(57)【要約】  新規な抗ＣＤ３葉酸抗体、および当該抗ＣＤ３葉酸抗体が有利に作用し得る疾患または病状の処置における当該抗ＣＤ３葉酸抗体の使用について記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜６２のうち少なくとも一つのアミノ酸配列を有する、抗ＣＤ３抗体または抗体断片。
【請求項２】
配列番号１〜６２のうち二つのアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片。
【請求項３】
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、および５７のいずれか一つ；および
（ｂ）配列番号７、８、９、１８、１９、２０、３９、５８、５９、６０、６１、および６２のいずれか一つ、を有する請求項１に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片。
【請求項４】
配列番号１〜６のいずれか一つおよび配列番号７〜９のいずれか一つを有する、請求項３に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片。
【請求項５】
配列番号４〜６のいずれか一つおよび配列番号７〜９のいずれか一つを有する、請求項４に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片。
【請求項６】
上記抗体または抗体断片は、ＩｇＧ、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片。
【請求項７】
（ｉ）第一結合ドメイン、および（ｉｉ）第二結合ドメインを有する二重特異的結合分子であって、上記第二結合ドメインは配列番号１〜６２のうち一つ以上を有する、二重特異的結合分子。
【請求項８】
上記第二結合ドメインは、配列番号１〜６２のうち二つを有する、請求項７に記載の二重特異的結合分子。
【請求項９】
上記第二結合ドメインは、
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、および５７のいずれか一つ；および
（ｂ）配列番号７、８、９、１８、１９、２０、３９、５８、５９、６０、６１、および６２のいずれか一つ、を有する、請求項７に記載の二重特異的結合分子。
【請求項１０】
上記第二結合ドメインは、配列番号１〜６のいずれか一つおよび配列番号７〜９のいずれか一つを有する、請求項７に記載の二重特異的結合分子。
【請求項１１】
配列番号１〜６２のうち一つ以上を有する、細胞毒性的に活性なＣＤ３特異的結合構築体。
【請求項１２】
配列番号１〜６２のうち二つを有する、細胞毒性的に活性なＣＤ３特異的結合構築体。
【請求項１３】
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、および５７のいずれか一つ；および
（ｂ）配列番号７、８、９、１８、１９、２０、３９、５８、５９、６０、６１、および６２のいずれか一つ、を有する、細胞毒性的に活性なＣＤ３特異的結合構築体。
【請求項１４】
配列番号１〜６のいずれか一つおよび配列番号７〜９のいずれか一つを有する、請求項１３に記載の細胞毒性的に活性なＣＤ３特異的結合構築体。
【請求項１５】
上記抗体または断片は天然にコードされていないアミノ酸を一つ以上含み、上記天然にコードされていないアミノ酸は、パラ−アセチルフェニルアラニン、ｐ−ニトロフェニルアラニン、ｐ−スルホチロシン、ｐ−カルボキシフェニルアラニン、ｏ−ニトロフェニルアラニン、ｍ−ニトロフェニルアラニン、ｐ−ボロニルフェニルアラニン、ｏ−ボロニルフェニルアラニン、ｍ−ボロニルフェニルアラニン、ｐ−アミノフェニルアラニン、ｏ−アミノフェニルアラニン、ｍ−アミノフェニルアラニン、ｐ−アシルフェニルアラニン、ｏ−アシルフェニルアラニン、ｍ−アシルフェニルアラニン、ｐ−ＯＭｅフェニルアラニン、ｏ−ＯＭｅフェニルアラニン、ｍ−ＯＭｅフェニルアラニン、ｐ−スルホフェニルアラニン、ｏ−スルホフェニルアラニン、ｍ−スルホフェニルアラニン、５−ニトロＨｉｓ、３−ニトロＴｙｒ、２−ニトロＴｙｒ、ニトロ置換Ｌｅｕ、ニトロ置換Ｈｉｓ、ニトロ置換Ｄｅ、ニトロ置換Ｔｒｐ、２−ニトロＴｒｐ、４−ニトロＴｒｐ、５−ニトロＴｒｐ、６−ニトロＴｒｐ、７−ニトロＴｒｐ、３−アミノチロシン、２−アミノチロシン、Ｏ−スルホチロシン、２−スルホオキシフェニルアラニン、３−スルホオキシフェニルアラニン、ｏ−カルボキシフェニルアラニン、ｍ−カルボキシフェニルアラニン、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−プロパルギル−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、ｔｒｉ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、およびｐ−プロパルギロキシ−Ｌ−フェニルアラニンである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片。
【請求項１６】
上記天然にコードされていないアミノ酸は、部位特異的に上記抗体に組み込まれている、請求項１５に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片。
【請求項１７】
リンカー、ポリマー、または生物活性を有する分子と連結している、請求項１〜６および１５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片。
【請求項１８】
上記リンカーまたはポリマーは、二機能性ポリマーまたは二機能性リンカーである、請求項１７に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片。
【請求項１９】
上記生物活性を有する分子は小分子を含む、請求項１７および１８のいずれか一項に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片。
【請求項２０】
上記生物活性を有する分子は、一つ以上の葉酸分子またはそのアナログもしくは誘導体を含む、請求項１〜６、１５、および１７〜１９のいずれか一項に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片。
【請求項２１】
上記天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結している、請求項１〜６、１５、および１７〜２０のいずれか一項に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片。
【請求項２２】
上記水溶性ポリマーは、一つ以上のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含む、請求項２１に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片。
【請求項２３】
上記ＰＥＧは、天然にコードされていないアミノ酸または生物活性を有する分子と連結している、請求項２２に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片。
【請求項２４】
上記ＰＥＧは、上記Ｃ末端の重鎖ドメインおよび／または軽鎖ドメインと共有結合により複合している、請求項２２に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片。
【請求項２５】
上記ＰＥＧは、ジスルフィド結合架橋を介して上記Ｃ末端の重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインと複合している、請求項２４に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片。
【請求項２６】
ＰＥＧは、直鎖状または分枝鎖状のＰＥＧである、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片。
【請求項２７】
一つ以上の葉酸分子および一つ以上のＰＥＧ分子を含む、請求項１７に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片。
【請求項２８】
上記重鎖配列および軽鎖配列は、抗原結合のための一つ以上の位置においてフレームワーク残基および／または生殖細胞変異を有する、請求項３に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片。
【請求項２９】
抗原結合を最適化するための、請求項２８に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片。
【請求項３０】
化合物２９Ａ、２９Ｂ、２９Ｃ、２９Ｄ、２９Ｅ、３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄおよび３０Ｅに示すＰＥＧリンカー分子構造をさらに含む、請求項１７に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片。
【請求項３１】
上記抗体または断片は、一つ以上の翻訳後修飾を含む、請求項７に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片。
【請求項３２】
治療に用いるための、請求項１〜６および１５〜３１のいずれか一項に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の二重特異的結合分子、または請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の細胞毒性的に活性なＣＤ３特異的結合構築体。
【請求項３３】
葉酸受容体を高発現する細胞における細胞殺傷を最適化する方法であって、請求項１〜６および１５〜３１のいずれか一項に記載の抗ＣＤ３抗体または抗体断片および請求項７〜１０に記載の二重特異的結合分子または請求項１１〜１４に記載の細胞毒性的に活性なＣＤ３特異的結合構築体を含み、上記抗体、結合分子、または結合構築体は一つ以上の葉酸塩を含み、一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸が上記抗体に組み込まれている、方法。
【請求項３４】
上記葉酸受容体の数は、１０，０００以上である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
上記一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸、または一つ以上の葉酸分子、または重鎖もしくは軽鎖のＣ末端、または重鎖および軽鎖両方のＣ末端に連結している一つ以上のＰＥＧ分子をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
葉酸受容体を高発現する細胞における疾患または病状を有する対象を処置する方法であって、上記患者に治療上有効量の請求項１〜６および１５〜３１のいずれか一項に記載の抗ＣＤ３抗体を投与することを含む、方法。
【請求項３７】
癌を患う患者を処置する方法であって、上記患者に治療上有効量の請求項１〜６および１５〜３１のいずれか一項に記載の抗ＣＤ３抗体を投与することを含む、方法。
【請求項３８】
上記癌は、葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）の高発現によって特徴付けられ、任意で、上記癌は卵巣癌である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
上記卵巣癌は、上皮（eptithelial）腫瘍、間質腫瘍、胚細胞腫瘍、卵管癌、または原発性腹膜癌腫を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
糖尿病を患う患者を処置する方法であって、上記患者に治療上有効量の請求項１〜６および１５〜３１のいずれか一項に記載の抗ＣＤ３抗体を投与することを含む、方法。
【請求項４１】
ＡＩＤＳを患う患者を処置する方法であって、上記患者に治療上有効量の請求項１〜６および１５〜３１のいずれか一項に記載の抗ＣＤ３抗体を投与することを含む、方法。
【請求項４２】
遺伝病を患う患者を処置する方法であって、上記患者に治療上有効な量の請求項１〜６および１５〜３１のいずれか一項に記載の抗ＣＤ３抗体を投与することを含む、方法。
【請求項４３】
葉酸受容体を高発現する細胞において使用するための医薬の製造における、請求項１〜６および１５〜３１のいずれか一項に記載の抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の二重特異的結合分子、または請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の細胞毒性的に活性なＣＤ３特異的結合構築体、の使用。
【請求項４４】
治療上有効量の、請求項１〜６および１５〜３１のいずれか一項に記載の抗ＣＤ３抗体、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の二重特異的結合分子、または請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の細胞毒性的に活性なＣＤ３特異的結合構築体と、薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤と、を含む、Ｆａｂ医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願の参照〕
本出願は、２０１８年８月２８日に出願された「Anti-CD3 Fab Folates Antibodies and Their Uses」という名称の米国仮出願第６２／７３２，７９３号の利益を主張するものであり、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
〔配列表〕
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１９年８月２８日に作成されたＡＳＣＩＩコピーの名称は、AMBX_0228_00PCT_Sequence_Listing.txtであり、サイズは１２８，４１７バイトである。
【０００３】
〔発明の分野〕
本発明の開示は、免疫腫瘍学の分野に関する。より詳細には、本発明は一つ以上の葉酸分子と複合している抗ＣＤ３抗体およびその断片または変異体に関する。本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と複合している抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸抗体およびその変異体にも関する。
【０００４】
〔発明の背景〕
卵巣癌は、女性において世界で最も多くみられる癌の一つである。年間約２５０，０００人の女性が卵巣癌と診断され、毎年約１４０，０００人の女性がこの疾患により死亡する。卵巣癌の五年生存率は癌の種類や病期によって異なり、その傾向をみると、より進行した卵巣癌ほど五年生存率が悪い。卵巣癌に対する現在の治療選択肢には、化学療法、手術、放射線またはこれらの療法の併用が含まれる。減量手術後にプラチナをベースにした化学療法を実施した後の進行性卵巣癌に対する奏効率は８０％であり、４０〜６０％が完全奏効である。残念ながら、これらの患者の約７０％が再発し、無進行生存期間の中央値は１８ヵ月である。
【０００５】
現在、卵巣癌、および上皮（eptithelial）腫瘍、間質腫瘍、および胚細胞腫瘍を含む卵巣癌の種類、ならびに卵管癌および原発性腹膜癌腫を含む卵巣癌を標的とする治療法の分野には欠点がある。卵巣癌患者の処置には手術、放射線照射および様々な化学療法薬が一般的に用いられているが、最近、ＦＤＡ（米国食品医薬品局）は一次治療として進行性卵巣癌治療のためのベバシズマブ（アバスチン）の追加の生物製剤承認申請（ｓＢＬＡ）を受け入れている。
【０００６】
免疫療法は、癌患者の新たな治療選択肢として評価されており、免疫療法では生物製剤または人工Ｔ細胞を用いて患者の免疫系を刺激することで患者の癌に対処している。いくつかの免疫療法は非常に有望であり、様々な種類の癌の治療に承認されている。癌患者に対して用いられる免疫治療薬の例としては、免疫チェックポイント阻害薬、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）、二重特異的Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、様々な設計のＴ細胞依存性二重特異的抗体（ＴＤＢ）、ＮＫ細胞依存性二重特異的抗体、マクロファージ依存性二重特異的抗体、自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）／癌ワクチン、が挙げられる。
【０００７】
卵巣癌患者を対象とした臨床試験を実施中の生物製剤には、葉酸受容体αに対する抗体薬物複合体（ミルベツキシマブソラブタンシン（ＩＭＧＮ８５３））、ＥｐＣＡＭ−ＣＤ３二重特異的抗体（カツマキソマブ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１を標的とするＤＬＬ４−ＶＥＧＦ二重特異性ワクチン、および葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）を標的とするＣＡＲ−Ｔなどが含まれる。
【０００８】
卵巣癌は、免疫抑制環境を有することが報告されている。これにより、チェックポイント阻害薬のような、特定種類の免疫療法薬の開発が課題となっている。現在、卵巣癌患者を治療するための免疫療法薬は承認されていないが、いくつかは臨床試験で評価されているところである。
【０００９】
葉酸受容体は、乳癌、子宮頚癌、結腸直腸癌、腎臓癌、鼻咽頭癌、卵巣癌、および子宮内膜癌などの上皮癌を含む（がこれらに限定されない）多くの癌において発現する。ヒトにおける葉酸受容体（ＦＲ）ファミリーには、ＦＲα、ＦＲβ、およびＦＲγが含まれる。葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）はＧＰＩアンカー型受容体であり、卵巣癌の約８０〜９０％に高発現している。ＦＯＬＲ１は、ビタミンＢ９としても知られる葉酸、および葉酸の主要代謝産物である５−メチル−テトラヒドロ葉酸（５−ＭＴＨＦ）に結合する。ＦＯＬＲ１の高発現は、粘液性卵巣癌では１１％であるのに対し、主な組織型である高度漿液性卵巣癌の約７６％で観察される。ＦＯＬＲ１は正常な組織において低い発現および制限された発現を有し、これにより、腫瘍学的薬物開発目標のための好ましい標的となる。
【００１０】
当技術分野における欠点を克服するために、本発明者らは、一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸が組み込まれ、さらに一つ以上の葉酸分子を含む抗ＣＤ３抗体における抗体複合体を開発した。二重特異的抗体は、Ｆａｂの重鎖または軽鎖に一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を有するように操作された抗ＣＤ３抗体を含むか、または当該抗ＣＤ３抗体からなりうる。二重特異的抗体または抗体断片は、重鎖および／または軽鎖に一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を有するように操作された抗ＣＤ３抗体を含みうる。
【００１１】
〔発明の概要〕
細胞傷害性Ｔ細胞を癌細胞に集積させる抗ＣＤ３二重特異的抗体は、様々な液性腫瘍および固形腫瘍の処置における有望な新アプローチである。本発明は、抗ＣＤ３抗体を提供する。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は二重特異的抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は抗ＣＤ３Ｆａｂを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、Ｆａｂの重鎖または軽鎖に、好ましくは重鎖に、天然にコードされていないアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸はパラアセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）である。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体はＦａｂの重鎖および／または軽鎖に二つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含み、例えば二つ、三つ、または四つの天然にコードされていないアミノ酸を含み、任意で、当該二つ以上の天然にコードされていないアミノ酸はｐＡＦである。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３Ｆａｂは葉酸塩と複合している。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３Ｆａｂは水溶性ポリマー（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）と複合している。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３Ｆａｂは葉酸塩およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の両方と複合しており、任意で、二機能性リンカーを用いて複合している。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３Ｆａｂは二つの葉酸塩および二つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子と複合している。いくつかの実施形態において、複合体化は天然にコードされていないアミノ酸（ｐＡＦなど）の側鎖を介して行われる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は葉酸受容体陽性（ＦＲ＋）腫瘍細胞に細胞傷害性Ｔ細胞を集積する。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、効能が向上し、毒性が低減し、薬物動態学的（ＰＫ）特性が向上し、親和性が向上し、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）結合が向上し、インビボ半減期（Ｔ１／２）が向上し、インビトロ活性が向上し、血清半減期が向上し、および／またはインビボ活性が向上している。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は効能が向上している。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は毒性が低減している。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体はＰＫ特性が向上している。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は親和性が向上している。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体はＴＡＡ結合が向上している。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体はインビボＴ１／２が向上している。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体はインビトロ活性が向上している。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は血清半減期が向上している。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体はインビボ活性が向上している。本発明は抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸複合体の最適化を提供する。当該最適化では、細胞傷害性Ｔ細胞を葉酸受容体陽性（ＦＲ＋）腫瘍細胞に向けさせることで、最適な効能、低減した毒性、および最適な薬物動態学的（ＰＫ）特性を得る。例えば、本発明は、最適化された抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸複合体を提供する。当該最適化された抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸複合体は、細胞傷害性Ｔ細胞を葉酸受容体陽性（ＦＲ＋）腫瘍細胞に向けさせることで、最適な効能、低減した毒性、および最適な薬物動態学的（ＰＫ）特性を得る。効能とサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）による毒性との間の最適なバランスを実現するために、発明者らは抗ＣＤ３抗体の親和性を微調整し、また、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）結合を最適化した。インビボ半減期（Ｔ１／２）を増加させるために、二機能性リンカーを用いて様々なサイズの葉酸塩分子およびＰＥＧ分子の両方を同時に複合した。最適化された複合体は、異種移植片マウスモデルにおいて、強力かつ選択的なインビトロ活性、良好な血清半減期、および強力なインビボ活性を示した。この半合成的アプローチは、他のＴＡＡに対して選択的な小分子リガンドを用いたさらなる抗ＣＤ３二重特異的薬剤の生成に適用できる可能性が高い。
【００１２】
本願発明は、抗ＣＤ３抗体および当該抗ＣＤ３抗体と葉酸塩との複合体を提供する。本願発明は、抗ＣＤ３抗体および当該抗ＣＤ３抗体とＰＥＧとの複合体も提供する。本願発明は、抗ＣＤ３抗体および当該抗ＣＤ３抗体と葉酸塩とＰＥＧとの複合体も提供する。いくつかの実施形態において、本発明の新規な抗ＣＤ３抗体は、一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、完全な抗体重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、完全な抗体軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、完全な抗体重鎖と完全な抗体軽鎖とを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、抗体軽鎖の可変領域を含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、抗体重鎖の可変領域を含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、抗体軽鎖の一つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、抗ＣＤ３抗体重鎖の一つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、軽鎖の一つ以上のＣＤＲおよび重鎖の一つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、軽鎖の三つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、重鎖の三つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、軽鎖の三つのＣＤＲおよび重鎖の三つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、Ｆａｂを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、二つのＦａｂを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、二つ以上のＦａｂを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、二つのｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、二つ以上のｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、ミニボディを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、二つのミニボディを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、二つ以上のミニボディを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、ダイアボディを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、二つのダイアボディを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、二つ以上のダイアボディを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、ＢｉＴＥを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、二つのＢｉＴＥを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、二つ以上のＢｉＴＥを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、ＤＡＲＴを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、二つのＤＡＲＴを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、二つ以上のＤＡＲＴを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、ＴａｎｄＡｂを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、二つのＴａｎｄＡｂを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、二つ以上のＴａｎｄＡｂを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、完全な軽鎖と完全な重鎖とを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、Ｆｃドメインまたはその一部を一つ以上含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、上述の実施形態の任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、任意の上述の実施形態のホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体またはヘテロ多量体を含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、結合対象に結合しているポリペプチドを含む（ここで、上記結合対象は、抗原、ポリペプチド、核酸分子、ポリマー、または他の分子もしくは物質を含む）。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、抗体以外の骨格分子または物質と結合している。
【００１３】
いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、一つ以上の翻訳後修飾を有する。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、リンカー、ポリマーまたは生物活性を有する分子と連結している。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、二機能性ポリマー、二機能性リンカー、または少なくとも一つの追加の抗ＣＤ３抗体と連結している。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、抗ＣＤ３抗体ではないポリペプチドと連結している。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸を有する抗原結合性ポリペプチドは、一つ以上の追加の抗原結合性ポリペプチドと連結している（追加の抗原結合性ポリペプチドもまた、天然にコードされていないアミノ酸を有していてもよい）。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸を有する抗原結合性ポリペプチドは、一つ以上のポリペプチド−小分子複合体と連結している（ポリペプチド−小分子複合体もまた、天然にコードされていないアミノ酸を有していてもよい）。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸を有する抗ＣＤ３抗体は、一つ以上の追加の抗原結合性ポリペプチドと連結している（追加の抗原結合性ポリペプチドもまた、天然にコードされていないアミノ酸を有していてもよい）。
【００１４】
いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、小分子リガンドと連結している。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、二つの小分子リガンドと連結している。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、二つ以上の小分子リガンドと連結している。いくつかの実施形態において、小分子リガンドは、葉酸分子またはＤＵＰＡ分子を有する。いくつかの実施形態において、小分子リガンドは、二つの葉酸分子または二つのＤＵＰＡ分子を有する。いくつかの実施形態において、小分子リガンドは、二つ以上の葉酸分子または二つ以上のＤＵＰＡ分子を有する。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、水溶性ポリマーと連結している。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、二機能性ポリマーである。いくつかの実施形態において、二機能性ポリマーは、第二のポリペプチドと連結している。いくつかの実施形態において、第二のポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、第二のポリペプチドは、抗ＣＤ３抗体である。いくつかの実施形態において、小分子リガンドは水溶性ポリマーと連結している。いくつかの実施形態において、二つの小分子リガンドは二つの水溶性ポリマーと連結している。いくつかの実施形態において、二つ以上の小分子リガンドは二つ以上の水溶性ポリマーと連結している。いくつかの実施形態において、葉酸塩はＰＥＧ分子と連結している。いくつかの実施形態において、二つの葉酸分子は二つの水溶性ポリマーと連結している。いくつかの実施形態において、二つ以上の葉酸分子は二つ以上のＰＥＧ分子と連結している。
【００１５】
いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体におけるアミノ酸の置換は、天然に生じるアミノ酸によるものであってもよいし、天然に生じないアミノ酸によるものであってもよい。ただし、少なくとも一つの置換は、天然にコードされていないアミノ酸によるものである。
【００１６】
いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は、カルボニル基、アセチル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基またはアルキン基を有する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子の平均分子量は、約０．１ｋＤａ〜約１００ｋＤａである。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子の平均分子量は、０．１ｋＤａ〜５０ｋＤａである。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）の平均分子量は、１ｋＤａ〜２５ｋＤａ、２〜２２ｋＤａ、または５ｋＤａ〜２０ｋＤａである。例えば、平均分子量は、約５ｋＤａ、または約１０ｋＤａ、または約２０ｋＤａでありうる。例えば、ポリ（エチレングリコール）ポリマーの平均分子量は、５ｋＤａ、または１０ｋＤａ、または２０ｋＤａでありうる。特定の実施形態において、分子量は、適当な方法（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、質量分析法、およびキャピラリー電気泳動など）によって測定される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、分枝ポリマーである。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分枝ポリマーの各分枝の分子量は、１ｋＤａ〜１００ｋＤａ、または１ｋＤａ〜５０ｋＤａである。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分枝ポリマーの各分枝の分子量は、１ｋＤａ〜２５ｋＤａ、２〜２２ｋＤａ、または５ｋＤａ〜２０ｋＤａである。例えば、ポリ（エチレングリコール）分枝ポリマーの各分枝の分子量は、約５ｋＤａ、または約１０ｋＤａ、または約２０ｋＤａでありうる。例えば、ポリ（エチレングリコール）分枝ポリマーの各分枝の分子量は、５ｋＤａ、または１０ｋＤａ、または２０ｋＤａでありうる。
【００１９】
本発明はまた、一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸と結合しているリンカー、ポリマーまたは生物活性を有する分子を含む、抗ＣＤ３抗体ポリペプチドを提供する（上記天然にコードされていないアミノ酸は、リボソームによって、上記ポリペプチドの事前に選択した位置に組み込まれる）。
【００２０】
本発明の実施形態は、配列番号１〜６２を一つ以上有する抗ＣＤ３抗体を提供する。配列番号１〜６２を二つ有する抗ＣＤ３抗体。本発明の実施形態は、配列番号１〜６２を二つ有する抗ＣＤ３抗体を提供する。配列番号１〜６のいずれか一つおよび配列番号７〜９のいずれか一つを有する抗ＣＤ３抗体。本発明の実施形態は、配列番号１〜５を二つ有する抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の他の実施形態は、（ｉ）第一結合ドメインおよび（ｉｉ）第二結合ドメインを有する二重特異的結合分子であって、上記第二結合ドメインは配列番号１〜６２からなる群より選ばれる、二重特異的結合分子を提供する。本発明の他の実施形態は、（ｉ）第一結合ドメインおよび（ｉｉ）第二結合ドメインを有する二重特異的結合分子であって、上記第二結合ドメインは、配列番号１、２、３、４、５、６、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、および５７のいずれか一つ、および配列番号７、８、９、１８、１９、２０、３９、５８、５９、６０、６１、および６２のいずれか一つ、を有する抗ＣＤ３を含む、二重特異的結合分子を提供する。本発明の他の実施形態は、（ｉ）第一結合ドメインおよび（ｉｉ）第二結合ドメインを有する二重特異的結合分子であって、上記第二結合ドメインは、配列番号１、２、３、４、５、６、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、および５７のいずれか一つ、を有する抗ＣＤ３Ｆａｂを含む、二重特異的結合分子を提供する。本発明の他の実施形態は、（ｉ）第一結合ドメインおよび（ｉｉ）第二結合ドメインを有する二重特異的結合分子であって、上記第二結合ドメインは、配列番号１、２、３、４、５、６、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、および５７のいずれか一つ；および配列番号７、８、９、１８、１９、２０、３９、５８、５９、６０、６１、および６２のいずれか一つ、を有する抗ＣＤ３Ｆａｂを含む、二重特異的結合分子を提供する。本発明の他の実施形態は、配列番号１〜６２の一つ以上に記載のアミノ酸配列を有する、細胞毒性的に活性なＣＤ３特異的結合構築体を提供する。本発明の他の実施形態は、配列番号１〜６２の二つに記載のアミノ酸配列を有する、細胞毒性的に活性なＣＤ３特異的結合構築体を提供する。本発明の他の実施形態は、配列番号１、２、３、４、５、６、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、および５７のいずれか一つ、を有する抗ＣＤ３を含む、細胞毒性的に活性なＣＤ３特異的結合構築体を提供する。本発明の他の実施形態は、配列番号７、８、９、１８、１９、２０、３９、５８、５９、６０、６１、および６２のいずれか一つ、を有する抗ＣＤ３Ｆａｂを含む、細胞毒性的に活性なＣＤ３Ｆａｂ特異的結合構築体を提供する。本発明の他の実施形態は、配列番号１、２、３、４、５、６、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、および５７のいずれか一つ；および配列番号７、８、９、１８、１９、２０、３９、５８、５９、６０、６１、および６２のいずれか一つ、を有する抗ＣＤ３を含む、細胞毒性的に活性なＣＤ３特異的結合構築体を提供する。本発明の他の実施形態は、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体であって、上記抗ＣＤ３抗体は、（ａ）配列番号１〜６からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび（ｂ）配列番号７〜９からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む結合ドメインを有する、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。
【００２１】
本発明の他の実施形態は、抗ＣＤ３抗体であって、上記抗体は一つ以上の翻訳後修飾を含む、抗ＣＤ３抗体を提供する。本発明の他の実施形態は、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体であって、上記抗体は、リンカー、ポリマーまたは生物活性を有する分子と連結している、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の他の実施形態は、生物活性を有する分子が葉酸塩である、抗ＣＤ３抗体を提供する。本発明の実施形態は、一つ以上の葉酸塩を含む抗ＣＤ３抗体を提供する。本発明の実施形態は、二つの葉酸塩を有する抗ＣＤ３抗体を提供する。本発明の他の実施形態は、生物活性を有する分子がＤＵＰＡである、抗ＣＤ３抗体を提供する。本発明の実施形態は、一つ以上のＤＵＰＡを含む抗ＣＤ３抗体を提供する。本発明の実施形態は、二つのＤＵＰＡを有する抗ＣＤ３抗体を提供する。
【００２２】
特定の実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、および５７のいずれか一つの重鎖アミノ酸配列；および配列番号７、８、９、１８、１９、２０、３９、５８、５９、６０、６１、および６２のいずれか一つの軽鎖アミノ酸配列、を有する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、および５７のいずれか一つ、を有する抗ＣＤ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、配列番号７、８、９、１８、１９、２０、３９、５８、５９、６０、６１、および６２のいずれか一つ、を有する抗ＣＤ３を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、および５７のいずれか一つ；および配列番号７、８、９、１８、１９、２０、３９、５８、５９、６０、６１、および６２のいずれか一つ、を有する抗ＣＤ３Ｆａｂを含む。本発明の他の実施形態は、配列番号１〜５の重鎖および配列番号７〜９の軽鎖を有する抗ＣＤ３変異体を提供する。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、配列番号７および１０、または７および１４、または７および１１、または７および１５、または７および１２、または７および１６、または７および１３、または７および１７、または７および１、または７および１８、または７および１９、または１２および１８、または１２および１９または１２および１６を有する抗ＣＤ３Ｆａｂを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、配列番号７および１０、または７および１４、または７および１１、または７および１５、または７および１２、または７および１６、または７および１３、または７および１７、または７および１、または７および１８、または７および１９、または１２および１８、または１２および１９または１２および１６を有する抗ＣＤ３Ｆａｂを含み、当該配列のそれぞれは一つ以上の非天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、配列番号７および１０、または７および１４、または７および１１、または７および１５、または７および１２、または７および１６、または７および１３、または７および１７、または７および１、または７および１８、または７および１９、または１２および１８、または１２および１９または１２および１６を有する抗ＣＤ３Ｆａｂを含み、当該配列のそれぞれは二つの非天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、一つ以上の非天然アミノ酸を含む配列番号７；および一つ以上の非天然アミノ酸を含む配列番号１０または１４または１１または１５または１２または１６または１３または１７または１または１８または１９のうちの一つを有する抗ＣＤ３Ｆａｂを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、一つ以上の非天然アミノ酸を含む配列番号１２；および一つ以上の非天然アミノ酸を含む配列番号１８または１９または１６のうちの一つを有する抗ＣＤ３Ｆａｂを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、配列番号５８および４９、または５８および４０、または５９および５０、または５９および４１、または５９および４２、または５９および５２、または５９および４３、または５９および４４、または５９および４５または５９および５４または５９および５５、または５９および４６、または９および４４、または９および５３、または６０および４４、または６０および５３、または６０および４２、または６０および５１、６０および５０、または６０および４１、または６１および４５、または６１および５４、または６２および５６、または６２および４７、または６２および４８、または６２および５７、または７および４７、または７および５６を有する抗ＣＤ３Ｆａｂを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、二つの非天然アミノ酸を有する抗ＣＤ３Ｆａｂを含み、上記抗体は、配列番号１８および１６、または１８および５９、または１８および４３を有する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、配列番号１および７、または１および８、または１および９を有する抗ＣＤ３Ｆａｂを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、配列番号２および７、または２および８、または２および９を有する抗ＣＤ３Ｆａｂを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、配列番号３および７、または３および８、または３および９を有する抗ＣＤ３Ｆａｂを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、配列番号４および７、または４および８、または４および９を有する抗ＣＤ３Ｆａｂを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、配列番号５および７、または５および８、または５および９を有する抗ＣＤ３Ｆａｂを含む。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、配列番号６および７、または６および８、または６および９を有する抗ＣＤ３Ｆａｂを含む。抗ＣＤ３抗体は、（ｉ）第一結合ドメインおよび（ｉｉ）第二結合ドメインを有する二重特異的抗体であって、上記第二結合ドメインは上記抗ＣＤ３Ｆａｂを含みうる。本発明の他の実施形態は、天然にコードされていないアミノ酸が組み込まれた配列番号１〜６２より選ばれる抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸は抗体に部位特異的に組み込まれている。
【００２６】
他の実施形態は、天然にコードされていないアミノ酸が、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、ｐ−プロパルギロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、ｔｒｉ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、またはイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニンからなる群より選ばれる、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。
【００２７】
本発明の他の実施形態は、天然にコードされていないアミノ酸が部位特異的に組み込まれている、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の実施形態は、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体であって、天然にコードされていないアミノ酸が（当業者に周知のＫａｂａｔナンバリングによる）Ｈ１１４、Ｈ１１５、Ｈ１２９、Ｌ１５７、Ｈ１６０、Ｌ１７２、およびＬ２０５の位置のいずれか一つにおいて部位特異的に組み込まれている抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の実施形態は、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体であって、天然にコードされていないアミノ酸がＫａｂａｔナンバリングによるＨ１１４、Ｈ１１５、Ｈ１２９、Ｌ１５７、Ｈ１６０、Ｌ１７２、およびＬ２０５の位置において部位特異的に組み込まれている抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の実施形態は、天然にコードされていないアミノ酸が１１４位において部位特異的に組み込まれている、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の実施形態は、天然にコードされていないアミノ酸が１１５位において部位特異的に組み込まれている、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の実施形態は、天然にコードされていないアミノ酸が１２９位において部位特異的に組み込まれている、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の実施形態は、天然にコードされていないアミノ酸が１５７位において部位特異的に組み込まれている、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の実施形態は、天然にコードされていないアミノ酸が１６０位において部位特異的に組み込まれている、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の実施形態は、天然にコードされていないアミノ酸が１７２位において部位特異的に組み込まれている、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の実施形態は、天然にコードされていないアミノ酸が２０５位において部位特異的に組み込まれている、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の他の実施形態は、一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸が組み込まれている、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の他の実施形態は、二つの天然にコードされていないアミノ酸が組み込まれている、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の他の実施形態は、重鎖または軽鎖に一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む抗ＣＤ３Ｆａｂ変異体を提供する。本発明の他の実施形態は、軽鎖に一つの天然にコードされていないアミノ酸を含む抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の他の実施形態は、重鎖に一つの天然にコードされていないアミノ酸を含む抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の他の実施形態は、二つの天然にコードされていないアミノ酸を含む抗ＣＤ３Ｆａｂ変異体を提供する。
【００２８】
本発明の他の実施形態は、重鎖がＣ末端にアミノ酸伸長をさらに含む、抗ＣＤ３Ｆａｂ変異体を提供する。本発明の実施形態は、アミノ酸伸長がアミノ酸ＤＫＴＨＴを含む、抗ＣＤ３Ｆａｂ変異体を提供する。本発明の他の実施形態は、Ｃ末端の重鎖においてアミノ酸伸長をさらに含む抗ＣＤ３Ｆａｂ変異体を提供する。本発明の他の実施形態は、アミノ酸伸長がアミノ酸ＤＫＴＨＴを含む、抗ＣＤ３Ｆａｂ変異体を提供する。
【００２９】
本発明の他の実施形態は、重鎖配列が抗原結合のための一つ以上の位置においてマウスフレームワーク残基を有する、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の他の実施形態は、重鎖配列が（Ｋａｂａｔナンバリングによる）３０位、４９位、７７位、または９３位においてマウスフレームワーク残基を有する、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の他の実施形態は、軽鎖配列が一つ以上の位置においてマウスフレームワーク残基を有する、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の他の実施形態は、軽鎖配列が（Ｋａｂａｔナンバリングによる）３６位、４６位、４９位、５７位、または５８位においてフレームワーク残基を有する、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態において、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体はリンカーを含む。本発明の他の実施形態は、リンカーが水溶性ポリマーである抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の他の実施形態は、水溶性ポリマーがポリ（エチレングリコール）を含む抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の他の実施形態は、水溶性ポリマーが直鎖状または分枝鎖状の水溶性ポリマーである抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の他の実施形態は、水溶性ポリマーが抗体中に存在する天然にコードされていないアミノ酸と連結している抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。いくつかの実施形態において、リンカーは、非天然アミノ酸の側鎖を介して抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体に結合している。本発明の実施形態は、ポリ（エチレングリコール）を含む水溶性ポリマーと連結している二つ以上のアミノ酸を含む抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の他の実施形態は、上記水溶性ポリマーと連結している一つ以上のアミノ酸が天然にコードされていないアミノ酸である抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供。本発明の他の実施形態は、一つ以上のポリ（エチレングリコール）を含む抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の他の実施形態は、ポリ（エチレングリコール）が１ｋＤａ〜１００ｋＤａである抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の他の実施形態は、一つ以上の葉酸塩および一つ以上のポリ（エチレングリコール）を含む抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の他の実施形態は、二つの葉酸塩および二つのポリ（エチレングリコール）を含む抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。
【００３１】
本発明の他の実施形態は、葉酸受容体を高発現する細胞における細胞殺傷を最適化する方法であって、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を含み、上記抗体は一つ以上の葉酸塩を含み、一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸が上記抗体に組み込まれている、方法を提供する。本発明の他の実施形態は、葉酸受容体を高発現する腫瘍細胞の死滅を再方向付けＴ細胞によって最適化する方法であって、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を含み、上記抗体は一つ以上の葉酸塩を含み、一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸が上記抗体に組み込まれている、方法を提供する。他の実施形態において、方法は一つ以上の水溶性ポリマーをさらに含む。本発明の他の実施形態は、水溶性ポリマーがポリ（エチレングリコール）を含む、方法を提供する。他に、水溶性ポリマーは、直鎖状または分枝鎖状の水溶性ポリマーである、方法を提供する。ポリ（エチレングリコール）は１ｋＤａ〜１００ｋＤａである。ポリ（エチレングリコール）は、５、１０、２０、３０、４０、５０、または６０ｋＤａである。他の実施形態において、葉酸受容体の数は、１０，０００以上である。
【００３２】
本発明の他の実施形態は、細胞における細胞毒性を低減する方法を提供する。本発明の他の実施形態は、Ｔ細胞を集積するための標的に対する、抗ＣＤ３抗体の親和性を最適化または低減することにより、細胞における細胞毒性を低減する方法を提供する。本発明の他の実施形態は、Ｔ細胞結合の前に、二つ以上の葉酸塩を複合して優先的に腫瘍細胞と結合させることにより、腫瘍細胞の細胞毒性を増強する方法を提供する。本発明の他の実施形態は、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体の血清半減期を向上させる方法を提供する。本発明の他の実施形態は、Ｆａｂを薬物動態学的（ＰＫ）伸長分子（ＨＳＡ、Ｃ１２〜Ｃ１６アシル鎖、ＸＴＥＮ、または水溶性ポリマー（ＰＥＧなど）が挙げられるがこれらに限定されない）と複合することにより抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体の血清半減期を向上させる方法を提供する。他の実施形態は、細胞傷害性Ｔ細胞をＦＲ＋腫瘍細胞に集積する方法を提供する。他の実施形態は、効能を向上させ、毒性を低減し、ＰＫ特性を向上させ、親和性を向上させ、ＴＡＡ結合を向上させ、インビボＴ１／２を向上させ、インビトロ活性を向上させ、血清半減期を向上させ、および／またはインビボ活性を向上させる、方法を提供する。他の実施形態は、効能を向上させる方法を提供する。他の実施形態は、毒性を低減する方法を提供する。他の実施形態は、ＰＫ特性を向上させる方法を提供する。他の実施形態は、親和性を向上させる方法を提供する。他の実施形態は、ＴＡＡ結合を向上させる方法を提供する。他の実施形態は、インビボＴ１／２を向上させる方法を提供する。他の実施形態は、インビトロ活性を向上させる方法を提供する。他の実施形態は、インビボ活性を向上させる方法を提供する。
【００３３】
本発明の他の実施形態は、重鎖配列または軽鎖配列が一つ以上の位置においてヒト生殖細胞変異を有する、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の実施形態は、重鎖配列におけるヒト生殖細胞変異が（Ｋａｂａｔナンバリングによる）３５位または５２位に位置する、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。本発明の他の実施形態は、軽鎖配列におけるヒト生殖細胞変異が（Ｋａｂａｔナンバリングによる）５３位に位置する、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。
【００３４】
本発明の他の実施形態は、化合物２９Ａ、２９Ｂ、２９Ｃ、２９Ｄ、２９Ｅ、３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄおよび３０Ｅの構造を有するＰＥＧ葉酸リンカーをさらに含む、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を提供する。
【００３５】
他の実施形態は、葉酸受容体を高発現する細胞における疾患または病状を有する患者を処置する方法であって、上記患者に治療上有効量の本明細書に記載の抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を投与することを含む、方法を提供する。本発明の他の実施形態は、二つの葉酸分子および二つのＰＥＧ化分子を含む二重特異的抗ＣＤ３Ｆａｂを提供する。他の実施形態において、二重特異的抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体は、部位特異的に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸をさらに含む。本発明は、患者に治療上有効量の本発明の抗ＣＤ３抗体を患者に投与することによって癌を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態では、癌は卵巣癌である。いくつかの実施形態では、卵巣癌は上皮（eptithelial）腫瘍、間質腫瘍、および胚細胞腫瘍である。いくつかの実施形態では、卵巣癌は卵管癌および原発性腹膜癌腫を含む。いくつかの実施形態では、癌は、葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）の高度発現によって特徴付けられ、卵巣癌などである。いくつかの実施形態では、癌は、細胞傷害性Ｔ細胞を葉酸受容体陽性（ＦＲ＋）腫瘍細胞に集積することにより処置される。本発明は、患者に治療上有効量の本発明の抗ＣＤ３抗体を患者に投与することによって遺伝病を処置する方法を提供する。本発明は、患者に治療上有効量の本発明の抗ＣＤ３抗体を患者に投与することによってＡＩＤＳを処置する方法を提供する。本発明は、患者に治療上有効量の本発明の抗ＣＤ３抗体を患者に投与することによって糖尿病を処置する方法を提供する。発明の上記抗ＣＤ３抗体は、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を含む二重特異的抗体であって、上記抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体は、任意で、二つの葉酸分子および二つのＰＥＧ化分子と複合している、二重特異的抗体でありうる。さらなる実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸が上記抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体に部位特異的に組み込まれており、非天然アミノ酸の側鎖を介して二つの葉酸分子および二つのＰＥＧ化分子と複合している。
【００３６】
本発明の抗ＣＤ３抗体は、葉酸受容体を高発現する細胞における疾患または病状の処置に使用される。本発明の抗ＣＤ３抗体は、癌の処置に使用される。いくつかの実施形態では、癌は卵巣癌である。いくつかの実施形態では、卵巣癌は上皮（eptithelial）腫瘍、間質腫瘍、および胚細胞腫瘍である。いくつかの実施形態では、卵巣癌は卵管癌および原発性腹膜癌腫を含む。いくつかの実施形態では、癌は、葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）の高発現によって特徴付けられ、卵巣癌などである。いくつかの実施形態では、癌は、細胞傷害性Ｔ細胞を葉酸受容体陽性（ＦＲ＋）腫瘍細胞に集積することにより処置される。本発明の抗ＣＤ３抗体は、遺伝病の処置に使用される。本発明の抗ＣＤ３抗体は、ＡＩＤＳの処置に使用される。本発明の抗ＣＤ３抗体は、糖尿病の処置に使用される。発明の上記抗ＣＤ３抗体は、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を含む二重特異的抗体であって、上記抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体は、任意で、二つの葉酸分子および二つのＰＥＧ化分子と複合している、二重特異的抗体でありうる。さらなる実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸が上記抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体に部位特異的に組み込まれており、非天然アミノ酸の側鎖を介して二つの葉酸分子および二つのＰＥＧ化分子と複合している。本発明の抗ＣＤ３抗体は、葉酸受容体を高発現する細胞における疾患または病状を処置するための医薬の製造において使用されうる。本発明の抗ＣＤ３抗体は、癌を処置するための医薬の製造において使用されうる。いくつかの実施形態では、癌は卵巣癌である。いくつかの実施形態では、卵巣癌は上皮（eptithelial）腫瘍、間質腫瘍、および胚細胞腫瘍である。いくつかの実施形態では、卵巣癌は卵管癌および原発性腹膜癌腫を含む。いくつかの実施形態では、癌は、葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）の高度発現によって特徴付けられ、卵巣癌などである。いくつかの実施形態では、癌は、細胞傷害性Ｔ細胞を葉酸受容体陽性（ＦＲ＋）腫瘍細胞に集積することにより処置される。本発明の抗ＣＤ３抗体は、遺伝病を処置するための医薬の製造において使用されうる。本発明の抗ＣＤ３抗体は、ＡＩＤＳを処置するための医薬の製造において使用されうる。本発明の抗ＣＤ３抗体は、糖尿病を処置するための医薬の製造において使用されうる。発明の上記抗ＣＤ３抗体は、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を含む二重特異的抗体であって、上記抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体は、任意で、二つの葉酸分子および二つのＰＥＧ化分子と複合している、二重特異的抗体でありうる。さらなる実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸が上記抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体に部位特異的に組み込まれており、非天然アミノ酸の側鎖を介して二つの葉酸分子および二つのＰＥＧ化分子と複合している。
【００３７】
本発明の開示は、抗体または断片または変異体に組み込まれている一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を有する抗ＣＤ３抗体または抗体断片または変異体を提供する。抗ＣＤ３抗体、抗体断片、または変異体としては、これらには限定されないが、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆａｂおよび（Ｆａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二機能性ハイブリッド抗体、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲの組み合わせ、可変領域、フレームワーク領域、定常領域、重鎖、軽鎖、他の骨格を有する非抗体分子、二重特異的抗体、などが挙げられる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体または抗体断片または変異体は、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体、断片、または変異体である。
【００３８】
発明の開示は、抗ＣＤ３抗体または抗体断片を含む二重特異的抗体複合体を提供する。本発明は、一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸が組み込まれた抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体または抗体断片を含む二重特異的抗体複合体を開示する。さらに、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体または抗体断片および一つ以上の葉酸分子を含む二重特異的抗体複合体であって、一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸が部位特異的に抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体に組み込まれている、二重特異的抗体複合体を記載する。抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体または抗体断片、一つ以上の葉酸分子、および一つ以上のＰＥＧ分子を含む二重特異的抗体複合体であって、一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸が部位特異的に抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体に組み込まれている、二重特異的抗体複合体を記載する。抗体または抗体断片、一つ以上の小分子、および一つ以上のリンカーを含む抗ＣＤ３Ｆａｂ二重特異的抗体であって、抗体または抗体断片は一つ以上のリンカーによって一つ以上の小分子に連結しており、小分子は一つ以上の葉酸分子または一つ以上のＤＵＰＡ分子またはアナログまたは誘導体である、抗ＣＤ３Ｆａｂ二重特異的抗体を記載する。抗体または抗体断片は、一つ以上のリンカーによって一つ以上の葉酸分子または一つ以上のＤＵＰＡ分子と部位特異的に連結しうる。抗体または抗体断片は、一つ以上の非天然アミノ酸を含みうる。抗体または抗体断片は、一つ以上の非天然アミノ酸に対する一つ以上のリンカーによって一つ以上の葉酸分子または一つ以上のＤＵＰＡ分子と連結しうる。非天然アミノ酸は、抗体に部位特異的に組み込まれていてもよい。抗体または抗体断片は、一つ以上の非天然アミノ酸に対する一つ以上のＰＥＧ分子によって一つ以上の葉酸分子またはＤＵＰＡ分子と連結しうる。あるいは、抗体または抗体断片は、天然アミノ酸にに対する一つ以上のリンカーによって一つ以上の葉酸分子または一つ以上のＤＵＰＡ分子と連結しうる。抗体または抗体断片は、抗ＣＤ３Ｆａｂでありうる。
【００３９】
抗ＣＤ３Ｆａｂ、一つ以上の葉酸分子、および一つ以上のリンカーを含む二重特異的抗体複合体であって、抗ＣＤ３Ｆａｂは一つ以上のリンカーによって一つ以上の葉酸分子と連結している、二重特異的抗体複合体を記載する。抗ＣＤ３Ｆａｂは、一つ以上の非天然アミノ酸を含みうる。一つ以上の非天然アミノ酸は、抗ＣＤ３Ｆａｂの天然アミノ酸に取って代わりうる。抗ＣＤ３Ｆａｂ、一つ以上のＤＵＰＡ分子、および一つ以上のリンカーを含む二重特異的抗体複合体であって、抗ＣＤ３Ｆａｂは一つ以上のリンカーによって一つ以上のＤＵＰＡ分子と連結している、二重特異的抗体複合体を記載する。抗ＣＤ３Ｆａｂは、一つ以上の非天然アミノ酸を含みうる。一つ以上の非天然アミノ酸は、抗ＣＤ３Ｆａｂの天然アミノ酸に取って代わりうる。
【００４０】
〔図面の簡単な説明〕
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載される。本発明の原理が利用される例示的な実施形態が記載されている以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって、本発明の開示の特徴および利点のより良い理解が得られるであろう。
【００４１】
図１は、ヒトＰＢＭＣに結合しているヒト化抗ＣＤ３Ｆａｂを示す。ＨＥＫ２９３細胞において発現したヒト化抗ＣＤ３ＦａｂとヒトＰＢＭＣとの結合（２回の実験）を示す。３ｖＨ鎖配列および３ｖＬ鎖配列を組み合わせることにより、合計９個のＦａｂを試験した。ｖＬ１．０鎖を有する３個のＦａｂは、すべてのｖＨ鎖との組み合わせにおいて、ヒトＣＤ３との結合を失った。
【００４２】
図２Ａ〜２Ｆは、ヒトＰＢＭＣおよびイヌＰＢＭＣに結合しているヒト化抗ＣＤ３Ｆａｂの滴定を示す。（図２Ａ）Ｆａｂ１の滴定；（図２Ｂ）Ｆａｂ２の滴定；（図２Ｃ）Ｆａｂ３の滴定；（図２Ｄ）Ｆａｂ４の滴定；（図２Ｅ）Ｆａｂ５の滴定；および（図２Ｆ）Ｆａｂ６の滴定。
【００４３】
図３は、抗ＣＤ３Ｆａｂ１分子のラットにおける薬物動態学的（ＰＫ）分析を示す。ヒト化抗ＣＤ３Ｆａｂ１分子のＰＥＧ化によって、ラットにおける血漿半減期（Ｔ１／２）が延長される。
【００４４】
図４Ａ〜４Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞由来の第１ラウンド低親和性Ｆａｂの結合を示す。ヒトＣＤ３（図４Ａ）およびイヌＣＤ３（図４Ｂ）に対する結合親和性の低い、ＨＥＫ２９３細胞から生成した第１ラウンド抗ＣＤ３Ｆａｂ変異体を示す。第１ラウンドスクリーニングにおいて試験した３５個の新たなＦａｂ変異体の中から、４個の選択された低親和性Ｆａｂ（Ｆａｂ７〜１０）および対照Ｆａｂ１についての滴定曲線を示す。
【００４５】
図５Ａ〜５Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞由来の第２ラウンド低親和性ＦａｂのヒトＣＤ３への結合を示す。ヒトＣＤ３（図５Ａ）およびイヌＣＤ３（図５Ｂ）に対する結合親和性の低い、ＨＥＫ２９３細胞から生成した第２ラウンド抗ＣＤ３Ｆａｂ変異体を示す。第２ラウンドスクリーニングにおいて試験した４３個の新たなＦａｂ変異体の中から、４個の選択された低親和性Ｆａｂおよび親対照Ｆａｂ１についての滴定曲線を示す。
【００４６】
図６Ａ〜６Ｂは、大腸菌細胞に由来する低親和性Ｆａｂ−葉酸変異体のヒトＣＤ３への結合を示す。図６Ａは大腸菌細胞から精製した抗ＣＤ３Ｆａｂ−ＨＫ１２９−葉酸分子の低親和性変異体の、ヒトＣＤ３への第１ラウンドの結合を示し、図６Ｂは第２ラウンドの上記結合を示す。親対照であるＦａｂ１−ＨＫ１２９−葉酸塩は、陽性対照として含まれる。
【００４７】
図７Ａ〜７Ｂは、イヌＣＤ３に結合している抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸の低親和性変異体を示す。図７Ａは大腸菌細胞から精製した抗ＣＤ３Ｆａｂ−ＨＫ１２９−葉酸分子の低親和性変異体の、イヌＣＤ３への第１ラウンドの結合を示し、図７Ｂは第２ラウンドの上記結合を示す。親対照であるＦａｂ１−ＨＫ１２９−葉酸塩は、陽性対照として含まれる。
【００４８】
図８は、ヒトＰＢＭＣを有するＳＫＯＶ−３細胞への細胞毒性を示す。ヒトＰＢＭＣを有する大腸菌細胞から生成したヒト化抗ＣＤ３Ｆａｂ−ＨＫ１２９−葉酸分子の４個の低親和性変異体のインビトロ細胞毒性。親対照であるＦａｂ１−ＨＫ１２９−葉酸塩は、陽性対照として含まれる。
【００４９】
図９は、イヌＰＢＭＣを有するＳＫＯＶ−３細胞への細胞毒性を示す。イヌＰＢＭＣを有する大腸菌細胞から生成したヒト化抗ＣＤ３Ｆａｂ−ＨＫ１２９−葉酸分子の４個の低親和性変異体のインビトロ細胞毒性。親対照であるＦａｂ１−ＨＫ１２９−葉酸塩は、陽性対照として含まれる。
【００５０】
図１０Ａ〜１０Ｂは、Ｔ細胞の活性化を示す。図１０Ａは、様々な低親和性抗ＣＤ３Ｆａｂ−ＨＫ１２９−葉酸分子による、ＳＫＯＶ−３細胞を含まないＴ細胞マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の活性化を示す。図１０Ｂは、様々な低親和性抗ＣＤ３Ｆａｂ−ＨＫ１２９−葉酸分子による、ＳＫＯＶ−３細胞を含むＴ細胞マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の活性化を示す。
【００５１】
図１１Ａ〜１１Ｄは、ＳＫＯＶ−３腫瘍細胞が存在しない場合における様々な低親和性抗ＣＤ３Ｆａｂ−ＨＫ１２９−葉酸変異体（図１１Ａおよび１１Ｃ）またはＳＫＯＶ−３腫瘍細胞が存在する場合における様々な低親和性抗ＣＤ３Ｆａｂ−ＨＫ１２９−葉酸変異体（図１１Ｂおよび１１Ｄ）の、ＩＦＮγによるインビトロサイトカイン放出（図１１Ａおよび１１Ｂ）、およびＴＮＦαによるインビトロサイトカイン放出（図１１Ｃおよび１１Ｄ）を示す。
【００５２】
図１２Ａ〜１２Ｆは、本発明の抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸二重特異的複合体およびＰＥＧリンカーを示す。図１２Ａは葉酸−ＰＥＧリガンドの代表的な例を示す；図１２Ｂは葉酸−分岐ＰＥＧリガンドの代表的な例を示す；図１２Ｃ〜１２ＤはＰＥＧ複合体を含むＣＤ３−葉酸二重特異の代表的な例を示す；図１２ＥはＣ末端にＰＥＧ化を含むＣＤ３−葉酸二重特異の代表的な例を示す；図１２ＦはＣ末端にＣＤ３−Ｆａｂ架橋によるＰＥＧ化を含むＣＤ３−葉酸二重特異の代表的な例を示す。
【００５３】
図１３Ａ〜１３Ｄは、ＰＥＧ化を伴うＣＤ３Ｆａｂ−葉酸複合体およびＰＥＧ化を伴わないＣＤ３Ｆａｂ−葉酸複合体を示す。図１３Ａおよび図１３Ｂは抗ＣＤ３Ｆａｂ単体組成物および抗ＣＤ３Ｆａｂ二重複合組成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動分析を示す；図１３Ｃは抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸Ｃ末端ＰＥＧ複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動分析を示す；図１３ＤはＫＢ細胞、ＯＶ−９０細胞、およびＳＫＯＶ−３細胞における抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸Ｃ末端ＰＥＧ複合体のインビトロ細胞毒性を示す。
【００５４】
図１４は、インビトロ細胞毒性を示し、ＦＯＬＲα発現ＫＢ細胞を選択的に死滅させる抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸二重特異的抗体を示す。
【００５５】
図１５Ａ〜１５Ｂは、インビトロ細胞毒性を示す。図１５Ａは２０ｎＭの葉酸の存在下においてＦＯＬＲα発現ＳＫＯＶ３細胞を選択的に死滅させる抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸二重特異的抗体を示し、図１５Ｂは５０ｎＭの葉酸の存在下における選択的な死滅を示す。
【００５６】
図１６Ａ〜１６Ｂはインビトロ細胞毒性データを示し、２０ｎＭの５−ｍＴＨＦの存在下（図１６Ａ）および５０ｎＭの５−ｍＴＨＦの存在下（図１６Ｂ）においてＦＯＬＲα発現ＳＫＯＶ３細胞を選択的に死滅させる抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸二重特異的抗体を示す。
【００５７】
図１７は、ＣＤ１マウスにおけるマウス薬物動態調査を示す。
【００５８】
図１８Ａ〜１８Ｂは、ヒトＭ２マクロファージを選択的に死滅させる抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸二重特異的抗体を示す。図１８Ａは、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸二重特異的抗体を含む単一の葉酸塩によるインビトロマクロファージ細胞毒性を示す。矢印および数字は、Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージとの間の差異（倍率）をＩＣ５０で表す。点線はＭ１およびＭ２におけるＦａｂ１−ＨＫ１２９−葉酸を示し、実線はＭ１およびＭ２におけるＦａｂ１−ＨＫ１２９−５ＫＰＥＧ−葉酸を示す。図１８Ｂは、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸二重特異的抗体を含む二重の葉酸塩によるインビトロマクロファージ細胞毒性を示す。矢印および数字は、Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージとの間の差異（倍率）をＩＣ５０で表す。点線はＭ１およびＭ２におけるＦａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−ＢｉＦｏｌａｔｅを示し、実線はＭ１およびＭ２におけるＦａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−ＢｉＦｏｌａｔｅ−Ｂｉ５ＫＰＥＧを示す。
【００５９】
図１９Ａ〜１９Ｂは抗ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体の抗腫瘍効能を示す。図１９Ａは腫瘍体積を示し、図１９Ｂは質量／体重を示す。図１９Ｃおよび１９Ｄは、それぞれ、ヒトＣＤ４５の発現およびＴＩＬの誘導を示す。
【００６０】
図２０Ａ〜２０Ｂは抗ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体の抗腫瘍効能を示す。図２０Ａは腫瘍体積を示し、図２０Ｂは質量／体重を示す。図２０Ｃおよび２０Ｄは、それぞれ、ヒトＣＤ４５の発現およびＴＩＬの誘導を示す。
【００６１】
図２１Ａ〜２１Ｆは、ＫＢ細胞株由来のヒト子宮頚腫瘍におけるＣＤ３−葉酸二重特異的抗体の複数回投与による抗腫瘍効能と（図２１Ａは腫瘍増殖を示し、図２１Ｂは体重を示す）、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５（図２１Ｃ）、ＣＤ６９（図２１Ｄ）、ＣＤ４５（図２１Ｅ）、およびＣＤ３（図２１Ｆ）の発現と、を示す。
【００６２】
図２２Ａ〜２２Ｂは、ＫＢ細胞株由来のヒト子宮頚腫瘍におけるＣＤ３−葉酸二重特異的抗体の抗腫瘍効能を示す；図２２Ａは腫瘍増殖を示し、図２２Ｂは体重を示す。
【００６３】
図２３Ａ〜２３Ｂは、ＯＶ−９０細胞株由来のヒト卵巣腫瘍における、カルボプラチンを比較したＣＤ３−葉酸二重特異的抗体の抗腫瘍効能を示す；図２３Ａは腫瘍増殖を示し、図２３Ｂは体重を示す。
【００６４】
〔定義〕
本発明は、本明細書で説明している具体的な方法、プロトコル、細胞株、構成および薬剤に限定されるものではなく、変更を施しうるものであることを理解されたい。また、本明細書で使用する術語は、具体的な実施形態を説明するためにのみ用いられるのであって、本発明の範囲を限定する意図はないことも理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。
【００６５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いるとき、単数形（「a」「an」「the」）には、文脈上明らかに除外されない限り、複数の対象が包含される。したがって、例えば、「抗ＣＤ３Ｆａｂ」または「抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸抗体」に対する言及は、このようなタンパク質の一つ以上に対する言及であって、当業者に知られている均等物なども含まれている。用語「ＰＥＧ−葉酸」または「葉酸−ＰＥＧ」および用語「ＢｉＰＥＧ−ＢｉＦｏｌａｔｅ」または「ＢｉＦｏｌａｔｅ−ＢｉＰＥＧ」は、本明細書において互いに可換に使用される。
【００６６】
別途定義されていない限り、本明細書において用いる技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味である。本明細書に記載の方法、装置および物質と類似または均等である任意ものを、本発明の実施または試験において使用することができる。しかし、好ましい方法、装置および物質は、ここに記載されているものである。
【００６７】
本明細書において言及する刊行物および特許は、参照により本明細書に組み込まれる。これは、例えば、本発明との関連において用いられ得る、当該刊行物に記載の構成および方法の説明および開示を目的とする。本明細書で論じる刊行物は、単に、本出願の出願日以前における開示を提供するためのものである。本明細書における何らの記載も、先行発明または他の理由を根拠に、本発明者らが上述の開示に先行する資格を有していないことの自白と解釈すべきではない。
【００６８】
用語「実質的に精製されている」とは、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体が、天然に産生される環境（すなわち、天然細胞）、または宿主細胞（組み換えで産生された抗ＣＤ３抗体の場合）において見られるような、タンパク質が通常伴ったり、タンパク質と相互作用したりする成分を、実質的にまたは本質的に含みえないことを表す。細胞性の物質を実質的に含みえない抗ＣＤ３抗体としては、例えば、混入しているタンパク質を、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満含む調製物が挙げられる。抗ＣＤ３抗体またはその変異体が組み換えによって宿主細胞から産生される場合は、このようなタンパク質が、細胞の乾燥重量の約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、または約１％以下存在してもよい。抗ＣＤ３抗体またはその変異体が組み換えによって宿主細胞から産生される場合は、ペリプラズムおよび／または培地中にこのようなタンパク質が、細胞の乾燥重量の約５ｇ／Ｌ以下、約４ｇ／Ｌ以下、約３ｇ／Ｌ以下、約２ｇ／Ｌ以下、約１ｇ／Ｌ以下、約７５０ｍｇ／Ｌ以下、約５００ｍｇ／Ｌ以下、約２５０ｍｇ／Ｌ以下、約１００ｍｇ／Ｌ以下、約５０ｍｇ／Ｌ以下、約１０ｍｇ／Ｌ以下、または約１ｍｇ／Ｌ以下存在していてもよい。したがって、本発明の方法によって提供されるとき、「実質的に精製されている」抗ＣＤ３抗体の純度は、約３０％以上、約３５％以上、約４０％以上、約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上であってもよい。具体的には、純度は約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上であってもよい。より具体的には、純度約９０％以上、純度約９５％以上、純度約９９％以上、またはそれを超えていてもよい。ここで、純度は、適切な方法により決定する（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣおよびキャピラリー電気泳動など）。
【００６９】
「組み換え宿主細胞」または「宿主細胞」とは、外来性のポリヌクレオチドを含む細胞を表す。外来性のポリヌクレオチドを挿入する方法は問わない（例えば、直接の取り込み、形質転換、形質導入、ｆ交配、または組み換え宿主細胞の作製に係る技術分野で公知の他の方法）。外来性のポリヌクレオチドは、組み込まれないベクター（例えばプラスミド）として維持してもよいし、そうではなく宿主ゲノムに組み込んでもよい。
【００７０】
抗体とは、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質である。天然の抗体は、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、二つの同一の軽鎖（Ｌ鎖）および二つの同一の重鎖（Ｈ鎖）から構成されている。各軽鎖は、一本の共有性ジスルフィド結合によって重鎖と連結している。重鎖間のジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのアイソタイプによって異なる。また、各重鎖および各軽鎖には、一定間隔で鎖間にジスルフィド架橋がある。各重鎖の一端には可変ドメイン（ＶＨ）があり、いくつかの定常ドメインがそれに続く。各軽鎖の一端には可変ドメイン（ＶＬ）があり、他端には定常ドメインがある。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと位置が揃っている。また、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと位置が揃っている。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの間の境界面を形成すると考えられている。
【００７１】
用語「可変」とは、可変ドメインの特定の部分の配列が抗体間で著しく異なっていることを表す。この配列の差異は、それぞれの特定の抗体の、特定の抗原に対する結合特異性の原因となっている。しかし、この可変性は、抗体の可変ドメインの中に均等に分布しているわけではない。軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方に存在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる三つの部分に、可変性が集中している。可変ドメインのより保存性が高い部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインには、いずれも、四つのＦＲ領域が含まれている。その多くはβシート構造を取っており、三つのＣＤＲと連結している。ＣＤＲはループ構造を形成しており、場合によってはβシート構造の一部を形成している。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接した状態でまとまって位置している。そして、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照）。
【００７２】
定常ドメインは、抗体の抗原に対する結合に直接は関わらないが、種々のエフェクター機能を示す。重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体または免疫グロブリンを異なるクラスに分類することができる。免疫グロブリンには五つの主要なクラスがあり（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）、そのうちいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）に分類することができる（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４；ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域を、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ぶ。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する軽鎖定常領域を、それぞれ、κおよびλと呼ぶ。種々のヒト免疫グロブリンのクラスの中でも、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３およびヒトＩｇＭだけが、補体を活性化させることが知られている。免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはそれらの断片もしくは修飾物から選択されうる。
【００７３】
インビボにおける抗体の親和性成熟は、主として体細胞超変異によって作られる親和性の高い抗体変異体を、抗原選択することによって進行する。また通常は、「レパートリー・シフト」も発生する。レパートリー・シフトでは、二次応答または三次応答の主要な生殖細胞遺伝子は、一次応答および二次応答のものとは異なっていることが判っている。
【００７４】
免疫系の親和性成熟のプロセスは、インビトロで抗体遺伝子に変異を導入し、親和性選択で親和性が向上している変異体を単離することによって、再現することができる。このような変異体抗体を、繊維状バクテリオファージまたは微生物（大腸菌、酵母など）の表面に提示させることができる。そして、抗原に対する親和性によって抗体を選抜したり、抗原からの解離速度（off-rate）によって抗体を選抜したりすることができる（Hawkins et al. J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)）。CDR walking mutagenesisによって、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）のヒトエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０に結合するヒト抗体を親和性成熟させた事例がある（Barbas III et al. PNAS (USA) 91: 3809-3813 (1994); Yang et al. J. Mol. Biol. 254:392-403 (1995)）。また、同様の手法で抗ｃ−ｅｒｂＢ−２一本鎖Ｆｖ断片を親和性成熟させた事例もある（Schier et al. J. Mol. Biol. 263:551567 (1996)）。抗体鎖シャッフリングおよびＣＤＲ変異導入によって、ＨＩＶの第三超可変ループに対する親和性の高いヒト抗体を親和性成熟させた事例がある（Thompson et al. J. Mol. Biol. 256:77-88 (1996)）。［Balint and Larrick Gene 137:109-118 (1993)］には、コンピュータを使用したオリゴデオキシリボヌクレオチド特異的なscanning mutagenesisが開示されている。この手法では、改良型変異体を得るために、可変領域遺伝子のＣＤＲの全体を同時にサーチする。initial limited mutagenesis strategyにより、αｖβ３に特異的なヒト化抗体を親和性成熟させた事例もある。この手法では、六つのＣＤＲの全ての位置に突然変異を導入して発現させ、スクリーニングにより親和性が最大の変異体が含まれるコンビナトリアル・ライブラリを得る（Wu et al. PNAS (USA) 95: 6037-6-42 (1998)）。ファージに提示された抗体については、［Chiswell and McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992); Rader and Barbas III Current Opinion in Biotech. 8:503-508 (1997)］のレビューがある。上述の文献のうち、親抗体よりも親和性が向上された変異抗体が報告されているいずれの例でも、変異抗体はＣＤＲにアミノ酸の置換を有していた。
【００７５】
本明細書において「親和性成熟」とは、抗体の抗原に対する親和性を向上させるプロセスを意味する。親和性成熟の方法としては、コンピュータによるスクリーニング法および実験的方法が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。
【００７６】
本明細書において「抗体」とは、抗体遺伝子の全部または一部によって実質的にコードされているポリペプチドの一つ以上を含む、タンパク質を意味する。免疫グロブリン遺伝子としては、定常領域遺伝子であるκ、λ、α、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）、δ、εおよびμ、ならびに無数にある免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。本明細書における抗体には、全長抗体および抗体断片が含まれる。また、任意の生物において天然に存在する抗体も、人工的に作製された抗体（例えば変異体）も含まれる。本明細書に記載される抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、操作された抗体、非ヒト抗体、および／またはキメラ抗体でありうる。そのようなものを製造するヒト化抗体および方法は、当技術分野で周知である。（例えば、米国特許第５，８２１，３３７号；同第７，５２７，７９１号；同第６，９８２，３２１号；同第７，０８７，４０９号；同第５，７６６，８８６号を参照のこと）。一般に、ヒト化抗体はＣＤＲまたはその一部が非ヒト抗体に由来し、フレームワーク領域またはその一部がヒト抗体配列に由来する一つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部を含みうる。いくつかの実施形態では、例えば、抗体特異性または抗体親和性を回復または改善するために、ヒト化抗体中のフレームワーク残基を非ヒト抗体（ＣＤＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換することができる。キメラ抗体は、別々の抗体のために最初にコードされた二つ以上の抗体遺伝子を組み合わせるか、または連結することによって生成された抗体を指す場合がある。例えば、キメラ抗体は、ヒト、ウシ、またはマウス種由来の二つ以上の抗体遺伝子（またはそれらに由来する断片）を組み合わせるか、または連結することによって生成されうる。いくつかの実施形態では、抗体または抗体断片の少なくとも一部がヒトまたはカニクイザル由来であってもよいが、これに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に記載される抗体は異種間反応性でありうるものであり、例えば、抗体はヒト抗原およびカニクイザル抗原（例えば、ヒト／イヌ抗体）を認識しうる。
【００７７】
「抗体断片」とは、全長形態以外の任意の形態である抗体を意味する。本明細書における抗体断片には、（ｉ）全長抗体の中に含まれる小部分である抗体と、（ｉｉ）人工的に作製された抗体と、が含まれる。抗体断片としては、これらには限定されないが、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆａｂおよび（Ｆａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二機能性ハイブリッド抗体、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲの組み合わせ、可変領域、フレームワーク領域、定常領域、重鎖、軽鎖、他の骨格を有する非抗体分子、二重特異的抗体、などが挙げられる（Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402）。別途記載のない限り、明細書および請求項で使用される用語「抗体（単数または複数）」は、具体的には「抗体断片（単数または複数）」を含みうる。特定の実施形態において、「抗ＣＤ３抗体」、「抗ＣＤ３Ｆａｂ」、「抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体」、および「抗ＣＤ３Ｆａｂ変異体」は、本明細書に規定される抗体断片である。
【００７８】
本明細書において「コンピュータによるスクリーニング法」とは、タンパク質における一つ以上の変異を設計する、任意の方法を意味する。この方法では、可能なアミノ酸側鎖の置換同士による相互作用エネルギーの評価、および／または、可能なアミノ酸側鎖の置換とタンパク質の残りの部分との相互作用エネルギーの評価、にコンピュータを利用する。
【００７９】
本明細書において「全長抗体」とは、抗体のＨ鎖および／またはＬ鎖の、天然の生物学的形態を構成する構造を意味する。多くの哺乳動物では（例えばヒトおよびマウス）、上記の形態は四量体であり、二本の免疫グロブリン鎖の組み合わせ二組（同一の組み合わせが二組）からなる。それぞれの組み合わせには、一本の軽鎖および一本の重鎖が含まれている。それぞれの軽鎖には、免疫グロブリンのＶＬドメインおよびＣＬドメインが含まれている。それぞれの重鎖には、免疫グロブリンのＶＨドメイン、Ｃγ１ドメイン、Ｃγ２ドメインおよびＣγ３ドメインが含まれている。それぞれの組み合わせの中で、軽鎖可変領域および重鎖可変領域（ＶＬおよびＶＨ）は、抗原に対する結合を共に担っている。定常領域（ＣＬ、Ｃγ１、Ｃγ２およびＣγ３、とりわけＣγ２およびＣγ３）は、抗体のエフェクター機能を担っている。ある種の哺乳動物では（例えばラクダおよびラマ）、全長抗体は二本の重鎖のみからなっていてもよい。それぞれの重鎖には、免疫グロブリンのＶＨドメイン、Ｃγ２ドメインおよびＣγ３ドメインが含まれている。
【００８０】
本明細書において「免疫グロブリン（Ｉｇ）」とは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされているポリペプチドの一つ以上から構成される、タンパク質を意味する。免疫グロブリンとしては、抗体などが挙げられる（ただし、これらに限定されない）。免疫グロブリンは、種々の構造上の形態をとってもよい。例えば、これらには限定されないが、全長抗体、抗体断片、免疫グロブリンの個々のドメイン（例えば、これらには限定されないが、ＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、ＶＬおよびＣＬ）が挙げられる。
【００８１】
本明細書において「免疫グロブリン（Ｉｇ）のドメイン」とは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされているポリペプチドから構成される、タンパク質ドメインを意味する。Ｉｇのドメインとしては、これらには限定されないが、ＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、ＶＬおよびＣＬが挙げられる。
【００８２】
本明細書において用いる「変異タンパク質配列」とは、他の類似のタンパク質配列とはアミノ酸同一性が異なる残基を一つ以上有する、タンパク質配列を意味する。上記の「類似のタンパク質配列」は、天然の野生型タンパク質配列であってもよいし、野生型配列とは異なる変異型であってもよい。一般的に、元の配列を「親配列」と表現する。親配列は、野生型配列であっても変異型配列であってもよい。例えば、本発明の好ましい実施形態では、ヒト化親配列を利用して、これをコンピュータ解析することによって変異型を作製してもよい。
【００８３】
本明細書において、抗体の「可変領域」とは、免疫グロブリンのＶＨドメイン、免疫グロブリンのＶＬドメイン、または免疫グロブリンのＶＨドメインおよびＶＬドメインから構成される、一つまたは複数のポリペプチドを意味する（変異体も含まれる）。「可変領域」は、単離された状態のこれらのポリペプチドを指してもよいし（Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、より大型の抗体断片に含まれる当該領域として）、全長抗体（あるいは、抗体以外の骨格分子）に含まれる当該領域を指してもよい。
【００８４】
本発明の抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体に関して、用語「抗原特異的」または「特異的に結合する」とは、抗原を含む混合物を含有するサンプル中で、所定の抗原または所定の結合対象のエピトープの一つ以上と結合するが、他の分子を実質的に認識せず結合しないような抗ＣＤ３抗体を表す。
【００８５】
本明細書において用いるとき、用語「二重特異的抗ＣＤ３抗体」または「多重特異的抗ＣＤ３抗体」とは、二つ以上の抗原結合部位または結合対象結合部位を有する抗ＣＤ３抗体を表す。ここで、第一の結合部位は第一の抗原またはエピトープに対する親和性を有しており、第二の結合部位は第二の抗原またはエピトープ（第一の抗原またはエピトープとは異なる）に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、二重特異的抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３に結合する結合部位と、別の抗原またはエピトープに対する結合親和性を有する一つまたは複数の結合部位とを有する。
【００８６】
本明細書において用いるとき、用語「エピトープ」とは、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体によって認識される、抗原上の部位または結合対象上の部位を表す。抗原がポリペプチドを含む場合、エピトープは、直線または立体的に形成されるアミノ酸の配列または形状でありうる。また、エピトープは、任意の種類の抗原上にある、抗ＣＤ３抗体が当該抗原に結合する任意の位置でもありうる。
【００８７】
本明細書において用いるとき、「抗原結合性ポリペプチド」または「抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体」には、特定の結合対象（抗原など）に対する特異的結合の生物活性を少なくとも有する、ポリペプチドおよびタンパク質が包含される。また、上記ポリペプチドおよびタンパク質の、ＣＤ３アナログ、ＣＤ３アイソフォーム、ＣＤ３模倣体(mimetics)、ＣＤ３断片、ハイブリッドＣＤ３タンパク質、融合タンパク質、オリゴマーおよび多量体、ホモログ、グリコシル化変異体、ならびに突然変異タンパク質も、同様の生物活性の有無にかかわらず包含される。さらに、これらの物質の合成方法または作製方法も限定されない。このような合成または作製方法としては、組み換え（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは核酸の他の形態のいずれから作製されるかにかかわらない）、インビトロまたはインビボでの核酸分子のマイクロインジェクションによる方法、合成法、トランスジェニック法、および遺伝子活性化法(gene activated methods)が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。抗ＣＤ３抗体の具体例としては、抗体分子、重鎖、軽鎖、可変領域、ＣＤＲ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、他の骨格を有する非抗体分子、リガンド、受容体、ペプチド、または抗原と結合する任意のアミノ酸配列が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。
【００８８】
抗原結合性ポリペプチドとしては、薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグがある。プロドラッグとしては、天然のヒト抗ＣＤ３抗体の、塩、多形体、水和物、溶媒和物、生物活性を有する断片、生物活性を有する変異体、および立体異性体がある。天然のヒト抗ＣＤ３抗体のアゴニスト変異体、模倣体およびアンタゴニスト変異体、ならびにそれらのポリペプチド融合体に対する塩、多形体なども、上記プロドラッグである。アミノ末端、カルボキシル末端またはその両方に追加のアミノ酸を有する融合体も、用語「抗原結合性ポリペプチド」に包含される。融合体の代表例としては、組み換え発現の結果として抗ＣＤ３抗体のＮ末端にメチオニンが連結している、メチオニル抗ＣＤ３抗体が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。また、精製目的のための融合体（例えば、これらには限定されないが、ポリヒスチジンまたは親和性エピトープ）、抗ＣＤ３抗体と他の生物活性を有する分子とを連結するための融合体、血清アルブミン結合ペプチドとの融合体、血清タンパク質（血清アルブミンなど）との融合体も挙げられる（ただし、これらに限定されない）。
【００８９】
用語「抗原」または「結合対象」とは、抗ＣＤ３抗体が示す結合活性の標的となる物質を表す。実質的には、任意の物質は、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体の抗原または結合対象でありうる。
【００９０】
天然に産生される抗体（Ａｂ）は、二つの同一の免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖、および二つの同一の免疫グロブリン軽鎖からなる四量体構造をしている。Ａｂの重鎖および軽鎖は、異なるドメインからなる。それぞれの軽鎖は、一つの可変ドメイン（ＶＬ）および一つの定常ドメイン（ＣＬ）を有する。一方、それぞれの重鎖は、一つの可変ドメイン（ＶＨ）および三つの定常ドメイン（ＣＨ）を有する。それぞれのドメイン（約１１０アミノ酸残基からなる）は、二つの逆平行βシートから形成されている、特徴的なβサンドイッチ構造に折り畳まれている（免疫グロブリンフォールド）。それぞれのＶＬドメインは三つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）を有しており、それぞれのＶＨドメインは最大で三つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）を有する。ＣＤＲとは、可変ドメインの一端でβストランドと連結している、ループ（またはターン）である。軽鎖および重鎖の可変領域はいずれも、通常は、抗原特異性の原因となっている（特異性に対する個々の鎖の寄与度は、同等であるとは限らないが）。抗体分子は、ＣＤＲループをランダム化することによって、多数の分子と結合するように進化してきた。
【００９１】
Ａｂの機能性部分構造は、タンパク質分解および組み換え法によって作製することができる。Ａｂには、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片およびＦｃ部分が含まれている。Ｆａｂ断片には、重鎖のＶＨ−ＣＨ１ドメインおよび軽鎖のＶＬ−ＣＬ１ドメインが含まれており、これらは一本の鎖間ジスルフィド結合で連結している。Ｆｖ断片には、ＶＨドメインおよびＶＬドメインのみが含まれている。Ｆｃ部分には、抗体分子の抗原と結合しない領域が含まれている。いくつかの例では、一つのＶＨドメインでも、抗原に対する顕著な親和性を保持している（Ward et al., Nature 341, 554-546, 1989）。また、特定の単量体κ軽鎖は、その抗原と特異的に結合することも示されている（L. Masat et al., PNAS 91:893-896, 1994）。分離された軽鎖または重鎖も、ある程度の抗原結合活性を保持する場合があることが判明している（Ward et al., Nature 341, 554-546, 1989）。
【００９２】
他の機能性部分構造には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）がある。ｓｃＦＶは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域からなっており、これらはペプチドリンカーと共有結合している（S-z Hu et al., Cancer Research, 56, 3055-3061, 1996）。これらの小タンパク質（Ｍｒ：２５，０００Ｄａ）は、通常、一つのポリペプチドの状態で、抗原に対する特異性および親和性を保持している。そして、より大きい抗原特異的な分子のための、便利なビルディングブロックを提供することができる。ｓｃＦｖは循環半減期が短く、多くの場合、治療上の有用性は限られている。
【００９３】
「ミニボディ（minibody）」と呼ばれる小型のタンパク質骨格は、ＩｇのＶＨドメインの一部をテンプレートに用いて設計された（Pessi et al., Nature 362, 367-369, 1993）。インターロイキン６に対する親和性が高いミニボディが（解離定数（Ｋｄ）：約１０−７Ｍ）、ＶＨのＣＤＲ１およびＣＤＲ２に対応するループをランダム化し、次いで変異体をファージディスプレイ法で選抜することによって発見されている（Martin et al., EMBO J. 13, 5303-5309, 1994）。
【００９４】
ラクダの血清由来のＩｇＧ様物質を分析すると、通常、軽鎖可変ドメインを欠いている。このことは、抗体の充分な特異性および親和性が、ＶＨドメイン（三つまたは四つのＣＤＲループ）のみに由来しうることを示唆している。高い親和性を有する「ラクダ化」ＶＨドメインが作製されている。また、ＣＤＲ３のみをランダム化することにより、高い特異性を得ることができる。
【００９５】
「ミニボディ」の代替物に、「ダイアボディ（diabody）」がある。ダイアボディは、二重特異性を有する二価の小型抗体断片であり、二箇所の抗原結合部位を有する。この断片には、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が含まれており、これらは同じポリペプチド鎖上で連結されている（ＶＨ−ＶＬ）。ダイアボディの大きさは、Ｆａｂ断片と同程度である。ダイアボディのリンカーは、同じ鎖上の二つのドメイン間で対合するには短すぎる。そのため各ドメインは、他の鎖上にある対応するドメインとの間で対合しなければならない。こうして、二箇所の抗原結合部位が作られる。これらの二量体抗体断片（または「ダイアボディ」）は、二価であり、二重特異性を有する（P. Holliger et al., PNAS 90:6444-6448, 1993を参照）。
【００９６】
ＣＤＲペプチドおよびＣＤＲ有機模倣体が作製されている（Dougall et al., 1994, Trends Biotechnol. 12, 372-379）。ＣＤＲペプチドは、通常は環状である短いペプチドで、抗体のＣＤＲループのアミノ酸配列に対応している。ＣＤＲループは、抗体−抗原相互作用の原因となるものである。ＣＤＲペプチドおよびＣＤＲ有機模倣体は、ある程度の結合親和性を保持していることが示されている（Smyth & von Itzstein, J. Am. Chem. Soc. 116, 2725-2733, 1994）。親和性を失わせることなく、マウスのＣＤＲがヒトのＩｇ骨格上に移植されている（Jones et al., 1986, Nature 321, 522-525; Riechmann et al., 1988）。
【００９７】
人体内では、巨大なライブラリの中から特定のＡｂが選択され増幅される（親和性成熟）。このプロセスは、コンビナトリアル・ライブラリ技術を用いれば、インビトロで再現できる。Ａｂ断片をバクテリオファージ表面に上手く提示させることにより、大量のＣＤＲ変異体を創出し、スクリーニングすることが可能となる（McCafferty et al., Nature 348, 552-554, 1990; Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7978-7982, 1991; Winter et al., Annu. Rev. Imμnol. 12, 433-455, 1994）。この技術により作製されるＦａｂおよびＦｖ（ならびにその誘導体）が増加している。コンビナトリアル技術は、擬似Ａｂと組み合わせることもできる。
【００９８】
潜在的なタンパク質骨格となりうる数多くのタンパク質ドメインが、ファージのカプシドタンパク質と融合した状態で発現させられてきた。そのレビューとしては［Clackson & Wells, Trends Biotechnol. 12:173-184, 1994］を参照。これらのタンパク質ドメインのいくつかは、ランダムなペプチド配列を提示させるための骨格として、既に使用されている。この例としては、ウシ膵臓トリプシン阻害剤（Roberts et al., PNAS 89:2429-2433, 1992）、ヒト成長ホルモン（Lowman et al., Biochemistry 30:10832-10838, 1991; Venturini et al., Protein Peptide Letters 1:70-75, 1994）、連鎖球菌のＩｇＧ結合ドメイン（O'Neil et al., Techniques in Protein Chemistry V (Crabb, L,. ed.) pp. 517-524, Academic Press, San Diego, 1994）が挙げられる。これらの骨格は、一つのランダム化されたループまたは領域を提示する。繊維状ファージＭ１３上における提示のための骨格としては、テンダミスタットが用いられてきた（McConnell and Hoess, J. Mol. Biol. 250:460-470, 1995）。
【００９９】
親水性ポリマーのポリ（エチレングリコール）（略称ＰＥＧ）を共有結合で付加する方法によって、（ｉ）水溶性および生体利用性が向上し、（ｉｉ）血清半減期および治療上の半減期が増加し、（ｉｉｉ）免疫原性および生物活性が調節され、または（ｉｖ）多くの生物活性を有する分子（例えば、タンパク質、ペプチド、そして特に疎水性の分子）について、循環時間を延長させる。製薬、人工移植、ならびに、生体適合性、毒性の除去および免疫原性の除去が重要となるその他の用途において、ＰＥＧは広範に用いられてきた。ＰＥＧの所望の特性を最大限に引き出すためには、ＰＥＧポリマーまたは生物活性を有する分子に付加するポリマーの合計分子量および水和状態を、充分に高くしなければならない。このようにすれば、ＰＥＧポリマーの付加に関連する、一般的な利点を付与することができる（親分子の生物活性に悪影響を及ぼすことなく、水溶性を増加させたり、循環中の半減期を延長させたりすることなど）。
【０１００】
よく、ＰＥＧ誘導体は、反応性の化学機能部位（リシン残基、システイン残基およびヒスチジン残基、Ｎ末端、ならびに炭化水素部分など）を介して、生物活性を有する分子と連結される。タンパク質および他の分子は、通常、限られた数の反応部位しかポリマーの付加に利用できない。通常、ポリマー付加修飾に最も好適な部位は、受容体の結合において重要な役割を果たしており、その分子の生物活性を保持するために必須である。結果的に、生物活性を有する分子の反応部位に対して無差別にポリマー鎖を付加すると、通常は、ポリマー修飾分子の生物活性が著しく低下するか、全く失われてしまう（R. Clark et al., J. Biol. Chem., 271:21969-21977, 1996）。標的分子に所望の利点を付与するために充分なポリマー分子量を有する複合体を形成させる従来のアプローチは、概して、分子に対して多数のポリマー鎖をランダム付加させることに関する物であった。それゆえ、親分子の生物活性を低減させるか、全く失ってしまうおそれが大きいアプローチであった。
【０１０１】
タンパク質へのＰＥＧ誘導体の付加のための遺伝子座を形成する反応部位は、タンパク質の構造によって指定される。酵素を含むタンパク質は、一般構造Ｈ２Ｎ−−ＣＨＲ−−ＣＯＯＨを有するαアミノ酸の種々の配列から構成される。一つのアミノ酸のαアミノ部分（Ｈ２Ｎ−−）は、隣のアミノ酸のカルボキシル部分（−−ＣＯＯＨ）に結合してアミド結合を形成し、これは、−−（ＮＨ−−ＣＨＲ−−ＣＯ）ｎ−−として表されうるものであり、ここで、下付き文字「ｎ」は数百または数千と同等でありうる。Ｒで表される断片は、タンパク質生物活性およびＰＥＧ誘導体の付加のための反応部位を有しうる。
【０１０２】
例えば、アミノ酸リシンでは、εの位置およびαの位置に−−ＮＨ２部分が存在する。ε−−ＮＨ２は、塩基性ｐＨの条件下で反応に対して遊離である。ＰＥＧによるタンパク質誘導体化の分野における多くの技術は、タンパク質中に存在するリシン残基のε−−ＮＨ２部分への付加のためのＰＥＧ誘導体の開発に関連するものである（“Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation”, Nektar Molecular Engineering Catalog, pp. 1-17, 2003）。しかしながら、これらのＰＥＧ誘導体には全て、タンパク質の表面上に存在する多数のリシン残基の中から選択的に設置することができないという一般的な制限がある。これは、リシン残基が例えば酵素活性部位に存在するタンパク質活性に重要である場合、または受容体の結合部位の場合のように、タンパク質と他の生物学的分子との相互作用を媒介する際にリシン残基が関与する場合に、有意な制限となりうる。
【０１０３】
タンパク質をＰＥＧ化する既存の方法の同様に重大な二つ目の困難な状況は、ＰＥＧ誘導体が、所望のもの以外の残基との望ましくない副反応を受けうることである。ヒスチジンは−−Ｎ（Ｈ）−−として構造的に表される反応性イミノ部分を有するが、ε−−ＮＨ２と反応する多くの化学反応性種も−−Ｎ（Ｈ）−−と反応しうる。同様に、アミノ酸システインの側鎖は、−ＳＨとして構造的に表される遊離スルフヒドリル基を有する。いくつかの場合において、リシンのε−−ＮＨ２基に向けられるＰＥＧ誘導体は、システイン、ヒスチジンまたは他の残基とも反応する。これは、ＰＥＧ誘導体化された生物活性分子の複雑で不均一な混合物を作り出し、標的とされる生物活性分子の活性を破壊する危険性がある。タンパク質内の一つの部位に化学機能性基を導入することを可能にするＰＥＧ誘導体を開発することが望ましく、その結果、明確かつ予測可能なタンパク質表面上の特定の部位において、生物活性分子への一つ以上のＰＥＧポリマーの選択的カップリングが可能になる。
【０１０４】
リシン残基に加えて、システイン、ヒスチジンおよびＮ末端を含む他のアミノ酸の側鎖を標的とする活性化ＰＥＧ試薬の開発に、当技術分野においてかなりの努力が向けられてきた。例えば、米国特許第６，６１０，２８１号、および［“Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation”, Nektar Molecular Engineering Catalog, pp. 1-17, 2003］（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。システイン残基は、部位特異的突然変異誘発および当技術分野で公知の他の技法を使用してタンパク質の構造に部位選択的に導入することができ、得られた遊離スルフヒドリル部分を、チオール反応性機能性基を有するＰＥＧ誘導体と反応させることができる。しかしながら、このアプローチは、遊離スルフヒドリル基の導入が、得られるタンパク質の発現、折り畳みおよび安定を困難にしうるという欠点がある。したがって、タンパク質中に典型的に見られるスルフヒドリルおよび他の化学機能性基と同時に適合（すなわち、それらと望ましくない副反応を起こさない）しながら、タンパク質への一つ以上のＰＥＧポリマーの選択的カップリングを可能にする、化学機能性基を生物活性分子中に導入する手段が望ましい。
【０１０５】
当技術分野で認められているように、タンパク質の側鎖、特にリシンアミノ酸の側鎖上の−−ＮＨ２部分およびシステイン側鎖上の−ＳＨ部分へ付加するために開発されたこれらの誘導体の多くは、それらの合成および使用において問題があることが証明されている。いくつかは、加水分解されることで分解し、あるいは、血流中などの水環境中で不安定である、タンパク質との不安定な結合を形成する。いくつかは、より安定な結合を形成するが、結合が形成される前に加水分解される。これは、ＰＥＧ誘導体上の反応基が、タンパク質の付加の前に不活性化される可能性があることを意味する。いくつかは、ある程度毒性であり、したがって、インビボでの使用にあまり適していない。いくつかは、反応が遅すぎて実用的ではない。いくつかは、タンパク質の活性に関与する部位に付加されることにより、タンパク質活性の喪失を生じさせる。いくつかは、それらが付加される部位に特異的ではなく、これはまた、所望の活性の喪失および結果の再現性の欠如をもたらしうる。ポリ（エチレングリコール）部分を有するタンパク質を修飾することに関連する課題を克服するために、より安定であるＰＥＧ誘導体（例えば、米国特許第６，６０２，４９８号（参照により本明細書に組み込まれる））、または分子および表面上のチオール部分と選択的に反応するＰＥＧ誘導体（例えば、米国特許第６，６１０，２８１号（参照により本明細書に組み込まれる））が開発されている。安定な化学結合を形成するために選択的に反応することが要求されるまで生理学的環境において化学的に不活性であるＰＥＧ誘導体が、当技術分野において明らかに必要とされている。
【０１０６】
最近、タンパク質科学における全く新しい技術が報告されており、当該技術は、タンパク質の部位特異的修飾に関連する制限の多くを克服する見込みがある。具体的には、原核生物Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば、［L. Wang, et al, Science 292:498-500, 2001］）および真核生物Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（例えば、［J. Chin et al, Science 301:964-7, 2003］）のタンパク質生合成機構に新しい成分が添加されている。これにより、インビボでのタンパク質への遺伝的にコードされていないアミノ酸の組み込みが可能となった。この方法を用いて、新規な化学的、物理的または生物学的特性を有する多数の新しいアミノ酸（光親和性標識および光異性化可能なアミノ酸、ケトアミノ酸、およびグリコシル化アミノ酸など）が、アンバーコドンＴＡＧに応じて効率的にかつ高い正確性で大腸菌およびイースト中のタンパク質に組み込まれてきた。例えば［J. W. Chin et al, Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027, 2002］、［J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137］、［J. W. Chin, et al, PNAS United States of America 99:11020-11024, 2002］、および［L. Wang, & P. G. Schultz, Chem. Comm., 1-10, 2002］を参照のこと。これらの研究によって、通常の２０種類の遺伝子にコードされているアミノ酸中に見られる機能性基のすべてに対して化学的に不活性であり、効率的かつ選択的に反応して安定な共有結合を形成するために使用されうる、タンパク質中に見られない化学機能性基（ケトン基、アルキン基およびアジド部分など）を選択的かつルーチン的に導入することができることが実証された。
【０１０７】
遺伝的にコードされていないアミノ酸を、タンパク質中に組み込むことができる。これによって、天然の機能性基（例えば、リシンのε−ＮＨ２、システインのスルフヒドリル−ＳＨ、ヒスチジンのイミノ基など）に代わる種々の代替物を提供しうるような、化学機能性基を導入することができる。特定の化学機能性基は、通常の２０種類のアミノ酸（遺伝子にコードされているアミノ酸）が有する機能性基に対しては不活性である一方で、手際よく効率的に反応して安定な結合を形成することが知られている。例えば、アジド基およびアセチレン基は、水性条件下かつ触媒量の銅の存在下で、Huisgen［３＋２］環状付加反応を起こすことが当業者に知られている（例えば、Tornoe, et al., (2002) Org. Chem. 67:3057-3064; Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599.を参照）。タンパク質構造中にアジド部分を導入することによって、例えば、タンパク質中のアミン基、スルフヒドリル基、カルボン酸基、ヒドロキシル基に対しては化学的に不活性である一方で、アセチレン部分と円滑かつ効率的に反応して環状付加生成物を形成するような、機能性基を組み込むことができる。重要なことには、アセチレン部分がない場合には、アジドは化学的に不活性なままであり、他のタンパク質側鎖の存在下かつ生理的条件下では反応しないのである。
【０１０８】
種々の文献が、ポリマーとの複合体化またはグリコシル化によるポリペプチドの修飾について開示している。用語「抗ＣＤ３抗体」または「抗原結合性ポリペプチド」とは、上述の抗ＣＤ３抗体に加えて、天然の抗体が有する生物活性の一つ以上を保持しているポリペプチドを表す。このような生物活性には、抗原に対する結合以外の活性も含まれる（ただし、これらに限定されない）。抗原に対する結合以外の活性としては、Ｆｃと関連する一つ以上の任意の活性が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。用語「抗ＣＤ３抗体」または「抗原結合性ポリペプチド」には、ＰＥＧなどのポリマーと複合しているポリペプチドであって、システイン、リシン、Ｎ末端もしくはＣ末端のアミノ酸、または他の残基の一つ以上が、追加で誘導体化されていてもよいポリペプチドが含まれる（ただし、これらに限定されない）。さらに、抗ＣＤ３抗体は、リンカー、ポリマーまたは生物活性を有する分子を有していてもよい。ここで、上記リンカー、ポリマーまたは生物活性を有する分子と複合しているアミノ酸は、本発明に係る非天然アミノ酸であってもよい。あるいは、公知の技術（リシンまたはシステインとのカップリングなど）を利用して、天然にコードされているアミノ酸と複合させてもよい。米国特許第４,９０４,５８４号は、リシンを低減させたＰＥＧ化ポリペプチドを開示している。上記ＰＥＧ化ポリペプチドは、一つ以上のリシン残基が欠失しているか、他のアミノ酸残基に置換されている。国際公開第９９／６７２９１号は、タンパク質をＰＥＧと複合体化させる方法を開示している。上記方法では、タンパク質の一つ以上のアミノ酸残基を欠失させ、タンパク質の複合体化に充分な条件下にて、当該タンパク質をＰＥＧと接触させる。国際公開第９９／０３８８７は、成長ホルモンスーパーファミリーに属するポリペプチドの、ＰＥＧ化変異体を開示している。上記ＰＥＧ化変異体のシステイン残基は、上記ポリペプチドの特定の領域に位置する非必須アミノ酸残基に置換されている。国際公開第００／２６３５４号は、アレルゲン性を低減させたグリコシル化ポリペプチド変異体の製造方法を開示している。上記ポリペプチド変異体は、対応する親ポリペプチドと比較して、一つ以上の追加のグリコシル化部位を有する。
【０１０９】
用語「抗原結合性ポリペプチド」には、グリコシル化抗ＣＤ３抗体も含まれる。グリコシル化抗ＣＤ３抗体とは、任意のアミノ酸の位置においてグリコシル化されたポリペプチドであって、当該ポリペプチドがＮ結合型グリコシル化またはＯ結合型グリコシル化したものなどである（ただし、これらに限定されない）。また、一個のヌクレオチド変異を有する変異体も、生物活性を有する抗ＣＤ３抗体変異体と考えられる。さらに、スプライシング変異体も抗原結合性ポリペプチドに含まれる。用語「抗原結合性ポリペプチド」には、一つ以上の任意の抗ＣＤ３抗体の、ヘテロ二量体、ホモ二量体、ヘテロ多量体またはホモ多量体も含まれる。あるいは、抗原結合性ポリペプチドには、任意の他のポリペプチド、タンパク質、炭化水素、ポリマー、小分子、リンカー、リガンド、または他の任意の種類の生物活性を有する分子と、化学的手段で連結している、または融合タンパク質として発現している物質も含まれる。同様に、例えば特定の欠失または他の修飾を有するポリペプチドアナログであって、生物活性が依然として維持されている物質も含まれる。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、抗原結合性ポリペプチドは、抗ＣＤ３抗体の生物活性を調節する付加、置換または欠失をさらに有する。例えば、付加、置換または欠失により、抗ＣＤ３抗体の特性または活性の一つ以上を調節してもよい。このような調節の例としては、（ｉ）抗原に対する親和性の調節、（ｉｉ）抗原の立体配置または他の二次構造、三次構造、四次構造の変化の調節（例えば変化量の増減であるが、これらには限定されない）、（ｉｉｉ）抗原の立体配置または他の二次構造、三次構造、四次構造の変化の安定化、（ｉｖ）抗原の立体配置または他の二次構造、三次構造、四次構造の変化の誘導、（ｖ）循環半減期の調節、（ｖｉ）治療上の半減期の調節、（ｖｉｉ）ポリペプチドの安定性の調節、（ｖｉｉｉ）投与量の調節、（ｉｘ）放出または生体利用性の調節、（ｘ）精製の促進、（ｘｉ）特定の投与経路の改善または変更、が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。同様に、抗原結合性ポリペプチドは、プロテアーゼ切断配列、反応性の基、抗体結合ドメイン（例えばＦＬＡＧまたはポリＨｉｓであるが、これらには限定されない）、または他の親和性配列（例えばＦＬＡＧ、ポリＨｉｓ、ＧＳＴなどであるが、これらには限定されない）、または結合分子（例えばビオチンであるが、これには限定されない）を有していてもよい。上記結合分子には、ポリペプチドの検出を容易にするもの（例えばＧＦＰだが、これらには限定されない）、精製を容易にするもの、他の特質を改善するものがある。
【０１１１】
用語「抗原結合性ポリペプチド」には、連結されている抗ＣＤ３抗体のホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体およびヘテロ多量体も含まれる。連結の様式としては、（ｉ）天然にコードされていないアミノ酸の側鎖を介した直接の連結、（ｉｉ）同じまたは異なる天然にコードされていないアミノ酸の側鎖の間の連結、（ｉｉｉ）天然にコードされているアミノ酸の側鎖間の連結、（ｉｖ）融合による連結、または（ｖ）リンカーを介した間接的な連結、が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。リンカーの代表例としては、小型の有機化合物、様々な長さの水溶性ポリマー（様々な長さのポリ（エチレングリコール）、ポリデキストランまたはポリペプチドなど）が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。
【０１１２】
特定の抗原結合性ポリペプチド配列中の位置に対応しているアミノ酸の位置を、当該抗原結合性ポリペプチドの断片または関連する抗原結合性ポリペプチドなどにおいて容易に特定できることを、当業者ならば理解するであろう。例えば、配列アライメントプログラム（ＢＬＡＳＴなど）を用いて、関連配列中の位置に対応しているタンパク質中の特定の位置を、整列させ特定することができる。
【０１１３】
用語「抗原結合性ポリペプチド」には、一つ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失を有する、抗原結合性ポリペプチドも含まれる。本発明の抗原結合性ポリペプチドは、一つ以上の天然アミノ酸が一つ以上の非天然アミノ酸と複合体化している修飾を有していてもよい。天然の抗ＣＤ３抗体ポリペプチド中の種々のアミノ酸の位置における置換の代表例については、既に説明した。例えば、抗原結合性ポリペプチドの生物活性の一つ以上を調節する置換が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。具体的には、アゴニスト活性の向上、ポリペプチドの溶解性の向上、ポリペプチドのアンタゴニストへの変換などである（ただし、これらに限定されない）。これらの例も、用語「抗ＣＤ３抗体」に含まれる。
【０１１４】
「天然にコードされていないアミノ酸」とは、２０種類の通常アミノ酸、またはピロリシンもしくはセレノシステインのうちの一種類ではないアミノ酸を表す。用語「天然にコードされていないアミノ酸」の同義語として用いられうる用語には、「非天然アミノ酸、非天然のアミノ酸(「non-natural amino acid」、「unnatural amino acid」、「non-naturally-occurring amino acid」、「non-canonical amino acid」)」、および上記の語にハイフンを付した、またはハイフンを付さない形態がある。用語「天然にコードされていないアミノ酸」には、天然にコードされているアミノ酸（２０種類の通常アミノ酸またはピロリシンおよびセレノシステインなどであるが、これらには限定されない）の修飾（例えば翻訳後修飾）により生じるが、それ自体としては、通常、翻訳複合体によって伸長するポリペプチド鎖に組み込まれることがないアミノ酸も含まれる（ただし、これらに限定されない）。このような非天然のアミノ酸の例としては、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−トレオニンおよびＯ−ホスホチロシンが挙げられる（ただし、これらに限定されない）。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は糖部分を有する。そのようなアミノ酸の例としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−トレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギン、およびＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンが挙げられる。そのようなアミノ酸の例としては、また、アミノ酸と糖類との間の天然のＮ−またはＯ−結合が、自然界では通例見られない共有結合に置き換わっているものが挙げられる。そのようなアミノ酸としては、アルケン、オキシム、チオエーテル、アミド、などが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなアミノ酸の例としては、また、天然のタンパク質には通例見られない糖類（２−デオキシ−グルコース、２−デオキシガラクトース、など）が挙げられる。非天然アミノ酸の具体例としては、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−プロパルギロキシフェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、ｔｒｉ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、およびイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
「アミノ末端修飾基」とは、ポリペプチドのアミノ末端に付加させることのできる、任意の分子を表す。同様に、「カルボキシ末端修飾基」とは、ポリペプチドのカルボキシ末端に付加させることのできる、任意の分子を表す。末端修飾基としては、種々の水溶性ポリマー、ペプチドもしくはタンパク質（血清アルブミンなど）、またはペプチドの血清半減期を延長させる他の部分が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。
【０１１６】
用語「機能性基」「活性部位」「活性化基」「脱離基」「反応部位」「化学反応基」および「化学反応部位」は、本技術分野および本明細書において、分子中の区別可能かつ定義可能な部分またはユニットを表すために用いられる。これらの用語は、化学の技術分野においては、概ね同じ意味を有する。また、本明細書においては、何らかの機能または活性を有したり、他の分子と反応したりする分子の部分を示すために用いる。
【０１１７】
本明細書において、用語「結合（linkage）」または「リンカー」とは、化学反応の結果として通常は形成され、典型的には共有結合である、基または結合を表すために用いる。「加水分解に対して安定な結合」とは、当該結合が水中で実質的に安定であり、実用的なｐＨ値において水と反応しないことを意味する（例えば、これらには限定されないが、生理的条件下において長期間（場合によってはいつまでも）反応しない）。「加水分解に対して不安定な結合」または「加水分解に対して分解性の結合」とは、当該結合が水中または水溶液中（例えば血液中）において分解性であることを意味する。「酵素に対して不安定な結合」または「酵素に対して分解性の結合」とは、当該結合が一種類以上の酵素によって分解されうることを意味する。本技術分野において知られているように、ＰＥＧおよび関連ポリマーは、（ｉ）ポリマー骨格中、または（ｉｉ）ポリマー骨格と当該ポリマー分子の末端機能性基の一つ以上との間にあるリンカー基中に、分解性の結合を有していてもよい。例えば、ＰＥＧカルボン酸または活性化ＰＥＧカルボン酸と、生物活性を有する薬剤のアルコール基との反応によって形成されるエステル結合は、通常、生理的条件下において加水分解して、上記薬剤を放出する。他の加水分解に対して分解性の結合としては、（ｉ）カーボネート結合、（ｉｉ）アミンとアルデヒドとの反応から生じるイミン結合、（ｉｉｉ）アルコールとリン酸基との反応により形成されるリン酸エステル結合、（ｉｖ）ヒドラジドとアルデヒドとの反応産物であるヒドラゾン結合、（ｖ）アルデヒドとアルコールとの反応産物であるアセタール結合、（ｖｉ）蟻酸塩とアルコールとの反応産物であるオルトエステル結合、（ｖｉｉ）アミン基（例えば、ＰＥＧなどのポリマー末端にあるが、これには限定されない）と、ペプチドのカルボキシ基によって形成されるペプチド結合、（ｖｉｉｉ）ホスホラミダイト基（例えば、ポリマーの末端にあるが、これには限定されない）と、オリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基とによって形成されるオリゴヌクレオチド結合、が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。本発明の抗原結合性ポリペプチドにおいては、分枝のあるリンカーを用いてもよい。
【０１１８】
本明細書において用いるとき、用語「生物活性を有する分子」「生物活性を有する部分」または「生物活性を有する薬剤」とは、生体システム、生体経路、生体分子、または生物（例えば、ウイルス、細菌、バクテリオファージ、トランスポゾン、プリオン、昆虫、真菌、植物、動物およびヒトであるが、これらには限定されない）に関連する相互作用の、何らかの物理的特性または生化学的特性に対して、何らかの影響を与えることができる任意の物質を意味する。具体的には、本明細書において用いるとき、「生物活性を有する分子」には、（ｉ）ヒトまたは他の動物の疾患の診断、治癒、緩和、治療または予防を目的とする任意の物質、あるいは、（ｉｉ）ヒトまたは動物の肉体的または精神的福祉を改善することを目的とする任意の物質、が含まれる（ただし、これらに限定されない）。生物活性を有する分子の例としては、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬、強い薬(hard drugs)、弱い薬(soft drugs)、色素、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、毒素、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子およびミセルが挙げられる（ただし、これらに限定されない）。本発明において好適に用いられる生物活性を有する薬剤の種類としては、薬物、プロドラッグ、放射性核種、造影剤、ポリマー、抗生物質、殺真菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心血管作用薬、抗不安剤、ホルモン、成長因子、ステロイド剤、微生物由来の毒素などが挙げられる（ただし、これらに限定されない）。
【０１１９】
本発明の抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸抗体は、ＰＥＧなどの分子と複合して、インビボにおける送達および薬物動態プロファイルを改善させてもよい。Ｌｅｏｎｇらは、抗ＩＬ−８抗体のＦａｂ’断片を部位特異的にＰＥＧ化することによって、抗原結合活性をほとんど（または全く）失うことなく、非ＰＥＧ化状態のものよりもクリアランス速度を低減させた旨を開示している（Leong, S.R. et al. (2001) Cytokine 16:106-119）。
【０１２０】
他にも、数多くの切断可能なリンカーが当業者に知られている（米国特許第４，６１８，４９２号、同第４，５４２，２２５号および同第４，６２５，０１４号を参照）。これらのリンカー基から薬剤が放出される機構としては、例えば、光に対して不安定な結合に対する光照射、および酸触媒による加水分解がある。例えば、米国特許第４，６７１，９５８号には、インビボにおいて、患者の補体系のタンパク質分解酵素によって標的部位で切断されるリンカーを有する、免疫複合体の記載がある。リンカーの長さは、事前に決定されていてもよいし、抗ＣＤ３抗体とこれに連結している分子との間における所望の空間的位置関係に応じて選択してもよい。種々の放射性診断用化合物、放射性治療用化合物、薬物、毒素および他の薬剤を抗体に付加する方法について、数多くの報告がなされており、この視座に立つと、当業者ならば、所定の薬剤を抗ＣＤ３抗体または他のポリペプチドに付加する適切な方法を決定することができるであろう。
【０１２１】
「二機能性ポリマー」とは、二つの別々の機能性基を有するポリマーを表す。この機能性基は、他の部分（例えばアミノ酸の側鎖があるが、これには限定されない）と特異的に反応して、共有結合または非共有結合を形成することができる。（ｉ）特定の生物活性を有する成分が有する基と反応できる一方の機能性基と、（ｉｉ）第二の生物学的成分が有する基と反応できる他方の基と、を有する二機能性リンカーを、第一の生物活性を有する成分、二機能性リンカーおよび第二の生物活性を有する成分を含む複合体の形成に使用してもよい。種々の化合物をペプチドに付加するための、多くの手法およびリンカー分子が知られている。例えば、欧州特許出願第１８８，２５６号、米国特許第４，６７１，９５８号、同第４，６５９，８３９号、同第４，４１４，１４８号、同第４，６９９，７８４号、同第４，６８０，３３８号、同第４，５６９，７８９号および同第４，５８９，０７１号を参照（参照により本明細書に組み込まれる）。「多機能性ポリマー」とは、二つ以上の別々の機能性基を有するポリマーを表す。この機能性基は、他の部分（例えばアミノ酸の側鎖があるが、これには限定されない）と特異的に反応して、共有結合または非共有結合を形成することができる。二機能性ポリマーまたは多機能性ポリマーは、任意かつ所望の分子長または分子量であってもよい。また、抗ＣＤ３抗体に連結している分子間において、所望かつ特定の間隙または立体配置を与えるように選択してもよい。
【０１２２】
本明細書において用いるとき、用語「水溶性ポリマー」とは、水性溶媒に溶解させられる任意のポリマーを表す。水溶性ポリマーと抗ＣＤ３抗体との結合により、例えば以下のような変化が生じる（ただし、これらに限定されない）：（ｉ）修飾していないものと比較した際の、血清半減期の延長もしくは調節、または治療上の半減期の延長もしくは調節、（ｉｉ）免疫原性の調節、（ｉｉｉ）物理的な会合特性の調節（凝集および多量体形成など）、（ｉｖ）受容体への結合の改変、および受容体の二量化または多量化の改変。水溶性ポリマーは、それ自体として生物活性を有していてもよいし、有していなくてもよい。また、水溶性ポリマーを、抗ＣＤ３抗体に他の物質を付加するためのリンカーに利用してもよい。他の物質としては、一つ以上の抗ＣＤ３抗体、または一つ以上の生物活性を有する分子が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。好適なポリマーとしては、以下が挙げられる（ただし、これらに限定されない）：ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール−プロピオンアルデヒド、ポリエチレングリコールのモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシ誘導体またはアリールオキシ誘導体（米国特許第５，２５２，７１４号に記載。参照により本明細書に組み込まれる）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテル−マレイン酸無水物、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、デキストラン誘導体（硫酸デキストランなど）、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(polyoxyethylated polyol)、ヘパリン、ヘパリン断片、多糖類、オリゴ糖類、グリカン、セルロースおよびセルロース誘導体（例えば、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースがあるが、これらには限定されない）、デンプンおよびデンプン誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアルキレングリコール共重合体およびその誘導体、ポリビニルエチルエーテル、α−β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパラギン酸アミドなど、またはこれらの混合物。このような水溶性ポリマーの例としては、ポリエチレングリコールおよび血清アルブミンが挙げられる（ただし、これらに限定されない）。
【０１２３】
本明細書において用いるとき、用語「ポリアルキレングリコール」または「ポリ（アルキレングリコール）」とは、ポリエチレングリコール（ポリ（エチレングリコール））、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、およびこれらの誘導体を表す。用語「ポリアルキレングリコール」には、直鎖ポリマーも分枝ポリマーも含まれる。ポリアルキレングリコールの平均分子量は、０．１ｋＤａ〜１００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、「ポリアルキレングリコール」または「ポリ（アルキレングリコール）」は、約５Ｋ〜５０Ｋ、または５Ｋ〜５０Ｋの範囲内であってもよい。例えば、商業的製造業者のカタログ（Shearwater Corporationのカタログ‘‘Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications’’ (2001)など）には、他の例示的実施形態がまとめられている。本明細書において用いるとき、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａなどの分子量を有するポリ（エチレングリコール）は、それぞれ、「５ＫのＰＥＧ」「１０ＫのＰＥＧ」「２０ＫのＰＥＧ」などと表す。
【０１２４】
本明細書において用いるとき、用語「調節された血清半減期／血清半減期を調節する」とは、修飾した抗ＣＤ３抗体を修飾していないものと比較した際の、循環半減期における正または負の変化を意味する。血清半減期は、抗ＣＤ３抗体投与後の種々の時点において血液サンプルを採取し、各サンプル中の当該分子の濃度を決定することによって測定する。血清濃度と時間とは相関関係にあるので、血清半減期を計算することができる。約二倍以上の血清半減期の延長が望ましいが、例えば充分な投与計画を与えたり毒性効果を防止したりする場合には、より小さな血清半減期の延長も有用でありうる。いくつかの実施形態において、血清半減期の延長は、約三倍以上、約五倍以上、約１０倍以上、約１５倍以上、約２０倍以上、約２５倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、または約５０倍以上である。
【０１２５】
本明細書において用いるとき、用語「調節された治療上の半減期（therapeutic half-life）／治療上の半減期を調節する」とは、治療上有効量の（ｉ）抗ＣＤ３抗体、または（ｉｉ）修飾された生物活性を有する分子を有する抗ＣＤ３抗体を、修飾していないものと比較した際の、半減期における正または負の変化を意味する。治療上の半減期は、投与後種々の時点における、当該分子の薬物動態学的特性および／または薬力学的特性を測定することによって測定される。治療上の半減期を延長することにより、投与計画または総投与量に特定の利点が与えられたり、望ましくない効果を避けられたりすることが望ましい。いくつかの実施形態においては、効能を増強させたり、修飾された分子の標的に対する結合を強化または弱化させたり、修飾されていない分子の他のパラメータまたは作用機序における増加または減少によって、治療上の半減期が延長される。
【０１２６】
用語「単離／単離された」とは、核酸またはタンパク質に使用する場合、当該核酸またはタンパク質が天然の状態では伴っている他の細胞成分を、実質的に含んでいないことを意味する。これは、均質な状態でありうる。単離された物質は、乾燥状態であってもよいし、半乾燥状態であってもよいし、溶液状態であってもよい（例えば水溶液があるが、これには限定されない）。通常は、分析科学の技術（ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィなど）を用いて、純度および均質性を決定する。調製物中に存在する種類のうち趨勢を占めているタンパク質は、実質的に精製されている。具体的には、単離された遺伝子は、当該遺伝子の隣に位置しており、当該遺伝子のもの以外のタンパク質をコードしているオープンリーディングフレームからは分離されている。用語「精製／精製された」とは、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲル中で実質的に一本のバンドとして現れることを意味する。具体的には、「精製された」とは、核酸またはタンパク質の純度が８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、またはそれを超えることを意味する。
【０１２７】
用語「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドまたはリボヌクレオチド、およびこれらの重合体を表す。「核酸」は、一本鎖の形態であっても二本鎖の形態であってもよい。具体的な限定がない限り、この用語には、天然ヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸も含まれる。このアナログは、比較対象の核酸と同等の結合特性を有しており、天然に生じるヌクレオチドと同様の方法で代謝される。別途具体的に限定されない限り、この用語は、オリゴヌクレオチドアナログ（ＰＮＡ（ペプチド核酸）など）、アンチセンス技術に用いられるＤＮＡアナログ（ホスホロチオアート、ホスホロアミデートなど）、も表す。別途記載のない限り、特定の核酸配列には、明示的に示されている配列に加えて、（ｉ）保存的に改変された変異体（例えば、縮重しているコドンによる置換があるが、これには限定されない）、および（ｉｉ）相補的配列も、実質的には含まれる。具体的には、縮重しているコドンによる置換は、一つ以上の（または全ての）選択されたコドンの三番目の位置を、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換した配列を生成することによって行ってもよい（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; and Cassol et al., 1992; Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994）。
【０１２８】
本明細書において、用語「ポリペプチド」「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基の重合体を表すために、互いに可換に使用される。つまり、ポリペプチドに関する記載は、ペプチドに関する記載およびタンパク質に関する記載に対しても、同様に適用される（逆もまた同様）。この用語は、天然に生じるアミノ酸重合体にも適用でき、一つ以上のアミノ酸残基が天然にコードされていないアミノ酸であるアミノ酸重合体にも適用できる。本明細書において用いるとき、この用語には、任意の長さのアミノ酸鎖が含まれる（例えば、アミノ酸残基が共有性ペプチド結合で連結されている全長タンパク質（すなわち抗原））。
【０１２９】
用語「アミノ酸」とは、天然に生じるアミノ酸および天然に生じないアミノ酸、さらに、これに加えて、天然に生じるアミノ酸と類似した様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体を表す。天然にコードされているアミノ酸とは、２０種類の通常アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン）、ならびにピロリシンおよびセレノシステインである。「アミノ酸アナログ」とは、天然に生じるアミノ酸と同じ基本的な化学構造（すなわち、水素、カルボキシ基、アミノ基およびＲ基と結合しているα炭素）を有する化合物を表す（ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなど）。このようなアナログは、修飾されたＲ基を有するか（ノルロイシンなど）、修飾されたペプチド骨格を有する。しかし、天然に生じるアミノ酸と同じ基本的な化学構造は保存されている。
【０１３０】
本明細書においては、一般的に知られている３文字の記号によってアミノ酸を表記してもよいし、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会が推奨する１文字の記号によって表記してもよい。同様にヌクレオチドも、一般的に使用されている１文字の記号によって表記してもよい。
【０１３１】
「保存的に改変された変異体（conservatively modified variants）」は、アミノ酸配列および核酸配列のいずれにも適用される。特定の核酸配列について、「保存的に改変された変異体」とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードしている核酸を表す。核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合は、本質的に同一の配列を表す。遺伝暗号の縮重のため、任意の所与のタンパク質をコードしている、機能上同一の核酸が多数ある。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全て、アミノ酸のアラニンをコードしている。したがって、あるコドンによってアラニンが特定される場所ならばどこでも、コードされているポリペプチドを変化させることなく、当該コドンを任意の上記の対応するコドンに変更することができる。このような核酸の変異が「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の一種である。本明細書においては、ポリペプチドをコードしている全ての核酸配列によって、当該核酸の全ての可能なサイレント変異も記載されているものとする。核酸中の各コドンを改変して、機能上同一の分子を得られることを、当業者ならば理解するであろう（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）。したがって、ポリペプチドをコードしている核酸のそれぞれのサイレント変異は、記載されている各配列に実質的に含まれる。
【０１３２】
アミノ酸配列について、核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加によって、コードされる配列における一個または小さな割合のアミノ酸が変更、追加または削除される場合、これも「保存的に改変された変異体」であることを当業者は理解するであろう（変化の結果、アミノ酸が化学的に類似しているアミノ酸に置換されるならば）。機能的に類似しているアミノ酸を与える、保存的置換の一覧は、本技術分野において周知である。さらに、このような保存的に改変された変異体には、本発明の多形変異体、種間ホモログおよびアレルも含まれる。
【０１３３】
下記の８群には、それぞれ、互いに保存的置換されるアミノ酸が記載されている：（１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；（４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；（７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；（８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、［Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993)］を参照）。
【０１３４】
用語「同一」または「同一性」パーセントは、二つ以上の核酸または二つ以上のポリペプチド配列に関連する場合、る二つ以上の同じ配列または二つ以上の同じ部分配列を指す。以下の配列比較アルゴリズムの一つを使用して、または手動位置合わせおよび目視検査によって、測定された比較ウィンドウまたは指定領域にわたって最大限対応するように比較および位置合わせされた場合、同一である（すなわち、特定の領域にわたって同一性が約６０％である、任意で同一性が約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％である）アミノ酸残基またはヌクレオチドの割合を有する場合、配列は「実質的に同一」である。この定義はまた、試験配列の補体を指す。同一性は、少なくとも約５０個のアミノ酸もしくはヌクレオチド長である領域にわたって、または７５〜１００個のアミノ酸もしくはヌクレオチド長である領域にわたって、または特定されない場合、配列全体もしくはポリヌクレオチド全体もしくはポリペプチド全体にわたって存在しうる。
【０１３５】
配列を比較する際、典型的には一つの配列が基準配列となり、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および基準配列をコンピュータに入力し、必要であれば、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用してもよいし、代替パラメータを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムによって、プログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【０１３６】
本明細書において用いるとき、用語「対象」とは、処置、観察または実験の目的となる動物を表し、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【０１３７】
本明細書において用いるとき、用語「有効量／有効な量」とは、（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドの投与量によって、処置すべき疾患、状態または障害の症状の一つ以上が、ある程度軽減されることを表す。本明細書に記載の（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドを含む組成物は、予防処置、増強処置および／または治療処置のために投与することができる。
【０１３８】
用語「増強／増強する（「enhance」、「enhancing」）」とは、所望の効果を、強さまたは持続期間のいずれかの点において、増加または延長させることを意味する。したがって、治療用薬剤の効果の増強に関しては、用語「増強／増強する」とは、あるシステムにおける他の治療用薬剤の効果を、強さまたは持続期間のいずれかの点において、増加または延長させる能力を表す。本明細書において用いるとき、「増強に有効な量」とは、所望のシステムにおける治療用薬剤の効果を増強するために充分な量を表す。患者に関して用いられる場合、このような使用に有効な量は、疾患、障害または状態の重篤度および経過、治療歴、当該患者の健康状態および薬物に対する反応、ならびに処置医の判断に依存する。
【０１３９】
本明細書において用いるとき、用語「修飾／修飾された」とは、ポリペプチドにおける翻訳後修飾の存在を表す。「（修飾された）」という用語の形式は、議論されているポリペプチドが、任意に修飾されていることを意味する。つまり、議論されているポリペプチドは、修飾されていてもよいし、修飾されていなくてもよい。
【０１４０】
用語「翻訳後修飾された」および「修飾された」とは、アミノ酸がポリペプチド鎖中に組み込まれた後に生じる、天然アミノ酸または非天然アミノ酸の任意の修飾を表す。この用語には、翻訳時におけるインビボでの修飾、翻訳後におけるインビボでの修飾、および翻訳後におけるインビトロでの修飾、が含まれる（ただし、以上は単なる例示である）。
【０１４１】
予防または治療への応用においては、（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドを含む組成物を、疾患、状態または障害に既に苛まれている患者に対して、治療に充分な量（または、少なくとも部分的に疾患、障害または状態の症状を抑制する量）だけ投与する。このような量を、「予防上有効量」または「治療上有効量」と定義する。予防上有効量または治療上有効量は、疾患、障害または状態の重篤度および経過、治療歴、当該患者の健康状態および薬物に対する反応、ならびに処置医の判断に依存する。このような治療上有効量を、通常の実験（例えば、用量漸増臨床試験）によって決定可能であると、本技術分野においては理解される。
【０１４２】
用語「処置」は、予防処置および／または治療処置のいずれもを表すために用いる。
【０１４３】
別途記載のない限り、本技術分野の範囲内にある質量分析、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術および薬学の常法が採用される。
【０１４４】
〔発明の詳細な説明〕
〔序論〕
本発明者らは、水溶性ポリマー分子の非存在下または存在下で生物活性を有する分子または薬剤を含む二重特異的抗体を開発した。特定の実施形態において、本発明は、一つ以上のＰＥＧ分子の非存在下または存在下で一つ以上の葉酸分子を含む抗ＣＤ３抗体、断片または変異体を含む二重特異的抗体を提供する。一つ以上のＰＥＧ分子は単一ＰＥＧまたは二重ＰＥＧ、例えば、単一または二重の５Ｋ  ＰＥＧ、１０Ｋ  ＰＥＧ、２０Ｋ  ＰＥＧまたはそれ以上のＰＥＧであってもよい。一つ以上のＰＥＧ分子は、直鎖状または分枝鎖状でありうる。抗ＣＤ３抗体、断片または変異体は、Ｆａｂの重鎖または軽鎖アミノ酸配列の任意の好適な位置（１１４位、１１５位、１２９位または１６０位（Ｋａｂａｔナンバリングによる）の重鎖、および１５７位、１７２位、２０５位（Ｋａｂａｔナンバリングによる）の軽鎖を含むがこれらに限定されない）に、一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸（例えばパラアセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）など）を有するように操作された抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を含む。二重特異的抗体は、Ｆａｂの重鎖（Ｋ１２９；Ｋａｂａｔナンバリング）および軽鎖（Ｌ１５７；Ｋａｂａｔナンバリング）上に一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸（例えば、パラアセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ））を有するように操作された抗ＣＤ３Ｆａｂを含みうる。二重特異的抗体は、Ｆａｂの重鎖（Ｋ１２９；Ｋａｂａｔナンバリング）および軽鎖（Ｌ１５７；Ｋａｂａｔナンバリング）上に一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸（例えば、パラアセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ））を有するように操作された抗ＣＤ３Ｆａｂからなりうる。本発明のいくつかの実施形態において、一つ以上のＰＥＧ分子は一つ以上の非天然アミノ酸（例えば、ｐＡＦ）に複合した一つ以上の葉酸分子に複合または連結しうるものであり、独自のオキシムケミストリーを使用して抗ＣＤ３抗体に組み込まれ、例えば、抗ＣＤ３Ｆａｂと安定に複合した一つまたは二つのＰＥＧ分子および／または葉酸分子を生じる。一つ以上のＰＥＧ分子（例えば、５Ｋ  ＰＥＧ、１０Ｋ  ＰＥＧ、または２０Ｋ  ＰＥＧ）を付加することにより、インビトロおよびインビボの両方でＦＯＬＲ１発現細胞に対する特異的な細胞毒性を維持しながら、二重特異的抗体の薬物動態特性が有意に改善される。前腫瘍形成マクロファージ（Ｍ２）およびＭＤＳＣ細胞は、本明細書に記載のＰＥＧ化抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸組成物によって優先的に減少させられることが観察された。この結果から、薬物動態特性を改善することにより、投与回数を減らし、注入ポンプを用いた投与を回避できることが示唆される。本明細書において、用語「ＰＥＧ−葉酸」または「葉酸−ＰＥＧ」および用語「ＢｉＰＥＧ−ＢｉＦｏｌａｔｅ」または「ＢｉＦｏｌａｔｅ−ＢｉＰＥＧ」は、互いに可換に使用される。
【０１４５】
〔抗体、抗体断片およびそれらの変異体〕
本発明の抗体または抗体断片または変異体は、ヒト抗体もしくは抗体断片、ヒト化抗体もしくは抗体断片、操作された抗体もしくは抗体断片、非ヒト抗体もしくは抗体断片、および／またはキメラ抗体もしくは抗体断片でありうる。本明細書における抗体または抗体断片または変異体は、二つ以上のアミノ酸配列を有しうる。第一のアミノ酸配列は第一の抗体鎖を含みうるものであり、第二のアミノ酸配列は第二の抗体鎖を含みうる。第一の抗体鎖は第一のアミノ酸配列を有しうるものであり、第二の抗体鎖は第二のアミノ酸配列を有しうる。抗体の鎖とは、抗体重鎖、抗体軽鎖、または領域の組み合わせ、または抗体重鎖および領域のすべて、または抗体軽鎖のすべてを指しうる。非限定的な例として、本明細書における抗体は、重鎖、断片、またはそれらの変異体、および軽鎖、断片、またはそれらの変異体を含む。抗体の二つのアミノ酸配列（二つの抗体鎖を含む）は、一つ以上のジスルフィド結合、化学リンカー、ペプチドリンカー、またはそれらの組み合わせによって連結されうる。化学リンカーは、非天然アミノ酸を介したリンカーを含む。化学リンカーは、一つ以上の非天然アミノ酸を介したリンカーを含む。化学リンカーは、化学複合体を含みうる。ペプチドリンカーは、二つのアミノ酸配列を連結する任意のアミノ酸配列を有する。ペプチドリンカーは、１個以上、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上、４０個以上、４５個以上、５０個以上、５５個以上、６０個以上、６５個以上、７０個以上、７５個以上、８０個以上、８５個以上、９０個以上、９５個以上、１００個以上のアミノ酸を含みうる。ペプチドリンカーは、可変ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、および／またはＣＬドメインなどの抗体のドメインを含む、任意の抗体の一部であってもよい。いくつかの実施形態において、重鎖および軽鎖は、例えば、ペプチドリンカーを介して連結される。いくつかの例では、重鎖および軽鎖は、例えば、一つ以上のジスルフィド結合によって連結される。
【０１４６】
本発明に記載の抗体、抗体断片および抗体変異体は、エフェクター細胞上の抗原と相互作用または係合しうる。エフェクター細胞としては、免疫細胞、細胞傷害性活性を増減させた遺伝子改変細胞、宿主防御機構に関連する細胞、抗炎症性細胞、白血球、リンパ球、マクロファージ、赤血球、血小板、好中球、単球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、またはＴ細胞、が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、免疫細胞はＴ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞またはナチュラルキラーＴ細胞）でありうる。抗体または抗体断片は、Ｔ細胞上の受容体（Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）などが挙げられるがこれに限定されない）と相互作用しうる。ＴＣＲは、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、および／またはＴＣＲδもしくはＴＣＲζを含みうる。本発明の抗体または抗体断片は、リンパ球、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、好中球および／またはＮＫ細胞上の受容体に結合しうる。本発明の抗体または抗体断片は、細胞表面受容体に結合しうる。本発明の抗体または抗体断片は、葉酸受容体に結合しうる。本発明の抗体または抗体断片は、Ｔ細胞表面抗原（例えば、２−［３−（１，３−ジカルボキシプロピル）−ウレイド］ペンタン二酸（ＤＵＰＡ）またはそのアナログもしくは誘導体が挙げられるがこれらに限定されない）と複合しうる。例えば、米国特許第６，４７９，４７０号；ＷＯ２０１７／１３６６５９およびＷＯ２０１４／１５３１６４を参照のこと（それぞれは、参照によりその全部が本明細書に組み込まれる）。
【０１４７】
特定の実施形態において、本明細書に記載される抗体または抗体断片は、抗ＣＤ３抗体または抗体断片またはそれらの変異体である。特定の実施形態において、本明細書に記載される抗ＣＤ３抗体または抗体断片または変異体はヒト化されうる。本明細書に記載される抗ＣＤ３抗体または抗体断片または変異体としては、ＣＤ３アナログ、アイソフォーム、模倣体、断片、またはハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗ＣＤ３抗体、抗体断片、または変異体としては、これらには限定されないが、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆａｂおよび（Ｆａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二機能性ハイブリッド抗体、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲの組み合わせ、可変領域、フレームワーク領域、定常領域、重鎖、軽鎖、他の骨格を有する非抗体分子、二重特異的抗体、などが挙げられる。本本発明の抗ＣＤ３抗体または抗体断片または変異体は、配列番号１〜６２の配列を有する。本発明の抗体、断片または変異体は、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体、断片または変異体であってもよい。本発明の抗体、断片または変異体は、一つ以上の抗ＣＤ３Ｆａｂを含みうる。本発明の抗体、断片または変異体は、二つの抗ＣＤ３Ｆａｂを含みうる。特定の実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、配列番号１〜６２の配列から選択される重鎖および／または軽鎖アミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、配列番号１〜６２の配列から選択される重鎖および／または軽鎖アミノ酸配列からなる。特定の実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、および５７のいずれか一つの重鎖アミノ酸配列；および配列番号７、８、９、１８、１９、２０、３９、５８、５９、６０、６１、および６２のいずれか一つの軽鎖アミノ酸配列、を有する。
【０１４８】
非天然アミノ酸を含む抗ＣＤ３二重特異的抗体もまた、本明細書に記載される。特定の実施形態において、抗ＣＤ３二重特異的抗体、抗体断片、または変異体としては、これらには限定されないが、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆａｂおよび（Ｆａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二機能性ハイブリッド抗体、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲの組み合わせ、可変領域、フレームワーク領域、定常領域、重鎖、軽鎖、他の骨格を有する非抗体分子、二重特異的抗体、などが挙げられる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３二重特異的抗体または抗体断片または変異体は、一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む抗ＣＤ３Ｆａｂ二重特異的抗体，断片または変異体である。本発明の抗ＣＤ３Ｆａｂ二重特異的抗体または抗体断片または変異体は、配列番号１〜６２の配列を一つ以上有しうる。本発明の二重特異的抗体、断片または変異体は、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体、断片または変異体であってもよい。抗ＣＤ３二重特異的抗体は、配列番号１〜６２の配列から選択される重鎖および／または軽鎖アミノ酸配列を有しうる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、配列番号１〜６２の配列から選択される重鎖および／または軽鎖アミノ酸配列からなる。特定の実施形態において、抗ＣＤ３二重特異的抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、および５７のいずれか一つの重鎖アミノ酸配列；および配列番号７、８、９、１８、１９、２０、３９、５８、５９、６０、６１、および６２のいずれか一つの軽鎖アミノ酸配列、を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される二重特異的抗体、断片または変異体は、ＣＤ３に特異的に結合する。二重特異的抗体、断片または変異体は、異種間反応性でありうる。二重特異的抗体、断片または変異体は、ヒト抗原およびサル抗原と異種間反応性でありうる。いくつかの実施形態では、抗体は異種間反応性ＣＤＲを含む。二重特異的抗体は、ヒト化抗体でありうる。
【０１４９】
【表１】
2021535140.tif 000002
【０１５０】
2021535140.tif 000003
【０１５１】
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【０１５２】
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【０１５３】
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【０１５４】
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【０１５５】
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【０１５６】
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【０１５７】
〔非天然アミノ酸〕
本発明は、天然にコードされていないアミノ酸を一つ以上含む抗ＣＤ３抗体、抗体断片または変異体を提供する。抗ＣＤ３抗体への一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸の導入は、２０種類の通常アミノ酸と反応しない一方で、一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸との特異的化学反応を含む複合体化化学の適用を可能にしうる。
【０１５８】
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む抗ＣＤ３抗体である。一つ以上の非天然アミノ酸は、２０種類の天然アミノ酸のうちの一つをコードしないコドンによってコードされうる。一つ以上の非天然アミノ酸は、ナンセンスコドン（終止コドン）によってコードされうる。終止コドンは、アンバーコドンであってもよい。アンバーコドンは、ＵＡＧ配列を有しうる。終止コドンはオーカーコドンでありうる。オーカーコドンは、ＵＡＡ配列を有しうる。終止コドンは、オパールコドンまたはアンバー（umber）コドンでありうる。オパールコドンまたはアンバー（umber）コドンは、ＵＧＡ配列を有しうる。一つ以上の非天然アミノ酸は、四塩基コドンによってコードされうる。
【０１５９】
一つ以上の非天然アミノ酸としては、ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＡｚ）、ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐＦ）、ｐ−プロパルギロキシフェニルアラニン（ｐＰｒＦ）、ｐ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩＦ）、ｐ−シアノフェニルアラニン（ｐＣＮＦ）、ｐ−カルボキシルメチルフェニルアラニン（ｐＣｍＦ）、３−（２−ナフチル）アラニン（ＮａｐＡ）、ｐ−ボロノフェニルアラニン（ｐＢｏＦ）、ｏ−ニトロフェニルアラニン（ｏＮｉＦ）、（８−ヒドロキシキノリン−３−イル）アラニン（ＨＱＡ）、（２，２’−ビピリジン−５−イル）アラニン（ＢｉｐｙＡ）、が挙げられるが、これらに限定されない。一つ以上の非天然アミノ酸は、β−アミノ酸（β３およびβ２）、ホモ−アミノ酸、プロリンおよびピルビン酸誘導体、３−置換アラニン誘導体、グリシン誘導体、環置換フェニルアラニンおよびチロシン誘導体、線形核アミノ酸、ジアミノ酸、Ｄ−アミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸、またはそれらの組み合わせでありうる。また、非天然アミノ酸としては、（１）種々の置換チロシンおよびフェニルアラニンアナログ（例えば、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−メトキシ−Ｌ−フェニルアラニンおよびｐ−イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニンなど）；（２）光架橋されうるアリールアジドおよびベンゾフェノン基を有するアミノ酸；（３）固有の化学反応性を有するアミノ酸（例えば、アセチル−Ｌ−フェニルアラニンおよびｍ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−アリル−Ｌ−チロシン、Ｏ−（２−プロピニル）−Ｌ−チロシン、ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンおよびｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニンなど）；（４）Ｘ線結晶学における整相のための重原子含有アミノ酸（例えば、ｐ−ヨードおよびｐ−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニンなど）；（５）酸化還元活性アミノ酸であるジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン；（６）グリコシル化アミノ酸（例えば、ｂ−Ｎ−アセチルグルコサミン−Ｏ−セリンおよびａ−Ｎ−アセチルガラクトサミン−Ｏ−トレオニンなど）；（７）ナフチル、ダンシル、および７−アミノクマリン側鎖を有する蛍光アミノ酸；（８）アゾベンゼンおよびニトロベンジルＣｙｓ、Ｓｅｒ、およびＴｙｒ側鎖を有する光切断可能かつ光異性化可能なアミノ酸；（９）ホスホチロシン模倣体であるｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン；（１０）グルタミンホモログであるホモグルタミン；および（１１）２−アミノオクタン酸、が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−トレオニン、およびＯ−ホスホチロシンである。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は糖部分を有する。そのようなアミノ酸の例としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−トレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギン、およびＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンが挙げられる。そのようなアミノ酸の例としては、また、アミノ酸と糖との間の天然のＮ−またはＯ−結合が、自然界では通例見られない共有結合に置き換わっているものが挙げられる。そのようなアミノ酸としては、アルケン、オキシム、チオエーテル、アミド、などが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなアミノ酸の例としては、また、天然のタンパク質には通例見られない糖類（２−デオキシ−グルコース、２−デオキシガラクトース、など）が挙げられる。非天然アミノ酸の具体例としては、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−プロパルギロキシフェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、ｔｒｉ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、およびイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニンなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる非天然アミノ酸は、［Liu et al, Annu Rev Biochem, 79:413-44, 2010］、［Wang et al, Angew Chem Int Ed, 44:34-66, 2005］、および国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３９４７２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３９４６８、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８８００９、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５８６６８、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８９１４２、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８８０１１、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００１４８５、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４９３９７、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４７８２２およびＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４４６８２（それぞれ、参照によりその全部が本明細書に組み込まれる）に開示されている。いくつかの実施形態では、一つ以上の非天然アミノ酸は、ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）であってもよい。
【０１６０】
本発明の特定の実施形態において、一つ以上の非天然アミノ酸を有する抗ＣＤ３抗体は、一つ以上の翻訳後修飾を有する。一実施形態において、一つ以上の翻訳後修飾には、分子の付加が含まれている。このとき付加される分子としては、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコール誘導体、薬物、第二のタンパク質またはポリペプチドもしくはポリペプチドアナログ、抗体または抗体断片、生物活性を有する薬剤、小分子、または上記の任意の組み合わせ、または他の任意の望ましい化合物または物質、が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。これらの分子は第二の反応基を有しており、第一の反応基を有する上記一つ以上の非天然アミノ酸と反応する。この反応は、特定の反応基に適していると当業者に知られている化学的方法による。例えば、第一の反応基はアルキニル部分であり（例えば、非天然アミノ酸であるｐ−プロパルギロキシフェニルアラニン（プロパルギル基は、時にアセチレン部分とも呼ばれる）中のものがあるが、これには限定されない）、第二の反応基はアジド部分である。この例では、［３＋２］環状付加の化学的方法が利用される。他の例においては、第一の反応基はアジド部分であり（例えば、非天然アミノ酸のｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン中のものがあるが、これには限定されない）、第二の反応基はアルキニル部分である。本発明の修飾された抗ＣＤ３抗体ポリペプチドの特定の実施形態では、一つ以上の翻訳後修飾にある糖部分において、一つ以上の翻訳後修飾を有する一つ以上の非天然アミノ酸（例えば、ケト機能性基を有する非天然アミノ酸が挙げられるが、これには限定されない）が使用されている。特定の実施形態において、翻訳後修飾は、真核細胞または非真核細胞中で、インビボにてなされる。他の実施形態では、翻訳後修飾はインビトロで行われる。他の実施形態において、翻訳後修飾はインビトロおよびインビボで行われる。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は化学基を組み込むように修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸はケトン基を組み込むように修飾されてもよい。一つ以上の非天然アミノ酸は、少なくとも一つのオキシム、カルボニル、ジカルボニル、ヒドロキシルアミン基、またはそれらの組み合わせを含みうる。一つ以上の非天然アミノ酸は、少なくとも一つのカルボニル、ジカルボニル、アルコキシアミン、ヒドラジン、非環状アルケン、非環状アルキン、シクロオクチン、アリール／アルキルアジド、ノルボルネン、シクロプロペン、トランス−シクロオクテン、または、テトラジン機能性基またはそれらの組み合わせ、を含みうる。
【０１６２】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、抗体、抗体断片または変異体に部位特異的に組み込まれる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、抗ＣＤ３抗体、抗体断片または変異体に部位特異的に組み込まれる。非天然アミノ酸を分子（例えば、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド）に組み込むための方法は、米国特許第７，３３２，５７１号；第７，９２８，１６３号；第７，６９６，３１２号；第８，００８，４５６号；第８，０４８，９８８号；第８，８０９，５１１号；第８，８５９，８０２号；第８，７９１，２３１号；第８，４７６，４１１号；または第９，６３７，４１１号（それぞれ、参照によりその全部が本明細書に組み込まれる）、ならびに本明細書中の実施例において開示されている。一つ以上の非天然アミノ酸は、当該分野で公知の方法によって組み込まれうる。例えば、細胞系または無細胞系を使用することができ、操作されたｔＲＮＡおよび合成酵素の代わりに栄養要求性株を使用することもできる。特定の実施形態において、直交なｔＲＮＡ合成酵素は、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０１２４６５；ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０１２６３５；ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３２５７６；ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４４０４１；ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４３６０３；ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４６６１８（それぞれ、参照によりその全部が本明細書に組み込まれる）に開示されているように使用される。一つ以上の非天然アミノ酸を抗体または抗体断片または変異体に組み込むことは、抗体または抗体断片または変異体中の一つ以上のアミノ酸残基を改変することを含みうる。抗体または抗体断片または変異体中の一つ以上のアミノ酸残基を改変することは、抗体または抗体断片または変異体をコードするヌクレオチド配列中の一つ以上のヌクレオチドを変異させることを含みうる。抗体または抗体断片または変異体をコードするヌクレオチド配列中の一つ以上のヌクレオチドを変異させることは、アミノ酸をコードするコドンをナンセンスコドンに変化させることを含みうる。一つ以上の非天然アミノ酸を抗体または抗体断片または変異体に組み込むことは、抗体または抗体断片または変異体中の一つ以上のアミノ酸残基を改変して、抗体または抗体断片または変異体中に一つ以上のアンバーコドンを産生することを含みうる。一つ以上の非天然アミノ酸は、アンバーコドンに応じて、抗体または抗体断片または変異体に組み込まれうる。一つ以上の非天然アミノ酸は、抗体または抗体断片または変異体に部位特異的に組み込まれうる。一つ以上の非天然アミノ酸を抗体または抗体断片または変異体に組み込むことは、生物活性を有する分子または標的化剤を部位特異的に改変するために、２０種類の標準的なアミノ酸に対して直交する化学反応性を有する一つ以上の遺伝子的にコードされた非天然アミノ酸を含みうる。一つ以上の非天然アミノ酸を組み込むことは、一つ以上のアンバーナンセンスコドンに応じて、生物活性を有する分子または標的化剤中の規定された部位に一つ以上の非天然アミノ酸を部位特異的に組み込むためのｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡの合成酵素対の使用を含みうる。非天然アミノ酸を組み込むためのさらなる方法としては、［Chatterjee et al, A Versatile Platform for Single- and Multiple-Unnatural Amino Acid Mutagenesis in Escherichia coli, Biochemistry, 2013］、［Kazane et al, J Am Chem Soc, 135(1):340-6, 2013］、［Kim et al, J Am Chem Soc, 134(24):9918-21, 2012］、［Johnson et al, Nat Chem Biol, 7(11):779-86, 2011］、および［Hutchins et al, J Mol Biol, 406(4):595-603, 2011］に記載の方法が挙げられるが、これらに限定されない。一つ以上の非天然アミノ酸は、一つ以上の天然アミノ酸の選択的反応によって生成されうる。選択的反応は、一つ以上の酵素によって媒介されうる。非限定的な例において、一つ以上のシステインとホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）との選択的反応によって、一つ以上のホルミルグリシンが生成されうる（［Rabuka et al, Nature Protocols 7: 1052-1067, 2012］に記載されるように）。一つ以上の非天然アミノ酸は、リンカーを形成するための化学反応に関連しうる。リンカーを形成するための化学反応は、生体直交反応を含みうる。リンカーを形成するための化学反応は、クリック(click)化学を含みうる。例えば、国際公開第ＷＯ２００６／０５０２６２号（参照によりその全部が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【０１６３】
〔生物活性を有する分子／薬剤〕
非天然アミノ酸を介して抗体または断片または変異体に連結された生物活性を有する分子を含む、抗ＣＤ３抗体または抗体断片またはその変異体を本明細書に記載する。生物活性を有する分子としては、小分子または薬剤、非ペプチド化合物、薬物、第二のタンパク質またはポリペプチドまたはポリペプチドアナログまたは誘導体、抗体または抗体断片または変異体、第二の生物活性を有する薬剤、標的化剤、または上記または任意の他の望ましい化合物または物質の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、生物活性を有する薬剤は、細胞（癌細胞または腫瘍細胞を含むが、これらに限定されない）への細胞傷害性Ｔ細胞の集積に関与する。いくつかの実施形態では、生物活性を有する分子は、葉酸もしくはその誘導体もしくはアナログ、あるいは２−［３−（１，３−ジカルボキシプロピル）ウレイドール］ペンタン二酸（ＤＵＰＡ）またはその誘導体もしくはアナログなど（これらに限定されない）の小分子である。いくつかの実施形態では、生物活性を有する分子は、葉酸塩またはその誘導体もしくはアナログである。生物活性を有する分子は、細胞標的化分子、リガンド、タンパク質、ペプチド、ペプトイド、ＤＮＡアプタマー、ペプチド核酸、ビタミン、基質または基質アナログ、コレシストキニンＢ受容体、ゴナドトロピン放出ホルモン受容体、ソマトスタチン受容体２、ａｖｂ３インテグリン、ガストリン放出ペプチド受容体、ニューロキニン１受容体、メラノコルチン１受容体、ニューロテンシン受容体、神経ペプチドＹ受容体およびＣ型レクチン様分子１、受容体、共受容体、膜貫通タンパク質または細胞マーカーまたは細胞表面タンパク質、から選択されうる。生物活性を有する分子は、標的細胞に結合しうる。生物活性を有する分子は、細胞表面タンパク質、細胞表面マーカー、または細胞上の細胞表面分子に結合しうる。生物活性を有する分子は、細胞（例えば癌細胞または腫瘍細胞または免疫抑制細胞が挙げられるがこれらに限定されない）上の細胞表面分子に結合しうる。細胞表面分子は、葉酸受容体分子であってもよい。生物活性を有する分子は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合する薬剤（例えば、ＤＵＰＡまたはそのアナログもしくは誘導体などが挙げられるがこれらに限定されない）でありうる。生物活性を有する分子または薬剤は、細胞表面マーカー、タンパク質または受容体を過剰に発現するまたは高度に発現する細胞に結合しうる。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、生物活性を有する分子は、葉酸塩もしくは葉酸リガンド、またはそれらのアナログもしくは誘導体でありうる。生物活性を有する分子は、葉酸受容体タンパク質（ＦＲ）に結合することができる。このような生物活性を有する分子は、Ｎ−（４−｛［（２−アミノ−４−オキソ−１，４−ジヒドロプテリジン−６−イル）メチル］アミノ｝ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン酸（葉酸）、またはそのアナログもしくは誘導体でありうる。そのアナログは、葉酸に基づく、ＦＲ結合を保存する部分でありうる。葉酸アナログは、葉酸の構造のかなりの部分を保存することができる。さらに、葉酸アナログは、リンカーまたは抗体または抗体断片または変異体と複合することから、わずかに修飾された形態の葉酸であってもよい。例えば、葉酸アナログは、リンカーまたは抗体または抗体断片または変異体に葉酸カルボキシ基を複合することから、わずかに修飾されてもよい。さらに、葉酸は、リンカーまたは抗体または抗体断片と複合することから、わずかに修飾されうるが、そのＦＲ結合特性は維持する。いくつかの実施形態では、葉酸分子は葉酸受容体αを標的とする。いくつかの実施形態では、葉酸分子は葉酸受容体βを標的とする。いくつかの実施形態において、葉酸または葉酸塩は、ＦＲ＋細胞株上で過剰に発現するまたは高度に発現する葉酸受容体（ＦＲ）抗原に結合するための生物活性を有する分子または標的化剤として使用される。いくつかの実施形態では、細胞は癌細胞または免疫抑制細胞であるが、これらに限定されない。
【０１６５】
生物活性を有する分子または薬剤は、一つ以上のリンカーによって抗体または抗体断片または変異体の一つ以上の非天然アミノ酸に部位特異的に連結されうる。リンカーは、化学リンカー、ペプチドリンカー、またはそれらの組み合わせでありうる。化学リンカーは、非天然アミノ酸を介したリンカーを含む。化学リンカーは、一つ以上の非天然アミノ酸を介したリンカーを含む。化学リンカーは、化学複合体を含みうる。ペプチドリンカーは、二つのアミノ酸配列を連結する任意のアミノ酸配列を有する。ペプチドリンカーは、１個以上、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上、４０個以上、４５個以上、５０個以上、５５個以上、６０個以上、６５個以上、７０個以上、７５個以上、８０個以上、８５個以上、９０個以上、９５個以上、１００個以上のアミノ酸を含みうる。ペプチドリンカーは、可変ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、および／またはＣＬドメインなどの抗体のドメインを含む、任意の抗体の一部であってもよい。抗体または抗体断片または変異体は、生物活性を有する分子と複合しうる。抗体または抗体断片または変異体は、化学リンカーおよび／またはペプチドリンカーを介して生物活性を有する分子と複合しうる。いくつかの実施形態では、本発明は、一つ以上の生物活性を有する分子または薬剤と複合している抗ＣＤ３抗体または抗体断片または変異体を提供する。いくつかの実施形態では、一つ以上の生物活性を有する分子または薬剤は、一つ以上の小分子である。いくつかの実施形態では、本発明は、一つ以上の小分子と複合している抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体または抗体断片または変異体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、一つ以上の葉酸分子と複合している抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体または抗体断片または変異体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、一つ以上のＤＵＰＡ分子と複合している抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体または抗体断片または変異体を提供する。いくつかの実施形態において、一つ以上の葉酸分子および／または一つ以上のＤＵＰＡ分子は、化学的リンカーおよび／またはペプチドリンカーを介して抗ＣＤＦａｂ抗体と複合しうる。
【０１６６】
〔ＰＥＧリンカー／リガンド／複合体〕
抗ＣＤ３抗体または抗原結合性ポリペプチドと小分子とは、リンカーで連結されていてもよいし、ポリマーで連結されていてもよいし、共有結合で連結されていてもよい。リンカー、ポリマーまたは小分子は、それ自体として、２０種類の通常アミノ酸とは反応しない機能性基を有していてもよい。リンカーまたはポリマーは、二機能性リンカーまたはポリマーであってもよい。二機能性リンカーまたはポリマーは、分枝のあるリンカーまたはポリマーである。リンカー、ポリマーまたは共有結合を介した抗ＣＤ３抗体または抗原結合性ポリペプチドと生物活性を有する分子との連結に関係する一つ以上の結合は、所望の環境下において、不可逆であってもよいし、可逆であってもよいし、不安定であってもよい。リンカー、ポリマーまたは共有結合を介した抗ＣＤ３抗体または抗原結合性ポリペプチドと分子との連結に関係している一つ以上の結合は、抗原結合性ポリペプチドまたは他の分子の放出を調節するものであってもよい。種々の小分子は、当業者によって、化学的手段で作製されたものでもよいし、天然の産物として単離されたものでもよいし、他の手段により作製されたものでもよい。
【０１６７】
一つ以上の水溶性ポリマー（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子またはリガンドなど）に連結された、一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を含む抗ＣＤ３抗体または抗体断片または変異体を本明細書に記載する。天然にコードされていないアミノ酸を含む抗ＣＤ３抗体または抗体断片または変異体は、二つの水溶性ポリマー（二つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子またはリガンドなど）に連結することができる。天然にコードされていないアミノ酸および一つ以上の生物活性を有する分子を含む抗体または抗体断片または変異体は、一つ以上の水溶性ポリマー（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子またはリンカーなど）に連結することができる。いくつかの実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸および二つの生物活性を有する分子を含む抗体または抗体断片または変異体は、二つの水溶性ポリマー（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子またはリンカーなど）に連結される。
【０１６８】
この方法は、抗体または抗体断片を、生物活性を有する分子、または水溶性ポリマー、または生物活性を有する分子および水溶性ポリマーを含む複合体に連結させることを含みうる。この方法は、一つ以上のリンカーを生物活性を有する分子と複合させて生物活性を有する分子−リンカー中間体を生成すること、および当該中間体を抗体または抗体断片と複合させることを含みうる。この方法は、一つ以上のリンカーをＰＥＧ分子と複合させてＰＥＧ−リンカー中間体を生成すること、および当該ＰＥＧ−リンカー中間体を抗体または抗体断片と複合させることを含みうる。この方法は、一つ以上のリンカーを抗体または抗体断片と複合させて抗体−リンカー中間体または抗体断片−リンカー中間体を生成すること、および当該抗体−リンカー中間体または抗体断片−リンカー中間体を別の生物活性を有する分子、水溶性ポリマー、または生物活性を有する分子および水溶性ポリマーを含む複合体と複合させることを含みうる。本明細書に記載の方法は、一つ以上のリンカーを一つ以上の抗体もしくは抗体断片、一つ以上の生物活性を有する分子、またはそれらの組み合わせと複合させて、一つ以上の中間体（抗体−リンカー中間体、抗体断片−リンカー中間体、および／または生物活性を有する分子抗体複合体−リンカー中間体など）を生成することを含みうる。この方法は、第一のリンカーを抗体または抗体断片と複合させて、抗体−リンカー中間体または抗体断片−リンカー中間体を生成することを含みうる。この方法は、リンカーを生物活性を有する分子と複合させて生物活性を有する分子−リンカー中間体を生成することを含みうる。
【０１６９】
本発明の二重特異的抗ＣＤ３抗体複合体の製造方法は、（ａ）第一のリンカーを抗体または抗体断片に組み込まれた一つ以上の非天然アミノ酸を含む抗体または抗体断片と複合させること、（ｂ）第二のリンカーを生物活性を有する分子と複合させて生物活性を有する分子−リンカー中間体を生成すること、および（ｃ）二つの中間体を連結させて抗ＣＤ３抗体−生物活性を有する分子複合体を生成することを含みうるものであり、生物活性を有する分子は、小分子（例えば、葉酸分子またはＤＵＰＡ分子またはそれらのアナログもしくは誘導体が挙げられるがこれらに限定されない）でありうる。特定の実施形態において、本発明の二重特異的抗ＣＤ３抗体複合体の製造方法は、（ａ）第一のリンカーを抗体または抗体断片に組み込まれた一つ以上の非天然アミノ酸を含む抗体または抗体断片と複合させて抗体−リンカー中間体または抗体断片−リンカー中間体を生成するること、（ｂ）第二のリンカーを生物活性を有する分子と複合させて生物活性を有する分子−リンカー中間体を生成すること、および（ｃ）二つの中間体を連結させて抗ＣＤ３抗体−生物活性を有する分子複合体を生成することを含みうるものであり、生物活性を有する分子は、小分子（例えば、葉酸分子またはＤＵＰＡ分子またはそれらのアナログもしくは誘導体が挙げられるがこれらに限定されない）でありうる。本発明の二重特異的抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体−葉酸複合体の製造方法は、（ａ）第一のリンカーを抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体または抗体断片に組み込まれた一つ以上の非天然アミノ酸を含む抗体または抗体断片と複合させて抗体−リンカー中間体または抗体断片−リンカー中間体を生成するること、（ｂ）第二のリンカーを生物活性を有する分子と複合させて生物活性を有する分子−リンカー中間体を生成すること、および（ｃ）二つの中間体を連結させて抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体−生物活性を有する分子複合体を生成することを含みうるものであり、生物活性を有する分子は一つ以上の葉酸分子またはＤＵＰＡ分子またはアナログまたは誘導体を含み、リンカーは、一つ以上の化学リンカーおよび／またはペプチドリンカーを含み、リンカーは、一つ以上のＰＥＧ分子を含む。一つ以上のＰＥＧ分子は、直鎖状または分枝鎖状のＰＥＧ分子である。一つ以上の分枝鎖状のＰＥＧ分子は、二機能性リンカーである。ＰＥＧ分子の平均分子量は、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、またはそれ以上である。ＰＥＧ分子の平均分子量は、５Ｋ、１０Ｋまたは２０Ｋである。
【０１７０】
抗体もしくは抗体断片、または生物活性を有する分子と一つ以上のリンカーとの複合体化は、同時に起こりうる。抗体もしくは抗体断片、または生物活性を有する分子と一つ以上のリンカーとの複合体化は、順番に起こりうる。抗体もしくは抗体断片、または生物活性を有する分子と一つ以上のリンカーとの複合体化は、単一工程プロセス（例えば、酵素複合体化、または化学的工程、またはプロセスもしくは反応など）で起こりうる。抗体もしくは抗体断片、または生物活性を有する分子と一つ以上のリンカーとの複合体化は、二工程プロセス（例えば、二つの酵素複合体化、または二つの化学的工程、または二つのプロセスもしくは二つの反応など）で起こりうる。抗体もしくは抗体断片、または生物活性を有する分子と一つ以上のリンカーとの複合体化は、二つ以上の工程プロセス（例えば、二つ以上の酵素複合体化、または化学的工程、またはプロセスもしくは反応など）で起こりうる。
【０１７１】
中間体を抗体もしくは抗体断片、または生物活性を有する分子、または水溶性ポリマーと複合させることは、当業者に周知のように、オキシム結合を形成するオキシム化学および／またはクリック化学を含みうる。抗体または抗体断片は、一つ以上の非天然アミノ酸を含みうる。抗体または抗体断片を中間体に連結させることは、非天然アミノ酸とリンカー中間体との間にオキシムを形成することを含みうる。リンカーを抗体もしくは抗体断片、または生物活性を有する分子もしくは水溶性分子と複合させることは、リンカーと抗体もしくは抗体断片、または生物活性を有する分子もしくは水溶性分子との間のイオン結合、共有結合、非共有結合、またはそれらの組み合わせを含みうる。抗体または抗体断片または生物活性を有する分子または水溶性分子とリンカーとの複合体化は、当該分野で公知である。例えば、［Roberts et al, Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476 (2002)］を参照のこと。
【０１７２】
一つ以上のリンカーを抗体または抗体断片および／または生物活性を有する分子と複合させることは、リンカーと抗体または抗体断片または生物活性を有する分子との間に一つ以上のオキシムを形成することを含みうる。一つ以上のリンカーを抗体または抗体断片および／または生物活性を有する分子と複合させることは、リンカーと抗体または抗体断片または生物活性を有する分子との間に一つ以上の安定な結合を形成することを含みうる。一つ以上のリンカーを抗体または抗体断片および／または生物活性を有する分子と複合させることは、リンカーと抗体または抗体断片または生物活性を有する分子との間に一つ以上の共有結合を形成することを含みうる。一つ以上のリンカーを抗体または抗体断片および／または生物活性を有する分子と複合させることは、リンカーと抗体、抗体断片または生物活性を有する分子との間に一つ以上の非共有結合を形成することを含みうる。一つ以上のリンカーを抗体または抗体断片および／またはリガンドと複合させることは、リンカーと抗体または抗体断片または生物活性を有する分子との間に一つ以上のイオン結合を形成することを含みうる。
【０１７３】
一つ以上のリンカーを抗体または抗体断片と複合させることは、一つ以上のリンカーを抗体または抗体断片と部位特異的に複合させるを含みうる。部位特異的複合体化は、一つ以上のリンカーを抗体または抗体断片の非天然アミノ酸に連結させることを含みうる。一つ以上のリンカーを抗体または抗体断片の非天然アミノ酸に連結させることは、オキシムの形成を含みうる。一つ以上のリンカーを抗体または抗体断片の非天然アミノ酸に連結させることは、硫化物の形成を含みうる。一つ以上のリンカーを抗体または抗体断片の非天然アミノ酸に連結させることは、非限定的な例として、一つ以上のリンカーのヒドロキシルアミンをアミノ酸のアルデヒドまたはケトンと反応させることを含みうる。アミノ酸は、非天然アミノ酸であってもよい。一つ以上のリンカーを抗体または抗体断片の非天然アミノ酸に連結させることは、非限定的な例として、一つ以上のリンカーのブロモ誘導体をアミノ酸のチオールと反応させることを含みうる。アミノ酸は、非天然アミノ酸であってもよい。
【０１７４】
一つ以上のＰＥＧまたはリンカーは、当業者に知られているように、複合体化化学を用いて二つのシステイン残基を連結するジスルフィド架橋を含みうる。（例えば、［ThioBridge（商標） technology, Abzena］も参照のこと）。二つ以上のＰＥＧ分子またはリンカーは、二つのアミノ酸残基を連結するマレイミド架橋を含みうる。二つのアミノ酸は、抗体または抗体断片のＣ末端に位置してもよい。一つ以上のリンカーは、二つのシステイン残基を連結するマレイミド架橋を含みうる。二つのシステイン残基は、抗体または抗体断片のＣ末端でありうる。いくつかの実施形態において、一つ以上のＰＥＧは、Ｃ末端ＰＥＧ複合体でありうる。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ＰＥＧ分子は、重鎖抗体と軽鎖抗体との間、または抗体断片間で、共有ジスルフィド結合または付加を伴わなくてもよい。いくつかの実施形態において、二つ以上のＣ末端に位置するＰＥＧ分子は、抗体または抗体断片の重鎖と軽鎖との間に共有結合または架橋されうる。このようなＰＥＧ複合体またはリンカーを、本明細書中に記載する。
【０１７５】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、葉酸−ＰＥＧリンカーは一つ以上の葉酸分子および一つ以上のＰＥＧ分子を含む。一つ以上のＰＥＧ分子は、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、またはそれ以上でありうる。ＰＥＧ分子には直鎖ポリマーも分枝ポリマーも含まれ、平均分子量は、０．１ｋＤａ〜１００ｋＤａである。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子またはリンカーの分子量は、約０．１ｋＤａ〜約１００ｋＤａである。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子またはリンカーの分子量は、０．１ｋＤａ〜５０ｋＤａである。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子またはリンカーは、分枝ポリマーまたは分枝リンカーである。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分枝ポリマーまたはリンカーの各分枝の分子量は、１ｋＤａ〜１００ｋＤａ、または１ｋＤａ〜５０ｋＤａである。ＰＥＧ分子は本技術分野において周知であり、例えば、Shearwater Corporationのカタログ‘‘Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications’’ (2001)を参照のこと。
【０１７６】
本明細書に記載の特定の実施形態において、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸ＰＥＧ化複合体は、一つ以上のＰＥＧ分子を含む。本明細書に記載の特定の実施形態において、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸ＰＥＧ化複合体は、一つ以上のＣ末端ＰＥＧ分子を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ＰＥＧ分子は、重鎖抗体または抗体断片と軽鎖抗体または抗体断片との間の共有ジスルフィド結合または付加を伴わなくてもよい。いくつかの実施形態において、Ｃ末端ＰＥＧ分子は、抗体または抗体断片の重鎖および軽鎖に別々に付加されうる。いくつかの実施形態において、二つ以上のＣ末端ＰＥＧ分子は、抗体または抗体断片の重鎖と軽鎖との間に共有結合または架橋されうる。いくつかの実施形態において、二つ以上のＰＥＧ分子は、二つのシステイン残基を連結するマレイミド架橋を介して共有結合または架橋されうる。
【０１７７】
薬物動態を改善し、組成物の細胞毒性を調節するために、ＰＥＧ化を使用することができる。ＰＥＧ部分はタンパク質にかなりの流体力学的半径を付加するので、タンパク質のＰＥＧ化は、腎クリアランスを遅らせることによってその血清半減期を増大させることができる。親水性ポリマーのポリ（エチレングリコール）（略称ＰＥＧ）を共有結合で付加する方法によって、（ｉ）水溶性および生体利用性が向上し、（ｉｉ）血清半減期および治療上の半減期が増加し、（ｉｉｉ）免疫原性および生物活性が調節され、または（ｉｖ）多くの生物活性を有する分子（例えば、タンパク質、ペプチド、そして特に疎水性の分子）について、循環時間を延長させる。製薬、人工移植、ならびに、生体適合性、毒性の除去および免疫原性の除去が重要となるその他の用途において、ＰＥＧは広範に用いられてきた。好ましくは、ＰＥＧ化は、生物活性を有する分子の活性を変化させないか、または最小限にしか変化させない。好ましくは、半減期の増大は、生物活性のいかなる低下よりも大きい。［Rader et al. in Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Apr 29;100(9):5396-400］は、一般抗体(generic antibody)分子と反応させることによって、合成小分子にエフェクター機能を与え、血清半減期を延長させる方法を開示している（参照により本明細書に組み込まれる）。上記文献に開示されている複合体は、ｍＡｂ  ３８Ｃ２（天然のアルドラーゼ酵素を模倣した触媒抗体）と、インテグリンを標的とするＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐペプチド模倣体のジケトン誘導体との間を、抗体上の反応性リシン残基を介して可逆な共有結合で結合することよって創出された。ペプチド模倣体の半減期が延長されただけでなく、この複合体には、インテグリンαｖβ３およびαｖβ５を発現している細胞表面を選択的に標的とするよう、抗体標的の切り替えが認められた。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸を有する抗ＣＤ３抗体は、当該天然にコードされていないアミノ酸の側鎖を介して、水溶性ポリマー（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）と連結されている。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸を有する抗ＣＤ３抗体は、当該天然にコードされていないアミノ酸の側鎖を介して、葉酸塩と連結されている。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸を有する抗ＣＤ３抗体は、当該天然にコードされていないアミノ酸の側鎖を介して、葉酸誘導体と連結されている。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸を有する抗ＣＤ３抗体は、当該天然にコードされていないアミノ酸の側鎖を介して、水溶性ポリマー（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）と連結されている。いくつかの実施形態において、天然にコードされていないアミノ酸を有する抗ＣＤ３抗体は、当該天然にコードされていないアミノ酸の側鎖を介して、水溶性ポリマー誘導体（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体など）と連結されている。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマー−葉酸リンカーが提供され、一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸を有する抗ＣＤ３抗体は、当該一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸の側鎖を介して、葉酸塩と、および／または水溶性ポリマーと、および／またはリンカーと連結されている。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、葉酸部分は、図１２Ａ〜１２Ｆに示す構造を含む以下の構造に由来する：
【０１８０】
【化１】
2021535140.tif 000010
【０１８１】
いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）である。いくつかの実施形態では、ポリ（エチレングリコール）という用語は、直鎖状ポリ（エチレングリコール）、分枝鎖状ポリ（エチレングリコール）、二機能性ポリ（エチレングリコール）、マルチアームポリ（エチレングリコール）、誘導体化されたポリ（エチレングリコール）および枝分かれしたポリ（エチレングリコール）を含む任意の形態のポリ（エチレングリコール）を含む。
【０１８２】
ポリ（エチレングリコール）の分子量は、１ｋＤａ〜１００ｋＤａであってもよい。ポリ（エチレングリコール）の分子量は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０ｋＤａでありうる。ポリ（エチレングリコール）の分子量は、約１ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、または約５ｋＤａ〜２０ｋＤａでありうる。ポリ（エチレングリコール）の分子量は、約５ｋＤａ、または約１０ｋＤａ、または約２０ｋＤａでありうる。ポリ（エチレングリコール）の分子量は、５ｋＤａまたは１０ｋＤａまたは２０ｋＤａであってもよい。ポリ（エチレングリコール）の分子量は５ｋＤａであってもよい。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、二機能性水溶性ポリマー−葉酸リンカーが以下の構造を有する：
【０１８４】
【化２】
2021535140.tif 000011
【０１８５】
式中、
Ａはの以下の構造を有し：
【０１８６】
【化３】
2021535140.tif 000012
【０１８７】
Ｂは、ＡとＣとを連結する二価の基であり；
ＣおよびＥは、それぞれ独立して、−アルキレン−、
−アルキレン−Ｃ（Ｏ）−、−（アルキレン−Ｏ）ｎ’−アルキレン−、−（アルキレン−Ｏ）ｎ’−アルキレン−Ｃ（Ｏ）−、−（アルキレン−Ｏ）ｎ’−（ＣＨ２）ｎ’−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ’−Ｃ（Ｍｅ）２−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ’−ＮＨＣ（Ｏ）−（アルキレン−Ｏ）ｎ’−アルキレン−、−（アルキレン−Ｏ）ｎ’−アルキレン−Ｕ−アルキレン−Ｃ（Ｏ）−、および−（アルキレン−Ｏ）ｎ’−アルキレン−Ｕ−アルキレン−、からなる群より選択され、
ここで、ｎ’は独立して１以上の整数であり；
Ｄは、Ｃ、ＦおよびＥを連結する三価の基であり；
Ｆは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマーであり；ここで、
Ｙは、ヒドロキシルアミン、メチル、アルデヒド、保護されたアルデヒド、ケトン、保護されたケトン、チオエステル、エステル、ジカルボニル、ヒドラジン、アミジン、イミン、ジアミン、アジド、ケトアミン、ケトアルキン、アルキン、シクロアルキン、およびエンジオン、からなる群より選ばれる。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、Ｂは置換二価ヘテロヒドロカルビル残基である。いくつかの実施形態では、置換基は、一つ以上のカルボキシル、ケトンおよび／またはアミド機能性基を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ原子は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、Ｂは、以下の構造を有する：
【０１９０】
【化４】
2021535140.tif 000013
【０１９１】
いくつかの実施形態では、Ｄは置換三価ヘテロヒドロカルビル残基である。いくつかの実施形態では、置換基は、一つ以上のカルボキシル、ケトンおよび／またはアミド機能性基を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ原子は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、Ｄは、以下の構造を有する：
【０１９３】
【化５】
2021535140.tif 000014
【０１９４】
いくつかの実施形態では、ＣおよびＥは、それぞれ−（アルキレン−Ｏ）ｎ’−アルキレン−である。いくつかの実施形態では、それぞれのアルキレンは、−ＣＨ２ＣＨ２−である。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、ｎ’は、１〜２０、または１〜１０、または１〜５である。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、Ｆは以下の構造を有する：
【０１９７】
【化６】
2021535140.tif 000015
【０１９８】
式中、ｎは２〜１０，０００である。いくつかの実施形態では、ｎはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）の分子量が１ｋＤａ〜１００ｋＤａとなるように選択される。例えば、分子量は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０ｋＤａでありうる。例えば、分子量は、約１ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、または約５ｋＤａ〜２０ｋＤａでありうる。例えば、分子量は、約５ｋＤａ、または約１０ｋＤａ、または約２０ｋＤａでありうる。例えば、分子量は、５ｋＤａ、または１０ｋＤａ、または２０ｋＤａでありうる。例えば、分子量は、５ｋＤａでありうる。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、二機能性水溶性ポリマー−葉酸リンカーが以下の構造を有する：
【０２００】
【化７】
2021535140.tif 000016
【０２０１】
いくつかの実施形態では、少なくとも一つの天然にコードされていないアミノ酸を含む抗ＣＤ３抗体が水溶性ポリマー二機能性ＰＥＧ−葉酸リンカーに連結され、したがって、以下の構造を有する：
【０２０２】
【化８】
2021535140.tif 000017
【０２０３】
式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは上記の実施形態のいずれかで定義した通りであり、Ｚは、非天然アミノ酸を介して抗ＣＤ３抗体に連結されたオキシムまたは環状結合である。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、Ｚは以下の構造を有する：
【０２０５】
【化９】
2021535140.tif 000018
【０２０６】
式中、
Ｊは任意構成であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｇは任意構成であり、存在する場合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、各Ｒ’は独立してＨ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群より選ばれるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも一つのアミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも一つのアミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
ここで、Ｒ１および／またはＲ２は抗ＣＤ３抗体であり；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、または置換低級アルキル、あるいは、Ｒ３およびＲ４または二つのＲ３基は、任意で、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成する。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、Ｚは以下の構造を有する：
【０２０８】
【化１０】
2021535140.tif 000019
【０２０９】
式中、Ｊ、Ｇ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は上記において定義されたとおりであり、
ここで、Ｄは以下の構造を有する：
【０２１０】
【化１１】
2021535140.tif 000020
【０２１１】
式中、それぞれのＲ１７は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールまたは置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’’、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２（ここで、各Ｒ’’は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、または置換アラルキルである）からなる群より独立して選ばれ；
それぞれのＺ１は結合であり、ＣＲ１７Ｒ１７、Ｏ、Ｓ、ＮＲ’、ＣＲ１７Ｒ１７−ＣＲ１７Ｒ１７、ＣＲ１７Ｒ１７−Ｏ、Ｏ−ＣＲ１７Ｒ１７、ＣＲ１７Ｒ１７−Ｓ、Ｓ−ＣＲ１７Ｒ１７、ＣＲ１７Ｒ１７−ＮＲ’、またはＮＲ’−ＣＲ１７Ｒ１７であり；
それぞれのＲ’は、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
それぞれのＺ２は、結合、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、任意で置換されたＣ１−Ｃ３アルキレン、任意で置換されたＣ１−Ｃ３アルケニレン、および任意で置換されたヘテロアルキルからなる群より選ばれ；
それぞれのＺ３は、結合、任意で置換されたＣ１−Ｃ４アルキレン、任意で置換されたＣ１−Ｃ４アルケニレン、任意で置換されたヘテロアルキル、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、および−Ｎ（Ｒ’）−からなる群より独立して選ばれ；
それぞれのＴ３は結合、Ｃ（Ｒ’’）（Ｒ’’）、Ｏ、またはＳであり（ただし、Ｔ３がＯまたはＳの場合、Ｒ’’はハロゲンではない）；
それぞれのＲ’’は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
ｍおよびｐは、０、１、２、または３である（ただし、ｍまたはｐの少なくとも一つは０ではない）；
Ｍ２は、以下の構造を有し、
【０２１２】
【化１２】
2021535140.tif 000021
【０２１３】
式中、（ａ）はＢ基への結合を示し、（ｂ）は複素環基内のそれぞれの位置への結合を示し；
Ｍ３は、以下の構造を有し、
【０２１４】
【化１３】
2021535140.tif 000022
【０２１５】
式中、（ａ）はＢ基への結合を示し、（ｂ）は複素環基内のそれぞれの位置への結合を示し；
Ｍ４は、以下の構造を有し、
【０２１６】
【化１４】
2021535140.tif 000023
【０２１７】
式中、（ａ）はＢ基への結合を示し、（ｂ）は複素環基内のそれぞれの位置への結合を示し；
それぞれのＲ１９は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、エステル、エーテル、チオエーテル、アミノアルキル、ハロゲン、アルキルエステル、アリールエステル、アミド、アリールアミド、ハロゲン化アルキル、アルキルアミン、アルキルスルホン酸、アルキルニトロ、チオエステル、スルホニルエステル、ハロスルホニル、ニトリル、アルキルニトリル、およびニトロ、からなる群より独立して選ばれ；
ｑは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１であり；
それぞれのＲ１６は、水素、ハロゲン、アルキル、ＮＯ２、ＣＮおよび置換アルキルからなる群より独立して選ばれる。
【０２１８】
本発明は、タンパク質をＰＥＧ誘導体によって選択的に修飾するための、非常に効率的な方法を提供する。この方法は、遺伝的にコードされていないアミノ酸を選択的に組み込む方法と関係している。遺伝子にコードされていないアミノ酸としては、選択コドンに対応してタンパク質に通常組み込まれる２０種類のアミノ酸には見られない機能性基または置換基（例えば、ケトン部分、アジド部分またはアセチレン部分であるが、これらには限定されない）を有するアミノ酸が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。そしてその結果、アミノ酸はＰＥＧ誘導体と適切に反応して修飾される。一度組み込まれると、次に、当業者に知られている適切な化学的方法によって、天然にコードされているアミノ酸にある特定の機能性基または置換基に対して、アミノ酸側鎖を修飾することができる。様々な種類の公知の化学的方法が、水溶性ポリマーをタンパク質に組み込むにあたって、本発明に好適に用いられる。このような方法としては、限定はされないが、それぞれアセチレン誘導体またはアジド誘導体（ただし、これらには限定されない）との間における、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環状付加反応（例えば［Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109, 1991; Huisgen, R. in 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176, 1984］を参照）が挙げられる。
【０２１９】
Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環状付加法は、求核性置換反応よりも環状付加に関係しているため、タンパク質を非常に高い選択性で修飾することができる。この反応は、触媒量のＣｕ（Ｉ）塩を反応混合物に加えることによって、水性条件下、室温にて、優れた部位特異性（１，４＞１，５）で発生させることができる（例えば、［Tornoe, et al., Org. Chem. 67:3057-3064, 2002; Rostovtsev, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599, 2002］および国際公開第０３／１０１９７２号を参照）。［３＋２］環状付加によって本発明のタンパク質に付加することができる分子としては、適切な機能性基または置換基（アジド誘導体またはアセチレン誘導体が挙げられるが、これらには限定されない）を有する、実質的にあらゆる分子が挙げられる。これらの分子を、アセチレン基を有する非天然アミノ酸（例えばｐ−プロパルギロキシフェニルアラニンであるが、これには限定されない）、またはアジド基を有する非天然アミノ酸（例えばｐ−アジド−フェニルアラニンであるが、これには限定されない）に、それぞれ付加することができる。
【０２２０】
Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環状付加の結果生じる５員環は、還元性環境下では一般的に不可逆であり、水性環境下でも加水分解に対して長期間安定している。それゆえ、厳しい水性環境下においても、広範な種類の物質の物理的特性および化学的特性を、本発明の活性化ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体により改変することができる。より重要なことには、アジド部分およびアセチレン部分は互いに特異的であるため（また、例えば、遺伝子にコードされている２０種類の通常のアミノ酸のいずれとも反応しないため）、一つ以上の特異的な部位において、非常に高い選択性でタンパク質を修飾することができる。
【０２２１】
本発明はまた、一つ以上のアセチレン部分またはアジド部分を有するＰＥＧ誘導体および関連する親水性ポリマーの、水溶性で加水分解に対して安定な誘導体を提供する。アセチレン部分を有するＰＥＧポリマー誘導体は、選択コドンに対応して選択的にタンパク質に導入されたアジド部分と、高い選択性でカップリングする。同様に、アジド部分を有するＰＥＧポリマー誘導体は、選択コドンに対応して選択的にタンパク質に導入されたアセチレン部分と、高い選択性でカップリングする。
【０２２２】
より具体的に、アジド部分としては、アルキルアジド、アリールアジド、およびこれらのアジドの誘導体が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。アルキルアジドおよびアリールアジドの誘導体は、アセチレンに特異的な反応性が保存されている限り、他の置換基を有していてもよい。アセチレン部分としては、アルキルアセチレンおよびアリールアセチレン、ならびにこれらの誘導体が挙げられる。アルキルアセチレンおよびアリールアセチレンの誘導体は、アジドに特異的な反応性が保存されている限り、他の置換基を有していてもよい。
【０２２３】
したがって、抗ＣＤ３抗体には、標的分子または抗原に対する特異的な結合能を示す任意のポリペプチドが包含されることが意図される。任意の公知の抗体または抗体断片は、抗ＣＤ３抗体である。
【０２２４】
一実施形態においては、非天然アミノ酸（ｐ−（プロパルギロキシ）−フェニルアラニンなど）を有する抗ＣＤ３抗体の組成物が提供される。また、ｐ−（プロパルギロキシ）−フェニルアラニンと、さらにタンパク質および／または細胞（ただし、これらに限定されない）とを含む、種々の組成物も提供される。一態様において、非天然アミノ酸であるｐ−（プロパルギロキシ）−フェニルアラニンを含む組成物は、直交なｔＲＮＡをさらに含む。非天然アミノ酸は、直交なｔＲＮＡと結合していてもよい（例えば共有結合によってであるが、これには限定されない）。この結合の例としては、（ｉ）アミノ−アシル結合を介した、直交なｔＲＮＡとの共有結合、（ｉｉ）直交なｔＲＮＡの末端にあるリボース糖の、３’ＯＨまたは２’ＯＨとの共有結合、などが挙げられる（ただし、これらに限定されない）。
【０２２５】
［抗ＣＤ３抗体の抗原または結合対象に対する、抗ＣＤ３抗体の活性および抗ＣＤ３抗体の親和性の測定］
抗ＣＤ３抗体の活性は、標準的なインビトロまたはインビボのアッセイによって測定することができる。例えば、抗ＣＤ３抗体と結合する細胞または細胞株（例えば、天然の抗ＣＤ３抗体抗原または結合対象を含む細胞、または、抗ＣＤ３抗体抗原または結合対象を組み換えにより産生する細胞であるが、これらには限定されない）を、抗ＣＤ３抗体の結合を評価するために用いることができる。非天然アミノ酸を有する、ＰＥＧ化されていない抗原結合性ポリペプチドまたはＰＥＧ化抗原結合性ポリペプチドに関しては、抗ＣＤ３抗体の抗原または結合対象に対する当該抗ＣＤ３抗体の親和性を、公知の技術を用いて測定することができる（例えば、BIAcore（商標）biosensor（Pharmacia）またはOctet（ForteBio）など）。
【０２２６】
抗ＣＤ３抗体の作製にどのような方法を採用するかにかかわらず、当該抗ＣＤ３抗体は生物活性を評価するアッセイに供される。適切な場合には、トリチウム化チミジンアッセイを行って細胞分裂の程度を確認してもよい。しかし、他の生物学的アッセイを所望の活性を確認するために用いてもよい。例えば、抗原の生物活性（酵素活性、増殖活性または代謝活性など）の阻害能を測定する生物学的アッセイによっても、抗ＣＤ３抗体の活性が示される。当業者に知られている他のインビトロアッセイを生物活性の確認に用いてもよい。一般的に、抗原の生物活性に対して適切であるときには、生物活性の試験は所望の結果に対する分析を与えるものでなくてはならない。この分析とは、例えば、（改変していない抗ＣＤ３抗体と比較した）生物活性の上昇もしくは減少、（改変していない抗ＣＤ３抗体と比較した）生物活性の変化、受容体との親和性分析、立体配置もしくは構造の変化、または、血清半減期の分析などである。当業者ならば、所望の最終結果を試験するために有用な、他のアッセイをも認知しているであろう。
【０２２７】
［効能、インビボにおける機能上の半減期、および薬物動態学的パラメータの測定］
本発明の重要な態様は、抗ＣＤ３抗体（抗ＣＤ３抗体と水溶性ポリマー部分との複合体化を伴うものも、伴わないものも含む）の構築によって獲得された、生物学的半減期の延長である。抗ＣＤ３抗体の血清濃度は急速に低下するため、複合体化もしくは非複合体化抗ＣＤ３抗体およびその変異体による処置に対する、生物学的応答の評価が重要となっていた。好ましくは、本発明の複合体化もしくは非複合体化抗ＣＤ３抗体およびその変異体は、静脈内投与の後でも血清半減期を延長させる。このため、例えばＥＬＩＳＡ法または一次スクリーニングアッセイによる測定が可能となる。インビボにおける生物学的半減期の測定は、本明細書に記載の方法で行われる。
【０２２８】
天然にコードされていないアミノ酸を有する抗原結合性ポリペプチドの薬物動態学的パラメータは、通常のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（オス）によって評価できる。抗ＣＤ３抗体の薬物動態学的データは、いくつかの種においてよく研究されており、天然にコードされていないアミノ酸を有する抗ＣＤ３抗体に関して得られたデータと直接比較することができる。
【０２２９】
本発明に係る抗ＣＤ３抗体の特定の活性は、種々の公知のアッセイによって測定できる。本発明に係る抗ＣＤ３抗体突然変異タンパク質またはその断片の生物活性は、得られたものであっても精製されたものであっても、本明細書に記載もしくは援用されている方法、または当業者に知られた方法により試験することができる。
【０２３０】
［投与および薬学的組成物］
本発明のポリペプチドまたはタンパク質（一つ以上の非天然アミノ酸を有する抗ＣＤ３抗体、合成酵素、タンパク質などであるが、これらには限定されない）を、任意で、治療用途に採用してもよい（例えば、適切な薬物学的キャリアと組み合わせて採用するが、これには限定されない）。このような組成物は、例えば、治療上有効な量の化合物と、薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤とを含む。このようなキャリアまたは賦形剤としては、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよび／またはこれらの組み合わせが挙げられる（ただし、これらに限定されない）。製剤は、投与の形態に合うように成される。一般的に、タンパク質を投与する方法は本技術分野においてよく知られており、本発明のポリペプチドの投与にも適用することができる。
【０２３１】
本発明のポリペプチドの一種類以上を含む治療用組成物を、任意で、適当な疾患のインビトロおよび／またはインビボ動物モデルの一つ以上において試験して、効能および組織中での代謝を確認してもよいし、投与量を評価してもよい。この試験は、本技術分野で周知の方法に従う。具体的には、投与量を、活性、安定性、または本明細書における非天然アミノ酸の天然アミノ酸ホモログに対する他の適切な尺度（すなわち比較アッセイ）によって最初に決定することができる（例えば、一つ以上の非天然アミノ酸を有するように改変した抗ＣＤ３抗体と、天然アミノ酸からなる抗ＣＤ３抗体との比較があるが、これには限定されない）。
【０２３２】
投与は、分子と血液または組織細胞とが最終的に接触するような導入に通常使用される、任意の経路によるものであってよい。本発明の非天然アミノ酸ポリペプチドは、任意構成で一種類以上の薬学的に許容可能なキャリアを伴って、任意の適切な様式により投与される。本発明に関するポリペプチドを、患者に対して投与する適切な方法が利用可能である。また、特定の経路は、通常、他の経路よりも即効性があり、より効果的な作用または反応をもたらすことができる（ただし、二種以上の経路を、特定の組成物の投与に使用することができる）。
【０２３３】
薬学的に許容可能なキャリアは、投与する特定の組成物、および当該組成物の投与に用いる特定の方法によって、ある程度決定される。それゆえ、本発明の薬学的組成物の適切な製剤には、様々な種類がある。
【０２３４】
種々の経路によって、ポリペプチド組成物を投与することができる。このような経路としては、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、経皮投与、皮下投与、局所投与、舌下投与または直腸投与が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。（修飾または非修飾の）非天然アミノ酸ポリペプチドを含む組成物を、リポソームを用いて投与することもできる。このような投与経路および適切な製剤は、当業者に周知である。
【０２３５】
非天然アミノ酸を有する抗ＣＤ３抗体を、それ単独でまたは他の適切な成分と組み合わせて、吸入により投与されるエアロゾル製剤とすることもできる（つまり、「噴霧」することができる）。エアロゾル製剤は、加圧可能な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）中に配置することができる。
【０２３６】
非経口投与（例えば、関節内経路（関節内へ）、静脈内経路、筋肉内経路、皮内経路、腹腔内経路および皮下経路など）に好適な製剤としては、水性または非水性の、等張無菌注入溶液が挙げられる。この注入溶液は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を対象患者の血液と等張に保つ溶質、ならびに、水性および非水性の無菌懸濁液（懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、防腐剤を含有していてもよい）、を含んでいてもよい。包装された抗ＣＤ３抗体製剤は、封入容器内（アンプルおよびバイアルなど）において、１回投与量ずつが封入されていてもよいし、複数回投与分が封入されていてもよい。
【０２３７】
非経口投与および静脈内投与が、好適な投与方法である。とりわけ、天然アミノ酸ホモログによる治療において既に使用されている投与経路（例えば、ＥＰＯ、ＧＨ、抗ＣＤ３抗体、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ、インターロイキン、抗体、および／または他の任意の薬学的に送達されるタンパク質において典型的に使用される経路であるが、これらには限定されない）は、その投与経路と共に使用されている剤型と併せて、本発明のポリペプチドにとって好適な投与経路および剤型を与える。
【０２３８】
本発明に関して、患者に投与する投与量は、当該患者に長期にわたって有利な治療反応を引き起こさせるのに充分な量である。あるいは、用途によっては、病原体による感染を防止する量、または他の適当な活性を阻害する量でもありうる（ただし、これらに限定されない）。投与量は、（ｉ）具体的なベクターまたは製剤の効果、（ｉｉ）採用する非天然アミノ酸ポリペプチドの活性、安定性または血清半減期、（ｉｉｉ）患者の状態、（ｉｖ）処置される患者の体重または体表面積、に応じて決定される。また、１回量は、特定の患者の生活、体質、および、特定のベクター、製剤などの投与に伴う何らかの好ましくない副作用の程度、に応じて決定される。
【０２３９】
疾患（癌、遺伝性疾患、糖尿病、ＡＩＤＳなどであるが、これらには限定されない）の処置または予防において、投与するベクターまたは製剤の有効な量を決定するにあたっては、循環血漿中のレベル、製剤の毒性、疾患の進行、および／または、（関係のある場合には）抗非天然アミノ酸ポリペプチド抗体の産生が、医師により評価される。
【０２４０】
例えば、７０ｋｇの患者に投与する投与量は、通常、現在使用されている治療用タンパク質の投与量と等価である範囲内であり、本組成物の変化した活性または血清半減期に合わせて調節する。本発明のベクターは、任意の公知の療法によって、状態の処置を補うことができる。このような公知の療法としては、抗体の投与、ワクチンの投与、および、細胞傷害性の物質、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチドアナログ、生体応答調節薬などの投与、が挙げられる。
【０２４１】
本発明の製剤の投与にあたっては、当該製剤のＬＤ−５０もしくはＥＤ−５０によって決定されるペースで投与するか、および／または、種々の濃度の非天然アミノ酸による何らかの副作用を観察することによって決定されるペースで投与する。後者の場合、この観察結果を、患者の体重および全体的な健康状態に適用してもよいが、これには限定されない。１回投与量で投与を完了させてもよいし、投与量を分割して投与を完了させてもよい。
【０２４２】
製剤を注入されている患者が、発熱、悪寒または筋肉痛を訴える場合は、適量のアスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェンまたは他の解熱鎮痛剤を投与する。注入に対して発熱、筋肉痛および悪寒などの反応を示す患者は、さらなる注入の３０分前に、アスピリン、アセトアミノフェンまたはジフェンヒドラミンなど（ただし、これらに限定されない）のいずれかを前投薬する。解熱剤および抗ヒスタミン剤に対する速やかな反応が見られない、より重篤な悪寒および筋肉痛には、メペリジンを使用する。反応の重篤度によっては、細胞注入のペースを緩めるか、または停止する。
【０２４３】
本発明のヒト抗原結合性ポリペプチドは、哺乳動物の被検体に直接投与することができる。投与は、抗ＣＤ３抗体の被検体への導入に通常使用される、任意の経路による。本発明の実施形態に係る抗ＣＤ３抗体組成物には、経口投与、直腸投与、局所投与、吸入投与（エアロゾルなどによるが、これには限定されない）、頬側投与（舌下投与を含むが、これには限定されない）、膣内投与、非経口投与（皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、関節内投与、胸腔内投与、腹腔内投与、脳内投与、動脈内投与または静脈内投与などがあるが、これらには限定されない）、局所投与（すなわち、皮膚表面および粘膜表面への投与であり、気道表面への投与も含む）、ならびに経皮投与に好適であるものが包含される。しかし、任意の所与の症例において、最適な経路は、処置しようとする状態の性質および重篤度によりけりである。投与は、局所的であってもよいし、全身的であってもよい。化合物の製剤は、密封容器内に（アンプルおよびバイアルなど）、１回投与量分だけ格納されていてもよいし、複数回投与量分が格納されていてもよい。本発明の抗ＣＤ３抗体は、薬学的に許容可能なキャリアと一緒に、１回投与量分の注入可能な形態の混合物として調製することができる（溶液、懸濁液またはエマルジョンなどであるが、これらには限定されない）。また、本発明の抗ＣＤ３抗体を、持続注入により投与してもよいし（例えば、浸透圧ポンプなどの小型ポンプを用いるが、これには限定されない）、１回のボーラス投与としてもよいし、徐放性のデポ剤として投与してもよい。
【０２４４】
投与に適した製剤としては、水性または非水性の溶液（無菌等張溶液）があり、これらには、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を等張に保つ溶質を含ませることができる。また、水性または非水性の無菌懸濁液も投与に適した製剤であり、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および防腐剤を含ませることができる。溶液および懸濁液は、無菌粉末、無菌顆粒、および上述した類の錠剤から調製することができる。
【０２４５】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能なキャリアを含んでいてもよい。薬薬学的に許容可能なキャリアは、投与する特定の組成物、および当該組成物の投与に用いる特定の方法によって、ある程度決定される。それゆえ、本発明の薬学的組成物の適切な製剤（任意構成として、薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤または安定剤を含む）には、様々な種類がある（例えば［Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985］を参照）。
【０２４６】
好適なキャリアとしては、以下が挙げられる：緩衝剤（リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩および他の有機酸）；酸化防止剤（アスコルビン酸など）；低分子量のポリペプチド（約１０残基未満）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなど）；単糖類、二糖類および他の炭化水素（グルコース、マンノースまたはデキストリンなど）；キレート剤（ＥＤＴＡなど）；二価金属イオン（亜鉛、コバルトまたは銅など）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；塩を形成する対イオン（ナトリウムなど）；および／または、非イオン性界面活性剤（Tween（商標）、Pluronics（商標）またはＰＥＧなど）。
【０２４７】
本発明の抗ＣＤ３抗体（水溶性ポリマー（ＰＥＧなど）と連結している抗体も含む）は、持続的放出系として（あるいは部分的に持続的放出系として）投与することができる。持続的放出する組成物としては、半透性ポリマー基剤の成形加工品（フィルムまたはマイクロカプセルなどであるが、これらには限定されない）が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。持続的放出する基剤としては、以下のような生体適合性物質が挙げられる：ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 1981; Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 1982）；エチレン−酢酸ビニル（Langer et al., supra）；または、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）；ポリラクチド（ポリ乳酸）（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）；ポリグリコリド（グリコール酸の重合体）；ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド無水物重合体（乳酸とグリコール酸との共重合体）；Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとの共重合体（U. Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 1983）；ポリ（オルト）エステル；ポリペプチド；ヒアルロン酸；コラーゲン；コンドロイチン硫酸；カルボン酸；脂肪酸；リン脂質；多糖類；核酸；ポリアミノ酸；アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンなど）；ポリヌクレオチド；ポリビニルプロピレン；ポリビニルピロリドン；およびシリコーン。また、持続的放出する組成物は、リポソームに封入された化合物をさらに含んでいてもよい。化合物を含むリポソームは、それ自体として公知の方法により調製される。ＤＥ３，２１８，１２１、［Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692, 1985］、［Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034, 1980］、ＥＰ５２，３２２、ＥＰ３６，６７６、ＥＰ８８，０４６、ＥＰ１４３，９４９、ＥＰ１４２，６４１、日本国特許出願昭第８３−１１８００８号、米国特許第４，４８５，０４５号、同第４，５４４，５４５号、ＥＰ１０２，３２４を参照（援用した全ての刊行物および特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２４８】
リポソームに封入された抗ＣＤ３抗体は、例えば以下の文献に記載の方法によって調製することができる：ＤＥ３，２１８，１２１、［Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692, 1985］、［Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034, 1980］、ＥＰ５２，３２２、ＥＰ３６，６７６、ＥＰ８８，０４６、ＥＰ１４３，９４９、ＥＰ１４２，６４１、日本国特許出願第８３−１１８００８号、米国特許第４，４８５，０４５号、同４，５４４，５４５号、ＥＰ１０２，３２４。リポソームの組成および大きさは周知であり、また、当業者はこれを容易に経験的に決定することもできる。リポソームに関するいくつかの例が、例えば、以下に記載されている：［Park JW, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1327-1331, 1995］、［Lasic D and Papahadjopoulos D (eds): Medical Applications of Liposomes, 1998］、［Drummond DC, et al., Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B (ed): Cancer Drug Discovery and Development, 2002］、［Park JW, et al., Clin. Cancer Res. 8:1172-1181, 2002］、［Nielsen UB, et al., Biochim. Biophys. Acta 1591(1-3):109-118, 2002、Mamot C, et al., Cancer Res. 63: 3154-3161, 2003］（援用した全ての刊行物および特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２４９】
本発明に関して、患者に投与する投与量は、被検体に長期間にわたって有利な反応を引き起こすのに充分な量でなくてはならない。本発明の抗ＣＤ３抗体を非経口的に投与する場合の、投与量あたりの薬学的に有効な量の合計は、通常、約０．０１μｇ／ｋｇ／日〜約１００μｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇである（患者の体重あたり）。しかし、投与量は治療上の判断に委ねられている。また、投与頻度も、治療上の判断に委ねられている。ヒトにおける使用が認可されている市販の抗ＣＤ３抗体製品よりも、高頻度で投与してもよいし、低頻度で投与してもよい。本発明の二重特異性抗原結合性ポリペプチドは、通常、上述の投与経路のいずれによっても投与することができる。
【０２５０】
［本発明の抗ＣＤ３抗体生物複合体の治療的使用］
本発明の抗ＣＤ３抗体ポリペプチドは、広範囲の障害を治療するために有用である。本明細書に記載される抗ＣＤ３抗体組成物は、免疫反応を調節するために使用されうる。免疫反応の調節は、免疫反応を刺激、活性化、増強、または上方制御することを含みうる。免疫反応の調節は、免疫反応を抑制、阻害、防止、減少、または下方制御することを含みうる。記載される抗ＣＤ３抗体―葉酸組成物は、天然の葉酸リガンドが、例えば、腫瘍上の葉酸受容体α、および免疫抑制細胞上の葉酸受容体βを標的としながら、固形腫瘍に浸透することにおいて利点を有しうるものである。いくつかの実施形態では、腫瘍は液性またはの固形腫瘍である。
【０２５１】
本明細書で開示されるのは、本発明の抗ＣＤ３抗体複合体または医薬組成物を用いて、対象の状態を治療する方法である。一部の癌では、特定の細胞表面受容体を過剰発現させることで、健康な細胞への影響を最小限に抑えながら、癌細胞を低分子または薬物で選択的に標的化することが可能である。例えば、前立腺癌の特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）を標的化する、２−［３−（１，３−ジカルボキシプロピル）−ウレイド］ペンタンジオ酸（ＤＵＰＡ）は、Ｔ細胞の表面抗原（抗ＣＤ３）結合抗体と複合化させることができ、細胞侵障害性Ｔ細胞を選択的に動員または標的化させて、前立腺を殺傷することができる。Ｎ−（４−｛［（２−アミノ−４−オキソ−１，４−ジヒドロプテリジン−６−イル）メチル｝ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン酸（葉酸）はまた、ＦＲ＋癌細胞株上で過剰発現する葉酸受容体（ＦＲ）抗原に結合する生物学的活性分子として使用することができる。
【０２５２】
本発明は、患者に治療上有効量の本発明の抗ＣＤ３抗体を患者に投与することによって癌を処置する方法を提供する。癌は卵巣癌（上皮（eptithelial）腫瘍、間質腫瘍、および胚細胞腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない）でありうる。卵巣癌は、卵管癌または原発性腹膜癌腫を含みうる。癌は、葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）の高発現によって特徴付けられ、例えば卵巣癌などでありうる。癌は、細胞傷害性Ｔ細胞を葉酸受容体陽性（ＦＲ＋）腫瘍細胞に集積することにより処置されうる。いくつかの実施形態では、本発明は、患者に治療上有効量の本発明の抗ＣＤ３抗体を患者に投与することによって遺伝病、ＡＩＤＳ、または糖尿病を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体または治療は、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を含む二重特異的抗体であって、任意で、上記抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体は、二つの葉酸分子および二つのＰＥＧ化分子と任意で複合している、部位特異的に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸を含む二重特異的抗体でありうる。さらなる実施形態では、上記抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体において、非天然アミノ酸の側鎖を介して二つの葉酸分子および二つのＰＥＧ化分子と複合している。
【０２５３】
本発明は、葉酸受容体を高発現する細胞における疾患または病状の処置に使用される抗ＣＤ３抗体を提供する。本発明の抗ＣＤ３抗体は、癌の処置に使用され、上記癌としては、卵巣癌（上皮（eptithelial）腫瘍、間質腫瘍、および胚細胞腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。卵巣癌は、卵管癌または原発性腹膜癌腫を含みうる。癌は、葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）の高発現によって特徴付けられ、例えば卵巣癌などでありうる。癌は、細胞傷害性Ｔ細胞を葉酸受容体陽性（ＦＲ＋）腫瘍細胞に集積することにより処置されうる。本発明の抗ＣＤ３抗体は、遺伝病、ＡＩＤＳ、または糖尿病（これらに限定されない）の処置に使用される。本発明の抗ＣＤ３抗体は、葉酸受容体を高発現する細胞における疾患または病状を処置するための医薬の製造において使用されうる。本発明の抗ＣＤ３抗体は、癌を処置するための医薬の製造に使用されうるものであり、上記癌としては、卵巣癌（上皮（eptithelial）腫瘍、間質腫瘍、および胚細胞腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。卵巣癌は、卵管癌または原発性腹膜癌腫を含みうる。癌は、葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）の高発現によって特徴付けられ、例えば卵巣癌などでありうる。癌は、細胞傷害性Ｔ細胞を葉酸受容体陽性（ＦＲ＋）腫瘍細胞に集積することにより処置されうる。本発明の抗ＣＤ３抗体は、遺伝病、ＡＩＤＳ、または糖尿病（これらに限定されない）を処置するための医薬の製造において使用されうる。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、処置される状態は癌である。癌として、乳癌、脳腫瘍、膵癌、皮膚癌、肺癌、肝臓癌、胆嚢癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、骨の癌、および血液の癌（白血病）、またはこれらの癌のいずれかに関連する癌または疾患または状態が挙げられるが、これらに限定されるものではない。癌腫は身体の表面を覆い、ホルモンを産生し、腺を構成する細胞である上皮細胞で発生する癌である。非限定的な例として、癌腫には、乳癌、膵癌、肺癌、結腸癌、大腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、脳腫瘍、膣癌、外陰癌、子宮癌、口腔癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、皮膚癌、卵管癌、頭頚部の癌、消化管間質の癌、腺癌、皮膚または眼内の黒色腫、肛門部の癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、尿道癌、腎盂癌、尿管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、下垂体癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、ＣＮＳ原発リンパ腫、脳幹グリオーマ、および脊髄軸腫瘍が含まれる。場合によっては、基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫、非黒色腫、または日光角化症（日光角化症）などの皮膚癌である。いくつかの実施形態では、癌は高度に発現する葉酸受容体αまたはβを有する任意の癌である。いくつかの実施形態において、治療される状態は疾患または状態である。疾患または状態は、病原性感染でありうる。病原性感染は細菌感染でありうる。病原性感染はウイルス感染でありうる。疾患または状態は炎症性疾患でありうる。疾患または状態は自己免疫疾患でありうる。自己免疫疾患は糖尿病でありうる。疾患または状態は癌でありうる。いくつかの実施形態では、疾患または状態は高発現した葉酸受容体αまたはβを有する任意の疾患または状態である。疾患または状態は、病原性感染でありうる。生物学的活性分子は、感染細胞上の細胞表面分子と相互作用しうる。生物学的活性分子は、細菌、ウイルス、または寄生虫上の分子と相互作用しうる。病原性感染は、１種または複数の病原体によって誘発されることがある。ある例では、病原体は細菌、真菌、ウイルス、または原生生物である。代表的な病原体としては、ボルデテラ、ボレリア、ブルセラ、カンピロバクター、クラミジア、クラミドフィラ、クロストリジウム、コリネバクテリウム、腸球菌、大腸菌、フランシセラ、ヘモフィルス、ヘリコバクター、レジオネラ、レプトスピラ、リステリア、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ナイセリア、シュードモナス、リケッチア、サルモネア、赤痢菌、ブドウ球菌、レンサ球菌、トリポネーマ、ビブリオ、またはエルシニアが挙げられるが、これらに限定されない。病原体はウイルスでありうる。ウイルスの例として、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、エプスタイン−バールウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎）、単純ヘルペスウイルス（１型と２型）、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ＲＳウイルス、風疹ウイルス、および水痘帯状疱疹ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスによって誘発される疾患または状態の例として、風邪、���ンフルエンザ、肝炎、エイズ、水痘、風疹、おたふくかぜ、はしか、いぼ、およびポリオが挙げられるが、これらに限定されない。疾患または状態は、自己免疫疾患または自己免疫関連疾患でありうる。自己免疫疾患とは、身体の免疫システムの機能不全であり、身体が自身の組織を攻撃することを誘発しうる。自己免疫疾患および自己免疫関連疾患の例として、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性心筋炎、ベーチェット病、セリアックスプルー、クローン病、皮膚筋炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、グッドパスチャー症候群、グレーヴス病、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、若年性関節炎、川崎病、ランバート−イートン症候群、ループス（ＳＬＥ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、結節性多発動脈炎、Ｉ型およびＩＩ型およびＩＩＩ型の自己免疫性多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、乾癬、乾癬性関節炎、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、精子および精巣の自己免疫、硬直人症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、血管炎、白斑、およびヴェーゲナー肉芽腫症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５５】
疾患または状態は、炎症性疾患でありうる。炎症性疾患の例として、胞隔炎、アミロイドーシス、血管炎、強直性脊椎炎、無血管性骨壊死、バセドウ病、ベル麻痺、滑液包炎、手根管症候群、セリアック病、胆管炎、膝蓋軟骨軟化症、慢性肝炎、慢性疲労症候群、コーガン症候群、先天性股関節形成異常、肋軟骨炎、クローン病、のう胞性線維症、ドケルバン腱炎、糖尿病関連関節炎、びまん性特発性骨増殖症、円板状ループス、エーラース−ダンロス症候群、家族性地中海熱、筋膜炎、線維炎／線維筋痛症、冷凍肩、ガングリオンのう胞、巨細胞性動脈炎、痛風、グレーヴス病、ＨＩＶ関連リウマチ性疾患症候群、副甲状腺機能亢進症関連関節炎、感染性関節炎、炎症性腸症候群／過敏性腸症候群、若年性関節リウマチ、ライム病、マルファン症候群、ミクリッツ病、混合性結合組織病、多発性硬化症、筋筋膜疼痛症候群、変形性関節症、骨軟化症、骨粗鬆症およびコルチコステロイド誘発性骨粗鬆症、ページェット病、回帰性リウマチ、パーキンソン病、プランマ―病、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、偽痛風、乾癬性関節炎、レイノー現象／症候群、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、坐骨神経痛（腰部神経根障害）、強皮症、壊血病、鎌状細胞関節炎、シェーグレン症候群、脊柱管狭窄症、スポンディスト、スチル病、全身性エリテマトーデス、高安（脈なし）病、腱炎、テニス肘／ゴルフ肘、甲状腺関連関節炎、トリガーフィンガー、潰瘍性大腸炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、およびホイップル病が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５６】
抗ＣＤ３抗体アゴニストまたはアンタゴニストの使用による効果を受けうる障害に苛まれているヒト患者に対して、種々の手段で投与した際に効果的な強さとなるように、抗ＣＤ３抗体を含む薬学的組成物を製剤することができる。抗ＣＤ３抗体アゴニストまたはアンタゴニストによる効果としては、抗増殖、抗炎症、抗ウイルスなどが挙げられる（ただし、これらに限定されない）。この効果は、状態または疾患そのものに対するものでもよいし、状態または疾患の一部に対するものでもよい。抗ＣＤ３抗体の平均量は変化しうる。とりわけ、適格な医師の推奨および処方に基づいて変化させるべきである。抗ＣＤ３抗体の正確な量は、処置する状態の正確な種類、処置される患者の状態、および組成物中の他の成分などの前提要因を満たすならば、選好の問題である。本発明はまた、治療上有効量の他の有効成分（抗癌用化学治療薬または免疫療法剤などが挙げられるがこれらに限定されない）の投与も提供する。当業者ならば、抗ＣＤ３抗体を用いる治療に基づいて、投与量を容易に決定することができる。
【０２５７】
〔実施例〕
以下の実施例は説明のために供されているのであって、特許請求の範囲に係る発明を制限するものではない。
【０２５８】
〔実施例１〕
抗ＣＤ３抗体中に天然にコードされていないアミノ酸を組み込むにあたって、好適な部位を選択するための基準群について説明する。本実施例で示されるのは、天然にコードされていないアミノ酸を導入するために、抗原結合性ポリペプチドＣＤ３中の好適な部位を選択する方法である。二つの抗ＣＤ３抗体分子から構成される三次元構造、または、抗ＣＤ３抗体の二次構造、三次構造もしくは四次構造を利用して、好適な部位を選択する。
【０２５９】
以下の基準は、天然にコードされていないアミノ酸を導入するにあたって、抗ＣＤ３抗体の各々の位置を評価するために用いられる。すなわち、残基は、（ａ）抗ＣＤ３抗体の結合を三次元構造の構造解析に基づいて妨げてはならず、また、抗ＣＤ３抗体の二次構造、三次構造または四次構造に基づいて妨げてもならない；（ｂ）アラニンまたはホモログを用いたスキャニング突然変異誘発による影響を受けてはならない；（ｃ）表面に露出していなくてはならず、周囲の残基との間におけるファンデルワールス相互作用または水素結合相互作用は最小限にとどめねばならない；（ｄ）抗ＣＤ３抗体の露出表面の一箇所以上であってもよい；（ｅ）第二の抗ＣＤ３抗体、または他の分子もしくはその断片の近位に位置する、一つまたは複数の抗ＣＤ３抗体の部位であってもよい；（ｆ）抗ＣＤ３抗体変異体においては、欠失しているか、可変であるか、のいずれかでなければならない；（ｇ）天然にコードされていないアミノ酸と置換した結果、保存的に変化しうる；（ｈ）完全な構造の柔軟性または剛直性を望ましく変化させることによって、抗ＣＤ３抗体自体、または一つ以上の抗ＣＤ３抗体を含む二量体もしくは多量体の立体配置を調節してもよい；（ｉ）柔軟性の高い領域(highly flexible regions)または構造上固定された領域(structurally rigid regions)のいずれにあってもよい；（ｊ）相補性決定領域（ＣＤＲ）にあってもよいし、なくてもよい。また、抗ＣＤ３抗体分子にＣｘプログラムでさらなる計算を実行し（Pintar et al. Bioinformatics, 18, pp 980）、タンパク質中の各原子について、突出の程度を評価する。その結果、いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体の一つ以上の部位が、天然にコードされていないアミノ酸で置換されている。
【０２６０】
〔実施例２〕
天然にコードされていないアミノ酸を有する抗ＣＤ３抗体の、大腸菌を用いた発現について詳述する。直交なｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および直交なアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ）を備えている導入翻訳系を用いて、天然にコードされていないアミノ酸を有する抗ＣＤ３抗体を発現させた。上記Ｏ−ＲＳは、天然にコードされていないアミノ酸とＯ−ｔＲＮＡとを、優先的にアミノアシル化する。その次に、上記翻訳系によって、コードされている選択コドンに対応して、天然にコードされていないアミノ酸が抗ＣＤ３抗体に挿入される。
【０２６１】
改変抗ＣＤ３抗体遺伝子と、直交なアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対（所望の天然にコードされていないアミノ酸に対して特異的である）とを含むプラスミドを用いて大腸菌を形質転換することによって、抗ＣＤ３抗体に、部位特異的に天然にコードされていないアミノ酸を組み込むことができる。形質転換させた大腸菌を、３７℃にて、特定の天然にコードされていないアミノ酸を０．０１〜１００ｍＭ含む培地で培養することにより、高い正確性および効率で改変抗ＣＤ３抗体を発現させる。天然にコードされていないアミノ酸を有する抗ＣＤ３抗体を、大腸菌宿主細胞に産生させる。産生物は、ペリプラスム中の可溶タンパク質として得られる。抗ＣＤ３抗体の精製方法は周知であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタン・ブロット分析、またはエレクトロスプレーイオン化−イオントラップ質量分析などにより確認することができる。
【０２６２】
［発現／抑制］天然にコードされていないアミノ酸（パラアセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ））による抑制：公知の標準的なプロトコルに則って、大腸菌のアンバー変異を抑制する。要約すると、大腸菌のペリプラズムにおいて抗体断片（Ｆａｂ）を抑制するために、次の操作を施した。まず、直交なｔＲＮＡ合成酵素（例えば、M. jannaschii由来の直交なチロシルｔＲＮＡ合成酵素（MjTyrRS））をコードしているプラスミドにより、発現ベクター構築体を大腸菌宿主細胞に形質転換させた。一晩後、ＬＢ（Luria-Bertani）培地またはSuperbrothを入れたフラスコ内で、振盪しながら細菌培地を１：１００に希釈した。そして、３７℃にて、ＯＤが０．８程度となるまで培養した。パラアセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）を最終濃度４ｍＭとなるように加えて、アンバーコドンを抑制しつつ、Ｆａｂの発現を誘導した。培地を２５℃にて一晩培養した。
【０２６３】
天然にコードされていないアミノ酸誘導体による抑制：このアミノ酸に特異的である直交な合成酵素（例えば、M. jannaschii由来のチロシルｔＲＮＡ合成酵素（MjTyrRS））を用いる以外は、上述したものと同様の方法によって、アンバー変異を天然にコードされていないアミノ酸の誘導体（例えば、ｐＡＦ（ａａ９．２））によって抑制する。例えば、誘導の際に、ａａ９．２を４ｍＭ加えることによって抑制する。
【０２６４】
遠心分離により細胞を回収し、１００μｇ／ｍｌのリゾチームを添加したペリプラズム放出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、２０％  スクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ；ｐＨ８．０）中で再懸濁する。その後、氷上で３０分間培養する。遠心分離の後、上清中の抗体断片を、当該抗体断片のＨｉｓタグを利用してProBindビーズ（Invitrogen; Carlsbad, CA）上に固定する。ビーズを結合緩衝液でよく洗った後、結合している断片を０．５Ｍのイミダゾールでビーズから溶離させる。精製した断片は、保存緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  グリセロール、５％  スクロース；ｐＨ７．８）中で透析した。ペリプラズム中で発現しているＦａｂ断片の小規模な分析のために、１５ｍｌの培地中にいる大腸菌を遠心分離により回収した。その後、１０μｇ／ｍｌのＤＮアーゼを添加した１ｍｌの溶解緩衝液（B-PER, Pierce Biotechnology; Rockford, IL）中で再懸濁した。混合物を３７℃にて３０分間培養し、Protein Loading緩衝液（Invitrogen; Carlsbad, CA）で１×に希釈して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０２６５】
〔実施例３〕
ｐＦＵＳＥベクター中のヒト化抗ＣＤ３遺伝子の設計および構築−マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体ＳＰ３４（ハーバードＢＩＤＭＣ）をヒト化した。インシリコ解析および設計に基づいて、選択したヒトフレームワーク骨格へのマウスＣＤＲ配列に加えて様々なマウスフレームワーク復帰突然変異を含む、三つの可変重鎖（ｖＨ１．０、ｖＨ１．１  ＆  ｖＨ１．２）および三つの可変軽鎖遺伝子（ｖＬ１．０、ｖＬ１．１  ＆  ｖＬ１．２）（Genewiz, South Plainfield, NJ）の合成を行った。表２はマウスフレームワーク残基（復帰突然変異）をＫａｂａｔナンバリングと共に列挙しており、それは図１に記載された九つのヒト化抗ＣＤ３Ｆａｂの三つの可変重鎖（ｖＨ）および三つの可変軽鎖（ｖＬ）に保持されていた。ヒトフレームワーク配列に復帰したアミノ酸残基を太字で示す。
【０２６６】
【表２】
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【０２６７】
表２に示すように、可変軽鎖には五つのマウス復帰突然変異（Ｖ３６、Ｇ４６、Ｇ４９、Ｇ５７およびＶ５８）が存在し、可変重鎖には四つのマウス復帰突然変異（Ｎ３０、Ａ４９、Ｉ７７およびＶ９３）が存在した。表２に示す六つの短い合成可変遺伝子をインビボゲンの重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）発現ベクター（それぞれ、ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ＨＧ１およびｐＦＵＳＥ−ＣＬｉｇ−ｈｋ）にクローン化し、ヒト化抗ＣＤ３  ＳＰ３４抗体を発現するプラスミドを得た。図１および表２に示すように、ヒト残基に変換された五つ全てのマウス復帰突然変異を有する可変軽鎖ｖＬ１．０は、任意の可変重鎖（ｖＨ）の組み合わせとの結合を失った。
【０２６８】
〔実施例４〕
ＨＥＫ２９３一過性システムにおけるヒト化抗ＣＤ３抗体の発現: 上記の実施例に記載したヒト化ＳＰ３４抗体を、各々のｖＨ遺伝子を含むプラスミドとプラスミドを各々のｖＬ遺伝子を含むプラスミドを組み合わせることにより（共トランスフェクション）、ＨＥＫ２９３細胞中に一過的に発現させた。各々の共トランスフェクション実験から細胞培地中のタンパク質濃度を測定し、さらに精製することなくＰＢＭＣベースのＣＤ３結合アッセイに直接使用した。使用した対照は、キメラＳＰ３４構築物（ポジティブコントロール）、無関係のＰＳＭＡ抗体構築物（ネガティブコントロール）であった。非天然アミノ酸の取り込みなし、およびＨＣ−ＤＫＴＨＴ延伸ありまたはなしのヒト化抗ＣＤ３抗体をまた、ＨＥＫ２９３細胞に発現させ、特徴付けた（表３）。これらの抗体を、低親和性Ｆａｂ変異体についてのスクリーニングに使用した。表３は、本明細書に記載されているＦａｂ  ＷＴ配列を生成するために様々な組み合わせで使用される、ヒト化抗ＣＤ３重鎖（ｖＨ＋ＣＨ１）および軽鎖（ｖＬ＋ＣＬ）配列の新規の野生型（ＷＴ）アミノ酸配列を示す。ヒト化抗ＣＤ３重鎖（ｖＨ＋ＣＨ１−ＤＫＴＨＴ）配列のＷＴアミノ酸配列も表３に示す。
【０２６９】
【表３】
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【０２７０】
〔実施例５〕
活性化ヒトおよびシノＰＢＭＣとのＣＤ３結合についての試験：生成されたヒト化抗ＣＤ３抗体を区別するために、ヒトＣＤ３への結合を、活性化ヒトＰＢＭＣを用いて試験した（ｎ＝２）。ＰＢＭＣの活性化、およびその後の蛍光ベースのＣＤ３結合アッセイは以前に記載された通り行った（例えば、Angew Chem Int Ed Engl, 52(46):12101-12104, 2013を参照のこと）。図１に示されるように、ｖＬ１．０軽鎖を有する三つの抗体は、任意のｖＨ重鎖との組み合わせでヒトＣＤ３への結合を失った。残りの六つのヒト化抗体のヒトおよびシノＣＤ３の両方への結合は、活性化されたヒトおよびシノＰＢＭＣをそれぞれ使用して滴定された。図２Ａ〜２Ｆに示されるように、六つ全てのヒト化抗ＣＤ３抗体（表３）に示される２  ｖＬの軽鎖の組み合わせを用いて３  ｖＨ重鎖から操作された）は、ヒトおよびシノＣＤ３の両方に対して同等の結合を保持した。六つのヒト化抗ＣＤ３抗体は下記に示すようにして得られた：Ｆａｂ１、Ｆａｂ２およびＦａｂ３野生型は、それぞれ、ＬＣ（（ｖＬ１．２＋ＣＬ）；（配列番号７））およびＨＣ（（ｖＨ１．２＋ＣＨ１）；（配列番号１））、（（ｖＨ１．１＋ＣＨ１）；（配列番号２））および（（ｖＨ１．０＋ＣＨ１）；（配列番号３））の組み合わせによって生成された。Ｆａｂ４、Ｆａｂ  ５およびＦａｂ６野生型は、それぞれＬＣ（（ｖＬ１．１＋ＣＬ）；（配列番号８））およびＨＣ（（（ｖＨ１．２＋ＣＨ１）；（配列番号１））、（（ｖＨ１．１＋ＣＨ１）；（配列番号２））および（（ｖＨ１．０＋ＣＨ１）；（配列番号３））の組み合わせによって生成された。
【０２７１】
両方のＣＤ３基質への結合に関して、六つのヒト化抗体間に有意差を示さなかったので、本発明の重要な側面をさらに実証するために、Ｆａｂ１（ｖＨ１．２＋ｖＬ１．２の組み合わせ）を選択した。例えばＦａｂ１を、以前に記載された直交アンバーサプレッションシステム（例えば、WO2017/079272, WO2012/166560およびWO2013/192360を参照のこと）による独自の非天然アミノ酸（ＵＡＡ）組み込み技術を使用したさらなる最適化のために、大腸菌での発現のために使用した。これら六つのＦａｂにおける結合活性の保持に必要であったマウスのフレームワーク復帰突然変異のリストは、図２Ａ〜２Ｆに記載された六つのヒト化抗ＣＤ３Ｆａｂに保持されたマウスフレームワーク残基（復帰突然変異）のリストをＫａｂａｔナンバリングとともに提供する表４に示される。ヒトフレームワーク配列に復帰したアミノ酸残基を太字で示す。Ｆａｂ１（下線）をもたらすｖＬ１．２およびｖＨ１．２可変鎖の組み合わせを、さらなる修飾のためのリードとして選択した。
【０２７２】
【表４】
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【０２７３】
〔実施例６〕
合成Ｆａｂ遺伝子の大腸菌発現ベクターへのクローニング：合成Ｆａｂ遺伝子を、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙクローニングキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、独自の標準大腸菌発現ベクターにクローニングした。各発現プラスミドの配列検証後、各プラスミドを標準大腸菌産生宿主Ｗ３１１０Ｂ６０株に形質転換し、各プラスミドについて単離された単一コロニーを精製してグリセロールバイアルを作製した。グリセロールバイアルは、これらのＦａｂ分子の大腸菌発酵のための産生クローンとして役立った。これらのＦａｂを操作する際に使用される４重鎖および３軽鎖のアミノ酸配列を、表５に配列番号１０〜２０として示す。
【０２７４】
【表５】
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【０２７５】
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【０２７６】
三つの軽鎖（ＬＬ１５７ｐＡＦ、ＬＫ１７２ｐＡＦ、およびＬＳ２０５ｐＡＦ）ｐＡＦ変異体（配列番号１８〜２０）、ならびに三つの二重ｐＡＦ変異体（（（ＨＫ１２９ｐＡＦ＋ＬＬ１５７ｐＡＦ）；（配列番号１６および１８））；（ＨＫ１２９ｐＡＦ＋ＬＫ１７２ｐＡＦ）；（配列番号１６および１９））、および（（ＨＫ１２９ｐＡＦ＋ＬＳ２０５ｐＡＦ）（配列番号１６および２０））を設計した。配列番号１０〜１３は、５−ａａ重鎖Ｃ末端延伸−ＤＫＴＨＴを含まない重鎖ｐＡＦ変異体を表す。
【０２７７】
大腸菌発酵：抗ＣＤ３Ｆａｂ−ｐＡＦの生産のための発酵処理は、二つの段階：（ｉ）接種物調製および（ｉｉ）発酵槽生産から構成される。接種材料を単一のグリセロールバイアルから開始し、解凍し、２５０ｍＬバッフル付き三角フラスコ中の５０ｍＬの規定種培地中に１：１０００（ｖ／ｖ）に希釈し、３７℃および２５０ｒｐｍでインキュベートする。使用前に、発酵槽を洗浄し、オートクレーブ処理する。特定量の基礎培地を発酵槽に添加し、蒸気滅菌する。特定量の硫酸カナマイシン溶液、フィード培地およびＰ２０００消泡剤を、接種前に基礎培地に添加する。オートクレーブ処理後に発酵槽に添加された全ての溶液は、０．２μｍ濾過されるか、または無菌添加の前にオートクレーブ処理される。
【０２７８】
産生発酵槽は、接種材料の内容物を無菌的に移すことによって、０．０００４の標的ＯＤ６００で接種される。接種後、培地は適当なインターバルでサンプリングされ、ＯＤ６００が決定される。温度、ｐＨおよび溶存酸素をモニターし、それぞれ３７℃、７．０および≧３０％の特定の設定点で制御される。ｐＨは、水酸化アンモニウム溶液または硫酸の添加によって制御される。溶解した酸素は、撹拌速度を変化させることによって、およびスパージされた空気／酸素混合物中の酸素の組成を増加させることによって制御される。発酵工程中に消泡剤を添加し、発泡を制御する。
【０２７９】
細胞密度が＞２５のＯＤ６００に達すると、フィード培地のボーラスが添加される。細胞密度が＞５０のＯＤ６００に達すると、フィード培地を０．０９４ｍＬ／Ｌ開始容量／分間の一定流速で、３２時間、それが０．０５２ｍＬ／Ｌ開始容量／分間に減少し発酵が終わるまで添加する。供給開始直後に、特定量の天然にコードされていないアミノ酸（例えば、ｐＡＦ）溶液を無菌的に添加して、非天然アミノ酸をタンパク質アミノ酸配列に取り込ませる。同時に、温度は成長の間に使用される３７℃から、生産のために２７℃にシフトされる。産生は、ｐｈｏＡプロモーターによって制御され、培地中のリン酸レベルが枯渇すると開始される。回収は、誘導の約４８時間後に開始される。
【０２８０】
〔実施例７〕
精製、および葉酸およびＰＥＧ−葉酸への複合体化：本発明の抗ＣＤ３Ｆａｂは大腸菌細胞中で産生され、全細胞溶解物（ＷＣＬ）上清から回収される。細胞溶解は４℃で行われる。細胞を１００ｍＭ酢酸、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ３．５において最初の発酵体積に等しい体積で溶解し、ｐＨ４．１〜４．２の溶解後産物を得る。
【０２８１】
溶解後、ＷＣＬを１５，９００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離し、濾過して（０．８／０．２ミクロン）、沈殿したタンパク質および細胞残屑を除去する。次いで、カプトＳ陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して、大腸菌ＷＣＬ上清から抗ＣＤ３Ｆａｂを捕捉する。Ｃａｐｔｏ  Ｓ塔カラムに続いて、ブチルＨＰ疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を研磨塔カラムとして使用して、Ｃａｐｔｏ  Ｓ溶出プールに存在する生成物関連不純物から完全な抗ＣＤ３Ｆａｂを単離する。次いで、完全な抗ＣＤ３Ｆａｂを含むブチルＨＰ溶出プールを、５０ｍＭ酢酸塩、５％トレハロース、ｐＨ  ４．０に緩衝液交換し、濃縮して、葉酸またはＰＥＧ−葉酸との複合体化のために調製する。この工程を４℃で行い、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  １０Ｋ再生セルロース（１５ｍＬ）遠心装置を利用する。
【０２８２】
緩衝液交換および５０ｍＭ酢酸、５％トレハロース、ｐＨ  ４への濃縮後、抗ＣＤ３Ｆａｂを葉酸またはＰＥＧ−葉酸と複合体化させて、癌細胞上の葉酸受容体を標的とする。複合体化反応は、２８℃、ｐＨ  ４で２４〜４８時間行う。葉酸との複合体化後、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸を、調製緩衝液、（５０ｍＭヒスチジン、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５％トレハロース、ｐＨ  ６．０）に緩衝液交換する。この工程を４℃で行い、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  １０Ｋ再生セルロース（１５ｍＬ）遠心装置を利用する。ＰＥＧ−葉酸との複合体化後、Ｔｏｙｏ  ＳＰ  ５ＰＷ陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、非複合、単一および二重複合抗ＣＤ３Ｆａｂ−ＰＥＧ−葉酸を分離する。
【０２８３】
ＣＤ３  Ｆａｂ  葉酸−５ＫＰＥＧ、ＣＤ３  Ｆａｂ  葉酸−１０ＫＰＥＧ、ＣＤ３  Ｆａｂ  葉酸−２０ＫＰＥＧ、ＣＤ３  Ｆａｂ  葉酸−（５Ｋ）２ＰＥＧ、ＣＤ３  Ｆａｂ  葉酸−（１０Ｋ）２ＰＥＧ化合物を作製した。緩衝液（５０ｍＭ酢酸、５％トレハロース、ｐＨ  ４）中のＣＤ３  Ｆａｂに、所望の葉酸−ＰＥＧ（５Ｋ、１０Ｋ、２０Ｋ、５Ｋ２、または１０Ｋ２ＰＥＧ）を２８℃で添加した。１時間後、混合物を陽イオン交換クロマトグラフィー（Ｔｏｙｏ  ＳＰ  ５ＰＷ）によって精製し、遠心フィルター（ｃ／ｏ  １０Ｋ）を使用することによって５０ｍＭヒスチジン、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％トレハロース、ｐＨ  ６．０の緩衝液で調整し、所望のＣＤ３  Ｆａｂ−葉酸−ＰＥＧ化組成物を得た。ＣＤ３  Ｆａｂ葉酸複合体の構造、化学、および複合体化は、本明細書に記載され、図１２Ａ〜１２Ｄに示される。
【０２８４】
さらに、ＣＤ３  Ｆａｂ葉酸−ＰＥＧ化Ｃ末端複合体を作製した。ＰＢＳ  （２．０ｍＬ）中のＣＤ３葉酸（８．０ｍｇ）に、ＥＤＴＡ（６．７  ｕＬ、０．５Ｍ、ｐＨ８）およびＤＴＴ（０．４ｍｇ）を添加し、溶液を３７℃で３０分間インキュベートした。混合物を、ＰＢＳ溶離剤中の５ｍｍｏｌのＥＤＴＡで、脱塩カラムによって精製した。混合物に、Ｍａｌ−ＰＥＧを様々な濃度で（４．２ｍｇの５Ｋ、８．２ｍｇの１０Ｋ、または１６ｍｇの２０Ｋ）、室温で添加した。２時間後、混合物をＴｏｙｏ  ＳＰ  ５ＰＷ陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、  ＣＤ３  Ｆａｂ  葉酸−（ＰＥＧ５Ｋ）２Ｃ末端複合体、ＣＤ３  Ｆａｂ  葉酸−（ＰＥＧ１０Ｋ）２Ｃ末端複合体、およびＣＤ３  Ｆａｂ  葉酸−（ＰＥＧ２０Ｋ）２Ｃ末端複合体を得た。Ｃ末端ＰＥＧ複合体の構造、化学および複合体化は、本明細書中に記載され、図１２Ｅ〜１２Ｆに示される。
【０２８５】
〔実施例８〕
インビトロ結合および殺傷アッセイ：種々の重鎖部位（ＨＡ１１４、ＨＳ１１５、ＨＫ１２９、ＨＴ１６０）で複合した葉酸を有する精製されたヒト化抗ＣＤ３Ｆａｂを、最初に、これらの位置にｐＡＦを有する対応する非結合タンパク質、ならびに対照としてのＷＴタンパク質と共に、ヒトおよびシノＣＤ３の両方への結合について試験した。表６は、大腸菌細胞から精製された修飾抗ＣＤ３  Ｆａｂ１タンパク質の、活性化ヒトおよびシノＰＢＭＣへのＥＣ５０を示す。表６に示すように、異なった部位のｐＡＦも複合体化葉酸もＣＤ３結合を有意に妨害しなかった。
【０２８６】
【表６】
2021535140.tif 000029
【０２８７】
これらの葉酸複合体抗ＣＤ３Ｆａｂの細胞毒性を、Ｅ：Ｔ＝１０：１で、ＳＫＯＶ−３細胞を有する活性化ヒトおよびシノＰＢＭＣを用いて、５０  ｎＭ血清葉酸（ＳＦＡ）の有無の下、試験した。細胞毒性アッセイは以前に記載された通り行った（例えば、Angew Chem Int Ed Engl, 52(46):12101-12104, 2013を参照のこと）。簡潔には、種々のＥ：Ｔ比のエフェクター細胞（活性化ＰＢＭＣまたは非活性化ＰＢＭＣのいずれか）および標的細胞（ＳＫＯＶ−３、ＫＢなど）を、Ｕ底９６ウェルプレート中で、種々の濃度の抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸と共に、一晩または示される通り、共インキュベートした。培地中に放出されたＬＤＨの量を細胞毒性の指標として使用し、プロメガ社の非放射性細胞毒性アッセイキットを製造業者の指示にしたがって用いて測定した。
【０２８８】
表７に示すように、ＥＣ５０の殺傷に関して複合体化部位間で有意な差はなかった。しかしながら、５０  ｎＭのＳＦＡが存在する場合に、遊離ＳＦＡによる競合的抑制のために、ＳＦＡが存在しない場合と比較して、細胞毒性ＥＣ５０の約１５〜６０倍の低下が観察された。また、シノＥＣ５０はヒトＥＣ５０よりも各変異体で約１０倍高かった。
【０２８９】
【表７】
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【０２９０】
〔実施例９〕
抗ＣＤ３−葉酸変異体の、種々の葉酸受容体（ＦＲα）レベルを有する種々のＦＯＬＲα腫瘍細胞株に対する細胞毒性：三つの異なる抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸複合の活性を、細胞表面上に種々のレベルのＦＲα過剰発現を有する六つの異なる細胞株を用いたインビトロ細胞毒性アッセイによって、ＨＡ１１４、ＨＳ１１５およびＨＫ１２９部位で試験した（表８）。ＦＲα数は、肺胞基底上皮細胞癌Ａ  ５４９細胞株における１細胞当たり５，７００から、上咽頭癌細胞株における１細胞当たり１，６３０，０００まで変動した。細胞を、活性化ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ；標的：エフェクター細胞の比率１：１０）と共培養し、５０ｎｍのＳＦＡの存在下で種々の濃度の抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸で処置した。細胞毒性は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏおよびＦＡＣＳに基づく毒性アッセイを用いて、溶解した細胞から放出されたＬＤＨレベルを測定することによって定量した。
【０２９１】
【表８】
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【０２９２】
複合体化の三つの異なる部位すべてにおける抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸複合体は１０Ｋを超えるＦＲαを有する五つの細胞株すべての効率的な殺傷を示した。しかしながら、５，７００のＦＲαを有する任意の部位複合を有するＡ５４９細胞株では、いずれの部位複合体を用いても殺傷は観察されなかった。効率的な殺傷のためには約１０，０００ＦＲαの閾値があるようだが、殺傷活性は閾値１０Ｋを超えるＦＲα数とは無関係であるようである。インビトロ殺傷ＥＣ５０は抗体中の葉酸複合体部位で有意に変化しなかったので、ＨＫ１２９位置をさらなる実験のための葉酸複合体部位として選択した。
【０２９３】
〔実施例１０〕
本実施例は、単一部位での葉酸−ＰＥＧ複合体または第二の葉酸（二葉酸）の付加のいずれかに対する、種々の抗ＣＤ３  Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ｐＡＦ分子のインビトロ結合親和性および細胞傷害活性に対する効果を実証する。
【０２９４】
葉酸−ＰＥＧ複合体の効果：表９は結合に対する効果を示し、表１０は本明細書中に記載されるような二官能性リンカーを使用して、５Ｋまたは２０Ｋのいずれかの線状ＰＥＧ分子と葉酸との複合体に対する細胞傷害性を示す。結合のわずかな減少（１．７〜８．４倍）が、活性化ヒトおよびシノＰＢＭＣの両方について、５Ｋまたは２０Ｋ  ＰＥＧサイズに依存して観察された。しかし、細胞傷害活性は、ヒトおよびシノＰＢＭＣの両方について、５Ｋ  ＰＥＧと比較して、２０Ｋ  ＰＥＧで劇的に減少した（３．７〜５．６倍対５０〜５８倍）。この実験に基づいて、２０Ｋ  ＰＥＧの代わりに５Ｋ  ＰＥＧを半減期延長のために使用した。
【０２９５】
【表９】
2021535140.tif 000032
【０２９６】
【表１０】
2021535140.tif 000033
【０２９７】
二重葉酸（二葉酸）複合体の効果：表１１は重鎖ＨＫ１２９部位と組み合わせた二つの軽鎖部位（ＬＬ１５７およびＬＫ１７２）における第二の葉酸複合体化のインビトロ結合に対する効果を示し、表１２は細胞毒性を示す。予期した通り、結合親和性および細胞傷害性活性の両方においてわずかな増大が、ＨＫ１２９単一葉酸分子を超えて、二葉酸変異体で観察された。二重対一重葉酸分子の細胞毒性におけるわずかな増大はまた、５０  ｎＭのＳＦＡの存在または非存在下で明らかであった。この実験に基づいて、ＬＫ１７２部位を超えて、ＬＬ１５７部位を、将来の研究のためにＨＫ１２９部位と組み合わせて使用した。
【０２９８】
【表１１】
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【０２９９】
【表１２】
2021535140.tif 000035
【０３００】
結合親和性およびインビトロ細胞毒性の要約：表１３は、ＰＥＧ化および第二の葉酸複合体化による種々の抗ＣＤ３Ｆａｂの結合および細胞毒性活性に対する効果を要約する。ＣＤ３およびＦＲαの両方に対する結合親和性のわずかな減少は有効性の有意な減少をもたらし、ＰＥＧの大きさと相関する。二葉酸分子の複合体は、ＣＤ３結合親和性のいくらかの減少にもかかわらず、ＦＲαに対する親和性を増加させ、それによって細胞毒性の有効性を増加させた。ＰＥＧの複合体化による両標的に対する親和性の低下にもかかわらず、全てのＣＤ３−Ｆａｂ−葉酸分子のインビトロ殺傷ＥＣ５０は、３７〜３３５ｐＭの高い有効性を維持した。
【０３０１】
【表１３】
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【０３０２】
〔実施例１１〕
抗ＣＤ３  Ｆａｂ１分子によるＳＫＯＶ−３細胞の細胞毒性に関する種々のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比の効果：ＳＫＯＶ−３細胞の細胞毒性に対するＥ：Ｔ比の効果を試験するために、三つの抗ＣＤ３  Ｆａｂ１分子の細胞毒性アッセイを、５０  ｎＭ  ＳＦＡの存在下で１０：１、５：１、１：１、１：５および１：１０のＥ：Ｔ比で行った。予期された通り、表１４に示されるように、Ｅ：Ｔ比はインビトロ殺傷有効性と相関した。Ｅ：Ｔ＝１：１では、ＥＣ５０の２倍の増加が二葉酸分子について観察されたが、５ＫＰＥＧ−葉酸分子では８倍の減少が見られた。三つの分子はすべて、１０：１〜１：１０のＥ：Ｔ比内で１．６９〜１７５ｐＭのＥＣ５０で高度に有効なままであった。
【０３０３】
【表１４】
2021535140.tif 000037
【０３０４】
〔実施例１２〕
血漿半減期を延長するための抗ＣＤ３  Ｆａｂ１分子のＰＥＧ化：ラットにおいて、ＰＥＧ複合の有無で、抗ＣＤ３  Ｆａｂ１−葉酸複合体の薬物動態特性を調べた。オスのSprague Dawleyラット（約７週齢）を使用した。投与日に、それぞれの動物の体重を測定した。それぞれ三匹ずつのラットに、体重１ｋｇあたり１ｍｇの非複合体化抗ＣＤ３抗体または複合体化抗ＣＤ３抗体のサンプルを、尾静脈から静脈内注入した。注入後の異なる時点において、ＣＯ２により麻酔した状態で、それぞれのラットから５００μｌの血液を採取した。血液サンプルを室温で１．５時間保存した後、遠心分離によって血清を分離した（４℃、１８０００×ｇにて５分間）。血清サンプルは、分析の日まで−８０℃で保存する。サンプルを氷上で解凍した後、抗ＣＤ３抗体インビトロ活性アッセイによって、血清サンプル中の活性な抗ＣＤ３抗体の量を求めた。
【０３０５】
図３に示すように、血清中濃度は、二つの抗ＣＤ３  Ｆａｂ１−葉酸および対応する非複合抗ＣＤ３  Ｆａｂ１について、１時間未満の血清半減期の同じ速度で急速に減少した。対照的に、二つのＰＥＧ複合抗ＣＤ３  Ｆａｂ１の血清半減期は、５ＫＰＥＧおよび二５ＫＰＥＧについてそれぞれ６．１時間および１０．６時間に有意に延長された。表１５は、ラットにおける種々の抗ＣＤ３  Ｆａｂ１分子のＩＶ投与後の種々のＰＫパラメータを示す。このデータは二５ＫＰＥＧ−二葉酸がＴ１／２を延長し、ＡＵＣを有意に増加させることを示す（Ｆａｂ１−葉酸の１３．２倍およびＦａｂ１−５ＫＰＥＧ−葉酸の３．９倍）（表１５）。
【０３０６】
【表１５】
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【０３０７】
〔実施例１３〕
本実施例は、ＨＥＫ２９３細胞での抗ＣＤ３低親和性抗体変異体の作製およびスクリーニングを実証する。
【０３０８】
マウス復帰および生殖系列細胞突然変異：抗ＣＤ３抗体のヒト化中に得られたｖＨおよびｖＬ配列の両方に対するマウスフレームワーク残基（復帰突然変異）を、それらを一度にヒト生殖系列残基に復帰させ、抗原結合（デコンボリューション）におけるそれらの効果を見ることによって調べた。ｖＨ配列については、カバット位置３０、４９、７７および９３の四つのマウスフレームワーク残基（復帰突然変異）が、抗原結合において重要な役割を果たすと予測された（表２〜３および１６〜１７）。同様に、ｖＬ配列について、位置３６、４６、４９、５７および５８における五つのマウスフレームワーク残基（復帰突然変異）もまた、抗原結合において重要な役割を果たすことが予測された。
【０３０９】
【表１６】
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【０３１０】
【表１７】
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【０３１１】
抗原結合（デコンボリューション）に対する効果を評価するために、四つの新しいｖＬ（ｖＬ２．１〜ｖＬ２．４）および三つの新しいｖＨ（ｖＨ２．１〜ｖＨ２．３）プラスミド（表１６〜１７のラウンド１プラスミド）を作製した。これらのｖＨおよびｖＬプラスミドを、上記の実施例（表１６〜１７のラウンド０プラスミド）に記載の元のｖＨおよびｖＬプラスミドと共に、ＨＥＫ２９３細胞を用いた共トランスフェクション試験において使用した。合計３５回の一過性トランスフェクションをラウンド１スクリーニングで実施し、細胞培地上清を直接使用して、以下および上記の実施例に記載されるように結合についてスクリーニングした。
【０３１２】
ラウンド１のスクリーニング結果に基づき、さらに三つのｖＨプラスミド（ｖＨ２．４〜２．６）（表１６〜１７のラウンド２プラスミド）を作製し、個々の復帰突然変異の相加効果を評価した。同様の方法で、ｖＬ（ｖＬ２．５）の新しいプラスミドを、二つのマウス復帰突然変異を組み合わせることによって作製した。さらに、ｖＨおよびｖＬ  ＣＤＲ内に見られたマウス生殖系列細胞突然変異を、このラウンドにおいて減少した結合を付与するために解析した。この目的のために、三つの新しいｖＨプラスミド（ｖＨ３．１〜３．３）（表１６〜１７のラウンド２プラスミド）を、ＨＣ−ＣＤＲ１のＫａｂａｔ位置Ｎ３５およびＨＣ−ＣＤＲ２のＹ５２ｃでアミノ酸を変化させることによって生成した。同様の方法で、ｖＬプラスミド（ｖＬ３．１）（表１６〜１７のラウンド２プラスミド）を、ＬＣ−ＣＤＲ２のＫａｂａｔ位置Ｋ５３のアミノ酸を変化させることによって作製した。ラウンド２スクリーニング実験を、種々のｖＬ／ｖＨプラスミドペアを選択的に組み合わせることによって、合計４３のトランスフェクションで行った。
【０３１３】
ヒトおよびシノＣＤ３結合についてのスクリーニング：スクリーニング段階におけるヒトＣＤ３への結合について試験するために、ＨＥＫ２９３培地上清を直接使用した。ラウンド１実験では、最初に３５個のクローンを、三つの異なるタンパク質濃度でヒトＣＤ３への結合について試験し、ヒトおよびシノＣＤ３の両方に対する詳細な結合アッセイのために１３個を選択した。それぞれのクローンについて、ヒト（図４Ａ）およびシノＣＤ３（図４Ｂ）の両方に１１点の結合滴定曲線を生成した。当該データに基づいて、Ｆａｂ７〜１０を、さらなる評価のための低親和性候補として選択した（図４Ａ〜４Ｂ）。同様に、４３個のクローンをラウンド２実験でスクリーニングした。ラウンド１について上記したような二段階スクリーニングの後、１１個の低親和性変異体が得られ、そのうちの四個を図５Ａ〜５Ｂに示す。
【０３１４】
次いで、これらの１５の低親和性抗ＣＤ３Ｆａｂ変異体（ラウンド１からのＦａｂ７〜１０およびラウンド２からのＦａｂ１１〜２１）を、非天然アミノ酸（ＵＡＡ）取り込みのために、大腸菌発現系に移し、以下の実施例に記載されるように、さらなる試験を行った。図６Ａは、図４Ａに示すのと同じ野生型ＦａｂのＦａｂ−葉酸複合体を示す。ラウンド２スクリーニングから得られた野生型Ｆａｂを代表するＦａｂ−葉酸複合体を図６Ｂに示す。表１８は、低親和性突然変異ならびにそれらのＨＣ、ＬＣおよびＦａｂ  ＩＤのリストを示す。示されるように、マウスフレームワーク復帰突然変異および生殖系列細胞ＣＤＲ突然変異の両方は、ヒトおよびシノＣＤ３の両方への結合の低下を付与する際に重要な役割を果たした。可変軽鎖（ｖＬ）では、ＬＣ−ＣＤＲ２のＫａｂａｔ位置Ｖ３６、Ｇ４６、Ｇ４９、Ｇ５７およびＶ５８の５つのマウス復帰残基およびＫａｂａｔ位置Ｋ５３の１つのマウス生殖系列細胞残基が結合の減少に関与していた。可変重鎖（ｖＨ）では、ＨＣ−ＣＤＲ１のＫａｂａｔ位置Ｎ３０、Ａ４９、Ｉ７７およびＶ９３の４つのマウス復帰残基、ならびにＨＣ−ＣＤＲ１のＫａｂａｔ位置Ｎ３５およびＨＣ−ＣＤＲ２のＹ５２ｃの２つのマウス生殖系列細胞残基が結合の減少に関与していた。
【０３１５】
【表１８】
2021535140.tif 000041
【０３１６】
【表１９】
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【０３１７】
2021535140.tif 000043
【０３１８】
配列番号２１〜２９は、低親和性変異体Ｆａｂのスクリーニングに使用される５−ａａ  Ｃ末端延伸−ＤＫＴＨＴを有する重鎖のアミノ酸配列を表す。配列番号３０および３８は、５−ａａ重鎖Ｃ末端延伸を有さないこれらのヒト化重鎖アミノ酸配列を表す。配列番号３９は、ＨＥＫ２９３細胞での低親和性変異体Ｆａｂのスクリーニングに使用される軽鎖のアミノ酸配列を表す。
【０３１９】
〔実施例１４〕
本実施例は、重鎖ＨＫ１２９アンバー突然変異を用いて大腸菌細胞から産生された低親和性ヒト化抗ＣＤ３Ｆａｂ変異体の構築、発現、精製および試験を実証する。
【０３２０】
大腸菌発現ベクターへのクローニング：合成遺伝子を、重鎖ＨＫ１２９位置に挿入されたアンバーＴＡＧ終止コドンを有するＳＴＩＩ−ＬＣ−スペーサー−ＳＴＩＩ−ＨＣ発現カセット構造を用いて、表２０に開示される全ての低親和性変異体（配列番号４０〜６２）について設計し、上記実施例に記載されるように、独自の大腸菌発現ベクターにクローニングした。これらのＦａｂを改変するために使用される重鎖および軽鎖の両方のアミノ酸配列は、配列番号４０〜６２として示される。配列番号４０〜４８は、試験に使用した５−ａａ重鎖Ｃ末端延伸−ＤＫＴＨＴを有するヒト化重鎖ＨＫ１２９ｐＡＦ変異体を表す。配列番号４９および５７は、５−ａａ重鎖Ｃ末端延伸−ＤＫＴＨＴを有さないこれらのヒト化重鎖ＨＫ１２９ｐＡＦ変異体を表す。配列番号５８〜６２は、大腸菌において発現され、さらに特徴付けられた配列番号４０〜４８のＨＫ１２９ｐＡＦ−ＤＫＴＨＴ変異体との組み合わせに使用される軽鎖配列を表す。
【０３２１】
【表２０】
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【０３２２】
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【０３２３】
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【０３２４】
発酵、精製および葉酸複合体化：大腸菌発酵、精製、葉酸複合体化および複合体化後精製を、上記実施例に記載の通り、行った。
【０３２５】
ヒトおよびシノＣＤ３への葉酸複合体Ｆａｂの結合：産生された大腸菌、およびヒト化抗ＣＤ３Ｆａｂの葉酸複合体低親和性変異体の結合を、上記の実施例に記載される通り、行った。図６Ａ〜６Ｂは陽性対照Ｆａｂ１と共に、抗ＣＤ３Ｆａｂ−ＨＫ１２９−葉酸の低親和性Ｆａｂ変異体の二つのサブセットについてのヒトＣＤ３に対する結合親和性を示す。試験した低親和性Ｆａｂのうち、１０個は試験した最高濃度（１０００ｎＭ）でさえ、ヒトＣＤ３に有意に結合することができなかった。残りの４個のＦａｂ（Ｆａｂ７〜１０；表１８に記載）の結合ＥＣ５０は、２．３１ｎＭである対照Ｆａｂ１と比較して、２３．４ｎＭ〜８３．６ｎＭで変化した。Ｆａｂ２１は、１０００  ｎＭ濃度でさえ、飽和しない弱い結合活性を示した。非常に類似した結合プロファイルが図７Ａ〜７Ｂに示されるように、シノＣＤ３結合について観察された。
【０３２６】
ヒトおよびシノＰＢＭＣを用いた葉酸複合体Ｆａｂの細胞毒性アッセイ：低親和性Ｆａｂの細胞毒性アッセイを、上記の実施例に記載の通り、行った。図８は、ＳＫＯＶ−３細胞を有する活性化ヒトＰＢＭＣの細胞毒性データを示す。示されるように、ヒトＣＤ３に対して１０〜３６倍率減少した結合親和性を有する４つすべてのＦａｂ（図６Ａ〜６Ｂ）は、対照Ｆａｂ１と比較して同等の殺傷活性を示した（図８）。３つのＦａｂ（Ｆａｂ１１、１９、および２０）は、いかなる細胞毒性活性も示さなかった（データは示さず）。他の８個のＦａｂはすべて、１０００ｎＭの濃度でさえ結合できなかったが、かなりの殺傷活性を示した。非常に類似した細胞毒性プロファイルが、活性化されたシノＰＢＭＣで観察された（図９）。
【０３２７】
〔実施例１５〕
本実施例は、ヒト化抗ＣＤ３低親和性抗体変異体のＴ細胞活性化およびサイトカイン放出アッセイを実証する。
【０３２８】
Ｔ細胞活性化／サイトカイン放出アッセイ：精製ヒトＴ細胞およびＴ細胞枯渇ヒトＰＢＭＣを、それぞれ、ＥａｓｙＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ細胞濃縮キットおよびＥａｓｙＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３陽性選択キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ）によって、同体積の全血から単離した。単離したＴ細胞およびアクセサリー細胞の純度をフローサイトメトリーによって確認した。アクセサリー細胞の存在下でのＴ細胞の活性化を選択的にモニターするために、精製Ｔ細胞を、Ｔ細胞枯渇ヒトＰＢＭＣと混合する前に、Ｃｅｌｌｖｕｅ  Ｌａｖｅｎｄｅｒ細胞標識キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で製造業者プロトコルにしたがって、標識した。得られた再構成ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３Ｆａｂ変異体の存在下で標的細胞と共にインキュベートした。４８時間後、細胞をＡＰＣ−Ｃｙ７複合体抗ヒトＣＤ２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）またはＰＥ複合体抗ヒトＣＤ６９（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識し、フローサイトメトリーによって解析した。培養上清中のＩＦＮγおよびＴＮＦαの放出を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）によって測定した。
【０３２９】
図１０Ａ〜１０Ｂに示すように、ＳＫＯＶ−３細胞の存在下で達成された有意なＴ細胞活性化（ＣＤ２５およびＣＤ６９Ｔ細胞マーカーによる）は、種々の低親和性抗ＣＤ３Ｆａｂ−ＨＫ１２９−葉酸分子に強く用量依存的である。同様の相関が、ＳＫＯＶ−３腫瘍細胞の非存在下および存在下でそれぞれＩＦＮγについて（図１１Ａ〜１１Ｂ）、およびＳＫＯＶ−３腫瘍細胞の非存在下および存在下でそれぞれＴＮＦαについて（図１１Ｃ〜１１Ｄ）観察された。
【０３３０】
低親和性変異体の特徴付けの要約：表２１は、結合と細胞毒性のデータ（ヒトおよびシノＣＤ３）、ならびにＴ細胞活性化（ＣＤ２５およびＣＤ６９マーカー）およびサイトカイン放出（ＩＦＮγおよびＴＮＦα）は、ＨＫ１２９−葉酸修飾を有する１２個の低親和性抗ＣＤ３Ｆａｂ変異体について解析する。図に示すように、ＣＤ３結合の強さ、細胞傷害能、Ｔ細胞活性化およびサイトカイン放出の間には一般的な相関がある。
【０３３１】
【表２１】
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【０３３２】
データセットに基づいて、３つの低親和性変異体Ｆａｂ９、Ｆａｂ１０、Ｆａｂ２１を、マウスにおけるインビボ試験を含む詳細なインビトロ特性付けのために、親分子Ｆａｂ１と共に選択した。表２２は、細胞毒性と二つのサイトカイン産生に関するこれらの変異体の比較を示す。示されるように、サイトカイン産生はＴ細胞の活性化および殺傷のためのＥＣ５０より、はるかに高いＥＣ５０を有する。したがって、その濃度ではサイトカイン放出は重大な安全問題を引き起こさないが、有効性およびＴ細胞活性化の殺傷は損なわれない、抗ＣＤ３Ｆａｂ濃度範囲を特定することが可能であり得る。この抗ＣＤ３抗体親和性微調整のアプローチはこれらの２つの対向する事象の分離を可能にし、効能を損なうことなく、より良好な安全プロファイルを達成しうる。
【０３３３】
【表２２】
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【０３３４】
〔実施例１６〕
抗ＣＤ３  Ｆａｂ１、９および１０のインシリコ免疫原性解析：潜在的な免疫原性を評価するために、抗ＣＤ３Ｆａｂ１、Ｆａｂ９およびＦａｂ１０のアミノ酸配列を、「ＨＬＡクラスＩＩ−Ｇｌｏｂａｌ  ｖ４．０」設定（Ｌｏｎｚａ、ＵＫ）を使用して、ＬｏｎｚａのＥｐｉｂａｓｅプラットフォームに基づいて、Ｔヘルパー（Ｔｈ）−細胞エピトープとしても知られる推定ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ制限エピトープの存在についてインシリコでスキャンした。標的配列に由来するすべての可能な１０量体ペプチドのＨＬＡ結合特異性を解析した。プロファイリングを、４３のＤＲＢ１、８のＤＲＢ３／４／５、２２のＤＱおよび１２のＤＰ、すなわち全体で８５個のＨＬＡクラスＩＩアロタイプについてアロタイプレベルで実施した。自己ペプチドに対応するペプチドを、「生殖系列細胞濾過」ペプチドとして別々に処置した。結果の一般的な概要として、表２３は、ＤＲＢ１、ＤＲＢ３／４／５、ＤＱおよびＤＰ遺伝子（エピトープ数）に対応する強力な結合体の数を示す。抗原に対して生じた体液性応答の場合と同様に、観察されたＴｈ細胞の活性化／増殖は、一般にＤＲＢ１特異性の観点から解釈される。表２３の結果は、Ｆａｂ  １、Ｆａｂ９およびＦａｂ１０がそれぞれ強力な潜在的ＤＲＢ１バインダー１３、１１および１３に対応することを示し、表２４は、ヒト化処置抗体のものに匹敵する世界中の母集団における、これら３つのＦａｂのそれぞれについてのＤＲＢ１危険スコアを示す。３つのＦａｂのうち、Ｆａｂ９は最も免疫原性が低い。
【０３３５】
【表２３】
2021535140.tif 000049
【０３３６】
【表２４】
2021535140.tif 000050
【０３３７】
〔実施例１７〕
図１２Ａ〜１２Ｆに示す二官能性ＰＥＧ−葉酸リンカーの設計および合成。本実施例は、種々のＰＥＧ−葉酸リンカー化合物の合成経路および構造を実証する。
【０３３８】
【化１５】
2021535140.tif 000051
【０３３９】
本実施例は、化合物１０の合成のための合成経路を実証する。
【０３４０】
【化１６】
2021535140.tif 000052
【０３４１】
Ｎ１０−トリフルオロアセチルプテロ酸（２）。丸底フラスコ中の１．０ｇのプテロイン酸（１）に、１０ｍｌの無水トリフルオロ酢酸を窒素下で１０分間滴下して導入した。反応混合物を室温で２４時間、光を避けて撹拌した。暗褐色溶液をセライトのパッドを通して濾過し、蒸発させた。得られた粘稠な褐色油状物をエーテルで研和し、分離した沈殿物を濾過により回収し、エーテルで洗浄し、真空下で一晩乾燥させて、粗中間体を淡褐色粉末として得た。粗アシル化材料を無水ＴＨＦに再懸濁し、氷で処理した。得られた混合物を室温で１０時間撹拌した；この間に淡褐色の沈殿物が分離した。反応混合物をエーテルで希釈し、沈殿物を濾取し、エーテルで洗浄し、真空化で一晩乾燥させて、Ｎ１０−トリフルオロアセチルプテロ酸（２）（１．４５ｇの粗製）を淡褐色粉末として得て、これをさらに精製することなく次の反応に使用した。
【０３４２】
Ｎ１０−トリフルオロアセチルプテロ酸ＯＳｕエステル（３）。無水ＤＭＳＯ中のＮ１０−トリフルオロアセチルプテロ酸（２）の溶液を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．４３ｇ）、続いてＥＤＣＩ−ＨＣｌ（２．０４ｇ）によって室温で一度に処理した。得られた暗色溶液を周囲温度で２４時間撹拌し、氷冷水（４０ｍｌ）で希釈した。分離した微細な褐色沈殿を遠心分離により集め、冷水で洗浄し、一晩空気乾燥し、真空下で１日間乾し、化合物（３）を褐色粉末、ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ５０６（Ｍ＋Ｈ）＋として得た。
【０３４３】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯｔＢｕ（７）。無水ＴＨＦ（４０ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ（４）、（４．２６ｇ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１．１５ｇ）の混合物に、ＤＣＣ（２．０６ｇ）を室温で一度に加えた。得られた溶液を室温で一晩撹拌し、次いで固体を濾別し、ＴＨＦで洗浄した。合わせたろ液を蒸発乾固し、真空化で乾燥させて、粗Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＳｕ）−ＯｔＢｕ（５）、（５．３ｇ）を白色泡状物として得た。この材料をＴＨＦ（２０ｍＬ）で再溶解し、室温で、無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）中のＨ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯｔＢｕ−ＨＣｌ（６）、（３．３９ｇ）、およびＤＩＰＥＡ（３．５ｍＬ）の混合物に加えた。得られた混合物を周囲温度で４時間、ＨＰＬＣ解析によって反応が完了したと判断されるまで撹拌し、真空下で溶媒を除去した。残渣を酢酸エチル（１００ｍＬ）で再溶解し、１０％クエン酸水溶液（５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、および塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を真空下で除去した後、残渣を５％エーテル／ヘキサン（５０ｍｌ）で研和した。分離した白色固体生成物を濾過し、ヘキサンで洗浄し、真空下で乾燥させて、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯｔＢｕ（７）を得た。
【０３４４】
Ｈ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯｔＢｕ（８）。ＤＣＭ中のＨ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯｔＢｕ（７）の溶液をジエチルアミンで処理した。得られた溶液を、ＨＰＬＣ解析により脱保護が完了したと判断するまで、室温で４時間撹拌した。全ての溶媒を真空下で除去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、最初にジクロロメタン、次にジクロロメタン中の５〜１０％ＭｅＯＨで溶出し、Ｈ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯｔＢｕ（８）を無色油状物として得た。
【０３４５】
化合物９：無水ＤＭＦ中のアミン８の溶液を、Ｎ１０−トリフルオロアセチルプテロ酸ＯＳｕエステル（３）で一度に処理した。得られた混合物を室温で２４時間撹拌し、その間、ＨＰＬＣ解析により完了をモニターした。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、酢酸エチル中１０％メタノールで溶出するシリカゲルのパッドを通して濾過した。合わせたろ液を蒸発乾固し、酢酸エチルに再溶解し、１０％クエン酸水溶液、水、飽和ＮａＨＣＯ３および塩水で連続して洗浄した。抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させ、真空下で一晩乾燥させて、褐色固体として粗９を得た。
【０３４６】
化合物１０：粗化合物９をトリフルオロ酢酸とジクロロメタンの１：１（ｖ／ｖ）混合物に溶解した。得られた溶液を、ＨＰＬＣ解析によって判定されるように、全体的な脱保護が完了するまで、室温で２時間放置した。全ての溶媒を真空下で除去し、残留褐色油状物をジエチルエーテルで研和し、短時間超音波処理した。分離した淡色沈殿物を濾過により回収し、エーテルで十分に洗浄し、真空下で１日間乾燥させて、生成物１０を淡黄色粉末として得た。
【０３４７】
本実施例は、化合物１３の合成のための合成経路を実証する。
【０３４８】
【化１７】
2021535140.tif 000053
【０３４９】
化合物１２：ＤＭＦ（１５ｍＬ）中の化合物１０（０．４５ｇ）および化合物１１（０．２６ｇ）の溶液に、ＤＩＥＡ（０．４４ｍＬ）を室温で添加した。反応混合物を室温で一晩、ＨＰＬＣ解析によって１１の完全な消費が観察されるまで撹拌した。反応混合物をｐＨ５酢酸緩衝液（０．５Ｍ）および１ｍＬのアセトニトリルで希釈し、２０〜９０％アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡ勾配を溶離剤として用いるＣ１８逆相ＨＰＬＣによって精製し、凍結乾燥後に化合物１２を白色固体として得た。
【０３５０】
化合物１３：ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中の化合物１２（０．３１ｇ）の溶液に、ヒドラジン、Ｈ２０（０．１９ｍＬ）を室温で加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を水（約２ｍＬ）で希釈し、２０〜９０％アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡ勾配を溶離剤として用いるＣ１８逆相ＨＰＬＣによって精製し、凍結乾燥後に化合物１３を黄色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ８３１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０３５１】
本発明は、化合物１１の合成のための合成経路（ＣＡＳ＃：  １４１５３２８−９５−８）を実証することによって、以下に例示されるようなリンカー合成を組み込む。
【０３５２】
【化１８】
2021535140.tif 000054
【０３５３】
化合物１６：無水ＴＨＦ中のテトラエチレングリコール１４の溶液に、ナトリウムの小片を室温で添加し、完全に溶解するまで撹拌した。得られた溶液にアクリレート１５を１５分間かけてゆっくりと添加した。反応混合物を室温で２０時間撹拌し、次いで真空下で濃縮し、塩水に再懸濁し、続いて酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。真空中で溶媒を除去すると、化合物１６が透明な黄色がかった油状物として得られた。
【０３５４】
化合物１７：無水ＤＣＭ中のアルコール１６およびピリジンの混合物に、０℃で少量ずつ塩化トシルを添加した。得られた混合物を０℃で３０分間撹拌し、次いで室温で一晩撹拌した。反応混合物を１０％クエン酸でクエンチし；水層を酢酸エチルで抽出し、合わせた有機物を飽和重炭酸ナトリウム、水、塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を除いた後、残基をシリカゲルで精製して、トシレート１７を透明な無色の油状物として得た。
【０３５５】
化合物１８：ＤＭＦ中のトシレート１７およびＮ−ヒドロキシフタルイミドの混合物に、ＤＢＵを室温で添加した。得られた濃赤色溶液を９０℃まで１時間加熱し、次いで冷却し、１０％クエン酸でクエンチし、酢酸エチルで抽出した。有機相を飽和重炭酸ナトリウム水溶液、水、および塩水で十分に洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除いた後、残基をシリカゲルで精製して、化合物１８を無色の油状物として得た。
【０３５６】
化合物１９：ｔ−ブチルエステル１８をＴＦＡとＤＣＭの１：１混合物で室温で処理した。３時間後、溶媒を真空下で除去し、残渣をジクロロメタンに取り、塩水で十分に洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。真空下で溶媒を除去した後、粗カルボン酸１９を黄色がかった透明な油状物として得た。
【０３５７】
化合物１１：無水ＴＨＦ中の粗カルボン酸１９をＮ−ヒドロキシスクシンイミドで処理し、続いて室温でＤＣＣで処理した。撹拌を６時間続け、固体を濾過により除去し、ＴＨＦで洗浄した。濾液を蒸発させ、残渣をシリカパッドに通し、ＥｔＯＡｃで洗浄して、化合物１１を無色油状物として得、これを保存すると白色固体へと徐々に固化した。
【０３５８】
本実施例は、分岐リンカー合成を開示する。例えば、化合物２５の合成のための合成経路：
【０３５９】
【化１９】
2021535140.tif 000055
【０３６０】
化合物２１：Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ２０  ＤＣＭ（５０ｍｌ）中のＯＳｕエステル１１（１．５５ｇ）およびＢｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ２０（０．７２ｇ）の溶液に、ＤＩＥＡ（１．０３ｍＬ）を２３℃で添加した。１０分後、ＬＣＭＳは反応が完了したことを示した。混合物を１Ｎ  ＨＣｌ（５０ｍｌ）、飽和重炭酸ナトリウム（５０ｍｌ）および塩水（５０ｍｌ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を除去することにより、白色固体として粗酸２１を得て、これを精製することなく次の工程に使用した。
【０３６１】
化合物２２：粗酸２１を無水ＴＨＦに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、続いて室温でＤＣＣで処理した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、次いで濾過してＤＣＵを除去し、ＴＨＦで洗浄した。生成物を、溶離剤として０〜１０％メタノール／ＤＣＭ勾配を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって単離して、化合物２２を白色固体（ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ７３７（Ｍ＋Ｈ）＋）として得た。
【０３６２】
化合物２４：化合物２２をＤＣＭに溶解し、化合物２３で処理した。得られた混合物をＤＩＥＡで処理し、室温で５時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、水、塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。粗生成物を５％クエン酸（２０ｍｌ）および塩水（５０ｍｌ）によって精製した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を真空中で除去して、化合物２４を白色固体として得た。粗生成物をさらに精製することなく次の工程に使用した。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ８８７（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０３６３】
化合物２５：化合物２４をＴＨＦに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、続いて室温でＤＣＣで処理した。４時間後、混合物を濾過してＤＣＵを除去し、真空中で濃縮した。残渣を、溶離剤として０〜６％メタノール／ＤＣＭ勾配を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物２５を白色固体（ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ９８４（Ｍ＋Ｈ）＋）として得た。
【０３６４】
本実施例は、化合物３０の合成のための合成経路を開示する。
【０３６５】
【化２０】
2021535140.tif 000056
【０３６６】
本実施例は、分岐ＰＥＧ−葉酸化合物３０の合成を開示する。
【０３６７】
【化２１】
2021535140.tif 000057
【０３６８】
【化２２】
2021535140.tif 000058
【０３６９】
化合物２６：ＤＭＦ（５ｍｌ）中の化合物２５（０．６ｇ、粗）および化合物１０（０．６ｇ）の溶液に、ＤＩＥＡ（０．４７ｍＬ）を２３℃で添加し、１時間撹拌した。混合物を、Ｃ１８カラムを使用することによって、５％〜６０％の水／９０％のＡＣＮ  ０．０５％ＴＦＡ勾配を用いて２０分間、Ｐｒｅｐ−ＬＣによって精製した。生成物を含む画分を合わせ、真空中で蒸発させて、化合物２６を茶色固形物として得た；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  １５３５（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０３７０】
化合物２７：化合物２６（０．２５ｇ）にＤＣＭ（３ｍｌ）およびＴＦＡ（２ｍｌ）を２３℃で添加し、次いで３０分間撹拌した。溶媒を真空中で除去した。残渣をＤＣＭ（約５ｍｌ）に溶解し、円錐管中の４５ｍｌのＭＴＢＥに滴下した。沈殿物を遠心分離（４０００ｒｐｍ、５分）によって単離し、乾燥させて、化合物２７を茶色固形物として得た；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  １４３４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０３７１】
化合物２９Ａ：ＤＭＦ（２ｍｌ）中の化合物２７（０．０５４ｇ）および化合物２８Ａ（ＰＥＧ５Ｋ−Ｃ５−ＮＨＳ、０．１７ｇ）の溶液に、ＤＩＥＡ（０．０３４ｍＬ）を２３℃で添加した。５時間撹拌した後、混合物を４０ｍＬのＭＴＢＥ上に滴下し、遠心分離（５分、４０００ｒｐｍ）して沈殿物を分離した。沈殿物に４５ｍＬのＭＴＢＥを添加し、遠心分離した（５分、４０００ｒｐｍ）。溶媒をデカントし、白色沈殿を高真空下で一晩乾燥させて、化合物２９Ａを粗白色固形物として得た。
【０３７２】
化合物３０Ａ：水（１０ｍｌ）中の化合物２９Ａ（０．２４ｇ）の溶液に、ヒドラジン、Ｈ２Ｏ（０．０３３ｍｌ）を２３℃で添加した。２４時間撹拌した後、混合物を、Ｃ１８カラムを用いて２０％〜１００％のＡＣＮおよび０．０５％ＴＦＡ水勾配で２０分間、Ｐｒｅｐ−ＬＣによって精製した。生成物を含有する画分を合わせ、蒸発させた。残渣を水（１０ｍＬ）に溶解し、凍結乾燥して、化合物３０Ａを淡黄色固形物として得た。（例えば、図１２を参照のこと）。
【０３７３】
化合物２９Ｂ：ＤＭＦ（６ｍｌ）中の化合物２７（０．０４ｇ）および化合物２８Ｂ（ＰＥＧ１０Ｋ−Ｃ５−ＮＨＳ、０．２６ｇ）の溶液に、ＤＩＥＡ（０．０４０ｍＬ）を２３℃で添加した。１６時間撹拌した後、混合物を４０ｍＬのＭＴＢＥ上に滴下し、遠心分離し（５分、４０００ｒｐｍ）、沈殿物を分離した。沈殿物に４５ｍＬのＭＴＢＥを添加し、次いで遠心分離した（５分、４０００ｒｐｍ）。溶媒をデカントし、白色沈殿物を高真空下で一晩乾燥させて、化合物２９Ｂを粗白色固形物として得た。
【０３７４】
化合物３０Ｂ：水（１０ｍｌ）中の化合物２９Ｂ（０．４７ｇ）の溶液に、ヒドラジン、Ｈ２Ｏ（０．０８０ｍｌ）を２３℃で添加した。６時間撹拌した後、混合物を、Ｃ１８カラムを使用することにより、２０％〜１００％のＡＣＮおよび０．０５％ＴＦＡ水勾配で２０分間、Ｐｒｅｐ−ＬＣによって精製した。生成物を含有する画分を合わせ、蒸発させた。残渣を水（１０ｍＬ）に溶解し、凍結乾燥して、化合物３０Ｂを淡黄色固形物として得た。
【０３７５】
化合物２９Ｃ：ＤＭＦ（８ｍｌ）中の化合物２７（０．０４０ｇ）および化合物２８Ｃ（ＰＥＧ２０Ｋ−Ｃ５−ＮＨＳ、０．５１ｇ）の溶液に、ＤＩＥＡ（０．０４０ｍＬ）を２３℃で添加した。１６時間撹拌した後、混合物を４０ｍＬのＭＴＢＥ上に滴下し、遠心分離（５分、４０００ｒｐｍ）して沈殿物を分離した。沈殿物に４５ｍＬのＭＴＢＥを添加し、再び遠心分離した（５分、４０００ｒｐｍ）。溶媒をデカントし、白色沈殿物を高真空下で一晩乾燥させて、化合物２９Ｃを粗白色固形物として得た。
【０３７６】
化合物３０Ｃ：水（８ｍｌ）中の化合物２９Ｃ（０．６７ｇ、＜０．０３１ｍｍｏｌ）の溶液に、ヒドラジン、Ｈ２Ｏ（０．０６０ｍｌ）を２３℃で添加した。６時間撹拌した後、混合物を、Ｃ１８カラムを用いて２０％〜１００％のＡＣＮおよび０．０５％のＴＦＡ水勾配で２０分間、Ｐｒｅｐ−ＬＣによって精製した。生成物を含有する画分を合わせ、蒸発させた。残渣を水（１０ｍＬ）に溶解し、凍結乾燥して、化合物３０Ｃを淡黄色固形物として得た。
【０３７７】
化合物２９Ｄ：ＤＭＦ（４ｍＬ）中の化合物２７（０．０３３ｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）および化合物２８Ｄ（（ＰＥＧ１０Ｋ）２−Ｃ２−ＮＨＳ、０．４ｇ）の溶液に、ＤＩＥＡ（０．０２０ｍＬ）を２３℃で添加した。１８時間撹拌した後、混合物を４０ｍＬのＭＴＢＥ上に滴下し、遠心分離（５分、４０００ｒｐｍ）して沈殿物を分離した。沈殿物に４５ｍＬのＭＴＢＥを加え、遠心分離した（５分、４０００ｒｐｍ）。溶媒をデカントし、白色沈殿物を高真空下で一晩乾燥させて、化合物２９Ｄを粗白色固形物として得た。
【０３７８】
化合物３０Ｄ：水（８ｍｌ）中の化合物２９Ｄ（０．４５ｇ、＜０．０２１ミリモル）の溶液に、ヒドラジン、Ｈ２Ｏ（０．０８０ｍｌ）を２３℃で添加した。４８時間撹拌した後、混合物を、Ｃ１８カラムを用いて２０％〜１００％のＡＣＮおよび０．０５％のＴＦＡ水勾配で２０分間、Ｐｒｅｐ−ＬＣによって精製した。生成物を含有する画分を合わせ、蒸発させた。残渣を水（１０ｍＬ）に溶解し、凍結乾燥して、化合物３０Ｄを淡黄色固形物として得た。
【０３７９】
化合物２８Ｅ：ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の化合物２８Ｅ１（（ＰＥＧ５Ｋ）２−ＮＨＳ、０．１ｇ）およびアミノバレイン酸（０．００３ｇ）の溶液に、ＤＩＥＡ（０．０１０ｍＬ）を２３℃で添加した。１時間撹拌した後、混合物を水で１ｍＬに希釈し、脱塩カラムで精製した。回収した画分を凍結乾燥して、化合物２８Ｅを白色固形物として得た。
【０３８０】
化合物３０Ｅ：ＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物２８Ｅ（０．０４ｇ）、ＤＭＴＭＭＴ（０．００３ｇ）およびＤＩＥＡ（０．００５ｍＬ）の溶液に、化合物２７（０．００９ｇ）を２３℃で添加した。１時間撹拌した後、ＬＣＭＳは反応が完了したことを示した。この混合物（粗化合物２９Ｅ）にヒドラジンを加え、Ｈ２Ｏ（２ｕｌ）をその場で添加した。１時間撹拌した後、混合物を、Ｃ１８カラムを使用することにより、２０％〜１００％のＡＣＮおよび０．０５％のＴＦＡ水勾配で２０分間、Ｐｒｅｐ−ＬＣによって精製した。生成物を含有する画分を合わせ、蒸発させた。残基を水（１０ｍＬ）に溶解し、凍結乾燥して、化合物３０Ｅを淡黄色固形物として得た。
【０３８１】
【化２３】
2021535140.tif 000059
【０３８２】
化合物３１：ＤＭＦ（１．０ｍｌ）中の２０Ｋ−ＰＥＧ−アミン（０．３１ｇ）および２、５−ジオキソピロリジン−１−イル２−（ビス（２−（２、５−ジオキソ−２、５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アミノ）酢酸塩（０．００３ｇ）の溶液に、２３℃でＤＩＥＡ（０．００６ｍＬ）を加えた。３０分後、混合物を脱塩カラム（ＰＤ−１０）で精製し、一晩凍結乾燥して、化合物３１を白色固形物として得た。他のＰＥＧ変異体は、本明細書中に記載される同じ手順を使用して調製され得る。
【０３８３】
〔実施例１８〕
本実施例は、二重アンバー含有ヒト化抗ＣＤ３Ｆａｂリード分子の構築、発現および精製を実証する。第二のｐＡＦ取り込み部位を、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９ｐＡＦ、Ｆａｂ９−ＨＫ１２９ｐＡＦおよびＦａｂ１０−ＨＫ１２９ｐＡＦの抗ＣＤ３Ｆａｂ軽鎖位置ＬＬ１５７に加え、それぞれＦａｂ１−ＨＫ１２９ｐＡＦ−ＬＬ１５７ｐＡＦ、Ｆａｂ９−ＨＫ１２９ｐＡＦ−ＬＬ１５７ｐＡＦおよびＦａｂ１０−ＨＫ１２９ｐＡＦ−ＬＬ１５７ｐＡＦとして新しいＦａｂ分子を得た。これにより、前の実施例に記載したように、いずれかの二機能性リンカーを用いて、それぞれのＦａｂにおいて２つの葉酸と２つの５ＫＰＥＧ分子とを複合体化することが可能になった。
【０３８４】
インビトロ活性、インビボ効能およびＰＫ試験に用いたＣＤ３−ＰＥＧ−葉酸精製タンパク質を、ＳＤＳゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）により解析した。精製したＣＤ３を、オキシム化学を用いてｐＡＦ部位で５Ｋまたは１０ＫのＰＥＧ−葉酸と複合体化させ、次いで精製し、複合体化後、陽イオン交換クロマトグラフィーを利用して非複合体、単一部位および二部位複合体化形態を分離した（図１３Ａ〜１３Ｂ）。精製後、組成物を５０ｍＭヒスチジン、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％トレハロースｐＨ６中に形成し、滅菌濾過した。
【０３８５】
図１３Ａは、５Ｋ  ＰＥＧ複合体を有する５μｇの各々の精製ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体を示す。レーン３および６は、それぞれ、単一および二重ｐＡＦ取り込みを有する非複合体化ＣＤ３Ｆａｂ組成物を表す。レーン４および７は、それぞれ、単一および二重ｐＡＦおよび葉酸を有するＣＤ３Ｆａｂ組成物を表す。レーン５および８は、複合体化５ＫＰＥＧ−葉酸およびＢｉ５ＫＰＥＧ−Ｂｉ葉酸をそれぞれ表す。
【０３８６】
図１３Ｂは、ウェル当たり１０μｇのタンパク質を搭載した非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。レーン２および７は非複合体化ＣＤ３Ｆａｂ組成物を示し、レーン３および４はそれぞれ異なる二重複合体化Ｂｉ５ＫＰＥＧ−Ｂｉ葉酸ＣＤ３Ｆａｂ組成物を示し、レーン５および６は、二重複合体化Ｂｉ１０ＫＰＥＧ−Ｂｉ葉酸および１０ＫＰＥＧ−葉酸をそれぞれ示す。データー（図１３Ａ〜Ｂ）は全てのサンプルについて高純度（＞９０％）を示し、ＰＥＧの大きさに基づく分子量の予想される増加を示す。
【０３８７】
複合体化効率を高めるために、精製ＣＤ３Ｆａｂ組成物を、二段階複合体化法を用いてＰＥＧ−葉酸と複合体化させた。葉酸を、オキシム化学を用いてｐＡＦ部位で複合体化させ、続いて、マレイミド−チオールクリック化学を用いて、重鎖および軽鎖の両方のＣ末端システインで、５Ｋ、１０Ｋまたは２０Ｋ  ＰＥＧで、ＰＥＧを複合体化した。図１３Ｃは、ウェル当たり１０μｇのタンパク質を搭載した非還元（レーン２〜５）および還元（レーン７〜１０）条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン２および７はＢｉ葉酸非複合体化組成物を表し、レーン３および８、４および９、５および１０は、それぞれ、Ｂｉ葉酸−Ｃ末端Ｂｉ５ＫＰＥＧ、Ｂｉ１０ＫＰＥＧおよびＢｉ２０ＫＰＥＧ組成物を表す。図１３Ｃのデータは全てのサンプルについて高純度（＞９５％）を示し、ＰＥＧの大きさに基づく分子量の予想される増加を示す。
【０３８８】
〔実施例１９〕
本実施例は、ＣＤ３Ｆａｂ１組成物および２つの低親和性変異体Ｆａｂ９およびＦａｂ１０におけるＢｉ−葉酸およびＢｉ−ＰＥＧ複合体化の効果を実証する。ヒトＣＤ３結合および細胞毒性：表２５は、５０ｎｍのＳＦＡの存在下でのＦａｂ１分子の結合親和性および細胞毒性におけるＢｉ５ＫＰＥＧ−Ｂｉ葉酸の複合体化を含む種々の修飾の効果を示す。
【０３８９】
【表２５】
2021535140.tif 000060
【０３９０】
インビトロでの細胞毒性試験もまた、５Ｋ、１０Ｋあるいは２０ＫのＰＥＧ  Ｃ末端複合体を有するＣＤ３−葉酸二重特異的抗体を用いて、ＫＢ、ＯＶ−９０およびＳＫＯＶ−３細胞中の５０  ｎＭのＳＦＡの存在下で行った（図１３Ｄ、表２６）。有効性はＰＥＧ長の増加と共にわずかに減少したが、試験した全ての構築物は強力な細胞毒性活性を保持した。結果および傾向は、試験したすべての細胞株の間で一致した。これらの研究に基づいて、ＰＥＧの大きさの増大に伴って観察される有効性のわずかな減少は、半減期延伸からの曝露の増大によって相殺されると仮定される。
【０３９１】
【表２６】
2021535140.tif 000061
【０３９２】
表２７は、親Ｆａｂ１ならびに２つの低親和性変異体、Ｆａｂ９および１０の、２０ｎＭのＳＦＡの存在下でのヒトＣＤ３に対する結合親和性を比較する。示されるように、ＰＥＧ−葉酸二官能性リンカーを使用するＢｉ５ＫＰＥＧ−Ｂｉ葉酸の複合体化は、上記の実施例に記載されるように、３つのＦａｂすべてについて、それらの非複合体化制御と比較して、ヒトＣＤ３結合および対応する細胞毒性の可能性の低下をもたらした。
【０３９３】
【表２７】
2021535140.tif 000062
【０３９４】
Ｔ細胞活性化およびサイトカイン放出：表２７は、Ｔ細胞マーカーＣＤ６９の活性化、および３つの修飾されたＦａｂによる２つのサイトカイン（ＩＦＮγおよびＴＮＦα）の放出を示す。上記の実施例に示されるように、ＣＤ３結合の強度、細胞毒性の可能性、Ｔ細胞の活性化、およびその後のサイトカインの放出の間の全般的な相互関係は、Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧ複合体化による有意な修飾の後でさえ、すべてのＦａｂにわたって真実である。このことは、効果を保持しながら、ＣＤ３親和性を低下させ、同時に腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）親和性を増加させることによって、サイトカイン放出症候群による毒性を最小限にできることを示唆している。さらに、半減期（Ｔ１／２）延伸を含むＰＫ特性は、独自のＵＡＡ（非天然アミノ酸）取り込み技術を用いた部位特異的ＰＥＧ化によって改善された。
【０３９５】
〔実施例２０〕
インビトロ細胞毒性データは、ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体がＦＯＬＲα発現ＫＢ細胞を選択的に殺傷させることを示す。ＫＢ細胞を、５０ｎＭの葉酸（生理学的に関連する濃度の葉酸）の存在下で、増加する濃度のＣＤ３−葉酸二重特異的抗体で処理した。最も強力なＣＤ３−葉酸二重特異的抗体、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸は２分子の葉酸を含み、１．３ｐＭのＩＣ５０を示した（図１４）。単一葉酸を含むＣＤ３−葉酸二重特異的抗体、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−葉酸は４０．３ｐＭのＩＣ５０を示し、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸より３１倍強力でなかった。このデータは、２つの葉酸がＣＤ３−葉酸二重特異的抗体の有効性を増加させることを示している。５ＫＰＥＧの添加により有効性は減少した。有効性の４．９倍の低下が、単一のＣＤ３−葉酸二重特異的抗体、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−葉酸、およびＦａｂ１−ＨＫ１２９−５ＫＰＥＧ−葉酸の間で観察され、ＩＣ５０値は１９８ｐＭであった。有効性の３７．３倍の低下が、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸とＦａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ５ＫＰＥＧ−Ｂｉ葉酸の間で観察され、ＩＣ５０値は４８．５ｐＭであった。これらのデータは、ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体は、生理学的に適当な濃度の葉酸で強力なインビトロ細胞毒性を保持することを示した。
【０３９６】
〔実施例２１〕
インビトロ細胞毒性データは、ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体が、２０または５０ｎＭの葉酸の存在下で、ＦＯＬＲα発現ＳＫＯＶ３細胞を選択的に殺傷することを示す。ＳＫＯＶ３細胞を、２０または５０ｎＭの葉酸（生理学的に関連のある濃度の葉酸）中で、濃度が増加したＣＤ３−葉酸二重特異的抗体で処理した（図１５Ａおよび１５Ｂ）。ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体は、葉酸濃度が２０ｎＭから葉酸の正常な生理学的に関連のある濃度の最高値に近い５０ｎＭに増加すると、有効性の５．６倍から８倍の減少を示した。５ＫＰＥＧを添加すると、ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体の有効性も低下した。単一葉酸と単一５ＫＰＥＧ葉酸の二重特異的抗体の間で５．４倍の低下、および二重葉酸と二重５ＫＰＥＧ葉酸の二重特異的抗体の間で２２．９倍の低下が観察された。有効性における有意な差は、単一および二重ペグ化ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体の間で観察されなかった。表２８のデータは、ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体が生理学的に関連のある濃度の葉酸の存在下でＦＯＬＲα発現細胞を殺傷でき、ペグ化抗体は非ペグ化抗体と比較して低下した有効性を有するが、ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体はＦＯＬＲα発現細胞を殺傷できることを示す。
【０３９７】
【表２８】
2021535140.tif 000063
【０３９８】
〔実施例２２〕
さらなるインビトロ細胞毒性試験を、２０または５０ｎＭの５−ｍＴＨＦの存在下で行った。ＳＫＯＶ３細胞を、２０または５０ｎＭ（ヒト血清中に見出される主な形態の葉酸の生理学的に関連のある濃度）、５−メチルテトラヒドロ葉酸（５−ｍＴＨＦ）の存在下で、濃度が増加したＣＤ３−葉酸二重特異的抗体で処理した（図１６Ａおよび１６Ｂ）。５−ｍＴＨＦはＦＯＬＲαに対して１〜１０ｎＭの結合親和性を有し、１ｎＭ未満の結合親和性を有する葉酸と同様にＦＯＬＲαに結合しない。ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体は、二重および単一のＣＤ３−葉酸二重特異的抗体について、それぞれ、０．０３〜０．１６ｐＭおよび０．１〜１．５ｐＭの間の非常に強力なＩＣ５０値を保持した。表２９のデータは、ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体が生理学的に関連のある濃度の５−ｍＴＨＦの存在下で、ＦＯＬＲα発現ＳＫＯＶ３細胞に対して強力なインビトロ細胞毒性を有することを示す。
【０３９９】
【表２９】
2021535140.tif 000064
【０４００】
〔実施例２３〕
ＣＤ１マウスにおけるマウス薬物動態研究：ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体を、ＣＤ−１マウスのマウス尾静脈を介して、１または５ｍｇ／ｋｇでｉｖ．投与した。血液サンプルを９つのタイムポイントで採取し、ＥＬＩＳＡによって解析した。データは、５ＫＰＥＧの添加が血清露出を増加させることを明らかに示した（ＡＵＣｌａｓｔ）（表３０〜３１および図１７）。１ｍｇ／ｋｇのＦａｂ１−ＨＫ１２９−５ＫＰＥＧ−葉酸はＦａｂ１−ＨＫ１２９−葉酸より４．３倍の向上を示し、５ｍｇ／ｋｇのＦａｂ１−ＨＫ１２９−５ＫＰＥＧ−葉酸はＦａｂ１−ＨＫ１２９−葉酸より５倍の改善を示した。Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ５ＫＰＥＧ−Ｂｉ葉酸は１ｍｇ／ｋｇでＦａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸より１６．２５倍の改善を示し、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ５ＫＰＥＧ−Ｂｉ葉酸は５ｍｇ／ｋｇでＦａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸より２１．７倍の改善を示した。データは、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−５ＫＰＥＧ−葉酸とＦａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ５ＫＰＥＧ−Ｂｉ葉酸の間に３．９倍の差を示す。５ＫＰＥＧをＣＤ３−葉酸二重特異的抗体に添加した場合、血清半減期（Ｔ１／２）の改善も観察された。血清半減期の最大の改善は、ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体に組み込まれた２つの５ＫＰＥＧで観察された。Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ５ＫＰＥＧ−Ｂｉ葉酸は、１ｍｇ／ｋｇでＦａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸よりも血清半減期が４．２倍改善し、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ５ＫＰＥＧ−Ｂｉ葉酸は、５ｍｇ／ｋｇでＦａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸よりも血清半減期が６．２５倍改善した。データは、５ＫＰＥＧの添加が血清露出およびＣＤ３−葉酸二重特異的抗体の血清半減期を改善し、インビボでの有効な血清露出に達するための投与頻度を低下させることを示している。
【０４０１】
【表３０】
2021535140.tif 000065
【０４０２】
【表３１】
2021535140.tif 000066
【０４０３】
〔実施例２４〕
本実施例は、ＣＤ３−葉酸−葉酸二重特異的抗体がヒトＭ２マクロファージを殺傷させることを示す：マクロファージは宿主防御において役割を果たす不均一な細胞集団である。古典的に活性化されたマクロファージ（Ｍ１マクロファージ）は炎症誘発性機能、腫瘍浸潤リンパ球の動員、抗腫瘍活性を有するが、Ｍ２マクロファージは抗炎症性であり、組織リモデリング、癌細胞の遊走、浸潤、転移に関与する。ヒトＭ２マクロファージは癌細胞の増殖と関連しており、卵巣癌の予後不良と関連している。Ｍ２マクロファージの阻害は、チェックポイント阻害剤などの免疫腫瘍処置の活性を増強しうる。ヒトＭ２マクロファージはＦＯＬＲβまたはＦＲβを発現し、これら、またはＦＲは、ＦＯＬＲαまたはＦＲαと同様の葉酸への結合親和性を有する。したがって、Ｍ１マクロファージへの再分極あるいはＭ２マクロファージを選択的に殺傷することによって、Ｍ２マクロファージに対するＭ１マクロファージの比率を増加させる戦略は、癌処置における潜在的な処置アプローチを提供する。
【０４０４】
試験１：マクロファージに対するＣＤ３−葉酸二重特異的抗体の効果を評価するために、以下の実験を行った：Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−ｐＡＦ、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−葉酸およびＦａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−５ＫＰＥＧ葉酸を、５０ｎＭ葉酸の存在下でヒトＭ２マクロファージおよびヒトＴ細胞とインキュベートした。データは、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−葉酸およびＦａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−５ＫＰＥＧ−葉酸が、それぞれ１．２ｐＭおよび１１２．１ｐＭのＩＣ５０値でヒトＭ２マクロファージを殺傷させることを示す（データは示さず）。葉酸を欠くＦａｂ１−ＨＫ１２９−Ｌ１５７−ｐＡＦは、ヒトＭ２マクロファージを殺傷させない。このデータは、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−葉酸およびＦａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−５ＫＰＥＧ−葉酸細胞毒性がＦＯＬＲβへの結合に特異的であることを裏付ける。さらに、ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体は、ＦＯＬＲα発現腫瘍細胞を殺傷させることに加えて、Ｍ２マクロファージ細胞、およびおそらく他のＦＯＬＲα／β発現免疫抑制細胞を殺傷させうることを示唆する。
【０４０５】
試験２：これらの試験では、単球由来マクロファージを健康なドナーのヒト血液から作製し、Ｍ１マクロファージ分化のための顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）またはＭ２マクロファージ分化のためのマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）のいずれかで処理した。
【０４０６】
試験を実施する前に、葉酸受容体β（ＦＯＬＲβあるいはＦＲ−β）発現を最初にフローサイトメトリーによって測定し、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）に関してＭ１マクロファージよりもＭ２マクロファージにおいて平均２６倍率増加加することが見出された。
【０４０７】
ヒトＭ１またはＭ２マクロファージを９６ウェル透明底部の白色プレート上に９，０００細胞／ウェルで播種し、一晩インキュベートした。翌日、９０，０００細胞のヒトＴ細胞を、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比率１０：１で、エフェクター細胞としてマクロファージを含むウェルに添加し、ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体の連続希釈物（０．００１ｐＭ〜１００ｎＭ）と共に、２０ｎＭの葉酸の存在下、３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートした。マクロファージの相対生存率を、浮遊細胞の除去後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（１００ｕＬ／ウェル）によって測定し、未処理対照の割合として計算した。
【０４０８】
ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体のＰＥＧ化の影響：表３２は、２０ｎｍの葉酸の存在下での単一葉酸を含むＣＤ３−葉酸二重特異的抗体によるインビトロマクロファージ細胞毒性についてのＩＣ５０データを示す。Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−葉酸は、Ｍ１マクロファージでは８５．０ｐＭ（範囲５３．５〜１２０．０ｐＭ）の平均ＩＣ５０を有し、Ｍ２マクロファージでは５．６ｐＭ（範囲１．４ｐＭ〜１５．０ｐＭ）の平均ＩＣ５０を有する。ＩＣ５０比率に基づくと、Ｍ２マクロファージは、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−葉酸で、Ｍ１よりも平均２６倍改善される（範囲５〜４２倍）。Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−５ＫＰＥＧ−葉酸は、Ｍ１マクロフェージでは平均６１６．８ｐＭ（範囲１９８．０〜９０８．９ｐＭ）の平均ＩＣ５０、Ｍ２マクロファージでは平均１３．４ｐＭ（範囲２．３−３３．２ｐＭ）の平均ＩＣ５０を示し、Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージとの間の平均ＩＣ５０比率は改善され、Ｍ２マクロファージでは平均６９倍（範囲２３〜１２６倍）改善した。これらの結果は単一葉酸を含むＣＤ３−葉酸二重特異的抗体がＭ２マクロファージの殺傷に特異的であり、単一葉酸を含むＣＤ３−葉酸二重特異的抗体（Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−５ＫＰＥＧ−葉酸）のＰＥＧ化はＦａｂ１−ＨＫ１２９−葉酸よりもＭ２マクロファージの殺傷により選択的であることを示す。
【０４０９】
【表３２】
2021535140.tif 000067
【０４１０】
代表的な供与体である供与体６００７からの単一葉酸を含むＣＤ３−葉酸二重特異的抗体による、インビトロマクロファージ細胞毒性の結果を図１８Ａに示す。矢印および数字は、Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージとの間の差異（倍率）をＩＣ５０で表す。点線はＭ１およびＭ２におけるＦａｂ１−ＨＫ１２９−葉酸を示し、実線はＭ１およびＭ２におけるＦａｂ１−ＨＫ１２９−５ＫＰＥＧ−葉酸を示す。
【０４１１】
表３３は、２０ｎＭの葉酸の存在下での、二重葉酸を含むＣＤ３−葉酸二重特異的抗体によるインビトロマクロファージ細胞毒性についてのＩＣ５０データを示す。Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸は、Ｍ１マクロファージで２９．２ｐＭの平均ＩＣ５０（範囲１０．９〜４２．８ｐＭ）、Ｍ２マクロファージで１．５ｐＭの平均ＩＣ５０（範囲０．１ｐＭ〜５．５ｐＭ）を有し、Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージとの間の平均ＩＣ５０の比率は差異が７２倍（範囲６〜２１２倍）である。Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧは、Ｍ１マクロファージにおいて平均１６２０．８ｐＭのＩＣ５０（範囲８３４．７〜２６５１ｐＭ）、Ｍ２マクロファージにおいて平均１５．７ｐＭのＩＣ５０（範囲３．６〜５２．４ｐＭ）を示し、Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージとの間の平均ＩＣ５０比率は改善され、Ｍ２マクロファージにおいて１８１倍（範囲４９〜５０１倍）である。これらの結果は、二重葉酸を含むＣＤ３−葉酸二重特異的抗体はＭ２マクロファージの殺傷に特異的であることを示す。二重葉酸を含むＣＤ３−葉酸二重特異的抗体（Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧ）のＰＥＧ化は、表ＸＸＸに示すように、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸あるいはＦａｂ１−ＨＫ１２９−５ＫＰＥＧ−葉酸よりも有効性が低いと示されるが、Ｍ２マクロファージの殺傷に対してはより選択的であると示される。
【０４１２】
【表３３】
2021535140.tif 000068
【０４１３】
図１８Ｂは、代表的な供与体である供与体６００７由来の二重葉酸を含むＣＤ３−葉酸二重特異的抗体によるインビトロマクロファージ細胞毒性の結果を示す。矢印および数字は、Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージとの間の差異（倍率）をＩＣ５０で表す。点線はＭ１およびＭ２におけるＦａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸を示し、実線はＭ１およびＭ２におけるＦａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧを示す。
【０４１４】
９．１〜４５．１ｎＭの範囲のヒト血清中に見出される主な形態の葉酸の生理学的に関連のある濃度を模倣するために、さらなる研究を行った。この生理学的範囲のうち、８６．７％（３７．５ｎＭ）は一次葉酸代謝産物である５−メチル−テトラヒドロ葉酸（５−ｍＴＨＦ）であり、４％（１．２ｎＭ）のみが未代謝葉酸である（Pfeifferら、Br.J.Nutr.,2015 June 28:113(12):1965-1977）。当技術分野で周知のように、葉酸のＦＲ−βに対する結合親和性は１ｎＭ未満であり、５−ｍＴＨＦのＦＲ−βに対する親和性は１〜１０ｎＭである。このことから、葉酸および５−ｍＴＨＦの濃度あるいは組成物がＣＤ３−葉酸二重特異的抗体の活性に影響を及ぼしうると仮定された。これを評価するために、以下の実験を行った：４５ｎＭの５−ｍＴＨＦの存在下でのインビトロマクロファージ細胞毒性データを表３４および表３５に示す。Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−葉酸のＩＣ５０の平均は、Ｍ１マクロファージあるいはＭ２マクロファージにおいてそれぞれ、９．１ｐＭと０．３１ｐＭであり、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−５ＫＰＥＧ−葉酸のＩＣ５０の平均は、Ｍ１マクロファージあるいはＭ２マクロファージにおいてそれぞれ、４８．５ｐＭと１．２６ｐＭであった。Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸の平均のＩＣ５０は、Ｍ１で４．０ｐＭ、Ｍ２で０．０５ｐＭであり、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧの平均のＩＣ５０は、Ｍ１で９９．４ｐＭ、Ｍ２で０．８５ｐＭであった。これらのデータは、ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体が葉酸よりも５−ｍＴＨＦの存在下でより強力であることを示す（表３２および表３３）。Ｍ１とＭ２との間のＩＣ５０比率は、単一葉酸を含むＣＤ３−葉酸二重特異的抗体では平均４３倍および平均５７倍であり、二重葉酸を含むＣＤ３−葉酸二重特異的抗体では平均８９倍および平均２１２倍であった。これらの結果は、二重特異的抗体を含むＣＤ３−葉酸はＭ２マクロファージ特異的殺傷を維持し、ＰＥＧ化は生理学的に適した濃度の５−ｍＴＨＦにおいて、より特異性を与えることを示す。
【０４１５】
【表３４】
2021535140.tif 000069
【０４１６】
【表３５】
2021535140.tif 000070
【０４１７】
全体として、データは、葉酸あるいは５ｍＴＨＦ代謝産物の存在下で、二重ＰＥＧ化ＣＤ３−葉酸組成物が単一ＰＥＧ化ＣＤ３−葉酸組成物よりもＭ２マクロファージの殺傷に対してより大きな特異性を示したことを示す。したがって、改善された選択性がより多くのＰＥＧ化で観察された。
【０４１８】
ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体によるさらなる研究を、ＦＲβ発現を検討するためにヒト骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）でも行った。健康なドナー由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−５ＫＰＥＧ−葉酸およびＦａｂ１−ＬＬ１５７−Ｂｉ５ＫＰＥＧ−Ｂｉ葉酸で処理し、それぞれのＣＤ３−葉酸二重特異的抗体について単核ＭＤＳＣ（ｍＭＤＳＣ）０、１、１０、および１００ｐＭに対する細胞毒性活性を試験し、ＰＢＭＣに添加して３７℃および５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間インキュベートした。インキュベーション後、ｍＭＤＳＣをＣＤ３−／ＣＤ３３＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１４＋／ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ集団により、フローサイトメトリーを用いてゲートし、未処理対照からの生細胞の割合（％）を測定した。
【０４１９】
観察に基づくと、ｍＭＤＳＣの割合は用量依存的に減少した。Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−５ＫＰＥＧ−葉酸は、１０ｐＭ対１００ｐＭでそれぞれ７２％から２４％への用量依存的低下を示した。同様に、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ５ＫＰＥＧ−Ｂｉ葉酸は、１０ｐＭ対１００ｐＭでそれぞれ８８％から２２％への用量依存的低下を示した。高いＨＬＡ−ＤＲを有する非ＭＤＳＣが保存されていることを考えると、ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体による処理は選択的にｍＭＤＳＣを排除することが示された。
【０４２０】
これらの抑制性細胞が葉酸受容体を発現し得て、免疫腫瘍薬の活性の抑制に関与していると仮定すると、チェックポイント阻害剤や他の免疫腫瘍薬を用いた併用療法は、葉酸受容体が発現しうる種々の癌あるいは状態／疾患／障害の治療薬として利用できることが示唆される。これは、本発明のＣＤ３−葉酸組成物を、他の免疫腫瘍治療とは極めて異なる貴重な治療薬としてしようすることを支持する。
【０４２１】
〔実施例２５〕
本実施例は、いくつかの細胞型におけるＦＯＬＲαへのＣＤ３−葉酸二重特異的抗体結合親和性を実証する。ＦＯＬＲα発現ＫＢ細胞へのＣＤ３−葉酸二重特異的抗体結合親和性：表３６に示すように、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−葉酸は１．９７ｎＭの親和性でＦＯＬＲα発現ＫＢ細胞に結合し、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−５ＫＰＥＧ−葉酸は３．６９ｎＭの親和性でＫＢ細胞に結合する。Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸は０．８５ｎＭの親和性でＫＢ細胞に結合し、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ５ＫＰＥＧ−Ｂｉ葉酸は２．２８ｎＭの親和性でＫＢ細胞に結合する。ＰＥＧ化抗体は、ＦＯＬＲα発現ＫＢ細胞の範囲で低ｎＭにおいて、非ＰＥＧ化抗体と同様の結合親和性を保持した。
【０４２２】
【表３６】
2021535140.tif 000071
【０４２３】
ヒトＴ細胞に対するＣＤ３−葉酸二重特異的抗体結合親和性：Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ｐＡＦ（抗ＣＤ３Ｆａｂ）は、葉酸またはＰＥＧを含まず、１．５９ｎＭの親和性でヒトＴ細胞に結合する（表３７）。Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−葉酸は１．５３ｎＭの親和性でＣＤ３発現ヒトＴ細胞に結合し、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−５ＫＰＥＧ−葉酸は２．３４ｎＭの親和性でヒトＴ細胞に結合する。これらのＣＤ３−葉酸二重特異的抗体は、ヒトＴ細胞に対して同様の結合親和性を有する。Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−ｐＡＦは０．６０４ｎＭの親和性でヒトＴ細胞に結合する。Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸は０．６６９ｎＭの親和性でヒトＴ細胞に結合し、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ５ＫＰＥＧ−Ｂｉ葉酸は３．３４ｎＭの親和性を有する。これらのデータは、ペグ化ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体が非ペグ化型よりもヒトＴ細胞に対して約５倍低い結合親和性を有することを示す。これらのデータはまた、ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体がヒトＴ細胞に対して低ｎＭの結合親和性を有することを示す。
【０４２４】
【表３７】
2021535140.tif 000072
【０４２５】
カニクイザルＴ細胞に対するＣＤ３−葉酸二重特異的抗体結合親和性：表３８に示すように、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ｐＡＦは、２．６７ｎＭの親和性でカニクイザルＴ細胞に結合する。Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−葉酸は、２．６９ｎＭの親和性でカニクイザルＴ細胞を発現するＣＤ３に結合し、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−５ＫＰＥＧ−葉酸は３．３１ｎＭの親和性で結合する。これは、単一のアンバー部位を有するＣＤ３−葉酸二重特異的抗体がカニクイザルＴ細胞と類似の結合親和性を有することを示す。二重のアンバー部位を有するＣＤ３−葉酸構築物は、カニクイザルＴ細胞において同様の結合親和性を示した。表３８に示すように、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−ｐＡＦは、０．９９５ｎＭの親和性でカニクイザルＴ細胞に結合する。Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸は１．０ｎＭの親和性でカニクイザルＴ細胞に結合し、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ５ＫＰＥＧ−Ｂｉ葉酸は５．０１ｎＭの親和性で結合する。したがって、データはさらに、ペグ化ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体が、カニクイザルＴ細胞に対して非ペグ化よりも約５倍低い結合親和性を有することを示す。総合的に見ると、データはＣＤ３−葉酸二重特異的抗体はカニクイザルＴ細胞に対する低ｎＭ結合親和性を有することを示す。
【０４２６】
【表３８】
2021535140.tif 000073
【０４２７】
〔実施例２６〕
以下の研究は、本発明のＣＤ３葉酸抗体を使用するマウスにおけるインビボの安全性および効能研究を実証する。
【０４２８】
研究１：抗ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体について、ＫＢ細胞株由来のヒト子宮頚部腫瘍を有する雌性免疫不全マウスに反復投与することにより、抗腫瘍効能を試験した。非標的化抗ＣＤ３抗体を対照として含めた。ＫＢ頸部腫瘍を有する雌性ＮＳＧマウス（継代７代目から２．０×１０６細胞を接種し、最初に凍結継代３代目から増殖させた）を５群、それぞれ動物８匹に分類した。腫瘍の大きさが約１００ｍｍ３の場合、７．５×１０６のＰａｎＴ細胞をマウスの腹腔内に接種した。２４時間後にマウスを以下の処理群に無作為に分けた：Ｇ１：抗ＣＤ３Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ｐＡＦ対照（０．０５ｍｐｋ）、Ｇ２およびＧ３：ＣＤ３Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−Ｌ１５７−Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧをそれぞれ０．０１ｍｐｋおよび０．０５ｍｐｋ、Ｇ４：Ｆａｂ９−ＨＫ１２９−Ｌ１５７−Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧ（０．１２５ｍｐｋ）、およびＧ５：ＣＤ３Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−葉酸対照（０．２５ｍｐｋ）；ならびに腫瘍体積（図１９Ａ）および質量／体重（図１９Ｂ）を求めた。全てのマウスに、７日目に静脈内（ＩＶ）投与し、この時の腫瘍の大きさの平均は約１２５  ｍｍ３であった。動物を、キャリパー測定および体重により腫瘍成長について、週２回モニターした。すべてのＣＤ３−葉酸二重特異的組成物は図１９Ａに示すように、群３（Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧ、０．０５ｍｐｋ）で効果を示し、腫瘍増殖の阻害に最大の影響を及ぼした（ＴＧＩ＝８２％）。対照のＣＤ３Ｆａｂ−ＨＫ１２９−ｐＡＦ抗体を除くすべての組成物は、体重減少を引き起こした（図１９Ｂ）。
【０４２９】
バイオマーカー解析：処理開始前、処理開始後７日目および２４日目にそれぞれの動物から血液サンプルを採取した。サンプルをＦＡＣ解析によりヒトＣＤ４５／マウスＣＤ４５の割合について解析し、処理が末梢ヒトＴ細胞集団を増加させるかどうかをＣＤ３−葉酸活性化／ターゲティングで示されるので判定した。研究の最後に、ヒトリンパ球マーカーｈＣＤ４５を用いて、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の存在についてＦＡＣにより腫瘍を分析した。すべてのＣＤ３−葉酸処理群は抗腫瘍効果を示し、ヒトＣＤ４５の血中濃度を様々な程度まで上昇させることができ、ヒトＣＤ４５の最高濃度は二重特異的抗体、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧ（０．０５ｍｐｋ）の処理によるものであった（図１９Ｃ）。この研究では、腫瘍増殖阻害と腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を促進する発明のＣＤ３−葉酸組成物の能力も調べた。さらに、腫瘍免疫監視活性化の特徴であるＴＩＬの存在は、対照群よりも全処理群で増加しており、群３（Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧ、０．０５ｍｐｋ）がＴＩＬの最も高い誘導を有することがわかった（図１９Ｄ）。
【０４３０】
研究２：この研究では、ＫＢ腫瘍を有するＮＣＧマウスにおける腫瘍増殖抑制（ＴＧＩ）と、マウス血液中のヒトＣＤ４５／腫瘍浸潤の割合の変化を調べた。単一（Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−葉酸−５ＫＰＥＧ）および二重（Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧ）のＰＥＧ化抗ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体を、ＫＢ細胞株由来のヒト頸部腫瘍を有する雌性免疫不全マウスに反復投与することにより抗腫瘍効能について試験した。非ターゲットＣＤ３抗体を対照として含めた。ＫＢ頸部腫瘍を有する３５匹の雌性ＮＣＧマウス（継代５代目からの２．０×１０６細胞を接種し、凍結継代３代目から最初に増殖させた）を、それぞれ１０匹の動物からなる３群に分類した。腫瘍が約８５〜１００ｍｍ３の場合、マウスに６．０ｘ１０６のＰａｎＴ細胞を腹腔内接種した。２４時間後、マウスを以下の処理群に無作為に分けた：Ｇ１：ＣＤ３Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ｐＡＦ対照、Ｇ２：Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−葉酸−５ＫＰＥＧ、Ｇ３：Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧ、それぞれ５日毎に０．０２５ｍｐｋ（図２０Ａおよび２０Ｂ）。全てのマウスに、７日目に６．０×１０６のＰａｎ−Ｔ細胞を接種し、８日目に静脈内（ＩＶ）投与し、腫瘍の平均は約１００ｍｍ３であった。動物を、腫瘍増殖について（図２０Ａ）カリパス測定および体重（図２０Ｂ）により週２回モニターした。すべてのＣＤ３−葉酸標的組成物は様々な程度の効能を示し、Ｇ２：Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−葉酸−５ＫＰＥＧ（単一ＰＥＧ組成物）は、腫瘍増殖抑制に対して最大の影響を有し（ＴＧＩ＝８５％）、１０匹のマウスのうち５匹において完全な腫瘍退縮（ＣＲ）を引き起こした。これと比較して、Ｇ３：Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧ（二重ＰＥＧ組成物）は、７６％のＴＧＩを有し、１０匹の動物のうち３匹がＣＲを有した（図２０Ａ）。すべての被験物質には耐性があり、Ｇ３（二重ＰＥＧ組成物）は少数のマウスでわずかな体重減少を示したが、これらは１５％の減少を超えなかった（図２０Ｂ）。
【０４３１】
バイオマーカー分析：血液サンプルを、上記に概説したように処理の開始から７日目および１４日目に、それぞれの動物から採取した。血液サンプルを、ヒトＣＤ４５の割合の変化について分析し、処理がＣＤ３−葉酸活性化／標的を介して末梢ヒトＴ細胞集団を増加させるかどうかを判定した。研究の最後に、ヒトリンパ球マーカーｈＣＤ４５を用いて、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）についてＦＡＣにより腫瘍を分析した。ＣＤ３−葉酸投与群はいずれも抗腫瘍効能と血液（図２０Ｃ）および腫瘍（図２０Ｄ）の増大能を示し、ヒトＣＤ４５のレベルは様々な程度であり、最も高いレベルのヒトＣＤ４５およびＴＧＩは単一のＰＥＧ化ＣＤ３−葉酸標的化組成物による処理に起因していた。試験３：試験１および２と同様の結果を示す。５０匹雌性ＮＳＧ−ヒト化マウス（ジャクソン実験室より得たＣＤ３４＋）はＫＢ頸部腫瘍を有し（継代５代目からの２．０×１０６細胞を接種し、最初は凍結継代３代目から増殖させた）、１０匹の動物からなる５群に分類した。腫瘍が約８０〜１００ｍｍ３の場合、処理を開始した。Ｇ１：Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ｐＡＦ対照（０．０１２５ｍｐｋ）Ｇ２：Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−Ｂｉ葉酸（０．００２５ｍｐｋ）、Ｇ３：Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−Ｂｉ葉酸（０．０１２５ｍｐｋ）、Ｇ４：Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧ（０．００２５ｍｐｋ）、Ｇ５：Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧ（０．０１２５ｍｐｋ）。すべてのマウスに週２回、静脈内（ＩＶ）投与した。動物を、腫瘍増殖について（図２１Ａ）、カリパス測定および体重（図２１Ｂ）により週２回モニターした。処理５日目（２回目の投与の１日後）に動物から採取した血液サンプルを用いて、Ｔ細胞の活性化を分析した。血液サンプルをＦＡＣ解析によってヒトＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ２５およびＣＤ６９の割合について解析し、ＣＤ３−葉酸標的組成物がＴ細胞活性化マーカーの発現を増大させるかどうかを判定した（図２１Ｃ−２１Ｆ）。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）も試験の終了時に分析し、各群からの五つの腫瘍についてＦＡＣによりＴＩＬ（ＣＤ４５、ＣＤ３およびＣＤ８）を解析した。すべてのＣＤ３−葉酸標的組成物は様々な程度の効能を示したが、類似の投与では、すべてのＰＥＧ化ＣＤ３−葉酸標的組成物（Ｇ４群で８７％ＴＧＩ、Ｇ５群で９１％ＴＧＩ）は、等しい投与でそれらの非ＰＥＧ化イソ型（Ｇ２群で５１％ＴＧＩ、Ｇ３群で６７％ＴＧＩ）より優れており、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５／ＣＤ６９の誘導を含み、ＴＩＬを増加させ、より大きな抗腫瘍増殖阻害を有した。すべての被験物質はマウスにおいてわずかな体重減少を引き起こしたが、１５％を超えなかった。
【０４３２】
試験４：ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸およびＦａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧについて、ＫＢ細胞株由来のヒト子宮頸癌を有する雌性免疫不全マウスに反復投与し、抗腫瘍効能を検討した。非ターゲットＣＤ３抗体（Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ｐＡＦ）を対照として含めた。ＫＢ頸部腫瘍を有する６５匹の雌性ＮＳＧマウス（継代７代目からの２．０×１０６細胞を接種し、最初に凍結継代３代目から増殖させた）を、それぞれ１０匹の動物からなる６群に分類した。腫瘍が約８５〜１００ｍｍ３である場合、７．５×１０６のＰａｎＴ細胞をマウスの腹腔内に接種した。２４時間後、マウスを以下の処理群に無作為に分けた：Ｇ１：ＣＤ３  Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ｐＡＦ対照、Ｇ２：Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧ（０．０１２５ｍｐｋ）、Ｇ３：Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧ（０．０５ｍｐｋ）、Ｇ４：Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸（０．０１２５ｍｐｋ）、Ｇ５：Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸（０．０５ｍｐｋ）。全てのマウスに８日目に静脈内（ＩＶ）投与し、腫瘍は平均約１００ｍｍ３であった。動物を腫瘍増殖について、カリパス測定および体重により週２回モニターした。図２２Ａに示すように、全てのＣＤ３−葉酸標的組成物は抗腫瘍活性（ＴＧＩ＝Ｇ２：９２％、Ｇ４：５５％、Ｇ５：９０％）を示し、Ｇ３群（０．０５ｍｐｋのＦａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧ）は腫瘍増殖抑制に最大の影響を有し（ＴＧＩ＝９９％）、８匹のマウスのうち６匹が完全な腫瘍退縮（ＣＲ）を経験した。対照ＣＤ３Ｆａｂ抗体を除くすべての試験組成物は、いくらかの体重減少を引き起こしたが、１５％の減少を超えなかった（図２２Ｂ）。本試験の結果は、ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸化合物へのＰＥＧ添加の生物物理学的特性に起因しうる用量依存性反応があることを示す。
【０４３３】
試験５：ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸およびＦａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧについて、ＯＶ−９０細胞株由来のヒト卵巣腫瘍を有する雌性免疫不全マウスに反復投与し、抗腫瘍効能を試験した（図２３Ａおよび２３Ｂ）。本発明のＣＤ３Ｆａｂ−葉酸組成物が卵巣癌の標準的な治療（すなわち、プラチナベース治療）に耐性のあるモデルにに活性を有するか否かを判定するために、ＯＶ−９０を選択した。非ターゲットＣＤ３抗体（Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ｐＡＦ）を対照として含めた。ＯＶ−９０卵巣腫瘍を有する７０匹の雌性ＮＳＧマウス（継代５代目からの７．５×１０６細胞を接種し、最初に凍結継代２代目から増殖させた）を、それぞれ１０匹の動物からなる６群に分類した。腫瘍が約１００〜２００ｍｍ３である場合、７．５×１０６のＰａｎＴ細胞をマウスの腹腔内に接種した。２４時間後、マウスを以下の処理群に無作為に分けた：Ｇ１：Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ｐＡＦ対象、Ｇ２：Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸（０．０１２５ｍｐｋ）、Ｇ３：Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸（０．０５ｍｐｋ）、Ｇ４：Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧ（０．０１２５ｍｐｋ）、Ｇ５：Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧ（０．０５ｍｐｋ）、およびＧ６：カルボプラチン（１００ｍｐｋ）。全てのマウスに８日目に静脈内（ＩＶ）投与し、腫瘍の平均は約１００ｍｍ３であった。第１〜５群は５日ごとに計３回投与し、第６群は７日後（１５日目）に計２回投与した。動物を腫瘍増殖について、カリパス測定および体重により週２回モニターした。ＯＶ−９０モデルは、卵巣癌を処置するためのカルボプラチンの標準的治療の使用（第６群）に抵抗性があるが、試験した全てのＣＤ３−Ｆａｂ葉酸標的組成物は様々な程度の効能を示し、Ｇ５群（０．０５ｍｐｋのＦａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧ）は腫瘍増殖抑制に最大の影響を有した（ＴＧＩ  ＝８１％）；図２３Ａ。対照ＣＤ３  Ｆａｂ抗体を除くすべての試験組成物は体重減少を引き起こしたが、それぞれのグループにおいて２０％の体重減少を超えなかった（図２３Ｂ）。
【０４３４】
試験４の結果と同様に、試験５は、Ｆａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸−Ｂｉ５ＫＰＥＧで処理された群がＦａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−Ｂｉ葉酸で処理された群と等しい濃度で投与された場合、より優れた抗腫瘍活性を有することを示す。これは、ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸組成物へのＰＥＧ付加から生じる生物物理学的特性の増強に起因しうる。さらに、低量の葉酸受容体コピーを有する卵巣癌細胞（細胞あたり約１０Ｋコピーを有するＯＶ−９０など）では、強い抗腫瘍効果が依然として観察されることが注目される。これは、葉酸受容体の高コピー数の前提条件なしに、患者集団を処置するための最前線治療薬としての本発明のＣＤ３Ｆａｂ−葉酸組成物の使用を支持する。これは、本明細書中のインビトロ細胞毒性分析によってさらに確認され、低量の葉酸受容体コピー数を有する細胞が依然としてピコモル範囲のＥＣ５０値を有することを示す。
【０４３５】
〔実施例２７〕
抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸二重特異的抗体（Ｆａｂ−Ｂｉ葉酸、Ｆａｂ−葉酸−ＰＥＧ，  およびＦａｂ−Ｂｉ葉酸−ＢｉＰＥＧ）の安全性および効能のヒトでの臨床試験
［目的］天然にコードされていないアミノ酸を有する抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸二重特異性組み換えヒト抗体を皮下投与した際の、同じ標的抗原に対して特異的である市販品と比較した、安全性および薬物動態を比較する。
【０４３６】
［患者］１８人の健康な協力者を、本研究に参加させる（年齢２０〜４０歳；体重６０〜９０ｋｇ）。被験者は、血液学上または血清化学上の臨床的に重要な臨床検査異常値を示さず、尿の毒性スクリーニング、ＨＩＶスクリーニングおよびＢ型肝炎表面抗原のいずれもが陰性である。被験者は、以下の徴候を呈していてはならない：高血圧；あらゆる原発性血液疾患の病歴；重篤な肝疾患、腎疾患、心血管疾患、胃腸疾患、尿生殖器疾患、代謝性疾患、神経疾患の病歴；貧血または発作障害の病歴；細菌もしくは哺乳動物由来の産物、ＰＥＧまたはヒト血清アルブミンに対する既知の感受性；カフェイン含有飲料の常習的かつ重度の消費；他のあらゆる臨床試験への参加、または試験開始前３０日以内の輸血もしくは献血への参加；試験開始前三箇月以内の抗ＣＤ３抗体への曝露；試験開始前七日以内の疾病への罹患；試験前の健康診断、または試験開始前１４日以内の臨床試験評価における重篤な異常。被検者全員について、安全性の評価が可能である。また、薬物動態分析のための血液は、スケジュールに沿って採取する。試験の全体が、施設内倫理委員会の承認および患者の同意の下に行われる。
【０４３７】
本試験は健康な女性協力者を対象とする、フェーズＩ、一施設、オープンラベル、ランダム化、二期クロスオーバー試験である。１８人の被検者を、二種類の処理シーケンス群の一方にランダムに割り振る（一群あたり九人の被検者）。抗ＣＤ３抗体は、投与期間に局所的あるいは全身的に、当業者によって、それを必要とする対象に抗体を導入するために通常使用される経路のいずれかによって投与される。本発明による抗ＣＤ３抗体組成物は、皮下、筋肉内、皮内、関節内、胸膜内、腹腔内、動脈内、または静脈内に投与しうるが、任意の特定の症例における最も適切な経路は処置される疾病および／あるいは状態の性質および重症度に依存する。例えば、投与は、天然にコードされていないアミノ酸および選択された市販品を含む、同等の用量の二重特異的抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸抗体を使用するボーラス皮下（ＳＣ）または静脈内注射として、二つの別々の投薬期間にわたりうる。市販品の投与量および投与頻度は、パッケージラベルの指示に従う。市販品を使用する、追加の用量、投与頻度または他の所望のパラメータを、追加の被検者群を含めることによって、本試験に追加してもよい。各投与期間の間には、１４日間のウォッシュアウト期間が挟まれている。２回の投与期間のそれぞれについて、投与の１２時間以上前〜投与後７２時間の間、被験者を試験施設に拘束する。ただし、投与期間の間には拘束しない。ＰＥＧ化二重特異的抗ＣＤ３抗体についても、追加の用量、投与頻度または他のパラメータを試験するならば、さらなる被検者群を追加してもよい。抗ＣＤ３抗体の実験対象となる製剤は、天然にコードされていないアミノ酸を有する二重特異的抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸抗体である。
【０４３８】
［血液サンプリング］抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸二重特異性抗体の投与前後に、静脈への直接穿刺によって一連の血液を採取する。血清中の抗ＣＤ３抗体濃度を検査するために、（ｉ）投与前約３０分、２０分および１０分において（３つのベースラインサンプル）、ならびに、（ｉｉ）投与後約３０分、１時間、２時間、５時間、８時間、１２時間、１５時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４８時間、６０時間および７２時間において、静脈血サンプル（５ｍＬ）を採取する。それぞれの血清サンプルを二等分する。全ての血清サンプルを−２０℃で保存する。血清サンプルは、ドライアイス中に入れて輸送する。空腹時の臨床検査試験（血液検査、血清化学検査および尿検査）を、１日目の初回投与直前、４日目の朝、１６日目の投与直前、および１９日目の朝に実施する。
【０４３９】
［生体分析の方法］ラジオイムノアッセイ（ＲＡ）法またはＥＬＩＳＡキット法により、血清中の二重特異的抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸抗体濃度を決定する。
【０４４０】
［安全性の判定］各投与（１日目および１６日目）の直前、ならびに各投与の６時間後、２４時間後、４８時間後および７２時間後に、バイタルサインを記録する。安全性の判定は、有害事象の発生および類型、ならびに臨床検査試験のベースラインからの変化に基づく。さらに、バイタルサイン（血圧を含む）の測定結果および健康診断結果の、試験前からの変化も評価する。
【０４４１】
［データ分析］投与後の値のそれぞれから、ベースライン抗ＣＤ３抗体濃度の平均値を減じることによって、投与後の血清濃度の値を投与前のベースライン抗ＣＤ３抗体濃度で較正する。ベースライン抗ＣＤ３抗体濃度の平均値は、投与前３０分、２０分および１０分に採取した三つのサンプルに由来する抗ＣＤ３抗体レベルの平均値から求める。投与前の血清中抗ＣＤ３抗体濃度がアッセイの定量レベルに満たない場合には、これを平均値の計算に含めない。薬物動態学的パラメータは、ベースライン抗ＣＤ３抗体濃度で較正した血清濃度データから決定する。Digital Equipment Corporation VAX 8600コンピュータシステムで最新バージョンのBIOAVLソフトウェアを用い、モデルに依存しない方法によって、薬物動態学的パラメータを計算する。以下の薬物動態学的パラメータを求める：ピーク血清濃度（Ｃｍａｘ）；ピーク血清濃度に達した時間（ｔｍａｘ）；線形台形則で計算した、時刻０〜最後の血液サンプリング時（ＡＵＣ０−７２）における濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）；消失速度定数から計算した、末端消失半減期（ｔ１／２）。消失速度定数は、対数線形な濃度−時間プロットの末端線形領域における連続するデータ点を、線形回帰することによって推定する。それぞれの処置について、薬物動態学的パラメータの平均、標準偏差（ＳＤ）および変動係数（ＣＶ）を計算する。パラメータの平均値の割合（保存されている製剤／保存されていない製剤）を計算する。
【０４４２】
［安全性の結果］有害事象の発生は、処置群の間で均等に分布している。ベースライン、試験前の臨床検査試験または血圧からの、臨床的に重要な変化は存在しない。また、試験前の健康診断結果およびバイタルサイン測定からの、特筆すべき変化も存在しない。二つの処置群の間で、安全性プロファイルは類似していなくてはならない。
【０４４３】
［薬物動態の結果］１８人の被検者全員について、同じ標的抗原に特異的な一種類以上の市販品を１回投与した後の血清中抗ＣＤ３抗体Ｆａｂ−葉酸二重特異性濃度の平均−時間のプロファイル（ベースライン抗ＣＤ３抗体レベルでの較正前）を、同じ時点において測定した天然にコードされていないアミノ酸を有する二重特異的抗ＣＤ３抗体のものと比較した。全ての被検者の投与前ベースライン抗ＣＤ３抗体濃度は、正常な生理的範囲に収まっていなければならない。投与前のベースライン抗ＣＤ３抗体濃度の平均から得た血清データによって、薬物動態学的パラメータを決定する。その後、Ｃｍａｘおよびｔｍａｘを決定する。選ばれた１または複数の臨床的比較対象のｔｍａｘの平均は、天然にコードされていないアミノ酸を有する二重特異的抗ＣＤ３抗体のｔｍａｘよりも有意に短い。試験に供した市販の抗ＣＤ３抗体製品の消失半減期の値は、本発明の天然にコードされていないアミノ酸を有する二重特異的抗ＣＤ３抗体の消失半減期と比較して有意に短い。
【０４４４】
結論として、健康な女性被検者にとって、１回投与量の天然にコードされていないアミノ酸を有する二重特異的抗ＣＤ３抗体の皮下投与は安全であり、耐えうるものである。有害事象の発生、臨床検査値、バイタルサインおよび健康診断結果の比較に基づくと、市販形態の抗ＣＤ３抗体と天然にコードされていないアミノ酸を有する二重特異的抗ＣＤ３  ｆａｂ葉酸抗体とは、同等の安全性プロファイルを有する。天然にコードされていないアミノ酸を有する二重特異的抗ＣＤ３抗体は、患者および医療関係者に対して、多大な臨床上の便益を供与しうるものである。
【０４４５】
本明細書に記載の実施例および実施形態は説明のみを目的としており、当業者にとっては、これらの実施例および実施形態を考慮に入れた多様な改変または変更が示唆されていることを理解されたい。そして、このような改変または変更も、本出願の趣旨および範囲に含まれ、添付の特許請求の範囲に含まれることも理解されたい。本明細書で援用した刊行物、特許および特許出願の全ては、その全体があらゆる目的において、参照により本明細書に組み込まれる。
【０４４６】
さらに、本発明を以下の番号付き実施形態によって記載する：
１．配列番号１〜６１を一つ以上有する、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体。
【０４４７】
２．配列番号１〜６１を二つ有する、請求項１の抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体。
【０４４８】
３．（ｉ）第一結合ドメインおよび（ｉｉ）第二結合ドメインを有する二重特異的結合分子であって、上記第二結合ドメインは配列番号１〜６１からなる群より選ばれる、二重特異的結合分子。
【０４４９】
４．配列番号１〜６１の一つ以上に記載のアミノ酸配列を有する、細胞毒性的に活性なＣＤ３Ｆａｂ特異的結合構築体。
【０４５０】
５．抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体であって、上記抗ＣＤ３抗体は、（ａ）配列番号１〜３からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび（ｂ）配列番号４〜５からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む結合ドメインを有する、抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体。
【０４５１】
６．上記抗体は、リンカー、ポリマーまたは生物活性を有する分子と連結している、請求項４の抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体。
【０４５２】
７．上記生物活性を有する分子は葉酸塩である、請求項６の抗ＣＤ３抗体。
【０４５３】
８．天然にコードされていないアミノ酸が組み込まれている、請求項１の抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体。
【０４５４】
９．上記重鎖は、Ｃ末端にアミノ酸伸長をさらに含む、請求項６の抗ＣＤ３Ｆａｂ変異体。
【０４５５】
１０．上記アミノ酸伸長はアミノ酸ＤＫＴＨＴを含む、請求項９の抗ＣＤ３Ｆａｂ変異体。
【０４５６】
１１．上記重鎖配列および軽鎖配列は、抗原結合のための一つ以上の位置においてフレームワーク残基または生殖細胞変異を有する、請求項５の抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体。
【０４５７】
１２．上記リンカーは、水溶性ポリマーである、請求項６の抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体。
【０４５８】
１３．上記水溶性ポリマーは、直鎖状または分枝鎖状の水溶性ポリマーである、請求項１２の抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体。
【０４５９】
１４．一つ以上葉酸塩および一つ以上のポリ（エチレングリコール）を含む、請求項６の抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体。
【０４６０】
１５．葉酸受容体を高発現する細胞における細胞殺傷を最適化する方法であって、請求項５の抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を含み、上記抗体は一つ以上の葉酸塩を含み、一つ以上の天然にコードされていないアミノ酸が上記抗体に組み込まれている、方法。
【０４６１】
１６．上記葉酸受容体の数は、１０，０００以上である、請求項１５に記載の方法。
【０４６２】
１７．化合物３０の構造を有するＰＥＧ葉酸リンカーをさらに含む、請求項５の抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体。
【０４６３】
１８．葉酸受容体を高発現する細胞における疾患または病状を有する患者を処置する方法であって、上記患者に治療上有効量の請求項１７に記載の抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体を投与することを含む、方法。
【０４６４】
１９．二つの葉酸分子および二つのＰＥＧ化分子を含む、請求項３の二重特異的抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体。
【０４６５】
２０．部位特異的に組み込まれた天然にコードされていないアミノ酸をさらに含む、請求項１９の二重特異的抗ＣＤ３Ｆａｂ抗体。
【図面の簡単な説明】
【０４６６】
【図１】図１は、ヒトＰＢＭＣに結合しているヒト化抗ＣＤ３Ｆａｂを示す。ＨＥＫ２９３細胞において発現したヒト化抗ＣＤ３ＦａｂとヒトＰＢＭＣとの結合（２回の実験）を示す。３ｖＨ鎖配列および３ｖＬ鎖配列を組み合わせることにより、合計９個のＦａｂを試験した。ｖＬ１．０鎖を有する３個のＦａｂは、すべてのｖＨ鎖との組み合わせにおいて、ヒトＣＤ３との結合を失った。
【図２Ａ−２Ｆ】図２Ａ〜２Ｆは、ヒトＰＢＭＣおよびイヌＰＢＭＣに結合しているヒト化抗ＣＤ３Ｆａｂの滴定を示す。（図２Ａ）Ｆａｂ１の滴定；（図２Ｂ）Ｆａｂ２の滴定；（図２Ｃ）Ｆａｂ３の滴定；（図２Ｄ）Ｆａｂ４の滴定；（図２Ｅ）Ｆａｂ５の滴定；および（図２Ｆ）Ｆａｂ６の滴定。
【図３】図３は、抗ＣＤ３Ｆａｂ１分子のラットにおける薬物動態学的（ＰＫ）分析を示す。ヒト化抗ＣＤ３Ｆａｂ１分子のＰＥＧ化によって、ラットにおける血漿半減期（Ｔ１／２）が延長される。
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ〜４Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞由来の第１ラウンド低親和性Ｆａｂの結合を示す。ヒトＣＤ３（図４Ａ）およびイヌＣＤ３（図４Ｂ）に対する結合親和性の低い、ＨＥＫ２９３細胞から生成した第１ラウンド抗ＣＤ３Ｆａｂ変異体を示す。第１ラウンドスクリーニングにおいて試験した３５個の新たなＦａｂ変異体の中から、４個の選択された低親和性Ｆａｂ（Ｆａｂ７〜１０）および対照Ｆａｂ１についての滴定曲線を示す。
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａ〜５Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞由来の第２ラウンド低親和性ＦａｂのヒトＣＤ３への結合を示す。ヒトＣＤ３（図５Ａ）およびイヌＣＤ３（図５Ｂ）に対する結合親和性の低い、ＨＥＫ２９３細胞から生成した第２ラウンド抗ＣＤ３Ｆａｂ変異体を示す。第２ラウンドスクリーニングにおいて試験した４３個の新たなＦａｂ変異体の中から、４個の選択された低親和性Ｆａｂおよび親対照Ｆａｂ１についての滴定曲線を示す。
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａ〜６Ｂは、大腸菌細胞に由来する低親和性Ｆａｂ−葉酸変異体のヒトＣＤ３への結合を示す。図６Ａは大腸菌細胞から精製した抗ＣＤ３Ｆａｂ−ＨＫ１２９−葉酸分子の低親和性変異体の、ヒトＣＤ３への第１ラウンドの結合を示し、図６Ｂは第２ラウンドの上記結合を示す。親対照であるＦａｂ１−ＨＫ１２９−葉酸塩は、陽性対照として含まれる。
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａ〜７Ｂは、イヌＣＤ３に結合している抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸の低親和性変異体を示す。図７Ａは大腸菌細胞から精製した抗ＣＤ３Ｆａｂ−ＨＫ１２９−葉酸分子の低親和性変異体の、イヌＣＤ３への第１ラウンドの結合を示し、図７Ｂは第２ラウンドの上記結合を示す。親対照であるＦａｂ１−ＨＫ１２９−葉酸塩は、陽性対照として含まれる。
【図８】図８は、ヒトＰＢＭＣを有するＳＫＯＶ−３細胞への細胞毒性を示す。ヒトＰＢＭＣを有する大腸菌細胞から生成したヒト化抗ＣＤ３Ｆａｂ−ＨＫ１２９−葉酸分子の４個の低親和性変異体のインビトロ細胞毒性。親対照であるＦａｂ１−ＨＫ１２９−葉酸塩は、陽性対照として含まれる。
【図９】図９は、イヌＰＢＭＣを有するＳＫＯＶ−３細胞への細胞毒性を示す。イヌＰＢＭＣを有する大腸菌細胞から生成したヒト化抗ＣＤ３Ｆａｂ−ＨＫ１２９−葉酸分子の４個の低親和性変異体のインビトロ細胞毒性。親対照であるＦａｂ１−ＨＫ１２９−葉酸塩は、陽性対照として含まれる。
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｂは、Ｔ細胞の活性化を示す。図１０Ａは、様々な低親和性抗ＣＤ３Ｆａｂ−ＨＫ１２９−葉酸分子による、ＳＫＯＶ−３細胞を含まないＴ細胞マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の活性化を示す。図１０Ｂは、様々な低親和性抗ＣＤ３Ｆａｂ−ＨＫ１２９−葉酸分子による、ＳＫＯＶ−３細胞を含むＴ細胞マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の活性化を示す。
【図１１Ａ−１１Ｄ】図１１Ａ〜１１Ｄは、ＳＫＯＶ−３腫瘍細胞が存在しない場合における様々な低親和性抗ＣＤ３Ｆａｂ−ＨＫ１２９−葉酸変異体（図１１Ａおよび１１Ｃ）またはＳＫＯＶ−３腫瘍細胞が存在する場合における様々な低親和性抗ＣＤ３Ｆａｂ−ＨＫ１２９−葉酸変異体（図１１Ｂおよび１１Ｄ）の、ＩＦＮγによるインビトロサイトカイン放出（図１１Ａおよび１１Ｂ）、およびＴＮＦαによるインビトロサイトカイン放出（図１１Ｃおよび１１Ｄ）を示す。
【図１２Ａ−１２Ｆ】図１２Ａ〜１２Ｆは、本発明の抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸二重特異的複合体およびＰＥＧリンカーを示す。図１２Ａは葉酸−ＰＥＧリガンドの代表的な例を示す；図１２Ｂは葉酸−分岐ＰＥＧリガンドの代表的な例を示す；図１２Ｃ〜１２ＤはＰＥＧ複合体を含むＣＤ３−葉酸二重特異の代表的な例を示す；図１２ＥはＣ末端にＰＥＧ化を含むＣＤ３−葉酸二重特異の代表的な例を示す；図１２ＦはＣ末端にＣＤ３−Ｆａｂ架橋によるＰＥＧ化を含むＣＤ３−葉酸二重特異の代表的な例を示す。
【図１３Ａ−１３Ｄ】図１３Ａ〜１３Ｄは、ＰＥＧ化を伴うＣＤ３Ｆａｂ−葉酸複合体およびＰＥＧ化を伴わないＣＤ３Ｆａｂ−葉酸複合体を示す。図１３Ａおよび図１３Ｂは抗ＣＤ３Ｆａｂ単体組成物および抗ＣＤ３Ｆａｂ二重複合組成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動分析を示す；図１３Ｃは抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸Ｃ末端ＰＥＧ複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動分析を示す；図１３ＤはＫＢ細胞、ＯＶ−９０細胞、およびＳＫＯＶ−３細胞における抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸Ｃ末端ＰＥＧ複合体のインビトロ細胞毒性を示す。
【図１４】図１４は、インビトロ細胞毒性を示し、ＦＯＬＲα発現ＫＢ細胞を選択的に死滅させる抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸二重特異的抗体を示す。
【図１５Ａ−１５Ｂ】図１５Ａ〜１５Ｂは、インビトロ細胞毒性を示す。図１５Ａは２０ｎＭの葉酸の存在下においてＦＯＬＲα発現ＳＫＯＶ３細胞を選択的に死滅させる抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸二重特異的抗体を示し、図１５Ｂは５０ｎＭの葉酸の存在下における選択的な死滅を示す。
【図１６Ａ−１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｂはインビトロ細胞毒性データを示し、２０ｎＭの５−ｍＴＨＦの存在下（図１６Ａ）および５０ｎＭの５−ｍＴＨＦの存在下（図１６Ｂ）においてＦＯＬＲα発現ＳＫＯＶ３細胞を選択的に死滅させる抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸二重特異的抗体を示す。
【図１７】図１７は、ＣＤ１マウスにおけるマウス薬物動態調査を示す。
【図１８Ａ−１８Ｂ】図１８Ａ〜１８Ｂは、ヒトＭ２マクロファージを選択的に死滅させる抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸二重特異的抗体を示す。図１８Ａは、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸二重特異的抗体を含む単一の葉酸塩によるインビトロマクロファージ細胞毒性を示す。矢印および数字は、Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージとの間の差異（倍率）をＩＣ５０で表す。点線はＭ１およびＭ２におけるＦａｂ１−ＨＫ１２９−葉酸を示し、実線はＭ１およびＭ２におけるＦａｂ１−ＨＫ１２９−５ＫＰＥＧ−葉酸を示す。図１８Ｂは、抗ＣＤ３Ｆａｂ−葉酸二重特異的抗体を含む二重の葉酸塩によるインビトロマクロファージ細胞毒性を示す。矢印および数字は、Ｍ１マクロファージとＭ２マクロファージとの間の差異（倍率）をＩＣ５０で表す。点線はＭ１およびＭ２におけるＦａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−ＢｉＦｏｌａｔｅを示し、実線はＭ１およびＭ２におけるＦａｂ１−ＨＫ１２９−ＬＬ１５７−ＢｉＦｏｌａｔｅ−Ｂｉ５ＫＰＥＧを示す。
【図１９Ａ−１９Ｄ】図１９Ａ〜１９Ｂは抗ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体の抗腫瘍効能を示す。図１９Ａは腫瘍体積を示し、図１９Ｂは質量／体重を示す。図１９Ｃおよび１９Ｄは、それぞれ、ヒトＣＤ４５の発現およびＴＩＬの誘導を示す。
【図２０Ａ−２０Ｄ】図２０Ａ〜２０Ｂは抗ＣＤ３−葉酸二重特異的抗体の抗腫瘍効能を示す。図２０Ａは腫瘍体積を示し、図２０Ｂは質量／体重を示す。図２０Ｃおよび２０Ｄは、それぞれ、ヒトＣＤ４５の発現およびＴＩＬの誘導を示す。
【図２１Ａ−２１Ｆ】図２１Ａ〜２１Ｆは、ＫＢ細胞株由来のヒト子宮頚腫瘍におけるＣＤ３−葉酸二重特異的抗体の複数回投与による抗腫瘍効能と（図２１Ａは腫瘍増殖を示し、図２１Ｂは体重を示す）、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５（図２１Ｃ）、ＣＤ６９（図２１Ｄ）、ＣＤ４５（図２１Ｅ）、およびＣＤ３（図２１Ｆ）の発現と、を示す。
【図２２Ａ−２２Ｂ】図２２Ａ〜２２Ｂは、ＫＢ細胞株由来のヒト子宮頚腫瘍におけるＣＤ３−葉酸二重特異的抗体の抗腫瘍効能を示す；図２２Ａは腫瘍増殖を示し、図２２Ｂは体重を示す。
【図２３Ａ−２３Ｂ】図２３Ａ〜２３Ｂは、ＯＶ−９０細胞株由来のヒト卵巣腫瘍における、カルボプラチンを比較したＣＤ３−葉酸二重特異的抗体の抗腫瘍効能を示す；図２３Ａは腫瘍増殖を示し、図２３Ｂは体重を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021535140.tif 000135
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