(57)【要約】RIPK2インヒビターを含む組成物、および、神経変性疾患または神経変性障害を処置または予防するために該RIPK2インヒビターを使用する方法が本明細書において提供される。神経変性疾患または神経変性障害を処置または予防するのに有用な治療用物質をスクリーニングまたは同定する方法も本明細書において提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象に、治療的有効量の受容体共役タンパク質(RIP)キナーゼ2(RIPK2)インヒビターを投与する工程を含む、神経変性疾患または神経変性障害を予防または処置する方法であって、
該神経変性疾患または神経変性障害が、中枢神経系(CNS)の1つまたは複数の領域におけるアップレギュレートされたNOD2、リン酸化RIPK2、および/またはRIPK2に関連する、該方法。
【請求項２】
前記RIPK2インヒビターがRIPK2の活性および/または発現を阻害する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記RIPK2インヒビターがRIPキナーゼ1および/またはRIPキナーゼ3よりも選択的である、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
前記RIPK2インヒビターが、NFκBのNOD1依存的活性化、NF-kBのNOD2依存的活性化、ミクログリア活性化、および/または反応性星状細胞形成より選択される1つまたは複数の活性を阻害するのに有効な量で投与される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
それを必要とする対象に有効量の受容体共役タンパク質(RIP)キナーゼ2(RIPK2)インヒビターを投与する工程を含む、異常に凝集したタンパク質による中枢神経系(CNS)常在性自然免疫細胞の活性化に関連する神経変性疾患または神経変性障害を処置するための方法。
【請求項６】
前記RIPK2インヒビターが、異常に凝集したタンパク質によるCNS常在性自然免疫細胞の活性化を阻害するのに有効な量で投与される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記RIPK2インヒビターの投与によって、活性化された自然免疫細胞から分泌され神経炎症およびニューロン損傷を誘導する1種類または複数種類の炎症性メディエーターまたは神経毒性メディエーターのレベルが低減する、請求項5または6記載の方法。
【請求項８】
前記1種類または複数種類の炎症性メディエーターまたは神経毒性メディエーターが、TNFα、IL-1α、IL-1β、C1q、IL-6、および/またはそれらの組み合わせである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記常在性自然免疫細胞がミクログリアおよび/または星状細胞である、請求項5〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記異常に凝集したタンパク質がα-シヌクレイン、アミロイド-β、および/またはタウである、請求項5〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記神経変性疾患または神経変性障害がパーキンソン病またはアルツハイマー病である、請求項5〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
中枢神経系(CNS)常在性自然免疫細胞を有効量の受容体共役タンパク質(RIP)キナーゼ2(RIPK2)インヒビターと接触させる工程を含む、異常に凝集したタンパク質による該CNS常在性自然免疫細胞の活性化を阻害する方法。
【請求項１３】
前記CNS常在性自然免疫細胞がミクログリアおよび/または星状細胞である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記異常に凝集したタンパク質がα-シヌクレイン、アミロイド-β、および/またはタウである、請求項12または13記載の方法。
【請求項１５】
前記接触させる工程がインビトロ、インビボ、またはエクスビボである、請求項12〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
RIPK2インヒビターの前記量が、前記CNS常在性自然免疫細胞によって分泌された1種類または複数種類の炎症性メディエーターまたは神経毒性メディエーターのレベルを対照と比較して低減するのに有効な量であり、該1種類または複数種類の炎症性メディエーターまたは神経毒性メディエーターが、TNFα、IL-1α、IL-1β、C1q、IL-6、および/またはそれらの組み合わせである、請求項12〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
それを必要とする対象に治療的有効量のRIPK2インヒビターを投与する工程を含む、該対象においてパーキンソン病を処置する方法。
【請求項１８】
前記RIPK2インヒビターが前記対象に経口投与または非経口投与される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
前記RIPK2インヒビターがRIPキナーゼ1および/またはRIPキナーゼ3よりも選択的である、請求項17または18記載の方法。
【請求項２０】
それを必要とする対象に治療的有効量のRIPK2インヒビターを投与する工程を含む、該対象においてアルツハイマー病を処置する方法。
【請求項２１】
前記RIPK2インヒビターが前記対象に経口投与または非経口投与される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
前記RIPK2インヒビターがRIPキナーゼ1および/または3よりも選択的である、請求項20または21記載の方法。
【請求項２３】
前記RIPK2インヒビターが、ゲフィチニブ、ソラフェニブ、レゴラフェニブ、ポナチニブ、SB203580、OD36(6-クロロ-10,11,14,17-テトラヒドロ-13H-1,16-エテノ-4,8-メテノ-1H-ピラゾロ[3,4-g][1,14,4,6]ジオキサジアザシクロヘキサデシン)、OD38([4,5,8,9-テトラヒドロ-7H-2,17-エテノ-10,14-メテノ-1H-イミダゾ[1,5-g][1,4,6,7,12,14]オキサペンタアザシクロヘキサデシン])、WEHI-435(N-(2-(4-アミノ-3-(p-トリル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)-2-メチルプロピル)イソニコチンアミド)、GSK583(6-(tert-ブチルスルホニル)-N-(5-フルオロ-1H-インダゾール-3-イル)キノリン-4-アミン)、またはその薬学的に許容される塩である、請求項1〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
前記RIPK2インヒビターがゲフィチニブ、GSK583、またはその薬学的に許容される塩である、請求項1〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも1種類のさらなる治療的に活性な化合物の有効量を前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
前記神経変性疾患または神経変性障害が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS/ルー・ゲーリック病)、パーキンソン病、糖尿病性ニューロパシー、ポリグルタミン(ポリQ)病、脳卒中、ファール病、メンケス病、ウィルソン病、脳虚血、プリオン障害、認知症、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、多系統萎縮、遺伝性痙性対麻痺、脊髄小脳萎縮、脳傷害、または脊髄傷害を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
前記RIPK2インヒビターが、静脈内に、皮下に、動脈内に、腹腔内に、眼に、筋肉内に、頬に、直腸に、膣に、眼窩内に、脳内に、皮内に、頭蓋内に、脊髄内に、脳室内に、くも膜下腔内に、大槽内に、関節内に、肺内に、鼻腔内に、経粘膜的に、経皮的に、および/または吸入を介して投与される、請求項1〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
前記RIPK2インヒビターが経口投与または非経口投与される、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
(a)候補治療用物質の存在下で、CNS常在性自然免疫細胞を、異常に凝集したタンパク質と接触させる工程;
(b)該候補治療用物質の存在下で、該CNS常在性自然免疫細胞の活性化を測定する工程;および
(c)対照と比較して該CNS常在性自然免疫細胞の活性化を阻害する治療用物質を同定する工程
を含み、
該候補治療用物質がRIPK2インヒビターである、
神経変性疾患または神経変性障害の治療用物質を同定する方法。
【請求項３０】
前記CNS常在性自然免疫細胞がミクログリアおよび/または星状細胞である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
前記異常に凝集したタンパクがα-シヌクレイン、アミロイド-β、および/またはタウである、請求項29または30記載の方法。
【請求項３２】
前記測定する工程が、NOD2、リン酸化RIPK2、および/またはRIPK2の発現レベルを測定することを含む、請求項29〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
前記測定する工程が、因子C1q、TNFα、および/またはIL-1αの発現レベルを測定することを含む、請求項29〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
前記測定する工程が、因子iNOS、Cxcl1、および/もしくはIL-1βの発現レベルを測定すること、ならびに/または前記CNS常在性自然免疫細胞の走化性を測定することを含む、請求項29〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
前記治療用物質がRIPK1および/またはRIPK3よりもRIPK2を選択的に阻害する、請求項29〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
前記治療用物質がNF-kBのNOD2依存的活性化を阻害する、請求項29〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
前記治療用物質が、アミロイド-β凝集物誘導性ミクログリア活性化、α-シヌクレイン凝集物誘導性ミクログリア活性化、および/またはA1星状細胞形成を阻害する、請求項29〜36のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
前記神経変性疾患または神経変性障害が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALSもしくはルー・ゲーリック病)、パーキンソン病、多発性硬化症、糖尿病性ニューロパシー、ポリグルタミン(ポリQ)病、脳卒中、ファール病、メンケス病、ウィルソン病、脳虚血、プリオン障害、認知症、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、多系統萎縮、遺伝性痙性対麻痺、脊髄小脳萎縮、脳傷害、および/または脊髄傷害である、請求項29〜37のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
前記神経変性疾患または神経変性障害がアルツハイマー病またはパーキンソン病である、請求項29〜37のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府の支援による研究および開発に関する記載
米国政府は、本発明において支払い済みライセンスを有し、限られた状況では、米国立衛生研究所によって付与されたR01NS107404の条項に定められるような妥当な条項で特許権者が他人にライセンス供与するように求める権利を有する。
【０００２】
本発明の開発中に行われた研究の一部では米国政府の資金を利用した。米国政府は本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明の態様は、神経変性疾患を予防および処置するための受容体共役タンパク質(RIP)キナーゼに指向している。
【背景技術】
【０００４】
背景
神経系は、2つの部分である、脳および脊髄を含む中枢神経系(CNS)と、脳および脊髄の外側にある神経ならびに神経節を含む末梢神経系とに分けられる。末梢神経系は修復と再生が可能であるが、CNSは自己修復と再生が不可能である。
【０００５】
神経変性とはニューロンの機能または構造の進行性の喪失を指す。アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、多発性硬化症(MS)、認知症、およびハンチントン病などの神経変性疾患は神経変性プロセスの結果であり、世界中で数百万もの人々に影響を及ぼす。CNSへのこれらの加齢性侵襲はニューロンの構造と機能の進行性の劣化、軸索喪失を引き起こし、ニューロン接続を破壊し、最終的に、死ぬまで続く失明、麻痺、ならびに他の認知機能、運動機能、および感覚機能の喪失をもたらす。現在、治療選択肢は非常に限られている。
【発明の概要】
【０００６】
様々な態様では、本発明は、少なくとも部分的に、中枢神経系に対して神経保護効果および疾患修飾効果を有するRIPK2インヒビターの開発および使用に基づいている。
【０００７】
本発明の態様は、特に、RIPキナーゼ2(RIPK2)と、任意で、他のRIPキナーゼとを阻害することによって神経変性疾患または神経変性障害を予防および処置するための組成物に指向している。本発明の態様はまた、少なくとも1種類のRIPK2インヒビターを対象に投与する工程を含む、神経変性疾患または神経変性障害を処置する方法に指向している。
【０００８】
ある特定の態様では、本発明は、神経変性疾患または神経変性障害を予防または処置する方法を提供する。一部の態様では、前記方法は、神経変性疾患または神経変性障害の予防または処置を必要とする対象に、少なくとも1種類のRIPK2インヒビターまたは少なくとも1種類のRIPK2インヒビターを含む薬学的組成物の治療的有効量を投与する工程を含む。
【０００９】
ある特定の態様では、少なくとも1種類のRIPK2インヒビターはRIPK2の活性および/または発現を阻害する。一部の態様では、RIPK2インヒビターはRIPK1および/またはRIPK3などの他のRIPキナーゼよりも選択的であり、例えば、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、またはそれより高い選択性がある。一部の態様では、RIPK2インヒビターには、他のRIPキナーゼに対して実質的に活性がない。しかしながら、一部の態様では、RIPK2インヒビターはまたデュアルもしくはマルチRIPキナーゼインヒビターまたは汎(pan)RIPキナーゼインヒビターであり得る。
【００１０】
一部の態様では、本開示は、少なくとも部分的に、神経変性疾患の進行に関与する重要な細胞であるミクログリアの活性化および反応性星状細胞の形成をブロックしてまたは逆転させて神経炎症および神経毒性経路のカスケードの誘発を止めるための組成物および方法を同定したことに基づいている。従って、一部の態様では、本開示は、脳における過剰発現したおよびリン酸化されたRIPK2を標的とすることで、グリオーシス(ミクログリアおよび/または星状細胞の活性化)ならびに活性化ミクログリアおよび/または反応性星状細胞からの毒性分子の放出をブロックすることによってニューロン細胞を保護する方法を提供する。
【００１１】
様々なRIPK2インヒビターが本明細書中の組成物および方法に適している。ある特定の態様では、RIPK2インヒビターは、低分子、siRNA、shRNA、マイクロRNA、抗体、アプタマー、DNAザイム(DNAzymse)、酵素、遺伝子編集システム、ホルモン、無機化合物、オリゴヌクレオチド、有機化合物、ポリヌクレオチド、ペプチド、リボザイム、または合成化合物を含む場合がある。
【００１２】
ある特定の態様では、RIPK2インヒビターはポリヌクレオチド分子である。ある特定の態様によれば、前記ポリヌクレオチド分子は、RIPK2発現をコードするか、または制御する核酸にハイブリダイズすることができる核酸配列または分子である。本発明の文脈において適した例示的な核酸配列には、RNA阻害(RNAi)分子、アンチセンス分子、およびリボザイムが含まれるが、これに限定されない。それぞれの可能性は本発明の別々の態様を表している。本明細書で使用するRNAiという用語は、標的遺伝子転写物にある相補的部位に結合して翻訳抑制または転写物分解を引き起こすことによって標的遺伝子発現を調節することができる短いRNA配列を表している。
【００１３】
一部の態様では、RIPK2遺伝子発現は、適切な対照と比較して少なくとも25％、少なくとも50％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％ダウンレギュレートされる。ある特定の他の態様では、部分的ダウンレギュレーションが好ましい。発現を阻害する(ダウンレギュレートまたはサイレンシングする)オリゴヌクレオチドの例は、本明細書において詳述されるようなアンチセンス分子、RNA干渉分子(RNAi)、および酵素的核酸分子である。
【００１４】
ある特定の態様では、RIPK2インヒビターは、RIPK2タンパク質の活性を阻害することができる低分子である。このような活性を有することが知られている任意の低分子を本発明の開示に従って使用することができる。さらなる典型的な態様によれば、この低分子を薬学的組成物中に製剤化することができる。ある特定の態様によれば、この低分子は血液脳関門(BBB)を通過することができるか、またはBBBを通過するように製剤化される。例えば、米国特許第8,629,114号、同第8,497,246号、および同第7,981,864号に開示されるように、BBBを通過して化合物を送達するためのいくつかの手段がある。例えば、RIPK2インヒビター化合物は、当技術分野に記載のようにBBB移行化合物と融合または結合体化することができる。
【００１５】
ある特定の態様では、RIPK2インヒビターは、以下の活性:NFκBのNOD1依存的活性化、NF-kBのNOD2依存的活性化、アミロイド-β凝集物誘導性ミクログリア活性化、α-シヌクレイン凝集物誘導性ミクログリア活性化、および/またはA1星状細胞形成のうちの1つまたは複数を選択的に阻害する。
【００１６】
ある特定の態様では、RIPK2活性を阻害することによって、脳におけるTNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、C1q、および/または活性化ミクログリアおよび反応性星状細胞のレベルは、適切な対照と比較して対象において低下するか、維持されるか、または正常レベルまで回復する。
【００１７】
ある特定の態様では、RIPK2活性を阻害することによって、脳タンパク質、例えば、α-シヌクレイン(レビー小体)、アミロイド斑、および/またはタウの異常沈着物のレベルは適切な対照と比較して対象において低下するか、維持されるか、または正常レベルまで回復する。
【００１８】
ある特定の態様では、RIPK2活性を阻害することによって、処置によって、適切な対照と比較して対象において、運動欠陥が軽減もしくは回復し、記憶機能が改善し、おかつ/または寿命が延びる。
【００１９】
ある特定の態様では、本明細書における方法は、少なくとも1種類のさらなる治療的に活性な化合物、例えば、さらなる抗パーキンソン病薬または抗アルツハイマー病薬の有効量を対象に投与する工程をさらに含む。一部の態様では、さらなる治療的に活性な化合物はまた、RIPK1、RIPK3、RIPK4、またはRIPK5などの他のRIPキナーゼのインヒビターでもよい。しかしながら、一部の態様では、RIPK2インヒビターはまた、それぞれの疾患または障害に対して対象に投与される唯一の活性化合物であり得る。
【００２０】
様々な態様では、RIPK2インヒビターおよび/またはさらなる治療的に活性な化合物は、静脈内に、皮下に、動脈内に、腹腔内に、眼に、筋肉内に、頬に、直腸に、膣に、眼窩内に、脳内に、皮内に、頭蓋内に、脊髄内に、脳室内に、くも膜下腔内に、大槽内に、関節内に、肺内に、鼻腔内に、経粘膜的に、経皮的に、吸入によって、またはそれらの任意の組み合わせで投与される。ある特定の態様では、RIPK2インヒビターは経口投与または非経口投与される。
【００２１】
様々な神経変性疾患または神経変性障害は、本明細書における方法によって処置するのに適している。ある特定の態様では、神経変性疾患または神経変性障害は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS/ルー・ゲーリック病)、パーキンソン病、多発性硬化症、糖尿病性ニューロパシー、ポリグルタミン(ポリQ)病、脳卒中、ファール病、メンケス病、ウィルソン病、脳虚血、プリオン障害、認知症、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、多系統萎縮、遺伝性痙性対麻痺、脊髄小脳萎縮、脳傷害、または脊髄傷害を含んでもよい。
【００２２】
ある特定の態様では、本開示はまた、神経変性疾患または神経変性障害に対する治療用物質を同定する方法も提供する。一部の態様では、前記方法は、RIPK2を発現する細胞または組織を候補治療用物質と接触させる工程;RIPK2の活性または発現をアッセイする工程;および、対照と比較してRIPK2発現または活性の阻害を測定する工程を含む。一部の態様では、前記方法は、候補治療用物質の存在下で、CNS常在性自然免疫細胞(例えば、ミクログリアおよび/または星状細胞)を、免疫細胞の活性化を誘導する作用物質(例えば、異常に凝集したタンパク質)と接触させる工程;候補治療用物質の存在下で、CNS常在性自然免疫細胞の活性化を測定する工程;ならびに、対照と比較してCNS常在性自然免疫細胞の活性化を阻害する治療用物質を同定する工程を含む。一部の態様では、候補治療用物質はRIPK2インヒビターである。
【００２３】
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に記載の1種類または複数種類のRIPK2インヒビターの治療的有効量を含む薬学的組成物を提供する。
【００２４】
他の態様では、本開示は、神経変性疾患または神経変性障害を処置するためのキットを提供する。一部の態様では、前記キットは、少なくとも1種類のRIPK2インヒビターと、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む薬学的組成物を含む。ある特定の態様では、前記キットは、少なくとも1種類のさらなる治療的に活性な化合物(例えば、本明細書に記載の治療的に活性な化合物)をさらに含む。
【００２５】
他の局面は下記で説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
本特許または出願ファイルは、カラーで作成した少なくとも1枚の図面を収録している。請求と必要な手数料の支払いがあり次第、この特許または特許出願公報とカラー図面のコピーが提供される。
【図１−１】図1A〜1Hは、ヒトPD死後組織におけるRIPK2発現に関連するグラフおよび写真を示す。図1Aは、PD死後組織におけるミクログリア活性化を示した写真を示す。図1Bは、PD死後組織におけるp-RIPK2活性化を示した写真を示す。p-RIPK2陽性シグナルを定量し、図1Bに棒グラフで表した。図1Cは、抗p-RIPK2(緑色)およびミクログリアマーカー抗cd-11b(赤色)を用いた代表的な共焦点画像を示す。図1Dは、ヒト死後組織のSNpc領域におけるNod2およびRipk2のmRNA発現レベルを示した棒グラフを示す。図1Eは、ウェスタンブロッティングによって評価したヒト死後のSNpcにおけるNOD2、p-RIPK2、およびRIPK2発現レベルを示す。NOD2発現レベルを定量し、図1Fに棒グラフで表した。p-RIPK2およびRIPK2発現レベルを定量し、図1Gに棒グラフで表した。図1Hは、近接ライゲーションアッセイ(proximity ligation assay)の結果を示した写真を示す。これは、ヒトPD死後組織のSNpcにおけるNOD2とα-シヌクレイン凝集物との間の相互作用を示す。
【図１−２】図1-1の説明を参照のこと。
【図２】α-シヌクレインPFFで3時間活性化したマウス初代ミクログリアのRIPK2、NOD1、およびNOD2の発現を示した棒グラフを示す。RIPK2、NOD1、およびNOD2の遺伝子発現をリアルタイムPCRによって測定した。
【図３】図3A〜3Cは、リアルタイムRT-PCRを用いた、PFF誘導性ミクログリアにおいて測定したA1反応性星状細胞誘導因子、例えば、C1q、TNFα、およびIL-1αのmRNAレベルを示した棒グラフである。図3Dは、PFFによって誘導されたWT、NOD2-/-、およびRIPK2-/-初代培養ミクログリアから精製したミクログリア条件づけ培地(microglia conditional medium)(MCM)の処置後24時間での初代培養星状細胞において測定した汎反応性(PAN-reactive)、A1特異的、およびA2特異的な転写物のレベルを示す。図3Eおよび3Fは、アラマーブルー(AlamarBlue)およびLDHアッセイを用いて測定した、MCM活性化星状細胞条件づけ培地(ACM)で処置した初代培養マウス皮質ニューロンの細胞傷害性を示した棒グラフである。値は、3回の独立した実験の平均±S.E.M.である(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。
【図４】図4Aおよび4Bは、α-シヌクレインPFF処置(n=3、各群)の12時間後の野生型(WT)、NOD2ノックアウト(NOD2-/-)、およびRIPK2ノックアウト(RIPK2-/-)マウスに由来する初代培養ミクログリアの形態学的相関物を示した顕微鏡写真および棒グラフを示す。図4C、4D、および4Eは、リアルタイムRT-PCRを用いて測定した、IL-1β、iNOS、およびケモカインCxcl1のmRNA発現を示した棒グラフを示す。図4Fは、遊走アッセイの模式図を示す。初代培養ミクログリアを上チャンバーおよび培養皿の底にプレートした。図4Gは、12時間のα-シヌクレインPFF処置後の結果を示した画像を示す。チャンバーの底部側にある遊走した細胞をIba-1抗体で染色した。図4Hは、PBS対照に対するIba-1陽性PFF誘導性遊走ミクログリアの数の比によって計算した遊走指数を示した棒グラフを示す(n=3、各群)。値は、3回の独立した実験の平均±S.E.M.である(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。
【図５】図5A〜5Cは、リアルタイムRT-PCRを用いた、PFF誘導性ミクログリアにおいて測定したA1反応性星状細胞誘導因子、例えば、C1q、TNFα、およびIL-1αのmRNAレベルを示した棒グラフを示す。図5Dは、RIPK2インヒビターであるゲフィチニブおよびGSK583を用いた、PFF誘導性初代ミクログリアから精製したα-シヌクレインPFF活性化ミクログリア条件づけ培地(MCM)の処置後24時間での初代培養星状細胞において測定した汎反応性、A1特異的、およびA2特異的な転写物のレベルを示す。図5Eおよび5Fは、アラマーブルーおよびLDHアッセイを用いて測定した、MCM活性化ACMで処置した初代培養マウス皮質ニューロンの細胞傷害性を示した棒グラフを示す。値は、3回の独立した実験の平均±S.E.M.である(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。
【図６】図6Aおよび6Bは、pS129-α-シヌクレインまたは抗Iba-1抗体で染色し、定量した、PFFを注射した野生型(WT)、NOD2ノックアウト(NOD2-/-)、およびRIPK2ノックアウト(RIPK2-/-)マウスの腹側中脳組織を示した写真および棒グラフを示す。
【図７】図7A〜7Cは、免疫パニング法によってWT、RIPK2ノックアウト、およびNOD2ノックアウトマウスに由来する精製ミクログリアを用いて測定した、A1反応性星状細胞誘導因子、例えば、C1q、TNFα、およびIL-1αのmRNAレベルを示した棒グラフを示す。mRNAレベルをリアルタイムRT-PCRによって測定し、棒グラフで表した。図7Dは、免疫パニング法による腹側中脳領域に由来する精製星状細胞において測定した、汎反応性、A1特異的、およびA2特異的な転写物のmRNAレベルを示す。図7Eは、腹側中脳におけるIba-1、GFAP、およびβ-アクチンの代表的なイムノブロットを示す。図7Fおよび7Gは、β-アクチンに対して基準化したIba-1、GFAPタンパク質レベルの定量を示した棒グラフを示す。エラーバーは、平均±S.E.M、n=4マウス/群を表す。一方向ANOVAを統計解析に使用した後に、複数群比較のための事後ボンフェローニ(post-hoc Bonferroni)検定を行った。*P<0.05、***P<0.001対ビヒクルを用いたPBS定位注射マウスまたはビヒクルを用いたα-シヌクレインPFF定位注射マウス。n.s.:有意でない。
【図８−１】図8Aは、TH免疫反応性について染色した線条体切片の代表的な顕微鏡写真を示す。線条体におけるTH繊維密度の強拡大視野(下パネル)。スケールバーは、それぞれ、100μm(上パネル)および50μm(下パネル)を示す。図8Bは、Image Jソフトウェアを用いた、線条体におけるドーパミン作動性繊維密度の定量を示した棒グラフを示す。図8Cは、定位装置を用いた、PBSおよびα-シヌクレインPFF線条体内注射マウスにおけるTH陽性ニューロンを含む冠状中脳切片からの代表的な顕微鏡写真を示す。スケールバーは500μmを示す。図8Dは、腹側中脳におけるTH、DAT、およびβ-アクチンの代表的なイムノブロットを示す。図8Eは、THのステレオロジーカウントを示した棒グラフを示し、図8Eは、SNpc領域におけるNissl陽性ニューロンを示した棒グラフを示す。偏りのないステレオロジーカウントをSNpc領域において行った。エラーバーは平均±S.E.M、n=5マウス/群を表す。図8Gおよび8Hは、β-アクチンに対して基準化したTH、およびDATタンパク質レベルの定量を示した棒グラフを示す。エラーバーは平均±S.E.M、n=4マウス/群を表す。PBSまたはα-syn PFF定位線条体内注射の6ヶ月後に行動試験を行った。ポール(図8I)および握力(図8J)試験におけるマウスの結果。エラーバーは平均±S.E.M(n=12〜16)を表す。一方向ANOVAを統計解析に使用した後に、複数群比較のための事後ボンフェローニ検定を行った。**P<0.01、***P<0.001対ビヒクルを用いたPBS定位注射マウスまたはビヒクルを用いたα-syn PFF定位注射マウス。ポールを下降する最大時間を60秒に制限した。
【図８−２】図8-1の説明を参照のこと。
【図９】図9Aおよび9Bは、RIPK2インヒビターであるゲフィチニブを使用し、pS129-α-シヌクレインまたは抗Iba-1抗体で染色し、定量した、PFF注射動物の腹側中脳組織の画像を示す。
【図１０】図10Aは、抗p-RIPK2抗体を用いた免疫組織化学による、AD死後のヒト海馬領域において評価したp-RIPK2発現を示す(矢じりはp-RIPK2陽性シグナルを示す)。図10Bは、ImageJによって測定した海馬のCA1領域におけるp-RIPK2シグナルの密度を示した棒グラフを示す(n=3、各群)。
【図１１】Aβ活性化BV-2ミクログリア細胞におけるp-RIP2K発現とNOD2結合を証明する代表的なウエスタンブロットを示す。
【図１２】図12Aは、行動実験手順を示す。マウスにAβO1-42 (合計5μmol、両側i.c.v.)を注射し、次いで、モーリス水迷路試験(MWMT)に供した。図12Bおよび12Cは、それぞれ、モーリス水迷路試験における逃避潜時(escape latency time)およびプローブ試行セッションのデータを示した棒グラフを示す。図12Dおよび12Eは、それぞれ、MWMTのプローブ試行セッションにおける全移動距離および遊泳速度のデータを示した棒グラフを示す。プローブ試行セッションを60秒間行った。図12Fは、プローブ試行5日目でのMWMTでの各群からのマウスの代表的な遊泳経路を示す。次いで、マウスに4日間連続して毎日、2回の試行セッションを与えた。試行間の間隔は15分であり、逃避潜時を記録した。このパラメータを各試行セッションおよび各マウスについて平均した。エラーバーは平均±S.E.Mを表す。全ての行動試験を一方向ANOVAの後に、複数群比較のための事後ボンフェローニによって分析した。n=9〜13匹/群。*P<0.05、**P<0.01、および***P<0.001対ビヒクルを用いたPBS定位注射マウスまたはビヒクルを用いたAβO1-42定位i.c.v.注射マウス。n.s.:有意でない。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
詳細な説明
定義
本明細書で使用する用語は特定の態様だけを説明することを目的とし、本発明の範囲を限定することを目的としない。
【００２８】
本明細書で使用する単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、特に文脈によってはっきりと規定されていない限り複数形も含むことが意図される。さらに、「含む(including)」、「含む(includes)」、「有する(having)」、「有する(has)」、「有する(with)」という用語、またはその変形は詳細な説明および/または特許請求の範囲において用いられる程度まで、このような用語は、「含む(comprising)」という用語と同様に包括的であることが意図される。
【００２９】
「約(about)」または「約(approximately)」という用語は、特定の値について、当業者によって決定されるような許容可能な誤差範囲内にあることを意味する。これは、値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定系の限界に一部依存する。例えば、「約」は、当技術分野での慣例に従って1または1より大きな標準偏差の範囲内にあることを意味する場合がある。または、「約」は、所定の値または範囲の20％まで、10％まで、5％まで、または1％までの範囲を意味する場合がある。または、特に、生物系または生物学的プロセスに関して、この用語は、ある値の5倍以内のオーダーの範囲内にあることを意味し、ある値の2倍以内にあることも意味する場合がある。この出願および特許請求の範囲において特定の値が説明されている場合、特に断りのない限り、特定の値について許容可能な誤差範囲内にあることを意味する「約」という用語を前提としなければならない。
【００３０】
本明細書で使用する、化合物の「投与」、化合物を「投与する」という句、またはその他の変形は、化合物または化合物のプロドラッグを、処置を必要とする対象に提供することを意味する。
【００３１】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス化合物」とは、別のRNAまたはDNA(標的RNA、DNA)に結合するRNAまたはDNA分子を意味する。例えば、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス化合物」がRNAオリゴヌクレオチドであれば、RNA-RNA相互作用によって別のRNA標的に結合するか、標的RNAの活性を変える。アンチセンスオリゴヌクレオチドは特定のポリヌクレオチドの発現および/または機能をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができる。この定義は、治療、診断、または他の観点から有用な任意の外来RNAまたはDNA分子を含むことが意図される。このような分子には、例えば、アンチセンスRNAまたはDNA分子、干渉RNA(RNAi)、マイクロRNA、デコイ(decoy)RNA分子、siRNA、核酸RNA、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)、治療編集(therapeutic editing)RNAならびにアゴニストおよびアンタゴニストRNA、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、外部ガイド配列(external guide sequence)(EGS)オリゴヌクレオチド、オルタネートスプライサー(alternate splicer)、プライマー、プローブ、ならびに少なくとも標的核酸の一部にハイブリダイズする他のオリゴマー化合物が含まれる。従って、これらの化合物は一本鎖、二本鎖、部分的一本鎖、または環状オリゴマー化合物の形で導入することができる。
【００３２】
アンチセンス化合物と標的核酸が結合することで、機能および/または活性を調節する標的核酸の正常機能が妨害され、かつ特異的結合が望ましい条件下で、すなわち、インビボアッセイまたは治療的処置の場合では生理学的条件下で、インビトロアッセイの場合ではアッセイが行われる条件下でアンチセンス化合物と非標的核酸配列との非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合に、アンチセンス化合物は「特異的にハイブリダイズ可能」である。
【００３３】
同時投与される活性作用物質は個体に同時に投与されてもまたは連続して投与されてもよい。
【００３４】
本明細書で使用する「含む(comprising)」、「含む(comprise)」、または「含まれる(comprised)」という用語、およびそのバリエーションは、品目、組成物、装置、方法、プロセス、システムなどの定義または説明された要素に関して、さらなる要素を可能にする包括的またはオープンエンドであることが意図され、それによって、定義または説明された品目、組成物、装置、方法、プロセス、システムなどが、指定された要素、または、適宜、その均等物を含み、他の要素が含まれ、それでもなお、定義された品目、組成物、装置、方法、プロセス、システムなどの範囲/定義の中にあることを示している。
【００３５】
「対照」という用語は、試験試料中の発現産物と比較するのに適した任意の参照基準を指す。一部の態様では、対照は、発現産物レベルが検出されかつ試験試料由来の発現産物レベルと発現産物レベルが比較される「対照試料」を入手することを含む。このような対照試料は、既知のアウトカムを有する、特定の神経変性疾患または神経変性障害がある対照患者に由来する試料(保管された試料または以前の試料測定値でもよい);対象、例えば、正常患者または特定の神経変性疾患もしくは神経変性障害がある患者から単離された正常組織または正常細胞、対象、例えば、正常対象または特定の神経変性疾患もしくは神経変性障害がある患者から単離された培養初代細胞/組織、特定の神経変性疾患もしくは神経変性障害がある患者の同じ器官または身体場所から得られた隣接する正常細胞/組織、正常対象から単離された組織または細胞試料、あるいは寄託機関から得られた初代細胞/組織を含むが、これに限定されない任意の適切な試料を含んでもよい。他の態様では、対照は、ハウスキーピング遺伝子を含むが、これに限定されない任意の適切な供給源に由来する参照基準発現産物レベル、正常組織(または他の以前に分析された対照試料)に由来する発現産物レベル範囲、ある特定のアウトカム(例えば、1年、2年、3年、4年などの生存期間)をもつか、またはある特定の処置(例えば、特定の神経変性疾患もしくは神経変性障害をもつ患者に対する標準治療)を受けている一群の患者または一組の患者に由来する試験試料内での以前に決定された発現産物レベル範囲を含む場合がある。このような対照試料および参照基準発現産物レベルは本発明の方法において対照として併用できると当業者に理解される。一部の態様では、対照は正常細胞/組織試料を含む場合がある。他の態様では、対照は、一組の患者、例えば、特定の神経変性疾患もしくは神経変性障害をもつ一組の患者、またはある特定の処置を受けている特定の神経変性疾患もしくは神経変性障害をもつ一組の患者、または別のアウトカムに対して、あるアウトカムをもつ一組の患者の発現レベルを含む場合がある。前者の場合、各患者の特定の発現産物レベル、例えば、RIPK2発現は発現のパーセンタイルレベルに割り当てられてもよく、参照基準発現レベルの平均(mean)または平均(average)より高い、または低いと表されてもよい。他の態様では、対照は、正常細胞、またはRIPキナーゼのインヒビターなどで処置された患者に由来する細胞を含む場合がある。他の態様では、対照はまた、ある集団内でのハウスキーピング遺伝子の発現のレベルと比較した、同じ集団での測定値、例えば、RIPキナーゼ遺伝子の発現の平均レベルも含む場合がある。このような集団は、正常対象、処置を全く受けたことがない(すなわち、無処置の)特定の神経変性疾患もしくは神経変性障害をもつ患者、または標準治療を受けている特定の神経変性疾患もしくは神経変性障害をもつ患者を含む場合がある。他の態様では、対照は、試験試料にある2種類の遺伝子の発現産物レベルの比の決定と、これと、参照基準にある同じ2種類の遺伝子の任意の適切な比との比較;試験試料にある2種類またはそれ以上の遺伝子の発現産物レベルの決定と、任意の適切な対照にある発現産物レベルの違いの決定;ならびに試���試料にある2種類またはそれ以上の遺伝子の発現産物レベルの決定、それらの発現の、試験試料にあるハウスキーピング遺伝子の発現に対する規準化、および任意の適切な対照と比較を含むが、これに限定されない発現産物レベルの比較を含む。一部の態様では、対照は、試験試料と同じ系統および/またはタイプの対照試料を含む。他の態様では、対照は、一組の患者試料、例えば、特定の神経変性疾患もしくは神経変性障害をもつ患者全員の内で、またはそれに基づいてパーセンタイルで分類された発現産物レベルを含む場合がある。一部の態様では、対照発現産物レベルが確かめられ、例えば、特定のパーセンタイルと比べて高い、または低い発現産物レベルがアウトカムを予測する基準として用いられる。他の態様では、対照発現産物レベルは、既知のアウトカムがある、特定の神経変性疾患または神経変性障害をもつ対照患者に由来する発現産物レベルを用いて確かめられ、試験試料に由来する発現産物レベルが、アウトカムを予測する基準である対照発現産物レベルと比較される。以下のデータによって証明されるように、本発明の方法は、試験試料における発現産物レベルを対照と比較する際に特定のカットポイントの使用に限定されない。
【００３６】
本明細書で使用する「有効量」、「治療的有効量」、または「有効用量」とは、対象において少なくとも1種類の望ましい治療効果を生じる、例えば、標的状態を予防もしくは処置する、またはその状態に関連する症状を有利に軽減する、組成物(例えば、治療用組成物または治療用物質)の量である。
【００３７】
「哺乳動物」は、典型的には、診療を受けている温血哺乳動物(例えば、ヒトおよび非ヒト、例えば、家畜化した動物)をカバーする。例には、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、およびヒトが含まれる。
【００３８】
本発明の文脈において「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸(RNA)もしくはデオキシリボ核酸(DNA)またはそのミメティックのオリゴマーまたはポリマーを指す。「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、その置換型およびα-アノマー型、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)、ホスホロチオエート、メチルホスホネートなどを含む、天然の、および/または修飾された単量体または結合の直鎖オリゴマーまたは環状オリゴマーも含む。オリゴヌクレオチドは、単量体と単量体との相互作用の通常のパターン、0、例えば、ワトソン・クリック型塩基対合、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型塩基対合などを介して標的ポリヌクレオチドに特異的に結合することができる。
【００３９】
「任意の」または「任意で」とは、その後で説明される事象または状況が発生する場合がある、または発生しない場合があり、その説明が、その事象または状況が発生する場合と、発生しない場合を含むことを意味する。
【００４０】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する「または」という用語は、一般的に、特に文脈によってはっきりと規定されていない限り「および/または」を含む意味で用いられる。
【００４１】
「患者」、「対象」、および「個体」という用語は同義で使用することができ、ヒトまたは非ヒト動物を指す。これらの用語は、哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、家畜(例えば、ウシ、ブタ)、コンパニオンアニマル(例えば、イヌ、ネコ)、ならびにげっ歯類(例えば、マウスおよびラット)を含む。
【００４２】
本明細書で使用する「shRNA」という用語は、相補的配列の第1の領域と第2の領域を含むステムループ構造を有するRNA作用物質を指し、相補性の程度と上記の領域の配向は領域間で塩基対合が起こるように十分であり、第1の領域と第2の領域はループ領域でつながっており、ループは、ループ領域内にあるヌクレオチド(またはヌクレオチド類似体)間の塩基対合の欠如に起因する。shRNAは酵素ダイサー(Dicer)の基質となることがあり、ダイサー切断産物はRNAiに関与することがある。shRNAは、shRNAをコードする内因性遺伝子の転写に由来してもよく、ベクター、例えば、プラスミドベクター上またはウイルスベクター上にある、細胞または生物に導入された外因性遺伝子の転写に由来してもよい。さらに、shRNAをコードする外因性遺伝子を、当技術分野において公知の他の方法、例えば、リポフェクション、ヌクレオフェクション(nucleofection)などを用いて細胞または生物に導入することができる。
【００４３】
「治療的」処置は、病変の徴候を示す対象に、その徴候を減らすか、または無くす目的で投与される処置である。
【００４４】
本明細書で使用する「処置する(treat)」、「処置する(treating)」、「処置」などという用語は、疾患もしくは状態、および/またはこれらに関連する症状を無くす、軽減する、または寛解させること、例えば、疾患または障害の症状に患者が経験する頻度を低減することを指す。除外されないが、疾患または状態の処置は、疾患、状態、またはこれらに関連する症状が完全に無くなることを必要としない。本明細書で使用する「処置する(treat)」、「処置する(treating)」、「処置」などという用語は、疾患もしくは状態の再発症または疾患もしくは状態の再発がないが、そのリスクがある、またはそれにかかりやすい対象における、疾患もしくは状態を再発症する可能性を小さくする、または以前では管理されていた疾患もしくは状態が再発する可能性を小さくすることを指す「予防的処置」を含むことがある。「処置する」という用語および同義語は、本明細書に記載の化合物、例えば、本明細書に記載のRIPK2インヒビターの治療的有効量を、このような処置を必要とする対象に投与することを意図する。
【００４５】
「阻害」、「阻害する(inhibiting)」、「阻害する(inhibit)」、または「インヒビター」という用語は、化合物が特定の生物学的プロセスの活性(例えば、ビヒクル対照と比べたRIPK2活性)を低減するか、遅くするか、止めるか、または阻止する能力を指す。
【００４６】
本明細書で使用する「治療的有効量」という句は、このような疾患の症状を軽減することを含む、疾患または状態を予防または処置する(疾患または状態の発症を遅延または阻止する、疾患または状態の進行を阻止する、疾患または状態を阻害する、低減する、または逆転させる)のに十分または有効な量を指す。
【００４７】
本明細書において開示された全ての遺伝子、遺伝子名、および遺伝子産物は、本明細書において開示された組成物および方法が適用可能な任意の種に由来するホモログに対応することが意図される。従って、これらの用語には、ヒトおよびマウスに由来する遺伝子および遺伝子産物が含まれるが、これに限定されない。特定の種に由来する遺伝子または遺伝子産物が開示された場合、この開示は例示にすぎないことが意図され、特に、現れる文脈によってはっきりと示されていない限り、限定するものと解釈してはならないことが理解される。従って、例えば、本明細書において開示された遺伝子または遺伝子産物は、一部の態様では哺乳動物の核酸およびアミノ酸配列に関連し、他の哺乳動物、魚類、両生類、ハ虫類、および鳥類を含むが、これに限定されない他の動物に由来する相同のおよび/またはオルソロガスな遺伝子および遺伝子産物を包含することが意図される。一部の態様では、前記遺伝子、核酸配列、アミノ酸配列、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質はヒトである。
【００４８】
RIPK2
ミクログリアは中枢神経系(CNS)の常在性マクロファージである。全身炎症または神経変性に応答して、ミクログリアは、M1様炎症誘発状態と呼ばれることが多い活性化状態になり、ミクログリアの慢性活性化によって潜在的に神経毒性が引き起こされ、神経変性疾患の進行が促進される可能性がある。ミクログリアが活性化されると、パーキンソン病(PD)およびアルツハイマー病(AD)を含む様々な神経変性疾患において休止星状細胞から反応性(A1)星状細胞への変換が起こる(Liddelow, S. A. et al. Nature 541, 481-487, doi:10.1038/nature21029 (2017))。α-シヌクレインおよびアミロイド-βの異常なミスフォールディングと凝集は、それぞれ、PDとADでのニューロンにおいて毒性作用を誘導する。従って、M1様ミクログリア形成および反応性星状細胞を阻害することができる作用物質の開発は、PDおよびADを含む神経変性障害に対する普遍的な神経保護薬物として開発することができる。
【００４９】
本発明の態様は、部分的に、α-シヌクレインおよびアミロイド-β凝集物が、TNFα、IL-1α、IL-1β、C1q、およびIL-6を含む神経毒性サイトカインを分泌することによってミクログリア活性化を誘導し、A1星状細胞形成を促進するという発見に基づいている。結果として、活性化ミクログリアまたは反応性星状細胞から放出された、このような炎症メディエーターはニューロン損傷を引き起こし、神経変性疾患の進行に寄与する。従って、活性化ミクログリアと反応性星状細胞は神経変性疾患における重要な上流活動だと述べることができる。ミクログリア活性化と反応性星状細胞形成の阻害は、神経変性プロセスを阻止する、止める、および/または逆転させるための論理的な戦略である。しかしながら、ミクログリア活性化を特異的に標的とするトランスレーショナル方法が無ければ、この戦略は阻まれる。
【００５０】
本明細書中の態様は、ミクログリア活性化および反応性星状細胞形成、ならびに活性化された常在性自然免疫細胞からの炎症性分子および神経毒性分子の放出を標的としかつブロックし、従って、神経変性疾患の進行を阻止する、止める、および/または寛解させるユニークな戦略について説明する。一部の態様では、このような方法はまた選択的である場合があり、例えば、毒性を引き起こすように、ニューロンなどのCNSにある他の細胞の正常機能を実質的に阻害しない。
【００５１】
本明細書において詳述するように、RNA配列決定分析を実施し、α-シヌクレインおよびアミロイド-β凝集物によって活性化されたミクログリアが、ヒトではRIPK2遺伝子によってコードされる酵素であるRIPK2(受容体共役セリン/スレオニン-プロテインキナーゼ2)(Silke J et al., Nat Immunol. 16(7):689-97 (2015))とNOD1(ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン含有タンパク質1(nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 1))ならびにNOD2を有意に誘導することが発見された。驚くべきことに、ミクログリアにおけるRIPK2およびNOD2の枯渇によりミクログリア活性化と神経毒性サイトカイン放出が有意に抑制され、従って、A1星状細胞形成が阻害され、ニューロンが保護されることが見出された。
【００５２】
重要なことに、PDおよびADの患者に由来するヒト死後脳組織におけるNOD2、RIPK2、およびリン酸化RIPK2(p-RIPK2)レベルは正常対象と比較して有意に増加することが発見された。さらに、免疫組織化学によって明らかなように、PDおよびADの患者に由来する脳組織においてp-RIPK2シグナルの増加はミクログリアと高度に共存している。このことから、PDおよびADを含む神経変性疾患の発病においてRIPK2活性化は中心的な役割を果たし、臨床上関連する治療標的になり得ることが示唆される。
【００５３】
さらに、NOD2およびRIPK2ノックアウト(KO)マウスにおいてα-シヌクレインプリフォームドフィブリル(preformed fibril)(α-シヌクレインPFF)定位注射によってPDが誘導された場合に、α-シヌクレインPFFによって誘導されたPDマウスと比較して、NOD2およびRIPK2 KOマウスのLB/LN様病態、マウス脳におけるドーパミン作動性変性(dopaminergic degeneration)、および運動機能不全が有意に寛解し、ミクログリア活性化とA1星状細胞形成が低減し、ニューロンが保護された。
【００５４】
同様に、アミロイド-β凝集物の脳室内注射によってADが誘導されたNOD2およびRIPK2 KOマウスは正常アミロイド-β誘導ADマウスと比較して記憶機能を明らかに改善し、認知障害を寛解させた。
【００５５】
さらに、様々な、経口活性のある低分子ベースのRIPK2インヒビターによるRIPK2活性の阻害は、(1)α-シヌクレインPFF誘導性またはアミロイド-β凝集物誘導性のミクログリア活性化を阻害し、(2)反応性星状細胞形成をブロックし、(3)最後にニューロンを保護することが見出された。本明細書に記載の本発明の前に、ミクログリア活性化および反応性星状細胞形成におけるRIPK2の役割とRIPK2インヒビターの効果は未知であった。
【００５６】
最後に、既知のRIPK2インヒビターであるゲフィチニブをα-シヌクレインPFF誘導PDマウスに経口投与することで、インビボでミクログリアと星状細胞の活性化が阻害されると同時に、マウスにおいてα-シヌクレインPFFによって誘導された病態が有意に救出されることが確認された。全体的に見て、これらの発見は、RIPK2が、PDおよびADを含む神経変性障害の実行可能な治療標的だという証拠をはっきりと提供する。
【００５７】
従って、ある特定の態様では、RIPK2およびNOD2を標的とすることによってミクログリア活性化および/または反応性星状細胞形成を阻害する作用物質には疾患修飾療法としてPDおよびADに対する大きな治療能力がある。
【００５８】
受容体共役タンパク質(RIP)キナーゼ
受容体共役タンパク質(RIP)キナーゼは、比較的保存されているキナーゼドメインを有するが、別個の非キナーゼ領域を有するスレオニン/セリンプロテインキナーゼメンバーの一群である。ヒトでは、5つの異なるRIPキナーゼ型が知られており、RIP1、RIP2、RIP3、RIP4、およびRIP5と名付けられている。多数の異なるドメイン構造、例えば、デスドメインおよびカスパーゼ活性化誘引ドメイン(CARD)が様々なRIPファミリーメンバーにおいて発見され、これらのドメインは、それぞれのRIPキナーゼの特定の機能の決定において重要な特徴だとみなされている。RIPキナーゼは、自然免疫における生物学的プロセスを含む様々な生物学的プロセスに関与することが知られているが、これらの下流基質はほとんど分かっていない。最近の証拠から、プログラムされた形の壊死であるネクロプトーシス(necroptosis)のシグナル伝達経路はデスレセプター誘導に応答したRIP1およびRIP3の活性化に依存することが分かっている。カスパーゼによるRIPの直接的な切断はネクロプトーシス細胞死を阻止し、アポトーシス細胞死に関連する。最近になって、RIP1およびRIP3はネクロプトーシスでの役割に加えて、樹状細胞においてNLRP3インフラマソーム活性化による炎症に寄与することが示された(Kang, T. B. et al., Immunity; 38:27-40; 2013)。
【００５９】
受容体共役セリン/スレオニン-プロテインキナーゼ2(アクセッション番号NP_003812;NCBI/タンパク質アクセッション番号NP_003812.1;遺伝子アクセッション番号NM_003821)は生産的な(productive)炎症応答を促進するように細胞内ペプチドグリカンセンサーNOD1およびNOD2の下流にシグナル伝達する。しかしながら、過度のNOD2シグナル伝達は、炎症性腸疾患(IBD)、類肉腫症、および炎症性関節炎を含む非常に多くの疾患と関連付けられている。
【００６０】
ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン含有タンパク質NOD1およびNOD2は、病原性細菌を検出するように自然免疫系において機能するサイトゾルNod様受容体(NLR)ファミリータンパク質である(Philpott et al. Nat. Rev. Immunol., 14 (2014), pp. 9-23, 2014)。NOD1は、ジアミノピメリン酸(DAP)を含有する細菌ペプチドグリカン断片に結合すると活性化されるのに対して、NOD2はムラミルジペプチド(MDP)構成要素を認識する(Chamaillard et al., Nat. Immunol., 4 (2003), pp. 702-707; Girardin et al., Science, 300 (2003), pp. 1584-1587; Girardin et al., J. Biol. Chem., 278 (2003), pp. 8869-8872; Inohara et al., J. Biol. Chem., 278 (2003), pp. 5509-5512)。NOD活性化は、受容体共役プロテインキナーゼ2(RIP2またはRICKとも知られる、RIPK2)による炎症促進性シグナル伝達を誘導する。これはNOD依存性の活性化において義務的かつ特異的な役割を果たすが、Toll様受容体応答でない(Park et al., J. Immunol., 178 (2007), pp. 2380-2386)。
【００６１】
RIPK2によるシグナル伝達は、二重Ser/ThrおよびTyrキナーゼ活性を有するN末端キナーゼドメイン(Dorsch et al. Cell. Signal., 18 (2006), pp. 2223-2229; Tigno-Aranjuez et al., Genes Dev., 24 (2010), pp. 2666-2677)、ならびに活性化されたNODとのCARD-CARDドメイン集合を媒介するC末端カスパーゼ活性化・動員ドメイン(CARD)(Inohara et al., J. Biol. Chem., 274 (1999), pp. 14560-14567; Ogura et al., J. Biol. Chem., 276 (2001), pp. 4812-4818)に依存する。結合したら、RIPK2は自己リン酸化によって活性化され(Dorsch et al., 2006)、さらに、XIAP(X連鎖アポトーシス抑制タンパク質)および他のE3リガーゼによって非分解性ポリユビキチン化の標的とされる(Bertrand et al., PLoS One, 6 (2011), p. e22356; Damgaard et al., Mol. Cell, 46 (2012), pp. 746-758; Tao et al., Curr. Biol., 19 (2009), pp. 1255-1263; Tigno-Aranjuez et al., Mol. Cell. Biol., 33 (2013), pp. 146-158; Yang et al., J. Biol. Chem., 282 (2007), pp. 36223-36229; Yang et al., Nat. Immunol., 14 (2013), pp. 927-936)。その後、ユビキチンが結合したタンパク質がTAK1およびIKKキナーゼを活性化し、それによって、マイトジェン活性化プロテインキナーゼシグナル伝達経路と核内因子κB(NF-κB)シグナル伝達経路が両方ともアップレギュレートされる(Kim et al., J. Biol. Chem., 283 (2008), pp. 137-144; Park et al., J. Immunol., 178 (2007), pp. 2380-2386)。さらに、RIPK2はNODとオートファジー因子ATG16L1との間のシグナル伝達によって抗菌性オートファジー応答を誘導する(Cooney et al., Nat. Med., 16 (2010), pp. 90-97; Homer et al., J. Biol. Chem., 287 (2012), pp. 25565-25576)。
【００６２】
RIPK2インヒビター
RIPK2活性の阻害は、典型的には、RIPK2の発現の低下、阻害、または阻止、RIPK2の機能性の無力化、およびRIPK2分解の誘導の少なくとも1つまたは複数によって媒介される。ある特定の態様によれば、RIPK2活性の阻害はRIPK2の発現の低下、阻害、または阻止によって媒介される。RIPK2活性の阻害は、直接的に、RIPK2タンパク質、遺伝子、もしくはmRNAと相互作用することによって媒介されてもよく、間接的に、RIPを介した活性または発現に関連するタンパク質、遺伝子、もしくはmRNAと相互作用することによって媒介されてもよい。
【００６３】
RIPK2またはRIPK2が関与する生物学的経路にある分子の発現、プロセシング、翻訳後修飾、または活性を阻害することができる、低分子、抗体、核酸分子(DNA、RNA、例えば、shRNA、siRNA、アンチセンス分子など)などを含むが、これに限定されない、RIPK2インヒビターの異なるカテゴリーが本明細書中の組成物および方法に適している。一部の態様では、RIPK2インヒビターは、RIPK2の発現、プロセシング、翻訳後修飾、または活性を阻害する(例えば、特異的に阻害する)ことができる。他の態様では、RIPK2インヒビターは、スプライシングされていないRIPK2遺伝子の発現、プロセシング、翻訳後修飾、または活性を阻害する(例えば、特異的に阻害する)ことができる。
【００６４】
一部の態様では、本発明のRIPK2インヒビターは、例えば、発現、プロセシング、翻訳後修飾、または活性、例えば、RIPK2またはRIPK2が関与する生物学的経路にある分子の発現、プロセシング、翻訳後修飾、または活性を特異的または直接的に阻害するように作用する細胞内結合分子でもよい。本明細書で使用する「細胞内結合分子」という用語は、タンパク質またはそのタンパク質をコードする核酸(例えば、mRNA分子)に結合することによって、タンパク質のプロセシング、発現、または活性を阻害するように細胞内で作用する分子を含むことが意図される。下記でさらに詳細に説明される細胞内結合分子の例には、RIPK2またはRIPK2が関与する生物学的経路にある分子の相互作用を阻害するアンチセンス核酸、細胞内抗体、ペプチド化合物、およびRIPK2活性またはRIPK2が関与する生物学的経路にある分子の活性を特異的または直接的に阻害する化学物質が含まれる。
【００６５】
一部の態様では、RIPK2インヒビターは酵素的核酸(enzymatic nucleic acid)でもよい。ある特定の遺伝子の発現は酵素的核酸によって阻害することができる。本明細書で使用する「酵素的核酸」とは、遺伝子の連続核酸配列と相補性を有し、遺伝子を特異的に切断することができる基質結合領域を含む核酸を指す。酵素的核酸の基質結合領域は、例えば、遺伝子にある連続核酸配列に50〜100％相補的、75〜100％相補的、90〜100％相補的、または95〜100％に相補的でもよい。酵素的核酸はまた塩基、糖、および/またはリン酸基に修飾を含んでもよい。本方法において使用するための例示的な酵素的核酸はリボザイムである。酵素的核酸という用語は、例えば、リボザイム、触媒RNA、酵素的RNA、触媒DNA、アプタザイム(aptazyme)またはアプタマー結合リボザイム、触媒オリゴヌクレオチド、ヌクレオザイム(nucleozyme)、DNAザイム(DNAzyme)、およびRNAザイム(RNAzyme)と同義で用いられる。
【００６６】
低分子: ある特定の態様では、RIPK2インヒビターは、RIPK2を阻害する(例えば、選択的に阻害する)1つまたは複数の低分子を含んでもよい。適切な低分子RIPK2インヒビターには、当技術分野において公知の任意の低分子RIPK2インヒビターが含まれる。例えば、ある特定の態様では、前記低分子は、ゲフィチニブ(IRESSA(商標), AstraZeneca)、SB203580(Gretchen M. Argast et al., Mol. Cell. Biochem. Vol. 268, 129-140 (2005))、OD36、OD38(J. T. Tigno-Aranjuez et al., J. Biol Chem. Vol. 289 No. 43, 29651-29664 (2014))、ポナチニブ、ソラフェニブ、レゴラフェニブ、またはGSK583(Pamela A Haile et al., J. Med. Chem. Vol 59 N. 10, 4867-4880(2016))、およびその薬学的に許容される塩でもよい。一部の態様では、RIPK2インヒビターは、インビトロRIPK2キナーゼアッセイにおけるゲフィチニブについて観察されたIC50値に類似するIC50値(5倍以内)、またはインビトロRIPK2キナーゼアッセイにおけるゲフィチニブについて観察されたIC50値よりも良いIC50値を有する。
【００６７】
非限定的な有用な低分子RIPK2インヒビターはまた、以下の米国またはPCT出願公報:US20160024114A1;WO2011106168A1;US2013/0251702A1;US20180118733A1;WO2016042087A1;WO2018052773A1;WO2018052772A1;WO2011112588A2;WO2011120025A1;WO2011120026A1;WO2011123609A1;WO2011140442A1;WO2012021580A1;WO2012122011A2;WO2013025958A1;WO2014043437A1;WO2014043446A1;WO2014128622A1;WO2016172134A2;WO2017046036A1;WO2017182418A1;WO2012003544A1に記載の任意の低分子RIPK2インヒビターも含む。これらのそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６８】
非限定的な適切な低分子RIPK2インヒビターはまた、以下:Cruz J. V., et al., 「Identification of Novel protein kinase receptor type 2 inhibitors using pharmacophore and structure-based virtual screening」, Molecules 23, 453, 1-25頁(2018); Sala M., et al.,「Identification and characterization of novel receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 2 inhibitors using structural similarity analysis, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 365:354-367 (2018); He X, et al., 「Identification of potent and selective RIPK2 inhibitors for the treatment of inflammatory diseases」, ACS Med Chem Lett 8:1048-1053(2017)に記載の任意の低分子RIPK2インヒビターも含んでよい。これらのそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６９】
一部の態様では、RIPK2インヒビターはまた、CSLP分子:
2021535152.tif 000002
またはその薬学的に許容される塩でもよく、
ここで、
XはメチルまたはNH2であり、
R1は水素、F、またはメトキシであり、
R2は水素、ヒドロキシル、またはメトキシであり、かつ
R3は-NHSO2(n-プロピル)である。
RIPK2インヒビターとしてのCSLP分子の例が説明されており、例えば、Hrdinka M. et al., The EMBO Journal, e99372, 1-16頁(2018)を参照されたい。これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。一部の態様では、RIPK2インヒビターはまたCSLP分子またはその薬学的に許容される塩でもよく、ここで、XはNH2であり、R1はメトキシであり、R2はメトキシであり、R3は-NHSO2(n-プロピル)である。一部の態様では、RIPK2インヒビターはCSLP分子またはその薬学的に許容される塩でもよく、ここで、XはNH2であり、R1はFであり、R2はメトキシであり、R3は-NHSO2(n-プロピル)である。
【００７０】
本明細書に記載の任意の態様において、RIPK2インヒビターはまた、ゲフィチニブ、ソラフェニブ、レゴラフェニブ、ポナチニブ、SB203580、OD36(6-クロロ-10,11,14,17-テトラヒドロ-13H-1,16-エテノ-4,8-メテノ-1H-ピラゾロ[3,4-g][1,14,4,6]ジオキサジアザシクロヘキサデシン)、OD38([4,5,8,9-テトラヒドロ-7H-2,17-エテノ-10,14-メテノ-1H-イミダゾ[1,5-g][1,4,6,7,12,14]オキサペンタアザシクロヘキサデシン])、WEHI-435(N-(2-(4-アミノ-3-(p-トリル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)-2-メチルプロピル)イソニコチンアミド)、またはGSK583(6-(tert-ブチルスルホニル)-N-(5-フルオロ-1H-インダゾール-3-イル)キノリン-4-アミン)またはその薬学的に許容される塩でもよい。一部の特定の態様では、RIPK2インヒビターはゲフィチニブもしくはGSK583またはその薬学的に許容される塩でもよい。
【００７１】
ある特定の態様では、低分子RIPK2インヒビターは、RIPキナーゼが関与する1つまたは複数の経路を阻害することができる。例えば、RIPK2キナーゼは、下流NF-κB、MAPK、およびオートファジー経路の開始を含むNOD2活性化に不可欠である(J. T. Tigno-Aranjuez et al., J. Biol Chem. Vol. 289 No. 43, 29651-29664 (2014); Kobayashi K., et al., Nature 416, 194-199 (2002); Park J. H., et al., J. Immunol. 178, 2380-2386 (2007); Homer C. R., et al., J. Biol. Chem. 287, 25565-25576 18-20 (2012))。有用な低分子RIPK2インヒビターは、下記で例示されるように1つまたは複数のアッセイによって同定することができる。
【００７２】
アンチセンスオリゴヌクレオチド: 一部の態様では、RIPK2インヒビターは、RIPK2もしくはRIPキナーゼが関与する経路にある分子(例えば、RIPK2が相互作用する分子)をコードする遺伝子、またはこのような遺伝子の一部に相補的なアンチセンス核酸分子、あるいはアンチセンス核酸分子をコードする組換え発現ベクターである。RIPK2アンチセンスのいくつかの例は米国特許第6,426,221号に記載されており、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。細胞において特定のタンパク質の発現をダウンレギュレートするためのアンチセンス核酸の使用は当技術分野において周知である(例えば、Weintraub, H., et al. 1986. Reviews--Trends in Genetics, Vol. 1(1); Askari, F. K., et al. 1996. N. Eng. Med. 334, 316-318; Bennett, M. R., et al. 1995. Circulation 92, 1981-1993; Mercola, D., et al. 1995. Cancer Gene Mer. 2, 47-59; Rossi, J. J., 1995. Br. Med. Bull. 51, 217-225; Wagner. R. W., 1994. Nature 372, 333-335を参照されたい)。アンチセンス核酸分子は、別の核酸分子のコード鎖(例えば、mRNA配列)に相補的なヌクレオチド配列を含み、従って、他の核酸分子のコード鎖と水素結合することができる。mRNAの配列に相補的なアンチセンス配列は、mRNAのコード領域に見出される配列に相補的でもよく、mRNAの5’または3’非翻訳領域に見出される配列に相補的でもよく、コード領域と非翻訳領域をつなぐ領域(例えば、5’非翻訳領域とコード領域の接合部)に見出される配列に相補的でもよい。さらに、アンチセンス核酸は、mRNAをコードする遺伝子の調節領域、例えば、転写開始配列または調節エレメントと配列が相補的でもよい。一態様では、アンチセンス核酸は、コード鎖上にある開始コドンの前にある領域もしくは開始コドンにまたがる領域、またはmRNAの3’非翻訳領域にある領域に相補的になるように設計される。RIPキナーゼ遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列が既知だとすると、従って、RIPキナーゼmRNAの配列が既知だとすると、本発明のアンチセンス核酸はワトソン・クリック塩基対の規則に従って設計することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドはRIPキナーゼの翻訳開始点を取り囲む領域に相補的でもよく、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さが約5、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、または約50ヌクレオチドでもよい。本発明のアンチセンス核酸は、当技術分野において公知の手順を用いて化学合成および酵素的連結反応を用いて構築することができる。細胞における発現を阻害するために、1つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【００７３】
または、アンチセンス核酸は、cDNAの全てまたは一部がアンチセンス配向にサブクローニングされている発現ベクターを用いて生物学的に産生することができる(すなわち、挿入された核酸から転写される核酸は、関心対象の標的核酸に対してアンチセンス配向の核酸である)。アンチセンス発現ベクターは、例えば、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒ウイルスの形をとってもよい。アンチセンス発現ベクターは標準的なトランスフェクション法を用いて細胞に導入することができる。
【００７４】
典型的には、本発明のアンチセンス核酸分子は、タンパク質をコードする細胞mRNAおよび/またはゲノムDNAとハイブリダイズまたは結合し、それによって、タンパク質の発現を、例えば、転写および/または翻訳を阻害することによって阻害するように対象に投与されるか、またはインサイチューで生成される。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の一例には組織部位での直接注射が含まれる。または、選択された細胞を標的とするようにアンチセンス核酸分子を改変し、次いで、全身投与することができる。例えば、全身投与の場合、例えば、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体にアンチセンス核酸分子を連結することによって、選択された細胞表面に発現している受容体または抗原にアンチセンス分子が特異的に結合するようにアンチセンス分子を改変することができる。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記載のベクターを用いて細胞に送達することもできる。
【００７５】
さらに他の態様では、本発明のアンチセンス核酸分子はα-アノマー核酸分子である。α-アノマー核酸分子は相補的RNAと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、α-アノマー核酸分子では通常のβ-ユニットとは反対に鎖は互いに平行している(Gautier, C., et al. 1987. Nucleic Acids. Res. 15, 6625-6641)。アンチセンス核酸分子はまた2’-O-メチルリボヌクレオチド(Inoue, H., et al. 1987. Nucleic Acids Res. 15, 6131-6148)またはキメラRNA-DNA類似体(Inoue, H., et al. 1987. FEBS Lett. 215, 327-330)を含む場合がある。
【００７６】
さらに他の態様では、本発明のアンチセンス核酸分子はリボザイムである。リボザイムは、mRNAなどの一本鎖核酸を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有し、この一本鎖核酸に対する相補領域がある触媒RNA分子である。従って、リボザイム(例えば、ハンマーヘッド型リボザイム(Haselhoff, J., et al. 1988. Nature 334, 585-591に記載))を用いてmRNA転写物を触媒的に切断し、それによってmRNA翻訳を阻害することができる。または、遺伝子の調節領域(例えば、RIPキナーゼプロモーターおよび/またはエンハンサー)に相補的なヌクレオチド配列を標的として、標的細胞における遺伝子転写を阻止する三重らせん構造を形成することによって遺伝子発現を阻害することができる。大まかには、Helene, C., 1991. Anticancer Drug Des. 6(6), 569-84; Helene, C., et al. 1992. Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27-36;およびMaher, L. J., 1992. Bioassays 14(12), 807-15を参照されたい。
【００７７】
他の態様では、RNAiを促進する化合物を用いて、RIPキナーゼまたはRIPキナーゼが関与する生物学的経路にある分子のいずれか1つまたは複数の発現を阻害することができる。本明細書で使用する「RNA干渉」または「RNAi」という用語は、一般的に、標的分子(例えば、標的遺伝子、タンパク質、またはRNA)がダウンレギュレートされる配列特異的または選択的プロセスを指す。特定の態様では、「RNA干渉」または「RNAi」のプロセスは、RNA分子、例えば、細胞内のRNA分子の分解を特徴とし、前記分解はRNA作用物質によって誘発される。分解は酵素的RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)によって触媒される。RNAiは外来RNA(例えば、ウイルスRNA)を除去するために細胞内で天然に生じる。天然RNAiは、分解機構を他の類似するRNA配列に向ける、遊離dsRNAから切断された断片を介して進行する。または、RNAiは、例えば、標的遺伝子の発現を停止させるために、人間の手によって開始することができる。RNA干渉(RNAi)は、dsRNAと同じ配列を含有するメッセンジャーRNA(mRNA)を分解するために、二本鎖RNA(dsRNA)を用いる転写後標的遺伝子サイレンシング法である(Sharp, P. A., et al. 2000. Science 287, 5462:2431-3; Zamore, P. D., et al. 2000. Cell 101, 25-33. Tuschl, T., et al. 1999. Genes Dev. 13, 3191-3197; Cottrell T. R., et al., 2003. Trends Microbiol. 11, 37-43; Bushman F., 2003. Mol. Therapy 7, 9-10; McManus M. T., et al.. 2002. Nat Rev Genet 3, 737-47)。このプロセスは、低分子干渉RNAまたはsiRNAと呼ばれる、もっと短い、例えば、21〜23ヌクレオチド長のRNAに、長いdsRNAが内因性リボヌクレアーゼによって切断された場合に起こる。本明細書で使用する「低分子干渉RNA」(「siRNA」)(当技術分野では「低分子干渉RNA」とも呼ばれる)という用語は、RNA作用物質、例えば、長さが約10〜50ヌクレオチドの二本鎖作用物質(「ヌクレオチド」という用語はヌクレオチド類似体を含む)、例えば、長さが約15〜25ヌクレオチド、または長さが約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、もしくは約25ヌクレオチドを指し、鎖は、任意で、RNA干渉を方向付ける、または媒介することができる、突出末端、例えば、1個、2個、または3個の突出ヌクレオチド(またはヌクレオチド類似体)を含む突出末端を有する。天然siRNAは細胞RNAi機構(例えば、ダイサーまたはそのホモログ)によって長いdsRNA分子(例えば、長さが>25ヌクレオチド)から生成される。次いで、もっと短いRNAセグメントが標的mRNAの分解を媒介する。RNAi合成のためのキットは、例えば、New England Biolabsor Ambionから市販されている。一部の態様では、アンチセンスRNAにおいて使用するための前述した化学的性質のうちの1つまたは複数を、RNAiを媒介する分子において使用することができる。
【００７８】
または、RIPキナーゼまたはRIPキナーゼが関与する生物学的経路にある分子の発現を阻害するために、RNAiを促進する化合物を、細胞、例えば、対象にある細胞において発現させることができる。siRNAとは対照的に、shRNAはマイクロRNA(miRNA)の天然前駆体を模倣しており、遺伝子サイレンシング経路の最初から入る。この理由から、shRNAは、天然遺伝子サイレンシング経路全体に送り込まれることで、より効率的に遺伝子サイレンシングを媒介すると考えられている。shRNA分子の必要な要素は、アニールまたはハイブリダイズして二重鎖または二本鎖ステム部分を形成するのに十分な相補性を有する、第1の部分と第2の部分を含む。2つの部分は完全に、または完璧に相補的である必要はない。第1および第2の「ステム」部分は、他のshRNA部分にアニールまたはハイブリダイズするのに十分でない配列相補性を有する配列を有する部分によってつながっている。この後者の部分はshRNA分子の「ループ」部分と呼ばれる。shRNA分子はsiRNAを生じるように処理される。shRNAはまた、ステムの一部に1つまたは複数のバルジ、すなわち、小さなヌクレオチド「ループ」、例えば、1、2、または3ヌクレオチドのループを生じる余分なヌクレオチドも含む場合がある。ステム部分は同じ長さでもよく、一方の部分は、例えば、1〜5ヌクレオチドのオーバーハングを含んでもよい。ある特定の態様では、本発明のshRNAは、前述した望ましいsiRNA分子の配列を含む。このような態様では、shRNA前駆体は、二重鎖ステムにおいて、インビボで生成されることが望ましいsiRNAの21〜23くらいのヌクレオチド配列を含む。
【００７９】
インビボで細胞に効率的に送達するには、特異的なターゲティング、および、細胞外空間からの、特に血清タンパク質からの実質的な保護が必要である。特異的なターゲティングを実現するある方法は標的部分をiRNA作用物質と結合体化することである。標的部分は、iRNA作用物質を、必要とされる標的部位にターゲティングする手助けになる。標的部分が送達を改善できるある手法は、受容体を介したエンドサイトーシス活性による手法である。この取り込み機構は、膜受容体に結合したiRNA作用物質が、膜構造の嵌入によって、または送達系と細胞膜との融合によって、膜で囲まれた領域の内部に移動することを伴う。このプロセスは、特異的リガンドと細胞表面受容体または膜受容体が結合した後に受容体が活性化することで開始する。糖、例えば、ガラクトース、マンノース、マンノース-6-リン酸、ペプチドおよびタンパク質、例えば、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質、ビタミンB12、インシュリン、および上皮細胞増殖因子(EGF)を認識する系を含めて、多くの受容体によって媒介されるエンドサイトーシス系が既知であり、研究されている。アシアロ糖タンパク質受容体(ASGP-R)は、肝細胞に非常に豊富にある、高い能力の受容体である。ASGP-Rは、D-GalよりもN-アセチル-D-ガラクトシラミン(GalNAc)に対して50倍高い親和性を示す。以前の研究から、nM親和性を実現するためには多価性が必要であるが、糖間の間隔も重要なことが分かっている。
【００８０】
マンノース受容体はD-マンノースに対して高親和性を有し、別の重要な炭水化物ベースのリガンド-受容体ペアである。マンノース受容体はマクロファージ、場合によっては樹状細胞などの特定の細胞タイプ上で高発現している。これらの細胞に薬物分子を標的とするためにマンノース結合体ならびにマンノシル化薬物担体が首尾良く用いられている。例えば、Biessen et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 28024-28030; Kinzel et al. (2003) J. Peptide Sci. 9, 375-385; Barratt et al. (1986) Biochim. Biophys. Acta 862, 153-64; Diebold et al. (2002) Somat. Cell Mol. Genetics 27, 65-74を参照されたい。
【００８１】
親油性部分、例えば、コレステロールまたは脂肪酸が核酸などの高親水性分子に取り付けられると血漿タンパク質結合を大幅に高め、その結果として循環半減期を大幅に延ばすことができる。さらに、リポタンパク質などの、ある特定の血漿タンパク質との結合が、対応するリポタンパク質受容体(例えば、LDL-受容体、HDL-受容体、またはスカベンジャー受容体SR-B1)を発現する特定の組織における取り込みを増加させることが示されている。例えば、Bijsterbosch, M. K., Rump, E. T. et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28, 2717-25; Wolfrum, C., Shi, S. et al. (2007) 25, 1149-57を参照されたい。親油性結合体はまた、標的送達アプローチの細胞内輸送を改善するために標的リガンドと併用することもできる。
【００８２】
PULMOZYME(商標)は、ネブライザー装置に使える準備が整っている液体タンパク質製剤として提供される。ネブライザー装置の他に、定量吸入器として知られる適切な液体ベース吸入器による吸入用に製剤化された吸入可能な溶液、またはドライパウダー吸入器(DPI)として知られる適切な吸入器による吸入用にドライパウダー製剤を提供することによって、薬物および他の薬を肺投与することができる。
【００８３】
細胞内抗体: RIPキナーゼまたはRIPキナーゼが関与する生物学的経路にある分子の発現および/または活性を阻害するのに使用することができる別のタイプの阻害化合物は、前記タンパク質に特異的な細胞内抗体である。細胞におけるタンパク質機能を阻害するための細胞内抗体の使用は当技術分野において公知である(例えば、Carlson, J. R., 1988. Mol. Cell. Biol. 8, 2638-2646; Biocca, S., et al. 1990. EMBO. J. 9, 101-108; Werge, T. M., et al. 1990. FEBS Letters 274, 193-198; Carlson, J. R., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7427-7428; Marasco, W.A., et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893; Biocca, S., et al. 1994. BioTechnology 12, 396-399; Chen, S. Y., et al. 1994. Human Gene Therapy 5, 595-601; Duan, L., et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5075-5079; Chen, S. Y., et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5932-5936; Beerli, R. R., et al. 1994. J. Biol. Chem. 269, 23931-23936; Beerli, R. R., et al. 1994. Biochem. Biophys. Res. Commun. 204, 666-672; Mhashilkar, A. M., et al. 1995. EMBO J. 14, 1542-1551; Richardson, J. H., et al. 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 3137-3141;MarascoらによるPCT公開番号WO 94/02610、およびDuanらによるPCT公開番号WO 95/03832を参照されたい)。
【００８４】
細胞内抗体を用いてタンパク質活性を阻害するために、ベクターを細胞に導入すると抗体鎖が機能的抗体として細胞の細胞内区画で発現されるような形で抗体鎖をコードする組換え発現ベクターが調製される。本発明の方法に従ってRIPキナーゼ活性を阻害するために、このタンパク質に特異的に結合する細胞内抗体が細胞核内で発現される。細胞内抗体の核発現は、N末端疎水性リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を抗体軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子から除去し、軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子のN末端またはC末端に核局在化シグナルをコードするヌクレオチド配列を付加することによって成し遂げることができる(例えば、Biocca. S., et al. 1990. EMBO J. 9, 101-108; Mhashilkar, A. M., et al. 1995. EMBO. J. 14, 1542-1551を参照されたい)。細胞内抗体鎖の核ターゲティングに使用することができる核局在化シグナルはSV40ラージT抗原の核局在化シグナルである(Biocca, S., et al. 1990. EMBO J. 9, 101-108; Mhashilkar, A. M., et al. 1995. EMBO J. 14, 1542-1551を参照されたい)。
【００８５】
遺伝子編集作用物質: ある特定の態様では、前記インヒビターは遺伝子編集作用物質である。遺伝子編集作用物質は、転写および翻訳を阻害または阻止するために遺伝子全体またはその一部を不活性化または除去することができる。例えば、エンドヌクレアーゼのアルゴノート(Argonaute)ファミリー、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)(クリスパー)ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、メガヌクレアーゼ、他のエンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせを含む任意の適切なヌクレアーゼ系を使用することができる。その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Schiffer, 2012, J. Virol. 88(17):8920-8936を参照されたい。
【００８６】
ある特定の態様では、遺伝子編集作用物質は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(クリスパー)関連エンドヌクレアーゼ/Cas(クリスパー/Cas)である。クリスパー/Cas様タンパク質は、野生型クリスパー/Casタンパク質、改変されたクリスパー/Casタンパク質、または野生型もしくは改変されたクリスパー/Casタンパク質の断片でもよい。核酸結合親和性および/もしくは特異性を高めるように、酵素活性を変えるように、ならびに/またはこのタンパク質の別の特性を変えるようにクリスパー/Cas様タンパク質を改変することができる。例えば、クリスパー/Cas様タンパク質のヌクレアーゼ(すなわち、DNアーゼ、RNアーゼ)ドメインを改変、欠失、または不活性化することができる。または、クリスパー/Cas様タンパク質は、このタンパク質の機能に必要不可欠でないドメインを除去するように切断することができる。クリスパー/Cas様タンパク質はまた、このタンパク質のエフェクタードメインの活性を最適化するように切断または改変することもできる。一般的に、クリスパー/Casタンパク質は少なくとも1種類のRNA認識ドメインおよび/またはRNA結合ドメインを含む。RNA認識および/またはRNA結合ドメインはガイドRNAと相互作用する。クリスパー/Casタンパク質はまたヌクレアーゼドメイン(すなわち、DNアーゼまたはRNアーゼドメイン)、DNA結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、RNAseドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、ならびに他のドメインを含んでもよい。
【００８７】
複数の態様では、クリスパー/CasシステムはI型、II型、またはIII型システムでもよい。適切なクリスパー/Casタンパク質の非限定的な例には、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(またはCasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas10d、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(またはCasA)、Cse2(またはCasB)、Cse3(またはCasE)、Cse4(またはCasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、およびCu1966が含まれる。
【００８８】
一部の態様では、RNAガイドエンドヌクレアーゼはII型クリスパー/Casシステムに由来する。他の態様では、RNAガイドエンドヌクレアーゼはCas9タンパク質に由来する。
【００８９】
ある特定の態様では、前記システムはアルゴノートヌクレアーゼシステムである。アルゴノートは、標的を切断するためのガイドとして、5'リン酸化された短い一本鎖核酸を使用するエンドヌクレアーゼファミリーである(Swarts, D.C. et al. The evolutionary journey of Argonaute proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 21, 743-753 (2014))。Cas9と同様に、アルゴノートは遺伝子発現の抑制および外来核酸に対する防御において重要な役割を有する(Swarts, D.C. et al. Nat. Struct. Mol. Biol. 21, 743--753 (2014); Makarova, K.S., et al. Biol. Direct 4, 29 (2009). Molloy, S. Nat. Rev. Microbiol. 11, 743 (2013); Vogel, J. Science 344, 972-973 (2014). Swarts, D.C. et al. Nature 507, 258-261 (2014); Olovnikov, I., et al. Mol. Cell 51, 594-605 (2013))。しかしながら、アルゴノートは多くの点でCas9と異なる(Swarts, D.C. et al. Nat. Struct. Mol. Biol. 21, 743-753 (2014))。Cas9は原核生物にしか存在しないのに対して、アルゴノートは進化を通じて保存されており、実質的に全ての生物に存在する。ほとんどのアルゴノートは一本鎖(ss)RNAと結合し、RNAサイレンシングにおいて中心的な役割を有するが、一部のアルゴノートはssDNAに結合し、標的DNAを切断する(Swarts, D.C. et al. Nature 507, 258-261 (2014); Swarts, D.C. et al. Nucleic Acids Res. 43, 5120-5129 (2015))。正しいCas9結合のためにガイドRNAは3'RNA-RNAハイブリダイゼーション構造を有さなければならないが、アルゴノート結合には、ガイドの特異的コンセンサス二次構造は必要とされない。Cas9はPAMの上流にある標的しか切断できないが、アルゴノートに必要な、標的上にある特異的配列はない。アルゴノートとガイドが結合したら、互いの物理化学的特徴に影響を及ぼし、全体的に見て、核酸結合タンパク質に特有のキネティック特性をもって働く(Salomon, W.E., et al. Cell 162, 84-95 (2015))。
【００９０】
アルゴノートタンパク質は典型的には約100kDaの分子量を有し、ピィウィ・アルゴノート・ジウレ(Piwi-Argonaute-Zwille)(PAZ)ドメインとPIWIドメインを特徴とする。古細菌および細菌のアルゴノートタンパク質の結晶学的研究から、PAZドメインはダイサー酵素にも共通して見られ、PAZドメインが結合する小型RNAの3’突出末端に対して特異的結合ポケットを形成することが明らかになった(Jinek and Doudna, (2009) Nature 457, 405-412))。PIWIドメインの構造は、RNA-DNAハイブリッドのRNA鎖を切断することが示されている細菌RNAse Hの構造と似ている(Jinek and Doudna, (2009) Nature 457, 405-412))。最近になって、スライサー(Slicer)活性とも呼ばれる、miRNAエフェクター複合体の触媒活性がアルゴノートタンパク質そのものに存在することが発見された。
【００９１】
ヒトAgoサブファミリーのメンバーはAGO1、AGO2、AGO3、およびAGO4からなり、普遍的に発現しており、miRNAおよびsiRNAと結合する。Agoタンパク質は種全体にわたって保存されており、多くの生物が複数のファミリーメンバーを発現し、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）では1つ、ショウジョウバエ(Drosophila)では5つ、ヒトでは8つ、アラビドプシス属(Arabidopsis)では10から線虫(C.elegans)では27まで及ぶ(Tolia and Joshua-Tor, (2007) Nat. Chem. Biol. 3, 36-43)。アルゴノートタンパク質はまた、サッカロマイセス・カステリ(Saccharomyces castellii)を含む出芽酵母のいくつかの種にも存在する。S.カステリは、動物、植物、および他の菌類において見出される古典的ダイサータンパク質とは異なるダイサータンパク質によって生成されるsiRNAを発現することが発見された(Drinnenberg et al., (2009) Science 326, 544-550)。
【００９２】
構造研究は、ガイド鎖のみと複合体化した、またはガイドDNA鎖と標的RNA二重鎖と複合体化したサーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)アルゴノートまで広げられている。この分析から、複合体の構造は2つの葉(lobe)に分けられることが明らかになった。一方の葉は、リンカー領域、L1を介してN末端ドメインに接続したPAZドメインを含有する。他方の葉は、中間(middle)(MID)ドメイン(PAZとPIWIドメインの間に位置する)と、PIWIドメインからなる。アルゴノートが結合する小型RNAの5’リン酸はMIDドメインの特異的結合ポケットの中に配置される(Jinek and Doudna, (2009) Nature 457, 405-412)。アルゴノートタンパク質とガイドDNAまたはRNA分子との接触は小型RNAまたはDNAの糖-リン酸バックボーンとの相互作用によって支配される。従って、RNAまたはDNAガイド鎖の塩基は相補的な標的RNAと塩基対合するために遊離している。構造から、標的mRNAはガイドDNA鎖と塩基対合するが、前記タンパク質に接触しないことが分かっている (Wang et al., (2008a) Nature 456, 921-926; Wang, Y. et al., (2009) Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 1259-1266; Wang et al., (2008b) Nature 456, 209-213)。
【００９３】
ゲノム編集のためのアルゴノートエンドヌクレアーゼ、例えば、ナトロノバクテリウム・グレゴルイ(Natronobacterium gregoryi)アルゴノート(NgAgo)の有用な特徴には、以下:(i)NgAgoはガイド-標的ミスマッチに対する許容度が低い(ii)5'リン酸化された短いssDNAは哺乳動物細胞において珍しく、そのため、細胞オリゴヌクレオチドがNgAgoを誤った方向に導く可能性が最小になる; (iii)NgAgoは「1ガイド忠実(one-guide-faithful)」規則に従う。すなわち、NgAgoタンパク質が発現プロセス中に存在する場合にしかガイドはロードされず、ロードされたら、NgAgoは37℃で、そのgDNAを他の遊離ssDNAと交換できない、が含まれる。
【００９４】
従って、ある特定の態様では、アルゴノートエンドヌクレアーゼは、一本鎖RNA(ssRNA)または一本鎖DNA(ssDNA)に結合するものを含む。ある特定の態様では、アルゴノートはナトロノバクテリウム・グレゴルイに由来する。他の態様では、ナトロノバクテリウム・グレゴルイアルゴノート(NgAgo)は、野生型NgAgo、改変されたNgAgo、または野生型もしくは改変されたNgAgoの断片である。NgAgoは、核酸結合親和性および/もしくは特異性を高めるように、酵素活性を変えるように、ならびに/または前記タンパク質の別の特性を変えるように改変することができる。例えば、NgAgoのヌクレアーゼ(例えば、DNアーゼ)ドメインを改変、欠失、または不活性化することができる。
【００９５】
RIPキナーゼまたはRIPキナーゼが関与する生物学的経路にある分子の活性を特異的に阻害するのに使用することができる他の阻害物質は、発現、プロセシング、翻訳後修飾、および/または活性、例えば、RIPキナーゼ-2の発現、プロセシング、翻訳後修飾、および/または活性を直接阻害する化合物である。このような化合物は、詳述されているように、ならびに他の当技術分野において認められている技法を用いて、このような化合物を選択するスクリーニングアッセイを用いて同定することができる。
【００９６】
例示的な態様では、治療的用途のための薬学的組成物を生成するために上記の阻害化合物のうちの1つまたは複数が標準的な製薬プロトコールに従って製剤化される。本発明の薬学的組成物は、その意図された投与経路と適合するように製剤化される。
【００９７】
スクリーニングアッセイ
ある特定の局面では、本発明は、RIPキナーゼの阻害において有用な化合物を同定するための方法を特徴とする。ある特定の態様では、前記インヒビターはRIPK2インヒビターである。スクリーニングアッセイの例には、遺伝子発現アッセイ、転写アッセイ、キナーゼアッセイ、免疫アッセイなどが含まれるが、それに限定されるわけではない。
【００９８】
RIPキナーゼのインヒビターとしてスクリーニングするための低分子は、市販のライブラリー、例えば、NANOCYCLIX(登録商標)(Oncodesign)から入手することができる。化合物ライブラリーのスクリーニングは、キナーゼとして昆虫細胞などの細胞内で発現された組み換え精製されたRIPK2と、基質としてRBER-CHKtideを利用したインビトロ放射測定キナーゼアッセイを用いて行うことができる。50μlの反応物あたり約50ngの組換えRIPK2と2μgの組換えRBER-CHKtide基質を用いて、3×10-6m〜9×10-11mに及ぶ様々なインヒビター濃度を試験することができる。次いで、<100nmのインビトロIC50値を示す化合物を細胞アッセイにおいて試験する。この細胞アッセイでは、NOD2とRIPK2の同時発現によってRIPK2活性(チロシン自己リン酸化)を誘導し、RIPK2インヒビターを用いる処理によるチロシン自己リン酸化の消失によってキナーゼ活性の阻害を評価する。次いで、さらなるインビトロアッセイおよびインビボアッセイのために、もっと少ない、例えば、約250nmの用量で、細胞アッセイにおいてRIPK2チロシンリン酸化の阻害を維持する化合物を使用する。キナーゼ特異性は、組換えキナーゼを様々な用量のインヒビターとプレインキュベートした後に、既知の基質を用いてインビトロキナーゼアッセイを行うことによって試験することができる。30分後に反応を止め、リン酸の組み込みを測定する。
【００９９】
従って、例示的な局面では、本発明は、RIPキナーゼのリン酸化活性の阻害において有用な化合物を同定する方法を特徴とする。これには、RIPキナーゼの転写、翻訳、遺伝子発現、活性などの阻害が含まれ得る。例示的な局面では、前記方法は、精製された組換えRIPキナーゼと基質を含む指標組成物を提供する工程;指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させる工程;および試験化合物のライブラリーから、キナーゼ活性を減少させる関心対象の化合物を選択する工程を含む。
【０１００】
他の態様では、スクリーニングアッセイは、(1)炎症において重要な役割を果たす、NF-kBのNOD1依存的およびNOD2依存的活性化、(2)アミロイド-βおよびα-シヌクレイン凝集物によって誘導されるミクログリア活性化ならびにA1星状細胞形成のブロッキング、ならびに(3)ニューロンの維持に対するインヒビターの効果を測定する。
【０１０１】
本明細書で使用する「試験化合物」という用語は、試験されている活性のモジュレーターだと以前に突き止められたことがない、または認識されたことがない化合物を指す。「試験化合物のライブラリー」という用語は、多種多様な試験化合物を含むパネルを指す。本明細書で使用する「指標組成物」という用語は、関心対象のタンパク質(例えば、RIPK2、またはRIPK2が関与する生物学的経路にある分子、例えば、NOD1、NOD2)、例えば、前記タンパク質を天然で発現する細胞、前記タンパク質をコードする1つもしくは複数の発現ベクターを導入することによって前記タンパク質を発現するように操作された細胞、または前記タンパク質(例えば、精製された天然タンパク質もしくは組み替えにより操作されたタンパク質)を含有する無細胞組成物を含む組成物を指す。「細胞」という用語は原核細胞および真核細胞を含む。一部の態様では、本発明の細胞は細菌細胞である。他の態様では、本発明の細胞は真菌細胞、例えば、酵母細胞である。他の態様では、本発明の細胞は、脊椎動物細胞、例えば、鳥類細胞または哺乳動物細胞である。他の態様では、本発明の細胞はマウス細胞またはヒト細胞である。本明細書で使用する、(操作された細胞のように)「操作された」という用語は、核酸分子、例えば、RIPキナーゼ(例えば、スプライシングされた形および/またはスプライシングされていない形)をコードする核酸分子が導入されている細胞を指す。
【０１０２】
一部の態様では、本発明はまた、神経変性疾患または神経変性障害(例えば、中枢神経系(CNS)の1つもしくは複数の領域におけるアップレギュレートされたNOD2、リン酸化RIPK2、および/またはRIPK2に関連するもの)に対する治療用物質を同定する方法を提供する。一部の態様では、前記方法は、候補治療用物質の存在下で、CNS常在性自然免疫細胞を、免疫細胞の活性化を誘導する作用物質(例えば、異常に凝集したタンパク質)と接触させる工程;候補治療用物質の存在下で、CNS常在性自然免疫細胞の活性化を測定する工程;および、対照と比較してCNS常在性自然免疫細胞の活性化を阻害する治療用物質を同定する工程を含む。一部の態様では、候補治療用物質は、RIPK2インヒビター、例えば、本明細書においてスクリーニングアッセイによって同定されたRIPK2インヒビターである。一部の態様では、CNS常在性自然免疫細胞を、NOD2のアップレギュレーション、リン酸化RIPK2、および/またはRIPK2を誘導する前記物質と接触させる。一部の態様では、CNS常在性自然免疫細胞はミクログリアおよび/または星状細胞である。一部の態様では、CNS常在性自然免疫細胞の活性化を誘導する前記物質は、異常に凝集したタンパク質、例えば、α-シヌクレイン、アミロイド-β、および/またはタウである。一部の態様では、測定する工程は、NOD2、リン酸化RIPK2、および/またはRIPK2の発現レベルを測定することを含む。一部の態様では、測定する工程は、因子iNOS、Cxcl1、および/またはIL-1βの発現レベルを測定することを含む。一部の態様では、測定する工程は、CNS免疫細胞の走化性を測定することを含む。このような態様のいずれでも、前記方法は、治療用物質を同定することを含んでもよく、前記治療用物質は、RIPK2の活性および/もしくは発現を阻害し、例えば、他のRIPキナーゼよりもRIPK2の活性および/もしくは発現を選択的に阻害し;NF-kBのNOD2依存的活性化を阻害し;かつ/またはアミロイド-β凝集物誘導性ミクログリア活性化、α-シヌクレイン凝集物誘導性ミクログリア活性化および/もしくはA1星状細胞形成を阻害する。このような態様のいずれでも、神経変性疾患または神経変性障害は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS/ルー・ゲーリック病)、パーキンソン病、糖尿病性ニューロパシー、ポリグルタミン(ポリQ)病、脳卒中、ファール病、多発性硬化症、メンケス病、ウィルソン病、脳虚血、プリオン障害、認知症、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、多系統萎縮、遺伝性痙性対麻痺、脊髄小脳萎縮、脳傷害、および/または脊髄傷害でもよい。一部の特定の態様では、神経変性疾患または神経変性障害はアルツハイマー病またはパーキンソン病の場合がある。一部の態様では、本発明はまた、本明細書中の任意のスクリーニング方法を用いて同定された治療用物質に指向している。
【０１０３】
薬学的組成物
さらなる局面は、活性作用物質としてRIPK2インヒビターと、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む薬学的組成物を提供する。本明細書に記載のRIPK2インヒビターのどれでも適している。一部の態様では、RIPK2インヒビターは薬学的組成物中の唯一の活性成分である。一部の態様では、RIPK2と、1種類または複数種類のさらなる活性成分(例えば、本明細書に記載のさらなる活性成分)を薬学的組成物に含めることができる。
【０１０４】
RIPK2インヒビターは投与経路に応じて製剤化することができる。ある特定の態様では、RIPK2インヒビターは、静脈内、皮下、動脈内、腹腔内、眼、筋肉内、頬、直腸、膣、眼窩内、脳内、皮内、頭蓋内、脊髄内、脳室内、くも膜下腔内、大槽内、関節内、肺内、鼻腔内、経粘膜、経皮、吸入、またはそれらの任意の組み合わせを含む投与経路を介して投与される。
【０１０５】
ある特定の態様では、RIPK2インヒビターは経口投与または非経口投与される。
【０１０６】
本発明のある特定の態様では、RIPK2インヒビター治療用物質は、ニューロン細胞に対して効果を発揮するように治療用物質が血液脳関門を通過できるような、全身取り込みを可能にする剤形で投与される。例えば、使用される非経口/注射液に適した治療用物質の薬学的製剤には、一般的に、滅菌した水溶液(水溶性の場合)または分散液、および滅菌注射液または分散液を即座に調製するための滅菌散剤が含まれる。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、容易な通針性(syringeability)が存在する程度まで流動性がなければならない。剤形は製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌および菌類などの微生物の汚染作用から守らなくてはならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、その適切な混合物、または植物油を含有する溶媒または分散媒でもよい。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンを使用することによって、分散液の場合、必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ベンジルアルコール、ソルビン酸などによって防止することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。組成物中に吸収を遅延する作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによって、注射可能な組成物を長期間吸収させることができる。
【０１０７】
滅菌注射液は、必要に応じて上記で列挙された様々な他の成分と一緒に、必要な量の治療用物質を適切な溶媒に組み入れた後に濾過または最終滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基本分散媒と、上記で列挙されたものに由来する必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。滅菌注射液調製用の滅菌散剤の場合、調製方法は、以前に滅菌濾過された溶液から活性成分と任意のさらなる望ましい成分の散剤を生じる真空乾燥法および凍結乾燥法を含む。本発明による薬学的組成物は、典型的には、注射または注入に適した液体製剤である。例えば、食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液を、液体担体、特に、注射液用の液体担体として使用することができる。
【０１０８】
静脈内投与に用いられる溶液または懸濁液には、典型的には、担体、例えば、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL(商標)(BASF, Parsippany, NJ)、エタノール、またはポリオールが含まれる。全ての場合において、前記組成物は無菌でなければならず、容易な通針性のために流動性がなければならない。適切な流動性は、多くの場合、レシチンまたは界面活性剤を用いて得ることができる。前記組成物はまた製造および保管の条件下で安定でなければならない。微生物は、抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどを用いて阻止することができる。多くの場合、等張剤(糖)、多価アルコール(マンニトールおよびソルビトール)、または塩化ナトリウムを前記組成物に含めることができる。前記組成物の長期吸収は、吸収を遅延する作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを添加することによって成し遂げることができる。必要な時に、前記組成物はまた注射部位での疼痛を和らげるために局所麻酔薬、例えば、リグノカインも含んでよい。一般的に、前記成分は、例えば、活性作用物質の量を示すアンプルまたは小さな袋(sachette)などの密閉封止された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、単位剤形で、別々に供給されるかまたは一緒に混合される。前記組成物が注入によって投与される場合、滅菌した薬学グレードの水または食塩水が入っている注入瓶(infusion bottle)を用いて分配することができる。前記組成物が注射によって投与される場合、投与前に前記成分を混合できるように、滅菌した注射用水または食塩水のアンプルは提供されることがある。
【０１０９】
経口組成物は不活性希釈剤または可食担体を含む。前記組成物はゼラチンで密封されてもよく、錠剤に圧縮されてもよい。経口投与のために、活性作用物質は賦形剤と混合し、錠剤、トローチ、またはカプセルの形にすることができる。薬学的に適合する結合物質またはアジュバント材料を組成物に含めることができる。錠剤、トローチ、およびカプセルは、任意で、結合物質、例えば、結晶セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチン;賦形剤、例えば、デンプンもしくはラクトース、崩壊剤、例えば、アルギン酸、Primogel、もしくはトウモロコシデンプン;潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム;流動化剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素;または甘味剤もしくは着香剤を含有してもよい。
【０１１０】
前記組成物はまた経粘膜経路または経皮経路でも投与することができる。経粘膜投与は、ロゼンジ、点鼻薬、吸入器、または坐剤を使用することによって成し遂げることができる。経皮投与もまた、当技術分野において公知の軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームを含有する組成物を使用することによって成し遂げることができる。経粘膜投与または経皮投与の場合、浸透しようとする障壁に適した浸透剤が用いられる。前記組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合物質および担体と一緒に坐剤として製剤化されてもよい。
【０１１１】
皮内用途または皮下用途に用いられる溶液または懸濁液は、典型的には、以下の成分:滅菌希釈剤、例えば、水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒;抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン;抗酸化物質、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム;キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA);緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩;および等張化剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースの少なくとも1つを含む。pHは、酸または塩基を用いて調節することができる。このような調製物は、アンプル、使い捨て注射器、または複数回投与用バイアル中に封入することができる。
【０１１２】
ある特定の態様では、ポリペプチド活性作用物質は、身体からの急速な排出から、このポリペプチドを保護するために担体と一緒に調製される。生分解性ポリマー(例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸)が用いられることが多い。このような製剤を調製する方法は当業者に公知である。リポソーム懸濁液も薬学的に許容される担体として使用することができる。リポソームは、当技術分野において公知の確立した方法に従って調製することができる(例えば、米国特許第4,522,811号)。
【０１１３】
処置を必要とする対象の様々な状態、例えば、症状の重篤度、対象の全身の健康状態、対象の年齢、体重、性別、食事、投与のタイミングおよび頻度、併用される薬物、処置に対する応答性、および処置の遵守を考慮しながら、本発明の方法におけるRIPK2インヒビターの投与用量を決定することができる。
【０１１４】
処置の方法
様々な態様では、本発明はまた、神経変性疾患または神経変性障害、例えば、パーキンソン病またはアルツハイマー病を予防または処置する方法も提供し、前記方法は、受容体共役タンパク質(RIP)キナーゼ2(RIPK2)インヒビターまたはRIPK2インヒビターを含む薬学的組成物の治療的有効量を、それを必要とする対象(例えば、ヒト)に投与する工程を含む。本明細書に記載のRIPK2インヒビターおよびRIPK2インヒビターを含む薬学的組成物のどれでも使用することができる。例えば、有用なRIPK2インヒビターには、RIPK2の活性および/またはその発現を阻害することができるRIPK2インヒビターが含まれる。一部の態様では、RIPK2インヒビターは、RIPK1および/またはRIPK3などの他のRIPキナーゼよりも選択的であるインヒビター、例えば、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、またはそれより大きな選択性を有するインヒビターでもよい。一部の態様では、RIPK2インヒビターには、他のRIPキナーゼに対して実質的に活性がない。しかしながら、一部の態様では、RIPK2インヒビターはまたデュアルもしくはマルチRIPキナーゼインヒビター、または汎RIPキナーゼインヒビターでもよい。
【０１１５】
一部の態様では、神経変性疾患または神経変性障害は、中枢神経系(CNS)の1つもしくは複数の領域における、アップレギュレートされたNOD2、リン酸化RIPK2、および/またはRIPK2に関連する。CNSにおけるアップレギュレートされたNOD2、リン酸化RIPK2、および/またはRIPK2に関連する様々な疾患または障害は、本明細書における方法を用いて処置することができる。非限定的な例には、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS/ルー・ゲーリック病)、パーキンソン病、糖尿病性ニューロパシー、ポリグルタミン(ポリQ)病、脳卒中、ファール病、メンケス病、ウィルソン病、脳虚血、プリオン障害、認知症、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、多系統萎縮、遺伝性痙性対麻痺、脊髄小脳萎縮、脳傷害、または脊髄傷害が含まれる。
【０１１６】
一部の態様では、神経変性疾患または神経変性障害はCNS常在性自然免疫細胞の活性化に関連する。一部の態様では、神経変性疾患または神経変性障害は、例えば、1つまたは複数の異常タンパク質、例えば、異常凝集タンパク質によって媒介される、CNS常在性自然免疫細胞の活性化に関連する。一部の態様では、CNS常在性自然免疫細胞はミクログリアおよび/または星状細胞である。一部の態様では、異常タンパク質はα-シヌクレイン、アミロイド-β、および/またはタウを含む。一部の態様では、神経変性疾患または神経変性障害はパーキンソン病またはアルツハイマー病である。このような態様では、RIPK2インヒビターは、典型的には、CNS常在性自然免疫細胞の活性化を阻害するのに有効な量で投与される。一部の態様では、RIPK2インヒビターは、活性化された常在性自然免疫細胞から分泌され神経炎症およびニューロン損傷を誘導する1種類または複数種類の炎症性メディエーターまたは神経毒性メディエーター(例えば、TNFα、IL-1α、IL-1β、C1q、および/またはIL-6)のレベルを低減するのに有効な量で投与することができる。
【０１１７】
ある特定の態様は、RIPK2インヒビターまたはRIPK2インヒビターを含む薬学的組成物の治療的有効量を、それを必要とする対象(例えば、ヒト)に投与する工程を含む、パーキンソン病を処置または予防する方法に指向している。本明細書に記載のRIPK2インヒビターおよびRIPK2インヒビターを含む薬学的組成物のどれでも使用することができる。例えば、有用なRIPK2インヒビターには、RIPK2の活性および/またはその発現を阻害することができるRIPK2インヒビターが含まれる。一部の態様では、RIPK2インヒビターは、RIPK1および/またはRIPK3などの他のRIPキナーゼよりも選択的であるインヒビター、例えば、約2倍、約4倍、約10倍、またはそれより大きな選択性を有するインヒビターでもよい。一部の態様では、RIPK2インヒビターには、他のRIPキナーゼに対して実質的に活性がない。しかしながら、一部の態様では、RIPK2インヒビターはまた、デュアルもしくはマルチRIPキナーゼインヒビター、または汎RIPキナーゼインヒビターでもよい。一部の態様では、RIPK2インヒビターは、本明細書に記載の低分子RIPK2インヒビターである。
【０１１８】
ある特定の態様はまた、RIPK2インヒビターまたはRIPK2インヒビターを含む薬学的組成物の治療的有効量を、それを必要とする対象(例えば、ヒト)に投与する工程を含む、アルツハイマー病を処置または予防する方法にも指向している。本明細書に記載のRIPK2インヒビターおよびRIPK2インヒビターを含む薬学的組成物のどれでも使用することができる。例えば、有用なRIPK2インヒビターには、RIPK2の活性および/またはその発現を阻害することができるRIPK2インヒビターが含まれる。一部の態様では、RIPK2インヒビターは、RIPK1および/またはRIPK3などの他のRIPキナーゼよりも選択的なインヒビター、例えば、約2倍、約4倍、約10倍、またはそれより大きな選択性を有するインヒビターでもよい。一部の態様では、RIPK2インヒビターには、他のRIPキナーゼに対して実質的に活性がない.しかしながら、一部の態様では、RIPK2インヒビターはまたデュアルもしくはマルチRIPキナーゼインヒビター、または汎RIPキナーゼインヒビターでもよい。一部の態様では、RIPK2インヒビターは、本明細書に記載の低分子RIPK2インヒビターである。
【０１１９】
一部の態様では、本発明はまた、RIPK2インヒビターまたはRIPK2インヒビターを含む薬学的組成物の有効量を対象に投与する工程を含む、対象においてニューロン細胞を保護する方法も提供する。一部の態様では、前記方法は、例えば、異常タンパク質、例えば、α-シヌクレイン、アミロイド-β、および/またはタウによって媒介されるグリオーシス(ミクログリアおよび/または星状細胞の活性化)に由来する神経炎症および/または毒性からニューロン細胞を保護する。一部の態様では、対象は1つまたは複数の神経変性疾患または神経変性障害(例えば、本明細書に記載の任意の神経変性疾患または神経変性障害)、例えば、パーキンソン病またはアルツハイマー病に罹患している。本明細書に記載のRIPK2インヒビターおよびRIPK2インヒビターを含む薬学的組成物のどれでも使用することができる。例えば、有用なRIPK2インヒビターには、RIPK2の活性および/またはその発現を阻害することができるRIPK2インヒビターが含まれる。一部の態様では、RIPK2インヒビターは、RIPK1および/またはRIPK3などの他のRIPキナーゼよりも選択的であるインヒビター、例えば、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、またはそれより大きな選択性を有するインヒビターでもよい。一部の態様では、RIPK2インヒビターには、他のRIPキナーゼに対して実質的に活性がない。しかしながら、一部の態様では、RIPK2インヒビターはデュアルもしくはマルチRIPキナーゼインヒビター、または汎RIPキナーゼインヒビターでもよい。一部の態様では、RIPK2インヒビターは、本明細書に記載の低分子RIPK2インヒビターである。
【０１２０】
本明細書に記載の方法のいずれにおいても、RIPK2インヒビターは、意図された投与経路を介した対象(例えば、ヒト)への投与のために製剤化することができる、または意図された投与経路を介して対象(例えば、ヒト)に投与することができる。例えば、一部の態様では、RIPK2インヒビターは、静脈内に、皮下に、動脈内に、腹腔内に、眼に、筋肉内に、頬に、直腸に、膣に、眼窩内に、脳内に、皮内に、頭蓋内に、脊髄内に、脳室内に、くも膜下腔内に、大槽内に、関節内に、肺内に、鼻腔内に、経粘膜的に、経皮的に、および/または吸入を介して投与することができる。一部の特定の態様では、RIPK2インヒビターは経口投与を介して投与することができる。一部の態様では、RIPK2インヒビターは非経口投与(例えば、注射、例えば、静脈内注射)を介して投与することができる。典型的に、RIPK2インヒビターは、NFκBのNOD1依存的活性化、NF-kBのNOD2依存的活性化、ミクログリア活性化、および反応性星状細胞形成より選択される1つまたは複数の活性を阻害するのに有効な量で投与される。
【０１２１】
ある特定の態様では、本明細書に記載のRIPK2インヒビター(例えば、低分子インヒビター)は少なくとも1種類の他の治療的に活性な作用物質と組み合わせて投与することができる。2種類またはそれ以上の作用物質が同時投与されてもよく、同時に製剤化されてもよく、別々に投与されてもよく、連続して投与されてもよい。例えば、一部の態様では、前記方法は、パーキンソン病を処置するための方法であり、RIPK2インヒビターは、レボドパ、カルボドーパ(carbodopa)、またはそれらの組み合わせ、プラミペキソール、ロピニロール、ロチゴチン、セレギリン、ラサギリン、エンタカポン、トルカポン、ベンズトロピン、トリヘキシフェニジル、もしくはアマンタジン、またはその薬学的に許容される塩と組み合わせて投与することができる。一部の態様では、前記方法は、アルツハイマー病を処置するための方法であり、RIPK2インヒビターは、ドネペジル、ガランタミン、メマンチン、リバスチグミン、アデュカヌマブ、クレネズマブ、ソラネズマブ、およびガンテネルマブを含む抗Aβ(アミロイドβ)療法、ベルベセスタット、AZD3293(LY3314814)、エレンベセスタット(elenbecestat)(E2609)、LY2886721、PF-05297909、JNJ-54861911、TAK-070、VTP-37948、HPP854、CTS-21166を含むBACE1の低分子インヒビター、もしくは抗タウ療法、例えば、LMTM(ロイコメチルチオニニウム-bis(ヒドロメタンスルホネート))、またはその薬学的に許容される塩と組み合わせて投与することができる。
【０１２２】
一部の態様では、RIPK2インヒビターは、RIPK1、RIPK3、RIPK4、および/またはRIPK5などの他のRIPキナーゼのインヒビターと組み合わせて投与することができる。例えば、一部の態様では、RIPK2インヒビターはRIPK1インヒビターと組み合わせて投与することができる。適切なRIPK1インヒビターには、当技術分野において公知のRIPK1インヒビター、例えば、米国特許第9,896,458号およびWO2017/096301に記載のRIPK1インヒビターが含まれる。米国特許第9,896,458号およびWO2017/096301の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２３】
ある特定の態様は、CNS常在性自然免疫細胞の活性化を阻害する方法を含む。一部の態様では、前記方法は、免疫細胞を有効量のRIPK2インヒビター(例えば、本明細書に記載のRIPK2インヒビター)と接触させる工程を含む。一部の態様では、前記方法は、異常タンパク質、例えば、異常に凝集したタンパク質、例えば、α-シヌクレイン、アミロイド-β、および/またはタウによって媒介される、CNS常在性自然免疫細胞の活性化を阻害する。一部の態様では、接触させる工程はインビボでもよい。一部の態様では、必要な時に、インビボでのCNS常在性自然免疫細胞の活性化またはその阻害を様々な画像化方法によって測定することができる。例えば、Dipont A.C.らは、神経変性疾患における活性化ミクログリアを検出するためのトランスロケータータンパク質-18kDa(TSPO)ポジトロン放出断層撮影(PET)画像化方法 Intl. J. Mol. Sci., 18(4):785 (2017)について述べた。例えば、一部の態様では、接触させる工程は、1つまたは複数の神経変性疾患(例えば、本明細書に記載の任意の神経変性疾患、例えば、パーキンソン病またはアルツハイマー病)を有する対象のCNSにおいて行われる。一部の態様では、接触させる工程はインビトロでもよい。一部の態様では、接触させる工程はまたエクスビボでもよい。一部の態様では、RIPK2インヒビターの量は、対照(例えば、RIPK2インヒビターが無いプラセボで処置/接触された実質的に同じ細胞)と比較して、CNS常在性自然免疫細胞によって分泌された1種類または複数種類の炎症性メディエーターまたは神経毒性メディエーターのレベルを低減するのに有効な量である。例えば、一部の態様では、RIPK2インヒビターと接触させる工程は、対照と比較して、TNFα、IL-1α、IL-1β、C1q、IL-6、またはそれらの組み合わせのレベルを低減するのに有効でもよい。
【０１２４】
キット
ある特定の態様では、その神経変性疾患または神経変性障害を処置するためのキットは、少なくとも1種類のRIPK2インヒビターと薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤の薬学的組成物を備える。一部の態様では、キットは、処置または投与の方法の指示があるラベルをさらに備えてもよい。ある特定の態様では、キットは少なくとも1種類のさらなる治療的に活性な化合物(例えば、本明細書に記載の治療的に活性な化合物)をさらに備える。
【０１２５】
2種類またはそれ以上のRIPK2インヒビターをキットに含めることができ、RIPK2インヒビターは、低分子、siRNA、shRNA、マイクロRNA、抗体、アプタマー、酵素、遺伝子編集システム、ホルモン、無機化合物、オリゴヌクレオチド、有機化合物、ポリヌクレオチド、ペプチド、または合成化合物を含んでもよい。
【実施例】
【０１２６】
実施例1: p-RIPK2はヒトPD死後組織のSNpcにおいて上昇する
研究の理論的根拠および目的: 本研究の目標は、PD患者の死後ヒト脳組織におけるリン酸化RIPK2(p-RIPK2)、RIPK2、およびNOD2の発現を調べること、パターン認識受容体であるNOD2がPDにおけるミクログリア中のαシヌクレイン凝集物の受容体であり得るかどうかを調べることであった。神経学的に損なわれていない正常対象(n=4)およびPD対象(n=7)に由来するヒト死後組織試料(黒質、SN)を、ジョンズホプキンス大学、病理学部門、神経病理課(Division of Neuropathology, Department of Pathology of Johns Hopkins University)から入手した。PD診断は病理学的基準および臨床基準によって確認された。PD患者および対照に由来するヒト死後黒質(SN)脳組織におけるp-RIPK2、RIPK2、およびNOD2レベルを免疫染色、PLA、リアルタイムPCR、およびウエスタンブロット分析によってモニタリングした。
【０１２７】
方法
PD死後脳の免疫組織化学(IHC): 10μm厚のホルマリン固定パラフィン包埋ヒト死後SN組織があるスライドをジョンズホプキンス大学、病理学部門、神経病理課から入手した。組織切片を脱パラフィンおよび再水和し、次いで、クエン酸ベースの抗原アンマスキング溶液(Vector Laboratories)を用いて熱誘導エピトープ賦活化(heat-induced epitope retrieval)を行った。次いで、スライドをウサギポリクローナルp-RIPK2またはIba-1抗体で染色した。全切片をH&Eで染色した。
【０１２８】
インサイチュー近接ライゲーションアッセイ(PLA): 組織切片を、製造業者の説明書に従ってインサイチュー近接ライゲーションアッセイ(Sigma)に使用した。簡単に述べると、切片を、提供されたブロッキング緩衝液でブロックし、一次抗体と4℃で12時間インキュベートした。次いで、マイナスまたはプラスプローブ結合二次抗体を添加し、37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後に、ライゲーションミックスを各カバーガラスに添加し、37℃でさらに30分間インキュベートした。次いで、増幅-ポリメラーゼ含有反応溶液を添加することによってシグナルを増幅した。ヘマトキシリン対比染色後にカバーガラスをマウントした。
【０１２９】
リアルタイムRT-PCR(qPCR): 全RNAを、RNeasy(登録商標)Plus Micro Kit(Qiagen)を用いてヒトSN死後組織およびマウス腹側中脳組織から単離した。次いで、第1鎖cDNAを、SuperScript(登録商標)IV First-Strand Synthesis System(Invitrogen)を用いて合成した。リアルタイムPCRを、ViiA(商標)7 Real-Time PCR System によってSYBR Green試薬を用いて行った。2-ΔΔCT法(Livak and Schmittgen, Methods 25:402-8 (2001))を、この値を計算するために使用した。全てのΔCT値をGAPDHに対して基準化した。
【０１３０】
ウエスタンブロット分析: 以前に述べられたように(Ko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:16691-6 (2010))、ヒトSNの死後組織を、150mM NaCl、5mM EDTA、10mM Tris-HCl pH7.4、Nonidet P 40、10mM Na-β-グリセロリン酸、complete protease inhibitor cocktail(Roche)、およびphosphatase inhibitor cocktail I and II(Sigma-Aldrich)を含有する組織溶解緩衝液中でホモジナイズした。次いで、溶解産物を利用して2X Laemmli buffer(Bio-Rad)を希釈した。20μgのタンパク質を8〜16％勾配SDS-PAGEゲルで分離し、ニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロース膜を、5％脱脂粉乳と0.1％Tween-20を含有するTris緩衝食塩水でRTで1時間ブロックした。次いで、膜を、以下の通り一次抗体:抗NOD2、抗RIPK2、および抗pRIPK2抗体と4℃で一晩インキュベートした。3回洗浄した後、膜をHRP結合ウサギまたはマウス二次抗体(HRP-conjugated rabbit or mouse secondary antibodies)(GE Healthcare)とRTで1時間インキュベートした。シグナルを利用して化学ルミネセンス試薬(Thermo Scientific)を視覚化した。次いで、膜をHRP結合β-アクチン抗体(Sigma)で再プローブした。
【０１３１】
結果: 本発明者らのデータから、強いミクログリア活性化とレビー小体(LB)病態(図1A)があるPD患者試料のSN(図1B)においてp-RIPK2免疫反応性は有意に増加し、免疫組織化学によって評価した場合に、PD患者試料のSNにおいてp-RIPK2シグナルは主にcd-11b陽性ミクログリアと共存することが分かる(図1C)。qPCR分析によって評価した場合に、PD患者試料に由来するSNにおいてNOD2およびRIPK2 mRNAレベルは有意に増加する(図1D)。また、ウエスタンブロット分析によって評価した場合に、PD患者試料に由来するSNにおいてNOD2、RIPK2、およびp-RIPK2タンパク質レベルも有意に増加する(図1E〜G)。まとめると、これらのデータから、RIPK2活性化部位は主にPD脳にあるミクログリアであり、過剰なRIPK2活性化がPD発病において中心的な役割を果たすことが分かる。
【０１３２】
パターン認識受容体であるNOD2がPDのミクログリアにおいてα-シヌクレイン凝集物の受容体であり得るかどうか確かめるために、本発明者らは、インビトロとインビボの両方でタンパク質間相互作用などの単一タンパク質事象を検出することができる強力な技術であるin situ Duolink近接ライゲーションアッセイ(PLA)を行った。本発明者らは、PD死後のSNにおいて、α-シヌクレイン凝集物とNOD2に対する特異的抗体の存在下で多数の強力な陽性シグナル(図1H)を観察した。このことから、ミクログリアにおいてα-シヌクレイン凝集物とNOD2が相互作用することが示唆される(図1H)。このデータから、α-シヌクレインはNOD2受容体のリガンドであることが分かる。
【０１３３】
（表１）NOD2およびRIPK2のmRNAレベル(相対倍率)(図1Dに関連する)。値は平均±S.E.M.である(n=5)。(*P<0.05、***P<0.001)
2021535152.tif 000003
【０１３４】
（表２）NOD2の相対タンパク質レベル(図1Fに関連する)。値は平均±S.E.M.である(n=4(対照)、n=7(PD))。(*P<0.05)
2021535152.tif 000004
【０１３５】
（表３）p-RIPK2およびRIPK2の相対タンパク質レベル(図1Gに関連する)。値は平均±S.E.M.である(n=4(対照)、n=7(PD))。(**P<0.01、***P<0.001)
2021535152.tif 000005
【０１３６】
実施例2: α-シヌクレインPFF活性化ミクログリアはインビトロでRIPK2、NOD1、およびNOD2を誘導する
研究の理論的根拠および目的: 本研究の目標は、qPCR分析によって、α-シヌクレインPFFが初代ミクログリアにおいてRIPK2、NOD1、およびNOD2のmRNA発現を誘導するかどうか調べることであった。
【０１３７】
方法
比較qPCR: 培養細胞に由来する全RNAを、RNA isolation kit(Qiagen, CA)によって、会社が提供した説明書に従って抽出した。RNA濃度を、NanoDrop 2000 (Biotek, Winooski, VT)を用いて分光測定で測定した。1〜2μgの全RNAを、High-Capacity cDNA Reverse Transcription System (Life Technologies, Grand Island, NY)を用いてcDNAに逆転写した。各試料について、比較qPCRを、fast SYBR Green Master Mix (Life Technologies)とViiA 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて2回または3回繰り返して行った。標的遺伝子の発現レベルをβ-アクチンの発現に対して基準化し、比較サイクル閾値Ct法(2-ΔΔCt)に基づいて計算した。
【０１３８】
結果: 本発明者らは、エンドトキシンフリーα-シヌクレインPFFで処理した初代ミクログリアを用いたRNAseq分析から、合計600個を超える特異的に発現した遺伝子を入手した。このうちNOD2およびRIPK2がトップランクにあった。本発明者らは、α-シヌクレインPFF活性化ミクログリアにおいてRIPK2およびNOD2のmRNAレベルが有意に増加し、従って、脳における活性化ミクログリアに関連する神経変性障害の治療標的になり得ることを確認した。
【０１３９】
（表４）正常(PBS)およびαシヌクレインPFF活性化マウス初代ミクログリアにおけるRIIPK2、NOD1、およびNOD2のmRNAレベル(相対倍率)。値は平均±SEMである(n=3)。(**P<0.01、***P<0.001)
2021535152.tif 000006
【０１４０】
実施例3. NOD2またはRIPK2の枯渇より、α-シヌクレインPFFによって誘導されるミクログリア活性化とA1反応性星状細胞が抑制される
研究の理論的根拠および目的: 本研究の目標は、1)α-シヌクレインPFFによって活性化された初代ミクログリアによるサイトカイン産生、例えば、TNFα、IL-1α、および補体C1q(A1星状細胞誘導物質)に対するNOD2またはRIPK2の枯渇効果を評価すること、2)活性化ミクログリアによって誘導された神経毒性反応性A1星状細胞の分化に対するNOD2またはRIPK2の枯渇効果を調べること、ならびに3)反応性A1星状細胞によって誘導されたニューロン毒性に対するNOD2またはRIPK2の枯渇効果を調べることであった。この目標に向かって、qPCRおよびニューロン毒性アッセイを使用した。
【０１４１】
方法
α-シヌクレイン精製およびα-シヌクレインPFF調製: IPTG依存性誘導性pRK172ベクター系を用いて以前に述べられたように、組換えマウスαシヌクレインタンパク質を精製した(Nat Protoc. 9:2135-46 (2014))。エンドトキシンをToxinEraser endotoxin removal kit(Genscript, NJ, USA)によって枯渇させた。マグネチックスターラで攪拌しながら(37℃で1,000rpm)、α-シヌクレインPFF(5mg ml-1)をPBSに溶解して調製した。α-シヌクレインタンパク質を1週間インキュベートした後、凝集物をPBSで0.1mg ml-1まで希釈し、10％振幅(Branson Digital sonifier, Danbury, CT, USA)で30秒間(0.5sパルスオン/オフ)超音波処理した。α-シヌクレインPFFを原子間力顕微鏡および透過型電子顕微鏡を用いて検証し、免疫染色を用いて、ホスホ-セリン129α-シヌクレイン(p-α-synSer129)を誘導する能力を確認した。αシヌクレインPFFを使用まで-80℃で保管した。
【０１４２】
初代ニューロン、ミクログリア、および星状細胞の細胞培養、ならびにα-シヌクレインPFF処置: NOD2またはRIPK2ノックアウトマウスをJackson Laboratories(Bar Harbor, ME, USA)から入手した。初代皮質ニューロンを胎生15.5日の子から調製し、ポリ-L-リジンでコーティングした組織培養プレート上にある、B-27、0.5mM L-グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシン(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)を加えたNeurobasal medium(Gibco)の中で培養した。3〜4日ごとに培地を交換することによってニューロンを維持した。以前に述べられたように(PMID: 26157004)、初代ミクログリアおよび星状細胞の培養を行った。生後1日目(P1)のマウスの子から全脳を入手した。髄膜を除去した後、脳を、10％熱失活FBS、50U ml-1ペニシリン、50μg ml-1ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、100μM非必須アミノ酸、および2mMピルビン酸ナトリウムを加えたDMEM/F12(Gibco)(DMEM/F12完全培地)で3回洗浄した。脳を0.25％トリプシン-EDTAに移した後、10分間、穏やかに攪拌した。DMEM/F12完全培地を使用してトリプシン処理を止めた。この培地で脳を3回、再洗浄した。シングル細胞懸濁液を粉砕によって入手した。シングル細胞懸濁液を100μmナイロンメッシュに通すことで細胞破片および凝集物を除去した。このように得られた最終シングル細胞懸濁液をT75フラスコ中で13日間培養し、完全培地を6日目に交換した。混合グリア細胞集団を、EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit(StemCell)を用いて星状細胞に富む画分とミクログリアに富む画分に分離した。ミクログリアを含有する磁気的に分離された画分と、星状細胞を含有する、流し出した(pour-off)画分を別々に培養した。
【０１４３】
野生型(WT)、NOD2ノックアウト(KO)、RIPK2 KOマウスから調製したミクログリアをα-シヌクレインPFF(最終濃度1μg/mL)で30分間処置した後にqPCRアッセイを行った。
【０１４４】
α-シヌクレインPFFで処置した、初代野生型ミクログリアに由来する条件培地(WT PFF-MCM)、NOD2ノックアウトミクログリアに由来する条件培地(NOD2-/-PFF-MCM)、またはRIPK2ノックアウトミクログリアに由来する条件培地(RIPK2-/-PFF-MCM)を収集し、初代星状細胞に24時間適用した。1)本発明者らがα-syn PFF-ACMと定義する、WT PFF-MCMによる活性化星状細胞からの条件培地、2)本発明者らがNOD2-/-PFF-ACMと定義する、NOD2-/-PFF-MCMによる活性化星状細胞からの条件培地、3)本発明者らがRIPK2-/-PFF-ACMと定義する、RIPK2-/-PFF-MCMによる活性化星状細胞からの条件培地を、complete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail(Sigma)を用いて収集し、約50×濃縮されるまでAmicon Ultra-15遠心式フィルターユニット(10kDaカットオフ)(Millipore)を用いて濃縮した。全タンパク質濃度を、Pierce BCA protein assay kit(Thermo Scientific)を用いて求めた。ニューロン細胞死アッセイのために、15μg ml-1または50μg ml-1の全タンパク質をマウス初代ニューロンに添加した。
【０１４５】
比較qPCR: 培養細胞に由来する全RNAを、RNA isolation kit(Qiagen, CA)によって、会社が提供した説明書に従って抽出した。RNA濃度を、NanoDrop 2000(Biotek, Winooski, VT)を用いて分光測定で測定した。1〜2μgの全RNAを、High-Capacity cDNA Reverse Transcription System(Life Technologies, Grand Island, NY)を用いてcDNAに逆転写した。各試料について、比較qPCRを、fast SYBR Green Master Mix(Life Technologies)とViiA 7 Real-Time PCR System(Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて2回または3回繰り返して行った。標的遺伝子の発現レベルをβ-アクチンの発現に対して基準化し、比較サイクル閾値Ct法(2-ΔΔCt)に基づいて計算した。
【０１４６】
LDHおよびアラマーブルーアッセイによる細胞生存率: 初代培養皮質ニューロンをPFF-ACMまたはNOD2-/-PFF-ACMまたはRIPK2-/-PFF-ACMで24時間処理した。細胞生存率を2種類の方法:アラマーブルー(Invitrogen)およびLDHアッセイ(Sigma)によって求めた。細胞死を、アラマーブルーアッセイによって製造業者のプロトコールに従って評価した。相対細胞生存率と膜完全性を表す培養培地中のLDH活性を、LDHアッセイキットを用いて製造業者のプロトコールに従って分光測定で測定した。各条件について3つの同じウェルをアッセイした。
【０１４７】
結果: 本発明者らのデータから、α-シヌクレインPFFは、ミクログリア(図3A、3B、および3C)ならびに隠れた(covert)A1星状細胞(図3D)において、反応性A1星状細胞誘導物質として知られるTNFα、IL-1α、およびC1qを誘導できることが分かる。重要なことに、ミクログリアにおけるNOD2またはRIPK2の枯渇により、ミクログリアからのA1星状細胞誘導物質の放出((図3A、3B、および3C)と、その後のA1星状細胞変換(図3D)が抑制される。α-シヌクレインPFF誘導性A1星状細胞条件培地(PFF-ACM)は初代皮質ニューロンに対して毒性があるが、NOD2-/-またはRIPK2-/-PFF-ACMは有意な毒性がない(図3Eおよび3F)。この結果から、RIPK2および/またはNOD2活性を阻害するとミクログリアの活性化と神経毒性A1星状細胞形成の形成がブロックされ、従って、ニューロンが保護されることがはっきりと分かる。
【０１４８】
（表５）C1qのmRNAレベル(相対倍率)(図3Aに関連する)。値は平均±SEMである(n=3)。(***P<0.001)
2021535152.tif 000007
【０１４９】
（表６）TNFαのmRNAレベル(相対倍率)(図3Bに関連する)。値は平均±SEMである(n=3)。(***P<0.001)
2021535152.tif 000008
【０１５０】
（表７）IL-1αのmRNAレベル(図3Cに関連する)。値は平均±SEMである(n=3)。(***P<0.001)
2021535152.tif 000009
【０１５１】
（表８）蛍光強度(対照に対する％;図3Eに関連する)。値は平均±SEMである(n=3)。(**P<0.01、***P<0.001)
2021535152.tif 000010
【０１５２】
（表９）LDH放出(正の対照に対する％;図3Fに関連する)。値は平均±SEMである(n=3)。(*P<0.05、***P<0.001)
2021535152.tif 000011
【０１５３】
実施例4. NOD2またはRIPK2の枯渇により、α-シヌクレインPFFによって誘導されるミクログリアの形態学的変化と遊走が抑制される
研究の理論的根拠および目的: 本研究の目標は、1)α-シヌクレインPFFによって誘導される形態学的変化と遊走に対するNOD2またはRIPK2の枯渇効果を評価することであった。これを探索するために、形態学アッセイ、qPCR、および遊走アッセイを使用した。
【０１５４】
方法
形態学的アッセイ: 初代培養ミクログリアをポリ-D-リジンコーティング12ウェルプレートにプレートした。α-シヌクレインPFF処理の12時間後に、形態学的に変化したアメーバ様型のミクログリアを計数した。細胞をDAPIで対比染色した。
【０１５５】
比較定量リアルタイムPCR(qPCR): 培養細胞に由来する全RNAを、RNA isolation kit(Qiagen, CA)によって、会社が提供した説明書に従って抽出した。RNA濃度を、NanoDrop 2000 (Biotek, Winooski, VT)を用いて分光測定で測定した。1〜2μgの全RNAを、High-Capacity cDNA Reverse Transcription System (Life Technologies, Grand Island, NY)を用いてcDNAに逆転写した。各試料について、比較qPCRを、fast SYBR Green Master Mix (Life Technologies)とViiA 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて2回または3回繰り返して行った。標的遺伝子の発現レベルをβ-アクチンの発現に対して基準化し、比較サイクル閾値Ct法(2-ΔΔCt)に基づいて計算した。
【０１５６】
遊走アッセイ: インビトロ細胞遊走アッセイのために、初代培養ミクログリアをポリ-D-リジンコーティング12ウェルポリカーボネート細胞培養インサート上と、培養皿の底に播種した。培養皿中でα-syn PFFで12時間処理した後に、インサートの底部側にある遊走したミクログリアをIba-1抗体で染色した。次いで、遊走指数(migration index)を、PBS対照に対するIba-1陽性遊走ミクログリアの数の比によって計算した。
【０１５７】
結果: 本発明者らのデータから、α-シヌクレインPFFはミクログリアの形態学的変化を有意に誘導することが分かる。ミクログリアにおいてNOD2またはRIPK2が欠失しているとアメーバ様型のミクログリアが抑制される(図4Aおよび4B)。NOD2-/-またはRIPK2-/-ミクログリアではIL-1αおよびiNOSなどのPFF誘導性炎症促進性遺伝子のmRNA発現が激減した(図4Cおよび4D)。NOD2-/-またはRIPK2-/-ミクログリアでは遊走能力とサイトカインCxcl1発現も低下した(図4E、図4F、図4G、および図4H)。
【０１５８】
（表１０）形態学的に変化したミクログリア(変化したミクログリアの数;図4Bに関連する)。値は平均±SEMである(n=3)。(*P<0.05、***P<0.001)
2021535152.tif 000012
【０１５９】
（表１１）IL-1αのmRNAレベル(相対倍率)(図4Cに関連する)。値は平均±SEMである(n=3)。(**P<0.01、***P<0.001)
2021535152.tif 000013
【０１６０】
（表１２）iNOSのmRNAレベル(相対倍率)(図4Dに関連する)。値は平均±SEMである(n=3)。(**P<0.01、***P<0.001)
2021535152.tif 000014
【０１６１】
（表１３）Cxcl1のmRNAレベル(相対倍率)(図4Eに関連する)。値は平均±SEMである(n=3)。(*P<0.05、**P<0.01)
2021535152.tif 000015
【０１６２】
（表１４）ミクログリアの遊走指数(図4Cに関連する)。値は平均±SEMである(n=3)。(*P<0.05、**P<0.01)
2021535152.tif 000016
【０１６３】
実施例5: RIPK2インヒビターは、インビトロで、α-シヌクレインPFFによって誘導されるミクログリア活性化とA1反応性星状細胞を抑制する
研究の理論的根拠および目的: 本研究の目的は、1)α-シヌクレインPFFによって活性化された初代ミクログリアによるサイトカイン産生、例えば、TNFα、IL-1α、および補体C1q(反応性A1星状細胞誘導物質)に対するRIPK2インヒビターの効果を評価すること、2)活性化ミクログリアによって誘導されたA1神経毒性星状細胞の形成に対するRIPK2インヒビターの効果を調べること、ならびに3)反応性A1星状細胞によって誘導されたニューロン毒性に対するRIPK2インヒビターの効果を調べることであった。この目標に向かって、qPCRおよびニューロン毒性アッセイを使用した。
【０１６４】
方法
α-シヌクレイン精製およびα-シヌクレインPFF調製: IPTG依存性誘導性pRK172ベクター系を用いて以前に述べられたように(Nat Protoc. 9(9):2135-46 (2014))、組換えマウスαシヌクレインタンパク質を精製した。エンドトキシンを ToxinEraser endotoxin removal kit (Genscript, NJ, USA)によって枯渇させた。マグネチックスターラで攪拌しながら(37℃で1,000 rpm)、α-シヌクレインPFF(5 mg ml-1)をPBSに溶解して調製した。α-シヌクレインタンパク質を1週間インキュベートした後、凝集物をPBSで0.1mg ml-1まで希釈し、10％振幅(Branson Digital sonifier, Danbury, CT, USA)で30秒間(0.5sパルスオン/オフ)超音波処理した。α-シヌクレインPFFを原子間力顕微鏡および透過型電子顕微鏡を用いて検証し、免疫染色を用いて、ホスホ-セリン129α-シヌクレイン(p-α-synSer129)を誘導する能力を確認した。αシヌクレインPFFを使用まで-80℃で保管した。
【０１６５】
初代ニューロン、ミクログリア、および星状細胞の細胞培養、ならびにα-シヌクレインPFF処理:  NOD2またはRIPK2ノックアウトマウスをJackson Laboratories(Bar Harbor, ME, USA)から入手した。初代皮質ニューロンを胎生15.5日の子から調製し、ポリ-L-リジンでコーティングした組織培養プレート上にある、B-27、0.5 mM L-グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシン(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)を加えたNeurobasal medium(Gibco)の中で培養した。3〜4日ごとに培地を交換することによってニューロンを維持した。以前に述べられたように(PMID: 26157004)、初代ミクログリアおよび星状細胞の培養を行った。生後1日目(P1)のマウスの子から全脳を入手した。髄膜を除去した後、脳を、10％熱失活FBS、50U ml-1ペニシリン、50μg ml-1ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、100μM非必須アミノ酸、および2mMピルビン酸ナトリウムを加えたDMEM/F12(Gibco)(DMEM/F12完全培地)で3回洗浄した。脳を0.25％トリプシン-EDTAに移した後、10分間、穏やかに攪拌した。DMEM/F12完全培地を使用してトリプシン処理を止めた。この培地で脳を3回、再洗浄した。シングル細胞懸濁液を粉砕によって入手した。シングル細胞懸濁液を100μmナイロンメッシュに通すことで細胞破片および凝集物を除去した。このように得られた最終シングル細胞懸濁液をT75フラスコ中で13日間培養し、完全培地を6日目に交換した。混合グリア細胞集団を、EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit(StemCell)を用いて星状細胞に富む画分とミクログリアに富む画分に分離した。ミクログリアを含有する磁気的に分離された画分と、星状細胞を含有する、流し出した(pour-off)画分を別々に培養した。
【０１６６】
ゲフィチニブまたはGSK583(10μM)を、WT、NOD2 KO、またはRIPK2 KOから調製したミクログリアに30分間添加し、さらにα-シヌクレインPFF(最終濃度1μg/mL)を4時間インキュベートした後にqPCRを行った。
【０１６７】
α-シヌクレインPFFで処理した、初代野生型ミクログリアに由来する条件培地(PFF-MCM)、ゲフィチニブ処理ミクログリアに由来する条件培地(PFF-ゲフィチニブ-MCM)、またはGSK583処理ミクログリアに由来する条件培地(PFF-GSK583-MCM)を収集し、初代星状細胞に24時間適用した。1)本発明者らがPFF-ACMと定義する、PFF-MCMによる活性化星状細胞に由来する条件培地、2)本発明者らがPFF-ゲフィチニブ-ACMと定義する、PFF-ゲフィチニブ-MCMによる活性化星状細胞に由来する条件培地、3)本発明者らがPFF-GSK583-ACMと定義する、PFF-GSK583-MCMによる活性化星状細胞に由来する条件培地を、complete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail(Sigma)を用いて収集し、約50×濃縮されるまでAmicon Ultra-15遠心式フィルターユニット(10kDaカットオフ)(Millipore)を用いて濃縮した。全タンパク質濃度を、Pierce BCA protein assay kit(Thermo Scientific)を用いて求めた。ニューロン細胞死アッセイのために、15μg ml-1または50μg ml-1の全タンパク質をマウス初代ニューロンに添加した。
【０１６８】
比較qPCR: 培養細胞に由来する全RNAを、RNA isolation kit(Qiagen, CA)によって、会社が提供した説明書に従って抽出した。RNA濃度を、NanoDrop 2000 (Biotek, Winooski, VT)を用いて分光測定で測定した。1〜2μgの全RNAを、High-Capacity cDNA Reverse Transcription System (Life Technologies, Grand Island, NY)を用いてcDNAに逆転写した。各試料について、比較qPCRを、fast SYBR Green Master Mix (Life Technologies)とViiA 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて2回または3回繰り返して行った。標的遺伝子の発現レベルをβ-アクチンの発現に対して基準化し、比較サイクル閾値Ct法(2-ΔΔCt)に基づいて計算した。
【０１６９】
LDHおよびアラマーブルーアッセイによる細胞生存率: 初代培養皮質ニューロンをPFF-ACM、PFF-ゲフィチニブ-MCM、またはPFF-GSK583-ACMで24時間処理した。細胞生存率を2種類の方法:アラマーブルー(Invitrogen)およびLDHアッセイ(Sigma)によって求めた。細胞死を、アラマーブルーアッセイによって製造業者のプロトコールに従って評価した。相対細胞生存率と膜完全性を表す培養培地中のLDH活性を、LDHアッセイキットを用いて製造業者のプロトコールに従って分光測定で測定した。各条件について3つの同じウェルをアッセイした。
【０１７０】
結果: 本発明者らのデータから、α-シヌクレインPFFはミクログリア(図5A、5B、および5C)ならびに隠れた反応性神経毒性A1星状細胞(図5D)においてTNFα、IL-1α、およびC1qを誘導することが分かる。ミクログリアにおいてゲフィチニブまたはGSK583などのRIPK2インヒビターを処置すると、ミクログリアからのA1星状細胞誘導物質の放出(図5A、5B、および5C)と、その後のA1星状細胞変換(図5D)が有意に抑制される。α-シヌクレインPFF誘導性A1星状細胞条件培地(PFF-ACM)は初代皮質ニューロンに対して毒性があるが、ゲフィチニブまたはGSK583で処理すると、主に神経毒性星状細胞によって誘導されるニューロン細胞死が有意に阻止された(図5Eおよび5F)。
【０１７１】
（表１５）C1qのmRNAレベル(相対倍率)(図5Aに関連する)。値は平均±SEMである(n=3)。(***P<0.001)
2021535152.tif 000017
【０１７２】
（表１６）TNFαのmRNAレベル(相対倍率)(図5Bに関連する)。値は平均±SEMである(n=3)。(***P<0.001)
2021535152.tif 000018
【０１７３】
（表１７）IL-1αのmRNAレベル(相対倍率)(図5Cに関連する)。値は平均±SEMである(n=3)。(***P<0.001)
2021535152.tif 000019
【０１７４】
（表１８）蛍光強度(対照に対する％;図5Eに関連する)。値は平均±SEMである(n=3)。(***P<0.001)
2021535152.tif 000020
【０１７５】
（表１９）LDH放出(正の対照に対する％;図5Fに関連する)。値は平均±SEMである(n=3)。(***P<0.001)
2021535152.tif 000021
【０１７６】
実施例6: NOD2またはRIPK2の枯渇により、α-シヌクレインPFF誘導PD動物モデルにおけるレビー小体(LB)病態が有意に寛解し、ミクログリア活性化が抑制される
研究の理論的根拠および目的: 本研究の目的は、NOD2またはRIPK2がPDの実行可能な治療標的になり得るかどうか検証するために、α-シヌクレインPFFモデルPDにおけるNOD2枯渇またはRIPK2枯渇の抗PD効力を調べることであった。
【０１７７】
方法
定位α-シヌクレインPFF注射のためのマウス系統: NOD2またはRIPK2ノックアウトマウスをJackson Laboratories (Bar Harbor, ME)から入手した。全ての収容、交配、および 手順がNIH Guide for the Care and Use of Experimental Animalsに従って実施され、ジョンズホプキンス大学実験動物委員会(Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee)によって承認された。
【０１７８】
α-シヌクレインタンパク質精製およびPFF調製: IPTG依存性誘導性pRK172ベクター系を用いて以前に述べられたように、組換えマウスαシヌクレインタンパク質を精製した。エンドトキシンをToxinEraser endotoxin removal kit (Genscript, NJ, USA)によって枯渇させた。マグネチックスターラで攪拌しながら(37℃で1,000rpm)、α-シヌクレインPFF(5mg ml-1)をPBSに溶解して調製した。α-シヌクレインタンパク質を1週間インキュベートした後、凝集物をPBSで0.1mg ml-1まで希釈し、10％振幅(Branson Digital sonifier, Danbury, CT, USA)で30秒間(0.5sパルスオン/オフ)超音波処理した。α-シヌクレインPFFを原子間力顕微鏡および透過型電子顕微鏡を用いて検証し、免疫染色を用いて、ホスホ-セリン129α-シヌクレイン(p-α-synSer129)を誘導する能力を確認した。αシヌクレインPFFを使用まで-80℃で保管した。
【０１７９】
定位α-シヌクレインPFF注射および免疫組織化学(IHC): α-シヌクレインPFFを定位注射するために、3ヶ月齢のNOD2 KOまたはRIPK2 KO雄および雌をキシラゼン(xylazene)およびケタミンで麻酔をかけた。注射カニューレ(injection cannula)(26.5ゲージ)を片側だけ右半球に入れて線条体(STR)(内外方向、ブレグマから2.0mm;腹背側、0.2mm;背腹側、2.6mm)に定位的に適用した。2μLのα-シヌクレインPFF(PBSに溶解して2.5μg/mL)または同じ体積のPBSを0.2μL/分の速度で注入した。最終投薬後に、α-シヌクレインPFFまたはPBSを完全に吸収させるために注射カニューレをさらに5分間STRに保ち、次いで、マウス脳からゆっくりと取り外した。頭部皮膚を縫合によって縫い合わせ、外科手術後に創傷治癒と回復をモニタリングした。IHC分析のために、線条体α-シヌクレインPFF注射の3ヶ月後に、動物に灌流し、氷冷PBSの後に4％パラホルムアルデヒドを用いて心臓内で固定した。脳を取り出し、免疫組織化学のために処理した。片側線条体α-シヌクレインPFF注射の3ヶ月後に、pS129-α-シヌクレインまたはIba-1に対するIHCを行った。
【０１８０】
結果: NOD2またはRIPK2の枯渇により、IHCによって評価した場合に、α-シヌクレインPFF誘導PDマウスモデルのレビー小体(LB)病態が有意に寛解し(図7A)、腹側中脳におけるミクログリア活性化が抑制される(図7B)。これらの結果から、NOD2および/またはRIPK2活性の阻害はPDの実行可能な治療標的になり得ることがはっきりと分かる。
【０１８１】
（表２０）SNにおけるp-αSynの陽性シグナルおよびミクログリア密度(図6Aに関連する)。値は平均±SEMである(n=5)。(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)
2021535152.tif 000022
【０１８２】
実施例7: NOD2またはRIPK2の枯渇によりPDマウスではミクログリア活性化と反応性星状細胞形成が有意に抑制される
研究の理論的根拠および目的: 本研究の目標は、1)α-シヌクレインPFF誘導PDマウスモデルにおけるサイトカイン産生、例えば、TNFα、IL-1α、および補体C1q(A1誘導物質)に対するNOD2またはRIPK2の枯渇効果を評価すること、2)α-シヌクレインPFF誘導PDマウスモデルにおけるA1神経毒性星状細胞の分化に対するNOD2またはRIPK2の枯渇効果を調べること、ならびに3)α-シヌクレインPFF誘導PDマウスモデルにおけるグリオーシスに対するNOD2またはRIPK2の枯渇効果を調べることであった。これを探索するために、qPCRアッセイおよびウエスタンブロット分析を使用した。
【０１８３】
方法
組織溶解産物の調製: 組織をRIPA緩衝液[50mM Tris, pH8.0、150mM NaCl、1％Nonidet P-40、1％SDS、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、phosphatase inhibitor cocktail II and III(Sigma-Aldrich)、およびcomplete protease inhibitor mixture(Sigma-Aldrich)]の中でホモジナイズすることによって全溶解産物を調製した。ホモジナイゼーション後に、完全に溶解させるために試料を4℃で30分間回転させ、ホモジネートを22,000rpmで20分間遠心分離し、上清を収集した。タンパク質レベルをBCA Kit(Pierce, Rockford, IL, USA)とBSA標準物質を用いて定量し、イムノブロッティングによって分析した。
【０１８４】
比較定量リアルタイムPCR(qPCR): α-シヌクレインPFF注射した、またはα-シヌクレインPFF注射していないWT、NOD2 KO、またはRIPK2 KOマウスの腹側中脳から単離したミクログリアまたは星状細胞に由来する全RNAをRNA isolation kit(Qiagen, CA)によって、会社が提供した説明書に従って抽出した。RNA濃度を、NanoDrop 2000(Biotek, Winooski, VT)を用いて分光測定で測定した。1〜2μgの全RNAを、High-Capacity cDNA Reverse Transcription System(Life Technologies, Grand Island, NY)を用いてcDNAに逆転写した。各試料について、比較qPCRを、fast SYBR Green Master Mix(Life Technologies)とViiA 7 Real-Time PCR System(Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて2回または3回繰り返して行った。標的遺伝子の発現レベルをβ-アクチンの発現に対して基準化し、比較サイクル閾値Ct法(2-ΔΔCt)に基づいて計算した。
【０１８５】
イムノブロット分析: マウス脳組織から得られた10〜20μgのタンパク質を分離するために、8〜16％および4〜20％勾配SDS-PAGEゲル上での電気泳動を行った。次いで、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。膜をブロッキング溶液(5％脱脂乳および0.1％Tween-20を含むTris緩衝食塩水)で1時間ブロックし、抗Iba-1(Abcam)および抗GFAP(EMD Millipore)抗体と4℃で一晩インキュベートした後に、HRP-conjugated rabbit of mouse secondary antibodies(1:50,000, GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA)と室温で1時間インキュベートした。バンドをエンハンスドケミルミネッセンス(enhanced chemiluminescence)(Thermo Scientific, IL, USA)によって視覚化した。最後に、膜をはがした後にHRP結合β-アクチン抗体(1:40,000, Sigma-Aldrich)で再プローブした。
【０１８６】
結果: インビトロ初代ミクログリア結果と一致して、α-シヌクレインPFFの線条体内注射によって、腹側中脳のミクログリアでは反応性A1星状細胞誘導物質として知られるTNFα、IL-1α、および補体C1qのmRNA発現が誘導される。この誘導はNOD2またはRIPK2の枯渇によって有意にブロックされる(図7A、7B、および7C)。腹側中脳から単離した初代星状細胞において、一般的な星状細胞反応性、A1特異的、およびA2特異的なmRNAレベルもqPCRによって評価した。α-シヌクレインPFFの線条体内注射によって主としてA1特異的転写物が誘導された。これはNOD2またはRIPK2の枯渇によって阻止される(図7D)。α-シヌクレインPFFの線条体内注射によって、腹側中脳において活性化ミクログリアマーカーであるIba-1と活性化星状細胞マーカーであるGFAPの発現が誘導され、これは、ウエスタンブロット分析によって評価した場合にNOD2またはRIPK2の枯渇によってブロックされる(図7E、7F、および7G)。これらの結果から、NOD2および/またはRIPK2の阻害によってミクログリアと星状細胞の両方の活性化が抑制され、従って、脳においてニューロンが保護されることが証明される。
【０１８７】
（表２１）IL-1αのmRNAレベル(相対倍率)(図7Aに関連する)。値は平均±SEMである(n=4)。
2021535152.tif 000023
【０１８８】
（表２２）TNFαのmRNAレベル(相対倍率)(図7Bに関連する)。値は平均±SEMである(n=4)。
2021535152.tif 000024
【０１８９】
（表２３）C1qのmRNAレベル(相対倍率)(図7Cに関連する)。値は平均±SEMである(n=4)。
2021535152.tif 000025
【０１９０】
（表２４）腹側中脳におけるタンパク質発現。n=4。(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)
2021535152.tif 000026
【０１９１】
実施例8: NOD2またはRIPK2の枯渇により、インビボで、α-シヌクレインPFFによって誘導されるドーパミン作動性神経変性とドーパミン作動性終末消失が救出される
研究の理論的根拠および目的: 本研究の目的は、α-シヌクレインPFF誘導PDマウスモデルにおけるNOD2枯渇またはRIPK2枯渇の抗PD効力を調べることであった。この目標に向かって、α-シヌクレインPFFをNOD2 KOまたはRIPK2 KOマウスの線条体に注射した。様々な神経病理学的評価および神経行動学的評価のために、α-syn PFFを注射した6ヶ月後の動物を利用した。
【０１９２】
方法
定位α-シヌクレインPFF注射のためのマウス系統: NOD2 KO または RIPK2 KO マウスをJackson Laboratories (Bar Harbor, ME)から入手した。全ての収容、交配、および 手順がNIH Guide for the Care and Use of Experimental Animalsに従って実施され、ジョンズホプキンス大学実験動物委員会(Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee)によって承認された。
【０１９３】
α-シヌクレインタンパク質精製およびPFF調製: IPTG依存性誘導性pRK172ベクター系を用いて以前に述べられたように、組換えマウスαシヌクレインタンパク質を精製した。エンドトキシンをToxinEraser endotoxin removal kit(Genscript, NJ, USA)によって枯渇させた。マグネチックスターラで攪拌しながら(37℃で1,000rpm)、α-シヌクレインPFF(5mg ml-1)をPBSに溶解して調製した。α-シヌクレインタンパク質を1週間インキュベートした後、凝集物をPBSで0.1mg ml-1まで希釈し、10％振幅(Branson Digital sonifier, Danbury, CT, USA)で30秒間(0.5sパルスオン/オフ)超音波処理した。α-シヌクレインPFFを原子間力顕微鏡および透過型電子顕微鏡を用いて検証し、免疫染色を用いて、ホスホ-セリン129α-シヌクレイン(p-α-synSer129)を誘導する能力を確認した。αシヌクレインPFFを使用まで-80℃で保管した。
【０１９４】
定位α-シヌクレインPFF注射: α-シヌクレインPFFを定位注射するために、3ヶ月齢のNOD2またはRIPK2KO雄マウスおよび雌マウスにキシラゼンおよびケタミンで麻酔をかけた。注射カニューレ(26.5ゲージ)を片側だけ右半球に入れて線条体(STR)(内外方向、ブレグマから2.0mm;腹背側、0.2mm;背腹側、2.6mm)に定位的に適用した。2μLのα-シヌクレインPFF(PBSに溶解して2.5μg/mL)または同じ体積のPBSを0.2μL/分の速度で注入した。最終投薬後に、α-シヌクレインPFFまたはPBSを完全に吸収させるために、注射カニューレをさらに5分間STRに保ち、次いで、マウス脳からゆっくりと取り外した。頭部皮膚を縫合によって縫い合わせ、外科手術後に創傷治癒と回復をモニタリングした。立体解析学的分析のために、線条体α-シヌクレインPFF注射の6ヶ月後に、動物に灌流し、氷冷PBSの後に4％パラホルムアルデヒドを用いて心臓内で固定した。脳を取り出し、免疫組織化学または免疫蛍光のために処理した。片側線条体α-シヌクレインPFF注射の6ヶ月後に行動試験を行った。
【０１９５】
チロシンヒドロキシラーゼ(TH)免疫組織化学および定量分析: マウスに氷冷PBSを灌流した後に、4％パラホルムアルデヒド/PBS(pH7.4)で固定した。脳を収集し、4％パラホルムアルデヒド中で一晩、後固定し、30％スクロース/PBS(pH7.4)溶液中でインキュベートした。脳をOCT緩衝液中で凍結し、30μm冠状連続切片をミクロトームで切断した。浮遊している30μm切片を4％ヤギまたはウマ血清/PBS+0.2％ Triton X-100でブロックし、THに対する抗体(Novus Biologicals, Littleton, CO, USA)とインキュベートした後に、ビオチン結合抗ウサギ抗体(Vectastain Elite ABC Kit, Vector laboratories, Burlingame, CA, USA)とインキュベートした。SigmaFast DAB Peroxidase Substrate(Sigma-Aldrich)を用いて発色させた後、切片をNissl(0.09％チオニン)で対比染色した。SNc領域に由来するTH陽性およびNissl陽性DAニューロンを、コンピュータ制御モーター駆動ステージ(Ludl Electronics)を備えたAxiophot顕微鏡写真機(Carl Zeiss Vision)、Hitachi HV C20カメラ、およびStereo Investigatorソフトウェア(MicroBright-Field)からなるコンピュータ支援画像解析システムを用いた細胞計数のための偏りのない方法であるオプチカルフラクショナー(optical fractionator)によって計数した。線条体中の繊維密度を、ImageJソフトウェア(NIH, http://rsb.info.nih.gov/ij/)を用いて光学密度(OD)測定によって分析した。
【０１９６】
イムノブロット分析: マウス脳組織を、溶解緩衝液[(10mM Tris-HCL, pH7.4、150mM NaCl、5mM EDTA、0.5％ Nonidet P-40、10mM Na-β-グリセロリン酸、phosphate inhibitor mixture I and II(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)、およびcomplete protease inhibitor mixture(Roche)中で、Diax 900ホモジナイザー(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)を用いてホモジナイズして調製した。ホモジナイゼーション後に、完全に溶解させるために試料を4℃で30分間回転させ、ホモジネートを15,000rpmで20分間遠心分離し、上清を収集した。タンパク質レベルを、BCA Kit(Pierce, Rockford, IL, USA)とBSA標準物質を用いて定量し、イムノブロッティングによって分析した。マウス脳組織から得られた10〜20μgのタンパク質を分離するために、8〜16％および4〜20％勾配SDS-PAGEゲル上での電気泳動を行った。タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。膜をブロッキング溶液(5％脱脂乳および0.1％Tween-20を含むTris緩衝食塩水)で1時間ブロックし、抗TH(1:2000, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA)、抗DATと4℃で一晩インキュベートした後に、HRP-conjugated rabbit of mouse secondary antibodies(1:50000, GE Healthcare)およびHRP-conjugated mouse of donkey secondary antibodies(1:10000, GE Healthcare)と室温で1時間インキュベートした。バンドをエンハンスドケミルミネッセンス(Thermo Scientific)によって視覚化した。最後に、膜をはがした後にHRP結合β-アクチン抗体(1:50,000, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)で再プローブした。
【０１９７】
ポール試験(pole test): マウスを行動処置室で30分間順応させた。ポールを直径9mmの75cmの金属棒で作製した。マウスの頭を上にしてポールの上端(ポールの上端から7.5cm)に配置した。ポールの土台に到達するのにかかる全時間を記録した。実際の試験の前に、2日間連続してマウスを訓練した。1回の訓練セッションは3回の試験試行からなる。試験日に、マウスを3回のセッションで評価し、全時間を記録した。試験と記録を中止するための最大カットオフ時間は60秒であった。向きを変える(turn down)、下降する(climb down)、および全時間(秒)の結果を記録した。
【０１９８】
握力試験: 神経筋力試験を、Bioseb握力試験装置(BIO-GS3, Bioseb, FL USA)を用いて行った。マウスの成績を3回評価した。握力を評価するために、マウスに、金属の格子を前肢で、または前肢と後肢の両方でつかませる。尾を優しく引っ張り、格子を握っている肢をマウスがはなした時に、最大保持力を力変換器(force transducer)によって記録した。ピーク保持強度をデジタル記録し、グラム単位の力で表示し、握力をグラム(g)単位でスコア付けした。
【０１９９】
結果: α-シヌクレインPFFによって誘導される線条体チロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性低下はNOD2またはRIPK2の枯渇によって救出される(図8Aおよび8B)。ウエスタンブロット分析から、α-シヌクレインPFFによって媒介されるチロシンヒドロキシラーゼとドーパミン輸送体(DAT)免疫反応性の低下は腹側中脳におけるNOD2またはRIPK2の枯渇によって回復することが明らかになる(図8D)。α-シヌクレインPFF注射によって、SNpcにおいてチロシンヒドロキシラーゼ陽性およびNissl陽性ニューロンの著しい消失が誘導される。これはNOD2またはRIPK2の枯渇によって阻止される(図8C、8E、および8F)。NOD2またはRIPK2の枯渇により、握力(図8G)とポール試験(図8H)によって測定した場合に、α-シヌクレインPFF注射によって誘発される行動欠陥も有意に低下する。これらの結果から、NOD2活性および/またはRIPK2活性を阻害するとインビボでニューロンが保護され、PDが寛解することがはっきりと分かる。
【０２００】
（表２５）TH陽性繊維の光学密度、ドーパミン作動性ニューロンの数、タンパク質発現、および行動欠陥(図8B、8E、8F、8G、8H、8I、および8Jに関連する)。n=5。(*P < 0.05、**P < 0.01、および***P < 0.001)
2021535152.tif 000027
2021535152.tif 000028
【０２０１】
実施例9: α-シヌクレインPFF誘導PD動物モデルにおいて経口投与RIPK2インヒビターはLB病態を寛解させ、ミクログリア活性化を抑制する
研究の理論的根拠および目的: 本研究の目的は、α-シヌクレインPFFモデルPDにおいてRIPK2インヒビターであるゲフィチニブの抗PD効力を調べることであった。この目標に向かって、α-シヌクレインPFFをNOD2 KOまたはRIPK2 KOの線条体に注射した。線条体にαシヌクレインPFFを注射して1ヶ月後に、α-シヌクレインPFF誘導PDマウスをゲフィチニブ(Gef)(30 mg/kg、1日1回)で経口により5ヶ月間にわたって処置し、組織を分析した。
【０２０２】
方法
定位α-シヌクレインPFF注射のためのマウス系統: NOD2またはRIPK2 KOマウスをJackson Laboratories (Bar Harbor, ME)から入手した。全ての収容、交配、および手順がNIH Guide for the Care and Use of Experimental Animalsに従って実施され、ジョンズホプキンス大学実験動物委員会(Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee)によって承認された。
【０２０３】
α-シヌクレインタンパク質精製およびPFF調製: IPTG依存性誘導性pRK172ベクター系を用いて以前に述べられたように、組換えマウスαシヌクレインタンパク質を精製した。エンドトキシンをToxinEraser endotoxin removal kit(Genscript, NJ, USA)によって枯渇させた。マグネチックスターラで攪拌しながら(37℃で1,000rpm)、α-シヌクレインPFF(5 mg ml-1)をPBSに溶解して調製した。α-シヌクレインタンパク質を1週間インキュベートした後、凝集物をPBSで0.1mg ml-1まで希釈し、10％振幅(Branson Digital sonifier, Danbury, CT, USA)で30秒間(0.5sパルスオン/オフ)超音波処理した。α-シヌクレインPFFを原子間力顕微鏡および透過型電子顕微鏡を用いて検証し、免疫染色を用いて、ホスホ-セリン129α-シヌクレイン(p-α-synSer129)を誘導する能力を確認した。αシヌクレインPFFを使用まで-80℃で保管した。
【０２０４】
定位α-シヌクレインPFF注射および免疫組織化学(IHC): α-シヌクレインPFFを定位注射するために、3ヶ月齢のNOD2 KOまたはRIPK2 KO雄マウスおよび雌マウスにキシラゼンおよびケタミンで麻酔をかけた。注射カニューレ(26.5ゲージ)を片側だけ右半球に入れて線条体(STR)(内外方向、ブレグマから2.0mm;腹背側、0.2mm;背腹側、2.6mm)に定位的に適用した。2μLのα-シヌクレインPFF(PBSに溶解して2.5μg/mL)または同じ体積のPBSを0.2μL/分の速度で注入した。最終投薬後に、α-シヌクレインPFFまたはPBSを完全に吸収させるために注射カニューレをさらに5分間STRに保ち、次いで、マウス脳からゆっくりと取り外した。頭部皮膚を縫合によって縫い合わせ、外科手術後に創傷治癒と回復をモニタリングした。IHC分析のために、線条体α-シヌクレインPFF注射の3ヶ月後に、動物に灌流し、氷冷PBSの後に4％パラホルムアルデヒドを用いて心臓内で固定した。脳を取り出し、免疫組織化学のために処理した。片側線条体α-シヌクレインPFF注射の3ヶ月後に、pS129-α-シヌクレイン免疫反応性についてIHCを行った。片側線条体α-シヌクレインPFF注射の1ヶ月後にゲフィチニブ処置を1日1回行った。
【０２０５】
結果: 未処置PDマウスと比較して、ゲフィチニブ処置によってpS129-α-シヌクレイン免疫反応性低下によって証明されたようにLB病態が有意に寛解し(図9A)、IHCによって評価した場合に腹側中脳におけるミクログリア活性化が抑制される(図9B)。これらの結果から、RIPK2インヒビターは、PDなどのミクログリア活性化に関連する神経変性障害の潜在的な薬物であることが証明される。
【０２０６】
（表２６）SNにおけるp-αSyn陽性シグナルおよびミクログリア(図9Aに関連する)。値は平均±SEMである(n=5)。(*P<0.05)
2021535152.tif 000029
【０２０７】
実施例10: p-RIPK2はヒトAD死後組織の海馬において上昇する
研究の理論的根拠および目的: 本研究の目標は、AD患者の死後ヒト脳組織におけるリン酸化RIPK2(p-RIPK2)の発現を調べることであった。これを探索するために、IHCを使用した。
【０２０８】
方法
AD死後脳に対するIHC: 10μm厚のホルマリン固定パラフィン包埋ヒト死後海馬組織(対照およびADのそれぞれについてn=3)があるスライドを、ジョンズホプキンス大学、病理学部門、神経病理課から入手した。組織切片を脱パラフィンおよび再水和し、次いで、クエン酸ベースの抗原アンマスキング溶液(Vector Laboratories)を用いて熱誘導エピトープ賦活化を行った。次いで、スライドをウサギポリクローナルpRIPK2抗体で染色した。全切片をヘマトキシリンで染色した。
【０２０９】
結果: 本発明者らのデータから、IHCによって評価した場合に、AD患者試料に由来する海馬においてp-RIPK2免疫反応性は有意に増加することが分かる(図10A、B)。このことから、過剰なRIPK2活性化がAD発病において中心的な役割を果たすことが示唆される。これらの結果から、RIPK2活性および/またはp-RIPK2活性を標的とすることが、ADを含む神経変性障害の実行可能な治療標的になり得ることが分かる。
【０２１０】
（表２７）AD死後の海馬におけるp-RIPK2の強度(図10Aに関連する)。値は平均±SEMである(n=9)。(***P<0.001)
2021535152.tif 000030
【０２１１】
実施例11: アミロイド-β(AβまたはAベータ)凝集物活性化ミクログリアはmRNA RIPK2および炎症性サイトカインを誘導する
研究の理論的根拠および目的: 本研究の目標は、Aβ凝集物によって活性化されたミクログリアがmRNA RIP2Kと炎症性サイトカインを誘導することを確認することであった。
【０２１２】
方法
以前に述べられたように(PMID:27834631)、合成Aβ1-42オリゴマーを作製した。ヒドロキシフルロイソプロパノール(hydroxyfluroisopropanol)(HFIP)で処理した合成Aβ1-42ペプチド(rPeptide, Bogart, GA, USA)をジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、さらにリン酸緩衝食塩水(PBS)で希釈して250μM原液を得た。原液を4℃で少なくとも24時間インキュベートし、使用まで-80℃で保管した。使用前に、溶液を12,000gで10分間遠心分離し、上清をオリゴマーAβとして使用した。
【０２１３】
BV-2ミクログリア細胞をDMEM培地中で培養した。6ウェルプレート内にある106個のBV-2ミクログリアを2.5μMのAβで4時間処理した。培養細胞に由来する全RNAをRNA isolation kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)によって製造業者の説明書に従って抽出した。RNA濃度を、NanoDrop 2000(Thermo scientific)を用いて分光測定で測定した。その後、2μgの全RNAを、High-Capacity cDNA Reverse Transcription System (Life Technologies, Grand Island, NY, USA)を用いてcDNAに逆転写した。比較qPCRを、fast SYBR Green Master Mix (Life Technologies)およびsteponeplus real-time pcr system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いて行った。標的遺伝子の発現レベルをGAPDHの発現に対して基準化し、比較サイクル閾値Ct法-ΔΔ(2)Ctに基づいて計算した(n=3)。
【０２１４】
結果: ミクログリアにおけるRIPK2の潜在的な作用機構を明らかにするために、RIPK2発現をBV-2ミクログリア細胞において評価した。BV-2ミクログリアをAβオリゴマー(AβO)によって活性化した場合に、RIPK2のmRNA発現は有意に増加した。ミクログリアにおいてAβOはRIPK2 mRNA発現をほぼ10倍増加させる。RIPK2発現と共に、複数の炎症メディエーターを測定した。AβOは、代表的なM1ミクログリアマーカーであるTNF-α、IL-1β、およびIL-6を含むサイトカインの一部のレベルを増加させた。
【０２１５】
（表２８）Aβ活性化ミクログリアはRIPK2および炎症性サイトカインを誘導する
2021535152.tif 000031
【０２１６】
実施例12: アミロイド-β(Aβ)凝集物活性化ミクログリアはRIPK2リン酸化を誘導する
研究の理論的根拠および目的: この目標は、Aβ凝集物によって活性化されたミクログリアがリン酸化RIPK2(p-RIPK2)およびNOD2を誘導することを確認ことであった。
【０２１７】
方法
6ウェルプレート内にある2×106個のBV-2ミクログリアを5μMのAβで15分間、60分間、120分間、240分間、または360分間処理した。その後に、細胞溶解産物を、complete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail(Sigma)を含むRIPA緩衝液で30分間溶解し、抗RIPK2抗体と一晩インキュベートした後に、プロテインA/Gと3時間インキュベートし、抗ホスホ特異的(anti-phospho-specific)RIP2KまたはNOD2抗体を用いたウェスタンブロッティングを用いて分析した。
【０２１８】
結果: 図11に示したように、p-RIPKはAβ処理の15分後から現れ、60分でピークになった。RIPK2リン酸化と一致して、ミクログリア細胞をAβOで処理した場合にリン酸化と共にNOD2結合が増加した。この結果は、ADでのミクログリア細胞におけるAβO誘導性活性化のためにNOD2とRIPK2の結合と、それに続くリン酸化の連鎖反応を示している。
【０２１９】
実施例13. NOD2またはRIPK2の枯渇によりAβO誘導性ミクログリア活性化が抑制される
研究の理論的根拠および目的: 本研究の目標は、1)AβOによって活性化されたミクログリアにおけるサイトカイン産生、例えば、TNFαおよびIL-6(A1誘導物質)に対するNOD2またはRIPK2の枯渇効果を評価することであった。これを探索するために、qPCRアッセイを使用した。
【０２２０】
方法
この研究では、野生型(WT)、NOD2ノックアウト(B6.129S1-Nod2tm1Flv/J、NOD2-/-)、およびRIPK2ノックアウト(B6.129S1-Nod2tm1Flv/J、RIPK2-/-)マウスをJackson Laboratoryから入手した。初代ミクログリア培養のために、生後2日目(P2)のマウスの子から全脳を入手した。髄膜を除去した後、脳を、10％熱失活FBS、50U ml-1ペニシリン、50μg ml-1ストレプトマイシンを加えたDMEM(Cellgro)で洗浄した。脳を0.25％トリプシン-EDTAに移し、10分間インキュベートした。DMEM完全培地を使用してトリプシンを中和した。シングル細胞懸濁液をピペッティングによって入手した。シングル細胞懸濁液を70μmナイロンメッシュに通すことで細胞破片および凝集物を除去した。このように得られた最終シングル細胞懸濁液をT75フラスコ中で2週間培養し、完全培地を7日目に交換した。混合グリア細胞集団を、EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit(StemCell)を用いて星状細胞に富む画分とミクログリアに富む画分に分離した。磁気的に分離されたミクログリア画分が培養物であった。野生型(WT)、NOD2ノックアウト(NOD2-/-)、およびRIPK2ノックアウト(RIPK2-/-)マウスからの初代培養ミクログリアを5μMのAβOで4時間活性化した。TNFαおよびIL-6の遺伝子発現をリアルタイムRT-PCRによって測定した。値は4回の独立した実験の平均±SDである。
【０２２１】
結果: ADにおけるNOD2-RIP2K経路の標的シグナル伝達を検証するために、初代ミクログリアをAβOによって活性化した後に、TNFαおよびIL-6に対するリアルタイムPCRを評価した。Aβ42オリゴマー(AβO)活性化ミクログリアは、WT同腹子に由来するミクログリアにおいてTNFαおよびIL-6のmRNAレベルをアップレギュレートした。NOD2またはRIPK2の枯渇により、AβOによって活性化された初代ミクログリアにおいて炎症促進性サイトカインのレベルが有意に低下した。この結果から、NOD2-RIPK2シグナル伝達が阻害されていると、AβO誘導毒性によって誘導される炎症誘発性メディエーターおよび毒性メディエーターの放出が停止することが分かる。
【０２２２】
（表２９）WT、RIP2、またはNOD2ノックアウトマウスの正常(PBS)およびAβ活性化マウス初代ミクログリアにおけるTNF-aおよびIL-6のmRNAレベル(相対倍率)。値は平均±SDである(n=2〜4)。(*P<0.05、PBSに対して)
2021535152.tif 000032
【０２２３】
実施例14: RIPK2インヒビターはAβO誘導性ミクログリア活性化を抑制する
研究の理論的根拠および目的: 本研究の目的は、1)Aβ凝集物によって活性化された初代ミクログリアによるサイトカイン産生、例えば、TNFα、IL-6、および補体C1q(反応性A1星状細胞誘導物質)に対するRIPK2インヒビターの効果を評価することであった。この目標に向かって、qPCRアッセイを使用した。
【０２２４】
方法
RIPK2阻害の効果を調べるために、6ウェルプレート内にある106個のBV-2ミクログリアを、DMSO、GSK583(1μM, Medchemexpress)、OD361(1μM, Calbiochem)、またはソラフェニブ(1μM)と1時間プレインキュベートした。mRNA分析のために5μMのAβOをさらに4時間処理した。
【０２２５】
結果: 異常に凝集したタンパク質、例えば、AβOによって活性化されたBV-2ミクログリアにおけるRIPK2阻害の抗炎症効力を確認するために、TNFα、IL-6、およびClqに対するリアルタイムPCRを評価した。Aβ42オリゴマー(AβO)によって活性化されたミクログリアはClq、IL-6、およびTNF-aのmRNAレベルをアップレギュレートした。重要なことに、ミクログリアをRIPK2インヒビターであるGSK583(1μM)、OD36(1μM)、またはソラフェニブ(1μM)に続いてAβO(5μM)で前処理すると、ミクログリア活性化がブロックされ、Clq、IL-6、およびTNFαを含む複数の炎症メディエーターの放出が有意に低下した。ELISAにおける研究結果と一致して、表30にまとめたように、RIPK2インヒビターで処理したAβO活性化ミクログリアは炎症促進性マーカー発現の有意な低下を示した。この結果から、RIPK2インヒビターによってRIPK2活性を阻害すると、反応性A1反応性星状細胞の形成と、PDおよびADを含む神経変性障害におけるニューロン損傷を誘導することができるミクログリア活性化がブロックされることが分かる。
【０２２６】
（表３０）Aβ活性化ミクログリアにおけるRIPK2インヒビターの効果。BV-2ミクログリアにおけるC1q、IL-6、およびTNF-αのmRNAレベルをリアルタイムPCRによって分析した。±SD、n=2〜4/群。(対照に対して**P<0.01、***P<0.001、Aβに対して♯P<0.05、♯♯P<0.01、♯♯♯P<0.001)
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【０２２７】
実施例15: 5x-FAD ADトランスジェニックマウスの脳ではRIPK2が上昇している
研究の理論的根拠および目的: 本研究の目的は、PDマウスモデルにおいて示されたようにトランスジェニックADマウスモデルにおけるRIPK2上昇を確認することであった。
【０２２８】
方法
動物: 5XFAD(Tg6799,B6SJL-Tg(APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax)マウスをJackson Labから入手した。これらの広く用いられているマウスは5つの変異を含み、変異ヒトAPP(695)と、スウェーデン(K670N、M671L)、フロリダ(I716V)、およびロンドン(V717I)家族性AD変異と、2つのFAD変異、M146LおよびL286Vを有するヒトPS1を過剰発現している。5XFADマウスはADアミロイド病態の主要な特徴を再現し、ニューロン内Aβ-42誘導性の神経変性およびアミロイド斑形成の有用なモデルとして知られている。Aβ沈着は進行性であり、3〜4ヶ月齢と早い段階で細胞内に現れ、細胞外沈着は前頭皮質に6ヶ月までに現れ、12ヶ月までにはもっと広範囲になる。この研究では、6ヶ月齢の雄5XFAD ADマウスを使用した。
【０２２９】
RIPキナーゼの発現: 全RNAを6ヶ月齢の野生型または5XFADマウスの海馬から単離し、RIPK1、RIPK2、RIPK3、およびNOD2を含む特異な遺伝子発現をリアルタイムPCRを用いて評価した。mRNAレベルをハウスキーピング遺伝子18S rRNAに対して基準化した。RIPキナーゼのタンパク質発現レベルを7ヶ月齢の野生型(WT)または5XFADマウスの皮質領域からウェスタンブロッティングを用いて入手した。
【０２３０】
結果: 5XFADマウスにおけるRIPK1、RIPK2、RIPK3、およびNOD2のmRNA発現をWT同腹子マウスと比較した。5XFADのRIPK1およびRIPK2はWT同腹子と比較して有意に増加した。このことから、RIPキナーゼは、ADおよびPDを含む神経変性疾患の実行可能な治療標的であることが分かる。RIPKタンパク質発現の変化を評価するために7ヶ月5XFADの皮質領域を分析した。5XFADにおけるRIPK2タンパク質発現はRIPK1またはRIPK2と比較して有意に増加した。
【０２３１】
実施例16: NOD2またはRIPK2の枯渇によりAβO誘導ADマウスにおいて認知障害が救出される
研究の理論的根拠および目的: 本研究の目的は、AβO誘導ADマウスモデルにおけるNOD2枯渇またはRIPK2枯渇の抗AD効力を調べることであった。この目標に向かって、AβOを対照、NOD2 KO、またはRIPK2 KOマウスの線条体に注射した。様々な神経行動学的評価のために、AβOを注射して2週間後の動物を利用した。
【０２３２】
方法
Aβ1-42オリゴマーの調製: 以前に述べられたように、合成Aβ1-42オリゴマー(AβO1-42)を作製した。ヒドロキシフルロイソプロパノール(HFIP)で処理した合成Aβ1-42ペプチド(rPeptide, Bogart, GA, USA)をジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、さらにリン酸緩衝食塩水(PBS)で希釈して250μM原液を得た。原液を4℃で少なくとも24時間インキュベートし、使用まで-80℃で保管した。使用前に、溶液を12,000gで10分間遠心分離し、上清をオリゴマーAβとして使用した。
【０２３３】
定位AβO1-42i.c.v.注射: AβO1-42を定位注射するために、3ヶ月齢のNOD2またはRIPK2 KO雄マウスおよび雌マウスにキシラゼンおよびケタミンで麻酔をかけた。注射カニューレ(26.5ゲージ)を脳室内(i.c.v.)空間に入れて、ブレグマから0.2mm後方、1.0mm側方、頭蓋骨表面から2.5mm腹側の座標に定位的に適用した(Paxinos and Franklin, The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 2nd Ed., Academic Press, San Diego (2001))。5μLのAβO1-42 (0.5μmol)または同じ体積のPBSを0.2μL/分の速度で注入した。最終投薬後に、AβO1-42またはPBSを完全に吸収させるために、注射カニューレをさらに5分間i.c.vに保ち、次いで、マウス脳からゆっくりと取り外した。頭部皮膚を縫合によって縫い合わせ、外科手術後に創傷治癒と回復をモニタリングした。両側i.c.v.AβO1-42注射(合計5μmol)の7日後に行動試験を行った。
【０２３４】
モーリス水迷路試験(MWMT): 以前の報告(Vorhees and Williams, Nat. Protoc. 1:848-58 (2006))に記載のようにMWMTを行った。MWMは、表面に4つの異なるインナーキュー(inner cue)がある白色の円形プール(直径150cm、高さ50cm)である。円形プールに水を満たし、プラットフォームが水面に見えなくなるように水面の1cm下に沈めた。プールを等面積の4つの象限に分けた。黒色のプラットフォーム(直径9cm、高さ15cm)をプールの4つの象限のうちの1つの中心に置いた。開始位置からプラットフォームまで、遊泳している各マウスの位置をビデオトラッキングシステム(ANY-maze, Stoelting Co., Wood Dale, IL, USA)によってデジタル化した。実験の前日を、プラットフォームが無い状態で60秒間、遊泳訓練するのに費やした。次いで、マウスに4日間連続して毎日2回の試行セッションを与えた。試行間の間隔は15分であり、逃避潜時を記録した。このパラメータを各試行セッションおよび各マウスについて平均した。マウスがプラットフォームの位置を突き止めたら、10秒間プラットフォームにのったままにした。マウスが60秒以内にプラットフォームの位置を突き止めることができなかったら、マウスを10秒間プラットフォームに載せ、次いで、実験者がケージに戻した。6日目に、プローブ試行試験はプールからのプラットフォームの取り外しを伴い、マウスに60秒のカットオフ時間を与えた。
【０２３５】
結果: 本発明者らは、AβO1-42またはPBSを注射して7日後にモーリス水迷路タスクによって空間学習と記憶を評価した。モーリス水迷路にさらした初日には、AβO1-42またはPBSを注射した野生型、RIPK2-/-、またはNOD2-/-マウスの間でプラットフォーム発見に差異はない(図12B)。モーリス水迷路にさらして3日目および4日目に、AβO1-42を注射した野生型マウスは、PBSで処置した野生型マウスと比較して逃避潜時(escaped latency time)の有意な増加を示した(図12B)。対照的に、AβO1-42を注射したRIPK2-/-およびNOD2-/-マウスは両方ともPBS野生型マウスに匹敵する逃避潜時を示した。試行セッションの最後の日(5日目)に、AβO1-42を注射したRIPK2-/-およびNOD2-/-マウスは両方とも、プラットフォームを取り外した後に、AβO1-42を注射した野生型マウスと比較して、PBSを注射した野生型マウスに同様の、遊泳時間と標的四半分内での経路の有意な増加を示した(図12Cおよび12F)。遊泳速度と全移動距離は全ての実験群間で有意差を示さなかった(図12Dおよび12E)。これらの結果から、ADモデルにおいてRIPK2および/またはNOD2活性を阻害すると記憶機能が改善し、認知障害が救出されることがはっきりと分かる。
【０２３６】
本発明は、指定された機能とその関係の実行を例示する機能的な基本構成要素の助けを借りて上記で説明された。これらの機能的な基本構成要素の境界は、説明の便宜を図って本明細書において任意に定義される。指定された機能とその関係が適切に実行される限り、代わりの境界を定義することができる。
【０２３７】
1つの分類として説明された本発明の局面に関して、全ての個々の種が本発明の別々の局面だと個別にみなされる。本発明の局面が特徴を「含む(comprising)」と説明されていれば、態様はまた、その特徴「からなる(consisting of)」またはその特徴「から本質的になる(consisting essentially of)」とも意図される。
【０２３８】
特定の態様の前述の説明は、本発明の一般概念から逸脱することなく、過度の実験なく、当技術の範囲内にある知識を適用することによって、他人が、このような特定の態様を様々な用途に合わせて容易に変更することができる、および/または適応させることができる本発明の一般的な性質を十分に明らかにする。従って、このような適応および変更は、本明細書において示された開示およびガイダンスに基づいて、開示された態様の均等物の意味および範囲の中にあることが意図される。開示およびガイダンスを考慮して、本明細書の言葉遣いまたは専門用語が当業者によって解釈されるように、本明細書中の言葉遣いまたは専門用語は説明のためであり、限定のためではないと理解しなければならない。
【０２３９】
本発明の幅および範囲は、上記の例示的な態様のいずれによっても限定されてはならず、以下の特許請求の範囲およびその均等物によってのみ定義すべきである。
【０２４０】
本明細書に記載の様々な局面、態様、および選択肢は全て任意の、および全てのバリエーションで組み合わせることができる。
【０２４１】
本明細書において言及される刊行物、特許、および特許出願は全て、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により本明細書に組み入れられるように詳細かつ個々に示されるのと同じ程度に参照により本明細書に組み入れられる。本文書中にある、あらゆる意味または定義が、参照により本明細書に組み入れられる文書中にある、同じ用語のあらゆる意味または定義と相反する程度まで、本文書中にある、この用語に割り当てられた意味または定義が適用されるものとする。
【図１−１】
2021535152.tif 000034
【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年5月6日(2021.5.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたNS107404の下で政府の支援を受けてなされたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
他の局面は下記で説明される。
[本発明1001]
それを必要とする対象に、治療的有効量の受容体共役タンパク質(RIP)キナーゼ2(RIPK2)インヒビターを投与する工程を含む、神経変性疾患または神経変性障害を予防または処置する方法であって、
該神経変性疾患または神経変性障害が、中枢神経系(CNS)の1つまたは複数の領域におけるアップレギュレートされたNOD2、リン酸化RIPK2、および/またはRIPK2に関連する、該方法。
[本発明1002]
前記RIPK2インヒビターがRIPK2の活性および/または発現を阻害する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記RIPK2インヒビターがRIPキナーゼ1および/またはRIPキナーゼ3よりも選択的である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記RIPK2インヒビターが、NFκBのNOD1依存的活性化、NF-kBのNOD2依存的活性化、ミクログリア活性化、および/または反応性星状細胞形成より選択される1つまたは複数の活性を阻害するのに有効な量で投与される、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
それを必要とする対象に有効量の受容体共役タンパク質(RIP)キナーゼ2(RIPK2)インヒビターを投与する工程を含む、異常に凝集したタンパク質による中枢神経系(CNS)常在性自然免疫細胞の活性化に関連する神経変性疾患または神経変性障害を処置するための方法。
[本発明1006]
前記RIPK2インヒビターが、異常に凝集したタンパク質によるCNS常在性自然免疫細胞の活性化を阻害するのに有効な量で投与される、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記RIPK2インヒビターの投与によって、活性化された自然免疫細胞から分泌され神経炎症およびニューロン損傷を誘導する1種類または複数種類の炎症性メディエーターまたは神経毒性メディエーターのレベルが低減する、本発明1005または1006の方法。
[本発明1008]
前記1種類または複数種類の炎症性メディエーターまたは神経毒性メディエーターが、TNFα、IL-1α、IL-1β、C1q、IL-6、および/またはそれらの組み合わせである、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記常在性自然免疫細胞がミクログリアおよび/または星状細胞である、本発明1005〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記異常に凝集したタンパク質がα-シヌクレイン、アミロイド-β、および/またはタウである、本発明1005〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記神経変性疾患または神経変性障害がパーキンソン病またはアルツハイマー病である、本発明1005〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
中枢神経系(CNS)常在性自然免疫細胞を有効量の受容体共役タンパク質(RIP)キナーゼ2(RIPK2)インヒビターと接触させる工程を含む、異常に凝集したタンパク質による該CNS常在性自然免疫細胞の活性化を阻害する方法。
[本発明1013]
前記CNS常在性自然免疫細胞がミクログリアおよび/または星状細胞である、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記異常に凝集したタンパク質がα-シヌクレイン、アミロイド-β、および/またはタウである、本発明1012または1013の方法。
[本発明1015]
前記接触させる工程がインビトロ、インビボ、またはエクスビボである、本発明1012〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
RIPK2インヒビターの前記量が、前記CNS常在性自然免疫細胞によって分泌された1種類または複数種類の炎症性メディエーターまたは神経毒性メディエーターのレベルを対照と比較して低減するのに有効な量であり、該1種類または複数種類の炎症性メディエーターまたは神経毒性メディエーターが、TNFα、IL-1α、IL-1β、C1q、IL-6、および/またはそれらの組み合わせである、本発明1012〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
それを必要とする対象に治療的有効量のRIPK2インヒビターを投与する工程を含む、該対象においてパーキンソン病を処置する方法。
[本発明1018]
前記RIPK2インヒビターが前記対象に経口投与または非経口投与される、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記RIPK2インヒビターがRIPキナーゼ1および/またはRIPキナーゼ3よりも選択的である、本発明1017または1018の方法。
[本発明1020]
それを必要とする対象に治療的有効量のRIPK2インヒビターを投与する工程を含む、該対象においてアルツハイマー病を処置する方法。
[本発明1021]
前記RIPK2インヒビターが前記対象に経口投与または非経口投与される、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記RIPK2インヒビターがRIPキナーゼ1および/または3よりも選択的である、本発明1020または1021の方法。
[本発明1023]
前記RIPK2インヒビターが、ゲフィチニブ、ソラフェニブ、レゴラフェニブ、ポナチニブ、SB203580、OD36(6-クロロ-10,11,14,17-テトラヒドロ-13H-1,16-エテノ-4,8-メテノ-1H-ピラゾロ[3,4-g][1,14,4,6]ジオキサジアザシクロヘキサデシン)、OD38([4,5,8,9-テトラヒドロ-7H-2,17-エテノ-10,14-メテノ-1H-イミダゾ[1,5-g][1,4,6,7,12,14]オキサペンタアザシクロヘキサデシン])、WEHI-435(N-(2-(4-アミノ-3-(p-トリル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)-2-メチルプロピル)イソニコチンアミド)、GSK583(6-(tert-ブチルスルホニル)-N-(5-フルオロ-1H-インダゾール-3-イル)キノリン-4-アミン)、またはその薬学的に許容される塩である、本発明1001〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記RIPK2インヒビターがゲフィチニブ、GSK583、またはその薬学的に許容される塩である、本発明1001〜1022のいずれかの方法。
[本発明1025]
少なくとも1種類のさらなる治療的に活性な化合物の有効量を前記対象に投与する工程をさらに含む、本発明1001〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記神経変性疾患または神経変性障害が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS/ルー・ゲーリック病)、パーキンソン病、糖尿病性ニューロパシー、ポリグルタミン(ポリQ)病、脳卒中、ファール病、メンケス病、ウィルソン病、脳虚血、プリオン障害、認知症、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、多系統萎縮、遺伝性痙性対麻痺、脊髄小脳萎縮、脳傷害、または脊髄傷害を含む、本発明1001の方法。
[本発明1027]
前記RIPK2インヒビターが、静脈内に、皮下に、動脈内に、腹腔内に、眼に、筋肉内に、頬に、直腸に、膣に、眼窩内に、脳内に、皮内に、頭蓋内に、脊髄内に、脳室内に、くも膜下腔内に、大槽内に、関節内に、肺内に、鼻腔内に、経粘膜的に、経皮的に、および/または吸入を介して投与される、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記RIPK2インヒビターが経口投与または非経口投与される、本発明1027の方法。
[本発明1029]
(a)候補治療用物質の存在下で、CNS常在性自然免疫細胞を、異常に凝集したタンパク質と接触させる工程;
(b)該候補治療用物質の存在下で、該CNS常在性自然免疫細胞の活性化を測定する工程;および
(c)対照と比較して該CNS常在性自然免疫細胞の活性化を阻害する治療用物質を同定する工程
を含み、
該候補治療用物質がRIPK2インヒビターである、
神経変性疾患または神経変性障害の治療用物質を同定する方法。
[本発明1030]
前記CNS常在性自然免疫細胞がミクログリアおよび/または星状細胞である、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記異常に凝集したタンパクがα-シヌクレイン、アミロイド-β、および/またはタウである、本発明1029または1030の方法。
[本発明1032]
前記測定する工程が、NOD2、リン酸化RIPK2、および/またはRIPK2の発現レベルを測定することを含む、本発明1029〜1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記測定する工程が、因子C1q、TNFα、および/またはIL-1αの発現レベルを測定することを含む、本発明1029〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記測定する工程が、因子iNOS、Cxcl1、および/もしくはIL-1βの発現レベルを測定すること、ならびに/または前記CNS常在性自然免疫細胞の走化性を測定することを含む、本発明1029〜1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
前記治療用物質がRIPK1および/またはRIPK3よりもRIPK2を選択的に阻害する、本発明1029〜1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
前記治療用物質がNF-kBのNOD2依存的活性化を阻害する、本発明1029〜1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
前記治療用物質が、アミロイド-β凝集物誘導性ミクログリア活性化、α-シヌクレイン凝集物誘導性ミクログリア活性化、および/またはA1星状細胞形成を阻害する、本発明1029〜1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
前記神経変性疾患または神経変性障害が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALSもしくはルー・ゲーリック病)、パーキンソン病、多発性硬化症、糖尿病性ニューロパシー、ポリグルタミン(ポリQ)病、脳卒中、ファール病、メンケス病、ウィルソン病、脳虚血、プリオン障害、認知症、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、多系統萎縮、遺伝性痙性対麻痺、脊髄小脳萎縮、脳傷害、および/または脊髄傷害である、本発明1029〜1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
前記神経変性疾患または神経変性障害がアルツハイマー病またはパーキンソン病である、本発明1029〜1037のいずれかの方法。
【国際調査報告】
2021535152.tif 000048
2021535152.tif 000049