(57)【要約】  本発明の技術は、一般に、標的核酸配列の濃縮のための方法および組成物、ならびにエラーを修正した核酸配列決定用途および他の核酸配列インテロゲーションのためのこのような濃縮の使用に関する。いくつかの実施形態において、提供される方法は、エラー修正のための分子バーコードの使用と適合する、増幅に基づかない標的化濃縮戦略を提供する。他の実施形態は、直接デジタル配列決定（ＤＤＳ）および分子バーコード付けを使用しない他の配列決定戦略（例えば、単分子配列決定様式およびインテロゲーション）と適合する、増幅に基づかない標的化濃縮戦略のための方法を提供する。
2021515579.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸物質を濃縮するための方法であって、
核酸物質を提供することと、
所定の長さの標的領域が前記核酸物質の残りから分離されるように、前記核酸物質を１つ以上の標的エンドヌクレアーゼで切断することと、
非標的核酸物質を酵素的に破壊することと、
前記標的エンドヌクレアーゼから前記所定の長さの標的領域を放出することと、
前記切断した標的領域を分析することと、を含む、方法。
【請求項２】
非標的核酸物質を酵素的に破壊することが、エキソヌクレアーゼ酵素を提供することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非標的核酸物質を酵素的に破壊することが、エキソヌクレアーゼ酵素およびエンドヌクレアーゼ酵素のうちの１つ以上を提供することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記破壊することが、酵素消化および酵素的開裂のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素的に破壊する工程中、前記１つ以上の標的エンドヌクレアーゼが、前記標的領域に結合したままである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの標的エンドヌクレアーゼが、捕捉標識を含むリボ核酸タンパク質複合体であり、所定の長さの前記標的領域が、前記捕捉標識を介して前記核酸の残りから物理的に分離される一方で、前記少なくとも１つの標的エンドヌクレアーゼが、前記標的領域に結合したままである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの標的エンドヌクレアーゼが、捕捉標識を含むリボ核酸タンパク質複合体であり、前記方法が、前記標的領域を、前記捕捉標識に結合するように構成された抽出部分で捕捉することをさらに含む、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項８】
捕捉標識が、アクリダイト、アジド、アジド（ＮＨＳエステル）、ジゴキシゲニン（ＮＨＳエステル）、ＩＬｉｎｋｅｒ、Ａｍｉｎｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６、Ａｍｉｎｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ１２、Ａｍｉｎｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６  ｄＴ、Ｕｎｉｌｉｎｋ  ａｍｉｎｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ、ヘキシニル、５−オクタジイニルｄＵ、ビオチン、ビオチン（アジド）、ビオチンｄＴ、ビオチンＴＥＧ、デュアルビオチン、ＰＣビオチン、デスチオビオチンＴＥＧ、ｔｈｉｏｌ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ３、ジチオール、ｔｈｉｏｌ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６  Ｓ−Ｓ、スクシニル基のうちの少なくとも１つであるか、またはこれらのうちの少なくとも１つを含む、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項９】
抽出部分が、アミノシラン、エポキシシラン、イソチオシアネート、アミノフェニルシラン、アミノプロピルシラン、メルカプトシラン、アルデヒド、エポキシド、ホスホネート、ストレプトアビジン、アビジン、抗体を認識するハプテン、特定の核酸配列、磁気誘引性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）、感光性樹脂のうちの少なくとも１つであるか、またはこれらのうちの少なくとも１つを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記抽出部分が、ある表面に結合している、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的領域が、前記非標的核酸物質を酵素的に破壊した後に物理的に分離される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の標的エンドヌクレアーゼが、リボ核酸タンパク質、Ｃａｓ酵素、Ｃａｓ９様酵素、Ｃｐｆ１酵素、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターベースヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、アルゴノートヌクレアーゼ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つ以上の標的エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、またはＣＰＦ１、またはこれらの誘導体を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸物質を切断することが、実質的に既知の長さの２つ以上の標的核酸フラグメントが形成されるように、前記核酸物質を１つ以上の標的エンドヌクレアーゼで切断することを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記所定の長さに基づき、前記２つ以上の標的核酸フラグメントを単離することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的核酸フラグメントが、異なる実質的に既知の長さのものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的核酸フラグメントが、各々、ゲノム中の１つ以上の異なる位置からの目的のゲノム配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的核酸フラグメントが、各々、前記核酸物質中の実質的に既知の領域からの標的配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記実質的に既知の長さに基づき、前記標的核酸フラグメントを単離することが、ゲル電気泳動、ゲル精製、液体クロマトグラフィー、サイズ排除精製、濾過、またはＳＰＲＩビーズ精製によって前記標的核酸フラグメントを濃縮することを含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つのＳＭＩおよび／またはアダプター配列を、所定の長さの前記切断した標的領域の５’または３’末端のうちの少なくとも１つにライゲーションすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
分析することが、前記標的領域の定量化および／または配列決定を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
定量化が、分光光度分析、リアルタイムＰＣＲ、および／または蛍光に基づく定量化のうちの少なくとも１つを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
配列決定が、二本鎖配列決定、ＳＰＬｉＴ二本鎖配列決定、Ｓａｎｇｅｒ配列決定、ショットガン配列決定、ブリッジ増幅／配列決定、ナノポア配列決定、単分子リアルタイム配列決定、イオントレント配列決定、パイロシーケンシング、デジタル配列決定（例えば、デジタルバーコードに基づく配列決定）、ダイレクトデジタル配列決定、ライゲーションによる配列決定、ポロニーに基づく配列決定、電流に基づく配列決定（例えば、トンネル電流）、質量分析法による配列決定、マイクロ流体に基づく配列決定、およびこれらの任意の組み合わせを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
配列決定が、
前記標的領域の第１の鎖を配列決定して、第１の鎖配列リードを生成することと、
前記標的領域の第２の鎖を配列決定して、第２の鎖配列リードを生成することと、
前記第１の鎖配列リードを前記第２の鎖配列リードと比較して、エラー修正済配列リードを生成することと、を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記エラー修正済配列リードが、前記第１の鎖配列リードと前記第２の鎖配列リードとの間で一致するヌクレオチド塩基を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記エラー修正済配列リード中の特定の位置で発生する変動が、真のバリアントとして識別される、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の鎖配列リードまたは前記第２の鎖配列リードのうちの１つのみの中の特定の位置で発生する変動が、潜在的なアーチファクトとして識別される、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記エラー修正済配列リードを使用して、癌、癌リスク、癌変異、癌代謝状態、変異誘発遺伝子表現型、発癌物質曝露、毒素曝露、慢性炎症曝露、年齢、神経変性疾患、病原体、薬物耐性バリアント、胎児分子、法医学的に関連する分子、免疫学的に関連する分子、変異したＴ細胞受容体、変異したＢ細胞受容体、変異した免疫グロブリン遺伝子座、ゲノム中のカタイジス部位、ゲノム中の高変異性部位、低頻度バリアント、サブクローンバリアント、少数の分子集合体、汚染物質源、核酸合成エラー、酵素による修飾エラー、化学修飾エラー、遺伝子編集エラー、遺伝子療法エラー、核酸情報貯蔵の一部、微生物の多種性、ウイルスの多種性、臓器移植、臓器移植拒絶、癌再発、治療後の残存癌、新生物発生前状態、異形成状態、マイクロキメリズム状態、幹細胞移植状態、細胞療法状態、別の分子に固定された核酸標識、または二本鎖標的核酸分子の由来となる生物もしくは被験体におけるこれらの組み合わせを識別または特定する、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記エラー修正済配列リードを使用して、変異誘発性化合物または曝露を識別する、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記エラー修正済配列リードを使用して、発癌性化合物または曝露を識別する、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸物質が、法医学的サンプルに由来し、前記エラー修正済配列リードが、法医学的分析に使用される、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的エンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素、リボ核酸タンパク質複合体、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、アルゴノートヌクレアーゼおよび／またはメガＴＡＬヌクレアーゼのうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素が、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素がＣｐｆ１であり、前記標的領域が、所定または既知のヌクレオチド配列を有する５’オーバーハングおよび３’オーバーハングを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記核酸物質を標的エンドヌクレアーゼで切断することは、前記核酸物質を２つ以上の標的エンドヌクレアーゼで切断することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記２つ以上の標的エンドヌクレアーゼが、２つ以上の標的領域を指向する２つ以上のＣａｓ酵素を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
所定の長さの標的領域が前記核酸物質の残りから分離されるように、前記核酸物質を標的エンドヌクレアーゼで切断することは、前記所定の長さを有する前記標的領域を作成するように、前記核酸物質を所定の距離だけ離して切断することを指向する一対の標的エンドヌクレアーゼで前記標的領域を切断することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記一対の標的エンドヌクレアーゼが、一対のＣａｓ酵素を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記一対のＣａｓ酵素が、同じ種類のＣａｓ酵素を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記一対のＣａｓ酵素が、異なる２種類のＣａｓ酵素を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
標的核酸物質を濃縮するための方法であって、
核酸物質を提供することと、
所定の長さの標的領域が前記核酸物質の残りから分離されるように、前記核酸物質を１つ以上の標的エンドヌクレアーゼで切断することであって、少なくとも１つの標的エンドヌクレアーゼが捕捉標識を含む、切断することと、
前記捕捉標識に結合するように構成される抽出部分を用い、前記所定の長さの標的領域を捕捉することと、
前記標的エンドヌクレアーゼから前記所定の長さの標的領域を放出することと、
前記切断した標的領域を分析することと、を含む、方法。
【請求項４２】
標的核酸物質を濃縮するための方法であって、
核酸物質を提供することと、
触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素を、前記核酸物質の標的領域に結合することと、
非標的核酸物質が破壊され、前記標的領域が、前記結合した触媒的に不活性なＣａｓ酵素によって消化酵素から保護されるように、前記核酸物質を１つ以上の核酸消化酵素で酵素処理することと、
前記触媒的に不活性なＣａｓ酵素から前記標的領域を放出することと、
前記標的領域を分析することと、を含む、方法。
【請求項４３】
前記結合する工程が、前記結合したＣａｓ酵素間の核酸物質が前記消化酵素から酵素的に保護されるように、一対の触媒的に不活性なＣａｓ酵素を前記標的領域に結合することを含み、それによって、前記標的領域の前記標的核酸物質を濃縮する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記触媒的に不活性なＣａｓ酵素が、捕捉標識を含み、前記方法が、前記標的領域を、前記捕捉標識に結合するように構成される抽出部分を用い、捕捉することをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記標的領域をサイズ選択によって濃縮することをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
標的核酸物質を濃縮するための方法であって、
核酸物質を提供することと、
一対の触媒的に活性な標的エンドヌクレアーゼと、捕捉標識を含む少なくとも１つの触媒的に不活性な標的エンドヌクレアーゼとを提供することであって、前記触媒的に不活性な標的エンドヌクレアーゼが、前記核酸物質の前記標的領域に結合するように指向され、前記一対の触媒的に活性な標的エンドヌクレアーゼが、前記触媒的に不活性な標的エンドヌクレアーゼのいずれかの側で前記標的領域に結合するように指向される、提供することと、
前記標的領域が前記核酸物質の残りから分離されるように、前記核酸物質を前記一対の触媒的に活性な標的エンドヌクレアーゼで切断することと、
前記捕捉標識に結合するように構成される抽出部分を用い、前記標的領域を捕捉することと、
前記標的エンドヌクレアーゼから前記標的領域を放出することと、
前記切断した標的領域を分析することと、を含む、方法。
【請求項４７】
複数の核酸フラグメントを含むサンプルから標的核酸物質を濃縮するための方法であって、
捕捉標識を有する１つ以上の触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素を、標的核酸フラグメントと非標的核酸フラグメントとを含む前記サンプルに提供することであって、前記１つ以上の触媒的に不活性なＣａｓ酵素が、前記標的核酸フラグメントに結合するように構成される、提供することと、
前記捕捉標識に結合するように構成される抽出部分を含む表面を提供することと、
前記抽出部分による前記捕捉標識の結合を介して前記標的核酸フラグメントを捕捉することによって、前記非標的核酸フラグメントから前記標的核酸フラグメントを分離することと、を含む、方法。
【請求項４８】
前記１つ以上の触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素を提供する前に、前記複数の核酸フラグメントの末端にアダプター分子を接続することをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
標的二本鎖核酸物質を濃縮するための方法であって、
核酸物質を提供することと、
前記核酸物質を１つ以上の標的エンドヌクレアーゼで切断して、５’の所定のヌクレオチド配列を有する５’粘着末端および／または３’の所定のヌクレオチド配列を有する３’粘着末端を含む二本鎖標的核酸フラグメントを作成することと、
前記５’粘着末端および前記３’粘着末端のうちの少なくとも１つを介して、前記核酸物質の残りから前記二本鎖標的核酸分子を分離することと、を含む、方法。
【請求項５０】
前記５’の所定のヌクレオチド配列または前記３’の所定のヌクレオチド配列に対して少なくとも部分的に相補性のライゲーション可能末端を含む少なくとも１つの配列決定アダプター分子を提供することと、
前記少なくとも１つの配列決定アダプター分子を前記二本鎖標的核酸分子にライゲーションすることと、
配列決定を介し、前記二本鎖標的核酸フラグメントを分析することと、をさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記少なくとも１つのアダプター分子が、Ｙ字形またはＵ字形を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記少なくとも１つのアダプター分子が、ヘアピン分子である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記少なくとも１つのアダプター分子が、抽出部分によって結合されるように構成される捕捉分子を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
配列決定アダプター分子が、前記二本鎖標的核酸フラグメントの前記５’粘着末端および前記３’粘着末端の各々にライゲーションする、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記５’粘着末端および前記３’粘着末端のうちの少なくとも１つを介して前記二本鎖標的核酸分子を前記核酸物質の残りから分離することは、前記５’の所定のヌクレオチド配列または前記３’の所定のヌクレオチド配列に対して少なくとも部分的に相補性の配列を有するオリゴヌクレオチドを提供することを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記オリゴヌクレオチドが、ある表面に結合している、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記オリゴヌクレオチドが、抽出部分に結合するように構成される捕捉標識を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記１つ以上の標的エンドヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
前記１つ以上の標的エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ニッカーゼを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項６０】
標的核酸物質を濃縮するためのキットであって、
核酸ライブラリであって、
核酸物質、および
複数の触媒的に不活性なＣａｓ酵素を含み、前記Ｃａｓ酵素が、配列コードを有するタグを含み、
前記複数のＣａｓ酵素が、前記核酸物質に沿って、複数の部位特異的標的領域に結合する、核酸ライブラリと、
複数のプローブであって、各プローブが、
対応する配列コードに対する相補体を含むオリゴヌクレオチド配列、および
捕捉標識を含む、複数のプローブと、
前記部位特異的標的領域間の関係を目録にするルックアップテーブルであって、前記配列コードが、前記部位特異的標的領域と関連付けられ、前記プローブが、対応する配列コードに対する前記相補体を含む、ルックアップテーブルと、を備える、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年３月１５日出願の米国仮特許出願第６２／６４３，７３８号に対する優先権およびその利益を主張し、その開示は、その全体が参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
大規模並列配列決定（ＭＰＳ、時に、次世代ＤＮＡ配列決定、ＮＧＳとしても知られる）用途において、ＰＣＲに基づくエラーの影響を軽減するために、プロトコル開発、化学／生物学およびデータ処理のレベルでの種々の手法が開発されてきた。これに加え、個々のＤＮＡフラグメントから生じるＰＣＲ重複検出を、増幅前または増幅中に、固有のランダム剪断点に基づいて、または外因性タグ化を介して（すなわち、分子タグとしても知られる分子バーコード、固有の分子識別子［ＵＭＩ］および単一分子識別子［ＳＭＩ］を用いて）解決することができる技術が一般的に使用される。この手法を使用して、ＤＮＡおよびＲＮＡテンプレートの計数精度を改善してきた。単一の出発分子に由来する全てのアンプリコンを明確に識別することができるため、同一のタグ付けされた配列決定リードの配列中の任意の変動を使用して、ＰＣＲまたは配列決定の間に生じる塩基エラーを修正することができる。例えば、Ｋｉｎｄｅら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８、９５３０−９５３５、２０１１）は、バーコードの配列決定を共有し、コンセンサスを形成するＰＣＲコピーをグループ分けすることによって、配列決定のエラー率を下げるために単一鎖分子バーコード化を使用する、ＳａｆｅＳｅｑＳを導入した。しかし、一本鎖分子バーコードの組み込みは、「ジャックポット」事象として誘導体コピー上に保有される第１ラウンドの増幅中に生じるＰＣＲアーチファクトを完全に除去することができない。
【０００３】
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）遺伝子座、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）遺伝子座、ならびに多くの他の形態の変異および遺伝子バリアントのより高い精度の遺伝子型決定のための方法は、医学、法医学、遺伝子毒性学および他の科学産業用途における種々の用途において望ましい。しかし、最も高い信頼性で、しかも合理的な費用で、配列決定される遺伝物質の可能な限り多くの関連するコピーからどのようにして最も効率よく配列情報を作成するかが課題である。種々のコンセンサス配列決定方法（分子バーコードに基づく方法および基づかない方法）が、エラー修正のために混合物中のバリアントをよりよく識別するのに役立たせるべく使用されてきた（詳細な考察のために、Ｊ．Ｓａｌｋら、Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ｏｆ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｒａｒｅ  ａｎｄ  ｓｕｂｃｌｏｎａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１８を参照）が、性能において種々の妥協がされてきた。本願発明者らは、以前、エラー修正の目的のために二本鎖核酸分子の配列決定された独立した鎖を遺伝子型決定し、比較することに基づく超高精度の配列決定方法である二本鎖配列決定（Ｄｕｐｌｅｘ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を記載した。本明細書に明示される技術の態様は、費用効率、回収効率および他の性能基準、ならびに高精度の配列決定リードを達成するための二本鎖配列決定および他の配列決定用途の全体的な処理速度を改善するための方法を記載する。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の技術は、一般に、標的核酸配列の濃縮のための方法、ならびにエラーを修正した核酸配列決定用途および他の核酸物質インテロゲーションのためのこのような濃縮の使用に関する。いくつかの実施形態において、核酸物質の非常に正確な、エラーが修正された大規模並列配列決定が、サンプルから濃縮された標的核酸物質を使用して可能である。いくつかの態様において、濃縮された標的核酸物質は二本鎖であり、二本鎖核酸複合体の鎖を固有に標識化する１つ以上の方法を、各鎖がその相補性鎖と情報学的に関連付けられるだけではなく、各鎖またはそれらに由来する増幅産物の配列決定後にその相補性鎖と区別することができるような様式で使用することができ、この情報を、決定された配列のエラー修正の目的のためにさらに使用することができる。本技術のいくつかの態様は、費用、配列決定される分子の変換および標的化される超高精度の配列決定のための標識された分子を作成する時間効率を改善するための方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物によって、非常に少量の核酸物質（例えば、小さな臨床サンプル、または犯罪現場から採取された血液またはサンプル中の自由に浮遊するＤＮＡからのもの）の正確な分析を可能にする。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物によって、１００個の細胞または分子中に１個未満（例えば、１０００個の細胞または分子中に１個未満、１万個の細胞または分子中に１個未満、１０万個の細胞または分子中に１個未満）の頻度で存在する核酸物質のサンプル中の変異の検出を可能にする。
【０００５】
本技術の態様は、標的核酸物質を濃縮するための方法であって、核酸物質を提供することと、所定の長さの標的領域が核酸物質の残りから分離されるように、核酸物質を１つ以上の標的エンドヌクレアーゼで切断する（ｃｕｔ）ことと、を含む、方法を対象とする。本方法は、非標的核酸物質を酵素的に破壊することと、標的エンドヌクレアーゼから所定の長さの標的領域を放出することと、切断した標的領域を分析することと、をさらに含んでいてもよい。
【０００６】
本技術のさらなる態様は、標的核酸物質を濃縮するための方法であって、核酸物質を提供することと、所定の長さの標的領域が核酸物質の残りから分離されるように、核酸物質を１つ以上の標的エンドヌクレアーゼで切断することであって、少なくとも１つの標的エンドヌクレアーゼが捕捉標識を含む、切断することと、捕捉標識に結合するように構成される抽出部分を用い、所定の長さの標的領域を捕捉することと、標的エンドヌクレアーゼから所定の長さの標的領域を放出することと、切断した標的領域を分析することと、を含む、方法を対象とする。
【０００７】
本技術のさらなる態様は、標的核酸物質を濃縮するための方法であって、核酸物質を提供することと、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素を、核酸物質の標的領域に結合することと、非標的核酸物質が破壊され、標的領域が、結合した触媒的に不活性なＣａｓ酵素によって消化酵素から保護されるように、核酸物質を１つ以上の核酸消化酵素で酵素処理することと、触媒的に不活性なＣａｓ酵素から標的領域を放出することと、標的領域を分析することと、を含む、方法を対象とする。
【０００８】
本技術の別の態様は、標的核酸物質を濃縮するための方法であって、核酸物質を提供することと、一対の触媒的に活性な標的エンドヌクレアーゼと、捕捉標識を含む少なくとも１つの触媒的に不活性な標的エンドヌクレアーゼとを提供することであって、触媒的に不活性な標的エンドヌクレアーゼは、核酸物質の標的領域に結合するように指向され、一対の触媒的に活性な標的エンドヌクレアーゼは、触媒的に不活性な標的エンドヌクレアーゼのいずれかの側で標的領域に結合するように指向される、提供することと、標的領域が核酸物質の残りから分離されるように、核酸物質を一対の触媒的に活性な標的エンドヌクレアーゼで切断することと、捕捉標識に結合するように構成される抽出部分を用い、標的領域を捕捉することと、標的エンドヌクレアーゼから標的領域を放出することと、切断した標的領域を分析することと、を含む、方法を対象とする。
【０００９】
さらなる態様は、複数の核酸フラグメントを含むサンプルから標的核酸物質を濃縮するための方法であって、捕捉標識を有する１つ以上の触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素を、標的核酸フラグメントと非標的核酸フラグメントとを含むサンプルに提供することであって、１つ以上の触媒的に不活性なＣａｓ酵素は、標的核酸フラグメントに結合するように構成される、提供することと、捕捉標識に結合するように構成される抽出部分を含む表面を提供することと、抽出部分による捕捉標識の結合を介して標的核酸フラグメントを捕捉することによって、非標的核酸フラグメントから標的核酸フラグメントを分離することと、を含む、方法を含む。
【００１０】
様々な実施形態は、標的二本鎖核酸物質を濃縮する方法であって、核酸物質を提供することと、核酸物質を１つ以上の標的エンドヌクレアーゼで切断して、５’の所定のヌクレオチド配列を有する５’粘着末端および／または３’の所定のヌクレオチド配列を有する３’粘着末端を含む二本鎖標的核酸フラグメントを作成することと、５’粘着末端および３’粘着末端のうちの少なくとも１つを介して、核酸物質の残りから二本鎖標的核酸分子を分離することと、を含む、方法を提供する。
【００１１】
さらなる実施形態は、標的核酸物質を濃縮するためのキットであって、核酸ライブラリを含み、核酸ライブラリは、核酸物質および複数の触媒的に不活性なＣａｓ酵素を含み、Ｃａｓ酵素が、配列コードを有するタグを含み、複数のＣａｓ酵素が、核酸物質に沿って、複数の部位特異的標的領域に結合する、キットを提供する。本キットは、複数のプローブをさらに含み、各プローブは、対応する配列コードに対する相補体を含むオリゴヌクレオチド配列と、捕捉標識とを含む。キットはまた、部位特異的標的領域間の関係を目録にするルックアップテーブルであって、配列コードが、部位特異的標的領域と関連付けられ、プローブが、対応する配列コードに対する相補体を含む、ルックアップテーブルも備えていてもよい。
【００１２】
いくつかの実施形態において、エラー修正済配列リードを使用して、癌、癌リスク、癌変異、癌代謝状態、変異誘発遺伝子表現型、発癌物質曝露、毒素曝露、慢性炎症曝露、年齢、神経変性疾患、病原体、薬物耐性バリアント、胎児分子、法医学的に関連する分子、免疫学的に関連する分子、変異したＴ細胞受容体、変異したＢ細胞受容体、変異した免疫グロブリン遺伝子座、ゲノム中のカタイジス部位、ゲノム中の高変異性部位、低頻度バリアント、サブクローンバリアント、少数の分子集合体、汚染物質源、核酸合成エラー、酵素による修飾エラー、化学修飾エラー、遺伝子編集エラー、遺伝子療法エラー、核酸情報貯蔵の一部、微生物の多種性、ウイルスの多種性、臓器移植、臓器移植拒絶、癌再発、治療後の残存癌、新生物発生前状態、異形成状態、マイクロキメリズム状態、幹細胞移植状態、細胞療法状態、別の分子に固定された（ａｆｆｉｘｅｄ）核酸標識、または二本鎖標的核酸分子の由来となる生物または被験体におけるこれらの組み合わせを識別または特定する。いくつかの実施形態において、エラー修正済配列リードを使用して、発癌性化合物または曝露を識別する。いくつかの実施形態において、エラー修正済配列リードを使用して、変異誘発性化合物または曝露を識別する。いくつかの実施形態において、核酸物質は、法医学的サンプルに由来し、エラー修正済配列リードは、法医学的分析に使用される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、単一分子識別子配列は、内因性剪断点またはその剪断点に位置的に関連し得る内因性配列を含む。いくつかの実施形態において、単一分子識別子配列は、変性もしくは半変性バーコード配列、核酸物質の１つ以上の核酸フラグメント末端、または二本鎖核酸分子を固有に標識するそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つである。いくつかの実施形態において、アダプターおよび／またはアダプター配列は、少なくとも部分的に相補的でないか、または少なくとも１つの非標準塩基を含む少なくとも１つのヌクレオチド位置を含む。いくつかの実施形態において、アダプターは、約５個以上の自己相補性ヌクレオチドによって形成される単一の「Ｕ字型」オリゴヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
種々の実施形態に従い、種々の核酸物質のうちいずれかを使用してもよい。いくつかの実施形態において、核酸物質は、カノニカル糖−リン酸骨格内のポリヌクレオチドに対する少なくとも１つの修飾を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、核酸物質は、核酸物質内の任意の塩基中に少なくとも１つの修飾を含んでいてもよい。例えば、非限定的な例として、いくつかの実施形態において、核酸物質は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）のうちの少なくとも１つであるか、またはこれらのうちの少なくとも１つを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、提供される方法は、アダプター分子を二本鎖核酸分子にライゲーションすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、ライゲーションする工程は、二本鎖核酸物質を少なくとも１つの二本鎖変性バーコード配列にライゲーションして、二本鎖核酸分子バーコード複合体を形成することを含み、二本鎖変性バーコード配列は、各鎖に単一分子識別子配列を含む。いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、二本鎖ＤＮＡ分子または二本鎖ＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド分子を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ライゲーションすることは、少なくとも１つのリガーゼの活性を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガーゼは、ＤＮＡリガーゼおよびＲＮＡリガーゼから選択される。いくつかの実施形態において、ライゲーションすることは、アダプター分子と会合したライゲーションドメインでのリガーゼ活性を含む。いくつかの実施形態において、ライゲーションすることは、アダプター分子および核酸分子のライゲーション可能末端と会合したライゲーションドメインでのリガーゼ活性を含む。いくつかの実施形態において、ライゲーションドメインおよび二本鎖核酸分子のライゲーション可能末端は、適合性がある（例えば、互いに相補性の一本鎖領域を有する）。いくつかの実施形態において、ライゲーションドメインは、１つ以上の変性または半変性ヌクレオチド由来のヌクレオチド配列であるか、または１つ以上の変性または半変性ヌクレオチドと関連している。いくつかの実施形態において、ライゲーションドメインは、１つ以上の非変性ヌクレオチド由来のヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、ライゲーションドメインは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態において、ライゲーションドメインおよび／またはライゲーション可能末端は、Ｔオーバーハング、Ａオーバーハング、ＣＧオーバーハング、平滑末端、組換え配列、エンドヌクレアーゼ切断部位オーバーハング、制限消化オーバーハングまたは別のライゲーション可能領域を含む。いくつかの実施形態において、ライゲーションドメインの少なくとも１本の鎖がリン酸化される。いくつかの実施形態において、ライゲーションドメインは、エンドヌクレアーゼ開裂配列またはその一部を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼ開裂配列は、エンドヌクレアーゼ（例えば、チューナブルエンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ）によって開裂され、平滑末端を得るか、またはライゲーション可能領域とオーバーハングされる。いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子のライゲーション可能末端は、エンドヌクレアーゼ開裂配列またはその一部を含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼ（例えば、プログラマブル／標的エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ）は、既知のヌクレオチド長（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはもっと多くのヌクレオチド）および配列を有する「粘着末端」または一本鎖オーバーハング領域を含むオーバーハングを与える。
【００１８】
いくつかの実施形態において、識別子配列は、単一分子識別子（ＳＭＩ）配列であるか、または単一分子識別子（ＳＭＩ）配列を含む。いくつかの実施形態において、ＳＭＩ配列は、内因性ＳＭＩ配列である。いくつかの実施形態において、内因性ＳＭＩ配列は、剪断点に関連する。いくつかの実施形態において、ＳＭＩ配列は、少なくとも１つの変性または半変性核酸を含む。いくつかの実施形態において、ＳＭＩ配列は、非変性である。いくつかの実施形態において、ＳＭＩ配列は、１つ以上の変性または半変性ヌクレオチドのヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、ＳＭＩ配列は、１つ以上の非変性ヌクレオチドのヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、ＳＭＩ配列は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施形態において、ＳＭＩ配列は、プライマー結合ドメインを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド分子は、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン（２−アミノ−ｄＡ）、５−ブロモｄＵ、デオキシウリジン、インバーテッドｄＴ（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ）、インバーテッドジデオキシＴ、ジデオキシＣ、５−メチルｄＣ、デオキシイノシン、Ｓｕｐｅｒ  Ｔ（商標登録）、Ｓｕｐｅｒ  Ｇ（商標登録）、ロックド核酸、５−ニトロインドール、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、ヒドロキシメチルｄＣ、イソ−ｄＧ、イソ−ｄＣ、フルオロＣ、フルオロＵ、フルオロＡ、フルオロＧ、２−メトキシエトキシＡ、２−メトキシエトキシＭｅＣ、２−メトキシエトキシＧ、２−メトキシエトキシＴ、８−オキソ−Ａ、８−オキソＧ、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン、５’−メチルイソシトシン、テトラヒドロフラン、イソ−シトシン、イソ−グアノシン、ウラシル、メチル化ヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、リボースヌクレオチド、８−オキソ−Ｇ、ＢｒｄＵ、Ｌｏｔｏ  ｄＵ、フラン、蛍光染料、アジドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、５−ニトロインドールヌクレオチドおよびジゴキシゲニンヌクレオチドから選択される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、切断部位は、制限エンドヌクレアーゼ認識配列であるか、または制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。いくつかの実施形態において、切断部位は、標的エンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲまたはＣＲＩＳＰＲ様エンドヌクレアーゼ）または他のチューナブルエンドヌクレアーゼのためのユーザ向け認識配列であるか、またはこれを含む。いくつかの実施形態において、核酸物質を切断することは、酵素消化、酵素的開裂、１本の鎖の酵素的開裂、両鎖の酵素的開裂、修飾核酸の組み込みの後、片方または両方の鎖の開裂を引き起こす酵素処理、複製を遮断するヌクレオチドの組み込み、連鎖停止剤の組み込み、光開裂可能なリンカーの組み込み、ウラシルの組み込み、リボース塩基の組み込み、８−オキソ−グアニン付加物の組み込み、制限エンドヌクレアーゼの使用、リボ核酸タンパク質エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ酵素、例えば、Ｃａｓ９またはＣＰＦ１）の使用、または他のプログラマブルエンドヌクレアーゼ（例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ（例えば、メガＴＡＬヌクレアーゼ）、アルゴノートヌクレアーゼなど）、およびこれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つを含んでいてもよい。
【００２１】
いくつかの実施形態において、捕捉標識は、アクリダイト、アジド、アジド（ＮＨＳエステル）、ジゴキシゲニン（ＮＨＳエステル）、Ｉ−Ｌｉｎｋｅｒ、Ａｍｉｎｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６、Ａｍｉｎｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ１２、Ａｍｉｎｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６  ｄＴ、Ｕｎｉｌｉｎｋ  ａｍｉｎｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ、ヘキシニル、５−オクタジイニルｄＵ、ビオチン、ビオチン（アジド）、ビオチンｄＴ、ビオチンＴＥＧ、デュアルビオチン、ＰＣビオチン、デスチオビオチンＴＥＧ、ｔｈｉｏｌ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ３、ジチオール、ｔｈｉｏｌ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６  Ｓ−Ｓおよびスクシニル基のうちの少なくとも１つであるか、またはこれらのうちの少なくとも１つを含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、抽出部分は、アミノシラン、エポキシシラン、イソチオシアネート、アミノフェニルシラン、アミノプロピルシラン、メルカプトシラン、アルデヒド、エポキシド、ホスホネート、ストレプトアビジン、アビジン、抗体を認識するハプテン、特定の核酸配列、磁気誘引性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）および感光性樹脂のうちの少なくとも１つであるか、またはこれらのうちの少なくとも１つを含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、提供される方法は、アダプター配列に特異的なプライマーの使用によって、および／または核酸産物の非アダプター部分に特異的なプライマーの使用によって、核酸物質を増幅することをさらに含む。種々の実施形態に従って、核酸物質を増幅するための種々の方法のいずれかが使用され得ることが想定される。例えば、いくつかの実施形態において、少なくとも１つの増幅工程は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、複数置換増幅（ＭＤＡ）、等温増幅、乳化液内のポロニー増幅、表面でのブリッジ増幅、ビーズの表面もしくはヒドロゲル内の表面、およびこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、核酸物質を増幅することは、第１のアダプター配列および第２のアダプター配列の領域に対して少なくとも部分的に相補性（例えば、核酸物質の各鎖の５’末端および／または３’末端上のアダプター配列に対して少なくとも部分的に相補性）の一本鎖オリゴヌクレオチドの使用を含む。いくつかの実施形態において、核酸物質を増幅することは、目的のゲノム配列の領域に対して少なくとも部分的に相補性の一本鎖オリゴヌクレオチドとアダプター配列の領域に対して少なくとも部分的に相補性の一本鎖オリゴヌクレオチドとの使用を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、核酸物質を増幅することは、第１の鎖に由来する複数のアンプリコンおよび第２の鎖に由来する複数のアンプリコンを生成することを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、提供される方法は、実質的に既知の長さの標的核酸フラグメントが形成されるように、核酸物質を１つ以上の標的エンドヌクレアーゼで切断する工程と、実質的に既知の長さに基づき、標的核酸フラグメントを単離する工程と、をさらに含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、アダプター（例えば、アダプター配列）を、実質的に既知の長さの標的核酸（例えば、標的核酸フラグメント）にライゲーションする（例えば、サイズ濃縮工程の後）ことをさらに含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、核酸物質は、１つ以上の標的核酸フラグメントであってもよく、または１つ以上の標的核酸フラグメントを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、１つ以上の標的核酸フラグメントは、各々、ゲノム中の１つ以上の位置からの目的のゲノム配列を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の標的核酸フラグメントは、核酸物質中の実質的に既知の領域からの標的配列を含む。いくつかの実施形態において、実質的に既知の長さに基づき標的核酸フラグメントを単離することは、ゲル電気泳動、ゲル精製、液体クロマトグラフィー、サイズ排除精製、濾過またはＳＰＲＩビーズ精製によって標的核酸フラグメントを濃縮することを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、提供される方法は、実質的に既知の長さおよび／または一本鎖オーバーハングの配列を有する片方または両方の末端を含む二本鎖標的核酸フラグメントが形成されるように、二本鎖核酸物質を１つ以上の標的エンドヌクレアーゼで切断する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、実質的に既知の長および／または一本鎖オーバーハングの配列に基づき、二本鎖標的核酸フラグメントを単離する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、アダプター（例えば、アダプター配列）を、実質的に既知の長さおよび／または一本鎖オーバーハングの配列を有する二本鎖標的核酸（例えば、標的核酸フラグメント）にライゲーションすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、二本鎖標的核酸は、核酸物質中の実質的に既知の領域からの標的配列を含む１つ以上の標的核酸フラグメントが、ライゲーション選択されたアダプター（複数可）と関連するアダプター配列に対して特異的なプライマーを用いた増幅によって選択的に濃縮可能であるように、ライゲーション選択されたアダプター分子のライゲーションドメインと実質的に固有に適合する（例えば、相補性の）ライゲーション可能末端を有していてもよい。
【００２８】
種々の実施形態によれば、いくつかの提供される方法は、核酸物質の任意の種々の最適ではない（例えば、損傷を受けているか、または分解している）サンプルの配列決定に有用な場合がある。例えば、いくつかの実施形態において、核酸物質の少なくとも一部が損傷を受けている。いくつかの実施形態において、損傷は、酸化、アルキル化、脱アミノ化、メチル化、加水分解、ヒドロキシル化、ニッキング、鎖内架橋、鎖間架橋、平滑末端鎖切断（ｂｒｅａｋａｇｅ）、付着末端二本鎖切断、リン酸化、脱リン酸化、ＳＵＭＯ化、グリコシル化、脱グリコシル化、プトレシニル化（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｙｌａｔｉｏｎ）、カルボキシル化、ハロゲン化、ホルミル化、一本鎖ギャップ、熱からの損傷、乾燥からの損傷、ＵＶ曝露からの損傷、γ放射線からの損傷、Ｘ線からの損傷、電離放射線からの損傷、非電離放射線からの損傷、重粒子放射線からの損傷、核崩壊からの損傷、β放射線からの損傷、α放射線からの損傷、中性子放射線からの損傷、陽子放射線からの損傷、宇宙放射線からの損傷、高ｐＨからの損傷、低ｐＨからの損傷、活性酸化種からの損傷、遊離ラジカルからの損傷、過酸化物からの損傷、次亜塩素酸塩からの損傷、ホルマリンまたはホルムアルデヒドなどの組織固定からの損傷、反応性鉄からの損傷、低イオン状態からの損傷、高イオン状態からの損傷、非緩衝状態からの損傷、ヌクレアーゼからの損傷、環境曝露からの損傷、火災からの損傷、機械的応力からの損傷、酵素分解からの損傷、微生物からの損傷、調製の機械剪断からの損傷、調製の酵素断片化からの損傷、インビボで自然発生した損傷、核酸抽出中に発生した損傷、配列決定ライブラリ調製中に発生した損傷、ポリメラーゼによって導入された損傷、核酸修復中に導入された損傷、核酸末端のテーリング中に発生した損傷、核酸ライゲーション中に発生した損傷、配列決定中に発生した損傷、ＤＮＡの機械的な取り扱いから発生した損傷、ナノポアを通過中に発生した損傷、生物における老化の一部として発生した損傷、個体の化学物質曝露の結果として発生した損傷、変異原によって生じた損傷、発癌物質によって生じた損傷、染色体異常誘発物質によって発生した損傷、酸素曝露に起因するインビボでの炎症損傷から生じた損傷、１つ以上の鎖切断に起因する損傷のうちの少なくとも１つ、およびこれらの任意の組み合わせであるか、またはこれらを含む。
【００２９】
核酸物質は、種々の供給源に由来していてもよいことが想定される。例えば、いくつかの実施形態において、核酸物質（例えば、１つ以上の二本鎖核酸分子を含む）は、ヒト被験体、動物、植物、真菌、ウイルス、細菌、原生動物または任意の他の生命体に由来するサンプルから提供される。他の実施形態において、サンプルは、少なくとも部分的に人工的に合成された核酸物質を含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、身体組織、生検、皮膚サンプル、血液、血清、血漿、汗、唾液、脳脊髄液、粘液、子宮洗浄液、膣スワブ、パップスメア、鼻スワブ、口腔スワブ、組織擦過物、毛髪、指紋、尿、便、硝子体液、腹腔洗浄液、痰、気管支洗浄、口腔洗浄、胸腔洗浄、胃洗浄、胃液、胆汁、膵管洗浄、胆管洗浄、総胆管洗浄、胆嚢液、滑液、感染した創傷、感染していない創傷、考古学的サンプル、法医学的サンプル、水サンプル、組織サンプル、食品サンプル、バイオリアクターサンプル、植物サンプル、細菌サンプル、原生動物サンプル、真菌サンプル、動物サンプル、ウイルスサンプル、複数生物サンプル、爪あか、精液、前立腺液、膣液、膣スワブ、卵管洗浄、細胞を含まない核酸、細胞内の核酸、メタゲノミクスサンプル、移植された異物の洗浄またはスワブ、鼻洗浄、腸液、上皮のブラッシング、上皮洗浄、組織生検、検死サンプル、壊死サンプル、臓器サンプル、ヒト識別サンプル、非ヒト識別サンプル、人工的に作られた核酸サンプル、合成遺伝子サンプル、預けられたサンプルまたは保存された核酸サンプル、腫瘍組織、胎児サンプル、臓器移植サンプル、微生物培養サンプル、核ＤＮＡサンプル、ミトコンドリアＤＮＡサンプル、クロロプラストＤＮＡサンプル、アピコプラストＤＮＡサンプル、オルガネラサンプル、およびこれらの任意の組み合わせであるか、またはこれらを含む。いくつかの実施形態において、核酸物質は、２つ以上の供給源に由来する。
【００３０】
本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態において、配列決定プロセスの効率、精度および／または速度を改善するように核酸物質を処理することが有利である。いくつかの実施形態において、核酸物質は、実質的に均一な長さおよび／または実質的に既知の長さの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、実質的に均一な長さおよび／または実質的に既知の長さは、約１〜約１，０００，０００塩基である。）例えば、いくつかの実施形態において、実質的に均一な長さおよび／または実質的に既知の長さは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００または５０，０００塩基長であってもよい。いくつかの実施形態において、実質的に均一な長さおよび／または実質的に既知の長さは、最大で６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１２０，０００、１５０，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００または１，０００，０００塩基であってもよい。具体的な非限定的な例として、いくつかの実施形態において、実質的に均一な長さおよび／または実質的に既知の長さは、約１００〜約５００塩基である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、濃縮核酸物質を標的とすることによって、１つまたは２つ以上の長さおよび／または実質的に既知の長さを有する核酸分子を提供する工程を含む。いくつかの実施形態において、核酸物質は、１つ以上の標的エンドヌクレアーゼによって、実質的に均一な長さおよび／または実質的に既知の長さの核酸分子に切断される。いくつかの実施形態において、標的エンドヌクレアーゼは、少なくとも１つの修飾を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、核酸物質は、１つ以上の実質的に既知のサイズ範囲内の長さを有する核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、１〜約１，０００，０００塩基、約１０〜約１０，０００塩基、約１００〜約１０００塩基、約１００〜約６００塩基、約１００〜約５００塩基、またはこれらのいくつかの組み合わせであってもよい。
【００３２】
いくつかの実施形態において、標的エンドヌクレアーゼは、認識部位または認識部位付近でＤＮＡを開裂する制限エンドヌクレアーゼ（すなわち、制限酵素）（例えば、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡｌｕＩ、ＡｖａＩＩ、ＢｓａＪＩ、ＢｓｔＮＩ、ＤｓａＶ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＭａｅＩＩＩ、Ｎ１ａＩＶ、ＮＳｉＩ、ＭｓｐＪＩ、ＦｓｐＥＩ、ＮａｅＩ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＮｏｔＩ、ＨｉｎＦ１、Ｓａｕ３ＡＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｍａＩ、ＨｇａＩ、ＡｌｕＩ、ＥｃｏＲＶなど）のうちの少なくとも１つであるか、またはこれらのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの制限エンドヌクレアーゼの列挙は、印刷された形態およびコンピュータ可読形態の両方で入手可能であり、多くの商業的な供給業者（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、イプスウィッチ、ＭＡ）によって提供される。当業者は、任意の制限エンドヌクレアーゼが本技術の種々の実施形態に従って使用され得ることを理解するだろう。他の実施形態において、標的エンドヌクレアーゼは、リボ核酸タンパク質複合体、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素／ガイドＲＮＡ複合体（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）またはＣａｓ９様酵素のうちの少なくとも１つであるか、またはこれらのうちの少なくとも１つを含む。他の実施形態において、標的エンドヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよび／またはメガヌクレアーゼ（例えば、メガＴＡＬヌクレアーゼなど）、アルゴノートヌクレアーゼ、またはこれらの組み合わせであるか、またはこれらを含む。いくつかの実施形態において、標的エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣＰＦ１、またはこれらの誘導体を含む。いくつかの実施形態において、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはもっと多く）の標的エンドヌクレアーゼが使用されてもよい。いくつかの実施形態において、標的エンドヌクレアーゼを使用して、核酸物質の２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはもっと多く）の潜在的な標的領域を切断してもよい。いくつかの実施形態において、核酸物質の２つ以上の標的領域が存在する場合、各標的領域は、同じ（または実質的に同じ）長さのものであってもよい。いくつかの実施形態において、核酸物質の２つ以上の標的領域が存在する場合、既知の長さを有する標的領域のうちの少なくとも２つは長さが異なっている（例えば、１００ｂｐの長さを有する第１の標的領域および１，０００ｂｐの長さを有する第２の標的領域）。
【００３３】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの増幅する工程は、少なくとも１つの標準的ではないヌクレオチドであるか、または少なくとも１つの標準的ではないヌクレオチドを含む少なくとも１つのプライマーおよび／またはアダプター配列を含む。さらなる例として、いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアダプター配列は、少なくとも１つの標準的ではないヌクレオチドであるか、または少なくとも１つの標準的ではないヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、標準的ではないヌクレオチドは、ウラシル、メチル化ヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、リボースヌクレオチド、８−オキソ−グアニン、ビオチン化ヌクレオチド、デスチオビオチンヌクレオチド、チオール修飾ヌクレオチド、アクリダイト修飾ヌクレオチド、イソ−ｄＣ、イソｄＧ、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、イノシンヌクレオチドロックド核酸、ペプチド核酸、５メチルｄＣ、５−ブロモデオキシウリジン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリンヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、５−ニトロインドールヌクレオチド、アデニル化ヌクレオチド、アジドヌクレオチド、ジゴキシゲニンヌクレオチド、Ｉ−リンカー、５’ヘキシニル修飾ヌクレオチド、５−オクタジイニルｄＵ、光開裂可能なスペーサー、光開裂可能ではないスペーサー、クリックケミストリーに適合性の修飾ヌクレオチド、蛍光染料、ビオチン、フラン、ＢｒｄＵ、フルオロ−ｄＵ、ロト−ｄＵ、およびこれらの任意の組み合わせから選択される。
【００３４】
いくつかの実施形態によれば、提供されるプロセスの精度、速度および効率のうちの１つ以上を高めるために、任意の様々な分析工程を使用してもよい。例えば、いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子の第１の核酸鎖および第２の核酸鎖の各々を配列決定することは、第１の核酸鎖に由来する複数の鎖の配列を比較して、第１の鎖のコンセンサス配列を決定することと、第２の核酸鎖に由来する複数の鎖の配列を比較して、第２の鎖のコンセンサス配列を決定することと、を含む。いくつかの実施形態において、第１の核酸鎖の配列を第２の核酸鎖の配列と比較することは、第１の鎖のコンセンサス配列および第２の鎖のコンセンサス配列を比較して、エラー修正済コンセンサス配列を提供することを含む。他の実施形態において、二本鎖標的核酸分子のエラー修正済配列は、第１の核酸鎖からの単一配列リードと第２の核酸鎖からの単一配列リードとを比較することによって決定することができる。
【００３５】
いくつかの実施形態によって提供される一態様は、非常に少量の核酸物質から高品質の配列決定情報を生成する能力である。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物は、開始時の核酸物質の量が最大で約１ピコグラム（ｐｇ）、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ナノグラム（ｎｇ）、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇまたは１０００ｎｇで使用されてもよい。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物は、核酸物質のインプット量が最大で１モルコピーまたはゲノム当量、１０モルコピーまたはそのゲノム当量、１００モルコピーまたはそのゲノム当量、１，０００モルコピーまたはそのゲノム当量、１０，０００モルコピーまたはそのゲノム当量、１００，０００モルコピーまたはそのゲノム当量、または１，０００，０００モルコピーまたはそのゲノム当量で使用されてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、最大で１，０００ｎｇの核酸物質が特定の配列決定プロセスのために最初に提供される。例えば、いくつかの実施形態において、最大で１００ｎｇの核酸物質が特定の配列決定プロセスのために最初に提供される。例えば、いくつかの実施形態において、最大で１０ｎｇの核酸物質が特定の配列決定プロセスのために最初に提供される。例えば、いくつかの実施形態において、最大で１ｎｇの核酸物質が特定の配列決定プロセスのために最初に提供される。例えば、いくつかの実施形態において、最大で１００ｐｇの核酸物質が特定の配列決定プロセスのために最初に提供される。例えば、いくつかの実施形態において、最大で１ｐｇの核酸物質が特定の配列決定プロセスのために最初に提供される。
【００３６】
本出願で使用される場合、「約」および「およそ」という用語は、同等の用語として使用される。本明細書における刊行物、特許または特許出願に対する任意の引用は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。本出願で使用される任意の数字は、約／およそを伴うか伴わないかにかかわらず、関連技術分野の当業者に理解される任意の通常の変動を包含することを意味する。
【００３７】
様々な実施形態において、核酸物質の濃縮（目的の領域（複数可）への核酸物質の濃縮を含む）は、より速い速度で（例えば、より少ない工程で）、少ない費用で（例えば、少ない試薬を利用して）提供され、より多くの望ましいデータが得られる。本技術の種々の態様は、前臨床および臨床での試験および診断において多くの用途を有するだけではなく、他の用途も有する。
【００３８】
本技術のいくつかの実施形態の具体的な詳細が、図１〜図２２Ｃを参照しつつ、以下に記載される。実施形態の多くは、本明細書では二本鎖配列決定に関して記載されるが、本明細書に記載されるものに加え、エラー修正済配列リードを作成することが可能な他の配列決定様式、配列情報を提供するための他の配列決定様式は、本技術の範囲内である。これに加え、本明細書に記載する核酸濃縮方法および試薬から利益を受けるような他の核酸インテロゲーションが想定される。さらに、本技術の他の実施形態は、本明細書に記載されるものとは異なる構成、構成要素または手順を有していてもよい。したがって、当業者は、本技術が、さらなる要素を有する他の実施形態を含んでいてもよく、また、図１〜図２２Ｃを参照しつつ以下に示され、記載される特徴のいくつかを含まない他の実施形態を含んでいてもよいことを理解するだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
本開示の多くの態様は、以下の図面を参照しつつ、よりよく理解することができる。図面中の構成要素は、必ずしも縮尺どおりではない。その代わりに、本開示の原理を明確に例示することを重視する。
【図１】核酸インサートサイズと、本技術の一実施形態による増幅後に得られたファミリーサイズとの間の関係をプロットしたグラフである。
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、本技術の態様による、異なる核酸インサートサイズについて作成された配列決定データを示す模式図である。
【図２Ｂ】同上。
【図３】本技術の一実施形態による、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてサイジングした標的フラグメントを作成するための方法の工程を示す模式図である。パネルＡは、標的ＤＮＡ部位でのＣａｓ９のｇＲＮＡによって促進された結合を示す。Ｃａｓ９の指向性開裂は、パネルＢに示されるように、既知の長さの平滑末端化された二本鎖標的ＤＮＡフラグメントを放出する。パネルＣは、サイズ選択を介する標的ＤＮＡフラグメントの陽性濃縮／選択のためのさらなる処理工程を示す。場合により、パネルＤに示されるように、濃縮されたＤＮＡフラグメントは、核酸インテロゲーション（例えば、配列決定）のためにアダプターにライゲーションされてもよい。
【図４】本技術の一実施形態による、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９バリアントを用い、既知の／選択された長さを有する標的核酸フラグメントを作成するための方法の工程を示す模式図である。適切な状態でＤＮＡに結合したままであるように操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボ核酸タンパク質複合体を用い、パネルＡは、標的ＤＮＡ部位に対するバリアントＣａｓ９のｇＲＮＡによって促進された結合を示す。開裂の後、Ｃａｓ９が、標的ＤＮＡフラグメントの開裂した５’末端および３末端に結合したままであるが、パネルＢは、ＤＮＡの露出した３’末端または５’末端で露出したホスホジエステル結合を加水分解するためにエキソヌクレアーゼを用いてサンプルを処理することを示す。全ての非標的ＤＮＡのエキソヌクレアーゼ破壊を介した、標的ＤＮＡフラグメントの陰性／濃縮選択の後、Ｃａｓ９は、ＤＮＡから解離し、パネルＣに示されるように、既知の長さの平滑末端化された二本鎖標的ＤＮＡフラグメントを放出する。パネルＤは、サイズ選択を介する標的ＤＮＡフラグメントの陽性濃縮／選択のための任意のさらなる処理工程を示す。場合により、パネルＥに示されるように、濃縮されたＤＮＡフラグメントは、核酸インテロゲーション（例えば、配列決定）のためにアダプターにライゲーションされてもよい。
【図５】本技術の別の実施形態による、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９バリアントを用い、既知の／選択された長さを有する標的核酸フラグメントを作成するための方法の工程を示す模式図である。パネルＡは、適切な状態でＤＮＡに結合したままであるように操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボ核酸タンパク質複合体を用いることを示し、ここで、リボ核酸タンパク質複合体は、捕捉標識を含む。捕捉標識を含むバリアントＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって促進された結合の後に、二本鎖標的ＤＮＡの開裂を行う。開裂の後、Ｃａｓ９が、標的ＤＮＡフラグメントの開裂した５’末端および３末端に結合したままであるが、パネルＢは、ＤＮＡの露出した３’末端または５’末端で露出したホスホジエステル結合を加水分解するためにエキソヌクレアーゼを用いてサンプルを処理することを示す。全ての非標的ＤＮＡのエキソヌクレアーゼ破壊を介した、標的ＤＮＡフラグメントの陰性／濃縮選択の後、Ｃａｓ９は結合したままであるが、パネルＣは、標的核酸に結合したままであるため、リボ核酸タンパク質複合体と会合した捕捉標識を結合することが可能な官能基化された表面の段階的な付加を伴う、標的核酸捕捉の陽性濃縮／選択プロセスを示す。アフィニティに基づく濃縮工程の後、パネルＤに示されるように、Ｃａｓ９は、ＤＮＡから解離し、既知の長さの平滑末端化された二本鎖標的ＤＮＡフラグメントを放出する。パネルＥは、サイズ選択を介する標的ＤＮＡフラグメントの陽性濃縮／選択のための任意のさらなる処理工程を示す。場合により、パネルＦに示されるように、濃縮されたＤＮＡフラグメントは、核酸インテロゲーション（例えば、配列決定）のためにアダプターにライゲーションされてもよい。
【図６】本技術の一実施形態による、Ｃａｓ９の触媒的に不活性なバリアントを用い、既知の／選択された長さを有する標的核酸フラグメントを作成するための方法の工程を示す模式図である。二本鎖ＤＮＡを標的とし、これに結合するように設計された触媒的に不活性なＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体を用い、パネルＡは、標的ＤＮＡ部位に対するバリアントＣａｓ９のｇＲＮＡによって促進された結合を示す。結合の後、パネルＢは、ＤＮＡの露出した３’末端または５’末端で露出したホスホジエステル結合を加水分解するためにエキソヌクレアーゼを用いてサンプルを処理することを示す。Ｃａｓ９の触媒的に不活性なバリアントは、標的ＤＮＡを切断しないが、エキソヌクレアーゼ活性が、結合したＣａｓ９複合体によって遮断されるまで各ヌクレオチド塩基を開裂するような、エキソヌクレアーゼ耐性を提供する。全ての非標的ＤＮＡのエキソヌクレアーゼ破壊を介した、標的ＤＮＡフラグメントの陰性／濃縮選択の後、触媒的に不活性なＣａｓ９は、ＤＮＡから解離し、パネルＣに示されるように、既知の長さの二本鎖標的ＤＮＡフラグメントを放出する。パネルＤは、サイズ選択を介する標的ＤＮＡフラグメントの陽性濃縮／選択のための任意のさらなる処理工程を示す。場合により、パネルＥに示されるように、濃縮されたＤＮＡフラグメントは、核酸インテロゲーション（例えば、配列決定）のためにアダプターにライゲーションされてもよい。
【図７】本技術の別の実施形態による、Ｃａｓ９の触媒的に不活性なバリアントを用いてサイジングした標的フラグメントを作成する方法の工程を示す模式図である。パネルＡは、適切な状態でＤＮＡに結合したままであるように操作されたリボ核酸タンパク質複合体において、Ｃａｓ９の触媒的に不活性なバリアントを用いることを示し、ここで、リボ核酸タンパク質複合体は、捕捉標識を含む。捕捉標識を有する触媒的に不活性なバリアントＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって促進された結合の後に、ＤＮＡの露出した３’末端または５’末端で露出したホスホジエステル結合を加水分解するために、サンプルへのエキソヌクレアーゼの添加を行う。Ｃａｓ９の触媒的に不活性なバリアントは、標的ＤＮＡを切断しないが、エキソヌクレアーゼ活性が、結合したＣａｓ９複合体によって遮断されるまで各ヌクレオチド塩基を開裂するような、エキソヌクレアーゼ耐性を提供する。全ての非標的ＤＮＡのエキソヌクレアーゼ破壊を介した、標的ＤＮＡフラグメントの陰性／濃縮選択の後、触媒的に不活性なＣａｓ９は結合したままであるが、パネルＣは、標的核酸に結合したままであるため、リボ核酸タンパク質複合体と会合した捕捉標識を結合することが可能な官能基化された表面の段階的な付加を伴う、標的核酸捕捉の陽性濃縮／選択プロセスを示す。アフィニティに基づく濃縮工程の後、パネルＤに示されるように、Ｃａｓ９は、ＤＮＡから解離し、既知の長さの二本鎖標的ＤＮＡフラグメントを放出する。パネルＥは、サイズ選択を介する標的ＤＮＡフラグメントの陽性濃縮／選択のための任意のさらなる処理工程を示す。場合により、パネルＦに示されるように、濃縮されたＤＮＡフラグメントは、核酸インテロゲーション（例えば、配列決定）のためにアダプターにライゲーションされてもよい。
【図８】本技術の別の実施形態による、触媒的に活性なＣａｓ９および触媒的に不活性なＣａｓ９の両方を使用する標的核酸濃縮スキームを示す模式図である。触媒的に活性なＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体および触媒的に不活性なＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体は両方とも、サンプル中の所望な配列を標的とすることができる。触媒的に活性なＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体は、標的ＤＮＡ領域に隣接する領域に指向され、これを使用して、標的二本鎖ＤＮＡを開裂し、既知の長さの平滑末端化された二本鎖標的ＤＮＡフラグメントを放出する。捕捉標識を有する１つ以上の触媒的に不活性なリボ核酸タンパク質複合体は、２つの部位選択された開裂部位の間の標的配列領域に指向される。標的ＤＮＡを開裂してＤＮＡフラグメントを放出した後、触媒的に不活性なリボ核酸タンパク質複合体と会合した捕捉標識を結合することが可能な官能基化された表面の付加が、標的フラグメントの陽性濃縮／選択を促進することができる。
【図９Ａ】図９Ａおよび９Ｂは、本技術の一実施形態による、捕捉標識を有するＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体の触媒的に不活性なバリアントを用いる、標的核酸フラグメントの陽性濃縮／選択のための方法の工程の概念図である。サンプル中のフラグメント化された二本鎖ＤＮＡフラグメント（例えば、機械的に剪断された、音響的にフラグメント化された、無細胞ＤＮＡなど）は、溶液中の触媒的に不活性なＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体による標的指向性結合を介して、陽性濃縮／選択することができる（図９Ａ）。標的核酸に結合したままであるため、リボ核酸タンパク質複合体と会合する捕捉標識を結合することが可能な官能基化された表面の段階的な付加によって、標的ではないフラグメントを破棄しつつ、所望な二本鎖ＤＮＡフラグメントのプルダウン（例えば、アフィニティ精製）を促進する（図９Ｂ）。
【図９Ｂ】同上。
【図１０】本技術の一実施形態による、捕捉標識を有するＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体の触媒的に不活性なバリアントを用いる、標的核酸フラグメントの陽性濃縮／選択のための方法の工程を示す模式図である。パネルＡは、小さすぎてサイズ選択またはアフィニティに基づく方法によって信頼性高く濃縮することができない分子２を含む、サンプル中の様々な大きさの複数のフラグメント化された二本鎖ＤＮＡフラグメントを示す。パネルＢは、サンプル中の分子の５’末端および３’末端にアダプターをライゲーションすることによって、このようなＤＮＡフラグメントをさらに長くすることを示す。パネルＣは、溶液中の捕捉標識を有する触媒的に不活性なＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体による標的指向性結合を介した、分子２の陽性濃縮／選択工程の後、プルダウン方法によるアフィニティ精製を示す。
【図１１】本技術の一実施形態による、陰性濃縮スキーム（パネルＡ）および陽性濃縮スキーム（パネルＢ）を用いて標的核酸物質を濃縮するための方法の工程を示す模式図である。パネルＡは、二本鎖標的ＤＮＡ分子の５’末端および３’末端にヘアピンアダプターをライゲーションし、露出した末端を有しないアダプター−核酸複合体を生成することを示す。アダプター−核酸複合体を、陰性濃縮／選択スキームにおいてエキソヌクレアーゼで処理し、パネルＢの右側に示されるように、保護されていない５’末端および３’末端を有する核酸物質フラグメントおよびアダプター（例えば、４個のライゲーションされたホスホジエステル結合を有しないアダプター−核酸複合体、ライゲーションされていないＤＮＡ、一本鎖核酸物質、遊離アダプターなど）を除去する。エキソヌクレアーゼ耐性のアダプター−核酸複合体は、サイズ選択または標的配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プルダウン）によってさらに濃縮することができる（パネルＢ、左側）。所望なアダプター−標的核酸複合体は、増幅および／または配列決定によって、さらに処理することができる。
【図１２】本技術の別の実施形態による、捕捉標識を有するヘアピンアダプターが、アフィニティに基づく濃縮のために標的二本鎖ＤＮＡにライゲーションされる実施形態を示す。
【図１３】本技術の一実施形態による、ヘアピンアダプターを用いたアダプター−標的核酸複合体の陽性濃縮（パネルＡ）の後、ローリングサークル増幅（パネルＢおよびＣ）、および実質的に同じ比率で二本鎖核酸フラグメントの第１の鎖および第２の鎖のアンプリコンを作成するためのアンプリコン作成工程（パネルＤ）のための方法の工程を示す模式図である。
【図１４】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１を用い、本技術の一実施形態による、既知のヌクレオチド長および配列を有する一本鎖オーバーハング領域を含む異なる５’および３’のライゲーション可能末端を有する、既知の／選択された長さを有する標的核酸フラグメントを作成するための方法の工程を示す模式図である。パネルＡは、標的ＤＮＡ部位でのＣｐｆ１のｇＲＮＡによって促進された結合を示す。Ｃｐｆ１指向性開裂は、付着切断を生成し、４（図示される）または５ヌクレオチドオーバーハング（例えば、「粘着末端」）を提供する。標的ＤＮＡ配列に隣接する部位指向性Ｃｐｆ１開裂によって、フラグメントの５’末端に粘着末端１を有し、３’末端に粘着末端２を有する、既知の長さ（例えば、サイズ選択によって濃縮されてもよい）の二本鎖標的ＤＮＡフラグメントを作成する（パネルＢ）。パネルＢは、フラグメントの５’末端にアダプター１を接続し、３’末端にアダプター２を接続することをさらに示し、アダプター１および２は、それぞれ、このフラグメントの粘着末端１および２に対して少なくとも部分的に相補性のオーバーハング配列を含む。
【図１５】本技術の一実施形態による、粘着末端（複数可）を含む標的ＤＮＡフラグメント（例えば、図１４の方法で作成された標的ＤＮＡフラグメント）のアフィニティに基づく濃縮のための方法の工程を示す模式図である。パネルＡは、溶液中の切断された標的ＤＮＡフラグメントと会合する粘着末端を結合することが可能な官能基化された表面の段階的な付加を示す。官能基化された表面に結合すると、パネルＢに示されるように、標的ではないフラグメントを破棄しつつ、アフィニティ相互作用が、所望な二本鎖ＤＮＡフラグメントのプルダウン（例えば、アフィニティ精製）を促進する。
【図１６】本技術の別の実施形態による、粘着末端（複数可）を含む標的ＤＮＡフラグメント（例えば、図１４の方法で作成された標的ＤＮＡフラグメント）のアフィニティに基づく濃縮のための方法の工程を示す模式図である。パネルＡは、溶液中の切断された標的ＤＮＡフラグメントと会合する粘着末端の一部に少なくとも部分的に相補性のヌクレオチド配列を有する捕捉標識を有するオリゴヌクレオチドの段階的な付加を示す。パネルＢに示されるように、捕捉標識を結合することが可能な官能基化された表面のさらなる付加によって、標的ではないフラグメントを破棄しつつ、所望な二本鎖ＤＮＡフラグメントのプルダウン（例えば、アフィニティ精製）を促進する。
【図１７−１】Ｃａｓ９ニッカーゼを用い、本技術の一実施形態による、既知のヌクレオチド長および配列を有する長い一本鎖オーバーハング領域を含む異なる５’および３’のライゲーション可能末端を有する、既知の長さを有する核酸物質の標的フラグメント濃縮のための方法の工程を示す模式図である。パネルＡは、標的ＤＮＡ領域での対になったＣａｓ９ニッカーゼのｇＲＮＡによって標的とされる結合を示す。二本鎖切断は、対になったニッカーゼの使用によって導入され、標的ＤＮＡ領域を切断（ｅｘｃｉｓｅ）することができ、対になったＣａｓ９ニッカーゼが使用される場合、パネルＢに示されるように、平滑末端の代わりに、開裂した末端各々に対して長いオーバーハング（粘着末端１および２）が生成される。パネルＣは、溶液中の切断された標的ＤＮＡフラグメントに会合した長い粘着末端（例えば、粘着末端１）を結合することが可能な官能基化された表面の段階的な付加を示す。官能基化された表面に結合すると、パネルＤに示されるように、標的ではないフラグメントを破棄しつつ、アフィニティ相互作用が、所望な二本鎖ＤＮＡフラグメントのプルダウン（例えば、アフィニティ精製）を促進する。パネルＥは、溶液中の切断された標的ＤＮＡフラグメントと会合する長い粘着末端（例えば、粘着末端１）の一部に少なくとも部分的に相補性のヌクレオチド配列を有する捕捉標識を有するオリゴヌクレオチドの付加を含む、陽性濃縮工程の変形を示す。パネルＦは、捕捉標識を有するオリゴヌクレオチドの一部に少なくとも部分的に相補性の第２のオリゴ鎖のアニーリングを示す。第２のオリゴ鎖の酵素伸長およびテンプレートＤＮＡフラグメントへのライゲーションによって、アダプター−標的ＤＮＡ複合体を生成する。さらなる工程は、捕捉標識を結合することが可能な官能基化された表面（図示せず）の導入によって、標的ではないフラグメントを破棄しつつ、所望なアダプター−二本鎖ＤＮＡ複合体のプルダウン（例えば、アフィニティ精製）を促進することを含んでいてもよい。
【図１７−２】同上。
【図１７−３】同上。
【図１８】本技術の別の実施形態による、触媒的に不活性なＣａｓ９を使用する標的核酸濃縮スキームを示す模式図である。触媒的に不活性なＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体は、サンプル中の所望な配列を標的とすることができる。１つ以上の捕捉標識を有する１つ以上の触媒的に不活性なリボ核酸タンパク質複合体は、標的ＤＮＡ領域に対する他のタンパク質複合体構造に指向する。このタンパク質複合体構造が、標的ＤＮＡ領域を覆う場合、エキソヌクレアーゼ耐性が提供される。エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼの組み合わせを用いた処理、タンパク質複合体のアフィニティ精製（例えば、官能基化された表面に結合する捕捉標識、抗体プルダウンなどを介する）の後、標的核酸フラグメントは、リボヌクレオチド複合体の結合から放出され得る。
【図１９】図１９Ａおよび１９Ｂは、本技術の一実施形態による、目的のＤＮＡ領域を選択的に調べるためのツールとして使用可能な、調製されたＤＮＡライブラリおよび試薬の概念図である。固有にタグ化された触媒的に不活性なＣａｓ９は、単離された／フラグメント化されていないゲノムＤＮＡ（またはＤＮＡの他の大きなフラグメント）の複数の（例えば、繰り返される）領域に標識指向性である（図１９Ａ）。各々の触媒的に不活性なＣａｓ９リボ核酸タンパク質は、既知の配列（例えば、コード配列）を有する既知のオリゴヌクレオチドタグを含み、ゲノムのあらかじめ設計された領域に結合する。ＤＮＡライブラリを使用する場合、ユーザは、目的のゲノムの領域に対応するコード配列の相補体（例えば、アンチコード配列）を含む１つ以上のプローブを段階的に付加することができる。フラグメント化方法を使用して、ゲノムＤＮＡを種々の大きさにフラグメント化することができる（例えば、制限酵素消化、機械剪断など）。プローブは、プローブに固定されているか、または組み込まれた捕捉標識を含む（図１９Ｂ）。捕捉標識を結合することが可能な官能基化された表面の付加は、インテロゲーションのための所望なゲノム領域のアフィニティ精製および陽性濃縮のために付加されてもよい。
【図２０−１】本技術の一実施形態による、直接デジタル配列決定方法と共に使用するための標的ＤＮＡフラグメントのアフィニティに基づく濃縮および配列決定のための方法の工程を示す。パネルＡは、粘着末端（複数可）を含む標的ＤＮＡフラグメント（例えば、図１４または図１７の方法で作成された標的ＤＮＡフラグメント）への選択されたアダプターの接続を示す。パネルＡは、フラグメントの５’末端にアダプター１を接続し、３’末端にアダプター２を接続することをさらに示し、アダプター１および２は、それぞれ、このフラグメントの粘着末端１および２に対して少なくとも部分的に相補性のオーバーハング配列を含む。アダプター１は、Ｙ字型を有しており、異なる特性を有する異なる標識（ＡおよびＢ）を有する５’および３’の一本鎖アームを含む。アダプター２は、ヘアピン形状のアダプターである。パネルＢは、標識Ａが官能基化された表面に結合するように構成される直接デジタル配列決定方法における工程を示す。標識Ｂは、電場または磁場の適用によって二本鎖アダプター−ＤＮＡ複合体の第１および第２の鎖の変性が起こった後、ＤＮＡフラグメントの電気伸長を引き起こすような物理特性（例えば、電荷、磁気特性など）を提供する。濃縮された／標的とされた鎖からの配列情報が、エラー修正および他の核酸インテロゲーション（例えば、ＤＮＡ損傷の評価など）のための二本鎖配列情報を提供するように、第１および第２の鎖は、ヘアピンアダプターによってつなぎ止められたままである。
【図２０−２】同上。
【図２１−１】本技術の別の実施形態による、直接デジタル配列決定方法を使用する標的ＤＮＡフラグメントの配列決定のためのアフィニティに基づく濃縮のための方法の工程を示す。パネルＡは、粘着末端（複数可）を含む標的ＤＮＡフラグメント（例えば、図１４または図１７の方法で作成された標的ＤＮＡフラグメント）のアフィニティに基づく濃縮を示す。示されているように、ヘアピンアダプターは、配列に依存する様式で二本鎖ＤＮＡフラグメントの３’末端に接続している。標的ＤＮＡ分子（複数可）は、切断された標的ＤＮＡフラグメント（例えば、結合したオリゴヌクレオチドを有する）と会合する粘着末端を結合することが可能な官能基化された表面の上を流れてもよい。これに加え、標識Ｂを含み、結合したオリゴヌクレオチドの一部と少なくとも部分的に相補性の第２のオリゴヌクレオチド鎖が、溶液に加えられる。アダプター／ＤＮＡフラグメント構成要素のアニーリングおよびライゲーションは、直接デジタル配列決定に適した表面に結合したアダプター−標的二本鎖ＤＮＡ複合体を提供する（パネルＢ）。配列決定工程のための電場または磁場の適用およびアダプター−ＤＮＡ複合体の電気伸長は、例えば、図２０に記載されている通りに行うことができる。
【図２１−２】同上。
【図２２Ａ】本技術のいくつかの実施形態と共に使用するための核酸アダプター分子、および本技術の実施形態に従う二本鎖核酸フラグメントへのアダプター分子のライゲーションから得られる二本鎖アダプター核酸分子複合体を示す。
【図２２Ｂ−Ｃ】図２２Ｂおよび図２２Ｃは、本技術の一実施形態に従う種々の二本鎖配列決定方法の工程の概念図である。
【００４０】
定義
本開示がより容易に理解されるために、まず、特定の用語を以下に定義する。以下の用語および他の用語についてのさらなる定義は、本明細書全体を通して記載される。
【００４１】
本出願では、文脈から別段明確でない限り、「１つの（ａ）」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解され得る。本出願で使用される場合、「または」という用語は、「および／または」を意味すると理解され得る。本出願では、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、それ自体によって示されるか、または１つ以上のさらなる構成要素または工程と共に示されるかにかかわらず、項目化された構成要素または工程を包含すると理解され得る。範囲が本明細書で提示される場合、その両端が含まれる。本出願で使用される場合、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語およびこの用語の変形語、例えば、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、他の添加剤、構成要素、整数または工程を除外することを意図しない。
【００４２】
約：「約」という用語は、ある値を参照しつつ本明細書で使用される場合、参照される値の観点で、類似する値を指す。一般に、その観点に精通している当業者は、その観点で「約」に包含される関連する程度の分散を理解するだろう。例えば、いくつかの実施形態において、「約」という用語は、参照される値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以内、またはさらに小さな範囲の値を包含し得る。
【００４３】
類似体：本明細書で使用される場合、「類似体」という用語は、１つ以上の特定の構造特徴、要素、構成要素または部分が参照物質と共通する物質を指す。典型的には、「類似体」は、参照物質と有意な構造類似性を示し、例えば、コアまたはコンセンサス構造が共通するが、特定の別個の様式では違いもある。いくつかの実施形態において、類似体は、参照物質から、例えば、参照物質の化学操作によって生成可能な物質である。いくつかの実施形態において、類似体は、参照物質を生成する合成プロセスと実質的に類似した（例えば、複数の工程が共通する）合成プロセスの性能によって生成可能な物質である。いくつかの実施形態において、類似体は、参照物質を生成するために使用されるものとは異なる合成プロセスの性能によって生成されるか、または生成可能である。
【００４４】
生体サンプル：本明細書で使用される場合、「生体サンプル」または「サンプル」という用語は、典型的には、本明細書に記載されるように、目的の生体源（例えば、組織または生物または細胞培養物）から得られるか、または目的の生体源に由来するサンプルを指す。いくつかの実施形態において、目的の供給源は、動物またはヒトなどの生物を含む。他の実施形態において、目的の供給源は、細菌、ウイルス、原虫または真菌などの微生物を含む。さらなる実施形態において、目的の供給源は、合成組織、生物、細胞培養物、核酸または他の材料であってもよい。さらにさらなる実施形態において、目的の供給源は、植物系生物であってもよい。さらに別の実施形態において、サンプルは、例えば、水サンプル、土壌サンプル、考古学サンプルまたは非生物源から採取された他のサンプルなどの環境サンプルであってもよい。他の実施形態において、サンプルは、多生物サンプル（例えば、混合生物サンプル）であってもよい。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、生体組織または生物流体であるか、生体組織または生物流体を含む。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、骨髄、血液、血球、腹水、組織または微細針生検サンプル、細胞を含有する体液、遊離浮遊核酸、痰、唾液、尿、脳脊髄液、腹腔液、胸水、糞便、リンパ液、婦人科系体液、皮膚スワブ、膣スワブ、パップスメア、口腔スワブ、鼻スワブ、導管洗浄または気管支肺泡洗浄などの染液または洗浄液、膣液、吸引物、擦過物、骨髄標本、組織生検標本、胎児組織または体液、外科標本、糞便、他の体液、分泌液、および／または排泄物、および／またはこれらからの細胞などであってもよく、またはこれらを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、個体から得られた細胞であるか、または個体から得られた細胞を含む。いくつかの実施形態において、得られる細胞は、サンプルが得られる個体由来の細胞であるか、またはサンプルが得られる個体由来の細胞を含む。特定の実施形態において、生体サンプルは、被験体から得られる液体生検である。いくつかの実施形態において、サンプルは、任意の適切な手段によって目的の供給源から直接的に得られる「一次サンプル」である。例えば、いくつかの実施形態において、一次生体サンプルは、生検（例えば、微細針吸引または組織生検）、手術、体液（例えば、血液、リンパ液、糞便など）の採取などからなる群から選択される方法によって得られる。いくつかの実施形態において、文脈から明らかになるように、「サンプル」という用語は、一次サンプルを処理することによって（例えば、その１つ以上の構成要素を除去することによって、および／または１つ以上の薬剤をこれに加えることによって）得られる調製物を指す。例えば、半透過性膜を使用して濾過すること。このような「処理されたサンプル」は、例えば、サンプルから抽出されるか、または一次サンプルに対して、ｍＲＮＡの増幅または逆転写、特定の構成要素の単離および／または精製などの技術を行うことによって得られる核酸またはタンパク質を含んでいてもよい。
【００４５】
捕捉標識：本明細書で使用される場合、「捕捉標識」という用語（他の名称の中でも特に、「捕捉タグ」、「捕捉部分」、「アフィニティ標識」、「アフィニティタグ」、「エピトープタグ」、「タグ」、「プレイ」部分または化学基と呼ばれることもある）は、精製の目的のために標的分子または基質の中または表面に組み込まれ得る部分を指す。いくつかの実施形態において、捕捉標識は、低分子、核酸、ペプチド、または任意の固有に結合可能な部分を含む群から選択される。いくつかの実施形態において、捕捉標識は、核酸分子の５’に固定される。いくつかの実施形態において、捕捉標識は、核酸分子の３’に固定される。いくつかの実施形態において、捕捉標識は、いずれかの末端ではなく、核酸分子の内部配列中のヌクレオチドに結合する。いくつかの実施形態において、捕捉標識は、核酸分子中のヌクレオチドの配列である。いくつかの実施形態において、捕捉標識は、特に、ビオチン、ビオチンデオキシチミジンｄＴ、ビオチンＮＨＳ、ビオチンＴＥＧ、デシオビオチンＮＨＳ、ジゴキシゲニンＮＨＳ、ＤＮＰ  ＴＥＧ、チオールの群から選択される。いくつかの実施形態において、捕捉標識としては、限定されないが、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗体によって認識されるハプテン、特定の核酸配列および磁気誘引性粒子が挙げられる。いくつかの実施形態において、核酸分子の化学修飾（Ａｃｒｉｄｉｔｅ（商標）修飾、アデニル化、アジド修飾、アルキン修飾、Ｉ−Ｌｉｎｋｅｒ（商標）修飾など）が、捕捉標識として機能することができる。
【００４６】
切断部位：「開裂部位」および「ニック部位」とも呼ばれ、核酸分子中のヌクレオチド間の結合または結合対である。二本鎖核酸分子（例えば、二本鎖ＤＮＡ）の場合、切断部位は、切断した後に「平滑」末端が形成されるように二本鎖分子中に互いにすぐ隣接する結合（一般的にホスホジエステル結合）を伴っていてもよい。切断部位は、開裂したときに「粘着末端」が残され、それによって、分子の末端に一本鎖ヌクレオチドの領域が残るように、互いにすぐ反対側には無い対の各一本鎖上にある２つのヌクレオチド結合も伴っていてもよい。切断部位は、酵素（例えば、制限酵素）またはＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓ９などの配列認識能力を有する別のエンドヌクレアーゼによって認識されることが可能な特定のヌクレオチド配列によって定義することができる。切断部位は、このような酵素（すなわち、１型制限酵素）の認識配列内にあってもよく、いくつかの定義されたヌクレオチド間隔によってこれらの酵素に隣接していてもよい（すなわち、２型制限酵素）。切断部位は、特定のヌクレアーゼによって認識されることが可能な修飾ヌクレオチドの位置によって定義することもできる。例えば、脱塩基部位は、エンドヌクレアーゼＶＩＩおよび酵素ＦＰＧによって認識され、開裂することができる。ウラシル系は、酵素ＵＤＧによって認識され、脱塩基部位へとレンダリングすることができる。その他のＤＮＡ配列中のリボース含有ヌクレオチドは、相補性ＤＮＡ配列にアニーリングされると、ＲＮＡｓｅＨ２によって認識され、開裂することができる。
【００４７】
決定：本明細書に記載の多くの方法論は、「決定する」工程を含む。当業者は、本明細書を読むと、このような「決定する」ことが、例えば本明細書に明示的に言及される特定の技術を含め、当業者が利用可能な種々の技術のいずれかの使用によって利用されるか、または達成することができることを理解するだろう。いくつかの実施形態において、決定することは、物理的なサンプルの操作を伴う。いくつかの実施形態において、決定することは、例えば、関連する分析を行うように調整されたコンピュータまたは他の処理ユニットを利用した、データまたは情報の検討および／または操作を伴う。いくつかの実施形態において、決定することは、情報源から関連情報および／または資料を受信することを伴う。いくつかの実施形態において、決定することは、サンプルまたはエンティティの１つ以上の特徴を、比較可能な参照と比較することを伴う。
【００４８】
発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、以下の事象のうちの１つ以上を指す。（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡテンプレートの作成（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写物の処理（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成および／または３’末端形成による）、（３）ＲＮＡのポリペプチドもしくはタンパク質への翻訳、および／または（４）ポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾。
【００４９】
抽出部分：本明細書で使用される場合、「抽出部分」との用語（他の名称の中でも特に、「結合パートナー」、「アフィニティパートナー」、「ベイト」部分または化学基と呼ばれることもある）は、捕捉標識を欠く核酸からの捕捉標識を有する核酸のアフィニティ分離を可能にする単離可能な部分または任意の種類の分子を指す。いくつかの実施形態において、抽出部分は、低分子、核酸、ペプチド、抗体、または任意の固有に結合可能な部分を含む群から選択される。抽出部分は、官能基化された表面を形成するために、固相または他の表面に連結するか、または連結可能であってもよい。いくつかの実施形態において、抽出部分は、ある表面（例えば、固体表面、ビーズ、磁性粒子など）に連結されたヌクレオチドの配列である。いくつかの実施形態において、抽出部分は、アビジン、ストレプトアビジン、抗体、ポリヒスタジンタグ、ＦＬＡＧタグ、または付着化学のための表面の任意の化学修飾の群から選択される。これら後者の非限定的な例としては、「クリック」法を介して１，２，３−トリアゾール結合を形成し得るアジドおよびアルキン基が挙げられ、またはチオール、アジドおよび末端アルキン、アクリダイト修飾されたオリゴヌクレオチドと共有反応することが可能なチオール修飾された表面、ならびにＩ−Ｌｉｎｋｅｒ（商標）標識されたオリゴヌクレオチドに結合するように反応可能なアルデヒドおよびケトン修飾された表面が挙げられる。
【００５０】
官能基化された表面：本明細書で使用される場合、「官能基化された表面」という用語は、捕捉標識を結合または固定する（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ）ことが可能な固体表面、ビーズまたは別の固定された（ｆｉｘｅｄ）表面を指す。いくつかの実施形態において、官能基化された表面は、捕捉標識を結合することが可能な抽出部分を含む。いくつかの実施形態において、抽出部分は、ある表面に直接的に連結される。いくつかの実施形態において、表面の化学修飾は、抽出部分として機能する。いくつかの実施形態において、官能基化された表面は、他のガラスまたは非ガラス表面の中でも特に、孔径が制御された多孔質ガラス（ＣＰＧ）、磁気多孔質ガラス（ＭＰＧ）を含んでいてもよい。化学官能基化は、特に、ケトン修飾、アルデヒド修飾、チオール修飾、アジド修飾およびアルキン修飾を伴っていてもよい。いくつかの実施形態において、アダプター合成に使用される官能基化された表面およびオリゴヌクレオチドは、他の表面化学の中でも特に、アミド結合、アルキルアミン結合、チオ尿素結合、ジアゾ結合、ヒドラジン結合を形成する固定化化学の群のうちの１つ以上を用いて連結される。いくつかの実施形態において、アダプター合成に使用される官能基化された表面およびオリゴヌクレオチドは、他の連結試薬の中でも特に、ＥＤＡＣ、ＮＨＳ、過ヨウ素酸ナトリウム、グルタルアルデヒド、ピリジルジスルフィド、硝酸、ビオチンを含む試薬群のうちの１つ以上を用いて連結される。
【００５１】
ｇＲＮＡ：本明細書で使用される場合、「ｇＲＮＡ」または「ガイドＲＮＡ」は、標的エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ酵素（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）または同様の特性を有する別のリボ核酸タンパク質など）を、ＤＮＡまたはＲＮＡの特定の領域の切断を容易にする実質的に標的特異性の配列に結合するのに適した足場配列を含む短いＲＮＡ分子を指す。
【００５２】
核酸：本明細書で使用される場合、その最も広い意味で、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれているか、または組み込まれ得る任意の化合物および／または物質を指す。いくつかの実施形態において、核酸は、ホスホジエステル結合を介してオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれているか、または組み込まれ得る化合物および／または物質である。文脈から明らかになるように、いくつかの実施形態において、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指し、いくつかの実施形態において、「核酸」は、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態において、「核酸」は、ＲＮＡであるか、またはＲＮＡを含み、いくつかの実施形態において、「核酸」は、ＤＮＡであるか、またはＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、１つ以上の天然核酸残基であるか、１つ以上の天然核酸残基を含むか、または１つ以上の天然核酸残基からなる。いくつかの実施形態において、核酸は、１つ以上の核酸類似体であるか、１つ以上の核酸類似体を含むか、または１つ以上の核酸類似体からなる。いくつかの実施形態において、核酸類似体は、ホスホジエステル骨格を利用しない点において核酸と異なる。例えば、いくつかの実施形態において、核酸は、１つ以上の「ペプチド核酸」であるか、１つ以上の「ペプチド核酸」を含むか、または１つ以上の「ペプチド核酸」からなり、「ペプチド核酸」は、当該技術分野で既知であり、骨格内にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有し、本技術の範囲内であると考えられる。これに代えて、またはこれに加えて、いくつかの実施形態において、核酸は、ホスホジエステル結合ではなく、１つ以上のホスホロチオエート結合および／または５’−Ｎ−ホスホラミダイト結合を有する。いくつかの実施形態において、核酸は、１つ以上の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシンおよびデオキシシチジン）であるか、１つ以上の天然ヌクレオシドを含むか、または１つ以上の天然ヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態において、核酸は、１つ以上のヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニルシチジン、Ｃ−５プロピニルウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−プロピニルシチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、０（６）−メチルグアニン、２−チオシチジン、メチル化塩基、インターカレーションされた塩基、およびこれらの組み合わせ）であるか、１つ以上のヌクレオシド類似体を含むか、または１つ以上のヌクレオシド類似体からなる。いくつかの実施形態において、核酸は、天然核酸中に一般的に存在する糖類と比較して、１つ以上の修飾された糖類（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、ヘキソースまたはロックド核酸）を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、ＲＮＡまたはタンパク質などの機能的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、核酸は、１つ以上のイントロンを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、非タンパク質コードＲＮＡ産物、例えば、マイクロＲＮＡ、リボソームＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡであってもよい。いくつかの実施形態において、核酸は、ゲノムにおいて調節目的を果たす。いくつかの実施形態において、核酸は、ゲノムから生じない。いくつかの実施形態において、核酸は、遺伝子間配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、染色体外要素または非核ゲノム（ミトコンドリア、クロロプラストなど）に由来する。いくつかの実施形態において、核酸は、天然源からの単離、相補性テンプレートに基づく重合による酵素合成（インビボまたはインビトロで）、組換え細胞または系における生殖および化学合成のうちの１つ以上によって調製される。いくつかの実施形態において、核酸は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００残基長、またはもっと長い残基長である。いくつかの実施形態において、核酸は、部分的または完全に一本鎖であり、いくつかの実施形態において、核酸は、部分的または完全に二本鎖である。いくつかの実施形態において、核酸は、ポリペプチドをコードするか、またはポリペプチドをコードする配列の相補体である少なくとも１つの要素を含むヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、核酸は、酵素活性を有する。いくつかの実施形態において、核酸は、例えば、リボ核酸タンパク質複合体またはトランスファーＲＮＡにおいて、機械的な機能を果たす。いくつかの実施形態において、核酸は、アプタマーとして機能する。いくつかの実施形態において、核酸は、データ貯蔵に使用されてもよい。いくつかの実施形態において、核酸は、インビトロで化学的に合成されてもよい。
【００５３】
参照：本明細書で使用される場合、これに対して相対的に比較が行われる標準または対照を記載する。例えば、いくつかの実施形態において、目的の薬剤、動物、個体、集合体、サンプル、配列または値を、参照または対照の薬剤、動物、個体、集合体、サンプル、配列または値と比較する。いくつかの実施形態において、参照または対照は、目的の試験もしくは決定と実質的に同時に試験され、および／または決定される。いくつかの実施形態において、参照または対照は、場合により有形の媒体で具現化されていてもよい、歴史的な参照または対照である。典型的には、当業者に理解されるように、参照または対照は、評価されるものと同等の条件もしくは状況下で決定されるか、または特徴付けられる。当業者は、特定の可能な参照もしくは対照に対する信頼および／または比較を正当化するのに十分な類似性がいつ存在するかを理解するだろう。
【００５４】
単一分子識別子（ＳＭＩ）：本明細書で使用される場合、「単一分子識別子」または「ＳＭＩ」という用語（特に、「タグ」、「バーコード」、「分子バーコード」、「固有分子識別子」すなわち「ＵＭＩ」と呼ばれてもよい）は、より大きな異種の分子集合体の中で個々の分子を区別することが可能な任意の物質（例えば、ヌクレオチド配列、核酸分子特徴）を指す。いくつかの実施形態において、ＳＭＩは、外部から適用されるＳＭＩであってもよく、または外部から適用されるＳＭＩを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、外部から適用されるＳＭＩは、変性または半変性した配列であってもよく、または変性または半変性した配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、実質的に変性したＳＭＩは、ランダム固有分子識別子（Ｒ−ＵＭＩ）として知られる場合もある。いくつかの実施形態において、ＳＭＩは、既知のコードのプール内からのコード（例えば、核酸配列）を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、所定のＳＭＩコードは、定義された固有分子識別子（Ｄ−ＵＭＩ）として知られる。いくつかの実施形態において、ＳＭＩは、内因性ＳＭＩであってもよく、または内因性ＳＭＩを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、内因性ＳＭＩは、標的配列の特定の剪断点、または標的配列を含む個々の分子の末端に関連する特徴に関連する情報であってもよく、またはこれらの情報を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ＳＭＩは、核酸分子に対する無作為または半無作為な損傷、化学修飾、酵素による修飾、または他の修飾によって引き起こされる、核酸分子における配列変動に関連するものであってもよい。いくつかの実施形態において、上述の修飾は、メチルシトシンの脱アミノ化であってもよい。いくつかの実施形態において、上述の修飾は、核酸ニックの部位を伴っていてもよい。いくつかの実施形態において、ＳＭＩは、外因性の要素と内因性の要素の両方を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ＳＭＩは、物理的に隣接するＳＭＩ要素を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ＳＭＩ要素は、分子内で空間的に明確に区別されてもよい。いくつかの実施形態において、ＳＭＩは、非核酸であってもよい。いくつかの実施形態において、ＳＭＩは、２つ以上の異なる種類のＳＭＩ情報を含んでいてもよい。ＳＭＩの種々の実施形態は、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１７／１００４４１号にさらに開示される。
【００５５】
鎖定義要素（ＳＤＥ）：本明細書で使用される場合、「鎖定義要素」または「ＳＤＥ」という用語は、二本鎖核酸物質の特定の鎖の識別を可能にし、したがって、他の／相補性の鎖からの区別を可能にする任意の材料（例えば、配列決定または他の核酸インテロゲーションの後に、標的二本鎖核酸から得られる２つの一本鎖核酸各々の増幅産物を互いに実質的に区別可能にする任意の材料）を指す。いくつかの実施形態において、ＳＤＥは、アダプター配列中の実質的に非相補性の配列の１つ以上のセグメントであってもよく、またはこのセグメントを含んでいてもよい。特定の実施形態において、アダプター配列中の実質的に非相補性の配列のセグメントは、Ｙ字型または「ループ」形状を含むアダプター分子によって提供されてもよい。他の実施形態において、アダプター配列中の実質的に非相補性の配列のセグメントは、アダプター配列中の隣接する相補性配列の中央に、対になっていない「バブル」を形成してもよい。他の実施形態において、ＳＤＥは、核酸修飾を包含してもよい。いくつかの実施形態において、ＳＤＥは、対になった鎖から物理的に分離した反応コンパートメントへの物理的な分離を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ＳＤＥは、化学修飾を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＳＤＥは、修飾された核酸を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＳＤＥは、核酸分子に対する無作為または半無作為な損傷、化学修飾、酵素による修飾、または他の修飾によって引き起こされる、核酸分子における配列変動に関連するものであってもよい。いくつかの実施形態において、上述の修飾は、メチルシトシンの脱アミノ化であってもよい。いくつかの実施形態において、上述の修飾は、核酸ニックの部位を伴っていてもよい。ＳＤＥの種々の実施形態は、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１７／１００４４１号にさらに開示される。
【００５６】
被験体：本明細書で使用される場合、「被験体」という用語は、生物、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、いくつかの実施形態において、産前ヒト形態を含む）を指す。いくつかの実施形態において、被験体は、関連する疾患、障害または状態に罹患している。いくつかの実施形態において、被験体は、ある疾患、障害または状態にかかりやすい。いくつかの実施形態において、被験体は、ある疾患、障害または状態の１つ以上の症状または特徴を示す。いくつかの実施形態において、被験体は、ある疾患、障害または状態の症状または特徴を何ら示さない。いくつかの実施形態において、被験体は、ある疾患、障害もしくは状態に対するかかりやすさ、またはある疾患、障害もしくは状態のリスクに特徴的な１つ以上の特徴を有する誰かである。いくつかの実施形態において、被験体は、患者である。いくつかの実施形態において、被験体は、診断および／または治療が実施されるか、および／または実施された個体である。
【００５７】
実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的の特徴または性質の全体またはほぼ全体の程度または度合いを示す定性的な状態を指す。生物学の当業者は、生物学的現象および化学的現象が、完全に終了すること、および／または完全に終了することに向けて進むこと、または絶対的な結果を達成するか、または回避することは、もしあるにしてもまれであることを理解するだろう。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物学的現象および化学的現象に固有の潜在的に完全に終了することはないことを捕捉するために本明細書で使用される。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本技術は、一般的に、配列決定用途および他の核酸物質インテロゲーションのための核酸物質の濃縮方法、ならびにこのような方法で使用するための関連する試薬に関する。本技術のいくつかの実施形態は、高精度の配列決定リードを達成するための二本鎖配列用途および他の配列決定用途などの配列決定用途のために核酸物質内の目的の１つ以上の領域を濃縮することを対象とする。例えば、本技術の種々の実施形態は、目的の領域について核酸物質（例えば、ゲノムＤＮＡ物質）を選択的に濃縮することと、二本鎖配列決定方法を行い、濃縮された核酸物質のエラー修正済配列リードを提供することと、を含む。本技術のさらなる例は、目的の領域について濃縮された核酸物質に対して二本鎖配列決定方法または他の配列決定方法（例えば、単一コンセンサス配列決定方法、Ｈｙｂ＆Ｓｅｑ（商標）配列決定方法、ナノポア配列決定方法など）を行う方法を対象とする。様々な実施形態において、核酸物質の濃縮（目的の領域（複数可）への核酸物質の濃縮を含む）は、より速い速度で（例えば、より少ない工程で）、少ない費用で（例えば、少ない試薬を利用して）提供され、より多くの望ましいデータが得られる。本技術の種々の態様は、前臨床および臨床での試験および診断において多くの用途を有するだけではなく、他の用途も有する。
【００５９】
二本鎖配列決定（ＤＳ）は、二本鎖核酸分子からエラー修正済核酸配列を生成する方法である。本技術の特定の態様において、ＤＳを使用して、誘導体配列リードを、大規模並列配列決定中に同じ二本鎖核酸親分子に由来するものとして認識することができるだけではなく、配列決定後に区別可能なエンティティとして互いに区別されるような様式で、個々の核酸分子の両方の鎖を独立して配列決定することができる。次いで、各鎖から得られる配列リードを、二本鎖コンセンサス配列として知られる元の二本鎖核酸分子のエラー修正済配列を得るという目的のために比較する。ＤＳのプロセスは、元の二本鎖核酸分子の片方または両方の鎖が、二本鎖コンセンサス配列を形成するために使用される作成された配列決定データ中に現れるかどうかを確認することを可能にする。
【００６０】
標準的な次世代配列決定のエラー率は、およそ１／１００〜１／１０００程度であり、分子の１／１００〜１／１０００未満が配列バリアントを有する場合、その存在は、配列決定プロセスのバックグラウンドエラー率によって不明瞭になる。一方、ＤＳは、得られる高度なエラー修正に起因して、きわめて低い頻度のバリアントを正確に検出することができる。ＤＳの鎖比較技術によって提供される高度なエラー修正は、標準的な次世代配列決定方法と比較して、二本鎖核酸分子の配列決定エラーを数桁程度減少させる。このエラーの減少は、ほぼ全ての種類の配列において、配列決定の精度を向上させるが、特にエラーが起こりやすいことが当該技術分野でよく知られている生化学的に厳しい配列にとって、または配列決定される分子集合体が異種である（すなわち、分子の少数の部分集合体が、その他の分子が有していない配列バリアントを有する）場合に、特に十分に適している場合がある。このような種類の配列の非限定的な一例は、ホモポリマーまたは他のマイクロサテライト／ショートタンデムリピートである。ＤＳのエラー修正から利益を得るエラーが起こりやすい配列の別の非限定的な例は、例えば、加熱、放射線、機械的応力、または１つ以上のヌクレオチドポリメラーゼによってコピーする間にエラーが起こりやすい化学付加物を生成し、また分子の末端として、またはニックおよびギャップとして一本鎖ＤＮＡを生成する種々の化学曝露によって損傷を受けた分子である。固定プロセス（すなわち、臨床病理学におけるＦＦＰＥ）によって起こる、高度に損傷を受けたＤＮＡ（酸化、脱アミノ化など）、または古代のＤＮＡ、または物質が苛酷な化学物質または環境に曝露された法医学用途において、二本鎖配列決定は、その損傷が与える高いエラーレベルが得られるのを減少させるのに特に有用である。
【００６１】
さらなる実施形態において、ＤＳは、二本鎖核酸分子の集合体の中で少数の配列バリアントの正確な検出にも使用することができる。本出願の非限定的な一例は、被験体内の癌ではない組織からの多数の変異していない分子の中で、癌に由来する少数のＤＮＡ分子の検出である。ＤＳは、標準的な配列決定のエラー率が特に高い、ゲノムの配列決定が困難な領域（ホモポリマー、マイクロサテライト、グアニン四重項など）の正確な遺伝子型決定にも十分に適している。ＤＳによる稀少なバリアント検出のための別の非限定的な用途は、遺伝毒性物質曝露から生じるＤＮＡ損傷の早期検出である。ＤＳのさらなる非限定的な用途は、ドライバー変異と共に出現している遺伝子クローンに注目することによって、遺伝毒性または非遺伝毒性の発癌物質から生成される変異の検出のための用途である。少数配列バリアントの正確な検出のためのなおさらなる非限定的な用途は、遺伝毒性物質と関連する変異誘発性シグネチャを作成することである。ＤＳの有用性のさらなる非限定的な例は、Ｓａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０１８、ＰＭＩＤ  ２９５７６６１５中に見出すことができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６２】
配列決定用途および他の核酸物質インテロゲーションのための核酸物質の濃縮に関する種々の実施形態は、単一分子配列決定および直接デジタル配列決定方法において有用である。いくつかの実施形態において、バーコード化されたプローブとの単一分子ハイブリダイゼーションを用いる技術を使用して、ゲノム領域を特性決定および／または定量化してもよい。概して、このような技術は、分子「バーコード」および単一分子画像診断を使用して、増幅することなく単一反応において特定の核酸標的を検出し、計数する。典型的には、各々のカラーコードが付けられたバーコードは、目的のゲノム領域に対応する単一標的に特異的なプローブに結合する。対照と混合すると、多重化されたコードセットを形成する。いくつかの実施形態において、２つのプローブを使用して、各々の個々の標的核酸をハイブリダイズする。特定の配置において、レポータープローブは、信号を運び、捕捉プローブは、データ収集のために複合体を固定することを可能にする。ハイブリダイゼーションの後、過剰なプローブが除去され、固定されたプローブ／標的複合体は、データ収集のためのデジタルアナライザによって分析されてもよい。カラーコードを計数し、各標的分子（例えば、目的のゲノム領域）について表にする。適切なデジタルアナライザとしては、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；シアトル、ＷＡ）が挙げられる。分子「バーコード」を含む方法および試薬、ならびにＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）技術に適した装置が、例えば、米国特許公開第２０１０／０１１２７１０号、同第２０１０／００４７９２４号、同第２０１０／００１５６０７号にさらに記載され、それらの内容全体がそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【００６３】
直接デジタル配列決定（ＤＤＳ）技術は、種々の研究、診断および他の用途のためにＤＮＡおよびＲＮＡを同時に捕捉し、直接的に配列決定する、非常に正確な単一分子配列決定を提供するための方法を含む。ＤＤＳは、ライブラリ作成または増幅工程を行わずに、短い配列決定リードおよび長い配列決定リードを両方とも提供し、例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１６／０８１７４０号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。概して、核酸標的の直接配列決定は、天然の核酸標的への蛍光分子バーコードのハイブリダイゼーションによって達成される。米国特許第７，９１９，２３７号にさらに記載され、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（シアトル、ＷＡ）から入手可能なように、標的ヌクレオチド配列の伸長であるオリゴマーは、各モノマーが固有の標識に接続されているモノマーを空間的に分離する電気伸長技術によって伸長される。したがって、標識されたモノマーのパターンを使用して、オリゴマータグ上のバーコードを識別することができる。
【００６４】
これに加え、核酸物質の濃縮に関する種々の実施形態は、核酸物質の特性決定および／または定量化の他の形態において有用性があり、当該技術分野で既知である。例えば、ゲノム変異の有無、ＤＮＡバリアント、ＤＮＡまたはＲＮＡのコピー数の定量化、および他の用途を決定するための核酸物質の特性決定は、本明細書に提供されるような標的核酸物質の選択的な濃縮から利益を受け得る。いくつかの方法論の例としては、限定されないが、特に、単一分子配列決定（例えば、単一分子リアルタイム配列決定、ナノポア配列決定、高スループット配列決定または次世代配列決定（ＮＧＳ）など）、デジタルＰＣＲ、ブリッジＰＣＲ、エマルションＰＣＲ、半導体配列決定が挙げられる。当業者は、濃縮された核酸物質を調べ、および／または濃縮された核酸物質から利益を受けるように適切に使用可能な他の核酸インテロゲーション方法および技術を認識するだろう。
【００６５】
ＤＳおよび他の配列決定様式を組み込んだ方法は、１つ以上の配列決定アダプターを標的二本鎖核酸分子にライゲーションし、二本鎖標的核酸複合体を生成することを含んでいてもよい。このようなアダプター分子は、例えば、配列決定プライマー認識部位、増幅プライマー認識部位、バーコード（例えば、単一分子識別子（ＳＭＩ）配列、インデックス配列、一本鎖部分、二本鎖部分、鎖識別要素または特徴など、ＭＰＳプラットフォームに適した種々の特徴のうちの１つ以上を含んでいてもよい。ＤＳまたは任意の次世代配列決定技術のための非常に純粋な配列決定アダプターの使用は、高品質の再現可能なデータを取得し、サンプルの配列収率（すなわち、独立した配列リードに変換される、インプットされた分子の相対割合）を最大化するために重要である。このことは、元々の二本鎖分子の両方の鎖を首尾良く回収する必要があるため、ＤＳでは特に重要である。
【００６６】
ＤＳプロセスまたは他の高精度の配列決定様式の効率に関して、本明細書では、変換効率とワークフロー効率の２種類の効率をさらに記載する。ＤＳの効率を考察する目的のために、変換効率は、少なくとも１つの二本鎖コンセンサス配列リードが作られる配列決定ライブラリ調製反応にインプットされる固有の核酸分子の分率であると定義することができる。ワークフロー効率は、二本鎖配列決定ライブラリを生成し、および／または目的の配列についての標的化濃縮を行うためにこれらの工程を行うのに必要な時間量、工程の相対数および／または試薬／材料の調達費用に対する相対的な非効率性に関連する場合がある。
【００６７】
いくつかの場合において、変換効率およびワークフロー効率のいずれかまたは両方の制限は、その制限がなければ非常に十分に適しているであろういくつかの用途について、高精度ＤＳの有用性を制限する場合がある。例えば、低い変換効率は、標的二本鎖核酸のコピー数が制限される状況をもたらす場合があり、これにより、作られる配列情報が所望な量より少なくなる場合がある。この概念の非限定的な例としては、循環腫瘍細胞由来のＤＮＡまたは腫瘍由来の無細胞ＤＮＡ、または血漿などの体液に流れ込み、他の組織由来の過剰なＤＮＡと混合した出生前乳児が挙げられる。ＤＳは、典型的には、１０万を超える変異していない分子の中で１個の変異体分子を分割することができる精度を有するが、例えば、サンプル中の利用可能な分子が１０，０００個しかない場合、これらを二本鎖コンセンサス配列リードに変換する理想的な効率が１００％であったとしても、測定可能な最も低い変異頻度は、１／（１０，０００＊１００％）＝１／１０，０００であろう。臨床診断として、癌または治療に関連する変異の低レベルの信号を検出するための最大感度を有することが重要な場合があり、そのため、この内容では、比較的低い変換効率は、望ましくないだろう。同様に、法医学用途では、試験に利用可能なＤＮＡが非常に少ないことが多い。犯罪現場または自然災害の現場から、わずかナノグラム量またはピコグラム量を回収することができる場合、また、複数の個体からのＤＮＡが混合している場合、混合物中の全ての個体のＤＮＡの存在を検出することができるという点で、最大の変換効率を有することが重要な場合がある。
【００６８】
いくつかの場合において、ワークフローの非効率性は、特定の核酸インテロゲーション用途にとって同様に課題となり得る。この非限定的な例の１つは、臨床微生物学試験である。時に、１つ以上の感染性生物、例えば、一部の生物が、保有する固有の遺伝子バリアントに基づき、特定の抗生物質に対して耐性である、微生物または複数菌の血流感染の性質を迅速に検出することが望まれるが、培養し、感染性生物の抗生物質感度を経験的に決定するのにかかる時間は、治療に使用される抗生物質についての治療上の決定を行わなければならない時間よりもはるかに長い。血液（または他の感染した組織または体液）由来のＤＮＡのＤＮＡ配列決定は、さらに迅速である可能性を有し、他の高精度の配列決定方法の中で特にＤＳは、例えば、ＤＮＡシグネチャに基づいて、感染性集合体において治療に重要な少数のバリアントを非常に正確に検出することができる。データ作成までのワークフロー回転時間が、治療選択肢を決定するために重要な場合があるため（例えば、本明細書で使用される例のように）、データ出力に到達する速度を上げるための応用も望ましいだろう。
【００６９】
種々の核酸物質インテロゲーション用途のための標的核酸配列濃縮のための方法および組成物が、本明細書でさらに開示される。特に、本技術のいくつかの態様は、標的核酸物質濃縮のための方法および組成物、ならびに費用、配列決定される分子の変換、標的化超高精度の配列決定のための標識された分子を作成する時間効率における改善を提供する、エラー修正済核酸配列決定用途のためのこのような濃縮の使用を対象とする。
【００７０】
Ｉ．核酸物質の濃縮のための方法および試薬の選択された実施形態
いくつかの実施形態において、提供される方法は、エラー修正のための分子バーコードの使用と適合する標的化濃縮戦略を提供する。他の実施形態は、ＤＤＳおよび分子バーコード付けを使用しない他の配列決定戦略（例えば、単分子配列決定様式およびインテロゲーション）と適合する、増幅に基づかない標的化濃縮戦略のための方法を提供する。
【００７１】
いくつかの実施形態において、配列決定プロセスの効率、精度および／または速度を改善するように核酸物質を処理することが有利である。本技術のさらなる態様によれば、例えば、ＤＳの効率は、標的核酸のフラグメント化によって高めることができる。典型的には、核酸（例えば、ゲノム、ミトコンドリア、プラスミドなど）のフラグメント化は、物理的な剪断（例えば、超音波処理）またはＤＮＡホスホジエステル結合を開裂するために酵素カクテルを利用する、比較的非配列特異的な酵素手法のいずれかによって達成される。上述の方法のいずれかの結果は、無傷の核酸物質（例えば、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ））が、無作為または半無作為にサイジングされた核酸フラグメントの混合物に還元されているサンプルである。これらの手法は、効果的ではあるが、様々な大きさの核酸フラグメントを作成し、増幅バイアス（例えば、短いフラグメントは、長いフラグメントよりも効率的にＰＣＲ増幅する傾向があり、ポロニー形成中により容易にクラスタ増幅し得る）および不均一な配列決定深さを引き起こす場合がある。例えば、図１は、核酸インサートサイズと、ライブラリ調製中に多様な分子バーコードでタグ化されたＤＮＡ分子の集合体の増幅後に得られたファミリーサイズとの間の関係をプロットしたグラフである。図１に示すように、短いフラグメントは、優先的に増幅する傾向があるため、平均して、これらの短いフラグメントは各々、多くの数のコピーが生成し、配列決定され、これらの領域の不均一なレベルの配列決定深さを提供する。
【００７２】
さらに、長いフラグメントを用いると、配列決定リードの限界間（またはペアエンド配列決定リードの末端間）にあるＤＮＡの一部は、それが配列決定プラットフォームの最大リード長さを超えて伸長する場合に、調べることができず、首尾良くライゲーションされ、増幅され、捕捉されたのにもかかわらず、「ダーク」となる（図２Ａ）。同様に、短いフラグメントを用いると、ペアエンド配列決定を用いるときに、両リードからの分子の中央にある同じ配列をカバーする際に重複したリードが、冗長情報を提供し、費用対効率が悪い（図２Ｂ）。無作為または半無作為な核酸フラグメント化は、標的分子内中に予測不可能な切断点を生じる場合もあり、ハイブリッド捕捉のためのベイト鎖に対して相補性を有し得ないか、または相補性が低下し得るフラグメントが得られ、それによって、標的捕捉効率が低下する。無作為または半無作為なフラグメント化は、目的の配列を破壊するか、および／またはライブラリ調製の他の段階中に失われる非常に小さいか、または非常に大きいフラグメントが得られる場合があり、データ収率および効率が低下し得る。
【００７３】
無作為なフラグメント化の多くの方法（特に、機械的方法または音響的方法）に伴う１つの他の問題は、二本鎖ＤＮＡの一部をもはや二本鎖ではなくしてしまう可能性がある、二本鎖切断を超える損傷を誘導することである。例えば、機械剪断は、分子末端に３’または５’オーバーハングを生成することがあり、分子の中央に一本鎖ニックまたはギャップを生成することがある。例えば、「末端修復」酵素のカクテルなど、これらのアダプターライゲーションに適した一本鎖部分を使用して、これを再び人工的に二本鎖にすると、人工的なエラー源（例えば、本明細書に記載の「偽の二本鎖分子」）となる場合がある。多くの実施形態において、取り扱い中に天然の二本鎖形態のままである目的の二本鎖核酸の量を最大化することが最適である。これに加え、無作為または半無作為な機械的フラグメント化の多くの方法に関与する高いエネルギーは、ＤＮＡ損傷（例えば、酸化、脱アミノ化または増幅または配列決定中に変異原性または阻害性となり得、人為的な塩基コールまたは信号減少を導入し得る他の付加物生成）の量を増やす。いくつかの無作為または半無作為な酵素フラグメント化方法は、同様に、部分的な切断部位に変異原性または遮断性の「傷跡」を残す場合がある。
【００７４】
これに加え、ＤＳ処理のために、元々の標的核酸分子の両方の鎖が、首尾良くライゲーションされなければならない。例えば、アダプターが分子の５’末端および３’末端の両方にライゲーションされる実施形態において、４個のホスホジエステル結合が首尾良く生成しなければならない。これらの結合の１つが形成されない場合、この分子の両方の鎖を増幅し、配列決定することは不可能になる。上述のように、例えば、必要な結合の形成失敗は、特に、標的二本鎖核酸分子の末端への損傷、ライブラリフラグメントの不完全な末端修復または尾部修復、不完全な合成または損傷を受けたアダプター分子、ライゲーションまたはその後の反応と、例えば望ましくない酵素活性（例えば、アダプターまたはライブラリフラグメントのライゲーション可能末端を破壊し得るエキソヌクレアーゼ活性、または多次元で触媒活性を不効率化するライゲーション酵素の変性）とのコンタミネーションを含む複数の理由で起こり得る。ライブラリフラグメントの末端への損傷は、高エネルギーの超音波または他の機械的なＤＮＡフラグメント化で特に一般的であろう。
【００７５】
アダプターライゲーションの成功に加え、アダプター−標的核酸複合体の第１の鎖および第２の鎖の両方が、二本鎖配列の精度を達成するために増幅可能でなければならない。例えば、標的核酸分子の特定の鎖が、ポリメラーゼが横断することができない様式でニックまたは損傷がある場合、この特定の鎖の増幅は起こらず、二本鎖コンセンサス配列リードを作成することができない。横断することができない損傷は、非限定的な例として、超音波ＤＮＡフラグメント化、高温または長期間の酵素工程またはライブラリ調製中の一本鎖ニッキング活性によって導入され得る。
【００７６】
したがって、ＤＳは、他の用途の中でも特に、増幅工程の前の標的核酸物質の濃縮を含め、サンプル中の標的核酸の濃縮のための１つ以上の方法を利用することによって、効率改善から利益を受けるだろう。その基礎となる方法にかかわらず、稀少な核酸バリアントの検出は、多数の分子のスクリーニングを必要とする。しかし、ライブラリ中で同時に調製される分子（すなわち、ゲノム当量）が多いほど、そのプロセスの相対効率は低くなる。
【００７７】
本技術の種々の態様は、配列決定用途および他の核酸インテロゲーションのための核酸物質の濃縮のための方法、試薬、核酸ライブラリおよびキットを提供する。本技術のさらなる態様は、上に列挙した制限の大部分を克服するために、ＤＳおよび他の配列決定様式の変換効率およびワークフロー効率の両方を改善するための複数の解決策を提供する。
【００７８】
本技術のいくつかの態様は、クラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）のプログラマブルエンドヌクレアーゼ系を用いて目的の領域（複数可）を濃縮するための方法を対象とする。他の態様において、ＣＲＩＳＰＥＲ様または他のプログラマブルエンドヌクレアーゼ、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼまたは他の配列特異的エンドヌクレアーゼ、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼまたは単純制限ヌクレアーゼ、またはこれらの誘導体を単独で、または開示される技術の一部として組み合わせて使用してもよい。
【００７９】
特に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（または他のプログラマブルまたは非プログラマブルエンドヌクレアーゼ、またはこれらの組み合わせ）を使用して、１つ以上の定義または半定義された領域において核酸骨格を選択的に開裂し、目的の１つ以上の配列領域を機能的に切断し、この領域から、切断された標的領域（複数可）が１つ以上の所定の長さまたは実質的に所定の長さであるように設計された、より長い核酸分子を機能的に切断し、それにより、ＤＳなどの配列決定用途のためのライブラリ調製の前にサイズ選択を介し、目的の１つ以上の核酸標的領域の濃縮を可能にする。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（または他のプログラマブルエンドヌクレアーゼまたは非プログラマブルエンドヌクレアーゼ、またはこれらの組み合わせ）を使用して、目的の１つ以上の配列領域を選択的に切断することができ、この切断された標的領域（複数可）が、実質的に所定の長さを有し、オーバーハングの配列を有するように設計される。これらのプログラマブルエンドヌクレアーゼは、単独で、または他の形態の標的ヌクレアーゼ、例えば、制限エンドヌクレアーゼ、または核酸を開裂するための他の酵素方法または非酵素方法と組み合わせて使用されてもよい。
【００８０】
いくつかの実施形態において、提供される方法は、核酸物質を提供する工程と、実質的に所定の長さである１つ以上の標的領域が核酸物質の残りから分離されるか、または濃縮されるように、核酸物質を標的エンドヌクレアーゼ（例えば、リボ核酸タンパク質複合体）で切断する工程と、切断した標的領域を分析する工程と、を含んでいてもよい。他の実施形態において、１つ以上の切断した領域は、核酸物質の残りから陰性濃縮（すなわち、枯渇）され、分析されなくてもよい。いくつかの実施形態において、提供される方法は、少なくとも１つのＳＭＩおよび／またはアダプター配列を、所定の長さの切断した標的領域の５’または３’末端のうちの少なくとも１つにライゲーションすることをさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、分析することは、定量化および／または配列決定であってもよく、またはこれらを含んでいてもよい。
【００８１】
いくつかの実施形態において、定量化は、分光光度分析、リアルタイムＰＣＲ、および／または蛍光に基づく定量化（例えば、蛍光染料タグ化を用いる）であってもよく、またはこれらを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、配列決定は、Ｓａｎｇｅｒ配列決定、ショットガン配列決定、ブリッジＰＣＲ、ナノポア配列決定、単分子リアルタイム配列決定、イオントレント配列決定、パイロシーケンシング、デジタル配列決定（例えば、デジタルバーコードに基づく配列決定）、ライゲーションによる配列決定、ポロニーに基づく配列決定、電流に基づく配列決定（例えば、トンネル電流）、質量分析法による配列決定、マイクロ流体に基づく配列決定、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定、次世代配列決定、大規模並列、およびこれらの任意の組み合わせであってもよく、またはこれらを含んでいてもよい。
【００８２】
いくつかの実施形態において、標的エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）または他のリボ核酸タンパク質複合体、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、アルゴノートヌクレアーゼ、メガＴＡＬヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼおよび／または制限エンドヌクレアーゼのうちの少なくとも１つであるか、またはこれらを含む。いくつかの実施形態において、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはもっと多く）の標的エンドヌクレアーゼが使用されてもよい。いくつかの実施形態において、標的ヌクレアーゼを使用して、所定の長さの２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはもっと多く）の潜在的な標的領域を切断してもよい。所定の長さの２つ以上の標的領域が存在するいくつかの実施形態において、各標的領域は、同じ（または実質的に同じ）長さのものであってもよい。所定の長さの２つ以上の標的領域が存在するいくつかの実施形態において、所定の長さの標的領域のうちの少なくとも２つは長さが異なっている（例えば、１００ｂｐの長さを有する第１の標的領域および１，０００ｂｐの長さを有する第２の標的領域）。
【００８３】
本開示は、特に、標的核酸物質のアフィニティに基づく濃縮のための方法および試薬を提供する。このような方法を含むいくつかの実施形態において、１つ以上の捕捉標識または部分が、ゲノム材料、標的外の核酸物質、コンタミネーションした核酸物質、混合サンプルからの核酸物質、ｃｆＤＮＡ物質などを含むサンプルからの所望な標的核酸物質の濃縮／選択に使用されてもよい。例えば、いくつかの実施形態は、所望な標的核酸物質（例えば、標的配列または目的のゲノム領域を含むフラグメント、フラグメント化されていないゲノムＤＮＡ中の目的の標的ゲノム領域）の陽性濃縮／選択のための１つ以上の捕捉標識／部分の使用を含む。他の実施形態において、捕捉標識は、望ましくないゲノム材料を除去するか、または量を減少させるための陰性濃縮／選択に使用されてもよい。
【００８４】
例えば、陽性濃縮を含むいくつかの実施形態において、アダプターオリゴヌクレオチドは、例えば、官能基化された表面（例えば、常磁性ビーズまたは他の形態のビーズ）に結合した抽出部分（例えば、ストレプトアビジン）を介して、１つ以上のその後の精製工程における捕捉を介して所望なアダプター−核酸複合体を単離または分離するために使用可能な固定された化学部分（例えば、ビオチン）であるか、またはこれを含む、捕捉標識を有していてもよい。陰性濃縮を含むいくつかの実施形態において、固定された化学部分（例えば、ビオチン）であるか、またはこれを含む捕捉標識を使用して、例えば、官能基化された表面（例えば、常磁性ビーズまたは他の形態のビーズ）に結合した抽出部分（例えば、ストレプトアビジン）を介して、１つ以上のその後の精製工程における捕捉を介して、アダプター（または捕捉標識を含む他のプローブ）にライゲーションするか、または接続した望ましくないゲノム材料（例えば、標的ではない核酸フラグメントなど）を精製して取り除くか、または分離してもよい。
【００８５】
核酸物質の大きさに基づく濃縮
いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物は、標的エンドヌクレアーゼ（例えば、リボ核酸タンパク質複合体（ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、アルゴノートヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼおよび／またはメガヌクレアーゼ（例えば、メガＴＡＬヌクレアーゼなど）、またはこれらの組み合わせ）、または核酸物質を切断して、配列決定のための最適なフラグメントサイズに目的の標的配列を切断することができる他の技術（例えば、１つ以上の制限酵素）を利用する。いくつかの実施形態において、標的エンドヌクレアーゼは、目的の正確な配列領域を特異的かつ選択的に切断する能力を有する。例えば、所定の実質的に均一な大きさのフラグメントを生じるプログラマブルエンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素／ガイドＲＮＡ複合体）を用い、切断部位を前もって選択することによって、バイアスおよび情報価値の無いリードの存在を劇的に減少させることができる。さらに、切断されたフラグメントと残った切断されていないＤＮＡとの間の大きさが違うために、サイズ選択工程（以下にさらに記載される）を行って、大きな標的外の領域を除去することができ、これによって、任意のさらなる処理工程の前に、サンプルを前もって濃縮する。末端修復工程の必要性も、同様に減るか、またはなくなってもよく、そのため、時間が節約され、偽の二本鎖の問題のリスクが小さくなり、ある場合には、分子の末端付近のデータの計算によるトリミングの必要性が減少するか、またはなくなり、それにより効率が改善する。したがって、標的酵素フラグメント化のさらなる利点は、機械的フラグメント化方法によって生じるニックまたは核酸付加物または他の形態の損傷を減少させる可能性である。
【００８６】
ＣＲＩＳＰＲ−ＤＳと呼ばれる方法は、非常に高い標識の濃縮を可能にし（その後のハイブリッド捕捉工程の必要性を減らし得る）、時間および費用を顕著に減らすだけではなく、変換効率を高めることができる。図３は、本技術の種々の実施形態による、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてサイジングした標的フラグメントを作成するための方法の工程を示す模式図である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、Ｃａｓ９のｇＲＮＡによって促進された結合によって、標的配列（図３、パネルＡ）中の１つ以上の特定の部位（例えば、プロトスペーサー隣接モチーフまたは「ＰＡＭ」部位）で切断してもよい。Ｃａｓ９の指向性開裂は、パネルＢに示されるように、既知の長さの平滑末端化された二本鎖標的ＤＮＡフラグメントを放出する。図３のパネルＣは、サイズ選択を介する標的ＤＮＡフラグメントの陽性濃縮／選択のためのさらなる処理工程を示す。切断された標的部分を単離する１つの方法は、ＳＰＲＩ／Ａｍｐｕｒｅビーズおよび磁石精製を用い、所定の短いフラグメントを残しつつ、高分子量ＤＮＡを除去することを含む。他の実施形態において、所定の長さの切断された部分は、特に、限定されないが、電気泳動、ゲル精製、液体クロマトグラフィー、サイズ排除精製および／または濾過精製方法を含む種々のサイズ選択方法を用い、望ましくないＤＮＡフラグメントおよび他の高分子量ゲノムＤＮＡ（該当する場合）から分離することができる。サイズ選択の後、ＣＲＩＳＰＲ−ＤＳ方法は、各鎖を配列決定し、二本鎖コンセンサス配列を作成する前に、Ａテーリング（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断によって平滑末端が残る）、アダプター（例えば、ＤＳアダプター）のライゲーション、二本鎖増幅、任意の捕捉工程および増幅（例えば、ＰＣＲ）を含む、ＤＳ方法の工程と一致する工程を含んでいてもよい。ワークフロー効率の改善に加え、ＣＲＩＳＰＲに基づくサイズ選択／標的濃縮は、高効率の増幅および配列決定工程に最適なフラグメント長さを提供する。ＣＲＩＳＰＲ−ＤＳの態様は、国際特許公開第ＷＯ／２０１８／１７５９９７号に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８７】
特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−ＤＳは、例えば、効率的ではない標的濃縮（これはＣＲＩＳＰＲに基づくサイズ選択によって最適化され得る）、配列決定エラー（エラー修正済二本鎖コンセンサス配列を作成するためのＤＳ方法論を用いて除去することができる）、および不均一なフラグメントサイズ（あらかじめ設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９フラグメント化によって軽減される）を含め、ＮＧＳに関連する複数の一般的な問題を解決する。当業者によって理解されるように、本明細書に記載される通り、ＣＲＩＳＰＲ−ＤＳは、サンプルがＤＮＡに限定されている状況（例えば、特に、法医学および早期癌検出用途）において、変異の感度の高い識別のための用途を有し得る。
【００８８】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼを用いたＤＮＡ物質のインビトロでの消化は、リボ核酸タンパク質複合体の形成を利用しており、既定の部位（例えば、ＰＡＭ部位、図３のパネルＡ）を認識し、開裂する。この複合体は、ガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」、例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ）およびＣａｓ９を用いて形成される。多重切断の場合、ｇＲＮＡは、全てのｃｒＲＮＡをプールし、次いでｔｒａｃｒＲＮＡと複合体化することによって、またはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを各々別個に複合体化し、次いでプールすることによって、複合体化することができる。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡ間の競争を除外するために、２番目の選択肢が好ましい場合がある。異なるＣａｓタンパク質を使用する他のＣＲＩＳＰＥＲ系は、異なるＰＡＭモチーフ配列に依存していてもよく、またはＰＡＭモチーフ配列を必要としなくてもよく、または他の形態の核酸配列に依存して、標的核酸領域へのヌクレアーゼの送達を誘導してもよい。
【００８９】
いくつかの実施形態において、核酸物質は、実質的に均一な長さの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、実質的に均一な長さは、約１〜約１，０００，０００塩基である。例えば、いくつかの実施形態において、実質的に均一な長さは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００または５０，０００塩基長であってもよい。いくつかの実施形態において、実質的に均一な長さは、最大で６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１２０，０００、１５０，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００または１，０００，０００塩基であってもよい。具体的な非限定的な例として、いくつかの実施形態において、実質的に均一な長さは、約１００〜約５００塩基である。いくつかの実施形態において、サイズ選択工程（例えば、本明細書に記載されるもの）は、任意の特定の増幅工程の前に行われてもよい。いくつかの実施形態において、サイズ選択工程（例えば、本明細書に記載されるもの）は、任意の特定の増幅工程の後に行われてもよい。いくつかの実施形態において、サイズ選択工程（例えば、本明細書に記載されるもの）に続き、さらなる工程、例えば、消化工程および／または別のサイズ選択工程を行ってもよい。いくつかの実施形態において、サイズ選択は、アダプターのライゲーション工程の前または後に行われてもよい。いくつかの実施形態において、サイズ選択は、切断する工程と同時に行われてもよい。いくつかの実施形態において、サイズ選択は、切断する工程の後に行われてもよい。
【００９０】
標的エンドヌクレアーゼ（複数可）の使用に加え、実質的に均一な長さの核酸分子を達成する任意の他の適用に適した方法（複数可）を使用してもよい。非限定的な例として、このような方法は、アガロースまたは他のゲル、ゲル電気泳動、アフィニティカラム、ＨＰＬＣ、ＰＡＧＥ、濾過、ゲル濾過、交換クロマトグラフィー、ＳＰＲＩ／Ａｍｐｕｒｅ型ビーズ、または当業者によって認識される任意の他の適切な方法のうちの１つ以上の使用であってもよく、またはこれらのうちの１つ以上の使用を含んでいてもよい。
【００９１】
いくつかの実施形態において、実質的に均一の長さ（または質量）の核酸分子を生成するように核酸物質を処理することを使用して、サンプルから１つ以上の所望な標的領域（例えば、目的の標的配列）を回収してもよい。いくつかの実施形態において、実質的に均一の長さ（または質量）の核酸分子を生成するように核酸物質を処理することを使用して、サンプルの特定の部分（例えば、望ましくない種または同じ種の望ましくない被験体からの核酸物質）を除外してもよい。いくつかの実施形態において、核酸物質は、様々な大きさで存在し得る（例えば、実質的に均一な長さまたは質量ではない）。
【００９２】
いくつかの実施形態において、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはもっと多く）の標的エンドヌクレアーゼまたは実質的に均一な長さの核酸分子を提供するための他の方法が使用されてもよい。いくつかの実施形態において、標的ヌクレアーゼを使用して、核酸物質の２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはもっと多く）の潜在的な標的領域を切断してもよい。核酸物質の２つ以上の標的領域が存在するいくつかの実施形態において、各標的領域は、同じ（または実質的に同じ）長さのものであってもよい。核酸物質の２つ以上の標的領域が存在するいくつかの実施形態において、既知の長さを有する標的領域のうちの少なくとも２つは長さが異なっている（例えば、１００ｂｐの長さを有する第１の標的領域および１，０００ｂｐの長さを有する第２の標的領域）。
【００９３】
いくつかの実施形態において、複数の標的エンドヌクレアーゼ（例えば、プログラマブルエンドヌクレアーゼ）を組み合わせて使用して、目的の標的核酸の複数の領域をフラグメント化してもよい。いくつかの実施形態において、１つ以上のプログラマブル標的エンドヌクレアーゼを、他の標的ヌクレアーゼと組み合わせて使用してもよい。いくつかの実施形態において、１つ以上の標的エンドヌクレアーゼを、無作為または半無作為のヌクレアーゼと組み合わせて使用してもよい。いくつかの実施形態において、１つ以上の標的エンドヌクレアーゼを、核酸フラグメント化の他の無作為または半無作為の方法、例えば、機械剪断または音響剪断と組み合わせて使用してもよい。いくつかの実施形態において、１つ以上の介在するサイズ選択工程を用いる連続工程で開裂を行うことが有利な場合がある。標的フラグメント化を無作為または半無作為のフラグメント化と組み合わせて使用するいくつかの実施形態において、後者の無作為または半無作為という性質は、固有分子識別子（ＵＭＩ）配列の目的のために有用な場合がある。標的フラグメント化を無作為または半無作為のフラグメント化と組み合わせて使用するいくつかの実施形態において、後者の無作為または半無作為という性質は、これ以外のハイブリッド捕捉の従来の方法によって濃縮することが困難であり得る１つ以上のゲノム中の他の領域に対してかなり類似性を有する長いか高度に反復した１つ以上の領域など、標的化された様式では容易に開裂しない核酸の領域の配列決定を促進するのに有用な場合がある。
【００９４】
標的エンドヌクレアーゼ
標的エンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連リボ核酸タンパク質複合体、例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１、ホーミングヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガＴＡＬヌクレアーゼ、アルゴノートヌクレアーゼ、および／またはこれらの誘導体）を使用して、配列決定用途のためにこのような標的部分を濃縮する目的のために、核酸物質の標的部分を選択的に切断し、切除することができる。いくつかの実施形態において、標的エンドヌクレアーゼは、例えば、熱安定性、塩耐性および／またはｐＨ耐性の向上、または特異性または代替のＰＡＭ部位認識の向上、またはより高い結合アフィニティを提供するために、修飾されていてもよい（例えば、アミノ酸置換を有する）。他の実施形態において、標的エンドヌクレアーゼは、ビオチン化されていてもよく、ストレプトアビジンと融合していてもよく、および／または他のアフィニティに基づく（例えば、ベイト／プレイ）技術を組み込んでいてもよい。特定の実施形態において、標的エンドヌクレアーゼは、改変された認識部位特異性を有していてもよい（例えば、改変されたＰＡＭ部位特異性を有するＳｐＣａｓ９バリアント）。他の実施形態において、標的エンドヌクレアーゼは、核酸物質の標的部分に結合すると開裂が起こらないように、触媒的に不活性であってもよい。いくつかの実施形態において、標的エンドヌクレアーゼは、核酸物質の標的部分の一本鎖を開裂するように修飾され（例えば、ニッカーゼバリアント）、それによって核酸物質中にニックを生成する。ＣＲＩＳＰＲに基づく標的エンドヌクレアーゼは、本明細書でさらに記載され、標的エンドヌクレアーゼの使用のさらに詳細な非限定な例を提供する。なお、このような標的エンドヌクレアーゼ周辺の命名法は、依然として流動的である。本明細書での目的のために、開裂される核酸配列を再定義するように核酸配列が修飾され得るような核酸配列を含むエンドヌクレアーゼを一般的に意味するように、「ＣＲＩＳＰＥＲに基づく」という用語を使用する。Ｃａｓ９およびＣＰＦ１は、現在使用されているこのような標的エンドヌクレアーゼの例であるが、さらに多くが自然界の異なる場所に存在すると思われ、このような標的化され、容易に調節可能なヌクレアーゼの異なる品種の利用可能性は、今後数年で急速に成長することが予想される。例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１３、ＣａｓＸなどは、種々の実施形態での使用が想定される。同様に、これらの特性を向上させるか、または改変するためのこれらの酵素の複数の操作されたバリアントが、利用可能になりつつある。本明細書において、ここに記載される開示内容と同様の目的を達成するために、本明細書で明示的に記載されていないか、またはまだ発見されていない実質的に機能的に類似した標的エンドヌクレアーゼの使用を明示的に想定する。
【００９５】
制限エンドヌクレアーゼ
任意の種々の制限エンドヌクレアーゼ（すなわち、酵素）を使用して、実質的に均一な長さの核酸物質を提供し、および／または核酸物質の標的領域を切断してもよいことが具体的に想定される。一般的に、制限酵素は、典型的には、特定の細菌／他の原核生物によって産生され、ＤＮＡの所与のセグメント中の特定の配列で、特定の配列付近またはその間で開裂する。
【００９６】
制限酵素が、特定の部位で、またはこれに代えて、切断のための制限部位を作成するために作られる部位で切断するために選択されることは当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態において、制限酵素は、合成酵素である。いくつかの実施形態において、制限酵素は、合成酵素ではない。いくつかの実施形態において、本明細書で使用される制限酵素は、酵素自体のゲノム中に１つ以上の変化を導入するように修飾されている。いくつかの実施形態において、制限酵素は、ＤＮＡの所与の部分中の定義された配列間で、二本鎖の切断部を生成する。
【００９７】
いくつかの実施形態に従って、任意の制限酵素（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型および／またはＩＶ型）を使用してもよいが、以下は、使用可能な制限酵素の非限定的なリストを表す。ＡｌｕＩ、ＡｐｏＩ、ＡｓｐＨＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｆａＩ、ＢｓａＩ、ＣｆｒＩ、ＤｄｅＩ、ＤｐｎＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨａｅＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎＦＩ、ＨＰＹＣＨ４ＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＭａｍＩ、ＭＮＬ１、ＭｓｅＩ、ＭｓｔＩ、ＭｓｔＩＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｏｔＩ、ＰａｃＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＲｃａＩ、ＲｓａＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｃａＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｔｕＩ、ＴａｑＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＸｈｏＩＩ、ＸｍａＩ、ＸｍａＩＩ、およびこれらの任意の組み合わせ。適切な制限酵素の広範ではあるが網羅的ではないリストは、公的に入手可能なカタログまたはインターネット上に見出すことができる（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、イプスウィッチ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．で入手可能）。同じ目的を達成することができる核酸分子のホスホジエステル骨格開裂を標的とするために単独で、または組み合わせて使用可能な種々の酵素、リボザイムまたは他の核酸修飾酵素が、上述のリストに含まれていなくてもよく、またはまだ発見されていなくてもよいことが、当業者によって理解される。種々の核酸修飾酵素は、（例えば、リアーゼ活性を有する酵素によって）開裂可能な隣接する核酸配列のさらなる修飾（例えば、脱塩基部位を生成するため）を標的とするために使用可能な塩基修飾（例えば、ＣｐＧメチル化）を認識することができる。したがって、開裂の実質的な配列特異性は、ＤＮＡまたはＲＮＡ修飾の認識に基づいて達成することができ、これを単独で、または標的核酸のフラグメント化を達成するための標的エンドヌクレアーゼと組み合わせて使用することができる。
【００９８】
核酸物質の陰性および陽性の濃縮／選択のための方法
いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物は、標的エンドヌクレアーゼ（例えば、リボ核酸タンパク質複合体（ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、アルゴノートヌクレアーゼおよび／またはメガヌクレアーゼ（例えば、メガＴＡＬヌクレアーゼなど、またはこれらの組み合わせ）、または所望な（標的の）核酸分子を陽性濃縮するための核酸物質との部位指向性相互作用が可能な他の技術を利用する。他の実施形態は、望ましくない（例えば、標的外の）核酸物質をサンプルから除去することによって、所望な核酸分子を陰性濃縮／選択するための方法およびこのような組成物を提供する。本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、陽性および陰性の濃縮スキームを両方組み合わせる。いくつかの実施形態において、提供される方法は、少なくとも１つのＳＭＩおよび／またはアダプター配列を、濃縮された標的領域の５’または３’末端のうちの少なくとも１つにライゲーションすることをさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、分析することは、定量化および／または配列決定であってもよく、またはこれらを含んでいてもよい。
【００９９】
いくつかの実施形態において、標的核酸物質の陰性濃縮／選択は、標的ではないか、または望ましくない核酸物質の除去または破壊によって促進され得る。図４は、本技術の一実施形態による、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９バリアントを用い、実質的に既知の／選択された長さを有する標的核酸フラグメントを作成するための方法の工程を示す模式図である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボ核酸タンパク質複合体と、場合により、向上した熱安定性を有し、および／または適切な条件で（例えば、除去されるまで、酵素置換など）ｄｓＤＮＡに結合したままであるように操作されたものを用い、パネルＡは、上述の標的ＤＮＡ部位に対するバリアントＣａｓ９のｇＲＮＡによって促進された結合を示す。一実施形態において、開裂の後、Ｃａｓ９が、標的ＤＮＡフラグメントの開裂した５’末端および３末端に結合したままであるが、サンプルは、エキソヌクレアーゼを用いて処理され、ＤＮＡの露出した３’末端または５’末端で露出したホスホジエステル結合を加水分解してもよい（パネルＢ）。エキソヌクレアーゼ処理中、望ましくないＤＮＡまたは非標的ＤＮＡは、酵素活性によって破壊され、エキソヌクレアーゼ耐性の標的ｄｓＤＮＡフラグメントのみが残るだろう。図４に示すように、結合したリボ核酸タンパク質複合体は、エキソヌクレアーゼ保護を提供することができる。非標的ＤＮＡのエキソヌクレアーゼ破壊を介した、標的ＤＮＡフラグメントの陰性／濃縮選択の後、Ｃａｓ９は、ＤＮＡから解離し、パネルＣに示されるように、既知の長さの平滑末端化された二本鎖標的ＤＮＡフラグメントを放出する。いくつかの実施形態において、本方法は、このようなサイズ選択を用いる陽性濃縮／選択スキームを組み込む工程も含んでいてもよい（パネルＤ）。いくつかの実施形態において、所望なおよび／予測された標的サイズのフラグメントを濃縮することによって、消化されないままであるか、および／または標的ではないＣａｓ９結合によって保護されたゲノムフラグメントをさらにフィルタリングによって除去することができる。場合により、パネルＥに示されるように、濃縮されたＤＮＡフラグメントは、核酸インテロゲーション（例えば、配列決定）のためにアダプターにライゲーションされてもよい。例えば、標的フラグメントの平滑末端は、平滑末端化されたアダプターに直接的にライゲーションすることができる。開裂した二本鎖核酸物質にアダプターをライゲーションする態様は、特定の用途で必要とされる場合、フラグメントの末端修復および３’−ｄＡテーリングを含んでいてもよい。他の実施形態において、フラグメントの適切なライゲーション可能末端を作成するためのフラグメントのさらなる処理は、例えば、特に、平滑末端、ａ−３’オーバーハング、１個のヌクレオチド３’オーバーハング、２個のヌクレオチド３’オーバーハング、３個のヌクレオチド３’オーバーハング、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはもっと多くのヌクレオチド３’オーバーハング、１個のヌクレオチド５’オーバーハング、２個のヌクレオチド５’オーバーハング、３個のヌクレオチド５’オーバーハング、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはもっと多くのヌクレオチド５’オーバーハングを含む「粘着」末端を有する、ライゲーション可能末端を形成する任意の種々の形態または工程を含んでいてもよく、いずれかであってもよい。ライゲーション部位の５’塩基は、リン酸化されていてもよく、３’塩基は、ヒドロキシル基を有していてもよく、またはいずれかが単独で、または組み合わせて、脱リン酸化または脱水されていてもよく、またはさらに化学修飾され、場合により、後の時点まで、片方の鎖のライゲーションを防ぐために片方の鎖のライゲーションの向上を促進してもよい。
【０１００】
別の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを用いる標的核酸物質の陽性濃縮／選択は、標的核酸物質のアフィニティに基づく濃縮によって促進することができる。図５は、本技術の別の実施形態による、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９バリアントを用い、実質的に既知の／選択された長さを有する標的核酸フラグメントを作成するための方法の工程を示す模式図である。パネルＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボ核酸タンパク質複合体を用いることを示し、場合により、適切な状態（上述のような）でＤＮＡに強く結合したままであるようにさらに操作されていてもよく、ここで、リボ核酸タンパク質複合体は、捕捉標識（例えば、ビオチン）を含む。捕捉標識は、ｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ）またはＣａｓ９タンパク質に組み込まれてもよい。したがって、リボ核酸タンパク質複合体は、その後のプルダウン工程のためのアフィニティ標識を提供する。
【０１０１】
捕捉標識が存在するバリアントＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって促進された結合の後に、二本鎖標的ＤＮＡの開裂を行う。開裂の後、Ｃａｓ９が、標的ＤＮＡフラグメントの開裂した５’末端および３末端に結合したままであるが、反応混合物を、１つ以上の抽出部分が結合した官能基化された表面と接触させる。提供される抽出部分は、捕捉標識を有する分子の固定化および分離のために捕捉標識に結合することが可能である（例えば、捕捉標識がビオチンである場合に、ストレプトアビジンビーズ）。特に、抽出部分は、結合対の任意のメンバー、例えば、ビオチン／ストレプトアビジンまたはハプテン／抗体または相補性核酸配列（ＤＮＡ／ＤＮＡ対、ＤＮＡ／ＲＮＡ対、ＲＮＡ／ＲＮＡ対、ＬＮＡ／ＤＮＡ対など）であってもよい。例示される実施形態において、（開裂した）標的ｄｓＤＮＡフラグメントに結合するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボ核酸タンパク質複合体に接続する捕捉標識は、単離可能な部分（例えば、磁気誘引性粒子または遠心分離によって沈殿させることが可能な大きな粒子）に接続しているその結合対（例えば、抽出部分）によって捕捉される。したがって、捕捉標識は、捕捉標識と会合していない核酸から、捕捉標識と会合する（例えば、Ｃａｓ９によって結合する）核酸のアフィニティ分離を可能にする任意の種類の分子／部分であってもよい。捕捉標識の一例は、固相またはオリゴヌクレオチドに接続しているか、または接続可能なストレプトアビジンに結合することによってアフィニティ分離が可能であり、次いで、固相に接続しているか、または接続可能な相補性オリゴヌクレオチドに結合することによってアフィニティ分離を可能にするビオチンである。望ましくないか、または非標的核酸物質は、溶液中で遊離したままであってもよい。有利なことに、遊離した／結合していない核酸物質は、捕捉標識を有していないか、または捕捉標識と会合しておらず、所望な標的核酸物質から効果的に除去／分離することができる。さらなる実施形態において、官能基化された表面（Ｓ）を洗浄して、残留する副産物または他の汚染物質を除去してもよい。
【０１０２】
図５に示されるアフィニティに基づく濃縮スキームを用い、望ましくないか、または非標的核酸物質は、実質的に量を減少させることができる。所望な／標的核酸フラグメントの収集は、任意の用途に適した様式で達成されてもよい。具体例として、いくつかの実施形態において、所望な核酸物質の収集は、サイズ濾過、磁気方法、電荷方法、遠心分離密度方法または任意の他の方法を介する、または、カラムに基づく精製方法または同様の方法を用いる場合の溶出フラクションの収集、または当業者によって一般的に理解される任意の他の精製の実施を介する、官能基化された表面の除去のうちの１つ以上を介して達成されてもよい。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、アフィニティに基づく陽性濃縮工程を組み合わせてもよく、または陰性濃縮工程と組み合わせて使用されてもよい。例えば、開裂の後、Ｃａｓ９が、標的ＤＮＡフラグメントの開裂した５’末端および３末端に結合したままである（アフィニティに基づく濃縮工程の前または後のいずれかに）が、サンプルは、エキソヌクレアーゼを用いて処理され、サンプル中の任意の望ましくない核酸物質または汚染物質を破壊することができる。アフィニティに基づく濃縮工程と、場合によりパネルＡおよびＢに示す陰性エキソヌクレアーゼ除去工程の後、Ｃａｓ９は、ＤＮＡから解離し、既知の長さの平滑末端化された二本鎖標的ＤＮＡフラグメントを放出する（パネルＤ）。場合により、上述の濃縮工程を、上述の大きさに基づく濃縮工程と組み合わせてもよく（パネルＥ）、いくつかの実施形態において、濃縮されたＤＮＡフラグメントは、上述のように核酸インテロゲーション（例えば、配列決定）のためにアダプターにライゲーションされてもよい（パネルＦ）。
【０１０４】
図６は、本技術の別の実施形態による、標的核酸物質の陰性濃縮／選択のための方法の工程を示す模式図である。例えば、標的二本鎖核酸物質の濃縮は、標的ではないか、または望ましくない核酸物質の除去または破壊によって促進され得る。図６は、Ｃａｓ９の触媒的に不活性なバリアントを使用して、実質的に既知の／選択された長さを有する標的核酸フラグメントを作成する濃縮の実施形態を示す。二本鎖ＤＮＡを標的とし、二本鎖ＤＮＡに選択的に結合するように操作された触媒的に不活性なＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体を用い、隣接する標的ＤＮＡ領域に対する触媒的に不活性なＣａｓ９バリアントの対の結合をｇＲＮＡが促進する（パネルＡ）。結合の後、サンプルは、１つ以上のエキソヌクレアーゼを用いて処理され、ＤＮＡの露出した３’末端または５’末端で露出したホスホジエステル結合を加水分解してもよい。Ｃａｓ９の触媒的に不活性なバリアントは、標的ＤＮＡを切断しないが、エキソヌクレアーゼ活性が、結合したＣａｓ９複合体によって遮断されるまで各ヌクレオチド塩基を開裂するような、エキソヌクレアーゼ耐性を提供する。したがって、エキソヌクレアーゼ処理は、露出した末端を有するサンプル中の全ての非標的核酸物質を破壊し、触媒的に不活性なＣａｓ９の対によって保護されるフラグメントが残る。特定の実施形態において、エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼのカクテルを使用して、望ましくない核酸物質を破壊することができる。例えば、エンドヌクレアーゼ（例えば、部位特異的制限酵素）を使用して、エキソヌクレアーゼ酵素活性を可能にする複数の露出した５’および３’末端を生成することができる。
【０１０５】
全ての非標的ＤＮＡのエキソヌクレアーゼ破壊を介する標的ＤＮＡフラグメントの陰性／濃縮選択（パネルＢ）の後、触媒的に不活性なＣａｓ９は、ＤＮＡから解離し、それによって、パネルＣに示されるように、既知の長さの二本鎖標的ＤＮＡフラグメントを放出する。上述のように、さらなるサイズ選択工程は、標的二本鎖ＤＮＡフラグメントのさらなる濃縮のために実施されてもよい（パネルＤ）。場合により、濃縮されたＤＮＡフラグメントは、ポリシングされ、平滑化され、またはテーリングされ、適切なライゲーション可能末端を作成することができ、その後に、核酸インテロゲーション（例えば、配列決定）のためにアダプターにライゲーションされてもよい（パネルＥ）。
【０１０６】
図７に示される別の実施形態において、陰性および陽性の濃縮スキームを両方とも、Ｃａｓ９の触媒的に不活性なバリアントを用いて実行することができる。パネルＡは、適切な状態でＤＮＡに結合したままであるように操作されたリボ核酸タンパク質複合体において、Ｃａｓ９の触媒的に不活性なバリアントを用いることを示し、ここで、リボ核酸タンパク質複合体は、捕捉標識を含む（例えば、ガイドＲＮＡ上、またはＣａｓ９タンパク質につなぎ止められている）。捕捉標識を有する触媒的に不活性なバリアントＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって促進された結合の後に、ＤＮＡの露出した３’末端または５’末端で露出したホスホジエステル結合を加水分解するために、サンプルへのエキソヌクレアーゼの添加を行う。Ｃａｓ９の触媒的に不活性なバリアントは、標的ＤＮＡを切断しないが、エキソヌクレアーゼ活性が、結合したＣａｓ９複合体によって遮断されるまで各ヌクレオチド塩基を開裂するような、エキソヌクレアーゼ耐性を提供する。全ての非標的ＤＮＡのエキソヌクレアーゼ破壊を介する標的ＤＮＡフラグメントの陰性／濃縮選択の後、触媒的に不活性なＣａｓ９は結合したままであるが、標的核酸に結合したままであるため、リボ核酸タンパク質複合体と会合する捕捉標識を結合することが可能な官能基化された表面（例えば、１つ以上の抽出部分が結合した官能基化された表面）の段階的な付加によって、サンプル中に残る望ましくない核酸物質から、捕捉標識を有するか、および／または捕捉標識と会合した分子を固定化および／または分離することができる（パネルＢ）。いくつかの実施形態において、提供される方法は、サンプル中の全てまたは実質的に全ての望ましくない核酸物質の除去を可能にするか、またはその量を実質的に減少させることを可能にする。所望な標的核酸物質の収集は、任意の用途に適した様式で達成されてもよい。具体例として、いくつかの実施形態において、所望な標的核酸フラグメントの収集は、サイズ濾過、磁気方法、電荷方法、遠心分離密度方法または任意の他の方法を介する、または、カラムに基づく精製方法または同様の方法を用いる場合の溶出フラクションの収集、または任意の他の一般的に理解される精製の実施を介する、官能基化された表面の除去のうちの１つ以上を介して達成されてもよい。
【０１０７】
アフィニティに基づく濃縮工程の後、パネルＤに示されるように、Ｃａｓ９は、ＤＮＡから解離し、既知の長さの二本鎖標的ＤＮＡフラグメントを放出する。パネルＥは、サイズ選択を介する標的ＤＮＡフラグメントの陽性濃縮／選択のための任意のさらなる処理工程を示す。場合により、パネルＦに示されるように、濃縮されたＤＮＡフラグメントは、核酸インテロゲーション（例えば、配列決定）のためにアダプターにライゲーションされてもよい。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、触媒的に活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体および触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の組み合わせを使用して、標的二本鎖核酸領域を含むフラグメントを陽性濃縮することができる。図８を参照すると、触媒的に活性なＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体および触媒的に不活性なＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体は、配列に依存する様式で、サンプル中の所望な核酸領域（例えば、特定のゲノム遺伝子座）を標的としてもよい。触媒的に活性なＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体は、標的ＤＮＡ領域に隣接する領域に指向され、これを使用して、標的二本鎖ＤＮＡを開裂し、既知の長さの平滑末端化された二本鎖標的ＤＮＡフラグメントを放出する。捕捉標識（例えば、ビオチン）を有する１つ以上の触媒的に不活性なリボ核酸タンパク質複合体は、２つの部位選択された開裂部位の間の標的配列領域に指向される。標的ＤＮＡを開裂してＤＮＡフラグメントを放出した後、触媒的に不活性なリボ核酸タンパク質複合体と会合した捕捉標識を結合することが可能な官能基化された表面の付加が、標的フラグメントの陽性濃縮／選択を促進することができる。標的核酸フラグメント化の多くの他の形態、例えば、上述のものは、このサンプル中の活性なＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体に置き換えることができることが認識されるだろう。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、陽性濃縮／選択工程は、核酸物質が既にフラグメント化されているサンプル（例えば、機械剪断されているか、または無細胞ＤＮＡサンプルから（例えば、液体生検から）のもの）から標的配列を濃縮するためにも行うことができる。図９Ａおよび図９Ｂは、上述の捕捉標識を有するＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体の触媒的に不活性なバリアントを用いる、標的核酸フラグメントの陽性濃縮／選択のための方法の工程の概念図である。サンプル中のフラグメント化された二本鎖ＤＮＡフラグメント（例えば、機械的に剪断された、音響的にフラグメント化された、無細胞ＤＮＡなど）は、溶液中の１つ以上の触媒的に不活性なＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体による標的指向性結合を介して、陽性濃縮／選択することができる（図９Ａ）。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、方法は、複数のＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体を異なる様式でタグ化するために使用可能な２個以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはもっと多く）の捕捉標識の使用を含んでいてもよい。例えば、サンプルは、複数の標的核酸サンプルを同時に濃縮することができる。いくつかの実施形態において、全てのＣａｓ９複合体が同じ捕捉標識（例えば、ビオチン）を有していることが想定されるが、その結果、全ての標的配列は、単一サンプルにおいて一緒にプルダウン（アフィニティ精製）される場合があり、他の実施形態において、異なる標的配列の分離は、異なる領域を標的とすることを対象とするＣａｓ９複合体を有する実質的に固有の捕捉標識を組み込むことによって促進することができる。いくつかの実施形態において、ある方法で使用される少なくとも２つの捕捉標識は、互いに異なっている（例えば、低分子およびペプチド）。いくつかの実施形態において、２つ以上の異なる捕捉標識を含むことで、陽性濃縮／選択および陰性濃縮／選択の両方の使用が可能になる。２つ以上の捕捉標識を含むことは、特に、その後の核酸インテロゲーション（例えば、配列決定）のために異なる標的配列を含む核酸フラグメントを物理的に分離することが望まれる場合に有用であろう。
【０１１１】
反応混合物を、１つ以上の抽出部分が結合した官能基化された表面（複数可）と接触させる。提供される抽出部分は、捕捉標識を有する分子の固定化および分離のために捕捉標識に結合することが可能である（例えば、捕捉標識がビオチンである場合に、ストレプトアビジンビーズ）（図９Ｂ）。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、小さく、それ以外の方法では処理工程（例えば、ＤＳプロセスの工程）中に失われてしまう可能性があるフラグメントサイズを含め、サンプルが種々の大きさのフラグメントを含む場合に、サンプルから標的核酸物質を濃縮または単離することが望ましい。図１０は、捕捉標識を有するＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体の触媒的に不活性なバリアントを用いる、標的核酸フラグメントの陽性濃縮／選択のための方法の工程を示す模式図である。パネルＡは、小さすぎてサイズ選択またはアフィニティに基づく方法によって信頼性高く濃縮することができない分子２を含む、サンプル中の様々な大きさの複数のフラグメント化された二本鎖ＤＮＡフラグメントを示す。この実施形態において、アダプター（例えば、配列決定アダプター）は、既知の配列決定ライブラリ調製工程を用い、フラグメント末端にライゲーション／接続されてもよい。この様式で、特定の小さな核酸フラグメントは、隣接するアダプター分子によって延長される。溶液からの標的フラグメントの陽性濃縮は、図９Ａおよび図９Ｂに関して上に記載したように進めることができる。例えば、図１０のパネルＢは、サンプル中の分子の５’末端および３’末端にアダプターをライゲーションすることによって、このようなＤＮＡフラグメントをさらに長くすることを示す。パネルＣは、溶液中の捕捉標識を有する触媒的に不活性なＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体による標的指向性結合を介した、分子２の陽性濃縮／選択工程の後、アフィニティ精製を示す。
【０１１３】
図１１は、本技術の一実施形態による、陰性濃縮スキーム（パネルＡ）および陽性濃縮スキーム（パネルＢ）を用いて標的核酸物質を濃縮するための方法の工程を示す模式図である。パネルＡは、二本鎖標的ＤＮＡ分子の５’末端および３’末端にヘアピンアダプターをライゲーションし、露出した末端を有しないアダプター−核酸複合体を生成することを示す。アダプター−核酸複合体を、陰性濃縮／選択スキームにおいてエキソヌクレアーゼで処理し、パネルＢの右側に示されるように、保護されていない５’末端および３’末端を有する核酸物質フラグメントおよびアダプター（例えば、４個のライゲーションされたホスホジエステル結合を有しないアダプター−核酸複合体、ライゲーションされていないＤＮＡ、一本鎖核酸物質、遊離アダプターなど）を除去する。
【０１１４】
図１１に示されるように、ヘアピンアダプターは、リンカー部分に、開裂可能な部分、例えばウラシル基、または任意の他の酵素的、化学的または光電気的に開裂可能な基を含んでいてもよい。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）と、脱塩基部位ＤＮＡリアーゼ活性を有する酵素、例えば、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩまたはホルムアミドピリミジン［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＦＰＧ）の組み合わせ、または市販のあらかじめ混合された組み合わせ（例えば、ＵＳＥＲ（商標）酵素）で処理される場合、ウラシルでの開裂は、ヘアピンアダプターを、ポロニー形成（ブリッジ増幅）および特定の配列決定様式に適したＹ字型を含むアダプターに変化させることができる。
【０１１５】
エキソヌクレアーゼ耐性のアダプター−核酸複合体は、サイズ選択または標的配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プルダウン）によってさらに濃縮することができる（図１１のパネルＢ、左側）。別の実施形態において、捕捉標識を有するヘアピンアダプターを使用してもよく（図１２に示されるように）、これは、露出した抽出部分を有する官能基化された表面を用いた、アフィニティに基づく濃縮に直接的に適している。
【０１１６】
図１１に記載のヘアピンアダプターにライゲーションされた標的核酸フラグメントの陰性濃縮の後の実施形態において、さらなる陽性濃縮工程を行ってもよい。例えば、図１３は、ヘアピンアダプターを用いたアダプター−標的核酸複合体の陽性濃縮（パネルＡ）の後、ローリングサークル増幅（パネルＢおよびＣ）のための方法の工程を示す模式図である。ローリングサークル増幅工程を使用して、（１）第２の鎖のアンプリコンに対する第１の鎖のアンプリコンの実質的に１：１の比率を提供し、（２）タグ化の前および／またはライブラリ除去工程の間の鎖の解離を防止することができる。長い分子配列決定プラットフォームは、ローリングサークルアンプリコンを直接的に配列決定するのに適している場合がある（パネルＣ）。しかし、短いリード配列決定プラットフォームについて、（１）開裂部位（例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識部位）を含むヘアピンリンカーセグメントを酵素開裂して、ほぼ均一な割合の第１の鎖および第２の鎖のアンプリコンを作成するか（パネルＤ、左側）、または（２）ＰＣＲ増幅を使用して、第１および第２の配列を含む複数の短いアンプリコンを実質的に同じ比率で作成することができる（パネルＤ、右側）。
【０１１７】
図１４は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１の部位指向性結合および開裂を使用して、異なる５’および３’のライゲーション可能末端を有する、既知の／選択された長さを有する標的核酸フラグメントを作成するための方法の工程を示す模式図である。種々の実施形態において、５’および３’のライゲーション可能末端は、既知のヌクレオチド長および配列を有する一本鎖オーバーハング領域を含む。ガイドの５’側でＴが豊富なＰＡＭを認識し、二本鎖ＤＮＡ標的配列中で付着切断を行う、標的エンドヌクレアーゼ中のＣｐｆ１。例えば、図１４に示すように、Ｃｐｆ１のバリアントは、センス鎖上のＰＡＭの後の１９ｂｐを切断し、アンチセンス鎖上の２３ｂｐを切断した。パネルＡは、標的ＤＮＡ部位でのＣｐｆ１のｇＲＮＡによって促進された結合を示す。Ｃｐｆ１指向性開裂は、付着切断を生成し、４（図示される）または５ヌクレオチドオーバーハング（例えば、「粘着末端」）を提供する。標的ＤＮＡ配列に隣接する部位指向性Ｃｐｆ１開裂によって、フラグメントの５’末端に粘着末端１を有し、３’末端に粘着末端２を有する、既知の長さ（例えば、さらに場合により、サイズ選択によって濃縮されてもよい）の二本鎖標的ＤＮＡフラグメントを作成する（パネルＢ）。パネルＢは、フラグメントの５’末端にアダプター１を接続し、３’末端にアダプター２を接続することをさらに示し、アダプター１および２は、それぞれ、このフラグメントの粘着末端１および２に対して少なくとも部分的に相補性のオーバーハング配列を含む。
【０１１８】
設計によって、粘着末端１（標的フラグメントの５’末端にあるオーバーハング）の配列は既知である。同様に、粘着末端２（標的フラグメントの３’末端にあるオーバーハング）の配列は既知である。実質的に相補性の配列を含む特定のアダプターは、フラグメントが両端でアダプターに接続することができるように合成することができる。一実施形態において、アダプターは、同じ種類のアダプターであってもよい（例えば、Ｙ字型、Ｕ字型を含むアダプター、バーコード化されたアダプターなど）。別の実施形態において、アダプターは、異なっていてもよい（例えば、アダプター１は、Ｙ字型を含んでいてもよく、アダプター２は、Ｕ字型を含んでいてもよい）。他の固有の特徴は、増幅のための異なるプライマー部位、異なる種類または位置のバーコードまたは他の固有の分子識別子、捕捉標識を含むアダプターおよび捕捉標識を含まないアダプターを含んでいてもよく、特定のアダプターは、蛍光タグなどを含んでいてもよい。フラグメントの５’末端または３’末端のいずれかに特定のアダプターが位置するように設計するためのいくつかの用途において、特定された利点が存在する。標的フラグメント上の実質的に固有の粘着末端の特異性は、これらの種類の用途を容易にする。さらに、首尾良く開裂し、アダプターがライゲーションした標的フラグメントの陽性選択は、濃縮された標的核酸領域の増幅および配列決定のみを確実にし得る。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、Ｃｐｆ１開裂によって生成する実質的に固有の粘着末端を、さらなる陽性濃縮スキームに使用することができる。例えば、図１５は、本技術の一実施形態による、粘着末端（複数可）を含む標的ＤＮＡフラグメント（例えば、図１４の方法で作成された標的ＤＮＡフラグメント）のアフィニティに基づく濃縮のための方法の工程を示す模式図である。パネルＡは、溶液中の切断された標的ＤＮＡフラグメントと会合する粘着末端を結合することが可能な官能基化された表面の段階的な付加を示す。例えば、官能基化された表面は、１つ以上の標的ＤＮＡオーバーハング配列に対する結合対として適している、結合した１つ以上の抽出部分を有していてもよい。提供される抽出部分は、例えば、Ｃｐｆ１開裂した標的配列の生成した粘着末端（複数可）に対して少なくとも部分的に相補性の所定または既知のオリゴヌクレオチド配列を有する合成オリゴヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドは、粘着末端（複数可）を含む標的の固定化および分離のために、捕捉標識に結合することが可能なＤＮＡ、ＲＮＡまたはＬＮＡ配列（例えば、粘着末端）を含んでいてもよい。官能基化された表面に結合すると、パネルＢに示されるように、標的ではないフラグメントを破棄しつつ、アフィニティ相互作用が、所望な二本鎖ＤＮＡフラグメントのプルダウン（例えば、アフィニティ精製）を促進する。
【０１２０】
図１６は、本技術の別の実施形態による、粘着末端（複数可）を含む標的ＤＮＡフラグメント（例えば、図１４の方法で作成された標的ＤＮＡフラグメント）のアフィニティに基づく濃縮のための方法の工程を示す模式図である。パネルＡは、溶液中の切断された標的ＤＮＡフラグメントと会合する粘着末端の一部に少なくとも部分的に相補性の所定または既知のオリゴヌクレオチド配列を有する捕捉標識を有するオリゴヌクレオチドの段階的な付加を示す。特定の例において、オリゴヌクレオチド鎖は、例えば、ホスホラミダイト方法によって、３’から５’方向に合成されてもよく（例えば、孔径が制御された多孔質ガラス（ＣＰＧ）フラグメント上などで）、化学部分は、オリゴヌクレオチドの合成後に５’末端に、またはオリゴヌクレオチドの合成の一部として、例えば、５’末端にある非カノニカルホスホラミダイト分子の組み込みによって、５’末端付近に、またはオリゴヌクレオチド中の内部位置で、接続していてもよい（例えば、共有結合、非共有結合、イオン結合、または他の結合化学）。
【０１２１】
パネルＢに示されるように、捕捉標識を結合することが可能な官能基化された表面のさらなる付加によって、標的ではないフラグメントを破棄しつつ、所望な二本鎖ＤＮＡフラグメントのプルダウン（例えば、アフィニティ精製）を促進する。
【０１２２】
図１５および図１６を合わせて参照し、次の工程（図示せず）において、標的フラグメントの溶出は、抽出部分からの放出を介して行われてもよい。いくつかの非限定的な例において、開裂可能な部分は、オリゴヌクレオチド抽出部分の結合した末端に近接して組み込まれてもよい。別の実施形態において、温度または他の条件を変え、標的核酸フラグメントの二本鎖の性質を維持しつつ、短い捕捉標識／抽出の結合を変性させてもよい。さらに別の実施形態において、ヘアピンアダプターは、標的フラグメントの第２の粘着末端で使用され、溶出およびさらなる処理の間に二本鎖を一緒につなぎ止めることができる。種々の実施形態において、濃縮工程の後、粘着末端は、偽反応分のエラーを避けるために、本明細書に記載するようにポリシングされ、トリミングされ、または生体計算によりフィルタリングされてもよい。
【０１２３】
図１７は、Ｃａｓ９ニッカーゼを用い、本技術の一実施形態による、既知のヌクレオチド長および配列を有する長い一本鎖オーバーハング領域を含む異なる５’および３’のライゲーション可能末端を有する、既知の長さを有する核酸物質の標的フラグメント濃縮のための方法の工程を示す模式図である。パネルＡは、標的ＤＮＡ領域での対になったＣａｓ９ニッカーゼのｇＲＮＡによって標的とされる結合を示す。二本鎖切断は、対になったニッカーゼの使用によって導入され、標的ＤＮＡ領域を切断することができ、対になったＣａｓ９ニッカーゼが使用される場合、パネルＢに示されるように、開裂した末端各々に対して長いオーバーハング（粘着末端１および２）が生成する。したがって、平滑末端を生成する触媒的に活性なＣａｓ９を用いた開裂とは対照的に、Ｃａｓ９ニッカーゼの戦略的な対形成は、対向するＤＮＡ鎖に一本鎖の付着切断を提供し、パネルＢに示すように、長いオーバーハングを生成することができる。図１５に関して上に記載したように、溶液中の切断された標的ＤＮＡフラグメントに会合した長い粘着末端（例えば、粘着末端１）を結合することが可能な官能基化された表面の段階的な付加は、溶液中の標的ＤＮＡフラグメントについての陽性濃縮工程を提供する。例えば、抽出部分は、フラグメントの長い粘着末端の所定または既知の配列に対して実質的に相補性の所定または既知のオリゴヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドであってもよい。官能基化された表面に結合すると、パネルＤに示されるように、標的ではないフラグメントを破棄しつつ、アフィニティ相互作用が、所望な二本鎖ＤＮＡフラグメントのプルダウン（例えば、アフィニティ精製）を促進する。
【０１２４】
図１７のパネルＥは、溶液中の切断された標的ＤＮＡフラグメントに会合した長い粘着末端（例えば、粘着末端１）の一部に対して少なくとも部分的に相補性の所定または既知のオリゴヌクレオチド配列を有する、捕捉標識を有するオリゴヌクレオチドの付加およびアニーリングを含む陽性濃縮工程の変形を示す。パネルＦは、捕捉標識を有するオリゴヌクレオチドの一部に少なくとも部分的に相補性の第２のオリゴ鎖のアニーリングを示す。第２のオリゴ鎖の酵素伸長およびテンプレートＤＮＡフラグメントへのライゲーションによって、アダプター−標的ＤＮＡ複合体を生成する。示されるように、第１および第２のオリゴヌクレオチド鎖は、得られるアダプター複合体がＤＳ処理のための非対称性を含むように、一本鎖部分を含む。さらに、第１のオリゴヌクレオチド鎖は、第２のオリゴヌクレオチド鎖が伸長するときに、第１のオリゴヌクレオチド鎖がテンプレート鎖として機能し、ＳＭＩ配列が二本鎖になるように、変性または半変性したＳＭＩ配列を含んでいてもよい。さらなる工程は、捕捉標識を結合することが可能な官能基化された表面（図示せず）の導入によって、標的ではないフラグメントを破棄しつつ、所望なアダプター−二本鎖ＤＮＡ複合体のプルダウン（例えば、アフィニティ精製）を促進することを含んでいてもよい。
【０１２５】
本技術の種々の態様は、タンパク質結合によってエキソヌクレアーゼ耐性およびエンドヌクレアーゼ耐性を提供することによって、核酸領域を陰性濃縮するための方法を含む。一実施形態において、図１８に示されるように、ＤＮＡを標的とするための部位選択されたタンパク質結合を使用して、エキソヌクレアーゼ耐性およびエンドヌクレアーゼ耐性を提供することができる。示されるように、標的核酸濃縮スキームは、触媒的に不活性なＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体を使用して、標的ゲノム領域を保護する。Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡによって、サンプル中の所望な配列を標的とすることができる。１つ以上の捕捉標識を有する１つ以上の触媒的に不活性なリボ核酸タンパク質複合体は、ゲノムＤＮＡの領域を酵素消化から保護するために近接および／または隣接して配置されてもよい。いくつかの実施形態において、示されるように、リボヌクレアーゼ複合体は、他のタンパク質複合体構造が標的ＤＮＡ領域に指向性であるように設計することができる。このタンパク質複合体構造が、標的ＤＮＡ領域を覆う場合、エキソヌクレアーゼ耐性が提供される。エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼの組み合わせを用いた処理、タンパク質複合体のアフィニティ精製（例えば、官能基化された表面に結合する捕捉標識、抗体プルダウンなどを介する）の後、溶液中の他の望ましくない核酸物質または結合していないタンパク質から、標的ＤＮＡフラグメントを分離する。次いで、標的核酸フラグメントは、リボヌクレオチド複合体結合から放出されてもよい。
【０１２６】
核酸ライブラリ、および核酸ライブラリを作成し、使用する方法
いくつかの実施形態において、提供される方法は、核酸物質を提供する工程と、複数の触媒的に不活性な標的エンドヌクレアーゼ（例えば、リボ核酸タンパク質複合体）を、核酸物質に沿って分配された複数の領域に対して指向性にして、任意の時間に選択プローブを介して調べることができる核酸ライブラリを作成する工程と、を含んでいてもよい。
【０１２７】
図１９Ａおよび図１９Ｂは、本技術の一実施形態による、目的のＤＮＡ領域を選択的に調べるためのツールとして使用可能な、調製されたＤＮＡライブラリおよび試薬の概念図である。固有にタグ化された触媒的に不活性なＣａｓ９は、単離された／フラグメント化されていないゲノムＤＮＡ（またはＤＮＡの他の大きなフラグメント）の複数の（例えば、間隔があいた）領域に標識指向性である（図１９Ａ）。各々の触媒的に不活性なＣａｓ９リボ核酸タンパク質は、既知の配列（例えば、コード配列）を有する既知のオリゴヌクレオチドタグを含み、ゲノムのあらかじめ設計された領域に結合する。図１９Ａに模式的に示されるように、複数の不活性なＣａｓ９リボ核酸タンパク質複合体（例えば、ｉＣａｓ９Ａ、ｉＣａｓ９Ｂ、ｉＣａｓ９Ｃ、ｉＣａｓ９Ｎ）は、ゲノム領域（例えば、大きな選択された領域、ゲノム全体など）全体に分配されたゲノム部位（ＳｉｔｅＡ、ＳｉｔｅＢ、ＳｉｔｅＣ、ＳｉｔｅＮ）に結合するようにｇＲＮＡ指向性である。各ｉＣａｓ９複合体は、オリゴヌクレオチドコード配列（ＡＡＡＡＡＡＡ）を含むオリゴヌクレオチドタグを含み、ここで、「Ａ」は、ヌクレオチドのスティング（ｓｔｉｎｇ）が、ルックアップテーブル中に記録され、後で調べることができる実質的に固有のコードを含む、任意のヌクレオチド（修飾されていないか、または修飾されたもの）である。
【０１２８】
特定の標的配列またはより小さい領域を調べる（例えば、配列決定する）ことが望ましい場合、ライブラリは、所望の領域をプルダウンするように操作された、特定的に設計された捕捉プローブを用いてプローブされてもよい。フラグメント化方法を使用して、ゲノムＤＮＡを種々の大きさにフラグメント化することができる（例えば、制限酵素消化、機械剪断など）。各々のｉＣａｓ９複合体が、ＤＮＡ部位と計算的に関連する実質的に固有のオリゴヌクレオチドタグを含むため、ユーザは、目的のゲノムの領域に対応するコード配列の相補体（例えば、アンチコード配列）を含む１つ以上のプローブを段階的に付加することができる。例えば、図１９Ｂに示されるように、アンチコード配列は、目的のコード配列に対して実質的に相補性のヌクレオチド配列である。例えば、ｓｉｔｅＡを含む領域を抽出するために、ユーザは、ｓｉｔｅＡに結合したｉＣａｓ９Ａ複合体に関連するコード配列（ＡＡＡＡＡＡＡ）を調べる。次いで、捕捉標識が固定されているか、または組み込まれており、アンチコード配列（Ａ’Ａ’Ａ’Ａ’Ａ’Ａ’Ａ’）を含むオリゴヌクレオチドプローブを用い、目的の領域は、適切な抽出部分（例えば、ビオチンが捕捉標識である場合にはストレプトアビジン）を有する官能基化された表面の導入によって、機能的に選択され、濃縮されてもよい。
【０１２９】
種々の実施形態において、核酸ライブラリは、いくつかのプローブによるインテロゲーションのためのリソースとして使用可能である。加えて、あらかじめ結合した複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ部位指向性複合を含むいくつかのライブラリを調製することができる。さらに、いくつかのライブラリは、機械剪断、エンドヌクレアーゼ切断（１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いる）のいずれかを用いて、あらかじめフラグメント化されてもよく、または切断されてもよい。所望の標的領域が切断される（例えば、標的エンドヌクレアーゼ消化（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、制限酵素など）を介する）場合、標的フラグメントの長さは既知であり、プローブを用いたプルダウンの後に、標的フラグメントは、サイズ選択によってさらに濃縮されてもよい。
【０１３０】
さらなる方法
本技術のいくつかの態様は、長い配列の配列決定技術、例えば、直接デジタル配列決定（ＤＤＳ）プラットフォームと共に使用するのに適している。いくつかの実施形態において、ＤＤＳと共に使用するための目的の標的配列を濃縮するのが望ましい。このような実施形態において、標的配列について、増幅を行わない濃縮をすることが望ましい。これに加えて、このようなプラットフォーム上で二本鎖配列決定データを作成することがさらに望ましい。
【０１３１】
図２０は、本技術の一実施形態による、直接デジタル配列決定方法と共に使用するための標的ＤＮＡフラグメントのアフィニティに基づく濃縮および配列決定のための方法の工程を示す。パネルＡは、粘着末端（複数可）を含む標的ＤＮＡフラグメント（例えば、図１４または図１７の方法で作成された標的ＤＮＡフラグメント）への選択されたアダプターの接続を示す。パネルＡは、フラグメントの５’末端にアダプター１を接続し、３’末端にアダプター２を接続することをさらに示し、アダプター１および２は、それぞれ、このフラグメントの粘着末端１および２に対して少なくとも部分的に相補性のオーバーハング配列を含む。アダプター１は、Ｙ字型を有しており、異なる特性を有する異なる標識（ＡおよびＢ）を有する５’および３’の一本鎖アームを含む。アダプター２は、ヘアピン形状のアダプターである。
【０１３２】
パネルＢは、標識Ａが官能基化された表面に結合するように構成される直接デジタル配列決定方法における工程を示す。標識Ｂは、電場または磁場の適用によって二本鎖アダプター−ＤＮＡ複合体の第１および第２の鎖の変性が起こった後、ＤＮＡフラグメントの電気伸長を引き起こすような物理特性（例えば、電荷、磁気特性など）を提供する。濃縮された／標的とされた鎖からの配列情報が、エラー修正および他の核酸インテロゲーション（例えば、ＤＮＡ損傷の評価など）のための二本鎖配列情報を提供するように、第１および第２の鎖は、ヘアピンアダプターによってつなぎ止められたままである。例えば、第１の鎖から作成された配列は、エラー修正のために第２の鎖と比較した配列と比較されてもよく、または別の例において、ＤＮＡ損傷の部位および特徴を決定してもよい。いくつかの実施形態において、濃縮される標的ゲノム領域は、約１〜１，０００，０００塩基の長さを有していてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、変性され、配列決定される場合、濃縮される核酸フラグメントの長さは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００または５０，０００塩基長であってもよい。いくつかの実施形態において、フラグメントの長さは、最大で６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１２０，０００、１５０，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００または１，０００，０００塩基であってもよい。
【０１３３】
図２１は、本技術の別の実施形態による、ＤＤＳ方法を使用する標的ＤＮＡフラグメントの配列決定のためのアフィニティに基づく濃縮のための方法の工程を示す。パネルＡは、粘着末端（複数可）を含む標的ＤＮＡフラグメント（例えば、図１４または図１７の方法で作成された標的ＤＮＡフラグメント）のアフィニティに基づく濃縮を示す。示されているように、ヘアピンアダプターは、配列に依存する様式で二本鎖ＤＮＡフラグメントの３’末端に接続している。標的ＤＮＡ分子（複数可）は、切断された標的ＤＮＡフラグメント（例えば、結合したオリゴヌクレオチドを有する）と会合する粘着末端を結合することが可能な官能基化された表面の上を流れてもよい。これに加え、標識Ｂを含み、結合したオリゴヌクレオチドの一部と少なくとも部分的に相補性の第２のオリゴヌクレオチド鎖が、溶液に加えられる。アダプター／ＤＮＡフラグメント構成要素のアニーリングおよびライゲーションは、直接デジタル配列決定に適した表面に結合したアダプター−標的二本鎖ＤＮＡ複合体を提供する（パネルＢ）。配列決定工程のための電場または磁場の適用およびアダプター−ＤＮＡ複合体の電気伸長は、例えば、図２０に記載されている通りに行うことができる。
【０１３４】
試薬および方法
アダプターの種類
本開示の例の大部分は、Ｙ字型またはループアダプターを示すが、種々の実施形態に従って、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１００４４１号に記載されるものなど、任意の既知のアダプター構造を使用してもよい。例えば、バブル（例えば、非相補性の内部領域）を含む種々のアダプター形状がさらに想定される。
【０１３５】
分離
本明細書に記載されるように、種々の方法は、少なくとも１つの分離工程を含む。任意の種々の分離工程が、種々の実施形態に含まれていてもよいことが具体的に想定される。例えば、いくつかの実施形態において、分離は、物理的な分離、サイズ分離、磁気分離、溶解性分離、電荷分離、疎水性分離、極性分離、電気泳動移動性分離、密度分離、化学溶出分離、ＳＢＩＲビーズ分離などであってもよく、またはこれらを含んでいてもよい。例えば、物理的な基は、磁気特性、電荷特性または不溶性特性を有していてもよい。実施形態において、物理的な基が磁気特性を有し、磁場が適用される場合、この物理的な基を含む関連するアダプター核酸配列は、この物理的な基を含まないアダプター核酸配列から分離される。別の実施形態において、物理的な基が電荷特性を有し、電場が適用される場合、この物理的な基を含む関連するアダプター核酸配列は、この物理的な基を含まないアダプター核酸配列から分離される。実施形態において、物理的な基が不溶性特性を有し、アダプター核酸配列が、この物理的な基が不溶性である溶液中に含まれる場合、この物理的な基を含む関連するアダプター核酸配列は、この物理的な基を含まず、溶液中に留まっているアダプター核酸配列から離れて沈殿する。
【０１３６】
任意の種々の物理的な分離方法が、種々の実施形態に含まれていてもよい。特定の例として、方法の非限定的なセットとしては、特に、サイズ選択濾過、密度遠心分離、ＨＰＬＣ分離、ゲル濾過分離、ＦＰＬＣ分離、密度勾配遠心分離およびゲルクロマトグラフィーが挙げられる。
【０１３７】
任意の種々の磁気分離方法が、種々の実施形態に含まれていてもよい。典型的には、磁気分離方法は、磁気特性を有する１つ以上の物理的な基を含むことまたは付加することを包含し、磁場が適用されると、このような物理的な基（複数可）を含む分子は、このような物理的な基を含まない分子から分離される。具体的な例として、磁気特性を含む示す物理的な基としては、限定されないが、常磁性材料、例えば、鉄、ニッケル、コバルト、ジスプロシウム、ガドリニウム、およびこれらのアロイが挙げられる。化学的分離および生化学的分離のために一般的に使用される常磁性ビーズは、表面内にこのような材料を埋め込み、材料と操作される化学物質（例えば、ポリスチレン）との化学的相互作用を減少させ、上述のアフィニティ特性のために官能基化されてもよい。
【０１３８】
捕捉標識
本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態において、捕捉標識は、タンパク質上に、オリゴヌクレオチドプローブ、アダプター、リボヌクレオチド配列、リボ核酸タンパク質複合体などに沿って、任意の種々の構成で存在していてもよい。いくつかの実施形態において、捕捉標識は、配列の５’領域にあるオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれてもよく、または固定されてもよい。いくつかの実施形態において、捕捉標識は、オリゴヌクレオチド鎖の中央のどこかに存在してもよい（すなわち、オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端にはない）。２つ以上の捕捉標識を含む実施形態において、各捕捉標識は、オリゴヌクレオチドに沿って異なる位置に存在していてもよい。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、捕捉標識は、特に、ビオチン、ビオチンデオキシチミジンｄＴ、ビオチンＮＨＳ、ビオチンＴＥＧ、ビオチン−６−アミノアリル−２’−デオキシウリジン−Ｓ’−トリホスフェート、ビオチン−１６−アミノアリル−２−デオキシシチジン−５’−トリホスフェート、ビオチン１６−アミノアリルシチジン−５’−トリホスフェート、Ｎ４−ビオチン−ＯＢＥＡ−２’−デオキシシチジン−５’−トリホスフェート、ビオチン−１６−アミノアリルウリジン−５’−トリホスフェート、ビオチン−１６−７−デアザ−７−アミノアリル−２’−デオキシグアノシン−５’−トリホスフェート、５’−ビオチン−Ｇ−モノホスフェート、５’−ビオチン−Ａ−モノホスフェート、５’−ビオチン−ｄＧ−モノホスフェート、５’−ビオチン−ｄＡ−モノホスフェート、デスチオビオチンＮＨＳ、デスチオビオチン−６−アミノアリル−２’−デオキシシチジン−５’−トリホスフェート、ジゴキシゲニンＮＨＳ、ＤＮＰ  ＴＥＧ、チオール、Ｃｏｌｉｃｉｎ  Ｅ２、Ｉｍ２、グルタチオン、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ニッケル、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグの群から選択される。いくつかの実施形態において、捕捉標識としては、限定されないが、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗体によって認識されるハプテン、特定の核酸配列および／または磁気誘引性粒子が挙げられる。いくつかの実施形態において、核酸分子の１つ以上の化学修飾（例えば、多くの他の修飾の中で特に、Ａｃｒｉｄｉｔｅ（商標）修飾されたもの、そのいくつかは、本出願の他の箇所に記載されている）は、捕捉標識として機能することができる。
【０１４０】
抽出部分
抽出部分は、標的捕捉標識に対する物理的な結合パートナーまたは対であってもよく、捕捉標識を欠く核酸から、捕捉標識を有するか、または捕捉標識を有する分子（例えば、オリゴヌクレオチド、タンパク質、リボ核酸タンパク質複合体など）によって結合した核酸のアフィニティ分離を可能にする単離可能な部分または任意の種類の分子を指す。抽出部分は、基質、例えば、固体表面に（例えば、核酸を介して、抗体を介して、アプタマーを介して、など）直接的に連結していてもよく、または間接的に連結していてもよい。いくつかの実施形態において、抽出部分は、低分子、核酸、ペプチド、抗体、または任意の固有に結合可能な部分を含む群から選択される。抽出部分は、官能基化された表面を形成するために、固相または他の表面に連結するか、または連結可能であってもよい。いくつかの実施形態において、抽出部分は、ある表面（例えば、固体表面、ビーズ、磁性粒子など）に連結されたヌクレオチドの配列である。いくつかの実施形態において、捕捉標識がビオチンである場合、抽出部分は、アビジンまたはストレプトアビジンの群から選択される。任意の種々のアフィニティ結合対を、種々の実施形態に従って使用してもよいことが当業者によって理解されるだろう。
【０１４１】
特定の実施形態において、抽出部分は、標的捕捉標識と相互作用する物理的特性または化学的特性であってもよい。例えば、抽出部分は、磁場、電荷場、または標的捕捉標識が不溶性である液体溶液であってもよい。このような物理的特性または化学的特性が適用されてもよく、捕捉標識を有するアダプター核酸は、容器（表面）またはカラムの中に／これらに対して固定されてもよい。所望な陽性濃縮／選択または陰性濃縮／選択の結果に応じて、固定された分子が保持されてもよく（陽性濃縮）、またはさらなる精製／処理または使用のために、固定されない分子が保持されてもよい（陰性濃縮）。
【０１４２】
固体表面
アフィニティパートナー／抽出部分が、固体表面または基質に接続し、捕捉標識に結合する場合、捕捉標識を含むアダプター核酸配列は、アフィニティ標識を含まないアダプター核酸配列から分離することができる。固体表面または基質は、ビーズ、単離可能な粒子、磁気粒子または別の固定された構造であってもよい。
【０１４３】
本明細書に記載され、当業者によって理解されるように、任意の種々の官能基化された表面を、種々の実施形態に従って使用してもよい。例えば、いくつかの実施形態において、官能基化された表面は、ビーズ（例えば、孔径が制御された多孔質ガラスビーズ、マクロ多孔性ポリスチレンビーズなど）であってもよく、またはこれらを含んでいてもよい。しかし、多くの他の化学部分／表面対を、同じ目的を達成するために同様に使用することができることが、当業者によって理解されるだろう。本明細書に記載される特定の官能基化された表面が、単に例としてのものであることを意味しており、１つ以上の抽出部分と会合する（例えば、連結する、結合するなど）ことが可能な、任意の他の適切な固定された構造または基質を使用してもよいことが理解されるだろう。
【０１４４】
核酸の切断
酵素開裂、一本鎖の酵素開裂、二本鎖の酵素開裂を組み込んでもよい、アダプター、オリゴヌクレオチドおよび捕捉標識を用いる核酸物質の濃縮、修飾核酸の組み込みの後に、片方または両方の鎖を開裂する酵素処理、光開裂可能なリンカーの組み込み、ウラシルの組み込み、リボース塩基の組み込み、８−オキソ−グアニン付加物の組み込み、制限エンドヌクレアーゼの使用、部位指向性切断酵素の使用などを含む、本技術の種々の態様。他の実施形態において、エンドヌクレアーゼ、例えば、リボ核酸タンパク質エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ酵素、例えば、Ｃａｓ９またはＣＰＦ１）、または他のプログラマブルエンドヌクレアーゼ（例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ（例えば、メガＴＡＬヌクレアーゼ）、アルゴノートヌクレアーゼなど）、およびこれらの任意の組み合わせを使用してもよい。
【０１４５】
本明細書に記載されるように、種々の実施形態は、１つ以上の鎖中の特定の位置で二本鎖核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を切断および／または開裂するための塩基または他の骨格化学修飾を認識する固有のヌクレオチド配列または修飾または他のエンティティを認識する、１つ以上のエンドヌクレアーゼの使用を含む。例としては、ウラシル（認識され、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼと脱塩基部位リアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩまたはＦＰＧ）の組み合わせを用いて開裂することができる）およびリボースヌクレオチド（ＤＮＡ塩基と対を形成したときに、ＲＮＡｓｅＨ２によって認識され、開裂することができる）が挙げられる。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組み合わせであってもよく、場合により、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックド核酸（ＬＮＡ）、または他の修飾核酸を含む。いくつかの実施形態において、切断は、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼの使用によって行われてもよい。いくつかの実施形態において、開裂は、開裂可能なリンカー、例えば、ウラシルデスチオボチン−ＴＥＧ、リボース開裂、または他の方法を用いて行われてもよい。いくつかの実施形態において、開裂可能なリンカーは、酵素を必要としない光開裂可能なリンカーまたは化学開裂可能なリンカーであってもよく、または部分的にそうであってもよい。
【０１４６】
認識部位で、または認識部位付近でＤＮＡを開裂する種々の制限エンドヌクレアーゼ（すなわち、制限酵素）（例えば、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡｌｕＩ、ＡｖａＩＩ、ＢｓａＪＩ、ＢｓｔＮＩ、ＤｓａＶ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＭａｅＩＩＩ、Ｎ１ａＩＶ、ＮＳｉＩ、ＭｓｐＪＩ、ＦｓｐＥＩ、ＮａｅＩ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＮｏｔＩ、ＨｉｎＦ１、Ｓａｕ３ＡＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｍａＩ、ＨｇａＩ、ＡｌｕＩ、ＥｃｏＲＶなど）が、本技術の種々の実施形態に従って使用されてもよいことが当業者によって理解されるだろう。いくつかの制限エンドヌクレアーゼの列挙は、印刷された形態およびコンピュータ可読形態の両方で入手可能であり、多くの商業的な供給業者（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、イプスウィッチ、ＭＡ）によって提供される。制限エンドヌクレアーゼおよび関連する認識部位の非限定的なリストは、ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｔｏｏｌｓ−ａｎｄ−ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ−ｃｈａｒｔｓ／ａｌｐｈａｂｅｔｉｚｅｄ−ｌｉｓｔ−ｏｆ−ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓで見出されるだろう。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドは、開裂可能な部分を提供することができる。例えば、ウラシル塩基（一例として、ＵＧＤとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩまたはＦＰＧの組み合わせを用いて開裂することができる）、脱塩基部位（一例としてエンドヌクレアーゼＶＩＩＩによって開裂することができる）、８−オキソ−グアニン（一例としてＦＰＧまたはＯＧＧ１によって開裂することができる）およびリボースヌクレオチド（一例において、ＤＮＡと対を形成したとき、ＲＮＡｓｅＨ２によって開裂することができる）。
【０１４８】
ライゲーション可能末端
いくつかの実施形態において、アダプター産物は、標的二本鎖核酸配列（例えば、配列決定ライブラリ調製のための）にライゲーションするのに適した、ライゲーション可能な３’末端と共に作成される。二本鎖アダプター産物の各々に存在するライゲーションドメインは、二本鎖標的核酸配列の一方の対応する鎖にライゲーション可能であってもよい。いくつかの実施形態において、ライゲーションドメインのうちの１つは、Ｔ−オーバーハング、Ａ−オーバーハング、ＣＧ−オーバーハング、複数ヌクレオチドオーバーハング、平滑末端、または別のライゲーション可能な核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、二本鎖３’ライゲーションドメインは、平滑末端を含む。特定の実施形態において、ライゲーションドメイン配列のうちの少なくとも１つは、修飾核酸または標準ではない核酸を含む。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、脱塩基部位、ウラシル、テトラヒドロフラン、８−オキソ−７，８−ジヒドロ−２’−デオキシアデノシン（８−オキソ−Ａ）、８−オキソ−７，８−ジヒドロ−２’−デオキシグアノシン（８−オキソ−Ｇ）、デオキシイノシン、５’−ニトロインドール、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン、イソ−シトシン、５’−メチル−イソシトシンまたはイソ−グアノシンであってもよい。いくつかの実施形態において、ライゲーションドメインの少なくとも１本の鎖は、脱リン酸化塩基を含む。いくつかの実施形態において、ライゲーションドメインのうちの少なくとも１つは、脱ヒドロキシル化塩基を含む。いくつかの実施形態において、ライゲーションドメインの少なくとも１本の鎖は、ライゲーションを不可能にするように化学修飾されている（例えば、ライゲーションドメインをライゲーション可能にするためのさらなる作業が行われるまで）。いくつかの実施形態において、３’オーバーハングは、末端トランスフェラーゼ活性を有するポリメラーゼの使用によって得られる。一例において、Ｔａｑポリメラーゼは、単一塩基対オーバーハングを付加し得る。いくつかの実施形態において、これは「Ａ」である。
【０１４９】
標準的ではないヌクレオチド
いくつかの実施形態において、提供されるテンプレートおよび／または伸長鎖は、１つ以上の標準的ではない／非カノニカルヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、標準的ではないヌクレオチドは、ウラシル、メチル化ヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、リボースヌクレオチド、８−オキソ−グアニン、ビオチン化ヌクレオチド、デスチオビオチンヌクレオチド、チオール修飾ヌクレオチド、アクリダイト修飾ヌクレオチド、イソ−ｄＣ、イソｄＧ、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、イノシンヌクレオチドロックド核酸、ペプチド核酸、５メチルｄＣ、５−ブロモデオキシウリジン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリンヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、５−ニトロインドールヌクレオチド、アデニル化ヌクレオチド、アジドヌクレオチド、ジゴキシゲニンヌクレオチド、Ｉ−リンカー、５’ヘキシニル修飾ヌクレオチド、５−オクタジイニルｄＵ、光開裂可能なスペーサー、光開裂可能ではないスペーサー、クリックケミストリーに適合性の修飾ヌクレオチド、蛍光染料、ビオチン、フラン、ＢｒｄＵ、フルオロ−ｄＵ、ロト−ｄＵ、およびこれらの任意の組み合わせであってもよく、またはこれらを含んでいてもよい。
【０１５０】
さらなる態様
本開示の態様によれば、いくつかの実施形態は、非常に少量の核酸物質から高品質の配列決定情報を提供する。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物は、開始時の核酸物質の量が最大で約１ピコグラム（ｐｇ）、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ナノグラム（ｎｇ）、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇまたは１０００ｎｇで使用されてもよい。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物は、核酸物質のインプット量が最大で１モルコピーまたはゲノム当量、１０モルコピーまたはそのゲノム当量、１００モルコピーまたはそのゲノム当量、１，０００モルコピーまたはそのゲノム当量、１０，０００モルコピーまたはそのゲノム当量、１００，０００モルコピーまたはそのゲノム当量、または１，０００，０００モルコピーまたはそのゲノム当量で使用されてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、最大で１，０００ｎｇの核酸物質が特定の配列決定プロセスのために最初に提供される。例えば、いくつかの実施形態において、最大で１００ｎｇの核酸物質が特定の配列決定プロセスのために最初に提供される。例えば、いくつかの実施形態において、最大で１０ｎｇの核酸物質が特定の配列決定プロセスのために最初に提供される。例えば、いくつかの実施形態において、最大で１ｎｇの核酸物質が特定の配列決定プロセスのために最初に提供される。例えば、いくつかの実施形態において、最大で１００ｐｇの核酸物質が特定の配列決定プロセスのために最初に提供される。例えば、いくつかの実施形態において、最大で１ｐｇの核酸物質が特定の配列決定プロセスのために最初に提供される。
【０１５１】
本技術の他の態様によれば、いくつかの提供される方法は、核酸物質の任意の種々の最適ではない（例えば、損傷を受けているか、または分解している）サンプルの配列決定に有用な場合がある。例えば、いくつかの実施形態において、核酸物質の少なくとも一部が損傷を受けている。いくつかの実施形態において、損傷は、酸化、アルキル化、脱アミノ化、メチル化、加水分解、ニッキング、鎖内架橋、鎖間架橋、平滑末端鎖切断、付着末端二本鎖切断、リン酸化、脱リン酸化、ＳＵＭＯ化、グリコシル化、一本鎖ギャップ、熱からの損傷、乾燥からの損傷、ＵＶ曝露からの損傷、γ放射線からの損傷、Ｘ線からの損傷、電離放射線からの損傷、非電離放射線からの損傷、重粒子放射線からの損傷、核崩壊からの損傷、β放射線からの損傷、α放射線からの損傷、中性子放射線からの損傷、陽子放射線からの損傷、宇宙放射線からの損傷、高ｐＨからの損傷、低ｐＨからの損傷、活性酸化種からの損傷、遊離ラジカルからの損傷、過酸化物からの損傷、次亜塩素酸塩からの損傷、ホルマリンまたはホルムアルデヒドなどの組織固定からの損傷、反応性鉄からの損傷、低イオン状態からの損傷、高イオン状態からの損傷、非緩衝状態からの損傷、ヌクレアーゼからの損傷、環境曝露からの損傷、火災からの損傷、機械的応力からの損傷、酵素分解からの損傷、微生物からの損傷、調製の機械剪断からの損傷、調製の酵素断片化からの損傷、インビボで自然発生した損傷、核酸抽出中に発生した損傷、配列決定ライブラリ調製中に発生した損傷、ポリメラーゼによって導入された損傷、核酸修復中に導入された損傷、核酸末端のテーリング中に発生した損傷、核酸ライゲーション中に発生した損傷、配列決定中に発生した損傷、ＤＮＡの機械的な取り扱いから発生した損傷、ナノポアを通過中に発生した損傷、生物における老化の一部として発生した損傷、個体の化学物質曝露の結果として発生した損傷、変異原によって生じた損傷、発癌物質によって生じた損傷、染色体異常誘発物質によって発生した損傷、酸素曝露に起因するインビボでの炎症損傷から生じた損傷、１つ以上の鎖切断に起因する損傷のうちの少なくとも１つ、およびこれらの任意の組み合わせであるか、またはこれらを含む。
【０１５２】
ＩＩ．二本鎖配列決定方法および関連するアダプターおよび試薬の選択された実施形態
二本鎖配列決定は、二本鎖核酸分子からエラー修正済ＤＮＡ配列を生成するための方法であり、元々、国際特許公開第ＷＯ２０１３／１４２３８９号および米国特許第９，７５２，１８８号および第ＷＯ２０１７／１００４４１号、Ｓｃｈｍｉｔｔら、ＰＮＡＳ、２０１２［１］、Ｋｅｎｎｅｄｙら、ＰＬＯＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１３［２］、Ｋｅｎｎｅｄｙら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２０１４［３］、およびＳｃｈｍｉｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１５［４］に記載された。上述の特許、特許出願および刊行物はそれぞれ、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。図１Ａ〜図１Ｃに示されるように、本技術の特定の態様において、二本鎖配列決定を使用して、誘導体配列リードを、大規模並列配列決定（ＭＰＳ）（一般的に次世代配列決定（ＮＧＳ）としても知られる）中に同じ二本鎖核酸親分子に由来するものとして認識することができるだけではなく、配列決定後に区別可能なエンティティとして互いに区別されるような様式で、個々のＤＮＡ分子の両方の鎖を独立して配列決定することができる。次いで、各鎖から得られる配列リードを、二本鎖コンセンサス配列（ＤＣＳ）として知られる元の二本鎖核酸分子のエラー修正済配列を得るという目的のために比較する。二本鎖配列決定のプロセスは、元の二本鎖核酸分子の両方の鎖が、ＤＣＳを形成するために使用される作成した配列決定データ中に現れることを明示的に確認することを可能にする。
【０１５３】
特定の実施形態において、ＤＳを組み込む方法は、１つ以上の配列決定アダプターを、第１の鎖標的核酸配列と第２の鎖標的核酸配列とを含む標的二本鎖核酸分子にライゲーションし、二本鎖標的核酸複合体を生成することを含んでいてもよい（例えば、図２２Ａ）。
【０１５４】
種々の実施形態において、得られる標的核酸複合体は、少なくとも１つのＳＭＩ配列を含んでいてもよく、外部から適用される変性または半変性した配列（例えば、図２２Ａに示されるランダム化された二本鎖タグ、図２２Ａではαおよびβとして識別された配列）、標的二本鎖核酸分子の特定の剪断点に関連する内因性情報、またはこれらの組み合わせを伴っていてもよい。ＳＭＩは、標的核酸分子を、単独で、またはそれらがライゲーションされた核酸フラグメントの要素を区別することと組み合わせて配列決定される集合中の複数の他の分子から実質的に区別可能にすることができる。ＳＭＩ要素の実質的に区別可能な特徴は、各々の鎖の誘導体増幅産物が、配列決定後に同じ元の実質的に固有の二本鎖核酸分子に由来するものであると認識することができるように、二本鎖核酸分子を形成する各々の一本鎖が独立して有していてもよい。他の実施形態において、ＳＭＩは、さらなる情報を含んでいてもよく、および／または上に引用した刊行物に記載されるものなど、このような分子を区別する機能が有用である他の方法で使用されてもよい。別の実施形態において、ＳＭＩ要素は、アダプターライゲーションの後に組み込まれてもよい。いくつかの実施形態において、ＳＭＩは、本質的に二本鎖である。他の実施形態において、ＳＭＩは、本質的に一本鎖である（例えば、ＳＭＩは、アダプターの一本鎖部分（複数可）上にあってもよい）。他の実施形態において、ＳＭＩは、本質的に一本鎖と二本鎖の組み合わせである。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、各二本鎖標的核酸配列複合体は、さらに、標的二本鎖核酸分子を形成する２つの一本鎖核酸の増幅産物を、配列決定後に互いに実質的に区別可能にする要素（例えば、ＳＤＥ）を含んでいてもよい。一実施形態において、ＳＤＥは、配列決定アダプター内に含まれる非対称プライマー部位を含んでいてもよく、または他の配置において、配列非対称をプライマー配列内ではなくアダプター分子内に導入してもよく、その結果、第１の鎖標的核酸配列複合体と標的核酸配列複合体の第２の鎖のヌクレオチド配列における少なくとも一部が、増幅および配列決定の後に互いに異なっている。他の実施形態において、ＳＭＩは、カノニカルヌクレオチド配列Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵとは異なるが、２つの増幅され、配列決定された分子における少なくとも１つのカノニカルヌクレオチド配列の差に変換される、２つの鎖間の別の生化学的非対称を含んでいてもよい。さらに別の実施形態において、ＳＤＥは、増幅前に２つの鎖を物理的に分離する手段であってもよく、その結果、第１の鎖標的核酸配列および第２の鎖標的核酸配列からの誘導体増幅産物は、これら２つの配列間の区別を維持する目的のために、互いに実質的に物理的に単離された状態を維持する。第１の鎖と第２の鎖とを区別することを可能にするＳＤＥ機能を提供するための他のこのような配置および方法論、例えば、上に引用した刊行物に記載されるもの、または記載した機能目的を果たす他の方法を利用してもよい。
【０１５６】
少なくとも１つのＳＭＩと少なくとも１つのＳＤＥとを含む二本鎖標的核酸複合体を作成した後、またはこれらの要素の片方または両方がその後に導入される場合に、複合体は、ＤＮＡ増幅（例えばＰＣＲを用いる）またはＤＮＡ増幅の任意の他の生化学的方法（例えば、ローリングサークル増幅、複数置換増幅、等温増幅、ブリッジ増幅または表面結合増幅）が行われてもよく、その結果、第１の鎖標的核酸配列の１つ以上のコピーおよび第２の鎖標的核酸配列の１つ以上のコピーが産生される（例えば、図２２Ｂ）。次いで、第１の鎖標的核酸分子の１つ以上の増幅コピーおよび第２の標的核酸分子の１つ以上の増幅コピーに、好ましくは、「次世代の」大規模並列ＤＮＡ配列決定プラットフォームを用いて、ＤＮＡ配列決定を行うことができる（例えば、図２２Ｂ）。
【０１５７】
元の二本鎖標的核酸分子に由来する第１の鎖標的核酸分子および第２の鎖標的核酸分子のいずれかから作られる配列リードは、共通する関連する実質的に固有のＳＭＩに基づいて識別され、ＳＤＥによって反対の鎖標的核酸分子から区別されてもよい。いくつかの実施形態において、ＳＭＩは、数学に基づくエラー修正コード（例えば、ハミングコード）に基づく配列であってもよく、それにより、特定の増幅エラー、配列決定エラーまたはＳＭＩ合成エラーは、元の二本鎖（例えば、二本鎖核酸分子）の相補性鎖に対してＳＭＩ配列の配列を関連付ける目的のために許容される場合がある。例えば、ＳＭＩが、カノニカルＤＮＡ塩基の完全に変性した配列の１５塩基対を含む二本鎖外因性ＳＭＩを含む場合、概算で４の１５乗＝１，０７３，７４１，８２４のＳＭＩバリアントが、完全に変性したＳＭＩの集合に存在する。２つのＳＭＩが、１０，０００個のサンプリングされたＳＭＩの集合からのＳＭＩ配列内で１個のヌクレオチドのみが異なる配列決定データのリードから回収される場合、これが偶然に発生する確率を数学的に計算することができ、この単一塩基対の違いが、上に記載した種類のエラーの１つを反映していることが起こりそうかどうかの決定を行い、そのＳＭＩ配列が、同じ元の二本鎖分子に由来するという事実を有することを決定することができる。ＳＭＩが少なくとも部分的に外部から適用される配列であり、その配列バリアントが互いに完全に変性したものではなく、少なくとも部分的には既知の配列である、いくつかの実施形態において、その既知の配列の同一性は、いくつかの実施形態において、上述の種類の１つ以上のエラーが、ある既知のＳＭＩ配列の同一性を別のＳＭＩ配列の同一性へと変換しないような様式で設計することができ、その結果、あるＳＭＩが別のＳＭＩであると誤って解釈されてしまう確率は減少する。いくつかの実施形態において、このＳＭＩ設計戦略は、ハミングコード手法またはその誘導体を含む。識別されたら、第１の鎖標的核酸分子から作られる１つ以上の配列リードを、第２の鎖標的核酸分子から作られる１つ以上の配列リードと比較して、エラー修正済標的核酸分子配列を生成する（例えば、図２２Ｃ）。例えば、第１の鎖標的核酸配列と第２の鎖標的核酸配列の両方からの塩基が一致するヌクレオチド位置は、真の配列であるとみなされ、一方、この２つの鎖間で一致しないヌクレオチド位置は、技術的なエラーの可能性がある部位と認識され、この部位は、考慮に入れられないか、除外されるか、修正されるか、または別の状況で識別されてもよい。このようにして、元の二本鎖標的核酸分子のエラー修正済配列を生成することができる（図２２Ｃに示される）。いくつかの実施形態において、第１の鎖標的核酸分子および第２の鎖標的核酸分子から作られる各々の配列決定リードを別個にグループ化した後、この第１の鎖および第２の鎖各々について一本鎖コンセンサス配列を作成してもよい。次いで、第１の鎖標的核酸分子および第２の鎖標的核酸分子に由来する一本鎖コンセンサス配列を比較して、エラー修正済標的核酸分子配列を生成することができる（例えば、図２２Ｃ）。
【０１５８】
これに代えて、いくつかの実施形態において、この２本の鎖間の配列が一致しない部位は、元の二本鎖標的核酸分子において、生物学的に由来するミスマッチの可能性がある部位と認識することができる。これに代えて、いくつかの実施形態において、この２本の鎖間の配列が一致しない部位は、元の二本鎖標的核酸分子において、ＤＮＡ合成に由来するミスマッチの可能性がある部位と認識することができる。これに代えて、いくつかの実施形態において、この２本の鎖間の配列が一致しない部位は、損傷を受けたか、または修飾されたヌクレオチド塩基が、片方または両方の鎖に存在し、酵素プロセス（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼまたは別の核酸修飾酵素または化学プロセス）によってミスマッチに変換された可能性がある部位と認識することができる。いくつかの実施形態において、この後者の知見を使用して、酵素プロセスまたは化学処理の前の核酸損傷またはヌクレオチド修飾の存在を推測することができる。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、本技術の態様に従い、本明細書に記載する二本鎖配列決定工程から作られる配列決定リードをさらにフィルタリングして、ＤＮＡ損傷分子（例えば、貯蔵、運搬中に、組織または血液の抽出中または抽出後に、ライブライリー調製中または調製後に損傷したなど）からの配列決定リードを除外することができる。例えば、ＤＮＡ修復酵素、例えば、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（ＦＰＧ）および８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＯＧＧ１）を利用して、ＤＮＡ損傷（例えば、インビトロでのＤＮＡ損傷またはインビボでの損傷）を除外するか、または修正することができる。これらのＤＮＡ修復酵素は、例えば、ＤＮＡから損傷した塩基を除去するグリコシラーゼである。例えば、ＵＤＧは、（シトシンの自発的な加水分解によって生じる）シトシン脱アミノ化から生じるウラシルを除去し、ＦＰＧは、８−オキソ−グアニン（例えば、活性酸素種から生じる共通のＤＮＡ病変）を除去する。ＦＰＧは、リアーゼ活性も有し、脱塩基部位に１塩基ギャップを生成することができる。このような脱塩基部位は、例えば、ポリメラーゼがテンプレートをコピーすることができないため、一般的に、その後にＰＣＲによって増幅することができない。したがって、このようなＤＮＡ損傷修復／除去酵素の使用は、真の変異を有していないが、配列決定および二本鎖配列分析の後に別の状況でエラーとして検出されない可能性がある損傷ＤＮＡを効果的に除去することができる。損傷した塩基に起因するエラーは、二本鎖配列決定によって多くは修正することができるが、まれに、相補性エラーが、両方の鎖上の同じ位置に起こることが理論的にあり得るため、エラーを増やす損傷を減少させることによって、アーチファクトの確率を減少させることができる。さらに、ライブラリ調製中、配列決定されるＤＮＡの特定のフラグメントは、その供給源から、または処理工程（例えば、機械的なＤＮＡ剪断）から一本鎖であってもよい。これらの領域は、典型的には、当該技術分野で知られる「末端修復」工程中に二本鎖ＤＮＡに変換され、ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオシド基質は、ＤＮＡサンプルに付加され、５’陥凹末端を延長する。コピーされるＤＮＡの一本鎖部分におけるＤＮＡ損傷の変異誘発性部位（すなわち、ＤＮＡ二本鎖の片方または両方の末端にある一本鎖５’オーバーハングまたは内部の一本鎖ニックまたはギャップ）は、末端平滑化反応中にエラーを生じる場合があり、一本鎖変異、合成エラーまたは核酸損傷部位を二本鎖形態にして、最終的な二本鎖コンセンサス配列において真の変異であると誤って解釈される場合があり、真の変異が元の二本鎖核酸分子内に実際には存在しなかった場合に、存在したと誤って解釈される場合がある。この状況は、「偽の二本鎖」と呼ばれ、このような損傷を破壊／修復する酵素の使用によって減少させることができ、または防ぐことができる。他の実施形態において、この発生は、元の二本鎖分子の一本鎖部位が形成するのを破壊するか、または防ぐための戦略の使用によって減少させることができ、または除外することができる（例えば、ニックまたはギャップが残る可能性がある機械的な剪断または特定の他の酵素ではなく、元の二本鎖核酸物質をフラグメント化するために使用される特定の酵素の使用）。他の実施形態において、元の二本鎖核酸の一本鎖部分を除外するためのプロセス（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼまたは緑豆ヌクレアーゼなどの一本鎖に特異的なヌクレアーゼ）の使用を、同様の目的のために利用することができる。
【０１６０】
さらなる実施形態において、本明細書に記載する二本鎖配列決定工程から作られる配列決定リードをさらにフィルタリングして、偽の二本鎖のアーチファクトに最もなりやすいリードの末端をトリミングすることによって、偽の変異を除外することができる。例えば、ＤＮＡフラグメント化は、二本鎖分子の末端に一本鎖部分を生成することができる。これらの一本鎖部分は、末端修復中に末端平滑化されてもよい（例えば、ＫｌｅｎｏｗまたはＴ４ポリメラーゼによって）。いくつかの場合において、ポリメラーゼは、これらの末端修復した領域においてコピーの誤りを起こし、「偽の二本鎖分子」の生成を引き起こす。ライブラリ調製のこれらのアーチファクトは、配列決定されたときに真の変異であると誤って見えてしまう場合がある。これらの末端修復機構の結果としてのエラーは、より高いリスクを有する領域で生じる可能性がある変異を除外するために配列決定リードの末端をトリミングすることによって、配列決定後の分析から除外することができるか、または減少させることができ、それにより、偽の変異の数を減少させることができる。一実施形態において、配列決定リードのこのようなトリミングは、自動的に達成することができる（例えば、通常の処理工程）。別の実施形態において、変異体頻度は、フラグメント末端領域について評価することができ、変異の閾値レベルがこのフラグメント末端領域で観察される場合、ＤＮＡフラグメントの二本鎖コンセンサス配列リードを作成する前に、配列決定リードのトリミングを行ってもよい。
【０１６１】
具体例として、いくつかの実施形態において、本明細書では、二本鎖標的核酸物質のエラー修正済配列リードを作成する方法が提供され、本方法は、二本鎖標的核酸物質を少なくとも１つのアダプター配列にライゲーションして、アダプター−標的核酸物質複合体を形成する工程を含み、ここで、少なくとも１つのアダプター配列は、（ａ）二本鎖標的核酸物質の各々の分子を固有に標識する変性または半変性した単一分子識別子（ＳＭＩ）配列と、（ｂ）アダプター−標的核酸物質複合体の各鎖が、その相補性鎖に対して別個に識別可能なヌクレオチド配列を有するように、アダプター−標的核酸物質複合体の第１の鎖をタグ化する第１のヌクレオチドアダプター配列およびアダプター−標的核酸物質複合体の第２の鎖をタグ化する第１のヌクレオチド配列と少なくとも部分的に非相補性の第２のヌクレオチドアダプター配列とを含む。次に、本方法は、アダプター−標的核酸物質複合体の各鎖を増幅させ、複数の第１の鎖アダプター−標的核酸複合体アンプリコンおよび複数の第２の鎖アダプター−標的核酸複合体アンプリコンを生成する工程を含んでいてもよい。本方法は、さらに、第１の鎖および第２の鎖を両方とも増幅させ、第１の核酸産物および第２の核酸産物を提供する工程を含んでいてもよい。本方法はまた、第１の核酸産物および第２の核酸産物の各々を配列決定して、複数の第１の鎖配列リードおよび複数の第２の鎖配列リードを生成する工程と、少なくとも１つの第１の鎖配列リードおよび少なくとも１つの第２の鎖配列リードの存在を確認する工程とを含んでいてもよい。本方法は、さらに、少なくとも１つの第１の鎖配列リードと少なくとも１つの第２の鎖配列リードとを比較することと、一致しないヌクレオチド位置を考慮に入れないことによって、二本鎖標的核酸物質のエラー修正済配列リードを作成すること、またはこれに代えて、比較した第１の鎖配列リードと第２の鎖配列リードが非相補性である１つ以上のヌクレオチド位置を有する、比較した第１の鎖配列リードと第２の鎖配列リードを除去することとを含んでいてもよい。
【０１６２】
さらなる具体例として、いくつかの実施形態において、本明細書では、サンプルからＤＮＡバリアントを識別する方法が提供され、本方法は、核酸物質（例えば、二本鎖標的ＤＮＡ分子）の両方の鎖を、少なくとも１つの非対称アダプター分子にライゲーションして、二本鎖標的ＤＮＡ分子の第１の鎖（例えば、上鎖）に関連付けられた第１のヌクレオチド配列と、二本鎖標的ＤＮＡ分子の第２の鎖（例えば、下鎖）と関連付けられた第１のヌクレオチドに少なくとも部分的に非相補性の第２のヌクレオチド配列とを有するアダプター−標的核酸物質複合体を形成する工程と、アダプター−標的核酸物質の各鎖を増幅させる工程とを含み、各々の鎖において、増幅したアダプター−標的核酸産物の別個のまだ関連するセットを生成する。本方法は、さらに、複数の第１の鎖アダプター−標的核酸産物および複数の第２の鎖アダプター−標的核酸産物の各々を配列決定する工程と、アダプター−標的核酸物質複合体の各鎖から少なくとも１つの増幅した配列リードの存在を確認する工程と、第１の鎖から得られた少なくとも１つの増幅した配列リードと、第２の鎖から得られた少なくとも１つの増幅した配列リードとを比較して、核酸物質（例えば、二本鎖標的ＤＮＡ分子）の両方の鎖の配列が一致しているヌクレオチド塩基のみを有する核酸物質（例えば、二本鎖標的ＤＮＡ分子）のコンセンサス配列リードを形成する工程とを含んでいてもよく、その結果、コンセンサス配列リード中の特定の位置で生じるバリアント（例えば、参照配列と比較して）が、真のＤＮＡバリアントとして識別される。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、本明細書では、二本鎖核酸物質から高精度のコンセンサス配列を作成する方法が提供され、本方法は、個々の二本鎖ＤＮＡ分子をアダプター分子でタグ化して、タグ化ＤＮＡ物質を形成する工程であって、ここで、各アダプター分子は、（ａ）二本鎖ＤＮＡ分子を固有に標識する変性または半変性した単一分子識別子（ＳＭＩ）と、（ｂ）各々のタグ化ＤＮＡ分子について、タグ化ＤＮＡ物質内の各々の個々のＤＮＡ分子の元の下鎖から、元の上鎖を区別する第１および第２の非相補性ヌクレオチドアダプター配列とを含む、工程と、タグ化ＤＮＡ分子の元の上鎖の重複のセットとタグ化ＤＮＡ分子の元の下鎖の重複のセットとを作成し、増幅したＤＮＡ物質を形成する工程とを含む。本方法は、さらに、元の上鎖の重複からの第１の一本鎖コンセンサス配列（ＳＳＣＳ）および元の下鎖の重複からの第２の一本鎖コンセンサス配列（ＳＳＣＳ）を作成する工程と、元の上鎖の第１のＳＳＣＳと、元の下鎖の第２のＳＳＣＳとを比較する工程と、元の上鎖の第１のＳＳＣＳおよび元の下鎖の第２のＳＳＣＳの両方の配列が相補性であるヌクレオチド塩基のみを有する高度に正確なコンセンサス配列を作成する工程とを含んでいてもよい。
【０１６４】
さらなる実施形態において、本明細書では二本鎖標的ＤＮＡ分子を含むサンプルからＤＮＡ損傷を検出および／または定量化する方法が提供され、本方法は、各二本鎖標的ＤＮＡ分子の両方の鎖を少なくとも１つの非対称アダプター分子にライゲーションして、複数のアダプター−標的ＤＮＡ複合体を形成する工程であって、ここで、各アダプター−標的ＤＮＡ複合体は、二本鎖標的ＤＮＡ分子の第１の鎖と関連付けられた第１のヌクレオチド配列と、二本鎖標的ＤＮＡ分子の第２の鎖と関連付けられた第１のヌクレオチド配列に少なくとも部分的に非相補性の第２のヌクレオチド配列とを有する、工程と、各々のアダプター標的ＤＮＡ複合体について、アダプター標的ＤＮＡ複合体の各鎖を増幅させる工程とを含み、それぞれの鎖において、増幅したアダプター標的ＤＮＡアンプリコンの別個のまだ関連するセットを生成する。本方法は、さらに、複数の第１の鎖アダプター−標的ＤＮＡアンプリコンおよび複数の第２の鎖アダプター−標的ＤＮＡアンプリコンの各々を配列決定する工程と、アダプター−標的ＤＮＡ複合体の各鎖から少なくとも１つの配列リードの存在を確認する工程と、第１の鎖から得られた少なくとも１つの配列リードと、第２の鎖から得られた少なくとも１つの配列リードとを比較して、二本鎖ＤＮＡ分子の１本の鎖の配列リードが、二本鎖ＤＮＡ分子の他の鎖の配列リードと一致していない（例えば、非相補性の）ヌクレオチド塩基を検出および／または定量化する工程とを含んでいてもよく、その結果、ＤＮＡ損傷の部位（複数可）を検出および／または定量化することができる。いくつかの実施形態において、本方法は、さらに、第１の鎖アダプター−標的ＤＮＡアンプリコンからの第１の一本鎖コンセンサス配列（ＳＳＣＳ）および第２の鎖アダプター−標的ＤＮＡアンプリコンからの第２の一本鎖コンセンサス配列（ＳＳＣＳ）を作成する工程と、元の第１の鎖の第１のＳＳＣＳと、元の第２の鎖の第２のＳＳＣＳとを比較する工程と、第１のＳＳＣＳの配列と第２のＳＳＣＳの配列が非相補性であるヌクレオチド塩基を識別して、サンプル中の二本鎖標的ＤＮＡ分子と関連付けられたＤＮＡ損傷を検出および／または定量化する工程とを含んでいてもよい。
【０１６５】
単一分子識別子配列（ＳＭＩ）
種々の実施形態に従い、提供される方法および組成物は、核酸物質の各々の鎖上に１つ以上のＳＭＩ配列を含む。ＳＭＩは、各々の鎖の誘導体増幅産物が、配列決定後に同じ元の実質的に固有の二本鎖核酸分子に由来するものであると認識することができるように、二本鎖核酸分子から得られる各々の一本鎖が独立して有していてもよい。いくつかの実施形態において、ＳＭＩは、さらなる情報を含んでいてもよく、および／または当業者が認識するように、このような分子を区別する機能が有用である他の方法で使用されてもよい。いくつかの実施形態において、ＳＭＩ要素は、核酸物質にアダプター配列をライゲーションする前、実質的に同時、または後に組み込まれてもよい。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、ＳＭＩ配列は、少なくとも１つの変性または半変性した核酸を含んでいてもよい。他の実施形態において、ＳＭＩ配列は、変性していなくてもよい。いくつかの実施形態において、ＳＭＩは、核酸分子のフラグメント末端（例えば、ライゲーションされた核酸物質の無作為に、または半無作為に剪断された末端）またはフラグメント末端付近と関連付けられた配列であってもよい。いくつかの実施形態において、外因性配列は、例えば、単一のＤＮＡ分子を互いに区別することが可能なＳＭＩ配列を得るために、ライゲーションされた核酸物質（例えば、ＤＮＡ）の無作為に、または半無作為に剪断された末端に対応する配列と組み合わせて考えられてもよい。いくつかの実施形態において、ＳＭＩ配列は、二本鎖核酸分子にライゲーションされるアダプター配列の一部である。特定の実施形態において、ＳＭＩ配列を含むアダプター配列は、二本鎖核酸分子の各鎖が、アダプター配列にライゲーションした後にＳＭＩを含むような、二本鎖である。別の実施形態において、ＳＭＩ配列は、二本鎖核酸分子にライゲーションする前または後に一本鎖であり、相補性ＳＭＩ配列は、その反対の鎖をＤＮＡポリメラーゼで延長し、相補性二本鎖ＳＭＩ配列を得ることによって作成されてもよい。他の実施形態において、ＳＭＩ配列は、アダプターの一本鎖部分（例えば、Ｙ字型を有するアダプターのアーム）にある。このような実施形態において、ＳＭＩは、二本鎖核酸分子の元の鎖に由来する配列リードのファミリーのグループ化を容易にしてもよく、いくつかの場合において、二本鎖核酸分子の元の第１の鎖と第２の鎖との間の関係を付与することができる（例えば、ＳＭＩの全てまたは一部が、ルックアップテーブルによって関連付けることが可能であってもよい）。実施形態において、第１の鎖および第２の鎖が異なるＳＭＩで標識される場合、２つの元の鎖からの配列リードは、１つ以上の内因性ＳＭＩ（例えば、核酸分子のフラグメント末端またはフラグメント末端付近と関連付けられる配列などのフラグメントに特有の特徴）を用いて関連付けられてもよく、またはこの２つの元の鎖によって共有されるさらなる分子タグ（例えば、アダプターの二本鎖部分中のバーコード）の使用によって関連付けられてもよく、またはこれらの組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態において、各ＳＭＩ配列は、約１〜約３０核酸（例えば、１、２、３、４、５、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、またはもっと多くの変性または半変性した核酸）を含んでいてもよい。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、ＳＭＩは、核酸物質およびアダプター配列の片方または両方にライゲーション可能である。いくつかの実施形態において、ＳＭＩは、Ｔ−オーバーハング、Ａ−オーバーハング、ＣＧ−オーバーハング、既知のヌクレオチド長（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはもっと多くのヌクレオチド）を有する「粘着末端」または一本鎖オーバーハング領域を含むオーバーハング、脱ヒドロキシル化塩基、および核酸物質の平滑末端のうちの少なくとも１つにライゲーションされてもよい。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、ＳＭＩの配列は、単一の核酸分子を互いに区別することが可能なＳＭＩ配列を得るために、例えば、核酸物質（例えば、ライゲーションされた核酸物質）の無作為に、または半無作為に剪断された末端に対応する配列と組み合わせて考えられ（またはこれと組み合わせて設計され）てもよい。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＳＭＩは、例えば、剪断点自体を用いて、または剪断点に対してすぐ横に隣接した核酸物質中の所定の数のヌクレオチド［例えば、剪断点から２、３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチド］を用いて、内因性ＳＭＩ（例えば、剪断点（例えば、フラグメント末端）に関連するＳＭＩ）であってもよい。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＳＭＩは、外因性ＳＭＩ（例えば、標的核酸物質にはみられない配列を含むＳＭＩ）であってもよい。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、ＳＭＩは、画像化部分（例えば、蛍光または別の状況で光学的に検出可能な部分）であってもよく、または画像化部分を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、このようなＳＭＩは、増幅工程を必要とすることなく、検出および／または定量化を可能にする。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、ＳＭＩ要素は、アダプター−標的核酸複合体上の異なる位置に配置される２つ以上の別個のＳＭＩ要素を含んでいてもよい。
【０１７２】
ＳＭＩの種々の実施形態は、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１７／１００４４１号にさらに開示される。
【０１７３】
鎖定義要素（ＳＤＥ）
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸物質の各鎖は、さらに、標的二本鎖核酸物質を形成する２つの一本鎖核酸の増幅産物を、配列決定後に互いに実質的に区別可能にする要素を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ＳＤＥは、配列決定アダプター内に含まれる非対称プライマー部位であってもよく、またはこの部位を含んでいてもよく、または他の配置において、配列非対称をプライマー配列内ではなくアダプター配列内に導入してもよく、その結果、第１の鎖標的核酸配列複合体と標的核酸配列複合体の第２の鎖のヌクレオチド配列における少なくとも一部が、増幅および配列決定の後に互いに異なっている。他の実施形態において、ＳＤＥは、カノニカルヌクレオチド配列Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵとは異なるが、２つの増幅され、配列決定された分子における少なくとも１つのカノニカルヌクレオチド配列の差に変換される、２つの鎖間の別の生化学的非対称を含んでいてもよい。さらに別の実施形態において、ＳＤＥは、増幅前に２つの鎖を物理的に分離する手段であってもよく、またはこの手段を含んでいてもよく、その結果、第１の鎖標的核酸配列および第２の鎖標的核酸配列からの誘導体増幅産物は、これら２つの誘導体増幅産物間の区別を維持する目的のために、互いに実質的に物理的に単離された状態を維持する。第１の鎖と第２の鎖を区別することを可能にするＳＤＥ機能を提供するための他のこのような配置または方法論が利用されてもよい。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、ＳＤＥは、ループ（例えば、ヘアピンループ）を形成することが可能であってもよい。いくつかの実施形態において、ループは、少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ認識部位を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、標的核酸複合体は、ループ内の切断事象を容易にするエンドヌクレアーゼ認識部位を含有していてもよい。いくつかの実施形態において、ループは、非カノニカルヌクレオチド配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、含有される非カノニカルヌクレオチドは、鎖開裂を容易にする１つ以上の酵素によって認識可能であってもよい。いくつかの実施形態において、含有される非カノニカルヌクレオチドは、ループ中の鎖開裂を容易にする１つ以上の化学プロセスによって標的とされてもよい。いくつかの実施形態において、ループは、ループ中の鎖開裂を容易にする１つ以上の酵素プロセス、化学プロセスまたは物理プロセスによって標的とされ得る、修飾された核酸リンカーを含有していてもよい。いくつかの実施形態において、この修飾されたリンカーは、光開裂可能なリンカーである。
【０１７５】
種々の他の分子ツールが、ＳＭＩおよびＳＤＥとして機能し得る。剪断点およびＤＮＡに基づくタグ以外に、対になった鎖を物理的に近接した状態に維持する単分子コンパートメント化方法、または他の非核酸タグ化方法は、鎖に関連する機能を果たし得る。同様に、アダプター鎖を物理的に分離し得る様式でのアダプター鎖の非対称化学標識は、ＳＤＥの役割を果たすことができる。近年記載された二本鎖配列決定の変形例は、重亜硫酸塩変換を使用して、シトシンメチル化の形態で天然に存在する鎖非対称を、２つの鎖を区別する配列の違いへと変換する。この実施態様は、検出され得る変異の種類に制限があるが、天然の非対称を利用するこの概念は、修飾ヌクレオチドを直接的に検出することができる配列決定技術を出現させるという観点で注目すべきものである。ＳＤＥの種々の実施形態は、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１７／１００４４１号にさらに開示される。
【０１７６】
アダプターおよびアダプター配列
種々の配置において、ＳＭＩ（例えば、分子バーコード）、ＳＤＥ、プライマー部位、フローセル配列および／または他の特徴を含むアダプター分子は、本明細書に開示する実施形態の多くと共に使用することが想定される。いくつかの実施形態において、提供されるアダプターは、（１）高い標的特異性、（２）多重化することが可能であること、（３）安定した最小限のバイアスを有する増幅を示すという性質のうちの少なくとも１つを有するＰＣＲプライマー（例えば、プライマー部位）に対して相補性または少なくとも部分的に相補性の１つ以上の配列であってもよく、またはこの配列を含んでいてもよい。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、アダプター分子は、「Ｙ」字型、「Ｕ」字型、「ヘアピン」形状であってもよく、バブル（例えば、相補性ではない配列の一部）を有していてもよく、または他の特徴を有していてもよい。他の実施形態において、アダプター分子は、「Ｙ」字型、「Ｕ」字型、「ヘアピン」形状、またはバブルを含んでいてもよい。特定のアダプターは、修飾ヌクレオチドまたは標準的ではないヌクレオチド、制限部位、またはインビトロで構造または機能を操作するための他の特徴を含んでいてもよい。アダプター分子は、末端を有する種々の核酸物質にライゲーションしてもよい。例えば、アダプター分子は、核酸物質のＴ−オーバーハング、Ａ−オーバーハング、ＣＧ−オーバーハング、複数ヌクレオチドオーバーハング（本明細書では「粘着末端」または「粘着オーバーハング」とも呼ばれる）、脱ヒドロキシル化塩基、平滑末端にライゲーションするのに適したものであってもよく、分子の末端は、標的の５’が脱リン酸化されているか、または別の状況で従来のライゲーションから遮断される。他の実施形態において、アダプター分子は、ライゲーション部位の５’鎖に脱リン酸化または別のライゲーションを防ぐ修飾を含んでいてもよい。後者の２つの実施形態において、このような戦略は、ライブラリフラグメントまたはアダプター分子の二量体化を防ぐのに有用な場合がある。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、アダプター分子は、捕捉分子にライゲーションした所望な標的核酸分子を単離するのに適した捕捉部分を含んでいてもよい。
【０１７９】
アダプター配列は、一本鎖配列、二本鎖配列、相補性配列、非相補性配列、部分的に相補性の配列、非対称配列、プライマーに結合する配列、フローセル配列、ライゲーション配列またはアダプター分子によって提供される他の配列を意味していてもよい。特定の実施形態において、アダプター配列は、オリゴヌクレオチドに対する相補性によって増幅するために使用される配列を意味していてもよい。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物は、少なくとも１つのアダプター配列（例えば、２つのアダプター配列であり、核酸物質の５’末端および３’末端の各々に１つ）を含む。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物は、２個以上のアダプター配列（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはもっと多く）を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、アダプター配列の少なくとも２つは、互いに（例えば、配列によって）異なる。いくつかの実施形態において、各アダプター配列は、アダプター配列が互いに（例えば、配列によって）異なる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアダプター配列は、少なくとも１つの他のアダプター配列の少なくとも一部に対して少なくとも部分的に相補性ではない（例えば、少なくとも１つのヌクレオチドによって相補性ではない）。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、アダプター配列は、少なくとも１つの標準的ではないヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、標準的ではないヌクレオチドは、脱塩基部位、ウラシル、テトラヒドロフラン、８−オキソ−７，８−ジヒドロ−２’デオキシアデノシン（８−オキソ−Ａ）、８−オキソ−７，８−ジヒドロ−２’−デオキシグアノシン（８−オキソ−Ｇ）、デオキシイノシン、５’ニトロインドール、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン、イソ−シトシン、５’−メチル−イソシトシン、またはイソグアノシン、メチル化ヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、リボースヌクレオチド、８−オキソ−グアニン、光開裂可能なリンカー、ビオチン化ヌクレオチド、デスチオビオチンヌクレオチド、チオール修飾ヌクレオチド、アクリダイト修飾ヌクレオチド、イソ−ｄＣ、イソｄＧ、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、イノシンヌクレオチドロックド核酸、ペプチド核酸、５メチルｄＣ、５−ブロモデオキシウリジン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリンヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、５−ニトロインドールヌクレオチド、アデニル化ヌクレオチド、アジドヌクレオチド、ジゴキシゲニンヌクレオチド、Ｉ−リンカー、５’ヘキシニル修飾ヌクレオチド、５−オクタジイニルｄＵ、光開裂可能なスペーサー、光開裂可能ではないスペーサー、クリックケミストリーに適合性の修飾ヌクレオチド、およびこれらの任意の組み合わせから選択される。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、アダプター配列は、磁気特性（すなわち、磁気部分）を有する部分を含む。いくつかの実施形態において、この磁気特性は、常磁性である。アダプター配列が磁気部分を含む（例えば、磁気部分を含むアダプター配列にライゲーションする核酸物質）いくつかの実施形態において、磁場が適用される場合、磁気部分を含むアダプター配列は、磁気部分を含まないアダプター配列（例えば、磁気部分を含まないアダプター配列にライゲーションする核酸物質）から実質的に分離される。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアダプター配列は、ＳＭＩに対して５’に位置する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアダプター配列は、ＳＭＩに対して３’に位置する。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、アダプター配列は、１つ以上のリンカードメインを介して、ＳＭＩおよび核酸物質のうちの少なくとも１つに接続してもよい。いくつかの実施形態において、リンカードメインは、ヌクレオチドで構成されていてもよい。いくつかの実施形態において、リンカードメインは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド分子（例えば、本開示の他の箇所に記載されるもの）を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、リンカードメインは、ループであってもよく、またはループを含んでいてもよい。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸物質の各々の鎖の片方または両方の末端上のアダプター配列は、さらに、ＳＤＥを提供する１つ以上の要素を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ＳＤＥは、アダプター配列内に含まれる非対称プライマー部位であってもよく、またはこの部位を含んでいてもよい。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、アダプター配列は、少なくとも１つのＳＤＥと少なくとも１つのライゲーションドメイン（すなわち、少なくとも１つのリガーゼの活性に修正可能なドメイン、例えば、リガーゼの活性によって核酸物質にライゲーションすることに適したドメイン）であってもよく、またはこれらを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、５’から３’まで、アダプター配列は、プライマー結合部位、ＳＤＥおよびライゲーションドメインであってもよく、またはこれらを含んでいてもよい。
【０１８７】
二本鎖配列決定アダプターを合成するための種々の方法は、例えば、米国特許第９，７５２，１８８号、国際特許公開第ＷＯ２０１７／１００４４１号および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／５９９０８号（２０１８年１１月８日に出願された）に既に記載されており、これらは全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８８】
プライマー
いくつかの実施形態において、（１）高い標的特異性、（２）多重化可能であること、（３）安定した最小限のバイアスを有する増幅を示すという特性のうちの少なくとも１つを有する１つ以上のＰＣＲプライマーは、本技術の態様に従う種々の実施形態に使用することが想定されている。多くの従来の試験および商業製品は、従来のＰＣＲ−ＣＥについての特定のこれらの基準を満たすプライマー混合物を設計している。しかし、これらのプライマー混合物は、ＭＰＳと共に使用するのに常に適しているというわけではないことを注記しておく。実際に、高度に多重化されたプライマー混合物を開発することは、挑戦的なことであり、時間がかかるプロセスである場合がある。簡便には、ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＰｒｏｍｅｇａの両者は、種々の標準的および標準的ではないＳＴＲおよびＳＮＰ遺伝子座の安定した効率的な増幅を示すＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームのための多重互換性プライマー混合物を近年開発した。これらのキットは、ＰＣＲを使用して、配列決定前にその標的領域を増幅するため、ペアエンド配列決定データにおける各リードの５’末端は、ＤＮＡを増幅するために使用されるＰＣＲプライマーの５’末端に対応する。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物は、均一な増幅を確実にするように設計されたプライマーを含み、これは、種々の反応濃度、溶融温度、および二次構造とプライマー内／プライマー間の相互作用を最小限にすることを伴っていてもよい。多くの技術が、ＭＰＳアプリケーションのための高度に多重化されたプライマーの最適化のために記載されてきた。特に、これらの技術は、当該技術分野で十分に記載されているように、多くはａｍｐｌｉｓｅｑ方法として知られている。
【０１８９】
増幅
提供される方法および組成物は、種々の実施形態において、核酸物質（またはその一部、例えば、特定の標的領域または遺伝子座）を増幅し、増幅した核酸物質（例えば、アンプリコン産物のいくつかのメンバー）を形成する少なくとも１つの増幅工程を利用するか、またはその少なくとも１つの増幅工程において使用される。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、核酸物質を増幅することは、ＳＭＩ配列が少なくとも部分的に維持されるように、第１のアダプター配列中に存在する配列に少なくとも部分的に相補性の少なくとも１つの一本鎖オリゴヌクレオチドを用い、元の二本鎖核酸物質からの第１の核酸鎖および第２の核酸鎖の各々に由来する核酸物質を増幅する工程を含む。増幅工程は、さらに、第２の一本鎖オリゴヌクレオチドを使用し、目的の各鎖を増幅することを含み、このような第２の一本鎖オリゴヌクレオチドは、（ａ）目的の標的配列に少なくとも部分的に相補性であってもよく、または（ｂ）少なくとも１つの一本鎖オリゴヌクレオチドと第２の一本鎖オリゴヌクレオチドが、核酸物質を効果的に増幅するような様式で配向するように、第２のアダプター配列中に存在する配列に少なくとも部分的に相補性であってもよい。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、サンプル中の核酸物質を増幅することは、「チューブ」（例えば、ＰＣＲチューブ）内で、乳化液滴、マイクロチャンバ、および上に記載の他の例または他の既知の容器内で核酸物質を増幅することを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、核酸物質を増幅することは、２個以上の（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０個、またはもっと多くのサンプル）物理的に分離したサンプル（例えば、チューブ、液滴、チャンバ、容器など）において核酸物質を増幅することを含んでいてもよい。例えば、増幅工程の前に、初期のサンプルを複数の容器に分離してもよい。いくつかの実施形態において、各サンプルは、互いのサンプルと実質的に同量の増幅した核酸物質を含み、いくつかの実施形態において、少なくとも２つのサンプルが、実質的に異なる量の増幅した核酸物質を含む。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの増幅する工程は、少なくとも１つの標準的ではないヌクレオチドである少なくとも１つのプライマー、または少なくとも１つの標準的ではないヌクレオチドを含む少なくとも１つのプライマーを含む。いくつかの実施形態において、標準的ではないヌクレオチドは、ウラシル、メチル化ヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、リボースヌクレオチド、８−オキソ−グアニン、ビオチン化ヌクレオチド、ロックド核酸、ペプチド核酸、高Ｔｍ核酸バリアント、対立遺伝子を区別する核酸バリアント、本明細書の他の箇所に記載される任意の他のヌクレオチドまたはリンカーバリアント、またはこれらの任意の組み合わせから選択される。
【０１９３】
任意の用途に適した増幅反応が、いくつかの実施形態に適合することが想定されるが、具体例として、いくつかの実施形態において、増幅工程は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、複数置換増幅（ＭＤＡ）、等温増幅、乳化液内のポロニー増幅、表面でのブリッジ増幅、ビーズの表面もしくはヒドロゲル内の表面、およびこれらの任意の組み合わせであってもよく、またはこれらを含んでいてもよい。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、核酸物質を増幅することは、核酸物質の各鎖の５’末端および３’末端上のアダプター配列の領域に少なくとも部分的に相補性の一本鎖オリゴヌクレオチドの使用を含む。いくつかの実施形態において、核酸物質を増幅することは、目的の標的領域または標的配列（例えば、ゲノム配列、ミトコンドリア配列、プラスミド配列、合成的に作られた標的核酸など）に少なくとも部分的に相補性の少なくとも１つの一本鎖オリゴヌクレオチドと、アダプター配列のある領域（例えば、プライマー部位）に少なくとも部分的に相補性の一本鎖オリゴヌクレオチドとの使用を含む。
【０１９５】
一般に、安定した増幅（例えば、ＰＣＲ増幅）は、反応条件に大きく依存し得る。マルチプレックスＰＣＲは、例えば、緩衝液の組成、一価または二価カチオンの濃度、洗剤濃度、クラウディング剤（すなわち、ＰＥＧ、グリセロールなど）の濃度、プライマー濃度、プライマーＴｍ、プライマー設計、プライマーＧＣ含有量、プライマー修飾ヌクレオチド特性およびサイクリング条件（すなわち、温度および伸長時間、ならびに温度変化速度）に対して感受性な場合がある。緩衝液の条件の最適化は、困難かつ時間がかかるプロセスである場合がある。いくつかの実施形態において、増幅反応は、既に知られている増幅プロトコルに従って、緩衝液、プライマープール濃度およびＰＣＲ条件のうちの少なくとも１つを使用してもよい。いくつかの実施形態において、新しい増幅プロトコルが作成されてもよく、および／または増幅反応の最適化が使用されてもよい。具体例として、いくつかの実施形態において、ＰＣＲ最適化キット、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）からのＰＣＲ最適化キットを使用してもよく、このキットは、種々のＰＣＲ用途（例えば、マルチプレックス、リアルタイム、ＧＣリッチおよび阻害剤耐性増幅）に部分的に最適化される、多くのあらかじめ配合された緩衝液を含む。これらのあらかじめ配合された緩衝液は、様々なＭｇ２＋濃度およびプライマー濃度、ならびにプライマープール比で迅速に補充することができる。これに加え、いくつかの実施形態において、種々のサイクリング条件（例えば、熱的サイクリング）が評価および／または使用されてもよい。特定の実施形態が、特定の望ましい用途に適しているかどうかを評価する際に、他の態様の中で特に、特異性、ヘテロ接合性遺伝子座に対する対立遺伝子カバレッジ比、遺伝子座間のバランスおよび深さのうちの１つ以上を評価してもよい。増幅成功の測定は、産物のＤＮＡ配列決定、ゲルまたはキャピラリー電気泳動またはＨＰＬＣまたは他のサイズ分離方法の後に行うフラグメントの視覚化による産物の評価、二本鎖核酸に結合する染料または蛍光プローブを使用する溶解曲線分析、質量分析法または当該技術分野で知られている他の方法を含んでいてもよい。
【０１９６】
種々の実施形態に従って、種々の因子のいずれかが、特定の増幅工程の長さ（例えば、ＰＣＲ反応中のサイクル数など）に影響を与えることがある。例えば、いくつかの実施形態において、提供される核酸物質は、損なわれるか、または別の状況で最適ではないものになる場合がある（例えば、分解および／または汚染される）。このような場合、より長い増幅工程は、所望な産物が許容され得る程度に増幅されることを確実にするのに役立つ場合がある。いくつかの実施形態において、増幅工程は、各々の開始時のＤＮＡ分子から平均で３〜１０の配列決定されたＰＣＲコピーを提供し得るが、他の実施形態において、第１の鎖および第２の鎖各々についてたった１つのコピーだけが必要である。特定の理論に縛られることを望まないが、多すぎるＰＣＲコピーまたは少なすぎるＰＣＲコピーは、アッセイ効率を低下させ、最終的には深さが低下する可能性がある。一般に、増幅（例えば、ＰＣＲ）反応に使用される核酸（例えば、ＤＮＡ）フラグメントの数は、同じＳＭＩ／バーコード配列を共有するリードの数を規定することができる、最初に調節し得る変数である。
【０１９７】
核酸物質
種類
種々の実施形態に従い、種々の核酸物質のうちいずれかを使用してもよい。いくつかの実施形態において、核酸物質は、カノニカル糖−リン酸骨格内のポリヌクレオチドに対する少なくとも１つの修飾を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、核酸物質は、核酸物質内の任意の塩基中に少なくとも１つの修飾を含んでいてもよい。例えば、非限定的な例として、いくつかの実施形態において、核酸物質は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）のうちの少なくとも１つであるか、またはこれらを含む。
【０１９８】
供給源
核酸物質は、任意の種々の供給源に由来していてもよいことが想定される。例えば、いくつかの実施形態において、核酸物質は、少なくとも１つの被験体（例えば、ヒトまたは動物被験体）または他の生体源由来のサンプルから提供される。いくつかの実施形態において、核酸物質は、保存／貯蔵されたサンプルから提供される。いくつかの実施形態において、サンプルは、血液、血清、汗、唾液、脳脊髄液、粘液、子宮洗浄液、膣スワブ、鼻スワブ、口腔スワブ、組織擦過物、毛髪、指紋、尿、便、硝子体液、腹腔洗浄液、痰、気管支洗浄、口腔洗浄、胸腔洗浄、胃洗浄、胃液、胆汁、膵管洗浄、胆管洗浄、総胆管洗浄、胆嚢液、滑液、感染した創傷、感染していない創傷、考古学的サンプル、法医学的サンプル、水サンプル、組織サンプル、食品サンプル、バイオリアクターサンプル、植物サンプル、爪あか、精液、前立腺液、卵管洗浄、細胞を含まない核酸、細胞内の核酸、メタゲノミクスサンプル、移植された異物の洗浄、鼻洗浄、腸液、上皮のブラッシング、上皮洗浄、組織生検、検死サンプル、壊死サンプル、臓器サンプル、ヒト識別アンプル、人工的に作られた核酸サンプル、合成遺伝子サンプル、核酸データ貯蔵サンプル、腫瘍組織のうちの少なくとも１つ、およびこれらの任意の組み合わせであるか、またはこれらを含む。他の実施形態において、サンプルは、微生物、植物系生物、または任意の集められた環境サンプル（例えば、水、土、考古学的サンプルなど）のうちの少なくとも１つであるか、またはこれらを含む。
【０１９９】
修飾
種々の実施形態に従い、核酸物質は、特定の提供される方法または組成物が使用される用途に応じて、任意の特定の工程の前、実質的に同時に、またはその後に、１つ以上の修飾を受けてもよい。
【０２００】
いくつかの実施形態において、修飾は、核酸物質の少なくとも一部の修復であってもよく、または核酸物質の少なくとも一部の修復を含んでいてもよい。核酸修復の任意の用途に適した方法が、いくつかの実施形態に適合することが想定されるが、そのため、特定の例示的な方法および組成物を以下に記載し、実施例に記載する。
【０２０１】
非限定的な例として、いくつかの実施形態において、ＤＮＡ修復酵素、例えば、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（ＦＰＧ）および８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＯＧＧ１）を利用して、ＤＮＡ損傷（例えば、インビトロでのＤＮＡ損傷）を修正することができる。上述のように、これらのＤＮＡ修復酵素は、例えば、ＤＮＡから損傷した塩基を除去するグリコシラーゼである。例えば、ＵＤＧは、（シトシンの自発的な加水分解によって生じる）シトシン脱アミノ化から生じるウラシルを除去し、ＦＰＧは、８−オキソ−グアニン（例えば、活性酸素種から生じる最も一般的なＤＮＡ病変）を除去する。ＦＰＧは、リアーゼ活性も有し、脱塩基部位に１塩基ギャップを生成することができる。このような脱塩基部位は、例えば、ポリメラーゼがテンプレートをコピーすることができないため、その後にＰＣＲによって増幅することができない。したがって、このようなＤＮＡ損傷修復酵素の使用は、真の変異を有していないが、配列決定および二本鎖配列分析の後に別の状況でエラーとして検出されない可能性がある損傷ＤＮＡを効果的に除去することができる。
【０２０２】
上述のように、さらなる実施形態において、本明細書に記載する処理工程から作られる配列決定リードをさらにフィルタリングして、アーチファクトに最もなりやすいリードの末端をトリミングすることによって、偽の変異を除外することができる。例えば、ＤＮＡフラグメント化は、二本鎖分子の末端に一本鎖部分を生成することができる。これらの一本鎖部分は、末端修復中に末端平滑化されてもよい（例えばＫｌｅｎｏｗによって）。いくつかの場合において、ポリメラーゼは、これらの末端修復した領域においてコピーの誤りを起こし、「偽の二本鎖分子」の生成を引き起こす。これらのアーチファクトは、配列決定されたときに真の変異であると見えてしまう場合がある。これらの末端修復機構の結果としてのエラーは、生じる可能性がある変異を除外するために配列決定リードの末端をトリミングすることによって、配列決定後の分析から除外することができ、それにより、偽の変異の数を減少させることができる。いくつかの実施形態において、配列決定リードのこのようなトリミングは、自動的に達成することができる（例えば、通常の処理工程）。いくつかの実施形態において、変異体頻度は、フラグメント末端領域について評価することができ、変異の閾値レベルがこのフラグメント末端領域で観察される場合、ＤＮＡフラグメントの二本鎖コンセンサス配列リードを作成する前に、配列決定リードのトリミングを行ってもよい。
【０２０３】
ＤＳ方法のいくつかの実施形態は、エラー修正のための分子バーコードの使用と適合する、ＰＣＲに基づく標的化濃縮戦略を提供する。例えば、配列決定のためのリンクされたテンプレートの分割ＰＣＲ（Ｓｅｐａｒａｔｅｄ  ＰＣＲｓ  ｏｆ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、「ＳＰＬｉＴ−ＤＳ」）方法の工程を利用する配列決定濃縮戦略も、本明細書に記載する実施形態のうちの１つ以上を使用して、あらかじめ濃縮された核酸物質から利益を得ることができる。ＳＰＬｉＴ−ＤＳは、元々、国際特許公開第ＷＯ／２０１８／１７５９９７号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＳＰＬｉＴ−ＤＳ手法は、上に記載したのと同様の様式で、標準的なＤＳライブラリ構築プロトコルに関して、フラグメント化された二本鎖核酸物質（例えば、ＤＮＡサンプル由来）を分子バーコードで標識する（例えば、タグ化する）ことから開始されてもよい。いくつかの実施形態において、二本鎖核酸物質は、フラグメント化されていてもよい（例えば、無細胞ＤＮＡ、損傷ＤＮＡなど）。しかし、他の実施形態において、種々の工程は、超音波などの機械的な剪断、または他のＤＮＡ切断方法（例えば、本明細書にさらに記載されるもの）を用いる核酸物質のフラグメント化を含んでいてもよい。フラグメント化された二本鎖核酸物質を標識する態様は、末端修復と３’−ｄＡテーリングを含んでいてもよく、特定の用途で必要とされる場合、その後に、二本鎖核酸フラグメントと、ＳＭＩを含有するＤＳアダプターとをライゲーションすることを含んでいてもよい。他の実施形態において、ＳＭＩは、元の核酸分子の両方の鎖からの固有に関連する情報のために、内因性であってもよく、または外因性配列と内因性配列の組み合わせであってもよい。二本鎖核酸物質へのアダプター分子のライゲーションの後、本方法は、増幅（例えば、ＰＣＲ増幅、ローリングサークル増幅、複数置換増幅、等温増幅、ブリッジ増幅、表面結合増幅など）に続いてもよい。
【０２０４】
特定の実施形態において、例えば、１つ以上のアダプター配列に特異的なプライマーを使用して、元の二本鎖核酸分子の各々の鎖に由来する核酸アンプリコンの複数のコピーにおいて生じる核酸物質の各鎖を増幅してもよく、各アンプリコンは、元に関連付けられたＳＭＩを保持している。増幅および反応副生成物を除去するための関連する工程の後、サンプルは、２つ以上の別個のサンプル（例えば、チューブ内、乳化液の液滴内、マイクロチャンバ内、ある表面上の単離された液滴、または他の既知の容器、これらをまとめて「チューブ（複数可）」と呼ぶ）に（好ましくは、必須ではないが、実質的に均一に）分けることができる。分離後、ＳＰＬｉＴ−ＤＳプロセスの一実施形態に従って、本方法は、第１のアダプター配列に対して特異的なプライマーの使用によって、第１のサンプル中の第１の鎖を増幅して、第１の核酸産物を提供することと、第２のアダプター配列に対して特異的なプライマーの使用によって、第２のサンプル中の第２の鎖を増幅して、第２の核酸産物を提供することと、を含んでいてもよい。次に、本方法は、第１の核酸産物および第２の核酸産物の各々を配列決定することと、第１の核酸産物の配列を第２の核酸産物の配列と比較することと、を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、核酸物質は、核酸物質の各鎖の５’および３’末端の各々にアダプター配列を含む。特定の用途において、分割されたサンプル中の個々の鎖の増幅は、単一分子識別子配列が少なくとも部分的に維持されるように、目的の標的配列に対して少なくとも部分的に相補性の一本鎖オリゴヌクレオチドを用いて達成することができる。
【０２０５】
選択された適用例
本明細書に記載されるように、提供される方法および組成物は、種々の目的のいずれかのために、および／または種々の状況のいずれかで使用されてもよい。以下は、特定の例示のみを目的とした非限定的な用途および／または状況の例を説明する。
【０２０６】
治療に対する応答のモニタリング（腫瘍変異など）
ゲノム研究における次世代配列決定（ＮＧＳ）の出現は、これまでにない詳細を有する腫瘍の変異状況の特性決定を可能にし、診断、予後および臨床的に原因となる変異の目録が得られた。まとめると、これらの変異は、個別化された医療による癌転帰の改善および早期癌検出およびスクリーニングを可能にするために、顕著な有望性を有する。本開示の以前には、当該分野における重要な制限は、これらの変異が低頻度で存在するときに、これらの変異を検出することができないことであった。臨床生検は、大部分が正常な細胞で構成されることが多く、そのＤＮＡ変異に基づく癌細胞の検出は、現代のＮＧＳにとっても依然として技術的な課題である。数千の正常なゲノムの中での腫瘍変異の識別は、干し草の中で針を見つけるようなものであり、以前から知られている方法を超えるレベルの配列決定精度を必要とする。
【０２０７】
一般的に、この問題は、液体生検の場合には深刻であり、ここでの課題は、腫瘍変異を見つけるのに必要な極端に高い感度を提供するだけではなく、これらの生検中に典型的に存在する少量のＤＮＡを用いてこれを行うことである。「液体生検」という用語は、典型的には、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の存在に基づき、癌についての情報を得る能力のある血液を指す。ｃｔＤＮＡは、癌細胞によって血流に流れ込み、癌をモニタリングし、検出し、予測すると共に、腫瘍の遺伝子型決定および治療の選択を可能にするための大きな有望性を示す。これらの用途は、癌患者の現在の管理に革命をもたらす可能性があるが、その進捗は、以前に予想されたものよりも遅い。主要な問題は、ｃｔＤＮＡが、典型的には、血漿中に存在する全ての無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の非常に少ない割合に相当することである。転移性癌において、その頻度は５％を超えることがあるが、局所的な癌においては、１％〜０．００１％しかない。理論上、任意の大きさのＤＮＡの部分集合体は、十分な数の分子をアッセイすることによって検出可能になるはずである。しかし、従来の方法の根本的な制限は、塩基が誤ってスコア付けされる頻度が高いことである。エラーは、クラスタ生成、配列決定サイクル、不十分なクラスタ解像度およびテンプレート分解の中で起こることが多い。その結果、配列決定された塩基のうち、およそ０．１〜１％が誤ってコールされる。さらなる課題は、ＰＣＲ中のポリメラーゼの誤りおよび増幅バイアスから生じる場合もあり、歪曲された集合体または誤った変異体対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）の導入が起こる場合がある。まとめると、従来の既知の技術（従来のＮＧＳを含む）は、低頻度の変異の検出に必要なレベルで行うことができない。
【０２０８】
その高い精度に起因して、ＤＳおよびこれらの配列決定プラットフォームの変換効率およびワークフロー効率を高めるための方法は、腫瘍学分野において有望性を有する。本明細書に記載されるように、提供される方法および組成物は、エラー修正を維持しつつ、効率および拡張性を高めるための標的核酸濃縮を用いたＤＳの二本鎖分子タグ化を組み込んだ、ＤＳ方法論に対する革新的な手法を可能にする。
【０２０９】
非常に正確かつ効率的なアッセイの必要性に加え、臨床研究室の現実は、迅速であり、拡張可能であり、合理的に費用対効果が高いアッセイも必要としている。したがって、ＤＳのワークフロー効率を改善する（例えば、ＤＳのための濃縮戦略）本技術の態様による種々の実施形態は、非常に望ましい。本明細書に記載されるような、ＤＳ用途のための特定の標的配列の消化／サイズ選択濃縮およびアフィニティに基づく濃縮は、高い標的特異性、低いＤＮＡインプットに対する性能、拡張性および最小限の費用を提供する。
【０２１０】
提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、一般的には癌研究のために、特にｃｔＤＮＡの分野について、本発明で開発される技術が、ＤＮＡインプット、調製時間および費用を最小限にしつつ、今までにない感度で癌変異を識別する能力を有するため、特に意義深いものである。本明細書に開示される標的核酸濃縮の実施形態は、患者管理の改善および早期癌検出によって生存率を顕著に上げることができる臨床用途にとって有用であろう。
【０２１１】
患者の階層化
患者の階層化は、一般的に、１つ以上の治療に無関係な因子に基づいて、患者を分割することを指し、医学界において顕著に興味があるトピックである。この興味の多くは、特定の治療候補が、ＦＤＡの承認を受けることができなかったという事実に起因するものであり、部分的には、治験中の患者間の以前には認識されていなかった差に起因するものであろう。これらの差は、ある患者群と、１つ以上の他の患者群において、治療薬の代謝の差、または副作用の存在または悪化を引き起こす１つ以上の遺伝的相違であってもよく、または１つ以上の遺伝的相違を含んでいてもよい。いくつかの場合において、これらの差の一部または全てが、同じ遺伝子プロファイルを示さない他の患者とは異なる治療薬に対する反応を引き起こす、患者（複数可）における１つ以上の別個の遺伝子プロファイル（複数可）として検出されてもよい。
【０２１２】
したがって、いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物は、特定の患者集合体（例えば、共通の疾患、障害または状態を患う患者）中の被験体（複数可）が、特定の療法に応答し得るかを決定するのに有用であろう。例えば、いくつかの実施形態において、提供される方法および／または組成物を使用して、特定の被験体が、治療に対する応答不良に関連する遺伝子型を有するか否かを評価してもよい。いくつかの実施形態において、提供される方法および／または組成物を使用して、特定の被験体が、治療に対する好応答に関連する遺伝子型を有するか否かを評価してもよい。
【０２１３】
法医学
法医学的ＤＮＡ分析に対する従来の手法は、ショートタンデムリピート配列における長さの多型を識別するためのＰＣＲアンプリコンのキャピラリー電気泳動分離にほぼ完全に頼っていた。この種の分析は、１９９１年に導入されて以来、非常に価値が高いことがわかっている。それ以降、いくつかの刊行物が、標準化されたプロトコルを紹介し、世界中の実験室でのその使用を検証し、多くの異なる集合体群でのその使用を詳細に記載し、例えばミニＳＴＲなど、より効率的な手法を紹介した。
【０２１４】
この手法は、非常に成功していることがわかっているが、この技術には、その有用性を制限するいくつかの欠点がある。例えば、ＳＴＲ遺伝子型決定に対する現在の手法は、テンプレートＤＮＡ上をポリメラーゼが滑ることによって引き起こされるＰＣＲスタッターから生じるバックグラウンド信号を生じることが多い。この課題は、真の対立遺伝子からスタッター対立遺伝子を区別することが困難であるため、２つ以上の寄与因子を有するサンプルにおいて特に重要である。分解したＤＮＡサンプルを分析するときには、別の課題が生じる。フラグメント長の変動は、多くは、著しく少ないか、または存在しない、より長いＰＣＲフラグメントを生じる。その結果、分解したＤＮＡからのプロファイルは、識別能力が低いことが多い。
【０２１５】
ＭＰＳシステムを導入することで、法医学的分析におけるいくつかの困難な課題に対処する可能性がある。例えば、これらのプラットフォームは、核およびｍｔＤＮＡにおけるＳＴＲおよびＳＮＰの同時分析を可能にする比類無き能力を与え、個人間の識別力を顕著に高め、民族性、さらには物理的属性を決定する可能性を与える。さらに、分子の集合体の集計した平均遺伝子型を単純に報告するＰＣＲ−ＣＥとは異なり、ＭＰＳ技術は、多くの個々のＤＮＡ分子の全ヌクレオチド配列をデジタルによって表にするため、異種ＤＮＡ混合物中のＭＡＦを検出する固有の能力を与える。２つ以上の寄与因子を含む法医学的標本は、依然として、法医学において最も問題となる課題の１つであるため、法医学分野へのＭＰＳの影響は、甚大な可能性がある。
【０２１６】
ヒトゲノムの公開は、ＭＰＳプラットフォームの計り知れない力を強調するものであった。しかし、かなり近年になるまで、これらのプラットフォームの全力は、ＳＴＲ遺伝子座よりも顕著に短いリード長さに起因して、長さに基づいて遺伝子型をコールする能力を排除してしまうため、法医学への使用は制限されていた。当初、パイロシーケンサ、例えば、Ｒｏｃｈｅ  ４５４プラットフォームは、コアＳＴＲ遺伝子座を配列決定するのに十分なリード長さを有する唯一のプラットフォームであった。しかし、技術の競争においてリード長さが増加したため、法医学用途に対する有用性が発揮されるようになってきている。いくつかの研究は、ＳＴＲ遺伝子座のＭＰＳ遺伝子型決定の可能性を明らかにした。全体的に、これら全ての研究の一般的な結果は、プラットフォームにかかわらず、ＳＴＲが、欠陥のある法医学サンプルからであっても、ＣＥ分析と同等の遺伝子型を首尾良く産生することができることである。
【０２１７】
これらの研究はすべて、従来のＰＣＲ−ＣＥ手法との一致を示し、さらに、ＳＴＲ内のＳＮＰの検出のようなさらなる利点を示しているが、これらは、この技術に関するいくつかの現在の課題を強調するものにもなっている。例えば、ＳＴＲ遺伝子型決定に対する現在のＭＰＳ手法は、ＰＣＲプライマーを配列決定し、導入するのに十分なＤＮＡを提供するためにマルチプレックスＰＣＲに頼っている。しかし、マルチプレックスＰＣＲキットは、ＰＣＲ−ＣＥ用に設計されたため、このキットは、様々な大きさのアンプリコンのためのプライマーを含有する。この変動によって、より小さなフラグメントの増幅に偏ったカバレッジ不均衡が生じ、対立遺伝子のドロップアウトが起こる場合がある。実際、最近の研究は、ＰＣＲ効率の差が、混合物の成分に、特に低ＭＡＦで影響を及ぼし得ることを示している。この課題に対処するために、法医学用に特別に設計されたいくつかの配列決定キットが現在市販されており、検証研究が報告され始めている。しかし、高レベルの多重化に起因して、増幅バイアスは依然として明らかである。
【０２１８】
ＰＣＲ−ＣＥと同様に、ＭＰＳは、ＰＣＲスタッターの発生に影響される。ＳＴＲに関するＭＰＳ研究の大多数は、人為的にドロップインした対立遺伝子の発生を報告している。近年、系統的なＭＰＳ研究は、大部分スタッター事象が、４つの塩基対単位での真の対立遺伝子とは異なる、より短い長さの多型として現れ、最も一般的なものは、ｎ−４であるが、ｎ−８およびｎ−１２位置も観察されていることを報告する。スタッターの割合は、典型的には、リードの約１％で発生したが、いくつかの遺伝子座では３％まで高くなる場合があり、このことは、ＭＰＳが、ＰＣＲ−ＣＥよりも高い率でスタッターを示し得ることを示している。
【０２１９】
これとは対照的に、いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物は、上に記載され、以下の実施例に記載される、低品質および／または少量のサンプルの高品質かつ効率的な配列決定を可能にする。したがって、いくつかの実施形態において、提供される方法および／または組成物は、異なる遺伝子型を有する別の個体のＤＮＡと共に少ない量で混合された１人の個体からのＤＮＡの稀少なバリアントの検出に有用であろう。
【０２２０】
法医学的ＤＮＡサンプルは、一般的に、非ヒトＤＮＡを含有する。この外来ＤＮＡの潜在的な供給源は、ＤＮＡの供給源（例えば、唾液または口腔サンプル中の微生物）、サンプルが集められた表面環境および実験室からのコンタミネーション（例えば、試薬、作業領域など）である。いくつかの実施形態によって提供される別の態様は、特定の提供される方法および組成物が、これらの物質（および／またはその影響）が最終的な分析から除去可能であり、配列決定結果に偏りがないように、他の供給源（例えば、他の種）および／または表面または環境コンタミネーションから混入した核酸物質の識別を可能にすることである。
【０２２１】
高度に分解されたＤＮＡにおいて、遺伝子座に特異的なＰＣＲは、必要なプライマーアニーリング部位を含まないＤＮＡフラグメントに起因して、十分に機能しない場合があり、対立遺伝子のドロップアウトを引き起こす場合がある。この状況は、特に、混合物の試験において、遺伝子型コールの一意性を制限し、マッチの信頼性の確実性は低い。しかし、いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物は、ＳＴＲマーカーに加えて、またはＳＴＲマーカーの代替として、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の使用を可能にする。
【０２２２】
実際に、ヒトの遺伝的変異に関するデータが増えるにつれて、ＳＮＰは、法医学的な仕事にますます関連するようになってきている。したがって、いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物は、例えば、１つ以上のＳＮＰ位置にわたるリードを実質的に確保する現時点で利用可能な配列決定キットに基づいて複数のプライマーパネルを作成することができるようにプライマー設計戦略を使用する。
さらなる実施例
１．標的核酸物質を濃縮するための方法であって、
核酸物質を提供することと、
所定の長さの標的領域が核酸物質の残りから分離されるように、核酸物質を１つ以上の標的エンドヌクレアーゼで切断することと、
非標的核酸物質を酵素的に破壊することと、
標的エンドヌクレアーゼから所定の長さの標的領域を放出することと、
切断した標的領域を分析することと、を含む、方法。
２．非標的核酸物質を酵素的に破壊することが、エキソヌクレアーゼ酵素を提供することを含む、実施例１に記載の方法。
３．非標的核酸物質を酵素的に破壊することが、エキソヌクレアーゼ酵素およびエンドヌクレアーゼ酵素のうちの１つ以上を提供することを含む、実施例１に記載の方法。
４．破壊することが、酵素消化および酵素的開裂のうちの少なくとも１つを含む、実施例１に記載の方法。
５．酵素的に破壊する工程中、１つ以上の標的エンドヌクレアーゼが、標的領域に結合したままである、実施例１〜４のいずれか１つに記載の方法。
６．少なくとも１つの標的エンドヌクレアーゼが、捕捉標識を含むリボ核酸タンパク質複合体であり、所定の長さの標的領域が、捕捉標識を介して核酸の残りから物理的に分離される一方で、少なくとも１つの標的エンドヌクレアーゼが、標的領域に結合したままである、実施例１〜５のいずれか１つに記載の方法。
７．少なくとも１つの標的エンドヌクレアーゼが、捕捉標識を含むリボ核酸タンパク質複合体であり、方法が、標的領域を、捕捉標識に結合するように構成された抽出部分で捕捉することをさらに含む、実施例１〜５に記載の方法。
８．捕捉標識が、アクリダイト、アジド、アジド（ＮＨＳエステル）、ジゴキシゲニン（ＮＨＳエステル）、ＩＬｉｎｋｅｒ、Ａｍｉｎｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６、Ａｍｉｎｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ１２、Ａｍｉｎｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６  ｄＴ、Ｕｎｉｌｉｎｋ  ａｍｉｎｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ、ヘキシニル、５−オクタジイニルｄＵ、ビオチン、ビオチン（アジド）、ビオチンｄＴ、ビオチンＴＥＧ、デュアルビオチン、ＰＣビオチン、デスチオビオチンＴＥＧ、ｔｈｉｏｌ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ３、ジチオール、ｔｈｉｏｌ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６  Ｓ−Ｓ、スクシニル基のうちの少なくとも１つであるか、またはこれらのうちの少なくとも１つを含む、実施例６または実施例７に記載の方法。
９．抽出部分が、アミノシラン、エポキシシラン、イソチオシアネート、アミノフェニルシラン、アミノプロピルシラン、メルカプトシラン、アルデヒド、エポキシド、ホスホネート、ストレプトアビジン、アビジン、抗体を認識するハプテン、特定の核酸配列、磁気誘引性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）、感光性樹脂のうちの少なくとも１つであるか、またはこれらのうちの少なくとも１つを含む、実施例７に記載の方法。
１０．抽出部分が、ある表面に結合している、実施例７に記載の方法。
１１．標的領域が、非標的核酸物質を酵素的に破壊した後に物理的に分離される、実施例７に記載の方法。
１２．１つ以上の標的エンドヌクレアーゼが、リボ核酸タンパク質、Ｃａｓ酵素、Ｃａｓ９様酵素、Ｃｐｆ１酵素、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターベースヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、アルゴノートヌクレアーゼ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施例１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．１つ以上の標的エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、またはＣＰＦ１、またはこれらの誘導体を含む、実施例１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．核酸物質を切断することが、実質的に既知の長さの２つ以上の標的核酸フラグメントが形成されるように、核酸物質を１つ以上の標的エンドヌクレアーゼで切断することを含む、実施例１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．所定の長さに基づき、２つ以上の標的核酸フラグメントを単離することをさらに含む、実施例１４に記載の方法。
１６．標的核酸フラグメントが、異なる実質的に既知の長さのものである、実施例１５に記載の方法。
１７．標的核酸フラグメントが、各々、ゲノム中の１つ以上の異なる位置からの目的のゲノム配列を含む、実施例１５に記載の方法。
１８．標的核酸フラグメントが、各々、核酸物質中の実質的に既知の領域からの標的配列を含む、実施例１５に記載の方法。
１９．実質的に既知の長さに基づき、標的核酸フラグメントを単離することが、ゲル電気泳動、ゲル精製、液体クロマトグラフィー、サイズ排除精製、濾過、またはＳＰＲＩビーズ精製によって標的核酸フラグメントを濃縮することを含む、実施例１５〜１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．少なくとも１つのＳＭＩおよび／またはアダプター配列を、所定の長さの切断した標的領域の５’または３’末端のうちの少なくとも１つにライゲーションすることをさらに含む、実施例１に記載の方法。
２１．分析することが、標的領域の定量化および／または配列決定を含む、実施例１に記載の方法。
２２．定量化が、分光光度分析、リアルタイムＰＣＲ、および／または蛍光に基づく定量化のうちの少なくとも１つを含む、実施例２１に記載の方法。
２３．配列決定が、二本鎖配列決定、ＳＰＬｉＴ二本鎖配列決定、Ｓａｎｇｅｒ配列決定、ショットガン配列決定、ブリッジ増幅／配列決定、ナノポア配列決定、単分子リアルタイム配列決定、イオントレント配列決定、パイロシーケンシング、デジタル配列決定（例えば、デジタルバーコードに基づく配列決定）、ダイレクトデジタル配列決定、ライゲーションによる配列決定、ポロニーに基づく配列決定、電流に基づく配列決定（例えば、トンネル電流）、質量分析法による配列決定、マイクロ流体に基づく配列決定、およびこれらの任意の組み合わせを含む、実施例２１に記載の方法。
２４．配列決定が、
標的領域の第１の鎖を配列決定して、第１の鎖配列リードを生成することと、
標的領域の第２の鎖を配列決定して、第２の鎖配列リードを生成することと、
第１の鎖配列リードを第２の鎖配列リードと比較して、エラー修正済配列リードを生成することと、を含む、実施例２１に記載の方法。
２５．エラー修正済配列リードが、第１の鎖配列リードと第２の鎖配列リードとの間で一致するヌクレオチド塩基を含む、実施例２４に記載の方法。
２６．エラー修正済配列リード中の特定の位置で発生する変動が、真のバリアントとして識別される、実施例２４または実施例２５に記載の方法。
２７．第１の鎖配列リードまたは第２の鎖配列リードのうちの１つのみの中の特定の位置で発生する変動が、潜在的なアーチファクトとして識別される、実施例２４〜２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．エラー修正済配列リードを使用して、癌、癌リスク、癌変異、癌代謝状態、変異誘発遺伝子表現型、発癌物質曝露、毒素曝露、慢性炎症曝露、年齢、神経変性疾患、病原体、薬物耐性バリアント、胎児分子、法医学的に関連する分子、免疫学的に関連する分子、変異したＴ細胞受容体、変異したＢ細胞受容体、変異した免疫グロブリン遺伝子座、ゲノム中のカタイジス部位、ゲノム中の高変異性部位、低頻度バリアント、サブクローンバリアント、少数の分子集合体、汚染物質源、核酸合成エラー、酵素による修飾エラー、化学修飾エラー、遺伝子編集エラー、遺伝子療法エラー、核酸情報貯蔵の一部、微生物の多種性、ウイルスの多種性、臓器移植、臓器移植拒絶、癌再発、治療後の残存癌、新生物発生前状態、異形成状態、マイクロキメリズム状態、幹細胞移植状態、細胞療法状態、別の分子に固定された核酸標識、または二本鎖標的核酸分子の由来となる生物もしくは被験体におけるこれらの組み合わせを識別または特定する、実施例２４〜２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．エラー修正済配列リードを使用して、変異誘発性化合物または曝露を識別する、実施例２４〜２７のいずれか１つに記載の方法。
３０．エラー修正済配列リードを使用して、発癌性化合物または曝露を識別する、実施例２４〜２７のいずれか１つに記載の方法。
３１．核酸物質が、法医学的サンプルに由来し、エラー修正済配列リードが、法医学的分析に使用される、実施例２４〜２７のいずれか１つに記載の方法。
３２．標的エンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素、リボ核酸タンパク質複合体、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、アルゴノートヌクレアーゼおよび／またはメガＴＡＬヌクレアーゼのうちの少なくとも１つを含む、実施例１に記載の方法。
３３．ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素が、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である、実施例３２に記載の方法。
３４．ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素がＣｐｆ１であり、標的領域が、所定または既知のヌクレオチド配列を有する５’オーバーハングおよび３’オーバーハングを含む、実施例３２に記載の方法。
３５．核酸物質を標的エンドヌクレアーゼで切断することは、核酸物質を２つ以上の標的エンドヌクレアーゼで切断することを含む、実施例１に記載の方法。
３６．２つ以上の標的エンドヌクレアーゼが、２つ以上の標的領域を指向する２つ以上のＣａｓ酵素を含む、実施例３５に記載の方法。
３７．所定の長さの標的領域が核酸物質の残りから分離されるように、核酸物質を標的エンドヌクレアーゼで切断することは、所定の長さを有する標的領域を作成するように、核酸物質を所定の距離だけ離して切断することを指向する一対の標的エンドヌクレアーゼで標的領域を切断することを含む、実施例３５に記載の方法。
３８．一対の標的エンドヌクレアーゼが、一対のＣａｓ酵素を含む、実施例３７に記載の方法。
３９．一対のＣａｓ酵素が、同じ種類のＣａｓ酵素を含む、実施例３８に記載の方法。
４０．一対のＣａｓ酵素が、異なる２種類のＣａｓ酵素を含む、実施例３８に記載の方法。
４１．標的核酸物質を濃縮するための方法であって、
核酸物質を提供することと、
所定の長さの標的領域が核酸物質の残りから分離されるように、核酸物質を１つ以上の標的エンドヌクレアーゼで切断することであって、少なくとも１つの標的エンドヌクレアーゼが捕捉標識を含む、切断することと、
捕捉標識に結合するように構成される抽出部分を用い、所定の長さの標的領域を捕捉することと、
標的エンドヌクレアーゼから所定の長さの標的領域を放出することと、
切断した標的領域を分析することと、を含む、方法。
４２．標的核酸物質を濃縮するための方法であって、
核酸物質を提供することと、
触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素を、核酸物質の標的領域に結合することと、
非標的核酸物質が破壊され、標的領域が、結合した触媒的に不活性なＣａｓ酵素によって消化酵素から保護されるように、核酸物質を１つ以上の核酸消化酵素で酵素処理することと、
触媒的に不活性なＣａｓ酵素から標的領域を放出することと、
標的領域を分析することと、を含む、方法。
４３．結合する工程が、結合したＣａｓ酵素間の核酸物質が消化酵素から酵素的に保護されるように、一対の触媒的に不活性なＣａｓ酵素を標的領域に結合することを含み、それによって、標的領域の標的核酸物質を濃縮する、実施例４２に記載の方法。
４４．触媒的に不活性なＣａｓ酵素が、捕捉標識を含み、方法が、標的領域を、捕捉標識に結合するように構成される抽出部分を用い、捕捉することをさらに含む、実施例４２に記載の方法。
４５．標的領域をサイズ選択によって濃縮することをさらに含む、実施例４２に記載の方法。
４６．標的核酸物質を濃縮するための方法であって、
核酸物質を提供することと、
一対の触媒的に活性な標的エンドヌクレアーゼと、捕捉標識を含む少なくとも１つの触媒的に不活性な標的エンドヌクレアーゼとを提供することであって、触媒的に不活性な標的エンドヌクレアーゼは、核酸物質の標的領域に結合するように指向され、一対の触媒的に活性な標的エンドヌクレアーゼは、触媒的に不活性な標的エンドヌクレアーゼのいずれかの側で標的領域に結合するように指向される、提供することと、
標的領域が核酸物質の残りから分離されるように、核酸物質を一対の触媒的に活性な標的エンドヌクレアーゼで切断することと、
捕捉標識に結合するように構成される抽出部分を用い、標的領域を捕捉することと、
標的エンドヌクレアーゼから標的領域を放出することと、
切断した標的領域を分析することと、を含む、方法。
４７．複数の核酸フラグメントを含むサンプルから標的核酸物質を濃縮するための方法であって、
捕捉標識を有する１つ以上の触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素を、標的核酸フラグメントと非標的核酸フラグメントとを含むサンプルに提供することであって、１つ以上の触媒的に不活性なＣａｓ酵素が、標的核酸フラグメントに結合するように構成される、提供することと、
捕捉標識に結合するように構成される抽出部分を含む表面を提供することと、
抽出部分による捕捉標識の結合を介して標的核酸フラグメントを捕捉することによって、非標的核酸フラグメントから標的核酸フラグメントを分離することと、を含む、方法。
４８．１つ以上の触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素を提供する前に、複数の核酸フラグメントの末端にアダプター分子を接続することをさらに含む、実施例４７に記載の方法。
４９．標的二本鎖核酸物質を濃縮するための方法であって、
核酸物質を提供することと、
核酸物質を１つ以上の標的エンドヌクレアーゼで切断して、５’の所定のヌクレオチド配列を有する５’粘着末端および／または３’の所定のヌクレオチド配列を有する３’粘着末端を含む二本鎖標的核酸フラグメントを作成することと、
５’粘着末端および３’粘着末端のうちの少なくとも１つを介して、核酸物質の残りから二本鎖標的核酸分子を分離することと、を含む、方法。
５０．５’の所定のヌクレオチド配列または３’の所定のヌクレオチド配列に対して少なくとも部分的に相補性のライゲーション可能末端を含む少なくとも１つの配列決定アダプター分子を提供することと、
少なくとも１つの配列決定アダプター分子を二本鎖標的核酸分子にライゲーションすることと、
配列決定を介し、二本鎖標的核酸フラグメントを分析することと、をさらに含む、実施例４９に記載の方法。
５１．少なくとも１つのアダプター分子が、Ｙ字形またはＵ字形を含む、実施例５０に記載の方法。
５２．少なくとも１つのアダプター分子が、ヘアピン分子である、実施例５０に記載の方法。
５３．少なくとも１つのアダプター分子が、抽出部分によって結合されるように構成される捕捉分子を含む、実施例５０に記載の方法。
５４．配列決定アダプター分子が、二本鎖標的核酸フラグメントの５’粘着末端および３’粘着末端の各々にライゲーションする、実施例５０に記載の方法。
５５．５’粘着末端および３’粘着末端のうちの少なくとも１つを介して二本鎖標的核酸分子を核酸物質の残りから分離することは、５’の所定のヌクレオチド配列または３’の所定のヌクレオチド配列に対して少なくとも部分的に相補性の配列を有するオリゴヌクレオチドを提供することを含む、実施例４９に記載の方法。
５６．オリゴヌクレオチドが、ある表面に結合している、実施例５５に記載の方法。
５７．オリゴヌクレオチドが、抽出部分に結合するように構成される捕捉標識を含む、実施例５５に記載の方法。
５８．１つ以上の標的エンドヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１を含む、実施例４９に記載の方法。
５９．１つ以上の標的エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ニッカーゼを含む、実施例４９に記載の方法。
６０．標的核酸物質を濃縮するキットであって、
核酸ライブラリであって、
核酸物質、および
複数の触媒的に不活性なＣａｓ酵素を含み、Ｃａｓ酵素が、配列コードを有するタグを含み、
複数のＣａｓ酵素が、核酸物質に沿って、複数の部位特異的標的領域に結合する、核酸ライブラリと、
複数のプローブであって、各プローブが、
対応する配列コードに対する相補体を含むオリゴヌクレオチド配列、および
捕捉標識を含む、複数のプローブと、
部位特異的標的領域間の関係を目録にするルックアップテーブルであって、配列コードが、部位特異的標的領域と関連付けられ、プローブが、対応する配列コードに対する相補体を含む、ルックアップテーブルと、を備える、キット。
６１．核酸物質が、二本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＲＮＡのうちの少なくとも１つであるか、または二本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＲＮＡのうちの少なくとも１つを含む、上述の実施例のいずれか１つに記載の方法。
６２．核酸物質のうちの少なくともいくつかが損傷を受けている、上述の実施例のいずれか１つに記載の方法。
６３．損傷は、酸化、アルキル化、脱アミノ化、メチル化、加水分解、ヒドロキシル化、ニッキング、鎖内架橋、鎖間架橋、平滑末端鎖切断、付着末端二本鎖切断、リン酸化、脱リン酸化、ＳＵＭＯ化、グリコシル化、脱グリコシル化、プトレシニル化（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｙｌａｔｉｏｎ）、カルボキシル化、ハロゲン化、ホルミル化、一本鎖ギャップ、熱からの損傷、乾燥からの損傷、ＵＶ曝露からの損傷、γ放射線からの損傷、Ｘ線からの損傷、電離放射線からの損傷、非電離放射線からの損傷、重粒子放射線からの損傷、核崩壊からの損傷、β放射線からの損傷、α放射線からの損傷、中性子放射線からの損傷、陽子放射線からの損傷、宇宙放射線からの損傷、高ｐＨからの損傷、低ｐＨからの損傷、活性酸化種からの損傷、遊離ラジカルからの損傷、過酸化物からの損傷、次亜塩素酸塩からの損傷、ホルマリンまたはホルムアルデヒドなどの組織固定からの損傷、反応性鉄からの損傷、低イオン状態からの損傷、高イオン状態からの損傷、非緩衝状態からの損傷、ヌクレアーゼからの損傷、環境曝露からの損傷、火災からの損傷、機械的応力からの損傷、酵素分解からの損傷、微生物からの損傷、調製の機械剪断からの損傷、調製の酵素断片化からの損傷、インビボで自然発生した損傷、核酸抽出中に発生した損傷、配列決定ライブラリ調製中に発生した損傷、ポリメラーゼによって導入された損傷、核酸修復中に導入された損傷、核酸末端のテーリング中に発生した損傷、核酸ライゲーション中に発生した損傷、配列決定中に発生した損傷、ＤＮＡの機械的な取り扱いから発生した損傷、ナノポアを通過中に発生した損傷、生物における老化の一部として発生した損傷、個体の化学物質曝露の結果として発生した損傷、変異原によって生じた損傷、発癌物質によって生じた損傷、染色体異常誘発物質によって発生した損傷、酸素曝露に起因するインビボでの炎症損傷から生じた損傷、１つ以上の鎖切断に起因する損傷のうちの少なくとも１つ、およびこれらの任意の組み合わせであるか、またはこれらを含む、実施例６２に記載の方法。
６４．核酸物質が、被験体または生物に由来する１つ以上の二本鎖核酸分子を含むサンプルから提供される、上述の実施例のいずれか１つに記載の方法。
６５．サンプルは、身体組織、生検、皮膚サンプル、血液、血清、血漿、汗、唾液、脳脊髄液、粘液、子宮洗浄液、膣スワブ、パップスメア、鼻スワブ、口腔スワブ、組織擦過物、毛髪、指紋、尿、便、硝子体液、腹腔洗浄液、痰、気管支洗浄、口腔洗浄、胸腔洗浄、胃洗浄、胃液、胆汁、膵管洗浄、胆管洗浄、総胆管洗浄、胆嚢液、滑液、感染した創傷、感染していない創傷、考古学的サンプル、法医学的サンプル、水サンプル、組織サンプル、食品サンプル、バイオリアクターサンプル、植物サンプル、細菌サンプル、原生動物サンプル、真菌サンプル、動物サンプル、ウイルスサンプル、複数生物サンプル、爪あか、精液、前立腺液、膣液、膣スワブ、卵管洗浄、細胞を含まない核酸、細胞内の核酸、メタゲノミクスサンプル、移植された異物の洗浄またはスワブ、鼻洗浄、腸液、上皮のブラッシング、上皮洗浄、組織生検、検死サンプル、壊死サンプル、臓器サンプル、ヒト識別サンプル、非ヒト識別サンプル、人工的に作られた核酸サンプル、合成遺伝子サンプル、預けられたサンプルまたは保存されたサンプル、腫瘍組織、胎児サンプル、臓器移植サンプル、微生物培養サンプル、核ＤＮＡサンプル、ミトコンドリアＤＮＡサンプル、クロロプラストＤＮＡサンプル、アピコプラストＤＮＡサンプル、オルガネラサンプル、およびこれらの任意の組み合わせであるか、またはこれらを含む、実施例６４に記載の方法。
６６．核酸物質が、実質的にまたはほぼ均一な長さの核酸分子を含む、上述の実施例のいずれか１つに記載の方法。
６７  標的核酸物質が、被験体または生物に由来する、上述の実施例のいずれか１つのいずれか１つに記載の方法。
６８．標的核酸物質が少なくとも部分的に人工的に合成されている、上述の実施例のいずれか１つのいずれか１つに記載の方法。
６９．核酸物質のうちの最大１０００ｎｇが、最初に提供される、上述の実施例のいずれか１つに記載の方法。
７０．核酸物質のうちの最大１０ｎｇが、最初に提供される、上述の実施例のいずれか１つに記載の方法。
７１．核酸物質が、２つ以上の供給源に由来する核酸物質を含む、上述の実施例のいずれか１つに記載の方法。
【０２２３】
均等物および範囲
本技術の実施形態の上述の詳細な説明は、網羅的であること、または本技術を上述の正確な形態に限定することを意図するものではない。本技術の具体的な実施形態および実施例は、例示的な目的のために上に記載されているが、関連技術分野の当業者が認識するように、本技術の範囲内で様々な等価な修正が可能である。例えば、工程は所与の順序で提示されるが、代替的な実施形態は、異なる順序で工程を実行してもよい。本明細書に記載の様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することもできる。本明細書に引用される全ての参考文献は、本明細書に完全に記載されるかのように、参照により組み込まれる。
【０２２４】
上の記載から、本技術の特定の実施形態は、例示のために本明細書に記載されているが、本技術の実施形態の説明を不必要に曖昧にすることを回避するために周知の構造および機能は詳細には示されていないことを理解されたい。文脈が許容する場合、単数または複数の用語は、それぞれ複数または単数の用語も含み得る。さらに、本技術のある特定の実施形態と関連付けられた利点は、それらの実施形態の文脈で説明されているが、他の実施形態も、そのような利点を示してもよく、全ての実施形態が必ずしも本技術の範囲内に収まるような利点を示す必要はない。したがって、本開示および関連技術は、本明細書に明示的に示されないまたは記載されない他の実施形態を包含することができる。
【０２２５】
当業者は、本明細書に記載される開示される技術の具体的な実施形態に対する多くの均等物を、通常の実験を超えない実験を用いて認識するか、または確認することができるだろう。本技術の範囲は、上述の説明に限定されることが意図されず、むしろ、以下の特許請求の範囲に記載される通りである。
【図１】
2021515579.tif 000003
【図２Ａ】
2021515579.tif 000004
【図２Ｂ】
2021515579.tif 000005
【図３】
2021515579.tif 000006
【図４】
2021515579.tif 000007
【図５】
2021515579.tif 000008
【図６】
2021515579.tif 000009
【図７】
2021515579.tif 000010
【図８】
2021515579.tif 000011
【図９Ａ】
2021515579.tif 000012
【図９Ｂ】
2021515579.tif 000013
【図１０】
2021515579.tif 000014
【図１１】
2021515579.tif 000015
【図１２】
2021515579.tif 000016
【図１３】
2021515579.tif 000017
【図１４】
2021515579.tif 000018
【図１５】
2021515579.tif 000019
【図１６】
2021515579.tif 000020
【図１７−１】
2021515579.tif 000021
【図１７−２】
2021515579.tif 000022
【図１７−３】
2021515579.tif 000023
【図１８】
2021515579.tif 000024
【図１９】
2021515579.tif 000025
【図２０−１】
2021515579.tif 000026
【図２０−２】
2021515579.tif 000027
【図２１−１】
2021515579.tif 000028
【図２１−２】
2021515579.tif 000029
【図２２Ａ】
2021515579.tif 000030
【図２２Ｂ−Ｃ】
2021515579.tif 000031
【国際調査報告】
2021515579.tif 000032
2021515579.tif 000033