(57)【要約】  本発明は、アグリコシル化抗体生産用形質転換マウス、これから生産された目的抗原に対するアグリコシル化抗体および生産されたアグリコシル化抗体で糖タンパク質バイオマーカーを分析して疾病を診断する方法に関する。本発明は、アグリコシル化抗体生産用形質転換マウスおよびこれから生産されたアグリコシル化抗体の用途に関し、本発明の形質転換マウスを用いれば、多様な目的抗原に対するアグリコシル化抗体を容易に生産することができ、生産されたアグリコシル化抗体で糖タンパク質バイオマーカーを精密に検出して疾病診断の精密化をはかることができる。
2021526379.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＧ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ）遺伝子を暗号化するＤＮＡに混成化する１つ以上のｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）を暗号化するヌクレオチド配列；
Ｃａｓ９タンパク質を暗号化するヌクレオチド配列；
ＡＢＥ（ａｄｅｎｉｎｅ  ｂａｓｅ  ｅｄｉｔｏｒ）を暗号化するヌクレオチド配列；および
前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター
を含む組換え発現ベクターまたは前記組換え発現ベクターから生産されたＲＮＡ。
【請求項２】
前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３からなる群より選択される１つ以上のＩｇＧである、請求項１に記載の組換え発現ベクターまたは前記組換え発現ベクターから生産されたＲＮＡ。
【請求項３】
前記ｇＲＮＡは、配列番号２〜５からなる群より選択されるいずれか１つの配列に相補的なヌクレオチド配列を含むものである、請求項１に記載の組換え発現ベクターまたは前記組換え発現ベクターから生産されたＲＮＡ。
【請求項４】
請求項１に記載の組換え発現ベクターまたはＲＮＡが導入されたアグリコシル化抗体（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）生産用動物モデルの作製用形質転換細胞株または受精卵。
【請求項５】
請求項４に記載の受精卵をヒトを除く動物である代理母の卵管に移植するステップ
を含むアグリコシル化抗体生産用動物モデルの製造方法。
【請求項６】
前記動物は、ウサギ、ヤギまたはマウス（ｍｏｕｓｅ）である、請求項５に記載のアグリコシル化抗体生産用動物モデルの製造方法。
【請求項７】
前記アグリコシル化抗体の生産は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３からなる群より選択される１つ以上のＩｇＧの変形によるものである、請求項５に記載のアグリコシル化抗体生産用動物モデルの製造方法。
【請求項８】
前記変形は、
配列番号２に相当する配列の、配列番号４０の配列への置換；
配列番号３に相当する配列の、配列番号３７の配列への置換；
配列番号４に相当する配列の、配列番号３８の配列への置換；および
配列番号５に相当する配列の、配列番号３９の配列への置換
からなる群より選択される１つ以上の置換により発生したものである、請求項７に記載のアグリコシル化抗体生産用動物モデルの製造方法。
【請求項９】
ＩｇＧ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ）遺伝子が変形されたアグリコシル化抗体生産用動物モデル。
【請求項１０】
前記変形は、
ＩｇＧ１重鎖のアミノ酸配列におけるＮ−Ｓ−Ｔ配列中のアミノ酸ＮがＮ以外の他のアミノ酸に置換されるか、またはＳがＰに置換されるか、またはＴがＳではない他のアミノ酸に置換；
ＩｇＧ２ｂ重鎖のアミノ酸配列におけるＮ−Ｓ−Ｔ配列中のアミノ酸ＮがＮ以外の他のアミノ酸に置換されるか、またはＳがＰに置換されるか、またはＴがＳではない他のアミノ酸に置換；
ＩｇＧ２ｃ重鎖のアミノ酸配列におけるＮ−Ｓ−Ｔ配列中のアミノ酸ＮがＮ以外の他のアミノ酸に置換されるか、またはＳがＰに置換されるか、またはＴがＳではない他のアミノ酸に置換；および
ＩｇＧ３重鎖のアミノ酸配列におけるＮ−Ｓ−Ｔ配列中のアミノ酸ＮがＮ以外の他のアミノ酸に置換されるか、またはＳがＰに置換されるか、またはＴがＳではない他のアミノ酸に置換；
からなる群より選択される１つ以上の置換により発生したものである、請求項９に記載のアグリコシル化抗体生産用動物モデル。
【請求項１１】
前記Ｎ−Ｓ−Ｔ配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３からなる群より選択されるいずれか１つのＩｇＧ重鎖の２９７番〜２９９番アミノ酸配列である、請求項１０に記載のアグリコシル化抗体生産用動物モデル。
【請求項１２】
前記変形は、
配列番号２に相当する配列の、配列番号４０の配列への置換；
配列番号３に相当する配列の、配列番号３７の配列への置換；
配列番号４に相当する配列の、配列番号３８の配列への置換；および
配列番号５に相当する配列の、配列番号３９の配列への置換
からなる群より選択される１つ以上の置換により発生したものである、請求項９に記載のアグリコシル化抗体生産用動物モデル。
【請求項１３】
前記動物は、ウサギ、ヤギまたはマウスである、請求項９に記載のアグリコシル化抗体生産用動物モデル。
【請求項１４】
請求項９に記載の動物モデルに診断しようとする抗原を投与するステップを含む抗原に対するアグリコシル化抗体の生産方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載のアグリコシル化抗体の生産方法で生産されたアグリコシル化抗体。
【請求項１６】
請求項１５に記載のアグリコシル化抗体；および
糖タンパク質バイオマーカー
を含む免疫診断キット。
【請求項１７】
前記糖タンパク質バイオマーカーは、レクチンによって検出されるものである、請求項１６に記載の免疫診断キット。
【請求項１８】
前記レクチンは、前記糖タンパク質バイオマーカーを特異的に検出できるレクチンである、請求項１７に記載の免疫診断キット。
【請求項１９】
前記糖タンパク質は、ＡＦＰ−Ｌ３である、請求項１６に記載の免疫診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アグリコシル化抗体生産用形質転換マウス、これから生産された目的抗原に対するアグリコシル化抗体および生産されたアグリコシル化抗体で糖タンパク質バイオマーカーを分析して疾病を診断する方法に関する。
【０００２】
本発明は、韓国科学技術情報通信部の課題番号ＮＲＦ−２０１６Ｍ３Ａ９Ｂ６９０３３４３、「アグリコシル化抗体生産システムのエンジニアリングによる正確な癌診断の開発」による韓国政府の支援を受けて行われた。
【０００３】
また、本発明は、韓国国家科学技術研究会の課題番号ＣＡＰ−１５−０３−ＫＲＩＢＢ、「非臨床研究のためのグリカン−ヒト化モデルマウスの生成」による韓国政府の支援を受けて行われた。
【０００４】
さらに、本発明は、韓国科学技術情報通信部の課題番号ＫＧＭ５１８１８１３、「ＫＲＩＢＢ研究イニシアチブプログラム（２０１５−２０１８）」による韓国政府の支援を受けて行われた。
【背景技術】
【０００５】
疾病診断のためのマーカーとして糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、疾病特異的抗原などが用いられている。例えば、前立腺癌の前立腺−特異的抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ、ＰＳＡ）、大膓癌の癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＥＡ）、睾丸癌および肝癌診断のためのアルファ−胎児タンパク質（ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＦＰ）などがある。これらのマーカーは、疾病の進行過程でマーカーの量的増加だけでなく、タンパク質に結合している糖鎖も変化することが知られている。
【０００６】
免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、Ｉｇ、抗体）は、疾病診断分野で幅広く用いられるものであり、ＩｇＧ類型の抗体が診断市場を最も大きく占めている。ＩｇＧは二硫化結合で連結された２個の重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）と２個の軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）とからなる。ＩｇＧは、重鎖のＣＨ２不変ドメイン（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｄｏｍａｉｎ）に存在するＡｓｎ２９７サイトに糖鎖修飾が起こる（Ｎ−糖質化）。Ｎ−糖質化はＡｓｎ−Ｘ（Ｐｒｏの他）−Ｓｅｒ／Ｔｈｒという保存された配列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）で起こる。糖タンパク質を標的とする疾病診断分野において、ＩｇＧの糖鎖は診断結果を乱す重要な要素である。一例として、レクチン（ｌｅｃｔｉｎ）は、糖タンパク質などの糖鎖を確認するために使用されるが、ＩｇＧの糖鎖にまで交差結合して分析結果を混同させることがある。この問題を解決するために、抗体の糖鎖部分を除去しようとする努力がなされてきており、ＰＮＧａｓｅ切断法、ペプシン切断法、クロス−リンカー（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ）方法などが行われていた。しかし、これらの方法は、酵素反応と化学反応の効率が完璧でなく、処理後にＩｇＧの回収が難しいという限界があった。したがって、抗体の糖鎖問題を根本的に解決する必要が要求されている。
【０００７】
本発明者らは、マウスのゲノムＤＮＡにおいてＩｇＧ遺伝子を編集して抗体のＮ−糖質化配列を無糖質化配列に変形させた。また、このように作製されたマウスから抗体を生産して、生産された抗体がアグリコシル化抗体であることを究明し、これを用いてＥＬＩＳＡとＣＬＩＡ方法でＡＦＰ−Ｌ３を定量的に分析できることを証明することにより、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】JU, M.-S.等 A glycosylated full-length IgG antibodies: steps toward next-generation immunotherapeutics. Current opinion in biotechnology. 2014 [2014年7月16日電子出版]. Vol. 30, 128-139頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の一つの目的は、ＩｇＧ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ）遺伝子を暗号化するＤＮＡに混成化する１つ以上のｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）を暗号化するヌクレオチド配列；Ｃａｓ９タンパク質を暗号化するヌクレオチド配列；ＡＢＥ（ａｄｅｎｉｎｅ  ｂａｓｅ  ｅｄｉｔｏｒ）を暗号化するヌクレオチド配列；および前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現ベクターまたは前記組換え発現ベクターから生産されたＲＮＡを提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記組換え発現ベクターまたはＲＮＡが導入されたアグリコシル化抗体（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）生産用動物モデルの作製用形質転換細胞株または受精卵を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、前記受精卵をヒトを除く動物である代理母の卵管に移植するステップを含むアグリコシル化抗体生産用動物モデルの製造方法を提供することである。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、ＩｇＧ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ）遺伝子の変形で得られたアグリコシル化抗体生産用動物モデルを提供することである。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、前記動物モデルに診断しようとする抗原を投与するステップを含む抗原に対するアグリコシル化抗体の生産方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、前記アグリコシル化抗体の生産方法で生産されたアグリコシル化抗体を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、前記アグリコシル化抗体；および糖タンパク質バイオマーカーを含む免疫診断キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の一態様は、ＩｇＧ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ）遺伝子を暗号化するＤＮＡに混成化する１つ以上のｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）を暗号化するヌクレオチド配列；Ｃａｓ９タンパク質を暗号化するヌクレオチド配列；ＡＢＥ（ａｄｅｎｉｎｅ  ｂａｓｅ  ｅｄｉｔｏｒ）を暗号化するヌクレオチド配列；および前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現ベクターまたは前記組換え発現ベクターから生産されたＲＮＡを提供する。
【００１７】
本発明の一具体例によれば、前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３からなる群より選択される１つ以上のサブクラスのＩｇＧであってもよい。
【００１８】
本発明の一具体例によれば、前記ｇＲＮＡは、配列番号２〜５からなる群より選択されるいずれか１つの配列に相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。
【００１９】
本発明の他の態様は、前記組換え発現ベクターまたはＲＮＡが導入されたアグリコシル化抗体（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）生産用動物モデルの作製用形質転換細胞株または受精卵を提供する。
【００２０】
本発明のさらに他の態様は、前記受精卵をヒトを除く動物である代理母の卵管に移植するステップを含むアグリコシル化抗体生産用動物モデルの製造方法を提供する。
【００２１】
本発明の一具体例によれば、前記動物は、ウサギ、ヤギまたはマウス（ｍｏｕｓｅ）であってもよい。
【００２２】
本発明の一具体例によれば、前記アグリコシル化抗体の生産は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３からなる群より選択される１つ以上のサブクラスのＩｇＧの変形によるものであってもよい。
【００２３】
本発明の一具体例によれば、前記変形は、配列番号２に相当する配列の、配列番号４０の配列への置換；配列番号３に相当する配列の、配列番号３７の配列への置換；配列番号４に相当する配列の、配列番号３８の配列への置換；および配列番号５に相当する配列の、配列番号３９の配列への置換からなる群より選択される１つ以上の置換により発生したものであってもよい。
【００２４】
本発明のさらに他の態様は、ＩｇＧ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ）遺伝子が変形されたアグリコシル化抗体生産用動物モデルを提供する。
【００２５】
本発明の一具体例によれば、前記変形は、ＩｇＧ１重鎖のアミノ酸配列におけるＮ−Ｓ−Ｔ配列中のアミノ酸Ｎの他のアミノ酸への置換；ＩｇＧ２ａ重鎖のアミノ酸配列におけるＮ−Ｓ−Ｔ配列中のアミノ酸Ｎの他のアミノ酸への置換；ＩｇＧ２ｂ重鎖のアミノ酸配列におけるＮ−Ｓ−Ｔ配列中のアミノ酸Ｎの他のアミノ酸への置換；ＩｇＧ２ｃ重鎖のアミノ酸配列におけるＮ−Ｓ−Ｔ配列中のアミノ酸Ｎの他のアミノ酸への置換；およびＩｇＧ３重鎖のアミノ酸配列におけるＮ−Ｓ−Ｔ配列中のアミノ酸Ｎの他のアミノ酸への置換からなる群より選択される１つ以上の置換により発生したものであってもよい。
【００２６】
本発明の一具体例によれば、前記Ｎ−Ｓ−Ｔ配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３からなる群より選択されるいずれか１つのＩｇＧ重鎖の２９７番〜２９９番アミノ酸配列であってもよい。
【００２７】
本発明の一具体例によれば、前記変形は、配列番号２に相当する配列の、配列番号４０の配列への置換；配列番号３に相当する配列の、配列番号３７の配列への置換；配列番号４に相当する配列の、配列番号３８の配列への置換；および配列番号５に相当する配列の、配列番号３９の配列への置換からなる群より選択される１つ以上の置換により発生したものであってもよい。
【００２８】
本発明の一具体例によれば、前記動物は、ウサギ、ヤギまたはマウスだけでなく、抗体を生産できるすべての動物であってもよい。
【００２９】
本発明のさらに他の態様は、前記動物モデルに診断しようとする抗原を投与するステップを含む抗原に対するアグリコシル化抗体の生産方法を提供する。
【００３０】
本発明のさらに他の態様は、前記アグリコシル化抗体の生産方法で生産されたアグリコシル化抗体を提供する。
【００３１】
本発明のさらに他の態様は、前記アグリコシル化抗体；および糖タンパク質バイオマーカーを含む免疫診断キットを提供する。
【００３２】
本発明の一具体例によれば、前記糖タンパク質バイオマーカーは、レクチンによって検出される。
【００３３】
本発明の一具体例によれば、前記レクチンは、Ｌ４−ＰＨＡ（Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−Ｌ４）、ＬＣＡ（ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＤＳＡ（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、セレクチン（Ｓｅｌｅｃｔｉｎ）、Ｃｏｎ  Ａ（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ−Ａ）、ＷＧＡ（Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ジャカリン（Ｊａｃａｌｉｎ）、ＳＮＡ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ  Ｎｉｇｒａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）またはガレクチン（ｇａｌｅｃｔｉｎ）であってもよい。
【００３４】
本発明の一具体例によれば、前記糖タンパク質は、ＡＦＰ−Ｌ３であってもよい。
【発明の効果】
【００３５】
本発明の形質転換マウスを用いれば、多様な目的抗原に対するアグリコシル化抗体を容易に生産することができ、生産されたアグリコシル化抗体で糖タンパク質バイオマーカーを精密に検出して疾病診断の精密化をはかることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】レクチンは被分析物が存在しなくても捕獲抗体に結合できることを示す模式図である。
【図２】適切なレクチンおよびアグリコシル化抗体を用いる免疫分析プラットフォームであるＡＬＩＱＵＡＴ（Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｌｅｃｔｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＱＵＡｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  ｍａｒｋｅｒ）による特定のグリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）分析方法を示す模式図である。
【図３】ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３に共通して存在するＮ−Ｓ−Ｔ配列を示す図である。
【図４】ＡＲＭＳ（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）およびＰＣＲを用いて編集された突然変異のスクリーニング過程を示す模式図である。
【図５】アデニン塩基編集過程の後に生まれた９個のｐｕｐのＩｇＧ２ｃ遺伝子に対するサンガー配列分析の結果を示す図である。
【図６】アデニン塩基編集過程の後に生まれた９個のｐｕｐのＩｇＧ２ｂ遺伝子に対するサンガー配列分析の結果を示す図である。
【図７】アデニン塩基編集過程の後に生まれた９個のｐｕｐのＩｇＧ３遺伝子に対するサンガー配列分析の結果を示す図である。
【図８】アデニン塩基編集により編集されたＩｇＧ２ｃの塩基配列を示す図である。
【図９】アデニン塩基編集により編集されたＩｇＧ２ｂの塩基配列を示す図である。
【図１０】アデニン塩基編集により編集されたＩｇＧ３の塩基配列を示す図である。
【図１１】ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３におけるｐｕｐ（＃１１）のサンガー配列分析の結果を示す図である。
【図１２】ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｆｏｕｎｄｅｒを選択するためのＩｇＧの構造分析の結果を示す図である。（ａ）野生型ＩｇＧタンパク質構造はＡｓｎ残基にＮ−グリコシル化されたＮ−Ｓ−Ｔの保存されたモチーフを示す。（ｂ）Ｎ−グリコシル化のない突然変異Ｄ−Ｓ−ＴおよびＧ−Ｓ−Ｔ抗体の仮想ＩｇＧ２構造を示し、Ｇ−Ｓ−Ｔモチーフはβ−サンドイッチフォールドの構造的変形をもたらすことが分かる。
【図１３】アデニン塩基編集により編集されたＩｇＧ１の塩基配列を示す図である。
【図１４】ゲノム編集されたマウスと野生型マウスにおいて生産される抗体がＩｇＧ発現の同一のプロファイルを示すことを示す図である。また、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３遺伝子がノックアウトされたマウスにおいて、相応するサブクラス（ｓｕｂｃｌａｓｓ）の生産に欠陥を示す図である。
【図１５】ＩｇＧ２ｂ遺伝子がノックアウトされたマウスにおいて、相応するサブクラス（ｓｕｂｃｌａｓｓ）の遺伝子の欠陥を示す図である。
【図１６】ＩｇＧ３遺伝子がノックアウトされたマウスにおいて、相応するサブクラスの遺伝子の欠陥を示す図である。
【図１７】肝細胞癌腫（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の癌マーカーであるヒトＡＦＰをモデル抗原として前記アグリコシル化抗体生産用動物に投与し、各免疫ステップで血清を採取してｈＡＦＰに対するｄｉｒｅｃｔ  ＥＬＩＳＡ分析を行った結果、時間の経過により増加した反応性を示すグラフである。
【図１８】ｈＡＦＰに対して特に特異的な抗体を生成するハイブリドーマクローンを示す図である。
【図１９】１Ｅ５、２Ａ２および３Ａ５クローンのＩｇＧ１サブクラスおよびカッパ（ｋａｐｐａ）軽鎖の単クローン抗体の分泌を示す図である。
【図２０】１Ｅ５抗体の重鎖にはＮ−グリカンがないことを示す図である。
【図２１】１Ｅ５、２Ａ２および３Ａ５クローンの無糖質化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を示す図である。
【図２２】フレームシフトナンセンス突然変異を有するＦＵＴ８−／−突然変異細胞株クローンの遺伝子型を示す図である。
【図２３】ＦＵＴ８−／−ＨＥＫ２９３−Ｔ細胞に対するＰｈｏＳＬの結合性がないことを示す図である。
【図２４】ＡＦＰの他のｇｌｙｃｏｆｏｒｍを定量化するために、抗−ｈＡＦＰ抗体を用いて免疫ブロット分析した結果を示す図である。
【図２５】ＦＵＴ８−／−細胞におけるＡＦＰ−Ｌ３は現れず、野生型細胞におけるＡＦＰ−Ｌ３の生成比率は９９．５％であることを確認した質量分析の結果を示す図である。
【図２６】有効性が確認された市販の抗体と比較して、０〜２０ｎｇ／ｍＬ  ＡＦＰの範囲で優れた線形性を示すアグリコシル化抗体に対する標準曲線分析の結果を示すグラフである。
【図２７】Ｌ３陽性ＡＦＰサンプルに対するＡＡＬおよびアグリコシル化抗体を用いたレクチンＥＬＩＳＡ分析による敏感性と線形性に優れた標準曲線を示すグラフである。
【図２８】ＡＦＰ−Ｌ３標準分子を１．０ｎｇ／ｍＬ未満のＡＦＰレベルを示す正常血清にスパイクした場合、０〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲で良好な線形性を有する標準曲線を示すグラフである。
【図２９】アグリコシル化抗体ベースのレクチン−ＥＬＩＳＡ  ｈＡＦＰテストとμ−ＴＡＳ分析によるＡＦＰの濃度に対する％ＡＦＰ−Ｌ３値を示すグラフである。
【図３０】熱条件に対するアグリコシル化抗体の安定性を示す図である。
【図３１】ｐＨ条件に対するアグリコシル化抗体の安定性を示す図である。
【図３２】酸化条件に対するアグリコシル化抗体の安定性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明の一態様は、ＩｇＧ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ）遺伝子を暗号化するＤＮＡに混成化する１つ以上のｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）を暗号化するヌクレオチド配列；Ｃａｓ９タンパク質を暗号化するヌクレオチド配列；ＡＢＥ（ａｄｅｎｉｎｅ  ｂａｓｅ  ｅｄｉｔｏｒ）を暗号化するヌクレオチド配列；および前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現ベクターまたは前記組換え発現ベクターから生産されたＲＮＡを提供する。
【００３８】
本明細書では、アデニン塩基編集システム（ａｄｅｎｉｎｅ  ｂａｓｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）を活用して細胞株または受精卵のＩｇＧ遺伝子を特異的に変形させるか、または形質転換体細胞複製手法の適用によって、ヒトを除く動物である代理母の卵管に受精卵を移植するステップを含むアグリコシル化抗体生産用動物モデルの製造方法、アグリコシル化抗体を生産する形質転換動物を生産する方法、および形質転換動物から生産されたアグリコシル化抗体の用途が提供される。
【００３９】
本発明で使われる用語、「アデニン塩基編集システム（ａｄｅｎｉｎｅ  ｂａｓｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）」は、ｎｉｃｋａｓｅ  Ｃａｓ９−ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ融合タンパク質（ａｄｅｎｉｎｅ  ｂａｓｅ  ｅｄｉｔｏｒ；ＡＢＥ）とｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）から構成される単一塩基校正誘導システムであって、微生物の免疫体系として知られたＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）とｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅシステムを用いて、所望の遺伝子塩基配列のうちアデニンをＤＮＡの切断なしにグアニンに置換するように考案されたゲノム編集システムをいう。
【００４０】
本発明で使われる用語、「ａｄｅｎｉｎｅ  ｂａｓｅ  ｅｄｉｔｏｒ（ＡＢＥ）」は、ａｄｅｎｉｎｅ  ｂａｓｅ  ｅｄｉｔｉｎｇシステムにおいて必須のタンパク質要素であって、ｎｉｃｋａｓｅ−Ｃａｓ９  ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ融合タンパク質であり、ｇＲＮＡと複合体を形成して単一塩基校正を誘導することができる。前記ＡＢＥタンパク質は２０１７年にＤａｖｉｄ  Ｒ．Ｌｉｕによって開発されたものであってもよい。
【００４１】
本発明で使われる用語、「ｂａｓｅ  ｅｄｉｔｏｒ」は、既存のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに対比して、ゲノムＤＮＡにおいてより効率的に変形を媒介するタンパク質をいい、具体的には、「Ｇ−Ｃ  ｔｏ  Ａ−Ｔ」あるいは「Ａ−Ｔ  ｔｏ  Ｇ−Ｃ」転換が可能な塩基編集システム（ｂａｓｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）に使用される。本発明では、なかでも「Ａ−Ｔ  ｔｏ  Ｇ−Ｃ」転換を誘導するａｄｅｎｉｎｅ  ｂａｓｅ  ｅｄｉｔｏｒを用いてＩｇＧ遺伝子の変形を誘導した。
【００４２】
本発明で使われる用語、「ｇＲＮＡ」は、標的ＤＮＡに相補的に結合可能な塩基配列を含むＲＮＡであり、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質あるいはａｄｅｎｉｎｅ  ｂａｓｅ  ｅｄｉｔｏｒ内のｎｉｃｋａｓｅ−Ｃａｓ９部分と複合体を形成することができ、Ｃａｓ９タンパク質あるいはａｄｅｎｉｎｅ  ｂａｓｅ  ｅｄｉｔｏｒタンパク質を標的ＤＮＡに持ち込むことが可能な単鎖ＲＮＡをいう。
【００４３】
本発明の組換え発現ベクターまたはＲＮＡを用いて受精卵または細胞を形質転換すれば、細胞内にｇＲＮＡ断片を伝達することができ、伝達されたｇＲＮＡ断片はＩｇＧ遺伝子を認識することができる。したがって、組換え発現ベクターまたはＲＮＡを用いて受精卵または細胞を形質転換すれば、細胞内にｇＲＮＡを伝達することができ、伝達されたｇＲＮＡは、ａｄｅｎｉｎｅ  ｂａｓｅ  ｅｄｉｔｏｒまたはＣａｓ９タンパク質複合体が認識可能な構造を形成する役割を果たすことができる。
【００４４】
本発明で使われる用語、「変形」は、塩基配列のうち特定のアミノ酸をコーディングする配列を他のアミノ酸をコーディングする配列に変換することをいう。
【００４５】
本発明で使われる用語、「組換え発現ベクター」は、目的のコーディング配列と、特定の宿主生物で作動可能に連結されたコーディング配列を発現するのに必須の適正核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子を意味する。真核細胞で利用可能なプロモーター、エンハンサー、終結シグナルおよびポリアデニレーションシグナルは公知である。
【００４６】
本発明で使われる用語、「作動可能に連結された」は、遺伝子発現調節配列と他のヌクレオチド配列との間の機能的な結合を意味する。前記遺伝子発現調節配列は、複製起点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ）、プロモーターおよび転写終結配列（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）などからなる群より選択される１種以上であってもよい。転写終結配列は、ポリアデニル化配列（ｐＡ）であってもよいし、複製起点は、ｆ１複製起点、ＳＶ４０複製起点、ｐＭＢ１複製起点、アデノ複製起点、ＡＡＶ複製起点またはＢＢＶ複製起点などであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００４７】
本発明で使われる用語、「プロモーター」は、構造遺伝子からのＤＮＡアップストリームの領域を意味し、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ分子をいう。
【００４８】
本発明の一具体例によるプロモーターは、特定遺伝子の転写開始を調節する転写調節配列の一つで、約１００ｂｐ〜約２５００ｂｐの長さのポリヌクレオチド断片であってもよい。プロモーターは、細胞、例えば、真核細胞（例えば、植物細胞、または動物細胞（例えば、ヒト、マウスなどの哺乳類細胞など）など）で転写開始を調節できれば、制限なく使用可能である。例えば、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（例えば、ヒトまたはマウスＣＭＶ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙプロモーター）、Ｕ６プロモーター、ＥＦ１−ａｌｐｈａ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １−ａ）プロモーター、ＥＦ１−ａｌｐｈａ  ｓｈｏｒｔ（ＥＦＳ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、アデノウイルスプロモーター（ｍａｊｏｒ  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ｐＬ  λプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、ＳＶ４０Ｅ１プロモーター、呼吸器細胞融合ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ；ＲＳＶ）プロモーター、メタロチオニンプロモーター（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、β−アクチンプロモーター、ユビキチンＣプロモーター、ヒトＩＬ−２（ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２）遺伝子プロモーター、ヒトリンホトキシン（ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ）遺伝子プロモーターおよびヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｈｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）遺伝子プロモーターからなる群より選択されるものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００４９】
本発明の一具体例による組換え発現ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ−関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターからなる群より選択されるものであってもよい。組換え発現ベクターとして使用可能なベクターは、当業界で使用されるプラスミド（例えば、ｐｃＤＮＡシリーズ、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ、ｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４λＢ、λ−Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１、Ｍ１３など）またはウイルスベクター（例えば、アデノ−関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなど）などをベースとして作製できるが、これに限定されるものではない。
【００５０】
本発明の組換え発現ベクターは、１つ以上の選択性マーカーをさらに含んでもよい。前記マーカーは、通常化学的な方法で選択できる特性を有する核酸配列で、形質注入された細胞を非形質注入細胞から区別できるすべての遺伝子がこれに相当する。例えば、グリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）、グルホシネートアンモニウム（ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ  ａｍｍｏｎｉｕｍ）またはホスフィノスリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）のような除草剤抵抗性遺伝子、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、Ｇ４１８、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）のような抗生剤耐性遺伝子であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００５１】
本発明の組換え発現ベクターの作製は、当該技術分野でよく知られた遺伝子組換え技術を利用して製造することができ、部位−特異的ＤＮＡの切断および連結は、当該技術分野で一般的に知られた酵素などを用いて行われる。
【００５２】
本発明の組換え発現ベクターから生産した「ＲＮＡ」は、前記組換え発現ベクターを鋳型として試験管内で合成されたｍＲＮＡをいう。
【００５３】
本発明の一具体例によれば、前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３からなる群より選択される１つ以上のＩｇＧであってもよい。
【００５４】
マウスのＩｇＧ遺伝子、具体的には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよび／またはＩｇＧ３の変形によってアグリコシル化抗体がマウスから生産可能であり、好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３がすべて変形されることが好ましい。また、このように変形されたＩｇＧ遺伝子をマウスの繰り返し逆交配（ｂａｃｋ  ｃｒｏｓｓ）によって固定させることにより、アグリコシル化抗体生産用マウス系統の確立が可能である。
【００５５】
本発明の一具体例によれば、前記ｇＲＮＡは、配列番号２〜５からなる群より選択されるいずれか１つの配列に相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。
【００５６】
本発明の他の態様は、前記組換え発現ベクターまたはＲＮＡが導入されたアグリコシル化抗体（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）生産用動物モデルの作製用形質転換細胞株または受精卵を提供する。
【００５７】
本発明の一具体例による組換え発現ベクターまたはＲＮＡが導入された形質転換受精卵を製造するために、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを交配して受精卵を獲得したが、これに限定されるものではない。核酸分子を受精卵または胚に導入する当分野で公知の方法を使用することができ、当分野で公知のように好適な標準技術を選択して行うことができる。この方法には、例えば、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
本発明の一具体例による組換え発現ベクターまたはＲＮＡが導入された形質転換細胞株を製造するために、核酸分子を有機体、細胞、組織または器官に導入する当分野で公知の方法を使用することができ、当分野で公知のように宿主細胞によって好適な標準技術を選択して行うことができる。この方法には、例えば、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、陽イオン性リポソーム法、および酢酸リチウム−ＤＭＳＯ法などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
形質転換細胞株として用いられる細胞の種類は、動物細胞または動物細胞由来の細胞であってもよく、好ましくは、哺乳類、好ましくは、マウス、ウサギおよびヤギなど抗体の生産に用いられる動物またはこれら動物由来の体細胞または受精卵および胚であってもよく、最も好ましくは、マウスまたはマウス由来の体細胞または受精卵および胚であってもよい。形質転換細胞株としてマウス由来の体細胞を用いる場合、生まれた直後にマウスが死亡する問題を改善することができる。
【００６０】
本発明のさらに他の態様は、前記受精卵をヒトを除く動物である代理母の卵管に移植するステップを含むアグリコシル化抗体生産用動物モデルの製造方法を提供する。
【００６１】
前記アグリコシル化抗体生産用動物モデルの製造方法は、体細胞核移植（ＳＣＮＴ；ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）によるものであってもよい。「体細胞核移植」は、生殖過程で一般的に行われる減数分裂および半数染色体保持生殖細胞を経由しなくても子孫を誕生させられる遺伝子組換え技術であって、生体が有する倍数体保持体細胞を核の除去された卵子に移植して受精卵を生産し、前記受精卵を生体内に移植して新しい個体を発生させる方法である。
【００６２】
本発明で使われる用語、「核移植卵」は、核供与細胞が導入または融合された卵子をいい、「融合」は、核供与細胞と卵子の脂質膜部分との結合を意味する。例えば、脂質膜は、細胞のプラズマ膜または核膜であってもよい。融合は、核供与細胞と卵子が互いに隣接して位置している場合、または核供与細胞が受核卵子の卵黄周囲空間（ｐｅｒｉｖｉｔｅｌｌｉｎｅ  ｓｐａｃｅ）内に位置している場合に電気的刺激を加えることにより起こる。前記形質転換細胞株は核供与細胞であって、核受容体である卵子に核を伝達する細胞または細胞の核をいう。卵子は、好ましくは、第２次減数分裂中期まで到達した成熟卵子をいい、好ましくは、マウスの卵子であってもよい。
【００６３】
本発明の一具体例によれば、前記動物は、ウサギ、ヤギまたはマウス（ｍｏｕｓｅ）であってもよいが、これに限定しない。
【００６４】
マウスは、すでに各種疾患の病理学的機序と治療のための研究に用いられており、特に、長い間経済動物として価値が認められ、他の中・大型動物を疾患モデルとして用いる時より倫理的な問題点を回避することができ、安定した飼育システムが構築されていて、実験動物モデルの開発時に保持および管理が容易であるという利点がある。また、ウサギおよびヤギなどはすでに抗体の生産に多様に活用されていて、本発明のアグリコシル化抗体の生産に容易に活用できる。抗体を生産可能なニワトリ、ウマなどその他の動物も活用可能である。
【００６５】
本発明の一具体例によれば、前記アグリコシル化抗体の生産は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３からなる群より選択される１つ以上のＩｇＧの変形によるものであってもよい。
【００６６】
ＩｇＧ遺伝子を構成する塩基の一部の置換によるＩｇＧの変形によって、アグリコシル化抗体を生産する動物モデルの製造が可能である。
【００６７】
本発明の一具体例によれば、前記変形は、配列番号２に相当する配列の、配列番号４０の配列への置換；配列番号３に相当する配列の、配列番号３７の配列への置換；配列番号４に相当する配列の、配列番号３８の配列への置換；および配列番号５に相当する配列の、配列番号３９の配列への置換からなる群より選択される１つ以上の置換により発生したものであってもよい。
【００６８】
本発明のさらに他の態様は、ＩｇＧ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ）遺伝子が変形されたアグリコシル化抗体生産用動物モデルを提供する。
【００６９】
本発明のアグリコシル化抗体生産用動物モデルにおいて、前述した内容と重複する部分は、前述した意味と同じ意味で使用できる。
【００７０】
本発明の一具体例によれば、前記変形は、ＩｇＧ１重鎖のアミノ酸配列におけるＮ−Ｓ−Ｔ配列中の１つ以上のアミノ酸の他のアミノ酸への置換；ＩｇＧ２ｂ重鎖のアミノ酸配列におけるＮ−Ｓ−Ｔ配列中の１つ以上のアミノ酸の他のアミノ酸への置換；ＩｇＧ２ｃ重鎖のアミノ酸配列におけるＮ−Ｓ−Ｔ配列中の１つ以上のアミノ酸の他のアミノ酸への置換；およびＩｇＧ３重鎖のアミノ酸配列におけるＮ−Ｓ−Ｔ配列中の１つ以上のアミノ酸の他のアミノ酸への置換からなる群より選択される１つ以上の置換により発生したものであってもよい。
【００７１】
さらに好ましくは、前記変形は、ＩｇＧ１重鎖のアミノ酸配列におけるＮ−Ｓ−Ｔ配列中のアミノ酸ＮがＮ以外の他のアミノ酸に置換されるか、またはＳがＰに置換されるか、またはＴがＳではない他のアミノ酸に置換；ＩｇＧ２ｂ重鎖のアミノ酸配列におけるＮ−Ｓ−Ｔ配列中のアミノ酸ＮがＮ以外の他のアミノ酸に置換されるか、またはＳがＰに置換されるか、またはＴがＳではない他のアミノ酸に置換；ＩｇＧ２ｃ重鎖のアミノ酸配列におけるＮ−Ｓ−Ｔ配列中のアミノ酸ＮがＮ以外の他のアミノ酸に置換されるか、またはＳがＰに置換されるか、またはＴがＳではない他のアミノ酸に置換；およびＩｇＧ３重鎖のアミノ酸配列におけるＮ−Ｓ−Ｔ配列中のアミノ酸ＮがＮ以外の他のアミノ酸に置換されるか、またはＳがＰに置換されるか、またはＴがＳではない他のアミノ酸に置換からなる群より選択される１つ以上の置換により発生したものであってもよい。
【００７２】
Ｎ−Ｓ−ＴのＤ−Ｓ−Ｔへの突然変異は、Ｄ−Ｇ−ＴまたはＧ−Ｓ−Ｔへの突然変異とは異なり、Ｎ−グリコシル化アスパラギン残基が免疫グロブリンβサンドイッチフォールド（ｆｏｌｄ）の二本鎖の間に露出したループに位置しているため、帯電した側鎖を有していても、アスパラギンと同一の幾何学的構造を示すアスパラギン酸は、グリシン（ＧＳＴ）に比べて潜在的幾何学的な構造的不安定性を回避することができるので、好ましい。
【００７３】
本発明の一具体例によれば、前記Ｎ−Ｓ−Ｔ配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３からなる群より選択されるいずれか１つのＩｇＧ重鎖の２９７番〜２９９番アミノ酸配列であってもよい。
【００７４】
本発明の一具体例によれば、前記変形は、配列番号２に相当する配列の、配列番号４０の配列への置換；配列番号３に相当する配列の、配列番号３７の配列への置換；配列番号４に相当する配列の、配列番号３８の配列への置換；および配列番号５に相当する配列の、配列番号３９の配列への置換からなる群より選択される１つ以上の置換により発生したものであってもよい。
【００７５】
本発明の一具体例によれば、前記動物は、ウサギ、ヤギまたはマウスであってもよいが、これに限定しない。
【００７６】
本発明のさらに他の態様は、前記動物モデルに診断しようとする抗原を投与するステップを含む抗原に対するアグリコシル化抗体の生産方法を提供する。
【００７７】
本発明の一具体例によれば、前記アグリコシル化抗体の生産方法は、抗原の投与後、形質転換マウスからアグリコシル化抗体を分離および精製する過程を含むことができる。抗体の分離および精製は、当該技術分野で知られた方法、カラムを用いた分離またはタンパク質Ｇアガロースビーズを用いた分離方法などを利用することができるが、これに限定されるものではない。
【００７８】
本発明のさらに他の態様は、前記アグリコシル化抗体の生産方法で生産されたアグリコシル化抗体を提供する。
【００７９】
本発明の方法で生産されたアグリコシル化抗体は、抗体の重鎖に糖鎖が付加されない抗体、すなわち、糖質化反応が起こらない抗体であるので、糖鎖部分による交差結合を排除できるため、糖鎖研究のための多様な分子生物学的分析実験法と疾病の診断に用いるためのキットなどに有用に活用できる。
【００８０】
本発明のさらに他の態様は、前記アグリコシル化抗体；および糖タンパク質バイオマーカーを含む免疫診断キットを提供する。
【００８１】
本発明の免疫診断キットは、例えば、免疫診断用ストリップを用いるものであってもよい。前記ストリップは、生物学的試料が吸収されるサンプルパッド（ｓａｍｐｌｅ  ｐａｄ）；前記生物学的試料に存在する、検査しようとする疾病抗原と特異的に結合するアグリコシル化抗体を含む接合パッド（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｐａｄ）；検査しようとする疾病抗原に特異的に結合するアグリコシル化抗体が固定されている検査線（ｔｅｓｔ  ｌｉｎｅ）および対照群抗体が固定されている対照線（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｌｉｎｅ）を含む反応膜（ｔｅｓｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）；および前記生物学的試料とそれぞれの抗体が反応した後に残る残量の試料が吸収される吸収パッド（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｐａｄ）を含むことができるが、これに限定されるものではない。また、当業界における免疫診断に一般的に使用される試薬をさらに含んでもよい。
【００８２】
糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）は、２〜６種類の単糖類とタンパク質とが共有結合で連結された複合タンパク質をいい、生体内のほぼすべての細胞に存在する。細胞の外部からのシグナルを検知、認識し、化学物質を運ぶ機能をし、各種炎症および疾病に関与することが知られている。したがって、糖タンパク質を分析することにより、多様な疾病の診断が可能である。
【００８３】
本発明で使われる用語、「免疫診断（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」は、特異的に反応する抗原−抗体反応に基づいて疾病の感染の有無、発病の有無、経過過程などを確認する方法をいい、酵素免疫検定法、蛍光免疫検定法などを含むことができるが、これらに限定されるものではない。
【００８４】
本発明の一具体例によれば、前記糖タンパク質バイオマーカーは、レクチンによって検出される。
【００８５】
本発明で使われる用語、「レクチン（ｌｅｃｔｉｎ）」は、特定の糖分子と特異的に結合するタンパク質をいい、分子診断分野では、タンパク質に修飾された糖鎖の確認に使用されるものであってもよい。
【００８６】
本発明の一具体例によれば、前記レクチンは、Ｌ４−ＰＨＡ（Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−Ｌ４）、ＬＣＡ（ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＤＳＡ（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、セレクチン（Ｓｅｌｅｃｔｉｎ）、Ｃｏｎ  Ａ（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ−Ａ）、ＷＧＡ（Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ジャカリン（Ｊａｃａｌｉｎ）、ＳＮＡ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ  Ｎｉｇｒａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ガレクチン（ｇａｌｅｃｔｉｎ）であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００８７】
本発明の一具体例によれば、前記糖タンパク質は、ＡＦＰ−Ｌ３であってもよいが、特定の疾病において特異的に診断に有効性があるバイオマーカーまで含むことができる。
【００８８】
肝癌患者ではＡＦＰ−Ｌ３レベルが増加し、肝硬変、卵巣癌患者ではＣＡ−１２５（ｍｕｃｉｎ１６、ＭＵＣ１６）のレベルが上昇することが知られている。前記アグリコシル化抗体にはレクチンが結合できないため、本発明のキットを用いて、生物学的試料に含まれている糖タンパク質の有無および量を正確に測定することができる。具体的には、本発明では、本発明のアグリコシル化抗体生産用動物モデルから生産されたアグリコシル化抗体としてＡＡＬを用いてＡＦＰ−Ｌ３の量を測定することにより、肝癌の信頼性ある診断が可能であることを具体的に確認した。
【００８９】
本発明の一具体例によれば、本発明の免疫診断キットを用いて糖タンパク質を分析する方法は、当業界で知られたタンパク質の分析方法を追加的に使用することができ、例えば、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）、放射線免疫分析（ｏｔＡ：ｂａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法、電気泳動、免疫沈殿分析法、ＦＡＣＳおよびタンパク質チップ方法などの方法を使用することができるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００９０】
以下、本発明を１つ以上の実施例を通じてより詳しく説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００９１】
実施例１．アグリコシル化抗体生産マウスの作製および評価方法
１−１．動物の用意
動物の使用および管理手続きはＫＲＩＢＢの動物実験倫理委員会（ＩＡＣＵＣ）で検討および承認された。接合子（ｚｙｇｏｔｅ）はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから得ており、ＩＣＲ雌マウスを代理母（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）として用いた。遺伝子編集されたＣ５７ＢＬ／６ＪマウスはＢａｌｂ／ｃマウスと逆交配（ｂａｃｋ−ｃｒｏｓｓ）された。すべての動物は１２時間の明暗周期で２４℃の恒温および４０％の湿度の無菌飼育場で飼育された。
【００９２】
１−２．ＡＢＥ（ａｄｅｎｉｎｅ  ｂａｓｅ  ｅｄｉｔｏｒ）  ｍＲＮＡの用意
ｐＣＭＶ−ＡＢＥ７．１０（ａｄｄｇｅｎｅ、＃１０２９１９）およびｘＣａｓ９（３．７）−ＡＢＥ（７．１０）（ａｄｄｇｅｎｅ、＃１０８３８２）プラスミドベクターはＡｄｄｇｅｎｅから購入した。プラスミドをＡｇｅＩ（ＮＥＢ）で３７℃で２時間分解し、線形化されたベクターをＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。精製されたベクター１μｇをｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ  Ｔ７  Ｕｌｔｒａキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｍＲＮＡ合成のための鋳型として用いた。ｍＲＮＡはＭＥＧＡｃｌｅａｒキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて分離し、凍結チューブバイアルに小分けした後、液体窒素に保存した。使用したＡＢＥの塩基配列は表１の通りである。
【００９３】
【表１】
2021526379.tif 000003
【００９４】
１−３．微細注入および電気穿孔によるゲノム編集および接合体の移植
ＰＭＳＧホルモン（５ＩＵ、Ｍｅｒｃｋ）の注入後、４８時間の間隔でＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウス（５週齢）の腹腔内にｈＣＧホルモン（５ＩＵ）を注入した。雌マウスを９週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスと交配させ、１細胞接合子を雌マウスの卵管膨大部（ａｍｐｕｌｌａ  ｏｆ  ｏｖｉｄｕｃｔ）から得た。卵丘細胞（ｃｕｍｕｌｕｓ  ｃｅｌｌ）は３ｍｇ／ｍｌのｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）が含有されたＭ２培地で培養して除去された。実施例１−２の表１の塩基配列を有するＡＢＥ  ｍＲＮＡ３μｇ／μｌと、標的ＤＮＡ結合のためのｓｇＲＮＡ（Ｔｏｏｌｇｅｎ、韓国）３μｇ／μｌとを含む混合物を、ＬＥＩＣＡ  ＤＭＩＲＢ遠隔操縦機（Ｌｅｉｃａ−ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）が装着されたＦｅｍｔｏｊｅｔ微量注入器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ）を用いて接合子の細胞質に微量注入した。
【００９５】
【表２】
2021526379.tif 000004
【００９６】
一方、ゲノム編集のために、ｓｇＲＮＡ５００ｎｇ／μｌおよび実施例１−２で用意したＡＢＥ  ｍＲＮＡ４００ｎｇ／μｌをｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に溶解して、電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）用混合物を製造した。接合子を電気穿孔用混合物に懸濁させ、製造会社のプロトコルに従い、ＮＥＰＡ２１電気穿孔機（ＮＥＰＡ  ＧＥＮＥ）を用いて電気穿孔した。
【００９７】
微量注入および電気穿孔後、５％ＣＯ２補充された３７℃の培養器で接合子をＫＳＯＭ＋ＡＡ培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で２細胞段階まで培養した後、生存可能な細胞を偽妊娠（ｐｓｅｕｄｏ−ｐｒｅｇｎａｎｔ）代理母マウスの卵管に移植した。
【００９８】
１−４．遺伝型の分析
ゲノムＤＮＡを分離するために、１週齢のｐｕｐから足指を切断した。
【００９９】
【表３】
2021526379.tif 000005
【０１００】
単一塩基校正確認のために、Ｈ−Ｔａｑ（Ｂｉｏｆａｃｔ）を用いたＡＲＭＳ（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）によって遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）の事前選別を表３のプライマーを用いて行い、標的部位でグアニンバンドのみを有するサンプルをサンガーシーケンシング分析した。最終突然変異は標的遺伝子座をＰｆｕおよび特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅させた（表４）。ＰＣＲ産物のサンガーシーケンシング分析方法で確認した。
【０１０１】
【表４】
2021526379.tif 000006
【０１０２】
１−５．ハイブリドーマ細胞の作製
ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ補助剤（Ｍｅｒｃｋ）１００μｌにヒトＡＦＰ（Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）５０μｇを溶解させて抗原性溶液（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を製造し、ゲノム編集されたマウス（６週齢）の足裏に１週間隔で４回注入した。最終注入後、膝窩リンパ節（ｐｏｐｌｉｔｅａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ）を解剖してＢ細胞を得た後、既存の方法によりＦＯ骨髓腫（ｍｙｅｌｏｍａ）細胞と融合させた。単一融合細胞を培養皿に入れて、２０％ＦＢＳ、１ｘＨＡＴ（１００μＭ  ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ、０．４μＭ  ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎおよび１６μＭ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）（Ｍｅｒｃｋ）、１ｘ抗生剤−抗菌溶液（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅおよび０．２５μｇ／ｍｌ  ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ）（Ｗｅｌｇｅｎｅ、Ｋｏｒｅａ）を添加したまま、２週間培養した。ｈＡＦＰに対する抗体を生産する陽性クローンをｉｎｄｉｒｅｃｔ  ＥＬＩＳＡ検査を用いて選別した。ヒトＡＦＰ溶液は１μｇ／ｍｌの濃度でｈＡＦＰをＰＢＳに溶解させて製造した。９６−ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の表面をコーティングするために抗原溶液（１００μｌ）を使用した。ブロッキング後、培養培地を１００倍希釈しコーティングされたプレートのウェルに添加した後、インキュベーションした。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０２％）で３回洗浄した後、ＨＲＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、希釈比率：１：２０００）がコンジュゲートされた抗−マウス二次抗体を処理し、ＴＭＢ−ｕｌｔｒａ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を処理した。０．２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４  １００μｌを添加して化学反応を停止させた後、ＶＥＲＳＡ  ｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４５０ｎｍでの吸光度を測定した。アグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）単クローン抗体を生産するために、陽性クローンを無血清培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。
【０１０３】
１−６．単クローン抗体の生産
実施例１−５で製造したハイブリドーマ細胞を５％ＣＯ２が補充されたチャンバで７２時間１００ＲＰＭで撹拌しながら、無血清培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。条件培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉａ）を得ており、１３，０００ｇで３０分間遠心分離して細胞破片を除去し、残留破片を０．２２μｍの注射器フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過して除去した。ＦＰＬＣシステム（ＡＫＴＡ浄水器、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたＨｉＴｒａｐＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で濾過液を精製した。ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）バッファーで平衡を合わせたカラムに１ｍｌ／ｍｉｎの流速で濾過液を通過させ、結合タンパク質を３ｍｌ／ｍｉｎの流速で５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で溶出させた。溶出した分画を１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和させた後、タンパク質安定化カクテル溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合し、−２０℃で保管した。
【０１０４】
１−７．ＦＵＴ８ノックアウト細胞の作製
混成化されたオリゴヌクレオチド対をｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−Ｐｕｒｏ（ＰＸ４５９）（Ａｄｄｇｅｎｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＃４８１３９）ベクターにクローニングすることにより、ＦＵＴ８標的化ガイドＲＮＡ構造物（表５）を生成した。
【０１０５】
【表５】
2021526379.tif 000007
【０１０６】
具体的には、１０μｇのベクターを５０ｕｎｉｔｓのＢｂｓＩで１時間切断し、切断されたベクターをゲル抽出キット（Ｓｏｌｇｅｎｔ）を用いて抽出した後、ｇＲＮＡ対（１０ｐｍｏｌ）を線形化されたベクターにクローニングした。標的配列はサンガーシーケンシング分析方法で確認した。ベクター構造物（１０μｇ）を用いて、電圧１３００Ｖ、パルス幅１０ｍｓおよびパルス数３の電気穿孔機（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）（Ｎｅｏｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ２９３−Ｔ細胞（８×１０５細胞）を形質転換した。各ウェルに単一細胞を分注してクローンを形成し、各クローンに対してサンガーシーケンシング分析方法で遺伝子型分析を行ってＦＵＴ８−／−クローンを選別した。
【０１０７】
１−８．μ−Ｔａｓ分析
自動分析器（ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ）（ｍＴＡＳ  Ｗａｋｏ  ｉ３０、Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）でマイクロチップ毛細管電気泳動（ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）および液相結合分析（ｌｉｑｕｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）を行って、残留血清検体でアルファ胎児蛋白（ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）であるＡＦＰ−Ｌ３を測定した。ＡＦＰに対して０．３〜２０００ｎｇ／ｍＬの範囲で測定し、ＡＦＰの濃度が０．３ｎｇ／ｍｌを超える血清でＡＦＰ−Ｌ３の濃度を計算した。試料のＡＦＰの濃度が２，０００ｎｇ／ｍＬ以上の場合、試料を製造会社の指針に従い、既存の結果に基づいて手動で希釈した。すべての検査は釜山（プサン）大学の梁山病院で行われ、検査前に被検体に関するいかなる情報も提供されなかった。
【０１０８】
１−９．免疫蛍光分析
編集されたＨＥＫ２９３−Ｔ細胞（２×１０４）をＤＥＭＥ培地の１８ｍｍ×１８ｍｍのカバーガラス上で１日間成長させた。細胞をＢＤ  ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で１２時間固定した。その後、細胞を２時間室温で９ｎｇ／μｌのＰｈｏＳＬ−ａｌｅｘａ４８８の存在下で培養した。ＰＢＳで３回洗浄した後、１．５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩを含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＶＥＣＴＯＲ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でカバーガラスを覆った。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０  Ｍｅｔａ顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ）で蛍光をモニタリングした。
【０１０９】
１−１０．サンドイッチレクチン−ＥＬＩＳＡ
緩衝液（ｐＨ７．４）０．１Ｍ重炭酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ−ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）に溶解した抗−ｈＡＦＰマウス単クローン抗体（＃ａｂ５４７４５、Ａｂｃａｍ）または抗−ｈＡＦＰアグリコシル化抗体０．５μｇでＥＬＩＳＡウェルプレートを４℃で一晩コーティングした。プレートをＴＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０で２回洗浄し、無蛋白ブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）または０．５％ポリビニルアルコール＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を用いて室温で１時間ブロッキングした。それぞれのウェルに臨床試料または培養培地（１００μｌ）を分注した。それぞれのウェルをＲＩＰＡバッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、１％ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％ＳＤＳ）で５回以上洗浄し、再びＴＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０で繰り返した。１：２，０００で希釈した抗−ｈＡＦＰウサギ多クローン抗体（＃ａｂ８２０１、Ａｂｃａｍ）または１：１，０００で希釈したビオチン−標識されたＡＡＬ（ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ  ｌｅｃｔｉｎ）（＃Ｂ−１３９５、ＶＥＣＴＯＲ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のうちの１つを室温で１時間処理した。十分に洗浄した後、それぞれＨＲＰとコンジュゲートされた抗ウサギ二次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）またはストレプトアビジンを１：２，０００で希釈し、室温で１時間処理した。ＴＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０で簡単に洗浄した後、ＴＭＰ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１００μｌを各ウェルに添加し、２Ｎ硫酸で反応を停止させた後、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１１０】
１−１１．安定性テスト
脱グリコシル化された（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体は、５０℃で１５分間Ｒａｐｉｄ  ＰＮＧａｓｅ  Ｆ非−還元型バッファーでＰＮＧａｓｅ−Ｆ（ＮＥＢ）１００ｕｎｉｔｓと市販中の抗−ｈＡＦＰ抗体（＃ＭＩＡ１３０５、Ｔｈｅｒｍｏ  ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１０μｇをインキュベーションして用意された。時間依存的および温度依存的タンパク質安定性は、ＰＢＳ緩衝液でグリコシル化、脱グリコシル化またはアグリコシル化抗体を４℃または３７℃で最大１４日間インキュベーションして測定した。インキュベーションされた抗体を４〜２０％のＭｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＴＧＸＴＭゲル（ＢｉｏＲａｄ）で電気泳動させ、クマシーブルー染色によって視覚化した。タンパク質安定性は、ｐＨ３．０、７．０または１０．０に調整された０．１Ｍリン酸塩バッファーで抗体を０〜１４日間インキュベーションしてモニタリングした。また、各抗体を０〜３％のＨ２Ｏ２を含有したＰＢＳバッファーで５時間、３７℃の培養器でインキュベーションした。抗体の完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）は前記記載のＥＬＩＳＡ分析によって測定された。
【０１１１】
１−１２．統計分析
インデル（ｉｎｄｅｌ）効率に対する統計的テストは、ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いてＳｉｇｍａ  Ｐｌｏｔで行われ、ｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０５は有意なものと見なした。
【０１１２】
実施例２．ゲノム編集によるアグリコシル化抗体生産マウスの確立
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）はＮ−連結された糖タンパク質で、一般的な糖タンパク質と同じく、グリカン構造に異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を示す。このような特性のため、レクチンを含むグリカン特異的プローブを用いて疾病特異的グリコール−バイオマーカーを測定するにあたり、ＥＬＩＳＡまたはＣＬＩＡのような日常的に使用される免疫測定法（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）の使用が制限された。一方、レクチンは被分析物が存在しなくても捕獲抗体に結合可能であり（図１）、グリカン構造は予測しにくく、ｂａｔｃｈ−ｔｏ−ｂａｔｃｈ変形が容易なため、統制できない大きな空試験値（ｂｌａｎｋ  ｖａｌｕｅ）を生成する。このような問題は、適切なレクチンおよびアグリコシル化抗体を用いる免疫分析プラットフォームであるＡＬＩＱＵＡＴ（Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｌｅｃｔｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＱＵＡｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  ｍａｒｋｅｒ）による特定のグリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）分析によって解決できる（図２）。したがって、本実施例では、ゲノム編集によりアグリコシル化抗体を生産するマウスを確立した。
【０１１３】
２−１．マウス接合体のゲノム編集の確認
ＨＤＲ効率性を向上させるために様々なアプローチ方法が開発されたが、これらの方法は依然として非相同末端連結（Ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＨＥＪ）ベースのノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）効率に比べて非常に低い。最近、二重鎖ＤＮＡの切断なしに、シトシンまたはアデニン塩基ベースの編集により高い効率でそれぞれ「Ｃ−Ｇ  ｔｏ  Ｔ−Ａ」または「Ａ−Ｔ  ｔｏ  Ｇ−Ｃ」転換が可能な塩基編集システム（ｂａｓｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）が開発された。Ｃ５７ＢＬ／６のＩｇＧ遺伝子の配列分析の結果、塩基編集ウィンドウ（図３）内でＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３がＮ−グリコシル化アスパラギンコーディング配列（ＡＡＣ）に編集可能なアデニンを共有することが明らかになった。１つまたは２つとものアデニンをグアニンに転換させると、非−アスパラギンコーディング配列が生成され、ＩｇＧからＮ−グリカンが無くなる。
【０１１４】
したがって、アグリコシル化抗体生産マウスを確立するために、実施例１−３により、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の接合体にＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３を標的とするガイドＲＮＡおよびＡＢＥ７．１０ｍＲＮＡを同時に注入して当該遺伝子の変形を誘導した。その後、実施例１−４により、遺伝子型分析を行った。遺伝子型分析はＡＲＭＳ（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）によって生まれたｐｕｐ（ｎ＝２４）で行われ、プライマーは、図４にて矢印で表されているように、ＡからＧに転換される時、異なる大きさのさらなるＰＣＲ生成物を生成するように設計された（図４）。
【０１１５】
分析結果、すべてのＩｇＧ遺伝子に対して高効率のＡからＧへの転換が観察された。転換率（少なくとも１つの遺伝子座の転換）は、ＩｇＧ２ｃが７９．１％（１９／２４）、ＩｇＧ２ｂが８７．５％（２１／２４）、ＩｇＧ３が６２．５％（１５／２４）であることが確認された。遺伝子型の選別結果を比較した結果、３つの遺伝子で同時転換を示すと見られる１５匹のｐｕｐを確認し、そのうち９匹に対して個別的にサンガー配列分析を行った。その結果、キメラ突然変異が含まれた場合、９匹のすべてのｐｕｐでＩｇＧ２ｃ（図５）、ＩｇＧ２ｂ（図６）およびＩｇＧ３（図７）の３つの遺伝子座に突然変異が発生したことが確認された。
【０１１６】
２−２．ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３遺伝子編集されたｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｆｏｕｎｄｅｒマウスの確立
実施例２−１で選別した９匹のｐｕｐのうち、ＩｇＧ１遺伝子座でゲノム編集を行うのに用いるために、他のｐｕｐに対比して、ＩｇＧ２ｃ（図８）、ＩｇＧ２ｂ（図９）およびＩｇＧ３（図１０）遺伝子で二対立因子性（ｂｉａｌｌｅｌｉｃ）「Ａ  ｔｏ  Ｇ」転換率が高いｐｕｐ（＃１１）を選択した。このｐｕｐはＩｇＧ２ｂで同型接合突然変異（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を示し、ＩｇＧ２ｃとＩｇＧ３でキメラ突然変異を示した（図１１）。
【０１１７】
【表６】
2021526379.tif 000008
【０１１８】
ゲノム編集されたｐｕｐと野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの交配して生じたｐｕｐを異型接合突然変異ｐｕｐと数回繰り返し交配および繁殖させて、突然変異アミノ酸モチーフであるＤ−Ｓ−Ｔ、Ｄ−Ｇ−Ｔ、Ｇ−Ｓ−ＴおよびＧ−Ｇ−Ｔのうちの１つを有するように固定した。Ｄ−Ｓ−Ｔ突然変異は、Ｎ−グリコシル化アスパラギン残基が免疫グロブリンβサンドイッチフォールド（ｆｏｌｄ）の二本鎖の間に露出したループに位置しているため、帯電した側鎖を有していても、アスパラギンと同一の幾何学構造を示すアスパラギン酸はグリシン（ＧＳＴ）に比べて潜在的幾何学的構造の不安定性を回避できるため、ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｆｏｕｎｄｅｒとして、Ｄ−Ｓ−Ｔ突然変異を選択した。Ｄ−Ｇ−ＴまたはＧ−Ｓ−Ｔのような２つの突然変異の導入は、構造物の変形を最小化するために排除した（図１２）。ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｆｏｕｎｄｅｒを飼育し、ＩｇＧ１遺伝子編集のために使用した。
【０１１９】
２−３．ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３遺伝子編集されたｆｏｕｎｄｅｒマウスの確立
ＩｇＧ１の標的部位はｃａｎｏｎｉｃａｌ（ＮＧＧ）を含まないが、標的の二本鎖ともＮＧ  ＰＡＭ配列のみを含む。したがって、可能な隣接サイトを標的として供与ＤＮＡを用いてＨＤＲ媒介遺伝子編集を行ったが、ＩｇＧ１遺伝子が編集されたｐｕｐを生成することができなかった。したがって、ＩｇＧ１の遺伝子編集のために、ＮＧ配列に対する遺伝子標的化活性を示す実施例１−２のｘＣａｓ９−ＡＢＥを用いて、実施例１−３によりＩｇＧ１遺伝子を編集した。
【０１２０】
その結果、２つのｐｕｐでｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｃ転換が現れ、１つの対立遺伝子がセリンを暗号化する配列（ＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＴＴＣＣＧＴＴＣＡＧＴ；ＩｇＧ１；配列番号４０）に転換された（図１３）。編集されたｐｕｐをｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  ＩｇＧ１になるまで数回繰り返し交配および繁殖させた。すべての突然変異は生殖腺転移（ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）が行われ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３で累積されたアグリコシル化突然変異を有するｆｏｕｎｄｅｒの確立に成功した。４つの対立遺伝子における突然変異はサンガーシーケンシングによって再び確認された。具体的なゲノム編集に対する手順は表７の通りである。
【０１２１】
【表７】
2021526379.tif 000009
【０１２２】
実施例３．ゲノム編集されたマウスにおいてヒトＡＦＰに対して生成されたアグリコシル化単クローン抗体の生産確認
３−１．免疫グロブリンのすべてのサブクラス生産能力の確認
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＮ−グリコシル化はマウス、ウサギおよびヒトを含む高等真核生物の間で高度に保存されている。ＩｇＧ  Ｎ−グリコシル化が安定性を付与したり免疫反応調節に関与するという報告があるが、進化論的圧力によって高等生物体がＩｇＧのＮ−グリコシル化を採用するようになったのかは明確ではない。
【０１２３】
したがって、欠陥のあるＩｇＧが生産されるかを確認するために、実施例２で確立されたゲノム編集されたマウス由来ＩｇＧに対して免疫グロブリンアイソタイピング（ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ）キットを用いてＩｇＧプロファイリングを行った。
【０１２４】
その結果、ゲノム編集されたマウスは、野生型マウスと同一のプロファイルを示すことが確認された（図１４）。これに対し、ＩｇＧ２ｂ（図１５）およびＩｇＧ３（図１６）遺伝子がノックアウトされたマウスは、相応するサブクラス（ｓｕｂｃｌａｓｓ）の生産に欠陥を示すことが確認された。
【０１２５】
この結果により、ゲノム編集されたマウスは、免疫グロブリンのすべてのサブクラスを生産できる能力を保持していることが確認された。
【０１２６】
３−２．アグリコシル化抗体の生産確認
ゲノム編集されたマウスから生産される抗体がアグリコシル化抗体であるか否かを確認した。
【０１２７】
具体的には、肝細胞癌腫（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）において最も特徴的な腫瘍マーカーの一つであるヒトＡＦＰをモデル抗原として用いた。同量の補助剤で乳化したヒトＡＦＰを６週齢のゲノム編集されたマウス（ｎ＝５）の後ろ足に１週間隔で５回注射し、各免疫ステップで血清を採取してｈＡＦＰに対するｄｉｒｅｃｔ  ＥＬＩＳＡ分析を行った。
【０１２８】
その結果、時間の経過により増加した反応性を示すことが確認され（図１７）、免疫化が進められたことが確認された。
【０１２９】
免疫化後、ネズミから膝窩リンパ節細胞を採取して、実施例１−５によりＦＯ骨髓腫（ｍｙｅｌｏｍａ）細胞と融合させ、ＨＡＴ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）含有プレート上にハイブリドーマ細胞のコロニーを形成させて６６６個のハイブリドーマクローンを得た。
【０１３０】
その結果、ハイブリドーマクローンのうち、１３．９％のクローン（９３個）でｈＡＦＰに高い反応性を示す抗体が分泌されることが確認された（図１８）。
【０１３１】
３−３．単クローン抗体の生産性に優れたハイブリドーマクローンの選別
抗−ｈＡＦＰ抗体は、ヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、ＨＡＳ）に存在するエピトープに対して交差反応を示し得るため、ＨＡＳに対する反応性を確認して反応性クローンを除いた。また、時間の経過により抗体の生産が減少したクローンは除き、抗体の生産が持続するクローンを選別して、１Ｅ５、２Ａ２および３Ａ５と指定された３個のクローンを選別した。３個のクローンはいずれもＩｇＧ１サブクラスおよびカッパ（ｋａｐｐａ）軽鎖の単クローン抗体を分泌することが確認された（図１９）。また、ＭＳ分析により、新たに形成された突然変異領域にＯ−ｌｉｎｋｅｄグリコシル化のような翻訳後変形（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は存在しないことが確認された。
【０１３２】
３−４．選別されたハイブリドーマクローンで生産された抗体の無糖化の確認
生成された抗体が完全に無糖化されたことを確認するために、Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ（Ｃｏｎ−Ａ）を用いたレクチンブロット分析および抗−マウスＩｇＧ抗体を用いた免疫ブロット分析を行った。
【０１３３】
その結果、矢印で表されたＣｏｎ−Ａに反応する商業的に購入した抗体とは異なり、抗体（１Ｅ５）の重鎖にはＮ−グリカンがないことが確認された（図２０）。ＩｇＧはＣＨ２領域以外にもＮ−グリカンの伝達は可能であるが、実施例３−３で確立された３個のクローンはＮ−グリコシル化の跡が現れないことが確認された（図２１）。
【０１３４】
実施例４．レクチン結合ＥＬＩＳＡ分析によるアグリコシル化抗体の妥当性検査
４−１．Ｌ３−ｎｕｌｌ  ＡＦＰ標準を作るためのＦＵＴ８−／−突然変異クローンの作製
ＨＥＫ２９３−Ｔ細胞は、ＧＤＰ−フコース（ｆｕｃｏｓｅ）においてｃｏｒｅ  Ｎ−グリカンへのフコース転移を触媒するＦＵＴ８（ａｌｐｈａ−（１，６）−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を発現する。ＦＵＴ８遺伝子には３つのスプライシング変異が存在し、触媒の活性に関連があり、すべての変異型が共有するエクソン９および１１はグリコシルトランスフェラーゼ（ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）ファミリー２３に属する。
【０１３５】
ＡＬＩＱＵＡＴ（Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｌｅｃｔｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＱＵＡｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  ｍａｒｋｅｒ）システムを確立するために、実施例１−１０によりアグリコシル化抗体の生産可能性をサンドイッチＥＬＩＳＡプラットフォームでテストするに先立ち、ＡＦＰ−Ｌ３が欠乏したｈＡＦＰ標準を得ることが重要であるので、Ｌ３−ｎｕｌｌ  ＡＦＰ標準を作るために、実施例１−７によりＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９でエクソン９および１１をそれぞれ標的化した。
【０１３６】
その結果、フレームシフトナンセンス突然変異を示すＦＵＴ８−／−突然変異クローンを得た（図２２）。
【０１３７】
４−２．ＦＵＴ８−／−細胞のＡＦＰ−Ｌ３を生成するか否かの確認
ＦＵＴ８遺伝子の除去による機能的損失を調べるために、ｃｏｒｅ−ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  Ｎ−ｇｌｙｃａｎに特異的な結合性を示すことが知られたＰｈｏＳＬ（ｍｕｓｈｒｏｏｍ  Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ｓｑｕａｒｒｏｓａ）由来レクチンを用いて、実施例１−９によりレクチン結合テストを行った。免疫蛍光（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）分析を行った結果、ＦＵＴ８−／−ＨＥＫ２９３−Ｔ細胞はＰｈｏＳＬ結合性がないことが確認された（図２３）。
【０１３８】
一方、ｈＡＦＰは野生型およびＦＵＴ８−／−ＨＥＫ２９３−Ｔ細胞ともにおいて過発現し、レクチン親和度電気泳動のために条件培地を得た。ＡＦＰ−Ｌ３とＡＦＰ−Ｌ１が異なる移動性を示すようにＬｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎが含まれたアガロースゲルでタンパク質の電気泳動を行った。抗−ｈＡＦＰ抗体を用いて免疫ブロット分析して、ＡＦＰの異なるｇｌｙｃｏｆｏｒｍを視覚化した（図２４）。ＡＦＰ−Ｌ３は野生型ＨＥＫ２９３−Ｔ細胞から得たＡＦＰ  ｇｌｙｃｏｆｏｒｍのほとんどを占めるのに対し、ＦＵＴ８−／−細胞はＡＦＰ−Ｌ３を生成しないことが確認された。また、質量分析の結果、ＦＵＴ８−／−細胞におけるＡＦＰ−Ｌ３は現れないことが確認され、野生型細胞におけるＡＦＰ−Ｌ３の生成比率は９９．５％であることが確認され（図２５）、μ−Ｔａｓ分析においても類似の結果を確認した。
【０１３９】
４−３．ＡＬＩＱＵＡＴシステムにおける、アグリコシル化抗体の妥当性の確認
ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡおよびＡＡＬを用いるｌｅｃｔｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ＥＬＩＳＡ分析により標準曲線を作成した。
【０１４０】
具体的には、ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡの場合、アグリコシル化抗体（１Ｅ５）または商業的抗体を捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ）抗体として用いた。検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）抗体対は、商業的に利用可能な抗体のうち、捕獲抗体とマッチングされる抗体を選択した。標準曲線分析の結果、有効性が確認された市販の抗体と比較して敏感度は低いが、アグリコシル化抗体は０〜２０ｎｇ／ｍＬ  ＡＦＰの範囲で優れた線形性を示すことが確認された（図２６）。
【０１４１】
アグリコシル化抗体の妥当性はＡＡＬレクチンを用いたＡＦＰ−Ｌ３テストによって証明された（図２７）。商業的抗体を用いたレクチンＥＬＩＳＡは大きな空試験値（ｂｌａｎｋ  ｖａｌｕｅ）を示し、Ｌ３陽性ＡＦＰの増加した濃度は高い標準誤差（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｅｒｒｏｒ）を有する光学密度の線形増加を反映しなかった。このパターンはＬ３陽性および陰性ＡＦＰサンプルともにおいて類似して観察された。しかし、アグリコシル化抗体を用いたレクチンＥＬＩＳＡ分析は、Ｌ３陽性ＡＦＰサンプルに対する線形性に優れた標準曲線を作った。０〜１，０００ｎｇ／ｍＬの範囲でいかなる干渉も観察されておらず、特定のグリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）定量化のための分析プラットフォームの提供において、レクチンとアグリコシル化抗体との組み合わせ使用による分析の妥当性を確認した。
【０１４２】
実施例５．アグリコシル化抗体ベースのレクチン−ＥＬＩＳＡ  ｈＡＦＰテストのμ−ＴＡＳ分析代替可能性の確認
μ−ＴＡＳは、ＬＣＡが内蔵された毛細管におけるＡＦＰ−Ｌ３の移動を電気泳動で分析する体外診断用免疫分析器である。分析器の高感度および強固性とＡＦＰ−Ｌ３測定の臨床的有用性のため、μ−ＴＡＳはＨＣＣ進行の危険性評価のための試験管内検査のＦＤＡ承認を受けた。分析的妥当性と臨床的有用性にもかかわらず、μ−ＴＡＳ分析は臨床的用途にいくつかの限界がある。一般的に高費用を要する分析であるので、癌検診のための日常的な臨床的使用が制限される。また、μ−ＴＡＳはＡＦＰ−Ｌ３の用途で開発され、他のグリコフォーム分析への使用が困難である。
【０１４３】
これに対し、ＡＬＩＱＵＡＴ方法は、多様な疾病特異的形態の検出のための汎用的かつ普遍的なプラットフォームを提供することができる。ただし、ＡＬＩＱＵＡＴプラットフォームは、グリコフォーム特異的プローブおよびアグリコシル化抗体が利用可能な場合にのみ、他の疾病特異的グリコフォームのテストに容易に適用可能である。腫瘍特異的バイオマーカーに対する特異性を有する多様なレクチンがすでに利用可能なため、本発明のゲノム編集されたマウスから容易に生産できるアグリコシル化抗体がＡＬＩＱＵＡＴ方法に適用できるかを確認するために、アグリコシル化抗体（１Ｅ５）がマグネチックビーズにコンジュゲーションされ、血清でｈＡＦＰを探知し、フコシル化された（ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）形態がＡＡＬで追跡される化学発光免疫分析（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＣＬＩＡ）プラットフォームに臨床サンプルを適用して分析の妥当性の有無を確認した。
【０１４４】
具体的には、ＡＦＰ−Ｌ３標準分子を１．０ｎｇ／ｍＬ未満のＡＦＰレベルを示す正常血清にスパイクした。標準曲線は０〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲で良好な線形性を示した（図２８）。その後、正常な志願者とｈｅｐａｔｉｔｉｓ、ｃｉｒｒｈｏｓｉｓおよびｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ患者から血清（ｎ＝１９）を採取した。１００ｎｇ／ｍＬより高いＡＦＰレベルを示す血清に対しては濃度が標準曲線の範囲内にあるように希釈した。それぞれの血清を均等体積に分けて、ＡＬＩＱＵＡＴ方法および実施例１−８によるμ−ＴＡＳ分析により測定した。
【０１４５】
測定された値をＸ軸に対してはＡＦＰレベルで、Ｙ軸に対しては％ＡＦＰ−Ｌ３でプロットし、２つのプラットフォームから得た各値を比較した結果、比較分析はｐ  ｖａｌｕｅ＞０．０５を示して、両検査が実質的に同一の結果を示すことが確認された（図２９）。
【０１４６】
実施例６．アグリコシル化抗体の保存されたタンパク質の安定性
タンパク質グリコシル化は、タンパク質の機能、タンパク質−タンパク質の相互作用、細胞−宿主認識など多様な効果を示す。また、タンパク質グリカンはｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでタンパク質安定性を付与することが知られている（Ｂｏｗｄｅｎ２０１２）。したがって、無糖質化によって抗体が保存および試験中にタンパク質安定性を失うか否かを、実施例１−１１により確認した。
【０１４７】
具体的には、多様な条件で抗体の安定性を調べるために、市販のグリコシル化された抗体とＰＮＧａｓｅ−Ｆ処理によって生成された脱グリコシル化（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅ）された形態の抗体を対照群として比較した。
【０１４８】
６−１．タンパク質の熱安定性の確認
ＰＢＳバッファーで多様な形態の抗体を１４日間、４℃および３７℃の条件で放置した。脱グリコシル化抗体は矢印で表しているように２つの異なる分解断片（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）を示すことが確認された（図３０）。処理初期に断片が観察されたため、断片のうち、分子量が約３５ｋＤａの断片はＰＮＧａｓｅ−Ｆ処理によって発生したことが確認された。断片のうち、分子量が約５０ｋＤａの断片は３７℃で時間により増加したことが確認された。しかし、本来のグリコシル化された形態は、調べられた条件下でいかなる分解生成物も現れていない。同様に、本発明者らはゲル上でアグリコシル化抗体に対する分解産物の跡を検出することができなかった。
【０１４９】
この結果により、グリカン自体の不在よりは、脱グリコシル化反応条件によってタンパク質の安定性がさらに損失することを確認した。
【０１５０】
６−２．タンパク質のｐＨ安定性の確認
抗体は多様な反応条件または精製過程でｐＨの変化に露出しうる。したがって、多様なｐＨ条件で多様なグリコフォーム抗体の安定性を調べた。
【０１５１】
具体的には、３７℃で１４日間、ｐＨ３．０、７．０および１０．０のバッファーでインキュベーションした抗体をｈＡＦＰ測定における検出抗体として用いた。テストの光学密度値を測定してタンパク質の結合力を評価した。その結果、グリコシル化およびアグリコシル化抗体は類似の安定性を示すことが確認された（図３１）。２種類の抗体とも中性（ｐＨ７．０）の条件で１４日間高い安定性を示し、塩基性（ｐＨ１０．０）の条件で高い抵抗性を示したのに対し、ｐＨ３．０では時間により安定性が減少した。対照的に、脱グリコシル化された形態は、中性ｐＨにおいても完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）において大きな損失を示した。ｐＨ７．０で１４日間恒温培養した抗体のうち約５０％の抗体が結合力を失い、ｐＨ１０．０で培養した場合、損失がさらに著しかった。特に、脱グリコシル化された形態は、ｐＨ３．０で４日間培養する場合、結合力が完全に損失することが確認された。
【０１５２】
６−３．酸化条件に対するタンパク質の安定性の確認
酸化条件下で抗体の完全性について調べた結果、グリコシル化およびアグリコシル化抗体ともこのような条件に対する抵抗性を示すことが確認され、これは脱グリコシル化された形態の物理的特性と非常に対照的であった（図３２）。アグリコシル化抗体は３．０％のＨ２Ｏ２を含有するＰＢＳ緩衝液で１時間恒温処理した場合、１０％未満の完全性の損失を示した。しかし、脱グリコシル化された抗体はこのような条件下で約５０％の結合活性（ａｖｉｄｉｔｙ）の損失が確認された。この結果により、グリコシル化された免疫グロブリンＧに対比してアグリコシル化抗体の安定性が低下しないことが確認された。
【０１５３】
これまで本発明についてその実施例を中心に説明した。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明が本発明の本質的な特性を逸脱しない範囲で変形した形態で実現できることを理解するであろう。そのため、開示された実施例は、限定的な観点ではなく、説明的な観点で考慮されなければならない。本発明の範囲は、上述した説明ではなく特許請求の範囲に示されており、それと同等範囲内にあるすべての差異点は本発明に含まれていると解釈されなければならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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