(57)【要約】  ヒトを含め、動物の結腸への活性物質の送達によって、腸の健康に対する様々な利益が得られる。活性物質は、リボフラビン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、β−カロテン、ビタミンＢ１、ナイアシン、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビオチン、ビタミンＢ１２、ω−３脂肪酸及びこれらの組合せを含む。利益は、腸管内の少なくとも１つの短鎖脂肪酸若しくはその塩の濃度の増加、腸管内の微生物叢多様性の増加、腸管内の有益細菌の増加、腸管内の酪酸合成経路の増加、腸管のバリア機能の向上、腸管の酸化還元電位の低下、腸管内で生成されるガスの量の減少；及び腸管免疫応答の刺激を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトを含め動物の腸の健康の改善に使用するための、リボフラビン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、β−カロテン、ビタミンＢ１、ナイアシン、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビオチン、ビタミンＢ１２、ω−３脂肪酸及びこれらの組合せからなる群から選択される活性物質において、前記改善が、
ｉ．前記腸管内の少なくとも１つの短鎖脂肪酸若しくはその塩の濃度の増加、
ｉｉ．前記腸管内の微生物叢多様性の増加、
ｉｉｉ．前記腸管内の有益細菌の存在量の増加、
ｉｖ．前記腸管内の酪酸合成経路の促進又は増加、
ｖ．前記腸管のバリア機能の向上、
ｖｉ．前記腸管の酸化還元電位の低下、
ｖｉｉ．前記腸管内で生成されるガスの量の減少、及び／又は
ｖｉｉｉ．前記腸管免疫応答の刺激
を含むか、又はそれらから構成され、
ここで、前記使用は、前記動物に
ａ）有効量の活性物質を含む製剤であって、前記活性物質は、大腸に送達される、製剤；又は
ｂ）前記活性物質の少なくとも有効量が、前記動物の腸管内に存在するような、超生理学的用量の活性成分
を投与することを含み；
但し、ナイアシンが存在する場合、それは唯一の活性物質ではなく；リボフラビンが存在する場合、それは、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の量を増加する以外の改善効果を有する、活性物質。
【請求項２】
前記動物はヒトであり、前記活性物質の前記有効量が、遅延放出製剤により送達される、請求項１に記載の活性物質。
【請求項３】
前記改善が、前記腸管内の少なくとも１つの短鎖脂肪酸若しくはその塩の濃度の増加；又は、前記腸管内の酪酸合成経路の促進若しくは増加を含み；ここで、前記短鎖脂肪酸は、酢酸、プロピオン酸及び酪酸又はそれらの塩からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の活性物質。
【請求項４】
前記活性物質が、ビタミンＡ、β−カロテン、ビタミンＣ、リボフラビン、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、ω−３脂肪酸、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３に記載の活性物質。
【請求項５】
ヒトを含め、前記動物が、代謝障害、２型糖尿病、肥満、慢性炎症、及びアテローム形成からなる群から選択される状態を経験している、請求項３又は４に記載の活性物質。
【請求項６】
前記改善が、前記腸管内の微生物叢多様性の増加を含む、請求項１又は２に記載の活性物質。
【請求項７】
前記微生物叢多様性が増加する、及び／又は有益細菌の存在量が前記結腸内で増加する、請求項６に記載の活性物質。
【請求項８】
増加させる前記有益細菌が、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アッカーマンシア属（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｓｐ．）、バクテロイデス・オバータス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ブラウティア・プロダクタ（Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ）、クロストリジウム・コクレアータム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｃｌｅａｔｕｍ）、コリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）、ドレア・ロンジカテナ（Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）、ラクノスピラ・ペクチノシザ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ  ｐｅｃｔｉｎｏｓｈｉｚａ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、パラバクテロイデス・ディスタソニス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）、ラウルテラ属（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｓｐｐ．）、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項６又は７に記載の活性物質。
【請求項９】
増加させる前記細菌が、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アッカーマンシア属（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）、フィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びバクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）からなる群から選択される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の活性物質。
【請求項１０】
ヒトを含め、前記動物が、過敏性腸症候群、代謝疾患、肥満、及び炎症性疾患からなる群から選択される状態を経験している、請求項６〜９のいずれか１項に記載の活性物質。
【請求項１１】
前記物質が、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、β−カロテン、ビオチン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＤ、葉酸、ビタミンＫ、ω３脂肪酸、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の活性物質。
【請求項１２】
前記改善が、前記腸管のバリア機能の向上を含む、請求項１又は２に記載の活性物質。
【請求項１３】
ヒトを含め、前記動物が、過敏性腸症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸管壁浸漏、及び栄養不良からなる群から選択される状態を経験している、請求項１２に記載の活性物質。
【請求項１４】
前記活性物質が、ビタミンＢ２、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ω−３脂肪酸、ビタミンＤ、ビタミンＡ、葉酸、ビタミンＫ及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１２又は１３に記載の活性物質。
【請求項１５】
前記改善が、前記腸管の酸化還元電位の低下を含む、請求項１又は２に記載の活性物質。
【請求項１６】
前記酸化還元電位の低下によって、結腸内の絶対嫌気有益細菌の増殖の促進；腸管内の耐気性病原性生物の低減；プラズマフリーチオールの低減；腸管内の炎症の軽減；及び腸管内の炎症によって起こる腸管内の細胞損傷の低減からなる群から選択される利益がもたらされる、請求項１５に記載の活性物質。
【請求項１７】
前記活性物質が、ビタミンＣ、ビタミンＥ及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１５又は１６に記載の活性物質。
【請求項１８】
前記改善が、前記腸管内で生成されるガスの量の減少である、請求項１又は２に記載の活性物質。
【請求項１９】
前記活性物質が、ビタミンＢ２、ビタミンＣ、ビタミンＥ及びそれらの組合せである、請求項１８に記載の活性物質。
【請求項２０】
前記改善が、前記腸管の免疫応答の刺激である、請求項１又は２に記載の活性物質。
【請求項２１】
前記免疫応答が、ＧＲＯａ−ＣＸＣＬ１、ＭＩＰ３Ａ−ＣＣＬ２０、インターロイキン８、及びそれらの組合せからなる群から選択される、免疫応答分子の増加である、請求項２０に記載の活性物質。
【請求項２２】
前記活性物質が、ビタミンＢ２、ビタミンＥ、ビタミンＤ、ビタミンＡ、及びビタミンＫ、並びにそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２０又は２１に記載の活性物質。
【請求項２３】
ヒトを含め動物の腸の健康を改善する方法であって、前記改善が、
ｉ．前記腸管内の少なくとも１つの短鎖脂肪酸若しくはその塩の濃度の増加、
ｉｉ．前記腸管内の微生物叢多様性の増加、
ｉｉｉ．前記腸管内の有益細菌の存在量の増加、
ｉｖ．前記腸管内の酪酸合成経路の促進又は増加、
ｖ．前記腸管のバリア機能の向上、
ｖｉ．前記腸管の酸化還元電位の低下、
ｖｉｉ．前記腸管内で生成されるガスの量の減少、及び／又は
ｖｉｉｉ．前記腸管免疫応答の刺激
を含むか、又はそれらから構成され、
これは、リボフラビン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、β−カロテン、ビタミンＢ１、ナイアシン、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビオチン、ビタミンＢ１２、ω−３脂肪酸及びこれらの組合せからなる群から選択される活性物質を前記動物に投与することを含み、前記活性物質は、
ａ）有効量の前記活性物質を含む製剤であって、前記活性物質は大腸に送達される、製剤；又は
ｂ）少なくとも有効量の前記活性物質が、前記動物の腸管内に存在するような、超生理学的用量の活性成分
中に存在し；
但し、ナイアシンが存在する場合、それは唯一の活性物質ではなく；リボフラビンが存在する場合、それは、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の量を増加する以外の改善効果を有する、方法。
【請求項２４】
前記動物はヒトであり、前記活性物質が、前記腸管に送達される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記活性物質が、超生理学的用量中に存在する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記改善が、動物における少なくとも１つの短鎖脂肪酸の増加及び／又は前記酪酸合成経路活性の増加である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記動物が、代謝疾患、２型糖尿病、肥満、慢性炎症、及びアテローム形成からなる群から選択される状態を経験している、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ビタミンＡ、ビタミンＣ、リボフラビン、ビタミンＥ、葉酸、β−カロテン、ω−３脂肪酸及びこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの活性物質を投与することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記改善が、前記腸管内の微生物叢多様性の増加、又は前記腸管内の有益細菌の存在量の増加である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記活性物質が、ビタミンＢ１、リボフラビン、ビタミンＢ５、ビタミンＢ１２、β−カロテン、ビオチン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＤ、葉酸、ビタミンＫ、ω−３脂肪酸、及びこれらの組合せからなる群から選択され；但し、リボフラビンが活性物質である場合、それは、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の存在量の増加以外の目的のために存在する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ヒトを含め、それを必要とする動物の過敏性腸症候群、代謝疾患、肥満、若しくは炎症性疾患の症状を処置、予防、又は軽減する方法であって、これは、有益細菌を増大する量の活性物質を前記動物の結腸に投与することを含み；前記活性物質が、ビタミンＢ１、リボフラビン、ビタミンＢ５、ビタミンＢ１２、β−カロテン、ビオチン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＤ、葉酸、ビタミンＫ、ω３脂肪酸、及びそれらの組合せからなる群から選択され；但し、リボフラビンが活性物質である場合、それは、Ｆ．プラウスニッツイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の存在量の増加以外の目的のために存在する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記改善が、前記腸管の免疫応答の刺激である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
ヒトを含め、前記動物が、急性又は慢性炎症を経験している、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記活性物質が、リボフラビン、ビタミンＥ、ビタミンＡ、ビタミンＫ及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記改善が、前記腸管の酸化還元電位の低下であり、これによって、
前記結腸内の絶対嫌気有益細菌の増殖の促進；
前記腸管内の耐気性病原性生物の低減；
前記腸管内の炎症の軽減；及び
前記腸管内の炎症によって起こる前記腸管内の細胞損傷の低減
からなる群から選択される利益がもたらされる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記物質が、リボフラビン、ビタミンＣ、ビタミンＥ及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記改善が、前記腸管内で生成されるガスの処置、予防、又はその量の減少である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３８】
前記活性物質が、ビタミンＢ２、ビタミンＣ及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２３又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記改善が、腸管バリア機能の向上である、請求項２３に記載の方法。
【請求項４０】
前記バリア機能の向上が、過敏性腸症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸管壁浸漏及び栄養不良からなる群から選択される状態の症状を処置、予防又は軽減する方法である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記物質が、リボフラビン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ω−３脂肪酸、ビタミンＤ、ビタミンＡ、葉酸、ビタミンＫ及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、動物及びヒトの腸の健康を改善するための製剤に関する。特に、下部消化管内の短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の濃度を高める、及び／又は下部消化管内の酪酸合成経路を増大する目的で、本発明の製剤を使用することができる。本発明の製剤は、さらに、下部消化管内のビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アッカーマンシア属（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）及びフィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などの有益細菌の微生物叢多様性及び／若しくは存在量を増加させるか、又は調節する目的でも使用することができる。本発明はさらに、腸管のバリア機能を改善するため及び腸の免疫応答を刺激するための方法及び組成物にも関する。
［背景］
【０００２】
ヒト及び動物の微生物叢は、ヒト／動物身体上及び体内に生息する微生物の集合であり、最大且つ最も多様な微生物のクラスターは腸内に生息している。腸内微生物叢は、宿主と共に共進化しており、これによって微生物に安定した環境が提供され、また、微生物は、複雑な食物主要栄養素の消化、栄養素及びビタミン類の生成、病原体からの防御、並びに免疫系の維持といった多種多様な機能を宿主に提供する。最新のデータは、異常な腸内微生物叢組成が、免疫の衰え、アレルギー、代謝障害（２型糖尿病など）、及び免疫性腸疾患（ＩＢＤ）を含む様々な疾患に関連することを明らかにしている。微生物叢が、ヒトの健康及び疾患に影響を与えるメカニズムの１つは、疾患の発生に関連する有害な代謝産物又は疾患から防御する有益な代謝産物のいずれかを生成するその能力である。上部腸管内の宿主酵素による消化を免れる食物繊維だけではなく、タンパク質及びペプチドも、盲腸及び結腸内の微生物叢により代謝される。腸内細菌の発酵活性からの主要産物は、ＳＣＦＡ、とりわけ、酢酸塩、プロピオン酸塩、及び酪酸塩である。増大するエビデンス群によって、ヒト又は動物の腸管内のＳＣＦＡは、グルコース代謝などの宿主の代謝性能、免疫系、胃腸管の健全性及びバリア、並びに胃腸運動性を含む腸の健康全般に有益な作用を有することが示唆される。
【０００３】
国際公開第２００７／０５８５２３Ａ１号パンフレットは、腸管バリア健全性を改善し、バリア機能を向上させ、腸管成熟性を刺激し、且つ／又は腸管バリア透過性を低減するための栄養医薬組成物の製造を目的とするｎ−３ドコサペンタン酸の使用を記載している。
【０００４】
国際公開第２０１６／０５３０８５Ａ１号パンフレットには、便秘、通過時間（ｔｒａｎｓｉｔ  ｔｉｍｅ）機能障害又は結腸長さ異常の予防又は処置に使用するためのウリジン供給源及び酪酸塩生成繊維を含む組成物が記載されている。
【０００５】
米国特許出願公開第２０１０／２４７４８９Ａ１号明細書は、結腸内のガス形成を低減するためのタングステンなどの特定のミネラルを含む遅延放出組成物の使用を開示する。この組成物は、さらにビタミン類を、又は酢酸生成若しくは酪酸生成菌の株を含み得る。
【０００６】
Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．１２，２８０９−２８２４は、マウスを使用して、ピーナッツアレルギーにおける食物繊維の有益な役割を検証する。Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．は、この効果が、腸内微生物叢の再形成、並びに短鎖脂肪酸のレベル及び受容体ＧＰＲ４３及びＧＰＲ１０９ａの活性の増大を含むと報告している。
【０００７】
国際公開第２０１０／１１７２７４Ａ１号パンフレットは、Ｃ５及び／又はＣ６短鎖脂肪酸の生成を増大する炭水化物を記載する。
【０００８】
国際公開第２０１７／１８２３４７Ａ１号パンフレットには、ビタミンＢ３を含有するコアを含むマイクロカプセルが記載され、これは、２つのシェラック層と、２つのシェラック層の間に配置されるｐＨ調節物質とを含むコーティング層システムを特徴とする。
【０００９】
米国特許第９，４３３，５８３Ｂ２号明細書は、大腸線腫様ポリープ及び大腸癌の予防を目的とする、ビタミンＤ及び任意選択でさらに別のビタミンを含む大腸標的化単剤形を記載する。
【００１０】
国際公開第２０１４／０７００１４号パンフレットは、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の集団を刺激するためのリボフラビン（ビタミンＢ２）の使用を記載する。
【００１１】
［発明の概要］
本出願の発明者らは、腸内微生物叢が、特定の微量栄養素の存在下で、より多量のＳＣＦＡを生成することを見出した。加えて、酪酸合成経路の増加も観察された。さらなる試験において、微量栄養素はまた、腸内微生物叢多様性及び微生物の存在量を増加させ、腸管のバリア機能を改善すると共に、ガス生成を低減し得ることが判明した。従って、本発明は、下記の項目［１］〜［６７］に関する：
［１］  動物の腸の健康の改善に使用するための、請求項１に記載の活性物質；又は：
リボフラビン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、β−カロテン、ビタミンＢ１、ナイアシン、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビオチン、ビタミンＢ１２、ω−３脂肪酸及びこれらの組合せからなる群から選択される活性物質であって、前記改善が、以下：
（ｉ）腸管内の少なくとも１つの短鎖脂肪酸若しくはその塩の濃度の増加、
（ｉｉ）腸管内の微生物叢多様性の増加、
（ｉｉｉ）腸管内の微生物叢存在量の増加、
（ｉｖ）腸管内の酪酸合成経路の促進又は増加、
（ｖ）腸管のバリア機能の向上、
（ｖｉ）腸管の酸化還元電位の低下、
（ｖｉｉ）腸管内で生成されるガスの量の減少、及び／若しくは
（ｖｉｉｉ）腸管免疫応答の刺激
を含むか、又はそれらから構成され、
ここで、前記使用は、有効用量の活性物質を含む遅延放出製剤を動物に投与することを含み、前記活性物質の放出は、腸、好ましくは大腸まで遅延される、活性物質。
【００１２】
［２］  前記改善が、腸管内の少なくとも１つの短鎖脂肪酸若しくはその塩の濃度の増加を含むか、又はそれから構成され、前記少なくとも１つの短鎖脂肪酸が、酪酸、酢酸、プロピオン酸及びそれらの組合せからなる群から選択される、項目［１］に記載の使用のための活性物質。
【００１３】
［３］  前記少なくとも１つの短鎖脂肪酸が、酪酸である、項目［２］に記載の使用のための活性物質。
【００１４】
［４］  前記少なくとも１つの短鎖脂肪酸が、酢酸である、項目［２］に記載の使用のための活性物質。
【００１５】
［５］  前記少なくとも１つの短鎖脂肪酸が、プロピオン酸である、項目［２］に記載の使用のための活性物質。
【００１６】
［６］  前記使用が、下部消化管内の１つ若しくは複数のＳＣＦＡの低濃度に関連する障害の処置又は予防を含むか、又はそれらから構成される、先行する項目のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００１７】
［７］  前記下部消化管内の１つ又は複数のＳＣＦＡの低濃度に関連する障害が、炎症性疾患である、項目［６］に記載の使用のための活性物質。
【００１８】
［８］  前記炎症性疾患が、慢性炎症を特徴とする、項目［７］に記載の使用のための活性物質。
【００１９】
［９］  前記下部消化管内の１つ又は複数のＳＣＦＡの低濃度に関連する障害が、アテローム形成である、項目［６］に記載の使用のための活性物質。
【００２０】
［１０］  前記下部消化管内の１つ又は複数のＳＣＦＡの低濃度に関連する障害が、代謝障害である、項目［６］に記載の使用のための活性物質。
【００２１】
［１１］  前記代謝障害が、２型糖尿病及び／又は肥満である、項目［１０］に記載の使用のための活性物質。
【００２２】
［１２］  前記改善が、腸管内の微生物叢多様性の増加を含むか、又はそれから構成される、項目［１］に記載の使用のための活性物質。
【００２３】
［１３］  前記使用が、腸管内の不十分な微生物叢多様性に関連する障害を処置又は予防することを含むか、又はそれらから構成される、項目［１２］に記載の使用のための活性物質。
【００２４】
［１４］  前記改善が、ヒト腸管内のビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アッカーマンシア属（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）及びフィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選択される少なくとも１種の微生物の存在量を増加することを含むか、又はそれから構成される、項目［１］に記載の使用のための活性物質。
【００２５】
［１５］  前記使用が、ヒト腸管内の不十分なビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アッカーマンシア属（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）及びフィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に関連する障害、例えば、ＩＢＤ、肥満及び２型糖尿病を含む代謝疾患、及びその他の炎症性疾患を処置又は予防することを含むか、又はそれらから構成される、項目［１４］に記載の使用のための活性物質。
【００２６】
［１６］  前記改善が、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）、及びフィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選択される少なくとも１種の微生物の存在量を増加することを含むか、又はそれらから構成される、項目［１］に記載の使用のための活性物質。
【００２７】
［１７］  前記改善が、腸管内の酪酸合成経路を促進又は増加することを含むか、又はそれらから構成される、項目［１］に記載の使用のための活性物質。
【００２８】
［１８］  前記使用が、腸管内の不十分な酪酸合成経路に関連する障害を処置又は予防することを含むか、又はそれらから構成される、項目［１７］に記載の使用のための活性物質。
【００２９】
［１９］  動物、好ましくは哺乳動物の腸管のバリア機能損傷に関連する状態の治療又は予防に使用するための、リボフラビン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、β−カロテン、ビタミンＢ１、ナイアシン、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビオチン、ビタミンＢ１２、ω−３脂肪酸及びそれらの組合せからなる群から選択される活性物質であって、前記使用は、有効用量の活性物質を含む遅延放出製剤を動物に投与することを含み、前記活性物質の放出は、大腸まで遅延される、活性物質。
【００３０】
［２０］  動物の前記腸管のバリア機能損傷に関連する前記状態が、腸管壁浸漏を特徴とする、項目［１９］に記載の使用のための活性物質。
【００３１】
［２１］  前記腸管のバリア機能損傷に関連する前記状態が、栄養不良に起因する、項目［１９］又は［２０］に記載の使用のための活性物質。
【００３２】
［２２］  動物の前記腸管のバリア機能損傷に関連する前記状態が、炎症性腸疾患である、項目［１９］又は［２０］に記載の使用のための活性物質。
【００３３】
［２３］  前記炎症性腸疾患が、クローン病である、項目［２２］に記載の使用のための活性物質。
【００３４】
［２４］  前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎である、項目［２２］に記載の使用のための活性物質。
【００３５】
［２５］  前記動物が、単胃動物である、項目［１９］に記載の使用のための活性物質。
【００３６】
［２６］  前記動物が、家禽又はブタである、項目［１９］に記載の使用のための活性物質。
【００３７】
［２７］  前記遅延放出製剤が、持続放出製剤である、項目［１］〜［２６］のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００３８】
［２８］  前記活性物質の放出が、大腸まで遅延される、項目［１］〜［２６］のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００３９】
［２９］  前記活性物質の放出が、結腸まで遅延される、項目［１］〜［２６］のいずれか１つに記載の活性物質。
【００４０】
［３０］  前記活性物質が、リボフラビンから構成される、項目［１］〜［２９］のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００４１】
［３１］  前記活性物質が、ビタミンＡから構成される、項目［１］〜［２９］のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００４２】
［３２］  前記活性物質が、ビタミンＣから構成される、項目［１］〜［２９］のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００４３】
［３３］  前記活性物質が、ビタミンＤから構成される、項目［１］〜［２９］のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００４４】
［３４］  前記活性物質が、ビタミンＥから構成される、項目［１］〜［２９］のいずれか１つに記載の活性物質。
【００４５】
［３５］  前記活性物質が、ビタミンＫから構成される、項目［１］〜［２９］のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００４６】
［３６］  前記活性物質が、葉酸から構成される、項目［１］〜［２９］のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００４７】
［３７］  前記活性物質が、β−カロテンから構成される、項目［１］〜［２９］のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００４８】
［３８］  前記活性物質が、ビタミンＢ１から構成される、項目［１］〜［２９］のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００４９】
［３９］  前記活性物質が、ナイアシンから構成される、項目［１］〜［２９］のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００５０】
［４０］  前記活性物質が、ビタミンＢ５から構成される、項目［１］〜［２９］のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００５１】
［４１］  前記活性物質が、ビタミンＢ６から構成される、項目［１］〜［２９］のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００５２】
［４２］  前記活性物質が、ビオチンから構成される、項目［１］〜［２９］のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００５３】
［４３］  前記活性物質が、ビタミン１２から構成される、項目［１］〜［２９］のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００５４】
［４４］  前記活性物質が、少なくとも１種のω−３脂肪酸から構成される、項目［１］〜［２９］のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００５５】
［４５］  前記活性物質が、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタン酸（ＥＰＡ）、又はそれらの組合せから構成される、項目［４４］に記載の使用のための活性物質。
【００５６】
［４６］  前記活性物質が、ＤＨＡから構成される、項目［４４］に記載の使用のための活性物質。
【００５７】
［４７］  前記活性物質が、ＥＰＡから構成される、項目［４４］に記載の使用のための活性物質。
【００５８】
［４８］  前記活性物質が、ＤＨＡ及びＥＰＡの組合せから構成される、項目［４４］に記載の使用のための活性物質。
【００５９】
［４９］  前記活性物質が、リボフラビン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、β−カロテン、ビタミンＢ１、ナイアシ、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビオチン、ビタミンＢ１２、ＤＨＡ及びＥＰＡの組合せから構成される、項目［１］〜［２９］のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００６０】
［５０］  前記活性物質が、体重１ｋｇ当たり最大２．９ｍｇのリボフラビン、体重１ｋｇ当たり最大４２．９μｇのビタミンＡ、体重１ｋｇ当たり最大３．６μｇのビタミンＤ、体重１ｋｇ当たり最大２８．６ｍｇのビタミンＣ、体重１ｋｇ当たり最大１４．３ｍｇのビタミンＥ、体重１ｋｇ当たり最大１４３μｇのビタミンＫ、体重１ｋｇ当たり最大１４．３μｇの葉酸、体重１ｋｇ当たり最大０．４ｍｇのβ−カロテン、最大１．４ｍｇのビタミンＢ１、最大２１．４ｍｇのナイアシン、最大１４．３ｍｇのビタミンＢ５、最大１．４ｍｇのビタミンＢ６、最大３５．７μｇのビオチン、最大４３μｇのビタミンＢ１２、７１．４ｍｇのω−３脂肪酸又はそれらの組合せの１日量で、前記動物、好ましくは哺乳動物に投与され、ここで、好ましくは、ＥＰＡは体重１ｋｇ当たり最大２５．７ｍｇであり、ＤＨＡは体重１ｋｇ当たり最大１４．３ｍｇである、先行する項目のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００６１】
［５１］  活性物質を腸管に送達するための遅延放出製剤であって、前記活性物質と腸溶層又は腸溶シェルとを含み、ここで、前記活性物質は、最大２００ｍｇのリボフラビン、最大３０００μｇのビタミンＡ、最大２０００ｍｇのビタミンＣ、最大２５０μｇのビタミンＤ、最大１０００ｍｇのビタミンＥ、最大１０ｍｇのビタミンＫ、最大１ｍｇの葉酸、最大２５ｍｇのβ−カロテン、最大１００ｍｇのビタミンＢ１、最大１５００ｍｇのナイアシン、最大１０００ｍｇのビタミンＢ５、最大１００ｍｇのビタミンＢ６、最大２５００μｇのビオチン、最大３０００μｇのビタミンＢ１２、最大５０００ｍｇのω−３脂肪酸又はそれらの組合せから構成され、ここで、好ましくは、ＥＰＡは最大１８００ｍｇであり、ＤＨＡは最大１０００ｍｇであり、前記活性物質の放出が腸管まで遅延される、遅延放出製剤。
【００６２】
［５２］  活性物質を腸管に送達するための遅延放出製剤であって、前記活性物質と腸溶層又は腸溶シェルとを含み、ここで、前記活性物質は、１〜８５ｍｇのリボフラビン、０．２〜０．４ｍｇのビタミンＡ、４００〜６００ｍｇのビタミンＣ、５〜８０μｇのビタミンＤ、８０〜１２０ｍｇのビタミンＥ、８０〜１４０μｇのビタミンＫ、０．３〜０．５ｍｇの葉酸、８０〜１２０ｍｇのω−３脂肪酸又はそれらの組合せから構成され、前記活性物質の放出が腸管まで遅延される、遅延放出製剤。
【００６３】
［５３］  前記活性物質が、７０〜８０ｍｇのリボフラビン、０．２５〜０．３５ｍｇのビタミンＡ、４５０〜５５０ｍｇのビタミンＣ、１５〜２５μｇのビタミンＤ、９０〜１１０ｍｇのビタミンＥ、１００〜１２０μｇのビタミンＫ、０．３５〜０．４５ｍｇの葉酸、９０〜１１０ｍｇのω−３脂肪酸又はそれらの組合せから構成される、項目［５１］又は［５２］に記載の遅延放出製剤。
【００６４】
［５４］  前記活性物質放出が、結腸まで遅延される、項目［５１］〜［５３］のいずれか１つに記載の組成物。
【００６５】
［５５］  腸管の障害又は病状に罹患していない動物、好ましくは哺乳動物、単胃動物、若しくは家禽の腸管の状態又は健康を改善するための、リボフラビン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、β−カロテン、ビタミンＢ１、ナイアシ、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビオチン、ビタミンＢ１２、ω−３脂肪酸及びそれらの組合せからなる群から選択される活性物質の非治療的使用。
【００６６】
［５６］  前記哺乳動物が、健康なヒトである、項目［５５］に記載の非治療的使用。
【００６７】
［５７］  前記哺乳動物が、健康な成人である、項目［５５］に記載の非治療的使用。
【００６８】
［５８］  前記改善が、腸管内の少なくとも１種の短鎖脂肪酸若しくはその塩の濃度の増加を含むか、又はそれから構成される、項目［５５］〜［５７］のいずれか１つに記載の非治療的使用。
【００６９】
［５９］  前記改善が、腸管内の微生物叢多様性の増加を含むか、又はそれから構成される、項目［５５］〜［５７］のいずれか１つに記載の非治療的使用。
【００７０】
［６０］  前記改善が、腸管内のビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アッカーマンシア属（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）及び／若しくはフィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の増加を含むか、又はそれから構成される、項目［５５］〜［５７］のいずれか１つに記載の非治療的使用。
【００７１】
［６１］  前記改善が、腸管内の酪酸合成経路の促進若しくは増加を含むか、又はそれから構成される、項目［５５］〜［５７］のいずれか１つに記載の非治療的使用。
【００７２】
［６２］  前記改善が、腸管のバリア機能の向上を含むか、又はそれから構成され、ここで、前記活性物質は、ω−３脂肪酸を含まない、項目［５５］〜［５７］のいずれか１つに記載の非治療的使用。
【００７３】
［６３］  前記活性物質が、ビタミンＤ３を含まない、項目［５５］〜［６２］のいずれか１つに記載の非治療的使用。
【００７４】
［６４］  前記活性物質が、ω−３脂肪酸を含まない、項目［５５］〜［６３］のいずれか１つに記載の非治療的使用。
【００７５】
［６５］  健康な哺乳動物の消化管機能の維持又は改善のための、リボフラビン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、β−カロテン、ビタミンＢ１、ナイアシン、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビオチン、ビタミンＢ１２、ω−３脂肪酸及びそれらの組合せからなる群から選択される活性物質の非治療的使用。
【００７６】
［６６］  動物の腸管の健康を改善する方法であって、前記改善が、以下：
（ｉ）腸管内の少なくとも１つの短鎖脂肪酸若しくはその塩の濃度の増加、
（ｉｉ）腸管内の微生物叢多様性の増加、
（ｉｉｉ）腸管内の微生物叢存在量の増加、
（ｉｖ）腸管内の酪酸合成経路の促進又は増加、
（ｖ）腸管のバリア機能の向上、
（ｖｉ）腸管の酸化還元電位の低下、及び／若しくは
（ｖｉｉ）腸管内で生成されるガスの量の減少、
を含むか、又はそれらから構成され、
有効用量の前記活性物質を含む遅延放出製剤を前記動物に投与することを含み、ここで、前記活性物質の放出は、腸管まで遅延されるか、又は超生理学的用量の活性物質を含む飼料であり、有効量で腸管内に存在し；
前記活性物質が、以下：リボフラビン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、β−カロテン、ビタミンＢ１、ナイアシン、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビオチン、ビタミンＢ１２、ω−３脂肪酸及びそれらの組合せからなる群から選択される、方法。
【００７７】
［６７］  リボフラビン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、β−カロテン、ビタミンＢ１、ナイアシン、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビオチン、ビタミンＢ１２、ω−３脂肪酸及びそれらの組合せからなる群から選択される活性物質を超生理学的用量で含む家禽又は非ヒト用飼料であって、十分な量の前記活性物質が、腸管内に存在する、家禽又は非ヒト用飼料。
【００７８】
本発明は、さらに下記の実施形態に関する：
（１）哺乳動物の腸管内の少なくとも１種の短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）又はその塩の濃度増加に使用するための、リボフラビン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、β−カロテン、ビタミンＢ１、ナイアシン、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビオチン、ビタミンＢ１２、ω−３脂肪酸及びそれらの組合せからなる群から選択される活性物質であって、前記使用が、有効量の前記活性物質を含む遅延放出製剤を前記哺乳動物に投与することを含み、ここで、前記活性物質の放出が腸管まで遅延される、活性物質。
【００７９】
（２）前記少なくとも１種の短鎖脂肪酸が、酪酸、酢酸、プロピオン酸及びそれらの組合せからなる群から選択される、実施形態（１）に記載の使用のための活性物質。
【００８０】
（３）前記少なくとも１種の短鎖脂肪酸が、酪酸である、実施形態（２）に記載の使用のための活性物質。
【００８１】
（４）前記少なくとも１種の短鎖脂肪酸が、酢酸である、実施形態（２）に記載の使用のための活性物質。
【００８２】
（５）前記少なくとも１種の短鎖脂肪酸が、プロピオン酸である、実施形態（２）に記載の使用のための活性物質。
【００８３】
（６）前記使用が、下部消化管内の１つ若しくは複数のＳＣＦＡの低濃度に関連する障害の処置若しくは予防を含むか、又はそれらから構成される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００８４】
（７）前記下部消化管内の１つ又は複数のＳＣＦＡの低濃度に関連する障害が、炎症性疾患である、実施形態（６）に記載の使用のための活性物質。
【００８５】
（８）前記炎症性疾患が、慢性炎症を特徴とする、実施形態（７）に記載の使用のための活性物質。
【００８６】
（９）前記下部消化管内の１つ又は複数のＳＣＦＡの低濃度に関連する障害が、アテローム形成である、実施形態（６）に記載の使用のための活性物質。
【００８７】
（１０）前記下部消化管内の１つ又は複数のＳＣＦＡの低濃度に関連する障害が、代謝障害である、実施形態（６）に記載の使用のための活性物質。
【００８８】
（１１）哺乳動物の腸管のバリア機能損傷に関連する状態の処置又は予防に使用するための、リボフラビン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、ω−３脂肪酸及びそれらの組合せからなる群から選択される活性物質であって、前記使用が、有効量の前記活性物質を含む遅延放出製剤を前記哺乳動物に投与することを含み、ここで、前記活性物質の放出が腸管まで遅延される、活性物質。
【００８９】
（１２）哺乳動物の前記腸管のバリア機能損傷に関連する前記状態が、腸管壁浸漏を特徴とする、実施形態（１２）に記載の使用のための活性物質。
【００９０】
（１３）前記腸管のバリア機能損傷に関連する前記状態が、栄養不良に起因する、実施形態（１２）又は（１３）に記載の使用のための活性物質。
【００９１】
（１４）動物の前記腸管のバリア機能損傷に関連する前記状態が、炎症性腸疾患である、実施形態（１２）又は（１３）に記載の使用のための活性物質。
【００９２】
（１５）前記炎症性腸疾患が、クローン病である、実施形態（１５）に記載の使用のための活性物質。
【００９３】
（１６）前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎である、実施形態（１５）に記載の使用のための活性物質。
【００９４】
（１７）前記遅延放出製剤が、持続放出製剤である、実施形態（１）〜（１７）のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００９５】
（１８）前記活性物質の放出が、大腸まで遅延される、実施形態（１）〜（１７）のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００９６】
（１９）前記活性物質の放出が、結腸まで遅延される、実施形態（１）〜（１７）のいずれか１つに記載の活性物質。
【００９７】
（２０）前記活性物質が、リボフラビンから構成される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００９８】
（２１）前記活性物質が、ビタミンＡから構成される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【００９９】
（２２）前記活性物質が、ビタミンＣから構成される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【０１００】
（２３）前記活性物質が、ビタミンＤから構成される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【０１０１】
（２４）前記活性物質が、ビタミンＥから構成される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の活性物質。
【０１０２】
（２５）前記活性物質が、ビタミンＫから構成される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【０１０３】
（２６）前記活性物質が、葉酸から構成される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【０１０４】
（２７）前記活性物質が、少なくとも１種のω−３脂肪酸から構成される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【０１０５】
（２８）前記活性物質が、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタン酸（ＥＰＡ）、又はそれらの組合せから構成される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【０１０６】
（２９）前記活性物質が、ＤＨＡから構成される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【０１０７】
（３０）前記活性物質が、ＥＰＡから構成される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【０１０８】
（３１）前記活性物質が、ＤＨＡ及びＥＰＡの組合せから構成される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【０１０９】
（３２）前記活性物質が、リボフラビン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、β−カロテン、ビタミンＢ１、ナイアシン、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビオチン、ビタミンＢ１２、ＤＨＡ及びＥＰＡの組合せから構成される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【０１１０】
（３３）前記活性物質が、体重１ｋｇ当たり０．０１〜１．２ｍｇのリボフラビン、体重１ｋｇ当たり２．９〜５．７μｇのビタミンＡ、体重１ｋｇ当たり０．１〜１．１μｇのビタミンＤ、体重１ｋｇ当たり０．２〜１．７ｍｇのビタミンＥ、体重１ｋｇ当たり１．１〜２．０μｇのビタミンＫ、体重１ｋｇ当たり４．３〜７．１μｇの葉酸、体重１ｋｇ当たり１．１〜１．７ｍｇのω−３脂肪酸又はそれらの組合せの１日量で、前記哺乳動物に投与される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【０１１１】
（３４）前記活性物質が、体重１ｋｇ当たり１．０〜１．１ｍｇのリボフラビン、体重１ｋｇ当たり３．６〜５．０μｇのビタミンＡ、体重１ｋｇ当たり０．２〜０．４μｇのビタミンＤ、体重１ｋｇ当たり１．３〜１．６ｍｇのビタミンＥ、体重１ｋｇ当たり１．４〜１．７μｇのビタミンＫ、体重１ｋｇ当たり５．０〜６．４μｇの葉酸、体重１ｋｇ当たり１．３〜１．６ｍｇのω−３脂肪酸、又はそれらの組合せの１日量で、前記哺乳動物に投与される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の使用のための活性物質。
【０１１２】
（３５）活性物質を腸管に送達するための遅延放出製剤であって、前記活性物質と腸溶コーティングとを含み、ここで、前記活性物質は、１〜８５ｍｇのリボフラビン、０．２〜０．４ｍｇのビタミンＡ、４００〜６００ｍｇのビタミンＣ、５〜８０μｇのビタミンＤ、８０〜１２０ｍｇのビタミンＥ、８０〜１４０μｇのビタミンＫ、０．３〜０．５ｍｇの葉酸、８０〜１２０ｍｇのω−３脂肪酸又はそれらの組合せから構成され、ここで、前記活性物質の放出が腸管まで遅延される、遅延放出製剤。
【０１１３】
（３６）前記活性物質が、７０〜８０ｍｇのリボフラビン、０．２５〜０．３５ｍｇのビタミンＡ、４５０〜５５０ｍｇのビタミンＣ、１５〜２５μｇのビタミンＤ、９０〜１１０ｍｇのビタミンＥ、１００〜１２０μｇのビタミンＫ、０．３５〜０．４５ｍｇの葉酸、９０〜１１０ｍｇのω−３脂肪酸又はそれらの組合せから構成される、実施形態（３６）に記載の遅延放出製剤。
【０１１４】
（３７）前記遅延放出製剤が、持続放出製剤である、実施形態（３６）又は（３７）に記載の遅延放出製剤。
【０１１５】
（３８）前記活性物質の放出が、大腸、好ましくは結腸まで遅延される、実施形態（３６）又は（３７）に記載の遅延放出製剤。
【０１１６】
（３９）前記活性物質の放出が、結腸まで遅延される、実施形態（３６）又は（３７）に記載の遅延放出製剤。
【０１１７】
（４０）唯一の活性物質としてリボフラビンを含む、実施形態（３６）〜（４０）のいずれか１つに記載の遅延放出製剤。
【０１１８】
（４１）唯一の活性物質としてビタミンＡを含む、実施形態（３６）〜（４０）のいずれか１つに記載の遅延放出製剤。
【０１１９】
（４２）唯一の活性物質としてビタミンＣを含む、実施形態（３６）〜（４０）のいずれか１つに記載の遅延放出製剤。
【０１２０】
（４３）唯一の活性物質としてビタミンＤを含む、実施形態（３６）〜（４０）のいずれか１つに記載の遅延放出製剤。
【０１２１】
（４４）唯一の活性物質としてビタミンＥを含む、実施形態（３６）〜（４０）のいずれか１つに記載の遅延放出製剤。
【０１２２】
（４５）唯一の活性物質としてビタミンＫを含む、実施形態（３６）〜（４０）のいずれか１つに記載の遅延放出製剤。
【０１２３】
（４６）唯一の活性物質として葉酸を含む、実施形態（３６）〜（４０）のいずれか１つに記載の遅延放出製剤。
【０１２４】
（４７）唯一の活性物質としてβ−カロテンを含む、実施形態（３６）〜（４０）のいずれか１つに記載の遅延放出製剤。
【０１２５】
（４８）唯一の活性物質としてビタミンＢ１を含む、実施形態（３６）〜（４０）のいずれか１つに記載の遅延放出製剤。
【０１２６】
（４９）唯一の活性物質としてナイアシンを含む、実施形態（３６）〜（４０）のいずれか１つに記載の遅延放出製剤。
【０１２７】
（５０）唯一の活性物質としてビタミンＢ５を含む、実施形態（３６）〜（４０）のいずれか１つに記載の遅延放出製剤。
【０１２８】
（５１）唯一の活性物質としてビタミンＢ６を含む、実施形態（３６）〜（４０）のいずれか１つに記載の遅延放出製剤。
【０１２９】
（５２）唯一の活性物質としてビオチンを含む、実施形態（３６）〜（４０）のいずれか１つに記載の遅延放出製剤。
【０１３０】
（５３）唯一の活性物質としてビタミンＢ１２を含む、実施形態（３６）〜（４０）のいずれか１つに記載の遅延放出製剤。
【０１３１】
（５４）唯一の活性物質として１つ又は複数のω−３脂肪酸を含む、実施形態（３６）〜（４０）のいずれか１つに記載の遅延放出製剤。
【０１３２】
（５５）腸管の障害又は病状に罹患していない哺乳動物の腸管内の少なくとも１種の短鎖脂肪酸若しくはその塩の濃度を増加するための、リボフラビン、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、β−カロテン、ビタミンＢ１、ナイアシン、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビオチン、ビタミンＢ１２、ω−３脂肪酸及びそれらの組合せからなる群から選択される活性物質の非治療的使用。
【０１３３】
（５６）前記哺乳動物が、健康なヒトである、実施形態（４９）に記載の非治療的使用。
【０１３４】
（５７）健康な哺乳動物の腸管機能を維持する、又は向上させるための、リボフラビン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、β−カロテン、ビタミンＢ１、ナイアシン、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビオチン、ビタミンＢ１２、ω−３脂肪酸及びそれらの組合せからなる群から選択される活性物質の非治療的使用。
【０１３５】
（５８）前記哺乳動物が、ヒトである、実施形態（５１）に記載の非治療的使用。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】水溶液（上）又はエタノールへの溶解（下）のいずれかとして、異なる試験製剤の投与から４８ｈ発酵後の酢酸塩生成を示す。各種ストック溶液の陰性対照も加えた。ＲＴＧ＝リボフラビンテーブルグレード、Ｒ５Ｐ＝リボフラビン−５−リン酸、ＡＡ＝アスコルビン酸、ＲＴＧ＋ＡＡ＝リボフラビンテーブルグレード＋アスコルビン酸、ＦＡ＝葉酸、ＶＫ１＝ビタミンＫ１、００８０ＥＥ＝ＤＨＡ、４５３５ＥＥ＝ＤＨＡ＋ＥＰＡ、８０００ＥＥ＝ＥＰＡ。各化合物は、３つの用量（０．２×、１×及び５×）で試験した（表１）。
【図２】水溶液（上）又はエタノールへの溶解（下）のいずれかとして、異なる試験製剤の投与から４８ｈ発酵後のプロピオン酸塩生成を示す。各種ストック溶液の陰性対照も加えた。ＲＴＧ＝リボフラビンテーブルグレード、Ｒ５Ｐ＝リボフラビン−５−リン酸、ＡＡ＝アスコルビン酸、ＲＴＧ＋ＡＡ＝リボフラビンテーブルグレード＋アスコルビン酸、ＦＡ＝葉酸、ＶＫ１＝ビタミンＫ１、００８０ＥＥ＝ＤＨＡ、４５３５ＥＥ＝ＤＨＡ＋ＥＰＡ、８０００ＥＥ＝ＥＰＡ。各化合物は、３つの用量（０．２×、１×及び５×）で試験した（表１）。
【図３】水溶液（上）又はエタノールへの溶解（下）のいずれかとして、異なる試験製剤の投与から４８ｈ発酵後の酪酸塩生成を示す。各種ストック溶液の陰性対照も加えた。ＲＴＧ＝リボフラビンテーブルグレード、Ｒ５Ｐ＝リボフラビン−５−リン酸、ＡＡ＝アスコルビン酸、ＲＴＧ＋ＡＡ＝リボフラビンテーブルグレード＋アスコルビン酸、ＦＡ＝葉酸、ＶＫ１＝ビタミンＫ１、００８０ＥＥ＝ＤＨＡ、４５３５ＥＥ＝ＤＨＡ＋ＥＰＡ、８０００ＥＥ＝ＥＰＡ。各化合物は、３つの用量（０．２×、１×及び５×）で試験した（表１）。
【図４】水溶液（上）又はエタノールへの溶解（下）のいずれかとして、異なる試験製剤の投与から４８ｈ発酵後の全ＳＣＦＡ生成を示す。各種ストック溶液の陰性対照も加えた。ＲＴＧ＝リボフラビンテーブルグレード、Ｒ５Ｐ＝リボフラビン−５−リン酸、ＡＡ＝アスコルビン酸、ＲＴＧ＋ＡＡ＝リボフラビンテーブルグレード＋アスコルビン酸、ＦＡ＝葉酸、ＶＫ１＝ビタミンＫ１、００８０ＥＥ＝ＤＨＡ、４５３５ＥＥ＝ＤＨＡ＋ＥＰＡ、８０００ＥＥ＝ＥＰＡ。各化合物は、３つの用量（０．２×、１×及び５×）で試験した（表１）。
【図５】トランスウェルプレート内で共培養したＣａｃｏ−２及び杯細胞の概略図である。経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の測定値は、分極細胞間に形成された密着結合の健全性に関する情報を提供する。「腸管壁浸漏」は、腸管透過性の増加を特徴とし、細胞にストレスを与えることによりインビトロで達成することができる。頂端面（ａｐｉｃａｌ）又は側底面（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ）ストレス因子の添加により、対照細胞と比較して、ＴＥＥＲの有意な時間依存性低下及びルシファーイエロー傍細胞流動速度の増大が起こる。
【図６】健康な腸細胞モデルにおける腸健全性に対するビタミン類及びω−３脂肪酸の影響を示す。数値は、４８ｈ発酵サンプルで処理した細胞の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）と０ｈ発酵サンプルで処理した細胞のＴＥＥＲとの差として表される。各化合物は、３つの用量（０．２×、１×及び５×）で試験した（表１）。
【図７】腸管壁浸漏細胞モデルの側底面誘導における腸健全性に対するビタミン類及びω−３脂肪酸の影響を示す。数値は、４８ｈ発酵サンプルで処理した細胞の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）／ルシファーイエローと０ｈ発酵サンプルで処理した細胞のＴＥＥＲ／ルシファーイエローとの差として表される。各化合物は、３つの用量（０．２×、１×及び５×）で試験した（表１）。
【図８】腸管壁浸漏細胞モデルの頂端面誘導における腸健全性に対するビタミン類及びω−３脂肪酸の影響を示す。数値は、４８ｈ発酵サンプルで処理した細胞の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）／ルシファーイエローと０ｈ発酵サンプルで処理した細胞のＴＥＥＲ／ルシファーイエローとの差として表される。各化合物は、３つの用量（０．２×、１×及び５×）で試験した（表１）。
【図９】水溶液（上）又はエタノールへの溶解（下）のいずれかとして、異なる試験製剤の投与から２４ｈ発酵後のシャノン（Ｓｈａｎｎｏｎ）多様性指数を示す。各種ストック溶液の陰性対照も加えた。各化合物は、３つの用量（０．２×、１×及び５×）で試験した（表１）。
【図１０】水溶液（上）又はエタノールへの溶解（下）のいずれかとして、異なる試験製剤の投与から２４ｈ発酵後のビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の相対存在量（％）を示す。各種ストック溶液の陰性対照も加えた。各化合物は、３つの用量（０．２×、１×及び５×）で試験した（表１）。
【図１１】水溶液（上）又はエタノールへの溶解（下）のいずれかとして、異なる試験製剤の投与から２４ｈ発酵後の酪酸経路へのアセチル−ＣｏＡ発酵に関与する遺伝子の相対存在量（％）を示す。各種ストック溶液の陰性対照も加えた。各化合物は、３つの用量（０．２×、１×及び５×）で試験した（表１）。
【図１２】ＨＴ２９細胞によるＧＲＯａ−ＣＸＣＬ１生成に対するビタミン類及びω−３脂肪酸の作用を示す。データは、ｐｇ／ｍｌとして表す。
【図１３】ＨＴ２９細胞によるＩＬ−８生成に対するビタミン類及びω−３脂肪酸の作用を示す。データは、ｐｇ／ｍｌとして表す。
【図１４】ＨＴ２９細胞によるＭＩＰ３Ａ−ＣＣＬ２０生成に対するビタミン類及びω−３脂肪酸の作用を示す。データは、ｐｇ／ｍｌとして表す。
【図１５】水溶液（上）又はエタノールへの溶解（下）のいずれかとしての、異なる試験製剤の投与からの異なる時間帯（０〜６ｈ、６〜２４ｈ、及び２４〜４８ｈ）にわたるガス圧力を示す。各種ストック溶液の陰性対照も加えた。各化合物は、３つの用量（０．２×、１×及び５×）で試験した（表１）。
【図１６】ドナーＣ（上）又はドナーＤ（下）のいずれかについて、異なる試験製剤の投与からの異なる時間帯（０〜６ｈ、６〜２４ｈ、及び２４〜４８ｈ）にわたる全ＳＣＦＡ生成を示す。陰性対照（ブランク）も含んだ。各化合物は、３つの用量（０．２×、１×及び５×）で試験した（表２）。
【図１７】ドナーＣ及びドナーＤの糞便接種材料を用いた２４ｈのインキュベーション後の対照インキュベーション及び試験製剤とのインキュベーションにおけるビフィドバクテリウム科（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の存在量（ｌｏｇ（細胞／ｍｌ））を示す。
【図１８】対照としての水と、ビタミン類補給との間のＢｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ距離（β多様性）を示す。点線は、２４ｈ時点の２つの対照間のＢｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ距離を示し、これは基準点として役立つ。
【図１９】対照としての水と、ビタミン類補給との間のシャノン（Ｓｈａｎｎｏｎ）多様性指数（α多様性）を示す。点線は、２４ｈ時点の水対照のα多様性を示す。この基準対照より高い多様性指数値は、多様性の増大として表される。
【図２０Ａ】Ａ群（緑色の影）、Ｂ群（金色の影）及びＣ群（ピンク色の影）のブロイラーの盲腸微生物叢プロフィールのＷｅｉｇｈｔｅｄ  ＵｎｉＦｒａｃ距離に基づく主座標分析（ＰＣｏＡ）を示す。サンプルは、提供される色凡例に従って、明色（早期サンプル）から暗色（後期サンプル）まで、様々な色の影に充填される点として描かれる。第１及び第２座標軸が各プロットに記録される；各軸により説明されるデータセットの変動率（％）が記録される。
【図２０Ｂ】Ａ群（緑色の影）、Ｂ群（金色の影）及びＣ群（ピンク色の影）のブロイラーの盲腸微生物叢プロフィールのＵｎｗｅｉｇｈｔｅｄ  ＵｎｉＦｒａｃ距離に基づく主座標分析（ＰＣｏＡ）を示す。サンプルは、提供される色凡例に従って、明色（早期サンプル）から暗色（後期サンプル）まで、様々な色の影に充填される点として描かれる。第１及び第２座標軸が各プロットに記録される；各軸により説明されるデータセットの変動率（％）が記録される。
【図２１Ａ】時点Ｔ１で採取したブロイラーの盲腸微生物叢プロフィールのＷｅｉｇｈｔｅｄ  ＵｎｉＦｒａｃ距離に基づく主座標分析（ＰＣｏＡ）を示す。サンプルは、図１と同様に異なる色、即ち、Ａ群は緑色、Ｂ群は金色、群はピンク色の影に充填される点として描かれる。第１及び第２座標軸が各プロットに記録される；各軸により説明されるデータセットの変動率（％）が記録される。
【図２１Ｂ】時点Ｔ２で採取したブロイラーの盲腸微生物叢プロフィールのＷｅｉｇｈｔｅｄ  ＵｎｉＦｒａｃ距離に基づく主座標分析（ＰＣｏＡ）を示す。サンプルは、図１と同様に異なる色、即ち、Ａ群は緑色、Ｂ群は金色、群はピンク色の影に充填される点として描かれる。第１及び第２座標軸が各プロットに記録される；各軸により説明されるデータセットの変動率（％）が記録される。
【図２１Ｃ】時点Ｔ３で採取したブロイラーの盲腸微生物叢プロフィールのＷｅｉｇｈｔｅｄ  ＵｎｉＦｒａｃ距離に基づく主座標分析（ＰＣｏＡ）を示す。サンプルは、図１と同様に異なる色、即ち、Ａ群は緑色、Ｂ群は金色、群はピンク色の影に充填される点として描かれる。第１及び第２座標軸が各プロットに記録される；各軸により説明されるデータセットの変動率（％）が記録される。
【図２１Ｄ】時点Ｔ１で採取したブロイラーの盲腸微生物叢プロフィールのＵｎｗｅｉｇｈｔｅｄ  ＵｎｉＦｒａｃ距離に基づく主座標分析（ＰＣｏＡ）を示す。サンプルは、図１と同様に異なる色、即ち、Ａ群は緑色、Ｂ群は金色、群はピンク色の影に充填される点として描かれる。第１及び第２座標軸が各プロットに記録される；各軸により説明されるデータセットの変動率（％）が記録される。
【図２１Ｅ】時点Ｔ２で採取したブロイラーの盲腸微生物叢プロフィールのＵｎｗｅｉｇｈｔｅｄ  ＵｎｉＦｒａｃ距離に基づく主座標分析（ＰＣｏＡ）を示す。サンプルは、図１と同様に異なる色、即ち、Ａ群は緑色、Ｂ群は金色、群はピンク色の影に充填される点として描かれる。第１及び第２座標軸が各プロットに記録される；各軸により説明されるデータセットの変動率（％）が記録される。
【図２１Ｆ】時点Ｔ３で採取したブロイラーの盲腸微生物叢プロフィールのＵｎｗｅｉｇｈｔｅｄ  ＵｎｉＦｒａｃ距離に基づく主座標分析（ＰＣｏＡ）を示す。サンプルは、図１と同様に異なる色、即ち、Ａ群は緑色、Ｂ群は金色、群はピンク色の影に充填される点として描かれる。第１及び第２座標軸が各プロットに記録される；各軸により説明されるデータセットの変動率（％）が記録される。
【図２２】時点Ｔ１（Ａ、Ｄ）、Ｔ２（Ｂ、Ｅ）、及びＴ３（Ｃ、Ｆ）で採取したブロイラーの盲腸微生物叢において、ＦａｉｔｈのＰＤ指数（Ａ〜Ｃ）及び観測されたＯＴＵの数（Ｄ〜Ｆ）として測定されるα多様性を示す。全サンプルにおける多様性指数の箱ひげ分布が描かれる。緑色、金色及びピンク色の影は、それぞれＡ、Ｂ及びＣ群のニワトリを識別するために使用される。＊、統計的に有意な差（Ｐ＜０．０００１）。
【図２３】ブロイラー盲腸生態系の門レベル微生物叢プロフィールを示す。各利用可能な時点（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３）について、Ａ、Ｂ及びＣ群のブロイラーの盲腸微生物叢の平均的系統発生プロフィールが門レベルの円グラフとして提供され；全ての利用可能なサンプルの少なくとも１％中＞０．１％としてのグラフ表示のために、細菌分類群をフィルタリングした。
【図２４】ブロイラー盲腸生態系の科レベル微生物叢プロフィールを示す。各利用可能な時点（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３）について、Ａ、Ｂ及びＣ群のブロイラーの盲腸微生物叢の平均的系統発生プロフィールが科レベルの円グラフとして提供され；全ての利用可能なサンプルの少なくとも１％中＞０．５％としてのグラフ表示のために、細菌分類群をフィルタリングした。
【図２５】ブロイラーの盲腸微生物叢中の細菌科の相対存在量分布を示す。３つの時点（左から右）で、全サンプル中の相対存在量（％）の箱ひげ分布は、少なくとも１つの時点で３つの群（Ａ、Ｂ、Ｃ）の間に有意な差を示す科について描かれる。緑色、金色及びピンク色の影は、それぞれＡ、Ｂ及びＣ群のニワトリを識別するために使用される。Ｂｅｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｅｒｇ相関Ｐ値は、統計的有意性（Ｐ＜０．０５）に達したときに、記録される。
【図２６】ブロイラーの盲腸微生物叢中の細菌属の相対存在量分布を示す。３つの時点（左から右）で、全サンプル中の相対存在量（％）の箱ひげ分布は、少なくとも１つの時点で３つの群（Ａ、Ｂ、Ｃ）の間に有意な差を示す属について描かれる。緑色、金色及びピンク色の影は、それぞれＡ、Ｂ及びＣ群のニワトリを識別するために使用される。Ｂｅｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｅｒｇ相関Ｐ値は、統計的有意性（Ｐ＜０．０５）に達したときに、記録される。
【図２７】Ａ群（緑色の影）、Ｂ群（金色の影）及びＣ群（ピンク色の影）のブロイラーの回腸微生物叢プロフィールのＷｅｉｇｈｔｅｄ（Ａ）及びＵｎｗｅｉｇｈｔｅｄ（Ｂ）ＵｎｉＦｒａｃ距離に基づく主座標分析（ＰＣｏＡ）を示す。サンプルは、提供される色凡例に従って、明色（早期サンプル）から暗色（後期サンプル）まで、様々な色の影に充填される三角として描かれる。第１及び第２座標軸が各プロットに記録され、各軸により説明されるデータセットの変動率（％）が記録される。
【図２８】時点Ｔ１（Ａ、Ｄ）、Ｔ２（Ｂ、Ｅ）、及びＴ３（Ｃ、Ｆ）で採取したブロイラーの回腸微生物叢プロフィールのＷｅｉｇｈｔｅｄ（Ａ〜Ｃ）及びＵｎｗｅｉｇｈｔｅｄ（Ｄ〜Ｅ）ＵｎｉＦｒａｃ距離に基づく主座標分析（ＰＣｏＡ）を示す。サンプルは、図２７と同様に異なる色、即ち、Ａ群は緑色、Ｂ群は金色、群はピンク色の影に充填される三角として描かれる。第１及び第２座標軸が各プロットに記録される；各軸により説明されるデータセットの変動率（％）が記録される。
【図２９】時点Ｔ１（Ａ、Ｄ）、Ｔ２（Ｂ、Ｅ）、及びＴ３（Ｃ、Ｆ）で採取したブロイラーの回腸微生物叢において、ＦａｉｔｈのＰＤ指数（Ａ〜Ｃ）及び観測されたＯＴＵの数（Ｄ〜Ｆ）として測定されるα多様性を示す。全サンプルにおける多様性指数の箱ひげ分布が描かれる。緑色、金色及びピンク色の影は、それぞれＡ、Ｂ及びＣ群のニワトリを識別するために使用される。統計的に有意な差（クラスカル・ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌｌ  Ｗａｌｌｉｓ）検定）は、対応するＰ値と一緒に表示される。
【図３０】ブロイラー回腸生態系の門レベル微生物叢プロフィールを示す。各利用可能な時点（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３）について、Ａ、Ｂ及びＣ群のブロイラーの回腸微生物叢の平均的系統発生プロフィールが門レベル細菌の円グラフとして提供され；全ての利用可能なサンプルの少なくとも１つにおける＞０．１％としてのグラフ表示のために、分類群をフィルタリングした。
【図３１】ブロイラー回腸生態系の科レベル微生物叢プロフィールを示す。各利用可能な時点（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３）について、Ａ、Ｂ及びＣ群のブロイラーの回腸微生物叢の平均的系統発生プロフィールが科レベル細菌の円グラフとして提供され；全ての利用可能なサンプルの少なくとも１つにおける＞０．５％としてのグラフ表示のために、分類群をフィルタリングした。
【図３２】ブロイラーの回腸微生物叢中のペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）科の相対存在量分布を示す。３つの時点（左から右）で、全サンプル中の相対存在量の箱ひげ分布が描かれる。緑色、金色及びピンク色の影は、それぞれＡ、Ｂ及びＣ群のニワトリを識別するために使用される。Ｂｅｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｅｒｇ相関Ｐ値は、統計的有意性（Ｐ＜０．０５）に達したときに、記録される。
【図３３】Ａ群（緑色の影）、Ｂ群（金色の影）及びＣ群（ピンク色の影）のブロイラーの廃棄物微生物叢プロフィールのＷｅｉｇｈｔｅｄ（Ａ）及びＵｎｗｅｉｇｈｔｅｄ（Ｂ）ＵｎｉＦｒａｃ距離に基づく主座標分析（ＰＣｏＡ）を示す。サンプルは、明色（早期サンプル）から暗色（後期サンプル）まで、様々な色の影に充填される四角として描かれる。第１及び第２座標軸が各プロットに記録される；各軸により説明されるデータセットの変動率（％）が記録される。
【図３４】廃棄物生態系の門レベル微生物叢プロフィールを示す。各利用可能な時点（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３）について、Ａ、Ｂ及びＣ群のブロイラーの廃棄物微生物叢の平均的系統発生プロフィールが門レベル細菌の円グラフとして提供され；全ての利用可能なサンプルの少なくとも１つにおける＞０．１％としてのグラフ表示のために、分類群をフィルタリングした。
【図３５】廃棄物生態系の科レベル微生物叢プロフィールを示す。各利用可能な時点（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３）について、Ａ、Ｂ及びＣ群のブロイラーの廃棄物微生物叢の平均的系統発生プロフィールが科レベル細菌の円グラフとして提供され；全ての利用可能なサンプルの少なくとも１つの中で、＞０．５％としてのグラフ表示のために、細菌分類群をフィルタリングした。
【図３６】ＤＳＭ盲腸サンプルＣ２８１  ｐＨ７．１３の水抽出物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。Ａの縦軸は、ダウンフィールド領域（芳香族領域）における小さなシグナルをより良く感知するために拡大されている。
【図３７】全サンプルのビン分割及び正規化された１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのＰＣＡスコアプロット及びＢ）外れ値サンプルのないＰＣＡスコアを示す（グラフは、Ｒソフトウエアを用いて実施される）。
【図３８】Ａ）６１サンプルのビン分割及び正規化された１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのＰＬＳ−ＤＡスコアプロットであり、ここで、３つの群が、時点に沿って線形分離可能であることがわかる。Ｂ）対照［Ａ］及び処理群［Ｂ＋Ｃ］を考慮するＰＬＳ−ＤＡスコアプロットである（グラフは、パイソン（Ｐｙｔｈｏｎ）ソフトウエアを用いて作成される）。
【図３９】５．７９３ｐｐｍ（ｄ）のウラシルシグナルの積分の箱ひげ図である；サンプルは、次の時点に従って比較される：Ａ）１４日齢に対応するＴ０；Ｂ）２８日齢に対応するＴ１及びＣ）４２日齢に対応するＴ２。
【図４０】２．０４４７ｐｐｍ（ｍ）のグルタミン酸シグナルの積分の箱ひげ図である；サンプルは、次の時点に従って比較される：Ａ）１４日齢に対応するＴ０；Ｂ）２８日齢に対応するＴ１及びＣ）４２日齢に対応するＴ２。ウラシルは、全ての処理物、特にサンプルＣについて、４２日までその濃度を増加するようである。
【図４１】１．４７０ｐｐｍ（ｄ）のアラニンシグナルの積分の箱ひげ図である；サンプルは、次の時点に従って比較される：Ａ）１４日に対応するＴ０；Ｂ）２８日齢に対応するＴ１及びＣ）４２日齢に対応するＴ２。
【図４２】３．９２０ｐｐｍ（ｓ）のクレアチンシグナルの積分の箱ひげ図である；サンプルは、次の時点に従って比較される：Ａ）１４日に対応するＴ０；Ｂ）２８日齢に対応するＴ１及びＣ）４２日齢に対応するＴ２。
【図４３】０．８８３ｐｐｍ（ｔ）の酪酸シグナルの積分の箱ひげ図である；サンプルは、次の時点に従って比較される：Ａ）１４日に対応するＴ０；Ｂ）２８日齢に対応するＴ１及びＣ）４２日齢に対応するＴ２。
【図４４】１．０４４６ｐｐｍ（ｍ）のプロピオン酸シグナルの積分の箱ひげ図である；サンプルは、次の時点に従って比較される：Ａ）１４日に対応するＴ０；Ｂ）２８日齢に対応するＴ１及びＣ）４２日齢に対応するＴ２。
【図４５】１．０９０９ｐｐｍ（ｓ）酢酸シグナルの積分の箱ひげ図である；サンプルは、次の時点に従って比較される：Ａ）１４日に対応するＴ０；Ｂ）２８日齢に対応するＴ１及びＣ）４２日齢に対応するＴ２。
【図４６】平均的代謝産物シグナル積分対時間のＬｏｇＮｏｒｍａｌ当てはめを示す。比較は、エラーバーとして標準偏差を用い、処理群同士で行う。半透明部分は、当てはめの９５％信頼区間を画定する。
【図４７】全サンプル（６３サンプル）の全ての正規化した機能特性（６３６１データ）のＰＣＡスコアプロットである。
【図４８】各時点について対照群（Ａ群）と比較した処理群（Ｂ及びＣ群）の正規化した機能特性のＰＣＡスコアプロットである。
【図４９】各利用可能な時点（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３）について、３つの異なる群Ａ、Ｂ及びＣのブロイラー盲腸内の一次ＫＥＧＧ代謝経路を示す。
【図５０】統計的に有意な相対存在量と共に、各利用可能な時点（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３）について、３つの異なる群Ａ、Ｂ及びＣのブロイラー盲腸内の環境情報処理及び代謝経路の相対存在量（ＫＥＧＧデータベース）を示す。緑色及び赤色の箱は、それぞれＢ及びＣ群に関し、また青色の箱は、Ａ群に関する。Ｐ値は、各グラフの右上に示す。
【図５１】各利用可能な時点（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３）について、３つの異なる群Ａ、Ｂ及びＣのブロイラー盲腸内の二次ＫＥＧＧ代謝経路を示し、ここで、相対存在量は≧０．５％である。
【図５２】酪酸合成のための４つの異なる経路及び対応する遺伝子（タンパク質名）を表示する。主要基質を示す。端部遺伝子は赤でハイライトした。Ｌ２Ｈｇｄｈ、２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ；Ｇｃｔ、グルタコン酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（α、βサブユニット）；ＨｇＣｏＡｄ、２−ヒドロキシ−グルタリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（α、β、γサブユニット）；Ｇｃｄ、グルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（α、βサブユニット）；Ｔｈｌ、チオラーゼ；ｈｂｄ、β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；Ｃｒｏ、クロトナーゼ；Ｂｃｄ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（電子伝達タンパク質α、βサブユニット）；ＫａｍＡ、リシン−２，３−アミノムターゼ；ＫａｍＤ、Ｅ、＿β−リシン−５，６−アミノムターゼ（α、βサブユニット）；Ｋｄｄ、３，５−ジアミノヘキサン酸デヒドロゲナーゼ；Ｋｃｅ、３−ケト−５−アミノヘキサン酸切断酵素；Ｋａｌ、３−アミノブチリル−ＣｏＡアンモニアリアーゼ；ＡｂｆＨ、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ；ＡｂｆＤ、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ；Ｉｓｏｍ、ビニルアセチル−ＣｏＡ３，２−イソメラーゼ（ＡｂｆＤと同じタンパク質）：４Ｈｂｔ、ブチリル−ＣｏＡ：４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡトランスフェラーゼ；Ｂｕｔ、ブチリル−ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡトランスフェラーゼ；Ａｔｏ、ブチリル−ＣｏＡ：アセト酢酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（α、βサブユニット）；Ｐｔｂ、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ；Ｂｕｋ、酪酸キナーゼ。個々のブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼの補基質を示す。（Ｖｉｔａｌ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４）。
【０１３７】
［定義］
本明細書及び特許請求の範囲全体を通して使用されるように、用語「有益細菌」は、以下の属：アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アッカーマンシア属（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラウティア属（Ｂｌａｕｔｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリンセラ属（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ）、ドレア属（Ｄｏｒｅａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクノスピラ属（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パラバクテロイデス属（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ラウルテラ属（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ）、ロゼブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、及びクリステンセネラ属（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｅｌｌａ）から選択される少なくとも１つの細菌分類群を含む。また、以下の科：エリシペロソリックス科（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）、コリオバクテリウム科（Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、バルネシエラシエ（Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａｃｅａｅ）も有益細菌の細菌分類群を含み得る。
【０１３８】
本明細書及び特許請求の範囲全体を通して使用されるように、用語「ナイアシン」と言うとき、これは、唯一の活性物質ではない。存在する場合、それは、少なくとももう１つ別の活性物質と併用され、ナイアシンは存在しないのが好ましい。
【０１３９】
「超生理学的」用量とは、「超栄養」と同じ意味、即ち、少なくとも有効量の活性物質が、動物の腸管、好ましくはその下部消化管及び／又は結腸内に存在し、且つ細菌集団に直接栄養を賦与できるような、動物に推奨される活性物質の量より高い投与量を意味する。
【０１４０】
「唯一の活性物質」とは、腸管、好ましくは結腸内に存在する唯一の活性物質が、示されるものであることを意味する。
【０１４１】
本明細書で使用される用語「腸管（消化管）」は、小腸及び大腸から構成される胃腸管の部分を指す。
【０１４２】
本明細書で使用される用語「ビタミンＡ」は、レチノール、レチナール、レチノイン酸、及びプロビタミンＡカロテノイド（とりわけ、β−カロテン）から選択される化合物を意味する。好ましい実施形態では、ビタミンＡは、レチノールである。本明細書で使用される任意の濃度又は量のビタミンＡは、レチノール当量を指す。
【０１４３】
用語「ビタミンＥ」は、α−トコフェロール活性を有する化合物を指す。好ましい実施形態では、ビタミンＥは、α−トコフェロール及びそのエステル、特にα−トコフェロール酢酸エステルである。本明細書で挙げる任意の濃度又は量のビタミンＥは、α−トコフェロール当量を指す。
【０１４４】
本明細書で使用される用語「ビタミンＤ」は、ビタミンＤ３を意味する。好ましくはヒト以外の種で、ビタミンＤ３の代わりに、又はそれに加えて、２５−ヒドロキシビタミンＤ３を使用することができる。ビタミンＤ３に対する２５−ヒドロキシビタミンＤ３の相対力価は、約４０：１であるため、２５−ヒドロキシビタミンＤ３の用量設定は、相応に調節しなければならない。
【０１４５】
用語「リボフラビン」は、リボフラビン及びそのエステル、特にリボフラビン−５’−リン酸を含む。
【０１４６】
用語「葉酸」は、葉酸及びその薬学的に許容される塩を指す。
【０１４７】
用語「ビタミンＣ」は、アスコルビン酸、薬学的に許容されるその塩（例えば、アスコルビン酸ナトリウム及びアスコルビン酸カルシウム）並びにその薬学的に許容される塩（特に、パルミチン酸アスコルビル）を指す。
【０１４８】
用語「ビタミンＫ」は、ビタミンＫ１及びビタミンＫ２を含む。
【０１４９】
用語「β−カロテン」は、β−カロテン又はプロビタミンＡを指す。
【０１５０】
用語「ビタミンＢ１」は、チアミン、アネウリウン及びその製剤用塩（例えば、チアミン硝酸塩）を意味する。
【０１５１】
用語「ナイアシン」は、ニコチン酸、ビタミンＢ３、ピリジン−３−カルボン酸を意味し、ニコチンアミド又はナイアシンアミドを含む。これは、少なくとも１種の他の活性物質と組み合わせて存在してもよいが、それが唯一の活性物質である場合、本発明から明確に除外される。
【０１５２】
用語「ビタミンＢ５」は、パントテン酸及びその薬学的に許容される塩（例えば、パントテン酸カルシウム）を意味し、その誘導体パントテノール又はパンテノールを含む。
【０１５３】
用語「ビタミンＢ６」は、ピリドキサールリン酸を意味し、ピリドキサール−５’−リン酸を含む。
【０１５４】
用語「ビオチン」は、ビタミンＢ７、ビタミンＨ、補酵素Ｒ、ビオペイダーム（ｂｉｏｐｅｉｄｅｒｍ）を意味する。
【０１５５】
用語「ビタミンＢ１２」は、コバラミンを意味し、ビタミンＢ１２のあらゆる形態（例えば、シアノコバラミン及びメチルコバラミン）を含む。
【０１５６】
「オメガ（ω）３脂肪酸」は、ｎ−３位に二重結合を有する多価不飽和脂肪酸である。好ましい実施形態では、ω−３脂肪酸は、エイコサペンタン（ＥＰＡ）若しくはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）又は両者の組合せである。
【０１５７】
［詳細な説明］
一形態では、本発明は、動物の腸の健康の改善に使用するための、以下：リボフラビン、ビタミンＡ、β−カロテン、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、β−カロテン、ビタミンＢ１ナイアシン（もしあれば）、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビオチン、ビタミンＢ１２、ω−３脂肪酸及びこれらの組合せからなる群から選択される活性物質であって、前記改善が、以下：
（ｉ）腸管内の少なくとも１つの短鎖脂肪酸若しくはその塩の濃度の増加、
（ｉｉ）腸管内の微生物叢多様性の増加、
（ｉｉｉ）腸管内の有益細菌の微生物叢存在量の増加、
（ｉｖ）腸管内の酪酸合成経路の促進又は増加、
（ｖ）腸管のバリア機能の向上、
（ｖｉ）腸管の酸化還元電位の低下、
（ｖｉｉ）腸管内で生成されるガスの量の減少、及び
（ｖｉｉ）腸管免疫応答の刺激
を含むか、又はそれらから構成され；
ここで、前記使用は、以下：
ａ）有効量の活性物質を含む製剤（活性物質は、大腸まで送達される）；又は
ｂ）少なくとも有効量の活性物質が、動物の腸管内に存在するような、超生理学的用量の活性物質
を動物に投与することを含み、
但し、ナイアシンが活性物質である場合、それは唯一の活性物質ではなく；リボフラビンが存在する場合、それは、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の量を増加する以外の改善効果を有する、活性物質に関する。
【０１５８】
典型的に、前記使用は、哺乳動物であり得る動物に、有効用量の活性物質を含む遅延放出製剤を投与することを含み、ここで、活性物質の放出は、大腸まで若しくは結腸まで遅延され、又は、物質が結腸に直接送達される非経口経路により投与される。遅延放出製剤及びその調製については、後にさらに詳しく説明する。
【０１５９】
動物が、単胃家畜又は家禽など、ヒト以外である場合、投与は、活性物質の放出が大腸まで遅延される遅延放出製剤、又は有効量の活性物質が腸管内に存在するような飼料中の超生理学的用量の使用のいずれかによって行うことができる。動物がヒトである場合、投与は、本明細書に詳述される通り、いくつかの方法で行うことができ、そうしたものとして、遅延放出製剤の投与、非経口経路を介した投与、及び／又は超生理学的用量の使用などがある。
【０１６０】
一部の実施形態では、ナイアシンは、本発明の活性物質の１つとみなされない。
【０１６１】
［短鎖脂肪酸の増加／酪酸合成の促進］
本明細書で使用される用語「短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）」は、２〜６個の炭素原子を有する脂肪酸を指す。ＳＣＦＡとしては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、２−メチルプロピオン酸、３−メチルブタン酸、及びヘキサン酸が挙げられる。最も重要なＳＣＦＡは、酢酸、プロピオン酸、及びブチル酸である。
【０１６２】
動物の結腸内の１種又は複数のＳＣＦＡの濃度の「増加」は、活性物質が投与されていない動物のＳＣＦＡ濃度と比較したものである。活性物質が投与されていない動物は、本明細書では「対照動物」と呼ばれる。好ましくは、動物の結腸内の１種又は複数のＳＣＦＡの濃度の「増加」は、活性物質が投与されていない同じ動物のＳＣＦＡ濃度と比較する。即ち、この状況での対照動物は、典型的に、活性物質の投与の開始前の同じ動物である。好ましくは、対照動物は、少なくとも２８日間、栄養補給剤の形態で本明細書に記載の活性物質を受けていない。一部の実施形態では、動物は哺乳動物であり；一部の実施形態では、動物は、単胃動物、例えばブタである。一部の実施形態では、動物は家禽である。
【０１６３】
一実施形態では、酢酸の濃度は、活性物質の投与時に増加する。別の実施形態では、プロピオン酸の濃度は、活性物質の投与時に増加する。別の実施形態では、酪酸の濃度は、活性物質の投与時に増加する。また別の実施形態では、酢酸、プロピオン酸及び酪酸の濃度は、活性物質の投与時に増加する。
【０１６４】
一実施形態では、１種又は複数のＳＣＦＡの濃度は、活性物質の単回投与時に増加する。別の実施形態では、１種又は複数のＳＣＦＡの濃度は、活性物質の２回投与時に増加し、これらは、連続２日で適用される。別の実施形態では、１種又は複数のＳＣＦＡの濃度は、活性物質の７回投与時に増加し、これらは、連続７日で適用される。別の実施形態では、１種又は複数のＳＣＦＡの濃度は、活性物質の１４回投与時に増加し、これらは、連続１４日で適用される。好ましくは、１種又は複数のＳＣＦＡ（例えば、酢酸、プロピオン酸及び／又は酪酸）の濃度は、活性物質の２１回投与時に増加し、これらは、連続２１日で適用される。最も好ましくは、１種又は複数のＳＣＦＡ（例えば、酢酸、プロピオン酸及び／又は酪酸）の濃度は、活性物質の２８回投与時に増加し、これらは、連続２８日間、１日１回適用される。
【０１６５】
結腸内のＳＣＦＡの濃度は、対照の結腸内のＳＣＦＡ濃度と比較して、少なくとも５％、好ましくは、少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％増加し得る。対照には、活性物質が一切投与されていない。
【０１６６】
結腸内のＳＣＦＡの濃度は、活性物質を投与した哺乳動物から糞便サンプルを取得して、１種又は複数のＳＣＦＡの濃度を測定することにより決定することができる。
【０１６７】
例えば、ガスクロマトグラフィーにより、一般的に既知のＳＣＦＡの濃度を測定する方法は、当業者に周知である。例えば、Ｄｅ  Ｗｅｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）（ＤＯＩ：１０．１１１１／ｊ．１５７４−６９４１．２０１０．２０１０．００９７４．×）は、好適な方法を記載する。
【０１６８】
或いは、活性物質を投与時の１種又は複数のＳＣＦＡの増加は、本出願の実施例に記載される通り、インビトロモデルのような反応体及び糞便懸濁液を用いて決定することもできる。
【０１６９】
さらに、活性物質の投与により、酪酸経路へのアセチル−ＣｏＡ発酵に関与する遺伝子の相対存在量の増加が起こることも見出された。本発明は、従って、酪酸合成経路の活性化又は増加を目的とする、活性物質の使用に関する。酪酸経路へのアセチル−ＣｏＡ発酵に関与する遺伝子の相対存在量は、実施例に記載されるように決定することができる。
【０１７０】
本明細書に記載の活性物質は、哺乳動物の結腸内の少なくとも１種のＳＣＦＡの濃度を増加し、且つ／又は腸管のバリア機能を向上させる上で有効な微量栄養素である。ビタミンＡ、ビタミンＣ、リボフラビン、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸及びω−３脂肪酸は、特定の濃度で投与されると、哺乳動物の結腸内の少なくとも１種のＳＣＦＡの濃度を増大できることが判明した。
【０１７１】
酪酸経路を増加するのに好ましい活性物質は、ビタミンＡ、ビタミンＣ、リボフラビン、ビタミンＥ、葉酸、β−カロテン、ω−３脂肪酸及びそれらの組合せである。この作用により処置、改善又は予防される状態としては、代謝障害、２型糖尿病、肥満、慢性炎症及びアテローム形成が挙げられる。
【０１７２】
従って、本発明の別の実施形態は、代謝障害、２型糖尿病、肥満、慢性炎症及びアテローム形成からなる群から選択される状態を経験するヒトを含む動物の少なくとも１種の短鎖脂肪酸を増加する、及び／又は酪酸合成経路活性を増加する方法であって、これは、ビタミンＡ、ビタミンＣ、リボフラビン、ビタミンＥ、葉酸、βカロテン、ω−３脂肪酸及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの活性物質を投与することを含む。
【０１７３】
本発明の別の実施形態は、ヒトを含む動物の腸管の健康の改善に使用するための活性物質であり、ここで、改善は、腸管内の少なくとも１種の短鎖脂肪酸若しくはその塩の濃度の増加；又は腸管内の酪酸合成経路の促進若しくは増加であり、ここで、短鎖脂肪酸は、以下：酢酸、プロピオン酸及び酪酸又はそれらの塩から選択される。
【０１７４】
本発明の別の実施形態は、腸管内の少なくとも１種の短鎖脂肪酸又はその塩の濃度の増加に使用するための、以下：ビタミンＡ、β−カロテン、ビタミンＣ、リボフラビン、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、ω−３脂肪酸及びそれらの組合せからなる群から選択される活性物質である。
【０１７５】
本発明の別の実施形態は、ヒトを含む動物の腸管の健康の改善に使用するための活性物質であり、ここで、改善は、腸管内の少なくとも１種の短鎖脂肪酸若しくはその塩の濃度の増加；又は腸管内の酪酸合成経路の促進若しくは増加であり、ここで、ヒトを含む動物は、以下：代謝障害、２型糖尿病、肥満、慢性炎症及びアテローム形成からなる群から選択される状態を経験している。
【０１７６】
［微生物叢多様性及び有益細菌の増強］
さらに、活性物質の投与は、腸内微生物叢多様性を増大することも認められた。従って、本発明は、腸内微生物叢多様性、好ましくは、結腸内微生物叢多様性の増大を目的とする活性物質の使用に関する。微生物叢多様性は、ヒト、ブタ、及び家禽について実施例に記載されるように決定することができる。
【０１７７】
特に、本発明者らは、活性物質の補給によって、ヒトにおける有益細菌、好ましくは、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アッカーマンシア属（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）及びフィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の相対存在量が増加することを見出した。従って、本発明は、有益細菌、好ましくは、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アッカーマンシア属（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）及び／又はフィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のうち少なくとも１種を含む有益細菌の相対存在量の増加を目的とする活性物質の腸内においての使用、好ましくは結腸においての使用に関する。
【０１７８】
例えば、家禽の場合、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）及びフィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）が増加する。従って、別の実施形態は、動物における有益細菌を増加する方法であり、これは、超生理学的用量の活性物質を動物に投与することを含む。
【０１７９】
有益細菌の存在量の増加によって、過敏性腸症候群、代謝疾患、肥満及び炎症性疾患の症状を処置、予防、又は軽減することができる。
【０１８０】
好ましい物質は、ビタミンＢ１、リボフラビン、ビタミンＢ５、ビタミンＢ１２、β−カロテン、ビオチン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＤ、葉酸、ビタミンＫ、ω３脂肪酸、及びそれらの組合せである。しかし、リボフラビンが活性物質である場合、それは、Ｆ．プラウスニッツイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の存在量の増加以外の目的のために存在する。
【０１８１】
従って、本発明の別の実施形態は、ヒトを含め、それを必要とする動物の過敏性腸症候群、代謝疾患、肥満、若しくは炎症性疾患の症状を処置、予防、又は軽減する方法であり、これは、有益細菌を増大する活性物質の量を動物の結腸に投与することを含み；活性物質は、以下：ビタミンＢ１、リボフラビン、ビタミンＢ５、ビタミンＢ１２、β−カロテン、ビオチン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＤ、葉酸、ビタミンＫ、ω３脂肪酸、及びそれらの組合せから選択され；但し、リボフラビンが活性物質である場合、それは、Ｆ．プラウスニッツイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の存在量の増加以外の目的のために存在する。
【０１８２】
本発明の別の実施形態は、腸管の健康の改善に使用するための活性物質であり、ここで、改善は、腸管内の微生物叢多様性の増加及び／又は結腸内の有益細菌の存在量の増加を含む。増加させる有益細菌は、以下：アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アッカーマンシア属（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｓｐ．）、バクテロイデス・オバータス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ブラウティア・プロダクタ（Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ）、クロストリジウム・コクレアータム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｃｌｅａｔｕｍ）、コリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）、ドレア・ロンジカテナ（Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）、ラクノスピラ・ペクチノシザ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ  ｐｅｃｔｉｎｏｓｈｉｚａ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、パラバクテロイデス・ディスタソニス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）、ラウルテラ属（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｓｐｐ．）、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）及びそれらの組合せからなる群から選択され、但し、リボフラビンが存在する場合、それは、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の量の増加以外の改善効果がある。好ましくは、増加させる細菌は、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アッカーマンシア属（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）、フィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びバクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ）からなる群から選択される。
【０１８３】
活性物質は、ヒトを含め、以下：過敏性腸症候群、代謝疾患、肥満、及び炎症性疾患からなる群から選択される疾患を経験している動物に使用することができる。好ましくは、活性物質は、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、β−カロテン、ビオチン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＤ、葉酸、ビタミンＫ、ω３脂肪酸、及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【０１８４】
免疫応答の刺激
さらに、結腸上皮細胞株ＨＴ２９による特定のマーカ及びサイトカインの生成は、活性物質の投与時の２４ｈ腸管バッチ発酵からの流出液で細胞を処理した後、増加することも観察された。バイオマーカ及びサイトカインとしては、ＧＲＯａ−ＣＸＣＬ１、ＩＬ−８及びＭＩＰ３Ａ−ＣＣＬ２０が挙げられる。
【０１８５】
ＧＲＯａ−ＣＸＣＬ１は、炎症に重要な役割を果たし、好中球の化学誘引物質として作用するケモカインである。これは、微生物殺傷の目的で組織部位に好中球を動員して、活性化することにより、宿主の免疫応答を活性化する。ＣＸＣＬ１はまた、微生物からの防御のためにプロテアーゼ及び活性酸素種（ＲＯＳ）の放出を活性化することも知られている。
【０１８６】
インターロイキン−８（ＩＬ−８）は、好中球遊走能を有することがわかっている走化性サイトカインであり、走化性の増強に役立つ。これは、標的細胞の走化性を誘導し、好中球及び他の顆粒球を感染部位に向かって遊走させる。
【０１８７】
ＭＩＰ３Ａ−ＣＣＬ２０もまた、エフェクター及びメモリーＴリンパ球、免疫ＤＣ、並びに受容体ＣＣＲ６を発現するネイティブＢ細胞を選択的に誘引するケモカインである。ＣＣＬ２０は、胃腸管及び皮膚などの免疫学的バリアにおいて構成的に発現される。
【０１８８】
これらのバイオマーカはすべて、免疫応答の活性化を反映する。
【０１８９】
免疫応答を刺激すると、急性炎症と同様に慢性炎症を含む状態に利益を与え得る。
【０１９０】
好ましい物質は、リボフラビン、ビタミンＥ、ビタミンＡ、ビタミンＫ、及びそれらの組合せである。
【０１９１】
従って、本発明の別の実施形態は、それが必要な動物の結腸に、有効用量の活性物質を使用及び／又は投与することによる、腸内免疫応答の刺激、免疫力低下の症状の改善、全身性抗炎症応答の生成を目的とする物質の使用であり、ここで、上記物質は、リボフラビン、ビタミンＥ、ビタミンＡ、ビタミンＫ及びそれらの組合せからなる群から選択される。さらなる実施形態は、慢性若しくは急性炎症の症状を処置する、予防する、又は軽減する方法であり、これは、免疫刺激有効量の物質を動物の結腸に投与することを含み、ここで、上記物質は、リボフラビン、ビタミンＥ、ビタミンＡ、ビタミンＫ、及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【０１９２】
本発明の別の実施形態は、腸の健康の改善に使用するための活性物質であり、この改善は、腸内免疫応答の刺激である。好ましくは、上記の使用は、以下：ＧＲＯａ−ＣＸＣＬ１、ＭＩＰ３Ａ−ＣＣＬ２０、インターロイキン８、及びそれらの組合せからなる群から選択される免疫応答分子を増加することを目的とする。好ましくは、活性物質は、ビタミンＢ２、ビタミンＥ、ビタミンＤ、ビタミンＡ、及びビタミンＫ、及びそれらの混合物からなる群から選択される。
【０１９３】
別の実施形態は、ヒトを含め、急性若しくは慢性炎症を経験している動物の腸内免疫応答を改善する方法であり、これは、リボフラビン、ビタミンＥ、ビタミンＡ、ビタミンＫ、及びそれらの組合せからなる群から選択される活性物質を腸管に投与することを含む。
【０１９４】
［酸化還元電位］
通常、ビタミンＣ及びＥなどの抗酸化化合物は、結腸に到達しないが、大腸への抗酸化ビタミン及び化合物の結腸標的送達は、腸管の酸化還元電位の低下を可能にする。このように低い酸化還元電位は、特に、腸内微生物叢環境が、絶対嫌気有益細菌の増殖を妨げ、耐気性病原性生物の増殖を促進し、且つ／又は宿主細胞に対して炎症及び細胞損傷を引き起こす、より多くの酸素及び／若しくは酸素ラジカルの存在に直面する状況下で、正常な腸内微生物叢の組成及び活動の障害に関連する症状を緩和することができる。
【０１９５】
従って、本発明の別の実施形態は、腸管内の酸化還元電位を低下させ、それにより、耐気性病原性生物の増殖を低減し、腸管炎症及びその結果としての細胞損傷を軽減すると共に、有益な絶対嫌気細菌の増殖を促進する目的での、活性物質、好ましくは、ビタミンＣ及び／又はＥの使用である。
【０１９６】
さらに、本発明の別の実施形態は、炎症性腸疾患などの様々な免疫疾患における全身酸化還元状態の尺度であるプラズマフリーチオールを低減する目的での、活性物質、好ましくは、ビタミンＣ及び／又はＥの使用である。
【０１９７】
従って、本発明の別の実施形態は、腸管の酸化還元電位を低下させる方法であり、これによって、
結腸内の絶対嫌気有益細菌の増殖の促進；
腸管内の耐気性病原性生物の低減；
腸管内の炎症の軽減；及び
腸管内の炎症によって起こる腸管内の細胞損傷の低減
からなる群から選択される利益がもたらされ、
この方法は、ヒトを含め、それを必要とする動物に、リボフラビン、ビタミンＣ、ビタミンＥ及びそれらの混合物からなる群から選択される物質を投与することを含む。
【０１９８】
［ガス生成］
閉鎖インキュベーションシステム内で結腸インキュベーションを実施した。これによって、ヘッド空間内のガスの蓄積を評価することができたが、これは、圧力計を用いて測定することができる。ガス生成は、微生物活性の尺度であり、従って、潜在的にプレバイオティックな基質の発酵の速度の尺度である。これは、プレバイオティックな消費時の膨満感及び消化の良好な状態の指標として用いることができる。
【０１９９】
実施例で実証される通り、活性物質、好ましくは、ビタミンＢ２及び／又はビタミンＣを用いて、腸管内で生成されるガスの量を低減することができる。
【０２００】
従って、本発明の別の実施形態は、腸管内で生成されるガスを処置、予防、又はその量を低減する方法であり、これは、ビタミンＢ２、ビタミンＣ及びそれらの組合せからなる群から選択される活性物質を大腸に送達することを含む。
【０２０１】
［腸管バリアの強化］
Ｃａｃｏ−２及びＨＴ２９−ＭＴＸ−Ｅ１２細胞の共培養物を使用して、発酵前後に上清の防御効果を評価した。経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）読取り値は、コンフルエント単層の密集度と相関し（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）、腸管バリア強度の指標として使用することができる。腸管のバリア強度の低下は、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸管壁浸漏及び栄養不良を含むいくつかの病状に関連する病状で認められる。
【０２０２】
腸管バリアを向上させるための好ましい物質は、リボフラビン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ω−３脂肪酸、ビタミンＤ、ビタミンＡ、葉酸、ビタミンＫ及びそれらの混合物である。従って、本発明の別の実施形態は、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸管壁浸漏及び栄養不良からなる群から選択される状態の症状を処置、予防又は軽減する方法であり、この方法は、ヒトを含め、それを必要とする動物に、リボフラビン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ω−３脂肪酸、ビタミンＤ、ビタミンＡ、葉酸、ビタミンＫ及びそれらの混合物からなる群から選択される物質を投与することを含む。
【０２０３】
本発明の別の実施形態は、腸管の健康の改善を目的とする活性物質の使用であり、上記改善は、腸管のバリア機能の向上を含む。この使用は、ヒトを含め、以下：過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸管壁浸漏、及び栄養不良からなる群から選択される状態を経験している動物に実施され得る。好ましくは、活性物質は、以下：ビタミンＢ２、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ω−３脂肪酸、ビタミンＤ、ビタミンＡ、葉酸、ビタミンＫ１及びそれらの混合物からなる群から選択される。
【０２０４】
［用量及び濃度］
本明細書で使用される用量は、一般的な栄養のために哺乳動物が摂取する活性成分に追加されることが意図される。その代わり、これらの用量は、腸内微生物の属、種及び株のレベルにおいて、全体としての腸内微生物叢環境に作用する。活性物質が哺乳動物により直接代謝されることが意図されるわけではなく、むしろ結腸の細菌集団によって利用されることが意図される。従って、以下に掲載される量は、通常の食物に加えて動物により消費されるが、それらは、遅延放出のために、動物が直接利用できるわけではない。
【０２０５】
【表１】
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【０２０６】
好ましくは、リボフラビンは、結腸内でのその局所濃度が少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも１．２５ｍｇ／ｍｌ、例えば、約１．４ｍｇ／ｍｌになるような量で投与される。結腸内の好ましい局所濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、又は約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、又は約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、又は約１．２５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌである。
【０２０７】
家禽に好適な一実施形態では、超生理学的量は、少なくとも約１０×又は２０×推奨用量であってもよく、例えば、推奨１日用量が５ｍｇであれば、リボフラビンを結腸に存在させるために、飼料に投与される量は５０ｍｇ又は１００ｍｇである。
【０２０８】
好ましくは、ビタミンＥは、結腸内でのその局所濃度が少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも０．０５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌになるような量で投与される。結腸内の好ましい局所濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．０３ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌである。
【０２０９】
好ましくは、アスコルビン酸は、結腸内でのその局所濃度が少なくとも０．０５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌになるような量で投与される。結腸内の好ましい局所濃度は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌである。
【０２１０】
好ましくは、ビタミンＤは、結腸内でのその局所濃度が少なくとも０．０１μｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも０．０３μｇ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも０．０４μｇ／ｍｌ又は少なくとも０．１μｇ／ｍｌになるような量で投与される。結腸内の好ましい局所濃度は、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約２０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．０３μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．０４μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌ、又は約０．１μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌである。
【０２１１】
好ましくは、ビタミンＡは、結腸内でのその局所濃度が少なくとも０．０５μｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも０．２μｇ／ｍｌになるような量で投与される。結腸内の好ましい局所濃度は、約０．０５μｇ／ｍｌ〜約２０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．２μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌである。
【０２１２】
好ましくは、ビタミンＫは、結腸内でのその局所濃度が少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも０．０３ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも０．０４ｍｇ／ｍｌになるような量で投与される。結腸内の好ましい局所濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．０３ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約０．５ｍｇ／ｍｌである。
【０２１３】
好ましくは、葉酸は、結腸内でのその局所濃度が少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも１μｇ／ｍｌになるような量で投与される。結腸内の好ましい局所濃度は、約０．１μｇ／ｍｌ〜約２０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．５μｇ／ｍｌ〜約１５μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌである。
【０２１４】
好ましくは、β−カロテンは、結腸内でのその局所濃度が少なくとも５μｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも４０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも１００μｇ／ｍｌになるような量で投与される。結腸内の好ましい局所濃度は、約５μｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約４０μｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１００μｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである。
【０２１５】
好ましくは、ビタミンＢ１は、結腸内でのその局所濃度が少なくとも１μｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも２０μｇ／ｍｌになるような量で投与される。結腸内の好ましい局所濃度は、約１μｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０μｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２０μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌである。
【０２１６】
好ましくは、ナイアシンは、結腸内でのその局所濃度が少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１μｇ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも２μｇ／ｍｌ又は少なくとも３μｇ／ｍｌになるような量で投与される。結腸内の好ましい局所濃度は、約０．５μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌである。ナイアシンが投与される場合、それは、唯一の活性物質ではない。
【０２１７】
好ましくは、ビタミンＢ５は、結腸内でのその局所濃度が少なくとも０．０５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも０．４ｍｇ／ｍｌになるような量で投与される。結腸内の好ましい局所濃度は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌである。
【０２１８】
好ましくは、ビタミンＢ６は、結腸内でのその局所濃度が少なくとも１μｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも５μｇ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも１０μｇ／ｍｌになるような量で投与される。結腸内の好ましい局所濃度は、約１μｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約５μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１０μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌである。
【０２１９】
好ましくは、ビオチンは、結腸内でのその局所濃度が少なくとも１μｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも２μｇ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも４μｇ／ｍｌになるような量で投与される。結腸内の好ましい局所濃度は、約１μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約２μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約４μｇ／ｍｌ〜約２００μｇ／ｍｌである。
【０２２０】
好ましくは、ビタミンＢ１２は、結腸内でのその局所濃度が少なくとも０．０１μｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも０．０３μｇ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも０．０５μｇ／ｍｌになるような量で投与される。結腸内の好ましい局所濃度は、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．０３μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．０５μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌである。
【０２２１】
好ましくは、ω−３脂肪酸は、結腸内でのその局所濃度が少なくとも０．０２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも０．０５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌになるような量で投与される。結腸内の好ましい局所濃度は、約０．０２ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌである。別の実施形態では、ω−３脂肪酸は、結腸内でのその局所濃度が少なくとも０．０２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも０．０５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌになるような量で投与される。結腸内の好ましい局所濃度は、約０．０２ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約６０ｍｇ／ｍｌである。別の実施形態では、活性物質は、体重１ｋｇ当たり最大２．９ｍｇのリボフラビン、体重１ｋｇ当たり最大４２．９μｇのビタミンＡ、体重１ｋｇ当たり最大３．６μｇのビタミンＤ、体重１ｋｇ当たり最大２８．６ｍｇのビタミンＣ、体重１ｋｇ当たり最大１４．３ｍｇのビタミンＥ、体重１ｋｇ当たり最大１４３μｇのビタミンＫ、体重１ｋｇ当たり最大１４．３μｇの葉酸、体重１ｋｇ当たり最大０．４ｍｇのβ−カロテン、最大１．４ｍｇのビタミンＢ１、最大２１．４ｍｇのナイアシ、最大１４．３ｍｇのビタミンＢ５、最大１．４ｍｇのビタミンＢ６、最大３５．７μｇのビオチン、最大４３μｇのビタミンＢ１２、７１．４ｍｇのω−３脂肪酸又はそれらの組合せの１日量で哺乳動物に投与され、ここで、好ましくは、ＥＰＡは体重１ｋｇ当たり最大２５．７ｍｇであり、ＤＨＡは体重１ｋｇ当たり最大１４．３ｍｇである。
【０２２２】
別の実施形態は、活性物質を腸管に送達するための遅延放出製剤であり、これは、活性物質と腸溶層又は腸溶シェルとを含み、ここで、前記活性物質は、最大２００ｍｇのリボフラビン、最大３０００μｇのビタミンＡ、最大２０００ｍｇのビタミンＣ、最大２５０μｇのビタミンＤ、最大１０００ｍｇのビタミンＥ、最大１０ｍｇのビタミンＫ、最大１ｍｇの葉酸、最大２５ｍｇのβ−カロテン、最大１００ｍｇのビタミンＢ１、最大１５００ｍｇのナイアシン、最大１０００ｍｇのビタミンＢ５、最大１００ｍｇのビタミンＢ６、最大２５００μｇのビオチン、最大３０００μｇのビタミンＢ１２、最大５０００ｍｇのω−３脂肪酸又はそれらの組合せから構成され、ここで、好ましくは、ＥＰＡは最大１８００ｍｇであり、ＤＨＡは最大１０００ｍｇであり、活性物質の放出は腸管まで遅延される。
【０２２３】
別の実施形態は、活性物質を腸管に送達するための遅延放出製剤であり、これは、活性物質と腸溶層又は腸溶シェルとを含み、ここで、前記活性物質は、１〜８５ｍｇのリボフラビン、０．２〜０．４ｍｇのビタミンＡ、４００〜６００ｍｇのビタミンＣ、５〜８０μｇのビタミンＤ、８０〜１２０ｍｇのビタミンＥ、８０〜１４０μｇのビタミンＫ、０．３〜０．５ｍｇの葉酸、８０〜１２０ｍｇのω−３脂肪酸又はそれらの組合せから構成され、前記活性物質の放出が腸管まで遅延される。
【０２２４】
別の実施形態は、前記活性物質が、７０〜８０ｍｇのリボフラビン、０．２５〜０．３５ｍｇのビタミンＡ、４５０〜５５０ｍｇのビタミンＣ、１５〜２５μｇのビタミンＤ、９０〜１１０ｍｇのビタミンＥ、１００〜１２０μｇのビタミンＫ、０．３５〜０．４５ｍｇの葉酸、９０〜１１０ｍｇのω−３脂肪酸又はそれらの組合せから構成される品目の遅延放出製剤である。
【０２２５】
一実施形態では、唯一の活性物質としてリボフラビンが投与される。
【０２２６】
別の実施形態では、唯一の活性物質としてビタミンＡが投与される。
【０２２７】
別の実施形態では、唯一の活性物質としてビタミンＣが投与される。
【０２２８】
別の実施形態では、唯一の活性物質としてビタミンＤが投与される。
【０２２９】
別の実施形態では、唯一の活性物質としてビタミンＥが投与される。
【０２３０】
別の実施形態では、唯一の活性物質としてビタミンＫが投与される。
【０２３１】
別の実施形態では、唯一の活性物質としてω−３脂肪酸が投与される。
【０２３２】
一実施形態では、唯一の活性物質として葉酸が投与される。
【０２３３】
別の実施形態では、唯一の活性物質としてβ−カロテンが投与される。
【０２３４】
別の実施形態では、唯一の活性物質としてビタミンＢ１が投与される。
【０２３５】
別の実施形態では、唯一の活性物質としてビタミンＢ５が投与される。
【０２３６】
別の実施形態では、唯一の活性物質としてビタミンＢ６が投与される。
【０２３７】
別の実施形態では、唯一の活性物質としてビオチンが投与される。
【０２３８】
別の実施形態では、唯一の活性物質としてビタミンＢ１２が投与される。
【０２３９】
別の実施形態では、唯一の活性物質としてＤＨＡが投与される。
【０２４０】
別の実施形態では、唯一の活性物質としてＥＰＡが投与される。
【０２４１】
別の実施形態では、唯一の活性物質としてＥＰＡ及びＤＨＡが投与される。
【０２４２】
別の実施形態では、活性物質は、リボフラビン、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、ＥＰＡ及びＤＨＡの組合せから構成される。また別の実施形態では、活性物質は、リボフラビン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、ＥＰＡ及びＤＨＡの組合せから構成される。さらに別の実施形態では、活性物質は、リボフラビン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、β−カロテン、ビタミンＢ１、ナイアシン、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビオチン、ビタミンＢ１２、ＥＰＡ及びＤＨＡの組合せから構成される。
【０２４３】
一実施形態では、本発明の遅延放出製剤は、１日１回投与される。他の実施形態では、製剤は、毎日又は２日毎に２回投与される。
【０２４４】
一実施形態では、活性物質は、哺乳動物に投与される。哺乳動物は、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、又はネコであり得る。より好ましくは、哺乳動物は、ヒト、例えば、成人である。一実施形態では、成人は、少なくとも２０、若しくは少なくとも２５、又は少なくとも３０のボディマス指数（ＢＭＩ）を有する。例えば、ＢＭＩは、２５〜３５、又は２６〜３４、又は２７〜３３、又は２８〜３２の範囲であり得る。
【０２４５】
［処置又は予防しようとする状態］
本発明の第１の態様によれば、活性物質は、１種又は複数のＳＣＦＡの濃度を増加させる目的で投与される。従って、結腸内の障害ＳＣＦＡレベルに関連する任意の状態を処置又は予防することができる。ＳＣＦＡのレベルは、健康な個体のレベルに比べて、有意に低い、例えば、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％低ければ障害されている。結腸内の濃度の尺度として糞便中濃度を採用することができる。
【０２４６】
本発明に従って処置又は予防しようとする状態としては、炎症性疾患、炎症、特に慢性炎症を特徴とする障害、及びアテローム形成が挙げられる。加えて、２型糖尿病、若しくは肥満などの代謝障害を処置又は予防又は改善することができる。さらに、免疫低下又はアレルギーを処置することもできる。
【０２４７】
本発明の別の態様によれば、活性物質は、腸管のバリア機能を改善又は強化するために投与される。一実施形態では、小腸のバリア機能が改善又は強化される。別の実施形態では、大腸のバリア機能が改善又は強化される。別の実施形態では、腸内のバリア機能が改善又は強化される。従って、腸透過性の増大に関連する状態又は障害を処置、改善又は予防することができる。処置しようとする状態としては、限定はされないが、腸透過性増大、腸疾患（例えば、環境性腸症、栄養不良による腸疾患）、炎症性腸疾患（例えば、クローン病若しくは潰瘍性大腸炎）、及び過敏性腸症候群を特徴とする障害が挙げられる。
【０２４８】
腸管のバリア機能の健全性は、モデル系において初期経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定することにより、決定することができる（実施例を参照）。或いは、腸管のバリア機能の健全性は、頂端面から側底面コンパートメントへのルシファーイエローの輸送を測定することにより、決定することができる（実施例を参照）。ヒトの場合、腸透過性は、リポ多糖コア部分への細菌のリポ多糖若しくは抗体の循環濃度の測定によって間接的に、又は二重糖吸収試験（Ｄｏｒｓｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ７，Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：１０８８８（２０１７））によって直接測定することができる。例えば、二重糖摂取後の尿中のラクツロース：マンニトース比を決定することができる。或いは、血中α−１アンチトリプシン：ミエロペルオキシダーゼ；及び／又はＲＥＧ１Ｂタンパク質を決定することができる。
【０２４９】
本発明の別の態様は、大腸発酵中のガス生成を低減することを目的とし、これによって、腸の良好な状態の改善、膨満感の軽減がもたらされると共に、繊維及びプレバイオティック処置に対する適合性が高くなる。
【０２５０】
［製剤］
本明細書で使用される場合、「遅延放出」は、投与直後より遅い時点での活性物質の放出を指す。好ましくは、「遅延放出」は、経口投与の際に活性物質が、即時放出製剤に比べ遅れて大腸に送達されることを意味する。
【０２５１】
「腸溶層」は、コアを取り囲む層であり、コアは活性物質を含み、この層は、胃液に対する耐性を付与する。「腸溶シェル」は、活性物質を取り囲むか、又は封入するシェル若しくはマトリックスであり、シェルは、胃液に対する耐性を付与する。或いは、マトリックスを基材とする送達系を使用することもできる。マトリックスを基材とする系には、コーティング材料の離散層はないが、活性物質は、マトリックス内に多かれ少なかれ均質に分布している。さらに、例えば繊維マトリックス（酵素トリガー型）内の活性物質及びその上の腸溶コーティングを埋め込む結腸放出系がある。
【０２５２】
ヒトの場合の好ましい実施形態では、本発明の製剤は、経口投与用の固体剤形である。製剤は、カプセル、ペレット、ビーズ、スフィア、ミニスフィア、錠剤、ミニタブレット、又は顆粒剤の形態であってよく、任意選択で、小腸の前、好ましくは結腸より前の活性物質の放出を妨げる遅延放出コーティング又はシェルでコーティングされる。
【０２５３】
経口投与に際して、活性物質の遅延放出、特に回腸又は大腸内での標的放出のためのコーティング、シェル、若しくはマトリックス材料は当技術分野で知られている。これらは、特定のｐＨを超えると崩壊するコーティング材料、胃腸管内の特定の滞留時間後に崩壊するコーティング材料、並びに腸管の特定の領域の微生物叢に特異的な酵素トリガーによって崩壊するコーティング材料にさらに分類される。一般に、異なるカテゴリーからのコーティング又はシェル材料が組み合わせて使用されている。大腸へターゲティングを目的とするこれら３つの異なるカテゴリーのコーティング又はシェル材料については、例えば、Ｂａｎｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｏｌｌｉｍ．Ｍｅｄ．２０１４，４４，２，１０９−１１８）に論評されている。本発明の一実施形態では、遅延放出コーティングは、ｐＨ依存的に崩壊するコーティング材料、時間依存的に崩壊するコーティング材料、腸内環境（例えば、回腸及び大腸の腸内環境）内の酵素トリガーにより崩壊するコーティング材料、並びにそれらの組合せから選択される少なくとも１つの構成要素を含む。
【０２５４】
ｐＨ依存的に崩壊するコーティング材料としては、ポリビニルアセテートフタレート、セルロースアセテートトリメリテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートＨＰ−５０、ＨＰ−５５若しくはＨＰ−５５Ｓ、セルロースアセテートフタレート、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）、ポリ（メタクリル酸、アクリル酸エチル）１：１（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ１００−５５、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ３０Ｄ−５５）、ポリ（メタクリル酸、メタクリル酸メチル）１：１（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ−１００、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ１２．５）、ポリ（メタクリル酸、メタクリル酸メチル）１：２（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｓ−１００、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｓ１２．５、及びＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＦＳ３０Ｄ）が挙げられる。
【０２５５】
時間依存的に崩壊するコーティング材料としては、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＲＬ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＲＳ、及びエチルセルロースが挙げられる。
【０２５６】
大腸内の酵素トリガーにより崩壊するコーティング材料としては、コンドロイチン硫酸、ペクチン、グアーガム、キトサン、イヌリン、ラクツロース、ラフィノース、スタキオース、アルギン酸塩、デキストラン、キサンタンガム、ローカストビーンガム、アラビノガラクタン、シクロデキストリン、プルラン、カラギーナン、スクレログルカン、キチン、カードラン（ｃｕｒｄｕｌａｎ）、レバン、アミロペクチン、デンプン、アミロース、レジスタントスターチ、及びアゾ結合分解菌により分解されるアゾ化合物が挙げられる。
【０２５７】
一実施形態では、製剤は、活性物質を含む組成物が充填された腸溶カプセル剤を含む。腸溶カプセル剤は、胃の酸性環境に対する耐性を付与する。例えば、ソフトジェル製剤は、溶液中の活性物質を送達し、さらに固体剤形の利点も提供し得る。ソフトジェルカプセルは、水に溶解しにくい疎水性活性物質に特に適している。ビタミンＫ及びω−３脂肪酸は、ソフトジェルカプセルに製剤化するのが好ましい。
【０２５８】
別の実施形態では、製剤は、（ｉ）活性物質を含むコアと、（ｉｉ）腸溶コーティングなどの遅延放出コーティングとを含む錠剤である。これは、ハードジェルカプセル剤であってもよい。
【０２５９】
薬剤の放出は、小腸まで遅延され得る。別の実施形態では、薬剤の放出は、末端小腸まで遅延される。また別の実施形態では、薬剤の放出は、結腸まで遅延される。
【０２６０】
例えば、一製剤は、活性物質と、腸溶層又は腸溶シェルとを含んでもよく、活性物質は、以下：最大２００ｍｇのリボフラビン、最大３０００μｇのビタミンＡ、最大２０００ｍｇのビタミンＣ、最大２５０μｇのビタミンＤ、最大１０００ｍｇのビタミンＥ、最大１０ｍｇのビタミンＫ、最大１ｍｇの葉酸、最大２５ｍｇのβ−カロテン、最大１００ｍｇのビタミンＢ１、最大１５００ｍｇのナイアシン、最大１０００ｍｇのビタミンＢ５、最大１００ｍｇのビタミンＢ６、最大２５００μｇのビオチン、最大３０００μｇのビタミンＢ１２、最大５０００ｍｇのω−３脂肪酸又はそれらの組合せからなる群から選択され、ここで、好ましくは、ＥＰＡは最大１８００ｍｇであり、ＤＨＡは最大１０００ｍｇであり、活性物質の放出は腸管まで遅延される。
【０２６１】
本発明の別の態様は、腸管の障害又は病状に罹患していない哺乳動物の腸管内の少なくとも１種の短鎖脂肪酸若しくはその塩の濃度の増加を目的とする、リボフラビン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、β−カロテン、ビタミンＢ１、ナイアシン、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビオチン、ビタミンＢ１２、ω−３脂肪酸及びそれらの組合せからなる群から選択される活性物質の非治療的使用であり、但し、ここで、ナイアシンが活性物質である場合、それは、唯一の活性物質ではない。哺乳動物は、好ましくは健康なヒトである。
【０２６２】
本発明のまた別の態様は、健康な哺乳動物、好ましくは健康なヒトの腸管機能の維持又は改善を目的とする、リボフラビン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、β−カロテン、ビタミンＢ１、ナイアシン、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビオチン、ビタミンＢ１２、ω−３脂肪酸及びそれらの組合せからなる群から選択される活性物質の非治療的使用であり、但し、ここで、ナイアシンが活性物質である場合、それは、唯一の活性物質ではない。
【０２６３】
本発明の１つの考慮事項は、使用される活性物質が、哺乳動物レシピエントに対する栄養の供給を意図するのではなく；むしろ、そうした物質は、大腸の微生物集団に直接利益をもたらし、それによって間接的に哺乳動物に利益をもたらすことが意図されることである。従って、用量は、哺乳動物の飼料の一部であるビタミン類、脂肪酸、及びその他の栄養素の通常の１日消費量に追加したものであることが意図される。そのため、胃及び好ましくは小腸での吸収を回避することにより、微生物集団は栄養を供給されて、腸管バリアをインタクトに保つ上で最適な能力を維持することができる。このように、本発明の製剤は、健康な腸の維持に役立つ。
【０２６４】
本発明者らは、消化全般に対する有益な効果も観察した。実施例に示すように、ビタミンＢ２を補給したブタは、非補給と比較して、ペプシン−ＨＣｌ中にインキュベートした基質（飼料又はブタの胃内容物）の高いＤＭ消化率を示した。これは、予想外であり、消化管機能性に対して明らかにプラスの効果である。さらに、本発明者らは、ブタからの盲腸内容物を用いた大腸発酵に対して有益な効果、即ち、メタン生成の低減を認めた。理論に縛られることは意図しないが、本発明者らは、これが、ビタミンＢ２がメタン生成菌又は古細菌集団の活性を抑制することができ、その結果、環境にプラスの影響を与えることによって説明され得ると考える。
【０２６５】
［実施例］
［実施例１］
［材料及び方法］
［ドナー及びサンプル調製］
腸内バッチ発酵インキュベーション開始時の第１組のインビトロ実験において、全ての試験材料をストック溶液から改変栄養培地に添加したが、これは、以下（ｇ／ｌ）を含有した：２．５Ｋ２ＨＰＯ４、１０．９ＫＨ２ＰＯ４、２ＮａＨＣＯ３、２酵素エキス、２ペプトン、１ムチン、０．５システイン、２Ｔｗｅｅｎ８０、２グルコース、２デンプン、２セロビオース、０．１ＮａＣｌ、０．０１ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．０１ＣａＣｌ２、６Ｈ２Ｏ、０．０５ヘミン、０．５胆汁酸塩。
【０２６６】
下記の化合物がストック溶液から添加され、水中で準備された：
・リボフラビンテーブルグレード（略語ＲＴＧ）、
・リボフラビン−５−リン酸（Ｒ５Ｐ）、
・アスコルビン酸粒状粉（ＡＡ）、
・ドライビタミンＥ  ５０ＣＷＳ−Ｓ（Ｅ５０  ＣＷＳ−Ｓ）、
・ドライビタミンＤ３  １００  ＣＷＳ（Ｄ３  １００  ＣＷＳ）、
・ドライビタミンＡ酢酸３２５ＣＷＳ／Ａ、
・リボフラビンテーブルグレード＋アスコルビン酸
・葉酸、
【０２６７】
他の化合物はエタノール中で調製した：
・ビタミンＫ１（ＶＫ１）、
・ＭＥＧ−３  ００８０  ＥＥオイル（ＭＥＧ−３  ００８０  ＥＥ）、
・ＭＥＧ−３  ４５３５  ＥＥオイル（ＭＥＧ−３  ４５３５  ＥＥ）、
・ＭＥＧ−３  ８０００  ＥＥオイル（ＭＥＧ−３  ８０００  ＥＥ）。
【０２６８】
各化合物を３つの異なる濃度で試験した；概略を表１に示す。エタノールは、抗菌作用を有することがわかっているため、各タイプのストック溶液の２つのブランクを加えた。微生物群の供給源として、選択されたドナーから新しく調製した糞便懸濁液を反応器に添加した。各反応器は、７０ｍｌの容積を有した。ブランクを除く全ての試験は、単一反復で実施し、表１に詳しく示すように、４０の独立したインキュベーションが得られた。プレスクリーニング実験及び最終実験のインキュベーション条件は、振盪（９０ｒｐｍ）及び嫌気条件下、３７℃で４８ｈであった。発酵前（０ｈ発酵）及び発酵後（２４ｈ発酵）に各発酵フラスコから収集した流出（ｅｆｆｌｕｅｎｔ）サンプルからＤＮＡを抽出し、ショットガン（Ｓｈｏｔｇｕｎ）シーケンシングによる微生物叢組成解析に使用した。流出サンプルは、発酵前（０ｈ発酵）及び発酵後（４８ｈ発酵）に各発酵フラスコから収集し、０．２２μｍフィルタを介した濾過により滅菌した後、細胞培養系中の短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）、免疫学的バイオマーカの定量及びインビトロ解析のために使用した。
【０２６９】
【表２】
2021535086.tif 000003
【０２７０】
【表３】
2021535086.tif 000004
【０２７１】
第２組のインビトロ実験では、短期結腸インキュベーションの開始時に、結腸内に存在する基礎栄養（例えば、ムチンなどの宿主由来のグリカン）を含有する栄養培地に試験材料を添加した。１製剤につき３つの用量を試験した。この特定のプロジェクトに使用される栄養培地には、ＮａＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２、ヘミン及び胆汁酸塩、さらには炭素源グルコース、デンプン及びセロビオースを再度補充した。製剤インキュベーションに使用されるものと同じ栄養培地を含むが、製剤は添加していないブランクを各ドナーについて加えた。そうすることで、評価は、栄養培地中の化合物の発酵から生じる細菌群のバックグラウンド活性から構成することができる。結腸内微生物叢の供給源として、２人の健康な成人の糞便接種材料を添加した。インキュベーションは、振盪（９０ｒｐｍ）及び嫌気条件下、光から保護し、３７℃で４８ｈ実施した。下記の化合物を試験した：
・チアミン塩酸塩
・β−カロテン１０％ＣＷＳ／Ｓ
・ナイアシンアミドＰＣ
・Ｄ−パントテン酸カルシウム
・ピリドキシン塩酸塩
・Ｄ−ビオチン
・ビタミンＢ１２結晶
【０２７２】
各化合物を３つの異なる濃度で試験した；概略を以下の表２に記載する：
【０２７３】
【表４】
2021535086.tif 000005
【０２７４】
［短鎖脂肪酸］
短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）は、微生物の炭水化物代謝（酢酸塩、プロピオン酸塩及び酪酸塩）又はタンパク質代謝（分岐ＳＣＦＡ）の評価であり、通常のＧＩ微生物叢についての典型的な発酵パターンと比較することができる。ＳＣＦＡ分析用のサンプルは、前述した２組のインビトロ実験についてインキュベーションの０、６、２４及び４８ｈ後に分析した。
【０２７５】
内部標準としての２−メチルヘキサン酸の添加後、ジエチルエーテルでサンプルからＳＣＦＡを抽出した。キャピラリー脂肪酸フリーＥＣ−１０００Ｅｃｏｎｏ−Ｃａｐカラム（サイズ：２５ｍｍ×０．５３ｍｍ、膜厚１．２ｍＭ；Ａｌｌｔｅｃｈ，Ｌａａｒｎｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、水素炎イオン化検出器及びスプリットインジェクタを備えたＧＣ−２０１４ガスクロマトグラフ（Ｓｈｉｍａｚｕ，‘ｓ−Ｈｅｒｔｏｇｅｎｂｏｓｃｈ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒ−ｌａｎｄｓ）を用いて、抽出物を分析した。注入量は１ｍＬであり、温度プロフィールは、１１０〜１６０℃に設定し、温度上昇は、６℃／ｍｉｎであった。キャリアガスは窒素で、インジェクタ及び検出器の温度は、それぞれ１００及び２２０℃であった。非分岐及び分岐ＳＣＦＡの生成は、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩及びカプロン酸塩のモル濃度を合計し、イソ酪酸塩、イソ吉草酸塩及びイソカプロン酸塩モル濃度をそれぞれ合計することによって計算した。総ＳＣＦＡ生成量は、非分岐及び分岐ＳＣＦＡの合計として定義した。
【０２７６】
［細胞培養］
Ｃａｃｏ−２及びＨＴ２９−ＭＴＸ−Ｅ１２細胞の共培養物を用いて、前述した２組のインビトロ実験の発酵前（０ｈ）及び発酵後（４８ｈ）の上清の保護効果を評価した。
【０２７７】
Ｃａｃｏ−２  ＥＣＡＣＣ  ８６０１０２０２及びＨＴ２９−ＭＴＸ−Ｅ１２  ＥＣＡＣＣ  １２０４０４０１細胞（いずれも、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫから）は両方とも、４．５ｇ／ＬのＤ−グルコース、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｂ．Ｖ．，Ｚｕｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及び１０％熱不活性ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を補充したＤＭＥＭ培地中、５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で培養した。サブコンフルエント状態の細胞を０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｂ．Ｖ．，Ｚｕｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてトリプシン処理してから、１：５〜１：１０の比で週２回継代させた。継代５５〜８５の間の細胞をこの試験に使用した。
【０２７８】
Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＨＴＳ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−２４システムＰＥＴ膜、０．４μＭ孔径、細胞増殖面積０．３３ｃｍ２／ウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＢＶ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中に、７：３比（Ｃａｃｏ−２：ＨＴ２９−ＭＴＸ−Ｅ１２）、２００００細胞／ウェルの密度で細胞を接種し、上述のように培養した。培地は２日〜３日置きに交換した。
【０２７９】
［健康な腸管モデルにおけるバリア健全性の測定］
細胞を１３日培養した後、両組のインビトロ実験について、ＳＴＸ１００電極を備えたＥＶＯＭ２  Ｖｏｌｔｏｈｍｍｅｔｅｒ（ＥＶＯＭ，Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｅｒｌｉｎ）を用いて、初期経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）読取り値を取得した。ＴＥＥＲ値は、コンフルエント単層の密集度（ｔｉｇｈｔｎｅｓｓ）と相関する（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。
【０２８０】
バックグラウンドＴＥＥＲ（挿入片）を総ＴＥＥＲ（細胞単層と挿入片）から差し引いて、単層抵抗を取得してから、挿入片の面積と掛け合わせることにより表面積に対して正規化した（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。ＴＥＥＲを測定することにより、単層の健全性を基礎レベルで決定した。３００Ωｃｍ２のＴＥＥＲを密集単層とみなした（結果のセクションを参照）。その後、細胞を滅菌濾過発酵上清又は対照としての発酵培地（増殖培地で１：２０希釈）で処理した。２４ｈのインキュベーション後、各細胞単層全体での抵抗を再度測定し、各挿入片について初期ＴＥＥＲと比較したＴＥＥＲのパーセンテージの変化を算出して、健康な腸管モデルとして呈示する。ＴＥＥＲ測定は全て、３７℃の保温プレート上に挿入片を含むプレートを配置することによって行い、同じ持続時間で実施した。
【０２８１】
［腸管壁浸漏モデルにおけるバリア健全性の測定］
両組のインビトロ実験について、ストレス因子テスト後の細胞単層の健全性を両方のＴＥＥＲ値により、さらには頂端面（ａｐｉｃａｌ）から側底面（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ）コンパートメントへのルシファー（Ｌｕｃｉｆｅｒ）イエローの輸送を測定することによって評価した（腸管壁浸漏モデル）。５．５ｍＭ  Ｄ−（＋）−グルコース、重炭酸ナトリウムを含み、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｂ．Ｖ．，Ｚｕｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を補充した、ｐＨ７．４のハンクス平衡塩液とＣａ２＋及びＭｇ２＋から構成される予熱ＨＢＳＳトランスポートバッファーを全ての透過性実験に使用した。リザーバトレイを用いて、挿入片をＨＢＳＳで２回すすいでから、１００μｌのＨＢＳＳを挿入片の頂端面（ａｐｉｃａｌ）側に添加した後、新しいＨＢＳＳを含む新たなウェルに移し、インキュベータ内で３７℃にて６０分間平衡させた後、ＴＥＥＲ測定を行うことにより、ベースライン抵抗読取り値を取得した。
【０２８２】
ルシファーイエローＣＨ二リチウム塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を１００μｇ／ｍｌの最終濃度でＨＢＳＳに溶解させた。側底面（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ）ストレス因子ＥｔＯＨ（Ｍｅｒｃｋ，ＫｇａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をＨＢＳＳ中５％に希釈した。頂端面（ａｐｉｃａｌ）ストレス因子ラムノリピドＲ９０（ＡＧＡＥ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，ＵＳＡ）を、ルシファーイエローを含有するＨＢＳＳに３５０μｇ／ｍｌの最終濃度で溶解させた。溶液は全て、毎回新しく調製した。
【０２８３】
側底面チャンバーからのＨＢＳＳトランスポートバッファーをまず吸引した後、頂端面チャンバーからのＨＢＳＳをルシファーイエロー溶液に取り換えた。頂端面ストレス因子テストのために、３５０μｇ／ｍｌのラムノリピドを含有するルシファーイエロー溶液又は対照としてストレス因子を含まないルシファーイエロー溶液を頂端面コンパートメントにロードし、続いて、ブランクＨＢＳＳを側底面チャンバーに添加した。側底面ストレス因子テストのために、ルシファーイエロー溶液を全ウェルの頂端面側に添加し、ＨＢＳＳ中の５％ＥｔＯＨ又は対照ウェル用のブランクＨＢＳＳのいずれかを側底面コンパートメント内に導入した。
【０２８４】
３７℃で３ｈのインキュベーション後、ＴＥＥＲ値を測定することにより、細胞単層の透過性を評価した。ＴＥＥＲデータを初期値のパーセンテージとして表示した。
【０２８５】
ＴＥＥＲ測定後、１００μｌアリコートサンプルを側底面側から２回反復で取り出し、輸送されたルシファーイエローの量を定量した。蛍光レベル（４２０ｎｍでの励起及び５３０ｎｍでの発光）を９６ウェル蛍光プレートリーダ（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｕｌｔｉ−Ｍｏｄｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で測定した。
【０２８６】
［ショットガンシーケンシングによる微生物叢組成の分析］
第１組のインビトロ実験の場合、以前記載されている（ＭｃＣｏｒｍａｃｋ  ｅｔａｌ．，２０１８）ように、ビーズビィーティングステップの追加及び溶解温度を９５℃に上昇させる以外は、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｓｔｏｏｌ  ｍｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｒａｗｌｅｙ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｄｄｏｍ）を用いて、製造者の指示に従い、試験全体を通して回収した全サンプルから全ＤＮＡを抽出した。
【０２８７】
ＤＮＡ単離の後、Ｑｕｂｉｔ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＤＮＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、ＤＮＡを定量した。次に、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用い、製造者の指示に従い、以下の修正を加えて全メタゲノムライブラリーを調製した：第１に、断片化（ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）時間を７分に増加し、第２に、指数の組込み及び産物のＡｍｐｕｒｅ精製の後、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｃｈｉｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ）に泳動させることにより、サンプルを各々個別にサイズ決定した後、Ｑｕｂｉｔ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＤＮＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、Ｔｅａｇａｓｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ＳＯＰに従い、定量した。次に、サンプルを等モルでプールし、ＮｅｘｔＳｅｑ５００／５５０ｖ２ハイアウトプット試薬キットを備えたＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ５００でシーケンシングした（３００サイクル）。シーケンシングは全て、標準的Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプロトコルに従い、Ｔｅａｇａｓｃシーケンシングファシリティで行った。
【０２８８】
送達された未処理ＦＡＳＴＱ配列ファイルを以下のように品質検査した：ＳＡＭ及びＰｉｃａｒｄツールの組合せを用いて、品質不良及び二重リードの除去、並びにトリミングを実施した。Ｋｒａｋｅｎソフトウエアを用いて、分類法をリードに割り当て、Ｓｕｐｅｒ  ｆｏｃｕｓを用いて機能分析を実施した。
【０２８９】
第２組のインビトロ実験の場合、Ｖａｎｄｅｐｕｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）に従って２つの技術を組み合わせることにより、異なる処置により誘導される群集シフトを極めて詳細にマッピングした：１）１６Ｓ標的化Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング、ＰＣＲに基づく方法であり、これにより、微生物シーケンスを飽和まで増幅して、様々な系統発生レベル（微生物門、科及びＯＴＵレベル）での異なる分類群の存在量割合を取得する。２）フローサイトメトリーによるサンプル中の総細菌細胞の正確な定量。１６Ｓ標的化Ｉｌｌｕｍｉｎａの高解像度系統発生学的情報とフローサイトメトリーによる細胞数の正確な定量を組み合わせることにより、反応器内部の様々な分類群実態の定量的計数を達成した。
【０２９０】
［免疫学的バイオマーカのＨＴ２９細胞培養及び定量］
両組のインビトロ実験ともに、ＨＴ２９細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から取得した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、及び非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｂ．Ｖ．，Ｚｕｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を補充したＤＭＥＭ中に細胞を培養した。ウェル当たり８×１０５細胞で細胞を１２ウェルプレートに接種し、２日の前培養後に使用した。これらは、処理前の１８ｈにわたり、０．２５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で飢餓状態にした。１００ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−α又は滅菌濾過し、０．２５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで１：２０希釈した発酵上清で細胞を２４時間処理した。処理は全て３回反復して行った。その結果として、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｐｒｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｐａｎｅｌキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）又はＬｕｍｉｎｅｘ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ａｓｓａｙキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｌｉｓ，ＭＮ）と共にＬｕｍｉｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＬｉｑｕｉＣｈｉｐ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  ＩＳ  ２００、Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、製造者の指示に従って、ＨＴ２９上清中のサイトカイン、ケモカイン及びインターロイキンを定量した。Ｌｕｍｉｎｅｘ  ＩＳ  ２．３ソフトウエアを用いてデータを取得し、ＬｉｑｕｉＣｈｉｐ  Ａｎａｌｙｓｅｒソフトウエア（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて評価した。
【０２９１】
［ガス生成］
両組のインビトロ実験ともに、前述した通りの閉鎖インキュベーションシステム内で結腸インキュベーションを実施した。これにより、ヘッド空間内のガスの蓄積を評価することが可能になり、これは、圧力計を用いて測定することができる。ガス生成は、微生物活動の尺度であり、従って、潜在的にプレバイオティックな基質の発酵速度の尺度である。
【０２９２】
［結果］
［図１〜１５に描かれる第１組の実験］
ビタミン類及びω−３脂肪酸の投与から４８ｈ発酵後の酢酸塩生成に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
−  １×及び５×用量のビタミンＥの補給で、酢酸塩生成が増加する
−  １×用量のビタミンＡの補給で、酢酸塩生成が増加する
−  １×用量のビタミンＢ２＋Ｃの補給で、酢酸塩生成が増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量の葉酸の補給で、酢酸塩生成が増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のビタミンＫ１の補給で、酢酸塩生成が増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＤＨＡの補給で、酢酸塩生成が増加する
−  ０．２×及び１×用量のＤＨＡ＋ＥＰＡの補給で、酢酸塩生成が増加する
−  ０．２×及び１×用量のＥＰＡの補給で、酢酸塩生成が増加する。
【０２９３】
ビタミン類及びω−３脂肪酸の投与から４８ｈ発酵後のプロピオン酸塩生成に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
−  １×用量のビタミンＥの補給で、プロピオン酸塩生成が増加する
−  １×及び５×用量のビタミンＤの補給で、プロピオン酸塩生成が増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のビタミンＡの補給で、プロピオン酸塩生成が増加する
−  ０．２×用量のビタミンＢ２＋Ｃの補給で、プロピオン酸塩生成が増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量の葉酸の補給で、プロピオン酸塩生成が増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のビタミンＫ１の補給で、プロピオン酸塩生成が増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＤＨＡの補給で、プロピオン酸塩生成が増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＤＨＡ＋ＥＰＡの補給で、プロピオン酸塩生成が増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＥＰＡの補給で、プロピオン酸塩生成が増加する。
【０２９４】
ビタミン類及びω−３脂肪酸の投与から４８ｈ発酵後の酪酸塩生成に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
−  ５×用量のビタミンＢ２の補給で、酪酸塩生成が増加する
−  ５×用量のビタミンＢ２−５−リン酸の補給で、酪酸塩生成が増加する
−  ０．２×及び１×用量のビタミンＤの補給で、酪酸塩生成が増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のビタミンＡの補給で、酪酸塩生成が増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量の葉酸の補給で、酪酸塩生成が増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のビタミンＫ１の補給で、酪酸塩生成が増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＤＨＡの補給で、酪酸塩生成が増加する
−  ０．２×及び１×用量のＤＨＡ＋ＥＰＡの補給で、酪酸塩生成が増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＥＰＡの補給で、酪酸塩生成が増加する。
【０２９５】
ビタミン類及びω−３脂肪酸の投与から４８ｈ発酵後の総ＳＣＦＡ生成に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
−  １×用量のビタミンＥの補給で、総ＳＣＦＡ生成が増加する
−  １×及び５×用量のビタミンＤの補給で、総ＳＣＦＡ生成が増加する
−  ０．２×及び５×用量のビタミンＡの補給で、総ＳＣＦＡ生成が増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量の葉酸の補給で、総ＳＣＦＡ生成が増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のビタミンＫ１の補給で、総ＳＣＦＡ生成が増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＤＨＡの補給で、総ＳＣＦＡ生成が増加する
−  ０．２×及び１×用量のＤＨＡ＋ＥＰＡの補給で、総ＳＣＦＡ生成が増加する
−  ０．２×及び１×用量のＥＰＡの補給で、総ＳＣＦＡ生成が増加する。
【０２９６】
健康な腸細胞モデル（図６）において０ｈ発酵サンプルで処理した細胞のＴＥＥＲを差し引いた後の４８ｈ発酵サンプルで処理した細胞のＴＥＥＲ測定値に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
−  ０．２×用量のビタミンＢ２−５−リン酸の発酵からのサンプルで処理した細胞は、ＴＥＥＲが増加する
−  １×用量のビタミンＣの発酵からのサンプルで処理した細胞は、ＴＥＥＲが増加する
−  １×及び５×用量のビタミンＥの発酵からのサンプルで処理した細胞は、ＴＥＥＲが増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＤＨＡ＋ＥＰＡの発酵からのサンプルで処理した細胞は、ＴＥＥＲが増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＥＰＡの発酵からのサンプルで処理した細胞は、ＴＥＥＲが増加する
【０２９７】
腸管壁浸漏細胞モデルの側底面誘導（図７）において０ｈ発酵サンプルで処理した細胞のＴＥＥＲを差し引いた後の４８ｈ発酵サンプルで処理した細胞のＴＥＥＲ測定値に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
−  ０．２×用量のビタミンＢ２の発酵からのサンプルで処理した細胞は、ＴＥＥＲが増加する
−  ０．２×用量のビタミンＢ２＋ビタミンＣの発酵からのサンプルで処理した細胞は、ＴＥＥＲが増加する
−  ０．２×用量のビタミンＥの発酵からのサンプルで処理した細胞は、ＴＥＥＲが増加する
−  ０．２×及び１×用量のＤＨＡ＋ＥＰＡの発酵からのサンプルで処理した細胞は、ＴＥＥＲが増加する
−  ０．２×及び１×用量のＥＰＡの発酵からのサンプルで処理した細胞は、ＴＥＥＲが増加する。
【０２９８】
腸管壁浸漏細胞モデルの側底面誘導（図７）において４８ｈ発酵サンプルで処理した細胞のＴＥＥＲを差し引いた後の４８ｈ発酵サンプルで処理した細胞のルシファーイエロー測定値に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
−  ０．２×用量のビタミンＢ２の発酵からのサンプルで処理した細胞は、ルシファーイエローが減少する
−  ０．２×用量のビタミンＢ２＋ビタミンＣの発酵からのサンプルで処理した細胞は、ルシファーイエローが減少する
−  ０．２×用量のビタミンＥの発酵からのサンプルで処理した細胞は、ルシファーイエローが減少する
−  ０．２×用量のＤＨＡ＋ＥＰＡの発酵からのサンプルで処理した細胞は、ルシファーイエローが減少する。
【０２９９】
腸管壁浸漏細胞モデルの頂端面誘導（図８）において０ｈ発酵サンプルで処理した細胞のＴＥＥＲを差し引いた後の４８ｈ発酵サンプルで処理した細胞のＴＥＥＲ測定値に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
−  ０．２×用量のビタミンＢ２の発酵からのサンプルで処理した細胞は、ＴＥＥＲが増加する
−  ０．２×用量のビタミンＢ２−５−リン酸の発酵からのサンプルで処理した細胞は、ＴＥＥＲが増加する
−  ０．２×及び１×用量のビタミンＣの発酵からのサンプルで処理した細胞は、ＴＥＥＲが増加する
−  ０．２×用量のビタミンＢ２＋ビタミンＣの発酵からのサンプルで処理した細胞は、ＴＥＥＲが増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のビタミンＥの発酵からのサンプルで処理した細胞は、ＴＥＥＲが増加する
−  ５×用量のビタミンＤの発酵からのサンプルで処理した細胞は、ＴＥＥＲが増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のビタミンＡの発酵からのサンプルで処理した細胞は、ＴＥＥＲが増加する
−  ０．２×及び１×用量の葉酸の発酵からのサンプルで処理した細胞は、ＴＥＥＲが増加する
−  ０．２×用量のＤＨＡ＋ＥＰＡの発酵からのサンプルで処理した細胞は、ＴＥＥＲが増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＥＰＡの発酵からのサンプルで処理した細胞は、ＴＥＥＲが増加する。
【０３００】
腸管壁浸漏細胞モデルの頂端面誘導（図８）において４８ｈ発酵サンプルで処理した細胞のＴＥＥＲを差し引いた後の４８ｈ発酵サンプルで処理した細胞のルシファーイエロー測定値に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
−  ０．２×用量のビタミンＢ２の発酵からのサンプルで処理した細胞は、ルシファーイエローが減少する
−  ０．２×用量のビタミンＢ２−５−リン酸の発酵からのサンプルで処理した細胞は、ルシファーイエローが減少する
−  ０．２×及び１×用量のビタミンＣの発酵からのサンプルで処理した細胞は、ルシファーイエローが減少する
−  ０．２×用量のビタミンＢ２＋ビタミンＣの発酵からのサンプルで処理した細胞は、ルシファーイエローが減少する
−  １×及び５×用量のビタミンＥの発酵からのサンプルで処理した細胞は、ルシファーイエローが減少する
−  １×及び５×用量のビタミンＡの発酵からのサンプルで処理した細胞は、ルシファーイエローが減少する
−  ０．２×用量のビタミンＫ１の発酵からのサンプルで処理した細胞は、ルシファーイエローが減少する
−  ０．２×用量のＤＨＡ＋ＥＰＡの発酵からのサンプルで処理した細胞は、ルシファーイエローが減少する。
【０３０１】
ビタミン類及びω−３脂肪酸の投与から２４ｈ発酵後の微生物叢α多様性に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
−  １×及び５×用量のビタミンＢ２の補給で、微生物叢多様性が増大する
−  ０．２×及び１×用量のビタミンＢ２−５−リン酸の補給で、微生物叢多様性が増大する
−  ５×用量のビタミンＣの補給で、微生物叢多様性が増大する
−  ０．２×、１×及び５×用量のビタミンＥの補給で、微生物叢多様性が増大する
−  ０．２×及び５×用量のビタミンＤの補給で、微生物叢多様性が増大する
−  １×及び５×用量のビタミンＡの補給で、微生物叢多様性が増大する
−  １×及び５×用量のビタミンＢ２＋ビタミンＣの補給で、微生物叢多様性が増大する
−  ０．２×及び１×用量の葉酸の補給で、微生物叢多様性が増大する
−  ０．２×、１×及び５×用量のビタミンＫ１の補給で、微生物叢多様性が増大する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＤＨＡの補給で、微生物叢多様性が増大する
−  １×及び５×用量のＤＨＡ＋ＥＰＡの補給で、微生物叢多様性が増大する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＥＰＡの補給で、微生物叢多様性が増大する。
【０３０２】
ビタミン類及びω−３脂肪酸の投与から２４ｈ発酵後のビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）相対存在量に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
−  １×及び５×用量のビタミンＢ２の補給で、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）相対存在量が増加する
−  ０．２×及び１×用量のビタミンＢ２−５−リン酸の補給で、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）相対存在量が増加する
−  １×用量のビタミンＣの補給で、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）相対存在量が増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のビタミンＥの補給で、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）相対存在量が増加する
−  ０．２×及び５×用量のビタミンＤの補給で、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）相対存在量が増加する
−  １×用量のビタミンＡの補給で、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）相対存在量が増加する
−  １×及び５×用量のビタミンＢ２＋ビタミンＣの補給で、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）相対存在量が増加する
−  ０．２×及び１×用量の葉酸の補給で、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）相対存在量が増加する
−  ０．２×用量のビタミンＫ１の補給で、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）相対存在量が増加する
−  ０．２×及び５×用量のＤＨＡの補給で、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）相対存在量が増加する
−  ５×用量のＤＨＡ＋ＥＰＡの補給で、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）相対存在量が増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＥＰＡの補給で、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）相対存在量が増加する。
【０３０３】
他の有益細菌についても同様の観察結果が得られた。
【０３０４】
ビタミン類及びω−３脂肪酸の投与から２４ｈ発酵後の酪酸合成経路へのアセチル−ＣｏＡ発酵に関与する遺伝子の相対存在量に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
−  １×及び５×用量のビタミンＢ２の補給で、酪酸合成経路へのアセチル−ＣｏＡ発酵に関与する遺伝子の相対存在量が増加する
−  ０．２×及び１×用量のビタミンＢ２−５−リン酸の補給で、酪酸合成経路へのアセチル−ＣｏＡ発酵に関与する遺伝子の相対存在量が増加する
−  ５×用量のビタミンＣの補給で、酪酸合成経路へのアセチル−ＣｏＡ発酵に関与する遺伝子の相対存在量が増加する
−  ０．２×用量のビタミンＥの補給で、酪酸合成経路へのアセチル−ＣｏＡ発酵に関与する遺伝子の相対存在量が増加する
−  ０．２×用量のビタミンＤの補給で、酪酸合成経路へのアセチル−ＣｏＡ発酵に関与する遺伝子の相対存在量が増加する
−  １×及び５×用量のビタミンＡの補給で、酪酸合成経路へのアセチル−ＣｏＡ発酵に関与する遺伝子の相対存在量が増加する
−  ５×用量のビタミンＢ２＋ビタミンＣの補給で、酪酸合成経路へのアセチル−ＣｏＡ発酵に関与する遺伝子の相対存在量が増加する
−  ０．２×用量の葉酸の補給で、酪酸合成経路へのアセチル−ＣｏＡ発酵に関与する遺伝子の相対存在量が増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のビタミンＫ１の補給で、酪酸合成経路へのアセチル−ＣｏＡ発酵に関与する遺伝子の相対存在量が増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＤＨＡの補給で、酪酸合成経路へのアセチル−ＣｏＡ発酵に関与する遺伝子の相対存在量が増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＤＨＡ＋ＥＰＡの補給で、酪酸合成経路へのアセチル−ＣｏＡ発酵に関与する遺伝子の相対存在量が増加する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＥＰＡの補給で、酪酸合成経路へのアセチル−ＣｏＡ発酵に関与する遺伝子の相対存在量が増加する。
【０３０５】
ビタミン類及びω−３脂肪酸の投与後２４ｈ発酵からの流出物で処理した後のＨＴ２９細胞によるＧＲＯａ−ＣＸＣＬ１生成に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
−  １×及び５×用量のビタミンＢ２の補給で、ＧＲＯａ−ＣＸＣＬ１生成が増大する
−  ５×用量のビタミンＥの補給で、ＧＲＯａ−ＣＸＣＬ１生成が増大する
−  １×用量のビタミンＢ２＋ビタミンＣの補給で、ＧＲＯａ−ＣＸＣＬ１生成が増大する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＤＨＡの補給で、ＧＲＯａ−ＣＸＣＬ１生成が増大する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＤＨＡ＋ＥＰＡの補給で、ＧＲＯａ−ＣＸＣＬ１生成が増大する
−  １×及び５×用量のＥＰＡの補給で、ＧＲＯａ−ＣＸＣＬ１生成が増大する。
【０３０６】
ビタミン類及びω−３脂肪酸の投与後２４ｈ発酵からの流出物で処理した後のＨＴ２９細胞によるＩＬ−８生成に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
−  １×及び５×用量のビタミンＢ２の補給で、ＩＬ−８生成が増大する
−  ５×用量のビタミンＢ２−５−リン酸の補給で、ＩＬ−８生成が増大する
−  ０．２×、１×及び５×用量のビタミンＥの補給で、ＩＬ−８生成が増大する
−  ０．２×及び５×用量のビタミンＡの補給で、ＩＬ−８生成が増大する
−  １×用量のビタミンＢ２＋ビタミンＣの補給で、ＧＩＬ−８生成が増大する
−  ０．２×及び５×用量の葉酸の補給で、ＩＬ−８生成が増大する
−  ０．２×用量のビタミンＫ１の補給で、ＩＬ−８生成が増大する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＤＨＡの補給で、ＩＬ−８生成が増大する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＤＨＡ＋ＥＰＡの補給で、ＩＬ−８生成が増大する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＥＰＡの補給で、ＩＬ−８生成が増大する。
【０３０７】
ビタミン類及びω−３脂肪酸の投与後２４ｈ発酵からの流出物で処理した後のＨＴ２９細胞によるＭＩＰ３Ａ−ＣＣＬ２０生成に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
−  ０．２×、１×及び５×用量のビタミンＥの補給で、ＭＩＰ３Ａ−ＣＣＬ２０生成が増大する
−  ０．２×、１×及び５×用量のビタミンＤの補給で、ＭＩＰ３Ａ−ＣＣＬ２０生成が増大する
−  ０．２×、１×及び５×用量のビタミンＡの補給で、ＭＩＰ３Ａ−ＣＣＬ２０生成が増大する
−  ０．２×、１×及び５×用量のビタミンＫ１の補給で、ＭＩＰ３Ａ−ＣＣＬ２０生成が増大する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＤＨＡの補給で、ＭＩＰ３Ａ−ＣＣＬ２０生成が増大する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＤＨＡ＋ＥＰＡの補給で、ＭＩＰ３Ａ−ＣＣＬ２０生成が増大する
−  ０．２×、１×及び５×用量のＥＰＡの補給で、ＭＩＰ３Ａ−ＣＣＬ２０生成が増大する。
【０３０８】
ビタミン類及びω−３脂肪酸の投与から４８ｈ発酵後のガス生成に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
１×及び５×用量のビタミンＣの補給で、ガス生成が低減する
１×及び５×用量のビタミンＥの補給で、ガス生成が低減する
１×及び５×用量のビタミンＣ及びＢ２の補給で、ガス生成が低減する。
【０３０９】
［図１６〜１９に示す第２組のインビトロ実験］
ビタミン類及びβ−カロテンの投与から４８ｈ発酵後の酢酸塩生成に関して、以下の観察結果が得られた：
−  対応する対照と比較し、両ドナーにおいて１×及び５×用量のβ−カロテンの補給で、酢酸塩生成が増加する。
【０３１０】
ビタミン類の投与から４８ｈ発酵後のプロピオン酸塩生成に関して、以下の観察結果が得られた：
−  ２人のドナーの一方（ドナーＣ）において１×及び５×用量のβ−カロテンの補給で、プロピオン酸塩生成が増加する
−  対応する対照と比較し、２人のドナーの一方（ドナーＣ）において０．２×用量のビタミンＢ５の補給で、プロピオン酸塩生成が増加する。
【０３１１】
ビタミン類の投与から４８ｈ発酵後の酪酸塩生成に関して、以下の観察結果が得られた：
−  両方のドナーにおいて１×用量のβ−カロテンの補給で、酪酸塩生成が増加する
−  対応する対照と比較し、２人のドナーの一方（ドナーＣにおいて０．２×用量のβ−カロテン補給で、酪酸塩生成が増加する。
【０３１２】
ビタミン類及びβ−カロテンの投与から４８ｈ発酵後の総ＳＣＦＡ生成に関して、以下の観察結果が得られた：
−  対応する対照と比較し、両方のドナーにおいて１×及び５×用量のβ−カロテンの補給で、総ＳＣＦＡ生成が増加する
−  対応する対照と比較し、両方のドナーにおいて５×用量のビタミンＢ５の補給で、分岐ＳＣＦＡ生成が減少する。
【０３１３】
ビタミン類の投与から２４ｈ発酵後のビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）相対存在量に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
−  両ドナーについて、１×及び５×用量のβ−カロテンの補給で、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）相対存在量が増加する
−  両ドナーについて５×用量のビタミンＢ５の補給で、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）相対存在量が増加する
−  ２人のドナーの一方（ドナーＤ）について、０．２×、１×及び５×用量のビオチンの補給で、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）相対存在量が増加する
−  ２人のドナーの一方（ドナーＤ）について、１×及び５×用量のピリドキシンの補給で、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）相対存在量が増加する。
【０３１４】
ビタミン類の投与から２４ｈ発酵後のエガセラ科（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａｃｅａｅ）相対存在量に関して、以下の観察結果が得られた：
−  対応する対照と比較し、両ドナーについて、５×用量のβ−カロテンの補給で、エガセラ科（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａｃｅａｅ）相対存在量が増加する。
【０３１５】
ビタミン類の投与から２４ｈ発酵後のデスルフォビブリオ科（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ）相対存在量に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
−  両ドナーについて、５×用量のβ−カロテンの補給で、デスルフォビブリオ科（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ）相対存在量が減少する
−  ２人のドナーの一方（ドナーＣ）について、５×用量のビタミンＢ５の補給で、デスルフォビブリオ科（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ）相対存在量が減少する。
【０３１６】
ビタミン類の投与から２４ｈ発酵後のアッカーマンシア科（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａｃｅａｅ）相対存在量に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
−  両ドナーについて、５×用量のβ−カロテンの補給で、アッカーマンシア科（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａｃｅａｅ）相対存在量が増加する
−  ２人のドナーの一方（ドナーＣ）について、１×用量のチアミンの補給で、アッカーマンシア科（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａｃｅａｅ）相対存在量が増加する
−  ２人のドナーの一方（ドナーＣ）について、０．２×用量のナイアシンアミドの補給で、アッカーマンシア科（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａｃｅａｅ）相対存在量が増加する
−  ２人のドナーの一方（ドナーＤ）について、０．２×用量のビタミンＢ５の補給で、アッカーマンシア科（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａｃｅａｅ）相対存在量が増加する
−  ２人のドナーの一方（ドナーＤ）について、０．２×、１×、及び５×用量のピリドキシンの補給で、アッカーマンシア科（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａｃｅａｅ）相対存在量が増加する
−  ２人のドナーの一方（ドナーＤ）について、０．２×用量のビオチンの補給で、アッカーマンシア科（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａｃｅａｅ）相対存在量が増加する
−  ２人のドナーの一方（ドナーＤ）について、０．２×及び１×用量のビタミンＢ１２の補給で、アッカーマンシア科（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａｃｅａｅ）相対存在量が増加する。
【０３１７】
ビタミン類の投与から２４ｈ発酵後のプレボテラ科（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）相対存在量に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
−  ２人のドナーの一方（ドナーＣ）について、１×用量のβ−カロテンの補給で、プレボテラ科（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）相対存在量が増加する
−  ２人のドナーの一方（ドナーＣ）について、５×用量のピリドキシンの補給で、プレボテラ科（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）相対存在量が増加する。
【０３１８】
ビタミン類の投与から２４ｈ発酵後のクロストリジウム科（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ）相対存在量に関して、以下の観察結果が得られた：
−対応する対照と比較し、２人のドナーの一方（ドナーＣ）について、１×用量のβ−カロテンの補給で、クロストリジウム科（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ）相対存在量が増加する。
【０３１９】
ビタミン類の投与から２４ｈ発酵後のエリシペロソリックス科（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）相対存在量に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
−  ２人のドナーの一方（ドナーＣ）について、５×用量のチアミンの補給で、エリシペロソリックス科（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）相対存在量が増加する
−  ２人のドナーの一方（ドナーＣ）について、１×及び５×用量のナイアシンアミドの補給で、エリシペロソリックス科（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）相対存在量が増加する
−  ２人のドナーの一方（ドナーＣ）について、１×用量のピリドキシンの補給で、エリシペロソリックス科（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）相対存在量が増加する
−  ２人のドナーの一方（ドナーＣ）について、０．２×及び１×用量のビオチンの補給で、エリシペロソリックス科（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）相対存在量が増加する
−  ２人のドナーの一方（ドナーＣ）について、１×及び５×用量のビタミンＢ１２の補給で、エリシペロソリックス科（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）相対存在量が増加する
−  ２人のドナーの一方（ドナーＤ）について、１×用量のビタミンＢ５の補給で、エリシペロソリックス科（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）相対存在量が増加する。
【０３２０】
ビタミン類の投与から２４ｈ発酵後のコリオバクテリウム科（Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）相対存在量に関して、以下の観察結果が得られた：
−  対応する対照と比較し、２人のドナーの一方（ドナーＤ）について、１×及び５×用量のβ−カロテンの補給で、コリオバクテリウム科（Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）相対存在量が増加する。
【０３２１】
ビタミン類の投与から２４ｈ発酵後のバルネシエラ科（Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａｃｅａｅ）相対存在量に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
−  ２人のドナーの一方（ドナーＤ）について、５×用量のβ−カロテンの補給で、バルネシエラ科（Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａｃｅａｅ）相対存在量が増加する
−  ２人のドナーの一方（ドナーＤ）について、１×用量のビオチンの補給で、バルネシエラ科（Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａｃｅａｅ）相対存在量が増加する。
【０３２２】
ビタミン類の投与から２４ｈ発酵後のフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）相対存在量に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
−  ２人のドナーの一方（ドナーＤ）について、１×及び５×用量のβ−カロテンの補給で、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）相対存在量が増加する
−  ２人のドナーの一方（ドナーＤ）について、０．２×、１×及び５×用量のビタミンＢ５の補給で、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）相対存在量が増加する
−  ２人のドナーの一方（ドナーＤ）について、０．２×、１×及び５×用量のピリドキシンの補給で、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）相対存在量が増加する
−  ２人のドナーの一方（ドナーＤ）について、０．２×、１×及び５×用量のビオチンの補給で、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）相対存在量が増加する
−  ２人のドナーの一方（ドナーＤ）について、０．２×、１×及び５×用量のビタミンＢ１２の補給で、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）相対存在量が増加する。
【０３２３】
ビタミン類の投与から２４ｈ発酵後のベイロネラ科（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）相対存在量に関して、以下の観察結果が得られた：
対応する対照と比較して、
−  ２人のドナーの一方（ドナーＤ）について、１×及び５×用量のβ−カロテンの補給で、ベイロネラ科（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）相対存在量が増加する
−  ２人のドナーの一方（ドナーＤ）について、０．２×用量のビタミンＢ５の補給で、ベイロネラ科（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）相対存在量が増加する
−  ２人のドナーの一方（ドナーＤ）について、５×用量のピリドキシンの補給で、ベイロネラ科（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）相対存在量が増加する。
【０３２４】
微生物叢多様性に関して、以下の観察結果が得られた：
１×及び５×用量のβ−カロテンの補給で、両ドナーにおけるβ多様性が増加する。
０．２×用量のβ−カロテンの補給で、２人のドナーの一方（ドナーＤ）におけるβ多様性が増加する。
５×用量５×用量のビタミンＢの補給で、両ドナーにおけるβ多様性が増加する。
０．２×及び１×用量のβ−カロテンの補給で、２人のドナーの一方（ドナーＤ）におけるβ多様性が増加する。
０．２×、１×及び５×用量のビタミンＢ６の補給で、２人のドナーの一方（ドナーＤ）におけるβ多様性が増加する。
０．２×、１×及び５×用量のビタミンＢ１２の補給で、２人のドナーの一方（ドナーＤ）におけるβ多様性が増加する。
１×用量のビタミンＢ７の補給で、両ドナーにおけるβ多様性が増加する。
５×用量のビタミンＢ７の補給で、２人のドナーの一方（ドナーＤ）におけるβ多様性が増加する。
１×用量のビタミンＢ１の補給で、２人のドナーの一方（ドナーＣ）におけるβ多様性が増加する。５×用量のビタミンＢ１の補給で、２人のドナーの一方（ドナーＤ）におけるβ多様性が増加する。
０．２×及び５×用量のビタミンＢ３の補給で、２人のドナーの一方（ドナーＤ）におけるβ多様性が増加する。
１×用量のビタミンＢ１の補給で、対応する対照と比較し、２人のドナーの一方（ドナーＣ）におけるβ多様性が増加する。
０．２×及び５×用量のビタミンＢ５の補給で、２人のドナーの一方（ドナーＤ）におけるα多様性が増加する。
５×用量のビタミンＢ６の補給で、２人のドナーの一方（ドナーＤ）におけるβ多様性が増加する。
０．２×及び１×用量のビタミンＢ１２の補給で、２人のドナーの一方（ドナーＤ）におけるα多様性が増加する。
０．２×用量のビタミンＢ７の補給で、両ドナーにおけるα多様性が増加する。
５×用量のビタミンＢ７の補給で、２人のドナーの一方（ドナーＤ）におけるα多様性が増加する。
０．２×及び１×用量のビタミンＢ１の補給で、２人のドナーの一方（ドナーＣ）におけるα多様性が増加する。
１×用量のビタミンＢ３の補給で、２人のドナーの一方（ドナーＣ）におけるα多様性が増加する。
【０３２５】
［実施例２］
［ヒトに使用するための製剤］
各々単一の活性成分を含む以下の製剤を調製し、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｓ  １００ポリマーでコーティングされた腸溶性ハードゼラチンカプセル（Ｃａｐｓｕｇｅｌ）に充填した。
【０３２６】
【表５】
2021535086.tif 000006
【０３２７】
製剤は、１日１回、好ましくは少なくとも２８日間連続で投与するのに適している。
【０３２８】
［実施例３］
［家禽モデル］
同じ遺伝子的特徴を有する１２０羽のニワトリ（全て雌）の３群を同じ環境条件を特徴とする３つの個室にそれぞれ収容し、３つの異なる餌：（Ａ）対照餌（５ｍｇ／ｋｇのリボフラビン）；（Ｂ）対照餌＋５０ｍｇ／ｋｇのビタミンリボフラビン）；（Ｃ）対照餌＋１００ｍｇ／ｋｇのビタミンリボフラビンを給餌した。飼料を給餌プログラムに従って変更する時期に対応する特定の日の３つの時点（即ち、Ｓ１＝１４日、Ｓ２＝２８日、Ｓ３＝３８／４２日）で各群をサンプリングした。
【０３２９】
４２日ブロイラー（試験終了時）は、体重が２．６ｋｇで、１羽当たり約２０５ｇ／日の飼料を摂餌する。従って、３つの試験投与量は、５；５０及び１００ｍｇ／ｋｇの飼料でそれぞれ０．３８；３．８２及び７．６５ｍｇ／ｋｇ（体重）のリボフラビン摂取に相当し、体重１ｋｇ当たりの摂取は、体重が低い方がはるかに高くなる。以下の表４は、ブロイラーの理論上の成長及び添加しようとするリボフラビンの量を示す。
【０３３０】
【表６】
2021535086.tif 000007
【０３３１】
各サンプリング（即ち、Ｓ１、Ｓ２及びＳ３）の間、計４０羽／群を人道的に安楽死させて、９リットルのサンプルを採取した（即ち、３サンプル／群）。
【０３３２】
［盲腸サンプルの微生物叢分析］
計７４１の盲腸サンプルがＵｎｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより分析されており、これは、第１時点からの１２０羽のサンプル、第２時点からの１１９羽（Ｃ群の１羽が行方不明）及び第３時点からの１１８羽（Ｂ群の１羽及びＣ群の１羽が行方不明）並びに第３時点からの１１８羽（Ｂ群の１羽及びＣ群の１羽が行方不明）を含む。
【０３３３】
［材料及び方法］
盲腸サンプルからのＤＮＡ抽出：市販のキット：ＤＮｅａｓｙ  ＰｏｗｅｒＳｏｉｌキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が選択され、製造者の指示に従って全ての利用可能な盲腸サンプルに適用されている。ＤＮＡ収量は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ計器を用いて測定した。
【０３３４】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子ＰＣＲ増幅及びシーケンシング。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３−Ｖ４超可変領域は、Ｉｌｌｕｍｉｎａオーバーハングアダプター配列を備える３４１Ｆ及び７８５Ｒプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  Ｂｅａｄｓ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を用いることによりアンプリコン精製を実施した。インデックス付きライブラリー調製のために、Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用した。さらなる磁気ビーズ精製ステップを実施し、Ｑｕｂｉｔ  ３．０フルオロメータ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてライブラリーを定量した後、４ｎＭでプールした。ライブラリープールをＮａＯＨ  ０．２Ｎで変性させてから、６ｐＭに希釈した。２×２５０ｂｐペアエンドプロトコルを用いて、製造者の指示（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットフォーム上でシーケンシングを実施した。
【０３３５】
バイオインフォマティクス及び統計。ＰＡＮＤＡｓｅｑ（Ｍａｓｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）及びＱＩＩＭＥ２（Ｃａｐｏｒａｓｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１０；ｈｔｔｐｓ：／／ｑｉｉｍｅ２．ｏｒｇ）を結合するパイプラインを用いて、未処理の配列をプロセシングした。キメラ配列の除去後、ハイクオリティリードをフィルタリングし、ｄａｄａ２（Ｃａｌｌａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１６）で実施されるオープンリファランス戦略による９９％の分類学的閾値に従って、高解像度操作的分類単位（ＯＴＵ）にビン分割した。分類は、ｖｓｅａｒｃｈ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ（Ｒｏｇｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１６）及び基準としてのＳＩＬＶＡデータベース（Ｑｕａｓｔ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）を用いて割り当てた。Ｆａｉｔｈ  ＰＣインデックス及び観測されたＯＴＵの数を用いて、α多様性を測定した。ライブラリーｖｅｇａｎ，ｍａｄｅ４，ＰＭＣＭＲを実装した、Ｒソフトウエア３．１．３（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）で作動するＲ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウエアバージョン１．０．１３６を用いて、統計を実施した。重み付けＵｎｉＦｒａｃ距離を計算することにより、β多様性を推定し、Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ  Ａｎａｌｙｓｅｓ（ＰＣｏＡｓ）により視覚化した。サンプル群間の隔たりの有意性は、ベーガン（ｖｅｇａｎ）パッケージの機能アドニスを用いて、置換分散多変量解析（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ）により検定した。サンプルの少なくとも１％中０．５％の最小相対存在量を示す細菌系統発生群（属、科、門）は、さらなる解析及びグラフ表示のために保持した。サンプル群間の組成の相違は、Ｋｒｕｓｔａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を用いて検定した。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いて、多重比較のためにＰ値を補正した。
【０３３６】
［結果］
７４１ＤＮＡサンプルから得られた１６ＳｒＲＮＡアンプリコンをシーケンシングしたところ、４，９８６，８６５個のハイクオリティ配列が得られ、これらは、サンプル当たり、１，０９９〜１５，１８２の範囲で、平均値が６，４９０±２７１５配列であった。リードは、９９％類似性に基づいて２０，９５０の操作的分類単位（ＯＴＵ）にクラスター化した。
【０３３７】
まず初めに、Ｂ群のニワトリのあらゆる利用可能なサンプル（図２０）に基づくβ多様性解析は、Ａ及びＣ群に関して、盲腸中の微生物叢構造に関して異なる縦断軌道を示す。
【０３３８】
この傾向は、Ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ＵｎｉＦｒａｃ距離を用いて、サンプルセット全体をプロットすれば特に明らかである（図２０Ａ）が、Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ  ＵｎｉＦｒａｃ距離を用いて得られたＰＣｏＡは、様々な群の間でより多くの重複を示す（図２０Ｂ）。これは、Ｂ群のブロイラーの微生物叢の相違が恐らく準優勢ではなく、最も多い細菌種に存在することを示している。
【０３３９】
時点Ｔ１、Ｔ２及びＴ３からのサンプルを用いて同じ分析を個別に実施した（図２１）。Ｔ１で、Ａ、Ｂ及びＣ群からのサンプルは、大部分が重複している（図２１Ａ及び１２１Ｄ）が、Ｂ群のサンプルは、特にＷｅｉｇｈｔｅｄ  ＵｎｉＦｒａｃ測定法を用いた場合、Ｔ２及びＴ３で他とは別にクラスターを形成し始める（図２１Ｂ及び２１Ｃ）。
【０３４０】
逆に、生物多様性（α多様性、図１８）に関して、Ｃ群内のニワトリに投与した栄養計画は、時点Ｔ２及びＴ３で、「観察ＯＴＵ」測定法により計算した種の豊かさに有意な増加を誘導する（Ｐ＜０．０００１）（図２２Ｅ及び２２Ｆ）。
【０３４１】
平均微生物叢プロフィールの視覚化によって、３つの実験群の間の組成の相違が、門レベルで評価可能であることが顕著に示された（図２３）。Ｂ群では、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）（図２３、青色）の相対存在量は、Ｔ２で顕著に増加するのに対し、Ａ群では、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）存在量の増加は、Ｔ３でしか起こらない。Ｃ群に投与された餌は、部分的にこの増加を阻害するようである。科レベルでの組成解析（図２４）から、Ｂ群に投与された餌のみがバクテロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）（図２４、濃紺）の漸進的増加を促進するのに対し、Ａ及びＣ群では、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）は、平均してリケネラ科（Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ）（図２４、水色）に帰属する細菌で大部分が構成される。この観察結果は、科（図２５）及び属レベル（図２５）の両方で統計的に確認された。バクテロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）及びバクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）は、全ての利用可能な時点で、Ｂ群において有意に高い存在量を示す。対照的に、リケネラ科（Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ）及びそのアリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）は、Ａ及びＣ群において、しかしＴ３でのみ、より高い存在量を示す。
【０３４２】
それとは違って、Ｃ群のブロイラーについて得られた平均科レベルプロフィールは、ビフィドバクテリウム科（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）（図２４、黄色）の存在量の漸進的増加（Ｔ１からＴ３）を示し、これは、Ａ及びＢ群では見られない（図２４）。この差の有意性は、両方の科（図２５）及び属レベル（ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、図２６）で、Ｔ２及びＴ３で確認された。また、科レベルでは、ビフィドバクテリウム科（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の増加は、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門に属する別の科であるコリオバクテリウム科（Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の損傷を招くことも明示された（図２５）。
【０３４３】
最も興味深いことには、属レベル解析から、Ｂ及びＣ群に投与された両方の食餌計画が、フィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）相対存在量の増加を加速させるようであり、これは、Ｔ１の対照群Ａに対して、Ｂ及びＣ群で有意に高いことが示された（図２６）。続く時点では、３つの群のフィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の相対存在量は、有意に相違しない。この縦断的傾向は、フィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）が帰属するルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）（図２５）について観察されるものを反映している。時点Ｔ２では、ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）に帰属する別の属、［ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）］・コプロスタノリゲネス（ｃｏｐｒｏｓｔａｎｏｌｉｇｅｎｅｓ）群は、対照群Ａと比較して、Ｂ及びＣ群で高い存在量を示す（図２６）。
【０３４４】
［生産周期（時点Ｔ１、Ｔ２及びＴ３）に沿った３つのブロイラー群（Ａ、Ｂ、Ｃ群）における回腸微生物叢の記述］
最初の観察で、全ての利用可能な回腸サンプルに関するβ多様性解析（図２７）から、異なる３つのニワトリ群（Ａ、Ｂ、及びＣ）から採取したサンプルは、盲腸微生物叢の場合に観察されたものとは異なり、微生物叢構造に関して、個別の縦断軌道に従わないことがわかった。実際に、３つの群からのサンプルは、サンプル距離計算に使用したＷｅｉｇｈｔｅｄ及びＵｎｗｅｉｇｈｔｅｄ  ＵｎｉＦｒａｃ測定法の両方のケースで重複する（図２７Ａ及びＢ）。
【０３４５】
７４１ＤＮＡサンプルから得られた１６Ｓ  ｒＲＮＡアンプリコンをシーケンシングして、４，９８６，８６５個のハイクオリティ配列が得られ、これらは、サンプル当たり、１，０９９〜１５，１８２の範囲で、平均値が６，４９０±２７１５配列であった。リードは、９９％類似性に基づいて２０，９５０の操作的分類単位（ＯＴＵ）にクラスター化された。
【０３４６】
これは、個別のＰＣｏＡについて、異なる時点で採取したサンプルをプロットすることにより確認された（図２８）。
【０３４７】
生物多様性（α多様性、図２９）に関して、Ｂ及びＣ群のニワトリに投与された栄養計画は、第１時点のＡ群と比較して、回腸生態系の多様性に有意な減少（ＦａｉｔｈのＰＤ指数として計算）を誘導する（Ｔ１、Ｐ＜０．００１、図２９Ａ）。反対に、同じ餌（Ｂ及びＣ群）が、時点Ｔ２及びＴ３で、「観察ＯＴＵ」測定法により計算した種の豊かさという点において有意な増加を誘導する（時点Ｔ２のみが有意、Ｐ＜０．０００１）（図２９Ｅ及び２９Ｆ）。
【０３４８】
平均微生物叢プロフィールの視覚化によって、門レベルで、回腸微生物叢が、盲腸について報告されたものと類似し、大部分の細菌が、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）（図３０、緑色）に属することが明示された。しかし、より下等の系統発生レベル（科）では、回腸微生物叢の特異性は明らかであり、全ての利用可能な時点で、主としてラクトバシラス科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）（フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に帰属する科）が優勢である（図３１、ラベンダー色）。
【０３４９】
縦断的解析により、栄養計画（Ａ、Ｂ及びＣ群）とは関係なく、Ｔ１からＴ３まで腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）（図３１、赤色）の漸進的減少が顕著に示された。さらには、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）（図３１、淡緑色）に有利に、Ｔ１からＴ３までクロストリジウム科（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ）（図３１、濃緑色）の漸進的減少を認めることができる。これは、Ｋｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定（Ｐ＜０．０００１、図３２）により確認される通り、Ａ及びＣ群のニワトリから採取したサンプルにおいてＴ３で特に明らかである。ペプトストレプトコッカス科（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）は、ブロイラーの腸管の未知の機能を有する細菌分類群である。ニワトリの盲腸微生物叢に的を絞った試験によって、餌、補給剤及び抗生物質処理の変化に応答してこの分類群の存在量の変動が顕著に示されている（Ｍｕｎｙａｋａ  ｅｔ  ａｌ，１０１６；Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ，２０１７；Ｚｅｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１９）が、回腸微生物叢に関する試験はまだ少なすぎるため、ペプトストレプトコッカス科（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）変動について考えられる機能的役割を仮定することは難しい。
【０３５０】
［生産周期（時点Ｔ１、Ｔ２及びＴ３）に沿った３つのブロイラー群（Ａ、Ｂ、Ｃ群）における廃棄物微生物叢の記述］
最初の観察で、全ての利用可能な廃棄物サンプルに関するβ多様性解析（図３３）から、Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ  Ｕｎｉｆｒａｃ測定法を用いてサンプル間の距離を計算した場合（Ａｄｏｎｉｓ検定）、Ｃ群のニワトリの入った箱から採取したサンプルは、微生物叢構造に関して、他のサンプルとは別にクラスター形成することが明らかになった。平均微生物叢にプロフィールの視覚化によって、門レベルで、回腸微生物叢が、盲腸について報告されたものと類似し、大部分の細菌が、フィルミクテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門（図３０、緑色）に属することが明示された。しかし、より下等の系統発生レベル（科）では、回腸微生物叢の特異性は明らかであり、全ての利用可能な時点で、主としてラクトバシラス科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）（フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に帰属する科）が優勢である（図３１、ラベンダー色）。
【０３５１】
縦断的解析により、栄養計画（Ａ、Ｂ及びＣ群）とは関係なく、Ｔ１からＴ３まで腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）（図３１、赤色）の漸進的減少が顕著に示された。さらには、ペプトストレプトコッカス科（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）（図３１、淡緑色）に有利に、Ｔ１からＴ３までクロストリジウム科（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ）（図３１、濃緑色）の漸進的減少を認めることができる。これは、Ｋｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定（Ｐ＜０．０００１、図３２）により確認される通り、Ａ及びＣ群のニワトリから採取したサンプルにおいてＴ３で特に明らかである。ペプトストレプトコッカス科（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）は、ブロイラーの腸管の未知の機能を有する細菌分類群である。ニワトリの盲腸微生物叢に的を絞った試験によって、餌、補給剤及び抗生物質処理の変化に応答してこの分類群の存在量の変動が顕著に示されている（Ｍｕｎｙａｋａ  ｅｔ  ａｌ，１０１６；Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ，２０１７；Ｚｅｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１９）が、回腸微生物叢に関する試験はまだ極めて僅かであるため、ペプトストレプトコッカス科（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）変動について考えられる機能上の役割を仮定することは難しい。
【０３５２】
［生産周期（時点Ｔ１、Ｔ２及びＴ３）に沿った３つのブロイラー群（Ａ、Ｂ、Ｃ群）における廃棄物微生物叢の記述］
最初の観察で、全ての利用可能な廃棄物サンプルに関するβ多様性解析（図３３）から、Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ  Ｕｎｉｆｒａｃ測定法を用いてサンプル同士の距離を計算した場合（Ａｄｏｎｉｓ検定）、Ｃ群のニワトリの入った箱から採取したサンプルは、微生物叢構造に関して、他のサンプルとは別にクラスター形成することが明らかになった。平均微生物叢にプロフィールの視覚化によって、門レベルで、回腸微生物叢が、盲腸について報告されたものと類似し、大部分の細菌が、フィルミクテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門（図３０、緑色）に属することが明示された。しかし、より下等の系統発生レベル（科）では、回腸微生物叢の特異性は明らかであり、全ての利用可能な時点で、主としてラクトバシラス科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）（フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に帰属する科）が優勢である（図３１、ラベンダー色；Ｐ＝０．００６、図３３Ｂ）。
【０３５３】
これは、Ｗｅｉｇｈｔｅｄ  Ｕｎｉｆｒａｃ距離に基づく解析（図３３Ａ）により確認されなかったため、Ｃ群廃棄物微生物叢と他の廃棄物との相違は、準優勢細菌分類群に存在し得ることを示している。また、Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ  Ｕｎｉｆｒａｃ距離（図３３Ｂ）に基づくＰＣｏＡにおけるＣ群廃棄物と他の廃棄物サンプルとの隔たりは、第２縦座標軸（ＭＤＳ２）に沿って位置したが、これは、データセットの総変動性の９．４％の原因を説明するに過ぎない。
【０３５４】
平均微生物叢プロフィールの視覚化（図３４及び３５）によって、門及び科レベルの両方で、単一の大きな優勢分類群が存在しないことが明示された。しかし、廃棄物微生物叢の細菌組成（科若しくは属レベル）及び種の豊かさ／多様性（データは示していない）の有意な差は、解析したデータセットでは示されなかった。
【０３５５】
［微生物叢解析］
［解析対象のサンプル］
計６３のサンプルがＢｉｏ−ＮＭＲ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ及びＩｎｔｅｒｄｅｐａｒｔｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ａｇｒｉ−Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｅｒｃｈ（ＣＩＲＩ）ｏｆ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｏｌｏｇｎａ（イタリア）に提供され、それらは、第１時点から採取した利用可能な２１の盲腸サンプル、第２時点からの２１、及び第３時点からの２１のサンプルを含んだ。
【０３５６】
［サンプル調製。］
以下のようにさらに分類される６３のサンプルについて予備的分析を実施した：１０ｍｇ／ｋｇのビタミンＢ２が供給される対照サンプル（Ａ）、５０ｍｇ／ｋｇのビタミンＢ２が供給される処理サンプル（Ｂ）、１００ｍｇ／ｋｇのビタミンＢ２が供給される処理サンプル（Ｃ）。１ｍＬの脱イオン水と糞便を５分間ボルテックスミキシングした後、１４，０００ｒｐｍ及び４℃で１０分の遠心分離により、サンプルを核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析のために調製した。約５４０ｍＬの上清を、０．１％ＴＳＰ（３−（トリメチルシリル）プロピオン酸−ｄ４）、ＮａＮ３  ２ｍＭを含有し、ｐＨ７．４０に設定された１００μＬのＤ２Ｏ１．５Ｍリン酸緩衝液に添加した。分析の前に、サンプルを１０分間再度遠心分離し、５９０ｕＬをＮＭＲ管に移した。
【０３５７】
［ＮＭＲスペクトルの取得。］
プロトンＮＭＲ（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルは、６００．１３ＭＨｚの周波数で作動するＡＶＡＮＣＥ  ＩＩＩ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）を用いて、２９８Ｋで記録した。プレサチュレーションにより水素重水（ＨＯＤ）残留シグナルを抑制すると共に、自由誘導減衰配列に対するＣａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌフィルタ２７を導入することにより、低速タンブリング分子からの広域シグナルを除去した。フィルタは、３２８ｍｓの合計時間の間、８００μｓの間隔を置く連続４００エコーにより構成された。７２１１．５４−Ｈｚスペクトルにわたり（２．２７秒の観測時間）、３２Ｋデータポイントを用いて、２５６のトランジェントを合計することにより各スペクトルを取得した。繰り返し時間（ｒｅｃｙｃｌｅ  ｄｅｌａｙ）は、検査中のプロトンの縦緩和時間を考慮に入れて、８秒に設定した。１回でベースライン及び位相補正を実施する自動コマンドａｐｋ０．ｎｏｅを使用し、且つ１Ｈｚの線幅拡大計数を適用することにより、Ｔｏｐ  Ｓｐｉｎ  ３．０（Ｂｒｕｋｅｒ）で各スペクトルを処理した。それらの化学シフト及び多重性を文献と比較すると共に、Ｃｈｅｎｏｍｘ  ＮＭＲ  ｓｕｉｔ  ８．１ソフトウエアを使用することにより、ピークを割り当てた。
【０３５８】
［１Ｈ−ＮＭＲスペクトル前処理］
フーリエ変換、位相及びベースライン補正の後、スペクトルを、内部標準ＴＳＰに割り当てた０．００ｐｐｍの化学シフトを基準にしてスペクトルを較正し；ウォーターシグナルと一緒にスペクトル周辺領域を除去した。その後、２つの異なる領域に対して個別に確率的指数アルゴリズム（ＰＱＮ）（Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｓｃａｌｉｎｇ）を使用して（このタイプのサンプルについて最良に機能したため）スペクトルを正規化した。正規化の後、且つあらゆる可能な統計解析の前に、スペクトルを、各々０．０１８３ｐｐｍの１００データポイント区間にビン分割した。その結果、新しいスペクトルプロフィールは、４１０のビン分割データから構成され、それは、テキストファイル内にマトリックスとして保存され、多変量統計解析（Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ｓｔａｓｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＭｖＳＡ）のためにＲ及びＰｙｔｈｏｎ空間の両方にインポートされた。
【０３５９】
［統計解析］
ＭｖＳＡは、ビン分割されたデータセットマトリックスに適用されている。具体的には、主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＰＣＡ）及び部分的最小二乗判別分析（Ｐａｒｔｉａｌ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＰＬＳ−ＤＡ）が採用されている。ＰＣＡは、ただ１つのタイプのオミックス（ｏｍｉｃｓ）データを検索して、最大の変動源を同定するために使用されるのに対し、マルチレベルアプローチは、生物学的サンプル間の生物学的変動とは別に、対象内の処理効果（この場合、５０及び１００ｍｇ／ｋｇのビタミンＢ２でそれぞれ処理したＢ及びＣ群に属するサンプル）を強調することを目標とする。
【０３６０】
［結果］
［ＮＭＲスペクトル］
図３６は、ｐＨ７．１３のＣ２８１と称されるサンプルの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを記録する。
【０３６１】
いくつかの代謝産物が、それらの化学シフト及び多重度を文献と比較すると共に、Ｃｈｅｎｏｍｘ  ＮＭＲ  ｓｕｉｔ  ８．１ソフトウエアを使用することによって割り当てられた（多重度についての略語は以下の通り：ｓ＝一重線、ｄｄ＝二重線の二重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線及びｍ＝多重線（複合パターンを示す）。１）酪酸塩（ｔ：０．８９９ｐｐｍ、ｍ：１．５６２ｐｐｍ、ｔ：２．１６５ｐｐｍ）；２）ロイシン（ｔ：０．９５９ｐｐｍ、ｍ：１．７０２ｐｐｍ、ｍ：３．７３４ｐｐｍ）；３）バリン（ｄ：０．９７８ｐｐｍ、ｄ：１．０３０、ｍ：２．２６１ｐｐｍ、ｄ：３．５８３ｐｐｍ）；４）プロピオン酸塩（ｔ：１．０６０ｐｐｍ、ｑ：２．１８８ｐｐｍ）；５）エタノール（ｔ：１．１８９ｐｐｍ、ｑ：３．６６４ｐｐｍ）；６）乳酸塩（ｄ：１．３３５ｐｐｍ、ｑ：４．１２４ｐｐｍ）；７）アラニン（ｄ：１．４８５ｐｐｍ、ｑ：３．７９２ｐｐｍ）；８）酢酸塩（ｓ：１．９２５ｐｐｍ）；９）グルタミン酸塩（ｍ：２．０４７ｐｐｍ、ｍ：２．１３４ｐｐｍ、ｔ：２．３３９ｐｐｍ、ｍ：２．３７１、ｑ：３．７６８ｐｐｍ）；１０）コハク酸塩（ｓ：２．４０９ｐｐｍ）；１１）アスパラギン酸塩（ｑ：２．６９２ｐｐｍ、ｄｄ：２．８１５ｐｐｍ、ｑ：３．８９３ｐｐｍ）；１２）ジメチルアミン（ｓ：２．７１４ｐｐｍ）；１３）トリメチルアミン（ｓ：２．８７８ｐｐｍ）；１４）クレアチン（ｓ：３．０１１ｐｐｍ、ｓ：３．９１８ｐｐｍ）；１５）ギ酸塩（ｓ：８．４６１ｐｐｍ）；１６）ウラシル（ｄ：５．８１０ｐｐｍ、ｄ：７．５５０ｐｐｍ）；１７）フェニルアラニン（ｍ：７．４３４ｐｐｍ、ｍ：７．３８２ｐｐｍ、ｄ：７．３３７ｐｐｍ）；１８）チロシン（ｄ：７．１９８ｐｐｍ、ｄ：６．９０７ｐｐｍ）；１９）フマル酸塩（ｓ：６．５２５ｐｐｍ）；２０）タウリン（ｔ：３．４２９ｐｐｍ、ｔ：３．２７３ｐｐｍ）。
【０３６２】
［多変量統計解析］
初めに、群同士の分離を可能にし、任意の外れ値サンプルを識別する最良の次元縮減モデルを見出すために、サイズリダクション（ＰＣＡ，Ｆａｃｔｏｒ  Ａｎａｌｙｔｉｓ，Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｋｅｒｎｅｌ  Ｄｒｉｖｅｎ  ＰＣＡ）及び分類子（Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔ，ＡＤＡＢｏｏｓｔｅｄ  Ｄｅｃｉｓｉｏｎ  Ｔｒｅｅ，Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｅ）の様々な教師なし方法（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ）を組み合わせた。図３７には、ビン分割及び領域スケール化（Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｓｃａｌｅｄ）データセットで実施された非スケール化ＰＣＡからの結果を示す。図３７ＡのＰＣＡは、２つの外れ値（それぞれＴ３−Ａ−Ｃ２５０及びＴ３−Ａ−Ｃ２６１であるサンプル４４及び４６）の存在を示す。これらの外れ値を排除した後の新しいＰＣＡの結果を図３７Ｂに示す。第１の２つの主成分は、全分散の８４％を占めるが、目に見える傾向又は分離は表されず、またそれ以上の外れ値も示されない。
【０３６３】
教師なし法からは分離が明示されないため、教師あり手法（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ）を適用する必要が出てきた（図３８）。外れ値のフィルタリングの後、各々４３７のスペクトル特徴を有する６１の対象が最終ＰＬＳ−ＤＡに用いられた（Ｓｚｙｍａｎｓｋａ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。時間群分離を識別する上で最も情報量が多い最初の３−ＰＬＳ方向、特に第１方向と組み合わせて、５−成分ＰＬＳ−ＤＡモデルを標準スケール化データで訓練した（図３８Ａ）。このように、Ｌｉｎｅａｒ  Ｋｅｒｎｅｌ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒに最初の３−ＰＬＳ方向を送ることにより、最良の予測精度が得られ、約８９％の平均予測精度を達成した。また、ＡＤＡＢｏｏｓｔｉｎｇ  Ｔｒｅｅ分類子も比較のために評価されており、これは、やや劣る平均性能をもたらす（Ｖａｌｄｅｓ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。この結果は、２ｄ−ＰＬＳ−ＤＡ空間射影と一致しており、ここで、時間を変数として考慮すると、３つの群が線形分離可能であることがわかるが；対照サンプル対処理サンプルを考慮すると、有意な分離は見られない（図３８Ｂ）。過剰適合を回避するために、層化１０倍交差検証が実行される分類及び予測ステップに特に注意を払いながら、使用したパイプラインの全てのステップを内部的に交差検証する。信号対ノイズ比を高めると共に、情報価値のないスペクトルシグナルをフィルタリングするために、平滑化及びベースライン補正の後に、スペクトル中最も情報量の多いシグナルに結合されたＰＬＳ−ＤＡ平均重量を抽出した。
【０３６４】
分離に関与する主な代謝産物は以下の通りである：ウラシル（図３９）、グルタミン酸塩（図４０）、アラニン（図４１）、クレアチン（図４２）、酪酸塩（図４３）、プロピオン酸塩（図４４）及び酢酸塩（図４５）。これらの図において、各代謝産物の積分面積を異なる時点（１４日、２８日及び３８／４２日に対応するＴ０−Ｔ１−Ｔ２）でのサンプル間で比較した。
【０３６５】
ウラシルの積分面積（図３９）は、特に濃度が他より常に高いサンプルＣについて、全ての処理で４２日（Ｔ２）までにその濃度を増加すると思われる。グルタミン酸塩（図４０）は、特に、Ｔ３で一定を維持するサンプルＡ及びＢで、２８日後（Ｔ１）にその濃度を増加する傾向を示す。また、アラニン（図４１）の積分面積も、とりわけサンプルＣについて、Ｔ１で増加する。対照的に、クレアチンは、Ｔ２でサンプルＡ及びＢのみ増加するが、その後Ｔ３でそれらの濃度は低下するという傾向を見せる（図４２）。
【０３６６】
図４３及び４４は、スペクトルで同定された有機酸に関連する。前のものと同様に、ピーク間隔の積分を時点に沿って３つの群の間で比較する。図４３及び４４は、酪酸塩及びプロピオン酸塩の結果を示す。
【０３６７】
酪酸塩（図４３）は、処理及び時間のどちらにも影響を被らないようである。実際、全サンプルにおけるＴ０、Ｔ１及びＴ２での積分面積は、多かれ少なかれ同じ量である。酢酸についても同じ傾向が生じる（図４５）。プロピオン酸塩の場合、増加する傾向が見られる（図４４）。
【０３６８】
結果がデータ不足に影響され、そのために、それらから有意な傾向が起こらないことを強調する必要がある。その理由で、さらなる解析を実施し、４つの主要代謝産物の傾向を当てはめた：図４６は、割り当てられた有機酸の積分面積が各群で時点に沿ってどう変化するかを示す。
【０３６９】
［メタゲノム解析］
［解析対象のサンプル］
計６３のサンプルがＦｏｏｄ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｏｌｏｇｎａ（ＵＮＩＢＯ）に提供され、それらは、第１時点から採取した２１の盲腸サンプル、第２時点からの２１、及び第３時点からの２１のサンプルを含んだ。
【０３７０】
［メタゲノム解析の方法］
［メタゲノムシーケンシングのためのＤＮＡ抽出］
ビーズビィーティング法を用いて、盲腸内容物の各サンプルからＤＮＡを抽出する。手短には、０．２５ｇの盲腸内容物を１ｍｌの溶解バッファー（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、４％ＳＤＳ）中に、ＭａｇＮＡ  Ｌｙｓｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｂｅａｄｓ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）と一緒に懸濁させ、ＭａｇＮＡ  Ｌｙｓｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）により６５００ｒｐｍで２５秒間ホモジナイズする。次に、サンプルを７０℃で１５分間加熱した後、遠心分離に付して、細菌細胞残屑からＤＮＡを分離した。このプロセスを、第２の３００μｌアリコートの溶解バッファーで繰り返す。次に、サンプルを１０Ｍｖ／ｖ酢酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）沈殿、続いてイソプロパノール（Ｓｉｇｍａ）沈殿及び７０％エタノール（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）洗浄に付した後、１００ｕｌの１×Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁させる。次に、サンプルをＤＮａｓｅ−フリーＲＮａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）で処理してから、４℃で一晩インキュベートした後、ＱＩＡｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）により、いくつかの変更を含む製造者の指示に従ってプロセシングした。サンプルをＢｉｏＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（登録商標）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）で測定して、ＤＮＡ量及び品質を評価する。ＤＮＡ品質スコア（即ち、１．８〜２．０のＡ２６０／２８０ｎｍ比）を満たす全てのサンプルは、Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いたライブラリー調製に付すことになる。次に、３００〜５００ｂｐの平均サイズと４ｐＭの最小濃度を有する全てのライブラリーは、ペアエンドモードの１５０ｐｂで、ＮｅｘＳｅｑ５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてシーケンシングする。
【０３７１】
［シーケンシング戦略及びプラットフォーム］
全てのサンプルをペアエンドでシーケンシングした。平均リード長さは３００ｐｂであった。ＩｌｌｕｍｉｎａによるＮｅｘＳｅｑ５００を用いることによりシーケンシングランを実施した。提出されたメタゲノムは、２０Ｍｂｐ〜１２Ｇｂｐの出力を特徴とした。
【０３７２】
［バイオインフォマティクス分析］
ＭＧＲａｓｔ（ＭＲ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｇ−ｒａｓｔ．ｏｒｇ）（Ｋｅｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）バイオインフォマティクスパイプラインを用いて、未処理リードのフィルタリング及びトリミングを実施した。さらに、デフォルト設定パラメータ（ｅ−値カットオフ：＜１ｅ−５、最小同一性％カットオフ：６０％、及び最小アラインメント長さカットオフ：１５）を用い、ＭＧ−ＲＡＳＴ  ｖ３．６メタゲノム解析サーバ（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）で機能アノテーションを実施した。機能性分類のためにＳＥＥＤ及びＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）識別子をそれぞれ用いて、遺伝子をＳＥＥＤ及びＫＥＧＧ分類にマッピングした。
【０３７３】
［統計解析］
統計解析用のＳＴＡＭＰ  ｖ２．０．８ソフトウエア（Ｐａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｅｉｋｏ，２０１０；Ｐａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）を用いて、比較機能プロファイリングを実施した。シーケンシング作業の差による偏りを除去するために、各メタゲノムデータセット中の遺伝子ヒットの総数で、個々の機能に対する遺伝子ヒットの数を割ることにより、遺伝子カウントを正規化した。メタゲノム中の存在量が異なるＳＥＥＤ及びＫＥＧＧ機能を同定するために、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ  Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ（ＦＤＲ）多重検定補正法及びｐ−値＜０．０５と共に、両側ウェルチの正確検定（ｔｗｏ−ｓｉｄｅｄ  Ｗｅｌｃｈ’ｓ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔ）を適用することにより、他のメタゲノムと比較した相対遺伝子存在量の統計的検定を実施した。
【０３７４】
［結果］
最初に、「機能特性データ」に基づく主成分分析（ＰＣＡ）は、群の分離を可能にする最良の次元縮減モデルを見出すことと、あらゆる外れ値サンプルを識別することを目的とした。図４７には、６３６１の機能特性を有する６３の対象に対して実施されたＰＣＡからの結果が記録される。最初の２つの主成分は、総分散の８１％を占める：処理群（Ｂ及びＣ群）と対照群（Ａ群）の間には明確に視認できる分離が表示される。時点に関して、分離を見出すことはできなかった。
【０３７５】
［生産周期（時点Ｔ１、Ｔ２及びＴ３）に沿った３つのブロイラー群（Ａ、Ｂ、Ｃ群）の一次ＫＥＧＧ代謝経路の記述］
利用可能な時点（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３）の各々について、３つの異なる群Ａ、Ｂ及びＣのブロイラー盲腸のＫＥＧＧデータベースに基づくレベル１での平均機能性遺伝子プロフィールの視覚化により、３つの実験群同士の組成の相違がレベル１で評価可能であることが明示された（図４９）。特に、Ａ群では、遺伝子情報処理の相対存在量（図４９、オレンジ色）が、処理群と比較して、各時点で統計的に有意な増加であった（表５）。対照的に、環境情報処理の相対存在量（図５０Ａ）は、Ａ群と比較して、Ｂ及びＣ群において各時点で統計的に有意な増加であった（表５）。さらに、代謝産物の相対存在量（図５０Ｂ）は、２８日齢のＡ群と比較して、Ｂ及びＣ群で統計的に増加であり、また、生物系（Ｏｒｇａｎｉｓｍａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、Ｂ及びＣ群と比較して、Ａ群で統計的に増加であった（表５）。
【０３７６】
【表７】
2021535086.tif 000008
【０３７７】
［生産周期（時点Ｔ１、Ｔ２及びＴ３）に沿った３つのブロイラー群（Ａ、Ｂ、Ｃ群）の二次ＫＥＧＧ代謝経路の記述］
相対存在量≧０．５％を有する二次ＫＥＧＧ代謝経路の視覚化により、各時点で３つの実験群の間の組成の差が評価可能であることが明示された（図５１）（即ち、１４日での翻訳、転写；２８日での膜輸送、翻訳、複製及び修復；４２日での膜輸送、翻訳、複製及び修復、ヌクレオチド代謝）。
【０３７８】
特に、Ｂ及びＣ群では、各時点日数における補因子及びビタミン類の代謝産物の相対存在量は、Ａ群と比較して、統計的に有意な増加であった（以下の表６、７及び８、薄いグレー）。反対に、翻訳、転写、及び環境適応の相対存在量は、Ｂ及びＣ群と比較して、Ａ群の各時点で統計的に有意な増加であった（表５、白）。
【０３７９】
他の経路に目を向けると、膜輸送、複製及び修復、他の二次代謝産物の生合成、テルペノイド及びポリケチドの代謝並びに他のアミノ酸の代謝の相対存在量は、２８及び４２日齢で、Ａ群と比較して、Ｂ及びＣ群で統計的に増加であった（表７及び８、オレンジ色）。対照的に、翻訳、エネルギー代謝、シグナル伝達、転写、感染症及び環境適応の相対存在量は、２８及び４２日齢で、Ｂ及びＣ群と比較して、Ａ群で統計的に増加であった（表７及び８、白）。最終的に、脂質代謝の相対存在量は、２８日齢で、Ａ群と比較して、Ｂ及びＣ群で統計的に有意な増加であった（表６及び７、薄いグレー）のに対し、フォールディング、選別及び分解、細胞連絡及びシグナル伝達分子及び相互作用は、２８日齢で、Ｂ及びＣ群と比較して、Ａ群で統計的に増加であった（表７、白）。
【０３８０】
【表８】
2021535086.tif 000009
【０３８１】
【表９】
2021535086.tif 000010
【０３８２】
【表１０】
2021535086.tif 000011
【０３８３】
［生産周期（時点Ｔ１、Ｔ２及びＴ３）に沿った３つのブロイラー群（Ａ、Ｂ、Ｃ群）の三次ＫＥＧＧ代謝経路の記述］
三次ＫＥＧＧ代謝経路を分析すると、１４日齢で実験群の間に相違は報告されなかった（データは記録していない）が、多数の経路が、２８及び４２日齢で有意な相違を示した（以下の表９及び１０）。
【０３８４】
特に、２８及び４２日齢で、相対存在量≧０．１％を有する１９の経路（ＡＢＣトランスポータ、ＤＮＡ複製、ピリミジン代謝、相同組換え、ペントースリン酸経路、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン生合成、ニコチン酸及びニコチンアミド代謝、フェニルプロパノイド生合成、イオウ運搬機構、グリセロリン脂質代謝、メタン代謝、パントテン酸及びＣｏＡ生合成、セレン化合物代謝、葉酸生合成、イノシトールリン酸代謝、リソソーム、ブタン酸代謝、ビオチン代謝、ホスホン酸及びホスフィン酸代謝）が、Ａ群と比較して、Ｂ及びＣ群で統計的に有意な増加であった（表９及び１０、薄いグレー）。反対に、相対存在量≧０．１％を有する９の経路（アラニン、アスパラギン酸及びグルタミン酸代謝、プリン代謝、ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ分解、二成分系、ピルビン酸代謝、ヌクレオチド除去修復、バリン、ロイシン及びイソロイシン分解、リシン分解）は、Ｂ及びＣ群と比較して、Ａ群で統計的に有意な増加であった（表９及び１０、白）。
【０３８５】
さらに、２７の経路（アミノアシル−ｔＲＮＡ生合成、解糖／糖新生、酸化的リン酸化、デンプン及びスクロース代謝、アルギニン及びプロリン代謝、ガラクトース代謝、アミノ糖及びヌクレオチド糖代謝、ペプチドグリカン生合成、ヒスチジン代謝、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）、テルペノイド骨格生合成、フルクトース及びマンノース代謝、脂肪酸生合成、クエン酸回路（ＴＣＡ回路）、塩基除去修復、ミスマッチ修復、チロシン代謝、グリオキシレート及びジカルボキシレート代謝、細菌走化性、ペルオキシソーム、他のグリカン分解、グルタチオン代謝、ビタミンＢ６代謝、ゼアチン生合成、リポ多糖生合成、トリプトファン代謝、カルシウムシグナル伝達経路）は、Ａ群と比較して、Ｂ及びＣ群において２８日齢で有意な増加を示した（表９、薄いグレー）。
【０３８６】
特に興味深いのは、処理群で増加し、ＳＣＦＡの生成と関連する、脂肪酸生合成、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）及びブタン酸代謝などの代謝経路である。さらに、処理群（Ｂ及びＣ群）で統計的に有意な増加が、ニコチン酸及びニコチンアミド代謝、パントテン酸生合成、葉酸生合成、ビオチン代謝及びビタミンＢ６代謝などのビタミンＢ群経路について報告されている。
【０３８７】
【表１１】
2021535086.tif 000012
【０３８８】
【表１２】
2021535086.tif 000013
【０３８９】
【表１３】
2021535086.tif 000014
【０３９０】
【表１４】
2021535086.tif 000015
【０３９１】
【表１５】
2021535086.tif 000016
【０３９２】
【表１６】
2021535086.tif 000017
【０３９３】
［ＳＣＦＡ及びグルコシダーゼに関連する遺伝子の相対存在量の評価］
短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）は、腸内生理に重要な役割を果たすことから、本発明者らは、酪酸及びプロピオン酸合成に至る代謝経路を特に分析した。文献に記載されているように、酪酸生成に至る４つの潜在的経路がある。第１の主要なものは、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼに基づくものであった（図３９）。
【０３９４】
本発明者らの酪酸生成に関連する遺伝子の相対存在量に目を向けると、本発明者らは、２８日齢で少なくとも７つの代謝機能、並びに４２日齢で５つが、Ａ群と比較して、処理群（Ｂ及びＣ群）で統計的に有意な増加を示すことを見出した（以下の表１１）。このエビデンスは、フィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などの異なる細菌属（Ｐｏｌａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ．，２０１８）と、Ｒｅｖｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６により報告されている通り、ビフィドバクテリア（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）の栄養共生活動によって相関し得る。これらの属は全て、微生物叢分析により本発明者らの研究で同定され、これらの結果から、ビタミンＢ２で処理した動物における酪酸生成の可能性を予測することができる。
【０３９５】
【表１７】
2021535086.tif 000018
【０３９６】
非常に興味深いのは、Ａ群と比較して、処理群（ｂ及びＣ群）のブロイラー盲腸内のβ−ガラクトシダーゼに関連する機能性遺伝子の相対存在量の統計的に有意な増加のエビデンスであった（図１２、以下）。この結果は、微生物叢分析で報告されているように、処理群におけるビフィドバクテリア（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）の増加によって、さらにはラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）でも説明され得る（Ｓｈａｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。ヒトの場合、この酵素は、それがラクトース発酵を促進する結腸内で豊富に存在し、その活性を測定することにより、結腸の微生物叢が腸内ラクトースを発酵させる能力がわかる。
【０３９７】
【表１８】
2021535086.tif 000019
【０３９８】
［結論］
・Ｂ及びＣ群に投与された食餌計画の両方が、盲腸内微生物叢に改変を誘導し、これは、対照餌と比較して、ブロイラーの生産周期の第１期間（Ｔ１）中のフィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に帰属する公知の抗炎症性及び健康促進性細菌の増加を含んだ。生産周期の第２及び第３期（Ｔ２及びＴ３）中、フィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の相対存在量は、３つの実験群の間で有意な差を示さなかった。総合すると、本発明者らの結果は、ブロイラーの生産周期（対照飼料、Ａ群）中にフィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）が自然に増加することを明示すると思われ、また、Ｂ及びＣ群のブロイラーに投与された食餌計画は、この増加を早めると思われる。
・Ｃ群に投与された飼料もまた、別の健康促進性群、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の存在量の漸進的増加、並びに対照餌（Ａ群に投与された）と比較して種の豊かさの増大を誘導した。逆に、Ｂ群に投与された飼料は、生産周期全体にわたってバクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）存在量の増加を促進した。
・バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）の増加は、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）の別のメンバーであるリケネラ科（Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ）（アリスティペス属（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ））の損傷を引き起こす。
・Ｂ及びＣ群のブロイラーに投与された飼料の両方とも、回腸内微生物叢組成及び多様性に対する影響は微々たるものであり、廃棄物サンプル中で微生物叢に対する有意な影響は検出されなかった。
・既述したように、代謝試験のために選択されたサンプルの不足は、データ及び結果のクオリティに影響した。従って、全サンプルの分析を含め、より堅牢なデータセットを有することが重要である。しかし、酢酸塩、グルタミン酸塩、プロピオン酸塩、及び酪酸塩といった代謝産物は、処理により影響を受けることは明らかであるようだ。
・６３６１の機能特性を備える６３の対象に対して実施したＰＣＡは、処理群（Ｂ及びＣ群）と対照群（Ａ群）との間の分離を引き起こしたビタミンＢ２の明らかな作用を示した。この結果は、分析時間の関数として明示されなかった。
・一次ＫＥＧＧ代謝経路を考慮すれば、遺伝子情報処理（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）及び生物系（Ｏｒｇａｎｉｓｍａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の相対存在量は、Ａ群（５ｐｐｍのビタミンＢ２）で増加するのに対し、環境情報処理（Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）及び代謝（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）は、処理群（５０及び１００ｐｐｍのビタミンＢ２）で増加する。
・相対存在量≧０．５％の二次ＫＥＧＧ代謝経路に目を向けると、これらの結果は、各時点について３つの実験群の間のかなりおおきな組成の相違を顕著に示している。特に、補因子及びビタミンの代謝、膜輸送、複製及び修復、他の二次代謝産物の生合成、テルペノイド及びポリケチドの代謝、並びに他のアミノ酸の代謝の相対存在量は、５０及び１００ｐｐｍのビタミンＢ２を用いた処理群で増加する。反対に、翻訳、エネルギー代謝、シグナル伝達、転写、感染症及び環境適応は、５ｐｐｍのビタミンＢ２を用いた対照群で統計的に増加した。
・三次ＫＥＧＧ代謝経路に目を向けると、実験群間に１４日齢で差は報告されなかったが、２８及び４２日齢では多数の経路が有意な差を示した。特に興味深いのは、脂肪酸生合成、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）及びブタン酸代謝などの代謝経路は、処理群（５０及び１００ｐｐｍのビタミンＢ２）で増加し、ＳＣＦＡの生成と関連したことである。さらに、処理群で統計的に有意な増加が、ニコチン酸及びニコチンアミド代謝、パントテン酸生合成、葉酸生合成、ビオチン代謝及びビタミンＢ６代謝などのビタミンＢ群経路についても報告されている。
・酪酸生成に関して、２８日齢で少なくとも７つの代謝機能及び４２日齢で５つが、対照群（５ｐｐｍのビタミンＢ２）と比較して、処理群（５０及び１００ｐｐｍのビタミンＢ２）で統計的に増加した。このエビデンスは、フィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などの異なる細菌属（Ｚａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ．，２０１８）と、Ｒｅｖｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６により報告されている通り、ビフィドバクテリア（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）の栄養共生活動によって相関し得る。これらの属は全て、微生物叢分析により本発明者らの研究で同定され、これらの結果から、ビタミンＢ２で処置した動物における酪酸生成の可能性を予測することができる。
【０３９９】
［実施例４］
［ブタモデル］
［材料及び方法］
３匹のブタに市販の飼料を４週間供給した。飼料は、主成分として、オオムギ、小麦、及びダイズミールを含有し、その主な化学組成は、（ｇ／ｋｇ）で、１５１粗タンパク質、３４粗脂肪、４０粗繊維、５５及び灰であった。実験期間の開始時（平均して：２３．９±１．０１Ｋｇ）及び終了時（平均して：４３．３±３．５６Ｋｇ）に動物を個別に計量した。３０日の順応後、動物を屠殺した。胃、小腸及び後腸内容物のｐＨをガラス電極ｐＨ計（ＣＲＩＳＯＮ  ５０７，ＣＲＩＳＯＮ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）で直接測定した。胃及び小腸内容物を直ちに濾過し、サンプリングした後、エクスビボ消化性の評価の目的で消化物接種材料として使用するために、−２０℃で保存した。盲腸内容物に関しては、一部を直ちにサンプリングし、２０ｍｌチューブ中に分散させ、液体窒素で凍結した後、インビトロガス生成試験用の凍結接種材料として使用するために、−８０℃で保存した。他の部分は、新鮮な発酵接種材料として直接使用した。
【０４００】
［インビトロ酵素消化］
ブタの胃及び小腸内の酵素消化率を決定するために、２つの実験を実施した：
【０４０１】
［Ａ−外性酵素を用いて：］
０．５ｇの基質のみ、又は３つのユーバイオティクスを補充したものを含有する三角フラスコ（全容積１００ｍＬ）を各処理について２回反復でインキュベートして、Ｂｏｉｓｅｎ及びＦｅｒｎａｎｄｅｚ（１９９７）の３ステップ法の後にインビトロ酵素消化率を決定した。消化率は、以下：
［１］ペプシン
［２］ペプシン＋パンクレアチン
［３］ペプシン＋パンクレアチン＋ビスコザイム
を用いて決定した。
【０４０２】
［Ｂ．胃内容物及び小腸内容物を用いて］
酵素消化率の同様の手順に従うが、この場合、ペプシン及びパンクレアチン溶液の代わりに、各動物の胃内容物及び小腸内容物を使用し、Ｂｏｉｓｅｎ及びＦｅｒｎａｎｄｅｚ（１９９７）の第３ステップは省略した。消化率は、以下：
胃内容物（９ｍＬ）
胃内容物＋小腸内容物（９ｍＬ）
を用いて決定した。
【０４０３】
［インビトロガス生成］
盲腸内容物の微生物発酵パターンをガス生成法（Ｔｈｅｏｄｏｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４．Ａｎｉｍ  Ｆｅｅｄ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ４８：１８５−１−９７）によりインビトロで試験した。盲腸の前に起こる消化プロセスをシミュレートするために、基質として０．８ｇ量の事前消化飼料（Ｂｏｉｓｅｎ及びＦｅｒｎａｎｄｅｚの方法、１９９７  Ａｎｉｍ  Ｆｅｅｄ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５１：２９−４３に従って、ペプシン−ＨＣｌ及びパンクレアチンインキュベーション中で連続的にインキュベートした）を単独で、又はビタミンＢ２を補充して使用した。最初に、各処理につき３本の同じガラス瓶（全容積１１０ｍＬ）を５６ｍＬのインキュベーション溶液で充填した。各処理について３匹のブタ各々の盲腸内容物をＣＯ２雰囲気下でインキュベーション溶液と２：１で混合し、ワーリングブレンダで数分ホモジナイズした（盲腸内容物は、総インキュベーション溶液の０．２０を含む）。次に、２４ｍＬの混合物を各瓶に添加して、８０ｍＬの総液体量を達成した。さらに、基質を含まない３本の同じ瓶もブランクとして加えた。ＣＯ２流の下で瓶を密封し、３９℃で１２ｈインキュベートした。ＴＰ８０４圧力計を取り付けたＨＤ２１２４．０２マノメータ（Ｄｅｌｔａ  Ｏｈｍ，Ｃａｓｅｌｌｅ  ｄｉ  Ｓｅｌｖａｚｚａｎｏ，Ｉｔａｌｙ）を用いて、全インキュベーション期間を通して２時間毎に圧力を記録した。同じ条件下の同じ瓶内で記録された圧力と既知空気体積との間で事前に確立された一次回帰式により、読取り値を体積に変換した（ｎ＝１０３；Ｒ２＝０．９９６）。各インキュベーション時間にわたって記録されたガス体積は、インキュベートされた有機物質（ＯＭ）の単位毎に表した。６時間毎にメタン（ＣＨ４）濃度を測定した。６及び１２ｈインキュベーションで、サンプルを回収し、０．１Ｎ  ＨＣｌで１：１酸性化するか、又は２ｍｇ／ｍｌの４−メチル吉草酸を含む０．５Ｍ  ＰＯ４Ｈ３の除タンパク質混合物０．５ｍｌに添加し、これらをそれぞれアンモニア及び揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）濃度の決定のために−２０℃で保存した。インビトロガス生成の手順は、新鮮な接種材料及び凍結接種材料の両方で同じであったが、ただ１つ違うのは、盲腸内容物の凍結サンプルを解凍のために事前に３８℃で５分間維持したことである。
【０４０４】
ガス生成の場合、ドナーブタをブロックとして、内容物（新鮮対凍結）をメインプロットとして、また処理をサブプロットとして考慮し、分割法として結果を各インキュベーション時間について分析した。同じ分割法を使用して、消化内容物（胃対小腸）から得られた結果をメインプロットとして使用した。インビトロ酵素結果は、実験上の変動の原因がなかったため、統計的に解析しなかった。Ｐ＜０．０５のとき、差は有意とみなされ、０．０５£Ｐ＜０．１０のとき有意性の傾向が考慮され、有意である場合には、Ｐ＜０．０５でのチューキーｔ検定により差を比較した。
【０４０５】
［結果］
［エクスビボ及び酵素消化］
胃内容物の場合、基質消化率は、対照と比較して、ビタミンＢ２で最も高かった（Ｐ＜０．０５）ことが認められた。こうした差は、小腸内容物の消化後に最小になり、処置の間で差は記録されなかった（Ｐ＞０．０５）。
【０４０６】
外性酵素で観察された基質消化率の結果は、消化器内容物について記録されたものと一致していたが、ペプシン−ＨＣｌ消化の程度は胃内容物のものよりやや低かった。従って、ペプシン−ＨＣｌ中でインキュベートしたとき、ビタミンＢ２を補充した基質について記録された消化率は、他の処理物の消化率より高かった。しかし、処理物を（Ｐ＋パンクレアチン）及び／又は（Ｐ＋Ｐ＋ビスコザイム）中でインキュベートすると、処理物間に差は観察されなかった。結果は、２つの方法が、ブタにおける酵素消化を評価するのに妥当であることを示している。
【０４０７】
［インビトロガス生成］
概して、新鮮な盲腸内容物と一緒にインキュベートした処理物からのガス生成パターンは、凍結盲腸内容物について記録されたものと差はなかった（Ｐ＞０．０５）；しかし、４ｈのインキュベーション後に、新鮮な内容物によるガスの体積は、高くなる傾向があった（Ｐ＝０．０８１）。概して、ビタミンＢ２について記録されたガスの体積は、４、１０、及び１２ｈインキュベーション後に対照より高かった（Ｐ＜０．０５）。
【０４０８】
インキュベーション期間を通して保存タイプと処理物との間の相互作用は、有意性（Ｐ＜０．０５）に到達しなかったが、これは、処理物が、盲腸内容物の凍結にもかかわらず同様に振舞ったことを示している。
【０４０９】
［メタン生成］
ＣＨ４生成に関しては、新鮮接種材料と凍結接種材料との間で１２ｈインキュベーションにわたり差は記録されなかった（Ｐ＞０．０５）。１２ｈインキュベーションまでに、全ガスのＣＨ４生成に関して処理物の間に差は記録されなかった（Ｐ＞０．０５）が、数値的にはビタミンＢ２について記録されたＣＨ４が最も低かった。同様に、ＣＨ４生成をインキュベーション基質の単位当たりの体積として表した場合、処理物の間で有意な差は記録されなかったが、処理物間の順位付けによって、ビタミンＢ２が６及び１２ｈインキュベーション後に最も低いＣＨ４蓄積を記録したことが明らかにされた。
【０４１０】
ビタミンＢ２がエネルギーの生成に重要な役割を果たし、炭水化物分解を助けることが知られているように、ビタミンＢ２で観察された結果は、このビタミンが、後腸細菌種の活動にプラスの効果を有し得ることを意味する。加えて、メタン生成の低減は、ビタミンＢ２がメタン生成菌又は古細菌集団の活動を抑制できることによっても説明され得る。
【０４１１】
［全揮発性脂肪酸濃度（ＴＶＦＡ）、ＶＦＡのモル比、及びアンモニア生成］
盲腸接種材料の保存についても、或いは処理物間でも、全ＶＦＡ、ＶＦＡのモル比、又はアンモニア濃度のいずれに関しても差は記録されなかった。これは、試験した実験処理物による盲腸発酵プロファイルに対して大きな作用が促進されなかったことを示している。
【０４１２】
結論として、ビタミンＢ２は、胃レベル（恐らくペプシン活性を刺激）及び後腸レベル（微生物活動を増強）の両方で、明らかにプラスの反応を示した。
【図１】
2021535086.tif 000020
【図２】
2021535086.tif 000021
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2021535086.tif 000027
【図９】
2021535086.tif 000028
【図１０】
2021535086.tif 000029
【図１１】
2021535086.tif 000030
【図１２】
2021535086.tif 000031
【図１３】
2021535086.tif 000032
【図１４】
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【図１５】
2021535086.tif 000034
【図１６】
2021535086.tif 000035
【図１７】
2021535086.tif 000036
【図１８】
2021535086.tif 000037
【図１９】
2021535086.tif 000038
【図２０】
2021535086.tif 000039
【図２１Ａ】
2021535086.tif 000040
【図２１Ｂ】
2021535086.tif 000041
【図２１Ｃ】
2021535086.tif 000042
【図２１Ｄ】
2021535086.tif 000043
【図２１Ｅ】
2021535086.tif 000044
【図２１Ｆ】
2021535086.tif 000045
【図２２】
2021535086.tif 000046
【図２３】
2021535086.tif 000047
【図２４】
2021535086.tif 000048
【図２５】
2021535086.tif 000049
【図２６】
2021535086.tif 000050
【図２７】
2021535086.tif 000051
【図２８Ａ】
2021535086.tif 000052
【図２８Ｂ】
2021535086.tif 000053
【図２８Ｃ】
2021535086.tif 000054
【図２８Ｄ】
2021535086.tif 000055
【図２８Ｅ】
2021535086.tif 000056
【図２８Ｆ】
2021535086.tif 000057
【図２９】
2021535086.tif 000058
【図３０】
2021535086.tif 000059
【図３１】
2021535086.tif 000060
【図３２】
2021535086.tif 000061
【図３３Ａ】
2021535086.tif 000062
【図３３Ｂ】
2021535086.tif 000063
【図３４】
2021535086.tif 000064
【図３５】
2021535086.tif 000065
【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
2021535086.tif 000069
【図４０】
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【図４１】
2021535086.tif 000071
【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月25日(2020.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトを含め動物の腸の健康の改善に使用するための、以下：リボフラビン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、β−カロテン、ビタミンＢ１、ナイアシン、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビオチン、ビタミンＢ１２、ω−３脂肪酸及びこれらの組合せからなる群から選択される活性物質において、前記改善が、以下：
ｉ．前記腸管内の少なくとも１つの短鎖脂肪酸若しくはその塩の濃度の増加、
ｉｉ．前記腸管内の微生物叢多様性の増加、
ｉｉｉ．前記腸管内の有益細菌の存在量の増加、
ｉｖ．前記腸管内の酪酸合成経路の促進又は増加、
ｖ．前記腸管のバリア機能の向上、
ｖｉ．前記腸管内で生成されるガスの量の減少、及び／又は
ｖｉｉ．腸管免疫応答の刺激
を含むか、又はそれらから構成され、
ここで、前記使用は、前記動物に
ａ）有効量の活性物質を含む製剤であって、前記動物はヒトであり、前記活性物質は、遅延放出製剤によって大腸に送達される製剤；又は
ｂ）前記活性物質の少なくとも有効量が、前記動物の腸管内に存在するような、超生理学的用量の活性成分
を投与することを含み；
但し、ナイアシンが存在する場合、それは唯一の活性物質ではなく；また、リボフラビンが存在する場合、それは、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の量を増加する以外の改善効果を有する、活性物質。
【請求項２】
前記改善が、前記腸管内の少なくとも１つの短鎖脂肪酸若しくはその塩の濃度の増加；又は、前記腸管内の酪酸合成経路の促進若しくは増加を含み；ここで、前記短鎖脂肪酸は、酢酸、プロピオン酸及び酪酸又はそれらの塩からなる群から選択される、請求項１に記載の活性物質。
【請求項３】
前記活性物質が、ビタミンＡ、β−カロテン、ビタミンＣ、リボフラビン、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、ω−３脂肪酸、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２に記載の活性物質。
【請求項４】
ヒトを含め、前記動物が、代謝障害、２型糖尿病、肥満、慢性炎症、及びアテローム形成からなる群から選択される状態を経験している、請求項２又は３に記載の活性物質。
【請求項５】
前記改善が、前記腸管内の微生物叢多様性の増加を含む、請求項１に記載の活性物質。
【請求項６】
前記微生物叢多様性が増加する、及び／又は有益細菌の存在量が前記結腸内で増加する、請求項５に記載の活性物質。
【請求項７】
増加させる前記有益細菌が、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アッカーマンシア属（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｓｐ．）、バクテロイデス・オバータス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ブラウティア・プロダクタ（Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ）、クロストリジウム・コクレアータム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｃｌｅａｔｕｍ）、コリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）、ドレア・ロンジカテナ（Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）、ラクノスピラ・ペクチノシザ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ  ｐｅｃｔｉｎｏｓｈｉｚａ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、パラバクテロイデス・ディスタソニス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）、ラウルテラ属（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｓｐｐ．）、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項５又は６に記載の活性物質。
【請求項８】
増加させる前記細菌が、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アッカーマンシア属（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）、フィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びバクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）からなる群から選択される、請求項５〜７のいずれか１項に記載の活性物質。
【請求項９】
ヒトを含め、前記動物が、過敏性腸症候群、代謝疾患、肥満、及び炎症性疾患からなる群から選択される状態を経験している、請求項５〜８のいずれか１項に記載の活性物質。
【請求項１０】
前記物質が、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、β−カロテン、ビオチン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＤ、葉酸、ビタミンＫ、ω３脂肪酸、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項５〜９のいずれか１項に記載の活性物質。
【請求項１１】
前記改善が、前記腸管のバリア機能の向上を含む、請求項１に記載の活性物質。
【請求項１２】
ヒトを含め、前記動物が、過敏性腸症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸管壁浸漏、及び栄養不良からなる群から選択される状態を経験している、請求項１１に記載の活性物質。
【請求項１３】
前記活性物質が、ビタミンＢ２、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ω−３脂肪酸、ビタミンＤ、ビタミンＡ、葉酸、ビタミンＫ及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１１又は１２に記載の活性物質。
【請求項１４】
前記改善が、前記腸管内で生成されるガスの量の減少である、請求項１に記載の活性物質。
【請求項１５】
前記活性物質が、ビタミンＢ２、ビタミンＣ、ビタミンＥ及びそれらの組合せである、請求項１４に記載の活性物質。
【請求項１６】
前記改善が、前記腸管の免疫応答の刺激である、請求項１に記載の活性物質。
【請求項１７】
前記免疫応答が、ＧＲＯａ−ＣＸＣＬ１、ＭＩＰ３Ａ−ＣＣＬ２０、インターロイキン８、及びそれらの組合せからなる群から選択される、免疫応答分子の増加である、請求項１６に記載の活性物質。
【請求項１８】
前記活性物質が、ビタミンＢ２、ビタミンＥ、ビタミンＤ、ビタミンＡ、及びビタミンＫ、並びにそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１６又は１７に記載の活性物質。
【請求項１９】
ヒトを含め動物の腸の健康を改善する方法であって、前記改善が、
ｉ．前記腸管内の少なくとも１つの短鎖脂肪酸若しくはその塩の濃度の増加、
ｉｉ．前記腸管内の微生物叢多様性の増加、
ｉｉｉ．前記腸管内の有益細菌の存在量の増加、
ｉｖ．前記腸管内の酪酸合成経路の促進又は増加、
ｖ．前記腸管のバリア機能の向上、
ｖｉ．前記腸管内で生成されるガスの量の減少、及び／又は
ｖｉｉ．前記腸管免疫応答の刺激
を含むか、又はそれらから構成され、
これは、リボフラビン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸、β−カロテン、ビタミンＢ１、ナイアシン、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビオチン、ビタミンＢ１２、ω−３脂肪酸及びこれらの組合せからなる群から選択される活性物質を前記動物に投与することを含み、前記活性物質は、
ａ）有効量の前記活性物質を含む製剤であって、前記動物はヒトであり、前記活性物質は大腸に送達される、製剤；又は
ｂ）少なくとも有効量の前記活性物質が、前記動物の腸管内に存在するような、超生理学的用量の活性成分
中に存在し；
但し、ナイアシンが存在する場合、それは唯一の活性物質ではなく；リボフラビンが存在する場合、それは、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の量を増加する以外の改善効果を有する、方法。
【請求項２０】
前記活性物質が、超生理学的用量中に存在する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記改善が、動物における少なくとも１つの短鎖脂肪酸の増加及び／又は前記酪酸合成経路活性の増加である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記動物が、代謝疾患、２型糖尿病、肥満、慢性炎症、及びアテローム形成からなる群から選択される状態を経験している、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ビタミンＡ、ビタミンＣ、リボフラビン、ビタミンＥ、葉酸、β−カロテン、ω−３脂肪酸及びこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの活性物質を投与することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記改善が、前記腸管内の微生物叢多様性の増加、又は前記腸管内の有益細菌の存在量の増加である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記活性物質が、ビタミンＢ１、リボフラビン、ビタミンＢ５、ビタミンＢ１２、β−カロテン、ビオチン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＤ、葉酸、ビタミンＫ、ω−３脂肪酸、及びこれらの組合せからなる群から選択され；但し、リボフラビンが活性物質である場合、それは、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の存在量の増加以外の目的のために存在する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ヒトを含め、それを必要とする動物の過敏性腸症候群、代謝疾患、肥満、若しくは炎症性疾患の症状を処置、予防、又は軽減する方法であって、これは、有益細菌を増大する量の活性物質を前記動物の結腸に投与することを含み；前記活性物質が、ビタミンＢ１、リボフラビン、ビタミンＢ５、ビタミンＢ１２、β−カロテン、ビオチン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＤ、葉酸、ビタミンＫ、ω３脂肪酸、及びそれらの組合せからなる群から選択され；但し、リボフラビンが活性物質である場合、それは、Ｆ．プラウスニッツイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の存在量の増加以外の目的のために存在する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記改善が、前記腸管の免疫応答の刺激である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
ヒトを含め、前記動物が、急性又は慢性炎症を経験している、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記活性物質が、リボフラビン、ビタミンＥ、ビタミンＡ、ビタミンＫ及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記改善が、前記腸管内で生成されるガスの処置、予防、又はその量の減少である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
前記活性物質が、ビタミンＢ２、ビタミンＣ及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記改善が、腸管バリア機能の向上である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
前記バリア機能の向上が、過敏性腸症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸管壁浸漏及び栄養不良からなる群から選択される状態の症状を処置、予防又は軽減する方法である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記物質が、リボフラビン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ω−３脂肪酸、ビタミンＤ、ビタミンＡ、葉酸、ビタミンＫ及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【国際調査報告】
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