(57)【要約】  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用する核酸の改変のための方法および製品が本明細書に記載される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞中の標的核酸の改変のためのそのような方法および製品の使用もまた本明細書に記載される。そのような方法および製品はまた、標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態の予防または治療のために使用されてもよい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中の標的ポリヌクレオチドの改変のためのｓｇＲＮＡであって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの領域に対応するガイド配列を含むガイドセグメントと、
（ｂ）前記ガイド配列の３’に位置する第１のヘアピン形成セグメントであって、前記第１のヘアピン形成セグメントが、ステム部分およびループ部分を含むヘアピンを形成することができ、前記ステム部分が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終結シグナルに対応する配列を含まない、前記第１のヘアピン形成セグメントと、
を含む、ｓｇＲＮＡ。
【請求項２】
前記ステム部分が４つより多くの連続するウラシルヌクレオチドを含まない、請求項１に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項３】
前記ステム部分が３つより多くの連続するウラシルヌクレオチドを含まない、請求項１に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項４】
前記ステム部分が第１のステム部分および第２のステム部分を含み、前記第１のステム部分が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終結シグナルに対応する配列を含まない、請求項１に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項５】
前記第１のステム部分が４つより多くの連続するウラシルヌクレオチドを含まない、請求項４に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項６】
前記第１のステム部分が３つより多くの連続するウラシルヌクレオチドを含まない、請求項５に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項７】
前記第１のステム部分および前記第２のステム部分が第１のバルジ部分により分離されている、請求項４〜６のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項８】
前記ループ部分が３〜６のヌクレオチドの配列を含むまたはからなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項９】
前記ループ部分が３〜５のヌクレオチドの配列を含むまたはからなる、請求項８に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項１０】
前記ループ部分が４のヌクレオチドの配列を含むまたはからなる、請求項９に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項１１】
前記ループ部分がヌクレオチド配列Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４を含みまたはからなり、Ｎ１、Ｎ２、およびＮ３がそれぞれ独立してＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、かつ、Ｎ４がＣまたはＧである、請求項１０に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項１２】
前記ループ部分がヌクレオチド配列Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４を含みまたはからなり、Ｎ１、Ｎ３、およびＮ４がそれぞれ独立してＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、かつ、Ｎ２がＵ、ＧまたはＡである、請求項１０または１１に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項１３】
Ｎ１がＧである、請求項１１または１２に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項１４】
Ｎ２がＵである、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項１５】
Ｎ３がＡである、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項１６】
Ｎ４がＣである、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項１７】
前記ループ部分がヌクレオチド配列ＧＵＡＣを含むまたはからなる、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項１８】
前記第２のステム部分が４のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、請求項４〜１７のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項１９】
前記第１のステム部分に対して遠位の、前記第２のステム部分の前記ハイブリッドの第４の対がＧ−Ｃ対である、請求項１８に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項２０】
前記第２のステム部分の前記ハイブリッドが、配列５’−ＣＡＧＡ−３’にハイブリダイズした配列５’−ＵＣＵＧ−３’を含むまたはからなる、請求項１８または１９に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項２１】
前記第１のステム部分が少なくとも５のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、請求項４〜２０のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項２２】
前記第１のステム部分が１２以下のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、請求項４〜２１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項２３】
前記第１のステム部分が６〜１０のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、請求項２１または２２に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項２４】
前記第１のステム部分が７〜９のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、請求項２３に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項２５】
前記第１のステム部分が８のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、請求項２４に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項２６】
前記第１のステム部分がミスマッチを含まない、請求項４〜２５のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項２７】
前記第１のステム部分の前記ハイブリッドが、配列５’−ＵＡＣＡＡＡＧＡ−３’にハイブリダイズした配列５’−ＵＣＵＵＵＧＵＡ−３’を含むまたはからなる、請求項４〜２６のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項２８】
前記第１のステム部分が単一のミスマッチを含む、請求項４〜２４のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項２９】
前記第１のステム部分の前記ハイブリッドが、配列５’−ＵＡＣＡＡＡＧＡＵ−３’にハイブリダイズした配列５’−ＧＵＣＵＵＵＧＵＡ−３’を含むまたはからなる、請求項２８に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項３０】
前記第１のヘアピン形成セグメントの３’に位置する１つまたはより多くの追加のヘアピン形成セグメントをさらに含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項３１】
前記第１のヘアピン形成セグメントと前記追加のヘアピン形成セグメントとの間、および／または前記追加のヘアピン形成セグメントの間に位置する１つまたはより多くのリンカーセグメントをさらに含む、請求項３０に記載のｓｇＲＮＡ。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項３３】
請求項３２に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項３４】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３３に記載のベクター。
【請求項３５】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがＣａｓ９酵素である、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３６】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが非病原性細菌に由来する、請求項３４または３５に記載のベクター。
【請求項３７】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３８】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがＩＩ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３９】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがストレプトコッカス・サーモフィルスＩＩ−Ａ型ＣＲＩＳＰＲ１−Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）である、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項４０】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが１つまたはより多くの核局在シグナル（ＮＬＳ）をさらに含み、かつ、前記ベクターが、前記１つまたはより多くのＮＬＳをコードする１つまたはより多くのヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項４１】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがそのアミノ末端における第１のＮＬＳおよびそのカルボキシ末端における第２のＮＬＳを含み、かつ、前記ベクターが、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に隣接するＮＬＳをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項４０に記載のベクター。
【請求項４２】
前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項３３に記載のベクター。
【請求項４３】
前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列および／または前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結した１つもしくはより多くのプロモーターをさらに含む、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項４４】
前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列およびまたは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列の両方が単一のプロモーターに作動可能に連結している、請求項４３に記載のベクター。
【請求項４５】
前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列が第１のプロモーターに作動可能に連結しており、かつ、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が第２のプロモーターに作動可能に連結しており、前記第１のプロモーターおよび前記第２のプロモーターが同じまたは異なっていてもよい、請求項４３に記載のベクター。
【請求項４６】
（ｉ）前記第１のプロモーターおよび前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列ならびに（ｉｉ）前記第２のプロモーターおよび前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ベクター内で同じ方向にある、請求項４５に記載のベクター。
【請求項４７】
（ｉ）前記第１のプロモーターおよび前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列ならびに（ｉｉ）前記第２のプロモーターおよび前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ベクター内で反対の方向にある、請求項４５に記載のベクター。
【請求項４８】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項３３〜４７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項４９】
前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項４８に記載のベクター。
【請求項５０】
請求項３２に記載の核酸または請求項３３〜４９のいずれか１項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５１】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、請求項３２に記載の核酸、請求項３３〜４９のいずれか１項に記載のベクター、または請求項５０に記載の宿主細胞を含む、組成物。
【請求項５２】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、請求項３２に記載の核酸、請求項３３〜４９のいずれか１項に記載のベクター、請求項５０に記載の宿主細胞、および／または請求項５１もしくは５２に記載の組成物を含む、システム。
【請求項５４】
請求項３３に記載のベクターおよびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなるベクターを含む、システム。
【請求項５５】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、請求項３５〜４１のいずれか１項において定義されるものである、請求項５４に記載のシステム。
【請求項５６】
請求項３３に記載のベクターが、前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターをさらに含み、かつ、さらなるベクターが、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項５４または５５に記載のシステム。
【請求項５７】
細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法であって、前記細胞を、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、請求項３２に記載の核酸、請求項３３〜４９のいずれか１項に記載のベクター、請求項５１もしくは５２に記載の組成物および／または請求項５３〜５６のいずれか１項に記載のシステムと接触させることを含む、方法。
【請求項５８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ｉｎ  ｖｉｖｏの方法であり、かつ、前記細胞が対象中にある、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変するための、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、請求項３２に記載の核酸、請求項３３〜４９のいずれか１項に記載のベクター、請求項５１もしくは５２に記載の組成物および／または請求項５３〜５６のいずれか１項に記載のシステムの使用。
【請求項６１】
細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変するための医薬の調製のための、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、請求項３２に記載の核酸、請求項３３〜４９のいずれか１項に記載のベクター、請求項５１もしくは５２に記載の組成物および／または請求項５３〜５６のいずれか１項に記載のシステムの使用。
【請求項６２】
細胞中の標的ポリヌクレオチドの改変において使用するための、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、請求項３２に記載の核酸、請求項３３〜４９のいずれか１項に記載のベクター、請求項５１もしくは５２に記載の組成物および／または請求項５３〜５６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６３】
それを必要とする対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療する方法であって、前記対象に有効量の請求項１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、請求項３２に記載の核酸、請求項３３〜４９のいずれか１項に記載のベクター、請求項５１もしくは５２に記載の組成物および／または請求項５３〜５６のいずれか１項記載のシステムを投与することを含む、方法。
【請求項６４】
前記病態が代謝性の病態である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記病態が肝臓の病態である、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項６６】
対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療するための、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、請求項３２に記載の核酸、請求項３３〜４９のいずれか１項に記載のベクター、請求項５１もしくは５２に記載の組成物および／または請求項５３〜５６のいずれか１項に記載のシステムの使用。
【請求項６７】
対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療するための医薬の調製のための、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、請求項３２に記載の核酸、請求項３３〜４９のいずれか１項に記載のベクター、請求項５１もしくは５２に記載の組成物および／または請求項５３〜５６のいずれか１項に記載のシステムの使用。
【請求項６８】
前記病態が代謝性の病態である、請求項６６または６７に記載の使用。
【請求項６９】
前記病態が肝臓の病態である、請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７０】
対象における標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態の予防または治療において使用するための、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、請求項３２に記載の核酸、請求項３３〜４９のいずれか１項に記載のベクター、請求項５１もしくは５２に記載の組成物および／または請求項５３〜５６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７１】
前記病態が代謝性の病態である、請求項７０に記載の使用のためのｓｇＲＮＡ、核酸、ベクター、組成物および／またはシステム。
【請求項７２】
前記病態が肝臓の病態である、請求項７０または７１に記載の使用のためのｓｇＲＮＡ、核酸、ベクター、組成物および／またはシステム。
【請求項７３】
医薬として使用するための、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、請求項３２に記載の核酸、請求項３３〜４９のいずれか１項に記載のベクター、請求項５０に記載の宿主細胞、請求項５１もしくは５２に記載の組成物および／または請求項５３〜５６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７４】
第１のドメインおよび前記第１のドメインのＣ末側にある第２のドメインを含む単離されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドであって、前記第１のドメインがガイドＲＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含み、かつ、前記第２のドメインがＷＥＤドメインおよびＰＡＭ相互作用ドメインを含み、前記第１および第２のドメインが異なる細菌株に由来する、単離されたポリペプチド。
【請求項７５】
前記第１および第２のドメインが非病原性細菌に由来する、請求項７４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７６】
前記第１および第２のドメインが異なる細菌種に由来する、請求項７４または７５に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７７】
前記第１および第２のドメインが同じ細菌種の異なる株に由来する、請求項７４または７５に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７８】
前記第１および第２のドメインがストレプトコッカス・サーモフィルスの異なる株に由来する、請求項７７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７９】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがＩＩ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項７４〜７８のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８０】
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがストレプトコッカス・サーモフィルスＩＩ−Ａ型ＣＲＩＳＰＲ１−Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）である、請求項７４〜７９のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８１】
１つまたはより多くの核局在シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む、請求項７４〜８０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８２】
前記第１のドメインのＮ末側にある第１のＮＬＳおよび前記第２のドメインのＣ末側にある第２のＮＬＳを含む、請求項８１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８３】
シチジンデアミナーゼドメインまたはアデノシンデアミナーゼドメインをさらに含む、請求項７４〜８２のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８４】
シチジンデアミナーゼドメインを含む、請求項８３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８５】
前記シチジンデアミナーゼがＡＰＯＢＥＣシチジンデアミナーゼである、請求項８４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８６】
前記シチジンデアミナーゼドメインが、配列番号５０のアミノ酸配列、またはその機能的断片、またはその機能的バリアントを含む、請求項８４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８７】
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインをさらに含む、請求項８４または８５に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８８】
前記ＵＧＩドメインが、配列番号５１のアミノ酸配列、またはその機能的断片、またはその機能的バリアントを含む、請求項８７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８９】
前記第１のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９、ＬＭＧ８３１１、ＣＮＲＺ１０６６またはＴＨ１４７７に由来する、請求項７４〜８８のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９０】
前記第２のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９、ＬＭＧ８３１１、ＣＮＲＺ１０６６またはＴＨ１４７７に由来する、請求項７４〜８９のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９１】
前記第１のドメインがストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９に由来し、かつ、前記第２のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＧ８３１１、ＣＮＲＺ１０６６またはＴＨ１４７７に由来する、請求項７４〜９０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９２】
前記第１のドメインがストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＧ８３１１に由来し、かつ、前記第２のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９、ＣＮＲＺ１０６６またはＴＨ１４７７に由来する、請求項７４〜９０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９３】
前記第１のドメインがストレプトコッカス・サーモフィルスＣＮＲＺ１０６６に由来し、かつ、前記第２のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＧ８３１１、ＬＭＤ−９またはＴＨ１４７７に由来する、請求項７４〜９０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９４】
前記第１のドメインがストレプトコッカス・サーモフィルスＴＨ１４７７に由来し、かつ、前記第２のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＧ８３１１、ＣＮＲＺ１０６６またはＬＭＤ−９に由来する、請求項７４〜９０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９５】
前記第１のドメインが、配列番号２６４、２６５、２６６、もしくは２６７のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、請求項７４〜８８のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９６】
前記第２のドメインが、配列番号２６０、２６１、２６２、もしくは２６３のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、請求項７４〜８８のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９７】
前記第１のドメインが、配列番号２６４のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含み、かつ、前記第２のドメインが、配列番号２６１、２６２、もしくは２６３のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、請求項７４〜８８、９５および９６のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９８】
前記第１のドメインが、配列番号２６５のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含み、かつ、前記第２のドメインが、配列番号２６０、２６２、もしくは２６３のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、請求項７４〜８８、９５および９６のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９９】
前記第１のドメインが、配列番号２６６のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含み、かつ、前記第２のドメインが、配列番号２６０、２６１、もしくは２６３のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、請求項７４〜８８、９５および９６のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１００】
前記第１のドメインが、配列番号２６７のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含み、かつ、前記第２のドメインが、配列番号２６０、２６１、もしくは２６２のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、請求項７４〜８８、９５および９６のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０１】
前記第１のドメインが、リンカー領域を介して前記第２のドメインに接続されている、請求項７４〜１００のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０２】
前記ポリペプチドが、前記第１のドメインが由来するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが結合するＰＡＭとは異なるＰＡＭに結合することができる、請求項７４〜１０１のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０３】
前記ポリペプチドが、配列ＮＮＡＧＡＡ、ＮＮＧＧＡＡ、ＮＮＡＣＡＡ、ＮＮＧＣＡＡ、ＮＮＧＡＡＡまたはＮＮＡＡＡＡを含むＰＡＭに結合する、請求項７４〜１０２のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０４】
請求項７４〜１０３のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項１０５】
請求項１０４に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項１０６】
ｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１０５に記載のベクター。
【請求項１０７】
前記ｓｇＲＮＡが、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡである、請求項１０６に記載のベクター。
【請求項１０８】
前記ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列および／または前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結した１つまたはより多くのプロモーターをさらに含む、請求項１０５〜１０７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１０９】
前記ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列および前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列の両方が単一のプロモーターに作動可能に連結している、請求項１０８に記載のベクター。
【請求項１１０】
前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列が第１のプロモーターに作動可能に連結しており、かつ、前記ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が第２のプロモーターに作動可能に連結しており、前記第１のプロモーターおよび前記第２のプロモーターが同じまたは異なっていてもよい、請求項１０８に記載のベクター。
【請求項１１１】
（ｉ）前記第１のプロモーターおよび前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列ならびに（ｉｉ）前記第２のプロモーターおよび前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ベクター内で同じ方向にある、請求項１１０に記載のベクター。
【請求項１１２】
（ｉ）前記第１のプロモーターおよび前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列ならびに（ｉｉ）前記第２のプロモーターおよび前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ベクター内で反対の方向にある、請求項１１０に記載のベクター。
【請求項１１３】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１１４】
前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１１３に記載のベクター。
【請求項１１５】
請求項１０４に記載の核酸または請求項１０５〜１１３のいずれか１項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１１６】
請求項７４〜１０３のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１０４に記載の核酸、請求項１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１１５に記載の宿主細胞を含む、組成物。
【請求項１１７】
薬学的または生物学的に許容される担体をさらに含む、請求項１１６に記載の組成物。
【請求項１１８】
請求項７４〜１０３のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１０４に記載の核酸、請求項１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター、請求項１１５に記載の宿主細胞、および／または請求項１１６もしくは１１７に記載の組成物を含む、システム。
【請求項１１９】
請求項１０５に記載のベクターおよびｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むさらなるベクターを含む、システム。
【請求項１２０】
細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法であって、前記細胞を、請求項７４〜１０３のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１０４に記載の核酸、請求項１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター、請求項１１５に記載の宿主細胞、および／または請求項１１６もしくは１１７に記載の組成物、および／または請求項１１８もしくは１１９に記載のシステムと接触させることを含む、方法。
【請求項１２１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
ｉｎ  ｖｉｖｏの方法であり、かつ、前記細胞が対象中にある、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変するための、請求項７４〜１０３のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１０４に記載の核酸、請求項１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター、請求項１１５に記載の宿主細胞、および／または請求項１１６もしくは１１７に記載の組成物、および／または請求項１１８もしくは１１９に記載のシステムの使用。
【請求項１２４】
細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変するための医薬の調製のための、請求項７４〜１０３のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１０４に記載の核酸、請求項１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター、請求項１１５に記載の宿主細胞、および／または請求項１１６もしくは１１７に記載の組成物、および／または請求項１１８もしくは１１９に記載のシステムの使用。
【請求項１２５】
細胞中の標的ポリヌクレオチドの改変において使用するための、請求項７４〜１０３のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１０４に記載の核酸、請求項１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター、請求項１１５に記載の宿主細胞、および／または請求項１１６もしくは１１７に記載の組成物、および／または請求項１１８もしくは１１９に記載のシステム。
【請求項１２６】
それを必要とする対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療する方法であって、前記対象に有効量の請求項７４〜１０３のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１０４に記載の核酸、請求項１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター、請求項１１５に記載の宿主細胞、および／または請求項１１６もしくは１１７に記載の組成物、および／または請求項１１８もしくは１１９に記載のシステムを投与することを含む、方法。
【請求項１２７】
前記病態が代謝性の病態である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記病態が肝臓の病態である、請求項１２６または１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療するための、請求項７４〜１０３のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１０４に記載の核酸、請求項１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター、請求項１１５に記載の宿主細胞、および／または請求項１１６もしくは１１７に記載の組成物、および／または請求項１１８もしくは１１９に記載のシステムの使用。
【請求項１３０】
対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療するための医薬の調製のための、請求項７４〜１０３のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１０４に記載の核酸、請求項１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター、請求項１１５に記載の宿主細胞、および／または請求項１１６もしくは１１７に記載の組成物、および／または請求項１１８もしくは１１９に記載のシステムの使用。
【請求項１３１】
前記病態が代謝性の病態である、請求項１２９または１３０に記載の使用。
【請求項１３２】
前記病態が肝臓の病態である、請求項１２９〜１３１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３３】
対象における標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態の予防または治療において使用するための、請求項７４〜１０３のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１０４に記載の核酸、請求項１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター、請求項１１５に記載の宿主細胞、および／または請求項１１６もしくは１１７に記載の組成物、および／または請求項１１８もしくは１１９に記載のシステム。
【請求項１３４】
前記病態が代謝性の病態である、請求項１３３に記載の使用のためのｓｇＲＮＡ、核酸、ベクター、組成物および／またはシステム。
【請求項１３５】
前記病態が肝臓の病態である、請求項１３３または１３４に記載の使用のためのｓｇＲＮＡ、核酸、ベクター、組成物および／またはシステム。
【請求項１３６】
医薬として使用するための、請求項７４〜１０３のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１０４に記載の核酸、請求項１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター、請求項１１５に記載の宿主細胞、および／または請求項１１６もしくは１１７に記載の組成物、および／または請求項１１８もしくは１１９に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月１１日に出願された米国仮出願第６２／６７０，１３５号の優先権を主張し、当該仮出願は本参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表：  本出願は、２０１９年５月９日に作成された約３４３ＫＢのサイズを有する「Ｇ１１２２９＿３９８＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」という名称のコンピューター読取り可能な形態の配列表を含む。コンピューター読取り可能な形態は本参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本開示は、概しては、核酸の改変に関し、特に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用する核酸の改変に関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質は、ロバストなゲノム編集のために利用されてきた原核性適応免疫系の成分である（文献１）。ＩＩ型ベースのツールは、操作されたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）キメラによりそのＤＮＡ標的にガイドされる大きいマルチドメインエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ９に依拠する（文献２、３、４）。Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡバイナリー複合体は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短鎖配列の認識およびＤＮＡとのガイドＲＮＡのその後の塩基対形成を通じてその標的を見出して特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成する（文献１、５）。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）は依然としてゲノム操作のために最も広く使用されているＣａｓ９バリアントであるが、他のＲＮＡガイドヌクレアーゼもまた同定されている（文献４、６）。しかしながら、ある特定の細菌ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＤＮＡ結合および切断のために正確に再プログラミングされるにもかかわらずヒト細胞において不活性であることが見出された（文献７〜１０）。よりいっそう大きな課題はｉｎ  ｖｉｖｏでの実施であり、例としては、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを使用するｉｎ  ｖｉｖｏ編集のためのスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）からのＩＩ−Ａ型Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）（文献７、１１、１２）の他に、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）およびナイセリア・メニンギチジス（Neisseria meningitidis）からのＣａｓ９（文献１３〜１５）の使用が挙げられる。
【０００５】
ｉｎ  ｖｉｖｏゲノム編集は、細胞種と臓器との相互作用をより良好に再現するために動物モデルにおいて表現型を生成する可能性を与える。追加的に、それは、疾患の基礎となる遺伝的欠陥の精密な分子的訂正を可能とするヒト治療法の新規のクラスとして想定され得る。そのため、例えば、ｒＡＡＶおよびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）媒介性肝臓標的化は新生および成体マウスモデルにおいて疾患表現型を訂正できることが示されており、臨床研究が現在進行中である（文献１６〜１９）。
【０００６】
したがって、例えばｉｎ  ｖｉｖｏ編集のための、ロバストかつ広範囲のＣＲＩＳＰＲベースの技術のさらなる開発の必要性が存在する。
【０００７】
本明細書は多数の文献を参照し、その内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、概しては、核酸の改変に関し、特に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用する核酸の改変に関する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用する核酸の改変のための方法および製品が本明細書に記載される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞中の標的核酸の改変のためのそのような方法および製品の使用もまた本明細書に記載される。そのような方法および製品はまた、標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態の予防または治療のために使用されてもよい。
【０００９】
様々な態様および実施形態では、本開示は、以下の項目１〜１３６を提供する：
１．細胞中の標的ポリヌクレオチドの改変のためのｓｇＲＮＡであって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの領域に対応するガイド配列を含むガイドセグメントと、
（ｂ）前記ガイド配列の３’に位置する第１のヘアピン形成セグメントであって、前記第１のヘアピン形成セグメントが、ステム部分およびループ部分を含むヘアピンを形成することができ、前記ステム部分が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終結シグナルに対応する配列を含まない、前記第１のヘアピン形成セグメントと
を含む、ｓｇＲＮＡ。
２．前記ステム部分が４つより多くの連続するウラシルヌクレオチドを含まない、項目１に記載のｓｇＲＮＡ。
３．前記ステム部分が３つより多くの連続するウラシルヌクレオチドを含まない、項目１に記載のｓｇＲＮＡ。
４．前記ステム部分が第１のステム部分および第２のステム部分を含み、前記第１のステム部分が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終結シグナルに対応する配列を含まない、項目１に記載のｓｇＲＮＡ。
５．前記第１のステム部分が４つより多くの連続するウラシルヌクレオチドを含まない、項目４に記載のｓｇＲＮＡ。
６．前記第１のステム部分が３つより多くの連続するウラシルヌクレオチドを含まない、項目５に記載のｓｇＲＮＡ。
７．前記第１のステム部分および前記第２のステム部分が第１のバルジ部分により分離されている、項目４〜６のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
８．前記ループ部分が３〜６のヌクレオチドの配列を含むまたはからなる、項目１〜８のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
９．前記ループ部分が３〜５のヌクレオチドの配列を含むまたはからなる、項目８に記載のｓｇＲＮＡ。
１０．前記ループ部分が４のヌクレオチドの配列を含むまたはからなる、項目９に記載のｓｇＲＮＡ。
１１．前記ループ部分がヌクレオチド配列Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４を含みまたはからなり、Ｎ１、Ｎ２、およびＮ３がそれぞれ独立してＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、かつ、Ｎ４がＣまたはＧである、項目１０に記載のｓｇＲＮＡ。
１２．前記ループ部分がヌクレオチド配列Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４を含みまたはからなり、Ｎ１、Ｎ３、およびＮ４がそれぞれ独立してＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、かつ、Ｎ２がＵ、ＧまたはＡである、項目１０または１１に記載のｓｇＲＮＡ。
１３．Ｎ１がＧである、項目１１または１２に記載のｓｇＲＮＡ。
１４．Ｎ２がＵである、項目１１〜１３のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
１５．Ｎ３がＡである、項目１１〜１４のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
１６．Ｎ４がＣである、項目１１〜１５のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
１７．前記ループ部分がヌクレオチド配列ＧＵＡＣを含むまたはからなる、項目１０〜１６のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
１８．前記第２のステム部分が４のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、項目４〜１７のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
１９．前記第１のステム部分に対して遠位の、前記第２のステム部分の前記ハイブリッドの第４の対がＧ−Ｃ対である、項目１８に記載のｓｇＲＮＡ。
２０．前記第２のステム部分の前記ハイブリッドが、配列５’−ＣＡＧＡ−３’にハイブリダイズした配列５’−ＵＣＵＧ−３’を含むまたはからなる、項目１８または１９に記載のｓｇＲＮＡ。
２１．前記第１のステム部分が少なくとも５のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、項目４〜２０のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
２２．前記第１のステム部分が１２以下のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、項目４〜２１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
２３．前記第１のステム部分が６〜１０のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、項目２１または２２に記載のｓｇＲＮＡ。
２４．前記第１のステム部分が７〜９のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、項目２３に記載のｓｇＲＮＡ。
２５．前記第１のステム部分が８のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる、項目２４に記載のｓｇＲＮＡ。
２６．前記第１のステム部分がミスマッチを含まない、項目４〜２５のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
２７．前記第１のステム部分の前記ハイブリッドが、配列５’−ＵＡＣＡＡＡＧＡ−３’にハイブリダイズした配列５’−ＵＣＵＵＵＧＵＡ−３’を含むまたはからなる、項目４〜２６のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
２８．前記第１のステム部分が単一のミスマッチを含む、項目４〜２４のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
２９．前記第１のステム部分の前記ハイブリッドが、配列５’−ＵＡＣＡＡＡＧＡＵ−３’にハイブリダイズした配列５’−ＧＵＣＵＵＵＧＵＡ−３’を含むまたはからなる、項目２８に記載のｓｇＲＮＡ。
３０．前記第１のヘアピン形成セグメントの３’に位置する１つまたはより多くの追加のヘアピン形成セグメントをさらに含む、項目１〜２９のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ。
３１．前記第１のヘアピン形成セグメントと前記追加のヘアピン形成セグメントとの間、および／または前記追加のヘアピン形成セグメントの間に位置する１つまたはより多くのリンカーセグメントをさらに含む、項目３０に記載のｓｇＲＮＡ。
【００１０】
３２．項目１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
３３．項目３２に記載の核酸を含む、ベクター。
３４．ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目３３に記載のベクター。
３５．前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがＣａｓ９酵素である、項目３４に記載のベクター。
３６．前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが非病原性細菌に由来する、項目３４または３５に記載のベクター。
３７．前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、項目３４〜３６のいずれか１項に記載のベクター。
３８．前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがＩＩ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、項目３４〜３７のいずれか１項に記載のベクター。
３９．前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがストレプトコッカス・サーモフィルスＩＩ−Ａ型ＣＲＩＳＰＲ１−Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）である、項目３４〜３８のいずれか１項に記載のベクター。
４０．前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが１つまたはより多くの核局在シグナル（ＮＬＳ）をさらに含み、かつ、前記ベクターが、前記１つまたはより多くのＮＬＳをコードする１つまたはより多くのヌクレオチド配列をさらに含む、項目３４〜３９のいずれか１項に記載のベクター。
４１．前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがそのアミノ末端における第１のＮＬＳおよびそのカルボキシ末端における第２のＮＬＳを含み、かつ、前記ベクターが、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に隣接するＮＬＳをコードするヌクレオチド配列を含む、項目４０に記載のベクター。
４２．前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、項目３３に記載のベクター。
４３．前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列および／または前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結した１つもしくはより多くのプロモーターをさらに含む、項目３４〜４１のいずれか１項に記載のベクター。
４４．前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列および／または前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列の両方が単一のプロモーターに作動可能に連結している、項目４３に記載のベクター。
４５．前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列が第１のプロモーターに作動可能に連結しており、かつ、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が第２のプロモーターに作動可能に連結しており、前記第１のプロモーターおよび前記第２のプロモーターが同じまたは異なっていてもよい、項目４３に記載のベクター。
４６．（ｉ）前記第１のプロモーターおよび前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列ならびに（ｉｉ）前記第２のプロモーターおよび前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ベクター内で同じ方向にある、項目４５に記載のベクター。
４７．（ｉ）前記第１のプロモーターおよび前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列ならびに（ｉｉ）前記第２のプロモーターおよび前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ベクター内で反対の方向にある、項目４５に記載のベクター。
４８．前記ベクターがウイルスベクターである、項目３３〜４７のいずれか１項に記載のベクター。
４９．前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、項目４８に記載のベクター。
５０．項目３２に記載の核酸または項目３３〜４９のいずれか１項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【００１１】
５１．項目１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、項目３２に記載の核酸、項目３３〜４９のいずれか１項に記載のベクター、または項目５０に記載の宿主細胞を含む、組成物。
５２．薬学的に許容される担体をさらに含む、項目５１に記載の組成物。
５３．項目１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、項目３２に記載の核酸、項目３３〜４９のいずれか１項に記載のベクター、項目５０に記載の宿主細胞、および／または請求項５１もしくは５２に記載の組成物を含む、システム。
５４．項目３３に記載のベクターおよびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むさらなるベクターを含む、システム。
５５．前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、項目３５〜４１のいずれか１項において定義されるものである、項目５４に記載のシステム。
５６．項目３３に記載のベクターが、前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターをさらに含み、かつ、さらなるベクターが、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、項目５４または５５に記載のシステム。
５７．細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法であって、前記細胞を、項目１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、項目３２に記載の核酸、項目３３〜４９のいずれか１項に記載のベクター、項目５１もしくは５２に記載の組成物および／または項目５３〜５６のいずれか１項に記載のシステムと接触させることを含む、方法。
５８．ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法である、項目５７に記載の方法。
５９．ｉｎ  ｖｉｖｏの方法であり、かつ、前記細胞が対象中にある、項目５７に記載の方法。
６０．細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変するための、項目１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、項目３２に記載の核酸、項目３３〜４９のいずれか１項に記載のベクター、項目５１もしくは５２に記載の組成物および／または項目５３〜５６のいずれか１項に記載のシステムの使用。
６１．細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変するための医薬の調製のための、項目１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、項目３２に記載の核酸、項目３３〜４９のいずれか１項に記載のベクター、項目５１もしくは５２に記載の組成物および／または項目５３〜５６のいずれか１項に記載のシステムの使用。
６２．細胞中の標的ポリヌクレオチドの改変において使用するための、項目１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、項目３２に記載の核酸、項目３３〜４９のいずれか１項に記載のベクター、項目５１もしくは５２に記載の組成物および／または項目５３〜５６のいずれか１項に記載のシステム。
６３．それを必要とする対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療する方法であって、前記対象に有効量の項目１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、項目３２に記載の核酸、項目３３〜４９のいずれか１項に記載のベクター、項目５１もしくは５２に記載の組成物および／または項目５３〜５６のいずれか１項に記載のシステムを投与することを含む、方法。
６４．前記病態が代謝性の病態である、項目６３に記載の方法。
６５．前記病態が肝臓の病態である、項目６３または６４に記載の方法。
６６．対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療するための、項目１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、項目３２に記載の核酸、項目３３〜４９のいずれか１項に記載のベクター、項目５１もしくは５２に記載の組成物および／または項目５３〜５６のいずれか１項に記載のシステムの使用。
６７．対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療するための医薬の調製のための、項目１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、項目３２に記載の核酸、項目３３〜４９のいずれか１項に記載のベクター、項目５１もしくは５２に記載の組成物および／または項目５３〜５６のいずれか１項に記載のシステムの使用。
６８．前記病態が代謝性の病態である、項目６６または６７に記載の使用。
６９．前記病態が肝臓の病態である、項目６６〜６８のいずれか１項に記載の使用。
７０．対象における標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態の予防または治療において使用するための、項目１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、項目３２に記載の核酸、項目３３〜４９のいずれか１項に記載のベクター、項目５１もしくは５２に記載の組成物および／または項目５３〜５６のいずれか１項に記載のシステム。
７１．前記病態が代謝性の病態である、項目７０に記載の使用のためのｓｇＲＮＡ、核酸、ベクター、組成物および／またはシステム。
７２．前記病態が肝臓の病態である、項目７０または７１に記載の使用のためのｓｇＲＮＡ、核酸、ベクター、組成物および／またはシステム。
７３．医薬として使用するための、項目１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡ、項目３２に記載の核酸、項目３３〜４９のいずれか１項に記載のベクター、項目５０に記載の宿主細胞、項目５１もしくは５２に記載の組成物および／または項目５３〜５６のいずれか１項に記載のシステム。
【００１２】
７４．第１のドメインおよび前記第１のドメインのＣ末側にある第２のドメインを含む単離されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドであって、前記第１のドメインがガイドＲＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含み、かつ、前記第２のドメインがＷＥＤドメインおよびＰＡＭ相互作用ドメインを含み、前記第１および第２のドメインが異なる細菌株に由来する、単離されたポリペプチド。
７５．前記第１および第２のドメインが非病原性細菌に由来する、項目７４に記載の単離されたポリペプチド。
７６．前記第１および第２のドメインが異なる細菌種に由来する、項目７４または７５に記載の単離されたポリペプチド。
７７．前記第１および第２のドメインが同じ細菌種の異なる株に由来する、項目７４または７５に記載の単離されたポリペプチド。
７８．前記第１および第２のドメインがストレプトコッカス・サーモフィルスの異なる株に由来する、項目７７に記載の単離されたポリペプチド。
７９．前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがＩＩ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、項目７４〜７８のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
８０．前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがストレプトコッカス・サーモフィルスＩＩ−Ａ型ＣＲＩＳＰＲ１−Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）である、項目７４〜７９のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
８１．１つまたはより多くの核局在シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む、項目７４〜８０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
８２．前記第１のドメインのＮ末側にある第１のＮＬＳおよび前記第２のドメインのＣ末側にある第２のＮＬＳを含む、項目８１に記載の単離されたポリペプチド。
８３．シチジンデアミナーゼドメインまたはアデノシンデアミナーゼドメインをさらに含む、項目７４〜８２のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
８４．シチジンデアミナーゼドメインを含む、項目８３に記載の単離されたポリペプチド。
８５．前記シチジンデアミナーゼがＡＰＯＢＥＣシチジンデアミナーゼである、項目８４に記載の単離されたポリペプチド。
８６．前記シチジンデアミナーゼドメインが、配列番号５０のアミノ酸配列、またはその機能的断片、またはその機能的バリアントを含む、項目８４に記載の単離されたポリペプチド。
８７．ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインをさらに含む、項目８４または８５に記載の単離されたポリペプチド。
８８．前記ＵＧＩドメインが、配列番号５１のアミノ酸配列、またはその機能的断片、またはその機能的バリアントを含む、項目８７に記載の単離されたポリペプチド。
８９．前記第１のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９、ＬＭＧ１８３１１、ＣＮＲＺ１０６６またはＴＨ１４７７に由来する、項目７４〜８８のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
９０．前記第２のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９、ＬＭＧ１８３１１、ＣＮＲＺ１０６６またはＴＨ１４７７に由来する、項目７４〜８９のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
９１．前記第１のドメインがストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９に由来し、かつ、前記第２のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＧ１８３１１、ＣＮＲＺ１０６６またはＴＨ１４７７に由来する、項目７４〜９０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
９２．前記第１のドメインがストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＧ１８３１１に由来し、かつ、前記第２のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９、ＣＮＲＺ１０６６またはＴＨ１４７７に由来する、項目７４〜９０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
９３．前記第１のドメインがストレプトコッカス・サーモフィルスＣＮＲＺ１０６６に由来し、かつ、前記第２のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＧ１８３１１、ＬＭＤ−９またはＴＨ１４７７に由来する、項目７４〜９０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
９４．前記第１のドメインがストレプトコッカス・サーモフィルスＴＨ１４７７に由来し、かつ、前記第２のドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＧ１８３１１、ＣＮＲＺ１０６６またはＬＭＤ−９に由来する、項目７４〜９０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
９５．前記第１のドメインが、配列番号２６４、２６５、２６６、もしくは２６７のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、項目７４〜８８のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
９６．前記第２のドメインが、配列番号２６０、２６１、２６２、もしくは２６３のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、項目７４〜８８のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
９７．前記第１のドメインが、配列番号２６４のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含み、かつ、前記第２のドメインが、配列番号２６１、２６２、もしくは２６３のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、項目７４〜８８、９５および９６のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
９８．前記第１のドメインが、配列番号２６５のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含み、かつ、前記第２のドメインが、配列番号２６０、２６２、もしくは２６３のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、項目７４〜８８、９５および９６のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
９９．前記第１のドメインが、配列番号２６６のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含み、かつ、前記第２のドメインが、配列番号２６０、２６１、もしくは２６３のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、項目７４〜８８、９５および９６のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
１００．前記第１のドメインが、配列番号２６７のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含み、かつ、前記第２のドメインが、配列番号２６０、２６１、もしくは２６２のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む、項目７４〜８８、９５および９６のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
１０１．前記第１のドメインが、リンカー領域を介して前記第２のドメインに接続されている、項目７４〜１００のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
１０２．前記ポリペプチドが、前記第１のドメインが由来するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが結合するＰＡＭとは異なるＰＡＭに結合することができる、項目７４〜１０１のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
１０３．前記ポリペプチドが、配列ＮＮＡＧＡＡ、ＮＮＧＧＡＡ、ＮＮＡＣＡＡ、ＮＮＧＣＡＡ、ＮＮＧＡＡＡまたはＮＮＡＡＡＡを含むＰＡＭに結合する、項目７４〜１０２のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【００１３】
１０４．項目７４〜１０３のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
１０５．項目１０４に記載の核酸を含む、ベクター。
１０６．ｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目１０５に記載のベクター。
１０７．前記ｓｇＲＮＡが、項目１〜３１のいずれか１項に記載のｓｇＲＮＡである、項目１０６に記載のベクター。
１０８．前記ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列および／または前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結した１つまたはより多くのプロモーターをさらに含む、項目１０５〜１０７のいずれか１項に記載のベクター。
１０９．前記ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列および前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列の両方が単一のプロモーターに作動可能に連結している、項目１０８に記載のベクター。
１１０．前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列が第１のプロモーターに作動可能に連結しており、かつ、前記ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が第２のプロモーターに作動可能に連結しており、前記第１のプロモーターおよび前記第２のプロモーターが同じまたは異なっていてもよい、項目１０８に記載のベクター。
１１１．（ｉ）前記第１のプロモーターおよび前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列ならびに（ｉｉ）前記第２のプロモーターおよび前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ベクター内で同じ方向にある、項目１１０に記載のベクター。
１１２．（ｉ）前記第１のプロモーターおよび前記ｓｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列ならびに（ｉｉ）前記第２のプロモーターおよび前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ベクター内で反対の方向にある、項目１１０に記載のベクター。
１１３．前記ベクターがウイルスベクターである、項目１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター。
１１４．前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、項目１１３に記載のベクター。
１１５．項目１０４に記載の核酸または項目１０５〜１１３のいずれか１項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
１１６．項目７４〜１０３のいずれか１項に記載のポリペプチド、項目１０４に記載の核酸、項目１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター、または項目１１５に記載の宿主細胞を含む、組成物。
１１７．薬学的または生物学的に許容される担体をさらに含む、項目１１６に記載の組成物。
【００１４】
１１８．項目７４〜１０３のいずれか１項に記載のポリペプチド、項目１０４に記載の核酸、項目１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター、項目１１５に記載の宿主細胞、および／または項目１１６もしくは１１７に記載の組成物を含む、システム。
１１９．項目１０５に記載のベクターおよびｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むさらなるベクターを含む、システム。
１２０．細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法であって、前記細胞を、項目７４〜１０３のいずれか１項に記載のポリペプチド、項目１０４に記載の核酸、項目１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター、項目１１５に記載の宿主細胞、および／または項目１１６もしくは１１７に記載の組成物、および／または項目１１８もしくは１１９に記載のシステムと接触させることを含む、方法。
１２１．ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法である、項目１２０に記載の方法。
１２２．ｉｎ  ｖｉｖｏの方法であり、かつ、前記細胞が対象中にある、項目１２０に記載の方法。
１２３．細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変するための、項目７４〜１０３のいずれか１項に記載のポリペプチド、項目１０４に記載の核酸、項目１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター、項目１１５に記載の宿主細胞、および／または項目１１６もしくは１１７に記載の組成物、および／または項目１１８もしくは１１９に記載のシステムの使用。
１２４．細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変するための医薬の調製のための、項目７４〜１０３のいずれか１項に記載のポリペプチド、項目１０４に記載の核酸、項目１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター、項目１１５に記載の宿主細胞、および／または項目１１６もしくは１１７に記載の組成物、および／または項目１１８もしくは１１９に記載のシステムの使用。
１２５．細胞中の標的ポリヌクレオチドの改変において使用するための、項目７４〜１０３のいずれか１項に記載のポリペプチド、項目１０４に記載の核酸、項目１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター、項目１１５に記載の宿主細胞、および／または項目１１６もしくは１１７に記載の組成物、および／または項目１１８もしくは１１９に記載のシステム。
１２６．それを必要とする対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療する方法であって、前記対象に有効量の項目７４〜１０３のいずれか１項に記載のポリペプチド、項目１０４に記載の核酸、項目１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター、項目１１５に記載の宿主細胞、および／または項目１１６もしくは１１７に記載の組成物、および／または項目１１８もしくは１１９に記載のシステムを投与することを含む、方法。
１２７．前記病態が代謝性の病態である、項目１２６に記載の方法。
１２８．前記病態が肝臓の病態である、項目１２６または１２７に記載の方法。
１２９．対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療するための、項目７４〜１０３のいずれか１項に記載のポリペプチド、項目１０４に記載の核酸、項目１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター、項目１１５に記載の宿主細胞、および／または項目１１６もしくは１１７に記載の組成物、および／または項目１１８もしくは１１９に記載のシステムの使用。
１３０．対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防または治療するための医薬の調製のための、項目７４〜１０３のいずれか１項に記載のポリペプチド、項目１０４に記載の核酸、項目１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター、項目１１５に記載の宿主細胞、および／または項目１１６もしくは１１７に記載の組成物、および／または項目１１８もしくは１１９に記載のシステムの使用。
１３１．前記病態が代謝性の病態である、項目１２９または１３０に記載の使用。
１３２．前記病態が肝臓の病態である、項目１２９〜１３１のいずれか１項に記載の使用。
１３３．対象における標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態の予防または治療において使用するための、項目７４〜１０３のいずれか１項に記載のポリペプチド、項目１０４に記載の核酸、項目１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター、項目１１５に記載の宿主細胞、および／または項目１１６もしくは１１７に記載の組成物、および／または項目１１８もしくは１１９に記載のシステム。
１３４．前記病態が代謝性の病態である、項目１３３に記載の使用のためのｓｇＲＮＡ、核酸、ベクター、組成物および／またはシステム。
１３５．前記病態が肝臓の病態である、項目１３３または１３４に記載の使用のためのｓｇＲＮＡ、核酸、ベクター、組成物および／またはシステム。
１３６．医薬として使用するための、項目７４〜１０３のいずれか１項に記載のポリペプチド、項目１０４に記載の核酸、項目１０５〜１１２のいずれか１項に記載のベクター、項目１１５に記載の宿主細胞、および／または項目１１６もしくは１１７に記載の組成物、および／または項目１１８もしくは１１９に記載のシステム。
【００１５】
本開示の他の目的、利点および特徴は、添付の図面を参照して例示としてのみ与えられる、その特定の実施形態の以下の非限定的な記載を読むことでより明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】操作されたＣＲＩＳＰＲ１−ＳｔＣａｓ９システムはヒト細胞においてロバストな遺伝子編集を駆動する。（ａ）核局在シグナル（ＮＬＳ）の隣接した、ＬＭＤ−９株からのＳｔ１Ｃａｓ９の図式。（ｂ）Ｓｔ１Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡ（ｖ１；配列番号１）のヌクレオチド配列、予測される二次構造、および機能モジュール；ｃｒＲＮＡ（位置３４まで；下ステム、バルジおよび上ステムの左側）、ループ（位置３５〜３８；上ステムの左側および右側を接続する）、ｔｒａｃｒＲＮＡ（位置３９以降；下ステム、バルジおよび上ステムの右側の他に、ステムループ１、リンカーおよびステムループ２）、突然変異型ヌクレオチド（位置２３および３４）。（ｃ）ＦＡＮＣＦ、ＥＭＸ１、およびＲＵＮＸ１におけるＳｔ１Ｃａｓ９標的部位（ＦＡＮＣＦ：センス、配列番号２；アンチセンス、配列番号３；ＥＭＸ１：センス、配列番号６６；アンチセンス、配列番号６７；ＲＵＮＸ１：センス、配列番号６８；アンチセンス、配列番号６９）およびＰＡＭ配列。（ｄ）Ｓｔ１Ｃａｓ９を安定的に発現するＫ５６２細胞に、増加性用量の指し示されるｓｇＲＮＡ発現ベクターをトランスフェクトし、ＳｕｒｖｅｙｏｒおよびＴＩＤＥアッセイを３日後に行って、各レーンの下部に指し示されるようにインデルの頻度を決定した。ＥＧＦＰ（−）をコードする発現ベクターを陰性対照として使用した。
【図２】マウス細胞における肝臓機能に影響する遺伝子を標的化する活性ｓｇＲＮＡのスクリーニング。（ａ）Ｐｃｋ１を標的化する様々なｓｇＲＮＡを用いてプログラムされたＳｔ１Ｃａｓ９活性を決定するためのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ。Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞に、Ｓｔ１Ｃａｓ９およびそのｓｇＲＮＡの発現を駆動する単一のベクター（０．５μｇ）を一過的にトランスフェクトした。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを３日後に行って、各レーンの下部に指し示されるようにインデルの頻度を決定した。ＥＧＦＰ（−）をコードする発現ベクターを陰性対照として使用した。（ｂ）（ａ）と同じであるがＰｃｓｋ９を標的化している。（ｃ）（ａ）と同じであるがＨｐｄを標的化している。
【図３】ホロＳｔ１Ｃａｓ９のｒＡＡＶ８媒介性送達を介したｉｎ  ｖｉｖｏ代謝経路再配線。（ａ）チロシン分解経路および関連付けられる遺伝性障害。（ｂ）ｉｎ  ｖｉｖｏ編集のための実験的設計。新生（２日齢）Ｆａｈ−／−マウスの後眼窩洞にｒＡＡＶ８−Ｓｔ１Ｃａｓ９または生理食塩水を注射し、２１日目に離乳させ、３０日齢時にＮＴＢＣを除去した。表現型および代謝訂正ならびに遺伝子破壊有効性についてマウスをアッセイした。ＮＴＢＣを除去したマウスが体重の２０％を喪失した時にマウスを殺した。（ｃ）ｒＡＡＶベクターおよびＨｐｄのエクソン１３内のＳｔ１Ｃａｓ９標的部位（Ｇ５）の図式。標的配列（センス、配列番号４；アンチセンス、配列番号５；アミノ酸、配列番号６）、ＰＡＭおよびヒトにおいてＩＩＩ型チロシン血症を引き起こすＩ３３５Ｍ突然変異（示される最後のアミノ酸、すなわち、ＬＬＱＩのＩ）の位置を示す。ヒトチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨｐＡ）およびｈＵ６プロモーターもまた注記されている。矢印は転写単位の方向を指し示す。（ｄ）新生Ｆａｈ−／−マウスの後眼窩洞に、Ｈｐｄエクソン１３（Ｇ５）を標的化する５Ｅ１０、１Ｅ１１、２Ｅ１１または４Ｅ１１のいずれかのベクターゲノム（ｖｇ）のｒＡＡＶ８−Ｓｔ１Ｃａｓ９を注射し、注射の２８日後に殺した。ゲノムＤＮＡを肝臓全体試料から抽出し、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用して各レーンの下部に指し示されるインデル％としてＳｔ１Ｃａｓ９誘導性遺伝子破壊の頻度を決定した。各レーンは異なるマウスを表す。生理食塩水（−）を注射したマウスを陰性対照として使用した。（ｅ）（ｂ）に記載されるように治療したマウスにおけるＮＴＢＣ除去後の生存解析。群当たりのマウスの数（ｎ）およびｒＡＡＶ用量（ｖｇ）を指し示す。（ｆ）（ｅ）と同じであるが、体重を１日毎に測定した。実線は平均を表し、エラーバーは陰影区画により表され、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。（ｇ）（ｆ）と同じであるが、糖血症を非絶食マウスにおいてモニターした。（ｈ）（ｅ）と同じであるが、尿中のスクシニルアセトンレベルをＮＴＢＣ除去の１５日後に決定した。代謝ケージを使用して２４時間の期間にわたり指し示される治療群から試料を収集した。
【図４】代替的なｒＡＡＶ−Ｓｔ１Ｃａｓ９ベクター構造は力価をさらに向上させることができる。（ａ）親ＡＡＶゲノムと類似したサイズ（約４．７ｋｂ）の第２世代ｒＡＡＶ−Ｓｔ１Ｃａｓ９（ｖ２）ベクターの図式。ヒトチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、合成ポリアデニル化配列（ＳｐＡ）およびｈＵ６プロモーターに注記した。矢印は転写単位の方向を指し示す。新生（２日齢）Ｆａｈ−／−マウスの後眼窩洞に、Ｈｐｄエクソン１３（Ｇ５）を標的化する２Ｅ１１ｖｇのｒＡＡＶ８−Ｓｔ１Ｃａｓ９  ｖ２または生理食塩水を注射し、注射の１３日後に殺した。ゲノムＤＮＡを肝臓全体試料から抽出し、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用して各レーンの下部に指し示されるインデル％としてＳｔ１Ｃａｓ９誘導性遺伝子破壊の頻度を決定した。各レーンは異なるマウスを表す。生理食塩水（−）を注射したマウスを陰性対照として使用した。（ｂ）（ａ）と同じであるが、ＴＢＧプロモーターを複合肝臓特異的ＬＰ１ｂプロモーターに交換してｒＡＡＶ８−Ｓｔ１Ｃａｓ９  ｖ３を生成した。
【図５−１】操作されたＣＲＩＳＰＲ１−ＳｔＣａｓ９システムはヒト細胞においてロバストな遺伝子編集を駆動する。（ａ）ＡＡＶＳ１セーフハーバー遺伝子座へのタグ化Ｓｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９の標的化された組込みの図式。ｃＤＮＡ付加後のドナー構築物および遺伝子座を示す。ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子の最初の２エクソンを白ボックスとして示す。スプライスアクセプター部位（ＳＡ）、２Ａ自己切断性ペプチド配列（２Ａ）、ピューロマイシン抵抗性遺伝子（Ｐｕｒｏ）、ポリアデニル化配列（ｐＡ）、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーター（ｈＰＧＫ１）、核局在シグナル（ＮＬＳ）、および３ｘＦＬＡＧ−２ｘＳＴＲＥＰタンデムアフィニティータグ（Ｔａｇ）の位置もまた注釈しており、相同アーム左および右（ＨＡ−Ｌ、ＨＡ−Ｒ）はそれぞれ８００および８４０ｂｐである。（ｂ）Ｋ５６２クローンおよびタグのみを発現する細胞（モック）中でのＣａｓ９−タグタンパク質発現を示すウエスタンブロット。ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を使用してＣａｓ９を検出し、チューブリン抗体をローディングコントロールとして使用した。（ｃ）Ｓｔ１Ｃａｓ９について以前に記載されたｓｇＲＮＡ配列（配列番号７〜１１）のアライメント。
【図５−２】操作されたＣＲＩＳＰＲ１−ＳｔＣａｓ９システムはヒト細胞においてロバストな遺伝子編集を駆動する。（ｄ）Ｋ５６２細胞に、指し示されるｓｇＲＮＡ発現プラスミド（０．８μｇ）に加えてＳｔ１Ｃａｓ９発現ベクター（０．５μｇ）を一過的にトランスフェクトした。ＳｕｒｖｅｙｏｒおよびＴＩＤＥアッセイを３日後に行って、各レーンの下部に指し示されるようにインデルの頻度を決定した。ＥＧＦＰ（−）をコードする発現ベクターを陰性対照として使用した。
【図６】ホロＳｔ１Ｃａｓ９のｒＡＡＶ８媒介性送達を介するｉｎ  ｖｉｖｏ代謝経路再配線。（ａ）ｒＡＡＶベクターおよびＨｐｄのエクソン８内のＳｔ１Ｃａｓ９標的部位（Ｇ２）の図式。標的配列（センス、配列番号１２；アンチセンス、配列番号１３；アミノ酸、配列番号１４）、ＰＡＭおよびヒトにおいてＩＩＩ型チロシン血症を引き起こすＹ１６０Ｃ突然変異の位置を示す。タンパク質のこの領域はヒトとマウスとの間でよく保存されているが、フェニルアラニンがマウス、ラット、ブタ、およびＣ．エレガンス（C. elegans）においてこの位置に見出されることに留意されたい。ヒトチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨｐＡ）およびｈＵ６プロモーターもまた注記されている。矢印は転写単位の方向を指し示す。（ｂ）新生Ｆａｈ−／−マウスの後眼窩洞に、Ｈｐｄエクソン８（Ｇ２）を標的化する１Ｅ１１ベクターゲノム（ｖｇ）のｒＡＡＶ８−Ｓｔ１Ｃａｓ９を注射し、注射の２８日後に殺した。ゲノムＤＮＡを肝臓全体試料から抽出し、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用して各レーンの下部に指し示されるインデル％としてＳｔ１Ｃａｓ９誘導性遺伝子破壊の頻度を決定した。各レーンは異なるマウスを表す。生理食塩水（−）を注射したマウスを陰性対照として使用した。（ｃ）図３におけるように治療されたマウスにおいてＮＴＢＣ除去後に体重を１日毎に測定した。群当たりのマウスの数（ｎ）を指し示す。ドットは平均を表し、エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を表す。（ｄ）（ｃ）と同じであるが、糖血症を非絶食マウスにおいてモニターした。
【図７】ＳａＣａｓ９およびＳｔ１Ｃａｓ９のｓｇＲＮＡは機能的に交換可能でない。（ａ）ＳａＣａｓ９を構成的に発現する安定なＫ５６２細胞株に、そのコグネイトｓｇＲＮＡまたはＳｔ１Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡ用の発現ベクター（０．２５μｇ）をトランスフェクトした。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを３日後に行って、各レーンの下部に指し示されるようにインデルの頻度を決定した。ＥＧＦＰ（−）をコードする発現ベクターを陰性対照として使用した。（ｂ）（ａ）と同じであるが、Ｓｔ１Ｃａｓ９を構成的に発現するＫ５６２細胞株において行った。これらのデータは、１つの部位においてＳｔ１Ｃａｓ９による切断を指定するようにプログラムされたｓｇＲＮＡは、この同じ部位においてＳａＣａｓ９による切断をリクルートおよび誘導することができず、逆もまた同様であることを指し示す。
【図８】Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９はヒト細胞においてＮＮＡＧＡＡおよびＮＮＧＧＡＡの両方のＰＡＭ配列で機能的である。（ａ）ＦＡＮＣＦ、ＥＭＸ１、ＶＥＧＦＡ、およびＲＵＮＸ１を標的化する様々なｓｇＲＮＡを用いてプログラムされたＳｔ１Ｃａｓ９活性を決定するためのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ（表３〜４）。Ｋ５６２細胞に、Ｓｔ１Ｃａｓ９およびそのｓｇＲＮＡの発現を駆動する単一のベクター（１μｇ）を一過的にトランスフェクトした。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを３日後に行って、各レーンの下部に指し示されるようにインデルの頻度を決定した。ＥＧＦＰ（−）をコードする発現ベクターを陰性対照として使用した。＊は、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイにおいてシグナルを生成する非特異的なＰＣＲ増幅産物を指し示す。このシグナルを全ての定量化から減算した。（ｂ）ＮＮリンカーを用いたＰＡＭにおいてＳｔ１Ｃａｓ９による切断を指定するｓｇＲＮＡを改変して、ＮＮＮリンカーを用いた機能性を試験した（表３、表６）。切断活性を（ａ）におけるように決定した。
【図９−１】異なる株からのＳｔ１Ｃａｓ９（それぞれＳｔ１Ｃａｓ９＿ＬＭＤ−９、Ｓｔ１Ｃａｓ９＿ＬＭＧ１８３１１およびＳｔ１Ｃａｓ９＿ＣＮＲＺ１０６６に対応する配列番号１６〜１８）とのＳａＣａｓ９（配列番号１５）のアミノ酸配列アライメント。ＳａＣａｓ９５（５ＣＺＺ）の二次構造を配列の上に示し、ＳａＣａｓ９の残基にしたがってナンバリングしている。同一の残基を黒で強調している。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（文献６）およびＥＳＰｒｉｐｔ（文献７）を用いてアライメントを行った。
【図９−２】同上
【図９−３】同上
【図１０−１】異なる株からのＳｔ１Ｃａｓ９のアミノ酸配列アライメント（それぞれＬＭＤ＿９、ＬＭＧ＿１８３１１、ＣＮＲＺ＿１０６６、およびＴＨ１４７７に対応する配列番号１６〜１９）。同一の残基を黒で強調している。ＷＥＤおよびＰＡＭ相互作用ドメイン（ＰＩ）の位置を矢印により指し示す。タンパク質のこの領域は、Ｎ末端セグメントと比較して最も多様化している。ＳａＣａｓ９において、ＰＡＭデュプレックスはＷＥＤドメインとＰＩドメインとの間に挟まれている（文献５）。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（文献６）およびＥＳＰｒｉｐｔ（文献７）を用いてアライメントを行った。
【図１０−２】同上
【図１０−３】同上
【図１１】Ａｄｄｇｅｎｅから入手可能なＳｔ１Ｃａｓ９ベクター（ガイドセンスおよびアンチセンス配列、配列番号２０〜２１）。
【図１２】図１のＴＩＤＥアッセイにより決定されたようなＦＡＮＣＦにおける総編集有効性。
【図１３】図１のＴＩＤＥアッセイにより決定されたようなＥＭＸ１における総編集有効性。
【図１４】図１のＴＩＤＥアッセイにより決定されたようなＲＵＮＸ１における総編集有効性。
【図１５】図５のＴＩＤＥアッセイにより決定されたような総編集有効性。
【図１６】株ＬＭＤ−９のＳｔ１Ｃａｓ９のヌクレオチド配列（配列番号２２）。ＳＶ４０  ＮＬＳを大文字とし、下線を引いており（配列番号２３〜２４）、Ｓｔ１Ｃａｓ９配列を大文字の斜体としており（配列番号２５）、リンカー領域を小文字としている（Ｓｔ１Ｃａｓ９に隣接するリンカー、配列番号２６〜２７）。
【図１７】株ＬＭＤ−９のＳｔ１Ｃａｓ９のアミノ酸配列（配列番号２８）。ＳＶ４０  ＮＬＳを大文字とし、下線を引いており（配列番号２９）、Ｓｔ１Ｃａｓ９配列を大文字の斜体としており（配列番号３０）、リンカー領域を小文字としている（Ｓｔ１Ｃａｓ９に隣接するリンカー、配列番号３１〜３２）。
【図１８】Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９はヒト細胞においてＮＮＡＧＡＡおよびＮＮＧＧＡＡの両方のＰＡＭ配列で機能的である。（ａ）様々なＰＡＭを標的化する様々なｓｇＲＮＡを用いてプログラムされたＳｔ１Ｃａｓ９活性を決定するためのｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイの結果。Ｋ５６２細胞に、Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９およびそのｓｇＲＮＡの発現を駆動する単一のベクター（１μｇ）を一過的にトランスフェクトした。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを３日後に行ってインデルの頻度を決定した。ＥＧＦＰ（−）をコードする発現ベクターを陰性対照として使用した。
【図１９−１】バリアントを使用して別個のＰＡＭ配列を標的化するためのＳｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９の再配線。（ａ）予測されるまたは実験的に決定されたＰＡＭと共にＬＭＤ−９（Ａ）、ＬＭＧ１８３１１（Ｂ）、およびＣＮＲＺ  １０６６（Ｃ）株からのＳｔ１Ｃａｓ９の図式。Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９のＮ末端ならびにＳｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＧ１８３１１およびＣＮＲＺ  １０６６のＣ末端ドメイン（ＷＥＤ＋ＰＩ）を含有するハイブリッドタンパク質（ＡＢ）もまた表している。
【図１９−２】バリアントを使用して別個のＰＡＭ配列を標的化するためのＳｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９の再配線。（ｂ〜ｇ）ヒト細胞において異なるＰＡＭを標的化するｓｇＲＮＡを用いてプログラムされたＳｔ１Ｃａｓ９バリアントの活性を決定するためのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ。Ｋ５６２細胞に、Ｓｔ１Ｃａｓ９およびそのｓｇＲＮＡの発現を駆動する単一のベクター（１μｇ）を一過的にトランスフェクトした。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを３日後に行って、各レーンの下部に指し示されるようにインデルの頻度を決定した。ＥＧＦＰ（−）をコードする発現ベクターを陰性対照として使用した。
【図２０】バリアントを使用して別個のＰＡＭ配列を標的化するためのＳｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９の再配線。（ａ）ＳＰＡＭＡＬＯＴに基づいて様々なＳｔ１Ｃａｓ９バリアントについて予測されるＰＡＭ特異性。（ｂ）様々なＰＡＭを標的化する様々なｓｇＲＮＡを用いてプログラムされたＳｔ１Ｃａｓ９  ＴＨ１４７７活性を決定するためのＴＩＤＥアッセイの結果。Ｋ５６２細胞に、Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＴＨ１４７７およびそのｓｇＲＮＡの発現を駆動する単一のベクター（１μｇ）を一過的にトランスフェクトした。ＴＩＤＥアッセイを３日後に行ってインデルの頻度を決定した。ＥＧＦＰ（−）をコードする発現ベクターを陰性対照として使用した。
【図２１】シトシン塩基エディター（ＣＢＥ）へのＳｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９の変換。ヒト細胞においてＮＮＡＧＡＡおよびＮＮＧＧＡＡ  ＰＡＭを標的化するｓｇＲＮＡを用いてプログラムされたＳｔ１ＢＥ４ｍａｘ。Ｋ５６２細胞に、Ｓｔ１ＢＥ４ｍａｘ  ＬＭＤ−９およびそのｓｇＲＮＡの発現を駆動する単一のベクター（１μｇ）を一過的にトランスフェクトした。サンガーシークエンシングリードからの塩基編集の定量化を３日後にＥｄｉｔＲ（商標）ソフトウェアを使用して行った。各ボックス中の数は、ＣからＴへの変換の％を指し示す。プロトスペーサー標的配列  配列番号１８２、１８０および１７８（ＲＵＮＸ１）；１７２、１７１、１６９および１６８（ＦＡＮＣＦ）；１５７、１６２、１６１、１５９および１６０（ＥＭＸ１）；１８５（ＡＴＰ１Ａ１）。
【図２２】バリアントを使用して別個のＰＡＭ配列を標的化するためのＳｔ１ＢＥ４ｍａｘの再配線。（ａ〜ｂ）それぞれＮＮＧＣＡＡおよびＮＮＡＣＡＡ  ＰＡＭを標的化するｓｇＲＮＡを用いてＳｔ１ＢＥ４ｍａｘ  ＬＭＧ  １８３１１およびＣＮＲＺ  １０６６をプログラムした。Ｋ５６２細胞に、Ｓｔ１ＢＥ４ｍａｘバリアントおよびそのｓｇＲＮＡの発現を駆動する単一のベクター（１μｇ）を一過的にトランスフェクトした。サンガーシークエンシングリードからの塩基編集の定量化を３日後にＥｄｉｔＲ（商標）ソフトウェアを使用して行った。各ボックス中の数は、ＣからＴへの変換の％を指し示す。プロトスペーサー標的配列  配列番号２３７、２３６および２３５（ＲＵＮＸ１）；２５８および２３９（Ｇｒｉｎ２Ｂ）；２３４（ＦＡＮＣＦ）；２４１および２４０（ＡＴＰ１Ａ１、パネルａ）；２３８（ＡＡＶＳ１）；２４３および２４２（ＥＭＸ１）；２４５（ＡＴＰ１Ａ１、パネルｂ）。
【図２３−１】ＮＬＳ−Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９／ＬＭＧ１８３１１ハイブリッドＮＬＳのヌクレオチド配列（配列番号３３）。ＳＶ４０  ＮＬＳを大文字とし、下線を引いており（配列番号２３〜２４）、Ｓｔ１Ｃａｓ９ハイブリッド配列を大文字の斜体としており（配列番号３４）、リンカー領域を小文字としている（Ｓｔ１Ｃａｓ９ハイブリッドに隣接するリンカー、配列番号２６〜２７）。
【図２３−２】同上
【図２４】ＮＬＳ−Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９／ＬＭＧ１８３１１ハイブリッドＮＬＳのアミノ酸配列（配列番号３５）。ＳＶ４０  ＮＬＳを大文字とし、下線を引いており（配列番号２９）、Ｓｔ１Ｃａｓ９ハイブリッド配列を大文字の斜体としており（配列番号３６）、リンカー領域を小文字としている（Ｓｔ１Ｃａｓ９に隣接するリンカー、配列番号３１〜３２）。
【図２５−１】ＮＬＳ−Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９／ＣＮＲＺ１０６６ハイブリッドＮＬＳのヌクレオチド配列（配列番号３７）。ＳＶ４０  ＮＬＳを大文字とし、下線を引いており（配列番号２３〜２４）、Ｓｔ１Ｃａｓ９ハイブリッド配列を大文字の斜体としており（配列番号３８）、リンカー領域を小文字としている（Ｓｔ１Ｃａｓ９ハイブリッドに隣接するリンカー、配列番号２６〜２７）。
【図２５−２】同上
【図２６】ＮＬＳ−Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９／ＣＮＲＺ１０６６ハイブリッドＮＬＳのアミノ酸配列（配列番号３０）。ＳＶ４０  ＮＬＳを大文字とし、下線を引いており（配列番号２９）、Ｓｔ１Ｃａｓ９ハイブリッド配列を大文字の斜体としており（配列番号４０）、リンカー領域を小文字としている（Ｓｔ１Ｃａｓ９に隣接するリンカー、配列番号３１〜３２）。
【図２７−１】ＮＬＳ−Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９／ＴＨ１４７７ハイブリッドＮＬＳのヌクレオチド配列（配列番号４１）。ＳＶ４０  ＮＬＳを大文字とし、下線を引いており（配列番号２３〜２４）、Ｓｔ１Ｃａｓ９ハイブリッド配列を大文字の斜体としており（配列番号４２）、リンカー領域を小文字としている（Ｓｔ１Ｃａｓ９ハイブリッドに隣接するリンカー、配列番号２６〜２７）。
【図２７−２】同上
【図２８】ＮＬＳ−Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９／ＴＨ１４７７ハイブリッドＮＬＳのアミノ酸配列（配列番号４３）。ＳＶ４０  ＮＬＳを大文字とし、下線を引いており（配列番号２９）、Ｓｔ１Ｃａｓ９ハイブリッド配列を大文字の斜体としており（配列番号４４）、リンカー領域を小文字としている（Ｓｔ１Ｃａｓ９に隣接するリンカー、配列番号３１〜３２）。
【図２９−１】ＮＬＳ−ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９−ＮＬＳ−２ｘＵＧＩ−ＮＬＳ−３ｘＨＡのヌクレオチド配列（配列番号４５）。ＳＶ４０  ＮＬＳを大文字とし、下線を引いており（配列番号２３）、ｒＡＰＯＢＥＣ１配列を大文字の太字としており（配列番号４６）、Ｓｔ１Ｃａｓ９配列を大文字の斜体としており（配列番号２５）、ＵＧＩ配列を大文字の太字の斜体としており（配列番号４７）、３ｘＨＡ配列を大文字の太字の斜体とし、下線を引いている（配列番号４８）。
【図２９−２】同上
【図３０】ＮＬＳ−ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９−ＮＬＳ−２ｘＵＧＩ−ＮＬＳ−３ｘＨＡのアミノ酸配列（配列番号４９）。ＳＶ４０  ＮＬＳを大文字とし、下線を引いており（配列番号２３）、ｒＡＰＯＢＥＣ１配列を大文字の太字としており（配列番号５０）、Ｓｔ１Ｃａｓ９配列を大文字の斜体としており（配列番号３０）、ＵＧＩ配列を大文字の太字の斜体としており（配列番号５１）、３ｘＨＡ配列を大文字の太字の斜体とし、下線を引いている（配列番号５２）。
【図３１−１】ＮＬＳ−ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９／ＬＭＧ１８３１１−ＮＬＳ−２ｘＵＧＩ−ＮＬＳ−３ｘＨＡのヌクレオチド配列（配列番号５３）。ＳＶ４０  ＮＬＳを大文字とし、下線を引いており（配列番号２３）、ｒＡＰＯＢＥＣ１配列を大文字の太字としており（配列番号４７）、Ｓｔ１Ｃａｓ９配列を大文字の斜体としており（配列番号５４）、ＵＧＩ配列を大文字の太字の斜体としており（配列番号４８）、３ｘＨＡ配列を大文字の太字の斜体とし、下線を引いている（配列番号４９）。
【図３１−２】同上
【図３２】ＮＬＳ−ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９／ＬＭＧ１８３１１−ＮＬＳ−２ｘＵＧＩ−ＮＬＳ−３ｘＨＡのアミノ酸配列（配列番号５５）。ＳＶ４０  ＮＬＳを大文字とし、下線を引いており（配列番号２３）、ｒＡＰＯＢＥＣ１配列を大文字の太字としており（配列番号５１）、Ｓｔ１Ｃａｓ９配列を大文字の斜体としており（配列番号５６）、ＵＧＩ配列を大文字の太字の斜体としており（配列番号５２）、３ｘＨＡ配列を大文字の太字の斜体とし、下線を引いている（配列番号５３）。
【図３３−１】ＮＬＳ−ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９／ＣＮＲＺ１０６６−ＮＬＳ−２ｘＵＧＩ−ＮＬＳ−３ｘＨＡのヌクレオチド配列（配列番号５７）。ＳＶ４０  ＮＬＳを大文字とし、下線を引いており（配列番号２３）、ｒＡＰＯＢＥＣ１配列を大文字の太字としており（配列番号４７）、Ｓｔ１Ｃａｓ９配列を大文字の斜体としており（配列番号５８）、ＵＧＩ配列を大文字の太字の斜体としており（配列番号４８）、３ｘＨＡ配列を大文字の太字の斜体とし、下線を引いている（配列番号４９）。
【図３３−２】同上
【図３４】ＮＬＳ−ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９／ＣＮＲＺ１０６６−ＮＬＳ−２ｘＵＧＩ−ＮＬＳ−３ｘＨＡのアミノ酸配列（配列番号５９）。ＳＶ４０  ＮＬＳを大文字とし、下線を引いており（配列番号２３）、ｒＡＰＯＢＥＣ１配列を大文字の太字としており（配列番号５１）、Ｓｔ１Ｃａｓ９配列を大文字の斜体としており（配列番号６０）、ＵＧＩ配列を大文字の太字の斜体としており（配列番号５２）、３ｘＨＡ配列を大文字の太字の斜体とし、下線を引いている（配列番号５３）。
【図３５】Ｓ．サーモフィルス（S. thermophilus）ＬＭＤ−９からのＳｔ１Ｃａｓ９のドメイン組成。ＢＨ：ブリッジヘリックス、ＣＴＤ：Ｃ末端ドメイン、ＰＩ：ＰＡＭ相互作用ドメイン、ＷＥＤ：ウェッジドメイン。（ａ）Ｓｔ１Ｃａｓ９ドメインの図式；（ｂ）異なる株からのＳｔ１Ｃａｓ９のＣ末端領域（ＷＥＤおよびＰＡＭ相互作用ドメイン（ＰＩ）を含む；図１０を参照）のアミノ酸配列アライメント（それぞれＬＭＤ＿９、ＬＭＧ＿１８３１１、ＣＮＲＺ＿１０６６、およびＴＨ１４７７のＣ末端領域に対応する配列番号２６０〜２６３）。同一の残基を黒で強調している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
例示的な実施形態の説明
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを使用する遺伝子改変のための試薬および方法が本明細書に記載される。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方におけるＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子改変が本明細書に示される。
【００１８】
一態様では、ＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子改変のための改変されたｓｇＲＮＡ構造が本明細書に記載される。したがって、一態様では、例えば、細胞中の標的ポリヌクレオチドの改変のための、ｓｇＲＮＡであって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドの領域に対応するガイド配列を含むガイドセグメントと、
（ｂ）ガイド配列の３’に位置する第１のヘアピン形成セグメントであって、第１のヘアピン形成セグメントが、ステム部分およびループ部分を含むヘアピンを形成することができ、ステム部分が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終結シグナルに対応する配列を含まない、第１のヘアピン形成セグメントと
を含む、ｓｇＲＮＡが本明細書に記載される。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩは、典型的には５〜６のヌクレオチドの長さの、ポリ（Ｔ）ストレッチを末端に持つ。標的上のポリ（Ｔ）ストレッチはｓｇＲＮＡ中のポリ（Ｕ）に対応する。そのため一実施形態では、ステム部分は４つより多くの連続するウラシルヌクレオチド（Ｕ）を含まず、さらなる実施形態では、ステム部分は３つより多くの連続するＵを含まない。
【００１９】
一実施形態では、細胞は、真核細胞、さらなる実施形態では、哺乳動物細胞、さらなる実施形態では、ヒト細胞である。さらなる実施形態では、細胞は、真菌（例えば、酵母）、植物または動物細胞である。
【００２０】
ホスホジエステル骨格が自身に戻るようにフォールディングして二重らせんトラクト（ステム）を形成し、対形成していないヌクレオチドを残して一本鎖「ループ」領域を形成する場合にヘアピン（またはステムループ）が形成される。
【００２１】
ステムは、第１および第２のステム部分（例えば、直立方向に示されたヘアピンを考慮した場合の下および上ステム部分）にさらに分割することができる。
【００２２】
第１のヘアピンは、任意選択的に、第１および第２のステム部分を分離するバルジ部分を含んでもよい。２つの二重らせんトラクトが、１つまたはより多くの対形成していないヌクレオチドに起因して、１つまたは両方の鎖において分離されている場合に、バルジおよび内部ループが形成（for）される。
【００２３】
一実施形態では、そのようなｓｇＲＮＡは、ヘアピン配置を取った場合に、任意選択的なバルジおよびリンカーを示して以下のように図式的に示すことができる。
【化１】
2021522825.tif 000003
【００２４】
直鎖状配置の同じｓｇＲＮＡは以下のように表される：
【化２】
2021522825.tif 000004
【００２５】
上記の図式において、（ａ）および（ｂ）は、単一の鎖が自身に戻るようにフォールディングして二本鎖ハイブリッドまたはデュプレックス構造を作製する場合に作製されるステム部分の２つの鎖を表す。そのため、（ａ）および（ｂ）部分は、ステム部分の形成を可能とするために互いに少なくとも部分的に相補的である。
【００２６】
一実施形態では、ｓｇＲＮＡの予測される二次構造が図１ｂに示され、「ガイド」はガイドセグメントに対応し、「下」および「上」ステムはそれぞれ第１および第２のステム部分に対応し、「ＧＵＡＣ」ループはループ部分に対応し、バルジも示している。実施形態では、図１ｂにおいて「ステムループ１」および「ステムループ２」として示されるように、さらなる二次構造が下流（第１のヘアピン形成セグメントに対して３’）に形成されてもよい。
【００２７】
実施形態では、ループ部分は、３〜６のヌクレオチド、さらなる実施形態では、３〜５のヌクレオチド、さらなる実施形態では、４のヌクレオチドの配列を含むまたはからなる。
【００２８】
実施形態では、そのようなループはヌクレオチド配列Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４を含みまたはからなり、Ｎ１、Ｎ２、およびＮ３はそれぞれ独立してＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、かつ、Ｎ４はＣまたはＧである。さらなる実施形態では、Ｎ１、Ｎ３、およびＮ４はそれぞれ独立してＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり、かつ、Ｎ２はＵ、ＧまたはＡである。さらなる実施形態では、Ｎ１はＧである。さらなる実施形態では、Ｎ２はＵである。さらなる実施形態では、Ｎ３はＡである。さらなる実施形態では、Ｎ４はＣである。一実施形態では、そのようなループは配列ＧＵＡＣを含むまたはからなる。
【００２９】
実施形態では、第２のステム部分は４のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる。一実施形態では、第１のステム部分に対して遠位の、第２のステム部分のハイブリッドの第４の対はＧ−Ｃ対である。さらなる実施形態では、第２のステム部分のハイブリッドは、配列５’−ＣＡＧＡ−３’にハイブリダイズした配列５’−ＵＣＵＧ−３’を含むまたはからなる。
【００３０】
一実施形態では、第１のステム部分は少なくとも５のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる。さらなる実施形態では、第１のステム部分は１２以下のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる。さらなる実施形態では、第１のステム部分は、６〜１０、７〜９、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のヌクレオチド対のハイブリッドを含むまたはからなる。一実施形態では、第１のステム部分のハイブリッドは、配列５’−ＵＡＣＡＡＡＧＡ−３’にハイブリダイズした配列５’−ＵＣＵＵＵＧＵＡ−３’を含むまたはからなる。一実施形態では、第１のステム部分のハイブリッドは、配列５’−ＵＡＣＡＡＡＧＡＵ−３’にハイブリダイズした配列５’−ＧＵＣＵＵＵＧＵＡ−３’を含むまたはからなる。
【００３１】
一実施形態では、第１のステム部分はミスマッチを含まない。一実施形態では、第１のステム部分は、１つまたはより多くのミスマッチ、さらなる実施形態では、１〜２つのミスマッチ、さらなる実施形態では、単一のミスマッチを含む。
【００３２】
上述のように、実施形態では、ｓｇＲＮＡは、第１のヘアピン形成セグメントの３’に位置する１つまたはより多くの追加のヘアピン形成セグメントをさらに含む。実施形態では、ｓｇＲＮＡは、第１のヘアピン形成セグメントと追加のヘアピン形成セグメントとの間、および／または追加のヘアピン形成セグメントの間に位置する１つまたはより多くのリンカーセグメントをさらに含む。
【００３３】
本明細書に記載のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸もまた本明細書に記載される。
【００３４】
本明細書に記載の核酸を含むベクターもまた本明細書に記載される。一実施形態では、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。代替的な構成では、一方はｓｇＲＮＡの発現用および他方はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの発現用の２つのベクターが使用されてもよいが、ｓｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの両方の発現用の単一のベクターが、特にｉｎ  ｖｉｖｏ応用のために、好ましい。
【００３５】
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは非病原性細菌に由来する。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、さらなる実施形態では、非病原性細菌からのＣａｓ９ヌクレアーゼである。さらなる実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼはストレプトコッカス・サーモフィルスＣａｓ９ヌクレアーゼである。さらなる実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼはストレプトコッカス・サーモフィルスＩＩ−Ａ型ＣＲＩＳＰＲ１−Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）である。Ｓｔ１Ｃａｓ９の特有の機能的なＰＡＭ配列（ＮＮＡＧＡＡおよびＮＮＧＧＡＡ）は、ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集ツールの標的化柔軟性およびコンビナトリアル可能性を増加させる。
【００３６】
１つの供給源からのｇＲＮＡ結合およびヌクレアーゼドメインを別の供給源からのＰＡＭ相互作用ドメインと組み合わせた操作されたハイブリッドＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼもまた本明細書に記載される。この戦略は、例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのＰＡＭ特異性の改変を可能とする。
【００３７】
したがって、一態様では、第１のドメインおよび第１のドメインのＣ末側にある第２のドメインを含む単離されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドであって、第１のドメインがガイドＲＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含み、かつ、第２のドメインがＷＥＤドメインおよびＰＡＭ相互作用ドメインを含む、単離されたポリペプチドがさらに提供される。
【００３８】
実施形態では、第１および第２のドメインは異なる供給源に由来し、すなわち、それらは天然には同じＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ中に一緒に存在しない。一実施形態では、第１および第２のドメインは、異なる細菌株から、さらなる実施形態では、異なる細菌種から、さらなる実施形態では、同じ細菌種の異なる株からのものである。一実施形態では、第１および第２のドメインは、ストレプトコッカス・サーモフィルスの異なる株に由来する。
【００３９】
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して標的核酸中のシチジン（Ｃ）をチミジン（Ｔ）に改変することにより、または標的配列中のアデノシン（Ａ）を、グアニン（Ｇ）として読まれるイノシン（Ｉ）に改変することにより塩基編集アプローチにおいて使用されてもよい。そのようなアプローチでは、ｓｇＲＮＡは、シチジンデアミナーゼ酵素と融合したＣａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）と組み合わせて設計および使用されてもよい。標的核酸中のＣをＴ）へ、またはＩ（Ｇとして読まれる）に改変するため。そのため、実施形態では、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼまたはポリペプチドは、シチジンデアミナーゼドメインまたはアデノシンデアミナーゼドメインをさらに含んでもよい。一実施形態では、シチジンデアミナーゼはＡＰＯＢＥＣシチジンデアミナーゼ（例えば、配列番号５０のアミノ酸配列、またはその機能的断片、またはその機能的バリアントを含む）である。さらに、増進されたＣからＴへの塩基編集は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）を共発現することにより達成されてもよい。そのため、一実施形態では、本明細書に記載の実施形態のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼまたはポリペプチドは、ＵＧＩドメイン（例えば、配列番号５１のアミノ酸配列、またはその機能的断片、またはその機能的バリアントを含む）と組み合わせてまたはそれに融合させて使用されてもよい。
【００４０】
実施形態では、操作されたハイブリッドＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９、ＬＭＧ１８３１１、ＣＮＲＺ１０６６またはＴＨ１４７７からのｇＲＮＡ結合およびヌクレアーゼドメインを含んでもよい。さらなる実施形態では、操作されたハイブリッドＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９、ＬＭＧ１８３１１、ＣＮＲＺ１０６６またはＴＨ１４７７からのＰＡＭ相互作用ドメインを含んでもよい。実施形態では、操作されたハイブリッドＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、
・ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９からのｇＲＮＡ結合およびヌクレアーゼドメインならびにストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＧ１８３１１、ＣＮＲＺ１０６６またはＴＨ１４７７に由来するＰＡＭ相互作用ドメイン
・ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＧ１８３１１からのｇＲＮＡ結合およびヌクレアーゼドメインならびにストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９、ＣＮＲＺ１０６６またはＴＨ１４７７に由来するＰＡＭ相互作用ドメイン
・ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＮＲＺ１０６６からのｇＲＮＡ結合およびヌクレアーゼドメインならびにストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＧ１８３１１、ＬＭＤ−９またはＴＨ１４７７に由来するＰＡＭ相互作用ドメイン
・ストレプトコッカス・サーモフィルスＴＨ１４７７からのｇＲＮＡ結合およびヌクレアーゼドメインならびにストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＧ１８３１１、ＣＮＲＺ１０６６またはＬＭＤ−９に由来するＰＡＭ相互作用ドメイン
を含んでもよい。
【００４１】
実施形態では、ｇＲＮＡ結合およびヌクレアーゼドメインを含むドメインは、配列番号２６４、２６５、２６６、もしくは２６７のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む。実施形態では、ｇＲＮＡ結合およびヌクレアーゼドメインを含むドメインは、配列番号２６４、２６５、２６６、および２６７の機能的バリアントの実施形態である、配列番号２６４、２６５、２６６、または２６７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％または９８％同一のアミノ酸配列を含む。実施形態では、ＰＡＭ相互作用ドメインを含むドメインは、配列番号２６０、２６１、２６２、もしくは２６３のアミノ酸配列、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアントを含む。実施形態では、ＰＡＭ相互作用ドメインを含むドメインは、配列番号２６０、２６１、２６２、および２６３の機能的バリアントの実施形態である、配列番号２６０、２６１、２６２、または２６３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％または９８％同一のアミノ酸配列を含む。
【００４２】
実施形態では、１つまたはより多くのリンカー領域（例えば、１つまたはより多くのアミノ酸）が、本明細書に記載の任意のドメインを接続するために使用されてもよい。
【００４３】
１つの供給源からのｇＲＮＡ結合およびヌクレアーゼドメインを別の供給源からのＰＡＭ相互作用ドメインと組み合わせた操作されたハイブリッドＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼもまた本明細書に記載される。この戦略は、例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのＰＡＭ特異性の改変を可能とする。そのため、操作されたポリペプチドは、ｇＲＮＡ結合およびヌクレアーゼドメインが由来するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが結合するＰＡＭとは異なるＰＡＭに結合することができるものであってもよい。実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列ＮＮＡＧＡＡ、ＮＮＧＧＡＡ、ＮＮＡＣＡＡ、ＮＮＧＣＡＡ、ＮＮＧＡＡＡまたはＮＮＡＡＡＡを含むＰＡＭに結合する。
【００４４】
実施形態では、ＰＡＭ相互作用ドメインを含むドメインはＬＭＤ−９（例えば、配列番号２６０、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアント）に由来し、かつＮＮＡＧＡＡおよびＮＮＧＧＡＡ  ＰＡＭに特異的である。実施形態では、ＰＡＭ相互作用ドメインを含むドメインはＣＮＲＺ１０６６（例えば、配列番号２６２、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアント）に由来し、ＮＮＡＣＡＡ  ＰＡＭに特異的である。実施形態では、ＰＡＭ相互作用ドメインを含むドメインはＬＭＧ１８３１１（例えば、配列番号２６１、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアント）に由来し、ＮＮＧＣＡＡ  ＰＡＭに特異的である。実施形態では、ＰＡＭ相互作用ドメインを含むドメインはＴＨ１４７７（例えば、配列番号２６３、またはそのいずれかの機能的断片、またはそのいずれかの機能的バリアント）に由来し、ＮＮＧＡＡＡ  ＰＡＭに特異的である。
【００４５】
実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（本明細書に記載のＣａｓまたは他のヌクレアーゼ／ニッカーゼ組換えタンパク質）は、好ましくは、タンパク質を細胞核に標的化するための少なくとも１つの核局在シグナル（ＮＬＳ）を含み、かつ、ベクターは、１つまたはより多くのＮＬＳをコードする１つまたはより多くのヌクレオチド配列をさらに含む。したがって、本明細書において使用される場合、「核局在シグナル」または「ＮＬＳ」という表現は、核輸送による細胞核へのインポートのためにタンパク質を「タグ化」するアミノ酸配列を指す。典型的には、このシグナルは、タンパク質表面に露出される正に荷電したリジンまたはアルギニンの１つまたはより多くの短鎖配列からなる。異なる核局在化タンパク質は同じＮＬＳを共有してもよい。ＮＬＳは、核の外にタンパク質を標的化する核外輸送シグナルの反対の機能を有する。古典的なＮＬＳは、単節型または双節型のいずれかとしてさらに分類することができる。発見された最初のＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原中の配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２９）であった（単節型ＮＬＳ）。ヌクレオプラスミンのＮＬＳ、ＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫ（配列番号６１）は遍在的な双節型シグナルのプロトタイプであり、塩基性アミノ酸の２つのクラスターが約１０アミノ酸のスペーサーにより分離されている。本明細書において例示されるＣａｓ９タンパク質は、１つまたはより多くの、好ましくは２つの、ＮＬＳ配列を含むＣａｓ９ヌクレアーゼである。
【００４６】
「非古典的」として適格の多くの他の種類のＮＬＳがあり、これは例えば、ｈｎＲＮＰ  Ａ１の酸性Ｍ９ドメイン、酵母転写リプレッサーＭａｔα２中の配列ＫＩＰＩＫ、Ｕ  ｓｎＲＮＰの複合体シグナルの他に、ＰＹ−ＮＬＳとして公知の最近同定されたクラスのＮＬＳである。そのため、目的のタンパク質を標的細胞の核に標的化する限り、任意の種類のＮＬＳ（古典的または非古典的）を本開示にしたがって使用することができる。一実施形態では、ＮＬＳはシミアンウイルス４０ラージＴ抗原に由来する。一実施形態では、本開示の組換えタンパク質のＮＬＳは以下のアミノ酸配列：ＳＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳ（配列番号６２）を含むまたはからなる。一実施形態では、ＮＬＳは配列ＫＫＫＲＫＶ（配列番号６３）を含むまたはからなる。一実施形態では、ＮＬＳは配列ＳＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６４）を含むまたはからなる。別の実施形態では、ＮＬＳは配列ＫＫＫＲＫ（配列番号６５）を含むまたはからなる。別の実施形態では、ＮＬＳは配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２９）を含むまたはからなる。
【００４７】
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはそのアミノ末端における第１のＮＬＳおよびそのカルボキシ末端における第２のＮＬＳを含み、かつ、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に隣接するＮＬＳをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００４８】
実施形態では、ベクターは、ｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列および／またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した１つもしくはより多くのプロモーターをさらに含む。一実施形態では、ｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列およびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の両方は単一のプロモーターに作動可能に連結している。さらなる実施形態では、ｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は第１のプロモーターに作動可能に連結しており、かつ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は第２のプロモーターに作動可能に連結しており、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは同じまたは異なっていてもよい。２つのプロモーターが使用される場合、（ｉ）第１のプロモーターおよびｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列ならびに（ｉｉ）第２のプロモーターおよびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、ベクター内で同じ方向にあってもよく、さらなる実施形態では、それらはベクター内で反対の方向にあってもよい。
【００４９】
一実施形態では、ベクターはウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【００５０】
本明細書に記載の核酸またはベクターを含む宿主細胞もまた本明細書に記載される。
【００５１】
本明細書に記載のｓｇＲＮＡ、核酸、ベクター、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよび／または宿主細胞を含む組成物もまた本明細書に記載され、これは、任意選択的に、生物学的または薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。
【００５２】
本明細書に記載のｓｇＲＮＡ、核酸、ベクター、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、宿主細胞、および／または組成物を含む、システムまたは組合せもまた、本明細書に記載される。
【００５３】
細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法であって、細胞を、本明細書に記載のｓｇＲＮＡ、核酸、ベクター、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、宿主細胞、組成物および／またはシステムもしくは組合せと接触させることを含む方法もまた本明細書に記載される。
【００５４】
一実施形態では、方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法である。さらなる実施形態では、方法はｉｎ  ｖｉｖｏの方法であり、かつ、細胞は対象中にある。一実施形態では、方法は、対象において免疫応答を結果として実質的にもたらさない。
【００５５】
細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変するための、または細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変するための組成物もしくは医薬の調製のための、ｓｇＲＮＡ、核酸、ベクター、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、宿主細胞、組成物および／またはシステムもしくは組合せの使用もまた本明細書に記載される。一実施形態では、細胞は対象中にあり、かつ、使用は、対象において免疫応答を結果として実質的にもたらさない。
【００５６】
本明細書に記載の方法、使用および製品は、疾患または病態と関連付けられる標的核酸において改変をもたらすために使用されてもよく、したがって、病態の予防または治療のための方法、使用および製品もまた本明細書において提供される。
【００５７】
したがって、それを必要とする対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を治療する方法であって、対象に有効量の本明細書に記載のｓｇＲＮＡ、核酸、ベクター、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、宿主細胞、組成物および／またはシステムもしくは組合せを投与することを含む、方法もまた本明細書に記載される。一実施形態では、方法は、対象において免疫応答を結果として実質的にもたらさない。
【００５８】
対象における標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態の予防もしくは治療において使用するための、または対象において標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態を予防もしくは治療するための医薬の調製のための、本明細書に記載のｓｇＲＮＡ、核酸、ベクター、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、宿主細胞、組成物および／またはシステムもしくは組合せの使用もまた本明細書に記載される。一実施形態では、使用は、対象において免疫応答を結果として実質的にもたらさない。
【００５９】
医薬として使用するための、例えば、本明細書に記載の病態の予防または治療において使用するための、本明細書に記載のｓｇＲＮＡ、核酸、ベクター、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、宿主細胞、組成物および／またはシステムもしくは組合せもまた本明細書に記載される。
【００６０】
実施形態では、病態は代謝性の病態、例えば、アミノ酸代謝に影響する病態（例えば、チロシン代謝、例えば、チロシン血症）である。一実施形態では、病態は肝臓の病態である。
【００６１】
「有効量」としては、「治療有効量」および「予防有効量」が挙げられる。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために必要な投与量および時間的期間での効果的な量を指す。「予防有効量」は、所望の予防結果、例えば、疾患または病態の開始または進行の速度の予防または阻害を達成するために必要な投与量および時間的期間での効果的な量を指す。予防有効量は、治療有効量について上記されるように決定され得る。
【００６２】
本明細書において使用される場合、「対象」または「患者」という用語は交換可能に使用され、ヒトおよび非ヒト霊長動物を含む哺乳動物などの任意の動物を意味するために使用される。一実施形態では、上記の対象は哺乳動物である。さらなる実施形態では、上記の対象はヒトである。
【００６３】
定義
本出願における用語の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義を提供する。
【００６４】
本明細書に開示される主題を記載する文脈（特に、以後の特許請求の範囲の文脈）における「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語ならびに類似した参照語の使用は、本明細書において他に指し示されず、文脈に明確に矛盾しなければ、単数および複数の両方をカバーすると解釈されるべきである。
【００６５】
特許請求の範囲および／または本明細書において「含む」という用語と組み合わせて使用される場合の「ａ」または「ａｎ」という語の使用は「１つ」を意味し得るが、それはまた、「１つまたはより多く」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは１つより多く」の意味と合致する。同様に、「別の」という語は、少なくとも第２またはさらなるものを意味し得る。
【００６６】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、「含む」（comprising）（ならびに「含む」（comprise）および「含む」（comprises）などの含む（comprising）の任意の形態）、「有する」（having）（ならびに「有する」（have）および「有する」（has）などの有する（having）の任意の形態）、「含む」（including）（ならびに「含む」（includes）および「含む」（include）などの含む（including）の任意の形態）または「含有する」（containing）（ならびに「含有する」（contains）および「含有する」（contain）などの含有する（containing）の任意の形態）という語は、包含的またはオープンエンドであり、追加の記載されていない要素または方法ステップを除外せず、「含むがそれに限定されない」という語句と交換可能に使用される。
【００６７】
本明細書における値の範囲の記載は、本明細書において他に指し示されなければ、その範囲に入る各別々の値を個々に参照する簡略化された方法として働くことが単に意図され、各別々の値は、それが本明細書において個々に記載されたかのように本明細書に組み込まれる。範囲内の値の全てのサブセットもまた、それらが本明細書において個々に記載されたかのように本明細書に組み込まれる。例えば、本明細書における数値範囲の記載について、同じ精度でのそれらの間の各介在する値が明示的に想定される。例えば、１８〜２０の範囲について、１８、１９および２０という数が明示的に想定され、６．０〜７．０という範囲について、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０という数が明示的に想定される。
【００６８】
本明細書に記載の全ての方法は、本明細書において他に指し示されず、文脈に他に明確に矛盾しなければ、任意の好適な順序で行われ得る。さらに、実施形態では、様々なステップは、例えば回収および精製を増加させるために、繰り返されてもよい。
【００６９】
本明細書において提供される任意および全ての例、または例示的な表現（例えば、「など」）の使用は、本開示をより良好に説明することを単に意図し、他に主張されなければ、本開示の範囲に対して限定を課さない。
【００７０】
本明細書に開示される実施形態および特徴の任意および全ての組合せおよび部分的組合せが本開示に包含される。
【００７１】
本明細書において他に定義されなければ、本開示との関連で使用される科学技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有する。例えば、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションとの関連で使用される任意の学術用語、およびその技術は、当該技術分野において周知かつ一般的に使用されるものである。用語の意味および範囲は明確なはずであるが、何らかの潜在的な曖昧性がある場合、本明細書において提供される定義が任意の辞典または外因性の定義に対して優先される。さらに、文脈により他に必要とされなければ、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数を含む。
【００７２】
本明細書に開示される方法の実施の他に、製品および組成物の調製および使用は、他に指し示されなければ、当該技術分野の技術的範囲内にあるような、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算機化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびに関連分野における従来技術を用いる。これらの技術は文献において充分に説明されている。例えば、Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989およびThird edition, 2001；Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987および定期的な改訂版；シリーズMETHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego；Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998；METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P. M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999；ならびにMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P. B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999を参照。
【００７３】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は交換可能に使用され、直鎖状または環状配座の、および一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であるとして解釈されるべきではない。該用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログの他に、塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されたヌクレオチドを包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対形成特異性を有し、すなわち、ＡのアナログはＴと塩基対形成する。
【００７４】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。該用語はまた、１つまたはより多くのアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログまたは修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーに適用される。
【００７５】
本明細書において使用される場合、ポリペプチドの文脈における「非保存的突然変異」または「非保存的置換」という用語は、アミノ酸を、異なる生化学的特性（すなわち、電荷、疎水性および／またはサイズ）を有する異なるアミノ酸に変化させるポリペプチドにおける突然変異を指す。アミノ酸を分類する多くのやり方があるが、それらは、多くの場合に、そのＲ基の構造および一般的な化学的特徴に基づいて６つの主な群に選別される。（ｉ）脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）；（ｉｉ）ヒドロキシルまたは硫黄／セレニウム含有（極性アミノ酸としても公知）（セリン、システイン、セレノシステイン、スレオニン、メチオニン）；（ｉｉｉ）環状（プロリン）；（ｉｖ）芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；（ｖ）塩基性（ヒスチジン、リジン、アルギニン）および（ｖｉ）酸性およびそのアミド（アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン）。そのため、非保存的置換としては、１つの群のアミノ酸を別の群の別のアミノ酸と変更するものが挙げられる（例えば、脂肪族アミノ酸を塩基性、環状、芳香族または極性アミノ酸に；塩基性アミノ酸を酸性アミノ酸に、負荷電アミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸）を正荷電アミノ酸（リジン、アルギニンまたはヒスチジン）に、など。
【００７６】
反対に、ポリペプチドの文脈における「保存的置換」または「保存的突然変異」は、アミノ酸を、類似した生化学的特性（例えば、電荷、疎水性およびサイズ）を有する異なるアミノ酸に変化させる突然変異である。例えば、ロイシンおよびイソロイシンは共に、脂肪族の分岐した疎水性物質である。同様に、アスパラギン酸およびグルタミン酸は共に、小さい、負に荷電した残基である。したがって、ロイシンのイソロイシンへの変更（もしくはその逆）またはアスパラギン酸のグルタミン酸への変更（もしくはその逆）は保存的置換の例である。
【００７７】
「コード配列」または「コードする核酸」（encoding nucleic acid）は、本明細書において使用される場合、タンパク質またはｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、調節エレメントに作動可能に連結した開始および終結シグナルをさらに含むことができ、調節エレメントとしては、核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞中での発現を指令することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルが挙げられる。コード配列は、例えば、真核、哺乳動物および／またはヒト細胞において使用するために、コドン最適化されていてもよい。
【００７８】
実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞中でのポリヌクレオチドの発現のために好適な形態で本開示のポリヌクレオチドを含むことができ、これは、組換え発現ベクターは、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結した、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択される、１つまたはより多くの調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結した」は、（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳システム中またはベクターが宿主細胞に導入される場合に宿主細胞中での）ヌクレオチド配列の発現を可能とする方式で目的のヌクレオチド配列が調節配列に連結されていることを意味することが意図される。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)において記載されている。調節配列としては、多くの種類の宿主細胞中でのヌクレオチド配列の構成的な発現を指令するものおよびある特定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指令するもの（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどの要因に依存し得ることが当業者により理解される。本開示の発現ベクターは、宿主細胞に導入されることにより、本明細書に記載されるようなポリヌクレオチドによりコードされるｓｇＲＮＡ、タンパク質またはペプチドを産生し得る。
【００７９】
「相補体」または「相補的」は、本明細書において使用される場合、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの間のワトソン−クリック（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはフーグスティーン塩基対形成を指す。「相補性」は、２つの核酸配列が互いに逆平行にアライメントされた場合に、各位置におけるヌクレオチド塩基が相補的となるような、これらの配列の間で共有される特性を指す。
【００８０】
配列類似性
「相同性」および「相同」は、２つのペプチドまたは２つの核酸分子の間の配列類似性を指す。相同性は、アライメントされる配列中の各位置を比較することにより決定され得る。核酸間またはアミノ酸配列間の相同性の程度は、配列により共有される位置における同一のまたはマッチするヌクレオチドまたはアミノ酸の数の関数である。当該用語が本明細書において使用される場合、２つの配列が実質的に同一であり、かつ、配列の機能的活性が保存されている場合に、核酸配列は別の配列と「実質的に相同」である（本明細書において使用される場合、「相同」という用語は、進化的関連性を暗示せず、むしろ実質的な配列同一性を指し、そのため「同一性」／「同一」という用語と交換可能である）。２つの核酸配列は、最適にアライメント（ギャップが許容される）された場合に、少なくとも約５０％の配列類似性もしくは同一性を共有する場合に、または、配列が、定義される機能的なモチーフを共有する場合に、実質的に同一であると考えられる。代替的な実施形態では、最適にアライメントされた実質的に同一の配列における配列類似性は、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％であってもよい。簡潔性のために、単位（例えば、６６、６７・・・８１、８２、・・・９１、９２％・・・）は体系的に記載されていないが、それにもかかわらず、本開示の範囲内であると考えられる。
【００８１】
実質的に相補的な核酸は、１つの分子の相補体が他の分子と実質的に同一である核酸である。２つの核酸またはタンパク質配列は、最適にアライメントされた場合に少なくとも約７０％の配列同一性を共有する場合に、実質的に同一であると考えられる。代替的な実施形態では、配列同一性は、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であってもよい。同一性の比較のための配列の最適アライメントは、様々なアルゴリズム、例えば、Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math 2: 482の局所相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443の相同性アライメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（Pearson and Lipman 1988）の類似検索法、ならびにこれらのアルゴリズムのコンピューターによる実施態様（例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、米国、ウィスコンシン州、マディソン）を使用して実行されてもよい。配列同一性はまた、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年（Altschul et al. 1990）に記載のＢＬＡＳＴアルゴリズム（報告されたデフォルトの設定を使用）を使用して決定されてもよい。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、（インターネットを通じてhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/において）Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて利用可能であり得る。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアライメントされた場合にマッチするまたは何らかの正値閾値スコアＴを満たすクエリ配列中の長さＷの短いワードを同定することにより高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定することを伴う。Ｔは隣接ワードスコア閾値と称される。初期の隣接ワードヒットは、より長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加できる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。各方向におけるワードヒットの拡張は、以下のパラメーターが満たされた場合に停止される：累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ離れる；１つもしくはより多くの負スコア残基アライメントの蓄積に起因して累積スコアが０もしくはそれ未満となる；またはいずれかの配列の最後に達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用する２つの配列間の統計的類似性の１つの尺度は最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のマッチが偶然に起こる確率の指標を提供する。本開示の代替的な実施形態では、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、試験配列の比較における最小和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満の場合に、実質的に同一であると考えられる。
【００８２】
２つの核酸配列が実質的に相補的であることの代替的な指標は、２つの配列が、中程度にストリンジェントな、または好ましくはストリンジェントな、条件下で互いにハイブリダイズすることである。中ストリンジェント条件下でのフィルター結合配列へのハイブリダイゼーションは、例えば、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡ（６５℃）中で行われてもよく、４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ中での洗浄が為されてもよい（Ausubel 2010）。代替的に、ストリンジェント条件下でのフィルター結合配列へのハイブリダイゼーションは、例えば、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ（６５℃）中で行われてもよく、６８℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ中での洗浄が為されてもよい（Ausubel 2010）。ハイブリダイゼーション条件は、目的の配列に依存して公知の方法にしたがって改変されてもよい（Tijssen 1993）。概しては、ストリンジェント条件は、定義されたイオン強度およびｐＨにおいて特定の配列についての熱的融点より約５℃低くなるように選択される。
【００８３】
「結合」は、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間またはｓｇＲＮＡと標的ポリヌクレオチドとの間またはｓｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１）との間の配列特異的な非共有結合性相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の全ての成分が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基との接触）。「親和性」は結合の強度を指し、結合親和性の増加はより低いＫｄと相関する。
【００８４】
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合できるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それは自身に結合する（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）ことができかつ／または１つもしくはより多くの異なるタンパク質の１つもしくはより多くの分子に結合することができる。結合タンパク質は、１つより多くの種類の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。
【００８５】
本明細書において使用される場合、「ヌクレアーゼベースの改変」は、ポリヌクレオチド（例えば、内因性遺伝子座またはゲノム配列）中の改変であって、（非相同的末端結合）ＮＨＥＪまたは相同組換え（ＨＤＲ）を伴う細胞による修復機構を最終的に誘発する切断（例えば、ポリヌクレオチド中の二本鎖切断）の導入を伴うものを指す。ヌクレアーゼベースの改変は、目的のポリヌクレオチド（すなわち、内因性遺伝子座またはゲノム配列）を標的化する部位特異的ヌクレアーゼにより為される。（操作された）部位特異的ヌクレアーゼは周知であり、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、Ｍｅｇａ−Ｔａｌ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮなどが挙げられる（但し、それに限定されない）。
【００８６】
「組換え」は、２つのポリヌクレオチドの間の遺伝情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え」（ＨＲ）は、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）機構を介する細胞中での二本鎖切断の修復の間に起こるような特殊な形態の交換を指す。このプロセスはヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の修復用の鋳型として「ドナー」または「パッチ」分子を使用し、「非クロスオーバー遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々に公知であり、その理由は、それはドナーから標的への遺伝情報の移動に繋がるからである。いずれの特定の理論にも縛られることを望まないが、そのような移動は、壊れた標的とドナーとの間に形成されるヘテロデュプレックスＤＮＡのミスマッチ訂正、ならびに／または、標的の部分となる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存的鎖アニーリング」、ならびに／または関連するプロセスを伴い得る。そのような特殊なＨＲは、多くの場合に、ドナーポリヌクレオチドの配列の部分または全てが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるような標的分子の配列の変化を結果としてもたらす。
【００８７】
本明細書に記載の方法において、１つまたはより多くの標的化された（部位特異的な）ヌクレアーゼ（例えば、ｓｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ）は、標的配列（例えば、細胞クロマチン）中の予め決定された部位において二本鎖切断を作製する。切断の領域中のヌクレオチド配列に対して相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドが所望の場合に細胞に導入されてもよい。二本鎖切断の存在は、ドナー配列の組込みを促進することが示されている。ドナー配列は物理的に組み込まれてもよく、または代替的に、ドナーポリヌクレオチドは、相同組換えを介する切断の修復用の鋳型として使用されて、細胞クロマチンへのドナー中にあるようなヌクレオチド配列の全てまたは部分の導入を結果としてもたらす。そのため、細胞クロマチン中の第１の配列を変化させることができ、ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド中に存在する配列に変換することができる。そのため、「置換する」または「置換」という用語の使用は、１つのヌクレオチド配列の別のヌクレオチド配列による置換（すなわち、情報的な意味での配列の置換）を表すと理解することができ、１つのポリヌクレオチドの別のポリヌクレオチドによる物理的または化学的置換を必ずしも必要としない。本明細書に記載の任意の方法において、追加のｓｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ペアジンクフィンガー、メガヌクレアーゼ、Ｍｅｇａ−Ｔａｌ、および／または追加のＴＡＬＥＮタンパク質は、細胞内の追加の標的部位の追加の二本鎖切断のために使用され得る。
【００８８】
本明細書において使用される場合、「ドナー」または「パッチ」核酸という用語は交換可能に使用され、細胞の内因性の標的化された遺伝子の断片（一部の実施形態では、標的化された遺伝子の全体）を含むが、特定のヌクレオチドにおいて所望の改変を含む、核酸を指す。ドナー（パッチ）核酸は、標的化された遺伝子との相同組換えを可能とするために充分なサイズおよび類似性（例えば、右および左相同アームにおいて）のものでなければならない。好ましくは、ドナー／パッチ核酸は、内因性の標的化されたポリヌクレオチド遺伝子配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％同一である（または５’末端および３’末端においてそのような配列により隣接されている）。パッチ核酸は、例えば、ｓｓＯＤＮとして、ＰＣＲ生成物（アンプリコン）としてまたはベクター内に提供されてもよい。好ましくは、パッチ／ドナー核酸は、ｉ）細胞のゲノムに組み込まれるとｓｇＲＮＡにより切断されることを不可能にしかつ／または相同組換えによるパッチ核酸の導入の検出を促進する、内因性遺伝子に対する改変を含む。
【００８９】
本明細書において使用される場合、「標的化された遺伝子」、「目的の遺伝子」または「標的化されたポリヌクレオチド」は、パッチ核酸の導入により改変される細胞内のポリヌクレオチドに対応する。それは、細胞内に天然に存在する内因性遺伝子に対応する。標的化された遺伝子は、パッチ／ドナー核酸の導入により訂正され得る（例えば、ＷＴ遺伝子に対応するように、または疾患もしくは病態を発生する増加したリスクともはや関連付けられない形態に改変される）疾患または障害を発生するリスクと関連付けられる１つまたはより多くの突然変異を含んでもよい。標的化された遺伝子の一方または両方のアレルは、本開示にしたがって細胞内で訂正または改変されてもよい。標的遺伝子の例は表３〜６に記載される。
【００９０】
「標的ポリヌクレオチド」は、本明細書において使用される場合、細胞のゲノム中に存在し、既知の遺伝子産物をコードするまたはコードしない任意の内因性のポリヌクレオチドまたは核酸を指す。「標的遺伝子」は、本明細書において使用される場合、細胞のゲノム中に存在し、既知または推定上の遺伝子産物をコードする任意の内因性のポリヌクレオチドまたは核酸を指す。標的遺伝子または標的ポリヌクレオチドは、本開示のヌクレアーゼにより単独でまたは１つもしくはより多くのドナー核酸もしくはパッチ核酸の導入と組み合わせて改変される細胞内のポリヌクレオチドにさらに対応する。標的遺伝子または標的ポリヌクレオチドは、遺伝病に関与する突然変異した遺伝子であってもよい。
【００９１】
「プロモーター」は、本明細書において使用される場合、細胞中での核酸の発現を付与、モジュレートまたは制御（例えば、活性化、増進および／もしくは抑制）することができる合成のまたは天然に由来する核酸分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに増進もしくは抑止するためならびに／またはその空間的発現および／もしくは時間的発現を変化させるための１つまたはより多くの特定の転写調節配列を含んでもよい。プロモーターはまた、遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含んでもよく、これは転写の開始部位から数千塩基対もの離れた位置にあってもよい。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む供給源に由来してもよい。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織もしくは臓器に関して、または発現が起こる発生ステージに関して、または生理学的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外的刺激に応答して、構成的または差次的に遺伝子成分の発現を調節してもよい。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、Ｕ６プロモーター、肝臓特異的プロモーター（例えば、ＬＰ１ｂ；ヒトアポリポタンパク質Ｅ／Ｃ−Ｉ遺伝子座制御領域（ＡｐｏＥ−ＨＣＲ）とＳＶ４０イントロンに連結された改変型ヒトα１アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）との組合せ）、ヒトチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＢＨプロモーター、ＵｂｉＣプロモーター、Ｅｆ１ａプロモーター、Ｈ１プロモーター、および７ＳＫプロモーターが挙げられ、これらのいずれも、細胞中で１つまたはより多くのｓｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを発現するために使用され得る。ＬＰ１ｂおよびＴＢＧプロモーターの配列は表８に提供される。
【００９２】
「ベクター」は、本明細書において使用される場合、複製起点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であってもよい。ベクターはＤＮＡまたはＲＮＡベクターであってもよい。ベクターは、自己複製性の染色体外ベクターであってもよく、好ましくはＤＮＡプラスミドである。例えば、ベクターは、本開示のｓｇＲＮＡ、ドナー（もしくはパッチ）核酸、および／またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９もしくはＣｐｆ１）をコードする核酸配列を含んでもよい。１つまたはより多くのｓｇＲＮＡを発現するためのベクターは、ｓｇＲＮＡの「ＤＮＡ」配列を含む。
【００９３】
本開示のｓｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードする核酸は、ウイルスベクターなどの１つまたはより多くの様々なベクターを使用して細胞に送達されてもよい。したがって、好ましくは、上記のベクターは、標的細胞中に本開示のｇＲＮＡおよび／またはヌクレアーゼを導入するためのウイルスベクターである。ウイルスベクターの非限定的な例としては、当該技術分野において周知のように、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスが挙げられる。
【００９４】
本明細書において交換可能に使用される「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、ヒトおよび一部の他の霊長動物種に感染するパルボウイルス（Parvoviridae）科のディペンドウイルス（Dependovirus）属に属する小さいウイルスを指す。ＡＡＶは、疾患を引き起こすことは現在知られておらず、結果的にウイルスは非常に穏やかな免疫応答を引き起こす。
【００９５】
実施形態では、ＡＡＶベクターは、好ましくは、１つまたはより多くの細胞種を標的化する。したがって、ＡＡＶベクターは、増進した心臓、骨格筋、ニューロン、肝臓、および／または膵臓組織（ランゲルハンス細胞）トロピズムを有してもよい。ＡＡＶベクターは、哺乳動物の細胞中に本開示の少なくとも１つのｇＲＮＡおよびヌクレアーゼを送達して発現させることができるものであってもよい。例えば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−ＳＡＳＴＧベクターであってもよい（Piacentino et al. (2012) Human Gene Therapy 23:635-646）。ＡＡＶベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏでｇＲＮＡおよびヌクレアーゼをニューロン、骨格筋および心筋、ならびに／または膵臓（ランゲルハンス細胞）に送達してもよい。ＡＡＶベクターは、いくつかのキャプシド種の１つまたはより多くに基づいてもよく、該キャプシド種としては、ＡＡＶｌ、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が挙げられる。ＡＡＶベクターは、全身送達および局所送達により骨格筋または心筋に効率的に形質導入を行うＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５およびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧベクターなどの代替的な筋肉トロピズムＡＡＶキャプシドを有するＡＡＶ２シュードタイプに基づいてもよい。一実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ−ＤＪである。一実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ−ＤＪ８ベクターである。一実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ２−ＤＪ８ベクターである。一実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂベクターである。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ−９またはＡＡＶ−ＤＪ８である（ＰＨＰ．Ｂ：ＰＭＩＤ：２６８２９３２０、ＰＭＩＤ：２７８６７３４８；ＡＡＶ  ＤＪ−８：www.cellbiolabs.com/news/aav-helper-free-expression-systems-aav-dj-aav-dj8、http://www.cellbiolabs.com/aav-expression-and-packaging; www.cellbiolabs.com/scaav-dj8-helper-free-complete-expression-systems；およびＡＡＶ９：ＰＭＩＤ：２７６３７３９０、ＰＭＩＤ：１６７１３３６０）。
【００９６】
さらに別の態様では、本開示は、上記の核酸および／またはベクターを含む細胞（例えば、宿主細胞）を提供する。実施形態では、宿主細胞は、原核性（例えば、細菌）または真核性（例えば、真菌（酵母）、哺乳動物、マウス、ヒト）であってもよい。本開示は、例えば、当該技術分野において周知の培養培地、製造、単離および精製方法を使用する、組換えタンパク質の発現／製造のための、上記のものなどの組換え発現系、ベクターおよび宿主細胞をさらに提供する。
【００９７】
別の態様では、本開示は、上記のｇＲＮＡ、および／またはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）、またはそれをコードする核酸またはそのような核酸を含むベクター、または上記の宿主細胞を含む、組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。一実施形態では、組成物は、１つまたはより多くの生物学的または薬学的に許容される担体、賦形剤、および／または希釈剤をさらに含む。
【００９８】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される」（または「生物学的に許容される」）担体、賦形剤、および／または希釈剤としては、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などであって、生理学的に適合性であり、かつ薬学的にまたは生物学的システムにおいて使用され得るものが挙げられる。そのような材料は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの毒性のまたは有害な生物学的効果の非存在（またはそれが限定されていること）により特徴付けられる。それは、妥当な医学的判断の範囲内で、合理的なベネフィット／リスク比に見合う、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症なしで対象（例えば、ヒト、動物）の生体液および／または組織および／または臓器と接触させて使用するために好適な化合物、組成物、および／または投与形態を指す。
【００９９】
賦形剤が希釈剤として働く場合、それは、活性成分用のビヒクル、担体または媒体として作用する固体、半固体、または液体材料であり得る。そのため、組成物は、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル、懸濁液、エマルション、溶液、シロップ、エアロゾル（固体としてまたは液体媒体中）、例えば１０重量％までの活性化合物を含有する軟膏、軟質および硬質ゼラチンカプセル、坐剤、無菌の注射可能な溶液、ならびに無菌の包装された粉末の形態であり得る（Remington: The Science and Practice of Pharmacy by Alfonso R. Gennaro, 2003, 21th edition, Mack Publishing Companyを参照）。実施形態では、担体は、神経内、非経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、舌下または経口投与のために好適であってもよい。
【０１００】
好適な賦形剤の一部の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、レシチン、ホスファチジルコリン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップおよびメチルセルロースが挙げられる。配合物は、潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油；湿潤剤；乳化剤および懸濁化剤；保存剤、例えば、メチルおよびプロピルヒドロキシベンゾエート；甘味剤；ならびに香味剤を追加的に含み得る。本開示の組成物は、当該技術分野において公知の手順を用いることによる患者への投与後に活性成分の迅速な持続放出または遅延放出を提供するように配合され得る。
【０１０１】
本開示において使用するために好適な医薬組成物としては、意図する目的（例えば、疾患または病態の予防、治療、寛解および／または阻害）を達成するための有効量で活性成分が含有された組成物が挙げられる。効果的な用量の決定は、充分に当業者の能力の範囲内である。任意の化合物について、治療的に効果的な用量は、最初に、細胞培養アッセイ（例えば、細胞株）または動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌもしくはブタのいずれかにおいて推定され得る。動物モデルはまた、投与の適切な濃度範囲および経路を決定するために使用されてもよい。そのような情報は次に、ヒトにおける投与のために有用な用量および経路を決定するために使用され得る。効果的な用量または量は、特定の疾患または病態を治療するために充分な１つまたはより多くの活性成分の量を指す。治療効果および毒性は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療的に効果的な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）により決定されてもよい。治療効果と毒性効果との用量比は治療指数であり、それは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現され得る。大きい治療指数を呈する医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒト使用のための投与量の範囲の定式化において使用される。そのような組成物中に含有される投与量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を有しないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、用いられる投与形態、患者の感受性、および投与の経路に依存してこの範囲内で変動する。正確な投与量は、治療を必要とする対象に関する要因に照らして、施術者により決定される。投与量および投与は、充分なレベルの活性部分を提供するためまたは所望の効果を維持するために調整される。考慮され得る要因としては、疾患状態の重篤度、対象の全般的健康状態、対象の年齢、体重、および性別、食事、投与の時間および頻度、薬物の組合せ、反応感受性、ならびに療法への忍容性／応答が挙げられる。特定の投与量および送達の方法に関するガイダンスは文献中に提供され、一般に当業者に利用可能である。実施形態では、約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重（一実施形態では、１日当たり）の活性成分の投与量が使用されてもよい。さらなる実施形態では、約０．５〜約７５ｍｇ／ｋｇ体重の投与量が使用されてもよい。さらなる実施形態では、約１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量が使用されてもよい。さらなる実施形態では、約１０〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、さらなる実施形態では、約１０、約２５または約５０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量が使用されてもよい。
【０１０２】
本開示は、上記のｓｇＲＮＡ、ヌクレアーゼ、ベクター、細胞、システム、組合せまたは組成物の少なくとも１つがその中に配された少なくとも１つの容器手段を含むキットまたはパッケージをさらに提供する。一実施形態では、キットまたはパッケージは、細胞中のヌクレオチド配列の改変用、または標的ポリヌクレオチドと関連付けられる病態の治療用などの使用のための説明書をさらに含む。
【０１０３】
ＣＲＩＳＰＲシステム
ＣＲＩＳＰＲ技術は、例えば、核酸配列の改変のための、ゲノム編集用のシステムであり、特定の遺伝子の発現を改変する例のためにも使用されることがある。
【０１０４】
このシステムは、侵入性ウイルスおよびプラスミドＤＮＡ中に存在する相補的配列を分解するためにｃｒＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を使用する、clustered regularly interspaced short palindromic repeats（ＣＲＩＳＰＲ）システムと称される適応免役防御を発達させた細菌および古細菌における発見に基づく。元々のＣＲＩＳＰＲシステムは、ハイブリッド（ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９をガイドする）を形成するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含んでいた。
【０１０５】
操作されたＣＲＩＳＰＲシステムは、例えば、一般にＲＮａｓｅ  ＩＩＩおよびｃｒＲＮＡプロセシングの必要性を取り除くｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ融合物に対応する、合成的に再構成された「ガイドＲＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」）を使用する。ｓｇＲＮＡは、「ｓｇＲＮＡガイド配列」または「ｓｇＲＮＡ標的配列」、および標的化された遺伝子へのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）の結合のために必要なＲＮＡ配列（Ｃａｓ認識配列）」を含む。ｓｇＲＮＡガイド配列は、特異性を付与する配列である。それは、標的配列の反対鎖とハイブリダイズする（すなわち、相補的である）（すなわち、それはＤＮＡ標的配列のＲＮＡ配列に対応する）。異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを使用する他のＣＲＩＳＰＲシステムが開発されており、当該技術分野において公知である（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの代わりにＣｐｆ１ヌクレアーゼを使用する）。
【０１０６】
ｓｇＲＮＡと組み合わせた元々のＣａｓ９ヌクレアーゼはオフターゲット突然変異誘発を生じさせることがあるので、ＤＮＡの両方の鎖を切断するためにＣａｓ９ニッカーゼと組み合わせてまたはｄＣａｓ９−ＦｏｌｋＩヌクレアーゼと組み合わせて特異的に設計されたｓｇＲＮＡのペアを本開示にしたがって代替的に使用してもよい。
【０１０７】
実施形態では、細胞中の標的核酸の改変において使用するためのＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼベースの操作されたシステムが本明細書において提供される。ＤＳＢの導入は特定の遺伝子をノックアウトすることまたは相同組換え修復（ＨＤＲ）によりそれを改変することを可能とすることができ、後者の場合、ＨＤＲにより改変を導入するために所望の改変を含む１つまたはより多くのドナーまたはパッチ核酸が提供される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導性のＤＮＡ切断、続いて非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復は、タンパク質コーディング遺伝子中に機能欠失型アレルを生成するためまたは非常に大きいＤＮＡ断片を欠失させるために使用されてきた（文献２０、２１）。本開示のＣＲＩＳＰＲベースの操作されたシステムは、（ｉ）目的の遺伝子を標的化および切断して遺伝子バリアントを生成する（例えば、インデルとも称される、挿入および／または欠失を作製する）ために設計される。
【０１０８】
したがって、一態様では、本開示は、目的の標的遺伝子中にＤＳＢ（またはニッカーゼの場合は２つの一本鎖切断（ＳＳＢ））を誘導するための１つまたはより多くのｓｇＲＮＡの設計および調製を伴う。実施形態では、本開示はまた、標的細胞のゲノム内の異なる遺伝子座に位置する標的ポリヌクレオチド中にＤＳＢ（またはニッカーゼの場合は２つのＳＳＢ）を誘導するための１つまたはより多くのｓｇＲＮＡの設計および調製を伴う。ｓｇＲＮＡおよびヌクレアーゼは次に、１つまたはより多くの標的細胞のゲノム内にＮＨＥＪまたはＨＤＲにより所望の改変（すなわち、遺伝子編集事象）を導入するために一緒に使用される。所望の改変が特定の点突然変異または挿入／欠失を含む場合、ＨＤＲにより改変を導入するために所望の改変を含む１つまたはより多くのドナーまたはパッチ核酸が提供される。
【０１０９】
ｓｇＲＮＡ
特定の部位においてＤＮＡを切断するために、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ｓｇＲＮＡおよび標的化された遺伝子上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在を必要とする。ＰＡＭは、標的化されたポリヌクレオチド遺伝子配列中のｓｇＲＮＡ標的配列に直ちに後続する（すなわち、隣接する）。ＰＡＭは、（使用されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに依存して）ｓｇＲＮＡ標的配列の３’末端または５’末端に位置するが、ｓｇＲＮＡガイド配列に含まれない。例えば、Ｃａｓ９  ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのためのＰＡＭは、標的遺伝子上のｓｇＲＮＡ標的配列の３’末端に位置し、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼのためのＰＡＭは、標的遺伝子上のｓｇＲＮＡ標的配列の５’末端に位置する。異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはまた、異なるＰＡＭを必要とする。したがって、特定のポリヌクレオチドのｓｇＲＮＡ標的配列の選択は、概しては、使用されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに基づく。ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲシステムのためのＰＡＭは５’−ＮＲＧ−３’（ＲはＡまたはＧのいずれかである）であり、ヒト細胞においてこのシステムの特異性を特徴付ける。Ｓ．アウレウス（S. aureus）Ｃａｓ９のＰＡＭはＮＮＧＲＲである。Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）ＩＩ型システムは天然に「ＮＧＧ」配列（「Ｎ」は任意のヌクレオチドであり得る）の使用を好むが、操作されたシステムにおいて「ＮＡＧ」などの他のＰＡＭ配列も許容する。同様に、ナイセリア・メニンギチジスに由来するＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９）は、通常、ＮＮＮＮＧＡＴＴの天然のＰＡＭを有するが、高度に縮重したＮＮＮＮＧＮＮＮ  ＰＡＭを含む様々なＰＡＭにわたり活性を有する。ＡｓＣｐｆ１またはＬｂＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのためのＰＡＭはＴＴＴＮである。一実施形態では、本開示にしたがって使用されるＣａｓ９タンパク質のためのＰＡＭはＮＧＧトリヌクレオチド配列（Ｃａｓ９）である。別の実施形態では、本開示にしたがって使用されるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのためのＰＡＭはＴＴＴＮヌクレオチド配列である。好ましい実施形態では、Ｓｔ１Ｃａｓ９が使用されてもよく、これはＰＡＭ配列ＮＮＡＧＡＡおよびＮＮＧＧＡＡに対応する。実施形態では、異なるＳｔ１Ｃａｓ９  ＰＡＭ配列が使用されてもよく、例えば、株ＣＮＲＺ１０６６およびＬＭＧ１３８１１からのＳｔ１Ｃａｓ９のための推測されるコンセンサスＰＡＭ配列はそれぞれＮＮＡＣＡＡ（Ｗ）およびＮＮＧＣＡＡ（Ａ）である（文献２４、２６）。以下の表１は、各々のＰＡＭ配列と共にＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼシステムの非限定的な例のリストを提供する。
【０１１０】
【表１】
2021522825.tif 000005
【０１１１】
本明細書において使用される場合、「ｓｇＲＮＡ」という表現は、ＤＮＡに切断を導入するためにＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと組み合わさって機能するガイドＲＮＡを指す。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡガイド配列および「ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列」を含む。
【０１１２】
本明細書において使用される場合、「ｓｇＲＮＡガイド配列」という表現は、「ｓｇＲＮＡ標的配列」の対応するＲＮＡ配列を指す。したがって、それは、標的ポリヌクレオチド遺伝子配列上のプロトスペーサーと同等のＲＮＡ配列である。それは、ゲノムＤＮＡ中の対応するＰＡＭ配列を含まない。それは、標的特異性を付与する配列である。ｓｇＲＮＡガイド配列は、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１）に結合するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列に連結している。ｓｇＲＮＡガイド配列は、標的化された目的の遺伝子を認識してそれに結合する。それは、ＰＡＭを含む標的遺伝子配列の反対鎖とハイブリダイズする（すなわち、相補的である）（すなわち、それは、ＰＡＭと反対のＤＮＡ鎖とハイブリダイズする）。上述のように、「ＰＡＭ」は、標的配列または標的ポリヌクレオチドに直ちに後続する（連続する）がｓｇＲＮＡ中にはない核酸配列である。
【０１１３】
「ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列」は、本明細書において使用される場合、標的遺伝子上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの結合および／または活性（活性化を含む）のために必要とされる１つまたはより多くのＲＮＡ配列（またはＲＮＡモチーフ）を広く指す。一部のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、機能するために他のものより長いＲＮＡ配列を必要とする。また、一部のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは機能するために複数のＲＮＡ配列（モチーフ）を必要とするが、他のものは単一の短いＲＮＡ配列／モチーフのみを必要とする。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、機能するためにｃｒＲＮＡ配列に加えてｔｒａｃｒＲＮＡ配列を必要とするが、Ｃｐｆ１はｃｒＲＮＡ配列のみを必要とする。そのため、干渉を媒介するためにｃｒＲＮＡ配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列の両方（またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方の融合物）を必要とするＣａｓ９とは異なり、Ｃｐｆ１はｔｒａｃｒＲＮＡとは独立してｃｒＲＮＡアレイをプロセシングし、Ｃｐｆ１−ｃｒＲＮＡ複合体は、いかなる追加のＲＮＡ種も必要とせずに単独で標的ＤＮＡ分子を切断する（Zetsche et al., PMID: 26422227を参照）。
【０１１４】
本明細書に記載のｓｇＲＮＡに含まれる「ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列」はそのため、使用される特定のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに基づいて選択される。それは、選択されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの結合および／または活性のために必要であることが既知の直接反復配列および任意の他のＲＮＡ配列を含む。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの適切な機能を可能とするためにＲＮＡガイド配列に融合され得る様々なＲＮＡ配列（本明細書においてＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列と称される）は当該技術分野において周知であり、本開示にしたがって使用され得る。「ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列」はそのため、ｃｒＲＮＡ配列（例えば、ＡｓＣｐｆ１活性のための、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣ  ＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号３８）など）のみを含んでもよく、または追加の配列（例えば、Ｃａｓ９活性のために必要なｔｒａｃｒＲＮＡ配列）を含んでもよい。さらには、本開示にしたがって、当該技術分野において公知のように、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの結合および活性のために必要なＲＮＡモチーフは、別々に提供されてもよい（例えば、（ｉ）１つのＲＮＡ分子中のＲＮＡガイド配列−ｃｒＲＮＡ  ＣＲＩＳＰＲ認識配列（ｃｒＲＮＡとしても公知）および（ｉｉ）別の、別々のＲＮＡ分子上のｔｒａｃｒＲＮＡ  ＣＲＩＳＰＲ認識配列。代替的に、全ての必要なＲＮＡ配列（モチーフ）は、単一のＲＮＡガイド中に融合して一緒になっていてもよい。ＣＲＩＳＰＲ認識配列は、好ましくは、（使用されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに依存して３’（例えば、Ｃａｓ９）または５’（Ｃｐｆ１）において）ｓｇＲＮＡガイド配列に直接的に融合しているが、２つのＲＮＡモチーフを分離するスペーサー配列を含んでもよい。実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列は、少なくとも６５のヌクレオチドを有するＣａｓ９認識配列である。実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列は、少なくとも８５のヌクレオチドを有するＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列である。実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列は、約１９のヌクレオチドを有するＣｐｆ１認識配列（５’直接反復）である。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列はＳｔ１Ｃａｓ９認識配列である。本開示のｓｇＲＮＡは、選択されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの適切な機能（例えば、目的の遺伝子および／または標的ポリヌクレオチド配列へのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質の結合）を可能とする限り、上記の配列の任意のバリアントを含んでもよい。
【０１１５】
一緒になって、ＲＮＡガイド配列およびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ認識配列は、本開示のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに標的化特異性およびスキャフォールディング／結合能力の両方を提供する。本開示のｓｇＲＮＡは天然に存在せず、すなわち、天然に存在しない核酸である。
【０１１６】
本開示のｓｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲシステムの文脈における「標的領域」、「標的配列」または「プロトスペーサー」は本明細書において交換可能に使用され、ＰＡＭなしで、ＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼベースのシステムにより標的化される標的遺伝子の領域を指す。それは、ゲノムＤＮＡ中のＰＡＭに先行する（すなわち、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに依存してＰＡＭの５’または３’）ヌクレオチドに対応する配列を指す。それは、ｓｇＲＮＡ発現構築物（例えば、ベクター／プラスミド／ＡＡＶ）に含められる配列である。ＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼベースのシステムは、少なくとも１つ（すなわち、１つまたはより多く）のｓｇＲＮＡを含んでもよく、各ｓｇＲＮＡは標的遺伝子上の異なるＤＮＡ配列を標的化する。標的ＤＮＡ配列は重なり合っていてもよい。標的配列またはプロトスペーサーは、プロトスペーサーの（使用されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに依存して３’または５’）末端においてＰＡＭ配列により後続または先行される。概しては、標的配列はＰＡＭ配列に直ちに隣接する（すなわち、連続する）（それは、ＳｐＣａｓ９様ヌクレアーゼについてＰＡＭの５’末端、Ｃｐｆ１様ヌクレアーゼについて３’末端に位置する）。
【０１１７】
実施形態では、本開示のｓｇＲＮＡは、「ｓｇＲＮＡガイド配列」を含み、またはＰＡＭ配列により後続もしくは先行される（ＰＡＭに隣接する）目的の遺伝子もしくは標的ポリヌクレオチド配列上の標的配列に対応する「ｓｇＲＮＡ標的配列」を有する。ｓｇＲＮＡは、そのポリヌクレオチド配列の５’末端において「Ｇ」を含んでもよい。５’中の「Ｇ」の存在は、ｓｇＲＮＡがＵ６プロモーターの制御下で発現される場合に好ましい（Taeyoung KooJungjoon Lee and Jin-Soo Kim Mol Cells. 2015 Jun 30; 38(6): 475-481）。本開示のＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼシステムは、様々な長さのｓｇＲＮＡを使用してもよい。ｓｇＲＮＡは、目的の遺伝子または標的ポリヌクレオチドの標的配列の少なくとも１０、少なくとも１２ｎｔ、少なくとも１３ｎｔ、少なくとも１４ｎｔ、少なくとも１５ｎｔ、少なくとも１６ｎｔ、少なくとも１７ｎｔ、少なくとも１８ｎｔ、少なくとも１９ｎｔ、少なくとも２０ｎｔ、少なくとも２１ｎｔ、少なくとも２２ｎｔ、少なくとも２３ｎｔ、少なくとも２４ｎｔ、少なくとも２５ｎｔ、少なくとも３０ｎｔ、または少なくとも３５ｎｔのｓｇＲＮＡガイド配列を含んでもよい（そのような標的配列は、目的の遺伝子または標的ポリヌクレオチド中でＰＡＭにより後続または先行されているが、ｓｇＲＮＡの部分ではない）。ｓｇＲＮＡの長さは、使用される特定のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに基づいて選択される。実施形態では、「ｓｇＲＮＡガイド配列」または「ｓｇＲＮＡ標的配列」は、少なくとも１７のヌクレオチド（１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３）の長さ、好ましくは１７〜３０ｎｔの長さ、より好ましくは１７〜２２のヌクレオチドの長さであってもよい。実施形態では、ｓｇＲＮＡガイド配列は、１０〜４０、１０〜３０、１２〜３０、１５〜３０、１８〜３０、または１０〜２２のヌクレオチドの長さである。実施形態では、ＰＡＭ配列は「ＮＧＧ」であり、「Ｎ」は任意のヌクレオチドであり得る。実施形態では、ＰＡＭ配列は「ＴＴＴＮ」であり、「Ｎ」は任意のヌクレオチドであり得る。ｓｇＲＮＡは、ＰＡＭ（例えば、ＮＧＧ／ＴＴＴＮまたは反対鎖に位置するＰＡＭについてＣＣＮ／ＮＡＡＡ）配列に直ちに隣接する（５’または３’において連続して接続する）標的遺伝子の任意の領域を標的化してもよい。実施形態では、本開示のｓｇＲＮＡは、エクソン中に位置する標的配列を有する（ｓｇＲＮＡガイド配列は、エクソン中に位置する標的（ＤＮＡ）配列のＲＮＡ配列からなる）。実施形態では、本開示のｓｇＲＮＡは、イントロン中に位置する標的配列を有する（ｓｇＲＮＡガイド配列は、イントロン中に位置する標的（ＤＮＡ）配列のＲＮＡ配列からなる）。実施形態では、ｓｇＲＮＡは、目的の遺伝子または標的ポリヌクレオチド中のＰＡＭにより後続（または使用されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに依存して先行）される任意の領域（配列）を標的化してもよい。
【０１１８】
ｓｇＲＮＡガイド配列と標的化された遺伝子上のＤＮＡ配列との完璧なマッチが好ましいが、標的化された遺伝子上のｓｇＲＮＡ標的ポリヌクレオチド配列の相補鎖とのｓｇＲＮＡのハイブリダイゼーションを依然として可能とする限り（as along as）、ｓｇＲＮＡガイド配列と目的の遺伝子配列上の標的配列とのミスマッチもまた許容される。ｓｇＲＮＡ標的配列の対応する部分に完璧にマッチするｓｇＲＮＡ中の８〜１２の連続するヌクレオチドのシード配列は、標的配列の適切な認識のために好ましい。ガイド配列の残りの部分は、１つまたはより多くのミスマッチを含んでもよい。一般に、ｓｇＲＮＡ活性はミスマッチの数と逆相関する。好ましくは、本開示のｓｇＲＮＡは、対応するｓｇＲＮＡ標的遺伝子配列（より少ないＰＡＭ）と７つのミスマッチ、６つのミスマッチ、５つのミスマッチ、４つのミスマッチ、３つのミスマッチ、より好ましくは２つのミスマッチ、またはそれ未満を含み、よりいっそう好ましくは、ミスマッチを含まない。好ましくは、ｓｇＲＮＡ核酸配列は、目的の遺伝子中のｓｇＲＮＡ標的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％同一である。当然、ｓｇＲＮＡガイド配列中のヌクレオチドの数が少なくなればなる程、許容されるミスマッチの数はより少なくなる。結合親和性は、マッチするｓｇＲＮＡ−ＤＮＡの組合せの和に依存すると考えられる。
【０１１９】
本開示の方法にしたがって標的細胞に投与されるまたは標的細胞中に発現されるｓｇＲＮＡの数は、少なくとも１個のｓｇＲＮＡ、少なくとも２個のｓｇＲＮＡ、少なくとも３個のｓｇＲＮＡ  少なくとも４個のｓｇＲＮＡ、少なくとも５個のｓｇＲＮＡ、少なくとも６個のｓｇＲＮＡ、少なくとも７個のｓｇＲＮＡ、少なくとも８個のｓｇＲＮＡ、少なくとも９個のｓｇＲＮＡ、少なくとも１０個のｓｇＲＮＡ、少なくとも１１個のｓｇＲＮＡ、少なくとも１２個のｓｇＲＮＡ、少なくとも１３個のｓｇＲＮＡ、少なくとも１４個のｓｇＲＮＡ、少なくとも１５個のｓｇＲＮＡ、少なくとも１６個のｓｇＲＮＡ、少なくとも１７個のｓｇＲＮＡ、または少なくとも１８個のｓｇＲＮＡであってもよい。細胞に投与されるまたは細胞中に発現されるｓｇＲＮＡの数は、少なくとも１個のｓｇＲＮＡ〜１５個のｓｇＲＮＡ、１個のｓｇＲＮＡ〜少なくとも１０個のｓｇＲＮＡ、１個のｓｇＲＮＡ〜８個のｓｇＲＮＡ、１個のｓｇＲＮＡ〜６個のｓｇＲＮＡ、１個のｓｇＲＮＡ〜４個のｓｇＲＮＡ、１個のｓｇＲＮＡ〜複数のｓｇＲＮＡ、２個のｓｇＲＮＡ〜５個のｓｇＲＮＡ、または２個のｓｇＲＮＡ〜３個のｓｇＲＮＡであってもよい。
【０１２０】
ｚＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ
ヒト細胞において高い効率で伸長した配列を認識して内因性遺伝子を編集できる組換えｄＣａｓ９−ＦｏＫＩ二量体ヌクレアーゼ（ＲＦＮ）が設計された。これらのヌクレアーゼは、酵素活性がないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質に融合した二量体化依存性の野生型ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを含む。融合タンパク質の二量体は、２つの半部位（それぞれは、ｄＣａｓ９（すなわち、ヌクレアーゼ活性を欠いたＣａｓ９ヌクレアーゼ）単量体ドメインに結合している）とそれらの間のスペーサー配列とから構成されて標的部位に結合した場合に配列特異的なＤＮＡ切断を媒介する。ｄＣａｓ９−ＦｏＫＩ二量体ヌクレアーゼは、効率的なゲノム編集活性のために二量体化を必要とするため、ＤＮＡに切断を導入するために２つのｓｇＲＮＡを使用する。
【０１２１】
本開示にしたがって使用されてもよい組換えＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ｉ）天然に存在するＣａｓに由来し、かつｉｉ）適切なｓｇＲＮＡの存在下にある場合に細胞ＤＮＡ中にＤＳＢ（またはニッカーゼの場合は２つのＳＳＢ）を導入するヌクレアーゼ（またはニッカーゼ）活性を有する。そのため、本明細書において使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ」という用語は、ヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を有しかつ目的の標的中にＤＳＢ（または１つもしくは２つのＳＳＢ）を導入するために本開示のｓｇＲＮＡと共に機能する天然に存在するＣａｓヌクレアーゼに由来する組換えタンパク質を指す。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはＳｔ１Ｃａｓ９である。さらなる実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはＳｐＣａｓ９またはＣｐｆ１である。別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９タンパク質である。本明細書において使用される場合、「Ｃａｓ９ニッカーゼ」という用語は、天然に存在するＣａｓ９に由来しかつＤＮＡに一本鎖切断（ＳＳＢ）を導入するように２つのヌクレアーゼドメインのうちの１つが不活性化された組換えタンパク質を指す。それはＲｕｖＣまたはＨＮＨドメインのいずれかであり得る。さらなる実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、二量体化依存性のＦｏｋＩヌクレアーゼドメインと融合したｄＣａｓ９タンパク質である。
【０１２２】
本開示にしたがって使用されてもよい例示的なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは上記の表１に提供される。
【０１２３】
Ｃａｓ９／ヌクレアーゼなどのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＰＡＭ配列の３〜４ｂｐ上流を切断する。他方でＣｐｆ１などのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは５’オーバーハングを生成する。切断は、標的化された（＋）鎖上でＰＡＭの１９ｂｐ後、反対鎖上で２３ｂｐ後に起こる（Zetsche et al., 2015, PMID 26422227）。野生型Ｃａｓ９を使用するとある程度のオフターゲットＤＳＢが起こり得る。オフターゲット効果の程度は多数の要因に依存し、該要因としては、どれほど近い相同性のオフターゲット部位がオンターゲット部位に対して比較されるか、特定の部位の配列、ならびにヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の濃度が挙げられる。これらの考慮は、ＰＡＭ配列がほぼ相同の標的部位に直ちに隣接する場合にのみ問題となる。追加のＰＡＭ配列の単なる存在はオフターゲットＤＳＢを生成するために充分なはずはなく、ＰＡＭにより後続または先行されるプロトスペーサーの大規模な相同性が必要である。
【０１２４】
コドンの縮重の最適化
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質は、通常は細菌中で発現されるタンパク質である（またはそれに由来する）ので、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ組換えタンパク質を設計および調製する場合に真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）中での最適な発現のために核酸配列を改変することが有利であり得る。同様に、標的ポリヌクレオチド中に特定の改変を導入するために使用される本開示のドナーまたはパッチ核酸は、（例えば、標的化された改変のより容易な検出を可能とするために新たな制限部位を導入するために）コドン縮重を使用してもよい。
【０１２５】
したがって、所与の核酸と同じまたはわずかに異なるアミノ酸配列をコードする核酸を製造するために、以下のコドンチャート（表２）が部位特異的突然変異誘発スキームにおいて使用されてもよい。
【０１２６】
【表２】
2021522825.tif 000006
【０１２７】
本発明を実施するための態様
以下の非限定的な例示により本開示をさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【０１２８】
材料および方法
細胞培養およびトランスフェクション
Ｋ５６２をＡＴＣＣ（ＣＣＬ−２４３）から得、１０％のＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシンおよびＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）を添加したＲＰＭＩ培地中で５％のＣＯ２下３７℃で維持した。Ｎｅｕｒｏ−２ａをＡＴＣＣから得、１０％のＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシンおよびＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）を添加したＤＭＥＭ培地中で５％のＣＯ２下３７℃で維持した。全ての細胞株をマイコプラズマ夾雑物の非存在について試験する。製造者の推奨にしたがってＡｍａｘａ  ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して細胞（２×１０５／トランスフェクション）にトランスフェクトを行った。ＡＡＶＳ１セーフハーバー遺伝子座からＳａＣａｓ９およびＳｔ１Ｃａｓ９を発現するＫ５６２細胞株を記載されたように生成した（文献３５、３６）。簡潔に述べれば、トランスフェクションの３日後に開始する０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加したメチルセルロースベースの半固体ＲＰＭＩ培地中での１０日間の同時の選択およびクローニングを行った。クローンを選び取り、９６ウェル中で３日間拡大増殖し、さらなる３日間のために１２ウェルプレートに移した後に細胞をウエスタンブロットのために回収した。
【０１２９】
ゲノム編集ベクター
この研究において生成したＣＲＩＳＰＲ１−ＳｔＣａｓ９  ＬＭＤ−９システムを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏゲノム編集用のベクターはＡｄｄｇｅｎｅから入手可能である（図１１）。ＣＲＩＳＰＯＲ（文献３９）ウェブツールを使用して、マウスおよびヒト標的に対するガイド（スペーサー）配列を設計した（表３〜６）。必要な場合、ヒトＵ６プロモーターの転写開始要件に起因して「Ｇ」をコードするようにスペーサー用のＤＮＡ配列を位置１において改変した。代替的に、天然に存在する「Ｇ」を捕捉するようにスペーサーの長さを増加させた。ＮおよびＣ末端においてＳＶ４０  ＮＬＳ配列に融合したＳ．サーモフィルスＣＲＩＳＰＲ１（Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９）用の哺乳動物発現ベクター（ＭＳＰ１５９４＿２ｘ＿ＮＬＳ；Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１１０６２５）をＭＳＰ１５９４（文献３４）（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃６５７７５）から構築した。Ｓ．サーモフィルスＣＲＩＳＰＲ１（Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９）（ｖ１）（Ｓｔ１Ｃａｓ９＿ＬＭＤ−９＿ｓｇＲＮＡ＿ｐＵＣ１９；Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１１０６２７）およびＳａＣａｓ９（文献７）用のＵ６駆動性ｓｇＲＮＡ発現プラスミドをｇＢｌｏｃｋｓ（商標）遺伝子断片（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として合成し、ｐＵＣ１９にクローニングした。ＢＰＫ２３０１（文献３４）（ｖ０）（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃６５７７８）を使用してＳｔ１Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡ構造を比較した。ＣＡＧプロモーター駆動性Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９およびそのＵ６駆動性ｓｇＲＮＡを含有する単一ベクター哺乳動物発現系（Ｕ６＿ｓｇＲＮＡ＿ＣＡＧ＿ｈＳｔ１Ｃａｓ９＿ＬＭＤ９；Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１１０６２６）を上記のプラスミドから構築した。肝臓特異的プロモーターを含有する単一ベクターｒＡＡＶ−Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９システム（表８）を上記の成分から、ＢｓｍＢＩ制限部位を除去するために骨格内に欠失を含有するｐＸ６０２（文献７）の誘導体（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃６１５９３）にアセンブルさせた。以前に記載（文献５３、５４）されたＡＡＶ発現カセットからのエレメントを組み合わせることによりＬＰ１ｂプロモーターを操作した。このベクター（ｖ３）のほとんどの活性版は構造ｐＡＡＶ＿ＬＰ１Ｂ＿Ｓｔ１Ｃａｓ９＿ＬＭＤ−９＿ＳｐＡ＿Ｕ６＿ｓｇＲＮＡ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１１０６２４）を有する。ｈＰＧＫ１プロモーターの制御下でＣ末端タグ化ＳａＣａｓ９およびＳｔ１Ｃａｓ９を構成的に発現するクローン性Ｋ５６２細胞株を確立するために、ｐＸ６０２からのＣａｓ９  ＯＲＦおよびＭＳＰ１５９４＿２ｘ＿ＮＬＳをＡＡＶＳ１＿Ｐｕｒｏ＿ＰＧＫ１＿３ｘＦＬＡＧ＿Ｔｗｉｎ＿Ｓｔｒｅｐ（文献３６）（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃６８３７５）にサブクローニングした。
【０１３０】
ＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼおよびＴＩＤＥアッセイ
製造者の推奨にしたがって２５０ｍｌのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて２．５Ｅ５の細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。表９に記載のプライマーを使用してＰＣＲにより様々な遺伝子座を増幅した。記載（文献３５、３７）されたようにＳｕｒｖｅｙｏｒ（商標）  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いてアッセイを行った。ＴＢＥ緩衝液中１０％のＰＡＧＥゲル上で試料を分離した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）  ＭＰ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）システムを使用してゲルをイメージングし、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ（商標）ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して定量化を行った。ｐ＜０．００１の分解用の有意カットオフ値を使用してＴＩＤＥ分析を行った（文献３８）。
【０１３１】
組換えアデノ随伴ウイルスの製造
本質的に記載（文献８１）されたようなトリプルプラスミドトランスフェクションにより組換えアデノ随伴ウイルスベクターの製造を行った。簡潔に述べれば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＨＥＫ２９３Ｔ１７細胞にヘルパープラスミドｐｘｘ−６８０、ｒｅｐ／ｃａｐハイブリッドプラスミドｐＡＡＶ２／８およびｒＡＡＶベクタープラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、培地をＦＢＳを含まない増殖培地で置き換え、２４時間後に細胞を回収した。凍結／解凍サイクルにより細胞抽出物からＡＡＶ粒子を抽出し、不連続のイオジキサノール勾配で精製した。ウイルスをＰＢＳ中の３２０ｍＭのＮａＣｌ＋１０％のソルビトール＋０．００２％のプルロニック酸に再懸濁し、アリコート化し、−８０℃で貯蔵した。記載（文献８２）されたようにＳＹＢＲ（商標）  ｇｒｅｅｎおよびＩＴＲプライマーを使用してｑＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ）によりＡＡＶを滴定した。トリス−グリシン−ＳＤＳ緩衝液中１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｓｔａｉｎ  ｆｒｅｅ  ｇｅｌ（Ｂｉｏｒａｄ）上で類似した体積のＡＡＶを分離することにより物理的力価および純度を確認した。ＡＡＶプラスミドのＢｓｓＨＩＩ消化後にＩＴＲ完全性を評価した。ＣＥＲＶＯ  ｂｒａｉｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｅｎｔｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  Ｌａｖａｌ）のｖｅｃｔｏｒ  ｃｏｒｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙによりｒＡＡＶ８を製造した。
【０１３２】
動物実験
Ｃ５７ＢＬ／６遺伝的背景のＦａｈ−／−マウス（文献８３）を集団飼育し、食物および水への自由なアクセスと共に標準的な食餌（Ｈａｒｌａｎ  ＃２０１８ＳＸ）を与えた。Ｆａｈ−／−マウスの飲用水に７．５ｍｇ（２−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルベンゾイル）−１，３−シクロヘキサンジオン）（ＮＴＢＣ）／Ｌを添加し、ｐＨを７．０に調整した。マウスを１２：１２ｈの暗−明サイクルに曝露し、２３±１℃の周囲温度下に保った。動物の世話および取扱いは、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓにしたがって行った。Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  Ｌａｖａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより手順は承認された。
【０１３３】
２日齢新生マウスの後眼窩洞（文献８４）の静脈内に総体積２０μＬのｒＡＡＶ８または生理食塩水の異なる用量を注射した。マウスを２１日齢時に離乳させ、ＮＴＢＣを７日後に除去した。体重および糖血症をＮＴＢＣ除去後１日毎にモニターした。マウスは糖血症の測定のために絶食させず、データ収集は午前９〜１０時に行った。予め決定された時点においてまたは体重減少が体重の２０％に達した時に麻酔下での心臓穿刺により動物を殺した。下流の適用のために肝臓をスナップ凍結させた。
【０１３４】
尿収集およびスクシニルアセトンの定量化
ＮＴＢＣ除去の１５日後に代謝ケージ（Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ）中で３〜４匹のマウスの群から尿を終夜収集した。尿を２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、アリコート化し、−８０ｏＣで凍結させた。以前に記載（文献８５）されたようにガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）を使用して高感度法により尿試料中のスクシニルアセトンを定量化した。Ｃｅｎｔｒｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ  ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｉｒｅ  ｄｅ  Ｓｈｅｒｂｒｏｏｋｅのｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより分析を行った。
【実施例２】
【０１３５】
ヒト細胞においてＳｔ１Ｃａｓ９によるロバストなＤＮＡ切断を指令するｓｇＲＮＡ構造の同定
Ｓ．サーモフィルスは２つまでのＩＩ−Ａ型システム（ＣＲＩＳＰＲ１およびＣＲＩＳＰＲ３）をコードする。Ｓ．サーモフィルスに感染したファージから単離されたＳｔ１Ｃａｓ９と多様なＡｃｒファミリーとの相互作用を特徴付けている間に（文献３２）、ヒト細胞において達成された実質的なレベルの編集に我々は驚いた。この観察は、このオルソログは軽度に活性であることを指し示した初期の報告（文献７、３３）と対照的である。
【０１３６】
本明細書に記載の研究において、様々な改変を行い、それらは活性を増加させることができることが見出された。第１に、Ｎ末端核局在シグナル（ＮＬＳ）をヒトコドン最適化発現構築物（文献３４）に付加し、ＡＡＶＳ１セーフハーバー遺伝子座からＳｔ１Ｃａｓ９（ＬＭＤ−９）を安定的に発現するＫ５６２細胞株を確立した（文献３５、３６）（図１ａおよび図５）。Ｓｔ１Ｃａｓ９（１１２１ａａ）は、ＳｐＣａｓ９およびＳａＣａｓ９とそれぞれ１７％および３７％の同一性を共有する。第２に、異種宿主大腸菌（Escherichia coli）中でのＳｔ１Ｃａｓ９活性をモニターするために使用されるｓｇＲＮＡ配列を採用した（文献３１）。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終結シグナルを妨害するために反復：逆反復領域の下ステム中に存在するウォブル塩基対をカノニカルなワトソン−クリック塩基対に置換した（図１ｂ）。次に、ＥＭＸ１、ＦＡＮＣＦ、およびＲＵＮＸ１を標的化することにより、このｓｇＲＮＡ構造（ｖ１）を、テトラループを介して接続された野生型全長ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡデュプレックスを含有するその対応物（ｖ０）と比較した（文献３４）（図１ｃおよび図５）。Ｓｔ１Ｃａｓ９発現細胞に増加性の量の各構築物をトランスフェクトし、Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイを使用して、ＮＨＥＪによる不正確なＤＳＢ修復に特徴的なインデルの頻度を決定した（文献３５、３７）（図１ｄ）。相補的ＴＩＤＥ（Tracking of Indels by DEcomposition）法（文献３８）を使用して標的化された突然変異のスペクトルおよび頻度もまた分析した（図１ｄおよび表３）。定量化方法にかかわらず、ｓｇＲＮＡ  ｖ１の力価は著しく優れていた。ゲノム編集実験のより典型的な設定で、Ｓｔ１Ｃａｓ９およびそのｓｇＲＮＡを一過的に共発現させた場合、活性の増加もまた観察された（図５）。この分析は、高い遺伝子破壊率がヒト細胞においてＳｔ１Ｃａｓ９を使用して標準的な条件下で得られ得ることを明らかにした。
【実施例３】
【０１３７】
マウス細胞におけるＳｔ１Ｃａｓ９による肝臓代謝に関与する標的遺伝子のロバストな編集
ＣＲＩＳＰＯＲ（文献３９）を使用して、破壊された場合に肝臓機能に影響する３つの遺伝子であるＰｃｋ１、Ｐｃｓｋ９、およびＨｐｄに対するｓｇＲＮＡを設計した。可能な場合、必須のタンパク質ドメインを標的化しかつ潜在的なオフターゲットをほとんど有しないことが予測されるガイドを選択した。Ｓｔ１Ｃａｓ９およびそのｓｇＲＮＡの両方を発現する単一のベクター構築物の一過性トランスフェクションは、１５の標的部位のうちの１４において強い切断活性（１８％〜＞５０％のインデル）を明らかにし、ｓｇＲＮＡ設計則（文献３３）に依拠しないにもかかわらずシステムのロバスト性を強調した（図２ａ〜ｃ）。注記として、このスクリーニングは、ヒトＨＰＤ中に見出される突然変異の近傍において標的化する高度に活性のｓｇＲＮＡを同定した（文献４０、４１）。チロシン異化経路における第２の酵素である４−ヒドロキシフェニル−ピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＤ）の欠損はチロシン血症ＩＩＩ型を引き起こす（Ｏｒｐｈａｎｅｔ  ＯＲＰＨＡ：６９７２３）（図３ａ）。この希少な疾患（頻度＜１／１，０００，０００）を引き起こす３つのミスセンス突然変異のみが公知であり、高い有効性でそれらの２つを標的化することができた（ＯＭＩＭ  ２７６７１０）（図３ｃおよび図６）。第３の突然変異の標的化は、ガイドの低い特異性スコアに起因して試みなかった。以上を合わせると、これらのデータは、Ｓｔ１Ｃａｓ９は、そのｓｇＲＮＡおよびその発現を駆動するために必要とされる調節エレメントと一緒に単一のｒＡＡＶ粒子にパッケージングできた場合にｉｎ  ｖｉｖｏゲノム編集を可能とする可能性を示唆する。
【実施例４】
【０１３８】
新生仔マウスにおけるオールインワンｒＡＡＶベクターを使用する強力なｉｎ  ｖｉｖｏゲノム編集
ホロＳｔ１Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡ）を肝臓に送達するために、元々のＳａＣａｓ９ベクター構造（文献７）をミラーリングすることによりＨｐｄエクソン１３を標的化する肝臓トロピックｒＡＡＶ血清型８（文献１１、１６〜１８）ベクター（別名ＡＡＶ８−Ｓｔ１Ｃａｓ９  Ｈｐｄ  Ｇ５）を生成した（図３ｃ）。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳｔ１Ｃａｓ９の切断活性を試験するために、生後２日目のマウスの後眼窩洞に増加性の量のベクターを注射し、注射後２８日目に全肝臓ＤＮＡを単離した（図３ｂ）。滴定は、編集の程度は実質的なものであり、ＡＡＶ８−Ｓｔ１Ｃａｓ９の用量に依存することを示した（図３ｄ）。
【０１３９】
ＡＡＶ８−Ｓｔ１Ｃａｓ９はｉｎ  ｖｉｖｏでの表現型訂正に繋がり得るかどうかを試験するために、チロシン異化経路の最後の酵素であるフマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ（ＦＡＨ）の欠損により引き起こされる常染色体劣性疾患である遺伝性チロシン血症Ｉ型（ＨＴ−Ｉ）（ＯＭＩＭ  ２７６７００）（Ｏｒｐｈａｎｅｔ  ＯＲＰＨＡ：８８２）のマウスモデルを使用した（図３ａ）。我々に特に関連することとして、ＨＴ−Ｉの発生率はケベック州（Ｃａｎａｄａ）の一地域において１／１８４６に達するが、世界中で約１／１００，０００人である（文献４９）。Ｆａｈ−／−突然変異体マウスは、経路（図３ａ）中の上流のＨｐｄを阻害する薬物であるニチシノン（nitisone）（ＮＴＢＣ）を用いて治療されなければ毒性代謝物の蓄積に起因して重篤な肝臓機能障害および腎損傷により新生仔で死亡する（図３ａ）（文献５０）。同様に、Ｈｐｄの遺伝子アブレーションは、肝臓損傷および致死性を予防する（文献５１、５２）。ＮＴＢＣを維持したＦａｈ−／−突然変異体仔に生後２日目にＡＡＶ８−Ｓｔ１Ｃａｓ９  Ｈｐｄ  Ｇ５を注射し、次に薬物を離乳直後に取り除いた（図３ｂ）。単回の新生仔注射を介する全身性送達は全てのマウスにおいて致死性をレスキューしたが、生理食塩水処置動物は、体重を損失して約３週後に死亡しなければならなかった（図３ｅ、ｆ）。同様に、治療群において糖血症は正常化された（図３ｇ）。顕著なことに、ＨＴ−Ｉの毒性代謝物および診断マーカーであるスクシニルアセトンの排出はｒＡＡＶの用量と逆相関し、代謝訂正を実証した（図３ｈ）。これらの観察は、ヒト患者においても見出される突然変異に対応する部位においてＨｐｄエクソン８を標的化した場合に再現された（図６）。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳｔ１Ｃａｓ９のｒＡＡＶ媒介性送達は、代謝経路を再配線することにより新生マウスにおいて表現型を訂正することができる。
【０１４０】
最後に、ｒＡＡＶのサイズを最小化させかつ全体的な活性に対するプロモーターの影響力を試験するために２つの追加のベクター構造を評価した（図４）。ヒトアポリポタンパク質Ｅ／Ｃ−Ｉ遺伝子座制御領域（ＡｐｏＥ−ＨＣＲ）とＳＶ４０イントロンおよび合成ポリアデニル化エレメントに連結した改変されたヒトα１アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）とを組み合わせた操作された肝臓特異的プロモーター（ＬＰ１ｂ）を含有するｒＡＡＶベクター（ｖ３）は、ＴＢＧプロモーターと比較して有効性を大きく向上させた（図４ａ、ｂ）。これらの改変はまた、効率的なパッケージングのために最適な約４．７ｋｂのサイズのベクターの作製に繋がった。合わせると、これらのデータは、Ｓｔ１Ｃａｓ９はｉｎ  ｖｉｖｏゲノム編集のための効率的なツールであることを指し示す。
【０１４１】
Ｓｔ１Ｃａｓ９は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのロバストかつ効率的なゲノム編集のために活用され得ることが本明細書に示される。Ｃａｓ酵素の多様性の活用においてかなりの関心が持たれているが、ゲノム編集ツールとしての実行は簡単明瞭な方法ではない（文献７〜１０）。一部の酵素は単純に機能せず、一部はその基質を乱雑に選択して、徹底的な生化学的な特徴付けを必要とする（文献５８〜６４）。さらに、Ｓｔ１Ｃａｓ９およびＳａＣａｓ９のｓｇＲＮＡは機能的に交換可能でなく、これはそれらの特有のＰＡＭ特異性に起因するようである（図７）。
【０１４２】
ｒＡＡＶ媒介性ｉｎ  ｖｉｖｏゲノム編集のために使用されるＣａｓ９オルソログは、ＳｐＣａｓ９の比較的単純なＮＧＧよりも複雑なＰＡＭを必要とする。これは、アクセス可能な標的の範囲を制限するが、オフターゲット突然変異誘発の発生を低減することにより特異性を増加させる可能性がある。Ｓｔ１Ｃａｓ９（２つのａａによってのみ異なるＬＭＤ−９およびＤＧＣＣ７７１０株）のコンセンサスＰＡＭは、Ｎ１Ｎ２Ａ３Ｇ４Ａ５Ａ６（Ｗ７）として定義されているが、コンセンサスに密接に関係する配列は試験管中および細菌細胞中で機能的であり得る（文献２９、３４、７３〜７６）。ＡリッチＰＡＭの認識はゲノムのＡ／Ｔリッチ領域の標的化を容易にする可能性があるが、我々は、Ｓｔ１Ｃａｓ９は哺乳動物細胞中のＮＮＡＧＡＡおよびＮＮＧＧＡＡの両方のＰＡＭに標的化され得ることを見出した（図８）。注記として、ＰＡＭの位置７におけるＡの存在は高い活性と相関する（図８）。保存されていないリンカー（Ｎ１Ｎ２）の長さもまた柔軟であることが示されており、２〜３塩基の伸長が許容されることが示されているが（文献３１，７７）、ヒト細胞においてこの観察は再現されず、この文脈におけるシステムのより高いストリンジェンシーを示唆した（図８）。
【０１４３】
実施形態では、異なるＳｔ１Ｃａｓ９  ＰＡＭ配列が使用されてもよく、例えば、株ＣＮＲＺ１０６６およびＬＭＧ１３８１１からのＳｔ１Ｃａｓ９の推測されるコンセンサスＰＡＭ配列はそれぞれＮＮＡＣＡＡ（Ｗ）およびＮＮＧＣＡＡ（Ａ）である（文献２４、２６）。顕著なことに、大腸菌（E. coli）に移植されたまたは精製された成分から再構成されたＬＭＧ１３８１１  ＣＲＩＳＰＲ１システムは、ＮＮＧＣＡＡＡ  ＰＡＭを使用してＤＮＡを標的化することができる（文献７７）。タンパク質レベルにおいて、これらの３つのＳｔ１Ｃａｓ９バリアントの配列は主にＣ末端ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメイン内で多様化する（図９〜１０）。
【実施例５】
【０１４４】
変化したプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を有するＳｔ１Ｃａｓ９ヌクレアーゼの操作
Ｓｔ１Ｃａｓ９の使用についての１つの制約は、標的化を制限し得るより長いＰＡＭの形態Ｎ１Ｎ２Ａ３Ｇ４Ａ５Ａ６Ｗ７（ＷはＡまたはＴ）の必要性である。このコンセンサスは最初に、バクテリオファージゲノム内のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９標的部位に隣接する配列を調べることにより得られた。しかしながら、コンセンサスに密接に関連する配列（ＮＮＡＧＡＡＷおよびＮＮＧＧＡＡＷ）は、試験管中でまたは大腸菌に移植された場合に機能的であり得る。これらの差異は、異種システムにより付与される異なるストリンジェンシーから生じると考えられる。それにもかかわらず、コンセンサスからのこれらの逸脱は、ＰＡＭ認識においてある程度の柔軟性があることを示唆する。そのため、適切な文脈、我々の場合にはヒトおよびマウス細胞において各Ｃａｓ９のために機能的なＰＡＭを定義することが極めて重要である。
【０１４５】
最初にヒト細胞中での発現のためにＳｔ１Ｃａｓ９をコドン最適化し、ＮおよびＣ末端核局在シグナル（ＮＬＳ）を付加した。ＮＮＡＧＡＡＷ７およびＮＮＧＧＡＡＷ７の両方のＰＡＭ配列は、細胞中で同等の有効性でＤＮＡ切断を指令できたことを示す（図１８）。位置７における置換は良好に許容されることも観察された（図１８）。そのため、Ｓｔ１Ｃａｓ９のための機能的なＰＡＭは、４つの特定の塩基対のコア（ＮＮＡＧＡＡまたはＮＮＧＧＡＡ）を必要とするようである。それ自体で、位置７におけるＷの必要性を除去することは、標的化範囲を２倍増加させる。ＮＮＧＧＡＡ  ＰＡＭは同様に振る舞うので、これは追加の２倍の拡大を結果としてもたらす。これと比較して、ＳａＣａｓ９は切断のためにＮＮＧＲＲＴ（ＲはＡまたはＧ）ＰＡＭを必要とする。
【０１４６】
別個のＰＡＭ特異性を有するＳｔ１Ｃａｓ９酵素の同定を本明細書に示す。これまでほぼ全ての研究において使用されたＳｔ１Ｃａｓ９タンパク質配列は、２つの保存的置換によってのみ異なるＬＭＤ−９またはＤＧＣＣ７７１０株に由来した。ＬＭＤ−９  Ｓｔ１Ｃａｓ９の他に、株ＬＭＧ１８３１１、ＣＮＲＺ１０６６およびＴＨ１４７７からのＳｔ１Ｃａｓ９を研究した。上述のように、タンパク質レベルにおいて、これらの３つのＳｔ１Ｃａｓ９バリアントの配列は主に、Ｃ末端ウェッジ（ＷＥＤ）およびＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメイン内で多様化する（図１０および図３５ｂ）。ガイドとしてＳａＣａｓ９の構造を使用して（文献２８）、Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９のＣ末端の、ＬＭＧ  １８３１１、ＣＮＲＺ  １０６６およびＴＨ１４７７からのものとの交換がＰＡＭ特異性を再プログラムできるかどうかを試験し、そのため、Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９のＮ末端ドメイン（ＲＥＣローブ、ＨＮＨおよびＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン、およびリン酸ロックループ；ａａ  １〜８２６）ならびにＳｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＧ  １８３１１、ＣＮＲＺ  １０６６およびＴＨ１４７７のＣ末端ドメイン（ＷＥＤおよびＰＩドメイン；ａａ  ８２７〜１１２１）を含有するハイブリッドタンパク質を操作した（図１９）。Ｓｔ１Ｃａｓ９  ＬＭＤ−９はＮＮＡＧＡＡおよびＮＮＧＧＡＡ  ＰＡＭのみを標的化できたが、ハイブリッド構築物は高い有効性でそれぞれＮＮＡＣＡＡおよびＮＮＧＣＡＡ  ＰＡＭを標的化した（図１９）。限定された交差反応性が観察され、特異性の緩和とは対照的に、真の再プログラミングが達成されたことを指し示した。これらのデータは、Ｃａｓ９酵素に本来備わっているモジュール性を強調し、この戦略は、Ｓｔ１Ｃａｓ９の標的化範囲をさらに拡大するために使用され得る。
【実施例６】
【０１４７】
拡大された標的化範囲を有するＳｔ１Ｃａｓ９バリアントの操作
新規のＰＡＭ要件を有する追加のＳｔ１Ｃａｓ９タンパク質を同定する試みにおいて、「Search for PAMs by ALignment Of Targets」（ＳＰＡＭＡＬＯＴ）と呼ばれる最近報告されたバイオインフォマティクスパイプラインを使用した（文献８６）。この方法は、ＮＮＧＡＡＡ  ＰＡＭを潜在的に標的化する株ＴＨ１４７７により表される追加のＳｔ１Ｃａｓ９を同定した（図２０ａ）。ＣＮＲＺ１０６６およびＬＭＧ１８３１について我々が行ったようにＬＭＤ−９のＮ末端およびＴＨ１４７７のＣ末端ドメインを有するキメラ融合タンパク質を生成した。このアプローチは、ＮＮＧＡＡＡ  ＰＡＭを標的化できるＴＨ１４７７株に由来する活性のＳｔ１Ｃａｓ９をもたらした（図２０ｂ）。
【実施例７】
【０１４８】
塩基エディターへのＳｔ１Ｃａｓ９の変換
ＤＮＡ塩基エディターは、触媒障害性Ｃａｓヌクレアーゼと一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）上で作動する塩基修飾酵素との融合物を含む（文献８０）。シトシン塩基エディター（ＣＢＥ）は、ＡＰＯＢＥＣ１シチジンデアミナーゼを使用してＣ・Ｇ塩基対をＴ・Ａに変換する。ストレプトコッカス・ピオゲネスＤ１０Ａ突然変異体（ニッカーゼ）および２コピーのウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）へのＡＰＯＢＥＣ１の融合物は、ＢＥ４ｍａｘ酵素の作製を結果としてもたらした。ＳａＢＥ４を作製するためにスタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９もまた塩基エディターに変換された。ＳｐＣａｓ９  Ｄ１０ＡをＳｔ１Ｃａｓ９  Ｄ９Ａ（ＬＭＤ−９）と交換して元々のＢＥ４ｍａｘ構築物に入れることによりＳｔ１ＢＥ４ｍａｘを作製した。これは、Ｓｔ１Ｃａｓ９の特有のＰＡＭに起因して新規の標的化特異性を有する強力なＣＢＥを作製した（図２１）。我々のデータは、Ｓｔ１ＢＥ４ｍａｘはＳａＢＥ４と類似した活性ウィンドウを有することを指し示す。塩基エディターの活性ウィンドウ（別名、編集ウィンドウ）は狭いので、ＰＡＭ配列の広い範囲に標的化可能な塩基エディターを作製するという確固とした利点がある。ＴＣＲ＞ＴＣＹ＞ＶＣＮのヒエラルキー（文献８０）にしたがって特定のモチーフ中のシチジンを優先的に脱アミノ化するＡＰＯＢＥＣ３Ａ（ｅＡ３Ａ）などのよりいっそう狭い編集ウィンドウを有するデアミナーゼドメインの最近の操作を考慮するとこれは特に重要である。
【０１４９】
次に、特有のＰＡＭ選好性を示すＳｔ１Ｃａｓ９株バリアントはまたＣＢＥとして機能的であることの実証を進めた。詳細には、ＬＭＤ−９／ＬＭＧ１８３１１ハイブリッドおよびＬＭＤ−９／ＣＮＲＺ１０６６ハイブリッドベースのＳｔ１ＢＥ４ｍａｘは、それぞれＮＮＧＣＡＡおよびＮＮＡＣＡＡ  ＰＡＭにおいて強力な塩基エディターである（図２２）。これらのデータは、ゲノム編集プラットフォームとしてのＳｔ１Ｃａｓ９の使用およびバリアントに基づいてＳｔ１Ｃａｓ９融合物を作製する価値をさらに実証する。
【０１５０】
【表３】
2021522825.tif 000007
【０１５１】
ガイドの位置１における「Ｇ」はゲノムに対するミスマッチを指し示し、ガイドのサイズ（ｂｐ）にカウントされない。
【０１５２】
【表４】
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【０１５３】
【表５】
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【０１５４】
【表６】
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【０１５５】
ガイドの位置１における「Ｇ」はゲノムに対するミスマッチを指し示し、ガイドのサイズ（ｂｐ）にカウントされない。
【０１５６】
【表７】
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【０１５７】
【表８】
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【０１５８】
【表９】
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【０１５９】
【表１０−１】
2021522825.tif 000014
【０１６０】
【表１０−２】
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【０１６１】
【表１０−３】
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【０１６２】
【表１１】
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【０１６３】
【表１２】
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【０１６４】
【表１３】
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【０１６５】
【表１４−１】
2021522825.tif 000020
【０１６６】
【表１４−２】
2021522825.tif 000021
【０１６７】
本発明をその特定の実施形態との関連で記載したが、請求項の範囲は、実施例に示される好ましい実施形態により限定されるべきではなく、全体としての記載と合致する最も広い解釈を与えられるべきであることが理解されるであろう。請求項において、「含む」という語はオープンエンドの用語として使用され、「含むがそれに限定されない」という語句と実質的に同等である。単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明確に規定しなければ、対応する複数の参照物を含む。
【０１６８】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021522825.tif 000070
2021522825.tif 000071
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