(57)【要約】  本開示は、チミジンキナーゼ１（ＴＫ−１）が、急速進行性Ｂ細胞リンパ腫、特にびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）に罹患している患者のリスク層別化の予後指標（ＰＩ）を決定するための方法における貴重なバイオマーカーであるという発見、このようなＰＩにおけるＴＫ−１の使用、およびマーカーＴＫ−１を含むＰＩに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）患者の予後指標（ＰＩ）（危険スコアまたはＰＩスコアとも呼ばれる）を決定する方法であって、
ａ）少なくとも次のパラメータ、すなわち
ｉ）節外性疾患の状態；ｉｉ）Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期、およびｉｉｉ）チミジンキナーゼ１のレベル
を決定することであって、
節外性疾患の非存在を０点の値とし、節外性疾患の存在を１点の値とし、
ＩまたはＩＩのＡｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期を０点の値とし、ＩＩＩまたはＩＶのＡｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期を１点の値とし、かつ
カットオフ以下のチミジンキナーゼのレベルを０点の値とし、前記カットオフを上回るチミジンキナーゼのレベルを少なくとも１点の値とする、決定することと、
ｂ）前記ＰＩの前記決定において、ｉ）、ｉｉ）、およびｉｉｉ）に対する前記値を合計することと
を含む方法。
【請求項２】
前記チミジンキナーゼカットオフレベルが、健常個体において決定されるようなＴＫ−１レベルの平均値の４倍に設定され、前記カットオフ以下のチミジンキナーゼレベルを０点の値とし、かつカットオフ値を上回るいかなるＴＫ−１レベルも１点の値とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記チミジンキナーゼカットオフレベルが、健常個体において決定されるようなＴＫ−１レベルの平均値の４倍に設定され、低いチミジンキナーゼレベル、すなわち前記カットオフ以下のＴＫ−１のレベルを０点の値とし、中間チミジンキナーゼレベル、すなわち前記カットオフを上回りかつ健常個体において決定されるような平均値の２０倍に相当する値以下のＴＫ−１のレベルを１点の値とし、かつ高チミジンキナーゼレベル、すなわち、健常個体において決定されるような平均値の２０倍を超えるＴＫ−１のレベルを２点の値とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＴＫ−１についてのタンパク質レベルのカットオフが、ＴＫ−１酵素活性における１８Ｕ／ｌと同等であり、かつこれを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質レベルの前記カットオフが１８Ｕ／ｌと同等であり、かつこれを含んでおり、また１８Ｕ／ｌを上回り、かつ８８Ｕ／ｌ以下のＴＫ−１のレベルを１点の値とし、また８８Ｕ／ｌを上回るＴＫ−１のレベルを２点の値とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
年齢というパラメータをさらに含み、前記ＰＩの前記決定において、前記年齢がカットオフを下回る場合、前記値が０点であり、また前記年齢がカットオフを上回る場合、前記値が１点である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＩの前記決定において、前記年齢が６０以下である場合、前記値が０点であり、前記年齢が６０を上回る場合、前記値が１点である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＥＣＯＧパフォーマンスステータスというパラメータをさらに含み、前記ＰＩの前記決定において、前記ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが１以下の場合、前記値が０点であり、また前記ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが２以上の場合、前記値が１点である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
年齢というパラメータおよびＥＣＯＧパフォーマンスステータスというパラメータをさらに含み、前記ＰＩの前記決定において、前記年齢が６０以下の場合、前記値が０点であり、前記年齢が６０を上回る場合、前記値が１点であり、かつ前記ＰＩの前記決定において、ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが１以下の場合、前記値が０点であり、またＥＣＯＧパフォーマンスステータスが２以上の場合、前記値が１点である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
年齢というパラメータおよびＥＣＯＧパフォーマンスステータスというパラメータをさらに含み、前記ＰＩの前記決定において、前記年齢が４０以下の場合、前記値が０点であり、前記年齢が４０を超えかつ６０以下の場合、前記値が１点であり、前記年齢が６０を超えかつ７５以下の場合、前記値が２点であり、前記年齢が７５を超える場合、前記値が３点であり、かつ前記ＰＩの前記決定において、前記ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが１以下の場合、値が０点であり、また前記ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが２以上の場合、前記値が１点である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＬＢＣＬ患者についての予後指標の決定におけるＴＫ−１のレベルについての値の、使用。
【請求項１２】
ＴＫ−１の前記レベルについての値が、ＩＰＩ、年齢調整されたＩＰＩ、Ｒ−ＩＰＩ、またはＮＣＣＮ−ＩＰＩで使用されるようなその他のパラメータと組み合わされる、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
ＴＫ−１の前記レベルについての前記値が、このようなＰＩにおけるＬＤＨのレベルについての値を置換するために使用されることを条件とする、請求項１２または１３に記載の使用。
【請求項１４】
チミジンキナーゼ１のレベルについての値を含むＤＬＢＣＬのための予後指標（ＰＩ）。
【請求項１５】
前記ＰＩが、ＩＰＩ、年齢調整されたＩＰＩ、Ｒ−ＩＰＩ、またはＮＣＣＮ−ＩＰＩから選択される、請求項１４に記載の予後指標（ＰＩ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チミジンキナーゼ１（ＴＫ−１）が、急速進行性Ｂ細胞リンパ腫、特にびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）に罹患している患者のリスク層別化の予後指標（ＰＩ）を決定するための方法における貴重なバイオマーカーであるという発見、このようなＰＩにおけるＴＫ−１の使用、およびマーカーＴＫ−１を含むＰＩに関する。
【背景技術】
【０００２】
異なる危険群へのＤＬＢＣＬ患者の層別化は通常、予後指標の採点に基づいて行われる。現在、このような患者の層別化に使用されるいくつかの予後指標（ＰＩ）がある（Ｗｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０１８）。ＮＣＣＮガイドラインには次のもの、すなわち、ＩＰＩ、年齢調整済ＩＰＩ、病期変更済ＩＰＩおよびＮＣＣＮ−ＩＰＩが含まれる。ＥＳＭＯガイドラインでは、ＩＰＩおよび年齢調整済ＩＰＩを推奨している。
【０００３】
標準的な国際予後指数（ＩＰＩ）［Ｚｉｅｐｅｒｔ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ：２８／１４（２０１０）２３７３］は、Ｒ−ＣＨＯＰ（リツキシマブ＋ＣＨＯＰ化学療法）で処置したＤＬＢＣＬ患者の予後を予測するために、診療所において広く使用されている。また、全米総合がん情報ネットワーク国際予後指標（ＮＣＣＮ−ＩＰＩ）も非常に一般的である［Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１２３，６：（２０１４）８３７］。
【０００４】
ＤＬＢＣＬの分野において使用される異なるＰＩを決定するために使用されるパラメータに関してはいくつかの違いがあるが、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期、節外性疾患の状態、および−唯一のバイオマーカーとして−乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）が、先に言及したＰＩの各々の鍵となる要素であるという一般受容概念がある。
【０００５】
すべての予後指標または予後スコアを用いる場合、改善が高水準で所望されており、その理由は、この指標／スコアがより正確でありかつ信頼できるほど、患者の層別化はより良好であるからである。
【０００６】
それゆえ、本開示に対する本発明者らの課題は、例えば、予後指標または予後スコアを決定することによってＤＬＢＣＬ患者の層別化を改善するために使用することができるバイオマーカーが存在するかどうかを調査することとした。
【０００７】
この課題は、特許請求の範囲で定義されたように、明細書、例、および実施形態を提供することによって、本開示において対処される。
【０００８】
パラメータ、すなわち、節外性疾患の状態、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期、チミジンキナーゼ１のレベルは、ＤＬＢＣＬ患者についての何らかの予後指標の決定のための鍵となることがわかっている。
【０００９】
驚くべきことに、また、バイオマーカーチミジンキナーゼ１は、調査したＰＩにおけるマーカーＬＤＨを置き換えることができるだけでなく、ＰＩにおいて使用した他のパラメータとの併用においても、このようなＰＩの改善、すなわち患者の層別化の改善をもたらすことができることも発見された。
【発明の概要】
【００１０】
一実施形態では、本開示は、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）患者についての予後指標（ＰＩ）を決定する方法であって、ａ）少なくとも次のパラメータ、すなわち、ｉ）節外性疾患の状態、ｉｉ）Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期、およびｉｉｉ）チミジンキナーゼ１のレベルを決定することであって、節外性疾患の非存在を０点の値とし、節外性疾患の存在を１点の値とし、ＩまたはＩＩのＡｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期を０点の値とし、ＩＩＩまたはＩＶのＡｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期を１点の値とし、かつカットオフ以下のチミジンキナーゼのレベルを０点の値とし、カットオフを上回るチミジンキナーゼのレベルを少なくとも１点の値とする、決定することと、ｂ）ＰＩの決定においてｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）に対する値を合計することとを含む方法に関する。
【００１１】
また、ＤＬＢＣＬ患者についての予後指標およびチミジンキナーゼ１のレベルについての値を含むＤＬＢＣＬについての予後指標（ＰＩ）の決定におけるＴＫ−１のレベルについての値の使用も本明細書に開示されている。
本発明のある特定の態様はまた、添付の図面によっても説明されている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】免疫検定法データのグラフ表示。図面の左側部分には、箱ひげ図（ボックスプロット）が付与されている。ｙ軸（対数目盛）には、ｎｇ／ｍｌ単位の濃度が示されている。図面の右側部分には、曲線下面積（ＡＵＣ）が示されている。（略語：Ｃｔｒ＝対照試料、ＤＬＢＣＬ＝びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫患者からの試料）。
【図２】ＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）チミジンキナーゼ（活性）アッセイデータのグラフ表示。図２の左側部分には、２つの箱ひげ図（ボックスプロット）があり、ｙ軸（対数尺度）に１ｍｌあたりの単位が示されている。この図面の右側部分には、曲線下面積（ＡＵＣ）が示されている。（略語：Ｃｔｒ＝対照試料、ＤＬＢＣＬ＝びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫患者からの試料）。
【図３】方法の比較  Ｄｏｍｉｎｇ回帰適合度は、図３のＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）チミジンキナーゼ（活性）アッセイデータのｘ軸とプロトタイプの免疫検定法のｙ軸との相関関係について示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
一実施形態では、本開示は、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）患者の予後指標（ＰＩ；危険スコアまたはＰＩスコアとも呼ばれる）を決定する方法であって、
ａ）少なくとも次のパラメータ、すなわち
ｉ）節外性疾患の状態、ｉｉ）Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期、およびｉｉｉ）チミジンキナーゼ１のレベル
を決定することであって、
節外性疾患の非存在を０点の値とし、節外性疾患の存在を１点の値とし、
ＩまたはＩＩのＡｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期を０点の値とし、ＩＩＩまたはＩＶのＡｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期を１点の値とし、かつ
カットオフ以下のチミジンキナーゼのレベルを０点の値とし、前記カットオフを上回るチミジンキナーゼのレベルを少なくとも１点の値とする、決定することと、
ｂ）ＰＩの決定において、ｉ）、ｉｉ）、およびｉｉｉ）に対する値を合計することと
を含む方法に関する。
【００１４】
本明細書では、特許出願および製造元のマニュアルを含む多くの文書が引用されている。これらの文書の開示は、本発明の特許性に関連するとは見なされないが、その全体が参照により本明細書とともに組み込まれる。より具体的には、参照されたすべての文書は、個々の文書が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されている場合と同程度まで、参照により組み込まれる。
【００１５】
ヒトチミジンキナーゼ１（略語：ＴＫ−１、ｈＴＫ−１、ｈＴＫ１またはＴＫ１）、（ＡＴＰ：チミジン５’−ホスホトランスフェラーゼ、ＥＣ２．７．１．２１）は、ＤＮＡ前駆体合成に関与する酵素である。ヒトチミジンキナーゼ１は、配列番号１に示されるような２３４個のアミノ酸からなる。ヒトの体内では、ＴＫ−１は、二量体、四量体、高分子量のポリマーなどのさまざまな形態で存在する。これらの形態は、ある特定の分子の存在、例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の有無、ｈＴＫ−１タンパク質自体の濃度、タンパク質、すなわち天然または組換えＴＫ１の種類、およびタンパク質の、すなわち血清または細胞質中での部位／位置に依存しているようである。
【００１６】
関心対象の試料中のチミジンキナーゼ１のレベルは、いずれかの適切な手段によって決定することができる。この決定は、インビトロで行われる。一実施形態では、チミジンキナーゼ１のレベルは、関心対象の試料からインビトロで決定される。
【００１７】
一実施形態では、ＴＫ−１のレベルは酵素活性レベルである。血清ＴＫ−１酵素活性は、例えば、放射性基質１２５１−ｄＵｒｄ（ＰＲＯＬＩＦＩＧＥＮ（登録商標）ＴＫ−ＲＥＡ，ＤｉａＳｏｒｉｎ  Ｉｎｃ．）または非放射性基質ＴＫ−１活性アッセイ（ＴＫ  ＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）アッセイ，ＤｉａＳｏｒｉｎ  Ｉｎｃ．）を使用して測定することができる。一実施形態では、チミジンキナーゼ１のレベルは、チミジンキナーゼ１のタンパク質レベルである。
【００１８】
「カットオフ値」という用語は、判定点、通常、値および／または濃度に関する。カットオフ値以下の値は、第１の群へと群別され、カットオフ値を上回る値は、第２の群へと群別される。時には１つを超えるカットオフ値点が使用される。この場合、第１のカットオフ値以下の値は、第１の群へと群別され、第１のカットオフ値を上回りかつ第２のカットオフ値以下の値は、第２の群へと群別され、第２のカットオフ値を上回りかつ〜以下の値などである。
【００１９】
ＤＬＢＣＬ患者のチミジンキナーゼ１のレベルが、健常個体からの試料において測定されたＴＫ−１のレベルをはるかに上回っていることは非常に驚くべき発見であった。一実施形態では、カットオフ値は、新たに診断されたＤＬＢＣＬ患者のベースライン試料において決定され、新たに診断されたＤＬＢＣＬ患者の２５％百分位数から３５％百分位数の範囲にある。
【００２０】
一実施形態では、カットオフ値は、健常対照から採取された試料に基づいて決定される。一実施形態では、チミジンキナーゼカットオフ値のレベルは、健常個体において決定されるようなＴＫ−１レベルの平均値の４倍である。
【００２１】
ＴＫ−１についての単一のカットオフ値点を使用し、２つの群の患者、すなわちカットオフ値以下のチミジンキナーゼ１レベルの患者、およびカットオフ値を上回るＴＫ−１レベルの患者を構築することは可能であることが発見された。
【００２２】
一実施形態では、本開示は、先に規定したようにＰＩを決定するための方法に関するものであり、チミジンキナーゼ１カットオフ値レベルは、健常個体において決定されるようなＴＫ−１レベルの平均値の４倍に設定され、カットオフ値以下のチミジンキナーゼ１レベルを０点の値とし、かつカットオフ値を上回るいかなるＴＫ−１レベルも１点の値とする。
【００２３】
さらに、ＴＫ−１のレベルに基づいて２つの群の患者、すなわちチミジンキナーゼ１レベルが低い、すなわちカットオフ値以下のＴＫ−１レベルの患者、中間群、すなわち、ＴＫ−１レベルがカットオフ値を上回り、健常個体において決定される平均値の２０倍に相当する値以下の患者、およびチミジンキナーゼレベルが高い、すなわち、ＴＫ−１のレベルが健常個体において決定される平均値の２０倍超の患者を構築することは有利である可能性があることが発見された。
【００２４】
一実施形態では、本開示は、先に規定されたようにＰＩを決定するための方法に関するものであり、チミジンキナーゼ１カットオフ値レベルは、健常個体において決定されるようなＴＫ−１レベルの平均値の４倍に設定され、チミジンキナーゼ１レベル、すなわちカットオフ値以下のＴＫ−１のレベルを０点の値とし、かつ中間的なチミジンキナーゼレベル、すなわち、カットオフ値を上回り、健常個体において決定されるような平均値の２０倍に相当する値以下のＴＫ−１のレベルを１点と評価し、高いチミジンキナーゼレベル、すなわち健常個体において決定されるような平均値の２０倍超のＴＫ−１のレベルを２点の値とする。
【００２５】
まだ完全に標準化されていない免疫検定法を用いて決定されたタンパク質濃度に関するＴＫ−１レベル、およびＤｉａＳｏｒｉｎから市販されている酵素活性アッセイを用いて決定されたＴＫ−１酵素活性レベルは、非常に良好な相関を示すことがわかっている（図３参照）。それゆえ、また、酵素活性（Ｕ／ｌ）に関するカットオフ値を与えることも可能である。
【００２６】
一実施形態では、本開示は、ＰＩを決定するための方法であって、ＴＫ−１についてのタンパク質レベルのカットオフが、ＴＫ−１酵素活性における１８Ｕ／ｌと同等であり、かつこれを含む方法に関する。
【００２７】
一実施形態では、本開示は、ＰＩを決定するための方法であって、タンパク質レベルのカットオフ値が、１８Ｕ／ｌと等価であり、かつこれを含む方法であって、１８Ｕ／ｌを上回りかつ８８Ｕ／ｌ以下のＴＫ−１のレベルを１点の値とし、８８Ｕ／ｌを上回るＴＫ−１のレベルを２点の値とする方法に関する。
【００２８】
いかなる患者についても、特に最近ＤＬＢＣＬと診断された患者については、ＴＫ−１が測定され、あらかじめ規定されたカットオフ値と比較されるものとすることが発見された。新たに診断された患者についての測定値が、あらかじめ規定されたカットオフ値（２値化アプローチ）を上回る場合、該患者は、より高い危険スコアを有し、好ましくない疾患転帰を経験する可能性が高いと見なされる。
【００２９】
また、上昇するカットオフ値のセットに基づいて、例えば、ＴＫ−１のレベルが低い患者についてのＰＩの決定において０（危険）点を、ＴＫ−１のレベルが中程度の患者についてのＰＩの決定において１（危険）点を、およびＴＫ−１のレベルが高い患者についてのＰＩの決定において２（危険）点を用いる三分法アプローチにおいて、２つを超える危険群を規定することも可能である。次に、患者は、ＴＫ−１測定値に基づいて危険群の１つに割り当てられるであろうし、危険スコアが高いほど、疾患の転帰は不利になる。
【００３０】
あるいは、あらかじめ規定された適切な変換関数（例えば、ｌｏｇ２変換）に基づいて、ＴＫ−１の測定値を連続的な危険スコアに直接的に変換することもできるであろう。本開示による方法における一実施形態では、ＰＩは、ｌｏｇ２変換されたＴＫ−１測定値に基づいて決定される。本開示による方法における一実施形態では、ＰＩは、ＴＫ−１測定値の連続的な危険スコアに基づいて決定される。これらの層別化されたまたは変換されたＴＫ−１値のいかなるものも、既存の予後指標のいずれかに（ＬＤＨの置き換えの有無にかかわらず）追加することができる。
【００３１】
一実施形態では、本明細書に開示されるような、すなわち、節外性疾患の状態、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期、およびチミジンキナーゼ１のレベルというパラメータを含む、予後指標を決定するための方法は、パラメータ年齢をさらに含み、年齢がカットオフ値を下回る場合、値は０点であり、年齢がカットオフ値を上回る場合、値は、ＰＩの決定において１点である。
【００３２】
一実施形態では、本明細書に開示されるような、すなわち、節外性疾患の状態、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期、およびチミジンキナーゼ１のレベルというパラメータを含む、予後指標を決定するための方法は、ＥＣＯＧパフォーマンスステータスというパラメータをさらに含み、ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが１以下の場合、値は、ＰＩの決定において０点であり、ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが２以上の場合、値は、１点である。
【００３３】
ＤＬＢＣＬについての少なくとも４つの異なるものの関連している予後指数は、現に利用可能であり、臨床診療、国際予後指標（ＩＰＩ）、「年齢調整済ＩＰＩ」、改訂標準国際予後指数（Ｒ−ＩＰＩ）、および全米総合がん情報ネットワーク国際予後指数（ＮＣＣＮ−ＩＰＩ）において使用されている。
【００３４】
「予後指標」（ＰＩ）（危険スコアまたはＰＩスコアとも呼ばれる）は、数値を提供する。このようなＰＩの数値は、例えば、このようなＰＩの各個々のパラメータ（構成要素）について決定された値を合計することによって生成される。一実施形態では、本開示によりＰＩを決定する方法は、コンピュータ可読プログラムにおいて実施される。一実施形態では、本開示によりＰＩを決定する方法は、アプリ内へと実装される。予後指標またはＰＩスコアは、例えば、患者を複数の群へと分割／層別化するために使用することができる。このような群は、例えば、疾患の進行の危険が異なる群であることができる。通常、約３つまたは４つの群が構築され、それぞれ、低危険群、中間危険群、および高危険群、または低危険群、中間低危険群、中間高危険群、および高危険群である。
【００３５】
ＤＬＢＣＬの分野における「元の」国際予後指標（ＩＰＩ）は、１９９３年にＳｈｉｐｐ  ＭＡ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＤＰ，“Ａ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ”；Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｐｒｏｊｅｃｔ、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９３；３２９（１４）：９８７−９４によって説明されている。また、この論文では、６０歳を超える患者と６０歳以下の患者とに群分けする年齢調整済ＩＰＩについても説明されている。この参考文献の開示は、参照により明示的に本明細書とともに含まれる。
【００３６】
「元の」国際予後指標（ＩＰＩ）は、年齢（６０歳超＝１点）、ＥＣＯＧパフォーマンスステータス（２以上＝１点）、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期（ＩＩＩまたはＩＶ＝１点）、ＬＤＨ（ＵＬＮ（正常値上限）超＝１点）および節外部位（１超＝１点）というパラメータを含む。ＩＰＩスコアから生じる危険群は次のとおり、すなわち、低危険群（０〜１点）、低中間危険（２点）、高中間危険（３点）、および高危険（４または５点）である。
【００３７】
年齢調整済ＩＰＩの最小複雑性版は、６０歳超の患者に適用される。該版は、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期（ＩＩＩまたはＩＶ＝１点）、ＬＤＨ（ＵＬＮ超＝１点）および節外部位（１超＝１点）というパラメータを含む。４つの危険群、つまり低危険群（０点）、低中間危険（１点）、高中間危険（２点）、および高危険（３点）が決定される。
【００３８】
６０歳以下の患者に適用される年齢調整済ＩＰＩはまた、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期（ＩＩＩまたはＩＶ＝１点）、ＬＤＨ（ＵＬＮ超＝１点）および節外部位（１超＝１点）というパラメータも含むが、わずかに異なる採点を使用する。本明細書では４つの危険群とは、低危険群（０〜１点）、低中間危険（１〜２点）、高中間危険（２〜３点）、および高危険（４点）である。
【００３９】
本発明に対して本発明者らによって発見されたように、ＴＫ−１は、ＩＰＩおよび年齢調整済ＩＰＩの両方においてＬＤＨの代わりに使用することができる。
【００４０】
（改訂）国際予後指標（Ｒ−ＩＰＩ）［Ｓｅｈｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００７］は、Ｒ−ＣＨＯＰ（リツキシマブ＋ＣＨＯＰ化学療法）を用いて処置されたＤＬＢＣＬ患者の転帰を予測するために診療所で広く使用されている。Ｒ−ＩＰＩは、５つの構成要素を含み、該構成要素は、最終的な危険スコアとして合計される（表１）。
【表１】
2021535392.tif 000002
【００４１】
一実施形態では、ＰＩを決定するための、すなわち、節外性疾患の状態、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期、およびチミジンキナーゼ１のレベルというパラメータを含む、本発明に開示される方法は、年齢というパラメータとＡｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期というパラメータをさらに含み、年齢が６０以下である場合、ＰＩの決定において値は０点であり、年齢が６０を超える場合、値は１点であり、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期がＩＩ以下である場合、ＰＩの決定において値は０点であり、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期がＩＩＩまたはＩＶである場合、値は１点である。この方法の一実施形態では、節外性疾患とは、１つを超える節外部位（骨髄を含む）における疾患であり、満たされた場合、ＰＩの決定において１点になる。一実施形態では、本発明は、表１からの先のパラメータ（構成要素）を含む改善されたＲ−ＩＰＩであって、ＬＤＨのレベルの代わりにＴＫ−１のレベルが使用されるＲ−ＩＰＩに関する。改善されたＲ−ＩＰＩにおける一実施形態では、チミジンキナーゼ１カットオフ値レベルは、健常個体において決定されたようなＴＫ−１レベルの平均値の４倍に設定され、カットオフ値以下のチミジンキナーゼ１レベルは、０点になり、カットオフ値を上回るいかなるＴＫ−１レベルも１点となる。改善されたＲ−ＩＰＩにおける一実施形態では、チミジンキナーゼのカットオフ値レベルは、健常個体において決定されるようなＴＫ−１レベルの平均値の４倍に設定され、低いチミジンキナーゼレベル、すなわちカットオフ値以下のＴＫ−１のレベルは０点となり、中間チミジンキナーゼレベル、すなわちカットオフ値を上回りかつ健常個体において決定されるような平均値の２０倍に相当する値以下のＴＫ−１のレベルは１点となり、高チミジンキナーゼレベル、すなわち、健常個体において決定されるような平均値の２０倍を超えるＴＫ−１のレベルは２点となる。
【００４２】
「ＴＫ−１  ＩＰＩ」（ＬＤＨの代わりにＴＫ−１を使用するＩＰＩ）危険群は、先に説明したようなＴＫ−１のレベルについての単一のカットオフ値点を使用する場合、公表されたとおりにとどまり、すなわち、低危険群（（０〜１点）、低中間危険（２点）、高中間危険（３点）、および高危険（４または５点）である。「ＴＫ−１  ＩＰＩ」（ＬＤＨの代わりにＴＫ−１を使用するＩＰＩ）の予後能力は、ＴＫ−１レベルについて決定された値を三分することによってさらに改善することができる。相当する危険群は、低危険群（０点）、低中間危険（１点）、高中間危険（２〜３点）、および高危険（４〜６点）である。
【００４３】
「ＴＫ−１  Ｒ−ＩＰＩ」（ＬＤＨの代わりにＴＫ−１を使用するＲ−ＩＰＩ）危険群は、先に説明したようなＴＫ−１のレベルについての単一のカットオフ値点が使用される場合、公表されるとおりにとどまり、すなわち、低危険群（「非常によい」、０点）、中間危険（「よい」、１〜２点）、高危険（「悪い」３〜５点）である。「ＴＫ−１  Ｒ−ＩＰＩ」（ＬＤＨの代わりにＴＫ−１を使用するＩＰＩ）の予後能力は、ＴＫ−１レベルについて決定された値を三分することによってさらに改善することができる。相当する危険群は、低危険群（「非常によい」、０点）、中間危険（「よい」、１〜３点）、高危険（「悪い」４〜６点）である。
【００４４】
全米総合がん情報ネットワーク国際予後指標（ＮＣＣＮ−ＩＰＩ）は、Ｒ−ＩＰＩの派生物であり、以下の危険構成要素を含有している（表２）。
【表２】
2021535392.tif 000003
【００４５】
一実施形態では、ＰＩを決定するための、すなわち、節外性疾患の状態、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期、およびチミジンキナーゼ１のレベルというパラメータを含む、本発明に開示される方法は、年齢というパラメータおよびＥＣＯＧパフォーマンスステータスというパラメータをさらに含み、年齢が４０以下の場合、ＰＩの決定において値は０点であり、年齢が４０を超えかつ６０以下の場合、値は１点であり、年齢が６０を超えかつ７５以下の場合、値は２点であり、年齢が７５を超える場合、ＰＩの決定において値は３点であり、ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが１以下の場合、ＰＩの決定において値は０点であり、ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが２以上の場合、値は１点である。この方法の一実施形態では、節外性疾患とは、骨髄、中枢神経系、肝臓、消化管および肺から選択される１つ以上の部位における疾患であり、この基準が満たされる場合、１点となる。一実施形態では、本発明は、表２からの先のパラメータ（構成要素）を含む改善されたＮＣＣＮ−ＩＰＩであって、ＬＤＨのレベルの代わりにＴＫ−１のレベルが使用される改善されたＮＣＣＮ−ＩＰＩに関する。改善されたＮＣＣＮ−ＩＰＩにおける一実施形態では、チミジンキナーゼのカットオフ値レベルは、健常個体において決定されるようなＴＫ−１レベルの平均値の４倍に設定され、低いチミジンキナーゼレベル、すなわちカットオフ値以下のＴＫ−１のレベルは０点となり、中間チミジンキナーゼレベル、すなわちカットオフ値を上回りかつ健常個体において決定されるような平均値の２０倍に相当する値以下のＴＫ−１のレベルは１点となり、高チミジンキナーゼレベル、すなわち、健常個体において決定されるような平均値の２０倍を超えるＴＫ−１のレベルは２点となる。
【００４６】
「ＴＫ−１  ＮＣＣＮ−ＩＰＩ」（ＬＤＨの代わりにＴＫ−１を使用するＮＣＣＮ−ＩＰＩ）危険群は、公表されたとおりにとどまり、すなわち、低危険群（（０〜１点）、高中間危険（２〜３点）、高中間危険（４〜５点）、および高危険（６点以上）である。
【００４７】
表１および表２、ならびに先の「より古い」ＩＰＩの説明から明らかなように、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期および節外性疾患、および唯一のバイオマーカーとしての乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）が、先に述べたＤＬＢＣＬについての各ＰＩの鍵となる要素であるという共通認識がある。
【００４８】
ＩＰＩ、年齢調整済ＩＰＩ、Ｒ−ＩＰＩ、およびＮＣＣＮ−ＩＰＩについてわかるように、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）値は通常、正常上限（ＵＬＮ）を使用して決定される。ＵＬＮ以下のＬＤＨレベルは、０となり、ＵＬＮを超えるＬＤＨレベルは、少なくとも１点となる。
【００４９】
Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒの病期分類は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／５１２１６９４およびｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／２８０９６７９において説明されているように実行される。その開示は、その全体が参照により本明細書により含まれる。
【００５０】
ＥＣＯＧ（米国東海岸癌臨床試験グループ）のパフォーマンスステータス（＝「ＥＣＯＧステータス」）は、Ｏｋｅｎ  ＭＭ，Ｃｒｅｅｃｈ  ＲＨ，Ｔｏｒｍｅｙ  ＤＣ，ｅｔ．ａｌ．，Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃｏｍｉｓ  Ｍ．Ｄ．，Ｇｒｏｕｐ  Ｃｈａｉｒ．Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ．Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９８２  Ｄｅｃ；５（６）：６４９−５５によって定義および説明されているように決定される。
【００５１】
先に述べたすべてのＤＬＢＣＬ  ＰＩは、ＥＣＯＧステータス（ＥＣＯＧパフォーマンスステータス）について同じカットオフ値を使用しており、すなわち、２以上のＥＣＯＧステータスは、これらの各指標の決定において１点となるのに対し、０または１のＥＣＯＤステータスは０点となる。同じことが、本明細書に開示される方法または予後指標の一部としてのＥＣＯＧステータスに適用される。
【００５２】
「節外性疾患」が、先に述べたＰＩのいずれかのさらに１つのさらなる中心的な要素を示すという広範な共通認識がある。先により詳細に説明したさまざまなＩＰＩ間における節外性疾患の定義に関してわずかな違いがある。所与の実施例から明らかなように、ＴＫ−１のレベルについての値を使用することができ、先に説明したＰＩのいずれかと組み合わせることができる。それゆえ、一実施形態では、本発明は、ＰＩを決定する方法またはＰＩそれ自体に関するものであり、節外性疾患についての定義は、１つを超える節外部位（骨髄を含む）における疾患または骨髄、中枢神経系、肝臓、消化管、肺における疾患（１つ以上）から選択される。
【００５３】
「試料」または「関心対象の試料」または「検査試料」という用語は、本明細書では相互互換可能に使用される。試料は、インビトロでの試料であり、インビトロで分析されることになり、体内に戻されることはない。一実施形態では、関心対象の試料は、ＤＬＢＣＬに罹患していると新たに診断され、処置が開始される前の患者から採取される。試料の例は、限定されるものではないが、血液、血清、血漿、滑液、尿、唾液、およびリンパ液などの流体試料、または組織抽出物、軟骨、骨、滑膜、および結合組織などの固形試料を含む。一実施形態では、試料は、血液、血清、血漿、滑液、および尿から選択される。一実施形態では、試料は、血液、血清、および血漿から選択される。一実施形態では、試料は、血清または血漿である。
【００５４】
本明細書で使用される「参照試料」という用語は、関心対象の試料と実質的に同一の様式で分析され、その情報が関心対象の試料の情報と比較される試料を指す。これにより、参照試料は、関心対象の試料から入手された情報の評価を可能にする標準を提供する。参照試料は、健常なまたは正常な組織、器官、または個体に由来することができ、それにより、組織、器官、または個体の健康状態の標準を提供する。一実施形態では、ＴＫ−１の平均値を決定するための参照試料は、健常個体に由来する。
【００５５】
先にさらに示すように、予後指標を決定するために使用されるチミジンキナーゼのレベルは、一実施形態ではタンパク質レベルである。タンパク質レベルを決定するためのさまざまな方法が利用可能であり、当業者の技術の範囲内である。
【００５６】
一実施形態では、チミジンキナーゼのタンパク質レベルは、免疫検定法において決定される。いかなる種類の免疫検定法を使用しても、試料中のＴＫ−１タンパク質レベルを測定することができる。ＰＩの決定において後の使用のためにＴＫ−１レベルを測定するために利用することができる免疫検定法の例は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）、放射性免疫検定（ＲＩＡ）、または発光、化学発光、電気化学発光、もしくは蛍光に基づく免疫検定法である。
【００５７】
市販の免疫検定法の１つは、マイクロタイタープレート法に基づくＡｒｏｃｅｌｌ製ｈＴＫ−１アッセイである。
【００５８】
一実施形態では、予後指標を決定するために使用されるＴＫ−１レベルは、サンドイッチアッセイ法において測定される。
【００５９】
典型的なサンドイッチ型法では、固相に結合した、または固相に結合することができる一次抗体、および検出可能に標識された二次抗体は各々、異なる重複しないエピトープで分析物に結合する。第１の分析物特異的結合剤（例えば、抗体）は、固体表面に共有結合しているかまたは受動結合している（ｐａｓｓｉｖｅｌｙ  ｂｏｕｎｄ）かのいずれかである。固体表面は、典型的にはガラスまたはポリマーであり、最も一般的に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンである。固体支持体は、管、ビーズ、マイクロプレートの円盤、または免疫検定法を実施するのに適したその他の表面であってもよい。結合プロセスは、当技術分野で周知であり、概して、架橋性共有結合、または物理的吸着からなり、ポリマー−抗体複合体は、検査試料のための調製において洗浄される。次に、検査されることになる試料の一定分量を固相複合体に添加し、十分な時間（例えば、２〜４０分またはより便利な場合は一晩）かつ適切な条件（例えば、２５℃〜３７℃など、室温から４０℃まで）下でインキュベートして、一次抗体または捕捉抗体と、相当する抗原との間の結合を可能にする。インキュベーション期間に続いて、一次抗体または捕捉抗体を含み、該抗体に結合した固相を洗浄することができ、抗原上の別のエピトープに結合する二次抗体または標識抗体とともにインキュベートすることができる。第２の抗体を、第１の抗体と関心対象の抗原との複合体に対する第２の抗体の結合を示すために使用するレポーター分子に結合させる。
【００６０】
非常に用途の広い代替サンドイッチアッセイ法には、結合対の第１のパートナーでコーティングされた固相、例えば、常磁性ストレプトアビジンでコーティングした微粒子の使用が含まれる。このような微粒子を、結合対の第２のパートナー（例えば、ビオチン化抗体）に結合した分析物特異的結合剤、結合対の該第２のパートナーが該分析物特異的結合剤に結合している分析物を含むと疑われるまたは含んでいる試料、および例えば、本明細書で使用されるような電気化学発光標識で検出可能に標識された第２の分析物特異的結合剤と混合およびインキュベートする。当業者には明らかなように、これらの構成要素を適切な条件下で、分析物、結合対の第２のパートナーおよび結合対の第１のパートナー（に結合した）分析物特異的結合剤を介して、標識抗体を固相微粒子へ結合させるのに十分な時間インキュベートする。適宜、このようなアッセイは、１つ以上の洗浄ステップ（複数可）を含むことができる。
【００６１】
当業者には明らかなように、試料は、いずれかの所望の順序で、すなわち、一次抗体が最初であり、二次抗体であり、一次抗体よりも最初に二次抗体、または同時に、一次抗ｈＴＫ−１抗体／ｈＴＫ−１／二次抗ｈＴＫ−１抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件下で、一次および二次抗体と接触させることができる。
【００６２】
当業者が容易に認識するように、特異的抗ｈＴＫ−１抗体とｈＴＫ−１抗原／分析物との間の複合体（抗ｈＴＫ−１抗体／ｈＴＫ−１複合体）の形成、またはｈＴＫ−１と、ｈＴＫ−１（分析物）と第２の抗ｈＴＫ−１抗体複合体（＝第１の抗ｈＴＫ−１抗体／ｈＴＫ−１／第２の抗ｈＴＫ−１抗体複合体）とを含む二次複合体またはサンドイッチ複合体の形成に適切であるまたは十分である時間および条件を確立することは常に、常用の実験法である。
【００６３】
抗ｈＴＫ−１抗体／ｈＴＫ−１複合体の検出は、何らかの適切な手段によって実施することができる。当業者は、このような手段／方法に完全に精通している。
【００６４】
ｈＴＫ−１のレベルを測定するためのイムノアッセイ法では、通常、ｈＴＫ−１に対する少なくとも１つの抗体は、検出可能な標識を含む。
【００６５】
検出可能に標識したという用語は、直接的または間接的に検出することができる標識を包含する。
【００６６】
直接的に検出可能な標識が、検出可能なシグナルを提供するか、または該標識が、第２の標識と相互作用するかのいずれかをして、第１または第２の標識によって提供される検出可能なシグナルを改変して、例えば、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を与える。蛍光色素および発光（化学発光および電気化学発光を含む）色素などの標識（Ｂｒｉｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  Ａｍｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，”Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｔｒａｎｓ．１（１９９７）１０５１−１０５８）は、検出可能なシグナルを提供し、標識法に概して適用可能である。一実施形態では、検出可能に標識したは、検出可能なシグナルを提供する、または提供するように誘導可能な標識、すなわち、それぞれ、蛍光標識、発光標識（例えば、化学発光標識または電気化学発光標識）、放射性標識または金属キレート系標識を指す。
【００６７】
多数の標識（色素ともいう）が利用可能であり、これらは概して、以下の区分に分類することができ、該区分はすべてまとまって、および該区分の各々が本開示による実施形態である。
【００６８】
（ａ）蛍光色素
蛍光色素は、例えば、Ｂｒｉｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  Ａｍｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，”Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｔｒａｎｓ．１（１９９７）１０５１−１０５８）によって説明されている。
【００６９】
蛍光標識または蛍光体には、希土類キレート（ユーロピウムキレート）、フルオレセイン型標識（ＦＩＴＣ、５−カルボキシフルオロセイン、６−カルボキシフルオロセインを含む）、ローダミン型標識（ＴＡＭＲＡを含む）、ダンシル、リサミン、シアニン、フィコエリトリン、テキサスレッド、およびこれらの類似体が含まれる。蛍光標識は、本明細書に開示される技術を使用して、標的分子内に含まれるアルデヒド基に結合させることができる。蛍光色素および蛍光標識試薬には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）およびＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）から市販されるものが含まれる。
【００７０】
（ｂ）発光色素
発光色素または標識は、化学発光色素および電気化学発光色素にさらに下位分類することができる。
【００７１】
化学発光標識の異なるクラスには、ルミノール、アクリジニウム化合物、セレンテラジンおよび類似体、ジオキセタン、ペルオキシしゅう酸およびペルオキシしゅう酸誘導体に基づく系が含まれる。免疫診断手順のためには、主にアクリジニウム系標識が使用される（詳細な概要は、Ｄｏｄｅｉｇｎｅ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｌａｎｔａ  ５１（２０００）４１５−４３９において付与されている）。
【００７２】
電気化学発光標識として使用される主な関連性のある標識は、それぞれルテニウムおよびイリジウム系の電気化学発光錯体である。電気化学発光（ＥＣＬ）は、高感度かつ選択的な方法として、分析上の応用において非常に有用であることが証明された。ＥＣＬは、化学発光分析の分析上の利点（背景光信号の非存在）を、電極電位を適用することによる反応制御の容易さと組み合わせている。概して、ルテニウム錯体、特に液相または液固界面においてＴＰＡ（トリプロピルアミン）を用いて再生する［Ｒｕ（Ｂｐｙ３］２＋（約６２０ｎｍで光子を放出）がＥＣＬ標識として使用される。
【００７３】
電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイは、関心対象の分析物の存在および濃度の高感度かつ正確な測定を提供する。このような技術は、適切な化学的環境において電気化学的に酸化または還元したときに発光するように誘導することができる標識または他の反応物を使用する。このような電気化学発光は、特定の時間に特定の様式で作用電極に印加される電圧によって生じる。標識によって生成された光は、測定され、分析物の存在または量を示す。このようなＥＣＬ技術のより完全な説明については、米国特許第５，２２１，６０５号、米国特許第５，５９１，５８１号、米国特許第５，５９７，９１０号、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９０／０５２９６、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９２／１４１３９、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９０／０５３０１、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９６／２４６９０、ＰＣＴ出願公開ＵＳ９５／０３１９０、ＰＣＴ出願ＵＳ９７／１６９４２、ＰＣＴ出願公開ＵＳ９６／０６７６３、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９５／０８６４４、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９６／０６９４６、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９６／３３４１１、ＰＣＴ出願公開ＷＯ８７／０６７０６、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９６／３９５３４、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９６／４１１７５、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９６／４０９７８、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０３６５３および米国特許出願第０８／４３７，３４８号（米国特許第５，６７９，５１９号）が参照される。また、Ｋｎｉｇｈｔ，ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌｙｓｔ，１９９４，１１９：８７９−８９０）によるＥＣＬの分析上の応用の１９９４年の総説および該総説に引用されている参考文献も参照される。一実施形態では、本明細書による方法は、電気化学発光標識を使用して実施される。
【００７４】
近年、イリジウム系ＥＣＬ標識も説明されている（ＷＯ２０１２１０７４１９（Ａ１））。
【００７５】
一実施形態では、直接敵に検出可能な標識は、化学発光標識または電気化学発光標識である。標識によって生成された光は、測定され、直接的にまたは間接的に分析物の存在または量を示す。
【００７６】
放射性標識は、放射性同位体（放射性核種）、例えば、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇｎ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９９ＴＣ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、または１３１Ｂｉを採用する。
【００７７】
（ｄ）撮像および治療目的のための標識として適切な金属キレート錯体は当技術分野で周知である（米国特許出願第２０１０／０１１１８５６、米国特許第５，３４２，６０６号、米国特許第５，４２８，１５５号、米国特許第５，３１６，７５７号、米国特許第５，４８０，９９０号、米国特許第５，４６２，７２５号、米国特許第５，４２８，１３９号、米国特許第５，３８５，８９３号、米国特許第５，７３９，２９４号、米国特許第５，７５０，６６０号、米国特許第５，８３４，４５６号、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５（１９８３）１４７−１５７、Ｍｅａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４２（１９８４）６８−７８、Ｍｉｒｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１（１９９０）５９−６５、Ｍｅａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９０），Ｓｕｐｐｌ．１０：２１−２６、Ｉｚａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３（１９９２）３４６−３５０、Ｎｉｋｕｌａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２２（１９９５）３８７−９０、Ｃａｍｅｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０（１９９３）９５５−６２、Ｋｕｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３９（１９９８）２１０５−２１１０、Ｖｅｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４（２００３）１６６３−１６７０、Ｃａｍｅｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２１（１９９４）６４０−６４６、Ｒｕｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０（１９９０）４２２１−４２２６、Ｖｅｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４（２００３）１６６３−１６７０、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１（２００１）４４７４−４４８２、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４（２００３）１１０５−１１１２、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１０（１９９９）１０３−１１１、Ｍｉｅｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４５（２００４）１２９−１３７、ＤｅＮａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４（１９９８）２４８３−９０、Ｂｌｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ＆Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  １８（２００３）３５５−３６３、Ｎｉｋｕｌａ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０（１９９９）１６６−７６、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３９（１９９８）８２９−３６、Ｍａｒｄｉｒｏｓｓｉａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０（１９９３）６５−７４、Ｒｏｓｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ＆Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，１４（１９９９）２０９−２０）。
【００７８】
実施例の節において使用した免疫検定法では、まだ公には入手可能ではない新たに開発された抗体をいくつか採用しており、それゆえ、以下でいくらか詳細において説明されている。使用される抗体はいずれも、配列番号１のヒトチミジンキナーゼ１（ｈＴＫ−１）に特異的に結合する。
【００７９】
「特異的に結合する」（本明細書では「特異的に相互作用する」ともいう）という用語は、本発明に従って、抗体がｈＴＫ−１のみを特異的に結合するが、異なるタンパク質、特に、例えば、チミジンキナーゼ２（配列番号５）などの類似の構造の異なるタンパク質とは交差反応しないか、または本質的に交差反応しないことを意味する。
【００８０】
抗体の特異度を分析することに対応する方法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、およびＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓにおいて説明されている。適切な研究の非限定的な例は、例えば、構造的および／または機能的に密接に関連する分子を用いた結合研究、ブロッキングおよび競合研究である。これらの研究は、例えば、ＦＡＣＳ分析、フローサイトメトリー滴定分析（ＦＡＣＳ滴定）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）による）、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、蛍光滴定のような方法によって、または放射性標識リガンド結合アッセイによって実施することができる。さらなる方法には、例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（競合ＥＬＩＳＡを含む）検査、ＲＩＡ検査、ＥＣＬ検査、およびＩＲＭＡ検査を含む。
【００８１】
本発明の文脈において、「抗体」という用語は、完全な免疫グロブリン分子、ならびにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどのその抗原結合フラグメントに関する。さらに、この用語は、改変および／または変化した抗体分子、ならびに組換えまたは合成で生成された／合成された抗体に関する。「抗体」という用語はまた、二機能性抗体、三機能性抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体、および一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）または抗体融合タンパク質のような抗体コンストラクトを含む。
【００８２】
本明細書で使用される「Ｆａｂフラグメント」は、１つの軽鎖と、１つの重鎖のＣＨ１および可変領域から構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することはできない。「Ｆａｂ’フラグメント」は、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメイン、ならびにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間の領域も含有し、それにより、２つのＦａｂ’フラグメントの２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合を形成して、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成することができるようにする、１つの軽鎖と１つの重鎖の一部とを含有する。「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間の定常領域の一部を含有する２つの軽鎖と２つの重鎖とを含有しており、それにより２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、２つの重鎖間のジスルフィド結合によって結合している２つのＦａｂ’フラグメントから構成される。
【００８３】
Ｆａｂ／ｃフラグメントは、Ｆｃ決定基およびＦａｂ決定基の両方を含有しており、「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖フラグメントを含有する。２つの重鎖フラグメントは、２つ以上のジスルフィド結合とＣＨ３ドメインの疎水性相互作用とによって結合している。
【００８４】
「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠いている。「一本鎖Ｆｖ」（「ｓｃＦｖ」とも略される）は、本発明の文脈において、抗体のＶＨドメインよびＶＬドメインを有する抗体フラグメントであり、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。概して、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖによって抗原結合のための所望の構造を形成することができるＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含む。一本鎖抗体の産生について説明されている技術は、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．１１３（１９９４），２６９−３１５において説明されている。
【００８５】
「キメラ抗体」という用語は、ヒトまたは非ヒト種の可変領域が、ヒトまたは非ヒト（例えば、マウス、ウマ、ウサギ、イヌ、ウシ、ニワトリ）のいずれかの別の種からの抗体領域（例えば、定常領域）に融合したまたはキメラ化したものを含む抗体を指す。
【００８６】
先に記載したように、「抗体」という用語はまた、抗体が、特定のアミノ酸配列によって本明細書に定義するドメインに加えて、組換え生成したコンストラクトの単離および／または調製のための追加のドメイン（複数可）を含む、抗体融合タンパク質などの抗体コンストラクトも包含する。
【００８７】
抗体は、それが組換え抗体、例えば組換えウサギ抗体、またはヘテロハイブリッド抗体でありながら、本発明で開示および定義されるＣＤＲを含むように作製することができる。
【００８８】
「組換え抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されたすべての抗体を含む。組換え抗体は、例えば、Ｂ細胞ＰＣＲによって得られた抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、宿主細胞内へトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを包含するいずれかの他の手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体である。Ｂ細胞ＰＣＲによって作製された組換えウサギ抗体は、ウサギ生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域（存在する場合）とを有している。すなわち、Ｂ細胞ＰＣＲの直接の結果は、抗体の結合関連フラグメントであり、当業者は、例えば、全長抗体、キメラ抗体と解釈されるものはどんなものであれ、または所望される／必要とされる「抗体」はどんなものであれ、何の問題もない。
【００８９】
１つのモノクローナル抗体であるＭＡＢ  ６Ｃ６は、免疫検定法を介してタンパク質レベルでＴＫ−１を測定するための非常に魅力的なツールであることがわかっている。ＭＡＢ  ６Ｃ６は、配列番号３の重鎖可変ドメインと配列番号４の軽鎖可変ドメインとを特徴とする。先に記載したように、一実施形態では、例えば、実施例の節において示されるように、ＴＫ−１レベルの測定のための免疫検定法において採用される抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３の可変重鎖（ｖＨＣ）と配列番号４の可変軽鎖（ｖＬＣ）とを含む抗体と同じエピトープに結合する。
【００９０】
配列番号３の可変重鎖（ｖＨＣ）と配列番号４の可変軽鎖（ｖＬＣ）とを含む抗体と同じエピトープに結合するいずれかのモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＴＫ−１の測定のための免疫検定法において採用されることができる。このような抗体、および同じ結合特性を有するいずれかの抗体は、例えば、所与の特定の抗体の変異体であることができ、例えば、アミノ酸置換を含むことができるか、あるいは、異なるｖＨＣまたは異なるｖＬＣ、あるいはその両方を有することができる。
【００９１】
本発明に従った「置換」という用語は、アミノ酸を別のアミノ酸と置き換えることを指す。したがって、アミノ酸の総数は同じままである。ある特定の位置でのアミノ酸の欠失および異なる位置での１つ（または複数）のアミノ酸の導入は、「置換」という用語に明示的に包含されるものではない。本発明に従った置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であってよい。「保存的アミノ酸置換」という用語は当技術分野で周知であり、アミノ酸の、類似の構造特性および／または化学特性を有する異なるアミノ酸との置き換えを指す。このような類似性には、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質における類似性を含む。次の基の１つのうちのあるアミノ酸が、同じ基の別のアミノ酸によって置換された場合、保存的アミノ酸置換である。非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ、極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ、正に帯電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ、負に帯電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【００９２】
抗体の「結合親和性」は、次式により、標的抗原上のエピトープと抗体の結合部位との間の相互作用の強度を測定する。
ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ
式中、
ＫＤ＝解離平衡定数［Ｍ］
ｋｄ＝解離速度定数［ｓ−１］
ｋａ＝会合速度定数［Ｍ−１・ｓ−１］
【００９３】
抗体の結合親和性についてのさらに関連するパラメータは次のとおりである。
ｔ／２＝解離複合体半減期＝ｌｎ２／ｋｄ／６０［分］
Ｒｍａｘ＝分析物の最大応答値［ＲＵ］
ＭＲ：モル比＝分析物の最大応答比（Ｒｍａｘ）
【００９４】
一実施形態では、ＰＩを決定するためのＴＫ−１レベルの免疫学的検出に使用されるｈＴＫ−１に対するモノクローナル抗体は、３７℃で１０分以上のｔ／２解離定数でｈＴＫ−１に結合する。
【００９５】
ｈＴＫ−１上の同じエピトープに結合する抗体は、配列番号３の重鎖可変ドメインと配列番号４の軽鎖可変ドメインとを有する抗体と、ｈＴＫ−１への結合について競合する抗体である。
【００９６】
このような競合抗体は、モノクローナルウサギ抗体ＭＡＢ  ６Ｃ６、すなわち、標準的なｈＴＫ−１結合アッセイにおいて配列番号３の重鎖可変ドメインと配列番号４の軽鎖可変ドメインとを含む抗体と競合する能力に基づいて同定することができる。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ分析、ＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリーを使用して、配列番号３の重鎖可変ドメインと配列番号４の軽鎖可変ドメインとを有するモノクローナル抗体またはその結合フラグメントとの競合を実証することができる。
【００９７】
モノクローナルウサギ抗体ＭＡＢ  ６Ｃ６のヒトＴＫ−１への結合を阻害する検査抗体の能力は、モノクローナルウサギ抗体ＭＡＢ  ６Ｃ６とｈＴＫ−１上での同じエピトープへの結合についてモノクローナルウサギ抗体ＭＡＢ  ６Ｃ６と競合することができ、したがって、該エピトープに結合することを実証している。
【００９８】
記載したように、いくつかの異なる競合アッセイを使用して、配列番号３の重鎖可変ドメインと配列番号４の軽鎖可変ドメインとを有するその結合フラグメントについてウサギモノクローナル抗体ＭＡＢ  ６Ｃ６と競合する抗体を同定することができる。
【００９９】
例示的な競合アッセイでは、固定したｈＴＫ−１を、ｈＴＫ−１に結合する第１の標識抗体（例えば、抗ｈＴＫ−１モノクローナル抗体または配列番号３の重鎖可変ドメインと配列番号４の軽鎖可変ドメインとを有するその結合フラグメント）と、ｈＴＫ−１への結合について第１の抗体と競合する能力について検査されている第２の非標識抗体とを含む溶液中でインキュベートする。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在し得る。対照として、固定したｈＴＫ−１を、第１の標識抗体を含むが第２の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートする。ｈＴＫ−１への第１の抗体の結合を許容する条件下でのインキュベーション後に、結合していない過剰な抗体を除去し、固定したｈＴＫ−１と会合した標識の量を測定する。固定したｈＴＫ−１と関係する標識の量が、対照試料と比較して検査試料中で実質的に低減した場合、そのことは、第２の抗体がｈＴＫ−１への結合について第１の抗体と競合していることを示す。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８）を参照されたい。
【０１００】
抗体、例えば抗ｈＴＫ−１抗体の結合特性は、Ｂｉａｃｏｒｅ技術が同義語となった表面プラズモン共鳴分光法のようなリアルタイムのバイオセンサー系分子相互作用測定を介して最も良好に決定される。Ｂｉａｃｏｒｅシステムでは、抗体を同じエピトープへの競合的結合について（すなわち、同一のエピトープまたは重複するエピトープへの結合について）分析することもできる。実験の詳細を実施例３に与える。一実施形態では、本明細書で同定される立体配座依存性エピトープに結合させるための抗体を特徴付けるための競合実験は、実施例の節において説明されるように、ＢＩＡｃｏｒｅ機で行われる。
【０１０１】
従来技術では、通常、血清または血漿の試料は、四量体でかつ酵素として非常に活性のある形態のｈＴＫ−１を生成するために前処理される。試料の前処理およびこのような前処理された試料からのｈＴＫ−１の測定は、非常に魅力的な方法であり、この方法により、例えば、ｈＴＫ−１酵素活性との非常に良い相関を達成することができる。
【０１０２】
適切な前処理試薬の選択は、完全に当業者の能力の範囲内である。このような前処理試薬は、オリゴマーのｈＴＫ−１を四量体のｈＴＫ−１に変換するために、少なくとも還元剤を含むであろう。説明されているように、例えば、Ｓｈａｒｉｆ  ｅｔ  ａｌ，（ＢＭＣ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１２），１３：１２）によると、ゲル濾過実験を介して、還元剤が有効であったかどうか、およびｈＴＫ−１が、処理後に、主に四量体として存在するかどうかを評価するのは容易である。当業者にとって、いくつかの異なる還元試薬、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、またはジチオブチルアミン（ＤＴＢＡ）が危機に瀕している。加えて、前処理試薬の濃度は、適切なインキュベーション時間後または希釈ステップ後のいずれかで、ｈＴＫ−１タンパク質を測定するのに使用される抗体に負の影響を及ぼさないように選択される。ジチオブチルアミン（ＤＴＢＡ）を還元剤として使用する場合、試料前処理ステップ（試料と前処理試薬との混合物）の適切な終濃度は、５ｍＭの範囲内である。前希釈、および／もしくはＤＴＴを遮断する薬剤の添加後、ならびに／または一次抗体を含む緩衝液を用いて希釈することにより、酸化形態のＤＴＴの濃度は、好ましくは１．５ｍＭ以下である。このように、使用される免疫学的試薬のいずれにも還元剤の影響はない。
【０１０３】
先に説明したように、ＡＴＰは、ｈＴＫ−１の四量体形態を安定化する。ＡＴＰの後者の機能は、例えば、前処理緩衝液に対する魅力的な助剤にする。一実施形態では、前処理緩衝液は、先に考察したような還元剤とＡＴＰとを含む。試料の前処理ステップにおけるＡＴＰの濃度は、１．２５ｍＭを下回らないものとする。前処理ステップにおけるＡＴＰ濃度についての適切な選択は、２ｍＭ〜２０ｍＭの範囲になるであろう。
【０１０４】
与えられた実施例から明らかなように、ＴＫ−１のレベルについての値は、ＤＬＢＣＬ患者についての予後指標の決定に非常に有用である。一実施形態では、本開示は、ＤＬＢＣＬ患者の予後指標の決定におけるＴＫ−１のレベルについての値の使用に関する。
【０１０５】
一実施形態では、本開示は、先に詳細に説明した３つのＰＩのいずれかの標準的なパラメータ（構成要素）と組み合わされたチミジンキナーゼ１のレベルについての値を含む、ＤＬＢＣＬについての予後指標（ＰＩ）に関する。
【０１０６】
一実施形態では、本発明は、該予後指標を決定する際に、ＤＬＢＣＬ患者についての予後指標の他の標準的なパラメータと組み合わせた、ＴＫ−１のレベルについての値の使用に関する。一実施形態では、本開示は、ＤＬＢＣＬ患者についての予後指標の決定におけるＴＫ−１の使用に関するものであり、ＴＫ−１のレベルについての値は、ＩＰＩ、年齢調整ＩＰＩ、Ｒ−ＩＰＩ、またはＮＣＣＮ−ＩＰＩにおいて使用される他のパラメータと組み合わされる。一実施形態では、本開示は、ＤＬＢＣＬ患者についての予後指標の決定におけるＴＫ−１の使用に関するものであり、ＴＫ−１のレベルについての値は、Ｒ−ＩＰＩ、またはＮＣＣＮ−ＩＰＩにおいて使用される他のパラメータと組み合わされる。
【０１０７】
一実施形態では、ＴＫ−１のレベルについての値は、ＴＫ−１のレベルについての値が、このようなＰＩにおけるＬＤＨのレベルについての値を置換するために使用されることを条件として使用される。
【０１０８】
いかなる患者についても、特に最近ＤＬＢＣＬと診断された患者については、ＴＫ−１を測定し、あらかじめ定義されたカットオフ値と比較し得る。新たに診断された患者についての測定値が、あらかじめ規定されたカットオフ値を上回る場合、該患者は、より高い危険スコアを有し、好ましくない疾患転帰を経験する可能性が高いと見なされるであろう。
【０１０９】
一実施形態では、本開示は、チミジンキナーゼ１のレベルについての値を含む、ＤＬＢＣＬについての予後指標（ＰＩ）に関する。
【０１１０】
一実施形態では、本開示は、チミジンキナーゼ１のレベルについての値を含むＤＬＢＣＬについての予後指標（ＰＩ）に関するものであり、ここで、該ＰＩは、ＩＰＩ、年齢調整済みＩＰＩ、Ｒ−ＩＰＩ、またはＮＣＣＮ−ＩＰＩから選択される。一実施形態では、本開示は、チミジンキナーゼ１のレベルについての値を含むＤＬＢＣＬの予後指標（ＰＩ）に関するものであり、ここで、該ＰＩは、Ｒ−ＩＰＩ、またはＮＣＣＮ−ＩＰＩから選択される。
【０１１１】
これらおよび他の実施形態は、本発明の明細書および実施例によって開示され、包含される。本発明に従って採用されるべき方法、使用、および化合物のいずれか１つに関するさらなる文献は、例えば、電子デバイスを使用して、公共の図書館およびデータベースから検索することができる。例えば、インターネット上で利用可能な公共データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」は、例えば、ワールドワイドウェブのｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌで利用することができる。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／、ｆｉｎｉ．ｃｈ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ，ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／など、ワールドワイドウェブにおいて利用可能なさらなるデータベースおよびアドレスは、当業者に公知でありまた、ｌｙｃｏｓ．ｃｏｍの下でワールドワイドウェブにおけるアドレスを用いて入手することもできる。
【０１１２】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含む特許明細書が優先される。
【０１１３】
本明細書で提供されるすべてのアミノ酸配列は、当技術分野で慣習的に行われるように、最もＮ末端の残基で始まり、最もＣ末端の残基で終わり（Ｎ→Ｃ）、本発明のいたるところでアミノ酸を同定するために使用される１文字または３文字のコード略語は、アミノ酸について一般的に使用されるものに対応する。
【０１１４】
以下の実施形態、および本明細書に説明されているその他の実施形態が企図されている。本発明は、実施形態の一覧表によって制限されることを意図しておらず、本明細書のいずれかの部分によって適切に支持されるいずれかの実施形態は、本出願において、またはその後の訴追もしくは継続／分割実施中のいずれかにおいて請求の対象となる。
【０１１５】
１．びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）患者の予後指標（ＰＩ）（危険スコアまたはＰＩスコアとも呼ばれる）を決定する方法の第１の実施形態であって、該方法は、
ａ）少なくとも次のパラメータ、すなわち
ｉ）節外性疾患の状態、ｉｉ）Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期、およびｉｉｉ）チミジンキナーゼ１のレベル
を決定することであって、
節外性疾患の非存在を０点の値とし、節外性疾患の存在を１点の値とし、
ＩまたはＩＩのＡｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期を０点の値とし、ＩＩＩまたはＩＶのＡｎｎ  Ａｒｂｏｒ病期を１点の値とし、かつ
カットオフ以下のチミジンキナーゼのレベルを０点の値とし、カットオフを上回るチミジンキナーゼのレベルを少なくとも１点の値とする、決定することと、
ｂ）ＰＩの決定において、ｉ）、ｉｉ）、およびｉｉｉ）に対する値を合計することと
を含む方法に関する。
【０１１６】
２．チミジンキナーゼカットオフ値レベルが、健常個体において決定されるようなＴＫ−１レベルの平均値の４倍に設定され、カットオフ以下のチミジンキナーゼレベルを０点の値とし、かつカットオフ値を上回るいかなるＴＫ−１レベルも１点の値とする、実施形態１の方法。
【０１１７】
３．チミジンキナーゼカットオフレベルが、健常個体において決定されるようなＴＫ−１レベルの平均値の４倍に設定され、低いチミジンキナーゼレベル、すなわちカットオフ以下のＴＫ−１のレベルを０点の値とし、中間チミジンキナーゼレベル、すなわちカットオフを上回りかつ健常個体において決定されるような平均値の２０倍に相当する値以下のＴＫ−１のレベルを１点の値とし、かつ高チミジンキナーゼレベル、すなわち、健常個体において決定されるような平均値の２０倍を超えるＴＫ−１のレベルを２点の値とする、実施形態１の方法。
【０１１８】
４．ＴＫ−１についてのタンパク質レベルのカットオフが、ＴＫ−１酵素活性における１８Ｕ／ｌと同等であり、かつこれを含む、実施形態１の方法。
【０１１９】
５．タンパク質レベルのカットオフが１８Ｕ／ｌと同等であり、かつこれを含んでおり、また１８Ｕ／ｌを上回り、かつ８８Ｕ／ｌ以下のＴＫ−１のレベルを１点の値とし、また８８Ｕ／ｌを上回るＴＫ−１のレベルを２点の値とする、実施形態１の方法。
【０１２０】
６．年齢というパラメータをさらに含み、ＰＩの決定において、年齢がカットオフ値を下回る場合、値は０点であり、年齢がカットオフ値を上回る場合、値は１点である、実施形態１〜５の方法。
【０１２１】
７．ＰＩの決定において、年齢が６０以下の場合、値が０点であり、年齢が６０を超える場合、値が１点である、実施形態６に記載の方法。
【０１２２】
８．ＥＣＯＧパフォーマンスステータスというパラメータをさらに含み、ＰＩの決定において、ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが１以下の場合、値が０点であり、ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが２以上の場合、値が１点である、実施形態１〜５に記載の方法。
【０１２３】
９．年齢というパラメータおよびＥＣＯＧパフォーマンスステータスというパラメータをさらに含み、ＰＩの決定において、年齢が６０以下の場合、値が０点であり、年齢が６０を超える場合、値が１点であり、ＰＩの決定において、ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが１以下の場合、値が０点であり、ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが２以上の場合、値が１点である、実施形態１〜５に記載の方法。
【０１２４】
１０．年齢というパラメータおよびＥＣＯＧパフォーマンスステータスというパラメータをさらに含み、ＰＩの決定において、年齢が４０以下の場合、値が０点であり、年齢が４０を超えかつ６０以下の場合、値が１点であり、年齢が６０を超えかつ７５以下の場合、値が２点であり、年齢が７５を超える場合、値が３点であり、かつＰＩの決定において、ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが１以下の場合、ＰＩの決定において値が０点であり、ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが２以上の場合、値が１点である、実施形態１〜５に記載の方法。
【０１２５】
１１．ＤＬＢＣＬ患者についての予後指標の決定におけるＴＫ−１のレベルについての値の使用である、実施形態。
【０１２６】
１２．ＴＫ−１のレベルについての値が、ＩＰＩ、年齢調整されたＩＰＩ、Ｒ−ＩＰＩ、またはＮＣＣＮ−ＩＰＩにおいて使用されるようなその他のパラメータと組み合わされる、実施形態１１による使用。
【０１２７】
１３．ＴＫ−１のレベルの値が、このようなＰＩにおけるＬＤＨのレベルについての値を置換するために使用されることを条件とする、実施形態１１または１２に記載の使用。
【０１２８】
１４．チミジンキナーゼ１のレベルについての値を含むＤＬＢＣＬについての予後指標（ＰＩ）である、実施形態。
【０１２９】
１５．該ＰＩが、ＩＰＩ、年齢調整されたＩＰＩ、Ｒ−ＩＰＩ、またはＮＣＣＮ−ＩＰＩから選択される、実施形態１４の予後指標（ＰＩ）。
【０１３０】
本明細書、特に特許請求の範囲において特徴付けられる実施形態に関して、従属請求項において言及される各実施形態は、該従属請求項が依存する各請求項（独立または従属）の各実施形態と組み合わされることが企図される。例えば、３つの代替案Ａ、ＢおよびＣを列挙する独立請求項１、３つの代替案Ｄ、ＥおよびＦを列挙する従属請求項２、ならびに請求項１および２に依存し、３つの代替案Ｇ、ＨおよびＩを列挙する請求項３の場合、本明細書は、別段の具体的な記載がない限り、組み合わせＡ、Ｄ、Ｇ；Ａ、Ｄ、Ｈ；Ａ、Ｄ、Ｉ；Ａ、Ｅ、Ｇ；Ａ、Ｅ、Ｈ；Ａ、Ｅ、Ｉ；Ａ、Ｆ、Ｇ；Ａ、Ｆ、Ｈ；Ａ、Ｆ、Ｉ；Ｂ、Ｄ、Ｇ；Ｂ、Ｄ、Ｈ；Ｂ、Ｄ、Ｉ；Ｂ、Ｅ、Ｇ；Ｂ、Ｅ、Ｈ；Ｂ、Ｅ、Ｉ；Ｂ、Ｆ、Ｇ；Ｂ、Ｆ、Ｈ；Ｂ、Ｆ、Ｉ；Ｃ、Ｄ、Ｇ；Ｃ、Ｄ、Ｈ；Ｃ、Ｄ、Ｉ；Ｃ、Ｅ、Ｇ；Ｃ、Ｅ、Ｈ；Ｃ、Ｅ、Ｉ；Ｃ、Ｆ、Ｇ；Ｃ、Ｆ、Ｈ；Ｃ、Ｆ、Ｉに対応する実施形態を明確に開示していることは理解されたい。
【０１３１】
同様に、また、独立請求項および／または従属請求項が代替案を列挙していない場合、従属請求項が複数の先行請求項を参照している場合、それによって網羅される主題のいずれかの組み合わせが明示的に開示されていると見なされることは理解される。例えば、独立請求項１、請求項１を参照する従属請求項２、および請求項２および１の両方を参照する従属請求項３の場合、請求項３および１の主題の組み合わせが、請求項３、２および１の主題の組み合わせと同様に、明確かつ明瞭に開示されていることが後に続く。請求項１〜３のいずれか１項を指すさらなる従属請求項４が存在する場合、請求項４および１、請求項４、２および１、請求項４、３および１、ならびに請求項４、３、２および１の主題の組み合わせは、明確かつ明瞭に開示されていることが後に続く。
【０１３２】
先の考慮は、添付の特許請求全部に対して必要な変更を加えて適用される。非限定的な例を与えるために、請求項８、５、および１の組み合わせは、請求項構造の観点から明確かつ明瞭に想定されている。同じことが、例えば、請求項８、７および２などの組み合わせに当てはまる。
【実施例】
【０１３３】
（実施例）
以下の実施例は、本発明を説明する。
【０１３４】
実施例１：材料および一般的な方法
タンパク質化学および標識技術
標準的なタンパク質化学および標識技術は、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１３）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓにおいて提供されている。
【０１３５】
生物情報学
生物情報学の方法は、例えば、Ｋｅｉｔｈ  Ｊ．Ｍ．（編）“Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ”Ｖｏｌ．ＩおよびＶｏｌ．ＩＩ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１５２５およびＶｏｌ．１５２６（２０１７）Ｓｐｒｉｎｇｅｒにおいて、ならびにＭａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．Ｒ．＆Ａｌｌｅｎ，Ｊ．“Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”ｉｎ：Ｄｕｂｅｌ  Ｓ．＆Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  Ｊ．Ｍ．（編）“Ｅｌａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ（２０１４）において提供されている。
【０１３６】
電気化学発光免疫検定法
免疫検定法および関連する方法は、例えば、Ｗｉｌｄ  Ｄ．（編）“Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１３）Ｅｌｓｅｖｉｅｒにおいて提供されている。電気化学発光標識としてのルテニウム錯体は、例えば、Ｓｔａｆｆｉｌａｎｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４２（２００３）７７８９−７７９８において提供されている。通常、電気化学発光（ＥＣＬ）系免疫検定法の性能について、Ｅｌｅｃｓｙｓ  ２０１０分析装置または後継システムを使用し、例えば、Ｅ１７０、コーバスｅ６０１モジュール、コーバスｅ６０２モジュール、コーバスｅ８０１モジュールおよびコーバスｅ４１１などのＲｏｃｈｅ分析装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｇｅｒｍａｎｙ）、ならびにこれらの分析装置に指定されるＲｏｃｈｅ  Ｅｌｅｃｓｙｓアッセイとし、特に明記されていない場合、標準条件下で各々使用した。
【０１３７】
（実施例２）：抗ｈＴＫ−１抗体
ｈＴＫ−１、クローン６Ｃ６、重鎖：（配列番号３）
ＭＥＴＧＬＲＷＬＬＬＶＡＶＬＫＧＶＱＣＱＥＱＬＥＥＳＧＧＤＬＶＫＰＥＧＳＬＴＬＴＣＴＡＳＲＦＳＦＳＳＳＹＷＩＣＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＡＣＩＹＡＧＤＳＧＳＳＹＹＡＳＷＡＫＧＲＦＴＶＳＫＴＳＳＴＴＶＴＬＱＴＴＳＬＴＡＡＤＴＡＴＹＦＣＡＲＡＳＶＧＡＡＹＤＹＦＡＬＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧ
【０１３８】
ｈＴＫ−１、クローン６Ｃ６、軽鎖：（配列番号４）
ＭＤＴＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣＡＬＶＭＴＱＴＰＡＳＶＥＡＡＭＧＧＴＶＴＩＫＣＱＡＳＥＤＶＳＳＨＬＡＷＹＱＱＲＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＧＡＳＤＬＡＳＧＶＰＳＲＦＴＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＡＩＳＤＬＥＣＡＤＡＡＴＹＹＣＱＧＹＹＹＩＳＤＳＰＹＶＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡＤＱＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＮＲＧＤＣ
【０１３９】
ｈＴＫ−１、クローン４Ｈ４、重鎖：（配列番号７）
ＭＥＴＧＬＲＷＬＬＬＶＡＶＬＫＧＶＱＣＱＳＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＰＥＧＳＬＴＬＴＣＴＡＳＧＦＳＦＳＳＧＹＤＭＣＷＶＲＱＴＰＧＫＧＬＥＷＩＡＣＩＳＶＤＳＤＧＶＴＹＹＡＳＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＳＴＴＶＴＬＱＭＴＳＬＴＡＡＤＴＡＴＹＦＣＡＲＧＹＥＳＳＳＧＶＹＩＰＹＦＴＬＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰ  ＶＴＶＴＷＮ  ＳＧ
【０１４０】
ｈＴＫ−１、クローン４Ｈ４、軽鎖：（配列番号８）
ＭＤＭＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣＡＤＩＶＬＴＱＴＰＡＳＶＥＡＡＶＧＧＴＶＴＩＫＣＱＡＳＱＳＩＹＳＹＬＡＷＹＱＨＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＫＡＳＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＥＹＴＬＴＩＳＤＬＥＣＡＤＡＡＴＹＹＣＱＨＹＹＹＳＳＴＳＧＧＧＶＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡＤＱＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＮＲＧＤＣ
【０１４１】
ｈＴＫ−１、クローン２３Ｃ１１、重鎖：（配列番号９）。
ＭＥＴＧＬＲＷＬＬＬＶＡＶＬＫＧＶＱＣＱＳＬＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＡＳＧＦＳＬＳＮＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＩＩＹＧＤＤＮＴＹＣＡＮＷＴＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＴＴＶＤＬＴＩＴＳＰＴＴＳＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＧＰＤＹＩＡＡＫＭＤＩＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＬＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰ  ＶＴＶＴＷＮＳＧ
【０１４２】
ｈＴＫ−１、クローン２３Ｃ１１、軽鎖：（配列番号１０）
ＭＤＴＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣＤＶＶＭＴＱＴＰＡＳＶＥＡＡＶＧＧＴＶＴＩＫＣＱＡＳＱＳＩＳＧＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＱＲＰＫＬＬＩＹＲＡＳＴＬＥＳＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＤＬＥＣＡＤＡＡＴＹＹＣＱＣＴＹＧＳＳＴＦＳＳＹＧＮＡＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡＤＱＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＮＲＧＤＣ
【０１４３】
明らかなように、完全長の免疫グロブリンまたはそのいずれかの結合フラグメント（所望の場合／必要な場合）は、先に開示した配列に基づいて、当業者によって容易に解釈することができる。
【０１４４】
実施例３：：エピトープの特性評価
実施例２に説明したように、免疫検定法の開発において有用であることが必要とされる必要な結合特性を呈する示す４つの異なるモノクローナル抗体を生成することができた。
【０１４５】
新たに生成された抗体が結合するエピトープを特徴付ける第１の試行では、ＰｅｐＳｃａｎ分析を実行した。この分析のために、各々が１アミノ酸（１〜１５、２〜１６など）だけ移行し、ｈＴＫ−１の配列全体（配列番号１）にまたがる、各々１５アミノ酸からなる合成ペプチドを合成した。これらのＰｅｐＳｃａｎペプチドを顕微鏡のスライドの上にスポットした。非特異的結合のためのブロッキングの後、さまざまなＭＡＢの細胞培養上清を顕微鏡スライド上でインキュベートした。通常の方法により、結合していないＭＡＢを洗い流し、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧの使用によって、結合したＭＡＢを検出した。
【０１４６】
実施例２の方法によって得られた４つのＭＡＢ（抗体４Ｈ１１）のうちの１つだけが、線状エピトープと反応した。示され得るように、この抗体によって結合したエピトープは、ｈＴＫ−１のアミノ酸残基２１１〜２３０にまたがる配列（配列番号６）に含まれる。
【０１４７】
ｈＴＫ−１（配列番号２）のアミノ酸１９４〜２２５からなるポリペプチドに対応する合成ペプチドと反応するポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、先行技術において公知であり、例えば、ＷＯ２０１５／０９４１０６を参照されたい。３つのＭＡＢ、すなわち４Ｈ４、６Ｃ６、および２３０１はそれぞれ、ｈＴＫ−１（配列番号２）のアミノ酸１９４〜２２５からなるポリペプチドに結合せず、検査したＰｅｐＳｃａｎペプチドのいずれにも有意な結合を示さなかった。このことは、これら３つのＭＡＢがすべて、ｈＴＫ−１の立体配座依存性エピトープに結合することを示している。これら３つのＭＡＢは当初から、さらなるアッセイ開発に非常に有望であるように見えたので、これら３つのＭＡＢが結合するエピトープに関する知識を深めるために追加の努力が払われた。
【０１４８】
競合実験によるエピトープの特性評価を、２５℃でのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉａｃｏｒｅ  ４０００において実行した。Ｂｉａｃｏｒｅビオチン捕捉キット、シリーズＳセンサー（カタログ番号２８−９２０２−３４）を機器に据え付け、製造元の説明書により、流体力学的にアドレス指定し、事前調整した。システム緩衝液は、ＨＢＳ−Ｎ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）とした。試料緩衝液は、システム緩衝液とした。製造元ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅが提供するビオチン捕捉試薬をシステム緩衝液中で１：５０希釈し、フローセル１、２、３および４に１０μｌ／分で６０秒間注入して、スポット１、２および４、５を処理した。スポット３は、基準として機能した。１０ｎＭのビオチン化一次抗体を３０μｌ／分で１２０秒間の接触時間で注入し、４つのフローセルすべてにおいてスポット１およびスポット５を処理した。スポット２およびスポット４は対照として機能した。１０ｎＭのヒト組換えチミジンキナーゼ１（ｈＴＫ−１、Ｒｏｃｈｅ、１１４ｋＤａ、四量体）を３０μｌ／分ですべてのフローセルに１８０秒間の接触時間注入して、スポット１、２および４、５を処理した。一次抗体の残りの接近可能なエピトープをブロックするために、１００ｎＭの非ビオチン化一次抗体を再び３０μｌ／分で注入して、すべてのフローセルのスポット１、２および４、５を１８０秒間処理した。１００ｎＭの二次抗体を３０μｌ／分で１８０秒間の接触時間ですべてのフローセル内に注入し、スポット１、２および４，５を処理した。最後に、センサー表面上に形成された複合体を、製造元のＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅが提供する再生溶液を使用して、すべてのフローセルおよびすべてのスポットで１２０秒間の接触時間の再生ステップによって完全に除去した。
【０１４９】
このようにして、４つの組換えモノクローナルウサギＩｇＧ抗体について、ｈＴＫ−１エピトープの接近可能性特性を調べた。抗体４Ｈ１１（ｈＴＫ−１およびウサギＭＡＢ  ２３Ｃ１１、６Ｃ６および４Ｈ４のアミノ酸２１１〜２３０（配列番号６）に含まれるエピトープに結合する抗体）。
【０１５０】
各試料注入の前後に、レポートポイントを設定した。応答ユニット（ＲＵ）におけるレポートポイントの読み出しを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ第１．１版ソフトウェアを用いることによって行った。
【０１５１】
最初のビオチン化一次抗体捕捉シグナル（ｂｉ−Ａｂ１、［ＲＵ］）に、非ビオチン化一次抗体（ブロックＡｂ１［ＲＵ］）の第２の結合応答シグナルを追加した。モル比エピトープ接近可能性ＭＲＥＡ＝Ａｂ２［ＲＵ］／（ｂｉ−Ａｂ１［ＲＵ］＋ブロックＡｂ１［ＲＵ］）を計算し、アッセイで使用したそれぞれの抗体のエピトープ接近可能性についての推定値として使用した。
【０１５２】
ｈＴＫ分析物の四量体状態を検証するために、式ＭＲ＝ｈＴＫ［ＲＵ］／ｂｉ−Ａｂ１［ＲＵ］×分子量ｂｉ−Ａｂ１（１５０ｋＤａ）／分子量ｈＴＫ（１１４ｋＤａ）を用いることによって、ビオチン化一次抗体の捕捉レベルに対するｈＴＫ結合シグナルから第２のモル比を計算した。
【０１５３】
例えば、抗体４Ｈ１１は、１：１の結合化学量論（＝モル比）抗体４Ｈ１１／ｈＴＫ−１  ＭＲを示した。このバイオセンサーアッセイでは、単一の四量体ｈＴＫ−１分子が単一の抗体４Ｈ１１分子に結合している。説明されている抗体のうち、ブロックＡｂとして使用すると、抗体４Ｈ１１のみが相同のｈＴＫ−１複合体形成を示す。それゆえ、サンドイッチアッセイは、抗体４Ｈ１１を２回使用する逐次アッセイプロトコルを使用することによって可能になるであろう。ウサギモノクローナル抗体ＭＡＢ  ２３Ｃ１１、６Ｃ６、および４Ｈ４については、相同複合体の形成は検出することができなかった。このことは、ＭＡＢ  ２３Ｃ１１、６Ｃ６、および４Ｈ４が、同じエピトープ領域に結合していることを意味する。抗体２３Ｃ１１、６Ｃ６および４Ｈ４は、二次抗体として抗体４Ｈ１１とサンドイッチを形成する。このアッセイによると、最高性能のサンドイッチ対とは、ビオチン化一次抗体としての６Ｃ６であり、抗体４Ｈ１１と複合体を形成し、モル比ＭＲＥＡ＝０．４を示し、これは、ｈＴＫ分析物で４０％のエピトープ接近可能性を意味する。
【０１５４】
以下に示す表から明らかなように、抗体４Ｈ１１（配列番号６に含まれるＣ末端線状エピトープに結合する）は、２３Ｃ１１、６Ｃ６および４Ｈ４と免疫複合体を形成することができる。一方、ウサギモノクローナル抗体ＭＡＢ  ２３Ｃ１１、６Ｃ６、および４Ｈ４が同じエピトープを共有していることは明らかである（以下の表３を参照されたい）。
【表３】
2021535392.tif 000004
【０１５５】
溶液中の分析物として組換えｈ−ＴＫ−１を使用した４つの抗ｈＴＫ−１抗体のサンドイッチ形成が示されている。表の０．０の値は、使用した一次および二次抗体が同じエピトープに結合することを示す。０．１以上の値は、中間のブロッキングステップにもかかわらず、サンドイッチ形成を示し、すなわち、研究した２つの抗体は、異なるエピトープに結合する。
【０１５６】
実施例４：Ｅｌｅｃｓｙｓ免疫検定法実験で使用するためのＭＡＢ複合体の生成
使用される手順は、当業者が精通している。それゆえ、実験の詳細を与えることは冗長であると見なされる。
【０１５７】
手短に言えば、免疫学的アッセイの捕捉側および検出側のための抗体複合体を得るために、次の手順／ステップを実施した。
【０１５８】
Ｂ細胞ＰＣＲにより作製した細胞（上述を参照されたい）から得られた細胞培養上清（そこに含まれる組換え抗体）を出発材料として使用した。
【０１５９】
組織培養上清中に含まれる組換え抗体を、プロテインＡに対するアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【０１６０】
捕捉抗体として使用される抗体を、ペプシンでＦ（ａｂ’）２フラグメントに開裂させ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントをアフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーとによってさらに精製した。次に、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントをＦａｂ’に還元し、チオール化学的性質を介して部位特異的にビオチン化することにより、モノビオチン化Ｆａｂ’フラグメントを得た。
【０１６１】
検出抗体として使用される抗体を、スルホ−ＢＰＲｕ  ＮＨＳエステル（＝当技術分野でルテナート（２−），ビス［［２，２’−ビピリジン］−４，４’−ジメタンスルホナト（２−）−κＮ１，κＮ１］［１−［４−（４’−メチル［２，２’−ビピリジン］−４−イル−κＮ１，κＮ１）−１−オキソブトキシ］−２，５−ピロリジンジオン］−，ナトリウム（１：２），（ＯＣ−６−３１）としても公知のＣＡＳ登録番号４８２６１８−４２−８）の使用によって、スルホ−ルテニウム（ＷＯ２００３／００２９７４）に化学的に結合させ、未結合の標識をサイズ除外クロマトグラフィーによって除去した。
【０１６２】
実施例５：試料およびｈＴＫ−１測定
５．１  試料
「白黒」パネルを調査した。一方では、５０人（一部の実験については４９しかなおも入手できなかった）の健常ドナーからの血清試料が、さまざまなアッセイにおいてｈＴＫ−１の定量に使用されている。もう一方では、ｈＴＫ−１は、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の患者からの４８の試料（一部の実験では４７しかなおも入手できなかった）において測定した。
【０１６３】
５．２  原型の電気化学発光免疫検定法
実施例３において説明されるように得られたモノクローナルウサギ抗体に基づいて、それぞれ実施例４に説明されるように精製および結合させ、いくつかの原型免疫検定法が確立されている。
【０１６４】
原型の電気化学発光免疫検定法の典型的なセットアップは、ビオチン化捕捉抗体（またはその抗原結合フラグメント）およびルテニウム複合体で標識された検出抗体（またはその抗原結合フラグメント）を使用する。
【０１６５】
ほとんどの場合、免疫検定法データは、従来の手順により、ビオチン化した従来のＦａｂ  ’フラグメントを使用して生成した。Ｒｏｃｈｅ製のｃｏｂａｓ（登録商標）Ｅ１７０分析装置でのサンドイッチアッセイフォーマットにおいて測定を実施した。ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｅ１７０分析装置におけるシグナル検出は、電気化学発光に基づいている。このサンドイッチアッセイでは、ビオチン結合体（すなわち、捕捉抗体）を、ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズの表面に固定する。検出抗体は、シグナル伝達部分として複合体化ルテニウムカチオンを有している。分析物の存在下で、発色性ルテニウム錯体を固相に架橋し、ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｅ１７０分析装置の測定セルに含まれる白金電極で励起後、６２０ｎｍで発光する。シグナル出力は、任意の光の単位である。
【０１６６】
測定は、例えば、ＨＥＫ細胞からの組換えｈＴＫ−１でスパイクした較正物質、および先に述べたヒト血清試料を使用して実施した。
【０１６７】
実験的ｈＴＫ−１アッセイは、次のように行った。２５μｌのヒト血清試料またはスパイクした較正物質、２５μｌの前処理試薬（１０ｍＭ  ＤＴＢＡを含む）を混合し、９分間インキュベートし、その後、６０μｌの捕捉抗体−ビオチン複合体および６０μｌの検出抗体ルテニウム標識複合体をさらに９分間一緒にインキュベートした後、３０μｌのストレプトアビジンでコーティングした常磁性微粒子を添加した。最終混合物をさらに９分間インキュベートした。その後、ｈＴＫ−１を通常通り検出した（すなわち、これらの実験において生成した電気化学発光シグナルを介して）。
【０１６８】
以下に、ビオチン化６Ｃ６（Ｆａｂ’−Ｂｉとして使用）とルテニル化４Ｈ１１（ＩｇＧとして使用）の組み合わせについて得られた結果を付与する。
【０１６９】
較正結果を、以下の表４に付与する。
【表４】
2021535392.tif 000005
【０１７０】
表４に、分析物としてさまざまな量の組換えｈＴＫ−１を使用した原型免疫検定法において得られたシグナルを与える。二重測定を実行した。
【０１７１】
箱ひげ図を計算し、受信者操作者特性（ＲＯＣ）を分析し、曲線下面積（ＡＵＣ）を決定した。原型免疫検定法については、ＡＵＣは０．９６５であった。ｈＴＫ−１の濃度の決定された箱ひげ図（ボックスプロット）およびＡＵＣの両方を図１に示す。
【０１７２】
５．３  ＤｉａＳｏｒｉｎＴＫ−１活性アッセイ
ＤｉａＳｏｒｉｎによって製造されたＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）チミジンキナーゼアッセイは、ヒト血清およびＥＤＴＡ血漿におけるＴＫを定量的に測定するための、間接的な修正された２段階の競合化学発光免疫検定法（ＣＬＩＡ）である。ＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）チミジンキナーゼアッセイは、５０の対照試料およびＤＬＢＣＬ患者からの４８の試料を使用して、製造元によって与えられた説明書により実行した。これは、試料中のＴＫがＡＺＴ（３’−アジド−３’−デオキシチミジン）をＡＺＴＭＰ（３’−アジド−３’−デオキシチミジンモノホスファート）に変換する最初の酵素反応を利用し、これに続いて、ＡＺＴＭＰの定量的測定のための競合免疫検定法を利用する。ＡＺＴＭＰに変換されたＡＺＴの量は、試料中に存在するＴＫの量の尺度である。アッセイでは、５０μＬの試料を１００μＬのアッセイ緩衝液１、２０μＬのアッセイ緩衝液２、および抗ＡＺＴＭＰポリクローナル抗体でコーティングした２０μＬの常磁性粒子とともにインキュベートした。ウサギ抗ヤギＩｇＧ、次に抗ＡＺＴＭＰヤギポリクローナルを固相にコーティングする。これを４０分間インキュベートした後、１００μＬのトレーサー（イソルミノール誘導体に結合したＡＺＴＭＰ類似体）を添加する。第１のインキュベーション中に、ＡＺＴＭＰは固相に結合する。第２のインキュベーションでは、トレーサー複合体は、溶液中のＡＺＴＭＰとの結合について競合する。２０分間のインキュベーション後、未結合の材料を洗浄サイクルで除去する。次に、出発試薬を添加し、フラッシュ化学発光反応を開始する。光信号は、光電子増倍管によって相対光単位（ＲＬＵ）として測定され、較正装置、対照、または試料中に存在するＴＫの濃度に比例する。
【０１７３】
箱ひげ図を計算し、受信者操作者特性（ＲＯＣ）を分析し、曲線下面積（ＡＵＣ）を決定した。ＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）チミジンキナーゼアッセイの場合、ＡＵＣは０．９５８であることがわかった。箱ひげ図（ボックスプロット）およびＡＵＣの両方を図２に示す。
【０１７４】
実施例６：活性アッセイ／免疫検定法を用いて測定されたＴＫー１値の比較
一方では、ＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）チミジンキナーゼアッセイ、もう一方では原型免疫検定法で得られた値を互いに比較した。一方のアッセイがチミジンキナーゼ活性を測定するのに対し、もう一方のアッセイが免疫反応性ｈＴＫ−１の量を測定することを考慮に入れると、２つの異なるアッセイ間に驚くほど高い相関（０．９５以上の範囲−使用される統計的方法に依存）が認められた。ｈＴＫ−１についてのこれらの異なるアッセイ間の良好な相関は、図３からも非常に明白である。
【０１７５】
実施例７：予後指標の鍵となる要素としてのＴＫ−１値の使用
７．１  分析的アプローチ
チミジンキナーゼ１（ＴＫ−１）の予後能力は、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）に罹患している患者を対象に実施された薬理学的ＭＡＩＮ試験の試料を用いて後向き評価を行い［Ｓｅｙｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４］、血清中のＴＫ−１濃度は、まだ利用可能な４０７のベースライン試料の各々について、実施例５．２における原型Ｂ）と呼ばれるアッセイを用いて測定した。この部分セット内での無増悪生存期間（ＰＦＳ）事象率は、全試験対象集団のＰＦＳと非常に類似していた（両方ともおよそ３１％）。
【０１７６】
すべての多変量モデルを公正に比較するために、本発明者らは、関連するすべてのデータ点（ＴＫ−１測定値およびすべての指標構成要素）を有する試料のみを含めるよう、データ部分セットを作成した。これにより、３７０の試料を含有する最終的な分析データセットが得られ、そのうち１１６は、Ｒ−ＣＨＯＰ処置の開始後３年以内にＰＦＳ事象呈した患者に由来した。事象のない経過観察期間が３年を超える試料数が少ないので、試料は３年の時点で打ち切られた。
【０１７７】
ＴＫ−１の予後値が、公知の臨床的および人口統計学的危険因子から独立しているかどうかを評価するために、それぞれの指標の危険構成要素とｌｏｇ２変換ＴＫ−１値とを含む３つの説明した予後指標の各々についてのＣｏｘ比例ハザードモデルを計算した。
【０１７８】
７．２  Ｒ−ＩＰＩおよびＮＣＣＮ−ＩＰＩへのＴＫ−１の寄与
ＰＦＳの予後についての既存の危険スコアを改善するＴＫ−１の能力を評価するために、指数構成要素をｌｏｇ２変換されたＴＫ−１値で拡張するか、またはＦＤＨ構成要素をｌｏｇ２  ＴＫ−１値と置き換えるかのいずれかを行った。拡張と置換の両方を、それぞれの危険構成要素を独立変数として含むＣｏｘ分割ハザードモデルを作成することと、元のモデル（Ｒ−ＩＰＩおよびＮＣＣＮ−ＩＰＩ）のｃ指標をＴＫ−１拡張モデルのｃ指標と比較することとによって実行した（それぞれＬＤＨ構成要素ありおよびなし）。それぞれの差のｐ値に関する有意性を、ブートストラップリサンプリングアプローチで評価した。
【０１７９】
ａ）Ｒ−ＩＰＩの共変量としてのＴＫ−１
Ｒ−ＩＰＩに対してＴＫ−１によって提供される寄与の統計分析の結果を、以下の表５に付与する。
【表５】
2021535392.tif 000006
【０１８０】
バイナリＲ−ＩＰＩ危険構成要素をＴＫ−１（ｌｏｇ２変換）と組み合わせたＣｏｘ比例ハザードモデルは、ＴＫ−１がモデルに予後情報を実質的に追加することを明確に示している。ハザード比（ＨＲ）はおよそ１．３であり、すべてのモデル構成要素の最小ｐ値は＜０．００１である（表５を参照されたい）。ハザード比は、ＴＫ−１の２倍増が、ＰＦＳ事象（すなわち、疾患進行または死亡）についての危険の１．３倍の増加と関係していると解釈することができる。
【０１８１】
三分されたＴＫ−１シナリオについて、ＴＫ−１濃度をまず３群（すなわち、低、中間および高レベル）に層別化した。最適なカットオフ値を、各群に少なくとも１０個の試料が存在することを確保しながら、対数順位統計を最大化すること（すなわち、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析における３つの生存曲線間の差を最大化すること）によって単変量設定で決定した。これにより決定される範囲は次のとおりである。
【表６】
2021535392.tif 000007
【０１８２】
Ｒｏｃｈｅ  Ｅｌｅｃｓｙｓ  ＴＫ−１濃度とＤｉａｓｏｒｉｎ  ＴＫ−１活性の測定値間の方法比較に基づいて、これらの範囲は、１ｎｇ／ｍｌのＴＫ−１（Ｒｏｃｈｅ）約２５Ｕ／ＬのＴＫ−１（Ｄｉａｓｏｒｉｎ）の関連性に基づいて、Ｕ／Ｌの点でさらに表すことができる。健常個体の平均活動は、カットオフ値についての相対参照として使用されるＤｉａｓｏｒｉｎによって４．３Ｕ／Ｌであると報告された。
【表７】
2021535392.tif 000008
【０１８３】
多変量Ｃｏｘモデルでは、三分されたＴＫ−１値は、中間対低および高対低のＴＫ−１レベルについてそれぞれ０．０１３および＜０．００１のｐ値で予後能力に大きく寄与している（表６を参照されたい）。対応するハザード比は、２．１１および５．４０であり、ＴＫ−１レベルが中間である患者は、ＴＫ−１が低い患者よりもＰＦＳ事象の危険がおよそ２．１倍高く、ＴＫ−１レベルが高い患者は５．４倍さえあることを意味する。
【表８】
2021535392.tif 000009
【０１８４】
ｂ）ＮＣＣＮ−ＩＰＩにおける共変量としてのＴＫ−１
ＮＣＣＮ−ＩＰＩに対してＴＫ−１によって提供される寄与の統計分析の結果を、以下の表７に付与する。
【表９】
2021535392.tif 000010
【０１８５】
２値化ＮＣＣＮ−ＩＰＩ危険構成要素をＴＫ−１（ｌｏｇ２変換）と組み合わせた多変量モデルはまた、ＴＫ−１の有意な追加の予後値も示している（ｐ値＝０．００９、表７を参照されたい）。ハザード比（ＨＲ）はおよそ１．２５であり、Ｒ−ＩＰＩモデルよりもわずかに小さいだけである。
【０１８６】
三分されたＴＫ−１によってＮＣＣＮ−ＩＰＩに提供した寄与の統計分析の結果を以下の表８に与える。
【表１０】
2021535392.tif 000011
【０１８７】
２値化ＮＣＣＮ−ＩＰＩ危険構成要素をＴＫ−１（三分法）と組み合わせたモデルは、ＴＫ−１の有意な追加の予後値を示している（中間対低：ｐ値＝０．０１１、高対低：ｐ値＜０．００１、表８を参照されたい）。対応するＨＲはそれぞれ２．１５および４．７２であり、またＲ−ＩＰＩの対応物と非常によく似ている。
【０１８８】
７．３  ＴＫ−１は、Ｒ−ＩＰＩおよびＮＣＣＮ−ＩＰＩの予後能力を改善する
危険モデルの予後能力の広く使用されている尺度はｃ指標であり、これは生存モデルにおけるＲＯＣ曲線アナログの下の面積（ＡＵＣ）と見なすことができる。表９は、調査された予後指標（Ｒ−ＩＰＩおよびＮＣＣＮ−ＩＰＩ）の計算されたｃ指標と、それぞれの２値化ＬＤＨ構成要素を除外した場合と除外していない場合のＴＫ−１拡張モデルのｃ指標を示している。ＴＫ−１を含めると、ＬＤＨの存在に関係なく、これらの指標が３．２％〜４％改善する（表９も参照されたい）。この改善は臨床的に関連があると見なすことができ、また、ほとんどの場合統計的に有意であるが、ｃ指標の有意な改善を示すことはできなかった（すなわち、ブートストラップ系の信頼区間には０が含まれておらず、但し、ＮＣＣＮ−ＩＰＩ対ＮＣＣＮ−ＩＰＩ＋ＴＫ−１（ｌｏｇ２）でＬＤＨなしおよびＫＰＩ対ＫＰＩ＋ＴＫ−１（ｌｏｇ２）でＬＤＨなしである（表１０を参照されたい））。これは、ＴＫ−１が調査された予後指標を改善するだけでなく、これらの指標におけるＬＤＨを置き換える可能性さえあることを明確に示している。
【表１１】
2021535392.tif 000012
【表１２】
2021535392.tif 000013
【０１８９】
表９および表１０にそれぞれ付与されているデータは、ＴＫ−１を既存の予後指標と組み合わせて使用して、ＤＬＢＣＬ患者のための疾患転帰を予測する際の臨床スコアを大幅に改善することができることを明確に示している。ＴＫ−１を含めることで、調査した各予後指標が改善された。
【０１９０】
表９および表１０からも明らかなように、ＴＫ−１は、これらの指標内でＬＤＨを置き換える可能性さえあり、これは、２つの予後指数（Ｒ−ＩＰＩおよびＫＰＩ）の場合、ＬＤＨを省略すればｃ値がわずかに良好になるためであり、ＮＣＣＮ−ＩＰＩの場合、ＬＤＨが含まれていなければわずかに悪化するに過ぎないからである。
【０１９１】
ＤＬＢＣＬに罹患していると診断された新たな患者の場合、特に処置を開始する前に、ＴＫ−１を測定し、あらかじめ規定されたカットオフ値と比較するものとする。新たな患者についての測定値が、あらかじめ規定されたカットオフ値を上回っている場合、その患者はより高い危険スコアを持ち、好ましくない疾患の転帰を経験する可能性が高いと見なされるであろう。
【図１】
2021535392.tif 000014
【図２】
2021535392.tif 000015
【図３】
2021535392.tif 000016
【配列表】
2021535392000001.app
【国際調査報告】
2021535392.tif 000017
2021535392.tif 000018