(57)【要約】  本発明は、インビトロでのＴ細胞枯渇の誘導およびモニタリングのための方法を提供する。該方法は、ヒトおよび非ヒトＴ細胞の両方、および抗原特異的Ｔ細胞およびポリクローナルＴ細胞の両方に対して有効である。本発明はまた、Ｔ細胞枯渇を誘導または逆転させることができる薬物をスクリーニングおよび／または評価するための方法を提供する。本発明はまた、Ｔ細胞枯渇を逆転させることができる特定の薬剤を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロでのＴ細胞枯渇を誘導する方法であって、
（ａ）Ｔ細胞受容体シグナル伝達を急性的に刺激する条件下で第１期間にわたってインビトロでＴ細胞を培養すること、および
（ｂ）次に、Ｔ細胞受容体シグナル伝達を慢性的に刺激する条件下で第２期間にわたってインビトロでＴ細胞を培養すること、
それにより枯渇されたＴ細胞を産生すること
を含む、方法。
【請求項２】
インビトロでの抗原特異的Ｔ細胞枯渇を誘導する方法であって、
（ａ）所定の抗原に特異的であるＴ細胞を、（ｉ）抗原および抗原提示細胞、および所望によりＩＬ−２、または（ｉｉ）抗原を提示する抗原提示細胞、および所望によりＩＬ−２のいずれかと培養すること、ここで、培養することは、第１期間にわたってインビトロで行われる、および
（ｂ）次に、Ｔ細胞を、（ｉ）抗原および抗原提示細胞、腫瘍細胞、またはウイルス感染細胞、および所望によりＩＬ−２、または（ｉｉ）ＭＨＣ分子上に抗原を提示する抗原提示細胞、腫瘍細胞、またはウイルス感染細胞、および所望によりＩＬ−２のいずれかと培養すること、ここで、培養することは、第２期間にわたってインビトロで行われる、
それにより抗原特異的な枯渇されたＴ細胞を産生すること
を含む、方法。
【請求項３】
インビトロでのポリクローナルＴ細胞枯渇を誘導する方法であって、
（ａ）Ｔ細胞を、（ｉ）抗ＣＤ３抗体および（ｉｉ）所望により抗ＣＤ２８抗体、および（ｉｉｉ）所望によりＩＬ−２と培養すること、ここで、培養することは、第１期間にわたってインビトロで行われる、および
（ｂ）次に、Ｔ細胞を、（ｉ）抗ＣＤ３抗体、（ｉｉ）所望により抗ＣＤ２８抗体、および（ｉｉｉ）所望によりＩＬ−２と培養すること、ここで、培養することは、第２期間にわたってインビトロで行われる、
それによりポリクローナルな枯渇されたＴ細胞を産生すること
を含む、方法。
【請求項４】
枯渇されたＴ細胞が、以下の特性：
（ａ）開始Ｔ細胞および／または枯渇されていないＴ細胞と比較して、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、および／またはＰＤ−Ｌ１の１つ以上の発現の増加、
（ｂ）開始Ｔ細胞および／または枯渇されていないＴ細胞と比較して、１つ以上のエフェクターサイトカインの生産の減少、
（ｃ）開始Ｔ細胞および／または枯渇されていないＴ細胞と比較して、増殖の減少、および
（ｄ）開始Ｔ細胞および／または枯渇されていないＴ細胞と比較して、標的細胞殺活性の減少
の１つ以上を示す、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
開始Ｔ細胞において、および／または  または枯渇されたＴ細胞の以下の特性：
（ａ）ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、および／またはＰＤ−Ｌ１の発現、
（ｂ）１つ以上のエフェクターサイトカインの生産、
（ｃ）増殖率、および
（ｄ）標的細胞殺活性
の１つ以上を測定するアッセイを行うことをさらに含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
第１期間が、約１−３日間（２４−７２時間）である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
第１期間が、約１−２日間（２４−４８時間）である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
第１期間が、約１１／２−２日間（３６−４８時間）である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
第１期間が、約２日間（４８時間）である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
第２期間が、約４−８日間（９６−１９２時間）である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
第２期間が、約６日間（１４４時間）である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
第２期間が、少なくとも約４日間（９６時間）である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
第２期間が、少なくとも約６日間（１４４時間）である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
第２期間中に、Ｔ細胞が、Ｔ細胞受容体シグナル伝達が慢性的に刺激される条件下で培養される、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
慢性刺激が一定の刺激である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
慢性刺激が反復刺激である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
第２期間中に、Ｔ細胞が、約１−２日ごとに再播種または分裂または継代される、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
第２期間中に、Ｔ細胞が、１ｍｌあたり約１００万個の細胞の密度で約１−２日ごとに再播種される、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
第２期間中に、新鮮な抗原または新鮮な抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体が、約１−２日ごとにＴ細胞培養物に加えられる、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
Ｔ細胞がポリクローナルＴ細胞であり、Ｔ細胞受容体シグナル伝達が、Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体と接触させることによって刺激される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
Ｔ細胞がポリクローナルＴ細胞であり、Ｔ細胞受容体シグナル伝達が、Ｔ細胞を（ａ）抗ＣＤ３抗体、および（ｂ）抗ＣＤ２８抗体と接触させることによって刺激される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
Ｔ細胞が抗原特異的Ｔ細胞であり、Ｔ細胞受容体シグナル伝達が、Ｔ細胞とＴ細胞が特異的である抗原とを接触させることによって刺激される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
抗原が、抗原提示細胞、腫瘍細胞、またはウイルス感染細胞の表面に提示される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
抗原提示細胞がプロフェッショナル抗原提示細胞である、請求項２または請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項２または請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
第２期間中に、Ｔ細胞が腫瘍細胞と培養される、請求項１から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
抗原が腫瘍抗原であり、第２期間中に、Ｔ細胞が腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞と培養される、請求項１から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
第２期間中に、Ｔ細胞がウイルス感染細胞と培養される、請求項１から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
抗原がウイルス抗原であり、第２期間中に、Ｔ細胞がウイルス抗原を含むウイルス感染細胞と培養される、請求項１から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体が、固体支持体に結合している、請求項３、１９、２０、および２１のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体が、組織培養プレートまたは他の組織培養容器に結合される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体が、ビーズの表面に結合している、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
Ｔ細胞がＣＤ４＋  Ｔ細胞である、請求項１から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
Ｔ細胞がＣＤ８＋  Ｔ細胞である、請求項１から３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
Ｔ細胞が哺乳動物Ｔ細胞である、請求項１から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
Ｔ細胞が齧歯動物Ｔ細胞である、請求項１から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
Ｔ細胞がマウスＴ細胞である、請求項１から３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
Ｔ細胞が霊長類Ｔ細胞である、請求項１から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
Ｔ細胞がヒトＴ細胞である、請求項１から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
Ｔ細胞がＴＣＲトランスジェニックマウスから得られる、請求項２または請求項２に従属する前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
Ｔ細胞が哺乳動物の血液から得られる、請求項１、請求項３、または請求項１または請求項３に従属する前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
Ｔ細胞がヒトの血液から得られる、請求項１、請求項３、または請求項１または請求項３に従属する前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
請求項１から４２のいずれかに記載の方法を使用して得られた枯渇されたＴ細胞の集団。
【請求項４４】
請求項１から４３のいずれかに記載の方法を使用して得られた枯渇されたＴ細胞の実質的に精製された集団。
【請求項４５】
Ｔ細胞枯渇に対する１つ以上の試験薬剤の効果を評価する方法であって、
（ａ）試験薬剤の存在下および試験薬剤の非存在下で、請求項１から４２のいずれかに記載の方法を行うこと、および
（ｂ）工程（ａ）で生成されたＴ細胞において以下の特性
ｉ．ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、および／またはＰＤ−Ｌ１の発現、
ｉｉ．１つ以上のエフェクターサイトカインの生産、
ｉｉｉ．増殖率、
ｉｖ．標的細胞殺活性、
の１つ以上を測定するためにアッセイを行うこと、
ここで、（ｉ）試験薬剤の存在下で生成されたＴ細胞が、試験薬剤の非存在下で生成されたＴ細胞と比較して、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、および／またはＰＤ−Ｌ１の発現の増加、１つ以上のエフェクターサイトカインの生産の減少、増殖率の減少、または標的細胞殺活性の減少を示すとき、試験薬剤はＴ細胞枯渇を増加させる、および、（ｉｉ）試験薬剤の存在下で生成されたＴ細胞が、試験薬剤の非存在下で生成されたＴ細胞と比較して、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、および／またはＰＤ−Ｌ１の発現の減少、１つ以上のエフェクターサイトカインの生産の増加、増殖率の増加、または標的細胞殺活性の増加を示すとき、試験薬剤はＴ細胞枯渇を減少させる、
を含む、方法。
【請求項４６】
枯渇されたＴ細胞の再活性化に対する１つ以上の試験薬剤の効果を評価する方法であって、
（ａ）請求項１から４２のいずれかに記載の方法を使用して生成された枯渇されたＴ細胞の第１の集団と１つ以上の試験薬剤とを接触させて、Ｔ細胞の試験集団を生成すること、
（ｂ）請求項１から４２のいずれかに記載の方法を使用して生成された枯渇されたＴ細胞の第２の集団と試験薬剤なしまたは１つ以上の対照薬剤とを接触させて、Ｔ細胞の対照集団を生成すること、
（ｃ）Ｔ細胞の試験集団およびＴ細胞の対照集団において以下の特性
ｉ．ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、および／またはＰＤ−Ｌ１の発現、
ｉｉ．１つ以上のエフェクターサイトカインの生産、
ｉｉｉ．増殖率、および
ｉｖ．標的細胞殺活性、
の１つ以上を測定するためにアッセイを行うこと、
ここで、（ｉ）Ｔ細胞の試験集団が、Ｔ細胞の対照集団と比較して、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、および／またはＰＤ−Ｌ１の発現の増加、１つ以上のエフェクターサイトカインの生産の減少、増殖率の減少、または標的細胞殺活性の減少を示すとき、試験薬剤はＴ細胞再活性化を減少させる、および、（ｉｉ）Ｔ細胞の試験集団が、Ｔ細胞の対照集団と比較して、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、および／またはＰＤ−Ｌ１の発現の減少、１つ以上のエフェクターサイトカインの生産の増加、増殖率の増加、または標的細胞殺活性の増加を示すとき、試験薬剤はＴ細胞再活性化を増加させる、
を含む、方法。
【請求項４７】
患者由来のＴ細胞のＴ細胞枯渇状態を評価する方法であって、請求項５、または請求項５に従属する請求項のいずれかに記載の方法を行うことを含む方法。
【請求項４８】
枯渇されたＴ細胞を再活性化する方法であって、枯渇されたＴ細胞と有効量のＮ−アセチルシステインとを接触させることを含む方法。
【請求項４９】
Ｔ細胞枯渇を低下または逆転させる方法であって、枯渇されたＴ細胞と有効量のＮ−アセチルシステインとを接触させることを含む方法。
【請求項５０】
Ｔ細胞性免疫応答を刺激または増加させる方法であって、Ｔ細胞と有効量のＮ−アセチルシステインとを接触させることを含む方法。
【請求項５１】
腫瘍細胞に対するＴ細胞性免疫応答を刺激または増加させる方法であって、Ｔ細胞と有効量のＮ−アセチルシステインとを接触させることを含む方法。
【請求項５２】
慢性感染症に対するＴ細胞性免疫応答を刺激または増加させる方法であって、Ｔ細胞と有効量のＮ−アセチルシステインとを接触させることを含む方法。
【請求項５３】
Ｔ細胞が生きている対象においてインビボであり、方法が有効量のＮ−アセチルシステインを生きている対象に投与することを含む、請求項４８から５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
Ｔ細胞がヒト対象においてであり、方法が有効量のＮ−アセチルシステインをヒト対象に投与することを含む、請求項４８から５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
Ｔ細胞と免疫チェックポイントインヒビターとを接触させることをさらに含む、請求項４８から５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
Ｔ細胞とＰＤ１インヒビター、ＰＤＬ１インヒビター、またはＣＴＬＡ４インヒビターとを接触させることをさらに含む、請求項４８から５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
有効量の免疫チェックポイントインヒビターを対象に投与することをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
有効量の免疫チェックポイントインヒビターをヒト対象に投与することをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
請求項４８から５８のいずれかに記載の方法における使用のためのＮ−アセチルシステインを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１８年４月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／６５７，９３２号の優先権の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援の声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＣＡ００９２０７の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
参照による援用
参照による援用を許可する国については、本開示で引用されているすべての文献は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書で引用または言及されている製品に関する製造業者の指示またはカタログは、参照により組み込まれる。このテキストに参照により組み込まれる文書、またはその中のあらゆる教示は、本発明の実施において使用することができる。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
癌および慢性感染症において、Ｔ細胞はしばしば、抗原（例えば腫瘍抗原またはウイルス抗原）に長期間暴露される。抗原へのこの長期の慢性暴露は、腫瘍増殖を制御する、および慢性感染症を制御する免疫系の能力の低下に関連している「Ｔ細胞枯渇」と呼ばれるＴ細胞機能の悪化につながる可能性がある。Ｔ細胞枯渇のレビューについて、Wherry and Kurachi, “Molecular and Cellular Insights into T Cell Exhaustion,” Nature (2015), Vol. 15, pp. 486-499を参照のこと、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。枯渇されたＴ細胞は、典型的には、抑制性受容体（例えばＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＰＤ−Ｌ１）の発現の増加、エフェクターサイトカインの生産の減少、増殖率の減少、および標的細胞殺活性の減少を示す。枯渇されたＴ細胞の再活性化は、免疫を再活性化することができる。例えば、ＰＤ１およびＰＤ−Ｌ１のインヒビター（いわゆる「免疫チェックポイントインヒビター」）は、Ｔ細胞枯渇を逆転させ、腫瘍に対する免疫系の応答を再活性化することができる。
【０００５】
Ｔ細胞枯渇を試験するための現在の方法は、インビボで枯渇された表現型を誘導することを含む。インビボでかかる試験を行うための要件は、Ｔ細胞枯渇がヒト免疫系においてどのように機能するかを試験すること、およびＴ細胞枯渇を可能にするまたは調節する（正または負のいずれか）新しい治療剤についてスクリーニングを行うことへの障壁を提示する。したがって、インビトロでのＴ細胞枯渇を誘導および研究するために、およびインビトロで新規な治療候補についてスクリーニングするまたはインビトロで公知または新規の治療剤の効果を試験するために、使用することができる新規なおよび改善された方法について当該分野で必要性がある。本発明は、これらのおよび他の必要性に対処する。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
本発明は、部分的に、以下に要約されている、ならびに本特許開示の「図面の簡単な説明」、「図面」、「詳細な説明」、「実施例」および「特許請求の範囲」セクションにさらに記載されている、一連の新しい方法および関連する新しい発見に基づいている。
【０００７】
本発明は、インビトロでのＴ細胞枯渇の誘導およびモニタリングのための新しい方法を提供し、インビボで誘導されるようにＴ細胞枯渇を必要とした以前の方法を超える有意な利点を提供する。これらの新しい方法は、典型的には、慢性ウイルス感染、または腫瘍を有するマウスへのＴ細胞の養子移植、次に腫瘍浸潤リンパ球の単離のインビボモデルに依存する、Ｔ細胞枯渇を誘導する従来の方法とは異なる。本明細書において提供される新しいインビトロ方法は、ヒトおよび非ヒトＴ細胞の両方、ならびに抗原特異的およびポリクローナルＴ細胞の両方で有効である。さらに、本明細書において提供される方法は、Ｔ細胞がインビトロシステムにおいて薬物で再活性化されることができるか否かを試験することによってメカニズムを提供する。例えば、本明細書において提供されるインビトロ方法は、限定はしないが免疫チェックポイントインヒビターを含む、免疫調節剤の前臨床評価のために使用することができる。本明細書で提供される方法はまた、患者由来の細胞のＴ細胞枯渇状態および／または慢性刺激に応答して枯渇に耐える患者由来のＴ細胞の能力のインビトロでの評価および測定を可能にする、予後適用のために有用である。
【０００８】
本発明の方法は、Ｔ細胞受容体のインビトロでの刺激によるＴ細胞枯渇を誘導する。例えば、１つの態様において、本発明は、インビトロでのＴ細胞枯渇を誘導する方法であって、Ｔ細胞受容体シグナル伝達を急性的に刺激する条件下で第１期間にわたってインビトロでＴ細胞を培養すること、および次に、Ｔ細胞受容体シグナル伝達を慢性的に刺激する条件下で第２期間にわたってインビトロでＴ細胞を培養すること、それにより枯渇されたＴ細胞を産生することを含む、方法を提供する。
【０００９】
重要なことには、本発明の方法は、非抗原特異的方法でのポリクローナルＴ細胞上のＴＣＲの一般化刺激、または抗原特異的Ｔ細胞上のＴＣＲの抗原特異的刺激のいずれかによって、Ｔ細胞枯渇を効果的に誘導することができる。前者の状況において、ポリクローナルＴ細胞上のＴＣＲの一般化刺激は、例えば、Ｔ細胞を、（ａ）抗ＣＤ３抗体および所望により抗ＣＤ２８抗体、または（ｂ）抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の両方と培養することによってなし遂げることができる。後者の状況において、抗原特異的Ｔ細胞上のＴＣＲの抗原特異的刺激は、例えば、抗原特異的Ｔ細胞を、抗原提示細胞、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、または表面上のＭＨＣ分子上の特定の抗原からのペプチドを提示する他の細胞と培養することによって（または、抗原特異的Ｔ細胞を、抗原提示細胞、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、または、抗原またはペプチドが細胞表面上のＭＨＣ分子上に表示されるように、特定の抗原または特定の抗原からのペプチドの存在下での他の細胞と培養することによって）なし遂げることができる。
【００１０】
いくつかの態様において、本発明の方法において使用されるＴ細胞（すなわちＴ細胞の開始／入力(input)集団）は、抗原特異的Ｔ細胞を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかのこのような態様において、抗原特異的Ｔ細胞は、興味ある抗原内の所定のエピトープに特異的である。いくつかのこのような態様において、抗原特異的Ｔ細胞は、モノクローナル抗原特異的Ｔ細胞である。いくつかのこのような態様において、使用されるＴ細胞（すなわちＴ細胞の開始／入力集団）は、抗原特異的Ｔ細胞の実質的に純粋な集団を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかのこのような態様において、使用されるＴ細胞（すなわちＴ細胞の開始／入力集団）は、興味ある抗原内の所定のエピトープに特異的である抗原特異的Ｔ細胞の実質的に純粋な集団を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかのこのような態様において、使用されるＴ細胞（すなわちＴ細胞の開始／入力集団）は、モノクローナル抗原特異的Ｔ細胞の実質的に純粋な集団を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００１１】
このような抗原特異的Ｔ細胞は、抗原特異的な枯渇されたＴ細胞を産生するために使用することができる。例えば、１つの態様において、本発明は、インビトロでの抗原特異的Ｔ細胞の枯渇を誘導する方法であって、抗原特異的Ｔ細胞を、（ｉ）Ｔ細胞が特異的である抗原またはペプチド／エピトープおよび抗原提示細胞、および所望によりＩＬ−２、または（ｉｉ）Ｔ細胞がＭＨＣ分子上で特異的である抗原またはペプチド／エピトープを提示する抗原提示細胞、および所望によりＩＬ−２のいずれかと培養すること、ここで、培養することは、第１期間にわたってインビトロで行われる、および、次に、Ｔ細胞を、（ｉ）Ｔ細胞が特異的である抗原またはペプチド／エピトープおよび抗原提示細胞、腫瘍細胞、またはウイルス感染細胞、および所望によりＩＬ−２、または（ｉｉ）Ｔ細胞がＭＨＣ分子上で特異的である抗原またはペプチド／エピトープを提示する抗原提示細胞、腫瘍細胞、またはウイルス感染細胞、および所望によりＩＬ−２と培養すること、ここで、培養することは、第２期間にわたってインビトロで行われる、それにより抗原特異的な枯渇されたＴ細胞を産生することを含む、方法を提供する。
【００１２】
いくつかの態様において、使用されるＴ細胞（すなわちＴ細胞の開始／入力集団）は、本明細書において「ポリクローナルＴ細胞」とも呼ばれる「非抗原特異的Ｔ細胞」を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかのこのような態様において、使用されるＴ細胞（すなわちＴ細胞の開始／入力集団）は、ポリクローナルＴ細胞の実質的に純粋な集団を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００１３】
このようなポリクローナルＴ細胞は、ポリクローナルな枯渇されたＴ細胞を産生するために使用することができる。例えば、１つの態様において、本発明は、インビトロでのポリクローナルＴ細胞の枯渇を誘導する方法であって、（ａ）ポリクローナルなＴ細胞を、（ｉ）抗ＣＤ３抗体および（ｉｉ）所望により抗ＣＤ２８抗体、および（ｉｉｉ）所望によりＩＬ−２と培養すること、ここで、培養することは、第１期間にわたってインビトロで行われる、および（ｂ）次に、Ｔ細胞を、（ｉ）抗ＣＤ３抗体、（ｉｉ）所望により抗ＣＤ２８抗体、および（ｉｉｉ）所望によりＩＬ−２と培養すること、ここで、培養することは、第２期間にわたってインビトロで行われる、それによりポリクローナルな枯渇されたＴ細胞を産生することを含む、方法を提供する。
【００１４】
上記で要約される、および本明細書の他の場所で説明されている方法は、全て、抗原特異的Ｔ細胞またはポリクローナルＴ細胞のどちらから開始しても、枯渇されたＴ細胞を産生する。典型的には、枯渇されたＴ細胞は、以下の特性（ａ）開始Ｔ細胞および／または枯渇されていないＴ細胞と比較して、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、および／またはＰＤ−Ｌ１の１つ以上の発現の増加、（ｂ）開始Ｔ細胞および／または枯渇されていないＴ細胞と比較して、１つ以上のエフェクターサイトカイン（例えばＩＦＮγ、ＴＮＦαおよび／またはＩＬ２）の生産の減少、（ｃ）開始Ｔ細胞および／または枯渇されていないＴ細胞と比較して、増殖の減少、および（ｄ）開始Ｔ細胞および／または枯渇されていないＴ細胞と比較して、標的細胞殺活性の減少の１つ以上（または全て）を示す。いくつかの態様において、上記で要約される、および本明細書の他の場所で説明されている方法は、方法を使用して産生される細胞において、（ａ）ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、および／またはＰＤ−Ｌ１の発現、（ｂ）１つ以上のエフェクターサイトカインの生産、（ｃ）増殖率、および／または（ｄ）標的細胞殺活性の１つ以上を測定するアッセイを行う工程を含む。この工程は、細胞の枯渇状態をアッセイするために有用である。いくつかの態様において、このようなアッセイは、「試験」Ｔ細胞および「対照」Ｔ細胞を用いて行われる。「試験」Ｔ細胞は、典型的には、本明細書に記載されるような枯渇を誘導する方法に付されている細胞である。いくつかの態様において、対照Ｔ細胞は、試験細胞が産生されたＴ細胞の開始／入力集団であってよい。いくつかの態様において、対照Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達の急性刺激のみに付され、Ｔ細胞受容体シグナル伝達の慢性刺激に付されていない（例えば、本明細書に記載されている方法の第１の工程に付されているが、かかる方法の第２の工程に付されていない）Ｔ細胞であってよい。他の適切な「試験」および「対照」細胞を、所望により選択することができる。
【００１５】
本方法の重要な特徴は、刺激がポリクローナルなＴ細胞上のＴＣＲの一般化刺激であってもまたは抗原特異的Ｔ細胞の抗原特異的刺激であっても、Ｔ細胞受容体の長期のインビトロでの刺激によってＴ細胞枯渇を産生することである。この長期の刺激は、（Ｔ細胞受容体シグナル伝達を急性的に刺激する）条件の第１のセット下で第１期間にわたってＴ細胞を培養すること、および次に、（Ｔ細胞受容体シグナル伝達を慢性的に刺激する）条件の第２のセット下で第２期間にわたってＴ細胞を培養することによって生産される。いくつかの態様において、第１期間は、約１−３日間（２４−７２時間）である。いくつかの態様において、第１期間は、約１−２日間（２４−４８時間）である。いくつかの態様において、第１期間は、約１１／２−２日間（３６−４８時間）である。いくつかの態様において、第１期間は、約２日間（４８時間）である。いくつかの態様において、第２期間は、約４−８日間（９６−１９２時間）である。いくつかの態様において、第２期間は、約６日間（１４４時間）である。いくつかの態様において、第２期間は、少なくとも約４日間（９６時間）である。いくつかの態様において、第２期間は、少なくとも約６日間（１４４時間）である。典型的には、第２期間中に、Ｔ細胞を再播種または分裂または継代してよく、またはそれらの培養液を数回交換または補充してよい。例えば、いくつかの態様において、Ｔ細胞を再播種または分裂または継代してよく、または第２期間中に、約１−２日ごとにそれらの培養液を交換または補充してよい。典型的には、第２期間中に、Ｔ細胞を再播種または分裂または継代して、またはそれらの培養培地を数回交換または補充して、一般化されたＴＣＲ刺激の補充供給（例えば抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体）を提供してよい。例えば、いくつかの態様において、第２期間中に、Ｔ細胞を再播種または分裂または継代して、またはそれらの培養培地を約１−２日ごとに交換または補充してよい。
【００１６】
枯渇されたＴ細胞の産生のための方法を提供することに加えて、本発明はまた、本明細書において提供される方法を使用して得られた枯渇されたＴ細胞の集団を提供する。いくつかのこのような態様において、枯渇されたＴ細胞の集団は、枯渇されたＴ細胞の実質的に純粋な集団である。
【００１７】
本発明はまた、Ｔ細胞枯渇に対する１つ以上の試験薬剤の効果を評価するための種々の方法を提供する。例えば、１つの態様において、本発明は、Ｔ細胞枯渇に対する１つ以上の試験薬剤の効果を評価するための方法であって、（ａ）試験薬剤の存在下および試験薬剤の非存在下で、上記または本明細書の他の場所で記載のＴ細胞受容体のインビトロでの刺激によってＴ細胞枯渇を誘導する方法を行うこと、および（ｂ）工程（ａ）で生成されたＴ細胞において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、および／またはＰＤ−Ｌ１の発現、１つ以上のエフェクターサイトカインの生産、増殖率、標的細胞殺活性の１つ以上を測定するためにアッセイを行うこと、ここで、試験薬剤の存在下で生成されたＴ細胞が、試験薬剤の非存在下で生成されたＴ細胞と比較して、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、および／またはＰＤ−Ｌ１の発現の増加、１つ以上のエフェクターサイトカインの生産の減少、増殖率の減少、または標的細胞殺活性の減少を示すとき、試験薬剤はＴ細胞枯渇を増加させる、および、試験薬剤の存在下で生成されたＴ細胞が、試験薬剤の非存在下で生成されたＴ細胞と比較して、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、および／またはＰＤ−Ｌ１の発現の減少、１つ以上のエフェクターサイトカインの生産の増加、増殖率の増加、または標的細胞殺活性の増加を示すとき、試験薬剤はＴ細胞枯渇を減少させる、を含む、方法を提供する
【００１８】
同様に、別の態様において、本発明は、枯渇されたＴ細胞の再活性化に対する１つ以上の試験薬剤の効果を評価する方法であって、（ａ）本明細書に記載されている方法を使用して生成された枯渇されたＴ細胞の第１の集団と１つ以上の試験薬剤とを接触させて、Ｔ細胞の試験集団を生成すること、（ｂ）本明細書に記載されている方法を使用して生成された枯渇されたＴ細胞の第２の集団と試験薬剤なしまたは１つ以上の対照薬剤とを接触させて、Ｔ細胞の対照集団を生成すること、（ｃ）Ｔ細胞の試験集団およびＴ細胞の対照集団において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、および／またはＰＤ−Ｌ１の発現、１つ以上のエフェクターサイトカインの生産、増殖率、および／または標的細胞殺活性の１つ以上を測定するためにアッセイを行うこと、ここで、Ｔ細胞の試験集団が、Ｔ細胞の対照集団と比較して、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、および／またはＰＤ−Ｌ１の発現の増加、１つ以上のエフェクターサイトカインの生産の減少、増殖率の減少、または標的細胞殺活性の減少を示すとき、試験薬剤はＴ細胞再活性化を減少させる、および、Ｔ細胞の試験集団が、Ｔ細胞の対照集団と比較して、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、および／またはＰＤ−Ｌ１の発現の減少、１つ以上のエフェクターサイトカインの生産の増加、増殖率の増加、または標的細胞殺活性の増加を示すとき、試験薬剤はＴ細胞再活性化を増加させる、を含む、方法を提供する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、枯渇されたＴ細胞を再活性化する方法であって、枯渇されたＴ細胞と有効量のＮ−アセチルシステインとを接触させることを含む方法を提供する。同様に、別の態様において、本発明はまた、Ｔ細胞枯渇を低下または逆転させる方法であって、Ｔ細胞と有効量のＮ−アセチルシステインとを接触させることを含む方法を提供する。加えて、さらに別の態様において、本発明は、（例えば腫瘍への、または慢性感染症への）Ｔ細胞性免疫応答を刺激または増加させる方法であって、Ｔ細胞と有効量のＮ−アセチルシステインとを接触させることを含む方法を提供する。このような態様のいくつかにおいて、Ｔ細胞は生きている対象においてインビボであり、方法が有効量のＮ−アセチルシステインを生きている対象に投与することを含む。いくつかのこのような態様において、対象はヒトである。このような態様のいくつかにおいて、方法は、Ｔ細胞と免疫チェックポイントインヒビター、例えばＰＤ１インヒビター、ＰＤＬ１インヒビター、またはＣＴＬＡ４インヒビターとを接触させることをさらに含む。
【００２０】
本発明のこれらおよび他の局面は、本特許出願の「図面の簡単な説明」、「図面」、「実施例」、および「特許請求の範囲」セクションにさらに説明されている。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ−Ｈ】抗原特異的マウスＴ細胞システムにおけるインビトロでの枯渇。図１Ａ。インビトロでの抗原特異的Ｔ細胞枯渇モデルの略図。ＯＴ−Ｉオボアルブミン特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、マウス脾臓およびリンパ節から単離した。次に、それらを、抗原提示細胞として脾臓の樹状細胞を使用して、２日間ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＴ−Ｉ−特異的オボアルブミンペプチド）で刺激した。２日間の刺激後、さらに６日間ペプチドの非存在下で細胞をＢ１６黒色腫細胞と共培養した。表現型検査を、再刺激有りまたは無しで、マルチカラーフローサイトメトリーを使用して行った。慢性刺激は、抑制性共受容体ＰＤ−１（図１Ｂ）、ＰＤ−Ｌ１（図１Ｆ）、およびＬＡＧ−３（図１Ｃ）の上方調節、転写因子エオメソデルミンの誘導（図１ＧおよびＨ）、およびエフェクターサイトカイン生産の抑制（図１ＤおよびＥ）によって示されるように、Ｔ細胞枯渇を誘導した。
【００２２】
【図２Ａ−Ｂ】抗原特異的マウスＴ細胞システムにおけるインビトロでの枯渇。図２Ａ。インビトロでの抗原特異的Ｔ細胞枯渇モデルの略図。表現型検査を、フローサイトメトリーを使用して行った。慢性刺激は、抑制性共受容体ＰＤ−１の上方調節およびエフェクターサイトカインＴＮＦ−α生産の抑制（図２Ｂ）によって示されるように、Ｔ細胞枯渇を誘導した。
【００２３】
【図３Ａ−Ｇ】ポリクローナルなＴ細胞システムにおけるインビトロでの枯渇。図３Ａ。インビトロでのＴ細胞枯渇モデルの略図。モデルはマウスまたはヒトのＴ細胞を利用することができる。図３Ｂ−Ｅに示されるデータは、野生型Ｃ５７／ＢＬ６マウスから得られたマウスＴ細胞を使用して産生された。単離されたＣＤ３＋  Ｔ細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を結合したプレートで２日間刺激した。２日間の刺激後、さらに６日間２日ごとに細胞を、ＩＬ−２のみでインキュベートしたか、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８でコーティングされたプレートに連続的に再播種した。表現型検査を、再刺激有りまたは無しで、マルチカラーフローサイトメトリーを使用して行った。慢性刺激は、抑制性共受容体ＰＤ−１（図３Ｂ）およびＬＡＧ−３の発現（図３Ｃ）およびサイトカインの抑制生産（図３ＤおよびＥ）を含む、Ｔ細胞枯渇の表現型および機能的特徴を誘導した。同様の結果が、健常ドナーから単離されたヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞を使用して得られた（図３Ｆ−Ｇ）。図３Ｆ。健常ドナーから単離されたヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞を使用するインビトロでのポリクローナルなＴ細胞枯渇モデルの略図。表現型検査を、フローサイトメトリーを使用して行った。慢性刺激は、抑制性共受容体ＰＤ−１の上方調節およびエフェクターサイトカインＴＮＦ−α生産の抑制（図３Ｇ）によって示されるように、Ｔ細胞枯渇を誘導した。
【００２４】
【図４Ａ−Ｃ】インビトロで枯渇されたＴ細胞は、腫瘍浸潤性の枯渇されたＴ細胞、慢性ウイルス感染からのＴ細胞、および免疫療法の非応答者に類似している。単離されたＣＤ３＋  Ｔ細胞を、前の図のように急性的にまたは慢性的に刺激した。次に、慢性的におよび急性的に刺激された細胞のＲＮＡ−ｓｅｑを、枯渇された腫瘍浸潤性マウスＴ細胞（図４Ａ）、慢性ＬＣＭＶ感染を有するマウスからの枯渇されたＴ細胞（図４Ｂ）、および抗ＰＤ−１または抗ＣＴＬＡ−４のいずれかでチェックポイント遮断を受け、応答しなかった患者から単離されたＴ細胞（図４Ｃ）からの発現プロフィールと比較した。結果は、インビトロで枯渇されたＴ細胞が、腫瘍および慢性ウイルス感染の両方から単離されたＴ細胞と転写的に類似しており、重要なことには、チェックポイント遮断に応答しない患者からのＴ細胞を効果的にモデル化するということを証明する。
【００２５】
【図５】慢性的に刺激されたＴ細胞は殺さない。ＯＴ−Ｉ  オボアルブミン特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、図１と同様に活性化した。急性または慢性刺激の８日後、Ｔ細胞を、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドとパルスされており、ルシフェラーゼレポーターを発現するＢ１６マウス黒色腫細胞と２４時間共培養した。殺能力は、Ｔ細胞と共培養されたパルスされていないＢ１６細胞と比較した残留発光として定量化された。図５のデータは、慢性的に刺激されたＴ細胞がＢ１６黒色腫細胞を殺すことができないことを証明した。
【００２６】
【図６Ａ−Ｂ】慢性的なＴＣＲ刺激は、ＣＤ８  Ｔ細胞増殖を制限する。図６Ａ−モデル／方法の略図。このモデルは、マウスまたはヒトのＴ細胞を利用することができる。図６Ｂに示されているデータは、野生型Ｃ５７／ＢＬ６マウスから得られたマウスＣＤ８＋  Ｔ細胞を使用して産生された。単離されたＣＤ８＋  Ｔ細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を結合したプレートで２日間刺激した。２日間の刺激後、さらに６日間２日ごとに細胞を、ＩＬ−２のみでインキュベートしたか、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８でコーティングされたプレートに連続的に再播種した。Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターを使用して、２日ごとに細胞をカウントした。図６Ｂのデータは、慢性的な抗原刺激がＴ細胞増殖を制限することを証明する。同様の結果は、健康ドナーから単離されたヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞を使用して得られた。
【００２７】
【図７Ａ−Ｂ】慢性的なＴＣＲ刺激は、ＣＤ４  Ｔ細胞増殖を制限する。慢性的なＴＣＲ刺激は、ＣＤ８  Ｔ細胞増殖を制限する。図７Ａ−モデル／方法の略図。このモデルは、マウスまたはヒトのＴ細胞を利用することができる。図７Ｂに示されているデータは、野生型Ｃ５７／ＢＬ６マウスから得られたマウスＣＤ４＋  Ｔ細胞を使用して産生された。単離されたＣＤ４＋  Ｔ細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を結合したプレートで２日間刺激した。２日間の刺激後、さらに６日間２日ごとに細胞を、ＩＬ−２のみでインキュベートしたか、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８でコーティングされたプレートに連続的に再播種した。Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターを使用して、２日ごとに細胞をカウントした。図７Ｂのデータは、慢性的な抗原刺激がＴ細胞増殖を制限することを証明する。同様の結果は、健康ドナーから単離されたヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞を使用して得られた。
【００２８】
【図８Ａ−Ｄ】慢性的なＴＣＲ刺激は、持続的な好気的解糖を誘導する。図８Ａ−モデル／方法の略図。単離されたＣＤ３＋  Ｔ細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を結合したプレートで２日間刺激した。２日間の刺激後、さらに６日間２日ごとに細胞を、ＩＬ−２のみでインキュベートしたか、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８でコーティングされたプレートに連続的に再播種した。８日目に、培地を回収し、ＹＳＩ生化学分析器を使用してグルコースおよび乳酸の濃度について分析した。グルコースおよび乳酸の消費および排出を、細胞を含むウェルからの培地を培地のみと比較することによって計算した。結果は、慢性的に刺激されたＴ細胞は、急性的に刺激されたＴ細胞よりも多くのグルコースを消費し（図８Ｂ）、消費されたグルコースの分子あたりより多くの乳酸を排出する（図８Ｃ−Ｄ）ということを証明する。
【００２９】
【図９Ａ−Ｄ】慢性的なＴＣＲ刺激は、持続的な好気的解糖を誘導する。図９Ａ−モデル／方法の略図。単離されたＣＤ３＋  Ｔ細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を結合したプレートで２日間刺激した。２日間の刺激後、さらに６日間２日ごとに細胞を、ＩＬ−２のみでインキュベートしたか、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８でコーティングされたプレートに連続的に再播種した。８日目に、細胞を９６ウェルプレートに再播種し、Ｓｅａｈｏｒｓｅ９６ウェル細胞外フラックスアナライザーを使用して酸素消費率および細胞外酸性化率について分析した。結果は、慢性的に刺激されたＴ細胞が、急性的に刺激されたＴ細胞よりも高い細胞外酸性化率（図９Ｃ−Ｄ）および低い酸素消費率（図９Ｂ、図９Ｄ）を示すということを証明する。
【００３０】
【図１０Ａ−Ｂ】インビトロで枯渇されたＴ細胞を使用する代謝アイソトープ追跡。単離されたＣＤ３＋  Ｔ細胞を、（ポリクローナルモデル）記載されているように急性的にまたは慢性的に刺激した。８日間の培養後、Ｔ細胞を普遍的にＣ１３標識されたグルコース（上）またはグルタミン（下）の存在下で６時間培養した。細胞を氷冷メタノールで固定し、代謝産物を抽出し、誘導体化し、およびガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）によりならびに液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により分析した。図１０Ａ−Ｂのデータは、慢性的に刺激されたＴ細胞が、慣用的に刺激されたＴ細胞と比較して、トリカルボン酸回路中間体の標識化に顕著な違いを示すことを示している。図１０Ａおよび図１０Ｂは、それぞれの水平軸に示されているように、さまざまなトリカルボン酸回路中間体についてのデータを提供する。
【００３１】
【図１１Ａ−Ｂ】高グルコースの利用可能性の条件下で、慢性的なＴ細胞刺激は酸化ストレスを誘導する。図１１Ａ−関連する代謝経路の略図。単離されたＣＤ８＋およびＣＤ４＋  Ｔ細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を結合したプレートで２日間刺激した。２日間の刺激後、さらに６日間２日ごとに細胞を、ＩＬ−２のみでインキュベートしたか、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８でコーティングされたプレートに連続的に再播種した。８日目に、フローサイトメトリーによるＧＦＰ蛍光の評価の前に、クロロメチル２’、７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＣＭ−ＤＣＦＤＡ）を３０分間細胞に加えた。ＣＭ−ＤＣＦＤＡは、活性酸素種（ＲＯＳ）の存在下で酸化されたときにのみ、ＧＦＰチャネルで蛍光を発するため、細胞内でＲＯＳの相対的な蓄積を反映する。図１１Ｂに示されている結果は、慢性的に（Ｃｈ）刺激されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞が、急性的に刺激された（Ａｃ）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞と比較して活性酸素種の蓄積の増加を示すということを証明する。
【００３２】
【図１２Ａ−Ｂ】低グルコースの利用可能性の下で、慢性的に刺激されたＴ細胞は生き残ることができない。単離されたＣＤ３＋  Ｔ細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を結合したプレートで２日間刺激した。２日間の刺激後、示されるように２０ｍＭ  グルコース、２ｍＭ  グルコースまたは０．５ｍＭ  グルコースのいずれかを含む培地中でさらに６日間２日ごとに細胞を、ＩＬ−２のみでインキュベートしたか、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８でコーティングされたプレートに連続的に再播種した。Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターを使用して、２日ごとに細胞をカウントした。図１２Ａ−Ｂに示されるデータは、慢性的に刺激されたＴ細胞（図１２Ａ）が、急性的に刺激されたＴ細胞（図１２Ａ）と比較して、低い細胞外グルコース利用可能性に対する感受性が増加することおよび低い細胞外グルコース利用可能性に対する増加した感受性を示すということを証明する。
【００３３】
【図１３Ａ−Ｂ】Ｎ−アセチルシステインは、慢性的に刺激されたＴ細胞の増殖を回復させる。図１３Ａ−モデル／方法の略図。単離されたＣＤ３＋  Ｔ細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を結合したプレートで２日間刺激した。２日間の刺激後、１０ｍＭ  Ｎ−アセチルシステインの存在または非存在下でさらに６日間２日ごとに細胞を、ＩＬ−２のみでインキュベートしたか、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８でコーティングされたプレートに連続的に再播種した。Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターを使用して、２日ごとに細胞をカウントした。図１３Ｂに示されているデータは、Ｎ−アセチルシステインが慢性的な刺激によって課せられた増殖の障害を完全に逆転させるということを証明する。
【００３４】
【図１４Ａ−Ｄ】Ｎ−アセチルシステインは内因性のＴ細胞枯渇を逆転させる。単離されたＣＤ３＋  Ｔ細胞を、抗ＰＤ−Ｌ１なし（図１４Ａ）または抗ＰＤ−Ｌ１（図１４Ｂ）および／またはＮ−アセチルシステイン（１０ｍＭ）（図１４Ｃ）の存在下または非存在下で、本明細書の他の場所に記載されているように急性的にまたは慢性的に刺激した。８日間の培養後、細胞をサイトカイン生産のために再刺激したか（上記）、または特定の抗原を発現する腫瘍細胞と共培養した。慢性的に刺激されたＴ細胞はサイトカイン生産の低下を示し（図１４Ａ）、腫瘍細胞を殺すことができなかった（図１４Ｄ）。このことは、抗ＰＤ−Ｌ１療法（図１４Ｂ、図１４Ｄ）によって最小限に救われたが、Ｎ−アセチルシステイン（図１４Ｂ、図１４Ｄ）によって効果的に逆転させた。
【００３５】
【図１５Ａ−Ｃ】Ｎ−アセチルシステインは、ＣＡＲ−Ｔ細胞枯渇を逆転させる。ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞をＣＤ１９発現Ａ２０リンパ腫細胞を有するマウスに移すことによって、枯渇されたＣＡＲ−Ｔ細胞を産生した。１４日後、ＣＡＲ−Ｔ細胞をマウスの脾臓から単離し、増殖能、酸化ストレス、およびサイトカイン生産について調べた。ビヒクルで処理された枯渇されたＣＡＲ−Ｔ細胞（ピンク色）は増殖できず（図１５Ａ）、またはサイトカインを生産できず（図１５Ｃ）、活性酸素種のレベルの上昇を示した（図１５Ｂ）。Ｎ−アセチルシステイン処理（１０ｍＭ）は、酸化ストレス（図１５Ｂ）を減らしながら、ＣＡＲ−Ｔ細胞増殖（図１５Ａ）およびサイトカイン生産（図１５Ｃ）を増強した。
【００３６】
【図１６Ａ−Ｂ】Ｎ−アセチルシステインはＴ細胞メモリーを回復させる。単離されたＣＤ３＋  Ｔ細胞を、本明細書に記載されているように急性的にまたは慢性的に刺激した。８日間の培養後、ＲＮＡを抽出し、転写因子Ｔｃｆ７を定義するメモリーＴ細胞の発現について分析した。Ｎ−アセチルシステインはＴｃｆ７の発現を回復させたが、これは慢性的な刺激中に著しく失われた（図１６Ａ）。チェックポイントインヒビターを受けた黒色腫を有する患者からの腫瘍浸潤Ｔ細胞を抽出し、シングルセルＲＮＡ−ｓｅｑにより分析した。遺伝子発現分析は、酸化ストレスの誘導がＴ細胞メモリーの産生と強い逆相関を有したことを示し（図１６Ｂ）、Ｎ−アセチルシステインでの酸化ストレスを逆転させることがメモリーＴ細胞分化を回復させることによってＴ細胞免疫療法を強化することができるという仮説と一致する。
【００３７】
【図１７Ａ−Ｃ】ｘＣＴの過剰発現は、Ｔ細胞の抗腫瘍機能を改善する。単離されたＣＤ３＋  Ｔ細胞を、本明細書に記載されているように急性的にまたは慢性的に刺激した。細胞を、対照コンストラクト（ＥＶ）またはシステイントランスポーターｘＣＴを発現するコンストラクトのいずれかにレトロウイルス感染した（図１７Ａ）。ｘＣＴの過剰発現は、慢性刺激中のＴ細胞増殖（図１７Ｂ）およびサイトカイン生産（図１７Ｃ）の両方の喪失を逆転させた。
【００３８】
【図１８Ａ−Ｃ】オフタルミン酸(Ophthalmate)は、枯渇されたＴ細胞の酸化ストレスに対するバイオマーカーであり、Ｎ−アセチルシステインによって逆転させる。単離されたＣＤ３＋  Ｔ細胞を、Ｎ−アセチルシステイン（１０ｍＭ）の存在または非存在下で、本明細書に記載されているように急性的にまたは慢性的に刺激した。８日後、ＬＣ−ＭＳにより細胞内のオフタルミン酸レベルについて分析した。図１８Ａの概略図は、グルタチオンが枯渇され、通常はグルタチオンを合成する酵素が脱抑制されたときに、通常はグルタチオンを合成する酵素によってオフタルミン酸がどのように産生されるかを証明している。オフタルミン酸レベルは慢性的に刺激されたＴ細胞においてより高く（図１８Ｂ）、このことはＮ−アセチルシステインの投与によって逆転させた（図１８Ｃ）。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
詳細な説明
本発明の主な態様は、本特許出願の「発明の概要」、「図面の簡単な説明」、「図面」、「実施例」、および「特許請求の範囲」のセクションに記載されている。この詳細な説明のセクションは、本発明に関連する特定の追加の定義および説明を提供し、本特許出願の他のすべてのセクションと併せて読まれることを意図している。
【００４０】
本明細書および特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。「ａ」（または「ａｎ」）という用語、および「１つ以上」および「少なくとも１つ」という用語は互換的に使用することができる。
【００４１】
さらに、「および／または」は、２つの特定の特徴または構成要素のそれぞれの特定の開示として、他方の有無にかかわらず解釈されるべきである。したがって、「Ａおよび／またはＢ」などの句で使用される「および／または」という用語は、ＡおよびＢ、ＡまたはＢ、Ａ（単独）、およびＢ（単独）を含むことを意図している。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの句で使用される「および／または」という用語は、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＢ；ＡまたはＣ；ＢまたはＣ；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）を含むことを意図している。
【００４２】
単位、接頭辞、および記号は、これらの国際単位系（Ｓｙｓｔｅｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｕｎｉｔｅｓ）（ＳＩ）で承認された形式で示される。本明細書で提供される数値範囲は、範囲を定義する数値を含む。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、「約」および「おおよそ」という用語は、数値に関連して使用されるとき、記載された値の＋または−２０％以内を意味する。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、略語「ＡＰＣ」は、抗原提示細胞を指す。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、略語「ＩＬ−２」または「ＩＬ２」は、インターロイキン２を指す。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、略語「ＩＦＮγ」は、インターフェロンガンマを指す。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、略語「ＴＮＦα」は、腫瘍壊死因子アルファを指す。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、略語「ＬＡＧ３」は、リンパ球活性化遺伝子３を指す。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、略語「ＰＤ−１」は、プログラム死１を指し、これは、プログラム死タンパク質１またはプログラム細胞死タンパク質１としても知られている。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、略語「ＰＤ−Ｌ１」は、ＰＤ−１に対するリガンドを指す。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、略語「ＥＯＭＥＳ」は、転写因子エオメソデルミンを指す。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、「抗原特異的」という用語は、Ｔ細胞に関して使用されるとき、興味ある所定の抗原に結合するＴ細胞を指す。「抗原特異的」という用語は、（ａ）すべてがまったく同じＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞、すなわち「モノクローナル抗原特異的Ｔ細胞」、（ｂ）異なるＴＣＲを有するが、興味ある所定の抗原の同じエピトープ／ペプチドに結合するＴ細胞、および（ｃ）異なるＴＣＲを有し、興味ある所定の抗原内から異なるエピトープ／ペプチドに結合するＴ細胞を含む。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、「ポリクローナル」という用語は、Ｔ細胞に関して使用されるとき、異なる抗原特異性を有するＴＣＲを有するＴ細胞の集団、すなわち特定の抗原に特異的ではないＴ細胞の集団を指す。したがって、「ポリクローナル」および「非抗原特異的」という用語は、本明細書においてＴ細胞に関して互換的に使用することができる。
【００５４】
本発明の態様のいくつかは、抗体を含む。本明細書において使用されるとき、「抗体」という用語は、無傷なポリクローナル抗体、無傷なモノクローナル抗体、単一ドメイン抗体、ナノボディ、抗体フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）変異体、多重特異性抗体、例えば少なくとも２つの無傷な抗体から産生される二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、および抗体が所望の生物学的活性を示す限り、抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を含む。いくつかの態様において、抗体は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる重鎖定常ドメインのアイデンティティに基づいて、免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、またはそれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のいずれかの免疫グロブリン分子であってよい。免疫グロブリンの異なるクラスは、異なるよく知られているサブユニット構造および三次元立体配置を有する。抗体は、ネイクド(naked)であるか、毒素、放射性同位体、または本明細書に記載されている他の特定の分子のいずれかなどの他の分子にコンジュゲートされていてよい。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、「有効量」という用語は、本明細書に具体的に記載されているもの（例えば、Ｔ細胞枯渇の逆転）などの１つまたは複数の望ましい結果を達成する、または達成に寄与するのに十分である、本明細書に記載されている活性剤の量を指す。個々の場合における適切な「有効」量は、用量漸増試験などの当技術分野で知られている標準的な技術を使用して決定してよく、インビトロまたはインビボでの使用が望ましいか否か、投与の望ましい経路（例えば、全身  対  腫瘍内）、投与の望ましい頻度などの要因を考慮して決定してよい。さらに、「有効量」は、使用される任意の共投与方法の文脈において決定されてよい。当業者は、かかる投与試験を容易に行って（単一の薬剤または薬剤の組み合わせを使用するかどうかにかかわらず）、使用する適切な用量を決定することができる。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、「対象」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、齧歯動物（ラット、マウスおよびモルモットなど）、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどを含むがこれらに限定されないすべての哺乳動物種を含み、畜産で使用されるすべての哺乳動物種、ならびにペットおよび動物園などで飼育されている動物を含む。好ましい態様において、対象はヒトである。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、「実質的に純粋」という用語は、７５％を超える、好ましくは８０％を超える、さらに好ましくは９０％を超える、より好ましくは９５％を超える純度を指す。
【００５８】
「阻害する」、「減少する」、「遮断する」、および「抑制する」などの用語は、本明細書で互換的に使用されてよく、指定されたパラメーターの完全な阻害を含む、指定されたパラメーター（例えば、指定された生物学的活性または指定されたマーカーの発現）の任意の検出可能なおよび統計的に有意な減少を指す。例えば、「阻害」という用語（および互換性のある用語）は、指定されたパラメーターにおいて約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の減少を指してよい。例えば、「減少」という用語がＴ細胞枯渇のマーカーへの影響（ＰＤ−１発現など）を説明するために使用されるとき、この用語はそのマーカーを統計的に有意に減少させることを指してもよい。減少の量は、適切な対照、例えば本明細書に記載の対照または当業者によって容易に選択される対照と比較して決定してよい。いくつかの態様において、「阻害する」、「減少する」、「遮断する」、および「抑制する」という用語は、例えば本明細書に記載されたアッセイの１つを使用して、決定されるとき、指定されたパラメーターの少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％または約１００％の減少を指す。
【００５９】
「刺激する」、「増加する」、「増強する」、「誘導する」などの用語は、本明細書で互換的に使用されてよく、指定されたパラメーターの完全な刺激を含む、指定されたパラメーター（例えば、指定された生物学的活性または指定されたマーカーの発現）の任意の検出可能なおよび統計的に有意な増加を指す。例えば、「増加」という用語（および互換性のある用語）は、指定されたパラメーターにおいて約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％、約２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、またはそれ以上の増加を指してよい。例えば、「増加」という用語がＴ細胞枯渇のマーカーへの影響（エフェクターサイトカイン生産など）を説明するために使用されるとき、この用語はそのマーカーを統計的に有意に増加させることを指してもよい。増加の量は、適切な対照、例えば本明細書に記載の対照または当業者によって容易に選択される対照と比較して決定してよい。いくつかの態様において、「増加」という用語（および互換性のある用語）は、例えば本明細書に記載されたアッセイの１つを使用して、決定されるときの指定されたパラメーターにおいて、指定されたパラメーターの少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％または少なくとも１００％、または少なくとも２倍、または少なくとも４倍、または少なくとも６倍、または少なくとも８倍、または少なくとも１０倍の増加を指す。
【００６０】
他の略語および定義は、この特許明細書の他の場所で定義されているか、または当技術分野におけるそれらの通常の意味にしたがって使用される。
【００６１】
本明細書に記載のＴ細胞枯渇方法を誘導する方法についての開始点／入力として使用されるＴ細胞は、任意の適切なＴ細胞であってよい。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、抗原特異的ではない−すなわち、それらはポリクローナルＴ細胞である。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、抗原特異的Ｔ細胞である。いくつかの態様において、抗原特異的Ｔ細胞は、興味ある所定の抗原の同じエピトープ／ペプチドに結合する。いくつかの態様において、抗原特異的Ｔ細胞は、モノクローナル抗原特異的Ｔ細胞である。いくつかの態様において、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。いくつかの態様において、Ｔ細胞はマウスＴ細胞である。いくつかの態様において、Ｔ細胞はＣＤ３＋  Ｔ細胞である。いくつかの態様において、Ｔ細胞はＣＤ４＋  Ｔ細胞である。いくつかの態様において、Ｔ細胞はＣＤ８＋  Ｔ細胞である。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、野生型（遺伝子操作されていない）Ｔ細胞である。いくつかの態様において、Ｔ細胞は遺伝子操作されたＴ細胞である。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）であり、すなわち、それらは、キメラ抗原受容体を含む。
【００６２】
本明細書に記載のＴ細胞枯渇方法を誘導する方法についての開始点／入力として使用されるＴ細胞は、任意の適切な供給源から入手できる。例えば、いくつかの態様において、Ｔ細胞は、培養されたＴ細胞（例えば、Ｔ細胞系）であってよい。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、動物から得てよい。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、マウスから得てよい。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、ヒトから得てよい。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、血液サンプルから得てよい。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、ドナー血液サンプルから得てよい。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、末梢血単核細胞のサンプルから得てよい。動物（ヒトを含む）からＴ細胞を得る方法は、当技術分野でよく知られている。同様に、特定の特徴を有するＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞またはＣＤ８＋  Ｔ細胞）を得る方法もまた、当技術分野でよく知られている。
【００６３】
本明細書に記載される方法のいくつかは、「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）を含む。ＡＰＣは、Ｔ細胞による認識のためにそれらの表面上のＭＨＣ分子上に抗原からのペプチドを提示できる細胞である。いくつかの態様において、任意の適切なＡＰＣを使用してよい。いくつかの態様において、ＡＰＣは、それらの表面上のＭＨＣ  ＩＩ分子上にペプチドを提示できるプロフェッショナルＡＰＣである。いくつかの態様において、プロフェッショナルＡＰＣは、樹状細胞、マクロファージ、またはＢ細胞である。いくつかの態様において、ＡＰＣは、それらの表面上のＭＨＣ  Ｉ分子上にペプチドを提示できる非プロフェッショナルＡＰＣである。いくつかの態様において、非プロフェッショナルＡＰＣは、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞である。多くの態様において、ＡＰＣという用語は、この用語が使用される文脈から明らかであるように、プロフェッショナルＡＰＣを指すために使用される。例えば、（ａ）ＡＰＣまたは（ｂ）腫瘍細胞またはウイルス感染細胞のいずれかを使用することを指すそれらの態様において、言及されるＡＰＣは、すなわち非プロフェッショナルＡＰＣである腫瘍細胞またはウイルス感染細胞と区別されるように、プロフェッショナルＡＰＣである。
【００６４】
本発明は、以下の非限定的な「実施例」を参照することにより、さらに説明および理解することができる。実施例に提供される特定の説明に対する多くの修飾が、過度の実験なしに、そして本発明および本開示の範囲から逸脱することなく、実施することができることが当業者には明らかであろう。
【実施例】
【００６５】
実施例
これらの実施例は、インビトロでのＴ細胞枯渇の誘導およびモニタリングのための新しい方法の開発、特性化、および使用について記載している。これらの新しい方法は、ヒトおよび非ヒトのシステムの両方において（例えば、ヒトおよび非ヒト（例えばマウス）のＴ細胞の両方を使用する）、および抗原特異的刺激およびポリクローナル刺激の両方で、効果的である。本明細書に記載の新しい方法は、慢性ウイルス感染または腫瘍を有するマウスへのＴ細胞の養子移植によるＴ細胞枯渇を誘導するインビボでの方法など、インビボで誘導されるＴ細胞枯渇を必要とする従来の方法に対して有意な利点を提供する。さらに、本明細書に記載の方法は、本明細書に示されている、Ｔ細胞が薬物で再活性化できるか否かを試験することによってメカニズムを提供する。
【００６６】
実施例１
Ｔ細胞枯渇のインビトロモデルにおける開発および特性化
この実施例は、抗原特異的Ｔ細胞枯渇モデルおよびポリクローナルＴ細胞枯渇モデルのＴ細胞枯渇の２つのインビトロモデルの開発および特性化を説明する。
【００６７】
抗原特異的なＴ細胞枯渇モデル
図１Ａは、本発明による抗原特異的Ｔ細胞枯渇モデルの略図を提供する。この実施例に記載されているモデルのバージョンは、オボアルブミンペプチドに特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞を利用している。しかしながら、このモデルはまた、異なる抗原特異性を有するＴ細胞でも使用できる。この実施例において、オボアルブミンペプチドに特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む脾臓およびリンパ節を、ＯＴ−Ｉ  ＴＣＲトランスジェニックマウス（https://www.jax.org/strain/003831）から単離した。単一細胞懸濁液を産生し、赤血球を溶解し、ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、２−メルカプトエタノール、および１０ｎｇ／ｍＬ  組み換えＩＬ−２を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（以下「Ｔ細胞培地」と称する）中で抗原提示細胞として脾臓の樹状細胞を使用して、細胞を１マイクロモルのＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＴ−Ｉ特異的オボアルブミンペプチド）とともにインビトロで２日間インキュベートした。２日間の刺激後、細胞を回収し、遠心分離し、１マイクロモルのＳＩＩＮＦＥＫＬでパルスしたか、パルスしないままにしたＢ１６黒色腫細胞を含む６ウェルプレート上のＴ細胞培地に再播種した。この手順は、２日ごとに合計８日間繰り返された（２、４、および６日目に合計３回の継代）；結果として、細胞は４８時間ごとに新鮮な培地にあった。腫瘍細胞をこのアッセイにおいて慢性刺激のために使用して、Ｔ細胞が抗腫瘍応答中に持続性抗原に遭遇する状況をより忠実に（fidelitously）モデル化した。Ｂ１６黒色腫細胞は、ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞とバックグラウンドを共有するマウス（Ｃ５７／Ｂｌ６マウス）に由来するため、同種異系（allogeneic）反応を回避するために使用されたが、同様の結果が、他の同系（syngeneic）腫瘍、例えばＭＣ３８（大腸）およびＥＬ４（リンパ腫）細胞系、ならびに他のＴＣＲトランスジェニックＴ細胞、例えば黒色腫特異的ＰＭＥＬ  ＣＤ８  ＴＣＲトランスジェニックマウス（https://www.jax.org/strain/005023）で得られた。本明細書に記載のアッセイ（代謝アッセイなど）の多くに有用である同じ方法で一度に何百万ものＴ細胞の刺激を可能にするため、ＴＣＲトランスジェニックマウスを使用した。しかしながら、同様の結果が、わずか１０００個の抗原特異的Ｔ細胞、すなわち非トランスジェニックマウスおよび／またはヒトから容易に単離できるＴ細胞の数で見られた。ここで記載される腫瘍抗原特異的モデルを、ＣＤ８＋  Ｔ細胞のために使用した。しかしながら、ＭＨＣ−ＩＩ発現細胞系が使用されれば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞のために使用できた。我々は、慢性抗原提示のためのＤ０１１．１０  ＣＤ４  ＴＣＲトランスジェニックマウスおよびＲＡＷ２４７マクロファージで同様の結果を観察した。
【００６８】
ポリクローナルのＴ細胞枯渇モデル
図３Ａおよび図３Ｆは、一般化されたＴＣＲおよびＣＤ２８刺激が使用されるポリクローナルＴ細胞枯渇モデルの略図を提供する。一般化されたＴＣＲおよびＣＤ２８刺激を利用することには複数の利点がある。抗腫瘍免疫応答で頻繁にあるように、抗原特異的Ｔ細胞を単離することができない、特定の抗原が不明である、またはＴ細胞が複数の抗原に応答している状況にこのアッセイを適用できる。また、図３、６、および７に示すように、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の両方、およびマウスおよびヒトＴ細胞の両方に容易に適用することができる。これらの図において、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスの脾臓からのＴ細胞（図３Ａ−Ｅ、６および７）または健常ドナー末梢血単核細胞（図３Ｆ−Ｇ）を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＵｎｔｏｕｃｈｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ精製キットを使用するネガティブセレクションによって単離した。それらを、１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ−２を含むＴ細胞培地で２日間、３ｕｇ／ｍＬのプレート結合抗ＣＤ３（２Ｃ１１、ＥＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および１ｕｇ／ｍＬのプレート結合抗ＣＤ２８（３７．５１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で刺激した。２日間の刺激後、細胞をＩＬ−２のみを含むＴ細胞培地でインキュベートするか、抗ＣＤ３（３ｕｇ／ｍＬ）でコーティングされたプレートに連続的に再播種した。このプロセスは、さらに６日間（合計８日間）２日ごとに新鮮な培地で繰り返された。
【００６９】
インビトロでのＴ細胞枯渇モデルを使用して産生されたＴ細胞の特性化
上記のモデルを使用して産生されたＴ細胞の表現型を、Ｔ細胞枯渇の既知の特徴を評価するように特徴付けた。例えば、枯渇されたＴ細胞は、いくつかの抑制性受容体（例えばＰＤ−１、ＬＡＧ−３、およびＰＤ−Ｌ１）の発現の増加、エフェクターサイトカイン（例えばＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ２）の生産の減少、増殖率の減少、および標的細胞殺活性の減少（例えば、Wherry and Kurachi, 2015を参照）を示すことが知られている。さらに、エオメソデルミン（Ｅｏｍｅｓ）の高発現およびＴ−ｂｅｔの低発現を含む、特定の転写因子プロフィールを有する細胞の濃縮が、終末期の枯渇および病気の制御不良に関連している（Buggert et al., PLoS Pathogens, 17 Jul 2014, 10(7):e1004251、およびLi et al., Front Immunol. 2018 Dec 18;9:2981）。
【００７０】
Ｔ細胞枯渇と関連する因子の発現プロフィール
抑制性受容体ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、およびＰＤ−Ｌ１、およびエフェクターサイトカインＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ２の発現を、フローサイトメトリーにより分析した。簡潔には、本明細書に記載のように８日間急性的にまたは慢性的に刺激された細胞を、一晩休止した後に５０ｎｇ／ｍＬのホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）および５００ｎｇ／ｍＬのイオノマイシンを使用して再刺激した。９０分後、サイトカイン放出を防ぐためにブレフェルジンＡを加えた。３時間後、細胞を固定し、表面マーカーおよび細胞内サイトカインについて染色した。
【００７１】
結果は、ＰＤ−１（図１Ｂを参照）、ＰＤ−Ｌ１（図１Ｆを参照）、およびＬＡＧ−３（図１Ｃを参照）の上方調節、転写因子ＥＯＭＥＳの誘導（図１ＧおよびＨを参照）、およびエフェクターサイトカイン生産の抑制（図１ＤおよびＥを参照）によって示されるように、慢性的な抗原特異的刺激がＴ細胞枯渇を誘導したことを示した。同様の結果が図２において示され、ＰＤ−１発現の上方調節およびＴＮＦ−α生産の抑制によって示されるように、慢性的な抗原特異的刺激がＴ細胞枯渇を誘導することが示された（図２Ｂを参照）。
【００７２】
結果は、ＰＤ−１（図３Ｂを参照）およびＬＡＧ−３（図３Ｃを参照）の発現の増加およびサイトカイン生産の抑制（図３ＤおよびＥを参照）によって示されるように、慢性的なポリクローナル刺激もまたＴ細胞枯渇を誘導したことを示した。同様の結果が図４に示され、ＰＤ−１発現の上方調節およびＴＮＦ−α生産の抑制によって示されるように、慢性的なポリクローナル刺激がＴ細胞枯渇を誘導することが示された（図４Ｂ）。図３に示される結果は、マウスＴ細胞のポリクローナル刺激によって産生されたが、同様の結果がまた、健常ドナーから単離されたヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞が我々のポリクローナル刺激モデルにおいて使用されたときに得られた（図４）。
【００７３】
細胞殺活性
最後に、慢性ウイルス感染および癌の両方の文脈においてＴ細胞枯渇の特徴は、標的細胞の死滅がないこととして定義されるエフェクター機能の喪失を必要とする。したがって、このインビトロシステムを使用して産生された枯渇された細胞が標的細胞を殺すことができなかったことを確立することが不可欠であった。このことを実証するために、ＯＴ−Ｉ  ＴＣＲ  トランスジェニック  Ｔ−細胞を、本願明細書に記載されているように刺激した。刺激の８日後、Ｔ細胞を、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドの用量を増やしてパルスされたルシフェラーゼレポーターを発現するＢ１６−黒色腫細胞と共培養した。２４時間後、照度計を使用して発光を測定した。殺傷有効性を、特定のペプチドの非存在下でＴ細胞と共培養されたＢ１６細胞と比較した発光によって決定した。図５の結果は、このシステムを使用して産生されたインビトロで枯渇されたＴ細胞が実際にエフェクター機能を失ったということを証明する。
【００７４】
Ｔ細胞増殖
Ｔ細胞枯渇は増殖能の喪失と強く関連しており（Barber et al, Nature 2006）、枯渇されたＴ細胞の再活性化は増殖の急速な増加と関連している（Huang et al, Nature 2017）。したがって、我々は、我々のインビトロでの枯渇モデルがＴ細胞増殖を制限したか否かを調査した。単離されたＣＤ３＋  Ｔ細胞を、プレートに結合した抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で２日間刺激した。２日間の刺激後、さらに６日間２日ごとに細胞を、ＩＬ−２単独でインキュベートするか、抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８でコーティングされたプレート上に連続して再播種した。Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターを使用して、２日ごとに細胞をカウントし、慢性的な抗原刺激がＴ−細胞増殖を制限するということを明らかに証明する（図６Ｂ）。同様の結果が、健常ドナーから単離されたヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞を使用して得られた。
【００７５】
実施例２
代謝および転写の特性化
Ｔ細胞枯渇を理解するための従来のインビボシステムの最も強力な制限の１つは、この病理の発症に関連する細胞代謝の変化を理解できないことである。これには複数の理由がある：これらのシステムを使用して単離できる細胞の数は、質量分析ベースの代謝アッセイを制限しており、フローサイトメトリーベースの選別の過程で細胞の代謝が劇的に変化する。我々が図８−１１において証明するように、我々のインビトロシステムは、従来のシステムを使用して行われることができない方法において、Ｔ細胞枯渇の発生中にＴ細胞の代謝挙動を詳細に評価できる。我々は、Ｔ細胞枯渇の発生中に栄養素の利用がどのように根本的に変化するかを理解できる。これらの試験は、Ｔ細胞枯渇の代謝的特徴としての酸化ストレスの同定および治療的介入としてのＮ−アセチルシステインの開発につながった（図１２−１６）。したがって、この系は、従来のシステムを使用して同定することができない、Ｔ細胞枯渇の発生中に新しい代謝変化の発見を可能にさせる。
【００７６】
我々はまた、我々のインビトロシステムの詳細なトランスクリプトームプロファイリングを実行して、Ｔ細胞枯渇のプロセスを正確に再現できるようにした。図４に見られるように、インビトロで枯渇されたＴ細胞のトランスクリプトームプロフィールが、枯渇されたＴ細胞を生成するための２つのゴールドスタンダードのインビボモデルである、Ｔ細胞枯渇の腫瘍内特徴および慢性ウイルス感染からのＴ細胞の両方と密接に重なる。さらに、チェックポイントインヒビターで処置された患者から単離されたＴ細胞からの単一細胞のトランスクリプトームデータの分析は、我々のインビトロシステムがチェックポイント遮断に反応しなかった患者からのＴ細胞のトランスクリプトームプロフィールと強く相関することを示す。これは、我々のインビトロシステムがＴ細胞枯渇の正確なモデルであるだけでなく、実際に免疫療法における真の満たされていない要求を表すチェックポイントインヒビター難治性Ｔ細胞枯渇の非常に正確なモデルであることを示唆する。
【００７７】
実施例３
薬物による枯渇の逆転
本明細書において開発および説明されたインビトロシステムは、Ｔ細胞枯渇の特徴としての酸化ストレスの同定に直接的につながる代謝評価を可能にした。したがって、我々は、慢性刺激の２−８日間４８時間ごとにＮ−アセチルシステイン（１０ｍＭ）をＴ細胞培地に添加することによって、Ｔ細胞の成長およびエフェクター機能に対する慢性刺激の効果を逆転させるのに十分であるか否かを評価した。実際に、我々は、Ｎ−アセチルシステインが、Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン生産に対する慢性的な刺激の悪影響を完全に逆転させることができたこと、さらに、標的細胞の殺能力および抗ＰＤ−１応答性を完全に回復させたことを見出した。図１２−１６。さらに、この戦略はまた、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の枯渇を逆転させることにおいて効果的でもあった。このアッセイについて、ＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体を発現するようにレトロウイルスによって感染したＴ細胞を、Ａ２０  Ｂ細胞リンパ腫細胞を以前に投与されたマウスに養子移入した。このプロトコールは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の移入後１４日目までに「枯渇された」ＣＡＲ  Ｔ細胞を生成することが知られている。我々は、移植の１４日後に単離されたＣＡＲ  Ｔ細胞が、実際に、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８による再刺激後に高レベルの酸化ストレスを有し、これが培養培地にＮ−アセチルシステイン（１０ｍＭ）を加えることによって逆転させることができることを見出した；これにより、ＣＡＲ  Ｔ細胞がサイトカインを急増および産生することができた。さらに、Ｎ−アセチルシステインの投与が、記憶マーカーＴｃｆ７の誘導を回復し、この誘導は、チェックポイント遮断の有効性に重要であることが示されている。図１６。このことを決定するために、１０ｍＭ  Ｎ−アセチルシステインの存在下または非存在下で急性的または慢性的に刺激されているＴ細胞を、リアルタイム定量ＰＣＲを介してＴｃｆ７発現について評価した。結果は、Ｔｃｆ７の発現が慢性的な刺激によって抑制され、Ｎ−アセチルシステインの添加によって大幅に回復されることを明確に示している。この関係は、酸化ストレスの誘導に関連する遺伝子がＴｃｆ７の発現と負の相関関係にある、チェックポイントインヒビターで処置された黒色腫を有する患者からの単一細胞のＲＮＡ−ｓｅｑデータの分析によって確認される（Sade-Feldman Cell 2018）。最後に、Ｎ−アセチルシステインの効果は、ｘＣＴトランスポーターのレトロウイルス過剰発現を介してシステイン摂取を可能にすることによって大部分を再現することができる。図１７。したがって、酸化ストレスを逆転させるための薬理学的アプローチおよび遺伝学的アプローチの両方が、Ｔ細胞枯渇を大幅に逆転させることができる。
【図１Ａ−Ｈ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４Ａ−Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ−Ｂ】
2021521778.tif 000009
【図７Ａ−Ｂ】
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【図８Ａ−Ｄ】
2021521778.tif 000011
【図９Ａ−Ｄ】
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【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１１Ａ−Ｂ】
2021521778.tif 000014
【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１４Ａ−Ｄ】
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【図１５Ａ−Ｃ】
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【図１６Ａ−Ｂ】
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【図１７Ａ−Ｃ】
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【図１８Ａ−Ｃ】
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【国際調査報告】
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