(57)【要約】  本開示の本菌株及び方法は、変化した表現型、変化した形態、変化した増殖特性等を有する変異菌株を生じさせる、糸状菌における遺伝子改変に関する。より詳細には、本明細書に提示及び記載したように、粘性が低下した表現型を含むそのような糸状菌の変異菌株は、深部培養中における増殖のために（例えば、商業的用途の酵素及びその他のタンパク質若しくは代謝産物を大量生産するために）特に適合する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
親菌株に由来する糸状菌の変異菌株であって、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号３１、配列番号３３若しくは配列番号３５との約５０％の配列同一性を含むＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ここで前記変異菌株の細胞は親細胞と比較して粘性が低下した表現型を含む、糸状菌の変異菌株。
【請求項２】
深部培養中における好気発酵中の前記変異菌株は、（ｉ）前記親菌株の前記細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために減少した撹拌量を必要とする細胞ブロスを産生する、及び／又は（ｉｉ）予め選択された撹拌量で、前記親菌株の前記細胞と比較して増加した溶存酸素量を維持する細胞ブロスを産生する、請求項１に記載の変異菌株。
【請求項３】
ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変は、前記ＳＳＢ７タンパク質をコードする前記遺伝子の少なくとも３’領域で欠失するか、又は破壊することを含む、請求項１に記載の変異菌株。
【請求項４】
目的タンパク質をコードする遺伝子を更に含む、請求項１に記載の変異菌株。
【請求項５】
前記変異菌株は、前記親菌株と比較して、バイオマス単位量当たり実質的に同一量の目的タンパク質を産生する、請求項４に記載の変異菌株。
【請求項６】
前記変異菌株は、バイオマス単位量当たりで前記親菌株より多量の前記目的タンパク質を産生する、請求項４に記載の変異菌株。
【請求項７】
前記糸状菌は、子嚢菌門（ｐｈｙｌｕｍ  Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）の糸状菌である、請求項１に記載の変異菌株。
【請求項８】
前記糸状菌は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種真菌、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種真菌、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種真菌、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種真菌、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種真菌、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種真菌及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種真菌から成る群から選択される、請求項１に記載の変異菌株。
【請求項９】
請求項４に記載の変異菌株によって産生した目的タンパク質。
【請求項１０】
ＭＰＧ１タンパク質、ＳＦＢ３タンパク質、ＳＥＢ１タンパク質、ＣＲＺ１タンパク質及び／又はＧＡＳ１タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の遺伝子改変を更に含む、請求項１に記載の変異菌株。
【請求項１１】
前記ＳＳＢ７タンパク質をコードする前記遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１の前記ｓｓｂ７遺伝子又はその相補的配列とハイブリダイズする、請求項１に記載の変異菌株。
【請求項１２】
前記ＳＳＢ７タンパク質をコードする前記遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１９、配列番号２０若しくは配列番号２１のｓｓｂ７エキソン又はそれらの相補的配列とハイブリダイズする、請求項１に記載の変異菌株。
【請求項１３】
前記ＳＳＢ７タンパク質をコードする前記遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２２の領域Ａ、配列番号２３の領域Ｂ、配列番号２４の領域Ｃ若しくは配列番号２５の領域Ｄをコードする核酸配列又はそれらの相補的配列とハイブリダイズする、請求項１に記載の変異菌株。
【請求項１４】
前記ＳＳＢ７タンパク質をコードする前記遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記ＳＳＢ７タンパク質の保存アミノ酸配列をコードする核酸配列とハイブリダイズし、前記保存配列は、配列番号２６〜３０から成る群又はそれらの相補的配列から選択される、請求項１に記載の変異菌株。
【請求項１５】
糸状菌細胞の粘性が低下した菌株を構築するための方法であって、
（ａ）糸状菌の親菌株を入手するステップ、及び、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号３１、配列番号３３若しくは配列番号３５との少なくとも５０％の配列同一性を含むＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子を遺伝子改変するステップ、及び
（ｂ）ステップ（ａ）において産生された変異菌株を単離するステップであって、前記変異菌株の前記細胞は、前記親細胞と比較して、粘性が低下した表現型を含むステップ
を含む、方法。
【請求項１６】
深部培養中における好気発酵中の前記変異菌株は、（ａ）前記親菌株の前記細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するための減少した撹拌量を必要とする細胞ブロスを産生する、及び／又は（ｂ）予め選択された撹拌量で、前記親菌株の前記細胞と比較して増加した溶存酸素量を維持する細胞ブロスを産生する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変は、前記ＳＳＢ７タンパク質をコードする前記遺伝子の少なくとも３’領域で欠失するか、又は破壊することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記真菌細胞は、目的タンパク質をコードする遺伝子を更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記変異菌株は、前記親菌株と比較して、バイオマス単位量当たり実質的に同一量の目的タンパク質を産生する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記変異菌株は、バイオマス単位量当たりで前記親菌株より多量の前記目的タンパク質を産生する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記糸状菌は、子嚢菌門（ｐｈｙｌｕｍ  Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）の糸状菌である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記糸状菌は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種真菌、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種真菌、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種真菌、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種真菌、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種真菌、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種真菌及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種真菌から成る群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１８に記載の方法によって産生した目的タンパク質。
【請求項２４】
ＭＰＧ１タンパク質、ＳＦＢ３タンパク質、ＳＥＢ１タンパク質、ＣＲＺ１タンパク質及び／又はＧＡＳ１タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の遺伝子改変を更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＳＳＢ７タンパク質をコードする前記遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１のｓｓｂ７遺伝子又はその相補的配列とハイブリダイズする、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＳＳＢ７タンパク質をコードする前記遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１９、配列番号２０若しくは配列番号２１のｓｓｂ７エキソン又はそれらの相補的配列とハイブリダイズする、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＳＳＢ７タンパク質をコードする前記遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２２の領域Ａ、配列番号２３の領域Ｂ、配列番号２４の領域Ｃ若しくは配列番号２５の領域Ｄをコードする核酸配列又はそれらの相補的配列とハイブリダイズする、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＳＳＢ７タンパク質をコードする前記遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記ＳＳＢ７タンパク質の保存アミノ酸配列をコードする核酸配列とハイブリダイズし、前記保存配列は、配列番号２６〜３０又はそれらの相補的配列から成る群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
粘性が低下した表現型を含む糸状菌細胞の変異菌株をスクリーニング及び単離する方法であって：
（ａ）配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号３１、配列番号３３若しくは配列番号３５との少なくとも５０％の配列同一性を含むＳＳＢ７タンパク質をコードする親糸状菌株内の遺伝子を遺伝子改変するステップ、
（ｂ）前記親菌株の細胞形態と比較して、ステップ（ａ）の前記改変変異菌株の細胞形態を粘性が低下した表現型についてスクリーニングするステップ、及び
（ｃ）粘性が低下した表現型を含むステップ（ｂ）の改変変異菌株を単離するステップ
を含む方法。
【請求項３０】
深部培養中における好気発酵中の前記変異菌株は、（ａ）前記親菌株の前記細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために減少した撹拌量を必要とする細胞ブロスを産生する、及び／又は（ｂ）予め選択された撹拌量で、前記親菌株の前記細胞と比較して増加した溶存酸素量を維持する細胞ブロスを産生する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
粘性が低下した表現型を含むステップ（ｃ）の前記変異菌株は、前記親菌株と比較して、短い菌糸体を含む、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に、生物学、分子生物学、生体流動学、糸状菌、工業用タンパク質産生等の分野に関する。より特別には、本開示の本菌株及び方法は、変化した表現型、変化した形態、変化した増殖特性等を有する変異菌株を生じさせる、糸状菌における遺伝子改変に関する。より詳細には、本明細書に提示及び記載したように、そのような糸状菌の変異菌株は、深部培養中における増殖のために（例えば、商業的用途の酵素及びその他のタンパク質若しくは代謝産物を大量生産するために）特に適合する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に援用される、２０１８年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／６６１，６５８号に基づく優先権を主張するものである。
【０００３】
配列表の参照
「ＮＢ４０８０８−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と名付けられた、配列表のテキストファイルの電子的提出の内容は、２０１９年４月５日に作製され、サイズは１８４ＫＢであり、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
糸状菌は、天然及び異種タンパク質を高レベルに発現させることができ、それらを工業用、製薬用、動物の健康用、食品及び飲料用途等の目的の酵素及び他のタンパク質及び／又は代謝産物を大量生産するために特に適合させる。糸状菌は、典型的にはバイオリアクター（発酵槽）内の菌糸体用深部培養中において増殖させられ、そのバイオリアクターは、酸素及び栄養分を培養培地（即ち、培養ブロス）内に導入して分布させるために適合する。菌糸体の形態学的特徴は、培養培地（ブロス）の流動学的特性に影響を及ぼし、これによりバイオリアクターの性能に影響を及ぼす。
【０００５】
例えば、糸状菌の宿主トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）では、多数の天然及び異種タンパク質が効率的に分泌され、高い比生産性（Ｑｐ）及びグルコースの収率の両方を生じさせる。しかし、トリコデルマプロセス（即ち、一般に糸状菌）に対する能力要件は、体積生産性が低いために極めて高い。例えば、低い体積生産性は、高い培養ブロスの粘性及び酸素移動制限のためにバイオマスレベルを制限する必要によって誘発される。
【０００６】
一般に、ブロスの粘性が高いほど、酸素及び栄養分の分布が不均一になり、培養を撹拌するために必要とされるエネルギーが高くなる。例えば、一部の場合には、培養ブロスの粘性は酸素及び栄養分の溶解を有意に妨害するのに十分な程高くなり、それにより真菌の増殖及び／又は真菌の生成物産生に有害な影響を及ぼす。更に、バイオリアクター内の粘性ブロスを混合して通気するために必要とされる出力は、生産コストを有意に増大させ、動力及び電源装置に関してより高額の設備投資を招く可能性がある。従って、概して上述したように、当分野においては、改良された体積効率、強化された／一様である酸素分布、低下した細胞ブロス粘性、高比生産性、改良された炭素源の収率、減少したバイオリアクターの運転費、変化した（細胞）表現型、変化した（細胞）形態、変化した（細胞）増殖特性等を含むがそれらに限定されない多数の進行中及び満たされていないニーズが残っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書では、変化した表現型、変化した形態、変化した増殖特性等を有する変異菌株を生じさせる遺伝子改変を有する糸状菌に関連する菌株、方法、構築物等について記載する。例えば、本開示の所定の実施形態は、親菌株に由来する糸状菌の変異菌株であって、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含む変異菌株に関する。
【０００８】
従って、所定の実施形態では、本開示は、親菌株に由来する糸状菌の変異菌株であって、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号３１、配列番号３３及び配列番号３５の何れか１つとの約５０％の配列同一性を含むＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ここで変異菌株の細胞が親細胞と比較して粘性が低下した表現型を含む変異菌株に関する。従って、所定の他の実施形態では、粘性が低下した表現型を含むそのような変異菌株は、（ａ）深部培養中における好気発酵中において、親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するための減少した撹拌量を必要とする細胞ブロスを産生する、及び／又は（ｂ）予め選択された撹拌量で、親菌株の細胞と比較して増加した溶存酸素量を維持する細胞ブロスを産生する。
【０００９】
従って、他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも３’領域で欠失するか、又は破壊することを含む。他の実施形態では、遺伝子によってコードされるＳＳＢ７タンパク質は、ＳＳＢ７のＣ末端の少なくとも最後の４００アミノ酸位置の欠失、ＳＳＢ７のＣ末端の少なくとも最後の６００アミノ酸位置の欠失、ＳＳＢ７のＣ末端の少なくとも最後の８００アミノ酸位置の欠失又はＳＳＢ７のＣ末端の少なくとも最後の１，０００アミノ酸位置の欠失を含む。他の実施形態では、遺伝子によってコードされるＳＳＢ７タンパク質は、完全に欠失している。
【００１０】
従って、所定の他の実施形態では、ｓｓｂ７遺伝子は、ＳＳＢ７のＣ末端の最後の４００アミノ酸位置をコードする３’領域で破壊しており、ｓｓｂ７遺伝子は、ＳＳＢ７のＣ末端の最後の６００アミノ酸位置をコードする３’領域で破壊しており、ｓｓｂ７遺伝子は、ＳＳＢ７のＣ末端の最後の８００アミノ酸位置をコードする３’領域で破壊しており、又はｓｓｂ７遺伝子は、ＳＳＢ７のＣ末端の最後の１，０００アミノ酸位置をコードする３’領域で破壊している。
【００１１】
関連する実施形態では、親菌株及び変異菌株は、同一の目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子を含む。他の実施形態では、変異菌株は、親菌株と比較してバイオマス単位量当たり実質的に同一量の目的タンパク質を産生する。他の実施形態では、変異菌株は、バイオマス単位量当たりで親菌株より多量の目的タンパク質を産生する。
【００１２】
他の実施形態では、糸状菌は、子嚢菌門（ｐｈｙｌｕｍ  Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）の糸状菌である。他の実施形態では、糸状菌は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種真菌、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種真菌、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種真菌、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種真菌、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種真菌、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種真菌及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種真菌から成る群から選択される。
【００１３】
従って、所定の他の実施形態では、本開示は、本開示の粘性が低下した変異体によって生成される１種以上の目的タンパク質に向けられる。
【００１４】
所定の他の実施形態では、変異菌株は、ＭＰＧ１タンパク質、ＳＦＢ３タンパク質、ＳＥＢ１タンパク質、ＣＲＺ１タンパク質及び／又はＧＡＳ１タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の遺伝子改変を更に含む。
【００１５】
他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１のｓｓｂ７又はその相補的配列とハイブリダイズする。他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１９のｓｓｂ７エキソン又はその相補的配列とハイブリダイズする。他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２０のｓｓｂ７エキソン又はその相補的配列とハイブリダイズする。他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２１のｓｓｂ７エキソン又はその相補的配列とハイブリダイズする。
【００１６】
更に他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２２の領域Ａをコードする核酸配列とハイブリダイズする。他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２３の領域Ｂをコードする核酸配列とハイブリダイズする。他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２４の領域Ｃをコードする核酸配列とハイブリダイズする。他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２５の領域Ｄをコードする核酸配列とハイブリダイズする。
【００１７】
他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＳＢ７タンパク質の保存アミノ酸配列をコードする核酸配列とハイブリダイズし、保存配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号２６〜３０から成る群から選択される。
【００１８】
所定の他の実施形態では、本開示は、糸状菌細胞の粘性が低下した菌株を構築するための方法であって、（ａ）糸状菌の親菌株を入手するステップ、及び、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号３１、配列番号３３又は配列番号３５との少なくとも５０％の配列同一性を含むＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子を遺伝子改変するステップ、及び（ｂ）ステップ（ａ）において改変された変異菌株を単離するステップを含み、ここで変異菌株の細胞が親細胞と比較して粘性が低下した表現型を含む方法に向けられる。従って、関連する実施形態では、深部培養中における好気発酵中の変異菌株は、（ａ）親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するための減少した撹拌量を必要とする細胞ブロスを産生する、及び／又は（ｂ）予め選択された撹拌量で、親菌株の細胞と比較して増加した溶存酸素量を維持する細胞ブロスを産生する。
【００１９】
従って、本方法の他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも３’領域で欠失するか、又は破壊することを含む。
【００２０】
所定の他の実施形態では、遺伝子によってコードされるＳＳＢ７タンパク質は、ＳＳＢ７のＣ末端の少なくとも最後の４００アミノ酸位置の欠失、ＳＳＢ７のＣ末端の少なくとも最後の６００アミノ酸位置の欠失、ＳＳＢ７のＣ末端の少なくとも最後の８００アミノ酸位置の欠失、ＳＳＢ７のＣ末端の少なくとも最後の１，０００アミノ酸位置の欠失等を含む。本方法の他の実施形態では、遺伝子によってコードされるＳＳＢ７タンパク質は、完全に欠失している。
【００２１】
本方法の所定の他の実施形態では、ｓｓｂ７遺伝子は、ＳＳＢ７のＣ末端の最後の４００アミノ酸位置をコードする３’領域で破壊しており、ｓｓｂ７遺伝子は、ＳＳＢ７のＣ末端の最後の６００アミノ酸位置をコードする３’領域で破壊しており、ｓｓｂ７遺伝子は、ＳＳＢ７のＣ末端の最後の８００アミノ酸位置をコードする３’領域で破壊しており、ｓｓｂ７遺伝子は、ＳＳＢ７のＣ末端の最後の１，０００アミノ酸位置をコードする３’領域等で破壊している。
【００２２】
従って、所定の他の実施形態では、そのような真菌細胞は、目的タンパク質をコードする遺伝子を含む。他の実施形態では、変異菌株は、親菌株と比較してバイオマス単位量当たり実質的に同一量の目的タンパク質を産生する。他の実施形態では、変異菌株は、バイオマス単位量当たりで親菌株より多量の目的タンパク質を産生する。従って、所定の他の実施形態では、本開示は、本開示の変異菌株によって生成される目的タンパク質に向けられる。
【００２３】
本方法の所定の他の実施形態では、糸状菌は、子嚢菌門（ｐｈｙｌｕｍ  Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）の糸状菌である。他の実施形態では、糸状菌は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種真菌、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種真菌、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種真菌、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種真菌、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種真菌、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種真菌及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種から成る群から選択される。
【００２４】
本方法の他の実施形態では、変異菌株は、ＭＰＧ１タンパク質、ＳＦＢ３タンパク質、ＳＥＢ１タンパク質、ＣＲＺ１タンパク質及び／又はＧＡＳ１タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の遺伝子改変を更に含む。
【００２５】
本方法の他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１のｓｓｂ７遺伝子又はその相補的配列とハイブリダイズする。所定の他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１９のｓｓｂ７エキソン又はその相補的配列とハイブリダイズする。他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２０のｓｓｂ７エキソン又はその相補的配列とハイブリダイズする。又別の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２１のｓｓｂ７エキソン又はその相補的配列とハイブリダイズする。
【００２６】
本方法の他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２２の領域Ａをコードする核酸配列とハイブリダイズする。他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２３の領域Ｂをコードする核酸配列とハイブリダイズする。又別の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２４の領域Ｃをコードする核酸配列とハイブリダイズする。他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２５の領域Ｄをコードする核酸配列とハイブリダイズする。本方法の他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＳＢ７タンパク質の保存アミノ酸配列をコードする核酸配列とハイブリダイズし、保存配列は、配列番号２６〜３０から成る群から選択される。
【００２７】
所定の他の実施形態では、本開示は、粘性が低下した表現型を含む糸状菌細胞の変異菌株をスクリーニング及び単離するための方法であって、（ａ）配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号３１、配列番号３３又は配列番号３５と少なくとも５０％の配列同一性を含むＳＳＢ７タンパク質をコードする親真菌株内の遺伝子を遺伝子改変するステップ、及び（ｂ）ステップ（ａ）において改変された変異菌株の細胞形態を親菌株の細胞形態と比較して粘性が低下した表現型についてスクリーニングするステップ、及び（ｃ）粘性が低下した表現型を含むステップ（ｂ）の改変変異菌株を単離するステップを含み、ここで深部培養中での好気発酵中の変異菌株は、（ａ）親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素含量を維持するための減少した撹拌量を必要とする細胞ブロスを産生する、及び／又は（ｂ）予め選択された撹拌量で、親菌株の細胞と比較して増加した溶存酸素含量を維持する細胞ブロスを産生する方法に向けられる。他の実施形態では、ステップ（ｃ）の変異菌株は、それが由来する親菌株と比較して、より短い菌糸体（図２）に関連する粘性が低下した表現型を含む。
【００２８】
生物学的配列の簡単な説明
配列番号１は、配列番号２の天然ＳＳＢ７タンパク質をコードする野生型Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｓｓｂ７遺伝子の核酸配列である。
【００２９】
配列番号２は、配列番号１によってコードされた天然Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＳＳＢ７タンパク質のアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号３は、フレームシフト（ｆｓ）突然変異及びｓｓｂ７遺伝子の最後のイントロン前の未成熟終止コドンを生じさせる、エキソン２におけるＧ（ΔＧ）の欠失を含む対立遺伝子ｓｓｂ７（ｆｓ）の核酸配列である。
【００３１】
配列番号４は、配列番号３の対立遺伝子ｓｓｂ７（ｆｓ）によってコードされた変異ＳＳＢ７タンパク質のアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号５は、図６Ａに提示した合成ｇＢｌｏｃｋ核酸配列である。
【００３３】
配列番号６は、図６Ｂに提示したｓｓｂ７遺伝子のＴＳ１を標的とする合成ｇＢｌｏｃｋシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）発現カセットである。
【００３４】
配列番号７は、図６Ｃに提示したｓｓｂ７遺伝子のＴＳ２を標的とする合成ｇＢｌｏｃｋシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）発現カセットである。
【００３５】
配列番号８は、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種のＳＳＢ７タンパク質オルソログのアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号９は、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種のＳＳＢ７タンパク質オルソログのアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号１０は、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種のＳＳＢ７タンパク質オルソログのアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号１１は、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種のＳＳＢ７タンパク質オルソログのアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号１２は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種のＳＳＢ７タンパク質オルソログのアミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号１３は、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種のＳＳＢ７タンパク質オルソログのアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号１４は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＭＰＧ１タンパク質のアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号１５は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＳＦＢ３タンパク質のアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号１６は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＳＥＢ１タンパク質のアミノ酸配列である。
【００４４】
配列番号１７は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＲＺ１タンパク質のアミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号１８は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＧＡＳ１タンパク質のアミノ酸配列である。
【００４６】
配列番号１９は、野生型Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｓｓｂ７遺伝子エキソン１の核酸配列である。
【００４７】
配列番号２０は、野生型Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｓｓｂ７遺伝子エキソン２の核酸配列である。
【００４８】
配列番号２１は、野生型Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｓｓｂ７遺伝子エキソン３の核酸配列である。
【００４９】
配列番号２２は、ＳＳＢ７タンパク質領域ＡをコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【００５０】
配列番号２３は、ＳＳＢ７タンパク質領域ＢをコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【００５１】
配列番号２４は、ＳＳＢ７タンパク質領域ＣをコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【００５２】
配列番号２５は、ＳＳＢ７タンパク質領域ＤをコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）核酸配列である。
【００５３】
配列番号２６は、図９Ｃに示した保存ＳＳＢ７アミノ酸配列である。
【００５４】
配列番号２７は、図９Ｃに示した保存ＳＳＢ７アミノ酸配列である。
【００５５】
配列番号２８は、図９Ｄに示した保存ＳＳＢ７アミノ酸配列である。
【００５６】
配列番号２９は、図９Ｄに示した保存ＳＳＢ７アミノ酸配列である。
【００５７】
配列番号３０は、図９Ｅに示した保存ＳＳＢ７アミノ酸配列である。
【００５８】
配列番号３１は、Ｔ．アトロビリデ（Ｔ．ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）ＳＳＢ７タンパク質のアミノ酸配列である。
【００５９】
配列番号３２は、配列番号３３の予測ＳＳＢ７タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）（ＱＭ６ａ菌株）ｓｓｂ７遺伝子の核酸配列予測である。
【００６０】
配列番号３３は、配列番号３２によってコードされたＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）（ＱＭ６ａ菌株）予測ＳＳＢ７タンパク質のアミノ酸配列である。
【００６１】
配列番号３４は、配列番号３５の予測ＳＳＢ７タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）（ＲＵＴ−Ｃ３０菌株）ｓｓｂ７遺伝子の核酸配列予測である。
【００６２】
配列番号３５は、配列番号３４によってコードされたＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）（ＲＵＴ−Ｃ３０菌株）予測ＳＳＢ７タンパク質のアミノ酸配列である。
【００６３】
配列番号３６は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｓｓｂ７遺伝子転写産物の５’−ＵＴＲ（未翻訳領域）である。
【００６４】
配列番号３７は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｓｓｂ７遺伝子転写産物の３’−ＵＴＲ（未翻訳領域）である。
【００６５】
配列番号３８は、天然Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｎｉｋ１タンパク質のアミノ酸配列である。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本明細書に開示及び例示したｓｓｂ７対立遺伝子を示している、ｓｓｂ７遺伝子座の略図である。より詳細には、実施例のセクションに提示及び記載したように、糸状菌のそのような（即ち、変異ｓｓｂ７対立遺伝子を含む）変異菌株は、野生型ｓｓｂ７対立遺伝子を含む親（コントロール）菌株と比較して、粘性が低下した（即ち、粘性が低下した発酵ブロスを産生する）表現型／形態を含む。従って、図１Ａに示したように、ｓｓｂ７遺伝子についての予測ＳＳＢ７タンパク質コーディング配列に対応する領域（即ち、エキソン）は、イントロンの位置を示すエキソン間に引かれた線と共に、矢印として示した。様々なバージョンのｓｓｂ７についての遺伝子予測は、それらの表示名（例えば、「ＱＭ６ａ  ＪＧＩ  ｓｓｂ７  ＰＩＤ  １０８７１２」及び「ＲＵＴ−Ｃ３０  ＰＩＤ  ８２３９７」）並びに本明細書に記載した予測（「ＳＳＢ７  ＣＤＳ  （ｆｕｎａｎｎｏｔａｔｅ）」）によって示した。この遺伝子座にマッピングされたＲＮＡシーケンシングリードの要約は、カバレッジマップ（ＲＮＡリードカバレッジ）に表示した。ｆｕｎａｎｎｏｔａｔｅによって予測された５’及び３’−未翻訳領域（ＵＴＲ）は、更にそのようなものとして指示及び表示した。配列の下の各トラックは、本明細書に開示及び例示した５種の対立遺伝子（例えば、対立遺伝子ｓｓｂ７（ｆｓ）、対立遺伝子ｓｓｂ７（３１１）、対立遺伝子ｓｓｂ７（ＴＳ１）、対立遺伝子ｓｓｂ７（ＴＳ２）及び対立遺伝子ｓｓｂ７（３３９ｆｓ））を例示している。（例えば、「ｐＲＡＴＴ３１１左フランク」、「ｐＲＡＴＴ３１１右フランク」、「ｐＲＡＴＴ３３９左フランク」及び「ｐＲＡＴＴ３３９右フランク」と表示した）ボックスは、ｓｓｂ７遺伝子座のマーカー（例えば、ｐｙｒ２）の統合を標的とするために使用される相同ボックスを示し；（例えば、「ＴＳ１」及び「ＴＳ２」と表示された）ボックスは、ｃａｓ９媒介性遺伝子編集のために使用される標的配列（ＴＳ）を示している。対立遺伝子内に存在する多型（即ち、突然変異及びインデル）は、小さな非表示（即ち、この分解能で可能な限り最善）のボックスとして提示した。更に、対立遺伝子の注釈の下には、下記の実施例１で詳述するように、その中のアミノ酸保存の４つの領域のコーディング配列内の場所を示している、Ａ〜Ｄと表示したボックス（即ち、図１Ａ、領域Ａ〜Ｄ）が存在する。明確にするために、図１Ｂは、より高い配列解像度で、対立遺伝子（ｓｓｂ７（ｆｓ）、ｓｓｂ７（３１１）、ｓｓｂ７（ＴＳ１）、ｓｓｂ７（ＴＳ２）及びｓｓｂ７（３９９ｆｓ））の各々について菌株Ｍｏｒｐｈ  ７７Ｂ７において同定されたフレームシフト（ｆｓ）部位の周囲の遺伝子改変を全て示している。
【００６７】
【図２】ＤＮＡ断片１及び６を用いた形質転換によるＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）突然変異菌株Ｍｏｒｐｈ  ７７Ｂ７菌糸表現型の相補性を示す図である。図２に示したように、ＤＮＡ断片１（図２、パネル１Ａ及びパネル１Ｂ）並びにＤＮＡ断片６（図２、パネル６Ａ及びパネル６Ｂ）は、各ＤＮＡ断片（即ち、ＤＮＡ断片１及び６）についての独立形質転換体を表す。大多数のＤＮＡ断片を有する形質転換体は、突然変異菌Ｍｏｒｐｈ  ７７Ｂ７について観察された高分岐及び粘性菌糸表現型を維持していた。例えば、図２に示したように、パネル１Ａ及び１ＢのＤＮＡ断片１を含む形質転換体（菌株Ｍｏｒｐｈ  ７７Ｂ７内の他の突然変異遺伝子座の１つをコードする）（即ち、ＰＩＤ  １１２３２８）は、この高分岐及び粘性菌糸表現型を例示している。これとは対照的に、図２のパネル６Ａ及び６Ｂに示したように、ＤＮＡ断片６を含む（即ち、ＰＩＤ  １０８７１２／ＳＳＢ７をコードする）形質転換体だけが、少なくとも部分的に、より粘性が低く低分岐の菌糸体を備えるようにこの表現型を逆転させた。
【００６８】
【図３】天然ＳＳＢ７タンパク質（図３Ｂ、配列番号２）をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）野生型ｓｓｂ７遺伝子（図３Ａ、配列番号１）の核酸配列及び変異ＳＳＢ７タンパク質（即ち、Ｃ末端が切断されている）をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）突然変異ｓｓｂ７対立遺伝子（ｓｓｂ７（ｆｓ）、図３Ｃ、配列番号３）の核酸配列を示す図であり、ここでコーディング配列領域は、大文字で示されており、イントロンはイタリック体の小文字で示されている。図３Ｃに示したように、突然変異ｓｓｂ７対立遺伝子の核酸配列内の（ΔＧ）フレームシフト突然変異の部位の隣接ヌクレオチドは、ボールド体の大文字及び下線を付した文字ＧＡとして示した。
【００６９】
【図４】エキソン１（図４Ａ、配列番号１９）、エキソン２（図４Ｂ、配列番号２０）及びエキソン３（図４Ｃ、配列番号２１）としてのＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｓｓｂ７遺伝子（ＯＲＦ）コーディング配列を示す図である。
【００７０】
【図５】ＳＳＢ７タンパク質のアミノ酸保存を例示しているグラフ表示である。より詳細には、図５は、Ｎ末端ＭＩＴドメインに渡るアミノ酸が欠如する短鎖タンパク質の予測を排除している、３５３個の子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）ホモログのＭＵＳＣＬＥアラインメントのグラフ表示である。図５の底部には、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＳＳＢ７タンパク質アミノ酸配列を示すボックスを示したが、ここでアミノ酸（残基）は、アラインメントされた配列の８５％超において保存されている場合は黒色の影付き（又はさもなければライトグレーの）ボックス内に示した。図５に示したように、配列アラインメントにおけるアミノ酸配列ギャップは、残基間のグレーの影付き線として示した。残基の下方の単一のグレーのボックスは、ＰＩＤ  １０８７１２／ＳＳＢ７についてダウンロードされたＧｅｎｅＢａｎｋ  ＥＧＲ４７３９２において注釈が付けられたＭＩＴドメインを示している。平均の疎水性及び等電点（ＰＩ）も又図５にプロット及び提示した。アラインメントにおけるアミノ酸同一性は、前記の直ぐ上にプロットした。バーの高さは、アミノ酸同一性と比例している。グレーのバーはアラインメントにおいて少なくとも３０％の配列と同一である、黒色のバーは３０％未満の配列と同一である残基を表している。アラインメントは、Ａ〜Ｄと表示したボックスとして示した領域Ａ〜ＤであるＳＳＢ７ホモログにおける４つの保存領域を解明した。領域Ａは、ＭＩＴドメインに対応する。
【００７１】
【図６】ｓｓｂ７遺伝子座でのｃａｓ９媒介性ゲノム編集のためにｐＴｒｅｘ２ｇ  ＭｏＣａｓに追加された合成ＤＮＡ配列を示す図である。例えば、配列番号５（図６Ａ）は、ｓｓｂ７遺伝子座を編集するための配列情報を備えるＩＤＴ  ｇＢｌｏｃｋ核酸配列であり、配列番号６（図６Ｂ）は、７７Ｂ７  ＴＳ１  ｓｇＲＮＡを発現させるためのＩＤＴ  ｇＢｌｏｃｋであり、配列番号７（図６Ｃ）は、７７Ｂ７  ＴＳ２  ｓｇＲＮＡを発現させるためのＩＤＴ  ｇＢｌｏｃｋである。図６Ａに示したように、一重下線付きのヌクレオチドは、インビトロプラスミドアセンブリーのために使用されるｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓと配列同一性の領域を示し、二重下線付ヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ配列に対応する２０ｎｔの標的部位を示し、大文字ボールド体の残基は、標的部位に隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位を変化させるＧからＣへのヌクレオチド変化を表し、グレーの影付きヌクレオチドは、野生型遺伝子内の７個のＧ’である６個のＧ残基を示している。図６Ｂ及び図６Ｃに示したように、一重下線付のヌクレオチドは、インビトロプラスミドアセンブリーのために使用されるｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓとの配列同一性の領域を示しており、小文字のヌクレオチドは、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ゲノム内の標的部位を示しており、二重下線付ヌクレオチドは、ｓｇＲＮＡの配列を示し、グレーの影付きヌクレオチドはイントロン配列を示している。
【００７２】
【図７】対立遺伝子ｓｓｂ７（３１１）及び対立遺伝子ｓｓｂ７（ＴＳ１）と共に発酵ブロスの粘性の低下を示しているデータを示す図である。より詳細には、図７は、（親）ＴｒＧＡ  ２９−９及び（娘）ｓｓｂ７突然変異体由来菌株のバイオリアクター発酵についての「撹拌」及び「溶存酸素（ＤＯ）」プロフィールを示す図である。撹拌量（図７、「ｘ」でマークした左のｙ軸（ＲＰＭ）；ｔ＝０前の上向きの傾向）及び溶存酸素（図７、「｜」でマークした右のｙ軸（ＤＯ％、；ｔ＝０前の下向きの傾向）は、撹拌の追加及びＤＯ制限の測定値を計算するために使用された時間枠（±１０時間）について、供給開始を調整した発酵時間（ｘ軸）に対してプロットした。親ＴｒＧＡ  ２９−９（「２９−９」：黒色）並びに２つのｓｓｂ７突然変異（娘）菌株（ＴｒＧＡ  ２９−９  ｓｓｂ７（３１１）：グレー）及び（ＴｒＧＡ  ２９−９  ｓｓｂ７（ＴＳ１）：白色）のプロフィールをプロットした。
【００７３】
【図８】一般に野生型Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＳＳＢ７タンパク質（配列番号２）のアミノ酸組成及び関連特性を示す図である。図８Ａは、配列番号２のＰＥＰＳＴＡＴＳ分析を示す図であり、ここでＳＳＢ７タンパク質は、１，３０８個の残基、１４２，５４０（Ｄａ）の推定（理論的）分子量、およそ６．８の等電点及び＋１０のおよその正味荷電を含む。モルパーセント（％）に基づくと、ＳＳＢ７タンパク質は、図８Ａに示したように、およそ１２．０％（１５７個）のセリン（Ｓ）残基、９．６％（１２６個）のアラニン（Ａ）残基、９．６％（１２６個）のプロリン（Ｐ）残基、６．８％（８９個）のロイシン（Ｌ）残基、５．８％（７６個）のグルタミン（Ｑ）等を含む。図８Ｂは、配列番号２の残基位置１〜１，３０８を含む天然（全長）ＳＳＢ７タンパク質の疎水性プロットを示している（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性インデックス、９−残基ウィンドウ、Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２による）。例えば、図８Ｃ〜図８Ｆは、配列番号２のＮ末端（残基１）で始まってＣ末端（残基１，３０８）で終了するおよそ３２０残基ウィンドウ内のＳＳＢ７タンパク質の配列（配列番号２）中１，３０８個の残基を走査したＳＳＢ７タンパク質の疎水性プロットを示しており、ここで、図８Ｃは、ＳＳＢ７タンパク質残基１〜３２０（配列番号２）の疎水性プロットを示し、図８Ｄは、ＳＳＢ７タンパク質残基３２１〜６４０（配列番号２）の疎水性プロットを示し、図８Ｅは、ＳＳＢ７タンパク質残基６４１〜９６１（配列番号２）の疎水性プロットを示し、及び図８Ｆは、ＳＳＢ７タンパク質残基９６２〜１，３０８（配列番号２）の疎水性プロットを示している。図８Ｇは、図８Ｂ〜８Ｆにおいて使用したＫｙｌｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅアミノ酸疎水性スコアを示している。従って、図８Ｂ〜８Ｇに示したように、ＳＳＢ７タンパク質配列の疎水性領域は、ゼロより大きいスコア値として示されており、ＳＳＢ７タンパク質の親水性領域は、ゼロより小さいスコア値として示されている（例えば、図８Ｇの残基値を参照されたい）。例えば、図８Ｃは、ＳＳＢ７タンパク質（Ｎ末端残基１〜３２０）の疎水性プロットを示しており、ここで残基１〜３２０の１文字アミノ酸配列は、疎水性プロットの直ぐ上に示されている。
【００７４】
【図９】６種の異なる子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）ＳＳＢ７タンパク質オルソログとアラインメントされた野生型トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＳＳＢ７タンパク質（略称「ＳＩＤ＿２」；ボールド体の大文字のアミノ酸残基で示した）及び野生型トリコデルマ・アトロビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）ＳＳＢ７タンパク質（略称「ＳＩＤ＿３１」）のＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（１．８３）多重配列アラインメントを示す図である。より特別には、図９Ａ〜９Ｅに示したように、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種ＳＳＢ７タンパク質（配列番号８；略称「ＳＩＤ＿８」）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種ＳＳＢ７タンパク質（配列番号９；略称「ＳＩＤ＿９」）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種ＳＳＢ７タンパク質（配列番号１０；略称「ＳＩＤ＿１０」）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｙｍｙｃｅｓ）種ＳＳＢ７タンパク質（配列番号１１；略称「ＳＩＤ＿１１」）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種ＳＳＢ７タンパク質（配列番号１２；略称「ＳＩＤ＿１２」）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種ＳＳＢ７タンパク質（配列番号１３；略称「ＳＩＤ＿１３」）及び野生型トリコデルマ・アトロビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）ＳＳＢ７タンパク質（配列番号３１）をＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＳＳＢ７タンパク質（配列番号２）とアラインメントした。図９Ａ〜９Ｅ（即ち、アラインメントしたアミノ酸残基の下方）に示したように、星印（＊）は単一の完全に保存された残基を有する位置を示し、コロン（：）は、強度に類似する特性（即ち、Ｇｏｎｎｅｔ  ＰＡＭ  ２５０マトリックス内で＞０．５のスコアリング）を有する基間の保存を示し、ピリオド（．）は、弱い類似性（即ち、Ｇｏｎｎｅｔ  ＰＡＭ  ２５０マトリックス内で＜０．５のスコアリング）を有する基間の保存を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
本明細書で説明及び記載したように、本開示は、当分野における、改良された体積効率、強化された／一様な酸素分布、低下した細胞ブロス粘性、高比生産性、改良された炭素源の収率、減少したバイオリアクター（発酵槽）の運転費、変化した（細胞）表現型、変化した（細胞）形態、変化した（細胞）増殖特性等を含むがそれらに限定されない、糸状菌タンパク質生産及びそれらの方法における、所定の進行中及び満たされていないニーズを取り扱う。従って、本開示の本菌株及び方法は、一般に、変化した表現型、変化した形態、変化した増殖特性等を有する変異菌株を生じさせる、糸状菌における遺伝子改変に関する。より特別には、本明細書に提示及び記載したように、そのような糸状菌の変異菌株は、酵素及びその他のタンパク質若しくは代謝産物を大量生産するために、深部培養中における増殖のために特に適合する。
【００７６】
従って、所定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載した親菌株に由来する糸状菌の変異菌株に関する。所定の実施形態では、そのような変異菌株は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含む。より特別には、所定の他の実施形態では、本開示の変異菌株（即ち、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含む）は、親菌株の（即ち、深部培養中における好気発酵中の）細胞と比較して、予め選択された（即ち、深部培養中における好気発酵中の）溶存酸素（ＤＯ）量を維持するために減少した撹拌量を必要とする、及び／又は予め選択された撹拌量で、増加したＤＯ量を維持する細胞集団を産生する細胞ブロスを産生する。
【００７７】
例えば、所定の実施形態では、本明細書で構築及び記載した糸状菌のそのような変異菌株は、特に本明細書では「粘性が低下した」表現型と呼ぶ変化した細胞形態表現型（例えば、実施例１〜３及び図２を参照されたい）を含む。より特別には、実施例１に提示したように、「Ｍｏｒｐｈ  ７７Ｂ７」と名付けられたＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）突然変異体は、特にその親より短くより粘性の糸状体を有する、深部液体培地中で変化した形態（表現型）を有することが観察されたが、ここでＭｏｒｐｈ  ７７Ｂ７突然変異体は、更に親を含有する培養と比較して、増殖中により高レベルの溶存酸素（ＤＯ）も又示した（実施例１、表１を参照されたい）。
【００７８】
更に、実施例１に記載したように、突然変異（Ｍｏｒｐｈ  ７７Ｂ７）表現型に相補性を示したのは、本明細書で「ｓｓｂ７」と名付けられた唯一の野生型遺伝子座だけであったが、ここでｓｓｂ７遺伝子は、同一ＤＮＡ配列上の他のタンパク質の予測と部分的に重複する、新規に予測されたタンパク質ＳＳＢ７、例えばトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＱＭ６ａタンパク質ＩＤ（ＰＩＤ）１０８７１２（Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｏｒｔａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｒｉｇｏｒｉｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０１１）をコードする。同様に、同定されたｓｓｂ７突然変異対立遺伝子は、エキソン２における単一グアニン（Ｇ）ヌクレオチド欠失（ΔＧ）（Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＱＭ６ａ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  １３、１６７４０４）を含むが、ここで（ｓｓｂ７変異対立遺伝子の）エキソン２におけるＧの欠失は、フレームシフト（ｆｓ）突然変異及びその変異対立遺伝子が「ｓｓｂ７（ｆｓ）」と名付けられたｓｓｂ７遺伝子の最終イントロン（イントロン２）の前の未成熟終止コドンを生じさせる。
【００７９】
本開示の実施例２では、更にｓｓｂ７突然変異が発酵（培養）ブロスの粘性の低下（即ち、変化した形態／表現型）の原因であることの妥当性を検証しているが、ここでｓｓｂ７遺伝子座は、詳細には親Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株において突然変異していた。例えば、本明細書で「ｓｓｂ７（３１１）」及び「ｓｓｂ７（ＴＳ１）」と名付けられた対立遺伝子を生成する、相同組換えによるｓｓｂ７突然変異生成を標的とするために、２種の異なる方法が使用されたが、ここでｓｓｂ７の両方の対立遺伝子は、粘性が低下した表現型を示した。
【００８０】
本開示の実施例３は、追加してそのようなｓｓｂ７突然変異体の有用性を試験及び確証したが、ここで「ｓｓｂ７（３１１）」、「ｓｓｂ７（３３９ｆｓ）」及び「ｓｓｂ７（ＴＳ２）」と名付けられたｓｓｂ７の３種の突然変異対立遺伝子についても又、セルラーゼの天然カクテルを発現する異なるトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）系統（「Ｔ４ａｂｃ」と名付けられた）において評価された。このバックグラウンドに由来するこれらの突然変異体も又、本明細書に記載した粘性が低下した表現型を証明した。
【００８１】
従って、本明細書で詳細に例示及び記載したように、本開示の粘性が低下した表現型を含む糸状菌のそのような変異菌株は、親菌株の細胞と比較して、深部培養中における好気発酵中の予め選択された溶存酸素（ＤＯ）量を維持するために減少した撹拌量を必要とする細胞ブロスを産生する、及び／又は深部培養中における好気発酵中の予め選択された撹拌量で、増加したＤＯ量を維持する細胞集団を産生する。例えば、糸状菌細胞のそのような変異（娘）菌株の細胞集団は、（未改変）親細胞の細胞集団と比較して粘性が低下した菌糸表現型を示すが、その低下した粘性は、下記の実施例のセクションで詳述するように、溶存酸素（ＤＯ）量及び追加の撹拌に関連する観察所見を説明する。
【００８２】
従って、本開示の所定の他の実施形態は、糸状菌細胞のそのような変異菌株を構築する方法、そのような変異菌株をスクリーニングする方法、そのような変異菌株等を使用して目的タンパク質を産生する方法に関するが、ここで変異菌株は、親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素（ＤＯ）量を維持するための減少した撹拌量を必要とする細胞ブロスを産生する、及び／又は深部培養中における好気発酵中の予め選択された撹拌量で増加したＤＯ量を維持する細胞集団を産生する。
【００８３】
Ｉ．定義
本菌株及び方法を詳細に説明する前に、明確にするために以下の用語を定義する。定義されていない用語は、当分野において使用されるそれらの通例の意味に一致するはずである。他に定義されていない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は全て、本発明の組成物及び方法が属する分野の当業者であれば一般に理解する意味と同一の意味を有する。
【００８４】
本明細書に記載のものに類似又は同等の任意の方法及び材料は、本組成物及び方法を実施又は試験するためにも使用できるが、以下では例示的な方法及び材料について記載する。本明細書で引用した刊行物及び特許は全て、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【００８５】
本明細書では、単数の冠詞「１つの」及び「その」は、別途文脈が明確に指示しない限り複数の指示対象を含む。
【００８６】
特許請求の範囲が任意選択的な要素を排除するように記載され得ることにも更に留意されたい。従って、この記述は、特許請求項の構成要素の列挙に関連して「唯一の」、「ただ〜のみ」、「〜を除いて」、「〜を含まない」等の排他的な用語の使用、又はその「否定的な」限定若しくは条件の使用のための先行文として機能することを意図している。
【００８７】
本開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書に記載及び例示する個々の実施形態のそれぞれは、本明細書に記載する本組成物及び方法の範囲又は精神から逸脱することなく、他の一部の実施形態の何れかの特徴から容易に分離又は組み合わせることができる別個の構成要素及び特徴を有する。記載した方法は何れも、記載した事象の順序で、又は論理的に可能な他の任意の順序で実施することができる。
【００８８】
本明細書に記載した操作、構築及び使用のための糸状菌細胞は、一般に、子嚢菌門（ｐｈｙｌｕｍ  Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、チャワンタケ亜門（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ  Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、特に栄養菌糸状態を有する真菌に由来する。そのような生物としては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ゲオスミチア（Ｇｅｏｓｍｉｔｈｉａ）種、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種等を含むがそれらに限定されない商業的に重要な工業用及び製薬用タンパク質を製造するために使用される糸状菌細胞が挙げられる。例えば、所定の実施形態では、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（以前はトリコデルマ・ロンギブラチアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）及びヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）として分類されていた）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・イタコニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｉｔａｃｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニデユランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・ソーヤエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、タラロマイセス（ゲオスミチア）・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ（Ｇｅｏｓｍｉｔｈｉａ）ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）及びクリソスポリウム・ルクノウエンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）（Ｃ１）を含むがそれらに限定されない糸状菌細胞及びそれらの菌株が挙げられる。
【００８９】
本明細書で使用するゲノム座標（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ  １３、１６７４０４）は、エネルギー省の共同ゲノム研究所（ＪＧＩ）によって生成されたトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＱＭ６ａゲノム配列アセンブリーのバージョン２を参照している（Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｏｒｔａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｒｉｇｏｒｉｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２０１２  Ｊａｎ；４０（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２６−３２．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｒ９４７）。ＪＧＩが組み立てたＳｃａｆｆｏｌｄ配列は、更に、ヌクレオチドアクセッション番号ＧＬ９８５０５６．１〜ＧＬ９８５１３２．１を付してＧｅｎｅＢａｎｋ（米国国立生物工学情報センター）に預託されている。
【００９０】
所定の実施形態では、本明細書に記載した操作、構築及び使用のための糸状菌細胞は、一般に子嚢菌門（ｐｈｙｌｕｍ  Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、チャワンタケ亜門（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ  Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、特に栄養菌糸状態を有し、ｓｓｂ７遺伝子（配列番号１）の遺伝子（又は遺伝子ホモログ）を含む真菌に由来する。
【００９１】
他の実施形態では、本開示の変異菌株（即ち、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含む）は、ＭＰＧ１、ＳＦＢ３、ＳＥＢ１、ＣＲＺ１及び／又はＧＡＳ１タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を更に含む。
【００９２】
本明細書で使用するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＭＰＧ１タンパク質は、ＰＣＴ出願の国際公開第２０１２／１４５５８４号パンフレット（本明細書に参照により全体として組み込まれる）に記載された配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
【００９３】
本明細書で使用するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＳＦＢ３タンパク質は、ＰＣＴ出願の国際公開第２０１２／０２７５８０号パンフレット（本明細書に参照により全体として組み込まれる）に記載された配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
【００９４】
本明細書で使用するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＳＥＢ１タンパク質は、ＰＣＴ出願の国際公開第２０１２／１４５５９５号パンフレット（本明細書に参照により全体として組み込まれる）に記載された配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
【００９５】
本明細書で使用するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＲＺ１タンパク質は、ＰＣＴ出願の国際公開第２０１２／１４５５９６号パンフレット（本明細書に参照により全体として組み込まれる）に記載された配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
【００９６】
本明細書で使用するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＧＡＳ１タンパク質は、ＰＣＴ出願の国際公開第２０１２／１４５５９６号パンフレット及び同第２０１２／１４５５９２号パンフレット（本明細書に参照により全体として組み込まれる）に記載された配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【００９７】
他の実施形態では、本開示のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種菌株は、ＰＣＴ出願の国際公開第２０１６／１３０５２３号パンフレットに記載のＮｉｋ１Ｍ７４３突然変異を含み、そのＮｉｋ１Ｍ７４３タンパク質は、配列番号３８の７４３位でのメチオニン置換を含む。
【００９８】
所定の他の実施形態では、本開示のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種菌株は、Ｎｉｋ１Ｍ７８６突然変異を含み、そのＮｉｋ１Ｍ７７６タンパク質は、ＰＣＴ出願の国際公開第２０１６／１３０５２３号パンフレット（本明細書にその全体として参照により組み込まれる）に記載したように７８６位でのメチオニン置換を含む。本明細書で使用する語句「親細胞」、「親真菌細胞」、「親菌株」、「親真菌株」、「糸状菌細胞の親菌株」、「参照菌株」等は、互換的に使用することができ、「未改変」親糸状菌細胞を意味する。例えば、「糸状菌細胞の親菌株」は、その中で「親」細胞のゲノムが、「親」及び「娘」細胞が唯一の遺伝子改変によってのみ相違するように糸状菌細胞の変異（娘）菌株を生成するために（例えば、親細胞内に導入された唯一の遺伝子改変によって）改変されている、又は改変可能である糸状菌の任意の細胞若しくは菌株を意味する。
【００９９】
本明細書で使用する語句「変異細胞」、「娘細胞」、「変異菌株」、「娘菌株」、「変異若しくは娘真菌株」、「糸状菌細胞の変異若しくは娘菌株」等は、同じ意味で用いられ、糸状菌細胞の親（若しくは参照）菌株に由来する（即ち、〜から得られた（ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ）、又は〜から得ることができる（ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ  ｆｒｏｍ））変異菌株を意味するが、ここで変異菌株は、比較によって、「親」及び「変異」菌株間の表現型の差を１つの遺伝子改変に帰せることができるように、親菌株内に存在しない唯一の遺伝子改変を含む。これを言い換えると、親菌株及び変異菌株は、変異菌株に「導入された」単一の遺伝子改変を除くと、他の点では同質遺伝子系である。従って、本開示では、親及び変異菌株は、遺伝子改変、発現表現型、形態表現型等の所定の特徴を有すると記載することができる；しかし、当業者であれば、それが技術的にはそのような特徴を有する親若しくは変異菌株の細胞であること、及び便宜上「菌株」と呼ばれることを理解するであろう。
【０１００】
所定の実施形態では、未改変（親）細胞は、特に、それらに由来する遺伝子改変（変異／娘）細胞と（に対して）比較した場合に、特に「コントロール細胞」若しくは「参照細胞」と呼ぶことができる。
【０１０１】
本明細書で使用する、（未改変）親細胞（即ち、コントロール細胞）の表現型／形態を変異（娘）細胞の表現型／形態と比較すると、「親」（未改変）及び「娘」（改変）細胞が、同一条件（例えば、培地、温度、ｐＨ等の同一条件）下で増殖／培養／発酵されることは理解されるであろう。
【０１０２】
同様に、変異（改変）娘細胞における同一ＰＯＩの産生に対して（未改変）親細胞（即ち、コントロール細胞）内の目的タンパク質（ＰＯＩ）の産生について記載する場合に、「親」及び「変異」細胞が本質的に同一条件（例えば、培地、温度、ｐＨ等の同一条件）下で増殖／培養／発酵させられることは理解されるであろう。
【０１０３】
本明細書で使用する「目的タンパク質」若しくは「ＰＯＩ」は、糸状菌細胞の深部培養における産生が所望されるタンパク質である。そのようなタンパク質（ＰＯＩ）は、酵素、基質結合タンパク質、界面活性タンパク質、構造的タンパク質、抗体等であってよく、高レベルで発現させることができる。従って、ＰＯＩは、変異菌株及び／又は親菌株と比較して、内在性遺伝子又は異種遺伝子によってコードされ得る。（ＰＯＩをコードする）異種遺伝子は、親及び／又は変異真菌株中に（例えば、本開示の１つ以上の遺伝子改変の実施前、実施中又は実施後に）導入（例えば、形質転換）され得る。ＰＯＩは、細胞内で、又は分泌タンパク質として発現させることができる。一般に、ＰＯＩは、工業、製薬、動物の健康、食品及び飲料の用途において商業的に重要なものであり、それらを大量に生産することが望ましい。
【０１０４】
本明細書で使用する「好気発酵」は、酸素の存在下における増殖を指す。
【０１０５】
本明細書で使用する用語「ブロス」、「細胞ブロス」、「発酵ブロス」及び／又は「培養ブロス」は、互換的に使用され、集合的に（ｉ）発酵（培養）培地及び（ｉｉ）液体（深部）培養中の細胞を指す。
【０１０６】
本明細書で使用する用語「細胞集団」は、液体（深部）培養中に存在する（インタクト細胞及び溶解細胞を含む）細胞成分を指す。細胞集団は、乾燥細胞重量又は湿潤細胞重量で表すことができる。
【０１０７】
本明細書で使用する「粘性」は、（例えば、剪断応力又は引張応力等の）機械的応力による変形に対する流体の抵抗性の尺度である。
【０１０８】
本開示の状況において、粘性は、機械的応力による変形に対する（上記に規定した）「細胞ブロス」の抵抗性を更に指す。従って、所定の実施形態では、「粘性」は、本明細書では（例えば、ローター／インペラーによって提供／誘導される）そのような機械的応力に対する「細胞ブロスの抵抗性の尺度」であると定義されている。しかしながら、細胞ブロスの粘性は直接的に測定するのが困難な場合があるため、予め選択された撹拌量での培養ブロスの溶存酸素（ＤＯ）含量、予め選択されたＤＯ量を維持するために必要とされる撹拌量、予め選択されたＤＯ量又は菌糸形態さえを維持するために細胞ブロスを撹拌するために必要とされる電力量等の粘性の間接的測定を使用することができる。
【０１０９】
本明細書で使用する糸状菌細胞の「粘性が低下した」変異菌株は、親菌株によって生成された同等の細胞ブロスと比較して、低下した粘性（即ち、剪断応力若しくは引張応力に対する抵抗性が低下している）を有する細胞ブロスを産生する変異菌株を指す。一般に、同等の細胞ブロスは、匹敵する細胞集団を有する。所定の実施形態では、任意の直接的若しくは間接的尺度に関する変異「粘性が低下した」菌株と親菌株との相違は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、又はそれ以上である。本明細書では、糸状菌細胞ブロスの粘性を比較するための方法について記載する。
【０１１０】
本明細書で使用する「溶存酸素」（ＤＯ）は、体積／体積単位で測定される、液体培地中に存在する酸素（Ｏ２）の量を指す。ＤＯレベルは、発酵を通して高レベルで、例えば、１７０〜１００％と２０％との間、１００〜８０％と２０％との間、７０％〜２０％、６５％〜２０％、６０％〜２０％、５５％〜２０％、５０％〜２０％、４５％〜２０％、４４％〜２０％、４３％〜２０％、４２％〜２０％、４１％〜２０％、４０％〜２０％、３５％〜２０％、３０％〜２０％、２５％〜２０％で維持され得る。特に、ＤＯは、発酵の開始時には高くてよく、発酵が進行するにつれて低下することが容認され得る。ＤＯレベルは、発酵培地がかき混ぜられる速度（例えば、撹拌する、及び／又は空気若しくは酸素の添加速度）によって制御することができる。培養は、かき混ぜる（例えば、４００〜７００ＲＰＭの間で撹拌する）ことができ、ＤＯレベルは、空気若しくは酸素流量及びインペラー速度を変化させることによって、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超及び５５％以上に維持される。
【０１１１】
本明細書中で使用する用語「野生型」及び「天然」は、互換的に使用され、天然において見出される遺伝子、タンパク質又は菌株を指す。
【０１１２】
本明細書で使用する「一次遺伝的決定基」は、他の遺伝子又はその遺伝子操作の非存在下において特定の表現型を付与するために必要及び十分である、遺伝子又はその遺伝子操作を指す。より特別には、本開示の実施例のセクションにおいて記載したように、本明細書では「ｓｓｂ７」と名付けられた糸状菌遺伝子は、本明細書に記載した粘性が「低下した」表現型を付与するために必要及び十分である「一次遺伝的決定基」である。
【０１１３】
本明細書で使用する用語「遺伝子」は、タンパク質又はＲＮＡの発現をコード且つ指示する核酸を指す用語「対立遺伝子」と同義である。糸状菌の栄養型は一般に一倍体であり、このため特定の表現型を付与するには、特定の遺伝子の単一コピー（即ち、単一の対立遺伝子）で十分である。
【０１１４】
本明細書で使用する用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」（及び／又はそれらのそれぞれの複数形）は、互換的に使用され、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを指す。本明細書では、アミノ酸残基に対する従来の１文字コード又は３文字コードを使用する。ポリマーは直鎖状又は分枝状であってよく、修飾アミノ酸を含むことができ、更に非アミノ酸によって中断されてもよい。これらの用語は、更に、自然に、又は、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は例えば標識化成分との共役結合等の任意の他の操作又は改変等のインターベンションによって改変されているアミノ酸ポリマーも含んでいる。又、この定義の範囲には、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸等を含む）の１つ以上のアナログを含有するポリペプチド及び当該技術分野において知られる他の改変も含まれる。
【０１１５】
本明細書で使用する用語「誘導ポリペプチド／タンパク質」は、Ｎ末端及びＣ末端の何れか又は両方への１つ以上のアミノ酸の付加、アミノ酸配列中の１つ又は多数の異なる部位での１つ以上のアミノ酸の置換、タンパク質の一方若しくは両方の末端での、又はアミノ酸配列中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠失、及び／又はアミノ酸配列中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の挿入によって、タンパク質から得られるか、又は得ることができるタンパク質を指す。タンパク質誘導体の調製は、天然のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を改変し、そのＤＮＡ配列を好適な宿主に形質転換し、その改変ＤＮＡ配列を発現させて誘導タンパク質を形成することによって達成することができる。
【０１１６】
関連（及び誘導）タンパク質には、「変異タンパク質」が含まれる。変異タンパク質は、少ない数のアミノ酸残基における置換、欠失、及び／又は挿入によって、参照／親タンパク質（例えば、野生型タンパク質）とは異なる。変異タンパク質と親タンパク質との間の異なるアミノ酸残基の数は、１つ以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０又はそれ以上のアミノ酸残基であり得る。変異タンパク質は、参照タンパク質と少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を共有し得る。変異タンパク質は又、選択されたモチーフ、ドメイン、エピトープ、保存領域等において、参照タンパク質と異なっていてもよい。
【０１１７】
本明細書で使用する用語「類似配列」は、目的タンパク質（即ち、典型的には元の目的タンパク質）と類似の機能、三次構造及び／又は保存残基を提供するタンパク質内の配列を指す。例えば、αへリックス又はβシート構造を含有するエピトープ領域では、類似配列中の置換アミノ酸は、好ましくは、同一の特異的構造を維持する。この用語は、ヌクレオチド配列並びにアミノ酸配列も指す。一部の実施形態では、アミノ酸の置換が類似若しくは改良された機能を示す変異酵素を生じさせるような類似の配列が開発される。一部の実施形態では、目的タンパク質内のアミノ酸の三次構造及び／又は保存残基は、目的の断片のセグメント又はその付近に位置する。従って、例えば目的セグメント若しくは断片が例えば、αへリックス若しくはβシート構造を含有する場合、置換アミノ酸は、好ましくはその特異的構造を維持する。
【０１１８】
本明細書で使用する用語「相同タンパク質」は、参照タンパク質との類似の活性及び／又は構造を有するタンパク質を指す。ホモログ（相同体）が必ずしも進化的に関連していることは意図されていない。従って、この用語は異なる生物から得られる（即ち、構造及び機能に関して）同一の、類似の、又は対応するタンパク質を包含することが意図されている。所定の実施形態では、ホモログは、参照タンパク質と少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を共有し得る。一部の実施形態では、参照タンパク質と類似の四次、三次及び／又は一次構造を有するホモログを特定することが望ましい。一部の実施形態では、相同タンパク質は、参照タンパク質と類似の免疫応答を誘導する。一部の実施形態では、相同タンパク質は、所望の活性を備える酵素を産生するように遺伝子操作される。
【０１１９】
配列間のアミノ酸同一性の程度は、当分野において公知の任意の好適な方法を使用して決定され得る（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ等のプログラム；並びにＤｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４を参照されたい）。
【０１２０】
例えば、ＰＩＬＥＵＰは、配列相同性レベルを決定するための有用なプログラムである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブなペアワイズアラインメントを用いて１群の関連配列から多数の配列アラインメントを作成する。それは更に、アラインメントを作成するために使用されるクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８７）のプログレッシブアラインメント法の簡易版を使用する。この方法はＨｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８９）によって記載された方法に類似している。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは、デフォルトのギャップ・ウェイト３．００、デフォルトのギャップ長ウェイト０．１０及び加重エンド・ギャップを含む。有用なアルゴリズムの又別の実施例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０及びＫａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３によって記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムである。１つの特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６を参照されたい）。パラメーター「Ｗ」、「Ｔ」及び「Ｘ」は、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９８９を参照されたい）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ’５、Ｎ’−４及び両方の鎖の比較を使用する。
【０１２１】
本明細書で使用する語句「実質的に類似（の）」及び「実質的に同一（の）」は、少なくとも２つの核酸若しくはポリペプチドとの関連では、通常、ポリヌクレオチド若しくはポリペプチドが参照（即ち、野生型）配列と比較して、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約７５％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を含むことを意味する。配列同一性は、標準的なパラメーターを用いて、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ及びＣＬＵＳＴＡＬ等の公知のプログラムを使用して決定することができる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；及びＨｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８を参照されたい）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、アメリカ国立生物工学情報センターを通して公的に入手可能である。更に、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）を使用してデータベースを検索することができる。２つのポリペプチドが実質的に同一であるという１つの指示は、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。典型的には、保存的なアミノ酸置換により異なるポリペプチドは、免疫学的に交差反応性である。従って、ポリペプチドは、例えば、２つのペプチドが、１つの保存的な置換によってのみ異なる場合、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという又別の指示は、２個の分子が、ストリンジェントな条件下で（例えば、中程度から高度のストリンジェンンシーの範囲内で）互いにハイブリダイズすることである。
【０１２２】
本明細書で使用する「核酸」は、ヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド配列及びそれらの断片若しくは部分並びにセンス鎖又はアンチセンス鎖の何れを表していても、二本鎖であっても一本鎖であってもよい、ゲノム又は合成起源のＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡを指す。
【０１２３】
本明細書で使用する用語「発現」は、本開示の核酸分子に由来するセンス（ｍＲＮＡ）若しくはアンチセンスＲＮＡの転写及び安定した蓄積を指す。発現は、更にｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指し得る。従って、用語「発現」には、ポリペプチドの産生、例えば、以下に限定されないが、転写、転写後改変、翻訳、翻訳後改変、分泌等に関与する任意のステップが含まれる。
【０１２４】
本明細書で使用する、例えば（ｉ）「糸状菌細胞の変異菌株が「増加した」量の目的タンパク質（ＰＯＩ）を発現する／生成する」及び（ｉｉ）「糸状菌細胞の変異菌株が「低下した」量の天然ＳＳＢ７タンパク質を発現する／生成する」、等の語句において使用される複合用語「発現／産生する」は、本開示のそのような変異糸状菌株におけるタンパク質の発現及び産生に関与する任意のステップを含むことが意図されている。例えば、「低下した」量の天然ＳＳＢ７タンパク質を発現／産生する糸状菌細胞の変異菌株を生成する手段には、ｓｓｂ７遺伝子のタンパク質コーディング配列、プロモーター配列、５’−ＵＴＲ配列、３’−ＵＴＲ配列、それらの組合せ等の遺伝子改変（例えば、突然変異、破壊、切断、欠失等）が含まれるがそれらに限定されない。
【０１２５】
本明細書で使用する語句「全長ＳＳＢ７タンパク質」及び「天然ＳＳＢ７タンパク質」は、互換的に使用することができ、特に、本開示の親真菌細胞に由来する、又はそれから得られるＳＳＢ７タンパク質配列を指す。例えば、所定の実施形態では、天然ＳＳＢ７タンパク質は配列番号２のアミノ酸位置１〜１，３０８を含む。他の実施形態では、天然ＳＳＢ７タンパク質は、配列番号３１のアミノ酸位置１〜１，２３５を含む。他の実施形態では、天然ＳＳＢ７タンパク質は、配列番号３３のアミノ酸位置１〜１，４６５を含む。他の実施形態では、天然ＳＳＢ７タンパク質は、配列番号３５のアミノ酸位置１〜１，２８５を含む。他の実施形態では、天然ＳＳＢ７タンパク質は、配列番号８のアミノ酸位置１〜１，３１０を含む。他の実施形態では、天然ＳＳＢ７タンパク質は、配列番号９のアミノ酸位置１〜１，３７０を含む。他の実施形態では、天然ＳＳＢ７タンパク質は、配列番号１０のアミノ酸位置１〜８０５を含む。他の実施形態では、天然ＳＳＢ７タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸位置１〜１，００４を含む。他の実施形態では、天然ＳＳＢ７タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸位置１〜１，２１５を含む。他の実施形態では、天然ＳＳＢ７タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸位置１〜１，０９８を含む。
【０１２６】
従って、所定の他の実施形態では、糸状菌細胞の変異菌株は、親菌株と比較して低下した量の天然ＳＳＢ７タンパク質を発現／産生する。
【０１２７】
所定の他の実施形態では、本開示は、配列番号２又は配列番号３１との少なくとも約５０％の配列同一性を含むＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含むトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種真菌細胞の変異菌株であって、予め選択された溶存酸素（ＤＯ）量を維持するために低下した撹拌量を必要とする、及び／又は深部培養中における好気発酵中の予め選択された撹拌量で増加したＤＯ量を維持する細胞集団を生成する細胞ブロスを産生する変異菌株に関する。所定の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードするトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種遺伝子は、配列番号１、配列番号３２又は配列番号３４との少なくとも約５５％〜９９％の配列同一性を含む。他の実施形態では、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種ｓｓｂ７遺伝子は、配列番号１、配列番号３２又は配列番号３４の核酸配列を含む。所定の他の実施形態では、本開示の粘性が低下した表現型を含む変異トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種菌株は、ｓｓｂ７（ｆｓ）、ｓｓｂ７（３１１）、ｓｓｂ７（３３９ｆｓ）、ｓｓｂ７（ＴＳ１）及びｓｓｂ７（ＴＳ２）から選択される対立遺伝子を含む。
【０１２８】
従って、上記で記載し、下記の実施例のセクションでより詳細に説明するように、ｓｓｂ７遺伝子は、本明細書に記載した粘性が低下した表現型を付与するために必要及び十分である一次遺伝的決定基である。従って、本開示の特定の実施形態は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含むそのような変異トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種菌株であって、粘性が低下した表現型を含む変異菌株に関する。
【０１２９】
従って、所定の実施形態では、本開示の粘性が低下した表現型を含む変異真菌株は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変であって、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変が配列番号１のｓｓｂ７遺伝子のエキソン１〜３の何れか１つ内で発生する遺伝子改変を含む。
【０１３０】
所定の他の実施形態では、変異菌株は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変は、配列番号１のｓｓｂ７遺伝子のエキソン１〜３の何れか２つ内で発生する。
【０１３１】
所定の他の実施形態では、変異菌株は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変は、配列番号１のｓｓｂ７遺伝子のエキソン１〜３の全３つ内で発生する。
【０１３２】
又別の実施形態では、変異菌株は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変は配列番号１のｓｓｂ７遺伝子のエキソン２内で発生する。
【０１３３】
他の実施形態では、本開示の粘性が低下した表現型を含む変異真菌株は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変は、図１Ａに記載したＳＳＢ７タンパク質の保存領域Ａ、領域Ｂ、領域Ｃ及び／又は領域Ｄ内で発生するか、又はそれらを破壊する。又別の実施形態では、本開示の粘性が低下した表現型を含む変異菌株は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変は、図１Ａに記載したＳＳＢ７タンパク質の保存領域Ａ内で発生する、又はそれを破壊する。又別の実施形態では、本開示の粘性が低下した表現型を含む変異菌株は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変は、図１Ａに記載したＳＳＢ７タンパク質の保存領域Ｂ内で発生するか、又はそれを破壊する。又別の実施形態では、本開示の粘性が低下した表現型を含む変異菌株は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変は、図１Ａに記載したＳＳＢ７タンパク質の保存領域Ｃ内で発生する。又別の実施形態では、本開示の粘性が低下した表現型を含む変異菌株は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変は、図１Ａに記載したＳＳＢ７タンパク質の保存領域Ｄ内で発生するか、又はそれを破壊する。
【０１３４】
所定の他の実施形態では、「実質的な配列相同性」を含むＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子は、（それと比較される）対応する核酸配列からの極めて些細な配列変化を有する、及び（それと比較される）対応する核酸配列と実質的に同一の生物学的機能を保持するＤＮＡ若しくはＲＮＡ（核酸）配列に関する。例えば、所定の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子（若しくはＯＲＦ）との実質的な配列相同性を含む核酸配列は、本明細書で記載するように、コードされた遺伝子産物（ＳＳＢ７タンパク質）を同定することによって評価される。
【０１３５】
所定の他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子（若しくはＯＲＦ）との実質的な配列相同性を含む核酸配列は、核酸ハイブリダイゼーション法を用いて決定／同定される。例えば、所定の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする本開示の遺伝子若しくはポリヌクレオチド（例えば、配列番号１）との実質的な配列相同性を含むＤＮＡ／ＲＮＡ配列は、ストリンジェントな条件下で、そのようなＤＮＡ／ＲＮＡ配列が本開示の特定の核酸配列とハイブリダイズする能力によって同定される。
【０１３６】
本明細書で使用する「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、相互に対して有意に同一若しくは相同であるヌクレオチド配列が相互にハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーション及び洗浄のための条件を説明することが意図されている。そのようなストリンジェントな条件は、当業者には周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照されたい）。例えば、所定の実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例としては、約６５〜７０℃での４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション（又は約４２〜５０℃での４×ＳＳＣ＋５０％のホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）、その後の約６５〜７０℃での１×ＳＳＣ中での１回以上の洗浄が挙げられる。同様に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの非限定的な例としては、約６５〜７０℃での１×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション（又は約４２〜５０℃での４×ＳＳＣ＋５０％のホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）、その後の約６５〜７０℃での０．３×ＳＳＣ中での１回以上の洗浄が挙げられる。従って、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、約５０〜６０℃での４×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション（又は代わりに約４０〜４５℃での６×ＳＳＣ＋５０％のホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）、その後の約５０〜６０℃での２×ＳＳＣ中での１回以上の洗浄が挙げられる。上記の数値、例えば６５〜７０℃で又は４２〜５０℃で、までの中間の範囲も又、本開示に含まれることが意図されている。所定の実施形態では、ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４及び１．２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）は、ハイブリダイゼーション及び洗浄バッファー中でＳＳＣ（１×ＳＳＰＥは、０．１５ＭのＮａＣｌ及び１５ｍＭのクエン酸ナトリウムである）と置換することができる；洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後に各１５分間実施される。長さが５０塩基対未満であると予想されたハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの溶融温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低くなくてはならないが、ここでＴｍは、下記の方程式に従って決定される。長さが１８塩基対未満であるハイブリッドのためには、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。長さが１８〜４９塩基対の間のハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃ％）−（６００／Ｎ）（式中、Ｎはハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーションバッファー中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣについての［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ））。当業者であれば、核酸分子の例えばニトロセルロース膜若しくはナイロン膜等への非特異的ハイブリダイゼーションを減少させるために、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄バッファーに、ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ若しくはサケ若しくはニシン精子キャリアＤＮＡ）、洗剤（例えば、ＳＤＳ）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、フ���コール、ＰＶＰ等を含むがそれらに限定されない追加の試薬を添加できることは認識できるであろう。ナイロン膜を使用する場合は、特に、追加の、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、約６５℃で０．２５〜０．５ＭのＮａＨ２ＰＯ４、７％のＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、その後の６５℃での０．０２ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１％のＳＤＳ中又は代わりに０．２×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ中での１回以上の洗浄である（例えば、Ｃｈｕｒｃｈ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９８４を参照されたい）。
【０１３７】
従って、本開示の所定の他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）真菌遺伝子は、配列番号１のｓｓｂ７遺伝子又はその相補的配列と高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む。所定の他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）真菌遺伝子は、配列番号３１のｓｓｂ７遺伝子又はその相補的配列と高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む。所定の他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）真菌遺伝子は、配列番号３２のｓｓｂ７遺伝子又はその相補的配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む。他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）真菌遺伝子は、配列番号３４のｓｓｂ７遺伝子又はその相補的配列と高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む。他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）真菌遺伝子は、配列番号１、配列番号３２、配列番号３４のｓｓｂ７遺伝子又はその相補的配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む。
【０１３８】
所定の他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）真菌遺伝子は、配列番号１９のエキソン１又はその相補的配列と高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む。別の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）真菌遺伝子は、配列番号２０のエキソン２又はその相補的配列と高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む。別の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）真菌遺伝子は、配列番号２１のエキソン３又はその相補的配列と高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む。
【０１３９】
所定の他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）真菌遺伝子は、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＳＢ７タンパク質の保存領域Ａ（配列番号２２）をコードする核酸配列とハイブリダイズする核酸配列を含む。他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）真菌遺伝子は、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＳＢ７タンパク質の保存領域Ｂ（配列番号２３）をコードする核酸配列とハイブリダイズする核酸配列を含む。他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）真菌遺伝子は、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＳＢ７タンパク質の保存領域Ｃ（配列番号２４）をコードする核酸配列とハイブリダイズする核酸配列を含む。又別の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）真菌遺伝子は、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＳＢ７タンパク質の保存領域Ｄ（配列番号２５）をコードする核酸配列とハイブリダイズする核酸配列を含む。
【０１４０】
所定の他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）真菌遺伝子は、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＳＢ７タンパク質の保存配列１（配列番号２６）をコードする核酸配列とハイブリダイズする核酸配列を含む。他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）真菌遺伝子は、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＳＢ７タンパク質の保存配列２（配列番号２７）をコードする核酸配列とハイブリダイズする核酸配列を含む。他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）真菌遺伝子は、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＳＢ７タンパク質の保存配列３（配列番号２８）をコードする核酸配列とハイブリダイズする核酸配列を含む。所定の他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）真菌遺伝子は、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＳＢ７タンパク質の保存配列４（配列番号２９）をコードする核酸配列とハイブリダイズする核酸配列を含む。更に他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）真菌遺伝子は、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＳＢ７タンパク質の保存配列５（配列番号３０）をコードする核酸配列とハイブリダイズする核酸配列を含む。
【０１４１】
従って、概して上述したように、糸状菌細胞の変異菌株は、ＳＳＢ７をコードする遺伝子の「遺伝子改変」を含み、この遺伝子改変は、（未改変）親細胞と比較される。
【０１４２】
本明細書で使用する用語「改変」及び「遺伝子改変」は、互換的に使用され、以下の：（ａ）遺伝子内の１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去、又は遺伝子の転写若しくは翻訳のために必要とされる調節エレメント内の１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去、（ｂ）遺伝子破壊、（ｃ）遺伝子変換、（ｄ）遺伝子欠失、（ｅ）遺伝子のダウンレギュレーション（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）（ｆ）特異的突然変異誘発（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した突然変異誘発を含むがそれらに限定されない）及び／又は（ｇ）本明細書に開示した任意の１つ以上の遺伝子のランダム突然変異誘発。例えば、本明細書で使用する遺伝子改変を含む糸状菌の変異菌株としては、本明細書に開示したｓｓｂ７遺伝子の遺伝子改変が挙げられるがそれには限定されない。従って、以下でより詳細に記載するように、様々な分子生物学的方法は周知であり、当業者であれば、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含む糸状菌細胞のそのような変異菌株を生成／構築するために利用することができる。
【０１４３】
本明細書で使用する「ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子内の１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去」には、遺伝子のコーディング配列（即ち、エキソン）、非コーディング介在（イントロン）配列、プロモーター配列、５’−ＵＴＲ配列、３’−ＵＴＲ配列等の遺伝子改変が含まれるが、それらに限定されない。
【０１４４】
従って、所定の実施形態では、遺伝子改変を含む糸状菌の変異菌株は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする内在性遺伝子を排除するための遺伝子欠失技術によって構築される。本明細書で使用する「遺伝子の欠失」若しくは「遺伝子欠失」は、宿主細胞のゲノムからの遺伝子のコーディング配列の完全な除去を指す。遺伝子が遺伝子のコーディング配列に直接隣接して位置していない制御エレメント（例えば、エンハンサーエレメント）を含む場合、遺伝子の欠失は、コーディング配列の欠失を指し、及び任意選択的に、例えば、プロモーター配列及び／又はターミネーター配列を含むがこれらに限定されない隣接エンハンサーエレメントの欠失を指す。
【０１４５】
本明細書で使用する「遺伝子の部分的欠失」若しくは「部分的欠失遺伝子」は、宿主細胞のゲノムからの遺伝子のコーディング配列の部分的除去を指す。例えば、配列番号２のトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＳＳＢ７タンパク質をコードする配列番号１のｓｓｂ７遺伝子は、エキソン１〜３（それぞれ、配列番号１９〜２３）のコーディング配列（ＣＤＳ）を含む。例えば、下記に記載する所定の実施形態では、ｓｓｂ７遺伝子の「部分的欠失」には、ｓｓｂ７遺伝子のエキソン１〜３の何れか１つ以上の欠失が含まれるがそれらに限定されない。
【０１４６】
標的遺伝子が遺伝子のコーディング配列に直接隣接して位置していない制御エレメント（例えば、エンハンサーエレメント）を含む場合、「遺伝子の部分的欠失」は、コーディング配列の部分的欠失を指す、及び任意選択的に、例えばプロモーター配列及び／又はターミネーター配列を含むがそれらに限定されない隣接エンハンサーエレメントの欠失を指す。
【０１４７】
本明細書で使用する「遺伝子の破壊」、「遺伝子破壊」、「遺伝子の不活化」及び「遺伝子不活化」は、互換的に使用され、標的遺伝子を実質的に破壊／不活化する任意の遺伝子改変を広く指す。例示的な遺伝子破壊方法には、限定されないがポリペプチドコーディング配列（ＣＤＳ）、プロモーター、エンハンサー又は又別の調節エレメントを含む遺伝子の任意の部分の完全若しくは部分的な消失又は同一物の突然変異誘発が含まれ、ここで突然変異誘発は、標的遺伝子を破壊／不活化し、機能的遺伝子産物（即ち、タンパク質）の産生を実質的に減少若しくは防止する、置換、挿入、欠失、逆位並びにそれらの任意の組合せ及びそれらの変形を包含する。本開示の所定の実施形態では、そのような遺伝子破壊は、宿主細胞がコードされたｓｓｂ７遺伝子産物を発現／産生することを妨害する。
【０１４８】
他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子は、確立されたアンチセンス（遺伝子サイレンシング）技術を使用して、即ち、その遺伝子の核酸配列に相補的であるヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）を使用してダウンレギュレートされる。
【０１４９】
所定の他の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）遺伝子編集、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ編集（ＴＡＬＥＮ）、ホーミング（メガ）ヌクレアーゼ編集等の確立された遺伝子編集技術を使用して遺伝子改変される。
【０１５０】
所定の他の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、遺伝子変換のプロセスによって構築（即ち、遺伝子改変）される（例えば、Ｉｇｌｅｓｉａｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｕｔｎｅｒ，１９８３を参照されたい）。
【０１５１】
他の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、化学的変異誘発（例えば、Ｈｏｐｗｏｏｄ，１９７０を参照されたい）及び転座（例えば、Ｙｏｕｎｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３を参照されたい）を含むがそれらに限定されない、当分野において周知の方法を使用して、ランダム突然変異誘発又は特異的変異誘発によって構築（即ち、遺伝子改変）される。
【０１５２】
例えば、本明細書に開示した１つ以上の遺伝子のそのような遺伝子改変は、遺伝子のプロモーターの効率を減少させ、エンハンサーの効率を減少させ、遺伝子のｍＲＮＡのスプライシング若しくは編集を妨害し、遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を妨害し、全長タンパク質の翻訳を防止するために遺伝子のコーディング配列内に終止コドンを導入し、低活性若しくは不活性のタンパク質を産生するためにタンパク質のコーディング配列を変化させ、タンパク質と他の核タンパク質構成成分との相互作用を減少させ、低安定性タンパク質を産生するため、若しくはタンパク質を破壊の標的とするため、若しくはタンパク質がミスフォールドする、若しくは（例えば、グリコシル化により）不正確に改変されることを誘発するため、若しくはタンパク質の細胞輸送を妨害するためにタンパク質のコーディング配列を変化させる。
【０１５３】
所定の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変は、変異宿主細胞によって発現／産生した天然ＳＳＢ７の量を減少させるが、ここで発現／産生した天然ＳＳＢ７タンパク質の減少した量は、当業者には公知の方法を使用して、検出、測定、アッセイ等される。従って、当業者であれば、本開示の粘性が低下した表現型を含む糸状菌細胞のそのような（突然変異した）変異菌株を同定するために実施例のセクションに記載したスクリーニング法を容易に採用及び／又は修正することができる。例えば、所定の実施形態では、発現／産生した天然ＳＳＢ７の減少した量は、本明細書に開示した粘性が低下した表現型と容易に関連付けることができ、ここで当業者であれば、親菌株とそれに由来する変異菌株との間の形態学的相違をスクリーニングすることによって、粘性が低下した表現型を含むそのような変異宿主菌株を容易に同定することができる。従って、当業者であれば、深部培養中における好気発酵中に予め選択された溶存酸素（ＤＯ）量を維持するために（親菌株と比較して）減少した撹拌量を必要とする細胞ブロスを産生する変異菌株を同定するステップ及び／又は（ｉｉ）深部培養中における好気発酵中に予め選択された撹拌量で（親菌株と比較して）増加したＤＯ量を維持する細胞集団を産生する変異菌株を同定するステップを含むがそれらに限定されない、親菌株と変異菌株とを粘性が低下した表現型についてスクリーニングするステップによって、粘性が低下した表現型を含むそのような変異菌株を容易に同定することができる。
【０１５４】
他の実施形態では、発現／産生した天然ＳＳＢ７の減少した量は、タンパク質移動／移動度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、質量分析法、ＨＰＬＣ、サイズ排除、超遠心分離沈降速度分析、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、蛍光タグ、エピトープタグ、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＲＦＰ等）キメラ／ハイブリッド等を含むがそれらに限定されないタンパク質定量法、遺伝子転写法、ｍＲＮＡ翻訳法等によって検出、同定、測定、アッセイ等される。
【０１５５】
本明細書で使用する、機能的及び／又は構造的に類似するタンパク質は、「関連タンパク質」であると見なされる。そのような関連タンパク質は、属及び／又は種が異なる生物、或いは異なる分類の生物（例えば、細菌及び真菌）に由来し得る。関連タンパク質は更に、一次配列分析によって決定されるか、二次若しくは三次構造分析によって決定されるか、又は免疫学的交差反応性によって決定されるホモログ及び／又はオルソログを包含する。
【０１５６】
本明細書で使用する用語「プロモーター」は、コーディング配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御できる核酸配列を指す。一般に、コーディング配列は、プロモーター配列の３’（下流）に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してもよい、又は天然に存在する種々のプロモーターに由来する種々のエレメントから構成されていてもよい、又は合成核酸セグメントを含んでいてさえよい。種々のプロモーターが、種々の細胞型で、又は種々の生育段階で、又は種々の環境若しくは生理的条件に応答して、遺伝子の発現を指示し得ることは、当業者には理解されている。殆どの細胞型で遺伝子の発現を最も多く引き起こすプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれている。更に、殆どの場合に調節配列の正確な境界は完全には明らかになっていないため、種々の長さのＤＮＡ断片が同じ活性を有し得ることは確認されている。
【０１５７】
本明細書で使用する用語「作動可能に連結した」は、一方の機能が他方により影響されるような、単一核酸断片上での核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、それがそのコーディング配列の発現に影響を及ぼすことができる場合（即ち、そのコーディング配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、コーディング配列（例えば、ＯＲＦ）に作動可能に連結している。コーディング配列は、センス又はアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結され得る。核酸は、それが他の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、「作動可能に連結」している。例えば、分泌リーダー（即ち、シグナルペプチド）をコードするＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現している場合は、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結している；プロモーター若しくはエンハンサーは、それがコーディング配列の転写に影響を及ぼす場合、そのコーディング配列に作動可能に連結している；又はリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コーディング配列に作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結した」は、連結されるＤＮＡ配列が隣接している、及び分泌リーダーの場合には、隣接してリーディング期にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、隣接している必要はない。連結は、便宜的な制限部位でのライゲーションによって行われる。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
【０１５８】
本明細書で定義する「好適な調節配列」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、配列内、又はその下流（３’非コーディング配列）に位置し、関連コーディング配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステムループ構造が含まれ得る。
【０１５９】
本明細書で定義する用語「導入する（こと）」は、少なくとも１つのポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、又はその遺伝子、又はそのベクターを「細菌細胞中に導入する（こと）」等の語句に使用される場合、ポリヌクレオチドを細胞中に導入するための当分野で公知の方法を含み、こうした方法としては、限定されないが、プロトプラスト融合、天然若しくは人工形質転換（例えば、塩化カルシウム、エレクトロポレーション）、形質導入、トランスフェクション等が挙げられる。
【０１６０】
本明細書で使用する「形質転換された」又は「形質転換」は、細胞が組換えＤＮＡ技術の使用によって形質転換されていることを指す。形質転換は、典型的には、１つ以上のヌクレオチド配列（例えば、１つのポリヌクレオチド、ＯＲＦ若しくは遺伝子）を細胞内に挿入することによって発生する。挿入されるヌクレオチド配列は、異種のヌクレオチド配列（即ち、形質転換する細胞中に天然には存在しない配列）であってよい。
【０１６１】
本明細書で使用する「形質転換」は、ＤＮＡが、染色体組込み体又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、外来ＤＮＡを宿主細胞内に導入することを指す。本明細書で使用する「形質転換ＤＮＡ」、「形質転換配列」及び「ＤＮＡ構築物」は、配列を宿主細胞内又は生物内に導入するために使用されるＤＮＡを指す。このＤＮＡは、インビトロでＰＣＲ又は任意の他の好適な技術によって生成され得る。一部の実施形態では、形質転換ＤＮＡは入来配列を含むが、他の実施形態では、形質転換ＤＮＡは、相同ボックスによって隣接された入来配列を更に含む。更に別の実施形態では、形質転換ＤＮＡは、末端に付加された、他の非相同配列（即ち、スタッファー配列又は隣接配列）を含む。末端は、例えば、ベクター内への挿入等のように、形質転換ＤＮＡが閉環を形成するように閉じることができる。
【０１６２】
本明細書で使用する「入来配列」は、真菌細胞染色体内に導入されるＤＮＡ配列を指す。一部の実施形態では、入来配列は、ＤＮＡ構築物の一部である。他の実施形態では、入来配列は、１種以上の目的タンパク質をコードする。一部の実施形態では、入来配列は、形質転換対象の細胞のゲノム内に既に存在していても存在していなくてもよい（即ち、相同配列であっても非相同配列であってもよい）配列を含む。一部の実施形態では、入来配列は、１種以上の目的タンパク質、遺伝子及び／又は突然変異若しくは改変遺伝子をコードする。代替の実施形態では、入来配列は、機能的な野生型遺伝子若しくはオペロン、機能的な変異遺伝子若しくはオペロン又は非機能的な遺伝子若しくはオペロンをコードする。一部の実施形態では、入来配列は、遺伝子の機能を崩壊させるために遺伝子内に挿入される非機能的配列である。又別の実施形態では、入来配列は、選択マーカーを含む。更に別の実施形態では、入来配列は、２つの相同ボックスを含む。
【０１６３】
本明細書で使用する「相同ボックス」は、真菌細胞染色体内の配列と相同である核酸配列を指す。より詳細には、相同ボックスは、本発明に従って、欠失される、破壊される、不活化される、ダウンレギュレートされる等の遺伝子又は遺伝子の一部の直接隣接するコーディング領域と約８０〜１００％の配列同一性、約９０〜１００％の配列同一性又は約９５〜１００％の配列同一性を有する上流又は下流領域である。これらの配列は、真菌細胞染色体内にＤＮＡ構築物が組み込まれる場所を指示し、真菌細胞染色体のどの部分を入来配列で置換するかを指示する。本開示を限定することを意図するものではないが、相同ボックスには、約１塩基対（ｂｐ）〜２００キロ塩基（ｋｂ）が含まれ得る。好ましくは、相同ボックスは、約１ｂｐ〜１０．０ｋｂ；１ｂｐ〜５．０ｋｂ；１ｂｐ〜２．５ｋｂ；１ｂｐ〜１．０ｋｂ、及び０．２５ｋｂ〜２．５ｋｂを含む。相同ボックスは又、約１０．０ｋｂ、５．０ｋｂ、２．５ｋｂ、２．０ｋｂ、１．５ｋｂ、１．０ｋｂ、０．５ｋｂ、０．２５ｋｂ及び０．１ｋｂを含み得る。一部の実施形態では、選択マーカーの５’及び３’末端は、相同ボックスによって隣接されるが、ここで相同ボックスは、遺伝子のコーディング領域に直接隣接する核酸配列を含む。
【０１６４】
本明細書で使用する用語「選択可能マーカーをコードするヌクレオチド配列」は、宿主細胞中で発現可能であり、選択可能マーカーの発現が発現された遺伝子を含む細胞に、対応する選択剤の存在下又は必須栄養素の欠如下で増殖する能力を付与するヌクレオチド配列を指す。
【０１６５】
本明細書で使用する用語「選択可能マーカー」及び「選択マーカー」は、ベクターを含有するそれらの宿主の選択を容易にさせる、宿主細胞内で発現することができる核酸（例えば、遺伝子）を指す。そのような選択可能マーカーの例としては、抗微生物剤が挙げられるが、それらに限定されない。従って、用語「選択可能マーカー」は、宿主細胞が目的入来ＤＮＡを取り上げたか、又は何らかの他の反応が発生したことの兆候を提供する遺伝子を指す。典型的には、選択可能マーカーは、形質転換中に外来配列を受け入れていない細胞から外来ＤＮＡを含有する細胞を区別することを可能にする抗微生物剤耐性又は代謝有利性を宿主細胞に付与する遺伝子である。
【０１６６】
本明細書で定義する宿主細胞「ゲノム」、真菌細胞「ゲノム」又は糸状菌細胞「ゲノム」は、染色体遺伝子及び染色体外遺伝子を含む。
【０１６７】
本明細書で使用する用語「プラスミド」、「ベクター」及び「カセット」は、典型的には細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を運び、及び通常は環状の二本鎖ＤＮＡ分子の形態にある染色体外エレメントを指す。そのような要素は、多数のヌクレオチド配列が、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片及びＤＮＡ配列を適切な３’未翻訳配列と共に細胞内に導入できる固有の構造に接合又は再結合されている任意の起源に由来する、線状若しくは環状の、一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡの自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列であってよい。
【０１６８】
本明細書で使用する用語「ベクター」は、細胞内で複製（増殖）することができ、新規な遺伝子若しくはＤＮＡセグメント（例えば、「入来配列」）を細胞中に運ぶことができる任意の核酸を指す。従って、この用語は、様々な宿主細胞間で移動するために設計された核酸構築物を指す。ベクターとしては、「エピソーム」である（即ち、自律的に複製する）か、又は宿主細胞の染色体内に組み込むことができる、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン並びにＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、ＰＬＡＣ（植物人工染色体）等の人工染色体が挙げられる。
【０１６９】
本明細書で使用する「形質転換カセット」は、遺伝子（若しくは、そのＯＲＦ）を含み、その遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特異的ベクターを指す。
【０１７０】
「発現ベクター」は、細胞内で異種ＤＮＡを組み込んで発現させる能力を有するベクターを指す。多数の原核生物及び真核生物の発現ベクターが市販されており、当業者には知られている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。
【０１７１】
本明細書で使用する用語「発現カセット」及び「発現ベクター」は、標的細胞中の特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素を用いて、組換えにより、又は合成的に生成される核酸構築物（即ち、これらは、上述したベクター若しくはベクター要素である）を指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス若しくは核酸断片内に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写対象の核酸配列及びプロモーターが含まれる。一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物には、標的細胞内の特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素も又含まれる。所定の実施形態では、本開示のＤＮＡ構築物は、本明細書で定義する選択マーカー及び不活化染色体セグメント又は遺伝子セグメント又はＤＮＡセグメントを含む。
【０１７２】
本明細書で使用する「ターゲティングベクター」は、その中にターゲティングベクターが形質転換される宿主細胞の染色体内の領域に相同なポリヌクレオチド配列を含み、その領域で相同組換えを促進できるベクターである。例えば、ターゲティングベクターは、相同組換えによって宿主細胞の染色体に変異を導入するのに使用される。一部の実施形態では、ターゲティングベクターは、例えば末端に付加された他の非相同配列（即ち、スタッファー配列又は隣接配列）を含む。末端は、例えば、ベクター内への挿入等、ターゲティングベクターが閉環を形成するように閉じることができる。
【０１７３】
本明細書で使用する変異菌株は、その変異菌株によって生成されるタンパク質の量が親菌株によって生成されるタンパク質の量と比較して、２０％以下低下する、１５％以下低下する、１０％以下低下する、更には５％以下低下する場合には、親菌株としてバイオマス１単位量当たり「実質的に同一量」のタンパク質を産生するが、ここで、タンパク質の量は、それからタンパク質産生が測定される細胞のバイオマスの総量に対して正規化されたものであり、バイオマスは、（例えば、細胞ペレットの）湿潤重量又は乾燥重量で表すことができる。
【０１７４】
本明細書で使用する変異菌株は、変異菌株によって産生するタンパク質の量が親菌株と比較して、少なくとも５％増加した、少なくとも１０％増加した、少なくとも１５％以上増加した場合は、親菌株よりも「バイオマス１単位量当たり実質的により多量のタンパク質」を生成するが、ここで、タンパク質の量はそれからタンパク質産生が測定される細胞のバイオマスの総量に対して正規化されたものであり、バイオマスは（例えば、細胞ペレットの）湿潤重量又は乾燥重量で表すことができる。
【０１７５】
本明細書で使用する、「蛍光色素」は、蛍光染料である。好ましい蛍光色素は、真菌の細胞壁内のセルロース及び／又はキチンに結合する。
【０１７６】
ＩＩ．粘性が低下した表現型を含むトリコデルマ（ＴＲＩＣＨＯＤＥＲＭＡ）菌株
上記で一般に記載し、下記の実施例のセクションで詳述するように、本開示の所定の実施形態は、親菌株に由来する糸状菌の変異菌株に関する。より特別には、所定の実施形態は、糸状菌の変異菌株及びその方法に関するが、ここでそのような変異菌株は、改良された体積効率、強化された／一様な酸素分布、低下した細胞ブロス粘性、高比生産性、改良された炭素源の収率、減少したバイオリアクター（発酵槽）の運転費、変化した（細胞）表現型、変化した（細胞）形態、変化した（細胞）増殖特性等を含む。
【０１７７】
例えば、本明細書で記載及び提示したように、本開示のそのような（即ち、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含む）変異菌株は、予め選択された（即ち、深部培養中における好気発酵中の）溶存酸素（ＤＯ）量を親菌株の（即ち、深部培養中における好気発酵中の）細胞と比較して維持するため減少した撹拌量を必要とする、及び／又は予め選択された撹拌量で、親菌株の（即ち深部培養中における好気発酵中の）細胞と比較して増加したＤＯ量を維持する細胞集団を産生する細胞ブロスを産生する。より特別には、本明細書で構築及び記載した糸状菌の変異菌株は、特に本明細書では「粘性が低下した」表現型と呼ぶ変化した細胞形態表現型（例えば、実施例１〜３及び図２を参照されたい）を含む。
【０１７８】
従って、実施例１に記載したように、「Ｍｏｒｐｈ  ７７Ｂ７」と名付けられたＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）突然変異体は、特にその親より短くより粘性の糸状体を有する、深部液体培地中で変化した形態（表現型）を有することが観察されたが、ここでＭｏｒｐｈ  ７７Ｂ７突然変異体は、更に親を含有する培養と比較して、増殖中により高レベルの溶存酸素（ＤＯ）も又示したが（実施例１、表１を参照されたい）、ここで突然変異体（Ｍｏｒｐｈ  ７７Ｂ７）表現型に相補性を示したのは、唯一の遺伝子座だけであった（これは「ｓｓｂ７」と名付けられた）。ｓｓｂ７遺伝子は、新規に予測されたタンパク質である、同一ＤＮＡ配列上の他のタンパク質の予測、例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＱＭ６ａタンパク質ＩＤ（ＰＩＤ）１０８７１２と部分的に重複するＳＳＢ７をコードする（Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｏｒｔａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｒｉｇｏｒｉｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）（図１を参照されたい）。菌株Ｍｏｒｐｈ  ７７Ｂ７内で同定されたｓｓｂ７突然変異対立遺伝子は、フレームシフト（ｆｓ）突然変異及びその変異対立遺伝子が「ｓｓｂ７（ｆｓ）」と名付けられたｓｓｂ７遺伝子の最終イントロン（イントロン２）の前の未成熟終止コドンを生じさせる、エキソン２における単一グアニン（Ｇ）ヌクレオチド欠失（ΔＧ）（Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＱＭ６ａ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  １３、１６７４０４；配列番号３）を含む。実施例２では、更に、ｓｓｂ７突然変異が発酵（培養）ブロスの粘性低下（形態／表現型の変化）の原因であることを検証するが、ここでｓｓｂ７の遺伝子座は、親Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株内で（２種の異なる方法によって）特異的に突然変異し、ｓｓｂ７の両方の対立遺伝子は、粘性が低下した表現型を示した。同様に、実施例３では、そのようなｓｓｂ７突然変異体の有用性を追加して試験及び確証したが、ここでｓｓｂ７の３個の突然変異対立遺伝子は、更にセルラーゼの天然カクテルを発現する異なるトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）系統（「Ｔ４ａｂｃ」と名付けられた）においても評価されたが、これらの突然変異対立遺伝子のそれぞれは、本明細書で記載した粘性が低下した表現型を証明した。
【０１７９】
従って、本開示の所定の実施形態は、粘性が低下した表現型を含む糸状菌の変異菌株に関する。所定の他の実施形態は、糸状菌細胞のそのような変異菌株を構築する、糸状菌細胞のそのような変異菌株をスクリーニングする、糸状菌細胞のそのような変異菌株を使用して目的タンパク質を産生する組成物及び方法に関する。
【０１８０】
ＩＩＩ．粘性が低下した表現型を含む変異糸状菌株の構築
所定の実施形態では、糸状菌の変異菌株（細胞）は、糸状菌の親菌株（細胞）に由来するが、ここで変異菌株は、ＳＳＢ７タンパク質／ＳＳＢ７オルソログをコードする遺伝子の（即ち、親菌株と比較した）少なくとも１つの遺伝子改変を含み、そのような変異菌株は、親菌株と比較して粘性が低下した表現型を含む。より特別には、本開示の所定の他の実施形態は、ＳＳＢ７タンパク質／ＳＳＢ７オルソログをコードする遺伝子の遺伝子改変を含む糸状菌のそのような変異菌株（細胞）に向けられ、ここで変異菌株は、深部培養中における好気発酵中に、（ｉ）予め選択された溶存酸素（ＤＯ）量を維持するために低下した撹拌量を必要とする細胞ブロス、及び／又は（ｉｉ）予め選択された撹拌量で、即ち親菌株と比較して増加したＤＯ量を維持する細胞ブロスを産生する。
【０１８１】
ＩＩＩ．Ａ  粘性が低下した表現型を含む変異トリコデルマ（ＴＲＩＣＨＯＤＥＲＭＡ）菌株の構築
上記で概して記載したように、本開示の所定の実施形態は、親トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種菌株に由来する変異トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種菌株に向けられる、ここで変異菌株は、粘性が低下した表現型を含む。所定の実施形態では、変異トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種菌株は、配列番号２又は配列番号３１のＳＳＢ７タンパク質と少なくとも約５０％の配列同一性を含むＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ここで変異菌株は、粘性が低下した表現型を含む。所定の他の実施形態では、変異トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種菌株は、配列番号１のｓｓｂ７遺伝子と少なくとも約５０％の配列同一性を含むｓｓｂ７遺伝子の遺伝子改変を含み、ここで変異菌株は、粘性が低下した表現型を含む。所定の他の実施形態では、変異トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種菌株は、配列番号３２のｓｓｂ７遺伝子と少なくとも約５０％の配列同一性を含むｓｓｂ７遺伝子の遺伝子改変を含み、ここで変異菌株は、粘性が低下した表現型を含む。所定の他の実施形態では、変異トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種菌株は、配列番号３４のｓｓｂ７遺伝子と少なくとも約５０％の配列同一性を含むｓｓｂ７遺伝子の遺伝子改変を含み、ここで変異菌株は、粘性が低下した表現型を含む。
【０１８２】
他の実施形態では、変異トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種菌株は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ここでＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変は、ＳＳＢ７タンパク質の保存領域Ａ〜Ｄ内で発生する（図１Ａ及び配列番号２２〜２５を参照されたい）。所定の他の実施形態では、変異トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種菌株は、エキソン１（配列番号１９）、エキソン２（配列番号２０）及びエキソン３（配列番号２１）から成る群から選択される少なくとも１つのエキソンの遺伝子改変を含み、ここで変異菌株は、粘性が低下した表現型を含む。又別の実施形態では、変異トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種菌株は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ここで遺伝子改変は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター配列内で発生する、及び／又はＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の未翻訳領域（ＵＴＲ）内で発生するが、ここで変異菌株は、粘性が低下した表現型を含む。
【０１８３】
所定の他の実施形態では、変異トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種菌株は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ここでＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変は、図８Ｂ〜８Ｆに示したように、１つ以上のコードされたＳＳＢ７タンパク質疎水性配列領域をそれらの親水性配列領域に転換させる、又はその逆も同様であるが、ここでこの変異菌株は、粘性が低下した表現型を含む。例えば、配列番号２のＳＳＢ７タンパク質配列の疎水性プロット（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（ＫＤ）インデックスによる）（図８Ｂ〜８Ｆに示した）は、ＳＳＢ７タンパク質配列内の所定のアミノ酸の疎水性度又は親水性度の定量的分析を提供する。従って、図８Ｂ〜８Ｆに示した疎水性プロットは、ｘ軸上にＳＳＢ７タンパク質の（１°）アミノ酸配列及びｙ軸上に疎水性度（＞０）及び親水性度（＜０）（スコア）を示しており、ＫＤインデックスを使用したアミノ酸疎水性スコアは図８Ｇに示した。例えば、当業者には一般に、そのようなプロットの形状を分析すると、タンパク質の部分的構造に関する特に重要な情報が得られることは理解されている。例えば、一続きのアミノ酸（即ち、球状（非膜貫通型）タンパク質についておよそ１０残基ウィンドウ）が疎水性について正（＞０）のスコアを示す場合、これらのアミノ酸はＳＳＢ７タンパク質の三次構造内に埋まっている（即ち、水性溶媒中に表面が露出していない）可能性が高い。対照的に、高い親水性スコア（＜０）を備えるアミノ酸配列領域は、これらのアミノ酸残基が水性溶媒と接触していること、従って、これらの残基は主としてＳＳＢ７タンパク質の外面上に位置することを示している。
【０１８４】
従って、本明細書で記載するように、そのような親水性若しくは疎水性ＳＳＢ７タンパク質配列領域をコードするｓｓｂ７遺伝子（若しくはその部分配列）は、それらの対向配列領域をコードするように容易に（例えば、疎水性配列と親水性との交換、又はその逆に）改変することができる。当分野において公知であるように、そのような遺伝子改変（例えば、少なくとも１個の親水性アミノ酸残基を疎水性残基に変換させる、又はその逆、好ましくは少なくとも２〜３個の連続親水性残基を疎水性残基に変換させる、又はその逆）の導入は、減少した量の天然ＳＳＢ７タンパク質を発現／産生する変異トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種菌株を構築する際に特に有用である。例えば、上述した改変ｓｓｂ７遺伝子（若しくはその部分配列）によってコードされた（非天然）ＳＳＢ７タンパク質は、ミスフォールディング及び／又はアンフォールディングに対する高度の傾向を有し、それにより結果としてタンパク質の凝集、沈降、タンパク質分解性切断、分解等を生じさせるであろう。そこで、当業者であれば、本開示の粘性が低下した表現型について親及び娘をアッセイすることによって、減少した量の天然ＳＳＢ７タンパク質を発現／産生する改変（娘）菌株に対して天然ＳＳＢ７タンパク質をコードする野生型遺伝子を含む親菌株をアッセイすることができる。
【０１８５】
従って、配列番号１のｓｓｂ７遺伝子、配列番号２のＳＳＢ７タンパク質、配列番号３１のＳＳＢ７タンパク質、疎水性プロット（図８Ｂ〜８Ｇ）、ＳＳＢ７タンパク質のアミノ酸組成（図８Ａ）等を参照することによって、当業者であれば、天然ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含むそのような変異トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種菌株を容易に構築することができるが、ここでそのような変異菌株は、粘性が低下した表現型を含む。例えば、当業者であれば、当分野において公知のルーチン及び従来型分子生物学的方法を使用してｓｓｂ７遺伝子を遺伝子改変することができ、本開示の粘性が低下した表現型を含むそれらの変異菌株を容易に同定することができる。
【０１８６】
ＩＩＩ．Ｂ  粘性が低下した表現型を含む変異子嚢菌門（ＡＳＣＯＭＹＣＯＴＡ）菌株の構築
上述したように、所定の実施形態は、糸状菌の親菌株（細胞）に由来する糸状菌の変異菌株（細胞）に向けられるが、ここで変異菌株は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ここで変異菌株は、粘性が低下した表現型を含む。より特別には、所定の実施形態は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ゲオスミチア（Ｇｅｏｓｍｉｔｈｉａ）種、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種等を含むがそれらに限定されない糸状菌の変異菌株に関する。従って、所定の実施形態では、本開示は、配列番号８のＳＳＢ７タンパク質オルソログをコードする遺伝子の遺伝子改変を含む変異フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種菌株に関する。他の実施形態では、本開示は、配列番号９のＳＳＢ７タンパク質オルソログをコードする遺伝子の遺伝子改変を含む変異ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種菌株に関する。他の実施形態では、本開示は、配列番号１０のＳＳＢ７タンパク質オルソログをコードする遺伝子の遺伝子改変を含む変異ミセリオフトラ（ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種菌株に関する。他の実施形態では、本開示は、配列番号１１のＳＳＢ７タンパク質オルソログをコードする遺伝子の遺伝子改変を含む変異タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種菌株に関する。他の実施形態では、本開示は、配列番号１２のＳＳＢ７タンパク質オルソログをコードする遺伝子の遺伝子改変を含む変異アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種菌株に関する。他の実施形態では、本開示は、配列番号１３のＳＳＢ７タンパク質オルソログをコードする遺伝子の遺伝子改変を含む変異ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種菌株に関する。
【０１８７】
より特別には、上記で概して記載したように、配列番号１の野生型トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種ｓｓｂ７遺伝子は、配列番号２の新規に予測されたタンパク質ＳＳＢ７をコードする（このタンパク質は、文献において特性解析されていない）。共同ゲノム研究所（ＪＧＩ）のトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）バージョン２．０データベース（菌株ＱＭ６ａ）は、この同一ＤＮＡ配列についての異なる遺伝子構造をＰＩＤ  １０８７１２であると予測している。より詳細には、本明細書に記載したｓｓｂ７タンパク質配列の分析は、微小管相互作用及び輸送（ＭＩＴ）ドメインを含有する。同様に、ＢＬＡＳＴの検索は、ＳＳＢ７タンパク質オルソログがフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種（配列番号８）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種（配列番号９）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種（配列番号１０）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｙｍｙｃｅｓ）種（配列番号１１）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種（配列番号１２）及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種（配列番号１３）の真菌株に存在するが、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）種には存在しないことを証明した。例えば、図５に提示及び記載したように、ＳＳＢ７タンパク質は、タンパク質配列保存の幾つかの領域を含む。図５は、Ｎ末端ＭＩＴドメインに渡るアミノ酸が欠如する短鎖タンパク質の予測を排除している、３５３個の子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）ホモログのＭＵＳＣＬＥアラインメントのグラフ表示である。より詳細には、アラインメントは、本明細書で「領域Ａ」（配列番号２２）、「領域Ｂ」（配列番号２３）、「領域Ｃ」（配列番号２４）及び「領域Ｄ」（配列番号２５）であると規定したＳＳＢ７ホモログ／オルソログにおける４つの保存領域を解明している。図５に示したように、領域Ａは、上記で参照したＭＩＴドメインに対応する。
【０１８８】
更に、野生型トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＳＳＢ７タンパク質（配列番号２）及び野生型トリコデルマ・アトロビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）ＳＳＢ７タンパク質（配列番号３１）を備えるそのようなＳＳＢ７オルソログ（配列番号８〜１３）のＣＬＵＳＴＡＬアラインメントは、アミノ酸配列保存の幾つかの領域を示している、図９Ａ〜９Ｅに示した。
【０１８９】
従って、所定の他の実施形態では、本開示の変異菌株は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ここで遺伝子は、配列番号２６の「保存１」ＳＳＢ７タンパク質アミノ酸をコードする核酸配列領域において改変されている。他の実施形態では、本開示の変異菌株は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ここで遺伝子は、配列番号２７の「保存２」ＳＳＢ７タンパク質アミノ酸をコードする核酸配列領域において改変されている。又別の実施形態では、本開示の変異菌株は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ここで遺伝子は、配列番号２８の「保存３」ＳＳＢ７タンパク質アミノ酸をコードする核酸配列領域において改変されている。他の実施形態では、本開示の変異菌株は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ここで遺伝子は、配列番号２９の「保存４」ＳＳＢ７タンパク質アミノ酸をコードする核酸配列領域において改変されている。又別の実施形態では、本開示の変異菌株は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ここで遺伝子は、配列番号３０の「保存５」ＳＳＢ７タンパク質アミノ酸をコードする核酸配列領域において改変されている。
【０１９０】
従って、上記のセクションＩＩＩにおいて記載したガイダンスに関して、下記に提示する実施例及び本明細書に開示したアミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、８〜１３、２２〜３１、３３及び３５）及び核酸配列（例えば、配列番号１、３、５〜７、１９〜２１、３２若しくは３４）を参照すると、当業者であれば、本開示の粘性が低下した表現型を含む糸状菌のそのような変異菌株を容易に構築することができる。
【０１９１】
ＩＶ．ＭＰＧ１、ＳＦＢ３、ＳＥＢ１、ＣＲＺ１及び／又はＧＡＳ１タンパク質をコードする遺伝子を更に含む変異真菌株
所定の実施形態では、本開示は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変、並びにＭＰＧ１タンパク質（配列番号１４）、ＳＦＢ３タンパク質（配列番号１５）、ＳＥＢ１タンパク質（配列番号１６）、ＣＲＺ１タンパク質（配列番号１７）及び／又はＧＡＳ１タンパク質（配列番号１８）をコードする遺伝子の１つ以上の遺伝子改変を含む糸状菌の変異菌株に関する。
【０１９２】
例えば、ＭＰＧ１タンパク質、ＳＦＢ３タンパク質、ＳＥＢ１タンパク質、ＣＲＺ１タンパク質及び／又はＧＡＳ１タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含む変異糸状菌株は、それからそれらが由来する親菌株（例えば、上記に参照した粘性が低下した表現型について記載している国際ＰＣＴ出願の国際公開第２０１２／１４５５８４号パンフレット、同２０１２／０２７５８０号パンフレット、同２０１２／１４５５９５号パンフレット、同２０１２／１４５５９６号パンフレット、同２０１２／１４５５９６号パンフレット及び同２０１２／１４５５９２号パンフレットを参照されたい）と比較して、粘性が低下した表現型を含む。
【０１９３】
従って、所定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、ＳＳＢ７をコードする遺伝子の遺伝子改変並びにＭＰＧ１、ＳＦＢ３、ＳＥＢ１、ＣＲＺ１及び／又はＧＡＳ１から選択されるタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの遺伝子改変を含む。
【０１９４】
所定の実施形態では、ｓｓｂ７遺伝子の遺伝子改変及びｍｐｇ１、ｓｆｂ３、ｓｅｂ１、ｃｒｚ１及び／又はｇａｓ１遺伝子の少なくとも１つの遺伝子改変を含む糸状菌の変異菌株は、ｓｓｂ７遺伝子単独の遺伝子改変しか含まない糸状菌の変異菌株と比較して、粘性が低下した表現型を更に含む。より詳細には、糸状菌のそのような変異菌株は、深部培養中における好気発酵中に（ｉ）予め選択された溶存酸素（ＤＯ）量を維持するために減少した撹拌量を必要とする、及び／又は（ｉｉ）予め選択された撹拌量で、（ｓｓｂ７単独の遺伝子改変を含む親菌株及び／又はそれらの変異菌株の細胞と比較して）増加したＤＯ量を維持する、細胞ブロスを産生する。
【０１９５】
Ｖ．分子生物学
概して上述したように、本開示の所定の実施形態は、糸状菌の親菌株に由来する糸状菌の変異菌株に向けられる。これらの変異菌株の細胞は、引き続いて、親菌株の細胞と比較して、深部培養中における好気発酵中に、予め選択された溶存酸素（ＤＯ）量を維持するための減少した撹拌量を必要とする細胞ブロス、及び／又は予め選択された撹拌量で、増加したＤＯ量を維持する細胞ブロスを産生する。従って、所定の実施形態では、粘性が低下した表現型を含む本開示の変異菌株は、（即ち、親菌株の細胞と比較して）ＳＳＢ７をコードする遺伝子の遺伝子改変を含む。
【０１９６】
従って、本明細書に記載した糸状菌の変異菌株は、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ここで遺伝子改変は：（ａ）遺伝子（若しくはＯＲＦ）における１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去、又は遺伝子（若しくはそのＯＲＦ）の転写若しくは翻訳に必要とされる調節エレメントにおける１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去、（ｂ）遺伝子破壊、（ｃ）遺伝子変換、（ｄ）遺伝子欠失、（ｅ）遺伝子のダウンレギュレーション、（ｆ）特異的突然変異誘発、及び／又は（ｇ）本明細書に開示したＳＳＢ７タンパク質のランダム突然変異誘発を含むがそれらに限定されない。他の実施形態では、ＳＳＢ７をコードする遺伝子の遺伝子改変を含む糸状菌の変異菌株は、ＭＰＧ１、ＳＦＢ３、ＳＥＢ１、ＣＲＺ１及び／又はＧＡＳ１タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の遺伝子改変を更に含む。
【０１９７】
従って、所定の実施形態では、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含む糸状菌の変異菌株は、天然ＳＳＢ７タンパク質の発現／産生を排除するための遺伝子欠失によって構築される。他の実施形態では遺伝子改変を含む糸状菌の変異菌株は、天然ＳＳＢ７タンパク質の発現／産生を排除するための部分的遺伝子欠失によって構築される。例えば、所定の実施形態では、改変糸状菌株は、ｓｓｂ７遺伝子の部分的欠失を含むが、ここで部分的欠失は、ｓｓｂ７遺伝子のコーディング配列の何れかの部分の部分的欠失を含む。従って、粘性が低下した表現型を含むそのような変異菌株は、天然ＳＳＢ７タンパク質を発現／産生しない。例えば、遺伝子欠失技術は、遺伝子の部分的若しくは完全な除去を可能にし、それによって天然タンパク質の発現／産生を排除する。そのような方法では、遺伝子の欠失は、遺伝子に隣接する５’及び３’領域が隣接して含まれるように構築された統合プラスミド／ベクターを使用する相同組換えによって達成され得る。隣接５’及び３’領域は、例えば、プラスミドが細胞内で統合されることを可能にする選択可能マーカーと会合している統合プラスミド／ベクター上で糸状菌細胞内に導入され得る。
【０１９８】
他の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、そのタンパク質（例えば、ＳＳＢ７）をコードする遺伝子を破壊若しくは不活化する遺伝子改変を含む。遺伝子破壊／不活化の典型的な方法としては、ポリペプチドコーディング配列（ＣＤＳ）、プロモーター、エンハンサー又は他の調節エレメントを含む遺伝子の何れかの部分を破壊することが挙げられ、その破壊は、置換、挿入、欠失、逆位並びにそれらの組合せ及びそれらの変形を含む。
【０１９９】
従って、所定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、遺伝子破壊技術によって構築される。遺伝子破壊技術の非限定的な例としては、本開示の１つ以上の遺伝子内へのその（例えば、ｓｓｂ７）遺伝子と相同である核酸断片を含有する統合可能なプラスミドを挿入（統合）することが挙げられるが、これは、重複領域間の相同性の領域と組込み（挿入）ベクターＤＮＡとの重複を作り出すであろう。例えば、実施例のセクションで記載するように、糸状菌のそのような変異菌株（即ち、ｓｓｂ７遺伝子破壊を含む）は、本開示の粘性が低下した表現型を含む。
【０２００】
従って、所定の他の非限定的な例では、遺伝子破壊技術として、遺伝子（例えば、ｓｓｂ７タンパク質をコードする遺伝子）内への（例えばｓｓｂ７）遺伝子と相同である核酸断片を含有する統合可能なプラスミドを挿入することが挙げられ、これは、重複領域間の相同性の領域と組込み（挿入）ベクターＤＮＡとの重複を作り出し、ここで挿入されたベクターＤＮＡは、例えば、ｓｓｂ７遺伝子のプロモーターをＳＳＢ７タンパク質コーディング領域から分離するか、又はｓｓｂ７遺伝子のコーディング若しくは非コーディング配列を遮断（破壊）し、結果としてそれらの粘性が低下した表現型株を生じさせる。従って、破壊構築物は、ｓｓｂ７遺伝子と相同の５’及び３’領域が付随する選択マーカー遺伝子（例えば、ｐｙｒ２）であってよい。選択マーカーは、破壊遺伝子を含有する形質転換体の同定を可能にする。従って、所定の実施形態では、遺伝子破壊は、プロモーター、未翻訳領域（ＵＴＲ）、コドン変化等の遺伝子の制御エレメントの改変を含む。
【０２０１】
他の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、それらの転写又は翻訳のために必要とされる遺伝子又は調節エレメント内の１つ以上のヌクレオチドを導入する、置換する、又は除去することによって構築（即ち、遺伝子改変）される。例えば、ヌクレオチドは、終止コドンの導入、開始コドンの除去又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のフレームシフトを生じさせるように、挿入又は除去され得るが、例えば対立遺伝子ｓｓｂ７（ｆｓ）を参照されたい。そのような改変は、当該技術分野の公知の方法に従って、部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ生成突然変異誘発によって実施され得る（例えば、Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔｌｅ，１９８５；Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｓｈｉｍａｄａ，１９９６；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９及びＳａｒｋａｒ  ａｎｄ  Ｓｏｍｍｅｒ，１９９０を参照されたい）。
【０２０２】
又別の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、遺伝子変換のプロセスによって構築（即ち、遺伝子改変）される（例えば、Ｉｇｌｅｓｉａｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｕｔｎｅｒ，１９８３を参照されたい）。例えば、遺伝子変換法では、目的遺伝子に対応する核酸配列をインビトロで変異させて欠陥のある核酸配列を生成し、次いでこれを親細胞に形質転換して欠陥遺伝子を含む変異細胞を生成する。相同組換えによって、欠陥のある核酸配列が内在性遺伝子に取って代わる。欠陥のある遺伝子又は遺伝子断片は又、欠陥のある遺伝子を含有する形質転換体の選択に使用され得るマーカーをコードすることが望ましい場合がある。例えば、欠陥のある遺伝子は、選択可能マーカーと会合している非複製プラスミド若しくは感温性プラスミド上に導入され得る。プラスミドを統合するための選択は、プラスミド複製を許容しない条件下でそのマーカーを選択することによって実施される。遺伝子置換をもたらす第２の組換え事象の選択は、選択可能マーカーの消失及び変異遺伝子の獲得についてコロニーを調査することによって実施される（Ｐｅｒｅｇｏ，１９９３）。
【０２０３】
他の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、ｓｓｂ７遺伝子の核酸配列と相補的であるヌクレオチド配列を使用して、確立されたアンチセンス（遺伝子サイレンシング）技術によって構築される（Ｐａｒｉｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔｏｋｅｒ，１９９７）。より詳細には、糸状菌株による遺伝子の発現は、この遺伝子の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を導入することにより低減（ダウンレギュレート）又は排除することができ、それは細胞内で転写され、細胞内で産生されるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる。相補的アンチセンスヌクレオチド配列がｍＲＮＡにハイブリダイズできる条件下では、従って、翻訳されるタンパク質量は低減又は排除される。そのようなアンチセンス法としては、以下に限定されないが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられ、これらの全てが当業者に周知である。
【０２０４】
他の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、化学的突然変異誘発（例えば、Ｈｏｐｗｏｏｄ，１９７０を参照されたい）及び転座（例えば、Ｙｏｕｎｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３を参照されたい）を含むがそれらに限定されない当分野において周知の方法を使用して、ランダム突然変異誘発又は特異的突然変異誘発によって構築（即ち、遺伝子改変）される。遺伝子の改変は、親細胞に突然変異誘発を受けさせること、及びその中で遺伝子の発現が低減又は排除されている変異細胞についてスクリーニングすることによって実施され得る。例えば、当業者であれば、粘性が低下した表現型を含む糸状菌細胞のそのような（突然変異した）変異菌株を同定するために実施例のセクションに記載したスクリーニング法を容易に採用及び／又は修正することができる。
【０２０５】
特異的であってもランダムであってもよい突然変異誘発は、例えば、好適な物理的若しくは化学的変異誘発剤の使用によって、好適なオリゴヌクレオチドの使用によって、又はＤＮＡ配列をＰＣＲ生成変異誘発にかけることによって実施され得る。更に、突然変異誘発は、これらの突然変異誘発法を任意に組み合わせることにより実施され得る。本発明の目的に好適な物理的又は化学的な変異誘発剤の例としては、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸及びヌクレオチドアナログが挙げられる。そのような薬剤を使用する場合、突然変異誘発は、典型的には、好適な条件下で最適な変異誘発剤の存在下で突然変異誘発対象の親細胞をインキュベートするステップ、及び遺伝子の減少した発現を示すか、又は発現を示さない突然変異細胞を選択するステップによって実施される。
【０２０６】
例えば、本明細書に開示した１つ以上の遺伝子のそのような遺伝子改変は、遺伝子のプロモーターの効率を減少させ、エンハンサーの効率を減少させ、遺伝子のｍＲＮＡのスプライシング若しくは編集を妨害し、遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を妨害し、全長タンパク質の翻訳を防止するために遺伝子のコーディング配列内に終止コドンを導入し、低活性若しくは不活性のタンパク質を産生するためにタンパク質のコーディング配列を変化させ、タンパク質と他の核タンパク質構成成分との相互作用を減少させ、低安定性タンパク質を産生するため、若しくはタンパク質を破壊の標的とするため、若しくはタンパク質がミスフォールドする、若しくは（例えば、グリコシル化により）不正確に改変されることを誘発するため、若しくはタンパク質の細胞輸送を妨害するためにタンパク質のコーディング配列を変化させる。
【０２０７】
所定の他の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、部位特異的遺伝子編集技術によって構築（即ち、遺伝子改変）される。例えば、所定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、転写活性化因子様エンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ホーミング（メガ）エンドヌクレアーゼ等の使用によって構築（即ち、遺伝子改変）される。より特別には、改変対象の遺伝子の部分（例えば、コーディング領域、非コーディング領域、リーダー配列、プロペプチド配列、シグナル配列、転写ターミネーター、転写活性化因子又はコーディング領域を発現させるために必要とされる他の調節エレメント）は、ＺＦＮ遺伝子編集、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集、ホーミング（メガ）エンドヌクレアーゼ等による遺伝子改変にかけられるが、それらの改変方法は、当業者には周知であり、利用することができる。
【０２０８】
従って、所定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集によって構築（即ち、遺伝子改変）される（例えば、本明細書の実施例を参照されたい）。より詳細には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系による真菌ゲノム改変のための組成物及び方法は、当分野において記載されており、周知である（例えば、国際ＰＣＴ出願の国際公開第２０１６／１００５７１号パンフレット、同第２０１６／１００５６８号パンフレット、同第２０１６／１００２７２号パンフレット、同第２０１６／１００５６２号パンフレット等を参照されたい）。従って、ＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子は、ＤＮＡ上の標的配列にエンドヌクレアーゼを動員するガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９）又はガイドＤＮＡ（例えば、ＮｇＡｇｏ）の何れかを結合することによってそれらの標的ＤＮＡを見出す、核酸誘導型エンドヌクレアーゼによって破壊、欠失、突然変異又はさもなければ遺伝子改変することができるが、ここでエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡにおいて一本鎖又は二本鎖切断を生成することができる。この標的化ＤＮＡ切断は、ＤＮＡ修復のための基質となり、遺伝子を破壊又は欠失させるために提供された編集鋳型と再結合し得る。例えば、核酸誘導型エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９又はＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするコドン最適化遺伝子）は、糸状菌細胞内で活性なプロモーター及び糸状菌細胞内で活性なターミネーターに作動可能に連結されており、これにより糸状菌Ｃａｓ９発現カセットを作製する。同様に、目的遺伝子に固有の１つ以上の標的部位は、当業者により容易に同定される。
【０２０９】
例えば、目的遺伝子内の標的部位に向けられたｇＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物を構築するためには、可変標的化ドメイン（ＶＴ）は、そのヌクレオチドが、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９に対するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲ）をコードするＤＮＡに融合している、（ＰＡＭ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＴＧＧ）の５’である標的部位のヌクレオチドを含むであろう。ＶＴドメインをコードするＤＮＡとＣＥＲドメインをコードするＤＮＡとの組合せは、それによりｇＲＮＡをコードするＤＮＡを生成する。従って、ｇＲＮＡのための糸状菌発現カセットは、糸状菌細胞内で活性なプロモーター及び糸状菌細胞内で活性なターミネーターにｇＲＮＡをコードするＤＮＡを作動可能に連結させることによって作製される。
【０２１０】
所定の実施形態では、エンドヌクレアーゼによって誘導されたＤＮＡ切断は、入来配列を用いて修復／置換される。例えば、上述したＣａｓ９発現カセット及びｇＲＮＡ発現カセットによって生成されたＤＮＡ切断を精密に修復するためには、細胞のＤＮＡ修復機構が編集鋳型を利用できるように、ヌクレオチド編集鋳型が提供される。例えば、標的化遺伝子の約５００ｂｐの５’は、編集鋳型を生成するために標的化遺伝子の約５００ｂｐの３’に融合させることができ、その鋳型は、ＲＧＥＮによって生成されたＤＮＡ切断を修復するために糸状菌宿主の機構によって使用される（ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ）。
【０２１１】
Ｃａｓ９発現カセット、ｇＲＮＡ発現カセット及び編集鋳型は、多数の様々な方法（例えば、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、天然コンピテンス又は誘導コンピテンス）を使用して糸状菌細胞に共送達することができる。形質転換細胞は、標的遺伝子座をフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて増幅させることにより、ＰＣＲによってスクリーニングされる。これらのプライマーは、野生型遺伝子座又はＲＧＥＮによって編集されている改変遺伝子座を増幅させることができる。次いで、これらの断片は、編集されたコロニーを同定するために、シーケンシングプライマーを使用して配列決定される。
【０２１２】
本開示のＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子を遺伝子改変させることのできる又別の方法は、目的遺伝子の発現レベルを変化させることによる。例えば、そのようなヌクレオチド誘導型エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ欠損性変異体（例えば、Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ、Ｎ８６３Ａ若しくはＣａｓ９  Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ）は、標的遺伝子の転写を強化若しくは拮抗することによって遺伝子の発現レベルを調節するために使用できる。これらのＣａｓ９変異体は、タンパク質配列内に存在する全てのヌクレアーゼドメインに対して不活性であるが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合活性は維持している（即ち、これらのＣａｓ９変異体は、同種標的部位に結合すると、ＤＮＡの何れの鎖も切断することができない）。
【０２１３】
従って、ヌクレアーゼ欠損性タンパク質（即ち、Ｃａｓ９変異体）は、糸状菌発現カセットとして発現させることができ、糸状菌ｇＲＮＡ発現カセットと結合すると、その結果としてＣａｓ９変異タンパク質は、細胞内の特異的標的配列に向けられる。Ｃａｓ９（変異）タンパク質の特異的遺伝子標的部位への結合は、細胞のＤＮＡ上の転写機構の結合若しくは移動を遮断し、それにより産生する遺伝子産物の量を減少させることができる。従って、本明細書に開示した遺伝子の何れも、この方法を用いて遺伝子発現を低下させるための標的とすることができる。遺伝子サイレンシングは、ＲＮＡｓｅｑ等の方法を使用することによって、ヌクレアーゼ欠損性Ｃａｓ９発現カセット及びｇＲＮＡ発現カセットを含有する細胞内で監視することができる。
【０２１４】
ＶＩ．実用性
一般に上記に記載したように、及び下記の実施例のセクションで提示するように、本明細書に開示した糸状菌の粘性が低下した菌株の使用は、深部培養中における酸素及び栄養分の分布を改良し、深部培養を撹拌するために必要とされるエネルギー量を減少させ、培養中に存在する細胞集団濃度の増加を可能にし、タンパク質生産の増加をもたらす。更に、本明細書に開示した糸状菌の変異菌株は、それらをその後の遺伝子操作、相補的分布、交配等のために良好に適合させる、完全に確定されたゲノムを含む。同様に、本発明の菌株は、例えば、付随する粘性低下を生じさせる操作によって、タンパク質産生に有害な影響を及ぼさない。更にその上、本明細書に開示した糸状菌のこれらの変異菌株（即ち、粘性が低下した菌株）は、既に高レベル発現が意図されたタンパク質（即ち、目的の内在性若しくは異種タンパク質）を生成する、既に選択マーカーをコードする、又は既に生産宿主において所望である他の特徴を含む親菌株を含む、本質的に任意の親菌株から生成することができる。従って、本発明の菌株及び方法は、目的タンパク質をコードする遺伝子を先在する粘性が低下した生産菌株内に移動させる必要を排除する。
【０２１５】
従って、本発明の菌株及び方法は、糸状菌の深部培養中における商業的に重要なタンパク質の産生において利用される。例えば、商業的に重要なタンパク質としては、セルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、リアーゼ、プロテアーゼ、キナーゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ペルヒドロラーゼ、トランスフェラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、クロロフィラーゼ、ヒドロホビン、キモシン、炭酸脱水酵素、チミジル酸シンターゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、チロシンキナーゼ、多剤耐性タンパク質（例えば、ＡＢＣ  Ｐ糖タンパク質）、ＣＡＤ（カルバミル−Ｐシンターゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、ジヒドロオロターゼ）、トポイソメラーゼ、リボヌクレオチド還元酵素、抗体及び他の酵素並びに糸状菌中で発現できる非酵素タンパク質が挙げられるが、それらに限定されない。そのようなタンパク質は、工業用、製薬用、動物の健康、食品及び飲料用等に適合する。
【０２１６】
ＶＩＩ．目的タンパク質
先行するセクションで手短に述べたように、本発明の菌株及び方法は、糸状菌の深部培養中における商業的に重要なタンパク質の産生において利用される。本開示の目的タンパク質（ＰＯＩ）は、任意の内在性又は異種タンパク質であってよく、そのようなＰＯＩの変異体であってもよい。タンパク質は、１つ以上のジスルフィド架橋を含有し得る、又はその機能的形態が単量体若しくは多量体であるタンパク質である、即ち、タンパク質は、四次構造を有し、複数の同一（相同）若しくは非同一（異種）サブユニットから構成され、ここで、ＰＯＩ若しくはその変異ＰＯＩは、好ましくは目的の特性を備えるタンパク質である。
【０２１７】
所定の実施形態では、ＰＯＩ若しくは変異ＰＯＩは、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンナナーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ及びこれらの組合せから成る群から選択される。
【０２１８】
所定の実施形態では、ＰＯＩ若しくは変異ＰＯＩは、ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５若しくはＥＣ６から成る群から選択される酵素委員会（ＥＣ）番号から選択される。
【０２１９】
例えば、所定の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ１．１０．３．２（例えば、ラッカーゼ）、ＥＣ１．１０．３．３（例えば、Ｌ−アスコルビン酸オキシダーゼ）、ＥＣ１．１．１．１（例えば、アルコール脱水素酵素）、ＥＣ１．１１．１．１０（例えば、塩化物ペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．１７（例えば、ペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．１．２７（例えば、Ｌ−乳酸脱水素酵素）、ＥＣ１．１．１．４７（例えば、グルコース１−脱水素酵素）、ＥＣ１．１．３．Ｘ（例えば、グルコースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１０（例えば、ピラノースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１３．１１．Ｘ（例えば、ジオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１３．１１．１２（例えば、リノール酸１３Ｓ−リポキシゲナーゼ（ｌｉｐｏｚｙｇｅｎａｓｅ））、ＥＣ１．１．３．１３（例えば、アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１４．１４．１（例えば、モノオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１４．１８．１（例えば、モノフェノールモノオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１５．１．１（例えば、スーパーオキシドジスムターゼ）、ＥＣ１．１．５．９（以前のＥＣ１．１．９９．１０、例えば、グルコース脱水素酵素）、ＥＣ１．１．９９．１８（例えば、セロビオース脱水素酵素）、ＥＣ１．１．９９．２９（例えば、ピラノース脱水素酵素）、ＥＣ１．２．１．Ｘ（例えば、脂肪酸還元酵素）、ＥＣ１．２．１．１０（例えば、アセトアルデヒド脱水素酵素）、ＥＣ１．５．３．Ｘ（例えば、フルクトシルアミン還元酵素）、ＥＣ１．８．１．Ｘ（例えば、ジスルフィド還元酵素）及びＥＣ１．８．３．２（例えば、チオールオキシダーゼ）から選択されるＥＣ１酵素（酸化還元酵素）を含むがそれらに限定されない酸化還元酵素である。
【０２２０】
所定の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ２．３．２．１３（例えば、トランスグルタミナーゼ）、ＥＣ２．４．１．Ｘ（例えば、ヘキソシルトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．４０（例えば、アルテルナスクラーゼ（ａｌｔｅｒｎａｓｕｃｒａｓｅ））、ＥＣ２．４．１．１８（例えば、１，４α−グルカン分枝酵素）、ＥＣ２．４．１．１９（例えば、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．２（例えば、デキストリンデキストラナーゼ）、ＥＣ２．４．１．２０（例えば、セロビオースホスホリラーゼ）、ＥＣ２．４．１．２５（例えば、４−α−グルカノトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．３３３（例えば、１，２−β−オリゴグルカンリントランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．４（例えば、アミロスクラーゼ）、ＥＣ２．４．１．５（例えば、デキストランスクラーゼ）、ＥＣ２．４．１．６９（例えば、ガラクトシド２−α−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．９（例えば、イヌロスクラーゼ）、ＥＣ２．７．１．１７（例えば、キシルロキナーゼ）、ＥＣ２．７．７．８９（以前のＥＣ３．１．４．１５、例えば、［グルタミンシンテターゼ］−アデニリル−Ｌ−チロシンホスホリラーゼ）、ＥＣ２．７．９．４（例えば、αグルカンキナーゼ）及びＥＣ２．７．９．５（例えば、ホスホグルカンキナーゼ）から選択されるＥＣ２（トランスフェラーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないトランスフェラーゼ酵素である。
【０２２１】
他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ３．１．Ｘ．Ｘ（例えば、エステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．１（例えば、ペクチナーゼ）、ＥＣ３．１．１．１４（例えば、クロロフィラーゼ）、ＥＣ３．１．１．２０（例えば、タンナーゼ）、ＥＣ３．１．１．２３（例えば、グリセロール−エステルアシルヒドロラーゼ）、ＥＣ３．１．１．２６（例えば、ガラクトリパーゼ）、ＥＣ３．１．１．３２（例えば、ホスホリパーゼＡ１）、ＥＣ３．１．１．４（例えば、ホスホリパーゼＡ２）、ＥＣ３．１．１．６（例えば、アセチルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７２（例えば、アセチルキシランエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７３（例えば、フェルロイルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７４（例えば、クチナーゼ）、ＥＣ３．１．１．８６（例えば、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．８７（例えば、フモシンＢ１エステラーゼ）、ＥＣ３．１．２６．５（例えば、リボヌクレアーゼＰ）、ＥＣ３．１．３．Ｘ（例えば、リン酸加水分解酵素）、ＥＣ３．１．３０．１（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ヌクレアーゼＳ１）、ＥＣ３．１．３０．２（例えば、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ヌクレアーゼ）、ＥＣ３．１．３．１（例えば、アルカリホスファターゼ）、ＥＣ３．１．３．２（例えば、酸性ホスファターゼ）、ＥＣ３．１．３．８（例えば、３−フィターゼ）、ＥＣ３．１．４．１（例えば、ホスホジエステラーゼＩ）、ＥＣ３．１．４．１１（例えば、ホスホイノシチドホスホリパーゼＣ）、ＥＣ３．１．４．３（例えば、ホスホリパーゼＣ）、ＥＣ３．１．４．４（例えば、ホスホリパーゼＤ）、ＥＣ３．１．６．１（例えば、アリールスルファターゼ）、ＥＣ３．１．８．２（例えば、ジイソプロピル−フルオロホスファターゼ）、ＥＣ３．２．１．１０（例えば、オリゴ−１，６−グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１０１（例えば、マンナンエンド−１，６−α−マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１１（例えば、α−１，６−グルカン−６−グルカノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３１（例えば、キシランα−１，２−グルクロノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３２（例えば、キトサンＮ−アセチルグルコサミノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３９（例えば、α−グルクロニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１４（例えば、キチナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１５１（例えば、キシログルカン特異的エンド−β−１，４−グルカナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１５５（例えば、キシログルカン特異的エキソ−β−１，４−グルカナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１６４（例えば、ガラクタンエンド−１，６−β−ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１７（例えば、リゾチーム）、ＥＣ３．２．１．１７１（例えば、ラムノガラクツロナンヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１７４（例えば、ラムノガラクツロナンラムノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．２（例えば、β−アミラーゼ）、ＥＣ３．２．１．２０（例えば、α−グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２２（例えば、α−ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２５（例えば、β−マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２６（例えば、β−フ���クトフラノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．３７（例えば、キシラン１，４−β−キシロシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．３９（例えば、グルカンエンド−１，３−β−Ｄ−グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．４０（例えば、α−Ｌ−ラムノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５１（例えば、α−Ｌ−フコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５２（例えば、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５５（例えば、α−Ｎ−アラビノフラノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５８（例えば、グルカン１，３−β−グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５９（例えば、グルカンエンド−１，３−α−グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．６７（例えば、ガラクツラン１，４−α−ガクツロニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．６８（例えば、イソアミラーゼ）、ＥＣ３．２．１．７（例えば、１−β−Ｄ−フルクタンフルクタノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．７４（例えば、グルカン１，４−β−グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．７５（例えば、グルカンエンド−１，６−β−グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．７７（例えば、マンナン１，２−（１，３）−α−マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８０（例えば、フルクタンβ−フルクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８２（例えば、エキソ−ポリ−α−ガラクツロニシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８３（例えば、κ−カラギナーゼ）、ＥＣ３．２．１．８９（例えば、アラビノガラクタンエンド−１，４−β−ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９１（例えば、セルロース１，４−β−セロビオシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９６（例えば、マンノシル−グリコプロテインエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９９（例えば、アラビナンエンド−１，５−α−Ｌ−アラビナナーゼ）、ＥＣ３．４．Ｘ．Ｘ（例えば、ペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．Ｘ（例えば、アミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．１（例えば、ロイシルアミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．１８（例えば、メチオニルアミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１３．９（例えば、Ｘａａ−Ｐｒｏジペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１４．５（例えば、ジペプチジル−ペプチダーゼＩＶ）、ＥＣ３．４．１６．Ｘ（例えば、セリン型カルボキシペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１６．５（例えば、カルボキシペプチダーゼＣ）、ＥＣ３．４．１９．３（例えば、ピログルタミル−ペプチダーゼＩ）、ＥＣ３．４．２１．Ｘ（例えば、セリンエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．１（例えば、キモトリプシン）、ＥＣ３．４．２１．１９（例えば、グルタミルエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．２６（例えば、プロリルオリゴペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．４（例えば、トリプシン）、ＥＣ３．４．２１．５（例えば、トロンビン）、ＥＣ３．４．２１．６３（例えば、オリジン）、ＥＣ３．４．２１．６５（例えば、テルモミコリン）、ＥＣ３．４．２１．８０（例えば、ストレプトグリシンＡ）、ＥＣ３．４．２２．Ｘ（例えば、システインエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２２．１４（例えば、アクチニダイン）、ＥＣ３．４．２２．２（例えば、パパイン）、ＥＣ３．４．２２．３（例えば、フィカイン）、ＥＣ３．４．２２．３２（例えば、ステムブロメライン）、ＥＣ３．４．２２．３３（例えば、フルーツブロメライン）、ＥＣ３．４．２２．６（例えば、キモパパイン）、ＥＣ３．４．２３．１（例えば、ペプシンＡ）、ＥＣ３．４．２３．２（例えば、ペプシンＢ）、ＥＣ３．４．２３．２２（例えば、エンドチアペプシン）、ＥＣ３．４．２３．２３（例えば、ムコールペプシン）、ＥＣ３．４．２３．３（例えば、ガストリクシン）、ＥＣ３．４．２４．Ｘ（例えば、メタロエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２４．３９（例えば、ドイテロリシン）、ＥＣ３．４．２４．４０（例えば、セラリシン）、ＥＣ３．５．１．１（例えば、アスパラギナーゼ）、ＥＣ３．５．１．１１（例えば、ペニシリンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．１４（例えば、Ｎ−アシル−脂肪族−Ｌ−アミノ酸アミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．２（例えば、Ｌ−グルタミンアミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．２８（例えば、Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．４（例えば、アミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．４４（例えば、タンパク質−Ｌ−グルタミンアミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．５（例えば、ウレアーゼ）、ＥＣ３．５．１．５２（例えば、ペプチド−Ｎ（４）−（Ｎ−アセチル−β−グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．８１（例えば、Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸デアシラーゼ）、ＥＣ３．５．４．６（例えば、ＡＭＰデアミナーゼ）及びＥＣ３．５．５．１（例えば、ニトリラーゼ）から選択されるＥＣ３（ヒドロラーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないヒドロラーゼ酵素である。
【０２２２】
他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ４．１．２．１０（例えば、マンデロニトリルリアーゼ）、ＥＣ４．１．３．３（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ）、ＥＣ４．２．１．１（例えば、炭酸脱水酵素）、ＥＣ４．２．２．−（例えば、ラムノガラクツロナンリアーゼ）、ＥＣ４．２．２．１０（例えば、ペクチンリアーゼ）、ＥＣ４．２．２．２２（例えば、ペクチン酸三糖リアーゼ）、ＥＣ４．２．２．２３（例えば、ラムノガラクツロナンエンドリアーゼ）及びＥＣ４．２．２．３（例えば、マンヌロン酸特異的アルギン酸リアーゼ）から選択されるＥＣ４（リアーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないリアーゼ酵素である。
【０２２３】
所定の他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ５．１．３．３（例えば、アルドース１−エピメラーゼ）、ＥＣ５．１．３．３０（例えば、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ）、ＥＣ５．４．９９．１１（例えば、イソマルツロースシンターゼ）及びＥＣ５．４．９９．１５（例えば、（１→４）−α−Ｄ−グルカン１−α−Ｄ−グルコシルムターゼ）から選択されるＥＣ５（イソメラーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないイソメラーゼ酵素である。
【０２２４】
更に他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ６．２．１．１２（例えば、４−クマリン酸塩：補酵素Ａリガーゼ）及びＥＣ６．３．２．２８（例えば、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ）から選択されるＥＣ６（リガーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないリガーゼ酵素である。
【０２２５】
本発明の菌株及び方法のこれらや他の態様及び実施形態は、本明細書及び下記の実施例に照らせば、当業者には明白になるであろう。
【実施例】
【０２２６】
本開示の所定の態様は、限定するものと解釈すべきでない以下の実施例に照らして更に理解することができる。材料及び方法の変更は、当業者には明白であろう。
【０２２７】
実施例１
糸状菌における形態学的変化の原因としてのｓｓｂ７遺伝子の同定
Ａ．概説
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）は、商業的発酵において使用した場合に濃い粘性発酵ブロスを産生する好気性糸状菌である。例えば、そのような発酵ブロスの高粘性は、特に酸素移動を減少させ、それにより細胞集団の量を限定し、これは同時にＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の商業的発酵において達成される体積生産性を減少させる。粘性が低下した突然変異体の単離は、より粘性が低い発酵ブロスを産生する突然変異菌株を生じさせ得る。そのような変異菌株を用いると、発酵は、より多くの細胞集団を利用することができ、体積生産性の増加をもたらす。より特別には、１つのそのような突然変異体であるＭｏｒｐｈ  ７７Ｂ７は、遺伝子スクリーニングから単離されたが、ここで原因となる突然変異は、以前に特性解析されていないＭＩＴドメインを含有するタンパク質をコードする遺伝子ｓｓｂ７におけるフレームシフト突然変異であると同定された。本実施例（及び下記に続く実施例２及び３）では、ｓｓｂ７の突然変異が発酵ブロスの粘性の低下を生じさせることを例示する、ｓｓｂ７の様々な突然変異対立遺伝子を開示する。本明細書に開示したｓｓｂ７遺伝子座及び突然変異ｓｓｂ７対立遺伝子は、図１に示した。
【０２２８】
Ｂ．形態突然変異体についてのスクリーニング
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株を発現する「ＴｒＧＡ  ２９−９」と名付けられたグルコアミラーゼ（ＧＡ）（全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，７２５，７２７号明細書を参照されたい）は、１０％の殺滅が得られるまで、ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を用いて突然変異させた。生存細胞をＰＤＡ（ポテトデキストロース寒天）上で平板培養し、胞子形成させた。胞子は、水中に懸濁させた後に平板から擦り取った。胞子は４８〜７２時間に渡りＹＥＧ（酵母エキスグルコースブロス）中で増殖させ、生じた菌糸体は２００マイクロメートル（μｍ）フィルターに通してふるい、引き続いてこのフィルターを大量の水を用いて洗浄した。濾液を遠沈させ、菌糸体を収集し、ＹＥＧ内に再接種した。毎回菌糸体をより小さなフィルターに通してふるった以外は、この同じ抽出手法を数回繰り返した。最終ステップでは、ＹＥＧ中での増殖後、菌糸体を４０μｍのフィルターに通して濾過し、菌糸体を濾液から回収し、ＰＤＡ上で平板培養した。
【０２２９】
胞子ライブラリーを作製し、コロニーピッカーを使用して９６ウエルのライブラリーを調製した。顕微鏡を使用して、ライブラリーを液体培養中でスクリーニングし、形態における変化（即ち、表現型）を示す突然変異体を回収した。このスクリーニングからの突然変異体を高細胞密度振とうフラスコ内で更に評価した。低粘性のブロスを用いた突然変異体は、更に１４Ｌの発酵槽内で低下した粘性（表現型）、酸素移動特性及びタンパク質産生について標準及び高細胞密度条件下で評価した。
【０２３０】
Ｃ．Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｍｏｒｐｈ  ７７Ｂ７の単離及び特性解析
「Ｍｏｒｐｈ  ７７Ｂ７」と名付けられたＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）突然変異体（即ち、実施例１Ｂで上述したように得られた）は、特にその親より短くより粘性の糸状体を有する、深部液体培養中で変化した形態（表現型）を有することが観察された。例えば、液体培地中では、Ｍｏｒｐｈ  ７７Ｂ７を含有する培養は、親を含有する培養と比較して、増殖中のより高レベルの溶存酸素（ＤＯ）を更に示した（表１を参照されたい）。
【０２３１】
より特別には、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株ＴｒＧＡ  ２９−９及びＭｏｒｐｈ  ７７Ｂ７は、深部（液体）培養中の類似の条件下で増殖させ、それらの増殖表現型を比較した。手短には、各菌株の胞子は、２７．５ｇ／Ｌの最終濃度まで添加した６０％のグルコースと共にサイドバッフル及びボトムバッフルの両方を備える３Ｌのフラスコ内の５００ｍＬの最小培地へ別個に添加した。培養は、３４℃の振とうインキュベーター内で４８時間に渡り増殖させた。
【０２３２】
４８時間後、各フラスコの内容物は、９．５Ｌの培地（４．７ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４．３ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４並びに１７５ｇ／Ｌのクエン酸、２００ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１６ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．２ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ及び０．８ｇ／ＬのＨ３ＢＯを含有する２．５ｍＬ／Ｌの４００×の微量元素溶液を含有する）を含有する１４Ｌの発酵槽に別個に添加した。これらの成分は一緒に、３０分間に渡り１２１℃で加熱殺菌した。６０％のグルコース及び０．４８％のＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏの溶液は、別個にオートクレーブ滅菌し、冷却し、７５ｇ／Ｌのグルコース及び０．６ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏの最終濃度まで発酵槽に添加した。この培地は２８％のＮＨ３を用いてｐＨ３．５へ調整し、温度は全増殖期間に渡り３４℃で維持した。
【０２３３】
溶存酸素（ＤＯ）プローブは、ヘッドスペース内に追加の圧力が加えられない場合に１００％へ較正された（即ち、０バールゲージ、１バール絶対値）。ヘッドスペース内の圧力は、次に０．７バール（ゲージ）に設定し、その後種培養前の酸素プローブ示度１７０％を添加した。発酵槽は、最初に５００ＲＰＭに設定した変速電動機によって混合を提供する２基の四枚刃タービンを含有していた。
【０２３４】
培養が増殖するにつれて、ＤＯ量レベルは、糸状菌菌糸の増殖に起因して、少なくとも部分的には発酵ブロスの粘性の増加の結果として低下した。ＤＯ量のレベルが４０％未満に低下すると、撹拌速度は、溶存酸素を４０％で維持するために増加させた。撹拌が７５０ＲＰＭに達すると、ＤＯ量のレベルは、４０％未満に低下させられるであろう。ＤＯ量が４０％未満に低下しなかった場合、発酵ラン中に撹拌速度を増加させることは不要で、初期撹拌速度は必要より高かった。グルコースが完全に消費されると、各発酵層中で生成されたバイオマス量が測定され、両方の菌株について実質的に同一であることが見出された。
【０２３５】
従って、所定の撹拌レベルでの各発酵槽内のＤＯ量レベル及び所定のＤＯ量レベルを維持するために必要とされる撹拌量は、（様々な菌株増殖表現型に起因する）様々なブロスの粘性の間接的尺度である。唯一の変量（即ち、ＤＯ若しくは撹拌）を変動させて相互に測定するのが理想的であろうけれども、各発酵槽内の十分なバイオマスを保証するために、ＤＯが４０％未満に低下するのを防止し、それによって様々な菌株の増殖間のより有意味な比較を許容することが望ましい。
【０２３６】
表１に示したように、菌株Ｍｏｒｐｈ  ７７Ｂ７は、（親）ＴｒＧＡ  ２９−９菌株と比較して、低下した発酵ブロス粘性を有する。例えば、バッチ増殖期の終了時（即ち、全グルコースが消費され尽くしたとき）、両方の菌株は類似のバイオマス濃度及び類似のピーク炭素発生率（ＣＥＲ）を達成した。そのために、コントロール菌株の撹拌が７５０ＲＰＭの最高設定点へ増加すると、ＤＯは１５％の最小設定点へ低下した。対照的に、Ｍｏｒｐｈ  ７Ｂ７７突然変異菌株は、同一バイオマス濃度を達成するためにこれ程多くの撹拌を必要とせず、ここで撹拌速度は、４０％の設定点でＤＯを維持するために６１６ＲＰＭまでしか増加しなかった。
【表１】
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【０２３７】
Ｄ．Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｍｏｒｐｈ  ７７Ｂ７における原因となるｓｓｂ７（ｆｓ）突然変異対立遺伝子の同定
Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＴｒＧＡ  ２９−９親菌株及びＭｏｒｐｈ  ７７Ｂ７突然変異菌株のゲノムを（概して国際ＰＣＴ出願の国際公開第２０１２／０２７５８０号パンフレットに記載されているように）シーケンシングすると、Ｍｏｒｐｈ  ７７Ｂ７ゲノムにおけるコーディング配列を変化させると予測された８つの新規な突然変異が同定され、それらの突然変異は何れも単独で、又は組み合わせて、本明細書に記載した観察された変化した形態表現型及び粘性の低下のために必要であると考えられる。そこで、これらの突然変異の何れが重要であるかを決定するために、相補性分析を実施した。
【０２３８】
より特別には、本明細書で「ｓｓｂ７」と名付けられた唯一の遺伝子座だけが突然変異表現型に相補性を示した。従って、配列番号１のｓｓｂ７遺伝子は、同一ＤＮＡ配列上の他のタンパク質の予測、例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＱＭ６ａタンパク質ＩＤ（ＰＩＤ）１０８７１２と部分的に重複する、新規に予測されたタンパク質であるＳＳＢ７をコードする（下記では「ＪＧＩポータル」と略記する、Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｏｒｔａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｒｉｇｏｒｉｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１を参照されたい）。突然変異菌株Ｍｏｒｐｈ  ７７Ｂ７においては、ｓｓｂ７突然変異対立遺伝子は、エキソン２内に単一グアニジン（Ｇ）ヌクレオチド欠失（ΔＧ）を含む（Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＱＭ６ａ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  １３，１６７４０４）。例えば、エキソン２内（即ち、ｓｓｂ７突然変異対立遺伝子内）のＧの欠失は、フレームシフト突然変異及びｓｓｂ７遺伝子の最終イントロンの前での早期終止を生じさせる。この対立遺伝子は、本明細書では「ｓｓｂ７（ｆｓ）」と呼ぶ。
【０２３９】
ＤＮＡ断片を用いた形質転換によるＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）突然変異菌株Ｍｏｒｐｈ  ７７Ｂ７菌糸表現型の相補性解析は下記のように実施した。突然変異Ｍｏｒｐｈ  ７７Ｂ７において欠失した８つの突然変異遺伝子座各々について、発現を確証するために、形質変換選択マーカーを含有するプラスミド及び十分な隣接配列を備える野生型遺伝子座配列に対応するＤＮＡ断片を構築した。突然変異菌株Ｍｏｒｐｈ  ７７Ｂ７プロトプラストは、これらのプラスミドを用いて別個に形質転換させた。これらのプラスミド各々からの２個の形質転換体は、選択液体培地を備える振とうフラスコに移し、３３℃で３日間に渡り増殖させた。大部分のＤＮＡ断片を運んでいる形質転換体は、Ｍｏｒｐｈ  ７７Ｂ７突然変異菌株について観察された高分岐性の粘性菌糸体表現型を維持していた。ＤＮＡ断片１についての（Ｍｏｒｐｈ  ７７Ｂ７内の他の突然変異遺伝子座の１つ、即ち、ＰＩＤ  １１２３２８をコードする遺伝子をコードする）形質転換体は、この突然変異表現型を例示している。これとは対照的に、ＤＮＡ断片６を含む（即ち、ＰＩＤ  １０８７１２／ＳＳＢ７をコードする）形質転換体だけが、少なくとも部分的に、より粘性が低く低分岐の菌糸体を備えるこの表現型を逆転させた。図２に示したように、ＤＮＡ断片１（図２、パネル１Ａ及びパネル１Ｂ）並びにＤＮＡ断片６（図２、パネル６Ａ及び６Ｂ）は、各ＤＮＡ断片１及び６についての独立形質転換体を表す。配列番号４の変異ＳＳＢ７タンパク質をコードする突然変異ｓｓｂ７（ｆｓ）対立遺伝子（配列番号３）の核酸配列は、図３に示した。
【０２４０】
従って、上記に概して記載したように、野生型Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｓｓｂ７遺伝子（配列番号１）の核酸配列は、文献において特性解析されていないＳＳＢ７（配列番号２）をコードする。例えば、ＳＳＢ７についてのＪＧＩポータルのＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＱＭ６ａ  ｖ２．０データベースＰＩＤは、１０８７１２（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｄｉｓｐＧｅｎｅＭｏｄｅｌ？ｄｂ＝Ｔｒｉｒｅ２＆ｉｄ＝１０８７１２；配列番号３３）であるが、ＳＳＢ７についてのＪＧＩのＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＲＵＴ−Ｃ３０データベースＰＩＤは、８２３９７（Ｊｏｕｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７；配列番号３５）である。従って、ＤＮＡ配列は、２種のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株間ではこの遺伝子座で同一である；しかしながら、コーディング領域は、僅かに相違すると予測されている（図１Ａ；「ＱＭ６ａ  ＪＧＩ  ｓｓｂ７  ＰＩＤ  １０８７１２」及び「ＲＵＴ−Ｃ３０  ＰＩＤ  ８２３９７」を参照されたい）。詳細には、菌株ＱＭ６ａ遺伝子モデルのＮ末端（ＰＩＤ  １０８７１２／配列番号３３をコードする配列番号３２）はＲＵＴ−Ｃ３０遺伝子モデルとは異なる追加の２つのエキソン（ＰＩＤ  ８２３９７／配列番号３５をコードする配列番号３４）を抱いているが、他方菌株ＲＵＴ−Ｃ３０遺伝子モデルは追加のイントロンを含有している。この遺伝子座での遺伝子モデル予測を解明するために、本発明者らは、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）からのＲＮＡシーケンシングデータをｆｕｎａｎｎｏｔａｔｅ真菌ゲノム注釈パイプラインと結び付けて利用した（ＪＭ  Ｐａｌｍｅｒ．２０１９．Ｆｕｎａｎｎｏｔａｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｐｉｐｅｌｉｎｅ．Ｚｅｎｏｄｏ．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．５２８１／ｚｅｎｏｄｏ．１１３４４７７）。Ｆｕｎａｎｎｏｔａｔｅは、ＲＮＡシーケンシングリードマッピングによって支援された遺伝子モデルを予測したが、ＱＭ６ａ及びＲＵＴ−Ｃ３０におけるＪＧＩからの両方のモデル予測は、ＲＮＡシーケンシングデータとの不適合のイントロン−エキソン境界を有していた（図１Ａを参照されたい）。ＳＳＢ７遺伝子予測は、３つのエキソン（配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１）、４６２ｂｐの５’ＵＴＲ（配列番号３６）及び３７３ｂｐの３’ＵＴＲ（配列番号３７）を含有する４７６２ｂｐの転写産物から翻訳された１３０８個のアミノ酸の翻訳タンパク質を生じさせる。本出願人は本明細書において、ｆｕｎａｎｎｏｔａｔｅソフトウエアに由来する予測を使用して、ｓｓｂ７遺伝子及びＳＳＢ７タンパク質の配位について言及する。本出願人は、本明細書でｆｕｎａｎｎｏｔａｔｅソフトウエアに由来する予測を使用して、ｓｓｂ７遺伝子（配列番号１）及びＳＳＢ７タンパク質（配列番号２）の座標について言及するが、他方ゲノム座標は、依然としてＪＧＩ  ＱＭ６ａ  ｖ２アセンブリーについて言及するであろう。
【０２４１】
Ｅ．相同性に基づく機能
本明細書で実施したＢＬＡＳＴの検索は、ＳＳＢ７タンパク質オルソログがフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種（配列番号８）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種（配列番号９）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種（配列番号１０）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｙｍｙｃｅｓ）種（配列番号１１）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種（配列番号１２）及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種（配列番号１３）中には存在するが、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）種には存在しないことを証明した。例えば、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｓｓｂ７遺伝子は、予測された微小管相互作用及び輸送（ＭＩＴ）ドメイン（表２、領域Ａ及び図５を参照されたい）及び表２の領域Ｂ、領域Ｃ及び領域Ｄに記載された未知のＳＳＢ７タンパク質ドメインを含む、特性解析されていないが高度に保存されたＳＳＢ７タンパク質をコードする。より特別には、３５３個の子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）ホモログ（Ｎ末端ＭＩＴドメインに渡るアミノ酸が欠如する短鎖タンパク質の予測を排除する）は、ソフトウエアパッケージＧｅｎｅｉｏｕｓ内のＭＵＳＣＬＥ法を使用してアラインメントさせた（Ｅｄｇａｒ  ＲＣ（２００４）．”ＭＵＳＣＬＥ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ”．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３２（５）：１７９２−９７．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｈ３４０）。グラフィカル出力は、図５に示したが、ここでアミノ酸保存の４つの領域（Ａ〜Ｄ）は、アラインメントから同定された。領域Ａは、ＭＩＴドメインと重複した。保存は、これらの４つの領域がＳＳＢ７機能にとって重要であることを意味するが、精密な酵素的若しくは構造的機能は、現在の化学的知見に基づくアミノ酸配列によっては示唆されない。
【表２】
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【０２４２】
実施例２
親菌株ＴｒＧＡ  ２９−９内でのｓｓｂ７の破壊によるＭＯＲＰＨ  ７７Ｂ７表現型の改造
Ａ．概説
ｓｓｂ７突然変異が粘性低下の原因であったことを詳細に検証するために、ｓｓｂ７遺伝子座を親菌株ＴｒＧＡ  ２９−９内で特異的に突然変異させた。そこで、相同組換えによりｓｓｂ７突然変異誘発を標的とするために、２種の方法を使用した。プラスミドｐＲＡＴＴ３１１由来の線状ＤＮＡカセットを使用する１つの方法は、菌株Ｍｏｒｐｈ  ７７Ｂ７において同定されたΔＧの部位（対立遺伝子「ｓｓｂ７（３１１）」）での破壊的ＤＮＡの挿入を標的とした。
環状プラスミドｐＴｒｅｘ２ｇ  ＭｏＣａｓ  ７７ｂ７−ＨＲ１を使用する第２方法は、フレームシフト突然変異の下流での（元のフレームと比較して）１つの同義コドン変化と一緒に、菌株Ｍｏｒｐｈ  ７７Ｂ７内で同定されたΔＧ突然変異を導入した（対立遺伝子「ｓｓｂ７（ＴＳ１）」；対立遺伝子の比較については図１を参照されたい）。従って、ｓｓｂ７の対立遺伝子はどちらも粘性の低下を示したが、他方フレームシフト対立遺伝子ｓｓｂ７（ＴＳ１）は、より良好な粘性の低下を有していた。
【０２４３】
Ｂ．菌株ＴｒＧＡ  ２９−９内の対立遺伝子ｓｓｂ７（３１１）
Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｓｓｂ７破壊カセットプラスミドｐＲＡＴＴ３１１は、標準的な分子生物学的手順を用いて調製した。従って、当業者であれば、このプラスミドを本明細書に開示した関連ＤＮＡ部分から容易に改造することができる。このプラスミドは、Ｓｃａｆｆｏｌｄ  １３、１６４８４９〜１６７４０３（左フランク）に対応するＤＮＡ配列と相同な２．６Ｋｂのホモロジーボックスを有するＤＮＡ配列を含んでいた。このプラスミド内には、Ｓｃａｆｆｏｌｄ  １３、１６７４０５〜１６９２１８（右フランク）に対応するＤＮＡ配列と相同な１．８Ｋｂのホモロジーボックスを有するＤＮＡ配列も又含まれていた。これらの配列は、ｓｓｂ７遺伝子を標的化し、左フランクと右フランクとの間のゲノムのヌクレオチド（Ｓｃａｆｆｏｌｄ  １３、１６７４０４）を介在カセット配列で置換するために設計された。これらの介在カセット配列は、トリコデルマ・アトロビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）由来のｐｙｒ２選択マーカーを含んでいた。ｐｙｒ２選択マーカーの直ぐ下流は、左フランク（リピート）の３’に最も近い領域と相同であるＳｃａｆｆｏｌｄ  １３、１６７４０３〜１６６８３３に対応する０．６Ｋｂ領域を有するＤＮＡ配列であった。これらの繰り返し配列は、唯一の新規な標的化遺伝子改変としてのｓｓｂ７遺伝子内に単一ヌクレオチドＧ欠失突然変異（Ｓｃａｆｆｏｌｄ  １３、１６７４０４）を残しながら、ｐｙｒ２マーカーのその後の消失を促進し、将来の菌株開発におけるこのマーカーの使用を可能にする。本明細書に提示したデータは、ｓｓｂ７コーディング配列を破壊するｐｙｒ２マーカー及びリピートを含有するｐＲＡＴＴ３１１形質転換体由来であることに留意されたい（図１）。
【０２４４】
菌株ＴｒＧＡ  ２９−９の自然発生ｐｙｒ２突然変異誘導体は、５−フルオロ−オロト酸（ＦＯＡ）選択によって単離した。このＴｒＧＡ  ２９−９  ｐｙｒ２菌株は、ＰＥＧ媒介性プロトプラスト形質転換法を使用して、ｐＲＡＴＴ３１１由来のｓｓｂ７破壊カセットを用いて形質転換させ、ｐｙｒ２マーカーによって獲得されたウリジン原栄養性に基づいて候補について選択するためにソルビトールを含有するフォーゲル最少培地上で平板培養した。個々の形質転換体を単離し、フォーゲル最少培地に移動させて増殖させた。当業者であれば下記のガイダンスによって実施できるように、ＰＣＲ分析を使用して、どの形質転換体で相同組換えによってｓｓｂ７遺伝子座でｓｓｂ７破壊カセットが統合したのかを同定した。
【０２４５】
目的遺伝子の破壊を正確に標的化するためには１サブセットの組換え細胞しか相同フランクを上首尾で利用することができないので、所望の事象を備える形質転換体を同定するためには、多数の形質転換体をスクリーニングする必要がある可能性がある。ＰＣＲを使用すると、どの組換え細胞が所望の標的化破壊を有するのかを試験することができる。ホモロジーボックス領域のそれぞれに渡って増幅するプライマーが設計されなければならないが、ここで、１つのプライマーは最も近い末端から１００ｂｐ超の選択マーカー内の１つの場所でプライミングし、他方のプライマーは、隣接ゲノム配列内のホモロジーボックス領域の末端を１００ｂｐ超える場所でプライミングする。正確な標的化破壊を含有する可能性が高い細胞は、破壊カセットの左フランクと右フランクに及ぶＰＣＲ産物を作製することに成功するであろうが、他方不成功に終わる形質転換事象は予想されるサイズの産物を生成しないであろう。この段階では、培養は形質転換細胞と未形質転換細胞の混合であるので、精製のステップが必要になる可能性がある。培養の精製は、破壊部位に渡る短いＰＣＲ産物の消失についてＰＣＲによって試験することができる。ｓｓｂ７破壊カセットの確証された相同統合を有する生成された菌株は、「ＴｒＧＡ  ２９−９  ｓｓｂ７（３１１）」と命名された。
【０２４６】
Ｃ．菌株ＴｒＧＡ  ２９−９内の対立遺伝子ｓｓｂ７（ＴＳ１）
本明細書に記載した菌株ＴｒＧＡ  ２９−９内のｓｓｂ７のｃａｓ９媒介性編集のために使用したベクター及び菌株開発の方法は、本質的には、国際ＰＣＴ出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１５／６５６９３及び国際公開第２０１６／１００２７２号パンフレットに記載された通りに実施したが、ここでその中の実施例３及び実施例４は、ｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓの構築について記載しており；実施例５はこのベクター内にガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）発現カセットを付加することを記載しており；及び実施例８は、ＨＲ指向性ゲノムの編集、形質転換及びスクリーニングのためのホモロジー領域の付加について記載している。
【０２４７】
図６Ａに示したｇＢｌｏｃｋ  ＤＮＡ配列（配列番号５）は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から発注されたが、５’末端又は３’末端の何れかで下線を付した配列は、ＥｃｏＲＶを用いた消化後に、ｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓを用いたＧｉｂｓｏｎアセンブリーを可能にするために付加された。これらの下線を付した配列間は、ｓｓｂ７遺伝子内のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ゲノム由来の１，０９８ｂｐである。グレーのハイライトは、野生型ｓｓｂ７遺伝子内の７個のＧ残基である、突然変異ｓｓｂ７（ｆｓ）対立遺伝子の６個のＧ残基を示している。内部の二重下線付配列は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列に対応する２０ヌクレオチド（ｎｔ）の標的配列である。最初の２０ｎｔ標的は「ＴＳ１」と呼ばれ、２番目の２０ｎｔ標的は「ＴＳ２」と呼ばれるが、ここでボールド体のｃ残基は、標的部位に隣接するＰＡＭ部位を変化させるＧからＣへの変化を表す。
【０２４８】
２つのｇＢｌｏｃｋは、２つの異なる単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のための発現カセットをコードするためにＩＤＴから発注されたが、１つはｓｓｂ７遺伝子内のＴＳ１（配列番号６、図Ｂ）を標的とし、１つは、ｓｓｂ７遺伝子内のＴＳ２（配列番号７、図６Ｃ）を標的とする。従って、２つのｇＢｌｏｃｋの何れかの端部で下線を付した配列は、ＳｆｉＩ及びＡｆｌＩＩを用いた消化後にｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓを用いたＧｉｂｓｏｎアセンブリーを可能にするために付加された。
【０２４９】
そこで、２個の最終ベクターが構築された。１個のｐＴｒｅｘ２ｇ  ＭｏＣａｓ  ７７ｂ７−ＨＲ１は、ｓｓｂ７ホモロジー領域及びＴＳ１  ｓｇＲＮＡカセットを有していた。第２のｐＴｒｅｘ２ｇ  ＭｏＣａｓ  ７７ｂ７−ＨＲ２は、ｓｓｂ７ホモロジー領域及びＴＳ２  ｓｇＲＮＡカセットを有していた。ＤＮＡシーケンシングは、所望のｇＢｌｏｃｋの挿入を検証した。
【０２５０】
従って、本明細書に開示した２つのｓｓｂ７対立遺伝子は、これらのプラスミド「ｓｓｂ７（ＴＳ１）」及び「ｓｓｂ７（ＴＳ２）」を用いて生成した。対立遺伝子ｓｓｂ７（ＴＳ１）は標的配列１（ＴＳ１）から生成し、Ｓｃａｆｆｏｌｄ  １３、１６７４０４で元のフレームシフト突然変異、並びにＴＳ１認識配列を不活化するためにＳｃａｆｆｏｌｄ  １３、１６７４３６でＧからＣへの突然変異を含有する（図１を参照されたい）。ｓｓｂ７遺伝子座の確証された相同遺伝子操作を用いて生成された菌株は、「ＴｒＧＡ  ２９−９  ｓｓｂ７（ＴＳ１）」と名付けられた。例えば、ＰＣＴ出願の国際公開第２０１６／１００２７２号パンフレット（ＰＣＴ出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６５６９３）は、（例えば、組換えＤＮＡ構築物によって発現した）ＣＡＳエンドヌクレアーゼを含む／発現する組換え真菌細胞、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む／発現する組換え真菌細胞、非機能的若しくは活性の低下した非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を含む組換え真菌細胞、糸状菌を形質転換させる方法及び組成物、そのような形質転換真菌細胞をスクリーニングするための方法及び組成物等について記載している。従って、当業者であれば、ＰＣＴ出願の国際公開第２０１６／１００２７２号パンフレットを参照することにより本開示の任意の糸状菌株において、対立遺伝子ｓｓｂ７（ＴＳ１）又は本明細書に開示した任意の他の改変対立遺伝子を同様に構築することができる。
【０２５１】
Ｄ．バイオリアクター内の粘性の低下
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）菌株は、深部（液体）培養中の類似の条件下で増殖させ、それらの増殖表現型を比較した。手短には、各菌株の胞子は、サイドバッフル及びボトムバッフルの両方を備える２５０ｍＬのフラスコ内の５０ｍＬのクエン酸最小培地へ別個に添加した。培養は、５ｃｍの動程を備える振とうインキュベーター内で１７０ＲＰＭ、３０℃で４８時間に渡り増殖させた。４８時間後、各フラスコの内容物は、接種のために２Ｌの発酵槽（バイオリアクター）に別個に添加した。インキュベーションの前に、４．７ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、９ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４及び２．５ｍＬ／Ｌの微量元素溶液を含有する０．９５ｋｇの培地を２Ｌのバイオリアクターに添加し、その後に３０分間に渡り１２１℃で一緒に加熱殺菌した。殺菌後の添加物：滅菌した４．８ｍＬの５０％のグルコース及び０．９６ｍＬの０．４８％のＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏは、インキュベーションの前にタンクに添加した。培地は、１４％のＮＨ３を用いてｐＨ３．５へ調整し、全増殖期間に渡り、温度は３０℃及びｐＨは３．５で維持した。
【０２５２】
溶存酸素（ＤＯ）プローブは、ヘッドスペース内に追加の圧力がない時点に１００％へ較正した（即ち、０バールゲージ、１バール絶対値）。バイオリアクターは、最初に８００ＲＰＭに設定した変速電動機によって混合を提供する、２枚の海洋インペラー間に４枚刃Ｒｕｓｈｔｏｎインペラーを含有していた。
【０２５３】
培養が増殖するにつれて、ＤＯレベルは、糸状菌菌糸の増殖に起因して、少なくとも部分的には発酵ブロスの粘性の増加の結果として低下した。バイオリアクター内の溶存酸素の制御は、数個の設定点を調整する制御ループに基づいた。ＤＯが３０％未満に低下すると、溶存酸素を３０％で維持するために撹拌速度は増加させられ、最大撹拌設定点は１，２００ＲＰＭであった。ＤＯが３０％を保持できなかった場合は、酸素富化は２１％から４０％まで増加させられた。それでも未だＤＯが保持できない場合は、ガス流量は６０ｓＬ／時から８０ｓＬ／時まで増加させられた。グルコースが完全に消費された時点に各バイオリアクター内で生成されたバイオマス量が測定され、全菌株について実質的に同一であると見出された（約５０ｇ／ｋｇの乾燥細胞重量）。バッチ処理グルコースの消耗後、グルコース制限状態にある細胞を維持し、たんぱく質産生を促進するために、グルコース及び混合二糖の緩徐な供給を開始した。親ＴｒＧＡ  ２９−９菌株及び２種のｓｓｂ７突然変異体（由来）菌株ＴｒＧＡ  ２９−９  ｓｓｂ７（３１１）及びＴｒＧＡ  ２９−９  ｓｓｂ７（ＴＳ１）のためのバイオリアクター内の撹拌及びＤＯプロフィールは、明確にするために図７に提示した。
【０２５４】
例えば、図７に示したように、所定レベルの撹拌での各バイオリアクター内のＤＯレベル及び所定のＤＯレベルを維持するために必要とされる撹拌量は、発酵ブロス粘性の間接的な尺度であり、その測定値は、本明細書に記載した観察された真菌株の増殖表現型と相関する（例えば、図２を参照されたい）。唯一の変量（即ち、ＤＯ若しくは撹拌）を変動させて相互に測定するのが理想的であろうけれども、各バイオリアクター内の十分なバイオマスの生産を保証し、高生産性を達成するために、ＤＯが３０％未満に低下するのを防止し、それによって様々な真菌株の増殖間のより有意味な比較を許容することが望ましい。
【０２５５】
従って、上述した粘性低下の２つの尺度は、各バイオリアクター内のラン、ＤＯ制限及び撹拌の追加から定量した。菌株は、それらがバッチ処理グルコースをいつ消耗するのか、従って供給開始を誘発するのか関して異なるので、菌株は、発酵中に、いつＤＯが最も制限されるかに関しても異なる。このため、これらの測定は、供給開始前２０時間及び供給開始後４０時間に及ぶ発酵時間の時間枠を使用して計算した。
【０２５６】
図７は、この時間枠±１０時間を示している。ＤＯ制限は、ＤＯレベルが最小ＤＯ設定点より２０％未満高いサンプリング点（即ち、３６％未満のＤＯ）の比率であると規定した。撹拌の追加は、制御ループによって誘発される８００ＲＰＭの設定点の上方の追加の撹拌の平均値であると規定した。発酵ブロスの粘性は、細胞密度に伴って増加する粘性と共に、細胞密度の関数であるので、変異菌株と親菌株との比較は、類似の細胞質量濃度でのみ有効である。このため、実施例においては、それからこれらの間接的尺度が計算される時間枠中ではピーク乾燥細胞重量（ＤＣＷ）が含まれる。
【０２５７】
従って、粘性評価は、親ＴｒＧＡ  ２９−９菌株及びｓｓｂ７突然変異体（娘）菌株であるＴｒＧＡ  ２９−９  ｓｓｂ７（３１１）及びＴｒＧＡ  ２９−９  ｓｓｂ７（ＴＳ１）に対してバイオリアクター内で実施した。全グルコースが消費され尽くしたバッチ増殖期の終了時には、全菌株は類似のバイオマス濃度を達成した（表３を参照されたい）。更に、ｓｓｂ７の対立遺伝子であるｓｓｂ７（３１１）及びｓｓｂ７（ＴＳ１）は、バイオリアクター発酵ブロス粘性の（即ち、ＴｒＧＡ  ２９−９親と比較して）低下を生じさせた。更に、ＤＯは、より短い発酵期間については低かった。従って、表３は、ＤＯを設定点の上方で維持するために必要とされる低下した撹拌量の尺度及びＤＯが設定点の２０％上方若しくは以下であった間の時間の低下した定量測定値を提供している。表３に示したように、粘性の低下は、マーカー挿入ｓｓｂ７（３１１）に比較して、フレームシフト対立遺伝子ｓｓｂ７（ＴＳ１）についての方が大きかった。
【表３】
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【０２５８】
表３に提示した粘性定量を行わない場合でさえ、突然変異ｓｓｂ７対立遺伝子を含む娘菌株については撹拌が減少させられたことは図７において視覚的に明白である。当業者は、最小溶存酸素、初期撹拌及び最高撹拌についての最適設定点値が糸状菌及び発酵槽容器によって相違する可能性があることを認識するであろう。発酵パラメーターは、親菌株の溶存酸素制限及び撹拌追加測定値が突然変異娘細胞の発酵中のブロス粘性変化の検出を可能にするための範囲で設定されるべきであることを認識すべきである。図７における親プロフィールは、そのような情報プロフィールを例示している。
【０２５９】
実施例３
全セルラーゼ菌株Ｔ４ａｂｃ内のｓｓｂ７の標的化突然変異
Ａ．概説
ｓｓｂ７突然変異体の有用性を詳細に試験するために、Ｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）突然変異（配列番号３６）を含み、セルラーゼの天然カクテルを発現する、ｓｓｂ７の３つの突然変異対立遺伝子についても、「Ｔ４ａｂｃ」と名付けられた異なるＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）系統内でも評価した。これらの突然変異体も又、粘性が低下した表現型を証明した。
【０２６０】
Ｂ．菌株Ｔ４ａｂｃ内の対立遺伝子ｓｓｂ７（３１１）、ｓｓｂ７（ＴＳ２）及びｓｓｂ７（３３９ｆｓ）
ｓｓｂ７（３１１）対立遺伝子は、菌株「Ｔ４ａｂｃ  ｓｓｂ７（３１１）」を生成するために、上記の実施例２に記載した菌株Ｔ４ａｂｃ  ｐｙｒ２内で生成した。ｓｓｂ７（ＴＳ２）対立遺伝子は、標的配列２を含有するプラスミド（ＴＳ２）を使用することを除いて、実施例２におけるｓｓｂ７（ＴＳ１）と同様に、菌株Ｔ４ａｂｃ内で生成した。従って、それは、ＴＳ１及びＴＳ２認識配列それぞれを不活化するために、Ｓｃａｆｆｏｌｄ  １３、１６７４０４でのＭｏｒｐｈ  ７７Ｂ７フレームシフト突然変異並びにＳｃａｆｆｏｌｄ  １３、１６７４３６及びＳｃａｆｆｏｌｄ  １３、１６７４６６での２個の追加のＧからＣへの突然変異を含有していた（図１）。この菌株は、「Ｔ４ａｂｃ  ｓｓｂ７（ＴＳ２）」と名付けられた。
【０２６１】
ｓｓｂ７（３３９ｆｓ）対立遺伝子は、当業者であれば、本明細書に開示した関連ＤＮＡ部品からこのプラスミドを容易に改造できるように、標準の分子生物学的手順を用いて調製されるプラスミドｐＲＡＴＴ３３９を用いて調製した。このプラスミドは、Ｓｃａｆｆｏｌｄ  １３、１６５８３９〜１６９２１８（左フランク）に対応するＤＮＡ配列と相同な３．４Ｋｂのホモロジーボックスを有するＤＮＡ配列を含んでいた。このフランク内には、エキソン２においてフレームシフト突然変異を誘発する単一Ｇ欠失があった。このプラスミド内には、Ｓｃａｆｆｏｌｄ  １３、１６９２７３〜１７１４５８（右フランク）に対応するＤＮＡ配列と相同な２．２Ｋｂのホモロジーボックスを有するＤＮＡ配列も又含まれていた。これらの配列は、ｓｓｂ７遺伝子を標的化し、左フランクと右フランクとの間のゲノムの領域（Ｓｃａｆｆｏｌｄ  １３、１６９２１９〜１６９２７２）を介在カセット配列で置換するために設計された。
【０２６２】
これらの介在カセット配列は、形質転換すべき菌株のゲノム内の内在性Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２との相同性を最小限に抑えることが意図されたトリコデルマ・アトロビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）由来のｐｙｒ２選択マーカーを含んでいた。ｐｙｒ２選択マーカーの直ぐ上流には、その後のマーカーの消失及び形質転換体／破壊株の有用なｐｙｒ２突然変異誘導体の単離を促進する、このマーカーの３’末端の直接繰返し重複（リピート）がある。正確に標的化された介在カセット配列を備える形質転換体のサブセットでは、左フランク内のフレームシフト突然変異も又エキソン２（Ｓｃａｆｆｏｌｄ  １３、１６７４０４）内で単一Ｇヌクレオチドが欠失しているゲノム内に組み込まれ得るであろう。本明細書に開示したｓｓｂ７（３３９ｆｓ）対立遺伝子は、Ｓｃａｆｆｏｌｄ  １３、１６７４０４でのヌクレオチド欠失及びＳｃａｆｆｏｌｄ  １３、１６９２１９〜１６９２７２の間での繰返し隣接ｐｙｒ２マーカーの挿入の両方を含有する（図１）。
【０２６３】
従って、菌株Ｔ４ａｂｃ  ｐｙｒ２は、ＰＥＧ媒介性形質転換法を使用して、ｐＲＡＴＴ３３９由来のｓｓｂ７破壊カセットを用いて形質転換させ、ｐｙｒ２マーカーによって獲得されたウリジン原栄養性に基づいて候補について選択するためにソルビトールを含有するフォーゲル最少培地上で平板培養した。個々の形質転換体を単離し、フォーゲル最少培地に移動させて増殖させた。ＰＣＲ分析を使用して、実施例２Ｂにおいて上述した相同組換えによってｓｓｂ７遺伝子座でｓｓｂ７破壊カセットが統合した形質転換体を同定した。胞子の精製後、統合が正確に発生したこと、及び形質転換体が同核状態であることを確認するために、更なるＰＣＲ分析を実施した。次に、統合事象中に左フランク内にこの突然変異が組込まれたかどうかを決定するために、フレームシフト突然変異に及ぶｓｓｂ７遺伝子の一部分をＰＣＲ増幅させてシーケンシングした。エキソン３内のｓｓｂ７破壊カセットの確証された相同統合及びエキソン２内のフレームシフト突然変異を備える生成された菌株は、「Ｔ４ａｂｃ  ｓｓｂ７（３３９ｆｓ）」と命名された。
【０２６４】
Ｃ．バイオリアクター内の粘性の低下
粘性の評価は、実施例２で記載したように、バイオリアクター内でＴ４ａｂｃ及びｓｓｂ７突然変異菌株について実施した。表４に示したように、全グルコースが消費され尽くしたバッチ増殖期の終了時には、全菌株は類似のバイオマス濃度を達成した（乾燥細胞重量）。３つのｓｓｂ７対立遺伝子は、そのすべてが、ＤＯを設定点より上方に維持するために必要とされた撹拌量の低下（撹拌の追加）及びその間にＤＯが設定点の２０％上方又はそれ以下（ＤＯ制限）となった時間分率の低下によって証明される、Ｔ４ａｂｃ親と比較したバイオリアクター内のブロス粘性の低下を生じさせた。
【表４】
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【０２６５】
参考文献
ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／６５６９３号
ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１２／０２７５８０号
ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１２／１４５５８４号
ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１２／１４５５９２号
ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１２／１４５５９５号
ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１２／１４５５９６号
ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１６／１００２７２号
ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１６／１００５６８号
ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１６／１００５７１号
ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１６／１３０５２３号
ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１６１／００５６２号
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
2021521821.tif 000009
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2021521821.tif 000011
【図３Ｃ】
2021521821.tif 000012
【図４Ａ】
2021521821.tif 000013
【図４Ｂ−Ｃ】
2021521821.tif 000014
【図５】
2021521821.tif 000015
【図６Ａ】
2021521821.tif 000016
【図６Ｂ−Ｃ】
2021521821.tif 000017
【図７】
2021521821.tif 000018
【図８Ａ】
2021521821.tif 000019
【図８Ｂ】
2021521821.tif 000020
【図８Ｃ】
2021521821.tif 000021
【図８Ｄ】
2021521821.tif 000022
【図８Ｅ】
2021521821.tif 000023
【図８Ｆ】
2021521821.tif 000024
【図８Ｇ】
2021521821.tif 000025
【図９Ａ】
2021521821.tif 000026
【図９Ｂ】
2021521821.tif 000027
【図９Ｃ】
2021521821.tif 000028
【図９Ｄ】
2021521821.tif 000029
【図９Ｅ】
2021521821.tif 000030
【図９Ｅ（Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ）】
2021521821.tif 000031
【配列表】
2021521821000001.app
【国際調査報告】
2021521821.tif 000032
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