(57)【要約】  本発明は、細胞または粒子が生成物の再循環によって精製されるマイクロ流体手順に関する。
2021522834.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定のサイズの細胞または粒子を含むサンプルから所定のサイズの標的細胞または標的粒子を分離する方法であって:
a)サンプルおよび洗浄液の両方をマイクロ流体デバイスに分離入口で適用し、ここに：
i)デバイスに適用した洗浄液は前記標的細胞または標的粒子を欠き、所定のサイズ未満の前記細胞または粒子を欠き；
ii)前記マイクロ流体デバイスは、列に並んだ障害物のアレイを含み、但し、障害物の後続の各列は、前の列に対して横方向にシフトし、障害物は、標的細胞または標的粒子を、標的細胞または標的粒子生成物として回収し得る第1の出口に示差的に偏向させ、方向付けるように配置され、所定のサイズ未満の細胞または粒子を第2の出口に送り、そこでそれらは収集されるかまたは廃棄物として廃棄され；
b)デバイスを通してサンプルおよび洗浄液を流すことによって決定論的横方向変位(DLD)を実行し、ここで前記DLDの実行中に、標的細胞または標的粒子生成物の少なくとも一部が、洗浄液の全部または少なくとも一部分がデバイスに適用されるように1回または複数回再循環され；
c)ステップb)の間、またはステップb)の終時に、第1の出口から標的細胞または標的粒子を含む最終生成物を収集する
ことを含む、方法。
【請求項２】
標的細胞または標的粒子生成物が再循環された後、再循環が停止され、洗浄液が再びマイクロ流体デバイスに適用される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
洗浄液が、水または水性バッファーであり、および/またはa)洗浄液中の細胞、粒子または他の成分と化学的に反応する試薬を含み；またはb)標的細胞または標的粒子と特異的に相互作用する抗体、担体またはアクチベーターを含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記第1の出口が、標的細胞または標的粒子生成物をマイクロ流体デバイスの入口に再循環させる導管に迂回させるために使用できるバルブを含むかまたは接続される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
マイクロ流体デバイスが、入口を通ってデバイスに入る供給物を、洗浄バッファーを供給する導管から細胞または標的粒子生成物を供給する導管に切り替えるために使用できるバルブを含むか、またはそれに接続される入口を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記マイクロ流体デバイスに再循環される標的細胞または標的粒子生成物が、マイクロ流体デバイスに再適用される前、間、または後に、担体、抗体、蛍光タグ、アクチベーターまたは化合物と反応するか、または結合する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
細胞または粒子の数が、標的細胞または標的粒子生成物からなる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
サンプル中の濃度に対して、細胞または粒子が少なくとも3倍に濃縮されるまで再循環が継続される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
サンプル中の濃度に対して、細胞または粒子が少なくとも5倍に濃縮されるまで再循環が継続される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
サンプル中の濃度に対して、細胞または粒子が少なくとも10倍に濃縮されるまで再循環が継続される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
マイクロ流体処理を伴う再循環が、細胞または粒子を濃縮するために使用される唯一の方法である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
サンプルが、所定のサイズの標的細胞または幹細胞および所定のサイズ未満の細胞を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
標的細胞が白血球であり、所定のサイズ未満の細胞が血小板または赤血球である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
サンプルが血液、または血液に対してアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス（ロイコアフェレーシス）を行うことによって得られた組成物である、請求項12または13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
再循環される白血球または幹細胞が、DLD分離を促進または補完する方法で担体、抗体、またはアクチベーターに結合される、請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
白血球がT細胞である、請求項13〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、CAR―T細胞を生成するためのプロセスにおいて使用される、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロセスが遠心分離ステップを含まない、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法が、患者への細胞の投与を可能にするのに十分に細胞を濃縮するために使用される、請求項17または18に記載の方法。
【請求項２０】
サンプルが患者から取得され、サンプルの取得が完了してからDLDが完了するまでに4時間以内が経過する、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
請求項12〜20のいずれか1項に記載の方法によって作製されたCAR―T細胞または他の遺伝子操作された細胞、NK細胞、B細胞、単球または幹細胞。
【請求項２２】
精製された遺伝子操作された標的細胞を作製する方法であって:
a)所定のサイズの標的細胞、および、所定のサイズよりも小さい1または複数の汚染細胞または汚染粒子を含むサンプルを取得し；
b)マイクロ流体デバイスに、サンプルを第1の入口で適用し、第2の入口で洗浄流体を適用し、ここで、マイクロ流体デバイスは、標的細胞の流れを第1の出口に、および、所定のサイズよりも小さい汚染細胞または汚染粒子を第2の出口に、視差的に偏向させるように配置された障害物のアレイを含み、そこで標的細胞は標的細胞生成物として回収することができ；
c)サンプルおよび洗浄液をデバイスに流し、ここで、第1の出口での標的細胞の濃度が決定され、標的細胞の少なくとも一部分が、デバイスの入口に適用される洗浄液のすべてまたは少なくとも一部分が置換されるように出口から再循環され、前記再循環は、所望の生成物細胞濃度、PCが達成されるまで継続または繰り返され；
d)PCに到達したら、標的細胞の流れを、第1の出口から、標的細胞が形質転換またはトランスフェクトされて遺伝子操作された標的細胞を形成する部位に指向し；
e)遺伝子操作された標的細胞をデバイスに流動し、そこで試薬、ウイルス、または標的細胞の形質転換またはトランスフェクションに使用される他の材料から分離して、精製された遺伝子操作された標的細胞を形成し；
f)精製された遺伝子操作された標的細胞を収集するか、または精製された遺伝子操作された標的細胞を収集前にさらに処理する別の部位に流動するかのいずれかをする
ことを含む、方法。
【請求項２３】
ステップb)におけるマイクロ流体デバイスへの細胞の適用から細胞の収集までのすべてのステップが、単一の連続プロセスとして実行される、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
標的細胞がリンパ球または幹細胞である、請求項22または23のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
標的細胞がTリンパ球である、請求項22または23のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２６】
Tリンパ球が、その表面上にキメラ抗原受容体(CAR)を生成するように遺伝子操作される、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
ステップb)およびc)において、標的細胞が、DLDによって所定のサイズよりも大きいまたは小さい細胞または粒子から分離される、請求項22〜26のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２８】
ステップe)において、デバイスがマイクロ流体デバイスであり、遺伝子操作された標的細胞が、DLDによる標的細胞の形質転換またはトランスフェクションに使用される試薬、ウイルスまたは他の材料から分離される、請求項22〜27のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２９】
ステップe)において、標的細胞の形質転換またはトランスフェクションに使用される試薬、ウイルスまたは他の材料の分離中に、精製された遺伝子操作された標的細胞が増殖培地に移され、ステップf)で収集され、細胞培養で増殖されるか、または細胞が培養されついで収集される場所に流されるかのいずれかが行われる、請求項22〜28のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
洗浄液が水または水性バッファーであり、および/または:a)洗浄液中で細胞、粒子または他の成分と化学的に反応する試薬を含み；またはb)標的細胞と特異的に相互作用する抗体、担体またはアクチベーターを含む、請求項22〜29のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第1の出口が、標的細胞を、マイクロ流体デバイスの入口に生成物を再循環させる導管に指向させるために使用できるか、標的細胞の流れを第1の出口から、標的細胞が形質転換またはトランスフェクトされて遺伝子操作された標的細胞を形成する部位に指向させることができるバルブを含むかまたはそれに接続される、請求項22〜30のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３２】
バルブが、マイクロ流体デバイス上の入口に生成物を再循環させる導管に標的細胞を指向することによって、PC未満の標的細胞の濃度に電子的に応答し、遺伝子操作された標的細胞を形成するために標的細胞が形質転換またはトランスフェクトされる部位に標的細胞を指向することによって、PC以上の標的細胞の濃度に電子的に応答するように構成される、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記マイクロ流体デバイスに再循環される標的細胞が、マイクロ流体デバイスに再適用される前、再適用中、または再適用された後に、担体、抗体、蛍光タグ、アクチベーターまたは化合物と反応するか、または結合する、請求項22〜32のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３４】
サンプル中の濃度に対して、標的細胞が少なくとも3倍濃縮されるまで再循環が継続される、請求項22〜33のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３５】
サンプル中の濃度に対して、標的細胞が少なくとも5倍に濃縮されるまで再循環が継続される、請求項22〜33のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３６】
マイクロ流体処理を伴う再循環が、細胞または粒子を濃縮するために使用される唯一の方法である、請求項22〜33のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３７】
ステップa)でのサンプルの取得からステップf)での細胞の収集までの全時間の間、標的細胞を遠心分離しない、請求項22〜36のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３８】
ステップa)でのサンプルの取得からステップf)での細胞の収集までの全時間の間、標的細胞を凍結しない、請求項22〜37のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３９】
サンプルが、血液、または血液に対してアフェレーシスまたは白血球アフェレーシスを行うことによって得られた組成物である、請求項22〜38のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４０】
標的細胞が白血球であり、ステップb)およびc)において、血小板および/または赤血球から白血球を分離するためにDLDを行う、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
再循環される白血球または幹細胞が、DLD分離を促進または補完する方法で担体、抗体、またはアクチベーターに結合される、請求項22〜40のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４２】
サンプルが患者から取得され、サンプルの取得が完了してからステップf)が完了するまでに10時間以内が経過する、請求項22〜41のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４３】
サンプルの取得が完了してからステップf)が完了するまで5時間以内が経過する、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
請求項22〜43のいずれか1項に記載の方法によって作製された、精製された遺伝子操作された標的細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は2018年3月13日に出願された米国仮特許出願番号62/670,839の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、生成物を再循環させながらマイクロ流体デバイス上で決定論的な横方向変位を実行することによって、細胞または他の粒子を同時に精製および濃縮する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
決定論的横方向変位(DLD)は通常、2つの並流液体を使用する。1つは粒子(サンプル)を含み、もう1つは洗浄/収集流体(「実行」または「洗浄」流体)である。DLD中、アレイの臨界直径を超える粒子は洗浄液に偏向されるが、臨界直径を下回る粒子はサンプルストリームの流れ方向に従う。最終生成物(収集した)ストリーム内の粒子の濃度は、サンプルストリーム内の粒子の入力濃度、サンプルと洗浄液の比率、および生成物として収集される総量のパーセンテージに依存する。最新のDLD手順を使用して高濃度係数を取得することは可能であるが、汚染のリスクを高める可能性がある(製品ストリームに収集される臨界直径よりも小さい粒子)、または狭い収集幅に効率的にぶつかるために余分な冗長性を備えた非常に長いDLDアレイが必要になる場合がある。
【０００４】
また、DLDによって生成される生成物の濃度を調整して、実行ごとに一貫性を実現したり、異なる入力細胞数の複数のドナーサンプルで得られた結果を標準化することも困難である。サンプルはいつでも希釈できるが、濃縮ははるかに困難である。入力濃度が異なるサンプルは、サンプルごとに異なる事前希釈を行わずに、単一の出力濃度に標準化することはできない。
【０００５】
現在の手順を使用して生成物濃度を制御する際の別の問題は、通常、比較的大量の洗浄液が必要になることである。これらの量を制限すると、生成物濃度が高くなるはずであるが、サンプル量全体を処理するのに十分な洗浄液が常に必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一般的記載
本発明は、生成物ストリームをマイクロ流体デバイスに再循環させ、それらを洗浄液の代わりに適用することによって、DLD生成物の最終濃度を制御することが可能であるというコンセプトに基づいている。最初に、サンプルと洗浄液(本明細書ではより具体的には洗浄緩衝液または試薬とも呼ばれる)の両方がデバイスに供給される。次に、実行中の選択されたポイントで、洗浄液を運ぶ入口が密閉され、デバイスの出口からの製品が洗浄液の場所の入口を通して供給される。これは、標準的なバルブを使用して実現できる。リサイクルされた製品の流れは、例えば、加圧容器、蠕動ポンプ、またはシリンジポンプを使用して推進される。
【０００７】
収集された生成物(P1)がデバイスに再循環される間に、2つのプロセスが発生する。第１に、再循環された生成物に隣接して流れるサンプルは、大きな粒子が「洗浄ストリーム」(ここはP1)に偏向され、製品の出口に向けられるように、サイズに基づいて分別される。第２に、P1の粒子数が増加しているため、生成物濃度が増加する。比率の典型的なセットは、入口で60%のサンプルと40%の洗浄液、出口で20%の生成物と80%の廃棄物である。このような状況で、P1が洗浄液として再循環される場合、洗浄ストリーム内の粒子は、アレイ内および生成物収集ストリーム内にまだ偏向されているため、2倍(40%/ 20%)濃縮される。したがって、収集された生成物(P2)には、その期間中に処理されたサンプルからの細胞に加えて、2倍に濃縮された両方のP1細胞が含まれる。
【０００８】
この方法の利点の1つは、出力生成物の最終濃度が再循環の回数と使用される初期洗浄量に依存することである。したがって、簡単に調整できる。例えば、非常に希薄なドナーサンプルの場合、オペレーターは、洗浄液に対して少量のサンプルのみを実行し、残りのサンプルを処理するために製品を数回再循環させることを選択できる。結果として、より高い濃縮係数が得られる可能性がある。これにより、オペレーター(または計装)は、入力濃度に関係なく、任意の出力濃縮を提供できる。また、入力ドナー濃度に関係なく、下流のアッセイステップに必要な固定された製品濃度を提供するように機器を最適化できることも意味する。ユーザーは、初期ドナー濃度を入力し、目的の出力濃度を選択するだけである。この情報を使用して、機器は選択された値を達成するために再循環の数を調整する。
【０００９】
この方法の別の利点は、別個の濃縮装置を必要とせずに濃縮が達成されることである(インラインまたは2回目のパスとして実行)。細胞の分離に使用されたのと同じDLDで濃縮が発生し、ドナーサンプルの処理に必要な時間は、サンプルが洗浄バッファーに対してのみ実行された場合と同じままである。
【００１０】
必要な洗浄液の体積も大幅に少なくなる。サンプル全体を処理するのに十分な洗浄液を必要とする代わりに、洗浄量は再循環生成物の量に対応する量だけ減少する。例えば、サンプルの約50%が処理された後に再循環が開始された場合、洗浄液の量は約半分に減少する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
実施形態
その第1の態様において、本発明は、所定のサイズ未満の細胞または粒子を含むサンプルから、所定のサイズの標的細胞または標的粒子を分離する方法に関する。この方法は、サンプルと洗浄液を別々の入口にあるマイクロ流体デバイスに適用することを含む。洗浄液は、水または水性緩衝液であり得、そして任意選択で、サンプル成分と化学的に反応する試薬、または標的細胞または標的粒子と特異的に相互作用する、抗体、担体またはアクチベーターを含み得る。デバイスに最初に適用されるように、すなわち、生成物の再循環の前に、洗浄液は、標的細胞または粒子を欠き、所定のサイズ未満の細胞または粒子を含まないべきである。
【００１２】
マイクロ流体デバイスは、好ましくは、流体の流れの方向から小さな角度で傾斜している特別に設計されたマイクロポストのアレイを通してサンプルを流すことを含むプロセスである、決定論的横方向変位(DLD)に構成される (出展明示して本明細書の一部とみなすDavisら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:14779-14784 (2006)；Inglisら, Lab Chip 6:655-658 (2006)；Chenら, Biomicrofluidics. 9(5):054105 (2015))。したがって、マイクロ流体デバイスは、列に配置された障害物のアレイを有し、障害物の後続の各列は、前の列に対して横方向にシフトされる。障害物は、標的細胞または標的粒子を第1の出口(標的細胞または標的粒子生成物として回収し得る)に偏向させ、所定のサイズ未満の細胞または粒子を第2の出口(ここで収集または廃棄物として廃棄し得る)に向けるように配置する必要がある。
【００１３】
DLDは、サンプルと洗浄液をマイクロ流体デバイスに流すことによって実行される。このプロセス中に、標的細胞または標的粒子生成物の少なくとも一部が第1の出口から再循環されて、デバイスの入口に適用される洗浄液のすべてまたは少なくとも一部を置き換える。手順中または手順の最後に、標的細胞または標的粒子を含む最終生成物が第１の出口から得られる。
【００１４】
再循環を容易にするために、マイクロ流体デバイスの第１の出口は、標的細胞または標的粒子生成物をマイクロ流体デバイスの入口に再循環させる導管に迂回させるために使用できる弁を含むか、またはそれに接続され得る。同様に、マイクロ流体デバイスは、洗浄流体を供給する導管から入口を通ってデバイスに入る供給物を、標的細胞または標的粒子生成物を供給する導管に切り替えるために使用することができるバルブを含むかまたはそれに接続する入口を有することができる。
【００１５】
いくつかの実施形態において、マイクロ流体プレートに再循環される標的細胞または標的粒子は、マイクロ流体デバイスに再適用される前、最中、または後に、担体、抗体、蛍光タグ、アクチベーターまたは化合物と反応または結合する。好ましい実施形態において、標的細胞、例えば、白血球、またはより具体的には、T細胞は、標的細胞であり、担体、抗体またはアクチベーターによって特異的に結合される。この文脈で使用される場合、「特異性」という言葉は、サンプルに結合した各非標的細胞に対して、少なくとも100個(好ましくは少なくとも1000個)の標的細胞が担体によって結合されることを意味する。このような結合は、細胞分裂を促進するために(アクチベーターの場合)、または細胞のアッセイまたはさらなる精製を容易にするために(抗体の場合)使用され得る。
【００１６】
担体は、DLD手順中にセルの動作を変更するために使用できる。例えば、ある位置でデバイスを出る細胞は、担体に結合されて、異なる位置で同じデバイスを出る複合体を形成し得る。したがって、他では可能でないであろうサイズベースの分離が達成され得る。この場合、担体の結合は「DLD分離を促進するように」行う必要がある。 この用語は、本文脈で使用される場合、この方法は、特定の標的細胞タイプに対して特異性を示す結合を最終的にもたらさなければならないことを意味し、少なくとも2μmの非結合細胞と比較して複合体のサイズの増加を提供する(あるいは、パーセンテージで表した場合、少なくとも20、50、100、200、500、または1000%)。治療または他の用途が遊離の標的細胞を必要とする場合、それは、例えば、ピペットを使用する物理的剪断、せん断応力を生成するため、または他の手段によって、他の結合剤との競合のために、化学的または酵素的切断、化学的溶解、消化によって標的細胞を複合体から放出することを可能にする。担体は、DLD分離を補完するように結合することもできる。
【００１７】
濃度を決定するために、細胞または粒子の数は、標的細胞または標的粒子生成物から作成され得る。これに基づいて、生成物の再循環を継続するかどうかを決定できる。プロセスを実行する当事者の目的に応じて、サンプル中の濃度と比較して、細胞または粒子は、少なくとも3倍または少なくとも10倍に濃縮され得る。細胞の場合、マイクロ流体処理と組み合わせた再循環が、このプロセス中の濃縮に使用される唯一の方法であることが好ましい。これは、遺伝子操作および/または治療的に使用される細胞に特に当てはまる。
【００１８】
本明細書に記載の方法は、バイオリアクター、フラスコ、培養プレート、培養バッグ、生物学的な流体または抽出物、および組織に由来する調製物に由来する細胞の分離および濃縮に使用し得る。特に好ましいのは、白血球(好ましくはT細胞、最も好ましくはCAR-T細胞)または所定のサイズの幹細胞である。これらの細胞を含むサンプルは、血液、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、または白血球除去を行うことによって得られた組成物、またはロイコパック調製物であり得、典型的には、所定のサイズよりも小さい血小板または赤血球を含む。また、細胞は、電気的、化学的、またはナノ粒子によるトランスフェクションまたはウイルスを使用した形質導入を含む、当技術分野で使用される任意の方法によって遺伝子操作され得る。
【００１９】
場合によっては、再循環される白血球または幹細胞は、DLD分離を促進または補完する方法で、担体、抗体、またはアクチベーターに結合し得る。結合は、細胞がマイクロ流体デバイスを少なくとも1回通過した後、マイクロ流体デバイスに再循環する前、最中、または後に行う必要がある。細胞を治療的に使用する場合、細胞を調製するプロセスには遠心分離ステップを含めるべきではなく、再循環は患者に治療的に投与するのに十分な濃度の細胞が得られるまで、またはその後に行う必要がある。同様に、放出前の濃縮ループへのウイルスまたは遺伝物質の添加が可能かもしれない。さらに、治療に使用される細胞の単離のために患者からサンプルが得られる場合、サンプルの得が完了してからDLDによる細胞の処理が完了するまで4時間以内が経過することが好ましい。
【００２０】
いくつかの修正を加えることにより、本明細書に記載の手順を、より大きなサイズの汚染物質から標的細胞または粒子を分離するように適合させることができることは、当業者には容易に明らかであろう。上記の方法に向けられることとは別に、本発明は、細胞(白血球、幹細胞およびCAR-T細胞を含む)または方法によって産生される粒子を含む。
【００２１】
精製された遺伝子操作された標的細胞を作るための統合された方法
好ましい実施形態において、上記の手順は、遺伝子操作された標的細胞を作製するための方法の一部として使用し得る。特に、本発明は、以下によって精製された遺伝子操作された標的細胞を作製する方法を含む:a)所定のサイズの標的細胞および所定のサイズよりも小さい1つ以上の汚染細胞または汚染粒子を含むサンプルを得；b)サンプルを第1の入口でマイクロ流体デバイスに適用し、第2の入口で洗浄流体に適用し、ここで、マイクロ流体デバイスは、標的細胞の流れを第1の出口に異なって偏向させるように配置された障害物のアレイを含み、そこでそれは標的細胞生成物として回収され、所定のサイズよりも小さい汚染細胞または汚染粒子を第2の出口に向け、そこでそれらは廃棄物として回収または廃棄され得；c)デバイスを通してサンプルおよび洗浄液を流し、ここで、第1の出口での標的細胞の濃度が決定され、標的細胞の少なくとも一部が出口から再循環されて、全部または少なくとも一部が置き換わり、デバイスの入口に適用される洗浄液のうち、前記再循環は、所望の生成物セル濃度、PCに達するまで継続または繰り返され；d)PCに到達したら、第1の出口から収集されるように標的細胞の流れを誘導するか、あるいは、遺伝子操作された標的細胞を形成するために形質転換またはトランスフェクトされる部位に標的細胞の流れを誘導し；e)ステップd）で、標的細胞が形質転換またはトランスフェクトされる場合、好ましくはこの精製が行われる部位またはデバイスに遺伝子操作された標的細胞を流すことによって、遺伝子操作された標的細胞を形成し、遺伝子操作中に使用されるウイルス、試薬または他の材料から遺伝子操作された標的細胞を精製して、精製された遺伝子操作された標的細胞を形成し、f)ステップe)で生成された精製された遺伝子操作された標的細胞を収集するか、またはステップe)で生成された精製された遺伝子操作された標的細胞を、収集前にさらに処理される部位に流す。好ましい実施形態において、ステップb)におけるマイクロ流体デバイスへの細胞の適用から細胞の収集までのすべてのステップは、単一の連続プロセスとして実行される。上記の生成物再循環手順によるマイクロ流体分離以外に、このプロセス中に標的細胞を濃縮するための他の手段を使用しないことも好ましい。
【００２２】
本明細書で使用される「所定のサイズの細胞」という用語は、分離のために選択された標的細胞のサイズをいう。サイズは、実験的に決定されるか、または当技術分野から知られているかのいずれかであり得る。例えば、ヒトT細胞のサイズは、血小板および赤血球のサイズと同様に当技術分野で知られている。したがって、T細胞が「所定のサイズの標的細胞」であり、血小板および赤血球が分離される汚染細胞である分離を行うことができた。「所定のサイズ」という用語は、分離を行うためのマイクロ流体デバイスの設計の文脈でも使用され得る。例えば、障害物アレイを通過する粒子の「臨界サイズ」または「所定のサイズ」という用語を使用して、流体の層流を追跡できる粒子のサイズ限界を記載することができる。より大きな粒子は、例えば、流体のフローチャネルから「バンプ」される可能性があるが、臨界サイズ(または所定のサイズ)よりも小さいサイズを有する粒子は、必ずしも変位されるとは限らない。
【００２３】
リンパ球や幹細胞などの治療的に活性な細胞を含む、多くの種類の細胞が標的細胞に使用され得る。Tリンパ球は、それらの表面にキメラ抗原受容体(CAR)を産生し、治療的に価値のあるキメラ抗原受容体T細胞を形成するように遺伝子操作し得るので、特に好ましい。
【００２４】
所定のサイズよりも小さい細胞または粒子から標的細胞を分離するための最も好ましいプロセス、すなわち、ステップb)およびc)は、DLDによるものである。DLDは、遺伝子操作された標的細胞を、標的細胞の形質転換またはトランスフェクションに使用される試薬、ウイルスまたは他の材料から分離するために、ステップe)でも使用し得る。遺伝子操作された細胞が細胞培養で増殖する場合(通常はCAR T細胞の生産で行われる)、標的細胞の形質転換またはトランスフェクションに使用される材料は、細胞を増殖培地に同時に移しながら、ステップe)で除去し得る。移入された細胞は、収集して培養できる。あるいは、培養が行われる場所に直接流すこともできる。
【００２５】
上記の方法で使用される洗浄液は、水または水性緩衝液であり得、洗浄液中の細胞、粒子または他の成分と化学的に反応する試薬を含み得るか、または標的細胞と特異的に相互作用する抗体、担体または活性化剤を含み得る。
【００２６】
一般に、デバイスを出る標的細胞の方向付けは、弁を含むか、または弁に接続されている出口によるものである。バルブが開いているか閉じているかに応じて、バルブは標的細胞を次のように誘導する。a)出口から導管に細胞を再循環させてマイクロ流体デバイスの入口に送る。またはb)出口から標的細胞が形質転換またはトランスフェクトされて遺伝子操作された標的細胞を形成する部位まで。好ましくは、バルブは、細胞をマイクロ流体デバイス上の入口に再循環させる導管に標的細胞を向けることによって、所望の濃度、PC、未満の標的細胞の濃度に電子的に応答し、標的の濃度に、標的細胞をそれらが収集される部位、またはそれらが遺伝子操作された標的細胞を形成するために形質転換またはトランスフェクトされる部位に向けることにより、PC以上の標的細胞の濃度に電子的に応答する。
【００２７】
マイクロ流体デバイス入口に再循環される標的細胞は、マイクロ流体デバイスに再適用される前、最中、または後に、担体、抗体、蛍光タグ、アクチベーターまたは化合物と反応または結合し得る。例えば、白血球または幹細胞は、DLD分離を促進または補完する方法で、担体、抗体、またはアクチベーターに結合し得る。
【００２８】
標的細胞の再循環は、サンプル中の濃度に対して、標的細胞が少なくとも3倍、好ましくは少なくとも5倍、さらにより好ましくは少なくとも10倍濃縮されるまで継続し得る。また、工程a)でサンプルを採取してから細胞を採取するまでの間、標的細胞を遠心分離または凍結しないことが好ましい。さらに、サンプルは、生成された細胞によって最終的に治療される患者から取得されることが好ましく、サンプルの取得が完了してからステップf)までは10時間以内(好ましくは5時間以内)に完了する。
【００２９】
最も好ましいサンプルは、血液、または血液を処理することによって、例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって処理することによって得られた組成物である。このタイプのサンプルは、例えば、血小板および/または赤血球から白血球を分離するために使用し得る。
【００３０】
本発明は、上記の方法だけでなく、その方法によって作製された精製された遺伝子操作された標的細胞、これらの細胞に基づく治療組成物、および治療組成物が患者の治療に使用される方法も包含する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ−１Ｃ】図1A〜図1Cは、1つのタイプのDLDデバイスのさまざまな動作モードを図示する。これには、i)分離(図1A)、ii)バッファー交換(図1B)、およびiii)濃縮(図1C)が含まれる。各モードにおいて、本質的に臨界直径を超えるすべての粒子が入口点からアレイの方向に偏向し、デバイスの形状の関数としてサイズの選択、バッファー交換、または濃縮が生じる。すべての場合において、臨界直径未満の粒子は、層流条件下でデバイスを直接通過し、その後、出口でデバイスから出る。DLDデバイスは、デバイスの作成および使用方法とともに文献に記載されている（例えば、全体を出展明示して本明細書の一部とみなす米国特許出願公開番号2016/0139012、米国特許出願公開番号2017/0333900；米国特許出願公開番号2016/0047735；米国特許出願公開番号2017/0209864；米国特許出願公開番号2017/0248508；および米国特許出願公開番号2019/0071639参照）。
【図１Ｄ】図1Dは、分離モードで使用される14レーンのDLD設計を示す。図示したアレイおよびマイクロチャネルの全長は75mm、幅は40mmで、個々のレーンの幅は1.8mmである。
【図１Ｅ】図1Eは、プラスチック製のダイヤモンドポストアレイおよび出口の統合収集ポートの拡大図である。
【図１Ｆ】図1Eは、プラスチック製のダイヤモンドポストアレイおよび出口の統合収集ポートの拡大図である。
【図１Ｇ】図1Gは、デバイスを使用して処理されている白血球アフェレーシス生成物の写真を示す。
【図２】図2は、特定のアプリケーションで要求されるスループットを行うために、現在の個々のチップがレイヤーでスタック可能になるように設計されていることを示す概略図である。
【図３】図3の左端の図は、DLD中のセルの動きを示す。バッファーおよびサンプルは、別々の注入口でデバイスに適用される。サンプルが出口に向かって進むと、アレイの臨界サイズより大きいサイズのセルがサンプルの流れ(チャネルの外側のハッチング部分)からバッファーの流れ(チャネルの中央、点描部分)に移動し、最終的に生成物出口を出る。パネル1〜3は、生成物の再循環が行われるDLD手順のさまざまなステップを示している。パネル1においては、サンプル(上部サンプルリザーバー中の白部分)およびバッファー(上部バッファーリザーバーの点描部分)が別々の注入口からマイクロ流体デバイスに適用される。アレイの臨界サイズを超える細胞を含む生成物は、生成物出口(下部の生成物リザーバーの点描部分)から収集され、廃棄物は廃棄物出口(下部の廃棄物リザーバー中のクリア部分)から収集される。生成物リザーバーからバッファー入口までのバルブは閉じているのに対し、バッファーリザーバーからバッファー入口までのバルブは開いていることに注意すること。パネル2においては、生成物リザーバーからバッファー入口までのバルブが開かれ、バッファーリザーバーからバッファー入口までのバルブが閉じられている。その結果、製品はマイクロ流体デバイスに再循環される。パネル3においては、処理がほぼ完了している。廃棄物の総量は増加し、生成物の総量は減少している。
【００３２】
実例となる表
手順から予想される計算結果を以下の表に示す。数値は、14レーンのマイクロ流体デバイスの入力条件および出力条件の選択されたセットに基づく。異なるレイアウト(および入口/出口の比率)を持つマイクロ流体デバイスは、異なるスケールの数値を持つことを認識しておく必要がある。
【００３３】
【表１】
2021522834.tif 000003
【００３４】
【表２】
2021522834.tif 000004
【００３５】
【表３】
2021522834.tif 000005
【００３６】
【表４】
2021522834.tif 000006
【００３７】
【表５】
2021522834.tif 000007
【００３８】
定義
アフェレーシス:本明細書で使用される場合、この用語は、患者またはドナーからの血液がその成分、例えば、血漿、白血球、および赤血球に分離される手順をいう。より具体的な用語は、「血小板フェレーシス」(血小板の分離をいう)および「白血球（ロイコ）アフェレーシス」(白血球の分離をいう)である。この文脈において、「分離」という用語は、全血と比較して特定の成分が豊富な生成物を得ることをいい、絶対的純粋が達成されたことを意味するものではない。
【００３９】
CAR T細胞:「CAR」という用語は「キメラ抗原受容体」の頭字語である。 したがって、「CAR T細胞」は、キメラ受容体を発現するように遺伝子操作されたT細胞である。CAR T細胞を作製および使用する方法は、当技術分野でよく知られている。手順は、例えば、出展明示して本明細書の一部の一部とみなす米国特許第9,629,877号；米国特許第9,328,156号；米国特許第8,906,682号；米国特許出願公開番号2017/0224789；米国特許出願公開番号2017/0166866；米国特許出願公開番号2017/0137515；米国特許出願公開番号2016/0361360；米国特許出願公開番号2016/0081314；米国特許出願公開番号2015/0299317および米国特許出願公開番号2015/0024482に記載されている。
【００４０】
CAR T細胞療法:この用語は、疾患がCART細胞で治療されるあらゆる手順をいう。治療できる疾患には、血液がんおよび固形腫瘍がん、自己免疫疾患、感染症が含まれる。
【００４１】
担体:本明細書で使用される場合、「担体」という用語は、直接的または間接的に(すなわち、１以上の媒介細胞、粒子または化合物を介して)結合する目的で調製物に添加される、生物学的または合成材料のいずれかで作られた薬剤、例えば、ビーズまたは粒子をいう。担体は、DEAE-デキストラン、ガラス、ポリスチレンプラスチック、アクリルアミド、コラーゲン、アルギン酸塩など、さまざまな材料で作ることができ、通常、サイズは1〜1000μmである。それらは、コーティングされていてもコーティングされていなくてもよく、細胞の表面上の抗原または他の分子を認識する親和性剤(例えば、抗体、アクチベーター、ハプテン、アプタマー、粒子または他の化合物)を含むように修飾される表面を有する担体は磁化されてもよく、これはDLDを補完するための追加の精製手段を提供し得、それらは細胞または細胞複合体にサイズに関連しない二次特性を与える粒子(例えば、ヤヌスまたはイチゴ様粒子)を含み得る。
【００４２】
例えば、粒子は、磁気分離、エレクトロポレーション、遺伝子導入、および/または特定の分析化学プロセスなどの下流プロセスで使用できる化学的、電気化学的、または磁気的特性をもたらす可能性がある。粒子はまた、細胞の代謝変化を引き起こしたり、細胞を活性化したり、細胞分裂を促進したりする可能性がある。
【００４３】
「DLD分離を促進する方法で」結合する担体:この用語は、状況に応じて、細胞、タンパク質、または粒子がDLD中に動作する方法に影響を与える担体および担体を結合する方法をいう。具体的には、「DLD分離を促進する方法での結合」とは、次のことを意味する。a)結合は、特定の標的細胞タイプ、タンパク質、または粒子に対して特異性を示さなければならない；およびb)結合していない細胞、タンパク質、または粒子と比較して、複合体のサイズを大きくする複合体を生成しなければならない。標的細胞に結合する場合、少なくとも２μｍの増加が必要である(あるいは、パーセンテージで表した場合、少なくとも20、50、100、200、500、または1000%)。治療または他の用途が、標的細胞、タンパク質または他の粒子がそれらの意図された用途を満たすために複合体から放出されることを必要とする場合、「DLD分離を促進する方法で」という用語はまた、複合体がそのような放出を可能にすることを必要とする。他の結合剤との競合による、または物理的剪断(例えば、ピペットを使用して剪断応力を生成する)による化学的または酵素的切断、化学的溶解、消化、および遊離した標的細胞、タンパク質または他の粒子は、活性を維持しなければならない。例えば、複合体から放出された後の治療用細胞は、それらを治療的に有用にする生物学的活性を依然として維持しなければならない。
【００４４】
担体は「DLD分離を補完する方法で」結合する可能性がある:この用語は、それがDLD分離を促進するのに十分にサイズを大きくするかどうかに関わりなく、細胞または細胞複合体の化学的、電気化学的、または磁気的特性を変化させる、または細胞の1つ以上の生物学的活性を変化させる担体および結合担体の方法をいう。DLD分離を補完する担体も、必ずしも標的細胞に特異的に結合するわけではない、すなわち、それらを特異的にする他の薬剤と組み合わせる必要がある場合もあれば、単に細胞調製物に添加して非特異的な結合を許容する場合もある。「DLD分離を補完する方法で」と「DLD分離を促進する方法で」という用語は、互いに排他的ではない。結合は、DLD分離を補完し、DLD分離を促進する可能性がある。例えば、多糖担体は、細胞増殖の速度を増加させるその表面上にアクチベーターを有し得、これらの担体の1つ以上の結合もまた、DLD分離を促進し得る。あるいは、結合は、DLD分離を促進するか、DLD分離を補完するだけとなり得る。
【００４５】
標的細胞：本明細書で使用される「標的細胞」は、本明細書に記載の様々な手順が必要とするか、または精製、収集、操作などするように設計された細胞である。特定の細胞が何であるかは、その用語が使用される文脈に依存する。たとえば、手順の目的が特定の種類の幹細胞を分離することである場合、その細胞は手順の標的細胞になる。
【００４６】
単離、精製:特に明記しない限り、これらの用語は、本明細書で使用される場合、同義であり、望ましくない材料に対する所望の生成物の濃縮をいう。これらの用語は、必ずしも生成物が完全に分離されている、または完全に純粋であることを意味するわけではない。例えば、開始サンプルがサンプル中の細胞の2%を構成する標的細胞を有し、標的細胞が存在する細胞の60%である組成をもたらす手順が実行された場合、手順は標的細胞の分離または精製において成功したであろう。
【００４７】
決定論的横方向変位:本明細書で使用される場合、「決定論的横方向変位」または「DLD」という用語は、いくつかのアレイパラメータに関連するサイズに基づいて、粒子がアレイを通る経路上で決定論的に偏向されるプロセスをいう。プロセスは、一般に、連続流(DC条件；すなわち、一方向のみのバルク流体流)の観点から本明細書に記載されている。しかしながら、DLDは振動流(AC条件、すなわち、2つの方向の間で交互に流れるバルク流体の流れ)でも機能する。
【００４８】
臨界サイズ:障害物アレイを通過する粒子の「臨界サイズ」または「所定のサイズ」は、流体の層流を追跡できる粒子のサイズ制限を表す。臨界サイズよりも大きい粒子は、流体のフローチャネルから「落（す」）される可能性があるが、臨界サイズ(または所定のサイズ)よりも小さいサイズの粒子は、必ずしもそのように変位するわけではない。ギャップを通る流体の流れのプロファイルが、バルクの流体の流れの方向にギャップを二等分する平面に対して対称である場合、臨界サイズはギャップの両側で同じである可能性がある；ただし、プロファイルが非対称の場合、ギャップの両側の臨界サイズが異なる可能性がある。
【００４９】
流体の流れ:DLDに関連して本明細書で使用される「流体の流れ」および「バルクの流体の流れ」という用語は、障害物アレイを横切る一般的な方向への流体の巨視的な動きをいう。これらの用語は、流体が全方向に移動し続けるために、流体が障害物の周りを移動するための流体の流れの一時的な変位を考慮していない。
【００５０】
傾斜角ε:バンプアレイデバイスにおいて、傾斜角は、バルク流体の流れの方向と、アレイ内の連続する(バルク流体の流れの方向の)障害物の列の整列によって定義される方向との間の角度である。
【００５１】
アレイの方向:バンプアレイデバイスでは、「アレイの方向」は、アレイ内の連続する障害物の行の配置によって定義される方向である。粒子は、ギャップを通過して下流の障害物に遭遇した場合に、粒子の全体的な軌道がバンプアレイのアレイ方向に従う場合(すなわち、バルク流体の流れに対して傾斜角εで移動する場合)、バンプアレイ内で「バンプ」される（落される）)。そのような状況下で、粒子の全体的な軌道がバルク流体の流れの方向に従う場合、粒子は落されない。
【００５２】
発明の詳細な説明
本発明は、治療的価値のある細胞を調製する際のDLDの使用に関する。以下のテキストは、本明細書に開示される方法に関する一般的なガイダンス、およびそれらの方法の実行に関与するデバイスの製造および使用を支援する可能性のある情報を提供する。
【００５３】
I.  マイクロ流体プレートの設計
細胞、特にアフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって調製された組成物中の細胞、および粒子は、流体がデバイスの一端またはその近くの1つまたは複数の入口から出口またはその近くのまたは反対側の出口に流れるチャネルを含むマイクロ流体デバイスを使用してDLDを実行することによって分離できる。サイズベースのマイクロ流体分離の基本原理および細胞を分離するための障害物アレイの設計は、他の出願で提供されている(出展明示して本明細書の一部とみなす米国特許出願公開番号2014/0342375；米国特許出願公開番号2016/0139012；米国特許第7,318,902号および米国特許第7,150,812号参照）。これらは以下のセクションにも要約する。
【００５４】
DLD中に、粒子または細胞を含む流体サンプルが入口でデバイスに導入され、デバイスを通って出口に流れる流体とともに運ばれる。サンプル内の細胞がデバイスを通過するときに、列に配置され、細胞が通過しなければならないギャップまたは細孔を形成する支柱または他の障害物に遭遇する。障害物の連続する各列は、フローチャネル内の流体の流れの方向とは異なる配列方向を形成するように、前の列に対して変位する。これらの2つの方向によって定義される「傾斜角」は、障害物間のギャップの幅、障害物の形状、およびギャップを形成する障害物の方向とともに、アレイの「臨界サイズ」を決定する主な要素である。臨界サイズよりも大きいサイズの細胞は、バルク流体の流れの方向ではなく、アレイの方向に移動し、臨界サイズよりも小さいサイズの粒子は、バルク流体の流れの方向に移動する。アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス由来の組成物に使用されるデバイスでは、赤血球および血小板がバルク流体の流れの方向に継続するのに対して、白血球がアレイ方向に迂回する結果となるアレイ特性を選択できる。選択されたタイプの白血球を同様のサイズを有する他の白血球から分離するために、次に、DLD分離を促進する方法でその細胞に結合し、それによって複合体を形成していない白血球よりも大きい複合体をもたらす担体を使用できる。次に、複合体よりも小さいが複合体化されていない細胞よりも大きい臨界サイズを有するデバイス上で分離を実行することが可能である可能性がある。
【００５５】
デバイスで使用される障害物は、柱の形をとるか、三角形、正方形、長方形、ひし形、台形、六角形、または涙の形をとり得る。さらに、隣接する障害物は、ギャップを定義する障害物の部分が、バルク流体の流れの方向に延びるギャップの軸に関して対称または非対称のいずれかであるような形状を有し得る。
【００５６】
II.  マイクロ流体デバイスの作製および操作 
サイズに基づいて細胞または粒子を分離できるマイクロ流体デバイスを作製および使用するための一般的な手順は、当技術分野で周知である。そのような装置には、米国特許第5,837,115号；米国特許第7,150,812号；米国特許第6,685,841号；米国特許第7,318,902号；米国特許第 7,472,794号；および米国特許第7,735,652号に記載されているものが含まれる。これらはすべて、出展明示して本明細書の一部とみなす。本発明の装置の製造および使用に役立つ可能性のあるガイダンスを提供する他の参考文献には、以下が含まれる。米国特許第7,276,170号；米国特許第6,913,697号；米国特許第7,988,840号；米国特許第8,021,614号；米国特許第8,282,799号；米国特許第8,304,230号；米国特許第8,579,117号；米国特許出願公開番号2006/0134599；米国特許出願公開番号2007/0160503；米国特許出願公開番号2005/0282293；米国特許出願公開番号2006/0121624；米国特許出願公開番号2005/0266433；米国特許出願公開番号2007/0026381；米国特許出願公開番号2007/0026414；米国特許出願公開番号2007/0026417；米国特許出願公開番号2007/0026415；米国特許出願公開番号2007/0026413；米国特許出願公開番号2007/0099207；米国特許出願公開番号2007/0196820；米国特許出願公開番号2007/0059680；米国特許出願公開番号2007/0059718；米国特許出願公開番号2007/005916；米国特許出願公開番号2007/0059774；米国特許出願公開番号2007/0059781；米国特許出願公開番号2007/0059719；米国特許出願公開番号2006/0223178；米国特許出願公開番号2008/0124721；米国特許出願公開番号2008/0090239；米国特許出願公開番号2008/0113358；およびWO2012/094642が含まれ、これらは出展明示して本明細書の一部とみなす。デバイスの製造と使用を説明するさまざまな参考文献の中で、米国特許第7,150,812号は特に優れたガイダンスを提供し、米国特許第7,735,652号は、血液中に見られる細胞を含むサンプルで実行される分離用のマイクロ流体デバイスに関して特に興味深いものである(この点については、米国特許出願公開番号2007/0160503を参照)。
【００５７】
デバイスは、シリコン、ガラス、プラスチック、ハイブリッド材料など、マイクロスケールおよびナノスケールの流体処理デバイスが通常製造される材料のいずれかを使用して作製できる。マイクロ流体製造に適したさまざまな熱可塑性材料が利用可能であり、特定の用途に合わせて活用およびさらに調整できる機械的および化学的特性の幅広い選択肢を提供する。
【００５８】
デバイスを作製するための技術には、レプリカ成形、PDMSを使用したソフトリソグラフィー、熱硬化性ポリエステル、エンボス加工、射出成形、レーザーアブレーションおよびそれらの組み合わせが含まれる。さらなる詳細は、フィオリーニらによる「Disposable microfluidic devices: fabrication, function and application」(BioTechniques 38:429-446(2005年3月))に見出すことができ、これは、出展明示して本明細書の一部とみなす。Keith E. HeroldおよびAvraham Rasoolyが編集した「Lab on a Chip Technology」，Caister Academic Press Norfolk UK(2009)は、作製方法の別のリソースであり、出展明示して本明細書の一部とみなす。
【００５９】
熱可塑性プラスチックのリールツーリール処理などのハイスループットエンボス加工法は、工業用マイクロ流体チップ製造にとって魅力的な方法である。シングルチップホットエンボス加工の使用は、プロトタイピング段階で高品質のマイクロ流体デバイスを実現するための費用効果の高い手法である。2つの熱可塑性プラスチック、ポリメチルメタクリレート(PMMA)および/またはポリカーボネート(PC)でマイクロスケールの特徴を複製する方法は、Yangraによる「熱可塑性ホットエンボス加工によるマイクロ流体デバイスの製造」(Methods Mol. Biol., 949:115-23)(2013))に記載されており、これは出展明示して本明細書の一部とみなす。
【００６０】
フローチャネルは、組み立てられたときに、その中に障害物が配置された閉じた空洞(好ましくは、流体を追加または引き出すためのオリフィスを有するもの)を形成する2つ以上の部品を使用して構築できる。障害物は、フローチャネルを形成するために組み立てられる1つまたは複数の部品上に製造でき、またはフローチャネルの境界を定義する2つまたは複数の部品の間に挟まれたインサートの形態で製造できる。
【００６１】
障害物は、フローチャネルを横切る、場合によってはフローチャネルの一方の面からフローチャネルの反対側の面まで延びる固体とすることができる。障害物が、障害物の一端でフローチャネルの面の1つと一体である(またはその延長である)場合、障害物の他端は、フローチャネルの反対側の面にシールまたは押し付けられ得る。障害物の構造的安定性またはデバイスの適切な流動特性に悪影響を及ぼさない限り、障害物の一端とフローチャネルの面との間の小さなスペース(好ましくは、意図された用途のために目的の粒子を収容するには小さすぎる)は許容される。
【００６２】
存在する障害物の数は、アレイの粒子分離特性を実現するのに十分でなければならない。障害物は通常、行と列に編成できる(注:「行と列」という用語の使用は、行と列が互いに垂直であることを意味または意味するものではない)。フローチャネル内の流体の流れを横切る方向に一般的に整列している障害物は、カラム内の障害物という場合がある。カラム内で互いに隣接する障害物は、流体が流れるギャップを定義し得る。
【００６３】
隣接するカラムの障害物は、ε(イプシロン)と呼ばれる傾斜角によって特徴付けられる程度によって互いにオフセットし得る。したがって、互いに隣接するいくつかのカラム(すなわち、一般にカラムを横切る一方向の流体の流れによって連続的に通過する障害物のいくつかのカラム)について、カラム内の対応する障害物は、対応する障害物が互いにオフセットされ得る。カラムを通過する流体の流れの方向に対して角度εで延びる障害物の列を形成する。1/ε(ラジアンで表される場合)が整数であり、障害物のカラムが周期的に繰り返されるように、傾斜角度を選択し、列を互いに離すことができる。単一のカラム内の障害物は、同じまたは異なる傾斜角度によって互いにオフセットすることもできる。例として、行と列は、フローチャネルを通るバルク流体の流れの方向に対してεの同じ角度で、行と列の両方が傾斜した状態で、互いに対して90度の角度で配置できる。
【００６４】
表面をコーティングしてその特性を修飾でき、デバイスの製造に使用される高分子材料をさまざまな方法で変更し得る。幾つかの場合において、天然ポリマーに含まれるか、湿式化学またはプラズマ処理によって添加されるアミンやカルボン酸などの官能基を使用して、タンパク質または他の分子を架橋する。DNAは、表面アミン基を使用してCOCおよびPMMA基板に結合し得る。Pluronic（登録商標）などの界面活性剤を使用して、Pluronic（登録商標）をPDMS処方に添加することにより、表面を親水性およびタンパク質反発性にし得る。いくつかの場合において、PMMAの層がデバイス、例えばマイクロ流体チップ上にスピンコーティングされ、PMMAにヒドロキシプロピルセルロースが「ドープ」されて、その接触角を変化する。
【００６５】
細胞または化合物の非特異的吸着を低減するために、例えば、溶解細胞によって放出されるか、または生物学的サンプルに見出されて、チャネル壁に、1つまたは複数の壁を化学的に修飾して非付着性または反発性にし得る。壁は、ヒドロゲルを形成するために使用されるものなどの市販の非粘着性試薬の薄膜コーティング(例えば、単層)でコーティングし得る。チャネル壁を修飾するために使用できる化学種のさらなる例には、オリゴエチレングリコール、フッ素化ポリマー、オルガノシラン、チオール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、ウシ血清アルブミン、ポリビニルアルコール、ムチン、ポリHEMA、メタクリル化PEG、およびアガロースが含まれる。ヘパリンなどの荷電ポリマーを使用して、反対に荷電した種をはじき得る。反発に使用される化学種のタイプおよびチャネル壁への付着方法は、反発される種の性質、および壁および付着される種の性質に依存し得る。そのような表面改質技術は当技術分野でよく知られている。壁は、デバイスが組み立てられる前または後に官能化し得る。
【００６６】
III.  DLDを使用する分離プロセス
本明細書に記載のDLDデバイスは、細胞、細胞断片、細胞付加物、または核酸を精製するために使用し得る。本明細書で論じられるように、これらのデバイスはまた、目的の細胞集団を複数の他の細胞から分離するために使用され得る。デバイスを使用した血液成分の分離および精製は、例えば、米国特許出願公開番号US2016/0139012に見出すことができ、その教示は、出展明示して本明細書の一部とみなす。いくつかの例示的な分離についての簡単な説明を以下に示す。
【００６７】
A.生存細胞
１つの実施形態において、デバイスは、生存細胞を非生存細胞から分離するように設計された手順で使用される。「生存細胞」という用語は、成長できる、活発に分裂する、複製できるなどの細胞をいう。生存細胞が非生存細胞よりも大きいサイズを有する場合、DLDデバイスは、非生存細胞の所定のサイズよりも大きく、生存細胞の所定のサイズよりも小さい臨界サイズを含むように設計し得る。臨界サイズは、非生存細胞の所定のサイズよりもわずか1.1倍大きい(または小さい)場合があるが、一般に、より大きな程度(またはより小さい)、例えば、約1.2倍〜2倍、好ましくは3〜10倍が好ましい。
【００６８】
B.付着細胞
もう１つの実施形態において、DLDデバイスを使用して付着細胞を分離し得る。本明細書で使用される「付着細胞」という用語は、表面に付着できる細胞をいう。接着細胞には、細胞培養に使用される不死化細胞が含まれ、哺乳類の宿主に由来し得る。幾つかの例において、付着細胞は精製前にトリプシン処理されてもよい。付着細胞の例には、MRC-5細胞；HeLa細胞；ベロ細胞；NIH3T3細胞；L929細胞；Sf21細胞；Sf9細胞；A549細胞；A9細胞；AtT-20細胞；BALB/3T3細胞；BHK-21細胞；BHL-100細胞；BT細胞；Caco-2細胞；Chang細胞；Clone 9細胞；Clone M-3細胞；COS-1細胞；COS-3細胞；COS-7細胞；CRFK細胞；CV-1細胞；D-17細胞；Daudi細胞；GH1細胞；GH3細胞；HaK細胞；HCT-15細胞；HL-60細胞；HT-1080細胞；HT-29細胞；HUVEC細胞；I-10細胞；IM-9細胞；JEG-2細胞；Jensen細胞；Jurkat細胞；K-562細胞；KB細胞；KG-1細胞；L2細胞；LLC-WRC256細胞；McCoy細胞；MCF7細胞；WI-38細胞；WISH細胞；XC細胞；Y-1細胞；CHO細胞；Raw264.7；BHK-21細胞；293A、293Tなどを含むHEK293細胞；HEP G2細胞；BAE-1細胞；SH-SY5Y細胞；およびその誘導体、操作された株および組換え株が含まれる。
【００６９】
いくつかの実施形態において、手順は、付着細胞の培養物の効率的な維持を提供し得る増殖培地などの希釈剤から細胞を分離することを含み得る。例えば、増殖培地における付着細胞の培養物は、トランスフェクション試薬を含むトランスフェクション培地、幹細胞の分化などの付着細胞内の変化を誘発するように設計された第2の増殖培地、または培養液から化合物を除去するように設計された一連の洗浄緩衝液に交換できる。
【００７０】
好ましい手順において、付着細胞は、DLD分離を促進する方法で結合する1つまたは複数の担体との会合を通して精製される。担体は、本明細書に記載のタイプのものであり得、結合は、細胞を安定化および/または活性化し得る。担体は通常１〜１０００μｍの範囲にあるが、この範囲外の場合もある。
【００７１】
担体と細胞との間の会合は、担体と関連していない他の材料と比較してサイズが増加した複合体を生成するはずである。細胞および担体の特定のサイズならびに存在する細胞および担体の数に応じて、複合体は、複合体を形成していない細胞よりも数パーセント大きいものから、複合体を形成していない細胞のサイズの何倍にもなる可能性がある。分離を容易にするために、少なくとも20%の増加が望ましく、より高いパーセンテージ(50；100；1000以上)が好ましい。
【００７２】
C.活性化細胞
DLDデバイスはまた、複数の他の細胞から、活性化細胞または活性化可能な細胞を分離するための手順において使用し得る。活性化を受けている細胞は大規模に増殖できるが、好ましい実施形態において、細胞は単一の患者に由来し、DLDは収集後少なくとも数時間以内に行う。「活性化細胞」または「活性化可能な細胞」という用語は、細胞アクチベーターとの会合、インキュベーション、または接触を通じて、それぞれ活性化された、または活性化され得る細胞をいう。活性化可能な細胞の例には、T細胞、B細胞；調節性T細胞、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、生来のリンパ系細胞、巨核球、ナチュラルキラー細胞、血小板、滑膜細胞など免疫または炎症反応において役割を果たす細胞；ベータ細胞、肝細胞、膵臓細胞などの代謝において役割を果たす細胞；およびDE3溶原化E.coli細胞、酵母細胞、植物細胞などの誘導性タンパク質発現が可能な組換え細胞などが含まれ得る。
【００７３】
通常、1つまたは複数の担体の表面にアクチベーターが存在する。細胞アクチベーターの例には、タンパク質、抗体、サイトカイン、CD3、CD28、特定のタンパク質に対する抗原、ヘルパーT細胞、受容体、および糖タンパク質；インスリン、グルカゴンなどのホルモン；IPTG、ラクトース、アロラクトース、脂質、グリコシド、テルペン、ステロイド、およびアルカロイドが含まれる。活性化可能細胞は、活性化可能細胞と担体の表面上の細胞アクチベーターとの間の相互作用を介して、担体と少なくとも部分的に会合しているべきである。形成された複合体は、複合体を形成していない細胞よりもわずか数パーセント大きいか、複合体を形成していない細胞のサイズの何倍も大きい可能性がある。分離を容易にするために、少なくとも20%の増加が望ましく、より高いパーセンテージ(40、50、100、1000またはそれ以上)が好ましい。
【００７４】
D.有毒物質から細胞の分離
DLDは、細胞に有毒である可能性のある化合物を除去するため、または有毒化合物による汚染から細胞を保護するために設計された精製にも使用し得る。例には、抗生物質、凍結保存剤、抗真菌剤、有毒代謝物、アジ化ナトリウム、金属イオン、金属イオンキレート剤、エンドトキシン、可塑剤、農薬、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。このデバイスを使用して、細胞から有毒な化合物を除去し、細胞からの物質の一貫した生成を確保できる。幾つかの例において、細胞は対数期細胞とし得る。「対数期細胞」という用語は、指数関数的対数増殖を特徴とする増殖段階で活発に分裂している細胞をいう。対数期では、細胞数の自然対数を時間に対してプロットすると直線が生成されるように、細胞集団は一定の割合で倍増し得る。
【００７５】
有毒物質を分離する能力は、BL21、Tuner、Origami、Origami B、Rosetta、C41、C43、DH5α、DH10βまたはXL1Blueなどの細菌株；Saccharomyces属、Pichia属、Kluyveromyces属、Hansenula属、Yarrowia属などの酵母株；藻類；MRC-5細胞；HeLa細胞；Vero細胞；NIH3T3細胞；L929細胞；Sf21細胞；Sf9細胞；A549細胞；A9細胞；AtT-20細胞；BALB/3T3細胞；BHK-21細胞；BHL-100細胞；BT細胞；Caco-2細胞；Chang細胞；Clone 9細胞；Clone M-3細胞；COS-1細胞；COS-3細胞；COS-7細胞；CRFK細胞；CV-1細胞；D-17細胞；Daudi細胞；GH1細胞；GH3細胞；HaK細胞；HCT-15細胞；HL-60細胞；HT-1080細胞；HT-29細胞；HUVEC細胞；I-10細胞；IM-9細胞；JEG-2細胞；Jensen細胞；Jurkat細胞；K-562細胞；KB細胞；KG-1細胞；L2細胞；LLC-WRC256細胞；McCoy細胞；MCF7細胞；WI-38細胞；WISH細胞；XC細胞；Y-1細胞；CHO細胞；Raw264.7；BHK-21細胞；HEK293細胞(293A、293Tなどを含む)；HEPG2細胞；BAE-1細胞；SH-SY5Y細胞；幹細胞およびその誘導体(操作および組換え株を含む)を含む広範な種々の細胞について重要である。
【００７６】
V.技術的背景
特定の理論にとらわれることなく、マイクロフルイディクスのいくつかの技術的側面の一般的な議論は、この分野で実行される分離に影響を与える要因を理解するのに役立ち得る。粒子を分離するための様々な微細加工されたふるい分けマトリックスが開示されている(Choura，Proc. Natl. Acad. Sci., 96:13762(1999)；Hanra，Science, 288:1026(2000)；Huangra,Nat. Biotechnol. 20:1048 (2002)；Turnerら, Phys. Rev. Lett. 88(12):128103 (2002)；Huangら, Phys. Rev. Lett. 89:178301(2002)；米国特許第5,427,663号；米国特許第7,150,812号；米国特許第6,881,317号)。バンプアレイ(「障害物アレイ」としても知られている)デバイスが説明されており、それらの基本的な動作は、例えば、米国特許第7,150,812号に説明されており、その全体を出展明示して本明細書の一部とみなす。バンプアレイは、基本的に、障害物のアレイ(通常は周期的に順序付けられたアレイ)を通過する粒子を分離することによって動作し、バルク流体の流れの方向または適用したフィールドの方向からオフセットされた「アレイ方向」に従う粒子間で分離が発生する(米国特許第7,150,812号)。
【００７７】
A.バンプアレイ
いくつかのアレイでは、隣接する障害物の形状は、ギャップを定義する障害物の部分が、バルク流体の流れの方向に延びるギャップの軸に関して対称であるようなものである。そのようなギャップを通る流体の流れの速度または体積プロファイルは、ギャップ全体でほぼ放物線状であり、流体の速度および流束は、ギャップを定義する各障害物の表面でゼロであり(滑りのない流れ条件を想定)、ギャップの中心点で最大値に達する。プロファイルは放物線状であり、ギャップを定義する障害物の1つに隣接する特定の幅の流体層には、ギャップを定義する他の障害物に隣接する同じ幅の流体層と同じ割合の流体束が含まれ、これは、ギャップを通過する間に「バンプ」される粒子のサイズは、粒子がどの障害物の近くを移動するかに関係なく等しくなることを意味する。
【００７８】
いくつかの場合において、障害物アレイの粒子サイズ分離性能は、障害物間のギャップに流体の流れを偏向させる隣接する障害物の一部分が、障害物内にバルク流体の流れの方向に延びるギャップの軸に対して対称ではないように障害物を成形および配置することによって改善できる。ギャップへのそのような流れの対称性の欠如は、ギャップ内の非対称の流体の流れプロファイルにつながり得る。ギャップの片側に向かう流体の流れの濃縮(すなわち、ギャップを通る非対称の流体の流れプロファイルの結果)は、バルク流体の流れの方向ではなく、アレイの方向に移動するように誘導される粒子の臨界サイズを減少し得る。これは、流れプロファイルの非対称性により、ギャップを通る流体フラックスの選択された割合を含む1つの障害物に隣接する流れ層の幅と、ギャップを定義する他の障害物に隣接している同じ割合の流体フラックスを含む流れ層の幅との間に差が生じるためである。障害物に隣接する流体層の異なる幅は、2つの異なる臨界粒子サイズを示すギャップを定義する。ギャップを通過する粒子は、それが運ばれる流体層の臨界サイズを超える場合、衝突する可能性がある(つまり、バルク流体の流れ方向ではなく、アレイ方向に移動する)。したがって、非対称の流れプロファイルを有するギャップを通過する粒子は、粒子が1つの障害物に隣接する流体層を移動する場合は衝突するが、粒子がギャップを定義する他の障害物に隣接する流体層を移動する場合は衝突しない可能性がある。
【００７９】
別の態様では、ギャップを定義する障害物のエッジの真円度を減少させることにより、障害物アレイの粒子サイズ分離性能を改善できる。例として、鋭い頂点を有する三角形の断面を有する障害物の配列は、丸い頂点を有する同じサイズおよび間隔の三角形の障害物の配列よりも低い臨界粒子サイズを示すことができる。
【００８０】
したがって、障害物アレイのギャップを定義する障害物のエッジを鋭くすることにより、バルク流体の流れの影響下でアレイ方向に偏向される粒子の臨界サイズを、必ずしも障害物のサイズを縮小することなく減らすことができる。逆に、より鋭いエッジを有する障害物は、より鋭いエッジを有さない同じサイズの障害物と同等の粒子分離特性をもたらすが、それでもより遠くに離間できる。
【００８１】
B.分画範囲
マイクロ流体デバイス上でサイズによって分離されるオ対象物には、細胞、生体分子、無機ビーズ、およびその他の対象物が含まれる。分別された典型的なサイズは、100ナノメートルから50マイクロメートルの範囲である。ただし、より大きなおよびより小さな粒子を分画し得る場合もある。
【００８２】
C.体積
設計に応じて、デバイスまたはデバイスの組み合わせを使用して、約10μlから少なくとも500μlのサンプル、約500μlから約40mLのサンプル、約500μlから約20mLのサンプル、約20mLから約200mLのサンプル、約40mLから約200mLのサンプル、または少なくとも200mLのサンプルを処理し得る。処理される材料の総量は、場合によっては50mLから5000mL、100mLから4000mLまたは500mLから2000 mLとし得る。出発物質には、血液、血液に由来する調製物(例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス調製物)、他の体液または抽出物、培養で増殖した細胞などが含まれる。
【００８３】
D.チャンネル
デバイスは、1つまたは複数の入口および1つまたは複数の出口を備えた1つまたは複数のチャネルを含み得る。注入口は、サンプルまたは粗(すなわち、未精製)流体組成物、緩衝液、または試薬の導入に使用できる。出口は、生成物を収集するために使用することも、廃棄物の出口としても使用することもできる。チャネルは、幅が約0.5から100mm、長さが約2〜200mmとし得るが、異なる幅および長さともし得る。深さは1〜1000μmとし得、1〜100チャネル以上のどこかに存在し得る。体積は、数μlから数mlまでの非常に広い範囲で変化し得、デバイスは、障害物の構成が異なる複数のゾーン(ステージまたはセクション)を有し得る。
【００８４】
E.ギャップサイズ(ポストまたは障害物間の端から端までの距離)
障害物のアレイのギャップサイズ(ポストまたは障害物間の端から端までの距離)は、約数マイクロメートル(例えば、1〜500)マイクロメートルから1ミリメートルを超える場合がある。障害物は、いくつかの実施形態において、1〜3000マイクロメートルの径を有し得、様々な形状(円形、三角形、涙滴形、ひし形、正方形、長方形など)を有し得る。ポストの第1の列は、入口の近く(たとえば、5μm以内)または1mm以上離れた場所に配置し得る。
【００８５】
F.積み重ね可能なチップ
デバイスは、複数の積み重ね可能なチップを含むことができる。デバイスは、約1〜50のチップを含み得る。幾つかの例において、デバイスは、直列または並列、あるいはその両方で配置された複数のチップを有し得る。
【００８６】
実施例
以下の実施例は、本発明を説明することを意図しているが、限定するものではない。
通常の血液サンプルを0.2倍に希釈し、通常の分離モード(バッファーに対してサンプルを実行)でDLDで処理した。収集された最初の生成物画分は、入力数と入口と出口のDLDデバイス比に基づいて予想された濃度(さらに0.28倍希釈)を有していた。実行の途中で、収集された生成物は「洗浄ストリーム」としてDLDデバイスに再循環した。 DLD生成物の再循環を継続しながら、さまざまな時点で種々の画分を収集した。回収率値を得るために、DLD生成物の最終体積および最終濃度をサンプルの入力体積および入力濃度と比較した。複数のパス後のWBCの正味の回収率は97.5%であり、入力材料から生成物材料への濃度係数の変化は2.9倍であった(ランニングバッファーに対してサンプルを処理した場合の入力から生成物への初期変化は0.28倍)。
【００８７】
本明細書で引用されるすべての参考文献は、参照により本明細書の一部とみなす。本発明を完全に説明したので、本発明は、本発明またはその任意の実施形態の精神または範囲に影響を与えることなく、広く同等の範囲の条件、パラメータなどの範囲内で実施できることが当業者によって理解される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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