(57)【要約】  サイトカインを検出および定量するための方法および組成物が提供される。開示されるアッセイは、市販のアッセイおよび／または対照アッセイと比較して、アッセイ干渉が低減している。干渉は、サイトカイン依存性、サイトカイン非依存性、またはその両方であり得る。一実施形態は、試料中に存在する内因性可溶性ＩＬ−３３結合分子によって引き起こされるアッセイ干渉を低減するＩＬ−３３イムノアッセイを提供する。例示的な可溶性ＩＬ−３３結合分子としては、抗ＩＬ−３３抗体、可溶性ＳＴ２受容体、および血清成分が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、試料中のＩＬ−３３複合体の酸解離後に試料中のＩＬ−３３複合体が再形成するのを低減、阻害、または遮断するために、遮断剤を試料に添加する。一実施形態では、遮断剤および検出試薬は、ＩＬ−３３への結合について競合しない。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アッセイ干渉を減少させる方法であって、
試料を、前記試料中のＩＬ−３３複合体からＩＬ−３３を解離するのに十分なｐＨに酸性化するステップと、
続いて、検出試薬と、任意選択でＩＬ−３３複合体形成を阻害する遮断剤とを含む緩衝塩基性溶液で前記酸性化試料を中和するステップと、
捕捉試薬を前記試料に添加するステップと、
前記検出剤を検出するステップと
を含み、検出された前記検出試薬の量が、前記試料中の前記ＩＬ−３３の量と相関する、前記方法。
【請求項２】
前記試料が、血液、血清、または血漿を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が、ＩＬ−３３製剤を投与された対象に由来する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＩＬ−３３製剤が抗ＩＬ−３３抗体を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＩＬ−３３複合体が、タンパク質に非共有結合したＩＬ−３３を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質が内因性血清タンパク質である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質が、ＳＴ２またはそのＩＬ−３３結合断片である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質が、抗ＩＬ−３３抗体またはそのＩＬ−３３結合断片である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記試料が、３〜５のｐＨに酸性化される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が、５〜６０分間酸性化される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出試薬が、検出可能な標識にコンジュゲートされた抗ＩＬ−３３抗体を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出試薬が、希少遷移金属粒子、フルオロフォア、発色団、量子ドット、および貴金属ナノ粒子からなる群から選択される検出可能な作用物質を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出試薬がルテニウムで標識される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記捕捉試薬が固体支持体にコンジュゲートされる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記捕捉試薬がビオチン化される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料が酢酸で酸性化される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記遮断剤が抗体である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記遮断剤が抗ＳＴ２抗体である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記捕捉試薬が、前記酸性化ステップ中に前記試料に添加される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記検出剤が、前記中和ステップの後に前記試料に添加される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記捕捉試薬および前記検出試薬が、前記中和ステップの後に前記試料に添加される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
１２．５ｐｇ／ｍＬの感度を有する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
５０ｎｇ／ｍＬ超のＳＴ２許容性を有する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
炎症性疾患または障害と診断された、またはそれを有する疑いがある対象から、前記試料が得られる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
喘息、慢性閉塞性肺疾患、またはアトピー性皮膚炎と診断された、またはそれを有する疑いがある対象から、前記試料が得られる、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記固体支持体が、電気化学発光プラットフォームである、請求項１４〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＩＬ−３３の量が、検出された検出試薬の量を所定の参照基準と相関させることによって決定される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
血清試料中のインターロイキン−３３を定量する方法であって、
前記血清試料を、前記試料中のＩＬ−３３複合体を解離するのに十分なｐＨに酸性化するステップと、
（ａ）検出可能な標識で標識された抗ヒトＩＬ−３３抗体と、任意選択で（ｂ）抗ヒトＳＴ２抗体とを含む緩衝塩基性溶液で、前記酸性化試料を中和するステップと、
前記試料を、ビオチン化抗ヒトＩＬ−３３抗体を含むアビジンコーティングされた固体支持体に添加するステップと、
前記アビジンコーティングされた固体支持体上で前記検出可能な標識を検出するステップと
を含み、検出された前記検出可能な標識の量が、前記試料中の前記ＩＬ−３３の量と相関する、前記方法。
【請求項２９】
前記固体支持体が、ストレプトアビジンコーティングされた電気化学発光プラットフォームである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記検出可能な標識がルテニウムである、請求項２８または２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗ヒトＳＴ２抗体が、前記試料中のＩＬ−３３へのＳＴ２の結合を低減するのに十分な量で存在する、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
１２．５ｐｇ／ｍＬの感度および５０ｎｇ／ｍＬ超のＳＴ２許容性を有する、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／６５５，８８７号の利益および優先権を主張し、参照によりその全体が組み込まれる。
【０００２】
発明の技術分野
本発明の態様は、一般に、インターロイキン３３（ＩＬ−３３）を含むがこれに限定されない、サイトカインの検出および定量化のためのイムノアッセイに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
インターロイキン３３（ＩＬ−３３）は、タバコの煙などの損傷シグナルまたは侵襲に応答して増加するサイトカインである。サイトカインは、壊死時にバリア組織によって放出され、損傷した組織の存在に対する免疫応答を伝播する。この「アラーミン」シグナルは、先天免疫および適応免疫の両方に対する炎症応答を増幅する。公開されているデータは、おそらく、可溶性ＳＴ２受容体などの内因性結合パートナーからの干渉に起因して、可溶性ＩＬ−３３を検出するための市販のキットが信頼できない結果を生成することを示す（Ｎｙｇａａｒｄ，Ｕ．，ｅｔ  ａ  ｌ．，ＳｐｒｉｎｇｅｒＰｌｕｓ，５：３３（２０１６）（非特許文献１）；Ｋｅｔｅｌａａｒ，Ｍ．Ｅ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ，４６（６）：８８４〜７（２０１６）（非特許文献２）；Ｒｉｖｉｅｒｅ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ，７５（３）：６３３−５（２０１６）（非特許文献３））。
【０００４】
血清などの複合体マトリックスにおけるリガンド結合アッセイの性能は、アッセイに干渉する特定の内因性成分によって影響を受けることがあり得る（Ｚｈｏｎｇ，Ｚ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，ＡＡＰＳ  Ｊ，１９：１５６４（２０１７）（非特許文献４））。イムノアッセイにおける干渉は、実験室による患者の結果の解釈の誤り、および医師によって与えられる間違った治療過程をもたらし得る（Ｔａｔｅ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．２００４，２５（２）：１０５〜１２０（非特許文献５））。
【０００５】
より優れたイムノアッセイを開発する試みは、他の人によって試みられてきた。Ｄｏｕｃｅｔ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．は、酸解離ステップを含む改善されたＩＬ−１３アッセイを報告した（Ｄｏｕｃｅｔ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍａｒｋｅｒｓ，３５（５）：４６５〜４７４（２０１３）（非特許文献６））。Ｄｏｕｃｅｔによって記述されるイムノアッセイはＩＬ−１３に特異的であるが、ＩＬ−３３を検出しなかった。加えて、Ｄｏｕｃｅｔのイムノアッセイは、検出前に試料を中和する必要はなく、アッセイ中にサイトカイン複合体の再形成を防止するために遮断剤を使用しなかった。
【０００６】
したがって、ＩＬ−３３の検出のための新しいアッセイおよび方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎｙｇａａｒｄ，Ｕ．，ｅｔ  ａ  ｌ．，ＳｐｒｉｎｇｅｒＰｌｕｓ，５：３３（２０１６）
【非特許文献２】Ｋｅｔｅｌａａｒ，Ｍ．Ｅ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ，４６（６）：８８４〜７（２０１６）
【非特許文献３】Ｒｉｖｉｅｒｅ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ，７５（３）：６３３−５（２０１６）
【非特許文献４】Ｚｈｏｎｇ，Ｚ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，ＡＡＰＳ  Ｊ，１９：１５６４（２０１７）
【非特許文献５】Ｔａｔｅ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．２００４，２５（２）：１０５〜１２０
【非特許文献６】Ｄｏｕｃｅｔ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍａｒｋｅｒｓ，３５（５）：４６５〜４７４（２０１３）
【発明の概要】
【０００８】
サイトカインを検出および定量するための方法および組成物が提供される。開示されるアッセイは、市販のアッセイおよび／または対照アッセイと比較して、アッセイ干渉が低減されている。干渉は、サイトカイン依存性、サイトカイン非依存性、またはその両方であり得る。一実施形態は、試料中に存在する内因性可溶性ＩＬ−３３結合分子によって引き起こされるアッセイ干渉を低減するＩＬ−３３イムノアッセイを提供する。例示的な可溶性ＩＬ−３３結合分子としては、抗ＩＬ−３３抗体、可溶性ＳＴ２受容体、および血清成分が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、試料中のＩＬ−３３複合体の酸解離後に試料中のＩＬ−３３複合体が再形成するのを低減、阻害、または遮断するために、遮断剤を試料に添加する。一実施形態では、遮断剤および検出試薬は、ＩＬ−３３への結合について競合しない。
【０００９】
別の実施形態は、電気化学発光イムノアッセイを使用して、ヒト血清試料中の総ＩＬ−３３の濃度を決定する方法を提供する。このアッセイは、試料中に存在する可溶性リガンド：薬物複合体を解離して、薬物の存在下でＩＬ−３３の検出を改善するための、血清試料の酸前処理を含み、このようにして、総ＩＬ−３３のレベルの定量測定を提供する。この実施形態では、この手順は、捕捉試薬としてビオチン化抗ヒトＩＬ−３３抗体とともに、ストレプトアビジンコーティングされたプレートを使用し、組み換えＩＬ−３３を標準として利用する。標準物質、対照、および試料は、酢酸で希釈され、検出試薬、例えば、ルテニウム標識抗ヒトＩＬ−３３抗体を含有するＴｒｉｓ塩基溶液を使用して中和される。抗ＩＬ−３３抗体および抗ＳＴ２受容体抗体に結合する抗体も、薬物（すなわち、抗体をＩＬ−３３に結合する抗体）または内因性可溶性ＳＴ２受容体からの干渉を最小限に抑えるために、Ｔｒｉｓ溶液に添加される。次いで、中和した標準物質、対照、および試料はプレートに添加される。プレート上に捕捉されたＩＬ−３３は、プレートリーダーで、電圧がプレートに印加されるとルテニウム標識によって生成される化学発光シグナルによって測定される。得られる電気化学発光シグナル（すなわち、カウント）は、血清試料中に存在するＩＬ−３３の量に比例する。
【００１０】
一実施形態では、本方法は、１２．５ｐｇ／ｍＬの感度および５０ｎｇ／ｍＬ超のＳＴ２許容性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
（図１）本発明の実施形態による例示的なアッセイスキームの図である。
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（図２Ａ）ｒｈＳＴ２（ｎｇ／ｍＬ）の濃度に対する回収率の折れ線グラフである。（■）Ｃ−ＡＤ  酸処理あり；（●）Ｃ−ＡＤ  酸無し；（□）Ｃ−Ａ−Ｄ  酸処理あり；（○）Ｃ−Ａ−Ｄ  酸無し。
（図２Ｂ）示される条件下でアッセイされた３つの個体（個体１、個体２、および個体３）由来の血清中の内因性ＩＬ−３３検出を示す棒グラフである。Ｃ−Ａ−Ｄ  酸無し、Ｃ−ＡＤ  酸無し、Ｃ−Ａ−Ｄ  酸、およびＣ−ＡＤ  酸。
（図３）改変アッセイ、ｒＳＴ２の添加、および抗ＩＬ−３３モノクローナル抗体の添加を使用した、個体１および個体３由来の血清中の内因性ＩＬ−３３特異性を示す棒グラフである。
（図４）アッセイが正確であることを示す複数の測定後の個体１および個体３のＩＬ−３３濃度（ｐｇ／ｍＬ）のグラフである。
（図５）示される条件下でアッセイされた抗ＩＬ−３３モノクローナル抗体の存在下でＩＬ−３３を検出するための方法の許容性を示す折れ線グラフである。Ｃ−ＡＤ  酸処理あり、およびＣ−Ａ−Ｄ−  酸処理あり。
（図６）正常な個体および喘息、ＣＯＰＤ、およびアトピー性皮膚炎を有する個体由来の血清中の内因性ＩＬ−３３（ｐｇ／ｍＬ）のグラフである。４つの異なる集団からそれぞれ２５の個体を商業ベンダーから購入し、酸処理を伴うＣ−ＡＤアッセイを使用して、内因性ＩＬ−３３についてスクリーニングした。
（図７Ａ）図７Ａおよび図７Ｂは、処置されたマウスおよび対照マウス由来のヒトＩＬ−３３（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。
（図７Ｂ）図７Ａおよび図７Ｂは、処置されたマウスおよび対照マウス由来のヒトＩＬ−３３（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書に記載の組成物および方法、ならびに記載の実験条件は変化し得るので、本開示は、これらに限定されないことを理解されたい。また、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのためであり、限定することを意図するものではないと理解されるべきである。
【００１３】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。なお、本明細書に記載されるものと類似または同等のあらゆる組成物、方法、および材料は、本発明の実施または試験に使用することができる。言及されているすべての刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１４】
「結合分子」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の標的と特異的に相互作用し、それに結合する分子を指すことが意図される。標的は、生物学的または小（化学的）分子を含み得る。標的分子は、抗原または抗原部分を定義し得る。結合分子の例としては、抗体（モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ならびに抗体断片を含む）、融合タンパク質、および当業者に既知である他の抗原結合分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、結合分子の例であり、ジスルフィド結合によって相互結合した４つのポリペプチド鎖、すなわち２つの重鎖（Ｈ）鎖、および２つの軽鎖（Ｌ）鎖を一般的に含む免疫グロブリンを指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨ）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲまたはＶＬ）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で配置される、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。
【００１６】
本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」もしくは「抗体断片」）という用語は、抗原（例えば、ｈＩＬ−３３）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって実行され得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ１、およびＣＨ１ドメインを含む一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ′）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合された２つのＦ（ａｂ）′断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含むＦｃ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを含むＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインを含むｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ、Ｅ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ２４１：５４４〜５４６（１９８９））、および（ｖｉ）ＣＤＲが挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価分子を形成する単一の連続鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって結合され得る（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られており、例えば、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６（１９８８）、およびＨｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３（１９８８）を参照されたい）。かかる一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語の中に包含されるように意図される。ダイアボディなどの他の形態の一本鎖抗体もまた包含される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８（１９９３）を参照されたい）。
【００１７】
「ＣＤＲ」または相補性決定領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域内に点在する超可変領域である。ＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよく、または天然にもしくは人工的に修飾されてもよい。
【００１８】
「エピトープ」という用語は、抗体分子の可変領域における、パラトープとして知られる特異的な抗原結合部位と相互作用する、抗原決定基である。単一の抗原は、２以上のエピトープを有し得る。エピトープは、立体配座または線状のいずれかであり得る。立体配座エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメント由来の空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。特定の状況では、エピトープは、抗原上の糖、ホスホリル基、またはスホニル基の部分を含み得る。
【００１９】
「アッセイ干渉」という用語は、ＩＬ−３３抗体または抗ＩＬ−３３抗体などの分析物の検出を遮断または阻害するアッセイにおける内因性成分を指す。分析物の測定可能な濃度を変化させるか、または抗体結合を変化させる物質は、イムノアッセイ干渉を潜在的にもたらし得る。アッセイ干渉は、分析物依存性または非依存性であり得る。分析物非依存干渉は、溶血、脂肪血症、ならびに抗凝固剤および試料貯蔵の作用の一般的な干渉を指し、分析物濃度に依存しない。イムノアッセイにおける分析物依存干渉は、試料中の成分と１つ以上の試薬抗体との相互作用を指す。それらには、化学的相違があるが、抗体と交差反応する構造的類似性を有する化合物が含まれる。天然の多反応性抗体または自己抗体（異好性）、ヒト抗動物抗体、または抗薬物抗体（ＡＤＡ）である、干渉する内因性物質、ならびに個体に特有の他の思いもよらない結合タンパク質は、イムノアッセイにおいて分析物と試薬抗体との間の反応を干渉し得る。干渉は、分析物の可溶性結合標的、分析物の可溶性受容体を含むがこれらに限定されない分析物の内因性リガンド、分析物の可溶性リガンド、分析物のシェディングされた受容体、またはリウマチ因子およびビオチンなどの血清因子によって引き起こされ得る。干渉は、分析物に対する抗体によって引き起こされ得る。
【００２０】
「ＳＴ２」という用語は、インターロイキン−１受容体様１（ＩＬ−１ＲＬ１）とも称されるＩＬ−３３の受容体を指す。ＳＴ２は、膜結合または可溶性であり得る。
【００２１】
「イムノアッセイ」という用語は、免疫特異的に分析物に直接または間接的に結合する結合部分が組み込まれた検出アッセイを指す。一般的に、結合部分は抗体である。抗体は、検出可能な標識で標識することができる。
【００２２】
「ＩＬ−３３複合体」という用語は、ＩＬ−３３と、血液、血漿、または血清の成分との非共有結合を指す。一般的に、ＩＬ−３３複合体は、タンパク質、例えば、タンパク質製剤、抗薬物抗体、ＩＬ−３３のリガンド、またはこれらの組み合わせに非共有結合したＩＬ−３３を含有する。
【００２３】
ＩＩ．ＩＬ−３３検出および定量アッセイならびにその使用方法
ＩＬ−３３の検出および定量化のためのアッセイならびに方法が提供される。開示されたアッセイおよび方法を使用して、試料中のＩＬ−３３を検出ならびに定量することができる。一実施形態では、試料は、ＩＬ−３３アンタゴニストまたはＩＬ−３３による治療を受けた、または治療を受けている対象から得られる。
【００２４】
開示されたアッセイは、市販のアッセイおよび／または対照アッセイと比較して、アッセイ干渉が低減している。干渉は、ＩＬ−３３依存性、ＩＬ−３３非依存性、またはその両方であり得る。一実施形態では、本方法は、試料中に存在する内因性可溶性ＩＬ−３３結合分子によって引き起こされるアッセイ干渉を低減または阻害する。例示的な可溶性ＩＬ−３３結合分子としては、抗ＩＬ−３３抗体、可溶性ＳＴ２、および血清成分が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、試料中のＩＬ−３３複合体の酸変性後に試料中のＩＬ−３３複合体が再形成するのを低減、阻害、または遮断するために、遮断剤を試料に添加する。一実施形態では、遮断剤および検出試薬は、ＩＬ−３３への結合について競合しない。
【００２５】
一実施形態では、本方法は、１２．５ｐｇ／ｍＬの感度および５０ｎｇ／ｍＬ超のＳＴ２許容性を有する。
【００２６】
Ａ．インターロイキン３３
一実施形態では、ＩＬ−３３または「ヒトインターロイキン−３３」または「ヒトＩＬ−３３」は、２７０個のアミノ酸の、完全長で未処理のＩＬ−３３（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｏ９５７６０および米国特許出願公開第２０１８０１５５４３６号を参照されたい、これらの両方は、それらの全体が参照により組み込まれる）、もしくはその生物学的に活性な断片、ならびに細胞内の処理から生じるＩＬ−３３のあらゆる形態を指す。本用語は、ＩＬ−３３の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント（例えば、Ｈｏｎｇ，ｅｔ．ａｌ．，（２０１１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６（２２）：２００７８〜２００８６を参照されたい）、もしくは対立遺伝子バリアント、またはＩＬ−３３の他の任意のアイソフォーム、例えば、ＷＯ２０１６／１５６４４０に記載のＩＬ−３３の酸化型もしくは還元型も包含する。抗体もしくはその抗原結合断片によって、またはＩＬ−３３トラップによって中和、阻害、遮断、抑止、減弱、低減、または干渉され得るＩＬ−３３の活性には、ＩＬ−３３受容体媒介性シグナル伝達の阻害、またはＩＬ−３３媒介性炎症の阻害が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
Ｂ．ＩＬ−３３の検出方法
一実施形態は、試料中のＩＬ−３３複合体を解離するのに十分なｐＨに試料を酸性化し、酸性化試料を緩衝塩基溶液で中和することによる、試料中のＩＬ−３３の検出方法を提供する。ＩＬ−３３を検出するために、捕捉試薬および検出試薬も試料に添加される。特定の実施形態では、試料中の成分がＩＬ−３３に結合するのを阻害、低減、または遮断するために、遮断剤が試料に添加される。
【００２８】
別の実施形態は、試料を、試料中のＩＬ−３３複合体からＩＬ−３３を解離するのに十分なｐＨに酸性化し、その後、検出試薬を含有する緩衝塩基性溶液で酸性化試料を中和することによって、アッセイ干渉を減少させる方法を提供する。任意選択で、試料中のＩＬ−３３複合体の再形成を阻害する遮断剤は、別個のステップで試料に添加することができるか、または緩衝塩基性溶液中に存在することができる。本方法は、捕捉試薬を試料に添加することと、検出剤を検出することとを含み、検出された検出試薬の量は、試料中のＩＬ−３３の量と相関する。捕捉剤は、別個のステップとして添加することができるか、または酸性化ステップに、もしくは緩衝塩基性溶液中に存在することができる。一般的に、試料中に存在するＩＬ−３３複合体は、可溶性ＳＴ２と非共有結合的に結合したＩＬ−３３を含有する。
【００２９】
別の実施形態は、血清試料を、試料中のＩＬ−３３複合体を解離するのに十分なｐＨに酸性化し、その後、（ａ）検出可能な標識で標識された抗ヒトＩＬ−３３抗体と、任意選択で（ｂ）抗ヒトＳＴ２抗体とを含有する緩衝塩基性溶液で酸性化試料を中和することによって、血清試料中のインターロイキン−３３を定量する方法を提供する。本方法は、試料を、ビオチン化抗ヒトＩＬ−３３抗体を含有するストレプトアビジンコーティングされた固体支持体に添加することと、アビジンコーティングされた固体支持体上で検出可能な標識を検出することとを含み、検出される検出可能な標識の量は、試料中のＩＬ−３３の量と相関する。
【００３０】
別の実施形態は、電気化学発光イムノアッセイを使用して、ヒト血清試料中の総ＩＬ−３３の濃度を決定する方法を提供する。アッセイは、試料中に存在する可溶性リガンド：薬物複合体を解離して、薬物の存在下でＩＬ−３３の検出を改善するための、血清試料の酸前処理を含み、このようにして、総ＩＬ−３３のレベルの定量測定を提供する。リガンド：薬物複合体としては、抗ＩＬ−３３抗体に非共有結合したＩＬ−３３が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な抗ＩＬ−３３抗体は、参照によりその全体が組み込まれる米国特許第１０，０００，５６４号および同第９，４５３，０７２号に開示されている。この実施形態では、この手順は、ビオチン化抗ヒトＩＬ−３３抗体を捕捉試薬として用いてストレプトアビジンコーティングされたプレートを使用し、組換えＩＬ−３３を標準物質として利用する。標準物質、対照、および試料は、酢酸で希釈され、検出試薬、例えば、ルテニウム標識抗ヒトＩＬ−３３抗体を含有するＴｒｉｓ塩基溶液を使用して中和される。抗ＩＬ−３３抗体および抗ＳＴ２受容体抗体に結合する抗体も、薬物または内因性可溶性ＳＴ２受容体からの干渉を最小限に抑えるためにＴｒｉｓ溶液に添加される。次いで、中和された標準物質、対照、および試料をプレートに添加する。プレート上に捕捉されたＩＬ−３３は、プレートリーダーで、電圧がプレートに印加されるとルテニウム標識によって生成される化学発光シグナルによって測定される。得られる電気化学発光シグナル（すなわち、カウント）は、血清試料中に存在するＩＬ−３３の量に比例する。
【００３１】
一実施形態では、試料中で検出される標識の量は、ＩＬ−３３の既知の濃度と、その濃度に対する対応する検出標識量とで校正された参照標準と比較される。試料中のＩＬ−３３の量は、試料中の検出標識量を参照標識と比較し、検出標識量を、その検出標識量に対して参照標識について示される濃度とマッチングさせることによって決定することができる。
【００３２】
１．生体試料
開示される方法において使用される試料は典型的に、検出される分析物、例えば、ＩＬ−３３またはその複合体を含有する生体体液などの生体試料である。生体体液としては、血液、血漿、血清、および唾液が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、生体試料は、ヒト生体試料である。
【００３３】
特定の実施形態では、試料は、炎症状態、疾患、または障害を有するか、または有する疑いのある対象から得られる。代表的な炎症状態、疾患、および障害としては、クローン病、大腸炎、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、好酸球性食道炎、鼻ポリープ、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
検出される分析物は、一般的に、対象、好ましくはヒト対象から採取された血清の成分である。試料中で検出および／または定量される代表的な分析物としては、サイトカイン、タンパク質製剤、および代謝産物またはその断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
代表的なサイトカインとしては、インターロイキンが挙げられる。インターロイキンとしては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５、およびＩＬ−３６が挙げられる。一実施形態では、分析物は、ＩＬ−３３である。
【００３６】
代表的なタンパク質製剤としては、組換えタンパク質、抗体、および融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、多反応性抗体または自己抗体（異好性）、ヒト抗動物抗体、または抗薬物抗体であり得る。一実施形態では、タンパク質製剤は、抗ＩＬ−３３抗体である。
【００３７】
２．ＩＬ−３３のリガンド
ＩＬ−３３のリガンドは、ＩＬ−３３に非共有結合する分子であり、分析物の抗体または可溶性結合標的などの試料中の内因性成分を含むがこれらに限定されず、ＩＬ−３３の内因性リガンドは、ＩＬ−３３の可溶性受容体、ＩＬ−３３の可溶性リガンド、および分析物のシェディングされた受容体を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、ＩＬ−３３のリガンドは、可溶性ＳＴ２受容体または可溶性共受容体ＩＬ−１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ−１ＲＡｃＰ）である。
【００３８】
ＳＴ２（ＩＬ１ＲＬ１、ＤＥＲ４、Ｔ１、およびＦＩＴ−１としても知られている）は、Ｔｏｌｌ様／ＩＬ−１受容体スーパーファミリーのメンバーである。このスーパーファミリーのメンバーは、共通の細胞内ドメイン、Ｔｏｌｌ／インターロイキン−１受容体（ＴＩＲ）ドメインによって定義される。約１６０個のアミノ酸のこのドメインは、タンパク質の細胞質末端に位置する５つのαヘリックスで囲まれた中央の５本鎖βシートから構成される。Ｔｏｌｌ様／ＩＬ−１受容体スーパーファミリーは、それらの細胞外ドメインに基づいて、ＩＬ−１受容体様サブファミリー、Ｔｏｌｌ受容体サブファミリー、およびそれらのアダプタータンパク質で構成されるファミリーの３つのサブファミリーに分けることができる。
【００３９】
３．ＩＬ−３３複合体の酸変性
開示される方法における試料は、１〜６０分間酸性化され得る。一実施形態では、試料は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３，１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０分間酸性化される。
【００４０】
酸性化ステップにおいて使用することができる酸としては、酢酸、塩酸、および硫酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
ＩＬ−３３複合体を解離するのに十分なｐＨは、３．０〜５．０であり得る。一実施形態では、ｐＨは、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５．０である。
【００４２】
一実施形態では、尿素を含むが、これに限定されないＩＬ−３３複合体を解離するために、変性剤を試料に添加することができる。
【００４３】
４．遮断剤
開示される方法において使用される遮断剤は、ＩＬ−３３複合体が酸性化ステップで解離された後の試料中のＩＬ−３３複合体の再形成を低減または防止する作用物質である。試料が対象、例えばヒト対象から採取されるとき、試料は典型的に、検出または定量されるＩＬ−３３複合体を含有する。遮断剤は、ＩＬ−３３以外のＩＬ−３３複合体の成分に免疫特異的に結合する抗体であり得る。一実施形態では、遮断剤は、抗ＳＴ２抗体である。
【００４４】
一実施形態では、遮断剤は、ＩＬ−３３製剤に結合する抗体、例えば、抗ＩＬ−３３抗体に結合する抗体である。
【００４５】
５．検出試薬
開示される方法において使用される検出試薬は、ＩＬ−３３アンタゴニストまたは阻害剤、例えば、抗ＩＬ−３３抗体、好ましくは、抗ヒトＩＬ−３３抗体またはＩＬ−３３トラップであり得る。抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、またはヒト化抗体であり得る。
【００４６】
一部の実施形態では、検出試薬は、検出可能な標識で標識される。検出可能な標識は当該技術分野で既知であり、希少遷移金属粒子、フルオロフォア、発色団、量子ドット、貴金属ナノ粒子、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、および化学発光標識が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、検出可能な標識は、ルテニウムである。
【００４７】
ａ．抗ＩＬ−３３アンタゴニスト
特定の実施形態では、開示されるアッセイおよび方法において使用することができるＩＬ−３３アンタゴニストまたは阻害剤は、ヒトＩＬ−３３に特異的に結合する抗ＩＬ−３３抗体または抗体の抗原結合断片である。一実施形態では、開示される方法およびアッセイで使用するための本明細書に記載の抗ＩＬ−３３抗体は、参照によりそれらの全体が組み込まれる米国特許第１０，０００，５６４号および第９，４５３，０７２号に開示されている。
【００４８】
開示されるアッセイおよび方法において使用される抗ＩＬ−３３抗体は、ＩＬ−３３に特異的に結合する。「特異的に結合する」などの用語は、抗体またはその抗原結合断片が、生理学的条件下で比較的安定である抗原と複合体を形成することを意味する。抗体が抗原に特異的に結合するかどうかを決定するための方法は当該技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などが挙げられる。例えば、本明細書で使用される、ＩＬ−３３に「特異的に結合する」抗体には、ＩＬ−３３またはその生物学的に活性な部分に、表面プラズモン共鳴アッセイで測定されと、約１０００ｎＭ未満、約５００ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約９０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満または約０．５ｎＭ未満のＫＤで結合する抗体が挙げられる。しかし、ヒトＩＬ−３３に特異的に結合する単離された抗体は、他の（非ヒト）種由来のＩＬ−３３分子などの他の抗原に対して交差反応性を有し得る。
【００４９】
一部の実施形態では、ＩＬ−３３アンタゴニストは、米国特許第１０，０００，５６４号および同第９，４５３，０７２号に記載される抗ＩＬ−３３抗体のアミノ酸配列のうちのいずれかを含む、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、および／または相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗ＩＬ−３３抗体、またはその抗原結合断片である。特定の実施形態では、ＩＬ−３３アンタゴニストは、米国特許第１０，０００，５６４号および同第９，４５３，０７２号に記載の参照抗体の結合特性を有する抗ＩＬ−３３抗体である。
【００５０】
本明細書に記載の方法において使用され得る他の抗ＩＬ−３３抗体およびその抗原結合断片は、ＥＰ１７２５２６１および米国特許第９，９７０，９４４号、同第８，１８７，５９６号、ＷＯ２０１１０３１６００号、ＷＯ２０１５０９９１７５および米国特許第９，７５８，５７８号、ＷＯ２０１５１０６０８０および米国特許第１０，０５９，７６４号（ＡＮＢ０２０）、同第２０１６／０１６８２４２、ＷＯ２０１６／０７７３８１および米国特許第１０，０９３，７３０号、ＷＯ２０１６／０７７３６６および米国特許第２０１８／０１７１４０５号、またはＷＯ２０１６／１５６４４０および米国特許第２０１８／０２０７２６５号に開示されており、それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる
【００５１】
ｂ．ＩＬ−３３トラップ
一部の実施形態では、開示される方法およびアッセイにおいて使用することができるＩＬ−３３アンタゴニストまたは阻害剤は、受容体ベースのＩＬ−３３トラップである。例示的なＩＬ−３３トラップは、ＩＬ−３３受容体タンパク質、例えば、ＳＴ２のＩＬ−３３結合部分を含有する少なくとも１つのＩＬ−３３結合ドメインを含む。特定の実施形態において、ＩＬ−３３トラップは、ＩＬ−３３共受容体、例えば、ＩＬ−１受容体アクセサリータンパク質、またはＩＬ−１ＲＡｃＰの細胞外部分をさらに含む。ＩＬ−３３トラップはまた、トラップの様々な成分を互いに結合するように機能する少なくとも１つの多量体化成分を含み得る。
【００５２】
一実施形態では、開示される方法およびアッセイで使用するために本明細書に記載のＩＬ−３３トラップは、米国特許第９，６３７，５３５号およびＷＯ２０１４／１５２１９５に開示されており、それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５３】
一般に、ＩＬ−３３トラップは、多量体化ドメイン（Ｍ）に結合した第１のＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ１）を含む。特定の実施形態では、ＩＬ−３３アンタゴニストは、Ｄ１および／またはＭに結合された第２のＩＬ−３３結合ドメイン（Ｄ２）を含む。特定の実施形態によれば、Ｄ１は、ＳＴ２タンパク質のＩＬ−３３結合部分を含む。ＳＴ２タンパク質のＩＬ−３３結合部分は、ＳＴ２タンパク質の細胞外ドメインのすべてまたは一部を含むか、またはそれからなり得る。特定の実施形態では、ＳＴ２タンパク質は、ヒトＳＴ２タンパク質である。本明細書で使用される場合、「ヒトＳＴ２タンパク質」とは、受託番号ＮＰ＿０５７３１６．３のアミノ酸１〜５５６に示されるＳＴ２タンパク質を指し、参照によりその全体が組み込まれる。特定の実施形態によれば、Ｄ２は、ＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質の細胞外部分を含む。
【００５４】
ＩＬ−３３トラップの個々の成分は、ＩＬ−３３に結合することができる機能的アンタゴニスト分子をもたらす様々な方法で互いに対して配置され得る。例えば、Ｄ１および／またはＤ２は、ＭのＮ末端に結合されてもよい。他の実施形態では、Ｄ１および／またはＤ２は、ＭのＣ末端に結合される。さらに他の実施形態では、Ｄ１は、Ｄ２のＮ末端に結合され、Ｄ２は、ＭのＮ末端に結合され、式Ｄ１〜Ｄ２〜Ｍで表されるアンタゴニスト分子のＮ末端からＣ末端にインライン融合をもたらす。
【００５５】
特定の実施形態では、ＩＬ−３３アンタゴニストは、Ｍ１およびＭ２の２つの多量体化ドメインを有し、Ｍ１およびＭ２は、互いに同一である。例えば、Ｍ１は特定のアミノ酸配列を有するＦｃドメインであり得、Ｍ２はＭ１と同じアミノ酸配列を有するＦｃドメインである。
【００５６】
ｃ．その他のＩＬ−３３アンタゴニスト
ＩＬ−３３アンタゴニストとして作用し得、開示される方法およびアッセイで使用され得る他の作用物質としては、イムノアドヘシン、ペプチボディ、可溶性ＳＴ２、もしくはそれらの誘導体、抗ＩＬ−３３受容体抗体（例えば、抗ＳＴ２抗体、例えば、ＡＭＧ−２８２（Ａｍｇｅｎ）もしくはＳＴＬＭ１５（Ｊａｎｓｓｅｎ）、またはそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／１１３８１３および米国特許第９，３０９，３１９号、ＷＯ２０１３／１７３７６１および米国特許第９，９８２，０５４号、ＷＯ２０１３／１６５８９４および米国特許第９，９５１，１３７号、同第８，４４４，９８７号、または同第７，４５２，９８０号に記載の抗ＳＴ２抗体）のうちのいずれかが挙げられる。開示される方法およびアッセイにおいて使用するための他のＩＬ−３３アンタゴニストとしては、ＳＴ２−Ｆｃタンパク質、例えば、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１７３７６１および米国特許第９，９８２，０５４号、またはＷＯ２０１３／１６５８９４および米国特許第９，９５１，１３７号に記載のものが挙げられる。
【００５７】
６．捕捉試薬
一実施形態では、開示される方法およびアッセイにおいて使用される捕捉試薬は、上述のＩＬ−３３アンタゴニスト、例えば、抗体、好ましくは抗ＩＬ−３３抗体、好ましくは抗ヒトＩＬ−３３抗体である。例示的な抗ＩＬ−３３抗体は、参照によりその全体が組み込まれる米国特許第１０，０００，５６４号に開示されている。使用することができる他の抗ＩＬ−３３抗体は、上記に記載されている。一実施形態では、捕捉試薬は、ビオチン化される。
【００５８】
一部の実施形態では、捕捉試薬は、固体支持体に固定されるか、または固体支持体に結合される。固体支持体は、マイクロプレート、例えば、ストレプトアビジンコーティングされたマイクロプレートであり得る。
【００５９】
一部の実施形態では、捕捉試薬は、上述のＩＬ−３３アンタゴニストである。
【００６０】
Ｃ．コンパニオン診断
一実施形態では、ＩＬ−３３を検出および定量するための開示される方法およびアッセイは、治療される対象におけるＩＬ−３３の循環レベルを低下させるよう、または治療される対象におけるＩＬ−３３の循環レベルを上昇させるように設計された治療と組み合わせて、コンパニオン診断方法として使用される。治療は、ＩＬ−３３アンタゴニストの投与またはＩＬ−３３の投与を含み得る。例示的なＩＬ−３３アンタゴニストは、上述のものであり、抗ＩＬ−３３抗体、抗ＩＬ−３３融合タンパク質、ｓＳＴデコイ受容体、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
一実施形態は、上述のＩＬ−３３アンタゴニストの投与またはＩＬ−３３の投与を含む治療を受けている対象におけるＩＬ−３３関連疾患の治療のモニタリング方法を提供する。ＩＬ−３３阻害剤またはＩＬ−３３で治療される代表的な疾患、障害、または病態としては、喘息、好酸球性または非好酸球性喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性腸疾患、クローン病、大腸炎、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、関節炎、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、好酸球性食道炎、乾癬、鼻ポリープ、アルツハイマー病、アテロース硬化症、心筋梗塞、虚血性脳卒中、および線維性状態（これに限定されないがデュピュイトレン病、肩関節周囲炎、関節周囲線維症、ケロイドまたは肥厚性瘢痕、子宮内膜症、腹部癒着、神経周囲線維症、レダーホース病、ペロニー病、腱周囲癒着、および関節周囲線維症）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
上述のＩＬ−３３アンタゴニストを含有する１つ以上の医薬組成物（例えば、特にＩＬ−３３が関与する作用機序に関連する医薬品）による、抗炎症療法による、または免疫吸収療法による、対象の処置の前および後に、対象における循環ＩＬ−３３レベルを評価、検出、または定量する（または、そのような処置の後にＩＬ−３３が評価され、ＩＬ−３３の濃度もしくは量が、所定のレベルと、または処置の前に対象において測定されたレベルと比較される）ために、本明細書に記載の方法およびアッセイを使用することができる。治療後に観察されるＩＬ−３３の好ましくない濃度の量は、対象がさらなる治療または継続的な治療を受けることから恩恵を受けないことを裏付けるが、治療後に観察されるＩＬ−３３の好ましい濃度または量は、対象がさらなる治療または継続的な治療を受けることから恩恵を受けることを裏付ける。
【００６３】
一実施形態では、ＩＬ−３３阻害剤が組み込まれた治療を受ける対象からの試料において、開示される方法およびアッセイによって検出される、ＩＬ−３３の好ましくない濃度は、治療前の対象において測定されるレベルと同じまたはそれよりも高いＩＬ−３３のレベルである。一実施形態では、ＩＬ−３３阻害剤が組み込まれた治療を受ける対象からの試料において、開示される方法およびアッセイによって検出される、ＩＬ−３３の好ましい濃度は、治療前に対象からの試料で測定されるＩＬ−３３のレベルよりも低いＩＬ−３３のレベルである。
【００６４】
別の実施形態では、ＩＬ−３３を組み込む治療を受ける対象からの試料において、開示される方法およびアッセイを使用して検出される、ＩＬ−３３の好ましくない濃度は、治療前に対象からの試料において測定されるＩＬ−３３のレベルよりも低いレベルである。別の実施形態では、ＩＬ−３３を組み込んだ治療を受ける対象からの試料において、開示される方法およびアッセイを使用して検出される、ＩＬ−３３の好ましい濃度は、治療前の対象からの試料で測定されるＩＬ−３３のレベルよりも高いＩＬ−３３のレベルである。
【００６５】
循環ＩＬ−３３レベルの確認により、臨床試験の管理、および改善された患者ケアの提供が促進される。
【００６６】
ＩＩＩ．キット
試験試料中のＩＬ−３３（またはその断片）の存在、量または濃度について試験試料をアッセイするためのキットも提供される。このキットは、ＩＬ−３３（またはその断片）について試験試料をアッセイするための少なくとも１つの成分、およびＩＬ−３３（またはその断片）について試験試料をアッセイするための説明書を含む。
【００６７】
一実施形態では、キットは、上述の検出試薬、上述の捕捉試薬、固体支持体、他の試薬、およびアッセイを行うための書面による説明書を含む。検出試薬および捕捉試薬は、モノクローナル抗体（もしくはその、断片、バリアントもしくはバリアントの断片）、融合タンパク質、ＩＬ−３３トラップ、または任意選択で固相上に固定化されたアパタマーなど、上述と同じまたは異なるＩＬ−３３アンタゴニストであり得る。
【００６８】
検出試薬は、一般的に、化学発光標識などの検出可能な標識で標識される。検出試薬は、本明細書に記載の検出可能な標識、例えば、フルオロフォア、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識などを組み込むことができるか、またはキットは、検出可能な標識化を行うための試薬を含み得る。抗体、キャリブレータ、および／または対照は、別個の容器で提供され得るか、または適切なアッセイフォーマット、例えば、マイクロタイタープレートに予め分配され得る。一実施形態では、ＩＬ−３３検出試薬は、ルテニウムで標識される。
【００６９】
一部の実施形態では、このキットは、ビオチン標識捕捉試薬およびストレプトアビジンコーティングされた固体支持体、例えば、マイクロタイタープレートまたは電気化学発光プラットフォームを含有する。一部の実施形態では、捕捉試薬およびマイクロタイタープレートまたは電気化学発光プラットフォームは、別個の容器で提供される。他の実施形態では、このキットは、捕捉試薬でコーティングされたマイクロタイターまたは電気化学発光プラットフォームプレートを含有する。このキットはまた、試料を処理するための上述の酸性溶液および緩衝液も含有する。
【００７０】
本キットは、キャリブレータまたは対照、例えば、単離されたまたは精製されたＩＬ−３３を含み得る。キットは、アッセイを行うための少なくとも１つの容器（例えば、チューブ、マイクロタイタープレートもしくはストリップもしくは電気化学発光プラットフォーム）、および／またはアッセイ緩衝液もしくは洗浄緩衝液などの緩衝液を含み得、これらのいずれか１つは、濃縮溶液、検出可能な標識のための基質溶液（例えば、酵素標識）、または停止溶液として提供され得る。好ましくは、キットは、アッセイを行うために必要なすべての成分、すなわち、試薬、標準物質、緩衝液、希釈剤などを含む。説明書は、紙形式またはコンピュータ可読形式であり得る。
【００７１】
任意選択で、キットは、品質管理コンポーネント（例えば、感度パネル、キャリブレータ、および陽性対照）を含む。品質管理試薬の調製は、当該技術分野で周知であり、様々な免疫診断用製品の挿入シートに記載されている。感度パネルメンバーは、アッセイ性能特性を確立するために任意選択で使用され、さらに任意選択で、イムノアッセイキット試薬の完全性、およびアッセイの標準化の有用な指標である。
【００７２】
このキットはまた、任意選択で、診断アッセイを行うため、または緩衝液、塩、酵素、酵素補因子、酵素基質、検出試薬などの品質管理評価を容易にするために必要とされる他の試薬を含むことができる。試験試料（例えば、前処理試薬）の単離および／または処理のための緩衝液および緩衝溶液などの他の成分も、キットに含めることができる。本キットは、さらに、１つ以上の他の対照を含むことができる。キットの成分のうちの１つ以上は、凍結乾燥され得る。この場合、キットは、凍結乾燥された成分の再構成に好適な試薬をさらに含むことができる。
【００７３】
キットの様々な成分は、必要に応じて、好適な容器、例えば、マイクロタイタープレートに任意選択的で提供される。このキットは、試料（例えば、尿試料のための容器またはカートリッジ）を保持または保管するための容器をさらに含むことができる。適切な場合、キットは、任意選択で、反応容器、混合容器、および試薬または試験試料の調製を容易にする他の成分を含有することもできる。本キットはまた、シリンジ、ピペット、鉗子、測定スプーンなどの試験試料の取得を補助するための１つ以上の器具を含むことができる。
【実施例】
【００７４】
実施例Ｉ：アッセイフォーマット
図１は、ＩＬ−３３を検出するための例示的なアッセイの図である。ＩＬ−３３を定量するためのこの方法は、電気化学発光プラットフォーム上でのサンドイッチイムノアッセイである。本手順は、ストレプトアビジンコーティングされたマイクロプレートを使用し、ビオチン化抗ＩＬ−３３抗体を捕捉試薬として使用する。方法は、試料中に存在する可溶性リガンド：結合パートナー複合体を解離して、結合パートナー、例えば、抗ＩＬ−３３治療薬および／または可溶性ＳＴ２の存在下でのＩＬ−３３の検出を改善するための、血清試料の酸前処理を含み、このようにして、総ＩＬ−３３のレベルの定量測定を提供する。次いで、一実施形態ではＩＬ−３３への結合について可溶性ＳＴ２受容体及び薬物と競合し得る標識された抗ＩＬ−３３検出抗体を含有する塩基性溶液中で、酸性化試料を中和した。
【００７５】
使用することができる例示的な酸としては、酢酸、硫酸、および塩酸が挙げられるが、これらに限定されない。試料は、緩衝塩基性溶液、例えば、Ｔｒｉｓ溶液を使用して中和することができる。
【００７６】
使用することができる例示的なＩＬ−３３抗体は、参照によりその全体が組み込まれる米国特許第１０，０００，５６４号に記載されている。開示される方法において使用することができる他の抗ＩＬ−３３抗体としては、米国特許第９，７５８，５７８号および米国特許出願公開第２０１８／００３７６４４号に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
一実施形態では、標準物質、対照、および試料を、酢酸で希釈し、検出試薬、例えば、ルテニウム標識抗ヒトＩＬ−３３抗体を含有するＴｒｉｓ塩基溶液を使用して中和する。抗ＩＬ−３３抗体および抗ＳＴ２抗体も、薬物または内因性結合パートナーからの干渉を最小限に抑えるためにＴｒｉｓ溶液に添加される。次いで、中和した標準物質、対照、および試料をプレートに添加する。プレート上に捕捉されたＩＬ−３３は、プレートリーダーで、電圧がプレートに印加されるとルテニウム標識によって生成される化学発光シグナルによって測定される。得られる電気化学発光シグナル（すなわち、カウント）は、血清試料中に存在するＩＬ−３３の量に比例する。
【００７８】
実施例ＩＩ：内因性結合パートナー干渉の最小化
材料および方法
組換えヒトＳＴ２許容性を、アッセイの４つの異なる条件（後述）を使用して試験し、すべての条件の最初の（捕捉）ステップは、ビオチン化抗ＩＬ−３３モノクローナル抗体をストレプトアビジンプレートに添加することであった。
【００７９】
段階的進行で行うアッセイ（捕捉−分析物−検出、Ｃ−Ａ−Ｄ）のために、試料（分析物、ＩＬ−３３を含有する）をまず酸性溶液で希釈して、インキュベートさせた。次いで、プレートを洗浄し、さらに酸性化試料を塩基性中和緩衝液で希釈してから、アッセイプレートに添加した。試料インキュベーションの後、アッセイプレートを洗浄し、標識された検出モノクローナル抗体溶液を添加する。検出試薬インキュベーションの後、プレートを洗浄し、緩衝液を添加して、プレートを読み取る。このアッセイはまた、酸性化ステップなしで行ない、このアッセイでは、アッセイプレートに試料を添加する前に、試料をアッセイ緩衝液で希釈した。
【００８０】
分析物およびディテクターを同時に添加して行うアッセイ（Ｃ−ＡＤ）のために、まず試料を酸性溶液で希釈し、インキュベートさせた。プレートを洗浄し、次いで、酸性化試料を、標識された検出モノクローナル抗体を含有する塩基性中和緩衝液でさらに希釈してから、アッセイプレートに添加した。試料インキュベーションの後、プレートを洗浄し、緩衝液を添加して、プレートを読み取る。このアッセイはまた、酸性化ステップなしで行ない、このアッセイでは、試料をまずアッセイ緩衝液で希釈した後、標識された検出モノクローナル抗体を含有するアッセイ緩衝液で次の希釈を行い、その後、アッセイプレートに試料を添加した。
【００８１】
３６ｐｇ／ｍＬの組換えＩＬ−３３を、図２Ａに示すように、濃度を上昇させた組換え可溶性ＳＴ２の存在下で、上述のように、アッセイの４つの異なる条件下で試験した。
【００８２】
結果
酸処理は、組換えＳＴ２の存在下で組換えヒトＩＬ−３３を検出するために必要である。Ｃ−Ａ−Ｄアッセイに酸処理ステップを追加することで、ＳＴ２許容性を約１２ｎｇ／ｍＬに改善させ、酸処理とともにＣ−ＡＤアッセイフォーマットを使用することによって、さらにＳＴ２許容性を５０ｎｇ／ｍＬ超に改善させることができる（図２Ａ）。酸処理は、ヒト血清中の内因性ＩＬ−３３の検出を改善するためにも必要である。内因性ＩＬ−３３の検出は、Ｃ−Ａ−Ｄアッセイフォーマットと比較すると、内因性結合パートナーからのアッセイ干渉の低減のために、Ｃ−ＡＤアッセイフォーマットを使用して改善される（図２Ｂ）。
【００８３】
実施例ＩＩＩ：精度および特異性：内因性ＩＬ−３３
材料および方法
ＩＬ−３３に対するアッセイ特異性は、実施例ＩＩに記載の酸処理を伴うＣ−ＡＤアッセイで２つの異なる個体血清試料を分析することによって確認し、検出試薬を含有する塩基性中和溶液中の過剰な組換えヒトＳＴ２または２００μｇ／ｍＬの抗ＩＬ−３３抗体を添加、添加せずの両方で試験した。
【００８４】
２個体は、実施例ＩＩに記載の酸処理を伴うＣ−ＡＤアッセイを使用して試験した。データは、別々の５日間に行った４つの別個の反復測定を表す。
【００８５】
結果
このアッセイは、結合パートナー、例えば、組換えＳＴ２、または抗ＩＬ−３３モノクローナル抗体の中和溶液への添加がＩＬ−３３の検出を阻害するので、内因性ＩＬ−３３に特異的である。図３は、内因性ＩＬ−３３特異性を示す棒グラフである。
【００８６】
このアッセイは、個体１および３についてそれぞれ７．１および１２．３の変動係数（％ＣＶ）で許容される精度を示す。図４は、ヒト血清中の内因性ＩＬ−３３を定量する際のアッセイの精度を示すグラフである。
【００８７】
実施例ＩＶ：抗ＩＬ−３３モノクローナル抗体の存在下でのＩＬ−３３の検出（抗ＩＬ−３３モノクローナル抗体許容性）
材料および方法
図５は、抗ＩＬ−３３モノクローナル抗体の存在下でＩＬ−３３を検出する方法の許容性を示す折れ線グラフである。９０ｐｇ／ｍＬの組換えＩＬ−３３を、図５に示すように、濃度を上昇させた抗ＩＬ−３３モノクローナル抗体の存在下で、実施例ＩＩに記載の酸処理を伴うＣ−ＡＤ方法で試験した。このアッセイを、過剰な抗薬物モノクローナル抗体および抗ＳＴ２モノクローナル抗体を中和溶液に添加することによって改変した。
【００８８】
結果
酸処理は、抗ＩＬ−３３モノクローナル抗体の存在下でヒトＩＬ−３３を検出するために重要である。抗薬物モノクローナル抗体および抗ＳＴ２モノクローナル抗体の添加とともに、検出試薬を中和溶液に添加することで、アッセイ中の抗ＩＬ−３３モノクローナル抗体許容性を５００μｇ／ｍＬ超に改善する。
【００８９】
実施例Ｖ：正常な個体および疾患個体における内因性ＩＬ−３３レベル
材料および方法
４つの異なる集団からそれぞれ２５の個体を商業ベンダーから購入し、実施例ＩＩに記載の酸処理を用いたＣ−ＡＤアッセイを使用して、内因性ＩＬ−３３についてスクリーニングした。
【００９０】
結果
図６は、正常な個体ならびに喘息、ＣＯＰＤ、およびアトピー性皮膚炎を有する個体由来の血清中の内因性ＩＬ−３３（ｐｇ／ｍＬ）のグラフである。すべての試験個体は、３１ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ−３３濃度をもたらした。
【００９１】
実施例ＶＩ：ヒト化マウスデータ
材料および方法
ヒト化ＩＬ−３３マウスを、ヒトの呼吸器疾患のモデルとして、１５週間にわたってハウスダストマイト（ＨＤＭ）で処理した。例示的なヒト化ＩＬ−３３マウスは、参照によりその全体が組み込まれる米国特許公開第２０１７０３１１５８０号に開示されている。試料を、実施例ＩＶに記載の酸処理を用いたＣ−ＡＤアッセイの改変版で試験した。
【００９２】
結果
図７Ａおよび７Ｂは、処置されたマウスおよび対照マウス由来のヒトＩＬ−３３（ｐｇ／ｍＬ）を示す。生理食塩水対照、ＨＤＭ処置対照、およびアイソタイプ対照は、処置の終了時にヒトＩＬ−３３の同様のレベルを示した。抗ＩＬ−３３モノクローナル抗体を投与したマウスは、血清ＩＬ−３３レベルの顕著な増加を示した。
【００９３】
純血清中１２．５ｐｇ／ｍＬの感度を有する総ヒトＩＬ−３３アッセイが開発されている。まとめると、データは、酸処理ステップがＩＬ−３３内因性結合パートナーを除去するために重要であることを示す。検出抗体を中和溶液に添加することにより、組換え／内因性ＳＴ２許容性が向上する。このアッセイは、内因性ヒトＩＬ−３３に対する特異性を示している。抗ＩＬ−３３抗体を投与したＨＤＭ処置マウスは、薬物の半減期を想定した結合標的に起因するヒトＩＬ−３３の増加を示し、一方、ＨＤＭ対照およびアイソタイプ対照はベースラインのままであるように見えた。
【００９４】
上述の明細書において、本発明は、その特定の実施形態に関連して記載されており、多くの詳細は、例示の目的のために提示されたが、本発明は、追加の実施形態の影響を受けやすく、本明細書に記載の詳細のいくつかは、本発明の基本原則から逸脱することなく、かなり変動し得ることは、当業者には明らかであろう。
【００９５】
本明細書で引用されたすべての参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。本発明は、その趣旨または本質的な特性から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化されてもよく、したがって、前述の明細書ではなく、本発明の範囲を示す添付の特許請求の範囲を参照する必要がある。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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