(57)【要約】  細胞に核酸治療薬を送達するための試薬組成物が提供される。試薬はイオン化可能な脂質、構造脂質、および核酸のトランスフェクション効率を改善し、トランスフェクトされた細胞を生存可能なままにする安定化剤を含む。５トランスフェクション試薬は、プラスミドおよびｍＲＮＡ送達、ならびにニューロンおよび前駆細胞様細胞において有効である。それは、エクスビボ細胞治療に使用することができる。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
３５〜５０モル％のイオン化可能な脂質またはその薬学的に許容される塩と、
１５〜２５モル％の構造脂質と、
３５〜４１モル％のステロールと、
０．５〜約１０モル％の安定剤を含むトランスフェクション試薬組成物。
【請求項２】
前記イオン化可能な脂質が、アミノ脂質またはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
安定化剤が、２つ以上の界面活性剤を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
安定化剤がポリソルベートである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
安定化剤がポリソルベート８０である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
安定化剤がマルトシドである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項７】
安定化剤がポリソルベートの混合物である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項８】
安定化剤がポリソルベートとマルトシドの混合物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
安定化剤が、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、およびトリデシル−Ｄ−マルトシドの混合物である、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
前記混合物におけるポリソルベート８０、ポリソルベート２０、およびトリデシル−Ｄ−マルトシドの比率が等しい、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
イオン化可能な脂質が組成物の約４０モル％を構成する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
安定化剤が組成物の約０．５〜５モル％を構成する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
ステロールがコレステロールである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
核酸またはペプチドをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＲＮＡを発現することができるプラスミドである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記イオン化可能な脂質が、ＢＯＣＨＤ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＫＣ２、ＭＣ３、ａ−Ｄ−トコフェロルスクシノイルおよびＤＯＤＭＡ、またはその薬学的に許容される塩から選択される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
構造脂質が、１，２ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）またはＤＳＰＥまたはＤＳＰＣである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が、約１５ｎｍ〜約３００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子の形態で存在する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
ｉＰＳＣまたはｉＰＳＣ様細胞を、核酸の活性および細胞の生存率を維持しながら、核酸治療剤でトランスフェクトするための方法であって、細胞を請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物と接触させるステップを含む、方法。
【請求項２０】
核酸の活性および細胞の生存率を維持しながら、ニューロン細胞を核酸治療剤でトランスフェクトするための方法であって、細胞を請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物と接触させるステップを含む、方法。
【請求項２１】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
細胞がヒト由来細胞型である、請求項１９または２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、細胞への活性核酸の導入である。
【背景技術】
【０００２】
ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの形態の核酸は、その発現を妨害することによって、またはその発現を回復もしくは増大させることによって、または遺伝子を編集することによって、特定の遺伝的標的に処置を集中させるために使用され得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
核酸を細胞または組織に送達することは、核酸が比較的大きく、負に荷電し、細胞膜を横切って受動的に拡散することができず、ヌクレアーゼに対しても脆弱である親水性化合物であるため、課題を提示する（Ａｋｈｔａｒ，  Ｂａｓｕ  Ｓ  Ｆａｕ−Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１）。
【０００４】
これらの核酸を細胞膜を横切って送達するための既存のアプローチには遺伝子回復のためのベクターとしてアデノ随伴ウイルスなどのウイルスが含まれるが、これらは処理された個体において免疫応答を引き起こす可能性がある（ＭｉｎｇｏｚｚｉおよびＨｉｇｈ  ２０１３）。イオン化可能な脂質およびポリマーも実験に使用されてきたが、各々はトランスフェクション効率、安定性および毒性の問題を有する（Ｌｖ、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６）。核酸の治療活性を増大させるために、当分野における重要な努力は細胞への核酸の効率的なカプセル化および送達のために、イオン化可能なカチオン性脂質（「イオン化可能な脂質」または「カチオン性脂質」としても知られる）およびＰＥＧ化脂質を含むイオン化可能な脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に焦点を当ててきた（Ｔａｍ，  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３，Ｋａｕｆｆｍａｎ，Ｗｅｂｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５）。
【０００５】
脂質粒子は核酸の治療活性に有利に働くように、異なる薬物動態学、組織における異なる生体分布、生分解性、または変化した毒性を得るように操作されている。
【０００６】
ｉＰＳＣまたはｉＰＳＣ様細胞の生成は、ドナーまたは患者の体細胞への鍵となるリプログラミング因子の導入を含む。安定なｉＰＳＣクローンがうまく樹立されれば、研究または臨床応用のためにほとんどの細胞型に分化する可能性がある。ｉＰＳＣイノベーションの出現は汎用性のある生理学的に関連するインビトロ系として、疾患モデリング、創薬および細胞に基づく治療の分野に、これまでにない可能性を提供する。ｉＰＳＣ技術の利点は神経科学の分野において特に関連性があり、一次組織を使用する実験モデルは実現可能ではなく、小動物モデルは、複雑なヒト神経解剖学を適切に反映しない。
【０００７】
ｉＰＳＣ由来ニューロンは、一次ニューロンと多くの形態学的、生化学的および機能的類似性を示す。しかしながら、神経細胞を含むが、これらに限定されない末端分化細胞はそれらの感受性および増殖不能性のために、それらの生存性を保持しながら、トランスフェクトする（又は、トランスフェクションする／transfect）ことが通常困難である。エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈、リポフェクションおよびヌクレオフェクションのような現在の方法はトランスフェクションおよび再プログラミングされた細胞が臨床的に関連性があることが見出されており、神経変性障害、ＣＮＳ障害および幹細胞移植における適用を有するという事実にもかかわらず、しばしば、高い速度の細胞死を生じ、この理由のために、研究者らおよび細胞への核酸送達に対する適切な代替物を見出すための遺伝子治療に関心を持っている者らである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、３５−５０モル％のイオン化可能な脂質またはその薬学的に許容される塩と、１５〜２５モル％の構造脂質と、３５〜４１モル％のステロールと、０．５〜約１０モル％の安定剤を含むトランスフェクション（又は、移入／transfection）試薬組成物が提供される。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質がアミノ脂質またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの実施形態では、安定化剤が２つ以上の界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、安定化剤がポリソルベート（８０）などのポリソルベート、またはポリソルベートの混合物である。いくつかの実施形態では、安定化剤はマルトシドである。いくつかの実施形態では、安定化剤がポリソルベートとマルトシドとの混合物である。好ましい実施形態において、安定化剤は、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、およびトリデシル−Ｄ−マルトシドの混合物である。３つの成分の比は、一実施形態では等しい（１：１：１）。実施形態において、イオン化可能な脂質は、組成物の約４０モル％を含む。実施形態において、安定化剤は、組成物の約０．５〜５モル％である。いくつかの実施形態では、ステロールはコレステロールである。本発明によれば、核酸またはペプチドをさらに含む、上記の組成物が提供される。実施形態において、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＲＮＡを発現し得るプラスミドである。いくつかの実施形態において、イオン化可能な脂質はＢＯＣＨＤ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＫＣ２、ＭＣ３、α−Ｄ−トコフェロールスクシノイルおよびＤＯＤＭＡから選択され、実施形態において、イオン化可能な脂質はその薬学的に許容される塩の形態である。実施形態では構造脂質が１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）であり、他の実施形態ではＤＳＰＥまたはＤＳＰＣである。いくつかの実施形態では、組成物が約１５ｎｍ〜約３００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子の形態である。
【０００９】
本発明の実施形態によれば、細胞を上記の組成物と接触させることによって、核酸の活性および細胞の生存率を維持しながら、ｉＰＳＣまたはｉＰＳＣ様細胞を核酸治療剤でトランスフェクトするための方法が提供される。
【００１０】
本発明の別の実施形態によれば、細胞を上記の組成物と接触させることによって、核酸の活性および細胞の生存率を維持しながら、核酸治療薬でニューロン細胞をトランスフェクトするための方法が提供される。実施形態において、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒトであるか、またはヒトから得られる。
【００１１】
本発明の他の態様および特徴は添付の図面と併せて本発明の特定の実施形態の以下の説明を検討することにより、当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
図１Ａ〜１Ｆはヒト神経前駆細胞に由来し、ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ａ（図１Ａ）、ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸＴＢＤ（図１Ｂ）、ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸＴ２０（図１Ｃ）、ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸＴ８０（図１Ｄ）、ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｋ（図１Ｅ）、およびＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｌ（図１Ｆ）を使用して調製されたプラスミドＧＦＰ−ＬＮＰでトランスフェクトされたＤＩＶ１４成熟ニューロンの「ＧＦＰマスク」位相コントラスト画像の白黒ネガティブ表現である。プラスミド−ＧＦＰ脂質粒子（脂質（Ｎ）：核酸（Ｐ）、比４）を、トランスフェクションの７２時間後に画像化した。長いひも状の突起は神経突起（軸索と樹状突起）で、球状要素は細胞体（細胞体）である。
図２はＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｓ３装置を用いて撮影された、ＤＩＶ１４における成熟ニューロンの白黒ネガティブ位相差顕微鏡画像であり、研究で使用されたものを代表する。
図３Ａ〜３Ｃは、ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ａ（３Ｂ）を用いて調製したプラスミドＧＦＰ−ＬＮＰ、またはＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｌ（３Ｃ）を用いて調製したプラスミドＧＦＰ−ＬＮＰでの処理後、ＤＩＶ１４、未処理（３Ａ）、および４８時間でＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）機器を用いて撮影したｉＰＳＣ由来ニューロンの代表的な位相コントラスト黒および白ネガティブ画像である。
図４Ａ〜４Ｄは４日目にＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｓ３機器を用い、未処理（４Ａ）、およびＮ／Ｐ６（４Ｂ）のＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ａ、Ｎ／Ｐ６（４Ｃ）のＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｌ、またはＧＦＰをコードするプラスミドを含むＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（４Ｄ）からなる脂質粒子での処理の４８時間後に撮影した、ｉＰＳＣ由来神経前駆細胞の黒色および白色のネガティブ位相コントラスト画像である。
図５は、ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ａ、ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｔ２０、ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｔ８０、ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｋ、またはＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｌを用いて調製したプラスミドＧＦＰ−ＬＮＰ（Ｎ／Ｐ４）での処置後０〜１４４時間で捕捉した画像からの、ＤＩＶ１４でＧＦＰを発現するｉＰＳＣ由来ニューロンのパーセンテージのグラフである。
図６は、ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ａ、ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｔ２０、ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｔ８０、ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｋ、またはＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｌを用いて調製したプラスミドＧＦＰ−ＬＮＰ（Ｎ／Ｐ４）での処理後０〜１４４時間で、ＤＩＶ１４で捕捉されたｉＰＳＣ由来ニューロンにおける、神経突起を発現するＧＦＰの長さ／ｍｍ２を示すグラフである。
図７は脂質混合物ＡおよびＵｐｉｄ混合物Ｌを用いて調製された２５０ｎｇ／ｍＬに相当する濃度での、処理なし、およびｍＲＮＡ−ＬＮＰ（Ｎ／Ｐ４）での処理後のＧＦＰ発現ｉＰＳＣのパーセンテージを示す棒グラフである。
図８Ａは、個々の界面活性剤Ｔｗｅｅｎ  ２０およびＴｗｅｅｎ  ８０、ならびにＴｗｅｅｎ  ２０およびＴｗｅｅｎ  ８０の両方の界面活性剤組合せを有するＬＮＰ組成物を使用した、神経前駆細胞におけるＧＦＰのプラスミド媒介発現の効果を示す棒グラフである。
図８Ｂは、個々の界面活性剤Ｍｙｒｊ５２（Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  Ａ）、Ｔｗｅｅｎ  ２０、およびＴｗｅｅｎ  ８０を用いたＬＮＰ組成物を用いた、神経前駆細胞におけるＧＦＰのプラスミド媒介発現の効果を示す棒グラフである。
図９Ａは２つの類似のＬＮＰ組成物を使用するが、２つの異なるイオン化可能な脂質を含む、神経前駆細胞におけるＧＦＰのｍＲＮＡ媒介発現（平均蛍光強度）を示す棒グラフであり。図９Ｂは２つの異なるイオン化可能な脂質を含む、２つの類似のＬＮＰ組成物を使用する、神経前駆細胞におけるＧＦＰのｍＲＮＡ媒介発現（平均蛍光強度）を示す棒グラフである。
図１０は未処理対照、Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  Ｌ、Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  Ｋ、およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）処理ＮＰＣについて、１４４時間にわたるＬＮＰ処理ＮＰＣ増殖（ディッシュ中のコンフルエンス）を比較する線グラフである。
図１１は、フローサイトメトリーによって測定されたＮＰＣ中のＧＦＰレベルを示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、脂質ミックス組成物、核酸治療薬およびペプチドなどの他のオリゴマーの脂質ベースの製剤（formulation）を生成する際のそれらの使用、ならびにトランスフェクション耐性細胞型を克服するためにこれらの脂質ミックスおよび得られる製剤を使用するための方法を提供する。
【００１４】
別の態様では、本発明の脂質混合組成物が核酸治療薬と混合して、標的細胞または組織への核酸の送達を増強する脂質核酸粒子を作製するために提供され、より伝統的な脂質混合組成物または脂質核酸粒子（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）トランスフェクション剤のような市販の脂質混合物から作製されるもの）よりも毒性が少ない。
【００１５】
別の局面において、本発明は、イオン化可能な脂質、１つ以上の構造脂質、コレステロール、および洗剤の特定の安定化混合物を含む脂質混合物組成物を提供する。
【００１６】
別の態様では、本発明による脂質混合組成物が中枢神経系の疾患の治療のための、または細胞再プログラミングのための、または患者細胞のエクスビボ形質転換のための、核酸およびペプチド治療薬を製剤化するために提供される。
【００１７】
「脂質」は、脂肪酸誘導体またはステロールであるか、または脂質様物質（例Ｃ１２〜２００）であり得、水に不溶性であるが多くの有機溶媒に可溶性であることを特徴とする有機化合物の構造的に多様な群を指す。
【００１８】
「脂質粒子」。本発明は、上記の脂質混合組成物から製造された脂質粒子を提供する。いくつかの実施形態では、脂質粒子は治療薬を含有する。脂質粒子は、脂質、核酸、コレステロールおよび安定化剤の集合体である。正および負の電荷、比、ならびに親水性および疎水性は、成分のサイズおよび配向に関して脂質粒子の物理的構造を決定する。これらの脂質粒子の構造的組織化は、リポソーム中のように最小の二重層を有する水性内部をもたらし得るか、または固体核酸脂質ナノ粒子中のように固体内部を含有し得る。
【００１９】
「イオン化可能な脂質」。脂質粒子は、イオン化可能な脂質を含む。本明細書中で使用される場合、「イオン化可能な脂質」という用語はｐＨが脂質のイオン化可能基のｐＫ未満に低下することにつれてカチオン性であるか、またはイオン化可能（プロトン化される）になる脂質を指すが、より高いｐＨ値では漸進的に中性である。ｐＫ未満のｐＨ値では脂質が次いで、負に荷電した核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）と会合することができる。本明細書中で使用される場合、「イオン化可能な脂質」という用語はｐＨ低下で正電荷を呈する双性イオン性脂質、および生理学的ｐＨなどの選択的ｐＨで正味の正電荷を担う多数の脂質種のいずれをも含む。このような脂質にはＮ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）−Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；３−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、およびＮ−（１，２−ジミリスチロキシプロップ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２０】
「バイアビリティ（又は、活力／生存能力／viability」はインビトロの細胞を参照する場合、細胞型または組織培養株について正常であるように、成長し続け、分裂し、成長および分裂を続ける能力を意味する。細胞のバイアビリティ（又は、細胞の生存率）は、過酷な状態または処置によって影響される。細胞生存率は非臨床の場では必ずしも重要ではないが、エクスビボ療法や非経口投与では極めて重要である。
【００２１】
好ましい実施形態では、イオン化可能な脂質はアミノ脂質である。本発明において有用な適切なアミノ脂質は、その全体が参照により本明細書に組み込まれているＷＯ／２００９／０９６５５８に記載されているものを含む。
代表的なアミノ脂質としては、１，２−ジリノレオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド（ＤＬｉｎ−ＴＡＰＯＯＡＣＩ）、１，２−ジリノレオイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）３−（Ｎ，Ｎ−ジリノールアミノ）−ｌ，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−ｌ，２−プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイル−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［ｌ，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、および１，２−ジオレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパンが挙げられる。
【００２２】
他の実施形態では、Almarsson Orn及び Lawlor, Ciarian PatricによってＵＳ２０１８００００９５３で参照されるより新しいイオン化可能な脂質、例えば、３−（ジドデシルアミノ）−Ｎ１，４−トリドデシル−１−ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、１４，２５−ジトリデシル−１５，１８，２１，２４−テトラアザ−オクタトリアンタン（ＫＬ２５）、２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−イルオキシ｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−ｌ−イルオキシ］プロパン−１−アミン（Ｏｃｔｙｌ−ＣＬｉｎ  ＤＭＡ）、（２Ｒ）−２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−ｌ−イルオキシ］プロパン−ｌ−アミン（Ｏｃｔｙｌ−ＣＬｉｎ  ＤＭＡ（２Ｒ））、および（２Ｓ）−２−｛［β］  ５‐エン‐３‐イルオキシ］オクチル｝オキシ）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐［（９Ｚ，ｌ２Ｚ）‐オクタデカ‐９，１２‐ジエン‐ｌ‐イルオキシ］プロパン‐１‐アミン（Ｏｃｔｙｌ‐ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））を用いた。
【００２３】
さらに他の実施形態において、イオン化可能な脂質様材料はKaufmannおよびその同僚（Kaufmann k 2015）によって記載されるように、Ｃ１２−２００である：
2021521861.tif 000003
【００２４】
本発明の好ましい実施形態において、イオン化可能な脂質は、１，１７−ビス（２オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート塩酸塩（ＢＯＣＨＤＣ３−ＤＭＡ）である。この化合物は、米国特許出願公開第２０１３３２３２６９号に開示されている。他の好ましい実施形態において、イオン化可能な脂質は、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＳＳ−ＥＰ４Ｃ２．Ｃａｔ  ＮｏＳＳ−ＥＣ、または「α−Ｄ−トコフェロールスクシノイル」である。
【００２５】
イオン化可能な脂質は好ましくは約３５〜約４５モル％、最も好ましくは４０モル％（「モル％」は特定の成分の全モルの百分率を意味する）の量を含む。
【００２６】
構造脂質。本発明の組成物および脂質粒子は、組成物の約２０モル％で１つ以上の構造脂質を含む。適切な構造脂質は、製造中の粒子の形成を支持する。構造脂質は、生理学的ｐＨでアニオン性、非荷電または中性双性イオン形態のいずれかで存在する多数の脂質種のいずれか１つを指す。代表的な構造脂質としては、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルグリセロール、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドが挙げられる。
【００２７】
例示的な構造脂質には、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジアルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−ｔｒａｎｓ  Ｐ１−ステアリオイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）および１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファタノールアミン（ｔｒａｎｓＤＯＰＥ）Ｅが含まれる。好ましい一実施形態では、構造脂質が１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。
【００２８】
別の実施形態では、構造脂質が生理学的ｐＨで負に帯電している任意の脂質である。これらの脂質には、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、カルジオリピン、ホスファチジルイノシトール、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジル酸、および中性脂質に結合した他のアニオン性修飾基などのホスファチジルグリセロールが含まれる。
【００２９】
他の適切な構造脂質としては、糖脂質（例えば、モノシアロガングリオシドＧＭｉ）が挙げられる。
【００３０】
安定化剤はとりわけ、混合物の完全性を確実にするために、脂質混合物組成物および脂質核酸実施形態に含まれる。本発明の好ましい態様において、安定化剤は洗剤（又は、デタージェント／detergent）である。界面活性剤は、分子間の疎水性−親水性相互作用を破壊するかまたは形成するのを助ける分子のクラスである。適切な洗浄剤は、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０としても知られる）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、またはＩＵＰＡＣ名２−［２−［３，４−ビス（２−ヒドロキシエトキシ）オキソラン−２−イル］−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］ドデカノエート、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０としても知られる）、ＩＵＰＡＣ名２−［２−［３，４−ビス（２−ヒドロキシエトキシ）オキソラン−２−イル］−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エチルオクタデク−９−エノエート、およびｎ−デシル−β−Ｄマルトピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、および６−シクロヘキシル−１−ヘキシル−β−Ｄ−マルトピラノシドなどのマルトシドを含む。
【００３１】
好ましい態様において、安定化剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、およびトリデシルβ−Ｄ−マルトシドを組み合わせたものである。いくつかの実施形態では、これらの３つの成分が重量比で１：１：１の割合で組み合わされる。いくつかの実施形態において、３つの界面活性剤の組み合わせは、あわせて全体の脂質混合物の０．５〜１０モル％を構成する。
【００３２】
ある態様において、３つの洗剤の組み合わせは、あわせて全体の脂質混合物の１〜３Ｍｏｌ％を構成する。いくつかの実施形態では、３つの界面活性剤の組み合わせはあわせて脂質混合物全体の０．５〜２．５モル％を構成する。
【００３３】
ステロールは好ましい脂質混合組成物に含まれ、それから作製される脂質粒子はコレステロールおよびフィトステロールなどのステロールを含む。本発明の脂質混合物において、コレステロールは、いくつかの実施形態において、最終脂質混合物の３０〜５０Ｍｏｌ％で存在する。あるいは、コレステロールが最終脂質混合物の３５〜４１モル％で存在する。コレステロールは、様々な好ましい実施形態において、３５．９、３７．５、３８、３９、および３９．４モル％として存在する。
【００３４】
ペプチド。本発明の脂質混合物組成物および脂質粒子は、ペプチドの全身送達または局所送達に有用である。本明細書中で使用される場合、用語「治療ペプチド」は、その細胞への送達が所望の効果を引き起こす任意のアミノ酸鎖を含むことを意味する。ペプチドは長鎖（５０アミノ酸以上）を有するタンパク質とは対照的に、長さ２〜５０アミノ酸のアミノ酸の短鎖であり、しばしば三次および／または四次構造を有する。ペプチド中のアミノ酸は、ペプチド結合と呼ばれる結合によって配列中で互いに連結されている。
【００３５】
核酸。本発明の脂質混合物組成物および脂質粒子は、核酸の全身送達または局所送達に有用である。本明細書中で使用される場合、用語「核酸治療剤」（ＮＡＴ）は、細胞への送達が所望の効果を引き起こす任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことを意味する。５０ヌクレオチドまでを含む断片は、一般にオリゴヌクレオチドと呼ばれ、より長い断片はポリヌクレオチドと呼ばれる。特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドが２０〜５０ヌクレオチドの長さである。本発明の実施形態では、オリゴヌクレオチドがメッセンジャーＲＮＡの場合のように、長さが９９６〜４５００ヌクレオチドである。
【００３６】
現在、ＮＡＴは、増加しつつある前臨床試験および臨床試験で積極的に追求されている。これらのＮＡＴには、デオキシリボ核酸、相補的デオキシリボ核酸、完全遺伝子、リボ核酸、オリゴヌクレオチド、および癌、感染症、遺伝障害および神経変性疾患などの様々な疾患を標的とする遺伝子治療のためのリボザイムが含まれる。本明細書中に記載されるように、核酸治療剤（ＮＡＴ）は、その形成の間に脂質粒子に組み込まれる。
【００３７】
本発明による脂質粒子中に存在する核酸は、公知の任意の形態の核酸を含む。本明細書中で使用される核酸は、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであり得る。二本鎖ＤＮＡの例には、構造遺伝子、制御領域および終結領域を含む遺伝子、およびウイルスまたはプラスミドＤＮＡのような自己複製系が含まれる。二本鎖ＲＮＡの例には、ｓｉＲＮＡおよび他のＲＮＡ干渉試薬が含まれる。一本鎖核酸には、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡ、ｍＲＮＡ、および三重鎖形成オリゴヌクレオチドが含まれる。
【００３８】
プラスミドＤＮＡは、本発明の実施形態において処方される好ましい核酸である。プラスミドとは、細胞内の染色体ＤＮＡとは別個のＤＮＡ分子であり、独立に複製することができる。プラスミドは、１０００ヌクレオチド未満〜数万ヌクレオチドのサイズの範囲である。最も一般的な形態は、小さな環状の二本鎖ＤＮＡである。プラスミドを合成し、治療目的で哺乳動物細胞に送達することができる。合成プラスミドは、宿主生物内で組換えＤＮＡ配列の複製を駆動するのに役立つ、分子クローニングにおけるベクターとして使用される。
【００３９】
プラスミドは、エレクトロポレーションのような物理的な方法、または脂質粒子増強トランスフェクションによる化学的手段を用いた形質転換によって細胞に導入することができる。これらの脂質ベースのベクター系は物理的技術を超えるいくつかの利点を有し、これには、ｉ）細胞系および組織系における高い生体適合性および低い毒性、ｉｉ）製造の比較的容易さ、ｉｉｉ）親油性マトリックスがポリマー系において観察される浸食現象に対してあまり感受性でないこと、ｉｖ）免疫系からのそれらの不可視性のために、インビボでの循環半減期の増加が挙げられる。
【００４０】
したがって、一実施形態では、核酸治療薬（ＮＡＴ）がプラスミドまたは環状核酸構築物である。別の実施形態では、ＮＡＴはレプリコンである。一実施形態では、ＮＡＴはｍＲＮＡである。
【００４１】
用語「核酸」はまた、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾リン酸−糖−骨格オリゴヌクレオチド、他のヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、およびそれらの組み合わせを指し、一本鎖、二本鎖、または適宜二本鎖および一本鎖配列の両方の部分を含むことができる。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は互換的に使用され、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合結合（例えば、３’−５’および２’−５’）、逆結合（例えば、３’−３’および５’−５’）、分岐構造、またはヌクレオチド間アナログによって連結された２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含む、ヌクレオチドモノマーの一本鎖および二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、Ｈ＋、ＮＨ４＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋などの関連する対イオンを有する。ポリヌクレオチドは、完全にデオキシリボヌクレオチド、完全にリボヌクレオチド、またはそれらのキメラ混合物から構成され得る。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド間、核酸塩基および／または糖アナログから構成され得る。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、「核酸」は、ヌクレオチドまたはそのアナログから形成される骨格を有する、核酸塩基配列含有ポリマーまたはポリマーセグメントである。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「Ｎ／Ｐ」は、ｍＲＮＡ／ＤＮＡのリン酸基のモルに対するイオン化可能な脂質のアミン基のモル比である。本発明の実施形態では、Ｎ／Ｐ比はＮ／Ｐ３〜Ｎ／Ｐ７であり、最も好ましい比はＮ／Ｐ４〜Ｎ／Ｐ６である。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態による脂質粒子は、電子顕微鏡法によって特徴付けることができる。実質的に固体のコアを有する本発明の粒子は電子顕微鏡で見られるように、電子密度の高いコアを有する。そのような構造の１つがＣｕｌｌｉｓらによる米国特許Ｎｏ．９，７５８，７９５に開示されている。電子密度は、（２−Ｄ極低温ＥＭ画像で見られるように）固体コア粒子の投影面積の５０％の内部の面積平均電子密度が粒子の周辺部における最大電子密度のｘ％（ｘ＝２０％、４０％、６０％）以上であるように定義される。電子密度は、ナノ粒子を含まない領域における背景強度から関心領域の画像強度の差の絶対値として計算される。
【００４６】
本発明の脂質粒子は、Ｍａｌｖｅｒｎ（登録商標）Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）のような、溶液中の粒子の大きさを決定するデバイスを使用して、大きさについて評価され得る。粒子は、約１５ｎｍ〜約３００ｎｍの平均粒径を有する。脂質粒子についての別の用語は「ＬＮＰ」であり、これは、「脂質ナノ粒子」を表す。いくつかの実施形態では、平均粒子直径は３００ｎｍより大きい。なお、一部の実施例では、脂肪粒子の径が約３００ｎｍ以下、２５０ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、ｌＯｎｍ以下、５０ｎｍ以下のものがある。一実施形態では、脂質粒子が約５０〜約１５０ｎｍの直径を有する。より小さい粒子は一般に、より大きい粒子と比較して、インビボで増加した循環寿命を示す。一実施形態では、脂質粒子が約１５〜約５０ｎｍの直径を有する。
【００４７】
混合。本発明の実施形態による脂質粒子は、標準的なＴチューブ混合技術、乱流混合、粉砕混合、攪拌促進秩序自己集合、または全ての要素とナノ粒子への要素の自己集合との受動混合によって調製することができる。遺伝薬物を含有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を製剤化するために、様々な方法が開発されてきた。適切な方法は、例として、Ａｎｓｅｌｌ，  Ｍｕｉ  ａｎｄ  Ｈｏｐｅによる米国特許第５，７５３，６１３号、およびＳａｒａｖｏｌａｃらによる米国特許第６，７３４，１７１号に開示されている。これらの方法はエタノールの存在下で予備形成された脂質粒子を核酸治療剤（ＮＡＴ）と混合すること、またはエタノールに溶解された脂質をＮＡＴを含有する水性媒体と混合することを含み、６５〜９５％のＮＡＴカプセル化効率を有する脂質粒子を生じる。これらの方法の両方は、ＮＡＴのカプセル化を達成するためのイオン化可能な脂質の存在、および凝集および大きな構造の形成を阻害するための安定化剤に依存する。製造される脂質粒子系の特性（サイズおよびＮＡＴカプセル化効率を含む）は、イオン強度、脂質およびエタノール濃度、ｐＨ、ＮＡＴ濃度および混合速度などの種々の製剤パラメーターに感受性である。Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ．  ２０１６年１１月２４（９）：８２１−８３５。
【００４８】
マイクロ流体二相液滴技術は薬物送達のための単分散ポリマー微粒子を生成するために、または細胞、タンパク質、もしくは他の生体分子のカプセル化のための大きな小胞を生成するために適用されてきた。制御されたサイズの単分散リポソームを作製するために、試薬の迅速な混合を提供するための一般的なマイクロ流体技術である流体力学的フローフォーカシングの使用が実証されている。
【００４９】
一般に、混合時の相対脂質およびＮＡＴ濃度、ならびに混合速度などのパラメータは現在の製剤化手順を使用して制御することが困難であり、調製物内および調製物間の両方で、生成されるＮＡＴの特性の変動をもたらす。ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）機器（カナダ国バンク−場のＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ）などの自動マイクロ混合機器は、ナノ医薬（リポソーム、脂質ナノ粒子、およびポリマーナノ粒子）の迅速かつ制御された製造を可能にする。ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）機器は、ナノリットル、マイクロリットル、またはより大きなスケールでのナノ粒子成分のミリ秒混合をカスタマイズまたは並列化で可能にするマイクロ流体混合カートリッジを介してナノ粒子の制御された分子自己集合を達成する。小規模での迅速な混合は、より大きな機器では不可能である粒子合成および品質の再現可能な制御を可能にする。
【００５０】
好ましい方法は形成プロセスで使用される核酸のほぼ１００％を達成するために、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）、Ｓｐａｒｋ（登録商標）、Ｉｎｇｎｉｔｅ（登録商標）、Ｂｅｎｃｈｔｏｐ（登録商標）およびＢｌａｚｅ（登録商標）のようなマイクロ流体混合デバイスのような器具を組み込んで、一工程で粒子中にカプセル化する。１つの実施形態において、脂質粒子は、形成プロセスにおいて使用される核酸の約９０〜約９５％が粒子中にカプセル化されるプロセスによって調製される。
【００５１】
Ｃｕｌｌｉｓらによる米国特許番号第９，７５８，７９５、第９，９４３，８４６は、少量混合技術およびそれにより導出された新規製剤を使用する方法を記載している。Ｒａｍｓａｙらの米国出願公開第２０１６００２２５８０は異なる材料を定式化するために、少量混合技術および製品を使用する、より進んだ方法を記載している。Ｗａｌｓｈらによる米国出願公開第２０１６２３５６８８は、混合される要素に対して異なる経路およびウェルを有するマイクロ流体ミキサーを開示する。Ｗｉｌｄ、Ｌｅａｖｅｒ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒによる国際公開番号ＷＯ２０１７１１７６４７は、使い捨て無菌経路を有するマイクロ流体ミキサーを開示している。Ｗｉｌｄ、Ｌｅａｖｅｒ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒによる国際公開番号第ＷＯ２０１７１１７６４号は、分岐トロイダルマイクロミキシング幾何学形状およびマイクロミキシングへのそれらの適用を開示している。Ｃｈａｎｇ、Ｋｌａａｓｓｅｎ、Ｌｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．による国際公開番号Ｗ０２０１８００６１６６は、プログラム可能な自動化マイクロミキサーおよびそのための混合チップを開示している。Ｃｈａｎｇらによる米国デザイン番号第Ｄ７７１８３４、Ｄ７７１８３３、Ｄ７７２４２７、およびＷｉｌｄ  ａｎｄ  ＷｅａｖｅｒによるＤ８０３４１６、Ｄ８００３３５、Ｄ８００３３６、およびＤ８１２２４２は、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．によって販売されているミキサー機器用のマイクロチャネルおよび混合形状を有する混合カートリッジを開示している。
【００５２】
本発明の態様において、生物学的マイクロ流体混合のためのデバイスは、本発明の脂質粒子および治療製剤を調製するために使用される。デバイスはマイクロ流体ミキサーに供給される試薬の第１および第２の流れを含み、脂質粒子は出口から収集されるか、または他の実施形態では無菌環境に現れる。
【００５３】
第１の流れは、第１の溶媒中に治療薬を含む。適切な第１の溶媒には、治療薬が可溶性であり、第２の溶媒と混和性である溶媒が含まれる。適切な第１の溶媒には、水性緩衝液が含まれる。代表的な第１の溶媒には、クエン酸緩衝液および酢酸緩衝液が含まれる。
【００５４】
第２の流れは、第２の溶媒中に脂質混合材料を含む。適切な第２の溶媒には、イオン化可能な脂質が可溶性であり、第１の溶媒と混和性である溶媒が含まれる。適切な第２の溶媒には、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、酸、およびアルコールが含まれる。
【００５５】
代表的な第２の溶媒には、水性エタノール９０％または無水エタノールが含まれる。
【００５６】
本発明の一実施形態では、適切なデバイスが１つ以上のマイクロチャネル（すなわち、最大寸法が１ミリメートル未満のチャネル）を含む。一例では、マイクロチャネルが約２０〜約３００ｐｍの直径を有する。実施例では、マイクロチャネルの少なくとも１つの領域が主流方向と、その中に画定された少なくとも１つの溝または突起を有する１つまたは複数の表面とを有し、溝または突起は米国特許公開第２００４０２６２２２３号に記載されているように、主方向と角度（例えば、互い違いのヘリングボーンミキサ）、または米国特許公開２０１８０９３２３２号に記載されているように分岐するトロイダル流（bifurcating toroidal flow）を形成する配向を有する。最大の混合速度を達成するために、混合領域の前に過度の流体抵抗を回避することが有利である。したがって、デバイスの一例は単一の混合チャネルに流体を送達するために、１０００ミクロンを超える寸法を有する非マイクロ流体チャネルを有する。
【００５７】
Ｚｈａｎｇ、Ｓ．、ｅｔ  ａｌ；  ＣｈｅｍＥｎｇ．  Ｊ．；  １４４；  ２００８；  ３２４−３２８およびＳｔｒｏｏｋ  Ａ．ら；  Ｓｃｉｅｎｃｅ−２９５；  ２００２；  ６４７−６５１に開示されているような、あまり自動化されていないマイクロミキシング方法および装置。もまた、本発明の処方物を作製する際に有用である。Ｔチューブ混合を含むより原始的な系はＪｅｆｆｓ  ＬＢらの「Ａ  ｓｃａｌａｂｌｅ、ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ（プラスミドＤＮＡの効率的なリポソームカプセル化のためのスケーラブルで押し出しのない方法）」、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．  ２００５；  ２２（３）：３６２−７２に開示されている。
【００５８】
本発明の脂質粒子は、インビトロまたはインビボで、細胞に治療剤を送達するために使用され得る。特定の実施形態では治療剤は核酸であり、核酸は本発明の核酸−脂質粒子を使用して細胞に送達される。核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＬＮＡ、プラスミドまたはレプリコン、ｍＲＮＡ、単一遺伝子であり得る。他の実施形態では、治療薬が本発明のペプチド−脂質粒子を使用して細胞に送達されるペプチドである。この方法および脂質混合組成物は、このような処置から利益を得る任意の疾患または障害の処置のための任意の適切な治療剤の送達に容易に適合され得る。
【００５９】
特定の実施形態において、本発明は核酸を細胞に導入するための方法（すなわち、トランスフェクション）を提供する。トランスフェクションは、送達された遺伝子の転写、翻訳および発現の目的で、細胞外から細胞内空間への核酸治療剤（またはＮＡＴ）の導入のために分子生物学において一般に使用される技術である。トランスフェクション効率は一般に、ｉ）（蛍光タンパク質の検出のための）生細胞イメージング、フローサイトメトリーまたはＥＬＩＳＡなどのタンパク質定量法によって測定される、送達された遺伝子の陽性発現を示す、処理された集団全体における細胞のパーセンテージ、またはｉｉ）処理された細胞によって発現されるタンパク質の強度または量のいずれかとして定義される。これらの方法は、本発明の粒子または脂質混合物組成物を、細胞内送達が起こるのに十分な期間、細胞と接触させることによって実施され得る。
【００６０】
典型的な適用は、特異的な細胞標的をノックダウンまたはサイレンスするためのｓｉＲＮＡの細胞内送達を提供するための周知の手順の使用を含む。あるいは、適用が治療的に有用なポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列の送達を含む。このようにして、欠損または欠損した遺伝子産物を供給することにより、遺伝病の治療が提供される。本発明の方法は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで実施することができる。例えば、本発明の脂質混合物組成物はまた、当業者に公知の方法を使用して、インビボでの細胞への核酸の送達のために使用され得る。別の例において、本発明の脂質混合組成物は、エクスビボである患者細胞の試料への核酸の送達のために使用され得、次いで、患者に戻される。
【００６１】
本発明の脂質粒子による核酸治療剤の送達を以下に記載する。
【００６２】
インビボ投与のために、医薬組成物は好ましくは非経口的に（例えば、関節内、静脈内、腹腔内、皮下、くも膜下、皮内、気管内、骨内または筋肉内）に投与される。特定の実施形態では、医薬組成物がボーラス注射によって静脈内、くも膜下腔内、または腹腔内に投与される。その他の投与経路としては、局所（皮膚、眼、粘膜）、口腔、肺、鼻腔内、舌下、直腸、膣などがある。
【００６３】
エクスビボ適用のために、医薬組成物は、好ましくは生物から除去された生物学的試料に投与され、次いで、細胞は洗浄され、生物に回復される。生物は哺乳動物であってもよく、特にヒトであってもよい。このプロセスは例えば、細胞再プログラミング、遺伝的修復、免疫療法に使用される。
【００６４】
１つの実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節する方法を提供する。これらの方法は一般に、細胞を、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節することができる核酸と結合した本発明の脂質粒子と接触させることを含む。本明細書中で使用される場合、用語「調節する」は、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を変化させることをいう。調節は増加または増強を意味することができ、または減少または減少を意味することができる。
【００６５】
関連する実施形態において、本発明は、対象におけるポリペプチドの過剰発現によって特徴付けられる疾患または障害を処置する方法であって、治療剤がｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡがポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補体に特異的に結合するポリヌクレオチドを含む、本発明の医薬組成物を対象に提供することを含む方法を提供する。
【００６６】
関連する実施形態において、本発明は被験体におけるポリペプチドの過小発現によって特徴付けられる疾患または障害を処置する方法であって、本発明の医薬組成物を被験体に提供する工程を包含し、ここで、治療剤は、ｍＲＮＡ、自己増幅ＲＮＡ（ＳＡＭ）、自己複製ＤＮＡ、またはプラスミドから選択され、過小発現ポリペプチドを特異的にコードするかまたは発現する核酸治療剤、またはその相補体を含む、方法を提供する。
【００６７】
実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で公知のまたは今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、このような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つ以上の他の補助成分と会合させる工程を包含する。
【００６８】
本開示による医薬組成物は、バルクで、単一単位用量として、および／または複数の単一単位用量として調製、包装、および／または販売することができる。本明細書中で使用される場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む別個の量の医薬組成物を指す。活性成分の量は一般に、対象に投与される活性成分の用量および／またはそのような用量の便利な分画（そのような用量の半分または３分の１を含むが、これらに限定されない）に等しくてもよい。
【００６９】
本開示による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、および／または任意の追加の成分の相対量は、治療される対象の同一性、サイズ、および／または状態に応じて、さらに組成物が投与される経路に応じて変化し得る。例えば、組成物は、活性成分の０．１パーセント〜９９パーセント（ｗ／ｗ）を含み得る。
【００７０】
医薬製剤は本明細書中で使用される場合、所望の特定の剤形に適した、任意のおよびすべての溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤などを含むが、これらに限定されない、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。医薬組成物を処方するための種々の賦形剤および組成物を調製するための技術は、当該分野で公知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ＡＲＧｅｎｎａｒｏ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、２００６を参照のこと；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。従来の賦形剤媒体の使用は、任意の従来の賦形剤媒体が任意の望ましくない生物学的効果を生成することによって、またはさもなければ医薬組成物の任意の他の成分（単数または複数）と有害な様式で相互作用することなどによって、物質またはその誘導体と不適合であり得る限りを除いて、本明細書で企図される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、脂質粒子の粒子サイズが増加および／または減少されてもよい。粒径の変化は炎症などの生物学的反応（これに限定されない）に対抗するのを助けることができ、または生体分布を変化させることによって哺乳動物に送達されるＮＡＴの生物学的効果を増大させることができる。
【００７２】
医薬組成物の製造に使用される薬学的に許容される賦形剤には不活性希釈剤、界面活性剤および／または乳化剤、防腐剤、緩衝剤、潤滑剤、および／または油が含まれるが、これらに限定されない。このような賦形剤は任意に、本発明の医薬製剤に含まれてもよい。
【００７３】
いくつかの実施形態において、例示的なプラスミドまたは他のＮＡＴは、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、酸性αグルコシダーゼＡ、アリルスルファターゼＡ、カルボキシペプチダーゼＡ、アルファ−イズロニダーゼ、イズロネート−２スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アルファ−グルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、ガラクトース−６−スルファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ、リソソーム酸リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、カルバモイルリン酸シンテターゼ（ＡＳＳ  １）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ１（ＡＲＧＩ）、のう胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）、第ＶＩＩＩ因子、ＴＡＬＥＮＳのようなメガヌクレアーゼ、Ｃａｓ９および低密度リポ蛋白質受容体（ＬＤＬＲ）から選択されるタンパク質または酵素をコードする。
【００７４】
他のプラスミドまたは核酸は、研究またはスクリーニングプラットフォームの文脈において、本発明を使用して、細胞ベースの系に適用され得る。これらには、誘導された多能性幹細胞の生成のための再プログラミングのプロセスにおけるような、細胞における特異的な生理学的または機能的変化を誘導する目的のための遺伝物質の導入が含まれる。この場合、特定の遺伝子（山中因子として知られる）が患者由来の体細胞に導入され、それが細胞の幹細胞様状態への逆転を誘発する。これらは細胞を無限に分裂させ、多能性（他の多くの下流の細胞型に分化可能）にすることを可能にし、これは研究および臨床応用の両方に使用することができる。これらおよび類似の遺伝子操作工程は、本発明の脂質粒子によって増強され得、誘導幹細胞を用いて作業する場合に一般的に使用されるプロセスの効率を改善する。
【００７５】
以下は、核酸（ＬＮＰ）を用いて調製された代表的な脂質粒子、それらがどのように作製されるか、それらの利点の証拠、およびそれらを使用して治療的利益を送達するための方法の説明である。
【００７６】
脂質粒子の処方はカオス移流を誘導し、中間レイノルズ数（２４＜  Ｒｅ  ＜１０００）で制御された混合環境を提供するように設計されたマイクロ流体ミキサー内で脂質−エタノール溶液を水性緩衝液と急速に混合することによって行った。マイクロ流体チャネルは、ヘリングボーン特徴を有するか、またはＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１７１１７６４７に示されるような様式で構成される。他の実施形態では、マイクロ流体チャネルが米国特許第１０，０７６，７３０号のように構成される。
【００７７】
脂質粒子の粒子サイズおよび「多分散指数」（ＰＤＩ）を動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。ＰＤＩは、粒子分布の幅を示す。これは単一粒子径モードと自己相関関数への単一指数関数適合を仮定した（ＤＬＳ）測定強度自己相関関数の累積解析から計算したパラメータである。生物物理学的観点から、０．１未満のＰＤＩは、サンプルが単分散であることを示す。ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）ＳｐａｒｋやＢｅｎｃｈｔｏｐなどのメカニカルマイクロミキサーで生成されるパーティクルは、他のすべての変数がニュートラルであると仮定すると、サイズがほぼ均一である。より低いＰＤＩは、脂質粒子のより均一な集団を示す。
【００７８】
特定の実施形態において、安定化剤は、約０．５〜約１０モル％の量で粒子中に存在する。ある態様において、安定化剤は、ポリソルベートおよびマルトシドなどの洗剤の混合物である。
【００７９】
実施形態において、安定化剤は、約２．５モル％で脂質ベースの製剤中に存在する。
【００８０】
好ましい実施形態において、安定化剤は、ポリソルベート２０（ポリソルベート２０またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、ポリソルベート８０（ポリソルベート８０またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、およびトリデシルβ−Ｄ−マルトシドの混合物である。好ましい実施形態において、これらの３つの成分は実質的に１：１：１の重量／重量比で、または透明性のために、各成分約３３．３３％で存在する。
【００８１】
好ましい実施形態において、核酸は、二本鎖デオキシリボ核酸から構成されるプラスミドである。プラスミドは（従来の細胞遺伝学が存在する核とは対照的に）細胞の細胞質に存在する遺伝的構造であり、染色体、典型的には小さな環状ＤＮＡ鎖とは無関係に複製することができる。これは正常な哺乳類の遺伝子構築物ではなく、細胞内の遺伝的機能を操作するための治療選択肢として用いられる。プラスミドはまた、医学研究のための新規の細胞モデルまたは動物モデルを作成するために使用することができる。プラスミドはｉ）操作および単離の容易さ、ｉｉ）スケールアップされた製造のために自己複製する能力、ｉｉｉ）長期安定性、ｉｖ）一連の生物および用途における機能性のために、分子生物学における重要なツールであり、また、新興の治療薬として重要である。改変されたプラスミドは、複製起点に加えて（意図された使用に依存して、ではない）、新しい遺伝物質を導入するために環を切断することを可能にする制限酵素認識部位、および抗生物質耐性遺伝子のような選択的マーカーを有するであろう。プラスミドは、約１０００塩基対〜約２０キロ塩基対であり得る。
【００８２】
用語
本明細書中で使用される場合、用語「約」は、列挙された数の１０％±を意味すると定義される。これは所望の目標濃度が例えば、４０モル％であってもよいが、混合の不一致によって、実際のパーセンテージが＋／５モル％だけ異なってもよいことを示すために使用される。
【００８３】
本明細書で使用される場合、用語「実質的に」は、列挙された数の５％±であると定義される。これは所望の目標濃度が例えば、４０モル％であってもよいが、混合の不一致によって、実際のパーセンテージが＋／５モル％だけ異なってもよいことを示すために使用される。
【００８４】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」は、疾患の診断、治癒、軽減、処置または予防において直接的な効果を有すること、または生理学的機能の回復、矯正または改変において直接的な効果を有すること、または研究試薬として作用することが意図される物質として定義される。好ましい態様において、核酸はオリゴヌクレオチドである。好ましい実施形態では、治療剤がＲＮＡポリヌクレオチドなどの核酸治療剤である。好ましい態様において、治療剤は二本鎖環状ＤＮＡ（プラスミド）である。
【００８５】
本明細書中で使用される場合、用語「試薬」は、それが細胞、組織または器官の生物学的効果に対して直接的な影響を有するという事実によって定義される。試薬としてはポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、多糖類、無機イオンおよび放射性核種が挙げられるが、これらに限定されない。核酸試薬の例としてはアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡ、ｍＲＮＡ、リボザイム、ｔＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、プレコンデンスＤＮＡ、ｐＤＮＡまたはアプタマーが挙げられるが、これらに限定されない。核酸試薬は遺伝子をサイレンシングし（例えば、ｓｉＲＮＡを用いて）、遺伝子を発現し（例えば、ｍＲＮＡを用いて）、ゲノムを編集し（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて）、そして起源生物に戻すために細胞を再プログラムする（例えば、癌治療のために免疫細胞を再プログラムするためのエクスビボ細胞治療）ために使用される。「試薬」は、細胞治療適用における補助剤、および医薬を含む。
【００８６】
本開示では単語「有する」が単語に続く項目が含まれることを意味する非限定的な意味で使用されるが、特に言及されていない項目は除外されない。特定の特徴または変数またはパラメータを含むか、または含むことができる実施形態では代替の実施形態がそのような特徴、変数またはパラメータからなるか、または本質的になることができることが理解されるのであろう。不定冠詞「ａ」による要素への言及は文脈が要素のうちの１つのみが存在することを明確に要求しない限り、要素のうちの２つ以上が存在する可能性を除外しない。
【００８７】
本開示において、「トランスフェクション試薬」は目的の特異的遺伝子の発現を誘導するために、細胞への核酸の移入を増強する組成物を意味する。それは、典型的には核酸と会合するためのイオン化可能な脂質、および構造脂質を含む。ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃが販売する確立された市販のトランスフェクション試薬である。
【００８８】
本開示では終点による数値範囲の列挙がすべての整数、すべての整数、およびすべての分数中間体を含むその範囲内に包含されるすべての数を含む（例えば、１〜５は１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、および５などを含む）。本開示では、単数形が内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含み、したがって、例えば、「化合物」を含む組成物への言及は２つ以上の化合物の混合物を含む。本開示では用語「または」が内容が明確に指示しない限り、「および／または」を含む意味で一般に使用される。
【００８９】
以下の実施例は本発明を説明する目的で提供されるが、本発明を限定するものではない。
【００９０】
実施例
材料及び方法
脂質混合物のいくつかは、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ、米国）によって合成された１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＢＯＣＨＤ−Ｃ３−ＤＭＡ）で形成された。他の脂質混合物を、ＤＯＤＭＡ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）またはＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ−Ｅ−Ｐ４Ｃ２、カタログ番号ＳＳ−３３／４ＰＥ−１５（ＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、アービン、カナダ）を用いて形成した。
【００９１】
構造脂質１，２‐ジオレオイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）もＡｖａｎｔｉ  Ｌｉｐｉｄｓから入手した。Ｋｃ２とＤｌｉｎ‐ＭＣ３‐ＤＭＡを自家合成した。供給源に関して特に記載されていない塩および試薬は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（フェア  ローン、ニュージャージー）から入手した。対照およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）対照は例外であった。Ｗｉｋｉｐｅｄｉａによれば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）剤はＹｏｎｇｌｉａｎｇ、Ｃｈｕらによる米国特許第７，４７９，５７３号に記載されており、３：１ｗ／ｗのＤＯＳＰＡ：ＤＯＰＥの組成を有する。
【００９２】
ＲＮａｓｅ  Ａは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ａｍｂｉｏｎ（テキサス州オースチン）から入手した。
【００９３】
安定化剤（ＴＷ２０：ＴＷ８０：ＴＢＤ）とは、１：１：１  ｗｔ／ｗｔ比のポリソルベート２０（ポリエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートまたはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０としても知られる）、ポリソルベート（８０）（ポリエチレン（８０）ソルビタンモノオレートまたはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０としても知られる）、およびトリデシルβ−Ｄ−マルトシド（すべてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）の混合物を意味する。他の実施形態において、ポリソルベート８０、またはポリソルベート２０、またはマルトシドは、それぞれ、安定化剤単独として存在する。他の実施形態ではそれらは異なる比率であるが、依然として一緒に存在する。他の実施形態では、ポリソルベート８０およびマルトシドのみが安定化剤を含む。
【００９４】
ＤｉＤは’ＤｉＤ’；  ＤｉｌＣ１８（５）オイル（１，１’−ジオクタデシル−３，３’，３’，３’’テトラメチルインドジカルボシアニンペルクロレート）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄ−３０７）を意味し、リサーチ用の脂質標識（脂質と共に残る）である。他のこのような脂質染料は、ダンシルＤＯＰＥおよびフルオレセインＤＨＰＥである。
【００９５】
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（プラスミドまたはメッセンジャーＲＮＡ、以下「核酸」または「核酸治療薬」と呼ぶ）溶液を、ｐＨ  ４．０の２５ｍＭ〜１００ｍＭ酢酸緩衝液中で調製した。所望のオリゴヌクレオチド対脂質比および製剤濃度に応じて、２．３ｍｇ／ｍｌ〜４ｍｇ／ｍｌ全脂質の標的濃度で溶液を調製した。１，１７‐ビス（２‐オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン‐９‐イル４‐（ジメチルアミノ）ブタノエート塩酸塩、ＤＯＰＥ、コレステロール、２．５Ｍｏｌ％安定化剤、および０‐１０％ＤｉＤ標識を含む脂質溶液をエタノール中で調製し、核酸と混合して２５％（ｖ／ｖ）のエタノール濃度を達成した。特定の例では、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、ＤＯＤＭＡ、または２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）を、ｌ，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート塩酸塩（ＢＯＣＨＤ−Ｃ３−ＤＭＡ）の代わりに使用した。
【００９６】
組成に対する核酸比はＮ／Ｐ４対Ｎ／Ｐ６であり、ここで、「Ｎ」は脂質アミンのモル数であり、「Ｐ」はヌクレオチドリン酸のモル数であり（各ヌクレオチドリン酸単位は１モル単位と考えられる）、「４」および「６」はその比である。
【００９７】
脂肪粒子は、ナノアセンブラー（登録商標）ベンチトップまたはナノアセンブラー（登録商標）スパークを用いて、”Ｍｉｘｉｎｇ”の下で述べた標準マイクロフルイディクスプロセスにより調製した。このようにして、混合はカオス的移流によって生じ、積層ストリームの分離をますます小さくし、それによって迅速な拡散を促進した。この混合はミリ秒の時間スケールで起こり、その結果、脂質は漸進的により水性の環境に移動し、それらの溶解度を低下させ、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の自発的な形成をもたらす。プラスミドの捕捉は、正に荷電した脂質頭部基と負に荷電したオリゴヌクレオチドとの会合によって得られる。
【００９８】
誘導多能性幹細胞またはｉＰＳＣ
非組み込みｏｒｉＰ／ＥＢＮＡｌプラスミドを用いて、再プログラムドナー由来線維芽細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製した。細胞をＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）増殖因子減少（ＧＦＲ）基本膜マトリックス（＃３５４２３０）上で維持し、完全ｍＴｅＳＲ培地（補充物を含む基本培地）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃０５８５０）中で維持した。３人の個々のドナーからの３つのｉＰＳＣクローンを、２５０ｎｇ／ｍＬのＧＦＰ  ｍＲＮＡ脂質粒子および１００ｎｇ／ｍＬのＡｐｏＥで４８時間処理した。
【００９９】
ヒト神経前駆細胞（ＮＰＣ）と培養
ＮＰＣは誘導された多能性幹細胞に由来する未熟なニューロン細胞型であり、特定の培養条件、試薬および分化を促進する細胞培養培地を用いて成熟皮質ニューロンに分化させることができる。ｉＰＳＣクローンから機能的および生理学的に定義された成熟皮質ニューロンへの分化過程は、時間がかかり技術的に困難な過程である。市販のＮＰＣは、これらの細胞型が分化経路にさらに沿っているので、ニューロン培養のプロセスを加速する。これらの研究において、十分に特徴付けられたＮＰＣを、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ、Ｆｅｍａｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  Ｃａｔ  ＃７０９０２、Ｍａｌｅ  ｌｉｎｅ：  ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃａｔ  ＃７０９０１）から購入し、培養して成熟皮質ニューロンを誘導した。本発明の脂質粒子製剤は、この分化経路に沿って、前駆段階からニューロン成熟の時点までの様々な時点に適用することができる。これはまた、脂質粒子ベースの核酸ベクターの、ｉＰＳＣ自体、またはＮＰＣ段階の上流のニューロン細胞型の遺伝子操作への可能な適用を示唆する。
【０１００】
ＮＰＣは、Ｎｅｕｒａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｍｅｄｉｕｍ  ２（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃａｔ＃０８５６０）を用いてＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）でコーティングした細胞培養フラスコに播種することによって維持した。細胞がコンフルエントになるまで１日おきに、およそ４日おきに、完全な培地交換を行い、その時点でそれらを継代した。ＮＰＣを、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）被覆２４ウェルプレート上に播種してから２４時間後に、１  ｕｇ／ｍＬのＡｐｏＥおよび１００ｎｇ／ｍＬのプラスミド脂質粒子製剤で処理した。
【０１０１】
ＮＰＣの分化は、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ（登録商標）Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｎ２−ＡおよびＳＭＩ  Ｋｉｔ  ｃａｔ＃０５７９３において達成された。分化を、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ＢｒａｉｎＰｈｙｓｔｍプロトコールの改変バージョンを使用して実施した：要するに、分化の０日目に、ＮＰＣを、神経前駆細胞培地２中のＰｏｌｙ−Ｌ−ＯｒｎｉｔｈｉｎｅおよびラミニンコーティングＴ２５組織培養フラスコに播種した。２４時間後、培地をニューロン分化培地（ＳＴＥＭｄｉｆｆ（登録商標）Ｎｅｕｒｏｎ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｃａｔ＃  ０８５００、ＳｔｅｍＣｅｌｌ）に交換し、次の１日おきに完全培地交換を行った。
【０１０２】
分化の６日目に、細胞を、ポリ−Ｌ−オルニチンおよびラミニンコーティングされた２４ウェル培養皿に、正常量のＳＴＥＭｄｉｆｆｔｍ培地の半分で継代した。これはニューロン成熟の０日目となる。２４時間後、ニューロン成熟の１日目に、正常量のＢｒａｉｎＰｈｙｓ（登録商標）Ｎｅｕｒｏｎａｌ培地の半分を添加し、そして１／２の培地交換を、実験の間、１日おきにＢｒａｉｎＰｈｙｓ（登録商標）Ｎｅｕｒｏｎａｌ培地で行った。
【０１０３】
ニューロンの処置およびＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｓ３生細胞スコープを使用した評価
ニューロンが必要な日（１日目、７日目、１０日目、１４日目など）まで成熟したとき、１  ｕｇ／ｍＬのＡｐｏＥを各ウェルに添加し、続いて６００ｎｇ／ｍＬの核酸治療薬／ＬのＬｉｐｉｄ  Ｍｉｘ製剤を添加した。次に、処理したプレートを、細胞培養インキュベーター内に置いたＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｓ３  Ｌｉｖｅ−Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＵＳＡ）を用いてリアルタイムで分析した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｓ３は実験の間、６時間毎に、各ウェル内の６つの視野位置で１０倍の倍率で画像を撮影するようにプログラムされた。データ取得に続いて、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｓ３ソフトウェアを用いてアルゴリズムを作成し、位相差画像および緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）画像の両方について細胞体および％コンフルエンスを同定した。
【０１０４】
以下の実施例は本発明を説明する目的で提供されるが、本発明を限定するものではない。
【０１０５】
実施例１
核酸治療薬（ＮＡＴ）の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）へのマイクロ流体混合
脂質混合物溶液は、エタノール中の個々の脂質ストックからの規定量の脂質（表１を参照のこと）を合わせることによって、エタノール中で調製した。ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）ＳＰＡＲＫ法では５０ｍＭの脂質混合溶液濃度を使用し、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）ベンチトップでは典型的には１２．５ｍＭの脂質混合溶液を使用した。
【０１０６】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＮＡＴを、酢酸ナトリウム緩衝液を使用して、必要な濃度に希釈した。次いで、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）Ｓｐａｒｋ機器を使用して両方の流体を流すことによって、脂質粒子サンプルを調製した。簡単に述べると、全容積３６ｍＬ中の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中の１０〜２０ｍｇの核酸を、Ｎ／Ｐ比率（４または６）によって必要とされるように、１２ｍＬの５０ｍＭ脂質混合液と混合した。マイクロ流体的に混合したナノ粒子を、水溶性アウトプットウェル中、ｐＨ  ７．４の４８ｍＬのカルシウムおよびマグネシウムを含まないＩＸ  ＰＢＳで即座に希釈した。これらの核酸脂質粒子を、９６ｍＬのＣａおよびＭｇを含まない１×ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）を含む微量遠心管に直ちに回収した。封入効率は、改変Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ／Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイによって測定した。観察された粒子属性は一般に、脂質組成に依存して、プラスミドについて１４０〜３００ｎｍの範囲であった。
【０１０７】
脂質ベースの製剤はまた、試験のためにＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）ベンチトップによって製造された。手短に言えば、３５０ｍＬのｍＲＮＡ／プラスミドを、６または４のＮ／Ｐ比に依存して、０．２〜０．３ｍｇ／ｍＬの必要濃度まで１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を使用して希釈した。次いで、両方の流体、すなわち、水性溶媒中の核酸およびエタノール中の脂質混合物を、３：１の流量比および１２ｍｌ／分の総流量で流すことによって、脂質粒子サンプルを調製した。マイクロ流体デバイス中で混合した後、カートリッジ後の脂質粒子試料を、３〜４０容量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液（ｐＨ  ７．４）を含有するＲＮＡｓｅを含まないチューブ中に希釈した。最後に、エタノールを、ＰＢＳ（ｐＨ  ７）中での透析を通して、またはＡｍｉｃｏｎ（登録商標）遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）を３０００  ＲＰＭで使用して、またはＴＦＦシステムを使用して除去した。必要な濃度に達したら、無菌条件下で２００ｐｍフィルターを用いて粒子を濾過滅菌した。最終的なＮＡＴカプセル化効率を、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイによって測定した。
【０１０８】
脂質混合物の成分
リピドミックスＡの成分は１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノエート塩酸塩、中性脂質ＤＯＰＥ、安定剤Ｍｙｒｊ５２（ポリオキシエチレン（４０）ステアレート）であり、リピドミックスＡ  ＤＯＤＭＡには、１，１７−ビス（２オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノエート塩酸塩の代わりにＤＯＤＭＡを用い、リピドミックスＡ−ＣＯＡＴＳＯＭＥにはＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）を用いた。安定化剤Ｍｙｒｊを、最初に単一の界面活性剤、次に２つの界面活性剤、次に３つの界面活性剤で置き換えた。
【０１０９】
（Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  Ｔ２０、すなわち、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  Ｔ８０（ポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノラウレート）、およびＬｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  ＴＤＭ（単にＴｒｉｄｅｃｙｌ  β−Ｄｍａｌｔｏｓｉｄｅまたは「ＴＢＤ」）。脂質混合物ＫおよびＬにおいて、安定化剤は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート：ポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノラウレート：トリデシルβ−Ｄマルトシドの１：１：１重量／重量比の組み合わせであった。全ての製剤において、０〜０．１モル％のＤｉＤ標識が存在した。脂質混合物の成分比のリストを表１に示す。
2021521861.tif 000004
＊ＩＬはイオン化可能な脂質。ＢＯＣＨＤ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、およびＣｏａｔｓｏｒｎｅｔ（登録商標）は種々の実施例のＩＬであった。
ＬｉｐｉｄＭｉｘＡまたはＬｉｐｉｄＭｉｘＫの後の接尾辞ＤＯＤＭＡまたはＣＯＡＴＳＯＭＥは、これらの脂質が使用された場所を示すために使用される。他のすべての状況では、ＩＬはＢＯＣＨＤ−Ｃ３−ＤＭＡである。
＊＊はポリソルベート２０またはトゥイーン２０としても知られる。
＊＊＊はポリソルベート８０またはトゥイーン８０としても知られる。
【０１１０】
実施例２
脂質粒子または「ＬＮＰ」キャラクタリゼーションおよびカプセル化
粒子径（粒子の流体力学的直径）は、ＺｅｔａＳｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（登録商標）、英国Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社を用いてＤｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＤＬＳ）によって決定した。光源には波長６３３ｎｍのＨｅ／Ｎｅレーザを用いた。後方散乱検出モード（測定角度１７３）で行った散乱強度データからデータを測定した。測定は、各サンプルあたり２サイクルの平均１０回の実験であった。Ｚ−平均サイズは、脂質粒子サイズとして報告され、高調波強度平均粒子直径として定義される。
【０１１１】
本出願に記載の種々の脂質混合物についてのプラスミドおよびｍＲＮＡカプセル化の結果を表２に示す。全ての製剤において良好なカプセル化があり、多分散性は０．３未満であった。
2021521861.tif 000005
2021521861.tif 000006
【０１１２】
実施例３
プラスミドＬＮＰによるニューロンの処置およびＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｓ３−ＧＦＰ発現を使用する評価
ｄｄＨ２Ｏ中のアンピシリン耐性、制限酵素ＨＩＮＤＩＩＩを含む、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪによってカスタムメードされたプラスミド調製物ｐＣＸ−ＥＧＦＰプラスミドサイズ５５１４  ｎｔ、配列番号１を、この評価のために使用した。プラスミドは、プラスミドが細胞内で発現される場合にのみ標的タンパク質を産生するＧＦＰ発現成分を含んでいた。
【０１１３】
次に、脂質粒子を使用する細胞処理に移る：純粋なニューロン集団が準備できたとき、通常は神経分化の８日目前後に、ＡｐｏＥのｌｕｇ／ｍＬおよびプラスミド脂質粒子６００ｎｇ／ｍＬを、Ｎｅｕｒａｌ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ−ＸＦ（登録商標）培養培地（Ａｘｏｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に添加した。次に、処理したプレートを、細胞培養インキュベーター内に配置したＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｓ３機器に入れた。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｓ３は、実験期間中、各ウェル内の６箇所で６時間毎に１０Ｘ画像を撮影した。
【０１１４】
データ取得に続いて、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｓ３ソフトウェアを用いてアルゴリズムを作成し、相画像およびＧＦＰ画像の両方についてニューロン細胞体および神経突起を同定した。
【０１１５】
図１Ａ〜１Ｆを作成するために、本発明者らはＧＦＰ蛍光シグナルについて陽性である細胞内の領域をマーキングするための画像分析ツールであるＧＦＰマスクを使用し、次いで、より良好な白黒再現のためにネガティブ画像を使用した。画像は、処置後７２時間、ＤＩＶ１４で撮影した。ＧＦＰ陽性の細胞体と神経炎がはっきりと見られる。
【０１１６】
試験した製剤は、以下の通りであった：図１Ａ  ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ａ、図１Ｂ  ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｄ、図１Ｃ  ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｔ２０、図１Ｄ  ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｔ８０、図１Ｅ  ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｋ、図１Ｆ  ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｌ．アミノ脂質対ヌクレオチドリン酸モル比はＮ／Ｐ４である。個々の界面活性剤であるポリソルベート２０、ポリソルベート８０、およびマルトシドはトランスフェクションまたは細胞生存率に大きなプラスの影響を与えなかったが、３つすべての組み合わせが与えたことは明らかである。
【０１１７】
実施例４
細胞の健康に及ぼす製剤の影響
参考のポイントとして、図２はニューロン成熟１４日目（ＤＩＶ１４）の未処理成熟ニューロンの位相差画像である。図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃは、アミノ脂質対ヌクレオチドリン酸モル比Ｎ／Ｐ６でＧＦＰをコードするプラスミドを含有するＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  ＡまたはＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｌからなる脂質粒子で処理した後、未処理および４８時間後の、ＤＩＶ１４におけるｉＰＳＣ由来ニューロンの位相差画像である。示されているデータは、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）のライブイメージング機器からのものである。観察：位相コントラスト画像中の白色丸細胞は死細胞／死細胞を示し；脂質混合物Ａの画像が製剤がヒトｉＰＳＣ由来ニューロンに対して毒性であることを示し；および脂質混合物Ｌが未処理細胞に非常に類似している（すなわち、毒性がない）。
【０１１８】
図４Ａ〜Ｄは、未処理のＤＩＶ  ３、および処理なし（図４Ａ）、ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ａ  ＧＦＰプラスミド（図４Ｂ）、ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｌ  ＧＦＰプラスミド（図４Ｃ）、またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）プラスミド（図４Ｄ）からなる脂質粒子での処理後４８時間における、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）装置で採取したＤＮＡ：脂質比Ｎ／Ｐ６でのｉＰＳＣ由来神経前駆細胞の位相差画像である。位相コントラスト画像中の白い丸い細胞は、死んだ細胞または死んでいる細胞である。脂質混合物Ａ試験の画像は、製剤がヒトｉＰＳＣ由来神経前駆細胞（ＮＰＣ）に対して毒性であることを示す。Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  Ｌは細胞に対する毒性が低く、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）は毒性である。毒性は生存細胞の数によって示され、より少ない細胞はより高い毒性を意味する。
【０１１９】
実施例５
フローサイトメトリーでそのようにして確認されたｉＰＳＣ由来の成熟ニューロン
ニューロンの処理およびインキュベーション後、各ウェルから培地を回収し、ＰＢＳ中の３％  ＦＢＳで不活性化した０．２５％トリプシンを用いて細胞を回収し、それらの対応する培地中でペレット化した。遠心分離後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、再びペレット化した。次いで、細胞をＢｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁し、ヨウ化プロピジウムを添加して、完全に破裂した膜（死細胞）を有する細胞について染色した。次いで、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃａｎｔｏ（登録商標）ＩＩフローサイトメーターを用いて細胞を評価した。
【０１２０】
マーカーパネルは、分化（成熟）ニューロンに存在するニューロン系列マーカーであるｂＩＩＩチューブリン（ｂＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎ）（ＴＵＪ１）、ニューロン分化初期に発現するダブルコルチン（ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ）（ＤＣＸ）、神経前駆細胞（未分化ニューロン）に発現するＳｏｘ  １から構成された。
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【０１２１】
フローサイトメトリーデータは分化したニューロン集団の大部分（７４％）が治療前に成熟ニューロンに特異的なマーカーを発現することを示し、試験したニューロンが実質的に成熟していることを確認した。
【０１２２】
実施例６
ニューロンの治療とニューロン生存能の評価
細胞生存率および神経突起伸長は、神経細胞の健康および機能の最も一般的に測定される指標である。細胞傷害性処理を受けた神経細胞は、しばしばその神経突起を短縮することによって反応する。また、神経突起伸長は、生存可能なニューロン培養のためのゴールドスタンダードマーカーである。神経突起長の測定単位はｍｍ／ｍｍ２である。「平均神経突起長」は、ｍｍ２当たりの神経突起の長さを見て、ウェルの全ての画像からのデータから導出される。
【０１２３】
「細胞体クラスター」は、細胞体の数の尺度である。処理細胞は毒性作用の欠如を示すために、未処理と同様の細胞体数を有するべきである。測定単位は１／ｍｍ２である。ウェルの全ての画像にわたる細胞体の平均数は、ｍｍ２当たりの同定された細胞体の数を見ることによって計算される。
【０１２４】
異なる脂質混合物によるトランスフェクションおよびＮＡＴによる発現を示すために使用される測定は、「％ＧＦＰ陽性細胞体クラスター」である。この測定はＧＦＰ細胞クラスター値を画像中の全細胞体の数に正規化し、画像中のＧＦＰ陽性ニューロンの数の全体的な推定値を与える。
【０１２５】
成熟ニューロン細胞を成熟期のＤＩＶ１４で処理した。ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ａ、ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  ＴＢＤ、ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｔ２０、ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｔ８０、ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｋ、およびＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｌを、核酸対脂質の重量比４倍でＧＦＰプラスミドと混合した。
【０１２６】
ＧＦＰ陽性細胞体の数およびＧＦＰ陽性神経突起の全長を測定した。これらの２つのグラフからのデータを図５および図６に示す。ＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  ＫおよびＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ｌ製剤はＬＩＰＩＤ  ＭＩＸ  Ａ／未処理と比較して、ＧＦＰ陽性細胞体および神経突起の最高数を示し、成熟ｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて最高％のＧＦＰ陽性をもたらす。細胞体数および相神経突起長（図５）からの結果は、ＧＦＰ％結果（図６）の結果を確認した。
【０１２７】
実施例７
ｍＲＮＡトランスフェクション
非組み込みｏｒｉＰ／ＥＢＮＡｌ｛Ｙｕ、２００９、Ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｅｅ  ｖｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ｝プラスミドを用いて、再プログラムドナー由来線維芽細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製した。細胞をＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）増殖因子減少（ＧＦＲ）基本膜マトリックス（＃３５４２３０）上で維持し、完全ｍＴｅＳＲ培地（補充物を含む基本培地）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃０５８５０）中で維持した。３人の個々のドナーからの３つのｉＰＳＣクローンを、２５０ｎｇ／ｍＬのＧＦＰ  ｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ  ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））脂質粒子および１００ｎｇ／ｍＬのＡｐｏＥで４８時間処理した。９９６ｂｐのｍＲＮＡは、配列番号２として表される。ＤＡＰＩ核標識を用いて細胞の総数を決定し、次いで、ウェル当たりの細胞の総数に対するＧＦＰ発現細胞のパーセンテージを計算した。図７に示されるように、Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  Ｌから作製された脂質粒子は、未処理およびＬｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  Ａ群と比較して、ＧＦＰ発現ｉＰＳＣの最も高い比率を示した（４０．４％対８．３６％）。グラフは、処置群あたりのＧＦＰ陽性細胞の平均パーセンテージを表す。この実験は、ｍＲＮＡならびにプラスミドトランスフェクションが本発明の脂質混合物によって好都合に達成され、そしてｉＰＳＣが首尾よくトランスフェクトされ得ることを示す。
【０１２８】
実施例８
インビトロでのプラスミドトランスフェクション、ＧＦＰ発現
プラスミドおよび脂質粒子の調製は、上記で特定した通りであった。この実験では、イオン化可能な脂質、中性脂質、コレステロールおよび界面活性剤の異なる比率を、プラスミドカプセル化と共に使用した。記載された製剤の詳細については表１を参照されたい。ＬＮＰ  Ｔｗｅｅｎ  ２０およびＬＮＰ  Ｔｗｅｅｎ  ８０は、ｍＲＮＡ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  Ｔ２０およびＴ８０に使用したものとはわずかに異なる比率のコレステロールおよび安定化剤を有していた。実験の目的は個々の界面活性剤と組み合わせた脂質粒子組成物を使用して、インビトロで神経前駆細胞（ＮＰＣ）におけるＧＦＰのプラスミド媒介発現の効果を研究することであり、第２の部分では、標準的な界面活性剤Ｍｙｒｊ５２に対して、単一の薬剤として異なる界面活性剤を使用した。脂質粒子中に１モル％のｔｗｅｅｎ  ２０、１モル％のＴｗｅｅｎ８０、および１モル％のｔｗｅｅｎ  ２０およびＴｗｅｅｎ８０の１対１の組み合わせを含む製剤によって媒介されるトランスフェクション活性を図８Ａに示す。２つのＴｗｅｅｎｓの組み合わせは、細胞中にＧＦＰタンパク質発現を点滴注入するために、各Ｔｗｅｅｎｓよりも個々に良好に機能した。
【０１２９】
実験の第２の部分について、脂質粒子中に２．５ｍｏｌ％  Ｍｙｒｊ５２（Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  Ａ）、２．５ｍｏｌ％ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  Ｔ２０）および２．５ｍｏｌ％ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  Ｔ８０）を含む製剤によって媒介されるトランスフェクション活性を図８Ｂに示す。ポリソルベート２０およびポリソルベート８０の両方は細胞中にＧＦＰタンパク質発現を点滴注入するために、Ｍｙｒｊ５２よりも良好に機能した。
【０１３０】
実施例９
ロニザブル脂質同一性に関わらず存在する界面活性剤併用の効果
ＮＰＣを、交互のイオン化可能な脂質含有形態のＬｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  ＡおよびＬｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  Ｋカプセル化ｍＲＮＡに曝露して、任意のイオン化可能な脂質特異的効果を同定した。図９Ａは、Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  ＫおよびＬｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  Ｋ  ＤＯＤＭＡと比較した、Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  ＡおよびＬｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  Ａ  ＤＯＤＭＡについてのＧＦＰのパーセントとしてのｍＲＮＡ発現を示す。同様の結果がＤＯＤＭＡとは対照的に、１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエートＨＣｌを用いて作製された脂質混合物について見られる。
【０１３１】
図９Ｂは、イオン化可能な脂質としてＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）を用いた、同様のパターンの試験を用いた、神経前駆細胞におけるＧＦＰのｍＲＮＡ媒介性発現（平均蛍光強度）を示す。再び、Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  Ｋをｌ，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエートＨＣＩまたはＣｏａｔｓｏｍｅ（登録商標）と混合すると、Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  ＡまたはＬｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  Ａ  Ｃｏａｔｓｏｍｅ（登録商標）よりも良好であった。
【０１３２】
Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  Ｋ中の組み合わせ界面活性剤の利点は、イオン化可能な脂質がｌ，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエートＨＣＩ、ＤＯＤＭＡまたはＣｏａｔｓｏｍｅ（登録商標）であっても維持された。
【０１３３】
実施例１０
トランスフェクタミン（登録商標）トランスフェクション剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を、ＮＰＣ中のＬｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  ＫおよびＬｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  Ｌ（１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエートＨＣＩ）と比較して、細胞の健康に対するその効果を調べた。結果を図１０に示す。継代培養を含む正常細胞培養１４４時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）で処理した細胞は生存不能であったが、Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  ＫおよびＬで処理した細胞はほぼ１００％コンフルエントであった。
【０１３４】
実施例１１
一般的に使用される２つのイオン化可能な脂質、ＫＣ２およびＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡを、脂質混合物ＡおよびＫのイオン化可能な脂質成分の代わりに用いた。ＮＰＣを、上記のようにトランスフェクトし、フローサイトメトリーによるＧＦＰ中央値蛍光強度についての４８Ｈでの結果を図１１に示す。参考のために、脂質粒子サイズ、ＰＤＩ、およびカプセル化効率を表４に列挙する。ＫＣ２およびＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（グラフ中のＭＣ３）はともに、Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  Ａに対するＧＦＰ表現を強化するためにＬｉｐｉｄ  Ｍｉｘ  Ｋで有効であり、ＰＮＩ−ＩＬ−１はｌ，１７−ｂｉｓ（２−オクタイシクロピロピル）ヘプタデカン−９−ｙｌ  ４−（ジエチルアミノブタノベートＨＣＩ）である。
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【０１３５】
本発明の特定の実施形態を説明し、例示したが、そのような実施形態は本発明の例示にすぎず、添付の特許請求の範囲に従って解釈されるように本発明を限定するものと見なされるべきではない。
【０１３６】
参考文献
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Tam, Y. Y., S. Chen and P. R. Cullis (2013).「siRNAデリバリーのための脂質ナノ粒子の進歩」。 Pharmaceutics 5（3）：498-507
【図１Ａ】
2021521861.tif 000009
【図１Ｂ】
2021521861.tif 000010
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
2021521861.tif 000012
【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３Ａ】
2021521861.tif 000016
【図３Ｂ】
2021521861.tif 000017
【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
2021521861.tif 000019
【図４Ｂ】
2021521861.tif 000020
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2021521861.tif 000022
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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