(57)【要約】  加齢性神経変性又は認知機能疾患の一方又は両方を診断、予防、及び治療するための方法及び系を提供する。リスクがある高齢の対象、軽度認知障害の対象、及び／又は病的神経変性を有する対象を認知機能低下から防護する、且つ／又はその認知機能低下の重症度を低下させる方法であって、ＣＤ８＋常在性メモリーＴ細胞のエフェクター分子の阻害剤であるＣＤ１０３阻害剤、及び／又は免疫寛容原性ワクチンを投与することを含む上記方法を提供する。加齢性神経変性になりやすい、又はなっている対象を特定するための方法であって、ＣＤ１０３＋常在性メモリーＴ細胞のレベル上昇を検出することを含む上記方法を提供する。ＣＤ１０３＋ＣＤ８＋常在性メモリーＴ細胞を収集及び定量するためのキットを提供する。【選択図】なし。
2021514361.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする対象における加齢性認知機能低下、軽度認知障害、病的神経変性、又はこれらの組合せを治療する、抑制する、重症度を低下させる、又は予防を促進するための方法であって、
分化抗原群（ＣＤ１０３）阻害剤、パーフォリン１阻害剤、及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）阻害剤のうちの１種又は複数種の治療有効量を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＣＤ１０３阻害剤が投与され、
前記ＣＤ１０３阻害剤が抗ＣＤ１０３抗体であり、且つ、クローンＢｅｒ−ＡＣＴＢに由来するＰＥ抗ヒトＣＤ１０３抗体、クローン２Ｇ５．１に由来するマウス抗ヒトＣＤ１０３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、２Ｇ５．１のヒト化抗体、ＯＸ−６２、ＯＸ−６２のヒト化抗体、クローン２Ｅ７由来の抗マウスＣＤ１０３モノクローナル抗体、２Ｅ７のヒト化抗体、又はパキシリンを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記パーフォリン１阻害剤が投与され、
前記パーフォリン１阻害剤が、ジアリールチオフェン又はＧＳＫ２１２６４５８を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＩＦＮγ阻害剤が投与され、
前記ＩＦＮγの阻害剤が、メソプラム又はロカグラミドを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記パーフォリン１阻害剤及び前記ＩＦＮγ阻害剤が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＤ１０３阻害剤、前記パーフォリン１阻害剤、及び前記ＩＦＮγ阻害剤が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記１種又は複数種の阻害剤が、ＣＤ８＋常在性メモリーＴ細胞（ＴＲＭ）又は前記細胞に由来するエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞を調節し、且つ、前記ＣＤ８＋ＴＲＭ又は前記エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞のアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）ペプチドへの結合又は反応を抑制する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＡＰＰペプチドへの結合又は反応の抑制が、脳における配列番号８のＡＰＰペプチドへの結合又は反応の抑制を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記対象が、５０歳以上、５５歳以上、６０歳以上、６５歳以上、又は７０歳以上の年齢のヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記１種又は複数種の阻害剤の投与前と比較して、又は前記１種若しくは複数種の阻害剤が投与されていない対照被検者と比較して、前記エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の活性が低下しており、且つ／又は前記ＣＤ８＋ＴＲＭが末梢系から脳への移動が減少している、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＤ１０３阻害剤、前記パーフォリン１阻害剤、及び前記インターフェロンγ（ＩＦＮγ）阻害剤が独立して、抗体、抗体の抗原結合断片、小分子、又は核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記病的神経変性が、多発性硬化症、パーキンソン病、及びアルツハイマー病のうちの１又は複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記加齢性認知機能低下又は前記軽度認知障害が、短期記憶又は長期記憶の喪失、集中力維持能力の低下、及び課題解決能力の低下のうちの１又は複数の症状を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象がヒト対象であり、
病的神経変性になりやすい、又は前記投与前に病的神経変性になっている前記ヒト対象を特定することをさらに含み、
ヒト対象の血液中のＣＤ１０３＋常在性メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８＋ＴＲＭ）の存在が、加齢性認知機能低下の症状の無い、より若齢の時の同じヒト対象から得られた値と比較して、又は加齢性認知機能低下の症状の無い１人の健康なヒト対象又は複数の健康なヒト対象のプールから得られた値と比較して、増加していることを検出することを含み、
前記病的神経変性が、パーキンソン病、多発性硬化症、又はアルツハイマー病を含み、
前記加齢性認知機能低下が、短期記憶又は長期記憶の喪失、集中力維持能力の低下、及び課題解決能力の低下のうちの１又は複数の症状を有する、
請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出する工程が、ＣＤ１０３＋ＣＤ８＋ＴＲＭにおけるＣＤ８Ａレベル及びＣＤ４４レベルの上昇を検出することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヒト対象が６５歳以上である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
必要とする対象における加齢性認知機能低下、又は多発性硬化症、パーキンソン病、若しくはアルツハイマー病を含む病的神経変性を治療する、抑制する、重症度を低下させる、又は予防を促進する方法であって、
治療有効量のワクチンを前記対象に投与することを含み、
前記ワクチンが、配列番号８、配列番号７、配列番号６、配列番号５、配列番号４、配列番号３、配列番号２、及びこれらの組合せからなる群より選択されるアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）ペプチド、又はＡＰＰを含む、
前記方法。
【請求項１８】
前記対象が、４０歳以上、５０歳以上、６０歳以上、又は７０歳以上の年齢のヒトである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
加齢性認知機能低下若しくは病的神経変性になりやすいか、又は加齢性認知機能低下若しくは病的神経変性になっているヒト対象を特定する方法であって、
短期記憶又は長期記憶の喪失、集中力維持能力の低下、及び課題解決能力の低下のうちの１又は複数の症状を有するヒト対象から得られた血液試料中のＣＤ１０３＋常在性メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８＋ＴＲＭ）の存在の増加を検出することを含む、
前記方法。
【請求項２０】
前記ＣＤ１０３＋ＣＤ８＋ＴＲＭの存在の増加が、前記１又は複数の症状のいずれも有しない１人の健康なヒト対象又は複数の健康なヒト対象のプールから得られた値と比較したものである、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年２月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／６３０１２９号に対する優先権をアメリカ合衆国特許法第１１９条（ｅ）の下で主張するものであり、この仮特許出願の内容全体を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、加齢性神経変性又は病的神経変性の診断、予防、及び治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
加齢は複数の疾患の発症及び／又は進行の一因であるが、加齢が個々の疾患の動態に影響する具体的な態様は大部分が謎のままである。慢性炎症は加齢性疾患の重要な寄与因子として認識されることが増えており、それらの疾患には癌、循環器疾患、癌、並びに卒中、外傷、及び神経変性などの神経症状が含まれる。
【０００４】
Ｔ細胞は体全体における炎症の主な調節因子であり、それらの誤調節により慢性炎症が助長される。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、特に末梢Ｔ細胞プールが枯渇してこれらの細胞が恒常性増殖を起こした際に、自己破壊能を獲得する場合がある。そのような枯渇は、加齢中に新規Ｔ細胞を産生しながら胸腺の退縮により徐々に起こるか、又はストレス、外傷、若しくは感染症に起因してより急速に起こる。加齢性Ｔ細胞増殖は、ヒトでは中年期の後期まで続き、且つ、どこでも生じるため、自然の老化プロセスの代わりに病理学的な因子が異常Ｔ細胞増殖に関与するのかを研究することが難しくなっている。また、異常加齢性Ｔ細胞増殖は、げっ歯類実験動物では比較的に稀であり、あったとしてもその機能的な影響は加齢中のげっ歯類動物では持続的な胸腺活性によって相殺されることが多い。
【０００５】
リンパ球が減少している宿主へＴ細胞を導入すると、それらの宿主では直ぐに恒常性増殖が起こり、げっ歯類実験動物ではそれにより生じた細胞により人為的自己免疫が亢進する場合がある。それにもかかわらず、このより急速な増殖と加齢性Ｔ細胞異常との関係性はあまり明確ではなく、認識可能な加齢性疾患がこの関係性により助長されることはほとんどの場合で知られていない。
【０００６】
異常ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンは特に大半の加齢中のヒトにおいて増殖する一方、加齢中のマウスではこのプロセスは代償的プロセスによって相殺される。また、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の変化はマウスモデルとヒトアルツハイマー病との間で観察される明白な生理学上の違いの中にも入っており、これらの細胞はマウスモデルでは減少し、ヒトアルツハイマー病では増加する。また、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞はアルツハイマー病患者の循環系及び／又は中枢神経系（ＣＮＳ）において増加することが近年の研究により説得力を持って示されている。これらの増加は、他のＴ細胞の顕著な変化を伴うことが一般的であるが、これらの増加はタウオパチー及び／又は認知機能低下とより強力に相関する傾向がある。したがって、加齢性恒常性増殖とその増殖により生じる異常メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞は、アルツハイマー病の全病態に対する抵抗性に影響し得るマウスの未知の生理学的因子である可能性がある。しかしながら、このことを検討することは、健康なヒトでは異常加齢性ＣＤ８＋Ｔ細胞が広範に存在すること、マウスではこれらの細胞が希少であること、及び全ての種において他の加齢の特徴と共にこれらの細胞が生じることのために困難なままとなっている。
【０００７】
したがって、本発明の目的の一つは、病的神経変性を含む加齢性認知機能低下の診断、予防、及び／又は治療のための組成物、並びにこの組成物を使用する診断法、予防法、及び／又は治療法を提供することである。
【０００８】
また、インビトロ系又はげっ歯類動物モデルにおいてヒト認知機能低下の候補治療薬、予防薬、及び／又は診断薬をスクリーニングするための組成物、及びこの組成物を使用するスクリーニング方法を提供することも本発明の目的の一つである。
【０００９】
本明細書内の全ての刊行物は、それぞれ個々の刊行物又は特許出願が参照により援用されると具体的及び個別に示された場合と同じ程度で参照により援用される。以下の記述には本発明の理解に有用であり得る情報が含まれている。このことは、本明細書において提供される情報のうちのいずれかが先行技術である、又は本出願で請求する発明に関連するということを認めるものでなければ、具体的又は明示的に参照される刊行物のいずれかが先行技術であることを認めるものでもない。
【発明の概要】
【００１０】
以下の実施形態及びそれらの態様を組成物及び方法と併せて説明及び例示するが、それらは代表及び例示を意味し、発明の範囲を限定することを意味しない。
【００１１】
リスクがある高齢の対象、軽度認知障害の対象、及び／又は病的神経変性を有する対象を認知機能低下から防護する且つ／又は認知機能低下の重症度を低下させるために、ＣＤ１０３阻害剤、ＣＤ８＋ＴＲＭ（ＣＤ８＋常在性メモリーＴ細胞）のエフェクター分子阻害剤、及び／又は免疫寛容原性ワクチンを投与することを含む方法を提供する。様々な実施形態において、ＣＤ８＋ＴＲＭはアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）又はＡＰＰペプチドに対して反応性又は特異的であり得る。本方法の一態様によると、ＣＤ１０３阻害剤、パーフォリン１阻害剤、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）阻害剤、及び／又はＡＰＰペプチドを含むワクチンを投与することにより、上記１種類若しくは複数種類の阻害剤又は１種類のワクチンの投与前と比較して、又は上記１種類又は複数種類の阻害剤が投与されていない対照被検者と比較して、ＡＰＰ又はＡＰＰペプチドへのＣＤ８＋ＴＲＭの結合又は反応を抑制することが可能である。
【００１２】
これらの阻害剤には、抗体若しくは抗体の断片、小分子、又は核酸が含まれる。幾つかの実施形態では、阻害剤は、２Ｇ５．１、マウス抗ヒトＩｇＧ２ａモノクローナル抗体、又は２Ｇ５．１のヒト化抗体などの抗ＣＤ１０３抗体であり得る。他の実施形態では、阻害剤は、パーフォリン１又はインターフェロンγを阻害し得る。幾つかの実施形態では、免疫寛容原性ワクチンはアミロイド前駆タンパク質又はそのペプチドを含み得る。
【００１３】
アルツハイマー病を含む加齢性神経変性になりやすい、又はなっている対象を特定するための方法であって、血液中のＣＤ１０３陽性常在性メモリーＴ細胞（ＴＲＭ）のレベル上昇を検出することを含み得る上記方法が提供される。
【００１４】
記憶障害の治療前、治療中、及び／又は治療と治療の間に、対象がＣＤ１０３陽性ＣＤ８＋ＴＲＭを収集し、定量するための試料収集装置と、所望により操作マニュアルと、を含むキットが提供される。
【００１５】
ヒト認知機能低下又は加齢性神経変性の候補治療薬、予防薬、及び／又は診断薬を特定及び／又はスクリーニングするための系であって、げっ歯類動物（例えばマウス）から得られるＣＤ４４ｈｉＣＤ１２３＋ＣＤ１２７ｈｉＫＬＲＧ１＋ＣＤ１０３＋常在性メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞表現型を含み得る上記系が提供される。幾つかの実施形態では、このＣＤ４４ｈｉＣＤ１２３＋ＣＤ１２７ｈｉＫＬＲＧ１＋ＣＤ１０３＋常在性メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞表現型は、胸腺欠損マウスに常在性メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を投与することによって取得可能である。
【００１６】
ヒトでの加齢性神経変性の治療又は予防のための候補薬剤を特定及び／又はスクリーニングする方法は、その候補薬剤をインビトロで上記ＣＤ４４ｈｉＣＤ１２３＋ＣＤ１２７ｈｉＫＬＲＧ１＋ＣＤ１０３＋常在性メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞と接触させて、又は上記ＣＤ４４ｈｉＣＤ１２３＋ＣＤ１２７ｈｉＫＬＲＧ１＋ＣＤ１０３＋常在性メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を含むモデル動物にその候補薬剤を投与してＣＤ１０３陽性常在性メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の減少レベル、それらの細胞のエフェクター分子の減少レベル、又は上記動物の末梢系から脳へのＣＤ８＋Ｔ細胞の移動量の減少を特定することを含み得る。
【００１７】
本発明の実施形態の様々な特徴を例として示す添付図面と併せて以下の詳細な説明から本発明の他の特徴及び利点が明らかになる。
【００１８】
参照図面に例となる実施形態を例示する。本明細書において開示される実施形態と図面は限定よりも例示としてみなされるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｇは、ｈｉＴ細胞が、加齢関連常在性メモリー表現型（ｈｉＴＲＭ）を示すことを示している図である。図１Ａ〜図１Ｄは脾臓標本での結果であり、図１Ｅ〜図１Ｇは脳の分析の結果である。若齢（１０週間未満）及び高齢（１２か月超）のＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）、（それぞれ「若齢Ｂ６」及び「高齢Ｂ６」と表示される）、並びにＣＤ８＋Ｔ細胞の静脈内注入から３〜５週間後の若齢（６週間）のＢ６．Ｆｏｘｎ１レシピエント（「ＣＤ８→Ｂ６．Ｆｏｘｎ１」と表示される）に由来する脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する加齢性マーカーの代表的なフローサイトメトリー分析を示す図（図１Ａ）。群当たり６匹以上のマウスから集められたフローサイトメトリーに由来するリンパ球のパーセンテージ（図１Ｂ）と、平均蛍光強度（図１Ｃ及び図１Ｄ）を示す図。「多様な」ＴＣＲＶβ鎖Ｄ→Ｊ遺伝子セグメント利用（脳当たり３を超えるセグメント）を有し、且つ、若齢（＜１０週間、「若齢Ｂ６」と表示される）、中齢（６か月、「中齢Ｂ６」と表示される）、及び高齢（１２か月超、「高齢Ｂ６」と表示される）のＢ６マウスの脳内で特定のＤ→Ｊセグメントを有するマウスの割合は、進行的な多様性の減少と特定のＤ→Ｊセグメント利用の増加という年齢依存的パターンを表している（すなわち、クロナリティー；図１Ｅ及び１Ｆ；各図の下の左から右へ定義されている順序でカラムが出現している）。Ｄ→Ｊ多様性とセグメント利用は高齢のＢ６の脳と若齢のＣＤ８→Ｂ６．Ｆｏｘｎ１の脳との間でのみ有意に相関した（図１Ｇ）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５。フローサイトメトリーマーカーについては３回以上の独立した試験で群当たり５匹以上のマウスで両側ｔ検定による。ＰＣＲコンピレーションについては群当たり１０匹以上のマウスでピアソンの相関による。
【図１Ｂ】同上
【図１Ｃ】同上
【図１Ｄ】同上
【図１Ｅ】同上
【図１Ｆ】同上
【図１Ｇ】同上
【図１Ｈ】図１Ｈ〜図１Ｋは、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）欠損Ｂ６．Ｆｏｘｎ１マウスにおけるドナー細胞の増殖を示している図である。雌Ｃ５７ＢＬ／６又は類遺伝子性ノックアウト宿主に由来する精製済みＣＤ８＋Ｔ細胞を８〜１０週齢の雌Ｂ６．Ｆｏｘｎ１レシピエント、Ｂ６．Ｆｏｘｎ１−ＡｐｐＫＯレシピエント、又はＢ６．ＣＤ４５．１類遺伝子性レシピエントに注入した（図１Ｈ）。示されているような（図１Ｉ）ゲート設定とＴ細胞マーカーに対する抗体を使用して３日後にフローサイトメトリーにより血液を分析し、ゲート内の細胞中のＣＤ３ε＋ＣＤ８＋細胞の割合（％）を（図１Ｊ）にまとめた。Ｂ６．Ｆｏｘｎ１マウスをＢ６．Ａｐｐ−ノックアウトマウスに交配し、ジャクソン・ラボラトリーズ（バーハーバー、メイン州）においてＰＣＲと表現型によりホモ接合性二重変異体（Ｂ６．Ｆｏｘｎ１−ＡｐｐＫＯ）を確認し、そしてＢ６．Ｆｏｘｎ１雌レシピエント及びＢ６．Ｆｏｘｎ１−ＡｐｐＫＯ雌レシピエントにおいてＣＦＳＥ希釈によりＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を評価した（図１Ｋ；ｎ＝３匹のＢ６．Ｆｏｘｎ１とｎ＝５匹のＢ６．Ｆｏｘｎ１−ＡｐｐＫＯ；３回の独立した試験での両側ｔ検定により＊Ｐ＜０．０４、＊＊＊Ｐ＜０．００００１；全てのマーカーについての３回以上の独立した試験においてｎ≧５匹マウス／群）。
【図１Ｉ】同上
【図１Ｊ】同上
【図１Ｋ】同上
【図２Ａ】図２Ａ〜図２Ｅは、ｈｉＴＲＭが自己抗原に反応し、選択的に脳に侵入すること（すなわち、ヌードマウスへの移入後の脳ＣＤ８＋Ｔ細胞表現型）を示している図である。Ｂ６．Ｆｏｘｎ１レシピエントにおける脳リンパ球とＣＤ８＋Ｔ細胞のライトスキャッターとゲート設定を示す図（図２Ａ）。注入から３日後（図２Ｂ）と１０週間後（図２Ｃ）のＢ６．Ｆｏｘｎ１レシピエントにおける脳リンパ球内のＣＦＳＥ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージと表現型を示す図。注入から１０週間後のＢ６．Ｆｏｘｎ１レシピエントの脳（図２Ｄ及び図２Ｅ）と脾臓（図２Ｅ）のＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＴｒｐ−２−ＤＣＴ（１８０−１８８）／Ｈ−２ＫｂエピトープとＡＰＰ（４７０−４７８）／Ｈ−２Ｄｂエピトープに対するｐＭＨＣ  Ｉマルチマー（バージニア州フェアファックスのＩｍｍｕｄｅｘ  ＵＳＡにより合成されたカスタムデクストラマー）を用いた染色の増強を示す図（３回以上の独立した試験での両側ｔ検定により＊Ｐ＜０．０５；全ての分析についてｎ＞６匹であり、ＰＢＳ群と比べて有意性を有した）。
【図２Ｂ】同上
【図２Ｃ】同上
【図２Ｄ】同上
【図２Ｅ】同上
【図２Ｆ】図２Ｆ〜図２Ｊは、ｈｉＴＲＭの誘導により脳においてＣＤ８とアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）／Ａｂが増加すること（すなわち、Ｔ細胞マーカーとアミロイドマーカーのＰＣＲとウエスタン分析）を示している図である。ＴＣＲＶβ鎖のＤ１→Ｊ１遺伝子セグメント（図２Ｆ）とＤ２→Ｊ２遺伝子セグメント（図２Ｇ）のＰＣＲにより若齢及び高齢のＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）では多様なＴ細胞レパートリーが示されたが１０週間後のＣＤ８＋Ｔ細胞のＢ６．Ｆｏｘｎ１レシピエント（ＣＤ８→Ｂ６．Ｆｏｘｎ１）では限定的なＴＣＲＶβ鎖多様性が示された。Ｂ６．Ｆｏｘｎ１マウスでは野生型ＣＤ８＋Ｔ細胞が以前に注入されていない場合では脳に再構成された（すなわち、生殖系列「Ｇ」のみを含むことが視覚的に確認された）ＴＣＲ産物が無かった（図２Ｆ及び図２Ｇ；注記：セグメントＪ２．６は偽遺伝子である）。若齢（５か月未満）のＣ５７ＢＬ６（Ｂ６）、及び若齢（６〜８週間）のＢ６ドナーに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入を１０週間にしたＢ６．Ｆｏｘｎ１宿主と養子移入していないＢ６．Ｆｏｘｎ１宿主の切り出された脳の海馬におけるＣＤ８αのウエスタンブロット（抗体クローン２．４３；図２Ｈ）及びβ−アミロイドのウエスタンブロット（抗体クローン４Ｇ８；図２Ｉ）を示す図。ＣＤ８タンパク質はＢ６では非常に低いレベルで検出可能であるが、Ｂ６．Ｆｏｘｎ１では野生型ＣＤ８＝Ｔ細胞を１０週間前に注入していないと検出不可能である。「Ｒｅｆ」＝同分析の対象とした６〜１０週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６脾臓ＤＮＡ又は細胞溶解物。図２Ｊは試験のタイムラインを示している。
【図２Ｇ】同上
【図２Ｈ】同上
【図２Ｉ】同上
【図２Ｊ】同上
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｊは、ｈｉＴ細胞を有するヌードマウスにおけるＡβ斑と神経原線維性疾患症状を示している図である。表示されているレシピエントでの対照注入又は細胞注入（→）から３週間後の切り出された皮質と海馬における界面活性剤可溶性ＡＰＰ切断産物（ＡＰＰＣｌ）のウエスタンを示す図（図３Ａ）。図３Ｂ〜図３Ｊの細胞／対照レシピエントはもっぱらＢ６．Ｆｏｘｎ１であり、別段の表示が無い限り注入から１５か月後の時点のものである。トリトン可溶性画分Ａβ１−４０／４２の前脳ＥＬＩＳＡを示す図（図３Ｂ）。表示されているマウス群におけるｐ−タウ又はクルクミン対比染色を含む実質中の斑とその対比染色を含まない実質中の斑を示す図（図３Ｃ）、及び嗅内（Ｅｎｔ）皮質と帯状（Ｃｎｇ）皮質と海馬（Ｈｉｐｐｏ）における４Ｇ８面積率のまとめ（図３Ｄ）。界面活性剤可溶性ホスホ−タウ（ｐ−タウ）及び対らせん状細線維（ＰＨＦ）の前脳ウエスタンを示す図（図３Ｅ）とシグナル定量のまとめ（図３Ｆ）。連続ｐ−タウ→ガリアス染色の挿入図を含む脳と１８か月齢のＡＤｔｇ（Ｔｇ２５７６）マウスにおける銀染色細胞を示す図（図３Ｇ）。ガリアス＋神経細胞の割合のまとめ（図３Ｈ）、星状細胞（Ｇｆａｐ＋）を示す図、及びミクログリアを示す図（Ｉｂａ−１＋；図３Ｉ及び図３Ｊ）。全ての分析について３回以上の独立した試験での両側ｔ検定によりＰＢＳ群と比べて＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５である。
【図３Ｂ】同上
【図３Ｃ】同上
【図３Ｄ】同上
【図３Ｅ】同上
【図３Ｆ】同上
【図３Ｇ】同上
【図３Ｈ】同上
【図３Ｉ】同上
【図３Ｊ】同上
【図３Ｋ】図３Ｋ及び図３Ｌは、ｈｉＴＲＭにより６か月の時点で脳細胞内に原線維封入体が誘導されること（すなわち、ｈｉＴ細胞を有するヌードマウスの歯状回におけるクルクミンとチオフラビンＳの別々の染色）を示している図である。表示されている群（ＡＤ−Ｔｇ＝Ｔｇ２５７６マウスを除いて全てがＢ６．Ｆｏｘｎ１レシピエント）に由来する海馬切片は静脈内対照／細胞注入から６か月後、又はＡＤ−Ｔｇについては１４か月齢の時点で４Ｇ８（Ａβ）及びクルクミン染色したものである（図３Ｋ）。右向きの矢はクルクミン共染色していないＡβ沈着体を強調している。上向きの矢は共局在したＡβ沈着体とクルクミン沈着体を示しており、成熟老人斑を意味する。下向きの矢はＡβ共染色していないクルクミン＋構造体、すなわち、非アミロイド性原線維沈着体を強調している。これらの染色ではＤＡＰＩを使用しなかった。ブルーチャネルのバックグラウンドは解剖学上の事情で提示されているだけである。対照／細胞注入から６か月後のＰＢＳ群及び野生型ＣＤ８群のＢ６．Ｆｏｘｎ１  ｈｉＴレシピエント、及び２０か月齢のＡＤ−遺伝子導入（Ｔｇ）ラット歯状回の追跡チオフラビンＳ染色を示す図（図３Ｌ）。ラットＡＤ−Ｔｇの脳は明らかにタウＰＨＦを含有する（Ｃｏｈｅｎら著、２０１３年）のでこれを使用したが、我々の技術ではチオフラビンＳで染色できなかった。
【図３Ｌ】同上
【図３Ｍ】図３Ｍ及び図３Ｎは、実験群における銀染色神経構造体を示している図である。野生型ＣＤ８群及びＩＦＮγＫＯ−ＣＤ８群のマウスにおける典型的な神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）形態（挿入図）を示している皮質脳領域及び海馬脳領域のガリアス銀染色を示す図。ＰｒｆＫＯ−ＣＤ８群又はＰＢＳ群のマウスではバックグラウンド銀染色が時折見られたが、類似するＮＦＴ形態は示されなかった（挿入図）。個々の画像は各群の別々のマウスに由来した（図３Ｍ）。ｈｉＴ細胞を有するヌードマウス（野生型ＣＤ８）の海馬（左）と皮質（ｃｔｘ、右）におけるガリアス＋構造体をヒト重度ＡＤ（ブラークステージＶＩ）の皮質のものと比較する図（図３Ｎ）。図３Ｍ及び図３Ｎの全ての画像と倍率とスケールは同一（２０倍）であり、挿入図でも同一である。
【図３Ｎ】同上
【図３Ｏ】図３Ｏ〜図３Ｓは、ｈｉＴＲＭレシピエントＢ６．Ｆｏｘｎ１マウスにおける脳ＣＤ８＋Ｔ細胞を示している図である。野生型、ＩＦＮγＫＯ、又はＰｒｆＫＯのＣＤ８＋Ｔ細胞の注入、又はＰＢＳの注入から１５か月後のＢ６．Ｆｏｘｎ１レシピエントに由来する海馬及び皮質の脳切片内で脳をＣＤ８及びｐ−タウについて共染色し（挿入図）（図３Ｏ）、且つ、定量した。ＣＤ８＋細胞は大部分が孤立しているが図３Ｏ（挿入図）に見られるように時折ｐ−タウ＋神経細胞と相互作用していることが見られた。群のデータが図３Ｐにまとめられている。図３Ａ〜図３Ｊ又は図３Ｏ〜図３Ｓにおいて有意に（＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５；ＰＢＳ対照と比較する両側ｔ検定）変化した星状細胞（ＧＦＡＰ、図３Ｑ）、ミクログリア細胞（Ｉｂａ−１、図３Ｒ）、又はＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８、図３Ｓ）の面積は各群の４Ｇ８＋斑面積率と相関した。線形回帰のＰ値とピアソンの相関（ｒ）が示されている（図３Ｑ〜図３Ｓ）。
【図３Ｐ】同上
【図３Ｑ】同上
【図３Ｒ】同上
【図３Ｓ】同上
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｎは、ｈｉＴ細胞を有するヌードマウス（すなわち、ｈｉＴＲＭレシピエントＢ６．Ｆｏｘｎ１マウス）における神経変性評価指数及び認知機能を示している図である。全てのパネルの細胞／対照レシピエントはもっぱらＢ６．Ｆｏｘｎ１である。細胞／対照注入から１５か月のＮｅｕＮとＧＦＡＰの染色（図４Ａ及び図４Ｂ）、及び海馬における細胞数を示す図（図４Ｃ）。ＰＢＳ群及び野生型ＣＤ８群における経時的な脳の萎縮を示す図（各時点でＰＢＳ対照に対して正規化された量；図４Ｄ）。代表的な前脳ウエスタンを示す図（図４Ｅ）、並びにＧＡＰＤＨに対して正規化されたＮｅｕＮ、ドレブリン、及びシナプトフィシンのウエスタンシグナルを示す図（図４Ｆ）。ＮｅｕＮの脳量との相関を示す図（図４Ｇ）。１３か月の時点での代表的なオープンフィールド試験を示す図（図４Ｈ）。恐怖条件づけ試験の経時的な成績を示す図（図４Ｉ）、及び１２か月の時点での自発的交替行動（ＳＡ）を示す図（図４Ｊ）。１４か月の時点でのバーンズ迷路学習（図４Ｋ；両側ＡＮＯＶＡのＰ）、記憶保持期（図４Ｌ）、及び逆転学習期（図４Ｍ及び図４Ｎ）を示す図（黒色のシンボル＝それぞれＰＢＳ、野生型ＣＤ８と比べたＰ）。他の検定が表示されている場合を除いて両側ｔ検定による＊＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、＋Ｐ＜０．１。
【図４Ｂ】同上
【図４Ｃ】同上
【図４Ｄ】同上
【図４Ｅ】同上
【図４Ｆ】同上
【図４Ｇ】同上
【図４Ｈ】同上
【図４Ｉ】同上
【図４Ｊ】同上
【図４Ｋ】同上
【図４Ｌ】同上
【図４Ｍ】同上
【図４Ｎ】同上
【図５Ａ】図５Ａ〜図５Ｄは、ＣＤ１０３欠損が主にＣＤ８＋Ｔ細胞及び脳局在に影響することを示している図である。ＣＤ１０３欠損（Ｂ６．ＣＤ１０３ＫＯ）マウス及び月齢が合致する野生型（Ｂ６）マウス（ｎ＝８匹）に由来するフローサイトメトリー（図５Ａ）、ウエスタンブロット（図５Ｂ）、のウエスタンシグナルのまとめ（図５Ｃ）、及びオープンフィールド試験の結果（図５Ｄ；この図の右側で上から下へ定義されている順序でカラムが出現している）を示す図。ＣＤ１０３欠損は主にＣＤ８＋Ｔ細胞に影響し（図５Ａ）、脳内のＣＤ８シグナルを特に減少させ（図５Ｂ及び図５Ｃ；欠損していない場合はＣＤ８＋ＴＲＭが加齢中の脳で特に増加する）、加齢に伴って運動をわずかに遅くした（図５Ｄ）。
【図５Ｂ】同上
【図５Ｃ】同上
【図５Ｄ】同上
【図５Ｅ】図５Ｅ〜図５Ｈは、ＣＤ１０３欠損により加齢性認知機能低下から防護されることを示している図である。若齢及び高齢のＣＤ１０３欠損マウス及び野生型マウスのバーンズ迷路の成績、すなわち、トレーニング期間の潜時（図５Ｅ）、記憶保持期の潜時（図５Ｆ）、逆転学習期の潜時（図５Ｇ）、及び各期間での侵入エラー（図５Ｈ）を示す図。この試験でのこの系統の主要な加齢による障害は侵入エラーであることが報告されている。
【図５Ｆ】同上
【図５Ｇ】同上
【図５Ｈ】同上
【図６Ａ】図６Ａ〜図６Ｆは、ヒトのアルツハイマー病の脳におけるｈｉＴ細胞関連評価指数の上昇を示している図である。図６ＡはＡＤの対象の脳におけるものと比較したアルツハイマー病ではない対象の脳（ＡＤ無し）におけるＧＦＡＰ発現ユニットを示している。図６Ｂは前記対象の脳における該当するＧＦＡＰ発現レベルと比較した遺伝子発現レベルの変化率（％）を示している。ＰＲＦ１ウエスタン及び免疫蛍光を示す図（図６Ｃ）、年齢が合致する正常（ｎ＝６人）、軽度（ｎ＝５人）、又は重度（ｎ＝１２人）のアルツハイマー病の脳での定量を示す図（図６Ｄ）。抗ＣＤ８（Ｓｅｒｏｔｅｃ）及びＡＰＰ（４７１−４７９）／ＨＬＡ−Ａ２マルチマー（Ｉｍｍｕｄｅｘ  ＵＳＡ、フェアファックス、バージニア州）で共染色したアルツハイマー病の脳を示す図（図６Ｅ）、エピトープ反応性Ｔ細胞の定量（Ｐ＝０．００２、両側ｔ検定）を示す図（図６Ｆ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の全体的レベルは変化しなかった（アルツハイマー病対正常加齢対照において１．６３±０．２９対２．２９±０．５５細胞／脈管；Ｐ＝０．３１、両側ｔ検定）。
【図６Ｂ】同上
【図６Ｃ】同上
【図６Ｄ】同上
【図６Ｅ】同上
【図６Ｆ】同上
【図７Ａ】図７Ａ及び図７Ｂは、全ての患者内（図７Ａ）及び具体的にＨＬＡ−Ａ２＋の患者（潜在的にＡＰＰエピトープ反応性）内（図７Ｂ）で加齢又は疾患性認知機能低下の恐れがある患者（ＭｏＣＡ＝２６〜３０）及び加齢又は疾患性認知機能が低下している患者（ＭｏＣＡ＜２６）における異常、ＡＰＰ特異的ＣＤ８＋ＴＲＭレベルを示している図である。
【図７Ｂ】同上
【図８】図８は、ＣＤ８＋ＴＲＭ介在性の脳への効果についての一般的モデルを示している図である。
【図９Ａ】図９Ａ〜図９Ｃは、ヒト患者血液におけるＣＤ８＋ＴＲＭ遺伝子発現（図９Ａ及び図９Ｂ）及びヒト患者血液（フローサイトメトリーによる）におけるｈｉＴＲＭ染色評価指数を示している図である（図９Ｃでは図の右上隅の上から下へ定義されている順序でカラムが出現している）。
【図９Ｂ】同上
【図９Ｃ】同上
【図１０Ａ】図１０Ａ〜図１０Ｅは、正常な加齢中のヒト対象の血液及びアルツハイマー病のヒト患者の血液における異常加齢性Ｔ細胞遺伝子発現を示している図である（遺伝子発現オムニバスデータセットＧＳＥ８５４２６）。図１０Ａ〜図１０Ｃはそれぞれ３種類の重要な遺伝子であるＣＤ１０３、ＣＤ８Ａ、ＣＤ４４がアルツハイマー病で有意に上昇することを示している。一般的なＴ細胞遺伝子であるＣＤ３Ｄの発現が平均より低い患者（図１０Ｄ）をバイオマーカー分析から除外することで予測力がＴ細胞依存的であることを確実にした。別の遺伝的原因を有する希少な早発型アルツハイマー病（ＡＤ）をふるい落とすために６５歳よりも若い患者（図１０Ｅ）も除外した。０．０５（＊）未満のＰ値は正常とＡＤ患者との間の統計学的有意差を意味し、＊＊＊＊はＰ＜０．０００５を意味する。
【図１０Ｂ】同上
【図１０Ｃ】同上
【図１０Ｄ】同上
【図１０Ｅ】同上
【図１１Ａ】図１１Ａ及び図１１Ｂは、３遺伝子パネル（ＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ１０３）によるアルツハイマー病（ＡＤ）の真陽性と偽陽性の予測率を示している図である。（前の段落で説明した）除外を行った後に高Ｔ細胞群でのバイオマーカー分析には４０の正常標本と４９のＡＤ標本が残され（図１１Ａ）、低Ｔ細胞群でのバイオマーカー分析には４０の標本と３９のＡＤ標本が残された（図１１Ｂ）。高Ｔ細胞標本における５％未満の偽陽性予測を含む少なくとも４０％のＡＤ患者の正確な予測から異常加齢性Ｔ細胞はＡＤに関連があり、且つ、遅発型のこの疾患の有力な血液バイオマーカーとして機能することが確認される。受信者操作特性（ＲＯＣ）分析にＣＤ１０３と共にＣＤ８ＡとＣＤ４４を含むことでＣＤ１０３単独よりも特異的にＣＤ８＋ＴＲＭ亜集団が特定される。図１２Ａ及び図１２Ｂに示されているＣＤ１０３のみに基づくそれぞれのＲＯＣ曲線と比較すると、図１１Ａ又は図１１Ｂの各ＲＯＣカーブは実質的には（又は有意には）異なっておらず、これはＣＤ１０３もこの亜集団に対しては非常に特異的であることを示しており、この３遺伝子パネルで偽陽性率がわずかに低いことはＴＲＭ特定の特異度をさらに高めることでそのバイオマーカーとしての価値がさらに改善されることを示している。
【図１１Ｂ】同上
【図１２Ａ】図１２Ａ及び図１２Ｂは、高Ｔ細胞群（図１２Ａ）及び低Ｔ細胞群（図１２Ｂ）のプロットのために図１１Ｄ及び図１１Ｅに関して説明したものと同じ除外を行った標本からのＣＤ１０３のみによるアルツハイマー病（ＡＤ）の真陽性と偽陽性の予測率を示している図である。高Ｔ細胞標本における８％未満の偽陽性予測を含む５０％を超えるＡＤ患者の正確な予測からＴ細胞上のＣＤ１０３はＡＤに関連があり、且つ、遅発型のこの疾患の単一遺伝子血液バイオマーカーとして機能することが確認される。
【図１２Ｂ】同上
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書において引用される全ての参照文献は、完全に記載されているかのように全体が参照により援用される。別段の定義が無い限り、本明細書において使用される技術用語と科学用語は本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら著、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ第３版、改定版、Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社（ニューヨーク、ニューヨーク州、２００６年）、Ｍａｒｃｈ著、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ第７版、Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社（ニューヨーク、ニューヨーク州、２０１３年）、並びにＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第４版、コールドスプリングハーバープレス（コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、２０１２年）は本出願で使用される用語の多くについての一般的な案内を当業者に与える。抗体調製法の参照文献についてはＤ．  Ｌａｎｅ著、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版（コールドスプリングハーバープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、２０１３年）、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ著、（１９７６年）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．誌、第６巻：５１１頁、Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５５８５０８９号明細書、及びＲｉｅｃｈｍａｎｎら著、Ｎａｔｕｒｅ誌、第３３２巻：３２３頁（１９８８年）、米国特許第４９４６７７８号明細書、Ｂｉｒｄ著、Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第２４２巻：４２３〜４２頁（１９８８年）、Ｈｕｓｔｏｎ  ら著、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ誌、第８５巻：５８７９〜５８８３頁（１９８８年）、Ｗａｒｄら著、Ｎａｔｕｒｅ誌、第３３４巻：５４４〜５４頁（１９８９年）、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  Ｉ．及びＨｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．著、（２０００年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ誌、第３２６巻、４６１〜４７９頁、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．著、（２００５年）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．誌、９月、第２３巻（第９号）：１１２６〜３６頁参照）を参照されたい。
【００２１】
当業者は、本発明の実施において使用可能である本明細書に記載される方法及び材料と類似又は同等の多数の方法及び材料を理解することになる。実際には本発明は本記載の方法及び材料に決して限定されない。本発明の目的のために以下に次の用語を定義する。
【００２２】
Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれるＴ細胞の表面上の特別な受容体の存在によって、Ｂ細胞などの他のタイプのリンパ球から区別できる。幾つかの異なるＴ細胞亜集団が発見されており、Ｔヘルパー細胞（ＴＨ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、又はＣＴＬ）、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）及びエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞）を含むメモリーＴ細胞（ＴＭ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、ガンマ・デルタＴ細胞（γδＴ細胞）、及び調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）をはじめとしてそれぞれが異なる機能を有する。
【００２３】
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞表面にＣＤ８糖タンパク質を発現する。大半のＴＣ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られる）は、特定の抗原を認識するＴＣＲを発現する。細胞内の抗原（たいていはタンパク質の細胞内分解により生じるペプチド）は、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成した後にこのＭＨＣクラスＩ分子と共にその細胞の表面に運ばれ、その細胞表面でこれらはＴＣ細胞によって認識可能になる。そのＴＣ細胞のＴＣＲがその抗原に対して特異的であれば、そのＴＣ細胞はそのＭＨＣ分子とそのペプチドの複合体に結合し、そのＴＣ細胞が前記細胞を破壊する。ＣＤ８とＭＨＣ分子との間の親和性によって、この抗原特異的活性化の間にＴＣ細胞と標的細胞との密接な結合が維持される。ＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化されると、それらの相棒はＴＣ細胞として認識され、一般的には免疫系内の定義済みの細胞傷害の役割を有するものと分類される。
【００２４】
本明細書において使用される「ＡＰＰ」とは、アミロイド前駆タンパク質のことである。本明細書において使用される「ＡＰＰペプチド」とは、ＡＰＰアミノ酸配列の一部を含むペプチドのことである。これらのペプチドは、２〜２０アミノ酸長（例えば、２アミノ酸長、３アミノ酸長、４アミノ酸長、５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長、１０アミノ酸長、１１アミノ酸長、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長、１５アミノ酸長、１６アミノ酸長、１７アミノ酸長、１８アミノ酸長、１９アミノ酸長、又は２０アミノ酸長）であってよい。その他の実施形態では、本明細書に記載される本発明の態様に関して使用するのに適切なＡＰＰペプチドは、配列番号１に示される全長配列を有するヒトＡＰＰに由来するものであってよい。実施形態の一例では、ＡＰＰペプチドはＡＬＥＮＹＩＴＡＬ（配列番号２）、ＫＬＶＦＦＡＥＤＶ（配列番号３）、ＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号４）、ＧＬＭＶＧＧＶＶＩ（配列番号５）、ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号６）、ＲＬＡＬＥＮＹＩＴ（配列番号７；ＡＰＰのアミノ酸４７０〜４７８）、又はＬＡＬＥＮＹＩＴＡ（配列番号８；ＡＰＰのアミノ酸４７１〜４７９）という配列を含む。国際出願公開第２０１７／０４０５９４号ではＡＰＰ又はＡＰＰペプチドについてさらに説明されており、この出願公開の内容を参照により本明細書に援用する。幾つかの実施形態では、配列番号２〜６は容易に製造可能である、西洋において最も一般的なＨＬＡアレル（ＨＬＡ−Ａ２）に安定的に結合し得るＡＰＰ由来ペプチドを表しており、当業者が理解するように患者コホートの人類学的特徴に応じてその他のペプチドとＨＬＡの組合せを利用することも可能である。
【００２５】
本明細書において使用される「アミノ酸」は、天然アミノ酸と合成アミノ酸の両方、及びＤ型アミノ酸とＬ型アミノ酸の両方を含むものとされる。「標準的アミノ酸」とは、天然のペプチドに一般的に見られる２０種類のＬ型アミノ酸のうちのいずれかのアミノ酸を意味する。「非標準的アミノ酸」とは、合成されたか天然の起源に由来するものであるかに関係なく、標準的アミノ酸以外のあらゆるアミノ酸を意味する。本明細書において使用される場合、「合成アミノ酸」は塩、アミノ酸誘導体（アミド等）、及び置換体を含むがこれらに限定されない化学的に修飾されたアミノ酸も包含する。本明細書において開示されるペプチド内に含まれるアミノ酸、特にカルボキシ末端又はアミノ末端に含まれるアミノ酸は、それらのペプチドの生物活性に悪影響を与えずにそれらのペプチドの循環半減期を変えることができるメチル化、アミド化、アセチル化、又は他の化学基による置換よって修飾可能である。また、本明細書において開示されるペプチドにはジスルフィド結合が存在しても存在しなくてもよい。
【００２６】
本明細書において「ペプチド」と「タンパク質」は互換的に使用され、ペプチド結合又は修飾型ペプチド結合により共有結合した少なくとも２アミノ酸残基から構成される化合物（例えば、ペプチドイソスター）のことを指す。タンパク質又はペプチドを構成し得るアミノ酸の最大数について制限はない。本明細書及び添付される特許請求の範囲に記載されるペプチド又はタンパク質を構成するアミノ酸は、Ｄ型アミノ酸又はＬ型アミノ酸のどちらかであることが理解され、Ｌ型アミノ酸が好ましい。本明細書に記載されるペプチド又はタンパク質を構成するアミノ酸は、翻訳後プロセッシングなどの自然の過程で修飾されても、当技術分野においてよく知られている化学修飾技術によって修飾されてもよい。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、及びアミノ末端又はカルボキシル末端をはじめとするペプチド中のどの場所にも生じてもよい。所与のペプチド中の幾つかの部位に同程度又は異なる程度で同じタイプの修飾が存在してもよいことが理解される。また、所与のペプチドは多種類の修飾を含んでもよい。修飾にはアセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド誘導体又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノ化、硫酸化、アルギニン付加などのトランスファーＲＮＡ介在性のタンパク質へのアミノ酸付加、及びユビキチン化が含まれる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ第２版、Ｔ．  Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ著、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社、ニューヨーク、１９９３年、及びＰｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｂ．  Ｃ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク、１９８３年内のＷｏｌｄ  Ｆ著、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ、１〜１２頁、Ｓｅｉｆｔｅｒら著、「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｆａｃｔｏｒｓ」、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．誌、（１９９０年）第１８２巻：  ６２６〜６４６頁、及びＲａｔｔａｎら著、（１９９２年）、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ」、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ誌、第６６３巻：  ４８〜６２頁を参照されたい。
【００２７】
本明細書において使用される「試料」又は「生体試料」とは、哺乳類動物（好ましくはヒト）から取り出された組織又は体液であって、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含むか又はＣＤ８＋Ｔ細胞を含むと考えられるものを指す。試料は、血液及び／又は血液分画物であってよく、試料には末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料又は血液（例えば、全血、血漿、血清）のような末梢血液試料、骨髄細胞試料、又は脳脊髄液（ＣＳＦ）が含まれる。試料は脳組織の生検試料であってもよい。試料にはリンパ球、胸腺、膵臓、眼、心臓、肝臓、神経、腸、皮膚、筋肉、軟骨、靭帯、滑液、及び／又は関節を含むがこれらに限定されない目的のあらゆる特定の組織／器官が含まれてもよい。これらの試料は、健康な個体又は望ましくない免疫応答を引き起こしている細胞、組織、及び／若しくは器官を有する個体を含むあらゆる個体から獲得できる。そのような試料を獲得する方法は、免疫学及び医学の当業者によく知られている。それらの方法には日常的な手法を用いた血液及び血液成分の採取及び処理、又は標準的な医術を用いた骨髄又は他の組織若しくは器官からの生検試料の獲得が含まれる。
【００２８】
Ｔ細胞は体全体における炎症の主な調節因子である。慢性炎症は様々なヒト疾患の重要な寄与因子として認識されることが増えており、Ｔ細胞の誤調節がこの慢性炎症を助長する。メモリーＣＤ８サブセットは加齢と共に異常増殖し、脳を含む幾つかの組織で増加する。しかしながら、これらの増殖は加齢中の実験動物では稀にしか起こらず、その機能的な帰結は持続的な胸腺活性によっても相殺される。
【００２９】
恒常性増殖は自己抗原及び／又はサイトカインの認識に依存することが一般的であり、したがって自己免疫を促進し得る。異常自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞は個々の加齢性炎症性疾患の発症又は進行に寄与すると考えられている。
【００３０】
本明細書では、一般的な実験げっ歯類モデルの限界を乗り越えるため、加齢に関連したＣＤ４４ｈｉＣＤ１２３＋ＣＤ１２７ｈｉＫＬＲＧ１＋ＣＤ１０３＋常在性メモリー表現型を得るための胸腺欠損マウスへの注入によりＣＤ８＋Ｔ細胞の恒常性増殖を誘導する。それにより生じた人為的恒常性増殖性（ｈｉＴ）細胞は、シグネチャ加齢性表面マーカーの変化とＴＣＲＶβ鎖クロナリティーを示すだけでなく、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）及びドーパクロムタウトメラーゼ／Ｔｒｐ−２を含む中枢神経系の自己抗原に対する反応性も示し、それによりｈｉＴ細胞レシピエントにおける神経病理学研究が可能になる。正常ＣＤ８＋ＴＲＭ細胞と同様に、これらの人為的恒常性増殖性常在性メモリー（ｈｉＴＲＭ）細胞は脳に多く存在し、驚くべきことに脳ではそれらの細胞は、（ｉ）ＡＰＰ切断産物の増加、（ｉｉ）脳内のびまん性βアミロイド（Ａβ）斑、（ｉｉｉ）神経細胞中の原線維封入体、（ｉｖ）神経炎症、及び（ｖ）加齢による認知障害を含む進行性の神経疾患症状の原因となる一方、神経細胞、シナプスマーカー、及び脳量の減少の原因となる。早期ｈｉＴは、ヌードマウスにおいて神経変性及び認知障害の原因となる炎症促進機能を示す。ＣＤ１０３欠損を介した脳でのＣＤ８＋Ｔ細胞の減少は、免疫正常マウスにおいて加齢性認知機能低下を抑制する。また、アルツハイマー病の脳、及び認知障害の患者の血液中の両方でｈｉＴＲＭエピトープ特異性が変化したが、このことはヒトの疾患性の認知機能低下と加齢性の認知機能低下におけるこのエピトープの関与を示している。
【００３１】
組成物
様々な実施形態において、本発明は、病的神経変性を含む加齢性神経変性の予防又は治療のための組成物を提供する。この組成物には、ＣＤ１０３阻害剤、ＣＤ８＋ＴＲＭのエフェクター分子阻害剤、及び／又は免疫寛容原性ワクチンが含まれる。本明細書において使用される「予防」には、上記疾患又は症状を有する可能性を低下させること、又はその発症を遅らせることが含まれるがこれらに限定されない。
【００３２】
ＣＤ１０３はインテグリンαＥとしても知られ、ヒトではＩＴＧＡＥ遺伝子によってコードされ、且つ、インテグリンαＥβ７のαサブユニット（ＣＤ１０３としても知られる）であるインテグリンタンパク質である。ＣＤ１０３は、肺、腸、及び皮膚を含む末梢非リンパ系組織などの組織に安定して存在する組織常在性メモリーＴ（ＴＲＭ）細胞と呼ばれるサブタイプのメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を限定し、それらの場所でそれらの細胞は持続性のウイルス感染症に対して非常に防御的な局所免疫応答を組織する。
【００３３】
幾つかの実施形態では、ＣＤ１０３阻害剤は、抗ＣＤ１０３抗体又はその抗体の抗原結合断片である。神経変性の予防又は治療用の抗ＣＤ１０３抗体の例としては、（１）クローンＢｅｒ−ＡＣＴＢに由来するＰＥ抗ヒトＣＤ１０３抗体（ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ［登録商標］）、（２）クローン２Ｇ５．１に由来するマウス抗ヒトＣＤ１０３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ＢＩＯＲＡＤ［登録商標］）又は２Ｇ５．１のヒト化抗体、（３）抗ラットＣＤ１０３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるＯＸ−６２又はＯＸ−６２のヒト化抗体、及び（４）クローン２Ｅ７由来の抗マウスＣＤ１０３モノクローナル抗体（ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ［商標］）又は２Ｅ７のヒト化抗体が含まれる。
【００３４】
他の実施形態では、ＣＤ１０３阻害剤は、ＣＤ８＋ＴＲＭに対するＣＤ１０３の活性を阻害する小分子である。さらに別の実施形態では、ＣＤ１０３阻害剤は、ＣＤ１０３に対応するＤＮＡ又はｍＲＮＡをサイレンシング又は切断する核酸である。別の実施形態では、ＣＤ１０３阻害剤は、ＣＤ１０３の細胞質ドメインに少なくとも結合するタンパク質であるパキシリンである。
【００３５】
幾つかの実施形態では、ＣＤ８＋ＴＲＭのエフェクター分子阻害剤は、加齢性認知機能低下、病的神経変性、又はそれらの両方の治療、抑制、その重症度の低下、又はその予防の促進のために投与され、このエフェクター分子阻害剤は、ＡＰＰ特異的ＣＤ８＋ＴＲＭ変換エフェクターＴ細胞が放出するパーフォリン１、インターフェロンγ、又は他の炎症性サイトカインの活性を阻害する、又はその発現レベルを減少させる小分子、抗体若しくは抗体の断片、又は核酸である。一態様によると、パーフォリン１阻害剤が投与され、このパーフォリン１阻害剤にはジアリールチオフェン及びＧＳＫ２１２６４５８が含まれるが、これらに限定されない。別の態様によると、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）阻害剤が投与され、このＩＦＮγ阻害剤にはメソプラム及びロカグラミドが含まれるが、これらに限定されない。
【００３６】
さらに他の実施形態では、免疫寛容原性ワクチンには、アミロイド前駆タンパク質又はそのペプチドの有効量を送達するワクチンが含まれ、このペプチドには配列番号２〜８のペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
医薬組成物
様々な実施形態において、本発明は、加齢性神経変性の予防又は治療のための医薬組成物を提供する。この医薬組成物には、ＣＤ１０３阻害剤、ＣＤ８＋ＴＲＭのエフェクター分子阻害剤（例えば、パーフォリン１阻害剤及びＩＦＮγの阻害剤など）、及び／又は免疫寛容原性ワクチンと、薬学的に許容可能な賦形剤と、が含まれる。一実施形態では、ＣＤ１０３阻害剤は抗ＣＤ１０３抗体である。別の実施形態では、エフェクター分子にはパーフォリン、インターフェロンγ、又は他の炎症性サイトカインが含まれる。さらに別の実施形態では、免疫寛容原性ワクチンにはＡＰＰ、又は配列番号２〜８のペプチドなどのＡＰＰペプチドが含まれる。
【００３８】
本発明の医薬組成物は、あらゆる薬学的に許容可能な賦形剤を含むことができる。「薬学的に許容可能な賦形剤」とは、一般的に安全、無毒、且つ、望ましい医薬組成物の調製に有用である賦形剤を意味しており、ヒト向けの製薬で使用するのに許容され、同様に獣医学にも許容される賦形剤が含まれる。そのような賦形剤は固体、液体、半固体、又はエアロゾル組成物の場合では気体であってよい。賦形剤の例としては、デンプン、糖、ミクロクリスタリンセルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、着色剤、剥離剤、被覆材、甘味剤、着香剤、芳香剤、保存剤、抗酸化剤、可塑剤、ゲル化剤、増粘剤、硬化剤、凝結硬化剤、懸濁化剤、界面活性剤、保水剤、担体、安定化剤、及びそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
様々な実施形態において、本発明の医薬組成物は、どの投与経路を介した送達向けに製剤されてもよい。「投与経路」とは、当技術分野において知られているいずれかの投与経路のことであってよく、これにはエアロゾル、経鼻、経口、経粘膜、経皮、非経口、又は腸内が含まれるが、これらに限定されない。「非経口」とは、一般的に注射に関連する投与経路のことであり、これには眼窩内、点滴、動脈内、嚢内、心臓内、皮内、筋肉内、腹膜内、肺内、脊髄内、胸骨内、髄腔内、子宮内、静脈内、クモ膜下、嚢下、皮下、経粘膜、又は経気管が含まれる。非経口経路を介する場合、組成物は、点滴又は注射用の溶液又は懸濁液の形態であってよく、凍結乾燥した粉剤であってもよい。非経口経路を介する場合、組成物は点滴又は注射用の溶液又は懸濁液の形態であってよい。腸内経路を介する場合、医薬組成物は、制御放出を可能にする錠剤、ゲルカプセル剤、糖衣錠剤、シロップ剤、懸濁液、溶液、粉剤、顆粒剤、乳剤、マイクロスフィア若しくはナノスフィエア、又は脂質ベシクル又は高分子ベシクルの形態であり得る。これらの組成物は注射によって投与されることが典型的である。これらの投与方法は当業者に知られている。
【００４０】
本発明に係る医薬組成物は、あらゆる薬学的に許容可能な担体を含むことができる。本明細書において使用される「薬学的に許容可能な担体」とは、１つの組織、器官、又は体の部分から別の組織、器官、又は体の部分への目的化合物の運搬又は輸送に関与する薬学的に許容可能な材料、組成物、又はベヒクルのことである。例えば、この担体は、液体又は固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、又は封入材料、又はこれらの組合せであってよい。この担体の各成分は、上記製剤の他の成分と適合しなくてはならないという点で「薬学的に許容可能」でなくてはならない。この担体は、この担体が接触し得るあらゆる組織又は器官と接触した状態で使用することにも適切でなくてはならず、このことはこの担体が毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、又はこの担体の治療上の利益よりも著しく勝る他のあらゆる合併症のリスクを持っていてはならないことを意味している。
【００４１】
本発明に係る医薬組成物は、経口投与用のカプセル剤に、錠剤に、又は懸濁液若しくはシロップ剤にも製剤可能である。薬学的に許容可能な固体又は液体の担体は、上記組成物を増強又は安定化するために、又は上記組成物の調製を容易にするために添加される場合がある。液体担体としては、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、グリセリン、生理食塩水、アルコール、及び水が挙げられる。固体担体としては、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウム又はステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシアガム、寒天、又はゼラチンが挙げられる。上記担体は、持続放出物質（例えば、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなど）を単体で、又はワックスと共に含んでもよい。
【００４２】
医薬調製物は、錠剤剤形については、必要に応じて粉砕、混合、造粒、及び打錠を伴い、又は硬質ゼラチンカプセル剤形については粉砕、混合、及び充填を伴う従来の製薬技術に従って作製される。液体担体を使用する場合、上記製剤はシロップ剤、エリキシル剤、乳剤剤、又は水性若しくは非水性の懸濁液の剤形である。このような液体製剤は、そのまま経口投与されても、軟質ゼラチンカプセルに充填して投与されてもよい。
【００４３】
本発明に係る医薬組成物は、治療有効量が送達される場合がある。この正確な治療有効量とは、所定の対象における治療効力に関して最も有効な結果を生じる組成物量である。この量は、治療化合物の特徴（活性、薬物動態学、薬力学、及び生物学的利用率を含む）、対象の生理的状態（年齢、性別、疾患の種類とステージ、一般健康状態、所与の投与量に対する応答性、及び薬品の種類を含む）、薬学的に許容可能な担体又は製剤中の担体の性質、及び投与経路を含む（がこれらに限定されない）様々な因子に応じて変わる。医療分野及び薬理学分野の当業者は日常の実験を通して、例えば、化合物の投与に対する対象の応答をチェックし、そしてそれに応じて投与量を調節することにより治療有効量を決定することができる。その他の指針についてはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ著、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ編、第２０版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ社、ペンシルバニア州、米国）（２０００年）を参照されたい。
【００４４】
循環半減期を増加させるための別の薬品送達系はリポソームである。リポソーム送達系の調製方法は、Ｇａｂｉｚｏｎら著、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ誌、（１９８２年）第４２巻：４７３４頁、Ｃａｆｉｓｏ著、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ誌、（１９８１年）第６４９巻：１２９頁、及び  Ｓｚｏｋａ著、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｅｎｇ誌、（１９８０年）第９巻：４６７頁において考察されている。他の薬品送達系が当技術分野において知られており、例えばＰｏｚｎａｎｓｋｙら著、ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ  （Ｒ．  Ｌ．  Ｊｕｌｉａｎｏ編、オックスフォード、ニューヨーク、１９８０年）、２５３〜３１５頁、Ｍ．  Ｌ．  Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ著、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｖｓ誌、（１９８４年）第３６巻：２７７頁に記載されている。
【００４５】
液体医薬組成物の調製後に、この液体医薬組成物は、分解防止と無菌状態の維持のために凍結乾燥される場合がある。液体組成物の凍結乾燥方法は当業者に知られている。追加の成分を含んでいてもよい無菌希釈液（例えば、リンゲル液、蒸留水、又は無菌生理食塩水）でこの組成物を使用直前に再構成する場合がある。再構成して当業者に知られる方法を用いてこの組成物を対象に投与する。
【００４６】
キット
一実施形態では、キットは、生体試料からＣＤ１０３陽性ＣＤ８＋ＴＲＭ集団を特定、単離、及び／又は濃縮するために必要な構成要素を含む。本実施形態の別の態様では、キットは、陽性対照及び／又は陰性対照、及び／又は本キットの内容物を使用することによりＣＤ１０３陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞を特定、単離、及び／又は濃縮するための指示書をさらに含んでいてもよい。本実施形態のさらに他の態様では、本キットは、培養容器（例えば、ディッシュ又はフラスコ）、培地、又は細胞の増殖の促進に有用なあらゆる必要な緩衝液、因子をさらに含んでいてもよい。
【００４７】
別の実施形態では、キットは、生体試料からＣＤ８Ａ陽性、ＣＤ４４陽性、及びＣＤ１０３陽性のＣＤ８＋ＴＲＭ集団を特定、単離、及び／又は濃縮するために必要な構成要素を含む。本実施形態の別の態様では、キットは、陽性対照及び／又は陰性対照、及び／又は本キットの内容物を使用することによりＣＤ８Ａ陽性、ＣＤ４４陽性、及びＣＤ１０３陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞を特定、単離、及び／又は濃縮するための指示書をさらに含んでいてもよい。本実施形態のさらに他の態様では、本キットは、培養容器（例えば、ディッシュ又はフラスコ）、培地、又は細胞の増殖の促進に有用なあらゆる必要な緩衝液、因子をさらに含む場合がある。
【００４８】
取扱説明書が本キットに含まれていてもよい。「取扱説明書」とは、対象の加齢性神経変性の治療、その重症度の低下、抑制、又は予防などの所望の帰結をもたらすために本キットの構成要素を使用する上で用いられる技法について説明する明確な表現を含んでいることが典型的である。所望により、本キットは、他の有用な構成要素、例えば測定装置、希釈剤、緩衝液、薬学的に許容可能な担体、注射筒、又は当業者が容易に理解するような他の有用な道具も含む。
【００４９】
様々な実施形態により、ＣＤ８Ａ陽性、ＣＤ４４陽性、及びＣＤ１０３陽性のＣＤ８＋ＴＲＭの検出又はＣＤ８＋ＴＲＭ上でのその他のバイオマーカーの検出が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）技法に基づくフローサイトメトリー分析を用いて実施される。ＦＡＣＳフローサイトメトリー分析の詳細な標準操作手順は実施例２において提示されている。
【００５０】
使用方法
病的神経変性になりやすい、又は病的神経変性になっている対象を特定する方法は、その対象の末梢血液中でのＣＤ１０３陽性常在性メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８＋ＴＲＭ）の存在の増加を検出することを含む。その他の態様によると、対象は少なくとも６５歳の年齢のヒト対象であり、血液中のＣＤ８Ａ陽性、ＣＤ４４陽性、及びＣＤ１０３陽性のＣＤ８＋ＴＲＭのレベル上昇について検出される。
【００５１】
記憶障害又は加齢性神経変性を有する対象におけるＣＤ１０３陽性ＣＤ８＋ＴＲＭを定量する方法であって、上記対象に由来する生体試料中のＣＤ１０３陽性ＣＤ８＋ＴＲＭ細胞の量を検出することを含む方法も提供される。幾つかの実施形態では、この方法は、ＣＤ１０３陽性ＣＤ８＋ＴＲＭ細胞の量を基準値と比較することをさらに含む。
【００５２】
生体試料中の様々な検出方法が利用可能であり、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング分析、酵素結合免疫吸着アッセイ、免疫沈殿、ＵＶ分光光度計、クロマトグラフィー、マススペクトロメトリー、免疫組織化学染色、及び画像撮影を含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
定量アッセイ又は定量方法の基準値は、１人の対照被検者（例えば、記憶障害又は神経変性のいかなる症状も無い健康な対象）から得られた値、又は複数のこのような対照被検者のプールから得られた値であり得る。他の実施形態では、基準値は、記憶障害の症状が全くないか、又は記憶障害の症状がほとんど見られない若齢の時の対象自身の数値であり、現在の値がその基準値を超える場合には、高リスク、その症状の治療の必要性、又は準最適な治療結果を判定するための基準として使用される。さらに別の実施形態では、基準値は、記憶障害又は神経変性の治療前の対象自身の数値であり、治療の効力を判定するための基準として使用される。
【００５４】
必要とする対象において、加齢性認知機能低下、病的神経変性、又はそれらの両方を治療する、抑制する、その重症度を低下させる、又はその予防を促進するための方法が提供される。この方法は、ＣＤ１０３阻害剤、常在性メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８＋ＴＲＭ）から生じるエフェクターＴ細胞阻害剤、及びＣＤ８＋ＴＲＭから生じる上記エフェクターＴ細胞から放出される分子の阻害剤のうちの１種類又は複数種類の治療有効量を、上記対象に投与することを含む。幾つかの実施形態では、この方法におけるＣＤ１０３阻害剤は抗ＣＤ１０３抗体であり、常在性メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞から生じるエフェクターＴ細胞の阻害剤にはパーフォリン１の阻害剤又はＩＦＮγの阻害剤が含まれる。一態様によると、この投与によりＡＰＰペプチド（例えば、配列番号８のペプチド）へのＣＤ８＋ＴＲＭ又はそれに由来するエフェクターＴ細胞の反応又は結合が、１人の対照被検者（例えば、記憶障害又は神経変性のいかなる症状も無い１人の健康な対象）で得られたものと比較して、又は複数のこのような対照被検者のプールから得られたものと比較して減少する。別の態様によると、この投与により、ＡＰＰペプチド（例えば、配列番号８のペプチド）へのＣＤ８＋ＴＲＭ又はそれに由来するエフェクターＴ細胞の反応又は結合が、記憶障害の症状が全く見られないか、又は記憶障害の症状がほとんど見られない若齢の時の対象自身の数値と比較して減少する。
【００５５】
必要とする対象における加齢性認知機能低下、病的神経変性、又はそれらの両方を治療する、抑制する、その重症度を低下させる、又はその予防を促進するための方法も提供される。この方法は、アミロイド前駆タンパク質又はそのペプチド断片（例えば、配列番号２〜８のペプチドのうちのいずれか）を送達する免疫寛容原性ワクチンの治療有効量を上記対象に投与することを含む。
【００５６】
加齢性認知機能低下又は病的神経変性になりやすい、又はなっているヒト対象を特定する方法であって、短期又は長期の記憶の喪失、集中力維持能力の低下、及び課題解決能力の低下のうちの１又は複数の症状を有するヒト対象から得られた得血液試料中のＣＤ１０３＋常在性メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８＋ＴＲＭ）の存在の増加を検出することを含む上記方法が提供される。この方法の一態様によると、ＣＤ１０３＋ＣＤ８＋ＴＲＭの存在の増加は、上記１又は複数の症状のいずれも有しない１人の健康なヒト対象又は複数の健康なヒト対象のプールから得られた値と比較される。別の態様によると、このヒト対象は少なくとも６５歳、又は少なくとも５０歳、５５歳、又は６０歳である。
【００５７】
様々な実施形態において、上記方法における対象はヒトである。幾つかの実施形態では、ヒト対象は、中年期かそれ以降、例えば３０歳以降、３５歳以降、４０歳以降、４５歳以降、５０歳以降、５５歳以降、６０歳以降、６５歳以降、７０歳以降、７５歳以降、８０歳以降、８５歳以降、９０歳以降、又は９５歳以降である。他の実施形態では、ヒト対象は、以前にもＣＤ１０３陽性ＣＤ８＋ＴＲＭ細胞の記録を示したことがある。
【００５８】
様々な実施形態において、上記の方法及び組成物のうちの１又は複数における加齢性認知機能欠損、病的神経変性、又は記憶障害などには、健忘症又は短期記憶若しくは長期記憶の喪失、集中力維持能力の低下、課題解決能力の低下、多発性硬化症、パーキンソン病、及びアルツハイマー病の症状が含まれる。
【００５９】
動物モデルなど
ヒトの認知機能低下の候補治療薬、予防薬、及び／又は診断薬を特定及び／又はスクリーニングするための系であって、げっ歯類動物（例えばマウス）から得られるＣＤ４４ｈｉＣＤ１２３＋ＣＤ１２７ｈｉＫＬＲＧ１＋ＣＤ１０３＋常在性メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞表現型を含む上記系が提供される。幾つかの実施形態では、このＣＤ４４ｈｉＣＤ１２３＋ＣＤ１２７ｈｉＫＬＲＧ１＋ＣＤ１０３＋常在性メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞表現型は、胸腺欠損マウスに常在性メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を投与することによって得られる。
【００６０】
ヒトでの加齢性神経変性の治療又は予防のための候補薬剤を特定及び／又はスクリーニングする方法は、候補薬剤をインビトロでＣＤ４４ｈｉＣＤ１２３＋ＣＤ１２７ｈｉＫＬＲＧ１＋ＣＤ１０３＋常在性メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞と接触させること、又はＣＤ４４ｈｉＣＤ１２３＋ＣＤ１２７ｈｉＫＬＲＧ１＋ＣＤ１０３＋常在性メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を含むモデル動物に候補薬剤を投与することにより、ＣＤ１０３陽性常在性メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の減少レベル、これらの細胞のエフェクター分子の減少レベル、又は上記動物の末梢系から脳へのＣＤ８＋Ｔ細胞の移動量の減少を特定することを含む。
【実施例】
【００６１】
以下の実施例は本出願で請求される発明をより良好に例示するために提示されるものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。具体的な材料の言及について、それは単に例示を目的としたものであり、本発明を制限することを意図してはいない。当業者は発明力を発揮せずとも、且つ、本発明の範囲から逸脱せずに同等の方法又は反応物質を開発することができる。
【００６２】
実施例１．異常常在性メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞は病的神経変性及び加齢性認知機能低下をもたらす
ＣＤ８＋Ｔ細胞恒常性増殖は少数のＴ細胞の関数（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）であり、加齢と共に徐々に起こるだけでなく、若齢のＴ細胞欠損宿主に注入されると急速に起こる（２０、２１）。この現象は、加齢性のＣＤ８＋Ｔ細胞の機能異常に関連することが立証されていることを前提として、この誘導可能な現象によりアルツハイマー病などの疾患における異常ＣＤ８＋Ｔ細胞の役割の明快な検証が可能になった。ヌードマウスへの注入による自発的恒常性誘導により、疾患のある加齢マウスにおける異常と区別できない分子的な異常、表現型の異常、及び機能上の異常を示すＣＤ８＋Ｔ（「ｈｉＴ」）細胞が均一に誘導されることが分かった。これらのｈｉＴ細胞は脳に局在し、脳においてそれらの細胞は最終的に、ＦＡＤ変異遺伝子導入動物で失われている顕著な疾患特徴を含むアルツハイマー病様の神経変性症状を助長する。ヒトのアルツハイマー病の脳ではｈｉＴ細胞関連評価指数も上昇した。加齢及びリスク因子により誘導されるアルツハイマー病様症状に対するマウスの抵抗性を凌駕する加齢性免疫細胞プロセスが我々の研究により特定されている。これらの発見は、孤発性アルツハイマー病のモデル化、病因の追求、及び治療と同様にマウスにおける加齢性疾患のモデル化にも重要な意味を有している。
【００６３】
材料及び方法
動物対象
１２時間明期／１２時間暗期サイクルでの標準的な条件下にある無病原体動物飼育施設内で、雌のＣ５７ＢＬ／６、Ｂ６．Ｆｏｘｎ１マウス並びに類遺伝子性及び／又は同一遺伝子性ノックアウト系統（ジャクソン・ラボラトリーズ）を自由に飲食させて飼育した。レシピエント動物は、８〜１０週齢の雌Ｂ６．Ｆｏｘｎ１マウス（ｎ＞５匹）、Ｂ６．Ｆｏｘｎ１−ＡｐｐＫＯマウス（ｎ＞４匹）、又はＢ６．ＣＤ４５．１類遺伝子性マウス（ｎ＞５匹）であり、ドナーは同じ系統の５〜８週齢の雌であった。実験当たり５匹を超えるドナーのプール化により、細胞源を無作為にした。若齢（８〜１０週間）及び高齢（１５か月）の雄及び雌のＣ５７ＢＬ／６及びＢ６．ＣＤ１０３−ノックアウトマウス（若齢マウスはｎ＝１２匹、高齢マウスはｎ＝７〜８匹）を使用して加齢性認知機能低下を研究した。ドナー動物、レシピエント動物、及び未処理動物はシダースサイナイ・メディカルセンターの比較医学科の無病原体施設内で飼育され、全ての育種と遺伝的スクリーニングはジャクソン・ラボラトリーズ（バーハーバー、メイン州）で実施された。
【００６４】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入
抗ＣＤ８イムノビーズ（ミルテニーバイオテク、サニーベール、カリフォルニア州）を使用して、雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（５〜７週齢）由来の脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞を精製した。５０μｌのＰＢＳ中の３×１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞を雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊ宿主又はＢ６．Ｆｏｘｎ１ヌードマウス宿主に静脈内注入した。注入から３週間後に脾臓リンパ球中にＣＤ８＋Ｔ細胞が５％を超える割合で定着していることによって、Ｂ６．Ｆｏｘｎ１宿主への導入効率を検証した。個々のレシピエントの間で細胞注入と対照注入を交互に行うことで処理の順序を無作為にした。その後の全ての分析について、分析を実施する調査者から群の正体と予期される結果の両方を秘匿した。
【００６５】
組織（脳、脾臓）の処理
ＰＢＳ灌流マウスから脳と脾臓を採取した。大脳縦裂（正中線）の右側まで脳の１ｍｍの切片を作製した。タンパク質の研究のために右半球を−８０℃の条件で瞬間凍結し、続いて細胞溶解緩衝液（セルシグナリング・テクノロジーズ、マサチューセッツ州）中でホモジェナイズして、細胞核を遠心分離した。１０％（重量／体積）塩ショ糖溶液及び１％（重量／体積）サルコシル塩ショ糖溶液の連続インキュベーションを用いて細胞溶解液をトリトン可溶性画分、サルコシル可溶性画分、及びサルコシル不溶性画分に分けた。左半球を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、免疫組織化学染色のために保存した。脳重量の標準化：頭蓋から脳全体を取り出し、メトラー天秤で計量する前に小脳、脳幹、及び嗅球を取り除いた。
【００６６】
ウエスタンブロット
トリトン可溶性画分細胞溶解液を１２％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌプレキャストゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で電気泳動により分離し、０．２μｍニトロセルロースにブロットした。膜をＢＳＡでブロック処理し、室温で１時間にわたって連続的に一次抗体及び二次抗体の希釈物の中でのインキュベーションと３回を超える回数の洗浄を行い、強化型化学発光基質（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス、ピッツバーグ、ペンシルバニア州）を使用して現像し、そしてアマーシャム・ハイパーフィルム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス、ピッツバーグ、ペンシルバニア州）に対する露光に供した。
【００６７】
ＥＬＩＳＡ
ホモジェナイズした脳組織の上清をトリトン可溶性画分Ａβに使用した。トリトンを使用してホモジェナイズした脳に由来する不溶性ペレットを、１０倍の体積の５Ｍグアニジン塩酸中で４時間にわたって再懸濁してグアニジン可溶性Ａβを作製した。トリトン可溶性試料及びグアニジン可溶性試料を可溶性Ａβ及び不溶性Ａβ  ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズ；グランドアイランド、ニューヨーク州）による分析の対象とした。ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  Ｐｌｕｓ３８４マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス、サニーベール、カリフォルニア州）で吸光度を読み、デルタをＧｒａｐｈｐａｄ  ＰＲＩＳＭ（グラフパッド・ソフトウェア、サンディエゴ、カリフォルニア州）で分析した。
【００６８】
フローサイトメトリー
それぞれの抗体で染色された精製済みのＴ細胞を、三色フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ  ＩＩ；ＢＤハイオサイエンス、サンノゼ、カリフォルニア州）により分析して純度を評価した。５％ＦＢＳを含むＰＢＳ中の全脾臓単一細胞懸濁液と抗体を氷上で３０分間にわたってインキュベートし、続いて５％ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄した。１００，０００〜３００，０００回のフローイベントを取得した。
【００６９】
組織染色及びウエスタン用の抗体
自由浮遊している脳切片（８〜１４μｍの厚さ）をスライド上に乗せ、室温で１時間にわたってブロック処理した。切片を、ブロッキング溶液（Ｄａｋｏ、カリフォルニア州）中の一次抗体と４℃で一晩にわたってインキュベートした。切片をＰＢＳ中で４回洗浄し、クルクミン（ＰＢＳ中に０．０１％）と共に、又はクルクミン無しでフルオロクローム結合又はビオチン結合二次抗体と９０分間インキュベートするか、又はチオフラビンＳだけ（ＰＢＳ中に１％）と共にインキュベートした。切片を洗浄し、カバーグラスを掛け、そしてＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＰｒｏＬｏｎｇＧｏｌｄ退色防止メディアを載せた。ＣＣＤカメラが付いたＺｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒＺ１（カールツァイス・マイクロイメージング）を使用して明視野像と蛍光像を得た。ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して顕微鏡像の画像分析を実施した。抗Ａβ／ＡＰＰ抗体（３週間の時点についてはＡｂｃａｍのａｂ１４２２０；他の全てについてはＣｈｅｍｉｃｏｎのクローン４Ｇ８）を免疫組織化学（ＩＨＣ）には１：５００で、ウエスタンブロット（ＷＢ）には１：１０００で使用した。抗ｐ−タウｐＳ１９９／２０２抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＩＨＣには１：５０で、ＷＢには１：１００で使用し、ホスホＰＨＦタウｐＳｅｒ２０２＋Ｔｈｒ２０５抗体（ＡＴ８）をＷＢに１：２０００で使用してＰＨＦを確認した。マーカーサイズのためにβ−アクチン（クローンＡＣ−７４、Ｓｉｇｍａ）のシグナルに対してｐ−タウのＷＢシグナルを正規化し、他の全てのマーカーの正規化にはＧＡＰＤＨを使用した。抗ＧＦＡＰ（Ｄａｋｏ）をＩＨＣとＷＢに１：２５０で使用した。抗ＮｅｕＮ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）をＩＨＣとＷＢに１：１００で使用した。抗Ｉｂａ１（Ｗａｋｏ株式会社）をＩＨＣに１：２００で使用した。抗ＣＤ８（クローン５３−６．７２、ＢＤファーミジェン）をＩＨＣには１：１００で、ＷＢには１：１０００で使用した。全ての二次抗体（ＨＲＰ、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ−４８８、−５９４、−６４７；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＩＨＣには１：２００で、ＷＢには１：２０００で使用した。マルチマーの作成と使用：自己抗原／脳抗原について構築されたエピトープ（Ｔｒｐ−２−ＤＣＴ（１８０−１８８）／Ｈ−２Ｋｂ）、及び／又は１００ｎＭ未満の予測親和性を有する（ＮｅｔＭＨＣバージョン３．４）カスタムＡＰＰエピトープのデクストラマーはＩｍｍｕｄｅｘにより作製された。
【００７０】
ガリアス銀染色
ガリアス銀染色を用いて原線維凝集体を可視化した。自由浮遊脳切片を５％過ヨウ素酸中に３分間に入れ、２回洗浄し、ヨウ化銀溶液中に１分間入れた後、０．５％酢酸中で５分間インキュベートし（２回）、蒸留水で洗浄した。切片が薄い茶色／灰色になるまで、切片を現像液中で約１０分間インキュベートし、０．５％酢酸中に５分間入れて発色を停止し、蒸留水で洗浄し、スライドグラスに載せた。染色した切片を顕微鏡観察により調査した。海馬のＣＡ２から染色された神経細胞を数え、且つ、嗅内皮質と帯状皮質の全神経細胞中の染色された神経細胞の数を三回の実験で視覚的に定量した。
【００７１】
神経細胞の計数
立体解析ソフトウェア（ステレオ・インベスティゲーター；ＭＢＦバイオサイエンス）と共に光学式分画方法を用いて、全神経細胞数の推定を行った。５０μｍの間隔の傍正中矢状連続切片をＮｅｕＮに関して染色した。Ｐａｘｉｎｏｓ及びＷａｔｓｏｎのマウス脳アトラスに基づいてＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３、及び目的の他の領域を限定した。ＲＯＩ上にグリッドを無作為に配置し、１００倍の対物レンズを使用して三次元光学ディセクタ（５０μｍ×５０μｍ×１０μｍ）内の細胞の数を数えた。各ディセクタ内で切片の上面と底面の１μｍのガードゾーンを除外した。ステレオ・インベスティゲーター・ソフトウェアを使用することで切片の厚さにより重みをつけた推定上の全数が得られ、０．１０の誤差係数が得られた。
【００７２】
行動試験
細胞又は対照の注入から３か月、６か月、及び１３か月後に、他の全ての行動試験の前にオープンフィールド試験を実施した。細胞又は対照の注入から６か月及び１１か月後に、フリンチジャンプ／恐怖条件づけすくみ行動回数を決定した。細胞又は対照の注入から１２か月後に、一回だけマウスをＳＡについて試験した。細胞又は対照の注入から１４か月後に、一回だけバーンズ迷路試験を実施した。対照群と処置群の動物での実験を交互に行うことで行動試験の順序を無作為にした。１日より多くの日数で行われる試験については試験を同時（±１．５時間）に開始し、群間でのランダム化のために早い時間の試験と遅い時間の試験を交互に行った。バーンズ迷路では群で一匹ずつの動物の間で、及び動物当たり毎日３回のトレーニング試験の各々の間で避難区画の位置を交互にする追加のランダム化を採用した。
【００７３】
バーンズ迷路（ＢＭ）試験
バーンズ迷路は、対象がやや嫌悪的な環境から逃避する手段を突き止めるために空間的手掛かりを使用することを許す空間学習作業である（すなわち、これらのマウスは空間手掛かりを使用して避難所を見つけることが求められる）。エスケープボックスの位置を学習するマウスの能力について、それらのマウスをＢＭ装置の中で９日間の期間にわたって評価した。エスケープホールは５日間のトレーニング期間にわたって各マウスに対して不変である。各マウスを４日間にわたって毎日３回試験し（３回の試行）、続いて２日間にわたって試験を行わず、７日目に再試験を行った。各試験は、３５〜６０分間の試行間間隔により分けられている。各試験は、迷路の中央に位置する底の無い立方体のスタートボックスの中に１匹のマウスを入れることで始めた。３０秒後にこのスタートボックスを持ち上げ、エスケープホールを見つけるようにマウスがスタートボックスから放たれた。天井又は室内高くに位置する２本の蛍光灯がこの試験室を照明する。各試験は最大で４分間、又はマウスがエスケープボックスに入るまで続けた。各トレーニング試験の後に、実験者は、４分間内にエスケープホールを見つけることができなかったマウスを正しいホールまで導いた。このマウスがエスケープボックスに入ると、このマウスをそのボックスの中に１分間居続けさせた。７日目の試験の後、かつ同日ではない日に、さらに２日間にわたってマウスを試験し、その試験では８日目にエスケープボックスを逆の位置に配置し、９日目には元の位置に配置しなおした。完全に同じ試験法を全ての群の全てのマウスに対して適用した。各試験の後、及び、毎日の試験の前に、あらゆる嗅覚による手掛かりを取り除くためにイソプロピルアルコールでこの迷路と全ての区画を徹底的に掃除した。
【００７４】
Ｙ迷路自発的交替行動（ＳＡ）試験
Ｙ迷路交替行動試験は、作業記憶を評価するために用いられる。不透明な黒色のアクリルでできたＹ迷路（アーム部分：長さ４０ｃｍ、幅４ｃｍ；ウォール部分：高さ３０ｃｍ）の１本のアームに動物を個々に配置することで自発的交替行動を測定し、８分間の期間でのアームへの侵入の順序と合計の侵入回数を記録した。一回だけマウスをＳＡについて試験した。
【００７５】
フリンチジャンプ／恐怖条件づけ試験
まず、フリンチジャンプ試験を用いて、処置群の間で侵害受容閾値（痛覚感度）に顕著な差が無いことを判定した。その後、パブロフ型恐怖条件づけを用いて嫌悪的事象に関する学習と記憶を評価した。装置（Ｆｒｅｅｚｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒ（商標）、サンディエゴインツルメンツ、サンディエゴ、カリフォルニア州）は、ステンレス鋼のグリッド床を有するプレキシガラスの箱（２５．４×２５．４×３１．７５ｃｍ高）から構成されていた。この箱の上部に音声刺激ユニットが配置されており、この箱の周囲に光束と光学センサが配置されていた。これらの光学センサを入力マトリックスによりコンピューターに接続し、光束の遮断を自動的に記録した。試験のために、１日目に個々のマウスをこのテストボックスの中に入れ、３分間慣れさせた。３分目に、３０秒間にわたって音を与えた。この音の停止から３０秒後に、０．５秒の足への刺激（強度＝フリンチジャンプ試験により決定されたその処置群の平均ジャンプ閾値）を与えた。その後、このマウスを箱から取り出し、２分間にわたってマウスのホームケージに戻した。このチャンバーを清掃し、この動物をチャンバーに戻し、この手順を反復した。すくみ行動監視装置により、この手順の間におけるすくみ行動（５秒異常の動作が無く、光束の遮断が生じない）回数を記録した。２日目に、以前に音刺激と足への刺激を受けた場所である同じテストボックスの中にマウスを配置することにより、その時の状況を思い出すか判定するが、このときは音刺激と足への刺激を与えなかった。１０分間にわたってすくみ行動回数を測定した。３日目に、テストボックス中に三角形のプレキシガラスの箱を入れた後に、手掛かり条件付けを測定した。マウスが以前に音声又は足への刺激を受けたことがないこの三角形のチャンバーの中にこのマウスを入れ、１分後に３０秒間にわたって音を与え、１０分間にわたってすくみ行動回数を測定した。フリンチジャンプ及び恐怖条件づけ試験の全てのデータを、初めに各群内で１日目の最初の２回のトレーニング試験の平均に対して正規化し、次に全ての実験群内でＰＢＳ対照の文脈的学習性すくみ行動の値又は手掛かり学習性すくみ行動の値に対して正規化し、対照に対するパーセントとして表し、ＡＮＯＶＡにより分析し、続いて適切な場合はニューマン・コイルス検定により分析して処置群間の差異を検出した。
【００７６】
オープンフィールド試験
１６”×１６”×１５”高の寸法の上部が開いている透明なプレキシガラスの箱からできているオープンフィールド装置内で、この試験を実施した。２本のリング状の光束と光学センサがこの箱の周囲に配置されていた。これらの光学センサを入力マトリックスによりコンピューターに接続した。各マウスをこの箱の中に入れ、光束の遮断を自動的に記録し、これを歩行運動活動の尺度として使用した。３０分間の期間にわたってこの箱の中で各マウスを試験した。
【００７７】
統計分析
９００〜１２００μｍの海馬及び皮質を含む領域について１５０μｍ間隔（別段の指示が無い限り）で、各個体に由来する６〜８枚の冠状切片におけるβアミロイド斑、ＧＦＡＰ＋、Ｉｂａ１＋、又はＰｅｒｆｏｒｉｎ１＋の細胞の細胞数又は面積（μｍ２）の定量及び立体解析計数法を分析した。各画像について同じ露光時間で特定の蛍光シグナルを捕捉し、標本の各視野の光学切片をＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪに入力し、上記のように分析した。ＡＮＯＶＡ及びウェルチ補正付きｔ検定（等分散を仮定しない）を使用するデータ分析のために、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（バージョン５．０ｂ；サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用した。全てのヒストグラムで平均＋ＳＥＭを示している。
【００７８】
ＰｒｆＫＯ−ＣＤ８群及びＩｆｎγＫＯ−ＣＤ８群の試料サイズは、０．０５のαと９５を超える信頼性を用い、予期される効果サイズに対してＰＢＳ群及び野生型ＣＤ８群の平均値と標準偏差を用いて各評価指数について先験的に算出された。その後、計算されたｎに１を超える数を足したものをＰｒｆＫＯ−ＣＤ８群とＩｆｎγＫＯ−ＣＤ８群に使用した。
【００７９】
認識できるバックグランドシグナルを含まない切片又は試料、及び各群内で各群の中央値から標準偏差の２倍よりも上、又は下の範囲にある値が、前もって除外すると決めたものに含まれる。対象の数と試薬の検証方法は表Ｓ１に記載されている。
【００８０】
研究の承認
全ての動物実験手順は、実行する前にシダースサイナイ・メディカルセンターの動物実験委員会により承認された。シダースサイナイ・メディカルセンター治験審査委員会により、カリフォルニア大学デイビス校由来の匿名化されたヒト脳標本の分析は委員会の審査から免除される、と指定された。脳標本はカリフォルニア大学デイビス校メディカルセンターの治験審査委員会による以前の承認により収集、保存、及び頒布された。
【００８１】
結果
ヌードマウスにおける「ｈｉＴ」細胞の作製
若齢（９週間未満）のＣ５７ＢＬ／Ｂ６（Ｂ６）ドナーに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞をＢ６．Ｆｏｘｎ１レシピエントに注入し、表現型分析の対象とした（図１Ａ、図１Ｈ、及び図１Ｉ）。ドナーＣＤ８＋Ｔ細胞は、３日以内に若齢のＢ６．Ｆｏｘｎ１レシピエントの血液中で急速に増殖し、その血液中でこれらの細胞は長期にわたって残留した（図１Ｊ及び図１Ｋ）。ヌードマウス宿主から野生型Ｂ６宿主又はＢ６．ＣＤ４５．２類遺伝子性［Ｂ６（Ｃｇ）］宿主に連続的に移入されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、さらに増殖することはなかった（図１Ｉ及び図１Ｋ）。Ｂ６．Ｆｏｘｎ１宿主内の人為的恒常性増殖性ドナーＣＤ８＋Ｔ細胞（「ｈｉＴ」細胞）の分析から、高齢マウスにおいてクローン性増殖を行ったＣＤ８＋Ｔ細胞と同一の表面マーカープロファイルが示された（ＣＤ１２２ｈｉ、ＣＤ１２７ｈｉ、ＣＤ４４ｈｉ、ＫＬＲＧ１ｈｉ、ＰＮＡｈｉ、ＣＤ８ｌｏ、ＣＤ１０３＋；図１Ａ〜図１Ｄ）。加齢中のヒトにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞のクローン性増殖にも同様の表現型が見られる。したがって、ＣＦＳＥ標識ＣＤ８＋Ｔ細胞は、恒常性増殖に典型的なラダー状の色素希釈物と集団の拡大を示した（図１Ｋ）。しかしながら、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子を欠失しているヌードマウス（Ｂ６．Ｆｏｘｎ１ｘＡｐｐＫＯマウス）ではこれは生じず、急速な恒常性増殖はＡＰＰに対する反応性に依存し得ることを示している。
【００８２】
ｈｉＴ細胞のクロナリティーを検討するため、本発明者らは、ＰＣＲによりＴ細胞受容体β遺伝子セグメント中の可変領域Ｄ→Ｊの再構成体を分析した。以前の報告と一致して、１２か月齢の野生型マウス中の末梢Ｔ細胞はＴＣＲＶβ鎖に何のクローン性スキューイングの証拠も示さなかったが、ヌードマウスレシピエントに注入された末梢Ｔ細胞はちょうど１０週間後にＤ１→Ｊ１とＤ２→Ｊ２というクローン性スキューイングを示した（図２Ｆ及び図２Ｇ）。若齢の野生型マウスに見られる多様なＤ→Ｊ利用と対照的に、Ｄ１→Ｊ１とＤ２→Ｊ２というクローン性スキューイングは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を注入した若齢のヌードマウスの脳でも明らかであった（図１Ｅ及び図１Ｆ）ことが重要である。このパターン高齢マウスの脳でのＤ→Ｊ利用に最もよく似ていた。
【００８３】
ＣＦＳＥ標識ドナーＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｂ６．Ｆｏｘｎ１では静脈内注入から３日後に脳実質で増加しており、これによりｈｉＴ細胞が短時間で脳へ回帰することが直接的に実証された（図２Ａ及び図２Ｂ）。フローサイトメトリーでは、野生型Ｂ６と比べて、全ＣＤ８＋Ｔ細胞はＢ６．Ｆｏｘｎ１における注入から１０週間後にほんのわずかに増加しているだけであったが（図２Ｃ）、ウエスタンでは、この時点でのＣＤ８タンパク質の増加は明白であり、生存細胞の増加を伴わない細胞流入が増加したことが示唆された（図２Ｈ）。実際、フローサイトメトリーによると、ＣＤ１０３発現を保持していたＩＦＮγ＋のＣＤ８＋Ｔ細胞及びＫＬＲＧ１＋のＣＤ８＋Ｔ細胞は両方とも、この時点でヌードマウスレシピエントの脳内で有意に増加しており、脳内においてＣＤ８＋Ｔ細胞の量的ではなく質的な変化があったことが示された（図２Ｃ）。末梢血液中のＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、チロシナーゼ関連タンパク質−２／ドーパクロムタウトメラーゼ（Ｔｒｐ−２／ＤＣＴ）及びＡＰＰを含むＭＨＣクラスＩ制限抗原に対して反応するが、後者だけが脳内で有意に増加した（図２Ｄ及び図２Ｅ）。このように、ＡＰＰエピトープに対して反応性を有するｈｉＴ細胞が、選択的にヌードマウスの脳に蓄積したので、発明者らはＡＰＰ関連症状を分析することにした（図３Ｋ）。
【００８４】
Ａβ及び神経原線維沈着
ウエスタンブロットによると、静脈内ＣＤ８＋Ｔ細胞注入から３週間後及び１０週間後に、Ｂ６．Ｆｏｘｎ１宿主の切り出された皮質及び海馬で界面活性剤可溶性ＡＰＰ及び派生切断産物（ＡＰＰＣｌ）が増加した（図３Ａ及び図２Ｉ）。Ａβ１−４０は、ＥＬＩＳＡによると２．５か月後に増加しており、１５か月後も残り（図３Ｂ）、血管系で増加したＡβは６か月の時点で観察された（図３Ｌ及び図３Ｍ）。びまん斑及びＡβ１−４０の増加が、野生型ＣＤ８＋Ｔ細胞を注入したＢ６．Ｆｏｘｎ１レシピエント（野生型ＣＤ８群のマウス）の１５か月後の海馬、嗅内皮質、及び帯状皮質で検出された（図３Ｃ及び図３Ｎ）。しかしながら、ヒトアルツハイマー病に見られる家族性の遺伝子変異を発現するマウスとは異なり、ｈｉＴ担持ヌードマウスでは、Ａβ１−４２はあまり変化せず、アミロイド斑は主に拡散しており、クルクミン又はチオフラビンＳとほとんど共染色しなかった（図３Ｃ及び図３Ｏ）。したがって、ｈｉＴ担持ヌードマウスにおけるアミロイドパチーはＡＤｔｇマウスモデルで見られるアミロイドパチーとは異なった。
【００８５】
クルクミン及びチオフラビンＳにより、Ｔ細胞注入から６か月後の野生型ＣＤ８群のマウスの歯状回内の細胞が染色された（図３Ｋ）。類似の構造体は高齢のＡＤｔｇマウス（図３Ｋ）又はタウ対らせん状細線維を示すＡＤｔｇラット（図３Ｌ）では観察されなかった。ｈｉＴ担持ヌードマウスは、神経細胞中に高リン酸化タウタンパク質からなる線維状封入体を有する可能性があることがこれにより示された。したがって、注入から１０週間後の野生型ＣＤ８担持マウスの脳では、トリトン可溶性画分のｐ−タウが約３０％増加しており、且つ、より大きなタウＰＨＦは５倍近く増加した（図３Ｅ、図３Ｆ）。ｐ−タウの増加は持続しなかったが、注入から１５か月後でのタウＰＨＦは対照よりも２．５倍高いままだった（図３Ｆ）。最も興味深いことに、銀染色細胞もこの時点で野生型ＣＤ８群のマウスの海馬、嗅内皮質、及び帯状皮質で増加した（図３Ｇ、図３Ｈ）。連続銀／免疫蛍光染色により、これらは有核のｐ−タウ＋神経細胞から生じたものであることが示されたが、無核の「ゴーストタングル」は見られなかった（図３Ｇ、図３Ｍ、及び図３Ｎ）。同時に染色されたＡＤｔｇマウスの脳は銀染色斑のみを示し（Ｔｇ２５７６マウス；図３Ｇ）、これによりｈｉＴ担持マウスにのみ銀染色細胞が確認された。これらのデータから、ｈｉＴ細胞は、実質中Ａβ４０の組織的沈着、びまん斑、及び生神経細胞中の原線維封入体を助長することが示された。
【００８６】
免疫及び神経炎症性浸潤
前脳のフローサイトメトリーからは明らかではないが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、注入から１５か月後の野生型ＣＤ８群のマウスの海馬切片において有意に増加しており、それらは偶々ｐ−タウ＋神経細胞と相互作用した（図３Ｏ及び図３Ｐ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞数は海馬の外側では増加しなかった。皮質及び海馬のＩｂａ１＋ミクログリアと活性型ＧＦＡＰ＋星状細胞も、対照と比べて野生型ＣＤ８群のマウスにおいて有意に増加した（図３Ｉ、図３Ｊ）。Ａβ斑面積率は、皮質又は海馬のアストログリア増殖よりも海馬のＣＤ８＋Ｔ細胞数とより強力に相関し、アミロイドパチーに対するＴ細胞の強い影響と一致した（図３Ｑ、図３Ｒ、及び図３Ｓ）。
【００８７】
神経細胞の喪失及び脳萎縮
Ｔ細胞注入から１５か月後に、対照と比べて、野生型ＣＤ８群のマウスにおけるＣＡ２内のＮｅｕＮ＋細胞数が減少した（図４Ａ〜図４Ｃ）。また、Ｔ細胞注入から６か月後に野生型ＣＤ８群では脳量が５％減少し、１５か月の時点で１０％の減少まで進行した（図４Ｄ）。野生型ＣＤ８群における顕著な神経細胞及びシナプスの喪失は、ウエスタンブロットでのＮｅｕＮシグナル、ドレブリンシグナル、及びシナプトフィシンシグナルの減少により確認され、それぞれ注入から１５か月後の時点で約１０％のシグナル減少を示した（図４Ｅ及び図４Ｆ）。ＮｅｕＮのウエスタンシグナルは、処置群間で脳量と有意に相関し、これにより脳の萎縮が神経細胞の喪失を反映することが示された（図４Ｇ）。
【００８８】
重度認知障害
全体的運動及び立ち上がり活動（ｏｖｅｒａｌｌ  ｍｏｔｏｒ  ａｎｄ  ｒｅａｒｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、Ｔ細胞注入から３か月後、６か月後、又は１３か月後での処置群と対照群のヌードマウスレシピエントの間で有意には異なっていなかった（図４Ｈ）。対照的に、Ｔ細胞注入から６か月後の野生型ＣＤ８では、文脈的学習に対する恐怖条件づけ応答が特異的に低下し、１１か月の時点では文脈的学習及び手掛かり学習の両方に対する応答が減少した（図４Ｉ）。これらの結果は、野生型ＣＤ８群における認知障害は早期では（文脈的ＦＣに必要な）海馬機能に限定されていたが、進行した後期では（手掛かりＦＣに必要な）海馬機能及び扁桃体機能の両方を損なうことを示唆している。同様のパターンの進行性認知機能欠損がヒトアルツハイマー病でも起こる。６か月の時点での文脈的学習成績も脳量と相関し、これによりその神経変性に対する関係性が示された。
【００８９】
認知欠損を独立して確認するために、注入から１２か月後に自発的交替行動を測定した。この試験は、２本の小路を交互に探索したいというマウスの嗜好に基づいており、以前に侵入した小路を記憶していることを必要とする。あり得る最低スコアである５０％は、小路の無作為な選択を意味しており、短期記憶が無いこと、又は嗜好性が無いことのどちらかを反映している。対照ＰＢＳ群のＳＡは、５５〜５６％であり、公開されている野生型の値（２７）と同等であるが、野生型ＣＤ８群のＳＡは５０％であった（図４Ｊ）。これが記憶又は嗜好性の欠損を反映しているのかどうかを試験するために、発明者らは海馬依存性の記憶及び学習の決定的評価法であるバーンズ迷路試験を１４か月の時点で実施した。野生型ＣＤ８群ヌードマウスは、最初の４日のトレーニング期間にわたってこの迷路の学習に何の改善も示さなかった一方、他の全ての群はかなりの改善を示した（図４Ｋ）。この初期の欠損を考慮すると、野生型ＣＤ８マウスはこの迷路の記憶保持期及び逆転学習期にも障害を有すると予期された（図４Ｌ〜図４Ｎ）。恐怖条件づけと同様に、バーンズ迷路の成績と脳量との間にも有意な相関が存在した。したがって、野生型ＣＤ８群ヌードマウスは、明白な運動機能の欠損はないが、進行性であり、重篤かつ継続的な学習及び記憶の障害を示した。
【００９０】
バーンズ迷路の成績がタウ及び／又はＡβの評価指数の上昇と関連するかどうかをさらに調査した。バーンズ迷路での低成績（中央値よりも下の合計待ち時間＝ＢＭｌｏ）は可溶性ｐ−タウの増加とは有意な関連を示さず、ウエスタンでのタウＰＨＦの増加と有意な関連を示した。対照的に、迷路の低成績は、ＥＬＩＳＡによるとトリトン可溶性のＡβ４０／Ａβ４２又はグアニジン塩酸可溶性のＡβ４０／Ａβ４２のどちらとも有意に関連することがなかった。このように、ヒトアルツハイマー病で報告されているように、野生型ＣＤ８群ヌードマウスではアミロイドパチーよりもタウオパチーが認知障害を反映した。
【００９１】
ｈｉＴ細胞介在性神経変性症状の細胞機序
ｈｉＴ細胞介在性神経変性症状に関与する機序を決定するため、それぞれＴ細胞溶解活性及び炎症促進活性の重要なエフェクターであるパーフォリン１又はＩＦＮγを欠損したノックアウトドナーに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｂ６．Ｆｏｘｎ１マウスに注入した。どちらかの遺伝子（それぞれＰｒｆ１とＩｆｎγ）を欠損するＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｂ６．Ｆｏｘｎ１レシピエントにおいて野生型と同等に増殖し（図１Ｊ）、以前の研究と一致した。それにもかかわらず、パーフォリン１欠損及びＩｆｎγ欠損のどちらのＣＤ８＋Ｔ細胞レシピエント（それぞれＰｒｆＫＯ−ＣＤ８群とＩｆｎγＫＯ−ＣＤ８群）も、可溶性Ａβ又はｐ−タウ／ＰＨＦの増加をどの時点でも示さなかった（図３Ｂ、図３Ｆ）。しかしながら、ＩｆｎγＫＯ−ＣＤ８群のマウスは、海馬及び嗅内皮質において野生型ＣＤ８群と比べてわずかにだけ減少したアミロイド斑及び銀染色細胞の蓄積を示したが、それらは帯状皮質まで広がっていなかった（図３Ｄ、図３Ｈ）。ＩｆｎγＫＯ−ＣＤ８群のマウスはアストログリア増殖及びミクログリア増殖の減少も示したが（図３Ｉ、図３Ｊ）、ＰｒｆＫＯ−ＣＤ８群とは違って、ＣＤ８＋Ｔ細胞はこれらの細胞の注入から１５か月後では有意な数で脳に存在した（図３Ｏ、図３Ｐ）。ＩｆｎγＫＯ−ＣＤ８群も注入から１５か月後の時点で、脳量とＮｅｕＮ＋細胞の両方の有意な増加を示したことが予期せぬことであった。最後に、ＰｒｆＫＯ−ＣＤ８群とＩｆｎγＫＯ−ＣＤ８群のどちらのマウスも１１〜１５か月の時点で著しく低下した認知機能を示した。したがって、ＰｒｆＫＯ−ＣＤ８群のマウスは、脳におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を含むどの基準でも病態生理学の証拠を示さなかった一方、ＩｆｎγＫＯ−ＣＤ８群のマウスは、神経変性又は認知機能低下の証拠は示さなかったものの、幾らかの分子病態生理学を維持していた。
【００９２】
加齢性認知機能低下におけるＣＤ８＋ＴＲＭ
ＣＤ８＋ＴＲＭはヌードマウスにおいて認知神経症状を引き起こしたが、免疫応答性マウスにおいてもこれらの細胞が加齢関連神経欠損を媒介するかどうかは不明であった。ＣＤ１０３は高齢マウスの脳で増加するＣＤ８＋ＴＲＭの特徴であり、その発現は脳へのＴＲＭの回帰にとって重要である。ＣＤ１０３の遺伝子欠損は主にＣＤ８＋Ｔ細胞に影響し（図５Ａ）、脳のＣＤ８含量を減少させた（図５Ｂ、図５Ｃ）ことを実証する。若齢及び高齢のＣＤ１０３欠損マウスは、加齢と共に歩行活動が低下するにもかかわらず、バーンズ迷路のトレーニング期間において野生型の相対物と同様の成績を示した（図５Ｄ、図５Ｅ）。対照的に、高齢のＣＤ１０３欠損マウスは記憶保持期及び逆転学習期においてわずかにより良好な成績を示し（図５Ｆ、図５Ｇ）、バーンズ迷路では著しくエラーの回数が減り、この系統のマウスにおける記録にある加齢による差異と逆になった（図５Ｈ）。このように、ＣＤ１０３欠損により、高齢マウスは加齢性認知機能低下から防護された。ＣＤ１０３欠損は主にＣＤ８＋Ｔ細胞に影響し、且つ、ＣＤ１０３＋細胞だけが脳内又は脳の外側で加齢と共に増加するので、これにより加齢時の認知機能低下へのＣＤ１０３＋ＣＤ８＋ＴＲＭの関与が確証される。加齢性認知機能低下は、将来の神経変性症状の強力な予測因子であるので、これによりＣＤ８＋ＴＲＭは疾患性認知症（ＡＤなど）にさらに関連付けられる。
【００９３】
ヒトのアルツハイマー病の脳におけるｈｉＴ細胞表現型、エフェクタータンパク質、及び特異性
ｈｉＴ細胞のヒトアルツハイマー病へのあり得る関連性を検討するため、ＩＦＮγが疾患リスクと関連することが既に知られているので、この疾患の脳内のパーフォリン１とＣＤ８に注目した。ウエスタン分析により予期される抗体特異性（６８〜７５ｋＤａのＰｒｆ１、３３〜３５ｋＤａのＣＤ８α）が提示され、予期された点状パターンの抗Ｐｒｆ１染色リンパ球核が提示された（図６Ｃ）。パーフォリン１とＣＤ８のウエスタンシグナルは相関し（ｎ＝６人；ｒ＝０．８１５５、Ｐ＝０．０４８）、これらの両方が、重度ではなく軽度のアルツハイマー病の患者の皮質で増加し、パーフォリン１は統計有意性に達した（図６Ｃ）。パーフォリン１：ＣＤ８シグナル比も重度アルツハイマー病の脳で著しく増加し、ｈｉＴ細胞担持マウスで観察されるリンパ球溶解組成物の長期定性的変化と一致した（図６Ｂ）。これをさらに検討するため、ｈｉＴ細胞担持マウスで増加するＴ細胞エピトープである［ＡＰＰ（４７１−４７９）］に類似のヒトＴ細胞エピトープに対して、ｐＨＬＡ−Ａ２マルチマーを作製した。抗ＣＤ８とこのマルチマー又は対照マルチマーを含む重度アルツハイマー病患者及び正常加齢患者に由来する海馬切片を染色して、エピトープ反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を定量した。陰性対照の染色を差し引くと、ＡＰＰ（４７１−４７９）に対するＣＤ８＋Ｔ細胞反応性が疾患で有意に上昇した（図６Ｅ、図６Ｆ；Ｐ＝０．００２）。ｈｉＴ細胞担持マウスのように全ＣＤ８＋Ｔ細胞レベルはこの疾患の脳において有意に上昇してはいないが、わずかに上昇した（ｎ＝１０人；１．６±０．２９対２．３±０．５５、Ｐ＝０．３１）。このように、ＡＰＰ反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ｈｉＴ細胞担持ヌードマウスの脳と同様に、重度アルツハイマー病の脳で増加した。
【００９４】
以下の表は、群の数及び検証実験を記載している。検証：ＷＢ＝ウエスタンブロット、形態＝予期される形態が組織染色で得られた、ＷＢ（吸着）＝陰性抗原吸着対照を使用するウエスタンブロットによる予期された陽性シグナル、ｈｕＡＤ＝追加の予期される形態がヒトＡＤ患者から得られた脳組織で得られた、共染色＝第２の細胞種特異的試薬（抗ＣＤ８抗体）での染色。
【表１】
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【００９５】
ｈｉＴ細胞を有するヌードマウスはヒト神経変性障害、特にアルツハイマー病との幾つかの類似性を示した。具体的には、神経炎症、銀染色（原線維）神経封入体、脳萎縮を伴うシナプスと神経細胞の喪失、及び進行性認知障害と同じく早期のＡβの蓄積と後期のアミロイド斑の蓄積が、これらのマウスで明らかであった。これらの特徴のうちには、家族性アルツハイマー病遺伝子変異を発現するだけのマウスでは見られないものもある。これらに脳萎縮を伴う神経細胞の喪失と神経原線維封入体が含まれることが最も特筆すべきことである。しかしながら、アルツハイマー病又はＦＡＤ系のマウスモデルの神経症状とｈｉＴ細胞を有するヌードマウスの神経症状との間には違いがあり、明白にＡβ４２を含まずにＡβ４０だけが増加し、且つ、アミロイド斑は圧倒的に成熟斑というよりもびまん斑であった。ヌードマウスはヒトアルツハイマー病に典型的に見られる無細胞性「ゴーストタングル」も示さなかった。
【００９６】
アイオワ型ＡＰＰ変異を有する患者は、主にＡβ４０が増加するパターンを示すが、この特徴はｈｉＴ細胞担持ヌードマウスを、大半のヒトアルツハイマー病からと同様に、大半の遺伝子導入モデルからも区別するものであった。これはｈｉＴ細胞担持ヌードマウスが顕著な血管アミロイドを示しており、その血管アミロイドが主として有するＡβ４０組成が他のＡβ種を覆い隠している可能性があることに部分的に起因する可能性がある。マウスＡβ４０は、ヒトＡβペプチドと反対のパターンであるが、Ａβ４２と比べて低下した流出速度も有しており、これによってより多くのＡβ４０が保持されることが助長されると予期される。げっ歯類動物の脳内でＡβ４２線維集合を特異的に阻害する因子がＡβ４０の優位性をさらに助長している可能性がある。一方、ゴーストタングルは成体のマウスには実質的に存在しない３Ｒタウから主に構成されているという点で他の神経原線維構造体と異なる。したがって、ｈｉＴ担持ヌードマウスとヒトアルツハイマー病との間の食い違いは、技術的な要因と種特異的な要因の組合せから説明可能である。それにもかかわらず、これらのマウスの独特の症状からヒトの疾患に対するその他の類似点が明らかになった。例えば、海馬依存性作業から扁桃体依存性作業へと進行したｈｉＴ細胞担持ヌードマウスの認知障害は、Ａβレベルよりもｐ−タウ／ＰＨＦレベルと良く相関し、且つ、複数の行動試験では脳萎縮と相関した。この背景から、早期アルツハイマー病の脳でＣＤ８とパーフォリン１の両方の増加が観察されたことは驚くべきことではなく、それはｈｉＴ担持ヌードマウスにおけるエフェクター活性を有するＣＤ８＋Ｔ細胞の増加と同様であった。また、重症の疾患におけるＡｐｐ［４７１−４７９］に対するＣＤ８＋Ｔ細胞反応性の上昇はｈｉＴ担持ヌードマウスにおけるほぼ同一のエピトープ（Ａｐｐ［４７０−４７８］）に反応するＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖と正比例した。
【００９７】
溶解性及び炎症促進性のＴ細胞エフェクター機能は、ｈｉＴ細胞担持マウスの神経病理学的特徴に別々の影響を与えた。パーフォリン１欠損は全ての神経病理学的、且つ、徴候的特徴と同様に脳におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の残留も抑制した。対照的にＩｆｎγ欠損は、早期前臨床段階のアルツハイマー病を思い起こさせる限定的な分布ではあるが、アミロイド構造体と神経原線維構造体の蓄積を許した。このことは、以前の報告に見られるようにＩＦＮγが疾患の病状を促進することを示している。ＩｆｎγＫＯ−ＣＤ８群のマウスにおけるアストログリア増殖とミクログリア増殖の欠損も別個のアルツハイマー病モデルでＩＦＮγが神経炎症を促進することを示している初期の研究と一致する。しかしながら、ＩｆｎγＫＯ−ＣＤ８群のマウスにおけるＮｅｕＮ、ドレブリン、及び脳量の予期せぬ増加は、ＩＦＮγが神経炎症と無関係に神経変性を制御する可能性もあることを示している。これらの異なる効果を考慮するとパーフォリン１＋又はＩＦＮγ＋のＣＤ８＋Ｔ細胞がそれぞれ、アルツハイマー病の発症及び進行のバイオマーカーになるかどうかを確定することが興味深くなる。
【００９８】
アルツハイマー病及びパーキンソン病にもＨＬＡ−ＤＲリスクアレルが存在することから、Ｔ細胞が神経変性の病因に大いに関わる可能性があることが示されている。また、最近の脳内のリンパ管系の発見は、脳の病態生理学におけるＴ細胞の全般的な関与に対する構造的基礎の可能性を示している。全ての研究ではないが、これまでの研究の中には、アルツハイマー病におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増加又は一般的な自己免疫疾患の特徴の増加を報告しているものもあるが、Ｔ細胞関与の本質はあまり分かっていない。溶解性自己反応性がｈｉＴ細胞誘導性神経症状に寄与する可能性があると推測することは妥当であるが、この神経症状は多発性硬化症又は実験的自己免疫性脳脊髄炎に特徴的な古典的自己免疫性神経変性とは幾つかの点で異なった。例えば、この神経症状はＣＤ４＋Ｔ細胞よりもむしろＣＤ８＋Ｔ細胞に依存的であり、ＩＦＮγ欠損によって悪化するよりもむしろ改善され、且つ、高密度の免疫浸潤を伴わなかった。さらに、ｈｉＴ担持マウスはＭＳ及びＥＡＥの明確な運動障害も欠いていた。アルツハイマー病様の神経症状と併せてこのことからｈｉＴ細胞担持ヌードマウスはＭＳ様自己免疫神経変性を示さないことが強く示されている。
【００９９】
ｈｉＴ細胞介在性神経症状は、ＦＡＤ変異と協働して真に完全なアルツハイマー病様の病理学的、且つ、徴候的プロファイルを生じる可能性があり得る。ｈｉＴ細胞担持マウスにおける完全なこの疾患様の特徴が、ヒトのＡβ（Ａｐｐ）遺伝子及び／又はタウ（Ｍａｐｔ）遺伝子のノックイン系統で獲得可能であるかということ、及び神経症状の調節における系統のバックグラウンドの全般的な役割を問うことも同様に重要になる。最も重要なことに、孤発性アルツハイマー病、その疾患の前駆状態、及びリスク因子に類似するｈｉＴ細胞の関連性を確証することがそれらの細胞のバイオマーカーとしての能力と病因学的な意味を考慮すると重要である。とりあえず、加齢に伴うアルツハイマー病様神経変性の発症と神経原線維封入体の発生に対するマウスの通常の抵抗性にｈｉＴ細胞が打ち勝つことが発明者らの発見から示されている。これは、加齢に伴ってアルツハイマー病様神経変性を直接的に促進する初めての孤立性の生理学的因子、且つ、初めての加齢の免疫細胞特徴である。本明細書における発見は、異常ＣＤ８＋Ｔ細胞が加齢性疾患状態で組織変性を促進することの初めての証拠である。異なる組織抗原に反応するｈｉＴ細胞が、脳又は体の他の領域に損傷を与える可能性があると考えられる。したがって、このｈｉＴモデル及び加齢性ＣＤ８＋Ｔ細胞機能異常は概して他の加齢性障害、おそらくは加齢自体の間に認められる広範囲の組織変性にも関連する可能性がある。
【０１００】
実施例２：フローサイトメトリー用のＨＬＡ−ペプチド抗原マルチマー染色の標準操作手順
原理
この手順は、ＭＨＣクラスＩ腫瘍抗原テトラマーで陽性に染色されるＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔハイブリドーマ細胞、又は培養Ｔ細胞のパーセンテージを決定するために使用される方法を説明する。ヒト対象に由来する全血若しくはＰＢＭＣ、Ｔハイブリドーマ細胞、又は培養Ｔ細胞をアリコットに分割して、Ｕ字底９６ウェルマイクロタイタープレートに入れ、続いてモノクローナル抗体（ｍＡｂ）で染色する。これらのｍＡｂである抗ＣＤ８及び抗ＫＬＲＧ１又は抗ＣＤ１０３は、高齢Ｔ細胞の亜集団の細胞表面マーカーを認識する。その後、Ｔ細胞上の抗原特異的受容体を認識するｐＨＬＡマルチマーで細胞を染色する。インキュベートした後に、これらの細胞を洗浄して未結合の試薬を除去し、フローサイトメトリーを用いてこれらの細胞を分析する。対照株によって定義されている電子的ゲート内に入る細胞のパーセンテージを用いて、腫瘍抗原テトラマーを結合しているＰＢＭＣのパーセンテージを決定する。
【０１０１】
特定の要求事項
全ての試薬と器具を使用前に滅菌する。手技中の滅菌性の維持は必要ではないが、推奨される。滅菌された器具は、ラベルが付いた製造業者による包装状態で持ち込まれた後、無菌フードの中でのみ開封及び使用される。器具はオートクレーバブル滅菌ポーチ（示唆される供給業者としてのＦｉｓｈｅｒのカタログ番号９１０１５）の中で滅菌されてもよい。全ての処理は、ヒト細胞の処理用に承認されたラミナーフローフード内で行われなくてはならない。ヒト組織の操作に対する普遍的な予防策が必要である。
【０１０２】
材料／試薬
ピペット（滅菌済み）：Ｐ２０エッペンドルフ（ＶＷＲピペット、Ｃａｌｉｂｒｉｔｅ  ＩＮＣサービス）及びＰ２００エッペンドルフ（ＶＷＲピペット、Ｃａｌｉｂｒｉｔｅ  ＩＮＣサービス）
ピペットチップ（滅菌済み、フィルター付き）：ＡＲＴ２０μｌヌクレアーゼ／パイロジェンフリーチップ（Ｆｉｓｈｅｒ、２１４９Ｐ）及びＡＲＴ２００μｌヌクレアーゼ／パイロジェンフリーチップ（Ｆｉｓｈｅｒ、２０６９）
滅菌済みダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１４０４０−１３３）
滅菌済みＦＢＳ（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ．  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、１００−１０６）
滅菌済み２％ＦＢＳと９８％ＰＢＳの溶液
ヒト抗ＣＤ８（ファーミジェン、番号不明、Ｔ−Ｎｅｕｒｏ社供給）
ヒト抗ＫＬＲＧ１（ファーミジェン、番号不明、Ｔ−Ｎｅｕｒｏ社供給）
ヒト抗ＣＤ１０３（ファーミジェン、番号不明、Ｔ−Ｎｅｕｒｏ社供給）
ヒトＨＬＡ腫瘍抗原テトラマー、ペンタマー、又はデクストラマー（Ｈｅｒ−２、Ｍａｒｔ−１、ｇｐ１００）  Ｔ−Ｎｅｕｒｏ社供給
Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ、Ｉｍｍｕｄｅｘ、様々な番号
４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、５５Ｆ−０７３０）
７０％エタノールと３０％蒸留水の溶液
滅菌済みＵ字底９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ、３５９５）
滅菌済みＦＡＣＳチューブ
クラッシュアイス用の蓋つき容器
ブリーチ用の清潔な１リットル容器
ブリーチ
【０１０３】
器具
少なくとも２個のマイクロタイタープレートアダプターを有し、１４００ｇで回転可能な冷却遠心機
ＦＡＣＳｃａｎ  ＩＩ又は他のフローサイトメーター（最低３色）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、その他）注記：ＣＲＯと連絡を取っていない場合は施設のオペレーターと事前にＦＡＣＳ操作のスケジュールを組むこと。
品質管理（内部）：適切な検査日誌及びノートに結果を記録すること。観察結果、及びＧＬＰを守る場合は手技を行っていない証人による署名を含むこと。
手続き書のフォームとチェックリストを完全に埋め、同日に研究室の責任者（品質保証責任者）による署名を受けなければならない。
ＦＡＣＳ操作日のＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターの設定の印刷物をＦＡＣＳオペレーターからもらうこと。あるいは、責任者による処理と分析についての．ｆｃｓファイルを得ること。
【０１０４】
方法
細胞表面マーカーのＦＡＣＳ染色
１．７０％エタノールで拭き掃除したＰ２００ピペットを使用し、分析するテトラマーにつき最大でＵ字底９６ウェルマイクロタイタープレートの４ウェルの各々に、ＰＢＳ／２％ＦＢＳ中に２．５×１０５細胞（最大で１×１０６細胞；全てのウェルに等価の細胞数）のＰＢＭＣ又は全血を移す（例えば２テトラマー＝４ウェル。抗ＫＬＲＧ１抗体染色だけを計画している場合、試料当たりちょうど２ウェルになる）。
注記：以下の手技は臨床検査室又はラミナーフローフードの内部で行われる必要はない。
２．臨床検査室Ｄ２０９５の中に位置する遠心分離機を使用して、上記プレートを１４００ｒｐｍで５分間にわたって遠心分離する。
３．約２５０〜５００ｍｌのブリーチを含む清潔なプラスチック製廃棄物コンテナ容器の中に中身をはじき飛ばして上清を捨てる。その後、清潔なペーパータオルの上にプレートを置いて乾かす。
４．氷が詰められたアイスコンテナに、細胞及び抗体を含む上記９６ウェルプレートを移す。
５．７０％エタノールで拭き掃除した清潔なＰ２００と滅菌済みピペットチップとを使用して、ウェル中の細胞を５０μｌの以下の抗体カクテルと再懸濁する。
ａ）５μｌの抗ＣＤ８ＡＰＣ＋５μｌの抗ＣＤ８１０３ＦＩＴＣ＋３５μｌのＰＢＳ／２％ＦＢＳ；又は他のマーカーの抗体で置き換える
ｂ）５μｌの抗ＣＤ８ＡＰＣ＋５μｌの抗ＫＬＲＧ１ＦＩＴＣ＋３５μｌのＰＢＳ／２％ＦＢＳ
分析対象である各ＨＬＡ腫瘍抗原テトラマーに対して、同じ２種類のカクテルを含むこと（例えば、２テトラマー＋最大で２系統＝合計で最大４ウェル）。細胞を暗所において３０分間にわたって氷上でインキュベートする（Ｕ字底マイクロタイタープレートに蓋をし、誰もそれをひっくり返さないようにラベルをすること）。
注記：異なる抗体カクテル投与毎に清潔なピペットチップを使用すること。
６．７０％エタノールで拭き掃除した清潔なＰ２００と滅菌済みピペットチップとを使用して、各ウェルに２００μｌのＰＢＳ／２％ＦＢＳを添加する。汚染混入がないようにウェル毎に清潔なチップを使用すること。
７．ブレーキを高にしてプレートを１４００ｒｐｍで５分間にわたって遠心分離する。
８．約２５０〜５００ｍｌのブリーチを含む清潔なプラスチック製廃棄物コンテナ容器の中に中身をはじき飛ばして上清を捨てる。その後、清潔なペーパータオルの上にプレートを置いて乾かす。
９．７０％エタノールで拭き掃除した清潔なＰ２００と滅菌済みピペットチップとを使用し、予めインキュベートされたウェルを上記３種類の抗体カクテルの各々と各ＨＬＡ腫瘍抗原テトラマー溶液（分析するテトラマーにつき１ウェル；２テトラマー＝合計２ウェル）で以下のように再懸濁する。
ｃ）５μｌのＨＬＡ−ＡＰＰ−ＰＥ＋３５μｌのＰＢＳ／２％ＦＢＳ＝１ウェル
ｄ）５μｌのＨＬＡ−エンプティー−ＰＥ＋３５μｌのＰＢＳ／２％ＦＢＳ＝１ウェル
１０．上記細胞を暗所において３０分間にわたって室温（ちょうど２５℃）でインキュベートする（プレートに蓋をし、誰もそれをひっくり返さないようにラベルをすること）。
１１．７０％エタノールで拭き掃除した清潔なＰ２００と滅菌済みチップとを使用して、各ウェルに２００μｌの氷冷ＰＢＳ／２％ＦＢＳを添加する。汚染混入がないようにウェル毎に清潔なチップを使用すること。
１２．臨床検査室（Ｄ２０９５）の中に位置する遠心分離機を使用してブレーキを高にして、９６ウェルプレートを１４００ｒｐｍで５分間にわたって遠心分離する。
１３．約２５０〜５００ｍｌのブリーチを含む清潔なプラスチック製廃棄物コンテナ容器の中に中身をはじき飛ばして上清を捨てる。その後、清潔なペーパータオルの上にプレートを置いて乾かす。
１４．７０％エタノールで拭き掃除した清潔なＰ２００と滅菌済みピペットチップとを使用して、各ウェル中の細胞を１５０μｌの氷冷ＰＢＳ／２％ＦＢＳと再懸濁する。研和することにより再懸濁する。汚染混入がないようにウェル毎に清潔なチップを使用すること。
１５．７０％エタノールで拭き掃除した清潔なＰ２００と滅菌済みピペットチップとを使用して、上記細胞を分析用ＦＡＣＳチューブに移す。
１６．細胞の分析遅延のための選択過程（注記：全血ではなく、染色済みＰＢＭＣだけに向けた過程）
１６．１．７０％エタノールで拭き掃除した清潔なＰ２００と滅菌済みピペットチップとを使用して、９６ウェルプレート中の細胞を５０μｌの４％パラホルムアルデヒドで固定する。試料毎に異なるチップを使用し、前記チューブ内で上下するピペット操作により、上記細胞とホルムアルデヒドがよく混合されることを確実に行うこと。
１７．ＦＡＣＳ分析のリクエストフォームと共にチューブを４階のＤ４０２９まで持っていく。
１８．結果を取得し、ＦＡＣＳ分析用に割り当てられた実験室のノートブックに結果を保存し、後続の分析のためにｒａｗ．ｆｃｓファイルをダウンロードする。
結果の報告
１．オペレーターからＦＡＣＳの結果を得てから２４時間以内に、このアッセイの実行に責任のある同僚と主席研究員により全てのデータが検討され、承認を受けることになる。
２．分析されたデータは最小で５０，０００の収集イベント（２５０，０００超が好ましい）に由来するものであり、フォワードライトスキャッターとサイドライトスキャッターにより決定される生存リンパ球ゲート内の細胞の割合として提示されている。
３．後続の分析に適格であるように、ｐＨＬＡ−エンプティー（リンパ球ゲート内の０．７％超の細胞）及び抗ＣＤ８（リンパ球ゲート内の３．０％超の細胞）の両方について最小限の染色が達成されていなければならない。
４．手続き書のフォームを完全に埋め（器具使用記録の登録のためのチェックを含む）同日に研究室の責任者による署名を受けなければならない。
技術注記
１．滅菌済みの試薬と備品のみを使用すること。
２．特定のフード内でのみ作業すること。使用する１０分間前にフードのスイッチを入れること。
３．使用前に７０％エタノールでフードを拭き掃除すること。
４．フラスコ内で使用したピペットを試薬の中に戻さないこと。
５．フードから手を出すたびにグローブを交換すること。
６．いかなる血液成分を使用して作業する場合も必ずラボコート、グローブ、及び保護スリーブを着用すること。
７．細胞はフローサイトメトリーによる分析の前に最大で１週間にわたって４℃で貯蔵可能である。
【０１０５】
発明を実施するための形態の中で、本発明の様々な実施形態をこれまで説明してきた。これらの説明は、上記実施形態を直接的に説明しており、当業者は本明細書において提示及び記載されるこれらの特定の実施形態に対する改変及び／又は変形を思いつけることが理解される。この説明の範囲内に入るあらゆるこのような改変又は変形が、これらの実施形態の中に同様に含まれるものとする。特記されない限り、本発明者らは本明細書及び特許請求の範囲の中の言葉と言い回しは当該技術分野の当業者に対して通常、且つ、一般通りの意味で使用されることを意図している。
【０１０６】
本願書を出願した時点で出願者が知っていた本発明の様々な実施形態についての前述の説明をこれまで提示してきたが、それは例示と説明を目的としたものである。この説明は網羅的であることを意図したものでもなければ、本発明をまさに開示された形のものに限定することを意図したものでもなく、上記の教示に鑑みて多数の改変と変形が可能である。説明された実施形態は本発明の原理とその実際の適用を説明するのに役立ち、他の当業者が様々な実施形態で、且つ、考えられる特定の使用法に合うような様々な改変を加えて本発明を利用することを可能にするのにも役立つ。したがって、本発明は本発明を実施するために開示された特定の実施形態に限定されないものとする。
【０１０７】
本発明の特定の実施形態が提示及び記載されてきたが、本明細書内の教示に基づいて本発明と本発明のより広範囲の態様から逸脱せずに変更と改変を行うことができ、したがって、添付される特許請求の範囲がそれらの範囲内に包含され、全てのそのような変更と改変が本発明の真の主旨と範囲内にあることが当業者に明らかになる。概して、本明細書において使用される用語は概ね「開放系」の用語を意味する（例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は「含むが限定されない」と解釈されるべきであり、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は「含むが限定されない」と解釈されるべきである等）ことが当業者によって理解されることになる。
【０１０８】
本明細書において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は実施形態にとって有用である組成物、方法、及びそれらの個々の成分に言及するときに使用され、それでいて規定されていない要素を有用であるにしても有用ではないにしても包含することにも開かれている。概して、本明細書において使用される用語は概ね「開放系」の用語を意味する（例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は「含むが限定されない」と解釈されるべきであり、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は「含むが限定されない」と解釈されるべきである等）ことが当業者によって理解されることになる。含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）、又は有する（ｈａｖｉｎｇ）などの用語の類義語としての「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という開放型の用語が本発明を説明し、且つ、請求するために本明細書において使用されているが、本発明又は本発明の実施形態は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」又は「から基本的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの代替的な用語を使用して代替的に記載されることも可能である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
2021514361.tif 000014
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図３Ｏ】
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【図３Ｐ】
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【図３Ｑ】
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【図３Ｒ】
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【図３Ｓ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図４Ｌ】
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【図４Ｍ】
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【図４Ｎ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021514361.tif 000088
2021514361.tif 000089