(57)【要約】  本明細書では、キメラ抗原受容体を発現し、ＣＩＳＨを発現しないＮＫ細胞を作製するための方法が提供され、さらに、ＣＡＲ  ＮＫ細胞を投与することによって疾患を治療するための方法が提供される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と（２）ヒトＩＬ−１５（ｈＩＬ−１５）とを発現し、本質的にＣＩＳＨを発現しないように操作された単離ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。
【請求項２】
ＣＡＲを発現するように操作されている、請求項１に記載のＮＫ細胞。
【請求項３】
ＴＣＲを発現するように操作されている、請求項１に記載のＮＫ細胞。
【請求項４】
ＣＡＲ及びＴＣＲを発現するように操作されている、請求項１に記載のＮＫ細胞。
【請求項５】
臍帯血、末梢血、骨髄、ＣＤ３４＋細胞、又はｉＰＳＣに由来する、請求項１に記載のＮＫ細胞。
【請求項６】
臍帯血に由来する、請求項１に記載のＮＫ細胞。
【請求項７】
前記臍帯血が事前凍結されている、請求項６に記載のＮＫ細胞。
【請求項８】
前記ＣＡＲ及び／又はＴＣＲが、ＣＤ１９、ＣＤ３１９／ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＣＤ２０、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、ＣＤ２５、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ、がん胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＩＬ−１１Ｒａｌｐｈａ、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＷＴ−１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４、及び／又はＶＥＧＦＲ２に対して抗原特異性を有する、請求項１に記載のＮＫ細胞。
【請求項９】
前記ＣＡＲがＣＤ１９に対して抗原特異性を有する、請求項１に記載のＮＫ細胞。
【請求項１０】
前記ＮＫ細胞が第２のサイトカインをさらに発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記サイトカインがＩＬ−２１又はＩＬ−１２である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＮＫ細胞が哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）シグナル伝達を活性化させた、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＮＫ細胞がＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を増加させた、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＮＫ細胞を作製する方法であって、
（ａ）ＮＫ細胞の開始集団を取得すること、
（ｂ）前記ＮＫ細胞の開始集団を人工提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で培養すること、
（ｃ）ＣＡＲ及び／又はＴＣＲ発現ベクターを前記ＮＫ細胞に導入すること、
（ｄ）前記ＮＫ細胞をＡＰＣの存在下で増殖させること、それによって増殖したＮＫ細胞を得ること、ならびに
（ｅ）増殖したＮＫ細胞においてＣＩＳＨの発現を破壊すること、
を含む方法。
【請求項１５】
発現を破壊することが、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子サイレンシングを使用することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子サイレンシングが、ＣＡＲ  ＮＫ細胞と、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９とを接触させることを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｓｇＲＮＡがＣＩＳＨのエクソン４を標的とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｓｇＲＮＡが配列番号１〜２を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＮＫ細胞の開始集団が、フィコールパック密度勾配を使用して単核細胞を単離することによって得られる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＡＰＣがガンマ線照射されたＡＰＣである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＡＰＣがユニバーサルＡＰＣ（ｕＡＰＣ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＡＰＣが４１ＢＢ及びＩＬ−２１を発現するように操作されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｕＡＰＣが、（１）ＣＤ４８及び／又はＣＳ１（ＣＤ３１９）、（２）膜結合インターロイキン−２１（ｍｂＩＬ−２１）、及び（３）４１ＢＢリガンド（４１ＢＢＬ）を発現するように操作されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＮＫ細胞とＡＰＣとが１：２の比率で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｂ）及び（ｄ）のＮＫ細胞が、ＩＬ−２の存在下でさらに増殖される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＩＬ−２が１００〜３００Ｕ／ｍＬの濃度で存在する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＩＬ−２が２００Ｕ／ｍＬの濃度で存在する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
導入することが形質導入を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＣＡＲ及び／又はＴＣＲ発現構築体が、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである、請求項１４に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＮＫ細胞がＧＭＰに準拠している、請求項１４に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＮＫ細胞が同種異系である、請求項１４に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＮＫ細胞が自己由来である、請求項１４に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＣＡＲ及び／又はＴＣＲが、ＣＤ１９、ＣＤ３１９／ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＣＤ２０、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、ＣＤ２５、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ、がん胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＩＬ−１１Ｒａｌｐｈａ、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＷＴ−１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４、及び／又はＶＥＧＦＲ２に対して抗原特異性を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＣＡＲがＣＤ１９に対して抗原特異性を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＣＡＲ及び／又はＴＣＲ発現構築体がサイトカインをさらに発現する、請求項１４に記載の方法。
【請求項３６】
前記サイトカインがＩＬ−１５、ＩＬ−２１又はＩＬ−１２である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記増殖したＮＫ細胞の集団を凍結保存することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＮＫ細胞の集団、又は請求項１４〜３７のいずれか一項に記載の方法により作製されたＮＫ細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項３９】
対象の疾患又は障害の治療に使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＮＫ細胞、又は請求項１４〜３７のいずれか一項に記載の方法によって作製されたＮＫ細胞の有効量を含む組成物。
【請求項４０】
対象の免疫関連障害の治療のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＮＫ細胞、又は請求項１４〜３７のいずれか一項に記載の方法によって作製されたＮＫ細胞の有効量を含む組成物の使用。
【請求項４１】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＮＫ細胞、又は請求項１４〜３７のいずれか一項に記載の方法により作製されたＮＫ細胞の有効量を対象に投与することを含む、対象の免疫関連障害を治療する方法。
【請求項４２】
前記免疫関連障害が、がん、自己免疫障害、移植片対宿主病、同種移植片拒絶、又は炎症状態である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記免疫関連障害が炎症状態であり、前記免疫細胞が本質的にグルココルチコイド受容体の発現を有さない、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象がステロイド療法を投与されていたか、又は投与されている、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＮＫ細胞が自己由来である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＮＫ細胞が同種異系である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記免疫関連障害ががんである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記がんが固形がん又は血液悪性腫瘍である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
少なくとも第２の治療薬を投与することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
前記少なくとも第２の治療薬が、化学療法、免疫療法、外科手術、放射線療法、又は生物療法を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＮＫ細胞及び／又は少なくとも第２の治療薬が、静脈内、腹腔内、気管内、腫瘍内、筋肉内、内視鏡的、病変内、経皮的、皮下、局所的に、又は直接注射又は灌流によって投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記本質的にＣＩＳＨを発現しないＮＫ細胞が、ＣＩＳＨを発現するＮＫ細胞と比較して増強された機能を有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記増強された機能が、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの細胞内染色、ＣＤ１０７ａ脱顆粒、及び５１Ｃｒ放出アッセイによる腫瘍殺滅によって測定される、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
前記増強された機能が、グランザイム−ｂ、パーフォリン、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ３ｚ、Ｅｏｍｅｓ、Ｔ−ｂｅｔ、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ、ＣＤ２５及び／又はＫｉ６７の発現の増加によって測定される、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年５月３日出願の米国仮特許出願第６２／６６６，６６５号及び２０１８年５月４日出願の第６２／６６６，９６５号の利益を主張するものであり、これらは両方とも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［配列表の組み込み］
２０１９年５月３日に作成された２ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓで測定）の「ＵＴＦＣ１３６６ＷＯ．ｔｘｔ」と名付けられたファイルに含まれている配列表は、電子出願によって本明細書とともに提出され、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、全般に、免疫学及び医学の分野に関する。より具体的には、免疫チェックポイント遺伝子の発現を破壊することにより、キメラ抗原受容体を発現するように操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に関する。
【背景技術】
【０００４】
近年、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形質導入された自己由来Ｔ細胞を使用する養子細胞療法は、がん治療のための非常に強力なアプローチであることが証明されており、Ｂ細胞白血病及びリンパ腫に対する食品医薬品局（ＦＤＡ）の承認につながっている。しかし、腫瘍細胞に対する細胞傷害性を全身毒性から切り離すこと、標的抗原陰性再発の解決策を見つけること、及び自己由来製品を生成するという物流のハードルを回避するためのユニバーサルな既製の細胞療法製品を開発することの一方で、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）などの同種異系Ｔ細胞製品の課題を扱うことなど課題は残されている（Ｈａｒｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。
【０００５】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、腫瘍細胞に対する効果的な細胞傷害性を媒介し、Ｔ細胞とは異なり、同種異系環境でＧＶＨＤを引き起こす可能性がないため、魅力的な候補である。したがって、ＮＫ細胞は、すぐに臨床で使用するための既製の細胞療法製品として利用できるようになる可能性がある（Ｄａｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）。臍帯血（ＣＢ）は、広範な臨床的スケーラビリティの可能性がある、同種異系ＮＫ細胞の容易に入手可能な供給源である。ＣＡＲ形質導入ＮＫ細胞の強力な活性は、さまざまな腫瘍モデルの前臨床設定で証明されており、同種異系ＣＡＲ形質導入ＮＫ細胞の治験が現在進行中である（Ｍｅｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）。ＰＤ−１などの免疫チェックポイント分子はＣＡＲ−Ｔ細胞の機能を増強するために標的にされているが、これまでにＣＡＲ−ＮＫ細胞では免疫チェックポイント分子は標的にされていない（Ｇａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。
【０００６】
機能的ＮＫ細胞はいくつかの供給源から得ることができる。自己由来ＮＫ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで再現性よく発生させ得るが、自己腫瘍に対する活性は限られており、このことはＣＡＲ操作では克服することができない。臍帯血（ＣＢ）は、明らかな利点を有する、同種異系ＮＫ細胞の容易に入手可能な供給源である。ＣＢは既製の冷凍製品として入手可能であり、ｅｘ  ｖｉｖｏで冷凍ＣＢユニットから多数の高機能ＮＫ細胞を生成する方法によって支持される利点がある。大規模なグローバルＣＢバンクインベントリに保存されている凍結ＣＢユニットからのＣＡＲ形質導入ＮＫ細胞の作製は、スクリーニング及び白血球アフェレーシスを必要とする個々の成人ドナーでは再現できない広範なスケーラビリティが見込まれる。ただし、ＮＫ細胞の主な欠点は、サイトカインのサポートの非存在下における養子移入後の持続性の欠如である。したがって、サイトカインを発現するようにＣＡＲ−ＮＫ細胞を操作して、その持続性を高めることが、それらの臨床活性にとって重要である。そうすることにより、ＣＡＲ−ＮＫ細胞は、その機能を制限するチェックポイント分子をアップレギュレートする可能性がある。したがって、ＣＡＲ操作されたＮＫ細胞のチェックポイント分子を欠失させ、それらの効力と臨床活性を高める必要がある。
【発明の概要】
【０００７】
第１の実施形態において、本開示は、（１）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、ならびに（２）ヒトＩＬ−１５（ｈＩＬ−１５）を発現し、本質的にＣＩＳＨを発現しないように操作された単離ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を提供する。いくつかの態様において、ＮＫ細胞はＣＡＲを発現するように操作されている。特定の態様において、ＮＫ細胞は、ＴＣＲを発現するように操作されている。特定の態様において、ＮＫ細胞は、ＣＡＲ及びＴＣＲ又は３つもしくは４つの抗原受容体を発現するように操作されている。いくつかの態様において、ＮＫ細胞はＧＭＰに準拠している。特定の態様において、ＮＫ細胞は同種異系又は自己由来である。
【０００８】
いくつかの態様において、ＮＫ細胞は、臍帯血、末梢血、骨髄、ＣＤ３４＋細胞、又はｉＰＳＣに由来する。特定の態様において、ＮＫ細胞は臍帯血に由来する。特定の態様において、臍帯血は事前凍結されている。
【０００９】
特定の態様において、ＣＡＲ及び／又はＴＣＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３１９／ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＣＤ２０、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、ＣＤ２５、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ、がん胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＩＬ−１１Ｒａｌｐｈａ、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＷＴ−１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４、及び／又はＶＥＧＦＲ２に対して抗原特異性を有する。
【００１０】
追加の態様において、ＮＫ細胞はさらに、第２又は第３のサイトカインを発現する。特定の態様において、サイトカインは、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１又はＩＬ−１２である。
【００１１】
別の実施形態において、ＮＫ細胞の開始集団を取得すること、ＮＫ細胞の開始集団を人工提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で培養すること、ＣＡＲ及び／又はＴＣＲ発現ベクターを該ＮＫ細胞に導入すること、該ＮＫ細胞をＡＰＣの存在下で増殖させること、それによって増殖したＮＫ細胞を得ること、ならびに増殖したＮＫ細胞においてＣＩＳＨの発現を破壊すること、を含む前記実施形態のＮＫ細胞を作製するための方法が提供される。
【００１２】
いくつかの態様において、発現の破壊は、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子サイレンシングを使用することを含む。特定の態様において、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子サイレンシングは、ＣＡＲ  ＮＫ細胞と、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９とを接触させることを含む。特定の態様において、ｓｇＲＮＡは、ＣＩＳＨのエクソン４を標的とする。特定の態様において、ｓｇＲＮＡは、配列ＡＧＧＣＣＡＣＡＴＡＧＴＧＣＴＧＣＡＣＡ（配列番号１）を有するｃｒＲＮＡ１、及び配列ＴＧＴＡＣＡＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧ（配列番号２）を有するｃｒＲＮＡ２を含む。
【００１３】
いくつかの態様において、ＮＫ細胞の開始集団は、フィコールパック密度勾配を使用して単核細胞を単離することによって得られる。特定の態様において、ＡＰＣはガンマ線照射ＡＰＣである。いくつかの態様において、ＡＰＣはユニバーサルＡＰＣ（ｕＡＰＣ）である。特定の態様において、ＡＰＣは４１ＢＢ及びＩＬ−２１を発現するように操作されている。いくつかの態様において、ｕＡＰＣは、（１）ＣＤ４８及び／又はＣＳ１（ＣＤ３１９）、（２）膜結合インターロイキン−２１（ｍｂＩＬ−２１）、及び（３）４１ＢＢリガンド（４１ＢＢＬ）を発現するように操作されている。特定の態様において、ＮＫ細胞とＡＰＣとは、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、又は１：１０の比率などの１：１〜１：１０の比率で存在する。特定の態様において、ＮＫ細胞とＡＰＣとは１：２の比率で存在する。
【００１４】
特定の態様において、ＡＰＣとともに培養されているＮＫ細胞は、ＩＬ−２の存在下でさらに増殖する。特定の態様において、ＩＬ−２は、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、又は３００Ｕ／ｍＬなどの１００〜３００Ｕ／ｍＬの濃度で存在する。いくつかの態様において、ＩＬ−２は２００Ｕ／ｍＬの濃度で存在する。
【００１５】
いくつかの態様において、導入は形質導入を含む。特定の態様において、ＣＡＲ及び／又はＴＣＲ発現構築体は、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである。
【００１６】
特定の態様において、ＣＡＲ及び／又はＴＣＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３１９／ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＣＤ２０、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、ＣＤ２５、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ、がん胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＩＬ−１１Ｒａｌｐｈａ、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＷＴ−１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４、及び／又はＶＥＧＦＲ２に対して抗原特異性を有する。
【００１７】
いくつかの態様において、ＣＡＲ及び／又はＴＣＲ発現構築体は、２つ又は３つのサイトカインなどのサイトカインをさらに発現する。いくつかの態様において、サイトカインは、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１又はＩＬ−１２である。
【００１８】
いくつかの態様において、ＮＫ細胞は、ＣＩＳＨを発現するＮＫ細胞と比較して、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）のシグナル伝達が活性化した。特定の態様において、ＮＫ細胞は、ＣＩＳＨを発現するＮＫ細胞と比較して、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達が増加した。
【００１９】
追加の態様において、この方法は、増殖したＮＫ細胞の集団を凍結保存することをさらに含む。
【００２０】
本明細書において、前記実施形態のＮＫ細胞の集団、又は前記実施形態の方法によって作製されたＮＫ細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物がさらに提供される。別の実施形態において、対象の疾患又は障害の治療に使用するための、前記実施形態のＮＫ細胞、又は前記実施形態の方法によって作製されたＮＫ細胞の有効量を含む組成物が提供される。
【００２１】
別の実施形態において、対象の免疫関連障害の治療のための、前記実施形態のＮＫ細胞、又は前記実施形態の方法によって作製されたＮＫ細胞の有効量を含む組成物の使用が提供される。
【００２２】
さらなる実施形態は、前記実施形態のＮＫ細胞、又は前記実施形態の方法によって作製されたＮＫ細胞の有効量を対象に投与することを含む、対象における免疫関連障害を治療する方法を提供する。
【００２３】
上記の実施形態のいくつかの態様において、免疫関連障害は、がん、自己免疫障害、移植片対宿主病、同種移植片拒絶、又は炎症状態である。特定の態様において、免疫関連障害は炎症状態であり、免疫細胞は本質的にグルココルチコイド受容体の発現を有さない。特定の態様において、対象は、ステロイド療法を投与されていたか、又は投与されている。いくつかの態様において、ＮＫ細胞は自己由来又は同種異系である。特定の態様において、免疫関連障害はがんである。いくつかの態様において、がんは固形がん又は血液悪性腫瘍である。
【００２４】
上記の実施形態の追加の態様において、本方法は、少なくとも第２の治療薬を投与することをさらに含む。いくつかの態様において、少なくとも第２の治療薬は、化学療法、免疫療法、外科手術、放射線療法、又は生物療法を含む。いくつかの態様において、ＮＫ細胞及び／又は少なくとも第２の治療薬は、静脈内、腹腔内、気管内、腫瘍内、筋肉内、内視鏡的、病変内、経皮的、皮下、局所的に、又は直接注射又は灌流によって投与される。
【００２５】
いくつかの態様において、本質的にＣＩＳＨを発現しないＮＫ細胞は、ＣＩＳＨを発現するＮＫ細胞と比較して増強された機能を有する。ある態様において、増強された機能は、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの細胞内染色、ＣＤ１０７ａ脱顆粒及び５１Ｃｒ放出アッセイによる腫瘍殺滅によって測定される。いくつかの態様において、増強された機能は、グランザイム−ｂ、パーフォリン、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ３ｚ、Ｅｏｍｅｓ、Ｔ−ｂｅｔ、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ、ＣＤ２５及び／又はＫｉ６７の発現の増加によって測定される。
【００２６】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになると思われる。しかし、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の精神及び範囲内のさまざまな変更及び修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになるため、単なる例示として示されていることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに明示するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１又は複数を参照することにより、よりよく理解することができる。
【００２８】
【図１Ａ−Ｂ】ＣＩＳはＮＫ  ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５においてアップレギュレートされ、時間依存的に機能低下と相関する。図１Ａは、０日目（ベースラインの休止ＮＫ細胞）及びＣＡＲ形質導入後７日目及び１４日目に行われたＣＩＳＨ  ｍＲＮＡのｑＰＣＲを示す図である。ハウスキーピング遺伝子として１８Ｓを使用した。ＣＩＳＨ  ｍＲＮＡが、ＮＫＣＡＲ１９／ＩＬ−１５の増殖に続いて時間依存的にアップレギュレートされている。図１Ｂは、ＣＡＲ形質導入後７日目及び１４日目に行った、細胞傷害性又はＮＫ  ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５を評価するためのクロム放出アッセイを示す図である。結果は、経時的な細胞傷害性の低下を示しており、これはＣＩＳＨのアップレギュレーションと相関する。
【００２９】
【図２Ａ−Ｃ】ＣＩＳＨエクソン４を標的とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを使用した効率的なＣＩＳＨ  ＫＯ。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を使用して、ＮＫ増殖後１４日目に２つのｇＲＮＡを使用してＣＩＳＨエクソン４を標的とした。図２Ａは、ＫＯ後３日目のＣＩＳＨ遺伝子のＰＣＲによって評価したノックアウト効率を示す図である。図２Ｂは、７日目のＣＩＳタンパク質のウエスタンブロットによって評価したノックアウト効率を示す図である。図２Ｃは、７日目のフローサイトメトリーによって評価したノックアウト効率を示す図である。
【００３０】
【図３Ａ−Ｄ】ＣＩＳＨ  ＫＯ及びＣＡＲ１９／ＩＬ−１５形質導入は、機能及び細胞傷害性を相乗的に改善する。図３Ａ及びＢは、ＣＡＲ形質導入後１４日目に実施された、ＷＴ対応物と比較して、ＣＩＳＨ  ＫＯ  ＮＴ及びＣＩＳＨ  ＫＯ  ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５においてサイトカイン産生及び脱顆粒が増加したことを示す機能研究の図である。図３Ｃ及びＤは、ＣＩＳＨ  ＫＯグループにおいて細胞傷害性の改善を示すクロム放出アッセイの図である。
【００３１】
【図４Ａ−Ｄ】ＮＴ  ＮＫ細胞及びＮＫＣＡＲ１９／ＩＬ−１５におけるＣＩＳＨ  ＫＯは、Ｒａｊｉリンパ腫細胞との免疫シナプス形成を増強する。ＣＡＲ形質導入後１４日目に共焦点顕微鏡観察を実施して、ＣＩＳＨ  ＫＯ  ＮＴ及びＣＡＲ１９／ＩＬ−１５のＲａｊｉ細胞に対する免疫シナプス形成をｃａｓ９対照と比較した。図４Ａは、シナプスにおけるＦ−アクチン及びＣＡＲの蓄積が増加したことを示す図である。図４Ｂは、ＭＴＯＣからシナプスまでの距離が短縮されていることを示す図である。図４Ｃは、免疫シナプスにおいてＣＡＲとＦ−アクチンとの共局在が増加したことを示す図である。図４Ｄは、免疫シナプスにおいて、ＣＤ１９、Ｆ−アクチン及びＣＡＲの共局在が増加する傾向を示す図である。
【００３２】
【図５Ａ−Ｂ】ＣＩＳＨ  ＫＯ  ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞は、Ｒａｊｉリンパ腫マウスモデルにおける腫瘍制御及び生存を改善する。０日目に、マウスにＲａｊｉ細胞（２０Ｋ／マウス）をグループ１には単独で、又は異なるＮＫＣＡＲ１９／ＩＬ−１５調製物と組み合わせて注射した（１０７細胞／マウスＷＴ、Ｃａｓ９対照又はＣＩＳＨ  ＫＯ）。図５Ａは、ＣＩＳＨ  ＫＯ細胞を投与されたグループにおいて腫瘍制御が改善されたことを示すＢＬＩの図である。図５Ｂは、ＣＩＳＨ  ＫＯ細胞を投与されたグループにおいて生存の増加を示す生存曲線である。
【００３３】
【図６】屠殺の時点で、処理された血液、脾臓、肝臓、ＢＭに対してフローサイトメトリー分析を実行して、ＲａｊｉとＮＫ  ＣＡＲの存在を評価した。ＣＩＳＨ  ＫＯ  ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５細胞を投与されたマウスでは、Ｒａｊｉ  リンパ腫のエビデンスはなく、ＰＢ及び臓器でＣＡＲを発現するＮＫ細胞の明確な集団が検出されたことを示す図である。
【００３４】
【図７Ａ−Ｅ】ＣＩＳＨエクソン４を標的とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を使用した効率的なＣＩＳＨ  ＫＯ。図７Ａは、ＮＴ及びｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５形質導入のＮＫ細胞の両方において、１４日目及び２１日目にＣＩＳＨ転写の時間依存性の増加が示されたＲＴｑＰＣＲの結果である。図７Ｂは、エクソン４を標的とする２つの異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（配列番号１〜２）を使用したＣＲＩＳＰＲ媒介ＣＩＳＨ  ＫＯの概略図である。図７Ｃは、ＲＮＰエレクトロポレーションの２日後に行われた、ＣＩＳＨ  ＫＯ効率が９０％ｉｎｄｅｌを超えることを示すＰＣＲ結果である。図７Ｄは、ＲＮＰエレクトロポレーションの７日後に行われた、β−アクチンを参照遺伝子として使用したタンパク質の損失パーセントを示すウエスタンブロットである。図７Ｅは、ＮＨＥＪのＣＲＩＳＰＲ媒介イベントに対応する、それぞれのｃａｓ９モック対照（ｍｏｃｋ  ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較したＮＴ  ＣＩＳＨ  ＫＯ及びＣＡＲ  ＣＩＳＨ  ＫＯサンプルの複数のピークを示すサンガーシーケンシングの結果である。矢印は、遺伝子編集が開始される塩基対の位置を示している。
【００３５】
【図８Ａ−Ｆ】ＣＩＳＨ  ＫＯが、ＮＴ及びｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５形質導入のＮＫ細胞において機能及び細胞傷害性を改善する。機能研究により、異なるＮＫ細胞条件（ＮＴ、ＮＴ  ＣＩＳＨ  ＫＯ、ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５、ｉＣ９／ＣＡＲ１９／Ｉｌ−１５  ＣＩＳＨ  ＫＯ）のＲａｊｉリンパ腫に対する活性を比較した。図８Ａは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＣＤ１０７ａの発現の代表的ＦＡＣＳプロットである。図８Ｂは、ＮＫ細胞におけるＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＣＤ１０７ａの発現パーセントの棒グラフである、矢印はＳＤを表す（ｎ＝６）。図８Ｃは、異なるＥ：Ｔ比（５：１、２：１、１：１、０．５：１）でのクロム放出アッセイの図である（ｎ＝３）。図８Ｄは、ＮＫ細胞とＲａｊｉリンパ腫細胞との間の免疫シナプス形成を示す共焦点顕微鏡観察である（ｎ＝３）。図８Ｅは、シナプス距離に対するＭＴＯＣのプロットである。図８Ｆは、ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５とｉＣ９／ＣＡＲ１９／Ｉｌ−１５  ＣＩＳＨ  ＫＯとを比較する、異なるＥ：Ｔ比、１：１、１：２及び１：４での１２時間にわたるＲａｊｉリンパ腫の殺滅パーセントを示すＩｎｃｕｃｙｔｅ実験の図である。
【００３６】
【図９Ａ−Ｈ】ＣＩＳＨ  ＫＯ  ｉＣ９／ＣＡＲ１９／Ｉｌ−１５  ＮＫ細胞の表現型及び分子シグネチャー。図９Ａは、Ｃａｓ９対照ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５（ｎ＝２）と比較してＣＩＳＨ  ＫＯサンプルでより低い又はより高い発現を示す、ＣＩＳＨ  ＫＯ  ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５におけるマーカー発現の中央値を示すマスサイトメトリーデータの比較ヒートマップである。図９Ｂは、Ｃａｓ９対照ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５と比較してＣＩＳＨ  ＫＯ  ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５において発現の増加を示す選択されたマーカーの代表的なＶｉｓｎｅプロットである。ｔｓｎｅ−１対ｔｓｎｅ２を挿入。図９Ｃは、ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ１５  ＮＫ細胞の対照（ＣＴＲＬ）対ＣＩＳＨ  ＫＯ（ｎ＝２）において差次的に発現する遺伝子を示すヒートマップである。図９Ｄは、Ｃａｓ９対照ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ１５  ＮＫ細胞と比較したＣＩＳＨ  ＫＯ  ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ１５  ＮＫ細胞におけるＮＦＫＢ及びＩＦＮγ応答を介したＴＮＦαシグナル伝達での濃縮を示す遺伝子セット濃縮分析プロットである。図９Ｅは、Ｃａｓ９対照ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞と比較してＣＩＳＨ  ＫＯ  ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ１５  ＮＫ細胞でアップレギュレートされる遺伝子のいくつかを示すボルケーノプロットである（ｎ＝２）。図９Ｆは、Ｃａｓ９対照ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ１５  ＮＫ細胞と比較したＣＩＳＨ  ＫＯ  ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ１５  ＮＫ細胞におけるＩＬ−２／ＳＴＡＴ５  シグナル伝達、ＳＴＡＴ３／ＩＬ−６シグナル伝達、及び炎症応答での濃縮を示す遺伝子セット濃縮分析のプロットである。図９Ｇは、Ｒａｊｉリンパ腫細胞との３０分間の共培養後の、Ｃａｓ９対照ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ１５  ＮＫ細胞と比較したＣＩＳＨ  ＫＯ  ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ１５  ＮＫ細胞におけるｐ−ＳＴＡＴ５、ｐ−ＳＴＡＴ３及びｐ−ＰＬＣｇ１の増強されたアップレギュレーションを示す代表的なヒストグラムである。図９Ｈは、Ｃａｓ９対照対ＣＩＳＨ  ＫＯのｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ１５  ＮＫ細胞におけるｐ−ＳＴＡＴ５、ｐ−ＳＴＡＴ３及びｐ−ＰＬＣｇ１のＭＦＩを示す棒グラフである。
【００３７】
【図１０Ａ−Ｌ】ＣＩＳＨ  ＫＯは、ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞の代謝を再プログラムする。図１０Ａは、ＭＴＯＲＣ１、解糖、低酸素遺伝子セットの濃縮を示すＧＳＥＡ分析の図である。図１０Ｂは、異なる濃縮された代謝経路に関連する遺伝子の差次的発現を示すヒートマップである。図１０Ｃは、濃縮された代謝経路（ノード）に関連するアップレギュレートされた遺伝子（円）：ＩＬ−２／ＳＴＡＴ５シグナル伝達（褐色）、ｍＴＯＲＣ１、解糖及び低酸素を示すネットワーク分析の図であり、経路と特定の遺伝子との間のエッジが示されている。図１０Ｄは、ＣＩＳの欠失が、ＭＴＯＲＣ１、ＨＩＦ−１ａ及び解糖のアップレギュレートを介してｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５の代謝経路をどのように調節するかについての仮説を表す概略図である。ＣＩＳＨ  ＫＯは、Ｒａｊｉ腫瘍細胞に応答してＮＫ細胞の代謝適合性を調節する。図１０Ｅ及びＦは、Ｒａｊｉとの２時間の共培養後のＮＴ、ＮＴＫＯ、ＣＡＲ、ＣＡＲＫＯに対するＥＣＡＲの結果を示すＳｅａ  ｈｏｒｓｅアッセイの図である。図１０Ｇは、異なるＮＫ細胞条件でＲａｊｉと４時間共培養されたウェルから収集された上清について行われた、グルコース比色試験の結果である。図１０Ｈは、ＩＰＡを介して作成された解糖経路の図であり、赤色で彩色されたノードによって表される解糖酵素のアップレギュレーションを示す。図１０Ｉは、ＣＡＲ及びＣＡＲ  ＣＩＳＨ  ＫＯにおけるホスホ−Ｓ６の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。図１０Ｊは、ＮＴ、ＮＴＫＯ、ＣＡＲ、ＣＡＲＫＯに対するＯＣＲ結果を示すｓｅａ  ｈｏｒｓｅアッセイの図である。図１０Ｋ及びＬは、リソソーム、ミトコンドリア、及び核を評価し、ＮＴｃａｓ９とＮＴＫＯ、ＣＡＲ  ｃａｓ９とＣＡＲＫＯとの間でそれらの数と体積を統計的に比較する共焦点顕微鏡の結果である。
【００３８】
【図１１Ａ−Ｉ】ＣＩＳＨ  ＫＯ  ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞は、低注入用量であっても、Ｒａｊｉリンパ腫マウスモデルにおいて腫瘍制御及び生存を改善する。図１１Ａは、ｉｎ−ｖｉｖｏ実験のタイムラインを表す概略図である。図１１Ｂは、生物発光イメージング（ＢＬＩ）の結果の図である。図１１Ｃは、Ｒａｊｉ単独（ｎ＝５）対Ｒａｊｉ＋ＮＴ（ｎ＝５）対Ｒａｊｉ＋ＮＴ  ｃａｓ９対照（ＣＴＲＬ）（ｎ＝５）対Ｒａｊｉ＋ＮＴ  ＣＩＳＨ  ＫＯ（ｎ＝５）を投与されたマウスのグループを比較した生存曲線である。図１１Ｄは、異なる日のｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞のＣａｓ９対照とＣＩＳＨ  ＫＯとを比較する、マウスの末梢血に存在するＣＤ４５＋細胞のうちのＮＫ細胞のパーセントを示す図である。図１１Ｅは、ＢＬＩイメージングの結果の図である。図１１Ｆは、平均発光を示す図である。図１１Ｇは、生存曲線である。図１１Ｈは、以下のグループのマウスを比較する体重曲線である：Ｒａｊｉ単独（ｎ＝５）対Ｒａｊｉ＋ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５、３×１０６のｃａｓ９対照（ｎ＝５）対ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５、３×１０６のＣＩＳＨ  ＫＯ（ｎ＝５）対ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５、１０×１０６のｃａｓ９対照（ｎ＝５）対ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５、１０×１０６のＣＩＳＨ  ＫＯ（ｎ＝３）。ｈは、肝臓（左パネル）及び骨髄（右パネル）の代表的な病理写真であり、上のパネルにＨ＆Ｅ染色、下のパネルにＣＤ２０免疫組織化学的染色を示し、Ｒａｊｉ単独グループとＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  対照（１０ｘ１０６）グループとＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＣＩＳＨ  ＫＯ（１０ｘ１０６）グループとを比較している。図１１Ｉは、異なるグループ間の経時的なマウス体重のプロットである。
【００３９】
【図１２Ａ−Ｄ】ＧＵＩＤＥ−ＳｅｑによるＣａｓ９オフターゲット部位の特定及びｒｈＡｍｐＳｅｑ（商標）技術を使用した潜在的Ｃａｓ９オフターゲット切断部位の定量。図１２Ａは、ＣＩＳＨ遺伝子座を標的とする２つのガイドに対するＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑによって特定されたオフターゲット部位の配列である。ガイド配列が上部に記載されており、オフターゲット部位がその下に記載されている。オンターゲット部位は黒い四角で特定されている。ガイドとの不一致が強調表示で示され、挿入部分が灰色で示されている。ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑシーケンシングリードの数は、各部位の右側に示されている。Ａｌｔ−Ｒ  ｔｒａｃｒＲＮＡと複合体を形成した１０μＭのＡｌｔ−Ｒ  ｃｒＲＮＡ  ＸＴは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを構成的に発現するＨＥＫ２９３細胞にヌクレオフェクションによって送達された。図１２Ｂは、オンターゲット及びオフターゲットの、固有のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９特異的リードカウントの合計の部分パーセンテージを示す円グラフである。ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑによって特定されたオンターゲット部位及びオフターゲット部位における全編集は、ＮＧＳの多重化された標的濃縮アプローチであるｒｈＡｍｐＳｅｑを使用して測定された。２つのＣＩＳＨ標的化ガイドのそれぞれに対して、アンプリコンは、各Ｃａｓ９切断部位の周囲にオンターゲットＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑリードの１％を超えるリードを有するように設計された。ＷＴ  Ｃａｓ９又はＡｌｔ−Ｒ  ＨｉＦｉ  Ｃａｓ９のいずれかと形成されたＲＮＰ複合体は、エレクトロポレーションを介して増殖したＮＫ細胞に送達された。図１２Ｃは、単一のＲＮＰ複合体が送達された場合の、ＣＩＳＨガイド１（パネル１、１１プレックス）及びＣＩＳＨガイド２（パネル２、７０プレックス）の各標的遺伝子座でのＩＮＤＥＬ形成を示す図である。図１２Ｄは、ＣＩＳＨガイド１とＣＩＳＨガイド２が同時送達された場合の、各標的遺伝子座におけるＩＮＤＥＬ形成を示す図である。オンターゲット遺伝子座はアスタリスクで示される。
【００４０】
【図１３Ａ−Ｃ】ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５の形質導入及びＣＩＳＨ  ＫＯ効率は、経時的に安定している。図１３Ａは、形質導入細胞及び対照細胞におけるＣＤ５６のフローサイトメトリー分析の図である。図１３Ｂは、形質導入された細胞の細胞生存率を示す図である。図１３Ｃは、形質導入中のさまざまな日のウエスタンブロットである。
【００４１】
【図１４Ａ−Ｄ】ＣＩＳＨ  ＫＯ  ＮＴ  ＮＫ細胞の表現型及び分子シグネチャー。図１４Ａ及びＢは、遺伝子シグネチャーのヒートマップである。図１４Ｃ及びＤは、ＣＩＳＨ  ＫＯ  ＮＴ  ＮＫ細胞の分析の図である。
【００４２】
【図１５】図１５は、ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５の単回投与が、Ｒａｊｉリンパ腫マウスモデルの生存を延長させるが、治癒には至らないことを示す図である。
【００４３】
【図１６Ａ−Ｃ】ＣＩＳＨ  ＫＯ  ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞は、二量体を使用して排除可能である。図１６Ａ及びＢは、ＣＩＳＨ  ＫＯ  ＮＴ  ＮＫ細胞のフローサイトメトリー分析の図である。図１６Ｃは、血液、肝臓、脾臓又は骨髄中のＣＡＲ＋ＮＫ細胞のパーセントを示す図である。
【００４４】
【図１７】図１７は、高用量のＣＩＳＨ  ＫＯ  ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞を投与されたマウスにＲａｊｉリンパ腫のエビデンスがないことを示す図である
【発明を実施するための形態】
【００４５】
タンパク質のサイトカインシグナル伝達サプレッサー（ＳＯＣＳ）ファミリーは、サイトカインシグナル伝達、機能的活性、及びＮＫ細胞のがんに対する免疫を弱めることにより、ＮＫ細胞生物学において重要な役割を果たす。そのメンバーの１つである、ＣＩＳＨ遺伝子によってコードされるサイトカイン誘導ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳ）は、ＮＫ細胞の重要な細胞内チェックポイント分子として同定されており、ＩＬ−１５を含むサイトカインによって誘導される。したがって、本発明者らは、ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５形質導入ＣＢ−ＮＫ細胞におけるＣＩＳの発現及びＣＩＳＨ欠失の結果を評価することにより、操作されたＮＫ細胞が、未改変ＮＫ細胞におけるサイトカインシグナル伝達を生理学的にダウンレギュレートするのと同じ逆調節回路にさらされるかどうかを決定しようとした。
【００４６】
本研究は、ＣＡＲ操作とＣＩＳＨノックアウト（ＫＯ）とを組み合わせた新しいアプローチが、いずれかのアプローチ単独と比較して優れた腫瘍制御をもたらすことを実証した。ＣＩＳＨ  ＫＯは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を増加させることにより、ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５形質導入ＣＢ−ＮＫ細胞の活性を増強させた。さらに、ＣＩＳＨの標的化は、ＣＡＲ−ＮＫ細胞の代謝を調節し、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）シグナル伝達経路を活性化し、代謝に解糖スイッチを誘導することにより、それらの「適合性」を高めることが示された。これは、免疫チェックポイント分子の遺伝子編集が、代謝経路を調節することにより、ＣＡＲ．ＮＫ細胞の活性と適合性を増強することを示す最初の実証である。
【００４７】
具体的には、本研究は、ｍＲＮＡ  ｑＰＣＲによって決定されるように、７日間の増殖後に、ＣＩＳＨがＣＡＲ１９／ＩＬ−１５形質導入ＣＢ−ＮＫ細胞において誘導されることを示した（図１）。ＣＡＲ．１９／ＩＬ−１５形質導入ＮＫ細胞におけるＣＩＳＨ欠失の機能的影響を調べるために、ＣＩＳＨをサイレンシングするためのＣａｓ９リボ核タンパク質（Ｃａｓ９  ＲＮＰ）媒介遺伝子編集と、ｉＣ９／ＣＡＲ．ＣＤ１９／ＩＬ−１５構築体のレトロウイルス形質導入とを組み合わせるプロトコルを開発した。ｉＣ９／ＣＡＲ．１９／ＩＬ−１５構築体をＣＢ−ＮＫ細胞に形質導入した７日後、形質導入ＮＫ細胞に、Ｃａｓ９単独（Ｃａｓ９対照）又はＣＩＳＨエクソン４を標的とする化学合成ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡデュプレックスをプリロードしたＣａｓ９をヌクレオフェクトした。次に、細胞をクローン９．ｍｂＩＬ２１及びＩＬ−２（１００  ｉＵ／ｍｌ）とともにさらに７日間培養して、増殖を促進した。遺伝子編集効率をＰＣＲ（２日目）によって定量化して、タンパク質発現レベルの低下をＣＡＲ−ＮＫ細胞のフローサイトメトリー（７日目）によって判定した。ＣＩＳＨノックアウトは、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの細胞内染色、ＣＤ１０７ａ脱顆粒、及び５１Ｃｒ放出アッセイによる腫瘍殺滅によって評価されるように、特に低いエフェクター：標的比で、Ｒａｊｉ腫瘍細胞に対するｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５形質導入ＣＢ−ＮＫ細胞の機能を有意に増強させた。有望なｉｎ  ｖｉｔｒｏデータを考慮して、操作されたＣＢ由来ＣＡＲ−ＮＫ細胞を、Ｒａｊｉリンパ腫のネズミマウスモデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ試験した。マウスを、３００万又は１０００万のＮＫ細胞の１回だけの注射で処置し、ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５形質導入ＣＢ−ＮＫのＣＩＳＨ  ＫＯがそれらのｉｎ  ｖｉｖｏでの持続性を高め、両方の用量レベルでマウスの生存を改善することが示されたが、より印象的な長期生存は、１０００万の用量レベルで見られた。
【００４８】
したがって、特定の実施形態において、本開示は、レトロウイルス形質導入などによってＣＡＲを発現するようにそれらを操作することによって、及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介ＣＩＳＨノックダウンを使用することなどによって、ＣＩＳＨの発現を破壊することでＮＫ細胞を作製する方法を提供する。ＣＡＲ構築体は、ＩＬ−１５などのサイトカインを発現し得る。
【００４９】
本明細書で提供されるＮＫ細胞は、効力を増強することによって養子ＣＡＲ細胞療法を改善するために使用することができ、したがってより少ない数のＣＡＲ  ＮＫ細胞を患者に注入して、毒性を低下させることができる。したがって、さらなる実施形態は、血液悪性腫瘍、固形がん、感染症、又は限定するものではないが移植片対宿主病を含む免疫疾患を有するがん患者を治療するために、ＣＡＲ  ＮＫ細胞を用いた養子細胞療法を投与する方法を提供する。
【００５０】
（Ｉ．定義）
本明細書で使用する場合、特定の成分に関して「本質的に含まない」は、特定の成分が意図的に組成物に配合されておらず、かつ／又は汚染物質として、又は微量でのみ存在することを意味するために本明細書で使用される。したがって、組成物の意図しない汚染から生じる特定の成分の総量は、０．０５％をはるかに下回り、好ましくは０．０１％を下回る。最も好ましいのは、特定の成分の量が標準的な分析方法で検出できない組成物である。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」は、１又は複数を意味し得る。本明細書において特許請求の範囲で使用される場合、「含む」という単語と併せて使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」という単語は、１又は複数を意味し得る。
【００５２】
特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、代替物のみを参照するように明示的に示されない限り、又は代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は代替物のみと、「及び／又は」とを指すという定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２又はそれ以上を意味し得る。「約」、「実質的に」及び「おおよそ」という用語は、一般に、記載された値プラスマイナス５％を意味する。
【００５３】
「免疫障害」、「免疫関連障害」、又は「免疫介在性障害」は、免疫応答が疾患の発症又は進行において重要な役割を果たす障害を指す。免疫介在性障害には、自己免疫障害、同種移植片拒絶反応、移植片対宿主病、ならびに炎症性及びアレルギー性状態が含まれる。
【００５４】
「免疫応答」は、刺激に対するＢ細胞、Ｔ細胞、又は自然免疫細胞などの免疫系の細胞の応答である。一実施形態において、応答は特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。
【００５５】
「自己免疫疾患」とは、免疫系が、正常な宿主の一部である抗原（すなわち、自己抗原）に対して免疫応答（例えば、Ｂ細胞又はＴ細胞応答）を生じ、結果として組織に損傷を与える疾患を指す。自己抗原は、宿主細胞に由来する場合もあれば、通常は粘膜表面にコロニーを形成する微生物（共生生物として知られる）などの共生生物に由来する場合もある。
【００５６】
疾患又は状態を「治療すること」又はその治療は、疾患の兆候又は症状を軽減するために、患者に１又は複数の薬物を投与することを含み得るプロトコルを実行することを指す。治療の望ましい効果には、疾患の進行速度の低下、病状の改善又は軽減、寛解又は予後の改善が含まれる。緩和は、疾患又は状態の兆候又は症状が現れる前に行われても、ならびにそれらが現れた後に行われてもよい。したがって、「治療すること」又は「治療」は、疾患又は望ましくない状態を「予防すること」又はその「予防」を含み得る。さらに、「治療すること」又は「治療」は、兆候又は症状の完全な緩和を必要とせず、治癒を必要とせず、具体的には、患者にわずかな影響しか及ぼさないプロトコルを含む。
【００５７】
本出願を通して使用される「治療上の利益」又は「治療上有効な」という用語は、この状態の医学的治療に関して対象の健康を促進又は増強するあらゆるものを指す。これには、限定するものではないが、疾患の兆候又は症状の頻度又は重症度の低下が含まれる。例えば、がんの治療は、例えば、腫瘍のサイズの縮小、腫瘍の浸潤性の減少、がんの成長速度の低下、又は転移の予防を含み得る。がんの治療はまた、がんを有する対象の生存を延長することを指す場合もある。
【００５８】
「対象」及び「患者」は、ヒト又は非ヒト、例えば霊長類、哺乳類、及び脊椎動物のいずれかを指す。特定の実施形態において、対象はヒトである。
【００５９】
「薬学的又は薬理学的に許容される」という句は、必要に応じて、ヒトなどの動物に投与されたときに副作用、アレルギー反応、又は他の有害な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。抗体又は追加の有効成分を含む医薬組成物の調製は、本開示に照らして当業者には公知と思われる。さらに、動物（例えば、ヒト）投与の場合、調製物は、ＦＤＡ生物学的基準局が要求する無菌性、発熱性、一般的安全性、及び純度の基準を満たす必要があることは理解されよう。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、ありとあらゆる水性溶媒（例えば、水、アルコール／水溶液、生理食塩水、塩化ナトリウム、リンゲル・デキストロースなどの非経口ビヒクル、など）、非水性溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステル）、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤又は抗真菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス）、等張薬剤、吸収遅延剤、塩、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、染料、流体及び栄養補給剤などの材料及びそれらの組み合わせが含まれ、当業者には公知である。医薬組成物中のさまざまな成分のｐＨ及び正確な濃度は、周知のパラメーターに従って調整される。
【００６１】
「ハプロタイピング又は組織型判定」という用語は、例えば、特定の対象のリンパ球上でどの（１又は複数の）ΗＬＡ遺伝子座が発現されるかを決定することによって、対象のハプロタイプ又は組織型を同定するために使用される方法を指す。ΗＬＡ遺伝子は、第６染色体の短腕の領域である主要組織適合遺伝子複合体（ＭΗＣ）に位置し、細胞間相互作用、免疫応答、臓器移植、がんの発症、及び疾患への感受性に関与している。移植に重要な６つの遺伝子座があり、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ならびにＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ及びＨＬＡ−ＤＱと呼ばれている。各遺伝子座には、いくつかの異なる対立遺伝子のいずれかが存在する可能性がある。
【００６２】
ハプロタイピングに広く使用されている方法では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、対象のＤＮＡを、ＭＨＣ抗原をコードする遺伝子の既知のセグメントと比較する。遺伝子のこれらの領域の変動性は、対象の組織型又はハプロタイプを決定する。血清学的方法も、細胞表面の血清学的に定義された抗原を検出するために使用される。ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、及び−Ｃの決定因子は、公知の血清学的手法で測定することができる。簡単に説明すると、対象のリンパ球（新鮮な末梢血から単離）を、すべての公知のＨＬＡ抗原を認識する抗血清とともにインキュベートする。細胞を、さまざまな種類の抗血清を含む顕微鏡ウェルを備えたトレイに広げる。細胞を３０分間インキュベートした後、さらに６０分間補体とインキュベートする。リンパ球の表面に抗血清中の抗体によって認識される抗原がある場合、リンパ球は溶解される。色素を添加して、細胞膜の透過性と細胞死の変化を示すことができる。溶解によって破壊された細胞のパターンは、組織学的な不適合の程度を示す。例えば、ＨＬＡ−Ａ３の検査を受けている人のリンパ球が、ＨＬＡ−Ａ３に対する抗血清を含むウェルで破壊された場合、この抗原グループに対する検査は陽性である。
【００６３】
「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」という用語は、免疫系の特異的エフェクター細胞によって認識可能なペプチド−ＭＨＣ複合体の形で１又は複数の抗原を提示し、それによって、提示されている１又は複数の抗原に対する効果的な細胞免疫応答を誘導することができる細胞のクラスを指す。「ＡＰＣ」という用語は、マクロファージ、Ｂ細胞、内皮細胞、活性化Ｔ細胞及び樹状細胞などの無傷の全細胞、又は抗原を提示できる天然に存在する分子もしくは合成分子、例えばｙ２−ミクログロブリンと複合体を形成した精製ＭＨＣクラスＩ分子を包含する。
【００６４】
（ＩＩ．ＮＫ細胞）
特定の実施形態において、ＮＫ細胞は、当技術分野で周知の方法により、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、非刺激白血球アフェレーシス産物（ＰＢＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄、又は臍帯血から誘導される。特に、ＮＫ細胞は、臍帯血（ＣＢ）、末梢血（ＰＢ）、骨髄、又は幹細胞から単離することができる。特定の実施形態において、免疫細胞は、プールされたＣＢから単離される。ＣＢは、２、３、４、５、６、７、８、１０又はそれ以上のユニットからプールすることができる。免疫細胞は自己由来であっても、又は同種異系であってもよい。単離されたＮＫ細胞は、細胞療法を投与される対象に対してハプロタイプが一致し得る。ＮＫ細胞は、ＣＤ３の発現がないヒトでは、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ８などの特異的表面マーカーによって検出することができる。
【００６５】
特定の態様において、ＮＫ細胞の開始集団は、フィコール密度勾配遠心分離を使用して単核細胞を単離することによって得られる。細胞培養物は、ＣＤ３、ＣＤ１４、及び／又はＣＤ１９細胞を発現する任意の細胞を枯渇させることができ、ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞又はＮＫ細胞のパーセンテージを決定するために特徴付けることができる。
【００６６】
細胞は、ＵＡＰＣなどの現在のＡＰＣの存在下で増殖させる。増殖は、約２〜３０日、例えば３〜２０日、特に１２〜１６日、例えば１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９日、特に約１４日であり得る。ＮＫ細胞及びＡＰＣは、約３：１〜１：３、例えば２：１、１：１、１：２、特には約１：２の比率で存在し得る。増殖培養物は、ＩＬ−２、ＩＬ−２１及び／又はＩＬ−１８などの、増殖を促進するためのサイトカインをさらに含み得る。サイトカインは、約１０〜５００Ｕ／ｍＬ、例えば、１００〜３００Ｕ／ｍＬ、特に約２００Ｕ／ｍＬの濃度で存在し得る。サイトカインは、例えば２〜３日ごとに、増殖培養物に補充することができる。ＡＰＣは、ＣＡＲ形質導入後など、少なくとも２回は培養物に添加することができる。
【００６７】
増殖後、免疫細胞は直ちに注入されるか、又は凍結保存などによって保存することができる。特定の態様において、細胞は、約１、２、３、４、５日以内にバルク集団としてｅｘ  ｖｉｖｏで数日、数週間、又は数ヶ月間増殖され得る。
【００６８】
増殖したＮＫ細胞は、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子−α、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのＩ型サイトカインを分泌し、自然免疫細胞と適応免疫細胞との両方、及び他のサイトカインやケモカインを活性化する。これらのサイトカインの測定は、ＮＫ細胞の活性化状態を決定するために使用することができる。さらに、ＮＫ細胞活性化を決定するための当技術分野で公知の他の方法を、本開示のＮＫ細胞の特性評価のために使用することができる。
【００６９】
（Ａ．ＣＩＳＨ）
サイトカイン誘導ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳ）は、ＣＩＳＨ遺伝子によってコードされる。これはＳＯＣＳファミリーのメンバーであり、ＮＫ細胞の細胞内チェックポイント分子である。ＣＩＳＨはＩＬ−１５に応答して急速に誘導され、ＣＩＳＨを欠失すると、ＮＫ細胞はＩＬ−１５に対して過敏になる。ＣＩＳＨノックアウトＮＫ細胞は、増殖が促進され、ＩＦＮγ産生が増加し、細胞傷害活性が増強される。ＣＩＳのアブレーションは、ＮＫ細胞活性にブレーキを掛ける。
【００７０】
本ＮＫ細胞は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのＤＮＡ結合標的化ヌクレアーゼを含む、配列特異的又は標的化ヌクレアーゼによって、ならびに遺伝子又はその一部の配列を標的とするように特別に設計された、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）などのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼによって、ＣＩＳＨを破壊することができる。特定の態様において、ＣＩＳＨの発現はＣＲＩＳＰＲ媒介破壊によって破壊される。
【００７１】
（Ｂ．ＩＬ−１５）
インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）は組織が制限されており、病理学的条件下でのみ、血清中に任意のレベルで、又は全身的に観察される。ＩＬ−１５は、養子療法に望ましいいくつかの属性を保有する。ＩＬ−１５は、ナチュラルキラー細胞の発生及び細胞増殖を誘導し、腫瘍常在細胞の機能抑制を緩和することで確立された腫瘍の根絶を促進し、ＡＩＣＤを阻害する恒常性サイトカインである。
【００７２】
一実施形態において、本開示は、ＣＡＲ及び／又はＴＣＲ免疫細胞をＩＬ−１５と同時改変することに関する。ＩＬ−１５に加えて、他のサイトカインが想定される。これらには、限定するものではないが、サイトカイン、ケモカイン、及びヒトへの適用に使用される細胞の活性化及び増殖に寄与する他の分子が含まれる。ＩＬ−１５を発現するＮＫ細胞又はＴ細胞は、注入後の生存に重要な、継続的な支持サイトカインシグナル伝達が可能である。
【００７３】
特定の実施形態において、Ｋ５６２  ａＡＰＣを開発し、ＣＤ２８、ＩＬ−１５、及びＣＤ３ζなどの共刺激分子とともに所望の抗原（例えば、ＣＤ１９）を発現して、持続的なＣＡＲ媒介増殖が可能な免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞）がｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択される。この強力な技術により、ヒトへの適用に適した、臨床的に適切な数（最大１０１０）のＣＡＲ＋ＮＫ細胞の製造が可能である。必要に応じて、追加の刺激サイクルを実行して、より多くの遺伝子改変ＮＫ細胞を作製することができる。通常、増殖したＮＫ細胞の少なくとも９０％がＣＡＲを発現し、注入のために凍結保存することができる。さらに、このアプローチは、導入されたＣＡＲの特異性を、ａＡＰＣ上でＣＡＲによって認識される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現と組み合わせることにより、多様な腫瘍型に対するＮＫ細胞を生成するために利用することができる。
【００７４】
遺伝子改変後、細胞はすぐに注入しても、又は保存されてもよい。特定の態様において、遺伝子改変後、細胞への遺伝子移入後約１、２、３、４、５日又はそれ以上以内に、細胞をバルク集団としてｅｘ  ｖｉｖｏで数日、数週間、又は数ヶ月増殖させることができる。さらなる態様において、トランスフェクタントはクローン化され、クローンは、単一の統合された、又はエピソーム的に維持された発現カセット又はプラスミドの存在を示し、キメラ受容体の発現が、エクスビボで拡大される。拡大のために選択されたクローンは、ＣＤ１９発現標的細胞を特異的に認識し、溶解する能力を示す。組換え免疫細胞は、ＩＬ−２、又は共通のガンマ鎖に結合する他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１など）による刺激によって増殖させることができる。組換え免疫細胞は、人工抗原提示細胞による刺激によって増殖させることができる。さらなる態様において、遺伝子改変細胞は、凍結保存することができる。
【００７５】
（Ａ．遺伝子操作された抗原受容体）
本開示のＮＫ細胞は、操作されたＴＣＲ及び／又はＣＡＲなどの抗原受容体を発現するように遺伝子操作することができる。例えば、ＮＫ細胞は、がん抗原に対して抗原特異性を有するＴＣＲを発現するように改変される。異なる抗原などに対する複数のＣＡＲ及び／又はＴＣＲをＮＫ細胞に追加することができる。
【００７６】
改変の適切な方法は当技術分野において公知である。例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ及びＡｕｓｕｂｅｌを参照されたい。例えば、細胞は、Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００８及びＪｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９に記載の形質導入技術を使用して、がん抗原に対する抗原特異性を有するＴＣＲを発現するように形質導入することができる。
【００７７】
完全長ＴＣＲ  α及びβ（又はγ及びδ）鎖をコードするＲＮＡのエレクトロポレーションは、レトロウイルスで形質導入されたＴＣＲ鎖と内因性ＴＣＲ鎖とのペアリングによって引き起こされる自己反応性の長期的な問題を克服するための代替手段として使用することができる。導入されたＴＣＲ  α及びβ鎖は一時的にしか発現されないため、そのような代替ペアリングが一過性トランスフェクション戦略で行われたとしても、作製し得る自己反応性Ｔ細胞はしばらくするとこの自己反応性を失う。導入されたＴＣＲ  α及びβ鎖の発現が減少すると、正常な自己由来Ｔ細胞のみが残る。これは、完全長のＴＣＲ鎖が安定したレトロウイルス形質導入によって導入された場合には当てはまらず、これにより、導入されたＴＣＲ鎖が失われることはなく、患者において常に自己反応性が生じる。
【００７８】
いくつかの実施形態において、細胞は、遺伝子工学を介して導入された、１又は複数の抗原受容体をコードする１又は複数の核酸、及びそのような核酸の遺伝子操作された産物を含む。いくつかの実施形態において、核酸は異種であり、すなわち、通常、細胞又は細胞から得られたサンプル中には存在しない、例えば、操作されている細胞、及び／又はそのような細胞が由来する生物中には通常見られない、別の生物又は細胞から得られたものである。いくつかの実施形態において、核酸は、自然界には見られない核酸（例えば、キメラ）など、天然には存在しない。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗原は、細胞の表面に発現されるタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲはＴＣＲ様ＣＡＲであり、抗原はプロセシングされたペプチド抗原、例えば、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に関連して細胞表面上で認識される、ＴＣＲのような細胞内タンパク質のペプチド抗原である。
【００８０】
ＣＡＲ及び組換えＴＣＲを含む例示的な抗原受容体、ならびに受容体を操作及び細胞に導入するための方法としては、例えば、国際特許出願公開番号第２０００１４２５７号、第２０１３１２６７２６号、第２０１２／１２９５１４号、第２０１４０３１６８７号、第２０１３／１６６３２１号、第２０１３／０７１１５４号、第２０１３／１２３０６１号パンフレット、米国特許出願公開番号第２００２１３１９６０号、第２０１３２８７７４８号、第２０１３０１４９３３７号明細書、米国特許第６，４５１，９９５号、第７，４４６，１９０号、第８，２５２，５９２、第８，３３９，６４５号、第８，３９８，２８２、第７，４４６，１７９号、第６，４１０，３１９号、第７，０７０，９９５号、第７，２６５，２０９号、第７，３５４，７６２号、第７，４４６，１９１号、第８，３２４，３５３号、及び第８，４７９，１１８号明細書、ならびに欧州特許出願番号第２５３７４１６号明細書に記載のもの、及び／又はＳａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｄａｖｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｔｕｒｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２に記載のものが挙げられる。いくつかの態様において、遺伝子操作された抗原受容体は、米国特許第７，４４６，１９０号明細書に記載のＣＡＲ、及び国際特許出願公開番号第２０１４０５５６６８Ａｌ号パンフレットに記載されているものを含む。
【００８１】
（２．キメラ抗原受容体）
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ａ）細胞内シグナル伝達ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、及びｃ）抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態において、操作された抗原受容体は、活性化又は刺激性ＣＡＲ、共刺激性ＣＡＲ（国際公開第２０１４／０５５６６８号パンフレットを参照されたい）、及び／又は抑制性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ、Ｆｅｄｏｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３を参照されたい）などのＣＡＲを含む。ＣＡＲは概して、１又は複数の細胞内シグナル伝達成分に、いくつかの態様においてはリンカー及び／又は膜貫通ドメインを介して、連結された細胞外抗原（又はリガンド）結合ドメインを含む。そのような分子は、典型的には、天然の抗原受容体を介したシグナル、そのような受容体を介した共刺激受容体と組み合わせたシグナル、及び／又は共刺激受容体単独を介したシグナルを模倣するか、又はそれに近似する。
【００８３】
本開示の特定の実施形態は、免疫原性を低減させるためにヒト化されたＣＡＲ（ｈＣＡＲ）を含む、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１又は複数のシグナル伝達モチーフを含む細胞外ドメインを含む抗原特異的ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸などの核酸の使用に関する。特定の実施形態において、ＣＡＲは、１又は複数の抗原間の共有空間を含むエピトープを認識し得る。特定の実施形態において、結合領域は、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域、及び／又はそれらの抗原結合フラグメントを含み得る。別の実施形態において、その特異性は、受容体に結合するペプチド（例えば、サイトカイン）に由来する。
【００８４】
ヒトＣＡＲ核酸は、ヒト患者の細胞免疫療法を強化するために使用されるヒト遺伝子であり得ることが企図される。特定の実施形態において、本発明は、完全長ＣＡＲ  ｃＤＮＡ又はコード領域を含む。抗原結合領域又はドメインは、特定のヒトモノクローナル抗体に由来する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のＶＨ及びＶＬ鎖のフラグメント、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，１０９，３０４号明細書に記載されているものを含み得る。フラグメントはまた、ヒト抗原特異的抗体の任意の数の異なる抗原結合ドメインであり得る。より具体的な実施形態において、フラグメントは、ヒト細胞での発現のためにヒトコドン使用に最適化された配列によってコードされる抗原特異的ｓｃＦｖである。
【００８５】
配置は、ダイアボディまた多量体などの多量体であり得る。多量体は、軽鎖と重鎖の可変部分をダイアボディにクロスペアリングすることによって形成される可能性が最も高い。構築体のヒンジ部分は、完全な欠失から、最初のシステインの維持、セリン置換ではなくプロリン、最初のシステインまでの切断、まで複数の選択肢を有し得る。Ｆｃ部分は欠失させることができる。安定及び／又は二量体化するタンパク質は、この目的に役立つ。Ｆｃドメインうちの１つだけ、例えば、ヒト免疫グロブリン由来のＣＨ２又はＣＨ３ドメインのいずれかを使用することができる。二量体化を改善するために改変されたヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を使用することもできる。免疫グロブリンのヒンジ部分だけを使用することもできる。ＣＤ８アルファの一部を使用することもできる。
【００８６】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ核酸は、膜貫通ドメイン及び改変されたＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインなどの他の共刺激受容体をコードする配列を含む。他の共刺激受容体としては、限定するものではないが、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ−４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）の１又は複数が挙げられる。ＣＤ３ζによって開始される一次シグナルに加えて、ヒトＣＡＲに挿入されたヒト共刺激受容体によって提供される追加シグナルはＮＫ細胞の完全な活性化にとって重要であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでの持続性と養子免疫療法の治療的成功を改善するのに役立ち得る。
【００８７】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、特定の抗原（又はマーカー又はリガンド）、例えば、がんマーカーなどの、養子療法によって標的とされる特定の細胞型で発現される抗原、及び／又は正常又は非罹患細胞型で発現される抗原などの、抑制反応の誘発を意図される抗原に対する特異性を有するように構築される。したがって、ＣＡＲは、典型的には、その細胞外部分に、１又は複数の抗原結合分子、例えば１又は複数の抗原結合フラグメント、ドメインもしくは部分、又は１又は複数の抗体可変ドメイン、及び／又は抗体分子を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、抗体分子の１又は複数の抗原結合部分、例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）に由来する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。
【００８８】
キメラ抗原受容体の特定の実施形態において、受容体の抗原特異的部分（抗原結合領域を含む細胞外ドメインと呼ばれ得る）は、腫瘍関連抗原又は病原体特異的抗原結合ドメインを含む。抗原には、デクチン−１などのパターン認識受容体によって認識される炭水化物抗原が含まれる。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の細胞表面に発現している限り、どのような種類でもよい。腫瘍関連抗原の例示的な実施形態には、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、ＣＤ２５、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ、がん胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ５６、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＡＫＴ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓなどが含まれる。特定の実施形態において、腫瘍関連抗原の量が少ない場合、ＣＡＲをサイトカインと共発現させて持続性を改善することができる。例えば、ＣＡＲはＩＬ−１５と共発現させることができる。
【００８９】
キメラ受容体をコードするオープンリーディングフレームの配列は、ゲノムＤＮＡ源、ｃＤＮＡ源から得ることができ、又は（例えば、ＰＣＲを介して）合成することができ、又はそれらの組み合わせから得ることができる。ゲノムＤＮＡのサイズ及びイントロンの数に応じて、イントロンがｍＲＮＡを安定化させることがわかっているため、ｃＤＮＡ又はそれらの組み合わせを使用することが望ましいと思われる。また、内因性又は外因性の非コード領域を使用してｍＲＮＡを安定化することがさらに有利であり得る。
【００９０】
キメラ構築体は、裸のＤＮＡとして、又は適切なベクター中で免疫細胞に導入され得ることが企図される。裸のＤＮＡを使用するエレクトロポレーションによって細胞を安定的にトランスフェクトする方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第６，４１０，３１９号明細書を参照されたい。裸のＤＮＡは、一般に、発現のために適切な方向でプラスミド発現ベクターに含有される、キメラ受容体をコードするＤＮＡを指す。
【００９１】
又は、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はレンチウイルスベクター）を使用して、キメラ構築体を免疫細胞に導入することができる。本開示の方法に従って使用するのに適したベクターは、免疫細胞において複製しない。細胞内に維持されるウイルスのコピー数が細胞の生存能力を維持するのに十分に低い、ウイルスに基づく多数のベクター、例えば、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶ又はＢＰＶに基づくベクターが公知である。
【００９２】
いくつかの態様において、抗原特異的な結合又は認識成分は、１又は複数の膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合された膜貫通ドメインを含む。一実施形態において、ＣＡＲ内のドメインの１つに自然に結合される膜貫通ドメインが使用される。場合によっては、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするために、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避するようにアミノ酸置換によって選択又は改変される。
【００９３】
いくつかの実施形態において膜貫通ドメインは、天然源又は合成源のいずれかに由来する。供給源が天然である場合、いくつかの態様においてドメインは、膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域には、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、又はゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＧＩＴＲ／ＣＤ３５７、ＮＫＧ２Ｄ、及びＤＡＰ分子に由来する領域が含まれる（すなわち、少なくともそれらの膜貫通領域を含む）。又は、いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは合成である。いくつかの態様において、合成膜貫通ドメインは、ロイシン及びバリンなどの主に疎水性残基を含む。いくつかの態様において、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの両端に見出されると思われる。
【００９４】
特定の実施形態において、ＮＫ細胞などの免疫細胞を遺伝子改変するために本明細書に開示されるプラットフォーム技術は、（ｉ）エレクトロポレーションデバイス（例えば、ヌクレオフェクター）を使用する非ウイルス遺伝子移入、（ｉｉ）エンドドメインを介してシグナル伝達するＣＡＲ（例えば、ＣＤ２８／ＣＤ３−ζ、ＣＤ１３７／ＣＤ３−ζ、又は他の組み合わせ）、（ｉｉｉ）抗原認識ドメインを細胞表面に接続する可変長の細胞外ドメインを有するＣＡＲ、及び場合によっては（ｉｖ）ＣＡＲ＋免疫細胞をロバストかつ数値的に増殖させることができるＫ５６２由来の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を含む。
【００９５】
（３．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ））
いくつかの実施形態において、遺伝子操作された抗原受容体は、組換えＴＣＲ及び／又は天然に存在するＴ細胞からクローン化されたＴＣＲを含む。「Ｔ細胞受容体」又は「ＴＣＲ」は、可変のａ及びβ鎖（それぞれ、ＴＣＲα及びＴＣＲβとしても知られる）又は可変のγ及びδ鎖（それぞれ、ＴＣＲγ及びＴＣＲδとしても知られる）を含む分子を指し、ＭＨＣ受容体に結合した抗原ペプチドに特異的に結合することができる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲはαβ形態である。
【００９６】
通常、αβ及びγδの形で存在するＴＣＲは一般に構造的に類似しているが、それらを発現するＴ細胞は異なる解剖学的位置又は機能を有し得る。ＴＣＲは、細胞の表面に、又は可溶性の形で見出すことができる。一般に、ＴＣＲはＴ細胞（又はＴリンパ球）の表面に見られ、概して主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に関与する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲはまた、定常ドメイン、膜貫通ドメイン、及び／又は短い細胞質尾部を含み得る（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９７を参照されたい）。例えば、いくつかの態様において、ＴＣＲの各鎖は、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、及びＣ末端に短い細胞質尾部を有することができる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、シグナル伝達の媒介に関与するＣＤ３複合体の不変タンパク質と関連している。特に明記しない限り、「ＴＣＲ」という用語は、その機能的なＴＣＲフラグメントを包含すると理解されるべきである。この用語はまた、αβ型又はγδ型のＴＣＲを含む無傷又は完全長のＴＣＲを包含する。
【００９７】
したがって、本明細書の目的のために、ＴＣＲへの言及は、任意のＴＣＲ、又はＭＨＣ分子に結合した特異的抗原ペプチド、すなわちＭＨＣ−ペプチド複合体に結合するＴＣＲの抗原結合部分などの機能的フラグメントを含む。ＴＣＲの「抗原結合部分」又は抗原結合フラグメントは交換可能に使用することができ、ＴＣＲの構造ドメインの一部を含み、それでも完全なＴＣＲが結合する抗原（例えば、ＭＨＣ−ペプチド複合体）に結合する分子を指す。場合によっては、抗原結合部分は、特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するのに十分な、ＴＣＲの可変α鎖及び可変β鎖などのＴＣＲの可変ドメインを含み、一般に、各鎖は、３つの相補性決定領域を含む。
【００９８】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖の可変ドメインは、ループ又は免疫グロブリンに類似した相補性決定領域（ＣＤＲ）の形成に関与し、ＴＣＲ分子の結合部位を形成することによって抗原認識を付与し、ペプチド特異性を決定する。通常、免疫グロブリンと同様に、ＣＤＲはフレームワーク領域（ＦＲ）によって分離される（例えば、Ｊｏｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００３を参照されたい）。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３はプロセシングされた抗原の認識に関与する主要なＣＤＲであり、アルファ鎖のＣＤＲ１も抗原ペプチドのＮ末端部分と相互作用することが示されており、ベータ鎖のＣＤＲ１はペプチドのＣ末端部分と相互作用する。ＣＤＲ２はＭＨＣ分子を認識すると考えられている。いくつかの実施形態において、β鎖の可変領域は、さらなる超可変（ＨＶ４）領域を含むことができる。
【００９９】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖は、定常ドメインを含む。例えば、免疫グロブリンと同様に、ＴＣＲ鎖（例えば、ａ鎖、β鎖）の細胞外部分は、Ｎ末端に２つの免疫グロブリンドメイン、可変ドメイン（例えば、Ｖａ又はＶｐ；典型的には、Ｋａｂａｔの番号付け、Kabat et al.,“Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services,Public Health Service National Institutes of Health,1991,5th ed.に基づくアミノ酸１〜１１６）と、細胞膜に隣接して１つの定常ドメイン（例えば、ａ−鎖定常ドメイン又はＣａ、典型的にはＫａｂａｔに基づくアミノ酸１１７〜２５９、β鎖定常ドメイン又はＣｐ、通常はＫａｂａｔに基づくアミノ酸１１７〜２９５）とを含み得る。例えば、場合によっては、２つの鎖によって形成されるＴＣＲの細胞外部分は、２つの膜近位定常ドメイン、及びＣＤＲを含む２つの膜遠位可変ドメインを含む。ＴＣＲドメインの定常ドメインには、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、２つの鎖の間に連結を形成する短い接続配列が含まれている。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、ＴＣＲが定常ドメインに２つのジスルフィド結合を含むように、α鎖及びβ鎖のそれぞれに追加のシステイン残基を有し得る。
【０１００】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖は、膜貫通ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは正に帯電している。場合によっては、ＴＣＲ鎖に細胞質尾部が含まれている。場合によっては、この構造により、ＴＣＲがＣＤ３などの他の分子と結合できるようになる。例えば、膜貫通領域を有する定常ドメインを含むＴＣＲは、タンパク質を細胞膜に固定し、ＣＤ３シグナル伝達装置又は複合体の不変サブユニットと結合させることができる。
【０１０１】
一般に、ＣＤ３は、哺乳類の３つの異なる鎖（γ、δ、及びε）とζ鎖とを有することができる多タンパク質複合体である。例えば、哺乳類では、複合体はＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖及びＣＤ３ζ鎖のホモ二量体を含むことができる。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ε鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンスーパーファミリーと関連性が高い細胞表面タンパク質である。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は負に帯電しており、このことが、これらの鎖が正に帯電したＴ細胞受容体鎖と結合可能にする特性である。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ε鎖の細胞内尾部にはそれぞれ、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られる単一の保存モチーフが含まれているが、各ＣＤ３ζ鎖は３つ有している。一般的に、ＩＴＡＭはＴＣＲ複合体のシグナル伝達能力に関与している。これらのアクセサリー分子は、負に帯電した膜貫通領域を有し、ＴＣＲから細胞内にシグナルを伝播する役割を果たす。ＣＤ３鎖及びζ鎖はＴＣＲとともに、Ｔ細胞受容体複合体として知られているものを形成する。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、２つの鎖α及びβ（又は任意選択でγ及びδ）のヘテロ二量体であっても、又は単鎖ＴＣＲ構築体であってもよい。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、例えば、１又は複数のジスルフィド結合によって連結された２つの別個の鎖（α及びβ鎖又はγ及びδ鎖）を含むヘテロ二量体である。いくつかの実施形態において、標的抗原（例えば、がん抗原）に対するＴＣＲが特定され、細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ＴＣＲをコードする核酸は、公的に入手可能なＴＣＲ  ＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などによって、さまざまな供給源から得ることができる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、生物学的供給源から、例えば、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｔ細胞ハイブリドーマなどの細胞から、又は他の公的に入手可能な供給源から得られる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで単離された細胞から得ることができる。いくつかの実施形態において、高親和性Ｔ細胞クローンは、患者から単離することができ、ＴＣＲが単離される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、培養されたＴ細胞ハイブリドーマ又はクローンであり得る。いくつかの実施形態において、標的抗原に対するＴＣＲクローンは、ヒト免疫系遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原系、すなわちＨＬＡ）で操作されたトランスジェニックマウスにおいて生成されている。例えば、腫瘍抗原を参照されたい（例えば、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００９及びＣｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５を参照されたい）。いくつかの実施形態において、ファージディスプレイは、標的抗原に対するＴＣＲを単離するために使用される（例えば、Ｖａｒｅｌａ−Ｒｏｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８及び  Ｌｉ，２００５を参照されたい）。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ又はその抗原結合部分は、ＴＣＲの配列の知識から合成的に作製することができる。
【０１０３】
（Ｂ．抗原提示細胞）
マクロファージ、Ｂリンパ球、樹状細胞を含む抗原提示細胞は、特定のＭＨＣ分子の発現によって区別される。ＡＰＣは抗原を内在化し、ＭＨＣ分子と一緒にその抗原の一部を細胞膜外側に再発現させる。ＭＨＣは、複数の遺伝子座を有する大きな遺伝子複合体である。ＭＨＣ遺伝子座は、クラスＩ及びクラスＩＩ  ＭＨＣと呼ばれる２つの主要なクラスのＭＨＣ膜分子をコードする。Ｔヘルパーリンパ球は一般にＭＨＣクラスＩＩ分子に関連する抗原を認識し、Ｔ細胞傷害性リンパ球はＭＨＣクラスＩ分子に関連する抗原を認識する。ヒトではＭＨＣはＨＬＡ複合体と呼ばれ、マウスではＨ−２複合体と呼ばれる。
【０１０４】
場合によっては、ａＡＰＣは、この実施形態の治療用組成物及び細胞治療用生成物を調製するのに有用である。抗原提示システムの調製及び使用に関する一般的なガイダンスについては、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、第６，３５５，４７９号、第６，３６２，００１号及び第６，７９０，６６２号明細書；米国特許出願公開第２００９／００１７０００号及び第２００９／０００４１４２号明細書；ならびに国際公開第２００７／１０３００９号パンフレットを参照されたい。
【０１０５】
ａＡＰＣシステムは、少なくとも１つの外因性補助分子を含み得る。任意の適切な数及び組み合わせの補助分子を使用することができる。補助分子は、共刺激分子及び接着分子などの補助分子から選択することができる。例示的な共刺激分子には、ＣＤ８６、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、４１ＢＢリガンド及びＩＬ−２１が含まれる。接着分子としては、セレクチンなどの炭水化物結合糖タンパク質、インテグリンなどの膜貫通結合糖タンパク質、カドヘリンなどのカルシウム依存性タンパク質、及び細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）などのシングルパス膜貫通免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリータンパク質を挙げることができ、これらは例えば、細胞間又は細胞とマトリックスとの接触を促進する。例示的な接着分子には、ＬＦＡ−３及びＩＣＡＭ−１などのＩＣＡＭが含まれる。共刺激分子及び接着分子を含む例示的な補助分子の選択、クローニング、調製、及び発現に有用な技術、方法、及び試薬は、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、第６，３５５，４７９号、及び第６，３６２，００１号明細書に例示されている。
【０１０６】
（Ｃ．抗原）
遺伝子操作された抗原受容体によって標的とされる抗原の中には、養子細胞療法によって標的とされる疾患、状態、又は細胞型に関連して発現されるものある。疾患及び状態の中には、増殖性、腫瘍性及び悪性の疾患及び障害があり、これには、リンパ腫、白血病及び／又は骨髄腫、例えば、Ｂ細胞性、Ｔ細胞性及び骨髄性の白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫などの血液がん、免疫系のがんを含むがん及び腫瘍が含まれる。いくつかの実施形態において、抗原は、正常又は非標的の細胞もしくは組織と比較して、疾患又は病態の細胞、例えば、腫瘍細胞又は病原性細胞上で選択的に発現又は過剰発現される。他の実施形態において、抗原は、正常細胞上で発現されるか、及び／又は操作された細胞上で発現される。
【０１０７】
任意の適切な抗原が本発明の方法で使用できることを見出した。例示的な抗原には、限定するものではないが、感染性病原体、自己／自己抗原、腫瘍／がん関連抗原、及び腫瘍新生抗原由来の抗原分子が含まれる（Ｌｉｎｎｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。特定の態様において、抗原には、ＮＹ−ＥＳＯ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｍｕｃ−１、Ｈｅｒ２、ＣＡ−１２５、ＷＴ−１、Ｍａｇｅ−Ａ３、Ｍａｇｅ−Ａ４、Ｍａｇｅ−Ａ１０、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４、及びＣＥＡが含まれる。特定の態様において、２又はそれ以上の抗原受容体に対する抗原には、限定するものではないが、ＣＤ１９、ＥＢＮＡ、ＷＴ１、ＣＤ１２３、ＮＹ−ＥＳＯ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＵＣ１、ＨＥＲ２、ＣＡ−１２５、ＷＴ１、Ｍａｇｅ−Ａ３、Ｍａｇｅ−Ａ４、Ｍａｇｅ−Ａ１０、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４及び／又はＣＥＡが含まれる。これらの抗原の配列は当技術分野では公知であり、例えば、ＣＤ１９（アクセッション番号ＮＧ＿００７２７５．１）、ＥＢＮＡ（アクセッション番号ＮＧ＿００２３９２．２）、ＷＴ１（アクセッション番号ＮＧ＿００９２７２．１）、ＣＤ１２３（アクセッション番号ＮＣ＿００００２３．１１）、ＮＹ−ＥＳＯ（アクセッション番号ＮＣ＿００００２３．１１）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（アクセッション番号ＮＧ＿００７７２６．３）、ＭＵＣ１（アクセッション番号ＮＧ＿０２９３８３．１）、ＨＥＲ２（アクセッション番号ＮＧ＿００７５０３．１）、ＣＡ−１２５（アクセッション番号ＮＧ＿０５５２５７．１）、ＷＴ１（アクセッション番号ＮＧ＿００９２７２．１）、Ｍａｇｅ−Ａ３（アクセッション番号ＮＧ＿０１３２４４．１）、Ｍａｇｅ−Ａ４（アクセッション番号ＮＧ＿０１３２４５．１）、Ｍａｇｅ−Ａ１０（アクセッション番号ＮＣ＿００００２３．１１）、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４（アクセッション番号ＮＣ＿０００００３．１２）及び／又はＣＥＡ（アクセッション番号ＮＣ＿００００１９．１０）である。
【０１０８】
腫瘍関連抗原は、前立腺、乳房、結腸直腸、肺、膵臓、腎臓、中皮腫、卵巣又はメラノーマのがんに由来し得る。例示的な腫瘍関連抗原又は腫瘍細胞由来抗原には、ＭＡＧＥ１、３及びＭＡＧＥ４（又は国際特許公開第ＷＯ９９／４０１８８号パンフレットに開示されているものなどの他のＭＡＧＥ抗原）；ＰＲＡＭＥ；ＢＡＧＥ；ＲＡＧＥ、Ｌａｇｅ（ＮＹ  ＥＳＯ  １とも呼ばれる）；ＳＡＧＥ；及びＨＡＧＥ又はＧＡＧＥが含まれる。腫瘍抗原のこれらの非限定的な例は、メラノーマ、肺がん、肉腫、及び膀胱がんなどの広範囲の腫瘍型で発現される。例えば、米国特許第６，５４４，５１８号明細書を参照されたい。前立腺がん腫瘍関連抗原には、例えば、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性リン酸塩、ＮＫＸ３．１、及び前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）が含まれる。
【０１０９】
他の腫瘍関連抗原としては、Ｐｌｕ−１、ＨＡＳＨ−１、ＨａｓＨ−２、Ｃｒｉｐｔｏ及びＣｒｉｐｔｉｎが挙げられる。さらに、腫瘍抗原は、多くのがんの治療に有用な、全長ゴナドトロピンホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、短い１０アミノ酸長のペプチドなどの自己ペプチドホルモンであり得る。
【０１１０】
腫瘍抗原には、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ発現などの腫瘍関連抗原の発現を特徴とするがんに由来する腫瘍抗原が含まれる。対象となる腫瘍関連抗原には、メラノサイト−メラノーマ系統抗原ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼ及びチロシナーゼ関連タンパク質などの系統特異的腫瘍抗原が含まれる。例示的な腫瘍関連抗原には、限定するものではないが、ｐ５３、Ｒａｓ、ｃ−Ｍｙｃ、細胞質セリン／スレオニンキナーゼ（例えば、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ及びＣ−Ｒａｆ、サイクリン依存性キナーゼ）、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＲＴ−１、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、−１０、ＧＡＧＥ−１、−２、−８、ＧＡＧＥ−３、−４、−５、−６、−７Ｂ、ＮＡ８８−Ａ、ＭＡＲＴ−１、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ−Ｂ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＴＲＫ受容体、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）、ＡＦＰ、−カテニン／ｍ、カスパーゼ−８／ｍ、ＣＥＡ、ＣＤＫ−４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン／ｍ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、７０７−ＡＰ、アネキシンＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ−ａｂｌ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、インターフェロン調節因子４（ＩＲＦ４）、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲ、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１（ＴＡＣＳＴＤ１）ＴＡＣＳＴＤ２、受容体チロシンキナーゼ（例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（特に、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ））、細胞質チロシンキナーゼ（例えば、ｓｒｃファミリー、ｓｙｋ−ＺＡＰ７０ファミリー）、インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）、シグナル伝達兼転写活性化因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴＳ及びＳＴＡＴＥ、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１及びＨＩＦ−２など）、核内因子−カッパＢ（ＮＦ−Ｂ）、Ｎｏｔｃｈ受容体（例えば、Ｎｏｔｃｈ１〜４）、ｃ−Ｍｅｔ、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、ＷＮＴ、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）及びそれらの調節サブユニット、ＰＭＳＡ、ＰＲ−３、ＭＤＭ２、メソテリン、腎細胞がん−５Ｔ４、ＳＭ２２−アルファ、炭酸脱水素酵素Ｉ（ＣＡＩ）及びＩＸ（ＣＡＩＸ）（Ｇ２５０としても知られる）、ＳＴＥＡＤ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＧＤ２、プロテイナーゼ３、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点（ｓａｒｃｏｍａ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ）、ＥｐｈＡ２、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリアン、ＰＳＣＡ、ｓＬｅ、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧＬｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧｓＳ、ＳＡＲＴ  ３、ＳＴｎ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ  １、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、ＴＩＥ２、Ｐａｇｅ４、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＭＡＤ−ＣＴ−２、ｆｏｓ関連抗原１、ＣＢＸ２、ＣＬＤＮ６、ＳＰＡＮＸ、ＴＰＴＥ、ＡＣＴＬ８、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＳＵＮＣ１、ＬＲＲＮ１及びイディオタイプのいずれか１又は複数に由来するか又はこれを含む腫瘍抗原が含まれる。
【０１１１】
抗原は、テロメラーゼ酵素、サバイビン、メソテリン、変異ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂｌ再配列、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、変異型又は野生型ｐ５３、シトクロムＰ４５０  １Ｂ１などの腫瘍細胞で変異した遺伝子、又は正常細胞と比較して腫瘍細胞で異なるレベルで転写された遺伝子に由来するエピトープ領域又はエピトープペプチド、及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖなどの異常に発現したイントロン配列；骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫で特有のイディオタイプを生成する免疫グロブリン遺伝子のクローン再配列；ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６及びＥ７などの腫瘍ウイルスプロセスに由来するエピトープ領域又はエピトープペプチドを含む腫瘍抗原；エプスタインバーウイルスタンパク質ＬＭＰ２；がん胎児性抗原及びα−フェトプロテインなどの腫瘍選択的発現を示す非変異がん胎児性タンパク質を含むこともできる。
【０１１２】
他の実施形態において、抗原は、病原性微生物、又は日和見病原性微生物（本明細書では感染症微生物とも呼ばれる）、例えば、ウイルス、真菌、寄生虫及び細菌から得られるか、又はそれに由来する。特定の実施形態において、そのような微生物に由来する抗原は、完全長タンパク質を含む。
【０１１３】
本明細書に記載の方法での使用が企図される抗原を有する例示的な病原性生物には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザＡ、Ｂ及びＣ、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ポリオーマウイルス（例えば、ＢＫウイルス及びＪＣウイルス）、アデノウイルス、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）を含むスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、及び肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を含むストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種が含まれる。当業者によって理解されるように、本明細書に記載の抗原として使用するためのこれら及び他の病原性微生物に由来するタンパク質、及び該タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、出版物及びＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（登録商標）及びＴＲＥＭＢＬ（登録商標）などの公開データベースで同定することができる。
【０１１４】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来する抗原には、ＨＩＶビリオン構造タンパク質（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｐ１７、ｐ２４）、プロテアーゼ、逆転写酵素、又はｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ及びｖｐｕによってコードされるＨＩＶタンパク質のいずれかが含まれる。
【０１１５】
単純ヘルペスウイルスに由来する抗原（例えば、ＨＳＶ  １及びＨＳＶ２）には、限定するものではないが、ＨＳＶ後期遺伝子から発現されるタンパク質が含まれる。後期の遺伝子グループは、主にビリオン粒子を形成するタンパク質をコードする。そのようなタンパク質には、ウイルスキャプシドが形成される５つのタンパク質（ＵＬ）：ＵＬ６、ＵＬ１８、ＵＬ３５、ＵＬ３８及び主要なキャプシドタンパク質ＵＬ１９、ＵＬ４５、及びＵＬ２７が含まれ、これらはそれぞれ、本明細書に記載の抗原として使用することができる。本明細書において抗原として使用することが企図されている他の例示的なＨＳＶタンパク質には、ＩＣＰ２７（Ｈ１、Ｈ２）、糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）及び糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タンパク質が含まれる。ＨＳＶゲノムは、少なくとも７４の遺伝子を含み、それぞれが抗原として使用し得るタンパク質をコードする。
【０１１６】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する抗原には、ＣＭＶ構造タンパク質、ウイルス複製の最初期及び初期段階で発現するウイルス抗原、糖タンパク質Ｉ及びＩＩＩ、キャプシドタンパク質、コートタンパク質、下部マトリックスタンパク質（ｌｏｗｅｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ｐｐ６５（ｐｐＵＬ８３）、ｐ５２（ｐｐＵＬ４４）、ＩＥ１及び１Ｅ２（ＵＬ１２３及びＵＬ１２２）、ＵＬ１２８−ＵＬ１５０の遺伝子クラスターからのタンパク質産物（Ｒｙｋｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００６）、エンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、ｇＨ、ｇＮ及びｐｐ１５０が含まれる。当業者によって理解されるように、本明細書に記載の抗原として使用するためのＣＭＶタンパク質は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（登録商標）、及びＴＲＥＭＢＬ（登録商標）などの公開データベースで同定することができる（例えば、Ｂｅｎｎｅｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｌｏｅｗｅｎｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｍａｒｓｃｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９を参照されたい）。
【０１１７】
特定の実施形態での使用が企図されるエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）に由来する抗原には、ＥＢＶ溶解タンパク質ｇｐ３５０及びｇｐ１１０、エプスタインバー核抗原（ＥＢＮＡ）−１、ＥＢＮＡ−２、ＥＢＮＡ−３Ａ、ＥＢＮＡ−３Ｂ、ＥＢＮＡ−３Ｃ、ＥＢＮＡリーダータンパク質（ＥＢＮＡ−ＬＰ）及び潜伏膜タンパク質（ＬＭＰ）−１、ＬＭＰ−２Ａ及びＬＭＰ−２Ｂを含む潜伏サイクル感染中に産生されるＥＢＶタンパク質が含まれる（例えば、Ｌｏｃｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８を参照されたい）。
【０１１８】
本明細書での使用が企図される呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に由来する抗原には、ＲＳＶゲノムによってコードされる１１のタンパク質：ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ（ヌクレオキャプシドタンパク質）、Ｍ（マトリックスタンパク質）ＳＨ、Ｇ及びＦ（ウイルスコートタンパク質）、Ｍ２（第２のマトリックスタンパク質）、Ｍ２−１（伸長因子）、Ｍ２−２（転写調節）、ＲＮＡポリメラーゼ、及びリン酸化タンパク質Ｐのいずれか、又はその抗原性フラグメントが含まれる。
【０１１９】
使用が企図される水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に由来する抗原には、ＶＳＶゲノムによってコードされる５つの主要なタンパク質：巨大タンパク質（Ｌ）、糖タンパク質（Ｇ）、核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、及びマトリックスタンパク質（Ｍ）のいずれか１つ、及びその抗原性フラグメントが含まれる（例えば、Ｒｉｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９を参照されたい）。
【０１２０】
特定の実施形態での使用が企図されるインフルエンザウイルス由来の抗原には、血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質Ｍ１及びＭ２、ＮＳ１、ＮＳ２（ＮＥＰ）、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ１−Ｆ２及びＰＢ２が含まれる。
【０１２１】
例示的なウイルス抗原には、限定するものではないが、アデノウイルスポリペプチド、アルファウイルスポリペプチド、カリシウイルスポリペプチド（例えば、カリシウイルスキャプシド抗原）、コロナウイルスポリペプチド、ジステンパーウイルスポリペプチド、エボラウイルスポリペプチド、エンテロウイルスポリペプチド、フラビウイルスポリペプチド、肝炎ウイルス（ＡＥ）ポリペプチド（Ｂ型肝炎のコア又は表面抗原、Ｃ型肝炎ウイルスＥ１又はＥ２糖タンパク質、コア、又は非構造タンパク質）、ヘルペスウイルスポリペプチド（単純ヘルペスウイルス又は水疱帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質を含む）、感染性腹膜炎ウイルスポリペプチド、白血病ウイルスポリペプチド、マールブルグウイルスポリペプチド、オルソミクソウイルスポリペプチド、パピローマウイルスポリペプチド、パラインフルエンザウイルスポリペプチド（例えば、血球凝集素及びノイラミニダーゼポリペプチド）、パラミクソウイルスポリペプチド、パルボウイルスポリペプチド、ペスチウイルスポリペプチド、ピコルナウイルスポリペプチド（例えば、ポリオウイルスキャプシドポリペプチド）、ポックスウイルスポリペプチド（例えば、ワクチニアウイルスポリペプチド）、狂犬病ウイルスポリペプチド（例えば、狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ）、レオウイルスポリペプチド、レトロウイルスポリペプチド、及びロタウイルスポリペプチドが含まれる。
【０１２２】
特定の実施形態において、抗原は、細菌性抗原であり得る。特定の実施形態において、目的の細菌性抗原は、分泌されたポリペプチドであり得る。他の特定の実施形態において、細菌性抗原には、細菌の外側細胞表面に露出されたポリペプチドの１又は複数の部分を有する抗原が含まれる。
【０１２３】
使用が企図されているメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含むスタフィロコッカス種に由来する抗原には、病原性調節因子、例えば、Ａｇｒシステム、Ｓａｒ及びＳａｅ、Ａｒｌシステム、Ｓａｒホモログ（Ｒｏｔ、ＭｇｒＡ、ＳａｒＳ、ＳａｒＲ、ＳａｒＴ、ＳａｒＵ、ＳａｒＶ、ＳａｒＸ、ＳａｒＺ及びＴｃａＲ）、ＳｒｒシステムならびにＴＲＡＰが含まれる。抗原として機能する可能性のある他のスタフィロコッカスタンパク質には、Ｃｌｐタンパク質、ＨｔｒＡ、ＭｓｒＲ、アコニターゼ、ＣｃｐＡ、ＳｖｒＡ、Ｍｓａ、ＣｆｖＡ及びＣｆｖＢが含まれる（例えば、Staphylococcus:Molecular Genetics,2008 Caister Academic Press,Ed.Jodi Lindsayを参照されたい）。黄色ブドウ球菌の２つの種（Ｎ３１５及びＭｕ５０）のゲノムはシーケンシングされており、例えばＰＡＴＲＩＣ（PATRIC:The VBI PathoSystems Resource Integration Center,Snyder et al.,2007）で公開されている。当業者によって理解されるように、抗原として使用するためのブドウ球菌タンパク質はまた、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（登録商標）、及びＴｒＥＭＢＬ（登録商標）などの他の公開データベースにおいて同定することができる。
【０１２４】
本明細書に記載の特定の実施形態において使用が企図される肺炎連鎖球菌由来の抗原には、ニューモリシン、ＰｓｐＡ、コリン結合プロテインＡ（ＣｂｐＡ）、ＮａｎＡ、ＮａｎＢ、ＳｐｎＨＬ、ＰａｖＡ、ＬｙｔＡ、Ｐｈｔ、及びピリンタンパク質（ＲｒｇＡ；ＲｒｇＢ；ＲｒｇＣ）が含まれる。肺炎連鎖球菌の抗原性タンパク質も当技術分野において公知であり、いくつかの実施形態において抗原として使用することができる（例えば、Ｚｙｓｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０００を参照されたい）。肺炎連鎖球菌の毒性株の完全なゲノム配列がシーケンシングされており、このことは当業者には理解されており、本明細書で使用するための肺炎連鎖球菌タンパク質もまた、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（登録商標）、及びＴｒＥＭＢＬ（登録商標）などの他の公開データベースにおいて同定することができる。本開示による抗原にとって特に興味深いタンパク質には、病原性因子、及び肺炎球菌の表面に曝露されると予測されるタンパク質が含まれる（例えば、Ｆｒｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０を参照されたい）。
【０１２５】
抗原として使用できる細菌性抗原の例には、限定するものではないが、アクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）ポリペプチド、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ポリペプチド、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）ポリペプチド、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）ポリペプチド、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）ポリペプチド、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）ポリペプチド（例えば、ライム病ボレリア（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ＯｓｐＡ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）ポリペプチド、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）ポリペプチド、キャプノサイトファーガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）ポリペプチド、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）ポリペプチド、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ポリペプチド、コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）ポリペプチド、デルマトフィルス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ）ポリペプチド、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）ポリペプチド、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）ポリペプチド、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ポリペプチド、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）ポリペプチド、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ポリペプチド、ヘモバルトネラ（Ｈａｅｍｏｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）ポリペプチド、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリペプチド、（例えば、Ｈ．インフルエンザｂ型外膜タンパク質）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）ポリペプチド、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）ポリペプチド、Ｌ型菌（Ｌ−ｆｏｒｍ  ｂａｃｔｅｒｉａ）ポリペプチド、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）ポリペプチド、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）ポリペプチド、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）ポリペプチド、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）ポリペプチド、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ポリペプチド、ネオリケッチア（Ｎｅｏｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）ポリペプチド、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）ポリペプチド、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）ポリペプチド、ペプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）ポリペプチド、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）ポリペプチド、肺炎双球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）ポリペプチド、（すなわち肺炎連鎖球菌ポリペプチド）（本明細書の記載を参照されたい）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）ポリペプチド、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ポリペプチド、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）ポリペプチド、ロシャリメア（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）ポリペプチド、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ポリペプチド、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ポリペプチド、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ポリペプチド、Ａ群連鎖球菌ポリペプチド、（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｍプロテイン）、Ｂ群連鎖球菌（Ｓ．アガラクチア（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ））ポリペプチド、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）ポリペプチド及びエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）ポリペプチド、（例えば、エルシニア・ペスティス（Ｙ  ｐｅｓｔｉｓ）Ｆ１  及びＶ抗原）が含まれる。
【０１２６】
真菌抗原の例には、限定するものではないが、アブシディア（Ａｂｓｉｄｉａ）ポリペプチド、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）ポリペプチド、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）ポリペプチド、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ポリペプチド、バシジオボラス（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）ポリペプチド、ビポラリス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）ポリペプチド、ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）ポリペプチド、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）ポリペプチド、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）ポリペプチド、コニディオボラス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）ポリペプチド、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）ポリペプチド、クルブラリア（Ｃｕｒｖａｌａｒｉａ）ポリペプチド、エピデルモフィトン（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）ポリペプチド、エクソフィアラ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）ポリペプチド、ゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）ポリペプチド、ヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）ポリペプチド、マヅレラ（Ｍａｄｕｒｅｌｌａ）ポリペプチド、マラセチア（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）ポリペプチド、ミクロスポルム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）ポリペプチド、モニリエラ（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ）ポリペプチド、モルチエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）ポリペプチド、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）ポリペプチド、ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）ポリペプチド、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）ポリペプチド、フィアレモニウム（Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｕｍ）ポリペプチド、フィアロフォア（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ）ポリペプチド、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）ポリペプチド、シュードアレシェリア（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ）ポリペプチド、シュードミクロドキウム（Ｐｓｅｕｄｏｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ）ポリペプチド、ピシウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）ポリペプチド、リノスポリジウム（Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）ポリペプチド、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）ポリペプチド、スコレコバシジウム（Ｓｃｏｌｅｃｏｂａｓｉｄｉｕｍ）ポリペプチド、スポロトリクス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）ポリペプチド、ステムフィリウム（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ）ポリペプチド、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）ポリペプチド、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）ポリペプチド及びキシロハイファ（Ｘｙｌｏｈｙｐｈａ）ポリペプチドが含まれる。
【０１２７】
寄生原虫抗原の例には、限定するものではないが、バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）ポリペプチド、バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ）ポリペプチド、ベスノイチア（Ｂｅｓｎｏｉｔｉａ）ポリペプチド、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）ポリペプチド、エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）ポリペプチド、エンセファリトゾーン（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ）ポリペプチド、エントアメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）ポリペプチド、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）ポリペプチド、ハモンディア（Ｈａｍｍｏｎｄｉａ）ポリペプチド、ヘパトゾーン（Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ）ポリペプチド、イソスポーラ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）ポリペプチド、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）ポリペプチド、ミクロスポリジア（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）ポリペプチド、ネオスポラ（Ｎｅｏｓｐｏｒａ）ポリペプチド、ノゼマ（Ｎｏｓｅｍａ）ポリペプチド、ペンタトリコモナス（Ｐｅｎｔａｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）ポリペプチド、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）ポリペプチドが含まれる。蠕虫寄生虫抗原の例には、アカントケイロネマ（Ａｃａｎｔｈｏｃｈｅｉｌｏｎｅｍａ）ポリペプチド、エルロストロンギルス（Ａｅｌｕｒｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）ポリペプチド、アンシロストーマ（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ）ポリペプチド、アンギオストロンギルス（Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）ポリペプチド、アスカリス（Ａｓｃａｒｉｓ）ポリペプチド、ブルギア（Ｂｒｕｇｉａ）ポリペプチド、ブノストムム（Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕｍ）ポリペプチド、キャピラリア（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ）ポリペプチド、チャベリタ（Ｃｈａｂｅｒｔｉａ）ポリペプチド、クーペリア（Ｃｏｏｐｅｒｉａ）ポリペプチド、クレノソーマ（Ｃｒｅｎｏｓｏｍａ）ポリペプチド、ディクチオカウルス（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ）ポリペプチド、ジオクトフィーマ（Ｄｉｏｃｔｏｐｈｙｍｅ）ポリペプチド、ディペタロネマ（Ｄｉｐｅｔａｌｏｎｅｍａ）ポリペプチド、ジフィロボスリウム（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ）ポリペプチド、ディピリジウム（Ｄｉｐｌｙｄｉｕｍ）ポリペプチド、ディロフィラリア（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ）ポリペプチド、ドラクンクルス（Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ）ポリペプチド、エンテロビウス（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ）ポリペプチド、フィラロイデス（Ｆｉｌａｒｏｉｄｅｓ）ポリペプチド、へモンクス（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）ポリペプチド、ラゴキルアスカリス（Ｌａｇｏｃｈｉｌａｓｃａｒｉｓ）ポリペプチド、ロア糸状虫（Ｌｏａ）ポリペプチド、マンソネラ（Ｍａｎｓｏｎｅｌｌａ）ポリペプチド、ムエレリウス（Ｍｕｅｌｌｅｒｉｕｓ）ポリペプチド、ナノフィエトゥス（Ｎａｎｏｐｈｙｅｔｕｓ）ポリペプチド、ネカトール（Ｎｅｃａｔｏｒ）ポリペプチド、ネマトジルス（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ）ポリペプチド、エソファゴストム（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ）ポリペプチド、オンコセルカ（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ）ポリペプチド、オピストルキス（Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ）ポリペプチド、オステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）ポリペプチド、パラフィラリア（Ｐａｒａｆｉｌａｒｉａ）ポリペプチド、パラゴニムス（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）ポリペプチド、パラスカリス（Ｐａｒａｓｃａｒｉｓ）ポリペプチド、フィサロプテラ（Ｐｈｙｓａｌｏｐｔｅｒａ）ポリペプチド、プロトストロンギルス（Ｐｒｏｔｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）ポリペプチド、セタリア（Ｓｅｔａｒｉａ）ポリペプチド、スピロセルカ（Ｓｐｉｒｏｃｅｒｃａ）ポリペプチド、スピロメトラ（Ｓｐｉｒｏｍｅｔｒａ）ポリペプチド、ステファノフィラリア（Ｓｔｅｐｈａｎｏｆｉｌａｒｉａ）ポリペプチド、ストロンギロイデス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ）ポリペプチド、ストロンギルス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）ポリペプチド、テラジア（Ｔｈｅｌａｚｉａ）ポリペプチド、トキサスカリス（Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ）ポリペプチド、トキソカラ（Ｔｏｘｏｃａｒａ）ポリペプチド、トリキネラ（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ）ポリペプチド、トリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）ポリペプチド、トリチュリス（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）ポリペプチド、ウンシナリア（Ｕｎｃｉｎａｒｉａ）ポリペプチド及びウケレリア（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ）ポリペプチド（例えば、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）（ＰｆＣＳＰ））、スポロゾイト表面タンパク質２（ＰｆＳＳＰ２）、肝臓病抗原１のカルボキシ末端（ＰｆＬＳＡ１  ｃ−ｔｅｒｍ）及び輸出タンパク質（ｅｘｐｏｒｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）１（ＰｆＥｘｐ−１）、ニューモシスティス（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）ポリペプチド、サルコシスティス（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ）ポリペプチド、シストソーマ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）ポリペプチド、タイレリア（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）ポリペプチド、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）ポリペプチド、及びトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）ポリペプチドが含まれる。
【０１２８】
外部寄生虫抗原の例には、限定するものではないが、ノミ；カタダニ及びヒメダニを含むダニ；ユスリカ、蚊、スナバエ、ブヨ、ウシアブ、ツノサシバエ、メクラアブ、ツェツェバエ、サシバエ、ハエウジ病の原因のハエ及び噛みつくハエ類などのハエ；アリ；クモ；シラミ；ダニ；ならびにトコジラミ及びオオサシガメなどのナンキンムシ由来のポリペプチド（抗原及びアレルゲンを含む）が含まれる。
【０１２９】
（Ｄ．自殺遺伝子）
本開示の免疫細胞のＣＡＲは、１又は複数の自殺遺伝子を含み得る。本明細書で使用される「自殺遺伝子」という用語は、プロドラッグの投与時に、その宿主細胞を殺す化合物への遺伝子産物の転移をもたらす遺伝子として定義される。使用できる自殺遺伝子／プロドラッグの組み合わせの例は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）及びガンシクロビル、アシクロビル又はＦＩＡＵ；オキシドレダクターゼ及びシクロヘキシミド；シトシンデアミナーゼ及び５−フルオロシトシン；チミジンキナーゼチミジン酸キナーゼ（Ｔｄｋ：：Ｔｍｋ）及びＡＺＴ；ならびにデオキシシチジンキナーゼ及びシトシンアラビノシドである。
【０１３０】
大腸菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼは、プロドラッグである６−メチルプリンデオキシリボシドを毒性プリン６−メチルプリンに変換するいわゆる自殺遺伝子である。プロドラッグ療法で使用される自殺遺伝子の他の例は、大腸菌シトシンデアミナーゼ遺伝子及びＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子である。
【０１３１】
例示的な自殺遺伝子には、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＥＧＦＲｖ３又は誘導性カスパーゼ９が含まれる。一実施形態において、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩの切断型（ＥＧＦＲｖ３）を、セツキシマブによって除去可能な自殺抗原として使用することができる。本開示で使用され得る当技術分野で公知のさらなる自殺遺伝子には、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、シトクロムｐ４５０酵素（ＣＹＰ）、カルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）、カルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、グアニンリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＲＴＰ）、グリコシダーゼ酵素、メチオニン−α、γ−リアーゼ（ＭＥＴ）、及びチミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）が含まれる。
【０１３２】
（Ｅ．送達方法）
当業者は、本開示の抗原受容体を発現させる標準的な組換え技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６を参照されたい。当該文献は双方とも参照により本明細書に両方とも組み込まれる）によってベクターを構築することを熟知していると思われる。ベクターには、限定するものではないが、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス及び植物ウイルス）、人工染色体（例えば、ＹＡＣ）、レトロウイルスベクター（例えば、モロニーネズミ白血病ウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ、ＳＮＶなどに由来）、レンチウイルスベクター（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶなどに由来）、複製可能、複製欠損及びガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）型を含むアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ−４０）ベクター、ウシ乳頭腫ウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、ネズミ乳腺腫瘍ウイルスベクター、ルース肉腫ウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルスベクター、マラバウイルスベクター及びＢ群アデノウイルスエナデノツシレフ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）ベクターが含まれる。
【０１３３】
（ａ．ウイルスベクター）
抗原受容体をコードするウイルスベクターを、本開示の特定の態様において提供することができる。組換えウイルスベクターの作製において、非必須遺伝子は、典型的には、異種（又は非天然）タンパク質の遺伝子又はコード配列で置き換えられる。ウイルスベクターは、ウイルス配列を利用して細胞に核酸やタンパク質を導入する一種の発現構築体である。特定のウイルスは、受容体媒介エンドサイトーシスにより細胞に感染したり、又は細胞に侵入し、宿主細胞のゲノムに組み込まれてウイルス遺伝子を安定的かつ効率的に発現したりするその能力により、外来核酸を細胞（哺乳類細胞など）に移入させる魅力的な候補となっている。本発明の特定の態様の核酸を送達するために使用され得るウイルスベクターの非限定的な例を、以下に記載する。
【０１３４】
レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖに加えて、調節又は構造機能を持つ他の遺伝子が含まれている。レンチウイルスベクターは当技術分野で周知である（例えば、米国特許第６，０１３，５１６号明細書及び第５，９９４，１３６号明細書を参照されたい）。
【０１３５】
組換えレンチウイルスベクターは非分裂細胞に感染することができ、ｉｎ  ｖｉｖｏとｅｘ  ｖｉｖｏとの両方の遺伝子移入及び核酸配列の発現に使用することができる。例えば、非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルス−適切な宿主細胞が、パッケージング機能、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖと、ｒｅｖ及びｔａｔとを運ぶ２つ以上のベクターをトランスフェクトされる−は、米国特許第５，９９４，１３６号明細書に記載されており、当該特許は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３６】
（ｂ．調節要素）
本開示において有用なベクターに含まれる発現カセットは、特に（５′から３′方向に）タンパク質コード配列に作動可能に連結された真核生物転写プロモーター、介在配列を含むスプライスシグナル、及び転写終結／ポリアデニル化配列を含む。真核細胞におけるタンパク質コード遺伝子の転写を制御するプロモーター及びエンハンサーは、複数の遺伝的要素で構成されている。細胞機構は、各要素によって伝達される調節情報を収集して統合することができ、異なる遺伝子が転写調節の異なる、しばしば複雑なパターンの進化を可能にする。本開示の文脈で使用されるプロモーターには、構成的、誘導性、及び組織特異的プロモーターが含まれる。
【０１３７】
（ｉ）プロモーター／エンハンサー
本明細書で提供される発現構築体は、抗原受容体の発現を駆動するためのプロモーターを含む。プロモーターは一般に、ＲＮＡ合成の開始部位を配置するように機能する配列を含む。この最もよく知られている例はＴＡＴＡボックスであるが、例えば、哺乳類のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターやＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなど、ＴＡＴＡボックスのない一部のプロモーターでは、開始部位に重なる個別の要素自体が開始の場所を修正するのを助ける。追加のプロモーター要素が転写開始の頻度を調節する。多くのプロモーターが開始部位の下流にも機能要素を含んでいることが示されているが、典型的には、これらは開始部位の３０１１０  ｂｐ上流の領域に配置されている。コード配列をプロモーターの「制御下」に持ってくるため、選択されたプロモーターの転写リーディングフレームの「下流」（すなわち、その３′）の転写開始部位の５′末端にコード配列を配置する。「上流」のプロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促進する。
【０１３８】
プロモーター要素間の間隔は柔軟であり、そのため、要素が互いに反転したり移動したりしても、プロモーター機能は保存される。ｔｋプロモーターでは、活性が低下し始める前に、プロモーター要素間の間隔を５０ｂｐ離れるように増やすことができる。プロモーターに応じて、個々の要素が協調的に又は独立して機能して転写を活性化することができると思われる。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列を指す「エンハンサー」と組み合わせて使用してもよく、又はしなくてもよい。
【０１３９】
プロモーターは、コーディングセグメント及び／又はエクソンの上流に位置する５′非コード配列を単離することによって得られるように、核酸配列に自然に結び付けられるものであり得る。このようなプロモーターは、「内因性」と呼ぶことができる。同様に、エンハンサーは、その配列の下流又は上流のいずれかに位置する、核酸配列と天然で結び付いているものであり得る。又は、コード核酸セグメントを、その自然環境において、ある核酸配列と通常結合しないプロモーターである組換え又は異種プロモーターの制御下に配置することによって、特定の利点が得られる。組換え又は異種エンハンサーはまた、その自然界において核酸配列と通常結び付けられないエンハンサーを指す。そのようなプロモーター又はエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、及び任意の他のウイルス又は原核細胞もしくは真核細胞から単離されたプロモーター又はエンハンサー、及び「天然に存在しない」、すなわち異なる転写調節領域の異なる要素、及び／又は発現を変化させる突然変異を含むプロモーター又はエンハンサーを含んでよい。例えば、組換えＤＮＡの構築で最も一般的に使用されるプロモーターとしては、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース、及びトリプトファン（ｔｒｐ−）プロモーターシステムが挙げられる。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に作製することに加えて、配列は、本明細書に開示される組成物に関連して、組換えクローニング及び／又はＰＣＲ（商標）を含む核酸増幅技術を使用して作製することができる。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などの非核オルガネラ内の配列の転写及び／又は発現を導く制御配列も同様に使用できることが企図される。
【０１４０】
当然のことながら、発現のために選択されたオルガネラ、細胞型、組織、器官、又は生物におけるＤＮＡセグメントの発現を効果的に導くプロモーター及び／又はエンハンサーを使用することが重要であると思われる。分子生物学の当業者には、一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー、及び細胞型の組み合わせの使用は公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９を参照されたい、当該文献は参照により本明細書に組み込まれる）。使用されるプロモーターは、構成的、組織特異的、誘導性であってよく、及び／又は組換えタンパク質及び／又はペプチドの大規模生産に有利であるような、導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を導く適切な条件下で有用であり得る。プロモーターは、異種又は内因性であり得る。
【０１４１】
さらに、プロモーター／エンハンサーの任意の組み合わせ（例えば、ｅｐｄ．ｉｓｂ−ｓｉｂ．ｃｈ／のワールドワイドウェブを介した真核生物プロモーターデータベースＥＰＤＢ）を使用して、発現を駆動することもできる。Ｔ３、Ｔ７又はＳＰ６細胞質発現系の使用は、別の可能な実施形態である。真核細胞は、適切な細菌ポリメラーゼが送達複合体の一部として、又は追加の遺伝子発現構築体として提供されている場合、特定の細菌プロモーターからの細胞質転写を支援することができる。
【０１４２】
プロモーターの非限定的な例には、ＳＶ４０初期又は後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーターなどの初期又は後期ウイルスプロモーター；ベータアクチンプロモーター、ＧＡＤＰＨプロモーター、メタロチオネインプロモーターなどの真核細胞プロモーター；及び最小ＴＡＴＡボックスの近くにある環状ＡＭＰ応答要素プロモーター（ｃｒｅ）、血清応答要素プロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）及び応答要素プロモーター（ｔｒｅ）などの連結された応答要素プロモーターが含まれる。ヒト成長ホルモンプロモーター配列（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋに記載されているヒト成長ホルモン最小プロモーター、アクセッション番号Ｘ０５２４４、ヌクレオチド２８３〜３４１）又はマウス乳腺腫瘍プロモーター（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＡＴＣＣ  ４５００７から入手可能）を使用することも可能である。特定の実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶ  ＩＥ、デクチン−１、デクチン−２、ヒトＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８０、ＳＭ２２、ＲＳＶ、ＳＶ４０、Ａｄ  ＭＬＰ、ベータアクチン、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩプロモーターであるが、治療遺伝子の発現の駆動に有用な任意の他のプロモーターが、本開示の実施に適用可能である。
【０１４３】
特定の態様において、本開示の方法はまた、エンハンサー配列、すなわち、プロモーターの活性を高め、比較的長い距離にわたって（標的プロモーターから最大数キロベース離れて）いても、それらの向きに関係なく、シスで作用する可能性がある核酸配列に関する。しかし、エンハンサー機能は、所与のプロモーターに近接して機能することもあるので、必ずしもそのような長い距離に限定されるわけではない。
【０１４４】
（ｉｉ）開始シグナル及び連結発現
特定の開始シグナルはまた、コード配列の効率的な翻訳のために、本開示において提供される発現構築体において使用することができる。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドン又は隣接する配列が含まれる。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを提供する必要がある場合がある。当業者は、これを容易に決定し、必要なシグナルを提供することができるであろう。開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと「インフレーム」でなければならないことは周知である。外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然であっても、又は合成であってもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素を含めることによって向上させることができる。
【０１４５】
特定の実施形態において、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素の使用は、多重遺伝子、又はポリシストロニックなメッセージを作製するために使用される。ＩＲＥＳ要素は、５’メチル化キャップ依存性翻訳のリボソームスキャンモデルをバイパスし、内部部位で翻訳を開始することができる。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオと脳心筋炎）からのＩＲＥＳ要素、及び哺乳類のメッセージからのＩＲＥＳが記載されている。ＩＲＥＳ要素は、異種オープンリーディングフレームに連結することができる。複数のオープンリーディングフレームを一緒に転写し、それぞれをＩＲＥＳで隔てて、ポリシストロンメッセージを作製することができる。ＩＲＥＳ要素のおかげで、効率的な翻訳のために、各オープンリーディングフレームはリボソームにアクセスすることができる。単一のプロモーター／エンハンサーを使用して複数の遺伝子を効率的に発現させ、単一のメッセージを転写することができる。
【０１４６】
さらに、特定の２Ａ配列要素を使用して、本開示で提供される構築体において遺伝子の連結又は共発現を生み出すことができる。例えば、切断配列を使用して、オープンリーディングフレームを連結して単一のシストロンを形成することにより、遺伝子を共発現させることができる。例示的な切断配列は、Ｆ２Ａ（口蹄疫ウイルス２Ａ）又は「２Ａ様」配列（例えば、ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス２Ａ；Ｔ２Ａ）である。
（ｉｉｉ）複製起点
宿主細胞内でベクターを増殖させるために、ベクターは、１又は複数の複製起点部位（しばしば「ｏｒｉ」と呼ばれる）、例えば、上記のＥＢＶのｏｒｉＰに対応する核酸配列、又は複製が開始される特異的核酸配列である、プログラミングで同様又は高い機能を有するように遺伝子操作されたｏｒｉＰを含み得る。又は、上記のような他の染色体外複製ウイルスの複製起点、又は自律複製配列（ＡＲＳ）を使用することができる。
【０１４７】
（ｃ．選択及びスクリーニング可能なマーカー）
いくつかの実施形態において、本開示の構築体を含む細胞は、発現ベクター中にマーカーを含めることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで同定することができる。そのようなマーカーは、同定可能な変化を細胞に与え、発現ベクターを含む細胞の容易な同定を可能にする。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するマーカーである。ポジティブ選択マーカーは、マーカーの存在により選択が可能なマーカーであり、ネガティブ選択マーカーは、マーカーの存在により選択が妨げられるマーカーである。ポジティブ選択マーカーの例は、薬剤耐性マーカーである。
【０１４８】
通常、薬物選択マーカーを含めると、形質転換体のクローニング及び同定が容易になり、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン及びヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は有用な選択マーカーである。条件の実施に基づいて形質転換体の識別を可能にする表現型を与えるマーカーに加えて、比色分析が基礎であるＧＦＰなどのスクリーニング可能なマーカーを含む他のタイプのマーカーも企図される。又は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのネガティブ選択マーカーとしてスクリーニング可能な酵素を利用してもよい。当業者には、例えばＦＡＣＳ分析と組み合わせて、免疫学的マーカーを使用する方法もまた公知であると思われる。使用されるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現することができる限り、重要であるとは考えられていない。選択及びスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
【０１４９】
（ｄ．核酸送達の他の方法）
抗原受容体をコードする核酸のウイルス送達に加えて、以下は、所与の宿主細胞へ組換え遺伝子を送達する、したがって、本開示において検討される追加の方法である。
【０１５０】
本開示の免疫細胞へのＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸の導入は、本明細書に記載されている、又は当業者に公知の、細胞の形質転換のために核酸を送達する任意の適切な方法を使用することができる。そのような方法には、限定するものではないが、ｅｘ  ｖｉｖｏトランスフェクション、マイクロインジェクションを含む注射、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストランに続くポリエチレングリコールの使用、直接音波負荷、リポソーム媒介トランスフェクション及び受容体媒介トランスフェクション、微粒子銃、炭化ケイ素繊維との攪拌、アグロバクテリウム媒介形質転換、乾燥／阻害を介したＤＮＡ取り込み、及びそのような方法の任意の組み合わせなどによるＤＮＡの直接送達が含まれる。これらのような技術の適用を通じて、オルガネラ、細胞、組織又は生物を、安定して又は一時的に形質転換することができる。
【０１５１】
（Ｆ．遺伝子発現の改変）
いくつかの実施形態において、本開示の免疫細胞は、ＣＩＳＨの発現を変化させるように改変させることができる。追加の実施形態において、細胞は、グルココルチコイド受容体及び／又はＴＧＦβ受容体（例えば、ＴＧＦβ−ＲＩＩ）の発現を破壊するようにさらに改変させることができる。一実施形態において、免疫細胞は、内因性ＴＧＦβを枯渇させるためのサイトカインシンクとして機能することができるドミナントネガティブＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩＤＮ）を発現するように改変させることができる。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、遺伝子発現の変化は、ノックアウト、挿入、ミスセンス、又は二対立遺伝子フレームシフト突然変異などのフレームシフト突然変異、遺伝子の全部又は一部、したがって例えば１又は複数のエクソン又はその部分の欠失などの遺伝子の破壊、及び／又はノックインをもたらすことによって実行される。例えば、遺伝子発現の変化は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのＤＮＡ結合標的ヌクレアーゼを含む配列特異的又は標的ヌクレアーゼによって、ならびに遺伝子又はその一部の配列を標的とするように特別に設計された、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）などのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼによってもたらすことができる。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、遺伝子の発現、活性、及び／又は機能の変化は、遺伝子を破壊することによって実行される。いくつかの態様において、遺伝子は、その発現が、遺伝子改変がない場合、又は改変を行うために導入された成分がない場合の発現と比較して少なくとも約２０、３０又は４０％、一般に少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０又は９５％減少するように改変される。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、遺伝子の発現が後で回復するように、変化は一過性又は可逆的である。他の実施形態において、変化は、可逆的又は一時的ではなく、例えば、永続的である。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変は、典型的には標的化された方法で、遺伝子における１又は複数の二本鎖切断及び／又は１又は複数の一本鎖切断の誘導によって実施される。いくつかの実施形態において、二本鎖又は一本鎖切断は、ヌクレアーゼ、例えば、遺伝子標的化ヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼによって行われる。いくつかの態様において、切断は、遺伝子のコード領域、例えば、エクソンにおいて誘導される。例えば、いくつかの実施形態において、誘導は、コード領域のＮ末端部分の近くで、例えば、第１のエクソン、第２のエクソン、又は後続のエクソンで起こる。
【０１５６】
いくつかの態様において、二本鎖又は一本鎖切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同組換え修復（ＨＤＲ）などによる細胞修復プロセスを介して修復を受ける。いくつかの態様において、修復プロセスはエラーを起こしやすく、フレームシフト突然変異、例えば、遺伝子の完全なノックアウトをもたらす可能性がある二対立遺伝子のフレームシフト突然変異などの遺伝子の破壊をもたらす。例えば、いくつかの態様において、破壊は、欠失、突然変異及び／又は挿入を誘発することを含む。いくつかの実施形態において、破壊は、早期終止コドンの存在をもたらす。いくつかの態様において、挿入、欠失、転座、フレームシフト突然変異、及び／又は時期尚早の終止コドンの存在は、遺伝子の発現、活性及び／又は機能の破壊をもたらす。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）などによるアンチセンス技術を使用して達成され、及び／又はリボザイムが遺伝子の発現を選択的に抑制又は阻止するために使用される。ｓｉＲＮＡ技術は、遺伝子から転写されるｍＲＮＡのヌクレオチド配列と相同な配列と、ヌクレオチド配列と相補的な配列とを有する二本鎖ＲＮＡ分子を用いたＲＮＡｉである。ｓｉＲＮＡは、一般に、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの１つの領域と相同／相補的であるか、又は異なる領域と相同／相補的である複数のＲＮＡ分子を含むｓｉＲＮＡであり得る。いくつかの態様において、ｓｉＲＮＡはポリシストロン構築体に含まれている。
【０１５８】
（１．ＺＦＰ及びＺＦＮ）
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子は、エンドヌクレアーゼなどのエフェクタータンパク質に融合された、１又は複数のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）又は転写活性化因子様タンパク質（ＴＡＬ）などのＤＮＡ結合タンパク質を含む。例としては、ＺＦＮ、ＴＡＬＥ及びＴＡＬＥＮが挙げられる。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子は、１又は複数のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）又は配列特異的にＤＮＡに結合するそのドメインを含む。ＺＦＰ又はそのドメインは、１又は複数のジンクフィンガーを介して配列特異的にＤＮＡに結合する、より大きなタンパク質内のタンパク質又はドメインであり、その構造が亜鉛イオンの配位によって安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質又はＺＦＰと略される。ＺＦＰの中には、個々のフィンガーのアセンブリによって生成される、通常９〜１８ヌクレオチド長の、特異的ＤＮＡ配列を標的とする人工ＺＦＰドメインがある。
【０１６０】
ＺＦＰには、単一のフィンガードメインが約３０アミノ酸長であり、単一のベータターンの２つのシステインと、亜鉛を介して配位された２つの不変のヒスチジン残基を含むαヘリックスを含み、２、３、４、５又は６のフィンガーを有するものが含まれる。一般に、ＺＦＰの配列特異性は、ジンクフィンガー認識ヘリックスの４つのヘリックス位置（−１、２、３及び６）でアミノ酸置換を行うことによって改変することができる。したがって、いくつかの実施形態において、ＺＦＰ又はＺＦＰ含有分子は、天然に存在せず、例えば、選択した標的部位に結合するように操作されている。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成するためにＤＮＡ切断ドメインに融合されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインであるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのタイプｌｉＳ制限酵素による切断ドメイン（又は切断ハーフドメイン）、及び１又は複数のジンクフィンガー結合ドメインを含み、これらは操作されても、又はされなくてもよい。いくつかの実施形態において、切断ドメインは、タイプｌｉＳ制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩによる。ＦｏｋＩは、一般に、一方の鎖の認識部位から９ヌクレオチド、及び他方の認識部位から１３ヌクレオチドにおいてＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。
【０１６２】
多くの遺伝子特異的に操作されたジンクフィンガーが市販されている。例えば、Ｓａｎｇａｍｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）と共同で、ジンクフィンガー構築用のプラットフォーム（ＣｏｍｐｏＺｒ）を開発した。これにより、研究者はジンクフィンガーの構築と検証とをバイパスすることができ、全体として、数千のタンパク質に対して特異的に標的化されたジンクフィンガーを提供する（Gaj et al.,Trends in Biotechnology,2013,31(7),397-405）。いくつかの実施形態において、市販のジンクフィンガーが使用されるか、又はカスタム設計される。（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号ＣＳＴＺＦＮＤ、ＣＳＴＺＦＮ、ＣＴｉｌ−１ＫＴ、及びＰＺＤ００２０を参照されたい）。
【０１６３】
（２．ＴＡＬ、ＴＡＬＥ及びＴＡＬＥＮ）
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化分子は、転写活性化因子様タンパク質エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質などにおいて、天然に存在する、又は操作された（天然に存在しない）転写活性化因子様タンパク質（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、米国特許公開第２０１１／０３０１０７３号明細書を参照されたく、当該特許公開は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６４】
ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン又はＴＡＬＥは、１つ又は複数のＴＡＬＥリピートドメイン／ユニットを含むポリペプチドである。リピートドメインは、ＴＡＬＥがその同族の標的ＤＮＡ配列に結合することに関与する。単一の「リピートユニット」（「リピート」とも呼ばれる）は、典型的には、３３〜３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥリピート配列と少なくともある程度の配列相同性を示す。各ＴＡＬＥリピートユニットには、反復可変二残基（ＲＶＤ）を構成する１つ又は２つのＤＮＡ結合残基が含まれ、通常はリピートの１２及び／又は１３の位置にある。これらのＴＡＬＥのＤＮＡ認識の自然な（標準的な）コードは、１２位と１３位のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧはＴに結合、ＮＩはＡに結合し、ＮＮはＧ又はＡに結合、及びＮＯはＴに結合するように決定されているが、非標準（非定型）ＲＶＤも公知である。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥは、標的ＤＮＡ配列に特異性を有するＴＡＬアレイの設計によって、任意の遺伝子を標的とし得る。標的配列は一般的にチミジンで始まる。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、分子は、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのＤＮＡ結合エンドヌクレアーゼである。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥに由来するＤＮＡ結合ドメイン及び核酸標的配列を切断するためのヌクレアーゼ触媒ドメインを含む融合タンパク質である。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮは、遺伝子内の標的配列を認識して切断する。いくつかの態様において、ＤＮＡの切断は二本鎖切断をもたらす。いくつかの態様において、切断は、相同組換え又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の速度を刺激する。一般に、ＮＨＥＪは不完全な修復プロセスであり、切断部位においてしばしばＤＮＡ配列に変化をもたらす。いくつかの態様において、修復メカニズムは、直接の再ライゲーション又はいわゆるマイクロホモロジー媒介末端結合を介して、２つのＤＮＡ末端の残りの部分の再結合を伴う。いくつかの実施形態において、ＮＨＥＪを介した修復は、小さな挿入又は欠失をもたらし、そしてそれを使用して、遺伝子を破壊し、それによって遺伝子を抑制することができる。いくつかの実施形態において、改変は、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、欠失、又は付加であり得る。いくつかの態様において、切断誘導性突然変異誘発イベント、すなわち、ＮＨＥＪイベントに連続する突然変異誘発イベントが発生した細胞は、当技術分野で周知の方法によって同定及び／又は選択することができる。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥリピートは、遺伝子を特異的に標的とするようにアセンブリされる。（Ｇａｊ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。１８，７４０のヒトタンパク質コード遺伝子を標的とするＴＡＬＥＮのライブラリーが構築されている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。カスタム設計されたＴＡＬＥアレイは、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ、ＵＳＡ）、及びＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）から市販されている。具体的には、ＣＤ３８をターゲットとするＴＡＬＥＮが市販されている（Ｇｅｎｃｏｐｏｅｉａ、カタログ番号ＨＴＮ２２２８７０−１、ＨＴＮ２２２８７０−２及びＨＴＮ２２２８７０−３を参照されたい）。例示的な分子は、例えば、米国特許公開第２０１４／０１２０６２２号明細書及び第２０１３／０３１５８８４号明細書に記載されている。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮは、１つ又は複数のプラスミドベクターによってコードされるトランス遺伝子として導入される。いくつかの態様において、プラスミドベクターは、前記ベクターを受け取った細胞の同定及び／又は選択を提供する選択マーカーを含むことができる。
【０１６９】
（３．ＲＧＥＮ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム））
いくつかの実施形態において、改変は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を介した改変など、１又は複数のＤＮＡ結合核酸を使用して実施される。例えば、改変は、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を使用して実行することができる。一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」とは、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現又は活性の誘導に関与する転写産物及び他の要素を総称して指し、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ−メイト配列（「ダイレクトリピート」及び内因性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連してｔｒａｃｒＲＮＡによりプロセシングされた部分的ダイレクトリピートを包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連して「スペーサー」とも呼ばれる）、及び／又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来の他の配列及び転写産物を含む。
【０１７０】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムには、ＤＮＡに配列特異的に結合する非コードＲＮＡ分子（ガイド）ＲＮＡ、及びヌクレアーゼ機能（例えば、２つのヌクレアーゼドメイン）を備えたＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）が含まれ得る。ＣＲＩＳＰＲシステムの１又は複数の要素は、例えば、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）などの内因性ＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物に由来する、タイプＩ、タイプＩＩ、又はタイプＩＩＩのＣＲＩＳＰＲシステムに由来し得る。
【０１７１】
いくつかの態様において、Ｃａｓヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ（標的配列に特異的なｃｒＲＮＡ及び固定されたｔｒａｃｒＲＮＡの融合を含む）が細胞に導入される。一般に、ｇＲＮＡの５′末端の標的部位は、相補的な塩基対を使用して、Ｃａｓヌクレアーゼを標的部位、例えば遺伝子に向かわせる。標的部位は、典型的にはＮＧＧ又はＮＡＧなどのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列のすぐ５′にあるその位置に基づいて選択され得る。この点で、ガイドＲＮＡの最初の２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１４、１２、１１又は１０ヌクレオチドを標的ＤＮＡ配列に対応するように改変することにより、ｇＲＮＡは所望の配列を標的とする。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する要素によって特徴付けられる。典型的には、「標的配列」は、一般に、ガイド配列が相補性を有するように設計されている配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ではない。
【０１７２】
ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的部位で二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘発し、その後、本明細書で説明するように破壊又は改変を引き起こす可能性がある。他の実施形態において、「ニッカーゼ」と見なされるＣａｓ９変異体を使用して、標的部位で一本鎖にニックを導入する。対のニッカーゼは、例えば、特異性を改善するために使用することができ、それぞれが、ニックの同時導入において５′オーバーハングが導入されるように、一対の異なるｇＲＮＡ標的化配列によって導かれる。他の実施形態において、触媒的に不活性なＣａｓ９は、遺伝子発現に影響を与えるために、転写リプレッサー又はアクチベーターなどの異種エフェクタードメインに融合される。
【０１７３】
標的配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含むことができる。標的配列は、細胞のオルガネラ内など、細胞の核又は細胞質に位置していてよい。一般に、標的配列を含む標的遺伝子座への組換えに使用され得る配列又はテンプレートは、「編集テンプレート」又は「編集ポリヌクレオチド」又は「編集配列」と呼ばれる。いくつかの態様において、外因性テンプレートポリヌクレオチドは、編集テンプレートと呼ぶことができる。いくつかの態様において、組換えは相同組換えである。
【０１７４】
典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連して、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズし、１又は複数のＣａｓタンパク質と複合体を形成したガイド配列を含む）の形成により、標的配列内、又はその近く（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、又はそれ以上の塩基対以内）の一方又は両方の鎖の切断がもたらされる。野生型ｔｒａｃｒ配列の全部又は一部を含むか、又はそれらからなり得るｔｒａｃｒ配列（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５又はそれ以上のヌクレオチド）はまた、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿って、ガイド配列に作動可能に連結されているｔｒａｃｒメイト配列の全部又は一部へのハイブリダイゼーションなどによって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成し得る。ｔｒａｃｒ配列は、ハイブリダイズしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関与するために、ｔｒａｃｒメイト配列に対して十分な相補性、例えば、最適にアラインメントされた場合にｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％配列相補性を有する。
【０１７５】
ＣＲＩＳＰＲシステムの１又は複数の要素の発現を駆動する１又は複数のベクターを細胞に導入して、ＣＲＩＳＰＲシステムの要素の発現が、１又は複数の標的部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を導くようにすることができる。成分も、タンパク質及び／又はＲＮＡとして細胞に送達することができる。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列はそれぞれ、別個のベクター上の別個の調節要素に作動可能に連結させることができる。又は、同じ又は異なる調節要素から発現される２つ以上の要素を単一のベクター中に組み合わせることができ、１又は複数の追加のベクターが、第１のベクターに含まれないＣＲＩＳＰＲシステムの任意の成分を提供する。ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニング部位」とも呼ばれる）などの１又は複数の挿入部位を含み得る。いくつかの実施形態において、１又は複数の挿入部位は、１又は複数のベクターの１又は複数の配列要素の上流及び／又は下流に配置される。複数の異なるガイド配列を使用する場合、単一の発現構築体を使用して、細胞内の複数の異なる対応する標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ活性を標的とすることができる。
【０１７６】
ベクターは、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された調節要素を含み得る。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても公知である）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらの同族体、又はそれらの改変型が挙げられる。これらの酵素は公知であり、例えば、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいてアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２で見出すことができる。
【０１７７】
ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）又は肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）由来）であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列内及び／又は標的配列の相補体内などの標的配列の位置で一方又は両方の鎖の切断を導くことができる。ベクターは、変異したＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素に対して変異しているＣＲＩＳＰＲ酵素をコードすることができる。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９のＲｕｖＣ  Ｉ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ガイド配列、例えば、ＤＮＡ標的のセンス及びアンチセンス鎖をそれぞれ標的とする２つのガイド配列と組み合わせて使用することができる。この組み合わせにより、両方の鎖にニックを導入して、ＮＨＥＪ又はＨＤＲを誘導するために使用することができる。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞における発現のためにコドン最適化されている。真核細胞は、限定するものではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ又は非ヒト霊長類を含む哺乳類などの特定の生物のものであるか、又はそれらに由来し得る。一般に、コドン最適化とは、天然配列の少なくとも１つのコドンを、その宿主の遺伝子においてより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、天然のアミノ酸配列を維持しながら、目的の宿主細胞における発現を増強するために核酸配列を改変するプロセスを指す。さまざまな種が、特定のアミノ酸の特定のコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の違い）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関することが多く、これは、とりわけ、翻訳されるコドンの特性と特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。選択されたｔＲＮＡの細胞内での優勢は、一般に、ペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンを反映している。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現に適合させることができる。
【０１７９】
一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を導くために十分な、標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインメントされた場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％又はそれ以上である。
【０１８０】
ＮＲ３ＣＳ（グルココルチコイド受容体）の例示的なｇＲＮＡ配列には、Ｅｘ３  ＮＲ３Ｃ１  ｓＧ１  ５−ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＧＧＡ−３（配列番号１）、及びＥｘ３  ＮＲ３Ｃ１  ｓＧ２  ５−ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＡＧＡ  ＧＴＴ−３（配列番号２）が含まれる。ＴＧＦ−ベータ受容体２のための例示的なｇＲＮＡ配列には、ＥＸ３  ＴＧＦＢＲ２  ｓＧ１  ５−ＣＧＧ  ＣＴＧ  ＡＧＧ  ＡＧＣ  ＧＧＡ  ＡＧＡ−３（配列番号３）、及びＥＸ３  ＴＧＦＢＲ２  ｓＧ２  ５−ＴＧＧ−ＡＧＧ−ＴＧＡ−ＧＣＡ−ＡＴＣ−ＣＣＣ−３（配列番号４）が含まれる。Ｔ７プロモーター、標的配列、及び重複配列は、配列ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ（配列番号５）＋標的配列＋ｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃ（配列番号６）を有し得る。
【０１８１】
最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定することができ、その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ  Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。
【０１８２】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１又は複数の異種タンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、及び任意選択で任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合され得るタンパク質ドメインの例としては、限定するものではないが、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、及び以下の活性のうちの１又は複数を有するタンパク質ドメインが挙げられる：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性及び核酸結合活性。エピトープタグの非限定的な例には、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが含まれる。レポーター遺伝子の例には、限定するものではないが、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータガラクトシダーゼ、ベータグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が含まれる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ分子に結合するか、又は限定するものではないが、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ  Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合体、ＧＡＬ４Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン融合体、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合体を含む、他の細胞分子に結合するタンパク質又はタンパク質のフラグメントをコードする遺伝子配列に融合され得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加のドメインは、米国特許出願第２０１１００５９５０２明細書に記載されており、当該出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８３】
（ＩＩＩ．治療の方法）
いくつかの実施形態において、本開示は、有効量の本開示のＮＫ細胞を投与することを含む免疫療法のための方法を提供する。一実施形態において、医学的疾患又は障害は、免疫応答を誘発するＮＫ細胞集団の移入によって治療される。本開示の特定の実施形態において、がん又は感染症は、免疫応答を誘発するＮＫ細胞集団の移入によって治療される。本明細書で提供されるのは、有効量の抗原特異的細胞療法を個体に投与することを含む、個体のがんを治療する、又はその進行を遅延させるための方法である。本発明の方法は、免疫障害、固形がん、血液がん、及びウイルス感染症の治療に適用することができる。
【０１８４】
本治療法が有用である腫瘍としては、固形腫瘍又は血液腫瘍に見られるものなどの任意の悪性細胞型が挙げられる。例示的な固形腫瘍としては、限定するものではないが、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭部、頸部、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、メラノーマ、前立腺及び乳房からなる群から選択される器官の腫瘍を挙げることができる。例示的な血液腫瘍には、骨髄、Ｔ細胞又はＢ細胞悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、芽細胞腫、骨髄腫などの腫瘍が含まれる。本明細書で提供される方法を使用して治療することができるがんのさらなる例には、限定するものではないが、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、及び肺の扁平上皮がんを含む）、腹膜がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ又はｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）（胃腸がん及び胃腸間質がんを含む）、膵臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん又は子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん又は腎がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、さまざまな種類の頭頸部がん及びメラノーマが含まれる。
【０１８５】
がんは、これらに限定するものではないが、具体的には以下の組織型であり得る：新生物、悪性；がん腫；がん腫、未分化；巨細胞がん及び紡錘細胞がん；小細胞がん；乳頭がん；扁平上皮がん；リンパ上皮がん；基底細胞がん；毛母がん（ｐｉｌｏｍａｔｒｉｘ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；移行上皮がん；乳頭状移行上皮がん；腺がん；ガストリノーマ、悪性；胆管がん；肝細胞がん；肝細胞がんと胆管がんの混合型；索状腺がん；腺様嚢胞がん；腺腫性ポリープの腺がん；腺がん、家族性大腸ポリポーシス；固形がん；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞腺がん（ｂｒａｎｃｈｉｏｌｏ−ａｌｖｅｏｌａｒ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）；乳頭状腺がん；色素嫌性がん；好酸性がん；好酸性腺がん；塩基好性がん；明細胞腺がん；顆粒細胞がん；濾胞腺がん；乳頭状・濾胞腺がん；非被包性硬化性がん；副腎皮質がん；類内膜がん；皮膚付属器がん；アポクリン腺がん；皮脂腺がん；耳垢腺がん；粘表皮がん；嚢胞腺がん；乳頭状嚢胞腺がん；乳頭状漿液嚢胞腺がん；粘液性嚢胞腺がん；粘液性腺がん；印環細胞がん；浸潤性乳管がん；髄様がん；小葉がん；炎症性がん；パジェット病、乳房；腺房細胞がん；腺扁平上皮がん；扁平上皮化生随伴腺がん（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｗ／ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）；（胸腺腫、悪性）；卵巣間質腫、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；男性ホルモン産生細胞腫、悪性；セルトリ細胞がん；ライディッヒ細胞腫、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性メラノーマ；無色素性メラノーマ；表在拡大型メラノーマ；悪性黒子メラノーマ；末端黒子型メラノーマ；結節性メラノーマ；巨大色素生母斑の悪性メラノーマ；類上皮細胞メラノーマ；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣性横紋筋肉腫；間質性肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；がん肉腫；間葉細胞腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚性がん腫；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛がん；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポシ肉腫；血管外皮腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星芽細胞腫；神経膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起膠芽腫；原始神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節芽腫；神経芽腫；網膜芽細胞腫；嗅神経腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞型、びまん性；悪性リンパ腫濾胞性；菌状息肉腫；他の指定された非ホジキンリンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫；低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性���ＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ワンデルシュトレームマクログロブリン血症；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；マスト細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；有毛細胞白血病；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；及び慢性骨髄芽球性白血病。
【０１８６】
特定の実施形態は、白血病の治療方法に関する。白血病は血液又は骨髄のがんであり、血球、通常は白血球細胞（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ））の異常な増殖（倍加による産生）を特徴とする。これは、血液新生物と呼ばれる幅広い疾患グループの一部である。白血病は、広範囲の疾患を網羅する広義の用語である。白血病は、臨床的及び病理学的に急性型と慢性型に分けられる。
【０１８７】
本開示の特定の実施形態において、免疫細胞は、がん又は感染症を有する個体など、それを必要とする個体に送達される。次に、細胞は個体の免疫システムを強化して、それぞれのがん又は病原性細胞を攻撃する。場合によっては、個体に１又は複数の用量の免疫細胞が提供される。個体に２回以上の免疫細胞の用量が提供される場合、投与間の期間は、個体における増殖のための時間を与えるのに十分でなければならず、特定の実施形態において、用量間の期間は１、２、３、４、５、６、７日、又はそれ以上である。
【０１８８】
本開示の特定の実施形態は、免疫介在性障害を治療又は予防するための方法を提供する。一実施形態において、対象は自己免疫疾患を有する。自己免疫疾患の非限定的な例には、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アディソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎及び精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、腹腔多発皮膚炎（ｃｅｌｉａｃ  ｓｐａｔｅ−ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、チャーグ−ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素疾患、クローン病、円板状狼瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、糸球体腎炎、グレイブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス（ｌｕｐｕｓ  ｅｒｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、メニエール病、混合性結合組織疾患、多発性硬化症、１型又は免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、ネフローゼ症候群（微小変化型ネフローゼ症候群、巣状糸球体硬化症又は膜性腎症（ｍｅｂｒａｎｏｕｓ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）など）、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発筋炎及び皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフ・マン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、脈管炎（結節性多発動脈炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎又はヘルペス状皮膚炎脈管炎など）、白斑及びウェゲナー肉芽腫症が含まれる。したがって、本明細書に開示される方法を使用して治療することができる自己免疫疾患のいくつかの例には、限定するものではないが、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、糸球体腎炎、強直性脊椎炎、脈管炎、又は乾癬が含まれる。対象はまた、喘息などのアレルギー性障害を有し得る。
【０１８９】
さらに別の実施形態において、対象は、移植された臓器又は幹細胞のレシピエントであり、免疫細胞は、拒絶を予防及び／又は治療するために使用される。特定の実施形態において、対象は、移植片対宿主病を有するか、又は発症するリスクがある。ＧＶＨＤは、血縁又は非血縁のドナー由来の幹細胞を使用する、又は含む任意の移植の合併症の可能性がある。ＧＶＨＤには、急性と慢性の２種類がある。急性ＧＶＨＤは、移植後最初の３ヶ月以内に現れる。急性ＧＶＨＤの兆候には、手足の赤みがかった皮膚の発疹が含まれ、この発疹は、皮膚の剥離や水疱を伴って広がり、より重症になる可能性がある。急性ＧＶＨＤは胃や腸にも影響を与える可能性があり、その場合、けいれん、吐き気、下痢が見られる。皮膚と眼の黄変（黄疸）は、急性ＧＶＨＤが肝臓に影響を及ぼしていることを示す。慢性ＧＶＨＤは、その重症度に基づいてランク付けされ、ステージ／グレード１は軽症であり、ステージ／グレード４は重症である。慢性ＧＶＨＤは、移植後３ヶ月以降に発症する。慢性ＧＶＨＤの症状は、急性ＧＶＨＤの症状と似ているが、さらに、慢性ＧＶＨＤは、目の粘液腺、口の唾液腺、胃の内壁や腸を滑らかにする腺にも影響を与える可能性がある。本明細書に開示の免疫細胞の集団のいずれかを利用することができる。移植された臓器の例には、腎臓、肝臓、皮膚、膵臓、肺及び／又は心臓などの固形臓器移植、又は膵島、肝細胞、筋芽細胞、骨髄、又は造血幹細胞もしくは他の幹細胞などの細胞移植が含まれる。移植は、顔の組織などの複合移植の可能性もある。免疫細胞は、移植前、移植と同時、又は移植後に投与することができる。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、移植前、例えば、移植の少なくとも１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、又は少なくとも１ヶ月前に投与される。１つの特定の非限定的な例では、治療有効量の免疫細胞の投与は、移植の３〜５日前に行われる。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、対象は、免疫細胞療法の前に骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法を投与され得る。骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法は、任意の適切な経路によって投与することができる、任意の適切な療法であり得る。骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法は、特にがんが転移の可能性があるメラノーマである場合、例えば、シクロホスファミド及びフルダラビンの投与を含み得る。シクロホスファミド及びフルダラビンを投与する例示的な経路は、静脈内投与である。また、任意の適切な用量のシクロホスファミド及びフルダラビンを投与することができる。特定の態様において、約６０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドが２日間投与され、その後、約２５ｍｇ／ｍ２のフルダラビンが５日間投与される。
【０１９１】
特定の実施形態において、免疫細胞の成長及び活性化を促進する成長因子が、免疫細胞と同時に、又は免疫細胞の後のいずれかで対象に投与される。免疫細胞成長因子は、免疫細胞の成長及び活性化を促進する任意の適切な成長因子であってよい。適切な免疫細胞成長因子の例には、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及びＩＬ−１２が含まれ、これらは、単独で、又はさまざまな組み合わせ、例えば、ＩＬ−２とＩＬ−７、ＩＬ−２とＩＬ−１５、ＩＬ−７とＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−７とＩＬ−１５、ＩＬ−１２とＩＬ−７、ＩＬ−１２とＩＬ−１５、又はＩＬ−１２とＩＬ２などで使用することができる。
【０１９２】
治療有効量の免疫細胞は、非経口投与、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、又は関節内注射、又は点滴を含む多くの経路によって投与することができる。
【０１９３】
養子細胞療法で使用するための免疫細胞の治療有効量は、治療される対象において所望の効果を達成する量である。例えば、これは、進行を阻害するため、又は自己免疫又は同種免疫疾患の退行を引き起こすために必要な、又は痛みや炎症などの自己免疫疾患によって引き起こされる症状を軽減することができる免疫細胞の量であり得る。それは、痛み、浮腫及び体温上昇などの炎症に関連する症状を軽減するのに必要な量でもあり得る。それはまた、移植された臓器の拒絶反応を減少又は予防するために必要な量であり得る。
【０１９４】
免疫細胞集団は、疾患と一致する治療レジメンで投与することができ、例えば、疾患状態を改善するための１日から数日間にわたる単回又は数回の用量、又は疾患の進行を阻害し、疾患の再発を予防するための長期間にわたる定期的な用量で投与することができる。製剤に使用される正確な用量は、投与経路、及び疾患又は障害の重症度にも依存し、開業医の判断及び各患者の状況に応じて決定されるべきである。免疫細胞の治療有効量は、治療される対象、苦痛の重症度と種類、及び投与方法に依存する。いくつかの実施形態において、ヒト対象の治療に使用できる用量は、少なくとも３．８×１０４、少なくとも３．８×１０５、少なくとも３．８×１０６、少なくとも３．８×１０７、少なくとも３．８×１０８、少なくとも３．８×１０９又は３．８×１０１０免疫細胞／ｍ２の範囲である。特定の実施形態において、ヒト対象の治療に使用される用量は、約３．８×１０９〜約３．８×１０１０免疫細胞／ｍ２の範囲である。追加の実施形態において、免疫細胞の治療有効量は、体重１ｋｇあたり約５×１０６細胞〜体重１ｋｇあたり約７．５×１０８細胞まで、例えば、体重１ｋｇあたり約２×１０７細胞〜約５×１０８細胞、又は体重１ｋｇあたり約５×１０７細胞〜約２×１０８細胞まで変化し得る。免疫細胞の正確な量は、対象の年齢、体重、性別及び生理学的状態に基づいて当業者によって容易に決定される。有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は動物モデル試験システムから得られた用量反応曲線から推定することができる。
【０１９５】
免疫細胞は、免疫介在性障害の治療のために、１又は複数の他の治療薬と組み合わせて投与することができる。併用療法には、限定するものではないが、１又は複数の抗菌剤（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤及び抗真菌剤）、抗腫瘍剤（例えば、フルオロウラシル、メトトレキサート、パクリタキセル、フルダラビン）、エトポシド、ドキソルビシン、又はビンクリスチン）、免疫枯渇剤（例えば、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシン又はビンクリスチン）、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン又はグルココルチコイド、例えば、デキサメタゾン又はプレドニゾン）、抗炎症剤（例えば、ヒドロコルチソン、デキサメタゾンもしくはプレドニゾンなどのグルココルチコイド、又はアセチルサリチル酸、イブプロフェン又はナプロキセンナトリウムなどの非ステロイド系抗炎症剤）、サイトカイン（例えば、インターロイキン−１０又は形質転換成長因子−ベータ）、ホルモン（例えば、エストロゲン）、又はワクチンを含み得る。さらに、限定するものではないが、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン及びタクロリムス）；ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）；ミコフェノール酸モフェチル、（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ１５４、ＣＤ４５、ＩＶＩＧ又はＢ細胞を認識する）抗体；化学療法剤（例えば、メトトレキサート、トレオサルファン、ブスルファン）；照射；又は、ケモカイン、インターロイキンもしくはそれらの阻害剤（例えば、ＢＡＦＦ、ＩＬ−２、抗ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＪＡＫキナーゼ阻害剤）を含む免疫抑制剤又は免疫寛容原性剤を投与することができる。そのような追加の医薬品は、所望の効果に応じて、免疫細胞の投与前、投与中、又は投与後に投与することができる。細胞及び薬剤のこの投与は、同じ経路又は異なる経路によって、同じ部位又は異なる部位のいずれかで行うことができる。
【０１９６】
（Ｂ．医薬組成物）
免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物及び製剤も本明細書において提供される。
【０１９７】
本明細書に記載の医薬組成物及び製剤は、所望の純度を有する有効成分（抗体又はポリペプチドなど）を、１又は複数の任意選択の薬学的に許容される担体（Remington’s Pharmaceutical Sciences 22nd edition,2012）と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で調製することができる。薬学的に許容される担体は、一般に、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、限定するものではないが、以下が含まれる：リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、ｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体には、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの組織内薬物分散剤がさらに含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び２００６／０１０４９６８号明細書に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１又は複数の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
【０１９８】
（Ｃ．併用療法）
特定の実施形態において、本実施形態の組成物及び方法は、少なくとも１つの追加の治療と組み合わせた免疫細胞集団を含む。追加の治療法は、放射線療法、外科手術（例えば、乳腺腫瘍摘出術及び乳房切除術）、化学療法、遺伝子治療、ＤＮＡ療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法、免疫療法、骨髄移植、ナノ療法、モノクローナル抗体療法、又は前述の組み合わせであり得る。追加の治療法は、アジュバント療法又はネオアジュバント療法の形態であり得る。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、追加の治療は、小分子酵素阻害剤又は抗転移剤の投与である。いくつかの実施形態において、追加の治療は、副作用制限剤（例えば、制吐剤などの、治療の副作用の発生及び／又は重症度を軽減することを目的とした薬剤）の投与である。いくつかの実施形態において、追加の療法は放射線療法である。いくつかの実施形態において、追加の治療は外科手術である。いくつかの実施形態において、追加の治療は、放射線療法と外科手術の組み合わせである。いくつかの実施形態において、追加の治療法はガンマ線照射である。いくつかの実施形態において、追加の治療は、ＰＢＫ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を標的とする治療、ＨＳＰ９０阻害剤、チューブリン阻害剤、アポトーシス阻害剤、及び／又は化学予防剤である。追加の治療法は、当技術分野で公知の１又は複数の化学療法剤であり得る。
【０２００】
免疫細胞療法は、免疫チェックポイント療法などの追加のがん療法に関連して、その前、最中、後、又はさまざまな組み合わせで投与することができる。投与は、同時から数分から数日から数週間の範囲の間隔であり得る。免疫細胞療法が追加の治療薬とは別に患者に提供される実施形態において、一般に、患者に対して有利な併用効果を依然として発揮できるように、それぞれの送達時間の間にかなりの期間が過ぎて効力を失うことがないことを確実にしなければならない。そのような場合、互いに約１２〜２４又は７２時間以内に、より具体的には、互いに約６〜１２時間以内に、抗体療法と抗がん療法とを患者に提供し得ることが企図される。状況によっては、治療期間を大幅に延長して、それぞれの投与の間を数日間（２、３、４、５、６又は７）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７又は８）経過させることが望ましい場合がある。
【０２０１】
さまざまな組み合わせを採用することができる。下の例では、免疫細胞療法が「Ａ」であり、抗がん療法が「Ｂ」である：
Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
【０２０２】
本実施形態の任意の化合物又は治療の患者への投与は、薬剤に毒性がある場合はそれを考慮して、そのような化合物の投与のための一般的なプロトコルに従う。したがって、いくつかの実施形態において、併用療法に起因する毒性を監視するステップがある。
【０２０３】
（１．化学療法）
多種多様な化学療法剤を、本実施形態に従って使用することができる。「化学療法」という用語は、がんを治療するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、がんの治療において投与される化合物又は組成物の意味を含んで使用される。これらの薬剤又は薬物は、細胞周期に影響を与えるかどうか、どの段階で影響を与えるかなど、細胞内の活性モードによって分類される。又は、薬剤は、ＤＮＡを直接架橋する、ＤＮＡに挿入する、又は核酸合成に影響を与えることによって染色体及び有糸分裂の異常を誘発するその能力に基づいて特徴付けることができる。
【０２０４】
化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボクオン、メチュレドーパ、及びウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチルオロメラミンを含むエチレンイミン及びメチルアメラミン；アセトゲニン（特にブラタシンとブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ  ｏｘｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド及びウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムヌスチンなどのニトロソウレア；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ１及びカリケアマイシンオメガＩ１）；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモフォア及び関連するクロモプロテインエンジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｒｎｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｒｎｙｃｉｎ）、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン及びゾルビシン；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、プテロプテリン及びトリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン及びチオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオ��シウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン及びフロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン及びテストトラクトンなどのアンドロゲン；ミトタン及びトリロスタンなどの抗副腎；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシン及びアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセル及びドセタキセルゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンなどの白金配位錯体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質タンスフェラーゼ（ｔａｎｓｆｅｒａｓｅ）阻害剤、トランスプラチナ、及び上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体が含まれる。
【０２０５】
（２．放射線療法）
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広く使用されてきた他の因子には、一般に、γ線、Ｘ線、及び／又は腫瘍細胞への放射性同位元素の直接送達として公知のものが含まれる。マイクロ波、陽子線照射（米国特許第５，７６０，３９５号明細書及び第４，８７０，２８７号明細書）、及びＵＶ照射などの他の形態のＤＮＡ損傷因子も企図されている。これらの因子はすべて、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製と修復、及び染色体のアセンブリと維持に対する広範囲の損傷に影響を与える可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３〜４週間）の１日線量５０〜２００レントゲンから単一線量２０００〜６０００レントゲンまでの範囲である。放射性同位元素の線量範囲は大きく異なり、放射性同位元素の半減期、放出される放射線の強度と種類、及び腫瘍細胞による取り込みに依存する。
【０２０６】
（３．免疫療法）
当業者は、追加の免疫療法が、実施形態の方法と組み合わせて、又は併せて使用できることを理解すると思われる。がん治療に関連して、免疫療法は、一般に、がん細胞を標的にして破壊するために免疫エフェクター細胞及び分子の使用に依存している。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））はそのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体が単独で治療のエフェクターとして機能する場合もあれば、他の細胞を動員して実際に細胞殺滅に影響を与える場合もある。抗体はまた、薬物又は毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）と結合することができ、標的化剤として役立つ。又は、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的又は間接的に相互作用する表面分子を運ぶリンパ球であってもよい。さまざまなエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が含まれる。
【０２０７】
抗体薬物複合体は、がん治療薬の開発への画期的なアプローチとして登場した。がんは、世界の主要な死亡原因の１つである。抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、細胞殺滅薬に共有結合しているモノクローナル抗体（ＭＡｂ）で構成されている。このアプローチは、抗原標的に対するＭＡｂの高い特異性と非常に強力な細胞障害性薬物とを組み合わせて、抗原レベルの高い腫瘍細胞にペイロード（薬物）を送達する「武装」ＭＡｂをもたらす。薬物の標的化送達はまた、正常組織への曝露を最小限に抑え、毒性の低下と治療指数の改善をもたらす。２０１１年のＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）及び２０１３年のＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（トラスツズマブエムタンシン又はＴ−ＤＭ１）の２つのＡＤＣ薬のＦＤＡによる承認により、このアプローチが検証された。現在、がん治療の治験のさまざまな段階で３０を超えるＡＤＣ薬候補がある（Ｌｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。抗体工学とリンカーペイロードの最適化がますます成熟するにつれて、新しいＡＤＣの発見と開発は、このアプローチに適した新しい標的の同定と検証、及び標的化ＭＡｂの作製にますます依存している。ＡＤＣ標的の２つの基準は、腫瘍細胞でのアップレギュレート／高レベルの発現と強力な内在化である。
【０２０８】
免疫療法の一態様において、腫瘍細胞は、標的化に適した、すなわち他の細胞の大部分に存在しない何らかのマーカーを持たなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれも、本実施形態に関連して標的化に適している可能性がある。一般的な腫瘍マーカーには、ＣＤ２０、がん胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂ及びｐ１５５が含まれる。免疫療法の代替の態様は、抗がん効果と免疫刺激効果とを組み合わせることである。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ガンマ−ＩＦＮなどのサイトカイン、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８などのケモカイン、及びＦＬＴ３リガンドなどの成長因子を含む免疫刺激分子もまた存在する。
【０２０９】
現在調査中又は使用中の免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えば、牛型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、ジニトロクロロベンゼン及び芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号明細書及び第５，７３９，１６９号明細書；Ｈｕｉ  ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，１９９８；Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β及びγ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）；遺伝子治療、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２及びｐ５３（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ａｕｓｔｉｎ−Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｖｉｌｌａｓｅｃａ，１９９８；米国特許第５，８３０，８８０号明細書及び第５，８４６，９４５号明細書）；ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２及び抗ｐ１８５（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，２０１２；Ｈａｎｉｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；米国特許第５，８２４，３１１号）である。１又は複数の抗がん療法を、本明細書に記載の抗体療法とともに使用可能であることが企図される。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤であり得る。免疫チェックポイントは、シグナル（例えば、共刺激分子）を上方に向けたり、又はシグナルを下方に向けたりする。免疫チェックポイント遮断により標的となり得る抑制性免疫チェックポイントには、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６とも呼ばれる）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４、別名ＣＤ１５２）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）ならびにＴ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）が含まれる。特に、免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ−１軸及び／又はＣＴＬＡ−４を標的とする。
【０２１１】
免疫チェックポイント阻害剤は、小分子、組換え型のリガンド又は受容体などの薬物であり得るか、又は特に、ヒト抗体などの抗体である（例えば、国際特許公開第２０１５０１６７１８号パンフレット；Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，１２（４）：２５２−６４，２０１２；双方とも参照により本明細書に組み込まれる）。免疫チェックポイントタンパク質又はその類似体の公知の阻害剤を使用してもよく、特に抗体のキメラ化、ヒト化又はヒト型を使用してもよい。当業者が知っているように、本開示において言及される特定の抗体について、代替及び／又は同等の名称が使用されている場合がある。そのような代替及び／又は同等の名称は、本開示の文脈において交換可能である。例えば、ランブロリズマブは、ＭＫ−３４７５及びペンブロリズマブの代替及び同等の名称でも知られていることが公知である。
【０２１２】
一部の実施形態において、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１とそのリガンド結合パートナーとの結合を阻害する分子である。特定の態様において、ＰＤ−１リガンド結合パートナーは、ＰＤＬ１及び／又はＰＤＬ２である。別の実施形態において、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１とその結合パートナーとの結合を阻害する分子である。特定の態様において、ＰＤＬ１結合パートナーは、ＰＤ−１及び／又はＢ７−１である。別の実施形態において、ＰＤＬ２結合アンタゴニストは、ＰＤＬ２とその結合パートナーとの結合を阻害する分子である。特定の態様において、ＰＤＬ２結合パートナーはＰＤ−１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質、又はオリゴペプチドであり得る。例示的な抗体は、米国特許第８７３５５５３号、第８３５４５０９号、及び第８００８４４９号明細書に記載されており、当該特許はすべて参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で提供される方法で使用するための他のＰＤ−１軸アンタゴニストは、米国特許出願第２０１４０２９４８９８号、第２０１４０２２０２１号、及び第２０１１０００８３６９号明細書に記載のような当技術分野で公知のものであり、当該特許出願はすべて参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１３】
いくつかの実施形態において、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体）である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ及びＣＴ−０１１からなる群から選択される。一部の実施形態において、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されたＰＤＬ１又はＰＤＬ２の細胞外又はＰＤ−１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの実施形態において、ＰＤ−１結合アンタゴニストはＡＭＰ−２２４である。ニボルマブは、ＭＤＸ−１１０６−０４、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８、ＢＭＳ−９３６５５８、及びＯＰＤＩＶＯ（登録商標）とも呼ばれ、国際公開第２００６／１２１１６８号パンフレットに記載の抗ＰＤ−１抗体である。ペンブロリズマブは、ＭＫ−３４７５、Ｍｅｒｃｋ  ３４７５、ランブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）及びＳＣＨ−９００４７５とも呼ばれ、国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレットに記載の抗ＰＤ−１抗体である。ＣＴ−０１１はｈＢＡＴ又はｈＢＡＴ−１としても公知であり、国際公開第２００９／１０１６１１号パンフレットに記載の抗ＰＤ−１抗体である。ＡＭＰ−２２４はＢ７−ＤＣＩｇとも呼ばれ、国際公開第２０１０／０２７８２７号及び第２０１１／０６６３４２号パンフレットに記載のＰＤＬ２−Ｆｃ融合可溶性受容体である。
【０２１４】
本明細書において提供される方法で標的とすることができる別の免疫チェックポイントは、ＣＤ１５２としても知られる細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）である。ヒトＣＴＬＡ−４の完全なｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｌ１５００６を有する。ＣＴＬＡ−４はＴ細胞の表面にあり、抗原提示細胞の表面のＣＤ８０又はＣＤ８６に結合すると「オフ」スイッチとして機能する。ＣＴＬＡ４は、ヘルパーＴ細胞の表面に発現し、抑制シグナルをＴ細胞に伝達する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ４はＴ細胞共刺激タンパク質ＣＤ２８に似ており、両方の分子が抗原提示細胞上のＣＤ８０及びＣＤ８６（それぞれＢ７−１及びＢ７−２とも呼ばれる）に結合する。ＣＤ２８は刺激シグナルを伝達するのに対し、ＣＴＬＡ４はＴ細胞に抑制シグナルを伝達する。細胞内ＣＴＬＡ４は調節性Ｔ細胞にも見られ、その機能に重要である可能性がある。Ｔ細胞受容体及びＣＤ２８を介したＴ細胞の活性化により、Ｂ７分子の抑制性受容体であるＣＴＬＡ−４の発現が増加する。
【０２１５】
いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体）、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質、又はオリゴペプチドである。
【０２１６】
本方法での使用に適した抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体（又はそれに由来するＶＨ及び／又はＶＬドメイン）は、当技術分野で周知の方法を使用して作製することができる。あるいは、当技術分野で承認されている抗ＣＴＬＡ−４抗体を使用することができる。例えば、米国特許第８，１１９，１２９号明細書、国際公開第０１／１４４２４号、国際公開第９８／４２７５２号パンフレット；国際公開第００／３７５０４号パンフレット（ＣＰ６７５，２０６、トレメリムマブとしても知られている；以前はチシリムマブ）、米国特許第６，２０７，１５６号明細書；Hurwitz et al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(17):10067-10071;Camacho et al.(2004)J Clin Oncology 22(145):Abstract No.2505(antibody CP-675206)；及びMokyr et al.(1998)Cancer Res 58:5301-5304に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体を、本明細書に開示される方法で使用することができる。前述の刊行物のそれぞれの教示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＣＴＬＡ−４への結合について、これらの技術分野で承認されている抗体のいずれかと競合する抗体も使用することができる。例えば、ヒト化ＣＴＬＡ−４抗体は、国際特許出願第２００１０１４４２４号、第２００００３７５０４号パンフレット、及び米国特許第８，０１７，１１４号明細書に記載されており、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１７】
例示的な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１及びＹｅｒｖｏｙ（登録商標）としても知られる）又はそれらの抗原結合フラグメント及び変異体（例えば、国際公開第０１／１４４２４号パンフレットを参照されたい）である。他の実施形態において、抗体は、イピリムマブの重鎖及び軽鎖のＣＤＲ又はＶＲを含む。したがって、一実施形態において、抗体は、イピリムマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにイピリムマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態において、抗体は、上記の抗体と同じＣＴＬＡ−４上のエピトープとの結合及び／又はそれに対する結合に競合する。別の実施形態において、抗体は、上記の抗体と少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列同一性（例えば、イピリムマブと少なくとも約９０％、９５％又は９９％の可変領域同一性）を有する。
【０２１８】
ＣＴＬＡ−４を調節するための他の分子には、米国特許第５８４４９０５号、第５８８５７９６号明細書、及び国際特許出願番号第１９９５００１９９４号及び第１９９８０４２７５２号パンフレットなどに記載のＣＴＬＡ−４リガンド及び受容体が含まれ、（これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）、ならびに参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８３２９８６７号明細書などに記載のイムノアドヘシンが含まれる。
【０２１９】
（４．外科手術）
がん患者の約６０％は、予防的、診断的又は病期分類的、治癒的、緩和的な外科手術を含む何らかの種類の外科手術を受ける。治癒的外科手術は、がん性組織の全部又は一部が物理的に除去、切除、及び／又は破壊される摘出術を含み、本実施形態の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法及び／又は代替療法などの他の療法と組み合わせて使用することができる。腫瘍摘出術とは、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを指す。腫瘍摘出術に加えて、外科手術による治療には、レーザー外科手術、凍結外科手術、電気外科手術、及び顕微鏡制御外科手術（モース術）が含まれる。
【０２２０】
がん性細胞、組織又は腫瘍の一部又は全部を切除すると、体内に空洞が形成される場合がある。治療は、灌流、直接注射、又は追加の抗がん療法を伴う領域の局所適用によって達成することができる。そのような治療は、例えば、１、２、３、４、５、６もしくは７日ごと、又は１、２、３、４、及び５週間ごと、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２ヶ月ごとに繰り返され得る。これらの治療法は、投与量もさまざまであり得る。
【０２２１】
（５．その他の薬剤）
治療の治療有効性を改善するために、他の薬剤を本実施形態の特定の態様と組み合わせて使用可能であることが企図される。これらの追加の薬剤には、細胞表面受容体及びギャップ結合のアップレギュレーションに影響を与える薬剤、細胞増殖抑制剤及び分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導物質に対する過剰増殖細胞の感受性を高める薬剤、又は他の生物学的薬剤が含まれる。ギャップ結合の数を増やすことによる細胞間シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増加させる。他の実施形態において、治療の抗過剰増殖有効性を改善するために、細胞増殖抑制剤又は分化剤を、本実施形態の特定の態様と組み合わせて使用することができる。細胞接着の阻害剤は、本実施形態の有効性を改善することが企図されている。細胞接着阻害剤の例は、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤及びロバスタチンである。治療有効性を改善するために、抗体ｃ２２５などの、アポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を増加させる他の薬剤を、本実施形態の特定の態様と組み合わせて使用可能であることがさらに企図される。
【０２２２】
（ＩＶ．製品又はキット）
免疫細胞を含む製品又はキットも本明細書で提供される。製品又はキットは、免疫細胞を使用して個体のがんを治療又は進行を遅延させるため、又はがんを有する個体の免疫機能を増強するための説明書を含む添付文書をさらに含むことができる。本明細書に記載の抗原特異的免疫細胞はすべて、製品又はキットに含めることができる。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、バッグ及び注射器が挙げられる。容器は、ガラス、プラスチック（ポリ塩化ビニル又はポリオレフィンなど）、又は金属合金（ステンレス鋼又はハステロイなど）などのさまざまな材料から形成することができる。いくつかの実施形態において、容器は製剤を保持し、容器上の又はそれに関連するラベルは、使用のための指示を示すことができる。製品又はキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器、及び使用説明書を含む添付文書を含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、製品は、１又は複数の別の薬剤（例えば、化学療法剤及び抗腫瘍剤）をさらに含む。１又は複数の薬剤に適した容器には、例えば、ボトル、バイアル、バッグ及び注射器が含まれる。
【実施例】
【０２２３】
［Ｖ．実施例］
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明者により本発明の実施において良好に機能することが発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましい様式を構成すると見なし得ることが当業者により理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示された特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、なおかつ本発明の精神及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
【実施例１】
【０２２４】
［ＣＩＳＨがノックアウトされたＣＡＲ  ＮＫ細胞］
ＮＫ細胞を、３つの異なる臍帯血（ＣＢ）ユニットからネガティブセレクションによって単離し、増殖させた。次に、ＮＫ細胞にＣＡＲ構築体を形質導入し、ＣＩＳＨ  ＫＯを各ＣＢに対して異なる時点で実施した。各ＣＢユニットに関して、ＮＴ、ＮＴ  ＣＩＳＨ  ＫＯ、ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５、及びＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＣＩＳＨ  ＫＯを含む、４つの異なる細胞グループを得た。
【０２２５】
具体的には、１日目に、ＮＫをネガティブセレクションを使用して単離し、照射されたＡＰＣ（表面に４１ＢＢ及びＩＬ−２１を発現するＫ５６２）と１：２の比率（ＮＫ：ＡＰＣ）で、ＩＬ−２  ２００ユニット／ｍｌのＳＣＧＭにおいて共培養した。培地は２日ごとに新鮮なＳＣＧＭ及びＩＬ−２  ２００ユニット／ｍｌに交換した。
【０２２６】
５日目に、ＮＫ細胞を再選択し、純粋なＮＫ細胞を得て、ＣＡＲ形質導入を実施した。この時点では、非形質導入細胞（ＮＴ）とＣＡＲ  ＮＫ細胞との両方が存在していた。ＣＡＲ形質導入効率は、形質導入の３日後に測定した。
【０２２７】
７日目に、照射されたＡＰＣを追加して、ＮＫ細胞（ＮＴとＣＡＲ  ＮＫとの両方）を再増殖させた。ＮＫ細胞は、ＩＬ−２  ２００Ｕ／ｍｌを含むＳＣＧＭにおいて培養した。培地は２日ごとに新鮮なＳＣＧＭ及びＩＬ−２  ２００Ｕ／ｍｌに交換した。
【０２２８】
１４日目に、ネオンエレクトロポレーションを使用して、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９をＣＡＲ  ＮＫ細胞のＣＩＳＨ  ＫＯに使用した。２つのｓｇＲＮＡを、ＣＩＳＨ遺伝子のエクソン４を標的として設計した。エレクトロポレーションの約１５〜３０分前に、Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとを、１０ｕｇのＣａｓ９と１０ｕｇのｓｇＲＮＡ（５０００ｎｇのｓｇＲＮＡ＃１及び５０００ｎｇのｓｇＲＮＡ＃２）との１：１反応で室温においてインキュベートした。インキュベーション産物（すなわち、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９とが一緒に結合したもの）を、１００ｕＬのエレクトロポレーションチップを用いて１００〜２００万個の細胞にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション条件は、Ｔバッファーを使用して１６００Ｖ、１０ｍｓ、３パルスであった。異なる細胞調製物（エレクトロポレーションされたＣＡＲ  ＮＫ細胞、対照ＣＡＲ  ＮＫ細胞及びＮＴ  ＮＫ細胞）を、照射されたＡＰＣと１：２の比率（ＮＫ：ＡＰＣ）でＩＬ−２  ２０Ｕ／ｍＬを含むＳＣＧＭにおいて共培養した。培地は２日ごとに新鮮なＳＣＧＭ及びＩＬ−２  ２００Ｕ／ｍｌに交換した。１５日目に、ＰＣＲを実施して、ＫＯ効率をチェックした。
【０２２９】
最後に、２１日目に機能研究を実施した。４つのグループの細胞を、ＢＦＡを含む９６ウェルプレートでＲａｊｉと２：１の比率で６時間共培養した。次に、サイトカイン産生（ＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＣＤ１０７α）を比較するために染色を行い、フローサイトメトリーによって評価した。２１日目にクロム放出アッセイを実施して、各ＣＢの４つの異なる細胞群の細胞傷害性を比較した。統計分析は、ボンフェローニ検定を使用した多重比較を伴う二元配置分散分析を使用して行った。
【０２３０】
ＮＫ細胞の遺伝子編集はＴ細胞の遺伝子編集よりも困難である。Ｔ細胞とは異なり、ＮＫ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで十分に増殖するためにフィーダー細胞を必要とするため、遺伝子編集のプロセスがより複雑になる。ＮＫ細胞はまた、より壊れやすく、遺伝子操作後の生存率が低いことが歴史的に知られている。ＣＡＲ形質導入及びＣＩＳＨ  ＫＯ後の現在の生存率は９５％超であった。
【実施例２】
【０２３１】
［ＮＫ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ特性評価］
ＣＩＳＨ  ＫＯされたＣＡＲ  ＮＫ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで特性評価するために、１０週齢のＮＳＧヌルの雌マウスを研究した。マウスに２０ｘ１０３のＲａｊｉ−ＦＦＬｕｃ細胞を注射した。エフェクター細胞については、以下のグループに応じて、細胞＃１〜細胞＃３を、３ｘ１０６又は１０７細胞／動物を注射した。
【０２３２】
グループカテゴリー：１群あたり５匹のマウスで７群、合計３５匹のマウス、
−グループ＃１：Ｒａｊｉ−ＦＦＬｕｃ単独
−グループ＃２：Ｒａｊｉ−ＦＦＬｕｃ＋細胞＃１  ３ｘ１０６細胞／動物
−グループ＃３：Ｒａｊｉ−ＦＦＬｕｃ＋細胞＃１  １０７細胞／動物
−グループ＃４：Ｒａｊｉ−ＦＦＬｕｃ＋細胞＃２  ３ｘ１０６細胞／動物
−グループ＃５：Ｒａｊｉ−ＦＦＬｕｃ＋細胞＃２  １０７細胞／動物
−細胞＃１：ＮＫＣＡＲ１９  ｃａｓ９＋エレクトロポレーション
−細胞＃３：ＮＫＣＡＲ１９  ＣＩＳＨ  ＫＯ
【０２３３】
マウスに、Ｒａｊｉ細胞を単独で、又はＣＡＲ  ＮＫ細胞と組み合わせて投与した。ＣＡＲ  ＮＫ細胞は野生型、ｃａｓ９のみ、又はＣＩＳＨがノックアウトされていた。ＣＩＳＨノックアウトＣＡＲ  ＮＫ細胞を投与されたマウスは生存率が高く、Ｒａｊｉリンパ腫のエビデンスを示さず、ＣＲＳを示さなかったことが見出された。ＣＩＳＨノックアウトＮＫ細胞はｉｎ  ｖｉｖｏでもより長く持続し、注入後７週間まで検出することができた。
【実施例３】
【０２３４】
［ＣＩＳチェックポイントの欠失は、臍帯血由来のＣＡＲ形質導入ナチュラルキラー細胞の適合性を調節する］
ＣＩＳ欠損ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能の増強：ＣＩＳの発現レベルを評価して、ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＣＢ−ＮＫ細胞が、非改変ＮＫ細胞においてサイトカインシグナル伝達を生理学的にダウンレギュレートする同じ逆調節回路にさらされているかどうかを判断した。ＣＢ−ＮＫ細胞を、ＩＬ−２の存在下で、膜結合型ＩＬ２１、４−１ＢＢリガンド及びＣＤ４８（ｕＡＰＣ）を発現するように操作されたＫ５６２フィーダー細胞株とともに２１日間培養した。ＮＫ細胞に、材料及び方法に記載されている、ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５を発現するレトロウイルスベクターを＋４日目に形質導入したか、又は形質導入しなかった（ＮＴ、対照）。ＣＩＳの発現は、時間の経過とともに、ＮＴ対照及びｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＣＢ−ＮＫ細胞のインビトロ増殖中に有意に増加した（図７Ａ）。特に、ＣＩＳの発現レベルは、おそらくＣＩＳ導入に対するＩＬ−１５の追加の効果のために、ＮＴ  ＣＢ−ＮＫ細胞と比較して、ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５においてより顕著であった（図７Ａ）。
【０２３５】
次に、ＣＩＳＨ欠失の機能的影響を、ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＣＢ−ＮＫ細胞で調べた。ＣＩＳはＮＫ細胞の強力な免疫チェックポイントであるため、ＣＩＳＨ遺伝子をノックアウトすると、Ｔ細胞のＰＤ−１遮断と同様にエフェクター機能を強化することができるという仮説を立てた。このアイデアを試験するために、ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ１５構築体のレトロウイルス形質導入とＣａｓ９リボ核タンパク質（Ｃａｓ９  ＲＮＰ）媒介遺伝子編集とを組み合わせてＣＩＳＨをサイレンシングするプロトコルを最初に開発した。７日目に、ＣＡＲを形質導入されたＮＫ細胞に、Ｃａｓ９単独（Ｃａｓ９モック）、又はＣＩＳＨエクソン４を標的とするｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡデュプレックスがプリロードされたＣａｓ９（ＣＩＳＨ  ＫＯ）をヌクレオフェクトした（図７Ａ−Ｂ）。７日目のｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５形質導入効率及び細胞生存率は９０％を超え、経時的に安定したままであった（図１３）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（図７Ａ）及びウエスタンブロット分析（図７Ｂ）によって評価したＣＩＳＨ  ＫＯ効率は、ＮＴ及びＣＡＲ発現ＮＫ細胞の両方において８０％を超えていた。これらの発見は、サンガーシーケンシングによっても確認された（図７Ｃ）。
【０２３６】
ＮＫ細胞の抗腫瘍活性に対するＣＩＳＨ  ＫＯの効果を決定するために、ＮＴ及びｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＣＢ−ＮＫ細胞の応答を、非標的ｇＲＮＡと結合したＣａｓ９（対照）、又はＣＩＳＨ遺伝子を標的とするｇＲＮＡと結合したＣａｓ９（ＣＩＳＨ  ＫＯ）をエレクトロポレーションした７日後に、Ｒａｊｉリンパ腫細胞標的に対して試験した。ＣＩＳＨ  ＫＯ  ＣＡＲ．ＮＫ細胞は、有意に大量のＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを産生し、脱顆粒の増強（ＣＤ１０７ａ）を示し、それぞれＮＴ又はｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５対照と比較してＲａｊｉに対してより大きな細胞傷害性を示した（図８Ａ〜８Ｃ）。特に、すべてのグループの中で、ＣＩＳＨ  ＫＯ  ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＣＢ−ＮＫ細胞は、最も多くのサイトカイン産生及びＲａｊｉ標的に対する細胞傷害性を示し、ＣＡＲ形質導入とＣＩＳＨサイレンシングとを組み合わせるとＮＫ細胞機能が増強されるという考えを裏付けた（図８Ａ〜８Ｃ）。
【０２３７】
次に、ＣＩＳＨ  ＫＯが、ＮＴ又はｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞とＲａｊｉ細胞との間の免疫シナプス（ＩＳ）形成に及ぼす影響を調べた。微小管形成中心（ＭＴＯＣ）の分極は、対照と比較してＭＴＯＣからＩＳまでの距離が短縮されたことによって反映されるように、ＣＩＳＨ  ＫＯによって増加された（図８Ｅ）。まとめると、これらの発見は、ＣＩＳＨ  ＫＯがＮＫ細胞（ＮＴ及びｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５）と腫瘍細胞との間の免疫シナプスを強化することを示唆しており、これはエフェクター機能及び細胞傷害性の増加と相関する。
【０２３８】
ＣＩＳＨ  ＫＯ  ＮＴ及びｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５形質導入ＮＫ細胞の表現型及び分子シグネチャー：ＮＫ細胞のＣＩＳＨ  ＫＯが腫瘍細胞に対する機能を高めるメカニズムを理解するために、飛行時間によるサイトメトリー（ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｂｙ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ）（ＣｙＴｏＦ）を使用した。抑制性及び活性化受容体に対する３２の抗体のパネル、ならびに分化、ホーミング、及び活性化マーカーにより、それらの表現型組成に関する洞察を得ることができる。ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞のＣＩＳＨ  ＫＯは、グランザイムＢ、パーフォリン、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ３ｚ、転写因子、Ｅｏｍｅｓ、Ｔ−ｂｅｔ、ＤＡＰ１２などのアダプター分子を含む細胞傷害性マーカーの発現が有意に高い機能的表現型を誘導し、ならびに対照の対応物と比較してＤＮＡＭ、ＣＤ２５及びＫｉ６７などの共受容体／増殖マーカーを活性化した（図９Ａ）。同様に、ＮＴ  ＮＫ細胞におけるＣＩＳＨの欠失は、対照のＮＴ  ＮＫ細胞と比較して、いくつかの活性化マーカーのアップレギュレーションをもたらした（図１４Ａ）。ｖｉＳＮＥ、ｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔＳＮＥ）アルゴリズムを使用して、ＣＩＳＨ  ＫＯ後のこれらの活性化ＮＫ細胞マーカーをさらに分析し、優勢に活性化された表現型（ＣＤ２５、Ｋｉ６７、ＣＤ３ｚ、パーフォリン及びグランザイム−ｂの発現の増加）がＣＩＳＨ  ＫＯ  ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞を支配している、対照とＣＩＳＨ  ＫＯ  ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞との間のかなりの分離を観察した（図９Ｂ）。
【０２３９】
次に、ＣＩＳＨ  ＫＯ後のＮＫ細胞トランスクリプトームプロファイルをより深く理解するために、ＲＮＡシーケンシングを実施した。特に、結果は、ＣＩＳＨ  ＫＯと対照のｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞との間の全く異なる遺伝子発現プロファイルを明らかにした（図９Ｃ）。ＮＴ  ＮＫ細胞におけるＣＩＳＨ  ＫＯは、インターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）、及びＯＳＡ−１、ＯＳＡ−２を含むＳＴＡＴ−１に関連する限られた数の遺伝子のアップレギュレーションをもたらした（図１４Ａ〜１４Ｃ）。対照的に、ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞におけるＣＩＳＨ  ＫＯは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ活性化及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路に関連する複数の遺伝子のアップレギュレーションもたらした（図９）。
【０２４０】
ｉＣ９／ＣＡＲ１９／Ｉｌ−１５  ＮＫ細胞におけるＣＩＳＨ  ＫＯによって誘導される機能及び細胞傷害性の増加メカニズムの基礎をより深く理解するために、遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）を使用して、表現型に寄与する可能性のある遺伝子セット又は生物学的経路を特定した。分析により、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２／ＳＴＡＴ５及びＩＬ−６／ＳＴＡＴ３シグナル伝達、ならびに炎症反応に関連する遺伝子の濃縮が明らかになった（図９Ｆ）。この所見は、ＣＩＳＨ  ＫＯ  ｉＣ９／ＣＡＲ１９／Ｉｌ−１５  ＣＢ−ＮＫ細胞におけるＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ３、及びホスホリパーゼＣガンマ１（ＰＬＣｇ１）のリン酸化の増強を示すことにより、タンパク質レベルで確認された（図９Ｇ、Ｈ）。まとめると、これらのデータは、ＩＬ−１５がＣＩＳＨの活性化を駆動させ、ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞におけるＣＩＳＨ  ＫＯが、活性化された表現型と対応している分子シグネチャーを誘導することを示す。
【０２４１】
ＣＩＳＨ  ＫＯはｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞の代謝を再プログラムする：図１０Ａに示すように、ＲＮＡ  ｓｅｑデータとＧＳＥＡの結果は、ＣＩＳＨ  ＫＯがｍＴＯＲＣ１、低酸素症、解糖系遺伝子の濃縮をもたらすという新しい観察結果も示した。ｍＴＯＲＣ１の活性は、活性化されたＮＫ細胞の解糖系の再プログラミングに不可欠であり、エフェクターＮＫ細胞機能の前提条件として主張されている。したがって、ＣＩＳＨの欠失がｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞の代謝活性を調節するかどうかを決定することが求められた。ＣＩＳＨ  ＫＯは、ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞の代謝を調節し、酸素とグルコースの消費を増加させることにより、その細胞傷害活性を高めるという仮説を立てた。この仮説を試験するために、一連のＳｅａｈｏｒｓｅアッセイを実行してＮＫ細胞のエネルギー経路を測定し、Ｒａｊｉリンパ腫に応答して、ＣＩＳＨ  ＫＯ  ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞が、細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）がＣａｓ９対照ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞と比較して解糖予備能が高いことが示された。これらの機能データは、解糖系酵素のアップレギュレーションを示す創意工夫経路分析（ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＩＰＡ）によってさらに裏付けられた。さらに、ＣＩＳＨ  ＫＯ  ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞は、Ｒａｊｉ腫瘍細胞と３時間共培養したＣＡＲ−ＮＫ細胞の上清で実施したグルコース比色試験によって示されるように、Ｃａｓ９対照と比較して高いグルコース消費を示した。これは、ＣＩＳＨ  ＫＯが、グルコースを消費して解糖に利用するＣＡＲ−ＮＫ細胞の能力を高めることによって、それらの代謝活性を高めたことを示唆する。さらに、ＣＩＳＨ  ＫＯ  ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞は、Ｓｅａｈｏｒｓｅアッセイにより、対照ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞と比較して酸素消費率（ＯＣＲ）の増加を示した。これは、ＣＩＳＨ  ＫＯが、ＣＡＲ−ＮＫ細胞のミトコンドリア活性を活性化することによって、それらの代謝を高めることも示している。実際、一連の特殊な共焦点顕微鏡研究では、ミトコンドリアの数及びミトコンドリア／核の体積比が、Ｃａｓ９対照と比較してｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＣＩＳＨ  ＫＯ細胞で有意に高いことが観察された（図１０）。
【０２４２】
これらのデータに基づいて、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ活性化を増加させることにより、ＣＩＳＨ  ＫＯはＭＴＯＲＣ１活性の増強とＨｉＦ１ａ活性のアップレギュレーションを引き起こし、解糖能力及びＮＫ細胞の適合性を高めるという仮説を立てた。実際、Ｒａｊｉ細胞と２時間共培養した後、ｍＴＯＲ１経路活性化の下流標的であるリボソームタンパク質Ｓ６（Ｓ６）のリン酸化は、Ｃａｓ９対照と比較してＣＩＳＨ  ＫＯ  ｉＣ９／ＣＡＲ１９／Ｉｌ−１５で有意に高かったことがわかった。
【０２４３】
ＣＩＳチェックポイント破壊とｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５操作との組み合わせにより、Ｒａｊｉリンパ腫マウスモデルの腫瘍制御と生存が改善される：侵攻性Ｒａｊｉラジリンパ腫ＮＳＧマウスモデル（図１１Ａ）を使用して、ＣＩＳＨ  ＫＯ  ＣＢ−ＮＫ細胞の養子移入がｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍制御を増強する可能性があるかどうかを調査した。最初に、マウスは、Ｃａｓ９（Ｃａｓ９  ＣＴＲＬ）をエレクトロポレーションされたか、又はＣＩＳＨ  ＫＯを有するかのいずれかの対照ＮＴ  ＣＢ−ＮＫ細胞の１回の静脈内注入（１０ｘ１０６／マウス）を受けた（５匹のマウス／群）。腫瘍の成長を、腫瘍生物発光イメージング（ＢＬＩ）の経時変化を使用して監視した。腫瘍量は時間とともに増加し、グループ間で生存率に有意差はなかった（図１１Ｂ〜Ｃ）。これは、ＣＡＲ形質導入がない場合、ＣＩＳＨ  ＫＯがＲａｊｉ  腫瘍に対してＮＫ細胞の活性を増強しないことを示唆している。次に、ＣＩＳＨ  ＫＯのｉｎ  ｖｉｖｏ効果を、ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞の抗腫瘍活性について調べた。ＣＩＳＨ  ＫＯ  ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５細胞は、低いＥ：Ｔ比でも標的腫瘍細胞を殺滅するのにより強力であるため、より低い注入量で腫瘍の制御により効果的であるという仮説を立てた。実際、わずか３ｘ１０６個の細胞を注入すると、ＣＩＳＨ  ＫＯ  ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞は、対照ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＣＢ−ＮＫ細胞と比較して、Ｒａｊｉリンパ腫の生存と制御を大幅に改善したが、最終的にマウスは４６日後に腫瘍により死亡した（図１１Ｅ〜Ｇ）。高用量の１０ｘ１０６ＣＡＲ−ＮＫ細胞を注入した場合、ＣＩＳＨ  ＫＯ細胞を投与されたグループは、ＢＬＩ（図１１）又は病理学による腫瘍のエビデンスを示さず、対照（ＣＴＲＬ）ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＣＢ−ＮＫ細胞と比較して生存期間が最大３４１日間著しく延長された（図１１Ｅ〜Ｈ、１６）。これは、対照ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＣＢ−ＮＫ細胞を投与された動物と比較して、ＣＩＳＨ  ＫＯ  ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５を投与されたマウスにおけるＮＫ細胞の持続性の改善と関連していた（図１１Ｄ）。注目すべきことに、ＣＩＳＨ  ＫＯは、体重減少などの、マウスにおける毒性増加の兆候とは関連していなかった（図１１Ｉ）。総合すると、これらのデータは、ＣＩＳＨのサイレンシングにより、ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＣＢ−ＮＫ細胞が毒性を増加させることなく、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ制御を発揮する能力が改善されたことを示す。
【０２４４】
再発／難治性Ｂ細胞悪性腫瘍に対する既製のＣＩＳＨ  ＫＯ  ｉＣ９／ＣＡＲ１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞の臨床応用（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）：ＣＩＳＨ  ＫＯ  ＣＡＲ．ＮＫ細胞で処置されたマウスでは、ｉｎ  ｖｉｖｏ毒性の増加は見られなかったが、ＩＬ−１５シグナル伝達の増強は、炎症性サイトカインの放出を増加させる可能性がある。したがって、誘導性カスパーゼ９（ｉＣ９）を構築体の自殺遺伝子として使用して、ＣＩＳＨ  ＫＯ  ＣＡＲ形質導入ＮＫ細胞が小分子二量体ＡＰ１９０３の存在下でアポトーシスを起こすように誘導できることを確認した。ｉＣ９／ＣＡＲ．１９／ＩＬ−１５  ＮＫ細胞の培養物にわずか１０ｎＭのＡＰ１９０３を添加すると、４時間以内に形質導入ＮＫ細胞のアポトーシスが誘導され、ＣＩＳＨ  ＫＯは二量体の作用に影響を与えなかった（図１７Ａ）。自殺遺伝子はまた、ＣＩＳＨ  ＫＯ及び対照のｉＣ９／ＣＡＲ．１９／ＩＬ−１５  ＣＢ−ＮＫ細胞の両方においてｉｎ  ｖｉｖｏでＣＡＲ細胞を排除するのに有効であった（図１６Ｂ）。Ｒａｊｉ腫瘍を移植したマウスに、対照又はＣＩＳＨ  ＫＯのｉＣ９／ＣＡＲ．１９／ＩＬ−１５  ＣＢ−ＮＫ細胞のいずれかを投与し、ＮＫ注入後７日目及び９日目に二量体で処置した（ｎ＝５匹のマウス／グループ）。その後、１２日目に動物を屠殺した。小分子二量体の投与は、処置されたマウスの血液及び組織（肝臓、脾臓及び骨髄）においてｉＣ９／ＣＡＲ．１９／ＩＬ−１５  ＣＢ−ＮＫ細胞（対照及びＣＩＳＨ  ＫＯの両方）の著しい減少をもたらした（図１７Ｂ−Ｃ）。
【０２４５】
このアプローチを臨床に持ち込む前に、オフターゲットＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ＲＧＮ）の挿入／欠失（ＩＮＤＥＬ）を特定することが重要である。したがって、ＧｕｉｄｅＳｅｑ及びＲｈａｍｐｓｅｑ技術を使用して、実験で使用した特異的ＣＩＳＨガイドＲＮＡのオフターゲット効果を評価した。Ｃａｓ９ヌクレアーゼを構成的に発現するＨＥＫ２９３細胞を使用したＧｕｉｄｅＳｅｑ実験により、ＣＩＳＨ遺伝子座を標的とする両方のｃｒＲＮＡの複数の潜在的なオフターゲット部位が特定され、ｃｒＲＮＡ２ではさらに高い頻度のオフターゲットイベントが認められた（図１２Ａ−Ｂ）。
【０２４６】
要約すると、これは、臍帯血由来のＮＫ細胞におけるＣＡＲ形質導入とチェックポイント遮断とを組み合わせた遺伝子工学戦略の最初の報告である。このＮＫ細胞治療製品は既製であり、低用量でもＣＤ１９＋腫瘍細胞を排除するのに安全かつ強力である。
【実施例４】
【０２４７】
［材料及び方法］
細胞株及び培地：Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫細胞株）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａ、ＶＡ、ＵＳＡ）から購入した。Ｋ５６２系のフィーダー細胞をレトロウイルスにより形質導入して、４−１ＢＢＬ、ＣＤ４８、及び膜結合型ＩＬ−２１  ９ｕＡＰＣを共発現させた。インビボ実験に使用されたホタルルシフェラーゼ形質導入Ｒａｊｉ（Ｒａｊｉ−ＦＦＬＵＣ）細胞は、Ｄｒ．Ｇｉａｎｐｉｅｔｒｏ  Ｄｏｔｔｉ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）のご厚意により提供された。
【０２４８】
すべての細胞株は、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン及び１％Ｌ−グルタミンを添加したロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地で培養した。ＮＫ細胞は、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン及び１％Ｌ−グルタミンを添加した幹細胞増殖培地（ＳＣＧＭ）で培養した。
【０２４９】
臍帯血ＮＫ細胞の増殖：研究用のＣＢユニットはＭＤアンダーソンがんセンターＣＢバンクから提供された。ＣＢは、密度勾配法（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）によって単離した。ＮＫ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で精製したＣＤ５６＋ＮＫ細胞を、照射（１００Ｇｙ）ｕＡＰＣ（２：１フィーダー細胞：ＮＫ比）と組換えヒトＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、２００Ｕ／ｍｌ；Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）とで完全幹細胞増殖培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ  ＧｍｂＨ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において０日目に刺激した。活性化されたＮＫ細胞を、＋４日目にヒトフィブロネクチンコーティングプレート（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）においてレトロウイルス上清で形質導入した。＋７日目及び＋１４日目に、ＮＫ細胞を照射ｕＡＰＣとＩＬ−２とで再度刺激した。＋２１日目に、ＣＡＲ形質導入ＮＫ細胞を収集して使用した。
【０２５０】
レトロウイルスのトランスフェクション及び形質導入：ｉＣ９．ＣＡＲ１９．ＣＤ２８−ｚｅｔａ−２Ａ−ＩＬ−１５をコードするレトロウイルスベクターは以前に記載されている（Ｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。一過性のレトロウイルス上清を、以前に記載されているように作製した（Ｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。活性化されたＮＫ細胞を、＋４日目にヒトフィブロネクチンコーティングプレート（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）においてレトロウイルス上清で形質導入した。３日後（＋７日目）、ＣＡＲ形質導入効率をフローサイトメトリーで測定し、ＮＫ細胞を照射ｕＡＰＣとＩＬ−２とで再度刺激した。
【０２５１】
ＣＩＳＨのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集：ＣＩＳＨ  ＫＯを、ＮＴ及びＣＡＲ形質導入ＮＫ細胞の両方で、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を使用して＋７日目に実行した。ＣＩＳＨ遺伝子のプロトスペーサー配列を、ＣＲＩＳＰＲｓｃａｎを使用して同定した（Ｍｏｒｅｎｏ−Ｍａｔｅｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ｇＲＮＡのＤＮＡテンプレートは、Ｌｉらによって記載されたプロトコルを使用して作製した。２つのｇＲＮＡを、ＣＩＳＨ遺伝子のエクソン４を標的として使用した：ｇＲＮＡ１：ＡＧＧＣＣＡＣＡＴＡＧＴＧＣＴＧＣＡＣＡ（配列番号１）、ｇＲＮＡ２：ＴＧＴＡＣＡＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧ（配列番号２）。Ｃａｓ９タンパク質（ＰＮＡ  ｂｉｏ）とｇＲＮＡとを、１０ｕｇのＣａｓ９と１０ｕｇのｇＲＮＡ（５０００ｎｇのｓｇＲＮＡ＃１及び５０００ｎｇのｓｇＲＮＡ＃２）との１：１反応で室温において１５分間インキュベートした。次に、インキュベーション産物（ｇＲＮＡとＣａｓ９が結合）を、ネオントランスフェクションシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して１００万〜２００万個のＮＴ又はＣＡＲ形質導入のＮＫ細胞にエレクトロポレーションするために使用した。最適化されたエレクトロポレーション条件は、Ｔバッファーを使用して、１６００Ｖ、１０ｍｓ、３パルスであった。次に、さまざまな細胞調製物を、照射ｕＡＰＣと１：２の比率（ＮＫ：ｕＡＰＣ）でＩＬ−２  ２００Ｕ／ｍｌを含むＳＣＧＭ培地において共培養した。
【０２５２】
リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ  Ｑ−ＰＣＲ）：ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して全ＲＮＡを単離し、ＲｅａｄｙＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成ミックス（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を使用して、製造業者の指示書に従ってｃＤＮＡ合成を行った。ＰＣＲ反応を、２０μＬ：１０μＬのＴａｑＭａｎ  ２Ｘ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、１μＬのＣＩＳＨ  ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、２μＬのｃＤＮＡ、及び７μＬのヌクレアーゼ非含有水で行った。プライマー配列及びＰＣＲ条件は記載されている（Ｋｏｌｅｓｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。リアルタイムＱ−ＰＣＲを、ＡＢＩ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実行した。ｍＲＮＡレベルを、増幅された各ＰＣＲフラグメントに対応するオリゴヌクレオチドの段階希釈を使用し、７５００  Ｆａｓｔ  ｖ２．３ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して作成された標準曲線に対して定量化した。相対発現を、目的の各遺伝子の量をハウスキーピング遺伝子１８Ｓに対して正規化することによって決定した。
【０２５３】
ウエスタンブロット：ＮＫ細胞を１０μＭのＭＧ１３２で４時間前処理して、プロテアソームの分解を遮断した。次に、ＮＫ細胞をプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡフリーカクテルタブレット、Ｒｏｃｈｅ  Ｈｏｌｄｉｎｇ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を添加した溶解バッファー（ＩＰ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で溶解し、氷上で３０分間インキュベートした。タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって決定した。以下の一次抗体を使用した：ＣＩＳ抗体（クローンＤ４Ｄ９）及びＢ−アクチン抗体（クローン８Ｈ１０Ｄ１０）、両方の抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。
【０２５４】
ＰＣＲ及びサンガーシーケンシングを使用した対立遺伝子改変頻度の測定：ＣＡＲを形質導入してｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させたＮＴ  ＮＫ細胞（対照及びＣＩＳＨ  ＫＯ条件）からＤＮＡを抽出及び精製した（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。標的遺伝子座の増幅に使用したＰＣＲプライマーは以下のとおりである。
エクソン４フォワードプライマー：ＣＧＴＣＴＧＧＡＣＴＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴ（配列番号７）
エクソン４リバースプライマー：ＧＴＡＣＡＡＡＧＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴ（配列番号８）
【０２５５】
精製したＰＣＲ産物を、両方のＰＣＲプライマーを使用したＭＤアンダーソンのコア施設のサンガーシーケンシングに送り、各配列のクロマトグラムが分析された。
【０２５６】
機能アッセイ：培養の１４日目又は２１日目に、１００×１０３細胞／ウェルの対照ｅｘ  ｖｉｖｏ増殖ＮＴ（対照又はＣＩＳＨ  ＫＯ）及びＣＡＲ１９／Ｉｌ−１５  ＮＫ細胞（対照又はＣＩＳＨ  ＫＯ）を、ブレフェルジンＡの存在下で６時間、Ｒａｊｉ細胞又はＫ５６２標的（ポジティブ対照）を２：１のエフェクター：標的細胞比（Ｅ：Ｔ）で含む丸底９６ウェルプレートにおいて共培養した。脱顆粒を測定するために、ＣＤ１０７ａ抗体（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ７８５（商標）抗ヒトＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ−１）抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を共培養の開始時にウェルに添加した。ＣＤ１０７ａ及び細胞内サイトカイン産生（ＴＮＦα（ＴＮＦアルファモノクローナル抗体（ＭＡｂ１１）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びＩＦＮ−γ（ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｖ４５０マウス抗ヒトＩＦＮ−γ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって測定された脱顆粒を、以前に記載されているフローサイトメトリー（Ｒｏｕｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）によって評価した。
【０２５７】
クロム放出アッセイ：細胞傷害性を評価するために、ｅｘ−ｖｉｖｏ増殖ＮＴ  ＮＫ細胞（対照及びＣＩＳＨ  ＫＯ）及びＣＡＲ形質導入ＮＫ細胞（対照及びＣＩＳＨ  ＫＯ）を、５１Ｃｒ標識Ｒａｊｉ標的と、複数のＥ：Ｔ比で共培養した。細胞傷害性を、以前に記載されたように（Ｒｏｕｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、５１Ｃｒ放出によって測定した。
【０２５８】
免疫シナプスを研究するための共焦点顕微鏡法：上記のように、０．５ｘ１０６のエフェクター細胞を、１０％の熱不活化ＦＢＳを含有する２５０ｍｌのＳＣＧＭ培地中で０．２５ｘ１０６のＲａｊｉ細胞と３７℃において４０分間結合させ、他の場所で示されているように（Ｂａｎａｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）染色した。簡単に説明すると、インキュベーション後、細胞をポリ−Ａ−リジンでコーティングしたスライド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に接着し、目的のタンパク質を染色した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識アフィニティー精製Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を使用して、ＣＡＲを検出した。抗ＣＤ１９  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ（ＡＦ）４８８（クローンＨＩＢ１９、ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｆ−アクチン検出用のファロイジンＡＦ  ５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び抗パーフォリン４８８（クローンδＧ９；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用した。結合体を退色防止剤含有媒体（Ｐｒｏｌｏｎｇ  ｇｏｌｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に載せ、Ｚｙｌａ  ４．２ｓＣＭＯＳカメラを搭載した横河スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して６３倍の対物レンズで順次スキャンして画像化した。画像を、定量測定のためにＩｍａｒｉｓ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）にエクスポートした。パーフォリン重心からシナプスまでの距離は、前述のように測定する。
【０２５９】
（マスサイトメトリー）
抗体コンジュゲーション：３８個の金属タグ付き抗体で構成されるパネルを使用して、ＮＫ細胞の詳細な特性評価を行った。対応する金属タグ同位体を有する抗体のリスト。非標識抗体はすべて無担体の形で購入し、製造業者の指示（Ｆｌｕｄｉｇｍ）に従って、Ｍａｘｐａｒ  Ｘ８ポリマーを使用して、社内で対応する金属タグと結合させた。塩化インジウム（ＩＩＩ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を除いて、すべての金属同位体はＦｌｕｄｉｇｍから入手した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用してＡ２８０タンパク質の量を測定することにより、抗体濃度を決定した。次に、結合した抗体を、ＰＢＳベースの抗体安定化溶液又は０．０５％アジドナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加したＬｏｗＣｒｏｓｓ−Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃａｎｄｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ、Ｗａｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。連続滴定実験を実施して、各抗体の最適なシグナル対ノイズ比で濃度を決定した。
【０２６０】
サンプルの調製と取得：ＮＴ  ＮＫ細胞（対照又はＣＩＳＨ  ＫＯ）及びＣＡＲ形質導入ＮＫ細胞（対照又はＣＩＳＨ  ＫＯ）を回収し、細胞染色バッファー（０．５％ウシ血清アルブミン／ＰＢＳ）で２回洗浄し、５μｌのヒトＦｃ受容体ブロッキング溶液（Ｔｒｕｓｔａｉｎ  ＦｃＸ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と室温で１０分間インキュベートした。次に、細胞を、細胞表面マーカーに対する新たに調製した抗体混合物で、シェーカー（１００ｒｐｍ）上で室温において３０分間染色した。インキュベーションの最後の３分間、細胞を２．５  μＭシスプラチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）とともにインキュベートし、細胞染色バッファーで２回洗浄し、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液を使用して４℃の暗所において３０分間固定／透過処理した。細胞を透過（ｐｅｒｍ）／洗浄バッファーで２回洗浄し、細胞内マーカーに対する抗体で染色し、追加の洗浄ステップの後、１２５ｎＭイリジウム核酸インターカレーター（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を含む５００μｌの１．６％パラホルムアルデヒド（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）／ＰＢＳに一晩保存した。翌日、サンプルを細胞染色バッファーで２回洗浄し、１ｍｌのＭｉｌｌｉＱ  ｄＨ２Ｏに再懸濁し、３５μｍのナイロンメッシュ（細胞ストレーナーキャップチューブ、ＢＤ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）でろ過してカウントした。分析前に、０．５ｘ１０５／ｍｌの濃度でＥＱ（商標）４元素キャリブレーションビーズ（ｆｏｕｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｅａｄｓ）を添加したＭｉｌｌｉＱ  ｄＨ２Ｏにサンプルを、懸濁した。サンプルは、Ｈｅｌｉｏｓ  ６．５．３５８取得ソフトウェア（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を使用して、Ｈｅｌｉｏｓ機器（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）で毎秒３００イベントで取得した。
【０２６１】
データ分析：マスサイトメトリーデータを、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ正規化ソフトウェア２を使用して、ＥＱ（商標）の４元素シグナルシフトに基づいて経時的に正規化した。最初のデータ品質管理を、Ｆｌｏｗｊｏバージョン１０．２を使用して実行した。キャリブレーションビーズをゲートアウトし、イリジウム１９３染色とイベント長に基づいてシングレットを選択した。死細胞をＰｔ１９５チャネルによって除外し、さらにゲーティングを実行してＣＤ４５＋細胞を選択して、次に目的のＮＫ細胞集団（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）を選択した。自動クラスタリングを実行するために、すべてのサンプルから合計３２０，０００個の細胞を比例的にサンプリングした。以前に公開されたように（Ｖａｎ  Ｇａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、免疫細胞の詳細な表現型をクラスタリングするために、ＦｌｏｗＳＯＭと組み合わせた（ｖｉＳＮＥ）を含む自動次元削減を使用してデータを分析した。
【０２６２】
ＲＮＡシーケンシング：ＣＡＲ形質導入ＮＫ細胞及びｅｘ  ｖｉｖｏ増殖ＮＴ  ＮＫ細胞（対照及びＣＩＳＨ  ＫＯ条件）からＲＮＡを抽出及び精製し（ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）、ＲＮＡシーケンスのためにＮｏｖｏｇｅｎｅに送信して、そこで品質管理、ライブラリー構築及びシーケンスが実行された。ＲＮＡｓｅｑデータの分析は、ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ部門によって実施した。シーケンスリードは、ＴＯＰＨＡＴ２  ｖ２．０．１３（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を使用して、ヒト参照ゲノム（ｈｇ３８）にアラインメントした。遺伝子発現レベルは、ｈｇ３８  ＧＥＮＣＯＤＥ  ｖ２５遺伝子モデルに基づくＨＴＳＥＱを使用してマッッピングされたリードをカウントすることによって測定された。差次的に発現する遺伝子を、ＦＤＲ（偽発見率）カットオフ＜０．０１及び倍数変化＞２でＥｄｇｅＲパッケージを使用して同定した（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０２６３】
［ミトコンドリア及びリソソームのイメージング］
ＮＫ細胞の標識化：ＮＫ細胞を、生細胞染色バッファー（ａｂｃａｍ）と、それぞれ、ミトコンドリア、リソソーム及び核の標識化のために、最終濃度５００ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ  ＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））、２５０ｎＭのＬｙｓｏＲｅｄ（ａｂｃａｍ）、及び１μＭのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｓｉｇｍａ）を含有するＲＰＭＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）との１：１（ｖ／ｖ）溶液中で３７℃において４０分間インキュベートした。次に、細胞をハンクスの平衡塩類溶液（Ｃｅｌｌｇｒｏ）＋１０％ＨＥＰＥＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で最初に洗浄し、完全培地ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ（Ｒ１０）で２回目の洗浄を行った。
【０２６４】
共焦点顕微鏡法：９６ガラス底プレートの個々のウェルに５０，０００個のＮＫ細胞をロードした。イメージングには、１００倍、１．４５ＮＡの対物レンズを備えたＮｉｋｏｎ  Ａ１／ＴｉＥ倒立顕微鏡を使用した。３Ｄ画像（ｚスタック、０．３μｍステップ、約４０スライス）を、ＤＡＰＩ（４０４．０ｎｍ）、ＴＸＲｅｄ（５６１．８ｎｍ）、及びＣｙ５（６４１．０ｎｍ）チャネルを使用してさまざまな視野から取得した。
【０２６５】
共焦点画像の分析：１６ビット画像のＺスタックがチャネルごとに抽出され、一連のプラグインを使用してＩｍａｇｅＪ（米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）、ＵＳＡ）で処理した。まず、しきい値を適用する前に、画像をチャネルごとにセグメント化した。次に、３Ｄオブジェクトカウンタープラグインを画像に適用して、ミトコンドリアとリソソームの目的の領域（ＲＯＩ）を決定した。これらのＲＯＩは元の画像にオーバーレイして、その後測定値を収集した。同様に、３Ｄオブジェクトカウンタープラグインを核にも使用したが、元の画像のみを使用した。最後に、単一細胞の動きの追跡は、不安定な細胞の動きを除外するために、ＴｒａｃｋＭａｔｅ１プラグインを使用して行った。すべての測定値をＲで統合し、ミトコンドリア、リソソーム、及び核が対応する細胞と一致した。
【０２６６】
異種リンパ腫モデル：ＣＡＲ形質導入ＣＢ−ＮＫ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果を評価するために、本発明者らは、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ）異種移植モデル、及び進行性のＮＫ耐性Ｒａｊｉ細胞株を使用した。マウス実験は、施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルの下で、ＮＩＨの推奨に従って実施した。ＮＳＧマウス（１０〜１２週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）に−１日目に３００ｃＧｙを照射し、０日目にホタルルシフェラーゼ標識Ｒａｊｉ細胞（２×１０４）を静脈内接種した。表示がある場合、新鮮な増殖ＮＴ（対照又はＣＩＳＨ  ＫＯ）又はＣＡＲ形質導入ＣＢ−ＮＫ（対照又はＣＩＳＨ  ＫＯ）細胞を０日目に尾静脈から注射した。マウスを毎週生物発光イメージング（Ｘｅｎｏｇｅｎ−ＩＶＩＳ  ２００  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ；Ｃａｌｉｐｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）に供した。光子／秒単位のシグナル定量化を、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して、標準化された目的の領域内の光子束率を決定することによって実行した。ＮＫ細胞の輸送、持続性及び増殖を、フローサイトメトリーによって測定した。
【０２６７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの自殺遺伝子の活性化及びｉｎ  ｖｉｖｏにおける検証：小分子二量体ＡＰ１９０３（１０  ｎＭ）をＣＢ−ＮＫ細胞に加え、４時間培養した。形質導入細胞の除去を、アネキシンＶ／ライブデッド染色によって評価した。自殺遺伝子の有効性を、ｉＣ９／ＣＡＲ．１９／ＩＬ−１５＋ＮＫ細胞（対照又はＣＩＳＨ  ＫＯ）投与された担がんマウスを、２用量のＡＰ１９０３（各５０μｇ）で７日目と９日目に２日間隔で腹腔内に処置することによってｉｎ  ｖｉｖｏでも試験した。他の２つのグループのマウス（対照とＣＩＳＨ  ＫＯ）は、ＡＰ１９０３処置なしの対照として機能した。１２日目にすべてのマウスを屠殺にし、血液と臓器（肝臓、脾臓及び骨髄）を収集して処理し、フローサイトメトリーを行ってＣＡＲ−ＮＫ画分と生存率を判定した。
【０２６８】
オフターゲットの特定：オフターゲット編集イベントの偏りのない発見には、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ法を採用した（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。この研究では、化膿連鎖球菌（Ｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを構成的に発現するＨＥＫ２９３細胞（「ＨＥＫ２９３−Ｃａｓ９」細胞）がＣａｓ９の供給源であった。Ａｌｔ−Ｒ（登録商標）ｇＲＮＡ複合体を、Ａｌｔ−Ｒ  ｔｒａｃｒＲＮＡとＡｌｔ−Ｒ  ｃｒＲＮＡ  ＸＴとを１：１のモル比で組み合わせることによって形成した。ｇＲＮＡ複合体を、Ａｍａｘａ（商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）９６ウェルＳｈｕｔｔｌｅ（商標）システム（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用したヌクレオフェクションによって送達した。各ヌクレオフェクションのために、３．５×１０５のＨＥＫ２９３−Ｃａｓ９細胞を１ＸＰＢＳで洗浄し、２０μＬの溶液ＳＦ（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁し、１０μＭのｇＲＮＡと０．５μＭのＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ  ｄｓＤＮＡドナーフラグメントとを組み合わせた。この混合物をＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）プレート（Ｌｏｎｚａ）の１つのウェルに移し、プロトコル９６−ＤＳ−１５０を使用してエレクトロポレーションした。ＧｅｎｅＪＥＴ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、エレクトロポレーションの７２時間後にＤＮＡを抽出した。ＮＧＳライブラリーの調製、シーケンシング、及びＧＵＩＤＥ−ｓｅｑソフトウェアの操作は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｃｈアラインメントが組み込まれていることを除いて、前述のように実行した（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。
【０２６９】
マルチプレックスＰＣＲのためのｒｈＡｍｐＳｅｑによる標的濃縮：ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑを使用して検出されたオフターゲット部位における編集をより正確に定量化するために、アンプリコンＮＧＳと結びつけたマルチプレックスＰＣＲを、ｒｈＰＣＲ（ＲＮａｓｅＨ２の存在下で実行されるＰＣＲ）（Ｄｏｂｏｓｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）及びブロック切断可能プライマー（ｂｌｏｃｋｅｄ−ｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｐｒｉｍｅｒ）を使用して実行した。プライマーを、マルチプレックス内の他のプライマーとの互換性に基づいて、プライマーの相互比較と選択のためのアルゴリズム（ＩＤＴ）によって設計した。この増幅技術では、増幅前にプライマーが標的部位に適切にハイブリダイズする必要がある。標的とプライマーとの不一致はブロック解除を防ぎ、それによって特異性を高め、プライマー二量体を排除する。このアプローチにより、単一のチューブ中で高度に多重化されたＰＣＲアンプリコンを効率的に作製可能である。これらの実験では、ｇＲＮＡ複合体を前述のようにＨＥＫ２９３−Ｃａｓ９細胞に送達するか、又はＡｌｔ−Ｒ  ＨｉＦｉ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼｖ３と複合体を形成して活性リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成し、２μＭのＡｌｔ−Ｒ  Ｃａｓ９エレクトロポレーションエンハンサー（ＩＤＴ）とともに２μＭでＨＥＫ２９３細胞に直接ヌクレオフェクトした。ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して、エレクトロポレーションの４８時間後にＤＮＡを抽出した。ｒｈ−プライマーによる遺伝子座特異的増幅を１０サイクル行った後、１．５ｘＳＰＲＩビーズをクリーンアップした。サンプル固有のＰ５及びＰ７インデックスを組み込むために、ＰＣＲのインデックス作成ラウンドを１８サイクル実行した後、１×ＳＰＲＩビーズのクリーンアップとｑＰＣＲ（ＩＤＴ）によるライブラリーの定量を行った。ＰＣＲアンプリコンはＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ機器（ｖ２ケミストリー、１５０ｂｐペアエンドリード）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）でシーケンシングした。カスタムビルドのパイプラインを使用してデータを分析した。データを逆多重化した（Ｐｉｃａｒｄツールｖ２．９）。フォワード及びリバースのリードを、拡張アンプリコンにマージした（ｆｌａｓｈ  ｖ１．２．１１）（Ｍａｇｏｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。リードをＧＲＣｈ３８ゲノムリファレンス（ｂｗａ  ｍｅｍ  ｖ０．７．１５）に対してアラインメントし、マルチプレックスプライマープールの標的に割り当てた（ｂｅｄｔｏｏｌｓ  ｔａｇｓ  ｖ２．２５）（Ｑｕｉｎｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。塩基の読み取り精度（ｂａｓｅ  ｑｕａｌｉｔｙ）スコアが１０未満のリードは除外した。各標的で、編集を、切断部位の１０ｂｐウィンドウ内にＩＮＤＥＬを含むリードの、合計に対するパーセンテージとして計算した。
【０２７０】
統計：二元配置分散分析を使用して、グループ間の量的差異（平均±標準偏差）を比較した。Ｐ値は両側であり、Ｐ＜０．０５を有意であると見なした。すべての生物発光実験について、強度シグナルを、ベースライン時及びその後の複数の時点でマウスの各グループについて平均±ｓ．ｄとして要約した（Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。生存確率は、カプランマイヤー法を使用して計算した。示された統計的検定は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄバージョン７．０ｃ）を使用して実行した。共焦点顕微鏡分析では、データセットは対応のない両側検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔａｉｌｅｄ  ｔｅｓｔ）を使用して分析した。データは平均±９５％の信頼区間を表す。画像はＩｍａｇｅＪを使用してアセンブリした。
【０２７１】
本明細書で開示及び特許請求する方法はすべて、本開示に照らして、過度の実験を行うことなく作製及び実行することができる。本発明の組成物及び方法は好ましい実施形態に関して記載されているが、本明細書に記載された方法及び該方法のステップ又は一連のステップにおいて、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく変更が適用され得ることは当業者に明らかであろう。より具体的には、化学的及び生理学的の両方に関連する特定の薬剤を、本明細書に記載の薬剤に置き換えても、同じ又は類似の結果を達成できることは明らかであろう。当業者に明らかなすべてのそのような類似の代替物及び修正は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲及び概念の範囲内であると見なされる。
【０２７２】
（参考文献）
下記の参考文献は、それらが本明細書に記載されたものを補足する例示的な手順又は他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
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国際特許出願公開番号WO 98/42752  国際特許出願公開番号WO/2014055668  国際特許出願公開番号WO1995001994  国際特許出願公開番号WO1998042752  国際特許出願公開番号WO2000037504  国際特許出願公開番号WO200014257
国際特許出願公開番号WO2001014424  国際特許出願公開番号WO2006/121168  国際特許出願公開番号WO2007/103009  国際特許出願公開番号WO2009/101611  国際特許出願公開番号WO2009/114335  国際特許出願公開番号WO2010/027827  国際特許出願公開番号WO2011/066342  国際特許出願公開番号WO2012/129514  国際特許出願公開番号WO2013/071154  国際特許出願公開番号WO2013/123061   国際特許出願公開番号WO2013/166321  国際特許出願公開番号WO2013126726  国際特許出願公開番号WO2014/055668  国際特許出願公開番号WO2014031687  国際特許出願公開番号WO2015016718  国際特許出願公開番号WO99/40188
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2021522798.tif 000004
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｌ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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