(57)【要約】  本発明は、概して、細胞培養を使用する特異性アッセイ、特に、異なるフォーマットの新規の標的抗原結合部分を試験するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現レポーターＴ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞アッセイに関する。さらに、本発明は、タグを含む認識ドメインに特異的に結合することができる改変されたＣＡＲがトランスフェクト／形質導入されたレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的抗原に特異的に結合することができる標的抗原結合部分の特異性を評価するための方法であって、以下の工程：
ａ）抗原結合ドメイン及び認識ドメインを含む抗原結合分子を提供する工程であって、抗原結合ドメインが標的抗原結合部分を含み、認識ドメインがタグを含む、工程；
ｂ）抗原結合分子を、表面上に標的抗原を含む標的細胞と接触させる工程であって、標的細胞ががん細胞である、工程；
ｃ）抗原結合分子を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現レポーターＴ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞と接触させる工程であって、レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が以下： 
ｉ．タグを含む認識ドメインに特異的に結合することができるＣＡＲであって、応答エレメントに作用的に結合されている、ＣＡＲ；
ｉｉ．応答エレメントの制御下のレポーター遺伝子； 
を含む工程；及び
ｄ）レポーター遺伝子の発現を測定することによりＴ細胞活性化を決定し、標的抗原結合部分の特異性を確立する工程
を含む方法。
【請求項２】
抗原結合分子が、ＩｇＧクラス抗体、特にＩｇＧ１又はＩｇＧ４アイソタイプ抗体、又はその断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗原結合ドメインがＦａｂ断片であり、認識ドメインがＦｃドメインである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
抗原結合ドメイン及び認識ドメインが、同じドメイン、特にＦａｂ断片である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
タグがハプテン分子である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ハプテン分子がジゴキシゲニン（ＤＩＧ）である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
タグがポリペプチドタグである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ポリペプチドタグが、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ａｖｉタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＧＣＮ４タグ、及びＮＥタグからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
標的抗原が細胞表面抗原又は受容体である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
標的抗原が、ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の分子に結合したペプチドであり、標的抗原結合部分が、Ｔ細胞受容体様（ＴＣＲＬ）抗原結合部分である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＴＣＢ抗体を生成するための方法であって、ＴＣＢ抗体が、標的抗原に特異的な第１の抗原結合部分と、Ｔ細胞活性化受容体に特異的に結合することができる第２の抗原結合部分とを含み、第１の抗原結合部分が請求項１から１０のいずれか一つに記載の方法に従って選択される、方法。
【請求項１２】
Ｔ細胞活性化受容体がＣＤ３である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
固定膜貫通ドメインと、抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、抗原結合部分が、タグを含む認識ドメインに特異的に結合することができるが、タグを含まない認識ドメインには特異的に結合することができない、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項１４】
タグがハプテン分子である、請求項１３に記載のＣＡＲ。
【請求項１５】
ハプテン分子がジゴキシゲニン（ＤＩＧ）である、請求項１４に記載のＣＡＲ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、細胞培養を使用する特異性アッセイ、特に、異なるフォーマットの新規の標的抗原結合部分を試験するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現レポーターＴ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞アッセイに関する。さらに、本発明は、タグを含む認識ドメインに特異的に結合することができる改変されたＣＡＲがトランスフェクト／形質導入されたレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去１５年間で、抗体ベースの治療法は進化し、現在、血液悪性腫瘍及び固形腫瘍の治療における化学療法アプローチの価値ある組み合わせ又は代替手段となっている。化学療法とは異なり、抗体療法はがん細胞の特定の抗原を標的とし、より部位特異的な治療を可能にし、それにより健康な組織への副作用を減少させる。抗体ベースの治療試薬を開発するプロセスでは、臨床試験に、最終的には市場に持ち込むための最良の候補を特定するために、様々なアッセイが必要である。最初の前臨床段階では、抗体を生成し、標的特異性と標的に対する親和性を分析する必要がある。
【０００３】
結合特性は、ＦＲＥＴベースの方法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）又は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）などの様々なタンパク質−タンパク質相互作用アッセイを使用して分析され得る。しかしながら、利用可能なアッセイフォーマットは、必ずしもｉｎ  ｖｉｖｏの状況を包括的且つ統合的に再現しない。例えば、細胞表面受容体に結合する治療抗体でのがん細胞の標的化は、複数のレベル、例えば、表面分子の結合及び架橋を介した細胞内シグナル伝達、並びに腫瘍細胞をマーキングして免疫細胞と結合することに影響を及ぼし得る。さらに、抗原結合からエフェクター機能、例えばＴ細胞の細胞毒性の確立までの認識カスケードには、抗原結合部分の結合親和性がいくつかの要因の一つである、細胞表面相互作用のうまく仕組まれた配列が必要である。したがって、プレーンなタンパク質−タンパク質親和性相互作用アッセイは、初期の候補の開発のための非常に貴重なツールであるが、完全な全体像を提供しない場合がある。
【０００４】
依然として、可能な限り標的抗体結合に対する非特異的影響を最小限に抑える、より包括的なセットアップでのｉｎ  ｖｉｖｏ相互作用の有意義な予測を提供する結合アッセイを開発する必要性が残っている。
【０００５】
本発明の発明者は、抗体の標的への結合を評価するために、多種多様ながん細胞タイプに適用可能な新規のアッセイを開発した。革新的なアッセイには、レポーター細胞として修飾Ｔ細胞が含まれ、直接的な読み取りと包括的且つ包含的な結果を組み合わせる。
【０００６】
さらに、本発明は、抗体及び抗体様コンストラクト（例えばリガンド）の結合及び機能性の評価を組み合わせるアッセイを提供する。新規のアッセイは、例えば、治療抗体薬物候補、即ちハイスループット形式のスクリーニング又は特性評価の目的に有用である。
【０００７】
この新たなアッセイは、ネイティブターゲットへの抗体の結合の初期及び後期のスクリーニング及び特性評価、並びに候補薬物の開発における最良の結合剤の同定を可能にする機能の評価のための貴重なツールを表す。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、概して、特に薬物開発プロセスにおける新規の抗原結合部分を評価及び選択するための方法に関し、例えば腫瘍細胞上の標的抗原への結合の決定を、抗体−標的結合に応答したＴ細胞の活性化と組み合わせる。本明細書では、標的抗原に特異的に結合することができる標的抗原結合部分の特異性を評価するための方法であって、以下の工程：
ａ）抗原結合ドメイン及び認識ドメインを含む抗原結合分子を提供する工程であって、抗原結合ドメインが標的抗原結合部分を含み、認識ドメインがタグを含む、抗原結合分子を提供する工程；
ｂ）抗原結合分子を、表面上に標的抗原を含む標的細胞と接触させる工程であって、標的細胞ががん細胞である、抗原分子を標的細胞と接触させる工程；
ｃ）抗原結合分子を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現レポーターＴ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞と接触させる工程であって、ＣＡＲ−Ｔ細胞が以下：
ｉ．タグを含む認識ドメインに特異的に結合することができるＣＡＲであって、応答エレメントに作用的に結合されている、ＣＡＲ；
ｉｉ．応答エレメントの制御下のレポーター遺伝子
を含む、抗原結合分子をＣＡＲ−Ｔ細胞と接触させる工程；及び
ｄ）レポーター遺伝子の発現を測定することによりＴ細胞活性化を決定し、標的抗原結合部分の特異性を確立する工程
を含む方法が提供される。
【０００９】
一実施態様では、抗原結合分子は、ＩｇＧクラス抗体、特にＩｇＧ１又はＩｇＧ４アイソタイプ抗体、又はその断片である。
【００１０】
一実施態様では、抗原結合ドメインはＦａｂ断片であり、認識ドメインはＦｃドメインである。
【００１１】
一実施態様では、抗原結合ドメイン及び認識ドメインは、同じドメイン、特にＦａｂ断片である。
【００１２】
一実施態様では、タグはハプテン分子である。
【００１３】
一実施態様では、ハプテン分子はジゴキシゲニン（ＤＩＧ）である。
【００１４】
一実施態様では、タグはポリペプチドタグである。
【００１５】
一実施態様では、ポリペプチドタグは、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ａｖｉタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＧＣＮ４タグ、及びＮＥタグからなる群より選択される。
【００１６】
一実施態様では、標的抗原結合部分は、Ｆａｂ断片、特にファージディスプレイライブラリースクリーニング由来のＦａｂ断片である。
【００１７】
一実施態様では、標的抗原結合部分の標的抗原への結合及びレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の標的抗原結合部分を含む抗原結合分子への結合は、レポーター遺伝子の発現をもたらす。
【００１８】
一実施態様では、標的抗原は、細胞表面抗原又は受容体である。
【００１９】
一実施態様では、標的抗原は、ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の分子に結合したペプチドである。
【００２０】
一実施態様では、標的抗原結合部分は、Ｔ細胞受容体様（ＴＣＲＬ）抗原結合部分である。
【００２１】
一実施態様では、固定膜貫通ドメインと、抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、抗原結合部分が、タグを含む認識ドメインに特異的に結合することができるが、タグを含まない認識ドメインには特異的に結合することができない、キメラ抗原受容体が提供される。
【００２２】
一実施態様では、抗原結合部分は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂ又はｓｃＦａｂ、特にＦａｂ又はｃｒｏｓｓＦａｂである。
【００２３】
一実施態様では、タグはハプテンである。
【００２４】
一実施態様では、ハプテン分子はジゴキシゲニン（ＤＩＧ）である。
【００２５】
一実施態様では、タグはポリペプチドタグである。
【００２６】
一実施態様では、ポリペプチドタグは、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ａｖｉタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＧＣＮ４タグ、及びＮＥタグからなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明に従って使用される例示的な抗原結合受容体（ＣＡＲ）の構造を図示する。図１Ａは、ｓｃＦｖフォーマットの構造を示す。認識ドメインに特異的に結合することができる抗原結合部分は、可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）からなる。Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーは、ＶＬ鎖に結合し、抗原認識ドメインを、ＣＤ３ｚの刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）に融合したＣＤ２８の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）に融合したＣＤ２８膜貫通ドメイン（ＴＭ）に結合する。１Ｂ及び１Ｃは、Ｆａｂ（１Ｂ）フォーマット及びｃｒｏｓｓＦａｂ（１Ｃ）フォーマットの構造を示す。抗原結合部分は、Ｉｇ重鎖及びＩｇ軽鎖からなる。Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーは、重鎖に結合し、抗原認識ドメインを、ＣＤ３ｚの刺激シグナル伝達ドメインに融合したＣＤ２８の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインに融合したＣＤ２８膜貫通ドメインに結合する。
【図２】本発明に従って使用される例示的な発現コンストラクトＣＡＲのモジュール組成を説明する概略図を図示する。２ＡはｓｃＦｖフォーマットを図示する。２ＢはＦａｂフォーマットを図示する。２ＣはｃｒｏｓｓＦａｂフォーマットを図示する。
【図３】ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）分子の構造式を図示する。
【図４】抗ジゴキシゲニン  ＣＡＲにより特異的に認識することができる例示的なジゴキシゲニル化ＩｇＧ１分子を図示する。
【図５】抗ジゴキシゲニン  ＣＡＲにより認識される別のジゴキシゲニル化抗原結合分子を図示する。この実施態様では、標的抗原結合ドメインと認識ドメインは同じドメインである。即ち、ジゴキシゲニンハプテンタグは、抗原結合ドメインに結合しており、ここで抗原結合ドメインは、認識ドメインの機能も発揮する。５Ａは、抗ジゴキシゲニン  ＣＡＲにより認識することができるジゴキシゲニル化Ｆａｂ分子を図示する。５Ｂは、抗ジゴキシゲニン  ＣＡＲにより認識することができるジゴキシゲニル化ｓｃＦｖ分子を図示する。
【図６】抗ＣＤ２０標的抗体ＧＡ１０１の功を奏したジゴキシゲニル化を確認するウェスタンブロットを図示する。ジゴキシゲニル化は、ウェスタンブロット分析による抗ジゴキシゲニン−ＡＰ  Ｆａｂ断片により検出された。
【図７】Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーター細胞上の抗ジゴキシゲニン−ｄｓ−ｓｃＦｖの表面検出を図示する。
【図８】Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイの概略図を図示する。Ｆｃ（認識ドメイン）でゴキシゲニン化した標的抗原結合ＩｇＧは、抗ジゴキシゲニンＣＡＲ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＴ細胞により認識することができる。この認識は、ルシフェラーゼ発光（ＣＰＳ／ＲＬＵ）を測定することにより検出され得る細胞の活性化をもたらす。
【図９】標的細胞としてＣＤ２０発現ＳＵＤＨＤＬ４腫瘍細胞を、及び１０倍モル過剰のジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでジゴキシゲニル化された抗ＣＤ２０  ＩｇＧ抗体（ＧＡ１０１）を使用するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイを図示する。抗体は、一方では腫瘍関連抗原を認識し、他方ではＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーター  ＣＡＲ−Ｔ細胞により認識される。抗ジゴキシゲニン−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のソート済プールをエフェクター細胞として使用した。
【図１０】抗ジゴキシゲニン−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化を図示する。活性化は、異なる量のジゴキシゲニル化分子に結合された抗ＣＤ２０  ＩｇＧ抗体（ＧＡ１０１）に依拠する。
【図１１】標的細胞としてＣＤ２０発現ＳＵＤＨＤＬ４腫瘍細胞を使用するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイを図示する。平均でおよそ１のジゴキシゲニン（等モルＤｉｇ−ＮＨＳ：抗体比）分子を用いてＦｃジゴキシゲニル化された抗ＣＤ２０  ＩｇＧ抗体（ＧＡ１０１）  を使用する。抗体は、一方では腫瘍関連抗原を認識し、他方ではＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーター  ＣＡＲ−Ｔ細胞により認識される。抗ジゴキシゲニン−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のソート済プールをエフェクター細胞として使用した。
【図１２】架橋ビオチン−ジゴキシゲニンアダプターを使用する別のＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイの概略図を図示する。ビオチン結合部分を介してＦｃドメインに結合するビオチン−ジゴキシゲニンアダプターは、このセットアップにおいて認識ドメインを形成する。ジゴキシゲニン部分は、抗ジゴキシゲニン  ＣＡＲ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞により認識することができる。
【図１３】標的細胞としてＭＣＦ７細胞を使用するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイを図示する。抗ＬｅＹ／ビオチン抗体及び架橋ビオチン−ジゴキシゲニンアダプターを使用した。抗体は、一方では腫瘍関連抗原（ＬｅＹ）を認識し、他方ではアダプター分子のビオチンを認識する。アダプター結合ジゴキシゲニンは、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞により認識される。抗ジゴキシゲニン−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のソート済プールをエフェクター細胞として使用した。ネガティブコントロールとして、非標的ビオチン結合抗ＣＤ３３抗体を使用した。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
定義
「親和性」は、分子（例えば、抗体又はＣＡＲ）の単一結合部位とその結合パートナー（例えばリガンド）との間の非共有結合的相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗原結合部分と抗原及び／又は受容体とそのリガンド）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（ＫＤ）によって表され、この解離定数（ＫＤ）は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比が同じである限り、同等の親和性が異なる速度定数を含むことがある。親和性は、ここに記載のものを含む当技術分野で既知の確立された方法により測定することができる。親和性を測定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）であり、測定に好ましい温度は２５℃である。
【００２９】
用語「アミノ酸」（「ａａ」）とは、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによりコードされたもの、並びに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ塩基性化学構造、即ち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニン、メチルスルホニウムに結合したα炭素を有する化合物を指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ塩基性化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、その機能は天然に存在するアミノ酸と同様である化学化合物を指す。本明細書では、アミノ酸は、それらの一般に知られている３文字の記号により、又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）が推奨する１文字の記号のいずれかで参照される。
【００３０】
本明細書で使用される用語「アミノ酸変異」は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意図している。最終コンストラクトが所望の特性を保有する限りにおいて、置換、欠失、挿入、及び修飾のいずれの組み合わせも最終コンストラクトに到達するように行なわれてよい。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失、並びにアミノ酸の挿入が含まれる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸の置換である。アミノ酸置換には、２０の標準のアミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、３−メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５−ヒドロキシリジン）の天然に存在するアミノ酸誘導体又は天然に存在しないアミノ酸による置き換えが含まれる。アミノ酸変異体は、当技術分野で周知の遺伝学的方法又は化学的方法を用いて生成することができる。遺伝学的方法は、部位特異的変異原性、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含みうる。遺伝学的改変以外の方法、例えば化学的修飾によるアミノ酸の側鎖基の変更方法も有用でありうると考えられる。
【００３１】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び所望の抗原結合活性を示す限りにおいて抗体断片を含む。したがって、本発明に関連して、抗体という用語は、完全な免疫グロブリン分子及びそのような免疫グロブリン分子の一部に関する。さらに、本明細書で述べられるように、該用語は、修飾及び／又は変更された抗体分子、特に修飾された抗体分子に関する。該用語は、組み換えで又は合成的に改変／合成された抗体にも関する。本発明に関連して、抗体という用語は、免疫グロブリンという用語と区別せずに使用される。
【００３２】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ）、及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；  及び米国特許第５５７１８９４号及び同第５５８７４５８号を参照。ダイアボディは、２つの抗原結合部位を有する抗体断片であって、二価又は二重特異性であり得る。例えば、ＥＰ４０４０９７；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); 及びHollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照）。抗体断片は、ここに記載されるように、インタクトな抗体のタンパク質消化や組み換え宿主細胞（例えば大腸菌又はファージ）による生成を含むがこれらに限定されない様々な技術により作製することができる。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体／免疫グロブリン及び誘導体、例えば、その断片である。さらに、本明細書で述べられるように、該用語は、修飾及び／又は変更された抗原結合分子、特に修飾された抗体分子に関する。該用語は、組み換えで又は合成的に改変／合成された抗体にも関する。本発明に関連して、抗原結合分子は、好ましくは抗体又はその断片である。
【００３４】
ここで使用される用語「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様では、抗原結合部分は、それが結合する実体（例えば、免疫グロブリン又はＣＡＲ）を標的部位へ、例えば特定の型の腫瘍細胞又は抗原決定基を有する腫瘍間質又は腫瘍細胞上の抗原決定基に結合する免疫グロブリンへと方向付けることができる。別の実施態様では、抗原結合部分は、その標的抗原を通じてシグナル伝達を活性化することができ、例えば、シグナル伝達は、Ｔ細胞上のＣＡＲへの抗原決定基の結合時に活性化される。本発明に関連して、抗原結合部分は、抗体及びその断片並びに本明細書でさらに規定されるような抗原結合受容体（例えばＣＡＲ）及びその断片に含まれ得る。抗原結合部分は、例えば免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗原結合ドメインを含む。
【００３５】
本発明に関連して、用語「抗原結合受容体」とは、固定膜貫通ドメインと、少なくとも一つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含む分子に関する。抗原結合受容体（例えばＣＡＲ）は、異なる源からのポリペプチド部分から作製することができる。したがって、抗原結合受容体は、「融合タンパク質」及び／又は「キメラタンパク質」としても理解され得る。通常、融合タンパク質は、別個のタンパク質について元来コードされた二つ以上の遺伝子（又は好ましくはｃＤＮＡ）の結合を通じて作成される。この融合遺伝子（又は融合ｃＤＮＡ）の翻訳は、好ましくは元来のタンパク質のそれぞれに由来する機能特性を有する、単一ポリペプチドをもたらす。組み換え融合タンパク質は、それらは、生物学的研究又は治療に使用するための組み換えＤＮＡ技術によって人工的に作成される。本発明に関連して、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）は、それ自体が例えばＣＤ３ｚ及びＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインに融合した固定膜貫通ドメインにスペーサー配列により融合した抗原結合部分を含む細胞外部分を含む抗原結合受容体であると理解される。
【００３６】
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を提供する抗原結合分子の部位、即ち、一又は複数のアミノ酸残基を指す。天然免疫グロブリン分子は、一般に二つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ又はｓｃＦｖ分子は一般に単一の抗原結合部位を有する。
【００３７】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、且つ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む抗体又は抗原結合受容体（例えばＣＡＲ）の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、一又は複数の免疫グロブリン可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）により提供され得る。特に、抗原結合ドメインは、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）及び免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００３８】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原の結合に関与する免疫グロブリン重鎖又は軽鎖のドメインを指す。通常、天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ、ＶＬ）は、一般的に類似の構造を有し、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）備える。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co, page 91 (2007)を参照のこと。抗原結合特異性を付与するには、通常、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分である。
【００３９】
本明細書で使用される場合の用語「ＡＴＤ」は、細胞の細胞膜に組み込むことができるポリペプチドストレッチを規定する「固定膜貫通ドメイン」を指す。ＡＴＤは、さらなる細胞外及び／又は細胞内ポリペプチドドメインに融合されることができ、これらの細胞外及び／又は細胞内ポリペプチドドメインは、同様に細胞膜に限定されることになる。本発明で使用されるような抗原結合受容体に関連して、ＡＴＤは、膜結合、及び抗原結合受容体、例えば、本発明に従って使用されるＣＡＲの制限を付与する。
【００４０】
本発明に従って使用される抗原結合受容体（例えばＣＡＲ）に関連して使用されるような用語「〜に結合」は、「抗原−相互作用−部位」及び抗原の互いとの結合（相互作用）を規定する。用語「抗原−相互作用−部位」は、特定の抗原又は抗原の特定の基との特異的な相互作用の能力を示すポリペプチドのモチーフを規定する。前記結合／相互作用は、「特異的認識」を規定するとも理解される。用語「特異的に認識する」とは、本発明に従って、抗原結合受容体が、認識ドメイン、即ち本明細書で規定される修飾分子と特異的に相互作用することができる且つ／又は該修飾分子に結合することができるのに対し、非修飾分子は認識されないことを意味する。抗原結合受容体（例えばＣＡＲ）の抗原結合部分は、同じ分子上の異なるエピトープを認識し、それと相互作用し且つ／又はそれに結合することができる。この用語は、抗原結合受容体の特異性、即ち、本明細書で規定されるように、修飾分子、即ち修飾Ｆｃドメインの特定の領域間を区別するその能力に関する。抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用は、例えば、抗原を含むポリペプチドの立体配座構造の変化の誘導、抗原を含むポリペプチドのオリゴマー化、抗原結合受容体のオリゴマー化などにより、シグナルの開始をもたらし得る。よって、抗原−相互作用−部位及び抗原のアミノ酸配列における特定のモチーフは、それらの一次、二次又は三次構造の結果として、並びに前記構造の二次修飾の結果として、互いに結合する。結合するという用語は、直鎖状エピトープに関係するだけでなく、立体配座構造エピトープ、構造エピトープ、又は標的分子の２つの領域若しくはその一部からなる不連続エピトープにも関係し得る。本発明に関連して、立体配座構造エピトープは、ポリペプチドが天然タンパク質に折りたたまれたときに分子の表面に集まる一次配列で分離された２つ以上の別個のアミノ酸配列によって規定される（Sela, Science 166 (1969), 1365及びLaver, Cell 61 (1990), 553-536）。さらに、用語「〜に結合する」は、本発明に関連して、用語「〜と相互作用する」と区別せずに使用される。ＣＡＲ又は抗体の抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ又はｓｃＦｖドメイン）の特定の標的抗原決定基への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えばＢＩＡｃｏｒｅ計器上での解析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)）、及び古典的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002））により測定することができる。一実施態様では、抗原結合部分の無関係なタンパク質への結合の程度は、特にＳＰＲによって測定した場合、標的抗原結合部分の標的抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、標的抗原に結合する抗原結合部分は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。本発明に従って使用される場合の用語「特異的結合」とは、本発明に使用される分子が、類似の構造の（ポリ）ペプチドと、即ち非修飾Ｆｃドメインと交差反応しないか、又は本質的に交��反応しないことを意味する。したがって、本発明に従って使用される抗原結合受容体（例えばＣＡＲ）は、認識ドメイン、例えばＦｃドメイン、好ましくは修飾Ｆｃドメインに特異的に結合し／それと相互作用する。調査中のコンストラクトのパネルの交差反応性は、例えば、従来の条件下での（例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)及びUsing Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1999)を参照）抗原結合部分のパネルの対象の認識ドメイン、例えば修飾Ｆｃドメインへ、及び親非修飾Ｆｃドメインへの結合を評価することにより試験され得る。対象のドメインに結合するが、構造的に密接に関連するドメイン、例えば非修飾Ｆｃドメインには結合しないか、又は本質的に結合しないコンストラクト（即ち、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖｓなど）のみが、対象の認識ドメインに特異的であると考慮され、本明細書で提供される方法に従ったさらなる研究のために選択される。これらの方法は、とりわけ、構造的及び／又は機能的に密接に関連するドメインとの結合研究、遮断及び競合研究を含み得る結合研究はまた、ＦＡＣＳ分析、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）を使用）、分析用超遠心、等温滴定熱量測定、蛍光異方性、蛍光分光法、又は放射性標識リガンド結合アッセイも含む。
【００４１】
本明細書で用いられる場合の用語「ＣＤＲ」は、「相補性決定領域」に関し、これは当該技術分野でよく知られる。ＣＤＲは、前記分子の特異性を決定し、特定のリガンドと接触する免疫グロブリン又は抗原結合受容体の一部である。ＣＤＲは分子の最も変化しやすい部分であり、これらの分子の抗原結合の多様性に寄与する。各Ｖドメインには、三つのＣＤＲ領域、ＣＤＲ１，  ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が存在する。ＣＤＲ−Ｈは、可変重鎖のＣＤＲ領域を示し、ＣＤＲ−Ｌは、可変軽鎖のＣＤＲ領域に関する。ＶＨは可変重鎖を意味し、ＶＬは可変軽鎖を意味する。Ｉｇ由来領域のＣＤＲ領域は、「Ｋａｂａｔ」  （Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit. NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services (1991); Chothia J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917)又は「Chothia」 (Nature 342 (1989), 877-883）に記載されるように決定され得る。
【００４２】
用語「ＣＤ３ｚ」とは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖を指し、「Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖」及び「ＣＤ２４７」としても知られる。
【００４３】
用語「キメラ抗原受容体」又は「キメラ受容体」又は「ＣＡＲ」は、スペーサー配列によって細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ｚ及びＣＤ２８のもの）に融合された抗原結合部分（例えば、ｓｃＦｖ又はＦａｂ）の細胞外部分から構成される抗原結合受容体を指す。
【００４４】
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体の五つの主要なクラス、即ちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００４５】
「クロスオーバーＦａｂ分子」（「ＣｒｏｓｓＦａｂ」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」とも表記される）は、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域が交換されているＦａｂ分子を意味し、即ち、ｃｒｏｓｓＦａｂ断片は、軽鎖可変領域と重鎖定常領域からなるペプチド鎖、及び重鎖可変領域と軽鎖定常領域からなるペプチド鎖を含んでいる。明瞭には、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変領域が交換されているｃｒｏｓｓＦａｂ断片において、重鎖定常領域を含むペプチド鎖を、本明細書ではクロスオーバーＦａｂ分子の重鎖と呼ぶ。逆に、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の定常領域が交換されているｃｒｏｓｓＦａｂ断片では、重鎖可変領域を含むペプチド鎖を、本明細書ではｃｒｏｓｓＦａｂ断片の重鎖と呼ぶ。したがって、ｃｒｏｓｓＦａｂ断片は、重鎖可変領域及び軽鎖定常領域（ＶＨ−ＣＬ）で構成される重鎖又は軽鎖と、軽鎖可変領域及び重鎖定常領域（ＶＬ−ＣＨ１）で構成される重鎖又は軽鎖を含む。これに対して、「Ｆａｂ」又は「従来のＦａｂ分子」とは、その天然フォーマットにおけるＦａｂ分子、即ち重鎖可変領域と定常領域（ＶＨ−ＣＨ１）で構成される重鎖、及び軽鎖可変領域と定常領域（ＶＬ−ＣＬ）で構成される軽鎖を含むＦａｂ分子を意味する。
【００４６】
本明細書で使用される場合の用語「ＣＳＤ」は、共刺激シグナル伝達ドメインを指す。
【００４７】
用語「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因しうる生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）；サイトカイン分泌；抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞の活性化が含まれる。
【００４８】
本明細書において使用される「改変する」、「改変された」、「改変」の用語は、ペプチド骨格のいずれかの操作、又は天然に存在するポリペプチド若しくは組み換えポリペプチド若しくはその断片の翻訳後修飾を含むと考慮される。改変には、アミノ酸配列、グリコシル化パターン、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾と、このような手法の組み合わせが含まれる。
【００４９】
用語「発現カセット」とは、標的細胞内の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸要素を用いて、組み換え又は合成により生成されたポリヌクレオチドを指す。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス又は核酸断片に組み込むことができる。発現ベクターの組換え発現カセット部分には、数ある配列の中でも特に、転写される核酸配列及びプロモーターが典型的に含まれる。
【００５０】
「Ｆａｂ分子」は、抗原結合分子の重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨ及びＣＨ１ドメインと軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬ及びＣＬドメインとからなるタンパク質を指す。
【００５１】
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は多少変動するが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６から又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までと定義される。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在してなくともよい。本明細書において別段の定めがない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載の「ＥＵ番号付け」システム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。ここで使用されるＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する二つのポリペプチドのうちの一つ、即ち安定した自己会合が可能な、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧＦｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３定常ドメインを含む。
【００５２】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は一般に、ＶＨ（又はＶＬ）の次の配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４に現れる。
【００５３】
用語「完全長抗体」は、二つの「完全長抗体重鎖」及び二つの「完全長抗体軽鎖」からなる抗体を意味する。「完全長抗体重鎖」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）；及びサブクラスＩｇＥの抗体の場合は任意選択的に抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）のＮ末端からＣ末端方向（ＶＨ−ＣＨ１−ＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３と略される）からなるポリペプチドである。好ましくは、「完全長抗体重鎖」は、ＶＨ、ＣＨ１、ＨＲ、ＣＨ２及びＣＨ３のＮ末端からＣ末端方向からなるポリペプチドである。「完全長抗体軽鎖」は、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）のＮ末端からＣ末端（ＶＬ−ＣＬと略される）からなるポリペプチドである。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、κ（カッパ）又はλ（ラムダ）であり得る。二つの完全長抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメイン間、及び完全長抗体重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合を介して一緒に結合される。典型的な完全長抗体の例は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥのような天然抗体である。本発明に従って使用される完全長抗体は、単一の種、例えば、ヒト由来であり得るか、又はそれらはキメラ化若しくはヒト化抗体であり得る。いくつかの実施態様では、本発明に従って使用される完全長抗体は、二つの抗原結合部位を含み、そのそれぞれは、同じ抗原にどちらも特異的に結合するＶＨとＶＬの対により形成される。さらなる実施態様では、本発明に従って使用される完全長抗体は、二つの抗原結合部位を含み、そのそれぞれはＶＨとＶＬの対により形成され、二つの抗原結合部位は、異なる抗原に結合する、例えば抗体は二重特異性である。前記完全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端は、前記重鎖又は軽鎖のＣ末端の最後のアミノ酸を意味する。
【００５４】
「融合した」とは、成分同士（例えばＦａｂ分子及び膜貫通ドメイン）が、ペプチド結合により、直接又は一つ又は複数のペプチドリンカーを介して結合されていることを意味する。
【００５５】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含量が親細胞と完全に同じでなくてもよく、突然変異を含んでもよい。本明細書には、最初に形質転換された細胞でスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する突然変異子孫が含まれる。宿主細胞は、本発明に従って使用される抗体を生成するのに使用できる任意の種類の細胞系である。宿主細胞は、培養細胞、例えばいくつか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞といった哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含み、さらには、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞を含む。
【００５６】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨに三つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに三つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、計六つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性を有し、及び／又は抗原認識に関与している。ＶＨのＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に言及して本明細書では区別せずに使用される。このような特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) and by Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)に記載されており、その定義には、互いに比較されたときのアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それでも、抗体及び／又は抗原結合受容体又はその変異体のＣＤＲに言及するためにいずれかの定義が適用される場合、本明細書において定義及び使用される用語の範囲に含まれることが意図されている。上記引用文献の各々により定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表１に明記する。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変化するであろう。当業者であれば、抗体の可変領域アミノ酸配列を前提に、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを慣用的に決定することができる。
【００５７】
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１表１ＣＤＲ定義の番号付けは全て、Ｋａｂａｔらが定めた番号付け規則に従っている（以下参照）。
２表１で使用されている、「ｂ」が小文字の「ＡｂＭ」は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒの「ＡｂＭ」抗体モデリングソフトウエアによって定義されているＣＤＲを指す。
【００５８】
Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者であれば、配列自体を超える実験データに頼らなくとも、この「Ｋａｂａｔ番号付け」のシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。「Ｋａｂａｔ番号付け」は、本明細書で使用される場合、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequence of Proteins of Immunological Interest」 (1983)によって定められた番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗原結合部分可変領域における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従っている。配列リストのポリペプチド配列は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされていない。しかしながら、配列リストの番号付けをＫａｂａｔ番号付けに変換することは、当技術分野の一般的な技術範囲内である。
【００５９】
「個体」又は「被験者」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
【００６０】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意図する。例えばベクターに含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持されている組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外に、又は天然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの本発明のＲＮＡ転写物、並びにポジティブ及びネガティブな鎖形式、及び二重鎖形式を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、さらに、合成により生成されたそのような分子を含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターといった調節要素を含んでも含まなくてもよい。
【００６１】
本発明の参照ヌクレオチド配列と、例えば、少なくとも９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点突然変異を含み得ること以外は、参照配列と同一であることを意味する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが削除されるか又は別のヌクレオチドで置換されてもよく、或いは参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてよい。参照配列のこのような変更は、参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置で、又はこれら末端位置の間のどの位置で起こってもよく、参照配列中の残基間に個々に散在してもよいし、又は参照配列内に１つ若しくは複数の連続した群として散在してもよい。実際問題として、特定のポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）などの既知のコンピュータプログラムを用いて慣例的に判定することができる。
【００６２】
「単離された」ポリペプチド若しくは変異体、又はその誘導体は、その自然の環境にない目的のポリペプチドである。特定のレベルの精製は必要でない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然又は自然の環境から除去することができる。宿主細胞に発現される、組み換えにより生成されたポリペプチド及びタンパク質を、任意の適切な技術により分離、画分化、又は部分的若しくは実質的に精製された天然又は組み換えポリペプチドのように、本発明のために単離することが考慮される。
【００６３】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２は、ジェネンテック社（South San Francisco, California）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されて変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、所与のアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：１００×Ｘ／Ｙ；
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同マッチとしてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して、前段落で説明したように得られる。
【００６４】
用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチドに含まれるプリン及びピリミジン塩基を含む塩基の配列に関するものであり、それにより、前記塩基は、核酸分子の一次構造を表す。本明細書では、核酸分子という用語は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、合成形態のＤＮＡ、及びこれらの分子の二つ以上を含む混合ポリマーを含む。さらに、核酸分子という用語は、センス鎖とアンチセンス鎖の両方を含む。さらに、本明細書に記載される核酸分子は、当業者により容易に理解されるように、非天然又は誘導体化ヌクレオチド塩基を含み得る。
【００６５】
本明細書で使用される場合の「ＮＦＡＴ」は、活性化Ｔ細胞の各因子を指し、ほとんどの免疫細胞に発現する転写因子のファミリーである。ＮＦＡＴファミリーの転写因子の活性化は、カルシウムシグナル伝達に依拠する。一例として、Ｔ細胞シナプスを通じたＴ細胞活性化は、カルシウム流入をもたらす。細胞内カルシウムレベルの増加は、ＮＦＡＴタンパク質のアミノ末端のセリンリッチ領域（ＳＲＲ）及びＳＰリピートを迅速に脱リン酸化するカルシウム感受性ホスファターゼ、カルシニューリンを活性化する。これは、ＮＦＡＴ核の輸入及び標的遺伝子の活性化を促進する核局在化シグナルを曝露する構造変化をもたらす。
【００６６】
本明細書で使用される場合の「ＮＦＡＴ経路」とは、転写因子のＮＦＡＴファミリーメンバーの活性の調節につながる刺激を指す。ＮＦＡＴ  ＤＮＡ要素は、当該技術分野で知られており、本明細書では「ＮＦＡＴ経路の応答エレメント」とも称する。よって、「ＮＦＡＴ経路の受容体」とは、ＮＦＡＴの活性の調節を引き起こすことができる受容体を指す。「ＮＦＡＴ経路の受容体」の例は、例えば、Ｔ細胞受容体及びＢ細胞受容体である。
【００６７】
本明細書で使用される場合の「ＮＦ−κＢ」は、「活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー」を指し、アポトーシス、ウイルス複製、腫瘍形成、様々な自己免疫疾患及び炎症反応のメディエーターをコードする多くの遺伝子の調節に関与している転写因子である。ＮＦκＢは、ほぼ全ての真核細胞に存在する。一般的に、それは抑制性のカッパＢ（ＩκＢ）タンパク質と複合体を形成するため、不活性状態でサイトゾルに存在する。リガンドの内在性膜受容体（「ＮＦ−κＢ経路の受容体とも称される）への結合を通じて、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）が活性化される。ＩＫＫは、二つのキナーゼと一つの調節サブユニットからなる酵素複合体である。この複合体はＩκＢタンパク質をリン酸化し、これはユビキチン化につながり、したがって、プロテアソームによるこれらのタンパク質の分解につながる。そして、遊離ＮＦκＢは活性状態にあり、核に移動し、κＢ  ＤＮＡ要素に結合して、標的遺伝子の転写を誘導する。
【００６８】
本明細書で使用される場合の「ＮＦ−κＢ経路」とは、ＮＦ−κＢの活性の調節につながる刺激を指す。例えば、Ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達、ＴＮＦ受容体シグナル伝達、Ｔ細胞受容体及びＢ細胞受容体シグナル伝達は、リガンド又は抗体の結合を通じて、ＮＦ−κＢの活性化をもたらす。続いて、リン酸化ＮＦ−κＢ二量体は、κＢ  ＤＮＡ要素に結合し、標的遺伝子の転写を誘導する。κＢ  ＤＮＡ要素は、当該技術分野で知られており、本明細書では「ＮＦ−κＢ経路の応答エレメント」とも称する。よって、「ＮＦ−κＢ経路の受容体」とは、ＮＦ−κＢの活性の調節を引き起こすことができる受容体を指す。「ＮＦ−κＢ経路の受容体」の例は、Ｔｏｌｌ様受容体、ＴＮＦ受容体、Ｔ細胞受容体及びＢ細胞受容体である。
【００６９】
本明細書で使用される場合の「ＡＰ−１」は、「活性化タンパク質１」を指し、分化、増殖、及びアポトーシスを含む多くの細胞プロセスに関与する転写因子である。ＡＰ−１の機能は、ＡＰ−１二量体に寄与する特定のＦｏｓ及びＪｕｎサブユニットに依拠する。ＡＰ−１は、パリンドロームＤＮＡモチーフ（５’−ＴＧＡ  Ｇ／Ｃ  ＴＣＡ−３’）に結合して、遺伝子発現を調節する。
【００７０】
用語「薬学的組成物」とは、中に含まれる活性成分の生物活性が有効になるような形態の調製物であり、且つ、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含まない調製物を指す。薬学的組成物は、通常、一又は複数の薬学的に許容される担体を含む。
【００７１】
「薬学的に許容される担体」は、薬学的組成物中の有効成分以外の成分で、対象に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容される担体には、限定されないが、バッファー、賦形剤、安定剤又は保存剤が含まれる。
【００７２】
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、アミノ結合（ペプチド結合としても知られる）により線形に結合したモノマー（アミノ酸）からなる分子を指す。用語「ポリペプチド」は、二以上のアミノ酸の任意の鎖を指すのであって、特異的な長さの生成物を指すのではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、アミノ酸鎖、又は二つ以上のアミノ酸の鎖を指す他のいずれの用語もポリペプチドの定義に含まれ、用語ポリペプチドは、これら用語のいずれかの代わりに、又はいずれかと区別せずに、使用することができる。用語ポリペプチドは、ポリペプチドの発現後修飾の成果を指すことも意図しており、このような成果には、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解的切断、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾が含まれる。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から得られるか、又は組み換え技術により生成されるが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるものではない。ポリペプチドは、化学合成を含むあらゆる手法で生成されてよい。本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１０００以上、又は２０００以上の大きさのアミノ酸からなってよい。ポリペプチドは、規定された三次元構造を有することができるが、必ずしもそのような構造を有するものではない。既定の三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれていると言われ、既定の三次元構造を有さず、多数の異なる形態をとりうるポリペプチドは折り畳まれていないと言われる。
【００７３】
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的な結合（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。用語核酸分子は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の一又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【００７４】
用語「内部蛍光を有するタンパク質」とは、タンパク質内の内部アミノ酸の環化及び酸化を通じて、又は蛍光補因子の酵素的付加を介して、高度に蛍光性の固有の発色団を形成することができるタンパク質を指す。用語「内部蛍光を有するタンパク質」は、変化したスペクトル特性又は物理的特性を示す野生型蛍光タンパク質及び変異体を含む。この用語は、タンパク質内の非修飾チロシン、トリプトファン、ヒスチジン及びフェニルアラニン基の蛍光寄与のみによって弱い蛍光を示すタンパク質は含まない。内部蛍光を有するタンパク質当該技術分野で知られており、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（BFP, Heim et al. 1994, 1996）、ＣＦＰとして知られるシアン蛍光変異体（Heim et al. 1996; Tsien 1998）；ＹＦＰとして知られる黄色蛍光変異体（Ormo et al. 1996; Wachter et al. 1998）；サファイア（Ｓａｐｐｈｉｒｅ）として知られるバイオレット励起可能な緑色蛍光変異体（Tsien 1998; Zapata-Hommer et al. 2003）；及び高感度緑色蛍光タンパク質又はＥＧＦＰとして知られるシアン励起可能な緑色蛍光変異体（Yang et al. 1996）があり、それらは、生細胞画像化（例えばＩｎｃｕｃｙｔｅ）又は蛍光分光法によって測定することができる。
【００７５】
「結合の低減」は、例えばＳＰＲによって測定した場合の、それぞれの相互作用に対する親和性の低下を指す。明確には、この用語は、親和性のゼロ（又は分析方法の検出限界未満）への低下、即ち相互作用の完全な廃止も含む。逆に、「結合の増大」は、それぞれの相互作用に対する結合親和性の上昇を指す。
【００７６】
「調節配列」という用語は、それらが結合されているコード配列の発現をもたらすために必要なＤＮＡ配列を指す。そのような制御配列の性質は、有機体に応じて異なる。原核生物では、制御配列は、一般的に、プロモーター、リボソーム結合部位、及びターミネーターを含む。真核生物では、一般的に、制御配列は、プロモーター、ターミネーター、及び場合によっては、エンハンサー、トランス活性化因子又は転写因子を含む。「制御配列」という用語は、少なくとも、その存在が発現に必要である全ての成分を含むことを意図しており、追加の有利な成分も含み得る。
【００７７】
本明細書で使用される場合の「レポーター遺伝子」とは、その発現をアッセイすることができる遺伝子を意味する。好ましい一実施態様では、「レポーター遺伝子」は、タンパク質をコードする遺伝子であり、その生成と検出は、試験される抗体又はリガンドの活性を間接的に検出するための代理として使用される。レポータータンパク質は、レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質である。好ましくは、レポーター遺伝子は簡単なアッセイ法によって触媒活性が検出され得る酵素、又は固有の蛍光若しくは発光などの性質を有するタンパク質をコードするため、レポーター遺伝子の発現は、最小限の試料の前処理が必要な簡単且つ迅速なアッセイで検出することができる。触媒活性が検出され得る酵素の非制限的な例には、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼが含まれる。ルシフェラーゼは、６１ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する単量体酵素である。ルシフェラーゼは、触媒として機能し、アデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）及びＭｇ２＋の存在下で、Ｄ−ルシフェリンをルシフェリルアデニレートに変換することができる。さらに、ピロホスフェート（ＰＰｉ）及びアデノシンモノホスフェート（ＡＭＰ）が副生成物として生成される。その後、中間体ルシフェリルアデニレートは酸化してオキシルシフェリン、二酸化炭素（ＣＯ２）及び光になる。オキシルシフェリンは、反応から放出される光によってルミノメーターで定量的に測定され得る生物発光生成物である。ルシフェラーゼレポーターアッセイは、市販され、当該技術分野で知られており、例えば、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １０００  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ及びＯＮＥ−ＧｌｏＴＭ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍがある。
【００７８】
「応答エレメント」とは、特定の転写因子結合エレメント、又は特定の転写因子の結合時に活性化若しくはサイレンシングされ得るシス作用エレメントを指す。一実施態様では、応答エレメントは、転写因子結合時にレポーター遺伝子の発現を引き起こす最小プロモーター（例えばＴＡＴＡボックスプロモーター）の上流に位置するシス作用エンハンサーエレメントである。
【００７９】
本明細書において使用される用語「単鎖」は、ペプチド結合により線形に結合したアミノ酸モノマーを含む分子を指す。特定の実施態様では、抗原結合部分の一つは、Ｆｖ断片、即ちペプチドリンカーによって結合されたＶＨドメイン及びＶＬドメインである。特定の実施態様では、抗原結合部分の一つは、単鎖Ｆａｂ分子、即ちＦａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖がペプチドリンカーにより結合されて一本のペプチド鎖を形成しているＦａｂ分子である。このような特定の一実施態様では、単鎖Ｆａｂ分子においてＦａｂ軽鎖のＣ末端がＦａｂ重鎖のＮ末端に結合している。
【００８０】
本明細書で使用される場合の用語「ＳＳＤ」は、刺激シグナル伝達ドメインを指す。
【００８１】
本明細書において用いられる場合、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などの文法的変形）は、治療されている個体の疾病の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために又は臨床病理の過程において実行できる。治療の望ましい作用には、限定されないが、疾患の発生又は再発の防止、症候の緩和、疾患のいずれかの直接的又は間接的病理学的帰結の縮小、転移の防止、疾患進行速度の低下、病態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。
【００８２】
本発明に関連して、用語「タグ」とは、タンパク質などの生体分子、特に抗原結合分子に結合又は生着した分子を指す。タグの機能は、タグに結合することができるがタグ化されていないタンパク質には結合することができない特定の抗原結合部分によって認識され得るように、「タグ化」タンパク質（例えば、免疫グロブリン又はその断片）をマーク又は標識するものである。この用語は、「分子タグ」と同義であり、限定されないが、蛍光タグ、タンパク質タグ、親和性タグ、可溶化タグ、クロマトグラフィータグ、エピトープタグ及び小分子タグ、例えばハプテンタグを含む。小分子タグ、例えばハプテンは、生体分子に化学的に共有結合することができるか又は非共有結合することができるのに対し、「タンパク質タグ」又は「ポリペプチドタグ」は、タンパク質に遺伝的にグラフトされ、続いて、タグに結合することはできるがタグ化されていないタンパク質には結合することができない特定の抗原結合分子により認識され得るペプチド配列である。ハプテンタグは、担体タンパク質に結合すると免疫応答を誘発し得るため、タンパク質などの担体上のタグを認識できる特定の抗原結合部分を生成するのに適している。本発明の好ましい実施態様では、タグはハプテンタグ又はポリペプチドタグである。
【００８３】
本明細書で使用される場合の用語「標的抗原決定基」は、「標的抗原」、「標的エピトープ」、及び「標的細胞抗原」と同義であり、抗体が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的広がり又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス−感染細胞の表面上に、その他の病気の細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中に遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に、見出すことができる。特に断らない限り、本明細書において抗原と呼ばれるタンパク質（例えば、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ２、ＬｅＹ、ＭＣＳＰ、ＳＴＥＡＰ１、ＴＹＲＰ、及びＷＴ１）は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型を指す。特定の実施態様では、標的抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定の標的タンパク質が言及される場合、その用語は、「完全長」、未処理の標的タンパク質だけではなく、細胞内でのプロセシングから生じる任意の型の標的タンパク質を包含する。その用語はまた、天然に存在する標的タンパク質の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。抗原として有用な例示的なヒト標的タンパク質には、限定されないが：ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ２、ＬｅＹ、ＭＣＳＰ、ＳＴＥＡＰ１、ＴＹＲＰ、及びＷＴ１が含まれる。
【００８４】
抗体は、１、２、３又はそれ以上の結合ドメインを有し、単一特異性、二重特異性又は多重特異性であり得る。抗体は、単一種からの完全長であり得るか、又はキメラ若しくはヒト化され得る。２より多くの抗原結合ドメインを有する抗体について、いくつかの結合ドメインは同一であってもよく、且つ／又は同じ特異性を有してもよい。
【００８５】
ここで使用される「Ｔ細胞活性化」は：増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現より選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の一つ又は複数の細胞応答を指す。Ｔ細胞活性化を測定するための適切なアッセイは、当技術分野で既知であり、ここに記載される。
【００８６】
本発明によれば、用語「Ｔ細胞受容体」又は「ＴＣＲ」は、一般的に当該技術分野で知られている。特に、本明細書では、用語「Ｔ細胞受容体」は、以下の三つの基準が満たされることを条件として、任意のＴ細胞受容体を指す：（ｉ）腫瘍特異性、（ｉｉ）（大部分の）腫瘍細胞の認識、これは、抗原又は標的が（大部分の）腫瘍細胞に発現すべきであることを意味する、及び（ｉｉｉ）ＴＣＲが、治療される対象のＨＬＡ型に合致すること。これに関連して、上記の三つの基準を満たす適切なＴ細胞受容体は、当該技術分野で知られており、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１（配列情報については、例えばＰＣＴ／ＧＢ２００５／００１９２４を参照）及び／又はＨＥＲ２ｎｅｕ（配列情報については、ＷＯ−Ａ１  ２０１１／０２８０８９４を参照）を認識する受容体などがある。主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子は、内因性抗原からＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞にペプチドを提示するため、ＭＨＣ−ペプチド複合体は、免疫療法アプローチの適切な標的である。ＭＨＣ−ペプチド複合体は、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）により標的にされ得る。しかし、ＴＣＲ特異性を有する高親和性結合部分が有益であるのに対して、ほとんどのＴＣＲは免疫療法には低すぎる親和性を有する場合がある。この目的について、例えば、ファージディスプレイライブラリー（例えば、コンビナトリアルライブラリー）を生成し、本明細書でさらに説明するようにそのようなライブラリーをスクリーニングすることによって、ＴＣＲ様特異性を有する高親和性可溶性抗体分子を生成することができる。本明細書に記載されるようなＴＣＲ様特異性を有するこれらの可溶性抗原結合部分、例えばｓｃＦｖ又はＦａｂは、「Ｔ細胞受容体様抗原結合部分」又は「ＴＣＲＬ抗原結合部分」と称される。
【００８７】
薬剤、例えば薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を得るのに必要な用量及び期間での有効な量を指す。薬剤の治療的有効量は、疾患の有害作用を、例えば排除し、低下させ、遅延させ、最小化し、又は防止する。
【００８８】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現コンストラクト」と同義であり、ＤＮＡ分子であって、それが標的細胞内において作動可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入し、指示するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造物としてのベクター、及び導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞転写及び／又は翻訳機構によって生成される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の抗原結合受容体をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【００８９】
これに関連して、本明細書では、特に標的細胞への接触時のレポーター細胞（例えばＴ細胞）の活性化に関する、新規の標的抗原結合分子をそれらの特異性によるさらなる開発のために選択するための方法、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法が提供される。本明細書に記載される方法及びアッセイでは、標的抗原結合部分は、標的細胞、特にがん細胞と、レポーター細胞、特にＴ細胞との間の接触を媒介する。これに関連して、本明細書に記載される方法は、標的、例えばがん細胞上の標的への結合、及びエフェクター細胞、例えばＴ細胞の活性化の特異性に従って、候補となる標的抗原結合部分を選択するのに有用である。
【００９０】
したがって、一実施態様では、標的抗原に特異的に結合することができる標的抗原結合部分の特異性を評価するための方法であって、以下の工程：
ａ）抗原結合ドメイン及び認識ドメインを含む抗原結合分子を提供する工程であって、抗原結合ドメインが標的抗原結合部分を含み、認識ドメインがタグを含む、抗原結合分子を提供する工程；
ｂ）抗原結合分子を、表面上に標的抗原を含む標的細胞と接触させる工程であって、標的細胞ががん細胞である、抗原分子を標的細胞と接触させる工程；
ｃ）抗原結合分子を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現レポーターＴ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞と接触させる工程であって、ＣＡＲ−Ｔ細胞が以下： 
ｉ．タグを含む認識ドメインに特異的に結合することができるＣＡＲであって、応答エレメントに作用的に結合されている、ＣＡＲ；
ｉｉ．  応答エレメントの制御下のレポーター遺伝子；
を含む、抗原結合分子をＣＡＲ−Ｔ細胞と接触させる工程；及び
ｄ）レポーター遺伝子の発現を測定することによりＴ細胞活性化を決定し、標的抗原結合部分の特異性を確立する工程
を含む方法が提供される。
【００９１】
これに関連して、本発明の方法についてさらに説明され、使用されるものは、（候補となる）標的抗原結合部分を含む抗原結合分子の認識ドメインに特異的に結合することができる抗原結合受容体（例えばＣＡＲ）である。認識ドメインは、分子タグ、例えばハプテンタグ又はポリペプチドタグによりタグ化され得るタンパク質ドメインに安定して折りたたむことができる任意のポリペプチドドメインであり得る。特定の実施態様では、認識ドメインは免疫グロブリンドメインである。免疫グロブリンは、典型的には、安定して折りたたむことができる可変及び定常領域を含み、可変領域は免疫グロブリン分子の標的抗原に対する特異性を付与する。したがって、可変ドメインは、配列変化が最も高度である免疫グロブリンの一部である。他方、定常ドメインは、同じクラスの免疫グロブリンのなかでも変化が最小である部分であるため、本発明の方法のための認識ドメインとして本発明に関連して特に適している。しかしながら、抗原結合分子のサイズを可能な限り減少させることも好ましい場合があり、そのような実施形態では、標的抗原に特異性を付与する免疫グロブリンの可変ドメインもまた、認識ドメインの機能を発揮することができ、即ち、抗原結合ドメインと認識ドメインは同じドメインであることができ、例えば、可変ドメインは、例えばハプテンタグ又はポリペプチドタグと結合することができ、あるいは、ハプテンタグはＦａｂ断片の定常領域に結合する。
【００９２】
（新規の）標的抗原結合部分を含む抗原結合分子は、好ましくは、ＩｇＧクラス抗体、特にＩｇＧ１又はＩｇＧ４アイソタイプ抗体、又はその断片である。しかしながら、抗原結合分子は、任意のクラスの免疫グロブリンであり得るか、又は標的抗原結合部分を含む抗原結合ドメイン及び認識ドメインに安定した骨格を提供することができるかぎり、他の抗原結合タンパク質であり得る。一実施態様において、抗原結合分子は、Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ  Ｆｃ領域、最も詳細にはＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む。好ましい実施態様では、抗原結合分子は、修飾Ｆｃ領域、特にＣＡＲによる特異的認識のためのタグ（例えばハプテンタグ又はポリペプチドタグ）を含むＦｃ領域を含む。そのような実施態様では、本発明に従って使用されるＣＡＲは、修飾Ｆｃ領域、即ちタグを含むＦｃ領域に特異的に結合することができる。
【００９３】
別の実施態様では、抗原結合分子は、Ｆａｂドメイン、特にＩｇＧ  Ｆａｂドメイン、最も詳細にはＩｇＧ１  Ｆａｂドメインを含む。好ましい実施態様では、抗原結合分子は、修飾Ｆａｂドメイン、特にＣＡＲによる特異的認識のためのタグ（例えばハプテンタグ又はポリペプチドタグ）を含むＦａｂドメインを含む。例示的な実施態様では、標的抗原結合部分を含む抗原結合ドメインと認識ドメインは同じドメインであり、本発明に従って使用されるＣＡＲは修飾Ｆａｂドメイン、即ちタグを含むＦａｂドメインに特異的に結合することができる。
【００９４】
本発明は、本明細書に記載されるようなレポーター系及び本明細書に記載されるようなＣＡＲ及び標的抗原結合部分及び認識ドメイン、好ましくはＦｃドメイン又はＦａｂドメイン、例えば本明細書に記載される修飾（タグ化）Ｆｃドメイン又はＦａｂ断片を含む抗原結合分子によるその標的動員と活性化を導入するための、Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、  ＣＤ３＋  Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、及び不死化細胞株、例えばＪｕｒｋａＴ細胞の形質導入及び使用をさらに記載する。一実施態様では、抗原結合分子、例えばタグ化ＩｇＧ１抗体又はタグ化Ｆａｂ断片は、標的細胞、特にがん細胞の表面に天然に存在する腫瘍特異的抗原に特異的に結合することができる。
【００９５】
標的抗原結合部分を含む抗原結合分子（例えばファージディスプレイスクリーニング由来）の標的細胞への結合時及びＣＡＲの認識ドメイン（例えば、タグ化ＩｇＧ１抗体又はタグ化Ｆａｂ断片）への結合時に、レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞は活性化され、レポーター遺伝子が発現する。したがって、レポーター遺伝子の発現は、例えば腫瘍細胞上の標的抗原に対して向けられた抗原結合分子によって誘導されるＴ細胞活性化に関連した標的抗原結合部分の（特異的）結合を示す。
【００９６】
本発明の手法は、従来の結合アッセイと比較して有意な利点を有するが、それは、本明細書に記載のＴ細胞ベースのインビトロ法が、理論に拘束されることなく、例えば、Ｔ細胞に関与する治療用抗体（例えば、Ｔ細胞二重特異性抗体）に対して又はそれとともに遭遇するｉｎ  ｖｉｖｏ状況により類似しているためである。
【００９７】
したがって、本発明は、多目的なスクリーニングプラットフォームを提供し、ここで、抗体、特に標的抗原結合部分を含むＩｇＧ型抗体は、標的細胞（例えば腫瘍細胞）を免疫細胞（例えばＴ細胞）のためのガイドとしてマーク又は標識するのに使用されてもよく、ここでＴ細胞は、標的抗原結合部分を含む抗体によって腫瘍細胞に対して特異的に標的とされる。ＣＡＲの認識ドメイン上のタグへの結合及び標的抗原結合部分の腫瘍細胞の表面上の標的抗原への結合の後、レポーターＴ細胞は活性化され、ここで活性化は、例えば蛍光又は発光シグナルの読み取りにより測定することができる。プラットフォームは、多様な新たに開発された標的抗原結合部分の使用、又は異なる抗原特異性を有するが同じ認識ドメインを含む複数の抗体の同時適用を可能にすることにより、柔軟で特異的である。
【００９８】
特定の実施態様では、標的抗原結合部分は、従来のＦａｂ断片、即ち、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖からなるＦａｂ分子である。このスクリーニングフォーマットの特定の利点は、フォーマットを変化させることのない新規ライブラリー由来の標的抗原結合部分の直接的な組み込みであり、例えば、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることに由来するＦａｂ抗原バインダーは、本明細書に記載されるようにＦａｂ及び／又はｃｒｏｓｓＦａｂ抗原結合分子免疫グロブリンフォーマットに含まれ得る。したがって、Ｆａｂディスプレイファージライブラリー由来の標的抗原結合部分は、ライブラリー由来のバインダーの結合特性に悪影響を及ぼす可能性があるフォーマットを変化させることなくスクリーニングするための抗体に含まれ得る。好ましい実施態様では、標的抗原結合部分は、Ｆａｂ断片、特にファージディスプレイライブラリースクリーニング由来のＦａｂ断片である。好ましい実施態様では、標的抗原結合部分は、Ｆａｂ断片、特にファージディスプレイライブラリースクリーニング由来のＦａｂ断片である。上に示したように、そのような実施態様は、バインダー（Ｆａｂ）のフォーマットが、特異性の評価にわたってＦａｂ断片（フォーマット）ファージディスプレイライブラリーから、最終的にはＴ細胞に関与する治療用抗体（例えば、Ｔ細胞二重特異性抗体）に変更される必要がないという利点を有する。
【００９９】
さらなる実施態様では、標的抗原結合部分は、ｃｒｏｓｓＦａｂ断片、つまりＦａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖からなるＦａｂ分子であり、Ｆａｂ  重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されている。
【０１００】
本発明に関連して、ＣＡＲは、Ｔ細胞中又はＴ細胞上に天然には存在しない細胞外ドメインを含む。よって、ＣＡＲは、認識ドメイン、例えば本発明に従ったスクリーニングに使用される治療用抗体フォーマットの（修飾）Ｆｃドメインに対して、適合した結合特異性を提供することができる。ＣＡＲが形質導入され、本発明に従って使用される細胞、例えばＴ細胞は、認識ドメインに特異的に結合することができるようになる。認識ドメインに対する特異性は、認識ドメインに特異的に結合することができる抗原結合部分を含むＣＡＲの細胞外ドメインにより提供される。好ましい実施態様では、認識ドメインは、断片結晶化可能（Ｆｃ）領域である。特定の実施態様では、認識ドメインは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。一実施態様において、認識ドメインはヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。さらなる実施態様では、認識ドメインは、例えばタグを含む、修飾Ｆｃドメインである。そのような実施態様では、本明細書に記載されるＣＡＲは、タグを含む認識ドメインに特異的に結合することができるが、タグを含まない認識ドメインには特異的に結合することができない。
【０１０１】
したがって、本発明は、修飾Ｆｃドメインに特異的に結合することができる少なくとも一つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含むＣＡＲの使用にも関し、ここで少なくとも一つの抗原結合部分は、非修飾Ｆｃドメインに特異的に結合することができない。そのような実施態様では、ＣＡＲは、抗原結合分子、例えば抗体の修飾  Ｆｃドメインに特異的に結合することができる。好ましい実施態様では、修飾Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインに結合したタグ、例えばハプテンタグ、又はＦｃドメインに含まれるタンパク質タグを含む。
【０１０２】
ＣＡＲは、タグを含む修飾免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるが、タグを含まない非修飾親免疫グロブリンドメインには特異的に結合することができず、ここで修飾は、ハプテンタグ又はポリペプチドタグの導入である。
【０１０３】
本発明の一態様では、修飾免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができる少なくとも一つの抗原結合部分を含むＣＡＲの使用が本明細書で提供される。そのようなＣＡＲを発現する形質導入細胞、例えばＴ細胞は、抗原結合分子、即ち、治療用抗体の、修飾免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができる。とりわけ、本発明は、治療的に有意義な抗原結合分子フォーマットにおける新規の標的抗原結合部分の特異性を評価するための直接的なスクリーニングプラットフォームを提供する。本発明による方法は、既知又は潜在的なエフェクター細胞の活性化カスケードの関連する細胞及び分子成分をハイスループットアッセイフォーマットで組み込む。
【０１０４】
標的抗原、例えば、腫瘍抗原、又は認識ドメイン、例えば修飾Ｆｃドメインに特異的に結合することができる抗原結合部分は、例えば、哺乳動物免疫系の免疫付与により生成され得る。そのような方法は、当該技術分野で知られており、例えばBurns in Methods in Molecular Biology 295:1-12 (2005)に記載されている。あるいは、所望の活性の抗原結合部分は、所望の活性（複数可）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための方法は、例えば、Lerner et al. in Nature Reviews 16:498-508 (2016)に概説がある。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作成して所望の結合特性を有する抗原結合部分の当該ライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Frenzel et al. in mAbs 8:1177-1194 (2016); Bazan et al. in Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828 (2012)及びZhao et al. in Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289 (2016)並びにHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)で総説されており、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)及びMarks and Bradbury in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)でさらに記載されている。特定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングし、ファージライブラリーにランダムに再結合させ、その後、Winter et al. in Annual Review of Immunology 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは通常、抗体断片を、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片のいずれかとして表示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に対する高アフィニティー抗原結合分子を提供する。あるいは、Griffiths et al. in EMBO Journal 12: 725-734 (1993)に記載されるように、ナイーブなレパートリーを、いかなる免疫感作も無く、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対し、抗原結合部分の単一起源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローニングすることができる。最後に、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)によって記載されているように、幹細胞由来の再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを用いて可変性に富むＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再配列を達成することにより、ナイーブライブラリーを合成的に作成することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーについて記載している特許公開には、例えば：米国特許第５７５０３７３号；同第７９８５８４０号；同第７７８５９０３号及び同第８６７９４９０号、並びに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号及び同第���００９／０００２３６０号が含まれる。コンビナトリアルライブラリーを一又は複数の所望の活性を有する抗原結合部分についてスクリーニングするための当技術分野で既知の方法のさらなる例には、リボソーム及びｍＲＮＡディスプレイ、並びに細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は酵母細胞での抗体のディスプレイ及び選択のための方法が含まれる。酵母表面ディスプレイのための方法は、例えばScholler et al., Methods in Molecular Biology 503:135-56 (2012)及びCherf et al., Methods in Molecular biology 1319:155-175 (2015)、及びZhao et al., Methods in Molecular Biology 889:73-84 (2012)に総説されている。リボソームディスプレイのための方法は、例えばHe et al., Nucleic Acids Research 25:5132-5134 (1997)及びHanes et al.,  PNAS 94:4937-4942 (1997)に記載されている。
【０１０５】
本発明の例示的な実施態様では、概念実証として、少なくとも一つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含むＣＡＲが提供され、ここで少なくとも一つの抗原結合部分は、修飾免疫グロブリンドメイン（例えば、Ｆｃドメイン又はＦａｂドメイン）に特異的に結合することができるが、非修飾免疫グロブリンドメインには特異的に結合することができず、修飾免疫グロブリンドメインはハプテンタグ又はポリペプチドタグを含む。
【０１０６】
本発明の例示的な実施態様では、概念実証として、ハプテンタグジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を含む修飾免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲが提供される。
【０１０７】
一実施態様では、ハプテンタグＤＩＧを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号１、配列番号２及び配列番号３の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号４、配列番号５及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１０８】
好ましい一実施態様では、ハプテンタグＤＩＧを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、以下： 
（ａ）ＤＹＡＭＳの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列（配列番号１）；
（ｂ）ＳＩＮＩＧＡＴＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧのＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列（配列番号２）；
（ｃ）ＰＧＳＰＹＥＹＤＫＡＹＹＳＭＡＹのＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列（配列番号３）；
を含む重鎖可変領域と、
以下：
（ｄ）ＲＡＳＱＤＩＫＮＹＬＮの軽鎖（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列（配列番号４）；
（ｅ）ＹＳＳＴＬＬＳのＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列（配列番号５）；及び
（ｆ）ＱＱＳＩＴＬＰＰＴのＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列（配列番号６）
を含む軽鎖可変領域と
を含む。
【０１０９】
一実施態様では、ハプテンタグＤＩＧを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号８及び配列番号３２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９及び配列番号３３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１１０】
一実施態様では、ハプテンタグＤＩＧを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号８及び配列番号３２から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９及び配列番号３３から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１１１】
一実施態様では、ハプテンタグＤＩＧを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＬ）と配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１１２】
好ましい一実施態様では、ハプテンタグＤＩＧを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１１３】
一実施態様では、少なくとも一つの抗原結合部分は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂ又はｓｃＦａｂ断片である。一実施態様では、ハプテンタグＤＩＧを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、Ｆａｂ断片を含む。好ましい実施態様では、ハプテンタグＤＩＧを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号３０の重鎖及び配列番号３１の軽鎖を含むＦａｂ断片を含む。
【０１１４】
一実施態様では、ハプテンタグＤＩＧを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであるｓｃＦＶ断片を含み、ここで前記可変ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、以下の構成：ａ）ＶＨ−リンカー−ＶＬ又はｂ）ＶＬ−リンカー−ＶＨのうちの一つを有する。好ましい実施態様では、ｓｃＦｖ断片は、ＶＨ−リンカー−ＶＬの構成を有する。
【０１１５】
好ましい実施態様では、ハプテンタグＤＩＧを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ断片を含む。
【０１１６】
本発明の別の例示的な実施態様では、概念実証として、ハプテンタグ蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を含む修飾免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲが提供される。
【０１１７】
一実施態様では、ハプテンタグＦＩＴＣを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号４２、配列番号４３及び配列番号４４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号４５、配列番号４６及び配列番号４７の軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１１８】
好ましい一実施態様では、ハプテンタグＦＩＴＣを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、以下：
（ａ）ＨＹＷＭＮの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列（配列番号４２）；
（ｂ）ＱＦＲＮＫＰＹＮＹＥＴＹＹＳＤＳＶＫＧのＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列（配列番号４３）；
（ｃ）ＡＳＹＧＭＥＹのＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列（配列番号４４）；
を含む重鎖可変領域と、
以下：
（ｄ）ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＲの軽鎖（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列（配列番号４５）；
（ｅ）ＫＶＳＮＲＶＳのＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列（配列番号４６）；及び
（ｆ）ＳＱＳＴＨＶＰＷＴのＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列（配列番号４７）
を含む軽鎖可変領域と
を含む。
【０１１９】
一実施態様では、ハプテンタグＦＩＴＣを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１２０】
一実施態様では、ハプテンタグＦＩＴＣを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１２１】
一実施態様では、少なくとも一つの抗原結合部分は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂ又はｓｃＦａｂ断片である。
【０１２２】
一実施態様では、ハプテンタグＦＩＴＣを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであるｓｃＦＶ断片を含み、ここで前記可変ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、以下の構成：ａ）ＶＨ−リンカー−ＶＬ又はｂ）ＶＬ−リンカー−ＶＨのうちの一つを有する。好ましい実施態様では、ｓｃＦｖ断片は、ＶＨ−リンカー−ＶＬの構成を有する。
【０１２３】
好ましい実施態様では、ハプテンタグＦＩＴＣを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号４９のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ断片を含む。
【０１２４】
本発明の別の例示的な実施態様では、概念実証として、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）糖タンパク質からのポリペプチドタグを含む修飾免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲが提供される。一実施態様では、ＨＡタンパク質からのポリペプチドタグは、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡのアミノ酸配列（配列番号１００）を含む。
【０１２５】
一実施態様では、ＨＡタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号５２、配列番号５３及び配列番号５４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号５５、配列番号５６及び配列番号５７の軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１２６】
好ましい一実施態様では、ＨＡタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、以下： 
（ａ）ＮＹＤＭＡの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列（配列番号５２）；
（ｂ）ＴＩＳＨＤＧＲＮＴＮＹＲＤＳＶＫＧのＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列（配列番号５３）；
（ｃ）ＰＧＦＡＨのＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列（配列番号５４）；
を含む重鎖可変領域と、
以下：
（ｄ）ＲＳＳＫＴＬＬＮＴＲＧＩＴＳＬＹの軽鎖（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列（配列番号５５）；
（ｅ）ＲＭＳＮＬＡＳのＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列（配列番号５６）；及び
（ｆ）ＡＱＦＬＥＦＰＬＴのＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列（配列番号５７）
を含む軽鎖可変領域と
を含む。
【０１２７】
一実施態様では、ＨＡタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号６０及び配列番号６５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６１及び配列番号６６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１２８】
一実施態様では、ＨＡタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号６０及び配列番号６５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６１及び配列番号６６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１２９】
一実施態様では、ＨＡタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１３０】
好ましい一実施態様では、ＨＡタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１３１】
一実施態様では、少なくとも一つの抗原結合部分は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂ又はｓｃＦａｂ断片である。一実施態様では、ＨＡタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、Ｆａｂ断片を含む。好ましい実施態様では、ＨＡタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号６３の重鎖及び配列番号６４の軽鎖を含むＦａｂ断片を含む。
【０１３２】
一実施態様では、ＨＡタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであるｓｃＦＶ断片を含み、ここで前記可変ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、以下の構成：ａ）ＶＨ−リンカー−ＶＬ又はｂ）ＶＬ−リンカー−ＶＨのうちの一つを有する。好ましい実施態様では、ｓｃＦｖ断片は、ＶＨ−リンカー−ＶＬの構成を有する。
【０１３３】
好ましい実施態様では、ＨＡタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号５９のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ断片を含む。
【０１３４】
本発明の別の例示的な実施態様では、概念実証として、ヒトｃ−ｍｙｃタンパク質からのポリペプチドタグを含む修飾免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲが提供される。一実施態様では、ヒトｃ−ｍｙｃタンパク質からのポリペプチドタグは、ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬのアミノ酸配列（配列番号１０１）を含む。
【０１３５】
一実施態様では、ｍｙｃタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号７７、配列番号７８及び配列番号７９の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号８０、配列番号８１及び配列番号８２の軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１３６】
好ましい一実施態様では、ｍｙｃタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、以下：
（ａ）ＨＹＧＭＳの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列（配列番号７７）；
（ｂ）ＴＩＧＳＲＧＴＹＴＨＹＰＤＳＶＫＧのＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列（配列番号７８）；
（ｃ）ＲＳＥＦＹＹＹＧＮＴＹＹＹＳＡＭＤＹのＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列（配列番号７９）；
を含む重鎖可変領域と、
以下：
（ｄ）ＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＦＳＦＭＮの軽鎖（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列（配列番号８０）；
（ｅ）ＡＩＳＮＲＧＳのＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列（配列番号８１）；及び
（ｆ）ＱＱＴＫＥＶＰＷＴのＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列（配列番号８２）
を含む軽鎖可変領域と
を含む。
【０１３７】
一実施態様では、ｍｙｃタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号８６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１３８】
一実施態様では、ｍｙｃタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号８６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１３９】
一実施態様では、少なくとも一つの抗原結合部分は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂ又はｓｃＦａｂ断片である。一実施態様では、ｍｙｃタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、Ｆａｂ断片を含む。好ましい実施態様では、ｍｙｃタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号８４の重鎖及び配列番号８５の軽鎖を含むＦａｂ断片を含む。
【０１４０】
一実施態様では、ｍｙｃタグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであるｓｃＦＶ断片を含み、ここで前記可変ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、以下の構成：ａ）ＶＨ−リンカー−ＶＬ又はｂ）ＶＬ−リンカー−ＶＨのうちの一つを有する。好ましい実施態様では、ｓｃＦｖ断片は、ＶＨ−リンカー−ＶＬの構成を有する。
【０１４１】
本発明の別の例示的な実施態様では、概念実証として、ハプテンタグｂビオチンを含む修飾免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲが提供される。
【０１４２】
一実施態様では、ハプテンタグビオチンを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号６７、配列番号６８及び配列番号６９の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２の軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１４３】
好ましい一実施態様では、ハプテンタグビオチンを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、以下：
（ａ）ＧＦＮＮＫＤＴＦＦＱの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列（配列番号６７）；
（ｂ）ＲＩＤＰＡＮＧＦＴＫＹＡＱＫＦＱＧのＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列（配列番号６８）；
（ｃ）ＷＤＴＹＧＡＡＷＦＡＹ  のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列（配列番号６９）；
を含む重鎖可変領域と、
以下： 
（ｄ）ＲＡＳＧＮＩＨＮＹＬＳの軽鎖（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列（配列番号７０）；
（ｅ）ＳＡＫＴＬＡＤのＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列（配列番号７１）；及び
（ｆ）ＱＨＦＷＳＳＩＹＴのＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列（配列番号７２）
を含む軽鎖可変領域と
を含む。
【０１４４】
一実施態様では、ハプテンタグビオチンを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１４５】
一実施態様では、ハプテンタグビオチンを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１４６】
一実施態様では、少なくとも一つの抗原結合部分は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂ又はｓｃＦａｂ断片である。
【０１４７】
一実施態様では、ハプテンタグビオチンを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであるｓｃＦＶ断片を含み、ここで前記可変ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、以下の構成：ａ）ＶＨ−リンカー−ＶＬ又はｂ）ＶＬ−リンカー−ＶＨのうちの一つを有する。好ましい実施態様では、ｓｃＦｖ断片は、ＶＨ−リンカー−ＶＬの構成を有する。
【０１４８】
好ましい実施態様では、ハプテンタグビオチンを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号７４のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ断片を含む。
【０１４９】
本発明の別の例示的な実施態様では、概念実証として、ヒトＧＣＮ４タンパク質からのポリペプチドタグを含む修飾免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲが提供される。一実施態様では、ヒトＧＣＮ４タンパク質からのポリペプチドタグは、ＹＨＬＥＮＥＶＡＲＬＫＫのアミノ酸配列（配列番号１０２）を含む。
【０１５０】
一実施態様では、ＧＣＮ４タグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号９０、配列番号９１及び配列番号９２の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号９３、配列番号９４及び配列番号９５の軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１５１】
好ましい一実施態様では、ＧＣＮ４タグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、以下： 
（ａ）ＤＹＧＶＮの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列（配列番号９０）；
（ｂ）ＶＩＷＧＤＧＩＴＤＨＮＳＡＬＫＳのＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列（配列番号９１）；
（ｃ）ＧＬＦＤＹのＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列（配列番号９２）；
を含む重鎖可変領域と、
以下：
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＳの軽鎖（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列（配列番号９３）；
（ｅ）ＧＴＮＮＲＡＰのＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列（配列番号９４）；及び
（ｆ）ＶＬＷＹＳＮＨＷＶのＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列（配列番号９５）
を含む軽鎖可変領域と
を含む。
【０１５２】
一実施態様では、ＧＣＮ４タグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号９８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１５３】
一実施態様では、ＧＣＮ４タグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号９８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１５４】
一実施態様では、少なくとも一つの抗原結合部分は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂ又はｓｃＦａｂ断片である。一実施態様では、ＧＣＮ４タグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、Ｆａｂ断片を含む。
【０１５５】
一実施態様では、ＧＣＮ４タグを含む免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができるＣＡＲは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであるｓｃＦＶ断片を含み、ここで前記可変ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、以下の構成：ａ）ＶＨ−リンカー−ＶＬ又はｂ）ＶＬ−リンカー−ＶＨのうちの一つを有する。好ましい実施態様では、ｓｃＦｖ断片は、ＶＬ−リンカー−ＶＨの構成を有する。
【０１５６】
Ｆａｂ及びｓｃＦａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合を介して安定化されている。本明細書に記載されるようなＦａｂ、ｃｒｏｓｓＦａｂ、ｓｃＦｖ及びｓｃＦａｂ断片などの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗原結合部分は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に鎖間ジスルフィド結合を導入することによりさらに安定化され得る。したがって、一実施態様では、本発明による抗原結合受容体に含まれるＦａｂ断片、ｃｒｏｓｓＦａｂ断片、ｓｃＦｖ断片及び／又はｓｃＦａｂ断片は、システイン残基（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けに従った可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定化され得る。そのような安定化された抗原結合部分は、本明細書では「ｄｓ」という用語で表す。
【０１５７】
ハプテンは、当該技術分野で知られる方法に従って、認識ドメインに共有結合又は非共有結合され得る。例えば、ビオチン化は、ハプテンビオチンをポリペプチド、例えば免疫グロブリンに結合するのに、当該技術分野で広く使用されている。ビオチンは、通常第一級アミン（例えばリジン）を介してタンパク質にコンジュゲートされる。ＩｇＧ抗体については、通常、１抗体分子あたり３から６の間のビオチンがコンジュゲートされる。あるいは、炭水化物は、当該技術分野で知られる方法に従ってビオチン化され得る。
【０１５８】
一実施態様では、ハプテン分子は、部位特異的結合を使用して認識ドメインに結合される。一実施態様では、ポリペプチドタグの抗原結合分子への導入は、ハプテン分子のポリペプチドタグへの部位特異的結合と組み合わされる。本発明のそのような実施態様では、抗原結合分子に結合したハプテン分子の数は、例えば、ポリペプチドタグに規定数の結合部位を提供することによりコントロールされ得る。部位特異的結合技術の例は、当該技術分野で知られているＡｖｉＴａｇシステムである。ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨ（配列番号１０３）のポリペプチドタグＡｖｉＴａｇは、ＢｉｒＡビオチン−タンパク質リガーゼを使用して選択的にビオチン化され得る天然ビオチン化部位を含む。一実施態様では、認識ドメインは、規定数のハプテン分子を含む。一実施態様では、認識ドメインは、１、２、３又は４を超えるハプテン分子を含まない。好ましい実施態様では、認識ドメインは二つのハプテン分子を含み、例えば認識ドメインは、それぞれ一つのハプテン分子を含む二つのポリペプチドで構成されるＦｃドメインである。別の好ましい実施態様では、認識ドメインは一つのハプテン分子を含み、例えば、認識ドメインは、重鎖又は軽鎖断片に結合しているハプテン分子を含むＦａｂ断片である。
【０１５９】
一実施態様では、認識ドメインは、１を超える種のハプテン分子を含む。そのような実施態様では、１を超える種のハプテン分子は、認識ドメイン個別に結合し得るか、又は１を超えるハプテン分子を含む一単位、例えば架橋アダプターとして結合し得る。本発明のそのような実施態様の非制限的な例は、概念実証として、実施例６及び図１３で提供する。そのような実施態様では、ハプテン分子のうちの一つは、本発明に従って提供及び使用されるそれぞれの抗ハプテンＣＡＲによって認識することができるのに対し、他のハプテン分子は、認識ドメインに非共有結合又は共有結合され得る。一実施態様では、ハプテン分子は、ハプテン分子に特異的に結合することができる抗原結合部分を介して認識ドメインに非共有結合される。一実施態様では、架橋アダプターは、第１のハプテン分子と第２のハプテン分子を含み、ここで第１のハプテン分子は、第１のハプテン分子に特異的に結合することができるＣＡＲと相互作用することができ、第２のハプテン分子は、認識ドメインと相互作用することができ、認識ドメインは、第２のハプテン分子に特異的に結合することができる抗原結合分子を含む。一実施態様では、標的抗原結合部分の標的抗原への結合時又は結合後に、ＣＡＲは第１のハプテン分子に結合し、認識ドメインに結合した抗原結合部分は、第２のハプテン分子に結合する。したがって、標的抗原結合部分を含む抗原結合分子の標的細胞への結合時及びＣＡＲの架橋ドメイン（例えばビオチン−ジゴキシゲニン架橋）を介した認識ドメインへの結合時に、レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞は活性化され、レポーター遺伝子が発現する。したがって、レポーター遺伝子の発現は、例えば腫瘍細胞上の標的抗原に対して向けられた抗原結合分子によって誘導されるＴ細胞活性化に関連した標的抗原結合部分の（特異的）結合を示す。したがって、一実施態様では、本発明に従った使用のための架橋ビオチン−ジゴキシゲニンアダプターが提供される。
【０１６０】
本明細書で提供及び使用されるＣＡＲは、認識ドメイン、固定膜貫通ドメイン並びに少なくとも一つの細胞内シグナル伝達及び／又は少なくとも一つの共刺激シグナル伝達ドメインに特異的に結合することができる抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む。固定膜貫通ドメインは、ＣＡＲのエフェクター細胞、例えばＴ細胞の細胞膜への閉じ込めを媒介する。細胞内シグナル伝達及び／又は少なくとも一つの共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲの認識ドメインへの結合を細胞内シグナル、例えば、レポーター遺伝子発現を測定することによって評価することができるＴ細胞活性化に移す。本発明に関連して、本明細書に記載されるレポーター遺伝子の発現は、標的抗原結合部分の標的抗原への結合を示し、本明細書に記載されるＴ細胞活性化をもたらす。
【０１６１】
ＣＡＲの固定膜貫通ドメインは、哺乳動物のプロテアーゼの切断部位を有しないことを特徴とし得る。プロテアーゼとは、プロテアーゼの切断部位を含む膜貫通ドメインのアミノ酸配列を加水分解することができるタンパク質分解酵素を指す。プロテアーゼという用語は、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼの両方を含む。本発明に関連して、ＣＤ命名法によってとりわけ定められている膜貫通タンパク質の任意の固定膜貫通ドメインは、本発明に従って適切なＣＡＲを生成するのに使用されてもよく、これは、認識ドメイン、例えば修飾免疫グロブリンドメインへの結合時に、本明細書に記載されるようにＴ細胞を活性化する。
【０１６２】
したがって、本発明に関連して、固定膜貫通ドメインは、マウス／マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ)の一部、又は好ましくはヒト膜貫通ドメインの一部を含み得る。そのような固定膜貫通ドメインの一例は、例えば、本明細書では配列番号１１（配列番号２４に示されるＤＮＡによってコードされる）に示されるアミノ酸配列を有する、ＣＤ２８の膜貫通ドメインである。本発明に関連して、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、配列番号１１（配列番号２４に示されるＤＮＡ配列によってコードされる）に示されるアミノ酸配列を含み得る／それからなり得る。
【０１６３】
本発明の例示的な実施態様では、概念実証として、配列番号１０（配列番号２２に示されるＤＮＡ配列によってコードされる）のアミノ酸配列と、本明細書で配列番号９５（配列番号１０８のＤＮＡ配列によりコードされる）で示されるＣＤ２８（ヒトＣＤ２８のＵｎｉｐｒｏｔ  Ｅｎｔｒｙ番号はＰ１０７４７（バージョン番号１７３及び配列のバージョン１））の断片／ポリペプチド部分とを含む抗原結合部分を含む。あるいは、とりわけＣＤ命名法によって提供されるような膜貫通ドメインを有する任意のタンパク質は、本発明で提供及び使用されるＣＡＲの固定膜貫通ドメインとして使用され得る。上記の通り、ＣＡＲは、配列番号１０９（配列番号１０８に示されるｃＤＮＡによりコードされる）に示されるヒト完全長ＣＤ２８タンパク質のアミノ酸１５３から１７９、１５４から１７９、１５５から１７９、１５６から１７９、１５７から１７９、１５８から１７９、１５９から１７９、１６０から１７９、１６１から１７９、１６２から１７９、１６３から１７９、１６４から１７９、１６５から１７９、１６６から１７９、１６７から１７９、１６８から１７９、１６９から１７９、１７０から１７９、１７１から１７９、１７２から１７９、１７３から１７９、１７４から１７９、１７５から１７９、１７６から１７９、１７７から１７９、又は１７８から１７９に位置するＣＤ２８の固定膜貫通ドメインを含み得る。したがって、本発明に関連して、固定膜貫通ドメインは、配列番号１１（配列番号２４に示されるＤＮＡ配列によってコードされる）に示されるアミノ酸配列を含み得るか又はそれからなり得る。
【０１６４】
本明細書に記載される通り、本発明に従って使用されるＣＡＲは、少なくとも一つの刺激シグナル伝達及び／又は共刺激シグナル伝達ドメインを含む。刺激シグナル伝達及び／又は共刺激シグナル伝達ドメインは、標的抗原結合部分を含む抗原結合分子の結合を、レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞中の細胞内シグナルに変換する。したがって、ＣＡＲは、好ましくは、刺激シグナル伝達ドメインを含み、これはＴ細胞活性化を提供する。好ましい一実施態様では、標的抗原結合部分の標的抗原への結合及びレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の標的抗原結合部分を含む抗原結合分子への結合は、細胞内シグナル伝達及び／又は共刺激ドメインの活性化をもたらす。特定の実施態様では、本明細書で提供されるＣＡＲは、マウス／マウス又はヒトＣＤ３ｚ（ヒトＣＤ３ｚのＵｎｉＰｒｏｔ  ＥｎｔｒｙはＰ２０９６３である（配列番号２を含むバージョン番号１７７；マウス／マウスＣＤ３ｚのＵｎｉＰｒｏｔ  ＥｎｔｒｙはＰ２４１６１（一次引用可能なアクセッション番号）又はＱ９Ｄ３Ｇ３（二次引用可能なアクセッション番号）であり、バージョン番号１４３及び配列番号１））、Ｆｃｇｒ３Ａ（ヒトＦＣＧＲ３ＡのＵｎｉＰｒｏｔ  ＥｎｔｒｙはＰ０８６３７（配列番号２を含むバージョン番号１７８））、又はＮＫＧ２Ｄ（ヒトＮＫＧ２ＤのＵｎｉＰｒｏｔ  ＥｎｔｒｙはＰ２６７１８（配列番号１を含むバージョン番号１５１）；マウス／マウスＮＫＧ２ＤのＵｎｉＰｒｏｔ  ＥｎｔｒｙはＯ５４７０９（配列番号２を含む１３２））の断片／ポリペプチド部分である刺激シグナル伝達ドメインを含む。よって、ＣＡＲに含まれる刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｚ、Ｆｃｇｒ３Ａ又はＮＫＧ２Ｄの完全長の断片／ポリペプチド部分であり得る。ＣＤ３ｚのマウス／マウス完全長のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号１０６（配列番号１０７に示されるＤＮＡ配列によりコードされるマウス／マウス）として示される。ヒト完全長ＣＤ３ｚのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号１０４（配列番号１０５に示されるＤＮＡ配列によりコードされるヒト）として示される。本明細書に従って提供及び使用されるＣＡＲは、少なくとも一つのシグナル伝達ドメインが含まれることを条件として、刺激ドメインとしてＣＤ３ｚ、Ｆｃｇｒ３Ａ又はＮＫＧ２Ｄの断片を含み得る。特に、ＣＤ３ｚ、Ｆｃｇｒ３Ａ、又はＮＫＧ２Ｄの任意の部分／断片は、少なくとも一つのシグナル伝達モチーフが含まれる限り、刺激ドメインとして適している。しかしながら、より好ましくは、ＣＡＲは、ヒト起源由来のポリペプチドを含む。好ましくは、ＣＡＲは、本明細書では配列番号１０４（ＣＤ３ｚ）（配列番号１０５（ＣＤ３ｚ）で示されるＤＮＡ配列によりコードされるヒト）として示されるアミノ酸配列を含む。ＣＡＲに含まれ得るヒトＣＤ３ｚの断片／ポリペプチド部分は、配列番号１３（配列番号２６に示されるＤＮＡによってコードされる）に示されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり得る。したがって、一実施態様では、ＣＡＲは、配列番号１３に示される配列、又は配列番号１３と比較して最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２��２３、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０の置換、欠失又は挿入を有し、刺激シグナル伝達活性を有することを特徴とする配列を含む。刺激シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲの特異的な構造は、本明細書の以下で並びに実施例及び図面で提供される。刺激シグナル伝達活性は、例えば、ＥＬＩＳＡ（ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）によって測定されるサイトカイン放出の増加、増殖活性の増加（細胞数の増加により測定される）、又はＬＤＨ放出アッセイにより測定される溶解作用の増加により決定され得る。
【０１６５】
ＣＡＲは、好ましくは、レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞に追加の活性を提供する少なくとも一つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲは、マウス／マウス又はヒトＣＤ２８（ヒトＣＤ２８のＵｎｉＰｒｏｔ  ＥｎｔｒｙはＰ１０７４７である（配列番号１を含むバージョン番号１７３）；マウス／マウスＣＤ２８のＵｎｉＰｒｏｔ  ＥｎｔｒｙはＰ３１０４１である（配列番号２を含むバージョン番号１３４））、ＣＤ１３７（ヒトＣＤ１３７のＵｎｉＰｒｏｔ  ＥｎｔｒｙはＱ０７０１１である（配列番号１を含むバージョン番号１４５）；マウス／マウスＣＤ１３７のＵｎｉＰｒｏｔ  ＥｎｔｒｙはＰ２０３３４である（配列番号１を含むバージョン番号１３９））、ＯＸ４０（ヒトＯＸ４０のＵｎｉＰｒｏｔ  ＥｎｔｒｙはＰ２３５１０である（配列番号１を含むバージョン番号１３８）；マウスＯＸ４０のＵｎｉＰｒｏｔ  ＥｎｔｒｙはＰ４３４８８である（配列番号１を含むバージョン番号１１９））、ＩＣＯＳ（ヒトＩＣＯＳのＵｎｉＰｒｏｔ  ＥｎｔｒｙはＱ９Ｙ６Ｗ８である（配列番号１を含むバージョン番号１２６））；マウス／マウスＩＣＯＳのＵｎｉＰｒｏｔ  ＥｎｔｒｙはＱ９ＷＶ４０（一次引用可能なアクセッション番号）又はＱ９ＪＬ１７（二次引用可能なアクセッション番号）である。バージョン番号１０２及び配列バージョン２））、ＣＤ２７（ヒトＣＤ２７のＵｎｉＰｒｏｔ  ＥｎｔｒｙはＰ２６８４２である（配列番号２を含むバージョン番号１６０）；マウス／マウスＣＤ２７のＵｎｉｐｒｏｔ  ＥｎｔｒｙはＰ４１２７２である（配列番号１を含むバージョン番号１３７））、４−１−ＢＢ（マウス／マウス４−１−ＢＢのＵｎｉＰｒｏｔ  ＥｎｔｒｙはＰ２０３３４である（配列番号１を含むバージョン番号１４０）；ヒト４−１−ＢＢのＵｎｉＰｒｏｔ  ＥｎｔｒｙはＱ０７０１１（配列バージョンを含むバージョン番号１４６））、ＤＡＰ１０（ヒトＤＡＰ１０のＵｎｉＰｒｏｔ  ＥｎｔｒｙはＱ９ＵＢＪ５である（配列番号１を含むバージョン番号２５）；マウス／マウスＤＡＰ１０のＵｎｉＰｒｏｔ  ｅｎｔｒｙはＱ９ＱＵＪ０（一次引用可能なアクセッション番号）又はＱ９Ｒ１Ｅ７（二次引用可能なアクセッション番号）である。バージョン番号１０１及び配列番号１））、又はＤＡＰ１２（ヒトＤＡＰ１２のＵｎｉＰｒｏｔ  ＥｎｔｒｙはＯ４３９１４である（バージョン番号１４６及び配列番号１）；マウス／マウスＤＡＰ１２のＵｎｉＰｒｏｔ  ｅｎｔｒｙはＯ０５４８８５（一次引用可能なアクセッション番号）又はＱ９Ｒ１Ｅ７（二次引用可能なアクセッション番号）である。バージョン番号１２３及び配列番号１）のフラグメント／ポリペプチド部分である共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。特定の実施態様では、ＣＡＲは、一又は複数、即ち１、２、３、４、５、６又は７の本明細書に規定される共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。したがって、本発明に関連して、ＣＡＲは、マウス／マウス又は好ましくはヒトＣＤ２８の断片／ポリペプチド部分を第１の共刺激シグナル伝達ドメインとして含んでもよく、第２の共刺激シグナル伝達ドメインは、マウス／マウス又は好ましくはヒトＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０���びＤＡＰ１２、又はその断片からなる群より選択される。好ましくは、ＣＡＲは、ヒト起源由来の共刺激伝達ドメインを含む。よって、より好ましくは、ＣＡＲに含まれる共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号（配列番号２５に示されるＤＮＡ配列によってコードされる）に示されるアミノ酸を含み得るか又はそれからなり得る。
【０１６６】
よって、ＣＡＲに含まれていてもよい共刺激シグナル伝達ドメインは、完全長ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２の断片／ポリペプチド部分である。マウス／マウス完全長ＣＤ２８のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号１１１（配列番号１１０に示されるＤＮＡ配列によりコードされるマウス／マウス）として示される。しかしながら、ヒト配列が本発明に関連して最も好ましいため、ＣＡＲタンパク質に含まれていてもよい共刺激シグナル伝達ドメインは、ヒト完全長ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０又はＤＡＰ１２の断片／ポリペプチド部分である。ヒト完全長ＣＤ２８のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号１０９（配列番号１０８に示されるＤＮＡ配列によりコードされるヒト）として示される。
【０１６７】
好ましい一実施態様では、ＣＡＲは、共刺激シグナル伝達ドメインとしてＣＤ２８又はその断片を含む。ＣＡＲは、ＣＤ２８の少なくとも一つのシグナル伝達ドメインが含まれることを条件として、共刺激シグナル伝達ドメインとしてＣＤ２８の断片を含み得る。特に、ＣＤ２８の任意の部分／断片は、ＣＤ２８のシグナル伝達モチーフの少なくとも一つが含まれる限り、ＣＡＲに適している。例えば、ＣＡＲに含まれるＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号１２（配列番号２５に示されるＤＮＡによってコードされる）に示されるアミノ酸配列を含み得るか又はそれからなり得る。本発明では、共刺激シグナル伝達ドメインとして機能する、ＣＤ２８の細胞内ドメインは、配列ＹＭＮＭ（配列番号１１２）及び／又はＰＹＡＰ  （配列番号１１３）を有するＣＤ２８ポリペプチドの細胞内ドメインに由来する配列を含み得る。好ましくは、ＣＡＲは、ヒト起源由来のポリペプチドを含む。ＣＡＲに含まれ得るヒトＣＤ２８の断片／ポリペプチド部分は、配列番号１２（配列番号２５に示されるＤＮＡによってコードされる）に示されるアミノ酸配列を含み得るか、又はそれからなり得る。したがって、一実施態様では、ＣＡＲは、配列番号１２に示される配列、又は配列番号１２と比較して最大１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０の置換、欠失又は挿入を有し、共刺激シグナル伝達活性を有することを特徴とする配列を含む。共刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）を含むＣＡＲの特異的な構造は、本明細書の以下で並びに実施例及び図面で提供される。共刺激シグナル伝達活性は、例えば、ＥＬＩＳＡ（ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）によって測定されるサイトカイン放出の増加、増殖活性の増加（細胞数の増加により測定される）、又はＬＤＨ放出アッセイにより測定される溶解作用の増加により決定され得る。
【０１６８】
上記の通り、本発明の実施態様では、ＣＡＲの共刺激シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ２８遺伝子（Ｕｎｉ  Ｐｒｏｔ  Ｅｎｔｒｙ番号：Ｐ１０７４７（エントリーバージョンを含むアクセッション番号：１７３及び配列のバージョン１））に由来し得、形質導入Ｔ細胞のような本明細書に記載される形質導入細胞のサイトカイン産生、増殖及び溶解作用として定義されるＣＤ２８活性を提供する。ＣＤ２８の活性は、ＥＬＩＳＡによるサイトカインの放出により、又はサイトカイン、例えばインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）又はインターロイキン２（ＩＬ−２）のフローサイトメトリー、例えばｋｉ６７測定により測定されるＴ細胞の増殖、フローサイトメトリーによる細胞の定量化、又は標的細胞のリアルタイムインピーダンス測定によって評価された溶解活性（例えば、Thakur et al., Biosens Bioelectron. 35(1) (2012), 503-506; Krutzik et al., Methods Mol Biol. 699 (2011), 179-202; Ekkens et al., Infect Immun. 75(5) (2007), 2291-2296; Ge et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 99(5) (2002), 2983-2988; Duwell et al., Cell Death Differ. 21(12) (2014), 1825-1837, Erratum in: Cell Death Differ. 21(12) (2014), 161）に記載されるＩＣＥＬＬｌｉｇｅｎｃｅ機器の使用による）により測定され得る。共刺激シグナル伝達ドメインＰＹＡＰ及びＹＭＮＭは、ＣＤ２８ポリペプチドの機能及び上に列挙された機能的効果にとって有益である。ＹＭＮＭドメインのアミノ酸配列は配列番号１１２に示され；ＰＹＡＰドメインのアミノ酸配列は配列番号１１３に示される。したがって、本明細書で提供及び使用されるＣＡＲでは、ＣＤ２８ポリペプチドは、好ましくは、配列ＹＭＮＭ（配列番号１１２）及び／又はＰＹＡＰ（配列番号１１３）を有するＣＤ２８ポリペプチドの細胞内ドメインに由来する配列を含む。これらのシグナル伝達モチーフは、ＣＡＲの細胞内ドメイン内のあらゆる部位に存在し得る。
【０１６９】
認識ドメインに特異的に結合することができる少なくとも一つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、哺乳動物プロテアーゼの切断部位を有しない固定膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び刺激シグナル伝達ドメインは、一本鎖多機能ポリペプチドに含まれ得る。一本鎖融合コンストラクトは、例えば、修飾免疫グロブリンドメインに特異的に結合することができる少なくとも一つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含むポリペプチド、固定膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は刺激シグナル伝達ドメインからなり得る。別の実施態様では、ＣＡＲは、一本鎖融合コンストラクトではない抗原結合部分を含み、即ち、修飾免疫グロブリンに特異的に結合することができる抗原結合部分は、Ｆａｂ又はｃｒｏｓｓＦａｂ断片である。そのような実施態様では、ＣＡＲは、一本のポリペプチド鎖のみを含む一本鎖融合コンストラクトではない。好ましくは、そのようなコンストラクトは、免疫グロブリン軽鎖と組み合わされた一本鎖重鎖融合ポリペプチドを含み、例えば、重鎖融合ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖、固定膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は刺激シグナル伝達ドメインを含み、免疫グロブリン軽鎖と組み合わされている。したがって、細胞外ドメイン、固定膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び刺激シグナル伝達ドメインが、一又は複数の同一又は異なるペプチドリンカーによって結合され得る。例えば、認識ドメインに特異的に結合することができる少なくとも一つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインと固定膜貫通ドメインとの間のリンカーは、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み得るか又はそれからなり得る。したがって、固定膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は刺激ドメインは、ペプチドリンカーによって、あるいはドメインの直接融合によって、互いに結合され得る。
【０１７０】
いくつかの実施態様では、細胞外ドメインに含まれる抗原結合部分は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり、これは１０から約２５のアミノ酸の短いリンカーペプチドにより接続した、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンに、可溶性のためにセリン又はスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に結合することができ、又はその逆も可能である。例えば、リンカーは、配列番号１６に示されるアミノ及びアミノ酸拝謁を有し得る。ｓｃＦｖ抗原結合部分は、定常領域の除去及びリンカーの導入にも関わらず、元の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ抗体は、例えばHouston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96に記載されている。
【０１７１】
ＣＡＲ又はその一部は、シグナルペプチドを含み得る。そのようなシグナルペプチドは、Ｔ細胞膜の表面にタンパク質をもたらすことになる。例えば、シグナルペプチドは、配列番号１１４（配列番号１１５に示されるＤＮＡ配列によってコードされる）に示されるアミノ酸配列を有し得る。
【０１７２】
ＣＡＲの成分は、様々な構成で互いに融合され得、Ｔ細胞活性化ＣＡＲが生成される。
【０１７３】
いくつかの実施態様では、ＣＡＲは、固定膜貫通ドメインに結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）から構成される細胞外ドメインを含む。いくつかの実施態様では、ＶＨドメインは、Ｃ末端において、場合によってはペプチドリンカーを通じて、ＶＬドメインのＮ末端に融合している。他の実施態様では、ＣＡＲは、刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。そのような特定の実施態様では、ＣＡＲは、ＶＨドメイン及びＶＬドメイン、固定膜貫通ドメイン、並びに場合によっては一又は複数のペプチドリンカーにより結合される刺激シグナル伝達ドメインから本質的になり、ここでＶＨドメインは、Ｃ末端においてＶＬドメインのＮ末端に融合しており、ＶＬドメインは、Ｃ末端において固定膜貫通ドメインのＮ末端に融合しており、固定膜貫通ドメインは、Ｃ末端において刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合している。場合によっては、ＣＡＲは共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。そのような特定の実施態様では、抗原結合受容体は、ＶＨドメイン及びＶＬドメイン、固定膜貫通ドメイン、刺激シグナル伝達ドメイン並びに一又は複数のペプチドリンカーによって結合される共刺激シグナル伝達ドメインから本質的になり、ここでＶＨドメインは、Ｃ末端においてＶＬドメインのＮ末端に融合しており、ＶＬドメインは、Ｃ末端において固定膜貫通ドメインのＮ末端に融合しており、固定膜貫通ドメインは、Ｃ末端において刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合しており、刺激シグナル伝達ドメインは、Ｃ末端において共刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合している。別の実施態様では、共刺激シグナル伝達ドメインは、刺激シグナル伝達ドメインの代わりに、固定膜貫通ドメインに結合される。好ましい実施態様では、ＣＡＲは、ＶＨドメイン及びＶＬドメイン、固定膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン並びに一又は複数のペプチドリンカーによって結合される刺激シグナル伝達ドメインから本質的になり、ここでＶＨドメインは、Ｃ末端においてＶＬドメインのＮ末端に融合しており、ＶＬドメインは、Ｃ末端において固定膜貫通ドメインのＮ末端に融合しており、固定膜貫通ドメインは、Ｃ末端において共刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合しており、共刺激シグナル伝達ドメインは、Ｃ末端において刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合している。
【０１７４】
好ましい実施態様では、結合部分のうちの一つは、Ｆａｂ断片又はｃｒｏｓｓＦａｂ断片である。好ましい一実施態様では、抗原結合部分は、Ｆａｂ又はｃｒｏｓｓＦａｂ重鎖のＣ末端において、場合によってはペプチドリンカーを通じて、固定膜貫通ドメインのＮ末端に融合している。別の実施態様では、抗原結合部分は、Ｆａｂ又はｃｒｏｓｓＦａｂ軽鎖のＣ末端において、場合によってはペプチドリンカーを通じて、固定膜貫通ドメインのＮ末端に融合している。他の実施態様では、ＣＡＲは、刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。そのような特定の実施態様では、ＣＡＲは、Ｆａｂ又はｃｒｏｓｓＦａｂ断片、固定膜貫通ドメイン、及び場合によっては一又は複数のペプチドリンカーによって結合される刺激シグナル伝達ドメインから本質的になり、ここでＦａｂ又はｃｒｏｓｓＦａｂ断片は、重鎖又は軽鎖のＣ末端で固定膜貫通ドメインのＮ末端に融合しており、固定貫通ドメインは、Ｃ末端で刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合している。好ましくは、ＣＡＲは共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。そのような一実施態様では、ＣＡＲは、Ｆａｂ又はｃｒｏｓｓＦａｂ断片、固定膜貫通ドメイン、刺激シグナル伝達ドメイン、及び一又は複数のペプチドリンカーによって結合される共刺激シグナル伝達ドメインから本質的になり、ここでＦａｂ又はｃｒｏｓｓＦａｂ断片は、重鎖又は軽鎖のＣ末端において固定膜貫通ドメインのＮ末端に融合しており、刺激シグナル伝達ドメインは、Ｃ末端において共刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合している。好ましい実施態様では、共刺激シグナル伝達ドメインは、刺激シグナル伝達ドメインの代わりに、固定膜貫通ドメインに結合される。最も好ましい実施態様では、ＣＡＲは、Ｆａｂ又はｃｒｏｓｓＦａｂ断片、固定膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、及び刺激シグナル伝達ドメインから本質的になり、ここでＦａｂ又はｃｒｏｓｓＦａｂ断片は、重鎖のＣ末端においてペプチドリンカーを通じて固定膜貫通ドメインのＮ末端に融合しており、固定膜貫通ドメインは、Ｃ末端において共刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合しており、共刺激シグナル伝達ドメインは、Ｃ末端において刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合している。
【０１７５】
抗原結合部分、固定膜貫通ドメイン並びに刺激シグナル伝達及び／又は共刺激シグナル伝達ドメインは、直接的に、又は一又は複数のアミノ酸、典型的には約２から２０のアミノ酸を含むペプチドリンカーを通じて、互いに融合していてもよい。ペプチドリンカーは当技術分野において既知であり、本願明細書に記載される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれ、ここで「ｎ」は通常１〜１０の間、典型的には２〜４の間の数である。抗原結合部分と固定膜貫通部分を結合するのに好ましいペプチドリンカーは、配列番号１７によるＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）である。可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）を結合するのに適した例示的なペプチドリンカーは、配列番号１６によるＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）４である。
【０１７６】
加えて、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含むことができる。特に抗原結合部分が固定膜貫通得ドメインのＮ末端に融合している場合には、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して、追加のペプチドリンカーを用いて又は用いずに、融合され得る。
【０１７７】
本明細書に記載されるとおり、本明細書に従って提供及び使用されるＣＡＲは、少なくとも一つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む。認識ドメインに特異的に結合することができる単一の抗原結合部分を有するＣＡＲは、特にＣＡＲの高発現が必要とされる場合に有用であり、好ましい。このような場合、標的細胞抗原に特異的な１を超える抗原結合部分の存在は、ＣＡＲの発現効率を限定し得る。しかしながら、他の場合、標的細胞抗原に特異的な二つ以上の抗原結合部分を含むＣＡＲを有することは、例えば標的部位への標的化を最適化するため、又は標的細胞抗原の架橋を可能にするために有利であろう。
【０１７８】
本発明による方法に関連して、標的抗原結合部分を含む抗原結合分子を表面上に標的抗原を含む標的細胞と接触させること、及び抗原結合分子を認識ドメインに特異的に結合することができる抗原結合部分を含むＣＡＲと接触させることは、本明細書に記載されるレポーター遺伝子の発現をもたらす。したがって、一実施態様では、本明細書に記載される細胞内シグナル伝達及び／又は共シグナル伝達ドメインの活性化は、本明細書に記載される応答エレメントの活性化につながる。好ましい実施態様では、応答エレメントは、レポーター遺伝子の発現を制御する。一実施態様では、標的抗原結合部分の標的抗原への結合時又は結合後、ＣＡＲは認識ドメイン、例えば修飾免疫グロブリンドメインに結合し、ここで応答エレメントは、本明細書に記載されるレポーター遺伝子の発現を活性化する。好ましい実施態様では、応答エレメントの活性化は、レポーター遺伝子の発現につながる。したがって、レポーター細胞（例えば、レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞）中のレポーター遺伝子は、標的抗原結合部分の標的抗原への結合及びＣＡＲの（候補となる）標的抗原結合部分を含む分子の認識ドメインへの結合の際に発現される。一実施態様では、レポーター遺伝子の発現は、標的抗原結合部分の標的抗原への結合を示す。これに関連して、抗原結合分子のＣＡＲへの結合は、直接的に又は細胞シグナル伝達のカスケードを通じて応答エレメントの活性の調節をもたらす細胞応答を引き起こす。応答エレメントは、転写因子等によりサイレンシング又は活性化できるＤＮＡエレメントである。応答エレメントは、当該技術分野で知られており、例えばレポーターベクターで市販されている。通常、応答エレメントはＤＮＡ反復エレメントを含み、転写因子結合時にレポーター遺伝子の発現を引き起こす最小プロモーターの上流に位置するシス作用性エンハンサーエレメントである。
【０１７９】
ＣＡＲの認識ドメイン、例えば修飾Ｆｃドメイン又はＦａｂ断片への結合は、応答エレメントを活性化する。一実施態様では、応答エレメントは、細胞核に位置する核応答エレメントである。別の実施態様では、前記応答エレメントは、レポーター細胞のプラスミドに位置する。一実施態様では、アッセイは、応答エレメントの制御下でレポーター遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクター内に、レポーター細胞、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞をトランスフェクトする予備工程を含む。さらに、レポーター細胞は、ＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクター内にトランスフェクトされ得る。レポーター細胞は、シグナル伝達カスケードの全エレメントを含む発現ベクターで、又は異なる成分を個別に発現する異なるベクターでトランスフェクトされ得る。一実施態様では、レポーター細胞は、応答エレメントの制御下でレポーター遺伝子をコードするＤＮＡ配列と、ＣＡＲをコードするＤＮＡ配列とを含む。
【０１８０】
したがって、本明細書に記載される通り、ＣＡＲは、応答エレメントに機能的に結合している。一実施態様では、応答エレメントは、レポーター遺伝子の発現を制御する。一実施態様では、応答エレメントは、ＮＦＡＴ経路、ＮＦ−κＢ経路又はＡＰ−１経路、好ましくはＮＦＡＴ経路の一部である。
【０１８１】
一実施態様では、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質、又は触媒活性が検出され得る酵素をコードする遺伝子から選択される。一実施態様では、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質をコードしている。さらなる実施態様では、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Heim et al. 1994, 1996）、ＣＦＰとして知られるシアン蛍光変異体（Heim et al. 1996; Tsien 1998）；ＹＦＰとして知られる黄色蛍光変異体（Ormo et al. 1996; Wachter et al. 1998）；サファイア（Ｓａｐｐｈｉｒｅ）として知られるバイオレット励起可能な緑色蛍光変異体（Tsien 1998; Zapata-Hommer et al. 2003）；及び高感度緑色蛍光タンパク質又はＥＧＦＰ高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）として知られるシアン励起可能な緑色蛍光変異体（Yang et al. 1996）があり、それらは、生細胞画像化（例えばＩｎｃｕｃｙｔｅ）又は蛍光分光法によって測定することができる。一実施態様では、触媒活性が検出され得る酵素は、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ及びアルカリホスファターゼからなる群より選択される。一実施態様では、レポーター遺伝子は、ＧＦＰをコードしている。好ましい実施態様では、レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼをコードしている。ルシフェラーゼの活性は、市販されているアッセイにより、例えば、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １０００  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ又はＯＮＥ−ＧｌｏＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（どちらもＰｒｏｍｅｇａ）により検出され得る。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １０００  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍは、基材としてのルシフェリンの他にコエンザイムＡ（ＣｏＡ）を含有し、これは、少なくとも１分間続く強力な光度をもたらす。細胞内ルシフェラーゼをアッセイするために、検出前に細胞を溶解する必要がある。反応の副生成物として生成される光は、可視スペクトル全体からルミノメーターによって収集される。本明細書に示される実施例では、シグナルは、生成されたルシフェラーゼの量に比例し、したがってＮＦＡＴプロモーターの活性化の強さに比例した。別の実施態様では、ルシフェラーゼが細胞から分泌されるルシフェラーゼアッセイが使用される。よって、アッセイは細胞の溶解を伴わずに実施され得る。
【０１８２】
本明細書で記載される通り、レポーター遺伝子の発現は、試験される標的抗原結合部分の結合、及びＴ細胞、例えばレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の得られる活性化と直接相関し得る。例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼをコードする遺伝子を使用するとき、細胞から検出された光は、標的抗原結合と直接相関し、適切な対照状況と比較した場合、試験される標的抗原結合部分の特異性を示している。一実施態様では、標的抗原結合部分を含む抗原結合分子は、異なる濃度で適用され、レポーター遺伝子活性化の最大半減有効濃度（ＥＣ５０）が決定される。ＥＣ５０とは、抗原結合分子が、特定の曝露時間後、ベースラインと最大値の中間でレポーター遺伝子を活性化又は阻害する、抗原結合分子（例えば抗体）又はリガンドの濃度を指す。したがって、用量反応曲線のＥＣ５０は、標的抗原に対するその最大の活性化又は阻害効果の５０％が観察される標的抗原結合部分の濃度を表す。
【０１８３】
一実施態様では、標的抗原は、細胞表面抗原又は受容体である。一実施態様では、標的抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ２、ＬｅＹ、ＭＣＳＰ、ＳＴＥＡＰ１、ＴＹＲＰ、及びＷＴ１、又はそれらの断片からなる群より選択される。しかしながら、標的抗原は、細胞表面に位置するタンパク質に限定されず、一時的に又は永久的に細胞内に位置するポリペプチド又はタンパク質にも由来し得る。そのような場合、細胞内ポリペプチド又はタンパク質由来の標的抗原は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の一又は複数の分子により細胞表面に示され得る。一実施態様では、標的抗原は、ＭＨＣの分子に結合したペプチドである。一実施態様では、ＭＨＣはヒトＭＨＣである。一実施態様では、ＭＨＣの分子に結合したペプチドは、８から１００の間、好ましくは８から３０の間、より好ましくは８から１６の間のアミノ酸の全長を有する。一実施態様では、標的抗原は、排他的に又は主に腫瘍組織に発現されるタンパク質に由来する。一実施態様では、タンパク質は細胞内タンパク質であり、ペプチドは、ＭＨＣ−Ｉ又はＭＨＣ−ＩＩ経路により生成され、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ複合体で示される。一実施態様では、ペプチドは、ＭＨＣ−Ｉ経路により生成され、ＭＨＣクラスＩ複合体で示される。一実施態様では、標的抗原結合部分は、Ｔ細胞受容体様（ＴＣＲＬ）抗原結合部分である。ＴＣＲＬ抗原結合部分は、排他的に又は主に腫瘍組織に発現されるペプチド抗原に特異的に結合することができ、ここでペプチド抗原は、細胞、特にがん細胞の表面に位置するＭＨＣの分子に結合している。これに関連して、本発明の方法は、ハイスループットアッセイフォーマットで確立された又は新規のＴＣＲＬ標的抗原結合部分の特異性を評価するのに適している。
【０１８４】
標的抗原結合部分を含む抗原結合分子の標的抗原への結合は、定性的に、即ちレポーター遺伝子の発現の存在又は不存在によって決定することができ；いかなる蛍光又は発光も存在しないことは、結合がないことを示す。結合及び活性化を定量的に測定するために、レポーター遺伝子の活性化の量は基準と比較され得る。したがって、本明細書に記載される方法は、レポーター遺伝子の発現レベルを基準と比較する工程をさらに含み得る。適切な基準は、通常、アッセイ又は方法の一又は複数の必須成分を省略した、基準アッセイと実質的に同一であるネガティブコントロールを含む。本発明の方法に関して、省略された構成要素は、例えば、抗原結合分子の追加を省略したり、標的細胞を省略したりすることができる。あるいは、抗原結合分子の認識ドメインに結合することができないレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が使用され得る。好ましい実施態様では、基準は、抗原結合分子の不存在下のレポーター遺伝子の発現である。特定の実施態様では、レポーター遺伝子の発現は、抗原結合分子の不存在下のレポーター遺伝子の発現と比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍、又は１００００倍高い。
【０１８５】
あるいは、レポーター遺伝子の発現の不存在は、特定の閾値により、即ち、バックグラウンドシグナルを差し引いた後に定義され得る。バックグラウンドシグナルは、通常、抗原結合分子を除いて全ての試薬を用いて、又は標的細胞の不存在下で実施することにより、決定される。新規の標的抗原結合部分は、例えば、レポーター遺伝子発現のベースライン活性化の閾値を定義すること、及び標的細胞の不存在下でのレポーター遺伝子の発現に対する抗原結合分子の存在下でのレポーター遺伝子の発現レベルが所定の閾値よりも高い場合に新規の標的抗原結合部分を選択することにより、本発明の方法によって選択され得る。したがって、本明細書に記載される方法は、抗原結合分子の不存在下でのレポーター遺伝子の発現に対する抗原結合分子の存在下でのレポーター遺伝子の発現レベルが所定の閾値よりも高い場合に新規の標的抗原結合部分を選択する工程をさらに含み得る。特定の実施態様では、閾値は２、３、４、５、１０、１００、１０００、又は１００００である。
【０１８６】
本明細書に記載される新規のアッセイは、ロバストで、ハイスループット形式での使用に適しており、アッセイを完了するために必要な実践時間の点で効率的である。さらに、本発明のアッセイは、分析される試料に死細胞が存在することを許容する。これは、抗原結合分子の結合及び機能性が、細胞生存率又は細胞死を測定することによって決定される細胞アッセイ、例えば、死滅アッセイとは対照的である。
【０１８７】
本明細書に記載される新たなアッセイのさらなる利点の一つは、洗浄工程を必要としないことである。試験される抗原結合分子及びレポーター細胞は、標的細胞、例えば腫瘍細胞に、順番に又は同時に添加され得る。一実施態様では、抗原結合分子が細胞培地で希釈され、腫瘍試料が、適切な細胞培養フォーマットで、例えば２４ウェルプレートのウェルで、又は９６ウェルプレートのウェルで、希釈された抗原結合分子を含有する細胞培地に添加される。好ましくは、試験培地は、細胞が最大４８時間生存するための条件を提供する培地である。一実施態様では、アッセイは、マイクロタイタープレートで実施される。一実施態様では、マイクロタイタープレートは、ハイスループットスクリーニングに適している。本発明のアッセイは、複数の反応の迅速な準備、処理、及び分析を可能にする任意のフォーマットで実施され得る。これは、例えば、マルチウェルアッセイプレート（例えば、２４ウェル、９６ウェル又は３８４ウェル）中であり得る。様々な薬剤の原液は、手動又ははロボットで作製することができ、その後の全てのピペッティング、希釈、混合、分配、洗浄、インキュベーション、試料読み取り、データ収集及び分析は、市販の分析ソフトウェア、ロボット工学、及び蛍光及び／又は発光信号を検出することができる検出機器を使用して、ロボットで行うことができる。
【０１８８】
一実施態様では、２４ウェルプレートの１ウェル当たり約１０００００から約１００００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が工程ｃ）で提供される。好ましい実施態様では、２４ウェルプレートの１ウェル当たり約３０００００から約７０００００、又は約４０００００から約６０００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が工程ｃ）で提供される。一実施態様では、２４ウェルプレートの１ウェル当たり約５０００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が工程ｃ）で提供される。一実施態様では、９６ウェルプレートの１ウェル当たり約１００００から約１０００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が工程ｃ）で提供される。好ましい実施態様では、９６ウェルプレートの１ウェル当たり約３００００から約７００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞、又は約４００００から約６００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が工程ｃ）で提供される。一実施態様では、９６ウェルプレートの１ウェル当たり約５００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が工程ｃ）で提供される。一実施態様では、３８４ウェルプレートの１ウェル当たり約３０００から約３００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が工程ｃ）で提供される。好ましい実施態様では、３８４ウェルプレートの１ウェル当たり約５０００から約１５０００、又は約８０００から約１２０００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が工程ｃ）で提供される。一実施態様では、３８４ウェルプレートの１ウェル当たり約１００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が工程ｃ）で提供される。一実施態様では、細胞培地１ｍｌ当たり約２０００００から約２００００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が工程ｃ）で提供される。好ましい実施態様では、細胞培地１ｍｌ当たり約６０００００から約１４０００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞、又は約８０００００から約１２０００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が工程ｃ）で提供される。一実施態様では、細胞培地１ｍｌ当たり約１００００００のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が工程ｃ）で提供される。
【０１８９】
一実施態様では、最終濃度が約０．１ｆｇ／ｍｌから約１０μｇ／ｍｌに達するように、抗原結合分子が工程ｂ）で提供される。さらなる実施態様では、最終濃度が約１ｆｇ／ｍｌから約１μｇ／ｍｌ又は約１ｐｇ／ｍｌから約１μｇ／ｍｌに達するように、抗原結合分子が工程ｂ）で提供される。さらなる実施態様では、最終濃度が約０．１ｎｇ／ｍｌに達するように、抗原結合分子が工程ｂ）で提供される。一実施態様では、最終濃度が約１ｎＭから約１０００ｎＭに達するように抗原結合分子が工程ｂ）で提供される。さらなる実施態様では、最終濃度が約５ｎＭから約２００ｎＭ、又は約１０ｎＭから約１００ｎＭに達するように、抗原結合分子が工程ｂ）で提供される。さらなる実施態様では、最終濃度が約５０ｎＭに達するように、抗原結合分子が工程ｂ）で提供される。抗原結合分子は、細胞培地中で希釈され得る。本明細書に記載されるように最終濃度に希釈された抗原結合分子は、レポーター細胞の添加前又は添加後に標的細胞に添加される。一実施態様では、本明細書に記載されるように最終濃度に希釈された抗原結合分子は、レポーター細胞の添加前に標的細胞に添加される。一実施態様では、標的細胞は細胞培養体に提供される。一実施態様では、標的細胞、例えば腫瘍細胞は、マトリゲルに包埋される。
【０１９０】
特定の実施態様では、本発明の方法は、Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）フォーマットに含まれる新規の標的抗原結合部分の特異性を評価するために使用され得る。本発明による方法は、ＴＣＢの新規の標的抗原結合部分を評価及び選択するのに特に適しているが、これは、本発明の方法が、Ｔ細胞活性化を測定するためである。当該技術分野で知られるアッセイ（例えば結合アッセイ）の欠点は、測定された親和性が必ずしもＴＣＢフォーマットの特異性を反映しないことである。ＴＣＢは、マイクロモル範囲の結合親和性を通じて、Ｔ細胞の活性化及び死滅をすでに媒介することができる非常に強力な分子である。したがって、新規の標的抗原結合部分を含むＴＣＢは、非特異的な反応性、例えば、標的細胞の死滅又はアロ反応性を回避するために高度に選択的である必要がある。本明細書に記載される方法は、そのようなフォーマットの高度の要求を満たすが、これは、アッセイがＴ細胞活性化、即ち同等の作用機序に基づいているためである。したがって、本明細書では、抗原結合分子の存在下でのレポーター遺伝子の高レベルの発現及び抗原結合分子の不存在下でのレポーター遺伝子の低レベルの発現が、特に標的抗原結合部分がＴ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体フォーマットに移されるときに、標的抗原結合部分の高特異性を示す方法が、本明細書で提供される。さらに、ＴＣＢ抗体を生成するための方法であって、ＴＣＢ抗体フォーマットが、標的抗原に特異的な第１の抗原結合部分と、Ｔ細胞活性化受容体に特異的に結合することができる第２の抗原結合部分とを含み、第１の抗原結合部分が本発明に記載される方法に従って選択され、即ち、第１の抗原結合部分が、本発明に方法における（候補となる）標的抗原結合部分としてアッセイ及び選択される方法が、提供される。好ましい実施態様では、Ｔ細胞活性化受容体はＣＤ３である。
【０１９１】
そのような一実施態様では、ＴＣＢ抗体は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分；
（ｂ）ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分
を含む。
【０１９２】
例示的な一実施態様では、概念実証として、ＴＣＢ抗体は、
（ａ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第１の抗原結合部分；
（ｂ）ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第２の抗原結合部分であって、配列番号１１８、配列番号１１９及び配列番号１２０の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３の軽鎖ＣＤＲとを含む第２の抗原結合部分
を含む。
【０１９３】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる単一の抗原結合部分を有するＴＣＢは、特に高親和性抗原結合部分の結合に続いて標的細胞抗原の内部移行が予想される場合に有用である。このような場合、標的細胞抗原に特異的な一を超える抗原結合部分の存在は、標的細胞抗原の内部移行を亢進し、それによりその利用可能性を低下させる。
【０１９４】
しかしながら、他の多くの場合、標的細胞抗原に特異的な二つ以上の抗原結合部分を含む二重特異性抗体を有することは、例えば標的部位への標的化を最適化するために有利になる。
【０１９５】
したがって、特定の実施態様では、ＴＣＢ抗体は、標的細胞抗原に特異的に結合することができる第３の抗原結合部分を含む。さらなる実施態様では、第３の抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子であるか、又はＦａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である。一実施態様では、第３の抗原結合部分は、第１の原結合部分と同じ標的細胞抗原に特異的に結合することができる。特定の実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＣＤ３に特異的に結合することができ、第１及び第３の抗原結合部分は標的細胞抗原に特異的に結合することができる。特定の実施態様では、第１及び第３の抗原結合部分は同一であり（即ち、それらは同じアミノ酸配列を含む）、本明細書に記載される方法に従って選択される。
【０１９６】
本明細書に記載されるＣＡＲを発現することができる形質導入されたＴ細胞、即ちレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞、並びに本発明による方法におけるそれらの使用がさらに提供される。ＣＡＲは、Ｔ細胞中に及び／又はＴ細胞の表面上に天然には含まれず、正常（非形質導入）Ｔ細胞中又は該細胞上に内因性発現していない分子に関する。よって、Ｔ細胞中及び／又はＴ細胞上の本明細書で使用されるＣＡＲは、Ｔ細胞に人工的に導入される。人工的に導入され、続いて前記Ｔ細胞、例えばレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞中及び／又は該細胞上に示されるＣＡＲ分子は、（Ｉｇ由来の）免疫グロブリン、好ましくは抗体に、特に本発明に従って使用される抗原結合分子のＦｃドメイン又はＦａｂ断片に（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで）アクセス可能な一又は複数の抗原結合部分を含むドメインを含む。これに関連して、これらの人工的に導入された分子は、本発明で以下に記載される形質導入後に、前記Ｔ細胞中及び／又は前記Ｔ細胞の表面上に示される。したがって、形質導入後、本開示によるＴ細胞は、免疫グロブリン、好ましくは抗原結合ドメイン及び認識ドメインを含む（治療用）抗体により活性化され得る。
【０１９７】
本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸分子によりコードされるＣＡＲを発現する形質導入されたＴ細胞も本明細書で提供される。したがって、本発明に関連して、形質導入された細胞は、本発明に従って提供及び使用されるＣＡＲをコードする核酸分子を含み得る。
【０１９８】
本発明に関連して、用語「形質導入されたＴ細胞」は、遺伝子組み換えＴ細胞（即ち、核酸分子が意図的に導入されたＴ細胞）に関する。特に、本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸分子は、レトロウイルス又はレンチウイルスの形質導入を使用することにより、Ｔ細胞のゲノムに安定して組み込まれ得る。ＣＡＲの細胞外ドメインは、本明細書に記載される抗原結合部分の完全な細胞外ドメインを含み得るが、その一部も含み得る。必要な最小サイズは、ＣＡＲの抗原結合部分の抗原結合部位である。ＣＡＲの細胞外部分（即ち、抗原結合部分を含む細胞外ドメイン）は細胞表面上で検出され得るが、細胞内部分（即ち、共刺激シグナル伝達ドメイン及び刺激シグナル伝達ドメイン）は細胞表面上で検出することができない。ＣＡＲの細胞外ドメインの検出は、この細胞外ドメインに特異的に結合する抗体を使用することによって、又は細胞外ドメインが結合することができる認識ドメイン、例えば修飾免疫グロブリンドメインによって、行うことができる。細胞外ドメインは、フローサイトメトリー又は顕微鏡法によりこれらの抗体又は認識ドメインを使用して検出され得る。
【０１９９】
形質導入された細胞は、任意の免疫細胞であり得る。これらには、限定されないが、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、γδＴ細胞、自然リンパ球、マクロファージ、単球、樹状細胞、又は好中球及びそれらの不死化細胞株が含まれる。優先的には、前記免疫細胞は、リンパ球、優先的にはＮＫ又はＴ細胞である。前記Ｔ細胞は、ＣＤ４  Ｔ細胞及びＣＤ８  Ｔ細胞を含む。白血球の細胞上にＣＡＲを生じさせることは、細胞が由来する系統に関係なく、認識ドメイン、例えば、修飾免疫グロブリンドメインを含む、抗原結合分子、例えば、治療用抗体と併せて、標的細胞に対して細胞を応答性にする。活性化は、ＣＡＲについて選択された刺激シグナル伝達ドメイン又は共刺激シグナル伝達ドメインに関係なく起こり、追加のサイトカインの外因的供給に依存しない。
【０２００】
形質導入された細胞は、さらなる核酸分子で、例えば本明細書に記載される応答エレメントをコードする核酸分子で共形質導入され得る。
【０２０１】
具体的には、本開示は、一又は複数のＣＡＲ及び一又は複数の応答エレメント及びレポーター遺伝子を発現するレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の生成のための方法であって、Ｔ細胞を本明細書に記載される一又は複数のベクターで形質導入する工程と、前記形質導入された細胞中又は該細胞上に抗原結合受容体を発現することを可能にする条件下で形質導入されたＴ細胞を培養する工程とを含む方法に関する。
【０２０２】
細胞を形質導入するための方法は、当該技術分野で知られており、核酸又は組み換え核酸が形質導入される場合、限定されないが、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、カチオン性脂質法又はリポソーム法を含む。形質導入される核酸は、例えば、市販のトランスフェクション試薬、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより製造、カタログ番号：１１６６８０２７）を使用することにより、形質導入され得る。ベクターが使用される場合、ベクターがプラスミドベクター（即ち、ウイルスベクターではないベクター）である限り、このベクターは、上記の核酸と同じやり方で形質導入され得る。
【０２０３】
形質導入された細胞は、好ましくは、自然環境の外で、管理された条件下で栽培される。特に、用語「培養する」とは、細胞（例えば、形質導入された細胞）がｉｎ  ｖｉｔｒｏであることを意味する。細胞の培養は、元の組織源から分離された細胞を生かしておく実験技術である。本明細書では、本発明に従って使用される形質導入された細胞は、前記形質細胞中又は該細胞上で導入遺伝子の発現を可能にする条件下で培養される。導入遺伝子の発現を可能にする条件は、当該技術分野で一般的に知られている。
【０２０４】
本開示のさらなる態様は、本発明に従って使用される一又は複数のＣＡＲをコードする核酸及びベクターである。核酸分子は、調節配列の制御下であり得る。例えば、ＣＡＲの誘導発現を可能にするプロモーター、転写エンハンサー及び／又は配列が用いられ得る。本発明に関連して、核酸分子は、構成的又は誘導性プロモーターの制御下で発現される。適切なプロモーターは、例えば、ＣＭＶプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＵＢＣプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＰＧＫ（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＥＦ１Ａプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010）, e10611）、ＣＡＧＧプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＳＶ４０プロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＣＯＰＩＡプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＡＣＴ５Ｃプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＴＲＥプロモーター（Qin et al., PLoS One. 5(5) (2010), e10611）、Ｏｃｔ３／４プロモーター（Chang et al., Molecular Therapy 9 (2004), S367-S367 (doi: 10.1016/j.ymthe.2004.06.904））、又はＮａｎｏｇプロモーター（Wu et al., Cell Res. 15(5) (2005), 317-24）である。本明細書では、ベクターという用語は、それが導入された細胞（即ち、形質導入された細胞）において自律的に複製することができる環状又は直鎖状の核酸分子に関する。多くの適切なベクターは、分子生物学の当業者に知られており、その選択は、所望の機能に依拠し、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、及び遺伝子工学で従来から使用されているその他のベクターを含む。当業者によく知られる方法は、様々なプラスミド及びベクターの構築に使用され得る；例えば、Sambrook et al. (loc cit.) and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994）に記載される技術を参照のこと。あるいは、本発明のポリヌクレオチド及びベクターは、標的細胞への送達のためにリポソームに再構成され得る。以下でさらに詳細に説明される通り、クローニングベクターが使用されて、ＤＮＡの個々の配列が単離された。関連する配列は、特定のポリペプチドの発現が必要とされる発現ベクターに移され得る。典型的なクローニングベクターには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、ｐＧＡ１８及びｐＧＢＴ９が含まれる。典型的な発現ベクターには、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＯＰ１３ＣＡＴが含まれる。
【０２０５】
本発明に関連して、ベクターは、多シストロン性であり得る。そのような調節配列（制御エレメント）は、当業者に知られており、プロモーター、スプライスカセット、翻訳開始コドン、ベクターにインサートを導入するための翻訳及び挿入部位を含み得る。本発明に関連して、前記核酸分子は、真核細胞又は原核細胞における発現を可能にする前記発現制御配列に作用可能に結合される。前記ベクターは、本明細書で定義されるＣＡＲをコードする核酸分子を含む発現ベクターであると想定される。作用可能に結合されるとは、そのように記述された成分が意図された方法で機能することを可能にする関係にある並置を指す。コード配列に作用可能に結合した制御配列は、コード配列の発現が制御配列と互換性のある条件下で達成されるような方法で連結される。制御配列がプロモーターである場合、二本鎖核酸が好ましくは使用されることは当業者に明らかである。
【０２０６】
本発明に関連して、列挙されたベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、選択された細胞を変換するために使用することができ、選択された細胞におけるコード配列の発現を提供するコンストラクトである。例えば、発現ベクターは、クローニングベクター、バイナリーベクター又は組み込みベクターであり得る。発現は、核酸分子の好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。原核生物及び／又は真核細胞における発現を確実にする調節要素は、当業者によく知られている。真核細胞の場合、それらは、通常転写の開始を確実にするプロモーター、並びに場合によっては転写の終了及び転写の安定化を確実にするポリＡシグナルを含む。原核宿主細胞に発現することを可能にする存在する可能性のある調節要素は、例えば、大腸菌中のＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターを含み、真核宿主細胞における発現を可能にする調節要素の例は、酵母中のＡＯＸ１又はＧＡＬ１プロモーター、又はＣＭＶ−、ＳＶ４０、ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶ−エンハンサー、ＳＶ４０−エンハンサー又は哺乳動物及び他の動物細胞中のグロブリンイントロンである。
【０２０７】
転写の開始に関与するエレメントの他に、このような調節エレメントは、ポリヌクレオチドの下流の転写終結シグナル、例えばＳＶ４０−ポリ−Ａ部位又はｔｋ−ポリ−Ａ部位も含み得る。さらに、使用される発現系に応じて、ポリペプチドを細胞内コンパートメントに向けることができるか又はそれを培地に分泌することができるシグナルペプチドをコードするリーダー配列は、列挙される核酸配列のコード配列に添加されてもよく、当該技術分野でよく知られている；例えば、添付の実施例も参照のこと。
【０２０８】
リーダー配列は、翻訳、開始及び終結配列、好ましくは、翻訳されたタンパク質又はその一部のペリプラズム空間又は細胞外培地への分泌を指示することができるリーダー配列を用いて適切な段階で組み立てられる。場合によっては、異種配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え産物の安定化又は単純化された精製を与えるＮ末端同定ペプチドを含むＣＡＲをコードすることができる；上掲参照。これに関連して、適切な発現ベクター、例えば、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ、ｐＥＦ−ＡＤＡ又はｐＥＦ−ｎｅｏ（Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001), 141-150）、又はｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）が当該技術分野で知られている。
【０２０９】
Ｔ細胞又はその前駆体細胞に導入された記載された核酸分子又はベクターは、細胞のゲノムに組み込まれ得るか、又は染色体外で維持され得る。
【０２１０】
例示的な実施態様
１．標的抗原に特異的に結合することができる標的抗原結合部分の特異性を評価するための方法であって、以下の工程:
ａ）抗原結合ドメイン及び認識ドメインを含む抗原結合分子を提供する工程であって、抗原結合ドメインが標的抗原結合部分を含み、認識ドメインがタグを含む、工程；
ｂ）抗原結合分子を、表面上に標的抗原を含む標的細胞と接触させる工程であって、標的細胞ががん細胞である、工程；
ｃ）  抗原結合分子を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現レポーターＴ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞と接触させる工程であって、ＣＡＲ−Ｔ細胞が以下： 
ｉ．タグを含む認識ドメインに特異的に結合することができるＣＡＲであって、ＣＡＲが応答エレメントに作用的に結合されている、ＣＡＲ；
ｉｉ．応答エレメントの制御下のレポーター遺伝子
を含む工程；及び
ｄ）  レポーター遺伝子の発現を測定することによりＴ細胞活性化を決定し、標的抗原結合部分の特異性を確立する工程
を含む方法。
【０２１１】
２．抗原結合ドメイン及び認識ドメインが、免疫グロブリンドメイン又はそれらの断片である、実施態様１に記載の方法。
【０２１２】
３．抗原結合ドメイン及び認識ドメインが、抗体、Ｆｃドメイン、Ｆａｂ断片、クロスオーバーＦａｂ断片、一本鎖Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、単一ドメイン抗体、ＶＨ、又はそれらの断片である、実施態様１又は２に記載の方法。
【０２１３】
４．抗原結合分子が、ＩｇＧクラス抗体、特にＩｇＧ１又はＩｇＧ４アイソタイプ抗体、又はその断片である、実施態様１から３のいずれか一つに記載の方法。
【０２１４】
５．抗原結合ドメインがＦａｂ断片であり、認識ドメインがＦｃドメインである、実施態様１から４のいずれか一つに記載の方法。
【０２１５】
６．抗原結合ドメイン及び認識ドメインが、同じドメイン、特にＦａｂ断片である、実施態様１から５のいずれか一つに記載の方法。
【０２１６】
７．ＣＡＲが、タグを含む認識ドメインに特異的に結合することができるが、タグを含まない認識ドメインには特異的に結合することができない、実施態様１から６のいずれか一つに記載の方法。
【０２１７】
８．タグがハプテン分子である、実施態様１から７のいずれか一つに記載の方法。
【０２１８】
９．ハプテン分子が認識ドメインに結合している、実施態様８に記載の方法。
【０２１９】
１０．ハプテン分子が認識ドメインに共有結合している、実施態様１から９のいずれか一つに記載の方法。
【０２２０】
１１．ハプテン分子が認識ドメインに非共有結合している、実施態様１から１０のいずれか一つに記載の方法。
【０２２１】
１２．認識ドメインが規定数のハプテン分子を含む、実施態様１から１１のいずれか一つに記載の方法。
【０２２２】
１３．認識ドメインが、１、２、３又は４を超えるハプテン分子を含まない、実施態様１から１２のいずれか一つに記載の方法。
【０２２３】
１４．認識ドメインが一種を超えるハプテン分子を含む、実施態様１から１３のいずれか一つに記載の方法。
【０２２４】
１５．ハプテン分子が、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）及びフルオレセイン（ＦＩＴＣ）からなる群より選択される、実施態様１から１４のいずれか一つに記載の方法。
【０２２５】
１６．タグがポリペプチドタグである、実施態様１から７のいずれか一つに記載の方法。
【０２２６】
１７．ポリペプチドタグが、１から３０のアミノ酸、１から２５のアミノ酸、１から２０のアミノ酸、１から１５のアミノ酸、又は１から１０のアミノ酸の長さを有する、実施態様１６に記載の方法。
【０２２７】
１８．ポリペプチドタグが、Ｃ末端において、場合によってはペプチドリンカーを通じて、認識ドメインのＮ末端に結合している、実施態様１６又は１７に記載の方法。
【０２２８】
１９．ポリペプチドタグが、Ｎ末端において、場合によってはペプチドリンカーを通じて、認識ドメインのＣ末端に結合している、実施態様１６又は１７に記載の方法。
【０２２９】
２０．ポリペプチドタグが、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ａｖｉタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＧＣＮ４タグ、及びＮＥタグからなる群より選択される、実施態様１６から１９のいずれか一つに記載の方法。
【０２３０】
２１．標的抗原結合部分が、Ｆａｂ断片、特にファージディスプレイライブラリースクリーニング由来のＦａｂ断片である、実施態様１から２０のいずれか一つに記載の方法。
【０２３１】
２２．ＣＡＲが、少なくとも一つの細胞内刺激シグナル伝達及び／又は共刺激シグナル伝達ドメインを含む、実施態様１から２１のいずれか一つに記載の方法。
【０２３２】
２３．標的抗原結合部分の標的抗原への結合及びレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の標的抗原結合部分を含む抗原結合分子への結合が、レポーター遺伝子の発現をもたらす、実施態様２２に記載の方法。
【０２３３】
２４．標的抗原結合部分の標的抗原への結合及びレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の標的抗原結合部分を含む抗原結合分子への結合が、細胞内シグナル伝達及び／又は共刺激ドメインの活性化をもたらす、実施態様２２に記載の方法。
【０２３４】
２５．細胞内シグナル伝達及び／又は共シグナル伝達ドメインが、応答エレメントの活性化をもたらす、実施態様２２から２４のいずれか一つに記載の方法。
【０２３５】
２６．応答エレメントが、レポーター遺伝子の発現を制御する、実施態様１から２５のいずれか一つに記載の方法。
【０２３６】
２７．応答エレメントの活性化が、レポーター遺伝子の発現をもたらす、実施態様１から２６のいずれか一つに記載の方法。
【０２３７】
２８．応答エレメントが、ＮＦＡＴ経路、ＮＦ−κＢ経路又はＡＰ−１経路の一部である、実施態様１から２７のいずれか一つに記載の方法。
【０２３８】
２９．レポーター遺伝子が蛍光タンパク質をコードしている、実施態様１から２８のいずれか一つに記載の方法。
【０２３９】
３０．レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はルシフェラーゼをコードしている、実施態様１から２９のいずれか一つに記載の方法。
【０２４０】
３１．標的抗原が細胞表面抗原又は受容体である、実施態様１から３０のいずれか一つに記載の方法。
【０２４１】
３２．標的抗原が、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ２、ＬｅＹ、ＭＣＳＰ、ＳＴＥＡＰ１、ＴＹＲＰ、及びＷＴ１、又はそれらの断片からなる群より選択される、実施態様１から３１のいずれか一つに記載の方法。
【０２４２】
３３．標的抗原が、ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の分子に結合したペプチドである、実施態様１から３２のいずれか一つに記載の方法。
【０２４３】
３４．標的抗原結合部分がＴ細胞受容体様（ＴＣＲＬ）抗原結合部分である、実施態様３３に記載の方法。
【０２４４】
３５．以下：
ｅ）レポーター遺伝子の発現を基準と比較する工程
の工程を追加で含む、実施態様１から３４のいずれか一つに記載の方法。
【０２４５】
３６．基準が、抗原結合分子の不存在下のレポーター遺伝子の発現である、実施態様３５に記載の方法。
【０２４６】
３７．抗原結合分子の存在下のレポーター遺伝子の発現が、抗原結合分子の不存在下のレポーター遺伝子の発現と比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍、又は１００００倍高い、実施態様３６に記載の方法。
【０２４７】
３８．以下： 
ｆ）抗原結合分子の不存在下でのレポーター遺伝子の発現に対する抗原結合分子の存在下でのレポーター遺伝子の発現が所定の閾値よりも高い場合に、標的抗原結合部分を選択する工程
の工程を追加で含む、実施態様３５に記載の方法。
【０２４８】
３９．閾値が、２、３、４、５、１０、１００、１０００、又は１００００である、実施態様３８に記載の方法。
【０２４９】
４０．抗原結合分子の存在下でのレポーター遺伝子の高レベルの発現及び抗原結合分子の不存在下でのレポーター遺伝子の低レベルの発現が、抗原結合部分の高特異性を示している、実施態様１から３９のいずれか一つに記載の方法。
【０２５０】
４１．抗原結合分子の存在下でのレポーター遺伝子の高レベルの発現及び抗原結合分子の不存在下でのレポーター遺伝子の低レベルの発現が、抗原結合部分を含むＴ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体の高特異性を示している、実施態様１から４０のいずれか一つに記載の方法。
【０２５１】
４２．ＴＣＢ抗体を生成するための方法であって、ＴＣＢ抗体が、標的抗原に特異的な第１の抗原結合部分と、Ｔ細胞活性化受容体に特異的に結合することができる第２の抗原結合部分とを含み、第１の抗原結合部分が実施態様１から４１のいずれか一つに記載の方法に従って選択される、方法。
【０２５２】
４３．Ｔ細胞活性化受容体がＣＤ３である、実施態様４２に記載の方法。
【０２５３】
４４．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法である、実施態様１から４３のいずれか一つに記載の方法。
【０２５４】
４５．固定膜貫通ドメインと、抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、抗原結合部分が、タグを含む認識ドメインに特異的に結合することができるが、タグを含まない認識ドメインには特異的に結合することができない、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【０２５５】
４６．タグがハプテン分子である、実施態様４５に記載のＣＡＲ。
【０２５６】
４７．ハプテン分子が、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）及びフルオレセイン（ＦＩＴＣ）からなる群より選択される、実施態様４６に記載のＣＡＲ。
【０２５７】
４８．ハプテン分子がビオチン又はＤＩＧである、実施態様４６に記載のＣＡＲ。
【０２５８】
４９．ハプテン分子がＤＩＧである、実施態様４６に記載のＣＡＲ。
【０２５９】
５０．タグがポリペプチドタグである、実施態様４５に記載のＣＡＲ。
【０２６０】
５１．ポリペプチドタグが、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ａｖｉタグ、ＦＬＡＧタグ、ｈｉｓタグ、ＧＣＮ４タグ、及びＮＥタグからなる群より選択される、実施態様５０に記載ＣＡＲ。
【０２６１】
５２．ポリペプチドタグが、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＣＮ４タグ及びｈｉｓタグからなる群より選択される、実施態様５１に記載のＣＡＲ。
【０２６２】
５３．固定膜貫通ドメインが、ＣＤ８、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０又はＤＡＰ１２膜貫通ドメイン又はその断片からなる群より選択され、特に、固定膜貫通ドメインがＣＤ２８膜貫通ドメイン又はその断片である、膜貫通ドメインである、実施態様４５から５２のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２６３】
５４．少なくとも一つの刺激シグナル伝達ドメイン及び／又は少なくとも一つの共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む、実施態様４５から５３のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２６４】
５５．少なくとも一つの刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ及びＮＫＧ２Ｄの細胞内ドメイン、又はそれらの断片からなる群より個別に選択され、特に、少なくとも一つの刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ｚ細胞内ドメイン又はその断片である、実施態様４５から５４のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２６５】
５６．少なくとも一つの共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２の細胞内ドメイン、又はそれらの断片からなる群より個別に選択され、特に、少なくとも一つの共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８細胞内ドメイン又はその断片である、実施態様４５から５５のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２６６】
５７．抗原結合受容体が、ＣＤ２８の細胞内ドメイン、又はその断片を含む一つの刺激シグナル伝達ドメインを含み、抗原結合受容体が、ＣＤ３ｚの細胞内ドメイン、又はその断片断片を含む一つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む、実施態様４５から５６のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２６７】
５８．抗原結合部分がｓｃＦｖ断片であり、ｓｃＦｖ断片が、Ｃ末端において、場合によってはペプチドリンカーを通じて、固定膜貫通ドメインのＮ末端に結合している、実施態様４５から５７のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２６８】
５９．抗原結合部分がＦａｂ又はｃｒｏｓｓＦａｂ断片であり、Ｆａｂ又はｃｒｏｓｓＦａｂ断片が、重鎖のＣ末端において、場合によってはペプチドリンカーを通じて、固定膜貫通ドメインのＮ末端に結合している、実施態様４５から５７のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２６９】
６０．ハプテン分子がＤＩＧである、実施態様４５から４９、又は５３から５９のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２７０】
６１．ＤＩＧを含む認識ドメインに特異的に結合することができるが、ＤＩＧを含まない認識ドメインには特異的に結合することができないＣＡＲが：
（ｉ）以下：
（ａ）重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列ＤＹＡＭＳ（配列番号１）；
（ｂ）ＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列ＳＩＮＩＧＡＴＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２）；及び
（ｃ）ＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列ＰＧＳＰＹＥＹＤＫＡＹＹＳＭＡＹ（配列番号３）；を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、
（ｉｉ）以下：
（ｄ）軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列ＲＡＳＱＤＩＫＮＹＬＮ（配列番号４）；
（ｅ）ＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列ＹＳＳＴＬＬＳ（配列番号５）；及び
（ｆ）ＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列ＱＱＳＩＴＬＰＰＴ（配列番号６）；
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と
を含む、実施態様６０に記載ＣＡＲ。
【０２７１】
６２．ハプテン分子がＦＩＴＣである、実施態様４５から４７、又は５３から５９のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２７２】
６３．ＦＩＴＣを含む認識ドメインに特異的に結合することができるが、ＦＩＴＣを含まない認識ドメインには特異的に結合することができないＣＡＲが：
（ｉ）以下：
（ａ）重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列ＨＹＷＭＮ（配列番号４２）；
（ｂ）ＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列ＱＦＲＮＫＰＹＮＹＥＴＹＹＳＤＳＶＫＧ（配列番号４３）；及び
（ｃ）ＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列ＡＳＹＧＭＥＹ（配列番号４４）；
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、
（ｉｉ）以下： 
（ｄ）軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＲ  （配列番号４５）；
（ｅ）ＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列ＫＶＳＮＲＶＳ（配列番号４６）；及び
（ｆ）ＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号４７）；
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と
を含む、実施態様６２に記載ＣＡＲ。
【０２７３】
６４．ハプテン分子がビオチンである、実施態様４５から４８、又は５３から５９のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２７４】
６５．ビオチンを含む認識ドメインに特異的に結合することができるが、ビオチンを含まない認識ドメインには特異的に結合することができないＣＡＲが：
（ｉ）以下：
（ａ）重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列ＧＦＮＮＫＤＴＦＦＱ（配列番号６７）；
（ｂ）ＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列ＲＩＤＰＡＮＧＦＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号６８）；及び
（ｃ）ＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列ＷＤＴＹＧＡＡＷＦＡＹ（配列番号６９）；
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、
（ｉｉ）以下：
（ｄ）軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列ＲＡＳＧＮＩＨＮＹＬＳ（配列番号７０）；
（ｅ）ＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列ＳＡＫＴＬＡＤ（配列番号７１）；及び
（ｆ）ＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列ＱＨＦＷＳＳＩＹＴ（配列番号７２）；
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と
を含む、実施態様６４に記載ＣＡＲ。
【０２７５】
６６．ポリペプチドタグがＨＡタグである、実施態様４５、又は５０から５９のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２７６】
６７．ＨＡタグを含む認識ドメインに特異的に結合することができるが、ＨＡタグを含まない認識ドメインには特異的に結合することができないＣＡＲが：
（ｉ）以下：
（ａ）重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列ＮＹＤＭＡ（配列番号５２）；
（ｂ）ＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列ＴＩＳＨＤＧＲＮＴＮＹＲＤＳＶＫＧ（配列番号５３）；及び
（ｃ）ＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列ＰＧＦＡＨ（配列番号５４）；
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、
（ｉｉ）以下： 
（ｄ）軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列ＲＳＳＫＴＬＬＮＴＲＧＩＴＳＬＹ（配列番号５５）；
（ｅ）ＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列ＲＭＳＮＬＡＳ（配列番号５６）；及び
（ｆ）ＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列ＡＱＦＬＥＦＰＬＴ  （配列番号５７）；
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と
を含む、実施態様６６に記載ＣＡＲ。
【０２７７】
６８．ポリペプチドタグがｍｙｃタグである、実施態様４５、又は５０から５９のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２７８】
６９．ｍｙｃタグを含む認識ドメインに特異的に結合することができるが、ｍｙｃタグを含まない認識ドメインには特異的に結合することができないＣＡＲが： 
（ｉ）以下： 
（ａ）重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列ＨＹＧＭＳ（配列番号７７）；
（ｂ）ＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列ＴＩＧＳＲＧＴＹＴＨＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号７８）；及び
（ｃ）ＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列ＲＳＥＦＹＹＹＧＮＴＹＹＹＳＡＭＤＹ（配列番号７９）；
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、
（ｉｉ）以下： 
（ｄ）軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列ＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＦＳＦＭＮ（配列番号８０）；
（ｅ）ＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列ＡＩＳＮＲＧＳ（配列番号８１）；及び
（ｆ）ＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列ＱＱＴＫＥＶＰＷＴ（配列番号８２）；
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と
を含む、実施態様６８に記載ＣＡＲ。
【０２７９】
７０．ポリペプチドタグがＧＣＮ４タグ（配列番号１０２）である、実施態様４５、又は５０から５９のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２８０】
７１．ＧＣＮ４タグを含む認識ドメインに特異的に結合することができるが、ＧＣＮ４タグを含まない認識ドメインには特異的に結合することができないＣＡＲが： 
（ｉ）以下： 
（ａ）重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）  １アミノ酸配列ＤＹＧＶＮ（配列番号９０）；
（ｂ）ＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列ＶＩＷＧＤＧＩＴＤＨＮＳＡＬＫＳ（配列番号９１）；及び
（ｃ）ＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列ＧＬＦＤＹ（配列番号９２）；
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、
（ｉｉ）以下： 
（ｄ）軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＳ  （配列番号９３）；
（ｅ）ＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列ＧＴＮＮＲＡＰ（配列番号９４）；及び
（ｆ）ＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列ＶＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号９５）；
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と
を含む、実施態様７０に記載ＣＡＲ。
【０２８１】
７２．上に記載の方法。
【実施例】
【０２８２】
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【０２８３】
組み換えＤＮＡ技術
Sambrook et al, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は以下に与えられている：Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242。
【０２８４】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖シーケンシングにより決定された。
【０２８５】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントを、適切なテンプレートを用いてＰＣＲによって生成するか、又は自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ生成物からＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Regensburg, Germany）により合成した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／シーケンシングベクター中でクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。全てのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする、５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。
【０２８６】
タンパク質の精製
標準的なプロトコールを参照して、濾過された細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、抗体を、プロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（GE healthcare）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出はｐＨ２．８で達成され、その直後に試料を中和した。凝集したタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、GE Healthcare）により、ＰＢＳ中又は２０ｍＭのヒスチジン（１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）中の単量体抗体から分離させた。単量体抗体画分をプールし、例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  （３０  ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を使用して濃縮し、−２０℃又は−８０℃で冷凍し、保存した。試料の一部が、その後のタンパク質分析、及び例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による分析的特徴付けのために提供された。
【０２８７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示書に従って使用した。特に、１０％若しくは４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化剤ランニングバッファー添加剤を含む）又はＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニングバッファーを使用した。
【０２８８】
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態の決定のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって実施した。簡潔には、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １１００システムで３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）中のＴｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷカラムに、又はＤｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣ−システムで２倍のＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥヘルスケア）に適用した。ＵＶ吸光度及びピーク面積の積分により、溶出したタンパク質を定量化した。ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １５１−１９０１が標準として機能した。
【０２８９】
抗体の産生
それぞれの抗体は、ポリエチレンイミンを使用してＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることにより産生された。細胞は、対応する発現ベクターを重鎖と軽鎖の１：１の比で用いてトランスフェクトされた。
【０２９０】
Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入
レンチウイルスベクターを生成するために、構成的に活性なヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ）の存在下、レンチウイルスポリヌクレオチドベクター中のフレームでそれぞれのＤＮＡ配列をクローニングした。レトロウイルスベクターには、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）エレメント、ｐＵＣ複製起点、及び細菌の増殖と選択を促進する抗生物質耐性をコードする遺伝子が含有されていた。
【０２９１】
活性化ウイルス粒子を生成するために、６０−７０％融合Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ３２１６）及びＣＡＲ含有ベクター並びに３：１：１：１の比のｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ：ｐＲＳＶ−ＲＥＶ：ｐＣｇｐＶ導入ベクターを使用して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸＴＭベースのトランスフェクションを実施した。４８時間後、上清を回収し、２５０ｇで５分間遠心分離して、細胞片を除去して、０．４５μｍ又は０．２２μｍのポリエーテルスルホンフィルターを通して濾過した。濃縮したウイルス粒子（Ｌｅｎｔｉ−ｘ−  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ，  Ｔａｋａｒａ）を使用して、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ細胞（Ｓｉｇｎｏｓｉｓ）を形質導入した。ＦＡＣＳ−ＡＲＩＡ分類機（BD Bioscience）を使用して、陽性の形質導入細胞をプール又は単一クローンとして分類した。適切な密度に細胞を増加させた後、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞を実験に使用した。
【０２９２】
実施例１
抗ＣＤ２０抗体ＧＡ１０１をジゴキシゲニル化し、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）分子の組み込みをウェスタンブロット分析によって実証した。抗体とジゴキシゲニンのカップリング反応について、２０ｍＭ  Ｈｉｓ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６に溶解した抗体を、初めに脱塩し、ＺｅｂａＴＭＳｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓ  （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号８９８８９）を使用して、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ８）バッファーにバッファー交換した。等モル又はより多くの量（１：３の比）の抗体とジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号１１３３３０５４００１）を、３００ｒｐｍ、振とう機で、室温で１時間インキュベートした。抗体−ジゴキシゲニンコンジュゲートを再度脱塩し、バッファーを２０ｍＭ  Ｈｉｓ  １４０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６に交換した。非コンジュゲートＤｉｇ−ＮＨＳを同じ工程で除去した（カットオフ７ｋＤａ）。
【０２９３】
ウェスタンブロットにおける抗ジゴキシゲニン−ＡＰ  Ｆａｂ断片（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号１１０９３２７４９１０）によって、ジゴキシゲニル化を検出した。１μｇのそれぞれの（非）コンジュゲート抗体を、ＮｕＰＡＧＥＴＭＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  （４Ｘ  （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号ＮＰ０００７）と２０μｌの全体積で混合し、９５℃で５分間沸騰させた。１０μｌをＮｕＰＡＧＥＴＭ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌ、１．０ｍｍ、１０ウェル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号ＮＰ０３２１）に充填し、１ｘＮｕＰＡＧＥＴＭＭＥＳ  ＳＤＳ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  （カタログ番号ＮＰ０００２）で１７０Ｖで１時間実験した。続いて、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）ＴｕｒｂｏＴＭＴｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号１７０４１５０、混合分子量標準プロトコール）を使用して、０，２μｍ  ＰＶＤＦ膜（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）ＴｕｒｂｏＴＭＰａｃｋ，  Ｂｉｏ−Ｒａｄカタログ番号１７０４１５６）にゲルをブロットした。オービタルシェーカーで、ＲＴで１時間にわたって、膜を５％のミルクが入った１ｘＴＢＳ−Ｔバッファーでブロックした。抗ジゴキシゲニン−ＡＰ  Ｆａｂ断片を５％ミルク／ＴＢＳ−Ｔで１：２０００に希釈し、オービタルシェーカーで室温で１時間インキュベートした。膜を１ｘＴＢＳ−Ｔでそれぞれ１０分間、３回洗浄した。その後、膜を２ｍｌのＢＣＩＰ（登録商標）／ＮＢＴ−Ｂｌｕｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  （Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｂ３８０４）で１分間インキュベートした。再蒸留水で３回洗浄した後、膜を乾燥させ、記録した（図６）。
【０２９４】
実施例２
Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞における抗ジゴキシゲニン−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤＣＤ３ｚＳＳＤの発現及びジゴキシゲニン−Ｃｙ５のＣＡＲへの結合を、ＦＡＣＳによって実証した。抗ジゴキシゲニン−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤＣＤ３ｚＳＳＤ形質導入Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞を室温で３分間３００ｇでペレットし、適切な体積でフレッシュなＲＰＭＩ−  １６４０＋１０％  ＦＣＳ＋１％  Ｇｌｕｔａｍａｘ（成長培地）に再懸濁させた。その後３ｘ１０５細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、３００ｇで５分間スピンダウンし、２％  ＦＣＳを含むＰＢＳの１００μｌ中に再懸濁させた。Ｄｉｇ−Ｃｙ５を添加して２０ｎＭの最終濃度にし、氷で４５分間インキュベートした。その後細胞をペレットし、氷冷ＰＢＳに再懸濁させた。洗浄工程をさらに２回繰り返した。その後細胞をフローサイトメトリーを介してＣｙ５シグナル（ＡＰＣチャネル）について分析した（図７）。ネガティブコントロールとして、非形質導入ＮＦＡＴ細胞を等しく処理及び分析した。
【０２９５】
実施例３
ここでは、ＣＤ２０発現ＳＵＤＨＤＬ４腫瘍細胞を標的細胞として使用するレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイ及びレポーター細胞としての抗ジゴキシゲニン−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のソート済プールが記載される（図９）。ジゴキシゲニル化ＧＡ１０１  ＩｇＧ（抗体：Ｄｉｇ−ＮＨＳ比１：１０）をＩｇＧとして使用した。これは一方では腫瘍抗原を認識し、他方では、形質導入Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞により認識される。ポジティブコントロールとして、９６ウェルプレート（Ｃｅｌｌｓｔａｒ  Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ番号６５５１８５）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中１０μｇ／ｍｌＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標））で、４℃で一晩又は３７℃で少なくとも１時間コーティングした。ＣＤ３をコーティングしたウェルをＰＢＳで２回洗浄し、最終の洗浄工程後にＰＢＳを完全に除去した。レポーター細胞又はＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ野生型細胞を数え、Ｃｅｄｅｘ  ＨｉＲｅｓを使用してそれらの生存率について調べた。細胞数を１ｘ１０６生存細胞／ｍｌに調整した。したがって、細胞懸濁液の適切な一定分量を室温（ＲＴ）で５分間、２１０ｇでペレットし、フレッシュなＲＰＭＩ−１６４０＋１０％  ＦＣＳ＋１％  Ｇｌｕｔａｍａｘ（成長培地）に再懸濁させた。対象の抗原を発現する標的細胞を数え、それらの生存率も調べた。細胞数を、成長培地中１ｘ１０６生存細胞／ｍｌに調整した。標的細胞及びレポーター（エフェクター）細胞を５：１のＥ：Ｔ比（合計で１ウェル当たり１１０．０００細胞）で９６ウェル懸濁液培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ  ｏｎｅ）中に三重にプレートした。次の工程として、連続希釈したジゴキシゲニル化ＧＡ１０１抗体（対象の抗原を標的化）を、２ｍｌの深さのウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ（登録商標））を使用して成長培地中に調製した。１ウェル当たり２００μｌの最終体積中１μｇ／ｍｌから０．０１ｐｇ／ｍｌの最終濃度を得るために、５０μｌの一定分量の異なる希釈物をそれぞれのウェルにピペットした。９６ウェルプレートを１９０ｇ及びＲＴで２分間遠心分離した。Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封したプレートを、湿度の高い雰囲気中３７℃及び５％  ＣＯ２でインキュベートした。インキュベーションの２０時間後、多重チャンネルピペットを使用して１０回ピペットアップ及びダウンすることにより、各ウェルの内容物を混合した。１００μｌ細胞懸濁液を新たな白色透明平底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ−ｏｎｅ）に移し、１００μｌのＯＮＥ−ＧｌｏＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。３００ｒｐｍ及び室温で、回転振とう機で暗所における１５分間のインキュベーション後、検出時間１秒／ウェルでＴｅｃａｎ（登録商標）Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーを使用して発光を測定した。標的細胞及びレポーター細胞の５：１の比（灰色の点）での２０時間の共培養において、グラフは、ジゴキシゲニル化ＧＡ１０１  ＩｇＧを抗体として使用したときの抗ジゴキシゲニン−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の用量依存的活性化を示す（図９）。ジゴキシゲニル化されていないＧＡ１０１  ＩｇＧ（図９、灰色の四角形で図示）を使用したとき、検出可能な形質導入Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化はなかった。１μｇ／ｍｌ  ジゴキシゲニル化ＧＡ１０１でインキュベートされたが標的細胞を含まないさらなるＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ野生型細胞は、活性化を示さなかった（図９、黒色の四角形）。対照的に、１μｇ／ｍｌ  ジゴキシゲニル化ＧＡ１０１  ＩｇＧでインキュベートしたが、標的細胞を含まない抗ジゴキシゲニン−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞は、活性化を示した（図９、黒色の三角形）。
【０２９６】
各ポイントは、テクニカルトリプリケートの平均値を表す。全ての値は、補正ベースラインとして図示される。標準偏差は、エラーバーで示す。
【０２９７】
実施例４
レポーター細胞としての抗ジゴキシゲニン−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（図１０）、及び異なる量のジゴキシゲニン（ＤＩＧ）分子に結合した抗ＣＤ２０  ＩｇＧ抗体（ＧＡ１０１）のソート済プールを使用したレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイが本明細書で記載される。エフェクター細胞を数え、Ｃｅｄｅｘ  ＨｉＲｅｓを使用してそれらの生存率を調べた。細胞数を１ｘ１０６生存細胞／ｍｌに調整した。したがって、細胞懸濁液の適切な一定分量を室温（ＲＴ）で５分間、２１０ｇでペレットし、フレッシュなＲＰＭＩ−１６４０＋１０％  ＦＣＳ＋１％  Ｇｌｕｔａｍａｘ（成長培地）に再懸濁させた。１ｘ１０５レポーター細胞を、９６ウェル懸濁液培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ  ｏｎｅ）に三重にプレートした。連続希釈抗ＧＡ１０１抗体を、２ｍｌの深さのウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ（登録商標））を使用して成長培地中に調製した。抗ＧＡ１０１抗体は、平均して、１（１：１  ＧＡ１０１−Ｄｉｇ）、３（１：３  ＧＡ１０１−Ｄｉｇ）又は１０（１：１０  ＧＡ１０１−Ｄｉｇ）ジゴキシゲニン分子のいずれかの特徴を使用した。コントロールとして、非ジゴキシゲニル化抗体（ＧＡ１０１  ｗｔ）を使用した。
【０２９８】
最終的な抗体濃度は、１ウェル当たり２００μｌの最終体積中１μｇ／ｍｌから１ｐｇ／ｍｌの範囲であり、１００μｌの一定分量の異なる希釈物を、レポーター細胞を含有するそれぞれのウェルにピペットした。９６ウェルプレートを１９０ｇ及び室温で２分間遠心分離した。Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封したプレートを、湿度の高い雰囲気中３７℃及び５％  ＣＯ２でインキュベートした。インキュベーションの２０時間後、多重チャンネルピペットを使用して１０回ピペットアップ及びダウンすることにより、各ウェルの内容物を混合した。１００μｌ細胞懸濁液を新たな白色透明平底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ−ｏｎｅ）に移し、１００μｌのＯＮＥ−ＧｌｏＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。３００ｒｐｍ及び室温で、回転振とう機で暗所における１５分間のインキュベーション後、検出時間１秒／ウェルでＴｅｃａｎ（登録商標）Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーを使用して発光を測定した。
【０２９９】
グラフは、ジゴキシゲニル化ＧＡ１０１  ＩｇＧを抗体として使用したときの抗ジゴキシゲニン−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の用量依存的活性化を示す（図１０）。グラフは、さらに、より多くのジゴキシゲニン分子が抗体に結合しているほど、抗ジゴキシゲニン−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化がより強いことを示す。ジゴキシゲニル化されていないＧＡ１０１  ＩｇＧ（図１０、黒色の三角形で図示）を使用した場合、検出可能な形質導入Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化はなかった。
【０３００】
各ポイントは、テクニカルトリプリケートの平均値を表す。全ての値は、補正ベースラインとして図示される。
【０３０１】
実施例５
ここでは、ＣＤ２０発現ＳＵＤＨＤＬ４腫瘍細胞を標的細胞として使用するレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイ及び標的細胞としての抗ジゴキシゲニン−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のソート済プールが記載される（図１１）。１：１ジゴキシゲニル化ＧＡ１０１  ＩｇＧをＩｇＧとして使用した。これは一方では腫瘍抗原を認識し、他方では、形質導入Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞により認識される。エフェクター細胞を数え、Ｃｅｄｅｘ  ＨｉＲｅｓを使用してそれらの生存率を調べた。細胞数を１ｘ１０６生存細胞／ｍｌに調整した。細胞懸濁液の適切な一定分量を室温で５分間、２１０ｇでペレットし、フレッシュなＲＰＭＩ−１６４０＋１０％  ＦＣＳ＋１％  Ｇｌｕｔａｍａｘ（成長培地）に再懸濁させた。対象の抗原を発現する標的細胞を数え、それらの生存率も調べた。レポーター細胞について記載される通りに、細胞数を成長培地中１ｘ１０６生存細胞／ｍｌに調整した。標的細胞及びレポーター（エフェクター）細胞を５：１のＥ：Ｔ比（合計で１ウェル当たり１１０．０００細胞）で９６ウェル懸濁液培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ  ｏｎｅ）中に三重にプレートした。次の工程として、連続希釈したジゴキシゲニル化ＧＡ１０１抗体（対象の抗原を標的化）を、２ｍｌの深さのウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ（登録商標））を使用して成長培地中に調製した。１ウェル当たり２００μｌの最終体積中０．０１μｇ／ｍｌから０．１ｆｇ／ｍｌの最終濃度を得るために、５０μｌの一定分量の異なる希釈物をそれぞれのウェルにピペットした。９６ウェルプレートを１９０ｇ及び室温で２分間遠心分離した。Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封したプレートを、湿度の高い雰囲気中３７℃及び５％  ＣＯ２でインキュベートした。インキュベーションの２０時間後、多重チャンネルピペットを使用して１０回ピペットアップ及びダウンすることにより、各ウェルの内容物を混合した。１００ｕｌ細胞懸濁液を新たな白色透明平底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ−ｏｎｅ）に移し、１００μｌのＯＮＥ−ＧｌｏＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。３００ｒｐｍ及び室温で、回転振とう機で暗所における１５分間のインキュベーション後、検出時間１秒／ウェルでＴｅｃａｎ（登録商標）Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーを使用して発光を測定した。標的細胞及びレポーター細胞の５：１の比（図１１、黒色の三角形）での２０時間の共培養において、グラフは、１：１ジゴキシゲニル化ＧＡ１０１  ＩｇＧを抗体として使用したときの抗ジゴキシゲニン−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の用量依存的活性化を示す。ジゴキシゲニル化されていないＧＡ１０１  ＩｇＧ（図１１、黒色の点で図示）を使用した場合、検出可能な形質導入Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化はなかった。
【０３０２】
各ポイントは、テクニカルトリプリケートの平均値を表す。全ての値は、補正ベースラインとして図示される。標準偏差は、エラーバーで示す。
【０３０３】
実施例６
ここでは、ＬｅＹ発現ＭＣＦ７腫瘍細胞を標的細胞として使用するレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイ及び抗ジゴキシゲニン−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のソート済プールが記載される。２つの抗ＬｅＹ／ビオチン抗体（２＋１、２＋２）及び架橋ビオチン−ジゴキシゲニンアダプターを使用した。抗体は、一方では腫瘍関連抗原を認識し、他方ではビオチン化アダプター分子を認識する。アダプター結合ジゴキシゲニンは、本発明によるＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞により認識される（図１３）。
【０３０４】
第０日に標的細胞を数え、ＣＡＳＹ（登録商標）Ｍｏｄｅｌ  ＴＴＣを使用してそれらの生存率を調べた。細胞を９６ウェルプレートにプレートした（１００μｌ中２０．０００細胞／ウェル）。細胞懸濁液の適切な一定分量を室温（ＲＴ）で３分間、３００ｇでペレットし、適量のフレッシュなＲＰＭＩ−１６４０＋１０％  ＦＣＳ＋１％  Ｇｌｕｔａｍａｘ（成長培地）に再懸濁させた。
【０３０５】
第１日に、対象の抗原を標的化する連続希釈したＬｅＹ／ビオチン抗体誘導体及び等モル量のビオチン−ジゴキシゲニンアダプター分子を、２ｍｌの深さのウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ（登録商標））を使用して成長培地中で調製した。０．０１ｎＭ−１０ｎＭの範囲の最終濃度を得るために、必要量をそれぞれのウェルにピペットした。
【０３０６】
３７℃及び５％  ＣＯ２でのインキュベーションの１時間後、非結合抗体／アダプターを含む培地を除去した。レポーター（エフェクター）細胞を数え、ＣＡＳＹ（登録商標）Ｍｏｄｅｌｌ  ＴＴＣを使用してそれらの生存率を調べ、細胞懸濁液を１ｘ１０６細胞／ｍｌに調整した。細胞懸濁液の適切な一定分量を室温（ＲＴ）で３分間、３００ｇでペレットし、適量のフレッシュなＲＰＭＩ−１６４０＋１０％  ＦＣＳ＋１％  Ｇｌｕｔａｍａｘ（成長培地）に再懸濁させた。１００μｌのレポーター細胞懸濁液（１ｘ１０５細胞／ウェル（５：１  Ｅ：Ｔ比））を各ウェルに添加した。
【０３０７】
プレートを、湿度の高い雰囲気中３７℃及び５％  ＣＯ２でインキュベートした。インキュベーションの２０時間後、１００μｌのＯＮＥ−ＧｌｏＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。３００ｒｐｍ及び室温で、回転振とう機で暗所における５分間のインキュベーション後、検出時間１秒／ウェルでＴｅｃａｎ（登録商標）Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００  Ｐｒｏを使用して発光を測定した。標的細胞及びレポーター細胞の５：１の比（図１３）での２０時間の共培養において、グラフは、アダプター分子及び標的ＬｅＹ抗体誘導体を使用したときの抗ジゴキシゲニン−ｄｓ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の用量依存的活性化を示す。非標的ＣＤ３３／ビオチン抗体＋アダプター、又はアダプター単独を使用した場合、検出可能な形質導入Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化はなかった。
【０３０８】
例示的な配列
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【０３０９】
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【０３１０】
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【０３１１】
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【０３１２】
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【０３１３】
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【０３１４】
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【０３１５】
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【０３１６】
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【０３１７】
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【０３１８】
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【０３１９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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