(57)【要約】  炎症疾患の改善および治療のための抗炎症成分を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法およびその幹細胞培養液を含む抗炎症組成物を提供する。具体的に、抗炎症成分は、炎症誘発物質である一酸化窒素（ＮＯ：Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ）およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２：Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２）の生成量を抑えることができ、より具体的には、炎症誘発物質に関わるｉＮＯＳおよびＣＯＸ２の遺伝子およびタンパク質の発現を抑えることにより炎症誘発物質の生成を抑えることができる。【選択図】  図５
2021526360.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
臍帯血から単球を分離するステップと、
前記単球を培養して臍帯血由来多分化能幹細胞を得るステップと、
前記得た臍帯血由来多分化能幹細胞を幹細胞抗炎症カスタムメイド培地において刺激するステップと、
前記刺激された臍帯血由来多分化能幹細胞を洗浄するステップと、
前記洗浄された臍帯血由来多分化能幹細胞を培養培地において培養するステップと、を含む
ことを特徴とする抗炎症成分を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法。
【請求項２】
前記幹細胞抗炎症カスタムメイド培地は、
αＭＥＭまたはＩＭＤＭと、
ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＩＬ−６およびＭＥＭビタミンよりなる群から選ばれる少なくとも一つの成分と、を含む
請求項１に記載の抗炎症成分を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法。
【請求項３】
前記刺激するステップは、２０〜２８時間の間に行われる
請求項１に記載の抗炎症成分を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法。
【請求項４】
前記刺激するステップは、３５〜３８℃で行われる
請求項１に記載の抗炎症成分を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法。
【請求項５】
前記培養培地は、
αＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２およびＭｅｄｉｕｍ  １９９よりなる群から選ばれる一つの培養液と、
インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ＭＥＭビタミンおよびヒトアルブミンよりなる群から選ばれる少なくとも一つの成分と、を含む
請求項１に記載の抗炎症成分を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法。
【請求項６】
前記抗炎症成分は、一酸化窒素（ＮＯ：Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ）の生成を抑える
請求項１に記載の抗炎症成分を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法。
【請求項７】
前記一酸化窒素（ＮＯ）の生成が抑えられることは、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ：ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）の発現レベルが抑えられることにより行われる
請求項６に記載の抗炎症成分を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法。
【請求項８】
前記抗炎症成分は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２:Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２）の生成を抑える
請求項１に記載の抗炎症成分を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法。
【請求項９】
前記プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の生成が抑えられることは、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ２：Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ２）の発現レベルが抑えられることにより行われる
請求項８に記載の抗炎症成分を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法により培養された臍帯血由来多分化能幹細胞が分泌する培養液を含む
ことを特徴とする抗炎症組成物。
【請求項１１】
前記抗炎症組成物は、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＧＭ−ＣＳＦおよびＭＩＰ−１αよりなる群から選ばれる少なくとも一つを含む
請求項１０に記載の抗炎症組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎症成分を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞を培養する方法およびその幹細胞培養液を含む抗炎症組成物に関する。さらに詳しくは、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）およびシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ２）を抑えることにより、一酸化窒素（ＮＯ：Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ、ニトリックオキシド）およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２：Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２）の生成量を抑える効果を有する成分を分泌する、臍帯血由来多分化能幹細胞を培養する方法およびその幹細胞培養液を含む抗炎症組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞とは、我々の身体を構成するあらゆる細胞へと分化可能な万能細胞と自己再生能があり、細胞および組織の損傷があるときに再生作用を行うことのできる細胞のことをいう。このような幹細胞は、胚性幹細胞と成体幹細胞とに大別され、胚性幹細胞は、着床前の段階の受精卵に由来し、成体幹細胞は、特定の細胞の形態に分化可能な多能性をもった細胞であって、臍帯血、羊膜、胎盤、骨髄、神経、筋肉、脂肪組織、皮膚組織（皮膚、肝または胃粘膜細胞、陰茎包皮）、毛包、膵臓、膀胱、睾丸、角膜、歯牙（乳歯、親知らず（知恵歯））、月経血など非常に様々な組織に由来する。幹細胞は、他の分類方法によれば、自己（自家）（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）幹細胞と他発的（他生的）（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）幹細胞とに区別され、その理由は、幹細胞を患者の身体に移植する場合に最も大きな副作用の一つが移植拒否反応であるためである。この理由から、自己幹細胞または他発的幹細胞に区別する場合が多い。成体幹細胞の場合、現在多くの臨床試験研究が行われているため、特に、成体幹細胞の移植の場合、自己幹細胞であるか、あるいは、他発的幹細胞であるかによって研究段階と方向が決められる。
【０００３】
現在、幹細胞を骨髄から分離し且つ培養することは非常に簡単に行えるとはいえ、骨髄を取得し難く、他人の幹細胞を移植する場合に免疫拒否反応の問題を解決することが現実的に困難であることが知られている。これに比べて、臍帯（へその緒）血は骨髄に比べて取得し易いだけではなく、多量の臍帯血を確保する場合には、患者の組織的合成遺伝子と一致するか、あるいは、それに最も類似している臍帯血幹細胞を用いることができるので、免疫拒否反応を解決することができるというメリットがある。すなわち、臍帯血は、幹細胞の供給源として現実的に使用できない胚性幹細胞よりも商業的に有利であり、成体幹細胞のように人為的に成人の体内にある骨髄、脂肪などを採取する作業などが不要であるという点からみても商業的にさらに利用しやすいといえる。
【０００４】
炎症性疾患に関わって、代表的な皮膚疾患であるアレルギー接触皮膚炎、乾癬、アトピー皮膚炎などは免疫細胞であるＴ細胞が媒介する炎症性疾患であって、このような炎症性疾患を治療するためにステロイド性抗炎症製剤が用いられているが、様々な副作用を示している。したがって、毒性が低く、しかも、副作用のない新規な物質の開発が望まれているのが現状であり、本発明者らは、臍帯血由来多分化能幹細胞を用いて抗炎症効果を発揮する物質を開発するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする技術的課題は、様々な副作用を有している従来の抗炎症製剤に取って代わる物質を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法およびその幹細胞培養液を含む抗炎症組成物を提供することである。
【０００６】
本発明において解決しようとする技術的課題は、上述した技術的課題に何ら制限されるものではなく、未言及の他の技術的課題は、次の記載から本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者にとって明らかに理解できる筈である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の技術的課題を達成するために、本発明の一局面に係る抗炎症成分を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法は、臍帯血から単球を分離するステップと、前記単球を培養して臍帯血由来多分化能幹細胞を得るステップと、前記臍帯血由来多分化能幹細胞を幹細胞抗炎症カスタムメイド培地において刺激するステップと、前記刺激された臍帯血由来多分化能幹細胞を洗浄するステップと、前記洗浄された臍帯血由来多分化能幹細胞を培養培地において培養するステップと、を含んでいてもよい。
【０００８】
本発明の実施形態において、前記幹細胞抗炎症カスタムメイド培地は、アルファ最小必須培地（αＭＥＭ）またはイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）と、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）および最少必須培地（ＭＥＭ）ビタミンよりなる群から選ばれる少なくとも一つの成分と、を含んでいてもよい。
【０００９】
本発明の実施形態において、前記幹細胞抗炎症カスタムメイド培地は、αＭＥＭまたはＩＭＤＭは１０〜３０重量部を含み、かつ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＩＬ−６およびＭＥＭビタミンよりなる群から選ばれる少なくとも一つの成分は１×１０−８〜１７×１０−６重量部を含んでいてもよい。
【００１０】
本発明の実施形態において、前記幹細胞抗炎症カスタムメイド培地は、ＩＭＤＭは１０〜３０重量部を含み、ＴＧＦ−βは１×１０−８〜１×１０−７重量部を含み、ＴＮＦ−αは１×１０−８〜５×１０−８重量部を含み、ＩＬ−３は１×１０−８〜５×１０−８重量部を含み、ＩＬ−６は１×１０−８〜５×１０−８重量部を含み、かつ、ＭＥＭビタミンは８×１０−６〜１７×１０−６重量部を含んでいてもよい。
【００１１】
本発明の実施形態において、前記刺激するステップは、２０〜２８時間の間に行われることを特徴としてもよい。
【００１２】
本発明の実施形態において、前記刺激するステップは、３５〜３８℃で行われることを特徴としてもよい。
【００１３】
本発明の実施形態において、前記臍帯血由来多分化能幹細胞培養培地は、αＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２(ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ−１２ハム)およびＭｅｄｉｕｍ  １９９よりなる群から選ばれる一つの培養液と、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ＭＥＭビタミンおよびヒトアルブミンよりなる群から選ばれる少なくとも一つの成分と、を含むことを特徴としてもよい。
【００１４】
本発明の実施形態において、前記臍帯血由来多分化能幹細胞培養培地は、αＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２およびＭｅｄｉｕｍ  １９９よりなる群から選ばれる一つの培養液は１０〜３０重量部を含み、かつ、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ＭＥＭビタミンおよびヒトアルブミンよりなる群から選ばれる少なくとも一つの成分は１×１０−６〜５×１０−２重量部を含むことを特徴としてもよい。
【００１５】
本発明の実施形態において、前記臍帯血由来多分化能幹細胞培養培地は、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９は１０〜３０重量部を含み、インスリンは１×１０−３〜５×１０−２重量部を含み、トランスフェリンは１×１０−３〜５×１０−２重量部を含み、亜セレン酸ナトリウムは１×１０−６〜５×１０−５重量部を含み、ＭＥＭビタミンは８×１０−６〜１７×１０−６重量部を含み、かつ、ヒトアルブミンは５×１０−３〜１５×１０−３重量部を含んでいてもよい。
【００１６】
本発明の実施形態において、前記抗炎症成分は、一酸化窒素（ＮＯ：Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ）の生成を抑えることを特徴としてもよい。
【００１７】
本発明の実施形態において、前記一酸化窒素（ＮＯ）の生成が抑えられることは、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ：ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）の発現レベルが抑えられることにより行われることを特徴としてもよい。
【００１８】
本発明の実施形態において、前記抗炎症成分は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２:Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２）の生成を抑えることを特徴としてもよい。
【００１９】
本発明の実施形態において、前記プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の生成が抑えられることは、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ２：Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ２）の発現レベルが抑えられることにより行われることを特徴としてもよい。
【００２０】
本発明の他の局面に係る抗炎症組成物は、本発明に係る方法により培養された臍帯血由来多分化能幹細胞が分泌する培養液を含んでいてもよい。
【００２１】
本発明の実施形態において、前記抗炎症組成物は、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびマクロファージ炎症性タンパク質１アルファ（ＭＩＰ−１α）よりなる群から選ばれる少なくとも一つを含むことを特徴としてもよい。
【００２２】
本発明の実施形態において、前記抗炎症組成物は、ＩＬ−８は４０〜５０重量部を含み、ＩＬ−１０は０．０５〜０．０７重量部を含み、ＩＬ−１８は１〜２重量部を含み、ＧＭ−ＣＳＦは０．４〜０．６重量部を含み、かつ、ＭＩＰ−１αは２０〜３０重量部を含むことを特徴としてもよい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の実施形態に係る臍帯血由来多分化能幹細胞が分泌する培養液を含む抗炎症組成物は、炎症疾患の改善または治療のための医薬品または機能性化粧品に利用可能である。
【００２４】
本発明の効果は、上記の効果に何ら限定されることはなく、本発明の詳細な説明の欄または特許請求の範囲に記載の発明の構成から推論可能なあらゆる効果を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明に係る臍帯血由来多分化能幹細胞が分泌する抗炎症成分（ＨＳＣＭ）の細胞毒性（ＭＴＴ〔臭化３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム〕試験）に対する結果値である。
【図２】抗炎症成分（ＨＳＣＭ）の濃度に伴う一酸化窒素（ＮＯ：Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ）の生成量を測定した結果値である。
【図３】抗炎症成分（ＨＳＣＭ）の濃度に伴うプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２：Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２）の生成量を測定した結果値である。
【図４】抗炎症成分（ＨＳＣＭ）の濃度に伴う炎症因子ｉＮＯＳ、ＣＯＸ２、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αの遺伝子発現を測定した結果値である。
【図５】抗炎症成分（ＨＳＣＭ）の濃度に伴う炎症因子ｉＮＯＳおよびＣＯＸ２のタンパク質発現を測定した結果値である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、実施例を挙げて本発明に係る抗炎症成分（ＨＳＣＭ）を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法およびこの効果について詳しく説明する。ただし、これらの実施例は単なる本発明の例示に過ぎず、本発明の範囲がこれらにのみ限定されることはない。
【００２７】
実施例１：臍帯血の選別
同意書を受けた産母から２４時間以内に搬送された臍帯血を用いるか、あるいは、既に有核細胞層のみを回収して零下１９６℃の超低温冷凍庫に保管中の冷凍保管臍帯血を選別した。
【００２８】
実施例２：臍帯血からの多分化能幹細胞の分離および培養
零下１９６℃で冷凍保管中であった臍帯血は３７℃の水浴（ｗａｔｅｒ  ｂａｔｈ）に入れて直ちに解凍して用い、産母から２４時間以内に搬送された臍帯血はそのまま用いた。臍帯血から単球を分離するために、アルファ最小必須培地（αＭＥＭ：ａｌｐｈａ−ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ，  Ｊｅｉｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  Ｋｏｒｅａ）やダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）で臍帯血を２倍の容量に希釈した後、室温で１０分間３００ｘｇで遠心分離した。分離されたバフィーコート層を収穫して再び２倍容量のαＭＥＭで希釈した後、フィコール・ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）に重ね、室温で３０分間３００ｘｇで遠心分離を行った。
【００２９】
血液から単球を分離するためには、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（スクロースの重合体）とハイパック（Ｈｙｐａｑｕｅ）（ジアトリゾ酸ナトリウム；ｓｏｄｉｕｍ  ｄｉｔｒｉｚｏａｔｅ）の重合体であるフィコール・ハイパックが主として用いられる。フィコール・ハイパックの比重は１．０７７ｇ／ｍｌであって、単球はこれよりは軽いものの、赤血球はこれよりも重いため、比重差による分離を行うことが可能である。すなわち、血液をフィコール・ハイパックの上に載せて遠心分離を行うと、単球はフィコール・ハイパックの上に集まることになる。
【００３０】
このような密度勾配遠心分離方法により得られた単球を再び添加物が混ざっていない洗浄用αＭＥＭで２回洗浄した。得られた単球を抗生剤（１０００Ｕ／ｍｌのペニシリンＧ、１０００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシン，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）と抗真菌剤（０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ）及び２ｍＭのグルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，Ｓｉｇｍａ）が含まれているαＭＥＭ培地に１０〜ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，  Ｊｅｉｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）とともに細胞成長因子としての幹細胞因子（５０ｎｇ／ｍｌ）、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ：ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；１０  ｎｇ／ｍｌ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ：ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；１０ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン３（ＩＬ−３：ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３；１０ｎｇ／ｍｌ）及びインターロイキン６（ＩＬ−６：ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６；１０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、細胞数１×１０６／ｃｍ２の濃度で浮遊させた。選択された細胞を５日間培養した後、多分化能幹細胞を得た。
【００３１】
臍帯血由来多分化能幹細胞を得、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した後、幹細胞抗炎症カスタムメイド培地（ＩＭＤＭ  ５００ｍｌ，  ＴＧＦ−β（Ｐｒｏｓｅｐｃ，  Ｉｓｒａｅｌ）１０〜１００ｐｇ／ｍｌ，  ＴＮＦ−α（Ｐｒｏｓｐｅｃ，  Ｉｓｔｒａｅｌ）１０〜５０ｐｇ／ｍｌ，  ＩＬ−３（Ｐｒｏｓｐｅｃ，  Ｉｓｔｒａｅｌ）１０〜５０ｐｇ／ｍｌ，  ＩＬ−６（Ｐｒｏｓｐｅｃ，  Ｉｓｔｒａｅｌ）１０〜５０ｐｇ／ｍｌおよびＭＥＭビタミン（Ｇｉｂｃｏ，  ＵＳＡ）  １〜２％（８，０００〜１７，０００ｐｇ／ｍｌ））で２４時間の間に３７℃の培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）において培養して刺激した。幹細胞の刺激が終わった後、ＰＢＳで３回洗浄し、培養培地（Ｍｅｄｉｕｍ  １９９  ５００ｍｌ、インスリン（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）１〜５０μｇ／ｍｌ、トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）１〜５０μｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）０．００１〜０．０５μｇ／ｍｌ、ＭＥＭビタミン（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）１〜２％（０．００８〜０．０１７μｇ／ｍｌ）、ヒトアルブミン（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）０．５〜１．５％（５〜１５μｇ／ｍｌ））に入れ、３７℃の培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）において培養した。２日おきに一回ずつ培地を交換して培養液を回収し、回収した培養液はそれぞれろ過（Ｔｏｐ  Ｆｉｌｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ，  Ｃｏｒｎｉｎｇ）した後、冷蔵および冷凍保管して用いた。
【００３２】
試験例１：細胞毒性実験（ＭＴＴ試験）
本発明に係る臍帯血由来多分化能幹細胞が分泌する抗炎症物質であるＨＳＣＭ（ヒト臍帯血細胞順化培養液）の細胞毒性の有無を確認するためにＭＴＴ試験を行った。Ｒａｗ ２６４．７細胞を１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭで９６ウェルプレートに３×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌにて１００μlずつ入れ、３７℃、５％  ＣＯ２の培養器において２４時間培養した。培養後に培地を取り除き、実験群（ＨＳＣＭ  ０、１０、２０、３０、４０、５０％）を用意して各グループあたりにトリプリケートで処理した後、３７℃、５％  ＣＯ２培養器において２４時間培養した。培養後に試験液が含まれている培地に５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ試薬を１ウェルあたりに１０μlずつ分注した後、９６ウェルプレートの光を遮って３７℃、５％  ＣＯ２の培養器において４時間培養した。培養が完了すると、ＭＴＴ試薬が含まれている培地を取り除き、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）１００μlを加えてＭＴＴホルマザン結晶を溶解させ、５７０ｎｍにおける吸光度を測定して細胞の生存率を確認した。
【００３３】
結果値は図１に示し、同図を参照すると、抗炎症成分（ＨＳＣＭ）の濃度が上がっても細胞生存には有意な影響を及ばさないことがわかる。
【００３４】
試験例２：抗炎症成分（ＨＳＣＭ）含有培地において培養された細胞からの一酸化窒素の生成量の測定
Ｒａｗ  ２６４．７マクロファージ細胞を用いたグリース（Ｇｒｉｅｓｓ）法にて一酸化窒素（ＮＯ：Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ）の生成量の測定実験を行った。１０％  ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで４８ウェルプレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌにて２５０μlずつ入れ、３７℃、５％  ＣＯ２の培養器において２４時間培養した。培養後に培地を取り除き、実験群（ＨＳＣＭ  ０、１０、３０、５０％）を１０％  ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液に入れ、ここに炎症誘発源である１μｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ：ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を添加し、３７℃、５％  ＣＯ２の培養器において２４時間培養した。次いで、培養液をすべて取って１．５ｍｌのチューブに移し、１４，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離して上澄み液を得た。得られた上澄み液を１００μlずつ９６ウェルプレートに移し、グリース試薬（ｃａｙｍａｎ，ＵＳＡ）を１００μlずつ添加して常温で２０分間反応させてＥＬＩＳＡリーダーで５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）標準物質を用いて標準曲線を作成し、これと比較してＮＯの生成量を定量した。
【００３５】
結果値は図２に示し、同図を参照すると、ＨＳＣＭの濃度が増加するにつれて一酸化窒素の濃度が次第に減少していることが分かる。
【００３６】
試験例３：抗炎症成分（ＨＳＣＭ）含有培地において培養された細胞からのプロスタグランジンＥ２の生成量の測定
ＰＧＥ２（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２）を測定するために、１０％  ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで４８ウェルプレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌにて２５０μlずつ入れ、３７℃、５％  ＣＯ２の培養器において２４時間培養した。培養後に培地を取り除き、実験群（ＨＳＣＭ  ０、１０、３０、５０％）を１０％  ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液に入れ、ここに炎症誘発源である１μｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ：ｌｉｐｏｐｏｌｉｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を添加し、３７℃、５％  ＣＯ２の培養器において２４時間培養した。次いで、培養液をすべて回収して１．５ｍｌのチューブに移し、１４，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離して上澄み液を得た。得られた上澄み液はＰＧＥ２  ＥＩＡキット（ｃａｙｍａｎ，ＵＳＡ）を用いて測定した。ヤギ抗マウスによりコーティングされた９６ウェルプレートにそれぞれスタンダードと試料（ＥＩＡ緩衝液を用いて５倍に希釈する）を５０μlずつ添加し、トレーサー溶液とモノクローナル抗体溶液をそれぞれ５０μlずつウェルに入れた後、４℃で１８時間反応させた。反応後に洗浄緩衝液で５回洗浄し、２００μlのエルマン試薬に６０〜９０分間反応させてＥＬＩＳＡリーダーで４０５〜４２０ｎｍにおける吸光度を測定した。標準曲線を作成し、これと比較してＰＧＥ２の生成量を定量した。
【００３７】
結果値は図３に示し、同図を参照すると、抗炎症成分（ＨＳＣＭ）の濃度が増加するにつれてＰＧＥ２の濃度が次第に減少していることが分かる。
【００３８】
試験例４：抗炎症成分（ＨＳＣＭ）含有培地において培養された細胞からの抗炎症関連遺伝子発現の分析（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法）
ＨＳＣＭが炎症反応を引き起こすときに生成が増加する炎症因子ｉＮＯＳ、ＣＯＸ２、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αの遺伝子発現への影響を調べるために、ＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｒａｗ  ２６４．７マクロファージ細胞を１０％  ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで２４ウェルプレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度にて分注し、３７℃、５％  ＣＯ２の培養器において培養した。培養後に培地を取り除き、実験群（ＨＳＣＭ  ０、１０、３０、５０％）を１０％  ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液に入れ、ここに炎症誘発源である１μｇ／ｍｌのＬＰＳを添加し、３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。次いで、培地を取り除き、ＰＢＳで１回洗浄した後、培養された細胞からの遺伝子発現の分析のためにＲＮＡｚｏｌ  Ｂ試薬を用いて細胞内の総ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡｚｏｌ  Ｂ試薬を１ｍｌ添加して細胞を溶かして組織を変性させた後、１．５ｍｌのチューブにそれぞれ移し、クロロホルム２００μlを添加した後、２０秒間ボルデックスして完全に混合されるようにした。室温で１５分間反応させた後、１４，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離して上澄み液を得、同量のイソプロピルアルコールを添加してインバーティングした後、１０分間室温に静置した。試料を１４，０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離してＲＮＡペレットを得、７０％ＲＮＡ用エタノールで１４，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して洗浄した後、アスピレーターを用いて５分間乾燥した。乾燥されたＲＮＡ試料は、０．１％  ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ；ｄｉｅｔｈｙｌ  ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）により処理された蒸留水２５μlを添加し、５５℃で１０分間反応させてペレットを溶かした後、ｃＤＮＡの合成のための試料として用い、これらのうちの５μlを２０倍に希釈して分光光度計を用いてＯ．Ｄ．２６０／２８０ｎｍにおけるＲＮＡの濃度および純度を測定した。
【００３９】
（１）ｃＤＮＡの合成
一本鎖ｃＤＮＡの合成は、抽出した総ＲＮＡ  １μｇにオリゴ−ｄ（Ｔ）プライマー（１００ｐｍｏｌ）１μlを混合して６５℃で１０分間反応させた後に急速冷却させることにより行われた。このテンプレートに１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ.，Ｊａｐａｎ）、０．１Ｍ  ＤＴＴと５×逆転写（ＲＴ）緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ, ５０ｍＭ  ＫＣｌ, ２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）各２μlを添加し、Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴａｓｅ（ＢｉｏＮｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）１００ｕｎｉｔを添加した後、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）により処理された蒸留水を用いて全体の量が２０μlになるように補正した。試料は、２５℃で５分間、４２℃で１時間合成反応させた後、７２℃で１５分間反応させることにより逆転写酵素を不活性化させて終結した。
【００４０】
（２）ＲＴ−ＰＣＲ
合成したｃＤＮＡと各遺伝子のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。反応条件は、テンプレート１μlとプライマー各０．５μl（１０ｐｍｏｌ）、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．５μl、１０×ＰＣＲ緩衝液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ  ８．３），５０ｍＭ  ＫＣｌ，  ２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２］２．５μl、Ｔａｑポリメラーゼ２ｕｎｉｔ／μlを添加した後、滅菌蒸留水を用いて全体の量を２５μlに補正してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応から得られた増幅産物は１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、各ＰＣＲ産物の検出強度は、画像分析システム（Ｋｏｄａｋ  ＥＤＡＳ２９０）を用いて分析した。バンドの検出強度の相対的な定量値は、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ：ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）とアクチンの検出強度を基準として補正した。
【００４１】
結果値は図４に示し、各バンドを比較すると、ＨＳＣＭの濃度が増加するにつれて炎症を引き起こす物質に関わるｉＮＯＳ、ＣＯＸ２、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦ−αの遺伝子の発現が次第に抑えられることが分かる。
【００４２】
試験例５：抗炎症成分（ＨＳＣＭ）含有培地において培養された細胞からの抗炎症関連遺伝子のタンパク質発現の分析（ウェスターンブロット法）
炎症反応の際に生成されるＮＯおよびＰＧＥ２に直接的に関与するｉＮＯＳとＣＯＸ２のタンパク質の発現の度合いを確認してＨＳＣＭの抗炎症効果について調べるために行った。Ｒａｗ  ２６４．７マクロファージ細胞に実験群（ＨＳＣＭ  ０、１０、３０、５０％）を１μｇ／ｍｌのＬＰＳと一緒に２４時間の間に処理した後、培養された培地を取り除き、１ｍｌのＰＢＳを添加してスクラッパー（ｓｃｒａｐｅｒ）で回収して１４，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離して洗浄した。遠心分離後に上澄み液を取り除き、５００μl  溶解緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、１％  ＮＰ４０、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  フッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ））を添加して超音波粉砕器で溶解させ、１４，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して細胞膜成分などを取り除いた。培養細胞から得られたタンパク質試料は、ビシンコニン酸(ＢＣＡ）法を用いて定量し、２０μｇの溶解物を１２％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、転移溶液を用いてタンパク質をＰＶＤＦメンブレインに９０Ｖにて５０分間転移させた。そして、メンブレインのブロッキングは、５％脱脂乳含有ＴＢＳＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．６，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）溶液で常温で１時間行った。ｉＮＯＳの抗体としてのウサギポリクローナル抗ｉＮＯＳ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＣＯＸ２の抗体としてのウサギポリクローナル抗ＣＯＸ２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、アクチン（Ａｃｔｉｎ）の抗体としてのヤギポリクローナル抗アクチン（Ｓａｎｔａ−Ｃｕｒｚ）を５％脱脂乳含有ＴＢＳＴ（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０含有トリス緩衝生理食塩水）溶液に希釈して常温で１時間３０分間反応させた。ＴＢＳＴ溶液で３回洗浄した後、２次抗体としての西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）結合抗ヤギ、抗ウサギＩｇＧを５％脱脂乳含有ＴＢＳＴ溶液に希釈して常温で１時間反応させた。次いで、メンブレインをＴＢＳＴで３回洗浄した後、イモビロンウェスターンキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＷＢＫＬＳ０１００）を用いて１分間反応させてＬＡＳ−３０００分析装備で発色されたバンドの強度を確認した。
【００４３】
結果値は図５に示し、同図を参照すると、ＨＳＣＭの濃度が増加するにつれて炎症を引き起こすＮＯおよびＰＧＥ２に関わるｉＮＯＳタンパク質およびＣＯＸ２タンパク質の発現が次第に抑えられることが分かる。
【００４４】
比較例１：抗炎症成分（ＨＳＣＭ）含有培地において培養された臍帯血由来多分化能幹細胞から分泌された抗炎症成分および豆タンパク質加水分解物含有培地において培養された臍帯血由来多分化能幹細胞から分泌された抗炎症成分の比較
【００４５】
韓国公開特許第１０−２００９−００９０８５０号公報または韓国公開特許第１０−２０１３−０１０４９２４号公報において公開された豆加水分解物含有培地において培養された臍帯血由来多分化能幹細胞が分泌する成分のうち、抗炎症に関わる主な成分であるＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＧＭ−ＣＳＦおよびＭＩＰ−１αの含量を本発明に従い刺激および培養された臍帯血由来多分化能幹細胞から分泌する前記成分の含量と比較し、その結果は、表１にまとめて示す。
【００４６】
【表１】
2021526360.tif 000003
【００４７】
［表１］に示す結果値を参照すると、本発明に従い刺激および培養された臍帯血由来多分化能幹細胞は、主な抗炎症成分であるＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＧＭ−ＣＳＦおよびＭＩＰ−１αの含量が前記公開された特許に開示されている培養技術により培養された臍帯血由来多分化能幹細胞よりも、ＩＬ−８は８．８倍、ＩＬ−１０は５０倍、ＧＭ−ＣＳＦは２４倍およびＭＩＰ−１αは２９２７倍ほどさらに多く分泌されることが分かる。なお、ＩＬ−１８は前記特許に記載の臍帯血多分化能幹細胞からは分泌されなかったが、本発明に係る臍帯血多分化能幹細胞からは上記の表１でのように分泌された。
【００４８】
上述した本発明の説明は、単なる例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的な思想や必須的な特徴を変更することなく、他の具体的な形態へと容易に変形できることが理解できる筈である。よって、上述した実施形態は、あらゆる面において例示的なものに過ぎず、限定的ではないものと理解すべきである。例えば、単一型であると説明されている各構成要素は、分散されて実施されてもよく、同様に、分散されていると説明されている構成要素も、組み合わせられた形態に実施されてもよい。
【００４９】
本発明の範囲は、後述する特許請求の範囲によって表わされ、特許請求の範囲の意味及び範囲、並びにその均等概念から導き出されるあらゆる変更または変形された形態も本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【００５０】
以下では、添付図面に基づいて、本発明について詳しく説明する。しかしながら、本発明は、種々の異なる形態に具体化可能であり、したがって、ここで説明する実施形態に限定されるものではない。なお、図中、本発明を明確に説明するために、説明とは無関係な部分は省略し、明細書の全般に亘って、類似の部分には類似の図面符号を付している。
【００５１】
明細書の全般に亘って、ある部分が他の部分と「連結（接続、接触、結合）」されているとしたとき、これは、「直接的に連結」されている場合のみならず、これらの間に他の部材を挟んで「間接的に連結」されている場合も含む。なお、ある部分がある構成要素を「備える」としたとき、これは、特に断りのない限り、他の構成要素を除外するわけではなく、他の構成要素をさらに備えていてもよいことを意味する。
【００５２】
本明細書において用いた用語は、単に特定の実施形態を説明するために用いられたものであり、本発明を限定しようとする意図はない。単数の表現は、文脈からみて明らかに他の意味を有さない限り、複数の言い回しを含む。本明細書において、「含む」、「備える」または「有する」などの用語は、明細書に記載の特徴、数字、段階、動作、構成要素、部品またはこれらを組み合わせたものが存在することを指定するものに過ぎず、一つまたはそれ以上の他の特徴や数字、段階、動作、構成要素、部品またはこれらを組み合わせたものの存在または付加の可能性を予め排除しないものと理解すべきである。
【００５３】
以下、添付図面に基づいて、本発明の実施例について詳しく説明する。
【００５４】
本発明の一局面に係る抗炎症成分を分泌する臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法は、１）臍帯血から単球を分離するステップと、２）前記単球を培養して臍帯血由来多分化能幹細胞を得るステップと、３）前記得た臍帯血由来多分化能幹細胞を幹細胞抗炎症カスタムメイド培地において刺激するステップと、４）前記刺激された臍帯血由来多分化能幹細胞を洗浄するステップと、５）前記洗浄された臍帯血由来多分化能幹細胞を培養培地において培養するステップと、を含んでいてもよい。
【００５５】
前記臍帯血とは、出産の際にへその緒から出るへその緒の血液のことをいい、白血球と赤血球、血小板などを作る造血幹細胞を含有していてもよく、軟骨と骨、筋肉、神経などを作る間葉系幹細胞をも含んでいてもよい。
【００５６】
前記多分化能幹細胞とは、ある組織および器官に特異的な細胞にしか分化できない分化能力を有している幹細胞のことをいい、例えば、多分化能を有する細胞としては、造血幹細胞（ＨＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）などの成体幹細胞を含んでいてもよい。このような多分化能を有する成体幹細胞は、胎児期、新生児期および成体期の各組織および臓器の成長と発達はもとより、成体組織の恒常性の保持と組織損傷の際に再生を誘導する機能に関与することができる。
【００５７】
前記多分化能幹細胞は、色々な成分を分泌することができ、これらの成分が生体内の損傷された細胞や組織に働いて損傷された部位を好転させることができる。本発明の実施形態によれば、前記多分化能幹細胞は、損傷された細胞や組織を直接的に修復することもできるが、損傷された細胞が自滅しないように守り、血管を新たに作り、硬くなったタンパク質を分解して組織の機能を取り戻せるだけではなく、ここに必要な様々な生理因子を分泌することもできる（これをパラクリーン効果とも呼ぶ）。具体的に述べると、前記多分化能幹細胞は、肌の成長や再生に役立つ細胞成長因子と肌を有害活性酸素などから保護する抗酸化物質の分泌を促し、炎症を減らす物質または抗癌性物質などを分泌することができる。
【００５８】
本発明の実施形態によれば、前記得た臍帯血由来多分化能幹細胞を幹細胞抗炎症カスタムメイド培地において刺激するステップにおいては、幹細胞の抗炎症に関わるシグナル伝達機序を活性化させることができ、その結果、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１αなどの抗炎症成分の分泌を誘導することができる。すなわち、前記臍帯血由来多分化能幹細胞の色々なシグナル伝達機序の中でも特異的に抗炎症に関わるシグナル伝達機序を通常の状態よりもさらに活性化させることができ、その結果、抗炎症成分の分泌に適するように前記幹細胞の状態を変化させることができる。
【００５９】
本発明の実施形態によれば、前記幹細胞抗炎症カスタムメイド培地は、αＭＥＭまたはＩＭＤＭと、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＩＬ−６およびＭＥＭビタミンよりなる群から選ばれる少なくとも一つの成分と、を含んでいてもよい。
【００６０】
本発明の実施形態によれば、前記幹細胞抗炎症カスタムメイド培地は、αＭＥＭまたはＩＭＤＭは１０〜３０重量部を含み、かつ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＩＬ−６およびＭＥＭビタミンよりなる群から選ばれる少なくとも一つの成分は１×１０−８〜１７×１０−７を含んでいてもよい。
【００６１】
本発明の実施形態によれば、前記ＭＥＭビタミンは、塩化コリン、パントテン酸Ｄ−カルシウム、葉酸、ニコチンアミド、ピリドキサール塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩およびｉ−イノシトールから構成されてもよい好ましく、前記ＭＥＭビタミンは、全体の１ｍｌ当たりに８０〜１２０μｇの塩化コリン、８０〜１２０μｇのパントテン酸Ｄ−カルシウム、８０〜１２０μｇの葉酸、８０〜１２０μｇのニコチンアミド、８０〜１２０μｇのピリドキサール塩酸塩、８〜１２μｇのリボフラビン、８０〜１２０μｇのチアミン塩酸塩および１８０〜２２０μｇのｉ−イノシトールから構成されてもよい。
【００６２】
本発明の実施形態によれば、前記幹細胞抗炎症カスタムメイド培地は、αＭＥＭまたはＩＭＤＭは１０〜３０重量部を含み、ＴＧＦ−βは１×１０−８〜１７×１０−７重量部を含み、ＴＮＦ−αは１×１０−８〜１７×１０−７重量部を含み、ＩＬ−３は１×１０−８〜１７×１０−７重量部を含み、ＩＬ−６は１×１０−８〜１７×１０−７重量部を含み、かつ、ＭＥＭビタミンは１×１０−８〜１７×１０−７重量部を含んでいてもよい。
【００６３】
本発明の好適な実施形態によれば、前記幹細胞抗炎症カスタムメイド培地は、ＩＭＤＭは１５〜２５重量部を含み、ＴＧＦ−βは１×１０−８〜１×１０−７重量部を含み、ＴＮＦ−αは１×１０−８〜５×１０−８重量部を含み、ＩＬ−３は１×１０−８〜５×１０−８重量部を含み、ＩＬ−６は１×１０−８〜５×１０−８重量部を含み、かつ、ＭＥＭビタミンは８×１０−６〜１７×１０−６重量部を含んでいてもよい。
【００６４】
本発明の他の実施形態によれば、αＭＥＭまたはＩＭＤＭは４００〜６００ｍｌを含み、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−３、ＩＬ−６およびＭＥＭビタミンよりなる群から選ばれる少なくとも一つの成分は１〜１００ｐｇ／ｍｌを含んでいてもよい。
【００６５】
本発明のさらに他の実施形態によれば、ＩＭＤＭは４５０〜５５０ｍｌを含み、ＴＧＦ−βは１〜１００ｐｇ／ｍｌを含み、ＴＮＦ−αは１〜１００ｐｇ／ｍｌを含み、ＩＬ−３は１〜１００ｐｇ／ｍｌを含み、ＩＬ−６は１〜１００ｐｇ／ｍｌを含み、かつ、ＭＥＭビタミンは１〜１００ｐｇ／ｍｌを含んでいてもよい。さらに好ましくは、前記ＴＧＦ−βは１０〜１００ｐｇ／ｍｌを含み、前記ＴＮＦ−αは１０〜５０ｐｇ／ｍｌを含み、前記ＩＬ−３は１０〜５０ｐｇ／ｍｌを含み、前記ＩＬ−６は１０〜５０ｐｇ／ｍｌを含み、かつ、前記ＭＥＭビタミンは８０００〜１７０００ｐｇ／ｍｌを含んでいてもよい。
【００６６】
本発明の実施形態によれば、前記刺激するステップは、２０〜２８時間の間に行われてもよい。好ましくは、２３〜２５時間であってもよい。２０時間よりも短い時間の間に刺激をすると、本発明の実施形態に係る幹細胞が抗炎症成分を分泌するために十分に刺激されず、また、２８時間を超えて刺激すると、前記幹細胞が過剰に刺激を受けてしまう結果、抗炎症成分に加えて他の成分がさらに出て抗炎症の純度を下げてしまう虞がある。
【００６７】
本発明の実施形態によれば、前記刺激するステップは、３５〜３８℃で行われてもよい。好ましくは、３６〜３７．５℃で行われてもよい。３５℃よりも低い温度で幹細胞を刺激すると、細胞の全般的な活動が減って十分な刺激が行われない虞があり、３８℃よりも高い温度で幹細胞を刺激すると、細胞内酵素などの活性が阻害されて、その結果、細胞が死滅する虞があるため、本発明の実施形態に係る抗炎症物質の分泌が正常に行われない虞がある。
【００６８】
前記刺激された臍帯血由来多分化能幹細胞を洗浄するステップは、前記幹細胞抗炎症カスタムメイド培地において刺激するステップの後に、かつ、培養培地において培養するステップの前に、幹細胞抗炎症カスタムメイド培地を取り除くとともに、前記刺激するステップの間に前記臍帯血由来多分化能幹細胞から分泌される成分も一緒に取り除くステップである。前記刺激するステップにおいて、臍帯血由来多分化能幹細胞から分泌される成分は、本発明の目的である抗炎症作用にふさわしい成分ではないため、洗浄過程を通じて取り除かれなければならない。
【００６９】
前記洗浄された臍帯血由来多分化能幹細胞を培養培地において培養するステップは、前記刺激が完了してから洗浄ステップを経た臍帯血由来幹細胞から抗炎症成分を産生して分泌するようにするために培養するステップである。すなわち、前記培養するステップにおいて培養された臍帯血由来多分化能幹細胞が分泌する成分は、抗炎症作用を有する成分を含んでいてもよい。
【００７０】
本発明の実施形態によれば、前記抗炎症成分は、ＮＯ（Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ）の生成を抑えることができる。前記ＮＯは、血圧の調節、神経の伝達、血小板の凝集の抑制、免疫機能などの役割を果たすものであることが知られており、色々な組織と細胞においてＬアルギニンから一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）により合成され得る。前記ＮＯＳは、大きく、神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ：ｎｅｕｒｏｎａｌ  ＮＯＳ）、内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ：ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ＮＯＳ）と誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ：ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＮＯＳ）に分けられる。特に、前記ｉＮＯＳは、細胞内のカルシウムの濃度に対して非依存性を示し、大食細胞、血管平滑筋細胞、内皮細胞、肝細胞と心筋細胞など色々な細胞においてＬＰＳ、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−１とＴＮＦ−αなどの刺激により活性化されて長い時間に亘って多量のＮＯを生成することができる。しかしながら、ＮＯが過剰に生成されると、ショックによる血管の拡張、炎症反応により引き起こされる組織の損傷、神経組織の損傷などを引き起こして生体に有害な作用を示す虞がある。
【００７１】
図２を参照すると、本発明の実施形態に係る臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法を用いて、幹細胞から分泌された抗炎症成分（ＨＳＣＭ）がＮＯの生成量を抑えることができるということが分かる。
【００７２】
本発明の実施形態によれば、前記抗炎症成分は、ｉＮＯＳ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）の発現レベルを抑えることにより、ＮＯの生成を抑えることができる。これは、図４および図５を参照すると、前記抗炎症成分がｉＮＯＳの遺伝子発現を抑えるだけではなく、それによるタンパク質の発現まで抑えることができるということを示唆する。
【００７３】
本発明の他の実施形態によれば、前記抗炎症成分は、ＰＧＥ２（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２）の生成を抑えることができる。前記ＰＧＥ２は、前記ＮＯのように炎症媒介物質の一つであり、血管の拡張、浮腫、発熱、疼痛などを媒介する虞がある。また、炎症疾患においてマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）の生成を誘導して組織の損傷に関与する虞があり、関節リウマチ患者から得た大食細胞において多量のＰＧＥ２が生成され、生成されたＰＧＥ２は、関節リウマチにおける炎症反応と組織の破壊前に重要な役割を果たす虞がある。前記ＰＧＥ２の合成は、ホスホリパーゼＡ２の酵素の作用により膜りん脂質からアラキドン酸が作られることから始まる。アラキドン酸は、酵素の作用によりプロスタグランジンＧ２となり、再び不安定な代謝産物であるプロスタグランジンＨ２となるが、これらの二つの過程は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）により促される。ＣＯＸには二種類以上の同位酵素（アイソザイム）が存在するが、これらのうち、ＣＯＸ１は持続的に発現させ続けて血小板の凝集、胃粘膜の保護、新機能の調節などの生理的な機能を司り、ＣＯＸ２は炎症などの刺激により発現し、したがって、ＣＯＸ２により生成されたプロスタグランジンが炎症反応と細胞の増殖に関与することができる。
【００７４】
図２を参照すると、本発明の実施形態に係る臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法を用いて、幹細胞から分泌された抗炎症成分（ＨＳＣＭ）がＰＧＥ２の生成量を抑えることができるということが分かる。
【００７５】
本発明の実施形態によれば、前記抗炎症成分は、ＣＯＸ２（Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ２）の発現レベルを抑えることにより、前記ＰＧＥ２を抑えることができる。これは、図４および図５を参照すると、前記抗炎症成分がＣＯＸ２の遺伝子発現を抑えるだけではなく、それによるタンパク質の発現まで抑えることができるということを示唆する。
【００７６】
本発明の実施形態によれば、前記培養培地は、αＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２およびＭｅｄｉｕｍ  １９９よりなる群から選ばれる一つの培養液と、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ＭＥＭビタミンおよびヒトアルブミンよりなる群から選ばれる少なくとも一つの成分と、を含んでいてもよい。
【００７７】
本発明の実施形態によれば、前記培養培地は、αＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２およびＭｅｄｉｕｍ  １９９よりなる群から選ばれる一つは１０〜３０重量部を含み、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ＭＥＭビタミンおよびヒトアルブミンよりなる群から選ばれる少なくとも一つの成分は１×１０−６〜５×１０−２重量部を含んでいてもよい。
【００７８】
本発明の他の実施形態によれば、前記培養培地は、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９は１０〜３０重量部を含み、インスリンは１×１０−６〜５×１０−２重量部を含み、トランスフェリンは１×１０−６〜５×１０−２重量部を含み、亜セレン酸ナトリウムは１×１０−６〜５×１０−２重量部を含み、ＭＥＭビタミンは１×１０−６〜５×１０−２重量部を含み、かつ、ヒトアルブミンは１×１０−６〜５×１０−２重量部を含んでいてもよい。
【００７９】
本発明の好適な実施形態によれば、前記培養培地は、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９は１５〜２５重量部を含み、インスリンは１×１０−３〜５×１０−２重量部を含み、トランスフェリンは１×１０−３〜５×１０−２重量部を含み、亜セレン酸ナトリウムは１×１０−６〜５×１０−５重量部を含み、ＭＥＭビタミンは８×１０−６〜１７×１０−６重量部を含み、かつ、ヒトアルブミンは５×１０−３〜１５×１０−３重量部を含んでいてもよい。
【００８０】
本発明の他の実施形態によれば、前記培養培地は、αＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２およびＭｅｄｉｕｍ  １９９よりなる群から選ばれる一つの培養液は４００〜６００ｍｌを含み、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ＭＥＭビタミンおよびヒトアルブミンよりなる群から選ばれる少なくとも一つの成分は０．００１〜５０μｇ／ｍｌを含んでいてもよい。
【００８１】
本発明の好適な実施形態によれば、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９は４５０〜５５０ｍｌを含み、インスリンは１〜５０μｇ／ｍｌを含み、トランスフェリンは１〜５０μｇ／ｍｌを含み、亜セレン酸ナトリウムは０．００１〜０．０５μｇ／ｍｌを含み、ＭＥＭビタミンは０．００８〜０．０１７μｇ／ｍｌを含み、かつ、ヒトアルブミンは５〜１５μｇ／ｍｌを含んでいてもよい。
【００８２】
本発明の他の一局面に係る抗炎症組成物は、前記臍帯血由来多分化能幹細胞の培養方法により培養された幹細胞が分泌する培養液を含んでいてもよい。
【００８３】
本発明の実施形態によれば、前記抗炎症組成物は、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＧＭ−ＣＳＦおよびＭＩＰ−１αよりなる群から選ばれる少なくとも一つを含んでいてもよい。好ましくは、前記抗炎症組成物は、ＩＬ−８は４０〜５０重量部を含み、ＩＬ−１０は０．０５〜０．０７重量部を含み、ＩＬ−１８は１〜２重量部を含み、ＧＭ−ＣＳＦは０．４〜０．６重量部を含み、かつ、ＭＩＰ−１αは２０〜３０重量部を含んでいてもよい。
【００８４】
本発明の他の実施形態によれば、前記抗炎症組成物は、ＩＬ−８は４０〜５０ｎｇ／ｍｌを含み、ＩＬ−１０は０．０５〜０．０７ｎｇ／ｍｌを含み、ＩＬ−１８は１〜２ｎｇ／ｍｌを含み、ＧＭ−ＣＳＦは０．４〜０．６ｎｇ／ｍｌを含み、かつ、ＭＩＰ−１αは２０〜３０ｎｇ／ｍｌを含んでいてもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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