(57)【要約】本発明は腫瘍免疫抑制因子であるＴＩＧＩＴ（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｏｔｉｆ［ＩＴＩＭ］  ｄｏｍａｉｎ）に特異的に結合する新規の抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸、前記核酸を含むベクター及び宿主細胞、前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法及び前記抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む医薬組成物及びその用途に関するものである。本発明によるＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、又はこれを有効成分として含む医薬組成物は好ましくは癌又は腫瘍治療の用途に使われることができる。【選択図】  図８
2021514642.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は２のアミノ酸配列を含む重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）ＣＤＲ１、
配列番号３又は４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５又は６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、を含む重鎖可変領域と、
配列番号７又は８のアミノ酸配列を含む軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）ＣＤＲ１、
配列番号９又は１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１１又は１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、を含む軽鎖可変領域と、
を含む、抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１５又は１６の軽鎖可変領域とを含む、請求項１に記載の抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
単クローン抗体であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗原結合断片は、前記抗−ＴＩＧＩＴ抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む、癌又は腫瘍治療用医薬組成物。
【請求項６】
前記癌又は腫瘍は、皮膚癌、肝臓癌、肝細胞癌、胃癌、乳房癌、肺癌、卵巣癌、気管支癌、鼻咽腔癌、喉頭癌、膵膓癌、膀胱癌、大膓癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、前立腺癌、骨癌、甲状腺癌、副甲状線癌、腎臓癌、食道癌、胆管癌、精巣癌、直膓癌、頭頸部癌、頸椎癌、尿管癌、骨肉腫、神経芽細胞腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫及び神経膠腫からなる群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片及び他の癌治療剤を含む癌又は腫瘍治療用併用投与組成物。
【請求項８】
前記癌治療剤は免疫チェックポイント抑制剤であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記免疫チェックポイント抑制剤は、抗−ＣＴＬＡ−４抗体、抗−ＰＤ−１抗体又は抗−ＰＤ−Ｌ１抗体であることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載の抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片を含む、抗体−薬物接合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）。
【請求項１１】
請求項１０に記載の抗体−薬物接合体を含む、癌又は腫瘍治療用組成物。
【請求項１２】
請求項１又は２に記載の抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片をコードする、核酸。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸を含む、組み換え発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組み換え発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項１５】
動物細胞、植物細胞、酵母、大膓菌及び昆虫細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
サル腎臓細胞７（ＣＯＳ７：ｍｏｎｋｅｙ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ）細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞、Ｗ１３８、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ：ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ＭＤＣＫ、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ７８細胞、ＨＥＫ２９３細胞、大膓菌、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）又はスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）から選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養する段階を含む、抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腫瘍免疫抑制因子であるＴＩＧＩＴ（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｏｔｉｆ［ＩＴＩＭ］  ｄｏｍａｉｎ）に特異的に結合する新規の抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸、前記核酸を含むベクター及び宿主細胞、前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法、及び前記抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む医薬組成物とその用途に関するものである。
【０００２】
本発明によるＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、又はこれを有効成分として含む医薬組成物は好ましくは癌又は腫瘍治療の用途に使うことができるが、これに限定されるものではない。
【背景技術】
【０００３】
我が身の免疫システム（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ）は、外部から流入する病源菌やウイルス（抗原）及び癌細胞などの異常細胞を攻撃して我が身を保護する機能をする。すなわち、我が身の免疫システムの主要機能は、身体内の正常細胞と、外部侵入者及び癌細胞などの異常細胞を区分し、攻撃するか否かを決定する。我が身の免疫システムにおいて、癌細胞を区分し出すことができる代表的な兔疫細胞はＴ細胞であり、元気な人体で癌細胞が発生しても免疫反応によって効果的に癌細胞を死滅させることができる。したがって、癌の実施は免疫体系に異常があることを意味する。
【０００４】
我が身の免疫システムは、Ｔ細胞の過多増殖による過多免疫反応を抑制するための免疫検問体系を有している。このような免疫検問体系を免疫チェックポイント（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）といい、免疫チェックポイントに関与するタンパク質を免疫チェックポイントタンパク質（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と言う。
【０００５】
根本的に免疫チェックポイントはＴ細胞の過活性化及び／又は過多増殖による過剰免疫反応を抑制する機能をするが、癌細胞はこのような免疫チェックポイントを悪用してＴ細胞が自身を攻撃することができないようにすることにより、免疫システムによる攻撃から脱するようになり、究極に癌が進行する結果をもたらす。
【０００６】
このような免疫チェックポイントの抑制剤を用いて癌などの疾患を治療することができるというのはもう該当技術分野に知られており、現在免疫チェックポイントタンパク質を標的とする抗体医薬品が市販されており、多様な免疫チェックポイント抑制剤が開発されている。
【０００７】
最初に開発された免疫チェックポイント抑制剤形態の治療剤は免疫チェックポイント受容体であるＣＴＬＡ−４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−４）に特異的な単クローン抗体であるイピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）であり、転移性悪性黒色腫にその効果を現した。ついで、ＰＤ−１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ−１）とＰＤ−１に対するリガンドであるＰＤ−Ｌ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ  ｌｉｇａｎｄ−１）に特異的な単クローン抗体が開発されている。代表的なものとしては、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）などがある。ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１抑制剤はその効果が悪性黒色腫だけではなく多様な腫瘍で現れる。
【０００８】
ＴＩＧＩＴ（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｏｔｉｆ［ＩＴＩＭ］  ｄｏｍａｉｎ）は主に活性化したＴ細胞及びＮＫ（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ）細胞で発現する受容体であり、広い意味の免疫チェックポイントタンパク質に含まれる。
【０００９】
ＴＩＧＩＴは癌細胞表面のＣＤ１５５、ＣＤ１１２などのリガンドと結合して兔疫細胞の活性化を阻害する。このようなＴＩＧＩＴを標的とする抗体は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断抗体とともにＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を誘導して腫瘍やウイルスを効果的に除去すると報告された。
【００１０】
現在まで数種の抗−ＴＩＧＩＴ抗体が報告されたが（ＵＳ９，７１３，６４１Ｂ、ＵＳ２０１６／０１７６９６３Ａ、ＵＳ９，４９９，５９６Ｂなど）、その具体的な機序に対する研究はまだ少ない実情であるのみならず、実際の治療剤として使用可能な程度の効力（ｅｆｆｉｃａｃｙ）を有する抗体が開発されてはいない実情であり、依然として高水準の効力を有するＴＩＧＩＴ特異的抗体に対する要求は切実な状況である。
【００１１】
したがって、本発明者は、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する新規の抗体を開発しようと鋭意努力した結果、癌細胞で過発現するＴＩＧＩＴに対する高い親和力を有する前記新規の抗−ＴＩＧＩＴ抗体を発明し、本発明による抗体又はその抗原結合断片の効率的な坑癌治療剤としての可能性を確認して本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国登録特許第９，７１３，６４１号公報
【特許文献２】米国公開特許第２０１６／０１７６９６３号公報
【特許文献３】米国登録特許第９，４９９，５９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する新規の抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む医薬組成物、特に免疫坑癌治療剤としての医薬組成物を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、前記抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片を投与することを特徴とする癌又は腫瘍の治療方法、癌又は腫瘍の治療のための前記抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片の用途及び癌又は腫瘍の治療用薬剤製造のための前記抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片の用途を提供することである。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、前記抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片及び他の癌治療剤を含む癌又は腫瘍治療用併用投与組成物を提供することである。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、前記抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸、前記核酸を含むベクター及び宿主細胞、これを用いた抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
前記目的を達成するために、本発明はＴＩＧＩＴに特異的に結合する新規の抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片を提供する。
本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体、又は抗原結合断片は、
配列番号１又は２のアミノ酸配列を含む重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、相補性決定領域）１、
配列番号３又は４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５又は６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、を含む重鎖可変領域と、
配列番号７又は８のアミノ酸配列を含む軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）ＣＤＲ１、
配列番号９又は１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１１又は１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、を含む軽鎖可変領域とを含むことを特徴とする。
【００１９】
また、本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体、又は抗原結合断片は配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１５又は配列番号１６の軽鎖可変領域とを含むことを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】初期選別された抗−ＴＩＧＩＴ抗体の種間交差反応性（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｃｒｏｓｓｒｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を確認するために、ヒト（ｈｕｍａｎ）、マウス（ｍｏｕｓｅ）及び赤毛猿（ｒｈｅｓｕｓ）のＴＩＧＩＴ抗原に対する抗−ＴＩＧＩＴ抗体の結合を確認するためにＥＬＩＳＡで測定した結果を示した図である。
【図２】初期選別された抗−ＴＩＧＩＴ抗体のＴＩＧＩＴスーパーファミリ（ｓｕｐｅｒ−ｆａｍｉｌｙ）間の特異性を確認するために、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ２２６に対する結合を確認するためにＥＬＩＳＡで測定した結果を示した図である。
【図３】初期選別された抗−ＴＩＧＩＴ抗体の細胞表面に発現したＴＩＧＩＴ抗原に対する結合を確認するために、蛍光柔細胞分析器を用いて測定した結果を示した図である。
【図４】抗−ＴＩＧＩＴ抗体とＴＩＧＩＴタンパク質の細胞表面での結合程度を蛍光柔細胞分析器で測定した結果を示した図である。
【図５】抗−ＴＩＧＩＴ抗体処理によるＴＩＧＩＴとＣＤ１５５との間の結合を抑制する程度を示すブロッケード分析（ｂｌｏｃｋａｄｅ  ａｓｓａｙ）結果を示した図である。
【図６】ＴＩＧＩＴが過発現したＮＫ９２細胞株とＰＶＲが過発現したＨｅＬａ細胞株を共培養した条件で、抗−ＴＩＧＩＴ抗体処理によるＮＫ９２細胞株に来由のＩＦＮ−ｇ分泌量を測定して示した図である。
【図７】ＴＩＧＩＴが過発現したＮＫ９２細胞株とＰＶＲが過発現したＨｅＬａ細胞株を共培養した条件で、抗−ＴＩＧＩＴ抗体処理によるＮＫ９２細胞株のＮＫＧ２Ｄ発現を蛍光柔細胞分析器で測定した結果を示した図である。
【図８】一実施例による抗−ＴＩＧＩＴ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効力を評価するために、評価試験の終了日の腫瘍容積を示したグラフであって、ＣＴ２６腫瘍モデルでの効能を示す結果を示した図である。
【図９】一実施例による抗−ＴＩＧＩＴ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ容量別単独及び抗−ＰＤ−Ｌ１抗体との併用効力を評価するために、評価試験の終了日の腫瘍容積を示したグラフであって、ＣＴ２６腫瘍モデルでの効能を示す結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
他に定義しない限り、本明細書で使用した全ての技術的及び科学的用語は本発明が属する技術分野で熟練した専門家によって通常的に理解されるものと同じ意味を有する。一般に、この明細書で使用した命名法は当該技術分野でよく知られて通常的に使われるものである。
【００２２】
本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１又は２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３又は４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５又は６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、を含む重鎖可変領域と、
配列番号７又は８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９又は１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１１又は１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、を含む軽鎖可変領域とを含むことを特徴とする。
【００２３】
また、本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１５又は配列番号１６の軽鎖可変領域とを含むことを特徴とする。
【００２４】
本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片は、好ましくは、
（１）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、を含む重鎖可変領域、及び
配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、を含む軽鎖可変領域と、
（２）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、を含む重鎖可変領域、及び
配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、を含む軽鎖可変領域と、
（３）配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
（４）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
を含むことを特徴とする。
【００２５】
Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹枝状細胞のような免疫細胞の表面に発現するＴＩＧＩＴは癌細胞表面のＰＶＲ（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＤ１５５）と結合して免疫細胞の活性を阻害する。本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片はＴＩＧＩＴのＣＤ１５５結合部位に特異的に結合してＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５相互作用による信号伝逹を阻害し、免疫細胞の活性化を誘導し、腫瘍細胞の成長を阻害する機能を有する。ＣＤ１５５は、ヒト、猿、マウス、ラットなどの多様な哺乳動物の細胞表面で発現し、ＴＩＧＩＴとの結合によって免疫細胞の活性化を抑制する信号を伝達する。
【００２６】
すなわち、本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片はＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５相互作用による信号伝逹を阻害し、これにより癌細胞による免疫細胞の抑制信号が相殺され、免疫反応の再活性化を誘導することにより効果的に癌細胞を攻撃するようにして坑癌効果を現すようになり、究極に腫瘍免疫抑制因子であるＴＩＧＩＴを標的とする免疫坑癌治療用途に使用可能である。特に、本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片は癌を有する個体でＴＩＧＩＴの発現又は活性を減少させるか抑制させてＴ細胞やＮＫ細胞の持続的な坑癌反応を誘導することによって癌を治療する効果を有する。
【００２７】
本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片の抗原として作用するＴＩＧＩＴタンパク質は免疫細胞の活性抑制に密接な関連があり、免疫細胞の表面に存在する膜タンパク質であり、免疫細胞の補助抑制受容体として作用する。前記ＴＩＧＩＴは、ヒト、猿などの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類から由来するものであり得る。
【００２８】
本明細書で、用語“ＴＩＧＩＴ”は細胞によって天然的に発現する、ＴＩＧＩＴの任意の変異体、イソ型及び種同族体を総称する概念であり、好ましくはヒトのＴＩＧＩＴを意味するが、これに限定されるものではなく、他の動物などのＴＩＧＩＴを含む概念であり得る。
【００２９】
本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体はヒトＴＩＧＩＴ（ｈＴＩＧＩＴ；配列番号２１；ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿７７６１６０）のＣＤ１５５結合部位又は結合を阻害する部位に特異的に結合することが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３０】
本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列及び可変領域の配列は表１〜表４に記載した通りである。
【００３１】
【表１】
2021514642.tif 000003
【００３２】
【表２】
2021514642.tif 000004
【００３３】
【表３】
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【００３４】
【表４】
2021514642.tif 000006
【００３５】
一方、配列番号１又は２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３又は４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５又は６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３とそれぞれ８０％以上の配列相同性、好ましくは９０％以上の配列相同性、より好ましくは９９％の配列相同性を有する配列を含む重鎖可変領域を含み、本発明によるＴＩＧＩＴと同じ特性を有する抗体又はその抗原結合断片も本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片の権利範囲に含まれ、
配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と８０％以上の配列相同性、好ましくは９０％以上の配列相同性、より好ましくは９９％の配列相同性を有する配列を含み、本発明によるＴＩＧＩＴと同じ特性を有する抗体又はその抗原結合断片も本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片の権利範囲に含まれる。
【００３６】
また、配列番号７又は８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９又は１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２，及び配列番号１１又は１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３とそれぞれ８０％以上の配列相同性、好ましくは９０％以上の配列相同性、より好ましくは９９％の配列相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含み、本発明によるＴＩＧＩＴと同じ特性を有する抗体又はその抗原結合断片も本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片の権利範囲に含まれ、
配列番号１５又は１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と８０％以上の配列相同性、好ましくは９０％以上の配列相同性、より好ましくは９９％の配列相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含み、本発明によるＴＩＧＩＴと同じ特性を有する抗体又はその抗原結合断片も本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片の権利範囲に含まれる。
【００３７】
また、本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片には、本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片において、同類置換によってアミノ酸配列の一部が置換された抗体又はその抗原結合断片も含まれる。
【００３８】
本明細書で、“保存的置換”とは、１個以上のアミノ酸を該当ポリペプチドの生物学的又は生化学的機能の損失を引き起こさない類似生化学的特性を有するアミノ酸に置換することを含むポリペプチドの変形を意味する。“保存的アミノ酸置換”はアミノ酸残基を類似測鎖を有するアミノ酸残基に代替させる置換である。類似測鎖を有するアミノ酸残基部類は当該技術分野で規定されており、よく知られている。これら部類は、塩基性測鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性測鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、帯電されなかった極性測鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性測鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝測鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族測鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。本発明の抗体が保存的アミノ酸置換を有し、依然として活性を保有することができることが予想される。
【００３９】
本明細書での用語“ＴＩＧＩＴ特異的抗体”はＴＩＧＩＴに結合してＴＩＧＩＴの生物学的活性の抑制をもたらす抗体を意味し、“抗−ＴＩＧＩＴ抗体”と混用される。
【００４０】
本明細書での“抗−ＴＩＧＩＴ抗体”は多クローン抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）及び単クローン抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の両者を含む概念であり、好ましくは単クローン抗体であり、完全な全抗体（ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）形態を有することができる。全抗体は２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する構造であって、不変領域を含む構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。
【００４１】
本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体の全抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＧ形態を含む概念であり、ＩｇＧは亜類型（ｓｕｂｔｙｐｅ）であり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。
【００４２】
本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体はヒト抗体ライブラリ（ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｙ）から選別された完全ヒト抗体（ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００４３】
本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体の“抗原結合断片”は抗−ＴＩＧＩＴ抗体の抗原、すなわちＴＩＧＩＴと結合可能な機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、及びＦｖなどを含む概念であり、本明細書では“抗体断片”と同じ意味で混用される。
【００４４】
前記Ｆａｂは軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域と重鎖の第１不変領域（ＣＨ１ドメイン）を有する構造であり、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂとは違いがある。Ｆ（ａｂ’）２抗体はＦａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を成しながら生成される。
【００４５】
前記Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）は重鎖可変部位及び軽鎖可変部位のみを有している最小の抗体断片を意味する。二重鎖Ｆｖ（ｄｓＦｖ）はジスルフィド結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、一般的にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連結されている。このような抗体断片はタンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全抗体をパパインで制限切断すればＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子組み換え技術（例えば、抗体の重鎖又はその可変領域をコードするＤＮＡ及び軽鎖又はその可変領域をコードするＤＮＡを鋳型とし、プライマー対を用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法で増幅させ、ペプチドリンカーをコードするＤＮＡと両末端がそれぞれ重鎖又はその可変領域及び軽鎖又はその可変領域と連結されるようにするプライマー対を組み合わせて増幅）によって製作することができる。
【００４６】
本発明は他の観点で、本発明は抗−ＴＩＧＩＴ抗体をコードする核酸に関するものである。本明細書で使われる核酸は、細胞、細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅ）中に存在するか、又は部分的に精製された形態又は実質的に純粋な形態で存在することもできる。核酸はアルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド化（ｂａｎｄｉｎｇ）、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当該技術分野によく知られたその他のものを含む標準技術によって他の細胞成分又はその他の汚染物質、例えば他の細胞の核酸又はタンパク質から精製されて出る場合、“単離”されるか“実質的に純粋になった”ものである。本発明の核酸は、例えばＤＮＡ又はＲＮＡであり得、イントロン配列を含むか含まないことができる。
【００４７】
本発明は、さらに他の観点で、前記核酸を含むベクターに関するものである。本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片の発現のために、部分的又は全長の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを標準分子生物学技術（例えば、ＰＣＲ増幅又は目的抗体を発現するハイブリドーマを用いたｃＤＮＡクローニング）で収得することができ、ＤＮＡが転写及び翻訳制御配列に“作動可能に結合”して発現ベクター内に挿入されることができる。
【００４８】
本明細書で使われる用語“作動可能に結合”はベクター内の転写及び翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節する意図された機能をするように抗体をコードする遺伝子がベクター内にライゲーションされるということを意味することができる。
【００４９】
発現ベクター及び発現制御配列は使われる発現用宿主細胞と親和性があるように選択される。抗体の軽鎖遺伝子及び抗体の重鎖遺伝子は別個のベクター内に挿入されるか、両遺伝子が共に同じ発現ベクター内に挿入される。抗体は標準方法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクター上の相補性制限酵素部位のライゲーション、又は制限酵素部位が全然存在しない場合、ブラント（ｂｌｕｎｔ）末端ライゲーション）で発現ベクター内に挿入される。場合によって、前記組み換え発現ベクターは宿主細胞からの抗体鎖の分泌を容易にする信号ペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、信号ペプチドがフレームに合わせて抗体鎖遺伝子のアミノ末端に結合するようにベクター内にクローニングされることができる。信号ペプチドは兔疫グロブリン信号ペプチド又は異種性信号ペプチド（すなわち、兔疫グロブリンの他のタンパク質来由の信号ペプチド）であり得る。また、前記組み換え発現ベクターは宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。“調節配列”は抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御するプローモーター、エンハンサー及びその他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化信号）を含むことができる。通常の技術者は、形質転換させる宿主細胞の選択、タンパク質の発現水準などの因子によって調節配列を異に選択して、発現ベクターのデザインが変わることができることを認識することができる。
【００５０】
本発明は、さらに他の観点で、前記核酸又は前記ベクターを含む宿主細胞に関するものである。本発明による宿主細胞は、動物細胞、植物細胞、酵母、大膓菌及び昆虫細胞からなる群から選択されることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００５１】
具体的には、本発明による宿主細胞は、大膓菌、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）又はスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）のような原核細胞であり得る。また、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）のような真菌、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）のような酵母、その他の下等真核細胞、及び昆虫からの細胞のような高等真核生物の細胞のような真核細胞であり得る。
【００５２】
また、植物又は哺乳動物から由来することができる。好ましくは、猿の腎臓細胞７（ＣＯＳ７：ｍｏｎｋｅｙ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ）細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞、Ｗ１３８、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ：ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ＭＤＣＫ、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ７８細胞及びＨＥＫ２９３細胞などが利用可能であるが、これに限定されない。特に好ましくは、ＣＨＯ細胞を使うことができる。
【００５３】
前記核酸又は前記ベクターは宿主細胞に形質移入又はトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）される。“形質移入”又は“トランスフェクション”させるために原核又は真核宿主細胞内に外因性核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を導入するのに通常使われる多種の多様な技術、例えば電気泳動法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション又はリポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）などを使うことができる。本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体を発現させるために多様な発現宿主／ベクターの組合せを用いることができる。真核宿主に適した発現ベクターとしては、これらに限定されるものではないが、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウィルス、アデノ関連ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルス及びレトロウイルスから来由する発現調節配列が含まれる。細菌宿主に使用可能な発現ベクターには、ｐＥＴ、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＵＣベクター、ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びこれらの誘導体のように大膓菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から得られる細菌性プラスミド、ＲＰ４のようにより広い宿主範囲を有するプラスミド、λｇｔ１０、λｇｔ１１、ＮＭ９８９のような非常に多様なファージラムダ（ｐｈａｇｅ  ｌａｍｂｄａ）誘導体として例示可能なファージＤＮＡ、及びＭ１３とフィラメント性の単一本のＤＮＡファージのようなその他のＤＮＡファージが含まれる。酵母細胞に有用な発現ベクターは２℃プラスミド及びその誘導体である。昆虫細胞に有用なベクターはｐＶＬ９４１である。
【００５４】
本発明は、さらに他の観点で、宿主細胞を培養して本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片を発現させる段階を含む本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片の製造方法に関するものである。
【００５５】
前記抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片を発現することができる組み換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞内に導入される場合、抗体は宿主細胞で抗体が発現するのに十分な期間の間、又はより好ましくは宿主細胞が培養される培養培地内に抗体が分泌されるのに十分な期間の間に宿主細胞を培養することによって製造することができる。
【００５６】
場合によって、発現した抗体は宿主細胞から分離して均一精製することができる。前記抗体の分離又は精製は、通常のタンパク質で使われている分離、精製方法、例えばクロマトグラフィーによって遂行することができる。前記クロマトグラフィーは、例えば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムを含む親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性クロマトグラフィーを含むことができる。前記クロマトグラフィーの他に、追加として濾過、限外濾過、塩析、透析などを組み合わせることにより抗体を分離及び精製することができる。
【００５７】
本発明は、さらに他の観点で、本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む癌又は腫瘍治療用薬学組成物に関するものである。
【００５８】
本発明は、さらに他の観点で、前記抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片を予防又は治療の必要な患者に投与することを特徴とする癌又は腫瘍の治療方法に関するものである。
【００５９】
本発明は、さらに他の観点で、癌又は腫瘍の治療のための前記抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片の用途に関するものである。
【００６０】
本発明は、さらに他の観点で、癌又は腫瘍の治療用薬剤製造のための前記抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片の用途に関するものである。
【００６１】
用語“癌”又は“腫瘍”は典型的に調節されなかった細胞成長／増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指称するか意味する。
【００６２】
本発明の組成物で治療可能な癌又は癌腫は特に制限されず、固形癌及び血液癌のいずれも含む。このような癌の例としては、黒色腫などの皮膚癌、肝臓癌、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胃癌、乳房癌、肺癌、卵巣癌、気管支癌、鼻咽腔癌、喉頭癌、膵膓癌、膀胱癌、大膓癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、前立腺癌、骨癌、甲状腺癌、副甲状線癌、腎臓癌、食道癌、胆管癌、精巣癌、直膓癌、頭頸部癌、頸椎癌、尿管癌、骨肉腫、神経芽細胞腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫及び神経膠腫からなる群から選択されることができるが、これに限定されるものではない。好ましくは、本発明の組成物で治療可能な癌は、大膓癌、乳房癌、肺癌及び腎臓癌からなる群から選択されることを特徴とすることができる。
【００６３】
本発明は、治療有効量の抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片、及び製薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。“製薬上（薬学的に）許容される担体”は製剤を製剤化するか又は安定化させることを助けるために活性成分に加わることができる物質であり、患者に有意な有害毒性効果を引き起こさない。
【００６４】
前記担体とは、患者を刺激しなく、投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体又は希釈剤を言う。液状溶液に製剤化する組成物において許容される薬学的担体としては、滅菌及び生体に適したものであって、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分の中で１成分以上を混合して使うことができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤に製剤化することができる。他の担体は、例えば文献[Remington's Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin)]に記載されている。このような組成物は、治療有効量の１種以上の抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片を含むことができる。
【００６５】
製薬上許容される担体は、滅菌注射可能な溶液剤又は分散液剤を即時投与用（ｅｘｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓ）に製造するための滅菌水溶液又は分散液及び滅菌粉末を含む。製薬活性物質のためのこのような媒質及び作用剤の使用は当該技術分野に公知となっている。組成物は、好ましくは、非経口注射用に製剤化される。組成物は、溶液剤、マイクロエマルジョン剤、リポソーム剤、又は高薬物濃度に適したその他の注文された構造物に製剤化されることができる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）及びこれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒質であり得る。ある場合には、組成物中に、等張化剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール又は塩化ナトリウムを含ませることができる。滅菌注射可能な溶液剤は所要量の活性化合物を必要によって前記記載の成分の中で１種又はこれらの組合せとともに適切な溶媒中に混入させた後、滅菌精密濾過を行って製造可能である。一般に、分散液剤は、活性化合物を基本的な分散媒質及び前記記載のものからのその他の必要な成分を含む滅菌ビークルに混入させることで製造される。滅菌注射可能な溶液剤を製造するための滅菌粉末の場合、ある製造方法は、活性成分及び任意の追加の所望成分の粉末をこれの予め滅菌濾過させた溶液から生成する真空乾燥及び冷凍乾燥（凍結乾燥）である。
【００６６】
本発明による医薬組成物の投与量は特に限定されないが、患者の健康状態及び体重、疾患の重症度、薬剤の種類、投与経路及び投与時間を含む多様な要因によって変更可能である。本発明による医薬組成物は、一日に１回容量又は多数回容量でラット（ｒａｔ）、マウス（ｍｏｕｓｅ）、家畜、ヒトなどを含む哺乳類内に典型的に許容された経路、例えば腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与又は直腸内投与の形態で投与可能であるが、これに限定されるものではない。
【００６７】
本発明による医薬組成物は、必要によってボーラスで又は連続注入で患者に投与されることができる。例えば、Ｆａｂ断片として提示される本発明の抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片のボーラス投与は、０．０１μｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１μｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の量であり得る。
【００６８】
本明細書で、“治療有効量”は治療が必要な患者に生体内測定可能な利点を引き起こすのに要求される抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片の組合せの量を意味する。正確な量は治療組成物の成分及び物理的特徴、意図する患者集団、個々の患者の考慮事項などによって異なるが、これに制限されない幾多の因子によって異なり、通常の技術者が容易に決定することができる。これらの要因を完全に考慮するとき、副作用なしに最大の効果を得るのに十分な最小量を投与することが重要であり、この服量は当該分野の専門家によって容易に決定されることができる。
【００６９】
さらに他の側面で、本発明は、本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片、又はこれを含む医薬組成物を治療の必要な個体に投与して癌を治療し、癌の成長を抑制する方法を提供する。
【００７０】
本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片、又はこれを含む医薬組成物は、癌細胞又はそれらの転移を治療するために、又は癌の成長を抑制するために薬学的に効果的な量で投与されることができる。
【００７１】
薬学的に効果的な量は、癌の種類、患者の年齢、体重、症状の特性及び程度、現在治療法の種類、治療回数、投与形態及び経路などの多様な要因によって変わることができ、当該分野の専門家によって容易に決定されることができる。本発明の組成物は前述した薬理学的又は生理学的成分を一緒に投与するか順次投与することができ、また従来の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤と順次又は同時に投与することができる。このような投与は単一又は多重投与であり得る。前記要素を全て考慮して副作用なしに最小量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、通常の技術者によって容易に決定されることができる。
【００７２】
本発明で、“個体”は本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片、又はこれを含む医薬組成物を投与して軽減、抑制又は治療することができる状態や疾患を患っているかそのような危険がある哺乳動物を意味し、好ましくはヒトを意味する。
【００７３】
本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片、及びこれを含む医薬組成物は従来の治療剤とともに使用する用途に使われることができる。
【００７４】
したがって、本発明は、さらに他の観点で、前記抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片及び他の癌治療剤を含む癌又は腫瘍治療のための併用投与組成物及びこれを用いた治療方法に関するものである。
【００７５】
前記他の癌治療剤は、本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片の他に、癌治療のために使用可能な全ての治療剤を意味する。
【００７６】
本発明において、前記癌治療剤は免疫チェックポイント抑制剤であることを特徴とすることができるが、これに制限されるものではない。
【００７７】
本発明において、前記免疫チェックポイント抑制剤はｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ又はｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを意味し、抗−ＣＴＬＡ−４抗体、抗−ＰＤ−１抗体又は抗−ＰＤ−Ｌ１抗体であることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではなく、具体的には、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）又はデュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）などが使われることができるが、これに限定されるものではない。
【００７８】
“併用”は、抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片と、他の癌治療剤のそれぞれが同時、順次、又は逆順に投与されることができることを意味し、通常の技術者の範囲内で適切な有効量の組合せで投与されることができる。
【００７９】
本発明の一実施例で、抗−ＰＤ−Ｌ１抗体と本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体を併用投与した場合、腫瘍の成長をもっと抑制することを確認した。
【００８０】
前記併用投与組成物は抗−ＴＩＧＩＴ抗体を含み、これに係わる構成は前述した癌の予防又は治療用組成物に含まれた構成と同一であるので、各構成についての説明は併用投与用組成物にも同様に適用される。
【００８１】
一側面で、本発明は、本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片に薬物が接合された抗体−薬物接合体及びこれを含む薬学組成物を提供する。また、本発明は、前記抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片に薬物が接合された抗体−薬物接合体及びこれを含む薬学組成物を用いて腫瘍を治療する方法を提供する。
【００８２】
前記抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片はリンカーを介して薬物に結合されることができる。前記リンカーは抗−ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片と薬物との間を連結する部位であり、例えば前記リンカーは細胞内の条件で切断可能な形態、すなわち細胞内の環境で抗体から薬物がリンカーの切断によって放出できるようにする。
【００８３】
前記リンカーは、細胞内環境、例えばリソソーム又はエンドソームに存在する切断剤によって切断されることができ、例えば細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素、例えばリソソーム又はエンドソームプロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーであり得る。一般に、ペプチドリンカーは少なくとも２個以上のアミノ酸長さを有する。前記切断剤は、カテプシンＢ及びカテプシンＤ、プラスミンを含むことができ、ペプチドを加水分解して薬物を標的細胞内に放出するようにする。
【００８４】
前記ペプチドリンカーはチオール依存性プロテアーゼカテプシン−Ｂによって切断されることができ、これは癌組職で過発現し、例えばＰｈｅ−Ｌｅｕ又はＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙリンカーが使われることができる。また、前記ペプチドリンカーは、例えば細胞内プロテアーゼによって切断されることができるものであり、Ｖａｌ−ＣｉｔリンカーであるかＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーであり得る。
【００８５】
一実施例で、前記切断性リンカーはｐＨ敏感性を有し、特定のｐＨ値で加水分解に敏感であり得る。一般に、ｐＨ敏感性リンカーは酸性条件で加水分解することができることを示す。例えば、リソソームで加水分解することができる酸性不安定リンカー、例えばヒドラゾン、セミカルバゾン、チオカルバゾン、シスアコニティックアミド（ｃｉｓ−ａｃｏｎｉｔｉｃ  ａｍｉｄｅ）、オルトエステル、アセタール、ケタールなどであり得る。
【００８６】
他の実施例で、前記リンカーは還元条件で切断されることもでき、例えば二流化リンカーがこれに相当することができる。ＳＡＴＡ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ）、ＳＰＤＰ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ＳＰＤＢ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｂｕｔｙｒａｔｅ）及びＳＭＰＴ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−ｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−ａｌｐｈａ−ｍｅｔｈｙｌ−ａｌｐｈａ−（２−ｐｙｒｉｄｙｌ−ｄｉｔｈｉｏ）ｔｏｌｕｅｎｅ）を使って多様な二流化結合を形成することができる。
【００８７】
前記薬物及び／又は薬物−リンカーは抗体のリシンを介して無作為に接合されるか、二流化結合鎖を還元したときに露出されるシステインを介して接合されることができる。場合によって、遺伝工学的に製作されたタグ、例えばペプチド又はタンパク質に存在するシステインを介してリンカー−薬物が結合されることができる。前記遺伝工学的に製作されたタグ、例えばペプチド又はタンパク質は、例えばイソプレノイドトランスフェラーゼによって認識可能なアミノ酸モチーフを含むことができる。前記ペプチド又はタンパク質はペプチド又はタンパク質のカルボキシ末端で欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を有するか、ペプチド又はタンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端にスペーサーユニットの共有結合による付加を有する。
【００８８】
また、前記リンカーは、例えば非切断性リンカーであり得、抗体加水分解の一段階のみを介して薬物が放出され、例えばアミノ酸−リンカー−薬物複合体を生産する。このような類型のリンカーはチオエーテル基又はマレイミドカプロイル基（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）であり得、血液内安全性を維持することができる。
【００８９】
前記抗体−薬物接合体における薬物は薬理学的効果を示す製剤であり、抗体に結合されることができ、具体的に化学療法剤、毒素、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は放射性アイソトープであり得る。前記化学療法剤は、例えば細胞毒性製剤又は免疫抑制剤であり得る。具体的に、マイクロチューブリン抑制剤、類似分裂抑制剤、トポイソメラーゼ抑制剤、又はＤＮＡ挿入剤として機能することができる化学療法剤を含むことができる。また、免疫調節化合物、抗癌剤及び抗ウイルス剤、又はこれらの組合せを含むことができる。
【００９０】
このような薬物には、例えば、メイタンシノイド、オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、アミノプテリン、オクチノマイシン、ブレオマイシン、サリドマイド、カンプトセシン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、１−（２−クロロエチル）−１，２−ジメチルスルホニルヒドラジド、エスペラマイシン、エトポシド、６−メルカプトプリン、ドラスタチン、トリコテセン、カリケアマイシン、タクソール（ｔａｘｏｌ）、タキサン、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、メトトレキサート、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、メルファラン、クロラムブシル、デュオカルマイシン、Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ；マイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、ナイトロジェンマスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎｍｕｓｔａｒｄ）、シトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ＣＮＵ（ｂｉｓｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、トレオスルファン（ｔｒｅｏｓｕｌｆａｎ）、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、９−アミノカンプトテシン（９−ａｍｉｎｏｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、クリスナトール（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ）、トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、チアゾフリン（ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）、リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）、ＥＩＣＡＲ（５−ｅｔｈｙｎｙｌ−１−ｂｅｔａ−Ｄｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ−４−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、デフェロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘ���ｍｉｎｅ）、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ（ａｒａＣ））、シトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、メスゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ）、ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、ロイプロリドアセテート（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ  ａｃｅｔａｔｅ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ＥＢ１０８９、ＣＢ１０９３、ＫＨ１０６０、ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）、フタロシアニン（ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）、光線感作剤Ｐｅ４（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ  Ｐｅ４）、デメトキシ−ヒポクレリンＡ（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙ−ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ  Ａ）、インターフェロン−α（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α）、インターフェロン−γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ベルケイド（ｖｅｌｃａｄｅ）、レブラミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ）、サロミド（ｔｈａｌｏｍｉｄ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウミオン（１−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍｉｏｎ）、スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシンＡ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  Ａ２）、ブレオマイシンＢ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  Ｂ２）、ペプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）及びタプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）、核酸分解酵素及び細菌や動植物来由の毒素からなる群から選択された１種以上であり得るが、これに限定されるものではない。
【００９１】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものに解釈されないというのは当該技術分野で通常の知識を有する者に自明であろう。
【００９２】
実施例１．抗−ＴＩＧＩＴ抗体の選別
１．１抗−ＴＩＧＩＴヒト抗体ｓｃＦｖとＦａｂクローン選別
【００９３】
ＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体はｓｃＦｖとＦａｂヒト抗体ライブラリを用いてファージディスプレイスクリーニング（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）方法で選別した。ｓｃＦｖライブラリは“Construction of a Large Synthetic Human ｓｃＦｖライブラリ with Six Diversified CDRs and High Functional Diversity(Yang HY et al Molecules and Cells 27, 225-235)”に開示された内容を参考して製造し、Ｆａｂライブラリは韓国登録特許第１６９４８３２号に開示された内容を参考して製造した。ファージディスプレイスクリーニング（Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）は総４次ラウンドまで実施し、ラウンド次数が進行する度に抗原量は減らし、水洗回数は増やす条件で実施した。１次と３次はヒトＴＩＧＩＴ−ＥＣＤ−Ｆｃ抗原を、２次と４次はマウスＴＩＧＩＴ−ＥＣＤ−Ｆｃ抗原を用いる抗原交差方式で実施した。ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒに希釈したＴＩＧＩＴ抗原２０μｇを免疫チューブ（ｉｍｍｕｎｅ  ｔｕｂｅ）に入れ、４℃で夜通しインキュベーションしてチューブの表面にコーティングした。ＴＩＧＩＴ抗原がコーティングされた免疫チューブにＰＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ（５％）溶液を入れ、常温で１時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、ｓｃＦｖ又はＦａｂヒト抗体ライブラリファージをそれぞれ４．７×１０１２と１．２×１０１３の量で入れ、常温で２時間インキュベーションしてＴＩＧＩＴ抗原と結合させた。ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４）溶液で水洗（ｗａｓｈ）してＴＩＧＩＴ抗原に結合しないファージを除去した後、０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．０）溶液を使ってファージを溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液で中和させた。溶出されたファージはＯＤ６０００．５のＥＲ２５３７大腸菌で３７℃で感染させた後、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを入れて増幅させ、次のスクリーニングラウンドに使った。各パニングスクリーニング（ｐａｎｎｉｎｇ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）ラウンドごとにファージの数を確認し、入れた総ファージ数と溶出したファージ数の比率を確認することにより、パニング次数が増えるのに従いＴＩＧＩＴ抗原に結合するファージの数が増えることを確認した。
【００９４】
各パニングラウンドの結果物から得たファージクローンをＥＲ２５３７大腸菌ストレイン（ｓｔｒａｉｎ）で感染させた後、アンピシリンプレートに塗抹してコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）形態で得た後、ペリプラズム抽出物（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｅｘｔｒａｃｔ）を用いてＴＩＧＩＴ抗原に対する結合特異性を次のようなＥＬＩＳＡ方法で確認した。ＳＢ／カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）メディアを１２０μＬずつ分株した９６−ｗｅｌｌプレートにコロニーを採集（ｐｉｃｋｉｎｇ）して接種した後、ＯＤ６００が０．６になるまで３７℃プレートシェーカー（ｐｌａｔｅ  ｓｈａｋｅｒ）の２ｓｐｅｅｄ条件で培養した。ＳＢ／カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）／ＩＰＴＧ５ｍメディアを３０μＬずつ入れ、３７℃プレートシェーカーの２ｓｐｅｅｄの条件で夜通しインキュベーションした。サンプルを３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液を除去した。生成されたペレットをＢＢＳ溶液（２００ｍＭホウ酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）１００μＬを入れてよく溶かした後、４℃で１時間インキュベーションした。３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上澄み液のみを分離してペリプラズム抽出物を得た。ペリプラズム抽出物８０μＬとＴＢＳＴ（５％ＢＳＡ）８０μＬを交ぜた後、常温で１時間ブロッキングした。ヒトＩｇＧ、ヒトＴＩＧＩＴ−Ｆｃ、マウスＴＩＧＩＴ−Ｆｃ抗原がコーティングされた９６−ｗｅｌｌプレートにブロッキングさせたペリプラズム抽出物をｗｅｌｌ当たり８０μＬ入れた後、室温で１時間インキュベーションして抗体が抗原に結合するようにした。その後、ＴＢＳＴで３回水洗した後ａｎｔｉ−ＨＡ−ＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ）を１：３，０００に希釈したＴＢＳＴ（５％ＢＳＡ）溶液をｗｅｌｌ当たり３０μＬずつ入れ、室温で１時間インキュベーションした。ＴＢＳＴで３回水洗した後、ＴＭＢ溶液をｗｅｌｌ当たり３０μＬずつ入れて発色した。１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で反応を止めた後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。抗体ペリプラズム抽出物を用いたＥＬＩＳＡスクリーニングによってＴＩＧＩＴ抗原に対する結合性がある抗体クローンでｓｃＦｖライブラリでは１４種（Ｓ０２、Ｓ０３、Ｓ０４、Ｓ０５、Ｓ０６、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１４、Ｓ１９、Ｓ３２、Ｓ３９、Ｓ４３、Ｓ６２、Ｓ６４）、Ｆａｂライブラリでは４種（Ｆ０１、Ｆ０２、Ｆ０３、Ｆ０４）をそれぞれ選別した。
【００９５】
１．２選別されたｓｃＦｖ及びＦａｂクローンのＩｇＧクローニングと抗体の生産及び精製
【００９６】
選別されたｓｃＦｖ及びＦａｂクローンをＩｇＧ形態に生産するために、それぞれの可変部位遺伝子をＩｇＧ１抗体の不変部位遺伝子を含んでいる発現ベクターを用いて遺伝子クローニングを実施した。ｓｃＦｖ及びＦａｂクローンからＰＣＲ増幅された重鎖と軽鎖の可変部位遺伝子はそれぞれＣｌａＩ（ＮＥＢ）とＮｈｅＩ（ＮＥＢ）そしてＣｌａＩとＢｓｉＷＩ（ＮＥＢ）組合せの制限酵素をそれぞれ用いてクローニングすることによりＩｇＧ形態に発現することができるベクターを製作した。重鎖はｐｃＤＮＡ３．３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、軽鎖はｐＯｐｔｉＶＥＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）ベクターを用いた。ＩｇＧ形態の抗体生産は２９３Ｆ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて過渡（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）トランスフェクション方法で実施した。ＩｇＧ形態がクローニングされたｐｃＤＮＡ３．３とｐＯｐｔｉＶＥＣベクターＤＮＡを２９３Ｆ  ｃｅｌｌにトランスフェクションした後、６日目に細胞培養液を採取（ｈａｒｖｅｓｔ）して精製に使った。抗体培養液で抗体を精製するために、タンパク質Ａ樹脂を用いたＦｃ精製を遂行した。１ＸＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ）させたＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅタンパク質Ａ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）に抗体培養液を１ｍＬ／ｍｉｎの速度で流してバインドさせた。抗体のバインドが完了した後、樹脂を１ＸＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１次水洗し、０．１Ｍグリシン（ｐＨ５．５）溶液を使って２次水洗を実施した。最終抗体を得るために、０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．５）溶液を使って溶出を実施し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液を用いて中和した。
【００９７】
ファージディスプレイスクリーニングで選別された抗−ＴＩＧＩＴ抗体の種交差反応性（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｃｒｏｓｓ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を確認するために、ヒトＴＩＧＩＴ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）、マウスＴＩＧＩＴ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）、そして赤毛猿ＴＩＧＩＴ抗原に対する結合可否をＥＬＩＳＡで確認した。赤毛猿ＴＩＧＩＴ抗原は赤毛猿  ＴＩＧＩＴ遺伝子配列（ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＸＰ＿０１４９８５３０３．１）を参考して遺伝子合成によってＦｃ−ｆｕｓｉｏｎ形態に発現、精製して使った。ＰＢＳに１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈された３種のＴＩＧＩＴ抗原をそれぞれ９６−ｗｅｌｌプレートにｗｅｌｌ当たり３０μＬずつ入れ、４℃で夜通しインキュベーションしてコーティングした後、選別された抗体をそれぞれ３０ｎｇずつ処理してＴＩＧＩＴ抗原に結合させた。１：３，０００に希釈したＴＢＳＴ（５％ＢＳＡ）溶液をｗｅｌｌ当たり３０μＬずつ入れ、常温で１時間インキュベーションした。ＴＢＳＴで３回水洗した後、ＴＭＢ溶液をｗｅｌｌ当たり３０μＬずつ入れて発色した。１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で反応を止めた後、吸光度４５０ｎｍで発色程度を確認した。選別された抗体の３種ＴＩＧＩＴ抗原に対する種交差反応性を確認した（図１）。これにより試験に使用された抗体の大部分がヒトＴＩＧＩＴとマウスＴＩＧＩＴに全て結合することを確認した。
【００９８】
ファージディスプレイスクリーニングで選別された抗−ＴＩＧＩＴ抗体のＴＩＧＩＴ特異性を確認するために、ＴＩＧＩＴのスーパーファミリー（ｓｕｐｅｒ−ｆａｍｉｌｙ）であるＣＤ９６（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ製）、ＣＤ１５５（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ製）、ＣＤ１１２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）、ＣＤ１１３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）、ＣＤ２２６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）抗原に対する結合をＥＬＩＳＡで確認した。ＴＩＧＩＴを含む抗原６種を９６−ｗｅｌｌプレートにｗｅｌｌ当たり１００ｎｇずつコーティングした後、選別された抗体をそれぞれ３０ｎｇずつ処理して常温で１時間インキュベーションした。ＴＢＳＴで３回水洗した後、抗ヒトＦａｂ−ＨＲＰ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）を１：３，０００に希釈したＴＢＳＴ（５％ＢＳＡ）溶液をｗｅｌｌ当たり３０μＬずつ入れ、常温で１時間インキュベーションした。ＴＢＳＴで３回水洗した後、ＴＭＢ溶液をｗｅｌｌ当たり３０μＬずつ入れて発色した。１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で反応を止めた後、吸光度４５０ｎｍで発色程度を確認した。選別された抗体の６種抗原に対する結合を測定した結果、全ての抗体がＴＩＧＩＴ抗原のみに特異的に結合することを確認した（図２）。
【００９９】
最後に、細胞表面に発現したＴＩＧＩＴ抗原に対する選別された抗体の結合を確認するために、人ＴＩＧＩＴタンパク質を過発現するＣＨＯ−Ｓ細胞株（ＣＨＯ−ｈＴＩＧＩＴ）を用いてＦＡＣＳ分析を実施した。ＣＨＯ−ｈＴＩＧＩＴ細胞株はｌｅｎｔｉｖｉｒａｌベクターを用いて全長ヒトＴＩＧＩＴ遺伝子ＣＨＯ−Ｓ細胞に形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）させた後、ブラストサイシン抗生剤でヒトＴＩＧＩＴを過発現するＣＨＯ細胞のみを選別する方法で製作した。製作されたＣＨＯ−ｈＴＩＧＩＴ細胞株を氷冷却ＰＢＳで水洗し、５×１０４個の細胞をチューブに移した後、ＩｇＧ形態に備えた抗体をそれぞれ１μｇずつ処理し、氷上で１時間インキュベーションした。その後、抗ヒトＩｇＧＦＩＴＣ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を１μｇずつ処理し、氷上で１時間インキュベーションした。細胞を氷冷却ＰＢＳで水洗した後、ＦＡＣＳ分析して細胞表面に発現した人ＴＩＧＩＴ抗原に対する抗体の結合を確認した（図３）。陽性対照群として使用した１０Ａ７抗体はハムスター来由の抗ヒト、マウス交差結合が可能な抗体であり、米国特許第２０１５／０２１６９７０号に記述された配列に基づいて可変領域をマウスＩｇＧ２ａの定常領域を有する抗体の形態に遺伝子を製作して自体生産した。人ＴＩＧＩＴ抗原に対して１０Ａ７抗体は結合するが、陰性対照群として使用したニボルメブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、ａｎｔｉ−ＰＤ１抗体）は結合しないことからＣＨＯ−ｈＴＩＧＩＴ細胞が正常に製作されたことを確認した。選別された抗体はいずれもＣＨＯ−ｈＴＩＧＩＴ細胞に特異的に結合することを確認した。
【０１００】
実施例２．抗−ＴＩＧＩＴ抗体の最適化
２．１Ｆ０４及びＳ６４抗体の最適化
【０１０１】
前記抗体スクリーニング過程によって抗−ＴＩＧＩＴヒト抗体としてＦ０４及びＳ６４の二つのクローンを最終に選別した。これら抗体の安全性を高めるために、Ｆ０４及びＳ６４抗体のアミノ酸配列を基にしてサブライブラリ（ｓｕｂ−ｌｉｂｒａｒｙ）を製作し、高温条件と拡張水洗方法を用いて安全性を高めるためのスクリーニングを実施した。Ｆ０４抗体のサブライブラリはＣＤＲＨ１とＣＤＲＨ２を同時にシャッフリング（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）したライブラリで１種をオーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）方法で製作した。Ｓ６４のサブライブラリはＣＤＲＨ１とＣＤＲＨ２を同時にシャッフリングしたものと、ＣＤＲＬ１、２、３を同時にシャッフリングしたものと、ＣＤＲＨ３を除いた残りのＣＤＲを全てシャッフリングしたライブラリ形態の総３種のサブライブラリをオーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ＰＣＲ方法で製作した。Ｆ０４及びＳ６４クローンの最適化のために、アミノ酸配列多様化したＣＤＲ領域を下記の表５（下線で表示した部分がＣＤＲ領域）に示した。
【０１０２】
【表５】
2021514642.tif 000007
【０１０３】
親クローンより安全性が向上したクローンを選別するために製作されたサブライブラリからファージをレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）した後、抗原に結合させる前にファージを加熱することにより、安全性が落ちるクローンをまず除去する過程を経た。１次と２次ファージディスプレイスクリーニングでは６０℃で、３次から６次までのスクリーニングでは８０℃で１０分間ファージを処理して実施した。また、ＥＬＩＳＡ段階では水洗時間を２時間に増やし、３７℃に温度を高めた条件で親クローンに比べて安全性が向上したクローンを区別することができるように残留比（ｒｅｍａｉｎｉｎｇ  ｒａｔｉｏ）を導出してスクリーニングを実施した。これに基づいて安全性が向上したクローンを選別し、その配列を分析した（表６及び表７）。
【０１０４】
【表６】
2021514642.tif 000008
【０１０５】
【表７】
2021514642.tif 000009
【０１０６】
最終的にＦ０４サブライブラリを用いたスクリーニングではＦ０４−１０クローンを選別し、Ｓ６４サブライブラリではＳ６４−３９クローンを最終に選別した。
【０１０７】
Ｆ０４−１０クローンによる抗体は配列番号１３によるアミノ酸配列を重鎖可変領域として、配列番号１５によるアミノ酸配列を軽鎖可変領域として含み、Ｓ６４−３９クローンによる抗体は配列番号１４によるアミノ酸配列を重鎖可変領域として、配列番号１６によるアミノ酸配列を軽鎖可変領域として含む。
【０１０８】
また、Ｆ０４−１０クローンによる抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、を含む重鎖可変領域と、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、を含む軽鎖可変領域とを含み、
【０１０９】
Ｓ６４−３９クローンによる抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、を含む重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１１０】
２．２抗−ＴＩＧＩＴ抗体の遺伝子クローニングと抗体精製
【０１１１】
Ｆ０４−１０−ＩｇＧ１とＳ６４−３９−ＩｇＧ１抗体の発現ベクターは前記実施例１．２のような方法で製作した。Ｓ６４−３９−ＩｇＧ４抗体の重鎖発現ベクターは次のように製作した。Ｓ６４−３９−ＩｇＧ１発現ベクターからＮｈｅＩとＸｈｏＩ（ＮＥＢ）制限酵素を用いてＩｇＧ１不変部位に相当する遺伝子を除去し、これに抗ＰＤ−１抗体であるニボルマブの重鎖不変部位をＮｈｅＩとＸｈｏＩで処理した遺伝子をサブクローニングして入れることにより、最終的にＳ６４−３９重鎖がＩｇＧ４形態に発現するように製作した。Ｆ０４−１０とＳ６４−３９抗体の軽鎖可変部位はそれぞれＣｌａＩとＸｈｏＩ制限酵素を用いてｐＯｐｔｉＶＥＣベクターにサブクローニングした。
【０１１２】
ＩｇＧ形態に製作された３種の抗体の生産と精製は前記実施例１．２のように２９３Ｆ細胞株を用いた一時的発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）とＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅタンパク質Ａ樹脂を用いて実施した。
【０１１３】
実施例３．抗−ＴＩＧＩＴ抗体の細胞表面のＴＩＧＩＴ結合確認試験
【０１１４】
前記実施例２で製造された３種の抗−ＴＩＧＩＴ抗体の細胞表面に発現しているＴＩＧＩＴに対する結合能を確認するために、ＴＩＧＩＴを過発現させたＣＨＯ細胞株（以下、ＣＨＯ−ＴＩＧＩＴ細胞株）に抗−ＴＩＧＩＴ抗体を処理した後、蛍光柔細胞分析器を用いて細胞表面のＴＩＧＩＴに結合した抗−ＴＩＧＩＴ抗体を探知した。
【０１１５】
具体的に、化学組成培地（ＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ化学的に組成された培地＋８ｍＭ  Ｌ−グルタミン＋２０μｇ／ｍＬブラストサイシン＋１％抗凝集剤）を使ってＣＨＯ−ＴＩＧＩＴ細胞株を３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターで４８〜７２時間培養した。培養が完了したＣＨＯ−ＴＩＧＩＴ細胞株は遠心分離によって収穫し、ＦＡＣＳ溶液（ＰＢＳ＋５％ＦＢＳ）に希釈した後、９６−ｗｅｌｌ丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ製）にｗｅｌｌ当たり１×１０５個ずつ分株した。その後、細胞表面に残っている化学組成培地を完全に除去するために、ＦＡＣＳ溶液を添加し、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離を実施した後、上澄み液を除去する洗浄作業を３回繰り返した。洗浄が完了したＣＨＯ−ＴＩＧＩＴ細胞株はＦＡＣＳ溶液を１００μＬずつ添加して再浮遊させた。ＦＡＣＳ溶液を用いて最終処理濃度の２倍濃度に希釈した各濃度別抗−ＴＩＧＩＴ抗体をＣＨＯ−ＴＩＧＩＴ細胞株が分株されている９６−ｗｅｌｌ丸底プレートに１００μＬずつ添加して４℃で１時間インキュベーションした。その後、細胞表面ＴＩＧＩＴに結合せず、上澄み液に残っている抗−ＴＩＧＩＴ抗体を除去するために、各ｗｅｌｌにＦＡＣＳ溶液を添加し、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離を実施した後、上澄み液を除去する洗浄作業を３回繰り返した。細胞表面ＴＩＧＩＴに結合した抗−ＴＩＧＩＴ抗体を探知するために、ＦＡＣＳ溶液を用いてヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ｃｒｏｓｓ−ａｄｓｏｒｂｅｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を１０μｇ／ｍＬ濃度に希釈して各ｗｅｌｌに１００μＬずつ添加した後、４℃で１時間インキュベーションした。洗浄作業を３回繰り返した後、各サンプルを１２×７５ｍｍのチューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）に移し、蛍光柔細胞分析器を用いて分析した。その結果、細胞表面ＴＩＧＩＴに対する抗−ＴＩＧＩＴ抗体の結合能（ＥＣ５０）は平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を基準に、Ｆ０４−１０−ＩｇＧ１は１６．４１ｎｇ／ｍＬ、Ｓ６４−３９−ＩｇＧ１は６９．０１ｎｇ／ｍＬ、Ｓ６４−３９−ＩｇＧ４は８０．７８ｎｇ／ｍＬ、１０Ａ７は１６．５４ｎｇ／ｍＬの水準とそれぞれ確認された（図４）。
【０１１６】
実施例４．抗−ＴＩＧＩＴ抗体のＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５結合阻害試験
【０１１７】
前記実施例２で製造された３種の抗−ＴＩＧＩＴ抗体の活性を確認するために、ＴＩＧＩＴとＣＤ１５５との間の結合阻害試験を遂行した。
【０１１８】
具体的に、本試験はＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５ブロッケード分析キット（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて、ＣＤ１５５発現ａＡＰＣ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞株とＴＩＧＩＴ発現エフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）細胞株の共培養システムで抗ＴＩＧＩＴ抗体のＴＩＧＩＴとＣＤ１５５に対する結合抑制能を確認した。
【０１１９】
ＣＤ１５５発現ａＡＰＣ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞株を溶かして基本培地（１０％ＦＢＳが含まれたＦ−１２培地）１４．５ｍＬに希釈して準備し、９６−ｗｅｌｌプレート（Ｃｏｓｔａｒ製）に１００μＬ添加した後、３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターで１６〜２４時間保管した。抗−ＴＩＧＩＴ抗体が含まれた濃縮物を分析用培地（１０％ＦＢＳが含まれたＲＰＭＩ１６４０培地）を用いて、Ｆ０４−１０−ＩｇＧ１は処理濃度より２倍高い２ｍｇ／ｍＬで４倍順次希釈し、Ｓ６４−３９−ＩｇＧ１とＳ６４−３９−ＩｇＧ４は３ｍｇ／ｍＬで２倍順次希釈して準備した。対照物質として使用した１０Ａ７抗体は２．４ｍｇ／ｍＬで３倍順次希釈して準備した。ＣＤ１５５発現ａＡＰＣ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞株がある９６−ｗｅｌｌプレートの培地を全て除去した後、準備した抗−ＴＩＧＩＴ抗体を各ｗｅｌｌに４０μＬずつ添加して、実際濃度がＦ０４−１０−ＩｇＧ１は１ｍｇ／ｍＬで４倍順次希釈された試料を処理し、Ｓ６４−３９−ＩｇＧ１とＳ６４−３９ＩｇＧ４は１．５ｍｇ／ｍＬで２倍順次希釈された試料を処理した。対照物質である１０Ａ７は１．２ｍｇ／ｍＬで３倍順次希釈された試料を処理した。次に、ＴＩＧＩＴ発現エフェクター細胞株を溶かした後、分析用培地６ｍＬに希釈して各ｗｅｌｌに４０μＬずつ添加した後、３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターで６時間反応させた。Ｂｉｏ−ＧｌｏＴＭ基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）にＢｉｏ−ＧｌｏＴＭｂｕｆｆｅｒを添加して作ったＢｉｏ−ＧｌｏＴＭ試薬を各ｗｅｌｌに８０μＬずつ処理して１０分間常温で反応させた。発光（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）測定可能なマイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｌ）で反応値（ＲＬＵ）を測定し、抗−ＴＩＧＩＴ抗体を処理しなかった反応値に対する抗体処理時の反応値の比（Ｆｏｌｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ＝ＲＬＵＡｂｄｉｌｕｔｉｏｎ／ＲＬＵｎｏａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｎｔｒｏｌ）を計算したところ、その結果は次の通りである。抗−ＴＩＧＩＴ抗体の結合抑制能（ＥＣ５０）は、Ｆ０４−１０−ＩｇＧ１は２３．８９ｎＭ、Ｓ６４−３９−ＩｇＧ１は０．５８１μＭ、Ｓ６４−３９−ＩｇＧ４は１．０８μＭ、１０Ａ７は０．７５２μＭの水準と確認した（図５）。
【０１２０】
実施例５．抗−ＴＩＧＩＴ抗体のＮＫ細胞活性化試験
【０１２１】
前記実施例２で製造された３種の抗−ＴＩＧＩＴ抗体処理の際、ＮＫ９２細胞株の活性を分析するために、ＴＩＧＩＴが過発現したＮＫ９２細胞株とＰＶＲが過発現したヒト来由卵巣癌細胞株であるＨｅＬａ細胞を共培養した条件でＮＫ９２細胞株のＩＦＮ−ｇ分泌量測定と蛍光柔細胞分析器を用いたＮＫＧ２Ｄ発現確認試験を実施した。
【０１２２】
具体的に、ＴＩＧＩＴが過発現したＮＫ９２細胞株を溶かして完全培地（Ａｌｐｈａ−ＭＥＭ＋１２．５％ＦＢＳ＋１２．５％ウマ血清＋０．１ｍＭ２−メルカプトエタノール＋１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２）２×１０５／ｍＬの濃度に希釈して準備した後、Ｔ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ製）に５ｍＬの体積で３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターで１６〜２４時間培養した。先立って培養が完了したＮＫ９２細胞株の過発現したＴＩＧＩＴを抑制するために、抗−ＴＩＧＩＴ抗体を２５μｇ／ｍＬの濃度で処理した後、３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターで７２時間培養した。ＮＫ９２細胞株と抗−ＴＩＧＩＴ抗体の培養が実施されるうちＰＶＲが過発現したＨｅＬａ細胞株を溶かして完全培地（１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地）に３×１０５／ｍＬの濃度でＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ製）に１５ｍＬの体積で３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターで２４〜４８時間培養した。その後、ＮＫ９２細胞株とＨｅＬａ細胞株を１：１０（１×１０５ＮＫ９２：１×１０６ＨｅＬａ）の比で１２−ｗｅｌｌプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ製）に１ｍＬの体積で３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターで４〜６時間共培養した。共培養が完了した後、培養上澄み液をＩＦＮ−ｇＥＬＩＳＡ試験を実施するために確保した後、−２０℃で冷凍保管し、培養した細胞はＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ製）に希釈して確保した。
【０１２３】
前記過程によって確保された培養上澄み液と細胞株を用いて、
【０１２４】
第一、培養上澄み液を用いてＮＫ９２細胞株から分泌するＩＦＮ−ｇの量を測定するためにＥＬＩＳＡ試験を実施した。この試験は、Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて実施した。前記試験で抗−ＴＩＧＩＴ抗体処理の際、ＮＫ９２ｃｅｌｌから分泌するＩＦＮ−ｇの量を分析した結果、対照抗体処理グループに比べ、Ｆ０４−１０−ＩｇＧ１、Ｓ６４−３９−ＩｇＧ１抗体処理グループでＩＦＮ−ｇ分泌の有意的な増加を確認することができ、Ｓ６４−３９−ＩｇＧ４抗体処理グループでは対照抗体処理グループと同等な水準のＩＦＮ−ｇ分泌量を確認することができた（図６）。
【０１２５】
第二、前記共培養によって確保された細胞株に対するＮＫ細胞活性マーカータンパク質の一つであるＮＫＧ２Ｄ発現を確認するために、蛍光柔細胞分析器で分析を実施した。細胞株に対する免疫染色のために、まずｃｅｌｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ製）に１×１０６／ｍＬの濃度で細胞株を希釈し、ＮＫ９２細胞のみ特異的に分離するためにｅＦｌｕｏｒ−ａｎｔｉ−ＣＤ５６抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）染色及びＰＥ−ａｎｔｉ−ＮＫＧ２Ｄ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）染色を４℃で光を遮断した状態で２０分間実施した。その後、染色を洗浄するために、ｃｅｌｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを１ｍＬずつ添加し、２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、前記作業を３回繰り返し実施した。その後、各サンプルを１２×７５ｍｍの蛍光柔細胞分析用チューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）に移し、蛍光柔細胞分析器を用いてＣＤ５６を発現する細胞株に対するＮＫＧ２Ｄ発現様相を確認した。その結果、対照抗体処理グループに比べ、Ｆ０４−１０−ＩｇＧ１、Ｓ６４−３９−ＩｇＧ１、Ｓ６４−３９−ＩｇＧ４抗体処理グループの全てでＮＫＧ２Ｄ発現が有意的に増加したことを確認することができた（図７）。
【０１２６】
実施例６．抗−ＴＩＧＩＴ抗体のＴＩＧＩＴ抗原親和度測定試験
【０１２７】
前記実施例２で製造された３種の抗−ＴＩＧＩＴ抗体のヒトＴＩＧＩＴ（ｒｈＴＩＧＩＴ−Ｆｃ）とマウスＴＩＧＩＴ（ｒｍＴＩＧＩＴ−Ｆｃ）に対する結合力を測定するために、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）を用いた表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）方式を用いた。ＳＰＲ方式はセンサーチップにコートされた物質の状態によってチップを通る光の屈折率が変化する原理を用いたものであり、チップに抗原又は抗体がコートされた状態で抗体又は抗原を流し、これら間の結合による屈折率の変化が発生し、これを測定した数値から親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ、ＫＤ）値を計算する。
【０１２８】
１０ｍＭアセテート溶液（ｐＨ４．０）とアミンカップリングキット（ａｍｉｎｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｋｉｔ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）を用いて抗−ＴＩＧＩＴ抗体を５００ＲＵレベルまでＳｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）に固定化させた。これにヒト又はマウスのＴＩＧＩＴ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）タンパク質を４０ｎＭ濃度からＨＢＳ−ＥＰバッファー（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  界面活性剤Ｐ２０）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）に順次２倍ずつ希釈させた後、それぞれ流す方法でセンサーチップに固定された抗体と結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、分離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、解離（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）させながら抗原−抗体間の親和度を測定した。ＴＩＧＩＴ−Ｆｃタンパク質の結合は、３０μＬ／ｍｉｎ速度で６００秒、分離は２，０００秒間測定し、解離は１０ｍＭグリシン溶液（ｐＨ１．５）又は４０ｍＭ  ＮａＯＨ溶液を１００μＬ／ｍｉｎ速度で２５秒間流した。ｒｈＴＩＧＩＴ−ＦｃとｒｍＴＩＧＩＴ−Ｆｃに対する結合力測定結果は下記の表８及び表９の通りである。
【０１２９】
【表８】
2021514642.tif 000010
【０１３０】
【表９】
2021514642.tif 000011
【０１３１】
実施例７．抗−ＴＩＧＩＴ抗体の腫瘍成長阻害効果
【０１３２】
抗−ＴＩＧＩＴ抗体の生体内活性を評価するために、マウス腫瘍モデル（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  ＣＴ２６  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｏｄｅｌ  ｕｓｉｎｇ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｉｃｅ）を製作した。ここで、前記実施例２で製造された抗体３種（Ｆ０４−１０−ＩｇＧ１、Ｓ６４−３９−ＩｇＧ１、Ｓ６４−３９−ＩｇＧ４）及び陽性対照抗体（１０Ａ７）を単独投与又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体（１０Ｆ．９Ｇ２−ｒａｔ  ＩｇＧ２ｂ）とともに投与して腫瘍成長阻害効果を比較評価した。
【０１３３】
まず、マウス腫瘍モデルを製作するために、培養したＣＴ２６腫瘍細胞をマウス当たり１００μＬ（１×１０６ｃｅｌｌｓ）ずつ注入して皮下移植し（０日）、腫瘍が一定の大きさ以上に成長するように放置した。８日経過の後、腫瘍の容積が１１９ｍｍ３に到逹したとき（８日、投与開始日）、陰性対照物質（ラットＩｇＧ２ｂ、１０ｍｇ／ｋｇ容量）及び試験物質４種（２５ｍｇ／ｋｇ容量）を単独又は項ＰＤ−Ｌ１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ容量）とともに３日の間隔で総３回腹腔投与した。その後、腫瘍容積及び体重を週２回の間隔で測定し、腫瘍成長阻害効果は生体内実験終了日（２８日）に測定した腫瘍容積を次の公式に代入して算出したＴＧＩで示した。
ＴＧＩ  ｒａｔｅ（％）＝１００×（１−ΔＴ／ΔＣ）
ΔＴ＝終了日に測定した試験物質投与群の平均腫瘍容積−投与開示日に測定した試験物質投与群の平均腫瘍容積
ΔＣ＝終了日に測定した陰性対照物質投与群の平均腫瘍体−積投与開日に測定した陰性対照物質投与群の平均腫瘍容積
【０１３４】
腫瘍容積は、終了日を基準に、投与開始日に比べ、陰性対照物質投与群で約２３倍増加した。このような陰性対照群に比べ、陽性対照抗体及び項ＰＤ−Ｌ１抗体は単独投与の際に少しの抗腫瘍効果を現し、この二つの併用は力強くて有意的な腫瘍抑制効果を現した（図８）。抗−ＴＩＧＩＴ抗体の場合、ＩｇＧ１タイプの２種の抗体（Ｓ６４−３９−ＩｇＧ１、Ｆ０４−１０−ＩｇＧ１）が、単独投与の際、陽性対照抗体と類似の水準の薬効を示し、併用投与の際にはＳ６４−３９−ＩｇＧ１が同等な水準の効果を現した。Ｓ６４−３９−ＩｇＧ４抗体の場合はＳ６４−３９−ＩｇＧ１に比べて単独及び併用投与で多少薬効が落ちることが現れた。
【０１３５】
結論的に、前記実施例２で製造された抗体３種（Ｆ０４−１０−ＩｇＧ１、Ｓ６４−３９−ＩｇＧ１、Ｓ６４−３９−ＩｇＧ４）は単独又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体とともに投与するとき、陰性対照物質投与群に比べて有意的な抗腫瘍効果を現し、特に、単独投与の際には２種（Ｆ０４−１０−ＩｇＧ１、Ｓ６４−３９−ＩｇＧ１）、併用投与の際には１種（Ｓ６４−３９−ＩｇＧ１）の抗体が陽性対照抗体と同等な水準の腫瘍抑制効果を現した。
【０１３６】
図８の統計分析はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を用いてダネットの多重比較（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）を実施し、陰性対照物質投与群との差に対する統計的有意性を次のように表記した。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１及び＊＊＊：ｐ＜０．００１
【０１３７】
実施例９．抗−ＴＩＧＩＴ抗体の容量及び併用による腫瘍成長阻害効果
【０１３８】
抗−ＴＩＧＩＴ抗体の容量及び併用による生体内活性を評価するために、マウス腫瘍モデル（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  ＣＴ２６  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｏｄｅｌ  ｕｓｉｎｇ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｉｃｅ）を製作した。ここで、前記実施例２で製造された抗体Ｆ０４−１０を容量別に単独投与又は抗−ＰＤ−Ｌ１抗体（１０Ｆ．９Ｇ２−ｒａｔ  ＩｇＧ２ｂ）とともに投与して腫瘍成長阻害効果を比較評価した。
【０１３９】
まず、マウス腫瘍モデルを製作するために、培養したＣＴ２６腫瘍細胞をマウス当たり１００μＬ（１×１０６ｃｅｌｌｓ）ずつ注入して皮下移植し（０日）、腫瘍が一定の大きさ以上に成長するように放置した。７日経過の後、腫瘍容積が８０ｍｍ３に到逹したとき（７日、投与開始日）、各試験群の平均腫瘍容積が類似するように無作為に群分離し、陰性対照物質（ラットＩｇＧ２ｂ  １０ｍｇ／ｋｇとヒトＩｇＧ１  ２５ｍｇ／ｋｇ併用）又はＦ０４−１０（５、１０、２５ｍｇ／ｋｇ）を単独又は抗−ＰＤ−Ｌ１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ容量）とともに３日の間隔で総３回腹腔投与した。その後、腫瘍容積及び体重を週２回の間隔で測定し、腫瘍成長阻害効果は生体内実験終了日（２４日）に測定した腫瘍容積を次の公式に代入して算出したＴＧＩで示した。
ＴＧＩ  ｒａｔｅ（％）＝１００×（１−ΔＴ／ΔＣ）
ΔＴ＝終了日に測定した試験物質投与群の平均腫瘍容積−投与開始日に測定した試験物質投与群の平均腫瘍容積
ΔＣ＝終了日に測定した陰性対照物質投与群の平均腫瘍容積−投与開始日に測定した陰性対照物質投与群の平均腫瘍容積
【０１４０】
腫瘍容積は、終了日を基準に、投与開始日に比べ、陰性対照物質投与群で約１６倍増加した反面、Ｆ０４−１０単独投与群の場合、３及び１０ｍｇ／ｋｇ容量では微々たる抗腫瘍効果を、２５ｍｇ／ｋｇでは最大薬効に到逹し、力強い腫瘍成長抑制効果を示した。抗−ＰＤ−Ｌ１抗体１０ｍｇ／ｋｇ単独投与群の場合、少しの腫瘍抑制効果を現し、これをＦ０４−１０３及び１０ｍｇ／ｋｇとともに投与した場合、同じ容量のＦ０４−１０単独投与より腫瘍成長抑制効果が力強かった。一方、最大効果を現したＦ０４−１０  ２５ｍｇ／ｋｇの場合、抗−ＰＤ−Ｌ１との併用による薬効増加は観察されなかった（図９）。
【０１４１】
結論として、前記実施例２で製造された抗体Ｆ０４−１０は、単独投与の際、２５ｍｇ／ｋｇで有意的な最大腫瘍抑制効果を現し、これより低い３及び１０ｍｇ／ｋｇ容量の場合、抗−ＰＤ−Ｌ１抗体との併用によってそれぞれの単独投与より薬効が増加する傾向を示した。
【０１４２】
図９の統計分析はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を用いてダネットの多重比較（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）を実施したところ、陰性対照物質投与群との差に対する統計的有意性を次のように表記した。＊：ｐ＜０．０５
【産業上の利用可能性】
【０１４３】
本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又は抗原結合断片は非常に特異的であり、力強くＴＩＧＩＴに結合し、既存の抗−ＴＩＧＩＴ抗体に比べて非常に優れた治療効能を示すことが明かされた。したがって、本発明による抗−ＴＩＧＩＴ抗体又は抗原結合断片を有効成分として含む医薬組成物は免疫細胞活性化による坑癌免疫治療剤として用いられることができる。
【０１４４】
また、本発明の抗−ＴＩＧＩＴ抗体と抗原結合断片を有効成分として含む医薬組成物は化学医薬品及びその他の坑癌治療剤との併用治療法などに活用可能である。
【０１４５】
以上で本発明内容の特定部分を詳細に記述したが、当該分野の通常の知識を有する者にとってこのような具体的技術はただ好適な実施様態であるだけであり、これによって本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかであろう。よって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項とそれらの等価物によって定義されると言える。
【図１】
2021514642.tif 000012
【図２】
2021514642.tif 000013
【図３】
2021514642.tif 000014
【図４】
2021514642.tif 000015
【図５】
2021514642.tif 000016
【図６】
2021514642.tif 000017
【図７】
2021514642.tif 000018
【図８】
2021514642.tif 000019
【図９】
2021514642.tif 000020
【配列表】
2021514642000001.app
【国際調査報告】
2021514642.tif 000021
2021514642.tif 000022
2021514642.tif 000023
2021514642.tif 000024