(57)【要約】  一部の態様および実施形態において、本発明は、例えばＨＳＣＴのための造血幹細胞を作製するための方法を提供する。本方法は、ＨＳＣの形成を刺激するために十分な条件下で、造血性内皮（ＨＥ）細胞または内皮細胞を含む細胞集団を用意すること、ならびにＨＥ細胞および／または内皮細胞における、ＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼ３ベータ（Ｄｎｍｔ３ｂ）および／またはＧＴＰａｓｅ  ＩＭＡＰファミリーメンバー６（Ｇｉｍａｐ６）の活性または発現を増大させることを含む。
2021527397.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞（ＨＳＣ）の集団を調製する方法であって、
ＨＳＣの形成を刺激するために十分な条件下で、
内皮細胞および／または造血性内皮（ＨＥ）細胞を含む集団を提供すること、ならびに、前記細胞におけるＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼ３ベータ（Ｄｎｍｔ３ｂ）および／またはＧＴＰａｓｅ  ＩＭＡＰファミリーメンバー６（Ｇｉｍａｐ６）の活性または発現を増大させることを含む、方法。
【請求項２】
前記ＨＳＣを回収することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞を、有効量の、Ｄｎｍｔ３ｂの前記活性または発現を増大させるアゴニストと接触させることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アゴニストが、機械感受性受容体または機械感受性チャネルのアゴニストである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記機械感受性受容体がピエゾ１である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ピエゾ１のアゴニストがＹｏｄａ１である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記有効量の前記Ｙｏｄａ１アゴニストが、５から５００ｕＭの範囲、または５から１００μＭの範囲である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｄｎｍｔ３ｂの活性または発現の前記増大が、前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞において、Ｄｎｍｔ３ｂのｍＲＮＡ発現を増大させること、Ｄｎｍｔ３ｂ導入遺伝子および／もしくはエピソームを導入すること、ならびに／またはＤｎｍｔ３ｂ発現エレメントの遺伝子修飾を導入することを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記内皮細胞および／またはＨＥ細胞が、ＨＬＡ修飾細胞もしくはＨＬＡヌル細胞、および／または導入遺伝子フリーの細胞に由来する、および場合によって、ｉＰＳ細胞または体細胞の遺伝的もしくは化学的誘導によって導出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
源細胞が、対象から得られるかまたはそれに由来し、前記対象は、場合によって万能適合ドナーである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記源細胞が、血液疾患、骨髄疾患、代謝性疾患、または免疫疾患を有する対象から得られるかまたはそれに由来する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が血液の悪性腫瘍を有していない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＳＣの集団がレシピエントに投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記源細胞が前記レシピエントに由来していた、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記造血幹細胞が長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
生体力学的な刺激を提供してＤｎｍｔ３ｂの前記活性または発現を増大させることを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記内皮細胞におけるＧｉｍａｐ６の前記活性または発現を増大させることをさらに含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
Ｇｉｍａｐ６の活性または発現の前記増大が、前記ＨＥ細胞において、Ｇｉｍａｐ６のｍＲＮＡ発現を増大させること、Ｇｉｍａｐ６導入遺伝子を導入することおよび／もしくはエピソームを導入すること、ならびに／またはＧｉｍａｐ６発現エレメントの遺伝子修飾を導入することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
造血性内皮（ＨＥ）細胞を含む集団をバイオリアクターに提供することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記バイオリアクターが、繰り返しひずみによる生体力学的伸展を提供する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記繰り返しひずみによる生体力学的伸展が、Ｄｎｍｔ３ｂの前記活性または発現を増大させる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記繰り返しひずみによる生体力学的伸展が、Ｇｉｍａｐ６の前記活性または発現を増大させる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＨＳＣが造血ニッチにおいて生着し、機能的な多細胞系成人血液を再構成する、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＨＥ細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非造血幹細胞、体細胞、または内皮細胞から得られる、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法によって調製されたＨＳＣの集団、および薬学的に許容されるビヒクルを含む、医薬組成物。
【請求項２６】
少なくとも１０２個の細胞を含む、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
造血幹細胞の治療法または移植を必要とする対象を処置する方法であって、治療有効量の、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法によって調製された造血幹細胞（ＨＳＣ）、または請求項２５もしくは２６に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２８】
前記対象が、悪性形態のまたは非悪性形態の血液疾患、骨髄疾患、代謝性疾患、または免疫疾患を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、急性骨髄性白血病、神経芽細胞腫、胚細胞腫瘍、自己免疫障害（全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）もしくは全身性硬化症）、骨髄異形成症候群、またはアミロイドーシスを有する、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
造血幹細胞の治療法または移植を必要とする対象の処置における使用のための、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法によって調製された造血幹細胞（ＨＳＣ）、または請求項２５もしくは２６に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記対象が、悪性形態または非悪性形態の血液疾患、骨髄疾患、代謝性疾患、または免疫疾患を有する、請求項３０に記載の使用のためのＨＳＣまたは医薬組成物。
【請求項３２】
前記対象が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、急性骨髄性白血病、神経芽細胞腫、胚細胞腫瘍、自己免疫障害（全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）もしくは全身性硬化症）、骨髄異形成症候群、またはアミロイドーシスを有する、請求項３０または３１に記載の使用のためのＨＳＣまたは医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本願は、２０１８年６月７日に出願された米国仮特許出願番号第６２／６８１，９８２号の利益を請求する。当該出願の全内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府の資金による研究
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された登録番号ＨＬ１３１６４５、ＤＫ０８５２１７、およびＤＫ１００６７２の下での政府支援を伴ってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、胚発生の間に、特異的誘導事象が中胚葉を血液幹細胞および血液前駆細胞に変換させる他とは異なる領域において派生する。ＨＳＣは、造血と呼ばれるプロセスにおいて、骨髄系およびリンパ系の両方の血球を生じさせることができる。
【０００４】
ＨＳＣ移植（ＨＳＣＴ）は、血液疾患、骨髄疾患、代謝性疾患、および免疫疾患を有する患者を処置するために広く使用されている。臍帯血およびハプロタイプ一致の幹細胞の移植が進歩しているにもかかわらず、ＨＳＣ移植の治療的使用は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が適合する適切なドナーを適時に、特に少数民族の国において見つけることの困難性、および国内での非血縁ドナー登録がないことから、制限されていることが多い。混血の人は米国人口の１．６パーセント（９７００万人）を占めているが、複合人種のボランティアは登録されている７００万人のうちわずか３パーセント（２１０００人）であり、６０００人の患者が、骨髄が適合しないままである。適切な適合が見つかる場合でも、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、ドナー拒絶、および処置に関連する高い死亡率などの免疫学的合併症が、患者の生存を危うくし得る。しかし、これらの合併症は、自家移植によって排除される。自家ＨＳＣは同種異系ＨＳＣの全てに代わるわけではないが、特に血液悪性腫瘍の状況では、自家ＨＳＣは、ドナーアベイラビリティの欠如、ならびに広範囲の悪性および非悪性の血液学的障害、免疫障害、および代謝障害を有する患者でのＧＶＨＤを含む、ＨＳＣＴにおける大きなハードルを克服する。
【発明の概要】
【０００５】
したがって、ＨＳＣＴのための、自家ＨＳＣを含むＨＳＣを生成することが必要とされている。
【０００６】
本開示は、機械感受性受容体（例えば、ピエゾ１）の生体力学的および／または薬理学的活性化が造血幹細胞（ＨＳＣ）の形成のためのＤｎｍｔ３ｂの発現を増強させるという発見に、少なくとも部分的に基づいている。本明細書において実証されているように、ｃｄｈ５−モルファント（ｃｄｈ５−ＭＯ）胚は、心拍出量および活性な血流を伴わずに、血管において、心拍動が介在する脈動を有する。脈動に由来する伸展は、ピエゾ１機械感受性チャネルを活性化させ、このチャネルは、大動脈−性腺−中腎（ＡＧＭ）領域におけるＤｎｍｔ３ｂの発現をさらに増強させて、造血性内皮細胞からＨＳＣへの転換を刺激する。脈動の刺激またはピエゾ１の薬理学的活性化はまた、３倍多い量のＨＳＣを生じさせ、このＨＳＣは、連続移植で、正常な機能的な多細胞系成人血液を再構成する。一部の実施形態において、本開示に従って生産される造血幹細胞は長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）を含み、これは、優れた生着を示し、レシピエントにおいて、機能的な多細胞系成人血液を再構成する。
【０００７】
一部の態様において、本発明は、ＨＳＣの形成を刺激するために十分な条件下で、内皮細胞（例えば、造血性内皮（ＨＥ）細胞）を含む集団を用意すること、ならびに、細胞におけるＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼ３ベータ（Ｄｎｍｔ３ｂ）および／またはＧＴＰａｓｅ  ＩＭＡＰファミリーメンバー６（Ｇｉｍａｐ６）の活性または発現を増大させることを含む、ＨＳＣを作製するための方法を提供する。ＨＳＣは、患者に投与するために回収することができる。
【０００８】
一部の実施形態において、内皮細胞は、有効量の、Ｄｎｍｔ３ｂの活性または発現を増大させるアゴニストと接触させられる。一部の実施形態において、アゴニストは、機械感受性受容体または機械感受性チャネルのアゴニストである。一部の実施形態において、機械感受性受容体は、ピエゾ１である。典型的なピエゾ１アゴニストは、Ｙｏｄａ１である。一部の実施形態において、有効量のＹｏｄａ１アゴニストは、約５μＭから約２００μＭ、もしくは約５μＭから約１００μＭ、または一部の実施形態において、約２５μＭから約１００μＭ、もしくは約２５μＭから約５０μＭの範囲である。
【０００９】
あるいは、Ｄｎｍｔ３ｂの活性または発現は、内皮細胞において直接増大させることができる。例えば、Ｄｎｍｔ３ｂのｍＲＮＡ発現は、ｍＲＮＡ転写産物を細胞に送達することによって、または、活性を増大させるためもしくは変化させるための１つもしくは複数の修飾を有し得るＤｎｍｔ３ｂ導入遺伝子および／もしくはエピソームを導入することによって、増大させることができる。一部の実施形態において、遺伝子編集を利用して、内皮細胞またはＨＥ細胞におけるＤｎｍｔ３ｂ発現エレメントに遺伝子修飾を導入して、例えば、プロモーターの強度、リボソーム結合、またはＲＮＡの安定性を増大させる。
【００１０】
一部の実施形態において、本発明は、内皮細胞におけるＧｉｍａｐ６の活性または発現を、単独でまたはＤｎｍｔ３ｂと組み合わせて増大させることを含む。Ｇｉｍａｐ６の活性または発現を増大させるために、Ｇｉｍａｐ６のｍＲＮＡ転写産物、または代わりにＧｉｍａｐ６導入遺伝子および／もしくはエピソームを細胞に導入することができ、ならびに／あるいは細胞におけるＧｉｍａｐ６発現エレメントの遺伝子修飾（プロモーターの強度、リボソーム結合、またはＲＮＡの安定性を増大させるための１つまたは複数の修飾など）の導入も行うことができる。
【００１１】
様々な実施形態において、内皮細胞（例えば、造血性内皮（ＨＥ）細胞）を含む細胞集団が、バイオリアクターに導入される。一部の実施形態において、バイオリアクターは、繰り返しひずみによる生体力学的伸展（cyclic-strain biomechanical stretching）をもたらす。繰り返しひずみによる生体力学的伸展は、Ｄｎｍｔ３ｂおよび／またはＧｉｍａｐ６の活性または発現を増大させる。例えば、底が柔らかい培養プレートのナイロン膜、ＰＤＭＳ膜、または類似の生体適合性生物模倣膜に取り付けられている、コンピュータ制御された真空ポンプシステム（例えば、ＦｌｅｘＣｅｌｌ（商標）Ｔｅｎｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｙｔｏｓｔｒｅｔｃｈｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ、または類似のもの）を使用して、２Ｄまたは３Ｄの円周方向の伸展を、エクスビボで、規定されたおよび制御された繰り返しひずみ条件下で、ＨＥ細胞に与えることができる。
【００１２】
様々な実施形態において、ＨＳＣの転換は、ピエゾ１の活性化；機械的伸展；Ｄｎｍｔ３ｂに対する、導入遺伝子による修飾を伴うもしくは伴わない（すなわち、導入遺伝子フリー）、エピソームによる修飾を伴うもしくは伴わない、または遺伝子修飾を伴うもしくは伴わない、ｍＲＮＡの導入；および／あるいは、Ｇｉｍａｐ６に対する、導入遺伝子による修飾を伴うもしくは伴わない（すなわち、導入遺伝子フリー）、エピソームによる修飾を伴うもしくは伴わない、または遺伝子修飾を伴うもしくは伴わない、ｍＲＮＡの導入；から選択される１つまたは複数によって誘発される。
【００１３】
一部の実施形態において、ＨＥ細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非造血幹細胞、または線維芽細胞もしくは内皮細胞などの体細胞から得られるかまたはそれに由来する。一部の実施形態において、ＨＥ細胞は、ＨＬＡヌル細胞、ＨＬＡ修飾細胞、および／もしくは導入遺伝子フリーの細胞から、または内皮細胞からＨＥ細胞への遺伝的誘導から得られるかまたはそれに由来する。同種異系ドナーの源細胞に由来する、またはＨＳＣで処置される対象に由来するものを含む、造血性内皮細胞（例えば、Ｆｌｋｌ＋ＣＤ４５＋細胞、Ｆｌｋｌ＋ＣＤ４１＋細胞、またはＣＤ３１＋ＣＤ４３＋細胞）は、あらゆる様式で得ることができる（すなわち、自家細胞または同種細胞から造血性内皮細胞への、化学的誘導、遺伝的誘導、ｍＲＮＡ誘導、導入遺伝子フリーの誘導、またはエピソーム誘導；一部の実施形態において、ＨＥ細胞は、レシピエントの細胞または万能適合ドナーの細胞を使用して作製されたｉＰＳＣから生成される）。一部の実施形態において、発生的に柔軟な（developmentally plastic）内皮細胞が利用される。
【００１４】
様々な実施形態において、本明細書において記載される方法によって調製されたＨＳＣの集団および薬学的に許容されるビヒクルを含む、細胞療法のための医薬組成物が調製される。医薬組成物は、少なくとも約１０２個のＨＳＣ、または少なくとも約１０３個のＨＳＣ、または少なくとも約１０４個のＨＳＣ、または少なくとも約１０５個のＨＳＣ、または少なくとも約１０６個のＨＳＣ、または少なくとも約１０７個のＨＳＣ、または少なくとも１０８個のＨＳＣを含み得る。例えば、一部の実施形態において、レシピエントの体重１キログラム当たり約１０万から約４０万個のＨＳＣ（例えば、約２０万細胞／ｋｇ）を含む医薬組成物が投与される。
【００１５】
一部の実施形態において、本明細書において記載される方法によって調製されたＨＳＣの集団を含む細胞療法が準備される。一部の実施形態において、細胞療法は、薬学的に許容されるビヒクルを含む。細胞療法は、少なくとも約１０２個のＨＳＣ、または少なくとも約１０３個のＨＳＣ、または少なくとも約１０４個のＨＳＣ、または少なくとも約１０５個のＨＳＣ、または少なくとも約１０６個のＨＳＣ、または少なくとも約１０７個のＨＳＣ、または少なくとも１０８個のＨＳＣを含み得る。例えば、一部の実施形態において、レシピエントの体重１キログラム当たり約１０万個から約４０万個のＨＳＣ（例えば、約２０万個細胞／ｋｇ）を含む医薬組成物が投与される。ＨＳＣ細胞の数は、患者の年齢および体重に基づいて変化させることができる。
【００１６】
移植のためのＨＳＣは、一部の実施形態において、約２ヶ月間未満、または約１ヶ月未満（例えば約４週間）、または約２週間未満、または約１週間未満、または約６日間未満、または約５日間未満、または約４日間未満、または約３日間未満などの、比較的短い期間で生成させることができる。一部の実施形態において、Ｄｎｍｔ３ｂおよび／またはＧｉｍａｐ６の活性または発現が増大した発生的に柔軟な内皮細胞またはＨＥ細胞が、１から４週間培養される。
【００１７】
本明細書において記載される方法によって調製されたＨＳＣは、例えば静脈内注入または骨髄内移植によって、対象（レシピエント）に投与される。本方法は、骨髄破壊的な、非骨髄破壊的な、または免疫毒素に基づく（例えば、抗ｃ−Ｋｉｔ、抗ＣＤ４５など）前処置レジメンの後に行うことができる。
【００１８】
本明細書において記載される方法は、血液疾患（悪性および非悪性の）、骨髄疾患、代謝性疾患、ならびに免疫疾患を例えば処置するための移植プロトコルにおいて使用するためのＨＳＣの集団を生成するために使用することができる。一部の実施形態において、ＨＳＣ集団は自家細胞に由来し、例えば、レシピエント対象の細胞を使用して作製されるｉＰＳＣから生成される。一部の実施形態において、ＨＳＣ集団は、万能適合ドナー細胞またはＨＬＡヌル造血性内皮細胞または正常なＨＳＣをもたらす類似の細胞に由来する。
【００１９】
本発明のこれらのおよび他の態様および実施形態は、以下の本発明の詳細な説明によって記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１−１】図１Ａは、２６〜４２ｈｐｆの間の、トランスジェニック胚のｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ＋内皮細胞から生じたｃｄ４１：ｅＧＦＰ＋ＨＳＣの低速度撮影共焦点イメージングを示す。データは、ピエゾ１のサイレンシングが内皮からＨＳＣへの転換を弱め、その一方で、ピエゾ１の薬理学的活性化（Ｙｏｄａ１）が対照胚におけるＨＳＣ形成を刺激し、また、ｓｉｈ−ＭＯ胚におけるＨＳＣ形成を回復させることを実証している。群当たりｎ＝５。＊対照に対してＰ＜０．０５、＄ｓｉｈ−ＭＯに対してＰ＜０．０５。
【図１−２】図１Ｂは、繰り返しひずみおよびピエゾ１アクチベーター（Ｙｏｄａ１）で処置されたＥ１１．５  ＡＧＭ細胞における発現変動遺伝子のヒートマップであり、これは、繰り返しひずみおよびピエゾ１の活性化が、内皮細胞から造血細胞への転換の際のＡＧＭにおいて類似の遺伝子発現パターンを有していることを示している。群当たりｎ＝３。
【図１−３】図１Ｃは、Ｅ１１．５  ＡＧＭ細胞での造血コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイのグラフであり、これは、ピエゾ１の、Ｙｏｄａ１介在性の薬理学的活性化が、内皮細胞から造血細胞への転換を刺激することを実証している。群当たりｎ≧６。＊対照に対してＰ＜０．０５。略記：ＧＥＭＭ（顆粒球、赤血球系、マクロファージ、巨核球）、ＧＭ（顆粒球マクロファージ）、Ｇ（顆粒球）、Ｍ（マクロファージ）、Ｅ（赤血球系）。
【図１−４】図１Ｄは、Ｅ１１．５  ＡＧＭ細胞での造血ＣＦＵアッセイのグラフであり、これは、ピエゾ１の、ＧｓＭｔＸ４介在性の薬理学的阻害が、内皮からＨＳＣへの転換に対する繰り返しひずみの誘発的影響を弱めることを実証している。群当たりｎ≧６。＊対照に対してＰ＜０．０５。略記：ＧＥＭＭ（顆粒球、赤血球系、マクロファージ、巨核球）、ＧＭ（顆粒球マクロファージ）、Ｇ（顆粒球）、Ｍ（マクロファージ）、Ｅ（赤血球系）。
【図２−１】図２Ａは、実験の概要（上部）および折れ線グラフ（下部）を示す図である。実験の概要（上部）は、Ｅ１１．５マウスＡＧＭに由来するＨＳＣの連続移植と、その後の、骨髄破壊的な免疫不全マウスへの１０％繰り返しひずみまたはＹｏｄａ１での処置を表す図式を示す。折れ線グラフ（下部）は、一次移植体（レシピエント）における、８〜１６週目の間の４週間隔の、Ｅ１１．５  ＡＧＭ（ドナー、３胚当量（embryo equivalent））に由来するＨＳＣの再構成で生じる、末梢血のキメリズムのパーセンテージを示し、これは、Ｅ１１．５  ＡＧＭに対する繰り返しひずみまたはピエゾ１の薬理学的活性化（Ｙｏｄａ１処置）が、ＨＳＣの形成を刺激することを示している。群当たりｎ≧５の一次レシピエント。＊対照に対してＰ＜０．０５、＄８週目のキメリズムに対してＰ＜０．０５。３胚当量（ｅ．ｅ．）のＡＧＭドナー細胞を、各レシピエントに注射した。
【図２−２】図２Ｂは、１６週目の一次移植体（レシピエント）における、Ｅ１１．５  ＡＧＭ（ドナー、３胚当量）に由来するＨＳＣからＭａｃ１＋Ｇｒ１＋骨髄細胞、Ｃｄ８＋Ｃｄ３＋Ｔ細胞、およびＢ２２０＋Ｃｄ１９＋Ｂ細胞への再構成のパーセンテージを示すグラフであり、これは、Ｅ１１．５  ＡＧＭに対する繰り返しひずみまたはピエゾ１の薬理学的活性化（Ｙｏｄａ１）が、血液に再構成するＨＳＣの形成を刺激することを示している。群当たりｎ≧５の一次レシピエント。
【図２−３】図２Ｃは、二次移植体（レシピエント）における、８〜１２週目の間の４週間隔の、一次移植体（ドナー）に由来するフローソーティングされたＬｉｎ−Ｓｃａ１＋ｃ−Ｋｉｔ＋ＨＳＰＣ（ｎ＝２０００）の再構成で生じる、末梢血のキメリズムのパーセンテージを示す折れ線グラフであり、これは、Ｅ１１．５  ＡＧＭの繰り返しひずみまたはＹｏｄａ１処置が、連続生着および自己再生能を有するＨＳＣを生産することを示している。群当たりｎ≧５の二次レシピエント。＊対照に対してＰ＜０．０５。
【図２−４】図２Ｄは、１２週目の二次移植体（レシピエント）における、一次移植体（ドナー）に由来するＨＳＣからＭａｃ１＋Ｇｒ１＋骨髄細胞、Ｃｄ８＋Ｃｄ３＋Ｔ細胞、およびＢ２２０＋Ｃｄ１９＋Ｂ細胞への再構成のパーセンテージを示すグラフであり、これは、Ｅ１１．５  ＡＧＭの繰り返しひずみまたはＹｏｄａ１処置が、血液に連続的に再構成し得るＨＳＣを生産することを示している。群当たりｎ≧５の二次レシピエント。
【図３−１】図３Ａは、実験の概要（上部）およびグラフ（下部）を示す図である。実験の概要（上部）は、一次移植体（レシピエントマウス）の造血組織における、ドナー由来の血液系統の機能分析および表現型分析のための戦略を示す。グラフ（下部）は、骨髄に由来する、選別されたＣｄ７１＋Ｔｅｒ１１９＋（ドナー）赤血球系細胞における、β−メジャー（成人）型、εγ（胚）型、およびβ−Ｈ１（胚）型のヘモグロビンの発現のパーセンテージを示す。データは、Ｅ１１．５  ＡＧＭの生体力学的伸展またはＹｏｄａ１処置の後に生産されたドナーＨＳＣが、成人ヘモグロビンを含有する赤血球に再構成されることを示す。群当たりｎ≧６。
【図３−２】図３Ｂは、骨髄由来の選別されたＧｒ１＋Ｍａｃ１＋（ドナー）好中球の一晩の培養（Ｏ／Ｎ）、およびその後の、ＥＬＩＳＡに基づくミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）タンパク質の定量を示すグラフである。データは、Ｅ１１．５  ＡＧＭの生体力学的伸展またはＹｏｄａ１処置の後に、十分なＭＰＯレベルを示す機能的骨髄細胞に再構成するドナーＨＳＣが生産されたことを実証している。群当たりｎ≧５。
【図３−３】図３Ｃは、一次移植体（レシピエント）マウスの末梢血における、免疫化前の免疫グロブリン（Ｉｇ）アイソタイプのＥＬＩＳＡ分析を示すグラフである。データは、一次移植体が、完全な免疫グロブリンレパートリーを有するＢ細胞を生産することを示している。群当たりｎ≧６。
【図３−４】図３Ｄは、脾臓選別型Ｃｄ３＋Ｔ細胞（ドナー）（上部）またはＭａｃ１＋骨髄細胞（ドナー、陰性対照）（下部）のＴ細胞受容体（ＴＣＲβ）遺伝子座分析を示す２つのゲル写真の画像である。データは、Ｅ１１．５  ＡＧＭの生体力学的伸展またはＹｏｄａ１処置の後に、ドナーＨＳＣが、脾臓に移動し、そしてＴＣＲβ遺伝子座を再編成するために十分な機能的組換え機構を有するＴ細胞に再構成される、Ｔ細胞を生産し、Ｔ細胞受容体β（ＴＣＲ  β）の再編成を示すことを示す。
【図３−５】図３Ｅは、遅延型過敏反応アッセイを示すドットプロットであり、これは、生体力学的伸展をしているまたはＹｏｄａ１処置されたＥ１１．５  ＡＧＭに由来するドナーＨＳＣで再構成された一次移植体（レシピエント）マウスが、Ｔ細胞介在性の免疫応答を有することを実証している。群当たりｎ≧６。＊右足蹠（陰性対照）に対してＰ＜０．０５。
【図４】遺伝子がＥＣ対ＨＳＣ（（１））、ＥＣ対ＨＥＣ（（２））、およびＨＥＣ対ＨＳＣ（（３））の最中に上方調節された状況における、繰り返しひずみおよび／またはＹｏｄａ１で処置されたＥ１１．５  ＡＧＭ細胞において上方調節された遺伝子のベン図である。上記の分析（（１）対（２）対（３））において共通して上方調節された遺伝子のベン図での比較は、円周方向の伸展およびピエゾ１の活性化の両方が、内皮からＨＳＣへの転換の際のＤｎｍｔ３ｂ転写産物の発現およびＧｉｍａｐ６転写産物の発現を特異的に刺激することを実証している。
【図５−１】図５Ａは、繰り返しひずみまたはＹｏｄａ１で処置されたＥ１１．５マウスのＡＧＭ細胞の核画分におけるＤｎｍｔ３ｂおよびＤｎｍｔ３ａのタンパク質レベルの２つのグラフを示す図である。データは、円周方向の伸展またはピエゾ１の活性化が、Ｄｎｍｔ３ａの発現に影響を与えることなくＤｎｍｔ３ｂタンパク質の発現レベルを特異的に刺激することを実証している。群当たりｎ≧３。＊対照に対してＰ＜０．０５。
【図５−２】図５Ｂは、ナナオマイシン（Ｎａｎａ）の存在下で繰り返しひずみまたはＹｏｄａ１で処置されたＥ１１．５マウスのＡＧＭ細胞の造血ＣＦＵアッセイのグラフである。データは、Ｄｎｍｔ３ｂの薬理学的阻害が、円周方向の伸展またはピエゾ１の活性化によって刺激される内皮からＨＳＣへの転換を弱めることを示している。群当たりｎ≧６の胚。＊対照に対してＰ＜０．０５。＄伸展に対してＰ＜０．０５。＋Ｙｏｄａ１に対してＰ＜０．０５。
【図５−３】図５Ｃは、２６〜４２ｈｐｆの間の、トランスジェニック胚のｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ＋内皮細胞から生じたｃｄ４１：ｅＧＦＰ＋ＨＳＣの低速度撮影共焦点イメージングの結果を示すグラフである。データは、ｄｎｍｔ３ｂｂ．１のサイレンシングが、ピエゾ１の活性化によって刺激される内皮からＨＳＣへの転換を弱めること、およびナナオマイシンがＤｎｍｔ３ａよりもＤｎｍｔ３ｂに対して特異的であることを実証している。群当たりｎ≧５。＊対照に対してＰ＜０．０５。＄Ｙｏｄａ１に対してＰ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
胎児の発生の間、大動脈−性腺−中腎（ＡＧＭ）における内皮細胞のサブセットは造血性内皮細胞であり、これは、その運命を変化させて、胎児の肝臓および骨髄を最終的にコロニー形成するＨＳＣとなる。しかし、造血性内皮細胞を刺激する因子の個性は依然として不明確であり、機能的ＨＳＣの潜在的由来源としての、造血性内皮細胞の利用性を制限している。内膜に対する、血流が介在するずり応力は、ＨＳＣの内皮性の出現を刺激する。しかし、Ｃｄｈ５ヌルゼブラフィッシュモデルおよびマウスモデルを使用して、早期の循環停止にもかかわらず、機能的ＨＳＣが生じることが確認された。Anderson H, et al., Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood 2015。これらのｃｄｈ５がサイレンシングされたモデルを、機能的ＨＳＣの出現を引き起こす、ずり応力および／または一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）非依存性の生体力学的力を研究するための中心として、本開示に従って使用して、脈圧が介在する円周方向の伸展がそれによってＨＳＣの出現を左右するさらなるメカニズムを調べた。
【００２２】
実験室において造血性内皮細胞からＨＳＣを生成するための試みは、造血性内皮細胞からのＨＳＣの出現を刺激する因子についての知識が欠如していることに一部には起因して、広く不成功に終わっている。現在は、拍動している心臓からの脈動に起因する血管の円周方向の伸展が、造血性内皮細胞からの機能的ＨＳＣの出現を引き起こし、この機能的ＨＳＣが最終的に生着し、確定的な細胞系に分化し得ることが確認されている。加えて、伸展感受性の一過性受容体電位型陽イオンチャネルサブファミリーバニロイドメンバー４（Ｔｒｐｖ４）チャネルの活性化は、サイレントな心臓（ｔｎｎｔ２、ｓｉｈ）、すなわち、心拍動および血流が不存在のサイレンシングされた胚における、ＨＳＣの形成を回復させた。参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／０９６２１５号パンフレットを参照されたい。
【００２３】
本開示は、機械感受性受容体（例えば、ピエゾ１）の生体力学的および／または薬理学的活性化が、造血幹細胞（ＨＳＣ）の形成のためのＤｎｍｔ３ｂの発現を増強させるという発見に、少なくとも一部は基づいている。本明細書において実証されているように、ｃｄｈ５−モルファント（ｃｄｈ５−ＭＯ）胚は、心拍出量および活性な血流を伴わずに、血管において、心拍動が介在する脈動を有する。脈動に由来する伸展は、ピエゾ１機械感受性チャネルを活性化させ、これはさらに、ＡＧＭにおけるＤｎｍｔ３ｂの発現を増強させて、内皮からＨＳＣへの転換を刺激する。脈動の刺激またはピエゾ１の薬理学的活性化はまた、少なくとも３倍多い量のＬＴ−ＨＳＣを生じさせ、これは、連続移植で、正常な機能的な多細胞系の成人血液に再構成する。
【００２４】
したがって、本開示の結果は、心拍動が介在する生体力学的力が、いかにして、機械感受性チャネルおよびエピジェネティックな機構を活性化することによって、細胞運命の転換および幹細胞の形成を刺激するかを実証している。ＬＴ−ＨＳＣの開発、増殖、および幹細胞性の維持は、血液疾患および骨髄疾患を処置するためのＨＳＣ移植および細胞療法における主要な目的である。本開示は、ＬＴ−ＨＳＣを開発するための遺伝的および薬理学的標的を提供する。
【００２５】
一部の態様において、本発明は、ＨＳＣの形成を刺激するために十分な条件下で、内皮細胞（例えば、ＨＥ細胞）を含む集団を用意すること、ならびに、内皮細胞におけるＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼ３ベータ（Ｄｎｍｔ３ｂ）および／またはＧＴＰａｓｅ  ＩＭＡＰファミリーメンバー６（Ｇｉｍａｐ６）の活性または発現を増大させることを含む、ＨＳＣを作製するための方法を提供する。ＨＳＣは、患者に投与するために回収することができる。
【００２６】
Ｄｎｍｔ３ｂ（ＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼ３ベータ）は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼである。Ｄｎｍｔ３ｂは核に主に局在し、その発現は、発生的に調節されている。Ｇｉｍａｐ６は、免疫関連タンパク質（ＧＩＭＡＰ）ファミリーのＧＴＰａｓｅのメンバーである。ＧＩＭＡＰタンパク質は、ＧＴＰ結合モチーフおよびコイルドコイルモチーフを有する。
【００２７】
一部の実施形態において、内皮細胞は、有効量の、Ｄｎｍｔ３ｂの活性または発現を増大させる機械感受性受容体または機械感受性チャネルのアゴニストと接触させられる。一部の実施形態において、機械感受性受容体は、ピエゾ１である。典型的なピエゾ１アゴニストは、Ｙｏｄａ１である。
【００２８】
Ｙｏｄａ１（２−［５−［［（２，６−ジクロロフェニル）メチル］チオ］−１，３，４−チアジアゾール−２−イル］−ピラジン）は、機械感受性イオンチャネルであるピエゾ１のために開発された低分子アゴニストである。Syeda R, Chemical activation of the mechanotransduction channel Piezo1. eLife (2015)。Ｙｏｄａ１は、以下の構造を有する。
【００２９】
【化１】
2021527397.tif 000003
【００３０】
Ｙｏｄａ１の誘導体は、様々な実施形態において利用することができる。例えば、２，６−ジクロロフェニル核を含む誘導体が、一部の実施形態において利用されている。典型的なアゴニストは、Evans EL, et al., Yoda1 analogue (Dooku1) which antagonizes Yoda1-evoked activation of Piezo1 and aortic relaxation, British J. of Pharmacology 175(1744-1759): 2018において開示されている。
【００３１】
一部の実施形態において、有効量のＹｏｄａ１アゴニストまたは誘導体は、約５μＭから約５００μＭ、もしくは約５μＭから約２００μＭ、もしくは約５μＭから約１００μＭの範囲、または一部の実施形態において、約２５μＭから約１５０μＭ、もしくは約２５μＭから約１００μＭ、もしくは約２５μＭから約５０μＭの範囲である。
【００３２】
あるいは、Ｄｎｍｔ３ｂの活性または発現は、内皮細胞またはＨＥ細胞において直接増大させることができる。例えば、Ｄｎｍｔ３ｂのｍＲＮＡ発現は、Ｄｎｍｔ３ｂをコードする転写産物を細胞に送達することによって、またはＤｎｍｔ３ｂをコードする導入遺伝子を導入することによって、または、細胞へのエピソームの導入に限定されない、活性を増大させるもしくは変化させるための１つもしくは複数のヌクレオチド修飾（もしくはコードされているアミノ酸の修飾）を有し得る導入遺伝子フリーの方法によって、増大させることができる。一部の実施形態において、遺伝子編集を、遺伝子修飾を内皮細胞内のＤｎｍｔ３ｂ発現エレメントに導入するために利用して、例えば、プロモーターの強度、リボソーム結合、ＲＮＡの安定性を増大させる、またはＲＮＡスプライシングに影響を与える。
【００３３】
一部の実施形態において、本発明は、内皮細胞におけるＧｉｍａｐ６の活性または発現を、繰り返しひずみまたはピエゾ１の活性化の際に、単独でまたはＤｎｍｔ３ｂおよび／または他の修飾された遺伝子と組み合わせて増大させることを含む。Ｇｉｍａｐ６の活性または発現を増大させるために、Ｇｉｍａｐ６をコードするｍＲＮＡの転写産物を細胞に導入することができ、導入遺伝子フリーのアプローチもまた利用することができ、これには、限定はしないが、細胞へのエピソームの導入が含まれ、または代わりに、活性を増大させるもしくは変化させるための１つもしくは複数のヌクレオチド修飾（もしくはコードされているアミノ酸の修飾）を有し得る、Ｇｉｍａｐ６をコードする導入遺伝子を利用することができる。一部の実施形態において、遺伝子編集が、遺伝子修飾を内皮細胞内のＧｉｍａｐ６発現エレメントに導入する（プロモーターの強度、リボソーム結合、ＲＮＡの安定性を増大させる、またはＲＮＡスプライシングに影響を与えるための、１つまたは複数の修飾など）ために利用される。
【００３４】
一部の実施形態において、ｍＲＮＡおよび／またはエピソーム（例えば、Ｄｎｍｔ３ｂまたはＧｉｍａｐ６をコードする）は、例えば直接的な化学合成またはインビトロでの転写によって、合成的に生産され、内皮細胞に導入される。既知の化学的修飾を使用して、細胞における自然免疫応答を避けることができる。例えば、基準的なヌクレオチドのみを含む合成ＲＮＡは、パターン認識受容体に結合することができ、細胞において強力な免疫応答を引き起こすことができる。この応答は、翻訳の遮断、炎症性サイトカインの分泌、および細胞死を生じさせ得る。ある特定の基準的でないヌクレオチドを含むＲＮＡは、自然免疫系による検出を回避し得、高い効率でタンパク質に翻訳され得る。特に、自然免疫応答を避けるためのヌクレオチド修飾に関しては、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第９，１８１，３１９号明細書を参照されたい。ｍＲＮＡは、既知の方法によって、ＨＳＣ生産の間に１回または定期的に細胞に導入することができる。
【００３５】
一部の実施形態において、Ｄｎｍｔ３ｂおよび／またはＧｉｍａｐ６の発現は、所望のレベルの過剰発現を導き得る導入遺伝子を細胞に導入することによって増大する（様々なプロモーター強度、または発現調節エレメントの他の選択を伴って）。導入遺伝子は、当技術分野において知られている様々なウイルスベクターまたはトランスフェクション試薬を使用して導入することができる。一部の実施形態において、Ｄｎｍｔ３ｂおよび／またはＧｉｍａｐ６の発現は、導入遺伝子フリーの方法（例えば、エピソーム送達）によって増大する。
【００３６】
一部の実施形態において、Ｄｎｍｔ３ｂおよび／またはＧｉｍａｐ６の発現または活性は、例えば、１つまたは複数の修飾を導入して、プロモーターの強度、リボソーム結合、またはＲＮＡの安定性を増大させるための遺伝子編集技術を使用して増大させられる。様々な編集技術が知られており、これらの技術としては、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガー（ＺＦ）、および転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）が含まれる。一部の実施形態において、Ｄｎｍｔ３ｂおよび／またはＧｉｍａｐ６の発現または活性は、導入遺伝子フリーの方法（例えば、エピソーム送達）によって増大する。これらのＤＮＡ結合ドメインの１つまたは複数およびＦｏｋｌエンドヌクレアーゼの切断ドメインを有する融合タンパク質を使用して、細胞内のＤＮＡの所望の領域において二本鎖切断を生じさせることができる（例えば、これらのうち全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／００６４６２０号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０２３９３１５号明細書、米国特許第８，４７０，９７３号明細書、米国特許出願公開第２０１３／０２１７１１９号明細書、米国特許第８，４２０，７８２号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０１４５９４０号明細書、米国特許第８，４５０，４７１号明細書、米国特許第８，４４０，４３１号明細書、米国特許第８，４４０，４３２号明細書、および米国特許出願公開第２０１３／０１２２５８１号明細書を参照されたい）。一部の実施形態において、遺伝子編集は、当技術分野において知られているＣＲＩＳＰＲ結合Ｃａｓシステムを使用して行われる。例えば、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６９７，３５９号明細書、米国特許第８，９０６，６１６号明細書、および米国特許第８，９９９，６４１号明細書を参照されたい。
【００３７】
様々な実施形態において、発生的に柔軟な内皮細胞またはＨＥ細胞を含む細胞集団が、バイオリアクターに導入される。一部の実施形態において、バイオリアクターは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０９６２１５号パンフレットにおいて記載されているように、繰り返しひずみによる生体力学的伸展を提供する。繰り返しひずみによる生体力学的伸展は、Ｄｎｍｔ３ｂおよび／またはＧｉｍａｐ６の活性または発現を増大させる。これらの実施形態において、機械的手段が伸展力を細胞に与える。例えば、底が柔らかい培養プレートのナイロン膜または類似の生体適合かつ生物模倣膜に接続された、コンピュータ制御される真空ポンプシステム（例えば、ＦｌｅｘＣｅｌｌ（商標）Ｔｅｎｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｙｔｏｓｔｒｅｔｃｈｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ、または類似のもの）を使用して、規定され制御された繰り返しひずみ条件下で、２Ｄまたは３Ｄの円周方向の伸展をエクスビボでＨＥ細胞に与えることができる。
【００３８】
様々な実施形態において、ＨＳＣの転換は、ピエゾ１の活性化、機械的伸展、ｍＲＮＡの導入、Ｄｎｍｔ３ｂに対する、ｍＲＮＡ、導入遺伝子による修飾、導入遺伝子フリーの（例えば、エピソームによる）修飾、もしくは遺伝子修飾の導入、および／または、Ｇｉｍａｐ６に対する、ｍＲＮＡ、導入遺伝子による修飾、導入遺伝子フリーの（例えば、エピソームによる）修飾、もしくは遺伝子修飾の導入、から選択される少なくとも手段によって誘発される。
【００３９】
ＨＥ細胞は、血液疾患、骨髄疾患、代謝性疾患、または免疫疾患を有する対象から得ることができるかまたはそれに由来し得る。一部の実施形態において、対象は、血液の悪性腫瘍を有していない。ＨＳＣの集団をレシピエントに投与することができる。自家ＨＳＣ移植では、ＨＥ細胞はレシピエントに由来している。
【００４０】
一部の実施形態において、ＨＥ細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非造血幹細胞、または限定はしないが線維芽細胞および内皮細胞を含む体細胞から得られるかまたはそれに由来する。一部の実施形態において、ＨＥ細胞は、ＨＬＡヌル細胞、ＨＬＡ修飾細胞、および／もしくは導入遺伝子フリーの細胞から、または内皮細胞からＨＥ細胞への遺伝的誘導から得られるかまたはそれに由来する。造血性内皮細胞（例えば、Ｆｌｋｌ＋ＣＤ４５＋細胞、Ｆｌｋｌ＋ＣＤ４１＋細胞、またはＣＤ３１＋ＣＤ４３＋細胞）は、例えば同種異系のドナーのまたはＨＳＣで処置される対象の源細胞から、任意の様式で得ることができる。例えば、ＨＥ細胞は、自家細胞または同種細胞から造血性内皮細胞への化学的誘導、遺伝的誘導、導入遺伝子フリーの誘導、またはエピソームによる誘導によって得ることができる。一部の実施形態において、ＨＥ細胞は、レシピエントの細胞から、またはＨＬＡ修飾されている細胞から、またはＨＬＡヌル細胞である細胞から作製されたｉＰＳＣから生じる。一部の実施形態において、ＨＥ細胞は、万能適合ドナーである対象の細胞から得られるかまたはそれに由来する。造血性内皮細胞を調製するための方法は、当技術分野において知られており、この方法としては、ヒト多能性幹細胞からの生成が含まれる。参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／０９６２１５号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１９／０１１９６４３号明細書を参照されたい。また、Ditadi et al., Nature Cell Biol. 17(5) 580-591 (2015)、Sugimura et al., Nature 2017; 545(7655):432-438、Nakajima-Takagi et al, Blood. 2013; 121(3):447-458、Zambidis et al., Blood. 2008 Nov 1; 112(9):3601-14、およびPark et al, Cytometry A. 2013 Jan; 83(1): 114-126（効率的なｈｉＰＳＣ分化のための、ヒト胚様体（ｈＥＢ）に基づく血液−内皮分化方法）；Choi et al., Cell Rep. 2012 Sep 27; 2(3): 553-567（ＯＰ９との共培養におけるｈＰＳＣ分化）；Sandler et al, 2014 July 17; 511(17509):312-318（内皮細胞から造血細胞）も参照されたく、また、Sluvkin, Blood 2013 122:4035-4046も参照されたい。一部の実施形態において、ＨＳＣの生産を開始するためのＨＥ細胞の数は、少なくとも約１０６個の細胞、約１０７個の細胞、または少なくとも１０８個の細胞である。一部の実施形態において、本開示に従って生産される造血幹細胞は、レシピエントにおいて優れた生着を示し、機能的な多細胞系成人血液を再構成する、長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）を含む。一部の実施形態において、ＨＳＣは、Ｌｉｎ−／Ｓｃａ１＋／ｃ−ｋｉｔ＋細胞を含む。
【００４１】
様々な実施形態において、本明細書において記載される方法によって調製されたＨＳＣの集団および薬学的に許容されるビヒクルを含む、細胞療法のための医薬組成物が調製される。医薬組成物は、少なくとも約１０２個のＨＳＣ、または少なくとも約１０３個のＨＳＣ、または少なくとも約１０４個のＨＳＣ、または少なくとも約１０５個のＨＳＣ、または少なくとも約１０６個のＨＳＣ、または少なくとも約１０７個のＨＳＣ、または少なくとも１０８個のＨＳＣを含み得る。例えば、一部の実施形態において、レシピエントの体重１キログラム当たり約１０万から約４０万個の（ＣＤ３４＋）ＨＳＣ（例えば、約２０万個細胞／ｋｇ）を含む医薬組成物が投与される。
【００４２】
治療または移植のためのＨＳＣは、一部の実施形態において、２ヶ月間未満、または１ヶ月間未満、または約２週間未満、または約１週間未満、または約６日間未満、または約５日間未満、または約４日間未満、または約３日間未満などの、比較的短い期間で生成させることができる。一部の実施形態において、Ｄｎｍｔ３ｂおよび／またはＧｉｍａｐ６の活性または発現が増大した内皮細胞が、１から４週間にわたり培養される。
【００４３】
細胞組成物は、静脈内注入または他の投与経路に適した薬学的に許容される担体またはビヒクルをさらに含み得、また、適切な凍結保護物質を含み得る。典型的な担体は、ＤＭＳＯ（例えば、約１０％ＤＭＳＯ）である。細胞組成物は、単位バイアルまたは袋で提供され得、使用まで凍結状態で保存され得る。ある特定の実施形態において、組成物の容積は、約１液量オンスから１パイントである。
【００４４】
本明細書において記載される方法を使用して生成されたＨＳＣは、例えば静脈内注入または骨髄内移植によって、対象（レシピエント）に投与される。本方法は、骨髄破壊的な、非骨髄破壊的な、または免疫毒素に基づく（例えば、抗ｃ−Ｋｉｔ、抗ＣＤ４５など）前処置レジメンの後に行うことができる。
【００４５】
本明細書において記載される方法は、例えば、血液疾患（悪性および非悪性の）、骨髄疾患、代謝性疾患、ならびに免疫疾患を処置するための移植プロトコルにおいて使用するためのＨＳＣの集団を生成するために使用することができる。一部の実施形態において、ＨＳＣ集団は、自家細胞または万能適合ドナー細胞またはＨＬＡ修飾細胞またはＨＬＡヌル細胞に由来する。すなわち、ＨＳＣ集団は、レシピエント対象の細胞から調製されたまたはドナー細胞（例えば、万能ドナー細胞、ＨＬＡ適合細胞、ＨＬＡ修飾細胞、もしくはＨＬＡヌル細胞）から調製された、発生的に柔軟な内皮細胞またはｉＰＳＣに由来するＨＥ細胞から生成される。一部の実施形態において、自己に由来する細胞が使用され、レシピエント対象は、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、急性骨髄性白血病、神経芽細胞腫、胚細胞腫瘍、自己免疫障害（全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性硬化症）、骨髄異形成症候群、アミロイドーシス、または自家ＨＳＣ移植を使用して処置可能な他の状態から選択される状態を有している。一部の実施形態において、自己に由来する細胞（例えば、ＨＳＣは、レシピエント対象の細胞から生成される）が使用され、レシピエント対象は、血液の悪性腫瘍を有していない。
【００４６】
一部の実施形態において、レシピエント対象は、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性障害、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、再生不良性貧血、純赤血球無形成症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ファンコニ貧血、サラセミアメジャー、鎌状赤血球性貧血、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、ウィスコット・オルドリッチ症候群、血球貪食性リンパ組織球症、先天性代謝異常、表皮水疱症、重症先天性好中球減少症、シュワッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、および白血球接着不全症から選択される状態を有している。一部のこのような実施形態において、同種異系由来細胞または万能適合ドナー細胞またはＨＬＡ修飾細胞またはＨＬＡヌル細胞が、ＨＥ細胞の生成に使用される。例えば、ＨＳＣは、ドナー対象、すなわちレシピエント対象以外の対象の細胞から生成される。一部の実施形態において、ドナー対象は、血液型およびヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タイピングに基づいてレシピエント対象と適合している。
【００４７】
本明細書において使用される場合、用語「約」は、それが伴う数値の±１０％を意味する。
【００４８】
本発明のこれらの態様および他の態様をここで、以下の非限定的な実施例で説明する。
【実施例】
【００４９】
二次造血の際、第１のセットのＨＳＣが、胎児発生の間にＡＧＭにおいて造血性内皮細胞から生じる。したがって、内皮細胞および／または造血性内皮細胞は、ＡＧＭ微小環境に存在する内因性因子および外因性因子のレパートリーが確立されていれば、臨床的使用のためのＨＳＣを発生または増殖させるための源であり得る。
【００５０】
７つの転写因子（ＥＲＧ、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＬＣＯＲ、ＲＵＮＸ１、およびＳＰＩ１）の誘発、ならびにＴＧＦβおよびＣＸＣＲ７の阻害またはＢＭＰおよびＣＸＣＲ４の活性化は、ヒトの内皮からＨＳＰＣへの転換を増強させる。しかし、これらのアプローチは、内皮細胞または造血性内皮細胞にＬＴ−ＨＳＣの機能および特性を付与しない。血流が介在するずり応力と、その後のＮＯＳの活性化とは、ＨＳＣ形成に関与する唯一の知られている生体力学的因子である。しかし、ｃｄｈ５−ＭＯ胚は、血流の欠如、およびＬ−ＮＡＭＥ介在性のＮＯＳ阻害にもかかわらず、ＨＳＣを生産する。したがって、ＨＳＣ形成の調節においてクロストークするだけではなく長期の（ＬＴ）自己再生ＨＳＣの開発における有用性も有する、生体力学的力、機械感受性経路、およびエピジェネティックなメカニズムを同定することが重要である。
【００５１】
心拍動は循環の先に生じ、血管内での脈動を生じさせることによって循環を引き起こす。しかし、血管の大動脈内膜からの循環の不存在下での、ＨＳＣ形成における、心拍動が介在する生体力学的力の直接的な役割は、依然として不明なままである。脈動は、血管の生体力学的伸展を生じさせ、一過性受容体電位型（ＴＲＰ）チャネル、ピエゾチャネル、デジェネリン／上皮ナトリウムチャネル（ＤＥＧ／ＥＮａＣ）、およびＫ１−ファミリーメンバーなどの機械感受性受容体を活性化させる。しかし、脈動または機械感受性受容体の活性化がＨＳＣ形成を刺激し得るかどうかは未知である。Lis et al. (Lis R, et al. Conversion of adult endothelium to immunocompetent haematopoietic stem cells Nature 2017)およびSugimura et al. (Sugimura et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells Nature 2017)は、ヒト造血性内皮細胞細胞からＨＳＰＣに変換させる方法を実証したが、どのメカニズムが、ＬＴ−ＨＳＣになるためのその内皮のエピジェネティックランドスケープを永続的に消し得るかは、未知である。
【００５２】
本明細書において開示されているように、本開示は、心拍動および／または脈動介在性の生体力学的伸展および／またはピエゾ１機械感受性経路の薬理学的活性化がいかにしてＤｎｍｔ３ｂの発現を増強し、このことによってＨＳＣ（例えば、ＬＴ−ＨＳＣ）を形成するための内皮のエピジェネティックランドスケープを消すかを実証している。さらに、脈動様状態を模倣するバイオリアクターを開発し、ピエゾ１を、ＬＴ−ＨＳＣ形成を刺激し、スケールアップするための薬理学的標的であると定めた。
【００５３】
心拍動が介在する脈動は、内皮からＨＳＣへの転換を刺激する。
不偏のゼブラフィッシュエチルニトロソウレア（ＥＮＵ）突然変異生成のスクリーニングによって、カドヘリン−５（ｃｄｈ５、ｖｅ−ｃｄｈ）のゼブラフィッシュ突然変異体であるｍａｌｂｅｃ（ｂｗ２０９ｍｌｂ）を得た。ｍａｌｂｅｃ胚およびｃｄｈ５−モルファント（ＭＯ）胚は、循環不全にもかかわらず、正常な一次造血および二次造血を示す。
【００５４】
内皮からＨＳＣへの転換を刺激する、血流およびずり応力に依存しない生体力学的力を同定するために、ｃｄｈ５欠損胚における心臓の機能および解剖学ならびに血管を分析した。
【００５５】
微細血管造影を、蛍光デキストランビーズをゼブラフィッシュ胚の２腔心臓の心房に注射することによってまず行い、デキストランビーズを次いで、循環内で追跡した。蛍光デキストランビーズは、対照胚では房室（ＡＶ）弁および心室を経由して全身循環に入るが、このビーズは、ｃｄｈ５−モルファント胚の心房で捕捉された。
【００５６】
心臓の構造を調べるために、心臓を、対照胚およびｃｄｈ５がサイレンシングされた胚から単離し、免疫組織化学を、内膜（ｇｆｐ）および心筋細胞（ｍｆ２０）について行った。心房（Ａ）、房室（ＡＶ）弁、心室（Ｖ）、および流出路（ＯＴ）がｃｄｈ５−モルファントでは形成されたが、ＡＶ弁は延び、歪んでいることが分かった。
【００５７】
ｃｄｈ５がサイレンシングされた胚においてなぜ循環が弱まったかを調べるために、ｃｄｈ５がサイレンシングされた胚における血管構造、ならびに血液循環、心拍数、心拍出量、および心臓タンポナーデを分析した。
【００５８】
ｍｌｂ×ｋｄｒ：ｄｓＲＥＤ胚において、内膜の完全性を分析した。動脈および静脈の構造がｃｄｈ５欠損胚において無傷であることが分かった。
【００５９】
心臓の経時的発生、心拍動、血管、血液循環、およびＨＳＣ形成は、ゼブラフィッシュ、マウス、およびヒトにおいて保存されている。ゼブラフィッシュの発生の間、心臓は受精の約２３時間後（ｈｐｆ）に拍動し始め、血液循環はおよそ２４〜２６ｈｐｆで開始され、確定的なＨＳＣは、３０〜４８ｈｐｆの間にＡＧＭ領域において造血性内皮細胞から生じる。
【００６０】
心臓が拍動を開始する前後の血管内の循環を分析するために、対照胚およびｃｄｈ５がサイレンシングされたｌｃｒ：ｅＧＦＰ×ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ胚の低速度撮影共焦点イメージングを行った。
【００６１】
心臓が拍動を開始した後でも、ｌｃｒ：ｅＧＦＰ＋赤血球が、ｃｄｈ５がサイレンシングされた胚の血管内に蓄積していたことが分かった。このことは、心拍動が開始し、血管が形成されているにもかかわらず、ｃｄｈ５−モルファントにおいて活性な循環が不存在であることを実証している。
【００６２】
ｃｄｈ５がサイレンシングされた胚における心臓の機能を調べるために、電気生理学的評価および心臓超音波による評価を行った。ｃｄｈ５−ＭＯ胚における心拍数は対照に匹敵していたが、一回拍出量はｃｄｈ５−ＭＯ胚においてほとんど存在しなかった。したがって、心拍出量（＝一回拍出量×心拍数）は、ｃｄｈ５−ＭＯ胚において減少していることが確認された。
【００６３】
ｃｄｈ５−ＭＯ胚は、心腔内に、心臓からの血液の逆流に起因し得る心膜液貯留を有していた。心膜腔における体液の蓄積によって、心室充満が低減し、その後、血行動態が悪化する。心臓タンポナーデが心膜腔内での体液の蓄積における因子であったかどうかを調べるために、ｃｄｈ５−ＭＯ胚の心腔を、心膜穿刺のように穿刺し、次いで、心膜液を吸入して、心臓に与えられる流体圧力を低減させた。しかし、ｃｄｈ５−モルファント心臓の心拍出量の欠乏は回復させることができなかった。
【００６４】
心拍動はｃｄｈ５−モルファントにおいて正常であったが、ｃｄｈ５−モルファントの心拍出量は、心臓の構造的欠陥に起因して損なわれており、その結果、囲心腔に血液が蓄積した。ｃｄｈ５−ＭＯ胚は正常な造血を有しているため、心拍動に由来する生体力学的力が活性循環の不存在下でのＨＳＣ形成に影響することが仮定された。
【００６５】
ｃｄｈ５−ＭＯ胚は拍動している心臓を有しており、活性な循環は有していないが、ｃｄｈ５−ＭＯ胚は、その血管の大動脈内皮でのＨＳＣ形成を有する。対照ゼブラフィッシュ胚のＡＧＭを拡大すると、血管の、他とは異なる脈動が確認された。循環血球に依存しない、血管内での脈動の存在と、おそらく血流であると思われるものとを区別するために、血管の脈動周波数と、循環血球の脈動周波数および血流に起因する動きとを比較した。具体的には、ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ＋血管内の循環ｌｃｒ：ｅＧＦＰ＋赤血球を有するダブルトランスジェニック系の低速度撮影共焦点イメージング、ならびに、両血管および循環血球からのシグナルのフーリエ分析を行った。血管の周波数スペクトルは、別個のピークを有することが分かった。したがって、血管内の脈動および血流は共存するが、これらの存在および性質は、互いに独立している。
【００６６】
３６ｈｐｆでのＡＧＭにおける脈動の時間的、空間的、および機能的存在を調べるために、対照ゼブラフィッシュ胚における血管領域のライトシート顕微鏡法と、その後のフーリエ分析とを行った。データは、ＡＧＭが、ｆｌｋ１：ｅＧＦＰ＋内皮細胞から生じるｒｕｎｘ１：ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＨＳＰＣの低速度撮影共焦点イメージングで見られる内皮細胞から造血細胞への転換のための時間および位置である３６ｈｐｆで、他とは異なる脈動周波数を有することをさらに裏付けている。総合すると、ＡＧＭ領域は拍動していることが分かり、ＡＧＭにおける脈動は、内皮細胞から造血細胞への転換と同時に発生する。
【００６７】
血管は、円周方向の壁応力および内皮のずり応力を生じさせる、心拍動が介在する血圧および血流からの一定の機械的ロード下にある。血流は内皮細胞にずり応力を与え、血管拡張を誘発するが、心拍動が介在する脈動は内皮細胞および平滑筋細胞の両方に対して円周方向の伸展を生じさせ、機械的膨張を生じさせる。
【００６８】
ＨＳＣ由来のｃｄｈ５−ＭＯ胚が血流介在性のおよびずり応力介在性のＮＯＳ活性化を経由するかまたはそれに依存しないかを分析するために、ＨＳＰＣの発現を、ＮＯＳ阻害剤であるＬ−ＮＡＭＥで処置した対照胚およびｃｄｈ５−ＭＯ胚において分析した。ＮＯＳの阻害は対照胚においてＨＳＰＣ形成を弱めるが、ｃｄｈ５−ＭＯ胚においてはＨＳＰＣ形成に影響を与えないことが実証された。したがって、ＨＳＣ由来のｃｄｈ５−ＭＯ胚は、ＮＯＳの活性化に依存しない。
【００６９】
総合すると、心拍動が介在する脈動は、循環に依存しない内皮からＨＳＣへの形成を刺激する。
【００７０】
伸展は、ＨＳＣ形成のためにピエゾ１を活性化させる。
生体力学的力は、細胞の形状および運命の転換を刺激するため、造血性内皮細胞の脈動介在性の周期的伸展がＨＳＣ形成を刺激すると仮定した。
【００７１】
内皮からのＨＳＣの形成における脈動の機能を試験するために、Ｅ１１．５マウス胚から採取したＡＧＭ細胞に対して繰り返しひずみを与え得るバイオリアクターを開発した（図２Ａ、上部のパネル）。造血コロニーの形成およびフローの分析アッセイは、１０％繰り返しひずみが多能性造血前駆細胞の形成を強化し、この形成が、伸展活性化受容体（ＳＡＲ）の、ＧｄＣｌ３介在性の全ての薬理学的阻害によって弱められることを実証した。ＧｄＣｌ３はまた、ゼブラフィッシュ胚におけるＨＳＰＣの発現を、ｓｉｈ−ＭＯ胚のレベルまで弱めた。
【００７２】
ＳＡＲファミリーメンバーは、４つの下位カテゴリー：Ｋ１−ファミリーメンバー、ならびにピエゾチャネル、ＴＲＰチャネル、およびＤＥＧ／ＥＮａＣチャネルを有する。組織の発現およびコンピュータ分析は、内皮組織および造血組織においてピエゾ１およびＴｒｐｖ４を示し、したがって、内皮からＨＳＣへの転換におけるこれらの役割を試験した。
【００７３】
ｔｒｐｖ４およびピエゾ１の機能喪失分析および薬理学的阻害は、ＨＳＰＣマーカーの発現および内皮からＨＳＣへの転換をなくした（図１Ａ）。逆に、ｔｒｐｖ４またはピエゾ１の薬理学的活性化は、対照胚におけるＨＳＰＣマーカーの発現を増強させ、ｓｉｈ胚におけるＨＳＰＣの発現を回復させた。時間的および空間的分析では、ｔｒｐｖ４は３６ｈｐｆでゼブラフィッシュ胚のＡＧＭ領域において検出されず、その一方で、ピエゾ１は、Ｅ１１．５  ＡＧＭにおいてＣｄ３１（内皮）およびｃ−Ｋｉｔ（造血）と共局在化していた。
【００７４】
伸展が介在するＨＳＣ形成の基にある分子メカニズムを確認するために、繰り返しひずみまたはピエゾ１の薬理学的アクチベーターのいずれかで処置したＡＧＭの全トランスクリプトーム分析を行った。繰り返しひずみおよびピエゾ１の活性化が類似の遺伝子シグネチャーを生じさせたことが分かった（図１Ｂ）。
【００７５】
ピエゾ１の薬理学的活性化は、多能性造血前駆細胞の形成をさらに増強させたが（図１Ｃ）、その一方で、ピエゾ１の薬理学的阻害は、ＨＳＰＣ形成の繰り返しひずみ介在性の誘発を弱めた（図１Ｄ）。総合すると、繰り返しひずみが介在する生体力学的伸展は、ピエゾ１を活性化して、内皮からＨＳＣへの転換を刺激する。
【００７６】
生体力学的伸展またはピエゾ１の活性化は、ＬＴ−ＨＳＣを生産する。
繰り返しひずみまたはピエゾ１の活性化が長期自己再生ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）を生産するかを分析するために、連続移植アッセイを行った。繰り返しひずみまたはピエゾ１のアクチベーターで処置されたＡＧＭの一次移植体は、より高い生着および正常な多細胞系の再構成を示した（図２Ａ、図２Ｂ）。また、繰り返しひずみまたはピエゾ１のアクチベーターで処置されたＡＧＭを移植された一次レシピエントの骨髄は、２倍から３倍多い量のＬｉｎ−Ｓｃａ１＋ｃ−Ｋｉｔ＋Ｃｄ４８−Ｃｄ１５０＋ＨＳＣを示した。免疫不全の二次レシピエントへの一次レシピエント由来の選別されたＬｉｎ−Ｓｃａ１＋ｃ−Ｋｉｔ＋ＨＳＰＣの移植もまた、より高い生着および正常な多細胞系の再構成をもたらした（図２Ｃ、図２Ｄ）。したがって、繰り返しひずみおよび／またはピエゾ１の活性化の両方が、より多い量の正常なＬＴ−ＨＳＣを生産することが予想された。この仮説を試験するために、限界希釈アッセイを、段階的な量のＬｉｎ−Ｓｃａ１＋ｃ−Ｋｉｔ＋ＨＳＰＣを免疫不全の三次レシピエントに移植することによって行った。三次移植体の分析は、繰り返しひずみが２倍から３倍多い量のＬＴ−ＨＳＣを生産したことを実証した。
【００７７】
ＡＧＭ−ＨＳＣ（ドナー）が生着し、正常な成人血液に再構成するかを調べるために、再構成した血液系の分子特徴および機能的特性を次いで、対照、繰り返しひずみ、またはピエゾ１のアクチベーターで処置されたＡＧＭを移植された一次レシピエントにおいて分析した。骨髄におけるドナー由来の赤血球系細胞の分析は、Ｂｃｌ１１ａの存在下での、Ｃｄ７１＋／Ｔｅｒ１１９＋の発現、および、胚のグロビンを利用した成人グロビンマーカーの発現の増強を示した（図３Ａ）。骨髄および血清における、ドナー由来の骨髄細胞のさらなる分析は、十分な量のＧｒ１＋／Ｍａｃ１＋骨髄細胞、およびそれらのミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）生産を示した（図３Ｂ）。次に、リンパ節、胸腺、および脾臓における、ドナー由来のキメリズム、Ｍａｃ１＋骨髄細胞、Ｃｄ１９＋Ｂ細胞、およびＣｄ４＋／Ｃｄ８＋Ｔ細胞の分析は、ドナーＨＳＣ由来の前駆細胞が循環し、造血ニッチにおいてコロニー形成して、成人血液系を再構成することを実証した。一次移植体由来の血清の分析では、これらが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＡ、およびＩｇＭなどの免疫化前の免疫グロブリン（Ｉｇ）の正常なレパートリーを生産したことも分かった（図３Ｃ）。脾臓のドナー由来Ｃｄ３＋Ｔ細胞の選別は、脾臓のドナー由来Ｍａｃ１＋骨髄細胞（陰性対照）では不存在の、Ｔ細胞受容体β（ＴＣＲβ）の再編成を実証した（図３Ｄ）。一次移植体におけるＴ細胞の機能的特性を分析するために、遅延型過敏反応アッセイは、一次移植体をヒツジ赤血球の注射で感作することによる、足蹠における抗原特異的な機能的Ｔ細胞の成功裏の動員を実証した（図３Ｅ）。したがって、ＡＧＭまたは造血性内皮細胞の繰り返しひずみまたはピエゾ１活性化はＨＳＣを生産し、このＨＳＣは、造血ニッチにおいて生着し、機能的な多細胞系成人血液を再構成した。
【００７８】
生体力学的伸展およびピエゾ１の活性化は、内皮からＨＳＣへの転換のためにＤｎｍｔ３ｂを上方調節する。
ＡＧＭは異種組織であるため、伸展が介在するピエゾ１の活性化がいかにしてＨＳＣへの大動脈内皮細胞の運命の転換を刺激するかは不明であった。Ｅ１０．５  ＡＧＭ選別型内皮細胞、造血性内皮細胞、およびＨＳＣからの変動遺伝子発現シグネチャーが得られた。ＡＧＭに由来する内皮細胞、造血性内皮細胞、およびＨＳＣの状況における、ＡＧＭの繰り返しひずみまたはピエゾ１の活性化で誘発される遺伝子シグネチャーの階層的クラスタリングは、さらに、過剰発現した生物学的プロセス、分子経路、遺伝子発現クラスター、およびこれらの遺伝子オントロジー（ＧＯ）タームについての定量的概要を示した。内皮からＨＳＣへの転換の間に上方調節された、周期的伸展および／またはピエゾ１の活性化が介在する遺伝子の、ベン図分析は、Ｄｎｍｔ３ｂを、ＨＳＣ形成に必要な内皮機構のサイレンシングに関与する潜在的候補メカニズムとして同定した（図４）。加えて、Ｇｉｍａｐ６もまた、ＨＳＣ形成に必要な内皮機構のサイレンシングに関与する潜在的候補メカニズムとして同定された。
【００７９】
バイオインフォマティクスおよびコンピュータ分析を検証するために、Ｅ１１．５  ＡＧＭにおけるＤｎｍｔ３ｂの時間的および空間的タンパク質発現を分析した。免疫組織化学アッセイは、Ｄｎｍｔ３ｂがＣｄ３１＋内皮およびｃ−Ｋｉｔ＋造血細胞と共局在化することを実証した。したがって、Ｄｎｍｔ３ｂが内皮からＨＳＣへの転換を刺激し得ると仮定された。
【００８０】
Ｄｎｍｔ３ｂおよびＤｎｍｔ３ａは高度に相同であり、ＨＳＣの維持または分化において他とは異なる機能を有するが、ＡＧＭでの内皮からＨＳＣへの転換におけるこれらの潜在的役割は未知であった。遺伝子シグネチャーおよび組織発現の分析は、ＡＧＭにおけるＨＳＣ形成におけるＤｎｍｔ３ａのあらゆる関与を排除した。Ｄｎｍｔ３ｂおよびＤｎｍｔ３ａの別個のまたは重複する造血性の役割を区別するために、Ｄｎｍｔ３ｂおよびＤｎｍｔ３ａタンパク質のレベルを、繰り返しひずみ処置またはＹｏｄａ１処置されたＡＧＭ細胞の核画分において分析し、これは、繰り返しひずみまたはピエゾ１の活性化が、Ｅ１１．５  ＡＧＭ細胞においてＤｎｍｔ３ｂタンパク質の発現を刺激し、Ｄｎｍｔ３ａは刺激しないことを明らかにした（図５Ａ）。
【００８１】
血流の不存在下での血管の脈動が、Ｄｎｍｔ３ｂの活性化を介するＨＳＣ形成を刺激したかどうかを分析するために、ＨＳＰＣマーカーの発現を、Ｄｎｍｔ３ｂ阻害剤であるナナオマイシンで処置されたｃｄｈ５−ＭＯ胚において測定した。Ｄｎｍｔ３ｂの薬理学的阻害は、対照胚およびｃｄｈ５−ＭＯ胚においてＨＳＰＣマーカーの発現を弱めた。
【００８２】
次に、この実施例の実験は、生体力学的伸展またはピエゾ１の活性化が、Ｄｎｍｔ３ｂの活性化を介する内皮細胞から造血細胞への転換を刺激したかどうかを分析した。Ｄｎｍｔ３ｂの阻害が、多能性造血前駆細胞形成の、生体力学的伸展が介在するまたはピエゾ１の活性化が介在する誘発（図５Ｂ）、および内皮細胞から造血細胞への転換（図５Ｂ）を弱めたことが分かった。ナナオマイシン処置は造血細胞を表現型内皮細胞に戻すが、このような内皮細胞は機能的ではなかった。ＨＳＰＣマーカーのホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、および、Ｙｏｄａ１と同時に処置されたまたはＹｏｄａ１を伴わずに処置された、ナナオマイシン処置されたまたはｄｎｍｔ３ｂ−ＭＯを注射されたゼブラフィッシュ胚における、内皮からＨＳＣへの転換の低速度撮影イメージングはさらに、ｄｎｍｔ３ｂの阻害または喪失が、ピエゾ１活性化が介在するＨＳＣ形成の増大を弱めたことを確認した（図５Ｃ）。総合すると、脈動が介在するピエゾ１の活性化は、ＡＧＭにおけるＤｎｍｔ３ｂの発現を増強して、内皮からＨＳＣへの転換を刺激した。
【００８３】
ヒトｉＰＳＣから生成したＨＥ細胞からのＨＳＣの生産
胚様体および造血性内皮細胞の分化を、（Sugimura et al. 2017、Ditadi et al. 2015）において記載されているように行った。簡潔に述べると、ｈｉＰＳＣコロニーを０．０５％トリプシンで５分間、３７℃で解離し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄し、そして、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（１ｍＭ）、ヒトホロ−トランスフェリン（１５０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｔ０６６５）、モノチオグリセロール（ＭＴＧ、０．４ｍＭ）、ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＹ−２７６３２（１０μＭ）を添加したＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０６３９−０１１）中に再懸濁した。５００万個の細胞を、１０ｃｍのディッシュ（Ｅｚｓｐｈｅｒｅ、旭硝子株式会社）に播種して、スフェロイドを形成させた。１日目に、ｂＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）およびＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）を培地に添加した。２日目に、培地を、ＳＢ４３１５４２（６μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）、ｂＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）、およびＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＳｔｅｍＰｒｏ−３４で交換した。３日目に、培地を、ＶＥＧＦ（１５ｎｇ／ｍｌ）およびｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＳｔｅｍＰｒｏ−３４で置き換えた。６日目に、培地を、ｂＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（１５ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン（ＩＬ）−６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＧＦ−１（２５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１１（５ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＥＰＯ（２ＩＵ）を添加したＳｔｅｍＰｒｏ−３４に交換した。細胞を、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、および９５％湿度のインキュベーター内で維持した。全てのサイトカインは、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入した。
【００８４】
ＣＤ３４＋細胞を単離するため、胚様体（８日目に得た）を０．０５％トリプシンによって解離し、７０μｍのストレーナーを通して濾過し、ＣＤ３４＋細胞をＣＤ３４磁気ビーズ染色によって単離し、その後、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に通した。全てのバッチのサンプルをＦＡＣＳによって試験して、その純度をパネルで検証した。以下の抗体を利用した：ＣＤ３４−ＰＥｃｙ７（Ｃｌｏｎｅ  ５８１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＦＬＫ１−ＰＥ（ＣＬＯＮＥ＃８９１０６、ＢＤ）、および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）。
【００８５】
単離されたＣＤ３４＋細胞を、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）、ＴＰＯ（３０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１１（５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＧＦ−１（２５ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＦＬＴ３（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有するＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地中で再懸濁した（Ferrel et al 2015）。細胞を、ウェル当たり５００００個細胞の密度で薄層マトリゲルコーティング２４−ウェルプレートに播種した。播種の１日後、Ｙｏｄａ１（６．２５から１００μＭの間）を培養物に添加した。７日後、浮遊細胞を回収し、ＦＡＣＳ分析を行った。ＦＡＣＳ分析では、細胞をＣＤ３４−ＰＥｃｙ７（Ｃｌｏｎｅ  ５８１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＣＤ４５−ＡＰＣ（クローン２Ｄ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。全てのサイトカインは、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入した。
【００８６】
Ｙｏｄａ１は、ヒトｉＰＳＣに由来するＨＥ細胞における内皮細胞から造血細胞への転換を誘発した（データは示していない）。この影響は用量依存性であった。
【００８７】
結論
長期ＨＳＣの発生、増殖、および維持は、幹細胞の生物学および造血において、非常に求められていたものであった。ゼブラフィッシュにおける低速度撮影共焦点、ライトシート、およびフーリエ変換分析に基づいて、血管内の脈動を刺激するスケーラブルバイオリアクターが確立されただけではなく、ピエゾ１の活性化が、内皮細胞をＬＴ−ＨＳＣに変換するための薬理学的な標的として同定された。この研究は、連続移植の際に生着し得、自己再生し得、および多細胞系の機能的な成人血液に再構成し得るＬＴ−ＨＳＣを開発するための、導入遺伝子フリーの新規なアプローチを提供する。
【００８８】
心拍動が介在する脈動は、内皮細胞および平滑筋細胞の両方に対して円周方向の伸展を生じさせ、機械的膨張を生じさせた。しかし、ピエゾ１は、Ｅ１１．５  ＡＧＭにおいて内皮細胞と造血細胞との間で共発現するが、血管の血管平滑筋細胞においては共発現せず、このことは、生体力学的伸展およびピエゾ１の活性化の造血性の役割が、ＡＧＭ−内皮細胞に対して固有であることを示唆した。
【００８９】
血管の生体力学的伸展は、ピエゾ１、Ｔｒｐｖ４、Ｋ１−ファミリーメンバー、およびＤＥＧ／ＥＮａＣチャネルを活性化し得た。ピエゾ１およびＴｒｐｖ４の両方の活性化は、内皮細胞から造血細胞への転換を刺激した。しかし、ピエゾ１阻害だけが、伸展が介在する造血効果を弱め、このことは、ピエゾ１およびＴｒｐｖ４が部分的に余分な役割を有し得ることを示唆した。
【００９０】
Ｄｍｎｔ３ｂの活性化は、内皮機構による、ＨＳＣへの自己再生能力および多細胞系再構成能力の付与をなくした。Ｄｎｍｔ３ｂの阻害は造血細胞を表現型内皮細胞に戻すが、これらの細胞は、機能的内皮特性を欠いていた。このことは、内皮細胞から造血細胞への転換におけるＤｎｍｔ３ｂの時間的および空間的役割が不可逆であったことを示唆した。生体力学的伸展またはピエゾ１の活性化は、Ｄｎｍｔ３ａの発現に影響を与えることなく、Ｄｎｍｔ３ｂの時間的および空間的発現を増強した。データは、ＨＳＣの発生および分化の間の、Ｄｎｍｔ３ｂの造血性の役割とＤｎｍｔ３ａの白血病性の役割との間の区別を実証した。
【００９１】
本明細書において開示されている所見は、いかにして生体力学的力が細胞の運命の転換を刺激し、エピジェネティックな機構を引き起こすことによって幹細胞に自己再生能力を付与することを実証している。この研究はまた、多能性幹細胞（ＰＳＣ）またはドナー細胞に由来する内皮細胞または造血性内皮細胞からＬＴ−ＨＳＣを誘導するためのプラットフォームを提供する。目的は万能適合ＨＳＣを開発することであるが、本明細書において開示されているバイオインスパイアードバイオリアクターは、万能適合の導入遺伝子フリーの源細胞が良性および悪性の血液疾患、代謝性疾患、免疫疾患、および骨髄疾患を有する患者を処置するために利用可能となる足掛かりである。
【００９２】
材料および方法
全ての手順は、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院およびボストン小児病院の動物実験委員会によって承認された。
【００９３】
マウスＣｄ４５．２（Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ）およびＣｄ４５．１（ＳＪＬ）はジャクソン研究所から購入し、ゼブラフィッシュモルフォリノはＧｅｎｅＴｏｏｌｓから購入した。微細血管造影を、蛍光標識したデキストラン色素をゼブラフィッシュの心臓の心房に注射することによって行い、その通過を、ライブイメージングを使用して記録した。ゼブラフィッシュの心臓およびマウスのＡＧＭの免疫染色を、倒立型蛍光顕微鏡を使用して分析した。ゼブラフィッシュ胚における心臓タンポナーデ、心拍数、および脈動周波数を、明視野イメージングまたは低速度撮影共焦点顕微鏡法を使用して分析した。ゼブラフィッシュトランスジェニック胚における血管内の赤血球の動きおよび内皮からＨＳＣへの転換を、低速度撮影共焦点イメージングを使用して分析した。
【００９４】
脈動血管様の状態を、Ｆｌｅｘｃｅｌｌ  ＦＸ−４０００機を使用してインビトロで刺激した。内皮からＨＳＣへの転換の調節における薬理学的標的の役割を分析するために、マウス胚に由来するＡＧＭまたは全マウス胚を、生体力学的伸展、化学物質、または薬剤にエクスビボで曝露した。次に、造血コロニー形成アッセイを、マウスＡＧＭに由来する細胞をＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｍ３４３４培地中で７日間インキュベートすることによって行った。致死線量照射したＳＪＬマウスにおいて、ＡＧＭ由来のＨＳＣの連続移植を行った。生体力学的伸展の際の幹細胞頻度を、限界希釈アッセイを使用して分析した。一次移植体におけるＡＧＭ−ＨＳＣ由来の血球の特性を特徴付けるために、キメリズムおよび再構成のパーセンテージを、ＦＡＣＳを使用して測定し、グロビン転写産物を、定量的逆転写酵素ＰＣＲを使用して分析し、ミエロペルオキシダーゼの量を、ＰｉｃｏＫｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキットを使用して測定し、ＴＣＲ−βの再編成を、ＴＣＲ−β遺伝子座についてのＰＣＲを使用して分析し、免疫前ＩＧの検出を、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇキットを使用して分析し、そして遅延型過敏反応を、ヒツジＲＢＣ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を感作前のマウスの足蹠に注射することによって分析した。
【００９５】
ＲＮＡシーケンシング分析を行って、繰り返しひずみまたは薬理学的調節物質で処置したマウスＡＧＭにおける遺伝子発現パターンを測定した。コンピュータアルゴリズムを使用して、発現変動遺伝子の階層的クラスタリングを行い、これらの過剰に出現している生物学的プロセスおよび経路を測定した。発現変動遺伝子の遺伝子発現クラスターを分析し、細胞集団ごとのこれらの平均発現レベルを比較した。次に、アップ遺伝子およびダウン遺伝子のベン図比較を構築して、繰り返しひずみまたは薬理学的調節物質が介在する内皮からＨＳＣへの転換に重要な候補を分析した。さらに、Ｄｎｍｔ３ｂタンパク質およびＤｎｍｔ３ａタンパク質の発現を、マウスＡＧＭ細胞の核画分において、ＥｑｉＱｕｉｃｋアッセイキットを使用して分析した。データは、別段の記載がない限り、平均±ｓ．ｄ．として表されている。統計分析は、対応のあるまたは対応のないスチューデントｔ検定によって行った。有意性は、Ｐ＜０．０５で設定された。
【００９６】
動物
実験では、野生型ＡＢ、Ｃａｓｐｅｒ、およびトランスジェニックゼブラフィッシュ系統ｌｃｒ：ｅＧＦＰ、ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ、ｆｌｋ１：ｅＧＦＰ、ｃｄ４１：ｅＧＦＰを使用した。胚は、受精後４日間までを使用した。実験では、ジャクソン研究所のＣｄ４５．２（Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ）マウスおよびＣｄ４５．１（ＳＪＬ）マウスを使用した。
【００９７】
モルフォリノ
モルフォリノアンチセンスオリゴを入手し（Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ、以下の配列）、一細胞期のｃａｓｐｅｒゼブラフィッシュ胚に注射した。注射された胚および注射されていない胚を、固定するまで、Ｅ３培地において２８℃でインキュベートした。
ｃｄｈ５−ＭＯ（５’−ＴＡＣＡＡＧＡＣＣＧＴＣＴＡＣＣＴＴＴＣＣＡＡＴＣ−３’、配列番号１）
ｓｉｈ−ＭＯ（５’−ＣＡＴＧＴＴＴＧＣＴＣＴＧＡＴＣＴＧＡＣＡＣＧＣＡ−３’、配列番号２）
ピエゾ１−ＭＯ（５’−ＣＡＡＡＧＴＴＣＡＧＴＴＣＡＧＣＴＣＡＣＣＴＣＡＴ−３’、配列番号３）
ｄｎｍｔ３ｂｂ．１−ＭＯ１（５’−ＴＴＡＴＴＴＣＴＴＣＣＴＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣ−３’、配列番号４）
ｄｎｍｔ３ｂｂ．１−ＭＯ２（５’−ＣＴＣＴＣＡＴＣＴＧＡＡＡＧＡＡＴＡＧＣＡＧＡＧＴ−３’、配列番号５）
【００９８】
胚の化学的処置
ゼブラフィッシュの胚を、Ｅ３  ｆｉｓｈ培地中の以下の化学調節物質で処置した：１００ｕＭのＬ−ＮＡＭＥ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５０ｕＭのジギトキシゲニン（Ｓｉｇｍａ）、２５〜５０ｕＭのＹｏｄａ１（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、１ｕＭのナナオマイシン（Ｎａｎａ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００ｕＭの塩化ガドリニウム（ＧｄＣｌ３、Ｓｉｇｍａ）、５〜１０ｕＭの４α−ホルボール１２，１３−ジデカン酸塩（４Αｐｄｄ、Ｓｉｇｍａ）、またはＧＳＫ２０５（１０ｕＭ）。
【００９９】
微細血管造影
蛍光色素標識したデキストランビーズを対照胚およびｃｄｈ５−ＭＯ胚の心房に注射し、リアルタイムな明視野ビデオを、Ｎｉｋｋｏｎ  ＳＭＺ１５００実体顕微鏡を使用して捕捉した。
【０１００】
心拍数および心拍出量
生きたゼブラフィッシュ心臓の画像を、組み込み型の白熱照明を使用して、５×対物レンズを有するＡｘｉｏｐｌａｎ（Ｚｅｉｓｓ）正立顕微鏡、および５１２×４８０ピクセルのグレースケールイメージセンサーを有するＦａｓｔＣａｍ−ＰＣＩハイスピードデジタルカメラ（Ｐｈｏｔｒｏｎ）で得た。画像は１秒当たり２５０フレームで得られ、１０８８フレーム（８回の心周期）が条件ごとに得られた。カスタムソフトウェアを使用して（ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）において実装された）、連続イメージファイルから心拍数を決定した。心室の長軸および短軸を、各ビデオについての拡張期および収縮期の両方で、ＩｍａｇｅＪを使用して手動で測定し、これを使用して、標準的な幾何学的仮定を使用して心腔容積を推定した。モルフォリノ用量当たり少なくとも１０個の胚について、心拍出量を、拡張期の心室容積から収縮期の心室容積を差し引き、そこに心拍数をかけたものとして測定した（Shin et al., 2010）。
【０１０１】
周期性の分析
ゼブラフィッシュＣａｓｐｅｒの胚を、トリカイン（Ｓｉｇｍａ）を有する０．８％低融点アガロースに包埋し、ペトリ皿に載せた。次に、ＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（株式会社ニコン）ソフトウェアを備えたＮｉｋｏｎ  ＳＭＺ１５００実体顕微鏡を使用して、ＡＧＭ領域における拍動する血管のリアルタイムな明視野ビデオを捕捉した。ビデオを使用して、血管内の脈動周波数を定量した。
【０１０２】
明視野のライブイメージング
明視野のライブイメージングを行うために、ゼブラフィッシュＣａｓｐｅｒの胚を、トリカイン（Ｓｉｇｍａ）を有する０．８％低融点アガロースに包埋し、ペトリ皿に載せた。ＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（株式会社ニコン）ソフトウェアを備えたＮｉｋｏｎ  ＳＭＺ１５００実体顕微鏡を使用して、リアルタイムな明視野のビデオおよび静止画像を捕捉した。
【０１０３】
共焦点顕微鏡法
ｃｄ４１：ｅＧＦＰをｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙゼブラフィッシュと交配し、ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙをｌｃｒ：ｅＧＦＰゼブラフィッシュと交配し、モルフォリノをこれらのトランスジェニック胚に注射した。トランスジェニック胚を低融点アガロースに載せ、スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して、３０から４２ｈｐｆのｆｌｋ１＋内皮から生じるｃｄ４１：ｅＧＦＰ＋ＨＳＣの低速度撮影共焦点イメージングを行った。ｌｃｒ：ｅＧＦＰ＋赤血球の相対的な動きを、ｆｌｋ１：ｍＣｈｅｒｒｙ＋内皮の状況で分析した。本発明らは、Ｉｍａｒｉｓ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）ソフトウェアを使用して画像分析を行った。
【０１０４】
ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、以前に記載されているように行った。
【０１０５】
心臓タンポナーデ
マイクロインジェクション針を使用して心膜を穿刺し、４８ｈｐｆのｃｄｈ５−ＭＯを注射したゼブラフィッシュ胚の心臓の周辺を構成する体液を放出させた。
【０１０６】
免疫染色
Ｅ１０．５キメラマウス胚を採取し、パラフィンブロックに包埋し、横断面を作製し、そして一次抗体であるピエゾ１（ウサギ抗マウスＩｇＧ、Ａｂｃａｍ）、Ｃｄ３１（ロバ抗マウスＩｇＧ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ｃ−Ｋｉｔ（ウサギ抗マウスＩｇＧ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、またはＤｎｍｔ３ｂ（ロバ抗マウスＩｇＧ、Ａｂｃａｍ）、および４，６ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）抗体、ならびに二次抗体であるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ロバ抗ウサギＩｇＧ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（ロバ抗ヤギＩｇＧ、Ａｂｃａｍ）で免疫染色して、Ｅ１０．５  ＡＧＭ領域におけるこれらの発現を検出した。
【０１０７】
ｆｌｋ１（ＧＦＰ）、ｍｆ２（ｍＣｈｅｒｒｙ）、およびＤＡＰＩ（ｖｉｏｌｅｔ）の発現を、対照胚およびｃｄｈ５−ＭＯをサイレンシングしたゼブラフィッシュ胚から単離した心臓において測定した。
【０１０８】
ＡＧＭ外植片
Ｅ１１．５  ＡＧＭをＣ５７ＢＬ６／Ｊ  Ｃｄ４５．２マウス胚から採取し、細胞の３胚同等物の単一細胞懸濁液を、ＢｉｏＦｌｅｘ  ６ウェル培養プレート（ＦｌｅｘＣｅｌｌ）の各ウェルに播種した。本発明らは、細胞を一晩、繰り返しひずみ（Ｆｌｅｘｃｅｌｌ（登録商標）ＦＸ−４０００（商標）Ｔｅｎｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）、および／または化学調節物質（２５〜５０μＭのＹｏｄａ１、１μＭのナナオマイシン、１００μＭのＧｄｃｌ３、１ｕＭのＧｓＭＴｘ４、５〜２０μＭの４αＰＤＤ、１０ｕＭのＧＳＫ２０５）での処置を適用して培養した。次に、採取した細胞を使用して、移植、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析、およびコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイを行った。
【０１０９】
薬剤での胚のエクスビボでのインキュベーション
Ｅ１１．５マウス胚を、タイミングを合わせて交配した（time−mated）妊娠したメスの子宮から採取し、ＦＢＳ、１ｍＭのグルコース、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、および／または選択された化学調節物質（２５〜５０μＭのＹｏｄａ１、１μＭのナナオマイシン、５〜２０μＭの４αＰＤＤ、もしくは１０ｕＭのＧＳＫ２０５）を含有する無菌のガラスバイアルに入れた。本発明らは、ガラスバイアルを、ローラー器具（≒３０ｒｐｍで回転する）、一定のガス供給（２１％Ｏ２、５％ＣＯ２、残部Ｎ２）、および３７℃の一定温度で構成されるエクスビボインキュベーター（ＢＴＣ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）内に置いた。２４時間後、ＡＧＭを採取して、ＦＡＣＳアッセイおよびＣＦＵアッセイによって造血細胞の形成を分析した。
【０１１０】
移植体
一次移植では、未処置のまたは処置された（繰り返しひずみまたは２５μＭのＹｏｄａ１）ＡＧＭの３胚同等物と、脾臓ヘルパー細胞（マウス当たり≒５０万個）とを、致死線量照射した（分割線量１０．５ｃＧｙ）Ｃｄ４５．１（ＳＪＬ）マウスに、眼窩後注射によって注射した。二次移植および三次移植では、移植されたマウスから骨髄を単離した（脚、腕、骨盤骨、脊椎、胸骨）。骨髄をフィコール勾配（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）−１０８３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）にロードし、バフィーコートから得た細胞を、ビオチンコンジュゲート型系統抗体およびストレプトアビジンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）とインキュベートした。次に、細胞系陰性の（Ｌｉｎ−）細胞をＭＡＣＳ  ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で分離し、ドナーＣｄ４５．２のＬｉｎ−Ｓｃａ１＋ｃ−Ｋｉｔ＋（ＬＳＫ）細胞を、ＭｏＦｌｏ  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒソーターで選別した。その後、選別されたＣｄ４５．２  ＬＳＫ細胞をＣｄ４５．１脾臓ヘルパー細胞（≒マウス当たり５０万個）と混合し、放射線照射した（分割線量１０．５ｃＧｙ）Ｃｄ４５．１  ＳＪＬマウスに、眼窩後注射によって移植した。
【０１１１】
生存しているレシピエントを、限界希釈アッセイに対する応答としてカウントした：信頼区間１／（幹細胞頻度）を、ポアソン分布に従って、ＥＬＤＡによって計算した。
【０１１２】
ＣＦＵアッセイおよびＦＡＣＳアッセイ
ＣＦＵアッセイでは、ＡＧＭ外植片のまたはエクスビボの細胞を、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  ＧＦ  Ｍ３４３４培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において平板培養した。播種の７日後、本発明らは、顆粒球、赤血球系、マクロファージ、巨核球（ＧＥＭＭ）、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）、顆粒球（Ｇ）、マクロファージ（Ｍ）、および赤血球系（Ｅ）コロニーを作るこれらの能力を分析した。
【０１１３】
外植片のおよびエクスビボのＡＧＭ細胞を、Ｓｃａ１−Ｐａｃｉｆｉｃ−Ｂｌｕｅ（Ｅ１３−１６１．７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＦｌｋ１−ＡＰＣ−Ｃｙ７（Ａｖａｓ  １２α１、ＢＤ）で染色した。移植されたマウスの血液を、以下の抗体カクテルで染色した：Ｃｄ４５．２−Ｐａｃｉｆｉｃ−Ｂｌｕｅ（１０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ４５．１−ＦＩＴＣ（Ａ２０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ３−ＰＥ（１４５−２Ｃ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ８−ＰＥ（５３−６．７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｍａｃ１−ＡＰＣ（Ｍ１／７０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｇｒ１−ＡＰＣ（１０８４１２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ１９−ＡＰＣ−ＣＹ７（６Ｄ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｂ２２０−ＡＰＣ−ＣＹ７（ＲＡ３−６Ｂ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。
【０１１４】
Ｅ１１．５  ＡＧＭ細胞を移植したマウスの骨髄、脾臓、胸腺、およびリンパ節の細胞を、以下の抗体パネルで染色した：骨髄ＬＴ−ＨＳＣ：Ｃｄ４５．２−ＦＩＴＣ（１０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｔｅｒ１１９−ビオチン（ＴＥＲ−１１９  ＢＤ）、Ｇｒ１−ビオチン（ＲＢ６−８Ｃ５、ＢＤ）、Ｃｄ５−ビオチン（５３−７．３、ＢＤ）、Ｃｄ８ａ−ビオチン（５３−６．７、ＢＤ）、Ｂ２２０−ビオチン（ＲＡ３−６Ｂ２、ＢＤ）、ストレプトアビジン−パシフィックブルー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｓｃａ１−ＰＥ−ＣＹ７（Ｄ７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ｃＫｉｔ−ＡＰＣ（２Ｂ８、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｃｄ４８−ＡＰＣ−ＣＹ７（ＨＭ４８−１、ＢＤ）、Ｃｄ１５０−ＰＥ−ＣＹ５（ＴＣ１５−１２Ｆ１２．２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。骨髄における赤血球系分化ＲＩ−ＲＶ：Ｃｄ４５．２−Ｐａｃｉｆｉｃ−Ｂｌｕｅ（１０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ４５．１−ＦＩＴＣ（Ａ２０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｔｅｒ１１９−ＡＰＣ（ＴＥＲ−１１９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ７１−ＰＥ（Ｒ１７２１７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。骨髄顆粒球：Ｃｄ４５．２−Ｐａｃｉｆｉｃ−Ｂｌｕｅ（１０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ４５．１−ＦＩＴＣ（Ａ２０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｇｒ１−ＰＥ（ＲＢ６−８Ｃ５、ＢＤ）、Ｍａｃ１−ＡＰＣ（Ｍ１／７０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。脾臓、胸腺、およびリンパ節Ｔ細胞：Ｃｄ４５．２−Ｐａｃｉｆｉｃ−Ｂｌｕｅ（１０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ４５．１−ＦＩＴＣ（Ａ２０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ８−ＰＥ（５３−６．７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ４−ＡＰＣ（ＲＭ４−５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。脾臓、胸腺、およびリンパ節の骨髄細胞およびＢ細胞：Ｃｄ４５．２−Ｐａｃｉｆｉｃ−Ｂｌｕｅ（１０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ４５．１−ＦＩＴＣ（Ａ２０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃｄ１９−ＡＰＣ−ＣＹ７（６Ｄ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｍａｃ１−ＡＰＣ（Ｍ１／７０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。本発明らは、全てのＦＡＣＳ分析を、ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａサイトメーターで行った。本発明らは、造血器官分析を、移植の１６週間後に行った。
【０１１５】
定量的逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応分析（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
ＦＡＣＳを使用して、ＡＧＭ移植マウスから単離された未溶解の骨髄から得た赤血球前駆体（Ｃｄ４５．２＋、Ｔｅｒ１１９＋、Ｃｄ７１＋）を選別した。全ＲＮＡを、ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して単離し、ｃＤＮＡ合成を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。定量的リアルタイムＰＣＲを、ＭＸ３０００Ｐ機でＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（ＱｕａｎｔａＢｉｏ）を指示されたプライマー（Sankaran et al., 2009）と共に使用して行った。本発明らは、発現を、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇａｐｄｈ）の発現に対して正規化した（Ochida et al., 2010）。
【０１１６】
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の発現
好中球（Ｃｄ４５．２＋、Ｇｒ１＋、Ｍａｃ１＋）を、１６週齢の一次移植されたマウスの単離された骨髄からＦＡＣＳ選別し、１０％ＦＢＳを有するＩＭＤＭ中で一晩（５０万個細胞／ｍＬ）、２４ウェルプレートにおいて培養した。上清を回収し、ＭＰＯ濃度を、マウスＭＰＯ／ミエロペルオキシダーゼＰｉｃｏＫｉｎｅ（商標）ＥＬＩＳＡキット（Ｂｏｓｔｅｒ）を使用して測定した。ＭＰＯ濃度はまた、血清においても測定した。
【０１１７】
ＴＣＲ−βの再編成についてのＰＣＲアッセイ
Ｔ細胞（Ｃｄ４５．２＋、Ｃｄ３＋）および骨髄細胞（Ｃｄ４５．２＋、Ｍａｃ１＋）を、１６週齢の一次移植されたマウスの脾細胞からＦＡＣＳ選別した。次に、ゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを、ＴＣＲ−β遺伝子座内のＤＨ  β２．１−ＪＨ  β２．７の再編成について行った。本発明らのサンプルは、変性させ（９４℃、１分間）、アニーリングし（６３℃、２分間）、そして３５サイクル伸長させた（７２℃、２分間）ものであった。プライマーの配列は以下の通りである：ＤＨ  β２．１の５’：５’−ＧＴＡＧＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＧＧＡＡＧＡＡＡＣＴ−３’；配列番号６、およびＪＨ  β２．７の３’：５’ＴＧＡＧＡＧＣＴＧＴＣＴＣＣＴＡＣＴＡＴＣＧＡＴＴ；配列番号７（Lu et al., 2017）。
【０１１８】
免疫前Ｉｇの検出
血清を１６週齢の一次移植されたマウスから単離し、免疫前Ｉｇのアイソタイプを、マウスＩｇアイソタイピングキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）によって定量した。
【０１１９】
遅延型過敏反応
移植体マウスを、皮下注射（腰背部）および皮内注射（右足蹠）を介して、ヒツジ赤血球（ｓＲＢＣ、１０９個細胞／ｍＬ、部位当たり５０μＬ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で感作した。感作の６日後、感作前のマウスを、左足蹠では２×１０９個ＲＢＣ／ｍＬで、また右足蹠では等容積のＰＢＳで（対照として）チャレンジした。チャレンジの４８時間後、足蹠の厚みをマイクロキャリパーで測定した。本発明らは、６日目の変化のパーセントを、各足蹠のチャレンジ前の厚みで正規化した。
【０１２０】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現
ＡＧＭ外植片からの核抽出物を、ＥｐｉＱｕｉｋ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．）を使用して採取した。Ｄｎｍｔ３ｂタンパク質およびＤｎｍｔ３ａタンパク質のレベルを、比色分析ＥｐｉＱｕｉｋアッセイキット（Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．）を製造者の指示に従って使用して分析した。Ｄｎｍｔ３ｂおよびＤｎｍｔ３ａの濃度は、１μｇの核抽出タンパク質と関連している。
【０１２１】
ＲＮＡｓｅｑ分析およびコンピュータ分析
Ｅ１１．５マウスのＡＧＭ外植片培養物の全ＲＮＡを、ＲＮＡｅａｓｙ  ＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で単離した（対照条件、伸展条件、Ｙｏｄａ１条件、および４αＰＤＤ条件）。本発明らのｃＤＮＡライブラリーは、ＢＧＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって作製され、ＨｉＳｅｑ４０００装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でレーン当たり８つのサンプルでシーケンシングされた。本発明らは、本発明らのシーケンシングされた読み取り断片を、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｈｏｒｔ−Ｒｅａｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔプログラム（バージョン２０１２−０７−２０）を使用して、マウス参照ゲノムＧＲＣｍ３８（ＥＮＳＥＭＢＬリリース６９）に対してマッピングした。ＤＥＳｅｑ２およびＤＥＸＳｅｑを使用して、それぞれ発現変動（ＦＤＲ＝０．１）およびエキソン使用の変動について試験した。発現変動遺伝子の遺伝子発現クラスターを分析し、細胞集団ごとのこれらの平均発現レベルを比較した。次に、アップ遺伝子およびダウン遺伝子のベン図比較を行って、繰り返しひずみまたは薬理学的調節物質が介在する内皮からＨＳＣへの転換に重要な候補を分析した。具体的には、本発明らは、Ｒ（Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ、２０１２）におけるｇｐｌｏｔｓパッケージ（Warners et al., 2017）を使用するブートストラップ分析で階層的クラスタリングを行った。ＧＯ分析では、本発明らは、ＧＯカテゴリーまたはパスウェイでの本発明らの発現変動遺伝子の過剰な出現について、フィッシャーの正確確率検定を使用して試験し、ボンフェローニ法を使用して複数の試験について補正した。本発明らは、Ｐ値０．００１を統計的に有意なエンリッチメントの最小として使用して、以前に記載されているように、ＧＯタームエンリッチメント分析を行った。
【０１２２】
統計分析
データは、別段の記載がない限り、平均±平均の標準誤差（平均±ＳＥＭ）として表されている。統計分析は、対応のあるまたは対応のないスチューデントｔ検定によって行った。有意性は、Ｐ＜０．０５で設定された。
【図１−１】
2021527397.tif 000004
【図１−２】
2021527397.tif 000005
【図１−３】
2021527397.tif 000006
【図１−４】
2021527397.tif 000007
【図２−１】
2021527397.tif 000008
【図２−２】
2021527397.tif 000009
【図２−３】
2021527397.tif 000010
【図２−４】
2021527397.tif 000011
【図３−１】
2021527397.tif 000012
【図３−２】
2021527397.tif 000013
【図３−３】
2021527397.tif 000014
【図３−４】
2021527397.tif 000015
【図３−５】
2021527397.tif 000016
【図４】
2021527397.tif 000017
【図５−１】
2021527397.tif 000018
【図５−２】
2021527397.tif 000019
【図５−３】
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【国際調査報告】
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