、少なくとも１０パーセントの透過率、少なくとも２０パーセントの透過率、少なくとも３０パーセントの透過率、又は３０パーセントを超える透過率で異なる。
【００５０】
一実施形態では、移動相遷移フロントは、変性剤を含む移動相から非変性剤を含む移動相への変化によって生成される。別の実施形態では、移動相遷移フロントは、非変性剤を含む移動相から変性剤を含む移動相への変化によって生成される。
【００５１】
別の実施形態では、移動相遷移フロントは、アルカリ性移動相状態から中性又はより酸性の移動相状態への変化によって生成される。あるいは、移動相遷移フロントは、酸性移動相状態から中性又はよりアルカリ性の移動相状態への変化によって生成される。
【００５２】
別の実施形態では、移動相遷移フロントは、有機溶媒を含む移動相から水性移動相への変化によって生成される。あるいは、移動相遷移フロントは、水性移動相から有機溶媒を含む移動相への変化によって生成される。
【００５３】
カラム出口信号及び累積流量パラメータは、移動遷移フロントの過程で様々な間隔で収集される。好ましくは、カラム出口信号及び累積流量パラメータは、最小カラム出口信号から最大カラム出口信号まで、又はその逆に、移動遷移フロントの全体の過程で収集される。一実施形態では、カラム出口信号及び累積流量パラメータは、不規則な間隔で収集され、例えば、カラム出口信号の変化が検出されると収集される。別の実施形態では、カラム出口信号及び累積流量パラメータは、移動遷移フロントの全体の過程で一定の時間間隔で収集される。例えば、一実施形態では、カラム出口信号及び累積流量パラメータは、移動遷移フロントの全体の過程で１秒間隔で収集される。別の実施形態では、カラム出口信号及び累積流量パラメータは、移動遷移フェーズの過程で５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０秒間隔で収集される。
【００５４】
一実施形態では、カラム出口信号データは、分析期間にわたって最大値を１に設定し、最小値を０に設定することによって、上述のように正規化される。流量はまた、カラム体積に変換され、異なるカラム充填間のデータの比較のために標準化される。このデータを使用して、ガンマ累積分布関数（「ＣＤＦ」を使用して、収集されたデータポイントに最も適合する曲線を生成する。ガンマＣＤＦは、３つの値：形状パラメータｋ；スケールパラメータθ（シータ）；及びオフセットのパラメータＶｉにより決定され、以下の式Ｉを使用する：
Ｃ＝ｆ（Ｖ，ｋ，θ，Ｖｉ）式Ｉ
【００５５】
式Ｉを参照すると、Ｃは、所与のＶのカラム出口信号であり、Ｖは、累積流量をカラム体積で除算したものである。式Ｉａは、式Ｉに由来し、上昇遷移フロントに沿ってガンマ分布関数値を決定するために使用される。
【００５６】
【数８】
2021522204.tif 000010
式中、
Γは、第２種不完全ガンマ関数であり、
γは、第１種不完全ガンマ関数である。
【００５７】
あるいは、式Ｉｂはまた、式Ｉに由来し、下降遷移フロントに沿ってガンマ分布関数値を決定するために使用される。
【００５８】
【数９】
2021522204.tif 000011
【００５９】
図１Ａは、カラム遷移フロントにわたって収集された例示的な正規化カラム出口信号及びカラム体積データをプロットするグラフである。式Ｉａを使用して、データに対する曲線適合を生成した。
【００６０】
最良適合ガンマＣＤＦパラメータは、ｋ、θ、及びＶｉの値を操作して、データからの平方和の偏差が最小となるモデル曲線を生成するパラメータを見出すことによって決定される。この曲線は、最適な適合モデルを生成するために、遷移フロント全体からのデータポイントを介して適合される。この曲線からのｋ、θ、及びＶｉパラメータを利用して、カラム効率の指標として、カラム内のプレート数Ｎｐ又はプレートの高さ、すなわち、ＨＥＴＰを計算する。
【００６１】
プレートの数Ｎｐは、モデル曲線の平均μ及び分散σ２に基づいて計算される。平均及び分散は、以下のように曲線から導出される：
平均、μ＝ｋθ＋Ｖｉ
分散、σ２＝ｋθ２
【００６２】
プレートの数は、以下の平均及び分散に基づいて計算される：
プレートの数、Ｎｐ＝μ２／σ２
【００６３】
ＨＥＴＰは、以下のように、センチメートルのカラムの長さＬをプレートの数Ｎｐで割ったものに基づいて、上述のように計算される。
【００６４】
【数１０】
2021522204.tif 000012
【００６５】
図１Ｂは、定義された平均μ及び分散σ２パラメータを有する、図１Ａに示されるものと同じグラフを示す。
【００６６】
本明細書に記載されるように計算されたデータに対するモデル適合を評価するために、平均（Ｖｍ）、平方和（ＳＳ）、及びモードも決定することができる。ＳＳは、導出されるプロセスデータからのモデル曲線の偏差の直接測定である。Ｖｍ値は、カラム体積単位における遷移の中心点の尺度である。バッファ遷移には典型的には１カラム体積が必要なため、この値は１に近い値にする必要がある。平均は、典型的には、フロントの形状によって影響されない。平均値を使用して、誤差の自動計算をチェックする。例えば、値が低い場合は、データ収集エラーを示している可能性があり、結果を確認するために更なる調査を必要とする可能性がある。モードは、変化率が最大である体積に対応する。これは、遷移曲線が対称である場合に平均と等しい。典型的には、遷移に歪みがあり、モードは平均よりも低い。
【００６７】
ＨＥＴＰに加えて、ｋ（形状）パラメータから計算することができる他の要因としては、非対称性に関連する尺度である歪度（γ１）、及びピーク鮮鋭度の尺度である尖度（γ２）が挙げられる。これらの要因を使用して、カラム性能の変化を特定することができる。
【００６８】
【数１１】
2021522204.tif 000013
【００６９】
本明細書に記載される方法によれば、カラム出口信号及び累積流量パラメータは、ガンマＣＤＦからＨＥＴＰを計算するために、カラムプロセスがカラム上で実行されるたびに、同じ移動遷移相について収集される。同じプロセス工程及び同じスケールで使用されるカラムにより生成される過去のデータはまた、ＨＥＴＰを計算するために取得し、利用することができる。ＨＥＴＰデータを収集して、過去又は現在の操作中に対応する遷移のＨＥＴＰ値の傾向を特定し、ＨＥＴＰ値の上限及び下限の管理限界を特定する。管理限界は、許容可能なＨＥＴＰ値の範囲、すなわち、許容可能なカラム効率に対応するＨＥＴＰ値を定義するＨＥＴＰの高値及び低値である。これらの上限及び下限の管理限界は、統計的評価に基づいて設定することができる。例えば、一実施形態では、上限及び下限の管理限界は、平均＋／−２、３、又は４標準偏差を計算することによって設定される。一実施形態では、上限及び下限の管理限界は、本明細書の実施例に記載される平均＋／−３標準偏差を計算することによって設定される。別の実施形態では、上限及び下限の管理限界は、過去のデータから信頼区間を計算することによって設定することができる。一実施形態では、上限及び下限の管理限界は、過去のデータから９５％、９６％、９７％、又は９８％信頼区間を計算することによって設定される。別の実施形態では、上限及び下限の管理限界は、過去のデータから９９％信頼区間を計算することによって設定される。
【００７０】
上限及び下限の管理限界を利用して、カラムの時間及び使用に対するカラム効率の変化を特定する。典型的には、上限管理限界を超えるＨＥＴＰの任意の増加は、カラム効率の低下を示し得る。ルーチンのカラムモニタリング中に、ＨＥＴＰの有害な傾向が観察されるか、又は管理限界を超えた場合、溶出液の製品品質、カラムプロセス性能、及び／又は不純物除去データを評価して、特定されたバッチの製品品質を確保する必要がある。製品品質又はカラム性能のいずれかが設定された基準に適合しない場合は、カラムのコンディショニング、再充填又は交換などの適切な是正処置を行い、更なる使用のためにリリースする前に品質評価を行う必要がある。充填されたベッドを再分配するためにクロマトグラフィカラムをコンディショニングする方法は、使用されるカラムに応じて異なるが、当業者にはよく理解される。
【００７１】
カラム操作中のカラム性能のモニタリングは、精製プロトコルにルーチンに含まれる１つ又は２つ以上の遷移相に基づくことができる。好ましくは、モニタリングは、精製プロトコル中の２つ又は３つ以上の遷移相についてガンマＣＤＦに基づいて計算されたＨＥＴＰ値に基づく。
【００７２】
以下に記載されるように、カラム性能を決定するために本明細書に記載されるＧＤＴＡ法を使用してＨＥＴＰを計算することは、同じプロセス工程及び同じスケールで使用されるカラムから収集された過去のデータに基づくことができる。プロセス工程の適格縮尺モデルモデルから生成されるデータを評価に使用することもできる。これにより、品質評価データと比較して、カラムの性能の品質を評価することができる。
【００７３】
流量（Ｖａｎ  Ｄｅｅｍｔｅｒ効果）、潜在的なバッファ相互作用、及び余分なカラム体積などの要因は、本明細書に記載されるＧＤＴＡ法の結果に影響を与える可能性があり、ＧＤＴＡの管理限界を設定する際に評価する必要がある。ＧＤＴＡに含まれる遷移フロントは、両方の移動相カラム出口信号測定値がスケール上にあり、移動相間のカラム出口信号測定値の差がバックグラウンド信号ノイズを上回っており、移動相と樹脂との間の相互作用が一貫しており、再現性があるなどの特定の基準を満たすことが好ましい。
【００７４】
使用中のリリース及びモニタリングに使用される一般的なカラム評価基準は、装置及び樹脂の種類に固有の過去のデータを評価することによって決定されるものとする。カラムの品質評価結果と性能との間の関係を評価するために使用することができる、ルーチンの製品品質及びプロセス性能の測定の例を表１に列挙する。評価に使用されるルーチンの品質及びプロセス性能の測定は、表１に列挙されるものに限定されるものではなく、リストはガイドラインであることを意味し、評価されるプロジェクト及びプロセス工程の特定の要件に基づいている必要がある。製品品質及びプロセス性能に関する仕様及び許容基準は、プロジェクト固有であり、プロセス要件に基づいて決定される。
【００７５】
【表１】
2021522204.tif 000014
【００７６】
本明細書に記載されるガンマ分布遷移分析法は、カラム操作中にリアルタイムで実行することができる。この方法は、クロマトグラフィカラムの品質評価のコンピューティングデバイスによって、カラム充填を含むクロマトグラフィカラムの第１の操作中に、カラム出口信号及び累積流量パラメータを、少なくとも１つの移動相遷移フロントの２つ以上の間隔で収集することと、クロマトグラフィカラムの品質評価のコンピューティングデバイスによって、少なくとも１つの移動相遷移フロントについての収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータに基づいて、上昇遷移フロントについては式Ｉａ又は下降遷移フロントについては式Ｉｂを使用して、モデルガンマ累積分布曲線を決定することとを含む。
【００７７】
【数１２】
2021522204.tif 000015
【００７８】
式Ｉａ及び式Ｉｂを参照すると、Ｃは所与のＶのカラム出口信号であり、Ｖは、カラム体積で除算された累積流量であり、ｋ、θ、及びＶｉは、曲線を画定するために使用される形状、スケール及びオフセットのパラメータである。この方法は、クロマトグラフィカラムの品質評価のコンピューティングデバイスによって、式ＩＩ及びモデルガンマ累積分布曲線のパラメータｋ、θ、及びＶｉを使用して、少なくとも１つの移動相遷移フロントについての理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値を計算することを更に含む。
【００７９】
【数１３】
2021522204.tif 000016
【００８０】
本方法は、クロマトグラフィカラムの品質評価のコンピューティングデバイスを使用して、当該計算されたＨＥＴＰ値に基づいて、クロマトグラフィカラム充填の品質を評価することを更に含む。この評価に基づいて、クロマトグラフィカラムの操作者は、クロマトグラフィカラムを再使用できるか、又は次のカラム操作の前に交換、再充填、又はコンディショニングする必要があるかを判断することができる。
【００８１】
図２は、クロマトグラフィカラムを操作し、本明細書に記載されるようなカラム効率をリアルタイムで評価する方法及びシステムの概要を提供する図である。図２及び上述のように、システム１０は、複雑な混合物としてカラムに導入された生体分子を分離するために使用されるクロマトグラフィカラム１２、すなわち、溶出液１４、クロマトグラフィカラムから溶出する際に溶出液中のカラム出力信号を検出する検出器２０、検出器２０からの信号／データを送信する通信インタフェース２２、カラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４、及びサーバ２６を含む。
【００８２】
クロマトグラフィカラム１２は、透過性、半透過性、又は不透過性の固相カラム充填材料で充填される。好適なクロマトグラフィカラム及びカラム充填材料は、上述のように記載されている。対象となる生体分子を含む溶出液１４をクロマトグラフィカラム１２に導入する。移動相１６もまた、クロマトグラフィカラム１２に導入する。移動相１６は、クロマトグラフィカラム１２の固定相を通じた生体分子の分離、及びクロマトグラフィカラムの出力１８を通じた溶出液中の生体分子の溶出を促進する。本明細書に記載される方法によって、移動相１６は、以下に記載されるように、１つ又は複数の物理的又は化学的特性、例えば、ｐＨ、導電率、塩濃度が互いに異なる、連続的に導入されたカラムバッファ及び／又は洗浄試薬を含む。１つ又は複数の物理的又は化学的特性におけるこれらの差違は、検出器２０によって溶出液中で検出される。
【００８３】
検出器２０は、クロマトグラフィカラム１２の出力１８に結合される。したがって、検出器２０は、クロマトグラフィカラム１２の溶出液を介してカラム出力信号をモニタリング及び収集する。好適な検出器及び溶出液の特性、すなわち、検出されるカラム出力信号は、上述のように記載されている。検出器は、検出器２０によって収集されたデータ（例えば、カラム出力信号及び累積流量パラメータ）を、データ処理用のカラムの品質評価コンピューティングデバイス２４及び／又はストレージのためのサーバ２６に送信する通信インタフェースユニット２２に結合されている。
【００８４】
本明細書に記載されるシステムのカラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４は、バス３６又は他のリンクによって一緒に結合される、中央処理ユニット（ＣＰＵ）又はプロセッサ３２、メモリ３０、ネットワークインタフェース２８、及びユーザインタフェース３４を含む、任意のコンピューティングデバイス、例えばコンピュータ、パーソナルコンピューティング装置、スマートフォンなどであってもよい。カラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４は、他のタイプ及び／又は数の他の構成の構成要素及び要素を含んでもよい。
【００８５】
カラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４内のプロセッサ３２は、本明細書の実施例によって説明及び例示されるガンマ分布遷移分析の１つ又は複数の態様の記憶された命令のプログラムを実行するが、他のタイプ及び／又は数の処理装置を使用することができ、プロセッサ３２は、他のタイプ及び／又は数のプログラムされた命令を実行することができる。一実施形態では、プロセッサ３２は、カラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４にのみ配置される。別の実施形態では、プロセッサは、検出器２０とカラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４との間に分散される。例えば、一実施形態では、カラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４のプロセッサ３２は、検出器に連結されたマイクロコントローラを含む。この実施形態では、マイクロコントローラは、検出器２０によって収集されたデータを、カラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４に送信されるデジタル信号にマッピング又は変換することができるオンボードプロセッサとして機能する。１つ又は複数の検出器に連結されたマイクロコントローラは、カラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４の１つ又は複数の処理機能を実行することができる。
【００８６】
カラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４内のメモリ３０は、本明細書に記載されるように、ＧＤＴＡの１つ又は複数の態様のためのこれらのプログラムされた命令を記憶している。メモリ３０には、タイミングプロセッサ装置内のランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）及び／又はリードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、又はカラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４内のプロセッサ３２に結合された磁気的、光学的、又は他の読み書きシステムによって読み書きされるフロッピーディスク、ハードディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、又は他のコンピュータ読み取り可能な媒体など、様々な種類のメモリ記憶装置を使用することができる。
【００８７】
カラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４のネットワークインタフェース２８は、カラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４と検出器２０との間の通信を操作的に結合し、通信を容易にするが、他のタイプ及び／又は数の接続及び構成を有する他のタイプ及び／又は数の通信ネットワーク又はシステムを使用することができる。
【００８８】
カラムの品質評価のコンピューティングデバイス２４は、例えば、グラフィカルユーザインタフェース、タッチユーザインタフェース、又はウェブベースのユーザインタフェースなどのユーザインタフェース３４を更に含んでもよい。ユーザインタフェースは、クロマトグラフィカラムの品質評価パラメータに関する情報をユーザに表示するように構成される。ユーザインタフェースはまた、クロマトグラフィカラムパラメータに関するユーザからの入力を受信するように構成される。
【００８９】
図２に示すサーバ２６は、それぞれがＣＰＵ又はプロセッサ、メモリ、及びネットワークインタフェースを含む１つ又は複数のコンピューティングデバイスであってもよく、これらは、カラムの品質評価のコンピューティング装置２４に関して記載されたものと同様のバス又は他のリンクによって一緒に結合される。サーバ２６は、他のタイプ及び／又は数の他の構成の構成要素及び要素を含んでもよい。
【００９０】
本明細書に記載されるシステムの通信インタフェース２２は、１つ又は複数のローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）及び／又はワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）を含むことができる。例示としてのみ、通信インタフェース２２は、ハイパーテキスト転送プロトコル（ＨＴＴＰ）及び／又はセキュアＨＴＴＰ（ＨＴＴＰＳ）を含む、イーサネット上のＴＣＰ／ＩＰ及び業界標準プロトコルを使用することができるが、他のタイプ及び／又は数の通信ネットワークが利用されてもよい。
【００９１】
本開示の別の態様は、ガンマ分布遷移分析を使用してクロマトグラフィカラムの品質評価のための命令を記憶している、一過性のコンピュータ読み取り可能な媒体に関する。これらの命令は、プロセッサによって実行されると、カラム充填を含むクロマトグラフィカラムの第１の操作中に、カラム出口信号及び累積流量パラメータを、少なくとも１つの移動相遷移フロントの２つ以上の間隔で収集する工程と、少なくとも１つの移動相遷移フロントについての収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータに基づいて、上昇遷移フロントについては上述のような式Ｉａ又は下降遷移フロントについては上述のような式Ｉｂを使用して、モデルガンマ累積分布曲線を決定する工程と、上述のように式ＩＩ及び本明細書に記載されるモデルガンマ累積分布曲線のパラメータｋ、θ、及びＶｉを使用して、少なくとも１つの移動相遷移フロントについての理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値を計算し、当該計算されたＨＥＴＰ値に基づいてクロマトグラフィカラム充填の品質を評価する工程とを含む工程をプロセッサに実行させる、実行可能なコードを含む。
【００９２】
本開示の別の態様は、クロマトグラフィカラムの品質評価の装置に関する。この装置は、プロセッサ及びプロセッサに連結されたメモリを含む。メモリは、メモリに記憶されたプログラム命令を実行するように構成される。これらの命令は以下を含む：カラム充填を含むクロマトグラフィカラムの第１の操作中に、カラム出口信号及び累積流量パラメータを、少なくとも１つの移動相遷移フロントの２つ以上の間隔で収集する工程と、上述のように、少なくとも１つの移動相遷移フロントについての収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータに基づいて、上昇遷移フロントについては式Ｉａ又は下降遷移フロントについては式Ｉｂを使用して、モデルガンマ累積分布曲線を決定する工程と、上述のように式ＩＩ及び本明細書に記載されるモデルガンマ累積分布曲線のパラメータｋ、θ、及びＶｉを使用して、少なくとも１つの移動相遷移フロントについての理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値を計算し、当該計算されたＨＥＴＰ値に基づいてクロマトグラフィカラム充填の品質を評価する工程。
【実施例】
【００９３】
実施例１−レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造に使用される、プロテインＡクロマトグラフィカラムのカラムの品質評価へのガンマ分布遷移分析の適用
概論：
治療抗体レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造プロセスは、いくつかの段階を含み、そのうちの４つはクロマトグラフィ精製を含む。カラムの品質評価のためのガンマ分布遷移分析（ＧＤＴＡ）を、これらのカラム工程のそれぞれの間に２つ又は３つの遷移に適用した。この実施例は、レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造中に使用されるプロテインＡカラム精製工程にＧＤＴＡ法を適用することを記載している。精製プロセスは、本明細書に記載されるように、ＧＤＴＡに適した２つの遷移フロント、すなわち、平衡化及び中間洗浄を含む。
【００９４】
６９バッチのレミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の連続精製から、６０の平衡化及び６９の洗浄フロントを含む１２９のフロントについてＧＤＴＡを実行した。ガンマフロント分布分析は、製造と並行して行われ、製造プロセスに影響を与えなかった。全ての製造、モニタリング及び制御は、現在の有効な手順を使用して行われた。レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）のカラムクロマトグラフィ精製中、導電率（すなわち、カラム出口信号）及び溶出液の流量（すなわち、累積流量）を記録した。
【００９５】
ＧＤＴＡをリアルタイムでカラム操作に適用したことに加えて、過去４年間に処理された２８５バッチの過去のデータもまた、本明細書に記載されるように収集及び分析した。データセットには、２５３の平衡化のフロント及び２８５の洗浄フロントを含み、合計５３８の過去のフロントが含まれていた。使用前消毒が行われた３２バッチについては、平衡化のフロントは生成されなかった。このデータセットは、カラムの寿命を通じて均等な分布を提供するために選択され、１１のカラム充填を表す。
【００９６】
ＧＤＴＡプロトコル：
プロテインＡカラム精製の各遷移フロント、すなわち、洗浄及び平衡化について、導電率及び累積流量を記録した。カラムがインラインに置かれた時点を特定するために、プレカラム導電率及び圧力の傾向を評価することによって、開始点の決定を行った。フロントの持続時間について、スプレッドシートを作成し、計算された１０秒の間隔を使用して、サーバから流量及び導電率のデータを取得するように設定した。
【００９７】
導電率データは、最大値を１及び最小値を０とし、他の点を比例的にスケーリングすることで正規化した。加えて、流量をカラム体積に変換した。
【００９８】
開始ガンマＣＤＦを、ＰＩモジュールと同じ開始ｋ、θ、Ｖｉパラメータを使用して計算した。Ｖｉは、ガンマ分布関数のｘ項の各体積値から減算した。精製中に増加していた導電率を正規化するために、Ｖｉ未満の体積では導電率の値を０に設定し、最大値を１に設定した。
【００９９】
各導電率値と各体積点に対するモデル適合との差（誤差）を計算した。加えて、０．５〜１．８ＣＶの誤差に対する平方和を計算した。次の式を使用して平方和の最小値を有するモデル曲線を生成するｋ、θ、及びＶｉパラメータを見つけるために、Ｅｘｃｅｌソルバーを使用して最良適合ガンマＣＤＦパラメータを計算した：
【０１００】
【数１４】
2021522204.tif 000017
【０１０１】
ソルバーは、最も近い適合に達することを確実にするために、ｋ≧０．０００１及びＶｉ≧０の制約を有するＧＲＧ非線形法を使用して、１０，０００回の反復を行った。
【０１０２】
ｋ、θ、及びＶｉの最終値から以下のパラメータを計算した：
【０１０３】
【数１５】
2021522204.tif 000018
【０１０４】
平均流量及びプレカラム圧力を、各フロントについて０．５〜１．８ＣＶの期間にわたって計算した。
【０１０５】
受入基準の分析及び評価：
正規性
平衡化及び洗浄フロントの両方についてのＨＥＴＰ及びＳＳの結果を、確率プロットを作成することによって正規性について評価した。確率プロット（図３〜図１２）では、データポイント（ＨＥＴＰ又はＳＳの結果）は、試料で観察された実際の累積分布を表している。線は、試料から推定されるパラメータを使用した正規分布に基づいて、適合された累積分布並びに信頼区間の上限値及び下限値を表している。パーセンタイルスケールを変換することにより、適合された分布が直線を形成する。ＨＥＴＰ及びＳＳデータセットはそれぞれ、下端で０に拘束されているが、正規分布モデルは負の値を示唆している。得られた確率プロットは、曲線形状を示す。図３〜図６を参照されたい。したがって、結果は、自然対数変換を用いて良好に適合する。自然対数変換データの確率プロットについては、図７〜図１０を参照されたい。
【０１０６】
平均（Ｖｍ）のデータもまた、正規性について評価した。図１１及び図１２は、データが正規分布に適合することを示し、わずかな孤立値のみを示す。したがって、変換は必要なかった。このパラメータは、プロトコルにおいて指定されなかったが、曲線適合が有効であることを保証した。このパラメータの管理限界もまた、この分析から生成される。
【０１０７】
孤立値の特定及び変動の原因。
孤立値を特定し、結果の変動性を評価するために、各パラメータについての管理図を作成した。図１３〜図２２を参照されたい。管理図は、ＨＥＴＰ及びＳＳの変換されたデータを使用し、自然対数変換が適用された。データはまた、これらのパラメータのそれぞれについて、変換された上限の管理限界を有する時系列プロットでプロットされる。
【０１０８】
ＨＥＴＰ：平衡化及び洗浄フロントの両方について、多くの孤立値及び傾向が、ＨＥＴＰ結果において明らかである。加えて、図１３及び図１８は、図中の四角で表され、以下に番号を付したシューハートルール１、２及び３に基づくデータの傾向を示している。
【０１０９】
【表２】
2021522204.tif 000019
【０１１０】
これらの変位に関連するバッチは、許容可能なプロセスを代表するので、分析から除外されなかった。
【０１１１】
管理図（図１３及び図１８）の両方は、管理限界を更に超える、多くのシューハートルール１の違反の数を示しており、これも管理限界を超えている。各場合において、問題は、カラムを再コンディショニングすることによって特定及び修正された。
【０１１２】
予想されるように、カラム充填の変動に起因して、いくつかの実行は、ルール２及び３の基準を満たしていた。傾向を更に評価するために、カラム充填（図２３〜図２４）及びスキッド（図２５〜図２６）によりグループ化されたデータを使用して時系列プロットを作成した。これらのチャートは、特別な原因による変動の多くが、カラムの劣化及びいくつかの孤立した変位に起因することを示している。平衡化フロントの各カラムについて、ＨＥＴＰの増加傾向が明らかである（図２３）。洗浄フロントで観察された変位は、異なる時間で一方のスキッド又は他方のスキッドに分離されているように見え（図２６）、これは、スキッドにおけるカラム性能の変動の原因がある可能性を示唆している。
【０１１３】
平方和（ＳＳ）：平方和は、ガンマ分布がプロセスデータにどのくらい良好に適合するかの尺度である。この測定は、ＨＥＴＰ結果が有効であることを確認にするためのチェックを提供する。変換されたデータの管理図は、それぞれ平衡化及び洗浄について図１５及び図２０に示される。この測定値は、上限の管理限界のみを有する。図１５は、上限の管理限界を超えた６点を示す。これらのうちの４つは、より高いＨＥＴＰと関連付けられる。バッチ８８０５７２Ｍは、フロントの間に流れが乱れてＳＳが高くなったが、ＨＥＴＰには影響しなかった。
【０１１４】
流量及び圧力の評価。
データセットの平均流量及びプレカラム圧力を評価して、任意の孤立値を特定した。特定された差違と結果との間の関係を評価した。
【０１１５】
流量及びプレカラム圧力は、図２７〜図３０の傾向がある。チャートは、各工程の流量制御に優れていることを示している。この評価の間、洗浄流量を変化させた。プレカラム圧力は、スキッド及びカラムに関連する変動を示しているが、一般的には、範囲内で安定である。図３１は、ＨＥＴＰ値が洗浄流量変化によって有意な影響を受けていないことを示している。
【０１１６】
プロテインＡカラムの管理限界
ＨＥＴＰ：
ＨＥＴＰは、カラム性能に直接関連し、分散を増加させる可能性があるシステム内の他の要因によっても影響を受ける。結果は、＞０でなければならない。ＨＥＴＰの管理限界は、平衡化についての図１３及び洗浄フロントについての図１８に示すように、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換（λ＝０）を使用することによって最適に決定される。管理図は、平均＋／−３標準偏差を使用してＭｉｎｉｔａｂにより計算された変換されたデータの管理限界を示す（以下の表２も参照されたい）。標準偏差は、平均移動範囲に基づいて決定される。カラム寿命にわたるカラム性能の変動を考慮するために、１００の移動範囲を選択した。上限及び下限の管理限界を逆変換（ｅｘ）して、変換されていないデータの管理限界を決定する。
【０１１７】
各フロントのＨＥＴＰ結果及び管理限界の時系列プロットを図１４及び図１９に示す。これらの限界内での動作は、この過去のレビューに基づいて、許容可能なクロマトグラフ性能が得られると期待されている。上限の管理限界を超える値は、カラム流量の問題を示している可能性があり、更に評価する必要がある。下限の管理限界を下回る値は、計算エラーを示している可能性がある。
【０１１８】
平方和（ＳＳ）：
ＳＳは、ガンマ分布モデルがどのくらい良好にデータに適合するかを示す尺度である。この尺度を使用して、ＧＤＴＡ法で計算されたＨＥＴＰ値がプロセスデータを表すことを確認する。下限は存在せず、結果は＞０でなければならない。ＳＳの上限の管理限界は、平衡化についての図１５及び洗浄フロントについての図２０に示すように、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換（λ＝０）を使用することによって最適に決定される。管理図は、平均＋／−３標準偏差を使用してＭｉｎｉｔａｂにより計算された変換されたデータの管理限界を示す。標準偏差は、平均移動範囲に基づいて決定される。カラム寿命にわたるカラム性能の変動を考慮するために、１００の移動範囲を選択した。管理図は、平衡化及び洗浄フロントについてそれぞれ０．０５０及び０．９８９を与えるように逆変換した、変換されたデータの上限の管理限界を示している（表２を参照されたい）。各フロントのＳＳ結果及び管理限界の時系列プロットを図１６及び図２０に示す。限界内の結果は、モデルがデータ及び過去の結果に適合することを確実にする。結果がこの範囲外である場合、特別な原因が考えられる。
【０１１９】
平均値：
平均値を、ガンマ分布モデルの精度の第２の尺度として加えた。平均値は、フロントの理論的な質量中心を表し、大きな余分なカラム体積や移動相と樹脂との間の相互作用など、システム内でそれをシフトさせる他の要因がない限り、常に１カラム体積に近い値であるべきである。平衡化及び洗浄フロントの両方の平均値は、ほぼ正規分布しており、変換を必要とせず、図１１及び図１２を参照されたい。平衡化フロントの平均は、１．０７ＣＶ付近に密に分布しており、いくつかの孤立値がいずれかの側に存在し、高い側では１．２に接近しており、図１７を参照されたい。洗浄フロントは、わずかに多くの変動を示し、０．８に接近したいくつかの低い孤立値が存在する０．９９ＣＶの中心にあり、図２２を参照されたい。両フロントの平均値については、０．８０〜１．２０ＣＶの管理限界を適用することが推奨される（表２を参照されたい）。平均値はカラム性能の尺度ではなく、分析が適切であったかどうかを確認するためのチェックとして用いられるものであるため、これは適切である。より厳しい管理限界は、このチェックのために不必要な感度になってしまう。
【０１２０】
【表３】
2021522204.tif 000020
【０１２１】
実施例２−レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造に使用される、プロテインＡクロマトグラフィカラムの最適以下の性能の検出のためのガンマ分布遷移分析の適用
治療抗体レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造プロセスは、いくつかの段階を含み、そのうちの４つはクロマトグラフィ精製を含む。カラムの品質評価のためのガンマ分布遷移分析（ＧＤＴＡ）を、これらのカラム工程のそれぞれの間に２つ又は３つの遷移に適用した。この実施例は、レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）製造に使用されるプロテインＡカラム精製工程にＧＤＴＡ法を適用することを記載している。精製プロセスは、本明細書に記載されるように、ＧＤＴＡに適した２つの遷移フロント、すなわち、平衡化及び中間洗浄を含む。
【０１２２】
カラム充填８８３３３３Ｍ００１で処理された２３バッチ及びカラム充填８８５４７３Ｍ００１で処理された２２バッチを含む、レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の４５バッチの連続した精製から、４５の平衡化フロントについてＧＤＴＡを実行した。ガンマフロント分布分析は、製造と並行して行われ、製造プロセスに影響を与えなかった。全ての製造、モニタリング及び制御は、現在の有効な手順を使用して行われた。レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）のカラムクロマトグラフィ精製中、導電率（すなわち、カラム出口信号）及び溶出液の流量（すなわち、累積流量）を記録した。
【０１２３】
４５バッチの平衡化ＨＥＴＰ結果の傾向は、図３２を参照して、カラム充填間の有意差を示した。カラム評価のための現在の対照では、２つのカラム充填間の差は確認されなかった。バッチ収率の評価は、２つのカラム充填で処理されたバッチ間の有意な差（ｐ＝０．００１）を示し、より高いＨＥＴＰ値を有するカラム充填の方が４．３％低いと推定された。他の潜在的要因を評価し、収率差に対する相関は示さなかった。したがって、この分析からの結論は、カラム性能差がより低い収率を引き起こしたことである。この発見に基づいて、より低い収率のカラムをコンディショニングして、使用を連続する前にカラム充填を改善した。この実施例は、クロマトグラフィカラム品質を評価する際のＧＤＴＡ法の感度を示す。
【０１２４】
実施例３−レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造に使用される、ＳＰ−セファロース高性能クロマトグラフィカラムのカラムの品質評価へのガンマ分布遷移分析の適用
概論：
上述のように、レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造プロセスは、いくつかの段階を含み、そのうちの４つはクロマトグラフィ精製を含む。本実施例は、レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）製造に使用されるＳＰ−セファロース高性能（ＳＰＨＰ）カラム精製工程にＧＤＴＡ法を適用することを記載している。ＳＰＨＰカラムは陽イオン交換クロマトグラフィカラムである。精製プロセスは、本明細書に記載されるように、ＧＤＴＡに適した３つの遷移フロント、すなわち、平衡化、ＷＦＩフラッシュ、及びストレージフロントを含む。
【０１２５】
２３バッチのレミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の精製から、２３の平衡化、ＷＦＩフラッシュ、及びストレージフロントを含む６９のフロントについてＧＤＴＡを実行した。ガンマフロント分布分析は、製造と並行して行われ、製造プロセスに影響を与えなかった。全ての製造、モニタリング及び制御は、現在の有効な手順を使用して行われた。レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）のカラムクロマトグラフィ精製中、導電率（すなわち、カラム出口信号）及び溶出液の流量（すなわち、累積流量）を記録した。
【０１２６】
ＧＤＴＡをリアルタイムでカラム操作に適用したことに加えて、過去４年間に処理された１８９の遷移フロントの過去のデータもまた、本明細書に記載されるように収集及び分析した。データセットには、６４の平衡化フロント、６３のＷＦＩフラッシュフロント、及び６２のストレージフロントが含まれた。このデータセットは、カラムの寿命を通じて均等な分布を提供するために選択され、６のカラム充填を表す。
【０１２７】
ＳＰＨＰカラムフロントのＧＤＴＡは、上記実施例１に記載されるように行われた。この分析は、ＨＥＴＰ、ＳＳの測定値、及び各フロントの平均値を生成した。統計的評価に基づいてこれら３つのパラメータのそれぞれに導出された管理限界を以下の表３に列挙する。
【０１２８】
ＳＰＨＰカラムの管理限界：
ＨＥＴＰ：
ＨＥＴＰは、カラム性能に直接関連し、分散を増加させる可能性があるシステム内の他の要因によっても影響を受ける。結果は、＞０でなければならない。ＨＥＴＰの管理限界は、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換（λ＝０）を使用することによって最良に決定される。変換されたデータの管理限界は、平均＋／−３標準偏差を使用してＭｉｎｉｔａｂにより計算した。標準偏差は、平均移動範囲に基づいて決定される。カラム寿命にわたるカラム性能の変動を考慮するために、２５の移動範囲を選択した。上限及び下限の管理限界を逆変換（ｅｘ）して、変換されていないデータの管理限界を決定する。各フロントのＨＥＴＰ結果及び管理限界の時系列プロットを図３３（平衡化フロント）、図３４（ＷＦＩフラッシュフロント）、及び図３５（ストレージフロント）に示す。これらの限界内での動作は、この過去のレビューに基づいて、許容可能なクロマトグラフ性能が得られると期待されている。上限の管理限界を超える値は、カラム流量の問題を示している可能性があり、更に評価する必要がある。下限の管理限界を下回る値は、計算エラーを示している可能性がある。
【０１２９】
平方和（ＳＳ）：
ＳＳは、ガンマ分布モデルがどのくらい良好にデータに適合するかを示す尺度である。この尺度を使用して、ＧＤＴＡ法で計算されたＨＥＴＰ値が、プロセスデータを表すことを確認する。下限は存在せず、結果は＞０でなければならない。ＳＳの上限の管理限界は、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換（λ＝０）を使用することによって最良に決定される。変換されたデータの管理限界は、平均＋／−３標準偏差を使用してＭｉｎｉｔａｂにより計算した。標準偏差は、平均移動範囲に基づいて決定される。カラム寿命にわたるカラム性能の変動を考慮するために、１００の移動範囲を選択した。変換されたデータの上限の管理限界を逆変換して、平衡化フロントについて０．１１０、ＷＦＩフラッシュフロントについて０．０２７、及びストレージフロントについて０．０７３を得た（表３を参照されたい）。限界内の結果は、モデルがデータ及び過去の結果に適合することを確実にする。結果がこの範囲外である場合、特別な原因が考えられる。
【０１３０】
平均値：
平均値を、ガンマ分布モデルの精度の第２の尺度として加えた。平均値は、フロントの理論的な質量中心を表し、大きな余分なカラム体積や移動相と樹脂との間の相互作用など、システム内でそれをシフトさせる他の要因がない限り、常に１カラム体積に近い値であるべきである。平衡化、ＷＦＩフラッシュ及びストレージフロントの平均値は、不規則な分布を有し、変換から恩恵を受けていない。フロントのそれぞれの平均については、０．８０〜１．２０ＣＶの管理限界を適用することが推奨される（表３を参照されたい）。平均値はカラム性能の尺度ではなく、分析が適切であったかどうかを確認するためのチェックとして用いられるものであるため、これは適切である。これらの限界は、予想される計算結果からの有意な逸脱を特定するために十分であると予想される。より厳しい管理限界は、このチェックのための不必要な感度になってしまい、これは各カラム充填で変化すると見られる。
【０１３１】
【表４】
2021522204.tif 000021
【０１３２】
実施例４−レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造に使用される、Ｑ２クロマトグラフィカラムのカラムの品質評価へのガンマ分布遷移分析の適用
概論：
この実施例は、レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）製造に使用される二次陰イオン交換（Ｑ２）カラム精製工程にＧＤＴＡ法を適用することを記載している。Ｑ２カラムは、陰イオン交換クロマトグラフィカラムである。精製プロセスは、本明細書に記載されるように、ＧＤＴＡに適した３つの遷移フロント、すなわち、平衡化、ストリップ、及びストレージフロントを含む。
【０１３３】
２３の平衡化及びストリップフロント、及び２２のストレージフロントを含む６８のフロントについてＧＤＴＡを実行した。ガンマフロント分布分析は、製造と並行して行われ、製造プロセスに影響を与えなかった。全ての製造、モニタリング及び制御は、現在の有効な手順を使用して行われた。レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）のカラムクロマトグラフィ精製中、導電率（すなわち、カラム出口信号）及び溶出液の流量（すなわち、累積流量）を記録した。
【０１３４】
ＧＤＴＡをリアルタイムでカラム操作に適用したことに加えて、過去４年間に処理された３２４の遷移フロントの過去のデータもまた、本明細書に記載されるように収集及び分析した。データセットには、１２１の平衡化フロント、１２４のストリップフロント、及び７９のストレージフロントが含まれた。このデータセットは、カラムの寿命を通じて均等な分布を提供するために選択され、１０のカラム充填を表す。
【０１３５】
Ｑ２カラムフロントのＧＤＴＡは、上記実施例１に記載されるように行われた。この分析は、ＨＥＴＰ、ＳＳの測定値、及び各フロントの平均値を生成した。統計的評価に基づいてこれら３つのパラメータのそれぞれに導出された管理限界を以下の表４に列挙する。
【０１３６】
Ｑ２カラムの管理限界：
ＨＥＴＰ：
ＨＥＴＰは、カラム性能に直接関連し、分散を増加させる可能性があるシステム内の他の要因によっても影響を受ける。結果は、＞０でなければならない。ＨＥＴＰの管理限界は、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換（λ＝０）を使用することによって最良に決定される。変換されたデータの管理限界は、平均＋／−３標準偏差を使用してＭｉｎｉｔａｂにより計算した。標準偏差は、平均移動範囲に基づいて決定される。カラム寿命にわたるカラム性能の変動を考慮するために、１００の移動範囲を選択した。上限及び下限の管理限界を逆変換（ｅｘ）して、変換されていないデータの管理限界を決定する。
【０１３７】
各フロントのＨＥＴＰ結果及び管理限界の時系列プロットを図３６（平衡化フロント）、図３７（ストリップフロント）、及び図３８（ストレージフロント）に示す。これらの限界内での動作は、この過去のレビューに基づいて、許容可能なクロマトグラフ性能が得られると期待されている。上限の管理限界を超える値は、カラム流量の問題を示している可能性があり、更に評価する必要がある。下限の管理限界を下回る値は、計算エラーを示している可能性がある。
【０１３８】
平方和（ＳＳ）：
ＳＳは、ガンマ分布モデルがどのくらい良好にデータに適合するかを示す尺度である。この尺度を使用して、ＧＤＴＡ法で計算されたＨＥＴＰ値が、プロセスデータを表すことを確認する。下限は存在せず、結果は＞０でなければならない。ＳＳの上限の管理限界は、自然対数Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換（λ＝０）を使用することによって最良に決定される。変換されたデータの管理限界は、平均＋／−３標準偏差を使用してＭｉｎｉｔａｂにより計算した。標準偏差は、平均移動範囲に基づいて決定される。カラム寿命にわたるカラム性能の変動を考慮するために、１００の移動範囲を選択した。移動範囲法ではより高い標準偏差を出していたため、ストレージフロントの集計データから標準偏差を決定した。管理限界を下の表４に報告する。限界内の結果は、モデルがデータ及び過去の結果に適合することを確実にする。結果がこの範囲外である場合、特別な原因が考えられる。
【０１３９】
平均値：
平均値を、ガンマ分布モデルの精度の第２の尺度として加えた。平均値は、フロントの理論的な質量中心を表し、大きな余分なカラム体積や移動相と樹脂との間の相互作用など、システム内でそれをシフトさせる他の要因がない限り、常に１カラム体積に近い値であるべきである。平衡化、ストリップ、及びストレージフロントの平均値は、不規則な分布を有し、変換から恩恵を受けていない。フロントのそれぞれの平均については、０．８０〜１．２０ＣＶの管理限界を適用することが推奨される（表４を参照されたい）。平均値はカラム性能の尺度ではなく、分析が適切であったかどうかを確認するためのチェックとして用いられるものであるため、これは適切である。これらの限界は、予想される計算結果からの有意な逸脱を特定するために十分であると予想される。より厳しい管理限界は、このチェックのための不必要な感度になってしまい、これは各カラム充填で変化すると見られる。
【０１４０】
【表５】
2021522204.tif 000022
【０１４１】
実施例５−ＳＴＥＬＡＲＡ（登録商標）（ウステキヌマブ）の製造プロセス
背景
ＳＴＥＬＡＲＡ（登録商標）（ウステキヌマブ）は、ヒトインターロイキン（ＩＬ）−１２及びＩＬ−２３サイトカインの共有ｐ４０サブユニットに対して高親和性及び特異性で結合する完全ヒトＧ１κモノクローナル抗体である。ウステキヌマブは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖、配列番号７の重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び配列番号８の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、並びに配列番号４、配列番号５、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む。ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０サブユニットへのウステキヌマブの結合は、天然キラー及びＣＤ４＋Ｔ細胞の表面におけるＩＬ−１２又はＩＬ−２３のＩＬ−１２Ｒβ１受容体への結合をブロックし、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３特異的細胞内シグナル伝達及びその後の活性化及びサイトカイン産生を阻害する。ＩＬ−１２及びＩＬ−２３の異常な調節は、複数の免疫介在性疾患に関連している。
【０１４２】
現在までに、ウステキヌマブは、慢性中程度から重度のプラーク乾癬及び／又は活動性乾癬性関節炎、及びクローン病（ＣＤ）を含む成人患者の治療のために、北米、ヨーロッパ、南米、及びアジア太平洋地域の国々を含む世界中で販売承認を受けている。ウステキヌマブはまた、活動性全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の治療のための第３相試験においても評価される。
【０１４３】
配列
例示的な抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体配列−ＳＴＥＬＡＲＡ（登録商標）（ウステキヌマブ）
抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体相補性決定領域重鎖１（ＣＤＲＨ１）のアミノ酸配列：（配列番号１）
ＴＹＷＬＧ
【０１４４】
抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体相補性決定領域重鎖２（ＣＤＲＨ２）のアミノ酸配列：（配列番号２）
ＩＭＳＰＶＤＳＤＩＲＹＳＰＳＦＱＧ
【０１４５】
抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体相補性決定領域重鎖３（ＣＤＲＨ３）のアミノ酸配列：（配列番号３）
ＲＲＰＧＱＧＹＦＤＦ
【０１４６】
抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体相補性決定領域軽鎖１（ＣＤＲＬ１）のアミノ酸配列：（配列番号４）
ＲＡＳＱＧＩＳＳＷＬＡ
【０１４７】
抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体相補性決定領域軽鎖２（ＣＤＲＬ２）のアミノ酸配列：（配列番号５）
ＡＡＳＳＬＱＳ
【０１４８】
抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体相補性決定領域軽鎖３（ＣＤＲＬ３）のアミノ酸配列：（配列番号６）
ＱＱＹＮＩＹＰＹＴ
【０１４９】
抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体可変重鎖領域のアミノ酸配列（ＣＤＲの下線部）：（配列番号７）
【０１５０】
[１]
2021522204.tif 000023
【０１５１】
抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体可変軽鎖領域のアミノ酸配列（ＣＤＲの下線部）：（配列番号８）
【０１５２】
[２]
2021522204.tif 000024
【０１５３】
抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体重鎖のアミノ酸配列（ＣＤＲの下線部）：（配列番号１０）
【０１５４】
[３]
2021522204.tif 000025
【０１５５】
抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体軽鎖のアミノ酸配列（ＣＤＲの下線部）：（配列番号１１）
【０１５６】
[４]
2021522204.tif 000026
【０１５７】
アミノ酸配列ＩＬ−１２
α及びβサブユニットを有するヒトインターロイキン（ＩＬ）−１２のアミノ酸配列：（配列番号９）
【０１５８】
[５]
2021522204.tif 000027
【０１５９】
組換え発現カセット
本発明は核酸を含む組換え発現カセットを使用する。核酸配列、例えば本発明の方法に使用される抗体をコード化するｃＤＮＡ又はゲノム配列を使用して、少なくとも１つの所望の宿主細胞に導入することができる組換え発現カセットを構築することができる。組換え発現カセットは、典型的には、意図される宿主細胞においてポリヌクレオチドの転写を導く、転写開始調節配列に操作可能に連結される、ポリヌクレオチドを含む。異種及び非異種（すなわち、内因性）プロモーターの両方を利用して、核酸の発現を導くことができる。
【０１６０】
一部の実施形態では、プロモーター、エンハンサー、又は他の要素として機能する単離された核酸を、ポリヌクレオチドの発現を上方又は下方調節するために、本発明のポリヌクレオチドの非異種形の適切な位置（上流、下流、又はイントロン内）に導入することができる。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで、突然変異、欠失及び／又は置換により、内因性プロモーターを変えることができる。
【０１６１】
ベクター及び宿主細胞
本発明は、単離された核酸分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子工学処理される宿主細胞、及び技術分野において周知である組換え技術による少なくとも１つの抗ＩＬ−２３抗体の産生にも関する。
【０１６２】
ポリヌクレオチドは、任意選択的に、宿主の増殖についての選択マーカーを含有するベクターに結合することができる。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物内、又は荷電脂質との複合体内に導入される。ベクターがウイルスである場合は、適切なパッケージング細胞株を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでこれをパッケージングし、その後、宿主細胞内に形質導入することができる。
【０１６３】
ＤＮＡ挿入物は、適切なプロモーターに機能的に連結されるべきである。発現コンストラクトは、転写開始部位、転写終結部位、及び転写された領域内では翻訳のためのリボソーム結合部位を更に含む。構築により発現する成熟した転写産物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるべきｍＲＮＡの最後に適切に位置する開始及び終止コドン（例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡ、又はＵＡＧ）で始まる翻訳を含み、哺乳類又は真核生物細胞の発現ではＵＡＡ及びＵＡＧが好ましい。
【０１６４】
発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含むが、これは任意である。かかるマーカーは、例えば、真核細胞培養のためのメトトレキサート（methotrexate、ＭＴＸ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（dihydrofolate reductase、ＤＨＦＲ、米国特許第４，３９９，２１６号；同第４，６３４，６６５号；同第４，６５６，１３４号；同第４，９５６，２８８号；同第５，１４９，６３６号；同第５，１７９，０１７号、アンピシリン、ネオマイシン（Ｇ４１８）、マイコフェノール酸又はグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）（米国特許第５，１２２，４６４号；同第５，７７０，３５９号；同第５，８２７，７３９号）抵抗性遺伝子、並びに大腸菌及び他の細菌又は原核生物における培養のためのテトラサイクリン又はアンピシリン抵抗性遺伝子を含むが、これらに限定されない（上記特許は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。上記の宿主細胞に対して適切な培養培地及び条件は、技術分野において既知である。適切なベクターは、当事者にとって容易に明白となるであろう。宿主細胞へのベクターコンストラクトの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染又は他の既知の方法により影響を受け得る。このような方法は技術分野において既知であり、多く記述されている。
【０１６５】
本発明の方法に使用される少なくとも１つの抗体は、融合タンパク質などの修飾された形態で発現され得、分泌シグナルだけでなく、追加の異種機能領域も含み得る。例えば、追加アミノ酸の領域、特に荷電アミノ酸を抗体のＮ末端に追加して、精製中又は後続の処理及び保存中に、宿主細胞における安定性及び持続性を改善することができる。また、ペプチド部分を本発明の抗体に追加して、精製を促進することもできる。抗体又は少なくとも１つのその断片の最終調製前に、かかる領域を除去することができる。このような方法は、多くの標準的な実験室マニュアルに記載されており、この方法は技術分野において既知であり、多く記述されている。
【０１６６】
当業者であれば、本発明の方法に使用されるタンパク質をコード化する核酸の発現に利用可能な多数の発現系について精通している。あるいは、核酸は、抗体をコード化する内因性ＤＮＡを含有する宿主細胞内で、（操作により）オン切換えすることにより、宿主細胞中で発現させることができる。このような方法は、例えば、米国特許第５，５８０，７３４号、同第５，６４１，６７０号、同第５，７３３，７４６号、及び同第５，７３３，７６１号に記載されているように、技術分野において既知である。
【０１６７】
抗体、その特定された部分又は変異体の産生にとって有用な細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳類細胞系は、細胞の単層の形態で培養されることが多いが、細胞はまた、例えば、振盪フラスコ又はバイオリアクター内の懸濁液中で増殖するように適合させることもできる。無傷なグリコシル化タンパク質を発現可能な多くの好適な宿主細胞株が技術分野において開発されており、これにはＣＯＳ−１（例えばＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（例えばＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えばＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１０）、ＢＳＣ−１（例えばＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２６）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＰ  Ｇ２、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ細胞などが挙げられ、これらは例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から容易に入手できる。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、並びに骨髄腫及びリンパ腫細胞などのリンパ系起源の細胞、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５８０）及びＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５８１）が挙げられる。
【０１６８】
これらの細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモーター（例えば、後期又は初期ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号；同第５，３８５，８３９号）、ＨＳＶ  ｔｋプロモーター、ｐｇｋ（ホスホグリセラートキナーゼ）プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター（米国特許第５，２６６，４９１号）、少なくとも１つのヒト免疫グロブリンプロモーター；エンハンサー、及び／又はリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０ラージＴ  Ａｇポリ付加部位）、並びに転写終結配列などのプロセシング情報部位などであるがこれらに限定されない、発現制御配列のうちの１つ又は２つ以上を含み得る。本発明の核酸又はタンパク質の生成に有用な他の細胞は既知であり、並びに／あるいは例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）又は他の既知の若しくは商業的供給源から入手可能である。
【０１６９】
真核宿主細胞が利用されるとき、典型的には、ベクター内にポリアデニル化又は転写終結配列が組み込まれる。終結配列の一例は、ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化配列である。転写の正確なスプライシングのための配列も、同様に含むことができる。スプライシング配列の例は、ＳＶ４０からのＶＰ１イントロンである（Ｓｐｒａｇｕｅら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ４５：７７３−７８１（１９８３年））。加えて、技術分野において既知であるように、宿主細胞内の複製を制御するための遺伝子配列をベクター内に組み込むことができる。
【０１７０】
ＣＨＯ細胞株
いくつかの他の哺乳類細胞株の利用可能性にもかかわらず、現在生産されている組換え治療タンパク質の大部分は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で作成されている（Ｊａｙａｐａｌ  ＫＰら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｒｏｍ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ−２０  ｙｅａｒｓ  ａｎｄ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｐｒｏｇ．２００７年；１０３：４０−４７；Ｋｕｎｅｒｔ  Ｒ、Ｒｅｉｎｈａｒｔ  Ｄ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６年；１００（８）：３４５１−６１）。それらの強みは、例えば、付着細胞又は懸濁液中での堅牢な増殖、無血清及び化学的に定義された培地への適応性、高い生産性、及び治療用組換えタンパク質産生に対する法的な承認の確立された歴史が挙げられる。これらはまた、遺伝子改変が非常に受入容易であり、細胞トランスフェクション、組換えタンパク質発現、クローン選択の方法は十分に特徴付けられる。ＣＨＯ細胞はまた、ヒトに適合する翻訳後修飾を提供することができる。本明細書で使用するとき、「ＣＨＯ細胞」としては、例えば、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−Ｋｌ、ＣＨＯ−Ｍ、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ  ＧＳノックアウト、並びにこれらの改変及び誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７１】
ＣＨＯ細胞におけるクローニング及び発現。
ＣＨＯ細胞における発現に一般的に使用される１つのベクターは、ｐＣ４である。プラスミドｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ（登録商標）３７１４６）の誘導体である。このプラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下でマウスＤＨＦＲ遺伝子を含有する。これらのプラスミドでトランスフェクトされる、ジヒドロ葉酸活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞又はその他の細胞は、化学療法剤メトトレキサートを補充した選択的培地（例えば、α−ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中で細胞を増殖させることによって選択することができる。メトトレキサート（ＭＴＸ）に対して耐性を有する細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、十分に文書化されている（例えば、Ｆ．Ｗ．Ａｌｔら、「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃｅｌｌｓ．」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０（１９７８年）；並びにＭ．Ｊ．Ｐａｇｅ及びＭ．Ａ．Ｓｙｄｅｎｈａｍ、「Ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ．」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：６４−６８（１９９１年））。増大したＭＴＸ濃度において成長した細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として、標的酵素であるＤＨＦＲの過剰生成により、薬物に対する耐性を発達させる。第２の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子に連結されている場合、通常、共増幅され、過剰発現される。このアプローチを使用して、増幅遺伝子（複数可）の１，０００を超えるコピーを有する細胞株を開発することができることが、技術分野において知られている。続いて、メトトレキサートを回収する際、宿主細胞の１つ以上の染色体（複数可）に組み込まれた増幅遺伝子を含有する細胞株が得られる。
【０１７２】
対象遺伝子を発現させるために、プラスミドｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）の強力なプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎら、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ  ｌｏｃａｔｅｄ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ａｖｉａｎ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ．」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３８−４４７（１９８５年））と、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の最初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、「Ａ  ｖｅｒｙ  ｓｔｒｏｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｉｓ  ｌｏｃａｔｅｄ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｏｆ  ａｎ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ．」Ｃｅｌｌ  ４１：５２１−５３０（１９８５年））を含む。プロモーターの下流は、遺伝子の組み込みを可能にするＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ及びＡｓｐ７１８制限酵素切断部位である。これらのクローニング部位の後に、プラスミドは、ラットプレプロインスリン遺伝子の３’イントロン及びポリアデニル化部位を含有する。他の高効率のプロモーター、例えば、ヒトβアクチンプロモーター、ＳＶ４０初期若しくは後期プロモーター、又は他のレトロウイルス、例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶＩからの長末端反復も発現のために使用することができる。クロンテックのＴｅｔ−Ｏｆｆ及びＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系並びに同様の系を使用して、哺乳動物細胞において調節された方法でタンパク質を発現することもできる（Ｍ．Ｇｏｓｓｅｎ、及びＨ．Ｂｕｊａｒｄ、「Ｔｉｇｈｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１（１９９２年））。ｍＲＮＡのポリアデニル化のために、例えば、ヒト成長ホルモン又はグロビン遺伝子からの他のシグナルも使用することができる。染色体に組み込まれた目的の遺伝子を有する安定した細胞株は、ｇｐｔ、Ｇ４１８又はハイグロマイシンなどの選択マーカーとの共トランスフェクションの際に選択することもできる。最初に１つを超える選択マーカー、例えばＧ４１８、に加えてメトトレキサートを使用するのが有利である。
【０１７３】
一般的な精製方法
抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０又はＩＬ−２３抗体は、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ及びレクチンクロマトグラフィが挙げられるがこれらに限定されない既知の方法により、組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。高速液体クロマトグラフィ（「ＨＰＬＣ」）を精製に利用することもできる。
【０１７４】
本明細書で使用するとき、用語「抗体」又は「複数の抗体」は、２００９年のバイオロジクス価格競争・イノベーション法（ＢＰＣＩ  Ａｃｔ）並びに同様の世界的な法律及び規則で承認されたバイオシミラー抗体分子を含む。ＢＰＣＩ  Ａｃｔの下で、抗体は、臨床的に不活性な成分のわずかな違いにもかかわらず、基準品と「非常に類似」しており、安全性、純度、効力の点で基準品と同等の臨床結果が得られると「期待される」ことをデータが示す場合、バイオシミラーであることが実証され得る（Ｒ．Ｄｏｌｉｎａｒ、Ｆ．Ｌａｖｅｒｎｉａ、及びＳ．Ｅｄｅｌｍａｎ．「Ａ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＦＯＬＬＯＷ−ＯＮ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＳ  ＡＮＤ  ＢＩＯＳＩＭＩＬＡＲＳ  ＷＩＴＨ  Ａ  ＦＯＣＵＳ  ＯＮ  ＩＮＳＵＬＩＮ．」Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：２０１８年２月、２４巻、Ｎｏ．２、１９５−２０４ページ）。これらのバイオシミラー抗体分子は、短縮された承認経路を提供し、それにより、出願人は、法的な承認を確保するために、イノベーターの基準品の臨床データに依存している。臨床試験の成功に基づいてＦＤＡに承認されたオリジナルのイノベーター基準抗体と比較して、バイオシミラー抗体分子は、本明細書では、「フォローオン生物学的」と呼ばれる。本明細書に提示されるように、ＳＴＥＬＡＲＡ（登録商標）（ウステキヌマブ）は、臨床試験の成功に基づいてＦＤＡに承認されたオリジナルのイノベーター基準抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０抗体である。ウステキヌマブは、２００９年から米国で販売されている。
【０１７５】
本明細書で使用するとき、用語「抗原結合断片」は、例えば、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄａｂ）ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、１つ又は２つ以上のＣＤＲを含む抗体の一部から形成される多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、又は抗原に結合するが完全な抗体構造を含まない任意の他の抗体断片などの抗体断片を指す。抗原結合断片は、親抗体又は親抗体断片が結合する同じ抗原に結合することができる。特定の実施形態によると、抗原結合断片は、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、及びＦｄセグメント（すなわち、Ｆａｂ断片に含まれる重鎖の部分）を含む。他の特定の実施形態によると、抗原結合断片は、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）を含む。
【０１７６】
製造プロセスの概要
ＳＴＥＬＡＲＡ（登録商標）（ウステキヌマブ）は、連続的な灌流細胞培養、続いて精製を含む１０段階プロセスで製造される。製造工程の概要は、図３９に示されている。
【０１７７】
本明細書で使用するとき、用語「培養」、「培養する」、「培養された」、及び「細胞培養物」は、細胞集団の生存及び／又は増殖に好適な条件下で培地中に懸濁される細胞集団を指す。技術分野には文脈から明らかであるように、本明細書で使用されるこれらの用語はまた、細胞集団及び集団が懸濁される培地を含む組み合わせを指す。細胞培養物は、例えば、バッチ、フェドバッチ又は灌流細胞培養法などによって増殖させた細胞を含む。特定の実施形態では、細胞培養物は、哺乳動物細胞培養物である。
【０１７８】
本発明で使用するための細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ細胞）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ細胞、マウス骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ０細胞及びＳｐ２／０細胞）、及びヒト網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７９】
本明細書で使用するとき、用語「化学的に定義された培地」、「化学的に定義された複数の培地」、「化学的に定義されたハイブリドーマ培地」、又は「化学的に定義された複数のハイブリドーマ培地」は、全ての成分の同一性及び濃度が既知である合成増殖培地を指す。化学的に定義された培地は、細菌、酵母、動物、又は植物抽出物、動物血清又は血漿を含まないが、個々の植物又は動物由来の構成成分（例えば、タンパク質、ポリペプチドなど）を含んでも含まなくてもよい。化学的に定義された培地は、増殖を支援するために必要なリン酸塩、硫酸塩などの無機塩を含んでもよい。炭素源が定義されており、通常、グルコース、ラクトース、ガラクトースなどの糖、又はグリセロール、乳酸、アセタートなどの他の化合物である。特定の化学的に定義された培地はまた、バッファとしてリン酸塩を使用するが、クエン酸塩、トリエタノールアミンなどの他のバッファを使用してもよい。市販の化学的に定義された培地の例としては、サーモフィッシャーのＣＤハイブリドーマ培地及びＣＤハイブリドーマＡＧＴ（商標）培地、様々なダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥ）培地（シグマアルドリッチ社；ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅｓ，Ｉｎｃ）、ハムの栄養混合液（シグマアルドリッチ社；ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅｓ，Ｉｎｃ）、これらの組み合わせ等が挙げられるが、これらに限定されない。化学的に定義された培地を調製する方法は、技術分野において既知であり、例えば、米国特許第６，１７１，８２５号及び同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、並びに米国特許出願公開第２００８／０００９０４０号及び同第２００７／０２１２７７０号に既知である。
【０１８０】
本明細書で使用するとき、用語「バイオリアクター」は、細胞培養物の増殖に有用な任意の容器を指す。バイオリアクターは、細胞の培養に有用である限り、任意の大きさであってもよい。特定の実施形態では、このような細胞は哺乳動物細胞である。典型的には、バイオリアクターは、少なくとも１リットルであり、１０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、８，０００、１０，０００、１２，０００リットル以上、又はこれらの間の任意の体積であってもよい。培養期間中、ｐＨ及び温度を含むがこれらに限定されないバイオリアクターの内部条件を任意に制御することができる。バイオリアクターは、ガラス、プラスチック、又は金属を含む、本発明の培養条件下で培地中に懸濁された哺乳動物細胞培養物を保持するのに好適な任意の材料から構成することができる。本明細書で使用するとき、用語「産生バイオリアクター」は、対象とするポリペプチド又は糖タンパク質の産生に使用される最終バイオリアクターを指す。産生バイオリアクターの体積は、典型的には少なくとも５００リットルであり、１，０００、２，５００、５，０００、８，０００、１０，０００、１２，０００リットル以上、又はこれらの間の任意の体積であってもよい。当業者であれば、本発明を実施する際に使用するのに好適なバイオリアクターを選択することができるであろう。
【０１８１】
ウステキヌマブの前培養、増殖、及び産生は、段階１及び段階２で実施される。段階１では、ウステキヌマブのＨＣ及びＬＣ配列を発現しているトランスフェクトされたＳｐ２／０細胞の単一のワーキングセルバンクバイアルから前培養を開始し、培養フラスコ、使い捨て培養バッグ、及び１００Ｌ播種バイオリアクターで細胞を増殖させる。５００Ｌの産生バイオリアクターの接種に必要な細胞密度及び体積が得られるまで細胞を培養する。段階２では、細胞培養物を、交互接線方向流（ＡＴＦ）中空糸フィルタ細胞保持システムを使用して５００Ｌの産生バイオリアクター内で灌流する。細胞培養透過液（回収物）をＡＴＦシステムから回収し、細胞をバイオリアクター内に保持し、培養物に新鮮な培地を補充する。１つ又は複数の５００Ｌの産生バイオリアクターからの回収物を、段階３で組み合わせることができる。回収物は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡ樹脂親和性クロマトグラフィを使用して精製される。得られた直接生成物捕獲（ＤＰＣ）溶出液は、更なる処理まで凍結される。
【０１８２】
ＤＣＰからのウステキヌマブの精製は、段階４〜８において、イオン交換クロマトグラフィ工程並びに潜在的なウイルス汚染を不活化又は除去する工程（溶媒／洗剤処理及びウイルス除去濾過）を組み合わせて行われる。段階４でＤＰＣ溶出液を解凍、プール及び濾過し、段階５でトリ−ｎ−ブチルホスファート（ＴＮＢＰ）及びポリソルバート８０／Ｄ処理と共にインキュベートして、潜在的に存在する任意の脂質エンベロープウイルスを不活性化する。段階６では、ＳＰＸＬ（登録商標）セファロース陽イオン交換樹脂クロマトグラフィを使用して、ＴＮＢＰ及びポリソルバート８０試薬、凝集体、及び不純物をウステキヌマブから除去する。段階７では、ＱＸＬ（登録商標）セファロース陰イオン交換樹脂クロマトグラフィを使用して、ウステキヌマブを更に精製して、ＤＮＡ、ウイルス、及び不純物を除去する。段階８では、精製ウステキヌマブ生成物を希釈し、ウイルス保持性フィルタ（ＮＦＰ（登録商標））を通して濾過する。
【０１８３】
ウステキヌマブの事前製剤化されたバルク（ＰＦＢ）及び製剤化されたバルク（ＦＢ）の調製は、段階９及び１０においてそれぞれ実施される。段階９では、限外濾過工程はウステキヌマブ生成物を濃縮し、透析濾過工程により、製剤賦形剤が添加され、プロセス中のバッファ塩が除去される。段階１０では、ポリソルバート８０をウステキヌマブＰＦＢに添加して、ＦＢを得る。凍結保存するために、ＦＢをポリカルボナート容器に濾過する。凍結したＦＢは、医療品製造現場への輸送のためにドライアイスを備えた断熱容器内に包装される。
【０１８４】
大規模製造プロセスの詳細な説明
段階１−前培養及び増殖
ウステキヌマブの産生における第１の段階は、ウステキヌマブのＨＣ及びＬＣ配列を発現するトランスフェクトされたＳｐ２／０細胞のワーキングセルバンク（ＷＣＢ）バイアルからの前培養の開始並びに培養フラスコ、使い捨て培養バッグ、及び１００Ｌ播種バイオリアクターにおける増殖である。５００Ｌの産生バイオリアクターの接種に必要な細胞密度及び体積が得られるまで細胞を培養する。
【０１８５】
製造手順
ＷＣＢの１つ又は複数の凍結保存バイアルを解凍し、６ｍＭのＬ−グルタミン、０．５ｍｇ／Ｌのミコフェノール酸、２．５ｍｇ／Ｌのヒポキサンチン、及び５０ｍｇ／Ｌキサンチンを補充したＣＤ（化学的に定義された）ハイブリドーマ培地（ＣＤＨ−Ａ）で希釈する。培養物生存率は≧４５％でなければならない。細胞を培養フラスコ内でＣＤＨ−Ａで更に希釈して、０．２〜０．５×１０６生存細胞（ＶＣ）／ｍＬの播種密度まで更に希釈する。前培養物は、バッチ記録に定義される範囲内で温度、ＣＯ２濃度、及び撹拌を制御した加湿ＣＯ２インキュベーターに維持される。≧０．６×１０６の最小細胞密度及び≧５０％の培養物生存率が得られるまで、前培養物を≦３日間インキュベートする。１００Ｌの播種バイオリアクターへの接種のためのスケールアップ機構として、前培養物を一連の培養フラスコ内で連続的に増殖させ、次いで、培養バッグで培養する。培養増殖期中、各インキュベーション工程は、継代条件を達成するために≦３日行われ、≧０．６×１０６ＶＣ／ｍＬの細胞密度及び≧８０％の培養物生存率を必要とする。各継代の播種密度は、培養フラスコ中で０．２〜０．５×１０６ＶＣ／ｍＬ、及び培養バッグ中で０．２〜０．６×１０６ＶＣ／ｍＬである。各継代を、生存細胞密度（ＶＳＤ）、培養物生存率、及び顕微鏡検査のためにサンプリングする。１００Ｌの播種バイオリアクターの接種前に、前培養物をバイオバーデンのためにサンプリングする。
【０１８６】
前培養は、解凍後最大３０日間維持され得る。３０日以内に使用されない前培養物を廃棄する。上述のように増殖させ、一次前培養物と同じインプロセスモニタリング、制御試験、及びプロセスパラメータの対象となるバックアップ前培養物は、必要に応じて、別の１００Ｌの播種バイオリアクターに接種するために維持及び使用することができる。
【０１８７】
前培養物が接種基準を満たす際、培養バッグの内容物を、ＣＤＨ−Ａを含む１００Ｌの播種バイオリアクターに移し、≧０．３×１０６ＶＣ／ｍＬの播種密度を目標とする。播種バイオリアクターの培養物のｐＨ、温度、及び溶存酸素濃度は、バッチ記録内に定義される範囲内で制御される。≧１．５×１０６ＶＣ／ｍＬの細胞密度及び≧８０％の培養物生存率が得られるまで、培養物を増殖させる。培養物を、播種バイオリアクタープロセス全体を通して、ＶＣＤ、培養物生存率、及び顕微鏡検査のためにサンプリングする。５００Ｌの産生バイオリアクターの接種前に、前培養物をバイオバーデンのためにサンプリングする。
【０１８８】
播種バイオリアクター培養物のＶＣＤが≧１．５×１０６ＶＣ／ｍＬに達すると、培養物を使用して、５００Ｌの産生バイオリアクターに接種してもよい。あるいは、培養物の一部を１００Ｌの播種バイオリアクターから取り出し、残りの培養物を新鮮な培地で希釈することができる。この「取り出し及び充填」プロセスに続いて、培養物を十分な細胞密度まで増殖させて、５００Ｌの産生バイオリアクターに接種する。１００Ｌの播種バイオリアクター培養物の最大持続時間は、接種から９日後である。
【０１８９】
段階２−バイオリアクターの製造
段階２では、細胞培養物を、交互接線方向流（ＡＴＦ）中空糸フィルタ細胞保持システムを使用して５００Ｌの産生バイオリアクター内で連続的に灌流する。細胞培養透過液（回収物）をＡＴＦシステムから回収し、細胞をバイオリアクターに戻し、培養物に新鮮培地を補充する。
【０１９０】
製造手順
５００Ｌの産生バイオリアクターの接種は、１００Ｌの播種バイオリアクターの内容物を、６ｍＭのＬ−グルタミン、０．５ｍｇ／Ｌのミコフェノール酸、２．５ｍｇ／Ｌのヒポキサンチン、及び５０ｍｇ／Ｌのキサンチンを補充したＣＤ（化学的に定義された）ハイブリドーマ培地（ＣＤＨ−Ａ）を含む５００Ｌの産生バイオリアクターに移すことによって行われる。移される体積は、≧０．３×１０６生存細胞（ＶＣ）／ｍＬの播種密度をもたらすのに十分でなければならない。培養物を３４．０〜３８．０℃の温度、６．８〜７．６のｐＨ及び１〜１００％の溶存酸素濃度で維持する。
【０１９１】
連続灌流が開始され、５００ＬのバイオリアクターからＡＴＦシステムに培養物を取り出し、透過液から細胞を分離する。透過液を０．２μｍのＡＴＦフィルタを通して濾過し、バイオプロセス容器（ＢＰＣ）で回収物として回収する。細胞をバイオリアクターに戻し、新鮮なＣＤＨ−Ａを供給して一定の培養体積を維持する。生存細胞（ＶＣＤ）、培養物生存率、ｐＨ、ＤＯ、温度及び免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）含有量は、産生運転中にモニタリングされる。灌流速度は、１日当たり約１バイオリアクター体積の目標速度に達するまで、ＶＣＤに比例して徐々に増加する。灌流速度は、１日当たり１．２０バイオリアクター体積を超えないように制御される。ＡＴＦシステムの保持をモニタリングして、フィルタ全体のＩｇＧ保持が５０％を超える前に、ＡＴＦフィルタのシャットダウンを容易にする。
【０１９２】
５００Ｌのバイオリアクター内のＶＣＤが、８．０×１０６ＶＣ／ｍＬに達するか、又は１０日目のいずれか早い方で、ｐＨの目標は７．２から７．１まで低下する。バイオマス除去は、２０日目、又は１２．０×１０６ＶＣ／ｍＬのＶＣＤに到達したときのいずれか早い方で、開始される。バイオマスを、５００Ｌの産生バイオリアクターから、１日当たり最大２０％のバイオリアクター体積の速度でＢＰＣに除去する。各回収物をバイオバーデンのためにサンプリングする。
【０１９３】
５００Ｌの産生バイオリアクターにおける灌流細胞培養操作は、接種後最大４６日間継続する。産生の終わりに、培養物をマイコプラズマ及び外膜ウイルス試験のためにサンプリングする。回収物は、バイオリアクターから切り離した後、２〜８℃で≦３０日間保存することができる。
【０１９４】
段階３−直接生成物捕獲（ＤＰＣ）
段階３では、１つ又は複数の５００Ｌの産生バイオリアクターからの回収物を、自動クロマトグラフィスキッドを用いたＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ピッツバーグ、ペンシルベニア州、米国）プロテインＡ親和性クロマトグラフィカラムを使用して精製する。ウステキヌマブは、回収物から捕捉され、宿主細胞不純物を含む細胞培養不純物が除去される。得られたＤＰＣ溶出液は、更なる処理まで凍結される。
【０１９５】
プロテインＡカラム調製及び再生
回収物充填の前に、充填ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡ親和性クロマトグラフィカラムを、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のポリソルバート８０、ｐＨ７．３（平衡化バッファ）で平衡化する。カラムが完全に平衡化されることを確認するために、導電率及びｐＨをモニタリングする。カラム溶出液のサンプルを採取し、微生物制御を確認するためにモニタリングする。使用後、カラムを消毒し、次いで、洗浄し、該当する場合は適切な保存条件で保存する。
【０１９６】
製造手順
回収物を、バイオバーデン、エンドトキシン、及び免疫グロブリンＧ含有量のためにサンプリングする。０．１Ｍのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ８．０バッファを回収物にラインで添加して、最終濃度５〜３０ｍＭのＥＤＴＡを達成する。回収物を０．２μｍで濾過し、１４〜４１ｇ／Ｌの充填速度及び３００〜５００ｃｍ／ｈの流量でプロテインＡカラムに充填する。２８０ｎｍ（Ａ２８０）での紫外線吸光度が≦１００ｍＡＵ／ｍｍに戻るまで３００〜５００ｃｍ／ｈの流量で平衡化バッファでカラムを洗浄し、次いで、少なくとも２つの追加のカラム体積（ＣＶ）の平衡化バッファで洗浄する。結合したウステキヌマブを、３００〜５００ｃｍ／ｈの流量で、少なくとも４．５ＣＶの０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０バッファで洗浄する。
【０１９７】
ウステキヌマブを、０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ３．５を使用して、３００〜５００ｃｍ／ｈの流量で溶出する。溶出生成物の回収は、≧５０ｍＡＵ／ｍｍ経路長の上昇Ａ２８０−シグナルで開始し、≧５０ｍＡＵ／ｍｍ経路長の下降Ａ２８０−シグナルで停止する。
【０１９８】
回収後、必要に応じて、１．０Ｍのトリスバッファ及び／又は０．１Ｍのクエン酸ナトリウムバッファを添加することにより、ＤＰＣ溶出液のｐＨを５．８〜６．２に調整する。ｐＨ調整中、ＤＰＣ溶出液を混合して溶液の均質性を確保する。ｐＨ調整ＤＰＣ溶出液を、濾過の前にバイオバーデンのためにサンプリングする。
【０１９９】
ｐＨ調整ＤＰＣ溶出液を、０．２μｍのエンドフィルタを用いて濾過する。ＤＰＣ溶出液を、ポリカルボナート容器にアリコートする。濾過ＤＰＣ溶出液を、モノマー含有量、バイオバーデン、エンドトキシン、及びタンパク質濃度の分析のためにサンプリングする（ここから工程収率が計算され、工程収率は≧６０％であるべきである）。濾過ＤＰＣ溶出液を、≦−４０℃で保存する前に、室温で≦４８時間及び２〜８℃で≦２４０時間の累積時間にわたって保持することができる。ＤＰＣ溶出液を凍結保存することができる。
【０２００】
段階４−直接生成物捕獲（ＤＰＣ）溶出物の解凍及びプール
段階４では、溶媒／洗剤のウイルス不活性化前に、ＤＰＣ溶出液を解凍、プール及び濾過する。
【０２０１】
製造手順
凍結ＤＰＣ溶出液を室温で解凍する。溶出液が氷を視覚的に含まない場合、解凍は完了しており、解凍は１２０時間を超えてはならない。解凍した溶出液をプールし、０．２μｍで密閉容器に濾過し、２．７〜５．４ｋｇのタンパク質を得る。濾過溶出液を混合して溶液の均質性を確保する。タンパク質濃度、エンドトキシン、バイオバーデン、及びｐＨについてサンプルを採取する。タンパク質濃度は、４．５〜５９ｇ／Ｌと測定される。次いで、必要に応じて、１．０Ｍのトリス又は１．０Ｍのクエン酸のいずれかを添加することにより、ｐＨを５．５〜６．５に調整する。プールしたＤＰＣ溶出液を、段階５の更なる処理の前に、室温で最大４８時間保存することができる。
【０２０２】
段階５−プールした直接生成物捕獲（ＤＰＣ）溶出液の溶媒／洗剤（Ｓ／Ｄ）処理
段階５では、プールしたＤＰＣを、トリ−ｎ−ブチルホスファート（ＴＮＢＰ）及びポリソルバート８０（溶媒／洗剤［Ｓ／Ｄ］処理）と共にインキュベートして、潜在的に存在する任意の脂質エンベロープウイルスを不活性化する。
【０２０３】
製造手順
２％のＴＮＢＰ／１０％のポリソルバート８０（ｗ／ｗ）を含むＳ／Ｄストック溶液を、プールしたＤＰＣ溶出液を含む容器に０．０８〜０．１２（ｖ／ｖ）の比で移して、最終濃度の０．２％のＴＮＢＰ／１％のポリソルバート８０（ｗ／ｖ）を得る。溶液を混合して溶液の均質性を確保し、不活性化容器内に移す。ウステキヌマブ及びＳ／Ｄ処理試薬を、連続混合しながら、≧１５℃でインキュベートする。不活性化は、Ｓ／Ｄ処理されたウステキヌマブが不活性化容器に完全に移された際に開始され、段階６で陽イオン交換クロマトグラフィカラム充填段階が開始された際に完了する。全不活性化時間は、≧６０分である。Ｓ／Ｄ試薬添加の開始から段階６でのカラム充填段階の終了までの合計時間は、≦３６時間である。
【０２０４】
段階６−陽イオン交換クロマトグラフィ
段階６では、溶媒／洗剤（Ｓ／Ｄ）で処理したウステキヌマブを、自動クロマトグラフィスキッドに接続されたＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ピッツバーグ、ペンシルベニア州、米国）陽イオン交換クロマトグラフィカラムに結合する。トリ−ｎ−ブチルホスファート（ＴＮＢＰ）及びポリソルバート８０試薬、凝集体、及び不純物を除去する。
【０２０５】
陽イオン交換クロマトグラフィカラムの調製及び再生
使用前に、充填ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ陽イオン交換クロマトグラフィカラムを、３０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５バッファ（平衡化バッファ）で平衡化する。カラムが完全に平衡化されることを確認するために、導電率及びｐＨをモニタリングする。カラム溶出液のサンプルを採取し、微生物制御を確認するためにモニタリングする。使用後、カラムは残留タンパク質を取り除き、再生及び消毒し、適切な保存溶液中に保存する。
【０２０６】
製造手順
Ｓ／Ｄ処理されたウステキヌマブを、２．４〜３．４ｍＳ／ｃｍの導電率を維持するために注入用水で希釈し、平衡化ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ陽イオン交換クロマトグラフィカラムに充填する。全ての充填、洗浄、及び溶出流量は、１００〜３００ｃｍ／ｈである。生成物対樹脂の充填比は、４５．５〜９０．９ｇウステキヌマブ／Ｌ樹脂である。カラムを、≧３カラム体積の平衡化バッファで洗浄する。次いで、３０ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．５バッファを使用して、ウステキヌマブを陽イオン交換カラムから溶出する。２８０ｎｍ（Ａ２８０）でのカラム溶出液のＵＶ吸光度が２５ｍＡＵ／ｍｍの最小値に上昇すると、生成物の回収が開始される。Ａ２８０ピークをモニタリングし、溶出液が１５０ｍＡＵ／ｍｍ以上に減少すると回収が終了する。溶出生成物をバイオバーデンの分析のためにサンプリングする。
【０２０７】
溶出液を０．２μｍのフィルタを通して密閉容器に濾過する。次いで、陽イオン交換精製したウステキヌマブを混合し、バイオバーデン及びエンドトキシンについてサンプルを採取する。収率をモニタリングし、≧８５％になると予想される。ウステキヌマブを、更なる処理の前に、室温で最大７２時間、２〜８℃で最大７日間保持することができる。
【０２０８】
段階７−陰イオン交換クロマトグラフィ
段階７では、ウステキヌマブを、自動クロマトグラフィスキッドを用いたＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ピッツバーグ、ペンシルベニア州、米国）陰イオン交換クロマトグラフィカラムを使用して更に精製する。ウステキヌマブは、ＤＮＡ、他の不純物、及びウイルスが保持されている間、樹脂を通って流れる。
【０２０９】
陰イオン交換クロマトグラフィカラム調製
再生の使用前に、充填Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ陰イオン交換クロマトグラフィカラムを、５０ｍＭのトリス、５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８．０（平衡化バッファ）で平衡化する。カラムが完全に平衡化されることを確認するために、導電率及びｐＨをモニタリングする。カラム溶出液のサンプルを採取し、微生物制御を確認するためにモニタリングする。使用後、カラムは残留タンパク質を取り除き、再生し、消毒し、適切な溶液に保存する。
【０２１０】
製造手順
充填前に、必要に応じてｐＨが７．５〜８．０になるまで、１．０Ｍのトリス又は１．０Ｍのクエン酸を添加することにより、陽イオン交換溶出液のｐＨを調整する。溶出液を混合して溶液の均質性を確保する。ｐＨ調整ウステキヌマブを、５０〜２５０ｃｍ／ｈの流量でＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ陰イオン交換カラムに充填する。生成物対樹脂の充填比は、４５．５〜１３６．４ｇウステキヌマブ／Ｌ樹脂である。
【０２１１】
ウステキヌマブは、結合することなく樹脂を通って流れ、２８０ｎｍ（Ａ２８０）でのＵＶ吸光度が３０ｍＡＵ／ｍｍの最小値に上昇すると回収される。ウステキヌマブを充填した後、カラムを５０〜２５０ｃｍ／ｈの流量で平衡化バッファで洗浄する。Ａ２８０ピークをモニタリングし、流出液が５０ｍＡＵ／ｍｍ以上に減少すると回収が終了する。溶出生成物をバイオバーデンの分析のためにサンプリングする。
【０２１２】
ウステキヌマブを、０．２μｍのフィルタを通して密閉容器に濾過し、混合し、バイオバーデン及びエンドトキシンのためにサンプリングする。収率をモニタリングし、≧８５％になると予想される。陰イオン交換精製ウステキヌマブを、段階８における更なる処理の前に、室温で最大７２時間、又は２〜８℃で最大７日間保持することができる。
【０２１３】
段階８−ウイルス除去濾過
段階８では、陰イオン交換精製ウステキヌマブを、５０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０バッファで希釈し、ウイルス保持性フィルタ（ＮＦＰ（登録商標））を通して濾過して、潜在的に存在する任意のウイルスを除去する。
【０２１４】
ＮＦＰ濾過システムの調製
使用前に、オートクレーブ処理した単回使用ＮＦＰフィルタを、消毒したＮＦＰ濾過システム上に設置し、注入用水（ＷＦＩ）でフラッシュし、次いで、水透過性について試験する。フィルタを、５０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０バッファ（平衡化バッファ）で平衡化する。システムが完全に平衡化されることを確認するために、導電率及びｐＨをモニタリングする。バッファフラッシュのサンプルを採取し、微生物制御を確認するためにモニタリングする。ＮＦＰ濾過システムを、使用後に消毒し、適切な保存溶液中に保存する。
【０２１５】
製造手順
濾過前に、陰イオン交換精製ウステキヌマブを平衡化バッファで≦８．２ｇ／Ｌの濃度に希釈する。次いで、希釈ウステキヌマブをＮＦＰフィルタを通して濾過し、ＮＦＰ濾液をステンレス鋼製容器に回収する。初期流量は、濾過開始の５分以内に決定され、初期流速（０％流速減衰として定義される）からの減少が８５％を超えないことを確認するために、流速減衰をモニタリングする。ＮＦＰ濾過が完了すると、スキッドを平衡化バッファでフラッシュし、残りの生成物をステンレス鋼容器に回収し、それを混合し、エンドトキシン、バイオバーデン、及びタンパク質濃度のためにサンプリングする。収率をモニタリングし、≧８５％になると予想される。ウステキヌマブＮＦＰ濾液を、段階９における更なる処理の前に、室温で最大７２時間、２〜８℃で最大７日間保持することができる。
【０２１６】
段９−濃縮及び透析濾過
段階９では、限外濾過工程はウステキヌマブ生成物を濃縮し、透析濾過工程により、製剤賦形剤が添加され、プロセス中のバッファ塩が除去される。
【０２１７】
限外濾過システム調製
使用前に、システムを、５０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０バッファで平衡化する。システムが完全に平衡化されることを確認するために、導電率及びｐＨをモニタリングする。バッファフラッシュのサンプルを採取し、微生物制御を確認するためにモニタリングする。使用後、限外濾過システムを消毒する。ＷＦＩをシステムを通してフラッシュし、正規化された透水性試験を実施する。必要に応じて、限外濾過システムを、適切な保存溶液中に保存する。
【０２１８】
製造手順
ウステキヌマブウイルスウイルス保持性濾液を、３６〜８２ｇ／Ｌに予め濃縮する。次いで、透過液のｐＨ及び導電率がそれぞれ５．５〜５．９及び４００〜７００μｓ／ｃｍ以内になるまで、≧８倍量の１０ｍＭのヒスチジン、８．５％のスクロース、ｐＨ５．７バッファに対して、それぞれ透析濾過する。ウステキヌマブは、１８０ｇ／Ｌ以下に更に濃縮される。プロセス全体を通して、膜差圧をモニタリングし、制御する。１０ｍＭのヒスチジン、８．５％スクロース、ｐＨ５．７バッファを使用して、バッファフラッシュで生成物を回収する。ウステキヌマブの最終濃度を、この同じバッファを用いて、８６．７〜９５．８ｇ／Ｌのタンパク質濃度に調整し、事前製剤化されたバルク（ＰＦＢ）と呼ばれる。段階９の収率をモニタリングし、≧８５％になると予想される。必要に応じて、ウステキヌマブを再処理して、限外濾過システムを通して濃度工程を繰り返すことによって、正しいタンパク質濃度を得ることができる。生成物を混合して溶液の均質性を確保する。ウステキヌマブＰＦＢを、室温又は２〜８℃で最大４８時間保存する。
【０２１９】
段階１０−製剤化されたバルクの調製
段階１０では、ポリソルバート８０を、ウステキヌマブの事前製剤化されたバルク（ＰＦＢ）に添加して、製剤化されたバルク（ＦＢ）を得る。凍結保存するために、ＦＢをポリカルボナート容器に濾過する。
【０２２０】
製造手順
１％のポリソルバート８０を、０．００３〜０．００５ｋｇ／Ｌの割合で、密閉ＰＦＢ容器内のウステキヌマブＰＦＢに添加し、混合してＦＢ溶液を得る。この溶液の均質性を確保するために、検証されたパラメータに従ってＦＢ溶液を混合する。ＦＢ溶液は、濾過前に、室温又は２〜８℃で最大４８時間保存することができる。ＦＢ溶液を、単回使用プレフィルタを使用してＦＢ容器内に濾過し、混合する。次いで、混合したＦＢを、ポリカルボナート容器に０．２μｍで濾過した。サンプルを放出試験のために採取する。ウステキヌマブＦＢ容器を、≦−４０℃で保存する。
【０２２１】
実施例６−ＳＴＥＬＡＲＡ（登録商標）（ウステキヌマブ）の製造に使用される、クロマトグラフィカラムのガンマ分布遷移分析（ＧＤＴＡ）法の適用
この実施例は、抗ＴＮＦ抗体、例えば、抗ＴＮＦα抗体ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の製造中の精製において、例えば、製造の段階３の間に使用されるプロテインＡ親和性クロマトグラフィカラムへのＧＤＴＡ法の適用を記載する。
【０２２２】
段階３−プロテインＡ親和性クロマトグラフィカラム
段階３では、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡ親和性クロマトグラフィカラムを使用して、分析された遷移フロントは、例えば、洗浄２フロント（図４０）、及び溶出中に生成されるフロント（図４１）を含む。消毒後のカラム洗浄中に生成された追加のフロント、及び保存後平衡化すすぎ工程は、現在、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡ親和性クロマトグラフィカラムについて評価されている。示される結果は、ＳＴＥＬＡＲＡ（登録商標）（ウステキヌマブ）製造に使用される１３の異なるカラム充填で処理されたバッチの分析を表す。傾向の予備評価は、カラム性能で明らかないくらかのずれ及びカラム充填間で観察されたいくらかの差違を示す。他の利用可能なバッチ情報及びカラム性能データとの比較を含む、このデータの完全な分析が完了し、将来的にリアルタイムでプロセスをモニタリングするためのＧＤＴＡ法を実施する際に使用するための管理限界を確立する。
【０２２３】
実施例７−ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の製造に使用される、クロマトグラフィカラムのガンマ分布遷移分析（ＧＤＴＡ）法の適用
この実施例は、抗ＴＮＦα抗体ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の製造中の精製において、クロマトグラフィカラム、例えば、段階３でのプロテインＡ親和性クロマトグラフィカラム、段階６での陽イオン交換クロマトグラフィカラム、及び段階７での陰イオン交換クロマトグラフィカラムへのＧＤＴＡ法の適用を記載する。ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の製造方法に使用されるこれらの段階及びカラムは、ＳＴＥＬＡＲＡ（登録商標）（ウステキヌマブ）を製造するために使用されるもの同等のものである。
【０２２４】
段階３−プロテインＡ親和性クロマトグラフィカラム
段階３では、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡ親和性クロマトグラフィカラムを使用して、分析された遷移フロントは、例えば、溶出フロント（図４２）、グアニジンＨＣｌでの消毒中に生成されるフロント（図４３）、及び０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５での消毒後のすすぎ中に生成されるフロント（図４４）を含む。示される結果は、ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の１６０バッチの分析を表す。傾向の予備評価は、カラム性能で明らかないくらかのずれ及びカラム充填間で観察されたいくらかの差違を示す。他の利用可能なバッチ情報及びカラム性能データとの比較を含む、このデータの完全な分析が完了し、将来的にリアルタイムでプロセスをモニタリングするためのＧＤＴＡ法を実施する際に使用するための管理限界を確立する。
【０２２５】
段階６−陽イオン交換クロマトグラフィカラム
段階６では、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓ（商標）陽イオン交換クロマトグラフィカラムを使用して、分析された遷移フロントは、例えば、溶媒／洗剤（Ｓ／Ｄ）処理物質の充填中に生成されるフロント（図４５）、溶出中に生成されるフロント（図４６）、及びストリップの間に生成されるフロント（図４７）を含む。示される結果は、ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の７２バッチの分析を表す。傾向の予備評価は、カラム性能で明らかないくらかのずれ及びカラム充填間で観察されたいくらかの差違を示す。他の利用可能なバッチ情報及びカラム性能データとの比較を含む、このデータの完全な分析が完了し、将来的にリアルタイムでプロセスをモニタリングするためのＧＤＴＡ法を実施する際に使用するための管理限界を確立する。
【０２２６】
段階７−陰イオン交換クロマトグラフィカラム
段階７では、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ陰イオン交換クロマトグラフィカラムを使用して、分析された遷移フロントは、例えば、水酸化ナトリウムで洗浄する間に生成されるフロント（図４８）及びストリップの間に生成されるフロント（図４９）を含む。示される結果は、ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の７１バッチの分析を表す。傾向の予備評価は、カラム性能で明らかないくらかのずれ及びカラム充填間で観察されたいくらかの差違を示す。他の利用可能なバッチ情報及びカラム性能データとの比較を含む、このデータの完全な分析が完了し、将来的にリアルタイムでプロセスをモニタリングするためのＧＤＴＡ法を実施する際に使用するための管理限界を確立する。
【０２２７】
好ましい実施形態を本明細書で詳細に描写及び説明するが、本発明の趣旨から逸脱することなく様々な修正、追加、置換などを行うことができ、したがって、これらは以下の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることは、当業者には明らかであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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