(57)【要約】  本発明は、筋疾患を治療及び/若しくは予防することにおける使用のための、並びに/又は筋肉再生における使用のための、アミノ酸配列RGDX1X2X3X4(ここで、X1からX4は独立して選択されるアミノ酸である)を含む結合ペプチドに結合したアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドポリペプチドに関する。本発明は更に、前記AAVカプシドポリペプチドに関するポリヌクレオチド、宿主細胞、アデノ随伴ウイルス(AAV)カプシド、医薬組成物、使用、及び方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋疾患を治療及び/若しくは予防することにおける使用のための、並びに/又は筋肉再生における使用のための、アミノ酸配列RGDX1X2X3X4(配列番号1)(ここで、X1からX4は独立して選択されるアミノ酸である)を含む結合ペプチドに結合したアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドポリペプチドであって、好ましくは前記結合ペプチドが、前記AAVカプシドポリペプチドに共有結合する、AAVカプシドポリペプチド。
【請求項２】
前記結合ペプチドが、前記AAVカプシドポリペプチドのアミノ酸配列に挿入される、請求項1に記載の使用のためのAAVカプシドポリペプチド。
【請求項３】
X1、X2、及びX3が、L、G、V、及びAから独立して選択され、X4が、S、V、A、G、又はLであり、好ましくはX2及びX3のうちの少なくとも1つがGである、請求項1又は2に記載の使用のためのAAVカプシドポリペプチド。
【請求項４】
前記結合ペプチドが、アミノ酸配列RGDLGLS(配列番号2)又はRGDAVGV(配列番号3)を含む、好ましくはそれからなる、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用のためのAAVカプシドポリペプチド。
【請求項５】
結合ペプチドの挿入部位が、AAV9カプシドポリペプチドのアミノ酸588又は589、好ましくは588に対応する、請求項2から4のいずれか一項に記載の使用のためのAAVカプシドポリペプチド。
【請求項６】
AAV9におけるP504A及び/又はG505Aアミノ酸交換に対応する交換を更に含む、好ましくはAAV9におけるP504A及びG505Aアミノ酸交換に対応するアミノ酸交換を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用のためのAAVカプシドポリペプチド。
【請求項７】
AAV9カプシドポリペプチドである、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用のためのAAVカプシドポリペプチド。
【請求項８】
前記筋肉が、横紋筋、好ましくは心臓又は骨格筋又は横隔膜である、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用のためのAAVカプシドポリペプチド。
【請求項９】
前記筋疾患が、筋ジストロフィー、心筋症、筋強直症、筋委縮症、ミオクローヌスジストニア、ミトコンドリアミオパチー、横紋筋融解症、線維筋痛症、及び/又は筋筋膜性疼痛症候群である、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用のためのAAVカプシドポリペプチド。
【請求項１０】
筋疾患を治療及び/若しくは予防することにおける使用のための、並びに/又は筋肉再生における使用のための、請求項2から7のいずれか一項に記載のAAVカプシドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
筋疾患を治療及び/若しくは予防することにおける使用のための、並びに/又は筋肉再生における使用のための、請求項1から9のいずれか一項に記載のAAVカプシドポリペプチド又は請求項10に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１２】
筋疾患を治療及び/若しくは予防することにおける使用のための、並びに/又は筋肉再生における使用のための、実施形態1から9のいずれか1つに記載のAAVカプシドポリペプチドを含むAAVカプシド。
【請求項１３】
筋疾患を治療及び/若しくは予防することにおける使用のための、並びに/又は筋肉再生における使用のための、請求項1から9のいずれか一項に記載のAAVカプシドポリペプチド、請求項10に記載のポリヌクレオチド、請求項11に記載の宿主細胞、及び/又は請求項12に記載のAAVカプシドを含む医薬組成物。
【請求項１４】
活性な化合物を筋細胞に移入するための、請求項1から9のいずれか一項に記載のAAVカプシドポリペプチド、請求項10に記載のポリヌクレオチド、請求項11に記載の宿主細胞、及び/又は請求項12に記載のAAVカプシドの使用。
【請求項１５】
非治療的使用、好ましくはin vitroにおける使用である、請求項14に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋疾患を治療及び/若しくは予防することにおける使用のための、並びに/又は筋肉再生における使用のための、アミノ酸配列RGDX1X2X3X4(配列番号1)(ここで、X1からX4は独立して選択されるアミノ酸である)を含む結合ペプチドに結合したアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドポリペプチドに関する。本発明は更に、前記AAVカプシドポリペプチドに関するポリヌクレオチド、宿主細胞、アデノ随伴ウイルス(AAV)カプシド、医薬組成物、使用、及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターは、様々な細胞型において、治療遺伝子を含む外来DNAの移入及び長期発現を可能にすることが知られている。異なる血清型のAAVは、培養細胞において及び生物内で異なる指向性（tropism）を有することが示されており、例えばAAV9は最も広範な指向性を有する。未改変カプシドを含むAAVベクターを用いて得ることができる形質導入効率及び細胞特異性は、一部の細胞型については良好であるが、他の大半の細胞型についてはあまりにも低いため、実験的に又は治療的に有用でない。AAVを再標的化することにおける更なる問題は、カプシドタンパク質に対してアミノ酸交換及び/又は追加のペプチドを含めることによってAAV株に新たな特異性を付与することが可能であり得るが、多くの場合、AAVの主要な標的である肝臓に対してかなりの感染力が残存していることであり、これは大半の適用に関して望ましいものではない。
【０００３】
過去10年にわたって、多くの新規合成AAVバリアントが様々なカプシド操作技術を使用することによって登場しており、そのうちの1つは、可変領域VIII(VRVIII)と呼ばれるカプシドタンパク質の曝露されたループへの7アミノ酸長の低分子ペプチドの挿入である。野生型カプシドへの新規ペプチドの導入は、バリアントの指向性を永続的に変化させるために非常に有望であることが示されている。AAV9のカプシド遺伝子へのペプチドP1(RGDLGLS)の挿入は、星細胞(Eike Kienleの博士論文、Ruprecht-Karls-Universitat Heidelberg, 2014を参照のこと)及び原発性乳癌細胞(Michelfelder et al. (2009))の感染を増加させることが見出された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
AAV感染に関する1つの望ましい標的は筋細胞である。これらの細胞に関する改善された感染力を有する様々なAAVバリアントが提供されている(Yu et al (2009)、Choudhury et al (2016)、及びYang et al (2009))が、それでもなお、これらの細胞を標的とする改善されたAAVベクターに対する必要性が当技術分野に依然として存在する。したがって、本発明の目的は、前述の必要性を満たし、先行技術の欠点を少なくとも部分的に回避する手段及び方法を提供することである。この課題は、本発明の化合物、方法、及び使用によって解決される。個別に、又は任意の組合せにおいて実現され得る実施形態は、従属請求項に列挙される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、本発明は、筋疾患を治療及び/若しくは予防することにおける使用のための、並びに/又は筋肉再生における使用のための、アミノ酸配列RGDX1X2X3X4(配列番号1)(ここで、X1からX4は独立して選択されるアミノ酸である)を含む結合ペプチドに結合したアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドポリペプチドに関する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１−１】筋肉バリアントの組織特異性。分析した組織におけるAAV9_P1、AAV9wt、AAVpo1wt、AAVpo1_A1、及びAAV6wtの細胞1個当たりの正規化した割合が示される。略語:腹部大動脈(Aa)、胸部大動脈(At)、脳(B)、血液細胞(BlC)、結腸(C)、横隔膜(Di)、十二指腸(Du)、眼(Eye)、褐色脂肪(FatB)、白色脂肪(FatW)、心臓(H)、内耳(I)、腎臓(K)、肝臓(Li)、肺(Lu)、卵巣(O)、膵臓(P)、大腿四頭筋(QF)、脾臓(S)、及び胃(St)。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図１−３】図１−２の続きである。
【図２−１】筋組織における効率性比較。横隔膜、心臓、及び大腿四頭筋における上位15種のバリアントについて正規化した割合が示される。略語は図1と同様。
【図２−２】図２−１の続きである。
【図３−１】筋肉バリアントの組織特異性。分析した組織におけるAAV9_P1、AAV9wt、AAV6wt、AAVpo1wt、AAVpo1_A1、及びAAV9_P3の細胞1個当たりの正規化した割合が示される。略語は図1と同様。
【図３−２】図３−１の続きである。
【図３−３】図３−２の続きである。
【図４−１】筋肉バリアントの組織特異性。分析した組織におけるAAVM41、AAVB1、AAV2_MTP、AAV9_K3、及びAAV9LDの細胞1個当たりの正規化した割合が示される。略語は図1と同様。
【図４−２】図４−１の続きである。
【図４−３】図４−２の続きである。
【図５−１】筋組織におけるAAV9_P1の効率性。棒グラフは、横隔膜、心臓、二頭筋、及び大腿四頭筋における上位15種のAAVバリアントの正規化した割合を示す。略語は図1と同様。
【図５−２】図５−１の続きである。
【図５−３】図５−２の続きである。
【図６−１】筋肉特異的バリアントのcDNA分析。AAV9_P1、AAVpo1_A1、AAVpo1wt、AAV9wt、及び未注射対照のEYFP相対量を示す。示した値は、3匹のマウスの平均とSDである。AAV9wtに関して、1匹のマウスは、分析した組織のいずれにもウイルス転写物が存在しなかったため、除外しなければならなかった。
【図６−２】図６−１の続きである。
【図６−３】図６−２の続きである。
【図７】ペプチド挿入の周囲のアミノ酸を示す、筋肉バリアントのペプチド挿入部位の概要。AAV9_P1、AAV9_P3、AAVpo1_A1、及びAAV9_K3の隣接するアミノ酸を変化させて、SfiIにより媒介されるペプチド挿入クローニングを可能にした。
【図８−１】筋肉特異的バリアントのcDNA分析。qPCRによって決定されるeGFP相対定量(RQ=2-eGFP及びRNA polIIのΔCT)が示される。示した値は、以下のバリアント:AAV9wt、AAVS1_P1、AAVS10_P1、AAVH15_P1、及びAAVD20_P1のそれぞれに関する3匹のマウスの平均と範囲である。マウスに2.5×1011vgの対応するAAVバリアントを注射した。QF:大腿四頭筋。
【図８−２】図８−１の続きである。
【図８−３】図８−２の続きである。
【図９−１】筋肉特異的バリアントのゲノム(g)DNA分析。eGFP及びRPP30のddPCRによって決定される、二倍体ゲノム1つ当たりのウイルスゲノム(vg/dg)値が示される。示した値は、以下のバリアント:AAV9wt、AAVS1_P1、AAVS10_P1、AAVH15_P1、及びAAVD20_P1のそれぞれに関する3匹のマウスの平均と範囲である。マウスに2.5×1011vgの対応するAAVバリアントを注射した。QF:大腿四頭筋。
【図９−２】図９−１の続きである。
【図９−３】図９−２の続きである。
【図１０】肝臓及び骨格筋(大腿四頭筋)における、AAVS10_P1によって媒介されたeGFP発現(レポーター)と、AAV9wt及びAAV9_P1によって媒介されたeGFP発現(レポーター)との、免疫ブロッティングを用いることによる比較。各レーンは、等用量(2.5×1011のウイルスゲノム)を尾静脈に注射した(バリアント1種当たり3匹のマウス)、1匹のマウスを表すものである。AAVS10_P1は、AAV9及びAAV9_P1と比較して、肝臓からの脱ターゲティング(detargeting)の向上及び骨格筋における発現の増加を示す。総タンパク質を、BCA(ビシンコニン酸(Bicinchonic acid))タンパク質アッセイを使用して定量し、対応する組織から抽出したタンパク質試料の等しいローディングを確実にした。
【図１１】1ラウンド(A)及び2ラウンド(B)の選択後の、骨格筋、心臓、及び横隔膜における、ランダム化AAV9ライブラリから富化した配列スペースの配列ロゴ。
【図１２−１】AAV9wt(A)に関する、AAV9S1_P1(B)及びAAV9S10_P1(C)と比較した、より多くの器官が分析された、図8と同様の筋肉特異的バリアントのcDNA分析;(D)AAV9と比較した、肝臓における表示されたAAVバリアントの相対的体内分布。
【図１２−２】図１２−１の続きである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
下記で使用される場合、用語「有する(have)」、「含む(comprise)」若しくは「含む(include)」、又はそれらのあらゆる任意の文法的な変化形は、非排他的な方法で使用される。したがって、これらの用語は、これらの用語によって導入される特徴以外のいかなる更なる特徴も、この文脈において説明される実体に存在しない状況、及び1つ以上の更なる特徴が存在する状況の両方を意味し得る。一例として、「AはBを有する」、「AはBを含む(comprise)」、及び「AはBを含む(include)」という表現は、B以外のいかなる他の要素もAに存在しない状況(すなわち、Aが単独的及び排他的にBからなる状況)、並びにBに加えて1つ以上の更なる要素、例えば要素C、要素C及び要素D、又はなお更なる要素が実体Aに存在する状況の両方を意味し得る。
【０００８】
更に、下記で使用される場合、用語「好ましくは」、「より好ましくは」、「最も好ましくは」、「特に」、「より特に」、「具体的には」、「より具体的には」、又は同様の用語は、任意選択的な特徴と併せて使用され、更なる可能性を制限するものではない。したがって、これらの用語によって導入される特徴は、任意選択的な特徴であり、決して特許請求の範囲を制限することを意図するものではない。本発明は、当業者が認識するように、代替的な特徴を使用することによって実施してもよい。同様に、「本発明の一実施形態において」又は同様の表現によって導入される特徴は、任意選択的な特徴であり、本発明の更なる実施形態に関するいかなる制限もなく、本発明の範囲に関するいかなる制限もなく、またそのように導入された特徴を本発明の他の任意選択的特徴又は非任意選択的特徴と組み合わせる可能性に関するいかなる制限もないことが意図される。
【０００９】
本明細書で使用される場合、用語「標準状態」は、別段の言及がない限り、IUPAC標準環境温度及び圧力(SATP)状態、すなわち、好ましくは25℃の温度及び100kPaの絶対圧に関し、更に好ましくは、標準状態は7のpHを含む。更に、別段の指示がない限り、用語「約」は、関連分野において一般的に認められている技術的精度で表示される値に関し、好ましくは、表示値±20%、より好ましくは±10%、最も好ましくは±5%に関する。更に、用語「本質的に」は、表示される結果又は使用に影響を与える逸脱（deviation）が存在しない、すなわち、潜在的逸脱が、表示される結果を±20%、より好ましくは±10%、最も好ましくは±5%を超えて逸脱させないことを示す。したがって、「から本質的になる」は、明記された構成成分を含むが、不純物として存在する物質、明記された構成成分を提供するために使用した処理の結果として存在する避けられない物質、及び本発明の技術的効果を達成すること以外の目的のために添加された構成成分を除く他の構成成分を除外することを意味する。例えば、句「から本質的になる」を使用して定義される組成物は、任意の公知の許容可能な添加剤、賦形剤、希釈剤、担体等を包含する。好ましくは、1組の構成成分から本質的になる組成物は、5重量%未満、より好ましくは3重量%未満、更により好ましくは1%未満、最も好ましくは0.1重量%未満の明記されていない構成成分を含むだろう。核酸配列の文脈において、用語「本質的に同一」は、少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性%値を示す。理解されるように、本質的に同一という用語は100%の同一性を含む。上記は、必要な変更を加えて用語「本質的に相補的」に適用される。誤解を避けるために記すと、単数形で化合物に言及する表現(例えば「カプシド(a capsid)」)は、前記化合物の単数の事例を意味し得るが、前記化合物の複数の事例も意味し得る。
【００１０】
本明細書で使用される場合、用語「アデノ随伴ウイルス」又は「AAV」は、短い(およそ4.7kB)一本鎖DNAを含有し、溶解複製においてアデノウイルスの存在に依存するウイルスの群に関する。AAVは、パルボウイルス科のウイルスのメンバーである。AAVに由来するベクター、すなわち、AAVのカプシドポリペプチドを使用して組換えポリヌクレオチドの標的細胞への移入を媒介する遺伝子移入ビヒクルも本発明によって企図される。用語「AAVカプシドポリペプチド」は、本明細書で意味する場合、AAV粒子のタンパク質の殻を生成する自己集合活性を有するポリペプチドに関し、コートタンパク質又はVPタンパク質とも称される。所与の細胞における全てのAAVカプシドポリペプチド分子が集合してAAVカプシドとなるわけではないことが理解されるべきである。好ましくは、全てのAAVカプシドポリペプチド分子の少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%が集合してAAVカプシドとなる。この生物活性を測定するのに好適なアッセイは、例えばSmith-Arica and Bartlett (2001), Curr Cardiol Rep 3(1): 43-49に記載されている。好ましくは、AAVカプシドポリペプチドは、AAV9(Genbankアクセッション番号AAS99264.1)、AAV1(Genbankアクセッション番号AAD27757.1)、AAV2(Genbankアクセッション番号AAC03780.1)、AAV3(Genbankアクセッション番号AAC55049.1)、AAV3b(Genbankアクセッション番号AF028705.1)、AAV4(Genbankアクセッション番号AAC58045.1)、AAV5(Genbankアクセッション番号AAD13756.1)、AAV6(Genbankアクセッション番号AF028704.1)、AAV7(Genbankアクセッション番号AAN03855.1)、AAV8(Genbankアクセッション番号AAN03857.1)、AAV10(Genbankアクセッション番号AAT46337.1)、AAVrh10(Genbankアクセッション番号AY243015.1)、AAV11(Genbankアクセッション番号AAT46339.1)、AAV12(Genbankアクセッション番号ABI16639.1)、又はAAV13(Genbankアクセッション番号ABZ10812.1)、AAVpo1(Genbankアクセッション番号FJ688147.1)のカプシドポリペプチドである。より好ましくは、AAVカプシドポリペプチドは、AAV9(Genbankアクセッション番号AAS99264.1)のカプシドポリペプチドである。
【００１１】
AAVカプシドポリペプチドという用語は、本明細書で使用される場合、好ましくは前記カプシドポリペプチドのポリペプチドバリアントを含む。本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチドバリアント」は、本明細書の他の箇所に明記される少なくとも1つのポリペプチド又は融合ポリペプチドを含み、示される活性を有するが、上に示した前記ポリペプチド又は融合ポリペプチドとは一次構造が異なる任意の化学分子に関する。したがって、ポリペプチドバリアントは、好ましくは、示される活性を有する突然変異タンパク質である。好ましくは、ポリペプチドバリアントは、上に明記したポリペプチドに含まれる、500〜1000個、より好ましくは650〜800個、更により好ましくは700〜770個、又は最も好ましくは710〜750個の連続するアミノ酸のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチドを含む。更に、前述のポリペプチドの更なるポリペプチドバリアントも包含される。そのようなポリペプチドバリアントは、特定のポリペプチドと少なくとも本質的に同じ生物活性を有する。更に、本発明に従って言及されるポリペプチドバリアントは、少なくとも1つのアミノ酸置換、欠失、及び/又は付加のために異なるアミノ酸配列を有するものとし、バリアントのアミノ酸配列は、依然として、好ましくは、特定のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、又は99%同一であることが理解されるべきである。2つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、当技術分野において周知のアルゴリズムによって決定することができる。好ましくは、同一性の程度は、比較ウィンドウにわたり2つの最適にアラインメントされた配列を比較することによって決定されるべきであり、ここで、比較ウィンドウにおけるアミノ酸配列の断片は、最適アラインメントのために比較される配列と比較して、付加又は欠失(例えば、ギャップ又はオーバーハング)を含み得る。パーセンテージは、好ましくはポリペプチドの全長にわたって、両方の配列において同一のアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して、一致する位置の数を得て、一致する位置の数を比較のウィンドウ内の位置の総数で割り、結果に100を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。比較のための配列の最適アラインメントは、Smith and Waterman (1981)の局所的相同性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman (1988)の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WIにおけるGAP、BESTFIT、BLAST、PASTA、及びTFASTA)、又は目視検査によって行ってもよい。比較のための2つの配列が同定されている場合は、GAP及びBESTFITが、好ましくは、それらの最適アラインメント、及びしたがって同一性の程度を決定するために用いられる。好ましくは、ギャップウェイト（gap weight）について5.00、及びギャップウェイトレングス（gap weight length）について0.30のデフォルト値が使用される。本明細書で言及されるポリペプチドバリアントは、対立遺伝子バリアント、又は任意の他の種特異的ホモログ、パラログ、若しくはオルソログであり得る。更に、本明細書で言及されるポリペプチドバリアントには、特定のポリペプチドの断片又は前述の種類のポリペプチドバリアントが含まれる(これらの断片及び/又はバリアントが、上で言及した生物活性を有する限り)。そのような断片は、例えば、ポリペプチドの分解産物若しくはスプライスバリアントであり得るか、又はそれに由来し得る。非天然アミノ酸を含むことによって、及び/又はペプチド模倣物であることによって、翻訳後修飾、例えば、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、スモ化（sumoylation）、又はミリスチル化のために異なるバリアントが更に含まれる。
【００１２】
好ましくは、AAVカプシドポリペプチドバリアントはキメラカプシドポリペプチドである。用語「キメラ」は、少なくとも2つの異なる種又は株を起源とする構成成分から構成される任意の分子に関すると当業者によって理解される。したがって、好ましくは、カプシドポリペプチドバリアントは、少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つのAAV株、より好ましくは本明細書の他の箇所に明記されるAAV株のカプシドポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、カプシドポリペプチドバリアントは、少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つのAAV株のカプシドポリペプチドに由来する、少なくとも5個、好ましくは少なくとも10個、より好ましくは少なくとも20個の連続したアミノ酸のアミノ酸配列を含む。好ましくは、前記キメラカプシドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、原則として当業者に公知の技術であるDNAシャッフリングによって生成した。
【００１３】
用語「結合ペプチド」は、本明細書で使用される場合、配列RGDX1X2X3X4(配列番号1)(ここで、X1からX4は独立して選択されるアミノ酸である)(配列番号1)を含む、好ましくはそれからなるペプチドに関する。本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、人工、すなわち天然に存在しないα-アミノ酸を含むα-アミノカルボン酸に関する。好ましくは、アミノ酸は天然に存在するアミノ酸である。好ましくは、アミノ酸は、L-α-アミノ酸、より好ましくは天然に存在するL-α-アミノ酸、最も好ましくはタンパク質を構成する（proteinogenic）アミノ酸、すなわち、好ましくは、タンパク質生合成中にポリペプチドに自然に組み込まれるアミノ酸である。好ましくは、配列番号1による結合ペプチドにおいて、X1、X2、及びX3は、L、G、V、及びAから独立して選択され、X4は、S、V、A、G、又はLである。好ましい実施形態において、X1は、L、Q、D、H、M、P、及びKから選択され、好ましくはLであり、X2は、G、V、S、D、M、及びNから選択され、好ましくはGであり、X3は、V、M、P、S、及びDから選択され、好ましくはVであり、並びに/又はX4は、S、N、L、H、及びMから選択され、好ましくはSである。更に好ましい実施形態において、配列番号1による結合ペプチドにおいて、X1はLである。更に好ましい実施形態において、配列番号1による結合ペプチドにおいて、X2はGである。更に好ましい実施形態において、配列番号1による結合ペプチドにおいて、X4はSである。更に好ましい実施形態において、X1はLであり、X2はG及びVから選択され、好ましくはGであり、X3はVであり、並びに/又はX4はS及びLから選択され、好ましくはSである。更に好ましい実施形態において、配列番号1による結合ペプチドにおいて、X1はLであり、X2はGであり、及び/又はX4はSである。より好ましくは、配列番号1による結合ペプチドにおいて、X2及びX3のうちの少なくとも1つはGである。更により好ましくは、結合ペプチドは、アミノ酸配列RGDLGLS(配列番号2)、RGDAVGV(配列番号3)、及び/又は上記の特定の配列のうちの1つと比較して最大2つ、好ましくは最大1つのアミノ酸置換を含む配列を含む、好ましくはそれからなる。更により好まし
くは、結合ペプチドは、アミノ酸配列RGDLGLS(配列番号2)及び/又はRGDAVGV(配列番号3)を含む、好ましくはそれからなる。更により好ましくは、結合ペプチドは、アミノ酸配列RGDLGLS(配列番号2)を含む、好ましくはそれからなるか、又は結合ペプチドは、アミノ酸配列RGDAVGV(配列番号3)を含む、好ましくはそれからなる。更により好ましくは、結合ペプチドは、アミノ酸配列RGDLGLS(配列番号2)、及び/又は前記配列と比較して最大2つ、好ましくは最大1つのアミノ酸置換を含む配列を含む、好ましくはそれからなる。最も好ましくは、結合ペプチドは、アミノ酸配列RGDLGLS(配列番号2)を含む、好ましくはそれからなる。
【００１４】
結合ペプチドは、AAVカプシドポリペプチドに結合する。本明細書で使用される場合、「結合する」という表現は、最大10-5mol/lの解離定数Kd(Strep-Tag:Strep-Tactin結合の場合)を有する、結合ペプチドとAAVカプシドポリペプチドとの間の化学的会合に関する。好ましくは、前記Kdは、最大10-6mol/l(Strep-TagII:Strep-Tactin結合における場合)、より好ましくは最大10-7mol/l(典型的には抗体:抗原結合における場合)、更により好ましくは最大10-8mol/l、最も好ましくは最大10-10mol/l(ストレプトアビジン:ビオチン結合に関する場合)である。例えば、好ましくは、ビオチンコンジュゲート結合ペプチドは、ストレプトアビジンコンジュゲートAAVカプシドポリペプチドに結合するために使用され得る。解離定数を決定する方法は、当業者に周知であり、例えば、分光学的滴定法、表面プラズモン共鳴測定、平衡透析等が挙げられる。
【００１５】
好ましくは、結合ペプチドは、AAVカプシドポリペプチドに共有結合し、したがって、好ましくは、結合ペプチドをAAVカプシドポリペプチドに接続する少なくとも1つの共有化学結合が存在する。理解されるように、共有結合は間接的、例えばリンカー分子の原子を介してもよい。好ましくは、結合ペプチドをAAVカプシドポリペプチドに接続する原子の鎖は、最大20の共有結合、より好ましくは最大10の共有結合、更により好ましくは最大5つの共有結合を含む。最も好ましくは、結合ペプチドは、AAVカプシドポリペプチドに直接結合する。
【００１６】
好ましくは、結合ペプチドは、AAVカプシドポリペプチドに挿入される、すなわち、好ましくは、結合ペプチドは、N末端においてAAVカプシドポリペプチドに対する直接共有結合、及びC末端においてAAVカプシドポリペプチドに対する直接共有結合を有し、AAVカプシドポリペプチドのアミノ酸配列を中断する。したがって、好ましくは、結合ペプチド及びAAVカプシドポリペプチドは配列において連続的である。したがって、本発明はまた、上に明記したアミノ酸配列RGDX1X2X3X4(配列番号1)を含む挿入された結合ペプチドを含むアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドポリペプチドに関する。好ましくは、結合ペプチドは、AAVカプシドの外部に曝露されたカプシドポリペプチドの部位に、好ましくは構造予測及び/又は実験データに基づいて挿入される。より好ましくは、結合ペプチドの挿入部位は、カプシド集合における前記ポリペプチドの活性に干渉しないようにAAVカプシドの外部に曝露された部位である。より好ましくは、結合ペプチドの挿入部位は、AAV9カプシドポリペプチドのアミノ酸588又は589、好ましくは588に対応する。AAVカプシドポリペプチドにおける挿入部位がAAV9カプシドポリペプチドにおける挿入部位に対応するかどうかは、当業者によって公知の方法により、好ましくはカプシドポリペプチドのアミノ酸を好ましくは本明細書の他の箇所に明記されるようにアラインメントすることにより、立証することができる。好ましい実施形態において、挿入部位は、上記アミノ酸に対応し、任意選択で、表1に示す隣接する改変アミノ酸を有する。当業者によって表1から理解されるように、AAV9カプシドポリペプチドのアミノ酸588又は589、好ましくは588に対応する結合ペプチドの挿入部位は、好ましくは、実際のAAVカプシドポリペプチドのアミノ酸567〜594の挿入部位である。したがって、好ましい挿入部位は、AAV9における588又は589、より好ましくは588、及びキメラAAVポリペプチドにおける587、588、又は589、特に配列番号28、30、32、及び34において使用されるものである。好ましい実施形態において、配列番号1の配列は、N末端がアミノ酸S若しくはR及びG、すなわちSG又はRGと隣接し、C末端がカプシドポリペプチドにおけるAと隣接する。
【００１７】
【表１】
2021521833.tif 000002
【００１８】
最も好ましくは、AAVカプシドポリペプチドはAAV9カプシドポリペプチドであり、結合ペプチドの挿入部位はアミノ酸588又は589、好ましくは588である。誤解を避けるために記すと、本明細書で使用される場合、挿入部位はアミノ酸Xであるという表示は、結合ペプチドがアミノ酸XとX+1との間に挿入されること、すなわち、好ましくは、結合ペプチドが表示されたアミノ酸の後ろに挿入されることを意味する。
【００１９】
好ましくは、挿入された結合ペプチドを含むAAVカプシドポリペプチドは、好ましくは配列番号13を含むポリヌクレオチドによってコードされる配列番号12のアミノ酸配列、好ましくは配列番号15を含むポリヌクレオチドによってコードされる配列番号14のアミノ酸配列、好ましくは配列番号17を含むポリヌクレオチドによってコードされる配列番号16のアミノ酸配列、好ましくは配列番号19を含むポリヌクレオチドによってコードされる配列番号18のアミノ酸配列、好ましくは配列番号21を含むポリヌクレオチドによってコードされる配列番号20のアミノ酸配列、好ましくは配列番号23を含むポリヌクレオチドによってコードされる配列番号22のアミノ酸配列、好ましくは配列番号25を含むポリヌクレオチドによってコードされる配列番号24のアミノ酸配列、又は好ましくは配列番号27を含むポリヌクレオチドによってコードされる配列番号26のアミノ酸配列を含む、より好ましくはそれからなる。また好ましくは、挿入された結合ペプチドを含む(キメラ)AAVカプシドポリペプチドは、好ましくは配列番号29を含むポリヌクレオチドによってコードされる配列番号28のアミノ酸配列、好ましくは配列番号31を含むポリヌクレオチドによってコードされる配列番号30のアミノ酸配列、好ましくは配列番号33を含むポリヌクレオチドによってコードされる配列番号32のアミノ酸配列、又は好ましくは配列番号35を含むポリヌクレオチドによってコードされる配列番号34のアミノ酸配列を含む、より好ましくはそれからなる。より好ましくは、AAVカプシドポリペプチドは、配列番号12又は28のアミノ酸配列を含む、より好ましくはそれからなる。
【００２０】
本発明によると、AAVカプシドポリペプチドは、好ましくはAAV9におけるP504A及び/又はG505Aアミノ酸交換に対応するアミノ酸交換を含むか又は更に含む。同一でない2つのAAVカプシドポリペプチドにおけるアミノ酸が対応するかどうかは、当業者に公知で本明細書の他の箇所に記載される方法、特にアラインメントによって立証することができる。Aへの交換に対応するアミノ酸交換は、好ましくはA、G、又はVへの交換、より好ましくはAへの交換である。好ましくは、AAVカプシドポリペプチドは、AAV9カプシドポリペプチドであり、AAVカプシドポリペプチドは、P504A及び/又はG505Aアミノ酸交換を含むか又は更に含む、好ましくはP504A及びG505Aアミノ酸交換を含むか又は更に含む。
【００２１】
用語「治療」は、本明細書で言及される疾患若しくは障害又はそれに伴う症状の、有意な程度の寛解を意味する。また前記治療することには、本明細書で使用される場合、本明細書で言及される疾患又は障害に関する健康の完全回復も含まれる。本発明に従って使用される場合、治療することは、治療しようとする全ての対象において効果的であるわけではない場合もあることが理解されるべきである。しかし、この用語は、好ましくは、本明細書で言及される疾患又は障害に罹患している対象のうちの統計的に有意な部分が首尾よく治療され得ることを必要とするものとする。ある部分が統計的に有意であるかどうかは、様々な周知の統計的評価ツール、例えば、信頼区間の決定、p値決定、スチューデントのt検定、マン・ホイットニー検定等を使用して、それ以上作業することなく当業者によって決定され得る。好ましい信頼区間は、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%である。p値は、好ましくは、0.1、0.05、0.01、0.005、又は0.0001である。好ましくは、治療は、所与のコホート又は集団の対象の少なくとも20%、より好ましくは少なくとも50%、更により好ましくは少なくとも60%、更により好ましくは少なくとも70%、更により好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%に効果的であるものとする。当業者によって理解されるように、治療の有効性は、例えば疾患の段階及び重症度を含む様々な因子に依存する。理解されるように、治療という用語には、本明細書で言及される疾患又は障害の進行を予防及び/又は遅延する手段が含まれる。
【００２２】
用語「予防すること」は、本明細書で言及される疾患又は障害に関する健康を、対象においてある期間保持することを意味する。前記期間は、投与された薬物化合物の量、及び本明細書の他の箇所で論じられる対象の個々の因子に依存することが理解されるだろう。予防は、本発明による化合物で治療される全ての対象において効果的であるというわけではない場合もあることが理解されるべきである。しかし、この用語は、コホート又は集団の対象のうちの統計的に有意な部分が、本明細書で言及される疾患若しくは障害又はそれに伴う症状に罹患することを効果的に予防することを必要とする。好ましくは、この文脈においては、通常、すなわち本発明による予防手段がない場合に、本明細書で言及される疾患又は障害を発症するであろう対象のコホート又は集団が想定される。ある部分が統計的に有意であるかどうかは、本明細書の他の箇所で論じられる様々な周知の統計的評価ツールを使用して、それ以上作業することなく当業者によって決定され得る。本明細書で使用される場合、予防という用語には、好ましくは、本明細書の他の箇所に記載される遺伝子療法の手段が含まれる。したがって、予防手段を受ける対象は、疾患のいかなる症状も有していなくてもよいが、例えば遺伝子分析によって本明細書で言及される疾患又は障害を発症するリスクが高いと同定されてもよい。
【００２３】
用語「筋肉」は、当業者によって理解される。好ましくは、筋肉は、脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、更により好ましくは動物、最も好ましくはヒト対象の筋肉である。好ましくは、筋肉は、平滑筋又は横紋筋、より好ましくは横紋筋である。好ましくは、筋肉は、心筋、骨格筋、又は横隔膜の筋肉である。したがって、好ましくは、「対象」は、本明細書で使用される場合、脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、更により好ましくは家畜又は伴侶動物、例えば、ニワトリ、ガチョウ、アヒル、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ハムスター、ラット、マウス、ハムスター、又はモルモットである。最も好ましくは、対象はヒトである。
【００２４】
用語「筋疾患」は、原則として、当業者によって理解される。好ましくは、この用語は、筋肉、特に筋細胞への活性な化合物の投与による治療及び/又は予防に適した疾患に関する。好ましくは、筋疾患は、筋ジストロフィー、心筋症、筋強直症、筋委縮症、ミオクローヌスジストニア(疾患遺伝子（affected gene）:SGCE)、ミトコンドリアミオパチー、横紋筋融解症、線維筋痛症、及び/又は筋筋膜性疼痛症候群である。
【００２５】
好ましくは、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(罹患遺伝子(gene affected):DMD)、ベッカー型筋ジストロフィー(罹患遺伝子:DMD)、肢帯型筋ジストロフィー(亜型及び疾患遺伝子:LGMD1A(遺伝子:TTID)、LGMD1B(遺伝子:LMNA)、LGMD1C(遺伝子:CAV3)、LGMD1D(遺伝子:DNAJB6)、LGMD1E(遺伝子:DES)、LGMD1F(遺伝子:TNPO3)、LGMD1G(遺伝子:HNRPDL)、LGMD1H、LGMD2A(遺伝子:CAPN3)、LGMD2B(遺伝子:DYSF)、LGMD2C(遺伝子:SGCG)、LGMD2D(遺伝子:SGCA)、LGMD2E(遺伝子:SGCB)、LGMD2F(遺伝子:SGCD)、LGMD2G(遺伝子:TCAP)、LGMD2H(遺伝子:TRIM32)、LGMD2I(遺伝子:FKRP)、LGMD2J(遺伝子:TTN)、LGMD2K(遺伝子:POMT1)、LGMD2L(遺伝子:ANO5)、LGMD2M(遺伝子:FKTN)、LGMD2N(遺伝子:POMT2)、LGMD2O(遺伝子:POMGNT1)、LGMD2Q(遺伝子:PLEC1))、先天性筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー(亜型及び疾患遺伝子:三好型ミオパチー(遺伝子:DYSF)、前脛骨発症を伴う遠位型ミオパチー（Distal myopathy with anterior tibial onset）(遺伝子:DYSF)、Welander型遠位型ミオパチー(遺伝子:TIA1)、Gowers-Laing型遠位型ミオパチー(遺伝子:MYH7)、埜中型遠位型ミオパチー、遺伝性封入体筋炎1型、声帯及び咽頭の衰弱を伴う遠位型ミオパチー、ZASP関連ミオパチー)、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー(亜型及び疾患遺伝子:1型(遺伝子:DUX4)、2型(遺伝子:SMCHD1))、眼咽頭型筋ジストロフィー(疾患遺伝子:PABPN1)、並びに/又は筋強直性ジストロフィー(亜型及び疾患遺伝子:DM1(遺伝子:DMPK)及びDM2(遺伝子:ZNF9))である。
【００２６】
好ましくは、筋強直症は、先天性筋強直症(疾患遺伝子:CLCN1、亜型:トムゼン型、ベッカー型)及び/又は先天性パラミオトニア(疾患遺伝子:SCN4A)である。
【００２７】
好ましい種類の心筋症は、肥大型心筋症、不整脈原性右室異形成症、拡張型心筋症、拘束型心筋症、左室緻密化障害、たこつぼ心筋症、心筋炎、好酸球性心筋炎、及び虚血性心筋症である。好ましくは、肥大型心筋症は、CMH1(遺伝子:MYH7)、CMH2(遺伝子:TNNT2)、CMH3(遺伝子:TPM1)、CMH4(遺伝子:MYBPC3)、CMH5、CMH6(遺伝子:PRKAG2)、CMH7(遺伝子:TNNI3)、CMH8(遺伝子:MYL3)、CMH9(遺伝子:TTN)、CMH10(遺伝子:MYL2)、CMH11(遺伝子:ACTC1)、又はCMH12(遺伝子:CSRP3)である。好ましくは、不整脈原性右室異形成症は、ARVD1(遺伝子:TGFB3)、ARVD2(遺伝子:RYR2)、ARVD3、ARVD4、ARVD5(遺伝子:TMEM43)、ARVD6、ARVD7(遺伝子:DES)、ARVD8(遺伝子:DSP)、ARVD9(遺伝子:PKP2)、ARVD10(遺伝子:DSG2)、ARVD11(遺伝子:DSC2)、又はARVD12(遺伝子:JUP)である。
【００２８】
好ましくは、筋疾患は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ミオチュブラーミオパチー(遺伝子:MTM1)、糖原病II型(ポンペ病、遺伝子:GAA)、又は心筋症である。
【００２９】
また好ましくは、対象がウマである場合、筋疾患は高カリウム性周期性四肢麻痺(遺伝子:HYPP)であり、また好ましくは、対象がイヌである場合、筋疾患はイヌx連鎖筋ジストロフィーCXMD(遺伝子:DMD)である。
【００３０】
用語「筋肉再生」は、本明細書で使用される場合、治療していない状態と比較した少なくとも一時的な筋肉量の増加を媒介する、本発明の手段又は方法による筋細胞の誘導又は筋肉再生に関する。したがって、筋肉再生には、好ましくは、既存の筋肉量を超える筋肉量の量を超える筋肉量の生成も含まれる。好ましくは、前記筋肉量の増加は、少なくとも1ヶ月、より好ましくは少なくとも6ヶ月、更により好ましくは少なくとも1年、最も好ましくは少なくとも2年持続する。病態の悪化後の筋構造の正常化又は再建もまた、筋肉再生という用語に包含される。好ましくは、前記筋肉量の増加又は筋構造の改善は統計的に有意である。本明細書で使用される場合、筋肉再生は、好ましくは本明細書において上に明記した治療の一部として治療的であってもよく、好ましくは例えばヒトにおける美容的な筋肉再生、又は動物における能力（performance）向上若しくは体重増加の増大として非治療的であってもよい。
【００３１】
好ましくは、AAVカプシドポリペプチドは、薬学的に活性な化合物と会合する。用語「活性な化合物」は、原則として、当業者によって理解される。好ましくは、この用語は、対象、好ましくは対象の筋細胞に投与された場合、前記対象及び/若しくは筋細胞における検出可能な変化を引き起こすか又はそれに寄与する化合物に関する。好ましくは、前記検出可能な変化は、前記対象及び/又は筋細胞の遺伝子発現、エピジェネティックな組成、ゲノムの組成、プロテオームの組成、及び/又はメタボロームの組成における変化である。好ましくは、活性な化合物は、「薬学的に活性な化合物」、すなわち本明細書で言及される疾患若しくは障害の治療及び/若しくは予防を引き起こすか又はそれに寄与する化合物である。また好ましくは、活性な化合物は、治療的には活性でない化合物であるか、及び/又は治療効果若しくは予防効果を媒介しない濃度で使用される活性な化合物であるか、及び/又は治療効果若しくは予防効果が得られないように投与される。
【００３２】
好ましい活性な化合物は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドである。好ましくは、ポリペプチドは、ヌクレアーゼ、より好ましくはCasヌクレアーゼであり、適切なヌクレアーゼ、特にCasヌクレアーゼは当技術分野において周知である。好ましくは、活性な化合物、より好ましくは薬学的に活性な化合物はポリヌクレオチドである。好ましくは、ポリヌクレオチドは、筋疾患を引き起こす対象において変異した遺伝子又はその断片の非疾患媒介バリアントを含み、好ましくは、前記非疾患媒介バリアントは、発現可能なポリペプチドに含まれ、好ましくは、疾患を引き起こす遺伝子の非疾患媒介バリアントの発現を媒介する。また好ましくは、前記非疾患媒介バリアントは、好ましくはヌクレアーゼと共に、対象のゲノムにおける前記疾患媒介バリアントの前記非疾患媒介バリアントへの交換を媒介する。また好ましくは、ポリヌクレオチドは、対象のゲノム由来の遺伝子の疾患媒介バリアントの発現を減少又は消失させる核酸配列を含む。したがって、好ましくは、ポリヌクレオチドは、対象のゲノム由来の遺伝子の疾患媒介バリアントの発現を減少又は消失させる、siRNA、miRNA、リボザイム、又は当業者に公知の同様の分子ツールの発現を媒介する発現可能な構築物、すなわち前記非疾患媒介バリアントを含む。筋疾患を媒介する好ましい遺伝子は、本明細書で上に、それぞれの筋疾患の文脈において記載したものである。また好ましくは、活性な化合物であるポリヌクレオチドは、in vivoにおける完全又は部分的な多能性への初期化のための少なくとも1種の因子、好ましくは、山中因子(Takahashi & Yamanaka (2006)、Lazaro (2017))であるOct-3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycのうちの少なくとも1種のための少なくとも1つの発現可能な構築物を含み、好ましくは、コードされる前記因子(単数又は複数)のためのコード配列は、対象と同じ種由来であるか、又は対象にコドン最適化した異種配列である。
【００３３】
活性な化合物と「会合する(associated)」という用語は、本明細書で使用される場合、AAVカプシドポリヌクレオチド及び活性な化合物が適切な条件下、好ましくはin vivoにおいて宿主細胞に侵入することを可能にする会合（association）に関する。好ましくは、前記会合は、本明細書において上に明記したKd値を有する結合である。したがって、会合は、好ましくは、活性な化合物のAAVカプシドポリペプチドへの共有結合を含む。
【００３４】
しかし、活性な化合物がAAウイルス粒子又はAAウイルス様粒子に含まれることも想定される。用語「アデノ随伴ウイルス様粒子」又は「AA-VLP」は、本明細書で使用される場合、宿主細胞に感染することが可能だが、前記宿主細胞内で複製することが不可能である、AAVに由来するウイルス粒子を意味する。好ましくは、AA-VLPは、電子顕微鏡法によって分析される本質的に典型的なAAV構造を有する、すなわちカプシドを有するが、通常のAAV粒子と対照的に、本発明のAA-VLPは、ウイルスの子孫の生成を導くことが可能なポリヌクレオチドを含有しない。一実施形態において、AA-VLPは空である、すなわちAAV DNAを含有しない、好ましくはDNAを一切含有しない。好ましくは、AA-VLPは、AAV粒子に含まれる当業者に公知のAAVタンパク質を含む、好ましくは、本明細書において上に明記したAAVカプシドポリペプチドを少なくとも含む、より好ましくは、本明細書において上に明記したAAVカプシドポリペプチドからなる。当業者によって理解されるように、活性な化合物がポリヌクレオチドである場合、ポリヌクレオチドは、好ましくは、ポリヌクレオチドをAAV粒子又はVLPにパッケージングするために必要とされるパッケージングシグナルを含む。更なる実施形態において、活性な化合物であるポリヌクレオチドは、他の複製コンピテントなAAVゲノムに含まれる。当業者によって理解されるように、活性な化合物を会合する上記様式はまた、例えばCasヌクレアーゼのためのガイドRNAをAAV粒子又はAA-VLPにパッケージングされるポリヌクレオチド上に提供し、Casヌクレアーゼを、例えば共有結合によって前記粒子に会合することによって組み合わせてもよい。
【００３５】
有利には、本発明の基礎となる研究において、本明細書で提案されるAAVカプシドポリペプチドは、AAV粒子の筋組織及び筋細胞に対する改善された指向性を媒介すると同時に、大幅に低下した肝臓指向性を呈することが見出された。したがって、前記AAVカプシドポリペプチドを含むAAVカプシドは、特に全身適用において、活性な化合物を筋細胞に送達するための改善されたビヒクルである。
【００３６】
上述した定義は、必要な変更を加えて以下に適用される。下記で更に述べる追加の定義及び説明もまた、必要な変更を加えて、本明細書に記載される全ての実施形態に適用される。
【００３７】
本発明は更に、筋疾患を治療及び/若しくは予防することにおける使用のための、並びに/又は筋肉再生における使用のための、本発明のAAVカプシドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００３８】
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、本明細書において上に明記したAAVカプシドポリペプチド、すなわち本明細書において上に記載した生物活性を有するAAVカプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、又は35の核酸配列を含む、より好ましくはそれからなる。上に詳述したアミノ酸配列を有するポリペプチドはまた、縮重遺伝コードのために、2種以上のポリヌクレオチドによってコードされ得ることが理解されるべきである。更に、用語「ポリヌクレオチド」は、本発明に従って使用される場合、前述の特定のポリヌクレオチドのバリアントを更に包含する。前記バリアントは、本発明のポリヌクレオチドのオルソログ、パラログ、又は他のホモログを表し得る。ポリヌクレオチドバリアントは、好ましくは、前述の特定の核酸配列から少なくとも1つのヌクレオチド置換、付加、及び/又は欠失によって誘導することができる（それによって、バリアント核酸配列が上に明記した活性を有するAAVカプシドポリペプチドを依然としてコードするものとする）ことを特徴とする核酸配列を含む。バリアントはまた、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前述の特定の核酸配列にハイブリダイズすることが可能な核酸配列を含むポリヌクレオチドを包含する。これらのストリンジェントな条件は当業者に公知であり、標準的な教科書に見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に関する好ましい例は、およそ45℃の6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(=SSC)、続いて0.2×SSC、0.1% SDS、50℃〜65℃での1回以上の洗浄ステップのハイブリダイゼーション条件である。当業者には、これらのハイブリダイゼーション条件が、核酸の種類に応じて、並びに例えば有機溶媒が存在する場合は、緩衝液の温度及び濃度に関して異なることは公知である。例えば、「標準ハイブリダイゼーション条件」下では、温度は、核酸の種類に応じて、0.1〜5×SSC(pH 7.2)の濃度を有する水性緩衝液中42℃から58℃の間で異なる。有機溶媒が上述の緩衝液中に存在する場合、例えば50%ホルムアミド、標準条件下の温度はおよそ42℃である。DNA:DNAハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、例えば0.1×SSC及び20℃〜45℃、好ましくは30℃から45℃の間である。DNA:RNAハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、例えば0.1×SSC及び30℃〜55℃、好ましくは45℃から55℃の間である。上述のハイブリダイゼーション温度は、例えば、長さがおよそ100bp(=塩基対)であり、50%のG+C含有量を有する核酸についてホルムアミドの非存在下で決定される。当業者は、教科書を参照することによって、必要とされるハイブリダイゼーション条件をどのように決定するかが分かる。或いは、ポリヌクレオチドバリアントは、PCRに基づく技術、例えば、混合オリゴヌクレオチドプライマーに基づくDNAの増幅によって、すなわち、本発明のポリペプチドの保存ドメインに対する縮重プライマーを使用して得ることができる。本発明のポリペプチドの保存ドメインは、上に明記した、ポリヌクレオチドの核酸配列又はポリペプチドのアミノ酸配列の配列比較によって同定すること���できる。好適なPCR条件は当技術分野において周知である。鋳型として、AAV由来のDNA又はcDNAが使用されてもよい。更に、バリアントは、上に詳述した核酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。更に、上で言及したアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドも包含される。同一性パーセント値は、好ましくは、アミノ酸又は核酸配列領域全体にわたって計算される。異なる配列を比較するために、様々なアルゴリズムに基づく一連のプログラムを当業者は利用することができる。この文脈において、Needleman及びWunsch又はSmith及びWatermanのアルゴリズムにより特に信頼性の高い結果が得られる。配列アラインメントを実行するには、GCGソフトウェアパケット(Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991))の一部である、プログラムPileUp(J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153)、又はプログラムGap及びBestFit(Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970))、並びにSmith及びWaterman(Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)))を使用することができる。上記においてパーセント(%)で挙げた配列同一性値は、好ましくは、以下の設定:ギャップウェイト:50、レングスウェイト:3、アベレージマッチ:10.000、及びアベレージミスマッチ:0.000(別段の記載がない限り、配列アラインメントの標準設定として常に使用されるものとする)で、配列領域全体に対してプログラムGAPを使用して決定することができる。前述の核酸配列のいずれかの断片を含むポリヌクレオチドも、ポリヌクレオチドとして包含される。断片は、上に明記した生物活性を依然として有するポリペプチドをコードするものとする。したがって、ポリペプチドは、前記生物活性を付与する本発明のポリペプチドのドメインを含み得るか、又はそれからなり得る。本明細書で意味する場合の断片は、好ましくは、前述の核酸配列のいずれか1つの少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも250個、若しくは少なくとも500個の連続するヌクレオチドを含むか、又は前述のアミノ酸配列のいずれか1つの少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも50個、少なくとも80個、少なくとも100個、若しくは少なくとも150個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする。ポリヌクレオチドは、前述の核酸配列から本質的になるか、又は前述の核酸配列を含む。したがって、ポリヌクレオチドは更なる核酸配列もまた含有し得る。具体的には、本発明のポリヌクレオチドは、融合タンパク質をコードしてもよく、融合タンパク質の一方のパートナーは、上に挙げた核酸配列によってコードされているポリペプチドである。そのような融合タンパク質は、好ましくは、追加の部分として、発現をモニターするためのポリペプチド(例えば、緑色、黄色、青色、若しくは赤色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ等)、又は検出可能マーカーとして若しくは精製目的のための補助手段として役立ち得るいわゆる「タグ」を含んでもよい。種々の目的のためのタグ���、当技術分野において周知であり、FLAGタグ、6-ヒスチジンタグ、MYCタグ等を含む。ポリヌクレオチドは、好ましくは、単離されたポリヌクレオチド(すなわち、その天然のコンテキストから単離されたもの)として、又は遺伝子改変形態で提供されるものとする。ポリヌクレオチドは、好ましくは、cDNAを含むDNA、又はRNAである。この用語は、一本鎖ポリヌクレオチド、及び二本鎖ポリヌクレオチドを包含する。更に、好ましくは、天然に存在する修飾ポリヌクレオチド、例えばグリコシル化ポリヌクレオチド若しくはメチル化ポリヌクレオチド、又は人工的に修飾されたもの、例えばビオチン化ポリヌクレオチドを含む、化学的に修飾されたポリヌクレオチドも含まれる。
【００３９】
本発明はまた、筋疾患を治療及び/若しくは予防することにおける使用のための、並びに/又は筋肉再生における使用のための、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００４０】
用語「ベクター」は、好ましくは、ファージ、プラスミド、ウイルス又はレトロウイルスベクター、及び人工染色体、例えば、細菌人工染色体又は酵母人工染色体を包含する。より好ましくは、ベクターは、AAVに由来するベクターに関する。更に、この用語はまた、ターゲティング構築物のゲノムDNAへのランダム又は部位特異的組込みを可能にするターゲティング構築物に関する。そのようなターゲティング構築物は、好ましくは、相同組換え又は非相同（heterologous）組換えのいずれかに十分な長さのDNAを含む。本明細書に明記されるポリヌクレオチドを包含するベクターは、好ましくは、宿主における増殖（propagation）及び/又は選択のための選択マーカーを更に含む。ベクターは、当技術分野において周知の様々な技法によって宿主細胞に組み込まれ得る。例えば、プラスミドベクターは、沈澱物、例えばリン酸カルシウム沈澱物若しくは塩化ルビジウム沈澱物に、又は帯電した脂質との複合体に、又は炭素系クラスター、例えばフラーレンに導入することができる。或いは、プラスミドベクターは、熱ショック又はエレクトロポレーションの技法によって導入され得る。ベクターは、ウイルスである場合、宿主細胞への適用前に、適切なパッケージング細胞株を使用してin vitroでパッケージングしてもよい。ウイルスベクターは、複製コンピテントであっても複製欠損であってもよい。後者の場合、ウイルス増殖は一般に、補完宿主/細胞においてのみ起こる。より好ましくは、ベクターにおいて、ポリヌクレオチドは、原核細胞若しくは真核細胞、又は単離されたその画分における発現を可能にする発現制御配列に作動的に連結される。前記ポリヌクレオチドの発現は、好ましくは翻訳可能なmRNAへの、ポリヌクレオチドの転写を含む。真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞における発現を保証する調節エレメントは、当技術分野において周知である。その調節エレメントは、好ましくは、転写の開始を保証する調節配列を含み、任意選択で、転写の終結及び転写物の安定化を保証するポリ-Aシグナルを含む。追加の調節エレメントとしては、転写エンハンサー及び翻訳エンハンサーを挙げることができる。原核宿主細胞における発現を可能にする、可能性のある調節エレメントは、例えば、大腸菌(E. coli)におけるlac、trp又はtacプロモーターを含み、真核宿主細胞における発現を可能にする調節エレメントの例は、酵母におけるAOX1若しくはGAL1プロモーター、又は哺乳動物細胞及び他の動物細胞におけるCMV-、SV40-、RSV-プロモーター(ラウス肉腫ウイルス)、CMV-エンハンサー、SV40-エンハンサー、若しくはグロビンイントロンである。更に、誘導性発現制御配列は、発現ベクターにおいて使用され得る。そのような誘導性ベクターは、好ましくは、tet若しくはlacオペレーター配列、又は熱ショック若しくは他の環境因子によって誘導可能な配列を含み得る。好適な発現制御配列は、当技術分野において周知である。転写の開始を担うエレメントに加えて、そのような調節エレメントはまた、ポリヌクレオチドの下流に、転写終結シグナル、例えば、SV40-ポリ-A部位又はtk-ポリ-A部位を含み得る。この文脈において、好適な発現ベクター、例えば、Okayama-Berg cDNA発現ベクターpcDV1(Pharmacia社)、pBluescript(Stratagene社)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen社)、又はpSPORT1(GIBCO BRL社)は当技術分野において公知である。ウイルス、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、又はウシパピローマウイルスに由来する発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを標的細胞集団に送達するのに使用してもよい。組換えウイルスベクターを構築するために使用される方法は、標準的な教科書から当業者に周知である。好ましくは、ベクターは、AAVベクター、より好ましくは、例えばGrimm et al. (2006)に記載されている自己相補的AAVベクターである。
【００４１】
本発明はまた、筋疾患を治療及び/若しくは予防することにおける使用のための、並びに/又は筋肉再生における使用のための、本発明によるAAVカプシドポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、及び/又は本発明によるベクターを含む宿主細胞に関する。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」は、好ましくは、細菌細胞、酵母細胞、又は昆虫細胞、又は哺乳動物細胞に関する。好ましくは、宿主細胞は哺乳動物細胞である。また好ましくは、宿主細胞は、筋細胞、より好ましくは平滑筋細胞又は横紋筋細胞である。最も好ましくは、細胞は横紋筋細胞である。好ましくは、宿主細胞は、in vivoの細胞、すなわち生きている対象に含まれる細胞である。より好ましくは、宿主細胞は、in vitroで、好ましくは好適な培養培地で維持される細胞である。好ましくは、宿主細胞は、AAVカプシドポリペプチドを産生することが可能である。
【００４３】
更に、本発明は、筋疾患を治療及び/若しくは予防することにおける使用のための、並びに/又は筋肉再生における使用のための、本発明によるAAVカプシドポリペプチドを含むアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドに関する。
【００４４】
用語「AAVカプシド」は当業者によって理解され、AAVカプシドの構成成分は当技術分野において公知である。好ましくは、AAVカプシドそれ自体は、複製コンピテントなAAVゲノムを含まず、好ましくは、AAVカプシドは、本明細書において上に明記したAA-VLPである。AAVカプシドポリペプチドを含むAAVカプシドは、本明細書に明記される少なくとも1つのAAVカプシドポリペプチド、すなわち、本明細書に明記される結合ペプチドに結合したAAVカプシドポリペプチドを含み、したがって、AAVカプシドを構成する他のAAVカプシドポリペプチドは、異なるAAVカプシドポリペプチドであり得る。好ましくは、AAVカプシドに含まれる、本発明によるAAVカプシドポリペプチド及び更なるAAVカプシドポリペプチドは、同じAAV株に由来する。好ましくは、AAVカプシドは、少なくとも10、より好ましくは少なくとも20、更により好ましくは少なくとも30、更により好ましくは少なくとも40、更により好ましくは少なくとも50の本発明によるAAVカプシドポリペプチドを含む。最も好ましくは、AAVカプシドは、本発明によるAAVカプシドポリペプチドを、唯一のカプシドポリペプチドとして、すなわち、好ましくは、唯一のVPポリペプチドとして含む。好ましくは、AAVカプシドは、本発明によるAAVカプシドポリペプチドからなる。理解されるように、AAVカプシドは、2種以上の本発明によるAAVカプシドポリペプチドを含んでもよい、例えば、配列番号2を含む1つ以上のAAVカプシドポリペプチド及び配列番号3を含む1つ以上のAAVカプシドポリペプチドを含んでもよい。しかし、より好ましくは、AAVカプシドは、1種類の本発明によるAAVカプシドポリペプチドを含み、より好ましくは、1種類のAAVカプシドポリペプチドからなり、前記AAVカプシドポリペプチドは、本発明によるAAVカプシドポリペプチドである。好ましくは、AAVカプシドは、本明細書の他の箇所に明記される少なくとも1種の薬学的に活性な薬剤を更に含む。
【００４５】
本発明はまた、筋疾患を治療及び/若しくは予防することにおける使用のための、並びに/又は筋肉再生における使用のための、本発明によるAAVカプシドポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、本発明による宿主細胞、及び/又は本発明によるAAVカプシドを含む医薬組成物に関する。
【００４６】
用語「組成物」は、本明細書で使用される場合、本明細書に明記されるAAVカプシドポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び/又はAAVカプシド、並びに少なくとも1種の担体を少なくとも含む化合物の混合物に関する。担体(複数可)は、組成物の他の成分と適合性があり、その潜在的受容者に有害ではないという意味において許容可能でなければならない。用いられる担体は、例えば、ゲル又は液体であり得る。液体担体の例は、リン酸緩衝食塩水、シロップ、油、例えば落花生油及びオリーブ油、水、乳剤、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液等である。同様に、担体又は希釈剤は、当技術分野に周知の時間遅延材料（time delay material）、例えばグリセリルモノステアレート又はグリセリルジステアレートを単独で、又はワックスと共に含んでいてもよい。好適な担体は、上述のもの及び当技術分野で周知の他のものを含む。担体(複数可)は、組成物の生物活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、及びハンクス液である。好ましくは、組成物において、少なくとも50%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも90%、更により好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは本質的に全てのウイルス粒子は、本明細書の他の箇所に明記されるポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。
【００４７】
当業者によって理解されるように、組成物、特に医薬組成物は、好ましくは本発明による更なるAAVカプシド及び/又はベクターを含み得る。例えば、組成物は、補助治療(例えば筋肉とその興奮している神経との同時治療)のための異なる指向性を提供する更なるAAVカプシド及び/若しくはベクター、又は同じAAVカプシドポリペプチドを含むが、異なる活性な化合物を輸送するAAVカプシド及び/若しくはベクターを含み得る(Grimm et al. (2010))。
【００４８】
本明細書による組成物は医薬組成物であり、したがって、好ましくは、担体は薬学的に許容可能な担体である。加えて、医薬組成物又は製剤はまた、他の担体、アジュバント、又は非毒性、非治療的、非免疫原性の安定剤等を含んでもよい。医薬組成物は、好ましくは、局所投与又は全身投与される。薬物投与に従来使用されている好適な投与経路は、局所投与、静脈内投与、又は非経口投与、及び吸入である。好ましくは、投与は全身投与、より好ましくは静脈内投与である。しかし、化合物の性質及び作用機序に応じて、医薬組成物は、特に本明細書の他の箇所に明記されるような他の経路によっても投与され得る。更に、ポリヌクレオチドは、共通の医薬組成物中で、又は個別の医薬組成物として、他の薬物と組み合わせて投与することができ、前記個別の医薬組成物はパーツのキット（kit of parts）形態で提供されてもよい。結合ポリペプチドは、好ましくは、従来の手順に従って、薬物を標準的な医薬担体と組み合わせることによって調製された従来の剤形で投与される。これらの手順は、必要に応じて成分を混合又は溶解して所望の調製物とすることを含み得る。薬学的に許容可能な担体又は希釈剤の形態及び特性は、それと組み合わされる有効成分の量、投与経路、及び他の周知の変動因子によって決定されることは理解されよう。
【００４９】
治療上有効量は、本明細書で言及される疾患又は状態に伴う症状を予防、寛解、又は治療する、本発明の医薬組成物中で使用されるポリヌクレオチドの量を意味する。そのような化合物の治療有効性及び毒性は、細胞培養又は実験動物における標準的な製薬手順、例えばED50(集団の50%で治療上有効な用量)及びLD50(集団の50%に対する致死用量)によって決定することができる。治療効果と毒性作用との間の用量比は治療指数であり、LD50/ED50の比として表すことができる。投与計画は、主治医及び他の臨床因子によって、好ましくは上に記載した方法のいずれか1つに従って決定することができる。医学分野において周知であるように、任意のある患者のための投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、全身の健康状態、並びに同時に投与されている他の薬物を含み得る、多くの因子に依存する。経過は、定期的評価によってモニターすることができる。典型的な用量は、例えば、1〜1000μgの範囲であり得るが、この例示範囲を下回る又は上回る用量が、とりわけ前述の因子を考慮して想定される。一般に、医薬組成物の規則的投与としての投与計画は、1日当たり1μg〜10mg単位の範囲内であるべきである。投与計画が持続注入である場合は、それぞれ、毎分体重1キログラム当たり1μg〜1mg単位の範囲内でもあるべきである。好ましくは、医薬組成物は、対象に1回投与される、すなわち、好ましくは、1回の治療として使用される。したがって、好ましくは、本明細書で挙げた化合物で疾患又は状態を治療又は予防することは、前記化合物の単回投与からなる。対象及び投与様式に応じて、物質投与の量は、体重1kg当たり約0.01mg〜体重1kg当たり約10mgを提供する広い範囲にわたって変動してもよい。理解されるように、ベクター、例えばAAVベクターが使用される場合、物質投与の量は更に低くてもよい、例えば、好ましくは1回の用量として、1用量当たり1ng〜1mgであってもよい。好ましくは、本発明の化合物がウイルスベクターにパッケージングされて投与される場合、用量は投与1回当たり1010〜1016個のウイルス粒子である。本明細書で言及される医薬組成物及び製剤は、本明細書で挙げた疾患又は状態を治療又は寛解又は予防するために、少なくとも1回投与される。しかし、前記医薬組成物は、2回以上、例えば1〜4回投与してもよい。経過は、定期的評価によってモニターすることができる。
【００５０】
具体的な医薬組成物は、製薬分野において周知の方法で調製され、本明細書において上で言及した少なくとも1種の活性な化合物を、薬学的に許容可能な担体若しくは希釈剤との混和物中で、又は他の場合にはそれと会合させて含む。これらの具体的な医薬組成物の製造するために、活性な化合物(複数可)は、通例、担体又は希釈剤と混合される。得られた製剤は、投与様式、すなわち錠剤、カプセル剤、坐剤、溶液、懸濁液等の形態に適合させることができる。考慮される受容者に応じた用量調整を予測するために、推奨投与量が処方者又は使用者の説明書に表示されるものとする。
【００５１】
本発明はまた、筋疾患の治療及び/若しくは予防、並びに/又は筋肉再生のための方法であって、対象を、本発明によるAAVカプシドポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、本発明による宿主細胞、及び/又は本発明によるAAVカプシドと接触させることを含む、方法に関する。
【００５２】
本発明の、治療及び/若しくは予防、並びに/又は筋肉再生のための方法は、好ましくはin vivo法である。更に、その方法は、上で明白に言及したものに加えて複数のステップを含み得る。例えば、更なるステップは、例えば、本発明によるAAVカプシドポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び/若しくはAAVカプシドを提供すること、又は前記接触の前、それと同時、若しくはその後の更なる治療/予防ステップに関し得る。更に、前記ステップの1つ以上は、自動化された装置によって実施してもよい。
【００５３】
本発明はまた、活性な化合物を筋細胞に移入するための、本発明によるAAVカプシドポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、本発明による宿主細胞、及び/又は本発明によるAAVカプシドの使用に関する。
【００５４】
本発明の、活性な化合物を筋細胞に移入するための使用は、好ましくはin vitroにおける使用である。しかし、使用が、好ましくはin vivoにおける使用であり、そのような場合、より好ましくは、使用が非治療的、例えば美容的使用であることも想定される。好ましくは、前記使用は、全身、とりわけ顔及び臀部を含む上体の形成修正（plastic modification）の分野における筋細胞の誘導又は筋肉再生のためのものである。更に、本発明は、筋疾患の治療のための医薬の製造のための、本発明によるAAVカプシドポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、本発明による宿主細胞、及び/又は本発明によるAAVカプシドの使用に関する。
【００５５】
上記を考慮すると、以下の実施形態が特に好ましい。
【００５６】
1. 筋疾患を治療及び/若しくは予防することにおける使用のための、並びに/又は筋肉再生における使用のための、アミノ酸配列RGDX1X2X3X4(配列番号1)(ここで、X1からX4は独立して選択されるアミノ酸である)を含む結合ペプチドに結合したアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドポリペプチド。
【００５７】
2. 前記結合ペプチドが、前記AAVカプシドポリペプチドに共有結合する、実施形態1に記載の使用のためのAAVカプシドポリペプチド。
【００５８】
3. 前記結合ペプチドが、前記AAVカプシドポリペプチドのアミノ酸配列に挿入される、実施形態1又は2に記載の使用のためのAAVカプシドポリペプチド。
【００５９】
4. 筋疾患を治療及び/若しくは予防することにおける使用のための、並びに/又は筋肉再生における使用のための、アミノ酸配列RGDX1X2X3X4(配列番号1)(ここで、X1からX4は独立して選択されるアミノ酸、好ましくはタンパク質を構成するアミノ酸である)を含む挿入された結合ペプチドを含むAAVカプシドポリペプチド。
【００６０】
5. X1、X2、及びX3が、L、G、V、及びAから独立して選択され、X4が、S、V、A、G、又はLである、実施形態1から4のいずれか1つに記載の使用のためのAAVカプシドポリペプチド。
【００６１】
6. X2及びX3のうちの少なくとも1つがGである、実施形態1から5のいずれか1つに記載の使用のためのAAVカプシドポリペプチド。
【００６２】
7. 前記結合ペプチドが、アミノ酸配列RGDLGLS(配列番号2)又はRGDAVGV(配列番号3)を含む、好ましくはそれからなる、実施形態1から6のいずれか1つに記載の使用のためのAAVカプシドポリペプチド。
【００６３】
8. 前記結合ペプチドが、アミノ酸配列RGDLGLS(配列番号2)を含む、好ましくはそれからなる、実施形態1から7のいずれか1つに記載の使用のためのAAVカプシドポリペプチド。
【００６４】
9. AAV9カプシドポリペプチドである、実施形態1から8のいずれか1つに記載の使用のためのAAVカプシドポリペプチド。
【００６５】
10. 結合ペプチドの挿入部位が、AAV9カプシドポリペプチドのアミノ酸588又は589、好ましくは588に対応する、実施形態1から9のいずれか1つに記載の使用のためのAAVカプシドポリペプチド。
【００６６】
11. AAV9におけるP504A及び/又はG505Aアミノ酸交換に対応する交換を更に含む、好ましくはAAV9におけるP504A及びG505Aアミノ酸交換に対応するアミノ酸交換を含む、実施形態1から10のいずれか1つに記載の使用のためのAAVカプシドポリペプチド。
【００６７】
12. AAV9カプシドポリペプチドであり、P504A及び/又はG505Aアミノ酸交換を更に含む、好ましくはP504A及びG505Aアミノ酸交換を更に含む、実施形態1から11のいずれか1つに記載の使用のためのAAVカプシドポリペプチド。
【００６８】
13. 筋疾患を治療及び/若しくは予防することにおける使用のための、並びに/又は筋肉再生における使用のための、AAV9におけるP504A及び/又はG505Aアミノ酸交換に対応する交換を含む、好ましくはAAV9におけるP504A及びG505Aアミノ酸交換に対応するアミノ酸交換を含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドポリペプチド。
【００６９】
14. 前記筋肉が、横紋筋、好ましくは心臓又は骨格筋又は横隔膜である、実施形態1から13のいずれか1つに記載の使用のためのAAVカプシドポリペプチド。
【００７０】
15. 前記筋疾患が、筋ジストロフィー、心筋症、筋強直症、筋委縮症、ミオクローヌスジストニア、ミトコンドリアミオパチー、横紋筋融解症、線維筋痛症、及び/又は筋筋膜性疼痛症候群である、実施形態1から14のいずれか1つに記載の使用のためのAAVカプシドポリペプチド。
【００７１】
16. 前記心筋症が、肥大型心筋症、不整脈原性右室異形成症、拡張型心筋症、拘束型心筋症、左室緻密化障害、たこつぼ心筋症、心筋炎、好酸球性心筋炎、及び/又は虚血性心筋症である、実施形態1から15のいずれか1つに記載の使用のためのAAVカプシドポリペプチド。
【００７２】
17. 薬学的に活性な化合物と会合する、実施形態1から16のいずれか1つに記載の使用のためのAAVカプシドポリペプチド。
【００７３】
18. 前記薬学的に活性な化合物が、ポリペプチド、好ましくはヌクレアーゼ、より好ましくはCasヌクレアーゼである、実施形態1から17のいずれか1つに記載の使用のためのAAVカプシドポリペプチド。
【００７４】
19. 筋疾患を治療及び/若しくは予防することにおける使用のための、並びに/又は筋肉再生における使用のための、実施形態3から16のいずれか1つに記載のAAVカプシドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００７５】
20. 筋疾患を治療及び/若しくは予防することにおける使用のための、並びに/又は筋肉再生における使用のための、実施形態19に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【００７６】
21. 筋疾患を治療及び/若しくは予防することにおける使用のための、並びに/又は筋肉再生における使用のための、実施形態1から18のいずれか1つに記載のAAVカプシドポリペプチド、実施形態19に記載のポリヌクレオチド、及び/又は実施形態20に記載のベクターを含む宿主細胞。
【００７７】
22. 筋疾患を治療及び/若しくは予防することにおける使用のための、並びに/又は筋肉再生における使用のための、実施形態1から18のいずれか1つに記載のAAVカプシドポリペプチドを含むアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシド。
【００７８】
23. 少なくとも1種の薬学的に活性な薬剤を更に含む、実施形態22に記載の使用のためのAAVカプシド。
【００７９】
24. 前記薬学的に活性な薬剤がポリヌクレオチドである、実施形態22又は23に記載の使用のためのAAVカプシド。
【００８０】
25. 前記薬学的に活性な薬剤が、非疾患媒介バリアント、好ましくは、GAA、MTM1、TTID、LMNA、CAV3、DNAJB6、DES、TNPO3、HNRPDL、CAPN3、DYSF、SGCG、SGCA、SGCB、SGCD、TCAP、TRIM32、FKRP、TTN、POMT1、ANO5、FKTN、POMT2、PLEC1、DYSF、TIA1、MYH7、DUX4、SMCHD、PABPN1、DMPK、ZNF9、CLCN1、SCN4A、MYH7、TNNT2、TPM1、MYBPC3、PRKAG2、TNNI3、MYL3、TTN、MYL2、ACTC1、CSRP3、TGFB3、RYR2、TMEM43、DES、DSP、PKP2、DSG2、DSC2、JUP、HYPP、及びDMDからなるリストから選択される少なくとも1つのヒト遺伝子の野生型バリアントをコードするポリヌクレオチドである、実施形態22から24のいずれか1つに記載の使用のためのAAVカプシド。
【００８１】
26. 筋疾患を治療及び/若しくは予防することにおける使用のための、並びに/又は筋肉再生における使用のための、実施形態1から18のいずれか1つに記載のAAVカプシドポリペプチド、実施形態19に記載のポリヌクレオチド、実施形態20に記載のベクター、実施形態21に記載の宿主細胞、及び/又は実施形態22から25のいずれか1つに記載のAAVカプシドを含む医薬組成物。
【００８２】
27. 対象における筋疾患の治療及び/若しくは予防、並びに/又は筋肉再生のための方法であって、前記対象を、実施形態1から18のいずれか1つに記載のAAVカプシドポリペプチド、実施形態19に記載のポリヌクレオチド、実施形態20に記載のベクター、実施形態21に記載の宿主細胞、実施形態22から25のいずれか1つに記載のAAVカプシド、及び/又は実施形態26に記載の医薬組成物と接触させることを含む、方法。
【００８３】
28. 活性な化合物を筋細胞に移入するための、実施形態1から18のいずれか1つに記載のAAVカプシドポリペプチド、実施形態19に記載のポリヌクレオチド、実施形態20に記載のベクター、実施形態21に記載の宿主細胞、及び/又は実施形態22から25のいずれか1つに記載のAAVカプシドの使用。
【００８４】
29. 前記活性な化合物が、治療的には活性でない化合物である、実施形態28に記載の使用。
【００８５】
30. 前記化合物が、ポリヌクレオチド又はポリペプチドである、実施形態28又は29に記載の使用。
【００８６】
31. 前記筋細胞が、横紋筋の細胞、好ましくは心筋細胞、骨格筋細胞、及び/又は横隔膜細胞である、実施形態28から30のいずれか1つに記載の使用。
【００８７】
32. 非治療的使用である、実施形態28から31のいずれか1つに記載の使用。
【００８８】
33. in vitroにおける使用である、実施形態28から32のいずれか1つに記載の使用。
【００８９】
34. 筋疾患の治療及び/若しくは予防並びに/又は筋肉の再生のための医薬の製造のための、実施形態1から18のいずれか1つに記載のAAVカプシドポリペプチド、実施形態19に記載のポリヌクレオチド、実施形態20に記載のベクター、実施形態21に記載の宿主細胞、及び/又は実施形態22から25のいずれか1つに記載のAAVカプシドの使用。
【００９０】
35. 前記AAVがAAV9であり、前記結合ペプチドがアミノ酸配列RGDLGLS(配列番号2)又はRGDAVGV(配列番号3)からなり、前記結合ペプチドがAAV9カプシドポリペプチドのアミノ酸588又は589、好ましくは588に挿入される、筋疾患を治療及び/又は予防することにおける使用のための、実施形態3から17のいずれか1つに記載のAAVカプシドポリペプチド。
【００９１】
36. 筋疾患を治療及び/又は予防することにおける使用のための、実施形態35に記載のAAVカプシドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００９２】
37. 筋疾患を治療及び/又は予防することにおける使用のための、実施形態36に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【００９３】
38. 筋疾患を治療及び/又は予防することにおける使用のための、実施形態35に記載のAAVカプシドポリペプチド、実施形態36に記載のポリヌクレオチド、及び/又は実施形態37に記載のベクターを含む宿主細胞。
【００９４】
39. 筋疾患を治療及び/又は予防することにおける使用のための、実施形態35に記載のAAVカプシドポリペプチドを含むアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシド。
【００９５】
40. 筋疾患を治療及び/又は予防することにおける使用のための、実施形態35に記載のAAVカプシドポリペプチド、実施形態36に記載のポリヌクレオチド、実施形態37に記載のベクター、実施形態38に記載の宿主細胞、及び/又は実施形態39に記載のAAVカプシドを含む医薬組成物。
【００９６】
41. 対象における筋疾患を治療及び/又は予防する方法であって、前記対象を、実施形態35に記載のAAVカプシドポリペプチド、実施形態36に記載のポリヌクレオチド、実施形態37に記載のベクター、実施形態38に記載の宿主細胞、及び/又は実施形態39に記載のAAVカプシドと接触させることを含む、方法。
【００９７】
42. 活性な化合物を筋細胞に移入するための、実施形態35に記載のAAVカプシドポリペプチド、実施形態36に記載のポリヌクレオチド、実施形態37に記載のベクター、実施形態38に記載の宿主細胞、及び/又は実施形態39に記載のAAVカプシドの使用。
【００９８】
43. 筋疾患の治療及び/又は予防のための医薬の製造のための、実施形態35に記載のAAVカプシドポリペプチド、実施形態36に記載のポリヌクレオチド、実施形態37に記載のベクター、実施形態38に記載の宿主細胞、及び/又は実施形態39に記載のAAVカプシドの使用。
【００９９】
44. 前記筋疾患が、糖原病II又はミオチュブラーミオパチーである、実施形態35から43のいずれか1つに記載の対象。
【０１００】
本明細書で引用される全ての参考文献は、それらの開示内容全体及び本明細書で具体的に言及される開示内容に関して、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１０１】
以下の実施例は、本発明を単に例示するに過ぎないものとする。それらは、どのようなものであれ、本発明の範囲を限定すると解釈されないものとする。
【０１０２】
[実施例1]
方法
本研究のために、BGH(ウシ成長ホルモン)ポリ-Aシグナルと隣接するCMVプロモーター駆動EYFP導入遺伝子を保有する自己相補的AAVゲノムを使用した。15nt長のバーコードが3' UTRに配置され、したがって転写されて、対応するAAVの追跡をRNA及びDNAレベルで可能にする。AAV産生の際には、HEK293T細胞に、AAVの複製に必須の遺伝子を送達するアデノウイルスヘルパープラスミドをトランスフェクトする。更に、rep2(AAV2のrep遺伝子)及びそれぞれのcap遺伝子の発現のためのプラスミドが、ITR(末端逆位反復)隣接バーコード化AAVゲノムを保有するプラスミドに加えて必要である。産生のためのカプシド/バーコード対を選択することによって、定義したバーコード化ゲノムの合成カプシドへのパッケージングを可能にした。その後、各AAVバリアントをイオジキサノール勾配で精製し、ウイルス力価を決定した。等モル量の全てのバリアントをプールして、AAV9_P1並びに重要な標準（benchmark）バリアント(Varadi et al. (2012)、Yu et al. (2009)、Choudhury et al. (2016)、Yang et al. (2009)、及びAdachi et al. (2014))を含むバーコード化AAVライブラリを生成した。
【０１０３】
ライブラリの体内分布評価のために、6匹の雌C57BL/6マウスに、尾静脈を介して1匹当たり1×1012vg(ベクターゲノム)を注射した。1週間後、腹部大動脈(Aa)、胸部大動脈(At)、脳(B)、血液細胞(BlC)、結腸(C)、横隔膜(Di)、十二指腸(Du)、眼(Eye)、褐色脂肪(FatB)、白色脂肪(FatW)、心臓(H)、内耳(I)、腎臓(K)、肝臓(Li)、肺(Lu)、卵巣(O)、膵臓(P)、大腿四頭筋(QF)、脾臓(S)、及び胃(St)を採取した。その後、DNA及びRNA単離を実施して、第1にcDNA合成、第2にPCRによるバーコード富化を可能にした。以下の次世代配列決定により、6匹のマウスのあらゆる組織における各バリアントの割合を、バーコード配列の出現に基づいて決定した。更に、個々の器官におけるウイルスゲノムの検出のためのq(定量)PCRから、異なる器官間での同じAAVバリアントの比較を可能にする多段階正規化手順に必要な全ての値を得た。最終結果は、適応させた（tailored）Pythonスクリプト(Marsic et al., 2015から改変)を使用することによって取得した。
【０１０４】
[実施例2]
結果
2.1 AAV9_P1を用いた第1のスクリーニング
収集したデータは、全ての組織にわたる1種のバリアントの組織特異性分析、及び1つの組織内の全てのバリアントの効率性分析を可能にした。
【０１０５】
器官特異性に関して(図1及び表2)、AAV9_P1は強力な筋肉指向性を実証し、74%のウイルスが最終的に、分析された筋組織、すなわち横隔膜、心臓、及び大腿四頭筋に侵入した。対照的に、親ウイルスのAAV9wtを使用した場合、10%の対応する転写物のみが筋組織に見出され、50%はAAVの主要なオフターゲットである肝臓で観察することができた。これらのデータに基づくと、AAV9_P1の場合、13分の1への減少が肝臓において検出された。筋肉ターゲティングのための別の周知のAAVであるAAV6wtに関しては、この場合もまた総ウイルス転写物の10%しか筋肉に見出すことができず、それに対し、84%は肝臓に見出すことができた。以前に同定された筋肉特異的候補のAAVpo1wt及びAAVpo1_A1は、それぞれ51%及び60%という強力な筋肉特異性、並びに肝臓におけるわずかなオフターゲティング(それぞれ3%及び6%)を示した。
【０１０６】
筋組織におけるカプシドの効率性の直接比較は、AAV9_P1の優位性を例証する(図2)。横隔膜、大腿四頭筋、及び心臓では、ライブラリにおける82種のバリアントから発現した全てのウイルス転写物のうち、それぞれ54%、45%、及び13%がAAV9_P1に属する。標準との比較は、標的組織への侵入及びバーコード化導入遺伝子の転写(表1)、並びに筋肉特異性(表2)の点での大きな改善を明らかにした。
【０１０７】
【表２】
2021521833.tif 000003
【０１０８】
【表３】
2021521833.tif 000004
【０１０９】
2.2 AAV9_P1を用いた第2のスクリーニング
AAV9_P1の向上した筋肉特異性及び効率性を確実なものとするために、NGSに基づく別のスクリーニングを、第1のスクリーニングに記載したのと全く同じワークフローに従って、但し、今回は筋組織において優れていることが報告されている3種の公開されているAAVバリアント、すなわちAAVM41(Yang et al. (2009))、AAVB1(Choudhury et al. (2016))、及びAAV2_MTP(Yu et al. (2009))も含めて、実行した。更に、2種の追加のペプチド挿入バリアントであるAAV9_P3及びAAV9_K3(Varadi et al. (2012))を試験した。それらは、AAV9_P1と同様のペプチドモチーフを保有し、筋肉中での改善された性能に関するペプチドそれ自体の役割を理解する可能性を提供する。
【０１１０】
第2のバーコード化AAVライブラリの生成のために、第1のライブラリを、標準バリアントを含む75種の追加のバリアントを追加することによって拡張した。6匹の雌C57BL/6マウスに、尾静脈を介して1.57×1012vg/匹を注射し、1週間飼育した後、大動脈(A)、二頭筋(Bi)、結腸(C)、横隔膜(Di)、十二指腸(Du)、眼(Eye)、褐色脂肪組織(FatB)、白色脂肪組織(FatW)、心臓(H)、内耳(I)、腎臓(K)、肝臓(Li)、肺(Lu)、卵巣(O)、膵臓(P)、大腿四頭筋(QF)、及び胃(St)を採取した。脾臓及びリンパ節から、CD3+、CD19+、CD11b+、及びCD11c+細胞をMACSによって単離して、AAVが免疫細胞に侵入できるかを研究した。RNA及びDNAを全ての組織から抽出し、試料をNGSに基づく分析のために処理及び調製した。データは、マウス3及び4に関してAAV9_P1の明確な外れ値を明らかにし、したがって、両方を除外した。以下のグラフは、マウス1、2、5、及び6の平均値並びに対応するSDを示す。
【０１１１】
以前に第1のスクリーニングにおいて観察されたように、AAV9_P1は、向上した筋肉指向性(66%)及び肝臓からの脱ターゲティング（detargeting）(5.5%)を実証した(図3)。野生型AAVに関しては、AAVpo1wtのみが固有の筋肉特異性を示す。筋肉形質導入に関する公開されている標準バリアントであるAAVM41、AAVB1、及びAAV2_MTPは、AAV9_P1よりも明確に劣る(図4)。AAVM41のみが、分析した4つの筋組織に好ましく形質導入する傾向を示す。AAVB1及びAAV2_MTPは大部分が最終的に肝臓に侵入する。AAV9_P1とAAV9_K3及びAAV9_P3との比較は特に有益である。例えば、AAV9_K3は、P1ペプチドと比較して2個のアミノ酸のみが異なるが589位に挿入されるのに対し、P1は588位に組み込まれた。これらはわずかな変化であるように思われるが、AAV9_K3の体内分布分析は、AAV9wtに関して見られる指向性さえ超える肝臓への強力な指向性を明らかにする。AAV9_P3のペプチドモチーフは4つのアミノ酸位置で変化しているが、今度は筋肉指向性を、AAV9_P1よりも弱い程度であるが、認めることができる(図3)。興味深いことに、AAV9wtと比較して2つの点変異を有するバリアントであるAAV9LDは、元々報告されていたように(Adachi et al., 2014)、肝臓から大幅に脱ターゲティングされる。しかし、同時に、AAV9LDは筋組織において富化される(図4)。
【０１１２】
1つの組織内の各バリアントの割合の分析から、第1のスクリーニングと同様の結果を得た(図5)。本研究では、AAV9_P1は、横隔膜、二頭筋、大腿四頭筋において、及びより少ない程度ではあるが心臓において、最も効率的なベクターである。その相違に関するより詳細な概要を表3及び4に示す。
【０１１３】
【表４】
2021521833.tif 000005
【０１１４】
【表５】
2021521833.tif 000006
【０１１５】
[実施例3]
AAV9_P1の筋肉の検証
AAV9_P1の筋肉特異性を確認するために、尾静脈を介して1×1011vg/匹を注射した雌C57BL/6マウスを使用して追跡研究を行った。AAV9_P1に加えて、以前のスクリーニングからの主な候補であるAAVpo1wt及びAAVpo1_A1、並びに筋組織において高度に効率的な血清型であるAAV9wtを使用した。今回は、全てのAAVバリアントを1群当たり3匹のマウスに個別に注射した。それにより、ライブラリを用いた場合に受容体競合から生じる潜在的な干渉作用が排除され、AAV9_P1の性能を評価することが可能となる。マウスを注射後1週間飼育した後、横隔膜、心臓、肝臓、及び大腿四頭筋を、POLR2Aをハウスキーパーとして使用するウイルス転写物に対するqPCR分析のために回収した(図6)。
【０１１６】
AAV9_P1に関するEYFP相対量の評価は、AAV9wtと比較して優れた増加を、横隔膜(55倍)、大腿四頭筋(17倍)、及び心臓(11倍)において示し、肝臓では9分の1の存在量であった。さらに、当該ペプチド挿入バリアントは、全ての筋組織においてAAVpo1wt及びAAVpo1_A1を凌駕する。他方、両方のブタバリアントは、肝臓においてより低いcDNAレベルを呈するが、これは効率性の点での大きな欠点を凌ぐほど十分ではない。
【０１１７】
[実施例4]
ターゲティング配列のin vivoでの富化
X1位からX4位が完全にランダム化され、N末端でアミノ酸S/RGと隣接し、C末端でAと隣接する配列番号1の配列がアミノ酸588と589との間に挿入されたカプシドポリペプチドをコードするAAV9ライブラリを構築した。ライブラリを含むウイルス粒子を、尾静脈を介してマウスに投与し、骨格筋、心臓、及び横隔膜から再び単離した。第1ラウンドの選択後、図11Aの配列ロゴによって表される配列スペースが得られ、第2ラウンドの選択後、図11Bの配列ロゴによって表される配列スペースが取得され、特定のアミノ酸の富化を示した。
【０１１８】
[実施例5]
AAVバリアントの組織指向性及び体内分布
AAV9S1_P1(配列番号30のアミノ酸配列を有するカプシドを有する)及びAAVS10_P1(配列番号28のアミノ酸配列を有するカプシドを有する)の組織指向性を、更なる器官に関して、本明細書において上の実施例1に記載したように、マウス1匹当たり2.5×1011vgを使用して、AAV9wtと比較した。結果を図12A〜Cに示す。更に、肝臓におけるAAV9P1、AAV9S1、及びAAV9S10の体内分布を、上の実施例1に記載したように、AAV9の体内分布と比較した。結果を図12Dに示す。
【０１１９】
引用した非標準文献:
-Adachi et al. (2014), Nat. Commun., vol. 5, no. June 2011, p. 3075. 
-Choudhury et al. (2016), Mol. Ther., vol. 24, no. 7, pp. 1247-1257.
-Grimm et al. (2006), Nature 441, 537-541.
-Grimm et al. (2010), J. Clin. Invest. 120, 3106-3119. 
-Kienle, PhD Thesis, Ruprecht-Karls-Universitat Heidelberg, 2014.
-Kunze et al. (2018), Glia, vol. 66, no. 2, pp. 413-427.
-Lazaro et al. (2017). bioRxiv doi: 10.1101/101188.
-Marsic et al. (2015), Mol. Ther. Methods Clin. Dev., vol. 2, no. September, p. 15041.
-Michelfelder et al. (2009), PLOS One 4(4):e5122
-Takahashi & Yamanaka (2006), Cell 126, 663-676.
-Varadi et al. (2012), Gene Ther., vol. 19, no. 8, pp. 800-809.
-Yang et al. (2009), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 106, no. 10, pp. 3946-51.
-Yu et al. (2009), Gene Ther., vol. 16, no. 8, pp. 953-962.
【図１−１】
2021521833.tif 000007
【図１−２】
2021521833.tif 000008
【図１−３】
2021521833.tif 000009
【図２−１】
2021521833.tif 000010
【図２−２】
2021521833.tif 000011
【図３−１】
2021521833.tif 000012
【図３−２】
2021521833.tif 000013
【図３−３】
2021521833.tif 000014
【図４−１】
2021521833.tif 000015
【図４−２】
2021521833.tif 000016
【図４−３】
2021521833.tif 000017
【図５−１】
2021521833.tif 000018
【図５−２】
2021521833.tif 000019
【図５−３】
2021521833.tif 000020
【図６−１】
2021521833.tif 000021
【図６−２】
2021521833.tif 000022
【図６−３】
2021521833.tif 000023
【図７】
2021521833.tif 000024
【図８−１】
2021521833.tif 000025
【図８−２】
2021521833.tif 000026
【図８−３】
2021521833.tif 000027
【図９−１】
2021521833.tif 000028
【図９−２】
2021521833.tif 000029
【図９−３】
2021521833.tif 000030
【図１０】
2021521833.tif 000031
【図１１】
2021521833.tif 000032
【図１２−１】
2021521833.tif 000033
【図１２−２】
2021521833.tif 000034
【配列表】
2021521833000001.app
【国際調査報告】
2021521833.tif 000035
2021521833.tif 000036
2021521833.tif 000037
2021521833.tif 000038