(57)【要約】本出願は、制御された形質細胞枯渇のための、例えば、形質細胞に関連する様々な疾患および状態の処置のための、組成物および方法に関する。本発明は、例えば、ａ）非機能的なＴ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）ドメインをコードするように改変された内在性Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＲＡ）遺伝子と、ｂ）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を認識することができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸とを含む、操作されたＴ細胞を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）非機能的なＴ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）ドメインをコードするように改変された内在性Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＲＡ）遺伝子と、ｂ）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を認識することができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸とを含む、操作されたＴ細胞。
【請求項２】
ＢＣＭＡを認識することができる前記ＣＡＲが、細胞外ＢＣＭＡ認識ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記細胞外ＢＣＭＡ認識ドメインが、ＢＣＭＡに特異的に結合することができる抗体部分である、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
前記抗体部分が、配列番号５５からの重鎖相補性決定領域（ＨＣ−ＣＤＲ）１、ＨＣ−ＣＤＲ２、ＨＣ−ＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域（ＬＣ−ＣＤＲ）１、ＬＣ−ＣＤＲ２およびＬＣ−ＣＤＲ３を含む、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
前記抗体部分が、ｓｃＦｖである、請求項３または４に記載の細胞。
【請求項６】
前記ＣＡＲ膜貫通ドメインがＣＤ８膜貫通ドメインを含み、前記ＣＡＲ共刺激ドメインが４−１ＢＢおよび／もしくはＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ならびに／または前記ＣＡＲ細胞質シグナル伝達ドメインがＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
前記ｂ）ＢＣＭＡを認識することができるＣＡＲをコードする核酸が、前記ＴＲＡＣドメインをコードする前記内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入されるか、または前記ｂ）ＢＣＭＡを認識することができるＣＡＲをコードする核酸が、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８】
ｃ）二量体化活性化可能な化学誘導シグナル伝達複合体（ＣＩＳＣ）のポリペプチド成分をコードする１つまたは複数の核酸をさらに含み、前記ＣＩＳＣのポリペプチド成分が、
ｉ）第１の細胞外結合ドメインまたはその一部分、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインまたはその一部分を含む、第１のＣＩＳＣ成分；ならびに
ｉｉ）第２の細胞外結合ドメインまたはその一部分、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインまたはその一部分を含む、第２のＣＩＳＣ成分
を含み；前記第１のＣＩＳＣ成分および前記第２のＣＩＳＣ成分が、発現されると、リガンドの存在下で二量体化してシグナル伝達能力を有するＣＩＳＣを作出するように構成されている、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９】
前記第１のＣＩＳＣ成分の前記シグナル伝達ドメインが、ＩＬ−２受容体サブユニットガンマ（ＩＬ２Ｒγ）細胞質シグナル伝達ドメインを含む、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記ＩＬ２Ｒγ細胞質シグナル伝達ドメインが、配列番号５０のアミノ酸配列、または配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
前記第１の細胞外結合ドメインまたはその一部分が、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインまたはその一部分を含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
前記ＦＫＢＰドメインが、配列番号４７のアミノ酸配列、または配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記第２のＣＩＳＣ成分の前記シグナル伝達ドメインが、ＩＬ−２受容体サブユニットベータ（ＩＬ２Ｒβ）細胞質シグナル伝達ドメインを含む、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
前記ＩＬ２Ｒβ細胞質シグナル伝達ドメインが、配列番号５１のアミノ酸配列、または配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
前記第２の細胞外結合ドメインまたはその一部分が、ＦＫＢＰラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインまたはその一部分を含む、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６】
前記ＦＲＢが、配列番号４８のアミノ酸配列、または配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
前記第１および第２のＣＩＳＣ成分の前記膜貫通ドメインが、独立して、ＩＬ−２受容体膜貫通ドメインを含む、請求項８〜１６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１８】
１）前記第１のＣＩＳＣ成分をコードする前記１つまたは複数の核酸が、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入され、前記第２のＣＩＳＣ成分をコードする前記１つまたは複数の核酸が、前記ＴＲＡＣドメインをコードする前記内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入されるか、または２）前記第１のＣＩＳＣ成分をコードする前記１つまたは複数の核酸が、前記ＴＲＡＣドメインをコードする前記内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入され、前記第２のＣＩＳＣ成分をコードする前記１つまたは複数の核酸が、前記内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入される、請求項８〜１７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１９】
前記リガンドが、ラパマイシンまたはラパマイシンアナログ（ラパログ）である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２０】
前記ラパログが、エベロリムス、ＣＣＩ−７７９、Ｃ２０−メタリルラパマイシン、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン、Ｃ１６−ｉＲａｐ、ＡＰ２１９６７、ミコフェノール酸ナトリウム、ベニジピン塩酸塩、ＡＰ１９０３もしくはＡＰ２３５７３、またはそれらの代謝物、誘導体および／もしくは組合せからなる群から選択される、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
前記リガンドが、０．０５ｎＭ〜１００ｎＭの量で存在するか、または提供される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２２】
ｄ）細胞外β２−ミクログロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体をコードする１つまたは複数の核酸をさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２３】
前記キメラ受容体膜貫通ドメインがＣＤ８膜貫通ドメインを含み、前記キメラ受容体共刺激ドメインが４−１ＢＢ共刺激ドメインを含み、および／または前記キメラ受容体細胞質シグナル伝達ドメインがＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む、請求項２２の記載の細胞。
【請求項２４】
前記キメラ受容体が、配列番号６５のアミノ酸配列、または配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
前記ｄ）前記キメラ受容体をコードする１つまたは複数の核酸が、前記ＴＲＡＣドメインをコードする前記内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入されるか、または前記ｄ）前記キメラ受容体をコードする１つまたは複数の核酸が、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入される、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２６】
ｇ）選択可能なマーカーをコードする核酸をさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２７】
前記選択可能なマーカーが、切断型低親和性神経成長因子受容体（ｔＬＮＧＦＲ）ポリペプチドである、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
前記ｔＬＮＧＦＲポリペプチドが、配列番号６６のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の細胞。
【請求項２９】
前記選択可能なマーカーをコードする前記核酸が、前記ＴＲＡＣドメインをコードする前記内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入されるか、または前記選択可能なマーカーをコードする前記核酸が、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入される、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３０】
ｅ）１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３１】
１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与する前記ポリペプチドが、タクロリムス（ＦＫ５０６）および／またはシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）に対する耐性を付与する、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与する前記ポリペプチドが、突然変異体カルシニューリン（ＣＮ）ポリペプチドである、請求項３０または３１に記載の細胞。
【請求項３３】
前記突然変異体ＣＮポリペプチドが、タクロリムス（ＦＫ５０６）およびシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）に対する耐性を付与する、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
前記突然変異体ＣＮポリペプチドが、ＣＮｂ３０（配列番号６７）である、請求項３２または３３に記載の細胞。
【請求項３５】
１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与する前記ポリペプチドをコードする前記核酸が、前記ＴＲＡＣドメインをコードする前記内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入されるか、または１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与する前記ポリペプチドをコードする前記核酸が、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入される、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３６】
ｆ）哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナーゼのＦＫＢＰ−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３７】
前記ＦＲＢドメインポリペプチドが、細胞内に発現される、請求項３６に記載の細胞。
【請求項３８】
前記ＦＲＢドメインポリペプチドが、配列番号６８もしくは６９のアミノ酸、または配列番号６８もしくは６９のアミノ酸と少なくとも９０％の配列相同性を有するバリアントを含む、請求項３６または３７に記載の細胞。
【請求項３９】
前記ＦＲＢドメインポリペプチドをコードする前記核酸が、前記ＴＲＡＣドメインをコードする前記内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入されるか、または前記ＦＲＢドメインポリペプチドをコードする前記核酸が、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入される、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４０】
ＴＲＡＣドメインをコードする領域内またはその付近の内在性ＴＲＡ遺伝子内の配列に相補的である配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）。
【請求項４１】
配列番号１〜３のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号１〜３のいずれか１つと少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、請求項４０に記載のｇＲＮＡ。
【請求項４２】
内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子内またはその付近の配列に相補的である配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）。
【請求項４３】
配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４〜１８のいずれか１つと少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、請求項４２に記載のｇＲＮＡ。
【請求項４４】
ａ）第１のｇＲＮＡおよび／または第２のｇＲＮＡであって、前記第１のｇＲＮＡが請求項４０または４１に記載のｇＲＮＡであり、前記第２のｇＲＮＡが請求項４２または４３に記載のｇＲＮＡである、第１のｇＲＮＡおよび／または第２のｇＲＮＡと、ｂ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）または前記ＲＧＥＮをコードする核酸とを含む、系。
【請求項４５】
ｃ）１つまたは複数のドナー鋳型であって、
ｉ）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）ポリペプチドを認識することができるＣＡＲ；
ｉｉ）第１の細胞外結合ドメインまたはその一部分、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインまたはその一部分またはその機能的誘導体とを含む、第１のＣＩＳＣ成分；ならびに
ｉｉｉ）第２の細胞外結合ドメインまたはその一部分、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインまたはその一部分を含む、第２のＣＩＳＣ成分
をコードする核酸を含む１つまたは複数のドナー鋳型をさらに含み；
前記第１のＣＩＳＣ成分および前記第２のＣＩＳＣ成分が、Ｔ細胞により発現されると、リガンドの存在下で二量体化して前記Ｔ細胞の生存および／または増殖を促進することができるシグナル伝達能力を有するＣＩＳＣを作出するように構成されている、請求項４４に記載の系。
【請求項４６】
ＢＣＭＡを認識することができる前記ＣＡＲが、細胞外ＢＣＭＡ認識ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含む、請求項４５に記載の系。
【請求項４７】
前記細胞外ＢＣＭＡ認識ドメインが、ＢＣＭＡに特異的に結合することができる抗体部分である、請求項４６に記載の系。
【請求項４８】
前記抗体部分が、配列番号５５からの重鎖相補性決定領域（ＨＣ−ＣＤＲ）１、ＨＣ−ＣＤＲ２、ＨＣ−ＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域（ＬＣ−ＣＤＲ）１、ＬＣ−ＣＤＲ２およびＬＣ−ＣＤＲ３を含む、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、請求項４７に記載の系。
【請求項４９】
前記抗体部分が、ｓｃＦｖである、請求項４７または４８に記載の系。
【請求項５０】
前記ＣＡＲ膜貫通ドメインがＣＤ８膜貫通ドメインを含み、前記ＣＡＲ共刺激ドメインが４−１ＢＢおよび／もしくはＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ならびに／または前記ＣＡＲ細胞質シグナル伝達ドメインがＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の系。
【請求項５１】
前記第１のＣＩＳＣ成分の前記シグナル伝達ドメインが、ＩＬ−２受容体サブユニットガンマ（ＩＬ２Ｒγ）ドメインを含む、請求項４５〜５０のいずれか一項に記載の系。
【請求項５２】
前記ＩＬ２Ｒγ細胞質シグナル伝達ドメインが、配列番号５０のアミノ酸配列、または配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、請求項５１に記載の系。
【請求項５３】
前記第１の細胞外結合ドメインまたはその一部分が、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインまたはその一部分を含む、請求項４５〜５２のいずれか一項に記載の系。
【請求項５４】
前記ＦＫＢＰドメインが、配列番号４７のアミノ酸配列、または配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、請求項５３に記載の系。
【請求項５５】
前記第２のＣＩＳＣ成分の前記シグナル伝達ドメインが、ＩＬ−２受容体サブユニットベータ（ＩＬ２Ｒβ）ドメインを含む、請求項４５〜５４のいずれか一項に記載の系。
【請求項５６】
前記ＩＬ２Ｒβ細胞質シグナル伝達ドメインが、配列番号５１のアミノ酸配列、または配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、請求項５５に記載の系。
【請求項５７】
前記第２の細胞外結合ドメインまたはその一部分が、ＦＫＢＰラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインまたはその一部分を含む、請求項４５〜５６のいずれか一項に記載の系。
【請求項５８】
前記ＦＲＢが、配列番号４８のアミノ酸配列、または配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、請求項５７に記載の系。
【請求項５９】
前記第１および第２のＣＩＳＣ成分の前記膜貫通ドメインが、独立して、ＩＬ−２受容体膜貫通ドメインを含む、請求項４５〜５８のいずれか一項に記載の系。
【請求項６０】
前記リガンドが、ラパマイシンまたはラパログである、請求項４５〜５９のいずれか一項に記載の系。
【請求項６１】
前記ラパログが、エベロリムス、ＣＣＩ−７７９、Ｃ２０−メタリルラパマイシン、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン、Ｃ１６−ｉＲａｐ、ＡＰ２１９６７、ミコフェノール酸ナトリウム、ベニジピン塩酸塩、ＡＰ１９０３もしくはＡＰ２３５７３、またはそれらの代謝物、誘導体および／もしくは組合せからなる群から選択される、請求項６０に記載の系。
【請求項６２】
前記ｃ）１つまたは複数のドナー鋳型が、
ｉｖ）細胞外β２−ミクログロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体；
ｖ）選択可能なマーカー；
ｖｉ）１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチド；または
ｖｉｉ）哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナーゼのＦＫＢＰ−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインポリペプチド
のうちの１つまたは複数をコードする核酸をさらに含む、請求項４５〜６１のいずれか一項に記載の系。
【請求項６３】
前記キメラ受容体膜貫通ドメインがＣＤ８膜貫通ドメインポリペプチドを含み、前記キメラ受容体共刺激ドメインが４−１ＢＢ共刺激ドメインを含み、および／または前記キメラ受容体細胞質シグナル伝達ドメインがＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む、請求項６２の記載の系。
【請求項６４】
前記キメラ受容体が、配列番号６５のアミノ酸配列、または配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、請求項６３に記載の系。
【請求項６５】
前記選択可能なマーカーが、切断型低親和性神経成長因子受容体（ｔＬＮＧＦＲ）ポリペプチドである、請求項６２〜６４のいずれか一項に記載の系。
【請求項６６】
前記ｔＬＮＧＦＲポリペプチドが、配列番号６６のアミノ酸配列を含む、請求項６５に記載の系。
【請求項６７】
１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与する前記ポリペプチドが、突然変異体カルシニューリン（ＣＮ）ポリペプチドである、請求項６２〜６６のいずれか一項に記載の系。
【請求項６８】
前記突然変異体ＣＮポリペプチドが、ＣＮｂ３０（配列番号６７）である、請求項６７に記載の系。
【請求項６９】
前記ＦＲＢドメインポリペプチドが、配列番号６８もしくは６９のアミノ酸、または配列番号６８もしくは６９のアミノ酸と少なくとも９０％の配列相同性を有するバリアントを含む、請求項６２〜６８のいずれか一項に記載の系。
【請求項７０】
前記ＲＧＥＮが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４およびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはその機能的誘導体からなる群から選択される、請求項４４〜６９のいずれか一項に記載の系。
【請求項７１】
前記ＲＧＥＮが、Ｃａｓ９である、請求項４４〜７０のいずれか一項に記載の系。
【請求項７２】
前記ＲＧＥＮをコードする前記核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）配列である、請求項４４〜７１のいずれか一項に記載の系。
【請求項７３】
前記ＲＧＥＮをコードする前記ＲＮＡ配列が、前記第１のｇＲＮＡまたは前記第２のｇＲＮＡに共有結合によって連結されている、請求項７２に記載の系。
【請求項７４】
前記１つまたは複数のドナー鋳型のうちの１つを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む、請求項４５〜７３のいずれか一項に記載の系。
【請求項７５】
前記ＡＡＶベクターが、配列番号１９〜４６のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号１９〜４６のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、請求項７４に記載の系。
【請求項７６】
前記第１のｇＲＮＡ、第１のＡＡＶベクター、前記第２のｇＲＮＡ、および第２のＡＡＶベクターを含み、
（Ａ）前記第１のｇＲＮＡが、配列番号１のポリヌクレオチド配列、または配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第１のＡＡＶベクターが、配列番号２８、３１、３４および３７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、ならびに配列番号２８、３１、３４および３７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のＡＡＶベクターが、配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；
（Ｂ）前記第１のｇＲＮＡが、配列番号２のポリヌクレオチド配列、または配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第１のＡＡＶベクターが、配列番号２９、３２、３５および３８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、ならびに配列番号２９、３２、３５および３８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のＡＡＶベクターが、配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；または
（Ｃ）前記第１のｇＲＮＡが、配列番号３のポリヌクレオチド配列、または配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第１のＡＡＶベクターが、配列番号３０、３３、３６および３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、ならびに配列番号３０、３３、３６および３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のＡＡＶベクターが、配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、
請求項７４または７５に記載の系。
【請求項７７】
（Ａ）前記第１のｇＲＮＡが、配列番号１のポリヌクレオチド配列、または配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第１のＡＡＶベクターが、配列番号１９もしくは２２のポリヌクレオチド配列、または配列番号１９もしくは２２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のＡＡＶベクターが、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；
（Ｂ）前記第１のｇＲＮＡが、配列番号２のポリヌクレオチド配列、または配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第１のＡＡＶベクターが、配列番号２０もしくは２３のポリヌクレオチド配列、または配列番号２０もしくは２３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のＡＡＶベクターが、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；または
（Ｃ）前記第１のｇＲＮＡが、配列番号３のポリヌクレオチド配列、または配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第１のＡＡＶベクターが、配列番号２１もしくは２４のポリヌクレオチド配列、または配列番号２１もしくは２４のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のＡＡＶベクターが、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、
請求項７４または７５に記載の系。
【請求項７８】
（Ａ）前記第１のｇＲＮＡが、配列番号１のポリヌクレオチド配列、または配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第１のＡＡＶベクターが、配列番号２５のポリヌクレオチド配列、または配列番号２５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のＡＡＶベクターが、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；
（Ｂ）前記第１のｇＲＮＡが、配列番号２のポリヌクレオチド配列、または配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第１のＡＡＶベクターが、配列番号２６のポリヌクレオチド配列、または配列番号２６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のＡＡＶベクターが、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；または
（Ｃ）前記第１のｇＲＮＡが、配列番号３のポリヌクレオチド配列、または配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第１のＡＡＶベクターが、配列番号２７のポリヌクレオチド配列、または配列番号２７のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のＡＡＶベクターが、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、
請求項７４または７５に記載の系。
【請求項７９】
前記ＲＧＥＮならびに前記第１のｇＲＮＡおよび／または前記第２のｇＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む、請求項４４〜７８のいずれか一項に記載の系。
【請求項８０】
前記ＲＧＥＮが、前記第１のｇＲＮＡおよび／または前記第２のｇＲＮＡと、それぞれ１：１〜２０：１の間のｇＲＮＡ対ＲＧＥＮのモル比で、前記ＲＮＰを形成するように事前に複合体化されている、請求項７９に記載の系。
【請求項８１】
配列番号１９〜４６のいずれか１つの核酸配列、または配列番号１９〜４６のいずれか１つと少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、ベクター。
【請求項８２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項８１に記載のベクター。
【請求項８３】
細胞のゲノムを編集する方法であって、前記細胞に、
ａ）第１のｇＲＮＡおよび／または第２のｇＲＮＡであって、前記第１のｇＲＮＡが請求項４０または４１に記載のｇＲＮＡであり、前記第２のｇＲＮＡが請求項４２または４３に記載のｇＲＮＡである、第１のｇＲＮＡおよび／または第２のｇＲＮＡと；
ｂ）ＲＧＥＮまたは前記ＲＧＥＮをコードする核酸と；
ｃ）１つまたは複数のドナー鋳型であって、
ｉ）ＢＣＭＡポリペプチドを認識することができるＣＡＲ、
ｉｉ）第１の細胞外結合ドメインまたはその一部分、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインまたはその一部分またはその機能的誘導体を含む、第１のＣＩＳＣ成分、ならびに
ｉｉｉ）第２の細胞外結合ドメインまたはその一部分、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインまたはその一部分を含む、第２のＣＩＳＣ成分
をコードする核酸を含む１つまたは複数のドナー鋳型と
を提供するステップを含み；
前記第１のＣＩＳＣ成分および前記第２のＣＩＳＣ成分が、Ｔ細胞により発現されると、リガンドの存在下で二量体化して前記Ｔ細胞の生存および／または増殖を促進することができるシグナル伝達能力を有するＣＩＳＣを作出するように構成されている、方法。
【請求項８４】
ＢＣＭＡを認識することができる前記ＣＡＲが、細胞外ＢＣＭＡ認識ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記細胞外ＢＣＭＡ認識ドメインが、ＢＣＭＡに特異的に結合することができる抗体部分である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記抗体部分が、配列番号５５からの重鎖相補性決定領域（ＨＣ−ＣＤＲ）１、ＨＣ−ＣＤＲ２、ＨＣ−ＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域（ＬＣ−ＣＤＲ）１、ＬＣ−ＣＤＲ２およびＬＣ−ＣＤＲ３を含む、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記抗体部分が、ｓｃＦｖである、請求項８５または８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記ＣＡＲ膜貫通ドメインがＣＤ８膜貫通ドメインを含み、前記ＣＡＲ共刺激ドメインが４−１ＢＢおよび／もしくはＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ならびに／または前記ＣＡＲ細胞質シグナル伝達ドメインがＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む、請求項８４〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記第１のＣＩＳＣ成分の前記シグナル伝達ドメインが、ＩＬ−２受容体サブユニットガンマ（ＩＬ２Ｒγ）細胞質シグナル伝達ドメインを含む、請求項８３〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記ＩＬ２Ｒγ細胞質シグナル伝達ドメインが、配列番号５０のアミノ酸配列、または配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記第１の細胞外結合ドメインまたはその一部分が、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインまたはその一部分を含む、請求項８３〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＦＫＢＰドメインが、配列番号４７のアミノ酸配列、または配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記第２のＣＩＳＣ成分の前記シグナル伝達ドメインが、ＩＬ−２受容体サブユニットベータ（ＩＬ２Ｒβ）細胞質シグナル伝達ドメインを含む、請求項８３〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記ＩＬ２Ｒβ細胞質シグナル伝達ドメインが、配列番号５１のアミノ酸配列、または配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記第２の細胞外結合ドメインまたはその一部分が、ＦＫＢＰラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインまたはその一部分を含む、請求項８３〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記ＦＲＢドメインが、配列番号４８のアミノ酸配列、または配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記第１および第２のＣＩＳＣ成分の前記膜貫通ドメインが、独立して、ＩＬ−２受容体膜貫通ドメインを含む、請求項８３〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記リガンドが、ラパマイシンまたはラパログである、請求項８３〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記ラパログが、エベロリムス、ＣＣＩ−７７９、Ｃ２０−メタリルラパマイシン、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン、Ｃ１６−ｉＲａｐ、ＡＰ２１９６７、ミコフェノール酸ナトリウム、ベニジピン塩酸塩、ＡＰ１９０３もしくはＡＰ２３５７３、またはそれらの代謝物、誘導体および／もしくは組合せからなる群から選択される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記ｃ）１つまたは複数のドナー鋳型が、
ｉｖ）細胞外β２−ミクログロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体；
ｖ）選択可能なマーカー；
ｖｉ）１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチド；または
ｖｉｉ）哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナーゼのＦＫＢＰ−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインポリペプチド
のうちの１つまたは複数をコードする核酸をさらに含む、請求項８３〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記キメラ受容体膜貫通ドメインがＣＤ８膜貫通ドメインポリペプチドを含み、前記キメラ受容体共刺激ドメインが４−１ＢＢ共刺激ドメインを含み、および／または前記キメラ受容体細胞質シグナル伝達ドメインがＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む、請求項１００の記載の方法。
【請求項１０２】
前記キメラ受容体が、配列番号６５のアミノ酸配列、または配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記選択可能なマーカーが、切断型低親和性神経成長因子受容体（ｔＬＮＧＦＲ）ポリペプチドである、請求項１００〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ｔＬＮＧＦＲポリペプチドが、配列番号６６のアミノ酸配列を含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与する前記ポリペプチドが、突然変異体カルシニューリン（ＣＮ）ポリペプチドである、請求項１００〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記突然変異体ＣＮポリペプチドが、ＣＮｂ３０（配列番号６７）である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ＦＲＢドメインポリペプチドが、配列番号６８もしくは６９のアミノ酸、または配列番号６８もしくは６９のアミノ酸と少なくとも９０％の配列相同性を有するバリアントを含む、請求項１００〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
細胞のゲノムを編集する方法であって、
前記細胞に、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、ＲＧＥＮまたは前記ＲＧＥＮをコードする核酸、第１のベクター、および第２のベクターを提供するステップを含み、
（Ａ）前記第１のｇＲＮＡが、配列番号１のポリヌクレオチド配列、または配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第１のベクターが、配列番号２８、３１、３４および３７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、ならびに配列番号２８、３１、３４および３７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のベクターが、配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；
（Ｂ）前記第１のｇＲＮＡが、配列番号２のポリヌクレオチド配列、または配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第１のベクターが、配列番号２９、３２、３５および３８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、ならびに配列番号２９、３２、３５および３８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のベクターが、配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；または
（Ｃ）前記第１のｇＲＮＡが、配列番号３のポリヌクレオチド配列、または配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第１のベクターが、配列番号３０、３３、３６および３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、ならびに配列番号３０、３３、３６および３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のベクターが、配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、
方法。
【請求項１０９】
細胞のゲノムを編集する方法であって、
前記細胞に、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、ＲＧＥＮまたは前記ＲＧＥＮをコードする核酸、第１のベクター、および第２のベクターを提供するステップを含み、
（Ａ）前記第１のｇＲＮＡが、配列番号１のポリヌクレオチド配列、または配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第１のＡＡＶベクターが、配列番号１９もしくは２２のポリヌクレオチド配列、または配列番号１９もしくは２２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のＡＡＶベクターが、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；
（Ｂ）前記第１のｇＲＮＡが、配列番号２のポリヌクレオチド配列、または配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第１のＡＡＶベクターが、配列番号２０もしくは２３のポリヌクレオチド配列、または配列番号２０もしくは２３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のＡＡＶベクターが、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；または
（Ｃ）前記第１のｇＲＮＡが、配列番号３のポリヌクレオチド配列、または配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第１のＡＡＶベクターが、配列番号２１もしくは２４のポリヌクレオチド配列、または配列番号２１もしくは２４のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のＡＡＶベクターが、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、
方法。
【請求項１１０】
細胞のゲノムを編集する方法であって、
前記細胞に、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、ＲＧＥＮまたは前記ＲＧＥＮをコードする核酸、第１のベクター、および第２のベクターを提供するステップを含み、
（Ａ）前記第１のｇＲＮＡが、配列番号１のポリヌクレオチド配列、または配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第１のＡＡＶベクターが、配列番号２５のポリヌクレオチド配列、または配列番号２５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のＡＡＶベクターが、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；
（Ｂ）前記第１のｇＲＮＡが、配列番号２のポリヌクレオチド配列、または配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第１のＡＡＶベクターが、配列番号２６のポリヌクレオチド配列、または配列番号２６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のＡＡＶベクターが、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；または
（Ｃ）前記第１のｇＲＮＡが、配列番号３のポリヌクレオチド配列、または配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第１のＡＡＶベクターが、配列番号２７のポリヌクレオチド配列、または配列番号２７のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、前記第２のＡＡＶベクターが、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、
方法。
【請求項１１１】
前記ＲＧＥＮが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４およびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはその機能的誘導体からなる群から選択される、請求項８３〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ＲＧＥＮが、Ｃａｓ９である、請求項８３〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ＲＧＥＮをコードする前記核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）配列である、請求項８３〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記ＲＧＥＮをコードする前記ＲＮＡ配列が、前記第１のｇＲＮＡまたは前記第２のｇＲＮＡに共有結合によって連結されている、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記ドナー鋳型が、ＡＡＶベクターに含有される、請求項８３〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記ＲＧＥＮが、前記細胞への提供前に、前記第１のｇＲＮＡおよび／または前記第２のｇＲＮＡと事前に複合体化されてＲＮＰ複合体を形成している、請求項８３〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ＲＧＥＮが、前記第１のｇＲＮＡおよび／または前記第２のｇＲＮＡと、それぞれ１：１〜２０：１の間のｇＲＮＡ対ＲＧＥＮのモル比で事前に複合体化されている、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記１つまたは複数のドナー鋳型が、独立して、前記細胞のゲノムに挿入される、請求項８３〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
第１のドナー鋳型が、ＴＲＡ遺伝子もしくは遺伝子調節エレメントに、その中に、もしくはその付近に挿入され、および／または第２のドナー鋳型が、ＩＬ２ＲＧ遺伝子もしくは遺伝子調節配列に、その中に、もしくはその付近に挿入される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
ｉ）前記第１のＣＩＳＣ成分をコードする核酸が、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入され、および／もしくはｉｉ）前記第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸が、前記ＴＲＡＣドメインをコードする前記内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入されるか、またはｉ）前記第１のＣＩＳＣ成分をコードする核酸が、前記ＴＲＡＣドメインをコードする前記内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入され、および／もしくはｉｉ）前記第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸が、前記内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入される、請求項１１８または１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項８３〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球またはＣＤ３＋汎Ｔ細胞である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記Ｔ細胞が、複数のドナーに由来するＴ細胞のプールのメンバーである、請求項１２１または１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記複数のドナーが、ヒトドナーである、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記細胞が、形質細胞に対して細胞傷害性である、請求項８３〜１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
請求項８３〜１２５のいずれか一項に記載の方法により産生される、操作された細胞。
【請求項１２７】
形質細胞に対して細胞傷害性である、請求項１〜３９および１２６のいずれか一項に記載の操作された細胞。
【請求項１２８】
移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）または自己免疫疾患の処置を必要とする対象の移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）または自己免疫疾患を処置する方法であって、前記対象に請求項１〜３９または１２６のいずれか一項に記載の操作された細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項１２９】
疾患または状態の処置を必要とする対象のおいて有害な抗体産生により特徴付けられる疾患または状態を処置する方法であって、
ａ）請求項８３〜１２０のいずれか一項に記載の方法に従ってＴ細胞のゲノムを編集することによって、操作されたＴ細胞を産生するステップと、
ｂ）前記対象に前記操作されたＴ細胞を投与するステップと
を含む方法。
【請求項１３０】
前記Ｔ細胞が、前記対象にとって自己である、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記Ｔ細胞が、前記対象にとって同種である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記Ｔ細胞が、複数のドナーに由来するＴ細胞のプールを含む、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記複数のドナーが、ヒトドナーである、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
疾患または状態の処置を必要とする対象において有害な抗体産生により特徴付けられる疾患または状態を処置する方法であって、請求項８３〜１２０のいずれか一項に記載の方法に従って前記対象のＴ細胞のゲノムを編集するステップを含む方法。
【請求項１３５】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞またはＣＤ３＋汎Ｔ細胞を含む、請求項１２９〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記対象が、ヒトである、請求項１２８〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記対象にラパマイシンまたはラパログを投与するステップをさらに含む、請求項１２８〜１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記ラパログが、エベロリムス、ＣＣＩ−７７９、Ｃ２０−メタリルラパマイシン、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン、Ｃ１６−ｉＲａｐ、ＡＰ２１９６７、ミコフェノール酸ナトリウム、ベニジピン塩酸塩、ＡＰ１９０３もしくはＡＰ２３５７３、またはそれらの代謝物、誘導体および／もしくは組合せからなる群から選択される、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
前記ラパマイシンまたは前記ラパログが、０．０５ｎＭ〜１００ｎＭの濃度で投与される、請求項１３７〜１３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記疾患または状態が、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、抗体媒介自己免疫、または軽鎖アミロイドーシスである、請求項１２９〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記疾患または状態がＧｖＨＤであり、前記対象が同種移植を以前に受けたことがある、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
使用説明書、ならびにａ）請求項１〜３９もしくは１２６のいずれか一項に記載の操作された細胞、および／または請求項４４〜８０のいずれか一項に記載の系の１つもしくは複数の成分、および／またはｂ）ラパマイシンもしくはラパログを含む、キット。
【請求項１４３】
前記ラパログが、エベロリムス、ＣＣＩ−７７９、Ｃ２０−メタリルラパマイシン、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン、Ｃ１６−ｉＲａｐ、ＡＰ２１９６７、ミコフェノール酸ナトリウム、ベニジピン塩酸塩、ＡＰ１９０３もしくはＡＰ２３５７３、またはそれらの代謝物、誘導体および／もしくは組合せからなる群から選択される、請求項１４２に記載のキット。
【請求項１４４】
請求項１〜３９もしくは１２６のいずれか一項に記載の操作された細胞、または請求項４４〜８０のいずれか一項に記載の系の１つもしくは複数の成分を含む組成物を含む、注射器。
【請求項１４５】
請求項１〜３９もしくは１２６のいずれか一項に記載の操作された細胞、または請求項４４〜８０のいずれか一項に記載の系の１つもしくは複数の成分を含む組成物を含む、カテーテル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月２７日に出願した米国特許仮出願第６２／６６３，９７４号および２０１８年１１月２９日に出願した米国特許仮出願第６２／７７３，０５８号の優先権の利益を主張するものであり、それらの各々の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
【０００２】
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出した配列表を含み、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。２０１９年４月２６日に作成したＡＳＣＩＩコピーは、０５２９８４−５１５００１ＷＯ＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名であり、サイズは２９５，０３８バイトである。
技術分野
【０００３】
本開示は、個体における制御された形質細胞枯渇のための組成物および方法に関する。特に、組成物は、Ｔ細胞の生存および／または増殖の制御を可能にする生理学的に機能的な合成化学誘導シグナル伝達複合体（ＣＩＳＣ）を生成するための一般的な構造を含む。様々な疾患および状態の処置のためなどにそのような組成物を使用する方法が、さらに提供される。
【背景技術】
【０００４】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、養子細胞免疫療法における使用のためのＴ細胞を遺伝子操作するために使用される操作された受容体である（Pule,  M.  et  al.  (2003).  Cytother.,  5(3):211-226；Restifo,  N.  P.  et  al.(2012).Nat.  Rev.  Immunol.12(4):269-281を参照されたい）。抗原結合は、ＣＡＲの細胞内セグメント上のシグナル伝達ドメインを刺激し、それによって、シグナル伝達経路を活性化する。ＣＡＲベースの養子細胞免疫療法は、従来の標準治療処置に対して難治性の腫瘍を有するがん患者を処置するために使用されている（Grupp,  S.  A.  et  al.(2013).  N.  Engl.  J.  Med.  368(16):1509-1518；Kalos,  M.  et  al.(2011).Sci.  Transl.  Med.  3(95):95ra73を参照されたい）。
ＣＡＲベースの養子細胞免疫療法は、疾患または状態に関与する宿主細胞を標的とするために使用することもできる。例えば、抗体産生形質細胞に特異的なＣＡＲ  Ｔ細胞は、自己免疫または臓器移植片拒絶などの有害な抗体媒介免疫応答によって特徴付けられる疾患または状態を処置するために使用することができる可能性があるだろう。しかし、個体の形質細胞を標的とする従来のＣＡＲ  Ｔ細胞の投与は、個体の形質細胞の無制御枯渇をもたらし得、その結果、病原体感染に対して応答することができないことなどの、重度の有害効果が生じ得る。有害な抗体産生により特徴付けられる疾患および状態に対する実行可能な処置を可能にするために形質細胞の枯渇の制御を可能にする新しい組成物および方法が、依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Pule,  M.  et  al.  (2003).  Cytother.,  5(3):211-226
【非特許文献２】Restifo,  N.  P.  et  al.(2012).Nat.  Rev.  Immunol.12(4):269-281
【非特許文献３】Grupp,  S.  A.  et  al.(2013).  N.  Engl.  J.  Med.  368(16):1509-1518
【非特許文献４】Kalos,  M.  et  al.(2011).Sci.  Transl.  Med.  3(95):95ra73
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
形質細胞に対して細胞傷害性の操作されたＴ細胞であって、操作されたＴ細胞の制御された生存および／または増殖を可能にする化学誘導シグナル伝達複合体（ＣＩＳＣ）を含む操作されたＴ細胞、操作されたＴ細胞を作製および使用する方法、ならびに方法に有用な組成物が、本明細書に記載される。
【０００７】
一態様では、ａ）非機能的なＴ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）ドメインをコードするように改変された内在性Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＲＡ）遺伝子と、ｂ）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を認識することができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸とを含む、操作されたＴ細胞が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、操作されたＴ細胞の生存および／または増殖を、操作されたＴ細胞と接触しているリガンドの量をモジュレートすることにより制御することができる。
【０００８】
一部の実施形態では、ＢＣＭＡを認識することができるＣＡＲは、細胞外ＢＣＭＡ認識ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含む。
【０００９】
一部の実施形態では、細胞外ＢＣＭＡ認識ドメインは、ＢＣＭＡに特異的に結合することができる抗体部分である。
【００１０】
一部の実施形態では、抗体部分は、配列番号５５からの重鎖相補性決定領域（ＨＣ−ＣＤＲ）１、ＨＣ−ＣＤＲ２、ＨＣ−ＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域（ＬＣ−ＣＤＲ）１、ＬＣ−ＣＤＲ２およびＬＣ−ＣＤＲ３を含む、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【００１１】
一部の実施形態では、抗体部分は、ｓｃＦｖである。
【００１２】
一部の実施形態では、ＣＡＲ膜貫通ドメインはＣＤ８膜貫通ドメインを含み、ＣＡＲ共刺激ドメインは４−１ＢＢおよび／もしくはＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ならびに／またはＣＡＲ細胞質シグナル伝達ドメインはＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む。
【００１３】
一部の実施形態では、ｂ）ＢＣＭＡを認識することができるＣＡＲをコードする核酸は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入されるか、またはｂ）ＢＣＭＡを認識することができるＣＡＲをコードする核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入される。
【００１４】
一部の実施形態では、ＣＩＳＣのポリペプチド成分は、ｉ）第１の細胞外結合ドメインまたはその一部分、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインまたはその一部分を含む、第１のＣＩＳＣ成分；ならびにｉｉ）第２の細胞外結合ドメインまたはその一部分、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインまたはその一部分を含む、第２のＣＩＳＣ成分を含み；第１のＣＩＳＣ成分および第２のＣＩＳＣ成分は、発現されると、リガンドの存在下で二量体化してシグナル伝達能力を有するＣＩＳＣを作出するように構成されている。
【００１５】
一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分のシグナル伝達ドメインは、ＩＬ−２受容体サブユニットガンマ（ＩＬ２Ｒγ）細胞質シグナル伝達ドメインを含む。
【００１６】
一部の実施形態では、ＩＬ２Ｒγ細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列、または配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【００１７】
一部の実施形態では、第１の細胞外結合ドメインまたはその一部分は、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインまたはその一部分を含む。
【００１８】
一部の実施形態では、ＦＫＢＰドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列、または配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【００１９】
一部の実施形態では、第２のＣＩＳＣ成分のシグナル伝達ドメインは、ＩＬ−２受容体サブユニットベータ（ＩＬ２Ｒβ）細胞質シグナル伝達ドメインを含む。
【００２０】
一部の実施形態では、ＩＬ２Ｒβ細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列、または配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【００２１】
一部の実施形態では、第２の細胞外結合ドメインまたはその一部分は、ＦＫＢＰラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインまたはその一部分を含む。
【００２２】
一部の実施形態では、ＦＲＢは、配列番号４８のアミノ酸配列、または配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【００２３】
一部の実施形態では、第１および第２のＣＩＳＣ成分の膜貫通ドメインは、独立して、ＩＬ−２受容体膜貫通ドメインを含む。
【００２４】
一部の実施形態では、１）第１のＣＩＳＣ成分をコードする１つまたは複数の核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入され、第２のＣＩＳＣ成分をコードする１つまたは複数の核酸は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入されるか、または２）第１のＣＩＳＣ成分をコードする１つまたは複数の核酸は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入され、第２のＣＩＳＣ成分をコードする１つまたは複数の核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入される。
【００２５】
一部の実施形態では、リガンドは、ラパマイシンまたはラパマイシンアナログ（ラパログ）である。
【００２６】
一部の実施形態では、ラパログは、エベロリムス、ＣＣＩ−７７９、Ｃ２０−メタリルラパマイシン、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン、Ｃ１６−ｉＲａｐ、ＡＰ２１９６７、ミコフェノール酸ナトリウム、ベニジピン塩酸塩、ＡＰ１９０３もしくはＡＰ２３５７３、またはそれらの代謝物、誘導体および／もしくは組合せからなる群から選択される。
【００２７】
一部の実施形態では、リガンドは、０．０５ｎＭ〜１００ｎＭの量で存在するか、または提供される。
【００２８】
一部の実施形態では、細胞は、ｄ）細胞外β２−ミクログロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体をコードする１つまたは複数の核酸をさらに含む。
【００２９】
一部の実施形態では、キメラ受容体膜貫通ドメインはＣＤ８膜貫通ドメインを含み、キメラ受容体共刺激ドメインは４−１ＢＢ共刺激ドメインを含み、および／またはキメラ受容体細胞質シグナル伝達ドメインはＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む。
【００３０】
一部の実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６５のアミノ酸配列、または配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【００３１】
一部の実施形態では、ｄ）キメラ受容体をコードする１つまたは複数の核酸は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入されるか、またはｄ）キメラ受容体をコードする１つまたは複数の核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入される。
【００３２】
一部実施形態では、細胞は、ｇ）選択可能なマーカーをコードする核酸をさらに含む。
【００３３】
一部の実施形態では、選択可能なマーカーは、切断型低親和性神経成長因子受容体（ｔＬＮＧＦＲ）ポリペプチドである。
【００３４】
一部の実施形態では、ｔＬＮＧＦＲポリペプチドは、配列番号６６のアミノ酸配列を含む。
【００３５】
一部の実施形態では、選択可能なマーカーをコードする核酸は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入されるか、または選択可能なマーカーをコードする核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入される。
【００３６】
一部の実施形態では、細胞は、ｅ）１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸をさらに含む。
【００３７】
一部の実施形態では、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドは、タクロリムス（ＦＫ５０６）および／またはシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）に対する耐性を付与する。
【００３８】
一部の実施形態では、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドは、突然変異体カルシニューリン（ＣＮ）ポリペプチドである。
【００３９】
一部の実施形態では、突然変異体ＣＮポリペプチドは、タクロリムス（ＦＫ５０６）およびシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）に対する耐性を付与する。
【００４０】
一部の実施形態では、突然変異体ＣＮポリペプチドは、ＣＮｂ３０（配列番号６７）である。
【００４１】
一部の実施形態では、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入されるか、または１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入される。
【００４２】
一部の実施形態では、細胞は、ｆ）哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナーゼのＦＫＢＰ−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインポリペプチドをコードする核酸をさらに含む。
【００４３】
一部の実施形態では、ＦＲＢドメインポリペプチドは、細胞内に発現される。
【００４４】
一部の実施形態では、ＦＲＢドメインポリペプチドは、配列番号６８もしくは６９のアミノ酸、または配列番号６８もしくは６９のアミノ酸と少なくとも９０％の配列相同性を有するバリアントを含む。
【００４５】
一部の実施形態では、ＦＲＢドメインポリペプチドをコードする核酸は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入されるか、またはＦＲＢドメインポリペプチドをコードする核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入される。
【００４６】
別の態様では、ＴＲＡＣドメインをコードする領域内またはその付近の内在性ＴＲＡ遺伝子内の配列に相補的である配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、本明細書で提供される。
【００４７】
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１〜３のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号１〜３のいずれか１つと少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【００４８】
別の態様では、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子内またはその付近の配列に相補的である配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、本明細書で提供される。
【００４９】
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４〜１８のいずれか１つと少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【００５０】
別の態様では、ａ）第１のｇＲＮＡおよび／または第２のｇＲＮＡであって、第１のｇＲＮＡが上記の実施形態のいずれかに従うｇＲＮＡであり、第２のｇＲＮＡが上記の実施形態のいずれかに従うｇＲＮＡである、第１のｇＲＮＡおよび／または第２のｇＲＮＡと、ｂ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）またはＲＧＥＮをコードする核酸とを含む系が、本明細書で提供される。
【００５１】
一部の実施形態では、系は、ｃ）１つまたは複数のドナー鋳型であって、ｉ）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）ポリペプチドを認識することができるＣＡＲ；ｉｉ）第１の細胞外結合ドメインまたはその一部分、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインまたはその一部分またはその機能的誘導体を含む、第１のＣＩＳＣ成分；ならびにｉｉｉ）第２の細胞外結合ドメインまたはその一部分、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインまたはその一部分を含む、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸を含む１つまたは複数のドナー鋳型をさらに含み；第１のＣＩＳＣ成分および第２のＣＩＳＣ成分は、Ｔ細胞により発現されると、リガンドの存在下で二量体化してＴ細胞の生存および／または増殖を促進することができるシグナル伝達能力を有するＣＩＳＣを作出するように構成されている。
【００５２】
一部の実施形態では、ＢＣＭＡを認識することができるＣＡＲは、細胞外ＢＣＭＡ認識ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含む。
【００５３】
一部の実施形態では、細胞外ＢＣＭＡ認識ドメインは、ＢＣＭＡに特異的に結合することができる抗体部分である。
【００５４】
一部の実施形態では、抗体部分は、配列番号５５からの重鎖相補性決定領域（ＨＣ−ＣＤＲ）１、ＨＣ−ＣＤＲ２、ＨＣ−ＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域（ＬＣ−ＣＤＲ）１、ＬＣ−ＣＤＲ２およびＬＣ−ＣＤＲ３を含む、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【００５５】
一部の実施形態では、抗体部分は、ｓｃＦｖである。
【００５６】
一部の実施形態では、ＣＡＲ膜貫通ドメインはＣＤ８膜貫通ドメインを含み、ＣＡＲ共刺激ドメインは４−１ＢＢおよび／もしくはＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ならびに／またはＣＡＲ細胞質シグナル伝達ドメインはＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む。
【００５７】
一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分のシグナル伝達ドメインは、ＩＬ−２受容体サブユニットガンマ（ＩＬ２Ｒγ）ドメインを含む。
【００５８】
一部の実施形態では、ＩＬ２Ｒγ細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列、または配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【００５９】
一部の実施形態では、第１の細胞外結合ドメインまたはその一部分は、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインまたはその一部分を含む。
【００６０】
一部の実施形態では、ＦＫＢＰドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列、または配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【００６１】
一部の実施形態では、第２のＣＩＳＣ成分のシグナル伝達ドメインは、ＩＬ−２受容体サブユニットベータ（ＩＬ２Ｒβ）ドメインを含む。
【００６２】
一部の実施形態では、ＩＬ２Ｒβ細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列、または配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【００６３】
一部の実施形態では、第２の細胞外結合ドメインまたはその一部分は、ＦＫＢＰラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインまたはその一部分を含む。
【００６４】
一部の実施形態では、ＦＲＢは、配列番号４８のアミノ酸配列、または配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【００６５】
一部の実施形態では、第１および第２のＣＩＳＣ成分の膜貫通ドメインは、独立して、ＩＬ−２受容体膜貫通ドメインを含む。
【００６６】
一部の実施形態では、リガンドは、ラパマイシンまたはラパログである。
【００６７】
一部の実施形態では、ラパログは、エベロリムス、ＣＣＩ−７７９、Ｃ２０−メタリルラパマイシン、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン、Ｃ１６−ｉＲａｐ、ＡＰ２１９６７、ミコフェノール酸ナトリウム、ベニジピン塩酸塩、ＡＰ１９０３もしくはＡＰ２３５７３、またはそれらの代謝物、誘導体および／もしくは組合せからなる群から選択される。
【００６８】
一部の実施形態では、ｃ）１つまたは複数のドナー鋳型は、ｉｖ）細胞外β２−ミクログロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体；ｖ）選択可能なマーカー；ｖｉ）１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチド；またはｖｉｉ）哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナーゼのＦＫＢＰ−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインポリペプチド、のうちの１つまたは複数をコードする核酸をさらに含む。
【００６９】
一部の実施形態では、キメラ受容体膜貫通ドメインはＣＤ８膜貫通ドメインポリペプチドを含み、キメラ受容体共刺激ドメインは４−１ＢＢ共刺激ドメインを含み、および／またはキメラ受容体細胞質シグナル伝達ドメインはＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む。
【００７０】
一部の実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６５のアミノ酸配列、または配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【００７１】
一部の実施形態では、選択可能なマーカーは、切断型低親和性神経成長因子受容体（ｔＬＮＧＦＲ）ポリペプチドである。
【００７２】
一部の実施形態では、ｔＬＮＧＦＲポリペプチドは、配列番号６６のアミノ酸配列を含む。
【００７３】
一部の実施形態では、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドは、突然変異体カルシニューリン（ＣＮ）ポリペプチドである。
【００７４】
一部の実施形態では、突然変異体ＣＮポリペプチドは、ＣＮｂ３０（配列番号６７）である。
【００７５】
一部の実施形態では、ＦＲＢドメインポリペプチドは、配列番号６８もしくは６９のアミノ酸、または配列番号６８もしくは６９のアミノ酸と少なくとも９０％の配列相同性を有するバリアントを含む。
【００７６】
一部の実施形態では、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４およびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはその機能的誘導体からなる群から選択される。
【００７７】
一部の実施形態では、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ９である。
【００７８】
一部の実施形態では、ＲＧＥＮをコードする核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）配列である。
【００７９】
一部の実施形態では、ＲＧＥＮをコードするＲＮＡ配列は、第１のｇＲＮＡまたは第２のｇＲＮＡに共有結合によって連結されている。
【００８０】
一部の実施形態では、系は、１つまたは複数のドナー鋳型のうちの１つを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。
【００８１】
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号１９〜４６のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号１９〜４６のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【００８２】
一部の実施形態では、系は、第１のｇＲＮＡ、第１のＡＡＶベクター、第２のｇＲＮＡ、および第２のＡＡＶベクターを含み、（Ａ）第１のｇＲＮＡは、配列番号１のポリヌクレオチド配列、または配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２８、３１、３４および３７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、ならびに配列番号２８、３１、３４および３７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；（Ｂ）第１のｇＲＮＡは、配列番号２のポリヌクレオチド配列、または配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２９、３２、３５および３８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、ならびに配列番号２９、３２、３５および３８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；または（Ｃ）第１のｇＲＮＡは、配列番号３のポリヌクレオチド配列、または配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターは、配列番号３０、３３、３６および３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、ならびに配列番号３０、３３、３６および３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【００８３】
一部の実施形態では、系は、以下を含む：（Ａ）第１のｇＲＮＡが、配列番号１のポリヌクレオチド配列、または配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターが、配列番号１９もしくは２２のポリヌクレオチド配列、または配列番号１９もしくは２２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターが、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；（Ｂ）第１のｇＲＮＡが、配列番号２のポリヌクレオチド配列、または配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターが、配列番号２０もしくは２３のポリヌクレオチド配列、または配列番号２０もしくは２３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターが、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；または（Ｃ）第１のｇＲＮＡが、配列番号３のポリヌクレオチド配列、または配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターが、配列番号２１もしくは２４のポリヌクレオチド配列、または配列番号２１もしくは２４のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターが、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【００８４】
一部の実施形態では、系は、以下を含む：（Ａ）第１のｇＲＮＡが、配列番号１のポリヌクレオチド配列、または配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターが、配列番号２５のポリヌクレオチド配列、または配列番号２５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターが、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；（Ｂ）第１のｇＲＮＡが、配列番号２のポリヌクレオチド配列、または配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターが、配列番号２６のポリヌクレオチド配列、または配列番号２６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターが、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；または（Ｃ）第１のｇＲＮＡが、配列番号３のポリヌクレオチド配列、または配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターが、配列番号２７のポリヌクレオチド配列、または配列番号２７のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターが、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【００８５】
一部の実施形態では、系は、ＲＧＥＮならびに第１のｇＲＮＡおよび／または第２のｇＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む。
【００８６】
一部の実施形態では、ＲＧＥＮは、第１のｇＲＮＡおよび／または第２のｇＲＮＡと、それぞれ１：１〜２０：１の間のｇＲＮＡ対ＲＧＥＮのモル比で、ＲＮＰを形成するように事前に複合体化されている。
【００８７】
別の態様では、配列番号１９〜４６のいずれか１つの核酸配列、または配列番号１９〜４６のいずれか１つと少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、ベクターが、本明細書で提供される。
【００８８】
一部の実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【００８９】
別の態様では、細胞のゲノムを編集する方法であって、細胞に、ａ）第１のｇＲＮＡおよび／または第２のｇＲＮＡであって、第１のｇＲＮＡが上記の実施形態のいずれかに従うｇＲＮＡであり、第２のｇＲＮＡが上記の実施形態のいずれかに従うｇＲＮＡである、第１のｇＲＮＡおよび／または第２のｇＲＮＡと；ｂ）ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸と；ｃ）１つまたは複数のドナー鋳型であって、ｉ）ＢＣＭＡポリペプチドを認識することができるＣＡＲ、ｉｉ）第１の細胞外結合ドメインまたはその一部分、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインまたはその一部分またはその機能的誘導体を含む、第１のＣＩＳＣ成分、ならびにｉｉｉ）第２の細胞外結合ドメインまたはその一部分、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインまたはその一部分を含む、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸を含む１つまたは複数のドナー鋳型とを提供するステップを含み；第１のＣＩＳＣ成分および第２のＣＩＳＣ成分が、Ｔ細胞により発現されると、リガンドの存在下で二量体化してＴ細胞の生存および／または増殖を促進することができるシグナル伝達能力を有するＣＩＳＣを作出するように構成されている、方法が、本明細書で提供される。
【００９０】
一部の実施形態では、ＢＣＭＡを認識することができるＣＡＲは、細胞外ＢＣＭＡ認識ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含む。
【００９１】
一部の実施形態では、細胞外ＢＣＭＡ認識ドメインは、ＢＣＭＡに特異的に結合することができる抗体部分である。
【００９２】
一部の実施形態では、抗体部分は、配列番号５５からの重鎖相補性決定領域（ＨＣ−ＣＤＲ）１、ＨＣ−ＣＤＲ２、ＨＣ−ＣＤＲ３、軽鎖相補性決定領域（ＬＣ−ＣＤＲ）１、ＬＣ−ＣＤＲ２およびＬＣ−ＣＤＲ３を含む、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【００９３】
一部の実施形態では、抗体部分は、ｓｃＦｖである。
【００９４】
一部の実施形態では、ＣＡＲ膜貫通ドメインはＣＤ８膜貫通ドメインを含み、ＣＡＲ共刺激ドメインは４−１ＢＢおよび／もしくはＣＤ２８共刺激ドメインを含み、ならびに／またはＣＡＲ細胞質シグナル伝達ドメインはＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む。
【００９５】
一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分のシグナル伝達ドメインは、ＩＬ−２受容体サブユニットガンマ（ＩＬ２Ｒγ）細胞質シグナル伝達ドメインを含む。
【００９６】
一部の実施形態では、ＩＬ２Ｒγ細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列、または配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【００９７】
一部の実施形態では、第１の細胞外結合ドメインまたはその一部分は、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインまたはその一部分を含む。
【００９８】
一部の実施形態では、ＦＫＢＰドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列、または配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【００９９】
一部の実施形態では、第２のＣＩＳＣ成分のシグナル伝達ドメインは、ＩＬ−２受容体サブユニットベータ（ＩＬ２Ｒβ）細胞質シグナル伝達ドメインを含む。
【０１００】
一部の実施形態では、ＩＬ２Ｒβ細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列、または配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０１０１】
一部の実施形態では、第２の細胞外結合ドメインまたはその一部分は、ＦＫＢＰラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインまたはその一部分を含む。
【０１０２】
一部の実施形態では、ＦＲＢドメインは、配列番号４８のアミノ酸配列、または配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０１０３】
一部の実施形態では、第１および第２のＣＩＳＣ成分の膜貫通ドメインは、独立して、ＩＬ−２受容体膜貫通ドメインを含む。
【０１０４】
一部の実施形態では、ラパログは、エベロリムス、ＣＣＩ−７７９、Ｃ２０−メタリルラパマイシン、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン、Ｃ１６−ｉＲａｐ、ＡＰ２１９６７、ミコフェノール酸ナトリウム、ベニジピン塩酸塩、ＡＰ１９０３もしくはＡＰ２３５７３、またはそれらの代謝物、誘導体および／もしくは組合せからなる群から選択される。
【０１０５】
一部の実施形態では、ｃ）１つまたは複数のドナー鋳型は、ｉｖ）細胞外β２−ミクログロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体；ｖ）選択可能なマーカー；ｖｉ）１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチド；またはｖｉｉ）哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナーゼのＦＫＢＰ−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインポリペプチドのうちの１つまたは複数をコードする核酸をさらに含む。
【０１０６】
一部の実施形態では、キメラ受容体膜貫通ドメインはＣＤ８膜貫通ドメインポリペプチドを含み、キメラ受容体共刺激ドメインは４−１ＢＢ共刺激ドメインを含み、および／またはキメラ受容体細胞質シグナル伝達ドメインはＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む。
【０１０７】
一部の実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６５のアミノ酸配列、または配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０１０８】
一部の実施形態では、選択可能なマーカーは、切断型低親和性神経成長因子受容体（ｔＬＮＧＦＲ）ポリペプチドである。
【０１０９】
一部の実施形態では、ｔＬＮＧＦＲポリペプチドは、配列番号６６のアミノ酸配列を含む。
【０１１０】
一部の実施形態では、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドは、突然変異体カルシニューリン（ＣＮ）ポリペプチドである。
【０１１１】
一部の実施形態では、突然変異体ＣＮポリペプチドは、ＣＮｂ３０（配列番号６７）である。
【０１１２】
一部の実施形態では、ＦＲＢドメインポリペプチドは、配列番号６８もしくは６９のアミノ酸、または配列番号６８もしくは６９のアミノ酸と少なくとも９０％の配列相同性を有するバリアントを含む。
【０１１３】
別の態様では、細胞のゲノムを編集する方法であって、細胞に、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、第１のベクター、および第２のベクターを提供するステップを含み、（Ａ）第１のｇＲＮＡが、配列番号１のポリヌクレオチド配列、または配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のベクターが、配列番号２８、３１、３４および３７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、ならびに配列番号２８、３１、３４および３７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のベクターが、配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；（Ｂ）第１のｇＲＮＡが、配列番号２のポリヌクレオチド配列、または配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のベクターが、配列番号２９、３２、３５および３８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、ならびに配列番号２９、３２、３５および３８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のベクターが、配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；または（Ｃ）第１のｇＲＮＡが、配列番号３のポリヌクレオチド配列、または配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のベクターが、配列番号３０、３３、３６および３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、ならびに配列番号３０、３３、３６および３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のベクターが、配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、方法が、本明細書で提供される。
【０１１４】
別の態様では、細胞のゲノムを編集する方法であって、細胞に、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、第１のベクター、および第２のベクターを提供するステップを含み、（Ａ）第１のｇＲＮＡが、配列番号１のポリヌクレオチド配列、または配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターが、配列番号１９もしくは２２のポリヌクレオチド配列、または配列番号１９もしくは２２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターが、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；（Ｂ）第１のｇＲＮＡが、配列番号２のポリヌクレオチド配列、または配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターが、配列番号２０もしくは２３のポリヌクレオチド配列、または配列番号２０もしくは２３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターが、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；または（Ｃ）第１のｇＲＮＡが、配列番号３のポリヌクレオチド配列、または配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターが、配列番号２１もしくは２４のポリヌクレオチド配列、または配列番号２１もしくは２４のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターが、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、方法が、本明細書で提供される。
【０１１５】
別の態様では、細胞のゲノムを編集する方法であって、細胞に、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、第１のベクター、および第２のベクターを提供するステップを含み、（Ａ）第１のｇＲＮＡが、配列番号１のポリヌクレオチド配列、または配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターが、配列番号２５のポリヌクレオチド配列、または配列番号２５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターが、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；（Ｂ）第１のｇＲＮＡが、配列番号２のポリヌクレオチド配列、または配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターが、配列番号２６のポリヌクレオチド配列、または配列番号２６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターが、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；または（Ｃ）第１のｇＲＮＡが、配列番号３のポリヌクレオチド配列、または配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターが、配列番号２７のポリヌクレオチド配列、または配列番号２７のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡが、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターが、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、方法が、本明細書で提供される。
【０１１６】
一部の実施形態では、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４およびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはその機能的誘導体からなる群から選択される。
【０１１７】
一部の実施形態では、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ９である。
【０１１８】
一部の実施形態では、ＲＧＥＮをコードする核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）配列である。
【０１１９】
一部の実施形態では、ＲＧＥＮをコードするＲＮＡ配列は、第１のｇＲＮＡまたは第２のｇＲＮＡに共有結合によって連結されている。
【０１２０】
一部の実施形態では、ドナー鋳型は、ＡＡＶベクターに含有される。
【０１２１】
一部の実施形態では、ＲＧＥＮは、細胞への提供前に、第１のｇＲＮＡおよび／または第２のｇＲＮＡと事前に複合体化されてＲＮＰ複合体を形成している。
【０１２２】
一部の実施形態では、ＲＧＥＮは、第１のｇＲＮＡおよび／または第２のｇＲＮＡと、それぞれ１：１〜２０：１の間のｇＲＮＡ対ＲＧＥＮのモル比で事前に複合体化されている。
【０１２３】
一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、独立して、細胞のゲノムに挿入される。
【０１２４】
一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、ＴＲＡ遺伝子もしくは遺伝子調節エレメントに、その中に、もしくはその付近に挿入され、および／または第２のドナー鋳型は、ＩＬ２ＲＧ遺伝子もしくは遺伝子調節配列に、その中に、もしくはその付近に挿入される。
【０１２５】
一部の実施形態では、ｉ）第１のＣＩＳＣ成分をコードする核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入され、および／またはｉｉ）第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入されるか、またはｉ）第１のＣＩＳＣ成分をコードする核酸は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入され、および／またはｉｉ）第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入される。
【０１２６】
一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。
【０１２７】
一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球またはＣＤ３＋汎Ｔ細胞である。
【０１２８】
一部の実施形態では、Ｔ細胞は、複数のドナーに由来するＴ細胞のプールのメンバーである。
【０１２９】
一部の実施形態では、複数のドナーは、ヒトドナーである。
【０１３０】
一部の実施形態では、細胞は、形質細胞に対して細胞傷害性である。
【０１３１】
別の態様では、上記の実施形態のいずれかに従う方法により産生される、操作された細胞が、本明細書に提供される。
【０１３２】
一部の実施形態では、操作された細胞は、形質細胞に対して細胞傷害性である。
【０１３３】
別の態様では、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）または自己免疫疾患の処置を必要とする対象の移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）または自己免疫疾患を処置する方法であって、対象に上記の実施形態のいずれかに従う操作された細胞を投与するステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【０１３４】
別の態様では、疾患または状態の処置を必要とする対象において有害な抗体産生により特徴付けられる疾患または状態を処置する方法であって、ａ）上記の実施形態のいずれかに従う方法に従ってＴ細胞のゲノムを編集することによって、操作されたＴ細胞を産生するステップと、ｂ）対象に操作されたＴ細胞を投与するステップとを含む方法が、本明細書で提供される。
【０１３５】
一部の実施形態では、Ｔ細胞は、対象にとって自己である。
【０１３６】
一部の実施形態では、Ｔ細胞は、対象にとって同種である。
【０１３７】
一部の実施形態では、Ｔ細胞は、複数のドナーに由来するＴ細胞のプールを含む。
【０１３８】
一部の実施形態では、複数のドナーは、ヒトドナーである。
【０１３９】
別の態様では、疾患または状態の処置を必要とする対象の疾患または状態を処置する方法であって、疾患または状態が有害な抗体産生により特徴付けられ、上記の実施形態のいずれかに従う方法に従って対象のＴ細胞のゲノムを編集するステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【０１４０】
一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞またはＣＤ３＋汎Ｔ細胞を含む。
【０１４１】
一部の実施形態では、対象はヒトである。
【０１４２】
一部の実施形態では、方法は、対象にラパマイシンまたはラパログを投与するステップをさらに含む。
【０１４３】
一部の実施形態では、ラパログは、エベロリムス、ＣＣＩ−７７９、Ｃ２０−メタリルラパマイシン、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン、Ｃ１６−ｉＲａｐ、ＡＰ２１９６７、ミコフェノール酸ナトリウム、ベニジピン塩酸塩、ＡＰ１９０３もしくはＡＰ２３５７３、またはそれらの代謝物、誘導体および／もしくは組合せからなる群から選択される。
【０１４４】
一部の実施形態では、ラパマイシンまたはラパログは、０．０５ｎＭ〜１００ｎＭの濃度で投与される。
【０１４５】
一部の実施形態では、疾患または状態は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、抗体媒介自己免疫、または軽鎖アミロイドーシスである。
【０１４６】
一部の実施形態では、疾患または状態はＧｖＨＤであり、対象は同種移植を以前に受けたことがある。
【０１４７】
別の態様では、使用説明書、ならびにａ）上記の実施形態のいずれかに従う操作された細胞、および／または上記の実施形態のいずれかに従う系の１つもしくは複数の成分、および／またはｂ）ラパマイシンもしくはラパログを含む、キットが、本明細書で提供される。
【０１４８】
一部の実施形態では、ラパログは、エベロリムス、ＣＣＩ−７７９、Ｃ２０−メタリルラパマイシン、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン、Ｃ１６−ｉＲａｐ、ＡＰ２１９６７、ミコフェノール酸ナトリウム、ベニジピン塩酸塩、ＡＰ１９０３もしくはＡＰ２３５７３、またはそれらの代謝物、誘導体および／もしくは組合せからなる群から選択される。
【０１４９】
別の態様では、上記の実施形態のいずれかに従う操作された細胞、または上記の実施形態のいずれかに従う系の１つもしくは複数の成分を含む組成物を含む、注射器が、本明細書で提供される。
【０１５０】
別の態様では、上記の実施形態のいずれかに従う操作された細胞、または上記の実施形態のいずれかに従う系の１つもしくは複数の成分を含む組成物を含む、カテーテルが、本明細書で提供される。
【０１５１】
別の態様では、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、または自己免疫疾患、または有害な抗体産生により特徴付けられる疾患もしくは状態の処置における使用のための、上記の実施形態のいずれかに従う操作されたＴ細胞が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、抗体媒介自己免疫疾患である。一部の実施形態では、疾患または状態は、軽鎖アミロイドーシスである。
【０１５２】
別の態様では、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、または自己免疫疾患、または有害な抗体産生により特徴付けられる疾患もしくは状態の処置のための医薬の製造における使用のための、上記の実施形態のいずれかに従う操作されたＴ細胞が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、抗体媒介自己免疫疾患である。一部の実施形態では、疾患または状態は、軽鎖アミロイドーシスである。
【０１５３】
別の態様では、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、または自己免疫疾患、または有害な抗体産生により特徴付けられる疾患もしくは状態の処置における使用のための、上記の実施形態のいずれかに従う系が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、抗体媒介自己免疫疾患である。一部の実施形態では、疾患または状態は、軽鎖アミロイドーシスである。
【０１５４】
別の態様では、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、または自己免疫疾患、または有害な抗体産生により特徴付けられる疾患もしくは状態の処置のための医薬の製造における使用のための、上記の実施形態のいずれかに従う系が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、抗体媒介自己免疫疾患である。一部の実施形態では、疾患または状態は、軽鎖アミロイドーシスである。
【０１５５】
別の態様では、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、または自己免疫疾患、または有害な抗体産生により特徴付けられる疾患もしくは状態の処置における使用のための、上記の実施形態のいずれかに従う１つもしくは複数のｇＲＮＡ、１つもしくは複数のドナー鋳型、キット、注射器、および／またはカテーテルが、本明細書で提供される。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、抗体媒介自己免疫疾患である。一部の実施形態では、疾患または状態は、軽鎖アミロイドーシスである。
【０１５６】
別の態様では、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、または自己免疫疾患、または有害な抗体産生により特徴付けられる疾患もしくは状態の処置のための医薬の製造における使用のための、上記の実施形態のいずれかに従う１つもしくは複数のｇＲＮＡ、１つもしくは複数のドナー鋳型、キット、注射器、および／またはカテーテルが、本明細書で提供される。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、抗体媒介自己免疫疾患である。一部の実施形態では、疾患または状態は、軽鎖アミロイドーシスである。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１−１】図１は、ドナー鋳型構築物に存在するエレメント（一定比率の縮小ではない）およびそれらの相対的位置を示す、ドナー鋳型構築物＃１〜＃１１の概略図を示す。５’ＨＡ：５’ホモロジーアーム；３’ＨＡ：３’ホモロジーアーム；ｓ  ｐＡ：合成ポリＡシグナル；ＳＶ４０  ｐＡ：ＳＶ４０ポリＡシグナル；ｐＭＳＣＶ：マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーター；ＣＤ８  ｓｐ：ＣＤ８シグナルペプチド；ＣＤ８  ｔｍ：ＣＤ８膜貫通ドメイン；ＣＤ２８：ＣＤ２８共刺激ドメイン；４−１ＢＢ：４−１ＢＢ共刺激ドメイン；ＣＤ３ｚ：ＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメイン；ＷＰＲＥ３：ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）３；ＣＩＳＣβ：ＦＲＢドメインおよびＩＬ２Ｒβドメインを伴うＣＩＳＣサブユニット；ｔＣＩＳＣγ：ＦＫＢＰドメインおよびＩＬ２Ｒγドメインの断片を伴うＣＩＳＣサブユニット；β２Ｍ  ＣＲ：β２−ミクログロブリンキメラ受容体；ＦＲＢ：ネイキッドＦＲＢドメインポリペプチド；Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ：自己切断ペプチド；ＥＲ：小胞体シグナル配列；ＣＮｂ３０：突然変異体カルシニューリンポリペプチド；ｔＬＮＧＦＲ：切断型低親和性神経成長因子受容体。
【図１−２】同上。
【発明を実施するための形態】
【０１５８】
形質細胞に対して細胞傷害性の操作されたＴ細胞であって、操作されたＴ細胞の制御された生存および／または増殖を可能にする化学誘導シグナル伝達複合体（ＣＩＳＣ）を含む操作されたＴ細胞、例えば、ＢＣＭＡ発現細胞に対する細胞傷害性を付与する抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する操作されたＴ細胞、操作されたＴ細胞を作製および使用する方法、ならびに方法に有用な組成物が、本明細書に記載される。
【０１５９】
本出願人は、細胞ゲノム内のＴＲＡ遺伝子および／またはＩＬ２ＲＧ遺伝子への抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲおよび／またはＣＩＳＣをコードする異種核酸配列の標的組込みのための一連の新規ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であって、編集された細胞における内在性ＴＣＲおよび／またはＩＬ２ＲＧの発現を機能的に抑制する異種核酸配列の組込みを活用して、ＣＩＳＣが、ラパマイシンまたはラパマイシンアナログの結合時に、ＩＬ２Ｒ様シグナル伝達することができる、一連の新規ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を開発した。ＴＲＡまたはＩＬ２ＲＧを標的とするスペーサー配列を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をオンターゲットおよびオフターゲット切断について分析し、好適なプロファイルを有することが判明したことから、それらを細胞ベースの治療などの下流の使用の候補にした。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲおよび／またはＣＩＳＣを発現するように初代ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を編集することに成功し、編集された細胞は、内在性ＴＣＲおよび／またはＩＬ２ＲＧの発現の減少を示した。これらの発見は、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が、疾患、例えばＢＣＭＡ発現細胞に関連する疾患の処置に有用であることを示す。
定義
【０１６０】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての専門および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書において言及される全ての特許、出願、公開出願および他の刊行物は、別段の記述がない限り、それら全体が参照により明確に本明細書に組み込まれる。本明細書における用語について複数の定義がある場合には、別段の記述がない限り、このセクションでの定義が優先する。
【０１６１】
本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは１つより多くを意味し得る。
【０１６２】
「約」は、本明細書に照らして読むときにその明白なかつ通常の意味を有し、例えば、測定可能な値への言及の際に使用されることがあり、指定されている値から±２０％または±１０％、±５％、±１％または±０．１％の変動を包含することを意図したものであり得る。
【０１６３】
本明細書で使用される場合、「タンパク質配列」は、タンパク質の一次構造であるアミノ酸のポリペプチド配列を指す。本明細書で使用される場合、「上流」は、ポリヌクレオチド上の場所の５’位、およびポリペプチド上の場所のＮ末端側の位置を指す。本明細書で使用される場合、「下流」は、ヌクレオチド上の場所の３’位、およびポリペプチド上の場所のＣ末端側の位置を指す。したがって、用語「Ｎ末端」は、ポリペプチド上の場所のＮ末端側のポリヌクレオチド上のエレメントまたは場所の位置を指す。
【０１６４】
「核酸」または「核酸分子」は、ポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生成された断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより生成された断片を指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、または天然に存在するヌクレオチドのアナログ（例えば、天然に存在するヌクレオチドのエナンチオマー形態）、または両方の組合せである、モノマーで構成され得る。改変ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジンもしくはプリン塩基部分に変更を有し得る。糖改変は、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基での１つもしくは複数のヒドロキシル基の置き換えを含むか、または糖をエーテルもしくはエステルとして官能化することができる。さらに、糖部分全体が、アザ糖および炭素環式糖アナログなどの、立体的におよび電子的に類似した構造で置き換えられてもよい。塩基部分の改変の例としては、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、または他の周知の複素環式置換体が挙げられる。核酸モノマーを、ホスホジエステル結合またはそのような連結のアナログによって連結させることができる。ホスホジエステル連結のアナログは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート、ホスホルアミデートなどを含む。用語「核酸分子」は、ポリアミド骨格に付着した天然に存在するかまたは改変された核酸塩基を含む、いわゆる「ペプチド核酸」も含む。核酸は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸配列が提供される。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡである。
【０１６５】
「をコードすること（ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ）」または「をコードすること（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」が本明細書で使用され、アミノ酸の定義された配列など他の高分子の合成のための鋳型として役立つ、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどの、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の特性を指す。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳により細胞または他の生物システムにおいてタンパク質が産生される場合、タンパク質をコードする。
【０１６６】
「ポリペプチドをコードする核酸配列」は、互いの縮重バージョンであるヌクレオチド配列および同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を全て含む。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸が提供される。
【０１６７】
「ベクター」、「発現ベクター」、または「構築物」は、異種核酸を、調節エレメントを有する細胞へ導入して、細胞において異種核酸の発現をもたらすために使用される核酸である。ベクターは、プラスミド、ミニサークル、酵母、およびウイルスゲノムを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミド、ミニサークル、酵母、またはウイルスゲノムである。一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスである。一部の実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌系におけるタンパク質発現のためのものである。本明細書で使用される場合、用語「発現」または「タンパク質発現」は、タンパク質分子への転写ＲＮＡ分子の翻訳を指す。タンパク質発現を、その時間的、空間的、発生的、または形態学的品質により、ならびに定量的または定性的表示度数により特徴付けることができる。一部の実施形態では、タンパク質（単数または複数）は、タンパク質がリガンドの存在下での二量体化のために配置されるように、発現される。
【０１６８】
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」は、別々のタンパク質またはタンパク質の部分を元々コードしていた２つまたはそれよりも多くの遺伝子の接合によって作出されたタンパク質である。融合タンパク質は、２つまたはそれよりも多くの別々のタンパク質からの特定のタンパク質ドメインで構成されていることもある。この融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質の各々に由来する機能特性を有する単一のまたは複数のポリペプチドをもたらすことができる。組換え融合タンパク質は、生物学的研究または治療薬における使用のための組換えＤＮＡ技術により人工的に作出することができる。融合タンパク質を作出するためのそのような方法は、当業者には公知である。一部の融合タンパク質は、全ペプチドを併せ持っており、したがって、元のタンパク質の全てのドメイン、特に、機能的ドメインを含有することができる。しかし、他の融合タンパク質、特に、天然に存在しないものは、コード配列の部分しか併せ持っておらず、したがって、それらを形成した親遺伝子の本来の機能を維持していない。
【０１６９】
本明細書で使用される場合、用語「調節エレメント」は、遺伝子調節活性を有するＤＮＡ分子、例えば、作動可能に連結した転写可能なＤＮＡ分子の転写および／または翻訳に影響を及ぼす能力を有するものを指す。プロモーター、リーダー、イントロンおよび転写終結領域などの、調節エレメントは、遺伝子調節活性を有し、生細胞における遺伝子の全体的発現において不可欠な役割を果たす、ＤＮＡ分子である。したがって、植物において機能するプロモーターなどの単離された調節エレメントは、遺伝子操作方法により植物の表現型を改変するのに有用である。
【０１７０】
本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結した」は、第２の分子に接合した第１の分子を指し、分子は、第１の分子が第２の分子の機能に影響を及ぼすように配列されている。２つの分子は、単一の連続した分子の一部であることもあり、隣接していることもある。例えば、プロモーターが細胞内の目的の転写可能なＤＮＡ分子の転写をモジュレートする場合、プロモーターは、転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結している。
【０１７１】
「プロモーター」は、特定の遺伝子の転写を開始させるＤＮＡの領域である。プロモーターは、遺伝子の転写開始部位の付近に、同じ鎖上に、およびＤＮＡ上の上流（センス鎖の５’領域）に位置することができる。プロモーターは、条件付き、誘導性または構成的プロモーターであり得る。プロモーターは、細菌、哺乳動物または昆虫細胞タンパク質発現に特異的であり得る。融合タンパク質をコードする核酸が提供される一部の実施形態では、核酸は、プロモーター配列をさらに含む。一部の実施形態では、プロモーターは、細菌、哺乳動物または昆虫細胞タンパク質発現に特異的である。一部の実施形態では、プロモーターは、条件付き、誘導性または構成的プロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは、ＭＮＤプロモーターである。
【０１７２】
本明細書で使用される場合の「二量体化学誘導シグナル伝達複合体」、「二量体ＣＩＳＣ」、または「二量体」は、互いに接合している融合タンパク質複合体であってもよく、またはなくてもよい、ＣＩＳＣの２つの成分を指す。「二量体化」は、２つの別々の実体が接合して単一の実体になるプロセスを指す。一部の実施形態では、リガンドまたは作用因子が二量体化を刺激する。一部の実施形態では、二量体化は、ホモ二量体化、すなわち、２つの同一のＣＩＳＣ成分などの２つの同一の実体の接合を指す。一部の実施形態では、二量体化は、２つの異なる別個のＣＩＳＣ成分などの２つの異なる実体の接合の、ヘテロ二量体化を指す。一部の実施形態では、ＣＩＳＣ成分の二量体化は、細胞シグナル伝達経路を生じさせる結果となる。一部の実施形態では、ＣＩＳＣ成分の二量体化は、細胞または細胞の集団の選択的拡大を可能にする。さらなるＣＩＳＣ系は、ＣＩＳＣジベレリンＣＩＳＣ二量体化系、またはＳＬＦ−ＴＭＰ  ＣＩＳＣ二量体化系を含み得る。他の化学誘導性二量体化（ＣＩＤ）系および成分部分を使用してもよい。
【０１７３】
本明細書で使用される場合、「化学誘導シグナル伝達複合体」または「ＣＩＳＣ」は、リガンド誘導二量体化の直接の転帰として細胞の内部へのシグナルを開始させる、操作された複合体を指す。ＣＩＳＣは、ホモ二量体（２つの同一成分の二量体化）であっても、ヘテロ二量体（２つの別個の成分の二量体化）であってもよい。したがって、本明細書で使用される場合、用語「ホモ二量体」は、同一のアミノ酸配列を有する本明細に記載の２つのタンパク質成分の二量体を指す。用語「ヘテロ二量体」は、同一ではないアミノ酸配列を有する本明細書に記載の２つのタンパク質成分の二量体を指す。
【０１７４】
ＣＩＳＣは、本明細書中でより詳細に説明されるような合成複合体であることもある。本明細書で使用される場合の「合成（の）」は、天然でない、または自然界に見られない、本明細書に記載の複合体、タンパク質、二量体または組成物を指す。一部の実施形態では、ＩＬ２Ｒ−ＣＩＳＣは、インターロイキン−２受容体成分を含むシグナル伝達複合体を指す。一部の実施形態では、ＩＬ２／１５−ＣＩＳＣは、インターロイキン−２およびインターロイキン−１５により共有されている受容体シグナル伝達サブユニットを含むシグナル伝達複合体を指す。一部の実施形態では、ＩＬ７−ＣＩＳＣは、インターロイキン−７受容体成分を含むシグナル伝達複合体を指す。このように、ＣＩＳＣは、所与のＣＩＳＣの成分を構成する成分部分に従って呼ばれ得る。化学誘導シグナル伝達複合体の成分部分が、ＣＩＳＣへの組込みに有用な天然または合成成分で構成され得ることは、当業者には分かるであろう。したがって、本明細書で提供される例は、限定的であることを意図したものではない。
【０１７５】
本明細書で使用される場合、「サイトカイン受容体」は、サイトカインを認識し、それに結合する、受容体分子を指す。一部の実施形態では、サイトカイン受容体は、サイトカイン受容体アミノ酸および／または核酸配列に対する置換、欠失および／または付加を伴うものを含む、改変サイトカイン受容体分子（例えば、「バリアントサイトカイン受容体」）を包含する。したがって、用語は、野生型、ならびに組換え、合成的に産生された、およびバリアントのサイトカイン受容体を包含することが意図される。一部の実施形態では、サイトカイン受容体は、細胞外結合ドメインとヒンジドメインと膜貫通ドメインとシグナル伝達ドメインとを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、受容体の成分（すなわち、受容体のドメイン）は、天然または合成である。一部の実施形態では、ドメインは、ヒト由来のドメインである。
【０１７６】
本明細書で使用される場合の「ＦＫＢＰ」は、ＦＫ５０６結合タンパク質ドメインである。ＦＫＢＰは、プロリルイソメラーゼ活性を有し、機能の点ではシクロフィリンに関連しているがアミノ酸配列の点では関連していない、タンパク質のファミリーを指す。ＦＫＢＰは、酵母からヒトまで多くの真核生物において同定されており、プロリン残基を含有するタンパク質のタンパク質フォールディングシャペロンとして機能する。シクロフィリンに加えて、ＦＫＢＰは、イムノフィリンファミリーに属する。用語ＦＫＢＰは、例えば、ＦＫＢＰ１２、ならびに遺伝子ＡＩＰ、ＡＩＰＬ１、ＦＫＢＰ１Ａ、ＦＫＢＰ１Ｂ、ＦＫＢＰ２、ＦＫＢＰ３、ＦＫＢＰ５、ＦＫＢＰ６、ＦＫＢＰ７、ＦＫＢＰ８、ＦＫＢＰ９、ＦＫＢＰ９Ｌ、ＦＫＢＰ１０、ＦＫＢＰ１１、ＦＫＢＰ１４、ＦＫＢＰ１５、ＦＫＢＰ５２および／またはＬＯＣ５４１４７３によりコードされるタンパク質を含み、タンパク質は、それらのホモログおよびそれらの機能的タンパク質断片を含む。
【０１７７】
ＦＫＢＰラパマイシン結合ドメインとしての、本明細書で使用される場合の「ＦＲＢ」。ＦＲＢドメインは、ＦＫＢＰタンパク質およびラパマイシンまたはそのラパログと三分子複合体を形成するように構成されているポリペプチド領域（タンパク質「ドメイン」）である。ＦＲＢドメインは、いくつかの天然に存在するタンパク質に存在し、そのようなタンパク質には、ヒトおよび他の種からのｍＴＯＲタンパク質（文献中でＦＲＡＰ、ＲＡＰＴ  １、またはＲＡＦＴとも呼ばれる）；Ｔｏｒ１および／またはＴｏｒ２を含む酵母タンパク質；ならびにＣａｎｄｉｄａ  ＦＲＡＰホモログが含まれる。ＦＫＢＰとＦＲＢの両方が、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）シグナル伝達の主要構成要素である。
【０１７８】
「裸のＦＫＢＰラパマイシン結合ドメインポリペプチド」または「裸のＦＲＢドメインポリペプチド」（「ＦＫＢＰラパマイシン結合ドメインポリペプチド」または「ＦＲＢドメインポリペプチド」とも呼ばれることがある）は、ＦＲＢドメインまたはタンパク質のアミノ酸のみを含むポリペプチドであって、タンパク質のアミノ酸の約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％がＦＲＢドメインのアミノ酸である、ポリペプチドを指す。ＦＲＢドメインは、１２ｋＤａの可溶性タンパク質として発現され得る（Chen,  J.  et  al.(1995).Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.,  92(11):4947-4951）。ＦＲＢドメインは、球状タンパク質における一般的な構造モチーフである、４ヘリックスバンドルを形成する。その全体的な寸法は、３０Å×４５Å×３０Åであり、４つ全てのヘリックスが、シトクロムｂ５６２折り畳み構造に類似した短い下向きの接続を有する（Choi,  J.  et  al.(1996).  Science,  273(5272):239-242）。一部の実施形態では、裸のＦＲＢドメインは、配列番号６８または６９のアミノ酸配列を含む。
【０１７９】
一部の実施形態では、本明細書に記載の手法において使用される免疫調節性イミド薬は：サリドマイド（類似体、誘導体を含み、その薬学的に許容される塩を含む。サリドマイドは、Ｉｍｍｕｎｏｐｒｉｎ、Ｔｈａｌｏｍｉｄ、Ｔａｌｉｄｅｘ、Ｔａｌｉｚｅｒ、Ｎｅｕｒｏｓｅｄｙｎ、α−（Ｎ−フタルイミド）グルタルイミド、２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イソインドール−１，３−ジオンを含み得る）；ポマリドミド（類似体、誘導体を含み、その薬学的に許容される塩を含む。ポマリドミドは、Ｐｏｍａｌｙｓｔ、Ｉｍｎｏｖｉｄ、（ＲＳ）−４−アミノ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）イソインドール−１，３−ジオンを含み得る）；レナリドミド（類似体、誘導体を含み、その薬学的に許容される塩を含む。レナリドミドは、Ｒｅｖｌｉｍｉｄ、（ＲＳ）−３−（４−アミノ−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）ピペリジン−２，６−ジオンを含み得る）；またはアプレミラスト（類似体、誘導体を含み、その薬学的に許容される塩を含む。アプレミラストは、Ｏｔｅｚｌａ、ＣＣ−１０００４、Ｎ−｛２−［（１Ｓ）−１−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−２−（メチルスルホニル）エチル］−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イソインドール−４−イル｝アセトアミドを含み得る）；またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１８０】
本明細書で使用される場合、用語「細胞外結合ドメイン」は、細胞の外側にあり、特定の原子または分子に結合するように構成されている、複合体のドメインを指す。一部の実施形態では、ＣＩＳＣの細胞外結合ドメインは、ＦＫＢＰドメインまたはその一部分である。一部の実施形態では、細胞外結合ドメインは、ＦＲＢドメインまたはその一部分である。一部の実施形態では、細胞外結合ドメインは、リガンドまたは作用因子を結合することよって２つのＣＩＳＣ成分の二量体化を刺激するように構成されている。一部の実施形態では、細胞外結合ドメインは、サイトカイン受容体モジュレーターに結合するように構成されている。
【０１８１】
本明細書で使用される場合、用語「サイトカイン受容体モジュレーター」は、サイトカイン受容体の下流の標的のリン酸化、サイトカイン受容体に関連するシグナル伝達経路の活性化、および／またはサイトカインなどの特定のタンパク質の発現をモジュレートする作用因子を指す。そのような作用因子は、サイトカイン受容体の下流の標的のリン酸化、サイトカイン受容体に関連するシグナル伝達経路の活性化、および／またはサイトカインなどの特定のタンパク質の発現を、直接または間接的にモジュレートすることができる。したがって、サイトカイン受容体モジュレーターの例としては、サイトカイン受容体またはその断片に免疫特異的に結合する、サイトカイン、サイトカインの断片、融合タンパク質および／もしくは抗体またはそれらの結合部分が挙げられるが、それらに限定されない。さらに、サイトカイン受容体モジュレーターの例としては、サイトカインまたはその断片に免疫特異的に結合する、ペプチド、ポリペプチド（例えば、可溶性サイトカイン受容体）、融合タンパク質および／もしくは抗体またはそれらの結合部分が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１８２】
本明細書で使用される場合、用語「活性化する」は、目的のタンパク質の少なくとも１つの生物活性の増大を指す。同様に、用語「活性化」は、活性増大状態にある目的のタンパク質の状態を指す。用語「活性化可能な」は、シグナル、作用因子、リガンド、化合物または刺激の存在下で活性化される目的のタンパク質の能力を指す。一部の実施形態では、本明細書に記載される場合の二量体は、シグナル、作用因子、リガンド、化合物または刺激の存在下で活性化され、シグナル伝達能力を有する二量体になる。本明細書で使用される場合、用語「シグナル伝達能力を有する」は、下流のシグナル伝達経路を開始または維持することができるような二量体の能力または構成を指す。
【０１８３】
本明細書で使用される場合、用語「ヒンジドメイン」は、細胞外結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するドメインを指し、細胞外結合ドメインに柔軟性を付与することができる。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、細胞外ドメインを原形質膜の近くに配置して、抗体またはその結合断片による認識の可能性を最小化する。一部の実施形態では、細胞外結合ドメインは、ヒンジドメインのＮ末端側に位置する。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、天然であっても、合成であってもよい。
【０１８４】
本明細書で使用される場合、用語「膜貫通ドメイン」または「ＴＭドメイン」は、細胞膜内でなど、膜内で安定しているドメインを指す。用語「膜貫通スパン」、「組み込まれているタンパク質」および「組み込まれているドメイン」も、本明細書で使用される。一部の実施形態では、ヒンジドメインおよび細胞外ドメインは、膜貫通ドメインのＮ末端側に位置する。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、天然または合成ドメインである。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＩＬ−２受容体膜貫通ドメインである。
【０１８５】
本明細書で使用される場合、用語「シグナル伝達ドメイン」は、哺乳動物細胞などの細胞内部のシグナル伝達カスケードに関与する、融合タンパク質またはＣＩＳＣ成分のドメインを指す。シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞などの細胞に、例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体のＣＤ３ゼータ鎖により提供される一次シグナルに加えて、活性化、増殖、分化および／またはサイトカイン分泌を含むがこれらに限定されないＴ細胞応答などの細胞応答を媒介するシグナルを提供する、シグナル伝達部分を指す。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメイン、ヒンジドメインおよび細胞外ドメインのＮ末端側にある。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、合成または天然ドメインである。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、連鎖状細胞質シグナル伝達ドメインである。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、サイトカインシグナル伝達ドメインである。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、抗原シグナル伝達ドメインである。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、インターロイキン−２受容体サブユニットガンマ（ＩＬ２ＲγまたはＩＬ２ＲＧ）ドメインである。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、インターロイキン−２受容体サブユニットベータ（ＩＬ２ＲβまたはＩＬ２ＲＢ）ドメインである。一部の実施形態では、細胞外結合ドメインへの作用因子またはリガンドの結合は、ＣＩＳＣ成分の二量体化の結果として、シグナル伝達経路の活性化によりシグナル伝達ドメイン経由でのシグナル伝達を引き起こす。本明細書で使用される場合、用語「シグナル伝達」は、細胞外ドメインへのリガンドまたは作用因子の結合によるシグナル伝達経路の活性化を指す。シグナルの活性化は、ＣＩＳＣ二量体化をもたらす、リガンドまたは作用因子への細胞外ドメインの結合の結果である。
【０１８６】
本明細書で使用される場合、用語「ＩＬ２ＲＢ」または「ＩＬ２Ｒβ」は、インターロイキン−２受容体サブユニットベータを指す。同様に、用語「ＩＬ２ＲＧ」または「ＩＬ２Ｒγ」は、インターロイキン−２受容体サブユニットガンマを指し、用語「ＩＬ２ＲＡ」または「ＩＬ２Ｒα」は、インターロイキン−２受容体サブユニットアルファを指す。ＩＬ−２受容体は、他のサイトカインの受容体のサブユニットでもある、アルファ、ベータおよびガンマという３つの形態、または鎖を有する。ＩＬ２ＲβおよびＩＬ２Ｒγは、Ｉ型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーである。本明細書で使用される場合の「ＩＬ２Ｒ」は、Ｔ細胞媒介免疫応答に関与するインターロイキン−２受容体を指す。ＩＬ２Ｒは、受容体媒介エンドサイトーシス、およびインターロイキン２からの細胞増殖シグナルの伝達に関与する。同様に、用語「ＩＬ−２／１５Ｒ」は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５により共有されている受容体シグナル伝達サブユニットを指し、サブユニットアルファ（ＩＬ２／１５ＲａまたはＩＬ２／１５Ｒα）、ベータ（ＩＬ２／１５ＲｂまたはＩＬ２／１５Ｒβ）、またはガンマ（ＩＬ２／１５ＲｇまたはＩＬ２／１５Ｒγ）を含み得る。
【０１８７】
一部の実施形態では、化学誘導シグナル伝達複合体は、２つの成分を含むヘテロ二量体化活性化シグナル伝達複合体である。一部の実施形態では、第１の成分は、ヘテロ二量体化対の一方の部分である細胞外結合ドメインと、必要に応じたヒンジドメインと、膜貫通ドメインと、１つまたは複数の連鎖状細胞質シグナル伝達ドメインとを含む。一部の実施形態では、第２の成分は、ヘテロ二量体化対の他方の部分である細胞外結合ドメインと、必要に応じたヒンジドメインと、膜貫通ドメインと、１つまたは複数の連鎖状細胞質シグナル伝達ドメインとを含む。したがって、一部の実施形態では、２つの別個の改変事象がある。一部の実施形態では、２つのＣＩＳＣ成分が、哺乳動物細胞などの細胞に発現される。一部の実施形態では、哺乳動物細胞などの細胞、または哺乳動物細胞の集団などの細胞の集団は、ヘテロ二量体化を引き起こすリガンドまたは作用因子と接触し、それによってシグナルを開始する。一部の実施形態では、ホモ二量体化対が二量体化し、これは、単一のＣＩＳＣ成分が哺乳動物細胞などの細胞に発現され、ＣＩＳＣ成分がホモ二量体化して、シグナルを開始することによる。
【０１８８】
本明細書で使用される場合、用語「リガンド」または「作用因子」は、所望の生物学的効果を有する分子を指す。一部の実施形態では、リガンドは、細胞外結合ドメインにより認識され、結合され、リガンドおよび２つの結合ＣＩＳＣ成分を含む三分子複合体を形成する。リガンドは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、翻訳後改変タンパク質、抗体、それらの結合部分を含むがこれらに限定されない、タンパク質性分子；小分子（１０００ダルトン未満）、無機または有機化合物；および二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡ、または二本鎖もしくは一本鎖ＲＮＡ（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉなど）、アプタマーを含むがこれらに限定されない、核酸分子；および三重らせん核酸分子を含むが、これらに限定されない。リガンドは、任意の公知の生物（動物（例えば、哺乳動物（ヒトおよび非ヒト哺乳動物）を含むがこれらに限定されない）、植物、細菌、真菌、および原生生物、またはウイルス）、または合成分子のライブラリーに由来するか、またはそれらから得られ得る。一部の実施形態では、リガンドは、タンパク質、抗体もしくはその一部分、小分子、または薬物である。一部の実施形態では、リガンドは、ラパマイシンまたはラパマイシンアナログ（ラパログ）である。一部の実施形態では、ラパログは、ラパマイシンに対する以下の改変：Ｃ７、Ｃ４２および／またはＣ２９のメトキシの脱メチル化、脱離または置き換え；Ｃ１３、Ｃ４３および／またはＣ２８のヒドロキシの脱離、誘導体化または置き換え；Ｃ１４、Ｃ２４および／またはＣ３０のケトンの還元、脱離または誘導体化；５員プロリル環での６員ピペコリン酸環の置き換え；ならびにシクロへキシル環に対する代替置換、または置換シクロペンチル環でのシクロへキシル環の置き換えのうちの１つまたは複数を有する、ラパマイシンのバリアントを含む。したがって、一部の実施形態では、ラパログは、エベロリムス、メリリムス、ノボリムス、ピメクロリムス、リダフォロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、ゾタロリムス、ＣＣＩ−７７９、Ｃ２０−メタリルラパマイシン、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン、Ｃ１６−ｉＲａｐ、ＡＰ２１９６７、ミコフェノール酸ナトリウム、ベニジピン塩酸塩、ＡＰ２３５７３もしくはＡＰ１９０３、またはそれらの代謝物、誘導体および／もしくは組合せである。一部の実施形態では、リガンドは、ＩＭＩＤクラスの薬物（例えば、サリドマイド、ポマリドミド、レナリドミドまたは関連類似体）である。
【０１８９】
したがって、一部の実施形態では、シグナル伝達複合体の化学的誘導のための本明細書に記載の手法において使用されるリガンドまたは作用因子は：ラパマイシン（類似体、誘導体を含み、その薬学的に許容される塩を含む。ラパマイシンは、シロリムス、Ｒａｐａｍｕｎｅ、（３Ｓ，６Ｒ，７Ｅ，９Ｒ，１０Ｒ，１２Ｒ，１４Ｓ，１５Ｅ，１７Ｅ，１９Ｅ，２１Ｓ，２３Ｓ，２６Ｒ，２７Ｒ，３４ａＳ）−９，１０，１２，１３，１４，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，３２，３３，３４，３４ａ−ヘキサデカヒドロ−９，２７−ジヒドロキシ−３−［（１Ｒ）−２−［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロへキシル］−１−メチルエチル］−１０，２１−ジメトキシ−６，８，１２，１４，２０，２６−ヘキサメチル−２３，２７−エポキシ−３Ｈ−ピリド［２，１−ｃ］［１，４］オキサアザシクロヘントリアコンチン−１，５，１１，２８，２９（４Ｈ，６Ｈ，３１Ｈ）−ペントンを含み得る）；エベロリムス（類似体、誘導体を含み、その薬学的に許容される塩を含む。エベロリムスは、ＲＡＤ００１、Ｚｏｒｔｒｅｓｓ、Ｃｅｒｔｉｃａｎ、Ａｆｉｎｉｔｏｒ、Ｖｏｔｕｂｉａ、４２−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）ラパマイシン、（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｅ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−ジヒドロキシ−１２−［（２Ｒ）−１−［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−メトキシシクロへキシル］プロパン−２−イル］−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−２，３，１０，１４，２０−ペントンを含み得る）；メリリムス（類似体、誘導体を含み、その薬学的に許容される塩を含む。メリリムスは、ＳＡＲ９４３、４２−Ｏ−（テトラヒドロフラン−３−イル）ラパマイシン（メリリムス−１）；４２−Ｏ−（オキセタン−３−イル）ラパマイシン（メリリムス−２）、４２−Ｏ−（テトラヒドロピラン−３−イル）ラパマイシン（メリリムス−３）、４２−Ｏ−（４−メチル，テトラヒドロフラン−３−イル）ラパマイシン、４２−Ｏ−（２，５，５−トリメチル，テトラヒドロフラン−３−イル）ラパマイシン、４２−Ｏ−（２，５−ジエチル−２−メチル，テトラヒドロフラン−３−イル）ラパマイシン、４２−Ｏ−（２Ｈ−ピラン−３−イル，テトラヒドロ−６−メトキシ−２−メチル）ラパマイシン、または４２−Ｏ−（２Ｈ−ピラン−３−イル，テトラヒドロ−２，２−ジメチル−６−フェニル）ラパマイシンを含み得る）；ノボリムス（類似体、誘導体を含み、その薬学的に許容される塩を含む。ノボリムスは、１６−Ｏ−デメチルラパマイシンを含み得る）；ピメクロリムス（類似体、誘導体を含み、その薬学的に許容される塩を含む。ピメクロリムスは、Ｅｌｉｄｅｌ、（３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，８Ｒ，９Ｅ，１２Ｓ，１４Ｓ，１５Ｒ，１６Ｓ，１８Ｒ，１９Ｒ，２６ａＳ）−３−（（Ｅ）−２−（（１Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−４−クロロ−３メトキシシクロへキシル）−１−メチルビニル）−８−エチル５，６，８，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２４，２６，２６ａヘキサデカヒドロ−５，１９−エポキシ−３Ｈ−ピリド（２，１−ｃ）（１，４）オキサアザシクロトリコシン−１，１７，２０，２１（４Ｈ，２３Ｈ）−テトロン３３−エピ−クロロ−３３−デスオキシアスコマイシンを含み得る）；リダフォロリムス（類似体、誘導体を含み、その薬学的に許容される塩を含む。リダフォロリムスは、ＡＰ２３５７３、ＭＫ−８６６９、デフォロリムス、（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｅ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１２−（（１Ｒ）−２−（（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−（（ジメチルホスフィノイル）オキシ）−３−メトキシシクロへキシル）−１−メチルエチル）−１，１８−ジヒドロキシ−１９，３０−ジメトキシ１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ（３０．３．１．０４，９）ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−２，３，１０，１４，２０−ペントンを含み得る）；タクロリムス（類似体、誘導体を含み、その薬学的に許容される塩を含む。タクロリムスは、ＦＫ−５０６、フジマイシン、Ｐｒｏｇｒａｆ、Ａｄｖａｇｒａｆ、プロトピック、３Ｓ−［３Ｒ＊［Ｅ（１Ｓ＊，３Ｓ＊，４Ｓ＊）］，４Ｓ＊，５Ｒ＊，８Ｓ＊，９Ｅ，１２Ｒ＊，１４Ｒ＊，１５Ｓ＊，１６Ｒ＊，１８Ｓ＊，１９Ｓ＊，２６ａＲ＊５，６，８，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２４，２５，２６，２６ａ−ヘキサデカヒドロ−５，１９−ジヒドロキシ−３−［２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロへキシル）−１−メチルエテニル］−１４，１６−ジメトキシ−４，１０，１２，１８−テトラメチル−８−（２−プロペニル）−１５，１９−エポキシ−３Ｈ−ピリド［２，１−ｃ］［１，４］オキサアザシクロトリコシン−１，７，２０，２１（４Ｈ，２３Ｈ）−テトロン，一水和物を含み得る）；テムシロリムス（類似体、誘導体を含み、その薬学的に許容される塩を含む。テムシロリムスは、ＣＣＩ−７７９、ＣＣＬ−７７９、Ｔｏｒｉｓｅｌ、（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−４−｛（２Ｒ）−２−［（３Ｓ，６Ｒ，７Ｅ，９Ｒ，１０Ｒ，１２Ｒ，１４Ｓ，１５Ｅ，１７Ｅ，１９Ｅ，２１Ｓ，２３Ｓ，２６Ｒ，２７Ｒ，３４ａＳ）−９，２７−ジヒドロキシ−１０，２１−ジメトキシ−６，８，１２，１４，２０，２６−ヘキサメチル−１，５，１１，２８，２９−ペンタオキソ−１，４，５，６，９，１０，１１，１２，１３，１４，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３１，３２，３３，３４，３４ａ−テトラコサヒドロ−３Ｈ−２３，２７−エポキシピリド［２，１−ｃ］［１，４］オキサアザシクロヘントリアコンチン−３−イル］プロピル｝−２−メトキシシクロへキシル３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロパノエートを含み得る）；ウミロリムス（類似体、誘導体を含み、その薬学的に許容される塩を含む。ウミロリムスは、Ｂｉｏｌｉｍｕｓ、Ｂｉｏｌｉｍｕｓ  Ａ９、ＢＡ９、ＴＲＭ−９８６、４２−Ｏ−（２−エトキシエチ���）ラパマイシンを含み得る）；ゾタロリムス（類似体、誘導体を含み、その薬学的に許容される塩を含む。ゾタロリムスは、ＡＢＴ−５７８、（４２Ｓ）−４２−デオキシ−４２−（１Ｈ−テトラゾール−１−イル）−ラパマイシンを含み得る）；Ｃ２０−メタリルラパマイシン（類似体、誘導体を含み、その薬学的に許容される塩を含む。Ｃ２０−メタリルラパマイシンは、Ｃ２０−Ｍａｒａｐを含み得る）；Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン（類似体、誘導体を含み、その薬学的に許容される塩を含む。Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシンは、Ｃ１６−ｉＲａｐを含み得る）；ＡＰ２１９６７（類似体、誘導体を含み、その薬学的に許容される塩を含む。ＡＰ２１９６７は、Ｃ−１６−（Ｓ）−７−メチルインドールラパマイシンを含み得る）；ミコフェノール酸ナトリウム（類似体、誘導体を含み、その薬学的に許容される塩を含む。ミコフェノール酸ナトリウムは、ＣｅｌｌＣｅｐｔ、Ｍｙｆｏｒｔｉｃ、（４Ｅ）−６−（４−ヒドロキシ−６−メトキシ−７−メチル−３−オキソ−１，３−ジヒドロ−２−ベンゾフラン−５−イル）−４−メチルヘキサ−４−エン酸を含み得る）；ベニジピン塩酸塩（類似体、誘導体を含み、その薬学的に許容される塩を含む。ベニジピン塩酸塩は、Ｂｅｎｉｄｉｐｉｎｕｍ、Ｃｏｎｉｅｌを含み得る）；もしくはＡＰ１９０３（類似体、誘導体を含み、その薬学的に許容される塩を含む。ＡＰ１９０３は、Ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ、［（１Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）−１−［３−［２−［２−［［２−［３−［（１Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）−１−［（２Ｓ）−１−［（２Ｓ）−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）ブタノイル］ピペリジン−２−カルボニル］オキシプロピル］フェノキシ］アセチル］アミノ］エチルアミノ］−２−オキソエトキシ］フェニル］プロピル］（２Ｓ）−１−［（２Ｓ）−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）ブタノイル］ピペリジン−２−カルボキシレートを含み得る）；またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１９０】
本明細書で使用される場合、用語「ジベレリン」は、色素体におけるテルペノイド経路により合成され、その後、それらが生物学的に活性な形態に至るまで小胞体およびサイトゾルにおいて改変される、合成または天然に存在する形態のジテルペノイド酸を指す。ジベレリンは、天然ジベレリンまたはその類似体であってもよく、例えば、ジベレリン１（ＧＡ１）、ＧＡ２、ＧＡ３．．．ＧＡ１３６、ならびにそれらの類似体および誘導体を含む、ｅｎｔ−ジベレラン骨格から導出されたまたはｅｎｔ−カウレン経由で合成されたジベレリンを含む。一部の実施形態では、ジベレリンまたはその類似体もしくは誘導体は、ＣＩＳＣ二量体化に利用される。
【０１９１】
本明細書で使用される場合、「ＳＬＦ−ＴＭＰ」または「トリメトプリムに連結されたＦＫＢＰの合成リガンド」は、ＣＩＳＣ二量体化のための二量体化剤を指す。一部の実施形態では、ＳＬＦ部分は、第１のＣＩＳＣ成分に結合し、ＴＭＰ部分は、第２のＣＩＳＣ成分に結合し、ＣＩＳＣ二量体化を生じさせる。一部の実施形態では、ＳＬＦは、例えば、ＦＫＢＰに結合することができ、ＴＭＰは、Ｅ．ｃｏｌｉジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｅＤＨＦＲ）に結合することができる。
【０１９２】
本明細書で使用される場合、用語「同時結合」は、ＣＩＳＣ成分とリガンド成分とを含む多成分複合体を形成するための、およびその後のシグナル活性化をもたらす、同時のまたは一部の場合には実質的に同時の２つまたはそれよりも多くのＣＩＳＣ成分によるリガンドの結合を指す。同時結合には、ＣＩＳＣ成分が、単一のリガンドを結合するように空間的に構成されていること、および両方のＣＩＳＣ成分が、同じリガンド（同じリガンド上の異なる部分を含む）に結合するように構成されていることも必要である。
【０１９３】
本明細書で使用される場合、用語「選択的拡大」は、哺乳動物細胞などの所望の細胞、または哺乳動物細胞の集団などの細胞の所望の集団の、拡大する能力を指す。一部の実施形態では、選択的拡大は、２つの遺伝子改変事象を経た哺乳動物細胞などの細胞の純粋な集団の生成または拡大を指す。二量体化ＣＩＳＣの一方の成分が一方の改変の部分であり、他方の成分が他方の改変である。したがって、ヘテロ二量体化ＣＩＳＣの一方の成分が各遺伝子改変に関連する。リガンドへの細胞の曝露は、両方の所望の改変を有する哺乳動物細胞などの細胞のみの選択的拡大を可能にする。したがって、一部の実施形態では、リガンドとの接触に応答することができる、哺乳動物細胞などの唯一の細胞は、ヘテロ二量体化ＣＩＳＣの両方の成分を発現するものである。
【０１９４】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は、核酸構築物またはベクターによる形質転換、トランスフェクションまたは形質導入を受けやすい、哺乳動物細胞などの任意の細胞型を含む。一部の実施形態では、哺乳動物細胞などの宿主細胞は、Ｔ細胞または調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。一部の実施形態では、哺乳動物細胞などの宿主細胞は、造血幹細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、またはＣＤ４＋細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択される、ＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球細胞である。本明細書で使用される場合、用語「細胞の集団」は、１つよりも多くの細胞を含む、哺乳動物細胞などの細胞の群を指す。一部の実施形態では、哺乳動物などの細胞であって、本明細書に記載のタンパク質配列または本明細書に記載のタンパク質配列をコードする発現ベクターを含む細胞が製造される。
【０１９５】
本明細書で使用される場合、用語「形質転換された」または「トランスフェクトされた」は、構築物などの外来ポリヌクレオチド分子が導入された、哺乳動物細胞などの細胞、組織、臓器または生物を指す。導入されたポリヌクレオチド分子を哺乳動物細胞などのレシピエント細胞、組織、臓器または生物のゲノムＤＮＡに組み込むことができ、したがって、導入されたポリヌクレオチド分子は、その後の子孫に遺伝する。「トランスジェニック」または「トランスフェクトされた」細胞、例えば哺乳動物細胞、または生物は、細胞または生物の子孫、および交配種の親としてそのようなトランスジェニック生物を用いる育種プログラムから産生され、外来ポリヌクレオチド分子の存在の結果として生じる遺伝子型変更を示す子孫も含む。用語「トランスジェニック」は、１つまたは複数の異種ポリ核酸分子を含有する、細菌、真菌または植物を指す。「形質導入」は、哺乳動物細胞などの細胞へのウイルス媒介遺伝子移入を指す。
【０１９６】
用語「操作された細胞」は、細胞が、「直接」操作された（例えば、細胞が、元のまたは野生型状態から物理的に変更された）のか、そのように改変された細胞の子孫であるのかを問わず、本発明の構築物を含む細胞を指す。したがって、「操作された細胞」は、直接改変された細胞およびそれらの子孫を含む。
【０１９７】
本明細書で使用される場合、「対象」は、処置、観察または実験の対象物である動物を指す。「動物」は、冷血および温血の脊椎動物および無脊椎動物、例えば、魚類、甲殻類、爬虫類および特に哺乳動物を含む。「哺乳動物」は、限定ではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、霊長類、例えばサル、チンパンジーおよび類人猿、特にヒトを含む。一部の代替では、対象はヒトである。
【０１９８】
一部の実施形態では、二量体化を誘導するために使用されるリガンドの有効量は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００ｎＭまたは前述の値のいずれか２つにより定義される範囲内の濃度の量である。
【０１９９】
本明細書に記載される場合の「マーカー配列」は、タンパク質、または目的のタンパク質を有する哺乳動物細胞などの細胞を、選択または追跡するために使用されるタンパク質をコードする。本明細書に記載の実施形態では、提供される融合タンパク質は、フローサイトメトリーなどの実験で選択され得るマーカー配列を含むことができる。
【０２００】
本明細書で使用される場合の「キメラ受容体」または「キメラ抗原受容体」は、疾患または障害に関連する分子に結合し、Ｔ細胞または他の受容体の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば共刺激ドメインに、スペーサードメインを介して連結される、抗体または他のタンパク質配列のリガンド結合ドメインを含む、合成的に設計された受容体を指す。一部の実施形態では、哺乳動物細胞などの細胞であって、融合タンパク質をコードする核酸を含む細胞、およびキメラ抗原受容体を含む細胞が、製造される。
【０２０１】
本明細書で使用される場合の「細胞傷害性Ｔリンパ球」（ＣＴＬ）は、その表面にＣＤ８を発現するＴリンパ球（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を指す。一部の実施形態では、そのような細胞は、抗原経験のある「メモリー」Ｔ細胞（ＴＭ細胞）である。一部の実施形態では、融合タンパク質分泌のための細胞が提供される。一部の実施形態では、細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球である。本明細書で使用される場合の「セントラルメモリー」Ｔ細胞（または「ＴＣＭ」）は、その表面にＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ−７および／またはＣＤ４５ＲＯを発現し、ナイーブ細胞と比較して、ＣＤ４５ＲＡを発現しないかまたは減少した発現を有する、抗原経験のあるＣＴＬを指す。一部の実施形態では、融合タンパク質分泌のための細胞が提供される。一部の実施形態では、細胞は、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）である。一部の実施形態では、セントラルメモリー細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯおよび／またはＣＤ９５の発現に対して陽性であり、ナイーブ細胞と比較してＣＤ５４ＲＡの減少した発現を有し得る。本明細書で使用される場合の「エフェクターメモリー」Ｔ細胞（または「ＴＥＭ」）は、セントラルメモリー細胞と比較して、その表面にＣＤ６２Ｌを発現しないかまたは減少した発現を有し、ナイーブ細胞と比較して、ＣＤ４５ＲＡを発現しないかまたは減少した発現を有する、抗原経験のあるＴ細胞を指す。一部の実施形態では、融合タンパク質分泌のための細胞が提供される。一部の実施形態では、細胞は、エフェクターメモリーＴ細胞である。一部の実施形態では、エフェクターメモリー細胞は、ナイーブ細胞またはセントラルメモリー細胞と比較してＣＤ６２Ｌおよび／またはＣＣＲ７の発現に対して陰性であり、ＣＤ２８および／またはＣＤ４５ＲＡの多様な発現を有し得る。
【０２０２】
本明細書で使用される場合の「ナイーブＴ細胞」は、ＣＤ６２Ｌおよび／またはＣＤ４５ＲＡを発現し、セントラルまたはエフェクターメモリー細胞と比較してＣＤ４５ＲＯ−を発現しない、抗原経験のないＴリンパ球を指す。一部の実施形態では、融合タンパク質分泌のための哺乳動物細胞などの細胞が提供される。一部の実施形態では、哺乳動物細胞などの細胞は、ナイーブＴ細胞である。一部の実施形態では、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７および／またはＣＤ４５ＲＡを含むナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現により特徴付けられる。
【０２０３】
本明細書で使用される場合の「エフェクター」Ｔ細胞は、セントラルメモリーまたはナイーブＴ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７および／またはＣＤ２８を発現しないかまたは減少した発現を有し、グランザイムＢおよび／またはパーフォリンに対して陽性である、抗原経験のある細胞傷害性Ｔリンパ球細胞を指す。一部の実施形態では、融合タンパク質分泌のための哺乳動物細胞などの細胞が提供される。一部の実施形態では、哺乳動物細胞などの細胞は、エフェクターＴ細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物細胞などの細胞は、セントラルメモリーまたはナイーブＴ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７および／またはＣＤ２８を発現しないかまたは減少した発現を有し、グランザイムＢおよび／またはパーフォリンに対して陽性である。
【０２０４】
本明細書で使用される場合の「エピトープ」は、抗体、Ｔ細胞および／またはＢ細胞を含む免疫系により認識される、抗原または分子の一部を指す。エピトープは、通常、少なくとも７個のアミノ酸を有し、直線状または立体構造エピトープであり得る。一部の実施形態では、融合タンパク質を発現する哺乳動物細胞などの細胞であって、キメラ抗原受容体をさらに含む細胞が、提供される。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、がん細胞上のエピトープを認識することができるｓｃＦｖを含む。本明細書で開示される様々なポリペプチドまたは核酸を説明するために使用する場合の「単離すること」または「精製すること」は、同定され、その天然の環境の成分から分離および／または回収されたポリペプチドまたは核酸を指す。一部の実施形態では、単離されたポリペプチドまたは核酸には、それが天然に会合している全ての成分との会合がない。その天然の環境の夾雑成分は、ポリペプチドまたは核酸の診断的または治療的使用に典型的に干渉し得る物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質様または非タンパク質様溶質を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つの核酸または本明細書に記載の実施形態のいずれか１つの発現ベクターを細菌細胞、哺乳動物細胞または昆虫細胞に送達するステップと、細胞を培養液中で成長させるステップと、融合タンパク質の発現を誘導するステップと、処置のために融合タンパク質を精製するステップとを含む方法が、提供される。
【０２０５】
本明細書で同定されるＣＩＳＣ配列に関しての「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大配列同一性パーセントを達成するために必要に応じて配列をアラインメントし、ギャップを導入した後の、かつ、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインの各々について参照配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当技術分野における技能の範囲内である様々な仕方で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの、公開されているコンピューターソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。例えば、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータープログラム（Altschul,  S.  F.  et  al.(1996).  Methods  in  Enzymol.,  266:460-480）を使用して生成されるアミノ酸配列同一性％値は、いくつかの検索パラメーターを使用し、それらの大部分がデフォルト値に設定される。デフォルト値に設定されないもの（例えば、調整可能なパラメーター）は、次の値を用いて設定される：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップ率＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、およびスコア行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２。ＣＩＳＣの一部の実施形態では、ＣＩＳＣは、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含み、各ドメインは、ネイティブドメインの天然、合成、または突然変異したもしくは切断された形態（例えば、ＩＬＲβシグナル伝達ドメインの切断された形態）を含む。一部の実施形態では、任意の所与のドメインの突然変異したまたは切断された形態は、本明細書で提供される配列で示される配列に対して１００％、９５％、９０％、８５％の配列同一性または前述のパーセンテージのいずれか２つにより定義される範囲内にある配列同一性パーセントを有するアミノ酸配列を含む。
【０２０６】
本明細書で使用される場合の「ＣＩＳＣバリアントポリペプチド配列」または「ＣＩＳＣバリアントアミノ酸配列」は、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインのタンパク質配列などの本明細書で提供されるタンパク質配列またはその特異的に導出された断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性（または前述のパーセンテージのいずれか２つにより定義される範囲内のアミノ酸配列同一性パーセンテージ）を有する、以下に定義される通りのタンパク質配列を指す。通常は、ＣＩＳＣバリアントポリペプチドまたはその断片は、アミノ酸配列またはその導出された断片と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも８１％のアミノ酸配列同一性、少なくとも８２％のアミノ酸配列同一性、少なくとも８３％のアミノ酸配列同一性、少なくとも８４％のアミノ酸配列同一性、少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも８６％のアミノ酸配列同一性、少なくとも８７％のアミノ酸配列同一性、少なくとも８８％のアミノ酸配列同一性、少なくとも８９％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９１％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９２％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９４％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９７％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。バリアントは、未変性タンパク質配列を包含しない。
【０２０７】
本明細書で使用される場合の「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、任意の哺乳動物、限定ではないがサル、イヌ、霊長類およびヒトを含む種からのものであり得る。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、レシピエント対象と同種（同じ種だが異なるドナーから）であり、一部の実施形態では、Ｔ細胞は、自己であり（ドナーおよびレシピエントが同じであり）、一部の実施形態では、Ｔ細胞は、同系のものである（ドナーおよびレシピエントは異なるが一卵性双生児である）。
【０２０８】
本明細書で使用される場合の「ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ」、「ＲＧＥＮ」、「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ」または「Ｃａｓヌクレアーゼ」は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）適応免疫系に関連するＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素を含むが、これに限定されない。本明細書では、「ＲＧＥＮ」または「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ」は、天然に存在するＣａｓエンドヌクレアーゼと組換えＣａｓエンドヌクレアーゼの両方を指す。
【０２０９】
特許請求の範囲の移行句においてであろうと、本文においてであろうと、本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、非限定的意味を有すると解釈されるべきである。すなわち、用語は、句「少なくとも〜を有する」または「少なくとも〜を含む」と同義語として解釈されるべきである。プロセスの文脈で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、プロセスが、少なくとも述べられているステップを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）が、追加のステップを含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）こともあることを意味する。化合物、組成物またはデバイスの文脈で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、化合物、組成物またはデバイスが、少なくとも述べられている特色または成分を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）が、追加の特色または成分も含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）ことがあることを意味する。
制御された形質細胞枯渇のための系
【０２１０】
一態様では、個体の形質細胞の制御された枯渇のための操作された細胞（例えば、操作されたＴ細胞）を生成するための系が、本明細書で提供される。系は、ａ）ｉ）細胞に形質細胞に対する細胞傷害性を付与することができる抗形質細胞構築物と、ｉｉ）二量体化活性化可能な化学誘導シグナル伝達複合体（ＣＩＳＣ）のポリペプチド成分とをコードする細胞（例えば、Ｔ細胞）のゲノムへの組込みための核酸であって、シグナル伝達能力を有するＣＩＳＣが、細胞の生存および／または増殖を促進する刺激シグナルをシグナル伝達経路において生じさせることができる、核酸；ならびにｂ）核酸を細胞のゲノムに組み込んで抗形質細胞構築物とＣＩＳＣとを発現する操作された細胞を産生させるためのゲノム編集エレメントを含む。ＣＩＳＣは、操作された細胞と接触しているＣＩＳＣ二量体化に必要なリガンドの量をモジュレートすることにより、操作された細胞の生存および／または増殖を制御することを可能にする。一部の実施形態では、ＣＩＳＣは、第１のＣＩＳＣ成分および第２のＣＩＳＣ成分を含み、第１のＣＩＳＣ成分および第２のＣＩＳＣ成分は、操作された細胞により発現されると、リガンドの存在下で二量体化してシグナル伝達能力を有するＣＩＳＣを作出するように構成されている。一部の実施形態では、操作された細胞は、リガンドの非存在下では生存および／または増殖することができない。一部の実施形態では、操作された細胞は、細胞の生存および／または増殖に関与する内在性シグナル伝達経路に欠陥があり、シグナル伝達能力を有するＣＩＳＣは、欠陥のある内在性シグナル伝達経路を、操作された細胞が生存および／または増殖することができるように補完することができる。
抗形質細胞構築物
【０２１１】
一部の実施形態では、本明細書に記載の系は、抗形質細胞構築物をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、抗形質細胞構築物は、抗形質細胞キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。抗形質細胞ＣＡＲは、形質細胞の表面に存在する抗原を認識する。一部の実施形態では、抗形質細胞ＣＡＲは、形質細胞の表面に選択的に発現される抗原を認識する。一部の実施形態では、形質細胞は、非悪性形質細胞である。一部の実施形態では、抗形質細胞ＣＡＲは、ＣＤ２７（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー７、ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ１２６（インターロイキン−６受容体、ＩＬ６Ｒ）、ＣＤ１３８（シンデカン１）、ＣＤ２６９（Ｂ細胞成熟抗原、ＢＣＭＡ）、またはＣＤ３１９（ＳＬＡＭファミリーメンバー７、ＳＬＡＭＦ７）を認識する。一部の実施形態では、抗形質細胞ＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲである。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、野生型ＢＣＭＡを認識する。ＢＣＭＡに特異的な抗体部分は、当技術分野で公知であり、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、これらの抗ＢＣＭＡ抗体部分のいずれかを含み得る。例えば、一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ抗体Ｃ１１Ｄ５．３に由来する抗体部分を含む。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ抗体Ｃ１１Ｄ５．３に由来する重鎖および軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖを含む。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ  ＣＤＲの各々が抗ＢＣＭＡ抗体Ｃ１１Ｄ５．３に由来する、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖを含む。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号５５のアミノ酸配列、または配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２１２】
一部の実施形態では、本明細書に記載の系は、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、細胞外ＢＣＭＡ認識ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞外ＢＣＭＡ認識ドメインは、ＢＣＭＡに特異的に結合することができる抗体部分である。一部の実施形態では、抗体部分は、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖである。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、重鎖相補性決定領域（ＨＣ−ＣＤＲ）１、ＨＣ−ＣＤＲ２およびＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、軽鎖相補性決定領域（ＬＣ−ＣＤＲ）１、ＬＣ−ＣＤＲ２およびＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含み、ＣＤＲのいくつかは、抗ＢＣＭＡ抗体に由来する。一部の実施形態では、ＨＣ−ＣＤＲ３およびＬＣ−ＣＤ３は、抗ＢＣＭＡ抗体に由来する。一部の実施形態では、ＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、ＨＣ−ＣＤＲ３、ＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２およびＬＣ−ＣＤＲ３は、抗ＢＣＭＡ抗体に由来する。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、Ｃ１１Ｄ５．３である。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号５５のアミノ酸配列、または配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号５６のアミノ酸配列、または配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ共刺激ドメインは、４−１ＢＢおよび／またはＣＤ２８共刺激ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号５７のアミノ酸配列、または配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、４−１ＢＢ共刺激膜貫通ドメインは、配列番号５８のアミノ酸配列、または配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号５９のアミノ酸配列、または配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、配列番号６０もしくは６１のアミノ酸配列、または配列番号６０もしくは６１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
ＣＩＳＣ
【０２１３】
一部の実施形態では、本明細書に記載の系は、第１のＣＩＳＣ成分と第２のＣＩＳＣ成分とを含む二量体ＣＩＳＣをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分は、第１の細胞外結合ドメインまたはその一部分と、第１の膜貫通ドメインと、第１のシグナル伝達ドメインまたはその一部分とを含む。一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分は、第１のヒンジドメインをさらに含む。一部の実施形態では、第２のＣＩＳＣ成分は、第２の細胞外結合ドメインまたはその一部分と、第２の膜貫通ドメインと、第２のシグナル伝達ドメインまたはその一部分とを含む。一部の実施形態では、第２のＣＩＳＣ成分は、第２のヒンジドメインをさらに含む。一部の実施形態では、第１および第２のＣＩＳＣ成分は、発現されると、リガンドの存在下で二量体化するように構成され得る。一部の実施形態では、第１の細胞外結合ドメインまたはその一部分は、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインまたはその一部分を含み、第２の細胞外結合ドメインまたはその一部分は、ＦＫＢＰラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインまたはその一部分を含む。一部の実施形態では、第２の細胞外結合ドメインまたはその一部分は、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインまたはその一部分を含み、第１の細胞外結合ドメインまたはその一部分は、ＦＫＢＰラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインまたはその一部分を含む。一部の実施形態では、リガンドは、ラパマイシンまたはラパログである。一部の実施形態では、第１のシグナル伝達ドメインは、ＩＬ２Ｒγに由来するシグナル伝達ドメインであり、および／または第１の膜貫通ドメインは、ＩＬ２Ｒγに由来する膜貫通ドメインであり、第２のシグナル伝達ドメインは、ＩＬ２Ｒβに由来するシグナル伝達ドメインであり、および／または第２の膜貫通ドメインは、ＩＬ２Ｒβに由来する膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、第２のシグナル伝達ドメインは、ＩＬ２Ｒγに由来するシグナル伝達ドメインであり、および／または第２の膜貫通ドメインは、ＩＬ２Ｒγに由来する膜貫通ドメインであり、第１のシグナル伝達ドメインは、ＩＬ２Ｒβに由来するシグナル伝達ドメインであり、および／または第１の膜貫通ドメインは、ＩＬ２Ｒβに由来する膜貫通ドメインである。
【０２１４】
一部の実施形態では、本明細書に記載の系は、第１のＣＩＳＣ成分と第２のＣＩＳＣ成分とを含む二量体ＣＩＳＣをコードする核酸を含み、ＣＩＳＣは、ＩＬ２ＲγおよびＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分は、シグナル伝達ドメインを含むＩＬ２Ｒγの一部分を含み、第２のＣＩＳＣ成分は、シグナル伝達ドメインを含むＩＬ２Ｒβの一部分を含むか、または第２のＣＩＳＣ成分は、シグナル伝達ドメインを含むＩＬ２Ｒγの一部分を含み、第１のＣＩＳＣ成分は、シグナル伝達ドメインを含むＩＬ２Ｒβの一部分を含む。一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分は、配列番号５０のアミノ酸配列、または配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、ＩＬ２Ｒγの一部分を含み、第２のＣＩＳＣ成分は、配列番号５１のアミノ酸配列、または配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、ＩＬ２Ｒβの一部分を含むか、または第２のＣＩＳＣ成分は、配列番号５０のアミノ酸配列、または配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、ＩＬ２Ｒγの一部分を含み、第１のＣＩＳＣ成分は、配列番号５１のアミノ酸配列、または配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、ＩＬ２Ｒβの一部分を含む。一部の実施形態では、第１の細胞外結合ドメインまたはその一部分は、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインまたはその一部分を含み、第２の細胞外結合ドメインまたはその一部分は、ＦＫＢＰラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインまたはその一部分を含む。一部の実施形態では、第２の細胞外結合ドメインまたはその一部分は、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインまたはその一部分を含み、第１の細胞外結合ドメインまたはその一部分は、ＦＫＢＰラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインまたはその一部分を含む。一部の実施形態では、ＦＫＢＰドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列、または配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、ＦＲＢは、配列番号４８のアミノ酸配列、または配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１および第２のＣＩＳＣ成分は、ラパマイシンまたはラパログの存在下で二量体化して、シグナル伝達能力を有するＣＩＳＣを形成する。一部の実施形態では、ラパログは、エベロリムス、ＣＣＩ−７７９、Ｃ２０−メタリルラパマイシン、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン、Ｃ１６−ｉＲａｐ、ＡＰ２１９６７、ミコフェノール酸ナトリウム、ベニジピン塩酸塩、ＡＰ１９０３もしくはＡＰ２３５７３、またはそれらの代謝物、誘導体および／もしくは組合せからなる群から選択される。
【０２１５】
他の実施形態では、ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含むＣＩＳＣ成分は、切断型細胞内ＩＬ２Ｒβドメインを含む。切断型ＩＬ２Ｒβドメインは、ＩＬ２Ｒγシグナル伝達ドメインを含むＣＩＳＣ成分とのヘテロ二量体化時に下流のＩＬ２シグナル伝達を活性化する能力を保持する。一部の実施形態では、切断型ＩＬ２Ｒβは、配列番号７６で示されるようなアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、配列番号７６の切断型ＩＬ２Ｒβドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のＮ末端アミノ酸のいずれかを欠いている。一部の実施形態では、切断型細胞内ＩＬ２Ｒβドメインを含むＣＩＳＣ成分は、配列番号７７のアミノ酸配列を含む。本明細書に記載のＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含むＣＩＳＣ成分のいずれかに従う一部の実施形態では、ＣＩＳＣ成分は、切断型細胞内ＩＬ２Ｒβドメインを含むＣＩＳＣ成分で置換されていることがある。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載のＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含むＣＩＳＣ成分は、配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＩＳＣ成分で置換されている。
抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物
【０２１６】
一部の実施形態では、本明細書に記載の系は、抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物をコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物は、構築物を発現する編集された細胞に、編集された細胞を異物と認識する細胞傷害性Ｔ細胞に対する細胞傷害性を付与することができるが、編集されたＴ細胞は、編集された細胞を異物と認識しない細胞傷害性Ｔ細胞に対して非細胞傷害性である。一部の実施形態では、抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物は、細胞外β２−ミクログロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体である。一部の実施形態では、細胞外β２−ミクログロブリンドメインは、配列番号６２のアミノ酸配列、または配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインポリペプチドを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号６３のアミノ酸配列、または配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体共刺激ドメインは、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体４−１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号６４のアミノ酸配列、または配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体ＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号５９のアミノ酸配列、または配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６５のアミノ酸配列、または配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
選択可能なマーカー
【０２１７】
一部の実施形態では、本明細書に記載の系は、選択可能なマーカーをコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、選択可能なマーカーは、選択可能なマーカーを発現する編集された細胞に、毒素の存在下または栄養素の非存在下などの選択的条件で生存する能力を付与することができる。一部の実施形態では、選択可能なマーカーは、選択可能なマーカーを発現する細胞の選択を可能にする表面マーカーである。一部の実施形態では、選択可能なマーカーは、切断型低親和性神経成長因子受容体（ｔＬＮＧＦＲ）ポリペプチドである。一部の実施形態では、ｔＬＮＧＦＲポリペプチドは、配列番号６６のアミノ酸配列、または配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
カルシニューリン阻害剤耐性
【０２１８】
一部の実施形態では、本明細書に記載の系は、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドを発現する編集された細胞に、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドは、タクロリムス（ＦＫ５０６）および／またはシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）に対する耐性を付与する。一部の実施形態では、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドは、突然変異体カルシニューリン（ＣＮ）ポリペプチドである。一部の実施形態では、突然変異体ＣＮポリペプチドは、タクロリムス（ＦＫ５０６）およびシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）に対する耐性を付与する。一部の実施形態では、突然変異体ＣＮポリペプチドは、ＣＮｂ３０（配列番号６７）である。
ラパマイシン耐性
【０２１９】
有用だが、ラパマイシンに曝露されたＣＩＳＣ発現細胞は、ラパログＡＰ２１９６７を使用して達成される増殖の量と比較して少なく増殖されることが観察されている。哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）は、ヒトではＭＴＯＲ遺伝子によりコードされるキナーゼである。ｍＴＯＲは、プロテインキナーゼのホスファチジルイノシトール３−キナーゼ関連キナーゼファミリーのメンバーである。このタンパク質は、脂質合成およびｍＲＮＡ翻訳などの同化過程を支配する基質をリン酸化することならびにオートファジーなどの異化過程を遅らせることにより細胞成長を刺激する、成長調節物質である。理論により拘束されるものではないが、ｍＴＯＲのＦＲＢドメインへのラパマイシン／ＦＫＢＰ複合体の結合は、ｍＴＯＲ媒介細胞内シグナル伝達を遮断または減少させ、その結果、ｍＲＮＡ翻訳および細胞成長を減少すると考えられる。
【０２２０】
一部の実施形態では、本明細書に記載の系は、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドを発現する編集された細胞に、ラパマイシンに対する耐性を付与することができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナーゼのＦＫＢＰ−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインポリペプチドである。一部の実施形態では、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドは、配列番号６８もしくは６９のアミノ酸配列、または配列番号６８もしくは６９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
ゲノム編集エレメント
【０２２１】
一部の実施形態では、本明細書に記載の系は、本明細書に記載の抗形質細胞構築物およびＣＩＳＣを発現する操作された細胞を産生するために細胞のゲノムに核酸を組み込むためのゲノム編集エレメントを含む。一部の実施形態では、ゲノム編集エレメントは、本明細書に記載の様々なポリペプチドをコードする核酸を内在性ＴＲＡ遺伝子および／または内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入することができる。一部の実施形態では、ゲノム編集エレメントは、ａ）内在性ＴＲＡ遺伝子を標的とする第１のｇＲＮＡ、および／または内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子を標的とする第２のｇＲＮＡと、ｂ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）またはＲＧＥＮをコードする核酸とを含む、ＣＲＩＳＰＲ系を含む。一部の実施形態では、第１のｇＲＮＡは、ＴＲＡＣドメインをコードする領域内またはその付近の内在性ＴＲＡ遺伝子を標的とする。ｇＲＮＡ標的部位は、その標的部位への組込みがＴＲＡＣドメイン発現および／または機能を撹乱することができる場合、ＴＲＡＣドメインをコードする領域の「付近」に、典型的には、フランキングまたは隣接配列内にある。一部の実施形態では、第１のｇＲＮＡは、配列番号１〜３のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号１〜３のいずれか１つと少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４〜１８のいずれか１つと少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４およびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはその機能的誘導体からなる群から選択される。
【０２２２】
一部の実施形態では、本明細書に記載の系は、ａ）内在性ＴＲＡ遺伝子を標的とする第１のｇＲＮＡ、および／または内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子を標的とする第２のｇＲＮＡと、ｂ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）またはＲＧＥＮをコードする核酸とを含む、ゲノム編集エレメントを含む。一部の実施形態では、第１のｇＲＮＡは、ＴＲＡＣドメインをコードする領域内またはその付近の内在性ＴＲＡ遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、第１のｇＲＮＡは、配列番号１〜３のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号１〜３のいずれか１つと少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４〜１８のいずれか１つと少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、ＲＧＥＮをコードする核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）配列である。一部の実施形態では、ＲＧＥＮをコードするＲＮＡ配列は、第１のｇＲＮＡまたは第２のｇＲＮＡに共有結合によって連結されている。一部の実施形態では、系は、本明細書に記載の抗形質細胞構築物およびＣＩＳＣをコードする核酸を含む、１つまたは複数のドナー鋳型を含む。一部の実施形態では、抗形質細胞構築物は、本明細書に記載の実施形態のいずれかに従う抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲである。一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、本明細書に記載の実施形態のいずれかに従う、抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物、選択可能なマーカー、カルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチド、およびラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドのうちの１つまたは複数をコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物は、細胞外β２−ミクログロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体である。一部の実施形態では、系は、内在性ＴＲＡ遺伝子への挿入のための第１のドナー鋳型、および／または内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子への挿入のための第２のドナー鋳型を含む。
【０２２３】
一部の実施形態では、本明細書に記載の系は、以下の系成分をコードする核酸を含む１つまたは複数のドナー鋳型を含む：ｉ）抗形質細胞構築物、ｉｉ）ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含む第１のＣＩＳＣ成分、ｉｉｉ）ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチド、ｉｖ）選択可能なマーカー、ｖ）１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチド、およびｖｉ）ＩＬ２Ｒγシグナル伝達ドメインまたはその断片を含む第２のＣＩＳＣ成分。一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、第１のドナー鋳型および第２のドナー鋳型を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子内に挿入されるように構成され、第２のドナー鋳型は、第２の内在性遺伝子内に挿入されるように構成されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットを含み、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットを含む。一部の実施形態では、第１のコードカセットは、抗形質細胞構築物をコードする核酸、および第１のＣＩＳＣ成分をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第２のコードカセットは、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、選択可能なマーカーをコードする核酸、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、および第２のＣＩＳＣ成分またはその断片をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットに作動可能に連結した第１のプロモーターを含む第１のポリシストロン性発現カセットの上流に合成ポリＡ配列を含み、したがって、第１のポリシストロン性発現カセットの発現は、第１のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターである。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットの上流に２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸を含む第１のポリシストロン性発現カセットの一部分をコードする核酸を含み、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子に挿入されると、第１のポリシストロン性発現カセットの部分が第１の内在性遺伝子の配列に連結され、第１の内在性遺伝子の配列に連結された第１のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第１のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。一部の実施形態では、第１の内在性遺伝子は、内在性ＴＲＡ遺伝子である。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入される。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型の挿入は、非機能的なＴＲＡＣドメインを生じさせる結果となる。細胞内のＴＲＡＣドメインは、細胞が機能的なネイティブ（未改変）Ｔ細胞受容体を発現することができない場合、非機能的である。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットに作動可能に連結した第２のプロモーターを含む第２のポリシストロン性発現カセットまたはその一部分を含み、したがって、第２のポリシストロン性発現カセットの発現は、第２のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、ＭＮ��プロモーターである。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子である。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子であり、第２のドナー鋳型は、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片を含む核酸を含む第２のポリシストロン性発現カセットの一部分を含み、第２のドナー鋳型は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入されると、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結され、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が一緒に第２のＣＩＳＣ成分をコードし、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第２のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。第１のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃４〜＃７に示されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号２８〜３９のいずれか１つからの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号１０１〜１０４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型には、ＴＲＡ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第１のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８０および８１、配列番号８２および８３、または配列番号８４および８５のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。第２のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃８に示されている。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号４０〜４３のいずれか１つからの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号１０５のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型には、ＩＬ２ＲＧ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第２のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８６および８７、配列番号８８および８９、または配列番号９０および９１のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のＡＡＶベクターであり、および／または第２のドナー鋳型は、第２のＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２８〜３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号２８〜３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号１０１〜１０４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号１０１〜１０４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４０〜４３のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４３のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１０５のポリヌクレオチド配列、または配列番号１０５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８��％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２２４】
本明細書に記載のドナー鋳型のいずれかに従う一部の実施形態では、ドナー鋳型は、抗形質細胞構築物をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、抗形質細胞構築物は、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲである。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、細胞外ＢＣＭＡ認識ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞外ＢＣＭＡ認識ドメインは、ＢＣＭＡに特異的に結合することができる抗体部分である。一部の実施形態では、抗体部分は、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖである。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、重鎖相補性決定領域（ＨＣ−ＣＤＲ）１、ＨＣ−ＣＤＲ２およびＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、軽鎖相補性決定領域（ＬＣ−ＣＤＲ）１、ＬＣ−ＣＤＲ２およびＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含み、ＣＤＲのいくつかは、抗ＢＣＭＡ抗体に由来する。一部の実施形態では、ＨＣ−ＣＤＲ３およびＬＣ−ＣＤ３は、抗ＢＣＭＡ抗体に由来する。一部の実施形態では、ＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、ＨＣ−ＣＤＲ３、ＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２およびＬＣ−ＣＤＲ３は、抗ＢＣＭＡ抗体に由来する。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、Ｃ１１Ｄ５．３である。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号５５のアミノ酸配列、または配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号５６のアミノ酸配列、または配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ共刺激ドメインは、４−１ＢＢおよび／またはＣＤ２８共刺激ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号５７のアミノ酸配列、または配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、４−１ＢＢ共刺激膜貫通ドメインは、配列番号５８のアミノ酸配列、または配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号５９のアミノ酸配列、または配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、配列番号６０もしくは６１のアミノ酸配列、または配列番号６０もしくは６１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２２５】
本明細書に記載のドナー鋳型のいずれかに従う一部の実施形態では、ドナー鋳型は、ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含む第１のＣＩＳＣ成分をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分の第１の細胞外結合ドメインは、ＦＲＢドメインを含む。一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分は、配列番号５４のアミノ酸配列、または配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２２６】
本明細書に記載のドナー鋳型のいずれかに従う一部の実施形態では、ドナー鋳型は、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドは、ＦＲＢドメインポリペプチドである。一部の実施形態では、ＦＲＢドメインポリペプチドは、配列番号６８もしくは６９のアミノ酸配列、または配列番号６８もしくは６９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２２７】
本明細書に記載のドナー鋳型のいずれかに従う一部の実施形態では、ドナー鋳型は、選択可能なマーカーをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、選択可能なマーカーは、ｔＬＮＧＦＲポリペプチドである。一部の実施形態では、ｔＬＮＧＦＲポリペプチドは、配列番号６６のアミノ酸配列、または配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２２８】
本明細書に記載のドナー鋳型のいずれかに従う一部の実施形態では、ドナー鋳型は、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドは、突然変異体ＣＮポリペプチドである。一部の実施形態では、突然変異体ＣＮポリペプチドは、ＣＮｂ３０（配列番号６７）である。
【０２２９】
本明細書に記載のドナー鋳型のいずれかに従う一部の実施形態では、ドナー鋳型は、ＩＬ２Ｒγシグナル伝達ドメインまたはその断片を含む第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第２のＣＩＳＣ成分の第２の細胞外結合ドメインは、ＦＫＢＰドメインを含む。一部の実施形態では、第２のＣＩＳＣ成分は、配列番号５３のアミノ酸配列、または配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号５２のアミノ酸配列または配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む第２のＣＩＳＣ成分の断片をコードする核酸を含む。
【０２３０】
本明細書に記載のドナー鋳型のいずれかに従う一部の実施形態では、ドナー鋳型は、ＭＳＣＶプロモーターを含む。一部の実施形態では、ＭＳＣＶプロモーターは、配列番号７５のポリヌクレオチド配列、または配列番号７５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２３１】
本明細書に記載のドナー鋳型のいずれかに従う一部の実施形態では、ドナー鋳型は、ＭＮＤプロモーターを含む。一部の実施形態では、ＭＮＤプロモーターは、配列番号７４のポリヌクレオチド配列、または配列番号７４のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２３２】
本明細書に記載のドナー鋳型のいずれかに従う一部の実施形態では、ドナー鋳型は、系成分をコードする隣接する核酸の間に２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、ドナー鋳型は、系成分をコードする隣接する核酸の各々の間に２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸を含む。例えば、一部の実施形態では、ドナー鋳型は、５’から３’の順に、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸、選択可能なマーカーをコードする核酸、２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸、および第２のＣＩＳＣ成分またはその断片をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、２Ａ自己切断ペプチドの各々は、独立して、Ｔ２Ａ自己切断ペプチド、またはＰ２Ａ自己切断ペプチドである。一部の実施形態では、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列、または配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、Ｐ２Ａ自己切断ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列、または配列番号７３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２３３】
一部の実施形態では、本明細書に記載の系は、以下の系成分をコードする核酸を含む１つまたは複数のドナー鋳型を含む：ｉ）抗形質細胞構築物、ｉｉ）ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含む第１のＣＩＳＣ成分、ｉｉｉ）抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物、ｉｖ）ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチド、ｖ）選択可能なマーカー、ｖｉ）１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチド、およびｖｉｉ）ＩＬ２Ｒγシグナル伝達ドメインまたはその断片を含む第２のＣＩＳＣ成分。一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、第１のドナー鋳型および第２のドナー鋳型を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子内に挿入されるように構成され、第２のドナー鋳型は、第２の内在性遺伝子内に挿入されるように構成されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットを含み、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットを含む。一部の実施形態では、第１のコードカセットは、抗形質細胞構築物をコードする核酸、および第１のＣＩＳＣ成分をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第２のコードカセットは、抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物をコードする核酸、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、選択可能なマーカーをコードする核酸、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、および第２のＣＩＳＣ成分またはその断片をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットに作動可能に連結した第１のプロモーターを含む第１のポリシストロン性発現カセットの上流に合成ポリＡ配列を含み、したがって、第１のポリシストロン性発現カセットの発現は、第１のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターである。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットの上流に２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸を含む第１のポリシストロン性発現カセットの一部分をコードする核酸を含み、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子に挿入されると、第１のポリシストロン性発現カセットの部分が第１の内在性遺伝子の配列に連結され、第１の内在性遺伝子の配列に連結された第１のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第１のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。一部の実施形態では、第１の内在性遺伝子は、内在性ＴＲＡ遺伝子である。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入される。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型の挿入は、非機能的なＴＲＡＣドメインを生じさせる結果となる。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットに作動可能に連結した第２のプロモーターを含む第２のポリシストロン性発現カセットまたはその一部分を含み、したがって、第２のポリシストロン性発現カセットの発現は、第２のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、ＭＮＤプロモーターである。一部の実施形態では、第��の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子である。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子であり、第２のドナー鋳型は、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片を含む核酸を含む第２のポリシストロン性発現カセットの一部分を含み、第２のドナー鋳型は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入されると、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結され、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が一緒に第２のＣＩＳＣ成分をコードし、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第２のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。第１のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃４〜＃７に示されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号２８〜３９のいずれか１つからの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号１０１〜１０４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型には、ＴＲＡ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第１のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８０および８１、配列番号８２および８３、または配列番号８４および８５のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。第２のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃９に示されている。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号４４からの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号１０６のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型には、ＩＬ２ＲＧ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第２のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８６および８７、配列番号８８および８９、または配列番号９０および９１のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のＡＡＶベクターであり、および／または第２のドナー鋳型は、第２のＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２８〜３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号２８〜３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号１０１〜１０４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号１０１〜１０４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４４のポリヌクレオチド配列、または配列番号４４のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１０６のポリヌクレオチド配列、または配列番号１０６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２３４】
本明細書に記載のドナー鋳型のいずれかに従う一部の実施形態では、ドナー鋳型は、抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物は、構築物を発現する編集されたＴ細胞に、編集されたＴ細胞を異物と認識する細胞傷害性Ｔ細胞に対する細胞傷害性を付与することができるが、編集されたＴ細胞は、編集されたＴ細胞を異物と認識しない細胞傷害性Ｔ細胞に対して非細胞傷害性である。一部の実施形態では、抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物は、細胞外β２−ミクログロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体である。一部の実施形態では、細胞外β２−ミクログロブリンドメインは、配列番号６２のアミノ酸配列、または配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインポリペプチドを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号６３のアミノ酸配列、または配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体共刺激ドメインは、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体４−１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号６４のアミノ酸配列、または配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体ＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号５９のアミノ酸配列、または配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６５のアミノ酸配列、または配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２３５】
一部の実施形態では、本明細書に記載の系は、以下の系成分をコードする核酸を含む１つまたは複数のドナー鋳型を含む：ｉ）抗形質細胞構築物、ｉｉ）ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含む第１のＣＩＳＣ成分、ｉｉｉ）ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチド、ｉｖ）１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチド、およびｖ）ＩＬ２Ｒγシグナル伝達ドメインまたはその断片を含む第２のＣＩＳＣ成分。一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、第１のドナー鋳型および第２のドナー鋳型を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子内に挿入されるように構成され、第２のドナー鋳型は、第２の内在性遺伝子内に挿入されるように構成されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットを含み、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットを含む。一部の実施形態では、第１のコードカセットは、抗形質細胞構築物をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第２のコードカセットは、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、第１のＣＩＳＣ成分をコードする核酸、および第２のＣＩＳＣ成分またはその断片をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットに作動可能に連結した第１のプロモーターの上流に合成ポリＡ配列を含み、したがって、抗形質細胞構築物をコードする核酸の発現は、第１のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターである。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコード配列の上流に２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸を含む第１のポリシストロン性発現カセットの一部分をコードする核酸を含み、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子に挿入されると、第１のポリシストロン性発現カセットの部分が第１の内在性遺伝子の配列に連結され、第１の内在性遺伝子の配列に連結された第１のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第１のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。一部の実施形態では、第１の内在性遺伝子は、内在性ＴＲＡ遺伝子である。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入される。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型の挿入は、非機能的なＴＲＡＣドメインを生じさせる結果となる。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットに作動可能に連結した第２のプロモーターを含む第２のポリシストロン性発現カセットまたはその一部分を含み、したがって、第２のポリシストロン性発現カセットの発現は、第２のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、ＭＮＤプロモーターである。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子である。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子であり、第２のドナー鋳型は、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片を含む核��を含む第２のポリシストロン性発現カセットの一部分を含み、第２のドナー鋳型は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入されると、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結され、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が一緒に第２のＣＩＳＣ成分をコードし、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第２のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。第１のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃１および＃２に示されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号１９〜２４のいずれか１つからの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号９８〜９９のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型には、ＴＲＡ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第１のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８０および８１、配列番号８２および８３、または配列番号８４および８５のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。第２のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃１０に示されている。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号４５からの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号１０７のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型には、ＩＬ２ＲＧ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第２のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８６および８７、配列番号８８および８９、または配列番号９０および９１のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のＡＡＶベクターであり、および／または第２のドナー鋳型は、第２のＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号１９〜２４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号１９〜２４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号９８〜９９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号９８〜９９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１０７のポリヌクレオチド配列、または配列番号１０７のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２３６】
一部の実施形態では、本明細書に記載の系は、以下の系成分をコードする核酸を含む１つまたは複数のドナー鋳型を含む：ｉ）抗形質細胞構築物、ｉｉ）ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含む第１のＣＩＳＣ成分、ｉｉｉ）抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物、ｉｖ）ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチド、ｖ）１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチド、およびｖｉ）ＩＬ２Ｒγシグナル伝達ドメインまたはその断片を含む第２のＣＩＳＣ成分。一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、第１のドナー鋳型および第２のドナー鋳型を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子内に挿入されるように構成され、第２のドナー鋳型は、第２の内在性遺伝子内に挿入されるように構成されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットを含み、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットを含む。一部の実施形態では、第１のコードカセットは、抗形質細胞構築物をコードする核酸、および１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第２のコードカセットは、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、第１のＣＩＳＣ成分をコードする核酸、および第２のＣＩＳＣ成分またはその断片をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットに作動可能に連結した第１のプロモーターを含む第１のポリシストロン性発現カセットの上流に合成ポリＡ配列を含み、したがって、第１のポリシストロン性発現カセットの発現は、第１のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターである。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットの上流に２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸を含む第１のポリシストロン性発現カセットの一部分をコードする核酸を含み、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子に挿入されると、第１のポリシストロン性発現カセットの部分が第１の内在性遺伝子の配列に連結され、第１の内在性遺伝子の配列に連結された第１のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第１のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。一部の実施形態では、第１の内在性遺伝子は、内在性ＴＲＡ遺伝子である。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入される。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型の挿入は、非機能的なＴＲＡＣドメインを生じさせる結果となる。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットに作動可能に連結した第２のプロモーターを含む第２のポリシストロン性発現カセットまたはその一部分を含み、したがって、第２のポリシストロン性発現カセットの発現は、第２のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、ＭＮＤプロモーターである。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子である。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２Ｒ��遺伝子であり、第２のドナー鋳型は、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片を含む核酸を含む第２のポリシストロン性発現カセットの一部分を含み、第２のドナー鋳型は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入されると、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結され、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が一緒に第２のＣＩＳＣ成分をコードし、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第２のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。第１のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃３に示されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号２５〜２７のいずれか１つからの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号１００のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型には、ＴＲＡ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第１のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８０および８１、配列番号８２および８３、または配列番号８４および８５のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。第２のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃１１に示されている。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号４６からの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号１０８のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型には、ＩＬ２ＲＧ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第２のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８６および８７、配列番号８８および８９、または配列番号９０および９１のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のＡＡＶベクターであり、および／または第２のドナー鋳型は、第２のＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２５〜２７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号２５〜２７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号１００のポリヌクレオチド配列、および配列番号１００のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１０８のポリヌクレオチド配列、または配列番号１０８のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２３７】
一部の実施形態では、本明細書に記載の系は、１つまたは複数のドナー鋳型および１つまたは複数のｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、第１のドナー鋳型および第２のドナー鋳型を含み、１つまたは複数のｇＲＮＡは、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のＡＡＶベクターであり、および／または第２のドナー鋳型は、第２のＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２８、３１、３４および３７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、ならびに配列番号２８、３１、３４および３７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のｇＲＮＡは、配列番号１のポリヌクレオチド配列、または配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２９、３２、３５および３８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、ならびに配列番号２９、３２、３５および３８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のｇＲＮＡは、配列番号２のポリヌクレオチド配列、または配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号３０、３３、３６および３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、ならびに配列番号３０、３３、３６および３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のｇＲＮＡは、配列番号３のポリヌクレオチド配列、または配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号１９もしくは２２のポリヌクレオチド配列、または配列番号１９もしくは２２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のｇＲＮＡは、配列番号１のポリヌクレオチド配列、または配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２０もしくは２３のポリヌクレオチド配列、または配列番号２０もしくは２３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のｇＲＮＡは、配列番号２のポリヌクレオチド配列、または配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２１もしくは２４のポリヌクレオチド配列、または配列番号２１もしくは２４のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のｇＲＮＡは、配列番号３のポリヌクレオチド配列、または配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２５のポリヌクレオチド配列、または配列番号２５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のｇＲＮＡは、配列番号１のポリヌクレオチド配列、または配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２６のポリヌクレオチド配列、または配列番号２６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のｇＲＮＡは、配列番号２のポリヌクレオチド配列、または配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２７のポリヌクレオチド配列、または配列番号２７のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のｇＲＮＡは、配列番号３のポリヌクレオチド配列、または配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２３８】
ドナー鋳型を含む本明細書に記載の系のいずれかに従う一部の実施形態では、ドナー鋳型は、コードカセットを含み、ドナー鋳型は、コードカセットを系内のｇＲＮＡが標的とするゲノム遺伝子座に相同組換え修復（ＨＤＲ）によって組み込むことができるように構成されている。一部の実施形態では、コードカセットの両側には、標的ゲノム遺伝子座内の配列に対応する相同アームが隣接している。一部の実施形態では、相同アームは、系内のｇＲＮＡの標的部位を含む標的ゲノム遺伝子座における配列に対応する。一部の実施形態では、相同アームの一方または両方は、系内のｇＲＮＡの標的部位に対応する配列を含む。一部の実施形態では、相同アームは、ゲノム遺伝子座へのコードカセットの組込みによって、ｇＲＮＡのゲノム標的部位が除去される、またはそうでなければ、ゲノム標的部位がもはやｇＲＮＡの標的でなくなるように改変されるように構成されている。一部の実施形態では、標的部位に対応する相同アーム内の配列は、標的部位のＰＡＭ配列の変化を含み、その結果、ｇＲＮＡの標的でなくなる。一部の実施形態では、相同アームの一方は、標的部位の一部分に対応する配列を含み、他方の相同アームは、標的部位の残部に対応する配列を含み、したがって、ゲノム遺伝子座へのコード配列の組込みは、ゲノム遺伝子座における標的部位を分断する。一部の実施形態では、相同アームは、長さが少なくともまたは少なくとも約０．２ｋｂ（例えば、少なくともまたは少なくとも約０．３ｋｂ、０．４ｋｂ、０．５ｋｂ、０．６ｋｂ、０．７ｋｂ、０．８ｋｂ、０．９ｋｂ、１ｋｂまたはそれを超えるｋｂのうちのいずれか）である。例示的な相同アームは、配列番号１９〜４６のいずれか１つの配列を有するドナー鋳型からの相同アームを含む。一部の実施形態では、ドナー鋳型は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ６ベクターである。
【０２３９】
ドナー鋳型を含む本明細書に記載の系のいずれかに従う一部の実施形態では、ドナー鋳型は、コードカセットを含み、ドナー鋳型は、系内のｇＲＮＡが標的とするゲノム遺伝子座に非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によってコードカセットを組み込むことができるように構成されている。一部の実施形態では、コードカセットの片側または両側には、ｇＲＮＡ標的部位が隣接している。一部の実施形態では、コードカセットの両側には、ｇＲＮＡ標的部位が隣接している。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ標的部位は、系内のｇＲＮＡの標的部位である。一部の実施形態では、ドナー鋳型のｇＲＮＡ標的部位は、系内のｇＲＮＡの細胞ゲノムｇＲＮＡ標的部位の逆相補配列である。一部の実施形態では、ドナー鋳型は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ６ベクターである。
【０２４０】
一部の実施形態では、本明細書に記載の系は、ＲＧＥＮと第１のｇＲＮＡおよび／または第２のｇＲＮＡとを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む。一部の実施形態では、ＲＧＥＮは、第１のｇＲＮＡおよび／または第２のｇＲＮＡと、それぞれ１：１〜２０：１の間のｇＲＮＡ対ＲＧＥＮのモル比で、ＲＮＰを形成するように事前に複合体化されている。
操作された細胞
【０２４１】
一部の態様では、操作された哺乳動物細胞（例えば、Ｔ細胞）などの、操作された細胞であって、核酸が、ｉ）本明細書で示され、説明されるような形質細胞に対する細胞傷害性を操作され細胞に付与することができる抗形質細胞構築物と、ｉｉ）本明細書で示され、説明されるような二量体化活性化可能な化学誘導シグナル伝達複合体（ＣＩＳＣ）のポリペプチド成分とをコードする核酸を含み、シグナル伝達能力を有するＣＩＳＣが、操作された細胞の生存および／または増殖を促進する刺激シグナルをシグナル伝達経路において生じさせることができる、操作された細胞が、本明細書で提供される。ＣＩＳＣは、操作された細胞と接触しているＣＩＳＣ二量体化に必要なリガンドの量をモジュレートすることにより、操作された細胞の生存および／または増殖を制御することを可能にする。一部の実施形態では、ＣＩＳＣは、第１のＣＩＳＣ成分および第２のＣＩＳＣ成分を含み、第１のＣＩＳＣ成分および第２のＣＩＳＣ成分は、操作された細胞により発現されると、リガンドの存在下で二量体化してシグナル伝達能力を有するＣＩＳＣを作出するように構成されている。一部の実施形態では、操作された細胞は、リガンドの非存在下では生存および／または増殖することができない。一部の実施形態では、操作された細胞は、細胞の生存および／または増殖に関与する内在性シグナル伝達経路に欠陥があり、シグナル伝達能力を有するＣＩＳＣは、欠陥のある内在性シグナル伝達経路を、操作された細胞が生存および／または増殖することができるように補完することができる。一部の実施形態では、操作された細胞は、操作されたＴ細胞である。一部の実施形態では、例えば抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲなどの本明細書に記載の抗形質細胞ＣＡＲを含む、操作されたＴ細胞は、その標的抗原の存在下でまたはその標的抗原との接触後に脱顆粒する。一部の実施形態では、操作されたＴ細胞は、個体の例えば多発性骨髄腫などの形質細胞新生物の腫瘍部位に局在する。一部の実施形態では、操作されたＴ細胞は、体内の形質細胞常在部位に、例えば、骨髄および腸に局在する。一部の実施形態では、操作されたＴ細胞は、ヒトである。
【０２４２】
一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された細胞は、抗形質細胞構築物をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、抗形質細胞構築物は、抗形質細胞キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。抗形質細胞ＣＡＲは、形質細胞の表面に存在する抗原を認識する。一部の実施形態では、抗形質細胞ＣＡＲは、形質細胞の表面に選択的に発現される抗原を認識する。一部の実施形態では、形質細胞は、非悪性形質細胞である。一部の実施形態では、抗形質細胞ＣＡＲは、ＣＤ２７（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー７、ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ１２６（インターロイキン−６受容体、ＩＬ６Ｒ）、ＣＤ１３８（シンデカン１）、ＣＤ２６９（Ｂ細胞成熟抗原、ＢＣＭＡ）、またはＣＤ３１９（ＳＬＡＭファミリーメンバー７、ＳＬＡＭＦ７）を認識する。一部の実施形態では、抗形質細胞ＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲである。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、野生型ＢＣＭＡを認識する。ＢＣＭＡに特異的な抗体部分は、当技術分野で公知であり、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、これらの抗ＢＣＭＡ抗体部分のいずれかを含み得る。例えば、一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ抗体Ｃ１１Ｄ５．３に由来する抗体部分を含む。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ抗体Ｃ１１Ｄ５．３に由来する重鎖および軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖを含む。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ  ＣＤＲの各々が抗ＢＣＭＡ抗体Ｃ１１Ｄ５．３に由来する、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖを含む。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号５５のアミノ酸配列、または配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２４３】
一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された細胞は、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、細胞外ＢＣＭＡ認識ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞外ＢＣＭＡ認識ドメインは、ＢＣＭＡに特異的に結合することができる抗体部分である。一部の実施形態では、抗体部分は、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖである。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、重鎖相補性決定領域（ＨＣ−ＣＤＲ）１、ＨＣ−ＣＤＲ２およびＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、軽鎖相補性決定領域（ＬＣ−ＣＤＲ）１、ＬＣ−ＣＤＲ２およびＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含み、ＣＤＲのいくつかは、抗ＢＣＭＡ抗体に由来する。一部の実施形態では、ＨＣ−ＣＤＲ３およびＬＣ−ＣＤ３は、抗ＢＣＭＡ抗体に由来する。一部の実施形態では、ＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、ＨＣ−ＣＤＲ３、ＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２およびＬＣ−ＣＤＲ３は、抗ＢＣＭＡ抗体に由来する。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、Ｃ１１Ｄ５．３である。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは、配列番号５５のアミノ酸配列、または配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号５６のアミノ酸配列、または配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ共刺激ドメインは、４−１ＢＢおよび／またはＣＤ２８共刺激ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号５７のアミノ酸配列、または配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、４−１ＢＢ共刺激膜貫通ドメインは、配列番号５８のアミノ酸配列、または配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号５９のアミノ酸配列、または配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、配列番号６０もしくは６１のアミノ酸配列、または配列番号６０もしくは６１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２４４】
本明細書に記載の操作された細胞のいずれかに従う一部の実施形態では、抗形質細胞構築物をコードする外来性核酸は、操作された細胞のゲノムに挿入される。一部の実施形態では、外来性核酸は、内在性ＴＲＡ遺伝子に挿入される。一部の実施形態では、外来性核酸は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入される。一部の実施形態では、外来性核酸の挿入は、非機能的なＴＲＡＣドメインを生じさせる結果となる。ＴＲＡＣドメインは、結果として生じる細胞が機能的なネイティブ（未改変）Ｔ細胞受容体を発現することができない場合、非機能性である。一部の実施形態では、外来性核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入される。一部の実施形態では、外来性核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入され、したがって、抗形質細胞構築物の発現は、１つまたは複数の内在性ＩＬ２ＲＧ調節エレメントの制御下にある。一部の実施形態では、外来性核酸は、抗形質細胞構築物をコードする外来性核酸の部分に作動可能に連結したプロモーターをさらに含み、したがって、操作された細胞における抗形質細胞構築物の発現は、プロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、プロモーターは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーの、負の制御領域が欠失され、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位が置換された（ＭＮＤ）プロモーターである。一部の実施形態では、ＭＮＤプロモーターは、配列番号７４のポリヌクレオチド配列、または配列番号７４のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２４５】
一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された細胞は、第１のＣＩＳＣ成分と第２のＣＩＳＣ成分とを含む二量体ＣＩＳＣをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分は、第１の細胞外結合ドメインまたはその一部分と、第１の膜貫通ドメインと、第１のシグナル伝達ドメインまたはその一部分とを含む。一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分は、第１のヒンジドメインをさらに含む。一部の実施形態では、第２のＣＩＳＣ成分は、第２の細胞外結合ドメインまたはその一部分と、第２の膜貫通ドメインと、第２のシグナル伝達ドメインまたはその一部分とを含む。一部の実施形態では、第２のＣＩＳＣ成分は、第２のヒンジドメインをさらに含む。一部の実施形態では、第１および第２のＣＩＳＣ成分は、発現されると、リガンドの存在下で二量体化するように構成され得る。一部の実施形態では、第１の細胞外結合ドメインまたはその一部分は、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインまたはその一部分を含み、第２の細胞外結合ドメインまたはその一部分は、ＦＫＢＰラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインまたはその一部分を含む。一部の実施形態では、第２の細胞外結合ドメインまたはその一部分は、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインまたはその一部分を含み、第１の細胞外結合ドメインまたはその一部分は、ＦＫＢＰラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインまたはその一部分を含む。一部の実施形態では、リガンドは、ラパマイシンまたはラパログである。一部の実施形態では、第１のシグナル伝達ドメインは、ＩＬ２Ｒγに由来するシグナル伝達ドメインであり、および／または第１の膜貫通ドメインは、ＩＬ２Ｒγに由来する膜貫通ドメインであり、第２のシグナル伝達ドメインは、ＩＬ２Ｒβに由来するシグナル伝達ドメインであり、および／または第２の膜貫通ドメインは、ＩＬ２Ｒβに由来する膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、第２のシグナル伝達ドメインは、ＩＬ２Ｒγに由来するシグナル伝達ドメインであり、および／または第２の膜貫通ドメインは、ＩＬ２Ｒγに由来する膜貫通ドメインであり、第１のシグナル伝達ドメインは、ＩＬ２Ｒβに由来するシグナル伝達ドメインであり、および／または第１の膜貫通ドメインは、ＩＬ２Ｒβに由来する膜貫通ドメインである。
【０２４６】
一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された細胞は、第１のＣＩＳＣ成分と第２のＣＩＳＣ成分とを含む二量体ＣＩＳＣをコードする核酸を含み、ＣＩＳＣは、ＩＬ２ＲγおよびＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分は、シグナル伝達ドメインを含むＩＬ２Ｒγの一部分を含み、第２のＣＩＳＣ成分は、シグナル伝達ドメインを含むＩＬ２Ｒβの一部分を含むか、または第２のＣＩＳＣ成分は、シグナル伝達ドメインを含むＩＬ２Ｒγの一部分を含み、第１のＣＩＳＣ成分は、シグナル伝達ドメインを含むＩＬ２Ｒβの一部分を含む。一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分は、配列番号５０のアミノ酸配列、または配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、ＩＬ２Ｒγの一部分を含み、第２のＣＩＳＣ成分は、配列番号５１のアミノ酸配列、または配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、ＩＬ２Ｒβの一部分を含むか、または第２のＣＩＳＣ成分は、配列番号５０のアミノ酸配列、または配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、ＩＬ２Ｒγの一部分を含み、第１のＣＩＳＣ成分は、配列番号５１のアミノ酸配列、または配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む、ＩＬ２Ｒβの一部分を含む。一部の実施形態では、第１の細胞外結合ドメインまたはその一部分は、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインまたはその一部分を含み、第２の細胞外結合ドメインまたはその一部分は、ＦＫＢＰラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインまたはその一部分を含む。一部の実施形態では、第２の細胞外結合ドメインまたはその一部分は、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインまたはその一部分を含み、第１の細胞外結合ドメインまたはその一部分は、ＦＫＢＰラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインまたはその一部分を含む。一部の実施形態では、ＦＫＢＰドメインは、配列番号４７のアミノ酸配列、または配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、ＦＲＢは、配列番号４８のアミノ酸配列、または配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１および第２のＣＩＳＣ成分は、ラパマイシンまたはパラログの存在下で二量体化して、シグナル伝達能力を有するＣＩＳＣを形成する。一部の実施形態では、ラパログは、エベロリムス、ＣＣＩ−７７９、Ｃ２０−メタリルラパマイシン、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン、Ｃ１６−ｉＲａｐ、ＡＰ２１９６７、ミコフェノール酸ナトリウム、ベニジピン塩酸塩、ＡＰ１９０３もしくはＡＰ２３５７３、またはそれらの代謝物、誘導体および／もしくは組合せからなる群から選択される。
【０２４７】
本明細書に記載の操作された細胞のいずれかに従う一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分もしくはその一部分をコードする第１の外来性核酸は、操作された細胞のゲノムに挿入され、および／または第２のＣＩＳＣ成分もしくはその一部分をコードする第２の外来性核酸は、操作された細胞のゲノムに挿入される。一部の実施形態では、第１の外来性核酸は、内在性ＴＲＡ遺伝子に挿入され、および／または第２の外来性核酸は、内在性ＴＲＡ遺伝子に挿入される。一部の実施形態では、第１の外来性核酸は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入され、および／または第２の外来性核酸は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入される。一部の実施形態では、外来性核酸の挿入は、非機能的なＴＲＡＣドメインを生じさせる結果となる。一部の実施形態では、第１の外来性核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入され、および／または第２の外来性核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入される。一部の実施形態では、ＩＬ２Ｒγの一部分を含むＣＩＳＣ成分をコードする外来性核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入される。一部の実施形態では、ＩＬ２Ｒγの一部分を含むＣＩＳＣ成分をコードする外来性核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入され、したがって、ＣＩＳＣ成分の発現は、１つまたは複数の内在性ＩＬ２ＲＧ調節エレメントの制御下にある。一部の実施形態では、ＩＬ２Ｒγの一部分を含むＣＩＳＣ成分のＮ末端断片をコードする外来性核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入され、したがって、ｉ）ＣＩＳＣ成分の発現は、１つまたは複数の内在性ＩＬ２ＲＧ調節エレメントの制御下にあり、ｉｉ）ＣＩＳＣ成分のＮ末端断片をコードする外来性核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子を有するフレーム内に挿入され、ＣＩＳＣ成分の残りのＣ末端部分は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子のコード配列のＣ末端部分によりコードされる。一部の実施形態では、第１の外来性核酸は、第１のＣＩＳＣ成分またはその一部分をコードする外来性核酸の部分に作動可能に連結した第１のプロモーターをさらに含み、したがって、操作された細胞における第１のＣＩＳＣ成分の発現は、第１のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第２の外来性核酸は、第２のＣＩＳＣ成分またはその一部分をコードする外来性核酸の部分に作動可能に連結した第２のプロモーターをさらに含み、したがって、操作された細胞における第２のＣＩＳＣ成分の発現は、第２のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分またはその一部分と、その一部分の第２のＣＩＳＣ成分とをコードする単一の外来性核酸が、操作された細胞のゲノムに挿入される。一部の実施形態では、単一の外来性核酸は、第１および第２のＣＩＳＣ成分またはそれらの一部分をコードする外来性核酸の部分に作動可能に連結した単一のプロモーターをさら含み、したがって、操作された細胞における第１および第２のＣＩＳＣ成分の発現は、単一のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第１の、第２の、および／または単一のプロモーターは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーの、負の制御領域が欠失され、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位が置換された（ＭＮＤ）プロモーターである。一部の実施形態では、ＭＮＤプロモーターは、配列番号７４のポリヌクレオチド配列、または配列番号７４のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２４８】
一部の実施形態では、操作された細胞は、Ｔ細胞であるか、またはＴ細胞に分化することができる前駆細胞である。一部の実施形態では、操作された細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、および／またはＣＤ４＋Ｔリンパ球である。一部の実施形態では、操作された細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞またはバルクＣＤ８＋Ｔ細胞を含み得る、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞である。
【０２４９】
リンパ球（Ｔリンパ球）は、公知の技術に従って収集することができ、フローサイトメトリーおよび／または免疫磁気選択などの抗体への親和性結合などの公知の技術により富化または枯渇させることができる。富化および／または枯渇ステップの後、当業者には明らかであろう公知の技術またはその変形形態に従って、所望のＴリンパ球のｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡大を行うことができる。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、患者から得られる自己Ｔ細胞である。
【０２５０】
例えば、所望のＴ細胞集団または部分集団は、初期Ｔリンパ球集団を培養培地にｉｎ  ｖｉｔｒｏで添加すること、次いで、培養培地に非分裂末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などの支持細胞を添加すること（例えば、その結果、得られる細胞の集団は、拡大される初期集団中の各Ｔリンパ球に少なくとも５、１０、２０もしくは４０個またはそれよりも多くのＰＢＭＣ支持細胞を含有する）、培養物を（例えば、Ｔ細胞の数を拡大するのに十分な時間にわたって）インキュベートすることにより、拡大することができる。非分裂支持細胞は、ガンマ線照射ＰＢＭＣ支持細胞を含み得る。一部の実施形態では、ＰＢＭＣには、細胞分裂を防止するために３０００〜３６００ｒａｄの範囲のガンマ線が照射される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣには、細胞分裂を防止するために、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００もしくは３６００ｒａｄ、または列挙された値のいずれかのうちの任意の２つの終点間の任意のｒａｄ値のガンマ線が照射される。培養培地へのＴ細胞および支持細胞の添加の順番を必要に応じて逆にしてもよい。培養物は、一般に、Ｔリンパ球の成長に適している温度などの条件下でインキュベートすることができる。例えば、ヒトＴリンパ球の成長のための温度は、一般に、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃、または少なくとも３７℃である。一部の実施形態では、ヒトＴリンパ球の成長のための温度は、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３７℃、または列挙された値のいずれかのうちの任意の２つの終点間の任意の他の温度である。
【０２５１】
Ｔリンパ球の単離後、細胞傷害性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ球の両方を、拡大前または後のいずれかで、ナイーブ、メモリーおよびエフェクターＴ細胞部分集団に選別することができる。
【０２５２】
当技術分野において公知の方法を使用することにより、ＣＤ８＋細胞を得ることができる。一部の実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、ナイーブ、セントラルメモリーおよびエフェクターメモリー細胞に、これらのＣＤ８＋細胞型の各々に関連する細胞表面抗原を同定することによりさらに選別される。一部の実施形態では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ球のＣＤ６２Ｌ＋サブセットとＣＤ６２Ｌ−サブセットの両方に存在する。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ８および抗ＣＤ６２Ｌ抗体での染色後にＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８＋画分とＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋画分に選別される。一部の実施形態では、セントラルメモリーＴＣＭの表現型マーカーの発現は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３および／またはＣＤ１２７を含み、グランザイムＢに対して陰性であるか、またはグランザイムＢについて少ない。一部の実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、エフェクターＴＥは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８および／またはＣＤ１２７に対して陰性であり、グランザイムＢおよび／またはパーフォリンに対して陽性である。一部の実施形態では、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７および／またはＣＤ４５ＲＡを含むナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられる。
【０２５３】
哺乳動物細胞などの細胞、または哺乳動物細胞の集団などの細胞集団が、拡大に選択されるかどうかは、細胞または細胞の集団が、２つの別個の遺伝子改変事象を経たかどうかに依存する。哺乳動物細胞などの細胞、または哺乳動物細胞の集団などの細胞の集団が、１つのまたはそれよりも少ない遺伝子改変事象を経た場合には、リガンドを添加しても二量体化が生じることにならない。しかし、哺乳動物細胞などの細胞、または哺乳動物細胞の集団などの細胞の集団が、２つの遺伝子改変事象を経た場合には、リガンドの添加により、ＣＩＳＣ成分の二量体化およびその後のシグナル伝達カスケードが生じることになる。したがって、哺乳動物細胞などの細胞、または哺乳動物細胞の集団などの細胞の集団を、リガンドとの接触に対するその応答に基づいて選択することができる。一部の実施形態では、リガンドは、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００ｎＭまたは前述の値のいずれか２つにより定義される範囲内の濃度の量で、添加され得る。
【０２５４】
一部の実施形態では、哺乳動物細胞などの細胞、または哺乳動物細胞の集団などの細胞の集団は、シグナル伝達経路の結果としてのマーカーの発現に基づいて二量体ＣＩＳＣに対して陽性であり得る。したがって、二量体ＣＩＳＣに対して陽性の細胞集団は、表面マーカーに対する特異的抗体およびアイソタイプ適合対照抗体での染色を使用してフローサイトメトリーにより決定することができる。
【０２５５】
一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された細胞は、抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物をコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物は、操作された細胞に、操作された細胞を異物と認識する細胞傷害性Ｔ細胞に対する細胞傷害性を付与することができ、編集されたＴ細胞は、操作された細胞を異物と認識しない細胞傷害性Ｔ細胞に対して非細胞傷害性である。一部の実施形態では、抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物は、細胞外β２−ミクログロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体である。一部の実施形態では、細胞外β２−ミクログロブリンドメインは、配列番号６２のアミノ酸配列、または配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインポリペプチドを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号６３のアミノ酸配列、または配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体共刺激ドメインは、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体４−１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号６４のアミノ酸配列、または配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体ＣＤ３−ζ細胞質シグナル伝達ドメインは、配列番号５９のアミノ酸配列、または配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６５のアミノ酸配列、または配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２５６】
抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物をコードする核酸を含む本明細書に記載の操作された細胞のいずれかに従う一部の実施形態では、抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物をコードする外来性核酸は、操作された細胞のゲノムに挿入される。一部の実施形態では、外来性核酸は、内在性ＴＲＡ遺伝子に挿入される。一部の実施形態では、外来性核酸は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入される。一部の実施形態では、外来性核酸の挿入は、非機能的なＴＲＡＣドメインを生じさせる結果となる。一部の実施形態では、外来性核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入される。一部の実施形態では、外来性核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入され、したがって、抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物の発現は、１つまたは複数の内在性ＩＬ２ＲＧ調節エレメントの制御下にある。一部の実施形態では、外来性核酸は、抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物をコードする外来性核酸の部分に作動可能に連結したプロモーターをさらに含み、したがって、操作された細胞における抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物の発現は、プロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、プロモーターは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーの、負の制御領域が欠失され、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位が置換された（ＭＮＤ）プロモーターである。一部の実施形態では、ＭＮＤプロモーターは、配列番号７４のポリヌクレオチド配列、または配列番号７４のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２５７】
一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された細胞は、選択可能なマーカーをコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、選択可能なマーカーは、操作された細胞に、毒素の存在下または栄養素の非存在下などの選択的条件で生存する能力を付与することができる。一部の実施形態では、選択可能なマーカーは、選択可能なマーカーを発現する細胞の選択を可能にする表面マーカーである。一部の実施形態では、選択可能なマーカーは、切断型低親和性神経成長因子受容体（ｔＬＮＧＦＲ）ポリペプチドである。一部の実施形態では、ｔＬＮＧＦＲポリペプチドは、配列番号６６のアミノ酸配列、または配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２５８】
選択可能なマーカーをコードする核酸を含む本明細書に記載の操作された細胞のいずれかに従う一部の実施形態では、選択可能なマーカーをコードする外来性核酸は、操作された細胞のゲノムに挿入される。一部の実施形態では、外来性核酸は、内在性ＴＲＡ遺伝子に挿入される。一部の実施形態では、外来性核酸は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入される。一部の実施形態では、外来性核酸の挿入は、非機能的なＴＲＡＣドメインを生じさせる結果となる。一部の実施形態では、外来性核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入される。一部の実施形態では、外来性核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入され、したがって、選択可能なマーカーの発現は、１つまたは複数の内在性ＩＬ２ＲＧ調節エレメントの制御下にある。一部の実施形態では、外来性核酸は、選択可能なマーカーをコードする外来性核酸の部分に作動可能に連結したプロモーターをさらに含み、したがって、操作された細胞における選択可能なマーカーの発現は、プロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、プロモーターは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーの、負の制御領域が欠失され、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位が置換された（ＭＮＤ）プロモーターである。一部の実施形態では、ＭＮＤプロモーターは、配列番号７４のポリヌクレオチド配列、または配列番号７４のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２５９】
一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された細胞は、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドは、タクロリムス（ＦＫ５０６）および／またはシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）に対する耐性を付与する。一部の実施形態では、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドは、突然変異体カルシニューリン（ＣＮ）ポリペプチドである。一部の実施形態では、突然変異体ＣＮポリペプチドは、タクロリムス（ＦＫ５０６）およびシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）に対する耐性を付与する。一部の実施形態では、突然変異体ＣＮポリペプチドは、ＣＮｂ３０（配列番号６７）である。
【０２６０】
１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸を含む本明細書に記載の操作された細胞のいずれかに従う一部の実施形態では、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする外来性核酸は、操作された細胞のゲノムに挿入される。一部の実施形態では、外来性核酸は、内在性ＴＲＡ遺伝子に挿入される。一部の実施形態では、外来性核酸は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入される。一部の実施形態では、外来性核酸の挿入は、非機能的なＴＲＡＣドメインを生じさせる結果となる。一部の実施形態では、外来性核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入される。一部の実施形態では、外来性核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入され、したがって、選択可能なマーカーの発現は、１つまたは複数の内在性ＩＬ２ＲＧ調節エレメントの制御下にある。一部の実施形態では、外来性核酸は、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする外来性核酸の部分に作動可能に連結したプロモーターをさらに含み、したがって、操作された細胞における１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドの発現は、プロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、プロモーターは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーの、負の制御領域が欠失され、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位が置換された（ＭＮＤ）プロモーターである。一部の実施形態では、ＭＮＤプロモーターは、配列番号７４のポリヌクレオチド配列、または配列番号７４のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２６１】
一部の実施形態では、本明細書に記載の操作された細胞は、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナーゼのＦＫＢＰ−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインポリペプチドである。一部の実施形態では、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドは、配列番号６８もしくは６９のアミノ酸配列、または配列番号６８もしくは６９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２６２】
ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸を含む本明細書に記載の操作された細胞のいずれかに従う一部の実施形態では、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする外来性核酸は、操作された細胞のゲノムに挿入される。一部の実施形態では、外来性核酸は、内在性ＴＲＡ遺伝子に挿入される。一部の実施形態では、外来性核酸は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入される。一部の実施形態では、外来性核酸の挿入は、非機能的なＴＲＡＣドメインを生じさせる結果となる。一部の実施形態では、外来性核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入される。一部の実施形態では、外来性核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入され、したがって、選択可能なマーカーの発現は、１つまたは複数の内在性ＩＬ２ＲＧ調節エレメントの制御下にある。一部の実施形態では、外来性核酸は、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする外来性核酸の部分に作動可能に連結したプロモーターをさらに含み、したがって、操作された細胞におけるラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドの発現は、プロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、プロモーターは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーの、負の制御領域が欠失され、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位が置換された（ＭＮＤ）プロモーターである。一部の実施形態では、ＭＮＤプロモーターは、配列番号７４のポリヌクレオチド配列、または配列番号７４のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２６３】
本明細書に記載の操作された細胞のいずれかに従う一部の実施形態では、操作された細胞は、以下の系成分をコードする核酸を含む：ｉ）抗形質細胞構築物、ｉｉ）ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含む第１のＣＩＳＣ成分、ｉｉｉ）ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチド、ｉｖ）選択可能なマーカー、ｖ）１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチド、およびｖｉ）ＩＬ２Ｒγシグナル伝達ドメインを含む第２のＣＩＳＣ成分。一部の実施形態では、操作された細胞は、第１のコードカセットを含む核酸、および第２のコードカセットを含む核酸を含む。一部の実施形態では、第１のコードカセットは、抗形質細胞構築物をコードする核酸、および第１のＣＩＳＣ成分をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第２のコードカセットは、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、選択可能なマーカーをコードする核酸、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、および第２のＣＩＳＣ成分またはその断片をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、操作された細胞は、第１のコードカセットに作動可能に連結した第１のプロモーターを含む第１のポリシストロン性発現カセットを含む核酸を含み、したがって、第１のポリシストロン性発現カセットの発現は、第１のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、外来性プロモーターであり、操作された細胞は、内在性遺伝子に挿入された第１の外来性核酸を含み、第１の外来性核酸は、第１のポリシストロン性発現カセットの上流に合成ポリＡ配列を含む。一部の実施形態では、外来性プロモーターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターである。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、第１の内在性遺伝子の内在性プロモーターであり、操作された細胞は、第１の内在性遺伝子に挿入された第１の外来性核酸を含み、第１の外来性核酸は、第１のコードカセットの上流に２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第１の内在性遺伝子は、内在性ＴＲＡ遺伝子である。一部の実施形態では、第１の外来性核酸は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入される。一部の実施形態では、第１の外来性核酸の挿入は、非機能的なＴＲＡＣドメインを生じさせる結果となる。一部の実施形態では、操作された細胞は、第２のコードカセットに作動可能に連結した第２のプロモーターを含む第２のポリシストロン性発現カセットを含む核酸を含み、したがって、第２のポリシストロン性発現カセットの発現は、第２のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、外来性プロモーターであり、操作された細胞は、第２の内在性遺伝子に挿入された第２の外来性核酸を含み、第２の外来性核酸は、第２のコードカセットに作動可能に連結した第２のプロモーターを含む。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、ＭＮＤプロモーターである。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子である。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子であり、第��の外来性核酸は、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片を含み、第２の外来性核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入され、したがって、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結され、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片は一緒に第２のＣＩＳＣ成分をコードする。一部の実施形態では、第１のポリシストロン性発現カセットは、配列番号２８〜３９のいずれか１つからの連続するヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、第２のポリシストロン性発現カセットは、配列番号４０〜４３のいずれか１つからの連続するヌクレオチドの配列を含む。
【０２６４】
ポリシストロン性発現カセットを含む本明細書に記載の操作された細胞のいずれかに従う一部の実施形態では、ポリシストロン性発現カセットは、系成分をコードする隣接する核酸の間に２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、ポリシストロン性発現カセットは、系成分をコードする隣接する核酸の各々の間に２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸を含む。例えば、一部の実施形態では、ポリシストロン性発現カセットは、５’から３’の順に、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸、選択可能なマーカーをコードする核酸、２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸、および第２のＣＩＳＣ成分またはその断片をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、２Ａ自己切断ペプチドの各々は、独立して、Ｔ２Ａ自己切断ペプチド、またはＰ２Ａ自己切断ペプチドである。一部の実施形態では、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列、または配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、Ｐ２Ａ自己切断ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列、または配列番号７３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２６５】
本明細書に記載の操作された細胞のいずれかに従う一部の実施形態では、操作された細胞は、以下の系成分をコードする核酸を含む：ｉ）抗形質細胞構築物、ｉｉ）ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含む第１のＣＩＳＣ成分、ｉｉｉ）抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物、ｉｖ）ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチド、ｖ）選択可能なマーカー、ｖｉ）１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチド、およびｖｉｉ）ＩＬ２Ｒγシグナル伝達ドメインを含む第２のＣＩＳＣ成分。一部の実施形態では、操作された細胞は、第１のコードカセットを含む核酸、および第２のコードカセットを含む核酸を含む。一部の実施形態では、第１のコードカセットは、抗形質細胞構築物をコードする核酸、および第１のＣＩＳＣ成分をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第２のコードカセットは、抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物をコードする核酸、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、選択可能なマーカーをコードする核酸、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、および第２のＣＩＳＣ成分またはその断片をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、操作された細胞は、第１のコードカセットに作動可能に連結された第１のプロモーターを含む第１のポリシストロン性発現カセットを含む核酸を含み、したがって、第１のポリシストロン性発現カセットの発現は、第１のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、外来性プロモーターであり、操作された細胞は、内在性遺伝子に挿入された第１の外来性核酸を含み、第１の外来性核酸は、第１のポリシストロン性発現カセットの上流に合成ポリＡ配列を含む。一部の実施形態では、外来性プロモーターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターである。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、第１の内在性遺伝子の内在性プロモーターであり、操作された細胞は、第１の内在性遺伝子に挿入された第１の外来性核酸を含み、第１の外来性核酸は、第１のコードカセットの上流に２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第１の内在性遺伝子は、内在性ＴＲＡ遺伝子である。一部の実施形態では、第１の外来性核酸は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入される。一部の実施形態では、第１の外来性核酸の挿入は、非機能的なＴＲＡＣドメインを生じさせる結果となる。一部の実施形態では、操作された細胞は、第２のコードカセットに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２のポリシストロン性発現カセットを含む核酸を含み、したがって、第２のポリシストロン性発現カセットの発現は、第２のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、外来性プロモーターであり、操作された細胞は、第２の内在性遺伝子に挿入された第２の外来性核酸を含み、第２の外来性核酸は、第２のコードカセットに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、ＭＮＤプロモーターである。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子��ある。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子であり、第２の外来性核酸は、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片を含み、第２の外来性核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入され、したがって、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結され、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片は一緒に第２のＣＩＳＣ成分をコードする。一部の実施形態では、第１のポリシストロン性発現カセットは、配列番号２８〜３９のいずれか１つからの連続するヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、第２のポリシストロン性発現カセットは、配列番号４４からの連続するヌクレオチドの配列を含む。
【０２６６】
本明細書に記載の操作された細胞のいずれかに従う一部の実施形態では、操作された細胞は、以下の系成分をコードする核酸を含む：ｉ）抗形質細胞構築物、ｉｉ）ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含む第１のＣＩＳＣ成分、ｉｉｉ）ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチド、ｉｖ）１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチド、およびｖ）ＩＬ２Ｒγシグナル伝達ドメインを含む第２のＣＩＳＣ成分。一部の実施形態では、操作された細胞は、第１のコードカセットを含む核酸、および第２のコードカセットを含む核酸を含む。一部の実施形態では、第１のコードカセットは、抗形質細胞構築物をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第２のコードカセットは、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、第１のＣＩＳＣ成分をコードする核酸、および第２のＣＩＳＣ成分またはその断片をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、操作された細胞は、第１のコードカセットに作動可能に連結された第１のプロモーターを含む第１のポリシストロン性発現カセットを含む核酸を含み、したがって、第１のポリシストロン性発現カセットの発現は、第１のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、外来性プロモーターであり、操作された細胞は、内在性遺伝子に挿入された第１の外来性核酸を含み、第１の外来性核酸は、第１のポリシストロン性発現カセットの上流に合成ポリＡ配列を含む。一部の実施形態では、外来性プロモーターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターである。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、第１の内在性遺伝子の内在性プロモーターであり、操作された細胞は、第１の内在性遺伝子に挿入された第１の外来性核酸を含み、第１の外来性核酸は、第１のコードカセットの上流に２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第１の内在性遺伝子は、内在性ＴＲＡ遺伝子である。一部の実施形態では、第１の外来性核酸は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入される。一部の実施形態では、第１の外来性核酸の挿入は、非機能的なＴＲＡＣドメインを生じさせる結果となる。一部の実施形態では、操作された細胞は、第２のコードカセットに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２のポリシストロン性発現カセットを含む核酸を含み、したがって、第２のポリシストロン性発現カセットの発現は、第２のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、外来性プロモーターであり、操作された細胞は、第２の内在性遺伝子に挿入された第２の外来性核酸を含み、第２の外来性核酸は、第２のコードカセットに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、ＭＮＤプロモーターである。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子である。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子であり、第２の外来性核酸は、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片を含��、第２の外来性核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入され、したがって、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結され、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片は一緒に第２のＣＩＳＣ成分をコードする。一部の実施形態では、第１のポリシストロン性発現カセットは、配列番号１９〜２４のいずれか１つからの連続するヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、第２のポリシストロン性発現カセットは、配列番号４５からの連続するヌクレオチドの配列を含む。
【０２６７】
本明細書に記載の操作された細胞のいずれかに従う一部の実施形態では、操作された細胞は、以下の系成分をコードする核酸を含む：ｉ）抗形質細胞構築物、ｉｉ）ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含む第１のＣＩＳＣ成分、ｉｉｉ）抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物、ｉｖ）ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチド、ｖ）１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチド、およびｖｉ）ＩＬ２Ｒγシグナル伝達ドメインを含む第２のＣＩＳＣ成分。一部の実施形態では、操作された細胞は、第１のコードカセットを含む核酸、および第２のコードカセットを含む核酸を含む。一部の実施形態では、第１のコードカセットは、抗形質細胞構築物をコードする核酸、および１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第２のコードカセットは、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、第１のＣＩＳＣ成分をコードする核酸、および第２のＣＩＳＣ成分またはその断片をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、操作された細胞は、第１のコードカセットに作動可能に連結された第１のプロモーターを含む第１のポリシストロン性発現カセットを含む核酸を含み、したがって、第１のポリシストロン性発現カセットの発現は、第１のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、外来性プロモーターであり、操作された細胞は、内在性遺伝子に挿入された第１の外来性核酸を含み、第１の外来性核酸は、第１のポリシストロン性発現カセットの上流に合成ポリＡ配列を含む。一部の実施形態では、外来性プロモーターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターである。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、第１の内在性遺伝子の内在性プロモーターであり、操作された細胞は、第１の内在性遺伝子に挿入された第１の外来性核酸を含み、第１の外来性核酸は、第１のコードカセットの上流に２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第１の内在性遺伝子は、内在性ＴＲＡ遺伝子である。一部の実施形態では、第１の外来性核酸は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入される。一部の実施形態では、第１の外来性核酸の挿入は、非機能的なＴＲＡＣドメインを生じさせる結果となる。一部の実施形態では、操作された細胞は、第２のコードカセットに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２のポリシストロン性発現カセットを含む核酸を含み、したがって、第２のポリシストロン性発現カセットの発現は、第２のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、外来性プロモーターであり、操作された細胞は、第２の内在性遺伝子に挿入された第２の外来性核酸を含み、第２の外来性核酸は、第２のコードカセットに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、ＭＮＤプロモーターである。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子である。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子であり、第２の外来性核酸は、第２の��ＩＳＣ成分をコードする核酸の断片を含み、第２の外来性核酸は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入され、したがって、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結され、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片は一緒に第２のＣＩＳＣ成分をコードする。一部の実施形態では、第１のポリシストロン性発現カセットは、配列番号２５〜２７のいずれか１つからの連続するヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、第２のポリシストロン性発現カセットは、配列番号４６からの連続するヌクレオチドの配列を含む。
ゲノムを編集する方法
【０２６８】
一部の実施形態では、細胞のゲノムを編集する、特に、細胞のゲノムを、ｉ）細胞に形質細胞に対する細胞傷害性を付与することができる抗形質細胞構築物、およびｉｉ）二量体化活性化可能な化学誘導シグナル伝達複合体（ＣＩＳＣ）のポリペプチド成分の発現を可能にするように編集する方法であって、シグナル伝達能力を有するＣＩＳＣが、細胞の生存および／または増殖を促進する刺激シグナルをシグナル伝達経路において生じさせることができる、方法が、本明細書で提供される。
【０２６９】
一態様では、細胞のゲノムを編集して操作された細胞を産生する方法であって、細胞に、ａ）本明細書に記載の実施形態のいずれかに従う第１のｇＲＮＡおよび／または第２のｇＲＮＡ；ｂ）本明細書に記載の実施形態のいずれかに従うＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸；ならびにｃ）本明細書に記載の実施形態のいずれかに従う１つまたは複数のドナー鋳型であって、ｉ）操作された細胞に形質細胞に対する細胞傷害性を付与することができる抗形質細胞構築物と、ｉｉ）二量体化活性化可能な化学誘導シグナル伝達複合体（ＣＩＳＣ）のポリペプチド成分とをコードする核酸を含む１つまたは複数のドナー鋳型を提供するステップを含み；シグナル伝達能力を有するＣＩＳＣが、操作された細胞の生存および／または増殖を促進する刺激シグナルをシグナル伝達経路において生じさせることができる、方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、ＣＩＳＣは、第１のＣＩＳＣ成分および第２のＣＩＳＣ成分を含み、第１のＣＩＳＣ成分および第２のＣＩＳＣ成分は、操作された細胞により発現されると、リガンドの存在下で二量体化してシグナル伝達能力を有するＣＩＳＣを作出するように構成されている。一部の実施形態では、操作された細胞は、リガンドの非存在下では生存および／または増殖することができない。一部の実施形態では、操作された細胞は、細胞の生存および／または増殖に関与する内在性シグナル伝達経路に欠陥があり、シグナル伝達能力を有するＣＩＳＣは、欠陥のある内在性シグナル伝達経路を、操作された細胞が生存および／または増殖することができるように補完することができる。一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分は、ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分の第１の細胞外結合ドメインは、ＦＲＢドメインを含む。一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分は、配列番号５４のアミノ酸配列、または配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＣＩＳＣ成分は、ＩＬ２Ｒγシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、第２のＣＩＳＣ成分の第２の細胞外結合ドメインは、ＦＫＢＰドメインを含む。一部の実施形態では、第２のＣＩＳＣ成分は、配列番号５３のアミノ酸配列、または配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、ｉｉｉ）抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物、ｉｖ）選択可能なマーカー、ｖ）１つもしくは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドまたはｖｉｉ）ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドのうちの１つまたは複数をコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、抗形質細胞構築物は、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲである。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、配列番号６０もしくは６１のアミノ酸配列、または配列番号６０もしくは６１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分の第１の細胞外結合ドメインは、ＦＲＢドメインを含む。一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分は、配列番号���４のアミノ酸配列、または配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドは、ＦＲＢドメインポリペプチドである。一部の実施形態では、ＦＲＢドメインポリペプチドは、配列番号６８もしくは６９のアミノ酸配列、または配列番号６８もしくは６９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、選択可能なマーカーは、ｔＬＮＧＦＲポリペプチドである。一部の実施形態では、ｔＬＮＧＦＲポリペプチドは、配列番号６６のアミノ酸配列、または配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドは、突然変異体ＣＮポリペプチドである。一部の実施形態では、突然変異体ＣＮポリペプチドは、ＣＮｂ３０（配列番号６７）である。一部の実施形態では、第２のＣＩＳＣ成分の第２の細胞外結合ドメインは、ＦＫＢＰドメインを含む。一部の実施形態では、第２のＣＩＳＣ成分は、配列番号５３のアミノ酸配列、または配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞などの、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞に分化することができる細胞などの、Ｔ細胞前駆体である。
【０２７０】
本明細書に記載の細胞のゲノムを編集する方法のいずれかに従う一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、以下の系成分をコードする核酸を含む：ｉ）抗形質細胞構築物、ｉｉ）ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含む第１のＣＩＳＣ成分、ｉｉｉ）ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチド、ｉｖ）選択可能なマーカー、ｖ）１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチド、およびｖｉ）ＩＬ２Ｒγシグナル伝達ドメインまたはその断片を含む第２のＣＩＳＣ成分。一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、第１のドナー鋳型および第２のドナー鋳型を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子内に挿入されるように構成され、第２のドナー鋳型は、第２の内在性遺伝子内に挿入されるように構成されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットを含み、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットを含む。一部の実施形態では、第１のコードカセットは、抗形質細胞構築物をコードする核酸、および第１のＣＩＳＣ成分をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第２のコードカセットは、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、選択可能なマーカーをコードする核酸、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、および第２のＣＩＳＣ成分またはその断片をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットに作動可能に連結された第１のプロモーターを含む第１のポリシストロン性発現カセットの上流に合成ポリＡ配列を含み、したがって、第１のポリシストロン性発現カセットの発現は、第１のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターである。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットの上流に２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸を含む第１のポリシストロン性発現カセットの一部分をコードする核酸を含み、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子に挿入されると、第１のポリシストロン性発現カセットの部分が第１の内在性遺伝子の配列に連結され、第１の内在性遺伝子の配列に連結された第１のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第１のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。一部の実施形態では、第１の内在性遺伝子は、内在性ＴＲＡ遺伝子である。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入される。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型の挿入は、非機能的なＴＲＡＣドメインを生じさせる結果となる。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２のポリシストロン性発現カセットまたはその一部分を含み、したがって、第２のポリシストロン性発現カセットの発現は、第２のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、ＭＮＤプロモーターである。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺��子である。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子であり、第２のドナー鋳型は、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片を含む核酸を含む第２のポリシストロン性発現カセットの一部分を含み、第２のドナー鋳型は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入されると、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結され、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が一緒に第２のＣＩＳＣ成分をコードし、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第２のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。第１のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃４〜＃７に示されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号２８〜３９のいずれか１つからの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号１０１〜１０４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型には、ＴＲＡ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第１のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８０および８１、配列番号８２および８３、または配列番号８４および８５のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。第２のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃８に示されている。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号４０〜４３のいずれか１つからの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号１０５のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型には、ＩＬ２ＲＧ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第２のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８６および８７、配列番号８８および８９、または配列番号９０および９１のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のＡＡＶベクターであり、および／または第２のドナー鋳型は、第２のＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２８〜３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号２８〜３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号１０１〜１０４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号１０１〜１０４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４０〜４３のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４３のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１０５のポリヌクレオチド配列、または配列番号１０５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２７１】
本明細書に記載の細胞のゲノムを編集する方法のいずれかに従う一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、以下の系成分をコードする核酸を含む：ｉ）抗形質細胞構築物、ｉｉ）ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含む第１のＣＩＳＣ成分、ｉｉｉ）抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物、ｉｖ）ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチド、ｖ）選択可能なマーカー、ｖｉ）１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチド、およびｖｉｉ）ＩＬ２Ｒγシグナル伝達ドメインまたはその断片を含む第２のＣＩＳＣ成分。一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、第１のドナー鋳型および第２のドナー鋳型を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子内に挿入されるように構成され、第２のドナー鋳型は、第２の内在性遺伝子内に挿入されるように構成されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットを含み、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットを含む。一部の実施形態では、第１のコードカセットは、抗形質細胞構築物をコードする核酸、および第１のＣＩＳＣ成分をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第２のコードカセットは、抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物をコードする核酸、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、選択可能なマーカーをコードする核酸、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、および第２のＣＩＳＣ成分またはその断片をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットに作動可能に連結された第１のプロモーターを含む第１のポリシストロン性発現カセットの上流に合成ポリＡ配列を含み、したがって、第１のポリシストロン性発現カセットの発現は、第１のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターである。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットの上流に２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸を含む第１のポリシストロン性発現カセットの一部分をコードする核酸を含み、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子に挿入されると、第１のポリシストロン性発現カセットの部分が第１の内在性遺伝子の配列に連結され、第１の内在性遺伝子の配列に連結された第１のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第１のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。一部の実施形態では、第１の内在性遺伝子は、内在性ＴＲＡ遺伝子である。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入される。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型の挿入は、非機能的なＴＲＡＣドメインを生じさせる結果となる。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２のポリシストロン性発現カセットまたはその一部分を含み、したがって、第２のポリシストロン性発現カセットの発現は、第２のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、ＭＮＤプロ��ーターである。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子である。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子であり、第２のドナー鋳型は、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片を含む核酸を含む第２のポリシストロン性発現カセットの一部分を含み、第２のドナー鋳型は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入されると、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結され、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が一緒に第２のＣＩＳＣ成分をコードし、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第２のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。第１のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃４〜＃７に示されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号２８〜３９のいずれか１つからの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号１０１〜１０４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型には、ＴＲＡ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第１のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８０および８１、配列番号８２および８３、または配列番号８４および８５のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。第２のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃９に示されている。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号４４からの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号１０６のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型には、ＩＬ２ＲＧ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第２のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８６および８７、配列番号８８および８９、または配列番号９０および９１のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のＡＡＶベクターであり、および／または第２のドナー鋳型は、第２のＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２８〜３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号２８〜３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号１０１〜１０４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号１０１〜１０４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４４のポリヌクレオチド配列、または配列番号４４のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１０６のポリヌクレオチド配列、または配列番号１０６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２７２】
本明細書に記載の細胞のゲノムを編集する方法のいずれかに従う一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、以下の系成分をコードする核酸を含む：ｉ）抗形質細胞構築物、ｉｉ）ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含む第１のＣＩＳＣ成分、ｉｉｉ）ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチド、ｉｖ）１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチド、およびｖ）ＩＬ２Ｒγシグナル伝達ドメインまたはその断片を含む第２のＣＩＳＣ成分。一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、第１のドナー鋳型および第２のドナー鋳型を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子内に挿入されるように構成され、第２のドナー鋳型は、第２の内在性遺伝子内に挿入されるように構成されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットを含み、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットを含む。一部の実施形態では、第１のコードカセットは、抗形質細胞構築物をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第２のコードカセットは、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、第１のＣＩＳＣ成分をコードする核酸、および第２のＣＩＳＣ成分またはその断片をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットに作動可能に連結された第１のプロモーターの上流に合成ポリＡ配列を含み、したがって、抗形質細胞構築物をコードする核酸の発現は、第１のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターである。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコード配列の上流に２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸を含む第１のポリシストロン性発現カセットの一部分をコードする核酸を含み、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子に挿入されると、第１のポリシストロン性発現カセットの部分が第１の内在性遺伝子の配列に連結され、第１の内在性遺伝子の配列に連結された第１のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第１のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。一部の実施形態では、第１の内在性遺伝子は、内在性ＴＲＡ遺伝子である。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入される。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型の挿入は、非機能的なＴＲＡＣドメインを生じさせる結果となる。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２のポリシストロン性発現カセットまたはその一部分を含み、したがって、第２のポリシストロン性発現カセットの発現は、第２のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、ＭＮＤプロモーターである。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子である。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子であり、第２のドナー鋳型は、第２のＣＩ��Ｃ成分をコードする核酸の断片を含む核酸を含む第２のポリシストロン性発現カセットの一部分を含み、第２のドナー鋳型は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入されると、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結され、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が一緒に第２のＣＩＳＣ成分をコードし、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第２のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。第１のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃１および＃２に示されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号１９〜２４のいずれか１つからの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号９８〜９９のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型には、ＴＲＡ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第１のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８０および８１、配列番号８２および８３、または配列番号８４および８５のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。第２のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃１０に示されている。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号４５からの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号１０７のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型には、ＩＬ２ＲＧ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第２のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８６および８７、配列番号８８および８９、または配列番号９０および９１のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のＡＡＶベクターであり、および／または第２のドナー鋳型は、第２のＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号１９〜２４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号１９〜２４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号９８〜９９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号９８〜９９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１０７のポリヌクレオチド配列、または配列番号１０７のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２７３】
本明細書に記載の細胞のゲノムを編集する方法のいずれかに従う一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、以下の系成分をコードする核酸を含む：ｉ）抗形質細胞構築物、ｉｉ）ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含む第１のＣＩＳＣ成分、ｉｉｉ）抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物、ｉｖ）ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチド、ｖ）１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチド、およびｖｉ）ＩＬ２Ｒγシグナル伝達ドメインまたはその断片を含む第２のＣＩＳＣ成分。一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、第１のドナー鋳型および第２のドナー鋳型を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子内に挿入されるように構成され、第２のドナー鋳型は、第２の内在性遺伝子内に挿入されるように構成されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットを含み、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットを含む。一部の実施形態では、第１のコードカセットは、抗形質細胞構築物をコードする核酸、および１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第２のコードカセットは、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、第１のＣＩＳＣ成分をコードする核酸、および第２のＣＩＳＣ成分またはその断片をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットに作動可能に連結された第１のプロモーターを含む第１のポリシストロン性発現カセットの上流に合成ポリＡ配列を含み、したがって、第１のポリシストロン性発現カセットの発現は、第１のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターである。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットの上流に２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸を含む第１のポリシストロン性発現カセットの一部分をコードする核酸を含み、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子に挿入されると、第１のポリシストロン性発現カセットの部分が第１の内在性遺伝子の配列に連結され、第１の内在性遺伝子の配列に連結された第１のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第１のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。一部の実施形態では、第１の内在性遺伝子は、内在性ＴＲＡ遺伝子である。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入される。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型の挿入は、非機能的なＴＲＡＣドメインを生じさせる結果となる。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２のポリシストロン性発現カセットまたはその一部分を含み、したがって、第２のポリシストロン性発現カセットの発現は、第２のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、ＭＮＤプロモーターである。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子である。一部の実施形態では��第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子であり、第２のドナー鋳型は、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片を含む核酸を含む第２のポリシストロン性発現カセットの一部分を含み、第２のドナー鋳型は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入されると、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結され、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が一緒に第２のＣＩＳＣ成分をコードし、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第２のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。第１のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃３に示されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号２５〜２７のいずれか１つからの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号１００のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型には、ＴＲＡ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第１のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８０および８１、配列番号８２および８３、または配列番号８４および８５のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。第２のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃１１に示されている。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号４６からの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号１０８のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型には、ＩＬ２ＲＧ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第２のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８６および８７、配列番号８８および８９、または配列番号９０および９１のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のＡＡＶベクターであり、および／または第２のドナー鋳型は、第２のＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２５〜２７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号２５〜２７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号１００のポリヌクレオチド配列、および配列番号１００のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１０８のポリヌクレオチド配列、または配列番号１０８のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２７４】
本明細書に記載の細胞のゲノムを編集する方法のいずれかに従う一部の実施形態では、方法は、細胞に、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、第１のベクター、および第２のベクターを提供するステップを含み、（Ａ）第１のｇＲＮＡは、配列番号１のポリヌクレオチド配列、または配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のベクターは、配列番号２８、３１、３４および３７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、ならびに配列番号２８、３１、３４および３７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のベクターは、配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；（Ｂ）第１のｇＲＮＡは、配列番号２のポリヌクレオチド配列、または配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のベクターは、配列番号２９、３２、３５および３８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、ならびに配列番号２９、３２、３５および３８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のベクターは、配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；または（Ｃ）第１のｇＲＮＡは、配列番号３のポリヌクレオチド配列、または配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のベクターは、配列番号３０、３３、３６および３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、ならびに配列番号３０、３３、３６および３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のベクターは、配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２７５】
本明細書に記載の細胞のゲノムを編集する方法のいずれかに従う一部の実施形態では、方法は、細胞に、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、第１のベクター、および第２のベクターを提供するステップを含み、（Ａ）第１のｇＲＮＡは、配列番号１のポリヌクレオチド配列、または配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターは、配列番号１９もしくは２２のポリヌクレオチド配列、または配列番号１９もしくは２２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；（Ｂ）第１のｇＲＮＡは、配列番号２のポリヌクレオチド配列、または配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２０もしくは２３のポリヌクレオチド配列、または配列番号２０もしくは２３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；または（Ｃ）第１のｇＲＮＡは、配列番号３のポリヌクレオチド配列、または配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２１もしくは２４のポリヌクレオチド配列、または配列番号２１もしくは２４のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２７６】
本明細書に記載の細胞のゲノムを編集する方法のいずれかに従う一部の実施形態では、方法は、細胞に、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、第１のベクター、および第２のベクターを提供するステップを含み、（Ａ）第１のｇＲＮＡは、配列番号１のポリヌクレオチド配列、または配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２５のポリヌクレオチド配列、または配列番号２５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；（Ｂ）第１のｇＲＮＡは、配列番号２のポリヌクレオチド配列、または配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２６のポリヌクレオチド配列、または配列番号２６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；または（Ｃ）第１のｇＲＮＡは、配列番号３のポリヌクレオチド配列、または配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２７のポリヌクレオチド配列、または配列番号２７のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２７７】
本明細書に記載の細胞のゲノムを編集する方法のいずれかに従う一部の実施形態では、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４およびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはその機能的誘導体からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、ＲＧＥＮをコードする核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）配列である。一部の実施形態では、ＲＧＥＮをコードするＲＮＡ配列は、第１のｇＲＮＡまたは第２のｇＲＮＡに共有結合によって連結されている。一部の実施形態では、ＲＧＥＮは、細胞への提供前に、第１のｇＲＮＡおよび／または第２のｇＲＮＡと事前に複合体化されてＲＮＰ複合体を形成している。一部の実施形態では、ＲＧＥＮは、第１のｇＲＮＡおよび／または第２のｇＲＮＡと、それぞれ１：１〜２０：１の間のｇＲＮＡ対ＲＧＥＮのモル比で事前に複合体化されている。
【０２７８】
本明細書に記載の細胞のゲノムを編集する方法のいずれかに従う一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球またはＣＤ３＋汎Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、複数のドナーに由来するＴ細胞のプールのメンバーである。一部の実施形態では、複数のドナーは、ヒトドナーである。一部の実施形態では、細胞は、形質細胞に対して細胞傷害性である。
処置方法
【０２７９】
一部の実施形態では、疾患または状態の処置を必要とする対象において有害な抗体産生により特徴付けられる疾患または状態を処置する方法であって、１）本明細書に記載の方法のいずれかに従ってＴ細胞のゲノムを編集することによって、操作されたＴ細胞を産生するステップ、および対象に操作されたＴ細胞を投与するステップを含むか、または２）本明細書に記載の方法のいずれかに従って対象のＴ細胞のゲノムを編集することによって、対象において操作されたＴ細胞を産生するステップを含む方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、ａ）のＴ細胞は、対象にとって自己である。一部の実施形態では、ａ）のＴ細胞は、対象にとって同種である。一部の実施形態では、ａ）のＴ細胞は、複数のドナーに由来するＴ細胞のプールを含む。一部の実施形態では、複数のドナーは、ヒトドナーである。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞またはＣＤ３＋汎Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、疾患または状態は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、抗体媒介自己免疫、形質細胞新生物、または軽鎖アミロイドーシスである。一部の実施形態では、形質細胞新生物は、形質細胞性骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）である。一部の実施形態では、疾患または状態はＧｖＨＤであり、対象は臓器移植を以前に受けたことがある。
【０２８０】
本明細書に記載の疾患または状態を処置する方法のいずれかに従う一部の実施形態では、操作されたＴ細胞を産生するためにＴ細胞のゲノムを編集することは、Ｔ細胞に、ａ）本明細書に記載の実施形態のいずれかに従う第１のｇＲＮＡおよび／または第２のｇＲＮＡ；ｂ）本明細書に記載の実施形態のいずれかに従うＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸；ならびにｃ）本明細書に記載の実施形態のいずれかに従う１つまたは複数のドナー鋳型であって、ｉ）操作された細胞に形質細胞に対する細胞傷害性を付与することができる抗形質細胞構築物と、ｉｉ）二量体化活性化可能な化学誘導シグナル伝達複合体（ＣＩＳＣ）のポリペプチド成分とをコードする核酸を含む１つまたは複数のドナー鋳型を提供することを含み；シグナル伝達能力を有するＣＩＳＣは、操作された細胞の生存および／または増殖を促進する刺激シグナルをシグナル伝達経路において生じさせることができる。一部の実施形態では、ＣＩＳＣは、第１のＣＩＳＣ成分および第２のＣＩＳＣ成分を含み、第１のＣＩＳＣ成分および第２のＣＩＳＣ成分は、操作された細胞により発現されると、リガンドの存在下で二量体化してシグナル伝達能力を有するＣＩＳＣを作出するように構成されている。一部の実施形態では、操作された細胞は、リガンドの非存在下では生存および／または増殖することができない。一部の実施形態では、操作された細胞は、細胞の生存および／または増殖に関与する内在性シグナル伝達経路に欠陥があり、シグナル伝達能力を有するＣＩＳＣは、欠陥のある内在性シグナル伝達経路を、操作された細胞が生存および／または増殖することができるように補完することができる。一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分は、ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分の第１の細胞外結合ドメインは、ＦＲＢドメインを含む。一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分は、配列番号５４のアミノ酸配列、または配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＣＩＳＣ成分は、ＩＬ２Ｒγシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、第２のＣＩＳＣ成分の第２の細胞外結合ドメインは、ＦＫＢＰドメインを含む。一部の実施形態では、第２のＣＩＳＣ成分は、配列番号５３のアミノ酸配列、または配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、抗形質細胞構築物は、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲである。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、配列番号６０もしくは６１のアミノ酸配列、または配列番号６０もしくは６１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、ｉｉｉ）抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物、ｉｖ）選択可能なマーカー、ｖ）１つもしくは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドまたはｖｉ）ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチド、のうちの１つまたは複数をコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドは、ＦＲＢドメインポリペプチドであ���。一部の実施形態では、ＦＲＢドメインポリペプチドは、配列番号６８もしくは６９のアミノ酸配列、または配列番号６８もしくは６９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、選択可能なマーカーは、ｔＬＮＧＦＲポリペプチドである。一部の実施形態では、ｔＬＮＧＦＲポリペプチドは、配列番号６６のアミノ酸配列、または配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドは、突然変異体ＣＮポリペプチドである。一部の実施形態では、突然変異体ＣＮポリペプチドは、ＣＮｂ３０（配列番号６７）である。
【０２８１】
本明細書に記載の疾患または状態を処置する方法のいずれかに従う一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、以下の系成分をコードする核酸を含む：ｉ）抗形質細胞構築物、ｉｉ）ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含む第１のＣＩＳＣ成分、ｉｉｉ）ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチド、ｉｖ）選択可能なマーカー、ｖ）１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチド、およびｖｉ）ＩＬ２Ｒγシグナル伝達ドメインまたはその断片を含む第２のＣＩＳＣ成分。一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、第１のドナー鋳型および第２のドナー鋳型を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子内に挿入されるように構成され、第２のドナー鋳型は、第２の内在性遺伝子内に挿入されるように構成されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットを含み、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットを含む。一部の実施形態では、第１のコードカセットは、抗形質細胞構築物をコードする核酸、および第１のＣＩＳＣ成分をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第２のコードカセットは、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、選択可能なマーカーをコードする核酸、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、および第２のＣＩＳＣ成分またはその断片をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットに作動可能に連結された第１のプロモーターを含む第１のポリシストロン性発現カセットの上流に合成ポリＡ配列を含み、したがって、第１のポリシストロン性発現カセットの発現は、第１のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターである。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットの上流に２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸を含む第１のポリシストロン性発現カセットの一部分をコードする核酸を含み、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子に挿入されると、第１のポリシストロン性発現カセットの部分が第１の内在性遺伝子の配列に連結され、第１の内在性遺伝子の配列に連結された第１のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第１のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。一部の実施形態では、第１の内在性遺伝子は、内在性ＴＲＡ遺伝子である。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入される。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型の挿入は、非機能的なＴＲＡＣドメインを生じさせる結果となる。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２のポリシストロン性発現カセットまたはその一部分を含み、したがって、第２のポリシストロン性発現カセットの発現は、第２のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、ＭＮＤプロモーターである。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ��伝子である。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子であり、第２のドナー鋳型は、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片を含む核酸を含む第２のポリシストロン性発現カセットの一部分を含み、第２のドナー鋳型は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入されると、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結され、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が一緒に第２のＣＩＳＣ成分をコードし、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第２のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。第１のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃４〜＃７に示されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号２８〜３９のいずれか１つからの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号１０１〜１０４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型には、ＴＲＡ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第１のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８０および８１、配列番号８２および８３、または配列番号８４および８５のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。第２のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃８に示されている。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号４０〜４３のいずれか１つからの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号１０５のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型には、ＩＬ２ＲＧ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第２のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８６および８７、配列番号８８および８９、または配列番号９０および９１のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のＡＡＶベクターであり、および／または第２のドナー鋳型は、第２のＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２８〜３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号２８〜３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号１０１〜１０４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号１０１〜１０４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４０〜４３のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４３のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１０５のポリヌクレオチド配列、または配列番号１０５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２８２】
本明細書に記載の疾患または状態を処置する方法のいずれかに従う一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、以下の系成分をコードする核酸を含む：ｉ）抗形質細胞構築物、ｉｉ）ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含む第１のＣＩＳＣ成分、ｉｉｉ）抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物、ｉｖ）ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチド、ｖ）選択可能なマーカー、ｖｉ）１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチド、およびｖｉｉ）ＩＬ２Ｒγシグナル伝達ドメインまたはその断片を含む第２のＣＩＳＣ成分。一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、第１のドナー鋳型および第２のドナー鋳型を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子内に挿入されるように構成され、第２のドナー鋳型は、第２の内在性遺伝子内に挿入されるように構成されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットを含み、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットを含む。一部の実施形態では、第１のコードカセットは、抗形質細胞構築物をコードする核酸、および第１のＣＩＳＣ成分をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第２のコードカセットは、抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物をコードする核酸、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、選択可能なマーカーをコードする核酸、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、および第２のＣＩＳＣ成分またはその断片をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットに作動可能に連結された第１のプロモーターを含む第１のポリシストロン性発現カセットの上流に合成ポリＡ配列を含み、したがって、第１のポリシストロン性発現カセットの発現は、第１のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターである。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットの上流に２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸を含む第１のポリシストロン性発現カセットの一部分をコードする核酸を含み、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子に挿入されると、第１のポリシストロン性発現カセットの部分が第１の内在性遺伝子の配列に連結され、第１の内在性遺伝子の配列に連結された第１のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第１のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。一部の実施形態では、第１の内在性遺伝子は、内在性ＴＲＡ遺伝子である。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入される。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型の挿入は、非機能的なＴＲＡＣドメインを生じさせる結果となる。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２のポリシストロン性発現カセットまたはその一部分を含み、したがって、第２のポリシストロン性発現カセットの発現は、第２のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、ＭＮＤプ��モーターである。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子である。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子であり、第２のドナー鋳型は、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片を含む核酸を含む第２のポリシストロン性発現カセットの一部分を含み、第２のドナー鋳型は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入されると、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結され、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が一緒に第２のＣＩＳＣ成分をコードし、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第２のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。第１のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃４〜＃７に示されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号２８〜３９のいずれか１つからの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号１０１〜１０４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型には、ＴＲＡ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第１のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８０および８１、配列番号８２および８３、または配列番号８４および８５のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。第２のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃９に示されている。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号４４からの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号１０６のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型には、ＩＬ２ＲＧ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第２のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８６および８７、配列番号８８および８９、または配列番号９０および９１のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のＡＡＶベクターであり、および／または第２のドナー鋳型は、第２のＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２８〜３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号２８〜３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号１０１〜１０４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号１０１〜１０４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４４のポリヌクレオチド配列、または配列番号４４のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１０６のポリヌクレオチド配列、または配列番号１０６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２８３】
本明細書に記載の疾患または状態を処置する方法のいずれかに従う一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、以下の系成分をコードする核酸を含む：ｉ）抗形質細胞構築物、ｉｉ）ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含む第１のＣＩＳＣ成分、ｉｉｉ）ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチド、ｉｖ）１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチド、およびｖ）ＩＬ２Ｒγシグナル伝達ドメインまたはその断片を含む第２のＣＩＳＣ成分。一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、第１のドナー鋳型および第２のドナー鋳型を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子内に挿入されるように構成され、第２のドナー鋳型は、第２の内在性遺伝子内に挿入されるように構成されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットを含み、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットを含む。一部の実施形態では、第１のコードカセットは、抗形質細胞構築物をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第２のコードカセットは、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、第１のＣＩＳＣ成分をコードする核酸、および第２のＣＩＳＣ成分またはその断片をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットに作動可能に連結された第１のプロモーターの上流に合成ポリＡ配列を含み、したがって、抗形質細胞構築物をコードする核酸の発現は、第１のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターである。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコード配列の上流に２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸を含む第１のポリシストロン性発現カセットの一部分をコードする核酸を含み、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子に挿入されると、第１のポリシストロン性発現カセットの部分が第１の内在性遺伝子の配列に連結され、第１の内在性遺伝子の配列に連結された第１のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第１のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。一部の実施形態では、第１の内在性遺伝子は、内在性ＴＲＡ遺伝子である。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入される。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型の挿入は、非機能的なＴＲＡＣドメインを生じさせる結果となる。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２のポリシストロン性発現カセットまたはその一部分を含み、したがって、第２のポリシストロン性発現カセットの発現は、第２のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、ＭＮＤプロモーターである。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子である。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子であり、第２のドナー鋳型は、第２のＣ��ＳＣ成分をコードする核酸の断片を含む核酸を含む第２のポリシストロン性発現カセットの一部分を含み、第２のドナー鋳型は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入されると、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結され、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が一緒に第２のＣＩＳＣ成分をコードし、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第２のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。第１のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃１および＃２に示されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号１９〜２４のいずれか１つからの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号９８〜９９のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型には、ＴＲＡ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第１のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８０および８１、配列番号８２および８３、または配列番号８４および８５のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。第２のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃１０に示されている。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号４５からの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号１０７のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型には、ＩＬ２ＲＧ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第２のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８６および８７、配列番号８８および８９、または配列番号９０および９１のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のＡＡＶベクターであり、および／または第２のドナー鋳型は、第２のＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号１９〜２４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号１９〜２４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号９８〜９９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号９８〜９９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１０７のポリヌクレオチド配列、または配列番号１０７のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２８４】
本明細書に記載の疾患または状態を処置する方法のいずれかに従う一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、以下の系成分をコードする核酸を含む：ｉ）抗形質細胞構築物、ｉｉ）ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含む第１のＣＩＳＣ成分、ｉｉｉ）抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物、ｉｖ）ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチド、ｖ）１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチド、およびｖｉ）ＩＬ２Ｒγシグナル伝達ドメインまたはその断片を含む第２のＣＩＳＣ成分。一部の実施形態では、１つまたは複数のドナー鋳型は、第１のドナー鋳型および第２のドナー鋳型を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子内に挿入されるように構成され、第２のドナー鋳型は、第２の内在性遺伝子内に挿入されるように構成されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットを含み、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットを含む。一部の実施形態では、第１のコードカセットは、抗形質細胞構築物をコードする核酸、および１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第２のコードカセットは、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸、第１のＣＩＳＣ成分をコードする核酸、および第２のＣＩＳＣ成分またはその断片をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットに作動可能に連結された第１のプロモーターを含む第１のポリシストロン性発現カセットの上流に合成ポリＡ配列を含み、したがって、第１のポリシストロン性発現カセットの発現は、第１のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターである。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のコードカセットの上流に２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸を含む第１のポリシストロン性発現カセットの一部分をコードする核酸を含み、第１のドナー鋳型は、第１の内在性遺伝子に挿入されると、第１のポリシストロン性発現カセットの部分が第１の内在性遺伝子の配列に連結され、第１の内在性遺伝子の配列に連結された第１のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第１のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。一部の実施形態では、第１の内在性遺伝子は、内在性ＴＲＡ遺伝子である。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、ＴＲＡＣドメインをコードする内在性ＴＲＡ遺伝子の領域に挿入される。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型の挿入は、非機能的なＴＲＡＣドメインを生じさせる結果となる。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、第２のコードカセットに作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２のポリシストロン性発現カセットまたはその一部分を含み、したがって、第２のポリシストロン性発現カセットの発現は、第２のプロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、ＭＮＤプロモーターである。一部の実施形態では、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子である。一部の実施形態で��、第２の内在性遺伝子は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子であり、第２のドナー鋳型は、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片を含む核酸を含む第２のポリシストロン性発現カセットの一部分を含み、第２のドナー鋳型は、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に挿入されると、第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結され、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のＣＩＳＣ成分をコードする核酸の断片が一緒に第２のＣＩＳＣ成分をコードし、内在性ＩＬ２ＲＧ遺伝子配列に連結された第２のポリシストロン性発現カセットの部分が一緒に第２のポリシストロン性発現カセットを構成するように構成されている。第１のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃３に示されている。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号２５〜２７のいずれか１つからの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、配列番号１００のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型には、ＴＲＡ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第１のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８０および８１、配列番号８２および８３、または配列番号８４および８５のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。第２のドナー鋳型の例示的な構成は、図１、ドナー鋳型構築物＃１１に示されている。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号４６からの連続するヌクレオチドの配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第２のドナー鋳型は、配列番号１０８のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第２のドナー鋳型には、ＩＬ２ＲＧ遺伝子内の配列に対応する相同アームが隣接している。第２のドナー鋳型の例示的な相同アームは、配列番号８６および８７、配列番号８８および８９、または配列番号９０および９１のポリヌクレオチド配列を有する相同アームを含む。一部の実施形態では、第１のドナー鋳型は、第１のＡＡＶベクターであり、および／または第２のドナー鋳型は、第２のＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２５〜２７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号２５〜２７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１のＡＡＶベクターは、配列番号１００のポリヌクレオチド配列、および配列番号１００のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶベクターは、配列番号１０８のポリヌクレオチド配列、または配列番号１０８のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２８５】
本明細書に記載の疾患または状態を処置する方法のいずれかに従う一部の実施形態では、方法は、細胞に、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、第１のベクター、および第２のベクターを提供するステップを含み、（Ａ）第１のｇＲＮＡは、配列番号１のポリヌクレオチド配列、または配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のベクターは、配列番号２８、３１、３４および３７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、ならびに配列番号２８、３１、３４および３７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のベクターは、配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；（Ｂ）第１のｇＲＮＡは、配列番号２のポリヌクレオチド配列、または配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のベクターは、配列番号２９、３２、３５および３８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、ならびに配列番号２９、３２、３５および３８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のベクターは、配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；または（Ｃ）第１のｇＲＮＡは、配列番号３のポリヌクレオチド配列、または配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のベクターは、配列番号３０、３３、３６および３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、ならびに配列番号３０、３３、３６および３９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のベクターは、配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号４０〜４４のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２８６】
本明細書に記載の疾患または状態を処置する方法のいずれかに従う一部の実施形態では、方法は、細胞に、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、第１のベクター、および第２のベクターを提供するステップを含み、（Ａ）第１のｇＲＮＡは、配列番号１のポリヌクレオチド配列、または配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターは、配列番号１９もしくは２２のポリヌクレオチド配列、または配列番号１９もしくは２２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；（Ｂ）第１のｇＲＮＡは、配列番号２のポリヌクレオチド配列、または配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２０もしくは２３のポリヌクレオチド配列、または配列番号２０もしくは２３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；または（Ｃ）第１のｇＲＮＡは、配列番号３のポリヌクレオチド配列、または配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２１もしくは２４のポリヌクレオチド配列、または配列番号２１もしくは２４のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４５のポリヌクレオチド配列、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２８７】
本明細書に記載の疾患または状態を処置する方法のいずれかに従う一部の実施形態では、方法は、細胞に、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、ＲＧＥＮまたはＲＧＥＮをコードする核酸、第１のベクター、および第２のベクターを提供するステップを含み、（Ａ）第１のｇＲＮＡは、配列番号１のポリヌクレオチド配列、または配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２５のポリヌクレオチド配列、または配列番号２５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；（Ｂ）第１のｇＲＮＡは、配列番号２のポリヌクレオチド配列、または配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２６のポリヌクレオチド配列、または配列番号２６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含むか；または（Ｃ）第１のｇＲＮＡは、配列番号３のポリヌクレオチド配列、または配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第１のＡＡＶベクターは、配列番号２７のポリヌクレオチド配列、または配列番号２７のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、および配列番号４〜１８のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含み、第２のＡＡＶベクターは、配列番号４６のポリヌクレオチド配列、または配列番号４６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
【０２８８】
本明細書に記載の疾患または状態を処置する方法のいずれかに従う一部の実施形態では、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４およびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはその機能的誘導体からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＲＧＥＮは、Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、ＲＧＥＮをコードする核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）配列である。一部の実施形態では、ＲＧＥＮをコードするＲＮＡ配列は、第１のｇＲＮＡまたは第２のｇＲＮＡに共有結合によって連結されている。一部の実施形態では、ＲＧＥＮは、細胞への提供前に、第１のｇＲＮＡおよび／または第２のｇＲＮＡと事前に複合体化されてＲＮＰ複合体を形成している。一部の実施形態では、ＲＧＥＮは、第１のｇＲＮＡおよび／または第２のｇＲＮＡと、それぞれ１：１〜２０：１の間のｇＲＮＡ対ＲＧＥＮのモル比で事前に複合体化されている。
【０２８９】
本明細書に記載の疾患または状態を処置する方法のいずれかに従う一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球またはＣＤ３＋汎Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、複数のドナーに由来するＴ細胞のプールのメンバーである。一部の実施形態では、複数のドナーは、ヒトドナーである。一部の実施形態では、細胞は、形質細胞に対して細胞傷害性である。
【０２９０】
一部の実施形態では、本明細書に記載の疾患または状態を処置する方法は、対象にラパマイシンまたはラパログを投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ラパログは、エベロリムス、ＣＣＩ−７７９、Ｃ２０−メタリルラパマイシン、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン、Ｃ１６−ｉＲａｐ、ＡＰ２１９６７、ミコフェノール酸ナトリウム、ベニジピン塩酸塩、ＡＰ１９０３もしくはＡＰ２３５７３、またはそれらの代謝物、誘導体および／もしくは組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、ラパマイシンまたはラパログは、０．０５ｎＭ〜１００ｎＭの濃度で投与される。
【０２９１】
別の態様では、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、または自己免疫疾患、または有害な抗体産生により特徴付けられる疾患もしくは状態の処置における使用のための、本明細書に記載の実施形態のいずれかに従う操作されたＴ細胞が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、抗体媒介自己免疫疾患である。一部の実施形態では、疾患または状態は、軽鎖アミロイドーシスである。
【０２９２】
別の態様では、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、または自己免疫疾患、または有害な抗体産生により特徴付けられる疾患もしくは状態の処置のための医薬の製造における使用のための、本明細書に記載の実施形態のいずれかに従う操作されたＴ細胞が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、抗体媒介自己免疫疾患である。一部の実施形態では、疾患または状態は、軽鎖アミロイドーシスである。
【０２９３】
別の態様では、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、または自己免疫疾患、または有害な抗体産生により特徴付けられる疾患もしくは状態の処置における使用のための、本明細書に記載の実施形態のいずれかに従う系が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、抗体媒介自己免疫疾患である。一部の実施形態では、疾患または状態は、軽鎖アミロイドーシスである。
【０２９４】
別の態様では、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、または自己免疫疾患、または有害な抗体産生により特徴付けられる疾患もしくは状態の処置のための医薬の製造における使用のための、本明細書に記載の実施形態のいずれかに従う系が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、抗体媒介自己免疫疾患である。一部の実施形態では、疾患または状態は、軽鎖アミロイドーシスである。
【０２９５】
別の態様では、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、または自己免疫疾患、または有害な抗体産生により特徴付けられる疾患もしくは状態の処置における使用のための、本明細書に記載の実施形態のいずれかに従う１つもしくは複数のｇＲＮＡ、１つもしくは複数のドナー鋳型、キット、注射器、および／またはカテーテルが、本明細書で提供される。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、抗体媒介自己免疫疾患である。一部の実施形態では、疾患または状態は、軽鎖アミロイドーシスである。
【０２９６】
別の態様では、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、または自己免疫疾患、または有害な抗体産生により特徴付けられる疾患もしくは状態の処置のための医薬の製造における使用のための、本明細書に記載の実施形態のいずれかに従う１つもしくは複数のｇＲＮＡ、１つもしくは複数のドナー鋳型、キット、注射器、および／またはカテーテルが、本明細書で提供される。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、抗体媒介自己免疫疾患である。一部の実施形態では、疾患または状態は、軽鎖アミロイドーシスである。
組成物
【０２９７】
本開示において示す通りに調製した遺伝子改変細胞、例として、哺乳動物細胞を含む組成物が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、細胞、例として、哺乳動物細胞は、本明細書の実施形態で説明するタンパク質配列を含む。一部の実施形態では、組成物は、細胞外結合ドメインと、ヒンジドメインと、膜貫通ドメインと、シグナル伝達ドメインとを含むＣＩＳＣを有するＴ細胞を含む。一部の実施形態では、ＣＩＳＣは、ＩＬ２Ｒ−ＣＩＳＣである。他の実施形態では、組成物は、細胞外結合ドメインと、ヒンジドメインと、膜貫通ドメインと、シグナル伝達ドメインとを含むＣＩＳＣを有するＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞、例として、哺乳動物細胞、調製物をさらに含む。一部の実施形態では、ＣＩＳＣ成分は、リガンド（例えば、ラパマイシンまたはラパログ）の存在下で二量体化し、これは、同時に、または逐次的に起こり得る。一部の実施形態では、これらの集団の各々を、互いに、または他の細胞種と組み合わせて、組成物を用意してもよい。
【０２９８】
一部の実施形態では、組成物の細胞は、ＣＤ８＋細胞である。ＣＤ８＋細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球細胞、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、中枢メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはバルクＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。一部の実施形態では、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球細胞は、中枢メモリーＴ細胞であり、中枢メモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。さらに他の実施形態では、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球細胞は、中枢メモリーＴ細胞である。
【０２９９】
一部の実施形態では、組成物は、Ｔ細胞前駆体を含む。一部の実施形態では、組成物は、造血幹細胞を含む。一部の実施形態では、組成物は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、中枢メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球細胞である宿主細胞と、Ｔ前駆細胞である第２の宿主細胞とを含む。一部の実施形態では、Ｔ前駆細胞は、造血幹細胞である。
【０３００】
一部の組成物では、細胞は、ＮＫ細胞である。
【０３０１】
一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ８＋である。一部の実施形態では、細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、中枢メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ前駆細胞である。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は、造血幹細胞またはＮＫ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、キメラ抗原受容体をさらに含む。
【０３０２】
また、本明細書で提供および説明される細胞、発現ベクターおよびタンパク質配列を含むキットおよび系が本明細書で提供される。したがって、例えば、本明細書で説明するタンパク質配列；本明細書で説明する発現ベクター；および／または本明細書で説明する細胞のうちの１つまたは複数を含むキットが本明細書で提供される。また、細胞の内部へのシグナルの選択的活性化のための系であって、本明細書で説明する細胞を含み、細胞が、本明細書で説明するタンパク質配列をコードする核酸を含む本明細書で説明する発現ベクターを含む、系が提供される。
二量体ＣＩＳＣ成分を発現する細胞を作製する方法
【０３０３】
本明細書で説明する一部の実施形態では、タンパク質配列または発現ベクターを宿主細胞、例として、哺乳動物細胞、例えば、リンパ球に導入して、二量体ＣＩＳＣ成分を発現する細胞の薬物により調節されたサイトカインシグナル伝達のため、および／または選択的拡張のために使用することが所望され得る。例えば、二量体ＣＩＳＣは、導入されたＣＩＳＣ成分を有する細胞において、リガンドとの接触に際して、シグナルを細胞、例として、哺乳動物細胞の内部へ伝達するためのサイトカインシグナル伝達を可能にし得る。加えて、細胞、例として、哺乳動物細胞の選択的拡張は、本明細書で説明する通り、２つの特異的遺伝的改変事象を経験した細胞のみを選択するように制御され得る。これらの細胞の調製は、本開示に基づいて当業者に明らかである公知の技術に従って行われ得る。
【０３０４】
一部の実施形態では、ＣＩＳＣ所有細胞、例として、哺乳動物細胞を作製する方法であって、細胞が、二量体ＣＩＳＣを発現する、方法が提供される。方法は、実施形態または本明細書で説明する実施形態のいずれか１つのタンパク質配列、または実施形態または本明細書で説明する実施形態の発現ベクターを細胞、例として、哺乳動物細胞に送達するステップと、細胞、例として、哺乳動物細胞に送達するステップとを含み得る。一部の実施形態では、タンパク質配列は、第１および第２の配列を含む。一部の実施形態では、第１の配列は、第１の細胞外結合ドメインと、ヒンジドメインと、特定された長さのリンカーであって、長さが必要に応じて最適化される、リンカーと、膜貫通ドメインと、シグナル伝達ドメインとを含む第１のＣＩＳＣ成分をコードする。一部の実施形態では、第２の配列は、第２の細胞外結合ドメインと、ヒンジドメインと、特定された長さのリンカーであって、長さが必要に応じて最適化される、リンカーと、膜貫通ドメインと、シグナル伝達ドメインとを含む第２のＣＩＳＣ成分をコードする。一部の実施形態では、スペーサーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸の長さ、または上記に挙げる長さのうちの任意の２つによって規定される範囲内の長さである。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、インターロイキン−２シグナル伝達ドメイン、例として、ＩＬ２ＲＢまたはＩＬ２ＲＧドメインを含む。一部の実施形態では、細胞外結合ドメインは、ＦＫＢＰもしくはＦＲＢまたはその部分を含む、ラパマイシンまたはラパログに結合する結合ドメインである。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ８＋細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、中枢メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ前駆細胞である。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は、造血幹細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＮＫ細胞である。
細胞の内部においてシグナルを活性化する方法
【０３０５】
一部の実施形態では、本明細書で説明する方法は、細胞、例として、哺乳動物細胞の内部においてシグナルを活性化するステップを用いる。方法は、本明細書で説明する細胞、例として、哺乳動物細胞を用意するステップであって、細胞が、本明細書で示すタンパク質配列または本明細書で示す発現ベクターを含む、ステップを含み得る。一部の実施形態では、方法は、本明細書で説明する二量体ＣＩＳＣをコードするタンパク質配列を発現するステップ、または本明細書で説明するベクターの発現をさらに含む。一部の実施形態では、方法は、細胞、例として、哺乳動物細胞を、第１および第２のＣＩＳＣ成分を二量体化させ、シグナルを細胞の内部へ伝達するリガンドと接触させるステップを含む。一部の実施形態では、リガンドは、ラパマイシンまたはラパログである。一部の実施形態では、二量体化を誘導するための有効量のリガンドは、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００ｎＭの量、または上記に挙げる値のうちの任意の２つによって規定される範囲内の濃度で提供される。
【０３０６】
一部の実施形態では、これらの手法で使用されるリガンドは、例えば、エベロリムス、ＣＣＩ−７７９、Ｃ２０−メタリルラパマイシン、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン、Ｃ１６−ｉＲａｐ、ＡＰ２１９６７、ミコフェノール酸ナトリウム、ベニジピン塩酸塩、ＡＰ２３５７３もしくはＡＰ１９０３、またはそれらの代謝物、誘導体および／もしくは組合せを含む、ラパマイシンまたはラパログである。追加の有用なラパログは、例えば、ラパマイシンと比較して以下の改変：Ｃ７、Ｃ４２および／もしくはＣ２９におけるメトキシの脱メチル化、除去もしくは置換；Ｃ１３、Ｃ４３および／もしくはＣ２８におけるヒドロキシの除去、誘導体化もしくは置換；Ｃ１４、Ｃ２４および／もしくはＣ３０におけるケトンの還元、除去もしくは誘導体化；６員ピペコリン酸環の５員プロリル環による置換；ならびに／またはシクロヘキシル環の代替の置換もしくはシクロヘキシル環の置換されたシクロペンチル環による置換のうちの１つまたは複数を有するラパマイシンのバリアントを含み得る。追加の有用なラパログは、ノボリムス、ピメクロリムス、リダフォロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムスもしくはゾタロリムス、またはそれらの代謝物、誘導体および／もしくは組合せを含み得る。
【０３０７】
一部の実施形態では、細胞、例として、哺乳動物細胞の内部においてシグナルを検出することは、シグナル伝達経路の結果であるマーカーを検出する方法によって達成され得る。したがって、例えば、シグナルは、ウェスタンブロット、フローサイトメトリーまたは他のタンパク質検出および定量法のプロセスを通して、細胞、例として、哺乳動物細胞においてＡｋｔまたは他のシグナル伝達マーカーのレベルを決定することによって検出され得る。検出のためのマーカーは、例えば、ＪＡＫ、Ａｋｔ、ＳＴＡＴ、ＮＦ−κ、ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ、ＪＮＫ、ＥＲＫもしくはＲａｓ、または細胞シグナル伝達事象を示す他の細胞シグナル伝達マーカーを含み得る。
【０３０８】
一部の実施形態では、シグナルの伝達は、サイトカインシグナル伝達に影響を及ぼす。一部の実施形態では、シグナルの伝達は、ＩＬ２Ｒシグナル伝達に影響を及ぼす。一部の実施形態では、シグナルの伝達は、サイトカイン受容体の下流の標的のリン酸化に影響を及ぼす。一部の実施形態では、シグナルを活性化する方法は、ＣＩＳＣ発現細胞、例として、哺乳動物細胞における増殖、および非ＣＩＳＣ発現細胞における同時の抗増殖を誘導する。
【０３０９】
細胞シグナル伝達が起こるためには、サイトカイン受容体が二量体化するか、またはヘテロ二量体化しなければならないのみでなく、それらは、コンフォメーション変化が起こるために適切な配置で存在しなければならない（Kim,  M.  J.  et  al.  (2007).  J.  Biol.  Chem.,  282(19):14253-14261）。したがって、受容体の二量体化またはヘテロ二量体化単独では、受容体活性化を駆動するために不十分であるので、シグナル伝達ドメインの正しいコンフォメーションの位置付けを伴う二量体化が、適切なシグナル伝達のための所望のプロセスである。本明細書で説明する化学誘導シグナル伝達複合体は一般的に、下流のシグナル伝達事象が起こるために正しい方向で存在する。
細胞集団の選択的拡張の方法
【０３１０】
一部の実施形態では、本明細書で説明する方法は、細胞、例として、哺乳動物細胞の集団を選択的に拡張するステップを用いる。一部の実施形態では、方法は、本明細書で説明する細胞、例として、哺乳動物細胞を用意するステップであって、細胞が、本明細書で示すタンパク質配列または本明細書で示す発現ベクターを含む、ステップを含む。一部の実施形態では、方法は、本明細書で説明する二量体ＣＩＳＣをコードするタンパク質配列を発現するステップ、または本明細書で説明するベクターの発現をさらに含む。一部の実施形態では、方法は、細胞、例として、哺乳動物細胞を、第１および第２のＣＩＳＣ成分を二量体化させ、シグナルを細胞の内部へ伝達するリガンドと接触させるステップを含む。一部の実施形態では、リガンドは、ラパマイシンまたはラパログである。一部の実施形態では、二量体化を誘導するために提供されるリガンドの有効量は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００ｎＭの量、または上記に挙げる値のうちの任意の２つによって規定される範囲内の濃度である。一部の実施形態では、リガンドがラパログである場合、二量体化を誘導するために提供されるリガンドの有効量は、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１０００ｎＭもしくはそれよりも多い量、または上記に挙げる値のうちの任意の２つによって規定される範囲内の濃度である。
【０３１１】
一部の実施形態では、使用されるリガンドは、例えば、エベロリムス、ＣＣＩ−７７９、Ｃ２０−メタリルラパマイシン、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン、Ｃ１６−ｉＲａｐ、ＡＰ２１９６７、ミコフェノール酸ナトリウム、ベニジピン塩酸塩もしくはＡＰ２３５７３、ＡＰ１９０３、またはそれらの代謝物、誘導体および／もしくは組合せを含む、ラパマイシンまたはラパログである。追加の有用なラパログは、例えば、ラパマイシンと比較して以下の改変：Ｃ７、Ｃ４２および／もしくはＣ２９におけるメトキシの脱メチル化、除去もしくは置換；Ｃ１３、Ｃ４３および／もしくはＣ２８におけるヒドロキシの除去、誘導体化もしくは置換；Ｃ１４、Ｃ２４および／もしくはＣ３０におけるケトンの還元、除去もしくは誘導体化；６員ピペコリン酸環の５員プロリル環による置換；ならびに／またはシクロヘキシル環の代替の置換もしくはシクロヘキシル環の置換されたシクロペンチル環による置換のうちの１つまたは複数を有するラパマイシンのバリアントを含み得る。追加の有用なラパログは、ノボリムス、ピメクロリムス、リダフォロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムスもしくはゾタロリムス、またはそれらの代謝物、誘導体および／もしくは組合せを含み得る。
【０３１２】
一部の実施形態では、細胞、例として、哺乳動物細胞の集団の選択的拡張は、２つの別個の遺伝的改変事象が起こった場合のみ起こる。１つの遺伝的改変事象は、化学誘導二量体シグナル伝達複合体の１つの成分であり、他の遺伝的改変事象は、化学誘導二量体シグナル伝達複合体の他の成分である。両方の事象が、細胞集団、例として、哺乳動物細胞集団内で起こる場合、化学誘導シグナル伝達複合体成分は、リガンドの存在下で二量体化し、活性化学誘導シグナル伝達複合体およびシグナルの細胞の内部への生成をもたらす。
核酸
ゲノムターゲティング核酸またはガイドＲＮＡ
【０３１３】
本開示は、会合したポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチドまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ）の活性を標的核酸内の特定の標的配列に方向付け得るゲノムターゲティング核酸を提供する。一部の実施形態では、ゲノムターゲティング核酸は、ＲＮＡである。ゲノムターゲティングＲＮＡは、本明細書で「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と呼ばれる。ガイドＲＮＡは、目的の標的核酸配列およびＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリダイズする少なくとも１つのスペーサー配列を有する。ＩＩ型系では、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも有する。ＩＩ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、互いにハイブリダイズして、二重鎖を形成する。Ｖ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ｃｒＲＮＡは、二重鎖を形成する。両方の系では、二重鎖は、ガイドＲＮＡと部位特異的ポリペプチドとが複合体を形成するように、部位特異的ポリペプチドに結合する。ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドとのその会合のために複合体に標的特異性を提供する。したがって、ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を方向付ける。
【０３１４】
一部の実施形態では、ゲノムターゲティング核酸は、２分子ガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ゲノムターゲティング核酸は、単分子ガイドＲＮＡである。２分子ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの２つの鎖を有する。第１の鎖は、５’〜３’方向に、必要に応じたスペーサー伸長配列、スペーサー配列および最小限ＣＲＩＳＰＲ反復配列を有する。第２の鎖は、最小限ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小限ＣＲＩＳＰＲ反復配列に相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列および必要に応じたｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を有する。ＩＩ型系における単分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’〜３’方向に、必要に応じたスペーサー伸長配列、スペーサー配列、最小限ＣＲＩＳＰＲ反復配列、単分子ガイドリンカー、最小限ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列および必要に応じたｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を有する。必要に応じたｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、ガイドＲＮＡへの追加の機能（例えば、安定性）に寄与するエレメントを有し得る。単分子ガイドリンカーは、最小限ＣＲＩＳＰＲ反復配列および最小限ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を連結して、ヘアピン構造を形成する。必要に応じたｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、１つまたは複数のヘアピンを有する。Ｖ型系における単分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’〜３’方向に、最小限ＣＲＩＳＰＲ反復配列およびスペーサー配列を有する。
【０３１５】
例示的なゲノムターゲティング核酸は、ＷＯ２０１８／００２７１９で説明されている。
ドナーＤＮＡまたはドナー鋳型
【０３１６】
部位特異的ポリペプチド、例として、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、核酸、例えば、ゲノムＤＮＡにおいて二本鎖切断部位または一本鎖切断部位を導入することができる。二本鎖切断部位は、細胞の内在性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同性依存性修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合もしくは代替的非相同末端結合（Ａ−ＮＨＥＪ）もしくはマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ））を刺激し得る。ＮＨＥＪは、相同鋳型を必要とすることなく、切断された標的核酸を修復し得る。これはときには、標的核酸の切断部位において小欠失または挿入（インデル）を生ずる場合があり、遺伝子発現の破壊または変更を引き起こし得る。相同組換え（ＨＲ）としても公知のＨＤＲは、相同修復鋳型またはドナーが使用可能である場合に起こり得る。
【０３１７】
相同ドナー鋳型は、標的核酸切断部位に隣接する配列に相同的な配列を有する。姉妹染色分体は一般的に、修復鋳型として細胞によって使用される。しかしながら、ゲノム編集の目的のためには、修復鋳型は多くの場合、外因性核酸、例として、プラスミド、二重鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチドまたはウイルス核酸として供給される。また、外因性ドナー鋳型により、追加または変更された核酸配列が標的遺伝子座に組み込まれるようにするために、隣接する相同性領域間に追加の核酸配列（例として、導入遺伝子）または改変（例として、単一または多数の塩基変化または欠失）を導入することが一般的である。ＭＭＥＪは、小欠失および挿入が切断部位において起こり得る点で、ＮＨＥＪと同様の遺伝的アウトカムをもたらす。ＭＭＥＪは、切断部位に隣接する数個の塩基対の相同配列を利用して、好ましい末端結合ＤＮＡ修復アウトカムを駆動する。一部の場合、ヌクレアーゼ標的領域における潜在的なマイクロホモロジーの分析に基づいて、起こりそうな修復アウトカムを予測することが可能であり得る。
【０３１８】
したがって、一部の場合、相同組換えは、外因性ポリヌクレオチド配列を標的核酸切断部位に挿入するために使用される。外因性ポリヌクレオチド配列は、本明細書でドナーポリヌクレオチド（またはドナーもしくはドナー配列もしくはポリヌクレオチドドナー鋳型）と呼ばれる。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドの複製物またはドナーポリヌクレオチドの複製物の一部は、標的核酸切断部位に挿入される。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸切断部位において天然には起こらない配列である。
【０３１９】
外因性ＤＮＡ分子が、二本鎖切断部位が起こる細胞の核の内側で十分な濃度にて供給される場合、外因性ＤＮＡは、ＮＨＥＪ修復プロセス中に二本鎖切断部位において挿入され、したがって、ゲノムに永久に付加されるようになり得る。これらの外因性ＤＮＡ分子は、一部の実施形態でドナー鋳型と呼ばれる。ドナー鋳型が、必要に応じて関連調節配列、例として、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ配列および／またはスプライスアクセプター配列と一緒に本明細書で説明する１つまたは複数の系の成分のコード配列を含有する場合、１つまたは複数の系の成分は、ゲノム中の組み込まれた核酸から発現され、細胞寿命の間の永久的な発現をもたらし得る。さらに、ドナーＤＮＡ鋳型の組み込まれた核酸は、細胞が分裂する場合、娘細胞に伝達され得る。
【０３２０】
二本鎖切断部位のいずれかの側のＤＮＡ配列と相同性を有する隣接ＤＮＡ配列（ホモロジーアームと呼ばれる）を含有する十分な濃度のドナーＤＮＡ鋳型の存在下で、ドナーＤＮＡ鋳型は、ＨＤＲ経路を介して組み込まれ得る。ホモロジーアームは、ドナー鋳型と二本鎖切断部位のいずれかの側の配列との間の相同組換えの基質として作用する。これは、ドナー鋳型のエラーを伴わない挿入（ｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）をもたらす場合があり、ここでは、二本鎖切断部位のいずれかの側の配列は、非改変ゲノムのその配列から変更されていない。
【０３２１】
ＨＤＲによる編集のために供給されるドナーは、著しく多様であるが、一般的にはゲノムＤＮＡへのアニーリングを可能にするための小または大隣接ホモロジーアームを伴う意図される配列を含有する。導入される遺伝的変化に隣接する相同性領域は、３０ｂｐもしくはそれよりも小さくても、またはプロモーター、ｃＤＮＡ等を含有し得る何キロベースものカセットほど大きくてもよい。一本鎖および二本鎖オリゴヌクレオチドドナーの両方を使用することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、１００ｎｔ未満〜多ｋｂを超える大きさに及ぶが、より長いｓｓＤＮＡもまた生成および使用することができる。多くの場合、ＰＣＲアンプリコン、プラスミドおよびミニサークルを含む二本鎖ドナーが使用される。一般的に、ＡＡＶベクターは、ドナー鋳型の非常に有効な送達手段であることが見出されているが、個々のドナーのパッケージング限界は５ｋｂ未満である。ドナーの活性転写は、ＨＤＲを３倍増大し、プロモーターの包含は変換を増大し得ることを示した。逆に、ドナーのＣｐＧメチル化は、遺伝子発現およびＨＤＲを低下し得る。
【０３２２】
一部の実施形態では、ドナーＤＮＡは、様々な異なる方法によって、例えば、トランスフェクション、ナノ粒子、マイクロインジェクションまたはウイルス形質導入によって、ヌクレアーゼを伴って、または独立して供給され得る。一部の実施形態では、ある範囲の係留選択肢は、ＨＤＲのためのドナーの利用可能性を増大するために使用され得る。例は、ドナーをヌクレアーゼに結合すること、近くに結合しているＤＮＡ結合タンパク質に結合すること、またはＤＮＡ末端結合または修復に関与するタンパク質に結合することを含む。
【０３２３】
ＮＨＥＪまたはＨＤＲによるゲノム編集に加えて、ＮＨＥＪ経路およびＨＲの両方を使用する部位特異的遺伝子挿入が行われ得る。組合せ手法は、可能性としてイントロン／エクソン境界を含む、ある特定の設定において適用可能であり得る。ＮＨＥＪは、イントロンにおけるライゲーションに有効であることが証明され得るが、エラーフリーＨＤＲは、コード領域においてよりよく適する場合がある。
【０３２４】
実施形態では、ゲノムに挿入されることが意図される外因性配列は、本明細書で説明する１つまたは複数の系の成分を含む。一部の実施形態では、外因性配列は、ｉ）抗形質細胞構築物；ｉｉ）ＩＬ２Ｒβシグナル伝達ドメインを含む第１のＣＩＳＣ成分；ｉｉｉ）抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物；ｉｖ）ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチド；ｖ）選択可能なマーカー；ｖｉ）１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチド；およびｖｉｉ）ＩＬ２Ｒγシグナル伝達ドメインまたはその断片を含む第２のＣＩＳＣ成分のうちの１つまたは複数をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、抗形質細胞構築物は、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲである。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、配列番号６０もしくは６１のアミノ酸配列、または配列番号６０もしくは６１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分の第１の細胞外結合ドメインは、ＦＲＢドメインを含む。一部の実施形態では、第１のＣＩＳＣ成分は、配列番号５４のアミノ酸配列、または配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、抗細胞傷害性Ｔ細胞構築物は、細胞外β２−ミクログロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体である。一部の実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６５のアミノ酸配列、または配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、ラパマイシンに対する耐性を付与するポリペプチドは、ＦＲＢドメインポリペプチドである。一部の実施形態では、ＦＲＢドメインポリペプチドは、配列番号６８もしくは６９のアミノ酸配列、または配列番号６８もしくは６９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、選択可能なマーカーは、ｔＬＮＧＦＲポリペプチドである。一部の実施形態では、ｔＬＮＧＦＲポリペプチドは、配列番号６６のアミノ酸配列、または配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のカルシニューリン阻害剤に対する耐性を付与するポリペプチドは、突然変異体ＣＮポリペプチドである。一部の実施形態では、突然変異体ＣＮポリペプチドは、ＣＮｂ３０（配列番号６７）である。一部の実施形態では、第２のＣＩＳＣ成分の第２の細胞外結合ドメインは、ＦＫＢＰドメインを含む。一部の実施形態では、第２のＣＩＳＣ成分は、配列番号５３のアミノ酸配列、または配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有するそのバリアントを含む。
部位特異的ポリペプチドまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸
【０３２５】
一部の実施形態では、それゆえ、ゲノム編集の方法および組成物は、部位特異的ポリペプチドまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を使用し得る。部位特異的ポリペプチドをコードする核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。部位特異的ポリペプチドをコードする核酸配列がＲＮＡである場合、それは、ｇＲＮＡ配列に共有結合されても、または別々の配列として存在してもよい。一部の実施形態では、部位特異的ポリペプチドまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼのペプチド配列が、その核酸配列の代わりに使用され得る。
ベクター
【０３２６】
別の態様では、本開示は、本開示のゲノムターゲティング核酸、本開示の部位特異的ポリペプチドおよび／または本開示の方法の実施形態を行うために必要な任意の核酸もしくはタンパク質性分子をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を提供する。一部の実施形態では、そのような核酸は、ベクター（例えば、組換え発現ベクター）である。
【０３２７】
企図される発現ベクターは、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにレトロウイルス、例として、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳癌ウイルス由来のベクター）に基づくウイルスベクターおよび他の組換えベクターを含むが、これらに限定されない。標的真核細胞のために企図される他のベクターは、ベクターｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含むが、これらに限定されない。標的真核細胞のために企図される追加のベクターは、ベクターｐＣＴｘ−１、ｐＣＴｘ−２およびｐＣＴｘ−３を含むが、これらに限定されない。他のベクターは、それらが宿主細胞と適合性である限り、使用することができる。
【０３２８】
一部の実施形態では、ベクターは、１つまたは複数の転写および／または翻訳制御エレメントを有する。利用される宿主／ベクター系に依存して、構成的および誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を含むいくつかの好適な転写および翻訳制御エレメントのうちのいずれかが、発現ベクターにおいて使用され得る。一部の実施形態では、ベクターは、ウイルス配列またはＣＲＩＳＰＲ機構の成分もしくは他のエレメントを不活性化する自己不活性化ベクターである。
【０３２９】
好適な真核生物プロモーター（すなわち、真核細胞において機能的なプロモーター）の非限定的な例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスからの末端反復配列（ＬＴＲ）、ヒト伸長因子１（ＥＦ１）プロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーターに融合されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーを有するハイブリッド構築物（ＣＡＧ）、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１遺伝子座プロモーター（ＰＧＫ）ならびにマウスメタロチオネイン−Ｉからのプロモーターを含む。
【０３３０】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼと関連して使用されるガイドＲＮＡを含む、小ＲＮＡを発現するために、様々なプロモーター、例として、例えば、Ｕ６およびＨ１を含むＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは有益であり得る。そのようなプロモーターの説明およびその使用を向上させるためのパラメーターは、当該技術分野で公知であり、追加の情報および手法は、正式に説明されている；例えば、Ma,  H.  et  al.  (2014).  Mol.  Ther.  -  Nucleic  Acids  3:e161,  doi:10.1038/mtna.2014.12を参照されたい。
【０３３１】
また、発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有し得る。また、発現ベクターは、発現を増幅させるための適切な配列を含み得る。また、発現ベクターは、部位特異的ポリペプチドに融合され、したがって融合タンパク質をもたらす非ネイティブタグ（例えば、ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、緑色蛍光タンパク質等）をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【０３３２】
一部の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリンにより調節されるプロモーター、ステロイドにより調節されるプロモーター、金属により調節されるプロモーター、エストロゲン受容体により調節されるプロモーター等）である。一部の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター）である。一部の実施形態では、プロモーターは、空間的制約および／または時間的制約プロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞種特異的プロモーター等）である。一部の実施形態では、ベクターは、遺伝子がゲノムに挿入された後、ゲノムに存在する内在性プロモーター下で、それが発現される予定である場合、少なくとも１つの遺伝子が宿主細胞において発現されるためのプロモーターを有しない。
部位特異的ポリペプチドまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ
【０３３３】
ＮＨＥＪおよび／またはＨＤＲによる標的ＤＮＡの改変は、例えば、突然変異、欠失、変更、組込み、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子タグ付け、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、転座および／または遺伝子突然変異をもたらし得る。ゲノムＤＮＡへの非ネイティブ核酸の組込みのプロセスは、ゲノム編集の一例である。
【０３３４】
部位特異的ポリペプチドは、ＤＮＡを切断するためにゲノム編集において使用されるヌクレアーゼである。部位特異的ポリペプチドは、１つまたは複数のポリペプチドとして、またはポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸として、細胞または患者に投与され得る。
【０３３５】
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系に関連して、部位特異的ポリペプチドは、ガイドＲＮＡに結合する場合があり、ガイドＲＮＡは、次に、標的ＤＮＡにおける、ポリペプチドが方向付けられる部位を特定する。本明細書のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系の実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、エンドヌクレアーゼ、例として、ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。そのようなＲＮＡ誘導型部位特異的ポリペプチドは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたはＲＧＥＮとも本明細書で呼ばれる。
【０３３６】
例示的な部位特異的ポリペプチドは、ＷＯ２０１８／００２７１９において説明されている。
標的配列選択
【０３３７】
一部の実施形態では、特定の参照遺伝子座に対する５’境界および／または３’境界の場所におけるシフトは、遺伝子編集の特定の適用を促進または向上するために使用され、これは、本明細書でさらに説明および例示される通り、部分的には、編集のために選択されるエンドヌクレアーゼ系に依存する。
【０３３８】
そのような標的配列選択の第１の非限定的な態様では、多くのエンドヌクレアーゼ系は、切断のための潜在的な標的部位の初期選択をガイドする規則または基準、例として、ＣＲＩＳＰＲ  ＩＩ型またはＶ型エンドヌクレアーゼの場合にはＤＮＡ切断部位に隣接する特定の位置におけるＰＡＭ配列モチーフの必要性を有する。
【０３３９】
標的配列選択または最適化の別の非限定的な態様では、標的配列と遺伝子編集エンドヌクレアーゼとの特定の組合せについての「オフターゲット」活性の頻度（すなわち、選択された標的配列以外の部位で起こるＤＳＢの頻度）を、オンターゲット活性の頻度と比較してアセスメントする。一部の場合、所望の遺伝子座において正しく編集された細胞は、他の細胞と比較して選択優位性を有し得る。選択優位性の例示的であるが、非限定的な例は、属性、例として、複製速度の向上、持続性、ある特定の条件に対する耐性、移植成功率の向上または患者への導入後のｉｎ  ｖｉｖｏでの持続性、およびそのような細胞の維持または数もしくは生存率の増大に関連する他の属性の取得を含む。他の場合、所望の遺伝子座において正しく編集された細胞は、正しく編集された細胞を特定、分類または別の方法で選択するために使用される１つまたは複数のスクリーニング方法によって陽性選択され得る。選択優位性および方向付けられた選択方法の両方は、修正と関連付けられる表現型を利用し得る。一部の実施形態では、細胞は、意図される細胞集団を選択または精製するために使用される新しい表現型を作出する第２の改変を作出するために、２回またはそれよりも多く編集され得る。そのような第２の改変は、選択可能なマーカーまたはスクリーニング可能なマーカーについての第２のｇＲＮＡを添加することによって作出され得る。一部の場合、細胞は、ｃＤＮＡおよびまた、選択可能なマーカーを含有するＤＮＡ断片を使用して所望の遺伝子座において正しく編集され得る。
【０３４０】
実施形態では、特定の場合において任意の選択優位性が適用可能であるか、任意の方向付けられた選択が適用されるべきであるかにかかわらず、また、標的配列選択は、適用の有効性を向上させるため、および／または所望の標的以外の部位における所望されない変更の可能性を低減させるために、オフターゲット頻度を考慮することによってガイドされる。本明細書および当該技術分野においてさらに説明および例示される通り、オフターゲット活性の発生は、標的部位と様々なオフターゲット部位との間の類似性および相違性、ならびに使用される特定のエンドヌクレアーゼを含むいくつかの因子によって影響を受ける。オフターゲット活性の予測において補助となるバイオインフォマティクスツールが使用可能であり、また、頻繁にそのようなツールは、オフターゲット活性の最も起こりそうな部位を特定するために使用される場合があり、その後、そのような部位は、オフターゲット活性のオンターゲット活性に対する相対的頻度を評価するために実験設定においてアセスメントされ、それによって、より高い相対的オンターゲット活性を有する配列の選択を可能にし得る。そのような技術の例示的な例は、本明細書で提供され、その他は、当該技術分野において公知である。
【０３４１】
標的配列選択の別の態様は、相同組換え事象に関する。相同性領域を共有する配列は、介在配列の欠失をもたらす相同組換え事象の焦点として働き得る。そのような組換え事象は、染色体および他のＤＮＡ配列の複製の正常な過程中、およびまた、それ以外の、正常な細胞複製周期中に定期的に起こるが、様々な事象（例として、ＵＶ光およびＤＮＡ切断の他のインデューサー）の発生またはある特定の剤（例として、様々な化学インデューサー）の存在によっても向上され得る二本鎖切断部位（ＤＳＢ）の修復の場合等のＤＮＡ配列が合成されるときに起こる。多くのそのようなインデューサーは、ＤＳＢがゲノムにおいて無差別に起こることをもたらし、正常細胞において、ＤＳＢは定期的に誘導され、修復される。修復中に元の配列は、完全な忠実度で再構築され得るが、しかしながら、一部の場合、小挿入または欠失（「インデル」と呼ばれる）がＤＳＢ部位において導入される。
【０３４２】
また、選択された染色体の場所において、方向付けられた遺伝的改変事象または優先遺伝的改変事象を引き起こすために使用され得る本明細書で説明するエンドヌクレアーゼ系の場合と同様に、ＤＳＢは、特定の場所において特異的に誘導することができる。ＤＮＡ修復（および複製）に関して相同配列が組換えに供される傾向は、いくつかの状況において利用される場合があり、遺伝子編集系、例としてＣＲＩＳＰＲの１つの適用のための基礎であり、ここでは、相同性により方向付けられた修復は、「ドナー」ポリヌクレオチドの使用を通して、目的の配列を所望の染色体の場所に挿入するために使用される。
【０３４３】
わずか１０塩基対またはそれよりも少ない塩基対を有し得る「マイクロホモロジー」の小領域であり得る特定の配列間の相同性領域も、所望の欠失をもたらすために使用することができる。例えば、単一のＤＳＢは、付近の配列とマイクロホモロジーを示す部位において導入される。そのようなＤＳＢの修復の正常な過程中、高頻度で起こる結果は、ＤＳＢにより促進される組換えおよび付随する細胞修復プロセスの結果としての介在配列の欠失である。
【０３４４】
しかしながら、一部の状況では、相同性領域内の標的配列を選択することは、遺伝子融合（欠失がコード領域内にある場合）を含む、かなり大きな欠失を生じる場合もあり、これは、特定の状況を仮定すれば所望される場合も、所望されない場合もある。
【０３４５】
本明細書で提供される実施例は、本明細書で説明する１つまたは複数の系の成分を挿入するように設計されるＤＳＢの作出のための様々な標的領域の選択、およびオンターゲット事象と比較してオフターゲット事象を最小限にするように設計されるそのような領域内の特定の標的配列の選択をさらに例示する。
標的組込み
【０３４６】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、標的細胞（例えば、Ｔ細胞）のゲノム内の特定の場所において本明細書で説明する１つまたは複数の系の成分をコードする核酸を組み込むことであり、これは、「標的組込み」と呼ばれる。一部の実施形態では、標的組込みは、ゲノムＤＮＡにおいて二本鎖切断部位を生成するために配列特異的ヌクレアーゼを使用することによって可能になる。
【０３４７】
一部の実施形態で使用されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、多数のゲノム標的を迅速にスクリーニングして、最適ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ設計を特定することができるという利点を有する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、会合したＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）をＤＮＡにおける特定の配列にターゲティングするシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれるＲＮＡ分子を使用する。このターゲティングは、ｓｇＲＮＡと、ｓｇＲＮＡの約２０ｂｐのターゲティング配列内のゲノム配列との間のワトソン・クリック塩基対形成によって起こる。標的部位に結合すると、Ｃａｓヌクレアーゼは、ゲノムＤＮＡの両方の鎖を切断し、二本鎖切断部位を作出する。ｓｇＲＮＡが特定のＤＮＡ配列をターゲティングするように設計するための唯一の必要条件は、標的配列が、ゲノム配列に相補的なｓｇＲＮＡ配列の３’末端におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含有しなければならないことである。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９ヌクレアーゼの場合、ＰＡＭ配列は、ＮＲＧ（ＲはＡまたはＧであり、Ｎは任意の塩基である）またはより制約されたＰＡＭ配列ＮＧＧである。それゆえ、ゲノムの任意の領域をターゲティングするｓｇＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで全てのＰＡＭモチーフに隣接する２０ｂｐ配列を位置付けることによって設計され得る。ＰＡＭモチーフは、真核生物のゲノムにおいて平均してまさに１５ｂｐで起こる。しかしながら、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法によって設計したｓｇＲＮＡは、異なる効率で細胞において二本鎖切断部位を生成し、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法を使用する一連のｓｇＲＮＡ分子の切断効率を予測することは可能ではない。ｓｇＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで迅速に合成することができるので、このことにより、所与のゲノム領域における全ての潜在的なｓｇＲＮＡ配列の迅速なスクリーニングが可能になり、最も効率的な切断をもたらすｓｇＲＮＡを特定する。一般的に、細胞において所与のゲノム領域内の一連のｓｇＲＮＡを試験する場合、０〜９０％の間の範囲の切断効率が観察される。また、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏアルゴリズムおよび研究実験を使用して、任意の所与のｓｇＲＮＡのオフターゲット可能性を決定することができる。ｓｇＲＮＡの２０ｂｐ認識配列への完全な適合は主に、ほとんどの真核生物ゲノムにおいて１回のみ起こるが、ｓｇＲＮＡへの１つまたは複数の塩基対ミスマッチを有するいくつかの追加の部位がゲノム内に存在する。これらの部位は、多くの場合ミスマッチの数または場所に基づいて予測不能である可変性の頻度で切断され得る。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析によって特定されなかった追加のオフターゲット部位における切断も起こり得る。したがって、関連細胞種におけるいくつかのｓｇＲＮＡをスクリーニングして、最も好都合なオフターゲットプロファイルを有するｓｇＲＮＡを特定することは、治療的使用のための最適ｓｇＲＮＡを選択する重要な成分である。好都合なオフターゲットプロファイルは、実際のオフターゲット部位の数およびこれらの部位における切断頻度のみでなく、これらの部位のゲノム内の場所もまた考慮に入れる。例えば、機能的に重要な遺伝子、特に癌遺伝子ま���は抗癌遺伝子に近接するか、またはその中のオフターゲット部位は、公知の機能がない遺伝子間領域における部位よりもあまり好都合でないと考えられ得る。したがって、最適ｓｇＲＮＡの特定は、単純に生物のゲノム配列のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析によって予測することはできず、実験試験を必要とする。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析は、試験するガイドの数を狭めることにおいて役に立ち得るが、それは、高いオンターゲット切断を有するガイドを予測することはできないか、または望ましくないオフターゲット切断が低いガイドを予測することはできない。所与のｓｇＲＮＡのＣａｓ酵素による切断を促進する能力は、ゲノムＤＮＡにおけるその特定の部位の、その領域のクロマチン構造によって決定され得るアクセス可能性に関連し得る。静止状態の分化した細胞におけるゲノムＤＮＡの大部分は、高度に凝縮したヘテロクロマチンで存在する一方で、活発に転写されている領域は、より開放型クロマチン状態で存在し、これは、Ｃａｓタンパク質のようなタンパク質等の大きな分子にとってよりアクセス可能であることが公知である。活発に転写されている遺伝子内でもさらに、ＤＮＡの一部の特定の領域は、結合した転写因子または他の調節タンパク質の存在または非存在のために、その他よりもアクセス可能である。ゲノム内、または特定のゲノム遺伝子座もしくはゲノム遺伝子座の領域内の部位を予測することは、可能ではなく、それゆえ、関連細胞種において実験的に決定する必要があり得る。一部の部位を挿入の可能性のある部位として選択すると、実験試験を伴って、または伴わずに、例えば、選択された部位から数個のヌクレオチド分上流または下流に移動することによって、そのような部位に一部の変化を付加することが可能であり得る。
【０３４８】
一部の実施形態では、本明細書で開示される方法において使用され得るｇＲＮＡは、配列番号１〜１８の任意の１つのポリヌクレオチド配列、または配列番号１〜１８の任意の１つと少なくとも約８５％のヌクレオチド配列同一性を有するその任意の誘導体を含むスペーサーを含む。
核酸改変
【０３４９】
一部の実施形態では、細胞に導入されたポリヌクレオチドは、本明細書でさらに説明し、当該技術分野で公知の通り、例えば、活性、安定性または特異性を向上させるか、送達を変更するか、宿主細胞における自然免疫応答を低減させるか、または他の向上のために独立して、または組み合わせて使用され得る１つまたは複数の改変を有する。
【０３５０】
ある特定の実施形態では、改変されたポリヌクレオチドが、本明細書で説明するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１系）で使用され、その場合、細胞に導入されるガイドＲＮＡ（単分子ガイドまたは二重分子ガイドのいずれか）および／またはＣａｓもしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡは、以下に説明および例示される通り改変され得る。そのような改変されたポリヌクレオチドは、任意の１つまたは複数のゲノム遺伝子座を編集するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系において使用され得る。
【０３５１】
そのような使用の非限定的な例示の目的のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、ガイドＲＮＡの改変は、単分子ガイドまたは二重分子であり得るガイドＲＮＡとＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼとを有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集複合体の形成または安定性を向上させるために使用され得る。また、またはあるいは、ガイドＲＮＡの改変は、ゲノム編集複合体とゲノム内の標的配列との間の相互作用の開始、安定性または速度論を向上させるために使用される場合があり、これは、例えば、オンターゲット活性を向上させるために使用され得る。また、またはあるいは、ガイドＲＮＡの改変は、特異性、例えば、他の（オフターゲット）部位における効果と比較したオンターゲット部位におけるゲノム編集の相対的速度を向上させるために使用され得る。
【０３５２】
また、またはあるいは、改変は、例えば、ガイドＲＮＡの、細胞に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）による分解に対するその耐性を増大させ、それによって、細胞におけるその半減期を増大させることによって、ガイドＲＮＡの安定性を増大させるために使用され得る。エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡと同時に導入されるガイドＲＮＡの半減期を増大させることは、ガイドＲＮＡとコードされるＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼとが細胞内に共存する時間を増大するために使用され得るので、ガイドＲＮＡ半減期を向上させる改変は、ＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼを生成するために翻訳される必要があるＲＮＡを介して編集される細胞に導入される実施形態で、特に有用であり得る。
【０３５３】
また、またはあるいは、改変は、細胞に導入されるＲＮＡが自然免疫応答を誘発する可能性または程度を低下させるために使用され得る。そのような応答は、以下および当該技術分野で説明する、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に関して十分に特徴付けられており、ＲＮＡの半減期の低減および／またはサイトカインもしくは免疫応答と関連付けられる他の因子の誘発と関連付けられる傾向がある。
【０３５４】
また、非限定的に、ＲＮＡの安定性を向上させる改変（例として、ＲＮＡの、細胞に存在するＲＮアーゼによる分解を増大させることによる）、生ずる生成物（すなわち、エンドヌクレアーゼ）の翻訳を向上させる改変および／または細胞に導入されるＲＮＡが自然免疫応答を誘発する可能性または程度を低下させる改変を含むが、これらに限定されない１つまたは複数の種類の改変が、細胞に導入されるエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡにも作製され得る。
【０３５５】
改変、例として、上記およびその他の改変の組合せは、同様に使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の場合、例えば、１つまたは複数の種類の改変が、ガイドＲＮＡ（上記に例示されるガイドＲＮＡを含む）に作製され得る、および／または１つもしくは複数の種類の改変が、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（上記に例示されるＣａｓエンドヌクレアーゼを含む）をコードするＲＮＡに作製され得る。
【０３５６】
例示的な改変された核酸は、ＷＯ２０１８／００２７１９において説明されている。
送達
【０３５７】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法において使用される任意の核酸分子、例えば、本開示のゲノムターゲティング核酸および／または部位特異的ポリペプチドをコードする核酸は、細胞への送達のために送達媒体内または送達媒体の表面上にパッケージングされる。企図される送達媒体は、ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、ポリエチレングリコール粒子、ハイドロゲルおよびミセルを含むが、これらに限定されない。当該技術分野で説明される通り、様々なターゲティング部分が、そのような媒体と所望の細胞種または場所との優先的な相互作用を向上させるために使用され得る。
【０３５８】
本開示の複合体、ポリペプチドおよび核酸の細胞への導入は、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接的マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達等によって起こり得る。
【０３５９】
例示的な送達方法および試薬は、ＷＯ２０１８／００２７１９で説明されている。
【０３６０】
本開示は、特定の選択肢を参照して上記に説明されている。しかしながら、上記に説明されるもの以外の選択肢は、本開示の範囲内で均等に可能である。上記に説明されるものとは異なる方法ステップが、本開示の範囲内で提供され得る。本明細書で説明する異なる特色およびステップは、説明されるもの以外の組合せで組み合わせてもよい。
【０３６１】
本明細書の複数および／または単数の用語の使用について、当業者は、文脈および／または適用に適切であるように、複数を単数に解釈すること、および／または単数を複数に解釈することができる。様々な単数／複数の順列は、明確にするために本明細書で明白に示され得る。
【０３６２】
一般的に、本明細書およびとりわけ、附属の特許請求の範囲（例えば、附属の特許請求の範囲の本文）で使用される用語は概して、「開放型」用語として意図されること（例えば、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「〜を含むが、これらに限定されない」と解釈されるべきであり、「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、「少なくとも〜を有する」と解釈されるべきであり、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は、「〜を含むが、これらに限定されない」と解釈されるべきである、等）が当業者によって理解される。
【０３６３】
加えて、本開示の特色または態様がマーカッシュ群に関して説明されている場合、当業者は、また、本開示は、それによって、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関して説明されていることを認識する。
【０３６４】
第１〜第１１の態様の選択肢の特色のいずれかは、本明細書で特定される全ての態様および選択肢に適用可能である。さらに、第１〜第１１の態様の選択肢の特色のいずれかは独立して、いかなるようにも、本明細書で説明する他の選択肢と部分的に、または全体的に組合せ可能であり、例えば、１、２もしくは３つまたはそれよりも多い選択肢は、全体的に、または部分的に組合せ可能であり得る。さらに、第１〜第１１の態様の選択肢の特色のいずれかは、他の態様または選択肢にとって必要に応じた特色にされ得る。様々な例の選択肢および実行に関して上記に説明されているが、個々の選択肢のうちの１つまたは複数で説明されている様々な特色、態様および機能性は、それらの、それらが説明されている特定の選択肢への適用可能性において限定されず、その代わりに、そのような選択肢が説明されているかどうかにかかわらず、かつそのような特色が説明されている選択肢の一部であると示されているかどうかにかかわらず、本出願の他の選択肢のうちの１つまたは複数に、単独で、または様々な組合せで適用され得ることが理解されるべきである。したがって、本出願の幅および範囲は、上記に説明されている例の選択肢のいずれかによって限定されるべきではない。
【０３６５】
本明細書で引用される全ての参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる出版物および特許または特許出願が、本明細書に含有される本開示と矛盾する限り、本明細書は、任意のそのような矛盾した材料に取って代わることおよび／または優先することが意図される。本明細書で参照により組み込まれる出版物および特許または特許出願が、本明細書に含有される本開示と矛盾する限り、本明細書は、任意のそのような矛盾した材料に取って代わることおよび／または優先することが意図される。
【０３６６】
本開示の１つまたは複数の実施形態の詳細は、以下の付随の説明で示される。本明細書で説明される材料および方法と同様または均等の任意の材料および方法は、本開示の実施または試験において使用することができる。本開示の他の特色、目的および利点は、本明細書から明らかである。本明細書において、また、単数形は、文脈が明らかに別のように示さない限り、複数を含む。別に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。不一致の場合、本明細書が優先する。
【０３６７】
本明細書で説明する実施例および実施形態は、単に例示目的のためであり、それに照らした様々な改変または変化が当業者に示唆され、本出願および付属の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に含まれるべきであることが理解される。本明細書で引用される全ての出版物、特許および特許出願は、全ての目的についてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３６８】
本明細書で提供される本開示の一部の実施形態は、以下の非限定的な実施例によってさらに例示される。
【実施例】
【０３６９】
材料および方法
試薬
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、２９３細胞の三重トランスフェクションから産生し、イオジキサノール勾配遠心分離により精製した。全てのＡＡＶは、血清型２／６のＡＡＶのものである。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をＳｙｎｔｈｅｇｏに注文し、製造業者の推奨に従って使用した。ｓｇＲＮＡ配列の標的結合部分は、以下の通りである：ＴＲＡＣ１：５’−ＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＴＧ−３’（配列番号３）；ＴＲＡＣ２：５’−ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ−３’（配列番号１）；ＴＲＡＣ３：５’−ＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡＣＧＧＣ−３’（配列番号２）；ＩＬ２ＲＧ  ＧＣ８：５’−ＧＧＴＴＡＴＣＴＣＴＧＴＴＧＧＣＴＣＣＡ−３’（配列番号１１）；ＩＬ２ＲＧ  ＧＣ１０：５’−ＡＡＧＧＣＴＧＡＴＡＡＴＣＡＡＴＣＣＣＡ−３’（配列番号１３）；およびＩＬ２ＲＧ  ＧＣ１２：５’−ＣＣＡＣＧＧＣＴＴＣＣＡＡＴＧＣＡＡＡＣ−３’（配列番号１５）。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからＣａｓ９酵素（ＴｒｕｅＣｕｔ  Ｖ２）を購入した。Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを、使用前に、リン酸緩衝食塩水中で室温にて少なくとも１０分間複合体形成させた。
【０３７０】
ＢＣＭＡを発現する／発現しない細胞系の同質遺伝子対を、３つの異なる方法で作出した。第１に、ＲＰＭＩ−８２６６細胞に、Ｃａｓ９と、ＢＣＭＡのコード領域の５’−ｔａｔｔａａｇｃｔｃａｇｔｃｃｃａａａｃ−３’（配列番号７８）配列をターゲティングするｓｇＲＮＡとをトランスフェクトした。細胞プールを、ＰＥコンジュゲートした抗ヒトＢＣＭＡ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ３５７５０３）で染色し、染色されなかった細胞を単離した。第２に、通常ＢＣＭＡ陰性であるＫ５６２細胞において、５’−ｇｇｇｇｃｃａｃｔａｇｇｇａｃａｇｇａｔ−３’（配列番号７９）をターゲティングするｓｇＲＮＡを使用する、ＳＡ−２Ａ−ＢＣＭＡ−ＢＧＨポリＡ構築物のＡＡＶＳ１遺伝子座への組込みによって、ＢＣＭＡ発現を、低レベルＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１）プロモーターの制御下に置いた。限界希釈によって細胞をクローニングし、ＢＣＭＡ発現をフローサイトメトリーによって確認した。第３に、Ｋ５６２細胞において、５’−ｇｇｇｇｃｃａｃｔａｇｇｇａｃａｇｇａｔ−３’（配列番号７９）をターゲティングするｓｇＲＮＡを使用する、ＭＮＤ−ＢＣＭＡ−ＢＧＨポリＡ構築物のＡＡＶＳ１遺伝子座への組込みによって、ＢＣＭＡ発現を、強いＭＮＤプロモーターの制御下に置いた。限界希釈によって細胞をクローニングし、ＢＣＭＡ発現をフローサイトメトリーによって確認した。２つのクローンを単離した：１つは高いＢＣＭＡ発現を有し、もう１つは非常に高いＢＣＭＡ発現を有した。
Ｔ細胞培養
【０３７１】
個々の全血ｌｅｕｋｏｐａｋｓから、ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を単離した。Ｔ細胞を、ＡＩＭ−Ｖ培地＋５％ヒトＡＢ血清＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−２中で培養した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、１３０−０９１−４４１）を使用して細胞を刺激して、増殖させた。細胞を、ビーズと１：１の比において０．５×１０６個の細胞／ｍＬの開始濃度で３日間インキュベートした。その後、ビーズを除去し、細胞をトランスフェクション前に１日間分裂させた。
Ｔ細胞トランスフェクションおよび感染
【０３７２】
Ｌｏｎｚａ  ４ＤヌクレオフェクターおよびプログラムＥ０−１１５を使用して、細胞に、６０ｐｍｏｌのｓｇＲＮＡと１２ｐｍｏｌのＣａｓ９とからなる事前に複合体形成したＲＮＰをトランスフェクトした。トランスフェクションの１時間後、細胞に、ＴＲＡＣ遺伝子のためのＢＣＭＡ−ＣＡＲ／ＣＩＳＣβもしくはＴＮＰ−ＣＡＲ／ＣＩＳＣβターゲティング構築物および／またはＩＬ２ＲＧ遺伝子のためのＦＲＢ／ｔＬＮＧＦＲ／ＣＮｂ３０／ＣＩＳＣγターゲティング構築物を含有するＡＡＶ２／６を、１，０００〜１００，０００の範囲（一般的に各々５０，０００）のＭＯＩで感染させた。
フローサイトメトリー
【０３７３】
遺伝子編集の５日後、Ｔ細胞を、ＴＲＡＣ、ＩＬ２ＲＧ、ＣＡＲおよびＣＩＳＣの発現についてフローサイトメトリーによって分析した。ＴＲＡＣ発現は、ＡＰＣコンジュゲートしたマウス抗ヒトα／β  ＴＣＲ（クローンＩＰ２６；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３０６７０２）で細胞を染色することによってプローブした。ＩＬ２ＲＧ発現は、マウス抗ヒトＣＤ１３２（ＢＶ４２１；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５６６２２２）とＰＥコンジュゲートしたものでモニターした。ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現は、ビオチニル化ＢＣＭＡ（Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＢＣ７−Ｈ８２Ｆ０）およびＰＥコンジュゲートしたストレプトアビジン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５５４０６１）を使用して検出した；ＢＣＭＡおよびＴＮＰ  ＣＡＲ発現は、ＰＥコンジュゲートしたヤギ抗マウスＦｖ  Ｆ（ａｂ）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  １１５−０６６−０７２）を使用して検出した。ｔＬＮＧＦＲ発現は、ＡＰＣコンジュゲートしたマウス抗ヒトＣＤ２７１（クローンＲＥＡ８４４；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  １３０−１１２−７９１）でモニターした。ＣＩＳＣ発現は、注文製ビオチン：ラパマイシンコンジュゲートおよびＰＥコンジュゲートしたストレプトアビジンで可視化した。全てのフローサイトメトリーは、Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で行った。
細胞傷害性アッセイ
【０３７４】
５０，０００個の標的細胞（ＲＰＭＩ−８２２６またはＲＰＭＩ−８２２６  ＢＣＭＡ−ＫＯ；Ｋ５６２またはＫ５６２  ＢＣＭＡ−低またはＫ５６２−ＢＣＭＡ高またはＫ５６２−ＢＣＭＡ非常に高）を、ｅＦｌｕｏｒ  ６７０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃５０−２４６−０９５）で標識し、ＣＡＲ  Ｔ細胞と０．５：１、１：１、２：１、４：１、８：１のエフェクター：標的比で１６時間インキュベートした。細胞プールを、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ｄ３５７１）で染色して、死細胞を検出し、Ｃｏｕｎｔｂｒｉｔｅ計数ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ｃ３６９５０）と混合して体積を正規化し、ｅＦｌｕｏｒ  ６７０陽性、ＤＡＰＩ陰性細胞およびｅＦｌｕｏｒ陽性、ＤＡＰＩ陽性細胞を定量した。生細胞の分数掛ける１００％として生存率パーセントを決定し；１００％引く生存率パーセントとして細胞傷害性パーセントを計算した。
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡ
【０３７５】
Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓからＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＡキットを購入し、製造業者の使用説明書に従って使用した。培養上清を、１６時間のインキュベーション後に測定した。
マウス異種移植片アッセイ
【０３７６】
ＮＳＧマウスに、５百万個のＲＰＭＩ−８２２６またはＲＰＭＩ−８２２６  ＢＣＭＡ−ＫＯ細胞を皮下注射した。腫瘍成長の２．５週間後、ＢＣＭＡ  ＣＡＲまたはＴＮＰ  ＣＡＲ改変Ｔ細胞を静脈内注射し、腫瘍サイズをノギスでモニターした。
ＣＩＳＣ媒介細胞拡張
【０３７７】
ＴＲＡＣ遺伝子およびＩＬ２ＲＧ遺伝子に組み込まれたＣＩＳＣを有するＴ細胞プールを、ＡＩＭ−Ｖ培地＋５％ＡＢ血清＋１０ｎＭラパマイシン（ＩＬ−２非含有）中で増殖させた。
（実施例１）
ｇＲＮＡの特徴付け
ＴＲＡＣ遺伝子をターゲティングするｇＲＮＡ
【０３７８】
ＴＲＡＣ遺伝子に特異的なｇＲＮＡの、ターゲティング切断をもたらす能力を評価するために、スペーサーＴＲＡＣ１（配列番号３）、ＴＲＡＣ２（配列番号１）およびＴＲＡＣ３（配列番号２）を含むｇＲＮＡを、Ｓｙｎｔｈｅｇｏに注文し、抗ＣＤ３／ＣＤ８／ＣＤ２８ビーズによる３日間の活性化後のエレクトロポレーションによって各ｇＲＮＡを含むＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰをトランスフェクトしたヒト初代ＣＤ８＋またはＣＤ３＋Ｔ細胞において評価した。トランスフェクションの４８時間後、ＴＩＤＥＳプロトコール（Brinkman,  E.  K.  et  al.  (2014).  Nucleic  Acids  Res.,  42(22):e168）を使用して、各ｇＲＮＡのオンターゲット部位における切断効率について、細胞を分析し、ここでは、予測される切断部位に隣接するＰＣＲプライマーを、処理細胞からのゲノムＤＮＡを増幅するために使用し、次に、ＰＣＲ産物についてＳａｎｇｅｒ配列決定した。細胞のゲノムにおいて二本鎖切断部位が作出された場合、細胞は、二本鎖切断部位を修復しようとする。この修復プロセスは、エラープローン（ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ）であり、それは、二本鎖切断の部位におけるヌクレオチドの欠失または挿入をもたらし得る。完全に修復された切断部位はＣａｓ９ヌクレアーゼによって再切断され、一方で、ヌクレオチドの挿入または欠失はＣａｓ９切断を防ぐので、切断効率の表示である挿入および欠失の蓄積がある。その後、配列決定クロマトグラムデータを、予測される切断部位における挿入または欠失塩基の頻度を計算するコンピュータアルゴリズムを使用して分析した。挿入または欠失塩基（インデル）の頻度を、全体的な切断頻度を計算するために使用した。細胞をインデル効率、細胞生存率および全細胞計数について編集後２日目に分析し、これは、試験した全ての３つのｇＲＮＡについて同様であった（表１、２回の独立実験からの結果）。ｇＲＮＡは、ＣＤ８＋およびＣＤ３＋Ｔ細胞の両方について５４％〜６４％に及ぶインデル効率をもたらし、７７％〜８９％に及ぶ細胞生存率を有し、これらのｇＲＮＡは、Ｔ細胞において細胞傷害性を誘導することなく、それらの標的部位において効率的に切断することを示した。
【表１】
2021521841.tif 000002
【０３７９】
編集後７日目に、フローサイトメトリーによってＴＣＲおよびＣＤ３発現について、細胞をさらに分析した（表２）。ｇＲＮＡの各々は、ＣＤ８＋およびＣＤ３＋Ｔ細胞の両方において非処理対照と比較して約９０％またはそれよりも多くＴＣＲ発現を低減させることができた。また、ＴＣＲ発現に依存する表面ＣＤ３発現は、ｇＲＮＡの各々で処理した細胞において低減した。これらの結果は、インデル効率についての発見を支持し、ｇＲＮＡによる編集は、Ｔ細胞においてＴＣＲ発現を抑制することができ、編集された細胞において内在性ＴＣＲを通したシグナル伝達をサイレンシングしたことを示す。
【表２】
2021521841.tif 000003
【０３８０】
ｇＲＮＡ  ＴＲＡＣ１、ＴＲＡＣ２およびＴＲＡＣ３によって媒介されるＴＲＡＣ遺伝子におけるドナー鋳型の標的組込みを評価するために、ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞に、各ｇＲＮＡを含むＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰをエレクトロポレーションによってトランスフェクトし、その後即座に、各ｇＲＮＡに特異的なホモロジーアームを有し、ＣＩＳＣおよび組込みについてのｍＣｈｅｒｒｙマーカー（配列番号９４〜９６）をコードするドナー鋳型を有する対応するＡＡＶベクターの形質導入を、５０，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で行った。形質導入の４８時間後に、細胞を、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＴＣＲ発現についてのフローサイトメトリーを使用して組込み効率について分析した。表３（異なるＴ細胞ロットによる２回の独立実験からの結果）に示す通り、ドナー鋳型の標的組込みは、試験した３つのｇＲＮＡの各々について達成され、ＴＣＲ−／ＣＩＳＣ＋細胞の量は、約１２％〜約１８％に及んだ。
【表３】
2021521841.tif 000004
ＩＬ２ＲＧ遺伝子座をターゲティングするｇＲＮＡ
【０３８１】
ＩＬ２ＲＧ遺伝子座に特異的なｇＲＮＡの、ターゲティングされた切断に影響を及ぼす能力を評価するために、ＩＬ２ＲＧ遺伝子のエクソン６をターゲティングするスペーサーＧＣ１（配列番号４）、ＧＣ２（配列番号５）、ＧＣ３（配列番号６）、ＧＣ４（配列番号７）、ＧＣ５（配列番号８）、ＧＣ６（配列番号９）、ＧＣ７（配列番号１０）、ＧＣ８（配列番号１１）、ＧＣ９（配列番号１２）、ＧＣ１０（配列番号１３）、ＧＣ１１（配列番号１４）、ＧＣ１２（配列番号１５）、ＧＣ１３（配列番号１６）、ＧＣ１４（配列番号１７）およびＧＣ１５（配列番号１８）を含む１５種のｇＲＮＡをＳｙｎｔｈｅｇｏに注文し、抗ＣＤ３／ＣＤ８／ＣＤ２８ビーズによる３日間の活性化後のエレクトロポレーションによって各ｇＲＮＡを含むＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰをトランスフェクトしたヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞において評価した。トランスフェクションの４８時間後、上記に説明するＴＩＤＥＳプロトコールを使用して、各ｇＲＮＡのオンターゲット部位における切断効率について、細胞を分析した。編集１日後に、細胞をインデル効率について分析し、それは、約１５％〜約８０％に及び、いくつかのｇＲＮＡは、Ｔ細胞においてそれらの標的部位で効率的に切断することを示した（表４、３回の独立実験からの結果）。
【表４】
2021521841.tif 000005
【０３８２】
ｇＲＮＡ  ＧＣ８、ＧＣ１０およびＧＣ１２によって媒介されるＩＬＲ２Ｇ遺伝子座におけるドナー鋳型の標的組込みを評価するために、ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞に、各ｇＲＮＡを含むＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰをエレクトロポレーション単独によってトランスフェクトするか、またはエレクトロポレーションによってトランスフェクトした後即座に、各ｇＲＮＡに特異的なホモロジーアーム（ＧＣ８について配列番号８６および８７のホモロジーアーム；ＧＣ１０について配列番号８８および８９のホモロジーアーム；およびＧＣ１２について配列番号９０および９１のホモロジーアーム）を有し、ＣＩＳＣおよび組込みについてのｔＬＮＧＦＲマーカー（配列番号９７）をコードするドナー鋳型を有する対応するＡＡＶベクターの形質導入を５０，０００の感染多重度（ＭＯＩ）で行った。形質導入の４８時間後に、細胞を、ｔＬＮＧＦＲについておよびインデル効率についてのフローサイトメトリーを使用して組込み効率について分析した。表５（異なるＴ細胞ロットによる２回の独立実験からの結果）に示す通り、ドナー鋳型の標的組込みは、試験した３つのｇＲＮＡの各々について達成され、ＣＩＳＣ＋細胞の量（ｔＬＮＧＦＲ発現によって示される）は、約１１％〜約２９％に及んだ。
【表５】
2021521841.tif 000006
オフターゲット分析
【０３８３】
ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ法（Tsai,  S.  Q.  et  al.  (2015).  Nat.  Biotechnol.,  33(2):187-197）を使用して、ヒトＩＬ２ＲＧターゲティングｇＲＮＡ  ＧＣ８、ＧＣ１０およびＧＣ１２のオフターゲット部位を、ヒト初代ＣＤ３＋細胞において評価した。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑは、切断部位を特定するために使用される経験的方法である。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑは、染色体ＤＮＡの二本鎖切断の部位におけるオリゴヌクレオチドの自発的捕捉に頼る。簡潔に説明すると、細胞に、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９  ＲＮＰ複合体および二本鎖オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした後、ゲノムＤＮＡを細胞から精製し、超音波処理し、一連のアダプターライゲーションを行って、ライブラリーを作出する。オリゴヌクレオチド含有ライブラリーを、高効率ＤＮＡ配列決定に供し、デフォルトＧＵＩＤＥ−ｓｅｑソフトウェアを使用して出力をプロセスして、オリゴヌクレオチド捕捉の部位を特定する。
【０３８４】
ＳｐＣａｓ９とｓｇＲＮＡとを含有するＲＮＰのトランスフェクションを伴わない試料を、並行してプロセスした。ＲＮＰ含有試料およびＲＮＰナイーブ試料の両方において見出される部位（＋／−１ｋｂ）を、さらなる分析から除外した。
【０３８５】
Ｃｏｍｍｏｎアダプターを、８マーの分子インデックスを含有する試料バーコードアダプター（Ａ０１〜Ａ１６）の各々にアニーリングすることによって、Ｙ−アダプターを調製した。ＲＮＰおよびＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ  ＯＤＮをヌクレオフェクトしたＣＤ３＋Ｔ細胞から抽出したゲノムＤＮＡを、Ｑｕｂｉｔ蛍光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量し、全ての試料を１２０μｌの体積のＴＥ緩衝液中で４００ｎｇに正規化した。Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｓ２２０超音波処理機の標準の操作手技に従って、ゲノムＤＮＡを２００ｂｐの平均長まで剪断した。平均断片長を確認するために、１μｌの試料をＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で製造業者のプロトコールに従って分析した。剪断したＤＮＡの試料を、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＳＰＲＩビーズを使用して製造業者のプロトコールに従って清浄化し、１７μｌのＴＥ緩衝液に溶出した。１．２μｌのｄＮＴＰ混合物（５ｍＭの各ｄＮＴＰ）、３μｌの１０×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液、２．４μｌのＥｎｄ−Ｒｅｐａｉｒ混合物、２．４μｌの１０×Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ緩衝液（Ｍｇ２＋非含有）および０．６μｌのＴａｑポリメラーゼ（非ホットスタート）ならびに１４μｌの剪断したＤＮＡ試料（前のステップから）を混合して、１管当たり２２．５μｌの総体積にし、サーモサイクラーでインキュベートする（１２℃、１５分間；３７℃、１５分間；７２℃、１５分間；４℃保持）ことによって、ゲノムＤＮＡについて末端修復反応を行った。これに、１μｌのアニーリングしたＹアダプター（１０μＭ）および２μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加し、混合物をサーモサイクラーでインキュベートした（１６℃、３０分間；２２℃、３０分間；４℃保持）。試料を、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＳＰＲＩビーズを使用して製造業者のプロトコールに従って清浄化し、２３μｌのＴＥ緩衝液に溶出した。１μｌの試料をＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎで製造業者のプロトコールに従って流して、アダプターの断片へのライゲーションを確認した。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑライブラリーを調製するために、１４μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ、３．６μｌの１０×Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ緩衝液、０．７μｌのｄＮＴＰ混合物（各１０ｍＭ）、１．４μｌのＭｇＣｌ２、５０ｍＭ、０．３６μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ、１．２μｌのセンスまたはアンチセンス遺伝子特異的プライマー（１０μＭ）、１．８μｌのＴＭＡＣ（０．５Ｍ）、０．６μｌのＰ５−１（１０μＭ）および１０μｌの前のステップからの試料を含有する反応を調製した。この混合物を、サーモサイクラーでインキュベートした（９５℃、５分間、その後、１５サイクルの９５℃、３０秒間；７０℃（１サイクル当たり−１℃）を２分間；７２℃、３０秒間；次に、１０サイクルの９５℃、３０秒間；５５℃、１分間；７２℃、３０秒間；次に、７２℃、５分間）。ＰＣＲ反応を、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＳＰＲＩビーズを使用して製造業者のプロトコールに従って清浄化し、１５μｌのＴＥ緩衝液に溶出した。１μｌの試料をＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎで製造業者のプロトコールに従ってチェックして、試料の進行を追跡した。６．５μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ、３．６μｌの��０×Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ緩衝液（Ｍｇ２＋非含有）、０．７μｌのｄＮＴＰ混合物（各１０ｍＭ）、１．４μｌのＭｇＣｌ２（５０ｍＭ）、０．４μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ、１．２μｌの遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）２（センス：＋、またはアンチセンス：−）、１．８μｌのＴＭＡＣ（０．５Ｍ）、０．６μｌのＰ５−２（１０μＭ）および１５μｌの前のステップからのＰＣＲ産物を混合することによって、第２のＰＣＲを行った。
【０３８６】
各ｇＲＮＡについての多数の独立した細胞試料複製物（独立したトランスフェクションからの）についてＧＵＩＤＥ−ｓｅｑを完了し、結果を表６および７に示す。これらの結果は概して、ｇＲＮＡスペーサーＧＣ８、ＧＣ１０およびＧＣ１２についての好都合なオンターゲット／オフターゲットプロファイルを実証する。
【表６】
2021521841.tif 000007
【表７】
2021521841.tif 000008
【０３８７】
オフターゲットリードのオンターゲットリードに対するパーセンテージは、ｇＲＮＡがその意図される標的に特異的であるかどうかの全体的な表示を提供するが、他の因子が関与し得る。例えば、生物の生存に必要な必須遺伝子のエクソンにおいてｇＲＮＡ候補のオフターゲット部位があると、そのｇＲＮＡは臨床における使用に不適当になり得る。他方で、非コード領域またはイントロン領域におけるオフターゲット部位は、あまり懸念を生じない場合がある。治療的使用に意図されるｇＲＮＡを評価するために有用な考慮は、１）オフターゲット部位の数、２）オフターゲット部位の場所、３）オンターゲット編集と比較したオフターゲット編集の頻度および４）オフターゲット部位のｇＲＮＡスペーサー配列に対する相同性の程度を含む。
【０３８８】
潜在的なオフターゲット部位を、細胞試料複製物において実験を再現することによって確証した。したがって、出願人は、ＩＬ２ＲＧエクソン６をターゲティングするｇＲＮＡを使用して編集した細胞において潜在的オフターゲット部位を特定するために実験を行った。多数の細胞試料複製物において検出されたオフターゲット部位を、表７に報告する。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑにおける各オフターゲット部位についてのリードカウントのオンターゲット部位に対する比較は、各ｓｇＲＮＡについてのオフターゲット部位のオフターゲット頻度の見積もりを提供する。これらのデータを、ゲノム部位、およびオフターゲット部位が遺伝子のコード領域内にあるかどうかについての情報と共に、表７に要約する。プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する標的配列に対応するスペーサーの７個のヌクレオチドからなるスペーサーシード配列は、Zheng,  T.  et  al.によって、ミスマッチに感受性であることが示されている（Zheng,  T.  et  al.  (2017).  Sci.  Rep.,  7,  40638.）。ｓｇＲＮＡスペーサーシード配列に対応するミスマッチを有する予測されるオフターゲット部位は、効率的に編集されるとは期待されない場合がある。このシード領域におけるミスマッチを有するそのようなオフターゲット部位は、偽陽性になりやすい。真のオフターゲット頻度は、アンプリコン配列決定等のディープ配列決定法によって確認され得る（Medinger,  R.  et  al.  (2010).  Mol.  Ecol.,  19(Suppl.  1):32-40を参照されたい）。
【０３８９】
ヒトＴＲＡＣターゲティングｇＲＮＡスペーサーＴＲＡＣ１（配列番号３）についてのオンターゲット部位および潜在的なオフターゲット部位を、ヒト初代ＣＤ３＋細胞においてアンプリコン配列決定を使用して評価した。ＰＣＲプライマーの対を、およそ中央に位置する潜在的な切断部位を伴う約２００ｂｐの目的の領域を増幅するように設計した。ＲＮＰ処理し、模擬トランスフェクトした細胞からバーコード化アンプリコンを生成し、多重化し、高効率ＤＮＡ配列決定に供した。配列リードを多重分離し、ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ  ｒｅａｄを整列し、Ｐａｎｄａｓｅｑ  ２．１１（Masella,  A.  P.,  et  al.  (2012).  BMC  bioinformatics,  13(1),  31）を使用して組み込み、Ｂｉｏｐｙｔｈｏｎ  １．６９  ｐａｉｒｗｉｓｅ２  ａｌｉｇｎｅｒを使用する特注ソフトウェアにより各標的部位についてインデルの頻度を決定した。各標的部位について、最少で１０，０００配列リードおよびリード収集にわたり平均で４０，０００を行った。表８に示す通り、オンターゲット部位についてのインデル頻度は、約８５％であった。０．２％を超えるインデル頻度を有する３つの潜在的なオフターゲット部位を特定したが、これらは、配列決定ランにおけるノイズから生じたように見える。これらの結果は、ｇＲＮＡスペーサーＴＲＡＣ１についての非常に好都合なオンターゲット／オフターゲットプロファイルを示す。
【表８−１】
2021521841.tif 000009
【表８−２】
2021521841.tif 000010
【０３９０】
全体として、ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＧＵＩＤＥ−ｓｅｑおよびアンプリコン配列決定分析からの結果は、スペーサーＧＣ８、ＧＣ１０、ＧＣ１２およびＴＲＡＣ１を有するｇＲＮＡが、養子細胞療法または他の細胞ベースの治療における使用等のさらなる使用のための優れた候補であることを実証した。
【０３９１】
ヒトＴＲＡＣおよびＩＬ２ＲＧ遺伝子における標的部位を有する追加のｇＲＮＡの、それらのヒト細胞におけるオンターゲット／オフターゲットプロファイルについての、本明細書で説明するＧＵＩＤＥ−ｓｅｑおよび／またはアンプリコン配列決定法を使用したスクリーニングは、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を作出する目的でこれらの遺伝子をターゲティングするために使用され得る追加のｇＲＮＡ分子を特定する手法として企図される。
（実施例２）
ＴＲＡＣ遺伝子における標的組込みによる抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞の生成および特徴付け
【０３９２】
ＨＤＲによる組込みのために設計したＡＡＶドナー鋳型と組み合わせた、ＴＲＡＣターゲティングＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰを使用して、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードする発現カセットのＴＲＡＣ遺伝子への標的組込みを有するＴ細胞を生成した。一般的に、ＨＤＲ媒介組込みのために設計したドナー鋳型は、組込み部位がｇＲＮＡ標的部位に近接するように、例えば、１０ｂｐ未満しか離れていないように構成されるべきである（blog.addgene.org/crispr-101-homology-directed-repair）。ＡＡＶドナー鋳型は、それ自体のプロモーターを有し、ＲＮＰにおけるｓｇＲＮＡの標的部位を含むホモロジーアームが隣接する発現カセットを含有した（図１、ドナー鋳型構築物＃１および＃６）。
【０３９３】
個々の全血ｌｅｕｋｏｐａｋｓから、ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を単離した。単離したＴ細胞を、ＡＩＭ−Ｖ培地＋５％ヒトＡＢ血清＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−２中で培養した。細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、１３０−０９１−４４１）を１：１の比において０．５×１０６個の細胞／ｍＬの開始濃度で３日間使用して刺激して、増殖させた。その後、ビーズを除去し、細胞をトランスフェクション前に１日間分裂させた。
【０３９４】
６０ｐｍｏｌのＴＲＡＣ３  ｓｇＲＮＡ（スペーサー配列：ＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡＣＧＧＣ（配列番号：２））および１２ｐｍｏｌのＣａｓ９（ＴｒｕｅＣｕｔ  Ｖ２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をリン酸緩衝食塩水中で室温にて少なくとも１０分間混合することによって、ＴＲＡＣ遺伝子をターゲティングするＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰを調製した。Ｌｏｎｚａ  ４ＤヌクレオフェクターおよびプログラムＥ０−１１５を使用して、細胞に、ＲＮＰをトランスフェクトした。トランスフェクションの１時間後、細胞に、ＣＤ２８共刺激ドメインを伴う抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ（＃１  ＴＲＡＣ３、配列番号２０）、４−１ＢＢ共刺激ドメインを伴う抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ（＃６  ＴＲＡＣ３、配列番号３５）、ＣＤ２８共刺激ドメインを伴う抗ＴＮＰ  ＣＡＲ（配列番号９２）または４−１ＢＢ共刺激ドメインを伴う抗ＴＮＰ  ＣＡＲ（配列番号９３）の発現のためのドナーＡＡＶ２／６ベクターを２０，０００のＭＯＩで感染させた。
【０３９５】
編集の５日後、細胞を、抗マウスＦｖ−ビオチン、次にストレプトアビジン−ＰＥで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。表９に示す通り、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲドナーで処理したＴ細胞の９％〜１２％は、ＣＡＲ発現を示した。これらの結果は、発現カセットの、Ｔ細胞のＴＲＡＣ遺伝子への標的組込みは、組み込まれたカセットからのＣＡＲの発現を可能にすることを実証する。
【表９】
2021521841.tif 000011
（実施例３）
ＴＲＡＣおよびＣＡＲ発現の同時分析
【０３９６】
異種配列のＴＲＡＣ遺伝子への標的組込みの、ＴＣＲ発現に対する効果を評価するために、実施例２と同様に処理したＴ細胞を、処理の５日後、抗α／β  ＴＣＲ抗体およびビオチニル化ＢＣＭＡ／ストレプトアビジン−ＰＥで同時染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＴＲＡＣターゲティングＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰで処理した場合、Ｔ細胞の約９０％がＴＣＲ発現を欠き、ＴＲＡＣターゲティングＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰおよび抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  ＡＡＶドナーで処理したＴ細胞の１８％〜２２％がＴＣＲ陰性であり、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現した（表１０）。これらの結果は、ＴＲＡＣターゲティングＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰを使用してＴ細胞を編集することは、編集された細胞においてＴＣＲ発現をノックアウトするために有効であったことを示す。
【表１０】
2021521841.tif 000012
（実施例４）
トランスフェクション後１２日目までのＣＡＲ持続性
【０３９７】
抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞における抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現の持続性を評価するために、実施例２と同様に処理したＴ細胞を、トランスフェクション後１２日目に、抗α／β  ＴＣＲ抗体およびビオチニル化ＢＣＭＡ／ストレプトアビジン−ＰＥで同時染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＴＲＡＣターゲティングＲＮＰで処理した場合、細胞の約９０％がＴＣＲ発現を欠き、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  ＡＡＶドナーで処理したＴ細胞の２２％〜３０％がＴＣＲ陰性であり、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現した（表１１）。これらの結果は、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現は、編集されたＴ細胞においてトランスフェクション後少なくとも１２日目まで持続することを実証する。
【表１１】
2021521841.tif 000013
【０３９８】
別の実験では、実施例２と同様に処理したＴ細胞を、トランスフェクション後１２日目に、ＣＡＲの各々の細胞外抗体部分を認識する抗マウス抗体で染色し、次にフローサイトメトリー分析によって、ＣＡＲ発現について評価した。抗マウス可変鎖ＣＡＲ検出試薬がマウスＴＣＲ抗体と干渉するので、α／β  ＴＣＲ発現は、この実験では評価しなかった。Ｔ細胞の１８％〜３０％がＣＡＲを発現した（表１２）。
【表１２】
2021521841.tif 000014
（実施例５）
より多くのＡＡＶは、より多くのＣＡＲ陽性細胞を与える
【０３９９】
形質導入に使用したＡＡＶドナーの量の、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現に対する効果を評価するために、Ｔ細胞を、実施例２と同様であるが、２５，０００、５０，０００または１００，０００のＭＯＩで編集した。細胞を、編集の５日後に、抗α／β  ＴＣＲ抗体およびビオチニル化ＢＣＭＡ／ストレプトアビジン−ＰＥで同時染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＴＲＡＣターゲティングＲＮＰで処理した場合、細胞の９５％よりも多くがＴＣＲ発現を欠き、Ｔ細胞の２０％〜６０％が抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現し、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ＋細胞の量は、ＡＡＶドナーＭＯＩと正に相関した（表１３）。これらの結果は、ＡＡＶドナーＭＯＩの、ドナー組込み効率に対する用量応答を実証する。
【表１３】
2021521841.tif 000015
（実施例６）
抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ発現細胞に対して細胞傷害性である
【０４００】
この実施例は、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のＢＣＭＡ発現細胞に対する細胞傷害性を実証する。Ｔ細胞に、ＴＲＡＣ３またはＴＲＡＣ１  ｓｇＲＮＡのいずれかを含有するＲＮＰをトランスフェクトし、その後、対応するＡＡＶドナー（α−ＢＣＭＡ／ＣＤ２８／ＣＤ３ｚ  ＴＲＡＣ１、配列番号２１；α−ＢＣＭＡ／ＣＤ２８／ＣＤ３ｚ  ＴＲＡＣ３、配列番号２０；またはα−ＢＣＭＡ／４１ＢＢ／ＣＤ３ｚ−ＣＩＳＣβ  ＴＲＡＣ１、配列番号３６）を５０，０００のＭＯＩで感染させた。トランスフェクションの１４日後（ＴＲＡＣ１  ｓｇＲＮＡ）または２２日後（ＴＲＡＣ３  ｓｇＲＮＡ）のいずれかに、Ｔ細胞を、標的細胞としての野生型Ｋ５６２細胞（非ＢＣＭＡ発現）または非常に高いＢＣＭＡのＫ５６２（Ｋ５６２  ＶＨ−ＢＣＭＡ）細胞（ＢＣＭＡ発現）のいずれかによる８：１のエフェクター：標的比での細胞傷害性アッセイにおいて使用した。Ｋ５６２  ＶＨ−ＢＣＭＡ標的細胞生存率（ＤＡＰＩ染色によって決定される）は、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞との共培養後、９３％から２６％まで降下したが、Ｋ５６２標的細胞生存率は、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞との共培養後に約８２％のままであり（表１４）、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ発現細胞に対して細胞傷害性であること、および細胞傷害性は、ＢＣＭＡ発現に依存することを実証した。
【表１４】
2021521841.tif 000016
（実施例７）
細胞傷害性は、ＢＣＭＡに結合するＣＡＲを必要とする
【０４０１】
この実施例は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の、ＢＣＭＡ発現細胞に対する細胞傷害性は、ＢＣＭＡについてのＣＡＲ特異性に依存することを実証する。Ｔ細胞に、ＴＲＡＣ１  ｓｇＲＮＡを含有するＲＮＰをトランスフェクトし、その後、抗ＴＮＰ  ＣＡＲ（α−ＴＮＰ／ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  ＴＲＡＣ１、配列番号９２；またはα−ＴＮＰ／４１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  ＴＲＡＣ１、配列番号９３）をコードする対応するＡＡＶドナーまたは抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ（α−ＢＣＭＡ／ＣＤ２８／ＣＤ３ｚ  ＴＲＡＣ１、配列番号２１；またはα−ＢＣＭＡ／４１ＢＢ／ＣＤ３ｚ−ＣＩＳＣβ  ＴＲＡＣ１、配列番号３６）をコードする対応するＡＡＶドナーを５０，０００のＭＯＩで感染させた。トランスフェクションの１４日後、Ｔ細胞を、標的細胞としての非常に高いＢＣＭＡのＫ５６２（Ｋ５６２  ＶＨ−ＢＣＭＡ）による８：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比での細胞傷害性アッセイにおいて使用した。標的細胞生存率は、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞への曝露後、９３％から約４０％まで降下したが、抗ＴＮＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞への曝露は、生存率を約１０％低減させたのみであった（表１５）。これらの結果は、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性の、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ特異性に対する依存性を実証する。
【表１５】
2021521841.tif 000017
【０４０２】
４１ＢＢ共刺激ドメインを伴う抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物を使用して、ＣＡＲ特異的細胞傷害性をさらに実証するために追加の実験を行った。ＴＮＰ特異的またはＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれかを、上記に説明する通り、Ｋ５６２  ＶＨ−ＢＣＭＡ細胞と様々なＣＡＲ  Ｔ：標的細胞比（２：１〜１６：１）で共培養した。共培養後、細胞をＤＡＰＩで染色し、ＤＡＰＩ陽性およびＤＡＰＩ陰性細胞の頻度を測定した。ＢＣＭＡ特異的であるが、ＴＮＰ特異的でないＣＡＲ  Ｔ細胞への曝露は、培養物の生存率を、Ｅ：Ｔ比に大まかに比例して低下させ、１６：１のＥ：Ｔ比では約１３％の最下点に達した（表１６）。ＣＡＲ  Ｔ曝露の非存在下では、標的細胞は、９５％を超えて生存した（データは示していない）。これらの結果は、ＣＡＲ  Ｔエフェクター細胞の、ＢＣＭＡ発現標的細胞の死滅のための、ＢＣＭＡ特異性の必要性をさらに実証する。
【表１６】
2021521841.tif 000018
（実施例８）
ＩＬ２ＲＧ遺伝子座への標的組込み
【０４０３】
この実施例は、遺伝子をターゲティングするｇＲＮＡと適合性のドナー鋳型とを使用したＩＬ２ＲＧ遺伝子への標的組込みを実証する。Ｔ細胞に、ＩＬ２ＲＧ遺伝子のエクソン６をターゲティングするＧＣ８、ＧＣ１０またはＧＣ１２  ｓｇＲＮＡを含有するＲＮＰをトランスフェクトし、その後、ＦＲＢ／ｔＬＮＧＦＲ／ＣＮｂ３０／ＣＩＳＣ−ガンマドナーＡＡＶ（配列番号４０）を５０，０００のＭＯＩで感染させた。ＲＮＰのみおよびＡＡＶのみの条件を対照として含めた。トランスフェクションの１．５日後、細胞を、抗ＩＬ２ＲＧおよび抗ＬＮＧＦＲ抗体で同時染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＧＣ８、ＧＣ１０およびＧＣ１２  ｓｇＲＮＡを使用した場合、それぞれ、細胞の４、４および６パーセントがｔＬＮＧＦＲ導入遺伝子を発現した（表１７）。全てのＲＮＰ処理した試料について、細胞の８５％よりも多くが、ＩＬ２ＲＧ発現を失った。
【表１７】
2021521841.tif 000019
【０４０４】
別の実験では、Ｔ細胞に、ＧＣ８、ＧＣ１０またはＧＣ１２  ｓｇＲＮＡを含有するＲＮＰをトランスフェクトし、その後、組み込まれた導入遺伝子の再切断を防ぐためおよび正しい相同性依存性ＤＮＡ修復を促進するために突然変異させた対応するｓｇＲＮＡ特異的ＦＲＢ／ｔＬＮＧＦＲ／ＣＮｂ３０／ＣＩＳＣ−ガンマドナーＡＡＶ（例えば、ＧＣ８、ＧＣ１０またはＧＣ１２  ｓｇＲＮＡについて、それぞれ、配列番号４１、４２または４３）を、例えば、５０，０００のＭＯＩで感染させる。トランスフェクション後（例えば、トランスフェクションの１．５日後）、細胞を、抗ＩＬ２ＲＧおよび抗ＬＮＧＦＲ抗体で同時染色し、フローサイトメトリーによって、ｔＬＮＧＦＲ導入遺伝子発現およびＩＬ２ＲＧ発現について分析する。
（実施例９）
ＴＲＡＣ遺伝子およびＩＬ２ＲＧ遺伝子への同時ＴＩ
【０４０５】
Ｔ細胞に、ＴＲＡＣターゲティングＲＮＰ（例えば、ＴＲＡＣ３、ＴＲＡＣ２またはＴＲＡＣ１  ＲＮＰ）を、ＩＬ２ＲＧターゲティングＲＮＰ（例えば、ＧＣ８、ＧＣ１０またはＧＣ１２  ＲＮＰ）と共にトランスフェクトする。トランスフェクション後（例えば、トランスフェクションの３０分後）、細胞に、ＴＲＡＣ遺伝子にターゲティングされた抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ／ＣＩＳＣ−ｂをコードするドナーＡＡＶ（例えば、配列番号２８〜３９）およびＩＬ２ＲＧ遺伝子にターゲティングされたＦＲＢ／ｔＬＮＧＦＲ／ＣＮｂ３０／ＣＩＳＣ−ガンマをコードするドナーＡＡＶ（例えば、配列番号４０〜４４）を（例えば、両方とも５０，０００のＭＯＩで）感染させる。細胞を、ラパマイシンまたはラパログ（例えば、１ｎＭラパマイシン）を含有する培地に回復し、ラパマイシン／ラパログ含有培地で維持する。細胞を、トランスフェクション後（例えば、トランスフェクションの５日後）、フローサイトメトリーによって、ＴＲＡＣ発現、ＣＡＲ発現、ＩＬ２ＲＧ発現および／またはｔＬＮＧＦＲ発現についてアッセイする。
【０４０６】
二重標的組込みの効率を例示するためにフローサイトメトリーを行った。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで３日間刺激し、ビーズを除去し、次いで、１日後に、細胞をＴＲＡＣ１  ＲＮＰ＋ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−ＣＩＳＣβ  ＡＡＶおよびＩＬ２ＲＧ  ＧＣ１２  ＲＮＰ＋ＦＲＢ−ｔＬＮＧＦＲ−ＣＮｂ３０−ＣＩＳＣγ  ＡＡＶで処理した。ドナーＡＡＶを、２５，０００の感染多重度で使用し；ＴＲＡＣ１  ＲＮＰは、３０ｐｍｏｌのガイドＲＮＡおよび６ｐｍｏｌのＣａｓ９を含有し；ＩＬ２ＲＧ  ＧＣ１２  ＲＮＰは、６０ｐｍｏｌのガイドＲＮＡおよび１２ｐｍｏｌのＣａｓ９を含有した。細胞を、１ｎＭラパマイシンを含有する培地に回復し、ラパマイシン含有培地で維持した。処理の１、３および７日後、細胞を、フローサイトメトリーによって、ｔＬＮＧＦＲの存在について、および抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲの存在について分析した。これらの実験において、単一遺伝子座ターゲティングの効率は、約２０％からの範囲であり、一方で、二重ターゲティング頻度（例えば、両方の遺伝子座における同時標的組込み）は、約８％であった（表１８）。
【表１８】
2021521841.tif 000020
（実施例１０）
ＴＲＡＣおよびＩＬ２ＲＧへの同時ＴＩは、ＣＩＳＣ調節可能Ｔ細胞を与える
【０４０７】
実施例９からの改変細胞または対応する非改変細胞を、ラパマイシンの存在下で、例えば、２週間または少なくとも１００倍拡張まで拡張する。この拡張後、細胞を、必要に応じてＩＬ−２を補充した（例えば、１００ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−２）ラパマイシン非含有培地に移し、細胞の生存率をモニターする（例えば、７日間毎日モニターする）。
（実施例１１）
ＴＲＡＣおよびＩＬ２ＲＧへの同時ＴＩは、シクロスポリン耐性細胞を与える
【０４０８】
実施例９からの改変細胞または対応する非改変細胞を、シクロスポリンＡおよびラパマイシン（またはラパログ）の存在下で増殖させ、細胞の増殖および／または生存率をモニターする。
（実施例１２）
ＴＲＡＣおよびＩＬ２ＲＧへの同時ＴＩは、ＢＣＭＡおよびＢ２Ｍ−ＣＡＲ発現細胞を与える
【０４０９】
Ｔ細胞に、ＴＲＡＣターゲティングＲＮＰ（例えば、ＴＲＡＣ３、ＴＲＡＣ２またはＴＲＡＣ１  ＲＮＰ）を、ＩＬ２ＲＧターゲティングＲＮＰ（例えば、ＧＣ８、ＧＣ１０またはＧＣ１２  ＲＮＰ）と共にトランスフェクトする。トランスフェクション後（例えば、トランスフェクションの３０分後）、細胞に、ＴＲＡＣにターゲティングされた抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ／ＣＩＳＣ−ｂをコードするドナーＡＡＶ（例えば、配列番号２８〜３９）、およびＩＬ２ＲＧにターゲティングされたＢ２Ｍ−ＣＡＲ／ＦＲＢ／ＣＮｂ３０／ＣＩＳＣ−ガンマをコードするドナーＡＡＶ（例えば、配列番号４４）を（例えば、両方とも５０，０００のＭＯＩで）感染させる。細胞を、ラパマイシン（例えば、１ｎＭラパマイシン）を含有する培地に回復し、ラパマイシン含有培地で維持する。トランスフェクション後（例えば、トランスフェクションの５日後）、細胞を、フローサイトメトリーによって、ＴＲＡＣ発現、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現、ＩＬ２ＲＧ発現および／またはＢ２Ｍ  ＣＡＲ発現についてアッセイする。
（実施例１３）
ＢＣＭＡ／Ｂ２Ｍ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、２つの異なる標的細胞種を死滅させる
【０４１０】
実施例１２からの改変細胞および対応する非改変細胞を、ＢＣＭＡ発現標的細胞、または改変細胞が由来する非関連Ｔ細胞ドナーに由来するＴリンパ球標的細胞による実施例６および７で説明する細胞傷害性アッセイにおいて使用する。
（実施例１４）
ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで多発性骨髄腫細胞を死滅させる
【０４１１】
実施例５および実施例９からの改変細胞を、確立された異種移植片多発性骨髄腫腫瘍（例えば、ＲＰＭＩ−８２２６細胞系またはＲＰＭＩ−８２２６細胞のＢＣＭＡ陰性プールに由来する）を有するＮＳＧマウスに静脈内注射する。腫瘍サイズをモニターする（例えば、注射後２週間毎日モニターする）。
【０４１２】
５００万個のＲＰＭＩ−８２２６細胞を、ＮＳＧマウスに移植し、腫瘍を形成させた。腫瘍成長の１９日後、マウスに、ＰＢＳ、８００万個のＴＮＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞または８００万個のＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を注射した。非処置マウス、抗ＴＮＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置したマウスおよび抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞による処置に応答した腫瘍の退縮を有するマウスを犠牲にし、腫瘍を解離させ、得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリーによって、各腫瘍に浸潤したＣＡＲ  Ｔ細胞のマーカーとしてのヒトＣＤ４５について分析した（ＣＤ４５は、白血球マーカーであり、ＲＰＭＩ−８２２６細胞では発現されない）。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置したマウスのみが、投与されたヒトＴ細胞の腫瘍浸潤を示し、腫瘍からの細胞の１２．００％がｈＣＤ４５＋であり、比較として対照マウスおよび抗ＴＮＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置したマウスについては、それぞれ０．０５％および０．１９％であった。このｈＣＤ４５＋細胞集団を、フローサイトメトリーによってヒトＣＤ８およびＣＡＲ発現についてさらに分析した。表１９で示す通り、ｈＣＤ４５＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の約９６％が、ＣＤ８＋であり、１４．６６％が、ＣＤ８＋およびＣＡＲ＋であった。これらの結果は、投与されたリンパ球の腫瘍浸潤は、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞処置特異的であったことを実証する。ＬＡＧ３、ＴＩＭ３およびＰＤ１等の疲弊マーカーは、検出不能であった（データは示していない）。
【表１９】
2021521841.tif 000021
（実施例１５）
ＣＡＲ特異的および抗原特異的Ｔ細胞脱顆粒
【０４１３】
ＣＡＲを発現するように編集されたＴ細胞における脱顆粒を評価するために、抗ＴＮＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞または抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、抗ＣＤ１０７ａ抗体（ＣＤ１０７ａは、細胞傷害性Ｔ細胞における脱顆粒のマーカーである）およびモネンシン（ＣＤ１０７ａの内部移行を防ぐため）の存在下でＢＣＭＡタンパク質、Ｋ５６２細胞またはＫ５６２  ＶＨ−ＢＣＭＡ細胞と１８時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、フローサイトメトリーによってＣＤ１０７ａ発現について分析し、結果を表２０に示す。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞＋ＢＣＭＡタンパク質条件における抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞のパーセンテージは、２５％であり（データは示していない）、この条件における脱顆粒した細胞のパーセンテージは、２２％であり、ＢＣＭＡタンパク質で処理した抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞のほとんど全てが、脱顆粒について活性化されたことを示唆した。対照的に、抗ＴＮＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞＋ＢＣＭＡタンパク質条件における細胞の０．２４％のみが、脱顆粒された。これらの結果は、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞についてのＣＡＲ特異的抗原特異的Ｔ細胞脱顆粒を実証する。Ｋ５６２  ＶＨ−ＢＣＭＡ細胞では、より弱い刺激が観察され、脱顆粒は依然として、標的特異的かつＣＡＲ特異的であった。
【表２０】
2021521841.tif 000022
【表２１−１】
2021521841.tif 000023
【表２１−２】
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【表２１−３】
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【表２１−４】
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【表２１−５】
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【表２１−６】
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【表２１−７】
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【表２１−８】
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【表２１−９】
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【表２１−１０】
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【表２１−１１】
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【表２１−１２】
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【表２１−１３】
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【表２１−１４】
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【表２１−１５】
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【表２１−１６】
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【表２１−１７】
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【表２１−１８】
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【表２１−１９】
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【表２１−２０】
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【表２１−２１】
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【表２１−２２】
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【表２１−２３】
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【表２１−２４】
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【表２１−２５】
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【表２１−２６】
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【表２１−２７】
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【表２１−２８】
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【表２１−２９】
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【表２１−３０】
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【表２１−３１】
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【表２１−３２】
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【表２１−３３】
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【表２１−３４】
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【表２１−３５】
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【表２１−３６】
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【表２１−３７】
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【表２１−３８】
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【表２１−３９】
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【表２１−４０】
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【表２１−４１】
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【表２１−４２】
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【表２１−４３】
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【表２１−４４】
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【表２１−４５】
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【図１−１】
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【図１−２】
2021521841.tif 000069
【配列表】
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【国際調査報告】
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