(57)【要約】  本発明は、ロット処分のためにトランス遺伝子発現ウイルスベクター薬物製品の効力を決定するための、ウイルスベクター感染に許容性の初代マウス細胞モデルシステムと、定量的ハイコンテント画像ベースシステムとを用いるインビトロ定量的細胞ベースアッセイに関する。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランス遺伝子発現を測定する方法であって、
ａ）第１の複数の最終分化神経前駆細胞（ＮＰＣ）を提供すること；
ｂ）目的タンパク質をコードする配列を含むウイルスベクターを含む試験サンプルで前記第１の複数の最終分化ＮＰＣを形質導入すること；
ｃ）前記形質導入された第１の複数の最終分化ＮＰＣを、前記目的タンパク質を発現させるのに十分な条件下でインキュベートすること；
ｄ）（ｃ）からの前記第１の複数の最終分化ＮＰＣを、前記目的タンパク質に特異的な分子に接触させること；
ｅ）前記第１の複数の最終分化ＮＰＣをイメージングして、１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）アッセイリードアウトを入手すること；及び
ｆ）前記ＩＦＩ−Ｃリードアウトに基づいて前記目的タンパク質の発現を決定すること
を含む方法。
【請求項２】
前記第１の複数の最終分化ＮＰＣは、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）−／−突然変異に関してホモ接合である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＳＭＮ１−／−突然変異は、ＳＭＮ１エクソン７の欠失（Δ７）を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記インキュベートするステップｃ）後、前記第１の複数の最終分化ＮＰＣを固定及び透過処理することが続く、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ｇ）第２の複数の最終分化ＮＰＣを提供すること；
ｈ）前記ウイルスベクターを含む参照標準品で前記第２の複数の最終分化ＮＰＣを形質導入すること；
ｉ）前記形質導入された第２の複数の最終分化ＮＰＣを、前記目的タンパク質を発現させるのに十分な条件下でインキュベートすること；
ｊ）（ｉ）からの前記第２の複数の最終分化ＮＰＣを、前記目的タンパク質に特異的な分子に接触させること；
ｋ）前記第２の複数の最終分化ＮＰＣをイメージングして、１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）アッセイリードアウトを入手すること；及び
ｌ）前記第１の複数の最終分化ＮＰＣのＩＦＩ−Ｃを前記第２の複数の最終分化ＮＰＣのＩＦＩ−Ｃと比較すること
を含み、それにより、前記参照標準品と比べた前記試験サンプルの前記ウイルスベクターの相対効力を決定する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の複数の最終分化ＮＰＣは、ＳＭＮ１−／−突然変異に関してホモ接合である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＳＭＮ１−／−突然変異は、ＳＭＮ１エクソン７の欠失（Δ７）を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記インキュベートするステップ（ｉ）後、前記第２の複数の最終分化ＮＰＣを固定及び透過処理することが続く、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項９】
前記第１及び第２の複数の最終分化ＮＰＣは、ＳＭＮ１−／−マウス胚の皮質から単離された神経前駆細胞を最終分化させることによって作製される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記神経前駆細胞（ＮＰＣ）は、
ａ．上皮成長因子（ＥＧＦ）と線維芽細胞成長因子−塩基性（ｂＦＧＦ）とを含有する無血清培養培地で前記ＮＰＣを培養してニューロスフェアを形成すること；
ｂ．前記ニューロスフェアを解離させて解離ＮＰＣを作製すること；及び
ｃ．成長因子なしの高血清培地で前記解離ＮＰＣを培養すること
によって最終分化され、それにより最終分化ＮＰＣを作製している、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１及び第２の複数の細胞は、前記試験サンプル及び前記参照標準品により、前記ウイルスベクターの少なくとも２つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１及び第２の複数の細胞は、前記試験サンプル及び参照標準品中の前記ウイルスベクターの５つの異なるＭＯＩで形質導入される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記５つのＭＯＩは、１細胞当たり３００，０００、１５０，０００、７５，０００、３７，５００、１８，７５０個のウイルス粒子を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記比較するステップ（ｌ）は、前記試験サンプル及び前記参照標準品の各々についてＭＯＩ対ＩＦＩ−Ｃの検量線をプロットすることを含む、請求項５〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記比較するステップ（ｌ）は、前記試験サンプル及び前記参照標準品の各々について対数ＭＯＩ対ＩＦＩ−Ｃの線形回帰を計算し、それにより試験サンプルの傾き及び参照標準品の傾きを導き出すことを含む、請求項５〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルスベクターの前記相対効力を決定することは、平行線分析（ＰＬＡ）によって実施され、前記ＰＬＡは、前記参照標準品の傾きに対する前記試験サンプルの傾きの傾き比を測定することを含む、請求項５〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記参照標準品の傾きは、１．０２Ｅ＋０５以上である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記傾き比は、０．６９〜１．４５である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記傾き比は、０．７５〜１．３３である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルの前記線形回帰の変動係数を計算することを含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記変動係数は、１５．６％〜２９．５％である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記変動係数は、４０％以下、３０％以下又は２０％以下である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記試験サンプル及び前記参照標準品の前記線形回帰についてＲ２値を計算することを含む、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記試験サンプル及び前記参照標準品についての前記Ｒ２値は、０．９５以上である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記参照標準品のアッセイダイナミックウィンドウを計算することを含む、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記アッセイダイナミックウィンドウは、２．６９以上である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記目的タンパク質は、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）タンパク質である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＳＭＮ１タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス血清型９型（ＡＡＶ９）である、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ウイルスベクターは、前記ＳＭＮ１タンパク質をコードする前記配列に作動可能に連結されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／ニワトリβ−アクチンハイブリッドプロモーター（ＣＢ）をコードする配列を含む、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ウイルスベクターは、ＡＡＶ血清型２型（ＡＡＶ２）ＤＮＡ由来のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ウイルスベクターは、配列番号１の配列を含む、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞は、前記ウイルスベクターによる形質導入前に８〜１５回継代される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＩＦＩ−Ｃリードアウトは、タンパク質発現の測定値を反映する、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
形質導入後に前記最終分化ＮＰＣをインキュベートする前記ステップは、約６９〜７５時間にわたって実施される、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記目的タンパク質に特異的な前記分子は、抗体、抗体断片又はアプタマーを含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体は、前記目的タンパク質に特異的な抗体を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗目的タンパク質抗体は、約４μｇ／ｍＬの濃度で提供される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗目的タンパク質抗体は、約２μｇ／ｍＬの濃度で提供される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記分子は、検出可能標識を含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記最終分化ＮＰＣを洗浄して、前記目的タンパク質に特異的な前記分子を取り出すことを更に含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記最終分化ＮＰＣを、前記目的タンパク質に特異的な前記分子を特異的に認識する第２の分子に接触させることを更に含む、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記第２の分子は、検出可能標識を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記第２の分子は、抗体、抗体断片又はアプタマーを含む、請求項４２又は４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記最終分化ＮＰＣは、前記固定及び透過処理するステップ後、抗核検出可能標識に接触される、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記最終分化ＮＰＣは、固体表面上にある、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記固体表面は、ポリ−Ｄ−リジンでコートされている、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記最終分化ＮＰＣは、２０，０００細胞／ウェルの密度で播種される、請求項４６又は４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記目的タンパク質のレベルの用量依存的増加の定量的測定を可能にする、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
ａ．ウイルスベクターで形質導入される能力を有する複数の細胞；
ｂ．目的タンパク質をコードするウイルスベクター；
ｃ．前記目的タンパク質と結合する能力を有する第１の分子；
ｄ．前記第１の分子と結合する能力を有する第２の分子であって、検出可能標識を含む第２の分子；及び
ｅ．イメージングアッセイにおける使用に関する説明書
を含むキット。
【請求項５１】
前記複数の細胞は、神経前駆細胞（ＮＰＣ）を含む、請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
前記ＮＰＣは、ＳＭＮ１−／−突然変異に関してホモ接合である、請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
前記ＳＭＮ１−／−突然変異は、エクソン７の欠失（Δ７）である、請求項５１に記載のキット。
【請求項５４】
前記ウイルスベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／ニワトリβ−アクチンハイブリッドプロモーター（ＣＢ）の制御下でＳＭＮ１タンパク質を発現するｃＤＮＡと、ＡＡＶ血清型２型（ＡＡＶ２）ＤＮＡ由来の２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）とを含むアデノ随伴ウイルス血清型９型（ＡＡＶ９）である、請求項５０〜５３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５５】
前記第１の分子は、抗ＳＭＮ１抗体を含む、請求項５０〜５４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５６】
前記第２の分子は、前記第１の分子に特異的な抗体を含む、請求項５０〜５５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５７】
前記第２の分子は、検出可能標識を含む、請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
前記目的タンパク質は、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）タンパク質である、請求項５０〜５７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５９】
トランス遺伝子を含むウイルスベクターを含む医薬組成物を作製する方法であって、
ａ．前記トランス遺伝子を含む前記ウイルスベクターを作製すること；
ｂ．請求項１〜４９のいずれか一項に記載のトランス遺伝子を測定する方法により、前記ウイルスベクターをアッセイすること；及び
ｃ．前記トランス遺伝子を含む前記ウイルスベクターを医薬組成物に製剤化すること
を含む方法。
【請求項６０】
前記ウイルスベクターを作製することは、
ａ．接着細胞を培養すること；
ｂ．前記接着細胞にプラスミドをトランスフェクトして、前記ＡＡＶウイルスベクターの産生を可能にすること；
ｃ．前記接着細胞を溶解させて前記ＡＡＶウイルスベクターを単離すること；
ｄ．（ｃ）の細胞ライセートを酸性化及び清澄化すること；
ｅ．（ｄ）の産物を、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いて精製すること；
ｆ．（ｅ）の産物を、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を用いてろ過すること；
ｇ．（ｆ）の産物を塩化セシウム（ＣｓＣｌ）緩衝液中で超遠心すること；及び
ｈ．（ｇ）の産物から前記ＡＡＶウイルスベクターを収集すること
を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ＡＡＶは、ＡＡＶ９である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＡＡＶは、自己相補的（ｓｃＡＡＶ）である、請求項６０又は６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記接着細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項６０又は６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記接着細胞は、培養前に接着性に関して選択される、請求項６０〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記選択は、前記接着細胞を複数回継代培養して、接着性に関して選択することを含む、請求項６０〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記接着細胞は、培養用バイオリアクターに播種される、請求項６０〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記バイオリアクターは、細胞培養培地の連続循環を提供することができる大規模バイオリアクターである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記バイオリアクターは、２００ｍ２、３３３ｍ２又は５００ｍ２バイオリアクターである、請求項６６又は６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記接着細胞は、再循環培地バッグ内の培地に加えられ、且つ前記バイオリアクターを通して循環される、請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記細胞は、蠕動ポンプを用いて循環される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
蠕動ポンプ輸送は、前記接着細胞が培養用バイオリアクターに播種される間、継続される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記播種密度は、約８，０００〜１２，０００細胞／ｃｍ２である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記トランスフェクションステップは、前記再循環培地バッグにトランスフェクション培地を加え、且つ前記バイオリアクターを通して前記トランスフェクション培地を循環させることを含む、請求項６０〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記トランスフェクション培地は、蠕動ポンプを用いて循環される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記循環は、１５〜２５℃で行われる、請求項７３又は７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記トランスフェクションステップは、前記接着細胞をアデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＨＥＬＰ）に接触させることを含む、請求項６０〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記トランスフェクションステップは、前記接着細胞を、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子をコードするプラスミドに接触させることを含む、請求項６０〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記トランスフェクションステップは、前記接着細胞を、ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドに接触させることを含む、請求項６０〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記トランスフェクションステップは、前記接着細胞を、同じプラスミド（ｐＡＡＶ）上にＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドに接触させることを含む、請求項６０〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子は、ｒｅｐ２である、請求項７７又は７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子は、ｃａｐ９である、請求項７８又は７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記トランスフェクションステップは、前記接着細胞をトランスフェクション剤ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に接触させることを含む、請求項６０〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
ＰＥＩと前記プラスミドの少なくとも１つとの比は、重量基準で１：１未満である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
ＰＥＩと前記プラスミドの少なくとも１つとの比は、重量基準で約１：１である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記トランスフェクションステップは、前記接着細胞を、血清を含有しないトランスフェクション培地に接触させることを含む、請求項７３〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記トランスフェクションステップは、前記接着細胞を、カルシウムを含有しないトランスフェクション培地に接触させることを含む、請求項６０〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記トランスフェクトするステップは、前記接着細胞を、グルタミンを含有しないトランスフェクション培地に接触させることを含む、請求項６０〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記トランスフェクトするステップは、１０〜６０分、１０〜３０分、２０〜３０分、１５〜３０分又は３０分未満にわたって実施される、請求項６０〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記溶解させるステップは、全細胞溶解を含む、請求項６０〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記溶解させるステップは、エンドヌクレアーゼを補足した溶解緩衝液を使用することを含む、請求項６０〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記エンドヌクレアーゼは、ベンゾナーゼである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記溶解させるステップは、ＴＷＥＥＮを補足した溶解緩衝液を使用することを含む、請求項６０〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記溶解させるステップは、１５〜２５℃で実施される、請求項６０〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
ステップ（ｃ）の前記細胞ライセートを（ｄ）の前記酸性化ステップ前に凍結することを更に含む、請求項６０〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記ＣｓＣｌ緩衝液は、２〜４Ｍ  ＣｓＣｌ緩衝液である、請求項６０〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
ＣｓＣｌは、約３Ｍの濃度である、請求項６０〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
（ｉ）（ｇ）の前記産物を、タンジェンシャルフローろ過を通してろ過することを更に含む、請求項６０〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記酸性化ステップは、前記細胞ライセートを約３．０〜４．０、約３．３〜３．７又は約３．４〜３．６のｐＨに酸性化することを含む、請求項６０〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記酸性化ステップは、前記細胞ライセートを約３．５のｐＨに酸性化することを含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記超遠心は、約４０，０００〜５０，０００ｒｐｍ又は約４３，０００〜４６，０００ｒｐｍで実施される、請求項６０〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記超遠心は、１５〜２５℃で実施される、請求項６０〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記超遠心は、１６〜２４時間又は２０〜２４時間にわたって実施される、請求項６０〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記細胞ライセートは、前記酸性化ステップ前にＴｗｅｅｎと共にインキュベートされる、請求項６０〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記細胞ライセートは、前記酸性化ステップ前にＴｗｅｅｎと共に約８〜２０時間にわたってインキュベートされる、請求項６０〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記清澄化ステップは、前記細胞ライセートを、デプスフィルタを通してろ過することを含む、請求項６０〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記清澄化ステップは、前記細胞ライセートを、０．４５ミクロンフィルタを通してろ過することを含む、請求項６０〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ＣＥＸは、スルホニル樹脂を含む、請求項６０〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
少なくとも１つのＴＦＦステップは、３００ｋＤａ  ＭＷの分子量カットオフのセルロース膜を使用することを含む、請求項６０〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ＴＦＦステップは、前記陽イオン交換ステップの溶出液容積を少なくとも６分の１に減少させる、請求項６０〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ＣｓＣｌ緩衝液は、トリス、ＭｇＣｌ２及びポロキサマー１８８を含む、請求項６０〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ＣｓＣｌ緩衝液は、約２０ｍＭトリスを含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ＣｓＣｌ緩衝液は、約２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む、請求項１１０〜１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ＣｓＣｌ緩衝液は、ポロキサマー１８８、任意選択で約０．２％ｗ／ｖポロキサマー１８８を含む、請求項１１０〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記ＣｓＣｌ緩衝液は、約ｐＨ７．５〜８．５又は約ｐＨ７．９〜８．２である、請求項６０〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
空のウイルスカプシドの数は、前記超遠心された細胞ライセートから前記ＡＡＶウイルスベクターを収集した後、総ウイルスカプシドの７％未満、５％未満、３％未満又は１％未満である、請求項６０〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記空のウイルスカプシドの数は、分析的超遠心法（ＡＵＣ）によって測定される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ＡＡＶウイルスベクターは、前記超遠心された細胞ライセートからシリンジを用いて収集される、請求項６０〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
第２のＴＦＦステップ後に収集される前記ＡＡＶウイルスベクターは、トリス、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ及びポロキサマー１８８を含む溶液中に貯蔵される、請求項６０〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記溶液は、約２０ｍＭトリスを含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記溶液は、約１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む、請求項１１８又は１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記溶液は、約２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む、請求項１１８〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記溶液は、約０．００５％ｗ／ｖポロキサマー１８８を含む、請求項１１８〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記溶液は、約ｐＨ７．５〜８．５又は約ｐＨ７．７〜８．３である、請求項１１８〜１２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記第２のＴＦＦ後に収集される前記ＡＡＶウイルスベクターは、約３０μｇ／ｇ未満又は約２０μｇ／ｇ未満のＣｓＣｌを含有する、請求項６０〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記第２のＴＦＦ後に収集されるＡＡＶウイルスベクターの濃度は、約３×１０１３ｖｇ／ｍｌ以上である、請求項６０〜１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
宿主細胞タンパク質及び／又は宿主細胞ＤＮＡは、前記細胞ライセートからデタージェントによるフロキュレーションを用いて除去される、請求項６０〜１２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ＡＡＶウイルスベクターは、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項６０〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記ＳＭＮタンパク質をコードする前記プラスミド、前記ｐＡＡＶをコードする前記プラスミド及び前記ｐＨＥＬＰをコードする前記プラスミドは、１：１：１の比でトランスフェクトされる、請求項７６〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記医薬組成物は、
ａ．１〜８×１０１３ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）；
ｂ．約７％未満の空のウイルスカプシド；
ｃ．１×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約１００ｎｇ／ｍＬ未満の宿主細胞タンパク質；
ｄ．１×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約５×１０６ｐｇ／ｍＬ未満の残留宿主細胞ＤＮＡ
を含み、前記１〜８×１０１３ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬの少なくとも約８０％は、機能性である、請求項６０〜１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記医薬組成物は、１．７〜２．３×１０１３ＡＡＶ９  ｖｇ／ｍＬ又は１．９〜２．１×１０１３ＡＡＶ９  ｖｇ／ｍＬを含む、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記医薬組成物は、約２×１０１３ＡＡＶ９  ｖｇ／ｍＬを含む、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３２】
前記医薬組成物は、約５％未満の空のカプシド、約３％未満の空のカプシド又は約１％未満の空のカプシドを含む、請求項１２９〜１３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記医薬組成物は、１〜２×１０１４ｖｇの前記ＡＡＶ９ウイルスベクター又は１．１×１０１４ｖｇの前記ＡＡＶ９ウイルスベクターを含むか又はそれからなる、請求項１２９〜１３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記医薬組成物は、１．７×１０１４ｖｇの前記ＡＡＶ９ウイルスベクターからなる、請求項１２９〜１３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記医薬組成物は、水性医薬製剤である、請求項１２９〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記製剤は、トリス緩衝液、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム及びポロキサマーを含み、前記医薬組成物は、保存剤を含まない、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記ポロキサマーは、ポロキサマー１８８を含む、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記製剤のｐＨは、約７．７〜約８．３である、請求項１３５〜１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記ｐＨは、約ｐＨ８．０である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
塩化マグネシウム濃度は、約０．５〜１．５ｍＭである、請求項１３６〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記塩化マグネシウム濃度は、約１ｍＭである、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
塩化ナトリウム濃度は、約１００〜３００ｍＭである、請求項１３６〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記塩化ナトリウム濃度は、約２００ｍＭである、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記製剤は、約０．００５％ｗ／ｖポロキサマー１８８を含む、請求項１３６〜１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記製剤は、３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項１３６〜１４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記医薬製剤は、
ａ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．０９ｎｇ未満のベンゾナーゼ、
ｂ．約３０μｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満のセシウム、
ｃ．約２０〜８０ｐｐｍのポロキサマー１８８、
ｄ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．２２ｎｇ未満のＢＳＡ、
ｅ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約６．８×１０５ｐｇ未満の残留プラスミドＤＮＡ、
ｆ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約１．１×１０５ｐｇ未満の残留ｈｃＤＮＡ、
ｇ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約４ｎｇ未満のｒＨＣＰ、
ｈ．約ｐＨ７．７〜８．３、
ｉ．約３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、
ｊ．１容器当たり約６００個未満の、≧２５μｍのサイズの粒子、
ｋ．１容器当たり約６０００個未満の、≧１０μｍのサイズの粒子、
ｌ．約１．７×１０１３〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価、
ｍ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約３．９×１０８〜８．４×１０１０ＩＵの感染力価、
ｎ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約１００〜３００μｇの全タンパク質、
ｏ．約７０〜１３０％の相対効力、及び
ｐ．約５％未満の空のカプシド
の少なくとも１つを含む、請求項６０〜１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４７】
前記医薬製剤は、
ａ．約ｐＨ７．７〜８．３、
ｂ．約３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、
ｃ．１容器当たり約６００個未満の、≧２５μｍのサイズの粒子、
ｄ．１容器当たり約６０００個未満の、≧１０μｍのサイズの粒子、
ｅ．約１．７×１０１３〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価、
ｆ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約３．９×１０８〜８．４×１０１０ＩＵの感染力価、
ｇ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約１００〜３００μｇの全タンパク質、
ｈ．約２０〜８０ｐｐｍのＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８含有量、
ｉ．約７０〜１３０％の相対効力、
ｊ．７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で２４日以上のΔ７ＳＭＮマウスモデルにおける生存期間中央値、
ｋ．約５％未満の空のカプシド、及び
ｌ．約９５％以上の総純度、並びに
ｍ．約０．７５ＥＵ／ｍＬ以下のエンドトキシン
の少なくとも１つを含む、請求項６０〜１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４８】
前記医薬製剤は、
ａ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．０９ｎｇ未満のベンゾナーゼ、
ｂ．約３０μｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満のセシウム、
ｃ．約２０〜８０ｐｐｍのポロキサマー１８８、
ｄ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．２２ｎｇ未満のＢＳＡ、
ｅ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約６．８×１０５ｐｇ未満の残留プラスミドＤＮＡ、
ｆ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約１．１×１０５ｐｇ未満の残留ｈｃＤＮＡ、及び
ｇ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約４ｎｇ未満のｒＨＣＰ
の少なくとも１つを含む、請求項６０〜１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４９】
前記ウイルスベクターの前記相対効力は、参照標準品と比べて少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％又は少なくとも１４０％である、請求項５９〜１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５０】
前記ウイルスベクターの前記相対効力は、前記参照標準品と比べて少なくとも９０％である、請求項５９〜１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５１】
前記医薬製剤中の前記ウイルスベクターの前記効力は、前記参照標準品の効力の５％以内、前記参照標準品の効力の１０％以内又は前記参照標準品の効力の２０％以内である、請求項５９〜１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５２】
トランス遺伝子を含むウイルスベクターを含む療法を用いて、治療を、それを必要としている患者に行う方法であって、
ａ．請求項１〜４９のいずれか一項に記載のトランス遺伝子発現を測定する方法により、トランス遺伝子を含む前記ウイルスベクターをアッセイすること；及び
ｂ．トランス遺伝子を含む前記ウイルスベクターを前記患者に投与すること
を含む方法。
【請求項１５３】
前記ウイルスベクターは、医薬組成物に製剤化される、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記医薬組成物は、
ａ．１〜８×１０１３ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）；
ｂ．約７％未満の空のウイルスカプシド；
ｃ．１×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約１００ｎｇ／ｍＬ未満の宿主細胞タンパク質；及び
ｄ．１×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約５×１０６ｐｇ／ｍＬ未満の残留宿主細胞ＤＮＡ
を含み、前記１〜８×１０１３ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬの少なくとも約８０％は、機能性である、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１５５】
前記それを必要としている患者は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、任意選択でＩ型ＳＭＡを有する、請求項１５２〜１５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５６】
前記それを必要としている患者は、
ａ．２歳以下、任意選択で生後９ヵ月以下であり；
ｂ．少なくとも約２．６ｋｇの体重を有し；
ｃ．両アレル性ＳＭＮ１ヌル突然変異又は欠失を有し；及び
ｄ．ＳＭＮ２の少なくとも１つの機能性コピーを有する、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
前記組成物は、髄腔内又は静脈内経路によって前記患者に投与される、請求項１５３〜１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５８】
前記ウイルスベクターは、約１〜２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１５２〜１５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５９】
前記ウイルスベクターは、約１．１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１５２〜１５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６０】
ウイルスベクターゲノムの量は、ｄｄＰＣＲを用いて測定される、請求項１５８又は１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
前記患者は、約１３．５ｋｇ以下、任意選択で約８．５ｋｇ以下の体重を有する、請求項１５５〜１６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６２】
前記患者は、ＳＭＮ２遺伝子の少なくとも１つのコピーのエクソン７にｃ．８５９Ｇ＞Ｃ置換を有しない、請求項１５５〜１６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６３】
前記治療は、２歳より前、任意選択で生後６ヵ月より前に前記患者に投与される、請求項１５５〜１６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６４】
前記治療は、筋緊張低下、運動技能遅滞、定頸不全、円背姿勢及び関節過度可動性から選択される１つ以上のＳＭＡ症状の発症前に前記患者に投与される、請求項１５５〜１６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６５】
前記患者は、投与前にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定される１：１００又は１：５０以下の抗ＡＡＶ９抗体力価を有する、請求項１５５〜１６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６６】
前記患者は、投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定される１：１００を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、且つ約１〜８週間にわたって又は力価が１：１００未満に低下するまでモニタされる、請求項１５５〜１６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６７】
前記患者は、投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定される１：１００を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、且つ約１〜８週間にわたって又は力価が１：５０未満に低下するまでモニタされる、請求項１５５〜１６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６８】
前記患者は、投与前又は投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定される１：１００を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、且つ人工栄養に切り換えられる、請求項１５５〜１６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６９】
前記患者は、投与前又は投与後に人工栄養に切り換えられる、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
前記患者は、投与前又は投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定される１：５０を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、且つ人工栄養に切り換えられる、請求項１５５〜１６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７１】
前記患者は、投与前又は投与後に人工栄養に切り換えられる、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
前記患者は、投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定される１：１００を上回る又は１：５０を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、且つプラスマフェレーシスを用いて治療される、請求項１５５〜１７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７３】
前記患者は、投与前に約６７，０００細胞／ｍｌを上回る、又は約１００，０００細胞／ｍｌを上回る、又は約１５０，０００細胞／ｍｌを上回る血小板数を有する、請求項１５５〜１７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７４】
前記患者は、投与後に約６７，０００細胞／ｍｌを下回る、又は約１００，０００細胞／ｍｌを下回る、又は約１５０，０００細胞／ｍｌを下回る血小板数を有し、且つ約１〜８週間にわたって又は血小板数が約６７，０００細胞／ｍｌに増加するまで、若しくは約１００，０００細胞／ｍｌを上回って増加するまで、若しくは約１５０，０００細胞／ｍｌを上回って増加するまでモニタされる、請求項１５５〜１７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７５】
前記患者は、投与後に約６７，０００細胞／ｍｌを下回る血小板数を有し、且つ血小板輸血で治療される、請求項１５５〜１７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７６】
前記患者は、投与前に血小板減少症を有しない、請求項１５５〜１７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７７】
前記患者は、投与後に血小板減少症を有し、且つ約１〜８週間にわたって又は前記患者が血小板減少症を有しなくなるまでモニタされる、請求項１５５〜１７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７８】
前記患者は、投与後に血小板減少症を有し、且つ血小板輸血で治療される、請求項１５５〜１７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７９】
前記患者は、前記ウイルスベクターの投与前に約０．１７６ｕｇ／ｍｌ未満のトロポニン−Ｉレベルを有する、請求項１５５〜１７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８０】
前記患者における前記トロポニン−Ｉのレベルは、前記ウイルスベクターの投与後にモニタされる、請求項１５５〜１７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８１】
モニタリングは、投与後、前記患者におけるトロポニン−Ｉレベルが約０．１７６ｕｇ／ｍｌ未満になるまで実施される、請求項１７９又は１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
前記患者は、投与前に正常な肝機能を有する、請求項１５５〜１８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８３】
前記患者は、投与前に約８〜４０Ｕ／Ｌ未満の肝トランスアミナーゼレベルを有する、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
肝トランスアミナーゼは、アラニントランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＬＴ）及びこれらの組み合わせから選択される、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
前記患者は、投与前に３．０ｍｇ／ｄＬ未満のビリルビンレベル、１．８ｍｇ／ｄＬ未満のクレアチニンレベル、８〜１８ｇ／ｄＬのＨｇｂレベル及び／又は約２００００／ｍｍ３未満の白血球数を有する、請求項１５５〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８６】
前記ウイルスベクターは、トリス緩衝生理食塩水中で投与される、請求項１５５〜１８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８７】
前記ウイルスベクターは、約５〜２０ｍＬ／ｋｇ、約１０〜２０ｍＬ／ｋｇ又は約５．５〜６．５ｍＬ／ｋｇのトリス緩衝生理食塩水中で投与される、請求項１５５〜１８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８８】
前記ウイルスベクターは、約４５〜７５分にわたって注入される、請求項１５５〜１８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８９】
前記ウイルスベクターは、約６０分にわたって注入される、請求項１５５〜１８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９０】
前記注入は、シリンジポンプを含む、請求項１８８又は１８９に記載の方法。
【請求項１９１】
前記患者は、前記ウイルスベクターを投与する少なくとも２４時間前に経口ステロイド薬を投与される、請求項１５５〜１８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９２】
前記患者は、前記ウイルスベクターを投与した後、少なくとも３０日間にわたって経口ステロイド薬を投与される、請求項１５５〜１９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９３】
前記経口ステロイド薬は、１日１回投与される、請求項１９２に記載の方法。
【請求項１９４】
前記経口ステロイド薬は、１日２回投与される、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９５】
前記患者は、前記ウイルスベクターの投与後、ＡＬＴ及び／又はＡＳＴのレベルの上昇に関してモニタされ、前記経口ステロイド薬は、３０日後、ＡＳＴ及び／又はＡＬＴレベルが正常上限の２倍を下回るか又は約１２０ＩＵ／Ｌを下回るまで継続して投与される、請求項１９１〜１９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９６】
前記患者は、ＡＳＴ及び／又はＡＬＴレベルが正常上限の２倍を下回るか又は約１２０ＩＵ／Ｌを下回るまで経口ステロイド薬を投与される、請求項１９１〜１９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９７】
前記経口ステロイド薬は、約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１９１〜１９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９８】
ＡＳＴ及びＡＬＴが正常上限の２倍を下回るか又は約１２０ＩＵ／Ｌを下回った後、前記経口ステロイド薬投与を漸減することを更に含む、請求項１９１〜１９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９９】
前記漸減することは、２週間で０．５ｍｇ／ｋｇ／日まで、続いて更に２週間で０．２５ｍｇ／ｋｇ／日までの段階的増加を含む、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２００】
前記経口ステロイド薬を約１ｍｇ／ｋｇの用量で３０日間にわたって投与し、且つその後、２週間で０．５ｍｇ／ｋｇ／日まで、続いて更に２週間で０．２５ｍｇ／ｋｇ／日まで漸減することを含む、請求項１９１〜１９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０１】
前記経口ステロイド薬は、プレドニゾロン又は均等物である、請求項１９１〜２００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０２】
前記患者に筋エンハンサー又は神経保護剤を投与することを含む、請求項１５５〜２０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０３】
ＳＭＮを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記患者に投与することを含む、請求項１５５〜２０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０４】
前記患者にヌシネルセンを投与することを含む、請求項１５５〜２０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０５】
前記患者にスタムルマブを投与することを含む、請求項１５５〜２０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０６】
有効性は、ＣＨＯＰ−ＩＮＴＥＮＤ尺度を用いて決定される、請求項１５５〜２０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０７】
前記患者は、疾患発症を伴うか又は伴わない、請求項１５５〜２０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０８】
ａ．前記患者の前記体重を決定すること；
ｂ．ＡＡＶ９ウイルスベクター医薬組成物のバイアルを含むキットを入手することであって、各バイアルにおけるウイルスベクター濃度は、約２．０×１０１３ｖｇ／ｍＬであり；
前記キットにおける前記バイアルの数及び容積は、
前記患者の前記体重が２．６〜３ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で２バイアル、
前記患者が３．１〜３．５ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で２バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で１バイアル、
前記患者が３．６〜４．０ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で１バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で２バイアル、
前記患者が４．１〜４．５ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で３バイアル、
前記患者が４．６〜５．０ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で２バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で２バイアル、
前記患者が５．１〜５．５ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で１バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で３バイアル、
前記患者が５．６〜６．０ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で４バイアル、
前記患者が６．１〜６．５ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で２バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で３バイアル、
前記患者が６．６〜７．０ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で１バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で４バイアル、
前記患者が７．１〜７．５ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で５バイアル、
前記患者が７．６〜８．０ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で２バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で４バイアル、
前記患者が８．１〜８．５ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で１バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で５バイアル、
前記患者が８．６〜９．０ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で６バイアル、
前記患者が９．１〜９．５ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で２バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で５バイアル、
前記患者が９．６〜１０．０ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で１バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で６バイアル、
前記患者が１０．１〜１０．５ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で７バイアル、
前記患者が１０．６〜１１．０ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で２バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で６バイアル、
前記患者が１１．１〜１１．５ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で１バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で７バイアル、
前記患者が１１．６〜１２．０ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で８バイアル、
前記患者が１２．１〜１２．５ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で２バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で７バイアル、
前記患者が１２．６〜１３．０ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で１バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で８バイアル、及び
前記患者が１３．１〜１３．５ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で９バイアル
からなる群から選択される、入手すること；及び
ｃ．前記バイアルから前記ＡＡＶ９ウイルスベクターを前記患者に投与すること
を含む、請求項１５５〜２０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０９】
前記ＡＡＶウイルスベクターは、約１．０×１０１４〜２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量での注入によって投与される、請求項２０８に記載の方法。
【請求項２１０】
前記ＡＡＶウイルスベクターは、約１．１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量での注入によって投与される、請求項２０８又は２０９に記載の方法。
【請求項２１１】
前記ウイルスベクターは、約４５〜７０分にわたって注入される、請求項２０９又は２１０に記載の方法。
【請求項２１２】
前記ウイルスベクターは、約６０分にわたって注入される、請求項２０９〜２１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１３】
前記注入は、シリンジポンプを含む、請求項２０９〜２１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１４】
ウイルスベクターゲノムの量は、ｄｄＰＣＲを用いて測定される、請求項２０９〜２１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１５】
ＡＡＶ９ウイルスベクターの用量力価は、ｄｄＰＣＲによって測定される、請求項２０９〜２１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１６】
前記患者が２．６〜３．０ｋｇの体重であるときに１６．５ｍＬ、前記患者が３．１〜３．５ｋｇの体重であるときに１９．３ｍＬ、前記患者が３．６〜４．０ｋｇの体重であるときに２２．０ｍＬ、前記患者が４．１〜４．５ｋｇの体重であるときに２４．８ｍＬ、前記患者が４．６〜５．０ｋｇの体重であるときに２７．５ｍＬ、前記患者が５．１〜５．５ｋｇの体重であるときに３０．３ｍＬ、前記患者が５．６〜６．０ｋｇの体重であるときに３３．０ｍＬ、前記患者が６．１〜６．５ｋｇの体重であるときに３５．８ｍＬ、前記患者が６．６〜７．０ｋｇの体重であるときに３８．５ｍＬ、前記患者が７．１〜７．５ｋｇの体重であるときに４１．３ｍＬ、前記患者が７．６〜８．０ｋｇの体重であるときに４４．０、前記患者が８．１〜８．５ｋｇの体重であるときに４６．８ｍＬ、前記患者が８．６〜９．０ｋｇの体重であるときに４９．５、前記患者が９．１〜９．５ｋｇの体重であるときに５２．３ｍＬ、前記患者が９．６〜１０．０ｋｇの体重であるときに５５．０、前記患者が１０．１〜１０．５ｋｇの体重であるときに５７．８ｍＬ、前記患者が１０．６〜１１．０ｋｇの体重であるときに６０．５、前記患者が１１．１〜１１．５ｋｇの体重であるときに６３．３ｍＬ、前記患者が１１．６〜１２．０ｋｇの体重であるときに６６．０、前記患者が１２．１〜１２．５ｋｇの体重であるときに６８．８ｍＬ、前記患者が１２．６〜１３．０ｋｇの体重であるときに７１．５及び前記患者が１３．１〜１３．５ｋｇの体重であるときに７４．３ｍＬの用量容積を投与することを含む、請求項１５５〜２１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１７】
前記医薬組成物は、
ａ．修飾ＡＡＶ２  ＩＴＲと、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーターと、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサーと、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロンと、ＳＭＮ１ポリペプチドをコードする配列と、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルと、非修飾ＡＡＶ２  ＩＴＲとを含む自己相補的ＡＡＶ９ウイルスベクター；
ｂ．ｐＨ８．０の２０ｍＭトリス；
ｃ．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２；
ｄ．２００ｍＭ  ＮａＣｌ；及び
ｅ．０．００５％ポロキサマー１８８
を含み、前記患者は、２歳未満である、請求項１５５〜２１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１８】
前記組成物は、保存剤を含まない、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２１９】
前記ウイルスベクターの前記相対効力は、参照標準品と比べて少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％又は少なくとも１４０％である、請求項１５２〜２１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２０】
前記ウイルスベクターの前記相対効力は、前記参照標準品と比べて少なくとも９０％である、請求項１５２〜２１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２１】
医薬製剤中の前記ウイルスベクターの前記効力は、前記参照標準品の効力の５％以内、前記参照標準品の効力の１０％以内又は前記参照標準品の効力の２０％以内である、請求項１５２〜２１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年６月８日に出願された米国仮特許出願第６２／６８２，２６３号明細書（その内容は、全体として参照により本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
参照による配列表の援用
本願は、ＥＦＳ−ＷｅｂからＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、この配列表は、全体として参照により本明細書に援用される。２０１９年６月４日に作成された前記ＡＳＣＩＩ複製物は、名称がＡＶＥＸ−００４００１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズが２５キロバイトである。
【背景技術】
【０００３】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科（ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）のメンバーである。ＡＡＶゲノムは、約４．７キロベース（ｋｂ）を含み、且つ非構造Ｒｅｐ（複製）及び構造Ｃａｐ（カプシド）タンパク質をコードする２つの主要なオープンリーディングフレームからなる線状一本鎖ＤＮＡ分子で構成されている。ＡＡＶコード領域には、約１４５ヌクレオチド長の、ＤＮＡ複製開始時にプライマーとして機能するヘアピン構造に折り畳まれることができる分断されたパリンドローム配列を含む２つのシス作用性ヌクレオチド逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接する。ＤＮＡ複製におけるその役割に加えて、ＩＴＲ配列は、ウイルス組込み、宿主ゲノムからのレスキュー及び成熟ビリオンへのウイルス核酸のカプシド化に必要であることが示されている。
【０００４】
ＡＡＶに由来するベクターは、（ｉ）筋線維及びニューロンを含めた多様な非分裂及び分裂細胞型に感染（形質導入）することが可能であり；（ｉｉ）ウイルス構造遺伝子を欠いているため、ウイルス感染に対する天然の宿主細胞応答、例えばインターフェロン媒介性応答がなくなり；（ｉｉｉ）野生型ウイルスは、これまでヒトにおけるいかなる病理とも関連付けられたことがなく；（ｉｖ）宿主細胞ゲノムへの組込み能を有する野生型ＡＡＶと対照的に、複製欠損ＡＡＶベクターは、概してエピソームとして残り、従って癌遺伝子の挿入突然変異誘発又は活性化のリスクが限定され；及び（ｖ）他のベクター系と対照的に、ＡＡＶベクターは、顕著な免疫応答を引き起こさず（ｉｉを参照されたい）、従って治療用トランス遺伝子の長期発現を（その遺伝子産物が拒絶されないならば）もたらすという理由のため、遺伝子材料の送達に特に魅力的である。
【０００５】
自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）は、天然に存在するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から遺伝子療法における使用向けに操作されたウイルスベクターである。ｓｃＡＡＶは、コード領域が分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されているため、「自己相補的」と称される。典型的なＡＡＶゲノムは、一本鎖ＤＮＡ鋳型であるため、標準的な一本鎖ＡＡＶゲノムの遺伝子発現における律速段階は、第２鎖合成を伴う。しかしながら、これは、ｓｃＡＡＶゲノムに当てはまらない。感染時、細胞媒介性の第２鎖合成を待つのでなく、むしろｓｃＡＡＶの２つの相補的な半分が会合して、いつでも複製及び転写できる状態の１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成することになる。
【０００６】
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、ＳＭＮ１遺伝子の遺伝的欠陥が原因となって運動ニューロンの喪失につながり、進行性の筋脱力及び完全麻痺が生じる重篤な神経筋疾患である。ＳＭＡは、疾患発症及び重症度に基づいて細分類され  −  ＳＭＡ１型、２型、３型及び４型  −、これらの分類は、概して、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質レベルと相関する。
【０００７】
ウイルスベクターを（送達ベクターとして）使用することによる遺伝子療法は、この疾患の一遺伝子的性質に起因して（これは、即ち、それが単一遺伝子の欠失又は突然変異によって引き起こされることを意味する）、ＳＭＡの治療によく適した手法である。これまで、ＳＭＡの遺伝子療法には、ＡＡＶ９が好適なウイルスベクターであることが明らかになっており、ここで、ＡＡＶ９はＳＭＡ１型及びＳＭＡ２型に用いられている。このウイルスベクターは、完全に機能性のヒトＳＭＮ遺伝子を標的運動ニューロン細胞に送達し、運動ニューロン機能の改善に必要とされる十分なレベルのＳＭＮタンパク質を産生し、且つ持続的なＳＭＮタンパク質発現に加えて効果の速やかな発現をもたらすことが示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
それにも関わらず、ＡＡＶ９薬物製品のロット処分を意図した相対効力を決定するための頑健で定量的なインビトロ細胞ベースアッセイの開発が必要とされている。これまでに試験された形質転換細胞又は初代細胞（ヒト又はマウス）のいずれも、ＡＡＶ９ベースのウイルスベクターを使用した感染力価試験においてよく使用されるＨｅＬａ  ＲＣ３２細胞株を含め、ＡＡＶ９ベクターに許容性でないことが示されているという事実は、頑健で定量的な細胞ベースインビトロ効力アッセイの開発の妨げとなっている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示では、非複製ＡＡＶ９ベクターによって有効に形質導入される能力を有するＳＭＮ１−／−遺伝的背景下にある神経前駆細胞に由来する最終分化した非分裂細胞（ＮＰＣに由来する最終分化細胞、以下ｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７と称する）が初めて提供される。更に重要なことに、こうした細胞は、インビトロ細胞モデルシステムにおいて、漸増感染多重度（ＭＯＩ）でＡＡＶ９ベクターを形質導入したときの目的タンパク質の発現の用量依存的増加を、目的タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を使用したハイコンテントイメージングシステムによって測定する定量的細胞ベースアッセイの開発に使用された。
【００１０】
一態様において、本開示は、トランス遺伝子発現を測定する方法を提供し、この方法は、（ａ）複数の細胞を培養するステップであって、細胞がウイルスベクターを含み、ウイルスベクターがトランス遺伝子を含み、培養が、トランス遺伝子から目的タンパク質を発現させるのに十分な条件下である、ステップ；（ｂ）複数の細胞をインキュベートするステップであって、それにより目的タンパク質のトランス遺伝子発現が続いて起こることを可能にする、ステップ；（ｃ）複数の細胞を、目的タンパク質に特異的な分子に接触させるステップ；（ｄ）細胞をイメージングするステップであって、それにより１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）アッセイリードアウトを入手する、ステップ；及び（ｅ）ＩＦＩ−Ｃリードアウトに基づいてトランス遺伝子の発現を決定するステップを含む。
【００１１】
関連する態様において、本開示は、複数の細胞のウイルス感染力価を測定又は定量化する方法を提供し、この方法は、（ａ）複数の細胞を培養するステップであって、細胞がウイルスベクターを含み、ウイルスベクターがトランス遺伝子を含み、培養が、トランス遺伝子から目的タンパク質を発現させるのに十分な条件下である、ステップ；（ｂ）複数の細胞をインキュベートするステップであって、それにより目的タンパク質のトランス遺伝子発現が続いて起こることを可能にするステップ；（ｃ）複数の細胞を、目的タンパク質に特異的な分子に接触させるステップ；（ｄ）細胞をイメージングするステップであって、それにより１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）アッセイリードアウトを入手する、ステップ；及び（ｅ）ＩＦＩ−Ｃリードアウトに基づいてトランス遺伝子の発現を決定するステップを含む。
【００１２】
別の態様において、本開示は、トランス遺伝子発現を測定する方法であって、（ａ）第１の複数の最終分化神経前駆細胞（ＮＰＣ）を提供すること；（ｂ）目的タンパク質をコードする配列を含むウイルスベクターを含む試験サンプルで第１の複数の最終分化ＮＰＣを形質導入すること；（ｃ）形質導入された第１の複数の最終分化ＮＰＣを、目的タンパク質を発現させるのに十分な条件下でインキュベートすること；（ｄ）（ｃ）からの第１の複数の最終分化ＮＰＣを、目的タンパク質に特異的な分子に接触させること；（ｅ）第１の複数の最終分化ＮＰＣをイメージングして、１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）アッセイリードアウトを入手すること；及び（ｆ）ＩＦＩ−Ｃリードアウトに基づいて目的タンパク質の発現を決定することを含む方法を提供する。
【００１３】
本開示の方法の一部の態様において、第１の複数の最終分化ＮＰＣは、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）−／−突然変異に関してホモ接合である。一部の態様において、ＳＭＮ１−／−突然変異は、ＳＭＮ１エクソン７の欠失（Δ７）を含む。一部の態様において、インキュベートするステップｃ）後、第１の複数の最終分化ＮＰＣを固定及び透過処理することが続く。
【００１４】
別の態様において、本開示は、（ｇ）第２の複数の最終分化ＮＰＣを提供すること；（ｈ）ウイルスベクターを含む参照標準品で第２の複数の最終分化ＮＰＣを形質導入すること；（ｉ）形質導入された第２の複数の最終分化ＮＰＣを、目的タンパク質を発現させるのに十分な条件下でインキュベートすること；（ｊ）（ｉ）からの第２の複数の最終分化ＮＰＣを、目的タンパク質に特異的な分子に接触させること；（ｋ）第２の複数の最終分化ＮＰＣをイメージングして、１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）アッセイリードアウトを入手すること；及び（ｌ）第１の複数の最終分化ＮＰＣのＩＦＩ−Ｃを第２の複数の最終分化ＮＰＣのＩＦＩ−Ｃと比較することを含み、それにより、参照標準品と比べた試験サンプルのウイルスベクターの相対効力を決定する、方法を提供する。
【００１５】
本開示の方法の一部の態様において、第２の複数の最終分化ＮＰＣは、ＳＭＮ１−／−突然変異に関してホモ接合である。一部の態様において、ＳＭＮ１−／−突然変異は、ＳＭＮ１エクソン７の欠失（Δ７）を含む。
【００１６】
一部の態様において、インキュベートするステップ（ｉ）後、第２の複数の最終分化ＮＰＣを固定及び透過処理することが続く。
【００１７】
一部の態様において、前記第１及び第２の複数の最終分化ＮＰＣは、ＳＭＮ１−／−マウス胚の皮質から単離された神経前駆細胞を最終分化させることによって作製される。一部の態様において、神経前駆細胞（ＮＰＣ）は、（ａ）上皮成長因子（ＥＧＦ）と線維芽細胞成長因子−塩基性（ｂＦＧＦ）とを含有する無血清培養培地でＮＰＣを培養してニューロスフェアを形成すること；（ｂ）前記ニューロスフェアを解離させて解離ＮＰＣを作製すること；及び（ｃ）成長因子なしの高血清培地で解離ＮＰＣを培養することによって最終分化され、それにより最終分化ＮＰＣを作製している。
【００１８】
本開示の方法の一部の態様において、前記第１及び第２の複数の細胞は、試験サンプル及び参照標準品により、ウイルスベクターの少なくとも２つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入される。一部の態様において、前記第１及び第２の複数の細胞は、試験サンプル及び参照標準品中のウイルスベクターの５つの異なるＭＯＩで形質導入される。一部の態様において、５つのＭＯＩは、１細胞当たり３００，０００、１５０，０００、７５，０００、３７，５００、１８，７５０個のウイルス粒子を含む。
【００１９】
本開示の方法の一部の態様において、比較するステップ（ｌ）は、試験サンプル及び参照標準品の各々についてＭＯＩ対ＩＦＩ−Ｃの検量線をプロットすることを含む。一部の態様において、比較するステップ（ｌ）は、試験サンプル及び参照標準品の各々について対数ＭＯＩ対ＩＦＩ−Ｃの線形回帰を計算し、それにより試験サンプルの傾き及び参照標準品の傾きを導き出すことを含む。
【００２０】
本開示の方法の一部の態様において、ウイルスベクターの相対効力を決定することは、平行線分析（ＰＬＡ）によって実施され、ＰＬＡは、参照標準品の傾きに対する試験サンプルの傾きの傾き比を測定することを含む。一部の態様において、参照標準品の傾きは、１．０２Ｅ＋０５以上である。一部の態様において、傾き比は、０．６９〜１．４５である。一部の態様において、傾き比は、０．７５〜１．３３である。
【００２１】
本開示の方法の一部の態様において、本方法は、サンプルの線形回帰の変動係数を計算することを含む。一部の態様において、変動係数は、１５．６％〜２９．５％である。一部の態様において、変動係数は、４０％以下、３０％以下又は２０％以下である。
【００２２】
本開示の方法の一部の態様において、本方法は、試験サンプル及び参照標準品の線形回帰についてＲ２値を計算することを含む。一部の態様において、試験サンプル及び参照標準品についてのＲ２値は、０．９５以上である。
【００２３】
本開示の方法の一部の態様において、本方法は、参照標準品のアッセイダイナミックウィンドウを計算することを含む。一部の態様において、アッセイダイナミックウィンドウは、２．６９以上である。
【００２４】
本開示の方法の一部の態様において、目的タンパク質は、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）タンパク質である。一部の態様において、ＳＭＮ１タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【００２５】
本開示の方法の一部の態様において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス血清型９型（ＡＡＶ９）である。一部の態様において、ウイルスベクターは、ＳＭＮ１タンパク質をコードする配列に作動可能に連結されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／ニワトリβ−アクチンハイブリッドプロモーター（ＣＢ）をコードする配列を含む。一部の態様において、ウイルスベクターは、ＡＡＶ血清型２型（ＡＡＶ２）ＤＮＡ由来のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。一部の態様において、ウイルスベクターは、配列番号１の配列を含む。
【００２６】
本開示の方法の一部の態様において、細胞は、ウイルスベクターによる形質導入前に８〜１５回継代される。
【００２７】
本開示の方法の一部の態様において、形質導入後に最終分化ＮＰＣをインキュベートするステップは、約６９〜７５時間（ｈｒ）にわたって実施される。
【００２８】
本開示の方法の一部の態様において、目的タンパク質に特異的な分子は、抗体、抗体断片又はアプタマーを含む。一部の態様において、抗体は、目的タンパク質に特異的な抗体を含む。一部の態様において、抗目的タンパク質抗体は、約４μｇ／ｍＬの濃度で提供される。一部の態様において、抗目的タンパク質抗体は、約２μｇ／ｍＬの濃度で提供される。一部の態様において、分子は、検出可能標識を含む。
【００２９】
本開示の方法の一部の態様において、本方法は、最終分化ＮＰＣを、目的タンパク質に特異的な分子を特異的に認識する第２の分子に接触させることを更に含む。一部の態様において、第２の分子は、検出可能標識を含む。一部の態様において、第２の分子は、抗体、抗体断片又はアプタマーを含む。
【００３０】
本開示の方法の一部の態様において、最終分化ＮＰＣは、固定及び透過処理するステップ後、抗核検出可能標識に接触される。
【００３１】
本開示の方法の一部の態様において、最終分化ＮＰＣは、固体表面上にある。一部の態様において、固体表面は、ポリ−Ｄ−リジンでコートされている。一部の態様において、最終分化ＮＰＣは、２０，０００細胞／ウェルの密度で播種される。
【００３２】
別の態様において、複数の細胞のウイルス感染力価を測定又は定量化する方法は、複数の細胞の感染多重度（ＭＯＩ）を最適化することを更に含む。
【００３３】
別の関連する態様において、複数の細胞は、ステップａ）前にウイルスベクターで形質導入される。別の態様において、インキュベートするステップｂ）後、複数の細胞を固定及び透過処理することが続く。
【００３４】
別の関連する態様において、ウイルスベクター試験サンプルの相対効力を決定するステップは、線形回帰データ当てはめ後に参照標準品の検量線に対する平行線分析（ＰＬＡ）によって実施される。
【００３５】
別の態様において、ウイルスベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／ニワトリβ−アクチンハイブリッドプロモーター（ＣＢ）の制御下でＳＭＮ１タンパク質を発現するｃＤＮＡと、ＡＡＶ血清型２型（ＡＡＶ２）ＤＮＡ由来のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）とを含むアデノ随伴ウイルス血清型９型（ＡＡＶ９）である。
【００３６】
別の関連する態様において、ウイルスベクターで形質導入される細胞は、最終分化した非分裂細胞である。
【００３７】
別の態様において、細胞は、ＳＭＮ１−／−遺伝的背景下にある神経前駆細胞（ｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７）に由来する。
【００３８】
別の態様において、ＩＦＩ−Ｃリードアウトは、タンパク質発現の測定値を反映する。
【００３９】
別の態様において、目的タンパク質に特異的な分子は、抗体、抗体断片又はアプタマーを含む。別の態様において、抗体は、目的タンパク質に特異的な抗体を含む。
【００４０】
別の態様において、分子は、検出可能標識を含む。
【００４１】
別の態様において、本方法は、細胞を洗浄して、目的タンパク質に特異的な分子を取り出すことを更に含む。
【００４２】
別の態様において、本方法は、細胞を、目的タンパク質に特異的な分子を特異的に認識する第２の分子に接触させることを更に含む。別の態様において、第２の分子は、検出可能標識を含む。別の態様において、第２の分子は、抗体、抗体断片又はアプタマーを含む。別の態様において、細胞は、固定及び透過処理後、抗核検出可能標識を接触される。
【００４３】
別の態様において、本方法は、目的タンパク質のレベルの用量依存的増加の定量的測定を可能にする。
【００４４】
別の態様において、目的タンパク質は、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）タンパク質である。
【００４５】
本開示は、（ａ）ウイルスベクターで形質導入される能力を有する複数の細胞；（ｂ）目的タンパク質をコードするウイルスベクター；（ｃ）目的タンパク質と結合する能力を有する第１の分子；（ｄ）第１の分子と結合する能力を有する第２の分子であって、検出可能標識を含む第２の分子；及び（ｅ）イメージングアッセイにおける使用に関する説明書を含むキットを提供する。
【００４６】
本開示は、トランス遺伝子を含むウイルスベクターを含む医薬組成物を作製する方法を提供し、この方法は、（ａ）トランス遺伝子を含むウイルスベクターを作製すること、（ｂ）本開示のトランス遺伝子を測定する方法により、前記ウイルスベクターをアッセイすること；及び（ｃ）トランス遺伝子を含むウイルスベクターを医薬組成物に製剤化することを含む。
【００４７】
本開示は、トランス遺伝子を含むウイルスベクターを含む療法を用いて、治療を、それを必要としている患者に行う方法を提供し、本方法は、（ａ）本開示のトランス遺伝子発現を測定する方法により、トランス遺伝子を含む前記ウイルスベクターをアッセイすること；及び（ｂ）トランス遺伝子を含むウイルスベクターを前記患者に投与することを含む。
【００４８】
本開示の方法の一部の態様において、ウイルスベクターの相対効力は、参照標準品と比べて少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％又は少なくとも１４０％である。一部の態様において、ウイルスベクターの相対効力は、参照標準品と比べて少なくとも９０％である。
【００４９】
本開示の方法の一部の態様において、医薬製剤中のウイルスベクターの効力は、参照標準品の効力の５％以内、参照標準品の効力の１０％以内又は参照標準品の効力の２０％以内である。
【００５０】
上記の態様のいずれも、任意の他の態様と組み合わせることができる。
【００５１】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、単語の単数形には、文脈上特に明確に指示されない限り、その単語の複数形も含まれる；例えば、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、単数形又は複数形であると理解され、用語「又は」は包含的と理解される。例として、「要素」は、１つ以上の要素を意味する。
【００５３】
本明細書全体を通じて語句「〜を含んでいる」又は「〜を含む」などの変化形は、明記される要素、整数又はステップ又は一群の要素、整数若しくはステップを包含するが、任意の他の要素、整数又はステップ又は一群の要素、整数若しくはステップを除外しないことを含意するものと理解されるであろう。本明細書全体を通じて語句「〜からなっている」又は「〜からなる」などの変化形は、明記される要素、整数又はステップ又は一群の要素、整数若しくはステップを包含し、且つ任意の他の要素、整数又はステップ又は一群の要素、整数若しくはステップを除外することを含意するものと理解されるであろう。本明細書全体を通じて語句「〜から本質的になっている」又は「〜から本質的になる」などの変化形は、明記される要素、整数又はステップ又は一群の要素、整数若しくはステップ及び特許請求される本発明の基本的な且つ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない任意の他の要素、整数又はステップ又は一群の要素、整数若しくはステップを包含することを含意するものと理解されるであろう。
【００５４】
約とは、明記される値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％又は０．０１％以内と理解することができる。文脈から特に明らかでない限り、本明細書に提供される数値は、全て用語「約」によって修飾される。
【００５５】
本開示の実施又は試験では、本明細書に記載されるものと同様の又は均等な方法及び材料を使用し得るが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書において言及される刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、全て全体として参照により援用される。本明細書に引用される参考文献は、特許請求される本開示の先行技術であると認めるものではない。矛盾が生じた場合、定義を含め、本明細書が優先するものとする。加えて、材料、方法及び例は例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。本開示の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００５６】
本特許又は出願ファイルには、カラーで作成された図面が少なくとも１つ含まれる。カラー図面を含む本特許又は特許出願公開の複写は、請求に応じて、必要な費用の支払いをもって当局によって提供されることになる。
【００５７】
ここで、上記の態様及び実施形態のいずれも、概要及び／又は詳細な説明の節に開示されるとおりの任意の他の態様又は実施形態と組み合わせることができる。
【００５８】
本発明の様々な目的及び利点並びに更なる詳細な理解は、付属の図面を併せて考慮したとき、以下の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲を参照することにより明らかであり、より容易に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】マスター／ワーキングバンクシステムを示す。
【図２】階層型マスター／ワーキングバンクシステムを示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、ＳＭＮ  Δ７マウスの胚皮質に由来するＮＰＣの最終分化を示す。（図３Ａ）約ｅ１４．５（中央の画像）のマウスＳＭＮ−／−胚皮質からＮＰＣを得て、（図３Ｂ）マイトジェン（成長因子ＥＧＦ及びＦＧＦ）の存在下で増殖性ニューロスフェアとして成長させた。（図３Ｃ）ニューロスフェアは成長因子から取り出して血清ベース培地に置くと、解離し、ＧＦＡＰ＋アストロサイトを含むＣＮＳ細胞に最終分化させることができる。
【図４】指示されるＭＯＩでＡＡＶ９−ｅＧＦＰを形質導入したｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７の画像を示す。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｂは、２０，０００細胞／ウェルの細胞密度（核染色）（図５Ａ）及び１０，０００細胞／ウェルの細胞密度（核染色）（図５Ｂ）でウェルの約４０％をカバーするモンタージュ画像を示す。
【図５−２】（上記のとおり。）
【図６】ＡＡＶ９ベクター（ロット番号ＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３）の形質導入後７２時間におけるＳＭＮ１（２Ｂ１）及び核（ヘキスト３３３４２）染色の画像を示す。
【図７】ＡＡＡＶ９ベクターロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（上）を形質導入したｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７についてのＧＦＰ及びＳＭＮ１染色の画像を示す（下のパネルは、対照群である）。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｂは、非コートプレートに播種したｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７についての核染色（ウェルの４０％をカバーするモンタージュ画像）（図８Ａ）及びポリ−Ｄ−リジンをコートしたプレートに播種したｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７についての核染色（ウェルの４０％をカバーするモンタージュ画像）（図８Ｂ）を示す。
【図８−２】（上記のとおり。）
【図９−１】図９Ａ〜９Ｂは、ＡＡＶ９−ｅＧＦＰを形質導入したｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７の形質導入後７２時間における画像（図９Ａ）及びＡＡＶ９−ｅＧＦＰを形質導入したｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７の形質導入後４８時間における画像（図９Ｂ）を示す。
【図９−２】（上記のとおり。）
【図１０】ＳＭＮ１コードＡＡＶ９ベクターを形質導入したｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７（形質導入後７２時間）についてのＳＭＮ１（緑色）及び核（青色）染色の画像を示す。
【図１１】様々な感染多重度（ＭＯＩ）でＮＣＨ０６１３を形質導入したｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７（形質導入後７２時間）についてのＳＭＮ１（緑色）及び核（青色）染色の画像を示す。
【図１２】１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）の１２ポイント用量データについての曲線フィットを示す（ｘ軸上、左：未変換、右：対数変換後）。
【図１３】対数ＭＯＩ対ＩＦＩ−Ｃの当てはめ後のラインプロットを示す。
【図１４】対数ＭＯＩに対するＩＦＩ−Ｃの散布図を示し、５回全てのレプリケートについてラインが極めて近いことが示される。５回のレプリケートは、全てペアワイズの平行性検定をパスした（全てｐ値＞０．２５）。
【図１５−１】図１５Ａ〜１５Ｃは、ｍＮＰＣベースのアッセイプラットフォームを使用した定量的感染力アッセイにおけるＡＡＶ９ベクターへのインビトロ相対効力アッセイの適用を示す。
【図１５−２】（上記のとおり。）
【図１５−３】（上記のとおり。）
【図１６−１】図１６Ａ〜１６Ｂは、感染力価ＥＣ５０についてのＡＡＶ９ベクター感染力アッセイを構築する概念実証研究を示す。
【図１６−２】（上記のとおり。）
【図１７】３つの異なる抗ＳＭＮ抗体濃度を用いたＳＭＮの均等な用量依存的増加を示すプロットである。
【図１８】ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔハイコンテントスクリーニングシステムを用いて撮影した核の例示的画像である。
【図１９】相対効力の実測値と予想値との間の直線性を実証するプロットである。四角は、幾何平均を示し、丸は、個別の値を示す。ｘ軸は、予想相対効力（％）を示し、ｙ軸は、実測相対効力（％）を示す。
【図２０−１】図２０Ａ〜２０Ｂは、ＳＭＮ１コードＡＡＶ９ベクター又はＭＥＣＰ２コードＡＡＶ９ベクターを形質導入した細胞を、ＳＭＮ１抗体を用いて染色することによって実証される特異性を示すプロットの対である。図２０Ａは、抗ＳＭＮ１抗体で染色した細胞を示す。白抜きの丸は、ＳＭＮ１コードＡＡＶ９ベクターを形質導入した対照細胞を示し、黒色の丸は、ＭＥＣＰ２コードＡＡＶ９ベクターを形質導入した細胞を示す。ｘ軸は、ｌｏｇ２  ＭＯＩ（感染多重度）を示し、ｙ軸は、１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）を示す。図２０Ｂは、ＭＥＣＰ２コードＡＡＶ９ベクターを形質導入し、抗ＭＥＣＰ２抗体で染色した細胞を示す。ｘ軸は、ｌｏｇ２  ＭＯＩを示し、ｙ軸は、ＩＦＩ−Ｃを示す。ＡＡＶ９−ＳＭＮ１ベクターを形質導入した細胞を抗ＳＭＮ１抗体によって染色したとき、ＭＯＩ用量の増加に伴い、外因性ＳＭＮ１タンパク質発現の指標であるＩＦＩ−Ｃシグナルが用量依存的に増加したことによって特異性が実証されたが、ＡＡＶ９−ＭＥＣＰ２ベクターを形質導入した細胞では、ＡＡＶ９−ＭＥＣＰ２は、抗ＭＥＣＰ２抗体による染色時、ＩＦＩ−Ｃの用量依存的増加によって示されるとおり細胞の形質導入に成功することが示されたにも関わらず、用量依存的増加がなかった。
【図２０−２】（上記のとおり。）
【図２１】均一性試験に用いたプレートレイアウトを示す。
【図２２】ＩＦＩ−Ｃの用量依存的増加を示すプロットである。ｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７細胞にＡＡＶ９−ＳＭＮ１又はＡＡＶ９−ＭＥＣＰ２のいずれかのベクターを形質導入し、抗ＳＭＮ１又は抗ＭｅＣＰ２で染色し、ＩＦＩ−Ｃを測定した。
【図２３】インビトロ相対効力アッセイプレートの画像モンタージュである。列１〜７は、抗ＳＭＮ１抗体によって染色する。列８〜１１は、抗ＭｅＣＰ２抗体で染色する。
【図２４】ＡＡＶ９−ＭＥＣＰ２形質導入についてのＩＦＩ−Ｃの用量依存的増加を示すプロットである。
【図２５】参照標準品に対するサンプルの傾き比推定値の概要を示すプロットである。
【図２６−１】図２６Ａは、ｐＳＭＮのプラスミドマップを示す。ｐＳＭＮは、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーエレメントを伴うニワトリ−β−アクチンハイブリッドプロモーターの制御下でヒト生存運動ニューロン（ＳＭＮ）ｃＤＮＡを発現する組換え自己相補的ＡＡＶ  ＤＮＡゲノムに関する情報をコードするプラスミドである。ＳＭＮ  ｃＤＮＡは完全長の機能タンパク質をコードする。発現カセットは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する修飾イントロン配列及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルを含有する。この発現カセット（ＣＭＶ−ＣＢ−ＳＶ４０−ＳＭＮ−ＢＧＨｐＡ）には、ＡＡＶ２由来の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する。左のＩＴＲは、自己相補的ＡＡＶゲノムを優先的にパッケージングするように修飾される。ＩＴＲ間にあり、且つＩＴＲを含む領域は、一緒になって、創薬製品の製造時に組換えＡＡＶ９カプシドにパッケージングされる。組換えＡＡＶゲノムへのパッケージングが意図されない重要なｐＳＭＮ成分として、カナマイシン耐性（ＫａｎＲ）をコードするオープンリーディングフレーム及びｐＵＣに由来する複製起点（ｏｒｉ）が含まれる。ｏｒｉ及びＫａｎＲ領域は、プラスミド製造に有用である。図２６Ｂは、ｐＨＥＬＰプラスミドのプラスミドマップを示す。ｐＨＥＬＰプラスミドは、組換えアデノ随伴ウイルス産生に必要なトランス作用性アデノウイルス成分を含有する。ｐＨＥＬＰプラスミドは、ＡＡＶ複製に重要な因子を提供するアデノウイルスゲノムの領域、即ちＥ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ  ＲＮＡを含有する。ｒＡＡＶ複製に関わるアデノウイルスＥ１機能は、宿主２９３細胞のトランスフェクションによって提供される。しかしながら、ｐＨＥＬＰプラスミドは、他のアデノウイルス複製又は構造遺伝子を含有しない。このプラスミド中に存在するアデノウイルス配列は、アデノウイルスゲノムの僅か約２８％（９，２８０／３５，９３８）に相当するに過ぎず、逆方向末端反復配列など、複製に決定的に重要なシスエレメントを含有しない。従って、かかる産生系から、感染性アデノウイルスは、生じないものと思われる。図２６Ｃは、ＡＡＶプラスミドのプラスミドマップを示す。野生型ＡＡＶゲノムは、ｒｅｐ及びｃａｐオープンリーディングフレームに隣接する逆方向末端反復配列と呼ばれる２つの非コード構造エレメントを含有する。ｒｅｐ及びｃａｐは、それぞれウイルス複製及びカプシドタンパク質をコードする。組換えアデノ随伴ウイルスベクターの産生では、これらのウイルス性ＩＴＲは、シスで用いられる唯一のエレメントである一方、ウイルス性オープンリーディングフレームは、トランスで供給される。接着性ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションを用いるＡＡＶの作製方法は、異なる遺伝エレメントを分割してプラスミドを分けることにより、それらのエレメントのシス／トランスの役割に対応する。ｐＡＡＶ２／９プラスミドは、ＡＡＶ２  ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ９  ｃａｐ遺伝子のオープンリーディングフレームを含有する。
【図２６−２】（上記のとおり。）
【図２６−３】（上記のとおり。）
【図２７】特別に優れた接着性に関するＨＥＫ２９３細胞の選択及びプレマスターセルバンク（ＭＣＢ）バンク化の工程フローチャートを示す。
【図２８】特別に優れた接着性に関するＨＥＫ２９３細胞の選択及びプレプレマスターセルバンク（ＭＣＢ）バンク化のための細胞処理詳細の要約を示す。
【図２９】原薬上流工程フロー図を示す。
【図３０】原薬下流工程フロー図を示す。
【図３１】１２０分の時点まで添加したＴｗｅｅｎ  ２０によるＸＭｕＬＶの不活性化を示す。
【図３２】１２０分の時点まで添加したＴｗｅｅｎ  ２０によるＰＲＶの不活性化を示す。
【図３３】細胞播種密度実験におけるＨＥＫ２９３細胞拡大工程フローを示す。
【図３４−１】図３４Ａ〜３４Ｅは、成長及び代謝産物プロファイルを示す。ＨＥＫ  ２９３細胞をバイオリアクター（ｐＨ７．２３、３７．０℃、５５％溶存酸素（ＤＯ））に１２，０００及び８，０００細胞／ｃｍ２においてデュプリケートで播種した。播種後４日（１２，０００細胞／ｃｍ２）及び５日（８，０００細胞／ｃｍ２）の時点で細胞にＤＮＡプラスミド／ＰＥＩをトランスフェクトした。播種後８日（１２，０００細胞／ｃｍ２）及び９日（８，０００細胞／ｃｍ２）でバイオリアクターを回収した。Ｎｏｖａ  ＢｉｏＦｌｅｘでｐＨ及び代謝産物の読取り値を毎日読み取った。
【図３４−２】（上記のとおり。）
【図３４−３】（上記のとおり。）
【図３４−４】（上記のとおり。）
【図３４−５】（上記のとおり。）
【図３５】細胞播種密度（８０００又は１２０００細胞／ｃｍ２）及び４つの異なるトランスフェクション時間長さ（２０分、１時間又は２時間）の関数としてのウイルスゲノム産生を示す。
【図３６】製造工程全体を通じて異なるろ過ステップでサンプリングした中間体のウイルス力価を示す。
【図３７−１】図３７Ａ〜３７Ｂは、ＴＦＦ１ステップにおけるウイルスベクターの回収及び宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の除去を示す。
【図３７−２】（上記のとおり。）
【図３８】細胞播種密度実験におけるＨＥＫ２９３細胞拡大工程フローを示す。
【図３９−１】図３９Ａ〜３９Ｅは、ＨＥＫ  ２９３細胞をバイオリアクター（ｐＨ７．２３、３７．０℃、５５％ＤＯ）に８，０００細胞／ｃｍ２、９，３５０細胞／ｃｍ２、１０，７００細胞／ｃｍ２、１２，０５０細胞／ｃｍ２においてデュプリケートで播種したことを示す。播種５日後に細胞にＤＮＡプラスミド／ＰＥＩ（１：１ｍ／ｍ）をトランスフェクトした。ＮＯＶＡ  ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ  ４００を使用してｐＨ及び代謝産物分析を実施した。
【図３９−２】（上記のとおり。）
【図３９−３】（上記のとおり。）
【図３９−４】（上記のとおり。）
【図３９−５】（上記のとおり。）
【図４０−１】図４０Ａ〜４０Ｂは、バイオリアクターでの４つの出発播種密度からの原薬産生を示す。ウイルス力価及び単位表面積当たりで回収されたベクターゲノムの比較を示す。
【図４０−２】（上記のとおり。）
【図４１】第１相（工程Ａ）及び第３相試験（工程Ｂ）製造工程を示す。
【図４２−１】図４２Ａ〜図４２Ｂは、同等性及び製造の一貫性の結果を示す表を提供する  −  工程Ａ（第１相）及び工程Ｂ（第３相）産物。工程Ｂ産物には、工程Ａと比較したときに更なる利益があることが示される。１ＮＣＨ第１相ロットＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３は、ｄｄＰＣＲによるゲノム力価の現在の「提案される試験限界」より前に製造された。このロットのゲノム力価値は、改良されたＳＯＰ−１３７（ｖ３）を用いて２０１７年８月に確立し直したものである。２工程Ａ及び工程Ｂロット間のゲノム力価結果の差は、製造目標濃度が異なることに起因する。ロットＮＣＨ  ＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３は、当初、より低い目標力価濃度（現在用いられているｄｄＰＣＲアッセイ（ＳＯＰ−１３７）によれば、現在では１．１×１０１３ｖｇ／ｍＬと決定される）で製剤化された一方、ＡＡＶ９−ＳＭＮ１ロット６００１５６及び６００３０７は、同じ方法によって測定したとき、４．０×１０１３ｖｇ／ｍＬの目標力価濃度で製剤化された。３２．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ〜６．０×１０１３ｖｇ／ｍＬの許容濃度範囲で適切な規格を実現する調整後の１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たりの結果。実際の値に以下の係数を乗じて１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たりの値を求めている：１／１．０６（ロットＮＣＨ  ＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３）、１／３．７（ロット６００１５６）及び１／４．０（ロット６００３０７）。４工程と工程との間の外観結果の差は、ベクター濃度の違いに起因する（ゲノム力価。ロットＮＣＨ  ＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３は、工程Ｂロットと比べてベクター濃度が大幅に低い。結果として、ロットＮＣＨ  ＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３は、希釈度が高く、より澄明で無色の溶液につながる一方、工程Ｂロットについての無色乃至白色でやや不透明という観察結果は、１ｍＬ当たりの溶液中におけるウイルス粒子濃度が４倍に近いことが理由である。５結果がそれぞれの方法のＬＯＱ未満であるため、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬに調整していない実際の結果。６ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３をＳＯＰ−２８５についての初期効力参照標準品に指定し、１００％の効力値を割り当てる。結果は、全てＳＯＰ−２８５  ｖ５を用いて生成された。
【図４２−２】（上記のとおり。）
【図４３】工程Ａ（第１相ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３）及び工程Ｂ（第３相ロット６００１５６）のペアワイズ比較を用いて工程Ａと工程Ｂとの間の同等性を示す。工程Ｂ産物には、工程Ａと比較したときに更なる利益があることが示される。
【図４４】工程Ｂ（第３相）ロット６００１５６及び６００３０７のペアワイズ比較による製造の一貫性の評価を示す。
【図４５】リアルタイム貯蔵条件≦−６０℃で１２ヵ月間貯蔵したＮＣＨロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３の安定性プロファイルを示す。
【図４６】第１相材料（ＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３）の沈降係数（秒×１０−１３）を示し、空のカプシド（７％）が約６０×１０−１３秒の沈降係数及び完全なカプシドが約８０〜１５０×１０−１３秒の沈降係数範囲であることを示す。
【図４７】第３相材料（６００１５６）の沈降係数（秒×１０−１３）を示し、空のカプシド（２％）が約６０×１０−１３秒の沈降係数及び完全なカプシドが約８０〜１５０×１０−１３秒の沈降係数範囲であることを示す。
【図４８】第３相材料（６００３０７）の沈降係数（秒×１０−１３）を示し、空のカプシド（４％）が約６０×１０−１３秒の沈降係数及び完全なカプシドが約８０〜１５０×１０−１３秒の沈降係数範囲であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本発明の開示は、目的タンパク質を発現するＡＡＶ９薬物製品のロット処分を意図した効力評価のためのＡＡＶ９ベクター形質導入に許容性の細胞を使用した定量的細胞ベースインビトロ効力アッセイを提供する。別の実施形態において、ウイルスベクター薬物製品は、ＳＭＮ１タンパク質を発現するＡＡＶ９ベクターである。このアッセイは、非複製ＡＡＶ９ベクターによって有効に形質導入される能力のある、ＳＭＮ１−／−遺伝的背景下にある神経前駆細胞に由来する最終分化した非分裂細胞（ＮＰＣに由来する最終分化細胞、以下ｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７と称する）を利用する。ｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７をインビトロ細胞モデルシステムとして使用して、ＳＭＮタンパク質に特異的な市販のモノクローナル抗体を使用したハイコンテントイメージングシステムにより、漸増感染多重度（ＭＯＩ）のＳＭＮ１コードＡＡＶ９ベクターの形質導入時におけるＳＭＮ１タンパク質レベルの用量依存的増加を測定する５日間定量的細胞ベースアッセイを開発した。一部の実施形態において、このインビトロ細胞ベースアッセイは、参照標準品との相対的なベクターサンプルの効力を測定することができる。
【００６１】
細胞ベースアッセイ
本開示は、目的タンパク質をコードするＡＡＶベクターの効力を測定するためのインビトロ細胞ベースアッセイを提供する。一部の実施形態において、目的タンパク質はＳＭＮ１であり、本明細書に記載される方法を用いて、ＳＭＮ１が欠損した最終分化非分裂細胞におけるベクターからのＳＭＮ１の発現が測定される。
【００６２】
本開示は、一実施形態において、トランス遺伝子発現を測定する方法を提供し、本方法は、（ａ）複数の細胞を培養するステップであって、細胞がウイルスベクターを含み、ウイルスベクターがトランス遺伝子を含み、培養が、トランス遺伝子から目的タンパク質を発現させるのに十分な条件下である、ステップ；（ｂ）複数の細胞をインキュベートするステップであって、それにより目的タンパク質のトランス遺伝子発現が続いて起こることを可能にするステップ；（ｃ）複数の細胞を、目的タンパク質に特異的な分子に接触させるステップ；（ｄ）細胞をイメージングするステップであって、それにより１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）アッセイリードアウトを入手する、ステップ；及び（ｅ）ＩＦＩ−Ｃリードアウトに基づいてトランス遺伝子の発現を決定するステップを含む。
【００６３】
別の実施形態において、複数の細胞のウイルス感染力価を測定又は定量化する方法が提供され、本方法は、（ａ）複数の細胞を培養するステップであって、細胞がウイルスベクターを含み、ウイルスベクターがトランス遺伝子を含み、培養が、トランス遺伝子から目的タンパク質を発現させるのに十分な条件下である、ステップ；（ｂ）複数の細胞をインキュベートするステップであって、それにより目的タンパク質のトランス遺伝子発現が続いて起こることを可能にするステップ；（ｃ）複数の細胞を、目的タンパク質に特異的な分子に接触させるステップ；（ｄ）細胞をイメージングするステップであって、それにより１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）アッセイリードアウトを入手する、ステップ；及び（ｅ）ＩＦＩ−Ｃリードアウトに基づいてトランス遺伝子の発現を決定するステップを含む。
【００６４】
別の実施形態において、複数の細胞のウイルス感染力価を測定又は定量化する方法は、複数の細胞の感染多重度（ＭＯＩ）を最適化することを更に含む。別の実施形態において、複数の細胞のウイルス感染力価を測定又は定量化するための感染力アッセイが提供される。
【００６５】
別の実施形態において、複数の細胞は、ステップ（ａ）前にウイルスベクターで形質導入される。別の実施形態において、インキュベートするステップ（ｂ）後、複数の細胞を固定及び透過処理することが続く。
【００６６】
別の実施形態において、ウイルスベクターの相対効力を決定するステップは、線形回帰データ当てはめ後に参照標準品の検量線に対する平行線分析（ＰＬＡ）によって実施される。平行線アッセイは、相対効力を計算する方法である。一部の実施形態において、相対効力は、希釈アッセイのために計算される。
【００６７】
一部の実施形態において、本方法は、（ａ）第１の複数の最終分化神経前駆細胞（ＮＰＣ）を提供すること；（ｂ）目的タンパク質をコードする配列を含むウイルスベクターを含む試験サンプルで第１の複数の最終分化ＮＰＣを形質導入すること；（ｃ）形質導入された第１の複数の最終分化ＮＰＣを、目的タンパク質を発現させるのに十分な条件下でインキュベートすること；（ｄ）（ｃ）からの第１の複数の最終分化ＮＰＣを、目的タンパク質に特異的な分子に接触させること；（ｅ）第１の複数の最終分化ＮＰＣをイメージングして、１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）アッセイリードアウトを入手すること；及び（ｆ）ＩＦＩ−Ｃリードアウトに基づいて目的タンパク質の発現を決定することを含む。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、「試験サンプル」は、目的タンパク質をコードする配列を含むＡＡＶウイルスベクターであって、その力価及び／又は効力が未知の、それが本明細書に記載される方法を用いて決定されることになるＡＡＶウイルスベクターを含むサンプルを指す。
【００６９】
一部の実施形態において、本方法は、（ｇ）第２の複数の最終分化ＮＰＣを提供すること；（ｈ）ウイルスベクターを含む参照標準品で第２の複数の最終分化ＮＰＣを形質導入すること；（ｉ）形質導入された第２の複数の最終分化ＮＰＣを、目的タンパク質を発現させるのに十分な条件下でインキュベートすること；（ｊ）（ｉ）からの第２の複数の最終分化ＮＰＣを、目的タンパク質に特異的な分子に接触させること；（ｋ）第２の複数の最終分化ＮＰＣをイメージングして、１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）アッセイリードアウトを入手すること；及び（ｌ）第１の複数の最終分化ＮＰＣのＩＦＩ−Ｃを第２の複数の最終分化ＮＰＣのＩＦＩ−Ｃと比較することを含み、それにより、参照標準品と比べた試験サンプルのウイルスベクターの相対効力を決定する。
【００７０】
一部の実施形態において、本方法は、第３の複数の最終分化ＮＰＣを提供すること、ウイルスベクターを含むアッセイ対照で第３の複数の最終分化ＮＰＣを形質導入すること、形質導入された第３の複数の最終分化ＮＰＣを、目的タンパク質を発現させるのに十分な条件下でインキュベートすること；第３の複数の最終分化ＮＰＣを、目的タンパク質に特異的な分子に接触させること；第３の複数の最終分化ＮＰＣをイメージングして、１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）アッセイリードアウトを入手すること；及び第３の複数の最終分化ＮＰＣのＩＦＩ−Ｃを第１及び／又は第２の複数の最終分化ＮＰＣのＩＦＩ−Ｃと比較することを含み、それによりインビトロ効力アッセイの有効性を決定する。一部の実施形態において、アッセイ対照は、陽性対照である。
【００７１】
一部の実施形態において、複数の最終分化ＮＰＣは並行して培養され、試験サンプル、参照サンプル及び任意選択でアッセイ対照で形質導入され、インキュベートされ、染色され、且つイメージングされる。例えば、複数の最終分化ＮＰＣは、同じ９６ウェルプレートにおいて培養され、試験サンプル、参照サンプル及び任意選択でアッセイ対照で形質導入され、且つ更なる下流処理を受け得る。
【００７２】
一部の実施形態において、前記第１及び第２の複数の細胞は、試験サンプル及び参照標準品からのウイルスベクターによって少なくとも２つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入される。一部の実施形態において、少なくとも２つの異なるＭＯＩは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１又は少なくとも１２のＭＯＩを含む。一部の実施形態において、少なくとも２つの異なるＭＯＩは、５つの異なるＭＯＩを含む。一部の実施形態において、５つのＭＯＩは、１細胞当たり３００，０００、１５０，０００、７５，０００、３７，５００、１８，７５０ウイルス粒子を含む。
【００７３】
一部の実施形態において、本方法は、第３の複数を形質導入することを更に含む
【００７４】
別の実施形態において、ウイルスベクター又はそれを含む医薬組成物は、参照標準品の±２０％、±１５％、±１０％、好ましくは±５％の効力を保持している。一実施形態において、効力は、本明細書に開示される方法を用いて参照標準品と比べて評価される。任意の好適な参照標準品を使用し得る。
【００７５】
本明細書で使用されるとき、「参照標準品」は、その濃度及び／又は効力が既知の、目的タンパク質をコードするＡＡＶベクターを含む組成物を指す。例示的参照標準品はＡＡＶ−ＳＭＮ１ベクターを含み、これは使用時まで−６０℃以下で保存され、一度解凍されると２〜８℃で１週間未満保存される。
【００７６】
一部の実施形態において、ウイルスベクターの相対効力は、参照標準品と比べて少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％又は少なくとも１４０％である。一部の実施形態において、ウイルスベクターの相対効力は、参照標準品と比べて少なくとも９０％である。
【００７７】
本方法は、本明細書に開示されるウイルスベクター中に存在するトランス遺伝子が発現するタンパク質の効力をアッセイするものであり、ここで、トランス遺伝子は、脳への送達が意図される。送達が企図される脳の領域としては、限定はされないが、運動皮質及び脳幹が挙げられる。一部の実施形態において、トランス遺伝子は脊髄に送達される。一部の実施形態において、トランス遺伝子は下位運動ニューロンに送達される。本発明の実施形態はｒＡＡＶ９を利用してトランス遺伝子を神経及びグリア細胞に送達する。一部の実施形態において、グリア細胞は、ミクログリア細胞、オリゴデンドロサイト又はアストロサイトである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ９は、トランス遺伝子をシュワン細胞に送達するために使用される。
【００７８】
本明細書に開示されるウイルスベクターの使用は、例えば、ＳＭＡ及びＡＬＳなどの下位運動ニューロン疾患並びにポンペ病、リソソーム蓄積障害、多形性膠芽腫及びパーキンソン病の治療に適応される。リソソーム蓄積障害としては、限定はされないが、アクチベーター欠損症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、αマンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステリルエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチン蓄積症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型）、ＧＭｌガングリオシドーシス（乳児型、後期乳児型／若年型、成人型／慢性）、Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ型、乳児遊離シアル酸蓄積症／ＩＳＳＤ、若年型ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、クラッベ病（乳児期発症型、晩期発症型）、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症障害（偽性ハーラー・ポリジストロフィー／ムコリピドーシスＩＩＩＡ型、ＭＰＳＩハーラー症候群、ＭＰＳＩシャイエ症候群、ＭＰＳ  Ｉハーラー・シャイエ症候群、ＭＰＳ  ＩＩハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ型／ＭＰＳ  ＩＩＩ  Ａ、サンフィリポ症候群Ｂ型／ＭＰＳ  ＩＩＩ  Ｂ、サンフィリポ症候群Ｃ型／ＭＰＳ  ＩＩＩ  Ｃ、サンフィリポ症候群Ｄ型／ＭＰＳ  ＩＩＩ  Ｄ、モルキオ病Ａ型／ＭＰＳ  ＷＡ、モルキオ病Ｂ型／ＭＰＳ  ＩＶＢ、ＭＰＳ  ＩＸヒアルロニダーゼ欠損症、ＭＰＳ  ＶＩマロトー・ラミー、ＭＰＳ  ＶＩＩスライ症候群、ムコリピドーシス１型／シアリドーシス、ムコリピドーシスＩＩＩＣ型、ムコリピドーシスＩＶ型）、多種スルファターゼ欠損症、ニーマン・ピック病（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型）、神経セロイドリポフスチン症（ＣＬＮ６病（非定型後期乳児型、晩期発症型バリアント、早期若年型）、バッテン・シュピールマイアー・フォークト／若年型ＮＣＬ／ＣＬＮ３病、フィンランドバリアント後期乳児型ＣＬＮ５、ヤンスキー・ビールショースキー病／後期乳児型ＣＬＮ２／ＴＰＰ１病、クーフス病／成人発症型ＮＣＬ／ＣＬＮ４病、北部てんかん／バリアント後期乳児型ＣＬＮ８、サンタブオリ・ハルチア（ＳａｎｔａｖｕｏｒｉＨａｌｔｉａ）／乳児型ＣＬＮｌ／ＰＰＴ病、β−マンノシドーシス、ポンペ病／ＩＩ型糖原病、ピクノディスオストーシス、サンドホフ病／成人発症型／ＧＭ２ガングリオシドーシス、サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス−乳児型、サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス−若年型、シンドラー病、サラ病／シアル酸蓄積症、テイ・サックス／ＧＭ２ガングリオシドーシス、ウォルマン病が挙げられる。
【００７９】
本明細書に開示されるウイルスベクターの使用は、例えば、ＳＭＡの治療に適応される。
【００８０】
更なる実施形態において、方法及び材料の使用は、レット症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経系疾患の治療又は脊髄及び脳外傷／傷害、脳卒中及び脳癌を含めた神経系傷害の治療に適応される。
【００８１】
「治療」は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物の有効用量若しくは有効な複数回用量を、それを必要としている動物（ヒトを含む）に静脈内投与するステップ又は髄腔内経路で投与するステップを含む。用量が障害／疾患の発症前に投与される場合、その投与は予防的である。用量が障害／疾患の発症後に投与される場合、その投与は治療的である。本発明の実施形態において、有効用量とは、治療下の障害／疾患状態に関連する少なくとも１つの症状を和らげる（消失させるか又は低減するかのいずれかの）用量、障害／疾患状態への進行を減速させる又は防止する用量、障害／疾患状態の進行を減速させる又は防止する用量、疾患の程度を小さくする用量、疾患の（部分的又は完全な）寛解をもたらす用量及び／又は生存を延長させる用量である。本発明の方法による治療に企図される疾患状態の例は、上記に提示する。
【００８２】
最終分化神経前駆細胞（ＮＰＣ）
本明細書には、最終分化ＮＰＣを作製し、インビトロ細胞ベース効力アッセイで最終分化ＮＰＣを使用して、目的タンパク質をコードするＡＡＶベクターの相対効力を決定するためのプロトコルが提供される。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターの効力は、参照標準品と比べて相対的に決定される。本明細書に提供されるプロトコルを用いると、医薬組成物、例えば原薬及び薬物製品組成物中のＡＡＶ−ＳＭＮ１ベクターの効力をアッセイすることができると共に、ベクター安定性も評価することができる。
【００８３】
本プロトコルの実行に使用される材料は当業者に公知であろう。例示的材料には、組織培養処理済みフラスコ（Ｔ７５、Ｔ１５０及びＴ１７５）、ポリプロピレン遠心管、１５及び５０ｍＬキャップ付き、ピペット（シングルチャンネルＰ１０００、Ｐ２００及びＰ２０並びに８又は１２チャンネルＰ１０００及びＰ３００）、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＢｉｏＣｏａｔポリ−Ｄ−リジン９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３５４６４０）、光学的に透明なプレートシール（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ  ８４０８２４０）、試薬リザーバ、ＰＩＰＥＴ−ＡＩＤ、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒスライド（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ、ＣＨＴ４−ＳＤ１００−００２）、９６ウェルＤｅｅｐＷｅｌｌ（商標）ポリプロピレンマイクロプレート、低結合性１．５ｍＬ微量遠心管、７０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール（ＩＰＡ）及びドライアイスが含まれる。しかしながら、均等な材料及び試薬が用いられ得る。
【００８４】
本明細書の実施例に提供されるとおり、ＮＰＣは、胎生期約１４．５日（ｅ１４．５）のＳＭＡ  Δ７（ＳＭＮ１−／−）マウス系統由来の胚の皮質から収集する。次にこれらの細胞を単一細胞に解離し得る。培養中、細胞は、未分化細胞の三次元コロニーであるニューロスフェアを形成する。約３〜５日後、次にニューロスフェアを単一細胞に解離することによって継代し、二次スフェアを形成させ得る。ＮＰＣを最終分化させるため、次にニューロスフェアを解離し、１Ｅ＋０６細胞／ウェルで０．５ｍＬ（２４ウェルプレート、Ｆａｌｃｏｎ）又は２Ｅ＋０５細胞／ウェルで１００μＬ（９６ウェルプレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ）の成長因子なしの高血清培地に播種し得る。分化後約２４時間で、細胞は主にグリア系統に最終分化する。
【００８５】
本明細書で使用されるとき、用語「細胞株」は、インビトロで継続的に又は長期にわたって成長及び分裂する能力を有する細胞の集団を指す。更に、当技術分野では、かかるクローン集団の保存又は移送中に自発的な又は誘導性の核型変化が起こり得ることが公知である。従って、言及される細胞株に由来する細胞は、祖先細胞又は培養物と厳密には同一でないこともあり、言及される細胞株は、かかる変異体を包含する。
【００８６】
一実施形態において、開示される細胞ベースアッセイにおいて用いるための本明細書に開示される最終分化した非分裂細胞は、ＳＭＮ１−／−遺伝的背景下にある神経前駆細胞（ＮＰＣに由来する最終分化細胞、本明細書では「ｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７」と称される）に由来する。このような細胞は、非複製ＡＡＶ９ベクターによって有効に形質導入される能力を備えている。
【００８７】
一部の実施形態において、マウス胚皮質から単離され、本明細書に記載されるとおり培養されるＮＰＣ−Δ７細胞は、インビトロ細胞ベース効力アッセイでの使用前に凍結（例えば、−６０℃以下で）される。
【００８８】
一部の実施形態において、ＮＰＣ−Δ７細胞は以下のプロトコルを用いて解凍される。完全成長培地を使用前に予め３７℃の水浴中又は均等物で少なくとも３０分間温める。液体窒素保存からｍＮＰＣ細胞の凍結クライオバイアルを取り出す。このバイアルは、その解凍準備が整うまでドライアイス上に置いておき、次に３７℃の水浴中で速やかに解凍し、時折かき混ぜながら確実に解凍させる。バイアル表面を７０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール（ＩＰＡ）で拭き取り、次に内容物をＢＳＣ内で滅菌ピペットを使用して５０ｍＬ遠心管に移す。細胞の解凍後、凍結保護物質を浸透圧ショック防止のためゆっくりと希釈する。通常、毒性作用を解消するのに約１０〜２０ｍＬで十分である。かき混ぜることによって穏やかに混合しながら１０〜２０ｍＬの加温した完全成長培地を滴下方式で加えた後、続いて２０℃において３００×ｇで５分間遠心する。上清を吸い取り、次にチューブを穏やかに撹拌して細胞ペレットを壊す。適切な容積（例えば１．０〜２．０ｍＬ）の温かい完全成長培地を細胞に加え、混合する。
【００８９】
一部の実施形態において、生細胞数及び生存率を入手する。一部の実施形態において、続行するための生細胞数は≧６０．０％生存である。
【００９０】
一部の実施形態において、細胞を組織培養フラスコに移し、１０．０ｍＬの完全成長培地を加え、フラスコを穏やかに揺動させて一様な分布を確保する。次にフラスコを３７℃及び５％ＣＯ２で少なくとも７２時間インキュベートした後、成長及び生存率に関して検査する。
【００９１】
ＮＰＣ細胞の培養
一部の実施形態において、ＮＰＣ細胞はＳＭＮ１の突然変異に関してホモ接合である（ＳＭＮ１−／−）。一部の実施形態において、ＳＭＮ１−／−の突然変異はヌル突然変異である。一部の実施形態において、ＳＭＮ１−／−はエクソン７の欠失（Δ７）であり、細胞はＮＰＣ−Δ７細胞と称される。一部の実施形態において、ＮＰＣはマウス胚皮質から単離されるか又はそれに由来する。
【００９２】
一部の実施形態において、ＮＰＣ−Δ７細胞は、本明細書に記載されるインビトロ細胞ベース効力アッセイでの使用前に１ラウンド以上の継代を通じて培養される。
【００９３】
一部の実施形態において、ＮＰＣ−Δ７細胞は解凍後２回目の継代からアッセイに使用される。
【００９４】
一部の実施形態において、ＮＰＣ−Δ７細胞は、本明細書に記載されるインビトロ細胞ベース効力アッセイにおいて継代８〜１５代目で使用される。解凍は継代とは見なされない。一部の実施形態において、細胞は継代１５代目まで使用される。例えば、ワーキングセルバンクを継代６代目（Ｐ６）以降に凍結した場合、細胞の解凍時には、その細胞の継代数はＰ６のままであった。細胞増殖に適切な日数が経った後、Ａｃｃｕｍａｘで解離することによって細胞を継代し、これがＰ７になった。Ｐ７では、細胞はアッセイに使用することができない。
【００９５】
一部の実施形態において、ＮＰＣ−Δ７細胞は、Ａｃｃｕｍａｘで解離されることによって継代され（Ｐ８）、次にインビトロ効力アッセイで使用することができる。
【００９６】
細胞が懸濁液中で増殖するにつれ、細胞はニューロスフェアと呼ばれる三次元コロニーを形成する。一部の実施形態において、例えばニューロスフェアが大きく成長し過ぎて中心が壊死することを防ぐため、細胞は４±１日毎に継代される。
【００９７】
例示的細胞継代プロトコルは、以下のとおり記載される。基本培地及び完全成長培地は使用前に予め３７℃の水浴中又は均等物で３０分間温める。例示的基本培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ添加剤、２％Ｂ２７添加剤（５０×）及び１％抗生剤−抗真菌剤を含む。例示的完全成長培地は、基本培地、０．１％ヘパリン（５ｍｇ／ｍＬ）、１００ｇ／ｍＬの０．０２％ｂＦＧＦ（線維芽細胞成長因子−塩基性）組換えヒトタンパク質及び１ｍｇ／ｍＬの０．００５％ＥＧＦ（上皮成長因子）組換えヒトタンパク質溶液を含む。
【００９８】
一部の実施形態では、細胞を継代するため、細胞が入ったフラスコをインキュベーターから取り出し、細胞が入った培地を使用してフラスコの表面をリンスする。細胞をフラスコから５０ｍＬコニカルチューブに移し、３００×ｇで５分間遠心する。細胞ペレットを乱さないようにしながら上清を吸い取り、２００．０μＬのＡｃｃｕｍａｘを加える。細胞ペレットを穏やかに研和し、次に室温で３０±１０分インキュベートした。
【００９９】
Ａｃｃｕｍａｘインキュベーションの終了時、予め温めた基本培地によってＡｃｃｕｍａｘを中和する。一部の実施形態では、４００．０μＬの予め温めた基本培地を加え、細胞を穏やかに研和して完全に単一細胞に解離させる。
【０１００】
一部の実施形態では、更なる４００．０μＬの予め温めた基本培地を加えて総容積を１．０ｍＬにする。
【０１０１】
一部の実施形態では、細胞を許容可能な細胞密度範囲に希釈する。例示的細胞密度範囲は、細胞カウント用に５．００Ｅ＋０５細胞／ｍＬ〜１．００Ｅ＋０７の範囲を含む。しかしながら、当業者は、細胞密度範囲を適切な細胞カウント方法に合わせて調整することが可能であろう。
【０１０２】
一部の実施形態では、細胞カウント前に、同じ細胞参照／ロットの複数のフラスコからの同じ継代数の細胞をプールする。
【０１０３】
一部の実施形態では、細胞を混合し、次に細胞のサンプルを取り出して、生細胞数及び生存率を決定する。
【０１０４】
一部の実施形態において、ｍＴＤ  ＮＰＣ−Δ７（最終分化ＮＰＣΔ７）プレートは、細胞カウントの各々についての生存率が≧６０．０％、≧７０．０％、≧８０．０％又は≧９０．０％のときに調製される。一部の実施形態において、ｍＴＤ  ＮＰＣ−Δ７（最終分化ＮＰＣΔ７）プレートは、細胞カウントの各々についての生存率が≧８０．０％のときに調製される。
【０１０５】
一部の実施形態において、細胞カウントの各々についての生存率が≧７０．０％生存である場合に限りインビトロ効力アッセイが続行される。
【０１０６】
ＮＰＣを最終分化させる
本開示は、ＮＰＣを最終分化させて、本明細書に記載されるインビトロ細胞ベース効力アッセイで使用するための最終分化ＮＰＣを作製する方法を提供する。一部の実施形態において、最終分化ＮＰＣは、ＳＭＮ１のエクソン７のホモ接合性欠失）を含む（ｍＴＤ  ＮＰＣ−Δ７細胞）。
【０１０７】
一部の実施形態において、ＮＰＣの最終分化にはプレート培地を使用する。例示的プレート培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ添加剤、２％Ｂ２７添加剤（５０×）、１％抗生剤−抗真菌剤及び１０％ＦＢＳを含む。
【０１０８】
一部の実施形態において、細胞はプレート培地中に２０，０００細胞／ウェル／１００μＬの密度（又は２．００×１０５細胞／ｍＬ）に希釈する。一部の実施形態において、細胞は５，０００細胞／ウェル／１００μＬ、１０，０００細胞／ウェル／１００μＬ、１５，０００細胞／ウェル／１００μＬ、２０，０００細胞／ウェル／１００μＬ、２５，０００細胞／ウェル／１００μＬ又は３０，０００細胞／ウェル／１００μＬの密度に希釈する。
【０１０９】
一部の実施形態では、１００μＬの細胞を穏やかに混合し、９６ウェルポリ−Ｄ−リジンコートプレートのウェルに加える。
【０１１０】
一部の実施形態では、１つ又は複数のプレートを周囲温度で２５±５分間静置した後、プレーティングした細胞を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに置く。
【０１１１】
一部の実施形態では、プレーティングした細胞は、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに２４時間±２時間置いた後に形質導入する。
【０１１２】
形質導入
一実施形態において、用語「トランスフェクション」は、本明細書では用語「形質導入」と同義的に使用され、いずれの用語又はその文法上の均等語も、細胞による外来ＤＮＡの取込みを指して使用され、細胞が「トランスフェクトされている」又は「形質導入されている」とは、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されたときを指す。幾つものトランスフェクション技法が当技術分野において概して公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ及びＣｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照されたい。かかる技法は、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を好適な宿主細胞に導入するために用いることができる。
【０１１３】
細胞の形質導入に好適な方法は、当技術分野において公知である。一実施形態において、細胞は、インビトロでウイルスベクターを細胞と組み合わせることによって形質導入される。一実施形態において、細胞は、インビトロでＡＡＶ９ベクターを細胞と組み合わせることによって形質導入される。一実施形態において、細胞は、インビトロでＳＭＮ１コードＡＡＶ９ベクターを細胞と組み合わせることによって形質導入される。一実施形態において、ＡＡＶ９は分化後約２４時間の細胞と組み合わされる。別の実施形態において、これは分化後約１２〜２４時間の細胞と組み合わされる。別の実施形態において、これは分化後約２４〜３２時間の細胞と組み合わされる。
【０１１４】
一実施形態において、任意の好適なトランスフェクション培地を使用し得る。一実施形態において、細胞拡大に使用されるＤＭＥＭ無血清成長培地が変法ＤＭＥＭトランスフェクション培地に置き換えられる。一実施形態において、トランスフェクション培地は、ＦＢＳ不含、カルシウム不含、Ｌ−グルタミン不含及び４．５ｇ／ｌグルコース含有ＤＭＥＭである。
【０１１５】
詳細な実施形態において、形質導入後に細胞をインキュベートするステップは、約６９〜７５時間実施される。一部の実施形態において、形質導入後に細胞をインキュベートするステップは、約２４〜４８時間、４８〜６９時間又は約７５〜９０時間実施される。
【０１１６】
一実施形態において、患者の細胞に本発明のｒＡＡＶを形質導入すると、ｒＡＡＶによってコードされるポリペプチド又はＲＮＡの持続的発現がもたらされる。
【０１１７】
別の実施形態において、ウイルスベクターを形質導入する細胞は、最終分化した非分裂細胞である。別の実施形態において、ウイルスベクターを形質導入する細胞は、ｍＴＤ  ＮＰＣ−Δ７細胞など、最終分化した非分裂性の初代細胞である。
【０１１８】
一部の実施形態において、ｍＴＤ  ＮＰＣ−Δ７細胞は、ＳＭＮ１タンパク質をコードするトランス遺伝子を含むＡＡＶベクターを含む試験サンプル及び参照標準品で形質導入される。一部の実施形態において、ｍＴＤ  ＮＰＣ−Δ７細胞は、ＳＭＮ１タンパク質をコードするトランス遺伝子を含むＡＡＶベクターを含む試験サンプル、参照標準品及びアッセイ対照（例えば、陽性対照、時に対照とも称される）で形質導入される。
【０１１９】
一部の実施形態において、ＡＡＶ９−ＳＭＮ１ベクター参照標準品（ＲＳ）、対照（Ｃｒｔｌ）及び試験サンプルは、以下のとおり調製される。参照標準品（ＲＳ）、対照及び試験サンプルのアリコートを周囲温度で解凍する。使用前に、製剤化緩衝液及びプレート培地を予め３７℃の水浴中又は均等物で少なくとも３０分間温める。予め温めた適切な製剤化緩衝液を使用して、サンプルを１．５ｍＬ微量遠心管内で予め１．００Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ（このプロトコルは他の濃度が適していることもある）に希釈する。
【０１２０】
一部の実施形態では、段階希釈を実施して異なるＭＯＩを調製し、ＭＯＩ対ＩＦＩ−Ｃプロットを作成する。例えば、３００Ｋ  ＭＯＩの出発濃度を段階希釈して、１５０Ｋ  ＭＯＩ、７５Ｋ  ＭＯＩ、３７．５Ｋ  ＭＯＩ及び１８．７５Ｋ  ＭＯＩのＲＳ、試験及びアッセイ／陽性対照サンプルを作成することができる。
【０１２１】
一部の実施形態では、調製したＭＯＩの調製したサンプルを穏やかに混合し、直ちに９６ウェルプレートの対応するウェルの壁に対して傾けて分注する。プレートをインキュベーター（３７±１℃、５±１％ＣＯ２）に移す。プレートは７２±２時間インキュベートした。
【０１２２】
細胞染色
本明細書には、目的タンパク質、例えばＳＭＮ１又はＳＭＮ２などのＳＭＮタンパク質、例えばＳＭＮ１に関して細胞を染色する方法が提供される。この細胞染色方法は、本明細書に記載されるインビトロ細胞ベース効力アッセイで用いることができる。
【０１２３】
一実施形態において、目的タンパク質に特異的な分子は、抗体、抗体断片又はアプタマーを含む。別の実施形態において、抗体は、目的タンパク質に特異的な抗体を含む。
【０１２４】
抗体はインタクトな免疫グロブリンとして存在するか、又は様々なペプチダーゼによる消化によって作製された幾つもの十分に特徴付けられた断片として存在する。このように、例えばペプシンは、抗体をヒンジ領域のジスルフィド結合の下で消化することにより、それ自体ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１につなぎ合わされた軽鎖であるＦａｂの二量体、Ｆ（ａｂ’）２を作り出す。Ｆ（ａｂ’）２を穏和条件下で還元してヒンジ領域のジスルフィド結合を壊し得、それによりＦ（ａｂ’）２二量体をＦａｂ’単量体に変換し得る。Ｆａｂ’単量体は、本質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（他の抗体断片の更に詳細な説明については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照されたい）。様々な抗体断片がインタクトな抗体の消化の観点で定義されるが、当業者は、かかるＦａｂ’断片等が、化学的に又は組換えＤＮＡ方法論を利用することによるかのいずれかでデノボ合成され得ることを理解するであろう。従って、用語の抗体には、本明細書で使用されるとき、全抗体の修飾によって作製されたか、又は組換えＤＮＡ方法論を用いてデノボ合成されたかのいずれかの抗体断片も含まれる。抗体には、可変重鎖及び可変軽鎖が（直接又はペプチドリンカーを介して）一体につなぎ合わされて連続したポリペプチドを形成する単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ又はｓｃＦｖ）抗体を含め、単鎖抗体が含まれる。
【０１２５】
上記で説明したとおり（「定義」、前掲を参照されたい）、本明細書において用いられる抗体は任意選択で、実施形態の具体的な要件に応じてＦ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ等を含む。一部の実施形態は、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥなど、代替の免疫グロブリンを利用する。更に、様々な免疫グロブリンの可能な全てのアイソタイプも本実施形態の範囲内で企図される。このように、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３等が、本発明における使用が可能な全ての分子である。
【０１２６】
一実施形態において、抗目的タンパク質抗体は約４μｇ／ｍＬの濃度で提供される。別の実施形態において、抗目的タンパク質抗体は、約１〜４μｇ／ｍＬ、４〜８μｇ／ｍＬ、８〜１２μｇ／ｍＬ又は１２〜１６μｇ／ｍＬの濃度で提供される。一実施形態において、抗目的タンパク質抗体は約２μｇ／ｍＬの濃度で提供される。
【０１２７】
別の実施形態において、分子は検出可能標識を含んで検出を可能にする。標識としては、例えば、キレート化されたユウロピウムなどのランタニド系列金属、ルテニウムなどの白金族金属、とりわけフルオレセイン及びローダミン又は両方の任意の誘導体などのキサンテン誘導体を含めた蛍光色素、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質及びその誘導体である黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）及び赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ヨウ素−１２５及びアクチニウム−２２５などの放射標識並びに当技術分野において公知の他の同様の検出可能標識が挙げられる。一部の実施形態において、洗浄ステップを実施する必要がなくなる検出可能標識が使用される。
【０１２８】
蛍光標識基は、概してその励起スペクトル、発光スペクトル又は蛍光寿命の１つ以上に基づいて互いに区別可能である。細胞に異なる波長の励起光を別々に当てることにより、従って任意の１つ以上の異なる検出可能標識から生じる蛍光レベルを決定することが可能になる。代わりに、検出可能標識は、区別可能な蛍光発光極大を有するように選択され、例えば、標識は実質的に異なる波長で発光するか又は蛍光を発する。動作上、細胞に単一光源が当てられる。次に細胞からの蛍光発光が光学フィルタに通され、それにより異なる蛍光発光が分離され、次にはそれが別々に定量化される。区別可能な励起極大又は発光極大のいずれかを選択することにおいて、概して、１つの標識、例えば参照標識の励起又は発光スペクトルに他の標識の励起又は発光スペクトルとの認め得るほどの重複がないことが好ましい。具体的には、概して異なる標識には最大励起又は発光波長が存在するが、典型的には、何らかの励起又は発光があるより広い波長範囲が存在する。典型的には、標識は、２つの標識の励起又は発光スペクトルの間に実質的に重複がないように選択され、例えば、１つの標識の検出において、他方の標識からの重複に起因する蛍光は１０％未満である。
【０１２９】
一実施形態では、蛍光強度の測定値が、細胞の内部で起こった目的タンパク質の発現の尺度を与える。別の実施形態では、本明細書に開示される細胞ベースアッセイ及びレプリケートにおいて提供されるウイルスベクターの各用量について、１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）値が計算される。別の実施形態では、ＩＦＩ−Ｃリードアウトが、目的タンパク質の発現の測定値を反映する。
【０１３０】
一実施形態において、本明細書に提供される方法は、細胞を洗浄して、目的タンパク質に特異的な分子を取り出すことを更に含む。別の実施形態において、洗浄後、本方法は、目的タンパク質に特異的な分子を特異的に認識する第２の分子を細胞に接触させることを更に含む。別の実施形態において、第２の分子は検出可能標識を含む。別の実施形態において、第２の分子は、抗体、抗体断片又はアプタマーを含む。
【０１３１】
本明細書に提供される方法の別の実施形態において、固定及び透過処理後に細胞に抗核検出可能標識を接触させる。核の検出に使用される検出可能標識としては、限定はされないが、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ヘキスト、ＮｕｃＳｐｏｔ（登録商標）４７０、ＲｅｄＤｏｔ（商標）２  Ｆａｒ−Ｒｅｄ核染色剤又はＤｙｅ  ＮｕｃＦｉｘ（商標）Ｒｅｄを挙げることができる。別の実施形態において、ＮｕｃＳｐｏｔ（登録商標）Ｌｉｖｅ  ４８８及びＮｕｃＳｐｏｔ（登録商標）Ｌｉｖｅ  ６５０核染色剤が使用される。ＮｕｃＳｐｏｔ（登録商標）Ｌｉｖｅ核染色剤は、洗浄の必要なしに生細胞又は固定された細胞の核を特異的に染色する。
【０１３２】
一実施形態において、本明細書に開示される少なくとも１つの検出可能標識による染色に続き、本方法は、細胞の１つ以上の画像を収集するステップを更に含み、ここで、画像は、光による励起時に検出可能標識の少なくとも１つによって提供される検出可能シグナルの検出によって決定されるとおりの、細胞内での目的タンパク質の発現を表示する。更に、画像を入手するステップ後、画像分析を実施するステップが続く。
【０１３３】
一実施形態において、本明細書に開示される細胞は、単離後及び／又は本明細書に開示される細胞ベースアッセイの実施前に生存率に関して評価される。細胞生存率の評価方法は、当技術分野において周知であり、例えば、トリパンブルー染色（又は使用される細胞計数器に依存して、均等な細胞生死判別試薬）、顕微鏡観察などが挙げられる。
【０１３４】
一実施形態において、複数の細胞は固体表面上に播種される。別の実施形態において、固体表面は、２４又は９６ウェルプレートを含め、当技術分野において公知の任意の種類のプレートを含む。別の実施形態において、アッセイに使用されるプレートは細胞のイメージングに適している。別の実施形態において、固体表面はポリ−Ｄ−リジンでコートされている。
【０１３５】
別の実施形態において、細胞は固体表面上に２０，０００細胞の密度で播種される。別の実施形態において、細胞は固体表面上に１０，０００細胞の密度で播種される。別の実施形態において、細胞は固体表面上に１０，０００〜２０，０００細胞の密度で播種される。別の実施形態において、細胞は２０，０００細胞／ウェルの密度で播種される。別の実施形態において、細胞は１０，０００細胞／ウェルの密度で播種される。別の実施形態において、細胞は１０，０００〜２０，０００細胞／ウェルの密度で播種される。
【０１３６】
一実施形態において、トランス遺伝子は、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態において、本明細書に開示されるウイルスベクターを形質導入した細胞が発現する目的タンパク質は、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）タンパク質である。
【０１３７】
一部の実施形態において、本明細書に記載される最終分化した形質導入細胞を含む形質導入後のプレートは、７２時間±２時間細胞染色した時点でインキュベーターから取り出される。
【０１３８】
一部の実施形態において、細胞は、以下に記載するプロトコルによって固定される。５０．０μＬの４％パラホルムアルデヒド又は適切な容積及び濃度のものを、ウェルに穏やかに加える。次にプレートを周囲室温で例えば５〜７分間インキュベートする。インキュベーション後、各ウェルから４％パラホルムアルデヒドを吸い取り、ウェルを２５０．０μＬ  ＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）で洗浄する。
【０１３９】
一部の実施形態において、プレートは２〜４℃で保存することができる。一部の実施形態において、プレートは最長３日間保存することができる。プレートの保存時、プレートの保存前にＤＰＢＳを取り除き、２５０．０μＬの新鮮なＤＰＢＳを加えた。
【０１４０】
一部の実施形態において、細胞はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理される。一部の実施形態において、各ウェルからＤＰＢＳを穏やかに吸い取ったと共に、５０．０μＬの０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を穏やかに加える。次にプレートを周囲室温で例えば５〜７分間インキュベートし、各ウェルから０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を吸い取り、ウェルをＤＰＢＳで洗浄することができる。
【０１４１】
一次抗体インキュベーション
例示的一次抗体としては、マウスモノクローナル抗ＳＭＮ抗体（クローン２Ｂ１）、１：５００希釈のＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−３２３１３  ＸＳロット番号Ｃ２８１８、１：１０００希釈のＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−３２３１３  ＸＳロット番号Ｆ２１１８及び１：５００希釈のＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅロット番号３０５４７００が挙げられる。例えば、１：５００希釈の抗体につき４．０ｍＬの染色溶液を調製するためには、４．０ｍＬのＤＰＢＳ中１％ＢＳＡに８．０μＬの抗ＳＭＮ抗体を加える。
【０１４２】
一部の実施形態では、周囲室温で一次抗体と共に１２０〜１５０分間インキュベートする。
【０１４３】
一部の実施形態では、一次抗体インキュベーション後に細胞をＤＰＢＳで洗浄する。
【０１４４】
二次抗体インキュベーション
例示的二次抗体は、ＤＰＢＳ中１％ＢＳＡ中における１：１０００希釈の２μｇ／ｍＬ終濃度のヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  Ｐｌｕｓ  ４８８及び２μｇ／ｍＬの核染色色素ヘキスト３３３４２（１：５０００希釈）を含む。ヘキスト３３３４２核染色色素は、１０．０μＬのヘキスト３３３４２核染色色素を４０．０μＬの蒸留水中に加えることによって予め希釈され得る。
【０１４５】
一部の実施形態では、細胞を遮光下に（例：フォイルで覆う）、周囲室温で二次抗体中において６０〜８０分間インキュベートする。
【０１４６】
各ウェルから二次抗体溶液を吸い取り、細胞をＤＰＢＳで洗浄する。
【０１４７】
一部の実施形態では、次に透明な光学プレートシールでプレートを密閉し、イメージングする。
【０１４８】
相対効力を計算する
本開示は、試験サンプル中のベクターの効力を決定する方法を提供する。一部の実施形態において、試験サンプル中のベクターの効力は、参照標準品（ＲＳ）と比べて相対的に決定される。一部の実施形態において、参照標準品は試験サンプルと同じベクターを含むが、参照標準品の特性（ベクター濃度、効力など）は既知である。
【０１４９】
一部の実施形態において、参照標準品中のベクターと比較した試験サンプル中のベクターの相対効力計算は、平行線分析法（ＰＬＡ）を用いて行われる。ＰＬＡは、用量反応曲線、例えば、ＭＯＩ又は対数ＭＯＩの結果としてのＩＦＩ−Ｃの比較に用いられる方法である。
【０１５０】
一部の実施形態において、ＰＬＡは、試験サンプル及び参照標準品の各々についてＬｏｇ２  ＭＯＩ対ＩＦＩ−Ｃに個別の線形モデルを当てはめることを含む。一部の実施形態において、アッセイ対照、例えば陽性対照のＩＦＩ−Ｃも同時に測定され、アッセイ対照についてのＭＯＩ又はＬｏｇ２  ＭＯＩ対ＩＦＩ−Ｃも計算される。一部の実施形態において、試験サンプル、参照標準品及び任意選択でアッセイ対照の各々についてのＩＦＩ−Ｃは、各ＭＯＩでの複数のアッセイリードアウト（例えば、２、３、４、５回又はそれ以上のレプリケート）から平均される。
【０１５１】
一部の実施形態において、試験サンプル、参照標準品及びアッセイ対照について、最小二乗法を用いて線形回帰のＲ二乗値（Ｒ２）、切片及び傾き推定値が計算される。
【０１５２】
一部の実施形態において、参照標準品と比べた試験サンプルの傾き推定値の比
【数１】
2021526806.tif 000003
を用いて試験サンプルと参照標準品との間の平行性を評価する。アッセイ対照サンプルと参照標準品との間で確立される経験的範囲内の傾き比であるならば、サンプルの傾きは参照標準品の傾きと平行であり、ここで、
ｙ＝α＋βｌｏｇ２（ＭＯＩ）＋ｅ（Ｍ２．１）
式中、ｙは、所与のＭＯＩレベルからの１細胞当たりの積分蛍光強度であり；α及びβは、それぞれ線形回帰線の切片及び傾きであり、且つｅは残差である。
【０１５３】
一部の実施形態では、ＰＬＡにおいて共通の傾きモデルが使用される。一部の実施形態では、各試験サンプル及び参照標準品及び任意選択でアッセイ対照について、個々の切片及び共通の傾きを有する線形回帰モデル（Ｍ２．２）が、プレート上でのｌｏｇ２変換後の予想ＭＯＩ値に対する１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）のアッセイリードアウトに当てはめられ、ここで、
ｙ＝α＋βｌｏｇ２（ＭＯＩ）＋ｅ（Ｍ２．１）
及び式中、ｙｉは、サンプルｉ、ｉ∈｛サンプル、参照標準品｝についての所与のＭＯＩレベルからの１細胞当たりの積分蛍光強度であり；αｉは、サンプルｉ、ｉ∈｛サンプル、参照標準品｝についての個々の切片であり；βは共通の傾きであり、且つｅは残差である。
【０１５４】
一部の実施形態において、試験サンプル及び参照サンプル及び任意選択でアッセイ対照の各々についてのＩＦＩ−Ｃは、各ＭＯＩにおける複数のアッセイリードアウト（例えば、２、３回又はそれ以上のレプリケート）から平均化される。
【０１５５】
一部の実施形態において、相対効力は以下のとおり計算される：試験サンプルの相対効力は、モデル（Ｍ２．２）からの傾き推定値の切片から、以下のとおり計算される
【数２】
2021526806.tif 000004
【０１５６】
一部の実施形態において、試験サンプルのＩＦＩ−Ｃのパーセント変動係数（％ＣＶ）、線形回帰フィットのＲ２値、参照標準品（ＲＳ）のアッセイダイナミックウィンドウ、ＲＳに対するアッセイ対照（例えば陽性対照）についての傾き比、アッセイ対照の相対効力及びＲＳに対する試験サンプルの傾きの比が特定の判定基準を満たす場合、アッセイプレートは有効と見なされる。
【０１５７】
一部の実施形態において、試験サンプルのＩＦＩ−Ｃの％ＣＶは４０％以下であるか、３０％以下であるか、２０％以下であるか、１０％以下であるか又は１０％以下である。一部の実施形態において、試験サンプルのＩＦＩ−Ｃの％ＣＶは２０％以下である。
【０１５８】
一部の実施形態において、線形回帰当てはめ時のＲ２は≧０．９９、≧０．９５、≧０．９０、≧０．８９又は≧０．８５である。
【０１５９】
一部の実施形態において、線形回帰当てはめ時のＲ２は≧０．９５である。
【０１６０】
一部の実施形態において、参照標準品（ＲＳ）はアッセイダイナミックウィンドウ（バックグラウンドシグナル細胞のみに対する最大シグナル）が≧２．０、≧２．１、≧２．２、≧２．３、≧２．４、≧２．５、≧２．６、≧２．６９、≧２．８、≧２．９又は≧３．０である。一部の実施形態において、参照標準品（ＲＳ）はアッセイダイナミックウィンドウ（バックグラウンドシグナル細胞のみに対する最大シグナル）が≧２．６９である。
【０１６１】
一部の実施形態において、参照標準品（ＲＳ）は傾きが≧１．０２Ｅ＋０５である。
【０１６２】
一部の実施形態において、参照標準品に対するアッセイ対照（例えば、陽性対照）についての傾き比は０．６０〜１．５以内である。一部の実施形態において、参照標準品に対するアッセイ対照（例えば、陽性対照）についての傾き比は０．７０〜１．４以内である。一部の実施形態において、参照標準品に対するアッセイ対照（例えば、陽性対照）についての傾き比は０．７５〜１．３３である。
【０１６３】
一部の実施形態では、各試験サンプルについて、自然対数変換相対効力結果の平均値
【数３】
2021526806.tif 000005
及び標準偏差
【数４】
2021526806.tif 000006
及び関連する９５％信頼限界が推定され；及び幾何平均相対効力
【数５】
2021526806.tif 000007
及びパーセント変動係数
【数６】
2021526806.tif 000008
が計算される。
【０１６４】
一部の実施形態では、試験サンプル全体でｌｏｇ（ｙｉｊ）＝μｉ＋εｉｊ（Ｍ２．１）が計算され、式中、ｙｉｊは回収率サンプルｉからの相対効力であり；μｉは回収率サンプルｉの対数変換相対効力平均値であり、且つ
【数７】
2021526806.tif 000009
はランダムアッセイ内残差である。
【０１６５】
一部の実施形態において、試験サンプル全体で総合中間精度
【数８】
2021526806.tif 000010
が計算される。一部の実施形態において、中間精度はｌｏｇ（ｙｉｊｋ）＝μｉ＋θｊ＋εｉｊｋ（Ｍ２．２）を用いて計算され、式中、ｙｉｊｋは回収率サンプルｉからの相対効力であり；μｉは回収率サンプルｉの対数変換相対効力平均値であり；
【数９】
2021526806.tif 000011
はアッセイランｊからのランダムアッセイ間効果であり；及び
【数１０】
2021526806.tif 000012
はランダムアッセイ内残差である。
【０１６６】
一部の実施形態において、試験サンプル全体で総合再現精度が計算される。一部の実施形態において、総合再現精度はｌｏｇ（ｙｉｌｊｋ）＝μｉ＋αｌθｊ＋εｉｊｋ（Ｍ２．３）を用いて計算され、式中、ｙｉｊｋは回収率サンプルｉからの相対効力であり；μｉは回収率サンプルの対数変換相対効力平均値であり、
【数１１】
2021526806.tif 000013
は、試験室ｌからのランダム試験室間効果であり；
【数１２】
2021526806.tif 000014
は、試験室ｌにネストしたアッセイランｊからのランダムアッセイ間効果であり；及び
【数１３】
2021526806.tif 000015
は、ランダムアッセイ内残差である。
【０１６７】
一部の実施形態において、傾き比の平行性が評価される。インビトロ相対効力アッセイの平行性は、試験サンプルと参照標準品との傾きの比、即ち傾きサンプル／傾き標準品によって測ることができ、ここで、傾きは、ＩＦＩ−ｃとｌｏｇ２変換後ＭＯＩレベルとの間の線形回帰モデルから推定される。
【０１６８】
一部の実施形態において、分析のため傾き比は対数変換される。一部の実施形態において、各試験サンプル及びアッセイ対照（例えば、陽性対照）サンプルの自然対数変換した傾き比について、平均値
【数１４】
2021526806.tif 000016
及び標準偏差
【数１５】
2021526806.tif 000017
が推定され、次に幾何平均相対効力
【数１６】
2021526806.tif 000018
及びパーセント変動係数
【数１７】
2021526806.tif 000019
が計算される。
【０１６９】
本明細書に記載される統計分析の実行方法は、当業者には公知であろう。例えば、統計分析は統計ソフトウェアＪＭＰ  Ｐｒｏ  １３．２．１、Ｒ、Ｍａｔｌａｂなどを用いて実施され得る。
【０１７０】
ベクター安定性
本明細書には、本明細書に記載されるインビトロ細胞ベース効力アッセイを用いてベクターの安定性を評価する方法が提供される。
【０１７１】
一部の実施形態において、本方法は、ベクター安定性サンプルをある長さの時間にわたって特定の温度（例えば２０〜２５℃）に保つこと及び次にベクター安定性サンプルの相対効力を、特定の温度に保たれなかった参照標準品と比較することを含む。例えば、ベクター安定性サンプルが２０〜２５℃に１週間、２週間、３週間、１ヵ月間、２ヵ月間、３ヵ月間又は４ヵ月間保たれ、ベクター安定性サンプルの効力が、本明細書に提供される方法を用いて同じ長さの時間にわたって−６０℃以下に保たれた参照標準品と比較され得る。
【０１７２】
ベクター
本開示は、疾患の診断を受けた小児患者の治療用に開発されることが意図される遺伝子療法生物学的製剤としてのウイルスベクターを提供する。本明細書に提供されるベクター及びそれを含む医薬組成物の効力は、本明細書に記載されるインビトロ細胞ベース効力アッセイを用いてアッセイすることができる。一実施形態において、疾患は、ＳＭＡ、例えば、ＳＭＡ１型、ＳＭＡ２型、ＳＭＡ３型、ＳＭＡ４型又はこれらの組み合わせである。一実施形態において、疾患は、運動ニューロンの生存に重要なＳＭＮ１遺伝子の遺伝的欠陥に起因した運動ニューロンの喪失によって特徴付けられる重篤な神経筋疾患であるＳＭＡ１型である。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／ニワトリβ−アクチンハイブリッドプロモーター（ＣＢ）の制御下でＳＭＮ１タンパク質を発現するｃＤＮＡと、ＡＡＶ血清型２型（ＡＡＶ２）ＤＮＡ由来の２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）とを含む非複製及び非組込み型の組換え自己相補的アデノ随伴ウイルス血清型９型（ＡＡＶ９）を含む。
【０１７３】
一実施形態において、用語「ベクター」は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなど、適切な調節エレメントと結び付けられたとき複製能を有し、且つ細胞間で遺伝子配列を移すことのできる任意の遺伝エレメントを指す。従って、この用語には、クローニング及び発現媒体並びにウイルスベクターが含まれる。
【０１７４】
一実施形態において、用語「ＡＡＶベクター」は、限定なしに、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８及びＡＡＶ−９を含めたアデノ随伴ウイルス血清型、好ましくはＡＡＶ−９に由来するベクターを指す。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ野生型遺伝子の１つ以上、好ましくはｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子が全体として又は部分的に欠失しているが、機能性の隣接ＩＴＲ配列は保持している。機能性ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製及びパッケージングに必要である。従って、ＡＡＶベクターは、本明細書では、ウイルスの複製及びパッケージングのためにシスで必要とされる配列（例えば機能性ＩＴＲ）を少なくとも含むものと定義される。ＩＴＲは野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、その配列が機能性のレスキュー、複製及びパッケージングを提供する限りにおいて、例えばヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によって改変され得る。好ましい実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ−２由来のＩＴＲを有するＡＡＶ−９ベクターである。また、「ＡＡＶベクター」とは、標的細胞の核へのベクター核酸の送達に効率的な媒体を提供するタンパク質外殻又はカプシドも意味される。
【０１７５】
一実施形態において、用語「ｓｃＡＡＶ」とは、自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）を指し、これは、遺伝子療法における使用のため天然に存在するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から操作されたウイルスベクターである。ｓｃＡＡＶは、コード領域が分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されているため「自己相補的」と称される。
【０１７６】
実施形態において、本明細書にはｒＡＡＶゲノムが提供される。ｒＡＡＶゲノムは、ポリペプチド（限定はされないが、ＳＭＮポリペプチドを含む）をコードするか、又はその遺伝子の突然変異タンパク質若しくは制御配列に向けられるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス及び／又はｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに隣接して１つ以上のＡＡＶ  ＩＴＲを含む。ポリヌクレオチドは、転写制御ＤＮＡ、具体的には標的細胞において機能性のプロモーターＤＮＡ及びポリアデニル化シグナル配列ＤＮＡに作動可能に連結されて遺伝子カセットを形成する。遺伝子カセットは、哺乳類細胞での発現時にＲＮＡ転写物のプロセシングを促進するイントロン配列も含み得る。
【０１７７】
ｒＡＡＶ９ゲノムは、一部の実施形態において、ハンチントン病などの神経変性障害の治療用に突然変異ハンチントンタンパク質（ｈｔｔ）の発現を低下させる方法で用いられるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス及び／又はｍｉＲＮＡをコードする。
【０１７８】
ｒＡＡＶ９ゲノムは、様々な実施形態において、ＡＬＳなどの神経変性障害の治療に用いられるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス及び／又はｍｉＲＮＡをコードする。治療は、ＴＮＦα、一酸化窒素、パーオキシナイトライト及び／又は一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）など、疾患の分子マーカーの発現の低下をもたらす。
【０１７９】
一部の実施形態において、ベクターは、ＡＬＳについてはスーパーオキシドジスムターゼなどの突然変異タンパク質に向けられるか、又はＡＬＳ若しくはパーキンソン病についてはＧＤＮＦ又はＩＧＦｌなどの神経栄養因子に向けられる低分子ヘアピンＲＮＡをコードする。
【０１８０】
一部の実施形態において、本発明のウイルスベクターの使用は、レット症候群などの神経発達障害の治療に適応される。レット症候群に関する実施形態については、ｒＡＡＶ９ゲノムは、例えば、メチルシトシン結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）をコードし得る。
【０１８１】
本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ  ＤＮＡが欠損し得る。ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ  ＤＮＡ（例えば、ＩＴＲ）は、限定はされないが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０及びＡＡＶ−１１を含め、それについて組換えウイルスを誘導することのできる任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当技術分野において公知である。例えば、ＡＡＶ−１の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７に提供され；ＡＡＶ−２の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５−５６４（１９８３）に提供され：ＡＡＶ−３の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿１８２９に提供され；ＡＡＶ−４の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９に提供され；ＡＡＶ−５ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６に提供され；ＡＡＶ−６の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００  １８６２に提供され；ＡＡＶ−７及びＡＡＶ−８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９に提供され；ＡＡＶ−９ゲノムはＧａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１−６３８８（２００４）に提供され；ＡＡＶ−１０ゲノムはＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７−７６（２００６）に提供され；及びＡＡＶ−１１ゲノムはＶｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５−３８３（２００４）に提供される。
【０１８２】
別の実施形態において、本発明のｒＡＡＶゲノムを含むＤＮＡプラスミドが提供される。ＤＮＡプラスミドは、ＡＡＶ９カプシドタンパク質を有する感染性ウイルス粒子にｒＡＡＶゲノムをアセンブルするため、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ＥＩ欠失アデノウイルス又はヘルペスウイルス）の感染許容性細胞に移される。ｒＡＡＶ粒子の作製技法は、当技術分野において標準的であり、この技法では、パッケージングしようとするＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子並びにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される。ｒＡＡＶの作製には、単一細胞（本明細書ではパッケージング細胞と称される）の中に以下の成分：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムと別個の（即ちそこにない）ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子及びヘルパーウイルス機能が存在する必要がある。シュードタイプｒＡＡＶの作製については、例えば、国際公開第０１／８３６９２号パンフレット（参照により全体として本明細書に援用される）に開示されている。
【０１８３】
様々な実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質を修飾することによって組換えベクターの送達を促進し得る。カプシドタンパク質の修飾は、概して当技術分野において公知である。例えば、米国特許出願公開第２００５／００５３９２２号明細書及び米国特許出願公開第２００９／０２０２４９０号明細書（これらの開示は全体として参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【０１８４】
ｒＡＡＶ産生の一般的原理については、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３−５３９；及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，ＣＵＭ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７−１２９）にレビューされている。様々な手法が、Ｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）；Ｈｅｎｎｏｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）；及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）．Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８）；米国特許第５，１７３，４１４号明細書；国際公開第９５／１３３６５号パンフレット及び対応する米国特許第５，６５８，７７６号明細書；国際公開第９５／１３３９２号パンフレット；国際公開第９６／１７９４７号パンフレット；ＰＣＴ／米国特許出願公開第９８／１８６００号明細書；国際公開第９７／０９４４１号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第９６／１４４２３号明細書）；国際公開第９７／０８２９８号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第９６／１３８７２号明細書）；国際公開第９７／２１８２５号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第９６／２０７７７号明細書）；国際公開第９７／０６２４３号パンフレット（ＰＣＴ／仏国特許出願公開第９６／０１０６４号明細書）；国際公開第９９／１１７６４号パンフレット；Ｐｅｒｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：１２４４−１２５０；Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：６０９−６１５；Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：１１２４−１１３２；米国特許第５，７８６，２１１号明細書；米国特許第５，８７１，９８２号明細書；及び米国特許第６，２５８，５９５号明細書に記載されている。前述の文献は、特にこれらの文献中のｒＡＡＶ作製に関連する節に重点を置いて、本明細書により全体として参照により本明細書に援用される。従って、本発明は、感染性ｒＡＡＶを作製するパッケージング細胞を提供する。一実施形態において、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞及びＰｅｒＣ．６細胞（コグネイト２９３株）、好ましくはＨＥＫ２９３細胞など、任意の好適なパッケージング細胞株を使用し得る。他の実施形態において、本発明は、本発明のｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶ９（即ち感染性カプシド化ｒＡＡＶ９粒子）を提供する。本発明の一態様において、ｒＡＡＶゲノムは自己相補的ゲノムである。
【０１８５】
別の実施形態において、本方法は、目的タンパク質のレベルの用量依存的増加の定量的測定を可能にする。
【０１８６】
他の実施形態において、本発明は、本発明のｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶ９（即ち感染性カプシド化ｒＡＡＶ９粒子）を提供する。本発明の一態様において、ｒＡＡＶゲノムは自己相補的ゲノムである。
【０１８７】
別の実施形態において、「ｒＡＡＶ９−ＳＭＮ」又は「ＡＡＶ９−ＳＭＮ１」と名付けられたｒＡＡＶ９など、ｒＡＡＶが提供される。ｒＡＡＶ  ＳＭＮゲノムは、順番に、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、サイトメガロウイルスエンハンサーを伴うニワトリβ−アクチンプロモーター、ＳＶ  ４０イントロン、（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３４４．２）に示されるＳＭＮコードＤＮＡ、ウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化シグナル配列及びもう１つのＡＡＶ２  ＩＴＲを有する。例示的ＳＭＮコード配列は、
【化１】
2021526806.tif 000020
の配列を含む。
【０１８８】
ＳＭＮ  ＤＮＡの保存的ヌクレオチド置換も企図される（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３４４．２の６２５位におけるグアニンからアデニンへの変更）。一部の実施形態において、ｒＡＡＶのゲノムはＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ  ＤＮＡを欠いており、即ちゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶ  ｒｅｐ又はｃａｐ  ＤＮＡがない。企図されるＳＭＮポリペプチドとしては、限定はされないが、ＮＣＢＩタンパク質データベース番号ＮＰ＿０００３３５．１に示されるヒトＳＭＮ１ポリペプチド及びそのアイソフォームが挙げられる。企図されるＳＭＮポリペプチドとしては、限定はされないが、ヒトＳＭＮ２ポリペプチド及び任意のＳＭＮポリペプチドのアイソフォームも挙げられる。また、ＳＭＮ１修飾因子ポリペプチドプラスチン−３（ＰＬＳ３）も企図される［Ｏｐｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０（５８７５）：５２４−５２７（２００８）］。他のポリペプチドをコードする配列がＳＭＮ  ＤＮＡの代わりに置き換えられ得る。ｒＡＡＶ９  ＳＭＮベクターについては、Ｆｏｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８（３）：２７１−２７４（２０１０）に記載されている。
【０１８９】
一実施形態において、ウイルスベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／ニワトリβ−アクチンハイブリッドプロモーター（ＣＢ）の制御下でＳＭＮ１タンパク質を発現するｃＤＮＡと、ＡＡＶ血清型２型（ＡＡＶ２）ＤＮＡ由来のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）とを含むアデノ随伴ウイルス血清型９型（ＡＡＶ９）である。別の実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ２由来ＩＴＲを伴う複製欠損ＡＡＶ９、好ましくはｓｃＡＡＶ９である。一実施形態において、ＡＡＶベクターはＳＭＮトランス遺伝子を担持する。好ましい実施形態において、ＳＭＮコードＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３４４．２に示される。ＳＭＮ  ＤＮＡの保存的ヌクレオチド置換も企図される（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３４４．２に示されるとおりの、位置６２５におけるグアニンからアデニンへの変更）。
【０１９０】
一部の実施形態において、用語「ベクター関連不純物」は、真正の組換えＡＡＶ粒子以外のあらゆる種類のＡＡＶ粒子を指す。ベクター関連不純物には、空のＡＡＶカプシド（「エンプティ」又は「空の粒子」とも称される）及び意図されるベクターゲノム以外のポリヌクレオチド配列を含有するＡＡＶ粒子（「ＡＡＶカプシド化核酸不純物」又は「ＡＡＶカプシド化ＤＮＡ不純物」とも称される）が含まれる。
【０１９１】
一部の実施形態において、「組換えウイルス」とは、例えば粒子への異種核酸構築物の付加又は挿入によって遺伝的に改変されたウイルスが意味される。「組換え」は「ｒ」と省略され得、例えばｒＡＡＶは組換えＡＡＶを指し得る。用語「ＡＡＶ」は、本明細書で使用されるとき、「組換えＡＡＶ」又は「ｒＡＡＶ」を包含することが意図される。
【０１９２】
一部の実施形態において、「ＡＡＶビリオン」とは、野生型（ｗｔ）ＡＡＶウイルス粒子（ＡＡＶカプシドタンパク質外被と結び付いた線状一本鎖ＡＡＶ核酸ゲノムを含む）など、完全なウイルス粒子が意味される。この点で、任意の１つのＡＡＶビリオン中にいずれかの相補的方向の一本鎖ＡＡＶ核酸分子、例えば「センス」鎖又は「アンチセンス」鎖がパッケージングされることができ、両方の鎖が等しく感染性である。
【０１９３】
一部の実施形態において、用語「組換えＡＡＶビリオン」、「ｒＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶベクター粒子」、「完全なカプシド」及び「完全な粒子」は、本明細書では、両側にＡＡＶ  ＩＴＲが隣接する目的の異種ヌクレオチド配列をカプシド化するＡＡＶタンパク質外殻を含む感染性の複製欠損ウイルスとして定義される。ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶベクターを指定する配列、ＡＡＶヘルパー機能及びアクセサリー機能がそこに導入された好適な宿主細胞において産生される。このようにして、宿主細胞は、続く遺伝子送達のための感染性組換えビリオン粒子へのＡＡＶベクター（目的の組換えヌクレオチド配列を含有する）のパッケージングをもたらすＡＡＶポリペプチドをコードする能力を持つようになる。
【０１９４】
一部の実施形態において、用語「空のカプシド」及び「空の粒子」は、ＡＡＶタンパク質外殻を含むが、両側にＡＡＶ  ＩＴＲが隣接する目的の異種ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド構築物を全体として又は部分的に欠いているＡＡＶビリオンを指す。
【０１９５】
用語「宿主細胞」は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶベクタープラスミド、アクセサリー機能ベクター又は他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして使用することができるか又はそれとして使用されている、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳類細胞を意味する。この用語には、トランスフェクトされた元の細胞の子孫が含まれる。従って、「宿主細胞」は、本明細書で使用されるとき、概して外因性ＤＮＡ配列をトランスフェクトされた細胞を指す。自然、偶発的又は意図的突然変異に起因して、単一の親細胞の子孫が必ずしも形態の点又はゲノム若しくは全ＤＮＡ相補体の点で元の親と完全に同一とは限らないことが理解される。
【０１９６】
別の実施形態において、用語「ＡＡＶヘルパー機能」は、発現してＡＡＶ遺伝子産物を供与することができ、従ってその産物がトランスで生産的ＡＡＶ複製のために機能するＡＡＶ由来のコード配列を指す。従って：ＡＡＶヘルパー機能には、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ｒｅｐ及びｃａｐの両方が含まれる。Ｒｅｐ発現産物は、とりわけ：ＡＡＶのＤＮＡ複製起点の認識、結合及びニッキング；ＤＮＡヘリカーゼ活性；及びＡＡＶ（又は他の異種）プロモーターからの転写の調節など、多くの機能を備えることが示されている。Ｃａｐ発現産物は必須のパッケージング機能を提供する。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書では、ＡＡＶベクターから失われているＡＡＶ機能をトランスで補完するために使用される。
【０１９７】
一実施形態において、用語「ＡＡＶヘルパー構築物」は、概して、目的のヌクレオチド配列の送達用形質導入ベクターの産生に使用されることになるＡＡＶベクターから欠失しているＡＡＶ機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶ  ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子の一過性発現を付与してＡＡＶ複製に必要なＡＡＶ機能の欠落を補完するため一般に用いられている。しかしながら、ヘルパー構築物はＡＡＶ  ＩＴＲを欠いており、それ自体は複製もパッケージングもできない。ＡＡＶヘルパー構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス又はビリオンの形態であり得る。Ｒｅｐ及びＣａｐ発現産物の両方をコードする一般に用いられているプラスミドｐＡＡＶ／Ａｄ及びｐｌＭ２９＋４５など、幾つものＡＡＶヘルパー構築物が記載されている。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；及びＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６−２９４５を参照されたい。Ｒｅｐ及び／又はＣａｐ発現産物をコードする幾つもの他のベクターが記載されている。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号明細書及び同第６，３７６，２３７号明細書を参照されたい。
【０１９８】
別の実施形態において、用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取込みを指して使用され、細胞は、細胞膜の内側に外因性ＤＮＡが導入されているとき、「トランスフェクト」されている。幾つものトランスフェクション技法が当技術分野において概して公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ及びＣｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照されたい。かかる技法を用いて１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を好適な宿主細胞に導入することができる。
【０１９９】
本明細書で使用されるとき、用語「細胞株」は、インビトロでの連続的又は持続的成長及び分裂能力を有する細胞集団を指す。更に、かかるクローン集団の貯蔵又は移送中に核型に自然の又は誘導性の変化が起こり得ることが当技術分野において公知である。従って、言及される細胞株に由来する細胞は、祖先細胞又は培養物と厳密に同一ではないこともあり、言及される細胞株には、かかる変異体が含まれる。一部の実施形態において、用語「ＨＥＫ２９３細胞」、「２９３細胞」又はこれらの文法上の均等語は、ここで、同義的に使用され、本明細書に開示される方法において使用される宿主／パッケージング細胞株を指す。
【０２００】
一部の実施形態において、用語「溶出液」は、文脈により、物質を溶出させるために使用される緩衝液を指すと理解され得る。一部の実施形態において、用語「溶出液」は、文脈により、溶出した物質、例えば、先行する精製ステップからの、例えばアッセイ又は更なる精製に望ましい産物又は物質を指すと理解され得る。
【０２０１】
一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則（ＧＭＰ）を用いて工業規模で実施される。ＧＭＰは、医薬品品質を確保するための規制実践、例えば連邦医薬品局（Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｄｒｕｇ  Ａｇｅｎｃｙ：ＦＤＡ）によって施行されるものである。ＧＭＰ規則は製造工程の管理を確立する。現行のＧＭＰ規則の例はＦＤＡにより発表されている。一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、工業規模でのＡＡＶウイルスベクターの産生にＧＭＰ手順を利用する。これまで、遺伝子療法用のＡＡＶウイルスベクターの工業規模産生は、規模拡張性の問題が理由で難題であった。従って、一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＡＡＶウイルスベクターを例えば接着細胞において工業規模で、且つヒトへの投与に十分な純度レベルで産生することにより利点を付与した。用語「工業規模」は、例えば収率が製造バッチ当たり５×１０１５ｖｇ超、又は８×１０１５ｖｇ超、又は１×１０１６ｖｇ超であるような、ベンチ規模よりも大きい、例えば商業規模での細胞におけるウイルスベクターの産生方法を指す。
【０２０２】
イメージング
本明細書に開示される細胞ベースアッセイの一環として、ハイコンテントイメージングプラットフォーム（ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ  ＣＸ５）を使用した画像分析が実施され得る。このプラットフォームは、１細胞毎の細胞内タンパク質発現の定量的測定（１細胞当たりの積分蛍光強度）を可能にする。加えて、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ  ＣＸ５はロット処分及び安定性試験に適切なスループットを実現する。
【０２０３】
ハイコンテントスクリーニングでは、初めに細胞が物質と共にインキュベートされ、一定期間後に細胞の構造及び分子成分が分析される。最も一般的な分析には、タンパク質を蛍光タグで標識することが含まれ、最後に自動画像分析を用いて細胞表現型の変化が測定される。異なる吸収及び発光極大の蛍光タグを用いることにより、幾つかの異なる細胞構成要素を並行して測定することが可能である。更に、このイメージングは、細胞成分レベル（例えば、細胞質と核と他の細胞小器官）での変化を検出することが可能である。従って細胞毎に多数のデータ点を収集することができる（Ｐｒｏｌｌ  Ｇ，Ｓｔｅｉｎｌｅ  Ｌ，Ｐｒｏｅｌｌ  Ｆ，Ｋｕｍｐｆ  Ｍ，Ｍｏｅｈｒｌｅ  Ｂ，Ｍｅｈｌｍａｎｎ  Ｍ，Ｇａｕｇｌｉｔｚ  Ｇ（Ａｕｇｕｓｔ  ２００７）．「ハイコンテントスクリーニング適用における無標識検出の可能性（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｉｇｈ−ｃｏｎｔｅｎｔ−ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」．Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ．１１６１（１−２）：２−８を参照されたい）。ハイコンテントスクリーニングは、細胞に取り込まれた特異的蛍光ベース試薬から得られる多色蛍光情報の抽出を自動化する（Ｇｉｕｌｉａｎｏ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ（１９９５），Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：４；Ｇｉｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２４：４０５）。細胞は、空間的動態及び時間的動態も測定することのできる光学系を使用して分析される（Ｆａｒｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５５：７８５；Ｇｉｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｉｎ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｂ．Ｈｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｋ．Ｊａｃｏｂｓｏｎ（ｅｄｓ．），ｐｐ．５４３−５５７．Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：７３６；Ｗａｇｇｏｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２７：４９４）。その概念は、標識された構成要素の活性に関する時空間的情報を有する「ウェル」として各細胞を扱うというものである。
【０２０４】
一実施形態において、顕微鏡対物レンズを有する高倍率蛍光光学系と、細胞を保持するアレイ状位置を含むプレートを保持し、且つそれらの位置を顕微鏡対物レンズと整列させるためプレートを動かす手段及び焦点合わせが達成される方向にプレートを動かす手段を備えるように適合されたＸＹ軸ステージと；デジタルカメラと；アレイ状位置にある細胞に励起光を当てる光学的手段を有する光源及び細胞が発する蛍光の光をデジタルカメラに向けるための手段と；デジタルカメラからデジタルデータを受け取って処理するコンピュータ手段であって、カメラから画像を受け取るデジタルフレーム取込み器、ユーザ対話及びアッセイ結果の表示用のディスプレイ、データの保存及びアーカイブ用のデジタル記憶媒体並びに結果の管理、収集、処理及び表示手段を含むコンピュータ手段とを含む細胞スクリーニングシステムが提供される。かかるシステムの使用方法については、米国特許第６，７５６，２０７号明細書（全体として本明細書に援用される）に開示されている。
【０２０５】
プレートスキャンの完了後、画像及びデータは、システムの画像レビュー、データレビュー及び概要レビューファシリティでレビューすることができる。スキャンからの全ての画像、データ及び設定が、後のレビューのため又はネットワーク情報管理システムとインターフェースさせるため、システムのデータベースにアーカイブ化され得る。データは、結果を表にし、且つ他のレポートを作成するため、他のサードパーティ統計パッケージにもエクスポートされ得る。完全なスキャンの最終段階として、測定された特徴の１つ以上の統計量に関するレポートが作成され得る。ユーザは、対話式レポート作成プロシージャを用いてプレートのスキャン領域についてウェル毎にまとめられたデータのグラフィカルなレポートを作成することができる。このレポートは、表及びグラフ形式のウェル別統計量のまとめ並びにサンプルに関する識別情報を含み得る。
【０２０６】
プレートのイメージング方法は当業者に公知であろう。例示的イメージングプラットフォームは、ＨＳＣ  ｓｔｕｄｉｏソフトウェア及び標準化プロトコルを用いたＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）プラットフォームを含む。しかしながら、本開示の方法の実施には、均等なイメージング及び／又はソフトウェアプラットフォームを使用し得る。
【０２０７】
データ収集に用いられる例示的ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ設定は、以下の設定を含む。アッセイ設定：イメージングモード：蛍光１（Ｆ１）％蛍光２（Ｆ２）；明視野像を収集する；Ｆ１画像細胞型：マウスＥＳ細胞；説明：ｍＮＰＣフルオロフォアＡＯ  ＶＣ−５３５−４０３；蛍光露光：７００．０ミリ秒；Ｆ２画像細胞型：マウスＥＳ細胞；説明：ｍＮＰＣフルオロフォア  Ｐ１  ＶＣ−６６０−５０３；蛍光露光：５０００．０ミリ秒；アッセイの希釈係数を設定する：２．０００；パーセントＦ１、Ｆ２：Ｆ１／（Ｆ１＋Ｆ２）×１００％を表示。細胞型設定：マウスＥＳ細胞；細胞直径：最小９．０ミクロン、最大３０．０ミクロン；真円度：０．１０；コントラスト増強：０．４０；デクラスターエッジ係数：０．５；デクラスターＴｈ係数：１．０；バックグラウンド調整：１．０。トリパンブルー生死判別パラメータ：死細胞直径：最小８．０ミクロン、最大３０ミクロン；感度：１．０；均一性：１５０；極めて薄暗い死細胞のコントラスト増強：０．６０。プロトコル設定：対物レンズ：２０×；視野サイズ：４５５．４×４５５．４ミクロン；カメラ：Ｘ１；カメラ収集モード：１１０４×１１０４（２×２ビニング）；ソフトウェアオートフォーカスを使用する；ソフトウェアフォーカスチャンネル：１；オートフォーカス間隔：１。チャンネル１設定：コンポジットに含まれるチャンネル、カメラゲイン：２；光強度（％単位）：１００；イメージングモード：広視野；色素：３８６−２３＿ＢＧＲＦＲＮ＿ＢＧＲＦＲＮ；視野深度：６．５６３；固定露光時間；目標％：２５；露光時間（秒）：０．０８。チャンネル２設定：コンポジットに含まれるチャンネル、カメラゲイン：２；光強度（％単位）：１００；イメージングモード：広視野；色素：４８５−２０＿ＢＧＲＦＲＮ＿ＢＧＲＦＲＮ；視野深度：６．５６３；固定露光時間；目標％：２５；露光時間（秒）：０．０８。
【０２０８】
ＡＡＶベクターの作製方法
本明細書には、ＡＡＶベクター及びそれを含む医薬組成物の作製方法並びに本明細書に記載される細胞ベース効力アッセイを用いたＡＡＶベクターの効力のアッセイ方法が提供される。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＳＭＮ１をコードする配列を含む。一部の実施形態において、ウイルスベクターの相対効力は、参照標準品と比べて少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％又は少なくとも１４０％である。
【０２０９】
一部の実施形態において、ウイルスベクターの相対効力は、参照標準品と比較して少なくとも９０％である。
【０２１０】
本明細書に記載されるとおりの相対効力細胞ベースアッセイを用いると、ＡＡＶ−ＳＭＮ１ベクター原薬及び薬物製品のロット処分及び安定性試験を意図したＡＡＶ−ＳＭＮ１ベクターの相対効力を決定することができる。
【０２１１】
上流工程
一部の実施形態では、上流工程を用いてワーキングセルバンクに由来する中間体が産生され、ここで、上流工程は、（ａ）細胞、例えば接着細胞を培養するステップ、（ｂ）培養した細胞、例えば接着細胞に３つのプラスミドをトランスフェクトするステップ、（ｃ）培養期間後に例えば全細胞溶解によって細胞から拡大後のウイルス粒子を回収するステップ、（ｄ）ウイルス粒子をろ過によって精製して任意のインタクトな細胞又は細胞デブリを除去するステップ、（ｅ）ステップ（ｄ）からの溶出液をタンジェンシャルフローろ過に供するステップ、及び（ｆ）任意選択で、得られた精製ウイルス粒子中間調製物を凍結するステップを含む。一部の実施形態において、中間調製物は凍結され得る。他の実施形態において、中間調製物は下流処理前に凍結されなくてもよい。一部の実施形態において、本明細書に開示される上流工程で調製されたＡＡＶは、本明細書に記載されるとおりの、ＳＭＮ１をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶである。一部の実施形態において、上流工程は、ＧＭＰに基づいて工業規模で行われる。
【０２１２】
１．細胞株トランスフェクション及び培養
一態様において、本明細書にはｒＡＡＶゲノムが開示される。このｒＡＡＶゲノムは、ポリペプチド（限定はされないが、ＳＭＮポリペプチドを含む）をコードするか、又は突然変異タンパク質若しくはそれらの遺伝子の調節配列に向けられるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス及び／又はｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに隣接する１つ以上のＡＡＶ  ＩＴＲを含む。ポリヌクレオチドは、標的細胞において機能性の転写調節ＤＮＡ、具体的にはプロモーターＤＮＡ、エンハンサーＤＮＡ及びポリアデニル化シグナル配列ＤＮＡに作動可能に連結され、遺伝子カセットを形成する。遺伝子カセットは、哺乳類細胞で発現したときにＲＮＡ転写物のプロセシングを促進するためイントロン配列も含み得る。
【０２１３】
一部の実施形態において、本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ  ＤＮＡを欠いている。ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ  ＤＮＡ（例えばＩＴＲ）は、限定はされないが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０及びＡＡＶ−１１を含め、その組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型由来であり得る。これらのＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当技術分野において公知である。例えば、ＡＡＶ−１の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７に提供され；ＡＡＶ−２の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ  ００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５−５６４｛１９８３）に提供され：ＡＡＶ−３の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿１８２９に提供され；ＡＡＶ−４の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９に提供され；ＡＡＶ−５ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６に提供され；ＡＡＶ−６の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８６２に提供され；ＡＡＶ−７及びＡＡＶ−８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９に提供され；ＡＡＶ−９ゲノムは、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１−６３８８（２００４）に提供され；ＡＡＶ−１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７−７６（２００６）に提供され；及びＡＡＶ−１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５−３８３（２００４）に提供される。
【０２１４】
本明細書で使用されるとき、「ｐＳＭＮ」ベクタープラスミドは、ＳＭＮタンパク質をコードするポリヌクレオチド、即ちＳＭＮ  ｃＤＮＡ発現カセットを含み、ここで、このカセットには、例えばＳＭＮ遺伝子をコードするポリヌクレオチドの「左」及び「右」の、アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接する。一部の実施形態において、ＳＭＮをコードするポリヌクレオチドは、ヒトＳＭＮ配列、例えば、天然に存在するヒトＳＭＮ配列又はそのアイソフォーム、変異体若しくは突然変異体である。一部の実施形態において、ＩＴＲ配列は、天然、変異体又は修飾ＡＡＶ  ＩＴＲ配列である。一部の実施形態において、少なくとも１つのＩＴＲ配列が、天然、変異体又は修飾ＡＡＶ２  ＩＴＲ配列である。一部の実施形態において、２つのＩＴＲ配列が両方とも天然、変異体又は修飾ＡＡＶ２  ＩＴＲ配列である。一部の実施形態において、「左」のＩＴＲが、自己相補的ゲノムの産生を可能にする修飾ＡＡＶ２  ＩＴＲ配列であり、「右」のＩＴＲが天然ＡＡＶ２  ＩＴＲ配列である。一部の実施形態において、「右」のＩＴＲが、自己相補的ゲノムの産生を可能にする修飾ＡＡＶ２  ＩＴＲ配列であり、「左」のＩＴＲが天然ＡＡＶ２  ＩＴＲ配列である。一部の実施形態において、ｐＳＭＮプラスミドはＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（「ＣＢ」）プロモーターを更に含む。一部の実施形態において、ｐＳＭＮプラスミドはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）イントロンを更に含む。一部の実施形態において、ｐＳＭＮプラスミドはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化（ポリＡ）終結シグナルを更に含む。上記で考察される成分の１つ以上に使用され得る例示的配列を以下の表１に示す。一部の実施形態において、以下の表１に示される全ての配列が使用される。一部の実施形態において、「ＡＶＸＳ−１０１」は、表１の全ての配列を使用する、且つ用語ｐＳＭＮの範囲内に含まれるベクター構築物の非限定的な例である。
【０２１５】
一部の実施形態において、ｐＳＭＮベクターは、ＳＭＮ  ｃＤＮＡ発現カセット、修飾ＡＡＶ２  ＩＴＲ、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロン、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル及び非修飾ＡＡＶ２  ＩＴＲを含み得る。修飾及び非修飾ＩＴＲは、ＳＭＮ  ｃＤＮＡ発現カセットに対していずれの向き（即ち５’側又は３’側）になり得る。
【０２１６】
一部の実施形態において、例えば、本明細書に記載される製造工程中、ベクター構築物配列は、例えばＡＡＶ９ビリオンにカプシド化される。これらの実施形態において、カプシド化は、安定した機能性のトランス遺伝子、例えば完全に機能性のヒトＳＭＮトランス遺伝子を送達する能力を有する非複製性の組換えＡＡＶ９カプシドにおけるカプシド化である。一部の実施形態において、カプシドは、ＶＰ２及びＶＰ３が２つのトランケート型のＶＰ１となり、全てが共通のＣ末端配列を有するような選択的スプライシングによって産生される６０個のウイルスタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）を例えば１：１：１０の比で含む。一部の実施形態において、この製造工程の産物、例えば薬物製品は、安定した完全に機能性のヒトＳＭＮトランス遺伝子を送達するため非複製性の組換えＡＡＶ９カプシドを含み得る。一部の実施形態において、カプシドは、ＶＰ２及びＶＰ３が２つのトランケート型のＶＰ１となり、全てが共通のＣ末端配列を有するような選択的スプライシングによって産生される６０個のウイルスタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）を１：１：１０の比で含む。
【０２１７】
例示的ベクター構築物、例えばＡＶＸＳ−１０１（ＡＡＶ９−ＳＭＮ１）のＤＮＡ配列を表１に示す。
【０２１８】
【表１】
2021526806.tif 000021
【０２１９】
別の態様において、ＡＶＸＳ−１０１ベクター構築物のＤＮＡ配列は配列番号１に提供される。
【化２】
2021526806.tif 000022
【０２２０】
一部の実施形態において、ｐＳＭＮプラスミドによってコードされるＳＭＮタンパク質のアミノ酸配列は以下を含む。
【化３】
2021526806.tif 000023
【０２２１】
一部の実施形態において、修飾ＡＡＶ２  ＩＴＲは、配列番号１のヌクレオチド１〜１０６の配列を含む。一部の実施形態において、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／ニワトリβ−アクチンハイブリッドプロモーター（ＣＢ）は、配列番号１のヌクレオチド１５３〜４３２の配列を含む。一部の実施形態において、ＳＭＮ１タンパク質を発現するｃＤＮＡの配列は、配列番号１のヌクレオチド１００３〜１８８７の配列を含む。一部の実施形態において、ＳＶ４０イントロンの配列は、配列番号１のヌクレオチド７７４〜８７０の配列を含む。一部の実施形態において、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルの配列は、配列番号１のヌクレオチド１９７３〜２２０４の配列を含む。一部の実施形態において、非修飾ＡＡＶ２  ＩＴＲは、配列番号１のヌクレオチド２２１７〜２３５９の配列を含む。
【０２２２】
一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３は同じ転写物に由来する。これらは選択的な開始部位を有するが、カルボキシ末端は共有する。以下では、ＶＰ１特異的アミノ酸配列を黒色で示し、太字にする。ＶＰ１及びＶＰ２に共通するアミノ酸配列には下線を付し、斜体にする。３つ全てのカプシドタンパク質に共通するアミノ酸は太字及び斜体である。
【化４】
2021526806.tif 000024
【０２２３】
一実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする転写物に由来する。
【０２２４】
別の態様において、本明細書には、ｒＡＡＶゲノムを含むＤＮＡプラスミドが開示される。このＤＮＡプラスミドは、ＡＡＶ９カプシドタンパク質を有する感染性ウイルス粒子にｒＡＡＶゲノムをアセンブルするためＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス又はヘルペスウイルス）と共に感染許容性細胞に移される。ｒＡＡＶ粒子の産生技法は、当技術分野において標準的であり、この技法では、パッケージングしようとするＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子並びにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶの産生には、単一の細胞（本明細書ではパッケージング細胞と称される）の中に存在する以下の成分：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムと別個の（即ちそこにない）ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子並びにヘルパーウイルス機能が関わる。シュードタイプｒＡＡＶの産生については、例えば、国際公開第０１／８３６９２号パンフレット（参照により全体として本明細書に援用される）に開示されている。様々な実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質を修飾することにより組換えベクターの送達を促進し得る。カプシドタンパク質の修飾は、概して当技術分野において公知である。例えば、米国特許出願公開第２００５／００５３９２２号明細書及び米国特許出願公開第２００９／０２０２４９０号明細書（これらの開示は全体として参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【０２２５】
ｒＡＡＶ産生の一般的原理については、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３−５３９；及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，ＣＵＭ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７−１２９）にレビューされている。様々な手法が、Ｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）；Ｈｅｎｎｏｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）；及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）．Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８）；米国特許第５，１７３，４１４号明細書；国際公開第９５／１３３６５号パンフレット及び対応する米国特許第５，６５８，７７６号明細書；国際公開第９５／１３３９２号パンフレット；国際公開第９６／１７９４７号パンフレット；ＰＣＴ／米国特許出願公開第９８／１８６００号明細書；国際公開第９７／０９４４１号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第９６／１４４２３号明細書）；国際公開第９７／０８２９８号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第９６／１３８７２号明細書）；国際公開第９７／２１８２５号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第９６／２０７７７号明細書）；国際公開第９７／０６２４３号パンフレット（ＰＣＴ／仏国特許出願公開第９６／０１０６４号明細書）；国際公開第９９／１１７６４号パンフレット；Ｐｅｒｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：１２４４−１２５０；Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：６０９−６１５；Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：１１２４−１１３２；米国特許第５，７８６，２１１号明細書；米国特許第５，８７１，９８２号明細書；及び米国特許第６，２５８，５９５号明細書に記載されている。前述の文献は、特にｒＡＡＶ産生に関連するこれらの文献の節に重点を置いて、本明細書により全体として参照により本明細書に援用される。
【０２２６】
パッケージング細胞の例示的作成方法は、ＡＡＶ粒子産生に必要な全ての成分を安定に発現する細胞株を作り出すことである。例えば、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いているｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムと別個のＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子並びにネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能マーカーを含むプラスミド（又は複数のプラスミド）が細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテール法（Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７−２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５−７３）又は直接的に、平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１−４６６６）などの手順によって細菌プラスミドに導入されている。次にパッケージング細胞株にアデノウイルスなどのヘルパーウイルスを感染させる。この方法の利点は、細胞を選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適なことである。好適な方法の他の例では、プラスミドよりむしろアデノウイルス又はバキュロウイルスを利用してｒＡＡＶゲノム及び／又はｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子がパッケージング細胞に導入される。
【０２２７】
従って本明細書における開示は、様々な実施形態において、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。パッケージング細胞は、懸濁液中で培養される非接着細胞又は接着細胞であり得る。一実施形態において、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ  ２９３細胞及びＰｅｒＣ．６細胞（コグネイト２９３株）など、任意の好適なパッケージング細胞株を使用することができる。一実施形態において、細胞株はＨＥＫ  ２９３細胞である。
【０２２８】
ウイルスベクター産生収率を増加させるため、接着細胞を培養し、培養フラスコへの接着性の改善に関して選択し得る。一部の実施形態において、後続のバイオリアクター播種ステップにおけるトランスフェクション効率及び細胞数が改善する。継代培養時、当技術分野において公知の方法により細胞が細胞培養表面から剥がされ得る。例えば、細胞は、掻き取ることによるか、又はプロテアーゼを含む溶液中でインキュベートすることによって浮き上がらせることができる。例示的実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシンによって室温で約２分間解離させ得る。血清を含有する成長培地を加えることにより解離を停止させ得、懸濁液のピペッティングを繰り返すことにより細胞集塊を解離させ得る。次に細胞懸濁液をペレット化し得、単離されたペレットを好適な完全成長培地に再懸濁し得る。次に細胞を新規細胞培養チャンバに播種して接着させ得る。然る時間後に表面に接着しない細胞は、細胞培養培地が完全に成長培地に入れ替わる前に、細胞培養培地と共に穏やかに吸引することにより除去され得る。一部の実施形態において、細胞を接着させておく時間は、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間又は約７時間であり得る。細胞が拡大したら、この工程を繰り返して、培養フラスコに強力に接着する細胞の画分を増加させ得る。一部の実施形態において、この工程は少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回又は任意の好適な回数だけ繰り返される。例示的実施形態において、ＨＥＫ２９３細胞は７５ｃｍ２フラスコに播種し、３７℃インキュベーターにおいて４時間接着させた後、接着が弱い細胞を吸引によって除去し、細胞培養培地を交換する。例示的実施形態において、強力な接着性の細胞を選択する工程は、３回の細胞培養継代にわたって繰り返される。
【０２２９】
他の実施形態において、ｒＡＡＶ９（即ち感染性カプシド化ｒＡＡＶ９粒子）は、本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムを含む。一態様において、ｒＡＡＶゲノムは自己相補的ゲノムである。
【０２３０】
トランスフェクション前、細胞は、フラスコ又は好適なバイオリアクター又は両方において好適な培養培地中で拡大させる。一部の実施形態において、細胞は、細胞培養培地の連続循環を提供するバイオリアクターにおいて拡大され得る。一実施形態において、細胞は、２００ｍ２、３３３ｍ２又は５００ｍ２  ｉＣＥＬＬｉｓバイオリアクターにおいて拡大させる。１つの培養培地は、５〜１０％ＦＢＳ、４．５ｇ／Ｌグルコース、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有するＤＭＥＭである。一部の実施形態では、接着細胞を再循環培地バッグ内の培地に加え、バイオリアクター中に循環させる。一部の実施形態では、細胞培養培地又は任意の他の培地は、蠕動ポンプを使用してバイオリアクター中に連続的に再循環させる。細胞はフラスコ又はバイオリアクター内に培養及びトランスフェクションに好適な密度で播種され得る。播種密度は細胞型及びトランスフェクションまでの時間に依存し得る。一部の実施形態において、細胞は約８０００〜１６０００細胞／ｃｍ２で播種される。ある実施形態において、ＨＥＫ２９３細胞は８０００〜１２，０００細胞／ｃｍ２で播種される。
【０２３１】
形質導入細胞を対象に形質導入及び再導入する好適な方法は、当技術分野において公知である。一実施形態において、細胞はインビトロで、例えば適切な培地中にｒＡＡＶを細胞と合わせ、目的のＤＮＡを担持する細胞に関してサザンブロット及び／又はＰＣＲなどの従来技法を用いるか、又は選択可能マーカーの使用によってスクリーニングすることにより形質導入することができる。
【０２３２】
一部の実施形態において、パッケージング細胞株には３つのプラスミド：ＡＡＶベクター中にパッケージングしようとするベクター配列をコードする又はそれを含むプラスミド（例えば、ｐＳＭＮ、ｐＭＥＣＰ２トランス遺伝子又はｐＳＯＤ１ｓｈ）、ｐＨＥＬＰ及びｐＡＡＶ２／９がトランスフェクトされる。トランスフェクションは、限定はされないが、電気穿孔、例えばリポフェクタミン、カチオン性ポリマー及びカチオン性脂質によるリポフェクションを含め、当技術分野において公知の技法のいずれを用いても実施され得る。任意の好適なトランスフェクション培地を使用し得る。トランスフェクション工程の一実施形態では、接着ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞に三重ＤＮＡプラスミドポリエチレンイミン（ＰＥＩ）共沈殿物がトランスフェクトされる。一実施形態において、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＳＭＮベクター（ＣＢプロモーターとＳＭＮをコードするポリヌクレオチドとを含む自己相補的ＡＡＶ９ベクター）が、大規模接着細胞バイオリアクターにおけるＰＥＩ共沈殿物を用いた接着ＨＥＫ２９３細胞中への三重ＤＮＡプラスミドトランスフェクションを用いて産生される。一実施形態において、細胞拡大に使用されるＤＭＥＭ成長培地は、変法ＤＭＥＭトランスフェクション培地に置き換えられる。この培地はカルシウム及びＬ−グルタミン不含で配合される。一実施形態において、トランスフェクション培地は、ＦＢＳ不含、カルシウム不含、Ｌ−グルタミン不含及び４．５ｇ／Ｌグルコース含有ＤＭＥＭである。
【０２３３】
一部の実施形態において、血清不含（例えば、ＦＢＳ不含）のトランスフェクション培地はトランスフェクションの有効性を向上させる。ある実施形態において、トランスフェクション培地はＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）である。一実施形態では、３つのプラスミド（ｐＳＭＮ、ｐＨＥＬＰ及びｐＡＡＶ２／９）をトランスフェクション培地中でＰＥＩと共に混合して反応させる。一部の実施形態において、３つのプラスミドは約１：１：１のモル比で共に混合される。一部の実施形態において、プラスミド及びＰＥＩは１：１のＤＮＡ：ＰＥＩ重量比で混合される。一部の実施形態において、プラスミド及びＰＥＩは１：１未満のＤＮＡ：ＰＥＩ重量比で混合される。ある実施形態において、ｐＳＭＮ、ｐＨＥＬＰ及びｐＡＡＶ２／９は１：１：１のモル比でＯｐｔｉＭＥＭ培地中に混合される。かかる実施形態において、ＰＥＩは、ＤＮＡ：ＰＥＩが重量基準で１：１となるように加えられる。一部の実施形態において、反応は０〜６０分間、又は１０〜４５分間、又は２０〜３０分間生じさせる。ある実施形態において、反応は１５〜３０分間生じさせる。
【０２３４】
ある実施形態において、本開示は、ＡＡＶベースのウイルスベクターの製造方法を提供し、この方法は、（ｉ）工業規模のバイオリアクターにおいて接着ＨＥＫ２９３細胞を培養するステップ、（２）接着細胞にプラスミドを６０分未満にわたってトランスフェクトしてＡＡＶベクターの産生を可能にするステップ並びに任意選択で更なる処理、精製、製剤化及び充填ステップを適用して医薬製品を作製するステップを含む。この工程の一実施形態において、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＳＭＮベクターは、ポリエチレンイミン（「ＰＥＩ」）共沈殿物を用いた三重ＤＮＡプラスミドトランスフェクションを用いて作製される。ある実施形態において、このトランスフェクションに利用される３つのプラスミドは、ｐＳＭＮ、ｐＡＡＶ２／９及びｐＨＥＬＰである。
【０２３５】
トランスフェクションは、パッケージング細胞株をＤＮＡ−ＰＥＩ共沈物と接触させることにより実施され得る。一部の実施形態では、トランスフェクション培地中のＤＮＡ−ＰＥＩ共沈物が培地再循環バッグに充填される。一部の実施形態では、トランスフェクション培地中のＤＮＡ−ＰＥＩ共沈物がバイオリアクター内を循環し、成長培地に完全に取って代わる。一部の実施形態では、トランスフェクション培地中のＤＮＡ−ＰＥＩ共沈物をバイオリアクター内で接着細胞に接触させる。一部の実施形態では、トランスフェクション培地中のＤＮＡ−ＰＥＩ共沈物をバイオリアクター内で最長２時間にわたって接着細胞に接触させる。一部の実施形態では、トランスフェクションは１〜２時間にわたって行う。一部の実施形態では、トランスフェクションは、１時間未満、例えば、１０分、２０分、３０分、４０分又は５０分にわたって行う。一部の実施形態では、トランスフェクションは１〜２時間にわたって行う。一部の実施形態では、トランスフェクションは、バイオリアクター中に完全成長培地を再循環させてトランスフェクション培地を完全に入れ替えることにより停止させる。
【０２３６】
２．拡大したウイルス粒子の回収
トランスフェクション後に好適な細胞拡大時間が経った後、一部の実施形態では、細胞を溶解させてウイルス粒子を回収する。一部の実施形態において、細胞は細胞溶解工程の開始前にリアクターから解離される。一部の実施形態において、細胞はインサイチューで溶解させる。任意選択で、ウイルス粒子は溶解させることなく回収される。一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼが最終目標濃度まで加えられ、例えばバイオリアクター内を循環する。エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を分解するものであり得る。一実施形態において、エンドヌクレアーゼは、商品名ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（登録商標）（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で販売されているセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）由来の遺伝子操作されたエンドヌクレアーゼである（Ｅａｖｅｓ，Ｇ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔ．１９６３，８５，２７３−２７８；Ｎｅｓｔｌｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６９，２４４，５２１９−５２２５）。この酵素は、ｐＮＵＣ１産生プラスミドを含有する株Ｋ１２の突然変異体である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０から産生及び精製される（米国特許第５，１７３，４１８号明細書、本明細書によって全体として参照により援用される）。構造的に、このタンパク質は、２つの重要なジスルフィド結合を有する約３０ｋＤａサブユニットの同一の２４５アミノ酸の二量体である。ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（登録商標）はあらゆる形態のＤＮＡ及びＲＮＡ（一本鎖、二本鎖、線状及び環状）を分解し、多種多様な作業条件で有効であり、核酸を２〜５塩基長の５’−一リン酸末端オリゴヌクレオチドに消化する。ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（登録商標）は、現行の医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則（ｃＧＭＰ）に基づいて作製され、従って、工業規模のタンパク質及び／又はウイルス粒子精製工程で使用することができる。ｃＧＭＰ条件下で作製される他のエンドヌクレアーゼも、同様に本願に開示される精製方法において使用することができる。一実施形態において、ベンゾナーゼは、５０〜２００Ｕ／ｍｌ、例えば７５〜１５０Ｕ／ｍｌ、例えば約１００Ｕ／ｍＬの最終濃度となるようにバイオリアクターに加えられる。一部の実施形態において、ベンゾナーゼを加えると、バイオリアクターにおける高いｖｇ産生が実現しつつ宿主細胞ＤＮＡが著しく減少する。
【０２３７】
一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼは、リアクターに溶解緩衝液を加える前に混合させておく。一部の実施形態において、細胞溶解溶液は、接着細胞と最長１時間、最長２時間、最長３時間、最長４時間又は最長５時間混合させておく。一部の実施形態において、溶解緩衝液は、好適な緩衝液中に塩化マグネシウム及び／又はＴｗｅｅｎ−２０を含み得る。例示的実施形態において、溶解緩衝液は、５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０％Ｔｗｅｅｎ  ２０、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０である。溶解反応を停止させるため、ベンゾナーゼ反応をクエンチする塩ショ糖液（ＳＳＳ）を加え得る。一部の実施形態では、リンス緩衝液を含む回収バッグにＳＳＳを加え、１５分間混合する。一部の実施形態において、バイオリアクターはバイオリアクターリンス緩衝液でリンスされ、次にリンス液が回収物収集バッグに、クエンチされた細胞溶解溶液及び溶解した細胞内容物と共に収集され、これらが全て一緒になってバルク回収物を含む。一部の実施形態において、バイオリアクターリンス緩衝液は、トリス、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、Ｔｗｅｅｎ−２０及びショ糖を含み得る。例示的実施形態において、バイオリアクターリンス緩衝液は、２０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｗｅｅｎ−２０ｗ／ｖ及び１％ショ糖ｗ／ｖ、ｐＨ８．１を含む。
【０２３８】
３．ウイルス粒子の精製
回収後、バルク回収物ウイルス粒子は、典型的にはろ過によって濃縮及び精製され得る。一実施形態において、ウイルス粒子は、デプスろ過と、それに続く大型分子夾雑物及び細胞デブリを除去するフィルタ、例えば０．４５μｍフィルタであって、しかし、ベクターゲノムがそこを通過することは許容するフィルタでのろ過によってろ過される。任意の好適なデプスフィルタを使用し得る。
【０２３９】
当技術分野において理解されるとおり、デプスろ過とは、大量の大型粒子（例えば、インタクトな細胞又は細胞デブリ）を含有する溶液を、かかる条件下で急速に詰まり得る膜ろ過と比較して多孔質ろ過剤を使用して清澄化することを指す。様々な細孔径の種々のデプスろ過剤が、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｐａｌｌ、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ及びＳａｒｔｏｒｉｏｕｓなど、種々の製造者から市販されている。
【０２４０】
デプスろ過の目標流速は、フィルタ入口圧力を規格の範囲内に保つため下げられ得る。全てのバルク回収物がろ過された後、デプスフィルタは、特定の実施形態では、続く第１のタンジェンシャルフローろ過ステップ（「ＴＦＦ１」）に使用されるダイアフィルトレーション緩衝液でチェーシング（ｃｈａｓｅ）され得る。デプスフィルタプール液は混合される。次にデプスフィルタプール液を０．４５μｍフィルタでろ過することにより、バルク回収物材料が更に清澄化され得る。次に０．４５μｍフィルタはＴＦＦ１緩衝液でチェーシング（ｃｈａｓｅ）される。
【０２４１】
４．タンジェンシャルフローろ過
様々な実施形態において、タンジェンシャルフローろ過が、例えばタンジェンシャルフローろ過を用いたバルク回収物の濃縮並びに塩及びタンパク質の除去に用いられる。タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）（クロスフローろ過ＣＦＦとも称される）は当業者に周知であり、広範囲の状況下でのその実施のための機器及びプロトコルが、限定はされないが、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ及びＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ、Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＣＡを含め、種々の製造者から市販されている。概して、ＴＦＦは、膜の表面を横切る保持液の再循環を伴い得る。この穏やかなクロスフロー供給液が、特定の実施形態では、膜の汚れを最小限に抑え、高いろ過率を維持し、且つ高い産物回収率をもたらす。一実施形態において、ＴＦＦステップは、本明細書に例示されるとおり、フラットシートシステムで実現され得る。フラットシートシステムは大規模産生で使用され得、ここで、かかるシステムは、ウイルス粒子に過剰な剪断力がかかることを防ぐ手段（例えば、オープンフローチャネル）を備える。代わりに、ＴＦＦステップは、本明細書に例示されるとおり、中空糸システムで実現され得る。一実施形態において、ＴＦＦシステムの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）は２００〜４００ｋＤａ、例えば約３００ｋＤａである。
【０２４２】
一実施形態において、ＴＦＦ１ステップは、３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ再生セルロース膜カセットを使用して実施される。このカセットはフラッシュされ、ＮａＯＨ溶液で衛生化され、且つＴＦＦ１緩衝液で平衡化される。一実施形態において、ＴＦＦ１緩衝液は、２０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ショ糖、ｐＨ８．１を含む。
【０２４３】
一部の実施形態において、ＴＦＦ１ステップの濃縮相は、清澄化された回収物の容積が約１０分の１に減少するように選択される。目標保持液容積に達した後、ダイアフィルトレーション作業が開始され得る。保持液のダイアフィルトレーションは、一部の実施形態では、約６ダイアボリュームのＴＦＦ１緩衝液で行うことができる。一部の実施形態において、保持液のダイアフィルトレーションは、約５〜２０、又は１０〜１５、又は１２ダイアボリュームのＴＦＦ１緩衝液で行われる。６ダイアボリュームの透過液全流量が達成された後、保持液は再び濃縮され、回収され得る。中間原薬の産物回収率を増加させるため、膜のリンス、例えば２回の連続的なリンスが実行され得る。
【０２４４】
５．中間産物
一部の実施形態において、次に中間原薬はドライアイス上又はフリーザー内で凍結され、次に≦−６０℃の貯蔵場所に移され得る。他の実施形態において、下流工程前に中間産物を凍結する必要はない。
【０２４５】
一部の実施形態において、更なる処理のため（例えば、例えば本明細書に記載されるとおりの下流工程による精製（ｐｕｒｆｉｃａｔｉｏｎ）のため）、複数の中間産物原体ロットが共にプールされる。複数の中間産物原体ロットは凍結及び貯蔵前にプールされ得る。他の実施形態において、複数の中間産物原体ロットは、凍結及び貯蔵されたロットを解凍した後にプールされ得る。
【０２４６】
下流工程
一部の実施形態では、下流工程を用いて中間産物（例えばプールされた中間産物）がろ過済み原薬に処理される。一部の実施形態において、下流工程ステップには、（ａ）酸性化及び清澄化（例えば、ろ過を用いる）、（ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー、（ｃ）タンジェンシャルフローろ過（「ＴＦＦ２」）、（ｄ）ＣｓＣｌ超遠心、（ｅ）ウイルスベクターの収集及び（ｆ）更なるタンジェンシャルフローろ過（「ＴＦＦ３」）が含まれ、これにより精製されたＡＡＶ粒子が薬学的に許容可能な担体中に懸濁されているろ過済み原薬が産生される。一部の実施形態において、下流工程は、ＴＦＦ１中間体の産生後に以下の製造ステップ：ＴＦＦ１中間体の解凍及びプール、酸性化及び清澄化、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ２）、ＣｓＣｌ超遠心による完全なカプシド／空のカプシドの分離、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ３）による濃縮／緩衝液交換、ＴＦＦ３プール材料ろ過による原薬の生成、原薬の希釈及びろ過による薬物製品の産生、薬物製品の貯蔵及びバイアルへの薬物製品の充填を含む。
【０２４７】
一部の実施形態において、本明細書に開示される下流工程を用いて、本明細書に記載されるとおりのＡＡＶ  ＳＭＮを含む中間体が処理され得る。
【０２４８】
１．中間体の酸性化及び清澄化
中間体が凍結される実施形態では、下流工程はＴＦＦ１中間材料を解凍することから始まる。デタージェント、例えばＴｗｅｅｎ  ２０を使用して、酸性ｐＨ下でのバルクの宿主細胞タンパク質及びＤＮＡのフロキュレーションを促進し得る。次にデタージェントを含有するＴＦＦ１中間体のｐＨを降下させ得る。次に、ｐＨの降下時に形成された凝集物及び沈殿物が、デプスフィルタ並びに大型分子夾雑物及び細胞デブリを除去するフィルタ、例えば０．４５μｍフィルタであって、しかし、ベクターゲノムがそこを通過することは許容するフィルタで溶液をろ過することにより除去され得る。任意の好適なデプスフィルタを使用し得る。
【０２４９】
一実施形態において、Ｔｗｅｅｎ  ２０は、１０〜２０％Ｔｗｅｅｎ  ２０の最終濃度に達するようにＴＦＦ１中間溶液にゆっくりと加えられる。一部の実施形態において、Ｔｗｅｅｎ  ２０を加えた後の目標組成は、２０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ショ糖ｍ／ｖ、ｐＨ８．１中３６％のＴｗｅｅｎ  ２０溶液である。一部の実施形態において、Ｔｗｅｅｎ  ２０は約１〜６時間の時間をかけてゆっくりと加えられる。一部の実施形態において、Ｔｗｅｅｎ  ２０は３〜６時間かけてゆっくりと加えられる。一部の実施形態において、Ｔｗｅｅｎ  ２０は４時間かけてゆっくりと加えられる。一部の実施形態において、Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＴＦＦ１中間溶液は室温で一晩インキュベートさせておく。一部の実施形態において、Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＴＦＦ１中間溶液は室温で８〜２０時間インキュベートさせておく。例示的実施形態において、Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＴＦＦ１中間溶液は室温で１２〜２０時間インキュベートさせておく。
【０２５０】
インキュベーション後、任意の好適な酸を加えることにより、Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＴＦＦ１中間体のｐＨを降下させ得る。一部の実施形態では、１Ｍグリシン、ｐＨ２．５を加えて３．５±０．１の目標ｐＨを達成する。一部の実施形態において、目標ｐＨはｐＨ３．０〜４．０、約ｐＨ３．３〜３．７、約ｐＨ３．４〜３．６又は約ｐＨ３．５である。ｐＨが許容範囲内になったら、溶液を任意のサイズのフィルタに通過させ得る。例示的実施形態において、デプスフィルタ（例えば、Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ  ＰＯＤ）、それと直列の０．４５μｍフィルタ（例えば、Ｏｐｔｉｃａｐ  ＸＬ１０  Ｄｕｒａｐｏｒｅフィルタ）又は０．８／０．４５μｍ  ＰＥＳフィルタが使用される。
【０２５１】
２．陽イオン交換クロマトグラフィー
様々な実施形態において、陽イオン交換（ＣＥＸ）捕捉クロマトグラフィーステップを用いて、例えば、ウイルスカプシドが宿主細胞タンパク質、宿主細胞ＤＮＡ、宿主細胞脂質、Ｔｗｅｅｎ  ２０及び他の工程関連不純物と分離される。陽イオン交換クロマトグラフィーの原理は、当技術分野において周知であるが、簡潔に言えば、この方法は、単離しようとする正電荷粒子と使用される負電荷樹脂との間の電荷間相互作用に頼るものである。一般に、初めにｐＨ及び伝導性が安定するまで数ダイアボリュームの緩衝液を流すことによりカラムを平衡化させる。次にサンプルをロードし、ローディング緩衝液でカラムを洗浄する。最後に、溶出緩衝液を使用してカラムから目的のサンプルを溶出させ、サンプルを含有する画分を収集する。目的のサンプルの存在は、溶出液の吸光度測定によって検出することができる。
【０２５２】
一実施形態において、ＣＥＸステップには、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ  Ｓ０３−８０００先端複合材料カラム（スルホニル）（２μｍ細径）クロマトグラフィーカラムが利用される。一実施形態において、溶出ピークは、ＯＤ２８０における急激な上昇から開始して収集される。ＯＤ２８０は、伝導性が８０〜８５ｍＳ／ｃｍになると上昇し始め得る。ＣＥＸ溶出物は常法どおり収集され得、２画分で収集され得る。一実施形態において、第１の画分はＯＤ２８０における急激な上昇から開始され、１．５コレクション容積（ＣＶ）が収集される。別の実施形態において、第２の画分は第１の画分の直後に開始され、１．０ＣＶが収集される。これらの２つの画分がプールされ、次にｐＨ８．０±０．３０に中和される。一実施形態において、中和緩衝液は、２０℃の１．０Ｍ  トリス、ｐＨ９．１±０．１を含む。
【０２５３】
３．タンジェンシャルフローろ過２
一部の実施形態では、濃縮、タンパク質不純物の除去及び続くＣｓＣｌ超遠心ステップに適切な緩衝液への緩衝液交換のため、タンジェンシャルフローろ過ステップ（ＴＦＦ２）が用いられる。任意の好適なＴＦＦ膜を使用し得る。ある実施形態において、ＴＦＦ２ステップには、３００ｋＤ  ＭＷＣＯ再生セルロース膜が利用される。
【０２５４】
一部の実施形態において、このステップの濃縮相は、ＣＥＸ溶出物の容積が減少するように設計される。一実施形態では、保持液がダイアフィルトレーション緩衝液で２倍希釈され、保持液がその初期容積まで濃縮される。一実施形態では、ダイアフィルトレーション緩衝液は、２０ｍＭトリス、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％ポロキサマー１８８、１％ショ糖を含有するｐＨ８．１±０．１、２０℃のＴＦＦ２  ＮａＣｌダイアフィルトレーション緩衝液である。かかる実施形態において、この工程は、新しい緩衝液によるダイアフィルトレーションが完了するまで繰り返され得る。一実施形態では、保持液がＣｓＣｌ含有ダイアフィルトレーション緩衝液で２倍希釈され、保持液がその初期容積まで濃縮される。ある実施形態では、ＣｓＣｌ含有ダイアフィルトレーション緩衝液は、２０ｍＭトリス、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３Ｍ  ＣｓＣｌ、０．２％ポロキサマー１８８を含有するｐＨ８．１±０．１、２０℃のＴＦＦ２  ＣｓＣｌダイアフィルトレーション緩衝液である。かかる実施形態において、この工程は、新しい緩衝液によるダイアフィルトレーションが完了するまで繰り返され得る。ＣｓＣｌダイアフィルトレーションの完了後、次に保持液は、システムのホールドアップ容積に依存する規定の容積まで濃縮され得る。一部の実施形態において、ＴＦＦ２システムからの産物回収率を最大化するため、膜のリンス、例えば２回の連続的なリンスが実行される。
【０２５５】
４．ＣｓＣｌ超遠心
インビボ遺伝子形質導入にＡＡＶが使用される一部の実施形態において、ｒＡＡＶの最終産物は不純物及び空の粒子を最小限のみ含有する。ＡＡＶベクターの２つの精製方法は、イオジキサノール勾配又はＣｓＣｌ勾配のいずれかを用いた超遠心である。これらの２つの方法を比較する一研究では、ＣｓＣｌと比較してイオジキサノールではより高いベクター純度のＡＡＶベクターが得られたが、空のウイルスカプシドがより多かったことが実証された。Ｓｔｒｏｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｅｓｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ−ａｎｄ  Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ−Ｂａｓｅｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．”Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２６（４）：１４７−１５７。ＣｓＣｌの使用が空のウイルスカプシド量の低下につながるとしても、ＣｓＣｌは細胞にとって毒性であり得ると共に、残留ＣｓＣｌの除去に複数回の精製ステップが必要となり得るため、イオジキサノール（約１日）のようなより短時間の方法と比較して長い工程所要時間（約３．５日）につながり得る。別の研究では、残留ＣｓＣｌを除去するためのステップの多さにより、高頻度でｒＡＡＶの劇的な損失が生じて低い収率及び回収率につながり、多くの場合にこの方法の他の利益が打ち消されることが示されている。Ｈｅｒｍｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  ｂｙ  Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ  Ａｌｌｏｗｓ  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｔｏｃｋｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ．”Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１０：１８８５−１８９１。更に、これらの２つの方法は実験室では前臨床サンプルの作製に上手く機能するが、これらには規模拡張性がなく、従って市販用製品の大規模産生には好適でない。例えば、Ｔｏｍｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  １（ｒＡＡＶ１）．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，３：１５０５８を参照されたい（「塩化セシウム（ＣｓＣｌ）又はイオジキサノール密度超遠心法を用いた精製方法は大規模産生には好適でない」）。
【０２５６】
一部の実施形態において、例えば空のカプシドを完全なカプシドと分離するため、超遠心ステップが用いられる。予想外にも、本明細書に開示されるＣｓＣｌ超遠心方法は規模拡張性があり、精製ＡＡＶベクターの大規模産生に好適であった。超遠心は分析的超遠心によって実施され得、勾配緩衝液の使用を伴い得る。勾配緩衝液の例としては、限定はされないが、ＣｓＣｌ、ショ糖、イオジキサノール及び当技術分野において公知の他のものが挙げられる。遠心は、所望のｇ力に達する能力を有する任意の遠心機、例えば、タイプ５０．２  Ｔｉロータ又は均等なロータを備えた自動Ｏｐｔｉｍａ  ＸＰＮ  １００超遠心システム又は均等なシステムで実施することができる。超遠心後、空のカプシドと完全なカプシドとがチューブ内で異なるバンドに分かれ、特異的バンドから材料を抜き取ることによってこれを抽出し得る。一部の実施形態において、ＴＦＦ２精製後のろ過済み材料が２４１，６００〜３０２，０００ｇ（５０．２  Ｔｉロータにおける約４０，０００〜５０，０００ｒｐｍ）で遠心される。一部の実施形態において、ＴＦＦ２精製後のろ過済み材料が一晩遠心される。一部の実施形態において、ＴＦＦ２精製後のろ過済み材料が１６〜２４時間遠心される。一部の実施形態において、ＴＦＦ２精製後のろ過済み材料が２０〜２４時間遠心される。一部の実施形態において、ＴＦＦ２精製後のろ過済み材料が１５〜２５℃で遠心される。ある実施形態において、ＴＦＦ２精製後のろ過済み材料が３０２，０００ｇ（５０．２  Ｔｉロータにおける５０，０００ｒｐｍ）で２０℃において１７時間遠心される。一部の実施形態において、ＣｓＣｌ遠心用の緩衝液は、以下の成分であって、（ａ）ＣｓＣｌを含み、（ｂ）ＭｇＣｌ２、（ｃ）ポロキサマー１８８及び（ｄ）トリスの１つ以上を更に含む成分うちの１つ以上を有し得る。一部の実施形態において、ＣｓＣｌ用の緩衝液は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の全てを含み得る。一部の実施形態において、ＣｓＣｌ用の緩衝液はｐＨ７．５〜８．５又はｐＨ７．９〜８．２である。ある実施形態において、ＣｓＣｌ遠心に好適な緩衝液は、２０ｍＭトリス、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３Ｍ  ＣｓＣｌ、０．２％ポロキサマー１８８、ｐＨ８．１±０．１０である。遠心ステップの完了後、超遠心機からチューブが取り出され得る。一部の実施形態において、一番上のバンド、バンドＡが、空のカプシドを含有する。一部の実施形態において、上から二番目以降のバンド、バンドＢ、Ｃ及びＤが完全なカプシドダブレットバンドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターはシリンジを使用して収集される。ある実施形態において、バンドＢ、Ｃ及びＤは、３０ｍＬシリンジに取り付けられた１８Ｇ針をバンドＤのほんの少し下からチューブの中央まで挿入することによって取り出される。他の実施形態（ｅｍｂｏｄｉｅｍｅｎｔｓ）において、当技術分野において公知の及び／又は本明細書に記載されるとおりの技法を用いてバンドが完全なカプシド又は空のカプシドの存在に関してアッセイされ得、且つ完全なカプシドを含有するバンドが収集され得る。
【０２５７】
空のウイルスカプシドと空でないウイルスカプシドとの比は、標準的な実験技法によって測定することができる。一部の実施形態において、測定は吸光度測定によって行われる。一部の実施形態において、測定はＵＶ吸光度測定によって行われる。一部の実施形態において、カプシドタンパク質の総量及びＤＮＡの総量は、ＵＶ吸光度測定から決定することができる。一部の実施形態において、測定は光屈折率測定によって行われる。一部の他の実施形態において、測定は分析的超遠心法によって行われる。
【０２５８】
一実施形態において、超遠心後に収集されるＡＡＶウイルスベクターは、空のカプシドを８％未満、空のカプシドを７％未満、５％未満、３％未満又は１％未満有する。一実施形態において、超遠心後に収集されるＡＡＶウイルスベクターは空のカプシドを１〜１０％有する。一実施形態において、超遠心後に収集されるＡＡＶウイルスベクターは空のカプシドを２〜８％有する。一実施形態において、空のカプシドの数は検出限界を下回る。別の実施形態において、空のカプシドの割合は、全カプシドに対する割合として決定される。
【０２５９】
５．タンジェンシャルフローろ過３によるろ過済み原薬の生成
一部の実施形態では、ＣｓＣｌの除去及び完全なベクターカプシドの濃縮のため、タンジェンシャルフローろ過ステップ（ＴＦＦ３）が用いられる。タンジェンシャルフローろ過は、好適な膜を使用して実施し得る。一実施形態において、３００ｋＤａ  ＭＷＣＯ再生セルロース膜が使用される。膜によってベクターカプシドが保持され得る。ＴＦＦ３作業の濃縮相は、残留ＣｓＣｌの濃度及び超遠心プールの容積が減少するように設計され得る。一部の実施形態において、目標保持液容積に達した後、ダイアフィルトレーションが開始される。保持液のダイアフィルトレーションは、最大１０ダイアボリュームの好適なＴＦＦ３緩衝液で行われる。一実施形態において、好適なＴＦＦ３緩衝液は、以下の成分であって、（ａ）トリス、（ｂ）ＭｇＣｌ２、（ｃ）ＮａＣｌ、又は（ｄ）ポロキサマー１８８を含む成分の１つ以上を含み得る。一実施形態において、好適なＴＦＦ３緩衝液は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の全てを含み得る。一実施形態において、ＴＦＦ３緩衝液はｐＨ７．５〜８．５、ｐＨ７．７〜８．３又はｐＨ８．０である。ある実施形態において、好適なＴＦＦ３緩衝液は、２０℃の２０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ポロキサマー１８８、ｐＨ８．０±０．１を含む。別の実施形態において、好適なＴＦＦ３緩衝液は、２０℃の２０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％ポロキサマー１８８、ｐＨ８．０±０．１を含む。一実施形態において、濃縮された保持液を０．２μｍ  Ｐａｌｌ  Ｓｕｐｏｒ（登録商標）ＥＫＶ滅菌用グレードフィルタ（Ｍｉｎｉ  Ｋｌｅｅｎｐａｋ）フィルタを使用してろ過すると、ろ過済み原薬が産生される。一部の実施形態において、本明細書に記載される方法では、製造バッチ当たり５×１０１５ｖｇ超、又は８×１０１５ｖｇ超、又は１×１０１６ｖｇ超のｒＡＡＶが得られる。
【０２６０】
医薬組成物
本明細書に開示される方法により精製されるウイルス（例えばＡＡＶ）粒子は、ヒト対象に投与することができる十分な純度において高収率で産生され得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子を含む医薬組成物の効力は、本明細書に記載されるインビトロ細胞ベース効力アッセイを用いてアッセイされる。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、約１〜８×１０１３ウイルスベクターゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）又は約１．７〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬの濃度で製剤化される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、約１．９〜２．１×１０１３ｖｇ／ｍＬの濃度で製剤化される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、約２．０×１０１３ｖｇ／ｍＬの濃度で製剤化される。
【０２６１】
一部の実施形態では、ウイルスベクターの産生工程において、核酸材料を含有しない空のウイルスカプシドが生成され得る。低量の空のウイルスカプシドを含む医薬組成物（ｐｈａｒｍａｃｕｅｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、未成熟な免疫系を有する患者、例えば乳児が、治療利益なしに不必要に抗原性物質（空のカプシド、宿主細胞タンパク質、宿主細胞ＤＮＡ）に曝露されることを回避するため有利であり得る。一部の実施形態において、かかる医薬組成物は、インフュージョンリアクション又は広域免疫応答の可能性を低減し得ると共に、治療有効性を改善し得る。ゲノム材料を有する完全なウイルスカプシドと比較すると、空のカプシドは密度が異なるため、これらの２つの種は勾配遠心法又は当技術分野において公知の他の方法によって分離することが可能である。一部の実施形態において、空のカプシドは超遠心法によって分離される。一部の実施形態において、空のカプシドはＣｓＣｌ勾配超遠心法によって分離される。他の実施形態において、空のカプシドはイオジキサノール勾配超遠心法によって分離される。一部の実施形態において、空のカプシドはショ糖勾配超遠心法によって分離される。
【０２６２】
空のウイルスカプシドと空でないウイルスカプシドとの比は、標準的な実験技法によって測定することができる。一部の実施形態において、比は吸光度測定によって測定される。一部の実施形態において、比はＵＶ吸光度測定によって測定される。一部の実施形態において、カプシドタンパク質の総量及びＤＮＡの総量はＵＶ吸光度測定によって決定することができる。一部の実施形態において、測定は光屈折率測定によって決定される。一部の他の実施形態において、測定は分析的超遠心法によって決定される。
【０２６３】
高レベルの空のカプシドは、ウイルスベクター治療の有効性に難題を突きつけ得る。一実施形態において、医薬組成物は、１０％未満の空のカプシド、８％未満の空のカプシド、７％未満、約５％未満、３％未満、１％未満の空のカプシドを有する。別の実施形態において、医薬組成物は１〜１０％の空のカプシドを有する。別の実施形態において、医薬組成物は２〜８％の空のカプシドを有する。別の実施形態において、医薬組成物は、６％以下の空のカプシド、５％の空のカプシド、４％の空のカプシド、３％の空のカプシド、２％の空のカプシド又はそれ未満を有する。ある実施形態において、空のカプシドの数は検出限界を下回る。別の実施形態において、空のカプシドの割合は、全カプシドに対する割合として、例えばＡＵＣを用いて決定される。一部の実施形態において、空のカプシドがこのように低い割合であることにより、例えば、より高い割合の空のカプシドを有する組成物と比較したとき、患者への投与後の治療の有効性が改善され、且つ／又は有害事象（例えば、炎症反応、肝傷害）が減少する。一部の実施形態において、本明細書に開示されるウイルスベクターの調製方法は、先行方法、例えば、接着細胞及び／又は本明細書に記載される精製方法を使用しないもののレベルと比較したとき、これらの改善された空のカプシド割合をもたらす。
【０２６４】
ウイルスベクターの産生工程において、ウイルスベクターの生成に使用される接着細胞（例えばＨＥＫ２９３細胞）からの残留タンパク質は、完全に分離して取り除くことはできない可能性もある。残留宿主細胞タンパク質には、免疫応答を誘発する恐れがある。残留宿主細胞の量は、ウイルスカプシドタンパク質と残留宿主細胞タンパク質とを区別できる任意の標準的な実験技法によって測定することができる。一部の実施形態において、残留宿主細胞タンパク質の量は、サイズ排除又はイオン交換クロマトグラフィーによって測定することができる。一部の実施形態において、測定は、親細胞特異抗体を用いたウエスタンブロットによって行うことができる。一実施形態において、残留宿主細胞タンパク質の量は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定することができる。一部の実施形態において、残留宿主細胞タンパク質の量は市販のＥＬＩＳＡキットによって測定することができる。一部の実施形態において、残留宿主細胞タンパク質の量は、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＨＥＫ２９３  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡキットによって測定することができる。
【０２６５】
別の実施形態において、前記医薬組成物中の残留宿主細胞タンパク質は、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり５×１０６ｐｇ／ｍｌ以下、１×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり１．２×１０６ｐｇ／ｍｌ以下又は１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１×１０５ｐｇ／ｍｌ〜１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．２×１０６ｐｇ／ｍｌ又は１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり４０ｎｇ／ｍｌ以下である。ある実施形態において、医薬組成物は、１．０×１０１３ｖｇ当たり５、４、３、２、１ｎｇ以下又はそれより少ない残留宿主細胞タンパク質を含む。一実施形態において、医薬組成物は、１．０×１０１３ｖｇ当たり４ｎｇ以下の残留宿主細胞タンパク質を含む。
【０２６６】
ウイルスベクターの産生工程において、接着細胞（例えばＨＥＫ２９３細胞）からの残留宿主細胞ＤＮＡ又はウイルスベクターの生成のためにトランスフェクトされた残留プラスミドＤＮＡは、完全には除去できない可能性もある。精製工程（例えば、酸性化、清澄化、タンジェンシャルフローろ過等）では、バルクの残留宿主細胞又はプラスミドＤＮＡが除去される。一実施形態において、残留宿主細胞又はプラスミドＤＮＡの量の測定は、ＰＣＲによって実施される。別の実施形態において、残留宿主細胞又はプラスミドＤＮＡの量の測定は、宿主細胞又はプラスミド配列に特異的なプライマーによる定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって実施される。別の実施形態において、残留宿主細胞又はプラスミドＤＮＡの量の測定は、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって実施される。一実施形態において、プラスミドＤＮＡの量は、プラスミドのカナマイシン耐性遺伝子領域に特異的なプライマーによるｑＰＣＲアッセイを用いて決定される。別の実施形態において、残留宿主細胞ＤＮＡの量は、市販のｑＰＣＲアッセイキット、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによるｒｅｓＤＮＡＳＥＱ（登録商標）ヒト残留ＤＮＡ定量化キット、Ｂｉｏｒａｄによる残留ＤＮＡ定量化スーパーミックス又は任意の均等な製品により決定される。残留宿主細胞又はプラスミドＤＮＡの量を低減すると、治療転帰（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｕｔｃｏｍｏｅｓ）を改善することができ、本明細書に開示される治療における使用のためにかかる組成物が精製及び／又は選択され得る。
【０２６７】
ある実施形態において、前記医薬組成物中の残留宿主細胞ＤＮＡは、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．７×１０６ｐｇ／ｍｌ以下、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１×１０５ｐｇ／ｍｌ〜１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．２×１０６ｐｇ／ｍｌである。ある実施形態において、前記医薬組成物中の残留宿主細胞ＤＮＡは、１．０×１０１３ｖｇ当たり３×１０５、２×１０５、１．１×１０５、１×１０５ｐｇ以下であるか又はそれより少ない。実施形態において、前記医薬組成物中の残留宿主細胞ＤＮＡは１．０×１０１３ｖｇ当たり１．１×１０５ｐｇ以下である。
【０２６８】
別の実施形態において、前記医薬組成物中の残留プラスミドＤＮＡは、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．７×１０６ｐｇ／ｍｌ以下、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１×１０５ｐｇ／ｍｌ〜１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．７×１０６ｐｇ／ｍｌである。別の実施形態において、前記医薬組成物中の残留プラスミドＤＮＡは１．０×１０１３ｖｇ当たり６．８×１０５ｐｇ以下である。
【０２６９】
ある実施形態において、医薬組成物中の残留宿主細胞ＤＮＡは１．０×１０１３ｖｇ当たり１．１×１０５ｐｇ以下であり、且つ前記医薬組成物中の残留プラスミドＤＮＡは、１．０×１０１３ｖｇ当たり６．８×１０５ｐｇ以下である。
【０２７０】
ある実施形態において、医薬組成物中の残留宿主細胞ＤＮＡは１．０×１０１３ｖｇ当たり１．１×１０５ｐｇ以下であり、且つ前記医薬組成物中の残留プラスミドＤＮＡは１．０×１０１３ｖｇ当たり６．８×１０５ｐｇ以下であり、且つ前記医薬組成物中の残留宿主細胞タンパク質は１．０×１０１３ｖｇ当たり４ｎｇ以下である。
【０２７１】
一部の実施形態において、医薬組成物中のエンドトキシンの量は、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約１ＥＵ／ｍＬ未満、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約０．７５ＥＵ／ｍＬ未満、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約０．５ＥＵ／ｍＬ未満、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約０．４ＥＵ／ｍＬ未満、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約０．３５ＥＵ／ｍＬ未満、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約０．３ＥＵ／ｍＬ未満、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約０．２５ＥＵ／ｍＬ未満、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約０．２ＥＵ／ｍＬ未満、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約０．１５ＥＵ／ｍＬ未満、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約０．１ＥＵ／ｍＬ未満、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約０．０５ＥＵ／ｍＬ未満又は１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約０．０２ＥＵ／ｍＬ未満である。エンドトキシンの量の決定方法は、例えばリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）試験など、当技術分野において公知である。実施形態において、エンドトキシンは、米国薬局方（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉｅａ）（「ＵＳＰ」）＜８５＞（全体として参照により本明細書に援用される）に従いアッセイされる。
【０２７２】
一実施形態において、医薬組成物中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．５ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．３ｎｇ未満又は１．０×１０１３ｖｇ当たり０．２２ｎｇ未満である。一実施形態において、前記医薬組成物中のベンゾナーゼは、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．２ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．１ｎｇ未満又は１．０×１０１３ｖｇ当たり０．０９ｎｇ未満である。
【０２７３】
一実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、以下の１つ以上を含む：１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．０９ｎｇ未満のベンゾナーゼ、約３０μｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満のセシウム、約２０〜８０ｐｐｍのポロキサマー１８８、１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．２２ｎｇ未満のＢＳＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり約６．８×１０５ｐｇ未満の残留プラスミドＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり約１．１×１０５ｐｇ未満の残留ｈｃＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり約４ｎｇ未満のｒＨＣＰ、ｐＨ７．７〜８．３、約３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、容器当たり約６００個未満の≧２５μｍサイズの粒子、容器当たり約６０００個未満の≧１０μｍサイズの粒子、約１．７×１０１３〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価、１．０×１０１３ｖｇ当たり約３．９×１０８〜８．４×１０１０ＩＵの感染力価、１．０×１０１３ｖｇ当たり約１００〜３００μｇの全タンパク質、約７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ用量のウイルスベクターによるΔ７ＳＭＡマウスの≧２４日の生存期間中央値、インビトロ細胞ベースアッセイに基づく約７０〜１３０％の相対効力及び／又は約５％未満の空のカプシド。
【０２７４】
一実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、以下の１つ以上、例えば全てを含む：ｐＨ７．７〜８．３（例えば、ＵＳＰ＜７９１＞により測定したとき）、約３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ（例えば、ＵＳＰ＜７８５＞により測定したとき）、容器当たり約６００個未満の≧２５μｍサイズの粒子（例えば、ＵＳＰ＜７８７＞により測定したとき）、容器当たり約６０００個未満の≧１０μｍサイズの粒子（例えば、ＵＳＰ＜７８７＞により測定したとき）、約１．７×１０１３〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価、１．０×１０１３ｖｇ当たり約３．９×１０８〜８．４×１０１０ＩＵの感染力価、１．０×１０１３ｖｇ当たり約１００〜３００μｇの全タンパク質、例えば本明細書に記載されるとおりの例えばインビボ機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｉｙ）試験において、約７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ用量のウイルスベクターによるΔ７ＳＭＡマウスの≧２４日の生存期間中央値、インビトロ細胞ベースアッセイに基づく約７０〜１３０％の相対効力及び／又は約５％未満の空のカプシド。実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、９５％以上の総純度を含む（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定したとき）。実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、非単一不特定関連不純物を２％超のレベルで含む（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定したとき）。実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、０．７５ＥＵ／ｍＬ以下のエンドトキシンレベルを含む。実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、無菌性試験で増殖がないとの試験結果が出る。
【０２７５】
高レベルの残留宿主細胞タンパク質、宿主細胞ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ及び／又はエンドトキシンは、ウイルスベクター治療の有効性に難題を突きつけ得る。一部の実施形態において、残留宿主細胞タンパク質、宿主細胞ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ及び／又はエンドトキシンがこのように低量（ｌｏｗ  ａｍｏｕｎｓ）であることにより、例えばより高量を有する組成物と比較したとき、患者への投与後の治療の有効性が改善され、且つ／又は有害事象（例えば、炎症反応、肝傷害）が減少する。一部の実施形態において、本明細書に開示されるウイルスベクターの調製方法は、先行方法、例えば、接着細胞及び／又は本明細書に記載される精製方法を使用しないもののレベルと比較したとき、これらの改善されたレベルをもたらす。一部の実施形態において、本明細書における方法は、低量（ｌｏｗ  ａｍｏｕｎｓ）の残留宿主細胞タンパク質、宿主細胞ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ及び／又はエンドトキシンに加えて、空のカプシドの割合が低下したウイルスベクターの調製も可能にする。
【０２７６】
一部の実施形態において、ＴＦＦ後、例えば第２のＴＦＦ後の残留セシウムの量は約５０μｇ／ｇを下回る。一部の実施形態において、ＴＦＦ後、例えば第２のＴＦＦ後の残留セシウムの量は約３０μｇ／ｇを下回る。一部の実施形態において、ＴＦＦ後、例えば第２のＴＦＦ後の残留セシウムの量は約２０μｇ／ｇを下回る。一部の実施形態において、医薬組成物中の残留セシウムは３０μｇ／ｇ（ｐｐｍ）以下である。一部の実施形態において、残留ＣｓＣｌの量は、質量分析法、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）及び／又は別の好適な方法によって測定され得る。一部の実施形態において、第２のＴＦＦ後の残留セシウムの量は、例えばＩＣＰ−ＭＳを用いて、定量限界を下回る。
【０２７７】
一部の実施形態において、第２のＴＦＦ後に収集されるＡＡＶウイルスベクターの濃度は、約５×１０１２ｖｇ／ｍｌ以上、約１×１０１３ｖｇ／ｍｌ以上又は約３×１０１３ｖｇ／ｍｌ以上である。
【０２７８】
一実施形態において、本医薬組成物は、以下の１つ以上を有する：１．０×１０１３ｖｇ当たり０．０９ｎｇ未満のベンゾナーゼ、３０μｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満のセシウム、約２０〜８０ｐｐｍのポロキサマー１８８、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．２２ｎｇ未満のＢＳＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり６．８×１０５ｐｇ未満の残留プラスミドＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり１．１×１０５ｐｇ未満の残留ｈｃＤＮＡ及び１．０×１０１３ｖｇ当たり４ｎｇ未満のｒＨＣＰ。
【０２７９】
一部の実施形態において、医薬組成物の効力は、本明細書に記載されるインビトロ細胞ベース効力アッセイを用いて測定される。一部の実施形態において、本医薬組成物はウイルスベクターを含み、ここで、ウイルスベクターの相対効力は、参照標準品と比べて少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％又は少なくとも１４０％である。一部の実施形態において、本医薬組成物はウイルスベクターを含み、ここで、ウイルスベクターの相対効力は、参照標準品と比べて少なくとも９０％である。
【０２８０】
本開示により精製されたウイルス粒子（ｖｉｒｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）（例えば、ウイルス粒子（ｖｉｒａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ））を公知の方法により製剤化して、薬学的に有用な組成物を調製することができる。本開示の組成物は、当技術分野において公知の技法を用いて、哺乳類対象、例えばヒトへの投与用に製剤化することができる。詳細には送達系は、筋肉内、皮内、粘膜、皮下、静脈内、髄腔内、注射用デポー型装置又は局所投与用に製剤化され得る。
【０２８１】
送達系が溶液又は懸濁液として製剤化されるとき、送達系は許容可能な担体中、例えば水性担体中にある。例えば、水、緩衝用水、０．８％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸など、種々の水性担体を使用し得る。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法によって滅菌され得るか又は滅菌ろ過され得る。結果として生じる水性溶液は、そのまま使用するために包装され得るか又は凍結乾燥され得、ここで、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌溶液と組み合わされる。
【０２８２】
組成物、例えば医薬組成物は、生理的条件を近似するため、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン等、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤などの薬学的に許容可能な補助物質を含有し得る。一部の実施形態において、医薬組成物は保存剤を含む。一部の他の実施形態において、医薬組成物は保存剤を含まない。
【０２８３】
ウイルスベクター、例えば、本明細書に開示される組成物及び製剤中にあるウイルスベクターのゲノム力価は、幾つもの標準的な方法で決定することができる。ウイルスベクターに特異的なプライマーによるＰＣＲは相対測定を提供できるが、より少量のサンプル及び絶対測定には定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が用いられ得る。ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）は、水−油エマルション滴技術をベースとするデジタルＰＣＲの実施方法である。サンプルが数万個の液滴に分割され、各個別の液滴で鋳型分子のＰＣＲ増幅が行われる。検量線を作成するか、又は高い増幅効率のプライマーを有する必要がないため、ｄｄＰＣＲは典型的には、従来のＰＣＲベースの技法ほど多くのサンプルを使用しない。一実施形態において、ウイルスベクターのゲノム力価はＰＣＲを用いて決定される。別の実施形態において、ウイルスベクターのゲノム力価はｑＰＣＲを用いて決定される。別の実施形態において、ウイルスベクターのゲノム力価はｄｄＰＣを用いて決定される。ｄｄＰＣＲを用いたウイルスゲノム力価の決定方法については、例えば、Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ａｎｄ  Ｓｅｌｆ−Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｔｉｔｅｒｓ  ｂｙ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ，”Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５（２）：１１５−１２５に記載されている。
【０２８４】
一部の実施形態において、ＰＣＲベースの方法は、ＳＭＮ遺伝子を標的とする特異的に設計されたプライマー及びプローブを使用してカプシド化ＡＡＶ９ウイルスゲノムを検出及び定量化する。他の実施形態において、ＰＣＲベースの方法は、ニワトリβ−アクチンプロモーターを標的とする特異的に設計されたプライマー及びプローブを使用してカプシド化ＡＡＶ９ウイルスゲノムを検出及び定量化する。他の実施形態において、ＰＣＲベースの方法は、ＣＭＶエンハンサーを標的とする特異的に設計されたプライマー及びプローブを使用してカプシド化ＡＡＶ９ウイルスゲノムを検出及び定量化する。他の実施形態において、ＰＣＲベースの方法は、ＩＴＲ配列を標的とする特異的に設計されたプライマー及びプローブを使用してカプシド化ＡＡＶ９ウイルスゲノムを検出及び定量化する。他の実施形態において、ＰＣＲベースの方法は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを標的とする特異的に設計されたプライマー及びプローブを使用してカプシド化ＡＡＶ９ウイルスゲノムを検出及び定量化する。
【０２８５】
一部の実施形態において、本医薬組成物は約ｐＨ７．７〜８．３であり、３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。一部の実施形態において、ｐＨは、ｐＨメーターを使用して測定される。一部の実施形態において、ｐＨは、米国薬局方（ＵＳＰ）、例えば＜７９１＞（全体として参照により援用される）による標準セットに基づいて温度補償付きマイクロ電極を使用して電位差測定法で測定される。一部の実施形態において、オスモル濃度は、ＵＳＰ、例えばＵＳＰ＜７８５＞（全体として参照により援用される）に基づいて凝固点降下法を用いて測定される。一部の実施形態において、オスモル濃度は、蒸気圧降下浸透圧計を使用して測定される。他の実施形態において、オスモル濃度は、膜浸透圧計を使用して測定される。
【０２８６】
一実施形態において、静脈内製剤は、７．５〜８．５のｐＨ、２×１０１３ｖｇ／ｍｌ〜６×１０１３ｖｇ／ｍｌのゲノム力価及び３８４〜４４８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。別の実施形態において、静脈内製剤は、７．５〜８．５のｐＨ、１．５×１０１３ｖｇ／ｍｌ〜３．５×１０１３ｖｇ／ｍｌのゲノム力価及び３８４〜４４８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。別の実施形態において、静脈内製剤は、７．５〜８．５のｐＨ、１．８×１０１３ｖｇ／ｍｌ〜２．２×１０１３ｖｇ／ｍｌのゲノム力価及び３８４〜４４８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。ある実施形態において、ＩＶ製剤は約０．１〜２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む。ある実施形態において、ＩＶ製剤は約１００〜３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む。ある実施形態において、ＩＶ製剤は約０．００１％〜０．０１％ｗ／ｖポロキサマー１８８を含む。ある実施形態において、ＩＶ製剤は、例えば７．５〜８．５のｐＨの、１０〜３０ｍＭトリス緩衝液中の水性製剤である。
【０２８７】
ある実施形態において、ＩＶ製剤は、ｐＨ８．０の２０ｍＭトリス緩衝液中、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％ｗ／ｖポロキサマー１８８を含む。実施形態において、ＩＶ製剤は、約１×１０１３〜３×１０１３ｖｇ／ｍＬ又は１．７×１０１３〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価を含む。
【０２８８】
医薬組成物の使用
本開示は、トランス遺伝子を含むウイルスベクターを含む療法でそれを必要としている患者を治療する方法を提供し、本方法は、本明細書に記載されるインビトロ細胞ベース効力アッセイ方法により、トランス遺伝子を含む前記ウイルスベクターをアッセイすること及びトランス遺伝子を含むウイルスベクターを前記患者に投与することを含む。一部の実施形態において、ウイルスベクターは医薬組成物に製剤化される。
【０２８９】
他の実施形態において、本明細書には、ポリヌクレオチドを含むゲノムを有するｒＡＡＶ９を投与することを含む、患者の中枢神経系へのポリヌクレオチドの送達方法が開示される。一部の実施形態において、送達は、ポリヌクレオチドを含むゲノムを有するｒＡＡＶ９を投与することを含む、患者の中枢神経系へのポリヌクレオチドの髄腔内送達である。一部の実施形態において、非イオン性低浸透圧性造影剤も患者に投与される。非イオン性低浸透圧性造影剤は、患者の中枢神経系において標的細胞の形質導入を増加させる。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ９ゲノムは自己相補的ゲノムである。他の実施形態において、ｒＡＡＶ９ゲノムは一本鎖ゲノムである。
【０２９０】
一部の実施形態において、非イオン性低浸透圧性造影剤も患者に投与される。より具体的には、本発明は、それを必要としている患者の中枢神経系にベクターを送達する方法であって、患者へのｒＡＡＶ９及び非イオン性低浸透圧性造影剤の髄腔内送達を含む方法を提供し、ここで、ｒＡＡＶ９は、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、目的タンパク質はＳＭＮ１である。ポリヌクレオチドは、例えば、脳、脊髄、グリア細胞、アストロサイト及び／又は下位運動ニューロンに送達される。非イオン性低浸透圧性造影剤は、例えば、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソール又はイオキシランである。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは生存運動ニューロン（ＳＭＮ）ポリヌクレオチドである。例示的イオヘキソール放射線不透過性薬剤は、［Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ（商標）（イオヘキソール、Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ジヒドロキシプロピル）−５−［Ｎ（２，３−ジヒドロキシプロピル）−アセトアミド］−２，４，６−−トリヨード−イソフタルアミド）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｗａｕｋｅｓｈａ、Ｗｉｓ．］を含む。一部の実施形態において、ベクター及び造影剤は髄腔内投与され、リアルタイム連続蛍光透視で髄腔内での広がりが記録される。
【０２９１】
一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは脳領域に送達される。送達に企図される脳の部位としては、限定はされないが、運動皮質及び脳幹が挙げられる。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは脊髄に送達される。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは下位運動ニューロンに送達される。本開示の実施形態は、ｒＡＡＶ９を利用してポリヌクレオチドを神経及びグリア細胞に送達する。一部の実施形態において、グリア細胞は、ミクログリア細胞、オリゴデンドロサイト又はアストロサイトである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ９を使用してポリヌクレオチドがシュワン細胞に送達される。
【０２９２】
一部の実施形態において、本方法及び材料の使用は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の治療に適応される。
【０２９３】
ＳＭＡには４種類あり、これらは従来、発症年齢及び最も高い獲得運動機能によって分類されている。いずれの形態のＳＭＡも、常染色体劣性遺伝であり、生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）遺伝子の突然変異によって引き起こされる。ヒトは、ＳＭＮ２と呼ばれるＳＭＮ遺伝子の第２のほぼ同一のコピーも保有する。Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  ｅｔ  ａｌ．“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｅ．”Ｃｅｌｌ，８０（１）：１５５−６５。Ｍｏｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．“Ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ：ａ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ａ  ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ａ  ｍｏｔｏｒ−ｎｅｕｒｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．”Ｎｅｕｒｏｎ，４８（６）：８８５−８９６。ＳＭＮ１及びＳＭＮ２遺伝子は、両方ともＳＭＮタンパク質を発現するが、ＳＭＮ２は、エクソン７に翻訳的にサイレントな突然変異を含み、これがＳＭＮ２転写物におけるエクソン７の取込みを非効率にする。従って、ＳＭＮ２は、完全長ＳＭＮタンパク質及びエクソン７を欠くトランケート型のＳＭＮの両方を、トランケート型を優勢型として産生する。結果として、ＳＭＮ２によって産生される機能性完全長タンパク質の量は、ＳＭＮ１によって産生される量と比べてはるかに（７０〜９０％だけ）少ない。Ｌｏｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＳＭＮ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ．”ＰＮＡＳ，９６（１１）６３０７−６３１１。Ｍｏｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，“Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ａｌｔｅｒｓ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ  ｔｈｅ  ＳＭＡ  ｇｅｎｅ  ＳＭＮ１  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｏｐｙ  ｇｅｎｅ  ＳＭＮ２．”Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ８（７）：１１７７−１１８３。ＳＭＮ２はＳＭＮ１遺伝子の損失を完全に補償することはできないが、軽症型のＳＭＡの患者は、概して、ＳＭＮ２コピー数がより高い。Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ａｎｄ  ＳＭＮ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｅｖｅｌ  ｉｎ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ．”Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １６（３）：２６５−２６９。Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ：ｎｅｗ  ａｎｄ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｄｅｌ  ｍｉｃｅ．”Ｃｕｒｒ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｐ  １０（２）：１０８−１１７。注意すべきは、ＳＭＮ２コピー数が唯一の表現型修飾因子ではないことである。詳細には、ＳＭＮ２遺伝子のエクソン７におけるｃ．８５９Ｇ＞Ｃ変異体が、正の疾患修飾因子と報告されている。この特定の突然変異を有する患者は、重症度の低い疾患表現型を有する。Ｐｒｉｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｆ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒ���ｐｈｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＳＭＮ２  ｇｅｎｅ．”Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ８５（３）：４０８−４１３。
【０２９４】
Ｉ型ＳＭＡ（乳児発症型又はウェルドニッヒ・ホフマン病とも称される）は、出生時に又は６ヵ月齢までにＳＭＡ症状が発現する場合である。この型では、乳児は典型的には、筋緊張が低く（筋緊張低下）、泣声が弱く、且つ呼吸窮迫を有する。こうした乳児は多くの場合に嚥下及び吸啜困難を有し、支持なしでの座位保持が可能という発達マイルストーンに到達しない。こうした乳児は、多くの場合、筋緊張低下、運動技能遅滞、定頸不全、円背姿勢及び関節過度可動性から選択されるＳＭＡ症状の１つ以上を示す。典型的には、こうした乳児は、各５番染色体上に１つずつ、２つのコピーのＳＭＮ２遺伝子を有する。全新規ＳＭＡ症例の半数超が、ＳＭＡ  Ｉ型である。
【０２９５】
ＩＩ型又は中間型ＳＭＡは、その発症が７〜１８ヵ月齢の間で、小児が独力で起立又は歩行できるようになる前であるＳＭＡの場合である。２型ＳＭＡの小児は、概して少なくとも３個のＳＭＮ２遺伝子を有する。遅発型ＳＭＡ（ＩＩＩ型及びＩＶ型ＳＭＡ、軽症型ＳＭＡ、成人発症型ＳＭＡ及びクーゲルバーグ・ウェランダー病としても知られる）は、様々なレベルの脱力を生じる。ＩＩＩ型ＳＭＡは、その発症が１８ヵ月より後であり、小児は独力で起立又は歩行できるが、補助を必要とし得る。ＩＶ型ＳＭＡは、その発症が成人であり、人はその成人期以降に歩行が可能である。ＩＩＩ型又はＩＶ型ＳＭＡの人は、概して４〜８個のＳＭＮ２遺伝子を有し、それらからかなりの量の完全長ＳＭＮタンパク質が産生され得る。
【０２９６】
一実施形態において、用語「治療」は、本明細書に開示されるとおりのｒＡＡＶを含む組成物の有効用量若しくは有効な複数用量を、それを必要としている動物（ヒトを含む）に静脈内投与するか又は髄腔内経路によって投与するステップを含む。障害／疾患の発症前にこの用量が投与される場合、投与は予防的である。障害／疾患の発症後にこの用量が投与される場合、投与は治療的である。実施形態において、有効用量は、治療下の障害／疾患状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和する（消失させるか又は低減するかのいずれかの）用量、障害／疾患状態への進行を減速させる又は防止する用量、障害／疾患状態の進行を減速させる又は防止する用量、疾患の程度を減じる用量、疾患の（部分的な又は全面的な）寛解をもたらす用量及び／又は生存を延長させる用量である。治療に企図される疾患状態の例は、本明細書に示される。
【０２９７】
一実施形態において、本開示のｒＡＡＶを含む組成物は、ＳＭＡ、例えばＳＭＡ  Ｉ型を有するそれを必要としている患者に静脈内投与される。一部の実施形態において、ＳＭＡを有する患者は２歳未満である。一部の実施形態において、患者はＳＭＮ１遺伝子に両アレル性変異を有する。別の実施形態において、本開示のｒＡＡＶを含む組成物は、ＳＭＡ  ＩＩ型、ＩＩＩ型又はＩＶ型を有するそれを必要としている患者に髄腔内投与される。一部の実施形態において、本開示のｒＡＡＶを含む組成物は、ＳＭＮ１遺伝子に両アレル性変異のあるＳＭＡを有する２歳未満の小児患者の治療に使用される。
【０２９８】
本明細書には、髄腔内又は静脈内経路でＡＡＶ９ウイルスベクターを投与することにより、それを必要としている患者のＳＭＡ、例えばＩ型ＳＭＡを治療する方法が開示される。一部の実施形態において、患者は生後０〜９ヵ月である。一部の他の実施形態において、患者は生後０〜６ヵ月である。一部の実施形態において、患者は２歳未満である。一部の実施形態において、患者は２歳未満で、ＳＭＮ１遺伝子に両アレル性変異を有する。患者のＳＭＡ、例えばＩ型ＳＭＡの治療にウイルスベクターが使用される一部の実施形態では、患者の体重が決定される。一部の実施形態において、患者は体重が１３．５ｋｇ未満である。一部の実施形態において、患者は体重が８．５ｋｇ未満である。一部の実施形態において、患者は体重が２．６ｋｇより重い。一部の実施形態において、患者は体重が２．６〜８．５ｋｇである。一部の実施形態において、患者は体重が２．６〜１３．５ｋｇである。
【０２９９】
一部の実施形態において、患者はＳＭＮ１遺伝子の１つのコピーに突然変異、例えばヌル突然変異を有する（コードされるＳＭＮ１を非機能性にする任意の突然変異を包含する）。一部の実施形態において、患者はＳＭＮ１遺伝子の２つのコピーに突然変異、例えばヌル突然変異を有する。一部の実施形態において、患者は、ＳＭＮ１遺伝子の全てのコピーに突然変異、例えばヌル突然変異を有する。一部の実施形態において、患者はＳＭＮ１遺伝子の１つのコピーに欠失を有する。一部の実施形態において、患者はＳＭＮ１遺伝子の２つのコピーに欠失を有する。一部の実施形態において、患者は両アレル性ＳＭＮ１突然変異を有し、即ち染色体の両方のアレルにＳＭＮ１の欠失又は置換のいずれかを有する。一部の実施形態において、患者はＳＭＮ２遺伝子の機能性コピーを少なくとも１つ有する。一部の実施形態において、患者はＳＭＮ２遺伝子の機能性コピーを少なくとも２つ有する。一部の実施形態において、患者はＳＭＮ２遺伝子の機能性コピーを少なくとも２つ有する。一部の実施形態において、患者はＳＭＮ２遺伝子の機能性コピーを少なくとも３つ有する。一部の実施形態において、患者はＳＭＮ２遺伝子の機能性コピーを少なくとも４つ有する。一部の実施形態において、患者はＳＭＮ２遺伝子の機能性コピーを少なくとも５つ有する。一部の実施形態において、患者はＳＭＮ２遺伝子の少なくとも１つのコピーのエクソン７にｃ．８５９Ｇ＞Ｃ置換を有しない。一部の実施形態において、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子の遺伝子配列は、全ゲノムシーケンシングによって決定され得る。他の実施形態において、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子の遺伝子配列及びコピー数は、ハイスループットシーケンシングによって決定され得る。一部の実施形態において、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子の遺伝子配列及びコピー数は、マイクロアレイ解析によって決定され得る。一部の実施形態において、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子の遺伝子配列及びコピー数は、サンガーシーケンシングによって決定され得る。一部の実施形態において、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子のコピー数は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって決定され得る。
【０３００】
一部の実施形態において、患者は１つ以上のＳＭＡ症状を示す。ＳＭＡ症状には、筋緊張低下、運動技能遅滞、定頸不全、円背姿勢及び関節過度可動性が含まれ得る。一部の実施形態において、定頸不全は、肩（前面及び背面）を支えながら患者にあぐら座位をとらせることにより決定される。定頸は、患者が上体を起こした状態を保持する能力によって評価される。一部の実施形態において、患者が仰臥位にあるときの自発運動が観察され、患者が肘、膝、手及び足を表面から持ち上げる能力によって運動技能が評価される。一部の実施形態において、患者の握力は、患者の手掌に指を入れ、患者をその肩が表面から浮くまで引き上げることにより測定される。筋緊張低下及び握力は、患者がどの程度早く／長く把握を維持するかによって測定される。一部の実施形態において、定頸は、患者の頭部を最大限可能なまで回旋させておき、患者が頭部を正中線に向かって戻す能力を測定することにより評価される。一部の実施形態において、肩の姿勢は、頭部及び体幹を支えながら患者を座らせ、腕の長さだけ離れたところにある肩の高さの刺激物を取ろうと患者が肘又は肩を屈曲させて手を伸ばすかどうかを観察することにより評価され得る。一部の実施形態において、肩の姿勢は、患者に側臥位をとらせ、腕の長さだけ離れたところにある肩の高さの刺激物を取ろうと患者が肘又は肩を屈曲させて手を伸ばすかどうかを観察することによっても評価され得る。一部の実施形態において、運動技能は、患者の足を撫でたとき、くすぐったとき又はつねったときに患者がその股関節部又は膝を屈曲させるかどうかを観察することにより評価される。一部の実施形態において、公知の臨床尺度、例えばＣＨＯＰ  ＩＮＴＥＮＤにより、肩屈曲、肘屈曲、股関節の内転、頸部屈曲、頭部伸展、頸部伸展及び／又は脊柱の内屈が評価され得る。公知の臨床尺度、例えばＣＨＯＰ  ＩＮＴＥＮＤに基づいて他のＳＭＡ症状が判定され得る。
【０３０１】
一部の実施形態において、患者は、本明細書に記載される検査の１つを用いて決定されるとおりの、ＳＭＡ、例えばＩ型ＳＭＡの症状（例えば、１つ以上の症状）を示した後に治療される。一部の実施形態において、患者は、ＳＭＡ、例えばＩ型ＳＭＡの症状を示す前に治療される。一部の実施形態において、患者は、症候性となる前に、遺伝子検査に基づいてＳＭＡ、例えばＩ型ＳＭＡと診断される。
【０３０２】
本明細書では、併用療法も企図される。併用は、本明細書で使用されるとき、同時に行われる治療又は逐次的に行われる治療のいずれも含む。方法の併用には、特定の標準的医学治療（例えば、ＡＬＳにおけるリルゾール）の追加が、新規療法との併用と同じく含まれ得る。例えば、他のＳＭＡ療法には、プレｍＲＮＡに改変・結合してそのスプライシングパターンを改変するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が含まれる。Ｓｉｎｇｈ．ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｍｕｌｔｉ−ｅｘｏｎ−ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｓｕｒｐｒｉｓｉｎｇ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｓｐｌｉｃｅ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｇｅｎｅｓ．”Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，７（１１）：ｅ４９５９５。一実施形態において、ヌシネルセン（米国特許第８，３６１，９７７号明細書及び同第８，９８０，８５３号明細書（参照により本明細書に援用される））が使用され得る。ヌシネルセンは、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン６、エクソン７又はイントロン７を標的とする承認済みのＡＳＯであり、完全長ＳＭＮタンパク質が一層効率的に産生されるようにＳＭＮ２のスプライシングを調節する。一部の実施形態において、ＡＡＶ９ウイルスベクターを含む治療方法は、筋エンハンサーと併用して投与される。一部の実施形態において、ＡＡＶ９ウイルスベクターを含む治療方法は、神経保護剤と併用して投与される。一部の実施形態において、ＡＡＶ９ウイルスベクターを含む治療方法は、ＳＭＮを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドベースの薬物と併用して投与される。一部の実施形態において、ＡＡＶ９ウイルスベクターを含む治療方法は、ヌシネルセンと併用して投与される。一部の実施形態において、ＡＡＶ９ウイルスベクターを含む治療方法は、ミオスタチン阻害薬と併用して投与される。一部の実施形態において、ＡＡＶ９ウイルスベクターを含む治療方法は、スタムルマブと併用して投与される。
【０３０３】
それを必要としている出生後の個体への送達が企図されるが、胎児への子宮内送達も企図される。
【０３０４】
ウイルスベクターを含む医薬組成物を使用したＳＭＡ、例えばＩ型ＳＭＡ患者の治療方法が企図される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは約１〜８×１０１３ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）の濃度で製剤化される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは約１．７〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬの濃度で製剤化される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは約１．９〜２．１×１０１３ｖｇ／ｍＬの濃度で製剤化される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは約２．０×１０１３ｖｇ／ｍＬの濃度で製剤化される。
【０３０５】
患者のＳＭＡ、例えばＩ型ＳＭＡの治療にウイルスベクターが使用される一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクター（例えばＡＡＶ  ＳＭＮ）は約１．０〜２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で患者に投与される。患者のＳＭＡ、例えばＩ型ＳＭＡの治療にウイルスベクターが使用される一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターは約１．１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で患者に投与される。患者のＳＭＡ、例えばＩ型ＳＭＡの治療にウイルスベクターが使用される一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターは約４５〜７０分かけて患者に注入される。患者のＳＭＡ、例えばＩ型ＳＭＡの治療にウイルスベクターが使用される一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターは約６０分かけて患者に注入される。患者のＳＭＡ、例えばＩ型ＳＭＡの治療にウイルスベクターが使用される一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターは、輸液ポンプ、蠕動ポンプ又は当技術分野において公知の任意の他の機器を使用して患者に注入される。患者のＳＭＡ、例えばＩ型ＳＭＡの治療にウイルスベクターが使用される一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターはシリンジポンプを使用して患者に注入される。
【０３０６】
投与されるｒＡＡＶウイルスベクターの力価は、例えば、詳細なｒＡＡＶ、投与方法、治療目標、個体及び標的とされる１つ又は複数の細胞型に応じて変わることになり、当技術分野において標準的な方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌ当たり約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３、約１×１０１４又はそれを超えるＤＮアーゼ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投薬量は、ベクターゲノム（ｖｇ）の単位でも表され得る。ゲノム力価は、本願、Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載されるとおりのｄｄＰＣＲ又は当技術分野において公知の任意の他の方法を用いて決定することができる。
【０３０７】
投薬量は、ヒトへの投与タイミングに基づいても変わり得る。ｒＡＡＶのこれらの投薬量は、成人では約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１６ｖｇ／ｋｇ又はそれを超える体重１キログラム当たりのベクターゲノムの範囲であり得る。新生児については、ｒＡＡＶの投薬量は、約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約３×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約３×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約３×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１６ｖｇ／ｋｇ、約３×１０１６ｖｇ／ｋｇ又はそれを超える体重１キログラム当たりのベクターゲノムの範囲であり得る。
【０３０８】
投薬量は、ヒトへの投与タイミングに基づいても変わり得る。ｒＡＡＶのこれらの投薬量は、成人で約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ／週、約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ／週、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ／週、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ／週、約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ／週、約１×１０１６ｖｇ／ｋｇ／週又はそれを超える体重１キログラム当たりのベクターゲノムの範囲であり得る。新生児については、ｒＡＡＶの投薬量は、約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ／週、約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ／週、約３×１０１２ｖｇ／ｋｇ／週、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ／週、約３×１０１３ｖｇ／ｋｇ／週、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ／週、約３×１０１４ｖｇ／ｋｇ／週、約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ／週、約３×１０１５ｖｇ／ｋｇ／週、約１×１０１６ｖｇ／ｋｇ／週、約３×１０１６ｖｇ／ｋｇ／週又はそれを超える１週間体重１キログラム当たりのベクターゲノムの範囲であり得る。成人で１×１０１１ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約１×１０１２ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約１×１０１３ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約１×１０１４ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約１×１０１５ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約１×１０１６ｖｇ／１．５ｋｇ／週又はそれを超える体重１キログラム当たりのベクターゲノムのｒＡＡＶの投薬量。新生児については、ｒＡＡＶの投薬量は、約１×１０１１ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約１×１０１２ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約３×１０１２ｖｇ／ｋｇ／週、約１×１０１３ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約３×１０１３ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約１×１０１４ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約３×１０１４ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約１×１０１５ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約３×１０１５ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約１×１０１６ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約３×１０１６ｖｇ／１．５ｋｇ／週又はそれを超える１週間体重１．５キログラム当たりのベクターゲノムの範囲であり得る。
【０３０９】
一部の実施形態において、投薬量は、同じ投薬量の参照標準品と比べて少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％又は少なくとも１４０％の効力を保持している。一部の実施形態において、投薬量は、同じ投薬量の参照標準品と比べて少なくとも９０％の効力を保持している。一部の実施形態において、相対効力は、本明細書に記載されるインビトロ細胞ベース相対効力アッセイを用いてアッセイされる。
【０３１０】
ある実施形態において、用量は、患者体重１ｋｇ当たり約１．１×１０１４ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）である。ある実施形態において、５ｋｇの患者であれば、０．５×１０１４〜５．０×１０１４ベクターゲノムの総用量を受けることになる。ある実施形態において、ウイルスベクターはトリス緩衝生理食塩水中に入れて投与される。ある実施形態において、ウイルスベクターは、約５〜２０ｍＬ／ｋｇ、約１０〜２０ｍＬ／ｋｇ又は約５．５〜６．５ｍＬ／ｋｇのトリス緩衝生理食塩水中に入れて投与される。
【０３１１】
用量は、幾つもの標準的な方法で決定することができる。ウイルスベクターに特異的なプライマーによるＰＣＲは相対測定を提供できるが、より少量のサンプル及び絶対測定にはｑＰＣＲが用いられ得る。ｄｄＰＣＲは、水−油エマルション滴技術をベースとするデジタルＰＣＲの実施方法である。Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  ｈｉｔｓ  ｉｔｓ  ｓｔｒｉｄｅ．”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，９（６）：５４１−５４４。Ｓｙｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ＰＣＲ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ．”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３（３）４４４−４４９。サンプルが数万個の液滴に分割され、各個別の液滴で鋳型分子のＰＣＲ増幅が行われる。検量線を作成するか、又は高い増幅効率のプライマーを有する必要がないため、ｄｄＰＣＲは典型的には、従来のＰＣＲベースの技法ほど多くのサンプルを使用しない。市販のｄｄＰＣＲ機の例としては、限定はされないが、ＢｉｏＲａｄ  ＱＸ１００  ｄｄＰＣＲ及びＲａｉｎＤａｎｃｅ  Ｒａｉｎｄｒｏｐ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲが挙げられる。一実施形態において、用量はＰＣＲを用いて決定される。別の実施形態において、用量はｑＰＣＲを用いて決定される。別の実施形態において、用量はデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いて決定される。一部の実施形態において、ＰＣＲベースの方法は、ＳＭＮ遺伝子を標的とする特異的に設計されたプライマー及びプローブを使用してカプシド化ＡＡＶ９ウイルスゲノムを検出及び定量化する。他の実施形態において、ＰＣＲベースの方法は、ニワトリβ−アクチンプロモーターを標的とする特異的に設計されたプライマー及びプローブを使用してカプシド化ＡＡＶ９ウイルスゲノムを検出及び定量化する。他の実施形態において、ＰＣＲベースの方法は、ＣＭＶエンハンサーを標的とする特異的に設計されたプライマー及びプローブを使用してカプシド化ＡＡＶ９ウイルスゲノムを検出及び定量化する。他の実施形態において、ＰＣＲベースの方法は、ＩＴＲ配列を標的とする特異的に設計されたプライマー及びプローブを使用してカプシド化ＡＡＶ９ウイルスゲノムを検出及び定量化する。他の実施形態において、ＰＣＲベースの方法は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを標的とする特異的に設計されたプライマー及びプローブを使用してカプシド化ＡＡＶ９ウイルスゲノムを検出及び定量化する。
【０３１２】
一態様において、２．０×１０１３ｖｇ／ｍｌを薬物製品の目標濃度として用いて、以下の表に従い用量が投与される。
【０３１３】
【表２】
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【０３１４】
一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターを含む医薬組成物は約２０〜７０分、例えば約４５〜７０分かけて患者に注入される。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターを含む医薬組成物は約６０分かけて患者に注入される。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターを含む医薬組成物は、輸液ポンプ、蠕動ポンプ又は当技術分野において公知の任意の他の機器を使用して患者に注入される。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターを含む医薬組成物はシリンジポンプを使用して患者に注入される。
【０３１５】
治療に適している患者のプレスクリーニング並びに本明細書に（ｈｅｒｉｅｎ）開示される判定基準により同定された患者への治療の投与も企図される。ＡＡＶは、細胞性及び体液性の両方の免疫応答を生じさせ得る。結果として、ＡＡＶベースの遺伝子療法に対する潜在的患者の一部は、ＡＡＶに対する既存の抗体を持っている。Ｊｅｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｅ−ｅｘｉｓｔｉｎｇ  ａｎｔｉ−Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  ａ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｉｎ  ＡＡＶ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４（２）：５９−６７。Ｂｏｕｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ＩｇＧ  ａｎｄ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｔｙｐｅｓ  １，２，５，６，８，ａｎｄ  ９  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ＡＡＶ  ｖｅｃｔｏｒｓ．”Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２１：７０４−７１２。極めて低いレベルの抗体であっても形質導入の成功を妨げ得るため、先行する抗ＡＡＶ抗体は、ＡＡＶ遺伝子療法の普遍的適用への深刻な障害となる。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターの投与前に患者の抗ＡＡＶ９抗体力価のレベルが決定される。一部の実施形態において、患者の抗ＡＡＶ９抗体力価のレベルは、ＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定される。一部の実施形態において、患者は、治療の投与前にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：１００以下の抗ＡＡＶ９抗体力価を有する。一部の実施形態において、患者は、治療の投与前にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：５０以下の抗ＡＡＶ９抗体力価を有する。一部の実施形態において、患者は、治療後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：１００を上回る抗ＡＡＶ９抗体力価を有し、１〜８週間にわたって又は力価が１：１００未満に低下するまでモニタされる。一部の実施形態において、患者は、治療後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：１００を上回る抗ＡＡＶ９抗体力価を有し、１〜８週間にわたって又は力価が１：５０未満に低下するまでモニタされる。
【０３１６】
高い抗ＡＡＶ抗体力価を解消する１つの手法は、免疫抑制薬の使用である。シクロスポリンＡとの併用でのモノクローナル抗ＣＤ２０抗体リツキシマブは、抗ＡＡＶ力価を下げるのに有効であることが示されている。Ｍｉｎｇｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ａ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ＡＡＶ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｆｏｒ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ｂ．”Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，２０：１４１０−１４１６。別の手法は、ベクター投与前に中和抗体を枯渇させるためのプラスマフェレーシスの使用である。Ｍｏｎｔｅｉｌｈｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  １０  ｐａｔｉｅｎｔ  ｃａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａｐｈｅｒｅｓｉｓ  ｕｐｏｎ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｔｙｐｅｓ  １，２，６，ａｎｄ  ８．”Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１９（１１）：２０８４−２０９１。プラスマフェレーシスでは、患者から血液が抜き取られ、血漿及び血液細胞が遠心又は中空糸ろ過のいずれかによって分離される。次に血液細胞が処理済みの血漿又は生理食塩水中４．５％ヒトアルブミンなどの補液のいずれかと共に患者に戻される。治療的アフェレーシスの一般的な用途は、望ましくない免疫グロブリンの除去であるが、この場合、プラスマフェレーシスは、抗ＡＡＶ抗体を枯渇させるための魅力的な手法に相当する。一部の実施形態において、患者は、治療前又は治療後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：１００を上回る抗ＡＡＶ９抗体力価を有し、プラスマフェレーシスで処置される。一部の実施形態において、患者は、治療前又は治療後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：５０を上回る抗ＡＡＶ９抗体力価を有し、プラスマフェレーシスで処置される。
【０３１７】
ＡＡＶ９に対する既存の母体抗体は、母乳又は子宮内での経胎盤移行によって乳児患者に移行し得る。一部の実施形態において、患者は、治療前又は治療後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：１００を上回る抗ＡＡＶ９抗体力価を有し、人工栄養に切り換えられる。一部の実施形態において、患者は、治療前又は治療後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：５０を上回る抗ＡＡＶ９抗体力価を有し、人工栄養に切り換えられる。
【０３１８】
治療の投与前及び投与後には、患者の状態がモニタされ得る。ＡＡＶベースの治療を受けた患者の一部は血小板減少症を起こしており、これは、低血小板数によって特徴付けられる状態である。血小板減少症は、血球計算器で希釈血液サンプルを使用して全血球数によって検出することができる。血小板減少症は、患者の血液（薄層塗抹標本又は末梢血スメア）で調製したスライドを顕微鏡下で観察することによっても検出することができる。正常ヒト血小板数は１５０，０００細胞／ｍｌ〜約４５０，０００細胞／ｍｌの範囲である。
【０３１９】
一部の実施形態において、患者は投与前に約６７，０００細胞／ｍｌ超の血小板数を有するか、又は約１００，０００細胞／ｍｌ超若しくは約１５０，０００細胞／ｍｌ超を有する。一部の実施形態において、患者は投与前に約１５０，０００細胞／ｍｌ未満の血小板数を有するか、又は約１００，０００細胞／ｍｌ未満若しくは約６７，０００細胞／ｍｌ未満を有し、１〜８週間にわたって又は血小板数が約６７，０００細胞／ｍｌ超、又は約１００，０００細胞／ｍｌ超、又は約１５０，０００細胞／ｍｌ超に増加するまでモニタされる。ウイルスベクターの投与後の血小板数が約６７，０００細胞／ｍｌ未満である一部の実施形態において、患者は血小板輸血で治療され得る。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与前に血小板減少症を有しない。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与後に血小板減少症を有し、約１〜８週間にわたって又は患者が血小板減少症を有しなくなるまでモニタされる。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与後に血小板減少症を有し、血小板輸血で治療される。
【０３２０】
患者の状態のモニタリングは、血小板、血清タンパク質電気泳動、血清γグルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、総ビリルビン、グルコース、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、クレアチニン、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、電解質、アルカリホスファターゼ及びアミラーゼのレベルを測定する標準的な血液検査も伴い得る。トロポニンＩレベルは心臓の健康の一般的な尺度であり、レベルの上昇は心臓の損傷又は心臓関連病態を反映する。一部の実施形態において、トロポニン−Ｉレベルはウイルスベクターの投与後にモニタされる。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与前に約０．３、０．２、０．１５又は０．１μｇ／ｍｌ未満のトロポニン−Ｉレベルを有し得る。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与前に約０．１７６μｇ／ｍｌ未満のトロポニン−レベルを有し得る。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与後に約０．１７６μｇ／ｍｌ超のトロポニン−レベルを有し得る。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与後にトロポニン−Ｉレベルが約０．１７６μｇ／ｍｌ未満になるまで心モニタリングを受ける。
【０３２１】
アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及び総ビリルビンは肝機能の一般的な尺度である一方、クレアチニンは腎機能を追う。ＡＳＴ、ＡＬＴ又は総ビリルビンのレベルの上昇は、肝機能不全を指示し得る。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与前に正常な肝機能を有する。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与前に約８〜４０Ｕ／Ｌ未満の肝トランスアミナーゼレベルを有する。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与前に約８〜４０Ｕ／Ｌ未満のＡＳＴ又はＡＬＴレベルを有する。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与前に３．０ｍｇ／ｄＬ未満のビリルビンレベルを有する。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与前に１．８ｍｇ／ｄＬ未満のクレアチニンレベルを有する。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与前に８〜１８ｇ／ｄＬのヘモグロビン（Ｈｇｂ）レベルを有する。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与前に２００００／ｍｍ３未満の白血球（ＷＢＣ）数を有する。
【０３２２】
治療方法の有効性は、治療前及び治療後に種々の運動技能検査を用いて決定され得る。詳細には、Ｉ型ＳＭＡ患者の運動技能を判定するため、フィラデルフィア小児病院乳児神経筋疾患検査（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｉｎｆａｎｔ  Ｔｅｓｔ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ＣＨＯＰ  ＩＮＴＥＮＤ）が開発された。Ｇｌａｎｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｉｎｆａｎｔ  Ｔｅｓｔ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（ＣＨＯＰ  ＩＮＴＥＮＤ）：Ｔｅｓｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ．”Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，２０（３）：１５５−１６１。ＣＨＯＰ  ＩＮＴＥＮＤ検査は、平均年齢１１．５ヵ月（１．４〜３７．９ヵ月）の２６人のＩ型ＳＭＡ乳児についての乳児運動能力検査（Ｔｅｓｔ  ｏｆ  Ｉｎｆａｎｔ  Ｍｏｔｏｒ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ：ＴＩＭＰ）及び新たに考案されたＳＭＡの運動評価であるフィラデルフィア小児病院ＳＭＡ強度検査（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｔｅｓｔ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｉｎ  ＳＭＡ：ＣＨＯＰ  ＴＯＳＳ）による判定を受けて開発された。治療有効性の検査はＣＨＯＰ  ＩＮＴＥＮＤ検査に限定されず、限定はされないが、ＴＩＭＰ、ＣＨＯＰ  ＴＯＳＳ、ピーボディ発達運動尺度（Ｐｅａｂｏｄｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｍｏｔｏｒ  Ｓｃａｌｅｓ）、ブラゼルトン新生児行動評価（Ｂｒａｚｅｌｔｏｎ  Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）検査、運動マイルストーン発達調査（Ｍｏｔｏｒ  Ｍｉｌｅｓｔｏｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｕｒｖｅｙ）、インタラクティブビデオ判定によって捉えた能力（Ａｂｉｌｉｔｙ  Ｃａｐｔｕｒｅｄ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｖｉｄｅｏ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ：ＡＣＴＩＶＥ）、ベイリー乳幼児発達尺度（Ｂａｙｌｅｙ  Ｓｃａｌｅ  ｏｆ  Ｉｎｆａｎｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）及び複合運動活動電位（ＣＭＡＰ）測定を含め、当技術分野において公知の他の運動技能検査も含まれ得る。
【０３２３】
一部の実施形態では、ＣＨＯＰ  ＩＮＴＥＮＤ尺度を用いて治療前ベースライン検査が実施される。一実施形態において、治療の有効性は、フォローアップビジットの間にＣＨＯＰ  ＩＮＴＥＮＤ尺度を用いて決定される。一部の実施形態において、ＣＨＯＰ  ＩＮＴＥＮＤは、定頸、立ち直り反射、支持ありでの座位、仰臥位及び腹臥位における体幹運動の尺度を含む。一部の実施形態において、ＣＨＯＰ  ＩＮＴＥＮＤは、補助しながらの寝返り動作時、腹位懸垂及び支持ありでの立位における抗重力運動の尺度を含む。
【０３２４】
ＡＡＶベクターが関わる多くの遺伝子療法研究では、ＡＡＶベクターに対する抗原特異的Ｔ細胞応答が観察されており、これは遺伝子導入後２〜４週間と予想し得る。かかる抗原特異的Ｔ細胞応答の１つの可能性のある帰結は、形質導入細胞のクリアランス及びトランス遺伝子の発現欠損である。ＡＡＶベースの療法に対する宿主免疫応答を弱めるため、患者に免疫抑制薬が与えられ得る。一部の実施形態において、患者にはウイルスベクターの投与前にグルココルチコイドが与えられ得る。一部の実施形態において、患者にはウイルスベクターの投与前にコルチコステロイドが与えられ得る。一部の実施形態において、患者にはウイルスベクターの投与前に経口ステロイド薬が与えられ得る。経口ステロイド薬の例としては、限定はされないが、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、ベタメタゾン（ｂｅｔｈａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、デキサメタゾン及びヒドロコルチゾンが挙げられる。一部の実施形態において、経口ステロイド薬はプレドニゾロンであるか又はそれを含む。一部の実施形態において、患者はウイルスベクター投与の少なくとも２４時間前に予防的ステロイド薬を開始する。一部の実施形態において、患者には経口ステロイド薬がウイルスベクター投与後少なくとも３０日間にわたって与えられる。一部の実施形態において、経口ステロイド薬は１日１回投与される。一部の実施形態において、経口ステロイド薬は１日２回投与される。一部の実施形態において、経口ステロイド薬は約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば約１ｍｇ／ｋｇの用量で与えられる。一部の実施形態において、経口ステロイド薬は約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、例えば約１ｍｇ／ｋｇ／日の用量で与えられる。一部の実施形態において、ウイルスベクターの投与後にＡＳＴ及びＡＬＴのレベルがモニタされる。かかる実施形態において、経口ステロイド薬治療は、ＡＳＴ及びＡＬＴレベルが例えば臨床標準及び当技術分野において公知の方法により決定したときの正常上限の２倍又は約１２０ＩＵ／Ｌを超えたときに投与される。一部の実施形態において、経口ステロイド薬治療は、ＡＳＴ及びＡＬＴレベルが例えば臨床標準及び当技術分野において公知の方法により決定したときの正常上限の２倍又は約１２０ＩＵ／Ｌを超えている限り、３０日超にわたって投与される。コルチコステロイドによる持続的治療の間、副腎のコルチゾール産生が自然に低下する。コルチコステロイド治療を急に中止すると、体がコルチゾール欠乏を来し得る。経口ステロイド薬が患者に少なくとも３０日間与えられる一部の実施形態において、ステロイド用量はスケジュールに沿って徐々に漸減される。一部の実施形態において、経口ステロイド薬用量は、ＡＳＴ及びＡＬＴレベルが例えば臨床標準及び当技術分野において公知の方法により決定したときの正常上限の２倍又は約１２０ＩＵ／Ｌを下回ったとき、漸減される。一部の実施形態において、漸減は、２週間にわたって０．５ｍｇ／ｋｇ／日、それに続き更に２週間にわたって０．２５ｍｇ／ｋｇ／日に段階的に減らすことを含む。一部の他の実施形態において、経口ステロイド薬の漸減は医師の裁量により行われる。
【０３２５】
キット
一実施形態において、本明細書には、
ａ．ウイルスベクターで形質導入される能力を有する複数の細胞；
ｂ．目的タンパク質をコードするウイルスベクター；
ｃ．目的タンパク質と結合する能力を有する第１の分子；
ｄ．第１の分子と結合する能力を有する第２の分子であって、検出可能標識を含む第２の分子；及び
ｅ．イメージングアッセイにおける使用に関する説明書
を含むキットが提供される。
【０３２６】
本開示のキットの一部の実施形態において、複数の細胞は、ＳＭＮ１−／−遺伝的背景下にある神経前駆細胞（ｍＴＤ−ＮＰＣ−？７）を含む。
【０３２７】
一部の実施形態において、ウイルスベクター薬物製品は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／ニワトリβ−アクチンハイブリッドプロモーター（ＣＢ）の制御下でＳＭＮ１タンパク質を発現するｃＤＮＡと、ＡＡＶ血清型２型（ＡＡＶ２）ＤＮＡ由来の２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）とを含むアデノ随伴ウイルス血清型９型（ＡＡＶ９）である。一部の実施形態において、ベクターは配列番号２の配列を含む。一部の実施形態において、ベクターは配列番号１の配列を含む。一部の実施形態において、ベクターは、配列番号３のアミノ酸配列を含むＳＭＮ１タンパク質をコードする配列を含む。
【０３２８】
一部の実施形態において、第１の分子は抗ＳＭＮ１抗体を含む。例示的抗体はマウスモノクローナル抗体２Ｂ１抗体を含む。
【０３２９】
一部の実施形態において、第２の分子は、前記第１の分子に特異的な抗体を含む。一部の実施形態において、第２の分子は検出可能標識を含む。
【０３３０】
本開示及び添付の特許請求の範囲で使用されるとおり、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、文脈上特に明確に指示されない限り複数形の指示対象を含むことにも留意する必要がある。任意選択の又は任意選択でとは、続いて記載される事象又は状況が起こっても又は起こらなくてもよく、且つその記載に事象又は状況が起こる場合と、それが起こらない場合とが包含されることを意味する。例えば、任意選択で組成物が組み合わせを含み得るという語句は、その組成物が異なる分子の組み合わせを含んでも又は組み合わせを含まなくてもよいことを意味し、その記載に組み合わせ及び組み合わせ無し（即ち組み合わせ中の個々のメンバー）の両方が包含されることになる。範囲は、本明細書では、約１つの特定の値から及び／又は約別の特定の値までとして表され得る。かかる範囲が表されるとき、別の態様は、１つの特定の値から及び／又は他の特定の値までを含む。同様に、先行する約の使用により値が近似値として表されるとき、その特定の値が別の態様を形成することは理解されるであろう。更に、範囲の各々の端点は、他方の端点に対して有意であると共に、他方の端点と独立にも有意であることが理解されるであろう。本開示に引用される参考文献は、全て本明細書によって全体として本明細書に援用される。
【０３３１】
ここで、本発明を以下の例によって例示する。前述の記載は例示目的に過ぎず、本発明の範囲を限定する意図はないことが理解されるべきである。当業者は、特許請求の範囲に示されるとおりの本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく変形を加え得ることを理解し得る。
【０３３２】
実施形態の列挙
本発明は、以下の実施形態の列挙を参照することによって理解され得る。
【０３３３】
１．トランス遺伝子発現を測定する方法であって、
ａ）第１の複数の最終分化神経前駆細胞（ＮＰＣ）を提供すること；
ｂ）目的タンパク質をコードする配列を含むウイルスベクターを含む試験サンプルで第１の複数の最終分化ＮＰＣを形質導入すること；
ｃ）形質導入された第１の複数の最終分化ＮＰＣを、目的タンパク質を発現させるのに十分な条件下でインキュベートすること；
ｄ）（ｃ）からの第１の複数の最終分化ＮＰＣを、目的タンパク質に特異的な分子に接触させること；
ｅ）第１の複数の最終分化ＮＰＣをイメージングして、１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）アッセイリードアウトを入手すること；及び
ｆ）ＩＦＩ−Ｃリードアウトに基づいて目的タンパク質の発現を決定すること
を含む方法。
【０３３４】
２．第１の複数の最終分化ＮＰＣは、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）−／−突然変異に関してホモ接合である、実施形態１の方法。
【０３３５】
３．ＳＭＮ１−／−突然変異は、ＳＭＮ１エクソン７の欠失（Δ７）を含む、実施形態２の方法。
【０３３６】
４．インキュベートするステップｃ）後、第１の複数の最終分化ＮＰＣを固定及び透過処理することが続く、実施形態１〜３のいずれか１つの方法。
【０３３７】
５．ｇ）第２の複数の最終分化ＮＰＣを提供すること；
ｈ）ウイルスベクターを含む参照標準品で第２の複数の最終分化ＮＰＣを形質導入すること；
ｉ）形質導入された第２の複数の最終分化ＮＰＣを、目的タンパク質を発現させるのに十分な条件下でインキュベートすること；
ｊ）（ｉ）からの第２の複数の最終分化ＮＰＣを、目的タンパク質に特異的な分子に接触させること；
ｋ）第２の複数の最終分化ＮＰＣをイメージングして、１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）アッセイリードアウトを入手すること；及び
ｌ）第１の複数の最終分化ＮＰＣのＩＦＩ−Ｃを第２の複数の最終分化ＮＰＣのＩＦＩ−Ｃと比較すること
を含み、それにより、参照標準品と比べた試験サンプルのウイルスベクターの相対効力を決定する、実施形態１〜４のいずれか１つの方法。
【０３３８】
６．第２の複数の最終分化ＮＰＣは、ＳＭＮ１−／−突然変異に関してホモ接合である、実施形態５の方法。
【０３３９】
７．ＳＭＮ１−／−突然変異は、ＳＭＮ１エクソン７の欠失（Δ７）を含む、実施形態６の方法。
【０３４０】
８．インキュベートするステップ（ｉ）後、第２の複数の最終分化ＮＰＣを固定及び透過処理することが続く、実施形態４又は５の方法。
【０３４１】
９．前記第１及び第２の複数の最終分化ＮＰＣは、ＳＭＮ１−／−マウス胚の皮質から単離された神経前駆細胞を最終分化させることによって作製される、実施形態１〜８のいずれか１つの方法。
【０３４２】
１０．最終分化ＮＰＣは、
ａ．上皮成長因子（ＥＧＦ）と線維芽細胞成長因子−塩基性（ｂＦＧＦ）とを含有する無血清培養培地でＮＰＣを培養してニューロスフェアを形成すること；
ｂ．前記ニューロスフェアを解離させて解離ＮＰＣを作製すること；及び
ｃ．成長因子なしの高血清培地で解離ＮＰＣを培養すること
によって最終分化され、それにより最終分化ＮＰＣを作製している、実施形態９の方法。
【０３４３】
１１．前記第１及び第２の複数の細胞は、試験サンプル及び参照標準品により、ウイルスベクターの少なくとも２つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入される、実施形態１〜１０のいずれか１つの方法。
【０３４４】
１２．前記第１及び第２の複数の細胞は、試験サンプル及び参照標準品中のウイルスベクターの５つの異なるＭＯＩで形質導入される、実施形態１１の方法。
【０３４５】
１３．５つのＭＯＩは、１細胞当たり３００，０００、１５０，０００、７５，０００、３７，５００、１８，７５０個のウイルス粒子を含む、実施形態１２の方法。
【０３４６】
１４．比較するステップ（ｌ）は、試験サンプル及び参照標準品の各々についてＭＯＩ対ＩＦＩ−Ｃの検量線をプロットすることを含む、実施形態５〜１３のいずれか１つの方法。
【０３４７】
１５．比較するステップ（ｌ）は、試験サンプル及び参照標準品の各々について対数ＭＯＩ対ＩＦＩ−Ｃの線形回帰を計算し、それにより試験サンプルの傾き及び参照標準品の傾きを導き出すことを含む、実施形態５〜１４のいずれか１つの方法。
【０３４８】
１６．ウイルスベクターの相対効力を決定することは、平行線分析（ＰＬＡ）によって実施され、ＰＬＡは、参照標準品の傾きに対する試験サンプルの傾きの傾き比を測定することを含む、実施形態５〜１５のいずれか１つの方法。
【０３４９】
１７．参照標準品の傾きは、１．０２Ｅ＋０５以上である、実施形態１６の方法。
【０３５０】
１８．傾き比は、０．６９〜１．４５である、実施形態１６又は１７の方法。
【０３５１】
１９．傾き比は、０．７５〜１．３３である、実施形態１６又は１７の方法。
【０３５２】
２０．サンプルの線形回帰の変動係数を計算することを含む、実施形態１６〜１９のいずれか１つの方法。
【０３５３】
２１．変動係数は、１５．６％〜２９．５％である、実施形態２０の方法。
【０３５４】
２２．変動係数は、４０％以下、３０％以下又は２０％以下である、実施形態２０の方法。
【０３５５】
２３．試験サンプル及び参照標準品の線形回帰についてＲ２値を計算することを含む、実施形態１６〜２２のいずれか１つの方法。
【０３５６】
２４．試験サンプル及び参照標準品についてのＲ２値は、０．９５以上である、実施形態２３の方法。
【０３５７】
２５．参照標準品のアッセイダイナミックウィンドウを計算することを含む、実施形態１６〜２４のいずれか１つの方法。
【０３５８】
２６．アッセイダイナミックウィンドウは、２．６９以上である、実施形態２５の方法。
【０３５９】
２７．目的タンパク質は、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）タンパク質である、実施形態１〜２６のいずれか１つの方法。
【０３６０】
２８．ＳＭＮ１タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含む、実施形態２７の方法。
【０３６１】
２９．ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス血清型９型（ＡＡＶ９）である、実施形態２７又は２８の方法。
【０３６２】
３０．ウイルスベクターは、ＳＭＮ１タンパク質をコードする配列に作動可能に連結されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／ニワトリβ−アクチンハイブリッドプロモーター（ＣＢ）をコードする配列を含む、実施形態２７〜２９のいずれか１つの方法。
【０３６３】
３１．ウイルスベクターは、ＡＡＶ血清型２型（ＡＡＶ２）ＤＮＡ由来のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む、実施形態２７〜３０のいずれか１つの方法。
【０３６４】
３２．ウイルスベクターは、配列番号１の配列を含む、実施形態２７〜３１のいずれか１つの方法。
【０３６５】
３３．細胞は、ウイルスベクターによる形質導入前に８〜１５回継代される、実施形態１〜３２のいずれか１つの方法。
【０３６６】
３４．ＩＦＩ−Ｃリードアウトは、タンパク質発現の測定値を反映する、実施形態１〜３３のいずれか１つの方法。
【０３６７】
３５．形質導入後に最終分化ＮＰＣをインキュベートするステップは、約６９〜７５時間にわたって実施される、実施形態１〜３４のいずれか１つの方法。
【０３６８】
３６．目的タンパク質に特異的な分子は、抗体、抗体断片又はアプタマーを含む、実施形態１〜３５のいずれか１つの方法。
【０３６９】
３７．抗体は、目的タンパク質に特異的な抗体を含む、実施形態３６の方法。
【０３７０】
３８．抗目的タンパク質抗体は、約４μｇ／ｍＬの濃度で提供される、実施形態３７の方法。
【０３７１】
３９．抗目的タンパク質抗体は、約２μｇ／ｍＬの濃度で提供される、実施形態３７の方法。
【０３７２】
４０．分子は、検出可能標識を含む、実施形態１〜３９のいずれか１つの方法。
【０３７３】
４１．最終分化ＮＰＣを洗浄して、目的タンパク質に特異的な分子を取り出すことを更に含む、実施形態１〜４０のいずれか１つの方法。
【０３７４】
４２．最終分化ＮＰＣを、目的タンパク質に特異的な分子を特異的に認識する第２の分子に接触させることを更に含む、実施形態１〜３８のいずれか１つの方法。
【０３７５】
４３．第２の分子は、検出可能標識を含む、実施形態４２の方法。
【０３７６】
４４．第２の分子は、抗体、抗体断片又はアプタマーを含む、実施形態４２又は４３の方法。
【０３７７】
４５．最終分化ＮＰＣは、固定及び透過処理するステップ後、抗核検出可能標識に接触される、実施形態１〜４４のいずれか１つの方法。
【０３７８】
４６．最終分化ＮＰＣは、固体表面上にある、実施形態１〜４５のいずれか１つの方法。
【０３７９】
４７．固体表面は、ポリ−Ｄ−リジンでコートされている、実施形態４６の方法。
【０３８０】
４８．最終分化ＮＰＣは、２０，０００細胞／ウェルの密度で播種される、実施形態４６又は４７の方法。
【０３８１】
４９．目的タンパク質のレベルの用量依存的増加の定量的測定を可能にする、実施形態１〜４８のいずれか１つの方法。
【０３８２】
５０．ａ．ウイルスベクターで形質導入される能力を有する複数の細胞；
ｂ．目的タンパク質をコードするウイルスベクター；
ｃ．目的タンパク質と結合する能力を有する第１の分子；
ｄ．第１の分子と結合する能力を有する第２の分子であって、検出可能標識を含む第２の分子；及び
ｅ．イメージングアッセイにおける使用に関する説明書
を含むキット。
【０３８３】
５１．複数の細胞は、神経前駆細胞（ＮＰＣ）を含む、実施形態５０のキット。
【０３８４】
５２．ＮＰＣは、ＳＭＮ１−／−突然変異に関してホモ接合である、実施形態５１のキット。
【０３８５】
５３．ＳＭＮ１−／−突然変異は、エクソン７の欠失（Δ７）である、実施形態５１のキット。
【０３８６】
５４．ウイルスベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／ニワトリβ−アクチンハイブリッドプロモーター（ＣＢ）の制御下でＳＭＮ１タンパク質を発現するｃＤＮＡと、ＡＡＶ血清型２型（ＡＡＶ２）ＤＮＡ由来の２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）とを含むアデノ随伴ウイルス血清型９型（ＡＡＶ９）である、実施形態５０〜５３のいずれか１つのキット。
【０３８７】
５５．第１の分子は、抗ＳＭＮ１抗体を含む、実施形態５０〜５４のいずれか１つのキット。
【０３８８】
５６．第２の分子は、前記第１の分子に特異的な抗体を含む、実施形態５０〜５５のいずれか１つのキット。
【０３８９】
５７．第２の分子は、検出可能標識を含む、実施形態５６のキット。
【０３９０】
５８．目的タンパク質は、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）タンパク質である、実施形態５０〜５７のいずれか１つのキット。
【０３９１】
５９．トランス遺伝子を含むウイルスベクターを含む医薬組成物を作製する方法であって、
ａ．トランス遺伝子を含むウイルスベクターを作製すること；
ｂ．実施形態１〜４９のいずれか１つのトランス遺伝子を測定する方法により、前記ウイルスベクターをアッセイすること；及び
ｃ．トランス遺伝子を含むウイルスベクターを医薬組成物に製剤化すること
を含む方法。
【０３９２】
６０．ウイルスベクターを作製することは、
ａ．接着細胞を培養すること；
ｂ．接着細胞にプラスミドをトランスフェクトして、ＡＡＶウイルスベクターの産生を可能にすること；
ｃ．接着細胞を溶解させてＡＡＶウイルスベクターを単離すること；
ｄ．（ｃ）の細胞ライセートを酸性化及び清澄化すること；
ｅ．（ｄ）の産物を、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いて精製すること；
ｆ．（ｅ）の産物を、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を用いてろ過すること；
ｇ．（ｆ）の産物を塩化セシウム（ＣｓＣｌ）緩衝液中で超遠心すること；及び
ｈ．（ｇ）の産物からＡＡＶウイルスベクターを収集すること
を含む、実施形態５９の方法。
【０３９３】
６１．ＡＡＶは、ＡＡＶ９である、実施形態６０の方法。
【０３９４】
６２．ＡＡＶは、自己相補的（ｓｃＡＡＶ）である、実施形態６０又は６１の方法。
【０３９５】
６３．接着細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である、実施形態６０〜６１のいずれか１つの方法。
【０３９６】
６４．接着細胞は、培養前に接着性に関して選択される、実施形態６０〜６３のいずれか１つの方法。
【０３９７】
６５．選択は、接着細胞を複数回継代培養して、接着性に関して選択することを含む、実施形態６０〜６４のいずれか１つの方法。
【０３９８】
６６．接着細胞は、培養用バイオリアクターに播種される、実施形態６０〜６５のいずれか１つの方法。
【０３９９】
６７．バイオリアクターは、細胞培養培地の連続循環を提供することができる大規模バイオリアクターである、実施形態６６の方法。
【０４００】
６８．バイオリアクターは、２００ｍ２、３３３ｍ２又は５００ｍ２バイオリアクターである、実施形態６６又は６７の方法。
【０４０１】
６９．接着細胞は、再循環培地バッグ内の培地に加えられ、且つバイオリアクターを通して循環される、実施形態６６〜６８のいずれか１つの方法。
【０４０２】
７０．細胞は、蠕動ポンプを用いて循環される、実施形態６９の方法。
【０４０３】
７１．蠕動ポンプ輸送は、接着細胞が培養用バイオリアクターに播種される間、連続的である、実施形態７０の方法。
【０４０４】
７２．播種密度は、約８，０００〜１２，０００細胞／ｃｍ２である、実施形態７１の方法。
【０４０５】
７３．トランスフェクションステップは、再循環培地バッグにトランスフェクション培地を加え、且つバイオリアクターを通してトランスフェクション培地を循環させることを含む、実施形態６０〜７２のいずれか１つの方法。
【０４０６】
７４．トランスフェクション培地は、蠕動ポンプを用いて循環される、実施形態７３の方法。
【０４０７】
７５．循環は、１５〜２５℃で行われる、実施形態７３又は７４の方法。
【０４０８】
７６．トランスフェクションステップは、接着細胞をアデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＨＥＬＰ）に接触させることを含む、実施形態６０〜７５のいずれか１つの方法。
【０４０９】
７７．トランスフェクションステップは、接着細胞を、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子をコードするプラスミドに接触させることを含む、実施形態６０〜７６のいずれか１つの方法。
【０４１０】
７８．トランスフェクトするステップは、接着細胞を、ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドに接触させることを含む、実施形態６０〜７７のいずれか１つの方法。
【０４１１】
７９．トランスフェクションステップは、接着細胞を、同じプラスミド（ｐＡＡＶ）上にＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドに接触させることを含む、実施形態６０〜７８のいずれか１つの方法。
【０４１２】
８０．ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子は、ｒｅｐ２である、実施形態７７又は実施形態７９の方法。
【０４１３】
８１．ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子は、ｃａｐ９である、実施形態７８又は７９の方法。
【０４１４】
８２．トランスフェクションステップは、接着細胞をトランスフェクション剤ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に接触させることを含む、実施形態６０〜８１のいずれか１つの方法。
【０４１５】
８３．ＰＥＩとプラスミドの少なくとも１つとの比は、重量基準で１：１未満である、実施形態８２の方法。
【０４１６】
８４．ＰＥＩとプラスミドの少なくとも１つとの比は、重量基準で約１：１である、実施形態８２の方法。
【０４１７】
８５．トランスフェクションステップは、接着細胞を、血清を含有しないトランスフェクション培地に接触させることを含む、実施形態７３〜８４のいずれか１つの方法。
【０４１８】
８６．トランスフェクションステップは、接着細胞を、カルシウムを含有しないトランスフェクション培地に接触させることを含む、実施形態６０〜８５のいずれか１つの方法。
【０４１９】
８７．トランスフェクトするステップは、接着細胞を、グルタミンを含有しないトランスフェクション培地に接触させることを含む、実施形態６０〜８６のいずれか１つの方法。
【０４２０】
８８．トランスフェクトするステップは、１０〜６０分、１０〜３０分、２０〜３０分、１５〜３０分又は３０分未満にわたって実施される、実施形態６０〜８７のいずれか１つの方法。
【０４２１】
８９．溶解させるステップは、全細胞溶解を含む、実施形態６０〜８８のいずれか１つの方法。
【０４２２】
９０．溶解させるステップは、エンドヌクレアーゼを補足した溶解緩衝液を使用することを含む、実施形態６０〜８９のいずれか１つの方法。
【０４２３】
９１．エンドヌクレアーゼは、ベンゾナーゼである、実施形態９０の方法。
【０４２４】
９２．溶解させるステップは、ＴＷＥＥＮを補足した溶解緩衝液を使用することを含む、実施形態６０〜９１のいずれか１つの方法。
【０４２５】
９３．溶解させるステップは、１５〜２５℃で実施される、実施形態６０〜９２のいずれか１つの方法。
【０４２６】
９４．ステップ（ｃ）の細胞ライセートを（ｄ）の酸性化ステップ前に凍結することを更に含む、実施形態６０〜９３のいずれか１つの方法。
【０４２７】
９５．ＣｓＣｌ緩衝液は、２〜４Ｍ  ＣｓＣｌ緩衝液である、実施形態６０〜９４のいずれか１つの方法。
【０４２８】
９６．ＣｓＣｌは、約３Ｍの濃度である、実施形態６０〜９４のいずれか１つの方法。
【０４２９】
９７．（ｉ）（ｇ）の産物を、タンジェンシャルフローろ過を通してろ過することを更に含む、実施形態６０〜９６のいずれか１つの方法。
【０４３０】
９８．酸性化ステップは、細胞ライセートを約３．０〜４．０、約３．３〜３．７又は約３．４〜３．６のｐＨに酸性化することを含む、実施形態６０〜９８のいずれか１つの方法。
【０４３１】
９９．酸性化ステップは、細胞ライセートを約３．５のｐＨに酸性化することを含む、実施形態９８の方法。
【０４３２】
１００．超遠心は、約４０，０００〜５０，０００ｒｐｍ又は約４３，０００〜４６，０００ｒｐｍで実施される、実施形態６０〜９９のいずれか１つの方法。
【０４３３】
１０１．超遠心は、１５〜２５℃で実施される、実施形態６０〜１００のいずれか１つの方法。
【０４３４】
１０２．超遠心は、１６〜２４時間又は２０〜２４時間にわたって実施される、実施形態６０〜１０１のいずれか１つの方法。
【０４３５】
１０３．細胞ライセートは、酸性化ステップ前にＴｗｅｅｎと共にインキュベートされる、実施形態６０〜１０２のいずれか１つの方法。
【０４３６】
１０４．細胞ライセートは、酸性化ステップ前にＴｗｅｅｎと共に約８〜２０時間にわたってインキュベートされる、実施形態６０〜１０３のいずれか１つの方法。
【０４３７】
１０５．清澄化ステップは、細胞ライセートを、デプスフィルタを通してろ過することを含む、実施形態６０〜１０４のいずれか１つの方法。
【０４３８】
１０６．清澄化ステップは、細胞ライセートを、０．４５ミクロンフィルタを通してろ過することを含む、実施形態６０〜１０５のいずれか１つの方法。
【０４３９】
１０７．ＣＥＸは、スルホニル樹脂を含む、実施形態６０〜１０６のいずれか１つの方法。
【０４４０】
１０８．少なくとも１つのＴＦＦステップは、３００ｋＤａ  ＭＷの分子量カットオフのセルロース膜を使用することを含む、実施形態６０〜１０７のいずれか１つの方法。
【０４４１】
１０９．ＴＦＦステップは、陽イオン交換ステップの溶出液容積を少なくとも６分の１に減少させる、実施形態６０〜１０８のいずれか１つの方法。
【０４４２】
１１０．ＣｓＣｌ緩衝液は、トリス、ＭｇＣｌ２及びポロキサマー１８８を含む、実施形態６０〜１０９のいずれか１つの方法。
【０４４３】
１１１．ＣｓＣｌ緩衝液は、約２０ｍＭトリスを含む、実施形態１１０の方法。
【０４４４】
１１２．ＣｓＣｌ緩衝液は、約２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む、実施形態１１０又は１１１の方法。
【０４４５】
１１３．ＣｓＣｌ緩衝液は、ポロキサマー１８８、任意選択で約０．２％ｗ／ｖポロキサマー１８８を含む、実施形態１１０〜１１２のいずれか１つの方法。
【０４４６】
１１４．ＣｓＣｌ緩衝液は、約ｐＨ７．５〜８．５又は約ｐＨ７．９〜８．２である、実施形態６０〜１１３のいずれか１つの方法。
【０４４７】
１１５．空のウイルスカプシドの数は、超遠心された細胞ライセートからＡＡＶウイルスベクターを収集した後、総ウイルスカプシドの７％未満、５％未満、３％未満又は１％未満である、実施形態６０〜１１４のいずれか１つの方法。
【０４４８】
１１６．空のウイルスカプシドの数は、分析的超遠心法（ＡＵＣ）によって測定される、実施形態１１５の方法。
【０４４９】
１１７．ＡＡＶウイルスベクターは、超遠心された細胞ライセートからシリンジを用いて収集される、実施形態６０〜１１６のいずれか１つの方法。
【０４５０】
１１８．第２のＴＦＦステップ後に収集されるＡＡＶウイルスベクターは、トリス、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ及びポロキサマー１８８を含む溶液中に貯蔵される、実施形態６０〜１１７のいずれか１つの方法。
【０４５１】
１１９．溶液は、約２０ｍＭトリスを含む、実施形態１１８の方法。
【０４５２】
１２０．溶液は、約１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む、実施形態１１８又は１１９の方法。
【０４５３】
１２１．溶液は、約２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む、実施形態１１８〜１２０のいずれか１つの方法。
【０４５４】
１２２．溶液は、約０．００５％ｗ／ｖポロキサマー１８８を含む、実施形態１１８〜１２１のいずれか１つの方法。
【０４５５】
１２３．溶液は、約ｐＨ７．５〜８．５又は約ｐＨ７．７〜８．３である、実施形態１１８〜１２２のいずれか１つの方法。
【０４５６】
１２４．第２のＴＦＦ後に収集されるＡＡＶウイルスベクターは、約３０μｇ／ｇ未満又は約２０μｇ／ｇ未満のＣｓＣｌを含有する、実施形態６０〜１２３のいずれか１つの方法。
【０４５７】
１２５．第２のＴＦＦ後に収集されるＡＡＶウイルスベクターの濃度は、約３×１０１３ｖｇ／ｍｌ以上である、実施形態６０〜１２４のいずれか１つの方法。
【０４５８】
１２６．宿主細胞タンパク質及び／又は宿主細胞ＤＮＡは、細胞ライセートからデタージェントによるフロキュレーションを用いて除去される、実施形態６０〜１２５のいずれか１つの方法。
【０４５９】
１２７．ＡＡＶウイルスベクターは、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態６０〜１２０のいずれか１つの方法。
【０４６０】
１２８．ＳＭＮタンパク質をコードするプラスミド、ｐＡＡＶをコードするプラスミド及びｐＨＥＬＰをコードするプラスミドは、１：１：１の比でトランスフェクトされる、実施形態７６〜１２７のいずれか１つの方法。
【０４６１】
１２９．医薬組成物は、
ａ．１〜８×１０１３ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）；
ｂ．約７％未満の空のウイルスカプシド；
ｃ．１×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約１００ｎｇ／ｍＬ未満の宿主細胞タンパク質；
ｄ．１×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約５×１０６ｐｇ／ｍＬ未満の残留宿主細胞ＤＮＡ
を含み、１〜８×１０１３ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬの少なくとも約８０％は、機能性である、実施形態６０〜１２８のいずれか１つの方法。
【０４６２】
１３０．医薬組成物は、１．７〜２．３×１０１３ＡＡＶ９  ｖｇ／ｍＬ又は１．９〜２．１×１０１３ＡＡＶ９  ｖｇ／ｍＬを含む、実施形態１２９の方法。
【０４６３】
１３１．医薬組成物は、約２×１０１３ＡＡＶ９  ｖｇ／ｍＬを含む、実施形態１２９の方法。
【０４６４】
１３２．医薬組成物は、約５％未満の空のカプシド、約３％未満の空のカプシド又は約１％未満の空のカプシドを含む、実施形態１２９〜１３１のいずれか１つの方法。
【０４６５】
１３３．医薬組成物は、１〜２×１０１４ｖｇのＡＡＶ９ウイルスベクター又は１．１×１０１４ｖｇのＡＡＶ９ウイルスベクターを含むか又はそれからなる、実施形態１２９〜１３２のいずれか１つの方法。
【０４６６】
１３４．医薬組成物は、１．７×１０１４ｖｇのＡＡＶ９ウイルスベクターからなる、実施形態１２９〜１３２のいずれか１つの方法。
【０４６７】
１３５．医薬組成物は、水性医薬製剤である、実施形態１２９〜１３４のいずれか１つの方法。
【０４６８】
１３６．製剤は、トリス緩衝液、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム及びポロキサマーを含み、医薬組成物は、保存剤を含まない、実施形態１３５の方法。
【０４６９】
１３７．ポロキサマーは、ポロキサマー１８８を含む、実施形態１３６の方法。
【０４７０】
１３８．製剤のｐＨは、約７．７〜約８．３である、実施形態１３５〜１３７のいずれか１つの方法。
【０４７１】
１３９．ｐＨは、約ｐＨ８．０である、実施形態１３８の方法。
【０４７２】
１４０．塩化マグネシウム濃度は、約０．５〜１．５ｍＭである、実施形態１３６〜１３９のいずれか１つの方法。
【０４７３】
１４１．塩化マグネシウム濃度は、約１ｍＭである、実施形態１４０の方法。
【０４７４】
１４２．塩化ナトリウム濃度は、約１００〜３００ｍＭである、実施形態１３６〜１４１のいずれか１つの方法。
【０４７５】
１４３．塩化ナトリウム濃度は、約２００ｍＭである、実施形態１４２の方法。
【０４７６】
１４４．製剤は、約０．００５％ｗ／ｖポロキサマー１８８を含む、実施形態１３６〜１４３のいずれか１つの方法。
【０４７７】
１４５．製剤は、３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、実施形態１３６〜１４４のいずれか１つの方法。
【０４７８】
１４６．医薬製剤は、
ａ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．０９ｎｇ未満のベンゾナーゼ、
ｂ．約３０μｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満のセシウム、
ｃ．約２０〜８０ｐｐｍのポロキサマー１８８、
ｄ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．２２ｎｇ未満のＢＳＡ、
ｅ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約６．８×１０５ｐｇ未満の残留プラスミドＤＮＡ、
ｆ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約１．１×１０５ｐｇ未満の残留ｈｃＤＮＡ、
ｇ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約４ｎｇ未満のｒＨＣＰ、
ｈ．約ｐＨ７．７〜８．３、
ｉ．約３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、
ｊ．１容器当たり約６００個未満の、≧２５μｍのサイズの粒子、
ｋ．１容器当たり約６０００個未満の、≧１０μｍのサイズの粒子、
ｌ．約１．７×１０１３〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価、
ｍ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約３．９×１０８〜８．４×１０１０ＩＵの感染力価、
ｎ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約１００〜３００μｇの全タンパク質、
ｏ．約７０〜１３０％の相対効力、及び
ｐ．約５％未満の空のカプシド
の少なくとも１つを含む、実施形態６０〜１４５のいずれか１つの方法。
【０４７９】
１４７．医薬製剤は、
ａ．約ｐＨ７．７〜８．３、
ｂ．約３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、
ｃ．１容器当たり約６００個未満の、≧２５μｍのサイズの粒子、
ｄ．１容器当たり約６０００個未満の、≧１０μｍのサイズの粒子、
ｅ．約１．７×１０１３〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価、
ｆ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約３．９×１０８〜８．４×１０１０ＩＵの感染力価、
ｇ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約１００〜３００μｇの全タンパク質、
ｈ．約２０〜８０ｐｐｍのＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８含有量、
ｉ．約７０〜１３０％の相対効力、
ｊ．７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で２４日以上のデルタ７ＳＭＮマウスモデルにおける生存期間中央値、
ｋ．約５％未満の空のカプシド、及び
ｌ．約９５％以上の総純度、並びに
ｍ．約０．７５ＥＵ／ｍＬ以下のエンドトキシン
の少なくとも１つを含む、実施形態６０〜１４５のいずれか１つの方法。
【０４８０】
１４８．医薬製剤は、
ａ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．０９ｎｇ未満のベンゾナーゼ、
ｂ．約３０μｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満のセシウム、
ｃ．約２０〜８０ｐｐｍのポロキサマー１８８、
ｄ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．２２ｎｇ未満のＢＳＡ、
ｅ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約６．８×１０５ｐｇ未満の残留プラスミドＤＮＡ、
ｆ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約１．１×１０５ｐｇ未満の残留ｈｃＤＮＡ、及び
ｇ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約４ｎｇ未満のｒＨＣＰ
の少なくとも１つを含む、実施形態６０〜１４５のいずれか１つの方法。
【０４８１】
１４９．ウイルスベクターの相対効力は、参照標準品と比べて少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％又は少なくとも１４０％である、実施形態５９〜１４８のいずれか１つの方法。
【０４８２】
１５０．ウイルスベクターの相対効力は、参照標準品と比べて少なくとも９０％である、実施形態５９〜１４８のいずれか１つの方法。
【０４８３】
１５１．医薬製剤中のウイルスベクターの効力は、参照標準品の効力の５％以内、参照標準品の効力の１０％以内又は参照標準品の効力の２０％以内である、実施形態５９〜１４８のいずれか１つの方法。
【０４８４】
１５２．トランス遺伝子を含むウイルスベクターを含む療法を用いて、治療を、それを必要としている患者に行う方法であって、
ａ．実施形態１〜４９のいずれか１つについてのトランス遺伝子発現を測定する方法により、トランス遺伝子を含む前記ウイルスベクターをアッセイすること；及び
ｂ．トランス遺伝子を含むウイルスベクターを前記患者に投与すること
を含む方法。
【０４８５】
１５３．ウイルスベクターは、医薬組成物に製剤化される、実施形態１５２の方法。
【０４８６】
１５４．医薬組成物は、
ａ．１〜８×１０１３ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）；
ｂ．約７％未満の空のウイルスカプシド；
ｃ．１×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約１００ｎｇ／ｍＬ未満の宿主細胞タンパク質；及び
ｄ．１×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約５×１０６ｐｇ／ｍＬ未満の残留宿主細胞ＤＮＡ
を含み、１〜８×１０１３ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬの少なくとも約８０％は、機能性である、実施形態１４６の方法。
【０４８７】
１５５．それを必要としている患者は、ＳＭＡ、例えば脊髄性筋萎縮症Ｉ型（ＳＭＡ）を有する、実施形態１５２〜１５４のいずれか１つの方法。
【０４８８】
１５６．それを必要としている患者は、
ａ．２歳以下、任意選択で生後９ヵ月以下であり；
ｂ．少なくとも約２．６ｋｇの体重を有し；
ｃ．両アレル性ＳＭＮ１ヌル突然変異又は欠失を有し；及び
ｄ．ＳＭＮ２の少なくとも１つの機能性コピーを有する、実施形態１５５の方法。
【０４８９】
１５７．組成物は、髄腔内又は静脈内経路によって患者に投与される、実施形態１５３〜１５６のいずれか１つの方法。
【０４９０】
１５８．ウイルスベクターは、約１〜２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５２〜１５７のいずれか１つの方法。
【０４９１】
１５９．ウイルスベクターは、約１．１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１５２〜１５７のいずれか１つの方法。
【０４９２】
１６０．ウイルスベクターゲノムの量は、ｄｄＰＣＲを用いて測定される、実施形態１５８又は１５９の方法。
【０４９３】
１６１．患者は、約１３．５ｋｇ以下、任意選択で約８．５ｋｇ以下の体重を有する、実施形態１５５〜１６０のいずれか１つの方法。
【０４９４】
１６２．患者は、ＳＭＮ２遺伝子の少なくとも１つのコピーのエクソン７にｃ．８５９Ｇ＞Ｃ置換を有しない、実施形態１５５〜１６１のいずれか１つの方法。
【０４９５】
１６３．治療は、２歳より前、任意選択で生後６ヵ月より前に患者に投与される、実施形態１５５〜１６２のいずれか１つの方法。
【０４９６】
１６４．治療は、筋緊張低下、運動技能遅滞、定頸不全、円背姿勢及び関節過度可動性から選択される１つ以上のＳＭＡ症状の発症前に患者に投与される、実施形態１５５〜１６３のいずれか１つの方法。
【０４９７】
１６５．患者は、投与前にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定される１：１００又は１：５０以下の抗ＡＡＶ９抗体力価を有する、実施形態１５５〜１６４のいずれか１つの方法。
【０４９８】
１６６．患者は、投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定される１：１００を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、且つ約１〜８週間にわたって又は力価が１：１００未満に低下するまでモニタされる、実施形態１５５〜１６４のいずれか１つの方法。
【０４９９】
１６７．患者は、投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定される１：１００を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、且つ約１〜８週間にわたって又は力価が１：５０未満に低下するまでモニタされる、実施形態１５５〜１６４のいずれか１つの方法。
【０５００】
１６８．患者は、投与前又は投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定される１：１００を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、且つ人工栄養に切り換えられる、実施形態１５５〜１６４のいずれか１つの方法。
【０５０１】
１６９．患者は、投与前又は投与後に人工栄養に切り換えられる、実施形態１６８の方法。
【０５０２】
１７０．患者は、投与前又は投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定される１：５０を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、且つ人工栄養に切り換えられる、実施形態１５５〜１６４のいずれか１つの方法。
【０５０３】
１７１．患者は、投与前又は投与後に人工栄養に切り換えられる、実施形態１７０の方法。
【０５０４】
１７２．患者は、投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定される１：１００を上回る又は１：５０を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、且つプラスマフェレーシスを用いて治療される、実施形態１５５〜１７１のいずれか１つの方法。
【０５０５】
１７３．患者は、投与前に約６７，０００細胞／ｍｌを上回る、又は約１００，０００細胞／ｍｌを上回る、又は約１５０，０００細胞／ｍｌを上回る血小板数を有する、実施形態１５５〜１７２のいずれか１つの方法。
【０５０６】
１７４．患者は、投与後に約６７，０００細胞／ｍｌを下回る、又は約１００，０００細胞／ｍｌを下回る、又は約１５０，０００細胞／ｍｌを下回る血小板数を有し、且つ約１〜８週間にわたって又は血小板数が約６７，０００細胞／ｍｌに増加するまで、若しくは約１００，０００細胞／ｍｌを上回って増加するまで、若しくは約１５０，０００細胞／ｍｌを上回って増加するまでモニタされる、実施形態１５５〜１７３のいずれか１つの方法。
【０５０７】
１７５．患者は、投与後に約６７，０００細胞／ｍｌを下回る血小板数を有し、且つ血小板輸血で治療される、実施形態１５５〜１７４のいずれか１つの方法。
【０５０８】
１７６．患者は、投与前に血小板減少症を有しない、実施形態１５５〜１７５のいずれか１つの方法。
【０５０９】
１７７．患者は、投与後に血小板減少症を有し、且つ約１〜８週間にわたって又は患者が血小板減少症を有しなくなるまでモニタされる、実施形態１５５〜１７５のいずれか１つの方法。
【０５１０】
１７８．患者は、投与後に血小板減少症を有し、且つ血小板輸血で治療される、実施形態１５５〜１７５のいずれか１つの方法。
【０５１１】
１７９．患者は、ウイルスベクターの投与前に約０．１７６ｕｇ／ｍｌ未満のトロポニン−Ｉレベルを有する、実施形態１５５〜１７８のいずれか１つの方法。
【０５１２】
１８０．患者におけるトロポニン−Ｉのレベルは、ウイルスベクターの投与後にモニタされる、実施形態１５５〜１７９のいずれか１つの方法。
【０５１３】
１８１．モニタリングは、投与後、患者におけるトロポニン−Ｉレベルが約０．１７６ｕｇ／ｍｌ未満になるまで実施される、実施形態１７９又は実施形態１８０の方法。
【０５１４】
１８２．患者は、投与前に正常な肝機能を有する、実施形態１５５〜１８１のいずれか１つの方法。
【０５１５】
１８３．患者は、投与前に約８〜４０Ｕ／Ｌ未満の肝トランスアミナーゼレベルを有する、実施形態１８２の方法。
【０５１６】
１８４．肝トランスアミナーゼは、アラニントランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＬＴ）及びこれらの組み合わせから選択される、実施形態１８３の方法。
【０５１７】
１８５．患者は、投与前に３．０ｍｇ／ｄＬ未満のビリルビンレベル、１．８ｍｇ／ｄＬ未満のクレアチニンレベル、８〜１８ｇ／ｄＬのＨｇｂレベル及び／又は約２００００／ｍｍ３未満の白血球数を有する、実施形態１５５〜１８４のいずれか１つの方法。
【０５１８】
１８６．ウイルスベクターは、トリス緩衝生理食塩水中で投与される、実施形態１５５〜１８５のいずれか１つの方法。
【０５１９】
１８７．ウイルスベクターは、約５〜２０ｍＬ／ｋｇ、約１０〜２０ｍＬ／ｋｇ又は約５．５〜６．５ｍＬ／ｋｇのトリス緩衝生理食塩水中で投与される、実施形態１５５〜１８６のいずれか１つの方法。
【０５２０】
１８８．ウイルスベクターは、約４５〜７５分にわたって注入される、実施形態１５５〜１８７のいずれか１つの方法。
【０５２１】
１８９．ウイルスベクターは、約６０分にわたって注入される、実施形態１５５〜１８８のいずれか１つの方法。
【０５２２】
１９０．注入は、シリンジポンプを含む、実施形態１８８又は実施形態１８９の方法。
【０５２３】
１９１．患者は、ウイルスベクターを投与する少なくとも２４時間前に経口ステロイド薬を投与される、実施形態１５５〜１８９のいずれか１つの方法。
【０５２４】
１９２．患者は、ウイルスベクターを投与した後、少なくとも３０日間にわたって経口ステロイド薬を投与される、実施形態１５５〜１９１のいずれか１つの方法。
【０５２５】
１９３．経口ステロイド薬は、１日１回投与される、実施形態１９２の方法。
【０５２６】
１９４．経口ステロイド薬は、１日２回投与される、実施形態１９３の方法。
【０５２７】
１９５．患者は、ウイルスベクターの投与後、ＡＬＴ及び／又はＡＳＴのレベルの上昇に関してモニタされ、経口ステロイド薬は、３０日後、ＡＳＴ及び／又はＡＬＴレベルが正常上限の２倍を下回るか又は約１２０ＩＵ／Ｌを下回るまで継続して投与される、実施形態１９１〜１９４のいずれか１つの方法。
【０５２８】
１９６．患者は、ＡＳＴ及び／又はＡＬＴレベルが正常上限の２倍を下回るか又は約１２０ＩＵ／Ｌを下回るまで経口ステロイド薬を投与される、実施形態１９１〜１９５のいずれか１つの方法。
【０５２９】
１９７．経口ステロイド薬は、約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１９１〜１９５のいずれか１つの方法。
【０５３０】
１９８．ＡＳＴ及びＡＬＴが正常上限の２倍を下回るか又は約１２０ＩＵ／Ｌを下回った後、経口ステロイド薬投与を漸減することを更に含む、実施形態１９１〜１９７のいずれか１つの方法。
【０５３１】
１９９．漸減することは、２週間で０．５ｍｇ／ｋｇ／日まで、続いて更に２週間で０．２５ｍｇ／ｋｇ／日までの段階的増加を含む、実施形態１９８の方法。
【０５３２】
２００．経口ステロイド薬を約１ｍｇ／ｋｇの用量で３０日間にわたって投与し、且つその後、２週間で０．５ｍｇ／ｋｇ／日まで、続いて更に２週間で０．２５ｍｇ／ｋｇ／日まで漸減することを含む、実施形態１９１〜１９８のいずれか１つの方法。
【０５３３】
２０１．経口ステロイド薬は、プレドニゾロン又は均等物である、実施形態１９１〜２００のいずれか１つの方法。
【０５３４】
２０２．患者に筋エンハンサー又は神経保護剤を投与することを含む、実施形態１５５〜２０１のいずれか１つの方法。
【０５３５】
２０３．ＳＭＮを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与することを含む、実施形態１５５〜２０２のいずれか１つの方法。
【０５３６】
２０４．患者にヌシネルセンを投与することを含む、実施形態１５５〜２０３のいずれか１つの方法。
【０５３７】
２０５．患者にスタムルマブを投与することを含む、実施形態１５５〜２０４のいずれか１つの方法。
【０５３８】
２０６．有効性は、ＣＨＯＰ−ＩＮＴＥＮＤ尺度を用いて決定される、実施形態１５５〜２０５のいずれか１つの方法。
【０５３９】
２０７．患者は、疾患発症を伴うか又は伴わない、実施形態１５５〜２０６のいずれか１つの方法。
【０５４０】
２０８．ａ．患者の体重を決定すること；
ｂ．ＡＡＶ９ウイルスベクター医薬組成物のバイアルを含むキットを入手することであって、各バイアルにおけるウイルスベクター濃度は、約２．０×１０１３ｖｇ／ｍＬであり；
キットにおけるバイアルの数及び容積は、患者の体重が２．６〜３ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの組成物で２バイアル、患者が３．１〜３．５ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの組成物で２バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの組成物で１バイアル、患者が３．６〜４．０ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの組成物で１バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの組成物で２バイアル、患者が４．１〜４．５ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの組成物で３バイアル、患者が４．６〜５．０ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの組成物で２バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの組成物で２バイアル、患者が５．１〜５．５ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの組成物で１バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの組成物で３バイアル、患者が５．６〜６．０ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの組成物で４バイアル、患者が６．１〜６．５ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの組成物で２バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの組成物で３バイアル、患者が６．６〜７．０ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの組成物で１バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの組成物で４バイアル、患者が７．１〜７．５ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの組成物で５バイアル、患者が７．６〜８．０ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの組成物で２バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの組成物で４バイアル、患者が８．１〜８．５ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの組成物で１バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの組成物で５バイアル、患者が８．６〜９．０ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの組成物で６バイアル、患者が９．１〜９．５ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの組成物で２バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの組成物で５バイアル、患者が９．６〜１０．０ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの組成物で１バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの組成物で６バイアル、患者が１０．１〜１０．５ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの組成物で７バイアル、患者が１０．６〜１１．０ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの組成物で２バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの組成物で６バイアル、患者が１１．１〜１１．５ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの組成物で１バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの組成物で７バイアル、患者が１１．６〜１２．０ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの組成物で８バイアル、患者が１２．１〜１２．５ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの組成物で２バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの組成物で７バイアル、患者が１２．６〜１３．０ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの組成物で１バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの組成物で８バイアル及び患者が１３．１〜１３．５ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの組成物で９バイアルからなる群から選択される、入手すること；及びｃ．バイアルからＡＡＶ９ウイルスベクターを患者に投与すること
を含む、実施形態１５５〜２０７のいずれか１つの方法。
【０５４１】
２０９．ＡＡＶウイルスベクターは、約１．０×１０１４〜２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量での注入によって投与される、実施形態２０８の方法。
【０５４２】
２１０．ＡＡＶウイルスベクターは、約１．１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量での注入によって投与される、実施形態２０８又は２０９の方法。
【０５４３】
２１１．ウイルスベクターは、約４５〜７０分にわたって注入される、実施形態２０９又は２１０の方法。
【０５４４】
２１２．ウイルスベクターは、約６０分にわたって注入される、実施形態２０９〜２１１のいずれか１つの方法。
【０５４５】
２１３．注入は、シリンジポンプを含む、実施形態２０９〜２１２のいずれか１つの方法。
【０５４６】
２１４．ウイルスベクターゲノムの量は、ｄｄＰＣＲを用いて測定される、実施形態２０９〜２１３のいずれか１つの方法。
【０５４７】
２１５．ＡＡＶ９ウイルスベクターの用量力価は、ｄｄＰＣＲによって測定される、実施形態２０９〜２１４のいずれか１つの方法。
【０５４８】
２１６．患者が２．６〜３．０ｋｇの体重であるときに１６．５ｍＬ、患者が３．１〜３．５ｋｇの体重であるときに１９．３ｍＬ、患者が３．６〜４．０ｋｇの体重であるときに２２．０ｍＬ、患者が４．１〜４．５ｋｇの体重であるときに２４．８ｍＬ、患者が４．６〜５．０ｋｇの体重であるときに２７．５ｍＬ、患者が５．１〜５．５ｋｇの体重であるときに３０．３ｍＬ、患者が５．６〜６．０ｋｇの体重であるときに３３．０ｍＬ、患者が６．１〜６．５ｋｇの体重であるときに３５．８ｍＬ、患者が６．６〜７．０ｋｇの体重であるときに３８．５ｍＬ、患者が７．１〜７．５ｋｇの体重であるときに４１．３ｍＬ、患者が７．６〜８．０ｋｇの体重であるときに４４．０、患者が８．１〜８．５ｋｇの体重であるときに４６．８ｍＬ、患者が８．６〜９．０ｋｇの体重であるときに４９．５、患者が９．１〜９．５ｋｇの体重であるときに５２．３ｍＬ、患者が９．６〜１０．０ｋｇの体重であるときに５５．０、患者が１０．１〜１０．５ｋｇの体重であるときに５７．８ｍＬ、患者が１０．６〜１１．０ｋｇの体重であるときに６０．５、患者が１１．１〜１１．５ｋｇの体重であるときに６３．３ｍＬ、患者が１１．６〜１２．０ｋｇの体重であるときに６６．０、患者が１２．１〜１２．５ｋｇの体重であるときに６８．８ｍＬ、患者が１２．６〜１３．０ｋｇの体重であるときに７１．５及び患者が１３．１〜１３．５ｋｇの体重であるときに７４．３ｍＬの用量容積を投与することを含む、実施形態１５５〜２１５のいずれか１つの方法。
【０５４９】
２１７．医薬組成物は、
ａ．修飾ＡＡＶ２  ＩＴＲと、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーターと、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサーと、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロンと、ＳＭＮ１ポリペプチドをコードする配列と、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルと、非修飾ＡＡＶ２  ＩＴＲとを含む自己相補的ＡＡＶ９ウイルスベクター；
ｂ．ｐＨ８．０の２０ｍＭトリス；
ｃ．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２；
ｄ．２００ｍＭ  ＮａＣｌ；及び
ｅ．０．００５％ポロキサマー１８８
を含み、患者は、２歳未満である、実施形態１５５〜２１６のいずれか１つの方法。
【０５５０】
２１８．組成物は、保存剤を含まない、実施形態２１７の方法。
【０５５１】
２１９．ウイルスベクターの相対効力は、参照標準品と比べて少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％又は少なくとも１４０％である、実施形態１５２〜２１８のいずれか１つの方法。
【０５５２】
２２０．ウイルスベクターの相対効力は、参照標準品と比べて少なくとも９０％である、実施形態１５２〜２１８のいずれか１つの方法。
【０５５３】
２２１．医薬製剤中のウイルスベクターの効力は、参照標準品の効力の５％以内、参照標準品の効力の１０％以内又は参照標準品の効力の２０％以内である、実施形態１５２〜２１８のいずれか１つの方法。
【実施例】
【０５５４】
実施例１：マウスΔ７細胞の作成
目的
本手順は、アッセイ適格性確認、バリデーション、製造された遺伝子置換薬物物質の出荷及び安定性検査において使用するための、マウス初代神経前駆細胞（ｍＮＰＣ）から作り出される細胞株及びバンクの作成について記載する。
【０５５５】
範囲
本手順は、特に、ヒトＩ型ＳＭＡ疾患に似たＩ型脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）疾患につながるＳＭＮ遺伝子からのエクソン７の欠失を有するＳＭＡΔ７マウスに由来するＳＭＮ１タンパク質の発現が欠損したマウス初代神経前駆細胞株の作成に適用される。
【０５５６】
手順
初代神経前駆細胞（ＮＰＣ）の作成
胎生１４±２日目（Ｅ１４±２）の妊娠Δ７（＋／−）マウスに致死量のイソフルランを与えた。腹部をエタノールで拭いた後、ハサミで開腹し、胚を取り出した。冷ハンクス平衡緩衝生理食塩水（ＨＢＳＳ）の層を有するペトリ皿に胚を置いた。胚は一度に１つずつ、ハサミで切り、清潔なペトリ皿に置き、且つ鉗子で羊膜嚢から取り出すことによって摘出した。
【０５５７】
尾を取り外し、遺伝子タイピングのためエッペンドルフチューブに入れた。脳から皮質を分離し、可能な限り多くの髄膜を取り除いた。皮質を細片に切り刻み、１４ｍＬの冷ＨＢＳＳと共に１５ｍＬコニカルチューブに入れた。これらのステップ（この段落内の）を各胚について、ＤＮＡ及び細胞のコンタミネーションを防ぐため清潔な用具を使用して繰り返した。
【０５５８】
解剖した組織が入ったコニカルチューブを３００ｇで５分間遠心した。
【０５５９】
神経前駆細胞の単離
各チューブ間で清潔な吸引ピペットを使用して各コニカルチューブから緩衝溶液を吸い取った。細胞解離プロセスの一環として各サンプルに２００μＬのａｃｃｕｍａｘを加え、室温で３０分間インキュベートした。次に個々のサンプルに４００μＬの完全培地を加え、上下にピペッティングすることによって組織を研和して細胞を解離した。各サンプルでこの手順を実施した後、次のステップに移った。
【０５６０】
更なる４００μＬの完全培地を加えて総容積を１ｍＬにした。７０μｍセルストレーナーを使用して細胞を濾し、新しい１５ｍＬコニカルチューブに入れた。
【０５６１】
所定容積の細胞を所定容積のトリパンブルー染色剤（又は使用する細胞計数器に応じて均等な細胞生死判別試薬）に加え、自動細胞計数器に挿入するスライドに適切な容積を加えることにより、自動細胞計数器を使用して細胞をカウントした。
【０５６２】
個々にラベル表示したＴ−７５組織培養フラスコ内の９ｍＬの完全培地に細胞の全容積（１ｍＬ）を加え、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに置いた。マウス初代細胞をＳＭＡΔ７マウスの胚皮質から直接単離したと共に、これを継代０代目（Ｐ０）に指定した。少なくとも１つの解剖した胚からの１つ又は複数の細胞株について、それがそのエクソン７が欠失した（Δ７）ＳＭＮ１遺伝子の２つのアレルを保因していることに起因してＳＭＮ１タンパク質の発現が欠損していることを確実にするため、少なくとも４つの胚を採取して解剖した。ＳＯＰ−２６９によるＰＣＲ遺伝子タイピングにより、ホモ接合体ＳＭＮ１（Δ７）を含む細胞株を確認した。並行して下記の継代の節に記載するとおりの細胞株の継代を、１つの細胞株にＳＭＮ１  Δ７遺伝子型及び適切な細胞成長が確認されるまで継続する。残りの細胞株は廃棄し、選択された細胞株（ＳＭＮ１  Δ７）の継代を継続して、適宜１つ又は複数のマスターセルバンク及び１つ又は複数のワーキングセルバンクを作成する。
【０５６３】
細胞の継代及び凍結
【０５６４】
【表３】
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【０５６５】
ニューロスフェア
細胞を継代できるようになったところで（即ち細胞が最大推奨密度に達する前に）、インキュベーターからフラスコを取り出し、十分に混合した。
【０５６６】
細胞をフラスコから５０ｍＬコニカルチューブに移し、３００ｇで５分間遠心した。収集される培地中の細胞の容積が更に大きい場合、遠心時間を増やし得る。例えば、５０ｍＬが収集された場合、細胞は、３００ｇで８分間遠心され得る。
【０５６７】
上清を吸い取り、２００μＬのａｃｃｕｍａｘを加えた。細胞ペレットを撹拌し、１〜３回研和して、次に室温で３０分間インキュベートした。
【０５６８】
次に４００μＬの完全成長培地を加えることによってａｃｃｕｍａｘを中和し、細胞を１０〜１５回研和して単一細胞を解離した。
【０５６９】
更に４００μＬの完全培地を加えて総容積を１ｍＬとした。カウントが容易となるように、更なる容積の完全培地を加えて細胞を希釈することができた。
【０５７０】
細胞の少量のサンプルを取り出し、上記のとおり総細胞数及び生存率を決定した（トリパンブルー及び自動細胞計数器を使用）。得られた細胞を継代１代目（Ｐ１）に指定した。
【０５７１】
Ｐ１細胞懸濁液を１００，０００細胞／ｍＬに希釈し、適切な容積を（ピペットで）新規細胞培養ベッセルに移し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０５７２】
上記の継代ステップを繰り返し、継代サイクル毎に前の継代に継代数１を加えた。
【０５７３】
細胞の凍結
細胞形態、生存率、密度  細胞濃度）及び微生物汚染に関して細胞を顕微鏡で調べた後、低温バイアルに凍結した。
【０５７４】
細胞は凍結用培地に凍結し、凍結保存容器内の低温バイアルに−８０℃のフリーザーにおいて２４〜７２時間保存した。
【０５７５】
初期凍結後、バイアルは液体窒素フリーザーに移した。
【０５７６】
セルバンク化
マスターセルバンク（ＭＣＢ）
初期供給源からの細胞の拡大から且つ品質管理（ＱＣ）検査後にマスターセルバンク（ＭＣＢ）を作成し、拡大は、マスターセルバンクの作製に使用した初期供給源から継続し、それを拡大してワーキングセルバンクを確立した（図１〜図２を参照されたい）。
【０５７７】
マスターセルバンク及びワーキングセルバンクのごく一部を隔離し、他の全ての材料から離れた場所に維持した。細胞は、凍結し、次に本明細書に開示されるアッセイでの必要に応じて使用のため解凍し、継代することができる。
【０５７８】
実施例２：頑健で定量的な相対効力細胞ベースアッセイの方法開発
材料及び方法
神経前駆細胞（ＮＰＣ）の単離及び継代
胎生期約１４．５日（ｅ１４．５）のＳＭＡ  Δ７マウス系統（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）由来の胚の皮質からＮＰＣを採取した。これらの細胞をＡｃｃｕｍａｘ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中において室温で３０分間インキュベートすることによって単一細胞に解離し、５％ＣＯ２インキュベーターにおける非接着性組織培養フラスコ内のＥＧＦ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）及びｂＦＧＦ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を成長因子として含有する無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｇｉｂｃｏ）で培養した。培養時、細胞は、未分化細胞の三次元コロニーであるニューロスフェアを形成する。約３〜５日後、ニューロスフェアをＡｃｃｕｍａｘ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中において室温で３０分間インキュベートすることによって単一細胞に解離し、二次スフェアを形成させた（「継代」として知られるプロセス）。
【０５７９】
ＮＰＣの分化
ＮＰＣを最終分化させるため、ニューロスフェアをＡｃｃｕｍａｘ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中において室温で３０分間インキュベートすることによって解離し、１Ｅ＋０６細胞／ウェルで０．５ｍＬ（２４ウェルプレート、Ｆａｌｃｏｎ）又は２Ｅ＋０５細胞／ウェルで１００μＬ（９６ウェルプレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ）の成長因子なしの高血清培地に播いた。分化後２４時間で細胞は主にグリア系統に最終分化した。
【０５８０】
ｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７の形質導入
分化後２４時間で細胞から培地を取り除き、ＡＡＶ９ベクターを含む１００μＬの培地を細胞に加えた。これらの研究に使用したＡＡＶ９ベクターは、ＡＡＶ９−ｅＧＦＰバッチＳＡＢ−１３８及びＳＭＮ１コードＡＡＶ９（ＡＡＶ９−ＳＭＮ１）ベクター薬物製品バッチＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（参照標準品）、８１６８３６及び６００１５６である。
【０５８１】
ＳＭＮ１染色
指示される形質導入後時点で、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウェルにつき５０μＬのＰＢＳ（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）中４％パラホルムアルデヒドを加えることによって細胞を固定した。細胞を４％パラホルムアルデヒド中において室温（ＲＴ）で５分間インキュベートし、次に各ウェル２５０μＬのＰＢＳで洗浄した。次に、ＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して細胞をＲＴで５分間透過処理し、続いて２５０μＬのＰＢＳを使用して洗浄した。ＳＭＮ１の染色には、マウスモノクローナル抗体２Ｂ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を４μｇ／ｍＬで使用した。ＰＢＳ中１％ＢＳＡ（Ｆｉｓｈｅｒ）に希釈した５０μＬの抗体と共に細胞をＲＴで２時間インキュベートし、次に２５０μＬのＰＢＳで洗浄した。最後に、細胞を５０μＬのＰＢＳ中１％ＢＳＡ中の二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ４８８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及び核染色剤（ヘキスト３３３４２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にＲＴで１時間インキュベートした。細胞を２５０μＬのＰＢＳで洗浄した後、光学的に透明なプレートシール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でプレートを密閉し、以下に記載するとおりイメージングした。
【０５８２】
画像収集及び分析
画像の収集には、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ  ＣＸ５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、以下ＣＸ５と称する）を使用した。ＣＸ５は、マルチウェルプレート内にある単一細胞の生物学的活性の測定を可能にする自動ハイコンテントイメージング装置である。ＣＸ５は、対物レンズ及び露光時間などのパラメータを設定するためＨＣＳ  Ｓｔｕｄｉｏ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて操作される。高ダイナミックレンジの蛍光検出のため、２０倍対物レンズを使用して固定露光時間で画像を収集した。次に取り込まれた画像をＨＣＳ  Ｓｔｕｄｉｏを用いて分析した。ＨＣＳ  Ｓｔｕｄｉｏは、アルゴリズム及びフィルタのセットを用いて核染色を用いて各細胞を画定し、次にこの核染色をシードとして用いて細胞を同定する。ＳＭＮ１染色後の各細胞の範囲内での積分蛍光強度をＨＣＳ  Ｓｔｕｄｉｏを用いて分析した。このソフトウェアは、各ウェルの全細胞集団にわたる測定値の平均値も計算し、これはウェルの範囲内での生物学的変化に相当する。データ分析には、ＳＭＮ１タンパク質発現の測定値として１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）を使用した。
【０５８３】
結果
神経前駆細胞由来のマウス最終分化細胞の形質導入（ｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７）
非複製自己相補的ＡＡＶ９−ＳＭＮ１（ＡＶＸＳ−１０１）に対するｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７の許容性を評価するため、ＡＡＶ９−ｅＧＦＰベクターを使用して２４ウェルプレートフォーマットでｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７を形質導入した。形質導入は、形質導入細胞に発現するｅＧＦＰからの緑色蛍光シグナルを用いてモニタし、形質導入後２４時間で画像を取得した。ＭＯＩ依存的ｅＧＦＰ発現により、ｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７細胞が、化学的処理又は細胞のエンジニアリングの必要なしにＡＡＶ９ベクターに許容性であることが実証された。図４は、感染多重度（ＭＯＩ）の増加に伴うｅＧＦＰ陽性細胞の上昇を示す。
【０５８４】
ｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７ベースアッセイに９６ウェルプレートフォーマットを用いることの実現可能性
ロット処分用の効力アッセイとして用いることが可能なアッセイに妥当なスループットを得るため、９６ウェルプレートフォーマットを用いることの実現可能性を評価した。
【０５８５】
９６ウェルプレート上での細胞分布の均一性及び細胞プレーティング密度の決定
イメージング技術を用いて生物学的変化を正確に捕捉可能であるためには、各ウェルが適切な細胞密度であることが決定的に重要である。本発明者らは２０，０００細胞／ウェル（図５Ａ）及び１０，０００細胞／ウェル（図５Ｂ）を試験し、比較した。２０，０００細胞／ウェルの密度では、細胞が互いに広範囲に接触し合うことなく最適な画像分析に適切な生物学的環境を培うのに十分に互いに近かった。
【０５８６】
９６ウェルプレートフォーマットにおけるＡＡＶ９ベクター形質導入ｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７のＳＭＮ１染色方法の確立
ｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７のＳＭＮ１染色
商業的供給元からの少数のマウスモノクローナル抗体（データは示さず）を、免疫染色を用いてＳＭＮ１タンパク質の検出に関してスクリーニングし、検出ダイナミックレンジが一貫して良好な、低バックグラウンドを示したマウスモノクローナル抗体（２Ｂ１）を同定した。
【０５８７】
ＳＭＮ１モノクローナル抗体（２Ｂ１）の特異性
２Ｂ１によって検出されたタンパク質がＡＡＶ９ベクターのものでない又は形質導入手順のアーチファクトでないことを確実にするため、ＡＡＶ９−ｅＧＦＰ形質導入ｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７を２Ｂ１で染色した。１００，０００のＭＯＩで形質導入した細胞は、２Ｂ１による染色時にいかなる検出可能シグナルも示さなかったが、ＡＡＶ９形質導入の成功が実証され、これはＧＦＰ発現によって確認された（図７）。
【０５８８】
ポリ−Ｄ−リジンをコートした組織培養プレートの評価
染色手順中の細胞の損失が最小限となるよう確実にするため、本発明者らは、ポリ−Ｄ−リジンコート９６ウェルプレートを使用する必要性について判定した。図８Ａ及び図８Ｂは、コートされていない典型的な組織培養処理済み９６ウェルプレート（図８Ａ）とポリ−Ｄ−リジンコートプレート（図８Ｂ）との比較を示す。非コートプレートに細胞を播いて染色したとき、細胞の損失が観察され、残りの細胞の多くが剥がれ落ちた。しかしながら、ポリ−Ｄ−リジンに播いた細胞は、全ての染色手順を終えた後にもこの現象を示さなかった。従って、本発明者らは、以降のアッセイ開発実験にポリ−Ｄ−リジンコートプレートを使用することにした。
【０５８９】
ＳＭＮ１タンパク質レベルを測定する定量的ｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７ベースイメージングアッセイの確立
トランス遺伝子発現の検出のためのアッセイ継続時間の決定。
【０５９０】
トランス遺伝子発現の検出のためのアッセイ継続時間は形質導入後７２時間と決定された。ｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７は最終分化して非分裂性であるため、トランス遺伝子ＳＭＮ１発現は形質導入後に蓄積し、これは、ＳＭＡΔ７疾患モデル又はＳＭＡ患者におけるインビボでのＳＭＮ１コードＡＡＶ９ベクター形質導入時の非分裂性運動ニューロンのトランス遺伝子発現を反映する。評価のため、本発明者らは、２時点、形質導入後４８時間及び形質導入後７２時間におけるトランス遺伝子発現をモニタするツールとしてＡＡＶ９−ｅＧＦＰを使用した。形質導入後７２時間では、細胞の大部分（最大８０％）がＧＦＰ陽性で、１細胞当たりの蛍光シグナルが高かったことから、これは良好なアッセイウィンドウを提供する。しかしながら、形質導入後４８時間では、ＧＦＰ陽性の細胞ははるかに少なく、１細胞当たりの蛍光シグナルもはるかに低かった。
【０５９１】
３つのＡＡＶ９ベクターバッチについてのＳＭＮ１タンパク質発現のＭＯＩ依存的増加の検出及び分析
確立されたアッセイ条件を用いて、ｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７を３つの異なるＭＯＩの３つのＳＭＮ１発現ＡＡＶ９ベクターロット（ＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３、８１６８３６又は６００１５６）で形質導入し、細胞を抗ＳＭＮ１  ２Ｂ１モノクローナル抗体で染色した。染色後に取得された画像は、ＭＯＩの増加に伴うＳＭＮ１発現の増加を示した。免疫染色からの蛍光シグナルをＳＭＮ１発現の定量的評価に用いることができるかどうかを決定するため、各細胞の積分蛍光強度（１細胞当たりの積分蛍光強度、ＩＦＩ−Ｃ）を分析した。この実験はｎ＝３で行った。試験した臨床ロットの各々について、ＩＦＩ−ＣはＭＯＩの増加に伴い増加した（表３）。データは、３つの所与のＭＯＩで３つの臨床ロットを形質導入したときの同等のＳＭＮ１発現を実証した（表３）。図１０は、形質導入後７２時間におけるｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７の代表的な画像を示す。
【０５９２】
【表４】
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【０５９３】
【表５】
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【０５９４】
ｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７ベースアッセイが９６−ウェルフォーマットで用量依存的定量アッセイであることを実証する概念実証データ
このアッセイの定量的特性を決定するため、開発したｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７ベースアッセイを用いてベクターの２倍希釈液中でＡＡＶ９−ＳＭＮ１ベクターロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３の１２ポイントＭＯＩ形質導入（ｎ＝５）を実施した。バックグラウンド（ＭＯＩ＝１）から最も高いＭＯＩ（ＭＯＩ＝２００Ｋ）まで、ＩＦＩ−Ｃの４．８倍の増加があり、許容可能なバックグラウンド対シグナル比を実証している。表３に示されるとおり、全１２のＭＯＩにわたる５回のレプリケートからのＳＭＮ１  ＩＦＩ−Ｃの相対標準偏差（ＲＳＤ）（又はＣＶ％）は５％未満であった（０．５％〜４％）。この初期概念実証（ＰＯＣ）データから、アッセイが高精度であることが示された。図１１は、ＭＯＩの増加に伴うＳＭＮ１発現のＭＯＩ依存的増加の視覚的確認を示す（１０のＭＯＩのみを図示する）。このアッセイが定量的であり、従って細胞ベース効力アッセイとして潜在的に好適であるかどうかを更に判定するため、適切な曲線当てはめアルゴリズムで１２ポイントデータを分析した。図１２に示されるとおり、このアッセイは双曲線モデルを用いると良好な曲線フィット（Ｒ２＝０．９９４）を示す。ｘ軸を対数変換したとき、ＭＯＩ（２００Ｋ〜１２．５Ｋ）は直線範囲に入った。
【０５９５】
この用量依存的当てはめデータから、平行線分析（ＰＬＡ）によるＡＡＶ９−ＳＭＮ１ベクターの相対効力の決定に画像ベースアッセイを利用できる可能性がもたらされた。
【０５９６】
加えて、３つのＡＡＶ９−ＳＭＮ１ベクター臨床バッチを比較するデータと共に、これらのデータは、インビトロ細胞ベースアッセイを用いてＳＭＮ１の頑健で定量的な測定を実現し得るという概念実証を裏付けている。
【０５９７】
【表６】
2021526806.tif 000029
【０５９８】
統計的方法
潜在的ロット処分効力アッセイとしてのｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７ベースのイメージングアッセイの適合性を評価するため、本発明者らは、平行線分析（ＰＬＡ）を支持する５つのＭＯＩを決定した。以下の統計分析により、平行線分析（ＰＬＡ）を用いることによって線形回帰モデルを用いてＡＡＶ９−ＳＭＮ１ベクターの相対効力を計算し得ることが実証された。
【０５９９】
１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）
用量及びレプリケート毎に１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）値を計算した。ＩＦＩ−Ｃは各用量についてのアッセイリードアウトである。
【０６００】
線形用量反応モデル
測定したＭＯＩ毎に５回のレプリケートを入手し、線形回帰モデルを適用して、ｘ軸（用量）の対数変換後に９８．９％のＲ２の良好な当てはめを実証した。
【０６０１】
ＰＬＡを用いた相対効力（ＲＰ）の決定の概念実証研究
５セットのＳＭＮ１  ＩＦＩ−Ｃ対ｌｏｇＭＯＩデータを使用して、データの一方のセットを「モック参照標準品」とし、それに対してデータの他方のセットを「モック試験物質」とするペアワイズ分析で「モック」相対効力計算を行った。この手法では、可能なペアワイズの組み合わせは以下に挙げるとおり１０通りある（表６）。１０個のモック試験物質の相対効力（％）は９３．６％〜１０１．８％の範囲内であり、％ＣＶは５％未満であった。この統計分析により、新規に開発したアッセイが定量的であり、１６倍線形範囲が２倍離れた５つのＭＯＩをカバーすることが実証された。
【０６０２】
ＡＡＶ９薬物製品のロット処分を意図した効力アッセイとしてのこのアッセイの有用性の最終的な評価前にアッセイの頑健性、適格性確認及びバリデーションを決定した。
【０６０３】
【表７】
2021526806.tif 000030
【０６０４】
ｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７の免疫染色に最適なＳＭＮ抗体（２Ｂ１）濃度の評価
ＡＡＶ９−ＳＭＮ１ベクターを形質導入したｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７の染色に異なる抗ＳＭＮ（２Ｂ１）抗体濃度が及ぼす効果について、暫定的なＰＬＡツールを用いて更に評価した。画像ベースアッセイに用いられる一次及び二次抗体の許容濃度は、概してＥＬＩＳＡなどの他のイムノアッセイと比較して広い。これは、装置の高感度カメラによって実現される画像ベースアッセイが、光源に対する露光時間を調整することによって広域のシグナルを検出可能であることに起因する。従って、抗体濃度最適化の主な目標は、選択の一次又は二次抗体濃度が、用量依存的反応によって決まるとおりの目的タンパク質レベル（例えば、ＳＭＮ１）の定量化を制限する要因とならないよう確実にすることであった。
【０６０５】
そのために、３つの異なる濃度のＳＭＮ（２Ｂ１）抗体を試験して（４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ及び１μｇ／ｍＬ）、線形回帰によって決定される用量依存的反応の直線性を評価した。端的には、ＳＭＮ１コードＡＡＶ９ベクターロットから調製した１２のＭＯＩ用量を表７に示すとおりウェルに加え、次に細胞をプレートレイアウトに従い２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ及び４μｇ／ｍＬのＳＭＮ抗体によって免疫染色した。２００Ｋ  ＭＯＩ〜１２．５Ｋ  ＭＯＩの範囲の５用量を上記に記載したとおり線形回帰に当てはめ、これらは試験した３つ全ての条件について、ＳＭＮタンパク質レベルの用量依存的増加の優れた直線性を示した（Ｒ２＝０．９８）。加えて、暫定的なＰＬＡを用いて、２μｇ／ｍＬ条件を参照標準として取り、４μｇ／ｍＬ及び１μｇ／ｍＬ条件を参照標準と比較して％相対効力を計算することによってデータを分析した。この分析では、３つのＳＭＮ抗体濃度条件が同等であることが実証され、４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ（参照標準）及び１μｇ／ｍＬのそれぞれについて、相対効力値は９９．８％、１００％及び９７．２％及び傾き比（参照標準の傾きに対する試験条件の傾き）は０．９９１、１．０００及び０．９８０であった（図１７及び表８）。まとめると、これらのデータによれば、ＳＭＮ１抗体が、ｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７細胞において発現するＳＭＮタンパク質の定量的決定を制限する要因ではないことが実証された。
【０６０６】
３つの異なる濃度のＳＭＮ１抗体から得られたデータが均等であることを所与として、ＳＭＮ１コードＡＡＶ９ベクターのインビトロ細胞ベース相対効力の確立には中間点の２μｇ／ｍＬを選択した。この濃度は、ＳＭＮ（２Ｂ１）抗体が過剰に消費されることを回避しつつ、しかし、一次抗体濃度の僅かな変動であればアッセイ性能が損なわれないことが確実となるように選択した。
【０６０７】
二次抗体使用濃度は、供給業者の推奨に基づいて、二次抗体が、マイクロプレートセッティングで播かれた細胞中の標的タンパク質に結合する一次抗体の検出を制限する要因とならないよう確実にするため２μｇ／ｍＬと決定した。図１７及び表８に示されるデータは、優れた直線性（０．９８のＲ２）及び表８の傾き比によって示されるとおりの同等の傾きでＳＭＮの用量依存的増加の定量化を確立しており、免疫染色に十分な量の二次抗体があることが確認される。
【０６０８】
【表８】
2021526806.tif 000031
【０６０９】
【表９】
2021526806.tif 000032
【０６１０】
結論
上記の研究は、ＡＡＶ９に許容性の新規初代マウス細胞モデルシステムの同定の成功；定量的ハイコンテント画像ベースシステムを用いることによるインビトロ細胞ベースのトランス遺伝子（ＳＭＮ１）発現測定方法の開発；及び開発したｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７ベースアッセイがアッセイバリデーションの完了時にロット処分効力アッセイとして適合する可能性を実証するＰＯＣデータについて記載している。
【０６１１】
加えて、新規に確立された細胞ベースアッセイシステムは、以下の特徴を備えることが示されている：
・急速に複製するＮＰＣにより、前駆細胞表現型がその分化前に保存されているセルバンクの作成が可能になった；
・ｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７は天然でＡＡＶ９形質導入に許容性であり、ＭＯＡ反映的であった；
・ＴＤ−ＮＰＣはバックグラウンドが低く（ＳＭＮ−／−マウスに由来する）、こうした細胞は非分裂性である（トランス遺伝子産物の蓄積を可能にする）ため、ｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７におけるＳＭＮ１発現レベルの測定は良好なアッセイウィンドウを示した（シグナル：バックグラウンド＞４）；
・このアッセイウィンドウにより、ＳＭＮ１タンパク質レベルの用量依存的増加の定量的測定が可能になった；
・ＩＦＩ−Ｃを測定するこのアッセイは頑健であったと共に、９６ウェルプレートフォーマットでスループットを提供する；
・統計分析により、ＰＬＡが精確さ及び併行精度のある相対効力計算であることが裏付けられた。
【０６１２】
実施例３：ｍＮＰＣにおけるＡＡＶ９感染力についての新規方法の開発
ＳＭＮ−／−Δ７マウス神経前駆細胞株（ｍＮＰＣ）及びハイコンテントイメージングシステムＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔを利用する頑健で定量的な作用機序（ＭＯＡ）反映的ＡＡＶ９感染力アッセイを確立した。ｍＮＰＣベースのアッセイプラットフォームを用いて、頑健で定量的な感染力アッセイとなるようＡＡＶ９ベクターのインビトロ相対効力アッセイを開発した。
【０６１３】
その定量的性質及びより容易で煩雑さの少ないアッセイプロセスなどの側面で現行のＴＣＩＤ５０感染力アッセイに対してその優位性を示す概念実証データが得られた。
【０６１４】
概念実証研究を実施して、感染力価ＥＣ５０についてのＡＡＶ９ベクター感染力アッセイを確立した。
【０６１５】
【表１０】
2021526806.tif 000033
【０６１６】
優れた４ｐフィットで低プラトー上側プラトーの両方をカバーする感染多重度（ＭＯＩ）の完全用量範囲を同定した（０〜８０００Ｋ  ＭＯＩ）。
【０６１７】
１ミリリットル当たりのウイルスゲノムのＥＣ５０値（ｖｇ／ｍＬ）をＡＡＶ９ベクター薬物製品の感染力価として用いた。これは時間のかかる変動し易いＴＣＩＤ５０アッセイに代わるものである。
【０６１８】
ＨｅＬａＲＣ３２細胞を用いる現行のＴＣＩＤ５０ベースアッセイと比べたＳＭＮ−／−ｍＮＰＣ細胞を用いるこの感染力アッセイの利点
【０６１９】
【表１１】
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【０６２０】
実施例４：ＳＭＮ１コードＡＡＶ９ベクター原薬及び薬物製品についてのインビトロ相対効力の決定
実施例１〜３で開発したインビトロ定量的細胞ベース相対効力アッセイを用いてＡＡＶ９−ＳＭＮ１ベクター原薬及び薬物製品の相対効力を決定した。
【０６２１】
本相対効力細胞ベースアッセイは、ＳＭＮ１コードＡＡＶ９ベクター原薬及び薬物製品のロット処分及び安定性検査が意図される相対効力を決定するための頑健で定量的なインビトロアッセイである。このアッセイで使用される細胞は、実施例１及び２に記載のとおりＳＭＮΔ７マウスの皮質から単離したマウス初代神経前駆細胞（ＮＰＣ）に由来した。ＳＭＮΔ７マウスは、ＳＭＮ１遺伝子ノックアウトアレルに関してホモ接合性且つそのエクソン７の欠失を有するＳＭＮ２のアレルに関してホモ接合性の、それが細胞においてＳＭＮタンパク質の発現がないことにつながるＳＭＡ疾患のインビボ動物モデルである。このアッセイで使用した細胞モデルシステムは、最終分化したＮＰＣ（ｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７）であった。漸増用量のＳＭＮ１コードＡＡＶ９ベクターで形質導入したｍＴＤ−ＮＰＣ−Δ７において、ＳＭＮに特異的なモノクローナル抗体を使用して染色することにより、ＳＭＮタンパク質発現の増加レベルを測定した。
【０６２２】
以下の式によって記述される平行線分析（ＰＬＡ）を用いて参照標準品（ＲＳ）と比べたサンプルの相対効力を計算した（式中、α（切片）及びβ（傾き）は共通の傾きモデルからの線形回帰線の推定値である）。
【数１８】
2021526806.tif 000035
【０６２３】
このアッセイに用いたハイコンテントイメージングプラットフォーム（ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ  ＣＸ５）により、１細胞毎の細胞内タンパク質発現の定量的測定が可能となった（１細胞当たりの積分蛍光強度）。加えて、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ  ＣＸ５プラットフォームにより、ロット処分及び安定性試験に適切なスループットが実現した。
【０６２４】
細胞ベース相対効力アッセイの実施には、以下の機器を使用した：生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ  ＣＸ５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＣＸ５１１１０）、５％ＣＯ２で３７±１℃に設定した加湿型ＣＯ２インキュベーター、３７℃に設定した水浴又は均等物、温度制御付き遠心機、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ  Ｋ２イメージサイトメーター及び顕微鏡。
【０６２５】
細胞ベース相対効力アッセイの実施には、以下の材料を使用した：組織培養処理済みフラスコ（Ｔ７５、Ｔ１５０及びＴ１７５）、ポリプロピレン遠心管、１５及び５０ｍＬキャップ付き、ピペット（シングルチャンネルＰ１０００、Ｐ２００及びＰ２０並びに８又は１２チャンネルＰ１０００及びＰ３００）、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＢｉｏＣｏａｔポリ−Ｄ−リジン９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３５４６４０）、光学的に透明なプレートシール（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ  ８４０８２４０）、試薬リザーバ、ＰＩＰＥＴ−ＡＩＤ、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒスライド（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ、ＣＨＴ４−ＳＤ１００−００２）、９６ウェルＤｅｅｐＷｅｌｌ（商標）ポリプロピレンマイクロプレート、低結合性１．５ｍＬ微量遠心管、７０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール（ＩＰＡ）及びドライアイス。
【０６２６】
細胞ベース相対効力アッセイの実施には、以下の表１１に掲載する試薬を使用した。特に注記又は再試験しない限り、試薬は製造者の提案する有効期限を遵守した。
【０６２７】
【表１２】
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【０６２８】
【表１３】
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【０６２９】
【表１４】
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【０６３０】
アッセイ手順
以下に概説するプロトコルを用いてＮＰＣ−Δ７細胞を解凍した。
【０６３１】
完全成長培地は使用前に予め３７℃の水浴中又は均等物で少なくとも３０分間温めた。
【０６３２】
液体窒素保存からｍＮＰＣ細胞の凍結クライオバイアルを取り出した。このバイアルは、その解凍準備が整うまでドライアイス上に置いておいた。バイアルを３７℃の水浴中で速やかに解凍し、時折かき混ぜながら確実に解凍させた。
【０６３３】
バイアル表面を７０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール（ＩＰＡ）で拭き取り、次に内容物をＢＳＣ内で滅菌ピペットを使用して５０ｍＬ遠心管に移した。細胞の解凍後、凍結保護物質を浸透圧ショック防止のためゆっくりと希釈した。通常、毒性作用を解消するのに約１０〜２０ｍＬで十分である。
【０６３４】
かき混ぜることによって穏やかに混合しながら１０〜２０ｍＬの加温した完全成長培地を滴下方式で加えた後、続いて２０℃において３００×ｇで５分間遠心した。
【０６３５】
上清を吸い取り、次にチューブを穏やかに撹拌して細胞ペレットを壊した。
【０６３６】
適切な容積（推奨１．０〜２．０ｍＬ）の温かい完全成長培地を細胞に加え、ピペットで穏やかに混合した。
【０６３７】
Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ  Ｋ２ソフトウェアのプロトコル「ＮＰＣｄ７  Ｃｏｕｎｔ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ（ＡＯ／ＰＩ）」を用いて生細胞数及び生存率を取得した。カウントの各々についての生存率は６０．０％以上の生存であることが期待された。
【０６３８】
細胞をＴ７５組織培養フラスコに移し、収集された細胞容積を記録した。１０．０ｍＬの完全成長培地を加え、フラスコを穏やかに揺動させて一様な分布を確保した。
【０６３９】
次にフラスコを３７℃及び５％ＣＯ２に設定したインキュベーターに置き、３７℃、５％ＣＯ２で少なくとも７２時間の培養時間にわたりインキュベートした後、成長及び生存率に関して検査した。細胞は４±１日毎に継代した。
【０６４０】
ＮＰＣ−Δ７細胞の培養
細胞は解凍後２回目の継代からアッセイに使用した。解凍は継代とは見なさなかった。細胞は継代１５代目まで使用した。例えば、ワーキングセルバンクを継代６代目（Ｐ６）以降に凍結した場合、細胞の解凍時には、継代数はＰ６のままであった。細胞増殖に適切な日数が経った後、Ａｃｃｕｍａｘで解離することによって細胞を継代し、これがＰ７となった。Ｐ７では、細胞はアッセイに使用することができない。細胞をＡｃｃｕｍａｘで解離することによって再び継代したとき（Ｐ８）、その細胞はアッセイに使用することができる。
【０６４１】
【表１５】
2021526806.tif 000039
【０６４２】
細胞が懸濁液中で増殖するにつれ、細胞はニューロスフェアと呼ばれる三次元コロニーを形成する。ニューロスフェアが大きく成長し過ぎて中心が壊死することを防ぐため、細胞は４±１日毎に継代した。
【０６４３】
細胞継代手順
細胞を以下に記載する手順のとおり継代した。
【０６４４】
基本培地及び完全成長培地は使用前に予め３７℃の水浴中又は均等物で３０分間温めた。
【０６４５】
細胞を継代するため、細胞が入ったフラスコをインキュベーターから取り出し、細胞が入った培地を使用してフラスコの表面をリンスした。
【０６４６】
細胞をフラスコから５０ｍＬコニカルチューブに移し、３００×ｇで５分間遠心した。
【０６４７】
細胞ペレットを乱さないようにしながら上清を吸い取り、２００．０μＬのＡｃｃｕｍａｘを加えた。細胞ペレットをペレットが解離するまで上下に複数回ピペッティングすることによって穏やかに研和し、次に室温で３０±１０分間インキュベートした。
【０６４８】
Ａｃｃｕｍａｘインキュベーションの終了時、４００．０μＬの予め温めた基本培地を加えることによってＡｃｃｕｍａｘを中和した。細胞を穏やかに研和して（例えば１０〜１５回）、完全に単一細胞に解離した。
【０６４９】
更なる４００．０μＬの予め温めた基本培地を加えて総容積を１．０ｍＬにした。細胞カウント用に、更なる容積の基本培地で５．００Ｅ＋０５細胞／ｍＬ〜１．００Ｅ＋０７の許容可能な細胞密度範囲となるように細胞を希釈した。この時点において、任意選択で、細胞をＡｃｃｕｍａｘで解離し、基本培地で別々に中和し終えた後、同じ細胞参照／ロットの複数のフラスコからの同じ継代数の細胞をプールした。合計１．０ｍＬの各細胞懸濁液（８００．０μＬの基本培地によって中和した２００．０μＬのＡｃｃｕｍａｘ中にある細胞）を組み合わせることが可能であった。細胞カウント用に、更なる容積の基本培地を加えて細胞を５．００Ｅ＋０５細胞／ｍＬ〜１．００Ｅ＋０７の許容可能な細胞密度範囲に希釈した（例えばフラスコ１からの１．０ｍＬの細胞とフラスコ２からの１．０ｍＬの細胞とを混合し、次に更なる３．０ｍＬの基本培地を加えて細胞を更に希釈した）。
【０６５０】
細胞を混合し、次に細胞の少量のサンプルを取り出して、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ  Ｋ２ソフトウェアのプロトコル「ＮＰＣｄ７  Ｃｏｕｎｔ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ（ＡＯ／ＰＩ）」を用いて生細胞数及び生存率を決定した。細胞カウントの各々の生存率が８０．０％以上になったとき、ｍＴＤ  ＮＰＣ−Δ７（最終分化ＮＰＣΔ７）プレートを調製した。細胞の培養を続行するには、細胞カウントの各々の生存率が７０．０％以上の生存でなければならなかった。
【０６５１】
細胞懸濁液の濃度が高過ぎる場合、更なる容積の基本培地を加えて十分に混合し、生細胞数及び生存率を決定し直した。
【０６５２】
細胞懸濁液を予め温めた完全成長培地で１００，０００細胞／ｍＬに希釈した。適切な容積を新しい細胞培養ベッセルにピペッティングし、細胞を３７±１℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに４±１日間戻した。
【数１９】
2021526806.tif 000040
【０６５３】
【表１６】
2021526806.tif 000041
【０６５４】
任意選択でこの継代プロトコルを繰り返し、継代サイクル毎に前の継代に継代数１を加えた。
【０６５５】
ｍＴＤ  ＮＰＣ−Δ７（最終分化ＮＰＣΔ７）プレートの調製
細胞の継代に使用した培地と異なるプレート培地を使用して細胞をプレーティングした。プレート培地はＮＰＣ細胞を最終分化させる。プレート培地中の細胞を各プレートにつき少なくとも７ｍＬ調製した。
【０６５６】
生細胞数を記録し、プレーティングに用いるのに適切な細胞容積を決定した。
【０６５７】
細胞をプレート培地中２０，０００細胞／ウェル／１００μＬの密度（又は２．００×１０５細胞／ｍＬ）に希釈した。
【数２０】
2021526806.tif 000042
【０６５８】
２．００×１０５細胞／ｍＬの１００．０μＬの細胞を穏やかに混合し、９６ウェルポリ−Ｄ−リジンコートプレートの内側の６０ウェルに、ウェルの壁に対して傾けてゆっくりとピペッティングした。このステップでは逆ピペッティングが推奨される。
【０６５９】
各プレートの端のウェル（行Ａ、行Ｈ、列１、列１２）に１００．０μＬ  ＤＰＢＳ（１×）を加えた。
【０６６０】
１つ又は複数のプレートを周囲温度で２５±５分間静置した後、プレーティングした細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに置いた。開始時間及び終了時間を記録し、インキュベーターが３７±１℃、５％ＣＯ２でのアッセイ要件を満たしていることを確認した。次にプレーティングした細胞を形質導入前に３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに２４時間±２時間置き、開始時間及び終了時間を記録した。インキュベーター温度及び％ＣＯ２レベルも記録した。
【０６６１】
１つ又は複数の９６ウェルプレートにおけるｍＴＤ  ＮＰＣ−Δ７細胞の形質導入
プレート培地の調製
プレートの数に十分なプレート培地を調製した。ｍＴＤ−ＮＰＣΔ７細胞の各プレートに、最低１０ｍＬのプレート培地が必要であった。
【０６６２】
ＡＡＶ９−ＳＭＮ１ベクター参照標準品（ＲＳ）、対照及び試験サンプルの調製
ＡＡＶ９−ＳＭＮ１ベクター参照標準品（ＲＳ）、対照（Ｃｒｔｌ）及び試験サンプル（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３等）を以下のとおり調製した。
【０６６３】
参照標準品（ＲＳ）、対照及び試験サンプルのアリコートを周囲温度で解凍した。製剤化緩衝液及びプレート培地は使用前に予め３７℃の水浴中又は均等物で少なくとも３０分間温めた。
【０６６４】
サンプルは、予め温めた適切な製剤化緩衝液を使用して、１．５ｍＬ微量遠心管内で１．００Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬに予め希釈した。ピペッティングの精確さを確保するため、サンプルの事前希釈用にサンプルバイアルから１０．０μＬの最小容積を取った。
【０６６５】
用量Ａ（３００ＫのＭＯＩ）を調製するため、プレート培地を使用してサンプルを更に６．００Ｅ＋１０ｖｇ／ｍＬに１６．６７倍希釈した。
【０６６６】
２倍段階希釈を実施して用量Ｂ〜Ｅを調製した。例えば、用量Ａ溶液をＰ−３００ピペッターで穏やかに混合した後、用量Ａ溶液から２５０．０μＬを移し、２５０．０μＬのプレート培地（希釈剤）と合わせて用量Ｂを調製する。段階希釈を繰り返して用量Ｃ、Ｄ及びＥを調製する。各用量は、各用量のデュプリケートウェルを各１００．０μＬで形質導入するのに十分な容積（２５０．０μＬ）が段階希釈後に残るように調製した。例として表１４を参照されたい。
【０６６７】
【表１７】
2021526806.tif 000043
【０６６８】
形質導入
調製した１つ又は複数の分化細胞プレートをインキュベーターから取り出し、ＢＳＣに移した。インキュベーター温度及び％ＣＯ２を記録し、それが３７±１℃、５％ＣＯ２でのアッセイ要件を満たしていることを確認した。
【０６６９】
各９６ウェルプレートのウェルを単一の参照サンプル及び１つ又は複数の試験サンプルでの使用に割り付けた。プレートマップの例として、表１５を参照されたい。端のウェル（行Ａ、行Ｈ、列１、列２）には０．１ｍＬのＤＰＢＳ（プレート播種中に充填する）を入れた。端のウェルは吸い取らなかった。
【０６７０】
マルチチャンネルピペットを使用して、細胞が入ったウェルからプレート培地を穏やかに取り出した。細胞の乾燥を防ぐため、プレート培地は２つの列から一度に取り出した。
【０６７１】
マルチチャンネルピペットを使用して、１００．０μＬの調製サンプルを穏やかに混合し、直ちにプレートマップに従い対応するウェルの壁に対して傾けて分注した。
【０６７２】
細胞のみ（バックグラウンド）を割り付けたウェル（非形質導入対照）について、１００．０μＬの新鮮なプレート培地を加えた。１つのサンプルのみを試験した場合、１００．０μＬの新鮮なプレート培地を非形質導入ウェルに加えた。これらのウェルは計算に使用しなかった。
【０６７３】
プレートをインキュベーター（３７±１℃、５±１％ＣＯ２）に移した。プレートを７２±２時間インキュベートし、開始及び終了時間を記録した。インキュベーター温度及び％ＣＯ２レベルを記録し、インキュベーターが３７±１℃、５％ＣＯ２でのアッセイ要件を満たすことを確認した。
【０６７４】
【表１８】
2021526806.tif 000044
【０６７５】
細胞染色手順
形質導入したプレートを細胞染色のため７２時間±２時間の時点で取り出した。インキュベーター温度及び％ＣＯ２レベルを記録し、インキュベーターが３７±１℃、５％ＣＯ２でのアッセイ要件を満たすことを確認した。端のウェルを細胞染色処理した。内側の６０ウェルは、全てサンプルの入っていないウェルを含めて染色した。
【０６７６】
細胞固定
細胞を以下に記載するプロトコルのとおりに固定した。
【０６７７】
染色しようとするウェルから培地を吸い取った。制御されたピペッティングを用いて細胞の損失を回避した。
【０６７８】
内側の６０ウェルに５０．０μＬの４％パラホルムアルデヒドをウェルの壁に対して傾けて穏やかに加えた。
【０６７９】
次にプレートを周囲室温で５〜７分間インキュベートした。開始及び終了時間を記録した。
【０６８０】
インキュベーション後、各ウェルから４％パラホルムアルデヒドを吸い取り、内側の６０ウェルを２５０．０μＬ  ＤＰＢＳで洗浄した。直後に以下のステップを続けることができない場合、この時点でプレートを２〜４℃において最長３日間保存することができる。その場合、プレートの保存前に、洗浄に使用した２５０．０μＬ  ＤＰＢＳを取り除き、２５０．０μＬの新鮮なＤＰＢＳを加えた。プレートシールを使用して保存中の蒸発を防いだ。
【０６８１】
細胞透過処理
各ウェルからＤＰＢＳを穏やかに吸い取り、内側の６０ウェルに５０．０μＬの０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００をウェルの壁に対して傾けて穏やかに加えた。
【０６８２】
プレートを周囲室温で５〜７分間インキュベートし、開始及び終了時間を記録した。
【０６８３】
各ウェルから０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を吸い取り、内側の６０ウェルを２５０．０μＬ  ＤＰＢＳで洗浄した。
【０６８４】
一次抗体インキュベーション
２〜８℃で保存したマウスモノクローナル抗ＳＭＮ抗体（クローン２Ｂ１）を使用した。染色に必要なワーキング抗体の量は、染色しようとする参照、試験及び対照サンプルの数を足し合わせ、各サンプルにつき５０．０μＬの容積を乗じることによって計算した。ピペッティング容量損失に足りる十分な過剰容積を調製した。
【０６８５】
ＤＰＢＳ溶液中１％ＢＳＡを希釈剤として使用してマウス抗ＳＭＮ抗体の一次抗体染色溶液を調製した。発色データに基づいてＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−３２３１３  ＸＳロット番号Ｃ２８１８は１：５００希釈で使用し、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−３２３１３  ＸＳロット番号Ｆ２１１８は１：１０００希釈で使用し、且つＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅロット番号３０５４７００は１：５００希釈で使用した。一次抗体溶液調製は、必要に応じてスケールアップ又はスケールダウンすることができる。例えば、１：５００希釈の抗体について４．０ｍＬの染色溶液を調製するためには、４．０ｍＬのＤＰＢＳ中１％ＢＳＡに８．０μＬの抗ＳＭＮ抗体を加えた。
【０６８６】
各ウェルからのＤＰＢＳであり、及び内側の６０ウェルに５０．０μＬの一次抗体染色溶液をウェルの壁に対して傾けて穏やかに加えた。
【０６８７】
１つ又は複数のプレートを周囲室温で１２０〜１５０分間インキュベートし、開始及び終了時間を記録した。
【０６８８】
インキュベーション後、各ウェルから一次抗体溶液を吸い取った。内側の６０ウェルを２５０．０μＬ  ＤＰＢＳで洗浄した。洗浄ステップでＤＰＢＳを取り除く前に、二次抗体染色溶液を調製した。
【０６８９】
二次抗体インキュベーション
二次抗体溶液調製は必要に応じてスケールアップ又はスケールダウンすることができ、使用時以外は容器をアルミニウム箔で覆った。１：１０００希釈の２μｇ／ｍＬ終濃度のヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  Ｐｌｕｓ  ４８８と、ＤＰＢＳ中１％ＢＳＡ中２μｇ／ｍＬの核染色色素ヘキスト３３３４２（１：５０００希釈）とを含有する二次抗体染色溶液を調製した。ヘキスト３３３４２核染色色素は、１０．０μＬのヘキスト３３３４２核染色色素を４０．０μＬの蒸留水中に加えることによって予め希釈した。予め希釈したヘキスト３３３４２は、染色毎に新鮮なものとした。１つのプレートについて、推奨される５ｍＬ二次抗体溶液は、５．０μＬの予め希釈したヘキスト及び５．０μＬの二次抗体をＤＰＢＳ中１％ＢＳＡに加えることによって調製した。
【０６９０】
各ウェルからＤＰＢＳを吸い取り、各ウェルに５０．０μＬの二次抗体溶液をウェルの壁に対して傾けて加えた。プレートを遮光下に（例：フォイルで覆う）、周囲室温で６０〜８０分間インキュベートし、開始及び終了時間を記録した。
【０６９１】
各ウェルから二次抗体溶液を吸い取り、内側の６０ウェルを２５０．０μＬ  ＤＰＢＳで洗浄した。
【０６９２】
各ウェルからＤＰＢＳ洗浄液を吸い取り、内側の６０ウェルに２５０．０μＬ  ＤＰＢＳを加えた。次にプレートを透明な光学的プレートシールで密閉し、シールは各ウェルにしっかりと押し付けた。１つ又は複数のプレートは、画像収集が行うことができるようになるまで遮光した。１つ又は複数のプレートは周囲温度に保ち、染色したのと同じ日に読み取った。
【０６９３】
画像収集及び分析
ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）プラットフォームを用いて、ＨＳＣ  ｓｔｕｄｉｏソフトウェア及び標準化プロトコルを用いてプレートの画像を収集した。
【０６９４】
プレートシールの上面及びプレートの底面を７０％アルコールで予め湿らせたＫｉｍＷｉｐｅｓで拭いて埃を取り除き、プレートをＨＣＳの受け口にロードし、プレートのＡ１を受け口のＡ１と整列させた。
【０６９５】
オートフォーカスを使用して細胞を収集し、核に焦点が合っていることを目視で確認した。このシステムを用いて捕捉された焦点が合っている核の例を図１８に示す。
【０６９６】
データ収集には、以下のとおり記載されるＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔセッティングを使用した。アッセイ設定：イメージングモード：蛍光１（Ｆ１）％蛍光２（Ｆ２）；明視野像を収集する；Ｆ１画像細胞型：マウスＥＳ細胞；説明：ｍＮＰＣフルオロフォアＡＯ  ＶＣ−５３５−４０３；蛍光露光：７００．０ミリ秒；Ｆ２画像細胞型：マウスＥＳ細胞；説明：ｍＮＰＣフルオロフォア  Ｐ１  ＶＣ−６６０−５０３；蛍光露光：５０００．０ミリ秒；アッセイの希釈係数を設定する：２．０００；パーセントＦ１、Ｆ２：Ｆ１／（Ｆ１＋Ｆ２）×１００％を表示。細胞型設定：マウスＥＳ細胞；細胞直径：最小９．０ミクロン、最大３０．０ミクロン；真円度：０．１０；コントラスト増強：０．４０；デクラスターエッジ係数：０．５；デクラスターＴｈ係数：１．０；バックグラウンド調整：１．０。トリパンブルー生死判別パラメータ：死細胞直径：最小８．０ミクロン、最大３０ミクロン；感度：１．０；均一性：１５０；極めて薄暗い死細胞のコントラスト増強：０．６０。プロトコル設定：対物レンズ：２０×；視野サイズ：４５５．４×４５５．４ミクロン；カメラ：Ｘ１；カメラ収集モード：１１０４×１１０４（２×２ビニング）；ソフトウェアオートフォーカスを使用する；ソフトウェアフォーカスチャンネル：１；オートフォーカス間隔：１。チャンネル１設定：コンポジットに含まれるチャンネル、カメラゲイン：２；光強度（％単位）：１００；イメージングモード：広視野；色素：３８６−２３＿ＢＧＲＦＲＮ＿ＢＧＲＦＲＮ；視野深度：６．５６３；固定露光時間；目標％：２５；露光時間（秒）：０．０８。チャンネル２設定：コンポジットに含まれるチャンネル、カメラゲイン：２；光強度（％単位）：１００；イメージングモード：広視野；色素：４８５−２０＿ＢＧＲＦＲＮ＿ＢＧＲＦＲＮ；視野深度：６．５６３；固定露光時間；目標％：２５；露光時間（秒）：０．０８。
【０６９７】
アッセイ結果の分析
エクセルのスプレッドシートを使用することにより、以下に記載される統計学的方法を用いた参照標準品に対する試験サンプルの％相対効力値の計算を合理化及び自動化した。
【０６９８】
平行線分析を用いた相対効力計算
個別線形モデル
各サンプルについて、プレート上のｌｏｇ２変換後予想ＭＯＩ値に対するデュプリケートのアッセイリードアウト（１細胞当たりの積分蛍光強度）の平均値に線形回帰モデル（Ｍ２．１）を当てはめた。
【０６９９】
全てのサンプル（ＲＳ、Ｃｔｒｌ及びＳ１、Ｓ２、Ｓ３等）について、最小二乗法を用いた線形回帰線のＲ二乗値（Ｒ２）、切片（ＲＳのみ）及び傾き推定値を求めた。
【０７００】
各サンプル（アッセイ対照及び試験サンプル）について、参照標準品と比べたサンプルの傾き推定値の比
【数２１】
2021526806.tif 000045
を用いてサンプルと参照標準品との間の平行性を評価した。
【０７０１】
アッセイ対照サンプルと参照標準品との間で確立される経験的な範囲内の傾き比であるならば、サンプルの傾きは参照標準品の傾きと平行である。ここで、
ｙ＝α＋βｌｏｇ２（ＭＯＩ）＋ｅ（Ｍ２．１）
ｙは所与のＭＯＩレベルからの１細胞当たりの積分蛍光強度であり、
α及びβはそれぞれ線形回帰線の切片及び傾きであり、
ｅは残差である
【０７０２】
共通の傾きモデル
各サンプル（アッセイ対照及び試験サンプル）及び参照標準サンプルについて、個別の切片及び共通の傾きを有する線形回帰モデル（Ｍ２．２）をプレート上のｌｏｇ２変換後予想ＭＯＩ値に対する１細胞当たりの積分蛍光強度対のデュプリケートアッセイリードアウトの平均に当てはめた。ここで、
ｙ＝α＋βｌｏｇ２（ＭＯＩ）＋ｅ（Ｍ２．１）
ｙｉはサンプルｉ、ｉ∈｛サンプル、参照標準品｝についての所与のＭＯＩレベルからの１細胞当たりの積分蛍光強度であり、
αｉはサンプルｉ、ｉ∈｛サンプル、参照標準品｝についての個別の切片であり、
βは共通の傾きであり、
ｅは残差である
【０７０３】
相対効力計算
以下のとおりモデル（Ｍ２．２）からの傾き推定値の切片からサンプル（アッセイ対照及び試験サンプル）の相対効力を計算した。
【数２２】
2021526806.tif 000046
【０７０４】
システム適合性判定基準
以下の判定基準を満たす場合、アッセイプレートは有効と見なした。
【０７０５】
全てのサンプルが以下の許容判定基準を満たした：ＩＦＩ−Ｃの％ＣＶ≦２０％及び線形回帰当てはめ時のＲ２が≧０．９５であった。
【０７０６】
アッセイ参照標準品（ＲＳ）は以下の適合性判定基準を満たした。アッセイダイナミックウィンドウ（バックグラウンドシグナル細胞のみに対する最大シグナル）が≧２．６９であり、傾きが≧１．０２Ｅ＋０５であった。
【０７０７】
アッセイ対照は以下の適合性判定基準を満たした：ＲＳに対するアッセイ対照の傾き比が０．７５〜１．３３の範囲内であり、アッセイ対照の相対効力が１００％±４０％の範囲内であった。
【０７０８】
試験サンプル（試験物質）は以下の適合性判定基準を満たした：ＲＳに対する試験サンプルの傾きの比が０．６９〜１．４５の範囲内でなければならない。
【０７０９】
システム適合性の不適合
参照標準品又はアッセイ対照に関連するシステム適合性のいずれかが満たされない場合、プレートは無効と見なし、サンプルを再試験した。
【０７１０】
サンプルシステム適合性判定基準の不適合
いずれか１つ又は複数の試験サンプルが上記に記載するとおりのサンプルシステム適合性の許容判定基準（ＣＶ％、Ｒ２及び傾き比）を実に満たした場合、サンプル結果は無効と見なし、いかなる結果も生成することなくサンプルを再試験した。
【０７１１】
報告値（％ＲＰ）
報告値は、特に指定されない限り、３つの独立した有効なアッセイ結果の平均値と定義した。
【０７１２】
３つのサンプルアッセイ結果からの％ＲＰの平均値、標準偏差及び％ＣＶ（ＲＳＤ）を計算した。％ＣＶが３０％より大きくなった場合、報告値は生成されないことになり、３つの追加的な有効なアッセイを実施して、第２の一組の検査についての平均値及び％ＣＶを計算した。
【０７１３】
参照標準品％ＲＰが１００％でなかった場合、最終的なサンプル結果は以下の計算に基づいて報告した：
サンプル％ＲＰ報告結果＝サンプル％ＲＰ（ＰＬＡ）×現在のＷＲＳ又はＰＲＳ割当て％ＲＰ
式中、ＰＬＡ：平行線分析
ＷＲＳ：ワーキング参照標準品
ＰＲＳ：一次参照標準品
【０７１４】
実施例５：ＡＡＶ９−ＳＭＮ１ベクター薬物製品についてのインビトロ相対効力細胞ベースアッセイのバリデーション
包括的バリデーション試験を行い、インビトロ相対効力細胞ベースアッセイの精確さ、精度（併行精度、中間精度及び再現精度）、直線性、平行性、アッセイ範囲及び特異性並びに定量限界（ＬＯＱ）を含めた広範な性能パラメータを評価した。適格性確認データを利用した統計分析に基づいて、予め定義された許容判定基準（その一部は初期適格性確認プロトコルと比べてバリデーションプロトコルでより厳しかった）を確立した。
【０７１５】
表１６にまとめるとおり、バリデーション試験の結果は、予め定義された許容判定基準を全て満たした。これにより、バリデートされた方法は高精度であることが実証され、中間精度は１５．６％〜２９．５％の％ＲＳＤ（相対標準偏差）範囲及び２３．５％の合成％ＲＳＤ（表１６及び表１８）、併行精度は４．９％〜１５．６％の％ＲＳＤ範囲及び１１．０％の合成％ＲＳＤ（表１６及び表２２）、且つ再現精度は１３．２％〜２２．７％の％ＲＳＤ範囲及び１９．７％の合成％ＲＳＤであった（表１６及び表１９）。
【０７１６】
加えて、この方法は精確であり、相対バイアスは−７．５％〜８．３％の範囲（表１６及び表２０）又は％回収率は９２．５％〜１０８．３％の範囲（表１９）であった。精確さは、４０％〜１６０％までの相対効力範囲を包含する５つの回収率サンプルからの傾きが０．８９０及びＲ２値が０．９９である予想相対効力に対する実測相対効力の幾何平均の優れた直線関係によっても実証された（表２１及び図１９）。この方法は、ＡＡＶ９−ＳＭＮ１ベクターによって形質導入した細胞においてのみ用量依存的増加を検出でき、ＳＭＮ１と無関係なタンパク質を発現するＡＡＶ９ベクターによって形質導入した細胞において検出しなかったため、特異性もあった（図２０）。加えて、バリデートされたアッセイ範囲から、この方法の定量下限（ＬＬＯＱ）及び定量上限（ＵＬＯＱ）はそれぞれ約４０％及び１６０％であると結論付けられた。
【０７１７】
更に、細胞播種密度、細胞継代数（Ｐ８〜Ｐ１５）、同じワーキングセルバンクからの異なるバイアルの使用、抗体濃度及びアッセイインキュベーション時間など、主要なアッセイパラメータの条件を意図的に変化させた影響がそのアッセイ性能に及ぶことがなかったため、この効力試験方法が頑健であることは明らかであった（表１７）。
【０７１８】
まとめると、このバリデートされた効力試験方法は、その安定性の指標を与える特性を所与として、臨床及び認可薬物製品のロット処分並びに安定性試験に対するその適合性を保証するものである。
【０７１９】
加えて、潜在的なプレート効果に関する試験では、プレートレイアウト（例えば、表１５を参照されたい）に定義されるとおりの３つの異なるサンプル位置（Ｓ１、Ｓ２及びＳ３）で測定した相対効力値について系統的バイアスはほとんど又は全く示されなかった。従って、プレートレイアウトは、インビトロ細胞ベース効力アッセイにおける意図される使用に許容可能であった。
【０７２０】
【表１９】
2021526806.tif 000047
【０７２１】
【表２０】
2021526806.tif 000048
【０７２２】
【表２１】
2021526806.tif 000049
【０７２３】
材料及び方法
特に指定されない限り、試験方法及び実験計画は実施例４に記載する。
【０７２４】
この細胞ベース効力試験方法は、ＡＡＶ９−ＳＭＮ１ベクターを含有する薬物製品（ＤＰ）がマウス初代細胞を形質導入し及びＳＭＮ１タンパク質を発現する能力を測定することによるＳＭＮ１コードＡＡＶ９ベクター薬物製品又は安定性サンプルの％相対効力（％ＲＰ）の定量的決定を可能にした。ハイコンテント画像システムを用いて、内因性ＳＭＮ１タンパク質の発現が欠損したマウス神経前駆細胞株（ｍＴＤ−ＮＰＣΔ７．２．６）由来の最終分化細胞中にある免疫染色したＳＭＮ１タンパク質を測定した。バリデートされ及び保護されたエクセルのテンプレートを使用した平行線分析（ＰＬＡ）を用いて参照標準品（ＲＳ）（これを１００％と定める）に対する回収率サンプルの％ＲＰ値を計算した。
【０７２５】
結果
方法の中間精度、再現精度、精確さの評価
直線性、アッセイ範囲及び定量限界
２人の分析者によって実施された２つの独立したランから得られた５つの回収率サンプルデータ（各分析者につき２つのラン、Ｎ＝４）を使用して中間精度を決定した。本方法の中間精度は、１５．６％〜２９．５％の範囲のその％ＲＳＤ値、２３．５％の合成％ＲＳＤによって示され（表１８を参照されたい及び実施例６）、これは％ＲＳＤ≦４０％の中間精度の許容判定基準を満たした。
【０７２６】
２つの試験室で３人の分析者によって実施された２つの独立したランから得られたデータ（各分析者につき２つのラン、Ｎ＝６）を使用して再現精度を評価した。５つの回収率サンプルに関連する％ＲＳＤとして測定した本方法の再現精度は１３．２％〜２２．７％の範囲で、合成％ＲＳＤは１９．７％であり、これは％ＲＳＤ≦４５％の再現精度の許容判定基準を満たした。
【０７２７】
方法の精確さは、５つの回収率サンプルから３人の分析者によって生成されたデータ（Ｎ＝６）を使用してその％回収率又は％相対バイアス値によって実証した。４０％、７０％、１００％、１３０％及び１６０％の予想相対効力に対応する５つの回収率サンプルの実測％ＲＰ値の幾何平均値は、それぞれ４３．３％、６５．１％、１０１．３％、１２２．７％及び１４８．１％であった。％回収率値は９２．６％〜１０８．３％の範囲であった（表１９）。相対バイアス値は−７．５％〜８．３％であった（表２０及び実施例６）。
【０７２８】
更に、３人の分析者からのデータ（Ｎ＝６）を使用して４０％〜１６０％の範囲内の予想％相対効力に対する実測％相対効力（％ＲＰ）の幾何平均に線形回帰モデルを適用することにより（実施例６を参照されたい）、方法の直線性を判定した。表２１及び図１９に見られるとおり（また実施例６も参照されたい）、４０％、７０％、１００％、１３０％及び１６０％における予想に対する実測％ＲＰ値が、傾きが０．８９０及びＲ２値が０．９９の優れた直線関係を示すことは明らかである。加えて、回収率サンプルを使用した試験の成功により、この方法のアッセイ定量下限（ＬＬＯＱ）及び定量上限（ＵＬＯＱ）がそれぞれ約４０％及び１６０％であると結論付けられた。従って、この方法は、４０％〜１６０％の評価したアッセイ範囲内で％ＲＰ値の精確且つ高精度な決定を保証する。
【０７２９】
方法の併行精度の決定
その予想％ＲＰが４０％、１００％及び１６０％の３つの回収率サンプルを使用して併行精度を評価した。１回目のランで２つのプレートのシステム適合性が不適合であったことに起因して、結果は２つの実験ランから導き出した（説明については、例外的条件の節を参照されたい）。表２２にまとめるとおり、これらの３つの回収率サンプルからの％ＲＳＤ値（各サンプルにつきＮ＝３）は、それぞれ１５．６％、９．７％、４．９％であり、合成％ＲＳＤは１１．０％であった（Ｎ＝９）（実施例６も参照されたい）。全ての％ＲＳＤ値が、併行精度について定義された％ＲＳＤ≦２０％の許容判定基準を満たしたことから、この方法のプレート内精度が実証された。
【０７３０】
方法の特異性
細胞ベース効力アッセイが、無関係なタンパク質を発現するＡＡＶ９ベクターではなく、ＳＭＮ１を発現するＳＭＮ１コードＡＡＶ９  ＤＰの相対効力の定量化に特異的かどうかを更に決定するため、ＳＭＮ１コードＡＡＶ９又はＭｅＣＰ２タンパク質を発現するＭＥＣＰ２−ＡＡＶ９を使用してｍＴＤ−ＮＰＣΔ７を形質導入した。次にマウス抗ＳＭＮ１（クローン２Ｂ１）によって形質導入細胞を染色した。ＡＡＶ９−ＭＥＣＰ２形質導入細胞では、ＳＭＮ１タンパク質発現レベルの指標である１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）はバックグラウンドレベルのまま（細胞のみと同等）であった（図２０Ａ）。ＡＡＶ９−ＭＥＣＰ２形質導入細胞からのバックグラウンドレベルＩＦＩ−Ｃリードアウトの知見が形質導入の不成功に起因するものでないことを確認するため、ＡＡＶ９−ＭＥＣＰ２形質導入細胞を抗ＭｅＣＰ２抗体によって染色した。図２０Ｂに示されるとおり、ＭｅＣＰ２タンパク質発現の指標であるＩＦＩ−Ｃの用量依存的な増加が認められ、ＡＡＶ９−ＭＥＣＰ２が確かに細胞の形質導入に成功したことが確認された。
【０７３１】
方法の頑健性
アッセイ性能に影響を与える可能性のあるアッセイ条件を意図的に変えることにより、方法の頑健性を判定した。各頑健性試験は、１００％相対効力のサンプルの相対効力を測定することにより、各プレートにつき１つのアッセイ条件を評価するように設計した。表２３の結果によれば、実測相対効力値は、全て目標である１００％の±４０％の範囲内であるという許容判定基準を満たしたため、アッセイ性能が条件の変化の影響を受けなかったことが実証された。従って、この方法は、細胞播種密度、細胞継代数、ワーキングセルバンクからの細胞バイアル、ＳＭＮ１抗体濃度、細胞分化時間及び感染期間が含まれる評価したアッセイ条件下で頑健と見なされる。
【０７３２】
方法の平行性
平行性は、参照標準品の傾きと比べたサンプルの傾きの比によって測定される。傾き比の判定基準を適切に確立することは、平行性を確保するものであり、相対効力の精確且つ高精度な定量化に決定的に重要である。アッセイ対照は参照標準品と同じように調製されるため、傾き比の判定基準はアッセイ対照サンプルからの傾き比の分布を用いて決定した。適格性確認試験についての傾き比の判定基準は、アッセイ開発及び事前適格性確認において外れ値プレートを除いた後に作成されたプレートを使用して０．６９〜１．４５と決定された。この判定基準は、その後、バリデーション試験について、アッセイ開発プレートの除外及びアッセイ適格性確認プレートの組み入れによって０．７５〜１．３３に絞り込まれた。バリデーション試験では、他のシステム適合性判定基準に全て適合したサンプル中、０．７５〜１．３３のきついサンプル傾き比判定基準を満たさなかったのは２つのサンプルのみで（両方とも、４０％回収率サンプルを用いた併行精度試験からのもの）、これらの２つのサンプルは、適格性確認試験に用いたサンプル傾き比判定基準（０．６９〜１．４５）は実に満たした。
【０７３３】
適格性確認及びバリデーション試験から得られた５つの回収率サンプル及びアッセイ対照の傾き比の更なる評価により、これらの２つの４０％回収率サンプルの不適合が４０％回収率サンプルに関連するやや低い傾き比及び大きいばらつきに起因したことが明らかになった（表２４）。４０％回収率サンプルは傾き比が低く及びばらつきが大きいにも関わらず、アッセイ適格性確認試験及びバリデーション試験の両方において、このサンプルについて精度、精確さ及び直線性の点でアッセイ性能を全て実証することに成功した（実施例６）。従って、４０％回収率サンプルについて観察された傾き比範囲（平均値±３ＳＤ範囲：０．６７〜１．０９、表２４）は許容可能であり、相対効力アッセイ結果に与える影響は最小限と見なされる。まとめると、表２５に示されるとおりの調整後サンプル傾き比許容判定基準がなおも相対効力の精確且つ高精度な測定に好適な方法の平行性を確保することが実証される。
【０７３４】
調整後サンプル傾き比に関連する逸脱については、本実施例の「例外的条件」と題される節にまとめた。
【０７３５】
【表２２】
2021526806.tif 000050
【０７３６】
この試験では、１．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ  ＡＶＸＳ−１０１を目標濃度（１００％の相対効力と定める）として用いた。２人の分析者により、１００％（１．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬの濃度）に対して４０〜１６０％の範囲の相対効力にわたる５つの回収率サンプルで中間精度を評価した（各サンプルにつきＮ＝４）。サンプル毎の％ＲＳＤ（Ｎ＝４）及び合成％ＲＳＤ（Ｎ＝２０）をそれぞれ決定した。この場合、ＡＶＸＳ−１０１参照物質は、０．４Ｅ＋１２、０．７Ｅ＋１２、１．０Ｅ＋１２、１．３Ｅ＋１２及び１．６Ｅ＋１２ｖｇ／ｍｌの名目濃度に希釈し、希釈したサンプルのゲノム力価をｄｄＰＣＲで決定することによって確認した。
【０７３７】
【表２３】
2021526806.tif 000051
【０７３８】
【表２４】
2021526806.tif 000052
【０７３９】
【表２５】
2021526806.tif 000053
【０７４０】
【表２６】
2021526806.tif 000054
【０７４１】
【表２７】
2021526806.tif 000055
【０７４２】
【表２８】
2021526806.tif 000056
【０７４３】
【表２９】
2021526806.tif 000057
【０７４４】
結論
包括的バリデーション試験から得られたデータ及びその統計分析（実施例６）をまとめると、実施例４に記載されるＡＡＶ９−ＳＭＮ１ベクターの効力測定方法は、相対バイアス値が−７．５％〜８．３％の範囲内と精確で、且つ合成中間精度が２３．５％の％ＲＳＤ（Ｎ＝２０）、合成再現精度が１９．７％の％ＲＳＤ（Ｎ＝３０）及び合成併行精度が１１．０％の％ＲＳＤ（Ｎ＝９）と高精度であることが実証された。この方法は、４０％〜１６０％の％ＲＰのアッセイ範囲内で優れた直線性も示し、４０％、７０％、１００％、１３０％及び１６０％の５つの回収率サンプルからの予想％ＲＰに対する実測％ＲＰの関係を線形回帰で統計的に分析したとき（実施例６）、傾き及びＲ２はそれぞれ０．８９０及び０．９９であった。更に、バリデートされたアッセイ範囲により、アッセイＬＬＯＱ及びＵＬＯＱはそれぞれ約４０％及び１６０％であると結論付けられた。
【０７４５】
この方法バリデーション試験によって示されたアッセイ性能に加え、熱ストレスを加えたサンプルによる最近の試験により、実施例４に記載されるインビトロ細胞ベース効力測定方法が安定性の指標を与えることが実証された（実施例９）。この試験では、２０〜２５℃で３ヵ月間（Ｔ＝３Ｍ）保持したＳＭＮ１コードＡＡＶ９ベクターのＧＭＰロット１００６５６の熱ストレスサンプルがその効力の半分以上を失い、実測％ＲＰは４２．２％であった一方、対照ＧＭＰ５サンプル（Ｔ０）及び同じ温度で１ヵ月間（Ｔ＝１Ｍ）保持した熱ストレスサンプルは完全な効力があった。更に、プレート効果の可能性を評価する試験により、実施例４に記載されるプロトコルに従うサンプル検査用に設計されたプレートレイアウトを用いて、効力測定値に系統的バイアスは認められないことが実証された（実施例６及び実施例７を参照されたい）。
【０７４６】
従って、実施例４に記載されるバリデートされた、安定性の指標を与えるインビトロ細胞ベース効力測定方法は、臨床的な認可済みのＳＭＮ１コードＡＡＶ９ベクター薬物製品（ＤＰ）のロット処分及び安定性サンプルの効力判定に好適と見なされた。
【０７４７】
例外的条件
逸脱
インビトロ相対効力細胞ベースアッセイのバリデーションでは、３つの回収率サンプル（目標効力４０％、１００％及び１６０％）を使用して併行精度試験を実施した。参照標準品及びアッセイ対照に関連するアッセイシステム適合性判定基準の全てにプレートが適合したにも関わらず、４０％サンプルが入ったプレートからのサンプルシステム適合性は不適合であったことが観察された。
【０７４８】
併行精度試験の各プレートで、プレートレイアウトにおいてＳ１、Ｓ２及びＳ３として設計されたサンプル位置から３つの％ＲＰ値が得られた。各サンプルから有効なデータを入手するためには、システム適合性は、他のアッセイパラメータ許容判定基準の中でも特に、参照標準品に対する試験サンプルの傾きの比が０．７５〜１．３３の範囲内であり、且つそのＲ２値が０．９５以上である必要があった（実施例４を参照されたい）。しかしながら、４０％サンプルが入ったプレートのアッセイにおけるＳ２及びＳ３の傾き比は、それぞれ０．７２及び０．６６であった。加えて、Ｓ３のＲ２値は０．９３１１であった。サンプルシステム適合性が不適合であったこれらの２つのサンプルは％ＲＰ値の生成に使用しなかった。従って、このアッセイプレートから１つの％ＲＰ値のみが生成された。併行精度評価に各プレート３つの％ＲＰ値が必要であることを考えて、４０％回収率サンプルを使用した併行精度試験を繰り返した。再検査時、Ｓ１の傾き比（０．７３）は再びサンプル傾き比判定基準に不適合となった。データレビュー及び統計分析を開始した。
【０７４９】
根本的原因及び正当化の理由
「逸脱」に記載されるとおりの併行精度試験における試験サンプルについてのサンプルシステム適合性判定基準の不適合に関して調査を行った。
【０７５０】
不適合となった３つの個別のサンプル（４０％併行精度試験について元のアッセイからの２つ及び繰り返しのアッセイからの１つ）に共通するシステム適合性判定基準を満たさなかったアッセイパラメータは、傾き比であった。加えて、バリデーションにおける唯一の更なる無効のアッセイ（１６０％回収率サンプルを使用した併行精度試験）が、サンプルの１つの用量ポイントの％ＣＶの不適合に起因したが、これはすぐにアッセイプレートのアーチファクトによって引き起こされたと決定された。合計３４個のプレートを含む包括的バリデーション試験では、実施例４による残りのシステム適合性及び予め定義された許容判定基準は、全て満たされた。ここに報告するとおりのバリデーション結果は、ＳＭＮ１コードＡＡＶ９ベクターインビトロ相対効力細胞ベースアッセイの許容可能な頑健性、精度、精確さ、直線性及びアッセイ範囲も実証した。従って、本研究者らは、バリデーションプロトコルにおけるサンプル傾き比の許容判定基準が好適でなかった可能性があり、アッセイ適格性確認後及びアッセイバリデーションプロトコル前に（０．６９〜１．４５から０．７５〜１．３３に）厳しく確立された可能性があると仮定した。
【０７５１】
本研究者らは、適格性確認についてシステム適合性許容判定基準がどのように確立され、次にバリデーションについてより厳しい判定基準に修正されたかをレビューしした。適格性確認のシステム適合性許容判定基準は、傾き比が０．６９〜１．４５と定義された１ヵ月の期間中に得られた利用可能なアッセイ開発及び事前適格性確認データに基づいて決定された。傾き比の範囲を含めた幾つかのアッセイパラメータを（０．６９〜１．４５から０．７５〜１．３３に）きつくしたバリデーションについての修正されたシステム適合性判定基準は、事前適格性確認及び適格性確認データに基づいた。更に、システム適合性判定基準をきつくする際、方法バリデーションの間に入り込んだ更なる分析者間、試験室間、装置間変動は考慮されなかった（表２６）。
【０７５２】
【表３０】
2021526806.tif 000058
【０７５３】
調査後、傾き比システム適合性判定基準が極めて短いアッセイ実施歴からのアッセイ対照に基づいて、次に追加的な確証的データがなくても方法適格性確認後直ちに更にきつくされたことが決定された。特に、アッセイ対照を用いて決定された傾き比判定基準は、４０％回収率サンプルによって示されるばらつきの大きい、平均して低めの傾き比範囲を反映しなかった（表２４を参照されたい）。加えて、方法適格性確認とバリデーションとの間で実行環境を比較すると、方法バリデーション環境には追加的な変数が含まれたことが示された。従って、研究者らは、限られたアッセイ経験で大きく成功した方法適格性確認の直後にサンプルシステム適合性許容判定基準をきつくするのは早計で、十分な正当化の理由がなく、実行環境の点で方法適格性確認と比較して多くの違いを内包する方法バリデーションにおけるサンプル傾き比の不適合につながったと結論付けた。
【０７５４】
４０％回収率サンプルは傾き比がやや低いにも関わらず、アッセイ適格性確認試験及びバリデーション試験の両方において、このサンプルについて精度、精確さ及び直線性の点でアッセイ性能を全て実証することに成功した。従って、４０％回収率サンプルについて観察された傾き比範囲（平均値±３ＳＤ範囲：０．６７〜１．０９）は許容可能と見なされたと共に、相対効力アッセイ結果に与える影響は最小限である。更に、４０％回収率サンプルの試験サンプルにおける傾き比の大きいばらつき及びやや低い傾き比に対応するため、バリデーション試験データの分析には、アッセイ適格性確認試験に用いた０．６９〜１．４５の広いサンプル傾き範囲を適用した。アッセイ対照の傾き比範囲（０．７５〜１．３３）並びに他の全てのシステム適合性許容判定基準は変えないままであり、データ品質への影響がないことことを確実にした。反転させたサンプル傾き比判定基準を用いて分析したバリデーションデータによれば、アッセイの所望の精確さ、精度、直線性、頑健性及び特異性が実証された（実施例６）。まとめると、これは、０．６９〜１．４５のサンプル傾き比許容判定基準を適用して相対効力の測定におけるデータ品質が保証されることを示している。
【０７５５】
実施例６：ＳＭＮ１コードＡＡＶ９ベクター薬物製品についてのインビトロ相対効力細胞ベースアッセイのバリデーションの統計分析
実施例４に記載する方法を用いて行ったＳＭＮ１−ＡＡＶ９のインビトロ相対効力細胞ベースアッセイのバリデーション試験（実施例５）の結果について、統計的有意性を評価した。
【０７５６】
バリデーション試験の結果について、精度（併行精度、中間精度及び再現精度）、精確さ、直線性、アッセイ範囲及び特異性を評価した。結果は以下の表２７にまとめる。アッセイ精度、精確さ、直線性及び特異性の点で、４０％〜１６０％の相対効力のアッセイ範囲のバリデーションに成功した。この方法バリデーション試験の成功により、アッセイ範囲は４０％〜１６０％である（それぞれアッセイＬＬＯＱ及びＵＬＯＱに相当する）と結論付けられた。
【０７５７】
参照標準品と比べたサンプルの傾きの比により、インビトロ相対効力アッセイの平行性を測定した。アッセイ対照は参照標準品と同じように調製したため、傾き比の判定基準はアッセイ対照サンプルからの傾き比の分布を用いて決定した。適格性確認試験の傾き比判定基準は、アッセイ開発及び事前適格性確認で外れ値プレートを除いた後に生成されたプレートを用いて０．６９〜１．４５と決定された。判定基準は、その後、アッセイ開発プレートの除外及びアッセイ適格性確認プレートの組み入れにより、バリデーション試験について０．７５〜１．３３に絞り込まれた（表２８）。
【０７５８】
アッセイバリデーション試験（実施例５）では、他の全てのシステム適合性判定基準に適合したサンプルについて、サンプル傾き比は、全て０．７５〜１．３３の範囲内であったが、但し２つの４０％回収率サンプルレプリケートは例外で、これらは両方とも０．６９〜１．４５の範囲内であった（表２９及び図２５）。これらの２つの４０％回収率サンプルレプリケートの不適合は、（１）４０％回収率サンプルの傾き比が平均して低かったこと、及び（２）４０％回収率サンプルについて傾き比の大きいばらつきが認められることに起因した（表２９）。
【０７５９】
４０％回収率サンプルは傾き比がやや低いにも関わらず、アッセイ適格性確認試験及びバリデーション試験の両方において、このサンプルについて精度、精確さ及び直線性の点でアッセイ性能を全て実証することに成功した。従って、４０％回収率サンプルについて観察された傾き比範囲（平均値±３ＳＤ範囲：０．６７〜１．０９、表２９）は許容可能であり、相対効力アッセイ結果に与える影響は最小限と見なした。バリデーション試験（実施例５）には、調整後の傾き比判定基準を採用した（表２８）。調整後判定基準について、アッセイ対照サンプルは０．７５〜１．３３の傾き比範囲のままとする一方、試験サンプルには、アッセイ適格性確認試験に用いたより広い０．６９〜１．４５の範囲を適用して、４０％回収率サンプルで示されるとおりの試験サンプルにおける傾き比の大きいばらつき及びやや低い傾き比に対応した（表２８及び表２９）。調整後の傾き比判定基準に関連する逸脱については、実施例５の「例外的条件」の節に記載する。
【０７６０】
【表３１】
2021526806.tif 000059
【０７６１】
ａＲＳＤ％（相対標準偏差）はＣＶ％（変動係数）としても知られる
【数２３】
2021526806.tif 000060
【０７６２】
【表３２】
2021526806.tif 000061
【０７６３】
【表３３】
2021526806.tif 000062
【０７６４】
併行精度
併行精度データは３つの回収率サンプルを含み、各々が、同じアッセイランから生成された３つの相対効力結果を有した。併行精度データは表３０に掲載する。この分析において相対効力は対数正規分布に従うと仮定した。
【０７６５】
各回収率サンプルについて、自然対数変換後の相対効力結果の平均値
【数２４】
2021526806.tif 000063
及び標準偏差
【数２５】
2021526806.tif 000064
及び関連する９５％信頼限界を推定する；次に幾何平均相対効力
【数２６】
2021526806.tif 000065
及びパーセント変動係数
【数２７】
2021526806.tif 000066
を計算し、表３１にまとめた。併行精度のＣＶ％推定値は４．９％〜１５．６％の範囲であった。
【０７６６】
３つの回収率サンプルを合わせたものについて、プールデータにモデル（Ｍ２．１）を当てはめて、全３つの回収率サンプルの総合併行精度を推定した。３つの回収率サンプルからのプールデータを用いた総合併行精度は１１．０％であった（表３０）。
ｌｏｇ（ｙｉｊ）＝μｉ＋εｉｊ（Ｍ２．１）
式中、ｙｉｊは回収率サンプルｉからの相対効力であり；μｉは回収率サンプルｉの対数変換後相対効力平均値であり、且つ
【数２８】
2021526806.tif 000067
はランダムアッセイ内残差である。
【０７６７】
【表３４】
2021526806.tif 000068
【０７６８】
中間精度
中間精度データには５つの回収率サンプルが含まれ、各々が、２つのアッセイ日に２人の分析者によって４つの独立したアッセイから生成された４つの相対効力結果を有した。サンプルを分析してインビトロ効力アッセイの中間精度を評価した。中間精度試験のデータは表４１に掲載する。この分析において相対効力は対数正規分布に従うと仮定した。
【０７６９】
各回収率サンプルについて、自然対数変換後の相対効力結果の平均値
【数２９】
2021526806.tif 000069
及び標準偏差
【数３０】
2021526806.tif 000070
及び関連する９５％信頼限界を推定し；次に幾何平均相対効力
【数３１】
2021526806.tif 000071
及びパーセント変動係数
【数３２】
2021526806.tif 000072
を計算し、表３１にまとめた。ＣＶ％推定値は１５．６％〜２９．５％の範囲であった。
【０７７０】
５つの回収率サンプルを合わせたものについて、プールデータにモデル（Ｍ２．２）を当てはめて、全５つの回収率サンプルの総合中間精度
【数３３】
2021526806.tif 000073
を推定した。５つの回収率サンプルからのプールデータを用いた総合中間精度は２３．５％であった（表３０）。
ｌｏｇ（ｙｉｊｋ）＝μｉ＋θｊ＋εｉｊｋ（Ｍ２．２）
式中、ｙｉｊｋは回収率サンプルｉからの相対効力であり；
μｉは回収率サンプルｉの対数変換後相対効力平均値であり；
【数３４】
2021526806.tif 000074
は、アッセイランｊからのランダムアッセイ間効果であり；及び
【数３５】
2021526806.tif 000075
はランダムアッセイ内残差である。
【０７７１】
【表３５】
2021526806.tif 000076
【０７７２】
【表３６】
2021526806.tif 000077
【０７７３】
再現精度
再現精度データには５つの回収率サンプルが含まれ、各々が、第１の試験室からの２つのアッセイ日における２人の分析者による４つの独立したアッセイ及び第２の試験室からの２つのアッセイ日における１人の分析者による２つの独立したアッセイから生成された６つの相対効力結果を有した。データを分析して、このインビトロ効力アッセイのアッセイ再現精度を評価した。再現精度、精確さ及び直線性のデータを表４１に掲載する。この分析において相対効力は対数正規分布に従うと仮定した。
【０７７４】
各回収率サンプルについて、自然対数変換後の相対効力結果の平均値
【数３６】
2021526806.tif 000078
及び標準偏差
【数３７】
2021526806.tif 000079
及び関連する９５％信頼限界を推定し；次に幾何平均相対効力
【数３８】
2021526806.tif 000080
及びパーセント変動係数
【数３９】
2021526806.tif 000081
を計算し、表３３にまとめた。ＣＶ％推定値は１３．２％〜２２．７％の範囲であった。
【０７７５】
５つの回収率サンプルを合わせたものについて、プールデータにモデル（Ｍ２．３）を当てはめて、全５つの回収率サンプルの総合再現精度
【数４０】
2021526806.tif 000082
を推定した。５つの回収率サンプルからのプールデータを用いた総合中間精度は１９．７％であった（表３４）。
ｌｏｇ（ｙｉｌｊｋ）＝μｉ＋αｌθｊ＋εｉｊｋ（Ｍ２．３）
式中、ｙｉｊｋは回収率サンプルｉからの相対効力であり；
μｉは回収率サンプルｉの対数変換後相対効力平均値であり；
【数４１】
2021526806.tif 000083
は試験室ｌからのランダム室間効果であり；
【数４２】
2021526806.tif 000084
は、試験室ｌにネストしたアッセイランｊからのランダムアッセイ間効果であり；及び
【数４３】
2021526806.tif 000085
は、ランダムアッセイ内残差である。
【０７７６】
【表３７】
2021526806.tif 000086
【０７７７】
【表３８】
2021526806.tif 000087
【０７７８】
精確さ
幾何平均相対効力及び予想相対効力から、
【数４４】
2021526806.tif 000088
として各回収率サンプルの相対バイアスを推定した。結果を表３５にまとめる。相対バイアス推定値は−７．５％〜８．３％の範囲である。
【０７７９】
【表３９】
2021526806.tif 000089
【０７８０】
直線性
表３５にあるとおりの実測相対効力の幾何平均及び予想効力に線形回帰モデルを当てはめた。直線性の結果は表３６にまとめており、データは図１９にグラフ化する。線形回帰モデルのＲ２は０．９９であり、傾き推定値は０．８９０であった。
【０７８１】
【表４０】
2021526806.tif 000090
【０７８２】
特異性
それぞれＳＭＮ１及びＭｅＣＰ２染色からの２組のデータにおいて特異性が実証された。分析したとおりのデータを表４２に掲載する。第１のデータセットでは、１８．７５ｋ〜３００ｋのＭＯＩ用量範囲のＡＡＶ９−ＳＭＮ１又はＡＡＶ９−ＭＥＣＰ２ベクターで形質導入した細胞をマウス抗ＳＭＮ１  ２Ｂ１抗体で染色した。各ＭＯＩ用量レベルのＡＡＶ９−ＭＥＣＰ２で形質導入したデュプリケートウェルからのＩＦＩ−Ｃリードアウト平均値は用量依存的増加傾向を示さなかった一方、ＡＶＸＳ−１０１対照は予想どおり直線的用量反応傾向を示した（図２０Ａ）。図２０Ａは、抗ＳＭＮ１マウスモノクローナル抗体２Ｂ１によって染色したＡＡＶ９−ＳＭＮ１及びＡＡＶ９−ＭＥＣＰ２形質導入の用量反応傾向の概要を示す。
【０７８３】
第２のデータセットでは、１８．７５Ｋ〜３００ＫのＭＯＩ用量範囲のＡＡＶ９−ＭＥＣＰ２で形質導入した細胞を抗ＭｅＣＰ２ウサギモノクローナル抗体で染色した。このデータでは、形質導入細胞におけるＭＥＣＰ２発現の指標となる蛍光シグナルの用量依存的増加により、細胞へのＡＡＶ９−ＭＥＣＰ２の効率的な形質導入が実証された（図２０Ｂ）。図２０Ｂは、抗ＭｅＣＰ２ウサギモノクローナル抗体によって染色したＡＡＶ９−ＳＭＮ１及びＡＡＶ９−ＭＥＣＰ２形質導入の用量反応傾向の概要を示す。
【０７８４】
バリデーション試験結果概要
精度（併行精度、中間精度及び再現精度）、精確さ、直線性及び特異性を含めたアッセイバリデーション試験の分析結果を表３７にまとめる。このアッセイバリデーション試験では、予め指定した試験判定基準の全てが適合した。
【０７８５】
【表４１】
2021526806.tif 000091
【０７８６】
ａＲＳＤ％（相対標準偏差）はＣＶ％（変動係数）としても知られる
【数４５】
2021526806.tif 000092
【０７８７】
傾き比平行性の評価
試験サンプルと参照標準品との傾きの比、即ち傾きサンプル／傾き標準品（ここで、傾きは、ＩＦＩ−ｃとｌｏｇ２変換後ＭＯＩレベルとの間の線形回帰モデルから推定した）により、インビトロ相対効力アッセイの平行性を測定した。
【０７８８】
アッセイ適格性確認試験及びバリデーション試験のシステム適合性判定基準を表３８に掲載する。アッセイ対照は参照標準品と同じように調製されるため、傾き比の判定基準はアッセイ対照サンプルからの傾き比の分布を用いて決定した。適格性確認試験の傾き比判定基準は、アッセイ開発及び事前適格性確認で外れ値プレートを除いた後に生成されたプレートを用いて０．６９〜１．４５と決定され、この判定基準は、その後、アッセイバリデーション試験について、アッセイ開発プレートの除外及びアッセイ適格性確認プレートの組み入れによって０．７５〜１．３３に絞り込まれた。
【０７８９】
アッセイ適格性確認試験及びバリデーション試験で生成されたアッセイ結果からの傾き比をプールして分析することにより、参照標準品と比べたサンプルの総合平行性を判定した。分析のため、傾き比は対数変換した。アッセイ対照及び各回収率サンプルについて、自然対数変換後の傾き比の平均値
【数４６】
2021526806.tif 000093
及び標準偏差
【数４７】
2021526806.tif 000094
を推定し；次に幾何平均相対効力
【数４８】
2021526806.tif 000095
及びパーセント変動係数
【数４９】
2021526806.tif 000096
を計算し、表３９にまとめた。７０％、１００％、１３０％及び１６０％回収率サンプルについて、アッセイ対照サンプルと比較して幾何平均傾き比に有意な差はなかった。しかし、４０％回収率サンプルの傾き比は、アッセイ対照よりも低かった（ｐ＜０．０００１）。データは、４０％及び１６０％回収率サンプルについて傾き比のばらつきがより大きいことも示唆している（ＣＶ％：４０％及び１６０％について、それぞれ８．１％及び９．２％、表３９）。
【０７９０】
アッセイバリデーション試験では、他の全てのシステム適合性判定基準に適合したサンプルについて、サンプル傾き比は０．７５〜１．３３の範囲内であったが、但し２つの４０％回収率サンプルレプリケートは例外で、これらは両方とも０．６９〜１．４５の範囲内であった（表３９及び図２５）。これらの２つの４０％回収率サンプルレプリケートの不適合は、（１）４０％回収率サンプルの傾き比が平均して低かったこと、及び（２）４０％回収率サンプルについて傾き比の大きいばらつきが認められたことに起因した（表３９）。
【０７９１】
４０％回収率サンプルは傾き比がやや低いにも関わらず、アッセイ適格性確認試験及びバリデーション試験の両方において、このサンプルについて精度、精確さ及び直線性の点でアッセイ性能を全て実証することに成功した。従って、４０％回収率サンプルについて観察された傾き比範囲（平均値±３ＳＤ範囲：０．６７〜１．０９、表３９）は許容可能であり、相対効力アッセイ結果に与える影響は最小限と見なした。バリデーション試験には、調整後の傾き比判定基準を採用した（表３９）。調整後判定基準について、アッセイ対照サンプルは０．７５〜１．３３の傾き比範囲のままとする一方、試験サンプルには、アッセイ適格性確認試験に用いたより広い０．６９〜１．４５の範囲を適用して、４０％回収率サンプルで示されるとおりの試験サンプルにおける傾き比の大きいばらつき及びやや低い傾き比に対応した（表３８及び表３９）。
【０７９２】
【表４２】
2021526806.tif 000097
【０７９３】
【表４３】
2021526806.tif 000098
【０７９４】
統計ソフトウェア
アッセイ適格性確認試験及びシステム適合性に関する統計分析は、統計ソフトウェアＪＭＰ  Ｐｒｏ  １３．２．１を使用して実施した。
【０７９５】
データ
【０７９６】
【表４４】
2021526806.tif 000099
【０７９７】
【表４５】
2021526806.tif 000100
【０７９８】
【表４６】
2021526806.tif 000101
【０７９９】
【表４７】
2021526806.tif 000102
【０８００】
【表４８】
2021526806.tif 000103
【０８０１】
【表４９】
2021526806.tif 000104
【０８０２】
【表５０】
2021526806.tif 000105
【０８０３】
【表５１】
2021526806.tif 000106
【０８０４】
実施例７：ＳＭＮ１コードＡＡＶ９ベクターのインビトロ相対効力細胞ベースアッセイについての均一性試験
ＳＭＮ１コードＡＡＶ９ベクターのインビトロ相対効力細胞ベースアッセイについて均一性検査を実施した。均一性は、９６ウェルプレートのウェルＢ２〜Ｇ１１（図２１に示されるとおり、これらがアッセイに利用されるウェル（即ちプレートの内側の６０ウェル）であることに伴う）にわたって単一用量のＭＯＩを用いて評価した。例えば、実施例４に記載される５ポイント検量線の最も低い用量ＭＯＩ（１８．７５Ｋ）が、変化に対する感度が最も高いポイントに対応し、均一性評価向けであった。２人の分析者が各自、分析者が一度に検査することのできるプレートの最大数に相当する３プレートを実施例４に記載される手順に従い調製した。データは、存在する場合に不均一性の検出が可能な３Ｄヒートマッププロットを用いて分析した。
【０８０５】
ＳＭＮ１コードＡＡＶ９ベクター細胞ベース効力アッセイの均一性の判定には、中間的な用量ＭＯＩ（７５Ｋ）を選択した。ＳＭＮ１コードＡＡＶ９薬物製品（ロット６０４４３−０５、４．３Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬ）を、製剤化緩衝液（ＴＦＦ３緩衝液５０ｐｐｍ）を使用して１．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬに希釈することによってサンプルを調製した。次にサンプルを、プレート培地を使用して１６．７倍希釈し、続いてプレート培地を使用して２ラウンドの１：２段階希釈を行った。これらの調製ステップは、実施例４における参照標準品の調製方法と一致した。
【０８０６】
追加的なアッセイを実施して、プレート位置効果の可能性に対処した。インビトロ細胞ベース効力アッセイに対するプレート効果を決定する統計分析に、これらの２つの試験からのデータを含めた。
【０８０７】
実施例４のとおり４つのアッセイを実施し、４つの異なる位置からのサンプルについて参照標準品に対するパーセント相対効力を測定した。参照標準品は実施例４に記載されるとおり調製し、４つ全てのサンプルを参照標準品と同じように調製した。表４４はプレートレイアウトを示す。
【０８０８】
【表５２】
2021526806.tif 000107
【０８０９】
これらのデータから、実施例４に記載されるインビトロ相対効力細胞ベースアッセイに用いられるプレートレイアウトが任意のプレート効果に関連したどうかを統計分析（実施例６）によって決定することが可能であった。参照標準品及びサンプルの両方とも、ＳＭＮ１コードＡＡＶ９薬物製品ＧＭＰ７（ロット６０４４３−０５、４．３Ｅ＋１３ｖｇ／ｍＬ）を使用して調製したことに留意されたい。
【０８１０】
測定された相対効力値の系統的バイアスはほとんど又は全くなかった。
【０８１１】
実施例８：ＳＭＮ１コードＡＡＶ９ベクターのインビトロ相対効力細胞ベースアッセイの特異性
当初、ｍＴＤ  ＮＰＣ−Δ７細胞へのＭＥＣＰ２コードＡＡＶ９ベクターの形質導入時にＭｅＣＰ２染色（ＩＦＩ−Ｃ）の用量依存的増加は、ごく僅かにのみ認められた。
【０８１２】
この実験のプレートのレイアウトを以下の表４５に示す。
【０８１３】
【表５３】
2021526806.tif 000108
【０８１４】
アッセイプレートの作製後、実施例４に記載されるインビトロ細胞ベース効力アッセイにおけるＳＭＮ１コードＡＡＶ９ベクターについてのデータの入手に向けては、３つの主要なステップがある。それらステップは、
（１）ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ  ＣＸ５のＨＣＳ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用した画像収集；
（２）ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ  ＣＸ５のＨＣＳ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用した画像分析；及び
（３）インビトロ相対効力計算スプレッドシートを使用したデータ分析
である。
【０８１５】
データ分析のステップ（３）後になされた初期観察は、列１０〜１１におけるＩＦＩ−Ｃのほんの僅かな増加であった（図２２を参照されたい）。
【０８１６】
この観察が真に生物学的事象を反映したのか、それとも画像分析によって生じたのかを決定するため、ステップ（１）（画像収集）で入手された生画像データを目視で確認した。図２３は、表４５に示すプレートの画像モンタージュを示す。
【０８１７】
画像収集プロセスの間にＭｅＣＰ２染色細胞を過度に露光した。露光過度及びそれによるＭｅＣＰ２染色細胞の極めて高いＩＦＩ−Ｃの結果、ＳＭＮ１発現の分析用に特別にセットアップした画像分析（ステップ２）の間にそれらの細胞が除外されることになった。これは、核内の局在化した発現（ＭｅＣＰ２染色）というよりむしろ、分散した斑点のように見えるＳＭＮ１染色用に特別にセットアップしたパラメータに起因した。
【０８１８】
図２３に示されるとおりの当初入手された画像を、ＭｅＣＰ２染色細胞を特異的に判定するように修正した画像分析プロトコルを用いて再分析した。次に、入手された画像分析データを用いて、Ｌｏｇ２ＭＯＩに対するＩＦＩ−Ｃを示すグラフをプロットした（図２４）。
【０８１９】
図２４に示されるデータは、ＡＡＶ９−ＭＥＣＰ２で形質導入した細胞におけるＭｅＣＰ２染色の用量依存的且つ直線的増加を確立し、抗ＳＭＮ１抗体がＡＡＶ９−ＳＭＮ１形質導入細胞のみを特異的に染色したことを実証している。従って、実施例４に記載されるとおりのＳＭＮ１コードＡＡＶ９ベクターのインビトロ細胞ベース効力アッセイは、ＡＡＶ９−ＳＭＮ１ベクター薬物製品の相対効力の特異的な決定に用いることができる。
【０８２０】
実施例９：ＳＭＮ１コードＡＡＶ９ベクターのインビトロ相対効力細胞ベースアッセイは安定性の指標を与える
ＡＡＶ９−ＳＭＮ１（ＧＭＰ５バッチ番号６００１５６）ストレスサンプルについて、実施例４に記載されるインビトロ細胞ベース効力アッセイ方法を用いて２０〜２５℃に１及び１ヵ月及び３ヵ月保持した後の安定性を検査した。
【０８２１】
以下の表４６によって示されるとおり、３つ全てのサンプル（Ｓ１、ＤＰバッチ番号６００１５６；Ｓ２、２０〜２５℃に１ヵ月保持及びＳ３、２０〜２５℃に３ヵ月保持）が許容判定基準を満たした。
【０８２２】
【表５４】
2021526806.tif 000109
【０８２３】
【表５５】
2021526806.tif 000110
【０８２４】
サンプル３（時間＝３ヵ月、２０〜２５℃）の相対効力は５０％未満に低下した一方、サンプル１（時間＝０、２０〜２５℃）及びサンプル２（時間＝１ヵ月、２０〜２５℃）の相対効力はいかなる低下も示さなかった。これらのデータは、インビトロ相対効力アッセイが、アッセイの直線性を評価するために生成される回収率サンプルの相対効力のみならず、実際の製造用サンプルの相対効力も測定できることを示している。更に、ＧＭＰ５ストレスサンプルの検査の成功は、ＡＡＶ９−ＳＭＮ１インビトロ効力アッセイが安定性の指標を与えるものであり、従ってそのロット処分のためのＡＡＶ９−ＳＭＮ１ベクター薬物製品の検査に好適であることを実証している。
【０８２５】
実施例１０：ＡＡＶ９−ＳＭＮ１製造用のプレＧＭＰマスターセルバンクの作成
方法
解凍：単一細胞バイアル（１×１０６細胞）を３７℃の水浴中で約１分間解凍し、５ｍＬの予め温めた完全成長培地に内容物を希釈した。細胞をＴ−２５ｃｍ２フラスコに移し、３７℃のインキュベーターで４日間、培養培地を予め温めた完全成長培地と毎日交換しながら成長させた。
【０８２６】
接着性増加に関する選択：以下の技法を用いて細胞を培養して、強く接着する細胞を選択した。２５ｃｍ２フラスコ内で細胞が９５％コンフルエンシーに達した後、細胞を継代培養した。細胞を５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、次に０．５〜１ｍＬのＨｙＱＴａｓｅによって室温で約２分間解離した。５ｍＬ完全成長培地を加えることにより解離を停止させ、繰り返しピペッティングして細胞集塊を解離させた。次に細胞懸濁液を２００×ｇで４分間遠心した。上清を廃棄し、細胞ペレットを１０ｍＬの完全成長培地に再懸濁した。細胞を７５ｃｍ２フラスコに移した。３７℃のインキュベーターで４時間インキュベートした後、細胞培養培地を吸引することにより接着の弱い細胞を洗い流して接着の弱い細胞及び非接着細胞を取り除いた。培養培地を１０ｍＬの予め温めた完全成長培地と交換した。この工程により、目視検査によれば細胞数の最大３５％だけ細胞量が減少した。細胞を更に２日間インキュベートした後、再び継代培養した。播種４時間後の培地交換からなるこの選択工程を３回実施した後、選択された細胞集団を拡大した（図２７及び図２８）。最終選択ステップでは、細胞は２５ｍＬの最終容積として２×１７５ｃｍ２フラスコに播種した。播種４時間後の最後の培地交換後に細胞損失の減少があったことが認められた。
【０８２７】
細胞拡大：続いて細胞が２×１７５ｃｍ２フラスコ内でコンフルエントになった後、細胞を拡大した。細胞を１５ｍＬ  ＰＢＳで洗浄し、次に３ｍＬ  ＨｙＱＴａｓｅで解離し、室温で約２分間インキュベートした。１０ｍＬの完全成長培地を加えることにより解離を停止させた。次に細胞懸濁液を遠心し、上清の吸引後に２つの細胞ペレットを生じさせた。各ペレットを８ｍＬの完全成長培地に再懸濁し、この濃縮細胞懸濁液の２ｍＬを８×１７５ｃｍ２フラスコに加えた。これらのフラスコは、２０ｍＬの完全成長培地を合計２２ｍＬの細胞懸濁液及び１：４の分割比となるように加えることによって調製した。次の拡大ステップも同じ手順を用いたが、以下の点は変更した：４×１７５ｃｍ２フラスコは１：２の分割比で拡大し、且つ４×１７５ｃｍ２フラスコは１：３の分割比で拡大した。これにより合計２０×１７５ｃｍ２フラスコとなった。
【０８２８】
回収：２０×１７５ｃｍ２フラスコから細胞を回収した。細胞を１５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、次に先述のとおり３ｍＬ  ＨｙＱＴａｓｅで解離した。１０ｍＬの完全成長培地を加えることにより細胞解離を停止させ、４×１７５ｃｍ２フラスコからの細胞懸濁液を１×５０ｍＬチューブに加えて５０ｍＬチューブに収集した。これにより、各４０ｍＬの細胞懸濁液の５×５０ｍＬチューブとなった。チューブを遠心して細胞ペレットを作り、上清を吸引し、細胞を１０ｍＬの完全成長培地で再懸濁すると、５０ｍＬの細胞懸濁液となった。
【０８２９】
この容積を、各チューブにつき合計２５ｍＬの細胞懸濁液として２×５０ｍＬチューブに分割した。１：２希釈したこのサンプルを使用することにより、血球計算器及びトルイジン（Ｔｏｌｕｄｉｎｅ）（トリパン）ブルーを使用してチューブ細胞当たりの生細胞数を計算した。チューブ１サンプルは生細胞数が１．９９×１０６細胞／ｍＬで、３．９８×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度が得られ、且つチューブ２サンプルは生細胞数が２．４×１０６細胞／ｍＬ（合計１×１０８細胞）で、４．８×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度が得られた（合計１．２×１０８細胞）。従って、合計２．２×１０８細胞が回収された。両方のチューブを再び遠心し（６分、２００×ｇ）、ペレットをそれぞれ１０ｍＬ（チューブ１）及び１２ｍＬ（チューブ２）の凍結用培地中に再懸濁して細胞濃度を１×１０７細胞／ｍＬに調整した。これらの２つの細胞懸濁液をプールし、２２本の滅菌クライオバイアルに１ｍＬアリコート（各々１×１０７細胞が入っている）を充填した（表４８）。
【０８３０】
【表５６】
2021526806.tif 000111
【０８３１】
次に、充填したバイアルを新鮮なイソプロパノールと共に凍結チャンバに一晩移し、−８０℃のフリーザー内で制御された速度で凍結させた。次に凍結バイアルを液体窒素槽内の気相式液体窒素に移した。ＧＭＰ施設にバンク化されることになる１０本のバイアルをドライアイス上に移した。
【０８３２】
ＡＴＣＣからのＨＥＫ２９３細胞を解凍し、３継代で接着性増加に適合させることに成功した後、拡大し、シードバンクのバンク化に成功した。このシードバンクを成長及び外来病原体（マイコプラズマ、真菌及び細菌）の存在に関して試験した。試験により、このシードバンクがＧＭＰ施設におけるマスターセルバンク化に好適であることが示された。
【０８３３】
実施例１１：製造の上流工程
上流工程（例えば、図２９を参照されたい）を用いてワーキングセルバンクに由来する中間体を産生した。ここで、上流工程は、（ａ）接着細胞を培養するステップ、（ｂ）培養細胞に図２６Ａ〜２６Ｃに示されるとおりの３つのプラスミド（例えば、本明細書に記載されるＡＡＶ９−ＳＭＮ１を含む）をトランスフェクトしてＡＡＶウイルスベクターの産生を可能にするステップ、（ｃ）接着細胞を溶解させてＡＡＶウイルスベクターを単離するステップ、（ｄ）ウイルス粒子をろ過によって精製して任意のインタクトな細胞又は細胞デブリを除去するステップ、及び（ｅ）精製された（ｄ）の産物をタンジェンシャルフローろ過に供するステップ、及び（ｆ）得られた精製ウイルス粒子中間調製物を凍結するステップを含む。
【０８３４】
（ａ）接着細胞の培養
ＨＥＫ２９３細胞を解凍し、ＣＯ２インキュベーターを用いて使い捨てフラスコ内で７継代にわたって拡大した。解凍した細胞を細胞拡大成長培地で洗浄し、遠心し、新鮮な細胞拡大成長培地に再懸濁した。この再懸濁細胞を、細胞拡大成長培地が入ったフラスコに播種し、インキュベートした。
【０８３５】
細胞がコンフルエントになったところで、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ酵素溶液でフラスコから取り出した。細胞拡大成長培地を加えて酵素（ｅｎｙｍｅ）溶液を中和し、懸濁細胞を分割して、細胞拡大成長培地が入った新しいフラスコに再播種した。この拡大工程を７回繰り返した。繰り返しの最終回では、懸濁細胞はフラスコに再播種せず、代わりに細胞スラリーをバイオリアクターに接種して更に拡大させた。
【０８３６】
接種に先立ち、接種用にｉＣＥＬＬｉｓ  ５００／２００ｍ２又はｉＣＥＬＬｉｓ  ５００／３３３ｍ２接着細胞バイオリアクターを調製した。調製作業には、使い捨てバイオリアクターの荷解き、現物検査、漏れ試験、管類アセンブリの取り付け及びプローブ平衡化が含まれた。細胞拡大成長培地を入れてバイオリアクターを平衡化させた。ｐＨ（ｐＨ６．９〜７．５）、温度（３５℃〜３９℃）及び溶存酸素（４０〜１２５％）が規定の範囲内にあることを確認後、バイオリアクターに４８００〜７０００細胞／ｃｍ２（２００ｍ２リアクターについて）又は５０００〜１２０００細胞／ｃｍ２（３３３ｍ２リアクターについて）の目標播種密度で播種した。再循環培地バッグ中の培地に前のステップからの細胞スラリーを加え、バイオリアクター内に循環させた。
【０８３７】
（ｂ）接着細胞のトランスフェクション
バイオリアクター接種時点から４、５又は６日後、接着ＨＥＫ２９３細胞に三重ＤＮＡプラスミドＰＥＩ共沈殿物をトランスフェクトした。このトランスフェクションに利用した３つのプラスミドは、ｐＳＭＮ、ｐＡＡＶ２／９及びｐＨＥＬＰである。細胞拡大に使用したＤＭＥＭ成長培地をバイオリアクターから取り出し、トランスフェクション培地に交換する。大規模接着細胞バイオリアクターにおいてポリエチレンイミン（「ＰＥＩ」）共沈殿物を用いた接着性ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞への三重ＤＮＡプラスミドトランスフェクションを用いてｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＳＭＮベクターを作製する。このベクタープラスミドｐＳＭＮは、ヒト生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ）のｃＤＮＡを含む。このトランスフェクションに利用した３つのプラスミドは、ｐＳＭＮ（２２２ｍｇ）、ｐＡＡＶ２／９（３３３ｍｇ）及びｐＨＥＬＰ（４４４ｍｇ）である。これらのプラスミドは１：１：１のモル比でトランスフェクトされ得る。トランスフェクション培地は、ＰＥＩ−プラスミド共沈殿物を加える前に、バイオリアクター温度が＞３０℃になるまでバイオリアクター内で平衡化させた。ＰＥＩ−プラスミド共沈殿工程は、トランスフェクション培地にプラスミドを加えること及び０．２μろ過して反応バッグに入れることを伴う。ＰＥＩをトランスフェクション培地に加え、次に反応バッグに加えた。ＰＥＩ−プラスミド比は、重量基準で約１：１である。ＰＥＩ−プラスミド反応物を手動で混合して均一懸濁液を形成した。及び反応は１５〜３０分の時間にわたって行う。この反応時間の終わりに、ＰＥＩ−プラスミド共沈殿物を反応バッグからバイオリアクターに移した。このＰＥＩ−プラスミド共沈殿物をバイオリアクター内で１〜２時間（別の継続期間が実施例７に記載される）にわたって混合させた後、撹拌を再開した。次の培地交換前にトランスフェクション培地をバイオリアクターに１８〜２４時間再循環させた。
【０８３８】
バイオリアクター６日目、トランスフェクションから１８〜２４時間後、バイオリアクターを排液し、トランスフェクション培地再循環培地バッグをトランスフェクション後培地に交換した。トランスフェクション後培地をバイオリアクター中で再循環させながらバイオリアクターに再充填した。７日目、６日目の培地交換から１８〜２４時間後、再循環バッグ中のトランスフェクション後培地を新鮮なトランスフェクション後培地バッグに交換した。このステップの間、バイオリアクターは排液しなかった。培地の再循環は、通常９日目である回収まで継続する。
【０８３９】
（ｃ）トランスフェクト接着細胞の溶解
バイオリアクター内で９日後、リアクターから最終的な回収前サンプルを採取し、全細胞溶解工程を開始した。バイオリアクターに１００Ｕ／ｍＬの最終濃度となるようにベンゾナーゼを加えた。ベンゾナーゼをリアクター内で混合させて、そのリアクターに溶解緩衝液を加えた。溶解緩衝液をリアクター内で１５〜２５℃で２時間混合した後、バイオリアクターの内容物を回収バッグに移した。ベンゾナーゼ反応をクエンチする塩ショ糖液（ＳＳＳ）を回収バッグに加え、１５分間混合した。次にバイオリアクターをバイオリアクターリンス緩衝液で１５分間リンスし、次にリンス液を回収物収集バッグに、クエンチした細胞溶解溶液と共に収集した。収集バッグにリンス液が加わった後、内容物を１５分間混合し、バルク回収物サンプルを採取した。
【０８４０】
（ｄ）ろ過及びタンジェンシャルフローろ過によるウイルス粒子の調製
混合したバルク回収物をＰＯＤデプスフィルタでろ過して収集バッグに入れた。全てのバルク回収物がろ過された後、デプスフィルタをＴＦＦ１緩衝液でチェーシング（ｃｈａｓｅ）した。デプスフィルタプール液を混合し、サンプリングした。次にデプスフィルタプール液を０．４５μｍフィルタでろ過してバルク回収物材料を更に清澄化した。次に０．４５μｍフィルタをＴＦＦ１緩衝液でチェーシング（ｃｈａｓｅ）した。
【０８４１】
ＴＦＦ１ステップについては、５．０ｍ２の３００ｋＤａ  ＭＷカットオフ再生セルロース膜カセットをフラッシュし、ＮａＯＨ溶液で衛生化し、ＴＦＦ１緩衝液で平衡化した。この作業の濃縮相は、清澄化された回収物の容積が約１０分の１に減少するように設計した。目標保持液容積に達した後、ダイアフィルトレーション作業を開始する。６ダイアボリュームのＴＦＦ１緩衝液で保持液のダイアフィルトレーションを行った。代わりに、保持液のダイアフィルトレーションは、６ダイアボリュームより多いＴＦＦ１緩衝液、例えば１０ダイアボリューム（ｄｉｖｏｌｕｍｅ）、１２ダイアボリューム又は１５ダイアボリュームで行った。６ダイアボリュームの透過液総流量が達成された後、保持液を再び濃縮し、収集バッグに回収した。２回の連続的な膜リンスを実行してＴＦＦシステムからの産物回収率を最大化し、中間原薬が産生された。
【０８４２】
（ｅ）中間体の凍結
ＬＦＨフード内でＴＦＦ１中間体をアリコートに分けて１又は２リットル滅菌ＰＥＴＧボトルに入れ、次にドライアイス上又はフリーザー内で凍結し、−６０℃の貯蔵場所に移した。
【０８４３】
【表５７】
2021526806.tif 000112
【０８４４】
実施例１２：製造の下流工程
下流工程（例えば、図３０を参照されたい）を用いてＴＦＦ１中間体をろ過済み原薬に処理した。一部の実施形態において、本明細書に開示される下流工程を用いて、本明細書に記載されるとおりのＡＡＶ９−ＳＭＮを含む中間体を処理し得る。下流工程ステップには、（ａ）中間体を（ろ過を用いて）酸性化及び清澄化するステップ、（ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製するステップ、（ｃ）タンジェンシャルフローろ過（「ＴＦＦ２」）でろ過するステップ、（ｄ）ＣｓＣｌ緩衝液を用いて超遠心することにより中身の詰まったカプシドと空のウイルスカプシドとを分離するステップ、（ｅ）ＡＡＶウイルスベクターを収集するステップ、及び（ｄ）収集されたＡＡＶウイルスベクターを第２のタンジェンシャルフローろ過（「ＴＦＦ３」）ステップでろ過するステップが含まれる。
【０８４５】
（ａ）酸性化及び清澄化
上流工程からのＴＦＦ１中間材料（それ以前に凍結した場合には室温に解凍する）をミキサでバッグに送り込んだ。プールしたＴＦＦ１中間体を混合し、サンプルを採取して力価を決定した。プールしたＴＦＦ１中間体は、１１〜１４％のＴｗｅｅｎ  ２０を添加することにより直ちに処理した。Ｔｗｅｅｎ  ２０は、酸性ｐＨ条件下でのバルクの宿主細胞タンパク質及びＤＮＡのフロキュレーションを促進するために使用した。この混合物を１２〜２０時間インキュベートさせておいた。次に酸性化緩衝液（１Ｍグリシン）を加えることによりｐＨをｐＨ３．３〜３．７に下げた。次に、溶液を１．１ｍ２  Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ及び２．２ｍ２  Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋Ｃ０ＨＣデプスフィルタ及び０．４５μｍポリッシングフィルタでろ過することにより、ｐＨを下げた後に形成された沈殿物を取り除いた。この工程により、酸性化及び清澄化されたＴＦＦ中間体が生じた。
【０８４６】
（ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製
陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーステップを用いてウイルスカプシドをタンパク質、ＤＮＡ及び他の工程不純物、例えば、宿主細胞脂質、ＴＷＥＥＮ  ２０と分離した。このステップには、自動プロセスクロマトグラフィーシステムを用いて操作されるＣＩＭｍｕｌｔｕｓ  Ｓ０３−８０００先端複合材料カラム（スルホニル）（０．２μｍ細径）クロマトグラフィーカラム（８．０Ｌ）を利用した。緩衝液及び溶液について、以下の表に記載する。
【０８４７】
【表５８】
2021526806.tif 000113
【０８４８】
酸性化及び清澄化したＴＦＦ中間体（即ちＣＥＸロード）を清浄化及び平衡化したＣＥＸカラムにロードした。条件は、ウイルスベクターがモノリスカラムに結合するようなものであった。ＣＥＸ  Ａ緩衝液でカラムから未結合の材料を洗浄した。ＣＥＸ  Ａ緩衝液中のＣＥＸ  Ｂ緩衝液の勾配によって樹脂から産物を溶出させた。画分１の収集は、溶出勾配の始まりから開始して、それぞれ２．３〜２．７ＣＶの規定容積である１０カラム容積（ＣＶ）にわたった。クロマトグラフィーカラムは各バッチ後に廃棄した（即ちクロマトグラフィーカラムを再利用しなかった）。次に、ＣＥＸ産物溶出物（画分２）を、中和緩衝液を用いて７．７〜８．３のｐＨに中和した。
【０８４９】
（ｃ）タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ２）によるろ過
ＴＦＦ２ステップでは、ウイルスベクターを濃縮し、タンパク質不純物を除去し、緩衝液をＣｓＣｌ超遠心ステップに適切な緩衝液に交換した。中和したＣＥＸ溶出物を、０．３ｍ２の３００ｋＤａ  ＭＷＣＯ再生セルロース膜を装着したＴＦＦシステムを用いて処理した。
【０８５０】
中和したＣＥＸ溶出物の容積を目標保持液容積に減少させた。目標保持液容積に達した後、不連続ＴＦＦモード（バッチモード）でダイアフィルトレーションを開始した。保持液をＴＦＦ２  ＮａＣｌダイアフィルトレーション緩衝液で２倍希釈し、保持液をその初期容積まで濃縮した。ＴＦＦ２  ＮａＣｌダイアフィルトレーション緩衝液によるダイアフィルトレーションが完了するまでこれを繰り返した。次に保持液をＴＦＦ２  ＣｓＣｌダイアフィルトレーション緩衝液で２倍希釈し、保持液をその初期容積まで濃縮した。ＴＦＦ２  ＮａＣｌダイアフィルトレーション緩衝液によるダイアフィルトレーションが完了するまでこれを繰り返した。
【０８５１】
中和したＣＥＸ溶出物の物理的力価、システムのホールドアップ容積、システムのフラッシュ容積及び保持液密度に基づいて保持液を最終重量に更に濃縮して所望の目標ベクター濃度を達成し、回収して収集バッグに入れた。ＴＦＦ２  ＣｓＣｌダイアフィルトレーション緩衝液でシステムのフラッシュサイクルを１回行った後、産物をブローダウンしてＴＦＦシステムからの産物回収率を最大化した。ＴＦＦ２保持液のサンプル（これは保持液及びフラッシュ液を含有する）を物理的力価測定のため採取した。ＴＦＦ２膜カセットは各バッチ後に廃棄した（即ちＴＦＦ膜を再利用しなかった）。
【０８５２】
【表５９】
2021526806.tif 000114
【０８５３】
（ｄ）ＣｓＣｌ超遠心
超遠心ステップの目的は、塩化セシウム勾配超遠心法を利用することにより完全なカプシドから空のカプシドを除去することであった。超遠心チューブにＴＦＦ２保持液を加え、チューブを密封した。タイプ５０．２  Ｔｉロータ又は均等なロータを備えた自動Ｏｐｔｉｍａ  ＸＰＮ  １００超遠心システム又は均等なシステムなど、超遠心機にチューブを置いた。充填したチューブを２０℃において４５，０００ｒｐｍで２２時間遠心した。
【０８５４】
（ｅ）ＡＡＶウイルスベクターの収集
遠心ステップの完了後、超遠心機からチューブを取り出し、バイオセーフティキャビネットに置いた。産物の入ったチューブを廃棄物容器の上にあるリングスタンドにマウントした。ランプをチューブの真下に位置決めして、空のカプシドバンド（バンドＡ、一番上のバンド）、完全なカプシドのダブレットバンド（バンドＢ及びバンドＣ、ダブレットの上及び下のバンド）及びダブレットの下の一番下のバンド（バンドＤ）を可視化した。シリンジに取り付けた針でチューブに穴をあけてチューブをベントし、針によってバンドＢ、Ｃ及びＤを取り取り出した。収集された材料を収集バッグに移した。収集された超遠心プール（ＵＣプール）をＴＦＦ２緩衝液で希釈して、ＴＦＦ２ロード材料中で一貫した出発ＣｓＣｌ濃度に至らせた。希釈したＵＣプールはＴＦＦ３ステップで処理される。ＣｓＣｌ超遠心ステップ用の緩衝液を以下の表に挙げる。
【０８５５】
【表６０】
2021526806.tif 000115
【０８５６】
（ｆ）タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ３）によるろ過
ＴＦＦ３ステップでは、ＣｓＣｌを除去し、最終製剤化緩衝液を用いて完全なベクターを濃縮した。５０ｃｍ２の３００ｋＤａ  ＭＷＣＯ再生セルロース膜と併せてタンジェンシャルフローろ過システムを利用した。膜によってウイルスベクターが保持された。
【０８５７】
希釈後ＵＣプールの容積を目標保持液容積に減少させた。目標容積に達した後、一定の保持液容積での連続ダイアフィルトレーションを開始した。ＴＦＦ３緩衝液で保持液のダイアフィルトレーションを行った。ダイアフィルトレーションの保持液のサンプルを物理的力価測定のため採取した。透過液重量を目標とすることにより保持液を更に濃縮し、この重量は、１）ダイアフィルトレーション終了時のＴＦＦシステム中の保持液容積、２）希釈後ＵＣプールの物理的力価、３）目標原薬（ＤＳ）濃度、４）システムフラッシュ液及びフィルタフラッシュ液の合計容積、及び５）ＴＦＦ３緩衝液の密度により計算した。ＴＦＦ３膜カセットは各バッチ後に廃棄した（即ちカセットを再利用しない）。
【０８５８】
【表６１】
2021526806.tif 000116
【０８５９】
ＴＦＦ３緩衝液によるＴＦＦ膜の２回連続２０ｍＬリンスを実施して、ＴＦＦシステムからベクターを回収した。０．２ｍｍ  Ｐａｌｌ  Ｓｕｐｏｒ（登録商標）ＥＫＶ滅菌用グレードフィルタ（Ｍｉｎｉ  Ｋｌｅｅｎｐａｋ）によってリンス液を回収した。ＴＦＦ３緩衝液でフィルタのリンスを実施して、フィルタに残る任意のベクターを回収し、ろ過後ＴＦＦ３プール（即ち原薬ＤＳ）の最終容積を調整した。ＤＳをアリコートに分けて１２５又は２５０ｍＬ  ＰＥＴＧボトルに入れ、＜−６０℃で凍結した。
【０８６０】
実施例１３：製造工程における製剤化及び充填
薬物製品（ＤＰ）は、単回用量、保存剤不含、無菌、澄明〜やや不透明及び無色〜淡白色の、２．０×１０１３ｖｇ／ｍｌの目標濃度の非複製性自己相補的ＡＡＶ９ベクターの静脈内注入液であった。ＤＰは、２０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％ｗ／ｖポロキサマー１８８を含んだ。この溶液のｐＨ範囲は７．７〜８．３であった。
【０８６１】
【表６２】
2021526806.tif 000117
【０８６２】
滅菌した既製の１０ｍｌ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｚｅｎｉｔｈ（ＣＺ）バイアルにＤＰを充填し、滅菌した既製のクロロブチル（ｃｈｒｌｏｒｏｂｕｔｙｌ）ゴム栓で栓をして、滅菌した２０ｍｍフリップオフアルミニウムシールで密封した。バイアルには５．５ｍＬ又は８．３ｍＬのいずれかの名目充填容積を充填した。目標過充填は０．４ｍＬであり、バイアルは５．９±０．１ｍＬ又は８．７±０．１ｍＬとなるように充填した。
【０８６３】
実施例１４：インビボ効力アッセイ
薬物製品の相対効力を、定量的インビボアッセイを用いて測定した。このアッセイでは、確立されたＳＭＡ疾患マウスモデルを使用した。つがいのＳＭＡΔ７マウス系統（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃００５０２５）は、表現型は正常であるが、その子孫の約２５％が、標的となるＳＭＮ遺伝子突然変異に関してホモ接合であり、ＳＭＡ様表現型を示す。これらのマウスは５日目までに筋脱力の徴候を示し、その翌週には歩行異常を生じて転び易くなる。Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓは、ＳＭＡ様表現型を有する動物の平均生存期間を約１５±２日と報告している。パイロット試験では、ＳＭＡ様表現型を有する未治療の動物について１６．３日の生存期間中央値が実証された（幾何平均；ｎ＝３試験；試験当たり１０匹のマウス）。
【０８６４】
生物学的に活性な薬物製品を静脈内（ＩＶ）注入によって投与すると、用量（ｖｇ／ｋｇ）の関数である生存期間の増加が得られる。標準物質（先行ベクターバッチ）と比べた薬物製品効力を測定した。薬物製品及び標準物質の力価（ベクターゲノム／ｍＬ；ｖｇ／ｍＬ）をドロップレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）によって決定した。ベクターを生理食塩水に希釈して、ＳＭＡ様表現型を有するマウスに投与されることになる３つの指定用量レベルの各々を実現した。
【０８６５】
アッセイの結果は、そのアッセイが適合性を満たす場合、受入れ可能と考えられる。アッセイ適合性は、以下からなる：
１．陰性対照サンプルの許容限界（１５±２日、生存期間中央値）
２．陽性対照サンプルの許容限界（＞４０日、生存期間中央値）
３．参照標準品の生存期間中央値用量反応曲線に関する許容限界
【０８６６】
本試験では、先行ベクターバッチ（以下、先行バッチ）を使用して、０．９％生理食塩水を使用した０（ゼロ）用量（未治療群）を含む５つの異なる用量レベルで薬物製品を投与したときのＳＭＡΔ７マウスの生存期間中央値（日）の間の線形相関を決定した。表５５は、先行バッチ参照バッチを使用した検量線を示す。
【０８６７】
【表６３】
2021526806.tif 000118
【０８６８】
この試験のデータにより、生存期間中央値用量反応曲線の直線範囲は０〜７．４ｖｇ／ｋｇであったことが実証された。先行バッチ参照標準品の線形回帰曲線を薬物製品バッチ８１６８３６の線形回帰曲線と比較することにより、薬物製品バッチ８１６８３６の相対効力を確立した。これは、各線形回帰線（即ち参照標準品及び試験物質）のｙ切片及び傾きの比を用いることにより達成された。パーセント相対効力計算は、以下の式（１）に記述される：
％ＲＰ＝［（試験物質のｙ切片／傾き）÷（参照標準品のｙ切片／傾き）］×１００（１）
【０８６９】
第１相臨床試験に使用したＮＣＨ０６１３バッチを参照標準品バッチとして使用し、１００％の効力を割り当てた。
【０８７０】
前述のデータにより、生存期間中央値用量反応曲線の直線部分を用いて予備的アッセイ許容判定基準が確立され、薬物製品臨床バッチの相対効力が以下のとおり決定された：
・５つの用量（ｖｇ／ｋｇ）レベルを使用して生存期間中央値（日）用量反応曲線を作成した
・線形用量反応モデルの実行に用量０、１．２Ｅ＋１３及び７．４Ｅ＋１３を選択した。
・生理食塩水（未治療群）の適合性限界は１３〜１７日の生存期間中央値であった。
・参照標準品サンプルの適合性限界は、以下と確立された：
〇傾き≧２．０Ｅ−１３
〇ｙ切片≧１６．００（日）
〇ｙ切片／傾き比≧８．５Ｅ＋１３
〇Ｒ２≧０．７
【０８７１】
Δ７マウスモデルを使用して、薬物製品を含めたＳＭＡ療法の有効性を実証した。１５日±２日の生存期間中央値では、未処置の又は生理食塩水で処置した対照動物は信頼できるベースライン対照を提供し、それからの生存期間中央値の増加として製品効力を測定することができる。薬物製品による開発作業では、投与用量（ｖｇ／ｋｇ）を対数変換して、治療されたＳＭＡΔ７新生仔マウスの生存期間中央値（日数単位）に対してプロットしたとき線形相関でマウスモデルの生存に影響を及ぼすドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いたゲノム力価によって決定される３つの用量（媒体治療用量を除く）が同定された。低力価、中間力価及び高力価標準については、表５６の標準力価（ｖｇ／ｍＬ）を参照されたい。加えて、検量線ゼロ点並びに陰性対照の両方にＴＦＦ緩衝液（媒体）溶液が使用される。≧４０日の生存期間を実証する用量（生存期間中央値の倍増を実証する用量より高い）も陽性対照として含めた。
【０８７２】
【表６４】
2021526806.tif 000119
【０８７３】
用量溶液調製（希釈スキーム例については表５７を参照されたい）。陰性対照−０．９％生理食塩水を陰性対照として使用した。陽性対照−試験物質ロットは生理食塩水を使用して１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇで調製した。参照標準品溶液−参照標準品ロットは生理食塩水を使用して表５６に詳述される３つの濃度で調製した。
【０８７４】
【表６５】
2021526806.tif 000120
【０８７５】
試験物質調製−生理食塩水溶液を使用して試験物質を希釈した。希釈は、５０μｌの最終総容積中、マウス当たり表２６に説明される試験用量（ｖｇ／ｋｇ）が生じるように計算した。希釈はその時点で１０匹のマウスについて行い、治療されたマウスの最低寿命を≧４０日の生存期間中央値（日）に増加させることを目標とした陽性対照としての１つの追加の容積を含んだ。
【０８７６】
対照サンプルの許容限界。陰性対照（未治療マウス）−陰性対照群のアッセイ許容限界は、ＳＭＡΔ７マウスが１５±２日の生存期間中央値を達成することであった。加えて、１０日以内に死亡するマウスはいずれも、分析から除外することになる。群に８匹以上のマウスが使用される場合、１０日以内の死亡について最大２匹のマウスを除外し得る。
【０８７７】
陽性対照（目標臨床用量で治療される群）−陽性対照群のアッセイ許容限界は、治療されたマウスの寿命が最低でも≧４０日の生存期間中央値であることであった。加えて、１０日以内に死亡するマウスはいずれも、分析から除外することになる。群において８匹以上のマウスを使用する場合、１０日以内での死亡について最大で２匹のマウスを除外することができる。
【０８７８】
参照標準品の用量反応曲線の許容限界
投与用量（ｖｇ／ｍＬ）に対して生存期間中央値（日）をプロットする参照標準品の線形用量反応曲線について、アッセイ適合性判定基準が決定されることになる。アッセイ適合性判定基準については表５８を参照されたい。
【０８７９】
【表６６】
2021526806.tif 000121
【０８８０】
ｙ切片／傾き比−参照標準品及び試験物質についての投与用量（ｖｇ／ｋｇ）に対する生存期間中央値（日）の線形回帰曲線を決定する。各線形回帰について傾きに対するｙ切片の比を計算する。
【０８８１】
結果報告
相対効力結果の定性的報告−アッセイ毎にアッセイ適合性判定基準を判定した後、陽性対照材料について一点での生存期間中央値（日）読取りが≧４０日にあることを決定する。陽性対照群の生存期間中央値が≧４０日である場合、判定基準不適合が満たされる場合にはその試験物質は処分され得る。
【０８８２】
相対効力結果の定量的報告−アッセイ毎にアッセイ適合性判定基準を判定した後、試験物質の相対効力を定量的に決定する。陽性対照が≧４０日に達し、且つ７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇの上側標準用量に相当するマウス群について３１±３日の生存期間中央値が達成されたら、試験物質の相対効力を報告し得る。試験物質のパーセント相対効力（％ＲＰ）は、生存期間中央値（日）用量反応の線形回帰のｙ切片及び傾きを用いて以下のとおり計算されることになる。
％ＲＰ＝１００％×［（試験物質ｙ切片／傾き）÷（参照標準品ｙ切片／傾き）］
【０８８３】
実施例１５：界面活性剤不活性化試験
低ｐＨ及びｔｗｅｅｎの影響を分けるため、ｐＨ７．６及び４〜８％Ｔｗｅｅｎ−２０を有する原薬ＴＦＦ１中間体のサンプルを界面活性剤不活性化試験に使用した。ＴＦＦ１中間体のＴｗｅｅｎ−２０濃度は、酸性化前にＴＦＦ１中間体にＴｗｅｅｎ−２０を添加したときの完全工程と比べて約２．５分の１である。この低いＴｗｅｅｎ−２０濃度は、原薬工程で界面活性剤によって促される不活性化についての最悪条件と考えられた。界面活性剤処理によるウイルス不活性化ステップについての試験物質は、４〜８％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＦＦ−１中間体であった。界面活性剤処理ステップによるウイルス不活性化能力を判定するため、ＸＭｕＬＶ及びＰＲＶを各々使用して、デュプリケート実験において試験物質をウイルスでスパイクした。ウイルスはプラーク形成感染力アッセイを用いて定量化した。
【０８８４】
ＴＦＦ１製造ステップでは、４〜８％Ｔｗｅｅｎ−２０の界面活性剤濃度範囲が生じる。ＴＦＦ１中間体をプールし、そのＴＦＦ１中間体に１６〜２０℃の作業温度で更なる１２％のＴｗｅｅｎ−２０を１２〜２０時間の時間にわたって混合しながら追加した。４〜８％Ｔｗｅｅｎ−２０の濃度及び１６．０℃±０．１℃の制御された温度でウイルス除去工程を実施した。１６時間の典型的な工程所要時間に対し、この不活性化工程の所要時間は１２０分であった。
【０８８５】
不活性化工程のため、試験物質の容積を測定し、目標温度に平衡化し、次にウイルスでスパイクすることにより、不活性化負荷を調製した。スパイクした不活性化負荷のサンプルを６時点で取り出して、時間の経過：＜１分、１５分、３０分、６０分、９０分及び１２０分に伴う不活性化の動態を実証した。収集後、各サンプルを成長培地に希釈してウイルス不活性化を停止させ、ウイルスに関してアッセイした。９０分及び１２０分におけるアッセイ感度を高めるため、これらの時点サンプルの大容積もウイルスに関してアッセイした。このステップについては試験物質中にＴｗｅｅｎ−２０が存在するため、不活性化負荷の力価は、スパイク用ウイルスの力価及びスパイクしたウイルスの容積から計算した。
【０８８６】
界面活性剤処理（Ｔｗｅｅｎ−２０）によるウイルス不活性化の有効性は、９０分の時点における両方のウイルスの４ｌｏｇ１０より高いＬＲＶ値からも明らかなとおり、有効であることが示された。界面活性剤処理による不活性化の動態は、図３１及び図３２に、Ｔｗｅｅｎ−２０界面活性剤処理中の１２０分の経過にわたるウイルス不活性化速度のグラフとして示す。
【０８８７】
実施例１６：高い播種密度、早いトランスフェクション及び回収並びにＤＮＡ／ＰＥＩ混合回数が原薬の産生に及ぼす効果
高い播種密度、１日早いトランスフェクション及び回収並びにＤＮＡ／ＰＥＩ混合回数がＤＳの産生に及ぼす効果を判定した。各条件につき、１．６ｍ２バイオリアクターにおいてデュプリケートで判定した。
【０８８８】
材料及び方法
細胞のスケールアップ
ＨＥＫ  ２９３細胞を解凍し、１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭに再懸濁した。細胞を室温において２０９×ｇで５分間遠心し、次に上清を除去し、新鮮ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを加えた。生細胞密度及び生存率に関して細胞をカウントし、２×Ｔ１７５ｃｍ２フラスコに播種して、培養物が約９０％コンフルエンシーに達するまで３日間、３７．０℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞継代毎に使用済みの培地を取り除き、フラスコを０．０８ｍＬ／ｃｍ２のＰＢＳ（−ＣａＣｌ２、−ＭｇＣｌ２）で洗浄し、次にフラスコをＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（０．０４ｍＬ／ｃｍ２）で処理し、３７．０℃、５％ＣＯ２で２〜３分間インキュベートした。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（０．０４ｍＬ／ｃｍ２）でトリプシンをクエンチした。図３３の図に従い細胞を拡大し、播種した。
【０８８９】
細胞接種及びモニタリング
バイオリアクターにＨＥＫ  ２９３細胞を、成長培地（高グルコースＤＭＥＭ＋１０％オーストラリア産ＦＢＳ＋１：１００ペニシリンストレプトマイシン（Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ）中８，０００細胞／ｃｍ２及び１２，０００細胞／ｃｍ２の目標密度で、デュプリケートで撹拌しながら接種した。工程パラメータは、ｐＨ７．２３、３７．０℃、５５％溶存酸素（ＤＯ）及び２ｃｍ／ｓの線速度に設定した。播種の２４時間後、ＤＭＥＭ成長培地（０．１８８ｍＬ／ｃｍ２）の再循環をオンにして再循環速度（１２．５ｍＬ／分）に至らせた。オフラインｐＨ、代謝産物及び栄養素に関して採取される毎日のサンプルは、Ｎｏｖａ  ＢｉｏＦｌｅｘを使用して読み取った。播種後４日目（１２，０００細胞／ｃｍ２）、５日目（８，０００細胞／ｃｍ２）及び９日目、３つのファイバーを取り出し、１：１：１ｖ／ｖのＰＢＳ、Ａ１００及びＢ１００溶液（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ）で溶解させ、全核数に関してカウントして（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ−２００）、培養物の成長をモニタした。
【０８９０】
トランスフェクション
細胞接種後４日目（１２，０００細胞／ｃｍ２）及び５日目（８，０００細胞／ｃｍ２）、再循環を停止させて、各バイオリアクター内の細胞にプラスミドＤＮＡ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をトランスフェクトした。ＤＮＡ及びＰＥＩは１：１ｍｇ／ｍｇの比で混合した。プラスミドＤＮＡは、ｐＳＭＮプラスミド、ｐＡＡＶ２／９プラスミド及びｐＨＥＬＰプラスミドを１：１．５：２の質量比でトランスフェクトし、ＤＭＥＭ−／−培地；高グルコース、−ＣａＣｌ２、−Ｌ−グルタミンに加え、０．２μＭろ過し、逆さにすることにより混合した。ＰＥＩはＤＭＥＭ−／−培地に加え、逆さにすることにより混合した。次にＤＮＡにＰＥＩを加え、逆さにすることにより混合し、８，０００細胞／ｃｍ２（対照）及び１２，０００細胞／ｃｍ２について室温で２０分間インキュベートした。他の２つの８，０００細胞／ｃｍ２条件についてはＤＮＡ／ＰＥＩを１時間及び２時間インキュベートした。このＤＮＡ／ＰＥＩ複合混合物を使用して、４条件の各々につき２つのバイオリアクターをトランスフェクトした。各バイオリアクターにＤＮＡ／ＰＥＩ複合物を加え、工程パラメータで２時間インキュベートした。トランスフェクションの２時間後、再循環ループを再びオンにした。
【０８９１】
トランスフェクション後培地交換
トランスフェクションの２４時間後、バイオリアクター及び再循環ループ内の全ての培地を取り除き、ＯｐｔｉＭＥＭ＋１：１００Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ（０．１３２ｍＬ／ｃｍ２）に交換し、工程パラメータで２４時間再循環させた。トランスフェクションの４８時間後、再循環からのみ全ての培地を取り除き、ＯｐｔｉＭＥＭ＋１：１００Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ（１２ｍＬ／分）に交換し、工程パラメータで再循環させた。
【０８９２】
回収
細胞接種後８日目（１２，０００細胞／ｃｍ２）及び９日目（８，０００細胞／ｃｍ２）、ベンゾナーゼ（１００Ｕ／ｍＬ）を加え、溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）でチェーシング（ｃｈａｓｅ）し、工程パラメータで２時間インキュベートした。バイオリアクターを排液し、ショ糖塩溶液（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ｗ／ｖショ糖）を加え、それらを逆さにすることにより混合した。バイオリアクターをバイオリアクターリンス緩衝液（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ｗ／ｖショ糖、２０ｍＭトリス塩基、１％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）によって約１５分間、工程パラメータで洗浄した。バイオリアクターを排液し、バイオリアクターリンス緩衝液を粗バルク回収物と共にプールし、逆さにすることにより混合し、ｄｄＰＣＲアッセイ用にサンプリングした。
【０８９３】
デプスろ過及びタンジェンシャルフローろ過
細胞接種後８日目（１２，０００細胞／ｃｍ２）及び９日目（対照８，０００細胞／ｃｍ２）、各条件について（ｎ＝２バイオリアクター）バイオリアクターを回収し、サンプリングし、粗ライセートをプールした。次にプールしたライセートをＭｉｌｌｉｓｔａｋ  Ｃ０ＨＣ  Ｐｏｄ、２７０ｃｍ２フィルタ及びＭｉｌｌｉｐａｋ  ４０、０．４５μｍ、Ｄｕｒａｐｏｒｅ、２００ｃｍ２ポリッシュフィルタ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で清澄化した。Ｃ０ＨＣ＋０．４５後にサンプルを採取し、−８０．０℃で凍結した。次に清澄化したライセートをタンジェンシャルフローＰｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）２限外ろ過モジュールＰＬＣＭＫ  Ｃ  ０．１ｍ２フィルタ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって濃縮した。最終産物のダイアフィルトレーションには少なくとも６ダイアボリュームを使用した。ＴＦＦ１ろ過後サンプルを入手し、−８０．０℃で凍結した。サンプルは、全てＡＡＶ２／９力価及び宿主細胞タンパク質に関して分析にかけた。
【０８９４】
バイオリアクターにおいてプラスミドを使用してＤＳを産生した。データはデュプリケートの各条件を表し、表５９に示すバイオリアクター番号及び条件に対応する。
【０８９５】
【表６７】
2021526806.tif 000122
【０８９６】
細胞成長：播種日（０日目）に細胞をカウントし、播種後４日目（１２，０００細胞／ｃｍ２）、５日目（８，０００細胞／ｃｍ２）及び９日目に核をカウントした。データは、全てのリアクター内の細胞が０日目〜５日目の間に指数関数的に成長したことを示している。トランスフェクション後、９日目の核数は、バイオリアクター２２１で５日目〜９日目に総核数が２．０倍に増加したことを示唆している。他のリアクター（２２２〜２２８）はいずれも、５日目〜９日目に有意な成長を呈しなかった。バイオリアクター２２１における成長の増加は、総核数カウントに使用される個々のファイバー上で細胞の分布が不均一なことに基づくアーチファクトであり得る。図３４Ａ〜図３４Ｅに示される代謝産物データに基づけば、全てのバイオリアクター内の細胞が同様に成長した可能性がある。
【０８９７】
ｐＨ、栄養素及び代謝産物：全てのバイオリアクター培養物でグルコース消費の傾向が同じであったことから、バイオリアクター２２１の成長曲線の増加にも関わらず、細胞はグルコースを同様の速度で消費したことが示唆される。最初の３日間、１２，０００細胞／ｃｍ２で播種したバイオリアクターのｐＨは平均７．０６であり、８，０００細胞／ｃｍ２では平均７．１８であった。ｐＨは栄養素代謝の増加に伴いやや下がり、アンモニウムイオンレベルが高くなると同時に９日目までに上昇した。乳酸塩は５日目（バイオリアクター２２１、２２３、２２４、２２５、２２７）及び６日目（バイオリアクター２２２、２２６、２２８）まで上昇し、次に産生の終わりが近付くにつれ横這いになったことから、この段階でのエネルギー源としての乳酸塩の利用が示唆される。
【０８９８】
産生力価
回収材料からのウイルスゲノムをデジタルドロップレット（ｄｄＰＣＲ）によって測定した。１２，０００細胞／ｃｍ２で播種したバイオリアクターでは力価は約１．５倍の高さであり、平均力価測定値が６．３７Ｅ＋１０ｖｇ／ｍＬ（ｎ＝２）であったのに対し、８，０００細胞／ｃｍ２で播種した対照バイオリアクターは平均力価測定値が４．３３Ｅ＋１０ｖｇ／ｍＬであった（ｎ＝２）。力価データから、高い密度での播種、１日早いトランスフェクション及び回収が、より高いＤＳ産生収率を支持することが示唆される。ＤＮＡ／ＰＥＩを２０分間インキュベートした対照（４．３３Ｅ１０ｖｇ／ｍＬ  ｎ＝２）と比較して、１時間インキュベートしたＤＮＡ／ＰＥＩについての力価収率は１．４分の１の平均力価測定値の低下を呈し（３．１７Ｅ１０ｖｇ／ｍＬ  ｎ＝２）、２時間インキュベーションについては、平均力価測定値は１．６分の１の低下であった（２．６７Ｅ１０ｖｇ／ｍＬ  ｎ＝２）。データから、インキュベーション時間が長いほど力価の低下につながることが示唆される。これは、ＤＮＡ及びＰＥＩが、ＨＥＫ２９３細胞の効率的なトランスフェクションが可能でない大型の複合体を形成することに起因し得る。陽性対照としての既知の工程における産生と比較したときの、１ｍＬ当たりのウイルス産生及び表面積値を図３５に示す。
【０８９９】
清澄化及び濃縮ステップの各ステップで測定されたウイルス力価を図３６に示す。ＴＦＦ１ステップの間の各ステップにおける残留宿主細胞タンパク質を図３７Ａ〜図３７Ｂに示す。
【０９００】
実施例１７：播種密度が原薬の産生に及ぼす効果
播種密度がＤＳの産生に及ぼす効果を判定した。４つの播種密度を判定し、バイオリアクターにおいて各播種密度につきデュプリケートとした。
【０９０１】
細胞のスケールアップ
ＨＥＫ  ２９３細胞を解凍し、１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭに再懸濁した。細胞を室温において２０９×ｇで５分間遠心し、次に上清を除去し、新鮮ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを加えた。生細胞密度及び生存率に関して細胞をカウントし、２×Ｔ１７５ｃｍ２フラスコに播種して、培養物が約９０％コンフルエンシーに達するまで４日間、３７．０℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞継代毎に使用済みの培地を取り除き、フラスコを０．０８ｍＬ／ｃｍ２のＰＢＳ（−ＣａＣｌ２、−ＭｇＣｌ２）で洗浄し、次にフラスコをＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（０．０４ｍＬ／ｃｍ２）で処理し、３７．０℃、５％ＣＯ２で２〜３分間インキュベートした。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（０．０４ｍＬ／ｃｍ２）でトリプシンをクエンチした。図３８の図に従い細胞を拡大し、播種した。
【０９０２】
細胞接種及びモニタリング
バイオリアクターにＨＥＫ  ２９３細胞を、７００ｍｌ成長培地（高グルコースＤＭＥＭ＋１０％オーストラリア産ＦＢＳ＋１：１００Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ）中４つの目標密度：８，０００細胞／ｃｍ２、９，３５０細胞／ｃｍ２、１０，７００細胞／ｃｍ２及び１２，０５０細胞／ｃｍ２で、各々デュプリケートで撹拌しながら接種した。工程パラメータは、ｐＨ７．２３、３７．０℃、５５％溶存酸素（ＤＯ）及び２ｃｍ／ｓの線速度に設定した。播種の２４時間後、ＤＭＥＭ成長培地（総容積はこのとき０．１８８ｍＬ／ｃｍ２）の再循環をオンにして再循環速度（１２．５ｍＬ／分）に至らせた。オフラインｐＨ、代謝産物及び栄養素に関して毎日サンプルを採取し、Ｎｏｖａ  ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ  ４００を使用して読み取った。播種後５日目及び９日目に３つのファイバーを取り出し、１：１：１ｖ／ｖのＰＢＳ、Ａ１００及びＢ１００溶液（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ）で溶解させ、全核数に関してカウントして（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ−２００）、培養物の成長をモニタした。
【０９０３】
トランスフェクション
細胞接種後５日目、再循環を停止させて、各バイオリアクターチャンバ内の（再循環ボトルでない）培地を６００ｍｌ  ＤＭＥＭ−／−培地（高グルコース、−ＣａＣｌ２、−Ｌグルタミン）に交換した。各リアクターにプラスミドＤＮＡ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩｐｒｏ）を１：１の質量比でトランスフェクトした。プラスミドＤＮＡを１：１．５：２の質量比（ｐＳＭＮ−３．５６ｍｇ、ｐＡＡＶ２／９−５．３４ｍｇ及びｐＨＥＬＰ−７．１ｍｇ）で混合し、３００ｍＬ  ＤＭＥＭ−／−培地に加え、０．２μＭろ過し、逆さにすることにより混合した。ＰＥＩ（１６ｍＬ）を３００ｍＬ  ＤＭＥＭ−／−培地に加え、逆さにすることにより混合した。ＰＥＩ及びＤＮＡ混合物を合わせ、逆さにすることにより混合し、室温で２０分間インキュベートした。各６００ｍｌ  ＰＥＩ／ＤＮＡ複合混合物を使用して２つのバイオリアクターをトランスフェクトし、各対応する播種密度について繰り返した。ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体を各バイオリアクターに加え、工程パラメータで２時間インキュベートした。トランスフェクションの２時間後、再循環ループを再びオンにした（１２．５ｍＬ／分）。
【０９０４】
トランスフェクション後培地交換
トランスフェクションの２４時間後、バイオリアクター及び再循環ループ内の全ての培地を取り除き、ＯｐｔｉＭＥＭ（０．１３２ｍＬ／ｃｍ２）に交換して、工程パラメータで２４時間再循環させた（１２．５ｍＬ／分）。トランスフェクションの４８時間後、再循環ボトル内の培地を新鮮なＯｐｔｉＭＥＭに入れ替え、工程パラメータで再循環させた（１２ｍＬ／分）。
【０９０５】
回収
細胞接種後９日目、ベンゾナーゼ（１００Ｕ／ｍＬ）を加え、溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）でチェーシング（ｃｈａｓｅ）し、工程パラメータで２時間インキュベートした。バイオリアクターを排液し、ショ糖塩溶液（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ｗ／ｖショ糖）を加え、逆さにすることにより混合した。バイオリアクターをバイオリアクターリンス緩衝液（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ｗ／ｖショ糖、２０ｍＭトリス塩基、１％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）で１５分間、工程パラメータで洗浄した。バイオリアクターを排液し、バイオリアクターリンス緩衝液を粗バルク回収物と共にプールし、逆さにすることにより混合し、ｄｄＰＣＲアッセイ用にサンプリングした。
【０９０６】
バイオリアクターにおいてプラスミドを使用して原薬を産生した。リアクターに様々な密度で播種し、同じスケジュールでトランスフェクトし、回収した（それぞれ播種後５日目、９日目）。データは、以下の表６０に示されるとおり、各播種密度のデュプリケートを表す。
【０９０７】
【表６８】
2021526806.tif 000123
【０９０８】
細胞成長：播種日（０日目）に細胞をカウントし、播種後５及び９日目に核をカウントした。データは、全てのリアクター内の細胞が０日目〜５日目の間に指数関数的に成長したことを示している。出発播種密度の差にも関わらず、核数が示すところによれば、５日目に群間で細胞数に大きい差はない。トランスフェクション後、９日目の核数は、リアクターの５つ（２２１、２２４、２２５、２２６、２２８）で５日目〜９日目に総核数が倍増したことを示唆している。２つのリアクター（２２２、２２３）では、図３９Ａに示されるとおり、総核数が１．４倍に増加した。リアクター２２７では５日目〜９日目に総核数が３．８倍に増加した。この差は、カウントに使用される個々のファイバー間で細胞の分布が不均一なことに基づくアーチファクトであり得る。図３９Ｂ〜図３９Ｅに示される代謝産物データに基づけば、全てのリアクター内の細胞が同様に成長した可能性がある。
【０９０９】
ｐＨ、栄養素及び代謝産物：全てのバイオリアクター培養物でグルコース消費（図３９Ｂ）の傾向が同じであったことから、出発播種密度の差にも関わらず、細胞はグルコースを同様の速度で消費したことが示唆される。最初の３日間、全ての培養物でオフラインｐＨ（図３９Ｃ）は一貫したままであり（ｐＨ７．２５）、栄養素代謝の増加に伴い下がり、８日目の後にアンモニウムイオンレベルが高くなると同時に上昇した（図３９Ｅ）。乳酸塩（図３９Ｄ）は６日目まで上昇し、次に産生の終わりが近付くにつれ横這いになったことから、この段階でのエネルギー源としての乳酸塩の利用が示唆される。異なる出発密度で播種したリアクター間において代謝産物プロファイルに有意差は認められなかった。これは、出発播種密度の差が最小限で、＜１．２倍の差であることに起因する可能性がある。
【０９１０】
産生力価：
回収材料からのウイルスゲノムをデジタルドロップレット（ｄｄＰＣＲ）によって測定した。８，０００細胞／ｃｍ２及び１０，０７０細胞／ｃｍ２の出発播種密度間で力価は同等であり、それぞれ平均３．９９Ｅ＋１０±２．１Ｅ＋０９ｖｇ／ｍＬ（ｎ＝２）及び３．７０Ｅ＋１０±７．４Ｅ＋０９ｖｇ／ｍＬ（ｎ＝２）であった。理由を特定できないが、９，３５０細胞／ｃｍ２で播種したリアクターは５．０２Ｅ＋０８ｖｇ／ｍＬ（ｎ＝２）の平均力価測定値を呈し、隣接密度で播種したリアクターの平均力価と比べて約２ｌｏｇ低かった。この差は、この播種密度での生産性の欠如というよりむしろ、トランスフェクション又は回収中に特定できない操作ミスがあった結果と思われる。１２，０５０細胞／ｃｍ２で播種したレプリケートリアクターは互いの２倍の差を実証し、一方のリアクターは低播種密度について観察される範囲内、３．２Ｅ＋１０ｖｇ／ｍｌであったのに対し、第２のリアクターでは僅か１．４Ｅ＋１０ｖｇ／ｍｌの力価のみ生じたに過ぎなかった。１ｍＬ当たりのウイルス産生及び表面積値を図４０Ａに示す。
【０９１１】
図４０Ｂに示されるとおり、播種密度及びＤＳの産生を判定した。８Ｅ＋０３〜１０Ｅ＋０３細胞／ｃｍ２の範囲で播種したＨＥＫ  ２９３細胞は、一貫した成長プロファイル、ｐＨ、グルコース消費、乳酸塩及びアンモニア発生を示した。加えて、同等の力価が生じたことから、やや高い播種密度であっても産生に悪影響はないことが示唆される。対照的に、１２×１０３細胞／ｃｍ２の高い密度で播種したリアクターは、他の条件と比較して平均力価が低いことを含め、デュプリケート間でより高いばらつきを呈したことから、この実験で用いられた手法が産生に最適でない可能性があることが示唆される。これらの結果から、バイオリアクター実験については細胞を８×１０３〜１×１０４細胞／ｃｍ２の範囲の密度で播種することが支持される。
【０９１２】
実施例１８：同等性評価
第１相臨床試験（工程Ａ）に使用したＡＶＸＳ−１０１薬物製品とピボタル臨床試験（工程Ｂ）に使用した薬物製品との間の同等性を主要目的として評価し、副次目的は、薬物製品ロット６００１５６及び６００３０７を比較することにより、工程Ｂを用いる製造の一貫性を評価することであった。図４１は、第１相（工程Ａ）及び第３相試験（工程Ｂ）製造工程フロー及びそれらの違いを表す。
【０９１３】
同等性評価は、ネーションワイド小児病院（Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ：ＮＣＨ）で製造された第１相臨床薬物製品ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３及びＡｖｅＸｉｓで製造された薬物製品ロット６００１５６を使用して実施した。
【０９１４】
製品
表６１に要約するとおり、以下の材料ロットを判定した。この評価には、工程Ａを用いた第１相臨床薬物製品ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３及び工程Ｂを用いたＡＶＸＳ−１０１薬物製品ロット６００１５６から得られた品質特性の直接比較が含まれた。加えて、スケールアップ工程の再現性及び一貫性に関してロット６００１５６の出荷時試験結果をロット６００３０７と共に総合的に判定した。
【０９１５】
【表６９】
2021526806.tif 000124
【０９１６】
製造工程概要
図４２Ａ〜図４２Ｂは、同等性結果の要約を提供する。
【０９１７】
同等性及び製造の一貫性評価
同等であると評価されたための工程Ａ及び工程Ｂ材料並びに工程Ｂ材料は一貫性があると評価された。工程Ｂ材料は、更なる利益、例えば工業規模産生上の利益を有することも決定された。
【０９１８】
試験方法
ｐＨ
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関してｐＨ分析を実施した。いずれの工程の結果も、７．９〜８．０の範囲であった。これにより、工程Ａ及び工程Ｂ材料のｐＨが同等であったこと及び工程Ｂ材料に一貫性があることが実証された。
【０９１９】
外観
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関して目視検査により外観を調べた。工程Ａと工程Ｂとの外観結果の明らかな違いは、ベクター濃度（ゲノム力価）が異なることに起因した。ロットＮＣＨ  ＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３は工程Ｂロットよりもベクター濃度が低かった。結果として、ロットＮＣＨ  ＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３は希釈度が高くなり、より澄明な無色の溶液につながった一方、工程Ｂロットについての無色〜白色のやや不透明な観察結果は、１ｍＬ当たりの溶液中のウイルス粒子濃度が約４倍であることに起因する。
【０９２０】
濃度が異なることを考慮すると、工程Ａ及び工程Ｂ材料の外観は同等であると評価され、工程Ｂ材料には一貫性があると評価された。
【０９２１】
オスモル濃度
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関して凝固点降下によりオスモル濃度を調べた。いずれの工程の結果も、４１０〜４１５ｍＯＳｍ／ｋｇの範囲であった。これにより、工程Ａ及び工程Ｂ材料のオスモル濃度が同等であったこと及び工程Ｂ材料に一貫性があったことが実証された。
【０９２２】
サブビジブル粒子
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関して光遮蔽法によりサブビジブル粒子を調べた。いずれの工程の結果も、ＵＳＰモノグラフの注射用薬物製品に関する推奨限界値を十分に下回った。これにより、工程Ａ及び工程Ｂ材料のサブビジブル粒子数が同等であったこと及び工程Ｂ材料に一貫性があったことが実証された。
【０９２３】
ゲノム力価
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関してｄｄＰＣＲによりゲノム力価を調べた。ＡＶＸＳ−１０１ロットのゲノム力価は製造時の目標濃度に基づいて変動することが予想された。工程Ｂ（３．７×１０１３ｖｇ／ｍＬ及び４．０×１０１３ｖｇ／ｍｌ）によって生じたゲノム力価は、工程Ａ（１．１×１０１３ｖｇ／ｍＬ）のゲノム力価の少なくとも３倍であったため、従ってＡＶＸＳ−１０１（ＡＡＶ９−ＳＭＮ１）の大規模製造には工程Ｂの方が優れた方法であった。
【０９２４】
感染力価
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関してＴＣＩＤ５０により感染力価を調べた。工程Ｂ（１．３×１０１０ＩＵ／ｍＬ及び６．７×１０９ＩＵ／ｍｌ）では工程Ａ（５．９×１０１０ＩＵ／ｍＬ）と比べて平均して６６％高い感染力価が生じた。これは、例えば、ｒＡＡＶ、例えばＡＶＸＳ−１０１の大規模製造に有利であり得る。
【０９２５】
全タンパク質
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関してマイクロＢＣＡにより全タンパク質を調べた。１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬに対して正規化すると、いずれの工程の結果も、１６７〜１７９μｇ／ｍＬの範囲であった。正規化した全タンパク質値により、工程Ａ及び工程Ｂ材料が同等であったこと及び工程Ｂ材料に一貫性があったことが実証された。
【０９２６】
インビボ相対効力
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３をアッセイの標準物質として使用した。標準検量線に基づけば、ロット６００１５６及びロット６００３０７について得られた各効力結果は、それぞれ９７％及び９６％であった。これらの結果により、工程Ａ及び工程Ｂ材料が同等であったこと及び工程Ｂ材料に一貫性があったことが実証された。
【０９２７】
ウエスタンブロットによるアイデンティティ
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関してウエスタンブロットによりアイデンティティを調べた。主バンド（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）のブロットプロファイル及び見かけの分子量値は工程Ａ及び工程Ｂ材料について同等であると評価され、且つ工程Ｂ材料に一貫性があったことも評価された。
【０９２８】
ＡＵＣによる％空のカプシド
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関してＡＵＣにより％空のカプシドを調べた。ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）の結果は７％であった。ロット６００１５６及び６００３０７（工程Ｂ）の結果は、それぞれ２％及び４％であった。工程Ｂ（２％及び４％）では、産生された空のカプシドはＡＵＣにより測定したとき工程Ａ（７％）の約２分の１であった。従って、工程Ｂは、低濃度の空のカプシドを含む改良された組成物を産生可能であった。
【０９２９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるアイデンティティ及び純度
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、  ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関してＳＤＳ−ＰＡＧＥによりアイデンティティ及び純度を調べた。いずれの工程の％総純度も≧９８％であり、３つのカプシドタンパク質の各々の結合パターン並びに見かけの分子量は高度に一貫性があった。これらの結果により、工程Ａ及び工程Ｂ材料が同等であったこと及び工程Ｂ材料に一貫性があったことが実証された。
【０９３０】
残留宿主細胞タンパク質
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関してＥＬＩＳＡにより残留宿主細胞タンパク質を調べた。試験した全てのロットの結果が、アッセイのＬＯＱ（８ｎｇ／ｍＬ）未満であった。これらの結果により、工程Ａ及び工程Ｂ材料が同等であったこと及び工程Ｂ材料に一貫性があったことが実証された。
【０９３１】
残留ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関して残留ＢＳＡを調べた。試験した全てのロットの結果が、アッセイのＬＯＱ（０．５０ｎｇ／ｍＬ）未満であった。これらの結果は、工程Ａ及び工程Ｂ材料が同等であること及び工程Ｂ材料に一貫性があることを実証している。
【０９３２】
残留ベンゾナーゼ
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関してＥＬＩＳＡにより残留ベンゾナーゼを調べた。試験した全てのロットの結果が、アッセイのＬＯＱ（０．２０ｎｇ／ｍＬ）未満であった。これらの結果は、工程Ａ及び工程Ｂ材料が同等であること及び工程Ｂ材料に一貫性があることを実証している。
【０９３３】
残留宿主細胞ＤＮＡ
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関してｑＰＣＲにより残留宿主細胞ＤＮＡを調べた。１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬに対して正規化すると、工程Ａの結果は３．７×１０５ｐｇ／ｍＬであった一方、工程Ｂの結果は、それぞれ０．７６×１０５ｐｇ／ｍＬ及び０．６８×１０５ｐｇ／ｍＬであった。従って、工程Ｂでは、大幅に低い残留ｈｃＤＮＡのウイルスベクターが産生された。これは、例えば、ｒＡＡＶ、例えばＡＶＸＳ−１０１（ＡＡＶ９−ＳＭＮ１）の大規模製造に有利であり得る。
【０９３４】
統計的分析
定量的品質特性に関して統計的分析を実施した。比較は以下に挙げるとおりの工程Ａロット（ＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３）と各工程Ｂロット（６００１５６及び６００３０７）との間においてペアワイズで実施した。これらの結果は図４３及び図４４に示す。
【０９３５】
これらの試験は、工程Ｂが優れたウイルスベクター産生方法であることを示している。工程Ｂは、一貫してより多量のウイルスベクターを産生したと共に（ゲノム力価及び感染力価により測定したとき）、不純物がより少なく（残留ｈｃＤＮＡがより少なかった）、空のカプシドが少なかった。
【０９３６】
次世代シーケンシング
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）も実施して、工程ＢからのＡＶＸＳ−１０１薬物製品第３相材料のアイデンティティを確立し（ゲノム配列を決定及び／又は確認し）、それについて配列変異体（部分集団）が存在したかどうかを評価した。資金援助者から提供された参照配列（ｐｓｃＳＭＮ）に対する配列データセットのアラインメントにより、変異体検出を可能にするゲノムの全長にわたる完全な（１００％の）幅及び十分な深さのカバレッジが明らかになった。合計４つの軽微な変異位置が認められたが、しかしながら、これらは、真の変異体というよりむしろ、ＡＡＶの配列決定が困難な領域（例えば、その高いＧＣ含量及びパリンドローム配列のために配列決定が困難なことで有名な逆方向末端反復（ＩＴＲ））の範囲内でのシーケンシングエラーに相当するように見える。シーケンシング結果については表６２を参照されたい。
【０９３７】
【表７０】
2021526806.tif 000125
【０９３８】
第１相ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３安定性プロファイル
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３を≦−６０℃で１２ヵ月間貯蔵した。各時点でロットを分析した。好ましくない傾向は認められない。図４５に、現在までの安定性結果を示す。
【０９３９】
第１相臨床試験に使用したＡＶＸＳ−１０１に関して同等性試験を完了した。評価は、ネーションワイド小児（Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ）で製造された第１相臨床薬物製品ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３及びＡｖｅＸｉｓで製造されたＡＶＸＳ−１０１薬物製品ロット６００１５６を使用して実施した。加えて、工程Ｂロット６００１５６及び６００３０７を使用して製造の一貫性を判定した。同等性評価（工程Ａ対工程Ｂ）及び製造の一貫性（工程Ｂロット６００１５６対６００３０７）の両方について、本試験では、新規改良された工程及び分析的方法を用いてＡＶＸＳ−１０１臨床試験材料のアイデンティティ、品質、純度及び効力を判定し、同等性及び製造の一貫性のロバストな評価を可能にした。
【０９４０】
定量的品質特性に関して統計的分析を実施した。比較は工程ＡロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３と工程Ｂロット６００１５６との間においてペアワイズで実施した。工程Ａと比べて工程Ｂの方が、より高純度でより多量のウイルスベクターを産生した良好な方法であった。例えば、工程Ａと比較したとき、工程Ｂによって産生されたウイルスベクターは、感染力価が４８％高く、ゲノム力価（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｔｉｅｒ）が８％高く、１０μｍ径超のサブビジブル粒子が９２％少なく、２５μｍ径超のサブビジブル粒子が５０％少なく、空のカプシドが１００％少なく、且つ残留ｈｃＤＮＡが１１％少なかった。結果は、全て各品質特性の試験限界と比べて一貫性があった。
【０９４１】
更に、工程Ｂを用いた製造の一貫性を確立するため、ロット６００１５６及び６００３０７を使用してペアワイズ比較を実施した。工程Ｂロット６００１５６と６００３０７との間のこの初期ペアワイズ比較の結果は、製造の一貫性を呈している。同様に結果は、全て各品質特性の試験限界と比べて一貫性があった。
【０９４２】
この結果判定に基づけば、工程Ａを用いた第１相臨床薬物製品ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３及び工程Ｂを用いたＡＶＸＳ−１０１薬物製品ロット６００１５６から得られた品質特性により、工程Ｂではより多量のウイルスベクター及び純度の向上が生じたことが実証された。これは、例えばｒＡＡＶの大規模製造に有利であり得る。加えて、工程Ｂから生成されたこれらの２つの材料ロット（ロット６００１５６及び６００３０７）は再現性があり、更に製造の一貫性を呈することが見出された。
【０９４３】
実施例１９：分析的超遠心（ＡＵＣ）分析
第１相（工程Ａ、ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３）及び第３相（工程Ｂ、ロット６００１５６及び６００３０７）からの材料を、ＡＵＣ方法を用いて分析した。ＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３、６００１５６及び６００３０７のＡＵＣプロファイル（デュプリケートで分析した）をそれぞれ図４６、図４７及び図４８に示す。
【０９４４】
各材料のＡＵＣ分析は、空のカプシド含有量がそれぞれ２％及び４％である第３相材料（工程Ｂ、ロット６００１５６及び６００３０７）と比較したとき、上昇した空のカプシド含有量（７％）を示す第１相材料（工程Ａ、ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３）では、空のカプシドと完全なカプシドとについて同様の沈降係数を呈する。これは、工程ＢにおけるＣｓＣｌ勾配超遠心製造ステップが、工程Ａに用いられているイオジキサノール勾配超遠心製造ステップと比較して、空のカプシドを完全なカプシドとより有効に分離可能であることに起因する。
【０９４５】
臨床的及び商業的体裁を用いるＡＶＸＳ−１０１産生ロットは、超遠心を用いたＣｓＣｌ勾配精製工程に供したとき、ネーションワイド小児病院（Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）で産生された第１相臨床試験材料（ＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３）及びＡｖｅＸｉｓによる各々の後続の生産ロットの両方において一貫してカプシドの３つの可視的バンドを呈する。工程Ａを用いた第１相臨床薬物製品ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３及び工程Ｂを用いたＡＶＸＳ−１０１薬物製品ロット６００１５６のＡＵＣプロファイルに基づけば、これらの材料は同等と考えられる。加えて、工程Ｂから生成された２つの材料ロット（ロット６００１５６及び６００３０７）のＡＵＣプロファイルは一貫性があると評価された。
【０９４６】
実施例２０：製造の上流工程
上流工程を用いてワーキングセルバンクに由来する中間体を産生した。ここで、上流工程は、（ａ）細胞を培養するステップ、（ｂ）培養細胞に図２６Ａ〜図２６Ｃに示されるとおりの３つのプラスミドをトランスフェクトするステップ、（ｃ）培養期間後に細胞から拡大したウイルス粒子を回収するステップ、（ｄ）ウイルス粒子をろ過によって精製して任意のインタクトな細胞又は細胞デブリを除去するステップ、（ｅ）ステップ（ｄ）からの溶出液をタンジェンシャルフローろ過に供するステップ、及び（ｆ）得られた精製ウイルス粒子中間調製物を凍結するステップを含む。
【０９４７】
トランスフェクション前、フラスコ又は好適なバイオリアクター又は両方において細胞を好適な培養培地中で拡大した。１つの培養培地は、１０％ＦＢＳ、４．５ｇ／Ｌグルコース、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン含有ＤＭＥＭである。一実施形態では、最初にフラスコ内で接着細胞を成長させて、次にｉＣＥＬＬｉｓバイオリアクターに移してバイオリアクター内で接着細胞を更に拡大させる。
【０９４８】
細胞拡大後、接着ＨＥＫ２９３細胞に三重ＤＮＡプラスミドＰＥＩ共沈殿物をトランスフェクトした。このトランスフェクションに利用される３つのプラスミドは、ｐＳＭＮ、ｐＡＡＶ２／９及びｐＨＥＬＰである。細胞拡大に使用したＤＭＥＭ成長培地を変法ＤＭＥＭトランスフェクション培地に交換する。ＤＭＥＭトランスフェクション培地は、ＦＢＳ不含、カルシウム不含、Ｌ−グルタミン不含で、且つ４．５ｇ／Ｌグルコースを含有した。大規模接着細胞バイオリアクターにおいてＰＥＩ共沈殿物を用いた接着ＨＥＫ２９３細胞への三重ＤＮＡプラスミドトランスフェクションを用いてｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＳＭＮベクターを作製した。このベクタープラスミドｐＳＭＮはヒトＳＭＮのｃＤＮＡを含有する。このトランスフェクションに利用した３つのプラスミドは、ｐＳＭＮ（２２２ｍｇ）、ｐＡＡＶ２／９（３３３ｍｇ）及びｐＨＥＬＰ（４４４ｍｇ）である。トランスフェクション培地は、ＰＥＩ−プラスミド共沈殿物を加える前に、バイオリアクター温度が＞３０℃になるまでバイオリアクター内で平衡化させた。ＰＥＩ−プラスミド共沈殿工程には、プラスミドをトランスフェクション培地に加えること及び０．２μろ過して反応バッグに入れることが含まれた。ＰＥＩをトランスフェクション培地に加え、次に反応バッグに入れた。ＰＥＩ−プラスミド反応物を手動で混合して均一懸濁液を形成した。及びこの反応は１５〜３０分の時間にわたって行う。この反応時間の終わりに、バイオリアクターにＰＥＩ−プラスミド共沈殿物を加えた。このＰＥＩ−プラスミド共沈殿物をバイオリアクター内で１〜２時間にわたって混合させた後、再循環を再開した。次の培地交換前にＤＭＥＭ成長培地をバイオリアクターに１８〜２４時間再循環させた。
【０９４９】
ｒＡＡＶ  ＳＭＮゲノムは順番に、ＡＡＶ２  ＩＴＲ、サイトメガロウイルスエンハンサーを伴うニワトリβ−アクチンプロモーター、ＳＶ４０イントロン、（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３４４．２）に示されるＳＭＮコードＤＮＡ、ウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化シグナル配列及びもう１つのＡＡＶ２  ＩＴＲを有する。ＳＭＮ  ＤＮＡの保存的ヌクレオチド置換も企図される（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３４４．２の６２５位におけるグアニンからアデニンへの変更）。ゲノムはＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ  ＤＮＡを欠いており、即ちゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶ  ｒｅｐ又はｃａｐ  ＤＮＡはない。企図されるＳＭＮポリペプチドとしては、限定はされないが、ＮＣＢＩタンパク質データベース番号ＮＰ＿０００３３５．１に示されるヒトＳＭＮ１ポリペプチドが挙げられる。
【０９５０】
バイオリアクター６日目、トランスフェクションの１８〜２４時間後、バイオリアクターを排液し、ＤＭＥＭ再循環培地バッグを２００リットルの新鮮ＯｐｔｉＭＥＭトランスフェクション後培地に交換した。バイオリアクターに６４リットルを再充填し、バイオリアクターにおける再循環を再開した。７日目、６日目の培地交換から１８〜２４時間後、再循環バッグ（約１３５リットル）中のＯｐｔｉＭＥＭトランスフェクション後培地を新鮮なＯｐｔｉＭＥＭ培地バッグに交換した。このステップの間、バイオリアクターは排液しなかった。培地の再循環は、９日目の回収まで継続した。
【０９５１】
バイオリアクター内で９日後、リアクターから最終的な回収前サンプルを採取し、細胞溶解工程を開始した。バイオリアクターに１００Ｕ／ｍＬの最終濃度となるようにベンゾナーゼを加えた。ベンゾナーゼをリアクター内で混合させた後、リアクターに７．１リットルの溶解溶液を加えた。最初の回収ステップ前に、溶解溶液をリアクター内で２時間混合した。２時間の溶解の終了時、バイオリアクターの内容物を回収バッグに移した。回収バッグに８．９リットルの塩ショ糖液（ＳＳＳ）を加え、１５分間混合した。このＳＳＳ溶液により回収培地中のベンゾナーゼがクエンチされた。次にバイオリアクターをバイオリアクターリンス緩衝液でリンスした。バイオリアクターのリンスには、バイオリアクターに６４リットルのバイオリアクターリンス緩衝液を加え、１５分間混合した。次にリンス液を共通の回収物収集バッグに移した。収集バッグにリンス液が加わった後、内容物を１５分間混合し、バルク回収物サンプルを採取した。
【０９５２】
混合したバルク回収物をデプスフィルタでろ過して収集バッグに入れた。全てのバルク回収物がろ過された後、デプスフィルタを５０リットルのＴＦＦ１ダイアフィルトレーション緩衝液でチェーシング（ｃｈａｓｅ）した。デプスフィルタプール液を混合し、サンプリングした。次にデプスフィルタプール液を０．４５μｍフィルタでろ過してバルク回収物材料を更に清澄化した。次に０．４５μｍフィルタを６リットルのＴＦＦ１緩衝液でチェーシング（ｃｈａｓｅ）する。
【０９５３】
ＴＦＦ１ステップについては、５．０ｍ２の３００ｋＤａＭＷカットオフ再生セルロース膜カセットをフラッシュし、ＮａＯＨ溶液で衛生化し、且つＴＦＦ１緩衝液で平衡化した。この作業の濃縮相は、清澄化された回収物の容積が約１０分の１に減少するように設計した。目標保持液容積に達した後、ダイアフィルトレーション作業を開始する。６ダイアボリュームのＴＦＦ１緩衝液で保持液のダイアフィルトレーションを行った。６ダイアボリュームの透過液総流量が実現した後、保持液を再び濃縮し、収集バッグに回収した。２回の連続的な膜リンスを実行してＴＦＦシステムからの産物回収率を最大化し、中間原薬が産生された。ＬＦＨフード内でＴＦＦ１中間体をアリコートに分けて１又は２リットル滅菌ＰＥＴＧボトルに入れ、次にドライアイス上又はフリーザー内で凍結し、−６０℃の貯蔵場所に移した。
【０９５４】
【表７１】
2021526806.tif 000126
【０９５５】
実施例２１：製造の下流工程
下流工程を用いて中間体をろ過済み原薬に処理した。下流工程ステップには、酸性化及び清澄化ステップ（ろ過を用いる）と、それに続く陽イオン交換クロマトグラフィー、タンジェンシャルフローろ過（「ＴＦＦ２」）、ＣｓＣｌ超遠心及び更なるタンジェンシャルフローろ過ステップ（「ＴＦＦ３」）が含まれ、これにより精製されたＡＡＶ粒子が薬学的に許容可能な担体中に懸濁されているろ過済み原薬が産生された。具体的には、下流工程は、ＴＦＦ１中間体の産生後に以下の製造ステップを含んだ：ＴＦＦ１中間体の解凍及びプール、酸性化及び清澄化、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ２）、ＣｓＣｌ超遠心による完全なカプシド／空のカプシドの分離、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ３）による濃縮／緩衝液交換、ＴＦＦ３プール材料ろ過による原薬の生成、原薬の希釈及びろ過による薬物製品の産生、薬物製品の貯蔵及びバイアルへの薬物製品の充填。
【０９５６】
ＴＦＦ１中間材料を解凍し、穏やかに混合した。Ｔｗｅｅｎ  ２０を使用して、酸性ｐＨ下でのバルクの宿主細胞タンパク質及びＤＮＡのフロキュレーションを促進した。ＣＥＸクロマトグラフィーのため、１５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＴＦＦ１中間体プールのｐＨを下げた（ｐＨ３．５）。次に、溶液をデプスフィルタ及び０．４５μｍフィルタでろ過することにより、ｐＨを下げた後に形成された沈殿物を取り除いた。
【０９５７】
Ｔｗｅｅｎ  ２０（２０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ショ糖ｍ／ｖ、ｐＨ８．１中３６％Ｔｗｅｅｎ  ２０溶液）をＴＦＦ１中間溶液に４時間かけてゆっくりと加え、２０％Ｔｗｅｅｎ  ２０の最終濃度を実現した。室温（ＲＴ）で一晩インキュベートした後、ＴＦＦ１中間体／Ｔｗｅｅｎスパイクプールの１ｋｇ当たり約４ｇの１Ｍグリシン  ｐＨ２．５を加えることによりＴｗｅｅｎ  ２０含有ＴＦＦ１中間体のｐＨを下げて、３．５±０．１の目標ｐＨを実現した。ｐＨが許容範囲内になった後、溶液をＣｌａｒｉｓｏｌｖｅ  ＰＯＤデプスフィルタ、それと直列の０．４５μｍ  Ｏｐｔｉｃａｐ  ＸＬ１０  Ｄｕｒａｐｏｒｅフィルタ又は０．８／０．４５μ  ＰＥＳフィルタに通過させて、続いてこれらのフィルタをＣＥＸ緩衝液ＡでＰＯＤフィルタのホールドアップ容積の２倍＋ポリッシングフィルタの１ホールドアップ容積だけフラッシュした。
【０９５８】
陽イオン交換（ＣＥＸ）捕捉クロマトグラフィーステップを用いてウイルスカプシドをタンパク質、ＤＮＡ及び他の工程不純物と分離した。このステップには、自動プロセスクロマトグラフィーシステムを用いて操作されるＣＩＭｍｕｌｔｕｓ  Ｓ０３−８０００先端複合材料カラム（スルホニル）（細孔２μｍ）クロマトグラフィーカラム（８．０Ｌ）を利用した。緩衝液及び溶液については、以下の表に記載する。
【０９５９】
【表７２】
2021526806.tif 000127
【０９６０】
清澄化し、酸性化したＴＦＦ１中間体のタンパク質含有量により、ＣＥＸカラム負荷を決定した。ＣＥＸカラムのタンパク質負荷は、最大カラム容量の７０％に設定した。
【０９６１】
溶出ピークをＯＤ２８０における急激な上昇から開始して手動で収集した。ＯＤ２８０は伝導性が８０〜８５ｍＳ／ｃｍのとき上昇した。ＣＥＸ溶出物（産物）の近似容積は約２０リットル又は２．５ＣＶ（カラム容積）であった。ＣＥＸ溶出物は２つの画分で収集した。第１の画分はＯＤ２８０における急激な上昇から開始し、１．５ＣＶにわたって収集した。第２の画分は第１の画分の直後に開始し、１．０ＣＶにわたって収集した。これらの２つの画分を、ｐＨ９．０中和緩衝液を使用してｐＨ８．０±０．３０に中和した。
【０９６２】
ＴＦＦ２ステップでは、濃縮し、タンパク質不純物を除去し、緩衝液をＣｓＣｌ超遠心ステップに適切な緩衝液に交換した。タンジェンシャルフローろ過システムを０．４ｍ２（２回のＣＥＸサイクル）又は０．２ｍ２（１回のＣＥＸサイクル）３００ｋ  ＭＷＣＯ再生セルロース膜と併せて利用した。
【０９６３】
この作業の濃縮相は、ＣＥＸ溶出物の容積を減少させた。目標保持液容積に達した後、不連続ＴＦＦモード（バッチモード）でダイアフィルトレーションを開始した。保持液を２倍希釈し、不連続ＴＦＦモードで８ダイアボリュームのＴＦＦ２  ＮａＣｌダイアフィルトレーション緩衝液及びその後８ダイアボリュームのＴＦＦ２  ＣｓＣｌダイアフィルトレーション緩衝液によるダイアフィルトレーションにかけた。ＣｓＣｌダイアフィルトレーションが完了した後、保持液をシステムのホールドアップ容積に依存する規定の容積に濃縮した。２回の連続的な膜リンスを実行してＴＦＦ２システムからの産物回収率を最大化した。
【０９６４】
保持液供給速度は、透過液への２０％の変換速度（５００ｍＬの保持液供給高速当たり１００ｍｌの透過液流速）として５Ｌ／ｍ２／分（０．１ｍ２カセット当たり５００ｍＬ／分）に設定した。透過液流速は、透過液チューブ上のクランプにより、保持液供給流速の２０％の透過液流速が維持されるように制御した。
【０９６５】
【表７３】
2021526806.tif 000128
【０９６６】
塩化セシウム勾配超遠心法を利用することにより、超遠心法を用いて完全なカプシドから空のカプシドを除去し得る。ＣｓＣｌ超遠心ステップには、タイプ５０．２  Ｔｉロータ又は均等なロータを備えた自動Ｏｐｔｉｍａ  ＸＰＮ  １００超遠心システム又は均等なシステムを使用した。超遠心チューブにＴＦＦ２精製後のろ過済み材料を、溶液に気泡が混入しないようにチューブ壁の内側に沿ってゆっくりと加えた。充填されたチューブを携帯型ヒートシーラで密封し、２０℃において３０２，０００ｇ（５０．２  Ｔｉロータで５０，０００ｒｐｍ）で１７時間遠心した。遠心ステップの完了後、超遠心機からチューブを取り出し、バイオセーフティキャビネットに置いた。産物の入ったチューブを廃棄物容器の上にあるリングスタンドにマウントした。ランプをチューブの真下に位置決めして、空のカプシドバンド（バンドＡが一番上のバンドである）、完全なカプシドのダブレットバンド（バンドＢ及びＣ、ダブレットの上及び下のバンド）及びダブレットの下の一番下のバンドをチューブ上にマークした。３０ｍＬシリンジに取り付けられた１８Ｇ針をバンドＤのほんの少し下からチューブの中央まで挿入することにより、バンドＢ、Ｃ及びＤを取り出した。収集された材料を滅菌１Ｌ  ＰＥＴＧボトルに移した。全ての遠心チューブからの材料を滅菌１Ｌ  ＰＥＴＧボトルにプールして超遠心機（ＵＣ）プールを作製した。ＣｓＣｌ超遠心ステップ用の緩衝液を以下の表に挙げる。
【０９６７】
【表７４】
2021526806.tif 000129
【０９６８】
ＴＦＦ３ステップでは、ＣｓＣｌを除去し、最終製剤化緩衝液を使用して充填ベクターを濃縮した。タンジェンシャルフローろ過システムを２つの５０ｃｍ２  ３００ｋ  ＭＷＣＯ再生セルロース膜と併せて利用した。ＴＦＦ３作業の濃縮相は、残留ＣｓＣｌの濃度及びＵＣプールの容積が減少するように設計した。目標保持液容積に達した後、ダイアフィルトレーションを開始した。１０ダイアボリュームのＴＦＦ３緩衝液で保持液のダイアフィルトレーションを行った。ダイアフィルトレーションが完了した後、濃縮された保持液を０．２μｍ  Ｐａｌｌ  Ｓｕｐｏｒ（登録商標）ＥＫＶ滅菌用グレードフィルタ（Ｍｉｎｉ  Ｋｌｅｅｎｐａｋ）フィルタに通して二次コニカルチューブに移した。
【０９６９】
膜の連続的なリンスを実行してＴＦＦ３システムからベクターを回収した。先にＴＦＦ３保持液を保持した一次コニカルチューブにＴＦＦ３緩衝液を加えた。この材料を、セルロース膜を通じて再循環させた。再循環後、フラッシュ液を０．２μｍ  Ｐａｌｌ  Ｓｕｐｏｒ（登録商標）ＥＫＶ滅菌用グレードフィルタ（Ｍｉｎｉ  Ｋｌｅｅｎｐａｋ）フィルタに通して二次コニカルチューブに移した。ＴＦＦ３濃縮物及び部分的プールを混合して、≧４．５×１０１３ｖｇ／ｍＬの原薬（プールされたＴＦＦ３保持液＋２回のリンス液）の最終ベクター濃度を実現した。
【０９７０】
膜の連続的なリンスを実行してＴＦＦ３システムからの産物回収率を最大化した。先にＴＦＦ３保持液及び初期フラッシュ材料を保持した一次コニカルチューブにＴＦＦ３緩衝液を加えた。この材料を、セルロース膜を通じて再循環させた。二次コニカルチューブにおいて決められた重量が実現するまで、二次フラッシュ液を０．２μｍ  Ｐａｌｌ  Ｓｕｐｏｒ（登録商標）ＥＫＶ滅菌用グレードフィルタ（Ｍｉｎｉ  Ｋｌｅｅｎｐａｋ）フィルタに通して二次コニカルチューブに移した。この最終濃縮溶液が、原薬（ＤＳ）と称される。
【０９７１】
【表７５】
2021526806.tif 000130
【０９７２】
ＤＳをＰａｌｌ  Ｓｕｐｏｒ（登録商標）ＥＫＶ滅菌用グレードフィルタ（Ｍｉｎｉ  Ｋｌｅｅｎｐａｋ）でろ過し、滅菌使い捨てアセンブリを使用して滅菌１Ｌガラスボトルに入れた。ＴＦＦ３プールのろ過前に、蠕動ポンプを使用してＴＦＦ３緩衝液をフィルタに通過させ、廃棄物フラッシュバッグに廃棄することにより、フィルタをフラッシュした。次に蠕動ポンプを使用してフラッシュ済みのフィルタで原薬（ＤＳ）をろ過し、１Ｌ滅菌ガラスボトルに収集した。５×１０１３ｖｇ／ｍＬの目標としたＤＳ濃度に基づいて、ＤＳを保持する二次コニカルチューブにＴＦＦ３緩衝液を加え、３．５×１０１３ｖｇ／ｍＬの目標濃度となるようにフィルタに通して希釈薬物製品（「ＤＰ」）を調製した。
【０９７３】
ＤＰの調製のためのフィルタフラッシュ及びＤＳ希釈に使用されるＴＦＦ３緩衝液は、以下の配合を含む。
【０９７４】
【表７６】
2021526806.tif 000131
【０９７５】
５ｍＬの滅菌した既製のＣｒｙｓｔａｌ  Ｚｅｎｉｔｈ（ＣＺ）バイアルにＤＰを充填し、滅菌した既製の栓で栓をして、滅菌した既製のシールで密封した。
【０９７６】
実施例２２：脊髄性筋萎縮症のための単回用量遺伝子置換療法：用量研究
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、生存運動ニューロン１をコードする遺伝子（ＳＭＮ１）の喪失又は機能不全によって生じる重篤な小児単一遺伝子疾患である。この疾患の発生率は１０，０００人の出生に約１人であり、保因者頻度は５４人に１人である。ＳＭＡは下位運動ニューロンの変性及び喪失によって特徴付けられ、これが筋萎縮につながる。この疾患は、発症年齢及びマイルストーン獲得に基づいて４つの亜型（１〜４）に分けられる。ＳＭＡ１型（ＳＭＡ１）は最も重症型であり、乳児死亡の最も多い遺伝的原因である。ＳＭＡには２つの形態のＳＭＮがある；ＳＭＮ１は、ＳＭＮタンパク質の機能的産生に関与する主要な遺伝子である。ＳＭＮ２はスプライシングの間にエクソン７を優先的に除外し、結果として、ＳＭＮ１と比較すると機能性ＳＭＮタンパク質をごく一部のみ産生する。従って、ＳＭＮ２コピー数は疾患表現型を修飾し、ＳＭＮ２の２つのコピーの存在がＳＭＡ１に関連する。ＳＭＮ１両アレル欠失及び２コピーのＳＭＮ２を有する乳児は、ＳＭＡ１のリスクが９７％である。
【０９７７】
ＳＭＡ１の自然歴（歴史的コホート）の最近の研究では、この疾患を有する乳児の間での症状発現時の年齢中央値が１．２ヵ月（範囲、０〜４ヵ月）であり、この疾患は、筋緊張低下、乳児期早期からの重度の脱力及び支持なしでの座位不能によって特徴付けられることが示された。２コピーのＳＭＮ２を有するＳＭＡ１乳児では、死亡時又は少なくとも１４日連続で１日少なくとも１６時間の非侵襲的換気（持続的換気と均等と考えられる）が必要となる時点の年齢中央値は１０．５ヵ月であった。罹患小児の１つのコホートでは、１３．６ヵ月時点で持続的換気補助なしに生存したのは僅か２５％であり、２０ヵ月までにこの補助なしに生存したのは８％であった。２コピーのＳＭＮ２を有する患者に関する国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の支援を受けた別の前向き多施設歴史的研究（ＮｅｕｒｏＮＥＸＴ）は、８ヵ月の気管開口術なしの生存期間中央値を示した（９５％信頼区間、６〜１７）。全てのＳＭＡ１患者が出生後に呼吸及び嚥下機能が急激に低下し、最終的には、十分な栄養を維持し及び誤嚥に伴う呼吸器リスクを低減するため、（経鼻胃チューブ又は胃瘻チューブからの）機械的栄養補助が必要になる。症状の発現が３ヵ月齢までに起こるＳＭＡ１患者について、ほとんどの患者は１２ヵ月齢までに栄養補助が必要となる。
【０９７８】
ＳＭＡ１患者はまた、ＣＨＯＰ  ＩＮＴＥＮＤ（フィラデルフィア小児病院乳児神経筋疾患検査）尺度で測定したとき、運動機能の主要なマイルストーンを獲得せず、機能低下がある（ＣＨＯＰ  ＩＮＴＥＮＤは０〜６４の範囲をとり、ここで、スコアが高いほど良好な運動機能であることを指し、四肢の抗重力運動など、運動機能の僅かな変化に感受性があるツールである）。３４人のＳＭＡ１患者の歴史的分析では、１人を除く全ての患者が６ヵ月齢以降は少なくとも４０のスコアに達しなかった。ＮｅｕｒｏＮＥＸＴコホートでは、ＣＨＯＰ  ＩＮＴＥＮＤスコアは６ヵ月齢〜１２ヵ月齢の間に平均１０．７点下がった。
【０９７９】
運動ニューロンのＳＭＮタンパク質レベルを増加させる治療戦略は、ＳＭＮ２の有効性を亢進させることに重点が置かれてきた。１つの手法は、ＳＭＮ２におけるエクソン７スプライシングを阻害するために開発されたアンチセンスオリゴヌクレオチドであるヌシネルセン（Ｉｏｎｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｂｉｏｇｅｎ）の中枢神経系送達とされている。この薬物は、重症ＳＭＡのマウスモデルにおいて脱力を改善し、罹患マウスの平均寿命を１６日から２５日に増加させることが示されている。２０１６年１２月にヌシネルセンはＳＭＡの治療に食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって承認された。この薬物は、生後２ヵ月以内における４負荷用量後の反復髄腔内注射を用いて投与される。
【０９８０】
可能性のある別のＳＭＡ１治療は遺伝子療法であり、これは、自己相補的アデノ随伴ウイルス血清型９型（ｓｃＡＡＶ９）（この組換えウイルスのコード領域は分子内二本鎖ＤＮＡ［又は自己相補的］鋳型を形成する）でＳＭＮのコピーを送達する単回静脈内投与として与えられる。この手法によって運動ニューロン及び末梢組織におけるＳＭＮ発現が誘導されており、それがマウスモデルにおけるＳＭＡの効果を抑え、このモデルの平均生存期間を１５日から低用量（体重１キログラム当たり６．７×１０１３ｖｇ）では２８．５日及びより高用量のベクター（１キログラム当たり２．０×１０１４及び３．３×１０１４ｖｇ）では２５０日を超えるまでに延長させている。
【０９８１】
ＳＭＮタンパク質が遍在的に発現し、且つＳＭＡ１が、多くの細胞型（例えば、心臓、膵臓及び骨格筋）と共に、複数の系（例えば、自律神経系及び腸管神経系、心血管系及び膵臓）に発症することを踏まえると、血液脳関門を越え、且つ脊髄のあらゆる領域にある中枢神経系ニューロンを標的とすることに加え、ＡＡＶ９媒介性遺伝子療法の全身投与が有利であり得る。ハイブリッドサイトメガロウイルスエンハンサー−ニワトリβアクチンプロモーターと組み合わせたこのベクターの自己相補的特徴が、ＳＭＮの迅速且つ持続的な発現を可能にする。２０１４年４月、本発明者らは、ニワトリβ−アクチンプロモーターの制御下にあるヒト生存運動ニューロン遺伝子（ｈＳＭＮ）の送達を伴う単回用量のｓｃＡＡＶ９（ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮ）（ＡＶＸＳ−１０１）の投与を受けたＳＭＡ１乳児が関わる遺伝子置換療法の試験を開始した。
【０９８２】
方法
患者及び試験手順：本試験の目的上、患者は、全てＳＭＡ１の遺伝子確定診断、ホモ接合性ＳＭＮ１エクソン７欠失及び２コピーのＳＭＮ２を有した。ＳＭＮ２のエクソン７にｃ．８５９Ｇ→Ｃ疾患修飾因子を有する患者は除外した。選択された患者は、出生直後から６ヵ月齢までに、運動技能遅滞、定頸不全、円背姿勢及び関節過度可動性を伴う臨床評価によって決定されるとおりの筋緊張低下によって特徴付けられる疾患の発現を示していた者であった。活動性ウイルス感染症（ＨＩＶ又はＢ型若しくはＣ型肝炎の血清陽性を含む）又は不必要な遺伝子導入リスクをもたらす併発疾患を有する患者は本試験から除外した。侵襲的換気補助（陽圧法を伴う気管切開術）が必要な患者又はスクリーニングビジット時にパルスオキシメトリ＜９５％飽和の患者も除外した。
【０９８３】
患者は、投与される遺伝子療法の用量に基づく２つのコホートに登録した。コホート１の患者は低用量（１キログラム当たり６．７×１０１３ｖｇ）の投与を受け、５ヵ月にわたって登録した；コホート２の患者は高用量（１キログラム当たり２．０×１０１４ｖｇ）の投与を受け、１年にわたって登録した。投与後３０日目、コホート１の患者１に対するＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによりＴ細胞応答が検出され、ＡＡＶ９カプシドに対して＞５０である１０６個の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の急増が示された（正常、１０６個のＰＢＭＣ当たり＜５０ＳＦＣ）。プレドニゾロンを２ｍｇ／ｋｇで開始し、３５日間、Ｔ細胞応答及び血清トランスアミナーゼが低下するまで維持した。結果として、この実験プロトコルは修正され、患者２〜１５は１日１キログラム当たり１ｍｇの用量の経口プレドニゾロンの投与を遺伝子ベクターの投与２４時間前から開始して約３０日間受けた。治療は、プレドニゾロンを維持しながら、ＡＳＴ及びＡＬＴ酵素が１２０ＩＵ／Ｌのレベルを下回り且つＴ細胞応答が１０６個のＰＢＭＣ当たり１００ＳＦＣを下回るまで継続した後、臨床上の判断に基づいてプレドニゾロンを漸減することになった。
【０９８４】
ベクターは通常生理食塩水（１キログラム当たり約１０〜２０ｍｌ）に入れて送達し、これは約６０分間で静脈内注入した。一部の患者は登録時点で胃瘻造設術又は経鼻胃チューブを用いた経腸栄養が必要であったが、その選択は親又は主治医の意向に基づいた。本試験に登録後は、栄養補助が必要な全ての患者に胃瘻チューブの留置を行い、試験中、チューブは抜去しなかった。
【０９８５】
アウトカム：主要アウトカムは、グレード３以上の任意の治療関連有害事象を基準とする安全性の決定であった。副次アウトカムは、死亡までの時間又は持続的換気補助の必要性であった。後者は、急性の可逆的疾患がない又は周術期状態でない中での、少なくとも１４日間連続で１日少なくとも１６時間の呼吸補助として定義した。探索的アウトカムには、運動マイルストーンの獲得（特に、支持なしでの座位）及びＣＨＯＰ  ＩＮＴＥＮＤスコアが含まれた。
【０９８６】
ＳＭＡにおけるＣＨＯＰ  ＩＮＴＥＮＤ尺度の適用では、４０点を超えるスコアの維持が臨床的に有意味と見なされている。支持なしでの座位は、以下の判定基準により判定し、等級分けした：ベイリー乳幼児発達尺度（Ｂａｙｌｅｙ  Ｓｃａｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｆａｎｔ  ａｎｄ  Ｔｏｄｄｌｅｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）粗大運動下位検査の項目２２による、少なくとも５秒間の支持なしでの座位（「支持なしでの座位」）；世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：ＷＨＯ）判定基準による、少なくとも１０秒間の支持なしでの座位（「ＷＨＯ判定基準に従う支持なしでの座位」）；及び上述のベイリー尺度（Ｂａｙｌｅｙ  Ｓｃａｌｅｓ）の項目２６による、少なくとも３０秒間の支持なしでの座位（「自力での機能的座位」）。主要な運動マイルストーンは、インタラクティブビデオ判定によって捉えた能力−ミニ（Ａｂｉｌｉｔｙ  Ｃａｐｔｕｒｅｄ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｖｉｄｅｏ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ−ｍｉｎｉ：ＡＣＴＩＶＥ−ｍｉｎｉ）によって独立した評価者が患者のビデオ記録を調べることにより確認した。複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）はベースライン時及び注入後６ヵ月毎に表面電極から記録した。筋肉の病理学的状態は電気インピーダンスミオグラフィー（ＥＩＭ）によって定量化した。
【０９８７】
統計的分析：全ての患者において安全性分析を実施し、これらの患者は、一次生存分析（上記及びプロトコルに定義するとおり）並びにＣＨＯＰ  ＩＮＴＥＮＤ尺度のベースラインから１ヵ月及び３ヵ月までの変化の分析にも含まれた。かかるベースラインから各試験ビジットまでの変化は、反復測定混合効果モデルを用いて分析した。混合モデルは、コホート及びビジットの固定効果並びにベースラインスコアの共変量を含んだ。コホート２ではマイルストーンの獲得並びに栄養及び換気補助を分析した。統計的分析は、ＳＡＳソフトウェア、バージョン９．４を使用して実施した。歴史的コホートとの比較は、全てもっぱら記述的とした。
【０９８８】
結果
患者：スクリーニングを受けた１６人の患者のうち、１人は抗ＡＡＶ９抗体力価の持続的上昇（＞１：５０）が理由で除外した。本試験に組み入れた１５人の患者のうち、３人が低用量コホート１に登録し、１２人が高用量コホート２に登録した。治療時点での患者の平均年齢は、コホート１で６．３ヵ月（範囲、５．９〜７．２）及びコホート２で３．４ヵ月（範囲、０．９〜７．９）であった（表６９）。
【０９８９】
【表７７】
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【０９９０】
生存及び持続的換気：試験終了時、全ての患者が少なくとも２０ヵ月齢に達しており、持続的機械換気は不要であった；その最新の肺評価時における年齢中央値はコホート１で３０．８ヵ月及びコホート２で２５．７ヵ月であった。対照的に、歴史的コホートの患者で持続的機械換気が不要であったのは８％に過ぎなかった。コホート１の１人の患者は、２９ヵ月齢の時点で流涎過多のため持続的換気を必要とした。唾液腺結紮後、非侵襲的換気を使用する必要性が１日１５時間に２５％低下した。
【０９９１】
運動機能評価：コホート１及び２の全ての患者においてＣＨＯＰ  ＩＮＴＥＮＤ尺度に関してベースラインからのスコア増加があり、試験中、その変化が維持された。コホート２の患者は平均増加が１ヵ月時点で９．８点及び３ヵ月時点で１５．４点であった（両方の比較についてＰ＜０．００１）；１１人の患者は４０点を超えるスコアを達成し、維持した。２０１７年８月７日の試験カットオフ時、コホート１の患者は１６．３点の平均ベースラインから平均７．７点増加し、コホート２の患者は２８．２点の平均ベースラインから平均２４．６点増加した。
【０９９２】
コホート２における運動マイルストーン：コホート２の１２人の患者のうちの合計１１人が少なくとも５秒間、１０人が少なくとも１０秒間及び９人が少なくとも３０秒間の支持なしでの座位が可能であった（表７０）。合計１１人が定頸を獲得し、９人が寝返りでき、且つ２人がずり這い、つかまり立ち、単独立位及び独歩が可能であった。１１人の患者は発話能力を達成した。歴史的コホートの患者でこれらの運動マイルストーンのいずれかを獲得した者はおらず、発話能力を獲得した者もほぼいなかった。
【０９９３】
【表７８】
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【０９９４】
コホート２における肺及び栄養状態：コホート２の１２人の患者の中で、１０人はベースライン時に非侵襲的換気が不要であったのに対し、最終回のフォローアップビジット時に換気補助を受けていなかったのは７人であった（表７０）。ベースライン時、７人の患者は経腸栄養が不要であったが、その中の１人は後に、恐らくは脊柱側彎症手術に関連して遺伝子置換療法後に胃瘻チューブの留置が必要になった。遺伝子置換療法前に経腸栄養を受けていた５人の患者のうち、最終回のフォローアップ時には、１２人中１１人の患者が自力での嚥下能力を獲得又は保持しており、４人が経口摂取可能であった。
【０９９５】
安全性：試験終了時点で、２つのコホートの１３人の患者に合計５６件の重篤有害事象が認められた。治験責任医師らは、有害事象共通用語規準（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔｓ）に従い、検査値に基づけばこれらの事象のうちの２件の事象が治療関連グレード４事象であると決定した（表７１）。コホート１の患者１には血清アミノトランスフェラーゼ値の上昇（アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）について正常範囲上限の３１倍及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）について上限の１４倍）があったが、他の肝機能異常（即ち総ビリルビン及び間接ビリルビン並びにアルカリホスファターゼ）はなく、臨床症状はなかった。上記に記載したとおり、これらの上昇はプレドニゾロン治療によって軽減され、プレドニゾロン治療は続いて残りの患者にも投与された。コホート２の１人の患者は、血清ＡＬＴ及びＡＳＴ値の上昇（ＡＬＴについて正常範囲上限の３５倍及びＡＳＴについて３７倍）を軽減するために追加的なプレドニゾロンが必要であった。２４１件の非重篤有害事象のうち、２人の患者における３件が治療関連と見なされ、無症候性の血清アミノトランスフェラーゼ値上昇からなったが（ＡＬＴ及びＡＳＴ、両方とも正常範囲上限の１０倍未満）、これらは追加のプレドニゾロン治療なしに解消された（表７１）。肝機能検査に他の異常はなかった。１５人の患者のうちの１４人は、ＳＭＡ１小児において高頻度で死亡又は気管開口術の必要性を招くことになる呼吸器疾患を有した。
【０９９６】
【表７９】
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【０９９７】
【表８０】
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【０９９８】
【表８１】
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【０９９９】
ＳＭＮをコードするＤＮＡを含有するアデノ随伴ウイルスベクターをＳＭＡ１患者において単回静脈内注入すると、この疾患の歴史的コホートと比べて生存が延びた。１５人の患者全てが、２つのＳＭＮ２コピーを有するＳＭＡ１患者についての１０．５ヵ月というこれまでに報告されている持続的換気なしでの生存の年齢中央値を超えた。また全ての患者が、典型的には僅か８％のこの疾患の患者が持続的換気なしに生存するに過ぎない時点である２０ヵ月のベンチマークも超えた。コホート２の１２人の患者のうちの４人は、１人を除き全員が、歴史的コホートでは報告されたことのない運動機能マイルストーンを獲得した。達成された運動機能は、摂食（手から口へ）、座位及び発話に反映されるとおり、臨床的に有意味であった。登録時に補助ケアが不要であった患者の大半は、最終回のフォローアップビジット時に栄養補助（７人中６人の患者）及び換気補助（１０人中７人の患者）なしであった。２つのコホートにおいて、患者はＣＨＯＰ  ＩＮＴＥＮＤ尺度のスコアがベースラインから増加した。コホート２における最初の１ヵ月以内の平均増加は９．８点であり、これはＮｅｕｒｏＮＥＸＴ研究における歴史的コホートで６〜１２ヵ月齢の間に平均１０点超低下したのと対照的であった。
【１０００】
ＳＭＮΔ７マウスモデルにおけるＳＭＮ遺伝子置換療法の前臨床試験では、恐らくは運動ニューロンがまだインタクトな時点での早期治療による生存及び運動機能の改善が示された。本発明者らの早期治療試験における臨床所見は、前臨床試験におけるその方向性を反映したものであった。早期治療後、２人の患者がずり這い、起立及び歩行が支持なしで可能であった。これらの患者は両者ともＳＭＡの家族歴を有し、恐らくはそれが早期診断に寄与した。本発明者らの試験における２つのコホートの患者は、全て運動機能が改善し続けているが、前臨床及び臨床データは、ＳＭＡに関する早期治療及び新生児検診の利益を示唆している。
【１００１】
ＡＡＶ遺伝子置換療法によって引き起こされる重篤有害事象は、２人の患者における治療約３週間後の血清アミノトランスフェラーゼ値の上昇に限られ、他の肝酵素異常はなかった；他の２人の患者に、重篤有害事象の定義についてのカットオフ（即ち正常範囲の＞１０倍）に達しない上昇があった。肝酵素の上昇はプレドニゾロン治療によって軽減された。１人の患者は抗ＡＡＶ９抗体が存在したためスクリーニングを通過しなかったが、これは、小児及び若年成人で抗ＡＡＶ９血清陽性率が低く、４０歳を超える人で抗ＡＡＶ９血清陽性率が高くなることを示唆する集団研究と一致している。しかしながら、ウイルスに対する抗体の存在はＡＡＶ遺伝子置換療法の制約であり得る。
【１００２】
本試験では、歴史的コホートを対照とした単一群設計を用いたが、これは、疾患の自然歴が十分に特徴付けられていて且つ致死性であるときの限られた数の選択肢の１つである。既発表の歴史的研究と同様の均一サンプルを登録するため、本発明者らは、両アレル性ＳＭＮ１突然変異及び２つのＳＭＮ２コピーを有した症候性のＳＭＡ１患者のみを組み入れるように登録を制限し、ＳＭＮ２のエクソン７にｃ．８５９Ｇ→Ｃ遺伝的修飾因子を有する患者は、この遺伝的修飾因子がより軽症の表現型の疾患を予測するものであるため登録しなかった。しかしながら、この遺伝子置換療法が症候性の患者又は特定のゲノム亜型を有する患者に限定される必要はない。
【１００３】
結論として、ＳＭＮをコードするＤＮＡを含有するアデノ随伴ウイルスベクターの高用量をＳＭＡ１患者において単回静脈内注入すると、生存が延び、運動機能が改善し、且つＣＨＯＰ  ＩＮＴＥＮＤ尺度のスコアがこれまでにこの疾患で観察されたことのないレベルにまで増加した。かかる改善により、歴史的研究のものと比べて補助ケアが必要な患者の割合が低下した。最長２年のフォローアップの中で、効果の減少又は運動機能の臨床的後退が報告されたことはなかった。数人の患者に一過性及び無症候性のアミノトランスフェラーゼ値の上昇があった。ＳＭＡ１患者における遺伝子置換療法の長期安全性及び耐久性を評価するには、更なる試験が必要である。
【１００４】
実施例２３：ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮの薬物動態
従来の臨床薬物動態試験は、遺伝子置換療法製品には適用できない。しかしながら、体液及び排泄物として体外に排出されるベクターの量を評価するｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクター排出試験は、従来の薬物動態試験に代えて遺伝子置換療法に用い得る尺度である。
【１００５】
臨床試験中、複数の時点で、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮの注入後のベクター排出を調べた。唾液、尿及び便のサンプルを３０日目まで毎週、次に１２ヵ月目まで毎月、その後３ヵ月毎に採取した。ドロップレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応による１８ヵ月目のビジットまでのｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクター排出分析に、５人の患者からのサンプルを使用した。ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクター排出に関して分析した５人の患者全てに、１．１×１０１４ｖｇ／ｋｇの治療用量を投与した。
【１００６】
注入後の排出サンプル中にｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮを検出可能であった。尿及び唾液中のｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮ濃度は、注入後１日目に体内初期濃度の０．１％〜０．０１％であり、その後、濃度は定量限界未満に下がった。便中では、注入後１日目に体内初期濃度の１０％〜３０％のレベルを検出可能であった。１人の患者は、注入後１４日目に便中に体内初期濃度の２８０％のピーク濃度を示した。対照的に、データを利用可能であった３人の患者は、注入後１４日目に体内初期濃度の＜１％の濃度を示し、濃度は注入後３０日間にわたって約４ｌｏｇ減少した（１０，０００分の１）。総じて、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮは主に便で体外に除去され、便中では注入後６０日目までに定量限界を下回った。
【１００７】
実施例２４：非臨床毒性試験
動物薬理学：Δ７  ＳＭＡマウス疾患モデル（ＳＭＮ  Δ７マウス）におけるｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクターの注入後、未治療ＳＭＮ  Δ７マウスと比較して体重が増加し、正向反射行動が改善し、生存が用量依存的に有意に延長し、且つＳＭＡ関連心臓障害が正常化した。
【１００８】
動物毒性学：マウスにおける静脈内注入後、ベクター及びトランス遺伝子は広く分布し、最も高い発現が概して心臓及び肝臓に見られ、実質的な発現が脳及び脊髄に見られた。ピボタル優良試験所基準（Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：ＧＬＰ）準拠３ヵ月マウス毒性試験において、毒性の主な標的器官は心臓及び肝臓であった。ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクター関連の心室所見は用量依存性の炎症、浮腫及び線維化を含み、心房所見は炎症及び血栓症を含んだ。肝所見は、肝細胞肥大、クッパー細胞活性化及び散在性肝細胞壊死を含んだ。マウスにおけるｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクター関連の心及び肝所見について無有害作用量（ＮｏＡＥＬ）は特定されず、最大耐量は、１．１×１０１４ｖｇ／ｋｇの推奨治療用量に対して約１．４倍の安全域を与えて、１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇと定義された。マウスで観察された所見を霊長類に適用できるかどうかは、現時点では不明である。
【１００９】
実施例２５：小児患者における脊髄性筋萎縮症
本試験は、遺伝子検査によって両アレル性ＳＭＮ１欠失、２コピーの生存運動ニューロン２（ＳＭＮ２）、エクソン７におけるｃ．８５９Ｇ＞Ｃ修飾の陰性所見が確認された、且つ臨床症状の発症が６ヵ月齢未満であるＳＭＡ１型患者におけるｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクターの安全性及び有効性を判定する第１相試験であった。０．９〜７．９ヵ月齢の患者においてｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクターを単回用量注入時に静脈内送達した。２つのコホートに投与した：コホート１（ｎ＝３）は、本試験に用いられる低用量の投与を受け、コホート２（ｎ＝１２）は、本試験に用いられる高用量（治療用量：１．１×１０１４ｖｇ／ｋｇ）の投与を受けた。報告される試験アウトカムはコホート２を反映し、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクター注入後２４ヵ月までの全患者のフォローアップを含む。
【１０１０】
死亡率及び無イベント生存率
生存及びイベントまでの時間分析がｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクターの有効性を裏付ける。コホート２では、全１２人の患者（１００％）が２４ヵ月齢超で無イベントであったのに対し、自然歴研究では僅か８％の患者であった。これは、未治療の患者と比較したときの、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクターを注入した患者についての全生存の有意且つ臨床的に有意味な増加を示している。注入後２年の時点で患者の死亡報告はなかった。
【１０１１】
運動発達マイルストーン
運動発達マイルストーンを調べた；全１５人の患者についての評価をビデオで記録して、運動発達マイルストーンの獲得を確認できるようにした。コホート２の患者は、一貫して主要な運動発達マイルストーンを獲得し、維持した。投与後２４ヵ月のフォローアップの時点で、１１人の患者（９１．７％）はその≧３秒の頸定保持及び≧５秒の支持なしでの座位が可能であり、１０人の患者（８３．３％）は≧１０秒の支持なしでの座位が可能であり、９人の患者（７５．０％）は≧３０秒の支持なしでの座位が可能であり、且つ２人の患者は各々（１６．７％）、単独立位、支持ありでの歩行及び独歩が可能であった。本試験の進行中の観察的長期フォローアップに現在登録されているコホート２患者は、その運動発達マイルストーンを維持しており、一部は追加的な運動マイルストーンを獲得している。
【１０１２】
【表８２】
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【１０１３】
肺
ベースライン時に非侵襲的換気（ＮＩＶ）を使用していなかったコホート２の１０人の患者のうち、７人は２４ヵ月のフォローアップ時にＮＩＶの日常使用がなかった。ほぼ全ての患者が、ＳＭＡ１型小児において典型的に気管開口術又は死亡を招く共通の小児呼吸器疾患を起こした。全ての患者が、気管開口術又は持続的換気の必要性なしに呼吸器科入院を乗り切った。
【１０１４】
栄養
栄養確保も観察した。コホート２において、７人の患者は遺伝子置換療法前に経腸栄養を受けていなかった。これらの７人の患者のうちの１人は、脊柱側彎症手術からの回復が困難であったことを受けて創傷治癒を促進するため栄養補助を有したが、経口摂取もあった。遺伝子置換療法前に経腸栄養を受けていたコホート２の５人の患者のうちの４人は、試験終了時に経口摂取可能であった；従って、コホート２の１２人の患者のうちの合計１１人が経口摂取可能で、６人は経口摂取のみであった。
【１０１５】
運動機能（ＣＨＯＰ−ＩＮＴＥＮＤ）
治療用量の投与を受けている患者は、１ヵ月目及び３ヵ月目までに統計的に有意な運動機能の改善を実現した；フィラデルフィア小児病院乳児神経筋疾患検査（ＣＨＯＰ−ＩＮＴＥＮＤ）のベースラインからの平均増加は、それぞれ９．８点（ｎ＝１２、Ｐ＜０．００１）及び１５．４点（ｎ＝１２、Ｐ＜０．００１）であった。
【１０１６】
ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクターを注入した患者において、運動機能の改善は時間が経っても持続した。１２人中１１人（９１．７％）のコホート２患者が２４ヵ月時点で≧５０のＣＨＯＰ−ＩＮＴＥＮＤスコアを実現した。早期の介入及び投与が応答に正の影響を及ぼすように見える。一般臨床診療では、６ヵ月齢以上の未治療ＳＭＡ１型小児がＣＨＯＰ−ＩＮＴＥＮＤで４０点のスコアを上回ることはない。更に、前向き自然歴の一部として追跡された未治療乳児では、６〜１２ヵ月齢の間に１０．７点の平均低下が報告された。
【１０１７】
実施例２６：ｑＰＣＲを用いたＡＡＶ９ウイルスベクター中の残留宿主細胞ＤＮＡの測定
方法
この方法は、ＡＡＶ原薬、例えばＡＶＸＳ−１０１及び工程間サンプル中の残留ｈｃＤＮＡのｑＰＣＲによる定量化に用いた。１プレート当たり最大６つのサンプルを試験した。ｑＰＣＲアッセイはＴａｑＭａｎプローブを使用して実施した。ＴａｑＭａｎプローブは、５’末端に結合した蛍光発生レポーター色素と、３’末端に結合した非蛍光性消光剤とを有する。プローブがインタクトな間は、消光剤がレポーター色素に近接しているため、レポーター色素が発する蛍光は大幅に減少する。プローブが切断されるとレポーター色素と消光剤とが分離し、レポーター蛍光が増加する。
【１０１８】
ヒトゲノム内の反復配列に結合するように設計された隣接フォワード及びリバースプライマーを反応混合物に加え、サンプル及び標準中に存在する標的配列にアニーリングさせた。ＴａｑＭａｎ蛍光発生プローブはプライマー部位間にアニーリングした。鋳型変性、プライマーアニーリング及び産物伸長の連続サイクルにより、標的配列を増幅した。増幅サイクルの伸長ステップの間、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によってプローブからレポーター色素が放出され、消光剤から色素が遊離して、鋳型の量に比例した蛍光発光が生じた。
【１０１９】
ｑＰＣＲ機器によって９６ウェルプレートの各ウェルの蛍光を測定した。追加のＰＣＲサイクルを通じて標的配列の増量を行った。及び結果は、プローブからより多くのレポーター色素が放出され、連続ＰＣＲサイクル毎に蛍光が高まったというものである。蛍光シグナルが所定の閾値に達するために必要な増幅サイクル回数を測定する。このサイクルは、閾値サイクル又はＣＴ値と称される。サンプル又は標準ウェル中の出発ＤＮＡ濃度が高いほど、閾値蛍光レベルに達するために必要なＰＣＲサイクルの回数が減り、ＣＴ値が低くなる。各標準時点について測定されるＣＴ値に対してｌｏｇ１０（ＤＮＡ濃度）をプロットすることにより、検量線を決定する。ＣＴ値を使用して、サンプルの個々のＣＴ値を使用し且つＤＮＡ値について解くことにより、サンプル中に存在するＤＮＡの量を決定する。
【１０２０】
初めにＷａｋｏＤＮＡ抽出キット（Ｗａｋｏ、２９５−５０２０１）を使用してサンプルを調製した。簡潔に言えば、試験用サンプルを十分に混合し、１０００倍希釈した。希釈したサンプルを４本のチューブに分割し（各５００μＬ）、それらのチューブの２本に５０μＬの水を加えた（スパイクなしレプリケート）一方、他の２本のチューブに５０μＬの３０，０００ｐｇ／ｍＬ  ＤＮＡ標準を加えた（スパイクあり対照）。各チューブに２０μＬのＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム溶液を加えて５秒間ボルテックスし、次に短時間遠心することにより、タンパク質可溶化を実施した。グリコーゲン及びＰｅｌｌｅｔ  Ｐａｉｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、７０７４８）を含有するＮａＩ溶液を、それが２０００：５：４の比のＮａＩ：グリコーゲン：Ｐｅｌｌｅｔ  Ｐａｉｎｔとなるように調製した。各チューブに５００μＬのＮａＩ混合物を加え、５３℃±１℃で１５分間インキュベートした。チューブを加熱から外し、９００μＬのイソプロパノールと混合し、室温で１５分間インキュベートした。次にチューブを１８℃において１０，０００ｇで１５分間遠心し、上清をデカントした。残りのペレットを８００μＬの洗浄溶液Ａで洗浄し、スピンし、２回再ペレット化した。最後に、グリコーゲンを含有する１５００μＬの冷イソプロパノール洗浄溶液でペレットを洗浄し、スピンし、再ペレット化した。最終ペレット化物を５００μＬヌクレアーゼフリー水に再懸濁した。
【１０２１】
ｒｅｓＤＮＡ  ＳＥＱヒト定量キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａ２６３６６）を使用してｑＰＣＲを実施した。キットに指示されるとおり２×Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌマスターミックス、１０×ヒトＤＮＡアッセイミックス及び陰性対照を組み合わせることにより、反応混合物を調製した。２０μＬ反応混合物を１０μＬの調製サンプルと混合し、ＰＣＲプレート上の各ウェルに加えた。各サンプルにつきトリプリケートでプレーティングした。プレートを光学粘着フィルムで密封した。熱サイクルでは、初めに融解を９５℃で１０分間実施し、次にサンプルを９５℃で１５秒間と６０℃で１分間との間のサイクルに４０サイクルかけた。
【１０２２】
ｌｏｇ単位のＤＮＡ量（［ｐｇ／ｍＬ］）に対するＣＴ値をプロットすることにより、検量線を作成した。以下の式によって与えられる直線にデータをフィッティングした：
ＣＴ値＝ｍ×ｌｏｇ１０（ｘ）＋ｂ
式中、ｘ＝標準の濃度、ｐｇ／ｍＬ単位であり、ｍは傾きであり、且つｂはｙ切片である。宿主細胞ＤＮＡの濃度は、上記の式を用いてウェルのＣＴ値から逆算し、次に希釈係数によって補正した。
【１０２３】
結果
ｑＰＣＲにより測定された残留宿主細胞ＤＮＡは、先行ベクターバッチについて３．７×１０５ｐｇ／ｍＬ、ＡＶＸＳ−１０１ロット６００１５６について０．７６×１０５ｐｇ／ｍＬ、ＡＶＸＳ１−１０１ロット６００３０７について０．６８×１０５ｐｇ／ｍＬ及びＡＶＸＳ−２０１  ＤＳについて１．３×１０５ｐｇ／ｍＬであった。
【１０２４】
実施例２７：ＥＬＩＳＡによるＡＡＶ９ウイルスベクター中の残留宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の測定
方法
市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを使用して、ＡＶＸＳ−１０１サンプル中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）濃度を測定した。Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓヒト胎児腎臓２９３ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡキットは、固相２部位酵素イムノアッセイである。これは直接サンドイッチ法に基づくものであり、２つのポリクローナル抗体がＨＣＰの別個の抗原決定基に対して向けられる。インキュベーションの間に、サンプル中のＨＣＰが、マイクロプレートウェルに結合した抗ＨＣＰ抗体及び溶液中のペルオキシダーゼコンジュゲート抗ＨＣＰ抗体と結合した。
【１０２５】
インキュベーション期間後、ウェルを洗浄して全ての未結合の酵素コンジュゲート抗体を除去した。次にウェルに３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液を加えた。結合したペルオキシダーゼコンジュゲートが基質の色変化反応を触媒した。酸を加えることによりこの反応を停止させると、４５０ｎｍで分光光度法により（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）読み取ることのできる比色エンドポイントが得られた。加水分解された基質の量は、存在するＨＣＰの濃度に正比例した。
【１０２６】
試験するサンプルを本方法の範囲４ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬに適合するように希釈した。次に各サンプルをＳＤＢで２倍希釈し（１１０μＬサンプル及び１１０μＬ  ＳＤＢ）、混合した。一貫性を確かめるため、スパイクした対照も作製した。スパイクした対照では、１１０μＬの各サンプルを２７．５μＬの２００ｎｇ／ｍＬ  ＨＣＰ標準及び８２．５μＬのＳＤＢと混合した。最後に、５０μＬの各標準、対照又は試験サンプルを９６ウェルプレートのウェルに加え、１００μＬの抗ＨＥＫ  ２９３−ＨＲＰコンジュゲートと混合した。条件は、全てトリプリケートでプレーティングした。プレートをシールテープで密封し、室温において４００〜６００ｒｐｍで２時間振盪した。インキュベーション後、ウェル内の溶液を、プレートを逆さまにして振り払い、吸収性タオルで拭き取ることにより取り除いた。ウェルを洗浄瓶で洗浄し、手早く拭き取って軽く叩き、洗浄溶液をウェルに浸らせないようにした。この洗浄を４回繰り返し、最終回の洗浄後、逆さまにして約２０秒間静置させることにより排液した。最後に、プレートの各ウェルに１００μＬのＴＭＢ基質を加え、撹拌なしに室温で２０〜３０分間インキュベートした。１００μＬの停止液を各ウェルに加えることにより、反応を停止させた。このプレートを、停止液を加えてから４５分以内にプレートリーダーに装填し、プレートを４５０ｎｍ及び６５０ｎｍで読み取った。
【１０２７】
片対数グラフ中に標準の平均吸光度を標準の理論上のＨＣＰ濃度に対してプロットして、以下の式に基づいて４パラメータロジスティック（４ＰＬ）当てはめ曲線を作成した：
Ｙ＝［（Ａ−Ｄ）／（１＋（Ｘ／Ｃ）＾Ｂ）］＋Ｄ
式中、Ａは下方漸近線であり、Ｂはヒル勾配であり、Ｃは２つの漸近線間の中点吸光度値に対応する濃度（ｎｇ／ｍＬ）であり、Ｄは上方漸近線であり、Ｘはサンプル濃度（ｎｇ／ｍＬ）であり、且つＹは吸光度である。次にこの検量線を用いることにより、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェアを使用してスパイクありサンプル対照及びスパイクなし試験サンプルのＨＣＰ濃度を決定した。この試験は、検量線のｒ２が≧０．９８であり、２００ｎｇ／ｍＬ標準の平均補正後吸光度が≧１．０ＯＤであり、０ｎｇ／ｍＬ標準の平均補正後吸光度が≦０．２ＯＤであり、且つ３ウェルレプリケートにわたる補正後吸光度の変動係数が≦１５％であった場合に限り受け入れるものとした。各サンプルのＨＣＰ最終濃度は、以下の式を用いて計算した：
ＨＣＰ濃度サンプル（ｎｇ／ｍＬ）＝希釈係数×平均ＨＣＰ濃度計測値（ｎｇ／ｍＬ）。
【１０２８】
結果
ＥＬＩＳＡによって測定された残留宿主細胞タンパク質は、先行ベクターバッチ、ＡＶＸＳ−１０１ロット６００１５６、ＡＶＸＳ１−１０１ロット６００３０７及びＡＶＸＳ−２０１  ＤＳについて定量限界（８ｎｇ／ｍＬ）未満であった。
【１０２９】
実施例２８：ＥＬＩＳＡによるＡＡＶ９ウイルスベクター中の残留ベンゾナーゼの測定
方法
市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを使用して、ＡＡＶ産物、例えばＡＶＸＳ−１０１中の残留ベンゾナーゼ濃度を測定した。ＭｅｒｃｋベンゾナーゼエンドヌクレアーゼＥＬＩＳＡキットＩＩは、固相２部位酵素イムノアッセイである。これは直接サンドイッチ法に基づくものであり、２つのポリクローナル抗体がベンゾナーゼの別個の抗原決定基に対して向けられる。インキュベーションの間に、サンプル中のベンゾナーゼが、マイクロプレートウェルに結合した抗ベンゾナーゼ抗体及び溶液中のペルオキシダーゼコンジュゲート抗ベンゾナーゼ抗体と結合した。
【１０３０】
インキュベーション期間後、ウェルを洗浄して全ての未結合の酵素コンジュゲート抗体を除去した。次にウェルに３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液を加えた。結合したペルオキシダーゼコンジュゲートが基質の色変化反応を触媒した。酸を加えることによりこの反応を停止させると、４５０ｎｍで分光光度法により読み取ることのできる比色エンドポイントが得られた。加水分解された基質の量は、存在するベンゾナーゼの濃度に正比例する。
【１０３１】
簡潔に言えば、１７５μＬのサンプルを１７５μＬのＰＢＳＴと合わせることにより、サンプルを２倍希釈した。並行して、１７５μＬのサンプルを３５μＬの１０ｎｇ／ｍＬベンゾナーゼ標準及び１４０μＬのＰＢＳＴと合わせることにより、ベンゾナーゼでスパイクしたサンプル対照も調製した。キットからのプレコートしたＥＬＩＳＡストリップをストリップ支持体にマウントし、各ウェルにつき１００μＬの各試験混合物をロードした。ブランクについては、サンプルの代わりに１００μＬのＰＢＳＴをロードした。各条件はトリプリケートでロードした。プレートを密封し、プレートシェーカー（４５０ｒｐｍ）で撹拌しながら室温で２時間±５分インキュベートした。インキュベーション後、内容物を廃棄し、イムノウォッシャーを使用して約３５０μＬのＰＢＳＴを加えることによりプレートを洗浄し、１分間インキュベートし、次に逆さにして吸収性タオルに載せて軽く叩いた。合計３回の洗浄を実施した後、各ウェルに１００μＬの希釈ＨＲＰコンジュゲート抗体を加えた。プレートを密封し、プレートシェーカー（４５０ｒｐｍ）で撹拌しながら室温で１時間±５分インキュベートした。インキュベーション後、内容物を廃棄し、イムノウォッシャーを使用して約３５０μＬのＰＢＳＴを加えることによりプレートを洗浄し、１分間インキュベートし、次に逆さにして吸収性タオルに載せて軽く叩いた。合計３回の洗浄を実施した後、各ウェルに１００μＬのＴＭＢ基質を加えた。プレートを密封し、内容物を暗所下で撹拌なしに室温で１５〜４０分間インキュベートした。各ウェルに１００μＬの０．２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４停止液を加えることにより反応を停止させた。停止液を加えてから４５分以内に分光光度計を使用して４５０ｎｍでプレートの吸光度を測定した。
【１０３２】
片対数グラフ中に標準の平均吸光度を標準の理論上のベンゾナーゼ濃度に対してプロットして、以下の式に基づいて４パラメータロジスティック（４ＰＬ）当てはめ曲線を作成した：
Ｙ＝［（Ａ−Ｄ）／（１＋（Ｘ／Ｃ）＾Ｂ）］＋Ｄ
式中、Ａは下方漸近線であり、Ｂはヒル勾配であり、Ｃは２つの漸近線間の中点吸光度値に対応する濃度（ｎｇ／ｍＬ）であり、Ｄは上方漸近線であり、Ｘはサンプル濃度（ｎｇ／ｍＬ）であり、且つＹは吸光度である。次にこの検量線を用いることにより、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェアを使用してスパイクありサンプル対照及びスパイクなし試験サンプルのＨＣＰ濃度を決定した。この試験は、検量線のｒ２が≧０．９８であり、２．５ｎｇ／ｍＬ標準の平均補正後吸光度が≧１．０ＯＤであり、０．１０ｎｇ／ｍＬ標準の平均補正後吸光度がＰＢＳＴブランクの平均ＯＤよりも高く、且つ３ウェルレプリケートにわたる補正後吸光度の変動係数が≦１５％であった場合に限り受け入れるものとした。各サンプルのＨＣＰ最終濃度は、以下の式を用いて計算した：
ベンゾナーゼ濃度サンプル（ｎｇ／ｍＬ）＝希釈係数×平均ベンゾナーゼ濃度測定値（ｎｇ／ｍＬ）。
【１０３３】
結果
ＥＬＩＳＡによって測定された残留ベンゾナーゼ濃度は、先行ベクターバッチ、ＡＶＸＳ−１０１ロット６００１５６及びＡＶＸＳ１−１０１ロット６００３０７について定量限界（０．２ｎｇ／ｍＬ）未満であった。
【１０３４】
実施例２９：マイクロＢＣＡアッセイによるＡＡＶ９ウイルスベクター中のタンパク質濃度の測定
方法
２ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２３２０９）参照タンパク質標準及びマイクロＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２３２３５）を使用して、例えばＡＶＸＳ−１０１の、工程間、原薬及び薬物製品サンプル中のタンパク質の量をマイクロＢＣＡプレートアッセイにより測定した。このアッセイは、全タンパク質の比色検出及び定量化のためのデタージェント適合性ビシンコニン酸（ＢＣＡ）製剤に基づく。ＢＣＡは、アルカリ性環境でタンパク質によってＣｕ２＋が減少すると形成されるＣｕ１＋を検出する。ＢＣＡの２つの分子が１つの第一銅イオン（Ｃｕ１＋）とキレート化することにより紫色呈色反応産物が形成され、これは５６２ｎｍで、タンパク質濃度の増加と線形関係にある強い吸光度を呈する。
【１０３５】
簡潔に言えば、希釈剤（２０倍希釈の製剤緩衝液、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００１％ｗ／ｖ  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８、ｐＨ８．０）に２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡの段階希釈を実施することにより標準を調製した。ＡＶＸＳ−１０１の試験サンプルも水に２０倍希釈し、希釈剤中に段階希釈物を作製した。目標濃度は約７．５μｇ／ｍＬである。キットからの２５部のマイクロＢＣＡ試薬Ａ、２４部の試薬Ｂ及び１部の試薬Ｃを混合することにより、ワーキング試薬（ＷＲ）を調製した。１５０μＬの各標準及び試験サンプルを９６ウェルプレートにトリプリケートでロードし、１５０μＬのＷＲと混合した。プレートを密封し、プレートシェーカー上で３０秒間、３００ｒｐｍで振盪した。次にプレートを振盪なしに３７℃±２℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを１０００ｒｐｍで２分間遠心して凝縮物を収集し、インキュベーション後にプレートを１５〜６０分間冷却した。プレートをプレートリーダーにおいて５６２ｎｍで読み取り、データをＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏで分析した。
【１０３６】
標準の平均吸光度と標準の理論上のタンパク質濃度を片対数プロットでプロットし、二次式の当てはめを作成した。二次式の当てはめは、以下の式に基づく：
Ｙ＝Ａ＋Ｂｘ＋Ｃｘ２
式中、Ａ、Ｂ、Ｃは曲線当てはめパラメータであり、ｘはサンプル濃度、μｇ／ｍＬ単位であり、且つＹは吸光度、ＯＤ単位である。この試験は、検量線のｒ２が≧０．９８であり、ブランクの平均吸光度が最も低い標準（１μｇ／ｍＬ）の平均吸光度未満であり、各標準の３ウェルレプリケートにわたる吸光度の変動係数が≦１０％であった場合に限り受け入れるものとした。次にこの検量線を用いて、試験サンプル中のタンパク質濃度を決定した。最終的なタンパク質濃度は、以下の式を用いて計算した：
全タンパク質濃度（μｇ／ｍＬ）＝希釈係数×平均タンパク質濃度計測値（μｇ／ｍＬ）。
【１０３７】
結果
マイクロＢＣＡによって測定された全タンパク質濃度は、先行ベクターバッチについて１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり１６７μｇ／ｍＬ、ＡＶＸＳ−１０１ロット６００１５６について１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり１７９μｇ／ｍＬ及びＡＶＸＳ１−１０１ロット６００３０７について１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり１７６μｇ／ｍＬであった。
【１０３８】
実施例３０：ＡＶＸＳ−１０１（ＡＡＶ９−ＳＭＮ１）の純度及び出荷規格
実施例１〜４からのＡＶＸＳ−１０１原薬及びＡＶＸＳ−１０１薬物製品を純度に関して試験した。表７８及び表７９は、これらの製品の規格及び出荷判定基準を示す。
【１０３９】
【表８３】
2021526806.tif 000138
【１０４０】
【表８４】
2021526806.tif 000139
【１０４１】
【表８５】
2021526806.tif 000140
【１０４２】
添付の図面を参照しながら本発明の実施形態を説明したが、本発明は詳細な実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲に定義されるとおりの本発明の範囲又は趣旨から逸脱することなく当業者によってそれらに様々な変更及び修正がなされ得ることが理解されるべきである。
【図１】
2021526806.tif 000141
【図２】
2021526806.tif 000142
【図３】
2021526806.tif 000143
【図４】
2021526806.tif 000144
【図５−１】
2021526806.tif 000145
【図５−２】
2021526806.tif 000146
【図６】
2021526806.tif 000147
【図７】
2021526806.tif 000148
【図８−１】
2021526806.tif 000149
【図８−２】
2021526806.tif 000150
【図９−１】
2021526806.tif 000151
【図９−２】
2021526806.tif 000152
【図１０】
2021526806.tif 000153
【図１１】
2021526806.tif 000154
【図１２】
2021526806.tif 000155
【図１３】
2021526806.tif 000156
【図１４】
2021526806.tif 000157
【図１５−１】
2021526806.tif 000158
【図１５−２】
2021526806.tif 000159
【図１５−３】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
2021526806.tif 000163
【図１８】
2021526806.tif 000164
【図１９】
2021526806.tif 000165
【図２０−１】
2021526806.tif 000166
【図２０−２】
2021526806.tif 000167
【図２１】
2021526806.tif 000168
【図２２】
2021526806.tif 000169
【図２３】
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【図２４】
2021526806.tif 000171
【図２５】
2021526806.tif 000172
【図２６−１】
2021526806.tif 000173
【図２６−２】
2021526806.tif 000174
【図２６−３】
2021526806.tif 000175
【図２７】
2021526806.tif 000176
【図２８】
2021526806.tif 000177
【図２９】
2021526806.tif 000178
【図３０】
2021526806.tif 000179
【図３１】
2021526806.tif 000180
【図３２】
2021526806.tif 000181
【図３３】
2021526806.tif 000182
【図３４−１】
2021526806.tif 000183
【図３４−２】
2021526806.tif 000184
【図３４−３】
2021526806.tif 000185
【図３４−４】
2021526806.tif 000186
【図３４−５】
2021526806.tif 000187
【図３５】
2021526806.tif 000188
【図３６】
2021526806.tif 000189
【図３７−１】
2021526806.tif 000190
【図３７−２】
2021526806.tif 000191
【図３８】
2021526806.tif 000192
【図３９−１】
2021526806.tif 000193
【図３９−２】
2021526806.tif 000194
【図３９−３】
2021526806.tif 000195
【図３９−４】
2021526806.tif 000196
【図３９−５】
2021526806.tif 000197
【図４０−１】
2021526806.tif 000198
【図４０−２】
2021526806.tif 000199
【図４１】
2021526806.tif 000200
【図４２−１】
2021526806.tif 000201
【図４２−２】
2021526806.tif 000202
【図４３】
2021526806.tif 000203
【図４４】
2021526806.tif 000204
【図４５】
2021526806.tif 000205
【図４６】
2021526806.tif 000206
【図４７】
2021526806.tif 000207
【図４８】
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【配列表】
2021526806000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年2月9日(2021.2.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランス遺伝子発現を測定する方法であって、
ａ）第１の複数の最終分化神経前駆細胞（ＮＰＣ）を提供すること；
ｂ）目的タンパク質をコードする配列を含むウイルスベクターを含む試験サンプルで前記第１の複数の最終分化ＮＰＣを形質導入すること；
ｃ）前記形質導入された第１の複数の最終分化ＮＰＣを、前記目的タンパク質を発現させるのに十分な条件下でインキュベートすること；
ｄ）（ｃ）からの前記第１の複数の最終分化ＮＰＣを、前記目的タンパク質に特異的な分子に接触させること；
ｅ）前記第１の複数の最終分化ＮＰＣをイメージングして、１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）アッセイリードアウトを入手すること；及び
ｆ）前記ＩＦＩ−Ｃリードアウトに基づいて前記目的タンパク質の発現を決定すること
を含む方法。
【請求項２】
前記第１の複数の最終分化ＮＰＣは、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）−／−突然変異に関してホモ接合である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インキュベートするステップｃ）後、前記第１の複数の最終分化ＮＰＣを固定及び透過処理することが続く、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ｇ）第２の複数の最終分化ＮＰＣを提供すること；
ｈ）前記ウイルスベクターを含む参照標準品で前記第２の複数の最終分化ＮＰＣを形質導入すること；
ｉ）前記形質導入された第２の複数の最終分化ＮＰＣを、前記目的タンパク質を発現させるのに十分な条件下でインキュベートすること；
ｊ）（ｉ）からの前記第２の複数の最終分化ＮＰＣを、前記目的タンパク質に特異的な分子に接触させること；
ｋ）前記第２の複数の最終分化ＮＰＣをイメージングして、１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）アッセイリードアウトを入手すること；及び
ｌ）前記第１の複数の最終分化ＮＰＣのＩＦＩ−Ｃを前記第２の複数の最終分化ＮＰＣのＩＦＩ−Ｃと比較すること
を含み、それにより、前記参照標準品と比べた前記試験サンプルの前記ウイルスベクターの相対効力を決定する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の複数の最終分化ＮＰＣは、ＳＭＮ１−／−突然変異に関してホモ接合である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記インキュベートするステップ（ｉ）後、前記第２の複数の最終分化ＮＰＣを固定及び透過処理することが続く、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記第１及び第２の複数の最終分化ＮＰＣは、ＳＭＮ１−／−マウス胚の皮質から単離された神経前駆細胞を最終分化させることによって作製される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記神経前駆細胞（ＮＰＣ）は、
ａ．上皮成長因子（ＥＧＦ）と線維芽細胞成長因子−塩基性（ｂＦＧＦ）とを含有する無血清培養培地で前記ＮＰＣを培養してニューロスフェアを形成すること；
ｂ．前記ニューロスフェアを解離させて解離ＮＰＣを作製すること；及び
ｃ．成長因子なしの高血清培地で前記解離ＮＰＣを培養すること
によって最終分化され、それにより最終分化ＮＰＣを作製している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１及び第２の複数の細胞は、前記試験サンプル及び前記参照標準品により、前記ウイルスベクターの少なくとも２つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１及び第２の複数の細胞は、１細胞当たり３００，０００、１５０，０００、７５，０００、３７，５００、１８，７５０個のウイルス粒子を含む、５つのＭＯＩで前記試験サンプル及び参照標準品中により形質導入される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記比較するステップ（ｌ）は、前記試験サンプル及び前記参照標準品の各々についてＭＯＩ対ＩＦＩ−Ｃの検量線をプロットすることを含む、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記比較するステップ（ｌ）は、前記試験サンプル及び前記参照標準品の各々について対数ＭＯＩ対ＩＦＩ−Ｃの線形回帰を計算し、それにより試験サンプルの傾き及び参照標準品の傾きを導き出すことを含む、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ウイルスベクターの前記相対効力を決定することは、平行線分析（ＰＬＡ）によって実施され、前記ＰＬＡは、前記参照標準品の傾きに対する前記試験サンプルの傾きの傾き比を測定することを含む、請求項４〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記参照標準品の傾きは、１．０２Ｅ＋０５以上であり、前記傾き比は、０．６９〜１．４５である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記参照標準品のアッセイダイナミックウィンドウを計算することを含み、前記アッセイダイナミックウィンドウは、２．６９以上である、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記目的タンパク質は、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）タンパク質である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルスベクターは、ＡＡＶ血清型２型逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含むアデノ随伴ウイルス血清型９型（ＡＡＶ９）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ウイルスベクターは、前記ＳＭＮ１タンパク質をコードする前記配列に作動可能に連結されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／ニワトリβ−アクチンハイブリッドプロモーター（ＣＢ）をコードする配列を含む、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ウイルスベクターは、配列番号１の配列を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＩＦＩ−Ｃリードアウトは、タンパク質発現の測定値を反映する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記目的タンパク質に特異的な前記分子は、抗体、抗体断片又はアプタマーを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗目的タンパク質抗体は、約４μｇ／ｍＬの濃度で提供される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記分子は、検出可能標識を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記最終分化ＮＰＣを、前記目的タンパク質に特異的な前記分子を特異的に認識する第２の分子に接触させることを更に含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２の分子は、検出可能標識を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２の分子は、抗体、抗体断片又はアプタマーを含む、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記最終分化ＮＰＣは、前記固定及び透過処理するステップ後、抗核検出可能標識に接触される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記最終分化ＮＰＣは、固体表面上にある、請求項１〜２７いずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ａ．ウイルスベクターで形質導入される能力を有する複数の細胞；
ｂ．目的タンパク質をコードするウイルスベクター；
ｃ．前記目的タンパク質と結合する能力を有する第１の分子；
ｄ．前記第１の分子と結合する能力を有する第２の分子であって、検出可能標識を含む第２の分子；及び
ｅ．イメージングアッセイにおける使用に関する説明書
を含むキット。
【請求項３０】
トランス遺伝子を含むウイルスベクターを含む医薬組成物を作製する方法であって、
ａ．前記トランス遺伝子を含む前記ウイルスベクターを作製すること；
ｂ．請求項１〜２８のいずれか一項に記載のトランス遺伝子を測定する方法により、前記ウイルスベクターをアッセイすること；及び
ｃ．前記トランス遺伝子を含む前記ウイルスベクターを医薬組成物に製剤化すること
を含む方法。
【請求項３１】
前記医薬組成物は、
ａ．１〜８×１０１３ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）；
ｂ．約７％未満の空のウイルスカプシド；
ｃ．１×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約１００ｎｇ／ｍＬ未満の宿主細胞タンパク質；
ｄ．１×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約５×１０６ｐｇ／ｍＬ未満の残留宿主細胞ＤＮＡ
を含み、前記１〜８×１０１３ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬの少なくとも約８０％は、機能性である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記医薬製剤は、
ａ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．０９ｎｇ未満のベンゾナーゼ、
ｂ．約３０μｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満のセシウム、
ｃ．約２０〜８０ｐｐｍのポロキサマー１８８、
ｄ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．２２ｎｇ未満のＢＳＡ、
ｅ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約６．８×１０５ｐｇ未満の残留プラスミドＤＮＡ、
ｆ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約１．１×１０５ｐｇ未満の残留ｈｃＤＮＡ、
ｇ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約４ｎｇ未満のｒＨＣＰ、
ｈ．約ｐＨ７．７〜８．３、
ｉ．約３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、
ｊ．１容器当たり約６００個未満の、≧２５μｍのサイズの粒子、
ｋ．１容器当たり約６０００個未満の、≧１０μｍのサイズの粒子、
ｌ．約１．７×１０１３〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価、
ｍ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約３．９×１０８〜８．４×１０１０ＩＵの感染力価、
ｎ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約１００〜３００μｇの全タンパク質、
ｏ．約７０〜１３０％の相対効力、及び
ｐ．約５％未満の空のカプシド
の少なくとも１つを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記医薬製剤は、
ａ．約ｐＨ７．７〜８．３、
ｂ．約３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、
ｃ．１容器当たり約６００個未満の、≧２５μｍのサイズの粒子、
ｄ．１容器当たり約６０００個未満の、≧１０μｍのサイズの粒子、
ｅ．約１．７×１０１３〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価、
ｆ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約３．９×１０８〜８．４×１０１０ＩＵの感染力価、
ｇ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約１００〜３００μｇの全タンパク質、
ｈ．約２０〜８０ｐｐｍのＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８含有量、
ｉ．約７０〜１３０％の相対効力、
ｊ．７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で２４日以上のΔ７ＳＭＮマウスモデルにおける生存期間中央値、
ｋ．約５％未満の空のカプシド、及び
ｌ．約９５％以上の総純度、並びに
ｍ．約０．７５ＥＵ／ｍＬ以下のエンドトキシン
の少なくとも１つを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
トランス遺伝子を含むウイルスベクターを含む療法を用いて、治療を、それを必要としている患者に行う方法であって、
ａ．請求項１〜２８のいずれか一項に記載のトランス遺伝子発現を測定する方法により、トランス遺伝子を含む前記ウイルスベクターをアッセイすること；及び
ｂ．トランス遺伝子を含む前記ウイルスベクターを前記患者に投与すること
を含む方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８６３】
実施例１４：インビボ効力アッセイ
薬物を、定量的インビボアッセイを用いて測定した。このアッセイでは、確立されたＳＭＡ疾患マウスモデルを使用した。つがいのＳＭＡΔ７マウス系統（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃００５０２５）は、表現型は正常であるが、その子孫の約２５％が、標的となるＳＭＮ遺伝子突然変異に関してホモ接合であり、ＳＭＡ様表現型を示す。これらのマウスは５日目までに筋脱力の徴候を示し、その翌週には歩行異常を生じて転び易くなる。Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓは、ＳＭＡ様表現型を有する動物の平均生存期間を約１５±２日と報告している。パイロット試験では、ＳＭＡ様表現型を有する未治療の動物について１６．３日の生存期間中央値が実証された（幾何平均；ｎ＝３試験；試験当たり１０匹のマウス）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８６６】
本試験では、先行ベクターバッチ（以下、先行バッチ）を使用して、０．９％生理食塩水を使用した０（ゼロ）用量（未治療群）を含む５つの異なる用量レベルで薬物製品を投与したときのＳＭＡΔ７マウスの生存期間中央値（日）の間の線形相関を決定した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８６７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８６８】
先行バッチ参照標準品の線形回帰曲線を薬物製品バッチ８１６８３６の線形回帰曲線と比較することにより、薬物製品バッチ８１６８３６の相対効力を確立した。これは、各線形回帰線（即ち参照標準品及び試験物質）のｙ切片及び傾きの比を用いることにより達成された。パーセント相対効力計算は、以下の式（１）に記述される：
％ＲＰ＝［（試験物質のｙ切片／傾き）÷（参照標準品のｙ切片／傾き）］×１００（１）
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８７０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８７１】
Δ７マウスモデルを使用して、薬物製品を含めたＳＭＡ療法の有効性を実証した。未処置の又は生理食塩水で処置した対照動物は信頼できるベースライン対照を提供し、それからの生存期間中央値の増加として製品効力を測定することができる。薬物製品による開発作業では、投与用量（ｖｇ／ｋｇ）を対数変換して、治療されたＳＭＡΔ７新生仔マウスの生存期間中央値（日数単位）に対してプロットしたとき線形相関でマウスモデルの生存に影響を及ぼすドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いたゲノム力価によって決定される３つの用量（媒体治療用量を除く）が同定された。低力価、中間力価及び高力価標準については、表５６の標準力価（ｖｇ／ｍＬ）を参照されたい。加えて、検量線ゼロ点並びに陰性対照の両方にＴＦＦ緩衝液（媒体）溶液が使用される。≧４０日の生存期間を実証する用量（生存期間中央値の倍増を実証する用量より高い）も陽性対照として含めた。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８７８】
参照標準品の用量反応曲線の許容限界
投与用量（ｖｇ／ｍＬ）に対して生存期間中央値（日）をプロットする参照標準品の線形用量反応曲線について、アッセイ適合性判定基準が決定されることになる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８７９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９２６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９３９】
第１相臨床試験に使用したＡＶＸＳ−１０１に関して同等性試験を完了した。評価は、ネーションワイド小児（Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ）で製造された第１相臨床薬物製品ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３及びＡｖｅＸｉｓで製造されたＡＶＸＳ−１０１薬物製品ロット６００１５６を使用して実施した。加えて、工程Ｂロット６００１５６及び６００３０７を使用して製造の一貫性を判定した。同等性評価（工程Ａ対工程Ｂ）及び製造の一貫性（工程Ｂロット６００１５６対６００３０７）の両方について、本試験では、新規改良された工程及び分析的方法を用いてＡＶＸＳ−１０１臨床試験材料のアイデンティティ、品質、純度を判定し、同等性及び製造の一貫性のロバストな評価を可能にした。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９４０】
定量的品質特性に関して統計的分析を実施した。比較は工程ＡロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３と工程Ｂロット６００１５６との間においてペアワイズで実施した。工程Ａと比べて工程Ｂの方が、より高純度でより多量のウイルスベクターを産生した良好な方法であった。例えば、工程Ａと比較したとき、工程Ｂによって産生されたウイルスベクターは、感染力価が高く、ゲノム力価（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｔｉｅｒ）が８％高く、１０μｍ径超のサブビジブル粒子が９２％少なく、２５μｍ径超のサブビジブル粒子が５０％少なく、空のカプシドが１００％少なく、且つ残留ｈｃＤＮＡが１１％少なかった。結果は、全て各品質特性の試験限界と比べて一貫性があった。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０４２】
添付の図面を参照しながら本発明の実施形態を説明したが、本発明は詳細な実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲に定義されるとおりの本発明の範囲又は趣旨から逸脱することなく当業者によってそれらに様々な変更及び修正がなされ得ることが理解されるべきである。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．トランス遺伝子発現を測定する方法であって、
ａ）第１の複数の最終分化神経前駆細胞（ＮＰＣ）を提供すること；
ｂ）目的タンパク質をコードする配列を含むウイルスベクターを含む試験サンプルで前記第１の複数の最終分化ＮＰＣを形質導入すること；
ｃ）前記形質導入された第１の複数の最終分化ＮＰＣを、前記目的タンパク質を発現させるのに十分な条件下でインキュベートすること；
ｄ）（ｃ）からの前記第１の複数の最終分化ＮＰＣを、前記目的タンパク質に特異的な分子に接触させること；
ｅ）前記第１の複数の最終分化ＮＰＣをイメージングして、１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）アッセイリードアウトを入手すること；及び
ｆ）前記ＩＦＩ−Ｃリードアウトに基づいて前記目的タンパク質の発現を決定すること
を含む方法。
２．前記第１の複数の最終分化ＮＰＣは、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）−／−突然変異に関してホモ接合である、上記１に記載の方法。
３．前記ＳＭＮ１−／−突然変異は、ＳＭＮ１エクソン７の欠失（Δ７）を含む、上記２に記載の方法。
４．前記インキュベートするステップｃ）後、前記第１の複数の最終分化ＮＰＣを固定及び透過処理することが続く、上記１〜３のいずれかに記載の方法。
５．ｇ）第２の複数の最終分化ＮＰＣを提供すること；
ｈ）前記ウイルスベクターを含む参照標準品で前記第２の複数の最終分化ＮＰＣを形質導入すること；
ｉ）前記形質導入された第２の複数の最終分化ＮＰＣを、前記目的タンパク質を発現させるのに十分な条件下でインキュベートすること；
ｊ）（ｉ）からの前記第２の複数の最終分化ＮＰＣを、前記目的タンパク質に特異的な分子に接触させること；
ｋ）前記第２の複数の最終分化ＮＰＣをイメージングして、１細胞当たりの積分蛍光強度（ＩＦＩ−Ｃ）アッセイリードアウトを入手すること；及び
ｌ）前記第１の複数の最終分化ＮＰＣのＩＦＩ−Ｃを前記第２の複数の最終分化ＮＰＣのＩＦＩ−Ｃと比較すること
を含み、それにより、前記参照標準品と比べた前記試験サンプルの前記ウイルスベクターの相対効力を決定する、上記１〜４のいずれかに記載の方法。
６．前記第２の複数の最終分化ＮＰＣは、ＳＭＮ１−／−突然変異に関してホモ接合である、上記５に記載の方法。
７．前記ＳＭＮ１−／−突然変異は、ＳＭＮ１エクソン７の欠失（Δ７）を含む、上記６に記載の方法。
８．前記インキュベートするステップ（ｉ）後、前記第２の複数の最終分化ＮＰＣを固定及び透過処理することが続く、上記４又は５に記載の方法。
９．前記第１及び第２の複数の最終分化ＮＰＣは、ＳＭＮ１−／−マウス胚の皮質から単離された神経前駆細胞を最終分化させることによって作製される、上記１〜８のいずれかに記載の方法。
１０．前記神経前駆細胞（ＮＰＣ）は、
ａ．上皮成長因子（ＥＧＦ）と線維芽細胞成長因子−塩基性（ｂＦＧＦ）とを含有する無血清培養培地で前記ＮＰＣを培養してニューロスフェアを形成すること；
ｂ．前記ニューロスフェアを解離させて解離ＮＰＣを作製すること；及び
ｃ．成長因子なしの高血清培地で前記解離ＮＰＣを培養すること
によって最終分化され、それにより最終分化ＮＰＣを作製している、上記９に記載の方法。
１１．前記第１及び第２の複数の細胞は、前記試験サンプル及び前記参照標準品により、前記ウイルスベクターの少なくとも２つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入される、上記１〜１０のいずれかに記載の方法。
１２．前記第１及び第２の複数の細胞は、前記試験サンプル及び参照標準品中の前記ウイルスベクターの５つの異なるＭＯＩで形質導入される、上記１１に記載の方法。
１３．前記５つのＭＯＩは、１細胞当たり３００，０００、１５０，０００、７５，０００、３７，５００、１８，７５０個のウイルス粒子を含む、上記１２に記載の方法。
１４．前記比較するステップ（ｌ）は、前記試験サンプル及び前記参照標準品の各々についてＭＯＩ対ＩＦＩ−Ｃの検量線をプロットすることを含む、上記５〜１３のいずれかに記載の方法。
１５．前記比較するステップ（ｌ）は、前記試験サンプル及び前記参照標準品の各々について対数ＭＯＩ対ＩＦＩ−Ｃの線形回帰を計算し、それにより試験サンプルの傾き及び参照標準品の傾きを導き出すことを含む、上記５〜１４のいずれかに記載の方法。
１６．前記ウイルスベクターの前記相対効力を決定することは、平行線分析（ＰＬＡ）によって実施され、前記ＰＬＡは、前記参照標準品の傾きに対する前記試験サンプルの傾きの傾き比を測定することを含む、上記５〜１５のいずれかに記載の方法。
１７．前記参照標準品の傾きは、１．０２Ｅ＋０５以上である、上記１６に記載の方法。
１８．前記傾き比は、０．６９〜１．４５である、上記１６又は１７に記載の方法。
１９．前記傾き比は、０．７５〜１．３３である、上記１６又は１７に記載の方法。
２０．前記サンプルの前記線形回帰の変動係数を計算することを含む、上記１６〜１９のいずれかに記載の方法。
２１．前記変動係数は、１５．６％〜２９．５％である、上記２０に記載の方法。
２２．前記変動係数は、４０％以下、３０％以下又は２０％以下である、上記２０に記載の方法。
２３．前記試験サンプル及び前記参照標準品の前記線形回帰についてＲ２値を計算することを含む、上記１６〜２２のいずれかに記載の方法。
２４．前記試験サンプル及び前記参照標準品についての前記Ｒ２値は、０．９５以上である、上記２３に記載の方法。
２５．前記参照標準品のアッセイダイナミックウィンドウを計算することを含む、上記１６〜２４のいずれかに記載の方法。
２６．前記アッセイダイナミックウィンドウは、２．６９以上である、上記２５に記載の方法。
２７．前記目的タンパク質は、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）タンパク質である、上記１〜２６のいずれかに記載の方法。
２８．前記ＳＭＮ１タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含む、上記２７に記載の方法。
２９．前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス血清型９型（ＡＡＶ９）である、上記２７又は２８に記載の方法。
３０．前記ウイルスベクターは、前記ＳＭＮ１タンパク質をコードする前記配列に作動可能に連結されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／ニワトリβ−アクチンハイブリッドプロモーター（ＣＢ）をコードする配列を含む、上記２７〜２９のいずれかに記載の方法。
３１．前記ウイルスベクターは、ＡＡＶ血清型２型（ＡＡＶ２）ＤＮＡ由来のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む、上記２７〜３０のいずれかに記載の方法。
３２．前記ウイルスベクターは、配列番号１の配列を含む、上記２７〜３１のいずれかに記載の方法。
３３．前記細胞は、前記ウイルスベクターによる形質導入前に８〜１５回継代される、上記１〜３２のいずれかに記載の方法。
３４．前記ＩＦＩ−Ｃリードアウトは、タンパク質発現の測定値を反映する、上記１〜３３のいずれかに記載の方法。
３５．形質導入後に前記最終分化ＮＰＣをインキュベートする前記ステップは、約６９〜７５時間にわたって実施される、上記１〜３４のいずれかに記載の方法。
３６．前記目的タンパク質に特異的な前記分子は、抗体、抗体断片又はアプタマーを含む、上記１〜３５のいずれかに記載の方法。
３７．前記抗体は、前記目的タンパク質に特異的な抗体を含む、上記３６に記載の方法。
３８．前記抗目的タンパク質抗体は、約４μｇ／ｍＬの濃度で提供される、上記３７に記載の方法。
３９．前記抗目的タンパク質抗体は、約２μｇ／ｍＬの濃度で提供される、上記３７に記載の方法。
４０．前記分子は、検出可能標識を含む、上記１〜３９のいずれかに記載の方法。
４１．前記最終分化ＮＰＣを洗浄して、前記目的タンパク質に特異的な前記分子を取り出すことを更に含む、上記１〜４０のいずれかに記載の方法。
４２．前記最終分化ＮＰＣを、前記目的タンパク質に特異的な前記分子を特異的に認識する第２の分子に接触させることを更に含む、上記１〜３８のいずれかに記載の方法。
４３．前記第２の分子は、検出可能標識を含む、上記４２に記載の方法。
４４．前記第２の分子は、抗体、抗体断片又はアプタマーを含む、上記４２又は４３に記載の方法。
４５．前記最終分化ＮＰＣは、前記固定及び透過処理するステップ後、抗核検出可能標識に接触される、上記１〜４４のいずれかに記載の方法。
４６．前記最終分化ＮＰＣは、固体表面上にある、上記１〜４５のいずれかに記載の方法。
４７．前記固体表面は、ポリ−Ｄ−リジンでコートされている、上記４６に記載の方法。
４８．前記最終分化ＮＰＣは、２０，０００細胞／ウェルの密度で播種される、上記４６又は４７に記載の方法。
４９．前記目的タンパク質のレベルの用量依存的増加の定量的測定を可能にする、上記１〜４８のいずれかに記載の方法。
５０．ａ．ウイルスベクターで形質導入される能力を有する複数の細胞；
ｂ．目的タンパク質をコードするウイルスベクター；
ｃ．前記目的タンパク質と結合する能力を有する第１の分子；
ｄ．前記第１の分子と結合する能力を有する第２の分子であって、検出可能標識を含む第２の分子；及び
ｅ．イメージングアッセイにおける使用に関する説明書
を含むキット。
５１．前記複数の細胞は、神経前駆細胞（ＮＰＣ）を含む、上記５０に記載のキット。
５２．前記ＮＰＣは、ＳＭＮ１−／−突然変異に関してホモ接合である、上記５１に記載のキット。
５３．前記ＳＭＮ１−／−突然変異は、エクソン７の欠失（Δ７）である、上記５１に記載のキット。
５４．前記ウイルスベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／ニワトリβ−アクチンハイブリッドプロモーター（ＣＢ）の制御下でＳＭＮ１タンパク質を発現するｃＤＮＡと、ＡＡＶ血清型２型（ＡＡＶ２）ＤＮＡ由来の２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）とを含むアデノ随伴ウイルス血清型９型（ＡＡＶ９）である、上記５０〜５３のいずれかに記載のキット。
５５．前記第１の分子は、抗ＳＭＮ１抗体を含む、上記５０〜５４のいずれかに記載のキット。
５６．前記第２の分子は、前記第１の分子に特異的な抗体を含む、上記５０〜５５のいずれかに記載のキット。
５７．前記第２の分子は、検出可能標識を含む、上記５６に記載のキット。
５８．前記目的タンパク質は、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）タンパク質である、上記５０〜５７のいずれかに記載のキット。
５９．トランス遺伝子を含むウイルスベクターを含む医薬組成物を作製する方法であって、
ａ．前記トランス遺伝子を含む前記ウイルスベクターを作製すること；
ｂ．上記１〜４９のいずれかに記載のトランス遺伝子を測定する方法により、前記ウイルスベクターをアッセイすること；及び
ｃ．前記トランス遺伝子を含む前記ウイルスベクターを医薬組成物に製剤化すること
を含む方法。
６０．前記ウイルスベクターを作製することは、
ａ．接着細胞を培養すること；
ｂ．前記接着細胞にプラスミドをトランスフェクトして、前記ＡＡＶウイルスベクターの産生を可能にすること；
ｃ．前記接着細胞を溶解させて前記ＡＡＶウイルスベクターを単離すること；
ｄ．（ｃ）の細胞ライセートを酸性化及び清澄化すること；
ｅ．（ｄ）の産物を、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いて精製すること；
ｆ．（ｅ）の産物を、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を用いてろ過すること；
ｇ．（ｆ）の産物を塩化セシウム（ＣｓＣｌ）緩衝液中で超遠心すること；及び
ｈ．（ｇ）の産物から前記ＡＡＶウイルスベクターを収集すること
を含む、上記５９に記載の方法。
６１．ＡＡＶは、ＡＡＶ９である、上記６０に記載の方法。
６２．前記ＡＡＶは、自己相補的（ｓｃＡＡＶ）である、上記６０又は６１に記載の方法。
６３．前記接着細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である、上記６０又は６１に記載の方法。
６４．前記接着細胞は、培養前に接着性に関して選択される、上記６０〜６３のいずれかに記載の方法。
６５．前記選択は、前記接着細胞を複数回継代培養して、接着性に関して選択することを含む、上記６０〜６４のいずれかに記載の方法。
６６．前記接着細胞は、培養用バイオリアクターに播種される、上記６０〜６５のいずれかに記載の方法。
６７．前記バイオリアクターは、細胞培養培地の連続循環を提供することができる大規模バイオリアクターである、上記６６に記載の方法。
６８．前記バイオリアクターは、２００ｍ２、３３３ｍ２又は５００ｍ２バイオリアクターである、上記６６又は６７に記載の方法。
６９．前記接着細胞は、再循環培地バッグ内の培地に加えられ、且つ前記バイオリアクターを通して循環される、上記６６〜６８のいずれかに記載の方法。
７０．前記細胞は、蠕動ポンプを用いて循環される、上記６９に記載の方法。
７１．蠕動ポンプ輸送は、前記接着細胞が培養用バイオリアクターに播種される間、継続される、上記７０に記載の方法。
７２．前記播種密度は、約８，０００〜１２，０００細胞／ｃｍ２である、上記７１に記載の方法。
７３．前記トランスフェクションステップは、前記再循環培地バッグにトランスフェクション培地を加え、且つ前記バイオリアクターを通して前記トランスフェクション培地を循環させることを含む、上記６０〜７２のいずれかに記載の方法。
７４．前記トランスフェクション培地は、蠕動ポンプを用いて循環される、上記７３に記載の方法。
７５．前記循環は、１５〜２５℃で行われる、上記７３又は７４に記載の方法。
７６．前記トランスフェクションステップは、前記接着細胞をアデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＨＥＬＰ）に接触させることを含む、上記６０〜７５のいずれかに記載の方法。
７７．前記トランスフェクションステップは、前記接着細胞を、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子をコードするプラスミドに接触させることを含む、上記６０〜７６のいずれかに記載の方法。
７８．前記トランスフェクションステップは、前記接着細胞を、ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドに接触させることを含む、上記６０〜７７のいずれかに記載の方法。
７９．前記トランスフェクションステップは、前記接着細胞を、同じプラスミド（ｐＡＡＶ）上にＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドに接触させることを含む、上記６０〜７８のいずれかに記載の方法。
８０．前記ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子は、ｒｅｐ２である、上記７７又は７９に記載の方法。
８１．前記ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子は、ｃａｐ９である、上記７８又は７９に記載の方法。
８２．前記トランスフェクションステップは、前記接着細胞をトランスフェクション剤ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に接触させることを含む、上記６０〜８１のいずれかに記載の方法。
８３．ＰＥＩと前記プラスミドの少なくとも１つとの比は、重量基準で１：１未満である、上記８２に記載の方法。
８４．ＰＥＩと前記プラスミドの少なくとも１つとの比は、重量基準で約１：１である、上記８２に記載の方法。
８５．前記トランスフェクションステップは、前記接着細胞を、血清を含有しないトランスフェクション培地に接触させることを含む、上記７３〜８４のいずれかに記載の方法。
８６．前記トランスフェクションステップは、前記接着細胞を、カルシウムを含有しないトランスフェクション培地に接触させることを含む、上記６０〜８５のいずれかに記載の方法。
８７．前記トランスフェクトするステップは、前記接着細胞を、グルタミンを含有しないトランスフェクション培地に接触させることを含む、上記６０〜８６のいずれかに記載の方法。
８８．前記トランスフェクトするステップは、１０〜６０分、１０〜３０分、２０〜３０分、１５〜３０分又は３０分未満にわたって実施される、上記６０〜８７のいずれかに記載の方法。
８９．前記溶解させるステップは、全細胞溶解を含む、上記６０〜８８のいずれかに記載の方法。
９０．前記溶解させるステップは、エンドヌクレアーゼを補足した溶解緩衝液を使用することを含む、上記６０〜８９のいずれかに記載の方法。
９１．前記エンドヌクレアーゼは、ベンゾナーゼである、上記９０に記載の方法。
９２．前記溶解させるステップは、ＴＷＥＥＮを補足した溶解緩衝液を使用することを含む、上記６０〜９１のいずれかに記載の方法。
９３．前記溶解させるステップは、１５〜２５℃で実施される、上記６０〜９２のいずれかに記載の方法。
９４．ステップ（ｃ）の前記細胞ライセートを（ｄ）の前記酸性化ステップ前に凍結することを更に含む、上記６０〜９３のいずれかに記載の方法。
９５．前記ＣｓＣｌ緩衝液は、２〜４Ｍ  ＣｓＣｌ緩衝液である、上記６０〜９４のいずれかに記載の方法。
９６．ＣｓＣｌは、約３Ｍの濃度である、上記６０〜９４のいずれかに記載の方法。
９７．（ｉ）（ｇ）の前記産物を、タンジェンシャルフローろ過を通してろ過することを更に含む、上記６０〜９６のいずれかに記載の方法。
９８．前記酸性化ステップは、前記細胞ライセートを約３．０〜４．０、約３．３〜３．７又は約３．４〜３．６のｐＨに酸性化することを含む、上記６０〜９８のいずれかに記載の方法。
９９．前記酸性化ステップは、前記細胞ライセートを約３．５のｐＨに酸性化することを含む、上記９８に記載の方法。
１００．前記超遠心は、約４０，０００〜５０，０００ｒｐｍ又は約４３，０００〜４６，０００ｒｐｍで実施される、上記６０〜９９のいずれかに記載の方法。
１０１．前記超遠心は、１５〜２５℃で実施される、上記６０〜１００のいずれかに記載の方法。
１０２．前記超遠心は、１６〜２４時間又は２０〜２４時間にわたって実施される、上記６０〜１０１のいずれかに記載の方法。
１０３．前記細胞ライセートは、前記酸性化ステップ前にＴｗｅｅｎと共にインキュベートされる、上記６０〜１０２のいずれかに記載の方法。
１０４．前記細胞ライセートは、前記酸性化ステップ前にＴｗｅｅｎと共に約８〜２０時間にわたってインキュベートされる、上記６０〜１０３のいずれかに記載の方法。
１０５．前記清澄化ステップは、前記細胞ライセートを、デプスフィルタを通してろ過することを含む、上記６０〜１０４のいずれかに記載の方法。
１０６．前記清澄化ステップは、前記細胞ライセートを、０．４５ミクロンフィルタを通してろ過することを含む、上記６０〜１０５のいずれかに記載の方法。
１０７．前記ＣＥＸは、スルホニル樹脂を含む、上記６０〜１０６のいずれかに記載の方法。
１０８．少なくとも１つのＴＦＦステップは、３００ｋＤａ  ＭＷの分子量カットオフのセルロース膜を使用することを含む、上記６０〜１０７のいずれかに記載の方法。
１０９．前記ＴＦＦステップは、前記陽イオン交換ステップの溶出液容積を少なくとも６分の１に減少させる、上記６０〜１０８のいずれかに記載の方法。
１１０．前記ＣｓＣｌ緩衝液は、トリス、ＭｇＣｌ２及びポロキサマー１８８を含む、上記６０〜１０９のいずれかに記載の方法。
１１１．前記ＣｓＣｌ緩衝液は、約２０ｍＭトリスを含む、上記１１０に記載の方法。
１１２．前記ＣｓＣｌ緩衝液は、約２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む、上記１１０〜１１１に記載の方法。
１１３．前記ＣｓＣｌ緩衝液は、ポロキサマー１８８、任意選択で約０．２％ｗ／ｖポロキサマー１８８を含む、上記１１０〜１１２のいずれかに記載の方法。
１１４．前記ＣｓＣｌ緩衝液は、約ｐＨ７．５〜８．５又は約ｐＨ７．９〜８．２である、上記６０〜１１３のいずれかに記載の方法。
１１５．空のウイルスカプシドの数は、前記超遠心された細胞ライセートから前記ＡＡＶウイルスベクターを収集した後、総ウイルスカプシドの７％未満、５％未満、３％未満又は１％未満である、上記６０〜１１４のいずれかに記載の方法。
１１６．前記空のウイルスカプシドの数は、分析的超遠心法（ＡＵＣ）によって測定される、上記１１５に記載の方法。
１１７．前記ＡＡＶウイルスベクターは、前記超遠心された細胞ライセートからシリンジを用いて収集される、上記６０〜１１６のいずれかに記載の方法。
１１８．第２のＴＦＦステップ後に収集される前記ＡＡＶウイルスベクターは、トリス、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ及びポロキサマー１８８を含む溶液中に貯蔵される、上記６０〜１１７のいずれかに記載の方法。
１１９．前記溶液は、約２０ｍＭトリスを含む、上記１１８に記載の方法。
１２０．前記溶液は、約１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む、上記１１８又は１１９に記載の方法。
１２１．前記溶液は、約２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む、上記１１８〜１２０のいずれかに記載の方法。
１２２．前記溶液は、約０．００５％ｗ／ｖポロキサマー１８８を含む、上記１１８〜１２１のいずれかに記載の方法。
１２３．前記溶液は、約ｐＨ７．５〜８．５又は約ｐＨ７．７〜８．３である、上記１１８〜１２２のいずれかに記載の方法。
１２４．前記第２のＴＦＦ後に収集される前記ＡＡＶウイルスベクターは、約３０μｇ／ｇ未満又は約２０μｇ／ｇ未満のＣｓＣｌを含有する、上記６０〜１２３のいずれかに記載の方法。
１２５．前記第２のＴＦＦ後に収集されるＡＡＶウイルスベクターの濃度は、約３×１０１３ｖｇ／ｍｌ以上である、上記６０〜１２４のいずれかに記載の方法。
１２６．宿主細胞タンパク質及び／又は宿主細胞ＤＮＡは、前記細胞ライセートからデタージェントによるフロキュレーションを用いて除去される、上記６０〜１２５のいずれかに記載の方法。
１２７．前記ＡＡＶウイルスベクターは、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、上記６０〜１２０のいずれかに記載の方法。
１２８．前記ＳＭＮタンパク質をコードする前記プラスミド、前記ｐＡＡＶをコードする前記プラスミド及び前記ｐＨＥＬＰをコードする前記プラスミドは、１：１：１の比でトランスフェクトされる、上記７６〜１２７のいずれかに記載の方法。
１２９．前記医薬組成物は、
ａ．１〜８×１０１３ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）；
ｂ．約７％未満の空のウイルスカプシド；
ｃ．１×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約１００ｎｇ／ｍＬ未満の宿主細胞タンパク質；
ｄ．１×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約５×１０６ｐｇ／ｍＬ未満の残留宿主細胞ＤＮＡ
を含み、前記１〜８×１０１３ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬの少なくとも約８０％は、機能性である、上記６０〜１２８のいずれかに記載の方法。
１３０．前記医薬組成物は、１．７〜２．３×１０１３ＡＡＶ９  ｖｇ／ｍＬ又は１．９〜２．１×１０１３ＡＡＶ９  ｖｇ／ｍＬを含む、上記１２９に記載の方法。
１３１．前記医薬組成物は、約２×１０１３ＡＡＶ９  ｖｇ／ｍＬを含む、上記１２９に記載の方法。
１３２．前記医薬組成物は、約５％未満の空のカプシド、約３％未満の空のカプシド又は約１％未満の空のカプシドを含む、上記１２９〜１３１のいずれかに記載の方法。
１３３．前記医薬組成物は、１〜２×１０１４ｖｇの前記ＡＡＶ９ウイルスベクター又は１．１×１０１４ｖｇの前記ＡＡＶ９ウイルスベクターを含むか又はそれからなる、上記１２９〜１３２のいずれかに記載の方法。
１３４．前記医薬組成物は、１．７×１０１４ｖｇの前記ＡＡＶ９ウイルスベクターからなる、上記１２９〜１３２のいずれかに記載の方法。
１３５．前記医薬組成物は、水性医薬製剤である、上記１２９〜１３４のいずれかに記載の方法。
１３６．前記製剤は、トリス緩衝液、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム及びポロキサマーを含み、前記医薬組成物は、保存剤を含まない、上記１３５に記載の方法。
１３７．前記ポロキサマーは、ポロキサマー１８８を含む、上記１３６に記載の方法。
１３８．前記製剤のｐＨは、約７．７〜約８．３である、上記１３５〜１３７のいずれかに記載の方法。
１３９．前記ｐＨは、約ｐＨ８．０である、上記１３８に記載の方法。
１４０．塩化マグネシウム濃度は、約０．５〜１．５ｍＭである、上記１３６〜１３９のいずれかに記載の方法。
１４１．前記塩化マグネシウム濃度は、約１ｍＭである、上記１４０に記載の方法。
１４２．塩化ナトリウム濃度は、約１００〜３００ｍＭである、上記１３６〜１４１のいずれかに記載の方法。
１４３．前記塩化ナトリウム濃度は、約２００ｍＭである、上記１４２に記載の方法。
１４４．前記製剤は、約０．００５％ｗ／ｖポロキサマー１８８を含む、上記１３６〜１４３のいずれかに記載の方法。
１４５．前記製剤は、３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、上記１３６〜１４４のいずれかに記載の方法。
１４６．前記医薬製剤は、
ａ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．０９ｎｇ未満のベンゾナーゼ、
ｂ．約３０μｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満のセシウム、
ｃ．約２０〜８０ｐｐｍのポロキサマー１８８、
ｄ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．２２ｎｇ未満のＢＳＡ、
ｅ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約６．８×１０５ｐｇ未満の残留プラスミドＤＮＡ、
ｆ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約１．１×１０５ｐｇ未満の残留ｈｃＤＮＡ、
ｇ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約４ｎｇ未満のｒＨＣＰ、
ｈ．約ｐＨ７．７〜８．３、
ｉ．約３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、
ｊ．１容器当たり約６００個未満の、≧２５μｍのサイズの粒子、
ｋ．１容器当たり約６０００個未満の、≧１０μｍのサイズの粒子、
ｌ．約１．７×１０１３〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価、
ｍ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約３．９×１０８〜８．４×１０１０ＩＵの感染力価、
ｎ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約１００〜３００μｇの全タンパク質、
ｏ．約７０〜１３０％の相対効力、及び
ｐ．約５％未満の空のカプシド
の少なくとも１つを含む、上記６０〜１４５のいずれかに記載の方法。
１４７．前記医薬製剤は、
ａ．約ｐＨ７．７〜８．３、
ｂ．約３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、
ｃ．１容器当たり約６００個未満の、≧２５μｍのサイズの粒子、
ｄ．１容器当たり約６０００個未満の、≧１０μｍのサイズの粒子、
ｅ．約１．７×１０１３〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価、
ｆ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約３．９×１０８〜８．４×１０１０ＩＵの感染力価、
ｇ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約１００〜３００μｇの全タンパク質、
ｈ．約２０〜８０ｐｐｍのＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８含有量、
ｉ．約７０〜１３０％の相対効力、
ｊ．７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で２４日以上のΔ７ＳＭＮマウスモデルにおける生存期間中央値、
ｋ．約５％未満の空のカプシド、及び
ｌ．約９５％以上の総純度、並びに
ｍ．約０．７５ＥＵ／ｍＬ以下のエンドトキシン
の少なくとも１つを含む、上記６０〜１４５のいずれかに記載の方法。
１４８．前記医薬製剤は、
ａ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．０９ｎｇ未満のベンゾナーゼ、
ｂ．約３０μｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満のセシウム、
ｃ．約２０〜８０ｐｐｍのポロキサマー１８８、
ｄ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．２２ｎｇ未満のＢＳＡ、
ｅ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約６．８×１０５ｐｇ未満の残留プラスミドＤＮＡ、
ｆ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約１．１×１０５ｐｇ未満の残留ｈｃＤＮＡ、及び
ｇ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約４ｎｇ未満のｒＨＣＰ
の少なくとも１つを含む、上記６０〜１４５のいずれかに記載の方法。
１４９．前記ウイルスベクターの前記相対効力は、参照標準品と比べて少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％又は少なくとも１４０％である、上記５９〜１４８のいずれかに記載の方法。
１５０．前記ウイルスベクターの前記相対効力は、前記参照標準品と比べて少なくとも９０％である、上記５９〜１４８のいずれかに記載の方法。
１５１．前記医薬製剤中の前記ウイルスベクターの前記効力は、前記参照標準品の効力の５％以内、前記参照標準品の効力の１０％以内又は前記参照標準品の効力の２０％以内である、上記５９〜１４８のいずれかに記載の方法。
１５２．トランス遺伝子を含むウイルスベクターを含む療法を用いて、治療を、それを必要としている患者に行う方法であって、
ａ．上記１〜４９のいずれかに記載のトランス遺伝子発現を測定する方法により、トランス遺伝子を含む前記ウイルスベクターをアッセイすること；及び
ｂ．トランス遺伝子を含む前記ウイルスベクターを前記患者に投与すること
を含む方法。
１５３．前記ウイルスベクターは、医薬組成物に製剤化される、上記１５２に記載の方法。
１５４．前記医薬組成物は、
ａ．１〜８×１０１３ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）；
ｂ．約７％未満の空のウイルスカプシド；
ｃ．１×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約１００ｎｇ／ｍＬ未満の宿主細胞タンパク質；及び
ｄ．１×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約５×１０６ｐｇ／ｍＬ未満の残留宿主細胞ＤＮＡ
を含み、前記１〜８×１０１３ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬの少なくとも約８０％は、機能性である、上記１４６に記載の方法。
１５５．前記それを必要としている患者は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、任意選択でＩ型ＳＭＡを有する、上記１５２〜１５４のいずれかに記載の方法。
１５６．前記それを必要としている患者は、
ａ．２歳以下、任意選択で生後９ヵ月以下であり；
ｂ．少なくとも約２．６ｋｇの体重を有し；
ｃ．両アレル性ＳＭＮ１ヌル突然変異又は欠失を有し；及び
ｄ．ＳＭＮ２の少なくとも１つの機能性コピーを有する、上記１５５に記載の方法。
１５７．前記組成物は、髄腔内又は静脈内経路によって前記患者に投与される、上記１５３〜１５６のいずれかに記載の方法。
１５８．前記ウイルスベクターは、約１〜２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、上記１５２〜１５７のいずれかに記載の方法。
１５９．前記ウイルスベクターは、約１．１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、上記１５２〜１５７のいずれかに記載の方法。
１６０．ウイルスベクターゲノムの量は、ｄｄＰＣＲを用いて測定される、上記１５８又は１５９に記載の方法。
１６１．前記患者は、約１３．５ｋｇ以下、任意選択で約８．５ｋｇ以下の体重を有する、上記１５５〜１６０のいずれかに記載の方法。
１６２．前記患者は、ＳＭＮ２遺伝子の少なくとも１つのコピーのエクソン７にｃ．８５９Ｇ＞Ｃ置換を有しない、上記１５５〜１６１のいずれかに記載の方法。
１６３．前記治療は、２歳より前、任意選択で生後６ヵ月より前に前記患者に投与される、上記１５５〜１６２のいずれかに記載の方法。
１６４．前記治療は、筋緊張低下、運動技能遅滞、定頸不全、円背姿勢及び関節過度可動性から選択される１つ以上のＳＭＡ症状の発症前に前記患者に投与される、上記１５５〜１６３のいずれかに記載の方法。
１６５．前記患者は、投与前にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定される１：１００又は１：５０以下の抗ＡＡＶ９抗体力価を有する、上記１５５〜１６４のいずれかに記載の方法。
１６６．前記患者は、投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定される１：１００を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、且つ約１〜８週間にわたって又は力価が１：１００未満に低下するまでモニタされる、上記１５５〜１６４のいずれかに記載の方法。
１６７．前記患者は、投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定される１：１００を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、且つ約１〜８週間にわたって又は力価が１：５０未満に低下するまでモニタされる、上記１５５〜１６４のいずれかに記載の方法。
１６８．前記患者は、投与前又は投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定される１：１００を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、且つ人工栄養に切り換えられる、上記１５５〜１６４のいずれかに記載の方法。
１６９．前記患者は、投与前又は投与後に人工栄養に切り換えられる、上記１６８に記載の方法。
１７０．前記患者は、投与前又は投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定される１：５０を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、且つ人工栄養に切り換えられる、上記１５５〜１６４のいずれかに記載の方法。
１７１．前記患者は、投与前又は投与後に人工栄養に切り換えられる、上記１７０に記載の方法。
１７２．前記患者は、投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定される１：１００を上回る又は１：５０を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、且つプラスマフェレーシスを用いて治療される、上記１５５〜１７１のいずれかに記載の方法。
１７３．前記患者は、投与前に約６７，０００細胞／ｍｌを上回る、又は約１００，０００細胞／ｍｌを上回る、又は約１５０，０００細胞／ｍｌを上回る血小板数を有する、上記１５５〜１７２のいずれかに記載の方法。
１７４．前記患者は、投与後に約６７，０００細胞／ｍｌを下回る、又は約１００，０００細胞／ｍｌを下回る、又は約１５０，０００細胞／ｍｌを下回る血小板数を有し、且つ約１〜８週間にわたって又は血小板数が約６７，０００細胞／ｍｌに増加するまで、若しくは約１００，０００細胞／ｍｌを上回って増加するまで、若しくは約１５０，０００細胞／ｍｌを上回って増加するまでモニタされる、上記１５５〜１７３のいずれかに記載の方法。
１７５．前記患者は、投与後に約６７，０００細胞／ｍｌを下回る血小板数を有し、且つ血小板輸血で治療される、上記１５５〜１７４のいずれかに記載の方法。
１７６．前記患者は、投与前に血小板減少症を有しない、上記１５５〜１７５のいずれかに記載の方法。
１７７．前記患者は、投与後に血小板減少症を有し、且つ約１〜８週間にわたって又は前記患者が血小板減少症を有しなくなるまでモニタされる、上記１５５〜１７５のいずれかに記載の方法。
１７８．前記患者は、投与後に血小板減少症を有し、且つ血小板輸血で治療される、上記１５５〜１７５のいずれかに記載の方法。
１７９．前記患者は、前記ウイルスベクターの投与前に約０．１７６ｕｇ／ｍｌ未満のトロポニン−Ｉレベルを有する、上記１５５〜１７８のいずれかに記載の方法。
１８０．前記患者における前記トロポニン−Ｉのレベルは、前記ウイルスベクターの投与後にモニタされる、上記１５５〜１７９のいずれかに記載の方法。
１８１．モニタリングは、投与後、前記患者におけるトロポニン−Ｉレベルが約０．１７６ｕｇ／ｍｌ未満になるまで実施される、上記１７９又は１８０に記載の方法。
１８２．前記患者は、投与前に正常な肝機能を有する、上記１５５〜１８１のいずれかに記載の方法。
１８３．前記患者は、投与前に約８〜４０Ｕ／Ｌ未満の肝トランスアミナーゼレベルを有する、上記１８２に記載の方法。
１８４．肝トランスアミナーゼは、アラニントランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＬＴ）及びこれらの組み合わせから選択される、上記１８３に記載の方法。
１８５．前記患者は、投与前に３．０ｍｇ／ｄＬ未満のビリルビンレベル、１．８ｍｇ／ｄＬ未満のクレアチニンレベル、８〜１８ｇ／ｄＬのＨｇｂレベル及び／又は約２００００／ｍｍ３未満の白血球数を有する、上記１５５〜１８４のいずれかに記載の方法。
１８６．前記ウイルスベクターは、トリス緩衝生理食塩水中で投与される、上記１５５〜１８５のいずれかに記載の方法。
１８７．前記ウイルスベクターは、約５〜２０ｍＬ／ｋｇ、約１０〜２０ｍＬ／ｋｇ又は約５．５〜６．５ｍＬ／ｋｇのトリス緩衝生理食塩水中で投与される、上記１５５〜１８６のいずれかに記載の方法。
１８８．前記ウイルスベクターは、約４５〜７５分にわたって注入される、上記１５５〜１８７のいずれかに記載の方法。
１８９．前記ウイルスベクターは、約６０分にわたって注入される、上記１５５〜１８８のいずれかに記載の方法。
１９０．前記注入は、シリンジポンプを含む、上記１８８又は１８９に記載の方法。
１９１．前記患者は、前記ウイルスベクターを投与する少なくとも２４時間前に経口ステロイド薬を投与される、上記１５５〜１８９のいずれかに記載の方法。
１９２．前記患者は、前記ウイルスベクターを投与した後、少なくとも３０日間にわたって経口ステロイド薬を投与される、上記１５５〜１９１のいずれかに記載の方法。
１９３．前記経口ステロイド薬は、１日１回投与される、上記１９２に記載の方法。
１９４．前記経口ステロイド薬は、１日２回投与される、上記１９３に記載の方法。
１９５．前記患者は、前記ウイルスベクターの投与後、ＡＬＴ及び／又はＡＳＴのレベルの上昇に関してモニタされ、前記経口ステロイド薬は、３０日後、ＡＳＴ及び／又はＡＬＴレベルが正常上限の２倍を下回るか又は約１２０ＩＵ／Ｌを下回るまで継続して投与される、上記１９１〜１９４のいずれかに記載の方法。
１９６．前記患者は、ＡＳＴ及び／又はＡＬＴレベルが正常上限の２倍を下回るか又は約１２０ＩＵ／Ｌを下回るまで経口ステロイド薬を投与される、上記１９１〜１９５のいずれかに記載の方法。
１９７．前記経口ステロイド薬は、約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、上記１９１〜１９５のいずれかに記載の方法。
１９８．ＡＳＴ及びＡＬＴが正常上限の２倍を下回るか又は約１２０ＩＵ／Ｌを下回った後、前記経口ステロイド薬投与を漸減することを更に含む、上記１９１〜１９７のいずれかに記載の方法。
１９９．前記漸減することは、２週間で０．５ｍｇ／ｋｇ／日まで、続いて更に２週間で０．２５ｍｇ／ｋｇ／日までの段階的増加を含む、上記１９８に記載の方法。
２００．前記経口ステロイド薬を約１ｍｇ／ｋｇの用量で３０日間にわたって投与し、且つその後、２週間で０．５ｍｇ／ｋｇ／日まで、続いて更に２週間で０．２５ｍｇ／ｋｇ／日まで漸減することを含む、上記１９１〜１９８のいずれかに記載の方法。
２０１．前記経口ステロイド薬は、プレドニゾロン又は均等物である、上記１９１〜２００のいずれかに記載の方法。
２０２．前記患者に筋エンハンサー又は神経保護剤を投与することを含む、上記１５５〜２０１のいずれかに記載の方法。
２０３．ＳＭＮを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記患者に投与することを含む、上記１５５〜２０２のいずれかに記載の方法。
２０４．前記患者にヌシネルセンを投与することを含む、上記１５５〜２０３のいずれかに記載の方法。
２０５．前記患者にスタムルマブを投与することを含む、上記１５５〜２０４のいずれかに記載の方法。
２０６．有効性は、ＣＨＯＰ−ＩＮＴＥＮＤ尺度を用いて決定される、上記１５５〜２０５のいずれかに記載の方法。
２０７．前記患者は、疾患発症を伴うか又は伴わない、上記１５５〜２０６のいずれかに記載の方法。
２０８．ａ．前記患者の前記体重を決定すること；
ｂ．ＡＡＶ９ウイルスベクター医薬組成物のバイアルを含むキットを入手することであって、各バイアルにおけるウイルスベクター濃度は、約２．０×１０１３ｖｇ／ｍＬであり；
前記キットにおける前記バイアルの数及び容積は、
前記患者の前記体重が２．６〜３ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で２バイアル、
前記患者が３．１〜３．５ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で２バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で１バイアル、
前記患者が３．６〜４．０ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で１バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で２バイアル、
前記患者が４．１〜４．５ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で３バイアル、
前記患者が４．６〜５．０ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で２バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で２バイアル、
前記患者が５．１〜５．５ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で１バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で３バイアル、
前記患者が５．６〜６．０ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で４バイアル、
前記患者が６．１〜６．５ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で２バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で３バイアル、
前記患者が６．６〜７．０ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で１バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で４バイアル、
前記患者が７．１〜７．５ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で５バイアル、
前記患者が７．６〜８．０ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で２バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で４バイアル、
前記患者が８．１〜８．５ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で１バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で５バイアル、
前記患者が８．６〜９．０ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で６バイアル、
前記患者が９．１〜９．５ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で２バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で５バイアル、
前記患者が９．６〜１０．０ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で１バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で６バイアル、
前記患者が１０．１〜１０．５ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で７バイアル、
前記患者が１０．６〜１１．０ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で２バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で６バイアル、
前記患者が１１．１〜１１．５ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で１バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で７バイアル、
前記患者が１１．６〜１２．０ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で８バイアル、
前記患者が１２．１〜１２．５ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で２バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で７バイアル、
前記患者が１２．６〜１３．０ｋｇであるときに１バイアル当たり５．１〜５．９ｍＬの前記組成物で１バイアル及び１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で８バイアル、及び
前記患者が１３．１〜１３．５ｋｇであるときに１バイアル当たり７．９〜８．８ｍＬの前記組成物で９バイアル
からなる群から選択される、入手すること；及び
ｃ．前記バイアルから前記ＡＡＶ９ウイルスベクターを前記患者に投与すること
を含む、上記１５５〜２０７のいずれかに記載の方法。
２０９．前記ＡＡＶウイルスベクターは、約１．０×１０１４〜２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量での注入によって投与される、上記２０８に記載の方法。
２１０．前記ＡＡＶウイルスベクターは、約１．１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量での注入によって投与される、上記２０８又は２０９に記載の方法。
２１１．前記ウイルスベクターは、約４５〜７０分にわたって注入される、上記２０９又は２１０に記載の方法。
２１２．前記ウイルスベクターは、約６０分にわたって注入される、上記２０９〜２１１のいずれかに記載の方法。
２１３．前記注入は、シリンジポンプを含む、上記２０９〜２１２のいずれかに記載の方法。
２１４．ウイルスベクターゲノムの量は、ｄｄＰＣＲを用いて測定される、上記２０９〜２１３のいずれかに記載の方法。
２１５．ＡＡＶ９ウイルスベクターの用量力価は、ｄｄＰＣＲによって測定される、上記２０９〜２１４のいずれかに記載の方法。
２１６．前記患者が２．６〜３．０ｋｇの体重であるときに１６．５ｍＬ、前記患者が３．１〜３．５ｋｇの体重であるときに１９．３ｍＬ、前記患者が３．６〜４．０ｋｇの体重であるときに２２．０ｍＬ、前記患者が４．１〜４．５ｋｇの体重であるときに２４．８ｍＬ、前記患者が４．６〜５．０ｋｇの体重であるときに２７．５ｍＬ、前記患者が５．１〜５．５ｋｇの体重であるときに３０．３ｍＬ、前記患者が５．６〜６．０ｋｇの体重であるときに３３．０ｍＬ、前記患者が６．１〜６．５ｋｇの体重であるときに３５．８ｍＬ、前記患者が６．６〜７．０ｋｇの体重であるときに３８．５ｍＬ、前記患者が７．１〜７．５ｋｇの体重であるときに４１．３ｍＬ、前記患者が７．６〜８．０ｋｇの体重であるときに４４．０、前記患者が８．１〜８．５ｋｇの体重であるときに４６．８ｍＬ、前記患者が８．６〜９．０ｋｇの体重であるときに４９．５、前記患者が９．１〜９．５ｋｇの体重であるときに５２．３ｍＬ、前記患者が９．６〜１０．０ｋｇの体重であるときに５５．０、前記患者が１０．１〜１０．５ｋｇの体重であるときに５７．８ｍＬ、前記患者が１０．６〜１１．０ｋｇの体重であるときに６０．５、前記患者が１１．１〜１１．５ｋｇの体重であるときに６３．３ｍＬ、前記患者が１１．６〜１２．０ｋｇの体重であるときに６６．０、前記患者が１２．１〜１２．５ｋｇの体重であるときに６８．８ｍＬ、前記患者が１２．６〜１３．０ｋｇの体重であるときに７１．５及び前記患者が１３．１〜１３．５ｋｇの体重であるときに７４．３ｍＬの用量容積を投与することを含む、上記１５５〜２１５のいずれかに記載の方法。
２１７．前記医薬組成物は、
ａ．修飾ＡＡＶ２  ＩＴＲと、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーターと、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサーと、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロンと、ＳＭＮ１ポリペプチドをコードする配列と、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルと、非修飾ＡＡＶ２  ＩＴＲとを含む自己相補的ＡＡＶ９ウイルスベクター；
ｂ．ｐＨ８．０の２０ｍＭトリス；
ｃ．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２；
ｄ．２００ｍＭ  ＮａＣｌ；及び
ｅ．０．００５％ポロキサマー１８８
を含み、前記患者は、２歳未満である、上記１５５〜２１６のいずれかに記載の方法。
２１８．前記組成物は、保存剤を含まない、上記２１７に記載の方法。
２１９．前記ウイルスベクターの前記相対効力は、参照標準品と比べて少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％又は少なくとも１４０％である、上記１５２〜２１８のいずれかに記載の方法。
２２０．前記ウイルスベクターの前記相対効力は、前記参照標準品と比べて少なくとも９０％である、上記１５２〜２１８のいずれかに記載の方法。
２２１．医薬製剤中の前記ウイルスベクターの前記効力は、前記参照標準品の効力の５％以内、前記参照標準品の効力の１０％以内又は前記参照標準品の効力の２０％以内である、上記１５２〜２１８のいずれかに記載の方法。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４２−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４２−２】
2021526806.tif 000209
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４３】
2021526806.tif 000210
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４４】
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【手続補正１７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４５】
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【国際調査報告】
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