(57)【要約】本発明は、pMHC結合部分およびPD−1アゴニストを含む二機能性結合ポリペプチドを提供する。【選択図】図１
2021522835.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
pMHC結合部分とPD−1アゴニストとを含む二機能性結合ポリペプチド。
【請求項２】
前記pMHC結合部分がTCR可変領域および／または抗体可変領域を含む、請求項１に記載の二機能性結合ポリペプチド。
【請求項３】
前記pMHC結合部分がT細胞受容体（TCR）またはTCR様抗体である、請求項１に記載の二機能性結合ポリペプチド。
【請求項４】
前記pMHC結合部分がヘテロ二量体アルファ／ベータTCRポリペプチド対である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の二機能性結合ポリペプチド。
【請求項５】
前記pMHC結合部分が一本鎖アルファ／ベータTCRポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の二機能性結合ポリペプチド。
【請求項６】
前記TCRが、アルファ鎖の定常領域とベータ鎖の定常領域との間に非天然のジスルフィド結合を含む、請求項３〜５のいずれか１項に記載の二機能性結合ポリペプチド。
【請求項７】
前記TCRがペプチド抗原に特異的に結合する、請求項３〜６のいずれか１項に記載の二機能性結合ポリペプチド。
【請求項８】
前記PD-1アゴニストがPD-L1またはその機能的断片である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の二機能性結合ポリペプチド。
【請求項９】
前記PD-L1が以下の配列を含むかまたはそれからなる、請求項８に記載の二機能性結合ポリペプチド。
FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPY
【請求項１０】
前記PD−1アゴニストが完全長抗体またはその断片である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の二機能性結合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記PD−1アゴニストがscFv抗体である、請求項１０に記載の二機能性結合ポリペプチド。
【請求項１２】
前記PD−1アゴニストが、前記pMHC結合部分のCまたはN末端に融合されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の二機能性結合ポリペプチド。
【請求項１３】
前記PD−1アゴニストがリンカーを介して前記pMHC結合部分に融合されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の二機能性結合ポリペプチド。
【請求項１４】
前記リンカーが２、３、４、５、６、７または８アミノ酸長である、請求項１３に記載の二機能性結合ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の二機能性結合ポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の二機能性結合ポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１８】
任意に前記二機能性結合ポリペプチドをコードする核酸が、アルファ鎖およびベータ鎖をコードする、単一のオープンリーディングフレームとして存在するか、または、それぞれコードする２つの別個のオープンリーディングフレームとして存在する、請求項１６に記載の核酸または請求項１７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
核酸の発現のための任意の条件下で請求項１８に記載の宿主細胞を維持し、二機能性結合ペプチドを単離することを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の二機能性結合ポリペプチドを作製する方法。
【請求項２０】
医学において使用するため、特に自己免疫疾患を治療するための、または、痛み、特に炎症に関連する痛みの治療または予防に使用するための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の二機能性結合ポリペプチド、請求項１５に記載の医薬組成物、請求項１６に記載の核酸および／または請求項１７に記載のベクター。
【請求項２１】
前記己免疫疾患が、円形脱毛症、強直性脊椎炎、アトピー性皮膚炎、バセドウ病、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病および白斑、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、小児脂肪便症（セリアック病）、眼疾患（例えば、ブドウ膜炎）、皮膚エリテマトーデスおよびループス腎炎、およびPD−1／PD−L1アンタゴニストによって引き起こされる癌患者の自己免疫疾患のいずれかである、請求項２０に記載の使用のための二機能性結合ポリペプチド、医薬組成物、核酸および／またはベクター。
【請求項２２】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の二機能性結合ポリペプチド、請求項１５に記載の医薬組成物、請求項１６に記載の核酸および／または請求項１７に記載のベクターを、必要とする患者に投与することを含む、自己免疫障害を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
PD−1経路は、免疫系における抑制性シグナルと刺激性シグナルのバランスを調節する上で重要な役割を果たすことが知られている。PD−1経路の活性化は免疫活性をダウンレギュレートし、末梢免疫寛容を促進し、自己免疫を防ぐ（Keirら、Annu Rev Immunol、26：677-704,2008; Okazakiら、Int Immunol 19：813-824,2007）。PD−1は、T細胞、B細胞、NK細胞、単球などの活性化免疫細胞の表面に発現する膜貫通型受容体タンパク質である（Agataら、Int Immunol 8：765-772,1996）。PD−1の細胞質尾部は、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ITIM）を含む。PD−L1およびPD−L2はPD−1の天然リガンドであり、抗原提示細胞の表面に発現する（Dongら、Nat Med.、5：1365-1369,1999; Freemanら、J Exp Med 192：1027-1034,2000; Latchmanら、Nat Immunol 2：261-268,2001）。リガンドが関与すると、ホスファターゼがPD−1のITIM領域に動員され、TCRを介したシグナル伝達が阻害され、続いてリンパ球の増殖、サイトカイン分泌、および細胞毒性活性が低下する。PD−1は、共刺激による生存シグナルを阻害する能力を介してT細胞にアポトーシスを誘導する可能性もある（Keirら、Annu Rev Immunol、26：677-704,2008）。
【０００２】
自己免疫の制御におけるPD−1経路の中心的な役割は、PD−1ノックアウトマウスが遅発性進行性関節炎、狼瘡様糸球体腎炎、および自己免疫性心筋症を発症することの観察により最初に実証された（Nishimuraら、Immunity 11：141-151,1999；Nishimuraら、Science 291：319-322,2001）。さらに、非肥満糖尿病（NOD）マウスにPD−1欠損症が導入されると、糖尿病の発生率が大幅に増進し、すべてのマウスが10週齢までに糖尿病を発症した（Wangら、PNAS 102：11823-11828, 2005）。ヒトでは、PD−1も同等の調節機能を示すようである。PD−1遺伝子内の単一ヌクレオチド多型は、エリテマトーデス、多発性硬化症、I型糖尿病、関節リウマチ、バセドウ病などのさまざまな自己免疫疾患と関連しており（Prokuninaら、Arthritis Rheum 50：1770,2004; Neilsonら、Tissue Antigens 62：492,2003; Kronerら、Ann Neurol 58：50,2005; Okazakiら、Int Immunol 19：813-824,2007）; PD−1経路の摂動（perturbation）は、他の自己免疫疾患でも報告されている（Kobayashiら、J Rheumatol 32：215,2005; Matakiら、Am J Gastroenterol 102：302,2007）。最後に、拮抗抗体によるPD−1経路の遮断は、癌患者における自己免疫性副作用と関連している（Michotら、Eur J Cancer 54：139-148,2016）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
PD−1経路の活性化につながる治療戦略は、自己免疫状態の治療のための有望なアプローチを提供する。たとえば、PD−L1を過剰発現する人工樹状細胞は、マウスモデルにおいて脊髄の炎症と実験的自己免疫性脳脊髄炎の臨床的重症度を軽減することが示されている（Hirataら、J Immunol 174：1888-1897,2005）。さらに、共刺激分子の遮断を伴うPD−L1を発現する組換えアデノウイルスは、BXSBマウスのループス腎炎を予防することが示されている（Dingら、Clin Immunol 118：258-267,2006）。ヒトの様々な自己免疫疾患の治療のために、多くのPD−1アゴニスト抗体が開発されてきた（例えば、WO2013022091、WO2004056875、WO2010029435、WO2011110621、WO2015112800を参照）。しかし、そのような試薬の開発にもかかわらず、可溶性薬剤がPD−1シグナル伝達を誘発するのに効率的であることを示唆する証拠はほとんどなく、私たちの知る限り、そのような分子は１つだけが、乾癬の治療のために臨床試験に入っている（NCT03337022を参照）。PD−1アゴニストの投与は、臨床毒性につながる疾患部位から離れた全身性免疫効果を引き起こす可能性もある。したがって、自己免疫疾患の治療のための、より安全でより効果的なPD−1アゴニスト療法の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、驚くべきことに、ペプチド−MHC結合部分に融合されているPD−1アゴニストを含む分子が、PD−1シグナル伝達の効率的な阻害をもたらすことを発見した。
【０００５】
理論に拘束されることなく、本発明者らは、T細胞活性化の効率的な阻害には、免疫シナプスへのPD−1アゴニストの局在化が必要であると仮定している。TCRまたはTCR様抗体などの疾患特異的ペプチド−MHCに結合する部分にPD−1アゴニストを結合させると、アゴニストが免疫シナプスに誘導され、PD−1経路を調節するためのより安全でより強力な戦略が提供される。
【０００６】
T細胞受容体（TCR）は、CD4+およびCD8+ T細胞によって自然に発現する。TCRは、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子（ヒトでは、MHC分子はヒト白血球抗原（HLA）としても知られている）と複合体を形成した抗原提示細胞の表面に表示される短いペプチド抗原を認識するように設計されている（Davisら、（1998）, Annu Rev Immunol 16：523-544.）。細胞毒性T細胞とも呼ばれるCD8+T細胞は、MHCクラスIに結合したペプチドを特異的に認識し、一般に感染細胞または癌細胞の破壊を発見して媒介する役割を果たす。
【０００７】
免疫療法用のTCRが標的抗原を強く認識できることが望ましい。これは、強力な応答を発揮するために、TCRが標的抗原に対して高い親和性および／または長い結合半減期を有することを意味する。自然界に存在するTCRは通常、標的抗原に対する親和性が低い（マイクロモル範囲が低い）ため、抗原結合を改善するために、所与のTCR配列に対して行うことができる置換、挿入、および／または削除を含むがこれらに限定されない変異を特定する必要がある。可溶性標的剤として使用するためには、TCR抗原結合親和性がナノモルからピコモルの範囲で、結合半減期が数時間であることが好ましい。治療用TCRが標的抗原に対して高レベルの特異性を示して、標的外結合に起因する臨床応用における毒性のリスクを軽減することも望ましい。このような高い特異性は、TCR抗原認識の自然な縮退を考えると、取得するのが特に難しい場合がある（Wooldridgeら、（2012）, J Biol Chem 287（2）：1168-1177; Wilsonら、（2004）, Mol Immunol 40（14-15）：1047-1055）。最後に、治療用TCRが非常に安定した形で発現および精製できることが望ましい。
【０００８】
本発明は、第１の側面として、pMHC結合部分とPD−1アゴニストとを含む二機能性結合ポリペプチドを提供する。pMHC結合部分は、TCR可変領域および／または抗体可変領域を含み得る。pMHC結合部分は、T細胞受容体（TCR）またはTCR様抗体であり得る。pMHC結合部分は、ヘテロ二量体アルファ／ベータTCRポリペプチド対または一本鎖アルファ／ベータTCRポリペプチドであり得る。PD−1アゴニストはPD−L1の可溶性細胞外形態またはその機能的断片であり得、PD−L1は以下の配列を含むかまたはそれからなり得る：FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCY。PD−1アゴニストは、完全長抗体またはその断片、例えば、scFv抗体であり得る。
【０００９】
PD−1アゴニストは、pMHC結合部分のCまたはN末端に融合され得、そしてリンカーを介してpMHC結合部分に融合され得る。そのリンカーの長さは最大25アミノ酸である。好ましくは、リンカーは、2、3、4、5、6、7または8アミノ酸長である。
【００１０】
pMHC結合部分がTCRである場合、そのTCRは、アルファ鎖の定常領域とベータ鎖の定常領域との間に非天然型ジスルフィド結合を含み得、ペプチド抗原に特異的に結合し得る。
【００１１】
本発明のさらなる側面として、円形脱毛症、強直性脊椎炎、アトピー性皮膚炎、バセドウ病、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、白斑および炎症性腸疾患などの自己免疫疾患の治療に使用するための本発明の第１の側面による二機能性結合ポリペプチドを提供する。
【００１２】
本発明はまた、第１の側面による二機能性結合ポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
第１の側面による二機能性結合ポリペプチドをコードする核酸、ならびにそのような核酸を含む発現ベクターが提供される。
【００１４】
二機能性結合ポリペプチドをコードする核酸が、単一のオープンリーディングフレームとして、またはTCRのアルファ鎖およびベータ鎖をそれぞれコードする２つの別個のオープンリーディングフレームとして存在し得る、そのような核酸またはそのようなベクターを含む宿主細胞がさらに提供される。
【００１５】
第１の側面による二機能性結合ポリペプチドを作製する方法も提供され、その方法は、核酸の発現のための任意の条件下で本発明の宿主細胞を維持し、第１の側面の二機能性結合ペプチドを単離することを含む。
【００１６】
第１の側面による二機能性結合ポリペプチドを、それを必要とする患者に投与することを含む自己免疫障害を治療する方法もまた、本発明に含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の詳細な説明
本発明は、第１の側面として、pMHC結合部分およびPD−1アゴニストを含む二機能性結合ポリペプチドを提供する。pMHC結合部分は、TCR可変領域を含み得る。あるいは、pMHC結合部分は抗体可変領域を含み得る。pMHC結合部分は、T細胞受容体（TCR）またはTCR様抗体であり得る。
【００１８】
TCR配列は、ほとんどの場合、TCR分野の当業者に広く知られアクセス可能なIMGT命名法を参照して説明される。たとえば、LeFranc and LeFranc、（2001）、「T cell Receptor Factsbook」、Academic Press; Lefranc,（2011）、Cold Spring Harb Protoc 2011（6）：595-603; Lefranc,（2001）、Curr Protoc Immunol Appendix 1：Appendix 10; およびLefranc,（2003）、Leukemia 17（1）：260-266を参照。簡単に、αβTCRは2つのジスルフィド結合鎖からなる。各鎖（アルファおよびベータ）は、一般に２つの領域、つまり可変領域と定常領域を持っていると見なされる。短い結合領域は、可変領域と定常領域とを接続し、通常、アルファ可変領域の一部と見なされる。さらに、ベータ鎖には通常、結合領域の隣に短い多様性領域が含まれている。これは通常、ベータ可変領域の一部と見なされる。
【００１９】
各鎖の可変領域はN末端に位置し、フレームワーク配列（FR）に埋め込まれた３つの相補性決定領域（CDR）を含む。CDRは、ペプチド−MHC結合の認識部位を含む。アルファ鎖可変（Vα）領域をコードするいくつかの遺伝子とベータ鎖可変（Vβ）領域をコードするいくつかの遺伝子があり、それらはフレームワーク、CDR1とCDR2配列、および部分的に定義されたCDR3配列によって区別される。VαおよびVβ遺伝子は、IMGT命名法でそれぞれ接頭辞TRAVおよびTRBVによって参照される（Folch and Lefranc、（2000）、Exp Clin Immunogenet 17（1）：42-54; Scaviner and Lefranc、（2000）、Exp Clin Immunogenet 17（2）：83-96; LeFranc and LeFranc、（2001）、「T cell Receptor Factsbook」、Academic Press）。同様に、アルファ鎖とベータ鎖それぞれにはTRAJまたはTRBJと呼ばれるいくつかの結合遺伝子またはJ遺伝子があり、ベータ鎖にはTRBDと呼ばれる多様性またはD遺伝子がある（Folch and Lefranc、（2000）、Exp Clin Immunogenet 17（2）：107-114; Scaviner and Lefranc、（2000）、Exp Clin Immunogenet 17（2）：97-106; LeFranc and LeFranc、（2001）、「T cell Receptor Factsbook」、Academic Press）。T細胞受容体鎖の莫大な多様性は、対立遺伝子変異型を含むさまざまなV、J、およびD遺伝子間のコンビナトリアル再配列、および結合多様性に起因する（Arstilaら、（1999）、Science 286（5441）：958-961 ; Robinsら、（2009）、Blood 114（19）：4099-4107。）TCRアルファおよびベータ鎖の定常またはC領域は、それぞれTRACおよびTRBCと呼ばれる（Lefranc、（2001）、Curr Protoc Immunol Appendix 1：Appendix 10）。
【００２０】
pMHC結合部分がTCRである場合、TCRは、天然に存在しないものであってもよく、および／または精製および／または遺伝子を操作されていてもよい。天然のTCRと比較して、アルファ鎖可変領域および／またはベータ鎖可変領域に１以上の変異が存在し得る。変異は、好ましくは、CDR領域内で行われる。そのような変異は、典型的には、特定のペプチド抗原HLA複合体への結合部分（例えば、TCR）の結合親和性を改善するために導入される。
【００２１】
pMHC結合部分は、TCR様抗体であり得る。TCR様抗体は、MHCによって提示されるペプチド抗原に対するTCR様の特異性を備えた抗体分子について当技術分野で使用される用語であり、通常、天然のTCRよりも抗原に対して高い親和性を有する。（Dahanら、Expert Rev Mol Med 14：e6、2012）。そのような抗体は、それぞれが可変領域および定常領域を含む重鎖および軽鎖を含み得る。そのような抗体の機能的断片は、scFv、Fab断片など当技術分野で周知であるように、本発明に包含される。
【００２２】
本発明の二機能性結合ポリペプチドは、特定のペプチド抗原−MHC複合体に結合する特性を有する。本発明のポリペプチドに関して、特異性は、ペプチド抗原−MHC複合体を提示しない標的細胞を認識する能力が最小限である一方、ペプチド抗原−MHC複合体を提示する標的細胞を認識するそれらの能力に関連する。
【００２３】
本発明の二機能性結合ポリペプチドは、治療試薬として使用するための理想的な安全性プロファイルを有し得る。理想的な安全性プロファイルとは、良好な特異性を示すことに加えて、本発明のポリペプチドがさらなる前臨床安全性試験に合格する可能性があることを意味する。このような試験の例には、代替HLAタイプの認識の可能性が低いことを確認するための同種抗原反応性試験が含まれる。
【００２４】
本発明の二機能性結合ポリペプチドは、高収率の精製に適用し得る。収量は、精製プロセス中に保持された材料の量（すなわち、リフォールディング前に得られた可溶化材料の量に対する精製プロセスの最後に得られた正しくフォールディングした材料の量）に基づいて決定され得、およびまたは収量は、元の培養量に対する精製プロセスの最後に得られた正しくフォールディングした材料の量に基づいて決定され得る。高収率とは、1％を超える、より好ましくは5％を超える、またはより高い収率を意味する。高収量とは、1mg/mlを超える、より好ましくは3 mg/mlを超える、または5 mg/mlを超える、またはより高い収量を意味する。
【００２５】
本発明の二機能性結合ポリペプチドは、ペプチド抗原およびPD−1に対して適切な結合親和性を有する。結合親和性（平衡定数KDに反比例する）および結合半減期（T1/2として表される）を決定する方法は、当業者に知られている。好ましい実施形態では、結合親和性および結合半減期は、表面プラズモン共鳴（SPR）またはバイオレイヤー干渉法（BLI）を使用して、例えば、それぞれBIAcore機器またはOctet機器を使用して決定される。結合ポリペプチドの親和性が２倍になると、KDが半分になることが理解されよう。T1/2は、ln2をオフレート（koff）で割ったものとして計算される。したがって、T1/2が２倍になると、koffが半分になる。KDおよびkoff値は通常、可溶型のポリペプチドについて測定される。独立した測定間の変動、特に２０時間を超える解離時間との相互作用を説明するために、所与のポリペプチドの結合親和性およびまたは結合半減期を数回、例えば３回以上、同じアッセイプロトコルを使用して測定することができ、得られた結果の平均を取ることができる。２つの試料（すなわち、２つの異なるポリペプチドおよび／または同じポリペプチドの２つの調製物）間の結合データを比較するために、同じアッセイ条件（例えば、温度）を使用して測定を行うことが好ましい。
【００２６】
pMHC結合部分がTCR可変領域を含む本発明の二機能性結合ポリペプチドの場合、その領域は、αおよびβ可変領域であり得る。pMHC結合部分がTCRである場合、そのようなTCRは、αβヘテロ二量体であり得る。場合によっては、pMHC結合部分はγおよびδTCR可変領域を含む。pMHC結合部分がTCRである場合、そのようなTCRはγδヘテロ二量体であり得る。
【００２７】
本発明のpMHC結合部分は、細胞外アルファ鎖TRAC定常領域配列および／または細胞外ベータ鎖TRBC1またはTRBC2定常領域配列を含み得る。その定常領域は、膜貫通領域および細胞質領域が存在しないように切り詰められ（truncated）得る。定常領域の一方または両方は、天然のTRACおよび／またはTRBC 1/2配列と比較して、変異、置換、または欠失を含み得る。TRACおよびTRBC 1/2という用語は、天然の多型変異体、たとえばTRACの4位のNからKへの置換も包含する（BragadoらInternational immunology、1994 Feb; 6（2）：223-30）。
【００２８】
あるいは、完全長または切り詰められた定常領域ではなく、TCR定常領域がない場合がある。したがって、本発明のpMHC結合部分は、TCRアルファ鎖およびベータ鎖の可変領域から構成され得る。
【００２９】
pMHC結合部分がTCR可変領域を含む場合、そのようなTCR可変領域は、例えば一本鎖TCRなどの一本鎖の形態であり得る。一本鎖の形態には、Vα−L−Vβ、Vβ−L−Vα、Vα−Cα−L−Vβ、Vα−L−Vβ−Cβ、またはVα−Cα−L−Vβ−CβタイプのαβTCRポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない（ここで、VαおよびVβはそれぞれTCRαおよびβ可変領域であり、CαおよびCβはそれぞれTCRαおよびβ細胞外定常領域であり、Lはリンカー配列である）（Weidanzら、（1998）J Immunol Methods. Dec 1; 221（1-2）：59-76; Epelら、（2002）、Cancer Immunol Immunother. Nov; 51（10）：565-73; WO 2004/033685; WO9918129）。存在する場合、細胞外定常領域の一方または両方は、完全長であり得るか、またはそれらは上記のように切り詰められ得るか、および／または変異を含み得る。特定の実施形態では、本発明の一本鎖TCR可変領域および／または一本鎖TCRは、WO 2004/033685に記載されているように、それぞれの定常領域の残基間に導入されたジスルフィド結合を有し得る。一本鎖TCRはさらに、WO2004/033685; WO98/39482; WO01 / 62908; Weidanz ら（1998）J Immunol Methods 221（1-2）：59-76; Hooら（1992）Proc Natl Acad Sci U S A 89（10）：4759-4763; Schodin（1996）Mol Immunol 33（9）：819-829）に記載されている。
【００３０】
pMHC結合部分がTCRである本発明の二機能性結合ポリペプチドの場合、そのようなTCRのアルファおよびベータ鎖定常領域配列は、TRACのエクソン2のCys4とTRBC1またはTRBC2のエクソン2のCys2との間の天然のジスルフィド結合を削除するために、切り詰めまたは置換によって修飾され得る。アルファおよび／またはベータ鎖定常領域配列は、例えば、WO 03/020763に記載されているように、それぞれの定常領域の残基間に導入されたジスルフィド結合を有し得る。好ましい実施形態において、アルファおよびベータ定常領域は、TRACの位置Thr 48およびTRBC1またはTRBC2の位置Ser 57のシステイン残基の置換によって修飾され得、前記システインは、TCRのアルファおよびベータ定常領域間にジスルフィド結合を形成する。TRBC1またはTRBC2は、定常領域の位置75でのシステインからアラニンへの変異、および定常領域の位置89でのアスパラギンからアスパラギン酸への変異をさらに含み得る。本発明のαβヘテロ二量体に存在する細胞外定常領域の一方または両方は、C末端で、例えば、最大１５、最大１０、または最大８以下のアミノ酸を切り詰められ得る。本発明のαβヘテロ二量体に存在する細胞外定常領域の一方または両方は、例えば、最大１５個、最大１０個、または最大８個のアミノ酸を、C末端で切り詰められ得る。アルファ鎖の細胞外定常領域のC末端は8アミノ酸を切り詰められ得る。
【００３１】
非天然型ジスルフィド結合は、細胞外定常領域間に存在し得る。前記非天然型ジスルフィド結合は、WO03020763およびWO06000830にさらに記載されている。非天然型ジスルフィド結合は、TRACの位置Thr 48とTRBC1またはTRBC2の位置Ser 57との間にあり得る。定常領域の一方または両方は、天然のTRACおよび／またはTRBC1/2配列と比較して１以上の変異、置換または欠失を含み得る。
【００３２】
pMHC結合部分がTCR可変領域を含む二機能性結合ポリペプチドの別の好ましい形態では、TCR可変領域およびPD−1アゴニスト領域は、別々のポリペプチド鎖上で互い違いに位置して、二量体化をもたらしてもよい。そのような形態は、WO2019012138に記載されている。簡単に、第１のポリペプチド鎖は、（N末端からC末端へ）第１の抗体可変領域、続いてTCR可変領域、場合により続いてFc領域を含み得る。第２の鎖は、（N末端からC末端へ）TCR可変領域とそれに続く第２の抗体可変領域、場合により続いてFc領域を含み得る。適切な長さのリンカーが与えられると、鎖は二量体化して多重特異性分子になり、場合によりFc領域を含み得る。領域がこのように異なる鎖上に位置する分子は、ダイアボディ（diabodies）と呼ばれることもあり、これも本明細書で企図されている。追加の鎖および領域を追加して、例えば、トリアボディ（triabodies）を形成することができる。
【００３３】
したがって、本明細書では、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含む分子の群から選択される二重特異性ポリペプチド分子も提供され、ここで、
第１のポリペプチド鎖は、PD−1アゴニスト抗体の可変領域の第１の結合領域（VD1）、およびMHC結合ペプチドエピトープに特異的に結合するTCRの可変領域の第１の結合領域（VR１）、ならびに前記領域を接続する第１のリンカー（LINK1）を含み、
第２のポリペプチド鎖は、MHC結合ペプチドエピトープに特異的に結合するTCRの可変領域の第２の結合領域（VR2）、およびPD−1アゴニスト抗体の可変領域の第２の結合領域（VD2）、ならびに前記領域を接続する第２のリンカー（LINK2）を含み、
ここで、前記第１の結合領域（VD1）および前記第２の結合領域（VD2）は、会合して第１の結合部位（VD1）（VD2）を形成し、
前記第１の結合領域（VR1）および前記第２の結合領域（VR2）は、会合して前記MHC結合ペプチドエピトープに結合する第２の結合部位（VR1）（VR2）を形成し、
ここで、前記２つのポリペプチド鎖は、ヒトIgGヒンジ領域および／またはヒトIgG Fc領域またはその二量体化部分に融合され、そして
ここで、前記２つのポリペプチド鎖は、前記ヒンジ領域間および／またはFc領域間の共有結合および／または非共有結合によって接続され、そして
ここで、前記二重特異性ポリペプチド分子は、PD−1を刺激すること（agonising）およびMHC結合ペプチドエピトープに結合することが同時にでき、二重特異性ポリペプチド分子は、２つのポリペプチド鎖の結合領域の順序がVD1−VR1およびVR2−VD2、またはVD1−VR2およびVR1−VD2、またはVD2−VR1およびVR2−VD1、またはVD2−VR2およびVR1−VD1から選択され、その領域はLINK1またはLINK2のいずれかによって接続されている。
【００３４】
PD−1アゴニストは、PD−L1（Uniprot ref：Q9NZQ7）またはPD−L2（Q9BQ51）の可溶性細胞外領域またはその機能的断片に対応し得る。PD−L1は、以下に記載されるような配列を含み得るか、またはそれからなり得る。
【００３５】
完全長PD−L1は以下の配列を有する。
FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSY
RQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVV
DPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIF
YCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNER
【００３６】
PD−L1の切り詰め型は、PD−1に結合して刺激する能力を保持していることを前提として、pMHC結合部分に融合され得る。このような切り詰められた断片は、以下の配列に示されているとおりである。
FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSY
RQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPY
あるいは、より短いまたはより長い切り詰めもまた、pMHC結合部分に融合され得る。
【００３７】
PD−1アゴニストは、完全長抗体またはscFv抗体もしくはFab断片もしくはナノボディのようなその断片であり得る。そのような抗体の例は、WO2011110621およびWO2010029434およびWO2018024237に提供されている。本発明の抗体分子は、完全長の重鎖および軽鎖を有する完全な抗体分子またはその断片を含み得、そしてこれらに限定されないが、Fab、修飾Fab、Fab '、修飾Fab'、F（ab '）2、Fv、単一領域抗体（例えば、VHもしくはVLまたはVHH）、scFv、２、３または４価抗体、Bis−scFv、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ナノボディおよび上記のいずれかのエピトープ結合断片であり得る。
【００３８】
PD−1アゴニストは、pMHC結合部分のCまたはN末端に融合され得、2、3、4、5、6、7、または8アミノ酸長のリンカーを介してpMHC結合部分に融合され得る。リンカーは、10、12、15、16、18、20または25アミノ酸長であり得る。リンカー配列を繰り返して、より長いリンカーを形成し得る。各リンカーは、より短いリンカー配列の１、２、３、または４の繰り返しで形成され得る。リンカー配列は通常、可撓性を制限する可能性のある嵩高い側鎖を持たないグリシン、アラニン、およびセリンなどのアミノ酸で主に構成されているという点で可撓性がある。あるいは、より高い剛性を有するリンカーが望ましい場合がある。リンカー配列の使用可能なまたは最適な長さは容易に決定され得る。リンカーは最大25アミノ酸長である。多くの場合、リンカー配列は約12以下、たとえば10以下、または2〜8アミノ酸長である。本発明のTCRで使用できる適切なリンカーの例には、GGGGS、GGGSG、GGSGG、GSGGG、GSGGGP、GGEPS、GGEGGGP、およびGGEGGGSEGGGS（WO2010/133828に記載されているように）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明の二機能性結合ポリペプチドは、pK修飾部分をさらに含み得る。免疫グロブリンFc領域が使用される場合、それは任意の抗体Fc領域であり得る。そのFc領域は、細胞表面のFc受容体および補体系のいくつかのタンパク質と相互作用する抗体の尾部領域である。Fc領域は、典型的には、共に２つまたは３つの重鎖定常領域（CH2、CH3およびCH4と呼ばれる）およびヒンジ領域を有する２つのポリペプチド鎖を含み、この２つの鎖はヒンジ領域内のジスルフィド結合によって結合される。免疫グロブリンサブクラスIgG1、IgG2、およびIgG4からのFc領域は、FcRnと結合しFcRnを介したリサイクルを受け、長い循環半減期（3〜4週間）をもたらす。IgGとFcRnの相互作用は、CH2およびCH3領域をカバーする、Fc領域の部分に局在している。本発明で使用するための好ましい免疫グロブリンFcには、IgG1またはIgG4からのFc領域が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、Fc領域はヒト配列に由来する。Fc領域はまた、好ましくは、二量体化を促進するKiH変異、ならびに活性化受容体との相互作用を防止する変異（すなわち機能的に休止している分子）を含み得る。免疫グロブリンFc領域は、他の領域（すなわち、TCR可変領域または免疫エフェクター）のCまたはN末端に融合され得る。免疫グロブリンFcは、リンカーを介して他の領域（すなわち、TCR可変領域または免疫エフェクター）に融合され得る。リンカー配列は通常、可撓性を制限する可能性のある嵩高い側鎖を持たないグリシン、アラニン、およびセリンなどのアミノ酸で主に構成されているという点で可撓性がある。あるいは、より高い剛性を有するリンカーが望ましい場合がある。リンカー配列の使用可能なまたは最適な長さは容易に決定され得る。多くの場合、リンカー配列は約12以下、たとえば10以下、または2〜10アミノ酸長であり、リンカーは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30アミノ酸長であり得る。本発明の多重領域結合分子を使用し得る適切なリンカーの例には、GGGSGGGG、GGGGS、GGGSG、GGSGG、GSGGG、GSGGGP、GGEPS、GGEGGGP、およびGGEGGGSEGGGS（WO2010/133828に記載されているように）が含まれるが、これらに限定されない。免疫グロブリンFcがTCRに融合されている場合、リンカーの有無にかかわらず、アルファ鎖またはベータ鎖のいずれかに融合し得る。さらに、Fcの個々の鎖は、TCRの個々の鎖に融合され得る。
【００４０】
好ましくは、Fc領域は、IgG1またはIgG4サブクラスに由来し得る。２つの鎖は、CH2およびCH3定常領域ならびにヒンジ領域の全部または一部を含み得る。ヒンジ領域は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4からのヒンジ領域に実質的または部分的に対応し得る。ヒンジは、コアヒンジ領域の全部または一部と、下部ヒンジ領域の全部または一部を含み得る。好ましくは、ヒンジ領域は、２つの鎖を連結する少なくとも１つのジスルフィド結合を含む。
【００４１】
Fc領域は、WT配列に対する変異を含み得る。変異には、置換、挿入、および削除が含まれる。そのような変異は、望ましい治療特性を導入する目的で行われ得る。たとえば、ヘテロ二量体化を促進するために、knobs into holes（KiH）変異をCH3領域に組み込むことができる。この場合、一方の鎖はYのような嵩高い突出した残基（つまりknob）を含むように設計され、もう一方の鎖は相補的なポケット（つまりhole）を含むように設計される。KiH変異の適切な位置は、当技術分野で知られている。追加的または代替的に、Fcy受容体への結合を無効化または低減する、および/またはFcRnへの結合を増加させる、および／またはFabアーム交換を防止する、またはプロテアーゼ部位を除去する変異を導入し得る。
【００４２】
PK修飾部分はまた、半減期を延長するように作用し得るアルブミン結合領域であり得る。当技術分野で知られているように、アルブミンは、そのサイズ、腎閾値を超えること、およびその特異的相互作用およびFcRnを介したリサイクルに一部起因して、19日の長い循環半減期を有する。アルブミンへの付着は、in vivoでの治療用分子の循環半減期を改善するための、周知の戦略である。アルブミンは、特異的アルブミン結合領域の使用を通じて非共有結合的に、または接合または直接的な遺伝子融合によって共有結合され得る。半減期を改善するためにアルブミンへの付着を利用した治療用分子の例は、Sleepら、Biochim BiophysActa. 2013年12月; 1830（12）：5526-34に記載されている。
【００４３】
アルブミン結合領域は、任意の既知のアルブミン結合部分を含む、アルブミンに結合することができる任意の部分であり得る。アルブミン結合領域は、内因性または外因性のリガンド、小有機分子、脂肪酸、ペプチド、およびアルブミンに特異的に結合するタンパク質から選択され得る。好ましいアルブミン結合領域の例には、Dennisら、J Biol Chem. 2002年9月20日; 277（38）：35035-43に記載されているような短いペプチド（例えばペプチドQRLMEDICLPRWGCLWEDDF）、抗体、抗体断片、および抗体様足場といったアルブミンに結合するように設計されたタンパク質、例えば、GSKによって商業的に提供されているAlbudab（登録商標）（O'Connor-Semmesら、Clin Pharmacol Ther. 2014年12月; 96（6）：704-12）およびAblynxによって商業的に提供されているNanobody（登録商標）（Van Royら、Arthritis Res Ther. 2015年5月20日; 17：135）および連鎖球菌タンパク質Gタンパク質（Storkら、Eng Des Sel. 2007年11月； 20（11）：569-76）といった自然界に見られるアルブミン結合領域に基づくタンパク質、例えばAffibodyによって商業的に提供されているAlbumod（登録商標）が含まれる。
【００４４】
好ましくは、アルブミンは、ヒト血清アルブミン（HSA）である。ヒトアルブミンに対するアルブミン結合領域の親和性は、ピコモルからマイクロモルの範囲であり得る。ヒト血清中のアルブミンの濃度が非常に高い場合（35〜50 mg/ml、約0.6mM）、実質的にすべてのアルブミン結合領域がin vivoでアルブミンに結合すると計算される。
【００４５】
アルブミン結合部分は、他の領域（すなわち、TCR可変領域または免疫エフェクター）のCまたはN末端に連結され得る。アルブミン結合部分は、リンカーを介して他の領域（すなわち、TCR可変領域または免疫エフェクター）に連結され得る。リンカー配列は通常、可撓性を制限する可能性のある嵩高い側鎖を持たないグリシン、アラニン、およびセリンなどのアミノ酸で主に構成されているという点で可撓性がある。あるいは、より高い剛性を有するリンカーが望ましい場合がある。リンカー配列の使用可能なまたは最適な長さは容易に決定され得る。多くの場合、リンカー配列は約12以下、たとえば10以下、または2〜10アミノ酸長であり、リンカーは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30アミノ酸長であり得る。本発明の多重領域結合分子を使用し得る適切なリンカーの例には、GGGSGGGG、GGGGS、GGGSG、GGSGG、GSGGG、GSGGGP、GGEPS、GGEGGGP、およびGGEGGGSEGGGS（WO2010/133828に記載されているように）が含まれるが、これらに限定されない。アルブミン結合部分は、TCRに結合している場合、リンカーの有無にかかわらず、アルファ鎖またはベータ鎖のいずれかに連結され得る。
【００４６】
本発明のさらなる側面は、円形脱毛症、強直性脊椎炎、アトピー性皮膚炎、バセドウ病、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、白斑、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、小児脂肪便症（セリアック病）、眼疾患（例えば、ブドウ膜炎）、皮膚エリテマトーデスおよびループス腎炎、およびPD−1／PD−L1アンタゴニストによって癌患者に引き起こされる自己免疫疾患のような、自己免疫疾患の治療に使用するための本発明の第１の側面による二機能性結合ポリペプチドを提供する。
【００４７】
本発明はまた、痛み、特に炎症に関連する痛みの治療または予防に使用するための、本発明の第１の側面による二機能性結合ポリペプチドを提供する。
【００４８】
任意に、本発明の二機能性ポリペプチドは、１型糖尿病、炎症性腸疾患、および関節リウマチの治療に使用するためである。
【００４９】
本発明はまた、第１の側面による二機能性結合ポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００５０】
さらなる側面において、本発明は、本発明の二機能性結合ポリペプチドをコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、核酸はcDNAである。いくつかの実施形態では、核酸はmRNAであり得る。いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のTCRのα鎖可変領域をコードする配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のTCRのβ鎖可変領域をコードする配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、TCR様抗体の軽鎖をコードする配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、TCR様抗体の重鎖をコードする配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、PD−1アゴニストの全部または一部、例えば、PD−L1またはその切り詰め型、あるいは抗体の軽鎖および／または重鎖などのアゴニストPD−1抗体の全部または一部をコードする配列を含む核酸を提供する。その核酸は、天然に存在しないものもあり得、および／または、精製および／または遺伝子を操作されていてもよい。核酸配列は、利用される発現系に従って、コドン最適化され得る。当業者に知られているように、発現系は、大腸菌などの細菌細胞、もしくは酵母細胞、もしくは哺乳動物細胞、もしくは昆虫細胞を含み得るか、またはそれらは無細胞発現系であり得る。
【００５１】
別の側面では、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。好ましくは、そのベクターは適切な発現ベクターである。
【００５２】
本発明はまた、本発明のベクターを収容する細胞を提供する。適切な細胞には、大腸菌などの細菌細胞、または酵母細胞、または哺乳動物細胞、または昆虫細胞が含まれる。ベクターは、TCRのアルファ鎖およびベータ鎖を、またはTCR様抗体の軽鎖および重鎖単一のオープンリーディングフレームに、またはそれぞれ２つの別個のオープンリーディングフレームにコードする本発明の核酸を含み得る。
【００５３】
別の側面は、本発明のポリペプチドのTCR／TCR様抗体のアルファ鎖／軽鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、および本発明のTCR／TCR様抗体のベータ鎖／重鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクターを有する細胞を提供する。本発明の細胞は、単離され、および／または組換え体であり、および／または非天然に存在し、および／または遺伝子操作されていてもよい。
【００５４】
当技術分野で周知であるように、ポリペプチドは、翻訳後修飾を受け得る。グリコシル化はそのような修飾の１つであり、TCR／TCR様抗体／PD−L1もしくはPD−1抗体または他のPD−1アゴニストの規定されたアミノ酸へのオリゴ糖部分の共有結合を含む。たとえば、アスパラギン残基、またはセリン／スレオニン残基は、オリゴ糖結合の周知の位置である。特定のタンパク質のグリコシル化状態は、タンパク質配列、タンパク質の立体構造、および特定の酵素の利用可能性を含む、いくつかの要因に依存する。さらに、グリコシル化状態（すなわち、オリゴ糖の型、共有結合、および結合の総数）は、タンパク質の機能に影響を与え得る。したがって、組換えタンパク質を製造する際、多くの場合、グリコシル化を制御することが望ましい。制御されたグリコシル化は、抗体ベースの治療法を改善するために使用されてきた。（Jefferisら、（2009）Nat Rev Drug Discov Mar; 8（3）：226-34。）本発明の可溶性TCRの場合、グリコシル化は、例えば特定の細胞株（チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞またはヒト胎児腎臓（HEK）細胞などの哺乳動物細胞株を含むがこれらに限定されない）を使用することによって、または化学修飾によって制御され得る。グリコシル化は薬物動態を改善し、免疫原性を低下させ、天然のヒトタンパク質をより厳密に模倣できるため、このような修飾が望ましい場合がある（Sinclair and Elliott、（2005）Pharm Sci. Aug; 94（8）：1626-35）。
【００５５】
患者への投与のために、本発明の二機能性結合ポリペプチドは、１以上の薬学的に許容される担体または賦形剤と共に、無菌医薬組成物の一部として提供され得る。この医薬組成物は、任意の適切な形態であり得る（患者にそれを投与する所望の方法に依存する）。それは単位投与量の形態で提供され得、一般に密封された容器で提供され、キットの一部として提供され得る。このようなキットには、通常（必ずしもそうとは限らないが）使用説明書が入っている。それは、複数の前記単位投与量形態を含み得る。
【００５６】
医薬組成物は、非経口（皮下、筋肉内、髄腔内または静脈内を含む）、経腸（経口または直腸を含む）、吸入または鼻腔内経路などの任意の適切な経路による投与に適合させ得る。そのような組成物は、薬学の当技術分野で知られている任意の方法によって、例えば、無菌条件下で有効成分を担体または賦形剤と混合することによって調製され得る。
【００５７】
本発明の物質の投与量は、治療される疾患または障害、治療される個体の年齢および状態などに応じて、広い範囲の間で変動し得る。二機能性結合ポリペプチドの適切な用量の範囲は、25ng/kg〜50μg/kgまたは1μg〜1gの範囲である。医師が最終的に使用する適切な投与量を決定する。
【００５８】
本発明の二機能性結合ポリペプチド、医薬組成物、ベクター、核酸および細胞は、実質的に純粋な形態、例えば、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％純粋な形態で提供され得る。
【００５９】
二機能性結合ポリペプチドをコードする核酸が、TCRのアルファ鎖およびベータ鎖をコードする、単一のオープンリーディングフレームとして存在するか、または、それぞれコードする２つの別個のオープンリーディングフレームとして存在し得る、核酸またはベクターを含む宿主細胞がさらに提供される。
【００６０】
第１の側面による二機能性結合ポリペプチドを作製する方法も提供され、この方法は、本発明の核酸の発現のための任意の条件下で、本発明の宿主細胞を維持し、第１の側面の二機能性結合ペプチドを単離することを含む。
【００６１】
本発明の各側面の好ましい特徴は、他の側面の各々についても同様である（ただし必要な変更を加える）。本明細書に記載の先行技術文献は、法律で許可される最大限の範囲で組み込まれている。
【００６２】
ここで、本発明は、以下の非限定的な例および図を参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、ペプチドパルス化標的細胞の存在下での、可溶性TCRおよび切り詰め型PD−L1を含む本発明の二機能性ポリペプチドによる、NFATレポーター活性の用量依存的阻害を示す。
【図２】図２は、ペプチドパルス化標的細胞の存在下での、可溶性TCRおよびPD−1アゴニストscFv抗体断片を含む本発明の二機能性ポリペプチドによる、NFATレポーター活性の阻害を示す。
【図３】図３は、ペプチドパルス化標的細胞の存在下での、可溶性TCRおよびPD−1アゴニストscFv抗体断片を含む本発明の二機能性ポリペプチドによる、初代ヒトT細胞活性化の阻害を示す。
【図４】図４は、ペプチドパルス化標的細胞の存在下で、特異性の異なる２つの可溶性TCRの１つとPD−1アゴニストscFv抗体断片とを含む本発明の二機能性ポリペプチドによる、NFATレポーター活性の阻害を示す。
【実施例】
【００６４】
実施例１
次の実施例は、可溶性TCRに融合したPD−1アゴニストが、免疫シナプスを標的とした場合にT細胞の活性化を効果的に阻害できることを示している。
【００６５】
この二機能性結合ポリペプチドで使用される可溶性TCRは、ヒトプレ−プロインスリンに由来するHLA−A*02制限ペプチドを特異的に認識する天然のTCRの親和性増強バージョンである（このような分子はWO2015092362に記載されている）。PD−1アゴニストは、PD−1相互作用部位を含むPD−L1の細胞外領域の切り詰めバージョンである（Zakら、Structure 23：2341-2348,2015）。PD−L1は、標準5アミノ酸リンカーを介してTCRアルファ鎖のN末端に融合している。
【００６６】
Jurkat NFATルシフェラーゼPD−1レポーターアッセイを用いて、HEK293T抗原提示標的細胞の存在下でTCR-PD1アゴニスト融合分子を介したT細胞NFAT活性の阻害を測定した。
【００６７】
方法
TCR−PD1アゴニスト融合分子の発現、リフォールディングおよび精製
TCR−PD1アゴニスト融合分子の発現は、浮遊培養に適応したチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞に基づく高収量の一過性発現系（ExpiCHO Expression system、Thermo Fisher）を用いて実施した。PD−1アゴニストに融合したTCR鎖を含む哺乳動物発現プラスミドを使用して、製造元の指示に従って細胞をコトランスフェクトした。回収後、冷蔵遠心分離機で4000〜5000 x gで30分間遠心分離することにより、細胞培養上清の清澄化を行った。上清を0.22μmフィルターでろ過し、さらに精製するために収集した。
【００６８】
あるいは、TCR−PD1アゴニスト融合分子の発現は、宿主生物として大腸菌を使用して実施された。アルファ鎖およびベータ鎖を含む発現プラスミドを別々に、BL21pLysS大腸菌株に形質転換し、100μg/mLアンピシリンを含むLB寒天プレートに播種した。各形質転換体から白金耳量のコロニーを採取し、LB培地（100μg/mLアンピシリンと1％グルコースを含む）にて37℃でOD600が約0.5〜1.0に達するまで増殖させた。次に、そのLBスターターカルチャーを自動誘導培地（Foremedium）に加え、細胞を37℃で約3時間、続いて30℃で一晩増殖させた。遠心分離により細胞を回収し、Bugbuster（Novagen）で溶解した。封入体（IB）は、2回のTriton洗浄（50 mMのTris pH 8.1、100 mM、NaCl、10 mMのEDTA、0.5％Triton）を実行して、細胞の破砕片と膜を除去することにより抽出した。各回、10000gで5分間の遠心分離によってIBを回収した。界面活性剤を除去するために、IBを50 mMのTris pH8.1、100 mMのNaClおよび10 mMのEDTAで洗浄した。最後に、IBを50 mMのTris pH8.1、100 mMのNaClおよび10mMのEDTAバッファーに再度懸濁した。タンパク質の収量を測定するために、IBを8Mの尿素バッファーに溶解し、280nMでの吸光度によって濃度を測定した。
【００６９】
リフォールディングのために、アルファ鎖とベータ鎖を１：１のモル比で混合し、6Mのグアニジン−HCl、50 mMのTris pH8.1、100mMのNaCl、10 mMのEDTA、20 mMのDTT中にて37℃で30分間変性させた。次に、変性した鎖を、4Mの尿素、100mMのTris pH 8.1、0.4MのL−アルギニン、2 mMのEDTA、1mMのシスタミン、および10 mMのシステアミンからなるリフォールディングバッファーに加え、絶えず撹拌しながら10分間インキュベートした。変性した鎖を含むリフォールディングバッファーをスペクトラポア１透析膜で、10倍量のH2Oに対して約16時間、10倍量の10mMのTris pH 8.1で約7時間、および10倍量の10mMのTris pH8.1で約16時間透析した。
【００７０】
哺乳動物または大腸菌発現系から得られた可溶性タンパク質を、ローディングバッファーとして20mMのTris pH8.1を、結合および溶出バッファーとして20mMのTris pH8.1と1MのNaClを使用するPOROS 50 HQ（Thermo Fisher Scientific）陰イオン交換カラムを用いるAKTA pure（GEヘルスケア）で精製した。タンパク質をカラムにロードし、溶出バッファーの0〜50％勾配で溶出した。タンパク質を含む画分をプールし、20mMのMES pH6.0および20mMのMES pH6.0、1MのNaClをそれぞれ結合および溶出バッファーとして使用するPOROS 50 HS（Thermos Fisher Scientific）カラムでの第２段階の陽イオン交換クロマトグラフィー用に、20mMのMES pH6.0で20倍（容量／容量）に希釈した。陽イオン交換カラムからの結合タンパク質は、溶出バッファーの0〜100％勾配を使用して溶出した。タンパク質を含む陽イオン交換画分をプールし、PBSをランニングバッファーとして使用してSuperdex 200 HR（GEヘルスケア）ゲルろ過カラムでさらに精製した。ゲルろ過からの陽性画分をプールし、濃縮し、必要になるまで−80℃で保存した。
【００７１】
Jurkat NFAT Luc−PD−1レポーターアッセイ
HLA−A*02陽性HEK293T標的細胞に、TCRアクティベータープラスミド（BPS Bioscience、カタログ番号：60610）を一過性にトランスフェクトし、TCR−PD1アゴニスト融合分子によって認識される該当ペプチドで細胞をパルスした。次に、標的細胞を異なる濃度のTCR−PD1アゴニスト融合分子とインキュベートして、同族のペプチド-HLA−A2複合体への結合を可能にした。PD−1を構成的に発現するJurkat NFAT Luc PD−1エフェクター細胞を標的細胞に添加し、18〜20時間後にNFAT活性を測定した。実験は（TCR−PD1アゴニスト融合分子結合後に）洗い流しありまたはなしで実施された。非パルス化標的細胞を使用して、さらなる対照実験を行った。TCRアクティベーター／PD−L1をトランスフェクトしたHEK293T A2B2M標的細胞を陽性対照として含めた。
【００７２】
結果
図１に示すデータは、NFATレポーター活性の用量依存的阻害が、ペプチドパルス化標的細胞の存在下で、洗い流しのありまたはなしで、TCR−PD1アゴニスト融合分子で観察されることを示している。重要なことに、パルス化されていない標的細胞では最小限の阻害が観察され、免疫シナプスへの標的化がPD−1アゴニスト活性にとって重要であることを示している。
【００７３】
実施例２
次の例は、可溶性TCRに融合したPD−1アゴニストが、免疫シナプスを標的とした場合にT細胞の活性化を効果的に阻害できるという、さらなる証拠を提供する。
【００７４】
この実施例で使用される実験系および方法は、この場合、TCR−PD1アゴニスト融合分子のPD−1アゴニスト部分がWO2011110621に記載されるようなscFv抗体断片であったことを除いて、実施例１に記載されるものと同じであった。
【００７５】
実施例１に記載のJurkat NFATルシフェラーゼPD−1レポーターアッセイを使用して、HEK293T抗原提示標的細胞の存在下でTCR−PD1アゴニスト融合分子を介したT細胞NFAT活性の阻害を測定した。
【００７６】
結果
図２ａに示すように、100nMのTCR−PD1アゴニスト融合分子で処理したペプチドパルス化細胞（+PPIとラベル付け）では、NFAT活性の実質的な阻害（> 60％）が観察された。一方、TCR−PD1アゴニスト融合分子で処理された非パルス化標的細胞（−PPIと表示）では、最小限の阻害が見られた。可溶性TCRのみ、またはPD−1アゴニストのみ（scFvまたはIgG4形態の両方において）を使用した対照実験では、レポーター活性の阻害は示されず、PD−1アゴニストが免疫シナプスを標的とすることがPD−1アゴニスト活性に必要であることを示している。図２ｂはさらにNFAT活性の用量依存的阻害を示している。この場合も、TCR−PD1アゴニスト融合分子形態のみがNFAT活性を阻害することができる。標的付けられていないPD−1アゴニスト抗体は活性を阻害することができない。
【００７７】
まとめると、これらの結果は、PD−1アゴニストが免疫シナプスを標的とすることが、PD−1アゴニスト活性にとって重要であることを示している。
【００７８】
実施例３
次の例は、可溶性TCRに融合したPD−1アゴニストが免疫シナプスを標的とした場合、T細胞の活性化を効果的に阻害できるというさらなる証拠を提供する。
【００７９】
この実施例で使用されたTCR−PD1アゴニスト融合分子は、PD−1アゴニストがscFv抗体断片である実施例２に記載されたものと同じであった。
【００８０】
この場合、代替アッセイを使用して、初代ヒトT細胞機能に対するTCR−PD1アゴニスト融合分子の効果を評価した。
【００８１】
方法
初代ヒトT細胞アッセイ
初代ヒトT細胞は、pan-T細胞単離キット（Miltenyi、カタログ番号：130-096-535）を使用して、新たに調製したPBMCから単離した。HLA−A*02陽性RajiB細胞（Raji A2B2M）にブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB、100ng/ml、Sigma S4881）を１時間事前にロードし、その後33Gyで照射した。事前活性化のために、初代ヒトT細胞を、24ウェル細胞培養プレートで各細胞タイプの1x10E6細胞/mlを使用して、SEBをロードしたRaji A2B2M標的細胞と1：1の比率でインキュベートした。初代ヒトT細胞を、SEBをロードしたRajiA2B2M細胞とともに１０日間インキュベートし、３日目と７日目にIL−2（50 U/ml）を添加した。１０日目に、事前に活性化したT細胞を洗浄し、新鮮な培地に再懸濁した。新鮮なRajiA2B2M細胞に、TCR−PD1アゴニスト融合分子によって認識される20μMの該当するペプチドで２時間パルスするか、またはパルスしないままにした。ペプチドパルス化の最後の１時間、Raji A2B2M細胞にSEB（10ng/ml）をロードし、その後33Gyで照射した。Raji A2B2M細胞を1x10E5細胞／ウェルで96ウェル細胞培養プレートに播種し、その後TCR−PD1アゴニスト融合分子滴定物とともに１時間プレインキュベートした。事前活性化されたT細胞を1x10E5細胞／ウェルでRajiA2B2M標的細胞に添加し、４８時間インキュベートした。上清を収集し、MSD ELISAを使用してIL−2レベルを決定した。
【００８２】
結果
図３に示すデータは、TCR−PD1アゴニスト融合分子が、ペプチドパルス化標的細胞の存在下で初代ヒトT細胞IL−2産生を用量依存的に阻害するのに対し、標的付けられていないTCR−PD1アゴニスト融合分子（すなわち非パルス化標的細胞）では、またはPD−1アゴニストscFv単独では阻害しないことを示している。これらのデータは、PD−1アゴニストが免疫シナプスを標的とすることが、初代細胞でのPD−1アゴニスト活性を導くことを示している。
【００８３】
実施例４：
次の例は、代替抗原を認識するTCRを使用して同じ技術的効果が観察されることを示している。
【００８４】
この実施例で使用された実験系および方法は、実施例２に記載されたものと同じであった。この場合、PD−1アゴニスト抗体は、２つの異なる可溶性TCRに融合された。
【００８５】
実施例１に記載のJurkat NFATルシフェラーゼPD−1レポーターアッセイを使用して、HEK293T抗原提示標的細胞の存在下でTCR−PD1アゴニスト融合分子を介したT細胞NFAT活性の阻害を測定した。
【００８６】
結果
図４に示すように、２つのTCR−PD1アゴニスト融合分子（TCR1またはTCR2のいずれかに融合したPD−1アゴニストscFv抗体断片を含む）を、それぞれのペプチド（ペプチド1または2）でパルス化した標的細胞の存在下で投与すると、強力で用量依存的な阻害が観察された。両方のTCR−PD1アゴニスト融合分子について、標的ペプチドの存在なしで研究を行った場合、最小限の活性が観察された。
【００８７】
これらの結果は、TCR−PD1アゴニスト融合分子が、異なるpMHCに対して特異性を持つ可溶性TCRを使用してさまざまな組織に指向させ、T細胞活性の標的化阻害を促進できることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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