(57)【要約】  本発明は、エクソソームが親和性精製を可能にするように操作される、薬物負荷細胞外小胞、特にエクソソームの親和性に基づく単離および精製に関する。
2021526817.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＥＶポリペプチドと、（ｉｉ）精製ドメインと、（ｉｉｉ）薬物負荷部分と、を含む、融合タンパク質。
【請求項２】
前記薬物負荷部分が、核酸（ＮＡ）結合タンパク質またはタンパク質結合ドメインである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ＥＶポリペプチドが、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ５４、ＣＤ５０、ＦＬＯＴ１、ＦＬＯＴ２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＩＸ、シンテニン−１、シンテニン−２、Ｌａｍｐ２ｂ、ＴＳＰＡＮ８、シンデカン−１、シンデカン−２、シンデカン−３、シンデカン−４、ＴＳＰＡＮ１４、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ１５１、ＣＤ２３１、ＣＤ１０２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＣＤ４９ｄ／ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ４１、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、Ｆｃ受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩ構成要素、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２５、ＣＤ１３５、ＣＤ１８４、ＣＤ２００、ＣＤ２７９、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ３６２、ＣＯＬ６Ａ１、ＡＧＲＮ、ＥＧＦＲ、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＲ２、ＧＬＵＲ３、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＳＰＧ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１、ＡＲＲＤＣ１、ＬＦＡ−１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、Ｍａｃ−１α、Ｍａｃ−１β、ＭＦＧＥ８、ＳＬＩＴ２、ＳＴＸ３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＶＴＩ１Ａ、ＶＴＩ１Ｂ、および任意の他のＥＶポリペプチド、ならびにこれらの任意の組み合わせ、誘導体、ドメイン、変異したバリアント、および／または領域を含む群から選択される、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ＥＶポリペプチドが、膜貫通または膜結合ポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記膜貫通または膜結合ＥＶポリペプチドが、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９、ＣＤ８２、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５５、ＬＡＭＰ２Ｂ、ＩＣＡＭ、インテグリン、および任意の他のＥＶポリペプチド、ならびにこれらの任意の組み合わせ、誘導体、ドメイン、変異したバリアント、または領域を含む群から選択される、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ＥＶポリペプチドが、前記融合タンパク質をエクソソーム膜に位置付ける膜貫通または膜結合ポリペプチドに融合された非膜貫通ポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記非膜貫通ＥＶポリペプチドが、前記融合タンパク質を前記エクソソーム膜に位置付ける膜貫通ポリペプチドに融合される、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記ＮＡ結合タンパク質が、ｍＲＮＡ結合タンパク質、ｍｉＲＮＡ結合タンパク質、ｐｒｅ−ｒＲＮＡ結合タンパク質、ｔＲＮＡ結合タンパク質、小核または核小体ＲＮＡ結合タンパク質、ノンコーディングＲＮＡ結合タンパク質、転写因子、ヌクレアーゼ、ＲＩＳＣタンパク質、およびこれらの任意の組み合わせ、誘導体、ドメイン、または一部を含む群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記ＮＡ結合タンパク質が、ＰＵＦ、ＰＵＦ５３１、ＰＵＦｘ２、ＤＤＸ３Ｘ、ＥＥＦ２、ＥＥＦ１Ａ１、ＨＮＲＮＰＫ、ＨＮＲＮＰＭ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＮＨＰＨ１、ＨＮＲＮＰＤ、ＨＮＲＮＰＵ、ＨＮＲＮＰＵＬ１、ＮＳＵＮ２、Ｃａｓ６、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ９、ＷＤＲ１、ＨＳＰＡ８、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＭＶＰ、ＰＣＢ１、ＭＯＣＳ３、ＤＡＲＳ、ＥＬＣ２、ＥＰＲＳ、ＧＮＢ２Ｌ１、ＩＡＲＳ、ＮＣＬ、ＲＡＲＳ、ＲＰＬ１２、ＲＰＳ１８、ＲＰＳ３、ＲＵＶＢＬ１、ＴＵＦＭ、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ＤＤＸ４、ＡＤＡＤ１、ＤＡＺＬ、ＥＬＡＶＬ４、ＥＬＡＶＬ１、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＨＮＲＮＰＱ、ＲＢＦＯＸ１、ＲＢＦＯＸ２、Ｕ１Ａ、ＰＰＲファミリー、ＺＲＡＮＢ２、ＮＵＳＡ、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、Ｌｉｎ２８、ＫＳＲＰ、ＳＡＭＤ４Ａ、ＴＤＰ４３、ＦＵＳ、ＦＭＲ１、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＥＩＦ４Ａ１〜３、ＭＳ２コートタンパク質、ＤＥＡＤ、ＫＨ、ＧＴＰ＿ＥＦＴＵ、ｄｓｒｍ、Ｇパッチ、ＩＢＮ＿Ｎ、ＳＡＰ、ＴＵＤＯＲ、ＲｎａｓｅＡ、ＭＭＲ−ＨＳＲ１、ＫＯＷ、ＲｎａｓｅＴ、ＭＩＦ４Ｇ、ｚｆ−ＲａｎＢＰ、ＮＴＦ２、ＰＡＺ、ＲＢＭ１ＣＴＲ、ＰＡＭ２、Ｘｐｏ１、Ｐｉｗｉ、ＣＳＤ、およびこれらの任意の組み合わせ、誘導体、ドメイン、領域、部位、変異したバリアント、または一部（複数可）のうちのいずれか１つである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記精製ドメインが、受容体、抗体結合ポリペプチド、Ｆｃ結合ポリペプチド、ポリヒスチジン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、インテインキチン結合ドメイン（Ｉ−ＣＢＤ）、ストレプトアビジン、アビジン、ＦＬＡＧエピトープタグ、ＨＡエピトープタグ、Ｔ７タグ、Ｓタグ、ＣＬＩＰ、ＤＨＦＲ、セルロース結合ドメイン、およびこれらの任意の組み合わせ、誘導体、ドメイン、または一部である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記Ｆｃ結合ポリペプチドが、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、プロテインＬＧ、Ｚドメイン、ＺＺドメイン、ヒトＦＣＧＲＩ、ヒトＦＣＧＲ２Ａ、ヒトＦＣＧＲ２Ｂ、ヒトＦＣＧＲ２Ｃ、ヒトＦＣＧＲ３Ａ、ヒトＦＣＧＲ３Ｂ、ヒトＦＣＧＲＢ、ヒトＦＣＡＭＲ、ヒトＦＣＥＲＡ、ヒトＦＣＡＲ、マウスＦＣＧＲＩ、マウスＦＣＧＲＩＩＢ、マウスＦＣＧＲＩＩＩ、マウスＦＣＧＲＩＶ、マウスＦＣＧＲｎ、ＦｃＩＩＩペプチド、およびそれらの任意の組み合わせ、誘導体、ドメイン、または一部を含む群から選択される、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質と関心対象の薬物との間の複合体であって、前記融合タンパク質の前記薬物負荷部分が、前記関心対象の薬物に結合することができる、複合体。
【請求項１３】
前記関心対象の薬物が、ＮＡ剤、タンパク質、および／またはペプチドである、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１４】
前記ＮＡ剤が、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ミニサークルＤＮＡ、および／またはプラスミドＤＮＡを含む群から選択される、請求項１２または１３に記載の複合体。
【請求項１５】
前記ＮＡ剤が、前記ＮＡ結合タンパク質が結合する少なくとも１つの天然に存在するかまたは人工的に導入される領域または部位を含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１６】
前記ＮＡ剤が、治療用タンパク質をコードする、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１７】
前記治療用タンパク質が、抗体、抗体断片、抗体誘導体、単一ドメイン抗体、内部抗体、単鎖可変断片、アフィボディ、酵素、トランスポーター、腫瘍抑制剤、ウイルスまたは細菌阻害剤、細胞成分タンパク質、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ修復阻害剤、ヌクレアーゼ、プロテイナーゼ、インテグラーゼ、転写因子、成長因子、アポトーシス阻害剤および誘導剤、毒素、構造タンパク質、神経栄養因子、膜輸送体、ヌクレオチド結合タンパク質、熱ショックタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、ならびにこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項１６に記載の複合体。
【請求項１８】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、細胞外小胞（ＥＶ）。
【請求項１９】
前記融合タンパク質が、関心対象の薬物との複合体の形態で存在する、請求項１８に記載のＥＶ。
【請求項２０】
前記関心対象の薬物が、前記ＥＶにおけるおよび／または標的環境における前記複合体から解離される、請求項１９に記載のＥＶ。
【請求項２１】
前記融合タンパク質の精製部分が前記ＥＶの外側に少なくとも部分的に存在する、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のＥＶ。
【請求項２２】
前記融合タンパク質の精製部分が精製リガンドと相互作用することができる、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のＥＶ。
【請求項２３】
前記ＥＶがエクソソームである、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載のＥＶ。
【請求項２４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項２４に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、細胞。
【請求項２６】
関心対象の薬物をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】
関心対象の薬物をコードする前記ポリヌクレオチドが、タンパク質、ペプチド、ｍＲＮＡ、短ヘアピンＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ガイドＲＮＡ、シングルガイドＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、および／またはこれらの任意の組み合わせもしくは誘導体をコードする、請求項２５または２６に記載の細胞。
【請求項２８】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むＥＶを産生するための方法であって、
（ｉ）ＥＶ産生細胞に、請求項２４に記載のポリヌクレオチドを導入するステップと、
（ｉｉ）前記ＥＶ産生細胞が、前記融合タンパク質を含むＥＶを産生することを可能にするステップと、を含む、方法。
【請求項２９】
関心対象の薬物を含むＥＶを産生するための方法であって、
（ｉ）ＥＶ産生細胞に、請求項２４に記載のポリヌクレオチドおよび関心対象の薬物をコードするポリヌクレオチドを導入するステップと、
（ｉｉ）前記ＥＶ産生細胞が、前記融合タンパク質を含むＥＶを産生することを可能にするステップであって、前記融合タンパク質の前記薬物負荷部分が、前記関心対象の薬物に結合し、それを前記ＥＶに輸送する、ステップと、を含む、方法。
【請求項３０】
関心対象の薬物をコードする前記ポリヌクレオチドが、タンパク質、ペプチド、ｍＲＮＡ、短ヘアピンＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ガイドＲＮＡ、シングルガイドＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、および／またはこれらの任意の組み合わせもしくは誘導体をコードする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２４に記載の前記ポリヌクレオチドおよび／または関心対象の薬物をコードする前記ポリヌクレオチドが、非ウイルスまたはウイルストランスフェクションを使用して、前記ＥＶ産生細胞に導入される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
関心対象の薬物を含むＥＶの精製の方法であって、
（ｉ）請求項１８〜２３のいずれか一項に記載のＥＶを提供するステップと、
（ｉｉ）前記ＥＶに含まれる前記融合タンパク質の精製部分が、精製リガンドに結合することを可能にするステップと、
（ｉｉｉ）前記精製リガンドに結合していないＥＶを除去するステップと、を含む、方法。
【請求項３３】
前記精製リガンドが、固相に付着される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記精製が、クロマトグラフィを使用して行われる、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１８〜２３のいずれか一項に記載のＥＶと、薬学的に許容可能な担体と、を含む、薬学的組成物。
【請求項３６】
医薬において使用するための、請求項３５に記載の薬学的組成物または請求項１８〜２３のいずれか一項に記載のＥＶ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞外小胞（ＥＶ）が親和性精製を可能にするように操作される、薬物負荷のＥＶ、特にエクソソームの親和性に基づく単離および精製に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外小胞（ＥＶ）は、ＥＶ産生細胞によって細胞外環境に放出される、ナノサイズの小胞（通常、流体力学直径で１０００ｎｍ未満）である。ＥＶ、特にエクソソーム（多くの場合、異なるパラメータ、例えば、その膜またはそのサイズにおける様々なテトラスパニンの存在によって規定される）は、抗体およびｓｉＲＮＡなどのタンパク質生物製剤を標的細胞に輸送することができ、組み換えタンパク質の特異性と組み合わせたＥＶの特性を利用する進歩的な生物学的治療法の全く新規な形態を可能にすることが示された。
【０００３】
ＥＶ（例えば、エクソソーム）を調製および単離するための従来の小規模な方法は、ＥＶが放出される培養培地中に存在する細胞または細胞残屑から小胞を分離するための一連の分画遠沈法のステップを含む。典型的には、一連の遠沈法が、例えば、３，０００ｇ、１０，０００ｇおよび７０，０００ｇ、または１００，０００ｇで適用され、その際に、チューブの底部に生じるペレットが、生理食塩水溶液でその元の体積の一部に対して再懸濁されて、濃縮されたＥＶまたはエクソソーム溶液を構成する。しかしながら、これらの方法は、以下の複数の理由のために、臨床応用に根本的に不適である：（１）プロセス全体に必要とされる時間の延長された長さ、（２）ＧＭＰ環境におけるスケールアップ、操作性、およびそれへの対応に関する問題、（３）細胞残屑による著しい汚染のリスク、（４）オペレータによる変動性のための再現性の乏しさ、（５）小胞のペレット化に起因するＥＶ／エクソソームの凝集、（６）処理の終了時の低回収性、ならびに（７）小胞形態、それによる潜在的な生体内分布および活性への悪影響。したがって、ＥＶを精製し、治療品質の小胞調製物の産生を可能にする改善された方法が必要である。そのために、ＰＣＴ出願第ＷＯ２０００／０４４３８９号は、陰イオン交換クロマトグラフィおよび／またはゲル浸透クロマトグラフィなどのクロマトグラフィ技術によって生体試料から膜小胞を調製する方法を開示している。ＷＯ２０１４／１６８５４８は、ＥＶのために大幅に改善された単離および精製方法、すなわち、濾過および様々な形態の液体クロマトグラフィの連続的な組み合わせ、例えば、限外濾過およびサイズ排除液体クロマトグラフィの組み合わせの使用を開示している。しかしながら、これらの技術は、ＥＶ内もしくはＥＶ上への操作された特定の部分もしくはドメインの存在、および／またはＥＶ中の薬物カーゴの存在にかかわらず、ＥＶの物理化学的特性、例えば、それらのサイズおよび電荷を主に利用している。したがって、当該技術分野においては、ＥＶの精製のための、例えば、治療用途、特に、特定の薬物カーゴで負荷されたＥＶの精製および濃縮のための、改善された、特異的な、薬物に重点を置いた方法がかなり必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２０００／０４４３８９号
【特許文献２】ＷＯ２０１４／１６８５４８
【発明の概要】
【０００５】
このため、ＥＶ、特に、様々な種類の薬物カーゴで負荷されたＥＶ集団からのＥＶの単離および精製に関連する上記で指摘している課題を克服することが本発明の目的である。さらに、本発明は、当該技術分野における他の既存のニーズを満たすこと、例えば、高収率かつ高特異性でのＥＶ精製のための一般に適用可能な親和性精製戦略を開発することを目的とする。
【０００６】
本発明は、単一の融合タンパク質コンストラクトを使用して、ＥＶへの薬物負荷およびかかるＥＶの親和性に基づく精製の両方を可能にする発明的タンパク質操作によってこれらの目的および他の目的を達成する。第１の態様では、本発明は、かかる発明的融合タンパク質に関し、少なくとも以下の構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）を含む：（ｉ）ＥＶポリペプチド（エクソソーム由来ポリペプチド、ＥＶタンパク質、エクソソーム由来タンパク質、および同様の用語とも交換可能に称される）、（ｉｉ）精製部分、ならびに（ｉｉｉ）薬物負荷部分。第２の態様では、本発明は、融合タンパク質と関心対象の薬物（ＤＯＩ）との複合体に関する。融合タンパク質とＤＯＩとの相互作用は、典型的には、融合タンパク質の薬物負荷部分と、ＤＯＩの部位、領域、ドメイン、または構造的もしくは化学的特徴との非共有相互作用（複数可）に基づく。
【０００７】
高度に発明的な態様では、本発明は、本発明の融合タンパク質を含む細胞外小胞（ＥＶ）に関する。さらに、上述のように、融合タンパク質は、その薬物負荷部分の助けを借りてＤＯＩと相互作用することができるため、ＥＶは、融合タンパク質との複合体の形態で存在し得るが、融合タンパク質から放出または解離され得、ＥＶ中に遊離ＤＯＩとして存在し得るＤＯＩをさらに含み得る。本発明による好ましいＤＯＩとしては、タンパク質、ペプチド、および／または核酸（ＮＡ）に基づく薬剤、例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、短ヘアピンＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、シングルガイドＲＮＡ、またはこれらの組み合わせ、例えば、Ｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲリボ核酸タンパク質などの様々な形態のＲＮＡ治療薬が挙げられる。本発明のＥＶは、好ましくは、エクソソームもしくは微小胞、またはエンドリソソーム経路もしくは形質膜から得られる任意の他の種類のＥＶである。
【０００８】
さらなる態様では、本発明は、本明細書の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびにかかるポリヌクレオチドを含むベクターおよび細胞に関する。本発明の細胞は、該融合タンパク質、ならびにＤＯＩをコードするポリヌクレオチドをさらに含み得る。
【０００９】
さらなる重要な態様では、本発明は、本発明による融合タンパク質を含むＥＶを産生する方法に関する。これらの方法は、典型的には、本発明による融合タンパク質を含むＥＶの集団を提供し、このような集団を親和性精製システム、例えば、固相上でリガンドへのＥＶに含まれる精製ドメインの結合を可能にするクロマトグラフィシステムに曝露するステップを含み、融合タンパク質および通常はＤＯＩを含むＥＶの捕捉を可能にする。より具体的には、かかる方法は、典型的には、（ｉ）当該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをＥＶ産生細胞に導入するステップと、（ｉｉ）ＥＶ産生細胞が融合タンパク質を含むＥＶを産生することを可能にするステップと、を含む。加えて、ＥＶ産生細胞が融合タンパク質を含むＥＶを産生することを可能にするために、関心対象の薬物（ＤＯＩ）をコードするポリヌクレオチドはＥＶ産生細胞に導入されてもよく、融合タンパク質の薬物負荷部分は、ＤＯＩに結合し、それをＥＶ内に輸送し、したがって、融合タンパク質およびＤＯＩの両方を含むＥＶを、典型的には、最初は複合体の一部として、しかし融合タンパク質からのＤＯＩを放出する結果として、単一の実体として生成する。ＤＯＩをコードするポリヌクレオチドは、タンパク質、ペプチド、ｍＲＮＡ、短ヘアピンＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ガイドＲＮＡ、シングルガイドＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、および／またはこれらの任意の組み合わせもしくは誘導体を含む、様々な種類の薬物カーゴをコードし得る。化学修飾オリゴヌクレオチドカーゴが特に好ましい。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は、ＤＯＩを含むＥＶの精製方法に関する。方法は、典型的には、（ｉ）本発明によるＥＶを提供するステップと、（ｉｉ）ＥＶに含まれる融合タンパク質の精製部分が精製リガンドに結合することを可能にするステップと、（ｉｉｉ）精製リガンドに結合していないＥＶを除去するステップと、を含む。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、ＥＶおよび薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物、ならびに薬学的組成物またはＥＶ（およびＥＶの集団）を使用する医学的使用および医学的治療に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】薬物負荷部分、エクソソームタンパク質、および精製ドメインを含む融合タンパク質を含む、エクソソームなどのＥＶの概略図を示す。ＥＶはさらに、薬物カーゴ分子、この場合、非限定的な例として、ヘアピンＲＮＡの形態のＲＮＡカーゴ分子を含み、これは薬物負荷部分によって結合され、次いで融合タンパク質の精製ドメインを使用して精製されるＥＶ内に移動される。
【図２】２つの異なる精製プロセスを使用して精製されたＥＶバッチからの出力を比較する。ＥＶは、エクソソームタンパク質としてのＣＤ６３、精製ドメインとしてのＺＺドメイン、およびｍＲＮＡ薬物負荷のための薬物負荷部分としてのＣａｓ６を含む融合タンパク質を含むように遺伝子操作された。Ｃａｓ６  ｍＲＮＡ負荷ドメインの助けを借りてエクソソームにナノルシフェラーゼｍＲＮＡを負荷し、エクソソーム媒介送達後に翻訳された全ｍＲＮＡを、生物発光読み出しを使用して評価した。図２において認識できるように、ＴＦＦおよびビーズ溶出サイズ排除クロマトグラフィ（ＢＥ−ＳＥＣ精製）の組み合わせによって、約５Ｅ８個のＲＬＵを生成したが、ＩｇＧカラムに基づく親和性クロマトグラフィプロセスは、最終ＥＶ集団におけるナノルシフェラーゼｍＲＮＡのより高い濃縮の結果として、約３．２Ｅ９個のＲＬＵが得られた。
【図３】薬物負荷部分、エクソソームタンパク質、精製ドメインを含む融合タンパク質を含み、精製ドメインとエクソソームタンパク質との間に酵素切断のための切断ドメインが挿入されたＥＶの概略図を示す。この設計は、精製ドメインを使用した親和性に基づく捕捉、後続の精製ドメインの同時除去、および薬物負荷ＥＶの溶出を可能にする。ｓｈＲＮＡは、薬物カーゴ分子を例示するために使用されるが、このアプローチは、ｓｇＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、ペプチドなどの他の形態の薬物カーゴに同様に適用可能である。
【図４】（ｉ）ＴＦＦおよびＢＥ−ＳＥＣ（ＢＥ−ＳＥＣ精製）、（ｉｉ）ＭＢＰに基づく親和性精製（ＭＢＰ親和性精製）、または（ｉｉｉ）ＭＢＰドメインの酵素除去のためのＴＥＶ切断ドメインをさらに含む融合タンパク質を使用したＭＢＰに基づく精製（ＭＢＰ−ＴＥＶ親和性精製）のいずれかを使用した精製後の最終ＥＶ集団におけるシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）陽性ＥＶの割合を示す。ＭＢＰに基づく親和性捕捉（ＴＥＶ切断リンカーの有無にかかわらず）は、ＩＧＦ２ＢＰ１  ｓｇＲＮＡが精製後の全てのＥＶのうちの約９０％に存在する一方、ＢＥ−ＳＥＣ精製ＥＶは、約４０％のＩＧＦ２ＢＰ１  ｓｇＲＮＡ陽性であるという結果が得られた（図４）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、薬物負荷ＥＶ、特にエクソソームの産生および親和性精製を可能にする、発明的な融合タンパク質および関連する態様および実施形態に関する。
【００１４】
本発明の特徴、態様、実施形態、または代替物がマーカッシュ群の観点から説明される場合、当業者は、本発明が、それによりマーカッシュ群の個々の構成要素（ｍｅｍｂｅｒ）または構成要素の部分群の観点からも説明されることを認識するであろう。当業者は、本発明が、それによりマーカッシュ群の個々の構成要素または構成要素の部分群の任意の組み合わせの観点からも説明されることをさらに認識するであろう。加えて、本発明の態様および／または実施形態のうちの１つに関連して説明される実施形態および特徴は、本発明の全ての他の態様および／または実施形態において準用されることに留意されたい。
【００１５】
第１の態様では、本発明は、少なくとも以下の構成要素を含む融合タンパク質に関する：（ｉ）ＥＶポリペプチド、（ｉｉ）精製部分（「精製ドメイン」と交換可能に称される）、および（ｉｉｉ）薬物負荷部分。重要な一実施形態では、薬物負荷部分は、核酸（ＮＡ）（例えば、ＲＮＡ剤）またはタンパク質（例えば、酵素、腫瘍抑制剤、または抗体などのタンパク質系薬物）のＥＶへの負荷を可能にするＮＡ結合タンパク質またはタンパク質結合ドメインである。したがって、本発明の融合タンパク質は、３つの機能、すなわち、（１）ＥＶポリペプチドが、融合タンパク質全体のＥＶ内への輸送を駆動する機能、（２）薬物負荷部分が、融合タンパク質が１つ以上の関心対象の薬物（ＤＯＩ）をＥＶ内にまたはＥＶ上に運ぶことを可能にする機能、（３）精製部分が、関心対象の薬物を含有するＥＶのみを精製および単離することを可能にする機能、を有する。この３つの機能を有するコンストラクトは、それによって、ＥＶ分野における重大な課題、すなわち、ＤＯＩにおいて濃縮される純粋なＥＶ集団の単離を解決し、最終的な薬物物質および薬物生成物は、より少ない（存在する場合）空の非薬物負荷ＥＶを含有することを意味する。
【００１６】
融合タンパク質、したがってＥＶへのＤＯＩの負荷を駆動するＥＶポリペプチドは、以下の非限定的な例を含む群から選択され得る：ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ５４、ＣＤ５０、ＦＬＯＴ１、ＦＬＯＴ２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体としても知られる）およびそのエンドソーム由来ソートドメイン、すなわち、トランスフェリン受容体エンドソーム由来ソートドメイン、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８（シンデカン−１）、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＩＸ、シンテニン−１、シンテニン−２、Ｌａｍｐ２ａ、Ｌａｍｐ２ｂ、ＴＳＰＡＮ８、シンデカン−１、シンデカン−２、シンデカン−３、シンデカン−４、ＴＳＰＡＮ１４、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ１５１、ＣＤ２３１、ＣＤ１０２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＣＤ４９ｄ／ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ４１、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、Ｆｃ受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩ構成要素、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２５、ＣＤ１３５、ＣＤ１８４、ＣＤ２００、ＣＤ２７９、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ３６２、ＣＯＬ６Ａ１、ＡＧＲＮ、ＥＧＦＲ、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＲ２、ＧＬＵＲ３、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＳＰＧ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１、ＡＲＲＤＣ１、ＬＦＡ−１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、Ｍａｃ−１α、Ｍａｃ−１β、ＭＦＧＥ８、ＰＴＧＦＲＮ、ＳＬＩＴ２、ＳＴＸ３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＴＳＧ１０１、ＶＴＩ１Ａ、ＶＴＩ１Ｂ、フィブロネクチン、Ｒａｂ７、１４−３−３ζ／δ、１４−３−３ε、ＨＳＣ７０、ＨＳＰ９０、ＨＳＰＡ１３、および任意の他のＥＶポリペプチド、ならびにこれらの任意の組み合わせ、誘導体、断片、ドメイン、または領域。
【００１７】
好ましい実施形態では、ＥＶポリペプチドは、膜貫通または膜関連ポリペプチドである。膜貫通エクソソームタンパク質の使用により、管腔側の薬物負荷部分およびＥＶ膜の小胞外側の精製部分を構成することが可能になる。この構成は、ｍＲＮＡまたはｓｈＲＮＡまたは他の感受性治療剤（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）などの感受性ＲＮＡ系薬物のＥＶへの負荷をサポートし、それらが分解から保護される一方で、外側の精製タグを曝露して、親和性精製リガンドまたは部分へのアクセスおよび結合を可能にする。好適な膜貫通または膜関連ＥＶポリペプチドは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９、ＣＤ８２、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５５、ＬＡＭＰ２Ｂ、ＩＣＡＭ、インテグリン、ＡＲＲＤＣ１、アネキシン、および任意の他のＥＶポリペプチド、ならびにこれらの任意の組み合わせ、誘導体、ドメイン、または領域を含む群から選択され得る。非限定的な例は、４つの膜貫通ドメイン、ならびにＥＶの内部に存在するタンパク質のＮ末端およびＣ末端の両方を有するＣＤ６３などのタンパク質であり得る。したがって、１つ以上の薬物負荷部分（例えば、ＲＮＡ結合タンパク質）は、Ｎ末端および／またはＣ末端上に融合されてもよく、一方、精製部分は、例えば、第１および／または第２のループなどの１つ以上の小胞外領域に導入されてもよい。特に好ましい一実施形態では、融合タンパク質は、以下のように概略的に記載され得る（Ｎ末端からＣ末端へ）：
ＣＤ６３−ＲＮＡ結合タンパク質の第１および第２ループに挿入されたＣＤ６３−ＺＺドメイン。
【００１８】
この特定の実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、例えば、Ｃａｓ６、Ｃａｓ９、ＰＵＦ、ＴＡＲ  ＲＮＡ結合タンパク質（ＴＲＢＰ）、または任意の他の種類のＲＮＡ結合タンパク質もしくは他の種類の薬物負荷タンパク質（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用を媒介する領域もしくはドメインもしくはポリペプチドなど）であってもよい。あるいは、薬物負荷部分および精製タグの両方を、当該融合タンパク質の小胞外部分、例えば、ＣＤ６３またはＣＤ８１またはＣＤ９などに対して操作することも可能である。かかる融合コンストラクトの構造は、タンパク質の第１または第２のループにおける精製タグの導入、およびタンパク質の第２または第３のループにおける薬物負荷部分の導入、またはその逆であってもよい。
【００１９】
他の同様の実施形態では、単一の膜貫通領域を有するエクソソームタンパク質を利用してもよい。かかる膜貫通エクソソームタンパク質の好適な例としては、ＣＤ６３、ＣＤ４７、Ｌａｍｐ２ｂ、ＡＲＲＤＣ１、Ｌ１ＣＡＭなどが挙げられる。かかる膜貫通エクソソームタンパク質の場合、薬物負荷部分は、有利にタンパク質の管腔末端に融合され、精製部分はタンパク質の小胞外末端に融合される。
【００２０】
代替の実施形態では、ＥＶポリペプチドは、融合タンパク質をエクソソーム膜に位置付ける膜貫通ポリペプチドに融合される非膜貫通ポリペプチドであってもよい。かかる非膜貫通ＥＶポリペプチドの好適な例としては、ＡＬＩＸ、シンテニン−１、シンテニン−２、Ｌａｍｐ２ｂ、シンデカン−１、シンデカン−２、シンデカン−３、シンデカン−４、および任意の他の非膜貫通エクソソームタンパク質が挙げられる。これらの非膜貫通エクソソームタンパク質は、有利に、例えば、サイトカイン受容体、共受容体、またはシグナル伝達物質（例えば、ＴＮＦ受容体１もしくは２、またはｇｐ１３０、またはＩＬ２３ＲもしくはＩＬ１７Ｒなど）の膜貫通ドメインと融合されて、それらをＥＶ膜にアンカーすることを可能にし得る。同様に、非膜貫通ＥＶポリペプチドを膜貫通ＥＶポリペプチドと融合させ、それによって、融合タンパク質のエクソソーム輸送をさらに強化することも可能である。
【００２１】
本発明の好ましい一実施形態では、融合タンパク質のＮＡ結合タンパク質は、ｍＲＮＡ結合タンパク質、ｍｉＲＮＡ結合タンパク質、ｐｒｅ−ｒＲＮＡ結合タンパク質、ｔＲＮＡ結合タンパク質、小核または核酸ＲＮＡ結合タンパク質、ノンコーディングＲＮＡ結合タンパク質、転写因子、ヌクレアーゼ、ＲＩＳＣタンパク質、および同じ目的、すなわち関心対象のＮＡ分子に結合することを満たし得るこれらの任意の組み合わせ、誘導体、ドメイン、領域、部位、または一部を含む群から選択される。
【００２２】
特に好適なＮＡ結合タンパク質は、ＰＵＦ、ＰＵＦ５３１、ＰＵＦｘ２（すなわち、ＰＵＦタンパク質のうちの少なくとも２つのＲＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質）、ＤＤＸ３Ｘ、ＥＥＦ２、ＥＥＦ１Ａ１、ＨＮＲＮＰＫ、ＨＮＲＮＰＭ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＮＨＰＨ１、ＨＮＲＮＰＤ、ＨＮＲＮＰＵ、ＨＮＲＮＰＵＬ１、ＮＳＵＮ２、Ｃａｓ６、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ９、ＷＤＲ１、ＨＳＰＡ８、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＭＶＰ、ＰＣＢ１、ＭＯＣＳ３、ＤＡＲＳ、ＥＬＣ２、ＥＰＲＳ、ＧＮＢ２Ｌ１、ＩＡＲＳ、ＮＣＬ、ＲＡＲＳ、ＲＰＬ１２、ＲＰＳ１８、ＲＰＳ３、ＲＵＶＢＬ１、ＴＵＦＭ、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ＤＤＸ４、ＡＤＡＤ１、ＤＡＺＬ、ＥＬＡＶＬ４、ＥＬＡＶＬ１、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＨＮＲＮＰＱ、ＲＢＦＯＸ１、ＲＢＦＯＸ２、Ｕ１Ａ、ＰＰＲファミリー、ＺＲＡＮＢ２、ＮＵＳＡ、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＦ２ＢＰ３、Ｌｉｎ２８、ＫＳＲＰ、ＳＡＭＤ４Ａ、ＴＤＰ４３、ＦＵＳ、ＦＭＲ１、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＥＩＦ４Ａ１〜３、ＭＳ２コートタンパク質、ならびにこれらの任意の組み合わせ、ドメイン、一部、または誘導体のうちのいずれか１つから選択されてもよい
【００２３】
より広義には、ＲＮＡ結合タンパク質およびドメインの特定の下位分類が、薬物負荷部分、例えば、ｍＲＮＡ結合タンパク質（ｍＲＢＰ）、ｐｒｅ−ｒＲＮＡ結合タンパク質、ｔＲＮＡ結合タンパク質、小核または核酸ＲＮＡ結合タンパク質、ノンコーディングＲＮＡ結合タンパク質、ｍｉＲＮＡ結合タンパク質、ｓｈＲＮＡ結合タンパク質、および転写因子（ＴＦ）として使用されてもよい。さらに、様々なドメインおよび誘導体が、ＥＶへＮＡカーゴを輸送するためのＮＡ結合ドメインとして使用されてもよい。例としては、ＤＥＡＤ、ＫＨ、ＧＴＰ＿ＥＦＴＵ、ｄｓｒｍ、Ｇパッチ、ＩＢＮ＿Ｎ、ＳＡＰ、ＴＵＤＯＲ、ＲｎａｓｅＡ、ＭＭＲ−ＨＳＲ１、ＫＯＷ、ＲｎａｓｅＴ、ＭＩＦ４Ｇ、ｚｆ−ＲａｎＢＰ、ＮＴＦ２、ＰＡＺ、ＲＢＭ１ＣＴＲ、ＰＡＭ２、Ｘｐｏ１、Ｐｉｗｉ、ＣＳＤ、リボソーム＿Ｌ７Ａｅ、およびこれらの任意の組み合わせ、誘導体、ドメイン、領域、部位、変異したバリアントまたは部分（複数可）が挙げられる。かかるＲＮＡ結合ドメインは、それらの主要機能（すなわち、関心対象のＮＡカーゴ、例えば、ｍＲＮＡまたは短ＲＮＡを輸送する能力）が維持される限り、複数で、単独で、または他のものと組み合わせて存在してもよく、より大きなＲＮＡ結合タンパク質コンストラクトの一部をそのように形成してもよい。
【００２４】
本発明のＮＡ結合ドメインは、ＮＡ結合ドメインとＮＡカーゴ分子との間のプログラム可能で修飾可能な親和性を可能にし、ＮＡ結合ドメインおよび少なくとも１つのＮＡカーゴ分子を含む融合ポリペプチドを含むＥＶの産生を可能にするように選択されていて、融合ポリペプチドコンストラクトのＮＡ結合ドメインが、ＮＡカーゴ分子とプログラム可能で可逆的で修飾可能な方法で相互作用し、ＥＶおよび／または標的細胞のいずれかにおいてあるいは標的細胞との接続においてＥＶへの負荷およびＮＡカーゴ分子の放出の両方を可能にする。これは、例えば、ＮＡカーゴ分子がレシピエント細胞内で放出されることが意図されるときに、有利である。次いで、規定された会合時間は、必要に応じて、ＲＮＡ分子を放出するように調節され得るが、産生細胞内では調節され得ない。これは、精製されたＥＶがカーゴを保持するだけでなく、カーゴ核酸が放出可能であり、したがって標的／レシピエント細胞に送達されるときに機能的（生体活性）であるように、精製プロセスが生じる間にカーゴ核酸がＥＶと安定して会合することを保証するために、本発明にとって特に重要である。
【００２５】
したがって、有利な実施形態では、本発明は、エクソソームタンパク質に融合される真核ＮＡ結合タンパク質に関する。好ましい実施形態では、ＮＡ結合ドメイン（複数可）は、タンパク質のＰＵＦファミリー、例えば、ＰＵＦ５３１、ＰＵＦｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ、および／またはＰＵＦｘ２由来である。重要なことに、ＰＵＦタンパク質は、ｍＲＮＡ薬物カーゴの高度に制御されかつ特異的な負荷を可能にするＰＵＦタンパク質の配列特異性のために、ｍＲＮＡのＥＶ媒介性送達に好ましく使用される。有利な融合タンパク質コンストラクトとしては、以下の非限定的な例が挙げられる：ＣＤ６３−ＰＵＦ５３１、ＣＤ６３−ＰＵＦｘ２、ＣＤ６３−ＰＵＦｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ、ＣＤ８１−ＰＵＦ５３１、ＣＤ８１−ＰＵＦｘ２、ＣＤ８１−ＰＵＦｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ、ＣＤ９−ＰＵＦ５３１、ＣＤ９−ＰＵｘ２、ＣＤ９−ＰＵＦｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ、および好ましくは、１つ、２つまたは３つ以上のＰＵＦタンパク質に融合されたテトラスパニンエクソソームタンパク質に基づく他の膜貫通型融合タンパク質。ＰＵＦタンパク質および少なくとも１つの可溶性エクソソームタンパク質を含む有利な融合タンパク質としては、以下の非限定的な例が挙げられる：シンテニン−ＰＵＦ５３１、シンテニン−ＰＵｘ２、シンテニン−ＰＵＦｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ、シンデカン−ＰＵＦ５３１、シンデカン−ＰＵｘ２、シンデカン−ＰＵＦｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ、Ａｌｉｘ−ＰＵＦ５３１、Ａｌｉｘ−ＰＵｘ２、Ａｌｉｘ−ＰＵＦｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ、ならびにＰＵＦタンパク質に融合された任意の他の可溶性エクソソームタンパク質。
【００２６】
同様に、Ｃａｓ６が認識し得るＲＮＡ配列は、関心対象のＮＡ分子に挿入されるように操作され得る。Ｃａｓ１３は、その規定されたＲＮＡ標的にのみ結合し、かつそれを分解しないように操作され得る。ｓｇＲＮＡ分子の配列を変えることによって、Ｃａｓ１３−ｓｇＲＮＡ複合体は、２０〜３０個のヌクレオチドの間で任意のＲＮＡ配列を結合するように調節され得る。ＰＵＦベースのＮＡ結合ドメインと同様に、Ｃａｓタンパク質は、標的ＮＡカーゴ分子に対するプログラム可能で修飾可能な配列特異性を有する放出可能で可逆的なＮＡ結合ドメインを表し、より低い総親和性でより高い特異性を可能にし、それによって、ＥＶへのＮＡカーゴの負荷および標的位置におけるＮＡカーゴの放出の両方を可能にする。かかるＰＵＦおよびＣａｓ核酸結合ドメインは、本発明による精製のためのＥＶへのｍＲＮＡの負荷に特に好適である。
【００２７】
ＰＵＦタンパク質およびＣＲＩＳＰＲ関連ポリペプチド（Ｃａｓ）、具体的にはＣａｓ６およびＣａｓ１３、ならびに／または本発明における様々な種類のＮＡ結合アプタマーを用いる実施形態は、上述のように、ＮＡ結合ドメインとＮＡカーゴ分子との間のプログラム可能な、より低い親和性の相互作用を達成する有利な効果を有する。これにより、本発明は、ＥＶ産生細胞内にＥＶを効率的に負荷する一方で、ＮＡカーゴ分子とＮＡ結合ドメインとの間の相互作用の親和性が低く、解放可能な性質が非常に有利である好適な位置（典型的には標的細胞内）においてＮＡカーゴの放出も可能にする。詳細には、本発明は、より長く、それによって、より特異的な、例えば、長さ６ｎｔ、または長さ８ｎｔのヌクレオチドの伸長への、配列特異的な低親和性または中親和性結合を可能にする。結合部位の長さが長いほど、修飾結合親和性の範囲を有する結合部位を生成する様々な突然変異の範囲を導入することが可能になり、したがって、上述のプログラム可能な低い親和性の相互作用をもたらす。例えば、６または８ヌクレオチド領域への単一点突然変異の導入は、結合親和性を微妙に修飾し、核酸に対するタンパク質の結合親和性に影響を与える１つ以上の突然変異を導入するためのより多くの範囲を提供する。同様に、より長いヌクレオチドの伸長が結合されることを必要とすると、より長いヌクレオチド配列と相互作用することができ、したがって、それらの相互作用するアミノ酸を突然変異させ、様々な結合親和性を有するより広い範囲の可能性のあるタンパク質変異体を再び産生するためのより多くの可能性を提供するより多くのアミノ酸がもたらされる。ＰＵＦ、Ｃａｓ６およびＣａｓ１３のより長いヌクレオチド結合部位およびより大きなタンパク質結合部位の両方は、突然変異によって広範囲の親和性を達成することを可能にする利点を提供する。
【００２８】
したがって、このより長い配列は、核酸および／または結合タンパク質を操作して、そのカーゴ核酸の放出を改善するために必要に応じて、関心対象の個々のカーゴに特異的に結合親和性を調整するより大きな可能性を提供する。ヌクレオチドカーゴへの結合の親和性を制御し、したがって、ヌクレオチドカーゴの放出性を修飾および制御する能力は、本発明の大きな利点であり、ＮＡ負荷ＥＶの成功裏の精製、ならびに後続する生物活性状態（非結合）でのそれらの核酸の送達および放出をもたらす。これは、ＮＡ結合ドメインから放出されたときにのみ生体活性であるｍＲＮＡにとって特に重要であり、その結果、それを能動的に翻訳することができる。ＮＡ系薬剤カーゴ分子のＥＶへの負荷に加えて、本発明は、アミノ酸系薬物分子の充填に非常に好適である。ポリペプチド系薬物の負荷は、多くの場合、ポリペプチド系ＤＯＩとエクソソームタンパク質との間で単一融合タンパク質を使用することによって有利に達成することができるが、典型的には、（ｉ）本発明の融合タンパク質の薬物負荷部分と、（ｉｉ）ペプチドおよび／またはタンパク質の形態のＤＯＩとの間の非共有相互作用は、例えば、可溶性治療用タンパク質および／またはペプチドＤＯＩの場合には、好ましいＥＶ負荷方法であり得る。アミノ酸系ＤＯＩ（複数可）の負荷との関係で使用するのに有利な、本発明の薬物負荷部分の非限定的な例としては、（インポーチンタンパク質が結合する）核局在化シグナルを含むＤＯＩを負荷するための手段としてのインポーチンと、ＤＯＩを負荷するための手段としての青色光下でのＣＲＹ２−ＣＩＢＮ相互作用であって、それによって、ＣＲＹ２およびエクソソームタンパク質とＣＩＢＮおよびＤＯＩとの間の融合が、エクソソームへの輸送を可能にする（またはその逆も同様）、ＣＲＹ２−ＣＩＢＮ相互作用と、ＤＯＩと本発明の融合タンパク質にグラフト化されるその結合モチーフとの間の任意のｐＨ依存性相互作用と、薬物負荷ドメインとしてのこの特定の実施形態で使用されるＦｃ結合ポリペプチドであって、それによって、Ｆｃドメイン、例えば、抗体、またはＦｃドメインを含むように人工的に操作されたタンパク質への結合およびそれを用いたポリペプチドの負荷を可能にする、Ｆｃ結合ポリペプチドと、Ｓｐｙ−Ｃａｔｃｈｅｒ  Ｓｐｙ−Ｔａｇシステムであって、それによって、ＴａｇまたはＣａｔｃｈｅｒのいずれか一方がＤＯＩに融合され、その結合パートナーが融合タンパク質に融合される、Ｓｐｙ−Ｃａｔｃｈｅｒ  Ｓｐｙ−Ｔａｇシステムと、および／またはＳｎｏｏｐＴａｇ−ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒシステムと、が挙げられる。
【００２９】
重要なことに、本発明の発明的な融合タンパク質の発明設計は、薬物負荷部分、したがってＤＯＩを含有するＥＶのみの親和性に基づく精製を可能にする。本発明の好適な精製部分としては、以下の非限定的な例が挙げられる：受容体、抗体結合ポリペプチド、Ｆｃ結合ポリペプチド、ポリヒスチジン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、インテインキチン結合ドメイン（Ｉ−ＣＢＤ）、ストレプトアビジン、アビジン、ＦＬＡＧエピトープタグ、ＨＡエピトープタグ、Ｔ７タグ、Ｓタグ、ＣＬＩＰ、ＤＨＦＲ、セルロース結合ドメイン、およびこれらの任意の組み合わせ、誘導体、ドメイン、または一部。
【００３０】
特定の有利な一実施形態では、Ｆｃ結合ポリペプチドは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、プロテインＬＧ、Ｚドメイン、ＺＺドメイン、ヒトＦＣＧＲＩ、ヒトＦＣＧＲ２Ａ、ヒトＦＣＧＲ２Ｂ、ヒトＦＣＧＲ２Ｃ、ヒトＦＣＧＲ３Ａ、ヒトＦＣＧＲ３Ｂ、ヒトＦＣＧＲＢ、ヒトＦＣＡＭＲ、ヒトＦＣＥＲＡ、ヒトＦＣＡＲ、マウスＦＣＧＲＩ、マウスＦＣＧＲＩＩＢ、マウスＦＣＧＲＩＩＩ、マウスＦＣＧＲＩＶ、マウスＦＣＧＲｎ、ＦｃＩＩＩペプチド、およびそれらの任意の組み合わせ、誘導体、ドメイン、または一部を含む群から選択される。
【００３１】
通常は融合タンパク質の場合と同様に、融合タンパク質に通常含まれる３つの構成要素（すなわち、薬物負荷部分、エクソソームタンパク質、および精製ドメイン）は、融合タンパク質において連続して直接連結され得るか、またはそれらは、様々なリンカー、放出ドメインもしくは放出部位、切断部位もしくは切断ドメインを使用して、互いに連結および／または付着され得る。例えば、精製ドメインを除去することが望ましいある特定の実施形態では、切断リンカーは、エクソソームタンパク質と精製ドメインとの間に導入され得、したがって、切断リンカーの切断（例えば、酵素活性を通じて）を、それによって、精製ドメインの除去を可能にする。精製ドメイン除去のためのかかる切断リンカーの好適な例は、それぞれ、２つの異なる種類のプロテアーゼによって切断され得るＴＥＶリンカーまたはＳＵＭＯリンカーである。別の有利な融合タンパク質の修飾は、ＤＯＩがエクソソームなどのＥＶに負荷されると、ＤＯＩの放出を可能にするために、薬物負荷部分とエクソソームタンパク質との間に放出ドメインを挿入することを伴う。かかる薬物放出リンカーの好適な例は、インテインである。
【００３２】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載の融合タンパク質とＤＯＩとの複合体に関する。この複合体を、２つの構成要素、すなわち、融合タンパク質および関心対象の薬物（ＤＯＩ）の系として認識することができる。典型的には、複合体（すなわち、系）の２つの構成要素間の相互作用は、薬物負荷部分とＤＯＩとの間の非共有相互作用に基づく。かかる複合体に含まれるＤＯＩは、例えば、１つ以上のＮＡ剤、１つ以上のタンパク質、および／または１つ以上のペプチド、またはこれらの任意の組み合わせ、例えば、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡなどのリボ核酸タンパク質複合体であってもよい。ＮＡ剤の場合、かかるＮＡ剤は、以下の非限定的な例を含む群から選択され得る：一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ、ｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチド、スプライススイッチングＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲガイド鎖（ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、環状ジヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド、ミニサークルＤＮＡ、プラスミド、プラスミドＤＮＡ、または任意の他のＲＮＡもしくはＤＮＡのベクター。化学合成された核酸系薬剤、および／または、２´−Ｏ−Ｍｅ、２´−Ｏ−アリル、２´−Ｏ−ＭＯＥ、２´−Ｆ、２´−ＣＥ、２´−ＥＡ２´−ＦＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ホスホロチオエート、トリシクロ−ＤＮＡ、ＤＮＡミックスマーなどの化学修飾されたヌクレオチドを含む核酸系剤が特に関心対象である。
【００３３】
有利な実施形態では、ＮＡは、ＮＡ結合タンパク質が結合する少なくとも１つの天然に存在する、および／または少なくとも１つの人工的に導入された領域、ドメイン、構成要素、または部位のいずれかを含んでもよい。そのような領域、構造、ドメイン、部位または配列は、ＮＡ剤中に天然に存在し得るか、または、例えば、遺伝子操作を通じてＮＡ剤中に導入され得る。ＮＡ結合タンパク質が結合し得る天然に存在するＮＡ領域、構造または部位の非限定的な例は、例えば、ｓｈＲＮＡまたは特定のヌクレオチド配列のヘアピン構造である。人工的に導入された領域、構造、ドメイン、官能性、部位または配列は、ＮＡ結合タンパク質が結合および付着することができる本質的に任意のそのような特徴、例えば、特定のヌクレオチド配列、特定のヌクレオチド修飾、幹ループ、ヘアピン、平滑末端、ならびにＮＡ剤、特にＲＮＡ剤に導入することができる様々な他の特徴であり得る。有利な一実施形態では、ＮＡ剤は、治療用タンパク質をコードし得る、例えば、ＮＡ剤は、関心対象のタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり得る。治療用タンパク質は、本質的に任意の種類または性質であり得る。ＮＡ（この実施形態では、有利には、ｍＲＮＡ）によってコードされ得る非限定的な関心対象のタンパク質（ＰｏＩ）の例としては、以下が含まれる：抗体、細胞内抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、アフィボディ、二重および多重特異性抗体または結合剤、受容体、リガンド、例えば酵素補充療法または遺伝子編集のための酵素、腫瘍抑制剤、ウイルスまたは細菌阻害剤、細胞成分タンパク質、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ修復阻害剤、ヌクレアーゼ、プロテイナーゼ、インテグラーゼ、転写因子、増殖因子、アポトーシス阻害剤および誘導剤、毒素（例えば、シュードモナス外毒素）、構造タンパク質、ＮＴ３／４などの神経栄養因子、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）および神経成長因子（ＮＧＦ）ならびに２．５Ｓベータサブユニットなどのその個々のサブユニット、イオンチャネル、膜輸送体、タンパク質恒常性因子、細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質、翻訳および転写関連タンパク質、ヌクレオチド結合タンパク質、タンパク質結合タンパク質、脂質結合タンパク質、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）およびＧＡＧ結合タンパク質、代謝タンパク質、細胞ストレス調節タンパク質、炎症および免疫系調節タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、ならびに熱ショックタンパク質など。好ましい一実施形態では、コードされたタンパク質は、ＥＶによって送達された後、標的細胞においてＣａｓポリペプチドにそのヌクレアーゼ活性を実行させるＲＮＡ鎖に関連する（すなわち、それと共に運ばれる）無傷のヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチドである。代替的に、別の好ましい実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、標的遺伝子操作を可能にするために、触媒的に不活性であり得る。さらに別の代替物は、単一のＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼＣｐｆ１などの任意の他の種類のＣＲＩＳＰＲエフェクターであり得る。Ｃｐｆ１を包含することは、それがスタッガードな二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｂｒｅａ���）を介して標的ＤＮＡを切断する（ｃｌｅａｖｅ）ために、本発明の特に好ましい実施形態であり、Ｃｐｆ１は、ＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅなどの種から得ることができる。さらなる例示的な方法では、Ｃａｓポリペプチドはまた、遺伝子発現を特異的に誘導するために、転写活性化因子（Ｐ３３３０コアタンパク質など）に対して融合され得る。さらなる好ましい実施形態は、リソソーム蓄積症のための酵素、例えば、イミグルセラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼおよびイズルスルファターゼ、などのグルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼ、ガルスルファーゼ、酸−αグルコシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、ガラクトシルセラミダーゼ、セラミダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リソソーム酸リパーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ヘパランスルファミダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、ヘパラン−α−グルコサミニド−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、ヒアルロニダーゼ、α−Ｎ−アセチルノイラミニダーゼ、ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ、ムコリピン１、パルミトイル−タンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼＩ、パルミトイル−タンパク質チオエステラーゼ１、トリペプチジルペプチダーゼ１、バテニン、リンクリン、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ、シスチノシン、カテプシンＫ、シアリン、ＬＡＭＰ２、およびヘキソサミニダーゼ、を含む群から選択されるタンパク質を含む。他の好ましい実施形態では、ＰｏＩは、例えば、炎症応答を修飾する細胞内タンパク質（例えば、メチラーゼおよびブロモドメインなどのエピジェネティックタンパク質）、または筋肉機能を修飾する細胞内タンパク質（例えば、ＭｙｏＤまたはＭｙｆ５などの転写因子）、筋肉収縮性を調節するタンパク質（例えば、ミオシン、アクチン、トロポニンなどのカルシウム／結合タンパク質）、または構造タンパク質（ジストロフィン、ウトロフィン、チチン、ネブリンなど）、ジストロフィン関連タンパク質（ジストロブレビン、シントロフィン、シンコイリン、デスミン、サルコグリカン、ジストログリカン、サルコスパン、アグリン、および／またはフクチンなど）であり得る。ＰｏＩは、典型的には、それらの名称、任意の他の命名法によって、または当業者に既知であるために、別段の指示がない限り、ヒト起源のタンパク質またはペプチドであり、これらを、様々な公的に利用可能なデータベース、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ、ＲＣＳＢなどにおいて見出すことができる。
【００３４】
当然ながら、本発明によるＮＡ剤によってコードされる全ての種類のタンパク質は、修飾、操作、切断、誘導体化、および様々な融合パートナーに融合され得る。ＮＡ剤によってコードされる（典型的には、ｍＲＮＡの形態である）特に有利なタンパク質としては、リソソーム酵素またはトランスポーター、例えば、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＧＢＡ、ＧＬＡ、シスチノシン、Ｌａｍｐ２、Ｌｉｍｐ２、およびアセチルヘキソサミニダーゼ；尿素サイクル酵素、例えば、ＡＳＳ、ＡＳＬ、およびＡＲＧ１；構造タンパク質、例えば、ジストロフィン、ミニジストロフィン、マイクロジストロフィン、ユートロフィン、フィブリリンなど；遺伝的な代謝誤差を欠く酵素およびタンパク質（ＩＥＭ）、抗体、イントラボディ、抗体ドメイン、抗体誘導体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖｓ、腫瘍抑制剤、転写因子、ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ６、ＴＡＬＥＮＳ、ＴＡＬＥＳ、および亜鉛フィンガーなどが挙げられる。当業者には明らかであろうように、本発明による発明的なＥＶ設計の助けを借りて負荷および送達され得るタンパク質のリストは、本質的に無制限であり、上記は、ｍＲＮＡカーゴ分子として送達されるのに特に好適なタンパク質の非限定的な例としてのみ機能する。
【００３５】
さらなる態様では、本発明は、本明細書の発明的な融合タンパク質を含むＥＶに関する。重要なことに、ある特定の実施形態では、ＥＶは、単一の小胞として存在し得るが、ＥＶは、通常、相当な複数個、すなわち、数千〜数百万〜数十億〜数兆個、さらにはより多くのＥＶを含む集団中に存在する。有利な実施形態では、ＥＶは、融合タンパク質を含み、融合タンパク質は、ＲＮＡ分子またはタンパク質などのＤＯＩとの複合体の形態でＥＶ中に存在する。ある特定の実施形態では、ＤＯＩは、薬物負荷部分の助けを借りてＥＶにおけるおよび／または標的環境における、例えば標的細胞の内側または外側の複合体からのＤＯＩの解離後にＥＶ内に輸送され得る。したがって、ＤＯＩと融合タンパク質との間の該複合体は、ＤＯＩおよび融合タンパク質の設計、性質および活性に応じて、長期的または比較的一過性であり得る。しかしながら、融合タンパク質とＤＯＩとの間のかかる複合体についての重要な成功基準は、ＤＯＩがＥＶに効率的に負荷され、親和性精製が精製ドメインの存在の結果として可能であり、ＤＯＩがその活性、例えば、ｍＲＮＡ  ＤＯＩのタンパク質への翻訳、または抗体ＤＯＩのその標的抗原への結合を発揮できることである。
【００３６】
「細胞外小胞」または「ＥＶ」または「エクソソーム」または「遺伝子組み換え／遺伝子操作されたエクソソーム」または「修飾エクソソーム」という用語は、本明細書で互換的に使用され、任意の形態で細胞から得ることができる任意の種類の小胞、例えば、微小胞（例えば、細胞の形質膜から脱落した任意の小胞）、エクソソーム（例えば、エンドソーム、リソソーム、および／またはエンドリソソーム経路に由来する任意の小胞）、アポトーシス体、ＡＲＭＭ（アレスチンドメイン含有タンパク質１［ＡＲＲＤＣ１］媒介微小胞）、微小粒子および小胞構造などに関連すると理解されるべきである。「遺伝子組み換えされた」および「遺伝子操作された」ＥＶという用語は、ＥＶが、通常、それらの細胞によって産生されるＥＶに組み込まれる組み換えまたは外因性ＮＡおよび／またはタンパク質生成物を含む遺伝子組み換え／操作された細胞由来であることを示す。「修飾ＥＶ」という用語は、例えば、ＥＶ産生細胞の遺伝子操作を介して、または、例えば、エクソソーム表面に部分を付着させるための化学コンジュゲーションを介して、遺伝子アプローチまたは化学的アプローチのいずれかを使用して小胞が修飾されたことを示す。ＥＶのサイズはかなり変動し得るが、ＥＶは典型的には、ナノサイズの流体力学的直径、すなわち１０００ｎｍ以下の直径を有する。明らかに、ＥＶは、インビボ、エクスビボ、およびインビトロで任意の細胞型に由来し得る。好ましいＥＶとしては、エクソソームおよび微小胞が挙げられるが、他のＥＶも、様々な状況下で有利であり得る。さらに、該用語はまた、細胞外小胞模倣体、例えば、膜押出、超音波処理、または他の技術などを通じて得られる細胞膜に基づく小胞に関連していると理解されるべきである。さらに、本明細書における教示が、ＥＶを単数形で指すとき、および／またはＥＶを別々の天然のナノ粒子様小胞として指すとき、全てのかかる教示は、複数のＥＶならびにＥＶの集団に対して等しく関連しており、適用可能であることが理解される必要がある。
【００３７】
上述のように、融合タンパク質の精製部位は、ＥＶの外側に少なくとも部分的に存在することが好ましく、例えば、ＤＯＩで負荷されるように操作されたＥＶの親和性に基づく精製を可能にする。典型的には、融合タンパク質の精製部分は、精製リガンド、精製マトリックス、または精製装置もしくは機械（互換的に、精製結合剤または精製リガンドと併せて称される）と相互作用することができるように設計されている。かかる精製リガンドは、特定の精製部分（例えば、抗体のＦｃ割合と相互作用するＺドメインなどのＦｃ結合ポリペプチドであって、該抗体はクロマトグラフィマトリックスに付着される、Ｆｃ結合ポリペプチド）と高い特異性で相互作用する特異的リガンドであってもよく、または、例えば、様々な金属原子、例えば、ニッケル原子と相互作用するＨｉｓタグであってもよい。
【００３８】
非常に好ましい実施形態では、本発明によるＥＶは、エクソソーム、微小胞（ＭＶ）、またはエンドソーム由来、エンドリソーム由来および／もしくはリソソーム経路から、または親細胞の形質膜から分泌される任意の他の種類の小胞である。一般に、本発明は、エクソソーム、微小胞、ＡＲＲＤＣ１媒介微小胞（ＡＲＭＭ）、押出小胞、押出細胞および／または細胞膜、ＥＶと脂質との間のハイブリッドを含む様々な脂質ベースの小胞などを含むが、これらに限定されない、細胞によって分泌される、産生される、および／または細胞に由来する任意の種類の小胞構造に関する。
【００３９】
追加の態様では、本発明は、本明細書における融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドコンストラクトは、様々な異なる形態および／または異なるベクターで存在し得る。例えば、ポリヌクレオチドは、本質的に直鎖状、環状であってもよく、および／または任意の二次構造および／もしくは三次構造および／またはより高次の構造を有してもよい。さらに、本発明はまた、ポリヌクレオチドを含むベクター、例えば、プラスミド、任意の環状または直鎖状ＤＮＡポリヌクレオチド、ミニサークル、ウイルス（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスなど）、ｍＲＮＡ、および／または修飾ｍＲＮＡに関する。
【００４０】
さらなる態様では、本発明は、（ｉ）本発明による少なくとも１つのポリヌクレオチドコンストラクト、および／または（ｉｉ）本発明による少なくとも１つの融合タンパク質を含む細胞に関する。さらに、本発明はまた、本発明によるＥＶ、すなわち、ＥＶが形成されるが、ＥＶ産生細胞からまだ放出されていないときのＥＶを含む細胞に関する。ＥＶ産生細胞は、例えば、一次細胞、細胞株、多細胞生物中に存在する細胞、または本質的に任意の他の種類の細胞源およびＥＶ産生細胞材料の形態で存在し得る。「源細胞」または「ＥＶ源細胞」または「親細胞」または「細胞源」または「ＥＶ産生細胞」という用語または任意の他の同様の用語を、例えば、懸濁培養における、または接着培養における、または任意の他の種類の培養系における好適な条件下でＥＶを産生することができる任意の型の細胞に関連すると理解することができる。本発明による源細胞はまた、インビボでエクソソームを産生する細胞を含み得る。本発明による源細胞は、懸濁培養もしくは接着培養で成長し得るか、または懸濁成長に適合され得る広範囲の細胞および細胞株から選択され得る。本発明による源細胞は、間葉系幹細胞または間質細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、ワルトン膠様質、周産期組織、胎盤、歯芽、臍帯血、皮膚組織などから得ることができる）、線維芽細胞、羊膜細胞、およびより具体的には任意選択で様々な早期マーカーを発現する羊膜上皮細胞、骨髄抑制細胞、Ｍ２極性マクロファージ、脂肪細胞、内皮細胞、線維芽細胞などを含む群から選択され得る。特に目的とされる細胞株には、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ）細胞、微小血管またはリンパ内皮細胞などの内皮細胞株、赤血球、赤血球前駆細胞、軟骨細胞、異なる源細胞のＭＳＣ、羊膜細胞、羊膜上皮（ＡＥ）細胞、羊水穿刺を通してまたは胎盤から得られる任意の細胞、気道または肺胞からの上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞などが挙げられる。また、免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞（ＤＣ）も、本発明の範囲内であり、ＥＶを産生することができる本質的に任意の種類の細胞が同様に本明細書に包含される。一般に、ＥＶは、本質的に任意の細胞源に由来し得、それは、一次細胞源または不死化細胞株であり得る。ＥＶ源細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および任意の方法に由来する他の幹細胞を含む、任意の胚性、胎児性、および成人の体性幹細胞型であり得る。神経学的疾患を治療する場合、源細胞、例えば、一次ニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、および神経前駆細胞を利用することを企図し得る。源細胞は、治療される患者に対して本質的に、同種異系、自家性、または異種のいずれかであり得、すなわち、細胞は、患者自身由来、または、無関係、一致するもしくは一致しないドナー由来であり得る。ある特定の状況下では、同種異系細胞は、それらが特定の適応症に罹患する患者の同種異系細胞から得ることのできない免疫調節効果をもたらし得るので、医学的観点から好ましいものであり得る。例えば、炎症性または変性性疾患の治療の状況下では、同種異系ＭＳＣまたはＡＥは、そのＥＶ、特にそのエクソソームの固有の免疫調節性に起因して、エクソソーム産生細胞源として非常に有利であり得る。特に関心対象の細胞株には、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ＨＥＫ２９３細胞などのヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、無血清ＨＥＫ２９３細胞、懸濁ＨＥＫ２９３細胞、微小血管またはリンパ内皮細胞などの内皮細胞株、赤血球、赤血球前駆体、軟骨細胞、異なる源のＭＳＣ、羊膜細胞、羊膜上皮（ＡＥ）細胞、羊水穿刺を通してまたは胎盤、気道または肺胞上皮細胞から得られる任意の細胞、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞などが含まれる。
【００４１】
さらに、本発明による細胞は、通常、本明細書のトリドメイン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびにＤＯＩをコードする別のまたは同じポリヌクレオチドを含み得る。したがって、源細胞は、単一、二重、または複数の安定した源細胞株を産生するようにトランスフェクトされ得る。単一の安定した細胞株は、単一コンストラクトのトランスフェクションのみを必要とすることによってＥＶの産生が簡素化されるため、有利である。例えば、一実施形態では、ＤＯＩは、ＥＶ産生細胞に挿入されるポリヌクレオチドコンストラクトによってコードされ得る。ＤＯＩは、例えば、有利な実施形態では、ｍＲＮＡ、短ヘアピンＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ガイドＲＮＡ、シングルガイドＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、および／またはこれらの任意の組み合わせもしくは誘導体のＮＡ剤であってよい。あるいは、ＤＯＩは、例えば、ポリヌクレオチドコンストラクトによってコードされるタンパク質および／またはペプチドの形態であってもよく、ポリヌクレオチドコンストラクトは、本明細書の融合タンパク質をコードするものと同じまたは異なるコンストラクトであってもよい。
【００４２】
追加の態様では、本発明は、本発明による融合タンパク質を含むＥＶを産生する方法に関する。方法は、典型的には、（ｉ）融合タンパク質（すなわち、少なくともエクソソームタンパク質、精製ドメイン、および薬物負荷部分を含む融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドをＥＶ産生細胞に導入するステップと、（ｉｉ）ＥＶ産生細胞が融合タンパク質を含むＥＶを産生することを可能にするステップと、を含み得る。さらなる態様では、本発明はまた、ＤＯＩを含むＥＶの産生方法に関し、方法は、（ｉ）融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびＤＯＩをコードするポリヌクレオチドをＥＶ産生細胞に導入するステップと、（ｉｉ）ＥＶ産生細胞が、ポリヌクレオチドによってコードされる融合タンパク質およびＤＯＩを含むＥＶを産生することを可能にするステップと、を含み、該融合タンパク質の薬物負荷部分は、ＤＯＩに結合し、それをＥＶに輸送する。上述のように、ＤＯＩをコードするポリヌクレオチドは、例えば、タンパク質、ペプチド、ｍＲＮＡ、短ヘアピンＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ガイドＲＮＡ、シングルガイドＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、および／またはこれらの任意の組み合わせもしくは誘導体であり得るＤＯＩをコードし得る。
【００４３】
好ましくは、源細胞は、本発明の融合タンパク質（複数可）をコードするコンストラクトで安定的にトランスフェクトされ、したがって、安定した細胞株が生成される。これは、均一な品質および収率のＥＶの一貫した産生を有利にもたらす。ＥＶ産生細胞は、細胞にポリヌクレオチドを導入するための本質的に任意の非ウイルスまたはウイルス方法を使用して、少なくとも１つのポリヌクレオチドコンストラクトで遺伝子組み換えされ得る。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびＤＯＩをコードするポリヌクレオチドは、細胞にポリヌクレオチドを導入するための本質的に任意の非ウイルスまたはウイルス方法を使用してＥＶ産生細胞に導入され得る。ポリヌクレオチドを導入するための好適な方法としては、ＰＥＩなどのポリカチオン、リポフェクタミン（ＲＴＭ）などの脂質系トランスフェクション試薬、レンチウイルス形質導入、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ誘導挿入、Ｆｌｐ−Ｉｎ系、トランスポゾン系、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、およびリン酸カルシウムトランスフェクションを使用したトランスフェクションが挙げられる。ポリヌクレオチドをＥＶ産生細胞に導入するための方法の選択は、細胞源の選択、ポリヌクレオチドベクターの性質および特徴（例えば、ベクターがプラスミドもしくはミニサークル、または例えば、直鎖ＤＮＡポリヌクレオチドもしくはｍＲＮＡである場合）、ならびに必要なコンプライアンスおよび対照のレベルを含む様々なパラメータに依存するであろう。同様に、安定な細胞株を生成するためのＥＶ産生細胞の不死化は、ｈＴＥＲＴ媒介性不死化、転写因子不死化、Ｅ１／Ｅ２不死化、または他のウイルス媒介性不死化技術などを含む細胞株開発の当該技術分野において周知の技術を使用して達成され得る。
【００４４】
さらなる態様では、本発明は、ＤＯＩを含むＥＶの精製方法に関する。方法は、典型的には、（ｉ）本発明による融合タンパク質を含むＥＶを提供するステップと、（ｉｉ）ＥＶに含まれる融合タンパク質の精製ドメインを精製リガンドに結合させて、ＥＶの単離および／または精製を可能にするステップと、（ｉｉｉ）精製リガンドに結合していないＥＶを除去するステップと、を含む。
【００４５】
好ましい実施形態では、精製リガンドは、例えば、クロマトグラフィおよび／または膜ベースの精製を可能にするために固相に付着される。親和性クロマトグラフィは、一般に、標的生体分子、この場合は標的ＥＶまたはエクソソーム上の固定化リガンドと構造要素との間の高度に選択的な相互作用に基づく。親和性クロマトグラフィの高い選択性は、例えば、クロマトグラフィマトリックス上の精製リガンドと、本発明のＥＶに含まれる融合タンパク質の一部を形成する精製ドメインとの間の複数の分子相互作用（水素結合、疎水性相互作用、イオン相互作用、および／またはファン・デル・ワルス相互作用を含む）によって提供され得る。融合タンパク質含有ＥＶの親和性に基づく精製に好適な精製ドメインとしては、受容体、抗体結合ポリペプチド、Ｆｃ結合ポリペプチド、ポリヒスチジン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、インテインキチン結合ドメイン（Ｉ−ＣＢＤ）、ストレプトアビジン、アビジン、ＦＬＡＧエピトープタグ、ＨＡエピトープタグ、Ｔ７タグ、Ｓ−タグ、ＣＬＩＰタグ、ＤＨＦＲ、セルロース結合ドメイン、ならびにこれらの任意の組み合わせ、誘導体、ドメイン、または一部が挙げられる。特に有利な実施形態では、精製ドメインは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、プロテインＬＧ、Ｚドメイン、ＺＺドメイン、ヒトＦＣＧＲＩ、ヒトＦＣＧＲ２Ａ、ヒトＦＣＧＲ２Ｂ、ヒトＦＣＧＲ２Ｃ、ヒトＦＣＧＲ３Ａ、ヒトＦＣＧＲ３Ｂ、ヒトＦＣＧＲＢ、ヒトＦＣＡＭＲ、ヒトＦＣＥＲＡ、ヒトＦＣＡＲ、マウスＦＣＧＲＩ、マウスＦＣＧＲＩＩＢ、マウスＦＣＧＲＩＩＩ、マウスＦＣＧＲＩＶ、マウスＦＣＧＲｎ、ＦｃＩＩＩペプチド、およびこれらの任意の組み合わせ、誘導体、ドメインまたはその一部を含む群から選択され得る、Ｆｃ結合ポリペプチドである。上記のように、精製ドメインに加えて、本発明の融合タンパク質は、例えば、親和性クロマトグラフィカラム上の精製リガンドによる捕捉後の精製ドメイン自体の除去を可能にする切断部位を含み得る。かかる切断反応の後、切断を触媒する酵素は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィ（例えば、ビーズ溶出クロマトグラフィを可能にするためにＣａｐｔｏｃｏｒｅ  ７００樹脂を使用する）または荷電膜／イオン交換クロマトグラフィ（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＱまたはＭｕｓｔａｎｇ  Ｑイオン交換器を使用する）を使用して除去され得る。
【００４６】
一般的に言えば、本発明の操作されたＥＶの親和性精製は、非常に純粋で高度に薬物濃縮されたＥＶ集団をもたらすであろう。しかしながら、追加の単離、精製、および／または研磨ステップは、親和性精製ステップの上流および／または下流の両方を含んでもよい。好適な相補的精製ステップとしては、サイズ排除液体クロマトグラフィ、ビーズ溶出液体クロマトグラフィ、イオン交換精製（陰イオン交換など）、荷電膜分離、ならびに当該技術分野で使用される様々な他の精製および／または研磨戦略が挙げられる。
【００４７】
追加の態様では、本発明は、本明細書に記載のＥＶを含む薬学的組成物に関する。通常、ＥＶは、ＥＶ産生細胞源によって産生され、これはまた、ＤＯＩがＥＶに組み込まれることにもつながる。次いで、ＥＶ（すなわち、ＥＶの集団）は、典型的には、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、および／もしくは希釈剤、または同様のものを含み得る薬学的に許容可能な組成物中に製剤化される。さらに、ＥＶおよび／または薬学的組成物は、様々な疾患（ｄｉｓｅａｓｅｓ）、障害、疾患（ａｉｌｍｅｎｔｓ）または病気を治療するために医学的に使用され得る。より具体的には、本発明は、様々な疾患の予防および／または治療および／または緩和における使用に関する。疾患および状態の非限定的な例としては、以下の非限定的な例が挙げられる：クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、特発性肺線維症、乾癬、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、インターロイキン−１受容体拮抗薬（ＤＩＲＡ）の欠乏、子宮内膜症、自己免疫性肝炎、強皮症、筋炎、脳卒中、急性脊髄損傷、血管炎、ギラン−バレ症候群、急性心筋梗塞、ＡＲＤＳ、敗血症、髄膜炎、脳炎、肝不全、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、腎不全、心不全、または任意の急性もしくは慢性臓器不全、ならびに関連する原因疾患、移植片対宿主病、デュシェンヌ筋ジストロフィー、および他の筋ジストロフィー、全てのリソソーム蓄積疾患、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、および／またはＩＩＩ型ガウチャー病、ファブリー病、ＭＰＳ  Ｉ、ＩＩ型（ハンター症候群）、ならびにＩＩＩ型、Ａ型、Ｂ型、およびＣ型ニーマン−ピック病、ポンペ病、シスチン病など、Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素欠乏症などの尿素サイクル障害、リン酸カルバモイル合成酵素欠乏症、オルニチントランスカルバモイラーゼ欠乏症、シトルリン血症（アルギニノコハク酸合成酵素の欠乏）、アルギニノコハク酸尿症（アルギニノコハク酸リアーゼの欠乏）、アルギニン血症（アルギナーゼの欠乏）、高オルニチン血症、高アンモニア血症、ホモシトルリン尿（ＨＨＨ）症候群（ミトコンドリアオルニチントランスポーターの欠乏）、シトルリン血症ＩＩ（シトリン、アスパラギン酸グルタミン酸トランスポーターの欠乏）、リジン尿タンパク質不耐性（ｙ＋Ｌアミノ酸トランスポーター１における変異）、オロト酸尿症（ウリジン一リン酸合成酵素ＵＭＰＳの欠乏）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＧＢＡ関連パーキンソン病、ハンチントン病、および他のトリヌクレオチド反復関連疾患を含む神経変性疾患、認知症、ＡＬＳ、癌性悪液質、２型糖尿病、および様々な癌。事実上全ての種類の癌が本発明について関連性のある疾患標的であり、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫（小脳または大脳）、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨腫瘍、脳幹神経膠腫、脳癌、脳腫瘍（小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、視経路および視床下部神経膠腫）���乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍（小児、消化管）、原発不明癌、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頸癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌（眼内黒色腫、網膜芽細胞腫）、胆嚢癌、胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（Ｓｔｏｍａｃｈ））癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍（頭蓋外、性腺外、または卵巣）、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫（脳幹の神経膠腫、大脳星状細胞腫、視経路および視床下部神経膠腫）、胃カルチノイド、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、膵島細胞癌（膵臓内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓癌（腎細胞癌）、咽頭癌（ｌａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、白血病（（急性リンパ芽球性（急性リンパ球性白血病とも呼ばれる）、急性骨髄性（急性骨髄性白血病とも呼ばれる）、慢性リンパ球性（慢性リンパ球性白血病とも呼ばれる）、慢性骨髄性（慢性骨髄性白血病とも呼ばれる）、ヘアリー細胞白血病））、口唇口腔癌、脂肪肉腫、肝臓癌（原発性）、肺癌（非小細胞、小細胞）、リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキン、髄芽腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、口腔癌（ｍｏｕｔｈ  ｃａｎｃｅｒ）、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫、菌状息肉腫、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）（急性、慢性）、骨髄腫、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌（ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、口腔咽頭癌、骨肉腫／骨の線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌（表面上皮−間質性腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、膵島細胞癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌（ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、褐色細胞腫、松果体星細胞腫、松果体胚細胞腫、松果体芽細胞腫およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、下垂体腺腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌（腎臓癌）、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫（ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、子宮肉腫）、セザリー症候群、皮膚癌（非黒色腫、黒色腫）、小腸癌、扁平上皮癌、頸部扁平上皮癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉腫瘍、精巣癌、咽頭癌（ｔｈｒｏａｔ  ｃａｎｃｅｒ）、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、腎盂および尿管の移行細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ならびに／またはウィルムス腫瘍である。
【００４８】
本発明によるＥＶは、例えば、耳介（耳）、頬側、結膜、皮膚、歯、電気浸透、子宮頸管内、洞内、気管内、腸内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸透、間質性、腹腔内（ｉｎｔｒａ−ａｂｄｏｍｉｎａｌ）、羊水内、動脈内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、心臓内、軟骨内、仙骨内、洞内、腔内、大脳内、槽内、角膜内、歯冠内（歯）、冠動脈内、海綿体内、皮内、脊髄内、管内、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、回腸内、病巣内、管腔内、リンパ管内、骨髄内、髄膜内、筋肉内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、胸膜内、前立腺内、肺内、鼻腔内、脊髄内、滑膜内、腱内、精巣内、包膜内、胸腔内、尿細管内、腫瘍内、鼓膜内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内ボーラス、静脈内点滴、心室内、膀胱内、硝子体内、イオン浸透法、洗浄、喉頭、鼻、経鼻胃、閉鎖包帯法、眼、経口、口腔咽頭、その他、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸（吸入）、眼球後、軟組織、くも膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓膜、尿管、尿道、および／または膣の投与、および／または上述の投与経路の組み合わせのような、典型的には治療すべき疾患、および／またはＥＶ、当該ＮＡカーゴ分子、もしくはそのようなＥＶ集団の特性に依存する、様々な異なる投与経路を介して、ヒトまたは動物に投与され得る。
【００４９】
ここで、本発明、ならびにその様々な態様、実施形態、代替物、および変形が、添付の実施例と共にさらに例示されるが、当然のことながら、本発明の範囲および要旨から逸脱することなく大きく変更することもできる。
【実施例】
【００５０】
実施例１：ｍＲＮＡ負荷型ＭＳＣ由来エクソソームの親和性精製
ワルトン膠様質由来ＭＳＣを従来の組織培養フラスコで培養し、ＰＥＩトランスフェクションを使用して一過性にトランスフェクトして、以下のドメイン、エクソソームタンパク質ＣＤ６３、精製ドメインとしてのＺドメイン（ブドウ球菌タンパク質Ａから得られた）、およびｍＲＮＡのエクソソームへの結合もしくは負荷を可能にする薬物負荷部分としてのＣａｓ６タンパク質を含む融合タンパク質の負荷および発現を可能にした。ＷＪ−ＭＳＣをまた、ナノルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡをコードするコンストラクトと共トランスフェクトした。操作されたＥＶを図１に概略的に示す。
【００５１】
トランスフェクトした細胞からのＥＶ含有上清を４８時間後に回収した。比較目的のために、次の２つの異なる下流精製経路を使用してＥＶを単離および精製した：（１）Ｃａｐｔｏｃｏｒカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）およびビーズ溶出液体クロマトグラフィの組み合わせ、ならびに（２）タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）およびＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ親和性樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の組み合わせ。方法論（１）を使用して、ＥＶ含有媒体を、回収し、３００ｇを５分間低速回転し、続いて、２０００ｇを１０分間回転して、より大きな粒子および細胞残屑を除去した。次に、上清を０．２２μｍシリンジフィルタによって濾過し、種々の精製ステップに供した。１００ｋＤａカットオフフィルタと共にＶｉｖａｆｌｏｗ  ５０Ｒタンジェンシャルフロー（ＴＦＦ）装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）または１００もしくは３００ｋＤａカットオフ中空糸フィルタと共にＫＲ２ｉ  ＴＦＦ  ｓｙｓｔｅｍ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｓ）を使用して、ＴＦＦを実行した。続いて、予め濃縮された媒体を、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に接続されたビーズ溶出カラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｃａｐｔｏ  Ｃｏｒｅ  ７００  ｃｏｌｕｍｎ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に負荷した。カラム平衡化のための流速設定、試料負荷、および適切なカラム清浄化の手順は、製造元の説明書に従って選択された。試料は、ＵＶ吸収クロマトグラムに従って回収され、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  １０ｋＤａ分子量カットオフスピンフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、最終容量に濃縮された。
【００５２】
方法論（２）を使用して、ＴＦＦステップを上述のように実行し、続いて、ＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ親和性樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通してＥＶ調製を実行した。細胞培養上清を、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓに接続されたＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ６に負荷した。カラム平衡化のための流速設定、試料負荷、およびカラム清浄化は、製造者メーカーの説明書に従って選択された。０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨを７．６に設定した０．１５ＭのＮａＣｌを含有する結合バッファを使用した。約６のｐＨを有する０．５ＭのＨＡｃを含む溶出バッファを利用して、Ｚドメイン精製部分を含むＩｇＧ結合ＥＶを溶出した。単離されたＺドメイン自体を使用した競争溶出も別々に評価されて、良好な結果を得た。試料は、ＵＶ吸収クロマトグラムに従って回収され、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  １０ｋＤａ分子量カットオフスピンフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、１００μｌの最終容量に濃縮され、さらなる下流の分析のために−８０℃で保存された。
【００５３】
得られたＥＶ集団におけるナノルシフェラーゼｍＲＮＡの濃縮を、ｑＰＣＲを使用して評価した。標準方法を使用して、１Ｅ１０個のＥＶからのＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴを使用してレトロ転写して、全長のＲＮＡ分子の量を評価した。負荷されたＲＮＡ分子の数は、ｑＰＣＲを使用する絶対定量化によって計算された。ＣＤ６３−ＺＺ−Ｃａｓ６の発現が、標準的なウェスタンブロット法を使用して、細胞およびＥＶの両方において検出された。ＴＦＦおよびＣａｐｔｏｃｏｒに基づく下流精製を使用する場合、ｍＲＮＡ分子は、最終集団に存在するＥＶのうちの約１５％存在した。ＴＦＦおよびＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６樹脂を組み合わせた精製アプローチを使用して、ＥＶの最終集団は、全てのＥＶの約６５％存在するナノルシフェラーゼｍＲＮＡを有し、したがって、最終生成物中で約４〜５倍高い薬物濃縮が得られた。
【００５４】
ＷＪ−ＭＳＣエクソソームも、インビトロ取り込みアッセイにおいて評価した。簡潔に述べると、Ｈｕｈ７細胞を細胞培養プレートに播種し、続いて、ｍＲＮＡ負荷の操作されたエクソソームに４時間曝露した。ナノルシフェラーゼｍＲＮＡによって生成された生体発光を、細胞を採取し、総生体発光出力を測定することによって測定した。ＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６カラムを使用して精製した操作されたＥＶで処理した細胞からのシグナルは、ＴＦＦ−Ｃａｐｔｏｃｏｒ精製アプローチを使用して精製したＥＶからのシグナルより約５倍高かった（図２）。
【００５５】
実施例２：ｍＲＮＡ負荷ＨＥＫ由来エクソソームの親和性精製
ヒト胎児由来腎臓細胞２９３（ＨＥＫ２９３）をレンチウイルス系で安定して形質導入し、以下のドメイン：エクソソームタンパク質Ｌａｍｐ２Ｂ、Ｎ末端における精製ドメインとしてのヘキサヒスチジン（Ｈ６）タグ、および薬物負荷部分としてのＴａｒＲＮＡ結合タンパク質２（ＴＢＰＲ２）からの二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、を含む融合タンパク質の発現を可能にした。自己切断可能なインテインタンパク質要素を含むバリアント融合タンパク質も評価し、Ｌａｍｐ２ｂとＲＢＤとの間に導入されたインテインも評価した。ＨＥＫ２９３細胞をまた、Ｃ−ＭＹＣ癌遺伝子に特異的なｓｈＲＮＡをコードするプラスミドと一過性に共トランスフェクトした。融合タンパク質のＴＲＢＰ２薬物負荷ドメインは、ｓｈＲＮＡのエクソソームへの負荷、続いてｓｈＲＮＡ薬物カーゴのインテイン媒介放出を可能にする。
【００５６】
トランスフェクト細胞由来のＥＶ含有上清を、プラスミドトランスフェクションの４８時間後に回収した。比較目的のために、次の２つの異なる下流精製経路を使用してＥＶを単離および精製した：（１）Ｃａｐｔｏｃｏｒカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）およびビーズ溶出液体クロマトグラフィの組み合わせ、ならびに（２）タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）およびＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰヒスチジンタグ付けタンパク質精製カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の組み合わせ。方法論（１）を使用して、ＥＶ含有媒体を、回収し、３００ｇを５分間低速回転し、続いて、２０００ｇを１０分間回転して、より大きな粒子および細胞残屑を除去した。次に、上清を０．２２μｍシリンジフィルタによって濾過し、種々の精製方法論に供した。１００ｋＤａカットオフフィルタと共にＶｉｖａｆｌｏｗ  ５０Ｒタンジェンシャルフロー（ＴＦＦ）装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）または１００もしくは３００ｋＤａカットオフ中空糸フィルタと共にＫＲ２ｉ  ＴＦＦ  ｓｙｓｔｅｍ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｓ）を使用して、ＴＦＦを実行した。続いて、予め濃縮された媒体を、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に接続されたビーズ溶出カラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｃａｐｔｏ  Ｃｏｒｅ  ７００  ｃｏｌｕｍｎ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に負荷した。カラム平衡化のための流速設定、試料負荷、および適切なカラム清浄化の手順は、製造元の説明書に従って選択された。試料を、ＵＶ吸収クロマトグラムに従って回収し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  １０ｋＤａ分子量カットオフスピンフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して最終容量に濃縮した。
【００５７】
方法論（２）を使用して、ＴＦＦステップを上述のように実行し、続いて、Ｎｉセファロース高性能親和性樹脂が充填されたＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰヒスチジンタグ付けタンパク質精製カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通してＥＶ調製を実行した。本質的に、この樹脂は、カップリングキレート基を有するアガロースビーズで高度に架橋される（このキレート基は、ニッケル（Ｎｉ−ＮＴＡ）で予め荷電されている）。カラム平衡化、試料負荷およびカラム清浄化プロトコルは、製造元の説明書に従って選択された。操作されたＥＶの外側に存在するヒスチジンタグは、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム（ＰＢＳ中）と１０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７．４）の結合バッファの下で予め荷電されたニッケルと選択的に結合する。カラムを、ＰＢＳ中の２０〜４０ｍＭのイミダゾールを含有するバッファ（ｐＨ７．４）を使用して洗浄した。次に、Ｈｉｓタグ付きＥＶを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で３００ｍＭのイミダゾールを含有する溶出バッファを使用してＨｉｓＴｒａｐカラムから溶出した。
【００５８】
２つの代替アプローチとして、融合タンパク質は、ヒスチジンとエクソソームタンパク質ＬＡＭＰ２Ｂとの間に導入されたＴＥＶリンカーペプチドまたはＳＵＭＯリンカーペプチドのいずれかを含むように修飾された（図３は、ＥＶの概略図を示す）。これにより、捕捉されたＥＶに対して非イミダゾール系溶出戦略、すなわち、いわゆる標的タンパク質分解クリッピング手順を使用することが可能になった。したがって、ｐｏｌｙＨｉｓタグ付きＥＶのＮｉ−ＮＴＡ親和性結合の後、０．１〜０．５ＭのＮａＣｌ中にＴＥＶまたはＳＵＭＯプロテアーゼ（酵素活性に基づいて決定される濃度）を含有する溶出バッファ（ＴＥＶプロテアーゼ切断については、４０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０ｍＭのスクロースと共に、およびＳＵＭＯプロテアーゼ媒介切断については、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％のＩｇｅｐａｌ、５０％（ｖ／ｖ）のグリセロールと共に）を使用し、これにより、タンパク質分解切断の結果として捕捉された操作ＥＶの溶出が誘発された。
【００５９】
負荷したｓｈＲＮＡの量を定量化するために、標準的な方法を使用して１Ｅ１０個のＥＶからのＲＮＡを抽出した。エクソソーム中の抗ｃ−ｍｙｃ  ｓｈＲＮＡの絶対定量化のために、合成ｓｈＲＮＡの標準曲線を作成した。Ｃ−ｍｙｃ  ｓｈＲＮＡの量を、ＮＴＡによって決定される粒子の数、またはＭｉｃｒｏ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定されるタンパク質の総量のいずれかによって正規化した。Ｈｉｓｘ６−Ｌａｍｐ２ｂ−ＴＲＢＰ２の発現を、ウェスタンブロット法を使用して細胞およびＥＶの両方において検出した。ＴＦＦおよびＣａｐｔｏｃｏｒに基づく下流精製を使用する場合、ｓｈＲＮＡ分子は、最終集団に存在するＥＶのうちの約４５％存在した。ＴＦＦをＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰ精製カラムと組み合わせる精製アプローチを使用する場合、ＥＶの最終集団は、全てのＥＶのうちの約９０％存在するｃ−ｍｙ  ｓｈＲＮＡを有し、したがって、最終生成物において約２倍の薬物濃縮がもたらされた。同様に、薬物負荷部分、エクソソームタンパク質、ＳＵＭＯまたはＴＥＶ切断リンカー、およびｐｏｌｙ−Ｈｉｓを含む融合タンパク質で修飾されたＥＶは、同様の当該ｓｈＲＮＡの濃縮を示したが、これら２つのコンストラクトの使用により、精製ドメイン（この場合はＨｉｓタグ）の酵素除去が可能になった。
【００６０】
操作されたＨＥＫ２９３  ＥＶを、インビトロアッセイにおいても評価した。簡潔に述べると、Ｈｕｈ７細胞を細胞培養プレートで播種し、続いて、ｓｈＲＮＡ負荷の操作されたＥＶに対して４時間曝露した。細胞を採取し、ｑＰＣＲを使用してノックダウンを評価することによって、Ｃ−ｍｙｃ  ＲＮＡの減少が評価された。ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰ精製カラムを使用して精製したＥＶで細胞を処理したときに検出されたｃ−ｍｙｃ  ＲＮＡの量は、ＴＦＦ−Ｃａｐｔｏｃｏｒ精製アプローチを使用して精製したＥＶで処理した細胞由来のＲＮＡよりも約５０％低かった（データ図示せず）。
【００６１】
実施例３：ｓｇＲＮＡ負荷ＡＳＣ由来エクソソームの親和性精製
ヒト羊膜上皮幹細胞（ｈＡＥ）を、環状円筒底を有する２４個の深いウェルプレートで培養し、ＰＥＩを使用して一過性にトランスフェクトして、薬物負荷タンパク質としてＣａｓ９（ストレプトコッカスピオゲネス由来）、エクソソームタンパク質シンテニン、融合タンパク質をＥＶ膜に固定する膜貫通ｇｐ１３０ドメイン、およびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグを含む融合タンパク質の発現を可能にした。ＡＥ細胞を、ＩＧＦ２ＢＰ１遺伝子に対するｓｇＲＮＡをコードするプラスミドで共トランスフェクトした。両方のプラスミドの共発現は、Ｃａｓ９によるｓｇＲＮＡの結合およびＲＮＡカーゴのＥＶへの負荷を可能にする。
【００６２】
トランスフェクトした細胞からのＥＶ含有上清を４８時間後に回収した。実施例１および２と同様に、ＥＶは、２つの異なる下流精製プロセス（（１）ビーズ溶出液ＬＣと組み合わせたＴＦＦ、および（２）ＭＢＰＴｒａｐ  ＨＰ親和性樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）が後続するＴＦＦを使用して単離および精製された。第２の方法を使用して、ＴＦＦステップを上述のように実行し、続いて、デキストリンセファロース高性能親和性樹脂が予め充填されたＭＢＰ  Ｔｒａｐ高精度カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通してＥＶ調製を実行した。カラム平衡化、試料負荷、およびカラム清浄化は、製造元の説明書に従って選択された。操作されたＥＶの外側に存在するＭＢＰタグは、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）の結合バッファの下で、予め充填されたデキストリンセファロースと選択的に結合する。次に、ＭＢＰタグ付きＥＶを、１０ｍＭのマルトースを含有する溶出バッファを使用して、ＭＢＰ  Ｔｒａｐ  ＨＰカラムから溶出した。実施例２と同様に、代替融合タンパク質設計において、ＴＥＶペプチドリンカーを含めて、ＭＢＰタグの酵素除去を可能にした。
【００６３】
負荷されるｓｇＲＮＡの量を定量化するために、１Ｅ１０個のＥＶからのＲＮＡを抽出し、続いて、合成ｓｇＲＮＡの標準曲線に対する定量を行った。ＩＧＦ２ＢＰ１  ｓｇＲＮＡの量を、ＮＴＡによって決定される粒子の数によって、またはＭｉｃｒｏ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定されるタンパク質の総量のいずれかによって正規化した。ウェスタンブロット法を使用して、ＭＢＰ−ｇｐｒ１３０−シンテニン−Ｃａｓ９の発現を細胞およびＥＶの両方において検出した。ビーズ溶出クロマトグラフィと組み合わされたにＴＦＦより、ｓｇＲＮＡカーゴ分子が最終集団に存在するＥＶのうちの約４０％に存在するという結果が得られた。ＴＦＦおよびＭＢＰに基づく親和性捕捉を組み合わせた精製アプローチ（およびその後のＭＢＰタグの酵素的除去の代替アプローチ）を使用して、ＥＶの最終集団は、全てのＥＶのおよそ９０％にＩＧＦ２ＢＰ１  ｓｇＲＮＡが存在し、したがって、最終ＥＶ集団において２倍以上の薬物カーゴ負荷をもたらした（図４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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