(57)【要約】  垂直マイクロ流体デバイスと、限定はしないが、自動化された機械的及び／又は磁気的アクチュエーション等の自動化されたアクチュエーション機構を含む、サンプルツーアンサー方式マイクロ流体システム及び方法を開示する。幾つかの実施形態では、サンプルツーアンサー方式マイクロ流体システムは、垂直配向マイクロ流体デバイスと、マイクロ流体デバイスに関連する回転アクチュエータとを含み、マイクロ流体デバイス及び回転アクチュエータがＸＺ平面で動作している。更に、サンプルツーアンサー方式マイクロ流体システムを使用する方法を提供する。【選択図】図２５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＸＺ平面内に位置するオイル／非混和性試薬相を収容する一次チャネルを含むマイクロ流体カートリッジであって、前記一次チャネルが前記マイクロ流体カートリッジ内のウェルを流体回路で接続し、磁気ビーズがウェル間で移送され再懸濁され得るように前記一次チャネルが構成されている、マイクロ流体カートリッジ。
【請求項２】
オイル／非混和性試薬容器を更に備え、前記オイル／非混和性試薬容器が前記一次チャネルと同一面内にある、請求項１に記載のマイクロ流体カートリッジ。
【請求項３】
前記オイル／非混和性試薬容器のＺ軸方向の高さが、前記マイクロ流体カートリッジ内へのオイルの流れを駆動するのに必要な圧力ヘッドを生成する為に用いられるように構成されている、請求項２に記載のマイクロ流体カートリッジ。
【請求項４】
前記オイル／非混和性試薬容器は、前記オイル／非混和性試薬容器の内容物を前記マイクロ流体カートリッジのウェル内に駆動する為の圧力ヘッドを発生させることができるように、前記ウェルに対してより高い位置に配置されている、請求項３に記載のマイクロ流体カートリッジ。
【請求項５】
前記圧力ヘッドの高さを増加させても、前記カートリッジのＹ軸方向の寸法が増加しないように構成されている、請求項２乃至４の何れか一項に記載のマイクロ流体カートリッジ。
【請求項６】
前記オイル／非混和性試薬相は気泡がないように構成されている、請求項２乃至５の何れか一項に記載のマイクロ流体カートリッジ。
【請求項７】
前記ＸＺ平面内に１つ以上のアクチュエータプレートを更に備えた、請求項１乃至６の何れか一項に記載のマイクロ流体カートリッジ。
【請求項８】
前記１つ以上のアクチュエータプレートが、空間的に配向され、ウェルの底部の試薬に磁気粒子を再懸濁させ、前記ウェルの上部のオイル／非混和性試薬を介して、又、一次チャネルを介して前記磁気粒子を移送できるように構成された磁石を含む、請求項７に記載のマイクロ流体カートリッジ。
【請求項９】
図１乃至図７の何れか１つ及び添付のテキストに実質的に示され記載されているようなマイクロ流体カートリッジ。
【請求項１０】
サンプルツーアンサー核酸増幅検査（ＮＡＡＴ）を実施するように構成された、請求項１乃至９の何れか一項に記載のマイクロ流体カートリッジ。
【請求項１１】
オンチップ磁気ビーズベースのサンプル処理が、単回回転中に磁気ビーズの捕捉、再懸濁、及び移送が行われる単回回転動作を用いて行われるように構成されている、請求項１０に記載のマイクロ流体カートリッジ。
【請求項１２】
一次チャネルは、磁気粒子を所望の位置に拘束し、磁場に向かって移動するのを防ぐ物理的障壁として機能するように構成されたバッフルを備えている、請求項１１に記載のマイクロ流体カートリッジ。
【請求項１３】
前記バッフルは、移送用磁石が磁気ビーズ粒子を１つのウェルから次のウェルに移動させる時に、前記磁気ビーズ粒子を捕捉するように構成されている、請求項１２に記載のマイクロ流体カートリッジ。
【請求項１４】
更に、試薬捕捉／再懸濁磁石は、前記ビーズを前記ウェル内に引き込んで、前記ビーズを前記ウェル内の試薬に懸濁させるようにする、請求項１３に記載のマイクロ流体カートリッジ。
【請求項１５】
請求項１乃至１４の何れか一項に記載のマイクロ流体カートリッジを受容するように構成された携帯装置。
【請求項１６】
前記装置を開閉するように構成されると共に、前記装置が閉じている時に前記マイクロ流体カートリッジ上の試薬パウチを粉砕するようにクラッシュプレートを前後に移動させるように構成されたレバーアームを更に備えた、請求項１５に記載の携帯装置。
【請求項１７】
前記ドアが閉じられた時に、前記マイクロ流体カートリッジ上の試薬パウチと接触してそれらを粉砕するように、内側に突起物を含むヒンジ式機構を更に含む、請求項１５に記載の携帯型装置。
【請求項１８】
前記マイクロ流体カートリッジが前記装置に挿入され、前記装置が閉じられた後で、前記空間的に配向された磁石及び／又は機械的要素を備えた１つ以上のアクチュエータプレートが回転して、一連のサンプル処理ステップを正確な順序で完了するように構成されている、請求項１６又は１７に記載の携帯型装置。
【請求項１９】
前記マイクロ流体カートリッジ内の液体を、分注／移送された液体のデッドボリューム／損失をゼロにして分注／移送するように構成されたウィックバルブを更に備えた、請求項１から１４の何れか一項に記載のマイクロ流体カートリッジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本開示は、２０１８年８月２７日に出願された「機械的及び磁気的アクチュエーションを用いた垂直チップサンプルツーアンサー方式マイクロ流体デバイス（Ｖｅｒｔｉｃａｌ Ｃｈｉｐ  Ｓａｍｐｌｅ−Ｔｏ−Ａｎｓｗｅｒ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｃｔｕａｔｉｏｎ）」という名称の米国仮特許出願６２／７２３，４７４号に関連しており、この仮特許出願の開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書で開示する主題は、一般に、アッセイを処理するシステム及び方法に関し、より詳細には、垂直マイクロ流体デバイス及び限定はしないが、自動化された機械的及び／又は磁気的アクチュエーション等の、自動化されたアクチュエーション機構を含む、サンプルツーアンサー方式マイクロ流体システム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
マイクロ流体システムは、例えば、生体材料の処理に使用されるマイクロ流体デバイス及び／又はカートリッジを含み得る。幾つかのケースでは、マイクロ流体デバイスは、オイル／非混和相を含む一次流体チャネルを含んでもよく、チャネルはＸＹ平面内に位置する。一次チャネルは、流体回路の流体ウェル（又はリザーバ）を接続し、例えば、磁気ビーズをウェル間で移送して再懸濁させる導管でもある。即ち、マイクロ流体デバイスは、例えば、試薬パウチ、試薬ウェル、サンプル入力ポート、サンプルウェル、廃液ウェル、検出ウェル、検出アレイ、検出スポット、ラテラルフローストリップ等と組み合わせて、１つ以上の反応（又はアッセイ）チャンバを含んでもよい。複数のこれらの要素の組み合わせが、一次流体チャネルを介して相互接続されてもよい。
【０００４】
このようなマイクロ流体デバイスでは、一次チャネルを介してウェルからウェルへとオーバーフローするオイル／非混和性液体オーバーレイを円滑に気泡なく充填して流体回路を形成できるようにする為に、一次チャネルの高さよりも高い、又は一次チャネルの高さを上回る高さに位置するオイル試薬容器を採用して圧力ヘッドを発生させる。試薬容器から排出されたオイルは、圧力ヘッドによって駆動され、マイクロ流体デバイス上の各ウェルに適切な高さになるまで順次充填されていく。この圧力ヘッドは、ヘッドの高さ、ウェル及び一次チャネルの形状、及びマイクロ流体デバイスの壁上の疎水性コーティング層と相まって、一次チャネルへのオイル相互接続層の制御された気泡のない充填をもたらすように最適化され得る。
【０００５】
一次チャネルがＸＹ平面内に配向しているマイクロ流体デバイスは、マイクロ流体装置内に水平に（即ち、ＸＹ平面内に）挿入され、操作される。しかし、マイクロ流体デバイスにオイルを充填するのに必要な圧力ヘッドを発生させる為には、オイル試薬容器の高さが、流体チャネルの深さよりもＺ平面（即ち、流体チャネルに垂直な方向）でかなり大きくなければならない。更に、容器の深さはＺ軸に沿っており、試薬はウェルの底部に位置し、非混和性流体（試薬より軽い場合）は一次チャネルのウェルの上部に位置している為、最低でも２つのアクチュエータプレートが必要である（即ち、少なくとも上部と下部のアクチュエータプレートが必要）。即ち、例えば、磁気粒子がウェル底部の試薬に再懸濁され、ウェル上部の非混和性媒体を通り一次チャネルを通って移送され得るように、磁石を空間的に配向させる為には、２つのアクチュエータプレートが必要である。
【０００６】
従って、現行のマイクロ流体デバイスは、油圧ヘッドの高さを増加させる為に、面外オイル試薬容器を必要とし、これによりマイクロ流体デバイスの全体的な高さを増加させる。この為、システムやデバイスに面外オイル試薬容器を実装する為に必要なコンポーネントや部品の数の増加により、組み立てや製造プロセスが複雑になる。従って、マイクロ流体システム及び／又はデバイスで生体材料を処理する為の新しいアプローチが必要である。
【発明の概要】
【０００７】
この発明は、上記従来の技術における課題を解決するためになされたものである。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
本発明の特徴及び利点は、添付の図面と併せて以下の説明からより明確に理解され得るものであるが、図面は必ずしも縮尺通りに描かれている訳ではない。
【図１】ＸＹ平面で操作する為の垂直配向マイクロ流体デバイス及びアクチュエータを含む、本開示のマイクロ流体システムの一例のブロック図である。
【図２Ａ】乃至
【図３】自動アッセイシーケンスを実行する為の定置型マイクロ流体デバイスに関連する回転型アクチュエータの例の斜視図である。
【図４】乃至
【図６】本発明のマイクロ流体システムの一例及び、垂直配向マイクロ流体デバイスをマイクロ流体装置に装填するプロセスを示す斜視図である。
【図７】図４、図５及び図６に示されたマイクロ流体装置の、ハウジングがない状態での詳細を示す等角図である。
【図８】乃至
【図１５】本開示のマイクロ流体システムの、内部で垂直配向マイクロ流体デバイスを処理する為のマイクロ流体装置の別例の様々な図である。
【図１６】乃至
【図２１】ＸＹ平面での動作の為のマイクロ流体カートリッジの一例の様々な図である。
【図２２】乃至
【図２４】ＸＺ平面での動作の為のマイクロ流体装置のアクチュエータプレートに関連するマイクロ流体カートリッジの更なる詳細を示す様々な図である。
【図２５】乃至
【図３４】垂直配向マイクロ流体カートリッジに関連してマイクロ流体装置の回転型アクチュエータプレートを使用するプロセスを示し、回転型アクチュエータプレートが、空間的に配向された磁石を含んでいる、平面図である。
【図３５】本開示のマイクロ流体システムを使用する方法の一例の流れ図である。
【図３６】オンチップサンプルツーアンサー方式ＮＡＡの動作原理を実証する為の例示的なマイクロ流体カートリッジの平面図である。
【図３７】マイクロ流体カートリッジ等のマイクロ流体デバイスにおけるウィックバルブの一例を示す平面断面図である。
【図３８】図３７に示されたウィックバルブのような、ウィックバルブを使用するマイクロ流体カートリッジの一例の平面図である。
【図３９】乃至
【図５１Ｂ】本開示のマイクロ流体装置の別例、及びマイクロ流体装置を、例えば、異なるタイプの垂直配向マイクロ流体カートリッジ及び／又は他のデバイスと組み合わせて使用する例を示す様々な図である。
【図５２】本開示のマイクロ流体装置を使用する方法の別の例の流れ図である。
【図５３】ループ介在等温増幅法（ＬＡＭＰ）の基本原理を示す反応ステップの一例を示す模式図である。
【図５４】トラコマチス及び淋菌の様々な量の初期ＤＮＡテンプレートのリアルタイムＬＡＭＰ増幅曲線の第１のプロット及び第２のプロットを夫々示す図である。
【図５５】被検生物及びＣＴ及びＮＧの検査ライン結果を示す、Ｎｏｖｅｌ Ｄｘ ＣＴ／ＮＧ ＬＡＭＰ Ａｓｓａｙの分析特異性を示した表１７を示す図である。
【図５６】特定のＬＡＭＰ結果のプロットを示す図である。
【図５７】乃至
【図５８】核ラテラルフローアッセイに関する特定の検査結果を示す図である。
【図５９】ＣＴの検出に関するオンチップサンプルツーアンサー方式Ｎｏｖｅｌ Ｄｘ ＣＴ／ＮＧ  Ａｓｓａｙの性能を示した表１８を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本開示の主題は、本開示の主題の全てではないが幾つかの実施形態が示されている添付の図面を参照して、以下により完全に説明される。同一の番号は、全体を通して同一の要素を示す。本開示の主題は、多くの異なる形態で具現化することができ、本明細書に記載された実施形態に限定して解釈されるべきではなく、寧ろ、これらの実施形態は、本開示が適用法的要件を満たすように提供されている。実際、本明細書に記載されている本開示の主題の多くの修正及び他の実施形態は、前述の説明及び関連する図面に提示された教示の恩恵があれば、本開示の主題が属する技術分野の当業者には思い浮かぶであろう。従って、本開示の主題は、開示された特定の実施形態に限定されるものではなく、修正及び他の実施形態が添付の請求項の範囲内に含まれることが意図されていることを理解されたい。
【００１０】
幾つかの実施形態では、本開示の主題は、垂直マイクロ流体デバイスと、自動化された機械的及び／又は磁気的な作動等の自動化されたアクチュエーション機構とを含む、サンプルツーアンサー方式マイクロ流体システム及び方法を提供するものである。
【００１１】
本開示のサンプルツーアンサー方式マイクロ流体システムは、機械的及び磁気的アクチュエーションを使用するサンプルツーアンサー方式マイクロ流体デバイス及び／又はカートリッジを提供し、単一の回転運動を使用して、サンプルツーアンサー方式アッセイシーケンスを定義する複数のアクチュエーションステップを実行する。サンプルツーアンサー方式マイクロ流体システム及びマイクロ流体デバイスは、ＸＺ平面で効率的に動作するように設計されている為、ＸＹ平面で動作している従来のマイクロ流体システム及び／又はデバイスと比較して、マイクロ流体カートリッジ及びアクチュエーション機器に必要なコンポーネント及び／又は組み立てステップの数を減らすことができる。
【００１２】
マイクロ流体デバイスの幾つかの実施形態では、磁場の存在下で磁気粒子を特定のウェルに拘束する為に必要な一次チャネル及びバッフルはＸＺ平面に配向される。その為、マイクロ流体カートリッジは装置内で垂直に（即ち、ＸＺ平面内に）装填され、操作される。ここで、マイクロ流体カートリッジへのオイルの流れを駆動する為に必要な圧力ヘッドを生成する為に、Ｚ軸方向のオイル試薬容器の高さも用いられる。オイル圧力ヘッドの高さを上げる為に、平面外のオイル試薬容器が必要となり、マイクロ流体カートリッジの全体的な高さが増加していた従来のマイクロ流体カートリッジ及び／又はデバイスとは異なり、この独自の実施形態では、オイル試薬容器が主チャネルと同一面内にある為、Ｙ軸方向のカートリッジの寸法を増やすことなく、圧力ヘッドの高さを容易に増加させる。これにより、従来のマイクロ流体カートリッジと比較して、マイクロ流体カートリッジの組み立て及び製造プロセスが大幅に簡素化される。更に、本実施形態では、ウェルの底部にある試薬中に磁気粒子を再懸濁させ、ウェルの上部に位置する非混和性媒体を介して、又、一次チャネルを介して移送することができるように、ＸＺ平面上に磁石を空間的に配向させた、最低限の１つのアクチュエータプレートのみを必要とする。
【００１３】
幾つかの実施形態では、本開示の主題は、ウェル内の流体の圧力ヘッド及び配向を維持する為に定置保持される垂直マイクロ流体デバイスを含む、サンプルツーアンサー方式マイクロ流体システム及び方法を提供する。
【００１４】
更に、本開示の主題は、ループ介在等温増幅法（Ｌｏｏｐ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＬＡＭＰ）プライマーを設計する方法を提供し、より詳細には、クラミジア・トラコマチス（ＣＴ ）／淋菌（ＮＧ）ＬＡＭＰプライマー（又はＣＴ／ＮＧ  ＬＡＭＰプライマー）を設計する方法を提供するものである。
【００１５】
ここで図１を参照すると、自動化されたアクチュエーション機構に関連する垂直配向マイクロ流体デバイスを含む、本開示のマイクロ流体システム１００の一例のブロック図である。マイクロ流体システム１００は、例えば、ポイントオブケア（ＰＯＣ）、サンプルツーアンサー方式アプリケーション及び／又はデバイスをサポートするマイクロ流体システムであってもよい。
【００１６】
例えば、マイクロ流体システム１００は、随意で、ネットワークに接続され得るマイクロ流体装置１１０を含んでもよい。例えば、マイクロ流体装置１１０のコントローラ１２０は、ネットワーク１９２を介してネットワークコンピュータ１９０と通信してもよい。ネットワークコンピュータ１９０は、例えば、任意の集中型サーバ又はクラウドサーバであってもよい。ネットワーク１９２は、例えば、インターネットに接続する為のローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）又はワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）であってもよい。コントローラ１２０は、例えば、汎用コンピュータ、専用コンピュータ、パーソナルコンピュータ、マイクロプロセッサ、又は他のプログラム可能なデータ処理装置であってもよい。コントローラ１２０は、ソフトウェア命令を格納、解釈、及び／又は実行する等の処理能力を提供すると共に、マイクロ流体システム１００の全体的な動作を制御する役割を果たす。
【００１７】
マイクロ流体システム１００のマイクロ流体装置１１０は、垂直配向マイクロ流体デバイス及び／又はカートリッジを受容、保持、及び／又は処理するように設計されている。一例では、マイクロ流体装置１１０は、垂直マイクロ流体デバイス１４０を受容、保持、及び／又は処理する。従って、マイクロ流体装置１１０は、垂直マイクロ流体デバイス１４０を受容し保持する為の受容部１３０を含む。更に、マイクロ流体装置１１０は、垂直マイクロ流体デバイス１４０に関連する回転アクチュエータ１１２を含む。即ち、垂直マイクロ流体デバイス１４０は、ＸＺ平面内に配向して動作するマイクロ流体デバイスを意味する。同様に、回転アクチュエータ１１２は、ＸＺ平面内に、垂直マイクロ流体デバイス１４０に関連して配向される。
【００１８】
回転アクチュエータ１１２は、１つ以上のアクチュエーション機構１１４及び／又は１つ以上の処理コンポーネント１１６を含んでもよい。アクチュエーション機構１１４は、磁気的及び／又は機械的アクチュエーション機構を含んでもよいが、これらに限定されない。処理コンポーネント１１６は、マイクロ流体システム１００及び／又は垂直マイクロ流体デバイス１４０において生体材料を処理する為に必要な任意のコンポーネントであってよい。処理コンポーネント１１６は、例えば、加熱要素、ミキサー、振動要素等を含んでもよい。
【００１９】
更に、マイクロ流体装置１１０は検出システム１２２を含んでもよい。検出システム１２２は、例えば、照明源、干渉フィルタや色ガラスフィルタ等の光学フィルタ、ビームスプリッタやダイクロイックミラー、及び光学測定デバイスを含んでもよい。照明源（図示せず）は、例えば、紫外（ＵＶ）から可視領域（２００〜８００ｎｍ）の光源であってもよく、例えば、紫外光源、白色光源、その他の色の光源、又は、複数の光源の組み合わせであってもよいが、それらに限定されない。光学測定デバイス（図示せず）は、例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）、光検出器、分光器、フォトダイオードアレイ、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。光学測定デバイスは、垂直マイクロ流体デバイス１４０の指定検出領域から光強度の測定値を得る為に使用されてもよい。
【００２０】
コントローラ１２０は、アクチュエーション機構１１４及び処理コンポーネント１１６を伴う回転アクチュエータ１１２、検出システム１２２、及び／又は垂直マイクロ流体デバイス１４０等、マイクロ流体システム１００の様々なコンポーネントに電気的に結合される。コントローラ１２０は、任意のデバイスのデータ及び／又は電力の側面を制御するように構成されプログラムされてもよい。
【００２１】
マイクロ流体システム１００及びマイクロ流体装置１１０において、主な特徴は、垂直マイクロ流体デバイス１４０が計測器内で垂直に（即ち、ＸＺ平面内に）装填され、動作することである。従って、垂直マイクロ流体デバイス１４０の一次流体チャネル（図２５〜図３４参照）はＸＺ平面内に配向される。同様に、磁場の存在下で、例えば磁気粒子を特定のウェルに拘束する為に必要とされる垂直マイクロ流体デバイス１４０のバッフルは何れもＸＺ平面内に配向される。垂直マイクロ流体デバイス１４０では、マイクロ流体デバイスへのオイルの流れを駆動する為に必要な圧力ヘッドを生成する為に、オイル試薬容器のＺ軸方向の高さも使用されている。しかし、オイル試薬容器（図２５〜図３４参照）が一次流体チャネルと同一面内にある為、マイクロ流体デバイスのＹ軸方向の寸法を増加させることなく圧力ヘッドの高さを増加させることが容易になる。ＸＹ平面内で配向され操作される従来のマイクロ流体デバイスと比較して、組み立て及び製造プロセスが大幅に簡素化される。
【００２２】
更に、マイクロ流体装置１１０におけるこの垂直構成は、最小限の１つの回転アクチュエータ１１２のみを使用した動作を可能にし、１つの回転アクチュエータ１１２も、ＸＺ平面内で、垂直マイクロ流体デバイス１４０に関連して配向される。一例では、回転アクチュエータ１１２は、オイル試薬容器又はウェルの底部の試薬に磁気粒子を再懸濁させ、それらを、ウェルの上部の非混和性媒体を介して、更に、一次チャネルを介して、マイクロ流体デバイスの後続のウェル及び反応チャンバに移送する為に使用され得る、その上に空間的に配向された磁石を含んでもよい（図２５〜図３４参照）。別の例では、回転アクチュエータ１１２は、アッセイの特定のステップで特定の流体を分注する為に、例えばブリスターパックやバルーンを粉砕する為に、その表面から突出する空間的に配向された機械的粉砕機能を含んでもよい。
【００２３】
マイクロ流体システム１００では、回転アクチュエータ１１２がマイクロ流体装置１１０に対して回転可能でありながら、垂直配向マイクロ流体装置１１０は、ウェル流体の圧力ヘッド及び流体の配向を維持するように定置保持されている。
【００２４】
マイクロ流体システム１００の回転アクチュエータ１１２及びマイクロ流体装置１１０の主な特徴は、回転運動を使用して、サンプルツーアンサー方式アッセイシーケンスを定義する複数のアクチュエーションステップを実行できることである。例えば、回転アクチュエータ１１２の単一の回転運動は、複数のアクチュエーションステップを実行する為に、空間的に配向された磁石を垂直マイクロ流体デバイス１４０に関連して操作する為に使用されてもよい。従って、ＸＺ平面に配向されたアクチュエータ（例えば、回転アクチュエータ１１２）及びマイクロ流体デバイス（例えば、垂直マイクロ流体デバイス１４０）を含むマイクロ流体システム１００の利点は、マイクロ流体デバイス及び／又はカートリッジ、並びにマイクロ流体装置を製造する為に必要とされるコンポーネント及び組立ステップの数が減少することであり得る。
【００２５】
ここで図２Ａ及び図２Ｂを参照すると、自動アッセイシーケンスを実行する為の定置型マイクロ流体デバイスに関連する回転型アクチュエータの例の斜視図である。一例として、図２Ａは、シャフト２１２を駆動するＤＣモータ２１０を含むアクチュエータアセンブリ２００を示す。アクチュエータアセンブリ２００は、例えば、２つの回転型アクチュエータ２１４を含み、これらは、例えば、ディスク状のプレートであってもよい。更に、２つの回転型アクチュエータ２１４の間には、マイクロ流体デバイス２１６（例えば、マイクロ流体カートリッジ）が配置されており、マイクロ流体デバイス２１６もディスク状である。ＤＣモータ２１０のシャフト２１２は、マイクロ流体デバイス２１６を２つの回転型アクチュエータ２１４に対して定置保持できるように、マイクロ流体デバイス２１６に接続せずに、マイクロ流体デバイス２１６を通過する。即ち、ＤＣモータ２１０は、マイクロ流体デバイス２１６は回転させずに、回転型アクチュエータ２１４を回転させる為に使用され得る。特定のアクチュエーション機構２１８は、マイクロ流体デバイス２１６に最も近い回転型アクチュエータ２１４の表面又はその近くに空間的に配向される。アクチュエーション機構２１８は、受動アクチュエーション機構（例えば、磁石及び破砕機能）及び／又は能動アクチュエーション機構（例えば、抵抗加熱器）を含んでもよい。別の例では、図２Ｂのアクチュエータアセンブリ２００は、正方形又は長方形の静止マイクロ流体デバイス２１６に関連してのみ回転可能な１つのアクチュエータ２１４を含む。
【００２６】
何れの例においても、アクチュエータアセンブリ２００は、水平方向（ＸＹ平面内）に配向しても、垂直方向（ＸＺ平面内）に配向してもよい。更に、回転型アクチュエータ２１４に回転運動を加える代わりに、直線運動を加えて、任意の空間的に配向されたアクチュエーション機構２１８を移動させてもよい。何れにせよ、アクチュエータアセンブリ２００は、単純な回転運動又はスライド運動を使用してアッセイシーケンスに対応する複数のアクチュエーションステップを完了する為に使用され得る小型化されたアッセイ自動化アクチュエータを提供する。例えば、回転型アクチュエータ２１４は、（１）溶解、サンプル処理、精製、フィルタリング、増幅及び検出、（２）チャンバ間での磁気ビーズの捕捉、移送、及び再懸濁、（３）混合及び洗浄、及び（４）サンプル加熱を含むがこれらに限定されない異なる操作を実行する為に、マイクロ流体デバイス２１６の周りで流体を移送する為のオンチップ流体ハンドリング／バルビングに使用され得る。
【００２７】
別の例として、図３は、ドーナツ状の回転型アクチュエータ２１４と組み合わせてマイクロ流体デバイス２１６を含むアクチュエータアセンブリ２００の例を示している。即ち、マイクロ流体デバイス２１６は、ドーナツ状の回転型アクチュエータ２１４の中心孔内に定置保持され、その一方で回転型アクチュエータ２１４は、マイクロ流体デバイス２１６の周りで回転することができる。
【００２８】
図２Ａ、図２Ｂ、及び図３は、１つ以上の回転型アクチュエータ２１４と組み合わせたマイクロ流体デバイス２１６の例を示しているが、これらは例示に過ぎない。一方の要素が他方の要素に対して相対的に移動するＸＹ平面内の任意の動きが可能である。即ち、マイクロ流体デバイス又はアクチュエータの何れかが可動部となり得る。例えば、任意の水平方向の構成において、マイクロ流体デバイス及びアクチュエータの何れか又は両方が可動であり得、運動は、回転運動及び／又は直線運動（図示せず）であり得る。更に、図３で使用されるようなマイクロ流体デバイスは、試薬パウチ等のデバイスの特定のコンポーネントがＸＹ平面に配向され、ウェル及び一次チャネルがシリンダの周方向部分に沿って配向されるように構成されてもよい。
【００２９】
ここで、図４、図５、及び図６を参照すると、本開示のマイクロ流体システム１００のマイクロ流体装置３００の一例、及び垂直配向マイクロ流体カートリッジ４００をそこに装填するプロセスの斜視図である。マイクロ流体装置３００は、図１に示した本開示のマイクロ流体システム１００のマイクロ流体装置１１０の一例である。この例では、マイクロ流体装置３００は、ハウジング３１０（例えば、プラスチック製のツーピースハウジング）、デジタルディスプレイ３１２（例えば、ＬＣＤディスプレイ）と、マイクロ流体カートリッジ４００を受容する為のものであり、マイクロ流体装置３００にスライド可能に結合されている装填ステーション３１４と、マイクロ流体カートリッジ４００を装填ステーション３１４に固定する為のロッキングヒンジ３１６と、マイクロ流体装置３００の内部コンポーネントをマイクロ流体カートリッジ４００に係合させる為のロッキングハンドル３１８と、ロッキングハンドル３１８を操作する為のハンドルシャフト及びヨークアセンブリ３２０とを含み、ロッキングハンドル３１８は、外向き及び内向きにスイングするベイルスタイルのハンドルである。ロッキングハンドル３１８は、マイクロ流体装置のロック／クランプ機構の一例である。ロッキング／クランピング機構の別の例は、図８から図１５及び図３９〜図５１Ｂを参照して本明細書に図示され、説明される。
【００３０】
装填ステーション３１４は、システムで使用されているカートリッジ又はカセットのタイプに合わせてカスタマイズされてもよい。一例では、装填ステーション３１４は、ラテラルフローイムノアッセイカセットが機器に挿入された時に、カートリッジに保持されたストリップの定性又は定量デジタル読み出しを実行して検査結果を画面に表示し、装置又はクラウドに保存できるように、光学検出システムの前に整列して配置されるようにカスタマイズされてもよい。別の例では、装填ステーション３１４は、ダイレクト増幅（Ｄｉｒｅｃｔ−ｔｏ−Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）サンプルツーアンサー方式ＮＡＡTカートリッジに適合するようにカスタマイズされてもよく、ダイレクト増幅サンプルツーアンサー方式ＮＡＡTカートリッジではサンプル調製及び精製ステップが迂回されてもよく、粗製ライセート又は希釈ライセートは、増幅及びその後のラテラルフローストリップの増幅産物の検出の為に増幅ウェルに直接入るようにされてもよい。サンプルは、磁気ビーズに結合され、磁気ビーズが次に一次チャネルを通って増幅ウェルに移送されるか、又はサンプルウェルがオーバーフローするように充填され、それが増幅ウェル内へと計量され、そこで増幅ミックスの凍結乾燥ペレットを再水和させてもよい。更に別の例では、装填ステーション３１４は、イムノアッセイに基づくマイクロ流体カートリッジを投入するようにカスタマイズされてもよく、カートリッジは、サンプルをラテラルフローストリップに自動分注する前にサンプルを調整する為にサンプルに導入する必要があるバッファを収容した１つ以上の試薬パウチを含む。更に別の実施形態（図示せず）では、装填ステーション３１４は、異なるサイズのマイクロ流体カートリッジ又はカセットをスライド及びロックするように調整可能なスライダを含んでもよい。幾つかの実施形態では、装填ステーションは、そこに挿入されたカートリッジの種類を自動検出する為のセンサを含んでいてもよい。これは、カートリッジ上のＲＦＩＤもしくはＮＦＣタグによるもの、又はカートリッジが装填ステーションに挿入された時に装填ステーションによって自動的に読み取られるバーコード又はＱＲコード（登録商標）の使用によるものであってもよい。装填ステーション３１４のこれらのカスタマイズ可能な機能により、本明細書に記載されたマイクロ流体アッセイ自動化システムは、包括的な検査メニューから多数の異なるタイプのラボ検査を実行することができるように、非常に多目的である。
【００３１】
マイクロ流体カートリッジ４００を垂直配向様式でマイクロ流体装置３００に装填する第１のステップでは、マイクロ流体装置３００が開かれ、マイクロ流体カートリッジ４００がそこに装填される。例えば、図４は、ロックハンドル３１８がハウジング３１０から離れて外側に引き出され、装填ステーション３１４がハウジング３１０から完全にスライドしている状態を示している。更に、ロッキングヒンジ３１６は、完全に開いた状態又はラッチされていない状態である。マイクロ流体カートリッジ４００は、装填ステーション３１４のレールに挿入する為に配置される。
【００３２】
マイクロ流体カートリッジ４００を垂直配向様式でマイクロ流体装置３００に装填する次のステップで、サンプルがマイクロ流体カートリッジ４００に装填される。例えば、図５は、マイクロ流体カートリッジ４００が装填ステーション３１４のレールに取り付けられ、ロッキングヒンジ３１６がラッチされた状態で、マイクロ流体カートリッジ４００と完全に係合している状態を示している。更に、シリンジ４５０は、マイクロ流体カートリッジ４００の装填ポート４２２に挿入する為に配置されている。
【００３３】
マイクロ流体カートリッジ４００を垂直配向様式でマイクロ流体装置３００に装填する次のステップで、マイクロ流体装置３００が閉じられ、アッセイシーケンスが開始される。例えば、図６は、マイクロ流体カートリッジ４００の装填ポート４２２に挿入され、流体結合されたシリンジ４５０の先端を示している。マイクロ流体カートリッジ４００及びシリンジ４５０を保持している装填ステーション３１４は、内側にスライドしてハウジング３１０内に入る。装填ステーション３１４の完全な内側への移動に達すると、ロックハンドル３１８が内側に押し込まれてロックされる。このロックハンドル３１８、ハンドルシャフト及びヨークアセンブリ３２０の状態では、マイクロ流体装置３００の特定の内部コンポーネントが、マイクロ流体カートリッジ４００の特定の機能と係合する。マイクロ流体カートリッジ４００はこの時点で、回転型アクチュエータプレート（図７〜図１５参照）に対して垂直に保持されており、自動アッセイシーケンスがＸＺ平面内で発生し得る。マイクロ流体装置３００の制御装置を使用して、ユーザは、この時アッセイシーケンスを開始することができる。マイクロ流体装置３００のより詳細な情報は、図７〜図１５を参照して以下に図示し説明する。
【００３４】
ここで図７を参照すると、図４、図５、及び図６に示されたマイクロ流体装置３００の、ハウジング３１０が無い状態の、その詳細を示す等角図である。デジタルディスプレイ３１２、装填ステーション３１４、ロッキングヒンジ３１６、ロッキングハンドル３１８、ハンドルシャフト及びヨークアセンブリ３２０に加えて、マイクロ流体装置３００は更に、下部ベースプレート３２２と、上部ベースプレート３２４と、例えば、ＤＣモータ、ギアボックス、シャフト、及びモータプレート３２８に取り付けられた駆動ハブを含むモータアセンブリ３２６と、開口部３３２を有するアクチュエータプレート３３０と、バルーン及びブリスターパックを粉砕する為のクラッシャープレート３３４と、カムフォロア３５８と、シーケンシャルバーストプランジャ３６０とを含む。
【００３５】
開口部３３２を有するアクチュエータプレート３３０は、図１に示した本開示のマイクロ流体システム１００の回転アクチュエータ１１２の一例であり、開口部３３２は、アクチュエーションコンポーネント１１４及び／又は処理コンポーネント１１６を取り付ける為の位置である。
【００３６】
マイクロ流体装置３００の幾つかの他のコンポーネントは、図７には見えていない。主要なコンポーネントの幾つかは、ＬＥＤ光源、カメラ、加熱器、制御プリント回路基板（ＰＣＢ）、シーケンシャルバーストカム等を含んでもよいが、これらに限定されない。一般に、マイクロ流体装置３００は、ハンドル、プレート、パネル、バー、ロッド、シャフト、ブラケット、ブロック、スペーサ、ハブ、カラー、クランプ、ブッシング、ベアリング、ピン、ダボ、カム、アライナー、ネジ、ナット、ボルト、ワッシャー、スプリング、クリップ、任意のタイプの機械的コネクタ、任意のタイプの電気的コネクタ、センサ、アクチュエータ等の多種多様なコンポーネントを含んでもよいが、これらに限定されない。
【００３７】
次に図８〜図１５を参照すると、内部で垂直配向したマイクロ流体デバイス（例えば、マイクロ流体カートリッジ４００）を処理する為の、本開示のマイクロ流体システム１００のマイクロ流体装置３００の別例の様々な図である。図８から図１５に示すマイクロ流体装置３００は、他の幾つかの些細な差異の中でも取り分け、ハンドルとディスプレイの実装を除いて、図７に示したマイクロ流体装置３００と実質的に同じである。
【００３８】
マイクロ流体装置３００のこの例の、図８は正面等角図、図９は背面等角図、図１０は正面図、図１１は背面図、図１２は左側面図、図１３は右側面図、図１５は上面図、及び図１５は底面図である。これらの図では幾つかの追加コンポーネントが見える。即ち、マイクロ流体装置３００のこの例は、デジタルディスプレイ３１２、装填ステーション３１４、ロッキングヒンジ３１６、ロッキングハンドル３１８、ハンドルシャフト及びヨークアセンブリ３２０、下部ベースプレート３２２、上部ベースプレート３２４、モータアセンブリ３２６、モータプレート３２８、開口部３３２を有するアクチュエータプレート３３０、クラッシャープレート３３４、カムフォロワ３５８、シーケンシャルバーストプランジャ３６０、ノブ３４０を備えたブリスタークラッシュハンドル３３８、ハンドルラッチフック３４２、装填ステーションサポート３４４、ＬＥＤ光源３４６、カメラ３４８、加熱器センブリ３５０、制御ＰＣＢ３５２、パワーマウントプレート３５４、及びシーケンシャルバーストカム３５６を含む。繰り返すと、マイクロ流体装置３００は、ハンドル、プレート、パネル、バー、ロッド、シャフト、ブラケット、ブロック、スペーサ、ハブ、カラー、クランプ、ブッシング、ベアリング、ピン、ダボ、カム、アライナー、ネジ、ナット、ボルト、ワッシャー、スプリング、クリップ、任意のタイプの機械的コネクタ、任意のタイプの電気的コネクタ、センサ、アクチュエータ等の多種多様なコンポーネントを含み得るが、これらに限定されない。
【００３９】
更に、この例では、ブリスタークラッシュハンドル３３８はクラッシャープレート３３４に結合されており、これは、マイクロ流体カートリッジ４００に分注する液体（例えば、試薬溶液、バッファ、オイルフィラー液等）を保持しているマイクロ流体カートリッジ４００上の、例えばブリスターパック及び／又はバルーンのフランジブルシールを破裂させる為に使用される。
【００４０】
ここで図１６から図２１を参照すると、例えば図４、図５、及び図６に示されているように、ＸＺ平面における組み立て及び動作の為のマイクロ流体カートリッジ４００の一例の様々な図である。マイクロ流体カートリッジ４００は、図１に示す本開示のマイクロ流体システム１００の垂直マイクロ流体デバイス１４０の一例である。一例では、マイクロ流体カートリッジ４００は、ＮＤｘ分子カートリッジであってもよい。具体的には、マイクロ流体カートリッジ４００の本実施例の、図１６は正面等角図、図１７は背面等角図、図１８は正面図、図１９は背面図、図２０は端面図、図２１は上面図と底面図である。
【００４１】
この例では、マイクロ流体カートリッジ４００は、サンプルツーアンサー核酸増幅検査（ＮＡＡＴ）を行うように設計されており、フランジブルシールによってマイクロ流体カートリッジ４００への入口から分離されている１つ以上の個別の試薬パウチ４１２、４１４、４１６及び他のパウチ４１７（例えば、洗浄バッファ）を含む１つ以上の試薬パウチパネル４１０と、ウェル４１８（例えば、結合ウェル、洗浄ウェル）と、ウェルを相互接続する一次チャネル４２０（図１７参照）と、サンプル装填ポート４２２と、サンプルフィルタ及びハウジング４２４と、ラテラルフローストリップハウジング４２６と、試薬で満たされたことを検出する為のラテラルフローストリップ４２８を含む。幾つかの実施形態では、試薬パウチパネルは、１つ以上の「フロースルー試薬パウチ」４１４、即ち、１つ以上の入口ポート４３０及び１つ以上の出口ポート４３２を含み、それによって、マイクロ流体カートリッジ４００と一体化しフランジブルシールを破裂させると、サンプルはマイクロ流体カートリッジ４００内に分注されて、入口ポート４３０を通ってパウチ内に流れ、出口ポート４３２を通って外に出ることができる。或いは、マイクロ流体カートリッジ４００と一体化すると、マイクロ流体デバイス上の別のパウチ又は別のリザーバ／ウェルからの試薬が、入口ポート４３０を通ってパウチ内に流れ、出口ポート４３２を通ってマイクロ流体デバイス上の別の地点に出ることができる。幾つかの実施形態では、フロースルー試薬パウチは試薬を収容していてもよく、それによって、入口ポートに流れる液体は、出口ポートを通ってマイクロ流体カートリッジ４００上のマイクロ流体ウェルに流れる時に、フロースルー試薬パウチの内容物と混合し、それによって調整される。試薬パウチ４１４は、それを通って流れる試薬を混合／調整する為の試薬を含むフロースルー試薬パウチの一例である。フロースルーパウチに収容される試薬は、液体、気体、又は固体形態の試薬であってもよい。幾つかの実施形態では、フロースルー試薬パウチは、マイクロ流体カートリッジ４００と一体化し、フランジブルシールを破裂させる際に、パウチがマイクロ流体カートリッジ４００上の空気に開放された導管を介して通気され、その内容物がマイクロ流体カートリッジ４００のウェルに通じる１つ以上の出口ポートを介してマイクロ流体カートリッジ４００内に空けられ得るように設計されてもよい。
【００４２】
幾つかの実施形態では、フロースルー試薬パウチの入口ポート４３０は、マイクロ流体カートリッジ４００との一体化時に、空気口又は空気入口に接続されてもよく、その結果、空気を用いてフロースルー試薬パウチ内に収容された流体を変位させて、その内容物を、フランジブルシールが破裂した時に、出口ポート４３２を介してマイクロ流体カートリッジ内に空けることができる。幾つかの実施形態では、フロースルー試薬パウチは、オイル／非混和性試薬を含んでもよい。
【００４３】
図１６〜図２１に示す例示的な実施形態では、オイル／非混和性試薬は、２つの位置「Ａ」及び「Ｂ」に存在するフランジブルシール及びラプチャーボールを備えたフロースルー試薬パウチ、即ちオイル／非混和性試薬パウチ４１６に格納される。「Ａ」はマイクロ流体カートリッジを介して通気口（図示せず）に接続され、アッセイのイベントシーケンスにおける所望の時間に開くように破裂させることができるように、フランジブルシールによって分離される。「Ｂ」はカートリッジの一次チャネル４２０に接続されており、「Ａ」と「Ｂ」の両方のポイントでフランジブルシールが破裂すると、パウチが通気し、オイル／非混和性液体が一次チャネル４２０を通じてカートリッジ内に放出され、ウェル内の試薬の上にオーバーレイを形成し、一次チャネルを完全に満たすようになっている。オイル／非混和性試薬パウチ４１６は、パウチ内の圧力ヘッドが、出口Ｂからカートリッジの一次チャネル４２０に試薬を送り出す為に使用されるように設計されている。独自の実施形態では、オイル／非混和性試薬パウチ４１６のフロースルー態様及び圧力ヘッドは、１つ以上の試薬パウチから順次又は並行して、夫々の出口ポートを介してマイクロ流体カートリッジ４００に流体を送り出す為に利用されてもよい。この独自の実施形態では、試薬をパウチから絞り出す為の機械的な圧縮力は必要ないことに留意することが重要である。寧ろ、流体自体の圧力ヘッドや、オイル／非混和性試薬の圧力ヘッドが、試薬をパウチからマイクロ流体カートリッジ４００内へと変位させる為に使用される。
【００４４】
マイクロ流体カートリッジ４００において、オイル／非混和性試薬パウチ４１６は、オイル／非混和性試薬パウチの内容物をマイクロ流体カートリッジ４００のウェルの中に押し出す為に圧力ヘッドが生成され得るように、ウェルに対してより高い位置に配置される。圧力ヘッドを使用して粘性の油相をマイクロ流体カートリッジ４００に充填するこの方法は、マイクロ流体デバイスの性能に重要な、滑らかで気泡のない油オーバーレイ相をもたらす。プランジャを使ってパウチを物理的に変形させ、オイル／非混和性試薬の内容物をパウチから絞り出す等、パウチに他の形態の圧力を加えることもできるが、パウチを押し潰す為に物理的な圧力を加えるこれらの方法では、絞り出しの際のカートリッジ内の気泡の発生の排除に関しては信頼性が低いことが実証されていることに留意されたい。
【００４５】
気泡は、マイクロ流体デバイスに壊滅的被害をもたらし、液体の計量量や流れに不整合が生じる等、精度や信頼性に問題を引き起こす可能性がある為、気泡の形成を最小限に抑える流体処理方法を使用することが有益である。本明細書で言及する実施形態の場合、気泡は、一次チャネルを通る磁気ビーズの経路に沿ってエアポケット／気泡が生じる為、サンプル処理中の磁気ビーズの移送及び回収に影響を与える可能性がある。３ＭリキセルＭＭ（Ｌｉｑｕｉ−Ｃｅｌ  ＭＭ）シリーズメンブレンコンタクター（３Ｍ社製、インラインメンブレンデバブラー）等のデバブラーを使用することは可能であるが、これらはシステムの組み立てやコンポーネントの要件を複雑にする。更に、これらは、適切に動作する為には、真空又は圧力差によって駆動される必要がある。
【００４６】
幾つかの実施形態では、フロースルー試薬パウチは、マイクロ流体カートリッジ４００上の或る点から別の点への流体フローの再誘導を制御する為の単回使用バルブとして使用されてもよい。マイクロ流体カートリッジ４００の流体処理にこのタイプのバルブシステムを使用する利点は、流体処理に一般的に使用される他のタイプのバルブと比較して、複雑さが極めて軽減されること、並びにフロースルー試薬パウチの組み立て及び製造にかかるコストの軽減である。図１６〜図２１に示す例示的な実施形態では、フロースルー試薬パウチバルブ４３４は、マイクロ流体デバイス上のウェルに接続され、フランジブルシールによって分離された、ラプチャーボールを有する入口ポート（図示せず）と、マイクロ流体デバイス上の通気口（図示せず）に接続された、ラプチャーボールを有する出口ポート（図示せず）とを含む。この実施形態では、最終ウェルからの試薬は、フロースルー試薬パウチバルブ４３４が入口ポート（図示せず）及び出口ポート（図示せず）で破裂した時に、マイクロ流体カートリッジ４００上のラテラルフローストリップ上に流れるように向けられる。
【００４７】
幾つかの実施形態では、フロースルー試薬パウチは、フロースルー試薬がそれに導入され得る別の試薬と混合された時に、又はフロースルー試薬パウチ内に収容された試薬がフランジブルシールによって開かれた通気口を介して空気に曝された時に引き起こされる発熱反応を含み、マイクロ流体デバイス上の所望の場所に電気を使わない加熱を提供するように設計されてもよい。幾つかの実施形態では、フロースルー試薬パウチのうち１つ以上は、気体放出化学物質を含むように設計されて、その結果、マイクロ流体カートリッジとの一体化及びフランジブルシールの破裂時に、気体の生成を用いて試薬パウチからマイクロ流体カートリッジ４００内に試薬を押し出すようにしてもよい。
【００４８】
ウェルの上及び一次チャネル内のオイルの層によって生成される圧力ヘッドの効果は、アッセイステップを実行する為に、マイクロ流体デバイス上の１つのポイントから別のポイントに試薬又は処理されたサンプルを効果的に移送する為にも使用され得る。例えば、マイクロ流体カートリッジ上の増幅ウェルは、フロースルー試薬パウチを介して、増幅産物の検出の為にラテラルフローストリップに接続されてもよく、フロースルー試薬パウチの一端は増幅ウェルに接続されてもよく、他端はラテラルフローストリップのサンプルパッドに接続されてもよい。フロースルー試薬パウチの２つの端部が破裂した場合、オイルの圧力ヘッドは、検出の為にフロースルー試薬パウチを介して増幅産物をラテラルフローストリップに押し出すことができる。水性試薬のみを選択的にラテラルフローストリップに進入させ、油がラテラルフローストリップに進入してアッセイ及びフロー特性に影響を与えるのをブロックすることが望ましい独自の実施形態では、親油性及び疎水性の吸収パッド及び／又はオイルと接触すると膨らむ材料が、流体経路に沿って、又はフロースルーパウチの内部に存在してもよい。これらのタイプの材料の幾つかの例は、シリコーン、エチレンプロピレンジエン変性（ＥＰＤＭ、ＥＰＭ）、ブチル、天然ゴム等のエラストマー、及び疎水性親油性吸収パッド、吸着剤、ナノファー、シラン分子でコーティングされたポリウレタンスポンジ等のオイルウィッキングスポンジ、オイル吸収ゲル、ペトロゲル又はポリオレフィンベースの疎水性吸収剤等の選択的に吸収処理された材料を含み、これらに限定されない。エラストマー素材は耐薬品性が無い為に一般にオイルに侵されて膨らむが、吸収材は自重の何倍ものオイルを吸収し、その過程で膨張する。これにより、水性の液体が通ることを可能にしながらオイルを選択的に吸い上げる。この過程で材料が膨潤又は膨張することで、フロースルーパウチの入口及び出口ポートを塞ぎ、油がラテラルフローストリップのサンプルパッドに到達するのを防ぐ。
【００４９】
ここで、図２２、図２３、及び図２４を参照すると、ＸＺ平面での動作の為のマイクロ流体装置３００のアクチュエータプレート３３０に関連するマイクロ流体カートリッジ４００の更なる詳細を示す様々な図である。即ち、図２２及び図２３は斜視図であり、一方、図２４は上から見た図又は図８〜図１５に示したマイクロ流体装置３００の一部である。モータアセンブリ３２６を使用することにより、アクチュエータプレート３３０は、マイクロ流体カートリッジ４００に対して回転可能であり、マイクロ流体カートリッジ４００は定置保持される。
【００５０】
次に図２５〜図３４を参照すると、垂直配向マイクロ流体カートリッジに関連してマイクロ流体装置３００の回転型アクチュエータプレート３３０を使用するプロセスを示す平面図であり、回転型アクチュエータプレート３３０は空間的に配向された磁石を含む。図２５〜図３４に示すプロセスは、磁気ビーズベースのサンプル処理の一例である。「磁気ビーズ」又は「ビーズ」は、磁気的に反応するビーズを意味する。このプロセスは、アクチュエータプレート３３０に関連してマイクロ流体カートリッジ５００を使用し、マイクロ流体カートリッジ５００とは、説明のみを目的としたマイクロ流体カートリッジの一般的な表現である。
【００５１】
この例では、オンチップ磁気ビーズベースのサンプル処理は、磁気ビーズの捕捉、再浮遊、及び移送が行われる間、アクチュエータプレート３３０の単回の回転動作を使用して行われる。これは、図２５〜３４に示すように、空間的に配向した磁石を含むアクチュエータプレート３３０を用いて達成される。即ち、アクチュエータプレート３３０は、磁石１、２、３、４、５、６及び７を含む。
【００５２】
マイクロ流体カートリッジ５００の一次チャネルは１つのウェルを別のウェルに接続する。この例では、一次チャネルは、その上にバッフルと呼ばれる機能を有しており、これは、磁気粒子を所望の位置に拘束し、磁場に向かって移動するのを防止する物理的障壁として作用する。これらのバッフルは、移送磁石（２、４、６）が磁気ビーズ粒子をウェルからウェルへ移動させる際に、磁気ビーズ粒子を捕捉する。試薬捕捉／再懸濁磁石（３、５、７）は、ビーズがそのウェル内の試薬に懸濁されるように、ビーズをウェル内に引き下げる。磁石１は、第１のウェル内でビーズを捕捉し、ウェル内の中間でビーズを収集して、ビーズが磁石２によって容易に捕捉され、一次チャネルを介してウェル２に移送され得るようにする為に使用される追加の磁石である。磁気ビーズと接触する一次チャネルとウェルの壁は、フルオロアクリルコポリマー等の疎水性コーティングでコーティングされている。これは、サイトニックス社（Ｃｙｔｏｎｉｘ  ＬＬＣ）（メリーランド州ベルツビル）によって製造された疎水性コーティングのフルオロペル（ＦｌｕｏｒｏＰｅｌ）（商標）ファミリーから選択されてもよい。このコーティングは、３Ｍノベック（３Ｍ  Ｎｏｖｅｃ）ファミリーのフッ素系ポリマーコーティング、例えばノベック−１９０８クリアコーティング、又はエレクトロルーブ社（Ｅｌｅｃｔｒｏｌｕｂｅ）製のＦＰＣ等のフッ素系ポリマーコーティングであってもよい。
【００５３】
図２５〜図３４は、反時計回りに回転している回転アクチュエータプレート（例えば、アクチュエータプレート３３０）を用いた磁気ビーズベースのサンプル処理のステップを以下のように示している。なお、アクチュエータプレート３３０を駆動しているモータ（図示せず）は、磁石を再利用する為に時計回りにも回転できる。
【００５４】
ホームポジション又はニュートラルポジションにおいて、図２５は、磁石１〜７が、充填中の相互作用を避ける為に、マイクロ流体カートリッジ５００の処理領域から離れて配置されていることを示している。
【００５５】
次に、図２６において、磁石１は、第１のウェル内のビーズを捕捉する。
【００５６】
次に、図２７において、磁石２は、第１のバッフルへの一次チャネルにビーズを引き込む。
【００５７】
次に、図２８において、磁石３はビーズを第２のウェルに引き込む。
【００５８】
次に、図２９において、磁石４はビーズを第２のバッフルへの一次チャネルに引き込む。
【００５９】
次に、図３０において、磁石５はビーズを第３のウェルに引き込む。
【００６０】
次に、図３１において、磁石６はビーズを一次チャネルに引き込む。
【００６１】
次に、図３２において、磁石６はビーズを一次チャネルを通して第３のバッフルに引き込む。
【００６２】
次に、図３３において、磁石７はビーズを第４のウェルに引き込む。
【００６３】
次に、図３４において、磁石はホームポジションに戻される。
【００６４】
図３５は、本開示のマイクロ流体システム１００を使用する方法６００の一例の流れ図を示す。方法６００は、サンプルツーアンサー動作シーケンスの一例であり、試薬の分注は、ユーザによって完了したカートリッジプロセスの単純な装填の間に完了する。方法６００は、試薬パウチを作動させる為に、ユーザがマイクロ流体カートリッジをマイクロ流体装置に装填することを利用する。方法６００は、以下のステップを含み得るが、これらに限定されない。
【００６５】
ステップ６１０で、サンプルがマイクロ流体デバイスに装填される。例えば、サンプル流体を収容したシリンジ４５０は、例えば、図５及び図６に示したように、マイクロ流体カートリッジ４００の装填ポート４２２に結合される。次に、サンプルをマイクロ流体カートリッジ４００に分注する。
【００６６】
ステップ６１５で、マイクロ流体デバイスがマイクロ流体装置に挿入される。例えば、マイクロ流体カートリッジ４００は、例えば、図４、図５、及び図６に示すように、マイクロ流体装置３００の装填ステーション３１４に挿入される。次いで、マイクロ流体装置３００のロックハンドル３１８又はブリスタークラッシュハンドル３３８をクランプして閉じ、それによって、必要な試薬をカートリッジ上の夫々のウェルに粉砕して分注する。
【００６７】
ステップ６２０で、アッセイサンプル調製プロセスが開始される。例えば、ユーザは、マイクロ流体装置３００上のボタンを押すことによって「開始」コマンドを入力し、アッセイサンプル調製、増幅、及びラテラルフローベースの検出ステップを開始する。
【００６８】
ステップ６２５で、アッセイサンプル調製プロセスは、両方ともＸＺ平面内で動作するマイクロ流体デバイス及び自動回転アクチュエータを用いて実行される。例えば、アッセイサンプル調製プロセスは、両方ともＸＺ平面内で動作するマイクロ流体装置３００内のマイクロ流体カートリッジ４００及び自動回転アクチュエータプレート３３０を用いて実行される。ＸＺ平面で動作するシーケンスの一例は、図２５〜図３４を参照して本明細書で説明したプロセスステップである。
【００６９】
ステップ６３０で、マイクロ流体装置（例えば、マイクロ流体装置３００）は、処理が完了したことを示す。例えば、アッセイ結果の準備ができた時に、ユーザは可聴器又はモバイル通知によってアラートされる。結果は、携帯電話で、又は例えばマイクロ流体装置３００のデジタルディスプレイ３１２上で直接、ユーザに表示されてもよい。
【００７０】
オンチップサンプルツーアンサー方式ＮＡＡＴの動作原理
図３６に示す例示的なマイクロ流体カートリッジ７００を参照して、オンチップサンプルツーアンサー方式ＮＡＡＴの動作原理を以下のように説明することができる。
【００７１】
磁気ビーズベースのサンプル調製試薬、増幅用再水和バッファ、磁気粒子及びオイル等のアッセイを行う為に必要な試薬は、夫々の単位用量試薬パウチに収納される。この例示的な実施形態で使用される磁気粒子はチャージスイッチ磁気ビーズ（カリフォルニア州カールスバッドのサーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））である。本実施形態で使用する磁気粒子は、核酸の精製を容易にする為に、核酸に対する親和性がｐＨに依存する独自のイオン化官能基を有する。磁気ビーズはフロースルー試薬パウチに収納されており、容易な再懸濁と、結合バッファやサンプルとの混合を促進する。代わりに、核酸及びイムノアッセイ又はタンパク質抽出プロトコル両方に利用可能なダイナビーズを利用してもよい。
【００７２】
例示的な実施形態において、図３６に示すマイクロ流体カートリッジ７００を続けて参照すると、アッセイは以下のように行われる。
【００７３】
サンプルの導入：最初にサンプルライセートを、サンプル入口を介してサンプル移送シリンジを用いてカートリッジに導入する。シリンジのプランジャを押すと、サンプルはプレフィルタディスクを介して分注され、これによりサンプルから阻害物質がろ過され、ライセート中のＤＮＡを通過させる。分注ステップ後、シリンジはカートリッジに接続されたままであることで、逆流を防ぐと共にサンプル入口ポートを閉状態に保つ。本実施形態では、５００ｕｌのサンプルライセートがカートリッジに導入される。
【００７４】
試薬の分注／充填：カートリッジは、次に装置に挿入され、装置への挿入行為によって、フランジブルフォイルシールを破裂させるようにラプチャービーズにアクチュエーション力が加えられ、次に、試薬パウチを押し潰して、そこから液体を分注させる。図３６に示すように、結合バッファ試薬の流体経路は、効果的に流れて磁気粒子と混合し、再懸濁させるように、磁気粒子のフロースルーパウチに接続されている。通常、２０ｕｌ以下の磁気粒子が使用される為、デッドボリュームの制約により、ビーズを正確に分注し、十分に再懸濁させることが困難である。フロースルーパウチは、ビーズが流れて溶解／結合ウェル内のサンプルと混合する際に、ビーズを結合バッファに再懸濁させることで、これらの問題を解決する。同時に、洗浄、増幅、再水和バッファが夫々のウェルに分注され、オイル試薬が分注される。オイル試薬のパウチは、通気口に接続するラプチャービーズと、マイクロ流体カートリッジの一次チャネルへの流路に接続するラプチャービーズとを含むフロースルー試薬パウチである。オイルの流れは、一次チャネルの上にあるオイル試薬パウチの高さによる圧力ヘッドによって駆動される。オイルの粘度と流路の長さにより、オイルは他の試薬パウチが粉砕され分注された後に一次チャネルに入るように設計されている。オイルは一次側の流路を順次満たし、それによって各ウェルの上に均一な油相オーバーレイが形成され、各ウェルは非混和性油相によって他のウェルから分離される。増幅ウェルは、凍結乾燥した増幅マスターミックスをビーズの形で含み、それは、増幅ウェルの小バンプアウトキャビティに捕捉される。３００μｌの結合バッファ＋２０μｌの磁気ビーズ、２００μｌの洗浄バッファ×２、及び５０ｕｌの分子グレードの水又は増幅バッファを、溶解／結合、洗浄１、洗浄２、及び増幅ウェルに夫々分注する。幾つかの実施形態では、結合バッファは、マイクロ流体デバイス上の乾燥フォーマットのチャンバ又はウェルに存在してもよく、サンプル又はライセートは、再水和してそれと混合するようにそれを介して流れてもよい。ＮＡＡＴのように正確なピペッティングを必要とするアッセイでは、５０μｌの再水和バッファ（分子グレードの水）を５％以下の誤差で正確に分注する必要がある。分注量の正確さを確保する為に、５０μｌのミネラルオイルを、５０μｌの分子グレードの水又は増幅バッファと一緒に再水和バッファのパウチに分注する。オイルは水の上に浮き、それによって水は再水和パウチの狭い出口からチップに押し出される。このようにして、オイルがパウチ内のデッドボリュームと増幅ウェルに至るチャネルを満たし、凍結乾燥した増幅マスターミックスペレットを正しく再水和させる為に必要な水を正確に計量することができる。
【００７５】
磁気ビーズベースのサンプル調製：図３６に示すように、オンチップ磁気ビーズベースのサンプル処理は単一の回転動作を用いて行われ、その回転運動中に磁気ビーズの捕捉、再懸濁及び移送が行われる。磁気ビーズと結合バッファの混合物は、溶解／結合ウェルに入り、ウェルに分注された５００μｌのライセートと混合する。必須ではないが、サンプルと結合バッファの追加混合が望まれる場合、幾つかの実施形態では、前後の回転運動を用いてサンプルを撹拌してもよい。ビーズは、ウォッシュ１及びウォッシュ２のウェルで２回洗浄された後、増幅器ウェルで増幅ミックスに再懸濁され、そこでビーズは増幅ミックスに直接溶出される。核酸の増幅には、様々な増幅法が用いられる。等温増幅法は、結果が出るまでの時間が短く、阻害剤が存在しても安定しており、単一の低温要件故に全体的消費電力を低減する為、ポイントオブケア・アプリケーションとして非常に魅力的である。ループ介在等温線増幅法ＬＡＭＰは、良く知られた等温線増幅法である。増幅ミックスのｐＨは８．８で、チャージスイッチ磁気ビーズを用いたＤＮＡの溶出に適している。代替的に、ＰＣＲ熱サイクルを利用して増幅することもできる。
【００７６】
増幅：サンプル調製に続いて、増幅ウェルは、装置に存在する加熱器及び／又は増幅ウェルに近接する外熱／相変化化学反応を用いて、増幅に適した温度に加熱される。ＬＡＭＰ等の等温増幅法では、温度は〜６５℃まで上昇する。
【００７７】
ラテラルフロー検出：密封されたハウジング内のラテラルフローストリップが、マイクロ流体カートリッジ上に存在する。増幅産物を検出する準備が整うと、「ラテラルフローストリップへのフロースルーパウチ」と「通気口へのフロースルーパウチ」を同時に破裂させ、ラテラルフローストリップを増幅ウェルに接続して通気させる。この場合、オイルの圧力ヘッドにより、増幅産物が増幅ウェルから、「ラテラルフローストリップへのフロースルーパウチ」を通してラテラルフローストリップのサンプルポートに押し出される。ラテラルフローストリップへのフロースルーパウチの出口は、ラテラルフローストリップのサンプルパッドのサンプル入口ポートに位置する。親油性で疎水性のウィッキングパッドが、増幅産物のラテラルフローストリップへの経路に沿って存在し、それが選択的に油を吸い上げ、増幅産物のみがラテラルフローストリップに入ることを可能にするようにする。幾つかの実施形態では、親油性ウィッキングパッドは、ラテラルフローストリップへのフロースルーパウチの内部に存在してもよい。幾つかの実施形態では、親油性ウィッキングパッドは、ラテラルフローストリップへのサンプルパッドの入口に存在してもよい。幾つかの実施形態では、密封されたラテラルフローストリップのハウジングは、直接通気されてもよいし、マイクロ流体デバイス上の通気口に接続されてもよい。通気口は、空気を選択的に通過させるが、液体が自己完結型マイクロ流体デバイスの外に出るのを阻止する半透膜フィルタ又は膜であってもよい。
【００７８】
ここで図３７を参照すると、マイクロ流体カートリッジ８００等のマイクロ流体デバイスにおけるウィックバルブ８００の一例を示す平面図及び断面図である。ウィックバルブ８００は、例えば、マイクロ流体カートリッジ８００等のマイクロ流体カートリッジにおいて、分注液のデッドボリューム／損失をゼロにして、液体を分注／移送する為に使用される。このアプリケーションは、バルブ内の液体の損失がないことにつながる、非常に少量の液体の分注に最適である。
【００７９】
ウィックバルブ８００の動作は、分注対象液体に非混和性移送流体を充填することに依存する。また、移送流体は、分注される流体よりも密度が低いことが必要である。そのような移送流体の例は、水性試薬と共に使用することができるミネラルオイルである。
【００８０】
移送液は、分注液の上に浮き、その重さによって下向きの力を加えることになる。この下向きの力は、液体をバルブの中に移動させ、バルブを通過させるのに必要な正圧である。ウィックは、移送流体を吸収して膨張し、フロースルーチャネルを塞ぐことで、バルブを通過して移送流体が分注されることが無いようにする。吸油性、撥水性のウィックは、スポンジ、吸着剤、エラストマー、ゲル、又はそれらの組み合わせであってもよい。
【００８１】
引き続き図３７を参照すると、ウィックバルブ８００は、ウィック８１６（例えば、親油性／疎水性の吸収パッド）がそのフロースルーチャネル８１２に閉じ込められた「フロースルー」ブリスター８１０を含む。断面Ａ−Ａはブリスターの断面を示している。フロースルーブリスター上にフランジブルシール８１８を破裂させる為に使用されるラプチャービーズ８１４がある。断面は、フロースルーチャネルに閉じ込められたウィック８１６も示している。
【００８２】
マイクロ流体カートリッジにウィックバルブ８００を取り付けてもよい。カートリッジからの液体を分注する必要がある場合、ラプチャービーズをフランジブルシールに押し込む。これにより、フラジブルシールが破裂し、マイクロ流体カートリッジへのビアが開かれる。移送液の重量により、分注対象液体がカートリッジから押し出され、ウィックバルブ８００に入る。
【００８３】
ウィックバルブ８００の内部では、水性の分注液がウィック８１６の周りの間質性空間を通って通過する。移送液は、密度が低く、分注液の上に浮いているので、分注液に追随する。移送液がウィック８１６に触れると直ちにウィックの内部に吸収され始める。この移送流体のウィッキングにより、カートリッジからウィックバルブ８００に更に移送流体を引き込む別の引張力が生じる。移送液は、ウィック内の流体フロントとして移動し、分注液を前方に押し出し、ウィックバルブ８００の出口に向かって押し出す。移送液は分注液と非混和性である為、分注液を全てウィックバルブ８００から押し出すように働く。ウィックが移送液で飽和すると、飽和したウィックの膨張特性により、入口ポートと出口ポートは十分にブロックされる。この時点で、粘性の移送液は「フロースルー」ウィックバルブを流れることができず、それ以上の移送液はウィックバルブに引き込まれない。こうして分注液はカートリッジから完全に分注され、ウィックバルブ８００を通過し、その一方で、移送液は選択的にウィックバルブ８００から出されないことになる。
【００８４】
次に図３８を参照すると、ウィックバルブ８００等のウィックバルブを使用するマイクロ流体カートリッジ９００の一例の平面図である。即ち、ウィックバルブ現象の一例は、図３８に示すノーベル（Ｎｏｖｅｌ）ＤＸカートリッジ９００において、カートリッジの増幅チャンバ９１２内にある増幅試薬産物９１０をラテラルフローストリップ上に分注する為に使用される。この例示的なラテラルフローストリップ９１４は、５０μＬの産物を必要とし、カートリッジの増幅チャンバ内の増幅試薬産物の体積は丁度５０μＬである。典型的なマイクロ流体カートリッジでは、カートリッジのチャネルで失われる少量のデッドボリュームがあり得るが、非常に低い体積では、その同じデッドボリュームが試薬産物の２０〜５０％までを占める可能性がある。このような大量の体積損失は、ラテラルフローストリップの機能不全につながる。
【００８５】
本実施形態では、移送液としてミネラルオイル９１６を用いる。ミネラルオイルは、増幅試薬産物に混和せず、また、試薬産物よりも軽いので浮く。増幅試薬産物の上にあるミネラルオイルの重量は、下向きの圧力を引き起こし、この圧力は、フランジブルシールが破られた時に、増幅試薬産物を増幅室からウィックバルブ８００に移動させる。本実施形態のウィックバルブ８００は、ウィック９２０として親油性のパッドを含む。このパッドは疎水性でもあるので、水性の増幅試薬産物を吸収することはない。増幅試薬産物は、ウィックとバルブの流路の間の間質空間を通過する。オイルは、より軽く、より粘性がある為、フロースルーチャネルを容易に流れることはないが、ウィックがオイルを吸収し始めると、より多くのオイルをウィックバルブ８００内に効果的に引き込むことになる。オイルがウィック内を移動してウィックを飽和させると、増幅試薬産物がバルブの出口に向かって押し出される。バルブの出口は、ラテラルフローストリップのサンプルパッドの真上にある。この方法を用いて、５０μＬの増幅産物がカートリッジ内の増幅室からラテラルフローストリップに分注される。この方法の利点は、ラテラルフローストリップにミネラルオイルが流れ込まないことである。これは、ミネラルオイルがラテラルフローストリップの誤動作を引き起こす可能性がある為、重要である。
【００８６】
更に、本開示のマイクロ流体装置（例えば、マイクロ流体装置３００）は、異なるマイクロ流体カートリッジ設計を処理することができる。特に、装填ステーション３１４自体及び／又はロッキングヒンジ３１６のプレート部分は、特定のマイクロ流体カートリッジの機能に対応するようにカスタマイズされてもよい。更に、幾つかの実施形態では、装填ステーション３１４はロッキングヒンジ３１６を有していなくてもよい。例えば、マイクロ流体カートリッジは、マイクロ流体カートリッジが装填ステーション３１４から脱落しないようにロック／拘束するレール／スロット機能等、何らかの他の機能によって保持されてもよい。その例は、図３９〜図５１Ｂを参照して、本明細書に図示され説明される。即ち、図３９〜図５１Ｂは、本開示のマイクロ流体デバイスの他の例であるマイクロ流体装置３０５の様々な図を示している。即ち、マイクロ流体装置３０５は、図１に示すマイクロ流体システム１００のマイクロ流体装置１１０の他の例である。図３９〜図５１Ｂでは、マイクロ流体装置３０５は、例えば、異なるマイクロ流体カートリッジ及び／又は他のデバイスと組み合わせて図示されている。
【００８７】
ここで図３９を参照すると、マイクロ流体装置３０５は、他の幾つかの些細な差異の中でもとりわけ、デジタルディスプレイ３１２の配置及びベースプレート３２４の機能を除いて、図８〜図１５に示されるマイクロ流体装置３００と実質的に同じである。例えば、マイクロ流体装置３０５では、装填ステーション３１４は、摺動プレート３７０の上に着座している。そして、摺動プレート３７０は、ベースプレート３２４の受容スロット３２５に摺動式に設置され得る。ここで、マイクロ流体装置３０５はロック解除状態で示されており、装填ステーション３１４は、マイクロ流体装置３０５の外側にある摺動プレート３７０の上に設置された状態である。更に、装填ステーション３１４のロッキングヒンジ３１６はロック解除状態で示されており、マイクロ流体カートリッジが存在していない。
【００８８】
次に図４０を参照すると、内部にマイクロ流体カートリッジ４００が設置されロックされた状態の装填ステーション３１４の斜視図である。更に、シリンジ４５０は、マイクロ流体カートリッジ４００に関連して示されている。従って、装填ステーション３１４、マイクロ流体カートリッジ４００、及びシリンジ４５０は、マイクロ流体装置３０５への装填の為に準備される。次に、図４１は、装填ステーション３１４、マイクロ流体カートリッジ４００、シリンジ４５０が付随する摺動プレート３７０が、マイクロ流体装置３０５のベースプレート３２４の受容スロット３２５内に装填されるところを示している。次に、図４２は、装填ステーション３１４、マイクロ流体カートリッジ４００、及びシリンジ４５０が付随する摺動プレート３７０が、マイクロ流体装置３０５に完全に装填され、ブリスタークラッシュハンドル３３８がハンドルラッチフック３４２に係合した状態を示す。図４２は、ラッチされた状態又はクランプされた状態のマイクロ流体装置３０５を示している。従って、マイクロ流体カートリッジ４００の流体は、ブリスタークラッシュハンドル３３８の破砕作用によって展開される。図４１及び図４２は、その詳細を明らかにする為に、ハウジング３１０及びデジタルディスプレイ３１２が無い状態でマイクロ流体装置３０５を示している。
【００８９】
更に例を挙げると、図４３及び図４４は夫々、マイクロ流体カートリッジ４００が装填ステーション３１４に装填されている一例の斜視図及び平面図を示す。ロッキングヒンジ３１６は未だマイクロ流体カートリッジ４００に対して閉じていない。ロッキングヒンジ３１６のプレート部分は、マイクロ流体カートリッジ４００の機能（例えば、ＮＤｘ分子カートリッジ）に対応するようにカスタマイズされている。更に、装填ステーション３１４の下部は、摺動プレート３７０の一対の対応する穴３７１に嵌め込む為の一対の取り付けペグ３１５を含む（図５１Ａ及び図５１Ｂ参照）。マイクロ流体カートリッジ４００は、マイクロ流体装置３０５に設置され処理され得るカートリッジの１つのタイプの一例である。
【００９０】
更に、図４５は、装填ステーション３１４に設置された２ウェルのマイクロ流体カートリッジ４０１の一例を示す斜視図を示している。この例では、ロッキングヒンジ３１６のプレート部分は、２ウェルマイクロ流体カートリッジ４０１の機能に対応するようにカスタマイズされている。２ウェルマイクロ流体カートリッジ４０１は、マイクロ流体装置３０５に設置され処理され得る別のタイプのカートリッジの一例である。
【００９１】
更に、図４６は、装填ステーション３１４に設置されたイムノアッセイマイクロ流体カートリッジ４０２の一例を示す斜視図を示す。この例では、ロッキングヒンジ３１６のプレート部分は、イムノアッセイマイクロ流体カートリッジ４０２の機能に対応するようにカスタマイズされている。イムノアッセイマイクロ流体カートリッジ４０２は、マイクロ流体装置３０５に設置され処理され得る更に別のタイプのカートリッジの一例である。
【００９２】
更に、図４７は、装填ステーション３１４に設置されたラテラルフローハウジング４０３及びスペーサプレート４０４の一例の斜視図を示す。この例では、ロッキングヒンジ３１６は存在しない。ラテラルフローハウジング４０３は、マイクロ流体装置３０５に設置され処理され得る、更に別のタイプのデバイスの一例である。
【００９３】
図４８Ａ及び図４８Ｂは、ハウジング３１０を備えたマイクロ流体装置３０５及びハウジング３１０を備えていないマイクロ流体装置３０５を示し、マイクロ流体装置３０５に装填されるラテラルフローハウジング４０３を伴う装填ステーション３１４の更なる詳細を示す。図４９Ａ及び図４９Ｂは、ハウジング３１０を備えたマイクロ流体装置３０５及びハウジング３１０を備えていないマイクロ流体装置３０５を示し、マイクロ流体カートリッジ４００がマイクロ流体装置３０５に装填されている装填ステーション３１４の詳細を示している。図５０Ａ及び図５０Ｂは、ハウジング３１０を備えたマイクロ流体装置３０５及びハウジング３１０を備えていないマイクロ流体装置３０５を示し、マイクロ流体カートリッジ４００がマイクロ流体装置３０５に完全に装填された状態の装填ステーション３１４の詳細を示す。図５１Ａ及び図５１Ｂは、ハウジング３１０を備えたマイクロ流体装置３０５及びハウジング３１０を備えていないマイクロ流体装置３０５を示し、マイクロ流体カートリッジ４００がマイクロ流体装置３０５からアンロードされている状態の装填ステーション３１４の詳細を示している。
【００９４】
図５２は、本開示のマイクロ流体システム１００を使用する別の方法の一例である方法１０００の流れ図を示す。方法１０００は、以下のステップを含み得るが、これらに限定されない。
【００９５】
ステップ１０１０で、マイクロ流体装置を電源投入する。例えば、図４乃至図６のマイクロ流体装置３００、図８乃至図１５のマイクロ流体装置３００、又は図３９乃至図５１Ｂのマイクロ流体装置３０５を電源投入する。一例では、電源投入時に、アクチュエータプレート３３０は、ホームポジションの磁石が磁気リードスイッチに近接するまで、反時計回り方向に回転する。これがホームポジションである。
【００９６】
ステップ１０１５で、マイクロ流体装置の装填シーケンスが開始される。例えば、ユーザは、患者ＩＤをスキャン（例えば、バーコード又はＲＦＩＤ）するか、又は手動で入力する。次に、ユーザは、カートリッジＩＤをスキャンするか、又は手動で入力する。
【００９７】
ステップ１０２０で、マイクロ流体カートリッジがマイクロ流体装置に設置される。例えば、ユーザは、装填ステーション３１４をマイクロ流体装置３００、３０５からスライドさせ、ロッキングヒンジ３１６を開く（図３９参照）。次に、ユーザは、マイクロ流体カートリッジ４００等の特定のマイクロ流体カートリッジを装填ステーション３１４に装填し（図４３参照）、ロッキングヒンジ３１６を閉じる（図４９Ａ及び図４９Ｂ参照）。そうすることで、ブリスターの下にあるフランジブルシールが破れ、マイクロ流体カートリッジ４００へと流体経路が開かれる。
【００９８】
ステップ１０２５で、サンプルがマイクロ流体カートリッジに提供される。例えば、関与サンプルを保持するシリンジ４５０が、マイクロ流体カートリッジ４００の装填ポート４２２に流体的に結合される（図４０及び図４１参照）。次に、ユーザは、マイクロ流体カートリッジ４００にサンプルを注入する。そうすることで、サンプル流体は、磁気電荷スイッチ粒子を収容したパウチを通って流れ、マイクロ流体カートリッジ４００の結合ウェルに入る。
【００９９】
ステップ１０３０で、マイクロ流体カートリッジ及びサンプルを伴う装填ステーションをマイクロ流体装置にスライドさせる。例えば、ユーザは、マイクロ流体装置３００の装填ステーション３１４をマイクロ流体カートリッジ４００にスライドさせる（図６参照）。
【０１００】
ステップ１０３５で、マイクロ流体装置をロック／クランプして閉じる。例えば、ユーザは、ハンドルラッチフック３４２がブリスタークラッシュハンドル３３８に係合するまで、ブリスタークラッシュハンドル３３８を押し下げる（図４２、図５０Ａ、図５０Ｂ参照）。そうすることで、ブリスタークラッシュハンドル３３８は、試薬分注プランジャを前方に移動させて試薬分注プランジャを試薬パウチに対して押し下げさせる。これにより、試薬パウチの内容物がマイクロ流体カートリッジ４００のウェル内に絞り込まれる。また、これにより、パウチが押し潰された状態で保持され、逆流を防ぐ。
【０１０１】
ステップ１０４０で、マイクロ流体装置の検査シーケンスが開始され、実行される。例えば、マイクロ流体装置３０５及びマイクロ流体カートリッジ４００の検査シーケンスが開始され、実行される。検査シーケンスが開始されると、サンプルが処理される。例えば、アクチュエータプレート３３０は、一定の時間（例えば、約３分）、マイクロ流体カートリッジ４００に対して相対的に回転する。一例では、アクチュエータプレート３３０が回転すると、洗浄及び溶出の異なる段階の間で磁気粒子を捕捉し、再懸濁させ、移送する。次に、増幅プロセスが起こる。一例では、増幅プロセスの間、増幅ウェルと接触している抵抗加熱器がオンになる（例えば、約１２〜２０分間）。
【０１０２】
ステップ１０４５で、テキストシーケンスの結果が読み取られ、処理される。例えば、マイクロ流体装置３０５のシーケンシャルバーストプランジャ３６０を使用して、マイクロ流体カートリッジ４００上でフランジブルシールを破裂させることにより、増幅産物をラテラルフローストリップ４２８上に順次分注する。シーケンシャルバーストカム３５６が回転すると、シーケンシャルバーストプランジャ３６０をフロースルーブリスターに押し付け、フォイルシールを破裂させる。これにより、ラテラルフローストリップ４２８への流路が開かれる。次に、図１に示す検出システム１２２のような検出システムからの情報が処理される。検査結果は、マイクロ流体装置３０５のデジタルディスプレイ１１２に表示されてもよい。取り込まれ得る情報の諸例については、図５３〜図５９を参照して以下に示す。
【０１０３】
ＣＴ／ＮＧループ介在等温線増幅（ＬＡＭＰ）プライマー
ＬＡＭＰは、核酸等温線増幅技術である。通常、ＬＡＭＰでは４〜６種類のプライマーと高い鎖置換活性を備えたＢｓｔポリメラーゼを使用する。ＬＡＭＰ産物は、リアルタイム蛍光、リアルタイム濁度計を用いてリアルタイムで分析してもよいし、ゲル電気泳動、濁度、蛍光色素、比色法、電気化学法、ラテラルフローアッセイを用いてエンドポイント分析してもよい。図５３は、ＬＡＭＰの基本原理を示す反応ステップ１１００の一例の模式図を示す。
【０１０４】
クラミジア・トラコマチス（ＣＴ）／淋菌（ＮＧ）ＬＡＭＰプライマー（又はＣＴ／ＮＧ  ＬＡＭＰプライマー）を設計する方法が提供される。即ち、ＣＴ／ＮＧ ＬＡＭＰプライマーを設計する為の戦略の例は以下の通りである。
【０１０５】
（１）ＬＡＭＰプライマーセットは、ｐｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ  Ｖ５（栄研化学株式会社（Ｅｉｋｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））を用いて設計した。
【０１０６】
（２）クラミジア・トラコマチス（ＣＴ）ＬＡＭＰプライマーセットは、マルチコピーの潜在プラスミド（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ） Ｊ０３３２１．１ ｐＣＨＬｌ）の特定の配列を標的に設計した。
【０１０７】
（３）淋菌（ＮＧ）ＬＡＭＰプライマーセットは、ｐｏｒＡ疑似遺伝子（ジェンバンクＡＪ２２３４４７．１株ＦＡ１０９０）及びｍｔｒＡ遺伝子（ジェンバンクＡＦ１３３６７６．１， 株 ＦＡ１０９０）に関して設計した。
【０１０８】
（４）各微生物について、設計されたＬＡＭＰプライマーは、フォワード内部プライマー（ＦＩＰ）、バックワード内部プライマー（ＢＩＰ）、フォワード外部プライマー（Ｆ３）、バックワード外部プライマー（Ｂ３）、フォワードループプライマー（ＬＦ）、バックワードループプライマー（ＬＢ）を含む。
【０１０９】
（５）生成したＬＡＭＰプライマーについて、更にオリゴアナライザーツール（Ｏｌｉｇｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ  ｔｏｏｌ）（ＩＤＴ社）を用いて、ＬＡＭＰ反応条件でＴｍ、ヘアピン、Ｇカルテット、ΔＧ、自己ダイマーを解析した。
【０１１０】
（６）サーモマルチプルプライマー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）で自己プライマーダイマーを評価した。
【０１１１】
（７）最後に、リアルタイムＬＡＭＰ（Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＬＡＭＰ）でプライマーを評価し、結果が出るまでの時間（Ｔｉｍｅ−Ｔｏ−Ｒｅｓｕｌｔ）（ＴＴＲ）／Δ（陽性ＴＴＲ−陰性 ＴＴＲ）の観点から最適なプライマーセットを選択し、最終的なアッセイ開発を行った。
【０１１２】
クラミジア・トラコマチス（ＣＴ）のＬＡＭＰプライマーセットの例を、表１〜表５を参照して以下に示す。
【表１】
2021535394.tif 000003
【表２】
2021535394.tif 000004
【表３】
2021535394.tif 000005
【表４】
2021535394.tif 000006
【表５】
2021535394.tif 000007
【０１１３】
淋菌（ＮＧ）のＬＡＭＰプライマーセットの例を、表６〜表１０を参照して以下に示す。
【表６】
2021535394.tif 000008
【表７】
2021535394.tif 000009
【表８】
2021535394.tif 000010
【表９】
2021535394.tif 000011
【表１０】
2021535394.tif 000012
【０１１４】
標準ＬＡＭＰ反応条件−１Ｘ等温増幅バッファＩＩ（ＮＥＢ社）、６ｍＭ硫酸マグネシウム、ＤＮＡテンプレート、各ｄＮＴＰを２．５ｍＭ、１．６μＭのフォワード内部プライマー（ＦＩＰ）、１．６μＭのバックワード内部プライマー（ＢＩＰ）、０．２μＭのフォワード外部プライマー（Ｆ３）、０．２μＭのバックワード外部プライマー（Ｂ３）、０．８μＭのフォワードループプライマー（ＬＦ）、０．８μＭのバックワードループプライマー（ＬＢ）、２μＬの１：１００のＳｙｔｏ ９色素及び２４ＵのＢｓｔ３．０ＤＮＡポリメラーゼを含むマスターミックスを合計５０μＬで、マルチプレックスＬＡＭＰ反応を実行した。ＬＡＭＰ反応は６５℃で２５〜４５分インキュベートした。
【０１１５】
オンチップＬＡＭＰ反応−増幅試薬は、乾燥及び液体フォーマットで存在し、マイクロ流体カートリッジ内に別々に保存される。凍結乾燥されたペレットは、ＢＳＴ３．０酵素、ｄＮＴＰ及びプライマーを含み、これは増幅ウェルに保存される。一方、等温増幅バッファ（５０μＬ）は液体のフォーマットで増幅ウェルの上のブリスターパウチに収納されている。増幅バッファの上には５０μＬのオイルが浮いており、ブリスターパウチの狭い出口から増幅ウェルに押し出し、凍結乾燥したペレットを再水和させるのに役立つ。サンプル調製後、増幅用ミックスバッファｐＨ８．８の存在下で磁気粒子からＤＮＡを溶出させ、その後、１２〜２０分間かけて温度を約６５℃までに上げてＬＡＭＰ反応を開始する。ＬＡＭＰミックス及びアッセイの条件は、凍結乾燥及び保存中の酵素損失を補う為に凍結乾燥ペレット中のより高いＢＳＴ酵素濃度を用いることを除いて、上記と同じである。
【０１１６】
ハプテン標識プライマー−マルチプレックスエンドポイントＮＡＬＦ分析の為に、プライマーをハプテンで標識して二重標識ＬＡＭＰ産物を製造する。１つのハプテンはニトロセルロース膜上の捕捉に使用され、２つ目のハプテンはレポーター分子の結合に使用される。ＬＡＭＰプライマーは、ビオチン、フルオレセイン（ＦＡＭ）、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、テキサスレッド（ＴＥＸ）、及びジニトロフェノール（ＤＮＰ）で標識されている。ラテラルフローストリップでのＣＴの検出には、ＦＩＰ−ＦＡＭ／ＬＦ−ビオチン、ＦＩＰ−ＦＡＭ／ＬＢ−ビオチン、又はＬＦ−ＦＡＭ／ＬＢ−ビオチンの何れかの標識プライマーの組み合わせを使用した。ＮＧ検出には、ＦＩＰ−ＴＥＸ／ＬＦ−ビオチン、ＦＩＰ−ＴＥＸ／ＬＢ−ビオチン、ＬＦ−ＴＥＸ／ＬＢ−ビオチンの標識プライマーの組み合わせを使用した。内在性コントロール標的（ヒトβアクチン遺伝子）は、以下の標識プライマーの組み合わせを使用した；ＦＩＰ−ＤＮＰ／ＬＦ−ビオチン、ＦＩＰ−ＤＮＰ／ＬＢ−ビオチン、又は、抗ＤＮＰでの検査ライン上での検出にはＬＦ−ＤＮＰ／ＬＢ−ビオチン。
【０１１７】
テール付きプライマー−（マルチプレックス）エンドポイントＮＡＬＦアッセイの為のハプテン標識ＬＡＭＰプライマーの代替として、テール付きプライマーアプローチを使用することができる。テール付きプライマーは、活性プライマー配列の５’末端に追加オリゴヌクレオチド配列を加え、ポリメラーゼストッパーで分離することによって設計された。最も一般的な市販のポリメラーゼストッパーは、Ｃ３スペーサ、トリエチレングリコールスペーサ（スペーサ９）、ヘキサエチレングリコールスペーサ（スペーサ１８）を含む。テール付き配列は、ＢＬＡＳＴで確認して、他の一般的な病原体と配列の類似性が無いことを確認し、偽陽性を回避した。テール付きプライマーを使用することで、ＮＡＬＦにおけるハプテン／抗ハプテンアプローチの使用に比べて、高い多重性と低コストを実現している。更に、マルチプレックスＮＡＬＦアッセイでは、ハプテン／抗ハプテンの親和性の違いによって検査ラインの強度が異なることがあるが、ＤＮＡ−ＤＮＡ結合親和性は通常高く、一貫した検査ラインの強度が得られる。テール付きプライマーペアを使用すると、アンプリコンの両端に２本の一本鎖ＤＮＡテールが付いたアンプリコンが生成される。一方のテールはニトロセルロース膜に固定化された相補的プローブに、もう一方のテールは金ナノ粒子で標識されたレポータープローブにハイブリダイズするのに使用できる。代替的に、単一のテールをビオチン又はハプテン標識オリゴと組み合わせて使用し、ビオチン／ハプテン末端がストレプトアビジン／抗ハプテン標識金ナノ粒子／着色粒子レポータープローブに結合し、テール末端が、ニトロセルロース膜上に固定化された相補的プローブにハイブリダイズすることもできる。ＦＩＰ／ＬＦ、ＦＩＰ／ＬＢ、ＬＦ／ＬＢのテール付きプライマーを組み合わせて、検査ラインへの捕捉とレポーターＤＮＡプローブとの結合を行うことができる。マルチプレックスＮＡＬＦ分析の為に、固有の配列を有する複数の異なるテールが設計され得る。
【０１１８】
核酸ラテラルフローアッセイ（ＮＡＬＦ）−核酸ラテラルフロー（ＮＡＬＦ）は、ＬＡＭＰ産物の、代替となる、単純で安価な、ポイントオブケアのエンドポイント検出システムを提供する。結果の分析には肉眼による視覚的な読み取りが使用できる為、ラテラルフローデバイスは安価であり且つ機器が要らない。このストリップには２本のコントロールラインがあり、ＬＡＭＰアンプリコンの有無とは無関係に常に陽性結果を示す。第１コントロールはストリップのフローチェックコントロールであり、第２コントロールはＬＡＭＰ反応の内部反応コントロールである。
【０１１９】
ハプテン−抗体ベースのＮＡＬＦアッセイ−ラテラルフローアッセイストリップは、アビンドン・ヘルス社（Ａｂｉｎｇｄｏｎ Ｈｅａｌｔｈ社）（英国）から供給された。このストリップは、フローコントロールライン用の抗ヤギ（Ｇｏａｔ）抗体、内部反応コントロールライン（β−アクチン）としての抗ＤＮＰ、ＣＴの検出用の抗ＦＩＴＣ検査ライン、及び（ＮＧ）標識ＬＡＭＰ産物の検出用の抗ＴＥＸ検査ラインを有する。二重標識されたＬＡＭＰアンプリコンは、検査ラインに固定化された抗体によって捕捉され、ニュートラビジン結合カーボンナノ粒子又は抗ビオチン官能化金ナノ粒子との結合後に可視化される。２つの異なるストリップを検査した；（ａ）ニュートラビジン共役カーボンナノ粒子のストリップ、（ｂ）抗ビオチンを結合した金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）のストリップである。５０μＬのＬＡＭＰ法増幅産物をラテラルフローストリップの装填ウェルに塗布し、２分後に標的ＤＮＡの有無を肉眼（定性）又はラテラルフローストリップリーダー（定性）で観察した。
【０１２０】
ダブルテール付きプライマーベースのＮＡＬＦアッセイ−ラテラルフローストリップは、フローコントロールライン、内部反応コントロールライン（β−アクチン）、ＣＴ及びＮＧ遺伝子標的を検出する為の２つの検査ラインで、インハウスで準備される。ビオチン標識オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブをニュートラビジンに結合させ、コントロールラインと検査ラインとしてニトロセルロース膜上に分注する。フローコントロールラインのプローブは、ＡｕＮＰｓ標識されたＤＮＡに相補的である。内部反応コントロールプローブは、ヒトβ−アクチンのテール付きＬＡＭＰアンプリコンに相補的である。検査ラインのプローブは、ＣＴとＮＧ標的遺伝子に対するテール付きＬＡＭＰアンプリコンに相補的である。ラテラルフローアッセイの安定性と感度を向上させる為に、ＤＮＡキャプチャプローブをキャリアタンパク質やマイクロビーズに共有結合させることが検討されてもよい。ＮＨＳ／ＥＤＣ化学、サクシニミジル−６−ヒドラジノニコチンアミド（Ｓ−ＨｙＮｉｃ）／４−ホルミルベンズアミド（４ＦＢ）化学、クリックケミストリー、マレイミド含有架橋剤、及びその他の関連する共役化学等、幾つかの共役化学が採用され得る。ＡｕＮＰｓ標識ＤＮＡレポータープローブは、よく知られたチオール−金化学を用いて調製される。テール付きプライマーＮＡＬＦアッセイは、増幅ＬＡＭＰ産物を、ＡｕＮＰｓ−ＤＮＡプローブを含むサンプル／共役パッド上に導入することによって行うことができる。ＤＮＡ標的の存在は、検査ゾーン上の着色されたラインとして可視化され、２〜５分後に肉眼で、又はラテラルフローストリップリーダーを用いて読み取ることができる。
【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【０１２１】
ハプテン／テール付きプライマーに基づくＮＡＬＦアッセイ−テール付きプライマーアプローチの場合と同様に、ラテラルフローストリップを作製し、インハウスで準備する。このアッセイでは、１つのテール付きプライマーと１つのハプテン（ビオチン）標識プライマーを用いてＬＡＭＰを行う。２つの異なるＮＡＬＦアッセイを使用する。ＬＡＭＰプライマーＦＩＰテール／ＬＦ−ビオチン又はＬＦビオチン／ＬＢテールを使用した場合、アンプリコンはニュートラビジン−ＤＮＡプローブで捕捉され、ニュートラビジン機能化金ナノ粒子の結合で可視化される。ＦＡＭ／ＬＦテールを備えたＬＡＭＰアンプリコンは、ニトロセルロース膜に固定化された抗ＦＡＭでＦＡＭ標識ＬＡＭＰを捕捉し、レポーターＡｕＮＰｓ−ＤＮＡとハイブリダイゼーションすることで、ラテラルフローアッセイで検出される。
【０１２２】
ハプテン／テール付きプライマーアプローチの為のプライマーセット
【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【０１２３】
ランタノイド標識を用いたラテラルフローシグナルの増強−近年、ランタノイドキレートナノ粒子は、ラテラルフローアッセイにおける金ナノ粒子の代替レポーターとして浮上している。何千もの蛍光性ランタノイドキレートを含むシリカやポリスチレンのナノ粒子は、従来のコロイド状金ナノ粒子に比べて５０〜１１００倍のシグナル増強効果があり、ラテラルフローアッセイのシグナルレポーターとして使用されている。ユーロピウム（Ｅｕ  ＩＩＩ）は最も一般的に使用されているランタノイドであり、粒子径やカルボン酸基、ストレプトアビジン等の官能基の異なるものが市販されている。Ｅｕ（ＩＩＩ）キレートナノ粒子のラテラルフロー検査ラインへの結合は、低コストのＬＥＤライト（波長３３０〜３６５ｎｍ）で可視化され得る。本発明のＮＡＬＦアッセイでは、ダブルテール付きプライマーアプローチの場合、片方のテール付きプライマーに相補的なレポータープローブをカルボキシル官能化したＥｕ（ＩＩＩ）キレートナノ粒子で共有結合させることができる。ハプテン／テール付きプライマーアプローチでは、ストレプトアビジン結合Ｅｕ（ＩＩＩ）粒子を用いて標的ＤＮＡの存在を可視化する。信号強度の自動測定（定性及び／又は半定量性）の為に、本発明のデバイスには、カメラ付きのインハウスＬＥＤシグナルリーダーが内蔵される。ラテラルフローストリップは、３本のコントロールラインと２本の検査ラインで調製されている。コントロールラインは、１）リーダーコントロールライン、２）フローコントロールライン、３）内在性コントロールライン（β−アクチン）である。検査ラインは、１)ＣＴと２)ＮＧの標的遺伝子を検出する為のものである。リーダーコントロールラインには、既知の量のＥｕ  ＩＩＩ粒子が含まれており、ＮＡＬＦラインの位置を検出する為のリーダーのコントロールとして使用される。フローコントロールラインは、ストレプトアビジン蛍光共役を捕捉するように設計された抗ビオチン抗体でストライプされている。内部反応コントロールは、現在、β−アクチンアンプリコンを捕捉する為に相補的なニュートラビジン結合ビオチン化オリゴである。ＮＧライン：ＮＧアンプリコンを捕捉する為に相補的なニュートラビジン結合ビオチン化オリゴ。ＣＴライン：ＣＴアンプリコンを捕捉する為に相補的なニュートラビジンビオチン化オリゴ。
【０１２４】
サポートデータ例
クラミジア・トラコマチス、淋菌、及びヒトβ−アクチン（内部陽性コントロール）の標的遺伝子の配列をジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）から入手した。ＬＡＭＰプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｌｏｒｅｒバージョン５オンラインソフトウェア（http://primerexplorer.jp/e/）を用いて設計した。プライマーは、インテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（米国、ＩＡ）により合成された。設計したＬＡＭＰプライマーは、フォワード内部プライマー（ＦＩＰ）、バックワード内部プライマー（ＢＩＰ）、フォワード外部プライマー（Ｆ３）、バックワード外部プライマー（Ｂ３）、フォワードループプライマー（ＬＦ）、バックワードループプライマー（ＬＢ）を含む。設計したＬＡＭＰプライマーは、オリゴアナライザーツール（Ｏｌｉｇｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ ｔｏｏｌ）（ＩＤＴ）を用いて、ＬＡＭＰ反応条件を設定し、Ｔｍ、ヘアピン、Ｇカルテット、ΔＧ、自己二量体の解析を行った。サーモマルチプルプライマーアナライザー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて、セルフプライマーとクロスプライマーの二量体を評価した。最後に、リアルタイムＬＡＭＰ（Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＬＡＭＰ）でプライマーを評価し、結果が出るまでの時間（Ｔｉｍｅ−Ｔｏ−Ｒｅｓｕｌｔ）（ＴＴＲ） ／ Δ（陽性ＴＴＲ−陰性ＴＴＲ）の観点から最適なプライマーセットを選択し、最終的なアッセイの開発を行った。
【０１２５】
リアルタイムＬＡＭＰ反応は、０．２ｍｌマイクロ遠心チューブ内のオープンｑＰＣＲサーモサイクラー（カリフォルニア州サンタクララのチャイ・バイオ社（Ｃｈａｉ Ｂｉｏ））を用いて、１Ｘ等温増幅バッファＩＩ（ＮＥＢ）、６ｍＭ硫酸マグネシウム、ＤＮＡテンプレート、各ｄＮＴＰ２ｍＭ、１．６μＭ  ＦＩＰ／ＢＩＰ、０．２μＭのＦ３／Ｂ３、０．８μＭのＬＦ／ＬＢ、１：１００に希釈したＳｙｔｏ９色素２μＬ、及び２４ＵのＢｓｔ３．０ＤＮＡポリメラーゼを含む総量５０μＬのマスターミックスを用いて実行された。ＬＡＭＰ反応は６５℃で２０分間インキュベートした。
【０１２６】
開発したＬＡＭＰアッセイをノーベル（Ｎｏｖｅｌ）Ｄｘマイクロ流体カートリッジに実装し、増幅産物のオンチップ・ラテラルフロー読み出しを用いて、サンプルツーアンサーアッセイの性能を実証した。更に、バッファ、尿、スワブマトリックスにスパイクしたＣＴ及びＮＧ細胞のオンチップ実験を行い、開発した自動サンプルツーアンサー式のノーベルＤｘデバイスが３０分以内にＣＴ／ＮＧの存在を検出できることを実証した。これは
、磁気ビーズを用いた３分間のサンプル調製ステップ、それに続いて２０分間のＬＡＭＰ増幅ステップ、及び３分間の自動検出とラテラルフロー検査結果の表示ステップで構成されている。
【０１２７】
リアルタイムＬＡＭＰを用いたＬＡＭＰアッセイの分析感度評価
図５４は、クラミジア・トラコマチス及び淋菌の初期ＤＮＡテンプレートの様々な量のリアルタイムＬＡＭＰ増幅曲線のプロット１２００及びプロット１２０５を夫々示す。クラミジア・トラコマチスのＤＮＡ（ＡＴＣＣ（登録商標） ＶＲ−９０１ＢＤ（商標））と淋菌のＤＮＡ（ＡＴＣＣ ＦＡ１０９０）の希釈系列を用いて、リアルタイムＬＡＭＰアッセイの分析感度を評価した。ＤＮＡから１０倍段階希釈が生成され、各希釈液から５μＬをＬＡＭＰ反応に使用した。図１の増幅曲線に示すように、本発明のＬＡＭＰアッセイは、クラミジア・トラコマチスについては５ＤＮＡコピー／検査、淋菌については２５ＤＮＡコピー／検査を検出することができる。
【０１２８】
分析特異性の評価
本発明の開発ＬＡＭＰアッセイの特異性を評価する為に、ＣＴ／ＮＧ株と、泌尿器系サンプルによく見られる非ＣＴ／ＮＧ株を含む３２種類の微生物のゲノムＤＮＡパネルを使用した。検査した生物と結果を表１にリストするが、表１は、我々のＬＡＭＰ−ＮＡＬＦアッセイは、１００％の感度と１００％の特異性を有し、全てのＣＴ血清株及びＮＧ株を検出することができ、他の一般的な泌尿器系微生物については交差反応が見られないということを実証している（図５５に示す表１７）。表１７は、ＣＴ及びＮＧの被検生物及び検査ラインの結果を示すノーベル（Ｎｏｖｅｌ）Ｄｘ ＣＴ／ＮＧ ＬＡＭＰアッセイの分析特異性を示す。
【０１２９】
凍結乾燥ＬＡＭＰ試薬の評価
Ｂｓｔポリメラーゼ及びｄＮＴＰｓは、温度感受性が最も高いＬＡＭＰ試薬である。低・中所得国で使用可能なポイントオブケアの分子検査を開発する為のものである。更に、ＬＡＭＰ試薬を凍結乾燥させることで、更なる利点が得られる。我々のＬＡＭＰ試薬はＢＩＯＬＹＰＨ ＬＬＣ（ミネソタ州チャスカ）によって凍結乾燥され、ジッパー付きのアルミホイルバッグの中で２２℃及び３７℃で保存され、リアルタイム及び加速保存期間での安定性を調査した。凍結乾燥した試薬を増幅バッファとプライマーで再構成し、５００コピーのゲノムＤＮＡの存在下で、１２週間（加速）及び２０週間（リアルタイム）、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＬＡＭＰで評価した。ＬＡＭＰの結果（図５６のプロット１４００を参照）は、凍結乾燥されたＬＡＭＰ試薬が、両方の保存条件で我々の研究期間中に安定しており、反応性を失うことなく新鮮なマスターミックスと同等であることを示している。
【０１３０】
核酸ラテラルフローアッセイの開発
マルチプレックスＬＡＭＰ産物のＮＡＬＦ検出の為の我々の予備検査では、異なる抗ハプテン抗体の結合親和性のばらつきに関連する可能性のある検査ライン強度の不一致を示していた。代替案として、ビオチン化オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブを検査ラインとして用いるＤＮＡベースのＮＡＬＦアッセイを開発した。当初、検査ラインのシグナルレポーターとして金ナノ粒子を使用していたが、その後、低コストのＵＶＬＥＤライト（３６５ｎｍ）で可視化できる蛍光ベースのレポーター粒子に切り替え、有望な結果を示した。開発したラテラルフローアッセイは、先ず合成短鎖ＤＮＡで検査して最適化し、最後にＬＡＭＰ産物で検査した（図５７参照）。図５８は、ラテラルフローストリップの結果の解釈チャートを示す。現在のＬＦストリップは、ＣＴ／ＮＧ用の２つの検査ラインと、ヒトＤＮＡ用の内在性コントロールを含む３つのコントロールライン、ラテラルフローストリップのフローコントロールライン、及びリーダーコントロールラインの５つのラインを含む。ヒトＤＮＡアクチンコントロールラインがない場合は、無効な検査結果となる。
【０１３１】
次に、図５９に示す表１８を参照すると、ＪＨＵ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ＰＯＣ Ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ＳＴＤから提供された身元不明の凍結／保存された臨床サンプルを用いたノーベル（Ｎｏｖｅｌ）Ｄｘ ＣＴ／ＮＧ検査の臨床性能が示されている。ＣＴ陽性検体については、比較対象のゴールドスタンダードであるＣＴ／ＮＧ用Ａｐｔｉｍａ Ｃｏｍｂｏ２アッセイを用いて、尿と膣スワブの両方で１００％の感度と１００％の特異度を示している（左）。ＮＧ陽性臨床サンプルがＮＧの検出に関して我々のＣＴ／ＮＧアッセイの感度と特異性を実証することを待機中である。
【０１３２】
長年の特許法の慣例に従い、特許請求の範囲を含む本出願では、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」という用語は、「１つ以上」を意味する。従って、例えば、「対象（ａ  ｓｕｂｊｅｃｔ）」への言及は、文脈上明らかに反対でない限り（例えば、複数の対象）、複数の対象を含む、等となる。
【０１３３】
本明細書及び特許請求の範囲を通して、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、文脈上そうでないことが要求される場合を除き、非排他的な意味で使用される。同様に、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語及びその文法上の変形は非限定的であることを意図しており、よって、リスト内のアイテムの列挙は、リストされたアイテムに代用又は追加できる他の同様のアイテムを除外するものではない。
【０１３４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲の目的の為、別段の指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される量、サイズ、寸法、比率、形状、配合、パラメータ、パーセンテージ、量、特性、及びその他の数値を表す全ての数字は、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語が値、量、又は範囲とともに明示的に現れていなくても、全ての場合において「約」という用語によって修正されていると理解されるものである。従って、反対の指示がない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に記載されている数値パラメータは、厳密ではなく、また厳密である必要もないが、本開示の主題によって得ることを目指した所望の特性に応じて、公差、変換係数、丸め、測定誤差等、当業者に知られている他の要因を反映して、近似値及び／又は所望の大きさ又は小ささであってもよい。例えば、値に言及する際の用語「約」は、開示された方法を実行する、又は開示されたコンポーネントを使用するのに適切なように、指定された量から、一部の実施形態では±１００％、一部の実施形態では±５０％、一部の実施形態では±２０％、一部の実施形態では±１０％、一部の実施形態では±５％、一部の実施形態では±１％、一部の実施形態では±０.５％、一部の実施形態では±０.１％の変動を包含することを意味し得る。
【０１３５】
更に、１つ以上の数値又は数値範囲に関連して使用される「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、範囲内の全ての数値を含み、設定された数値の上及び下に境界を拡張することによってその範囲を修正する、全てのそのような数値を指すと理解すべきである。端点による数値範囲の記載は、その範囲内に包含される全ての数値、例えば、その分数を含む整数（例えば、１〜５の記載は、１、２、３、４、及び５、並びにその分数、例えば、１．５、２．２５、３．７５、４．１等を含む）、及びその範囲内の任意の範囲を含む。
【０１３６】
前述の主題を、理解を明確にする為に、例示と実施例を用いて或る程度詳細に説明してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲内で特定の変更や修正を実施できることが理解されるであろう。
【符号の説明】
【０１３７】
１００  マイクロ流体システム
１１０、３００  マイクロ流体装置
１２０  コントローラ
１３０  受容部
１４０  垂直マイクロ流体デバイス
１９０  ネットワークコンピュータ
１９２  ネットワーク
２００  アクチュエータアセンブリ
２１０  ＤＣモータ
２１２  シャフト
２１４  アクチュエータ
２１６  マイクロ流体デバイス
２１８  アクチュエーション機構
３０５  マイクロ流体装置
３１０  ハウジング
３１２  デジタルディスプレイ
３１４  装填ステーション
３１６  ロッキングヒンジ
３１８  ロッキングハンドル
３２０  ハンドルシャフト及びヨークアセンブリ
３２４  ベースプレート
３２５  ベースプレート受容スロット
３３８  ブリスタークラッシュハンドル
３４２  ハンドルラッチフック
３７０  摺動プレート
４００  垂直配向マイクロ流体カートリッジ
４５０  シリンジ
８００  ウィックバルブ
８１０  フロースルーブリスター
８１２  フロースルーチャネル
８１４  ラプチャービーズ
８１６  ウィック
８１８  フランジブルシール
９００  マイクロ流体カートリッジ
９１０  増幅試薬産物
９１２  増幅チャンバ
９１４  ラテラルフローストリップ
９１６  ミネラルオイル
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【国際調査報告】
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