(57)【要約】  本発明は、前立腺癌又は乳癌を患っている患者の転帰を予測するための方法、及び、前立腺癌又は乳癌の処置のための方法に関する。本発明者らは、中枢神経系（ＣＮＳ）からダブルコルチン発現（ＤＣＸ＋）神経前駆体が血流に入り、前立腺腫瘍及び転移に浸潤し、腫瘍の発達に寄与する新生ニューロンへと分化することを示す。ヒト原発性前立腺腫瘍及びトランスジェニックマウス癌組織では、ＤＣＸ＋神経前駆体の密度は、腫瘍の侵襲性、浸潤性、及び再発と強く関連している。トランスジェニック癌マウスでは、ＣＮＳの神経新生領域である、脳室下帯（ＳＶＺ）内のＤＣＸ＋神経幹細胞の振動現象が、ＳＶＺから血流へのＤＣＸ＋細胞の退出に関連していた。その後、これらの細胞は、それらが神経新生を開始する腫瘍に到達する。マウスにおけるＤＣＸ＋細胞の選択的遺伝子除去は、前立腺癌の初期の発達を抑制し、一方、前立腺腫瘍又は脳組織から精製されたＤＣＸ＋細胞の同所移植は、腫瘍の増殖及び癌細胞の播種を促進する。これらの結果は、前立腺癌の発達に必要とされる神経新生プロセスを駆動する、ＣＮＳと腫瘍との間の独特な掛け合い応答を明らかとし、これは癌処置の標的候補としての腫瘍微小環境の新規な神経要素を示す。したがって、本発明は、前立腺癌を患っている患者の転帰を予測するための方法、及び、前立腺癌の処置に使用するためのＤＣＸ＋前駆細胞を標的化する化合物に関する。
2021521445.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）被験者から得られた生物学的試料中のＤＣＸ＋神経前駆細胞の量を決定する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で決定された量を、それらの対応する所定の基準値と比較する工程、及び
ｉｉｉ）工程ｉ）で決定された量と所定の基準値との差の検出が、患者の転帰を示す工程
を含む、前立腺癌又は乳癌を患っている患者の転帰を予測するための方法。
【請求項２】
ＤＣＸ＋神経前駆細胞が、ダブルコルチン（ＤＣＸ）、ポリシアル酸化神経細胞接着分子（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ）、インターネキシン（ＩＮＡ）、Ｓｃａ−１、ＣＤ２４、ＥＧＦＲ、又はネスチンからなる群より選択された神経マーカーの少なくとも１つを発現していることによって特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ｉ）で決定されたレベルが所定の基準値よりも低い場合に、患者は良好な予後を有すると結論付ける工程、又は、工程ｉ）で決定されたレベルが所定の基準値よりも高い場合に、患者は不良な予後を有すると結論付ける工程を含む、請求項１から２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
工程ｉ）で決定されたレベルが所定の基準値よりも低い場合に、患者は、非侵襲性、非浸潤性、及び／又は非再発性の前立腺癌を有すると結論付ける工程、又は、工程ｉ）で決定されたレベルが所定の基準値よりも高い場合に、患者は侵襲性、浸潤性、及び／又は再発性の前立腺癌又は乳癌を有すると結論付ける工程を含む、請求項１から２のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
工程ｉ）で決定されたレベルが所定の基準値よりも低い場合に、患者は、長い生存期間を有すると結論付ける工程、又は、工程ｉ）で決定されたレベルが所定の基準値よりも高い場合に、患者は短い生存期間を有すると結論付ける工程を含む、請求項１から２のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
患者が、不良な予後、侵襲性、浸潤性、及び／若しくは再発性の前立腺癌若しくは乳癌、又は短い生存期間を有すると結論付けられる場合、抗癌処置を投与する工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＤＣＸ＋神経前駆細胞を標的化する化合物の治療有効量を患者に投与することを含む、それを必要とする患者における前立腺癌又は乳癌を処置するための方法。
【請求項８】
ＤＣＸ＋神経前駆細胞を標的化する化合物が、ＤＣＸ阻害剤、ＣＤ２４阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ネスチン阻害剤、Ｓｃａ−１モジュレーター、及び／又はＰＳＡＮＣＡＭモジュレーターからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＤＣＸ＋神経前駆細胞を標的化する化合物が、前立腺癌又は乳癌の古典的処置と組み合わせて投与される、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
生物学的試料中のＤＣＸ＋神経前駆細胞のレベルを決定するための手段を含む、請求項１〜６に記載の方法を実施するためのキット又は器具。
【請求項１１】
ダブルコルチン（ＤＣＸ）、ポリシアル酸化神経細胞接着分子（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ）、インターネキシン（ＩＮＡ）、Ｓｃａ−１、ＣＤ２４、ＥＧＦＲ、又はネスチンからなる群より選択された神経マーカーの少なくとも１つを決定するための手段を含む、請求項１〜６に記載の方法を実施するためのキット又は器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、前立腺癌、乳癌、又は転移性腫瘍を患っている患者の診断法に関する。本発明はまた、前立腺癌、乳癌、又は転移性腫瘍の処置のための方法及び医薬組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
胚の発達と腫瘍の発達との間の類似点は、正常な微小環境と腫瘍微小環境によって保存されている調節経路を示唆する。胚は発達するのに神経新生及び血管新生を必要とするので、原発性腫瘍のイニシエーション及び転移は、神経及び血管のネットワークの発達を必要とする（１）。神経新生は、神経前駆体からの機能的ニューロンの新規生成を伴い、神経新生は、中枢神経系（ＣＮＳ）の２つの神経新生領域である、嗅球（ＯＢ）内の介在ニューロンを発生する脳室下帯（ＳＶＺ）と、海馬内の歯状回（ＤＧ）において生涯を通じて起こる。脳損傷後、機能的な創傷治癒応答が起こり、神経前駆体の僅かな増殖増加、及び損傷部位への新生ニューロンの遊走が起こる（３）。癌においては、数多くの研究が、新規に形成された神経線維が浸潤及び増殖して、腫瘍発生及び転移を制御することを明瞭に示した（４〜１０）。神経栄養因子が腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内で発現し放出され、新生神経又は既存神経からの軸索伸長を促進し、これにより、神経ネットワークが構築され、これは腫瘍内で神経シグナル伝達を生じる（４、７、８、１１）。健常な前立腺では、損傷後に交感神経支配が再生し得、これは、新規に形成されたニューロンのエビデンスを全く伴うことのない軸索形成のプロセスを示し（１２）、一方、前立腺癌では、神経節毎のニューロン数が増加し、これは可能性ある神経新生プロセスが腫瘍において起こり、このプロセスが腫瘍の発達及び進行を支持することを示唆する（１３）。
【０００３】
本発明が腫瘍の発達を育成する中枢神経前駆体の独特な遊走を明らかとするにつれて、本発明はＣＮＳと前立腺腫瘍又は乳腺腫瘍との間の新規な種類の掛け合い応答を明らかとする。本発明は、腫瘍がどのようにＣＮＳと対話をして、その増殖及び播種に必要とされる細胞を補充するのかを示す。
【０００４】
要するに、これらの結果により、癌の発達を診断及びモニタリングするための新しい道、並びに血中又は腫瘍微小環境内の神経前駆体を標的化する新規療法がもたらされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
発明の概要：
本発明は、前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍を患っている患者の診断法に関する。本発明はまた、前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍の処置のための方法及び医薬組成物にも関する。特に、本発明は特許請求の範囲によって定義される。
【０００６】
発明の詳細な説明：
腫瘍微小環境における自律神経線維の発達は、前立腺癌のイニシエーション及び播種を調節する重要な出来事であるが、どのように神経が腫瘍内に出現するかは現在不明である。本発明者らは、中枢神経系（ＣＮＳ）からダブルコルチン発現（ＤＣＸ＋）神経前駆体が血流に入り、前立腺腫瘍に浸潤し、腫瘍の発達に寄与する新生ニューロンへと分化することを示す。ヒト原発性前立腺腫瘍及びトランスジェニックマウス癌組織では、ＤＣＸ＋神経前駆体の密度は、腫瘍の侵襲性、浸潤性、及び再発と強く関連している。トランスジェニック癌マウスでは、ＣＮＳの神経新生領域である、脳室下帯（ＳＶＺ）内のＤＣＸ＋神経幹細胞の振動現象が、ＳＶＺから血流へのＤＣＸ＋細胞の退出に関連していた。その後、これらの細胞は、それらが神経新生を開始する腫瘍に到達する。したがって、前立腺腫瘍におけるＤＣＸ＋前駆体は、エクスビボでニューロンへと分化し、インビボで腫瘍関連神経ネットワークを構築することができる。マウスにおけるＤＣＸ＋細胞の選択的な遺伝子除去は、前立腺癌の初期の発達を抑制し、一方、前立腺腫瘍又は脳組織から精製されたＤＣＸ＋細胞の同所移植は、腫瘍の増殖及び癌細胞の播種を促進する。これらの結果は、前立腺癌又は乳癌の発達に必要とされる神経新生プロセスを駆動する、ＣＮＳと腫瘍との間の独特な掛け合い応答を明らかとし、これは癌処置の標的候補としての腫瘍微小環境の新規な神経要素を示す。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本発明は、
ｉ）被験者から得られた生物学的試料中のＤＣＸ＋神経前駆細胞の量を決定する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で決定された量を、それらの対応する所定の基準値と比較する工程、及び
ｉｉｉ）工程ｉ）で決定された量と所定の基準値との差の検出が、患者の転帰を示す工程
を含む、前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍を患っている患者の転帰を予測するための方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】ヒト前立腺腺癌に浸潤しているダブルコルチン発現（ＤＣＸ陽性）神経前駆細胞の予後予測値。Ａ、Ｂ。良性前立腺過形成（ＢＰＨ、ｎ＝１５）、低リスク（ｎ＝１７）又は高リスク（ｎ＝２０）ヒト前立腺腺癌におけるＤＣＸ＋細胞の定量。Ａ、１人の患者についての各々の棒グラフは、１つの正常な領域（白色）、癌の領域（黒色）又は過形成の領域（縞模様）あたり１０個の視野（８６０個のｚスタック共焦点画像、視野表面積＝０．１５mm２）から得られたＤＣＸ＋細胞の平均数を示す。
【図１Ｂ】Ｂ。低リスク（Ｌｏ）又は高リスク（Ｈｉ）患者の正常な組織（白色）及び癌組織（黒色）における、並びにＡで試験された患者の前立腺過形成領域（縞模様）における１視野あたりのＤＣＸ＋細胞の平均数。
【図１Ｃ】Ｃ。ＤＣＸ＋細胞数と、腫瘍細胞が中等度（１）又は高度（２、３、４）に浸潤した前立腺領域の数との間の関連。
【図１Ｄ】Ｄ。高い（２０個を超えるＤＣＸ＋細胞）及び低い（２０個未満のＤＣＸ＋細胞）ＤＣＸ＋細胞数を有する患者の無再発生存期間。スケールバー、２０μm。エラーバーは標準誤差を示す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。
【図２】高リスク前立腺癌患者の無再発生存期間の早期の時点における分析。根治的前立腺摘除後の早期再発は、多数のＤＣＸ＋細胞（２０個を超えるＤＣＸ＋細胞）に関連している。Ｐ＝０．０３３８、ログランク検定（マンテル・コックス検定）。＊Ｐ＜０．０５。図１Ｄに示されるのと同じコホートの患者であるが、高リスク腫瘍に着目した。
【図３Ａ】Ｌｉｎ陰性ｔｄＴｏｍ陽性細胞は、ＰＴＥＮ前立腺、ＰｙＭＴ（ポリオーマウイルス中型Ｔ抗原）乳腺腫瘍及び転移に帰還することができる。Ａ。ＰＴＥＮマウス（ｎ＝５）又は野生型同腹仔（ｎ＝８）におけるＬｉｎ陰性ｔｄＴｏｍ陽性細胞の出現頻度。Ｌｉｎ陰性ｔｄＴｏｍ陽性細胞は転移にも見られる。健常な組織（異種移植片無し）との比較による、腫瘍組織へのＰＣ−３ｌｕｃの異種移植から１２〜１４週間後における、Ｌｉｎ陰性ｔｄＴｏｍ陽性細胞の出現頻度（
【図３Ｂ】Ｂ、大腸、
【図３Ｃ】Ｃ、肝臓、
【図３Ｄ】Ｄ、肺、及び
【図３Ｅ】Ｅ．リンパ節）。データは平均値±標準誤差である。スチューデントｔ検定（片側、補正せず）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図３Ｆ】Ｆ。生誕後５週目にＳＶＺに定位脳手術によるｔｄＴｏｍａｔｏ発現レンチウイルスベクターの注入後、Ｌｉｎ陰性ｔｄＴｏｍ陽性細胞は、生誕後１６週目に、野生型前立腺又は乳腺パッド組織との比較により、ＰｙＭＴ乳腺腫瘍組織に認められる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書において使用する「患者」という用語は哺乳動物を示す。典型的には、本発明による患者は、前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍に苦しむ任意の患者（特にヒト）を指す。「患者」という用語はまた、抗癌療法を受けている前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍に苦しむ任意の患者も指す。「患者」という用語はまた、手術による前立腺癌の切除を受けた後に前立腺癌に苦しむ任意の患者、又は、手術による乳癌の切除を受けた後に乳癌に苦しむ任意の患者も指す。
【００１０】
本明細書において使用する「前立腺癌」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、世界保健機関（ＷＨＯ）分類に改訂されているような前立腺癌を指す。「前立腺癌」という用語はまた、任意の種類の前立腺癌を指し、前立腺の悪性新生物（Ｃ６１）；低度及び高度異形成の前立腺（Ｎ４２．３、Ｄ０７．５）；前立腺の良性新生物（Ｄ２１．１）；挙動の不確実又は不明な前立腺の新生物（Ｄ４０）；局所前立腺癌；進行前立腺癌；局所進行前立腺癌；転移性前立腺癌；ホルモン感受性前立腺癌（ＨＳＰＣ）；去勢抵抗性（ＣＲＰＣ）前立腺癌の群から選択される。
【００１１】
１つの実施態様では、前立腺癌は転移性前立腺癌である。
【００１２】
本明細書において使用する「乳癌」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＷＨＯ分類に改訂されているような乳癌を指す。更に「乳癌」という用語は、全ての進行ステージにおける全ての種類の乳癌を含む。最初期のステージの乳癌はステージ０（前癌状態、非浸潤性乳管癌又は非浸潤性小葉癌）と呼ばれ、次に、ステージＩからステージＩＶの範囲がある。転移性乳癌としても知られる、ステージＩＶの乳癌では、癌は乳房及び所属リンパ節を超えて進展している。乳癌に最もよく使用されるステージ分類システムは、対がん米国合同委員会（ＡＪＣＣ）ＴＮＭシステムであり、これは腫瘍のサイズ、腋窩のリンパ節への進展、及び腫瘍が転移しているかどうかに基づく。
【００１３】
１つの実施態様では、乳癌は転移性乳癌である。
【００１４】
本明細書において使用する「転移性乳癌」という用語は、それらが最初に形成された場所から離脱し、血管系又はリンパ系を通って移動し、身体の他の部分で新規腫瘍（転移性腫瘍又は転移と呼ばれる）を形成する癌細胞を指す。
【００１５】
「生物学的試料」という用語は、患者に由来する任意の生物学的試料、例えば血液試料、生検試料、前立腺癌試料、乳癌試料、腫瘍組織試料、腫瘍組織の間質、脳脊髄液、又は脳室下帯（ＳＶＺ）を指す。
【００１６】
本明細書において使用する「腫瘍組織試料」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、除去された、例えば手術による腫瘍の切除後に除去された、組織片又は組織薄片を包含する。腫瘍組織試料は、様々な周知の収集後の分取技術及び保存技術（例えば固定、保存、凍結など）にかけられ得、その後、細胞の量を決定することができる。典型的には、腫瘍組織試料をホルマリンで固定し、パラフィン（ワックス）又はエポキシなどの強固な固定剤に包埋し、これを型に入れ、その後に、硬化させてブロックを作製し、これは容易に切断される。その後、材料の薄片を、ガラススライド上に置かれたマイクロトームを使用して調製することができ、例えば、免疫組織化学的検査法（ＩＨＣ）（染色されたスライドを得るために、ＩＨＣ自動化装置、例えばベンチマーク（登録商標）ＸＴ又はダコ社の自動免疫染色装置を使用して）にかけることができる。
【００１７】
本明細書において使用する「ダブルコルチン」すなわち「ＤＣＸ」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＣＮＳの発達中の神経新生領域及び成人の神経新生領域に位置する、神経前駆体の古典的マーカーを指す（１４〜１６）。
【００１８】
本明細書において使用する「ＤＣＸ＋神経前駆細胞」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、中枢神経系（ＣＮＳ）に由来するダブルコルチン発現（ＤＣＸ陽性）神経前駆体を指す。「ＤＣＸ＋神経前駆細胞」という用語はまた、ＤＣＸ＋神経前駆体細胞も指す。「ＤＣＸ＋神経前駆細胞」という用語はまた、ＤＣＸ＋神経幹細胞も指す。本発明によると、「ＤＣＸ＋神経前駆細胞」という用語は、前立腺腫瘍又は乳腺腫瘍に浸潤し、そして腫瘍の発達に寄与する新生ニューロンへと分化する、中枢神経系（ＣＮＳ）に由来するダブルコルチン発現（ＤＣＸ陽性）神経前駆体を指す。「ＤＣＸ＋神経前駆細胞」という用語はまた、ダブルコルチン（ＤＣＸ）、ポリシアル酸化神経細胞接着分子（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ）（１７）、インターネキシン（ＩＮＡ）（１８、１９）、Ｓｃａ−１、ＣＤ２４、ＥＧＦＲ、又はネスチンからなる群より選択された神経マーカーの少なくとも１つを発現していることによって特徴付けられる神経前駆細胞も指す。
【００１９】
前立腺腫瘍又は乳腺腫瘍又は転移性腫瘍における「ＤＣＸ＋神経前駆細胞」という用語はまた、ＧＦＡＰ- ＧＬＡＳＴ- ＣＤ４５- ＣＤ３２６- ＣＤ４９ｆ- ＣＤ３１- ＴＥＲ１１９- Ｓｃａ−１hi ＣＤ２４int ＥＧＦＲhi ＤＣＸ+ ＰＳＡＮＣＡＭlo細胞も指す。「ＤＣＸ＋神経前駆細胞」という用語はまた、ＧＦＡＰ- ＧＬＡＳＴ- ＣＤ４５- ＣＤ３２６- ＣＤ４９ｆ- ＣＤ３１- ＴＥＲ１１９- Ｓｃａ−１lo ＣＤ２４+ ＥＧＦＲInt ＤＣＸ+ ＰＳＡＮＣＡＭInt細胞も指す。「ＤＣＸ＋神経前駆細胞」という用語はまた、ＧＦＡＰ- ＧＬＡＳＴ- ＣＤ４５- ＣＤ３２６- ＣＤ４９ｆ- ＣＤ３１- ＴＥＲ１１９- Ｓｃａ−１- ＣＤ２４int ＥＧＦＲint ＤＣＸ+ ＰＳＡＮＣＡＭ-細胞も指す。
【００２０】
血中の「ＤＣＸ＋神経前駆細胞」という用語はまた、ＣＤ４５- ＤＣＸ+ Ｓｃａ−１- ＰＳＡＮＣＡＭ-/lo細胞も指す。
【００２１】
脳室下帯（ＳＶＺ）中の「ＤＣＸ＋神経前駆細胞」という用語はまた、ＧＦＡＰ+ ＧＬＡＳＴ+ ＣＤ４５- ＣＤ３２６- ＣＤ４９ｆ- ＣＤ３１- ＴＥＲ１１９- Ｓｃａ−１- ＣＤ２４- ＥＧＦＲ- ＤＣＸ+ ＰＳＡＮＣＡＭ-細胞も指す。脳室下帯（ＳＶＺ）中の「ＤＣＸ＋神経前駆細胞」という用語はまた、ＧＦＡＰ+ ＧＬＡＳＴ+ ＣＤ４５- ＣＤ３２６- ＣＤ４９ｆ- ＣＤ３１- ＴＥＲ１１９- Ｓｃａ−１-/lo ＣＤ２４+ ＥＧＦＲ-/lo ＤＣＸ+ ＰＳＡＮＣＡＭ+細胞も指す。ＳＶＺ中の「ＤＣＸ＋神経前駆細胞」という用語はまた、ＧＦＡＰ+ ＧＬＡＳＴ+ ＣＤ４５- ＣＤ３２６- ＣＤ４９ｆ- ＣＤ３１- ＴＥＲ１１９- Ｓｃａ−１lo ＣＤ２４+ ＥＧＦＲ+ ＤＣＸ+ ＰＳＡＮＣＡＭint細胞も指す。
【００２２】
本明細書において使用する「ＤＣＸ＋神経前駆細胞の量」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＤＣＸ＋神経前駆細胞の数を指す。「ＤＣＸ＋神経前駆細胞の量」という用語はまた、ＤＣＸ＋神経前駆細胞の密度も指す。「ＤＣＸ＋神経前駆細胞の量」という用語はまた、ＤＣＸ＋神経前駆細胞の比率も指す。
【００２３】
いくつかの実施態様では、本発明は、
ｉ）被験者から得られた生物学的試料中のＤＣＸ＋神経前駆細胞の量を決定する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で決定された量を、それらの対応する所定の基準値と比較する工程、及び
ｉｉｉ）工程ｉ）で決定されたレベルが所定の基準値よりも低い場合に、患者は良好な予後を有すると結論付ける工程、又は、工程ｉ）で決定されたレベルが所定の基準値よりも高い場合に、患者は不良な予後を有すると結論付ける工程
を含む、前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍を患っている患者の転帰を予測するための方法に関する。
【００２４】
本明細書において使用する「良好な予後」という用語は、前立腺癌若しくは乳癌の侵襲性及び／又は浸潤性を呈さないようである、並びに／或いは、前立腺癌若しくは乳癌の再発、及び／又は前立腺癌若しくは乳癌の再燃を呈さないようである、並びに／或いは、長い全生存期間（ＯＳ）、無イベント生存期間（ＥＦＳ）、無転移生存期間（ＭＦＳ）及び／又は無再発生存期間（ＲＦＳ）を呈するようである、前立腺癌又は乳癌に苦しむ患者を指す。
【００２５】
本明細書において使用する「不良な予後」又は「悪い予後」という用語は、前立腺癌若しくは乳癌の侵襲性及び／又は浸潤性を呈するようである、並びに／或いは、前立腺癌若しくは乳癌の再発、及び／又は前立腺癌若しくは乳癌の再燃を呈するようである、並びに／或いは、短い全生存期間（ＯＳ）、無イベント生存期間（ＥＦＳ）、無転移生存期間（ＭＦＳ）及び／又は無再発生存期間（ＲＦＳ）を呈するようである、前立腺癌又は乳癌に苦しむ患者を指す。
【００２６】
本明細書において使用する「基準値」は、閾値又はカットオフ値を指す。よって、単一の「基準値」を設定することにより、患者の前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍の侵襲性、浸潤性及び／又は再発、癌再燃、及び／又は全生存期間（ＯＳ）に関する、不良な予後と良好な予後との区別が可能となる。典型的には、「閾値」又は「カットオフ値」は、実験的に、経験的に、又は理論的に決定され得る。閾値はまた、当業者によって認識されているようであろうように、既存の実験条件及び／又は臨床条件に基づいて任意に選択され得る。閾値は、試験の関数及びベネフィット/リスクのバランス（疑陽性及び偽陰性の臨床結果）に従って、最適な感度及び特異度が得られるように決定されなければならない。典型的には、最適な感度及び特異度（及びよって閾値）は、実験データに基づき受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して決定され得る。特に、当業者は、（本発明の方法に従って得られた）量を、所定の閾値と比較し得る。本発明の１つの実施態様では、閾値は、前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍を有する１人以上の患者から得られた生物学的試料において決定された量（又は比、又はスコア）から導かれる。更に、適切に寄託された過去の患者試料中の量（又は比、又はスコア）の遡及的測定値を、これらの閾値の確立のために使用してもよい。
【００２７】
比較のために使用される所定の基準値は、「カットオフ値」又は「閾値」を含み得、これは本明細書に記載のように決定され得る。各基準（カットオフ）値は、
ａ）前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍を患っている患者から試料の収集物（例えば腫瘍、血液）を準備する工程；
ｂ）工程ａ）で準備された収集物に含有されている、各試料のＤＣＸ＋神経前駆細胞の量を決定する工程；
ｃ）前記の細胞の量に従って、腫瘍試料を等級付けする工程；
ｄ）それらの細胞量に従って等級付けされた、それぞれ数が増加しているメンバー、数が減少しているメンバーのサブセット対に、該試料を分類する工程；
ｅ）工程ａ）で準備された各試料について、対応する前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍の患者の実際の臨床転帰に関する情報（すなわち、無イベント生存期間（ＥＦＳ）、無転移生存期間（ＭＦＳ）、又は全生存期間（ＯＳ）又は両方の期間）を準備する工程；
ｆ）各サブセット対の試料について、生存曲線のカプランマイヤー率を得る工程；
ｇ）各サブセット対の試料について、両方のサブセット間の統計学的有意性（ｐ値）を計算する工程；
ｈ）細胞の量の基準値として、ｐ値が最小である細胞量の数値を選択する工程
を含む、方法を実施することによって予め決定され得る。
【００２８】
例えば、１００人の患者の１００個の癌試料についてのＤＣＸ＋神経前駆細胞の量が評価される。１００個の試料は、その細胞量に従って等級付けされる。試料１は、最善の細胞量を有し、試料１００は最悪の細胞量を有する。第一のグループは、２つのサブセットを提供する：一方の側には試料番号１、他方の側には９９個の他の試料。次のグループは、一方の側には試料１及び２、他方の側には９８個の残りの試料などであり、最後のグループまで続く：一方の側には試料１〜９９、他方の側には試料番号１００。対応する前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍の患者についての実際の臨床転帰に関する情報に従って、２つのサブセットの９９個のグループのそれぞれについての、カプランマイヤー曲線を準備する。また、９９個のグループのそれぞれについて、両方のサブセット間のｐ値を計算した。
【００２９】
基準値は、最小ｐ値の基準に基づいた識別が最強であるように選択される。換言すれば、ｐ値が最小である両方のサブセット間の境界に相当する細胞の量が、基準値と考えられる。基準値は、必ずしも細胞量の中央値ではないことが注記されるべきである。
【００３０】
定型的作業では、基準値（カットオフ値）は、前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍の試料を識別するために、及びよって対応する患者を識別するために、本発明の方法において使用され得る。
【００３１】
時間の関数としての生存率のカプランマイヤー曲線は一般的に、処置後に一定の時間、生存している患者の割合を測定するためのものであり、これは当業者には周知である。
【００３２】
当業者はまた、細胞の量を評価する同技術が、勿論、基準値を得るために、及びその後、本発明の方法にかけられる患者の細胞量の評価のために使用されるべきであることを理解している。
【００３３】
特定の実施態様では、スコアは、コンピュータープログラムによって作成され得る。
【００３４】
いくつかの実施態様では、スコアはアルゴリズムによって作成され得、ここでのアルゴリズムは、線形判断分析（ＬＤＡ）、位相的データ分析（ＴＤＡ）、神経ネットワーク、サポートベクトルマシン（ＳＶＭ）アルゴリズム、及びランダムフォレストアルゴリズム（ＲＦ）から選択される。
【００３５】
いくつかの実施態様では、スコアは、分類アルゴリズムによって作成され得る。本明細書において使用する「分類アルゴリズム」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、米国特許第８，１２６，６９０号明細書；国際公開第２００８/１５６６１７号に記載のような当技術分野において周知である、分類木及び回帰木法並びに多変量分類を指す。本明細書において使用する「サポートベクトルマシン（ＳＶＭ）」という用語は、パターン認識に有用な万能学習マシンであり、その決定面は、ワンセットのサポートベクトル及びワンセットの対応する重みによってパラメーター化され、複数の変数を別々に処理するのではなく、同時に処理する方法を指す。したがって、サポートベクトルマシンは、分類のための統計学的ツールとして有用である。サポートベクトルマシンは、そのｎ次元入力空間を高次元特徴空間に非線形的にマッピングし、特徴間の最適なインターフェース（最適な分離面）を提示する。サポートベクトルマシンは、以下の２つのフェーズを含む：訓練フェーズ及び試験フェーズ。訓練フェーズでは、サポートベクトルが作成されるが、推定は、試験フェーズの特定の法則に従って行われる。一般的に、サポートベクトルマシンは、ｎ人の各被験者を、被験者１人あたり１つのバイオマーカー測定値のｋ次元ベクトル（ｋタプルと呼ばれる）に基づいて２つ以上の疾患カテゴリーに分類する際に使用するためのモデルを提供する。サポートベクトルマシンはまず、ｔタプルをカーネル関数を使用して同等又はより高次元の空間へと変換する。カーネル関数は、超平面を使用してカテゴリーを、元来のデータ空間で可能であったであろうよりも良好に分離することのできる空間へとデータを投影する。超平面（これを用いてカテゴリー間を識別する）を決定するために、疾患カテゴリー間の境界の最も近くにあるワンセットのサポートベクトルが選択され得る。その後、超平面は、サポートベクトルと超平面との間の距離が、コスト関数の限界内で最大となるように、公知のサポートベクトルマシンによって選択され、間違った予測にはペナルティーが科される。この超平面は、予測の点でデータを最適に分離するものである（Vapnik, 1998 Statistical Learning Theory. New York: Wiley）。その後、あらゆる新規な観察は、超平面に関してどこが観察されるかに基づいて、関心対象のカテゴリーのいずれか１つに属するとして分類される。２つを超えるカテゴリーが考えられる場合、プロセスは、全てのカテゴリーについて対で行なわれ、そうした結果を合わせて、全てのカテゴリー間を識別する法則を作り出す。本明細書において使用する「ランダムフォレストアルゴリズム」すなわち「ＲＦ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、米国特許第８，１２６，６９０号明細書；国際公開第２００８/１５６６１７号に記載のような分類アルゴリズムを指す。ランダムフォレストは、元々Leo Breiman（Breiman L, "Random forests," Machine Learning 2001, 45:5-32）によって開発されたアルゴリズムを使用して構築された、決定木に基づいた分類器である。分類器は、多くの個々の決定木を使用し、個々の木によって決定されるようなクラスのモードを選択することによってクラスを決定する。個々の木は、以下のアルゴリズムを使用して構築される：（１）訓練セットにおける症例数はＮであり、分類器における変数の数はＭであると仮定する；（２）入力変数の数を選択し、これを使用して木のノードにおける決断を決定するだろう；この数字ｍは、Ｍよりはるかに小さくあるべきである；（３）置換を含む訓練用セットからＮ個の試料を選択することによって、訓練用セットを選択する；（４）木の各ノードについて、そのノードにおける決定の基礎となる、Ｍ中ｍ個の変数を無作為に選択する；（５）訓練用セットにおけるこれらのｍ個の変数に基づいて、最善の分割を計算する。
【００３６】
いくつかの実施態様では、スコアは、コンピュータープログラムによって作成される。
【００３７】
本発明のアルゴリズムは、１つ以上のコンピュータープログラムを実行して、入力データを操作し出力を出すことによって機能を果たす、１つ以上のプログラム可能なプロセッサによって実施され得る。アルゴリズムは、特殊用途ロジック回路、例えばＦＰＧＡ（現場で書き換え可能な論理回路の多数配列）又はＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）によって実施されてもよく、装置もまた、特殊用途ロジック回路、例えばＦＰＧＡ（現場で書き換え可能な論理回路の多数配列）又はＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）として実装されてもよい。コンピュータープログラムの実行に適したプロセッサとしては、例えば、汎用及び特殊目的マイクロプロセッサの両方、並びに、任意の種類のデジタルコンピューターのいずれか１つ以上のプロセッサが挙げられる。一般的には、プロセッサは、リードオンリーメモリ又はランダムアクセスメモリ又はその両方からの指示及びデータを受け取るだろう。コンピューターの必須要素は、指示を行なうプロセッサと、指示及びデータを保存するための１つ以上のメモリ装置である。一般的には、コンピューターはまた、データを保存するための１つ以上の大容量記憶装置、例えば磁気ディスク、光磁気ディスク、若しくは光ディスクを含むであろうか、又はそれからデータを受け取るように若しくはそれにデータを転送するように若しくはその両方を行なうように動作上接続されているだろう。しかしながら、コンピューターはこのような装置を有する必要はない。更に、コンピューターは別の装置に組み込まれていてもよい。コンピュータープログラムの指示及びデータを保存するのに適したコンピューター可読媒体としては、全ての形式の不揮発性メモリ、媒体、及びメモリ装置を含み、これには例えば、半導体メモリ装置、例えばＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、及びフラッシュメモリ装置；磁気ディスク、例えば内臓ハードディスク又はリムーバブルディスク；光磁気ディスク；並びにＣＤ−ＲＯＭ及びＤＶＤ−ＲＯＭディスクが含まれる。プロセッサ及びメモリは、特殊目的ロジック回路によって補充されていても、又はそれに組み込まれていてもよい。ユーザーとのインタラクトを提供するために、本発明の実施態様は、ディスプレイデバイス、例えば非限定的な例では、ユーザーに情報を表示するためのＣＲＴ（陰極線管）又はＬＣＤ（液晶ディスプレイ）モニター、及びキーボード及びポインティングデバイス、例えばマウス又はトラックボール（これによりユーザーはコンピューターに入力することができる）を有する、コンピューター上に実装され得る。他の種類の装置も同様にユーザーとのインタラクトを提供するために使用することができ；例えば、ユーザーに提供されたフィードバックは、任意の形式の感覚フィードバック、例えば視覚フィードバック、聴覚フィードバック、又は触覚フィードバックであり得；ユーザーからの入力は、音響入力、音声入力、又は触覚入力をはじめとする任意の形式で受け取られ得る。したがって、いくつかの実施態様では、アルゴリズムは、例えばデータサーバーとしてバックエンドコンポーネントを含むか、又はミドルウェアコンポーネント、例えばアプリケーションサーバーを含むか、又はフロントエンドコンポーネント、例えばグラフィカルユーザーインターフェース若しくはウェブブラウザ―（これを通して、ユーザーは本発明の実装とインタラクトすることができる）を有するクライアントコンピューターを含むか、又は１つ以上のこのようなバックエンドコンポーネント、ミドルウェアコンポーネント若しくはフロントエンドコンポーネントの任意の組合せを含む、コンピューターシステムに実装され得る。システムのコンポーネントは、任意の形式又は媒体のデジタルデータ通信、例えば通信ネットワークによって相互接続されていてもよい。通信ネットワークの例としては、ローカルエリアネットワーク（「ＬＡＮ」）及びワイドエリアネットワーク（「ＷＡＮ」）、例えばインターネットが挙げられる。コンピューターシステムは、クライアント及びサーバーを含み得る。クライアント及びサーバーは一般的に互いにリモートであり、典型的には通信ネットワークを通してインタラクトする。クライアント及びサーバーの関係は、それぞれのコンピューター上で作動し、互いにクライアント−サーバー関係を有する、コンピュータープログラムのお蔭で生じる。
【００３８】
１つの実施態様では、基準値は、良好な予後を有する患者に関連した試料中で決定されたＤＣＸ＋神経前駆細胞の量に相当し得る。したがって、基準値よりも高い量のＤＣＸ＋神経前駆細胞は、不良な予後を有する患者を示し、基準値よりも低いか又は同等な量のＤＣＸ＋神経前駆細胞は、良好な予後を有する患者を示す。
【００３９】
別の実施態様では、基準値は、不良な予後を有する患者に関連した試料中で決定されたＤＣＸ＋神経前駆細胞の量に相当し得る。したがって、基準値よりも高いか又は同等な量のＤＣＸ＋神経前駆細胞は、不良な予後を有する患者を示し、基準値よりも低い量のＤＣＸ＋神経前駆細胞は、良好な予後を有する患者を示す。
【００４０】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、患者の前立腺癌又は乳癌の侵襲性、浸潤性、及び／又は再発を予測するのに特に適している。
【００４１】
したがって、本発明はまた、
ｉ）被験者から得られた生物学的試料中のＤＣＸ＋神経前駆細胞の量を決定する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で決定された量を、それらの対応する所定の基準値と比較する工程、及び
ｉｉｉ）工程ｉ）で決定されたレベルが所定の基準値よりも低い場合に、患者は非侵襲性、非浸潤性、及び／又は非再発性の前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍を有すると結論付ける工程、或いは、工程ｉ）で決定されたレベルが所定の基準値よりも高い場合に、患者は侵襲性、浸潤性、及び／又は再発性の前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍を有すると結論付ける工程
を含む、前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍を患っている患者の転帰を予測するための方法に関する。
【００４２】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、患者の生存期間を予測するのに特に適している。
【００４３】
したがって、本発明はまた、
ｉ）被験者から得られた生物学的試料中のＤＣＸ＋神経前駆細胞の量を決定する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で決定された量を、それらの対応する所定の基準値と比較する工程、及び
ｉｉｉ）工程ｉ）で決定されたレベルが所定の基準値よりも低い場合に、患者は長い生存期間を有すると結論付ける工程、或いは、工程ｉ）で決定されたレベルが所定の基準値よりも高い場合に、患者は短い生存期間を有すると結論付ける工程
を含む、前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍を患っている患者の転帰を予測するための方法に関する。
【００４４】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、患者の無再発生存期間を予測するのに特に適している。
【００４５】
したがって、本発明はまた、
ｉ）被験者から得られた生物学的試料中のＤＣＸ＋神経前駆細胞の量を決定する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で決定された量を、それらの対応する所定の基準値と比較する工程、及び
ｉｉｉ）工程ｉ）で決定されたレベルが所定の基準値よりも低い場合に、患者は長い無再発生存期間を有すると結論付ける工程、或いは、工程ｉ）で決定されたレベルが所定の基準値よりも高い場合に、患者は短い無再発生存期間を有すると結論付ける工程
を含む、前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍を患っている患者の転帰を予測するための方法に関する。
【００４６】
ＤＣＸ＋神経前駆細胞の量は、当技術分野における任意の周知の方法によって決定される。いくつかの実施態様では、ＤＣＸ＋神経前駆細胞の量は、実施例に記載のように決定される。いくつかの実施態様では、ＤＣＸ＋神経前駆細胞の量は、フローサイトメトリーによって決定される。いくつかの実施態様では、ＤＣＸ＋神経前駆細胞の量は、免疫組織化学法又は免疫蛍光法によって決定される。
【００４７】
例えば、ＤＣＸ＋神経前駆細胞の定量は、腫瘍組織試料を、該細胞の細胞マーカーに特異的な結合対（例えば抗体）と接触させることによって行なわれる。典型的には、ＤＣＸ＋神経前駆細胞の定量は、腫瘍組織試料を、ダブルコルチン（ＤＣＸ）、ポリシアル酸化神経細胞接着分子（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ）（１７）、インターネキシン（ＩＮＡ）（１８、１９）、Ｓｃａ−１、ＣＤ２４、ＥＧＦＲ、又はネスチンに特異的な結合対（例えば抗体）と接触させることによって行なわれる。
【００４８】
いくつかの実施態様では、ＤＣＸ＋神経前駆細胞の定量は、腫瘍組織試料を、ダブルコルチン（ＤＣＸ）に対して特異的な結合対（例えば抗体）と、それぞれポリシアル酸化神経細胞接着分子（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ）（１７）、インターネキシン（ＩＮＡ）（１８、１９）、Ｓｃａ−１、ＣＤ２４又はネスチンに対して特異的な結合対（例えば抗体）の両方と接触させることによって行なわれる。
【００４９】
典型的には、ＤＣＸ＋神経前駆細胞の量は、組織試料の表面積１単位あたりに計数されるこれらの細胞の数として、例えば、腫瘍組織試料の表面積１mm２あたりに計数される細胞の数として表現される。いくつかの実施態様では、ＤＣＸ＋神経前駆細胞の量はまた、全細胞（１００％に設定）あたりの特定の細胞の比率からなり得る。
【００５０】
免疫組織化学法は典型的には、以下の工程、ｉ）腫瘍組織試料をホルマリンで固定する工程、ｉｉ）該腫瘍組織試料をパラフィンに包埋する工程、ｉｉｉ）染色のために該腫瘍組織試料を切片に切断する工程、ｉｖ）該切片を、マーカーに特異的な結合対と共にインキュベートする工程、ｖ）該切片を濯ぐ工程、ｖｉ）該切片を、典型的にはビオチニル化された二次抗体と共にインキュベートする工程、及びｖｉｉ）抗原−抗体複合体を、典型的にはアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体を用いて顕現させる工程を含む。したがって、腫瘍組織試料をまず、結合対と共にインキュベートする。洗浄後、関心対象のマーカーに結合した標識された抗体を、標識された抗体によって生じる標識の種類、例えば放射性標識、蛍光標識、又は酵素標識などに応じて適切な技術によって顕現させる。複数の標識を同時に行なってもよい。或いは、本発明の方法は、増幅システム（染色シグナルを強化するため）及び酵素分子に結合させた二次抗体を使用してもよい。このような結合した二次抗体は市販されており、例えば、ダコ社のEnVision systemである。例えばヘマトキシリン及びエオシン、ＤＡＰＩ、ヘキストなどの対比染色を使用してもよい。他の染色法も、当業者には明らかであろうような任意の適切な方法又はシステム、例えば自動システム、半自動システム、又は手動システムを使用して成し遂げられ得る。例えば、１つ以上の標識を抗体に付着させ、これにより、標的タンパク質（すなわちマーカー）の検出が可能となり得る。例示的な標識としては、放射性同位体、フルオロフォア、リガンド、化学発光剤、酵素、及びその組合せが挙げられる。いくつかの実施態様では、標識は量子ドットである。一次及び／又は二次アフィニティリガンドにコンジュゲートさせることのできる標識の非限定的な例としては、蛍光色素又は金属（例えばフルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フルオレサミン）、発色団色素（例えばロドプシン）、化学発光化合物（例えばルミナル、イミダゾール）、及び生物発光タンパク質（例えばルシフェリン、ルシフェラーゼ）、ハプテン（例えばビオチン）が挙げられる。様々な他の有用な蛍光剤及び発色団が、Stryer L (1968) Science 162:526-533及びBrand L and Gohlke J R (1972) Annu. Rev. Biochem. 41:843-868に記載されている。アフィニティリガンドを、酵素（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ラクタマーゼ）、放射性同位体（例えば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、又は１２５Ｉ）、及び粒子（例えば金）を用いて標識することもできる。様々な種類の標識を、様々な化学反応、例えばアミン反応又はチオール反応を使用してアフィニティリガンドにコンジュゲートさせることができる。しかしながら、アミン及びチオール以外の他の反応性基、例えば、アルデヒド、カルボン酸、及びグルタミンも使用することができる。関心対象のタンパク質を検出するための様々な酵素染色法が、当技術分野において公知である。例えば、酵素相互作用を、様々な酵素、例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又は様々な色素原、例えばＤＡＢ、ＡＥＣ又はファストレッドを使用して可視化することができる。他の例では、抗体を、ペプチド又はタンパク質にコ��ジュゲートさせることができ、これを標識された結合対又は抗体を介して検出することができる。間接的な免疫組織化学アッセイでは、第一の結合対の結合を検出するために二次抗体又は二次結合対が必要とされる。なぜなら、第一の結合対は標識されていないからである。検出可能なシグナルを見て、画像、例えばデジタル染色画像を取得するためのシステムを使用して、結果として得られた染色された種をそれぞれ撮影する。画像取得のための方法は、当業者には周知である。例えば、一旦、試料が染色されたら、任意の光学的又は非光学的イメージング装置、例えば、正立型又は倒立型光学顕微鏡、走査型共焦点顕微鏡、カメラ、走査型又はトンネル電子顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡、及びイメージング赤外線検出器を使用して、染色又はバイオマーカー標識を検出することができる。いくつかの例では、画像をデジタルでキャプチャすることができる。その後、試料中のマーカーの量、又は関心対象のマーカーに陽性な細胞の絶対数、又は関心対象のマーカーに陽性な細胞の表面積を定量的に又は半定量的に決定するために、得られた画像を使用することができる。免疫組織化学法に使用するのに適した様々な自動試料処理、走査、及び分析システムが当技術分野において入手可能である。このようなシステムは、自動化された染色及び顕微鏡による走査、コンピューター化された画像分析、連続切片比較（試料の方向及びサイズのばらつきを制御するため）、デジタルリポートの作成、並びに試料（組織切片が置かれているスライドなど）の保存記録及び追跡を含み得る。免疫染色された試料を含む、細胞及び組織上での定量分析を実施するための、従来の光学顕微鏡をデジタル画像処理システムと組み合わせた細胞イメージングシステムは市販されている。例えば、ＣＡＳ−２００システム（ベクトン・ディッキンソン社）を参照されたい。特に、検出は、手作業で、又はコンピュータープロセッサ及びソフトウェアを伴う画像処理技術によって行なわれ得る。このようなソフトウェアを使用して、例えば染色品質又は染色強度をはじめとする因子に基づいて、当業者に公知の手順を使用して、例えば、画像を、構成、校正、標準化、及び／又は検証することができる（例えば、公開されている米国特許出願公開第２０１０／０１３６５４９号明細書）参照）。画像を、定量的に又は半定量的に分析し、試料の染色強度に基づいてスコア化することができる。定量的又は半定量的組織化学検査法は、組織化学検査法を受けた試料を走査及びスコア化して、特定のバイオマーカー（すなわちマーカー）の存在を同定及び定量する方法を指す。定量的又は半定量的方法は、染色密度若しくは染色量を検出するためのイメージングソフトウェア、又はヒトの眼によって染色を検出する方法を使用することができ、ここでの訓練された操作者は、結果を数値で順位付けする。例えば、ピクセルカウントアルゴリズム及び組織認識パターン（例えば、アペリオスペクトラムソフトウェア、自動QUantitative解析プラットフォーム（AQUA（登録商標）プラットフォーム）、又はIlastic及びCalopixソフトウェアとのTribvn）、並びに染色度を測定又は定量若しくは半定量する他の標準的な方法を使用して、画像を定量的に解析することができる��例えば、米国特許第８，０２３，７１４号明細書、米国特許第７，２５７，２６８号明細書、米国特許第７，２１９，０１６号明細書、米国特許第７，６４６，９０５号明細書、公開されている米国特許出願公開第２０１０／０１３６５４９号明細書及び同第２０１１／０１１１４３５号明細書；Camp et al. (2002) Nature Medicine, 8:1323-1327；Bacus et al. (1997) Analyt Quant Cytol Histol, 19:316-328参照。総染色面積の総計に対する（茶色染色のような）強力な陽性染色の比率を計算し、スコア化することができる。検出されたバイオマーカー（すなわちマーカー）の量を定量化し、陽性ピクセル及び／又はスコアの比率として示す。例えば、陽性ピクセルの比率として量を定量化することができる。いくつかの例では、染色された面積の比率、例えば陽性ピクセルの比率として、量を定量する。例えば、試料は、総染色面積と比較して、少なくとも又はほぼ少なくとも又はほぼ０％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の陽性ピクセルを有し得る。例えば、関心対象のマーカーに陽性な細胞の絶対数として量を定量化することができる。いくつかの実施態様では、試料の組織化学的染色の強度又は量の数的表示であるスコアが試料に対して付与され、該スコアは、試料中に存在するＤＣＸ＋神経前駆細胞（例えばマーカー）の量を示す。光学密度又は面積率の数値には、目盛りの付けられたスコア、例えば整数の目盛りのスコアが付与され得る。したがって、いくつかの実施態様では、本発明の方法は、ｉ）マーカー（例えば上記のような抗体）と選択的に相互作用することのできる結合対を使用することによって、自動スライド染色システムによって得られた１つ以上の免疫染色された組織切片の薄片を準備する工程、ｉｉ）高解像度のスキャンキャプチャにより、工程ｉ）のスライドをデジタル化へと進める工程、ｉｉｉ）デジタル写真上の組織切片薄片を検出する工程、ｉｖ）サイズ参照用格子に、同じ表面積を有する均一に分布された単位を付与する工程（ここでの格子は、分析される組織切片のサイズに適応させている）、及びｖ）各単位内において染色された細胞の強度又は絶対数を検出、定量、及び測定する工程（これにより、各単位の染色された細胞の数又は密度が評価される）からなる、工程を含む。
【００５１】
いくつかの実施態様では、ＤＣＸ＋神経前駆細胞の定量は、フローサイトメトリー又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって行なわれる。いくつかの実施態様では、ＤＣＸ＋神経前駆細胞の定量は、実施例に記載のようなフローサイトメトリーによって行なわれる。
【００５２】
更なる態様では、本発明の方法は、患者が抗癌処置又は抗癌療法に適格であるか否かを決定するのに適している。例えば、患者が不良な予後を有すると結論付けられる場合、医師は、抗癌処置を患者に投与する選択を採用することができる。典型的には、処置は、化学療法、放射線療法、放射線免疫療法、及び免疫療法を含む。
【００５３】
「抗癌処置」又は「抗癌療法」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、抗癌療法に使用される抗癌化合物、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ受容体（ＴＫＲ）阻害剤、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤、抗ＥＧＦＲ化合物、抗ＨＥＲ２化合物、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）経路阻害剤、インターフェロン療法、アルキル化剤、代謝拮抗剤、免疫療法剤、例えばシプリューセル−Ｔ、アンドロゲン抑制療法（ＡＤＴ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターロイキン、β遮断薬、ムスカリン受容体アンタゴニスト、放射線療法剤（例えばＲａ２２３、Ｐｂ２１２）、及び下記のような化学療法剤を指す。
【００５４】
「チロシンキナーゼ阻害剤」すなわち「ＴＫＩ」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、様々な治療剤又は薬物のいずれか、例えば、チロシンキナーゼ阻害化合物、チロシンキナーゼ受容体阻害剤（ＴＫＲＩ）、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤、ＥＧＦＲアンタゴニストを指す。「チロシンキナーゼ阻害剤」すなわち「ＴＫＩ」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、選択的又は非選択的な受容体型及び／又は非受容体型チロシンキナーゼの阻害剤として作用する、様々な治療剤又は薬物のいずれかを指す。チロシンキナーゼ阻害剤及び関連化合物は当技術分野において周知であり、米国特許出願公開第２００７/０２５４２９５号明細書（これはその全体が本明細書に参照により援用される）に記載されている。チロシンキナーゼ阻害剤に関連した化合物は、チロシンキナーゼ阻害剤の作用を再現するであろう、例えば、関連した化合物は、チロシンキナーゼシグナル伝達経路の異なるメンバーに作用して、そのチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ阻害剤と同じ作用を生じるであろうことが当業者に理解されるであろう。本発明の実施態様の方法に使用するのに適したチロシンキナーゼ阻害剤及び関連した化合物の例としては、エルロチニブ、スニチニブ（スーテント；ＳＵ１１２４８）、ダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）、ＰＰ２、ＢＥＺ２３５、サラカチニブ、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロチニブ（タルセバ；ＯＳＩ−１７７４）、ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６；ＧＷ２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ １０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７/ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）、イマチニブ（グリベック；ＳＴＩ５７１）、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（ザクチマ；ＺＤ６４７４）、ＭＫ−２２０６（８−［４−（アミノシクロブチル）フェニル］−９−フェニル−１，２，４−トリアゾロ［３，４−ｆ］［１，６］ナフチリジン−３（２Ｈ）−オン塩酸塩）、その誘導体、その類似体、及びその組合せが挙げられるがこれらに限定されない。本発明に使用するのに適した追加のチロシンキナーゼ阻害剤及び関連した化合物は、例えば、米国特許出願公開第２００７／０２５４２９５号明細書、米国特許第５，６１８，８２９号明細書、同第５，６３９，７５７号明細書、同第５，７２８，８６８号明細書、同第５，８０４，３９６号明細書、同第６，１００，２５４号明細書、同第６，１２７，３７４号明細書、同第６，２４５，７５９号明細書、同第６，３０６，８７４号明細書、同第６，３１３，１３８号明細書、同第６，３１６，４４４号明細書、同第６，３２９，３８０号明細書、同第６，３４４，４５９号明細書、同第６，４２０，３８２号明細書、同第６，４７９，５１２号明細書、同第６，４９８，１６５号明細書、同第６，５４４，９８８号明細書、同第６，５６２，８１８号明細書、同第６，５８６，４２３号明細書、同第６，５８６，４２４号明細書、同第６，７４０，６６５号明細書、同第６，７９４，３９３号明細書、同第６，８７５，７６７号明細書、同第６，９２７，２９３号明細書及び同第６，９５８，３４０号明細書に記載され、その全てのその全体が本明細書に参照により援用される。特定の実施態様では、チロシンキナーゼ阻害剤は、経口投与され、少なくとも１回の第Ｉ相臨床試験、より特定すると少なくとも１回の第ＩＩ相臨床試験、更により特定すると少なくとも１回の第ＩＩＩ相臨床試験の対象、最も特定すると少なくとも１つの血液学的徴候又は腫瘍学的徴候についてＦＤＡによって認可されている対象である、低分子キナーゼ阻害剤である。このような阻害剤の例としては、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ＢＭＳ−５９９６２６（ＡＣ−４８０）、ネラチニブ、ＫＲＮ−６３３、ＣＥＰ−１１９８１、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ＡＺＭ−４７５２７１、ＣＰ−７２４７１４、ＴＡＫ−１６５、スニチニブ、バタラニブ、ＣＰ−５４７６３２、バンデタニブ、ボスチニブ、レスタウルチニブ、タンデュチニブ、ミドスタウリン、エンザスタウリン、ＡＥＥ−７８８、パゾパニブ、アキシチニブ、モタセニブ、ＯＳＩ−９３０、セディラニブ、ＫＲＮ−９５１、ドビチニブ、セクシクリブ、ＳＮＳ−０３２、ＰＤ−０３３２９９１、ＭＫＣ−１（Ｒｏ−３１７４５３；Ｒ−４４０）、ソラフェニブ、ＡＢＴ−８６９、ブリバニブ（ＢＭＳ−５８２６６４）、ＳＵ−１４８１３、テラチニブ、ＳＵ−６６６８、（ＴＳＵ−６８）、Ｌ−２１６４９、ＭＬＮ−８０５４、ＡＥＷ−５４１、及びＰＤ−０３２５９０１が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５５】
本明細書において使用するＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤としては、エルロチニブ、ラパチニブ、ロシレチニブ（ＣＯ−１６８６）、ゲフィチニブ、ダコミチニブ（ＰＦ−００２９９８０４）、アファタニブ、ブリカチニブ（ＡＰ２６１１３）、ＷＪＴＯＧ３４０５、ＮＥＪ００２、ＡＺＤ９２９１、ＨＭ６１７１３、ＥＧＦ８１６、ＡＳＰ８２７３、ＡＣ００１０からなる群から選択されるがこれらに限定されない化合物が挙げられるがこれらに限定されない。ＥＧＦＲ抗体阻害剤の例としては、セツキシマブ、パニツムマブ、マツズマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、ネシツムマブ、イムガツズマブ（ＧＡ２０１、ＲＯ５０８３９４５）、及びＡＢＴ−８０６が挙げられる。
【００５６】
「β遮断薬」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、交感神経系のアドレナリン作動性β受容体上で内因性カテコールアミンであるエピネフリン（アドレナリン）及びノルエピネフリン（ノルアドレナリン）のための受容体部位を遮断する化合物などの様々な治療剤又は薬物のいずれかを指す。
【００５７】
「ムスカリン受容体アンタゴニスト」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ムスカリンアセチルコリン受容体の活性を遮断する、一種の抗コリン剤を指す。
【００５８】
「化学療法剤」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、腫瘍増殖を抑制するのに効果的である化合物を指す。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド；アルキルスルホネート類、例えばブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン；アジリジン系、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパ；エチレンイミン類及びメチルメラミン類、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチロールメラミン；アセトゲニン類（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン類（合成類似体のトポテカンなど）；ブリオスタチン類；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（例えば、そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（例えば合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢＩ−ＴＭＩなど）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノボエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア類、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシン（１１及びカリケアマイシン２１１、例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186（1994）参照）；ダイネミシン、例えばダイネミシンＡ；エスペラマイシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連したクロモプロテイン系エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カルビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（例えばモルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えばメトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシ��ルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン、５−ＦＵ；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎薬、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充物質、例えばフォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド、例えばメイタンシン及びアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲンナニウム（spirogennanium）；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベルカリンＡ、ロリジンＡ、及びアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール（登録商標）、Bristol-Myers Squibb Oncology、プリンストン、N.J.州）及びドセタキセル（タキソテア（登録商標）、Rhone-Poulenc Rorer、アントニー、フランス）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロン酸塩；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；カペシタビン；並びに、上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体が挙げられる。またこの定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用するホルモン拮抗剤、例えばエストロゲン拮抗薬、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（フェアストン）；及びアンドロゲン拮抗薬、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びに、上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体も含まれる。
【００５９】
「抗癌処置」又は「抗癌療法」という用語はまた、標的化された癌療法も指す。標的癌療法は、癌の増殖、進行、及び進展に関与する特定の分子（「分子標的」）と干渉することによって、癌の増殖及び進展を遮断する薬物又は他の物質である。標的癌療法は時に、「分子標的薬」、「分子標的療法」、「精密医薬」又は類似した名称で呼ばれる。いくつかの実施態様では、標的療法は、上記に定義されているようなチロシンキナーゼ阻害剤を被験者に投与する工程からなる。
【００６０】
「抗癌処置」又は「抗癌療法」という用語はまた、免疫療法剤も指す。本明細書において使用する「免疫療法剤」という用語は、癌細胞に対する生体の免疫応答を間接的に若しくは直接的に増強、刺激、若しくは増大させ、及び／又は、他の抗癌療法の副作用を低減する化合物、組成物、又は処置を指す。したがって、免疫療法は、癌細胞に対する免疫系の応答を直接的に若しくは間接的に刺激若しくは増強させ、及び／又は、他の抗癌剤によって引き起こされ得る副作用を和らげる療法である。免疫療法はまた、当技術分野において免疫学的療法、生物学的療法、生体応答調節剤療法、及び生物療法とも呼ばれる。当技術分野において公知である一般的な免疫療法剤の例としては、免疫チェックポイント阻害剤、サイトカイン、癌ワクチン、モノクローナル抗体、及び非サイトカインアジュバントが挙げられるがこれらに限定されない。或いは、免疫療法剤による処置は、ある量の免疫細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞など）を被験者に投与することからなり得る。免疫療法剤は非特異的であってもよく、すなわち、免疫系を全般的にブーストし、よってヒト生体が癌細胞の増殖及び／又は進展に対して戦うのにより効果的となるか、或いは、それらは特異的であってもよく、すなわち、癌細胞それ自体に標的化されてもよく、免疫療法計画は、非特異的な免疫療法剤と特異的な免疫療法剤を併用してもよい。非特異的免疫療法剤は、免疫系を刺激するか又は間接的に向上させる物質である。非特異的免疫療法剤は、癌の処置のための主要な療法として単独で使用されているだけでなく、主要な療法に付加して使用され、この場合には、非特異的免疫療法剤は、他の療法（例えば癌ワクチン）の効力を増強させるアジュバントとして機能する。非特異的免疫療法剤はまた、この後者の状況において、他の療法の副作用、例えば特定の化学療法剤によって誘発された骨髄抑制などを低減させるように機能することができる。非特異的免疫療法剤は、重要な免疫系の細胞に対して作用することができ、そして二次応答、例えばサイトカイン及び免疫グロブリンの増加した産生を引き起こすことができる。或いは、該薬剤は、それ自体、サイトカインを含んでいてもよい。非特異的免疫療法剤は、一般的に、サイトカイン又は非サイトカインアジュバントとして分類される。多くのサイトカインが、免疫系をブーストさせるように設計された一般的な非特異的免疫療法剤として、又は、他の療法と共に施されるアジュバントとしてのいずれかとして癌の処置に適用を見出す。適切なサイトカインとしては、インターフェロン、インターロイキン、及びコロニー刺激因子が挙げられるがこれらに限定されない。本発明によって考えられるインターフェロン（ＩＦＮ）としては、一般的な種類のＩＦＮ、ＩＦＮ−アルファ（ＩＦＮ−α）及びＩＦＮ−ベータ（ＩＦＮ−β）が挙げられる。ＩＦＮは、例えば、癌細胞の増殖を減速させることによって、癌細胞からより正常な行動を有する細胞への発達を促進することによって、及び／又は、癌細胞による抗原の産生を増加させて免疫系が癌細胞をより容易に認識し破壊できるようにすることによって、癌細胞に対して直接的に作用することができる。ＩＦＮはまた、例えば、血管新生��減速させることによって、免疫系をブーストすることによって、並びに／又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞及びマクロファージを刺激することによって、癌細胞に対して間接的に作用することもできる。組換え型ＩＦＮ−αは、ロフェロン（ロシュ製薬）及びイントロンＡ（シェリング社）として市販されている。本発明によって考えられるインターロイキンとしては、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１１及びＩＬ−１２が挙げられる。市販されている組換え型インターロイキンの例としては、プロロイキン（登録商標）（ＩＬ−２；カイロン社）及びニューメガ（登録商標）（ＩＬ−１２；ワイス製薬）が挙げられる。ザイモジェネティクス社（シアトル、ワシントン州）は、組換え型ＩＬ−２１を現在試験中であり、これもまた本発明の合剤への使用に考えられる。本発明によって考えられるコロニー刺激因子（ＣＳＦ）としては、サルグラモスチムが挙げられる。１つ以上の増殖因子を用いての処置は、従来の化学療法を受けている被験者において新たな血球の生成を刺激するのに役立ち得る。したがって、ＣＳＦを用いての処置は、化学療法に伴う副作用を低減させるのに役立ち得、またより高用量の化学療法剤の使用を可能とし得る。特異的又は非特異的標的を有することに加えて、免疫療法剤は、能動的であってもよく、すなわち、生体自身の免疫応答を刺激することができても、又は、免疫療法剤は受動的であってもよく、すなわち、生体の外部で生成される免疫系成分を含んでいてもよい。受動的な特異的免疫療法は典型的には、癌細胞の表面上に見られる特定の抗原に対して特異的であるか又は特定の細胞増殖因子に対して特異的である、１つ以上のモノクローナル抗体の使用を伴う。モノクローナル抗体は、癌の処置において、多くの方法で、例えば、特定の種類の癌に対する被験者の免疫応答を増強するために、血管新生に関与する細胞増殖因子などの特定の細胞増殖因子を標的化することによって、又は化学療法剤、放射性粒子若しくは毒素などの物質に連結若しくはコンジュゲートされている場合に癌細胞への他の抗癌剤の送達を増強することによって、癌細胞の増殖に干渉するために使用され得る。本発明の合剤に包含させるのに適した癌免疫療法剤として現在使用されているモノクローナル抗体としては、リツキシマブ（リツキサン（登録商標））、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、イブリツモマブチウキセタン（ゼヴァリン（登録商標））、トシツモマブ（ベキサール（登録商標））、セツキシマブ（Ｃ−２２５、アービタックス（登録商標））、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、ゲムツズマブオゾガマイシン（マイロターグ（登録商標））、アレムツズマブ（キャンパス（登録商標））、及びＢＬ２２が挙げられるがこれらに限定されない。他の例としては、抗ＣＴＬＡ４抗体（例えばイピリムマブ）、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＰＤＬ２抗体、抗ＴＩＭＰ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体、又は抗Ｂ７Ｈ６抗体が挙げられる。いくつかの実施態様では、抗体としては、Ｂ細胞を枯渇させる抗体が挙げられる。典型的なＢ細胞を枯渇させる抗体としては、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体［例えば、リツキシマブ（ロシュ社）、イブリツモマブチウキセタン（バイエル・シェーリング社）、トシツモマブ（グラクソスミスクライン社）、ＡＭＥ−１３３ｖ（アプライド・モレキュラー・エボリューション社）、オクレリズマブ（ロシュ社）、オファツムマブ（ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、ジェンマブ社）、ＴＲＵ−０１５（トルビオン社）、及びＩＭＭＵ−１０６（イムノメディクス社）］、抗ＣＤ２２抗体［例えば、エプラツズマブ、Leonard et al., Clinical Cancer Research (Z004) 10: 53Z7-5334］、抗ＣＤ７９ａ抗体、抗ＣＤ２７抗体、又は抗ＣＤ１９抗体（例えば米国特許第７，１０９，３０４号明細書）、抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体（例えば、ベリムマブ、グラクソスミスクライン社）、抗ＡＰＲＩＬ抗体（例えば、抗ヒトＡＰＲＩＬ抗体、プロサイ社）、及び抗ＩＬ−６抗体［例えば、De Benedetti et al., J Immunol (2001) 166: 4334-4340及びSuzuki et al., Europ J of Immunol (1992) 22 (8) 1989-1993によって以前に記載されている、これらは全体が参照により本明細書に援用される］が挙げられるがこれらに限定されない。免疫療法剤による処置は、同種移植、特に、造血幹細胞であるヒト幹細胞を用いての同種移植からなり得る。免疫療法剤による処置は、Nicholas P. Restifo, Mark E. Dudley and Steven A. Rosenberg “Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response, Nature Reviews Immunology, Volume 12, April 2012によって記載されているような養子免疫療法からなり得る。養子免疫療法では、被験者の循環中のリンパ球であるＮＫ細胞をインビトロで単離増殖し、被験者に再投与する。活性化されたリンパ球又はＮＫ細胞は最も特定すると、事前に血液又は腫瘍試料から単離されインビトロで活性化（又は「増殖」）させた被験者自身の細胞である。
【００６１】
本明細書において使用する「免疫チェックポイント阻害剤」という用語は、１つ以上の免疫チェックポイントタンパク質を完全に又は部分的に低減するか、阻害するか、干渉するか、又は調節する、分子を指す。
【００６２】
本明細書において使用する「免疫チェックポイントタンパク質」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、シグナルを上げる（刺激性チェックポイント分子）か又はシグナルを下げる（抑制性チェックポイント分子）のいずれかである、Ｔ細胞によって発現される分子を指す。
【００６３】
刺激性チェックポイントの例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＩＣＯＳが挙げられる。抑制性チェックポイント分子の例としては、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２７７、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、及びＶＩＳＴＡが挙げられる。
【００６４】
「抗癌処置」又は「抗癌療法」という用語はまた、ＢＲＡＦ阻害剤、例えばベムラフェニブ、ダカルバジン、ダブラフェニブ、ＢＭＳ−９０８６６２、ＬＧＸ８１８、ＰＬＸ３６０３、ＲＡＦ２６５、ＲＯ５１８４２６、ＧＳＫ２１１８４３６、及びMorris and Kopetz, 2013に記載の化合物も指す。
【００６５】
「抗癌処置」又は「抗癌療法」という用語はまた、放射線療法剤も指す。本明細書において使用する「放射線療法剤」という用語は、限定することなく、癌を処置又は寛解するのに効果的であることが当業者に公知である任意の放射線療法剤を指すことを意図する。例えば、放射線療法剤は、密封小線源療法又は放射性核種療法で投与されるような薬剤、例えばＲａ２２３又はＰｂ２１２であり得る。このような方法は場合により更に、化学療法及び／又は別の放射線療法などであるがこれらに限定されない、１つ以上の追加の癌療法の投与を含み得る。
【００６６】
本明細書において使用する「放射線による療法」に対する「放射線療法」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、電離放射線を用いた癌の処置を指す。電離放射線はエネルギーを付与し、これは細胞の遺伝子材料に傷害を与え、これらの細胞が増殖し続けることを不可能とさせることによって、処置される領域（標的組織）内の細胞を損傷するか又は破壊する。一般的に使用されるある種類の放射線療法は、光子、例えばＸ線を含む。それらが有するエネルギー量に応じて、光線を使用することにより、身体の表面上の又は身体のより深い場所にある癌細胞を破壊することができる。Ｘ線ビームのエネルギーが高ければ高いほど、Ｘ線は標的組織内のより深くに届くことができる。直線加速器及びベータトロンは、漸増するエネルギーのＸ線を発生する。機械を使用して、癌部位上に放射線（例えばＸ線）の焦点を当てることは、外部照射療法と呼ばれる。γ線は、放射線療法に使用される別の形態の光子である。γ線は、特定の元素（例えばラジウム、ウラン、及びコバルト６０）が分解又は減衰するにつれて放射線を放出する時に自然に生じる。いくつかの実施態様では、放射線療法は外部照射療法である。外部照射療法の例としては、従来の外部ビーム放射線療法；様々な方向から腫瘍の形状にぴったり合うように成形されたビームを送達する、３次元原体照射法（３Ｄ−ＣＲＴ）；腫瘍の形状にぴったり合うように放射線ビームを成形し、かつ、腫瘍の形状に応じて放射線量も変化させる、強度変調放射線療法（ＩＭＲＴ）、例えばヘリカルトモセラピー；集束陽子線照射療法；走査と放射線照射技術を組み合わせることにより、腫瘍のリアルタイムな画像を提供し、放射線による処置を誘導する、画像誘導放射線療法（ＩＧＲＴ）；手術中に腫瘍に放射線を直接送達する、術中放射線療法（ＩＯＲＴ）；１回のセッションで小さな腫瘍領域に正確な大用量の放射線を送達する、定位放射線手術；１日あたり１回を超える処置（分割）の放射線療法が被験者に与えられる、多分割放射線療法、例えば連続加速過分割放射線療法（ＣＨＡＲＴ）；並びに、１分割あたりより高い用量の放射線療法が与えられるが分割数がより少ない、少分割放射線療法が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６７】
１つの実施態様では、前記活性化合物は、同じ組成物に含有されていても、又は別々に投与されてもよい。
【００６８】
更なる態様では、本発明の方法は、患者が、ＤＣＸ＋神経前駆細胞を標的化する化合物での処置に適格であるか否かを決定するのに適している。例えば、患者が不良な予後を有すると結論付けられる場合、医師は、ＤＣＸ＋神経前駆細胞を標的化する化合物を患者に投与する選択を採用することができる。
【００６９】
更なる態様では、本発明は、それを必要とする患者における、前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍の処置に使用するための、ＤＣＸ＋神経前駆細胞を標的化する化合物に関する。
【００７０】
本明細書において使用する「処置」又は「処置する」という用語は、予防的又は防止的処置、並びに、治癒的又は疾患修飾的処置（疾患を罹患するリスクのある又は疾患を罹患したと疑われる被験者の処置、並びに、病気であるか又は疾患若しくは医学的容態に罹患していると診断されている被験者の処置を含む）の両方を指し、臨床的再発の抑制も含む。処置は、医学的障害を有しているか又は最終的に障害に罹患する可能性がある被験者に、障害若しくは再発している障害の発症を予防、治癒、遅延するために、その重症度を低減するために、又はその１つ以上の症状を寛解するために、或いは、このような処置を行なわない場合に予想される生存期間を超えるように被験者の生存期間を延長するために投与され得る。「治療処方計画」によって、病気の処置パターン、例えば、治療中に使用される投薬パターンを意味する。治療処方計画は、誘導処方計画及び維持処方計画を含み得る。「誘導処方計画」又は「誘導期間」という語句は、疾患の初期処置のために使用される治療処方計画（又は治療処方計画の一部）を指す。誘導処方計画の一般的目標は、処置処方計画の初期期間中に被験者に高いレベルの薬物を提供することである。誘導処方計画は（部分的に又は全体的に）「負荷処方計画」を使用し得、これは医師が維持処方計画中に使用するであろうよりも多くの用量の薬物を投与すること、医師が維持処方計画中に投与するであろうよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含み得る。「維持処方計画」又は「維持期間」という語句は、例えば、長期間（数か月又は数年間）にわたり被験者を寛解状態に保つために、病気の処置中に患者の維持のために使用される治療処方計画（又は治療処方計画の一部）を指す。維持処方計画は、連続的療法（例えば、規則的な間隔で、例えば週１回、月１回、年１回などに薬物を投与する）又は断続的療法（例えば、間断的処置、断続的処置、再発時における処置、又は特定の予め決定された基準［例えば疾患の顕現など］に到達した場合の処置）を使用し得る。
【００７１】
「ＤＣＸ＋神経前駆細胞を標的化する化合物」という用語は、ＤＣＸ＋神経前駆細胞を選択的に標的化する任意の化合物、例えばＤＣＸ阻害剤、ＣＤ２４阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ネスチン阻害剤、Ｓｃａ−１モジュレーター、及びＰＳＡ−ＮＣＡＭモジュレーターを指す。
【００７２】
したがって、本発明はまた、それを必要とする被験者における、前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍の処置に使用するための、ＤＣＸ阻害剤、ＣＤ２４阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ネスチン阻害剤、Ｓｃａ−１モジュレーター、及びＰＳＡ−ＮＣＡＭモジュレーターからなる群より選択された化合物に関する。
【００７３】
典型的には、ＤＣＸ阻害剤、ＣＤ２４阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ネスチン阻害剤、Ｓｃａ−１モジュレーター、及びＰＳＡ−ＮＣＡＭモジュレーターからなる群より選択された１個、２個、３個、４個、５個又は６個の化合物が本発明に従って使用される。
【００７４】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明に従って使用するためのＤＣＸ阻害剤に関する。
【００７５】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明に従って使用するためのＣＤ２４阻害剤に関する。
【００７６】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明に従って使用するためのＥＧＦＲ阻害剤に関する。
【００７７】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明に従って使用するためのネスチン阻害剤に関する。
【００７８】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明に従って使用するためのＳｃａ−１モジュレーターに関する。
【００７９】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明に従って使用するためのＰＳＡ−ＮＣＡＭモジュレーターに関する。
【００８０】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明に従って使用するための合剤としての、ＤＣＸ阻害剤及びＣＤ２４阻害剤に関する。
【００８１】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明に従って使用するための合剤としての、ＤＣＸ阻害剤、ＣＤ２４阻害剤及びＥＧＦＲ阻害剤に関する。
【００８２】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明に従って使用するための合剤としての、ＤＣＸ阻害剤、ＣＤ２４阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤及びネスチン阻害剤に関する。
【００８３】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明に従って使用するための合剤としての、ＤＣＸ阻害剤、ＣＤ２４阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ネスチン阻害剤及びＳｃａ−１モジュレーターに関する。
【００８４】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明に従って使用するための合剤としての、ＤＣＸ阻害剤、ＣＤ２４阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ネスチン阻害剤、Ｓｃａ−１モジュレーター及びＰＳＡ−ＮＣＡＭモジュレーターに関する。
【００８５】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明に従って使用するための合剤としての、ＣＤ２４阻害剤及びＥＧＦＲ阻害剤に関する。
【００８６】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明に従って使用するための合剤としての、ＣＤ２４阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤及びネスチン阻害剤に関する。
【００８７】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明に従って使用するための合剤としての、ＣＤ２４阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ネスチン阻害剤及びＳｃａ−１モジュレーターに関する。
【００８８】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明に従って使用するための合剤としての、ＣＤ２４阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ネスチン阻害剤、Ｓｃａ−１モジュレーター及びＰＳＡ−ＮＣＡＭモジュレーターに関する。
【００８９】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明に従って使用するための合剤としての、ＥＧＦＲ阻害剤、ネスチン阻害剤に関する。
【００９０】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明に従って使用するための合剤としての、ＥＧＦＲ阻害剤、ネスチン阻害剤及びＳｃａ−１モジュレーターに関する。
【００９１】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明に従って使用するための合剤としての、ＥＧＦＲ阻害剤、ネスチン阻害剤、Ｓｃａ−１モジュレーター及びＰＳＡ−ＮＣＡＭモジュレーターに関する。
【００９２】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明に従って使用するための合剤としての、ネスチン阻害剤及びＳｃａ−１モジュレーターに関する。
【００９３】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明に従って使用するための合剤としての、ネスチン阻害剤、Ｓｃａ−１モジュレーター及びＰＳＡ−ＮＣＡＭモジュレーターに関する。
【００９４】
「モジュレーター」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、標的阻害剤又はアクチベーターを指す。「モジュレーター」という用語はまた、特定の遺伝子の発現を増加又は減少させる化合物を指す。
【００９５】
「アクチベーター」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、標的（Ｓｃａ−１及び／又はＰＳＡ−ＮＣＡＭ）に関連したシグナル伝達カスケードを直接的に又は間接的に刺激することのできる任意の化合物を指す。「アクチベーター」という用語はまた、標的を選択的に活性化する化合物も指す。典型的には、Ｓｃａ−１アクチベーター及び／又はＰＳＡ−ＮＣＡＭアクチベーターは、低有機分子、ペプチド、改変されたＳｃａ−１及び／又はＰＳＡ−ＮＣＡＭ、或いは、Ｓｃａ−１及び／又はＰＳＡ−ＮＣＡＭの発現のアクチベーターである。
【００９６】
「発現のアクチベーター」は、遺伝子の発現を活性化する生物学的作用を有する天然又は合成の化合物を指す。
【００９７】
「阻害剤」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、標的（ダブルコルチン、ＣＤ２４、ＥＧＦＲ、ネスチン、Ｓｃａ−１及び／又はＰＳＡ−ＮＣＡＭ）を選択的に遮断又は不活化して、神経前駆体（例えば、Ｒａ２２３又はＰｂ２１２にコンジュゲートさせた抗体）を特異的に死滅させるか又は神経前駆体から新生ニューロンへの分化を阻害する化合物を指す。「阻害剤」という用語はまた、標的のその基質に対する結合を選択的に遮断する化合物も指す。「阻害剤」という用語はまた、例えば、下流エフェクターによる標的の制御を阻害することによって、例えば、標的経路シグナル伝達の活性化を阻害することによって、標的の作用を妨げることのできる化合物を指す。本明細書において使用する「選択的に遮断する又は不活化する」という用語は、標的ファミリーの他のサブタイプとのその相互作用よりも、それぞれ、より高い親和性及び強度をもって、標的に優先的に結合し遮断又は不活化する化合物を指す。標的を遮断又は不活化するが、部分的又は完全な阻害剤として他の標的サブタイプも遮断又は不活化する場合がある、化合物も考えられる。「阻害剤」という用語はまた、標的の発現を阻害する化合物も指す。典型的には、阻害剤は、低有機分子、ポリペプチド、アプタマー、抗体、オリゴヌクレオチド、又はリボザイムである。
【００９８】
化合物が阻害剤であるかどうかを決定するための試験及びアッセイは、Pastrana et al及びChapker et al（25; 26）に記載のように当業者には周知である。
【００９９】
別の実施態様では、本発明の標的阻害剤は、アプタマーである。アプタマーは、分子認識の点で抗体の代替物の典型であるクラスの分子である。アプタマーは、高い親和性及び特異性で実質的に全てのクラスの標的分子を認識することのできる、オリゴヌクレオチド配列である。このようなリガンドは、Tuerk C. and Gold L., 1990に記載のように、ランダム配列ライブラリーの指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）を通して単離されてもよい。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって得ることができる。このライブラリーでは、各メンバーは、特有な配列の、最終的に化学的に修飾された鎖状オリゴマーである。このクラスの分子の可能な修飾、用途、及び利点は、Jayasena S.D., 1999に概説されている。ペプチドアプタマーは、ツーハイブリッド法によってコンビナトリアルライブラリーから選択される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）チオレドキシンＡなどの、プラットフォームタンパク質によって提示される、コンフォメーションが制限されている抗体可変領域からなる（Colas et al., 1996）。その後、上記のような本発明の標的に対して指向されるアプタマーを発生させた後に、当業者は容易に、標的を遮断又は不活化するものを選択することができる。
【０１００】
別の実施態様では、本発明の標的阻害剤は、標的に対して指向される抗体（該用語は、「抗体部分」を含む）である。
【０１０１】
本明細書に記載の抗体又はその部分の１つの実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。本明細書に記載の抗体又はその部分の１つの実施態様では、抗体はポリクローナル抗体である。本明細書に記載の抗体又はその部分の１つの実施態様では、抗体はヒト化抗体である。本明細書に記載の抗体又はその部分の１つの実施態様では、抗体はキメラ抗体である。本明細書に記載の抗体又はその部分の１つの実施態様では、抗体の部分は、抗体の軽鎖を含む。本明細書に記載の抗体又はその部分の１つの実施態様では、抗体の部分は、抗体の重鎖を含む。本明細書に記載の抗体又はその部分の１つの実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦａｂ部分を含む。本明細書に記載の抗体又はその部分の１つの実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦ（ａｂ’） ２部分を含む。本明細書に記載の抗体又はその部分の１つの実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦｃ部分を含む。本明細書に記載の抗体又はその部分の１つの実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦｖ部分を含む。本明細書に記載の抗体又はその部分の１つの実施態様では、抗体の部分は、抗体の可変ドメインを含む。本明細書に記載の抗体又はその部分の１つの実施態様では、抗体の部分は、抗体の１つ以上のＣＤＲドメインを含む。
【０１０２】
本明細書において使用する「抗体」は、天然抗体及び非天然抗体の両方を含む。特に、「抗体」は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、並びにその一価及び二価の断片を含む。更に、「抗体」は、キメラ抗体、完全合成抗体、一本鎖抗体、及びその断片を含む。抗体は、ヒト抗体であっても、非ヒト抗体であってもよい。非ヒト抗体は、組換え法によってヒト化されることにより、ヒトにおけるその免疫原性が低減していてもよい。
【０１０３】
抗体は、従来の方法に従って調製される。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein（Nature, 256:495, 1975）の方法を使用して作製され得る。本発明において有用なモノクローナル抗体を調製するために、マウス又は他の適切な宿主動物に、適切な間隔（例えば週２回、週１回、月２回、又は月１回）で抗原性形態の標的を用いて免疫化する。動物に、屠殺の１週間以内に最終「ブースト」の抗原を投与し得る。免疫化の最中に免疫アジュバントを使用することがしばしば望ましい。適切な免疫アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、Ｒｉｂｉアジュバント、Hunter’s Titermax、サポニンアジュバント、例えばＱＳ２１若しくはクイルＡ、又はＣｐＧ含有免疫刺激オリゴヌクレオチドが挙げられる。他の適切なアジュバントも、当技術分野において周知である。動物に、皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、鼻腔内、又は他の経路によって免疫化してもよい。所与の動物に、複数の経路によって、複数の形態の抗原を用いて免疫化してもよい。
【０１０４】
簡潔に言えば、抗原は、標的内の関心対象の抗原性領域に相当する合成ペプチドとして提供されてもよい。免疫化処方計画の後、リンパ球を、動物の脾臓、リンパ節、又は他の臓器から単離し、ポリエチレングリコールなどの薬剤を使用して適切な骨髄腫細胞株と融合させてハイブリドーマを形成する。融合後、細胞を、記載（Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 3rd edition, Academic Press, New York, 1996）のような標準的な方法を使用して、ハイブリドーマの増殖は許容するが、融合対の増殖は許容しない培地中に入れる。ハイブリドーマの培養後、細胞上清を、所望の特異性の、すなわち、抗原に選択的に結合する抗体の存在について分析する。適切な分析技術としては、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫沈降法、及びウェスタンブロットが挙げられる。他のスクリーニング技術も当技術分野において周知である。特に、技術は、コンフォメーション的にインタクトで天然に折り畳まれた抗原に対する抗体の結合を確認する技術、例えば、非変性ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、及び免疫沈降法などである。
【０１０５】
重要なことには、当技術分野において周知であるように、抗体分子のほんの小さな部分、すなわちパラトープが、抗体のそのエピトープへの結合に関与している（一般的には、Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford参照）。例えば、Ｆｃ'領域及びＦｃ領域は、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原との結合には関与していない。ｐＦｃ’領域が酵素的に切断されているか、又はｐＦｃ’領域を伴わずに生成された抗体は、Ｆ（ａｂ'）２断片と呼称されるが、これはインタクトな抗体の両方の抗原結合部位を保持している。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断されているか、又はＦｃ領域を伴わずに生成された抗体は、Ｆａｂ断片と呼称されるが、これはインタクトな抗体分子の抗原結合部位の１つを保持している。更に進めると、Ｆａｂ断片は、Ｆｄで示される、共有結合した抗体軽鎖と抗体重鎖の部分からなる。Ｆｄ断片は、抗体特異性の主要決定基であり（１つのＦｄ断片は、抗体特異性を変化させることなく、最大１０個までの異なる軽鎖に会合し得る）、Ｆｄ断片は単独でエピトープ結合能を保持している。
【０１０６】
当技術分野において周知であるように、抗体の抗原結合部分内に、抗原のエピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びパラトープの三次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）が存在する（一般的にClark, 1986; Roitt, 1991参照）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄ断片及び軽鎖の両方に、それぞれ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲＳ）によって分断された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が存在する。ＣＤＲ、特にＣＤＲＳ領域、より特定すると重鎖ＣＤＲＳは主に抗体の特異性に関与している。
【０１０７】
哺乳動物の抗体の非ＣＤＲ領域は、元来の抗体のエピトープ特異性を保持しながら、同種又は異種特異的な抗体の類似領域で置き換えられていてもよいことが当技術分野において現在、十分に確立されている。これは、非ヒトＣＤＲを、ヒトＦＲ及び／又はＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合で連結して機能的抗体が作製されている、「ヒト化」抗体の開発及び使用において最も明瞭に現れている。
【０１０８】
本発明は、特定の実施態様において、ヒト化形態の抗体を含む組成物及び方法を提供する。本明細書において使用する「ヒト化」は、ＣＤＲ領域外のいくつか、大半、又は全てのアミノ酸を、ヒト免疫グロブリン分子に由来する対応するアミノ酸で置換した抗体を描写する。ヒト化法としては、米国特許第４，８１６，５６７号明細書、同第５，２２５，５３９号明細書、同第５，５８５，０８９号明細書、同第５，６９３，７６１号明細書、同第５，６９３，７６２号明細書及び同第５，８５９，２０５号明細書（これらは参照により本明細書に援用される）に記載されているものが挙げられるがこれらに限定されない。上記の米国特許第５，５８５，０８９号明細書及び同第５，６９３，７６１号明細書及び国際公開第９０/０７８６１号もまた、ヒト化抗体を設計する際に使用され得る、４つの可能性ある基準を提唱している。第一の提案は、アクセプターとして、ヒト化される予定のドナー免疫グロブリンに対して通常相同である特定のヒト免疫グロブリンに由来するフレームワークを使用すること、又は多くのヒト抗体に由来する共通フレームワークを使用することであった。第二の提案は、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク内のアミノ酸が異常であり、その位置におけるドナーアミノ酸がヒト配列に典型的なものである場合、アクセプターアミノ酸ではなくドナーアミノ酸が選択され得るというものであった。第三の提案は、ヒト化免疫グロブリン鎖内の３つのＣＤＲのすぐ近くの位置では、アクセプターアミノ酸ではなくドナーアミノ酸が選択され得るというものであった。第四の提案は、フレームワーク位置にドナーアミノ酸残基を使用することであり、この位置でのアミノ酸は、抗体の三次元モデルにおけるＣＤＲの３Å以内に側鎖原子を有すると予測され、ＣＤＲと相互作用することができると予測される。上記方法は、当業者が、ヒト化抗体を作製するために使用することのできる方法のいくつかの単なる例示である。当業者は、抗体のヒト化のための他の方法もよく知っているだろう。
【０１０９】
ヒト化形態の抗体の１つの実施態様では、ＣＤＲ領域外のいくつかの、大半の、又は全てのアミノ酸が、ヒト免疫グロブリン分子由来のアミノ酸と置き換えられているが、１つ以上のＣＤＲ領域内のいくつかの、大半の、又は全てのアミノ酸は不変である。アミノ酸の僅かな付加、欠失、挿入、置換、又は修飾は、該アミノ酸が所与の抗原に対する抗体の結合能を消失させない限り、許容可能である。適切なヒト免疫グロブリン分子は、ＩｇＧ１分子、ＩｇＧ２分子、ＩｇＧ３分子、ＩｇＧ４分子、ＩｇＡ分子、及びＩｇＭ分子を含むであろう。「ヒト化」抗体は、元来の抗体と類似した抗原特異性を保持している。しかしながら、特定のヒト化法を使用して、抗体の結合親和性及び／又は特異性を、Wu et al., /. Mol. Biol. 294:151, 1999（その内容は参照により本明細書に援用される）によって記載されているように、「定向進化」法を使用して増加させ得る。
【０１１０】
完全なヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座の大部分がトランスジェニックであるマウスを免疫化することによって調製され得る。例えば、米国特許第５，５９１，６６９号明細書、同第５，５９８，３６９号明細書、同第５，５４５，８０６号明細書、同第５，５４５，８０７号明細書、同第６，１５０，５８４号明細書、及びその中に引用されている文献（その内容は参照により本明細書に援用される）を参照されたい。これらの動物は、内因性（例えばマウス）抗体の産生が機能的に欠失するように、遺伝子的に改変されている。動物は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するように更に改変され、これにより、これらの動物の免疫化により、関心対象の抗原に対する完全なヒト抗体が産生されるだろう。これらのマウス（例えば、ゼノマウス（アブジェニクス社）、ＨｕＭＡｂマウス（メダレックス社／ジェンファーム社））の免疫化後、モノクローナル抗体を、標準的なハイブリドーマ技術に従って調製することができる。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有し、それ故、ヒトに投与された場合に、ヒト抗マウス抗体（ＫＡＭＡ）応答を惹起しないだろう。
【０１１１】
ヒト抗体を作製するためのインビトロでの方法も存在する。これらとしては、ファージディスプレイ技術（米国特許第５，５６５，３３２号明細書及び同第５，５７３，９０５号明細書）及びインビトロでのヒトＢ細胞の刺激（米国特許第５，２２９，２７５号明細書及び同第５，５６７，６１０号明細書）が挙げられる。これらの特許の内容は、参照により本明細書に援用される。
【０１１２】
したがって、当業者には明らかであろうように、本発明はまた、Ｆ（ａｂ'）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、及びＦｄ断片；キメラ抗体（ここでは、Ｆｃ領域及び／又はＦＲ領域及び／又はＣＤＲ１領域及び／又はＣＤＲ２領域及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されている）；キメラＦ（ａｂ'）２断片抗体（ここでは、ＦＲ領域及び／又はＣＤＲ１領域及び／又はＣＤＲ２領域及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されている）；キメラＦａｂ断片抗体（ここでは、ＦＲ領域及び／又はＣＤＲ１領域及び／又はＣＤＲ２領域及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されている）；及びキメラＦｄ断片抗体（ここでは、ＦＲ領域及び／又はＣＤＲ１領域及び／又はＣＤＲ２領域が、相同なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されている）も提供する。本発明はまた、いわゆる一本鎖抗体も含む。
【０１１３】
様々な抗体分子及び断片が、ＩｇＡ、分泌ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭを含むがこれらに限定されない、一般的に公知である免疫グロブリンクラスのいずれかに由来し得る。ＩｇＧサブクラスも、当業者には周知であり、これには、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４が含まれるがこれらに限定されない。特定の実施態様では、本発明の阻害剤は、ヒトＩｇＧ４である。
【０１１４】
いくつかの実施態様では、本発明は、ダブルコルチン、ＣＤ２４、ＥＧＦＲ、ネスチン、Ｓｃａ−１、及び／又はＰＳＡ−ＮＣＡＭに対して指向される本発明の抗体に由来する第一の抗原結合部位と、少なくとも１つの第二の抗原結合部位とを含む、多重特異的抗体を提供する。
【０１１５】
いくつかの実施態様では、第二の抗原結合部位は、例えば、米国特許第７２３５６４１号明細書に記載のＴ細胞上の標的抗原とＣＤ３とに対して指向される二重特異的ｓｃＦｖ２であるＢｉＴＥ（二重特異的Ｔ細胞誘導）抗体として、ヒトエフェクター細胞上の抗原に結合することによって、又は、細胞障害性薬剤若しくは第二の治療剤に結合することによってなどによる死滅機序を採用するために使用される。本明細書において使用する「エフェクター細胞」という用語は、免疫応答の認識相及び活性化相ではなく、免疫応答のエフェクター相に関与している免疫細胞を指す。例示的な免疫細胞としては、骨髄系又はリンパ球系の細胞、例えばリンパ球（例えばＢ細胞及びＴ細胞、例えば細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、肥満細胞、及び顆粒球、例えば好中球、好酸球及び好塩基球）が挙げられる。いくつかのエフェクター細胞は、特定のＦｃ受容体（ＦｃＲ）を発現し、特定の免疫機能を行なう。いくつかの実施態様では、エフェクター細胞は、抗体依存性細胞障害を誘導することができ、例えばナチュラルキラー細胞である。例えば、単球、マクロファージは、ＦｃＲを発現しているが、これらは標的細胞の特異的死滅、及び、免疫系の他の成分に対する抗原の提示に関与している。いくつかの実施態様では、エフェクター細胞は、標的抗原又は標的細胞を貪食し得る。エフェクター細胞上での特定のＦｃＲの発現は、サイトカインなどの体液性因子によって調節され得る。エフェクター細胞は、標的抗原を貪食し得るか、又は標的細胞を貪食若しくは溶解し得る。適切な細胞障害性薬剤及び第二の治療剤は、以下に例示されており、これには毒素（例えば放射性標識されたペプチド）、化学療法剤及びプロドラッグが挙げられる。
【０１１６】
いくつかの実施態様では、第二の抗原結合部位は、組織特異的抗原に結合し、特定の組織への二重特異的抗体の局在化を促進する。
【０１１７】
いくつかの実施態様では、第二の抗原結合部位は、［ダブルコルチン、ＣＤ２４、ＥＧＦＲ、ネスチン、Ｓｃａ−１及び／又はＰＳＡ−ＮＣＡＭ］発現細胞と同じ種類の細胞上に位置する抗原、典型的には腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合するが、第一の抗原結合部位とは異なる結合特異性を有する。このような多重特異的又は二重特異的抗体は、腫瘍細胞結合特異性を増強させ得、及び／又は、複数のエフェクター経路に関与し得る。例示的な腫瘍関連抗原としては、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＣＴ抗原（例えばＭＡＧＥ−Ｂ５、−Ｂ６、−Ｃ２、−Ｃ３及びＤ；Ｍａｇｅ−１２；ＣＴ１０；ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ−２、ＧＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＭＡＧＥ、及びＳＡＧＥ）、ムチン抗原（例えば、ＭＵＣ１、ムチン−ＣＡ１２５など）、ガングリオシド抗原、チロシナーゼ、ｇｐ７５、ｃ−Ｍｅｔ、Ｍａｒｔｉ、メランＡ、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ＨＬＡ−Ｂ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、又は癌関連インテグリン、例えばα５β３インテグリンが挙げられる。或いは、第二の抗原結合部位は、［ダブルコルチン、ＣＤ２４、ＥＧＦＲ、ネスチン、Ｓｃａ−１及び／又はＰＳＡ−ＮＣＡＭ］の異なるエピトープに結合する。第二の抗原結合部位は、代替的には、血管新生因子又は神経栄養因子又は他の癌関連増殖因子、例えば血管内皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子、アンギオゲニン、ＮＴ−３、ＮＴ−４、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、又はこれらのいずれかの受容体、特に癌の進行に関連した受容体に結合し得る。
【０１１８】
いくつかの実施態様では、第二の抗原結合部位は、本発明の第二の抗体又は抗体薬物複合体、例えば本発明の抗体に由来する。
【０１１９】
本発明の多重特異的抗体分子の例示的なフォーマットとしては、（ｉ）化学的なヘテロコンジュゲーションによって架橋された２つの抗体、一方は［ダブルコルチン、ＣＤ２４、ＥＧＦＲ、ネスチン、Ｓｃａ−１及び／又はＰＳＡ−ＮＣＡＭ］に対して特異性を有する抗体、及び他方は第２の抗原に対する特異性を有する抗体；（ｉｉ）２つの異なる抗原結合領域を含む単一抗体；（ｉｉｉ）２つの異なる抗原結合領域、例えば外部ペプチドリンカーによって直列に連結された２つのｓｃＦｖを含む、一本鎖抗体；（ｉｖ）デュアル可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ）（各軽鎖及び重鎖は、短いペプチド結合を通して直列に２つの可変ドメインを含有している）（Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig（商標）) Molecule, In : Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)）；（ｖ）化学的に連結された二重特異的（Ｆａｂ’）２断片；（ｖｉ）２つの一本鎖ディアボディの融合により、各々の標的抗原に対して２つの結合部位を有する四価の二重特異的抗体となっている、タンデムディアボディ；（ｖｉｉ）ｓｃＦｖとディアボディの組合せにより多価分子となっているフレキシボディ；（ｖｉｉｉ）「二量体化及びドッキングドメイン」に基づいたいわゆる「ドッキング及びロック」分子であり、これがＦａｂに適用された場合、異なるＦａｂ断片に連結された２つの同一なＦａｂ断片からなる三価の二重特異的結合タンパク質を生成することができる；（ｉｘ）例えばヒトＦａｂアームの両末端に融合した２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるサソリ型分子；及び（ｘ）ディアボディ、が挙げられるがこれらに限定されない。二重特異的抗体の別の例示的なフォーマットは、ヘテロ二量体化を強制する相補的ＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子である。このような分子は、例えばTriomab/Quadroma（トリオン・ファーマ社／フレゼニウス・バイオテック社）、Knob-into-Hole（ジェネンテック社）、CrossMAb（ロシュ社）及び静電マッチ（アムジェン社）、ＬＵＺ−Ｙ（ジェネンテック社）、Strand Exchange Engineered Domain body（ＳＥＥＤボディ）（ＥＭＤセローノ社）、ビクロニック（Biclonic）（メルス社）及びデュオボディ（DuoBody）（ジェンマブ社）技術として知られる技術などの公知の技術を使用して調製することができる。
【０１２０】
いくつかの実施態様では、二重特異的抗体は、典型的にはデュオボディ技術を使用して、制御されたＦａｂ−アーム交換を介して得られるか又は得ることができる。制御されたＦａｂ−アーム交換によって二重特異的抗体をインビトロで生成するための方法が、国際公開第２００８／１１９３５３号及び国際公開第２０１１／１３１７４６号（どちらもジェンマブ社による）に記載されている。国際公開第２００８／１１９３５３号に記載された１つの例示的な方法では、還元条件下でのインキュベーション時の、２つの単一特異的抗体（どちらもＩｇＧ４様のＣＨ３領域を含む）の間の「Ｆａｂ−アーム」又は「分子の半分」の交換（重鎖と付着している軽鎖の交換）によって形成される。得られた生成物は、異なる配列を含み得る２つのＦａｂアームを有する二重特異的抗体である。国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載された別の例示的な方法では、本発明の二重特異的抗体は、以下の工程（ここでの第１及び第２の抗体の少なくとも一方は本発明の抗体である）；ａ）免疫グロブリンのＦｃ領域を含む第１の抗体を提供する工程（該Ｆｃ領域は第１のＣＨ３領域を含む）；ｂ）免疫グロブリンのＦｃ領域を含む第２の抗体を提供する工程（該Ｆｃ領域は第２のＣＨ３領域を含み、前記第１及び第２のＣＨ３領域の配列が異なり、前記第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が前記第１及び第２のＣＨ３領域の各々のホモ二量体相互作用より強いようなものである）；ｃ）前記第１の抗体を前記第２の抗体と共に、還元条件下においてインキュベーションする工程；及びｄ）前記二重特異性抗体を得る工程（ここで第１の抗体は本発明の抗体であり、第２の抗体は異なる結合特異性を有する、又はその逆である）を含む方法によって調製される。還元条件は、例えば、２−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンから選択される還元剤を加えることにより提供することができる。工程ｄ）は、例えば、還元剤の除去により、例えば、脱塩により、非還元性又は低還元性となるように条件を回復させることを更に含むことができる。好ましくは、第１及び第２のＣＨ３領域の配列は異なり、ほんの僅かの、かなり保存された、非対称な突然変異を含んでいるので、前記第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用は、前記第１及び第２のＣＨ３領域の各々のホモ二量体相互作用より強力である。これらの相互作用及びそれらをどのようにして達成することができるかの詳細は、国際公開第２０１１／１３１７４６号に提供され、これは、その全体が参照により本明細書に援用される。下記は、場合により、一方又は両方のＦｃ領域がＩｇＧ１アイソタイプのものである、このような非対称の突然変異の組み合わせの例示的な実施態様である。
【０１２１】
別の実施態様では、本発明による抗体は単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「ＶＨＨ」という用語は、天然的に軽鎖を欠いているラクダ科哺乳動物に認められ得る種類の抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。このようなＶＨＨは、「ナノボディ（登録商標）」とも呼ばれる。本発明によると、ｓｄＡｂは、特にラクダｓｄＡｂであり得る。「ＶＨＨ」という用語は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する単一重鎖を指す。「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」という用語は、ＶＨＨの結合親和性及び特異性を規定する超可変アミノ酸配列を指す。
【０１２２】
本発明によるＶＨＨは、通常の実験を使用して当業者によって容易に調製され得る。ＶＨＨ変異体及びその改変形は、インビトロ成熟などの当技術分野における任意の公知の技術下で作製され得る。
【０１２３】
ＶＨＨ又はｓｄＡｂは通常、免疫化動物から得られた血液、リンパ節、又は脾臓のｃＤＮＡに由来するＶドメインレパートリーの、ｐＨＥＮ２などのファージディスプレイベクターへのＰＣＲクローニングによって作製される。抗原特異的ＶＨＨは一般的に、固定された抗原上に、例えば試験管のプラスチック表面上にコーティングされた抗原上に、ストレプトアビジンビーズ上に固定されたビオチニル抗原上に、又は細胞表面上に発現された膜タンパク質上に、ファージライブラリーをパンニングすることによって選択される。しかしながら、このようなＶＨＨはしばしば、それらの抗原に対して、数回免疫化を受けた動物に由来するＶＨＨよりも低い親和性を示す。免疫ライブラリーのＶＨＨの高い親和性は、免疫化動物のリンパ器官でのＢ細胞のクローン性増殖の最中に変異ＶＨＨが自然に淘汰されることに起因する。非免疫ライブラリーのＶＨＨの親和性はしばしば、インビトロでこの戦略を模倣することによって、すなわち、ＣＤＲ領域の部位特異的突然変異誘発及びより高いストリンジェンシー条件下（高い温度、高い又は低い塩濃度、高い又は低いｐＨ、及び低い抗原濃度）で固定された抗原上での更なるパンニングによって改善され得る。ラクダ類に由来するＶＨＨは、通常の抗体の対応するドメインよりもはるかに高いレベルで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）周辺質において容易に発現され、それから精製される。ＶＨＨは一般的に、高い溶解度及び安定性を示し、そしてまた、酵母、植物、及び哺乳動物細胞において容易に産生され得る。例えば、「Ｈａｍｅｒｓ特許」は、任意の所望の標的に対するＶＨＨを作製するための方法及び技術を記載している（例えば、米国特許第５，８００，９８８号明細書；米国特許第５，８７４，５４１号明細書及び米国特許第６，０１５，６９５号明細書参照）。「Ｈａｍｅｒｓ特許」は、より特定すると、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌宿主（例えば米国特許第６，７６５，０８７号明細書参照）及びカビなどの下等真核生物宿主（例えばアスペルギルス又はトリコデルマ）又は酵母（例えば、サッカロマイセス、クリベロマイセス、ハンゼヌラ、又はピキア）（例えば米国特許第６，８３８，２５４号明細書参照）におけるＶＨＨの産生を記載する。
【０１２４】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体又は二重特異的抗体は、化学療法剤、放射性粒子（例えばＲａ２２３又はＰｂ２１２）又は毒素などの物質に連結又はコンジュゲートされている。
【０１２５】
典型的には、上記のような本発明による阻害剤は、治療有効量で患者に投与される。
【０１２６】
上記のような本発明の阻害剤の「治療有効量」によって、任意の医学的処置に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比でがんを処置するための阻害剤の十分量を意味する。しかしながら、本発明の阻害剤及び組成物の１日総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当医師によって決定されるだろうことが理解されるだろう。任意の特定の患者に対する具体的な治療有効投与量レベルは、処置される障害及び障害の重度；使用される具体的な阻害剤の活性；使用される具体的な組成、患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、及び食事；使用される具体的な阻害剤の投与時刻、投与経路、及び排泄速度；処置期間；使用される具体的な阻害剤と組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに、医学分野において周知である同様な要因をはじめとする、様々な要因に依存するだろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるよりも低いレベルで阻害剤の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで次第に用量を増加させることは十分に当分野の技能範囲内である。しかしながら、製品の１日量は、１日あたり成人１人あたり０．０１mg〜１，０００mgまでの幅広い範囲にわたって変動し得る。典型的には、該組成物は、処置される患者への症候による用量の調整のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgの本発明の阻害剤を含有している。医薬品は典型的には、約０．０１mg〜約５００mgの本発明の阻害剤、特に１mg〜約１００mgの本発明の阻害剤を含有している。有効量の薬物は、通常、１日あたり体重１kgあたり０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg、特に１日あたり体重１kgあたり約０．００１mg/kg〜７mg/kgの用量レベルで供給される。
【０１２７】
特定の実施態様では、本発明による化合物は、０．０１μM〜２０μMの濃度で使用され得、特に、本発明の化合物は、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２０．０μMの濃度で使用され得る。
【０１２８】
本発明によると、本発明の化合物は、医薬組成物の形で被験者に投与される。典型的には、本発明の化合物は、薬学的に許容される賦形剤、及び場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わせて、治療用組成物を形成し得る。「薬学的に」又は「薬学的に許容される」は、哺乳動物、特にヒトに適宜投与された場合に、有害反応、アレルギー反応、又は他の都合の悪い反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、無毒性の固体、半固体、又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料、又は任意のタイプの製剤化補助剤を指す。
【０１２９】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所、又は直腸投与用の本発明の医薬組成物において、活性成分は単独で又は別の活性成分と組み合わせて、単位投与剤形で、慣用的な薬学的支持体との混合物として、動物及びヒトに投与することができる。適切な単位投与剤形は、経口経路剤形、例えば錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤、及び経口用懸濁剤又は液剤、舌下及び頬側投与剤形、エアゾール、埋込剤、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、くも膜下腔内、及び鼻腔内投与剤形、並びに直腸投与剤形を含む。
【０１３０】
典型的には、医薬組成物は、注射され得る製剤にとって薬学的に許容されるビヒクルを含有している。これらは、特に、等張で無菌の食塩水溶液（リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウムなど、又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて滅菌水若しくは生理食塩水を添加すると注射液の復元を可能とする乾燥させた、特に凍結乾燥させた組成物であり得る。注射用途に適した医薬剤形としては、無菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び、無菌注射液又は分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、シリンジが容易に扱える程度に流動性でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から防腐されていなければならない。本発明の化合物を遊離塩基又は薬理学的に許容される塩として含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中において調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びその混合物中において並びに油中において調製され得る。通常の保存及び使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐ保存剤を含有している。本発明の化合物は、中性形又は塩の形の組成物へと製剤化され得る。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）が挙げられ、これは無機酸、例えば塩酸若しくはリン酸、又はこのような有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などを用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄、及びこのような有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどから誘導され得る。担体はまた、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、及び植物油を含有している溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防御は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、該組成物は、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含む。注射用組成物の吸収延長は、該組成物中に吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することによってもたらされ得る。無菌注射液は、必要量の活性化合物を適切な溶媒中に、必要であれば上記に列挙された他のいくつかの成分と共に取り込み、その後、滅菌ろ過することによって調製される。一般的に、分散液は、様々な滅菌された本発明の薬剤を、基本分散媒体と上記に列挙された成分の中からの必要とされる他の成分とを含有している無菌ビヒクルに取り込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、典型的な調製法は真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これにより、以前に滅菌ろ過されたその溶液から本発明の化合物と任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。直接注射のためのより濃縮された又は高度に濃縮された溶液の調製も考えられ、ここでの溶媒としてのＤＭＳＯの使用は極めて急速な浸透をもたらし、高濃度の活性薬剤を小さな腫瘍領域に送達すると考えられる。製剤化時に、液剤は、投与製剤と適合性の様式で、かつ治療的に有効な量で投与されるだろう。製剤は、様々な剤形で、例えば上記のタイプの注射液で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用することができる。水溶液での非経口投与のために、例えば、液剤は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤は、まず、十分な食塩水又はブドウ糖を用いて等張とすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与のために特に適している。これに関連して、使用され得る無菌水性媒体は、本開示に鑑みて当業者には公知であろう。用量の幾分の変更が、処置される被験者の容態に依存して必然的に行なわれるだろう。投与責任者は、いずれの事象においても、個々の被験者に対する適切な用量を決定するだろう。
【０１３１】
いくつかの実施態様では、本発明の化合物は、抗癌処置と組み合わせて投与される。
【０１３２】
いくつかの実施態様では、本発明の化合物は、１つ以上の治療に有効な薬剤、例えば抗癌療法、例えば免疫療法剤、化学療法剤、又は放射線療法剤と、同時に、順次、又は併用して、投与される。
【０１３３】
１つの実施態様では、前記の追加の活性化合物は、同じ組成物中に含有されていても、又は別々に投与されてもよい。
【０１３４】
別の実施態様では、本発明の医薬組成物は、それを必要とする患者における前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍の処置に、同時に、別々に又は順次、使用するための合剤に関する。
【０１３５】
本明細書において使用する「同時に投与」という用語は、同じ経路により、同時に又は実質的に同時に２つの活性成分を投与することを指す。「別々に投与」という用語は、同時に又は実質的に同時に異なる経路により２つの活性成分を投与することを指す。「順次投与」という用語は、異なる時点における２つの活性成分の投与を指し、投与経路は同一又は異なる。
【０１３６】
本発明はまた、本発明の化合物を含むキットも提供する。本発明の化合物を含むキットは、治療法に用途を見出す。
【０１３７】
したがって、本発明はまた、生物学的試料中のＤＣＸ＋神経前駆細胞のレベルを決定するための手段を含む、本発明の方法を実施するためのキット又は器具を指す。
【０１３８】
１つの実施態様では、キット又は器具は、ダブルコルチン（ＤＣＸ）、ポリシアル酸化神経細胞接着分子（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ）、インターネキシン（ＩＮＡ）、Ｓｃａ−１、ＣＤ２４、ＥＧＦＲ、又はネスチンからなる群より選択された神経マーカーの少なくとも１つを決定するための手段を含む。
【０１３９】
更なる態様では、本発明は、ＤＣＸ＋神経前駆細胞を標的化する化合物の治療有効量を患者に投与することを含む、それを必要とする患者における前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍を処置するための方法に関する。
【０１４０】
更なる態様では、本発明は、ＤＣＸ阻害剤、ＣＤ２４阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ネスチン阻害剤、Ｓｃａ−１モジュレーター、及び／又はＰＳＡ−ＮＣＡＭモジュレーターからなる群より選択される化合物の治療有効量を患者に投与する工程を含む、それを必要とする患者における前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍を処置するための方法に関する。
【０１４１】
更なる態様では、本発明は、ＤＣＸ阻害剤、ＣＤ２４阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ネスチン阻害剤、Ｓｃａ−１モジュレーター、及びＰＳＡ−ＮＣＡＭモジュレーターからなる群より選択された１個、２個、３個、４個、５個又は６個の化合物の治療有効量を患者に投与する工程を含む、それを必要とする患者における前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍を処置するための方法に関する。
【０１４２】
いくつかの実施態様では、本発明はまた、古典的処置と組み合わせてＤＣＸ＋神経前駆細胞を標的化する化合物の治療有効量を患者に投与する工程を含む、それを必要とする患者における前立腺癌又は乳癌又は転移性腫瘍を処置するための方法に関する。
【０１４３】
本明細書において使用する「古典的処置」という用語は、化学療法、放射線療法、放射線免疫療法、及び免疫療法を指す。
【０１４４】
更なる態様では、本発明は、それを必要とする患者における癌を処置するための薬物として使用するための候補化合物をスクリーニングする方法に関し、該方法は、
−  ダブルコルチン、ＣＤ２４、ＥＧＦＲ、ネスチン、Ｓｃａ−１及び／又はＰＳＡ−ＮＣＡＭを準備し、ダブルコルチン、ＣＤ２４、ＥＧＦＲ、及び／又はネスチンを発現している細胞、組織試料、又は生物を準備し、ＤＣＸ＋神経前駆細胞を準備する工程、
−  候補化合物、例えば低有機分子、ポリペプチド、アプタマー、抗体、又は内部抗体（intra-antibody）を準備する工程、
−  ダブルコルチン、ＣＤ２４、ＥＧＦＲ、ネスチン、Ｓｃａ−１及び／又はＰＳＡ−ＮＣＡＭの発現及び／又は活性を定量する工程、
−  ダブルコルチン、ＣＤ２４、及び／又はネスチンの発現及び／又は活性を阻害する、並びに／或いは、Ｓｃａ−１及び／又はＰＳＡ−ＮＣＡＭの発現及び／又は活性を調節する、候補化合物を正に選択する工程
を含む。
【０１４５】
ダブルコルチン、ＣＤ２４、ＥＧＦＲ、ネスチン、Ｓｃａ−１及び／又はＰＳＡ−ＮＣＡＭの活性を測定するための方法は当技術分野において周知である（２５〜２６）。例えば、ダブルコルチン、ＣＤ２４、ＥＧＦＲ、ネスチン、Ｓｃａ−１及び／又はＰＳＡ−ＮＣＡＭの活性の測定は、候補化合物の存在下又は非存在下において、安定な方法でＣＨＯ細胞株へとクローニング及びトランスフェクトされたダブルコルチン、ＣＤ２４、ＥＧＦＲ、ネスチン、Ｓｃａ−１及び／又はＰＳＡ−ＮＣＡＭに関するＫｉを決定し、ＤＣＸ＋神経前駆細胞の生存率／生存期間を測定し、癌細胞の遊走能及び浸潤能を測定し、癌細胞成長を測定し、癌細胞増殖を測定することを伴う。
【０１４６】
候補化合物が、ダブルコルチン、ＣＤ２４、ＥＧＦＲ、及び／又はネスチン阻害剤、Ｓｃａ−１モジュレーター及び／又はＰＳＡ−ＮＣＡＭモジュレーターであるかどうかをスクリーニング及び決定するための試験及びアッセイは当技術分野において周知である（２５〜２６）。インビトロ及びインビボアッセイを使用して、候補化合物が、ダブルコルチン、ＣＤ２４、ＥＧＦＲ、及び／又はネスチンの活性を阻害する、或いはＳｃａ−１及び／又はＰＳＡ−ＮＣＡＭの活性を調節する、強度及び選択性を評価し得る。
【０１４７】
候補化合物の活性、ダブルコルチン、ＣＤ２４、ＥＧＦＲ、ネスチン、Ｓｃａ−１及び／又はＰＳＡ−ＮＣＡＭへの結合能、並びにダブルコルチン、ＣＤ２４、ＥＧＦＲ、及び／又はネスチンの活性を阻害し、Ｓｃａ−１及び／又はＰＳＡ−ＮＣＡＭの活性を調節する能力は、ヒトダブルコルチン、ＣＤ２４、ＥＧＦＲ、ネスチン、Ｓｃａ−１及び／又はＰＳＡ−ＮＣＡＭによって安定した方法でクローニング及びトランスフェクトされた、単離された癌細胞、癌細胞株又はＣＨＯ細胞株を使用して試験され得る。
【０１４８】
本発明は、以下の図面及び実施例によって更に説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例及び図面は、いずれにしても、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきできではない。
【実施例】
【０１４９】
実施例
材料及び方法
マウス株
Ｂａｌｂ/ｃ ｎｕ／ｎｕ（Ｂ６．Ｃｇ−ＦｏｘｎＩｎｕ）及びｃＭｙｃマウス（ＦＶＢ−Ｔｇ（ＡＲＲ２／Ｐｂｓｎ−ＭＹＣ）７Ｋｅｙ（２１）、以後はＨｉＭｙｃと呼ぶ）は、それぞれ、チャールズリバーラボラトリーズ社及びアメリカ国立がん研究所から入手した。
【０１５０】
Ｈｉ−Ｍｙｃマウスを、以前にＴｇ（ＤＣＸ−ｃｒｅ／ＥＲＴ２）１Ｍｕｌマウスと交配しておいたＣ５７ＢＬ／６−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１（ＥＹＦＰ）Ｃｏｓマウス又はＣ５７ＢＬ／６−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１（ＨＢＥＧＦ）Ａｗａｉ／Ｊマウスと相互交配して、ダブルコルチン（ＤＣＸ）プロモーターの制御下で、ＣｒｅＥＲＴ２誘導性の強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）又はサルジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ；サルＨｂｅｇｆ由来）の発現を起こした（全てジャクソン研究所から入手）。結果として得られたＤＣＸ−ＣｒｅＥＲＴ２／ｌｏｘｐ−ＥＹＦＰ／Ｈｉ−Ｍｙｃ又はＤＣＸ−ＣｒｅＥＲＴ２／ｌｏｘｐ−ＨＢＥＧＦ／Ｈｉ−Ｍｙｃは、動物へのタモキシフェンの投与後にダブルコルチン発現細胞において、それぞれ、強化黄色蛍光タンパク質又はジフテリア毒素受容体を発現する。ジフテリア毒素受容体を発現している細胞を、ジフテリア毒素投与後に切除することができる。それぞれの対照はまた、３つの株を相互交配することによっても作製された。
【０１５１】
免疫不全Ｂ６．Ｃｇ−ＦｏｘｎＩｎｕ＋/−ヘテロ接合性ヌードマウスはまた、Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１（ＨＢＥＧＦ）Ａｗａｉ／Ｊマウスと交雑したＴｇ（ＤＣＸ−ｃｒｅ／ＥＲＴ２）１Ｍｕｌマウスと相互交配して、ｎｕ／ｎｕマウスにおいてダブルコルチンを発現している細胞を除去した。
【０１５２】
ＰＴＥＮトランスジェニックマウスは、プロバシンプロモーター（ＡＲＲ２Ｐｂｓｎ−Ｃｒｅ、ＰＢ−ｃｒｅ４）の制御下、前立腺上皮細胞において、特異的なＰＴＥＮの欠失（Ｐｔｅｎｌｏｘｐ／ｌｏｘｐ）によって作製された。ＰｙＭＴトランスジェニックマウスは、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）の制御下、特に乳腺上皮細胞においてポリオーマウイルスＰｙＶ中型Ｔ抗原を発現する。
【０１５３】
動物の手順
全てのインビボでの実験は、承認番号２０１５０２２６１７１４９５９７で参照されるＣＥＡの動物実験委員会（フォントネー・オー・ローズ、フランス）によって認可された。
【０１５４】
ＤＣＸ−ＣｒｅＥＲＴ２により媒介される組換えのために、タモキシフェンをコーン油中で調製し（１００mg/kg、１日２回５日間連続）、腹腔内注射（シグマ・アルドリッチ社、セントルイス、ＭＩ州）によって注射した。ＤＣＸ＋細胞の除去実験のために、ジフテリア毒素（４μg/kg、シグマ・アルドリッチ社）を、最後のタモキシフェンの注射から４８時間後に１日１回腹腔内に３日間連続して注射した。
【０１５５】
トランスジェニックモデルにおける実験のために、ＤＣＸ−ＣｒｅＥＲＴ２／ｌｏｘｐ−ＥＹＦＰ／Ｈｉ−Ｍｙｃマウスに、生誕後３週目から２４週目までの間の様々な時点でタモキシフェンを注射し、最後のタモキシフェンの注射から２週間後に屠殺した。誘導性遺伝子追跡実験のために、ＤＣＸ−ＣｒｅＥＲＴ２／ｌｏｘｐ−ＥＹＦＰ／Ｈｉ−Ｍｙｃマウスに、生誕から３週間後に注射し、動物を生誕から８、１２、１６、及び２０週間後に安楽死させた。ＤＣＸ＋細胞除去後の組織学的分析のために、ＤＣＸ−ＣｒｅＥＲＴ２／ｌｏｘｐ−ＨＢＥＧＦ／Ｈｉ−Ｍｙｃ動物にタモキシフェン（生誕から３週間後、４週間後、及び８週間後、又は１２週間後及び１６週間後）を注射し、２０週目に死滅させた。
【０１５６】
同所異種モデルのために、ヒト前立腺腫瘍を、６週令のＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスへの１×１０５個のＰＣ−３ｌｕｃ細胞の手術による同所埋め込みによって誘導した。細胞の注入から３週間後、動物を様々な群に無作為化し、ビヒクル、又は前立腺、ＯＢ若しくはＳＶＺの組織から単離され精製されたＬｉｎ−ＥＹＦＰ＋細胞の適切な移植片を同所に受けた。ＤＣＸ＋細胞の除去実験のために、１×１０５個のＰＣ−３ｌｕｃ細胞を、タモキシフェンの注入されたＤＣＸ−ＣｒｅＥＲＴ２／ｌｏｘｐ−ＨＢＥＧＦ／ ｎｕ／ｎｕマウス（又は対照の同腹仔）に、ＤＣＸ−ＣｒｅＥＲＴ２／ｌｏｘｐ−ＥＹＦＰ／Ｈｉ−Ｍｙｃ前立腺腫瘍から単離されたＬｉｎ−ＥＹＦＰ＋細胞の精製された亜集団の共移植を伴い又は伴わずに、ジフテリア毒素の最後の注入から２日後に、同所に移植した。
【０１５７】
成体マウス脳からのＳＶＺ、ＯＢ及びＤＧの顕微解剖
麻酔後、マウス頭部の、頸部脊髄領域から上を切り落とし、内側の尾側−吻側を切断して、頭部の皮膚を除去した。頭蓋を外側に剥がし、脳を露出させた。嗅球をまず取り出し、１０％ウシ胎児血清の補充されたＲＰＭＩ培地（ライフテクノロジーズ社、カールズバッド、ＣＡ州）中に収集した。その後、脳を回転させて、その腹側表面を露出させ、ＳＶＺは、解剖顕微鏡下で、視神経交差基部の位置における一回目の冠状面の切断、及び海馬の直前で２回目の切断を行なうことによって単離され（データは示されていない）、その結果、冠状切片が得られ、これから脳室下帯を回収し、Guo et al., 2005によって記載のような１０％ウシ胎児血清の補充されたＲＰＭＩ培地中に収集した。歯状回を含有している海馬は、脳の残りの尾側部分から解体された（３７）。脳半球の内面を上にして置き、海馬の内側を露出させた。針先を、歯状回とアンモン回の境界に挿入し、海馬の背側−腹側軸に沿って表面を滑らせ、ＤＧを単離し、これを１０％ウシ胎児血清の補充されたＲＰＭＩ培地中に収集した。
【０１５８】
脳及び前立腺組織の解離
解離前に、前立腺組織を、メスの刃を用いて刻み、その後、酵素による解離のためにＣチューブに入れた。脳及び前立腺組織を、それぞれの神経（Ｔ）又は腫瘍組織解離キット及びヒーター付きｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ自動組織分散・破砕装置（octo dissociator）を使用して、酵素で解離して、単一細胞懸濁液として、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳチューブに入れた。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳプログラムＮＴＤＫ＿１又はｍ＿ＴＤＫ＿１をそれぞれ、製造業者（ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）によって推奨されているように適用した。解離後、細胞懸濁液を、ＭＡＣＳスマートストレーナー（７０μm）に適用し、遠心分離にかけ、ＭＡＣＳランニング緩衝液に再懸濁した。
【０１５９】
細胞培養
ヒトユビキチンＣプロモーター（パーキンエルマー社、ウォルサム、ＭＡ州）の制御下のルシフェラーゼ２遺伝子を用いて安定にトランスフェクトされたＰＣ−３細胞を、１０％ウシ胎児血清、１．５ｇ/ｌの重炭酸ナトリウムの補充されたＦ１２−グルタマックス培地（ライフテクノロジーズ社、カールズバッド、ＣＡ州）中で増殖させた。
【０１６０】
ＤＣＸ−ＣｒｅＥＲＴ２／ｌｏｘｐ−ＥＹＦＰ／Ｈｉ−Ｍｙｃマウス由来のＯＢ及び前立腺細胞を酵素で解離した後、細胞を洗浄し、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、２０ng/ml）及び上皮増殖因子（ＥＧＦ、２０ng/ml；ペプロテック社、ロッキーヒル、ＮＪ州）の補充されたＭＡＣＳ神経培地（ミルテニーバイオテク社）中に再懸濁し、その後、１０６個の細胞を、ポリ−Ｌ−オルニチン（１０μg/ml、シグマアルドリッチ社、セントルイス、ＭＩ州）及びラミニン（１０μg/ml、コーニングライフサイエンス社、コーニング、ＮＹ州）で事前にコーティングされた２４ウェル組織培養プレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ウォルサム、ＭＡ州）の１つのウェルに蒔いた。培地の半分を１週間４８時間毎に交換した。その後、接着した細胞を回収し、ポリ−Ｌ−オルニチン及びラミニンでコーティングされた８ウェルのマイクロスライド（イビディ社、マルティンスリート、ドイツ）に移した。細胞を、ｂＦＧＦ（２０ng/ml）及びＥＧＦ（２０ng/ml）又は脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、１μg/ml、ミルテニーバイオテク社）及びニューロトロフィン−３（ＮＴ−３、０．１μg/ml；ミルテニーバイオテク社）の補充されたＭＡＣＳ神経培地中でインキュベートした。細胞が神経へと分化するまで、培地を４８時間毎に交換した。
【０１６１】
生物発光イメージング
インビボ及びエクスビボでの生物発光イメージングを行ない、ＩＶＩＳイメージングシステム２００シリーズ（キセノゲン社、キャリパーライフサイエンス社、ホプキントン、ＭＡ州）を使用して分析した。生物発光シグナルは、インビボイメージングの７分前にＤ−ルシフェリン（ＰＢＳ中１５０mg/kg）の腹腔内注入によって誘導された。エクスビボでのイメージングのために、Ｄ−ルシフェリン（３００mg/kg）を、剖検の８分前に注入した。関心対象の臓器を、１５０mg/mlのＤ−ルシフェリン溶液に浸漬した（４）。
【０１６２】
組織学的検査及び免疫蛍光検査
パラフィン包埋切片について、ヒト及びマウスの前立腺組織を事前に、ホルマリン又は４％パラホルムアルデヒドでそれぞれ固定した。塊を連続切片化し（厚さ５μm）、ヘマトキシリン及びエオシン染色を、標準的な手順を使用して実施した。染色前に、切片をキシレンを用いて脱パラフィンし、等級の付けられたアルコールによる洗浄を通して脱水し、その後、クエン酸ナトリウム中で製造業者（ベクターラボラトリーズ社、バーリンゲーム、ＣＡ州）の推奨に従って抗原を賦活させた。
【０１６３】
凍結切片については、マウスを４％イソフルランを用いて麻酔し、その後、致死用量のペントバルビタール（６０mg/ml）の投与を受けた。その後、動物を、０．０１Ｍ ＰＢＳ中０．９％ＮａＣｌ、次いで４％氷冷パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いての心灌流によって固定した。脳及び前立腺を収集し、＋４℃で４％ＰＦＡ中一晩かけて後固定し、ＰＢＳ中１２％ショ糖溶液に移し、その後、瞬間凍結させ、クリオスタットにより切片化した（厚さ１２μm；ライカ社、ヴェッツラー、ドイツ）。
【０１６４】
免疫蛍光検査のために、非特異的結合を、ウシ血清アルブミン溶液中のヤギ血清を用いて遮断し、切片を、ダブルコルチンに対するマウス抗体（ミリポア社、ビレリカ、ＭＡ州）、ＰＳＡ−ＮＣＡＭに対するマウス抗体（ＡＢＳサイエンティフィック社、ロサンゼルス、ＣＡ州）、又は汎サイトケラチンに対するマウス抗体（シグマアルドリッチ社）、ＭＡＰ−２に対するウサギ抗体（ミリポア社）、βＩＩＩ−チューブリンに対するウサギ抗体（コーヴァンス社、プリンストン、ＮＪ州）、又はα−インターネキシンに対するウサギ抗体（ミリポア社）、及びＮＦ−Ｈに対するニワトリ抗体（ミリポア社）、又はＥＹＦＰに対するニワトリ抗体（Aves labs社、タイガード、ＯＲ州）と共に一晩インキュベートした。続いて、二次染色を、室温で１時間かけて、それぞれマウス、ウサギ、又はニワトリＩｇＧに対するアレクサフルオル６４７、５６８、４８８にコンジュゲートさせた適切なヤギ抗体（ライフテクノロジーズ社、カールズバッド、ＣＡ州）を用いて実施した。
【０１６５】
色素の投与のために、フルオレセインでタグ化されたアルブミン（６５ｋＤａ、２mgを０．１mlの食塩水で希釈；シグマアルドリッチ社）及びＴＲＩＴＣでタグ化されたデキストラン（４．４ｋＤａ、２mgを０．１mlの食塩水で希釈；シグマアルドリッチ社）を、麻酔下の５か月齢のＨｉ−Ｍｙｃ癌マウスに静脈内及び腹腔内に同時に注入した。１時間の循環期間の後、マウスに、イソルフラン及びペントバルビタールを用いた深い麻酔をかけ、０．０１Ｍ ＰＢＳ中０．９％ＮａＣｌ、その後４％氷冷パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いた経心腔的灌流によって安楽死させた。脳を回収し、＋４℃で４％ＰＦＡ中で一晩かけて後固定し、ＰＢＳ中１２％ショ糖溶液に移し、その後、瞬間凍結させ、クリオスタットにより切片化した（厚さ１４μm；ライカ社）。
【０１６６】
Ｈｉ−Ｍｙｃ前立腺の全切片の明視野像をキャプチャし、Ｚｅｎ顕微鏡ソフトウェアによって制御される、日立ＨＶ−Ｆ２０２ＦＣＬカラーカメラの具備された、ツァイス社のaxioscan Z1（ツァイスマイクロイメージング社、ソーンウッド、ＮＹ州）を用いて収集した。
【０１６７】
蛍光画像をキャプチャし、白色光レーザー、超高感度共焦点イメージングのためのライカ社ハイブリッド検出器（ＨｙＤ）と連動したＰＭＴ ＳＰ共焦点検出器（ライカ社、ヴェッツラー、ドイツ）を具備したライカ社ＴＣＳ ＳＰ８ Ｘ共焦点顕微鏡を使用して分析した。画像は、ＬＡＳ Ｘ ２．０．１．１４３９２ソフトウェアによって制御される組織の全層を走査している３次元（３Ｄ）のスタックとして得られ、高性能３次元イメージングVolocity 6.3.1.ソフトウェア（パーキンエルマー社、ウォルサム、ＭＡ州）を使用して分析された。
【０１６８】
ヒト前立腺試料
アンリモンドール病院（クレテイユ、フランス；医薬品製剤証明書番号１６１６９）の病理学及び生物資源プラットフォーム部門における治験審査委員会の承認後に、染色のための根治的前立腺摘除物が得られた。ヒト前立腺組織は、収集され、ホルマリンで固定され、アンリモンドール病院での日常的な管理の一部として、パラフィン包埋された。各塊について、切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色して、組織の生存率を評価し、癌の間の正常な領域の場所を同定し、異なるグリーソングレードの領域をマッピングした。全患者が組織学的に確認され、前立腺癌又は良性過形成の場所が臨床的に同定され、施設において事前の処置は受けなかった。患者の特徴、例えば年齢、術前の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベル、手術日、病理ステージ、及びグリーソンスコアが表１に示されている。ＰＳＡの再発は、１つのＰＳＡの数値が０．２ng/mlを超える、２つの数値が０．２ng/mlである、又はＰＳＡの上昇のための二次的処置として定義された。再発は局所的であっても遠隔であってもよいが、転移は、この患者コホートにおいてこれまで全く記録されていない。前立腺外への進展は、１つ以上の被膜外への進展、神経節への進展、又は精嚢腺への進展、及び切除断端陽性を伴う、疾患として定義された。ＤＣＸ＋細胞の定量は、前立腺腫瘍又は過形成領域において、及び癌領域の周辺の残りの正常な前立腺組織において、臨床データの知見を用いずに盲検的に実施された。上記に定義された各マーカーについて、正常な領域からの及び上記のようにキャプチャした腫瘍グレードについての、１０箇所のそれぞれの視野の平均（１視野＝０．１５mm２）を計算した。合計で１０４０個のｚスタック画像を取得し、２次元の最大投影法に変換し、これをVelocityソフトウェアを用いて分析して、１視野あたりのＤＣＸ＋／ＤＡＰＩ陽性細胞を定量した（ＤＡＰＩ、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）。
【０１６９】
【表１】
2021521445.tif 000003
【０１７０】
フローサイトメトリー
ＤＣＸ−ＣｒｅＥＲＴ２／ｌｏｘｐ−ＥＹＦＰ／Ｈｉ−Ｍｙｃマウスの脳及び前立腺を、上記のように解体及び解離した。ＳＶＺ、ＯＢ、ＤＧ、及び前立腺の細胞密度は、ノイバウエルチャンバーを使用して、トリパンブルー中での生存率と共に手作業で計数され、その後、フロー分析を行なった。その後、細胞を、ＦｃＲ遮断試薬（ミルテニーバイオテク社）と共に１０分間インキュベートした。続いて、マウスＣＤ４５（クローン３０Ｆ１１）、ＴＥＲ１１９（クローンＴｅｒ−１１９）、ＣＤ３１（クローン３９０）、ＣＤ３２６（クローンｃａａ７−９Ｇ８）、ＣＤ４９ｆ（クローンＲＥＡ５１８）、Ｓｃａ−１（クローンＲＥＡ４２２）、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ（クローン２−２Ｂ）、ＣＤ２４（クローンＭ１/６９）に対して特異的な、蛍光色素とコンジュゲートさせたモノクローナル抗体を、製造業者（ミルテニーバイオテク社）によって推奨される濃度で３０分間使用した。また、細胞を、ＢＶ７８５−ストレプトアビジン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社によるインビトロジェン社）と複合体を形成したビオチニル化ＥＧＦと共にインキュベートした。染色された細胞懸濁液の分析は、５レーザーＳＯＲＰ ＬＳＲ ＩＩ（３５５/４０８/４８８/５６１/６４０；ＢＤバイオサイエンシーズ社、サンノゼ、ＣＡ州）で行ない、データはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Tree Star社、アシュランド、ＯＲ州）を用いて分析した。細胞集団は、ベクトンディッキンソン社のＳＯＲＰ ＡＲＩＡ ＩＩを使用して精製された。
【０１７１】
ＲＮＡ抽出、逆転写ＰＣＲ及び定量ＰＣＲ
ＤＣＸ−ＣｒｅＥＲＴ２／ｌｏｘｐ−ＥＹＦＰ／Ｈｉ−Ｍｙｃマウスの８週令の脳又は４か月齢及び１２か月齢の前立腺から単離された精製された細胞から、ＲＬＴ溶液（キアゲン社、カールズバッド、ＣＡ州）を使用して抽出されたＲＮＡからの遺伝子発現レベルを、定量リアルタイムＰＣＲによって分析した。逆転写酵素（スーパースクリプトＶＩＬＯ；インビトロジェン社）を、製造業者の説明書に従って実施した。定量ＰＣＲを、ＦａｓｔＳＹＢＲグリーン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社によるＡＢＩアプライドバイオシステムズ社）を用いて実施した。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現を標準物質として使用した。
【０１７２】
ＲＮＡシークエンス
Ｌｉｎ陰性ＥＹＦＰ陽性細胞を、ＤＣＸ−ＣｒｅＥＲＴ２／ｌｏｘｐ−ＥＹＦＰ／Ｈｉ−Ｍｙｃマウスの８週令の脳又は１６週令の前立腺から単離し、キアゾール（キアゲン社）中に収集した。ＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙマイクロキット（キアゲン社）を使用して抽出し、ｍＲＮＡライブラリーを、Ｓｍａｒｔ−Ｓｅｑ ｖ４ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡ（タカラ、大津、滋賀）を使用して調製した。簡潔に言えば、ｃＤＮＡを、ＳＭＡＲＴ（ＲＮＡ鋳型の５'末端でのスイッチ機構）技術と統合させたロックド核酸（ＬＮＡ）技術を使用することによって合成された。各ライブラリーについて、逆転写ＰＣＲサイクル後のサイクル数を、細胞数に応じて調整した。ライブラリーを個々に適応させ、イルミナ社のＮｅｘｔｅｒａＸＴキットを使用して指標を付け、その後、アジレント社のバイオアナライザ（Tapestation2200、アジレントテクノロジー社）で制御した。同一ライブラリーをプールし、その後、１試料あたり７０００万回の平均リード深度でシークエンスした。最終ライブラリーを、Tapestation2200（アジレントテクノロジー社）で収集し、蛍光定量インターカラントを用いて定量した。全てのＲＮＡシークエンスライブラリーを、ハイアウトプットカートリッジを含むイルミナ社Ｎｅｘｔｓｅｑ５００を使用してシークエンスし、約２×４億回の７５塩基のリードを行なった。
【０１７３】
シークエンスされたリードを、クオリティ閾値３３に基づいてtrimmomaticバージョン０．３６を使用してトリミングした。リードを、超高速ＲＮＡ−ｓｅｑアライナーＳＴＡＲを使用して、ハツカネズミゲノムリリースＧＲＣｍ３８．ｐ６上にアラインさせた。遺伝子発現の定量は、デフォールトパラメーターに基づき、ＨＴＳｅｑバージョン０．１０を使用して行なわれ、トランスクリプトーム分析は、ＥｄｇｅＲパッケージを用いて行なわれた。ニューロン投射及びニューロン分化に関連した遺伝子リストを試験するために、ＧＯターム識別番号ＧＯ：００４３００５及び番号ＧＯ：００３０１８２が選択された。ヒートマップ表示における階層的クラスタリングは、ウォード２距離法及び完全連結法に基づいて作成された。遺伝子オントロジーに属している選択された遺伝子リストに限定された相関分析は、スピアマン相関係数を使用して行なわれ、関連したＰ値に基づいて統計学的有意性が決定された。免疫ゲノムプロジェクト集団内の遺伝子の発現分析は、免疫ゲノムプロジェクトポータルサイトを使用して行なわれた（MyGeneSetサービスに基づく）。ＳＶＺ、ＯＢ又は前立腺の試料と免疫ゲノムプロジェクト集団との間の統計学的比較は、各試料における２００個の最も発現されている遺伝子のリストに限定された、スピアマン相関係数に基づいて行なわれた。
【０１７４】
定位注射
ＴｄＴｏｍａｔｏ ｃＤＮＡを、自己不活化ＨＩＶ−１由来ゲノムを含有しているレンチウイルスシャトルプラスミドのＣＡＧプロモーターの制御下にクローニングした（３８）。組換えレンチウイルス粒子は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって生成され、ｐ２４キャプシドタンパク質（ＨＩＶ−１ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡ、Gentaur社、フランス）のＥＬＩＳＡによる定量によって滴定した。ウイルス粒子を、５週令のマウスの脳室下帯に注入する前に、リン酸緩衝食塩水で、最終濃度が５０ng/μlのｐ２４となるまで希釈し、２μlの容量で定位注入によって以下の座標に送達した：ブレグマより０．７mm前方及び１．３mm側方；及び頭蓋骨表面より２．５mm下。ウイルス溶液は、０．２μl/分の速度で注入され、注入カニューレは５分間置いておき、その後、ゆっくりと除去した。
【０１７５】
統計分析
マウスの分析については、全ての数値は、平均値±標準誤差として報告される。統計学的有意性は、ノンパラメトリックの対応のないマンホイットニー検定によって評価された。有意性は、Ｐ＜０．０５に設定された。
【０１７６】
患者の試験については、統計分析は、Ｒソフトウェアを使用して実施された。異なる群間の統計比較は、ウィルコクソン順位和検定を使用して実施された。統計比較に対して患者の年齢が影響しないことは、回帰分析を使用して確認された。ＤＣＸ＋細胞数と浸潤帯域数との間の相関は、スピアマン相関係数を使用して同定された。生存曲線は、カプランマイヤー推定法を使用してモデル化された。その後、生存曲線間の統計学的有意差を、ログランク（マンテルコックス）検定を使用して評価した。０．０５より低いＰ値が有意と判断された。
【０１７７】
結果
ヒトにおけるＤＣＸ＋間質細胞及び腫瘍侵襲性
ダブルコルチン（ＤＣＸ）は、ＣＮＳの発達中の神経新生領域及び成人の神経新生領域に位置する、神経前駆体の古典的マーカーである（１４〜１６）。ヒト前立腺原発性腫瘍の間質の分析により、神経前駆体の特異的なマーカー（すなわち、ポリシアル酸化神経細胞接着分子、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ（１７）；インターネキシン、ＩＮＡ（１８、１９）；データは示されていない）も発現していたが、上皮細胞マーカー（パンサイトケラチン、すなわちＰａｎＣＫ、データは示されていない）又は成熟神経線維マーカー（すなわち神経フィラメント−重鎖、ＮＦ−Ｈ（２０）；データは示されていない）は発現していなかった、ＤＣＸ＋細胞が判明した。前立腺癌における神経ネットワークの新規発達の臨床的関連性の可能性を評価するために、本発明者らは、患者（３７人の未処置癌患者ｖｓ良性前立腺過形成を有する１５人の患者；表１）に由来する低リスク及び高リスクの前立腺癌標本における、ＤＣＸ＋細胞を定量した。ＤＣＸ＋細胞の密度は、腫瘍の侵襲性に高度に関連し（図１Ａ、Ｂ；表２）、これらの細胞は、悪性疾患の最中に、腫瘍の発達、浸潤（スピアマン順位相関係数＝０．７７９７；Ｐ＝７．９７×１０−９、図１Ｃ；表３及び４）及び再発（Ｐ＝４，６８８×１０−６、ログランク（マンテルコックス）；図１Ｄ、図２）を促進するために勝手に利用され得、このことは、ＤＣＸ＋細胞が、ヒト前立腺腫瘍の発達及び進行を制御する際に役割を果たし得ることを示唆する。
【０１７８】
【表２】
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【０１７９】
【表３】
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【０１８０】
【表４】
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【０１８１】
ＤＣＸ＋神経前駆体は、腫瘍神経新生を惹起させる
ＤＣＸ＋細胞はまた、Ｈｉ−Ｍｙｃマウス前立腺癌組織（Ｈｉ−Ｍｙｃマウスは、プロバシンプロモーターの制御下、前立腺上皮細胞において特異的にｃ−Ｍｙｃを発現している（２１）；データは示されていない）の間質にも存在していた。したがって、Ｈｉ−Ｍｙｃ腫瘍におけるＤＣＸ＋細胞を容易に追跡、単離及び特徴付けるために、本発明者らは、トリプル・トランスジェニック癌マウス（タモキシフェン誘導性Ｃｒｅを駆動するダブルコルチンプロモーター／エンハンサー；ＤＣＸ−ＣｒｅＥＲＴ２／ｌｏｘｐ−ＥＹＦＰ／Ｈｉ−Ｍｙｃマウス、データは示されていない）を作製した。脳の神経新生領域（すなわちＳＶＺ／ＯＢ及びＤＧ）におけるＤＣＸ：ＥＹＦＰ陽性細胞の存在は、組換え効率を示した（２２）（データは示されていない）。前立腺腫瘍では、ＤＣＸ：ＥＹＦＰ陽性細胞は、間質区画において認められ（データは示されていない）、抗原性プロファイルＬｉｎ−（分化抗原陰性：ＣＤ４５、ＴＥＲ１１９、ＣＤ３１、ＣＤ３２６、ＣＤ４９ｆ）、Ｓｃａ−１＋（前立腺間質細胞は、Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋として定義される）、ＤＣＸ：ＥＹＦＰ＋（以後、ＥＹＦＰ陽性と呼ぶ）及びＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋（データは示されていない）を用いて特徴付けられた（１７、２３、２４）。Ｌｉｎ−ＥＹＦＰ＋細胞は、前立腺腫瘍には見られたが、ｃ−Ｍｙｃ導入遺伝子を含まない同腹仔に由来する前立腺組織には見られなかった（データは示されていない）。この集団は、ＣＮＳのＳＶＺ、ＯＢ及びＤＧから単離された神経前駆体と類似した特異的な神経マーカー（すなわち、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ、ＣＤ２４、ＥＧＦＲ）を発現していた（データは示されていない）（２５、２６）。この結果は、腫瘍における神経前駆体の存在を示唆し、これらを本発明者らは更に特徴付けることに決めた。腫瘍から精製されたＬｉｎ−ＥＹＦＰ＋細胞は、脳から単離されたＬｉｎ−ＥＹＦＰ＋細胞の活性化された神経幹細胞サイン（ＧＦＡＰ＋ＧＬＡＳＴ＋ＣＤ１３３＋ＥＧＦＲ＋ＭＡＳＨ１＋／−ネスチン＋／−ＣＤ−／ｌｏ）を示さず、しかしむしろ、神経前駆体サイン（ＧＦＡＰ−ＧＬＡＳＴ−ＣＤ１３３−／ｌｏＥＧＦＲ−／ｌｏＭＡＳＨ１−／ｌｏネスチン＋ＣＤ２４＋；データは示されていない）を示した（２５、２６）。腫瘍から精製されたＬｉｎ−ＥＹＦＰ＋細胞のトランスクリプトーム分析は、免疫細胞又は内皮細胞の遺伝子発現プロファイリングと全く類似性を示さなかったが（データは示されていない）、ＳＶＺ又はＯＢから単離されたＬｉｎ−ＥＹＦＰ＋細胞と有意に類似していた、ニューロン分化（データは示されていない）及びニューロン投射（データは示されていない）サインを示した。この表現型と一致して、前立腺腫瘍から単離されたＬｉｎ−ＥＹＦＰ＋前駆体は、エクスビボで新生したニューロンへと分化することができた（データは示されていない）。インビボにおけるＬｉｎ−ＥＹＦＰ＋前駆体の神経新生能を探索するために（データは示されていない）、及びＬｉｎ−ＥＹＦＰ＋神経前駆細胞系統の様々な段階を決定するために（データは示されていない）、本発明者らは、前立腺腫瘍において誘導性組織特異的遺伝子追跡を行なった。生誕から３週間後におけるタモキシフェンによる遺伝子組換えの活性化により、８、１２、及び１６週目に、腫瘍においてＬｉｎ−ＥＹＦＰ＋前駆体の存在がもたらされたが、前立腺の周囲の健常な組織ではもたらされず（Ｈｉ−Ｍｙｃ腫瘍領域は、生誕から１２週間後に発達し始める、データは示されていない）、生誕から８カ月後にＥＹＦＰ＋神経芽細胞からＥＹＦＰ＋ＩＮＸ＋神経線維が出現し、このことは、新生ニューロンが、インサイツで、Ｌｉｎ−ＥＹＦＰ＋神経芽細胞に由来する腫瘍微小環境において発生し発達することを示唆する（データは示されていない）。このニューロン分化を記録するために、ＥＹＦＰ＋前駆細胞の２つの間質亜集団を、Ｌｉｎ−ＥＹＦＰ＋Ｓｃａ−１＋ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋（以後、ＳｃａｌｏＰＳＡＮ＋及びＳｃａｈｉＰＳＡＮ＋と呼ぶ；データは示されていない）に基づいて、腫瘍から精製した。ＳｃａｈｉＰＳＡＮ＋集団は、ＳＶＺからの活性化前駆体の単離のために使用されたマーカー、例えばネスチン、ＥＧＦＲ及びＭＡＳＨ１の発現をアップレギュレートし、このことは、これらの前駆体（例えばＴＡ細胞）の状態が活性化されている可能性を強調する（２６）。対照的に、ＳｃａｌｏＰＳＡＮ＋集団は、より低い神経マーカー発現を示し、このことは、あまり活性化されていない状態を示唆するが、ニューロン分化（すなわち、神経芽細胞（２６）；データは示されていない）に必要とされるＮｅｕｒｏ−Ｄ１転写因子の発現は示した（２７）。２つの亜集団の出現頻度は時と共に変動し、このことは、腫瘍の発達と共に異なる分化段階が生じることを反映している（データは示されていない）。これらの結果は、活性化されたＳｃａｈｉＰＳＡＮ＋前駆体が、腫瘍発達の初期に（１６週目から２０週目）ＳｃａｌｏＰＳＡＮ＋神経芽細胞を生じ得ることを示唆した。
【０１８２】
ＤＣＸ＋神経前駆体は、腫瘍発生中にＳＶＺから退出する
Ｈｉ−Ｍｙｃ前立腺癌の発達中に、ＳＶＺ／ＯＢ領域におけるＬｉｎ−ＥＹＦＰ＋神経前駆体の数は、時と共に有意に変動したが、ＤＧでは変動しなかった（データは示されていない）。これらの変動は、脳の神経新生領域の細胞密度の変化とも、又はタモキシフェンの非特異的毒性を除外した、細胞死の増加とも全く関連していなかった（データは示されていない）。その後、本発明者らは、ＳＶＺ領域においてＬｉｎ−ＥＹＦＰ＋神経前駆体の３つの亜集団（Ｓｃａ−ＰＳＡＮ−、Ｓｃａ−／ｌｏＰＳＡＮ＋、ＳｃａｌｏＰＳＡＮｉｎｔ）を同定し、Ｓｃａ−ＰＳＡＮ−集団のみが、癌発達中に有意に変動し（データは示されていない）、生誕から４、１２及び２０週後に低いレベルに達し、この時、この集団は腫瘍内において多かったことを発見した（Ｓｃａ−ＰＳＡＮ−は前立腺において緑色の集団）。系統追跡実験は、生誕から６週間後にＳＶＺにおけるＬｉｎ−ＥＹＦＰ＋前駆体の振動現象を確認し、６、１２及び１６週令のＨｉ−Ｍｙｃ癌マウスの血中におけるＬｉｎ−ＥＹＦＰ＋細胞の存在を強調した（データは示されていない）。これらの結果は、ＳＶＺからの、Ｌｉｎ−ＥＹＦＰ＋Ｓｃａ−ＰＳＡＮ−神経幹細胞／前駆細胞の退出の可能性を示唆し、これは腫瘍へのＬｉｎ−ＥＹＦＰ＋Ｓｃａ−ＰＳＡＮ−神経前駆体の帰還をもたらし得る。ＳＶＺ及び腫瘍におけるＳｃａ−ＰＳＡＮ−集団の更なる特徴付けにより、中心的な集団はＧＦＡＰ＋ＧＬＡＳＴ＋神経幹細胞であり、一方、腫瘍内のＳｃａ−ＰＳＡＮ−細胞は、幹細胞マーカーを発現してなかったことが示された（データは示されていない）。これらの結果は、ＳＶＺからのＧＦＡＰ＋ＧＬＡＳＴ＋Ｌｉｎ−ＥＹＦＰ＋Ｓｃａ−ＰＳＡＮ−神経幹細胞の退出の可能性を示唆し、これは、腫瘍内に存在するＧＦＡＰ−ＧＬＡＳＴ−Ｌｉｎ−ＥＹＦＰ＋Ｓｃａ−ＰＳＡＮ−神経前駆体を生じ得る。更に、本発明者らは、４か月齢のＨｉ−Ｍｙｃ癌マウスの血中にＣＤ４５−ＥＹＦＰ＋細胞を発見し、これは健常な同腹仔には見られなかった（データは示されていない）。退出の可能性を立証するために、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現（ｔｄＴｏｍ＋）レンチウイルスベクターの、ＤＣＸ−ＣｒｅＥＲＴ２／ｌｏｘｐ−ＥＹＦＰ／Ｈｉ−ＭｙｃマウスのＳＶＺへの定位注入を行なうことによって、ＳＶＺから前立腺腫瘍の方へと遊出する可能性のある前駆細胞を追跡した（データは示されていない）。Ｌｉｎ−Ｓｃａ−ＰＳＡＮ−ｔｄＴｏｍ＋ＥＹＦＰ−細胞が、４カ月の腫瘍ステージで血中に見られ、このことは、ＳＶＺから循環中へのこの集団の放出を示し（データは示されていない）、そして、Ｌｉｎ−ｔｄＴｏｍ＋ＥＹＦＰ＋細胞及びＬｉｎ−ｔｄＴｏｍ＋ＥＹＦＰ−細胞が、５か月齢のマウスの腫瘍に見られ、このことは、Ｌｉｎ−Ｓｃａ−ＰＳＡＮ−ｔｄＴｏｍ＋ＥＹＦＰ＋細胞及びｔｄＴｏｍ＋ＥＹＦＰ−細胞が、ＳＶＺから血流を通って前立腺腫瘍へと遊走し（データは示されていない）、そこでそれらはニューロンに分化することができることを示す（データは示されていない）。マウスＰｔｅｎ（３９）前立腺又はＰｙＭＴ（４０）乳癌モデルは、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現レンチウイルスベクターのＳＶＺへの類似した定位注入を受け、腫瘍においてＬｉｎ−ｔｄＴｏｍ＋細胞の有意な蓄積を呈し、このことは、神経前駆体の遊走が、Ｈｉ−Ｍｙｃ腫瘍に限定されず、より一般的な癌発達の特色であり得ることを示す（図３Ａ及び３Ｆ）。最後に、本発明者らは、ヒトＰＣ−３ｌｕｃ癌細胞が同所に異種移植されたヌードマウスにおける様々な転移組織（大腸、肝臓、肺、リンパ節）を研究した。ｔｄＴｏｍａｔｏ発現レンチウイルスベクターをＳＶＺに定位脳手術によって注入した後、Ｌｉｎ−ｔｄＴｏｍ＋細胞は、異種移植片及び転移組織においてのみ見られ（平均転移数：健常な組織と比較すると、大腸（１８個/マウス）、肝臓（５個/マウス）、肺（４個/マウス）、及びリンパ節（５個/マウス））（図３Ｂ〜Ｅ）、このことは、転移の発生を維持するための、癌細胞によってコロニー形成された部位への、神経前駆体の選択的な誘引及び遊走を示唆する。
【０１８３】
ＤＣＸ＋神経前駆体は、腫瘍の発達を調節する
癌発達におけるＤＣＸ＋前駆体の役割を特徴付けるために、本発明者らは、それぞれ、ルシフェラーゼを発現している異種同所腫瘍（以後、ＰＣ−３ｌｕｃと呼ぶ）又はトランスジェニック腫瘍（データは示されていない）の腫瘍増殖を研究するために、ＤＣＸ−ＣｒｅＥＲＴ２マウスを、ヌードマウス又はＨｉ−Ｍｙｃバックグラウンドマウスの誘導性ジフテリア毒素受容体（ｉＤＴＲ）株と相互交配した。タモキシフェン及びジフテリア毒素による処置後のＤＣＸ＋細胞の選択的除去は、新生物病変の発症率を有意に低減させ、ＰＣ−３ｌｕｃ腫瘍細胞の生着を抑制し、このことは、腫瘍の初期発達段階におけるＤＣＸ＋細胞の重要な役割を示唆する（データは示されていない）。更に、ＳＶＺ内へのジフテリア毒素の定位的注入による、ＳＶＺにおける前駆細胞の選択的除去は、腫瘍の発達の有意な抑制を誘導した（データは示されていない）。逆に、前立腺腫瘍又は脳組織から単離された、精製されたＬｉｎ−ＥＹＦＰ＋細胞の、樹立されたＰＣ−３ｌｕｃ異種移植片への同所移植は、腫瘍増殖（データは示されていない）、リンパ節の浸潤（データは示されていない）、及び転移（データは示されていない）を増強した。腫瘍の発達及び進行における３つの神経前駆体亜集団（Ｓｃａ−ＰＳＡＮ−、ＳｃａｌｏＰＳＡＮ＋及びＳｃａｈｉｇｈＰＳＡＮ＋）の活性を試験するために、本発明者らは、ＰＣ−３ｌｕｃ細胞を移植する前に、３つの精製された亜集団のそれぞれと混合したＤＣＸ−ＣＲＥＥＲＴ２/ｉＤＴＲヌードマウスにおいて、選択的除去実験を実施した（データは示されていない）。活性化された幹細胞／前駆細胞の移植は、静止細胞よりも速いニューロン形成動態を誘導するので（２８）、活性化されたＳｃａｈｉＰＳＡＮ＋集団のみが、移植から７週間後に腫瘍増殖を促進した（データは示されていない）。これらの結果は、ＤＣＸ＋神経前駆体が、前立腺腫瘍の発達及び播種に寄与することを示した。
【０１８４】
考察
数多くの研究により現在、癌の発達が神経に依存することが確立されている（４〜９）。腫瘍内への新たに形成された自律神経線維の内部増殖は、β−アドレナリン作用性及びムスカリン性コリン作用性シグナル伝達のそれぞれの活性化を通して、前立腺癌のイニシエーション及び進行に寄与し（４、７）、また、前立腺癌細胞は、腫瘍の周囲の大きな神経に浸潤して転移し得、これは神経周囲浸潤と呼ばれるプロセスである（２９）。本研究は、前例のない腫瘍に関連した神経新生プロセスを明らかとし、このプロセスによって神経幹細胞／前駆細胞はＳＶＺを出て、血液を通って、原発性腫瘍に到達し、そこでそれらは新生神経へと分化し、新生神経は癌の発達及び進行を支える。臨床腫瘍学研究は、脳内の神経前駆細胞を損傷する化学療法によって処置された癌患者の長期におよぶ認知力の低下を明瞭に指摘しているが、本発明者らの研究は、腫瘍それ自体が、腫瘍自体の発達を支えるために、神経前駆細胞を誘引することによって脳内の神経新生ニッチを枯渇させ得るという興味深い可能性を挙げ、未処置の癌患者もまた、認知障害を発症し得ることを示唆する（３０、３１）。
【０１８５】
ＣＮＳは、交感神経系の調節を通して、末梢器官の機能、例えばレプチン依存性の骨形成（３２、３３）、並びに自律神経系の調節を通して、健常状態及び病的状態における腸の機能（３４）を調節することが示されている。同様に、ＣＮＳは、癌の発達及び進行を調節することができる。ストレス条件下では、ＣＮＳは、自律神経系又は視床下部−下垂体−副腎系を活性化する可能性があり、これにより、多様なメディエーター、例えば糖質コルチコイド及びカテコールアミンの分泌が起こり、これは腫瘍のイニシエーション及び進行に好適である（３５）。本研究は、腫瘍の発達をはぐくむ中枢神経前駆体の特有の遊走を明らかにするにつれて、ＣＮＳと前立腺腫瘍との間の新規な種類の掛け合い応答を明らかとする。肺腫瘍が遠位の骨内の顆粒球生成を駆り立て得、これにより、好中球集団の放出及び遊走が起こり、腫瘍が育成されることを示した近年の研究と共に（３６）、本発明者らの結果もまた、腫瘍がどのように、遠隔器官と対話をして、その増殖及び播種に必要とされる細胞を補充し得るかを示した。脳からの神経幹細胞の退出を制御する分子イベントを特徴付けるために更なる研究が必要とされるだろう。
【０１８６】
要するに、これらの結果は、癌発達を診断及びモニタリングし、腫瘍微小環境における神経前駆体を標的化する新規療法を明らかとするための新規な道を開拓する。
【０１８７】
参考文献：
本出願全体をとおして、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の現在の技術水準を記載している。これらの文献の開示は、本開示への参照によりここに援用される。
【０１８８】
【表５】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【国際調査報告】
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