(57)【要約】  ＳＮＶベースジェネティック試験の確度の向上は、腫瘍サンプル及び対応正常部サンプルのＤＮＡシーケンシングデータを用いてＳＮＶを決定することにより実施され、且つ腫瘍サンプルのＲＮＡシーケンシングデータは、そのようにして同定されたＳＮＶの発現を確認するために使用される。
2021514604.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
確度の向上した単一ヌクレオチド変異体ベース癌試験を実施する方法であって、
患者の腫瘍サンプル及び対応正常部サンプルのＤＮＡシーケンシングデータを得るとともに前記腫瘍サンプルのＲＮＡシーケンシングデータをさらに得ることと、
前記対応正常部サンプルと比べて前記腫瘍サンプルでＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の存在を決定することと、
前記ＲＮＡシーケンシングデータを用いて前記ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の発現を決定することと、
前記単一ヌクレオチド変異体の存在及び発現に基づいて前記患者の癌状態に関連する少なくとも１つのＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体を同定することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡシーケンシングデータが全ゲノムＤＮＡシーケンシングデータである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腫瘍組織のＤＮＡシーケンシングデータが少なくとも５０×のリードデプスを有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記対応正常部組織のＤＮＡシーケンシングデータが少なくとも３０×のリードデプスを有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の存在を決定する工程が、前記腫瘍サンプル及び前記対応正常部サンプルのＤＮＡシーケンシングデータの位置ガイド同期アライメントを用いて実施される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の対立遺伝子頻度を用いて前記ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体をフィルタリングすることをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記腫瘍組織のＤＮＡシーケンシングデータが少なくとも５０×のリードデプスを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記対応正常部組織のＤＮＡシーケンシングデータが少なくとも３０×のリードデプスを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の存在を決定する工程が、前記腫瘍サンプル及び前記対応正常部サンプルのＤＮＡシーケンシングデータの位置ガイド同期アライメントを用いて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の対立遺伝子頻度を用いて前記ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体をフィルタリングすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
確度の向上した患者の治療選択肢を同定する方法であって、
前記患者の対応正常部サンプルと比べて腫瘍サンプルでＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の存在を決定することと、
ＲＮＡシーケンシングデータを用いて前記ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の発現を決定することと、
ＲＮＡとして発現される少なくとも１つのＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体を有する遺伝子を標的とする治療選択肢を同定することと、
を含む、方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の存在を前記決定することが、前記腫瘍サンプル及び前記対応正常部サンプルのＤＮＡシーケンシングデータの位置ガイド同期アライメントを用いて実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の存在を前記決定することが、腫瘍関連遺伝子の複数の参照配列を有するｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ遺伝子パネルを用いて実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の存在を前記決定することが、腫瘍関連遺伝子の複数の参照配列を有するｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ遺伝子パネルを用いて実施される、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ遺伝子パネルが癌型特異的である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ遺伝子パネルが癌型特異的である、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍関連遺伝子が、ＡＢＬ１、ＥＧＦＲ、ＧＮＡＳ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＮ１１、ＡＫＴ１、ＥＲＢＢ２、ＧＮＡＱ、ＭＥＴ、ＲＢ１、ＡＬＫ、ＥＲＢＢ４、ＨＮＦ１Ａ、ＭＬＨ１、ＲＥＴ、ＡＰＣ、ＥＺＨ２、ＨＲＡＳ、ＭＰＬ、ＳＭＡＤ４、ＡＴＭ、ＦＢＸＷ７、ＩＤＨ１、ＮＯＴＣＨ１、ＳＭＡＲＣＢ１、ＢＲＡＦ、ＦＧＦＲ１、ＪＡＫ２、ＮＰＭ１、ＳＭＯ、ＣＤＨ１、ＦＧＦＲ２、ＪＡＫ３、ＮＲＡＳ、ＳＲＣ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＦＧＦＲ３、ＩＤＨ２、ＰＤＧＦＲＡ、ＳＴＫ１１、ＣＳＦ１Ｒ、ＦＬＴ３、ＫＤＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＴＰ５３、ＣＴＮＢ１、ＧＮＡ１１、ＫＩＴ、ＰＴＥＮ、ＶＨＬからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍関連遺伝子が、ＡＢＬ１、ＥＧＦＲ、ＧＮＡＳ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＮ１１、ＡＫＴ１、ＥＲＢＢ２、ＧＮＡＱ、ＭＥＴ、ＲＢ１、ＡＬＫ、ＥＲＢＢ４、ＨＮＦ１Ａ、ＭＬＨ１、ＲＥＴ、ＡＰＣ、ＥＺＨ２、ＨＲＡＳ、ＭＰＬ、ＳＭＡＤ４、ＡＴＭ、ＦＢＸＷ７、ＩＤＨ１、ＮＯＴＣＨ１、ＳＭＡＲＣＢ１、ＢＲＡＦ、ＦＧＦＲ１、ＪＡＫ２、ＮＰＭ１、ＳＭＯ、ＣＤＨ１、ＦＧＦＲ２、ＪＡＫ３、ＮＲＡＳ、ＳＲＣ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＦＧＦＲ３、ＩＤＨ２、ＰＤＧＦＲＡ、ＳＴＫ１１、ＣＳＦ１Ｒ、ＦＬＴ３、ＫＤＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＧＮＡ１１、ＫＩＴ、ＰＴＥＮ、ＶＨＬからなる群から選択される、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の対立遺伝子頻度を用いて前記ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体をフィルタリングすることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の対立遺伝子頻度を用いて前記ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体をフィルタリングすることをさらに含む、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の発現を前記決定することが、前記ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体のＲＮＡ発現レベルを測定することと、あらかじめ決められた閾値と比較することと、を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の発現を前記決定することが、前記ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体のＲＮＡ発現レベルを測定することと、あらかじめ決められた閾値と比較することと、を含む、請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＲＮＡ発現レベルに基づいて前記ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体をランク付けすることをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＲＮＡ発現レベルに基づいて前記ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体をランク付けすることをさらに含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記あらかじめ決められた閾値との比較に基づいて前記ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体を「発現群」又は「非発現群」に分類することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記あらかじめ決められた閾値との比較に基づいて前記ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体を「発現群」又は「非発現群」に分類することをさらに含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、同時係属中の２０１７年１０月１０日出願の米国仮特許出願第６２／５７０，５８０号及び２０１８年１月１８日出願の米国仮特許出願第６２／６１８，８９３号（両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本発明の当技術分野は、癌に関するオミクスデータのプロファイリングであり、とりわけ、各種癌に対する遺伝子パネル腫瘍オンリー解析における多型の偽陽性の結果の低減に関するオミクスデータのプロファイリングである。
【背景技術】
【０００３】
背景の説明は、本発明の理解に役立ちうる情報を含む。本明細書に提供されるいずれの情報も、本特許請求の発明の先行技術又は関連技術であると認められたわけではなく、又は具体的若しくは黙示的に参照されたいずれの刊行物も、先行技術であると認められたわけではない。
【０００４】
本明細書に記載の刊行物及び特許出願はすべて、各個別の刊行物又は特許出願があたかも参照により具体的且つ個別的に示されて組み込まれたのと同程度に参照により組み込まれる。組み込まれた参照文献中の用語の定義又は使用が本明細書に提供されたその用語の定義と矛盾又は対立する場合、本明細書に提供されたその用語の定義が適用され、参照文献中のその用語の定義は適用されない。
【０００５】
ＤＮＡシーケンシングに基づく市販の臨床グレード遺伝子パネル試験は、臨床診療に広く使用されている。腫瘍オンリー解析に基づくこうしたパネルベース試験は、臨床判断支援のためのオンコロジーにおけるゲノミック試験の現在最も一般的なアプローチである。シーケンシングベースアプローチは、腫瘍成長を駆動する体細胞由来ゲノミック変異を同定するとともに、必然的に腫瘍ゲノムにおいて優位である遺伝生殖系ゲノミック変異の大きなバックグラウンドからこのジェネティック変異体を正確に識別しようとするものである。
【０００６】
２０１６年、メディケア・メディケイド・サービス・センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｉｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）（ＣＭＳ）は、肺癌治療を通知することが意図された３５遺伝子の腫瘍オンリーＤＮＡシーケンシングベース試験のカバレッジを認可した。この現在ＣＭＳにより承認されている試験は、かかる解析を患者の正常部生殖系組織と比較して特異的排除を行う標的遺伝子パネルの腫瘍オンリー解析に基づく。その代わりに現在承認されている試験は、参照ゲノム及びフィルトレーション技術を利用して正常部多型変異体又は遺伝生殖系変異体のどちらからも「真性」体細胞変異体を区別する。試験（ＭｏｌＤＸ：Ｌ３６１９４）は、「体細胞改変と生殖系改変とを識別しない腫瘍組織のみを用いた単一試験（すなわち、腫瘍及び正常部の対応がとられない）」として定義される。しかしながら、この腫瘍オンリーアプローチは、生殖系突然変異を体細胞由来ジェネティック変化及び潜在的癌ドライバー突然変異として誤って同定するリスク（「偽陽性」）を増加させると他者により報告されている。腫瘍オンリーシーケンシングに伴う偽陽性率は、すべての推定体細胞変異体を分子病理学者がレビューすることにより少なくともある程度まで低減されうることが最近示されたが、かかる個別レビューは、一般に時間がかかるうえに依然としてエラープローンである。
【発明の概要】
【０００７】
したがって、とりわけ偽陽性試験結果の可能性がある場合、癌患者のオミクスデータを解析する改善された方法の必要性が残っている。
【０００８】
本発明の主題は、患者の腫瘍ＤＮＡ、生殖系ＤＮＡ、及び腫瘍ＲＮＡのゲノミクス及びトランスクリプトミクスのデータを用いて腫瘍関連単一ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）を解析及び／又は同定する各種方法に関する。これは確度を予想外に向上させるとともに、それにより有効治療の可能性を向上させる。
【０００９】
したがって、本発明の主題の一態様では、本発明者らは、確度の向上したＳＮＶベース癌試験を行う方法を企図する。本方法は、腫瘍サンプル及び対応正常部サンプル（すなわち同一患者の非腫瘍サンプル）のＤＮＡシーケンシングデータを得る工程と、腫瘍サンプルのＲＮＡシーケンシングデータを得るさらなる工程と、を含む。次いで、本方法は、対応正常部サンプルと比べて腫瘍サンプルでＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の存在を決定する工程と、ＲＮＡシーケンシングデータを用いてＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の発現を決定する工程と、をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の存在を決定する工程は、腫瘍サンプル及び対応正常部サンプルのＤＮＡシーケンシングデータの位置ガイド同期アライメントを用いて実施される。好ましくは、本方法は、単一ヌクレオチド変異体の存在及び発現に基づいて患者の癌状態に関連する少なくとも１つのＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体を同定する工程をさらに含む。
【００１０】
最も典型的には、ＤＮＡシーケンシングデータは全ゲノムＤＮＡシーケンシングデータである。好ましくは、腫瘍組織のＤＮＡシーケンシングデータは、少なくとも５０×のリードデプスを有し、且つ／又は対応正常部組織のＤＮＡシーケンシングデータは、少なくとも３０×のリードデプスを有する。いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の対立遺伝子頻度を用いてＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体をフィルタリングする工程をさらに含む。
【００１１】
本発明の主題の別の態様では、本発明者らは、確度の向上した患者の治療選択肢を同定する方法を企図する。本方法は、患者の対応正常部サンプルと比べて腫瘍サンプルでＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の存在を決定する工程と、ＲＮＡシーケンシングデータを用いてＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の発現を決定する工程と、を含む。次いで、本方法は、ＲＮＡとして発現される少なくとも１つのＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体を有する遺伝子を標的とする治療選択肢を同定する工程をさらに含む。
【００１２】
好ましくは、ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の存在を決定する工程は、腫瘍サンプル及び対応正常部サンプルのＤＮＡシーケンシングデータの位置ガイド同期アライメントを用いて実施される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の存在を決定する工程は、腫瘍関連遺伝子の複数の参照配列を有するｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ遺伝子パネルを用いて実施される。かかる実施形態では、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ遺伝子パネルは癌型特異的であり、且つ／又は腫瘍関連遺伝子は、ＡＢＬｌ、ＥＧＦＲ、ＧＮＡＳ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＮ１１、ＡＫＴ１、ＥＲＢＢ２、ＧＮＡＱ、ＭＥＴ、ＲＢ１、ＡＬＫ、ＥＲＢＢ４、ＨＮＦ１Ａ、ＭＬＨ１、ＲＥＴ、ＡＰＣ、ＥＺＨ２、ＨＲＡＳ、ＭＰＬ、ＳＭＡＤ４、ＡＴＭ、ＦＢＸＷ７、ＩＤＨ１、ＮＯＴＣＨ１、ＳＭＡＲＣＢ１、ＢＲＡＦ、ＦＧＦＲ１、ＪＡＫ２、ＮＰＭ１、ＳＭＯ、ＣＤＨ１、ＦＧＦＲ２、ＪＡＫ３、ＮＲＡＳ、ＳＲＣ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＦＧＦＲ３、ＩＤＨ２、ＰＤＧＦＲＡ、ＳＴＫ１１、ＣＳＦ１Ｒ、ＦＬＴ３、ＫＤＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＧＮＡ１１、ＫＩＴ、ＰＴＥＮ、ＶＨＬからなる群から選択されることが好ましい。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の対立遺伝子頻度を用いてＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体をフィルタリングする工程をさらに含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の発現を決定する工程は、ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体のＲＮＡ発現レベルを測定することと、あらかじめ決められた閾値と比較することと、を含む。かかる実施形態では、本方法は、ＲＮＡ発現レベルに基づいてＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体をランク付けする工程、及び／又はあらかじめ決められた閾値との比較に基づいてＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体を「発現」群又は「非発現」群に分類する工程をさらに含みうることが企図される。
【００１５】
本発明の主題のさらに別の態様では、本発明者らは、患者の腫瘍及び対応正常部組織のＤＮＡオミクスデータを発生させる又は得る工程と、患者の腫瘍組織のＲＮＡオミクスデータを発生させる又は得るさらなる工程と、を含む患者サンプルの試験方法を企図する。そのうえさらに別の工程では、対応正常部組織のＤＮＡオミクスデータを用いて腫瘍のＤＮＡオミクスデータで腫瘍及び患者に特異的なＳＮＶが同定され、且つＳＮＶの発現の存在及び量を確認するために腫瘍組織のＲＮＡオミクスデータが使用される。
【００１６】
好ましくは、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡのオミクスデータはＢＡＭフォーマットであり、且つ腫瘍及び患者に特異的なＳＮＶを同定する工程は、インクリメンタル同期アライメントを用いて（たとえば、ＤＮＡオミクスデータ及びＲＮＡオミクスデータを使用しうるＢＡＭＢＡＭを用いて）実施される。必ずというわけではないが最も典型的には、ＲＮＡオミクスデータはＲＮＡｓｅｑデータであり、且つ／又は腫瘍のＤＮＡオミクスデータのＳＮＶは、癌ドライバー遺伝子又は遺伝癌リスク遺伝子に存在する。たとえば、好適な癌ドライバー遺伝子は、ＡＣＴ１、ＡＣＴ２、ＡＣＴ３、ＡＰＣ、ＡＴＭ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＨＥＫ１、ＣＨＥＫ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＨＲＡＳ、ＪＡＫ３、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＡＬＢ２、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＣ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＳＭＯ、ＳＲＣ、及びＴＰ５３を含み、且つ好適な遺伝癌リスク遺伝子は、ＡＰＣ、ＡＴＭ、ＡＸＩＮ２、ＢＭＰＲ１ＡＣＨＤ１、ＣＨＥＫ２、ＥＰＣＡＭ、ＧＲＥＭ１、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＴＹＨ、ＰＭＳ２、ＰＯＬＤ１、ＰＯＬＥ、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、ＳＴＫ１１、及びＴＰ５３を含む。
【００１７】
本発明の主題のさらに別の態様では、本発明者らは、腫瘍を有する患者において真性体細胞単一ヌクレオチドの同定確度を向上させる方法を企図する。本方法は、患者の腫瘍サンプル及び対応正常部サンプルのＤＮＡシーケンシングデータを得る工程と、腫瘍サンプルのＲＮＡシーケンシングデータをさらに得る工程と、対応正常部サンプルと比べて腫瘍サンプルでＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の存在を決定する工程と、対応正常部サンプルと比べて腫瘍サンプルでＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の存在を決定する工程と、単一ヌクレオチド変異体の存在及び発現に基づいて患者の癌状態に関連する少なくとも１つのＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体を同定する工程と、を含む。
【００１８】
最も典型的には、ＤＮＡシーケンシングデータは全ゲノムＤＮＡシーケンシングデータである。いくつかの実施形態では、腫瘍組織のＤＮＡシーケンシングデータは、少なくとも５０×のリードデプスを有し、且つ／又は対応正常部組織のＤＮＡシーケンシングデータは、少なくとも３０×のリードデプスを有する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の存在を決定する工程は、腫瘍サンプル及び対応正常部サンプルのＤＮＡシーケンシングデータの位置ガイド同期アライメントを用いて実施される。他の実施形態では、本方法は、ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の対立遺伝子頻度を用いてＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体をフィルタリングする工程をさらに含みうる。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の存在を決定する工程は、腫瘍関連遺伝子の複数の参照配列を有するｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ遺伝子パネルを用いて実施される。かかる実施形態では、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ遺伝子パネルは癌型特異的であり、且つ／又は腫瘍関連遺伝子は、ＡＢＬ１、ＥＧＦＲ、ＧＮＡＳ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＮ１１、ＡＫＴ１、ＥＲＢＢ２、ＧＮＡＱ、ＭＥＴ、ＲＢ１、ＡＬＫ、ＥＲＢＢ４、ＨＮＦ１Ａ、ＭＬＨ１、ＲＥＴ、ＡＰＣ、ＥＺＨ２、ＨＲＡＳ、ＭＰＬ、ＳＭＡＤ４、ＡＴＭ、ＦＢＸＷ７、ＩＤＨ１、ＮＯＴＣＨ１、ＳＭＡＲＣＢ１、ＢＲＡＦ、ＦＧＦＲ１、ＪＡＫ２、ＮＰＭ１、ＳＭＯ、ＣＤＨ１、ＦＧＦＲ２、ＪＡＫ３、ＮＲＡＳ、ＳＲＣ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＦＧＦＲ３、ＩＤＨ２、ＰＤＧＦＲＡ、ＳＴＫ１１、ＣＳＦ１Ｒ、ＦＬＴ３、ＫＤＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＧＮＡ１１、ＫＩＴ、ＰＴＥＮ、ＶＨＬからなる群から選択されることが好ましい。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の発現を決定する工程は、ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体のＲＮＡ発現レベルを測定することと、あらかじめ決められた閾値と比較することと、を含む。かかる実施形態では、本方法は、ＲＮＡ発現レベルに基づいてＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体をランク付けする工程、及び／又はあらかじめ決められた閾値との比較に基づいてＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体を「発現群」又は「非発現群」に分類する工程をさらに含みうることも企図される。
【００２２】
本発明の主題の各種目的、特徴、態様、及び利点は、添付の図面と併せて好ましい実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、実施例１で試験した４５名の肺癌患者間で生じる可能性のある偽陽性結果の数を描いたグラフである。
【図２】図２は、実施例１で試験したすべての癌患者間で生じる可能性のある偽陽性結果の数を描いたグラフである。
【図３】図３は、実施例１で試験した４５名の肺癌患者の真陽性及び偽陽性のＳＮＶの数を描いたグラフである。
【図４】図４は、実施例１で試験したすべての癌患者の真陽性及び偽陽性のＳＮＶの数を描いたグラフである。
【図５Ａ】図５Ａ〜図５Ｂは、実施例２で胃腸癌患者ごとに同定された体細胞起源及び生殖系起源のＳＮＶの数を描いたグラフである。
【図５Ｂ】図５Ａ〜図５Ｂは、実施例２で胃腸癌患者ごとに同定された体細胞起源及び生殖系起源のＳＮＶの数を描いたグラフである。
【図６Ａ】図６Ａ〜図６Ｂは、実施例２で遺伝子ごとに対立遺伝子頻度を用いてフィルタリングされた真陽性及び偽陽性のＳＮＶの数を描いたグラフである。
【図６Ｂ】図６Ａ〜図６Ｂは、実施例２で遺伝子ごとに対立遺伝子頻度を用いてフィルタリングされた真陽性及び偽陽性のＳＮＶの数を描いたグラフである。
【図７】図７は、実施例２で患者ごとに対立遺伝子頻度を用いてフィルタリングされた真陽性及び偽陽性のＳＮＶの数を描いたグラフである。
【図８】図８は、実施例２でＲＮＡ発現解析により同定された胃腸癌患者の真陽性及び偽陽性のＳＮＶの数を描いたグラフである。
【図９】図９は、実施例３で腫瘍型ごとにゲノミクス及び／又はトランスクリプトミクスのデータで解析された腫瘍サンプルの数を描いたグラフである。
【図１０】図１０は、実施例３で各種癌型患者で同定された体細胞起源及び生殖系起源のＳＮＶを描いたグラフである。
【図１１】図１１は、実施例３で対立遺伝子頻度を用いてフィルタリングされた真陽性及び偽陽性のＳＮＶを描いたグラフである。
【図１２】図１２は、実施例３で発現された又は発現されなかったミスセンス／ナンセンスのＳＮＶの数を描いたグラフである。
【図１３】図１３は、実施例３で発現された又は発現されなかった体細胞ＳＮＶの数を描いたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
従来の腫瘍ＤＮＡ解析により同定された単一ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）は、同定されたかかるＳＮＶの大多数が生殖系起源変異体であることから、偽陽性及び／又は偽陰性のＳＮＶを含むリスクが高いことを、予期せずして本発明者らは発見した。同定された体細胞ＳＮＶの多くはＲＮＡとして発現されないので、腫瘍治療用分子標的としてかかる非発現体細胞ＳＮＶを同定しても無効な癌治療をもたらすことを、本発明者らはさらに発見した。異なる観点から見て、体細胞ＳＮＶを同定するために対応正常部と比べて腫瘍ゲノミックＤＮＡと、発現又は非発現の体細胞ＳＮＶを同定するために腫瘍ＲＮＡ発現と、の同時バイオインフォマティクス解析により、単一ヌクレオチド変異体ベース癌試験の確度を有意に向上させることが可能であることを、このたび本発明者らは発見した。したがって、腫瘍で発現されることが同定されたかかる体細胞ＳＮＶは、癌状態に関連付け可能であるとともに、さらに腫瘍治療に有効な標的として同定可能であることが、本発明者らにより企図される。
【００２５】
本明細書で用いられる場合、「腫瘍」という用語は、人体の１つ以上の解剖学的位置に配置されうる又は見いだされうる１つ以上の癌細胞、癌組織、悪性腫瘍細胞、又は悪性腫瘍組織を意味し、それらと同義的に用いられる。本明細書で用いられる「患者」という用語は、病態（たとえば癌）を有すると診断された者、さらには病態の検出又は同定を目的として検査及び／又は試験を受けている者の両方を含むことに留意すべきである。そのため、腫瘍を有する患者とは、癌を有すると診断された者、さらには癌を有することが疑われる者の両方を意味する。本明細書で用いられる場合、「提供する（ｐｒｏｖｉｄｅ）」又は「提供する（ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ）」という用語は、製造する、生成する、配置する、使用可能にする、移動する、又は即使用可能にするいずれかの行為を意味及び包含する。
【００２６】
したがって、本発明の主題のとりわけ好ましい一態様では、患者の腫瘍サンプル及び／又は対応正常部サンプルのＤＮＡ及びＲＮＡのデータを得て、対応正常部サンプルと比べて腫瘍サンプルでＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体を決定するとともに、ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の発現を決定することにより、単一ヌクレオチド変異体ベース癌試験の確度を有意に向上させることが可能であることが、本発明者らにより企図される。ＲＮＡとして発現されるＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体は、患者の癌状態に高確度で関連付け可能であることが企図される。
【００２７】
オミクスデータの取得
患者の腫瘍サンプル（腫瘍細胞若しくは腫瘍組織）（又は比較として患者若しくは健常者の健常組織）を得るいずれかの好適な方法が企図される。最も典型的には、腫瘍サンプルは、生検を介して患者から得ることが可能であり（液体生検を含めて、又は手術や独立生検手順などの際に組織切除を介して得られる）、組織のオミクスデータを得るためのさらなるプロセスまで新鮮な状態又は処理した状態（たとえば凍結した状態など）でありうる。たとえば、腫瘍細胞又は腫瘍組織は、新鮮な状態又は凍結した状態でありうる。他の例では、腫瘍細胞又は腫瘍組織は、細胞／組織の抽出物の形態でありうる。いくつかの実施形態では、腫瘍サンプルは、単一の組織若しくは解剖学的領域又は複数の異なる組織若しくは解剖学的領域から得られうる。たとえば、転移乳癌組織は、患者の乳房から、さらには転移した乳癌組織に対しては他の器官（たとえば、肝臓、脳、リンパ節、血液、肺など）から得ることが可能である。好ましくは、患者の健常組織若しくは対応正常部組織（たとえば患者の非癌性乳房組織）を得ることが可能であるか、又は比較として類似の方法を介して健常者（患者以外）の健常組織を得ることも可能である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、腫瘍サンプルは、関連期間にわたり腫瘍サンプルのいずれかの変化を決定するために複数の時点で患者から取得可能である。たとえば、腫瘍サンプル（又は腫瘍が疑われるサンプル）は、サンプルが癌性として決定又は診断される前及びその後に得られうる。別の例では、腫瘍サンプル（又は腫瘍が疑われるサンプル）は、１回又は一連の抗腫瘍治療（たとえば、放射線療法、化学療法、免疫療法など）の前、その間、及び／又はその後（たとえば終了時など）に得られうる。さらに別の例では、腫瘍サンプル（又は腫瘍が疑われるサンプル）は、新たな転移した組織又は細胞を同定する際に腫瘍の進行中に得られうる。
【００２９】
得られた腫瘍細胞又は腫瘍組織から、ＤＮＡ（たとえば、ゲノミックＤＮＡ、染色体外ＤＮＡなど）、ＲＮＡ（たとえば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）、及び／又はタンパク質（たとえば、膜タンパク質、細胞質タンパク質、核タンパク質など）を単離し、そしてさらに解析することによりオミクスデータを得ることが可能である。代替的及び／又は追加的に、オミクスデータを得る工程は、１名以上の患者及び／又は健常者のオミクス情報を記憶するデータベースからオミクスデータを受け取ることを含みうる。たとえば、患者の腫瘍のオミクスデータは、患者の腫瘍組織から単離されたＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又はタンパク質から得られうるとともに、得られたオミクスデータは、同一型の腫瘍又は異なる型の腫瘍を有する他の患者の他のオミクスデータセットとともにデータベース（たとえば、クラウドデータベース、サーバーなど）に記憶しうる。健常者又は患者の対応正常部組織（又は健常組織）から得られたオミクスデータはまた、解析時に関連データセットをデータベースから検索できるようにデータベースに記憶可能である。同様に、タンパク質データを得る場合、これらのデータはまた、とりわけタンパク質が酵素活性を有する場合（たとえば、ポリメラーゼ、キナーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、リガーゼ、オキシドレダクターゼなど）、タンパク質活性を含みうる。
【００３０】
本明細書で用いられる場合、オミクスデータは、限定されるものではないが、ゲノミクス、プロテオミクス、及びトランスクリプトミクスに関連する情報、さらには特異的な遺伝子発現又は転写物の解析、並びに細胞の他の特性及び生物学的機能を含む。ゲノミクスデータに関して、好適なゲノミクスデータは、腫瘍サンプル及び対応正常部サンプルの両方の全ゲノムシーケンシング及び／又はエキソームシーケンシング（典型的には少なくとも１０×、より典型的には少なくとも２０×のカバレッジデプス）により取得可能なＤＮＡ配列解析情報を含む。代替的に、ＤＮＡデータは、先行する配列決定からすでに確立された配列レコード（たとえば、ＳＡＭ、ＢＡＭ、ＦＡＳＴＡ、ＦＡＳＴＱ、又はＶＣＦファイル）からも提供しうる。したがって、データセットは、未処理又は処理済みのデータセットを含みうるとともに、模範的データセットは、ＢＡＭフォーマット、ＳＡＭフォーマット、ＦＡＳＴＱフォーマット、又はＦＡＳＴＡフォーマットを有するものを含む。しかしながら、データセットは、ＢＡＭフォーマットで又はＢＡＭＢＡＭ差分オブジェクトとして提供されることがとりわけ好ましい（たとえば、米国特許出願公開第２０１２／００５９６７０Ａ１号明細書及び米国特許出願公開第２０１２／００６６００１Ａ１号明細書）。オミクスデータは、全ゲノムシーケンシング、エキソームシーケンシング、トランスクリプトームシーケンシング（たとえばＲＮＡ−ｓｅｑ）、又は遺伝子特異的解析（たとえば、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、ＬＣＲなど）に由来しうる。同様に、配列データのコンピューター解析は、多くの方式で実施しうる。しかしながら、最も好ましい方法では、解析は、たとえば、米国特許出願公開第２０１２／００５９６７０Ａ１号明細書及び米国特許出願公開第２０１２／００６６００１Ａ１号明細書に開示されるように、ＢＡＭファイル及びＢＡＭサーバーを用いて腫瘍サンプル及び正常サンプルの位置ガイド同期アライメントによりｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで実施される。かかる解析は、偽陽性ネオエピトープを有利に低減し、且つメモリー及びコンピューター資源に対する要件を有意に低減する。
【００３１】
コンピューター向けの言語はいずれも、サーバー、インターフェース、システム、データベース、エージェント、ピア、エンジン、コントローラー、又は個別に若しくは集団で動作する他のタイプのコンピューティングデバイスをはじめとするコンピューティングデバイスのいずれの好適な組合せも含むものと解釈すべきことに留意すべきである。コンピューティングデバイスは、タンジブル非一時コンピューター可読記憶媒体（たとえば、ハードドライブ、ソリッドステートドライブ、ＲＡＭ、フラッシュ、ＲＯＭなど）に記憶されたソフトウェア命令を実行するように構成されたプロセッサーを含むものと認識すべきである。ソフトウェア命令は、好ましくは、開示された装置に関して以下で考察される役割、責務、又は他の機能を提供するようにコンピューティングデバイスを構成する。さらに、開示された技術は、コンピューターベースのアルゴリズム、プロセス、方法、又は他の命令の実現に関連して開示された工程をプロセッサーに実行させるソフトウェア命令を記憶する非一時コンピューター可読媒体を含むコンピュータープログラム製品として具現化することが可能である。とりわけ好ましい実施形態では、各種サーバー、システム、データベース、又はインターフェースは、可能な限りＨＴＴＰ、ＨＴＴＰＳ、ＡＥＳ、公開鍵−秘密鍵交換、ウェブサービスＡＰＩ、既知の金融取引プロトコル、又は他の電子情報交換方法に基づいて、標準化されたプロトコル又はアルゴリズムを用いてデータを交換する。デバイス間のデータ交換は、パケット交換ネットワーク、インターネット、ＬＡＮ、ＷＡＮ、ＶＰＮ、又は他のタイプのパケット交換ネットワーク、回線交換ネットワーク、セル交換ネットワーク、又は他のタイプのネットワークで行うことが可能である。
【００３２】
対応正常部サンプルと対比される腫瘍サンプルのＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体
患者の腫瘍組織及び対応正常部組織（たとえば、非腫瘍血液サンプルの液体生検を含めて患者の非腫瘍組織）から得られたゲノミックＤＮＡ配列を比較することにより生殖系ＳＮＶから体細胞ＳＮＶを識別し同定することが可能であることが企図される。患者の腫瘍及び対応正常部組織の解析に関して、多くの方式は、かかる方法が腫瘍配列と対応正常部配列との間の差分配列オブジェクト又は位置特異的な差の他の同定を生成可能である限り、本明細書に記載の使用に好適であるとみなされる。模範的方法は、外部参照配列（たとえばｈｇ１８若しくはｈｇ１９）との配列比較又は内部参照配列（たとえば対応正常部配列）との配列比較、及び既知の共通突然変異パターン（たとえばＳＮＶ）と対比した配列処理を含む。したがって、腫瘍と対応正常部との間、腫瘍と液体生検との間、及び対応正常部と液体生検との間の突然変異を検出することが企図される方法及びプログラムとしては、ｉＣａｌｌＳＶ（ＵＲＬ：ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｒｈｓｈａｈ／ｉＣａｌｌＳＶ）、ＶａｒＳｃａｎ（ＵＲＬ：ｖａｒｓｃａｎ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）、ＭｕＴｅｃｔ（ＵＲＬ：ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ｍｕｔｅｃｔ）、Ｓｔｒｅｌｋａ（ＵＲＬ：ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ／ｓｔｒｅｌｋａ）、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｓｎｉｐｅｒ（ＵＲＬ：ｇｍｔ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｓｏｍａｔｉｃ−ｓｎｉｐｅｒ／）、及びＢＡＭＢＡＭ（米国特許出願公開第２０１２／００５９６７０号明細書）が挙げられる。
【００３３】
しかしながら、本発明の主題のとりわけ好ましい態様では、配列解析は、患者の腫瘍特異的突然変異データが生成されるように、たとえば、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１３  Ｏｃｔ  １；７３（１９）：６０３６−４５、米国特許出願公開第２０１２／００５９６７０号明細書、及び米国特許出願公開第２０１２／００６６００１号明細書などに記載のアルゴリズムを用いて、第１の配列データ（腫瘍サンプル）と第２の配列データ（対応正常部）とのインクリメンタル同期アライメントにより実施される。容易に分かるであろうが、配列解析はまた、患者内の腫瘍に真に由来する突然変異だけでなく治療時に新たに生じた突然変異もユーザーに通知可能な解析が達成されるように、腫瘍サンプルのオミクスデータと対応正常部のオミクスデータとを比較するかかる方法により実施しうる（たとえば、対応正常部及び対応正常部／腫瘍の比較を介して又は腫瘍の比較を介して）。その他、かかるアルゴリズム（とりわけＢＡＭＢＡＭ）を用いて特異的突然変異の対立遺伝子頻度及び／又はクローン集団を容易に決定可能であるので、特異的腫瘍細胞画分又は集団に対する治療成功の指標を有利に提供しうる。そのため、オミクスデータ解析は、ミスセンス及びナンセンス突然変異、コピー数の変化、ヘテロ接合性の損失、マイクロサテライトの欠失、挿入、逆位、転座、変化などを明らかにしうる。
【００３４】
さらに、データセットは、好ましくは、患者の腫瘍特異的情報が得られるように同一患者の腫瘍サンプル及び対応正常部サンプルを反映したものであることに留意すべきである。したがって、腫瘍を引き起こさないジェネティック生殖系改変（たとえば、サイレント突然変異、ＳＮＰなど）は除外しうる。当然ながら、腫瘍サンプルは、初期腫瘍、治療開始時の腫瘍、再発腫瘍、又は転移部位などに由来しうることを認識すべきである。ほとんどの場合、患者の対応正常部サンプルは、血液でありうるか又は腫瘍と同一の組織型の非疾患組織でありうる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、腫瘍及び対応正常部の全ゲノム又はエキソームのシーケンシングデータを外部参照配列と比較する場合、外部参照配列はｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ遺伝子パネルとして組織化されることが企図される。好ましくは、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ遺伝子パネルは、腫瘍ドライバー遺伝子若しくは癌ドライバー遺伝子（たとえば、ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＡＰＣなど）及び／又は薬剤感受性関連遺伝子若しくは代謝関連遺伝子をはじめとする複数の腫瘍関連遺伝子を含む。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ遺伝子パネルの遺伝子数及び遺伝子型は、患者が診断された又は診断される可能性のある癌型に依存して変化しうるとともに（たとえば、癌型特異的ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ遺伝子パネル）、好ましくは少なくとも２０遺伝子、少なくとも３０遺伝子、少なくとも４０遺伝子、又は少なくとも５０遺伝子を含むことが企図される。たとえば、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ遺伝子パネルは、ＡＢＬ１、ＥＧＦＲ、ＧＮＡＳ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＮ１１、ＡＫＴ１、ＥＲＢＢ２、ＧＮＡＱ、ＭＥＴ、ＲＢ１、ＡＬＫ、ＥＲＢＢ４、ＨＮＦ１Ａ、ＭＬＨ１、ＲＥＴ、ＡＰＣ、ＥＺＨ２、ＨＲＡＳ、ＭＰＬ、ＳＭＡＤ４、ＡＴＭ、ＦＢＸＷ７、ＩＤＨ１、ＮＯＴＣＨ１、ＳＭＡＲＣＢ１、ＢＲＡＦ、ＦＧＦＲ１、ＪＡＫ２、ＮＰＭ１、ＳＭＯ、ＣＤＨ１、ＦＧＦＲ２、ＪＡＫ３、ＮＲＡＳ、ＳＲＣ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＦＧＦＲ３、ＩＤＨ２、ＰＤＧＦＲＡ、ＳＴＫ１１、ＣＳＦ１Ｒ、ＦＬＴ３、ＫＤＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＧＮＡ１１、ＫＩＴ、ＰＴＥＮ、ＶＨＬの全ゲノム配列及び／又は全エキソーム配列を含みうる。
【００３６】
その他、かかる同定されたＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体はまた、ＤＮＡ対立遺伝子頻度を用いて（たとえば、報告された集団対立遺伝子頻度を有するパブリックデータベースを用いて）さらにフィルタリングされることも企図される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体は、あらかじめ決められた頻度閾値、たとえば、報告された対立遺伝子頻度≧０．０１（１％）、好ましくは≧０．００５（０．５％）、又はより好ましくは≧０．００１（０．１％）を用いてフィルタリングすることが可能である。
【００３７】
その他、ゲノミクスデータがＢＡＭファイルフォーマットである場合、変異体コーリングにより配列変化（ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体）の有意性を評価することが可能である。ＢａｍＢａｍはファイルペアの配列データをゲノム全体にわたり同期して維持するので、２つの生物学的サンプルに由来する両方のＢＡＭファイル、さらには参照のシーケンシングデータを必要とする複合突然変異モデルを容易に実現することが可能である。このモデルは、２つの生物学的サンプルの両方の配列ストリングの結合確率を最大化することを目指す。２つの生物学的サンプルの２つの配列ストリングの最適遺伝子型を見いだすために、本発明者らは、
【数１】
2021514604.tif 000003
（式中、ｒは、観測された参照対立遺伝子であり、αは、正常混入物分率であり、且つ配列ストリング１及び２の遺伝子型は、それぞれ、Ｇｔ＝（ｔ１，ｔ２）及びＧｇ＝（ｇ１，ｇ２）により定義され、ｔ１，ｔ２，ｇ１，ｇ２ε｛Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ｝である）により定義される尤度を最大化することを目指す。配列ストリング１及び２の配列データは、それぞれ、リードセットＤｔ＝｛ｄｔ１，ｄｔ２，．．．，ｄｔｍ｝及びＤｇ＝｛ｄｇ１，ｄｇ２，．．．，ｄｇｍ｝として定義される。ただし、観測された塩基ｄｔｉ，ｄｇｉε｛Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ｝である。モデルに使用されるデータはすべて、ユーザー定義の塩基及びマッピングの品質閾値を超えなければならない。
【００３８】
生殖系遺伝子型が与えられたとき生殖系対立遺伝子の確率は、以下のように４つのヌクレオチドにわたる多項式：
【数２】
2021514604.tif 000004
（式中、ｎは、この位置の生殖系リードの全数であり、且つｎＡ、ｎＧ、ｎＣ、ｎＴは、各々観測された対立遺伝子をサポートするリードである）としてモデリングされる。塩基確率Ｐ（ｄｇｉ｜Ｇｇ）は、独立とみなされ、遺伝子型Ｇｇにより表される２つの親対立遺伝子のどちらかに由来し、同時にシーケンサーの近似塩基エラー率も組み込まれる。配列ストリング１の遺伝子型の事前確率は、
Ｐ（Ｇｇ｜ｒ＝ａ）＝｛μａａ，μａｂ，μｂｂ｝
（式中、μａａは、その位置がホモ接合参照である確率であり、μａｂはヘテロ接合参照であり、且つμｂｂは、ホモ接合非参照である）として参照塩基に基づいて条件付けられる。この時点では、配列ストリング１の事前確率は、既知の遺伝ＳＮＰに関する情報のいずれも組み込まない。
【００３９】
配列２のリードセットの確率は、この場合も多項式として以下
【数３】
2021514604.tif 000005
（式中、ｍは、この位置の生殖系リードの全数であり、且つｍＡ、ｍＧ、ｍＣ、ｍＴは、配列２のデータセットで各々観測された対立遺伝子をサポートするリードであり、且つ各配列２のリードの確率は、
Ｐ（ｄｔｉ｜Ｇｔ，Ｇｇα）＝αＰ（ｄｔｉ｜Ｇｔ）＋（１−α）Ｐ（ｄｔｉ｜Ｇｇ）
として、正常混入物分率αにより制御される配列２及び配列１の両方の遺伝子型に由来する塩基確率の混合である）のように定義され、配列２の遺伝子型の確率は、配列１の遺伝子型からの単純突然変異モデル
Ｐ（Ｇｔ｜Ｇｇ）＝ｍａｘ［Ｐ（ｔ１｜ｇ１）Ｐ（ｔ２｜ｇ２），Ｐ（ｔ１｜ｇ２）Ｐ（ｔ２｜ｇ１）］
（式中、突然変異なし（たとえばｔ１＝ｇ１）の確率は最大であり、トランジション（すなわちＡ→Ｇ、Ｔ→Ｃ）の確率は、トランスバージョン（すなわちＡ→Ｔ、Ｔ→Ｇ）の確率の４倍である）により定義される。多項分布に対するモデルパラメーターα、μａａ、μａｂ、μｂｂ、及び塩基確率Ｐ（ｄｉ｜Ｇ）はすべて、ユーザー定義可能である。
【００４０】
選択された配列２及び１の遺伝子型Ｇｔ  ｍａｘ、Ｇｇ  ｍａｘｉは、（１）を最大化するものであり、且つ
【数４】
2021514604.tif 000006
により定義される事後確率は、推測された遺伝子型ペアの信頼度をスコア付けするために使用可能である。配列２及び配列１の遺伝子型が異なる場合、配列２の突然変異がそのそれぞれの信頼度とともに報告されるであろう。
【００４１】
配列１及び２の遺伝子型の一方又は両方の尤度の最大化は、とりわけ一方又は両方の配列データセットが特定のゲノミック位置の低いカバレッジを有する状況では、両方の推測された遺伝子型の確度を向上させるのに役立つ。単一シーケンシングデータセットを解析するＭＡＱやＳＮＶＭｉｘなどの他の突然変異コーリングアルゴリズムは、非参照又は突然変異の対立遺伝子のサポートが弱い場合、誤りを犯す可能性がより高い（Ｌｉ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍａｐｐｉｎｇ  ｓｈｏｒｔ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄｓ  ａｎｄ  ｃａｌｌｉｎｇ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｓｃｏｒｅｓ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１，１８５１−１８５８；Ｇｏｙａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＳＮＶＭｉｘ：ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｓ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２６，７３０−７３６）。
【００４２】
所与のゲノミック位置ですべてのリードから対立遺伝子サポートを収集する他、リードに関する情報（たとえば、リードがマッピングされるフォワード鎖又はリバース鎖、リード内の対立遺伝子の位置、対立遺伝子の平均品質など）を収集し、そして偽陽性コールを選択的にフィルタリング除去するために使用する。本発明者は、変異体をサポートするすべての対立遺伝子に対して鎖及び対立遺伝子位置のランダム分布を予想し、分布がこのランダム分布から有意に偏っている場合（すなわち、すべての変異対立遺伝子がリードのテール末端の近くに見いだされる場合）、これは変異体コールが疑わしいことを示唆する。
【００４３】
また、限定されるものではないがＭｕＴｅｃｔ（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３  Ｍａｒ；３１（３）：２１３−９）、ＭｕＴｅｃｔ２、ＨａｐｌｏＴｙｐｅＣａｌｌｅｒ、Ｓｔｒｅｌｋａ２（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２８，Ｉｓｓｕｅ  １４，１５  Ｊｕｌｙ  ２０１２，Ｐａｇｅｓ  １８１１−１８１７）をはじめとする他の解析ツールにより、又は他のゲノミックアーチファクト検出ツールにより、配列変化に対する変異体コーリングを実施することが可能であることも企図される。
【００４４】
ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の発現
その他、腫瘍及び／又は対応正常部のオミクスデータは、患者から得られたＲＮＡ（好ましくは細胞ｍＲＮＡ）の配列情報及び発現レベル（発現プロファイリング又はスプライス変異体解析を含む）を含むトランスクリプトームデータセットを含む。当技術分野で公知の多数のトランスクリプトーム解析方法が存在し、公知の方法はすべて、本明細書に記載の使用に好適とみなされる（たとえば、ＲＮＡｓｅｑ、ＲＮＡハイブリダイゼーションアレイ、ｑＰＣＲなど）。それゆえ、好ましい物質は、ｍＲＮＡ及び一次転写物（ｈｎＲＮＡ）を含み、且つＲＮＡ配列情報は、逆転写ｐｏｌｙＡ＋−ＲＮＡから得られうる。一方、これは、同一患者の腫瘍サンプル及び対応正常部（健常）サンプルから得られる。同様に、典型的にはトランスクリプトームの表現としてｐｏｌｙＡ＋−ＲＮＡが好ましいが、他の形態のＲＮＡ（ｈｎ−ＲＮＡ、非ポリアデニル化ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）も本明細書に記載の使用に好適とみなされることに留意すべきである。好ましい方法は、定量ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ）解析及び／又は定量プロテオミクス解析を含み、とりわけＲＮＡｓｅｑを含む。他の態様では、ＲＮＡ定量及びシーケンシングは、ＲＮＡ−ｓｅｑ、ｑＰＣＲ、及び／又はｒｔＰＣＲベース法を用いて実施されるが、各種代替法（たとえば、固相ハイブリダイゼーションベース法）も好適とみなされる。別の観点から見て、トランスクリプトーム解析は、癌特異的及び患者特異的な突然変異を有する遺伝子の同定及び定量に好適でありうる（単独で又はゲノミック解析との組合せで）。
【００４５】
好ましくは、トランスクリプトミクスデータセットは、対立遺伝子特異的な配列情報及びコピー数情報を含む。かかる実施形態では、トランスクリプトミクスデータセットは、遺伝子の少なくとも一部分のすべてのリード情報を、好ましくは少なくとも１０×、少なくとも２０×、又は少なくとも３０×で含む。対立遺伝子特異的なコピー数、より特定的には多数コピー数及び少数コピー数は、米国特許第９８２４１８１号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されるように、生殖系データのカバレッジに従ってウィンドウのゲノミック幅を拡大及び縮小させる動的ウィンドウ生成アプローチを用いて計算される。本明細書で用いられる場合、多数対立遺伝子とは、多数コピー数（全コピー数（リードサポート）の＞５０％又は最大コピー数）を有する対立遺伝子のことであり、且つ少数対立遺伝子とは、少数コピー数（全コピー数（リードサポート）の＜５０％又は最小コピー数）を有する対立遺伝子のことである。
【００４６】
いくつかの実施形態では、１つ以上の単一ヌクレオチド変異体を有する遺伝子（又は遺伝子の一部分）の発現は、ＲＮＡシーケンシングデータ（たとえばＲＮＡｓｅｑ）により決定可能であることが、本発明者らにより企図される。かかる実施形態では、１つ以上の単一ヌクレオチド変異体の発現は、発現されたＲＮＡにおける１つ以上の単一ヌクレオチド変異体の存在若しくは不在（又は存在若しくは非存在）として評価することが可能である。したがって、ＲＮＡシーケンシングデータに基づいて、単一ヌクレオチド変異体を「発現群」又は「非発現群」に分けることが可能である。他の実施形態では、１つ以上の単一ヌクレオチド変異体を有する遺伝子（又は遺伝子の一部分）の発現は、（たとえば、ｑＰＣＲ及び／又はｒｔＰＣＲを用いて）ＲＮＡｓｅｑデータとＲＮＡ定量データとを組み合わせることにより決定可能である。かかる実施形態では、１つ以上の単一ヌクレオチド変異体の発現レベルは、あらかじめ決められた閾値と比較することにより、存在（ｐｒｅｓｅｎｃｅ）若しくは不在（又は存在（ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）若しくは非存在）として評価することが可能である。あらかじめ決められた閾値は、遺伝子に依存して変化しうることが企図される。たとえば、あらかじめ決められた閾値は、健常者の同一若しくは類似の型の組織（たとえば、肝臓、肺など）における遺伝子の平均ＲＮＡ発現レベル又は患者の対応正常部組織における遺伝子のＲＮＡ発現レベルの１０％、５％、又は１％でありうる。代替的に、あらかじめ決められた閾値は、所与の反応におけるｑＰＣＲ及び／又はｒｔＰＣＲのノイズレベルに依存して変化しうる。たとえば、あらかじめ決められた閾値は、ｑＰＣＲ及び／又はｒｔＰＣＲの反応のノイズレベルの２０％以内、１０％以内、５％以内でありうる。したがって、ＲＮＡ発現レベルに基づいて、単一ヌクレオチド変異体は、発現レベルがあらかじめ決められた閾値以上である「発現群」、又は発現レベルがあらかじめ決められた閾値未満である「非発現群」に分けることが可能である。
【００４７】
いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ゲノミクスデータとトランスクリプトミクスデータとを組み合わせて発現されたＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体を同定することにより、偽陽性率（誤って生殖系突然変異を体細胞由来癌ドライバー突然変異として同定したり、且つ／又は有効突然変異として発現されない体細胞由来癌ドライバー突然変異を同定したりするなど）、及び／又は偽陰性率（たとえば、真性腫瘍体細胞ＳＮＶが除外されるなど）が有意に低減されることが、本発明者らにより企図される。腫瘍関連遺伝子のＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の同定で偽陽性率及び／又は偽陰性率を低減させることにより、腫瘍及び／又は癌に関連する遺伝子を同定する効率及び確度がさらに有意に向上するとともに、腫瘍又は癌に関連して解析され標的とされた発現されるＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の数を解析又は適用の比較的初期に有意に低減させることが可能であるので、望ましくない副作用や毒性の低減されたいずれかの有効治療レジメンを同定する効率及び確度もさらに有意に向上する。
【００４８】
したがって、単一ヌクレオチド変異体の存在／不在及び発現に基づいて、かかる単一ヌクレオチド変異体は、患者の癌状態にさらに関連しうる癌関連変異体（又は突然変異）として同定可能であることが、本発明者らによりさらに企図される。本明細書で用いられる場合、「癌状態」という用語は、癌又は腫瘍の分子的、生理学的、病理学的な病態のいずれかを意味する。したがって、癌状態は、癌の解剖学的型（たとえば、胃腸癌、肺癌、脳腫瘍など）、腫瘍の転移状態（たとえば、転移、高転移傾向、非転移など）、腫瘍クローン性、腫瘍組織の免疫状態（たとえば、免疫抑制、免疫活性化、免疫休眠など）、腫瘍の予後（たとえば、腫瘍の形態形成を含めて、腫瘍のステージ、腫瘍のグレードなど）を含みうる。その他、癌状態は、腫瘍治療に対する腫瘍の感受性又は耐性（たとえば、チェックポイント阻害剤投与に対する耐性、サイトカイン治療に対する感受性など）、化学療法薬剤による毒性（たとえば、ＣＹＰ２Ｄ６酵素媒介経路の要素の突然変異体／単一ヌクレオチド変異体に起因するものなど）を含みうる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、発現されたＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体と腫瘍又は癌の状態との関連は、有意性スコアを提供することにより定量しうる。たとえば、有意性スコアは、ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の数に関するサブスコア（１スコア／１核酸変化）、ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の型（たとえば、ナンセンス突然変異、ミスセンス突然変異など）、ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の位置（たとえば、機能的結合ドメインをコードする遺伝子のエクソン３など）、及び生理学的影響（シグナリング経路Ｂのドミナントネガティブ因子）を組み合わせることにより決定可能である。また、有意性スコアは、ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体を含む遺伝子の発現により決定可能である（たとえば、各非発現ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体に対して−１、各発現ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体に対して＋１、又はＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体を含む遺伝子の発現レベルに基づく各種インクリメンタルスコア、たとえば、ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体を含む遺伝子の各１０％増加発現当たり１スコアなど）。したがって、かかる実施形態では、ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体の有意性は、発現（ＲＮＡの存在若しくは不在）又は発現レベル（正常組織若しくは健常者と比較したＲＮＡ発現レベルの増加又は減少）に基づいてランク付け可能である。代替的及び／又は追加的に、ＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体を含む遺伝子の有意スコアは、遺伝子又はＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体をさらにランク付けするために使用可能である。
【００５０】
かかる同定された及び／又はランク付けされたＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体、並びに／或いはＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体を含む遺伝子は、患者の癌又は腫瘍を治療する治療選択肢を同定するためにさらに使用可能であることが、本発明者らによりさらに企図される。たとえば、１つ以上のＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体を有する腫瘍関連遺伝子において、ＲＮＡでＤＮＡ単一ヌクレオチド変異体（腫瘍対応正常部シーケンシングにより同定される）を確認した後、且つ（たとえば、対応正常部と比較して少なくとも２５％、対応正常部と比較して少なくとも５０％、対応正常部と比較して少なくとも７５％、対応正常部と比較して少なくとも１００％、対応正常部と比較して少なくとも１２５％、又は対応正常部と比較して少なくとも１５０％）発現されるＲＮＡを確認した後、腫瘍関連遺伝子を標的とする薬剤は、腫瘍を治療するのに有効な用量及びスケジュールで患者に投与される。本明細書で用いられる場合、腫瘍関連遺伝子を標的とする薬剤は、遺伝子の発現を（転写レベル又は翻訳レベルで）モジュレートする薬剤、遺伝子産物（タンパク質）の翻訳後修飾をモジュレートする薬剤、遺伝子産物（タンパク質）の活性をモジュレートする薬剤、又は遺伝子産物（タンパク質）の分解をモジュレートする薬剤を含みうる。
【００５１】
本明細書で用いられる場合、薬剤又は癌治療剤を「投与する」という用語は、薬剤又は癌治療剤の直接投与及び間接投与の両方を意味する。薬剤又は癌治療剤の直接投与は、典型的には、ヘルスケア専門家（たとえば、医師、看護師など）により実施され、且つ間接投与は、直接投与（たとえば、注射、経口摂取、局所適用などを介して）のために薬剤又は癌治療剤をヘルスケア専門家に提供する工程又はヘルスケア専門家が利用できるようにする工程を含む。
【実施例】
【００５２】
実施例１
肺癌用として現在承認されている試験は、患者の正常部生殖系組織の特異的排除を行う標的遺伝子パネルの腫瘍オンリー解析に基づく。しかしながら、以下でより詳細に示されるように、腫瘍オンリーアプローチは、生殖系突然変異を体細胞由来癌ドライバー突然変異として誤って同定するリスク（すなわち偽陽性）を実質的に増加させるとともに、さらに、潜在的ドラッガブル標的が腫瘍に有意量で存在する場合でさえも医師に通知することができない。
【００５３】
より具体的には、肺癌患者用として現在承認されている遺伝子パネル腫瘍オンリー解析で見いだされるすべての変異体の９４％は、実際には偽陽性多型であり、且つストリンジェントなフィルトレーション後でも４８％が偽陽性として残ることを、本発明者らは発見した。このパネルの直接的ドラッガブルサブセットで同定される真性体細胞突然変異のうち、約１８％は発現されなかったので、不正確な治療判断及び治療無益性のリスクを増悪させる。かかる診断不良の状況から見て、真性腫瘍体細胞変異体の同定を改善する必要性が存在することが明らかになった。以下でより詳細に記載されるように、かかる解析の改善は、腫瘍ＤＮＡ、生殖系ＤＮＡ、及び腫瘍ＲＮＡの協調解析により達成された。
【００５４】
腫瘍オンリー遺伝子パネル解析の偽陽性が懸念されることから、本発明者らは、腫瘍及び生殖系の両方を同時にシーケンス及び解析して突然変異を疾患の潜在的ドライバーとして同定可能な信頼度を改善することにより与えられる精度向上を実証しようとした。以下でさらに詳細に考察されるように、本発明者らは、ｉ）治療判断支援を目的とした腫瘍の分子的特徴付けが、対照として患者の正常組織を使用するバイオインフォマティック解析、すなわち腫瘍−正常部ＤＮＡシーケンシングによりかなり正確になること、及びそのようにして同定された真性体細胞変異体の精度がＲＮＡシーケンシングと組み合わせたときにさらに増大されること、ｉｉ）腫瘍オンリー配列解析からの多型のバイオインフォマティックフィルトレーションが、腫瘍−正常部ゲノミック解析の精度に一致しないこと、ｉｉｉ）いずれの真性体細胞突然変異もｍＲＮＡで発現されることを確認することにより、検出された体細胞腫瘍突然変異が発癌性ドライバーとしての役割を果たしうることを示す証拠のクリティカルな第２選択を提供すること、を実証する研究に取り組んだ。
【００５５】
この実施例では、４５名の肺癌患者及び３３癌型の６２１名の全癌患者からＣＭＳによりカバレッジが認可された３５遺伝子パネルの腫瘍ゲノム及び正常部生殖系ゲノムのＤＮＡシーケンシングを用いて、腫瘍オンリーシーケンシングアプローチの使用に由来する偽陽性腫瘍体細胞変異体の割合を定量した。ＲＮＡシーケンシングによるこれらの３５遺伝子の改変の発現解析に基づく精度向上の可能性も評価した。
【００５６】
患者及びシーケンシングデータ：この実施例では、本発明者らは、ＣＭＳによりメディケア（Ｍｅｄｉｃａｒｅ）カバレッジがすでに認可されている３５遺伝子の突然変異解析に焦点を当てて、臨床医が肺癌患者の療法をより良好に規定できるようにした。ＣＭＳは、ゲノミック変異体が腫瘍オンリーＤＮＡシーケンシング及び解析（すなわち、腫瘍及び正常部の対応がとられない）を介して同定されたときのみ、この遺伝子パネルの使用を承認した。このアプローチは、体細胞改変と生殖系改変とを直接識別しない。パネルは、体細胞腫瘍ドライバーに関係する２５遺伝子（腫瘍ドライバー遺伝子パネル）と、遺伝癌リスクに影響を及ぼすことが知られる１０遺伝子（遺伝リスク遺伝子パネル）と、を含んでいた。腫瘍ドライバー遺伝子パネルは、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＢＰＡ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＺＨ２、ＦＬＴ３、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＫＩＴ、ＫＭＴ２Ａ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＧＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＥＴからなる。遺伝癌リスクパネルは、ＡＰＣ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＥＰＣＡＭ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２、ＰＯＬＤ１、ＰＯＬＥ、ＳＴＫ１１からなっていた。
【００５７】
癌の成長及び拡大に寄与する可能性のある体細胞由来単一ヌクレオチド変異体を同定するために、６２１名の癌患者の腫瘍ＤＮＡ、腫瘍ＲＮＡ、及び正常部ＤＮＡの全ゲノムシーケンシングデータを解析した。この実施例は４５名の肺癌患者を含んでいた。患者はすべて、記載のデータをこの研究に使用するためのインフォームドコンセントを提供した。ＤＮＡ及びＲＮＡは、保存組織から抽出し、ナントオミクス臨床検査施設改善修正法（ＮａｎｔＯｍｉｃｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  Ａｍｅｎｄｍｅｎｔｓ）（ＣＬＩＡ）、及びＣｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ａｕｔｈｏｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎ（ＣＡＰ）で認証されたシーケンシング実験室のＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを用いてシーケンスした。使用した試験の性能特性は、ＲＮＡとして転写及び発現されたＳＮＶを検出するために＞９５％の感度及び＞９９％の特異度を含む。正常部生殖系ゲノム及び腫瘍ゲノムは、それぞれ、約３０×及び６０×のリードデプスでシーケンスされた。各腫瘍に対して約３億のＲＮＡシーケンシングリードを発生させた。
【００５８】
データ解析：ＢＷＡによりＤＮＡシーケンシングデータをＧＲＣｈ３７（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ａｓｓｅｍｂｌｙ／２７５８／）にアライメントし、ｓａｍｂｌａｓｔｅｒにより重複マークし、且つＧＡＴＫ  ｖ２．３によりインデル再アライメント及び塩基品質再校正を実施した。ｂｏｗｔｉｅによりＲＮＡシーケンシングデータをアライメントし、且つＲＳＥＭによりＲＮＡ転写物発現を推定した。体細胞及び生殖系のＳＮＶ、挿入、及び欠失を決定するために、及び腫瘍ゲノムの高増幅領域を同定するために、ＮａｎｔＯｍｉｃｓ  Ｃｏｎｔｒａｓｔｅｒ解析パイプラインを用いて腫瘍対対応正常部の変異体解析を実施した。
【００５９】
小さな変異体には、ｄｂＳＮＰ（ビルド１４２）からの塩基レベルＰｈａｓｔＣｏｎｓ保存スコア、集団対立遺伝子頻度、及びＲｅｆＳｅｑデータベースからダウンロードした遺伝子転写物へのそれらの予測される影響（たとえば、ＤＮＡ配列及びタンパク質の変化）をアノテートした。
【００６０】
腫瘍体細胞単一ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）の同定：４５名の肺癌患者の腫瘍及び正常部（生殖系）のゲノムの全ゲノムＤＮＡシーケンシングにより、肺癌病因に関連する３５遺伝子のパネルで８０２ミスセンス又はナンセンスタンパク質改変ＳＮＶが同定された。パネルは、体細胞腫瘍ドライバーと考えられる２５遺伝子（腫瘍ドライバー遺伝子パネル）と、遺伝癌リスクに影響を及ぼすことが知られる１０遺伝子（遺伝リスク遺伝子パネル；表１）と、を含んでいた。４５名の肺癌患者間で、合計８０２  ＳＮＶは１４７ユニークＳＮＶ部位で生じた。８０２変異体はすべて、腫瘍ゲノムに存在していた。腫瘍及び正常部生殖系のＤＮＡ配列のバイオインフォマティック解析により、７４６中７０１  ＳＮＶ（９４％）は生殖系に起源をもち、残りの４５  ＳＮＶ（６％）は体細胞組織に起源をもつことが示された。３３癌型を有する６２１名の癌患者の解析に同一の遺伝子パネルを適用して、腫瘍−正常部シーケンシング解析により、１０，７０４ミスセンス又はナンセンスタンパク質改変ＳＮＶを同定した。同定された１０，７０４  ＳＮＶに寄与した９１９ユニークＳＮＶ部位が存在した。各患者の腫瘍及び正常部生殖系のゲノム解析により、ＳＮＶの１０，１４９（９５％）は生殖系起源であり、残りの５５５（５％）ＳＮＶは体細胞起源であると決定された。
【００６１】
【表１】
2021514604.tif 000007
【００６２】
肺癌患者の場合、腫瘍ドライバー遺伝子パネル及び遺伝リスク遺伝子パネルで、それぞれ、ＳＮＶのちょうど７％及び３％が体細胞起源であった。すべての癌患者間では、腫瘍ドライバー遺伝子パネル及び遺伝リスク遺伝子パネルで、それぞれ、体細胞変化を示すＳＮＶのパーセントは遺伝子の６％及び３％であった。体細胞癌ドライバー突然変異を保有することが知られる２５遺伝子間では、体細胞変異体がより大きなパーセントで観測されると予想された。各遺伝子で観測されるＳＮＶの数に有意な変動が見られた。ユニークＳＮＶ部位の数は、遺伝子タンパク質コード配列のサイズと強い相関があった（すべての癌型に対してｐ値＜１０−９、Ｒ２＝０．７０）。しかしながら、生殖系変異体、体細胞変異体、又は全変異体の数と遺伝子のサイズとの間には相関が見られなかった（すべてのｐ値＞０．４０）。各遺伝子と癌アウトカムとの間の関連度は、遺伝子間で観測されるＳＮＶカウントの変動、さらには各遺伝子に存在する天然集団ジェネティック変異の有望な決定因子である。さらに、特定の癌ドライバーＳＮＶは患者間で富化される。
【００６３】
全変異体と比較してユニーク変異体の数が少ないことは、癌患者の研究集団の多くのゲノムで観測される共通ＳＮＶの存在を示す。６２１名の癌患者のサンプルで対立遺伝子頻度＞０．０２を有する変異体は２１存在し、そのうち１７は共通生殖系ＳＮＰであり、且つ４は共通体細胞ドライバー突然変異であった（ＫＲＡＳに２及びＰＩＫ３ＣＡに２）。２１共通変異体はすべて、ジェネティック多型の単一ヌクレオチド多型データベース（ｄｂＳＮＰ）にアーカイブされている。すべての患者間では、９１９全ユニーク変異体のうち６４５（７０％）は１回のみ観測されたにすぎなかった。３  ＳＮＶは、生殖系起源及び体細胞起源の両方であった。
【００６４】
肺癌患者の腫瘍ゲノムシーケンシング単独（正常部生殖系ゲノムとの比較なし）では、７４６ミスセンス及びナンセンスタンパク質改変ＳＮＶが同定されるであろう（表１）。腫瘍分子的プロファイリングとの関連では、体細胞起源としてカテゴリー化される生殖系起源のＳＮＶはいずれも、偽陽性の結果を構成する。推定生殖系変異体のいかなるフィルタリングも行わなければ、表１に示されるデータを考慮して約９４％の偽陽性率が予想される。３つの異なるＳＮＶフィルタリング基準：１）ｄｂＳＮＰデータベースに見いだされるすべてのＳＮＶを除去するもの、２）報告された集団対立遺伝子頻度≧０．０１（１％）を有するすべてのＳＮＶを除去するもの、及び３）報告された集団対立遺伝子頻度≧０．００１（０．１％）を有するすべてのＳＮＶを除去するものを用いて、図１は、４５名の肺癌患者間で生じる可能性のある偽陽性結果の数を示し、且つ図２は、各遺伝子に対して６２１名すべての癌患者で同一の結果を表す。（報告された集団対立遺伝子頻度を有していなかったが、癌患者間の共通生殖系ＳＮＶであり、且つｄｂＳＮＰに存在していた追加の３  ＳＮＶもまた除去した）。偽陽性結果の最大数は、０．０１の対立遺伝子頻度閾値を用いたときに生じた。対立遺伝子頻度フィルタリング閾値を０．００１に低減することにより、ほとんどの遺伝子で偽陽性の数を半分に低減することが可能であった。ほとんどのパブリックに利用可能な集団対立遺伝子頻度推定値の精度は０．０００１を超えなかったので、集団対立遺伝子頻度閾値のさらなる低減は偽陽性ＳＮＶの数に及ぼす名目上の効果を有していた。
【００６５】
ｄｂＳＮＰデータベースに存在していたＳＮＰをすべて排除したところ、偽陽性ＳＮＶの最小数が得られた。しかしながら、偽陽性率を改善したところ、多くの真性腫瘍体細胞ＳＮＶが排除されたため、偽陰性率が増加するという犠牲を生じた。ｄｂＳＮＰに存在していたすべてのＳＮＶを排除したところ、４５名の肺癌患者で観測された４５真性腫瘍体細胞変異体のうち１７偽陰性（３８％）を生じ、且つ肺癌患者間で５５５真性体細胞変異体のうち２４５偽陰性（４４％）を生じた。０．００１の対立遺伝子頻度閾値フィルターを用いたところ、肺癌患者間で４１偽陽性結果となり（観測された全７４６  ＳＮＶの５％、及びフィルタリング後に残った８６  ＳＮＶの４８％）且つ偽陰性結果がゼロになった。同一のフィルタリング閾値を用いると、６２１名すべての癌患者間で５５４偽陽性結果となり（観測された１０，７０４すべてのＳＮＶの５％、及びフィルタリング後に残った１，１０７  ＳＮＶの５０％）且つ偽陰性結果がゼロになる。
【００６６】
腫瘍オンリーシーケンシングアプローチの帰結：集団対立遺伝子頻度≧０．００１を有するすべてのＳＮＶをフィルタリングにより除去した後、４５名の肺癌患者のうち３７名及び６２１名すべての癌患者のうち４７２名は、３５遺伝子のパネルで少なくとも１つのミスセンス又はナンセンスタンパク質改変ＳＮＶを有していた。フィルタリング後にＳＮＶを有していなかった７名の肺癌患者及び１４９名すべての患者は、いずれの真性体細胞変異体も有していなかったことから、集団対立遺伝子頻度フィルターは偽陰性結果を生じなかったことを示す。図３は、肺癌で真陽性ＳＮＶの数（すなわち腫瘍体細胞ＳＮＶの数）及び偽陽性ＳＮＶの数（すなわち遺伝生殖系ＳＮＶの数）を示し、且つ図４は、フィルタリング後に残った少なくとも１つのＳＮＶを有していたすべての患者の同一の結果を示す。ＳＮＶの平均数は、肺癌患者及びすべての癌患者でそれぞれ１．９１及び１．８４であった。３９体細胞ＳＮＶを有する１名の患者は、提示目的のための図２ｂから排除した。肺癌患者では、４５名の患者のうち２９名（６５％）は、少なくとも１つの偽陽性ＳＮＶを有し、１５名の患者は、いかなる真陽性結果も含むことなく偽陽性ＳＮＶのみ（３３％）を有していた。０．００１の集団対立遺伝子頻度でフィルタリングした後、肺癌患者間で見いだされた全ＳＮＶの５％のみが偽陽性であったにすぎないが（発見された全８０２  ＳＮＶから４１偽陽性）、ＳＮＶは、患者の６５％にわたり分布していた。発見された８０２  ＳＮＶの大多数は、フィルタリングにより排除された共通変異体である。これらの結果から、偽陽性発見率に及ぼす稀な生殖系突然変異の影響が浮き彫りになる。十分な研究集団では、６２１名の患者のうち３６５名（５９％）は、少なくとも１つの偽陽性ＳＮＶを有し、平均０．９１偽陽性／患者を生じた。６２１名の患者のうち１９３名（３１％）では、真陽性結果を有することなく偽陽性ＳＮＶのみが存在した。
【００６７】
偽陽性ＳＮＶは、患者ケアに直接的な悪影響を及ぼしうる。表２は、１２ドラッガブル遺伝子、体細胞突然変異時に遺伝子の各々を標的とする特定の薬剤、及び遺伝子の各々で少なくとも１つの偽陽性ＳＮＶが観測された患者の数を示す。
さらに、偽陽性結果に基づいて薬剤処方の財政的及び臨床的な意義を例示するために、各薬剤に関連するコスト及び予想される健康への悪影響が示される。腫瘍オンリー配列解析は、非有効と思われる薬剤治療処方の悪影響を伴って、患者を深刻な薬剤の悪影響の不要なリスクにさらす可能性がある。
【００６８】
【表２】
2021514604.tif 000008
【００６９】
【表３】
2021514604.tif 000009
【００７０】
【表４】
2021514604.tif 000010
【００７１】
【表５】
2021514604.tif 000011
【００７２】
体細胞単一ヌクレオチド変異体の発現：腫瘍体細胞ＳＮＶの発現の評価を可能にするＲＮＡシーケンシングデータは、２６名の肺癌患者及び３７８名のすべての患者から入手可能であった。表３は、評価された体細胞ＳＮＶの全数、発現されなかった体細胞ＳＮＶの数、及び発現されなかった体細胞ＳＮＶを有する患者の数を示す。ＳＮＶの有意パーセント、すなわち、肺癌患者では１８％（３９  ＳＮＶのうち７）及びすべての癌患者では１５％（５１７  ＳＮＶのうち７５）は発現されなかった。遺伝子間には発現された腫瘍体細胞変異体のパーセントの実質的な変動が存在した。ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＧＲ、及びＲＥＴのＳＮＶのほぼ８０％以上は、すべての癌患者間で発現されなかった。研究集団では、肺癌患者の９％（腫瘍ＲＮＡシーケンシングデータを有する２６名すべての患者のうち６名）、及びすべての癌患者の１３％（腫瘍ＲＮＡシーケンシングデータを有する３７８名の全癌患者のうち５１名）は、メッセンジャーＲＮＡが発現されなかった少なくとも１つの真性腫瘍体細胞ＳＮＶを有していた。表２に示される特定の薬剤の標的である１２遺伝子で発現されなかった４腫瘍体細胞ＳＮＶが４名の肺癌患者に存在した。ＲＮＡが発現されなかった腫瘍体細胞ＳＮＶを有していたのはすべての癌患者のうち３３名であった。したがって、ＤＮＡ解析単独に基づく治療判断は、無効療法を施すおそれがある。
【００７３】
【表６】
2021514604.tif 000012
【００７４】
現在、患者の腫瘍体細胞変異を同定するために、２つのシーケンシングベースアプローチが利用可能である。第１のアプローチでは、標的遺伝子パネルを表す腫瘍ＤＮＡ、エキソーム、又は全ゲノムがシーケンスされ、且つ参照ゲノム及び腫瘍で発見された個別ゲノミック変異体の特性に基づいて推定生殖系変異がフィルタリングされる（腫瘍オンリー解析と称される）。評価可能な対立遺伝子頻度での集団ジェネティックデータベースのゲノミック変異体の同定は、変異体が遺伝生殖系起源であるかを決定する通常のフィルタリング基準である。本明細書に示される第２のより精度の良いアプローチは、体細胞由来のものから遺伝生殖系変異体を識別のために精度の良い対照（フィルトレーションのための参照ゲノムではない）として患者自身の生殖系ゲノムを使用するものである（腫瘍−正常部解析と称される）。肺癌治療を通知するために現在ＣＭＳにより承認されている試験は、前者のアプローチに基づき、且つ体細胞変異体を決定する際に正常組織（生殖系情報）の使用を特異的に排除する。
【００７５】
２つのアプローチを対比して、本発明者らは、ＣＭＳによりカバレッジが承認された腫瘍オンリー遺伝子パネルに対して４５名の肺癌患者及び６２１名の全癌患者の腫瘍及び正常部のＤＮＡシーケンシングデータを解析した。体細胞変異体を同定するために腫瘍オンリーシーケンシングを使用した場合、９４％の偽陽性率（すべての癌では９５％）であることが、研究から実証された。推定体細胞突然変異から多型をバイオインフォマティックにフィルタリングするために複数の方法を利用した後でさえも、偽陽性率は依然として３８％〜９４％の範囲内であった。使用した方法に依存して、過度にストリンジェントなフィルタリングは偽陰性の可能性をもたらした。体細胞突然変異の同定が治療判断を通知可能であるＦＤＡ承認薬剤の標的となる１２遺伝子のサブセットに焦点を当てたとき、偽陽性コールによる影響を受ける肺癌患者のパーセントは、使用した多型フィルトレーションの方法に依存して２９％〜５１％の範囲内であった。偽陽性結果のさらなるリスクは、体細胞組織から同定される変異体の同定に由来する。すなわち、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、及びＡＴＭなどの遺伝子で有害な（遺伝）生殖系変異体として誤同定される真性体細胞突然変異に由来する。家族性疾患の生殖系リスクに関連する１０遺伝子（遺伝リスク遺伝子パネル）では、生殖系遺伝子の真性体細胞突然変異は、腫瘍オンリーシーケンシングアプローチを使用したとき１０名の肺癌患者（１１変異体）及び１０１名の全患者（１１８変異体）で発見された。
【００７６】
患者の正常部生殖系ゲノム及び腫瘍ゲノムのシーケンシング及びデータ解析は、腫瘍ゲノム配列データ単独の解析に関連する偽陽性結果を排除する。腫瘍体細胞ＳＮＶが効果的に患者治療を通知する能力は、ＤＮＡ変異体をメッセンジャーＲＮＡとして発現し、次いでタンパク質に翻訳することに依存する。腫瘍のＲＮＡシーケンシングは、癌ドライバー遺伝子の相対発現レベル及び特異的腫瘍体細胞変異体の遺伝子発現に関する価値ある情報を提供する。肺癌患者の腫瘍／正常部シーケンシングから同定された真性体細胞突然変異の１８％、さらにはすべての癌患者の１５％は、メッセンジャーＲＮＡレベルで発現されなかったことが、この研究のＲＮＡ発現解析から示された。研究集団では、これらの結果は、肺癌患者の９％及びすべての癌患者の１３％で臨床判断に影響を与える可能性があった。本明細書に提示される結果は、腫瘍／正常部ＤＮＡシーケンシング＋ＲＮＡシーケンシングから導出される薬剤標的化のための分子的解析の精度向上に関連する利点のさらなる証拠を提供する。
【００７７】
したがって、以上を考慮して、癌療法用の分子標的の正確な同定のために、正常部生殖系ゲノム及び腫瘍ゲノムの両方のＤＮＡの同時シーケンシング及びバイオインフォマティクス解析が必要であることを認識すべきである。腫瘍ゲノムのみの解析では、ＳＮＶ同定で高い偽陽性率を生じる。同時腫瘍−正常部ＤＮＡ及びＲＮＡのシーケンシング解析を用いると、さらに高い精度が達成される。腫瘍オンリーＤＮＡ解析に基づく又はＲＮＡ解析の不在下での治療判断は、無効療法を施すおそれがあると同時に、ネガティブな薬剤関連副作用のリスクも増加させる。臨床判断の指針を与えるために使用するとき、腫瘍オンリー遺伝子パネル解析のアプローチは、患者へのリスクを増加させたり、潜在的に長期にわたるネガティブな健康への影響を引き起こしたり、ヘルスケアコストを増加させたりするおそれがある。
【００７８】
実施例２
この実施例では、本発明者らは、腫瘍ゲノム及び正常部ゲノムの両方の全ゲノムシーケンシングを用いて１１胃腸（ＧＩ）癌型を有する２０４名の癌患者を含めた。以下に示される４５遺伝子パネルで、真陽性（真性体細胞変異体）率及び偽陽性（体細胞変異体であると推定された真性生殖系変異体）率がミスセンス及びナンセンス単一ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）について測定された。４５遺伝子パネルは、既知の２６体細胞ドライバー遺伝子と１４遺伝癌リスク遺伝子とを含んでいた。また、これらのうち５遺伝子は、体細胞腫瘍ドライバー及び遺伝リスク遺伝子の両方として作用可能である。ＲＮＡシーケンシングは、２０４名の患者のうち１３９名で利用可能だった。配列アライメント及びＳＮＶ変異体コーリングは、十分に確立された且つ公開されたバイオインフォマティクス法を用いて実施した。好ましい方法では、ＤＮＡ及びＲＮＡの配列を用いて同期してインクリメンタルにＳＮＶをアライメントし同定するために、ＢＡＭＢＡＭを使用した。
【００７９】
結果：腫瘍ゲノム単独のシーケンシングから同定されたＳＮＶの９２％は、真性体細胞変異体ではなく生殖系起源であり潜在的偽陽性であった（体細胞＝真性体細胞変異体、生殖系＝真性生殖系変異体）。図５Ａ及び５Ｂを参照されたい。とくに、報告された集団対立遺伝子頻度≧０．００１でパブリックデータベースを用いてすべてのＳＮＶをフィルタリングしたところ、依然として４１％の偽陽性率になった（体細胞＝真性体細胞変異体、生殖系＝真性生殖系変異体）。図６Ａ及び６Ｂを参照されたい。図７に示されるように、ＧＩ患者の７１％は、対立遺伝子頻度でフィルタリングした後、少なくとも１つの偽陽性ＳＮＶ（生殖系）を有していた（体細胞＝真性体細胞変異体、生殖系＝真性生殖系変異体）。さらに、図８から得られるように、真性体細胞変異体の１０％は発現されず、且つ患者の１７％は、発現されない少なくとも１つの真性体細胞変異体を有していることが、ＲＮＡ解析により示された。
【００８０】
したがって、腫瘍ゲノムシーケンシングにより遺伝生殖系起源及び腫瘍体細胞起源のＳＮＶのすべてを同定した場合、大部分は生殖系起源になることを認識すべきである。集団対立遺伝子頻度及び他のパラメーターを用いてＳＮＶデータをフィルタリングし、生殖系起源と対比して体細胞起源を推定することが可能であるが、かかるフィルタリングは臨床用としては十分に正確でなかった。さらに、分子標的の正確な同定のために、正常部生殖系ゲノム及び腫瘍ゲノムの両方のＤＮＡの同時シーケンシング及びバイオインフォマティクス解析が必要であることを認識すべきである。腫瘍ゲノム単独の解析では、偽陽性結果を生じる。同時腫瘍−正常部ＤＮＡ及び腫瘍ＲＮＡのシーケンシング解析を用いると、より高い精度が達成される。腫瘍オンリーＤＮＡ解析に基づく又はＲＮＡの不在下での治療判断は、無効療法を施すおそれがあると同時にネガティブな薬剤関連副作用のリスクも増加させる。
【００８１】
実施例３
この実施例では、本発明者らは、共通に使用される５０遺伝子ホットスポットパネルを用いて、且つ正常部生殖系ＤＮＡ及び腫瘍ＲＮＡと同時に腫瘍ＤＮＡを解析することと対比して腫瘍組織を単独で解析して、腫瘍体細胞コーリングの確度及び精度を比較することを目指した。具体的には、この実施例では、４２癌型を有する１８７９名の癌患者の腫瘍サンプル及び対応正常部サンプルを得て、それらの組織の全ゲノムシーケンシングデータ又は全エキソームシーケンシングデータを発生させた。コホートのデモグラフィック概要は以下の表４に示され、且つ異なる癌型ごとにシーケンスされたアナライトの数は、図９に示される（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡに対してシーケンスされたサンプルの数）。表４のＮ＜１０を有する癌（又は図９の他の癌型）は、皮膚（非黒色腫）、中皮腫、精巣、胆管（肝外）、肛門、ファーター膨大部、白血病、腟動脈、骨髄腫、小腸、外陰、陰茎、及び尿道の癌を含む。
【００８２】
【表７】
2021514604.tif 000013
【００８３】
腫瘍組織のゲノミックシーケンシングデータから、本発明者らは、すべての患者が少なくとも１つの生殖系単一ヌクレオチド変異体を有すると判断した（合計３０９５５単一ヌクレオチド変異体）。次いで、本発明者らは、腫瘍及び対応正常部のゲノミックシーケンシングデータの比較から同定されたすべての単一ヌクレオチド変異体の数（生殖系起源のもの及び腫瘍体細胞起源のものを含む）を定量した。１８７９名の患者のうち１１２７名（６５％）は、少なくとも１つの体細胞単一ヌクレオチド変異体を有していた（合計３０８７２１）。アナライトがＤＮＡ／ＲＮＡペアで解析された１１３５名の患者のうち７４１名（６５％）は、少なくとも１つの体細胞単一ヌクレオチド変異体を有し（合計１９８８４４）、ＤＮＡ／ＲＮＡペア解析の患者間で１７７５ユニーク単一ヌクレオチド変異体を生じた。図１０に示されるように、腫瘍ゲノムを単独でシーケンスすることにより同定された単一ヌクレオチド変異体の９２％は生殖系起源であったことから、腫瘍ゲノムを単独でシーケンスすることにより同定された単一ヌクレオチド変異体の大多数は、真性体細胞変異体ではなく潜在的に偽陽性でありうることが示唆される。
【００８４】
本発明者らは、腫瘍ゲノムを単独でシーケンスすることにより同定された単一ヌクレオチド変異体を集団対立遺伝子頻度及び他のパラメーター（たとえば、既知の生殖系変異体、ｇｎｏｍＡＤ）によりさらにフィルタリングして、単一ヌクレオチド変異体の比（生殖系起源対腫瘍体細胞起源）を決定した。図１１に示されるように、腫瘍ゲノムを単独でシーケンスすることにより同定された単一ヌクレオチド変異体はすべて、報告された対立遺伝子頻度≧０．００１でｇｎｏｍＡＤを用いてフィルタリングした。本発明者らは、フィルタリング後の偽陽性率が３４％に低減されることを見いだした。とはいえ、かかる偽陽性率は、かかるデータのいずれの臨床使用にも十分に正確ではないことが、本発明者らにより企図される。
【００８５】
さらに、腫瘍体細胞起源の単一ヌクレオチド変異体のすべてが必ずしもＲＮＡで発現されるとは限らないことから、すべての同定された単一ヌクレオチド変異体間で真性体細胞単一ヌクレオチド変異体を得るために、ＲＮＡ発現解析を用いたさらなるフィルタリングが必要であることが示唆されることを、本発明者らは見いだした。図１２及び図１３に示されるように、ミスセンス／ナンセンス体細胞単一ヌクレオチド変異体の１５％（図１２に示される）、及びすべての体細胞単一ヌクレオチド変異体の１７％（ミスセンス／ナンセンス／同義）は発現されない。その他、この実施例の癌患者の２３％は、発現されない少なくとも１つの体細胞単一ヌクレオチド変異体（ナンセンス／ミスセンス）を有することを、本発明者らは見いだした。かかるデータから、腫瘍ゲノム単独の解析は高偽陽性体細胞変異体コールをもたらすので、また、ＲＮＡ発現が欠如すると、同定された単一ヌクレオチド変異体又は単一ヌクレオチド変異体を有する遺伝子を分子標的として使用したときに臨床効果を満たさないことに寄与するおそれがあるので、分子標的の正確な同定のために正常部生殖系ゲノム及び腫瘍ゲノムの両方のＤＮＡの同時シーケンシング及びバイオインフォマティクス解析が必要であることが、本発明者らにより企図される。異なる観点から見ると、正常部生殖系ゲノム及び腫瘍ゲノムの両方のＤＮＡの同時シーケンシング及びバイオインフォマティクス解析を用いれば、腫瘍治療及び／又は遺伝子間のドラッガブル標的を同定するときにより高い精度を達成可能であり、且つ／又は腫瘍状態の試験アルゴリズムの改善を達成可能である。
【００８６】
本明細書及び以下の特許請求の範囲全体で用いられる場合、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、とくに文脈上明確に規定されない限り、複数形の参照語を含む。また、本明細書で用いられる場合、文脈上明確に規定されない限り、「ｉｎ」の意味は「ｉｎ」及び「ｏｎ」を含む。文脈上逆の規定がない限り、本明細書に示される範囲はすべて、その端点を含むと解釈すべきであり、且つオープンエンドの範囲は、商業的に実用的な値を含むと解釈すべきである。同様に、値のリストはすべて、文脈上逆のことが示唆されない限り、中間値を含むとみなすべきである。
【００８７】
さらに、本明細書に記載の方法はすべて、とくに本明細書に指定がない限り又は文脈上明らかな矛盾がない限り、いずれかの好適な順序で実施可能である。本明細書のある特定の実施形態に対して提供されるあらゆる実施例又は模範的表現（たとえば、「〜などの（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、単に本発明をより良く理解できるようにすることが意図されたものであり、他の形で特許請求された本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書の表現は、本発明の実施に不可欠ないずれかの非特許請求要素を表すものと解釈すべきではない。
【００８８】
本明細書に開示される本発明の代替要素又は代替実施形態のグループ化は、限定と解釈すべきではない。各グループメンバーは、個別的に又はそのグループの他のメンバー若しくは本明細書に見いだされる他の要素とのいずれかの組合せで参照及び特許請求が可能である。グループの１つ以上のメンバーは、便宜性及び／又は特許性が理由で、グループに含めたり、グループから除外したりできる。いずれかのかかる包含又は除外を行う場合、その指定は、本明細書では、修正された通りにグループを含有するものとみなされるので、添付の特許請求の範囲で用いられるすべてのマーカッシュグループの記載内容を満たす。
【００８９】
本明細書に記載の本発明の概念から逸脱することなく、すでに説明したもの以外のより多くの変更が可能であることは、当業者には明らかなはずである。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲内でない限り制限すべきではない。さらに、本明細書及び特許請求の範囲の両方を解釈する際、用語はすべて、文脈に矛盾しない可能な限り最広義に解釈すべきである。特定的には、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、要素、成分、又は工程を非排他的に参照するものとして解釈すべきであり、参照された要素、成分、又は工程が存在しうるか、又はそれらを利用しうるか、又は明示的に参照されない他の要素、成分、又は工程と組み合わせうることを示唆する。本明細書及び以下の特許請求の範囲全体で用いられる場合、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、とくに文脈上明確に規定されない限り、複数形の参照語を含む。また、本明細書で用いられる場合、文脈上明確に規定されない限り、「ｉｎ」の意味は「ｉｎ」及び「ｏｎ」を含む。本明細書の特許請求の範囲がＡ、Ｂ、Ｃ．．．．及びＮからなる群から選択される何か少なくとも１つのものを参照する場合、その文言は、Ａ＋Ｎ、Ｂ＋Ｎなどではなくその群の１つの要素のみを必要とすると解釈すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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