(57)【要約】  本発明は、ＲＮＡの送達に適した組成物であって、（ｉ）液相に含有される粒子であって、ＲＮＡおよび脂質組成物を含む、粒子、ならびに（ｉｉ）１，２−プロパンジオールを含む、組成物を提供する。脂質組成物は、（ｉ−ａ）コレステロール誘導体、（ｉ−ｂ）ホスホグリセリド、および（ｉ−ｃ）ペグ化ホスホグリセリドを含む。組成物を調製するための方法、および、組成物を凍結することにより得られる固体組成物であって、粒子が、液相に含有される、固体組成物をさらに提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）液相に含有される粒子であって、粒子がＲＮＡおよび脂質組成物を含み、脂質組成物が、
（ｉ−ａ）式（Ｉ）のコレステロール誘導体、またはその塩：
【化１】
2021522228.tif 000024
（式中、
ｎは、０または１、好ましくは０であり、
Ｒ１は、−（ＣＨ２）ｑ−ＮＨ２基または−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ２基（式中、ｑ、ｒおよびｓは、独立して、２〜６の整数である）であり、
Ｒ２は、−（ＣＨ２）ｔ−ＮＨ２基または−（ＣＨ２）ｕ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ２基（式中、ｔ、ｕおよびｗは、独立して、２〜６の整数である）であり、
Ｒ３は、１〜４個の炭素原子を有する直鎖アルカンジイル基である）、
（ｉ−ｂ）式（ＩＩ）のホスホグリセリド、またはその塩：
【化２】
2021522228.tif 000025
（式中、
Ｒ４は、１０〜２４個の炭素原子を有する直鎖アルキル基、または１〜３つの二重結合および１０〜２４個の炭素原子を有する直鎖アルケニル基であり、
Ｒ５は、１０〜２４個の炭素原子を有する直鎖アルキル基、または１〜３つの二重結合および１０〜２４個の炭素原子を有する直鎖アルケニル基である）
ならびに
（ｉ−ｃ）式（ＩＩＩ）のペグ化ホスホグリセリド、またはその塩：
【化３】
2021522228.tif 000026
（式中、
ｐは、５〜２００、好ましくは１０〜１７０、最も好ましくは１０〜１４０の整数であり、
Ｒ６は、１０〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルキル基、または１〜３つの二重結合および１０〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルケニル基であり、
Ｒ７は、１０〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルキル基、または１〜３つの二重結合および１０〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルケニル基である）
を含む、粒子、
ならびに
（ｉｉ）１，２−プロパンジオール
を含む、組成物。
【請求項２】
前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
式（Ｉ）の前記コレステロール誘導体が、ＧＬ６７である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
式（ＩＩ）の前記ホスホグリセリドが、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンである、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
式（ＩＩＩ）の前記ペグ化ホスホグリセリドが、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ５０００である、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記脂質組成物中の成分（ｉ−ａ）：（ｉ−ｂ）：（ｉ−ｃ）のモル比が、１：（０．５〜５）：（０．０１〜１）である、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記粒子が、１〜５０００ｎｍの範囲の平均粒径を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
ＲＮＡにおける、式（Ｉ）の前記コレステロール誘導体由来の窒素原子Ｎの数のリン酸基Ｐの数に対するＮ／Ｐ比が、１〜１００の範囲である、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記１，２−プロパンジオールが、前記組成物の総体積を基準として、０．１〜５０％ｗ／ｖの濃度で含有される、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記粒子を含有する前記液相が、水を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物の調製のための方法であって、
ａ）有機溶媒中の脂質組成物の成分を溶解し、混合して、続いて脂質組成物を凍結乾燥するステップ、
ｂ）水を添加することにより、凍結乾燥された脂質組成物を再水和するステップ、
ｃ）再水和された脂質組成物をＲＮＡの水溶液と組み合わせて、液相に含有されるＲＮＡおよび脂質組成物を含む粒子を形成することを可能にするステップ、ならびに
ｄ）１，２−プロパンジオールを添加するステップ
を含む、方法。
【請求項１２】
（ｉ）ＲＮＡおよび脂質組成物を含む、粒子、ならびに
（ｉｉ）１，２−プロパンジオール
を含み、
請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物を凍結することにより得られる、固体組成物。
【請求項１３】
ＲＮＡに基づく療法を介する疾患の処置または予防での使用のための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
処置または予防される疾患が、肺疾患である、請求項１３に記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
処置または予防が、気道へ、または気道を介する、好ましくは経肺投与または経鼻投与を介する、組成物の投与を含む、請求項１３または１４に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象へのＲＮＡの効率的な投与に使用することができる、脂質に基づく組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な脂質に基づく製剤は、当該技術分野で知られており、患者の体内に送達することを可能にするような核酸用のベクターとして作用することができる（例えば、A.C. Silva et al., Current Drug Metabolism, 16, 2015, 3-16、およびそこで参照される文献）。吸入を介するｐＤＮＡ送達のために、臨床研究において首尾よく試験されてきた製剤は、ＧＬ６７Ａである（E. Alton et al., Efficacy and Mechanism Evaluation, Vol. 3, Issue 5, July 2016）。製剤ＧＬ６７Ａは、治療活性の核酸としてのｐＤＮＡと共に、ＧＬ６７（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｐｉｄ  ６７としても公知、カチオン的に誘導体化されたコレステロール）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ５０００（ＤＭＰＥ−ＰＥＧ５０００）を含有する。
【０００３】
しかし、製剤は、限られた安定性（ｔ１／２：６時間）を示すので、適用の直前に調製しなければならない。さらに、脂質製剤は、インビボでのＲＮＡのトランスフェクションに効果がないことが見出された（O. Andries et al., Molecular Pharmaceutics 2012, 9, 2136-2145）。これらの問題の観点から、有益な毒性プロファイルをもたらしながら、インビボでのＲＮＡの送達用の効果的なベクターとして作用することができる製剤の必要性は依然として残る。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の文脈では、１，２−プロパンジオール（プロピレングリコールとも称す）の存在が、核酸としてＲＮＡを含有するＧＬ６７Ａで使用される種類の脂質に基づく製剤のトランスフェクション効率の著しい増大をもたらすことが見出されている。
【０００５】
ゆえに、第一の態様によって、本発明は、
（ｉ）液相に含有される粒子であって、ＲＮＡおよび脂質組成物を含み、脂質組成物が、
（ｉ−ａ）式（Ｉ）のコレステロール誘導体、またはその塩：
【０００６】
【化１】
2021522228.tif 000002
（式中、
ｎは、０または１、好ましくは０であり、
Ｒ１は、−（ＣＨ２）ｑ−ＮＨ２基または−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ２基（式中、ｑ、ｒおよびｓは、独立して、２〜６の整数である）であり、
Ｒ２は、−（ＣＨ２）ｔ−ＮＨ２基または−（ＣＨ２）ｕ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ２基（式中、ｔ、ｕおよびｗは、独立して、２〜６の整数である）であり、
Ｒ３は、１〜４個の炭素原子を有する直鎖アルカンジイル基である）、
（ｉ−ｂ）式（ＩＩ）のホスホグリセリド、またはその塩：
【０００７】
【化２】
2021522228.tif 000003
（式中、
Ｒ４は、１０〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルキル基、または１〜３つの二重結合および１０〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルケニル基であり、
Ｒ５は、１０〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルキル基、または１〜３つの二重結合および１０〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルケニル基である）
ならびに
（ｉ−ｃ）式（ＩＩＩ）のペグ化ホスホグリセリド、またはその塩：
【０００８】
【化３】
2021522228.tif 000004
（式中、
ｐは、５〜２００、好ましくは１０〜１７０、最も好ましくは１０〜１４０の整数であり、
Ｒ６は、１０〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルキル基、または１〜３つの二重結合および１０〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルケニル基であり、
Ｒ７は、１０〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルキル基、または１〜３つの二重結合および１０〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルケニル基である）
を含む、粒子、
ならびに
（ｉｉ）１，２−プロパンジオール
を含む、組成物を提供する。
【０００９】
本発明の第二の態様は、上述の第一の態様による組成物の調製のための方法であって、
ａ）有機溶媒中の脂質組成物の成分を溶解し、混合して、続いて脂質組成物を凍結乾燥するステップ、
ｂ）水を添加することにより、凍結乾燥された脂質組成物を再水和するステップ、
ｃ）再水和された脂質組成物をＲＮＡの水溶液と組み合わせて、液相に含有されるＲＮＡおよび脂質組成物を含む粒子を形成することを可能にするステップ、
ｄ）１，２−プロパンジオールを添加するステップ
を含む、方法に関する。
【００１０】
１，２−プロパンジオールの添加は、例えば、ステップｂ）において水と共にそれを添加することにより、ステップｂ）に続いて再水和された脂質組成物にそれを添加することにより、ステップｃ）においてＲＮＡの水溶液と共にそれを添加することにより、または、ステップｃ）に続いて液相にそれを添加することにより、簡便に達成することができ、ＲＮＡおよび脂質組成物を含む粒子が含有される。添加が、１ステップ、または多数のステップにおいて、例えば、プロセスの異なる段階で行われ得ることは理解されよう。
【００１１】
さらに、１，２−プロパンジオールが、凍結中、例えば、このような粒子製剤が保存または取扱いのために凍結される場合、ＲＮＡの粒子製剤の安定性を向上することができることが見出されている。換言すると、１，２−プロパンジオールはまた、ＲＮＡおよび脂質組成物を含む粒子用の凍結保護剤として機能し得る。
【００１２】
ゆえに、第三の態様によって、本発明は、
（ｉ）ＲＮＡおよび脂質組成物を含む、粒子、ならびに
（ｉｉ）１，２−プロパンジオール
を含み、
上述の本発明の第一の態様による組成物を凍結することにより得られる、固体組成物を提供する。
【００１３】
以下において、本発明および上述の態様の詳細な説明が提供される。本文脈において、これらの態様が密接な相互関係を持つことが理解されよう。ゆえに、一態様の特徴に関して提供される詳細な情報が、別段の指示がない限り、この特徴に依存する他の態様にも適用するであろうことは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ｎ／Ｐ３および５で、異なる賦形剤溶液（水（０％のプロピレングリコール）または５％のプロピレングリコール）における、ＧＬ６７−複合体でのトランスフェクションの後のｔｄＴｏｍａｔｏレベルを示す。
【図２】水中または５％のプロピレングリコール溶液中のＧＬ６７複合体での処置の５時間後のＢａｌｂ／ｃマウスの鼻のルシフェラーゼ活性を示す。
【図３】１，２−プロパンジオールの存在下または不在下での凍結前と解凍後の粒子サイズを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ＲＮＡ
本発明による組成物および固体組成物は、リボ核酸（ＲＮＡ）、より好ましくは一本鎖ＲＮＡを含み、最も好ましいのは、ｍＲＮＡである。
【００１６】
ＲＮＡについて、原則として、任意の種類のＲＮＡを、本発明の文脈において利用することができる。好ましい実施形態では、ＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡである。用語「一本鎖ＲＮＡ」とは、別々の鎖のハイブリダイゼーションにより、２つ以上の別々の鎖が二本鎖分子を形成するＲＮＡ分子と対照的に、リボヌクレオチドの一本の連続する鎖を意味する。用語「一本鎖ＲＮＡ」は、一本鎖分子が、二次（例えば、ループおよびステム−ループ）、または三次構造のような二本鎖構造をそれ自身で形成することを排除しない。
【００１７】
用語「ＲＮＡ」は、アミノ酸配列をコードするＲＮＡ、ならびに、アミノ酸配列をコードしないＲＮＡを包含する。８０％超のゲノムが、タンパク質をコードしない機能性ＤＮＡエレメントを含有することを示唆している。これらの非コード配列として、調節ＤＮＡエレメント（転写因子、レギュレーター、およびコレギュレーターなどの結合部位）、ならびにタンパク質に決して翻訳されない転写物をコードする配列が挙げられる。これらの転写物は、ゲノムによりコードされ、ＲＮＡに転写されるが、タンパク質に翻訳されることはなく、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）と呼ばれる。ゆえに、一実施形態では、ＲＮＡは、ノンコーディングＲＮＡである。好ましくは、ノンコーディングＲＮＡは、一本鎖分子である。ｎｃＲＮＡが、遺伝子制御、ゲノム完全性の維持、細胞分化、および発生において重要なプレーヤーであり、様々なヒトの疾患において誤調節されることは、研究から実証されている。様々な種類のｎｃＲＮＡ：短い（２０〜５０ｎｔ）ｎｃＲＮＡ、中程度の（５０〜２００ｎｔ）ｎｃＲＮＡ、および、長い（＞２００ｎｔ）ｎｃＲＮＡが存在する。短いｎｃＲＮＡとして、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、および転写開始ＲＮＡ（ｔｉＲＮＡ）が挙げられる。中程度のｎｃＲＮＡの例は、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、転写開始点関連ＲＮＡ（ＴＳＳａＲＮＡ）、プロモーター関連小分子ＲＮＡ（ＰＡＳＲ）、およびプロモーター上流転写物（ＰＲＯＭＰＴ）である。長いノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）として、遺伝子間長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、アンチセンスｌｎｃＲＮＡ、イントロンｌｎｃＲＮＡ、転写された超保存ＲＮＡ（Ｔ−ＵＣＲ）、および他のものが挙げられる（Bhan A, Mandal SS, ChemMedChem. 2014 Mar 26. doi: 10.1002/cmdc.201300534）。上述のノンコーディングＲＮＡのうち、ｓｉＲＮＡのみが二本鎖である。ゆえに、好ましい実施形態では、ノンコーディングＲＮＡは一本鎖であるので、ノンコーディングＲＮＡはｓｉＲＮＡではないのが好ましい。別の実施形態では、ＲＮＡは、コーディングＲＮＡ、すなわち、アミノ酸配列をコードするＲＮＡである。このようなＲＮＡ分子はまた、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）とも称され、一本鎖ＲＮＡ分子である。ＲＮＡは、当業者に公知の合成化学的および酵素的な方法、もしくは組換え技術の使用により作製することができるか、もしくは天然源から単離することができるか、またはこれらの組合せにより作製することができる。
【００１８】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、ヌクレオシドとして主にアデノシン、シチジン、ウリジン、およびグアノシンを有するリン酸ヌクレオシド構成単位から構成されるコポリマーであり、中間担体として、細胞核におけるＤＮＡからの遺伝子情報を、ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳される細胞質にもたらす。ゆえに、これらは、遺伝子発現の代替物として好適である。
【００１９】
本発明の文脈では、ｍＲＮＡは、細胞に入る場合、タンパク質もしくはその断片の発現に適しているか、またはタンパク質もしくはその断片に翻訳可能である、任意のポリリボヌクレオチド分子を意味すると理解すべきである。本明細書の用語「タンパク質」とは、あらゆる種類のアミノ酸配列、すなわち、ペプチド結合を介して各々結合する２つ以上のアミノ酸の鎖を包含し、ペプチドおよび融合タンパク質も含む。
【００２０】
ｍＲＮＡは、細胞または細胞近傍部のその機能が必要または有益であるタンパク質またはその断片、例えば、その欠乏もしくは欠陥形態が疾患もしくは疾病の要因であり、その提供が疾患もしくは疾病を緩和もしくは予防することができるタンパク質、または細胞もしくはその近傍部において人体に有益であるプロセスを促進することができるタンパク質をコードする、リボヌクレオチド配列を含有する。ｍＲＮＡは、完全なタンパク質またはその機能性変異体に対する配列を含有することができる。さらに、リボヌクレオチド配列は、因子、インデューサー、レギュレーター、刺激物質、もしくは酵素として作用するタンパク質、またはその機能的断片をコードすることができ、このタンパク質は、その機能が障害、特に代謝障害を治療するため、または、新規の血管、組織などの形成のようなインビボでのプロセスを開始するために必要なものである。ここで、機能性変異体とは、細胞で必要であるか、または、その欠乏もしくは欠陥形態が病原性であるタンパク質の機能を、細胞において引き受けることができる断片を意味すると理解される。加えて、ｍＲＮＡはまた、さらなる機能性領域、および／または３’もしくは５’非コード領域を有することができる。３’および／または５’非コード領域は、ＲＮＡの安定化に寄与するタンパク質コード配列または人工配列に天然で隣接する領域であり得る。当業者は、通常の実験により、各場合において、これに適した配列を決定することができる。
【００２１】
好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは、特に翻訳を向上するために、３’末端に、５’−５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡに結合するｍ７ＧｐｐｐＧからなる５’キャップ（５プライムキャップ、キャップ０）、ｍＲＮＡの５’末端から２番目のヌクレオチド上の付加的メチル基（キャップ１、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ））、および／または、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および／または、ポリＡテールを含有する。ｍＲＮＡは、さらに翻訳を促進する領域、例えば、キャップ２構造、またはヒストンステム−ループ構造を有することができる。
【００２２】
上記の通り、具体的な文脈において別段の指示がない限り、本明細書で使用される用語ｍＲＮＡは、修飾されたｍＲＮＡを包含する、すなわち、ｍＲＮＡは、修飾されたｍＲＮＡであってもよい。
【００２３】
別の実施形態では、ｍＲＮＡは、標識核酸（好ましくは、ヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチド）、例えば、同位体、および／または蛍光標識されたヌクレオチドを含有する。標識ｍＲＮＡ分子は、例えば、ＲＮＡおよびＤＮＡ分子の細胞内構造を研究する上で重要な役割を果たす。
【００２４】
好ましい実施形態では、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、修飾されたヌクレオチド／リボヌクレオチドを含有する分子である。４つの古典的なリボヌクレオチド、すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、およびウリジンに加えて、これら核酸塩基の各々の多くの類似体が存在する。ときに、文献を通して、および文献において、これら類似体、または、これら類似体の１つまたは複数を含むＲＮＡ／ｍＲＮＡ分子は、本発明の用語において修飾されたと称す（例えば、修飾されたヌクレオチド、または修飾されたリボヌクレオチド）。いくつかの類似体は、上記の標準的な核酸塩基と異なるが、天然にも存在し得る。他の類似体は、天然に存在しない。いずれの種類の類似体も企図される。
好ましい修飾は、以下の表（表１）に記載される。
【００２５】
【表１−１】
2021522228.tif 000005
【００２６】
【表１−２】
2021522228.tif 000006
【００２７】
本発明によるＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡに対して、全てのウリジンヌクレオチドおよびシチジンヌクレオチドのいずれも、各々、同じ形態で修飾することができるか、または、修飾されたヌクレオチドの混合物を各々に使用することができる。修飾されたヌクレオチドは、天然に存在する修飾、または天然に存在しない修飾を有し得る。様々な修飾されたヌクレオチドの混合物を使用することができる。ゆえに、例えば、修飾されたヌクレオチドの一部分が、天然の修飾を有しながら、別の部分は、天然に存在しない修飾を有するか、または、天然に存在する修飾されたヌクレオチド、および／もしくは天然に存在しない修飾されたヌクレオチドの混合物を使用することができる。また、修飾されたヌクレオチドの一部分は、塩基修飾を有し、別の部分は、糖修飾を有し得る。同様に、全ての修飾は、塩基修飾であるか、または、全ての修飾が、糖修飾であるか、または任意の適したその混合である可能性がある。修飾の変化により、本発明によるＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡの安定性および／または作用期間を、選択的に調節することができる。
【００２８】
本発明の一実施形態では、少なくとも２つの異なる修飾は、１種類のヌクレオチドに使用され、１種類の修飾されたヌクレオチドは、追加の基が結合することができる官能基を有する。異なる官能基を有するヌクレオチドはまた、異なる基の結合に対する結合部位をもたらすために、使用することができる。ゆえに、例えば、修飾されたヌクレオチドの部分は、アジド基、アミノ基、ヒドロキシ基、チオール基、または、所定の条件下で、反応に適したいくつかの他の反応基を有することができる。官能基はまた、官能基を有する分子が連結されることができるために、ある種の条件下で、結合が可能な天然に存在する基を活性化できるようにしてもよい。結合部位をもたらすために修飾されるヌクレオチドはまた、アデノシンまたはグアノシン修飾として導入することができる。特に適した修飾の選択、および利用可能となる結合部位の選択は、どの基が導入されるか、どのくらいの頻度でこれらが存在するかに依存する。ゆえに、官能基および／または活性化基を有するヌクレオチドの含量は、連結させる基の含量がどの程度高いかに依存し、当業者により容易に決定することができる。一般に、官能基および／または活性化基で修飾されたヌクレオチドの含量は、存在する場合、１〜２５％の修飾されたヌクレオチドである。当業者は、必要ならば、通常の実験により、各場合で最も適した基、およびその最適な含量を決定することができる。
【００２９】
好ましい実施形態では、本発明によるＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、修飾されたウリジンが、２−チオウリジン、５−メチルウリジン、シュードウリジン、５−メチルウリジン５’−三リン酸（ｍ５Ｕ）、５−ヨードウリジン５’−三リン酸（Ｉ５Ｕ）、４−チオウリジン５’−三リン酸（Ｓ４Ｕ）、５−ブロモウリジン５’−三リン酸（Ｂｒ５Ｕ）、２’−メチル−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸（Ｕ２’ｍ）、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸（Ｕ２’ＮＨ２）、２’−アジド−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸（Ｕ２’Ｎ３）、および２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸（Ｕ２’Ｆ）から選択されることを特徴とする。
【００３０】
別の好ましい実施形態では、本発明によるＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、修飾されたシチジンが、５−メチルシチジン、３−メチルシチジン、２−チオ−シチジン、２’−メチル−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸（Ｃ２’ｍ）、２’−アミノ−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸（Ｃ２’ＮＨ２）、２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸（Ｃ２’Ｆ）、５−ヨードシチジン５’−三リン酸（Ｉ５Ｕ）、５−ブロモシチジン５’−三リン酸（Ｂｒ５Ｕ）、および２’−アジド−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸（Ｃ２’Ｎ３）から選択されることを特徴とする。
【００３１】
好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは、修飾されたヌクレオチドおよび修飾されていないヌクレオチドの組合せを含有するｍＲＮＡである。好ましくは、国際公開第２０１１／０１２３１６号パンフレットに記載された、修飾されたヌクレオチドおよび修飾されていないヌクレオチドの組合せを含有するｍＲＮＡである。これに記載されたｍＲＮＡは、安定性が増し、免疫原性が低下することを示すことが報告されている。好ましい実施形態では、このような修飾されたｍＲＮＡにおいて、シチジンヌクレオチドの５〜５０％、およびウリジンヌクレオチドの５〜５０％が修飾される。アデノシンおよびグアノシンを含有するヌクレオチドは、非修飾であり得る。アデノシンおよびグアノシンヌクレオチドは、修飾されないか、または部分的に修飾することができ、これらは、好ましくは、非修飾形態で存在する。好ましくは、シチジンおよびウリジンヌクレオチドの１０〜３５％は修飾され、特に好ましくは、修飾されたシチジンヌクレオチドの含量は、７．５〜２５％の範囲内にあり、修飾されたウリジンヌクレオチドの含量は、７．５〜２５％の範囲内にある。実際に、比較的低い含有量の、例えばそれぞれ１０％だけ修飾されたシチジンおよびウリジンヌクレオチドが、所望の特性を達成することができることが見出されている。修飾されたシチジンヌクレオチドが、５−メチルシチジン残基であり、修飾されたウリジンヌクレオチドは、２−チオウリジン残基であることは、特に好ましい。最も好ましくは、修飾されたシチジンヌクレオチドの含量、および修飾されたウリジンヌクレオチドの含量は、それぞれ２５％である。
【００３２】
ある種の他の実施形態では、このような修飾されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡにおいて、５〜５０％のシチジンは、Ｃの類似体であり、５〜５０％のウリジンは、Ｕの類似体である。ある種の実施形態では、このような修飾されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡにおいて、５〜４０％のシチジンは、Ｃの類似体であり、５〜４０％のウリジンは、Ｕの類似体である。ある種の実施形態では、このような修飾されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡにおいて、５〜３０％のシチジンは、Ｃの類似体であり、５〜３０％のウリジンは、Ｕの類似体である。ある種の実施形態では、このような修飾されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡにおいて、１０〜３０％のシチジンは、Ｃの類似体であり、１０〜３０％のウリジンは、Ｕの類似体である。ある種の実施形態では、このような修飾されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡにおいて、５〜２０％のシチジンは、Ｃの類似体であり、５〜２０％のウリジンは、Ｕの類似体である。ある種の実施形態では、このような修飾されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡにおいて、シチジンヌクレオチドの５〜１０％、およびウリジンヌクレオチドの５〜１０％が修飾される。ある種の実施形態では、このような修飾されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡにおいて、シチジンヌクレオチドの２５％、およびウリジンヌクレオチドの２５％が修飾される。ある種の実施形態では、アデノシンおよびグアノシンを含有するヌクレオチドは、非修飾であり得る。ある種の実施形態では、アデノシンおよびグアノシンヌクレオチドは、修飾されないか、または部分的に修飾することができ、これらは、好ましくは、非修飾形態で存在する。
【００３３】
上記の通り、ある種の実施形態では、Ｕの類似体とは、１種類のＵの類似体を指す。ある種の実施形態では、Ｕの類似体とは、２種類以上のＵの類似体を指す。ある種の実施形態では、Ｃの類似体とは、１種類のＣの類似体を指す。ある種の実施形態では、Ｃの類似体とは、２種類以上のＣの類似体を指す。
【００３４】
ある種の実施形態では、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡでのシチジンの類似体であるシチジンの百分率は、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡでのウリジンの類似体であるウリジンの百分率と同じではない。ある種の実施形態では、シチジンの類似体の百分率は、ウリジンの類似体の百分率より低い。上記の通り、アデノシンおよびグアノシンの類似体の存在下または不在下にあってよいが、ある種の実施形態では、アデノシンの類似体、およびグアノシンの類似体の不在下である。ある種の実施形態では、本開示のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、１５％未満、１０％未満、５％未満、または２％未満のアデノシンの類似体、グアノシンの類似体、またはその両方を含む。
【００３５】
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、シチジンの類似体およびウリジンの類似体を含み、５〜２０％のシチジンは、シチジンの類似体であり、２５〜４５％のウリジンは、ウリジンの類似体である。換言すると、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、修飾されたシチジンおよび修飾されていないシチジン、ならびに修飾されたウリジンおよび修飾されていないウリジンを含み、５〜２０％のシチジンは、シチジンの類似体を含み、その一方で２５〜４５％のウリジンは、ウリジンの類似体を含む。他の実施形態では、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、５〜１０％のシチジンの類似体、および３０〜４０％のウリジンの類似体、例えば、７〜９％、例として約７、７．５、または８％のシチジンの類似体、および、３２〜３８％、例として約３３、３４、３５、３６％のウリジンの類似体を含む。
【００３６】
ある種の実施形態では、本明細書に記載のウリジンの類似体およびシチジンの類似体のいずれかは、任意でシュードウリジンを除いて、使用することができる。ある種の実施形態では、シチジンの類似体は、５−ヨードシチジンを含むか、または５−ヨードシチジンからなり（例えば、からなるの場合は、使用される単一の類似体型である）、ウリジンの類似体は、５−ヨードウリジンを含むか、または５−ヨードウリジンからなる（例えば、からなるの場合は、使用される単一の類似体型である）。
【００３７】
前述のいずれかのある種の実施形態では、得られるヌクレオチドの類似体の百分率とは、入力百分率（例えば、反応開始時の、例としてインビトロでの転写反応開始時の類似体の百分率）を指す。前述のいずれかのある種の実施形態では、得られるヌクレオチドの類似体の百分率とは、出力（例えば、合成または転写された化合物での百分率）を指す。両方の選択肢は、等しく企図される。
【００３８】
本発明のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ分子は、当業者に公知の方法により、インビボ系で組換え生成することができる。
【００３９】
あるいは、本発明の修飾されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ分子は、例えば、当業者に公知のインビトロでの転写系を使用して、インビトロ系で生成することができる。ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを生成することが可能なインビトロでの転写系は、本発明の所望の特性で修飾されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ分子を生成するために、修飾されたヌクレオシド三リン酸および修飾されていないヌクレオシド三リン酸の入力混合物を必要とする。ある種の実施形態では、５〜５０％のシチジンは、このような入力混合物でのシチジンの類似体であり、５〜５０％のウリジンは、このような入力混合物でのウリジンの類似体である。ある種の実施形態では、５〜４０％のシチジンは、このような入力混合物でのシチジンの類似体であり、５〜４０％のウリジンは、このような入力混合物でのウリジンの類似体である。ある種の実施形態では、５〜３０％のシチジンは、このような混合物でのシチジンの類似体であり、５〜３０％のウリジンは、このような入力混合物でのウリジンの類似体である。ある種の実施形態では、５〜３０％のシチジンは、このような混合物でのシチジンの類似体であり、１０〜３０％のウリジンは、このような混合物でのウリジンの類似体である。ある種の実施形態では、５〜２０％のシチジンは、このような入力混合物でのシチジンの類似体であり、５〜２０％のウリジンは、このような入力混合物でのウリジンの類似体である。ある種の実施形態では、５〜１０％のシチジンは、このような入力混合物でのシチジンの類似体であり、５〜１０％のウリジンは、このような入力混合物でのウリジンの類似体である。ある種の実施形態では、２５％のシチジンは、このような入力混合物でのシチジンの類似体であり、２５％のウリジンは、このような入力混合物でのウリジンの類似体である。ある種の実施形態では、入力混合物は、アデノシンおよび／またはグアノシンの類似体を含まない。他の実施形態では、任意で、入力混合物は、アデノシンおよび／またはグアノシンの１つまたは複数の類似体（または、いずれでもない、または両方）を含む。
【００４０】
ある種の実施形態では、入力混合物でのシチジンの類似体であるシチジンの百分率は、入力混合物でのウリジンの類似体であるウリジンの百分率と同じではない。ある種の実施形態では、入力混合物でのシチジンの類似体の百分率は、入力混合物でのウリジンの類似体の百分率より低い。上記の通り、入力混合物でのアデノシンおよびグアノシンの類似体の存在下または不在下にあってよいが、ある種の実施形態では、入力混合物でのアデノシンの類似体、およびグアノシンの類似体の不在下である。
【００４１】
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを生成するインビトロでの転写系のためのヌクレオチドの入力混合物は、シチジンの類似体およびウリジンの類似体を含み、入力混合物のシチジンの５〜２０％は、シチジンの類似体であり、入力混合物のウリジンの２５〜４５％は、ウリジンの類似体である。換言すると、入力混合物は、修飾されたシチジンおよび修飾されていないシチジン、ならびに修飾されたウリジンおよび修飾されていないウリジンを含み、入力混合物のシチジンの５〜２０％は、シチジンの類似体を含みながら、入力混合物のウリジンの２５〜４５％は、ウリジンの類似体を含む。他の実施形態では、入力混合物は、５〜１０％のシチジンの類似体、および３０〜４０％のウリジンの類似体、例えば、７〜９％、例として７、７．５、または８％のシチジンの類似体、および、例えば、３２〜３８％、例として３３、３４、３５、３６％のウリジンの類似体を含む。
【００４２】
ある種の実施形態では、本明細書に記載のウリジンの類似体およびシチジンの類似体のいずれかは、任意でシュードウリジンを除いて、使用することができる。ある種の実施形態では、シチジンの類似体は、５−ヨードシチジンを含むか、または５−ヨードシチジンからなり（例えば、使用される単一のＣ類似体型である）、ウリジンの類似体は、５−ヨードウリジンを含むか、または５−ヨードウリジンからなる（例えば、使用される単一のＵ類似体型である）。
【００４３】
例示的な類似体は、上記の表に記載される。所望のポリペプチド（モジュール（ａ））をコードする修飾されたポリリボヌクレオチドのために、類似体および修飾のレベルは、別段の指示がない限り、５’および３’非翻訳領域を含む、所望のポリペプチド（モジュール（ａ））をコードするポリリボヌクレオチド全体にわたって考慮されることは理解されるべきである（例えば、類似体が、転写される位置で組み込むことができるので、修飾のレベルが、インビトロでの転写反応における類似体の入力比に基づく）。
【００４４】
さらに、修飾されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ分子は、例えば、固相支持体および標準的な技術を使用する自動ヌクレオチド配列合成装置での従来の化学的合成により、または、それぞれのＤＮＡ配列の化学的合成と、続くインビトロもしくはインビボでのその転写により、化学的に合成することができる。
【００４５】
別の好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは、関連の細胞においてのみ所望のｍＲＮＡの活性を可能にするために、標的結合部位、標的化配列、および／または、マイクロＲＮＡ結合部位と組み合わせることができる。さらに好ましい実施形態では、ＲＮＡは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの下流の３’ポリＡ尾部と組み合わせることができる。
【００４６】
一般に、治療効果は、リボ核酸と、細胞分子および小器官との相互作用により達成することができる。このような相互作用単独では、例えば、ｔｏｌｌ様および他の細胞外または細胞内受容体と、特異的に相互作用するために設計された特定のＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび配列の場合のように、先天的免疫系を活性化することができる。さらに、細胞内のリボ核酸（好ましくはｍＲＮＡ）の取込みまたは導入は、リボ核酸（好ましくはｍＲＮＡ）に含まれる遺伝子のようなヌクレオチド配列の発現をもたらすことを意図することができるか、導入された外因性核酸が細胞内に存在する結果として、内在性遺伝子発現の下方制御、サイレンシング、もしくはノックダウンを意図することができるか、または、選択された塩基、もしくは内因性核酸配列の全ストレッチの修復、切除、挿入、もしくは交換のような、内因性核酸配列の修飾を意図することができるか、または、導入された外因性リボ核酸（好ましくはｍＲＮＡ）が細胞内に存在し、相互作用する結果として、実質的に任意の細胞プロセスとの干渉を意図することができる。導入された外因性リボ核酸（好ましくはｍＲＮＡ）の過剰発現は、特に、少し例を挙げると、嚢胞性線維症、血友病、または筋ジストロフィーのような多くの代謝性遺伝性疾患の場合のように、内在性遺伝子が欠陥またはサイレントであり、遺伝子発現がない、遺伝子発現が不十分である、または、遺伝子発現の欠陥もしくは機能不全な産物をもたらす場合、内在性遺伝子発現を補償または相補することを意図することができる。導入された外因性リボ核酸（好ましくはｍＲＮＡ）の過剰発現はまた、発現の産物を、遺伝子発現の制御、シグナル伝達、および他の細胞プロセスのような、任意の内在性細胞プロセスと相互作用または干渉させることを意図することができる。導入された外因性リボ核酸（好ましくはｍＲＮＡ）の過剰発現はまた、トランスフェクトまたは形質導入された細胞が存在するまたは存在させる生物に関連して、免疫応答を引き起こすことを意図することができる。例としては、ワクチン接種目的のために抗原を存在させるための、樹状細胞のような抗原提示細胞の遺伝的修飾がある。他の例としては、腫瘍特異的免疫応答を引き出すための、腫瘍におけるサイトカインの過剰発現がある。さらに、導入された外因性リボ核酸（好ましくはｍＲＮＡ）の過剰発現はまた、修飾されたＴ細胞もしくは前駆体、または幹細胞もしくは再生医療用の他の細胞のような細胞療法のために、一過的に、遺伝的に修飾された細胞をインビボまたはエクスビボで生成することを意図することができる。
【００４７】
治療目的のための内在性遺伝子発現の下方制御、サイレンシング、またはノックダウンは、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、又はリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｔＲＮＡ、長い二本鎖ＲＮＡにより達成することができ、このような下方制御は、配列に特異的または非特異的であり得、長い二本鎖ＲＮＡが細胞内に導入される場合のように、細胞死ももたらし得る。内在性、または既存の遺伝子発現の下方制御、サイレンシング、またはノックダウンは、ウイルス感染およびがんを含む、後天的、遺伝的、または自発的に生じる疾患の処置に有用であり得る。核酸の細胞内への導入を、例えば、ウイルス感染または新生物を防ぐための予防措置として行うことができることも想定することもできる。内在性遺伝子発現の下方制御、サイレンシング、またはノックダウンは、転写レベルおよび翻訳レベルに対して発揮することができる。多数の機構は、当業者に知られており、例えば、後成的な修飾、クロマチン構造での変化、導入された核酸による転写因子の選択的結合、三重らせん形成のような、従来にはない塩基対形成メカニズムを含む塩基対形成による、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または他のＲＮＡ種において相補配列へ導入された核酸のハイブリダイゼーションを含む。同様に、遺伝子修復、塩基または配列変化は、エキソンスキッピングを含む、ゲノムレベルおよびｍＲＮＡレベルで達成することができる。塩基または配列変化は、例えば、ＲＮＡ誘導性部位に特異的なＤＮＡ切断、トランス−スプライシング、トランス−スプライシングリボザイム、キメラプラスト、スプライソソーム媒介ＲＮＡトランス−スプライシングを利用する切り貼り機構、または、グループＩＩイントロンもしくは再標的化されたイントロンを利用すること、または、ウイルスにより媒介される挿入突然変異誘発を利用すること、もしくは原核、真核もしくはウイルス性インテグラーゼシステムを使用する標的化されたゲノム挿入を利用することにより達成することができる。核酸が、生体系の設計計画の担体であり、直接的および間接的な形式で多くの細胞プロセスに加わるので、理論上、あらゆる細胞プロセスは、外部から細胞内に核酸を導入することにより影響を受ける可能性がある。とりわけ、この導入は、細胞または器官培養物においてインビボおよびエクスビボで直接行い、続いて、このようにして修飾された器官または細胞のレシピエントへの移植を行うことができる。治療活性剤として核酸を有する、本発明の文脈での使用のための粒子は、上述の全ての目的に有用であり得る。
【００４８】
上述の通り、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、細胞または細胞近傍部のその機能が必要であるか、もしくは有益であるタンパク質もしくはその断片、例えば、その欠乏もしくは欠陥形態が疾患もしくは疾病の要因であり、その提供は疾患もしくは疾病を緩和もしくは予防することができるタンパク質、または、細胞もしくはその近傍部において体に有益であるプロセスを促進することができるタンパク質をコードするリボヌクレオチド配列を含有することができる。実際に、近年、ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）は、新規の薬物の実体と益々関連するようになっている。ＤＮＡに基づく遺伝子療法に対して、ｍＲＮＡは、核内に輸送される必要がないが、細胞質においてタンパク質に直接翻訳される（J Control Release, 2011, 150:238-247、およびEur J Pharm Biopharm, 2009, 71:484-489）。
【００４９】
さらに、単一遺伝子の突然変異により引き起こされる、多くの遺伝性障害は、知られており、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡの治療手段に対する候補である。嚢胞性線維症、血友病、および他の多くのような単一遺伝子の突然変異により引き起こされる障害は、ある特色が子孫で出現するであろう可能性について、優性または劣性であり得る。優性対立遺伝子が、対立遺伝子の１つのコピーのみを有する個体で表現型を示すのに対し、劣性対立遺伝子では、個体は、表現型を示すのに各親からの１つの２つのコピーを有する必要がある。対照的に、多遺伝子性障害は、２つ以上の遺伝子により引き起こされ、それぞれの疾患の発現は、多くの場合、穏やかであり、環境的な要因に関連する。多遺伝子性障害の例は、高血圧症、高レベルのコレステロール、がん、神経変性障害、精神疾患などである。また、これらの場合では、これらの遺伝子の１つまたは複数を表す治療的なＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、これらの患者に有益であり得る。さらに、遺伝性障害は、親の遺伝子から受け継がれてはならないが、新規の突然変異によっても引き起こされ得る。また、これらの場合では、正確な遺伝子配列を表す治療的なＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、その患者に有益であり得る。
【００５０】
それぞれの遺伝子およびこれらの表現型の記載と共に、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓの現在２２，９９３個のエントリを含むオンラインカタログは、ＯＮＩＭ（Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ）ウェブページ（ｈｔｔｐ：／／ｏｎｉｍ．ｏｒｇ）で利用可能であり、各々の配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）から利用可能である。非限定例として、以下の表２は、いくつかの先天的な疾患、および対応する遺伝子を列挙する。細胞のシグナル伝達経路の高度な相互作用により、ある種の遺伝子の突然変異は、多数の病原性症候群を引き起こし、そのうち特徴的なもののみを、表２に列挙する。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡでコードされる治療的タンパク質は、表２に列挙された細胞タンパク質から選ばれる。ゆえに、本発明のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ分子は、治療的な細胞タンパク質をコードしてもよく、コードされる治療的タンパク質は、表２に列挙されるもの、またはその相同体である。
【００５２】
本発明の別の実施形態では、本発明のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡでコードされる治療的タンパク質は、表２に列挙された分泌タンパク質から選ばれる。ゆえに、本発明のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、治療的な融合タンパク質をコードしてもよく、コードされた治療的タンパク質またはその相同体は、表２に列挙されるものであり、第二のタンパク質は、治療的タンパク質の分泌を可能にするシグナルペプチドである。シグナルペプチドは、短く、典型的には、５〜３０アミノ酸長であり、アミノ酸配列は、上記の治療的タンパク質のＮ末端で存在し、ある種の小器官（例えば、小胞体、ゴルジ体、またはエンドソーム）を介して細胞の分泌経路に対して融合タンパク質をもたらすアミノ酸配列である。ゆえに、このような融合タンパク質は、細胞から、もしくは細胞小器官から分泌されるか、または、細胞成分もしくは細胞の表面で細胞膜（例えば、マルチスパニングトランス−膜タンパク質）に挿入される。
【００５３】
ゆえに、本発明の好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、限定されないが、疾患を引き起こす、疾患に罹患しやすい、または疾患から保護する遺伝子の以下のタンパク質をコードすることができる。処置（または予防）することができる、このような障害の非限定例として、上記のポリペプチド、タンパク質、またはペプチドが、以下の表２に概説されるものからなる群から選択されるものが挙げられる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのコードする配列は、天然のタンパク質のものと等しいか、またはそれより大きいレベルで細胞活性を含む部分長または全長タンパク質に転写および翻訳することができる。いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、治療効果または予防効果を有する、治療的または薬学的に活性なポリペプチド、タンパク質、またはペプチドをコードし、上記のポリペプチド、タンパク質、またはペプチドは、以下の表２に概説されるものからなる群から選択される。ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ、より具体的にはそのコードする配列は、天然のタンパク質のものと等しいか、またはそれより小さいレベルで細胞活性を有する部分長または全長タンパク質を発現するために使用することができる。これは、ＲＮＡ分子の投与を示すことができる疾患の処置を可能にし得る。
【００５５】
【表２−１】
2021522228.tif 000007
【００５６】
【表２−２】
2021522228.tif 000008
【００５７】
【表２−３】
2021522228.tif 000009
【００５８】
【表２−４】
2021522228.tif 000010
【００５９】
【表２−５】
2021522228.tif 000011
【００６０】
【表２−６】
2021522228.tif 000012
【００６１】
【表２−７】
2021522228.tif 000013
【００６２】
【表２−８】
2021522228.tif 000014
【００６３】
上記の表２は、欠陥が、本発明のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡで処置することができる疾患をもたらす遺伝子の例を示し、ここで本発明のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、上記で開示される欠陥遺伝子の無傷型のタンパク質またはその機能的な断片をコードする、リボヌクレオチド配列を含む。特に好ましい実施形態では、遺伝性疾患は、例えば、ＳＰＢ（サーファクタントタンパク質Ｂ）欠損症、ＡＢＣＡ３欠損症、嚢胞性線維症、およびα１−アンチトリプシン欠損症のような、肺に影響を及ぼすもの、もしくは、血漿タンパク質に影響を及ぼすもの（例えば、先天的なヘモクロマトーシス（ヘプシジン欠損症）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＰＰ、ＡＤＡＭＴＳ１３欠損症）、ならびに凝固欠陥（例えば、血友病ＡおよびＢ）および補体欠陥（例えば、タンパク質Ｃ欠損症）、例えばＳＣＩＤ（ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＪＡＫ３、ＩＬ７Ｒ、ＣＤ４５、ＣＤ３δ、ＣＤ３εのような異なる遺伝子での突然変異により引き起こされる）のような免疫欠損を引き起こすもの、または、アデノシンデアミナーゼの欠乏による欠損症、例えば（ＡＤＡ−ＳＣＩＤ）、敗血症性肉芽腫症（例えば、ｇｐ−９１−ｐｈｏｘ遺伝子、ｐ４７−ｐｈｏｘ遺伝子、ｐ６７−ｐｈｏｘ遺伝子、もしくはｐ３３−ｐｈｏｘ遺伝子の突然変異により引き起こされる）、およびゴーシェ病、ファブリー病、クラッベ病、ＭＰＳ  Ｉ、ＭＰＳ  ＩＩ（ハンター症候群）、ＭＰＳ  ＶＩ、ＩＩ型グリコーゲン蓄積症、もしくはムコ多糖症のような蓄積症を挙げることができる。
本発明のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡが有用であり得る他の障害として、ＳＭＮ１関連脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；ＧＡＬＴ関連ガラクトース血症；嚢胞性線維症（ＣＦ）；シスチン尿症を含む、ＳＬＣ３Ａ１関連障害；アルポート症候群を含む、ＣＯＬ４Ａ５関連障害；ガラクトセレブロシダーゼ欠損症；Ｘ連鎖型副腎白質ジストロフィー、および副腎脊髄神経障害；フリードライヒ運動失調症；ペリツェウス−メルツバッヘル病；ＴＳＣ１およびＴＳＣ２関連結節性硬化症；サンフィリポＢ症候群（ＭＰＳ  ＩＩＩＢ）；ＣＴＮＳ関連シスチン症；脆弱Ｘ症候群、脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群および脆弱Ｘ早期閉経症候群を含む、ＦＭＲ１関連障害；プラダー−ウィリー症候群；遺伝性出血性末梢血管拡張症（ＡＴ）；Ｃ１型ニーマン−ピック病；若年型神経セロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬ）、若年型バッテン病、サンタブオリ−ハルティア病（Santavuori-Haltia disease）、ヤンスキー−ビールショースキー病、ならびにＰＴＴ−１およびＴＰＰ１欠損症を含む、神経セロイドリポフスチン関連疾患；中枢神経系髄鞘形成不全／白質消失を伴う、ＥＩＦ２Ｂ１、ＥＩＦ２Ｂ２、ＥＩＦ２Ｂ３、ＥＩＦ２Ｂ４、およびＥＩＦ２Ｂ５関連小児期運動失調症；ＣＡＣＮＡ１ＡおよびＣＡＣＮＢ４関連発作性運動失調症２型；古典的レット症候群、ＭＥＣＰ２関連重度新生児脳症、およびＰＰＭ−Ｘ症候群を含む、ＭＥＣＰ２関連障害；ＣＤＫＬ５関連非定形レット症候群；ケネディ病（ＳＢＭＡ）；皮質下梗塞および白質脳症を伴う、ノッチ−３関連常染色体優性脳動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）；ＳＣＮ１ＡおよびＳＣＮ１Ｂ関連痙攣障害；アルパース−ヒュッテンロッチャー症候群（Alpers-Huttenlocher syndrome）、ＰＯＬＧ関連感覚運動失調神経障害、構音障害、および眼麻痺、ならびにミトコンドリアＤＮＡ欠失を伴う常染色体優性および劣性進行性外眼筋麻痺を含む、ポリメラーゼＧ関連障害；Ｘ連鎖型副腎発育不全；Ｘ連鎖型無ガンマグロブリン血症；ファブリー病；ならびにウィルソン病などの障害が挙げられる。
【００６４】
これら全ての疾患では、タンパク質、例えば酵素は、欠損しており、欠陥遺伝子またはその機能的な断片によりコードされるタンパク質を利用可能にする、本発明の上記のタンパク質のいずれかをコードするＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡでの処置により処置することができる。転写物置換療法／酵素置換療法は、原因をなす遺伝子欠陥に影響を及ぼさないが、患者が不足している酵素の濃度を高める。例として、ポンペ病では、転写物置換療法／酵素置換療法は、欠損リソソーム酵素酸アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）を置換する。
【００６５】
ゆえに、本発明のｍＲＮＡによりコードすることができるタンパク質の非限定例は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、成長ホルモン（ソマトトロピン、ｈＧＨ）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、ＧＭ−ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＰＳ、タンパク質Ｃ、ヘプシジン、ＡＢＣＡ３、およびサーファクタントタンパク質Ｂのような増殖因子である。本発明によるＲＮＡで処置することができる疾患のさらなる例は、血友病Ａ／Ｂ、ファブリー病、ＣＧＤ、ＡＤＡＭＴＳ１３、ハーラー病、Ｘ染色体媒介Ａ−γ−グロブリン血症、アデノシンデアミナーゼ関連免疫不全、および新生児の呼吸窮迫症候群であり、ＳＰ−Ｂと結合する。特に好ましくは、本発明によるＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）、またはエリスロポエチンのコード配列を含有する。本発明による本発明のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡによりコードすることができるタンパク質のさらなる例は、ヒト成長ホルモンｈＧＨ、ＢＭＰ−２のような増殖因子、または血管形成因子である。
【００６６】
あるいは、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、例えば対象に対して免疫を与えるための治療環境で使用することができる、全長抗体またはより小さい抗体（例えば、重鎖および軽鎖の両方）をコードするリボヌクレオチド配列を含有し得る。相当する抗体、およびその治療適用は、当該技術分野で知られている。
別の実施形態では、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、生物学的標的（例えば、腫瘍壊死因子のような刺激サイトカイン）を標的化および／または不活性化するために有用であり得る機能的モノクローナルまたはポリクローナル抗体をコードすることができる。同様に、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ配列は、例えば、ＩＩ型膜性増殖性糸球体腎炎または急性溶血性尿毒症症候群の処置に有用な機能的抗ネフローゼ因子抗体をコードすることができるか、あるいは、がんのようなＶＥＧＦ媒介疾患の処置に有用な抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）抗体をコードすることができる。
【００６７】
あるいは、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、好ましくは治療環境で使用することができる抗原をコードする、リボヌクレオチド配列を含有し得る。
【００６８】
別の実施形態では、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、ゲノム編集技術で使用することができるポリペプチドまたはタンパク質をコードする、リボヌクレオチド配列を含有し得る。ゲノム編集は、ＤＮＡを、ヌクレアーゼを使用して、生物のゲノムに挿入、欠失、または置換する遺伝子工学の種類である。これらヌクレアーゼは、ゲノムの所望の位置での、部位に特異的な切断を起こす。誘導される切断は、非相同末端結合または相同組換えにより修復され、その結果、ゲノムの標的化された突然変異をもたらし、これによりゲノムを「編集する」。切断は、一本鎖切断または二本鎖切断（ＤＳＢ）のいずれかであり得るが、二本鎖切断（ＤＳＢ）が好ましい。異なるポリペプチドまたはタンパク質を利用する多くのゲノム編集システムは、当該技術分野で知られており、すなわち、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および転写活性化因子様エフェクター系ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ゲノム工学の方法は、Trends in Biotechnology, 2013, 31 (7), 397-405に概説されている。
【００６９】
ゆえに、好ましい実施形態では、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）タンパク質ファミリー、好ましくはＣａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）のポリペプチドまたはタンパク質をコードする、リボヌクレオチド配列を含有し得る。Ｃａｓタンパク質ファミリー、好ましくはＣａｓ９のタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく方法、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集技術で使用することができる。ゲノム編集、制御、および標的化に対するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、Nat. Biotechnol., 2014, 32(4):347-355に概説されている。
【００７０】
別の好ましい実施形態では、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、メガヌクレアーゼをコードする、リボヌクレオチド配列を含有し得る。メガヌクレアーゼは、「従来の」エンドデオキシリボヌクレアーゼと対照的に、大きな認識部位（例えば、１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）を認識するエンドデオキシリボヌクレアーゼである。結果として、それぞれの部位は、任意の所与のゲノムにおいて、数回のみ、好ましくは１回のみ起こる。したがって、メガヌクレアーゼは、最も具体的な天然に存在する制限酵素であるとみなされるので、ゲノム編集技術に適したツールである。
【００７１】
別の好ましい実施形態では、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする、リボヌクレオチド配列を含有する。ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを、ＤＮＡ切断ドメインに融合することにより生成される人工制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、具体的な所望のＤＮＡ配列を標的化するように操作することができ、これは、ジンクフィンガーヌクレアーゼが複合体ゲノム内の独特な配列を標的化することを可能にする。内在性ＤＮＡ修復機構を利用することにより、ＺＦＮは、高等生物のゲノムを正確に変更するために使用することができるので、ゲノム編集技術に適したツールである。
【００７２】
別の好ましい実施形態では、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）をコードする、リボヌクレオチド配列を含有し得る。ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡの特定の配列を切断するように操作することができる制限酵素である。ＴＡＬＥＮは、融合タンパク質であり、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインに融合する。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、実質的に任意の所望のＤＮＡ配列を結合するように操作することができる。ゆえに、ヌクレアーゼと組み合わせる場合、ＤＮＡは、具体的な所望の位置で切断することができる。
【００７３】
上記の代わりに、ＲＮＡは、タンパク質またはポリペプチドとして発現していない、リボヌクレオチド配列を含有する。ゆえに、用語ＲＮＡは、細胞内に導入される場合、ポリペプチド／タンパク質またはその断片に翻訳可能である、任意のポリヌクレオチド分子を意味するだけと理解されるべきではない。むしろ、ＲＮＡが、（機能性）ＲＮＡに転写されるだけのリボヌクレオチド配列を含有し、上記のＲＮＡは、最終生成物である（したがって、翻訳される必要がない）ことも熟慮される。本文脈では、ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ配列または別の所望のリボヌクレオチド配列に対する遺伝子情報を好ましくは提供する、リボヌクレオチド配列を含有することが想定される。
【００７４】
本発明の文脈での使用のための粒子が、１種類のＲＮＡを含むことができるが、あるいは例えば、単一粒子に２種類以上のＲＮＡを含む粒子の形態、または、そこに含有されるＲＮＡの種類が異なる粒子のブレンドの形態で、２種類以上のＲＮＡの組合せを含むこともできると理解されよう。
【００７５】
脂質組成物
本発明の第一の態様による組成物、および本発明の第三の態様による固体組成物は、ＲＮＡおよび脂質組成物を含む粒子を含む。
【００７６】
脂質組成物は、（ｉ−ａ）式（Ｉ）のコレステロール誘導体、またはその塩、（ｉ−ｂ）式（ＩＩ）のホスホグリセリド、またはその塩、および、（ｉ−ｃ）式（ＩＩＩ）のペグ化ホスホグリセリド、またはその塩を含む。さらなる脂質組成物は、存在し得るが、好ましくは、成分（ｉ−ａ）、（ｉ−ｂ）、および（ｉ−ｃ）は、粒子に含有される脂質組成物中の唯一の脂質成分である。
【００７７】
脂質組成物の成分（ｉ−ａ）は、式（Ｉ）のコレステロール誘導体、またはその塩である。
【００７８】
【化４】
2021522228.tif 000015
（式中、
ｎは、０または１であり、
Ｒ１は、−（ＣＨ２）ｑ−ＮＨ２基または−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ２基（式中、ｑ、ｒおよびｓは、独立して、２〜６の整数である）であり、
Ｒ２は、−（ＣＨ２）ｔ−ＮＨ２基または−（ＣＨ２）ｕ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ２基（式中、ｔ、ｕおよびｗは、独立して、２〜６の整数である）であり、
Ｒ３は、１〜４個の炭素原子を有する直鎖アルカンジイル基である）
【００７９】
この式の化合物およびその調製物は、例えば、米国特許第５，７８３，５６５号明細書に記載されている。
【００８０】
式（Ｉ）の整数ｎは、好ましくは０である。
【００８１】
整数ｑ、ｒ、ｓ、ｔ、ｕおよびｗは、好ましくは、独立して、３および４から選択される。
【００８２】
また、Ｒ１は、−（ＣＨ２）ｑ−ＮＨ２基であり、Ｒ２は、−（ＣＨ２）ｔ−ＮＨ２基もしくは−（ＣＨ２）ｕ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ２基であるか、またはＲ２は、−（ＣＨ２）ｔ−ＮＨ２基であり、Ｒ１は、−（ＣＨ２）ｑ−ＮＨ２基もしくは−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ２基であることが好ましい。両方の場合、ｎはまた、好ましくは０である。
【００８３】
式（Ｉ）のコレステロール誘導体の塩形態は、化合物がカチオン性電荷を有するように、酸を伴う化合物に含有されるアミノ基の１つまたは複数をプロトン化することにより生成することができる。理解されるであろう通り、プロトン化したアミノ基は、追加の水素原子が、カチオン性電荷を有する四価窒素が生じるように、アミノ基の窒素原子に結合するものである。式（Ｉ）の化合物に適した窒素原子は、−Ｎ（Ｒ１）（Ｒ２）基に含有される窒素原子、およびそれぞれＲ１およびＲ２に含有される窒素原子である。任意のプロトン化したアミノ基に対する対イオンとして作用するアニオンが、一般に、生理学的に許容されるアニオンであることは理解されよう。本発明の組成物では、式（Ｉ）の化合物は、典型的には、ＲＮＡの酸性基で塩を形成するであろう。しかし、他の対イオンは、排除されず、例として、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸、硝酸、リン酸、リン酸水素、リン酸二水素、炭酸、および炭酸水素のアニオンが挙げられる。
【００８４】
当業者には理解されるであろう通り、コレステロール誘導体としての式（Ｉ）の化合物は、好ましい式（Ｉａ）：
【００８５】
【化５】
2021522228.tif 000016
または、さらにより好ましい式（Ｉｂ）：
【００８６】
【化６】
2021522228.tif 000017
によって例示されることができる。
【００８７】
式（Ｉａ）および（Ｉｂ）では、式（Ｉ）に関して、上記で与えられたＲ１、Ｒ３、Ｒ３、およびｎの定義および好ましい定義を、継続して適用する。
【００８８】
脂質組成物の成分（ｉ−ａ）として最も好ましいのは、ＧＬ６７またはその塩であり、式（Ｉ）、（Ｉａ）および（Ｉｂ）に関して、ｎは、０であり、Ｒ１は、−（ＣＨ２）３−ＮＨ２基であり、Ｒ２は、−（ＣＨ２）４−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２基である。
【００８９】
脂質組成物の成分（ｉ−ｂ）は、式（ＩＩ）のホスホグリセリド、またはその塩である。
【００９０】
【化７】
2021522228.tif 000018
（式中、
Ｒ４は、１０〜２４個の炭素原子を有する直鎖アルキル基、または１〜３つの二重結合および１０〜２４個の炭素原子を有する直鎖アルケニル基であり、
Ｒ５は、１０〜２４個の炭素原子を有する直鎖アルキル基、または１〜３つの二重結合および１０〜２４個の炭素原子を有する直鎖アルケニル基である）
【００９１】
好ましくは、Ｒ４およびＲ５は、各々、１４〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルキル基であるか、または、各々、１または２つの二重結合および１４〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルケニル基である。より好ましくは、Ｒ４およびＲ５は、各々、１つの二重結合および１４〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルケニル基である。
【００９２】
式（ＩＩ）の化合物の塩形態は、式（ＩＩ）で示すＰ原子に結合した酸性−ＯＨ基のプロトンが、ここで示すアミノ基をプロトン化する、内部塩形態を含む。このような塩形態はまた、酸性−ＯＨ基により塩基と共に形成される塩、または、アミノ基により酸と共に形成される塩を含む。再び、塩が、一般に、薬学的に許容される塩であることは理解されよう。塩基と共に形成される塩として、ナトリウムまたはカリウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウムまたはマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、および、アンモニウム塩を挙げることができる。酸と共に形成される例示的な塩として、ＲＮＡの酸性基と共に形成される塩を挙げることができるが、他の塩は排除されず、塩化物塩、臭化物塩、またはヨウ化物塩のような鉱酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、またはリン酸二水素塩、炭酸塩、および炭酸水素塩を、例として挙げることができる。
【００９３】
脂質組成物の成分（ｉ−ｂ）として最も好ましいのは、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、またはその塩である。
【００９４】
脂質組成物の成分（ｉ−ｃ）は、式（ＩＩＩ）のペグ化ホスホグリセリド、またはその塩である。
【００９５】
【化８】
2021522228.tif 000019
（式中、
ｐは、５〜２００、好ましくは１０〜１７０、最も好ましくは１０〜１４０の整数であり、
Ｒ６は、１０〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルキル基、または１〜３つの二重結合および１０〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルケニル基であり、
Ｒ７は、１０〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルキル基、または１〜３つの二重結合および１０〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルケニル基である）
【００９６】
好ましくは、Ｒ６およびＲ７は、各々、１０〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルキル基であり、より好ましくは、Ｒ６およびＲ７は、各々、１０〜１６個の炭素原子を有する直鎖アルキル基である。
【００９７】
ゆえに、式（ＩＩＩ）で、Ｒ６およびＲ７が、各々、１０〜１６個の炭素原子を有する直鎖アルキル基であり、ｐが、１０〜１４０の整数であることもまた好ましい。
【００９８】
式（ＩＩＩ）の化合物の塩形態は、一般に、薬学的に許容される塩である。式（ＩＩＩ）の化合物の典型的な塩は、塩基と共に形成される塩であり、例えば、ナトリウムまたはカリウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウムまたはマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、および、アンモニウム塩を挙げることができる。
【００９９】
脂質組成物の成分（ｉ−ｃ）として極めて好ましいのは、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ（ＤＭＰＥ−ＰＥＧ）、またはその塩であり、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）部分は、１０〜１４０個の繰返し単位を含有する、すなわち、式（ＩＩＩ）に関して、この極めて好ましい実施形態では、Ｒ６およびＲ７は、各々、１３個の炭素原子を有する直鎖アルキル基であり、ｐは、１０〜１４０の整数である。成分（ｉ−ｃ）として最も好ましいのは、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ５０００（ＤＭＰＥ−ＰＥＧ５０００）、またはその塩であり、５０００は、約１１３のｐの平均値に相当する、ＰＥＧ部分の数平均分子量を示す。
【０１００】
ゆえに、本発明の文脈での使用のための特に好ましい脂質組成物が、
成分（ｉ−ａ）が、ＧＬ６７、またはその塩であり、
成分（ｉ−ｂ）が、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、またはその塩であり、および
成分（ｉ−ｃ）が、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ（ＤＭＰＥ−ＰＥＧ）、またはその塩（ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）部分が、１０〜１４０個の繰返し単位を含有する）であり、より好ましくは、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ５０００（ＤＭＰＥ−ＰＥＧ５０００）、またはその塩である
ものであることが理解されよう。
【０１０１】
本組成物の粒子に含有される脂質組成物では、成分（ｉ−ａ）、（ｉ−ｂ）、および（ｉ−ｃ）のモル比、すなわち、（ｉ−ａ）：（ｉ−ｂ）：（ｉ−ｃ）は、好ましくは１：（０．５〜５）：（０．０１〜１）、より好ましくは１：（１〜５）：（０．０１〜０．５）、最も好ましくは１：（１〜３）：（０．０２〜０．２）である。
【０１０２】
脂質組成物は、好ましくは、唯一の脂質成分として、成分（ｉ−ａ）、（ｉ−ｂ）、および（ｉ−ｃ）を含有する。
【０１０３】
上記と一致して、本発明の第一の態様による極めて好ましい組成物は、
（ｉ）液相に含有される粒子であって、粒子がｍＲＮＡおよび脂質組成物を含み、脂質組成物が、
（ｉ−ａ）ＧＬ６７、またはその塩、
（ｉ−ｂ）１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、またはその塩、および
（ｉ−ｃ）１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ（ＤＭＰＥ−ＰＥＧ）、またはその塩（ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）部分が、１０〜１４０個の繰返し単位を含有する）であり、より好ましくは、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ５０００（ＤＭＰＥ−ＰＥＧ５０００）、またはその塩
を、成分（ｉ−ａ）：（ｉ−ｂ）：（ｉ−ｃ）のモル比が１：（１〜３）：（０．０２〜０．２）で、含む、粒子、ならびに
（ｉｉ）１，２−プロパンジオール
を含む、ものである。
【０１０４】
同様に、本発明の第三の態様の極めて好ましい実施形態は、（ｉ）ＲＮＡ、および上記の極めて好ましい脂質組成物を含む、粒子、ならびに（ｉｉ）１，２−プロパンジオールを含む、固体組成物であって、上記の極めて好ましい組成物を凍結することにより得られる、固体組成物に関する。
【０１０５】
粒子
本発明の第一の態様による組成物、および本発明の第三の態様による固体組成物は、上述のＲＮＡおよび脂質組成物を含む、粒子を含む。
【０１０６】
粒子は、典型的には、ＲＮＡおよび脂質組成物を含む、ナノ粒子、または、ＲＮＡおよび脂質組成物を含む、マイクロ粒子を含む。当業者に理解されるであろう通り、「または（ｏｒ）」は、別段の具体的な指示がない限り、非排他的に本文脈において使用される。ゆえに、ナノまたはマイクロ粒子への言及は、ナノ粒子を含有する組成物、マイクロ粒子を含有する組成物、ならびに、ナノ粒子およびマイクロ粒子の両方を含有する組成物を包含する。本明細書に記載される通り、用語、ナノ粒子とは、一般に、ナノメーターのサイズ範囲の直径、すなわち、１ｎｍ以上、１０００ｎｍ未満の直径の粒子を指す。用語、マイクロ粒子とは、一般に、マイクロメーターのサイズ範囲の直径、すなわち、１０００ｎｍ以上、１００μｍ以下の直径の粒子を指す。好ましくは、粒子は、ＲＮＡおよび脂質組成物を含む、ナノ粒子、または、ＲＮＡおよび脂質組成物を含む、マイクロ粒子からなる。
【０１０７】
本発明による組成物に含有される粒子は、好ましくは１〜５０００ｎｍ、より好ましくは１０〜４０００ｎｍ、最も好ましくは５０〜３０００ｎｍの範囲の平均粒径を示す。
【０１０８】
本発明による組成物での単一粒子の直径の上限値は、好ましくは２０μｍ、より好ましくは１０μｍ、最も好ましくは５μｍである。ゆえに、上記から理解されるであろう通り、極めて好ましい粒子製剤は、５０〜３０００ｎｍの範囲の平均粒径のものであり、最大粒径が５μｍである粒子であろう。
【０１０９】
本明細書で言及されるナノまたはマイクロ粒子製剤の粒径および平均粒径は、動的光散乱（ＤＬＳ）を介して、簡便に測定することができる。一般に、本明細書で言及される直径および平均直径は、動的光散乱を介して測定される懸濁されている状態での粒子の流体力学的直径として示される。温度の効果が、結果を報告する際に測定機器（例えばＭａｌｖｅｒｎ  ＺｅｔａＳｉｚｅｒ）により考慮されるので、測定された直径は、一般に、温度依存性ではない。しかし、測定は、典型的には、室温（２５℃）で行われる。ＤＬＳ測定用の懸濁媒体として、例えば、水、または１，２−プロパンジオールを含有する水を、適宜、使用することができる。凍結した固体組成物の場合、粒径は、典型的には、組成物を解凍した後に測定される。平均粒子サイズまたは平均粒径が示される場合、平均は、典型的には、別段の指示がない限りｚ平均である。
【０１１０】
本発明による組成物に含有される粒子では、ＲＮＡの酸性基は、典型的には、アニオン性ＲＮＡ分子およびカチオン性脂質分子が相互作用できるように、脂質製剤に含有されるアミノ基をプロトン化し、好ましくは、結果として、ＲＮＡ分子と脂質分子との間の複合体を形成する。
【０１１１】
脂質組成物における、式（Ｉ）のコレステロール誘導体由来の窒素原子Ｎの数の、ＲＮＡにおける、リン酸基Ｐの数に対するＮ／Ｐ比は、好ましくは１〜１００、より好ましくは１〜３０、最も好ましくは２〜２０の範囲である。
【０１１２】
好ましくは、粒子は、リポソーム、または脂質ナノ粒子の形態を有する。
【０１１３】
上記と一致して、本発明の第一の態様による極めて好ましい組成物は、
（ｉ）液相に含有されるナノまたはマイクロ粒子であって、ナノまたはマイクロ粒子がｍＲＮＡおよび脂質組成物を含み、脂質組成物が、
（ｉ−ａ）ＧＬ６７、またはその塩、
（ｉ−ｂ）１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、またはその塩、および
（ｉ−ｃ）１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ（ＤＭＰＥ−ＰＥＧ）、またはその塩（ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）部分が、１０〜１４０個の繰返し単位を含有する）であり、より好ましくは、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ５０００（ＤＭＰＥ−ＰＥＧ５０００）、またはその塩
を、成分（ｉ−ａ）：（ｉ−ｂ）：（ｉ−ｃ）のモル比が１：（１〜３）：（０．０２〜０．２）で、含み、
脂質組成物における、式（Ｉ）のコレステロール誘導体由来の窒素原子Ｎの数の、ｍＲＮＡにおける、リン酸基Ｐの数に対するＮ／Ｐ比が、２〜２０である、
ナノまたはマイクロ粒子、ならびに
（ｉｉ）１，２−プロパンジオール
を含む、ものである。
【０１１４】
同様に、本発明の第三の態様の極めて好ましい実施形態は、（ｉ）先の段落で挙げたＲＮＡ、および脂質組成物を含む、ナノまたはマイクロ粒子、ならびに（ｉｉ）１，２−プロパンジオールを含む、固体組成物であって、上記の極めて好ましい組成物を凍結することにより得られる、固体組成物に関する。
【０１１５】
ＲＮＡおよび脂質組成物に加えて、本発明による組成物での粒子は、１つまたは複数の追加成分、例えば、典型的に、薬学的に許容される成分である賦形剤または添加剤を含むことができる。例えば、このような追加成分は、患者に投与した後、特定部位への輸送を容易にするか、もしくは粒子の特定部位へのさらなる取込みを促進することができるか、または、粒子もしくはそこに含有される治療活性剤の安定化を助けることができる。
【０１１６】
ＲＮＡおよび脂質組成物の他に、本発明の第一および第三の態様による組成物に含有される粒子は、治療剤の送達の間に、好ましくは細胞へ、および細胞内に治療剤としてのリボ核酸の送達の間に、１つまたは複数の任意の添加剤として、エフェクター機能を発揮させる１つまたは複数の成分を含むことができる。このような成分は、限定されないが、ポリアニオン、さらなる脂質、遮蔽オリゴマーまたはポリマー、ポロキサマー（プルロニック（登録商標）としても公知）、ポロキサミン、標的化リガンド、エンドソーム溶解性（endosomolytic）薬剤、細胞透過性及びシグナルペプチド、磁性および非磁性ナノ粒子、ＲＮＡｓｅ阻害剤、蛍光色素、医療用イメージングのための放射性同位元素または造影剤であり得る。用語「エフェクター機能」は、生物学的標的でのもしくは生物学的標的内の、または生物学的標的の周囲の組成物の治療活性剤の意図した生物学的な効果を達成する助けとなる、任意の機能を包含する。例えば、核酸送達のための組成物は、スタッファ材としての非コード核酸または非核酸ポリアニオンを含むように製剤化されている（Kichler et al. 2005, J Gene Med, 7, 1459-1467）。このようなスタッファ材を含まない、より高用量の核酸で得られる効果の程度または度合いを維持しながら、意図した生物学的効果を有する核酸の用量を減らすのに、このようなスタッファ材は適している。非核酸ポリアニオンはまた、低い毒性での長期的なインビボでの遺伝子発現を得るために使用されている（Uchida et al. 2011, J Control Release, 155, 296-302）。
【０１１７】
リボ核酸とカチオン性賦形剤との複合体を含む粒子製剤に有用な成分であり得る、文献に記載された他の例示的な遮蔽ポリマーとして、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ：Noga et al. Journal of Controlled Release, 2012. 159(1): 92-103）、ＰＡＳ−／ＰＡ−ポリペプチド（Ｐｒｏ，Ａｌａ，Ｓｅｒ（またはＰｒｏ、Ａｌａ）ポリペプチド：Schlapschy et a. Protein Eng Des Sel. 2013 Aug;26(8):489-501）、またはポリサルコシン（Ｐｓａｒ：Heller et al. Macromol Biosci 2014; 14: 1380-1395）が挙げられる。
【０１１８】
標的化リガンドは、例えば、標的細胞の優先的で改善されたトランスフェクションに対する、リボ核酸送達のための粒子製剤において有用であり得る（Philipp and Wagner in "Gene and Cell Therapy - Therapeutic Mechanisms and Strategy", 3rd Edition, Chapter 15. CRC Press, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton 2009）。標的化リガンドは、本発明の組成物に、標的認識および／または標的結合機能を、直接的または間接的に付与する任意の化合物であり得る。例示的な標的化リガンドは、イロプロスト、またはトレプロスチニルのような、国際公開第２０１１／０７６３９１号パンフレットで開示されるプロスタサイクリン類似体である。抗体はまた、標的化リガンドとして作用することができる。粒子のリガンドとして、葉酸およびＮ−アセチルガラクトサミンを挙げることができる。最も一般的な用語では、標的は、標的化リガンドが分子相互作用を介して特異的に結合することができる、明瞭な生物学的構造であり、このような結合は、最終的に、標的組織内、および／または標的細胞での、もしくは標的細胞内の組成物に含まれる、核酸のような治療剤の優先的な蓄積をもたらすであろう。標的化リガンドは、例えば、遮蔽ポリマーの末端にカップリングすることができる。
【０１１９】
さらに、エンドソーム溶解性ペプチドのようなエンドソーム溶解性薬剤（Plank et al. 1998, Adv Drug Deliv Rev, 34, 21-35）、またはエンドサイトーシスされた核酸のエンドソーム放出を向上させるのに適した任意の他の化合物は、本発明の組成物の有用な成分である。同様に、細胞透過性ペプチド（別の文脈ではタンパク質伝達ドメインとしても公知）（Lindgren et al. 2000, Trends Pharmacol Sci, 21, 99-103）は、核酸の細胞内送達を媒介するために、本発明の組成物の有用な成分であり得る。いわゆるＴＡＴペプチドは、このクラスに含まれ、核局在化機能も有する（Rudolph et al. 2003, J Biol Chem, 278, 11411-11418）。
【０１２０】
好ましくは、粒子は、粒子製剤中の粒子の総重量に対する治療活性剤としてのＲＮＡの重量として表される、０．１〜９５％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．５〜８０％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは１〜５０％（ｗ／ｗ）の範囲の活性負荷を有する。
【０１２１】
粒子および１，２−プロパンジオールを含む、組成物
本発明の第一の態様による組成物、および本発明の第三の態様による固体組成物は、ＲＮＡおよび脂質組成物を含む粒子を、１，２−プロパンジオールと共に含む。理解されるであろう通り、ＲＮＡ、脂質組成物、およびそれらを含む粒子の適切で好ましい実施形態に関する上記の情報は、以下の説明の本文脈で継続して適用する。
【０１２２】
本発明の第一の態様による組成物が、治療活性剤としてＲＮＡを含有し、患者への治療活性剤の投与に適しているので、治療組成物または医薬組成物と称すことができる。
【０１２３】
液相にＲＮＡおよび脂質組成物を含む、粒子を含む、本発明の第一の態様による組成物では、ＲＮＡおよび脂質組成物を含む、粒子は、好ましくは、液相に分散している。用語「分散している」で示唆される通り、粒子は、この場合、連続液相中に不連続な相を形成する。一般に、分散体は、１つの連続液相と、そこで不連続相として分散しているＲＮＡおよび脂質組成物を含む粒子との二相分散体として提供されるのが好ましい。
【０１２４】
ＲＮＡおよび脂質組成物を含む粒子が、液相に含有される本発明の第一の態様による組成物は、好ましくは、組成物の総体積を基準として、０．０１〜５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０２〜３０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で粒子に含有されるＲＮＡを提供するような量で、粒子を含む。
【０１２５】
典型的には、１，２−プロパンジオールは、本発明の第一の態様による組成物の液相での追加成分として含有され、ここでＲＮＡおよび脂質組成物を含む、粒子は含有され、好ましくは懸濁されている。１，２−プロパンジオールは、好ましくは、液相に溶解している。しかし、これは、液相に含有される粒子にも部分的に関連する可能性もある。
【０１２６】
液相に含有される粒子を含む、本発明の第一の態様による組成物では、１，２−プロパンジオールは、好ましくは、０．１〜５０％ｗ／ｖ、より好ましくは０．２〜３０％ｗ／ｖ、最も好ましくは０．３〜２０％ｗ／ｖの濃度で表され、百分率値は、組成物の総体積の１００ｍｌ当たりの１，２−プロパンジオールの重量ｇを示す。
【０１２７】
粒子が含有され、好ましくは分散している液相は、典型的には、溶媒として水を含有する。好ましくは５０体積％以上、より好ましくは７０体積％以上（２０℃での液相の総体積を基準として）は、水で構成される。より好ましくは、水および１，２−プロパンジオールは、液相に含有される唯一の溶媒である。
【０１２８】
液相の例示的な追加の任意の添加剤として、塩、糖、有機溶媒、および緩衝液から選択される１つまたは複数を挙げることができる。薬学的、または生物学的適用で従来使用される緩衝液を、使用することができる。
【０１２９】
本発明の第三の態様による固体組成物は、凍結して固体組成物を得ることができる組成物と同じ成分を含有する。ゆえに、上記で提供されるＲＮＡ、脂質組成物、ＲＮＡおよび脂質組成物を含む粒子、１，２−プロパンジオール、ならびに、液相およびその成分の適切で好ましい実施形態に関する情報は、液相を含む組成物および固体組成物に等しく適用される。しかし、当業者に理解されるであろう通り、液相は、固体組成物で凝固している。その分、固体組成物は、好ましくは、凍結液体の連続固相において治療剤の粒子製剤の分散体を含有する。上記と一致して、１，２−プロパンジオールは、好ましくは、粒子製剤が分散している連続層に含有される。
【０１３０】
上記と一致して、本発明の第一の態様による極めて好ましい組成物は、
（ｉ）溶媒として水を含む液相に分散しているナノまたはマイクロ粒子であって、ナノまたはマイクロ粒子がｍＲＮＡおよび脂質組成物を含み、脂質組成物が、
（ｉ−ａ）ＧＬ６７、またはその塩、
（ｉ−ｂ）１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、またはその塩、および
（ｉ−ｃ）１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ（ＤＭＰＥ−ＰＥＧ）、またはその塩（ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）部分が、１０〜１４０個の繰返し単位を含有する）であり、より好ましくは、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ５０００（ＤＭＰＥ−ＰＥＧ５０００）、またはその塩
を、成分（ｉ−ａ）：（ｉ−ｂ）：（ｉ−ｃ）のモル比が１：（１〜３）：（０．０２〜０．２）で、含み、
脂質組成物における、式（Ｉ）のコレステロール誘導体由来の窒素原子Ｎの数の、ｍＲＮＡにおける、リン酸基Ｐの数に対するＮ／Ｐ比が、２〜２０である、
ナノまたはマイクロ粒子、ならびに
（ｉｉ）液相での追加成分としての１，２−プロパンジオールであって、ナノまたはマイクロ粒子が懸濁しており、
組成物が、組成物の総体積を基準として、０．３〜２０％ｗ／ｖの１，２−プロパンジオールの量で、１，２−プロパンジオールを含有する、１，２−プロパンジオール
を含有する、ものである。
【０１３１】
同様に、本発明の第三の態様の極めて好ましい実施形態は、（ｉ）先の段落で挙げたＲＮＡおよび脂質組成物を含む、ナノまたはマイクロ粒子、ならびに（ｉｉ）１，２−プロパンジオールを含む、固体組成物であって、上記の極めて好ましい組成物を凍結することにより得られる、固体組成物に関する。
【０１３２】
薬学的適用
既に上述した通り、ＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子は、上で定義されたように本発明による組成物中に存在するが、医療環境、およびある特定の疾患の処置、特にＲＮＡに基づく療法に特に有用である。ゆえに、ＲＮＡ分子を含む本発明による組成物は、医薬組成物として適している。
【０１３３】
特に、本発明の第一の態様による組成物は、対象への投与に適している。ゆえに、ここに含有されるＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡはまた、対象に送達することができる。組成物の投与の好ましい経路は、気道へ、または気道を介する投与、特に、経肺投与または経鼻投与である。
【０１３４】
しかし、本発明の第一の態様による組成物がまた、治療活性剤の粒子製剤の分野で公知の投与の他の経路、例えば、分散体の形態での静脈内投与を介して投与することができることは、当業者には理解されよう。
【０１３５】
液体に含有される粒子を含む組成物からエアゾール剤を形成するため、または、このような組成物を噴霧するためのデバイスは、当該技術分野で知られており、市販されている。本発明の第一の態様による組成物の、気道へ、または気道を介する投与、特に、経肺投与を達成するために、これらを使用することができる。鼻を介する投与に対して、例えば、鼻噴デバイスまたは経鼻注入を使用することができる。
【０１３６】
ゆえに、本発明のさらなる態様は、液体に含有される粒子状組成物からエアゾール剤を形成するための、または、このような組成物を噴霧するためのデバイスであって、本発明の第一の態様による組成物を含む、デバイスに関する。デバイスは、好ましくは、定量吸入器、ネブライザー、および鼻噴射デバイスから選択される吸入器である。
【０１３７】
対象へのこのような投与を介して、粒子に含有されるＲＮＡは、気道内の、または気道を介して標的細胞に送達することができる。用語「標的細胞に送達される」とは、好ましくは、細胞内への、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡの転移を意味する。
【０１３８】
組成物は、適した用量で対象に投与することができる。投与量レジメンは、担当医および臨床的要因により決定されるであろう。医療技術分野で周知であるであろう通り、任意の１つの対象に対する投与量は、対象のサイズ、対表面積、年齢、投与される粒子化合物、性別、投与の時間および経路、全身の健康、ならびに同時に投与している他の薬物を含む、多くの要因に依存する。治療的活性物質の典型的な用量は、例えば、１ｎｇ〜数グラムの範囲であり得る。発現または発現の阻害のための（ｍ）ＲＮＡの投与量は、この範囲に相当すべきであるが、この例示的な範囲より少ないまたは多い用量は、とりわけ前述の要因を考慮して想定される。一般に、医薬組成物の定期的な投与としてのレジメンは、一日当たり、体重１キログラム当たりに０．０１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲であるべきである。また、レジメンが持続注入である場合、それぞれ、体重１キログラム当たりに１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲でもあるべきである。経過は、定期的な評価によりモニタリングすることができる。投与量は、様々であるであろうが、本発明の組成物の構成成分としての（ｍ）ＲＮＡの投与に関する好ましい投与量は、（ｍ）ＲＮＡ分子のおよそ１０６〜１０１９コピーである。
【０１３９】
また、本発明で利用可能なのは、処置の方法であって、好ましくは気道へ、または気道を介する投与を介して、より好ましくは経肺投与または経鼻投与を介して、患者に本発明の第一の態様による組成物を投与することを含む、方法である。ゆえに、上記の組成物に含有されるＲＮＡは、予防効果または治療効果をもたらすことができる。とりわけ、用語「患者」とは、動物およびヒトを含む。
【０１４０】
本発明、特に本発明の第一の態様の組成物を対象に投与することにより、疾患は、処置または予防することができる。用語「疾患」とは、本発明の組成物を利用することにより処置、予防またはワクチン接種することができる、考えられる任意の病理学的状態を指す。上記の疾患は、例えば、先天性、後天性、感染性もしくは非感染性、加齢性、心血管性、代謝性、腸内、新生物（特にがん）、または遺伝性であり得る。疾患は、例えば、例として生物の遺伝的器官、化学物質または放射線への曝露のような行動的、社会的または環境的な要因に同様に基づくことができる生物内の生理学的プロセス、分子プロセス、生化学反応の不規則さに基づくことができる。
【０１４１】
本明細書で使用される用語「処置」または「処置すること」とは、一般に、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。したがって、本発明の処置は、ある種の疾患の（急性）状態の処置に関するが、疾患またはその症状を完全または部分的に防ぐことに関する予防的処置にも関する。好ましくは、用語「処置」とは、疾患および／または副作用および／または疾患に起因する症状を部分的または完全に治療することに関して、治療的であるとして理解されるべきである。「急性」とは、この点で、対象が疾患の症状を示すことを意味する。換言すると、処置される対象は、処置が実際に必要になっており、用語「急性処置」とは、本発明の文脈では、疾患の発症または疾患の発生後に、疾患を実際に処置するためにとられる措置に関する。処置はまた、予防的処置または防止的処置、例えば、感染および／または疾患の発症を防ぐために、すなわち、疾患予防のためにとられる措置であり得る。治療的進歩は、定期的な評価によりモニタリングすることができる。
【０１４２】
一般に、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、本発明による組成物に有効量で含まれる。用語「有効量」とは、医薬組成物を投与する対象への検出可能な治療応答を誘導するのに十分な量を指す。上記によって、医薬組成物での本発明の上記の第一の態様によるＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡの含量は、上述の処置に有用であれば限定されない。上記の通り、本発明の第一の態様による組成物は、ＲＮＡおよび脂質組成物を含む粒子が、液相に含有されるが、好ましくは、組成物の総体積を基準として、０．０１〜５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０２〜３０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で粒子に含有されるＲＮＡを提供するような量で、粒子を含む。
【０１４３】
本発明によって、用語「医薬組成物」とは、対象への投与のための、本発明による組成物、特に本発明の第一の態様による組成物に関する。例示的な対象として、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、齧歯類、例えばラット、マウスおよびモルモット、または、霊長類、例えばゴリラ、チンパンジーおよびヒトのような哺乳動物が挙げられる。最も好ましい実施形態では、対象は、ヒトである。
【０１４４】
本発明の医薬組成物は、ＲＮＡに基づく療法で使用することができる。上述の通り、ＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子は、タンパク質をコードする配列を含むので、ＲＮＡに基づく療法で使用することができ、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、治療効果または予防効果を有する、治療的または薬学的に活性なポリペプチドまたはタンパク質をコードする。ゆえに、好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、上記の表２に記載の疾患の処置または予防において、ＲＮＡに基づく療法で使用することができる。したがって、本発明によるＲＮＡに基づく療法は、上記の表２に記載の疾患の処置または予防で使用することができる。
【０１４５】
ゆえに、本発明の医薬組成物は、上記の表２に記載の遺伝子欠陥が、次いで、本発明のＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子での転写物置換療法／酵素置換療法により処置または予防することができる疾患をもたらす場合、ＲＮＡに基づく療法で使用することができ、ここでＲＮＡ分子は、開示される欠陥遺伝子を補償する無傷型のタンパク質またはその機能的な断片をコードする。
【０１４６】
他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本発明によって、ＲＮＡに基づく療法で使用することができ、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、治療効果または予防効果を有する、治療的または薬学的に活性なポリペプチド、タンパク質、またはペプチドをコードし、ここで上記のポリペプチド、タンパク質、またはペプチドは、表２に概説する遺伝子によりコードされる群から選択される。
【０１４７】
本発明の医薬組成物は、肺疾患の処置または予防において、ＲＮＡに基づく療法での使用に特に適している。例示的な疾患として、上記の表２に記載の、アルファ−１−アンチトリプシン、喘息、嚢胞性線維症、サーファクタント代謝機能不全、または原発性線毛機能不全を挙げることができる。
【０１４８】
他の例示的な実施形態では、本発明の医薬組成物は、リソソーム疾患、例えば、ゴーシェ病、ファブリー病、ＭＰＳ  Ｉ、ＭＰＳ  ＩＩ（ハンター症候群）、ＭＰＳ  ＶＩおよびグリコーゲン蓄積症、例として例えば、Ｉ型グリコーゲン蓄積症（フォンギールケ病）、ＩＩ型（ポンペ病）、ＩＩＩ型（コーリ病）、ＩＶ型（アンダーセン病）、Ｖ型（マッカードル病）、ＶＩ型（ハース病）、ＶＩＩ型（タウリ病）、ＶＩＩ型、ＩＸ型、Ｘ型、ＸＩ型（ファンコニ−ビッケル症候群）、ＸＩ型、または０型の処置または予防において、ＲＮＡに基づく療法で使用することができる。転写物置換療法／酵素置換療法は、有益に、原因をなす遺伝子欠陥に影響を及ぼさないが、患者が欠損している酵素の濃度を高める。例として、ポンペ病では、転写物置換療法／酵素置換療法は、欠損リソソーム酵素酸アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）を置換する。
【０１４９】
さらなる例によると、本発明によるＲＮＡに基づく療法は、がん、心血管疾患、ウイルス感染、免疫機能不全、自己免疫疾患、神経学的障害、先天性代謝障害、もしくは遺伝性障害、または、細胞で産生されるタンパク質もしくはタンパク質断片が、本特許に関して有益な効果を有することができる任意の疾患の処置で使用することができる。がんの例として、頭頚部がん、乳がん、腎がん、膀胱がん、肺がん、前立腺がん、骨がん、脳がん、子宮頚部がん、肛門がん、結腸がん、結腸直腸がん、虫垂がん、眼のがん、胃がん、白血病、リンパ腫、肝がん、皮膚がん、卵巣がん、陰茎がん、膵がん、精巣がん、甲状腺がん、膣がん、外陰部がん、子宮内膜がん、心臓がん、および肉腫が挙げられる。心血管疾患の例として、アテローム性動脈硬化、冠動脈性心疾患、肺性心疾患、および心筋症が挙げられる。免疫機能不全および自己免疫疾患の例として、限定されないが、リウマチ性疾患、多発性硬化症、および喘息が挙げられる。ウイルス感染の例として、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、ならびにＢ型およびＣ型肝炎ウイルスの感染が挙げられる。神経学的障害の例として、限定されないが、パーキンソン病、多発性硬化症、および認知症が挙げられる。先天性代謝障害の例として、限定されないが、ゴーシェ病、およびフェニルケトン尿症が挙げられる。
【０１５０】
調製の方法
液相に核酸および脂質組成物を含む粒子の提供に適した技術は、当業者には利用可能であり、本発明の第一の態様による組成物を生成するために適応することができ、粒子は、上述の脂質組成物と共にＲＮＡを含む。
【０１５１】
例えば、ＲＮＡおよび脂質組成物を含む粒子としてのリポソームは、脂質膜の再水和のような、脂質組成物の再水和と、必要な場合、それに続く、例えば超音波処理または押出のようなホモジナイズ技術を介して、簡便に生成することができる。代替的な手法は、有機溶媒に溶解している脂質組成物の、水または水溶液への注入である。例えば、脂質ナノ粒子の形成のために信用することができる例示的な方法として、溶媒置換法を挙げることができる。
【０１５２】
粒子が液相に含有される、本発明による組成物の提供のための代替的な方法として、粒子のナノ沈殿のような沈殿法を挙げることができる。
【０１５３】
１，２−プロパンジオールは、ＲＮＡおよび脂質組成物を含む粒子を含有するか、または粒子を生成する液相に、簡便に添加することができる。１，２−プロパンジオールの液相への添加は、液相にＲＮＡおよび脂質組成物を含む粒子を生成する前、生成する間、または生成した後を含む、様々な段階の１つまたは複数で達成することができる。
【０１５４】
ゆえに、上記の通り、本発明のさらなる態様は、本発明の第一の態様による組成物の調製のための方法であって、
ａ）有機溶媒中の脂質組成物の成分を溶解し、混合して、続いて脂質組成物を凍結乾燥するステップ、
ｂ）水を添加することにより、凍結乾燥された脂質組成物を再水和するステップ、
ｃ）再水和された脂質組成物をＲＮＡの水溶液と組み合わせて、液相に含有されるＲＮＡおよび脂質組成物を含む粒子を形成することを可能にするステップ、ならびに
ｄ）１，２−プロパンジオールを添加するステップ
を含む、方法に関する。
【０１５５】
１，２−プロパンジオールの添加は、例えば、ステップｂ）において水と共に添加することにより、ステップｂ）に続いて再水和された脂質組成物にそれを添加することにより、ステップｃ）においてＲＮＡの水溶液と共にそれを添加することにより、または、ステップｃ）に続いてそれをＲＮＡおよび脂質組成物を含む粒子が含有される液相に添加することにより、簡便に達成することができる。添加が、１ステップ、または多数のステップにおいて、例えば、プロセスの異なる段階で行われ得ることは理解されよう。
【０１５６】
本発明の第三の態様による固体組成物は、
ａ）有機溶媒中の脂質組成物の成分を溶解し、混合して、続いて脂質組成物を凍結乾燥するステップ、
ｂ）水を添加することにより、凍結乾燥された脂質組成物を再水和するステップ、
ｃ）再水和された脂質組成物をＲＮＡの水溶液と組み合わせて、液相に含有されるＲＮＡおよび脂質組成物を含む粒子を形成することを可能にするステップ、ならびに
ｄ）１，２−プロパンジオールを添加するステップ
を含む方法により、上記の第一の態様による組成物を調製する、第一のステップ、
ならびに、第一のステップで得られる組成物を凍結する、第二のステップ
を含む、方法により調製することができる。
【０１５７】
本方法でもまた、１，２−プロパンジオールの添加は、例えば、ステップｂ）においてそれを水と共に添加することにより、ステップｂ）に続いて再水和された脂質組成物にそれを添加することにより、ステップｃ）においてＲＮＡの水溶液と共にそれを添加することにより、または、ステップｃ）に続いてそれをＲＮＡおよび脂質組成物を含む粒子が含有される液相に添加することにより、簡便に達成することができる。添加が、１ステップ、または多数のステップにおいて、例えば、プロセスの異なる段階で行われ得ることは理解されよう。
【０１５８】
第二のステップとしての凍結するステップは、典型的には、適した容器で、懸濁組成物を、十分に冷たい温度（例えば、−１０℃以下、好ましくは−２０℃以下）に供することにより達成する。冷媒として、例えば、冷たい空気または冷たい液体を使用することができる。
【０１５９】
ところで、上記で説明した通り、本発明の第三の態様による固体組成物は、ＲＮＡを含む粒子を保管することを可能にする組成物である。その分、本発明の第一の態様による組成物がまた、本発明の第三の態様による固体組成物から、固体組成物を解凍することにより回収することができることは理解されよう。
【０１６０】
ゆえに、さらなる態様として、本発明はまた、上記の第一の態様による組成物の調製のための方法であって、
ａ）有機溶媒中の脂質組成物の成分を溶解し、混合して、続いて脂質組成物を凍結乾燥するステップ、
ｂ）水を添加することにより、凍結乾燥された脂質組成物を再水和するステップ、
ｃ）再水和された脂質組成物をＲＮＡの水溶液と組み合わせて、液相に含有されるＲＮＡおよび脂質組成物を含む粒子を形成することを可能にするステップ、ならびに
ｄ）１，２−プロパンジオールを添加するステップ
を含む方法により、上記の第一の態様による組成物を調製する、第一のステップ、
第一のステップで得られる組成物を凍結する、第二のステップ
ならびに、第二のステップで得られる凍結した組成物を解凍する、第三のステップ
を含む、方法を提供する。
【０１６１】
本発明の重要な態様の概要は、以下の項目で提供される。例えば、さらに好ましい実施形態または任意の特徴に関して、本明細書の先行部分で提供される情報も以下の項目に適用するために、これらの項目が、本発明の一般的な開示の部分を形成することが理解されよう。
【０１６２】
１．（ｉ）液相に含有される粒子であって、粒子がＲＮＡおよび液体組成物を含み、液体組成物が、
（ｉ−ａ）式（Ｉ）のコレステロール誘導体、またはその塩：
【０１６３】
【化９】
2021522228.tif 000020
（式中、
ｎは、０または１、好ましくは０であり、
Ｒ１は、−（ＣＨ２）ｑ−ＮＨ２基または−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨ２基（式中、ｑ、ｒおよびｓは、独立して、２〜６の整数である）であり、
Ｒ２は、−（ＣＨ２）ｔ−ＮＨ２基または−（ＣＨ２）ｕ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ２基（式中、ｔ、ｕおよびｗは、独立して、２〜６の整数である）であり、
Ｒ３は、１〜４個の炭素原子を有する直鎖アルカンジイル基である）、
（ｉ−ｂ）式（ＩＩ）のホスホグリセリド、またはその塩：
【０１６４】
【化１０】
2021522228.tif 000021
（式中、
Ｒ４は、１０〜２４個の炭素原子を有する直鎖アルキル基、または１〜３つの二重結合および１０〜２４個の炭素原子を有する直鎖アルケニル基であり、
Ｒ５は、１０〜２４個の炭素原子を有する直鎖アルキル基、または１〜３つの二重結合および１０〜２４個の炭素原子を有する直鎖アルケニル基である）
ならびに
（ｉ−ｃ）式（ＩＩＩ）のペグ化ホスホグリセリド、またはその塩：
【０１６５】
【化１１】
2021522228.tif 000022
（式中、
ｐは、５〜２００、好ましくは１０〜１７０、最も好ましくは１０〜１４０の整数であり、
Ｒ６は、１０〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルキル基、または１〜３つの二重結合および１０〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルケニル基であり、
Ｒ７は、１０〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルキル基、または１〜３つの二重結合および１０〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルケニル基である）
を含む、粒子、
ならびに
（ｉｉ）１，２−プロパンジオール
を含む、組成物。
【０１６６】
２．ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、項目１に記載の組成物。
【０１６７】
３．式（Ｉ）で、ｎが、０であり、Ｒ１が、−（ＣＨ２）３−ＮＨ２基であり、Ｒ２が、−（ＣＨ２）４−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２基である、項目１または２に記載の組成物。
【０１６８】
４．式（Ｉ）のコレステロール誘導体が、ＧＬ６７である、項目１または２に記載の組成物。
【０１６９】
５．式（ＩＩ）で、Ｒ４およびＲ５が、各々、１つの二重結合および１４〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルケニル基である、項目１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【０１７０】
６．式（ＩＩ）のホスホグリセリドが、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、項目１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【０１７１】
７．式（ＩＩＩ）で、Ｒ６およびＲ７が、各々、１０〜１６個の炭素原子を有する直鎖アルキル基であり、ｐが、１０〜１４０の整数である、項目１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【０１７２】
８．式（ＩＩＩ）のペグ化ホスホグリセリドが、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ（ＤＭＰＥ−ＰＥＧ）（ＰＥＧ部分が、１０〜１４０個の繰返し単位を含有する）であり、より好ましくは１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ＰＥＧ５０００（ＤＭＰＥ−ＰＥＧ５０００）である、項目１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【０１７３】
９．液体組成物での成分（ｉ−ａ）：（ｉ−ｂ）：（ｉ−ｃ）のモル比が、
１：（０．５〜５）：（０．０１〜１）、
より好ましくは
１：（１〜５）：（０．０１〜０．５）、
最も好ましくは
１：（１〜３）：（０．０２〜０．２）
である、項目１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【０１７４】
１０．粒子が、ナノまたはマイクロ粒子である、項目１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【０１７５】
１１．粒子が、１〜５０００ｎｍ、より好ましくは１０〜４０００ｎｍ、最も好ましくは５０〜３０００ｎｍの範囲の平均粒径を有する、項目１０に記載の組成物。
【０１７６】
１２．粒子が、２０μｍ、より好ましくは１０μｍ、最も好ましくは５μｍの最大粒径を有する、項目１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【０１７７】
１３．ＲＮＡにおける、式（Ｉ）のコレステロール誘導体由来の窒素原子Ｎの数の、リン酸基Ｐの数に対するＮ／Ｐ比が、１〜１００、より好ましくは１〜３０、最も好ましくは２〜２０の範囲である、項目１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【０１７８】
１４．粒子が、粒子の総重量に対するＲＮＡの重量として表される、０．１〜９５％、より好ましくは０．５〜８０％、最も好ましくは１〜５０％の範囲の活性負荷を有する、項目１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【０１７９】
１５．組成物の総体積を基準として、０．０１〜５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０２〜３０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＲＮＡを提供するような量で、ＲＮＡおよび脂質組成物を含む粒子を含む、項目１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【０１８０】
１６．ＲＮＡおよび脂質組成物を含む粒子が、液相に分散する、項目１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
【０１８１】
１７．１，２−プロパンジオールが、粒子を含有する液相に含有される、項目１から１６のいずれか一項に記載の組成物。
【０１８２】
１８．１，２−プロパンジオールが、組成物の総体積を基準として、０．１〜５０％ｗ／ｖ、より好ましくは０．２〜３０％ｗ／ｖ、最も好ましくは０．３〜２０ｗ／ｖの濃度で含有される、項目１から１７のいずれか一項に記載の組成物。
【０１８３】
１９．粒子を含有する液相が、水を含む、項目１から１８のいずれか一項に記載の組成物。
【０１８４】
２０．液相の総体積を基準として、５０体積％以上、より好ましくは７０体積％以上が、水によりもたらされる、項目１９に記載の組成物。
【０１８５】
２１．水および１，２−プロパンジオールが、液相に含有される唯一の溶媒である、項目１から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【０１８６】
２２．粒子を含有する液相が、緩衝液を含む、項目１から２１のいずれか一項に記載の組成物。
【０１８７】
２３．項目１から２２のいずれか一項に記載の組成物の調製のための方法であって、
ａ）有機溶媒中の脂質組成物の成分を溶解し、混合して、続いて脂質組成物を凍結乾燥するステップ、
ｂ）水を添加することにより、凍結乾燥された脂質組成物を再水和するステップ、
ｃ）再水和された脂質組成物をＲＮＡの水溶液と組み合わせて、液相に含有されるＲＮＡおよび脂質組成物を含む粒子を形成することを可能にするステップ、ならびに
ｄ）１，２−プロパンジオールを添加するステップ
を含む、方法。
【０１８８】
２４．（ｉ）ＲＮＡおよび脂質組成物を含む粒子、ならびに
（ｉｉ）１，２−プロパンジオール
を含み、
項目１から２２のいずれか一項に記載の組成物を凍結することにより得られる、固体組成物。
【０１８９】
２５．ＲＮＡに基づく療法を介する疾患の予防の処置での使用のための、項目１から２２のいずれか一項に記載の組成物。
【０１９０】
２６．処置または予防される疾患が、肺疾患である、項目２５に記載の使用のための組成物。
【０１９１】
２７．処置または予防が、気道へ、または気道を介する、好ましくは経肺投与または経鼻投与を介する、組成物の投与を含む、項目２５または２６に記載の使用のための組成物。
【０１９２】
２８．処置の方法であって、好ましくは気道へ、または気道を介する投与を介して、より好ましくは経肺投与または経鼻投与を介して、患者に項目１から２２のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【０１９３】
２９．肺疾患の処置のための、項目２８に記載の方法。
【０１９４】
３０．液体に含有される粒子状組成物からエアゾール剤を形成するための、または、このような組成物を噴霧するためのデバイスであって、項目１から２２のいずれか一項に記載の組成物を含む、デバイス。
【０１９５】
３１．定量吸入器、ネブライザー、および鼻噴射デバイスから選択される吸入器である、項目３０に記載のデバイス。
【実施例】
【０１９６】
略語
【０１９７】
【表３】
2021522228.tif 000023
【０１９８】
実施例Ｉ：ＡＬＩ培養への複合体の適用
方法：
Ｎ／Ｐ５（およびＮ／Ｐ３）でのＲＮＡ−脂質複合体の製剤化：
ＧＬ６７、ＤＯＰＥ、およびＤＭＰＥ−ＰＥＧ５０００の原液を、ｔ−ブタノールおよび水の９：１混合液で各々、１０〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度で生成した。脂質を、５ｍｇの全脂質質量で１：２：０．０５（ＧＬ６７：ＤＯＰＥ：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ５０００）のモル比において混合し、−８０℃で終夜、凍結し、少なくとも９６時間、凍結乾燥した。使用前に、乾燥脂質混合物を、４００μＬの５％（ｖ／ｖ）のプロピレングリコールを添加することにより再水和し（１２．５ｍｇ／ｍＬの全脂質濃度にする）、続いて、振とうせずに室温で３０分間インキュベートし、１０秒間ボルテックスし、続いて、３７℃の水浴で１０分間、超音波処理した。生成したリポソーム混合物を、ｍＲＮＡとの複合化のために希釈した。この目的のため、６９．６５μＬ（Ｎ／Ｐ３に対しては８７．６９μＬ）の水を、１０．２４μＬのプロピレングリコールと混合し、３秒間ボルテックスした。４５．１０μＬ（Ｎ／Ｐ３に対しては２７．０６μＬ）のリポソーム混合物を添加し、混合物を、１０秒間ボルテックスし、３９℃で３分間平衡させた。１２５μＬのｍＲＮＡ水溶液（ｃ：０．５ｍｇ／ｍＬ）を、３９℃で３分間平衡させた。複合体集合のためにｍＲＮＡ希釈物を、微細針シリンジ（ＢＤ  Ｍｉｃｒｏ−Ｆｉｎｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎｅシリンジ０．５ｍＬ  Ｕ４０  ８ｍｍ、０７４６８０６０  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中に浸漬し、リポソーム希釈液中に迅速に注入し、直ちに１０秒間ボルテックスし、複合体集合のためにＲＴで１０分間インキュベートした。次いで、複合体を氷上で保管した。
【０１９９】
ＡＬＩ培養の処置
ＭｕｃｉｌＡｉｒ（商標）−ＡＬＩを、Ｅｐｉｔｈｅｌｉｘ（Ｆｒａｎｃｅ）から得た。トランスフェクションの５日前に、粘液洗浄を行って、先端面上の蓄積した粘液を除去した。２００μＬのＰＢＳ−／−を、先端側に添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。先端面から粘液を除去するために、ピペットでの先端液体からの１００μＬを用いて、３回前後に動かした。ＭｕｃｉｌＡｉｒ（商標）の先端面からのＰＢＳ−／−を、上皮を損傷することなく、穏やかに吸引することにより除去した。トランスフェクションの当日、ＡＬＩ培養を、２００μＬのＰＢＳ−／−で再び洗浄し、続いて、２００μＬのｍＲＮＡ複合体（水または５％のプロピレングリコール）の相当する希釈液で洗浄するステップを行った。希釈液を、上皮を損傷することなく、穏やかに吸引することにより、ＡＬＩ培養の先端面から直ちに除去した。次いで、各ウェルを、５０μＬの体積において、３μｇの全複合体化したｍＲＮＡでトランスフェクトした。製剤を、相当する希釈液で希釈し、ＡＬＩ培養の先端面に添加し、３７℃、５％のＣＯ２で６時間インキュベートした。その後、複合体溶液を除去し、細胞層をＰＢＳ−／−で洗浄し、３７℃、５％のＣＯ２で２４時間、ＡＬＩ培養として維持した。
【０２００】
蛍光顕微鏡を介するｔｄＴｏｍａｔｏの検出：
蛍光イメージングを使用して、トランスフェクションの２４時間後、陽性ｔｄＴｏｍａｔｏシグナルを検出した。各ウェルにおいて、以下の設定で代表画像を作製した：露出：５００ｍｓ、ゲイン：１．５、強度：３０％。
【０２０１】
結果：
ＡＬＩ培養の処置のために、ｔｄＴｏｍａｔｏをコードするｍＲＮＡを使用した。処置したウェルを、処置の２４時間後、ｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質について分析した。図１では、例示的な画像を示す。
【０２０２】
図１で示す通り、プロピレングリコールの添加により、細胞に送達され、タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡのレベルは顕著に高くなる。この効果は、Ｎ／Ｐ３ならびにＮ／Ｐ５で観察することができる。
【０２０３】
実施例ＩＩ：複合体の経鼻投与
方法：
ＲＮＡ−脂質複合体の製剤化：
複合体を、先に実施例Ｉで記載したように形成した。
【０２０４】
動物の処置：
Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、１０μｇ／４０μＬのｍＲＮＡ用量で、複合体で処置した。溶液を、イソフルラン（Ｉｓｏｔｈｅｓｉａ、Ｈｅｎｒｙ  Ｓｈｉｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）吸入麻酔の間に、動物の鼻孔に１滴として適用した。
【０２０５】
鼻組織でのルシフェラーゼレベルの検出
適用の５時間後、５０μＬのＰＢＳに溶解している１．５ｍｇのＤ−ルシフェリンを、各動物の鼻孔で、鼻腔内に（吸入する方法で）適用した。生物発光イメージングを、ＩＶＩＳ  １００インビボイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＵＳＡ）を使用して行った。イメージングの直後、動物を頚椎脱臼により殺処分した。画像を、設定された関心領域（ＲＯＩ）での放射輝度を測定することにより、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＵＳＡ）を使用して分析した。値は、平均放射輝度［ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ］として示す。
【０２０６】
結果：
鼻に吸入することによるＢａｌｂ／ｃマウスの処置のため、Ｎ／Ｐ５で複合体化したホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを使用した。処置の５時間後、ルシフェラーゼ活性に対する鼻組織の分析の結果（図２）は、５％のプロピレングリコール溶液中の複合体では、プロピレングリコールを含まない同じ複合体（０％のＰＧ、水）と比較して、鼻組織において、より高いリポータータンパク質活性をもたらすことを示す。
【０２０７】
実施例ＩＩＩ：１回の凍結−解凍サイクルの間の粒子サイズの安定化
方法：
粒子の製剤化：
粒子を、先に実施例Ｉで記載したように形成した。
【０２０８】
粒子溶液の凍結：
製剤化の後、粒子を、−２０℃で少なくとも１６時間、保管することにより凍結した。
【０２０９】
サイズ測定：
粒子の流体力学的直径を、ＺｅｔａＳｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して動的光散乱により測定した。正確な測定のため、溶液粘度を計算するソフトウェアで使用される緩衝剤組成物を、適用可能である場合、１，２−プロパンジオール含有溶液に調節した。
【０２１０】
結果：
粒子を製剤化した。製剤化の後、新規の粒子の粒子サイズを、１，２−プロパンジオールを含む、または含まない溶液中で測定した。粒子を、−２０℃で１６時間凍結し、ＲＴでインキュベートすることにより解凍した。解凍した溶液中の粒子サイズを、再び測定した。活性を維持するため、凍結前と解凍後の粒子サイズのずれを、最小にしなければならない。図３に示す通り、１，２−プロパンジオールを含まない溶液中で凍結した粒子は、凍結の間に凝集プロセスにより、サイズが著しく増大する。１，２−プロパンジオールの存在下で、粒子サイズは、凍結解凍サイクルの後に安定を保つ。
【図１】
2021522228.tif 000027
【図２】
2021522228.tif 000028
【図３】
2021522228.tif 000029
【国際調査報告】
2021522228.tif 000030
2021522228.tif 000031