(57)【要約】  酵母細胞からキトサン製品を製造するための方法が本明細書に開示される。酵母細胞を培養して、酵母細胞のバイオマスを形成させる。酵母細胞の減数分裂を誘導され、酵母細胞に子嚢を含む子嚢胞子を形成させ、各子嚢胞子は子嚢胞子壁にキトサン保護層を含む。キトサンは子嚢胞子から抽出および精製して精製キトサンを形成し、沈殿および乾燥してキトサン製品を形成する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
キトサン製品の製造方法であって、
酵母細胞を培養し、培養した酵母細胞が酵母細胞のバイオマスを形成すること、
前記培養した酵母細胞の減数分裂を誘導し、前記誘導した酵母細胞が子嚢胞子を含む子嚢を形成し、各子嚢胞子が子嚢胞子壁にキトサン保護層を含むこと、
前記子嚢胞子壁からキトサンを抽出すること、
前記キトサンを精製し、精製キトサンを形成すること、および、
前記精製キトサンを沈殿および乾燥させて、キトサン製品を形成すること、を含む、方法。
【請求項２】
前記培養した酵母細胞の減数分裂を誘導後、前記子嚢壁を破壊する、または、前記子嚢壁および子嚢胞子壁を破壊することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養した酵母細胞の減数分裂を誘導後、前記子嚢壁を破壊すること、および、前記子嚢胞子を残骸から分離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記子嚢胞子を残骸から分離した後、前記子嚢胞子壁を破壊することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記酵母細胞が子嚢菌門の酵母株である酵母である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記酵母細胞がサッカロミケス亜門の酵母株である酵母である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記酵母細胞がサッカロミケス綱の酵母株である酵母である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記酵母細胞が、サッカロミケス属酵母株、コマガタエラ属酵母株、およびシゾサッカロミケス属酵母株からなる群から選択される酵母である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記酵母が、ヘテロタリック一倍体酵母株、ヘテロタリック二倍体酵母株、またはヘテロタリック多倍体酵母株からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵母が、互いに融合してハイブリッド細胞を形成することができる胞子形成酵母細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵母が、反対の交配型であるヘテロタリック酵母株である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記反対の交配型であるヘテロタリック酵母株が、互いに交配し、交配型に関してヘテロ接合であるハイブリッド細胞を形成することができる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記酵母が、ホモタリック自殖酵母株、交配型に関してヘテロ接合であるヘテロタリック二倍体酵母株、交配型に関してヘテロ接合であるヘテロタリック多倍体酵母株、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記ホモタリック自殖酵母株、前記交配型に関してヘテロ接合であるヘテロタリック二倍体酵母株、交配型に関してヘテロ接合であるヘテロタリック多倍体酵母株、およびそれらの組み合わせの細胞が、子嚢胞子を生産する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記培養した酵母細胞の減数分裂を誘導することが：
前記酵母細胞を胞子形成前培地中約６時間から約７２時間の間インキュベートすること；および
前記酵母細胞を胞子形成培地に移し、前記酵母細胞を約１２時間から約１４４時間の間インキュベートし、それにより、前記酵母細胞のバイオマスの約１０％から約１００％を少なくとも１つの子嚢胞子を含む子嚢に変化させる、ことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記培養した酵母細胞の減数分裂を誘導することが、前記酵母細胞を胞子形成培地に移し、前記酵母細胞を約１２時間から約１４４時間の間インキュベートし、それにより、前記酵母細胞の約１０％から約１００％を少なくとも１つの子嚢胞子を含む子嚢に変化させる、ことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記子嚢菌門酵母株が、野生型酵母株または遺伝子改変された野生型酵母株からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１８】
前記酵母細胞を培養することが、細胞培養容器、細胞保持システム、および培地交換システムからなる群から選択されるシステムを使用して行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記子嚢壁を破壊する、または、前記子嚢壁および子嚢胞子壁を破壊することが、酵素を用いて、または、機械的に行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
前記子嚢胞子を残骸から分離することが、密度勾配遠心分離または二相分離を使用することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
多価アルコール類、多糖類、コロイド状シリカ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される密度勾配媒体を使用して密度勾配を作る、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記二相分離が：
前記子嚢胞子および残骸を緩衝液または水性媒体に懸濁し、懸濁液を形成すること；
前記懸濁液を、前記懸濁液とは異なる相を有する溶液と、約１秒から約１８００秒の間混合すること；
前記子嚢胞子を子嚢胞子含有キトサン層に分割すること；および
前記子嚢胞子含有キトサン層を保持すること、を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記二相分離が、前記子嚢胞子および残骸を塩水溶液中の中間分子量ポリエーテルと混合し、前記子嚢胞子をポリエーテル相に分割することを含む水性二相抽出である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記子嚢胞子壁からキトサンを抽出することが、酸性溶液中で前記子嚢胞子を約６０℃から約１００℃の温度範囲に約１時間から約１２時間の間加熱することを含み、それにより前記キトサンを可溶化する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記酸性溶液が、前記酸性溶液の総重量の約０．１％ｗ／ｖから約５０％ｗ／ｖの範囲の量で存在する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記精製キトサンを沈殿および乾燥させることが：
前記キトサンをアルカリ性溶液で洗浄し、それによって前記キトサンを沈殿させること；および、前記キトサンを乾燥させて前記キトサン製品を形成すること、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記アルカリ性溶液が、前記アルカリ性溶液の総重量の約３％ｗ／ｖから約３０％ｗ／ｖの範囲の量で存在する水酸化ナトリウムまたは水酸化アンモニウムの溶液である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記キトサンを精製することが、約４℃から約１０５℃の温度範囲で約１時間から約２４時間の間、前記酸性溶液に酵素を加えることによる酵素分解を含む、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２０１８年６月８日に提出された米国仮出願第６２／６８２，２４５号の利益を主張し、当該仮特許出願は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
本開示は、酵母細胞の子嚢胞子からキトサン製品を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
キトサンは、各種産業で様々な製品に使用できる多糖である。複数の産業での製品において、キトサンが、凝集剤、賦形剤、または抗菌剤として使用され得る例はいくつかある。さらに、キトサンは治療用途で使用することもできる。現在、キトサンは、刺激の強い化学薬品による処理を伴う抽出プロセスを利用して、主に甲殻類の殻から供給されている。動物由来のキトサンは、重金属によるコンタミネーションや、甲殻類タンパク質に対するアレルギー反応の誘発、材料特性のばらつきの可能性があるため、特に生物医学産業での使用には問題がある。動物以外の供給源から得られるキトサンには、これらの問題は存在しない。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
本開示の実施例の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面を参照することによって明らかになり、同様の参照符号は、同一ではないかもしれないが、類似している構成要素に対応する。簡潔にするため、前述した機能を有する参照符号または特徴は、その参照符号または特徴が使用される他の図面に関連して説明されてもよく、されていなくてもよい。
【０００５】
【図１】図１は、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の子嚢胞子壁の断面の概略図の一例である。
【図２】図２は、本開示によるキトサン製品の製造方法の一例を示すフローチャートである。
【図３】図３は、サッカロミケス・セレビシエ酵母株によって生産された子嚢の光学顕微鏡画像である。
【図４】図４は、本開示によるキトサン製品の製造方法の別の例を示す別のフローチャートである。
【図５】図５は、本開示によるキトサン製品の製造方法の別の例を示す別のフローチャートである。
【図６】図６は、本開示によるキトサン製品の製造方法の別の例を示す別のフローチャートである。
【図７Ａ】図７Ａは、カルコフロールホワイトで染色した、ｄｉｔ１変異酵母株由来のサッカロミケス・セレビシエの子嚢の共焦点顕微鏡画像である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、カルコフロールホワイトで染色した、野生型酵母株由来のサッカロミケス・セレビシエの子嚢の共焦点顕微鏡画像である。
【図８】図８は、サッカロミケス・セレビシエ酵母株の酵母の栄養細胞由来の産物、標準キトサン、および標準キチンのＦＴ−ＩＲスペクトルを重ねたものであり、透過率％（「％Ｔ」とあるＹ軸）と波数（「ｃｍ−１」とあるＸ軸）を示す。
【図９】図９は、サッカロミケス・セレビシエ酵母株の子嚢胞子由来の産物および標準キトサンのＦＴ−ＩＲスペクトルを重ねたものであり、透過率％（「％Ｔ」とあるＹ軸）と波数（「ｃｍ−１」とあるＸ軸）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本明細書に開示されるキトサン製品の製造方法の例は、他の既知の方法と比較した場合、より少ない工程で動物以外の供給源からキトサンを製造し、これにより、使用する時間および労力ならびに資源を削減してキトサンを製造することができ、キトサン製造における最先端技術への重要な進歩となると考えられる。多くの方法で、キチンをキトサンに化学的に変換することなくキトサンの精製された製品を得るのは難しい可能性がある。例えば、動物以外の供給源からキトサンを製造するために使用される方法には、精製されたキトサン製品を得るためにキチンのアセチル基を除去することによってキチンをキトサンに変換する脱アセチル化工程を必要とし得る方法がいくつか存在する。
【０００７】
栄養細胞壁にキトサンを含み得る真菌類も一部あるが、一般に、酵母は栄養細胞壁にキチンしか含まない。よって、前述のように、酵母の栄養細胞壁からキトサンを製造する場合、キチンを脱アセチル化してキトサンを形成せずにキトサンを生産することはできない。理論に縛られることはないが、この工程を回避するために、非動物キトサン生産の一部の方法は、細胞壁でキトサンを生産する糸状の真菌類の菌糸体からキトサンを得ることにフォーカスしていると考えられている。ただし、これらの方法は、細胞壁でキトサンを生成する真菌類の種に特に限定されている。しかし、酵母の栄養細胞の細胞壁内にキトサンを含む酵母種は存在しない。
【０００８】
したがって、本開示における方法の例は、酵母の子嚢胞子壁からキトサン生産物を抽出することによってキトサンを製造する。特徴が分かっている酵母株では、酵母の子嚢胞子壁にはキトサンが含まれているが、キチンは含まれていない。一例では、図１は、サッカロミケス・セレビシエ酵母の子嚢胞子壁１００の概略断面図を示す。酵母子嚢胞子壁１００は、子嚢胞子の細胞膜１０２、マンナン層１０４、ベータ−１，３−グルカン層１０６、キトサン保護層１０８、およびジチロシン層１１０を含む。
【０００９】
図１に示されるように、子嚢胞子壁は、構造多糖層としてキトサンを含む。したがって、本明細書に開示される方法の例では、子嚢胞子壁から直接キトサンを抽出することにより、キチンの脱アセチル化に関連する追加の処理工程が回避される。いかなる理論にも拘束されることはないが、本開示の例は脱アセチル化工程を必要としないので、酵母の子嚢胞子からキトサンを製造する方法は、脱アセチル化工程を必要とする方法と比較した場合、必要とする工程ならびに資源および労力が少ない可能性があると考えられる。さらに、本明細書の方法の例は、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）酵母を使用するので、本明細書の方法で製造したキトサン製品は、治療または食品用途で使用され得る。
【００１０】
さらに、本開示における方法の例では、キトサン製造に望ましい特徴を有する酵母種を使用する。キトサン製品の製造方法の例において、酵母細胞がバイオマスを形成するよう特定の酵母を培養することにより、酵母細胞の減数分裂を促し、それにより、子嚢胞子壁に包まれたキトサン保護層を含む子嚢胞子が少なくとも１つ各子嚢に形成されることが有利にも見出され、キトサンは子嚢胞子壁から抽出、精製されてキトサン製品を形成し得る。
【００１１】
一例で、キトサン製品の製造方法２００が、図２を参照して本明細書に記載される。この例では、第１の工程２０２は、酵母細胞を培養して酵母細胞のバイオマスを形成することを含む。酵母細胞の培養は、酵母細胞を増殖させる任意の培地に酵母細胞をプレーティングすることによって実行され得る。例えば、培地は、酵母ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）培地であり得る。別の例では、培養は、酵母を増殖させる液体培地に酵母細胞を植菌することによって実施され得る。さらに他の例では、培養は、細胞培養容器、細胞保持システム、および培地交換システムを使用して実施され得る。培地は、細胞保持システムを介して培養容器に添加されてもよく、培地交換システムを使用して補充されてもよい。酵母は、約１５℃から約５０℃の温度範囲で培養され得る。さらに、酵母は、栄養供給の有無にかかわらず、約１２時間から約１２０時間の間培養され得る。
【００１２】
さらに、この例では、酵母細胞は、キトサンを含む子嚢胞子を生産し、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）によってＧＲＡＳとしてリストされている任意の酵母種を含む酵母株であり得る。いくつかの例としては、子嚢菌門の酵母種である任意の酵母株が挙げられ得る。さらに他の例では、酵母株は、サッカロミケス亜門の酵母種であり得る。さらに別の例では、酵母株は、サッカロミケス綱の酵母種から選択され得る。
【００１３】
より具体的には、別の例では、酵母株は、サッカロミケス属、コマガタエラ属、およびシゾサッカロミケス属の酵母種であり得る。酵母株として使用できる適切な酵母種の例としては、これらに限定されないが、オガタエア・メタノリカ、オガタエア・アングスタ、サッカロミケス・セレビシエ、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・ファフィ、シゾサッカロミケス・ポンベ、およびシゾサッカロミケス・ジャポニクスが挙げられる。
【００１４】
上記の例に加えて、本明細書で前述した酵母株はどれも、子嚢胞子を生産することができる、ホモタリック自殖酵母株、交配型に関してヘテロ接合であるヘテロタリック二倍体酵母株、交配型に関してヘテロ接合であるヘテロタリック多倍体酵母株であり得る。例えば、ヘテロタリック一倍体酵母株、ヘテロタリック二倍体酵母株、またはヘテロタリック多倍体酵母株を使用し得る。任意のヘテロタリック酵母株について、胞子形成酵母株は、２つの別個の株で酵母細胞を融合させた後、または、反対の交配型を有する２つの別個の株で交配させて、交配型に関してヘテロ接合であるハイブリッド細胞を形成させた後に得ることができる。従来の交配、プロトプラスト融合、または不和合同士の交配など、本明細書に記載の株のいずれかを融合または交配させる任意の適切な方法が使用できることを理解されたい。一例では、交配型が反対であるヘテロタリック酵母株は、互いに交配し、交配型に関してヘテロ接合であるハイブリッド細胞を形成し得る。一例では、ヘテロタリック一倍体酵母株または交配型がホモ接合であるヘテロタリック二倍体または多倍体酵母株をそれぞれ反対の交配型と交配させ、二倍体のハイブリッド細胞または交配型がヘテロ接合である多倍体のハイブリッド細胞を得ることができる。ホモタリック自殖酵母株、交配型に関してヘテロ接合であるヘテロタリック二倍体酵母株、交配型に関してヘテロ接合であるヘテロタリック多倍体酵母株は、本明細書で前述したように培養され得る。
【００１５】
別の例では、特に、酵母サッカロミケス・セレビシエの「ａ」および「アルファ」交配型の細胞を互いに交配させ、交配型に関してヘテロ接合である二倍体細胞を得、酵母細胞のバイオマスを生産するために使用し得る。次に、交配型に関してヘテロ接合である二倍体細胞を、本明細書で前述したように培養することができる。
【００１６】
別の例では、ヘテロタリック酵母株は、交配型に対してホモ接合である二倍体株であり得る。反対の交配型を有する任意の倍数性のヘテロタリック酵母株は、互いに交配させ、二倍体または倍数体ハイブリッド細胞を得、この二倍体または倍数体ハイブリッド細胞を培養して、交配型に関してヘテロ接合である酵母細胞のバイオマスを生産し、このバイオマスの減数分裂を誘導し、本明細書で前述したように子嚢胞子を形成し得ることを理解されたい。
【００１７】
別の例では、酵母株は、本明細書で前述した任意の酵母株のホモタリック自殖酵母株である。一例では、サッカロミケス・セレビシエのホモタリック酵母株を胞子形成培地中でインキュベートして減数分裂を誘導し、子嚢胞子を有する子嚢を形成させ得る。ホモタリック自殖酵母株は、本明細書で前述したように培養することができる。
【００１８】
別の例では、酵母種は、野生型（ＷＴ）酵母株として本明細書で前述した任意の種であり得る。いくつかの例では、野生型酵母株は、子嚢胞子壁の非キトサン層の形成を妨げるよう遺伝子改変されていてもよい。遺伝子改変は、子嚢胞子壁の外側の保護層の生合成に関与する生化学的経路に変化をもたらす標的遺伝子の変異、破壊、または欠失であり得ることを理解されたい。また、遺伝子改変は、子嚢胞子壁の非キトサン層の形成を妨げるような、子嚢胞子壁成分の生合成または集合の変化をもたらすものであってもよい。
【００１９】
より具体的には、一例では、サッカロミケス属の酵母種はどれも、子嚢胞子壁の外側のジチロシン層の形成を防ぐよう遺伝子改変され得る。例えば、サッカロミケス属の遺伝子ＤＩＴ１およびＤＩＴ２は、図１に示される一例の概略図において、子嚢胞子壁のジチロシン層１１０の集合を制御する因子の生合成に関与している。したがって、ＤＩＴ１、ＤＩＴ２遺伝子の不活性または変異、またはそれらの組み合わせを有する、交配型がヘテロ接合である二倍体および倍数体サッカロミケス株は、外側のジチロシン層を有さない子嚢胞子を形成し、これにより、図１の一例の概略図に示すキトサン保護層１０８は、最外層として形成される。サッカロミケスのＤＩＴ１遺伝子、ＤＩＴ２遺伝子、またはＤＩＴ１遺伝子およびＤＩＴ２遺伝子両方の不活化と変異は、１つ以上の標的遺伝子の点変異、破壊、または欠失の結果であり得る。このように、ＤＩＴ１もしくはＤＩＴ２、または、ＤＩＴ１およびＤＩＴ２遺伝子両方が変異または不活性化した、交配型遺伝子に対してヘテロ接合であるサッカロミケス株を使用する例では、より少ない資源でキトサン製品をより効率的に製造され得る。
【００２０】
図２に示されるように、第２の工程２０４は、酵母細胞の減数分裂を誘導させることを含み、これにより、酵母細胞は子嚢胞子を形成し、各子嚢胞子は子嚢胞子壁にキトサン保護層を含む。一例では、酵母細胞の減数分裂は、減数分裂および胞子形成を誘導する液体中または固体の胞子形成培地の表面上でインキュベートすることで、誘導され得る。一例では、胞子形成培地は、窒素飢餓をもたらす任意の液体または固体培地であり得る。胞子形成培地の例としては、酢酸カリウム含有培地が挙げられる。
【００２１】
酵母細胞を胞子形成培地に移した後、酵母細胞を胞子形成培地中または上で約１２時間から約１４４時間、インキュベートし得る。酵母細胞は、酵母細胞の約１０％から約１００％が子嚢胞子を少なくとも１つ含む子嚢になるまでインキュベートされ得る。酵母細胞は、胞子形成培地上で約１５℃から約５０℃の温度範囲でインキュベートされる。図３は、サッカロミケス・セレビシエの二倍体細胞を胞子形成培地中で３０℃で４８時間インキュベートした後に生産された子嚢の一例の光学顕微鏡画像である。
【００２２】
別の例では、酵母細胞のバイオマスは、最初に胞子形成前培地に移し、胞子形成前培地中または上でインキュベートし、胞子形成培地に移し、胞子形成培地中または上でインキュベートして、酵母細胞を子嚢に変化させる。前胞子形成培地の例としては、代謝可能な非発酵性炭素源を含む任意の液体または固体培地が挙げられる。例えば、胞子形成前培地は、非発酵性炭素源として酢酸カリウムを含み得る。酵母細胞は、胞子形成前培地中または上で約６時間から約７２時間インキュベートし、次いで本明細書に記載されるように減数分裂を誘導する追加のインキュベーションのために胞子形成培地へ移し得る。酵母細胞は、胞子形成前培地上で約１５℃から約５０℃の温度範囲でインキュベートされる。
【００２３】
図２に戻ると、キトサン製品の製造方法２００の次の工程２０６は、子嚢胞子壁からキトサンを抽出することを含む。一例では、子嚢胞子を含む子嚢は、ｐＨが７未満の酸性溶液に再懸濁され得る。次に、懸濁液を約６０℃から約１００℃の温度範囲で約１時間から約１２時間の間加熱して、酸に溶性であるキトサンを子嚢胞子壁から酸性溶液に抽出し得る。酸性溶液の例はキトサンを可溶化する任意の酸性溶液であり、酢酸、塩酸、ギ酸、およびそれらの組み合わせの溶液が挙げられる。酸は、酸性溶液の総重量の約０．１％ｗ／ｖから約５０％ｗ／ｖの範囲で酸性溶液中に存在し得る。工程２０６は、胞子形成後の子嚢、子嚢および子嚢胞子壁を破壊した後の破壊された子嚢の残骸および子嚢胞子壁の断片、破壊された子嚢から分離した破壊されていない子嚢胞子、または、子嚢の残骸から分離した後に破壊された子嚢胞子の子嚢胞子壁の断片に対して行われ得ることを理解されたい。キトサンの可溶化後、酸性溶液は続いて精製工程２０８で使用される。
【００２４】
図２に示されるように、方法２００のいくつかの例では、キトサン製品を製造するための次の工程２０８は、キトサンを精製して精製キトサンを形成することを含み得る。工程２０８の例において、可溶化されたキトサンを含む酸性溶液に酵素を添加し得る。酵素は、約１％ｖ／ｖから約３０％ｖ／ｖの範囲の量で存在する。酵素の例としては、キトサンとグルカンの間のいずれかのα（１→４）グルコシド結合を分解できる酵素、例えばα−アミラーゼ（例えば、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標））が挙げられる。さらに、酵素のとして、グルカン多糖のモノマー間の任意のグルコシド結合を分解することができる酵素が挙げられる。
【００２５】
酵素を可溶化キトサンを含む酸性溶液に添加し、約４℃から約１０５℃の温度範囲で約１時間から約２４時間の間インキュベートして、グルコシド結合を分解し得る。可溶化キトサンを含む酸性溶液に酵素を添加するとき、酸性溶液は７未満のｐＨを有し得る。残留グルカンは、酵素による分解後に溶液から沈殿し、固液分離技術（遠心分離など）を使用して除去および廃棄し得る。
【００２６】
残留グルカンを除去した後、次の工程２１０において、精製されたキトサンを沈殿させ、乾燥させて、キトサン製品を形成し得る。精製されたキトサンは、アルカリ性溶液または極性溶液で洗浄することにより、酵素含有溶液から沈殿させ得る。アルカリ性溶液の例としては、水酸化ナトリウムまたは水酸化アンモニウムの溶液など、ｐＨを上昇させ、溶液からキトサンを沈殿させることができる任意のアルカリ性溶液が挙げられる。アルカリ性溶液の塩基は、アルカリ性溶液の総重量の約３％ｗ／ｖから約８０％ｗ／ｖの範囲でアルカリ性溶液中に存在し得る。酸性溶液のｐＨは、アルカリ性溶液を加えることによって７を超えるｐＨに調整することができる。溶液のｐＨを調整した後、約２℃から約５０℃の温度範囲で約０．２５時間から約７２時間の間溶液をインキュベートすることにより、キトサン沈殿物が形成し得る。極性溶液の例としては、キトサン含有溶液の極性を変化させ、キトサンを沈殿させることができるアルコールまたはアセトンが挙げられる。極性溶液中のアルコールまたはアセトンは、極性溶液の総重量の約２．５％または１００％ｗ／ｖの範囲の量で存在し得る。溶液の極性を調整した後、約２℃から約１００℃の温度範囲で約０．２５時間から約７２時間の間溶液をインキュベートすることにより、キトサン沈殿物が形成し得る。
【００２７】
沈殿後、沈殿したキトサンを乾燥させてキトサン製品を形成することができる。沈殿したキトサンは、１回または複数回の固液分離工程でさらに精製することができる。最終的なキトサン製品は、乾燥させてから保存され得る。
【００２８】
別の例として、キトサン製品の製造方法４００が、図４を参照して本明細書に記載される。キトサン製品を作製するための方法４００において、酵母細胞を培養する工程４０２および酵母細胞の減数分裂を誘導する工程４０４は、本明細書で前述した図２の工程２０２および２０４と同じである。
【００２９】
工程４０４の後、一例では、第３の工程４０６は、子嚢壁または子嚢壁および子嚢胞子壁を破壊することを含む。この工程４０６において、子嚢壁および子嚢胞子壁は、連続的に（すなわち、子嚢壁、次に子嚢胞子壁を破壊する）または同時に破壊され得る。破壊には、酵素分解、機械的な破壊、または子嚢壁もしくは子嚢壁および子嚢胞子壁を破壊するのに適切な他の手段が含まれることを理解されたい。
【００３０】
一例では、子嚢胞子が子嚢から放出される条件で子嚢をインキュベートすることによって、子嚢壁を最初に破壊する。子嚢胞子が放出される条件で子嚢をインキュベートする例では、子嚢壁を分解する酵素を含む緩衝液に子嚢を添加し得る。緩衝液は、酵素活性に適した条件を提供する任意の緩衝液であり得る。
【００３１】
子嚢を緩衝液に加えた後、子嚢壁を分解して子嚢胞子を放出させる酵素とともに子嚢をインキュベートする。例えば、緩衝液に添加される酵素として、β−グルカナーゼまたはβ−グルクロニダーゼおよびβ−グルクロニドスルファターゼの組み合わせ、リチカーゼ、またはザイモリアーゼなど、任意のグルコシド加水分解酵素を使用することができる。子嚢は、約４℃から約４５℃の温度範囲で約１時間から約６時間の間酵素とインキュベートし、子嚢から子嚢胞子を放出させ得る。
【００３２】
工程４０６の別の例では、子嚢胞子を子嚢から放出させる条件で子嚢をインキュベートすることによる子嚢の破壊は、子嚢を自己融解させて子嚢胞子を放出させることによって達成してもよい。
【００３３】
工程４０６の別の例において、子嚢壁または子嚢壁および子嚢胞子壁の両方は、高圧ホモジナイザーにおいて子嚢壁または子嚢壁および子嚢胞子壁を機械的に破壊することによって破壊され得る。この例では、子嚢壁のみを破壊するためには、工程４０４からの子嚢溶液を、約１０Ｋｐｓｉから約３０Ｋｐｓｉの範囲の圧力を有する高圧ホモジナイザーに加える。子嚢溶液は、約１０分から約２０分の間、高圧ホモジナイザー内に滞留させる。子嚢壁および子嚢胞子壁の両方を破壊するためには、工程４０４からの子嚢溶液を、本明細書で前述したのと同じ時間の間、１００Ｋｐｓｉ以上の圧力で高圧ホモジナイザーに加える。
【００３４】
工程４０６の別の例において、子嚢壁または子嚢壁および子嚢胞子壁は、子嚢壁または子嚢壁および子嚢胞子壁を機械的に破壊することによって破壊され得る。例えば、子嚢壁を破壊する際、子嚢をジルコニアビーズを含む懸濁液に加え得る。ジルコニアビーズは、懸濁液の総体積の約３３体積％の範囲の量で添加し得る。ジルコニアビーズは、約０．７ｍｍから約２．０ｍｍの範囲のサイズおよび約５．５ｇ／ｃｃの密度を有し得る。
【００３５】
別の例では、子嚢壁および子嚢胞子壁を破壊するとき、子嚢はジルコニアおよびシリカビーズを含む懸濁液に加えられ得る。ジルコニアおよびシリカビーズは、懸濁液の総体積の約３３体積％の範囲の量で添加することができる。ジルコニアおよびシリカビーズは、約０．１ｍｍから約２．３ｍｍの範囲のサイズおよび約３．７ｇ／ｃｃの密度を有し得る。
【００３６】
ジルコニアビーズまたはジルコニアとシリカビーズのいずれかを使用して懸濁液に子嚢を添加した後、ボルテックスミキサーまたは細胞ホモジナイザーを使用して懸濁液を振とうし得る。子嚢は、約４℃から約４２℃の温度範囲で懸濁液と振とうすることができる。一例では、懸濁液は、約５分から約３０分の間振とうされ得る。懸濁液を振とうすることができる任意の適切なボルテックスミキサーまたは細胞ホモジナイザーを使用してよい。
【００３７】
図４を参照すると、子嚢壁または子嚢壁および子嚢胞子壁を破壊した後、キトサンは、図２の工程２０６に関して本明細書で前述したように、工程４０８で子嚢胞子壁または子嚢胞子壁の断片から抽出され得る。工程４０８で子嚢胞子壁または子嚢胞子壁の断片からキトサンを抽出した後、方法４００のいくつかの例では、キトサンは、図２の工程２０８に関して本明細書で前述したように、工程４１０で精製し得る。次に、工程４１２において、精製されたキトサンは、図２の工程２１０に関して本明細書で前述したように沈殿および乾燥され得る。キトサン製品は、乾燥させて保存され得る。
【００３８】
第３の例では、キトサン製品の製造方法５００が、図５を参照して本明細書に記載される。キトサン製品を作製するための方法５００において、酵母を培養する工程５０２および酵母細胞の減数分裂を誘導する工程５０４は、図２の工程２０２および２０４に関して本明細書で前述したようにそれぞれ同じである。さらに、キトサン製品の製造方法５００において、子嚢壁を破壊する工程５０６は、図４の工程４０６に関して本明細書で前述したものと同じである。しかしながら、この方法では、工程５０６で子嚢壁のみが破壊される。したがって、本明細書で前述した子嚢壁のみを破壊することを含む方法が、工程５０６で使用される。
【００３９】
子嚢壁の破壊後、次の工程５０８は、子嚢胞子を残骸から分離することを含む。残骸には、可溶性細胞成分、不溶性細胞成分、破壊された子嚢および細胞壁の断片、破壊されなかった酵母細胞、および破壊されなかった子嚢などの、子嚢胞子を除く酵母細胞材料が含まれることを理解されたい。残骸から子嚢胞子を分離するいくつかの例には、密度勾配遠心分離または二相分離が含まれる。
【００４０】
一例では、密度勾配遠心分離を使用して子嚢胞子を分離する。最初に、残骸を含む子嚢胞子を密度勾配媒体に加え得る。子嚢胞子を残骸から分離する任意の密度勾配媒体を使用し得る。密度勾配媒体の例はいくつかあり、多価アルコール類、多糖類、コロイド状シリカ、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４１】
子嚢胞子および残骸を密度勾配媒体に添加した後、密度勾配媒体を遠心分離にかけ、子嚢胞子および残骸を密度勾配の別々の層に分離することができる。一例では、遠心分離は、約８，５４０ＲＣＦから約１９，２００ＲＣＦの範囲の速度で、約３０分から約９０分の間で実施され得る。遠心分離中の温度は、約２℃から約４２℃の範囲であり得る。
【００４２】
遠心分離後、少なくとも２つ以上の層が形成され、最下層には高濃度の子嚢胞子を含む子嚢胞子濃縮層が含まれる。最上層は残骸濃縮層であり、残骸と低濃度の子嚢胞子が含まれる。密度勾配の最上層は、分割され（例えば、デカンテーション）、廃棄され得る。子嚢胞子を含む最下層は、非イオン性界面活性剤で少なくとも１回洗浄し得る。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（登録商標）などの非イオン性界面活性剤を使用し得る。残りの最下層は、より多くの残骸を除去するために、少なくとも１回または複数回の固液分離工程に供してもよい。例えば、最下層は、約１０００ＲＣＦから約１０，０００ＲＣＦの範囲の速度で、約３分から約７分の間で遠心分離に供され得る。遠心分離の温度は、約０℃から約４２℃の範囲であり得る。遠心分離は１回以上繰り返し得る。残りの最下層は、次の抽出工程５１０で使用される子嚢胞子ペレットを形成し得る。
【００４３】
別の例では、二相分離を使用して、子嚢胞子を残骸から分離することができる。二相分離の場合、最初に、子嚢胞子および残骸を水性媒体または緩衝液に懸濁し、懸濁液または溶液を形成し得る。水性媒体にはいくつか例があり、水または酵母培養培地などの懸濁液または溶液を形成する任意の媒体が挙げられる。緩衝液のいくつかの例としては、リン酸カリウムなどの懸濁液または溶液を形成する任意の緩衝液が含まれる。次に、懸濁液または溶液を、約１秒から約１，８００秒の間、異なる相の溶液と混合し得る。水性媒体または緩衝液とは異なる相の溶液の一例は、親油性溶液である。
【００４４】
溶液または懸濁液を異なる相の溶液と混合した後、混合物を分液漏斗または同様の装置で２つ以上の層に分離させ得る。キトサン層を含む子嚢胞子は、分液漏斗または同様の装置から収集し、工程５１０で説明する抽出のために保存され得る。懸濁液は、分液漏斗または同様の装置で遠心分離するか、または重力沈降に供して、残骸から子嚢胞子を分離して、子嚢胞子ペレットを形成し得る。子嚢胞子ペレットは、次の工程５１０で使用することができる。
【００４５】
二相分離のさらに別の例として、子嚢胞子は、水性二相抽出を使用して残骸から分離される。この例では、子嚢胞子と残骸を塩水溶液中の中間分子量ポリエーテルに添加し、懸濁液を形成する。
【００４６】
懸濁液を形成した後、子嚢胞子はポリエーテル相内にあり、これを分割して溶液を形成し得る。残骸は塩水溶液に含まれており、分割および廃棄することができる。子嚢胞子を含む残りの溶液は、子嚢胞子ペレットを形成するために少なくとも１つの固液抽出工程を経てもよい。子嚢胞子ペレットは、次の抽出工程５１０で使用することができる。
【００４７】
図５に戻ると、子嚢胞子を残骸から分離した後、工程５１０でキトサンを子嚢胞子ペレットから抽出され得る。工程５１０は、図２の工程２０６に関して本明細書で前述したように実施されてよい。工程５１０で子嚢胞子ペレットからキトサンを抽出した後、方法５００のいくつかの例では、キトサンは、図２の工程２０８に関して本明細書で前述したように、工程５１２で精製してもよい。次に、工程５１４において、精製されたキトサンは、図２の工程２１０に関して本明細書で前述したように沈殿および乾燥され得る。キトサン製品は、乾燥され、次いで保存され得る。
【００４８】
第４の例では、キトサン製品の製造方法６００が、図６を参照して本明細書に記載される。キトサン製品を作製するための方法６００において、酵母を培養する工程６０２および酵母細胞の減数分裂を誘導する工程６０４は、図２の工程２０２および２０４に関して本明細書で前述したようにそれぞれ同じである。さらに、キトサン製品の製造方法６００において、子嚢壁を破壊する工程６０６は、図４の工程４０６に関して本明細書で前述したものと同じである。しかしながら、この方法６００では、工程６０６で子嚢壁のみが破壊される。したがって、本明細書で前述した子嚢壁のみを破壊することを含む方法が、工程６０６で使用される。
【００４９】
さらに、キトサン製品の製造方法６００において、子嚢胞子を残骸から分離する工程６０８は、図５の工程５０８に関して本明細書で前述したものと同じである。工程６０８の後、本明細書で図４の工程４０６を参照して前述したように、子嚢壁および子嚢胞子壁の両方を破壊するために記載された任意の方法を利用して、子嚢胞子壁を破壊する方法６００の工程６１０が実施される。次に、キトサンは、工程６１２で子嚢胞子壁の断片から抽出され得る。工程６１２は、図２の工程２０６に関して本明細書で前述したように実施されてよい。工程６１２で子嚢胞子ペレットからキトサンを抽出した後、方法６００のいくつかの例では、キトサンは、図２の工程２０８に関して本明細書で前述したように、工程６１４で精製してもよい。次に、工程６１６において、精製されたキトサンは、図２の工程２１０に関して本明細書で前述したように沈殿および乾燥され得る。キトサン製品は、乾燥され、次いで保存され得る。
【００５０】
本開示をさらに説明するために、以下で実施例を示す。これらの実施例は、例示を目的しており、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことを理解されたい。
【実施例】
【００５１】
不活性ＤＩＴ１の株
カルコフロールホワイトを含む染色手順を利用し、サッカロミケス・セレビシエのｄｉｔ１変異株でＤＩＴ１遺伝子が欠失されていることを確認した。サンプルをカルコフロールホワイト（５００μＬのマッキルベイン緩衝液に１μＬ）で染色し、スライドガラスに準備した。サンプルは、カルコフロールホワイトを励起するＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、二塩酸塩）波長（３５８ｎｍおよび４６１ｎｍ）で、共焦点顕微鏡により同日に撮影した。
【００５２】
染色法により、カルコフロールホワイトで酵母子嚢胞子を同定することができた。カルコフロールホワイトは、ＤＩＴ１遺伝子が不活性であり、それによって色素が子嚢胞子壁の内部まで染色することができる場合にのみ、キチンとキトサンを染色できる。子嚢胞子の壁がカルコフロールホワイトで染色された場合、ＤＩＴ１遺伝子は不活性であった。図７Ａは、子嚢胞子壁が染色されているため、ｄｉｔ１変異株のＤＩＴ１遺伝子が不活性であることを示している。一方、機能するＤＩＴ１遺伝子を有するサッカロミケス・セレビシエ野生型株は、図７Ｂに示されるように、子嚢壁のみが染色されている。
【００５３】
子嚢胞子の形成
ワーキングセルプレート（ＷＣＰ）のサッカロミケス・セレビシｄｉｔ１変異株のコロニーを１つ、５ｍＬの液体ＹＰＤに懸濁し、２５０ＲＰＭで振とうしながら３０℃で一晩インキュベートした。作業容量の培養物全体を、１Ｌのバッフル付きフラスコ中２００ｍＬの液体ＹＰＤに植菌し、２５０ＲＰＭで振とうしながら３０℃でインキュベートした。２４時間の増殖後、酵母細胞は、Ｎａｌｇｅｎｅの２５０ｍＬ滅菌遠心分離ボトルを用いて、４℃および６７３０ＲＣＦで遠心分離し、沈殿させた。培地を廃棄し、酵母細胞を１Ｌのバッフル付きフラスコ中２００ｍＬの胞子形成前培地に懸濁した。培養物を、２５０ＲＰＭで振とうしながら３０℃でさらに２４時間インキュベートした。
【００５４】
さらに２４時間のインキュベーション後、酵母細胞は、Ｎａｌｇｅｎｅの２５０ｍＬ滅菌遠心分離ボトルを用いて、４℃および５６４０ＲＣＦで遠心分離し、沈殿させた。次に、遠心分離で形成された酵母細胞のペレットを胞子形成培地に移した。最後に、培養物を胞子形成培地中２５０ＲＰＭおよび３０℃で７２時間インキュベートし、採取した。子嚢を採取するために、子嚢を最初にＮａｌｇｅｎｅの２５０ｍＬ滅菌遠心分離ボトル内で４℃および５６４０ＲＣＦで遠心分離した。子嚢胞子を含む湿ったバイオマスが約５グラム、２００ｍＬの培養物から採取された。湿ったバイオマスをＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水で１回洗浄した後、２，１３０ＲＣＦおよび４℃で５分間遠心分離し、洗浄した上澄みをデカントした。
【００５５】
子嚢の破壊と子嚢胞子の単離の実施例１
子嚢ペレットを、４０ｍＭベータメルカプトエタノール（ＢＭＥ）、１．４Ｍソルビトール、５０ｍＭリン酸カリウムおよびナトリウム（ＫＰｈｏｓ）を含むｐＨ７．５溶解緩衝液中、リチカーゼ１ｍｇあたり２，０００Ｕである２５μＬのアリコートを含むリチカーゼと一緒に懸濁した。バイオマス１グラムあたり５ｍＬの緩衝液と２アリコート分のリチカーゼをファルコンの５０ｍＬコニカルチューブに添加した。懸濁液を３０℃で３時間インキュベートし、２５０ＲＰＭでボルテックスミキサーを使用して混合し、１：１のガラスビーズ対培養の比で、０．４５μＭジルコニアガラスビーズと１０分間激しくボルテックスにかけた。子嚢の破壊は、血球計算盤に１％メチレンブルーで染色したサンプルを載せ、光学顕微鏡で撮影し、確認された。
【００５６】
次に、ガラスビーズと混合し、リチカーゼ緩衝液に懸濁した後、子嚢胞子のペレットと残骸を、ペレット１グラムあたり５ｍＬの０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（登録商標）で３回洗浄した。次に、ペレットをパーコール遠心分離勾配によって精製した。パーコール勾配は、パーコール／０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（登録商標）／２．５Ｍスクロース溶液９ｍＬを次の比率で添加して調製した。１）８：１：１；２）７：２：１；３）６：３：１；４）５：４：１の比で、それぞれＳｏｒｖａｌｌの４０ｍＬ高速遠心チューブ４つに添加した。約１．５ｍＬのペレットを勾配に加え、１０，０００ＲＰＭで１時間４℃で遠心分離した。子嚢胞子画分の大部分は勾配の下部に集中しており、密度の低い細胞やその他の残骸は勾配の上層３層に残っていた。遠心分離後、勾配の上部２７ｍＬを除去し、下部９ｍＬの層を３０ｍＬの０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（登録商標）で３回洗浄し、２，１３０ＲＣＦおよび４℃で５分間遠心分離にかけ、子嚢から分離した子嚢胞子ペレットを得た。
【００５７】
子嚢破壊の実施例２
別の例では、子嚢胞子を含む子嚢を有するサッカロミケス・セレビシエｄｉｔ１変異酵母株培養物を激しくガラスビーズと混合し、子嚢壁を破壊した。３００μＬの０．４５μｍジルコニアビーズを２ｍＬの丸底プラスチックチューブ中、胞子形成培養液の高密度の水懸濁液２００μＬに添加し、ボルテックスミキサーを使用して１０分間混合した。次に、懸濁液を１３，０００ｒｐｍで１２分間遠心分離した。懸濁液の最下層にペレットが形成された。
【００５８】
ペレットを単離し、キチンとキトサンを選択的に染色するカルコフロールホワイトで染色し、ペレットにキチンとキトサンが含まれているかどうかを判断した。結果は、キチンおよびキトサンの存在を示し、混合物が子嚢壁（キチンを含む）および子嚢胞子壁（キトサンを含む）を含むことを示した。このデータは、機械的分解により単一の混合工程で子嚢と子嚢胞子の壁が破壊され、それによって次の工程でキトサンを抽出できることを示している。
【００５９】
キトサン抽出
子嚢胞子のサンプルを得た。サンプルには、パーコール勾配下部層から得た約０．２グラムの湿った子嚢胞子の重量が含まれていた。サンプルを２％酢酸３０ｍＬに懸濁した。凝縮器を備えた丸底フラスコ中、混合物を９５℃に５時間加熱することにより子嚢胞子からキトサンを抽出した。
【００６０】
混合物を室温に冷却し、１３，３００ＲＣＦおよび４℃で１０分間、ファルコンの５０ｍＬコニカルチューブで遠心分離にかけ、子嚢胞子の残骸を分離した。溶液中、キトサン生産物を含む上澄みをファルコンの５０ｍＬコニカルチューブに集めた。集めた溶液のｐＨは、約４ｍＬから５ｍＬの２．０ＭのＮａＯＨを用いて、サーモフィッシャーのｐＨプローブでｐＨの変化を追跡しながらｐＨ１２に上げた。キトサン製品が溶液中に白色の沈殿物として形成されるまで、溶液を４℃で約４８時間から約７２時間インキュベートした。
【００６１】
白色の沈殿物を、ファルコンの５０ｍＬコニカルチューブ中、１３，３００ＲＣＦおよび４℃で１０分間遠心分離した。次に、上澄みをデカントし、白い沈殿物を２ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、脱イオン水で３回洗浄した。各洗浄工程の後、２，１３０ＲＣＦおよび４℃で５分間の遠心分離を続いて行った。最終的なキトサン含有ペレットを、−２０℃の冷凍庫に保管した。
【００６２】
分光法の結果
フーリエ変換赤外（ＦＴ−ＩＲ）分光法を使用して、最終的なキトサン製品を分析した。最終製品のキトサンを分析するために、ＦＴ−ＩＲ分光法を使用して２つの異なるサンプルを分析した。最初のサンプルは、サッカロミケス・セレビシエ株由来の栄養細胞の産物であった。２番目のサンプルはサッカロミケス・セレビシエ株由来の子嚢胞子層の産物であった。
【００６３】
両方のサンプルを分析し、キチンとキトサンの分析用標準物と比較した。キチンがサンプルに存在する場合、１８００ｃｍ−１から１６００ｃｍ−１の間にアセチル基の存在を表す大きなピークがあると考えられている。ただし、キトサンが存在する場合、１８００ｃｍ−１から１６００ｃｍ−１の間にはピークがないか、あっても非常に小さいピークである。両方のサンプルをＦＴ−ＩＲ分光法を使用して分析し、透過率（「％Ｔ」とあるＹ軸）と波数（「ｃｍ−１」とあるＸ軸）を示すＦＴ−ＩＲスペクトルを重ねたものとして表示した。
【００６４】
最初のサンプルは、サッカロミケス・セレビシエ株由来の栄養細胞産物であり、キチンおよびキトサンの分析用標準物と分析および比較した。図８に示すように、キチンおよび栄養細胞層は両方とも１６２０ｃｍ−１領域に鋭いピークを有している。これは、栄養細胞層が細胞壁にキトサンではなくキチンを含んでいるという事実を裏付けている。一方、標準キトサンのスペクトルは、１６２０ｃｍ−１の領域にピークを示しておらず、これはキチンの脱アセチル化された形態であるため、予想通りである。
【００６５】
２番目のサンプルはサッカロミケス・セレビシエ株由来の子嚢胞子の産物であった。図９に示すように、子嚢胞子産物および標準キトサンは、１６２０ｃｍ−１領域にピークを示さなかった。したがって、このデータは、キトサンが子嚢胞子産物に存在したが、キチンは存在しなかったことを示している。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、所与の値が端点の「少し上」または「少し下」であり得ることを規定し、数値範囲端点に柔軟性を持たせるために使用される。この用語の柔軟度は、特定の変数によって決めることができ、経験および本明細書に関連する記載に基づいて決定する当業者の知識の範囲内である。
【００６７】
本明細書で使用される場合、複数のアイテム、構造要素、構成要素、および／または材料が、便宜上、共通のリストに提示され得る。ただし、これらのリストは、リストの各メンバーが個別かつ唯一のメンバーとして別々に識別されているかのように解釈する必要がある。したがって、そのようなリストの個々のメンバーは、特に指定のない限り、共通のグループで示されるということだけに基づいて、同じリストの他のメンバーと事実上同等であると解釈されるべきではない。
【００６８】
特に明記しない限り、本明細書に記載の任意の特徴は、本明細書に記載の任意の態様または任意の他の特徴と組み合わせることができる。
【００６９】
本明細書全体での「一例」、「別の例」、「例」などへの言及は、その例に関連して説明した特定の要素（例えば、特徴、構造、および／または特性）が本明細書に記載される少なくとも１つの例に含まれることを意味し、他の例に存在していても存在していなくてもよい。さらに、文脈上明らかに他のことを示さない限り、任意の例について説明された要素は、様々な例において任意の適切な方法で組み合わせることができることを理解されたい。
【００７０】
本明細書で提供される範囲は、記載された範囲、および記載された範囲内の任意の値または小範囲を含むことを理解されたい。例えば、約０．１ｗ／ｖから約２０ｗ／ｖの範囲は、約１０ｗ／ｖから約１５ｗ／ｖの明示的に記載された境界を含むだけでなく、３ｗ／ｖ、７ｗ／ｖ、１３．５ｗ／ｖなど個々の値、および約５ｗ／ｖから約１５ｗ／ｖなどの小範囲も含むと解釈されるべきである。
【００７１】
本明細書に開示される例を説明および請求する際に、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および、「その（ｔｈｅ）」は、文脈から明らかでない限り、複数の指示対象を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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