(57)【要約】本発明は、フォリスタチンなどの治療剤を産生するように遺伝子改変された自家および／または同種異系のＢ細胞を投与するための方法に関する。単回の最大有効用量の遺伝子改変Ｂ細胞を投与するための方法、および複数回用量の、フォリスタチンを発現する遺伝子改変Ｂ細胞を投与するための方法が、具体的に開示されている。本明細書において開示されている組成物および方法は、フォリスタチンの長期のｉｎ  ｖｉｖｏ送達に有用である。
2021515576.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フォリスタチン遺伝子を含む組換えＢ細胞。
【請求項２】
前記フォリスタチン遺伝子が、プロモーターに作動可能に連結している、請求項１に記載のＢ細胞。
【請求項３】
前記フォリスタチン遺伝子が、ヒトフォリスタチン遺伝子である、請求項１または２に記載のＢ細胞。
【請求項４】
前記フォリスタチン遺伝子が、ヒトフォリスタチンＦＳＴ−３４４のスプライス部位バリアントである、請求項１から３のいずれか一項に記載のＢ細胞。
【請求項５】
前記Ｂ細胞が、ヒトＢ細胞である、先行する請求項のいずれか一項に記載のＢ細胞。
【請求項６】
前記Ｂ細胞が、前記フォリスタチン遺伝子を形質導入されているかまたは転位されている、先行する請求項のいずれか一項に記載のＢ細胞。
【請求項７】
前記Ｂ細胞が、トランスポゾン系を使用して、前記フォリスタチン遺伝子を形質導入されているため、前記フォリスタチン遺伝子を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のＢ細胞。
【請求項８】
前記トランスポゾン系が、スリーピングビューティートランスポゾン系またはＰｉｇｇｙｂａｃトランスポゾン系である、請求項７に記載のＢ細胞。
【請求項９】
前記Ｂ細胞が、前記フォリスタチン遺伝子を保有するウイルスによる形質導入により、前記フォリスタチン遺伝子を発現する、請求項１から７のいずれか一項に記載のＢ細胞。
【請求項１０】
前記Ｂ細胞が、前記フォリスタチン遺伝子を含むレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスにより形質導入されているため、前記フォリスタチン遺伝子を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のＢ細胞。
【請求項１１】
前記Ｂ細胞が、標的化組込み手法を使用して、前記フォリスタチン遺伝子を含有するように操作される、請求項１から７のいずれか一項に記載のＢ細胞。
【請求項１２】
前記標的化組込みが、１または複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が挙げられるがこれらに限定されないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を利用する、請求項１１に記載のＢ細胞。
【請求項１３】
前記Ｂ細胞が、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、任意の他のＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクターからなる群より選択される方法を使用して、フォリスタチンをコードする核酸を導入することによって、前記フォリスタチン遺伝子を、リポフェクション、ポリカチオン複合体形成、エレクトロポレーション等のような化学的または物理的手段を使用して導入されたフォリスタチンをコードする非ウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含有するように操作される、請求項１から７のいずれか一項に記載のＢ細胞。
【請求項１４】
前記フォリスタチンタンパク質が、前記組換えＢ細胞によって分泌される、先行する請求項のいずれか一項に記載のＢ細胞。
【請求項１５】
フォリスタチンを被験体に送達する方法であって、フォリスタチン遺伝子を含む組換えＢ細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項１６】
フォリスタチンを、それを必要とする被験体に送達する方法であって、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組換えＢ細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項１７】
前記被験体が、哺乳動物である、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記被験体が、ヒトである、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記被験体が、筋ジストロフィーを有する、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記被験体が、ベッカー型筋ジストロフィーを有する、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記組換えＢ細胞の前記被験体へ前記投与するステップが、前記被験体の疾患、障害、または状態の処置をもたらす、請求項１５から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記組換えＢ細胞の前記被験体へ前記投与するステップが、筋ジストロフィーの処置をもたらす、請求項１５から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記組換えＢ細胞の前記被験体へ前記投与するステップが、前記被験体の体重を増加させる、請求項１５から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記被験体が、少なくとも約４％体重を増加させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
有意な体重の増加が、３０日以内に生じる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
有意な体重の増加が、約３０日の間に生じる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記組換えＢ細胞の前記被験体へ前記投与するステップが、前記被験体の筋肉量を増加させる、請求項１５から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記組換えＢ細胞の前記被験体へ前記投与するステップが、前記被験体の強度をより強くする、請求項１５から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記組換えＢ細胞の前記投与するステップが、前記被験体のフォリスタチン血漿中レベルを上昇させる、請求項１５から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
フォリスタチン遺伝子を含む組換えＢ細胞を投与することによって、筋障害を処置、予防、または軽減する方法。
【請求項３１】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の組換えＢ細胞を投与することによって、筋ジストロフィーを処置、予防、または軽減する方法。
【請求項３２】
前記組換えＢ細胞が、前記被験体から得られたＢ細胞または前記被験体から得られた細胞に由来するＢ細胞に由来する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組換えＢ細胞。
【請求項３３】
前記組換えＢ細胞が、前記被験体から得られたＢ細胞の前駆細胞に由来する、請求項３２に記載の組換えＢ細胞。
【請求項３４】
前記組換えＢ細胞が、前記Ｂ細胞またはＢ細胞の前駆細胞へと分化した、前記被験体から得られた細胞に由来する、請求項３２に記載の組換えＢ細胞。
【請求項３５】
前記組換えＢ細胞が、
（ａ）前記被験体の血液から免疫細胞を採取および単離するステップと；
（ｂ）前記フォリスタチンをコードするＤＮＡを前記細胞に形質導入するステップと；
（ｃ）選択された細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大増殖させるステップと；
（ｄ）ｅｘ  ｖｉｖｏで前記拡大増殖させた細胞を形質細胞および／または形質芽細胞へと分化させるステップ
とによって操作される、請求項１から１３および３２から３４のいずれか一項に記載の組換えＢ細胞。
【請求項３６】
ステップａから単離された前記免疫細胞が、ＣＤ１９陽性細胞である、請求項３５に記載の組換えＢ細胞。
【請求項３７】
前記ステップｂの形質導入するステップは、エレクトロポレーションによる、請求項３５または３６に記載の組換えＢ細胞。
【請求項３８】
前記エレクトロポレーションには、前記スリーピングビューティートランスポゾン系が利用される、請求項３７に記載の組換えＢ細胞。
【請求項３９】
前記分化した細胞が、ＣＤ３８（＋）およびＣＤ２０（−）である、請求項３５から３８のいずれか一項に記載の組換えＢ細胞。
【請求項４０】
請求項３５から３９のいずれか一項に記載の組換えＢ細胞を被験体に投与するステップを含む方法。
【請求項４１】
２またはそれよりも多い逐次用量の遺伝子改変Ｂ細胞を被験体に投与するステップを含む、請求項１５から３１および３５から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
投与するステップが、最適に満たない単回用量濃度で２またはそれよりも多い用量の前記遺伝子改変Ｂ細胞を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
投与するステップが、３またはそれよりも多い用量の遺伝子改変Ｂ細胞を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、前記被験体に対して自家である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、前記被験体に対して同種異系である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記被験体が、ヒトである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、ＣＤ２０−、ＣＤ３８−かつＣＤ１３８−である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、ＣＤ２０−、ＣＤ３８＋かつＣＤ１３８＋である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、ＣＤ２０−、ＣＤ３８＋かつＣＤ１３８−である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
前記投与するステップが、静脈内、腹腔内、皮下、髄腔内、前房内または筋肉内注射を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記投与するステップが、静脈内注射を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、培養後２日目または３日目に操作される、請求項１５から３１および３５から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、エレクトロポレーションを含む方法を使用して操作される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
（ａ）前記遺伝子改変Ｂ細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の１日目から１２日目までの範囲の日に被験体への投与のために収集され、
（ｂ）前記遺伝子改変Ｂ細胞が、操作後の培養における４日目、５日目、６日目、または７日目、または８日目に、被験体への投与のために収集される、
請求項１５から３１および３５から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、操作後の培養の開始から８日目またはそれよりも後に、被験体への投与のために収集される、請求項１５から３１および３５から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、操作後の培養の開始から１０日目またはそれより前に、被験体への投与のために収集される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記収集された遺伝子改変Ｂ細胞が、有意なレベルの炎症性サイトカインを産生しない、請求項１５から３１および３５から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、有意なレベルの炎症性サイトカインを産生しないことが決定される培養中の時点で収集される、請求項１５から３１および３５から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記遺伝子改変Ｂ細胞を、操作前および操作後の培養期間全体にわたって、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−３１および多量体化ＣＤ４０リガンドのそれぞれを含む培養系において成長させる、請求項１５から３１および３５から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記多量体化ＣＤ４０リガンドが、抗ｈｉｓ抗体を使用して多量体化される、ＨＩＳタグ付きＣＤ４０リガンドである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記被験体へ前記投与するステップの前に、前記遺伝子改変Ｂ細胞を拡大増殖させるステップをさらに含む、請求項１５から３１および３５から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
拡大増殖させた遺伝子改変Ｂ細胞の最終集団が、高い程度の多クローン性を示す、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
拡大増殖させた遺伝子改変Ｂ細胞の最終集団におけるあらゆる特定のＢ細胞クローンが、総Ｂ細胞集団の０．２％未満を構成する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
拡大増殖させた遺伝子改変Ｂ細胞の最終集団におけるあらゆる特定のＢ細胞クローンが、総Ｂ細胞集団の０．０５％未満を構成する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、選択可能なマーカーをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１５から３１および３５から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記選択可能なマーカーが、メトトレキセートに対して増強された耐性を有するヒトＤＨＦＲ遺伝子である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
メトトレキセートに対して増強された耐性を有する前記ヒトＤＨＦＲ遺伝子が、アミノ酸２２におけるロイシンからチロシンへの置換変異およびアミノ酸３１におけるフェニルアラニンからセリンへの置換変異を含有する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
投与のための収集の前に、前記遺伝子改変Ｂ細胞をメトトレキセートで処置するステップを含む、請求項１５から３１および３５から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記メトトレキセートによる処置が、１００ｎＭ〜３００ｎＭの間である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記メトトレキセートによる処置が、２００ｎＭである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記遺伝子改変Ｂ細胞が、前記被験体に投与されると、多様な組織へと遊走する、請求項１５から３１および３５から７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記被験体に投与される遺伝子改変Ｂ細胞の集団のうち少なくとも１個の遺伝子改変Ｂ細胞が、骨髄、腸、筋肉、脾臓、腎臓、心臓、肝臓、肺および脳からなる群より選択される１種または複数種の組織へと遊走する、請求項１５から３１および３５から７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記被験体に投与される遺伝子改変Ｂ細胞の集団のうち少なくとも１個の遺伝子改変Ｂ細胞が、前記被験体の骨髄、腸、筋肉、脾臓、腎臓、心臓、肝臓、肺および脳へと遊走する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
フォリスタチン遺伝子とＤＨＦＲ遺伝子とを発現するように形質導入された改変Ｂ細胞。
【請求項７５】
筋障害を処置するための方法であって、フォリスタチンを発現するように遺伝子改変されたＢ細胞を被験体に投与するステップを含む方法。
【請求項７６】
前記筋障害が、筋ジストロフィー、炎症性筋障害、筋損傷または筋外傷、筋廃用、および筋萎縮または筋衰弱から選択される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィーまたは顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーである、請求項７５または７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記炎症性筋障害が、封入体筋炎である、請求項７５または７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記筋廃用が、長期の床上安静または四肢固定の後に起こる、請求項７５または７６に記載の方法。
【請求項８０】
前記筋萎縮または筋衰弱が、加齢、がんまたは慢性疾患によって引き起こされる、請求項７５または７６に記載の方法。
【請求項８１】
前記筋障害が、筋肉減少症である、請求項７５に記載の方法。
【請求項８２】
前記筋障害が、脊髄性筋萎縮（ＳＭＡ）である、請求項７５に記載の方法。
【請求項８３】
前記筋障害が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項７５に記載の方法。
【請求項８４】
前記筋障害が、ポンペ病である、請求項７５に記載の方法。
【請求項８５】
前記フォリスタチンが、配列番号１〜４のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項７５から８４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１８年３月１６日に出願された米国仮出願第６２／６４４，３６２号、および２０１８年３月１６日に出願された米国仮出願第６２／６４４，３５６号（これらの出願のそれぞれは、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
配列表に関する陳述
この出願に関連する配列表は、紙でのコピーの代わりにテキストフォーマットで提供され、本明細書に参考として援用される。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＩＭＣＯ−００８＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは、１２ＫＢであり、２０１９年３月１８日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出された。
【０００３】
背景
技術分野
本開示は、治療剤、例えば、フォリスタチンの長期ｉｎ  ｖｉｖｏ送達のためのＢ細胞の使用に関し、特に、Ｂ細胞の単回および複数回投与量の被験体（例えば、ヒト）への投与に関する。
【背景技術】
【０００４】
関連技術の説明
筋ジストロフィー（ＭＤ）は、筋消耗および筋衰弱によって特徴付けられる進行性の遺伝性神経筋障害である（Emery  (2002)  The  Lancet,  359:687-695）。筋ジストロフィーの多くの形態は、致死性であり、現在のところ治療不能である。
【０００５】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、最も一般的なＸ連鎖神経筋疾患である。この疾患は、ジストロフィンをコードするＤＭＤ遺伝子における変異によって引き起こされる。このタンパク質の変更または非存在によって、異常な筋鞘膜断裂が生じる。近位筋における筋線維（萎縮性および肥厚性線維）の直径の異常な変動および進行する筋損傷が、この疾患の特徴である。損傷した筋肉は、細胞内酵素であるクレアチンキナーゼ（ＣＫ）を放出する。結果として、ＤＭＤ患者における血清中ＣＫレベルが高いことが特徴となる（正常値の最大１０倍）。病態生理学的カスケードは、組織の炎症、筋線維の壊死および線維性脂肪組織による筋肉の置き換えによって構成される。
【０００６】
ＤＭＤ遺伝子の別の対立遺伝子変異型は、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）として公知の、ＭＤのより穏やかな形態を引き起こす。ＢＭＤは、ＤＭＤに臨床的に類似しているが、症状の発症は晩年に生じる。
【０００７】
ＭＤでは、多くの薬剤が試されてきたが、いずれの薬剤も、この疾患の経過の抑止における有効性が証明されなかった。現在の処置モダリティは、依然として、物理療法およびリハビリテーションの範囲内にある。
【０００８】
コルチコステロイド（例えば、プレドニゾンおよび／またはその誘導体）を使用するいくつかの治験では、ＭＤを有する個体において、特に、短期間での、改善が実証された。コルチコステロイドによってこの疾患の表現型が緩和される正確なメカニズムは明らかではないが、コルチコステロイドは、炎症を低減し、免疫系を抑制し、カルシウムホメオスタシスを改善し、補償タンパク質（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現を上方調節し、かつ筋芽細胞の増殖を増加させることによって、作用すると考えられる（Khurana  et  al.  (2003)  Nat.  Rev.  Drug  Discovery  2:279-386）。しかし、経時的に投与されたコルチコステロイドは、筋萎縮を誘導し、これは主に、ＤＭＤおよびＢＭＤにおいて影響されるのと全く同じ筋肉である、近位の筋肉に影響を及ぼし得る。コルチコステロイドに誘導される筋肉への作用および他の副作用は、コルチコステロイド療法の長期的有効性を限定する場合がある。
【０００９】
形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ−ベータ）スーパーファミリーは、共通配列要素および構造モチーフを共有する様々な成長因子を含有する。これらのタンパク質は、脊椎動物と非脊椎動物の両方における多様な細胞型に生物学的作用を及ぼすことが公知である。このスーパーファミリーのメンバーは、パターン形成および組織特異化において、胚発生の間に重要な機能を果たし、脂肪生成、筋発生、軟骨形成、心発生、造血、神経発生、および上皮細胞分化を含む様々な分化プロセスに影響を及ぼし得る。このファミリーは、２つの一般的な枝：ＢＭＰ／ＧＤＦおよびＴＧＦ−ベータ／アクチビン／ＢＭＰ１０の枝に分けられ、これらのメンバーは、様々な、しばしば相補的な作用を有する。ＴＧＦ−ベータファミリーのメンバーの活性を操作することによって、多くの場合、生物に有意な生理的変化をもたらす可能性がある。例えば、ピエモンテ（Ｐｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅ）およびベルギアンブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）のウシ品種は、筋肉量における顕著な増加を引き起こす、ＧＤＦ８（ミオスタチンとも呼ばれる）遺伝子における機能喪失型変異を保有する。Grobet  et  al.,  Nat.  Genet.  1997,  17(1):71-4。さらに、ヒトでは、ＧＤＦ８の不活性対立遺伝子は、筋肉量の増加、および報告によれば、破格の強度と関連する。Schuelke  et  al.,  N  Engl  J  Med  2004,  350:2682-8。さらに、ドミナントネガティブアクチビン受容体ＩＩＢ（ＡｃｔＲＩＩＢ）を発現するかまたはフォリスタチンを発現するように遺伝子操作されたマウスは、並外れた筋肉量を有し（Lee,  SJ  and  McPherron,  AC,  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  2001  Jul  31;98(16):9306-11）、非ヒト霊長類におけるフォリスタチンの過剰発現によって、筋肉の成長および強度が増強される。Kota  J,  et  al.,  Sci  Transl  Med.  2009  Nov  11;1(6)。
【００１０】
よって、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達の有効な調節剤として機能する薬剤を送達する方法が必要とされている。
慢性疾患および障害を処置するための現在の方法は、治療剤の直接的注入（例えば、治療用ポリペプチド）、ウイルスベクターによる遺伝子療法、および幹細胞の養子移入（例えば、造血幹細胞移入）を含む。しかし、これらの方法のそれぞれに不利益がある。組換え治療用タンパク質の注射は、タンパク質の有限の半減期に悩まされ、３種の方法は全て、治療剤による最適に満たない組織浸透をもたらす。組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびレンチウイルスベクターの注射による等、治療剤を産生するように内在性組織を変更することは一般に、中央集中した位置から産生される治療剤をもたらす。１か所の位置からの治療剤の産生は、産生組織における局在化された毒性の確率を増加させる。その上、組換えウイルスは、外来のものとしてみなされるため、有害反応を引き起こすことなくウイルスベクターを複数回投与することができる可能性は低く、治療剤の正確な投与量を達成するために単回の注射機会があることを意味する。ウイルスを使用した細胞への核酸のｉｎ  ｖｉｖｏ導入等の手順に固有の生物学的変動を考慮すれば、単回注射の制約下で所望の投与量を達成することは非常に心許ないであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Emery  (2002)  The  Lancet,  359:687-695
【非特許文献２】Khurana  et  al.  (2003)  Nat.  Rev.  Drug  Discovery  2:279-386
【非特許文献３】Grobet  et  al.,  Nat.  Genet.  1997,  17(1):71-4
【非特許文献４】Schuelke  et  al.,  N  Engl  J  Med  2004,  350:2682-8
【非特許文献５】Lee,  SJ  and  McPherron,  AC,  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  2001  Jul  31;98(16):9306-11
【非特許文献６】Kota  J,  et  al.,  Sci  Transl  Med.  2009  Nov  11;1(6)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本技術分野において依然として、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達に関連する多くの慢性疾患および障害のための長期処置が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
実施形態の概要
本開示は、一般的に、慢性疾患および障害を処置するために、遺伝子改変Ｂ細胞組成物を投与および投薬するための組成物および方法に関する。様々な実施形態では、本開示は、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達をモジュレートすることが可能なポリペプチド（例えば、フォリスタチンポリペプチド）を発現するように遺伝子改変されたＢ細胞を投与および投薬するための組成物および方法を提供する。一部の特定の実施形態では、本開示は、フォリスタチンポリペプチドを発現するように遺伝子改変されたＢ細胞を投与および投薬するための組成物および方法に関する。ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のアミノ酸配列を有するフォリスタチンポリペプチドを発現するように遺伝子改変されたＢ細胞を投与および投薬するための組成物および方法に関する。斯かるＢ細胞を様々な実施形態で使用し、例えば、被験体（例えば、ヒト）における筋肉のサイズまたは強度を増加させることができる。本開示は、詳細な説明に記載されている通り、上述および他の利点を提供する。
【００１４】
一部の実施形態では、本発明は、フォリスタチン遺伝子を含む組換えＢ細胞を提供する。一部の実施形態では、フォリスタチン遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、フォリスタチン遺伝子は、ヒトフォリスタチン遺伝子である。一部の実施形態では、フォリスタチン遺伝子は、ヒトフォリスタチンＦＳＴ−３４４のスプライス部位バリアントである。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、ヒトＢ細胞である。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、フォリスタチン遺伝子を形質導入されている。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、スリーピングビューティートランスポゾン系を使用して、フォリスタチン遺伝子を形質導入されているため、フォリスタチン遺伝子を含む。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、フォリスタチン遺伝子を保有するウイルスによる形質導入により、フォリスタチン遺伝子を発現する。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、フォリスタチン遺伝子を含むレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスにより形質導入されているため、フォリスタチン遺伝子を含む。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、標的化組込み（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）手法を使用して、フォリスタチン遺伝子を含有するように操作される。一部の実施形態では、標的化組込みは、１つまたは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が挙げられるがこれらに限定されないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を利用する。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、任意の他のＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクターからなる群より選択される方法を使用して、フォリスタチンをコードする核酸を導入することによって、フォリスタチン遺伝子を、リポフェクション、ポリカチオン複合体形成、エレクトロポレーション等のような（such  and）化学的または物理的手段を使用して導入されたフォリスタチンをコードする非ウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含有するように操作される。一部の実施形態では、フォリスタチン遺伝子は、組換えＢ細胞によって分泌される。一部の実施形態では、組換えＢ細胞は、被験体から得られたＢ細胞または被験体から得られた細胞に由来するＢ細胞に由来する。一部の実施形態では、組換えＢ細胞は、被験体から得られたＢ細胞の前駆細胞に由来する。一部の実施形態では、組換えＢ細胞は、Ｂ細胞またはＢ細胞の前駆細胞へと分化した、被験体から得られた細胞に由来する。一部の実施形態では、組換えＢ細胞は、
（ａ）被験体の血液から免疫細胞を採取および単離するステップと；
（ｂ）フォリスタチンをコードするＤＮＡを細胞に形質導入するステップと；
（ｃ）選択された細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大増殖させるステップと；
（ｄ）ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大増殖させた細胞を形質細胞および／または形質芽細胞へと分化させるステップ
とによって操作される。
【００１５】
一部の実施形態では、ステップａから単離された免疫細胞は、ＣＤ１９陽性細胞である。一部の実施形態では、ステップｂの形質導入するステップは、エレクトロポレーションによる。一部の実施形態では、エレクトロポレーションには、スリーピングビューティートランスポゾン系が利用された。一部の実施形態では、分化細胞は、ＣＤ３８（＋）およびＣＤ２０（−）である。一部の実施形態では、本発明は、斯かる組換えＢ細胞を被験体に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１６】
一部の実施形態では、本発明は、フォリスタチンを、それを必要とする被験体に送達する方法であって、フォリスタチン遺伝子を含む組換えＢ細胞を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、フォリスタチンを、それを必要とする被験体に送達する方法であって、フォリスタチンポリペプチドを発現する、本明細書に開示されている組換えＢ細胞のいずれか１つを被験体に投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、被験体は、哺乳動物である。一部の実施形態では、被験体は、ヒトである。一部の実施形態では、被験体は、筋障害を有する。一部の実施形態では、筋障害は、筋ジストロフィーである。一部の実施形態では、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィーおよび顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（fascioscapulohumeral  muscular  dystrophy）から選択される。一部の実施形態では、筋障害は、炎症性筋障害である。一部の実施形態では、炎症性筋障害は、封入体筋炎である。一部の実施形態では、筋障害は、筋損傷または筋外傷である。一部の実施形態では、筋障害は、筋廃用（ｍｕｓｃｌｅ  ｄｉｓｕｓｅ）である。一部の実施形態では、筋廃用は、長期の床上安静または四肢固定の後に起こる。一部の実施形態では、筋障害は、筋萎縮または筋衰弱である。一部の実施形態では、筋萎縮または筋衰弱は、加齢、がん、または慢性疾患によって引き起こされる。一部の実施形態では、筋萎縮または筋衰弱は、筋肉減少症が原因である。一部の実施形態では、筋萎縮または筋衰弱は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）が原因である。一部の実施形態では、筋萎縮または筋衰弱は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）が原因である。一部の実施形態では、筋萎縮または筋衰弱は、ポンペ病が原因である。一部の実施形態では、被験体は、健康な筋肉を有する。一部の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドを発現するＢ細胞の、健康な筋肉を有する被験体への投与により、被験体の筋肉のサイズまたは強度を増加させる。
【００１７】
一部の特定の実施形態では、本開示は、筋ジストロフィーを処置するための方法であって、フォリスタチンポリペプチドを発現するＢ細胞を、筋ジストロフィーを有する被験体に投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、被験体は、ベッカー型筋ジストロフィーを有する。一部の実施形態では、組換えＢ細胞の被験体へ投与するステップは、被験体の疾患、障害、または状態の処置をもたらす。一部の実施形態では、組換えＢ細胞の被験体へ投与するステップは、筋ジストロフィーの処置をもたらす。一部の実施形態では、組換えＢ細胞の被験体へ投与するステップは、被験体の体重を増加させる。一部の実施形態では、被験体は、少なくとも約４％体重を増加させる。一部の実施形態では、有意な体重の増加は、３０日以内に生じる。一部の実施形態では、有意な体重の増加は、約３０日の間に生じる。一部の実施形態では、組換えＢ細胞の被験体へ投与するステップは、被験体の筋肉を増加させる。一部の実施形態では、組換えＢ細胞の被験体へ投与するステップは、被験体の強度をより強くする。一部の実施形態では、組換えＢ細胞の被験体へ投与するステップは、被験体のフォリスタチン血漿中レベルを上昇させる。
【００１８】
一部の実施形態では、本発明は、フォリスタチン遺伝子を含む組換えＢ細胞を投与することによって、筋ジストロフィーを処置、予防、または軽減する方法を提供する。一部の実施形態では、筋ジストロフィーを処置、予防、または軽減する方法は、本明細書に開示されている組換えＢ細胞のうちのいずれか１つを投与するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、２またはそれよりも多い逐次用量の遺伝子改変Ｂ細胞を被験体に投与するステップを含む。一部の実施形態では、投与するステップは、最適に満たない単回用量濃度で２またはそれよりも多い用量の遺伝子改変Ｂ細胞を含む。一部の実施形態では、投与するステップは、３またはそれよりも多い用量の遺伝子改変Ｂ細胞を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変Ｂ細胞は、被験体に対して自家である。一部の実施形態では、遺伝子改変Ｂ細胞は、被験体に対して同種異系である。一部の実施形態では、被験体は、ヒトである。一部の実施形態では、遺伝子改変Ｂ細胞は、ＣＤ２０−、ＣＤ３８−かつＣＤ１３８−である。一部の実施形態では、遺伝子改変Ｂ細胞は、ＣＤ２０−、ＣＤ３８＋かつＣＤ１３８＋である。一部の実施形態では、遺伝子改変Ｂ細胞は、ＣＤ２０−、ＣＤ３８＋かつＣＤ１３８−である。一部の実施形態では、投与するステップは、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内注射を含む。一部の実施形態では、投与するステップは、静脈内注射を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変Ｂ細胞は、培養後２日目または３日目に操作される。一部の実施形態では、遺伝子改変Ｂ細胞は、エレクトロポレーションを含む方法を使用して操作される。一部の実施形態では、遺伝子改変Ｂ細胞は、操作後の培養における４日目、５日目、６日目、または７日目に、被験体への投与のために収集される。一部の実施形態では、遺伝子改変Ｂ細胞は、操作後の培養における８日目またはそれよりも後に、被験体への投与のために収集される。一部の実施形態では、遺伝子改変Ｂ細胞は、操作後の培養における１０日目またはそれよりも前に、被験体への投与のために収集される。一部の実施形態では、収集された遺伝子改変Ｂ細胞は、有意なレベルの炎症性サイトカインを産生しない。一部の実施形態では、遺伝子改変Ｂ細胞は、有意なレベルの炎症性サイトカインを産生しないことが決定される培養中の時点で収集される。一部の実施形態では、遺伝子改変Ｂ細胞を、操作前および操作後の培養期間全体にわたって、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−３１および多量体化ＣＤ４０リガンドのそれぞれを含む培養系において成長させる。一部の実施形態では、多量体化ＣＤ４０リガンドは、抗ｈｉｓ抗体を使用して多量体化される、ＨＩＳタグ付きＣＤ４０リガンドである。一部の実施形態では、本方法は、被験体へ投与するステップの前に、遺伝子改変Ｂ細胞を拡大増殖させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、拡大増殖させた遺伝子改変Ｂ細胞の最終集団は、高い程度の多クローン性を示す。一部の実施形態では、拡大増殖させた遺伝子改変Ｂ細胞の最終集団におけるあらゆる特定のＢ細胞クローンは、総Ｂ細胞集団の０．２％未満を構成する。一部の実施形態では、拡大増殖させた遺伝子改変Ｂ細胞の最終集団におけるあらゆる特定のＢ細胞クローンは、総Ｂ細胞集団の０．０５％未満を構成する。一部の実施形態では、遺伝子改変Ｂ細胞は、メトトレキセートに対して増強された耐性を有するヒトＤＨＦＲ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、メトトレキセートに対して増強された耐性を有するヒトＤＨＦＲ遺伝子は、アミノ酸２２におけるロイシンからチロシンへの置換変異およびアミノ酸３１におけるフェニルアラニンからセリンへの置換変異を含有する。一部の実施形態では、本方法は、投与のための収集の前に、遺伝子改変Ｂ細胞をメトトレキセートで処置するステップを含む。一部の実施形態では、メトトレキセートによる処置は、１００ｎＭ〜３００ｎＭの間である。一部の実施形態では、メトトレキセートによる処置は、２００ｎＭである。一部の実施形態では、遺伝子改変Ｂ細胞が、被験体に投与されると、多様な組織へと遊走する。本方法の一部の実施形態では、被験体に投与される遺伝子改変Ｂ細胞の集団のうち少なくとも１個の遺伝子改変Ｂ細胞が、骨髄、腸、筋肉、脾臓、腎臓、心臓、肝臓、肺および脳からなる群より選択される１種または複数種の組織へと遊走する。本方法の一部の実施形態では、被験体に投与される遺伝子改変Ｂ細胞の集団のうち少なくとも１個の遺伝子改変Ｂ細胞が、被験体の骨髄、腸、筋肉、脾臓、腎臓、心臓、肝臓、肺および脳へと遊走する。
【００１９】
一部の実施形態では、本発明は、フォリスタチン遺伝子とジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子との両方を発現するように形質導入された改変Ｂ細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、フォリスタチンを発現するＢ細胞による処置によって、マウス血漿におけるフォリスタチンレベルの増加がもたらされることを示す。対照および処置群のそれぞれにおいて左から右へ：バーは、それぞれ、２１日目、２８日目、および３５日目に対応する。
【００２１】
【図２Ａ−Ｂ】図２は、フォリスタチンを発現するＢ細胞で処置されたマウスにおけるフォリスタチン血漿中レベルが、生着に対するサロゲートマーカーである、ヒトＩｇＧのレベルと相関することを示す。図２Ａ〜２Ｄは、フォリスタチンを発現するＢ細胞で処置した４匹の別々のマウスにおけるフォリスタチン血漿中レベルを示す。
【図２Ｃ−Ｄ】図２は、フォリスタチンを発現するＢ細胞で処置されたマウスにおけるフォリスタチン血漿中レベルが、生着に対するサロゲートマーカーである、ヒトＩｇＧのレベルと相関することを示す。図２Ａ〜２Ｄは、フォリスタチンを発現するＢ細胞で処置した４匹の別々のマウスにおけるフォリスタチン血漿中レベルを示す。
【００２２】
【図３】図３は、フォリスタチンを発現するＢ細胞で処置されたかまたは処置されていないマウスの体重のパーセント変化を示す。
【００２３】
【図４Ａ】図４は、フォリスタチンを発現するＢ細胞で処置されたかまたは処置されていないマウスの強度の評価を示す。図４Ａは、前肢グリップ試験によって評価された強度を示す。図４Ｂは、四肢グリップ試験によって評価された強度を示す。図４Ｃは、ハンギング試験によって評価された強度を示す。グラフの下に与えられた改善のパーセントは、未処置群と比較した処置群における改善の平均パーセントを示す。
【図４Ｂ−Ｃ】図４は、フォリスタチンを発現するＢ細胞で処置されたかまたは処置されていないマウスの強度の評価を示す。図４Ａは、前肢グリップ試験によって評価された強度を示す。図４Ｂは、四肢グリップ試験によって評価された強度を示す。図４Ｃは、ハンギング試験によって評価された強度を示す。グラフの下に与えられた改善のパーセントは、未処置群と比較した処置群における改善の平均パーセントを示す。
【００２４】
【図５】図５は、フォリスタチンを発現するＢ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのフォリスタチン発現を示す。図５Ａは、ＥＬＩＳＡによって決定されたフォリスタチンタンパク質の発現を示す。図５Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲによって決定されたフォリスタチンｍＲＮＡの発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な説明
本発明の実施は、それとは反対のことが特に指示されていなければ、当業者の技能範囲内で、分子生物学、組換えＤＮＡ技法、タンパク質発現およびタンパク質／ペプチド／炭水化物化学の従来方法を用いることになるであろうが、これらの多くについては、説明目的で後述する。斯かる技法は、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、２０００年）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ＆ＩＩ巻（Ｄ．  Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．  Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐ．  Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ編、２００４年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  Ｍｏｄｅｒｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＢｕｚｄｉｎおよびＬｕｋｙａｎｏｖ編、２００９年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６年）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．（２００５年）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，  ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第５版、Ｈｏｂｏｋｅｎ  ＮＪ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（第３版、２０１０年）；Ｆａｒｒｅｌｌ，  Ｒ．、ＲＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（第３版、２００５年）を参照されたい。上に記述されている刊行物は、本願の出願日に先立つそれらの開示のために単に提供されている。本明細書におけるいかなる記述も、本発明が、先行発明のために斯かる開示に先行する権利がないことの承認として解釈するべきではない。
【００２６】
定義および略語
他に定義されていなければ、本明細書で使用されているあらゆる技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意義を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されている場合、それとは反対のことが指定されていない限り、次の用語は、示されている意義を有する。本明細書に関して、本明細書で定義されている用語の定義が、取り込まれた参考文献においてこの同じ用語に与えられている定義とは異なる場合は常に、本明細書で明確に定義されている定義が、その用語の正確な定義である。
【００２７】
単語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、特に注意されていなければ、１つまたは複数を表示する。
【００２８】
「約」とは、参照分量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％ほど変動する分量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを意味する。用語「約」と併せて使用されている数値の文脈で記述されるいずれかの実施形態では、約という用語が省略され得ることが特に企図される。
【００２９】
「組成物」は、活性な薬剤および担体、不活性または活性な、例えば、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含むことができる。特定の実施形態では、組成物は、用いられている投与量または濃度において、無菌である、エンドトキシンを実質的に含まない、またはレシピエントにとって無毒性である。
【００３０】
文脈がそれ以外のことを要求しない限り、本明細書および特許請求の範囲を通じて、単語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「を含み（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等のその変化形は、オープンかつ包括的な意味合いで、すなわち、「が挙げられるがこれらに限定されない」として解釈するべきである。
【００３１】
「からなる」とは、語句「からなる」の前に来るものが何であれ、「を含みこれらに限定される」を意味する。よって、語句「からなる」は、列挙されている要素が、必要または必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。「から本質的になる」とは、この語句の前に列挙されているいずれかの要素を含むことを意味し、列挙されている要素について本開示に指定されている働きまたは作用に干渉も寄与もしない他の要素に限定される。よって、語句「から本質的になる」は、列挙されている要素が、要求されるまたは強制的であるが、他の要素は、必要に応じたものであり、列挙されている要素の働きまたは作用に影響を与えるか否かに応じて存在しても存在しなくてもよいことを示す。
【００３２】
「生物学的活性」または「生物活性」の本明細書を通じた参照は、本明細書で企図されるいずれかの化合物、薬剤、ポリペプチド、コンジュゲート、医薬組成物の投与の結果として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてまたは細胞、組織、臓器もしくは生物（例えば、動物または哺乳動物またはヒト）において誘導されるいずれかの応答を指す。生物学的活性は、アゴニスト作用またはアンタゴニスト作用を指すことができる。生物学的活性は、有益な効果となることができる；または生物学的活性は、有益でない、すなわち、毒性となり得る。一部の実施形態では、生物学的活性は、生きている被験体、例えば、ヒト等の哺乳動物における、薬物または医薬組成物が有するプラスまたはマイナスの効果を指すであろう。したがって、用語「生物学的に活性」は、本明細書に記載されている通り、生物学的活性を保有するいずれかの化合物を記載することを意味する。生物学的活性は、当業者にとって現在公知のいずれか適切な手段によって評価することができる。斯かるアッセイは、定性的または定量的となることができる。当業者であれば、異なるポリペプチドの活性を評価するために異なるアッセイを用いることの必要を容易に認めるであろう；平均的な研究者にとって慣例的な課題である。斯かるアッセイは多くの場合、最適化を殆ど要求することなく実験室設定において簡単に実行され、大抵の場合、多くの実験室に共通している様々な技術を使用して、広範囲のポリペプチドの生物学的活性の単純で、信頼でき、かつ再現性がある読み取りを提供する商業的キットを利用できる。斯かるキットが利用できない場合、通常技能を有する研究者であれば、過度の実験法を用いずに、標的ポリペプチドのための組織内の生物活性アッセイを簡単に設計および最適化することができる；その理由として、これが科学的プロセスの慣例的な側面であることが挙げられる。
【００３３】
用語「例えば」の参照は、「例えば、次のものが挙げられるがこれらに限定されない」を意味するように意図されるため、その後に続くものが何であれ、特定の実施形態の単なる例であることを理解するべきであるが、決して、限定的な例として解釈するべきではない。他に断りがなければ、「例えば」の使用は、他の実施形態が企図されており、これが本発明によって包含されることを明確に示すように意図される。
【００３４】
「実施形態」または「一実施形態」または「ある実施形態」または「一部の実施形態」または「ある特定の実施形態」の本明細書を通じた参照は、実施形態に関連して記載されている特定の特色、構造または特徴が、本発明の少なくとも一実施形態に含まれることを意味する。よって、本明細書を通じた様々な箇所における語句「一実施形態では」または「ある実施形態では」または「ある特定の実施形態では」の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指す訳ではない。さらに、特定の特色、構造または特徴は、１または複数の実施形態においていずれか適した様式で組み合わせることができる。
【００３５】
「増加された」または「増強された」量は典型的に、「統計的に有意な」量であり、本明細書に記載されている量またはレベルの１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０もしくは５０倍またはそれよりも多い（例えば、１００、５００、１０００倍）（その間の１より大きいあらゆる整数および小数点、例えば、２．１、２．２、２．３、２．４等を含む）増加を含むことができる。同様に、「減少された」または「低下された」または「より少ない」量は典型的に、「統計的に有意な」量であり、本明細書に記載されている量またはレベルの約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０もしくは５０分の１またはそれよりも少ない（例えば、１００、５００、１０００分の１）（その間の１より大きいあらゆる整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８等を含む）減少を含むことができる。
【００３６】
用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」、「ｅｘ  ｖｉｖｏ」および「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、それらの通常の科学的意義を有するように本明細書で意図される。したがって、例えば、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、例えば、適切な基質、酵素、ドナーおよび必要に応じてバッファー／補因子を使用して試験管内で行われる酵素反応等、単離された細胞構成成分により起こる実験または反応を指すことを意味する。「ｅｘ  ｖｉｖｏ」は、生物から摘出されたまたは生物とは独立して繁殖された機能的な臓器または細胞を使用して実行される実験または反応を指すことを意味する。「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、その正常でインタクトな状態で、生きている生物内で起こる実験または反応を指すことを意味する。
【００３７】
「哺乳動物」は、ヒトと、実験動物および家庭用ペット（例えば、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマおよびウサギ）等の飼育動物、ならびに野生生物その他等の非飼育動物の両方とを含む。
【００３８】
「必要に応じた」または「必要に応じて」は、その後に記載される事象または状況が、起こっても起こらなくてもよいこと、また、その記載が、前記事象または状況が起こる場合と起こらない場合とを含むことを意味する。
【００３９】
「医薬組成物」は、化合物（例えば、治療上有用なポリペプチド）、および動物、例えば、ヒトへの化合物の送達のために本技術分野で一般に許容される媒体の製剤を指す。斯かる媒体は、したがって、いずれか薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含むことができる。
【００４０】
「薬学的に有効な賦形剤」および「薬学的に有効な担体」は、当業者にとって周知であり、それらの調製のための方法もまた、当業者には容易に明らかである。斯かる組成物およびその調製のための方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５年、本明細書に組み込む）に見出すことができる。
【００４１】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」および「核酸」は、互換的に使用される。これらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはこれらのアナログのいずれかである、いずれかの長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、いずれかの三次元構造を有することができ、公知または未知のいずれかの機能を行うことができる。次に、ポリヌクレオチドの非限定例を挙げる：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座（単数または複数）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれかの配列の単離されたＤＮＡ、いずれかの配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ等、修飾ヌクレオチドを含むことができる。存在するのであれば、ポリマーのアセンブリの前または後に、ヌクレオチド構造に対する改変を与えることができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分を含むことができる。ポリヌクレオチドは、標識構成成分とのコンジュゲーションによる等、重合後にさらに改変することができる。
【００４２】
「被験体」は、本明細書において、本発明の薬剤で処置することができる、疾患もしくは症状を示すまたは疾患もしくは症状を示すリスクがあるいずれかの動物を含む。適した被験体は、実験動物（マウス、ラット、ウサギまたはモルモット等）、家畜および飼育動物またはペット（ネコまたはイヌ等）を含む。非ヒト霊長類および好ましくはヒト患者が含まれる。
【００４３】
「実質的に」または「本質的に」は、豊富なまたは相当な量、分量、サイズ；殆ど全体的にまたは完全に；例えば、ある所与の分量の９５％またはそれよりも多いことを意味する。
【００４４】
「治療剤」は、被験体（例えば、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒト）に治療有効量で投与されると、下に定義される疾患または状態の処置をもたらすことができる、いずれかの化合物を指す。
【００４５】
「治療有効量」または「治療有効用量」は、被験体（例えば、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒト）に投与されると、動物における疾患または状態の、下に定義される通りの処置をもたらすのに十分な、本発明の化合物の量を指す。「治療有効量」を構成する本発明の化合物の量は、化合物、状態およびその重症度、投与様式、ならびに処置されるべき動物の年齢に応じて変動するであろうが、当業者が自身の知識および本開示を考慮に入れることによって慣例的に決定することができる。
【００４６】
「処置すること」または「処置」は、本明細書において、目的の疾患または状態を有する被験体、好ましくは、ヒトにおける目的の疾患または状態の処置を網羅し、（ｉ）特に、被験体が、状態に対する素因を有するが、当該状態であると未だ診断されていない場合、被験体における疾患もしくは状態が起こることを予防もしくは阻害すること；（ｉｉ）疾患もしくは状態を阻害すること、すなわち、その発症を抑止すること；（ｉｉｉ）疾患もしくは状態を軽減すること、すなわち、疾患もしくは状態の退縮を引き起こすこと；または（ｉｖ）疾患もしくは状態に起因する症状を軽減することを含む。本明細書において、用語「疾患」、「障害」および「状態」は、互換的に使用することができる、または特定の疾病、傷害または状態は、公知の原因となる病原体を持たない場合がある（病因が未だ解明されていないように）という点で異なる場合があり、したがって、これは、傷害または疾患として未だ認識されていないが、単に望ましくない状態または症候群として認識されており、その場合、症状の特異性がより高いまたは低いセットが臨床医によって同定されている。
【００４７】
概要
本発明は、とりわけ、フォリスタチンを産生するための核酸の導入により変更された、自家および／または同種異系Ｂ細胞に関し、また、（例えば、疾患、障害、または状態、例えば、筋ジストロフィーなどの筋障害を処置するための）改変Ｂ細胞を投与する方法に関する。一部の実施形態では、用語「操作Ｂ細胞」、「遺伝子操作Ｂ細胞」、「改変Ｂ細胞」および「遺伝子改変Ｂ細胞」は、フォリスタチンを産生するための１種または複数種の核酸（例えば、導入遺伝子）（例えば、治療用フォリスタチンポリペプチド等、フォリスタチンポリペプチドの発現を可能にする導入遺伝子）を含むように変更されたＢ細胞を指すように本明細書で互換的に使用されている。具体的には、改変Ｂ細胞は、単回投与量または複数回投与量として投与することができる。
【００４８】
したがって、本明細書に記載されている改変Ｂ細胞組成物を投与するための方法は、フォリスタチンの長期ｉｎ  ｖｉｖｏ送達および発現に有用である。本開示は、全般的に、産物の安全性を確実にしつつ、フォリスタチンを産生する細胞の十分な濃縮および数、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏでのフォリスタチンの十分なレベルを達成するための方法に関する。
【００４９】
本明細書において、語句「長期ｉｎ  ｖｉｖｏ生存」および「長期生存」は、被験体における投与後１０日間またはそれよりも長い、本明細書に記載されている改変Ｂ細胞の生存を指す。長期生存は、日、週またはさらには年単位で測定することができる。一実施形態では、改変Ｂ細胞の大部分は、投与後１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０日間またはそれよりも長く、ｉｎ  ｖｉｖｏで生存する。一実施形態では、改変Ｂ細胞の大部分は、投与後２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２週間またはそれよりも長く、ｉｎ  ｖｉｖｏで生存する。別の実施形態では、改変Ｂ細胞は、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０年間またはそれよりも長く、ｉｎ  ｖｉｖｏで生存する。その上、本明細書に記載されている改変Ｂ細胞は、１０日間またはそれよりも長くｉｎ  ｖｉｖｏで生存することができるが、改変Ｂ細胞の大部分が、投与後１、２、３、４、５、６、７、８、９日間またはそれよりも長くｉｎ  ｖｉｖｏで生存することが理解される。したがって、本明細書に記載されている改変Ｂ細胞が、短期処置（例えば、４日間）および長期処置（例えば、３０日間またはそれよりも長い）方法に有用であることが企図される。
【００５０】
Ｂ細胞
骨髄から離れた後に、Ｂ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として作用し、抗原を内部移行させる。抗原は、受容体媒介性エンドサイトーシスを介してＢ細胞によって取り入れられ、プロセシングされる。抗原は、抗原ペプチドへとプロセシングされ、ＭＨＣ  ＩＩ分子上に負荷され、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞に対してＢ細胞の細胞外表面に提示される。このようなＴ細胞は、ＭＨＣ  ｌｌ／抗原分子に結合し、Ｂ細胞の活性化を引き起こす。Ｔ細胞による刺激後に、活性化されたＢ細胞は、より特殊化された細胞へと分化し始める。胚中心Ｂ細胞は、長寿命のメモリーＢ細胞または形質細胞へと分化することができる。さらに、二次免疫刺激は、追加的な形質細胞を生じるメモリーＢ細胞をもたらすことができる。メモリーまたは非メモリーＢ細胞のいずれかからの形質細胞の形成に先行して、大量の抗体を産生する形質細胞へと最終的に分化する前駆体形質芽球の形成が行われる（例えば、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９年６月；３０巻（６号）：２７７〜２８５頁；Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００５年、５巻：２３１〜２４２頁を参照）。形質芽球は、Ｂ細胞よりも多いが、形質細胞よりも少ない抗体を分泌する。これは、急速に分裂し、抗原を内部移行させ、Ｔ細胞に対して抗原を提示し続ける。形質芽球は、ケモカイン産生部位（例えば、骨髄内）へと遊走する能力を有し、それによって、長寿命の形質細胞へと分化することができる。最終的に、形質芽球は、形質芽球として数日間残った後に死ぬか、成熟し完全に分化した形質細胞へと変更不能に分化することができる。具体的には、形質細胞生存ニッチを含有する組織（例えば、骨髄内）へとホーミングすることができる形質芽球は、高レベルのタンパク質を数年間分泌し続けることができる、長寿命の形質細胞になるために、常在性形質細胞を置き換えることができる。
【００５１】
本明細書に記載されている方法において使用されるＢ細胞（例えば、フォリスタチンを発現するための）は、汎Ｂ細胞、メモリーＢ細胞、形質芽球、および／または形質細胞を含む。一実施形態では、改変Ｂ細胞は、メモリーＢ細胞（例えば、フォリスタチンを発現するために改変されている）である。一実施形態では、改変Ｂ細胞は、形質芽球（例えば、フォリスタチンを発現するために改変されている）である。一実施形態では、改変Ｂ細胞は、形質細胞（例えば、フォリスタチンを発現するために改変されている）である。
【００５２】
終末分化した形質細胞は典型的に、ＣＤ１９およびＣＤ２０等、共通汎Ｂ細胞マーカーを発現せず、比較的少ない表面抗原を発現する。形質細胞は、ＣＤ３８、ＣＤ７８、ＣＤ１３８およびインターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）を発現し、ＣＤ４５の発現を欠くことから、例えばフローサイトメトリーによってこれらのマーカーを使用して、形質細胞を同定することができる。ナイーブＢ細胞はＣＤ２７−であり、メモリーＢ細胞はＣＤ２７＋であり、形質細胞はＣＤ２７＋＋であるため、ＣＤ２７もまた、形質細胞の優れたマーカーである。メモリーＢ細胞サブセットが、表面ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＤを発現することもできる一方、形質細胞は、細胞表面にこれらのマーカーを発現しない。ＣＤ３８およびＣＤ１３８は、形質細胞に高レベルで発現される（Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ、Ｔｈｅ  Ｆｒｅｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ．「Ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌ」ページバージョンＩＤ：４０４９６９４４１；最新改訂の日付：２０１０年１２月３０日、０９：５４  ＵＴＣ、２０１１年１月４日検索を参照；Ｊｏｕｒｄａｎら、Ｂｌｏｏｄ．２００９年１２月１０日；１１４巻（２５号）：５１７３〜８１頁；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９年６月；３０巻（６号）：２７７〜２８５頁；Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００５年、５巻：２３１〜２４２頁；Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２０１０年、１６巻：１２３〜１２９頁；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，  Ｍ．  Ｓ．；  Ｈｏｎｊｏ，  Ｔ．；  Ａｌｔ，  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｗ．（２００４年）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ．  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１８９〜１９１頁；Ｂｅｒｔｉｌ  Ｇｌａｄｅｒ；  Ｇｒｅｅｒ，  Ｊｏｈｎ  Ｇ．；  Ｊｏｈｎ  Ｆｏｅｒｓｔｅｒ；  Ｒｏｄｇｅｒｓ，  Ｇｅｏｒｇｅ  Ｇ．；  Ｐａｒａｓｋｅｖａｓ，  Ｆｒｉｘｏｓ（２００８年）．Ｗｉｎｔｒｏｂｅ’ｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、第２巻、Ｓｅｔ．  Ｈａｇｅｒｓｔｗｏｎ，  ＭＤ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ．、３４７頁；Ｗａｌｐｏｒｔ，  Ｍａｒｋ；  Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｋｅｎｎｅｔｈ；  Ｊａｎｅｗａｙ，  Ｃｈａｒｌｅｓ；  Ｔｒａｖｅｒｓ，  Ｐａｕｌ  Ｊ．（２００８年）．Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、３８７〜３８８頁；Ｒａｗｓｔｒｏｎ  ＡＣ（２００６年５月）「Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌｓ」Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｃｙｔｏｍも参照）。
【００５３】
「静止状態の」は、本明細書において、細胞が活性に増殖していない細胞状態を指す。
【００５４】
「活性化された」は、本明細書において、細胞が活性に増殖している、および／または刺激に応答してサイトカインを産生している細胞状態を指す。
【００５５】
用語「分化する」および「分化した」は、本明細書において、ある細胞型または状態から別の細胞型または状態への、細胞の表現型の変化を指す。例えば、形質細胞へと移行するメモリーＢ細胞は、分化している。
【００５６】
用語「被験体」は、適応免疫応答を誘発することができる、生きている生物を含むように意図される（例えば、哺乳動物）。被験体の例として、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびこれらのトランスジェニック種が挙げられる。一実施形態では、被験体は、ヒトである。Ｂ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、感染部位由来の組織、脾臓組織および腫瘍を含む、多数の供給源から得ることができる。好ましい実施形態では、Ｂ細胞の供給源は、ＰＢＭＣである。本開示のある特定の実施形態では、本技術分野で利用できるいずれかの数のＢ細胞株を使用することができる。
【００５７】
本明細書に記載されている方法のある特定の実施形態では、Ｂ細胞は、ＦＩＣＯＬＬ（商標）（高密度溶液の調製に使用することができる、スクロースおよびエピクロロヒドリンのコポリマー）分離等、当業者に公知のいずれかの数の技法を使用して、被験体から採取された血液の単位から得ることができる。好まれる一実施形態では、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって、個体の循環血由来の細胞が得られる。アフェレーシス産物は典型的に、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球細胞を含むリンパ球、赤血球細胞および血小板を含有する。一実施形態では、アフェレーシスによって採取された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、その後の加工ステップのために適切なバッファーまたは培地中に細胞を置くことができる。本明細書に記載されている方法の一実施形態では、細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替の実施形態では、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠くことができる、または全てではないにしても多くの二価カチオンを欠くことができる。当業者であれば容易に認めるであろうが、洗浄ステップは、製造業者の指示に従って半自動「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１細胞プロセッサ）を使用することによる等、当業者にとって公知の方法によって達成することができる。洗浄後に、細胞は、例えばＰＢＳ等、種々の生体適合性バッファーに再懸濁することができる。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない構成成分を除去し、細胞を培養培地に直接的に再懸濁することができる。
【００５８】
Ｂ細胞は、本技術分野で公知の技法を使用して、末梢血または白血球アフェレーシスから単離することができる。例えば、ＰＢＭＣは、ＦＩＣＯＬＬ（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して単離することができ、ＣＤ１９＋Ｂ細胞は、Ｒｏｓｅｔｔｅ四量体複合体システム（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）またはＭＡＣＳ（商標）ＭｉｃｒｏＢｅａｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）等、本技術分野で公知の種々の抗体のいずれかを使用した負のまたは正の選択によって精製することができる。ある特定の実施形態では、メモリーＢ細胞は、Ｊｏｕｒｄａｎら（Ｂｌｏｏｄ．２００９年１２月１０日；１１４巻（２５号）：５１７３〜８１頁）によって記載されている通りに単離される。例えば、抗ＣＤ２磁気ビーズを使用したＣＤ２＋細胞の除去後に、ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋メモリーＢ細胞をＦＡＣＳによって選別することができる。骨髄形質細胞（ＢＭＰＣ）は、抗ＣＤ１３８磁気マイクロビーズ選別または他の同様の方法および試薬を使用して精製することができる。ヒトＢ細胞は、例えば、ＣＤ１９  ＭｉｃｒｏＢｅａｄ、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して単離することができる。ヒトメモリーＢ細胞は、例えば、メモリーＢ細胞単離キット、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して単離することができる。
【００５９】
Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのＭａｇＣｅｌｌｅｃｔヒトＢ細胞単離キット（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）等、他の単離キットが市販されている。ある特定の実施形態では、休止Ｂ細胞は、（Ｄｅｆｒａｎｃｏら（１９８２年）Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．１５５巻：１５２３頁）に記載されている通り、不連続パーコール勾配における沈降によって調製することができる。
【００６０】
一実施形態では、ＰＢＭＣは、勾配に基づく精製（例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標））を使用して、血液試料から得られる。別の実施形態では、ＰＢＭＣは、アフェレーシスに基づく採取から得られる。一実施形態では、Ｂ細胞は、汎Ｂ細胞を単離することによりＰＢＭＣから単離される。単離ステップは、正のおよび／または負の選択を利用することができる。一実施形態では、負の選択は、抗ＣＤ３コンジュゲートマイクロビーズを使用したＴ細胞の枯渇を含み、これにより、Ｔ細胞枯渇画分を提供する。さらなる実施形態では、メモリーＢ細胞は、ＣＤ２７に対する正の選択によって、汎Ｂ細胞またはＴ細胞枯渇画分から単離される。
【００６１】
特定の一実施形態では、メモリーＢ細胞は、望まれない細胞の枯渇、およびＣＤ２７  ＭｉｃｒｏＢｅａｄによるその後の正の選択によって単離される。望まれない細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、顆粒球、血小板および赤血球系細胞は、ＣＤ２、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３６、ＣＤ４３およびＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）に対するビオチン化抗体のカクテルならびに抗ビオチンＭｉｃｒｏＢｅａｄを使用して枯渇させることができる。
【００６２】
一実施形態では、スイッチしたメモリーＢ細胞が得られる。「スイッチしたメモリーＢ細胞」または「スイッチしたＢ細胞」は、本明細書において、アイソタイプクラススイッチングを起こしたＢ細胞を指す。一実施形態では、スイッチしたメモリーＢ細胞は、ＩｇＧに対して正に選択される。別の実施形態では、スイッチしたメモリーＢ細胞は、ＩｇＤおよびＩｇＭ発現細胞を枯渇させることにより得られる。スイッチしたメモリーＢ細胞は、例えば、スイッチしたメモリーＢ細胞キット、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して単離することができる。
【００６３】
例えば、特定の一実施形態では、非標的細胞は、ビオチン化ＣＤ２、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３６、ＣＤ４３、ＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）、抗ＩｇＭおよび抗ＩｇＤ抗体のカクテルで標識することができる。このような細胞はその後に、抗ビオチンＭｉｃｒｏＢｅａｄで磁気標識することができる。高度に純粋なスイッチしたメモリーＢ細胞は、磁気標識された細胞の枯渇によって得ることができる。
【００６４】
さらなる実施形態では、例えば、ＣＤ２７遺伝子（またはメモリーＢ細胞に特異的であり、ナイーブＢ細胞において発現されない他の遺伝子）等、メモリーＢ細胞に特有の遺伝子由来のプロモーター配列が、例えば、メトトレキセートの存在下でメモリーＢ細胞の正の選択を可能にする変異したジヒドロ葉酸レダクターゼ等、選択可能マーカーの発現の駆動に使用される。別の実施形態では、例えば、ＣＤ１９遺伝子等、汎Ｂ細胞遺伝子由来のプロモーター配列が、例えば、メトトレキセートの存在下でメモリーＢ細胞の正の選択を可能にする変異したジヒドロ葉酸レダクターゼ等、選択可能マーカーの発現の駆動に使用される。別の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ３を使用して、またはシクロスポリンの添加により枯渇される。別の実施形態では、ＣＤ１３８＋細胞は、正の選択によって汎Ｂ細胞から単離される。さらに別の実施形態では、ＣＤ１３８＋細胞は、正の選択によってＰＢＭＣから単離される。別の実施形態では、ＣＤ３８＋細胞は、正の選択によって汎Ｂ細胞から単離される。さらに別の実施形態では、ＣＤ３８＋細胞は、正の選択によってＰＢＭＣから単離される。一実施形態では、ＣＤ２７＋細胞は、正の選択によってＰＢＭＣから単離される。別の実施形態では、メモリーＢ細胞および／または形質細胞は、本技術分野で利用できるｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養方法を使用して、ＰＢＭＣから選択的に拡大増殖される。
【００６５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＢ細胞の培養
メモリーＢ細胞等、Ｂ細胞は、Ｂ細胞を活性化し、形質細胞もしくは形質芽球またはその両方へと分化させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を使用して培養することができる。当業者によって認識されるであろうが、形質細胞は、標準フローサイトメトリー方法を使用して、細胞表面タンパク質発現パターンによって同定することができる。例えば、終末分化した形質細胞は、比較的少ない表面抗原を発現し、ＣＤ１９およびＣＤ２０等、共通汎Ｂ細胞マーカーを発現しない。その代わりに、形質細胞は、ＣＤ３８、ＣＤ７８、ＣＤ１３８およびＩＬ−６Ｒの発現、ならびにＣＤ４５の発現欠如によって同定することができる。ナイーブＢ細胞はＣＤ２７−であり、メモリーＢ細胞はＣＤ２７＋であり、形質細胞はＣＤ２７＋＋であるため、ＣＤ２７を、形質細胞の同定に使用することもできる。形質細胞は、高レベルのＣＤ３８およびＣＤ１３８を発現する。
【００６６】
一実施形態では、Ｂ細胞は、ＣＤ１３８−メモリーＢ細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞は、ＣＤ１３８＋形質細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞は、活性化され、ＣＤ１３８−、ＣＤ２７＋の細胞表面表現型を有する。
【００６７】
一実施形態では、Ｂ細胞は、ＣＤ２０−、ＣＤ１３８−メモリーＢ細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞は、ＣＤ２０−、ＣＤ１３８＋形質細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞は、活性化され、ＣＤ２０−、ＣＤ１３８−、ＣＤ２７＋の細胞表面表現型を有する。
【００６８】
一実施形態では、Ｂ細胞は、ＣＤ２０−、ＣＤ３８−、ＣＤ１３８−メモリーＢ細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞は、ＣＤ２０−、ＣＤ３８＋、ＣＤ１３８＋形質細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞は、活性化され、ＣＤ２０−、ＣＤ３８−、ＣＤ１３８−、ＣＤ２７＋の細胞表面表現型を有する。
【００６９】
一実施形態では、Ｂ細胞は、１種または複数種のＢ細胞活性化因子、例えば、Ｂ細胞を活性化および／または分化させることが公知の種々のサイトカイン、増殖因子または細胞株のいずれかと接触される（例えば、Ｆｌｕｃｋｉｇｅｒら、Ｂｌｏｏｄ  １９９８年、９２巻：４５０９〜４５２０頁；Ｌｕｏら、Ｂｌｏｏｄ  ２００９年、１  １３巻：１４２２〜１４３１頁を参照）。斯かる因子は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４およびＩＬ−３５、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−δ、Ｃ型ケモカインＸＣＬ１およびＸＣＬ２、Ｃ−Ｃ型ケモカイン（現在まで、ＣＣＬ１〜ＣＣＬ２８を含む）およびＣＸＣ型ケモカイン（現在まで、ＣＸＣＬ１〜ＣＸＣＬ１７を含む）、ならびにＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（例えば、ＴＮＦ−α、４−１  ＢＢリガンド、Ｂ細胞活性化因子（ＢＬｙＳ）、ＦＡＳリガンド、ｓＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌの多量体バージョンを含む；例えば、複数のｓＣＤ４０Ｌ分子を一緒にグループ化するための、抗ポリ−ヒスチジンｍＡｂと組み合わせた、ヒスチジンタグ付き可溶性組換えＣＤ４０Ｌ）、リンホトキシン、ＯＸ４０Ｌ、ＲＡＮＫＬ、ＴＲＡＩＬ）、ＣｐＧ、ならびに他のｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（例えば、ＣｐＧ）からなる群より選択することができるが、これらに限定されない。
【００７０】
Ｂ細胞活性化因子は、様々な濃度でｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物に添加して、所望の成果（例えば、拡大増殖または分化）を達成することができる。一実施形態では、Ｂ細胞活性化因子は、培養下のＢ細胞の拡大増殖において利用される。一実施形態では、Ｂ細胞活性化因子は、培養下のＢ細胞の分化において利用される。別の実施形態では、Ｂ細胞活性化因子は、培養下のＢ細胞の拡大増殖および分化の両方において利用される。一実施形態では、Ｂ細胞活性化因子は、拡大増殖および分化のために同じ濃度で提供される。別の実施形態では、Ｂ細胞活性化因子は、拡大増殖のために第１の濃度で、また、分化のために第２の濃度で提供される。Ｂ細胞活性化因子を、１）Ｂ細胞の拡大増殖において利用し、Ｂ細胞の分化においては利用しないことができる、２）Ｂ細胞の分化において利用し、Ｂ細胞の拡大増殖においては利用しないことができる、または３）Ｂ細胞の拡大増殖および分化において利用することができることが企図される。
【００７１】
例えば、一部の実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞の拡大増殖のために、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１０から選択される１種または複数種のＢ細胞活性化因子を含むＢ細胞培養培地と共に培養される。一実施形態では、Ｂ細胞は、０．２５〜５．０μｇ／ｍｌ  ＣＤ４０Ｌと共に培養される。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌの濃度は、０．５μｇ／ｍｌである。一実施形態では、架橋剤（ＨＩＳタグ付きＣＤ４０Ｌと組み合わせた抗ＨＩＳ抗体等）が、ＣＤ４０Ｌの多量体の作製に使用される。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌの分子は、タンパク質多量体化ドメイン（例えば、ＩｇＧのＦｃ領域またはロイシンジッパードメイン）を使用して、共有結合により連結される、または一体に保持される。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、ビーズにコンジュゲートされる。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、フィーダー細胞から発現される。一実施形態では、Ｂ細胞は、１〜１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ−２の濃度は、５ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、１〜１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ−４の濃度は、２ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１０と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ−１０の濃度は、４０ｎｇ／ｍｌである。
【００７２】
一実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞の拡大増殖のために、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１から選択される１種または複数種のＢ細胞活性化因子を含むＢ細胞培養培地と共に培養される。一実施形態では、Ｂ細胞は、０．２５〜５．０μｇ／ｍｌ  ＣＤ４０Ｌと共に培養される。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌの濃度は、０．５μｇ／ｍｌである。一実施形態では、架橋剤（ＨＩＳタグ付きＣＤ４０Ｌと組み合わせた抗ＨＩＳ抗体等）が、ＣＤ４０Ｌの多量体の作製に使用される。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌの分子は、タンパク質多量体化ドメイン（例えば、ＩｇＧのＦｃ領域またはロイシンジッパードメイン）を使用して、共有結合により連結される、または一体に保持される。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、ビーズにコンジュゲートされる。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、フィーダー細胞から発現される。一実施形態では、Ｂ細胞は、１〜１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ−２の濃度は、５ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、１〜１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ−４の濃度は、２ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１０と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ−１０の濃度は、４０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、５０〜１５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１５と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ−１５の濃度は、１００ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、５０〜１５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２１と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ−２１の濃度は、１００ｎｇ／ｍｌである。特定の実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞の拡大増殖のために、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１を含むＢ細胞培養培地と共に培養される。
【００７３】
例えば、一実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞の拡大増殖のために、Ｂ細胞活性化因子ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１を含むＢ細胞培養培地と共に培養され、ＣＤ４０Ｌは、架橋剤により架橋されて、ＣＤ４０Ｌの多量体を作製する。斯かる培養系は、培養期間全体（例えば、７日間の培養期間）にわたって維持することができ、Ｂ細胞は、目的の導入遺伝子（例えば、例えば、ＦＳＴ等、外因的ポリペプチド）を発現するようにトランスフェクトまたは他の仕方で操作されている。導入遺伝子は、Ｂ細胞に組み込むことができる（例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクターにより）。導入遺伝子は、トランスポゾンの使用により、Ｂ細胞において発現させることができる。導入遺伝子は、Ｂ細胞のゲノムへの導入遺伝子の標的化組込みのために、Ｂ細胞において発現させることができる。標的化組込みは、相同組換えによるものとなることができる。相同組換えは、ヌクレアーゼによって誘導された二本鎖切断の際に起こることができる。ヌクレアーゼは、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ（例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ）となることができる、またはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９−ヌクレアーゼ系によるものとなることができる。
【００７４】
別の例では、一部の実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞の分化のために、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１およびＰ−クラスＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ｐ−ＯＤＮ）から選択される１種または複数種のＢ細胞活性化因子を含むＢ細胞培養培地と共に培養される。一実施形態では、Ｂ細胞は、２５〜７５ｎｇ／ｍｌ  ＣＤ４０Ｌと共に培養される。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌの濃度は、５０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、２５０〜７５０Ｕ／ｍｌ  ＩＦＮ−αと共に培養される。一実施形態では、ＩＦＮ−αの濃度は、５００Ｕ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、５〜５０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ−２の濃度は、２０Ｕ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、２５〜７５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ−６の濃度は、５０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１０と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ−１０の濃度は、５０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、１〜２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１５と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ−１５の濃度は、１０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２１と共に培養される。一実施形態では、ＩＬ−２１の濃度は、５０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、Ｂ細胞は、１〜５０μｇ／ｍｌ  ｐ−ＯＤＮと共に培養される。一実施形態では、ｐ−ＯＤＮの濃度は、１０μｇ／ｍｌである。
【００７５】
一実施形態では、Ｂ細胞は、フィーダー細胞の上で接触または培養される。一実施形態では、フィーダー細胞は、ストロマ細胞株、例えば、マウスストロマ細胞株Ｓ１７またはＭＳ５である。別の実施形態では、単離されたＣＤ１９＋細胞は、ＣＤ４０−リガンド（ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１５４）を発現する線維芽細胞の存在下で、ＩＬ−１０およびＩＬ−４等、１種または複数種のＢ細胞活性化因子サイトカインと共に培養される。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、組織培養プレートまたはビーズ等の表面に結合された状態で提供される。別の実施形態では、精製されたＢ細胞は、フィーダー細胞の存在または非存在下で、ＣＤ４０Ｌ、ならびにＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ｐ−ＯＤＮ、ＣｐＧ  ＤＮＡ、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ６およびＩＦＮ−αから選択される１種または複数種のサイトカインまたは因子と共に培養される。
【００７６】
別の実施形態では、Ｂ細胞活性化因子は、Ｂ細胞または他のフィーダー細胞へのトランスフェクションによって提供される。この文脈において、Ｂ細胞から抗体分泌細胞への分化を促進する１種もしくは複数の因子、および／または抗体産生細胞の長寿命を促進する１種もしくは複数の因子を使用することができる。斯かる因子は、例えば、Ｂｌｉｍｐ−１、ＴＲＦ４、Ｂｃｌ−ｘｌもしくはＢｃｌ５のような抗アポトーシス因子、またはＣＤ４０受容体の構成的に活性な変異体を含む。さらに、ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）等、下流シグナル伝達分子の発現を促進する因子を、Ｂ細胞の活性化／分化において使用することもできる。この点に関して、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの細胞活性化、細胞生存および抗アポトーシス機能は、大部分は、ＴＲＡＦ１〜６によって媒介される（例えば、Ｒ．Ｈ．  Ａｒｃｈら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２巻（１９９８年）２８２１〜２８３０頁を参照）。ＴＲＡＦシグナル伝達の下流エフェクターは、細胞および免疫機能の様々な側面に関与する遺伝子をオンにすることができる、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１ファミリーにおける転写因子を含む。さらに、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１の活性化は、抗アポトーシス遺伝子の転写により、アポトーシスからの細胞保護をもたらすことが示された。
【００７７】
別の実施形態では、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来のタンパク質が、Ｂ細胞の活性化および／または分化のために、または抗体産生細胞の長寿命を促進するために使用される。ＥＢＶ由来のタンパク質として、ＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−２、ＥＢＮＡ−３、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２、ＥＢＥＲ、ｍｉＲＮＡ、ＥＢＶ−ＥＡ、ＥＢＶ−ＭＡ、ＥＢＶ−ＶＣＡおよびＥＢＶ−ＡＮが挙げられるがこれらに限定されない。
【００７８】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供されている方法を使用したＢ細胞の活性化因子とＢ細胞との接触は、とりわけ、細胞増殖（すなわち、拡大増殖）、活性化された成熟Ｂ細胞と一貫した表現型へのｌｇＭ＋細胞表面表現型のモジュレーション、Ｉｇの分泌、およびアイソタイプスイッチングをもたらす。ＣＤ１９＋Ｂ細胞は、ＭｉｎｉＭＡＣＳ（商標）細胞分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）等、公知かつ市販の細胞分離キットを使用して単離することができる。ある特定の実施形態では、ＣＤ４０Ｌ線維芽細胞は、本明細書に記載されている方法における使用前に照射される。一実施形態では、Ｂ細胞は、ＩＬ−３、ＩＬ−７、Ｆｌｔ３リガンド、トロンボポエチン、ＳＣＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、Ｇ−ＣＳＦおよびＣｐＧのうち１種または複数種の存在下で培養される。ある特定の実施形態では、本方法は、低レベルの繋留されたＣＤ４０Ｌおよび／またはプレートもしくはビーズに結合されたＣＤ４０Ｌを提供する形質転換ストロマ細胞（例えば、ＭＳ５）と併せて、上述の因子のうち１種または複数種の存在下でＢ細胞を培養するステップを含む。
【００７９】
上に記述されている通り、Ｂ細胞活性化因子は、Ｂ細胞の拡大増殖、増殖または分化を誘導する。したがって、Ｂ細胞は、上に列挙されている１種または複数種のＢ細胞活性化因子と接触されて、拡大増殖された細胞集団を得る。細胞集団は、トランスフェクションの前に拡大増殖することができる。それに代えてまたはその上、細胞集団は、トランスフェクションの後に拡大増殖することができる。一実施形態では、Ｂ細胞集団の拡大増殖は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＣＤ４０Ｌと共に細胞を培養することを含む（例えば、Ｎｅｒｏｎら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、２０１２年、７巻（１２号）：ｅ５１９４６頁を参照）。一実施形態では、Ｂ細胞集団の拡大増殖は、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＣｐＧおよびＣＤ４０Ｌと共に細胞を培養することを含む。一実施形態では、Ｂ細胞集団の拡大増殖は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１およびＣＤ４０Ｌと共に細胞を培養することを含む。一実施形態では、Ｂ細胞集団の拡大増殖は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１および多量体化されたＣＤ４０Ｌと共に細胞を培養することを含む。
【００８０】
別の実施形態では、Ｂ細胞集団の拡大増殖は、Ｂ細胞へと導入された導入遺伝子によって誘導および／または増強される。例えば、そのリガンド（例えば、可溶性リガンドまたは細胞表面発現リガンド）と結合した際に細胞シグナル伝達経路（例えば、ＣＤ４０の下流のシグナル伝達）を誘導する組換え受容体または操作された受容体を含有するＢ細胞。一実施形態では、Ｂ細胞は、ＣＤ４０導入遺伝子の発現のため、ＣＤ４０を過剰発現する。別の実施形態では、Ｂ細胞は、例えば、組換えにより操作された抗体を含む、操作された受容体を発現する。一実施形態では、操作された受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と同様であり、ｓｃＦｖおよびＢ細胞受容体（例えば、ＣＤ４０）の細胞内シグナル伝達部分の融合タンパク質を含む。
【００８１】
一実施形態では、Ｂ細胞集団の拡大増殖は、細胞培養物に添加された小分子化合物によって誘導および／または増強される。例えば、ＣＤ４０に結合しこれを二量体化する化合物を使用して、ＣＤ４０シグナル伝達経路を誘発することができる。
【００８２】
当業者に公知の通り、本方法において種々の培養培地のいずれかを使用することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、２０００〜２００９年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．よりを参照）。一実施形態では、本明細書に記載されている方法における使用のための培地として、イスコフ改変ダルベッコ培地（ウシ胎仔または他の適切な血清を含有するまたは含有しない）が挙げられるがこれに限定されない。例示的な培地として、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０も挙げられるがこれらに限定されない。さらなる実施形態では、培地は、界面活性剤、抗体、プラスマネート（ｐｌａｓｍａｎａｔｅ）または還元剤（例えば、Ｎ−アセチル−システイン、２−メルカプトエタノール）、１種または複数種の抗生物質、および／またはインスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウムおよびシクロスポリン等の添加物を含むことができる。一部の実施形態では、ＩＬ−６、可溶性ＣＤ４０Ｌおよび架橋増強物質を使用することもできる。
【００８３】
Ｂ細胞は、所望の分化および／または活性化を達成するための条件下および十分な期間培養される。ある特定の実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞の１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらには１００％が、所望の通りに分化および／または活性化されるような条件下および十分な期間培養される。一実施形態では、Ｂ細胞は、活性化され、形質芽球および形質細胞の混合集団へと分化される。当業者によって認識されるであろうが、形質芽球および形質細胞は、ＣＤ３８、ＣＤ７８、ＩＬ−６Ｒ、ＣＤ２７ｈｉｇｈおよびＣＤ１３８のうち１種もしくは複数の発現、および／またはＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ４５のうち１種もしくは複数の発現の欠如もしくは低下等、本明細書の他の箇所に記載されている通りに標準フローサイトメトリー方法を使用して、細胞表面タンパク質発現パターンによって同定することができる。当業者によって理解されるであろうが、メモリーＢ細胞は一般に、ＣＤ２０＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ３８−であるが、初期形質芽球は、ＣＤ２０−、ＣＤ１９＋、ＣＤ２７＋＋、ＣＤ３８＋＋である。一実施形態では、本明細書に記載されている方法を使用して培養された細胞は、ＣＤ２０−、ＣＤ３８＋、ＣＤ１３８−である。別の実施形態では、細胞は、ＣＤ２０−、ＣＤ３８＋、ＣＤ１３８＋の表現型を有する。ある特定の実施形態では、細胞は、１〜７日間培養される。さらなる実施形態では、細胞は、７、１４、２１日間またはそれよりも長く培養される。よって、細胞は、適切な条件下で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９日間またはそれよりも長く培養することができる。細胞は再播種され、本技術分野で公知の技法を使用して、必要に応じて培地およびサプリメントを添加または交換することができる。
【００８４】
ある特定の実施形態では、Ｂ細胞は、細胞の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が、分化および活性化されて、Ｉｇを産生する、および／または導入遺伝子を発現するような、条件下および十分な期間培養される。
【００８５】
Ｂ細胞活性化の誘導は、ＲＮＡへの３Ｈ−ウリジン取り込み（Ｂ細胞が分化するにつれて、ＲＮＡ合成は増加する）等の技法によって、または細胞増殖に伴うＤＮＡ合成を測定する３Ｈ−チミジン取り込みによって、測定することができる。一実施形態では、インターロイキン−４（ＩＬ−４）を、Ｂ細胞増殖の増強に適切な濃度（例えば、約１０ｎｇ／ｍｌ）で培養培地に添加することができる。
【００８６】
あるいは、Ｂ細胞活性化は、免疫グロブリン分泌の関数として測定される。例えば、ＣＤ４０Ｌが、ＩＬ−４（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−５（例えば、５ｎｇ／ｍｌ）、またはＢ細胞を活性化する他のサイトカインと共に、休止Ｂ細胞に添加される。活性化されたＢ細胞に典型的な細胞表面マーカーを測定するために、フローサイトメトリーを使用することもできる。例えば、Ｃｉｖｉｎ  ＣＩ，  Ｌｏｋｅｎ  ＭＲ、Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ９８７；５巻：１〜１６頁；Ｌｏｋｅｎ，  ＭＲら、Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ，  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｉｎｅａｇｅｓ  ｉｎ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ，  ｉｎ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、Ｌａｅｒｕｍ  ＯＤ，  Ｂｊｅｒｋｓｎｅｓ  Ｒ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９２年；３１〜４２頁；およびＬｅＢｅｉｎ  ＴＷら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １９９０年；４巻：３５４〜３５８頁を参照されたい。
【００８７】
例えば２、３、４、５、６、７、８、９日間またはそれよりも長くから、一般に、３日間前後等、適切な期間にわたる培養後に、追加的な容量の培養培地を添加することができる。個々の培養物由来の上清を、培養における様々な時点で収集し、Ｎｏｅｌｌｅら（１９９１年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６巻：１１１８〜１１２４頁に記載されている通りにＩｇＭおよびＩｇＧ１に関して定量化することができる。一実施形態では、培養物は、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ＥＬＩＳＰＯＴまたは本技術分野で公知の他のアッセイを使用して、目的の導入遺伝子の発現に関して収集および測定される。
【００８８】
別の実施形態では、ＥＬＩＳＡが、抗体アイソタイプ産生、例えば、ＩｇＭ、または目的の導入遺伝子の産物の測定に使用される。ある特定の実施形態では、捕捉抗体としてヤギ抗ヒトＩｇＧ等、市販の抗体を使用して、ＩｇＧ決定が為され、続いて、ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇ、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼおよび基質等、種々の適切な検出試薬のいずれかを使用して検出が為される。
【００８９】
ある特定の実施形態では、Ｂ細胞は、細胞の数が、培養開始時のＢ細胞の数の、１、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００倍またはそれよりも多くなるような、条件下および十分な期間培養される。一実施形態では、細胞の数は、培養開始時のＢ細胞の数の１０〜１０００倍（その中の連続した整数を含む）である。例えば、拡大増殖されたＢ細胞集団は、初期単離Ｂ細胞集団の少なくとも１０倍である。別の実施形態では、拡大増殖されたＢ細胞集団は、初期単離Ｂ細胞集団の少なくとも１００倍である。一実施形態では、拡大増殖されたＢ細胞集団は、初期単離Ｂ細胞集団の少なくとも５００倍である。
【００９０】
Ｂ細胞の操作
様々な実施形態では、本開示は、Ｂ細胞をトランスフェクトするか、Ｂ細胞に感染するか、または導入遺伝子がＢ細胞において発現されるように、他の仕方で導入遺伝子（例えば、フォリスタチン導入遺伝子）をＢ細胞中に取り込む方法を提供する。本明細書に記載されているかまたは当技術分野で公知の組込み方法のいずれかは、一部の実施形態では、Ｂ細胞においてフォリスタチンを発現するために利用することができる。
【００９１】
一実施形態では、遺伝子改変Ｂ細胞は、導入遺伝子をトランスフェクトされる。特定の実施形態では、遺伝子改変Ｂ細胞は、フォリスタチン導入遺伝子を伴う。
【００９２】
細胞をトランスフェクトするための例示的な方法は、ＷＯ２０１４／１５２８３２およびＷＯ２０１６／１００９３２に提供されており、これらは両者共に、それらの全体を参照により本明細書に組み込む。Ｂ細胞のトランスフェクションは、Ｂ細胞へとＤＮＡまたはＲＮＡを導入するための本技術分野で利用できる種々の方法のいずれかを使用して達成することができる。適した技法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、圧力媒介性トランスフェクションまたは「細胞圧搾（ｃｅｌｌ  ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）」（例えば、ＣｅｌｌＳｑｕｅｅｚｅマイクロ流体システム、ＳＱＺ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ナノ粒子媒介性もしくはリポソーム媒介性トランスフェクション、およびレトロウイルスもしくは他のウイルス、例えば、ワクシニアを使用した形質導入を含むことができる。例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２巻：４５６頁；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｄａｖｉｓら、１９８６年、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｃｈｕら、１９８１年、Ｇｅｎｅ  １３巻：１９７頁；ＵＳ５，１２４，２５９；ＵＳ５，２９７，９８３；ＵＳ５，２８３，１８５；ＵＳ５，６６１，０１８；ＵＳ６，８７８，５４８；ＵＳ７，７９９，５５５；ＵＳ８，５５１，７８０；およびＵＳ８，６３３，０２９を参照されたい。Ｂ細胞に適した市販のエレクトロポレーション技法の一例は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）トランスフェクション技術である。
【００９３】
トランスフェクションは、上述の１種または複数種の活性化および／または分化因子の存在下、単離されたＢ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の前にまたはその間に行うことができる。例えば、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８または３９日目にトランスフェクトされる。一実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の１、２または３日目にトランスフェクトされる。特定の実施形態では、細胞は、２日目にトランスフェクトされる。例えば、細胞は、例えば、プラスミド、トランスポゾン、ミニサークルまたは自己複製ＲＮＡの送達のため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の２日目にエレクトロポレーションされる。別の実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の４、５、６または７日目にトランスフェクトされる。特定の実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の６日目にトランスフェクトされる。別の実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の５日目にトランスフェクトされる。
【００９４】
一実施形態では、細胞は、活性化の前に、トランスフェクトまたは他の仕方で操作される（例えば、フォリスタチン導入遺伝子の標的化組込みにより）。別の実施形態では、細胞は、活性化の間に、トランスフェクトまたは他の仕方で操作される（例えばフォリスタチン導入遺伝子の標的化組込みにより）。一実施形態では、細胞は、活性化の後に、トランスフェクトまたは他の仕方で操作される（例えば、フォリスタチン導入遺伝子の標的化組込みにより）。一実施形態では、細胞は、分化の前に、トランスフェクトまたは他の仕方で操作される（例えば、フォリスタチン導入遺伝子の標的化組込みにより）。別の実施形態では、細胞は、分化の間に、トランスフェクトまたは他の仕方で操作される（例えば、フォリスタチン導入遺伝子の標的化組込みにより）。一実施形態では、細胞は、分化の後に、トランスフェクトまたは他の仕方で操作される（例えば、フォリスタチン導入遺伝子の標的化組込みにより）。
【００９５】
一実施形態では、非ウイルスベクターが、メモリーＢ細胞および／または形質細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、フォリスタチンポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ）の送達に使用される。例えば、ウイルス組込み系の必要なしに、メモリーＢ細胞および／または形質細胞のトランスフェクションを容易にすることができる系は、トランスポゾン（例えば、スリーピングビューティーまたはＰｉｇｇｙｂａｃなどの他のトランスポゾン系）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、メガヌクレアーゼ、ミニサークル、レプリコン、人工染色体（例えば、細菌人工染色体、哺乳動物人工染色体、および酵母人工染色体）、プラスミド、コスミド、およびバクテリオファージを限定することなく含む。
【００９６】
一部の実施形態では、斯かる非ウイルス依存性ベクター系は、本技術分野で公知のまたは後述するウイルスベクターにより送達することもできる。例えば、一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス）は、１種または複数種の非ウイルスベクター（例えば、上述のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）メガヌクレアーゼのうち１種または複数種等）、または標的化組込みを容易にすることができる他のいずれかの酵素／補完的ベクター、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの送達に利用される。したがって、一部の実施形態では、細胞（例えば、メモリーＢ細胞および／または形質細胞等、Ｂ細胞）は、標的化組込み方法により、外因的配列（例えば、フォリスタチンポリペプチドをコードする配列）を発現するように操作することができる。斯かる方法は、本技術分野で公知であり、１種または複数種のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、メガヌクレアーゼ）を使用して、細胞における内在性遺伝子座を切断するステップと、内在性遺伝子座に組み込まれ、細胞内で発現されるように、フォリスタチン導入遺伝子を細胞に投与するステップとを含むことができる。フォリスタチン導入遺伝子は、ヌクレアーゼによる切断ポイントにまたはその付近において宿主細胞のＤＮＡに組み込まれるドナー配列に含まれていてよい。
【００９７】
外因的配列（例えば、フォリスタチンポリペプチドをコードする配列）の組込みは、組換えにより起こることができる。当業者には明らかであろうが、「組換え」は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によるドナー捕捉および相同組換えが挙げられるがこれらに限定されない、２本のポリヌクレオチドの間での遺伝情報の交換のプロセスを指す。組換えは、相同組換えとなることができる。本開示の目的のため、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同性指向性修復機構により細胞における二本鎖切断の修復の際に行われる、斯かる交換の特殊化された形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を利用し、それによって、「ドナー」分子（例えば、ドナーポリヌクレオチド配列または斯かる配列を含むドナーベクター）は、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）を修復するための鋳型として、細胞のＤＮＡ修復の仕組みによって利用され、これらの手段は、ドナーから標的への遺伝情報の移入を引き起こす。ＨＲ指向性組込みの一部の実施形態では、ドナー分子は、ゲノムに対する相同性の少なくとも２個の領域を含有することができる（「相同性アーム」）。一部の実施形態では、相同性アームは、例えば、少なくとも５０〜１００塩基対の長さとなることができる。相同性アームは、標的化組込みが起こるべき、切断部位に隣接するゲノムＤＮＡの領域に対する実質的ＤＮＡ相同性を有することができる。ドナー分子の相同性アームは、標的ゲノムまたは標的ＤＮＡ遺伝子座に組み込まれるべき（例えば、フォリスタチンをコードするＤＮＡを含む）ＤＮＡに隣接することができる。染色体の切断と、それに続く鋳型としてプラスミドＤＮＡの相同領域を使用した修復は、相同性アームによって隣接される介在する導入遺伝子のゲノムへの移入をもたらすことができる。例えば、Ｋｏｌｌｅｒら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６巻（２２号）：８９２７〜８９３１頁；Ｔｈｏｍａｓら（１９８６年）Ｃｅｌｌ  ４４巻（３号）：４１９〜４２８頁を参照されたい。この種類の相同性指向性標的化組込みの頻度は、標的領域の近傍での二本鎖切断の計画的作製によって最大１０５倍増加され得る（Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒら（２００９年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２７巻（９号）：８５１〜８５７頁；Ｌｏｍｂａｒｄｏら（２００７年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５巻（１１号）：１２９８〜１３０６頁；Ｍｏｅｈｌｅら（２００７年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０４巻（９号）：３０５５〜３０６０頁；Ｒｏｕｅｔら（１９９４年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１巻（１３号）：６０６４〜６０６８頁。
【００９８】
導入遺伝子（例えば、フォリスタチン導入遺伝子）が標的細胞のゲノムに組み込まれ得るような（例えば、ＨＲ等、組換えによる）、ゲノム遺伝子座の標的化切断を媒介することができるいずれかのヌクレアーゼは、本開示に従った細胞（例えば、メモリーＢ細胞または形質芽球）の操作において利用することができる。
【００９９】
二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ等の部位特異的ヌクレアーゼによって、または特異的切断をガイドするための操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｔ  ＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡ）によるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して作製することができる。例えば、あらゆる目的のためそれらの開示全体を参照により本明細書に組み込む、Ｂｕｒｇｅｓｓ（２０１３年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４巻：８０〜８１頁、Ｕｒｎｏｖら（２０１０年）Ｎａｔｕｒｅ  ４３５巻（７０４２号）：６４６〜５１頁；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６０１８８９８７号；同第２００９０２６３９００号；同第２００９０１１７６１７号；同第２０１０００４７８０５号；同第２０１１０２０７２２１号；同第２０１１０３０１０７３号および国際公開ＷＯ２００７／０１４２７５を参照されたい。
【０１００】
一部の実施形態では、細胞（例えば、メモリーＢ細胞または形質芽球）は、ドナー構築物（例えば、フォリスタチンドナー構築物）のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介性標的化組込みにより操作される。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、１または複数のジンクフィンガー、およびヌクレアーゼ酵素を介して配列特異的様式でＤＮＡに結合する「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（ＺＦＰ）（または結合ドメイン）のカップリングによる特異性で、標的ヌクレオチド配列を認識および切断することができる酵素である。ＺＦＮは、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインに操作可能に連結されたいずれか適した切断ドメイン（例えば、ヌクレアーゼ酵素）を含んで、標的ＤＮＡ配列の部位特異的切断を容易にすることができる操作されたＺＦＮを形成することができる（例えば、Ｋｉｍら（１９９６年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３巻（３号）：１１５６〜１１６０頁を参照）。例えば、ＺＦＮは、ＦＯＫ１酵素またはＦＯＫ１酵素の部分に連結された標的特異的ＺＦＰを含むことができる。一部の実施形態では、ＺＦＮ媒介性標的化組込みアプローチにおいて使用されるＺＦＮは、ＺＦＰにそれぞれ結合されたＦＯＫ１酵素のサブユニットをそれぞれ含む２種の別々の分子を利用し、各ＺＦＰは、標的切断部位に隣接するＤＮＡ配列に対する特異性を有し、この２種のＺＦＰが、それぞれの標的ＤＮＡ部位に結合するとき、ＦＯＫ１酵素サブユニットは、互いに近接させられ、一体に結合し、標的切断部位を切断するヌクレアーゼ活性を活性化する。ＺＦＮは、種々の生物におけるゲノム改変に使用されてきた（例えば、それらの全体を参照により本明細書に組み込む、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６０１８８９８７号；同第２００６００６３２３１号；および国際公開ＷＯ０７／０１４，２７５）。カスタムＺＦＰおよびＺＦＮは、例えば、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から市販されており、斯かるカスタムＺＦＮを使用して、ＤＮＡの任意の位置を慣例的に標的化および切断することもできる。
【０１０１】
一部の実施形態では、細胞（例えば、メモリーＢ細胞または形質芽球）は、ドナー構築物（例えば、フォリスタチンドナー構築物）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９）ヌクレアーゼ媒介性組込みにより操作される。ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼ系は、ゲノム操作に使用され得る細菌系に基づく操作されたヌクレアーゼ系である。これは、多くの細菌および古細菌の適応免疫応答の一部に基づく。ウイルスまたはプラスミドが、細菌に侵入するとき、侵入者のＤＮＡのセグメントは、「免疫」応答によってＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に変換される。次いで、このｃｒＲＮＡは、部分的相補性の領域を介して、ｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる別の種類のＲＮＡと会合して、「プロトスペーサー」と呼ばれる標的ＤＮＡにおけるｃｒＲＮＡと相同の領域にＣａｓ９ヌクレアーゼをガイドする。Ｃａｓ９は、ＤＮＡを切断して、ｃｒＲＮＡ転写物内に含有される２０ヌクレオチドガイド配列によって指定された部位におけるＤＳＢに平滑断端を生成する。Ｃａｓ９は、部位特異的ＤＮＡ認識および切断のために、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方を要求する。この系は現在、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを１分子（「シングルガイドＲＮＡ」）へと組み合わせることができるように操作されており、シングルガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡに相当する部分は、任意の所望の配列を標的化するようＣａｓ９ヌクレアーゼをガイドするように操作することができる（Ｊｉｎｅｋら（２０１２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７巻、８１６〜８２１頁、Ｊｉｎｅｋら（２０１３年）ｅＬｉｆｅ  ２巻：ｅ００４７１頁およびＤａｖｉｄ  Ｓｅｇａｌ（２０１３年）ｅＬｉｆｅ  ２巻：ｅ００５６３頁を参照）。よって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ゲノムにおける所望の標的にＤＳＢを作製するように操作することができ、ＤＳＢの修復は、誤りがちな修復の増加の原因となる修復阻害剤の使用によって影響され得る。当業者にとって明らかであるように、Ｃａｓ９に加えて、他のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが公知であり、本発明において使用するのに好適である。
【０１０２】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ媒介性組込みは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲを利用する。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けされた系の１つであり、標的化ＤＮＡ二本鎖切断を４つの逐次的なステップで実行する。第１に、２種の非コードＲＮＡであるプレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡは、プレｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズし、プレｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介して、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡにする。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、標的認識のための追加的な要件である、ｃｒＲＮＡにおけるスペーサーおよびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡにおけるプロトスペーサーの間のワトソン・クリック塩基対形成により、標的ＤＮＡへとＣａｓ９を方向付ける。第４に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖切断を作製する。
【０１０３】
Ｃａｓ９関連のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、２種のＲＮＡ非コード構成成分：ｔｒａｃｒＲＮＡ、および同一の直列反復（ＤＲ）を散りばめたヌクレアーゼガイド配列（スペーサー）を含有するプレｃｒＲＮＡアレイを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、ゲノム操作を達成するために、これらのＲＮＡの両方の機能が存在していなければならない（Ｃｏｎｇら（２０１３年）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ  １／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ  １２３１１４３を参照）。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびプレｃｒＲＮＡは、別々の発現構築物によりまたは別々のＲＮＡとして供給される。他の実施形態では、キメラＲＮＡが構築され、それによると、操作された成熟ｃｒＲＮＡ（標的特異性を付与）が、ｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ９との相互作用を供給）に融合されて、キメラｃｒ−ＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを作製する（シングルガイドＲＮＡとも命名される）。（Ｊｉｎｅｋ、前記箇所およびＣｏｎｇ、前記箇所を参照）。
【０１０４】
一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方を含有するシングルガイドＲＮＡは、任意の所望の配列を標的化するようにＣａｓ９ヌクレアーゼをガイドするように操作することができる（例えば、Ｊｉｎｅｋら（２０１２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７巻、８１６〜８２１頁、Ｊｉｎｅｋら（２０１３年）ｅＬｉｆｅ  ２巻：ｅ００４７１頁、Ｄａｖｉｄ  Ｓｅｇａｌ（２０１３年）ｅＬｉｆｅ  ２巻：ｅ００５６３頁）。よって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ゲノムにおける所望の標的にＤＳＢを作製するように操作することができる。
【０１０５】
カスタムＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）から市販されており、斯かるカスタムシングルガイドＲＮＡ配列を使用して、ＤＮＡの任意の位置を慣例的に標的化および切断することもできる。組換えのための一本鎖ＤＮＡ鋳型は、合成することができる（例えば、本技術分野で公知のおよび市販のオリゴヌクレオチド合成方法により）、またはベクター、例えば、ＡＡＶ等のウイルスベクター中に提供することができる。
【０１０６】
一部の実施形態では、細胞（例えば、メモリーＢ細胞または形質芽球）は、ドナー構築物（例えば、フォリスタチンドナー構築物）のＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）媒介性標的化組込みにより操作される。「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１または複数のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、その同族標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥの結合に関与する。単一「反復単位」（「反復」とも称される）は典型的に、３３〜３５アミノ酸の長さであり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともある程度の配列相同性を示す。ＴＡＬ−エフェクターは、タンデム反復の核局在化配列、酸性転写活性化ドメインおよび中央集中ドメインを含有することができ、各反復は、このようなタンパク質のＤＮＡ結合特異性の鍵となるおよそ３４アミノ酸を含有する。（例えば、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ  Ｓ，ら（２００６年）Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １６３巻（３号）：２５６〜２７２頁）。ＴＡＬエフェクターは、およそ１０２ｂｐを含むタンデム反復に見出される配列に依存し、反復は典型的に、互いに９１〜１００％相同である（例えば、Ｂｏｎａｓら（１９８９年）ＭｏＩ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２１８巻：１２７〜１３６頁）。このようなＤＮＡ結合反復を操作して、新たな組み合わせおよび数の反復をタンパク質に入れて、新たな配列と相互作用し、非内在性レポーター遺伝子の発現を活性化することができる人工転写因子を作製することができる（例えば、Ｂｏｎａｓら（１９８９年）ＭｏＩ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２１８巻：１２７〜１３６頁）。操作されたＴＡＬタンパク質は、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインに連結させて、標的特異的ＤＮＡ配列を切断するためのＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合体（ＴＡＬＥＮ）を得ることができる（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら（２０１０年）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ｅｐｕｂ  １０．１５３４／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１１０．１２０７１７）。
【０１０７】
カスタムＴＡＬＥＮは、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から市販されており、ＤＮＡの任意の位置を慣例的に標的化および切断することもできる。
【０１０８】
一部の実施形態では、細胞（例えば、メモリーＢ細胞または形質芽球）は、ドナー構築物（例えば、フォリスタチンドナー構築物）のメガヌクレアーゼ媒介性標的化組込みにより操作される。メガヌクレアーゼ（または「ホーミングエンドヌクレアーゼ」）は、１２塩基対を超える認識配列において二本鎖ＤＮＡに結合しこれを切断するエンドヌクレアーゼである。天然に存在するメガヌクレアーゼは、単量体（例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ）または二量体（例えば、Ｉ−ＣｒｅＩ）となることができる。天然に存在するメガヌクレアーゼは、１５〜４０塩基対切断部位を認識し、一般的に、４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーへとグループ化される。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩを含む。これらの認識配列は公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻：３３７９〜３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ  ８２巻：１１５〜１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２巻、１１２５〜１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２巻：２２４〜２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２６３巻：１６３〜１８０頁；Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２８０巻：３４５〜３５３頁およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。用語「メガヌクレアーゼ」は、単量体メガヌクレアーゼ、二量体メガヌクレアーゼ、および会合して二量体メガヌクレアーゼを形成する単量体を含む。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されている方法および組成物は、操作された（天然に存在しない）ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）を含むヌクレアーゼを活用する。Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩ等、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列が公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻：３３７９〜３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ  ８２巻：１１５〜１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２巻、１１２５〜１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２巻：２２４〜２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２６３巻：１６３〜１８０頁；Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２８０巻：３４５〜３５３頁およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２年）Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ  １０巻：８９５〜９０５頁；Ｅｐｉｎａｔら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１巻：２９５２〜２９６２頁；Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６年）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１巻：６５６〜６５９頁；Ｐａｑｕｅｓら（２００７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７巻：４９〜６６頁；米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ全体としての文脈において（すなわち、ヌクレアーゼが、同族切断ドメインを含むように）変更することができる、または異種切断ドメインに融合することができる。カスタムメガヌクレアーゼは、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から市販されており、ＤＮＡの任意の位置を慣例的に標的化および切断することもできる。
【０１１０】
Ｂ細胞の操作は、例えば、コードされたヌクレアーゼを含むベクターがＢ細胞によって取り入れられるような、ヌクレアーゼをコードする１種または複数種のベクターによる、Ｂ細胞への１種または複数種のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、メガヌクレアーゼ）の投与を含むことができる。ベクターは、ウイルスベクターであり得る。
【０１１１】
一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、細胞（例えば、メモリーＢ細胞または形質細胞）における特異的内在性遺伝子座（例えば、目的のセーフハーバー遺伝子または遺伝子座）を切断し、１種または複数種の外因的（ドナー）配列（例えば、導入遺伝子）が投与される（例えば、これらの外因的配列を含む１種または複数種のベクター）。斯かる実施形態では、ドナー配列は、フォリスタチン（例えば、フォリスタチン導入遺伝子）をコードし得る。ヌクレアーゼは、標的ＤＮＡにおける二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ニック）を誘導することができる。一部の実施形態では、ドナー導入遺伝子（例えば、フォリスタチンドナー導入遺伝子）の標的化挿入は、細胞のゲノムへの導入遺伝子（例えば、フォリスタチン導入遺伝子）の組込み部位における、相同組換え修復（ＨＤＲ）、非相同修復機構（例えば、ＮＨＥＪ媒介性末端捕捉）、またはヌクレオチド（例えば、内在性配列）の挿入および／もしくは欠失により行うことができる。一実施形態では、Ｂ細胞をトランスフェクトする方法は、ベクターとＢ細胞との接触に先立つＢ細胞のエレクトロポレーションを含む。一実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の１日目から１２日目までの範囲の日にエレクトロポレーションされる。一実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の１、２、３、４、５、６、７、８、または９日目にエレクトロポレーションされる。一実施形態では、細胞は、プラスミドの送達のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の２日目にエレクトロポレーションされる。
【０１１２】
一実施形態では、細胞は、トランスポゾンを使用してトランスフェクトされる。本明細書において、用語「トランスポゾン化」は、一部の実施形態では、トランスポゾンを用いてトランスフェクトされるような細胞を指し得る。多数のトランスポゾン系が当技術分野で公知であり、本発明において使用するのに好適である。例えば、スリーピングビューティートランスポゾン系およびＰｉｇｇｙｂａｃトランスポゾン系は、当技術分野で周知であり、本発明において使用するのに好適である。例えば、これらのそれぞれが、それらの全体を参照により本明細書に組み込む、Hackett  P.B.,  et  al.,  Evaluating  Risks  of  Insertional  Mutagenesis  by  DNA  Transposons  in  Gene  Therapy,  Transl  Res.  2013  April  ;  161(4):  265-283；Hudecek  M,  et  al.,  Going  non-viral:  the  Sleeping  Beauty  transposon  system  breaks  on  through  to  the  clinical  side,  Crit  Rev  Biochem  Mol  Biol.  2017  Aug;52(4):355-380を参照されたい。一部の実施形態では、細胞は、スリーピングビューティートランスポゾンを使用してトランスフェクトされる。スリーピングビューティートランスポゾンは、一部の実施形態では、Ｔ２スリーピングビューティートランスポゾンまたはＴ４スリーピングビューティートランスポゾンであってもよい。一部の実施形態では、スリーピングビューティートランスポゾン系の利用は、Ｂ細胞を、トランスポゾン系の機構をコードするＤＮＡ構築物およびフォリスタチンポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物を用いてトランスフェクトすることを（例えば、エレクトロポレーションにより）含み得る。一部の実施形態では、トランスポゾン系機構をコードするＤＮＡ構築物は、ｐＣＭＶ−ＳＢ１００ｘであってもよい。一部の実施形態では、スリーピングビューティートランスポゾン系の利用は、Ｂ細胞を、フォリスタチンポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物でトランスフェクトすること（例えば、エレクトロポレーションによる）、さらに、Ｂ細胞を、トランスポゾン系機構をコードするｍＲＮＡを用いてトランスフェクトすることを含む。一部の実施形態では、トランスポゾン系機構をコードするｍＲＮＡは、ＳＢ１００×トランスポサーゼをコードする。一部の実施形態では、細胞は、Ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンを使用してトランスフェクトされる。一実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の１日目から１２日目までの範囲の日に、トランスポゾン（例えば、Ｔ２もしくはＴ４スリーピングビューティートランスポゾンまたはＰｉｇｇｙｂａｃトランスポゾン）を使用してトランスフェクトされる。一実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の１、２、３、４、５、６、７、８、または９日目に、トランスポゾン（例えば、Ｔ２もしくはＴ４スリーピングビューティートランスポゾンまたはＰｉｇｇｙｂａｃトランスポゾン）を使用してトランスフェクトされる。一実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の１日目から１２日目までの範囲の日に、ミニサークルを使用してトランスフェクトされる。一実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の１、２、３、４、５、６、７、８、または９日目に、ミニサークルを使用してトランスフェクトされる。
【０１１３】
一実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の１日目から１２日目までの範囲の日に、スリーピングビューティートランスポゾン（例えば、Ｔ２またはＴ４スリーピングビューティートランスポゾン）を使用してトランスフェクトされる。一実施形態では、細胞は、エレクトロポレーションによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の２日目に、スリーピングビューティートランスポゾン系（例えば、Ｔ２またはＴ４スリーピングビューティートランスポゾン）を使用して形質導入される。一実施形態では、細胞は、エレクトロポレーションによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の５日目に、スリーピングビューティートランスポゾン系（例えば、Ｔ２またはＴ４スリーピングビューティートランスポゾン）を使用して形質導入される。一実施形態では、細胞は、エレクトロポレーションによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の８日目に、スリーピングビューティートランスポゾン系（例えば、Ｔ２またはＴ４スリーピングビューティートランスポゾン）を使用して形質導入される。一実施形態では、細胞は、エレクトロポレーションによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の１１日目に、スリーピングビューティートランスポゾン（例えば、Ｔ２またはＴ４スリーピングビューティートランスポゾン）系を使用して形質導入される。一実施形態では、細胞は、エレクトロポレーションによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の１４日目に、スリーピングビューティートランスポゾン（例えば、Ｔ２またはＴ４スリーピングビューティートランスポゾン）系を使用して形質導入される。
【０１１４】
一実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の１日目から１２日目までの範囲の日に、Ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンを使用してトランスフェクトされる。一実施形態では、細胞は、エレクトロポレーションによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の２日目に、Ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンを使用して形質導入される。一実施形態では、細胞は、エレクトロポレーションによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の５日目に、Ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンを使用して形質導入される。一実施形態では、細胞は、エレクトロポレーションによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の８日目に、Ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンを使用して形質導入される。一実施形態では、細胞は、エレクトロポレーションによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の１１日目に、Ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンを使用して形質導入される。一実施形態では、細胞は、エレクトロポレーションによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の１４日目に、Ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンを使用して形質導入される。
【０１１５】
一実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞の少なくとも部分をトランスフェクトするのに十分な条件下、プロモーターに作動可能に連結した目的の核酸を含むベクターと接触される。一実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞の少なくとも５％をトランスフェクトするのに十分な条件下、プロモーターに作動可能に連結した目的の核酸を含むベクターと接触される。さらなる実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらには１００％をトランスフェクトするのに十分な条件下、ベクターと接触される。特定の一実施形態では、本明細書に記載されている通りにｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されたＢ細胞がトランスフェクトされ、この場合、培養されたＢ細胞は、Ｂ細胞の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらには１００％をトランスフェクトするのに十分な条件下、本明細書に記載されているベクターと接触される。
【０１１６】
ウイルスベクターを用いて、メモリーＢ細胞および／または形質細胞を形質導入することができる。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスに基づくベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクター、レトロウイルスベクター、レトロウイルスアデノウイルスベクター、ならびにアンプリコンベクターを含む単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、複製欠損ＨＳＶおよび弱毒化ＨＳＶに由来するベクターを限定することなく含む（例えば、これらそれぞれの全体を参照により本明細書に組み込む、Ｋｒｉｓｋｙ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５巻：１５１７〜３０頁、１９９８年；Ｐｆｅｉｆｅｒ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．２巻：１７７〜２１１頁、２００１年を参照）。
【０１１７】
一実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の１、２、３、４、５、６、７、８または９日目に、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）により形質導入される。特定の実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の５日目に、ウイルスベクターにより形質導入される。一実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスである。一実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の１日目に、麻疹ウイルスシュードタイプ化レンチウイルスにより形質導入される。
【０１１８】
一実施形態では、Ｂ細胞は、本技術分野における種々の公知技法のいずれかを使用して、レトロウイルスベクターにより形質導入される（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９６年４月１２日、２７２巻：２６３〜２６７頁；Ｂｌｏｏｄ  ２００７年、９９巻：２３４２〜２３５０頁；Ｂｌｏｏｄ  ２００９年、１  １３巻：１４２２〜１４３１頁；Ｂｌｏｏｄ  ２００９年１０月８日；１  １４巻（１５号）：３１７３〜８０頁；Ｂｌｏｏｄ．２００３年；１０１巻（６号）：２１６７〜２１７４頁；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏｌｏｇｙまたはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（２００９年）を参照）。Ｂ細胞のウイルス形質導入に関する追加的な記載は、これらそれぞれの全体を参照により本明細書に組み込む、ＷＯ２０１１／０８５２４７およびＷＯ２０１４／１５２８３２に見出すことができる。
【０１１９】
例えば、ドナー由来のＰＢＭＣ、ＢまたはＴリンパ球、およびＢ−ＣＬＬ等の他のＢ細胞がん細胞を単離し、ＩＭＤＭ培地もしくはＲＰＭＩ  １６４０（ＧｉｂｃｏＢＲＬ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａｕｃｋｌａｎｄ、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ）、または本明細書に記載されている他の適した培地において、無血清で、または血清（例えば、５〜１０％ＦＣＳ、ヒトＡＢ血清および血清代替物）およびペニシリン／ストレプトマイシン、および／またはトランスフェリンおよび／またはインスリン等の他の適したサプリメントを補充して培養することができる。一実施形態では、細胞は、４８ウェルプレートにおける１×１０５個の細胞で播種され、濃縮されたベクターは、慣例的な方法論を使用した当業者によって慣例的に最適化され得る様々な用量で添加される。一実施形態では、Ｂ細胞は、１０％ＡＢ血清、５％ＦＣＳ、５０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈｌＬ−１５および５ｎｇ／ｍｌ  ｒｈｌＬ−２を補充したＲＰＭＩにおいてＭＳ５細胞単層に移入され、培地は必要に応じて定期的に新しくする。当業者によって認識されるであろうが、他の適した培地およびサプリメントを所望の通りに使用することができる。
【０１２０】
ある特定の実施形態は、レトロウイルスベクター、またはレトロウイルスに由来するベクターの使用に関する。「レトロウイルス」は、動物細胞に感染することができ、感染初期段階で逆転写酵素を利用して、自身のＲＮＡゲノムからＤＮＡコピーを生成し、次いでこれが典型的に宿主ゲノムに組み込まれる、エンベロープ型ＲＮＡウイルスである。レトロウイルスベクターの例として、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来ベクター、造血前駆体細胞およびその分化した後代等の標的細胞における長期安定的発現をもたらすマウス幹細胞ウイルスに基づくレトロウイルスベクター（例えば、Ｈａｗｌｅｙら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９３巻：１０２９７〜１０３０２頁、１９９６年；Ｋｅｌｌｅｒら、Ｂｌｏｏｄ  ９２巻：８７７〜８８７頁、１９９８年を参照）、ハイブリッドベクター（例えば、Ｃｈｏｉら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １９巻：２３６〜２４６頁、２００１年を参照）、ならびにレンチウイルスベクター等の複合レトロウイルス由来ベクターが挙げられる。
【０１２１】
一実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞の少なくとも部分を形質導入するのに十分な条件下、プロモーターに作動可能に連結した目的の核酸を含むレトロウイルスベクターと接触される。一実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞の少なくとも２％を形質導入するのに十分な条件下、プロモーターに作動可能に連結した目的の核酸を含むレトロウイルスベクターと接触される。さらなる実施形態では、Ｂ細胞は、休止Ｂ細胞の少なくとも２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらには１００％を形質導入するのに十分な条件下、ベクターと接触される。特定の一実施形態では、本明細書に記載されている通りにｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された、分化および活性化されたＢ細胞が形質導入され、この場合、培養された分化／活性化されたＢ細胞は、分化および活性化されたＢ細胞の少なくとも２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらには１００％を形質導入するのに十分な条件下、本明細書に記載されているベクターと接触される。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、形質導入の前に、細胞は、当業者に公知で慣例的に最適化される適切な濃度のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ａｕｒｅｕｓ  Ｃｏｗａｎ（ＳＡＣ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）および／またはＩＬ−２で予め刺激される。当業者に公知で本明細書に記載されている通り、他のＢ細胞活性化因子（例えば、ＰＭＡ）を使用することができる。
【０１２３】
上に記す通り、ある特定の実施形態は、レンチウイルスベクターを用いる。用語「レンチウイルス」は、分裂および非分裂細胞の両方に感染することができる、複合レトロウイルスの属を指す。レンチウイルスの例として、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ  １型およびＨＩＶ  ２型を含む）、ビスナ・マエディ、ヤギ関節炎・脳炎ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。レンチウイルスベクターは、これらのレンチウイルスのうちいずれか１種または複数種に由来することができる（例えば、これらそれぞれの全体を参照により本明細書に組み込む、Ｅｖａｎｓら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０巻：１４７９〜１４８９頁、１９９９年；Ｃａｓｅら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９６巻：２９８８〜２９９３頁、１９９９年；Ｕｃｈｉｄａら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５巻：１  １９３９〜１  １９４４頁、１９９８年；Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３巻：６８２〜６８６頁、１９９９年；Ｓｕｔｔｏｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２巻：５７８１〜５７８８頁、１９９８年；およびＦｒｅｃｈａら、Ｂｌｏｏｄ．１  １２巻：４８４３〜５２頁、２００８年を参照）。
【０１２４】
休止ＴおよびＢ細胞を、ＨＩＶアクセサリータンパク質（ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆ）の大部分を保有するＶＳＶＧコートＬＶによって形質導入することができることが記録された（例えば、Ｆｒｅｃｈａら、２０１０年、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８巻：１７４８頁を参照）。ある特定の実施形態では、レトロウイルスベクターは、ＨＩＶゲノムまたはＳＩＶゲノム等、レンチウイルスゲノム由来のある特定の最小配列を含む。レンチウイルスのゲノムは典型的に、５’末端反復配列（ＬＴＲ）領域、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、アクセサリー遺伝子（例えば、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ）および３’ＬＴＲ領域へと組織化される。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ（反復）およびＵ５と称される３つの領域へと分けられる。Ｕ３領域は、エンハンサーおよびプロモーターエレメントを含有し、Ｕ５領域は、ポリアデニル化シグナルを含有し、Ｒ領域は、Ｕ３およびＵ５領域を分離する。Ｒ領域の転写された配列は、ウイルスＲＮＡの５’および３’末端の両方に現れる（例えば、これらそれぞれの全体を参照により本明細書に組み込む、「ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ａｌａｎ  Ｊ．  Ｃａｎｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００年）；Ｏ  Ｎａｒａｙａｎ、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７０巻：１６１７〜１６３９頁、１９８９年；Ｆｉｅｌｄｓら、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ．、１９９０年；Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２巻：８１５０〜７頁、１９９８年；および米国特許第６，０１３，５１６号を参照）。レンチウイルスベクターは、レンチウイルスゲノムのこれらのエレメントのうちいずれか１種もしくは複数を含んで、所望の通りにベクターの活性を調節することができる、またはこれらのエレメントのうち１種または複数に欠失、挿入、置換もしくは変異を含有して、例えば、レンチウイルス複製の病理学的効果を低下させる、もしくは単一ラウンドの感染にレンチウイルスベクターを限定することができる。
【０１２５】
典型的に、最小レトロウイルスベクターは、ある特定の５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲ配列、１種または複数種の目的の遺伝子（標的細胞において発現されるべき）、１種または複数種のプロモーター、ならびにＲＮＡのパッケージングのためのシス作用性配列を含む。本明細書に記載され、本技術分野で公知の通り、他の調節配列が含まれていてもよい。ウイルスベクターは典型的に、真核細胞（例えば、２９３−ＨＥＫ）等のパッケージング細胞株にトランスフェクトされ得るプラスミドにクローニングされ、また、典型的に、細菌におけるプラスミドの複製に有用な配列を含む。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルス等、レトロウイルスの５’および／または３’ＬＴＲ由来の配列を含む。ＬＴＲ配列は、いずれかの種由来のいずれかのレンチウイルス由来のＬＴＲ配列となることができる。例えば、ＬＴＲ配列は、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶまたはＢＩＶ由来のＬＴＲ配列となることができる。好ましくは、ＬＴＲ配列は、ＨＩＶ  ＬＴＲ配列である。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスの５’ＬＴＲ由来のＲおよびＵ５配列、ならびにレンチウイルス由来の不活性化されたまたは「自己不活性化型」３’ＬＴＲを含む。「自己不活性化型３’ＬＴＲ」は、ＬＴＲ配列が下流遺伝子の発現を駆動するのを防止する変異、置換または欠失を含有する３’末端反復配列（ＬＴＲ）である。３’ＬＴＲ由来のＵ３領域のコピーは、組み込まれたプロウイルスにおける両方のＬＴＲの生成のための鋳型として作用する。よって、不活性化型欠失または変異を有する３’ＬＴＲが、プロウイルスの５’ＬＴＲとして組み込む場合、５’ＬＴＲからの転写は不可能である。このことは、ウイルスエンハンサー／プロモーターおよびいずれかの内部エンハンサー／プロモーターの間の競合を排除する。自己不活性化型３’ＬＴＲは、例えば、これらそれぞれの全体を参照により本明細書に組み込む、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２巻：９８７３〜９８８０頁、１９９８年；Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２巻：８１５０〜８１５７頁、１９９８年；およびＩｗａｋｕｍａら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６１巻：１２０〜１３２頁、１９９９年に記載されている。自己不活性化型３’ＬＴＲは、本技術分野で公知のいずれかの方法によって生成することができる。ある特定の実施形態では、３’ＬＴＲのＵ３エレメントは、そのエンハンサー配列、好ましくは、ＴＡＴＡボックス、Ｓｐｌおよび／またはＮＦ−カッパーＢ部位に欠失を有する。自己不活性化型３’ＬＴＲの結果として、宿主細胞ゲノムに組み込まれたプロウイルスは、不活性化された５’ＬＴＲを含むであろう。
【０１２８】
本明細書に提供されているベクターは典型的に、１または複数の標的細胞において望ましく発現されるタンパク質、例えば、フォリスタチンをコードする遺伝子を含む。しかし、本明細書に提供されているベクターは、１または複数の標的細胞において望ましく発現される他の分子（例えば、ｓｉＲＮＡなど）をコードする遺伝子も含む。一部の実施形態では、ウイルスベクター中で、目的の（例えば、フォリスタチン）遺伝子は、好ましくは、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲ配列の間に位置する。さらに、一部の実施形態では、目的の（例えば、フォリスタチン）遺伝子は、好ましくは、他の遺伝的エレメント、例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー等、転写調節配列と機能的関係性にあって、一度標的細胞に遺伝子が取り込まれると、特定の様式で目的の（例えば、フォリスタチン）遺伝子の発現を調節する。ある特定の実施形態では、有用な転写調節配列は、時間的および空間的の両方で、活性に関して高度に調節される配列である。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、１種または複数種の追加的な遺伝子は、安全対策として取り込んで、例えば、ヒト患者内等、不均一集団内のトランスフェクトされた標的細胞の選択的殺滅または枯渇を可能にすることができる。非限定的な例示的な一実施形態では、遺伝子は、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）であり、その発現は、標的細胞を、薬物ガンシクロビルの作用に対して感受性にする。一部の実施形態では、追加の遺伝子は、細胞表面タンパク質のタグである。一部の実施形態では、遺伝子は、自殺遺伝子である。一部の実施形態では、自殺遺伝子は、二量体化薬によって活性化されるカスパーゼ９自殺遺伝子である（例えば、Tey  et  al.,  Biology  of  Blood  and  Marrow  Transplantation  13:913-924,  2007を参照されたい）。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、マーカータンパク質をコードする１種または複数種の追加的な遺伝子を、ウイルスまたは非ウイルスベクターにおける一次遺伝子（例えば、フォリスタチン遺伝子）の前または後に配置して、所望のタンパク質（例えば、フォリスタチン）を発現している細胞の同定および／または選択を可能にすることができる。ある特定の実施形態は、所望のタンパク質（例えば、フォリスタチン）を発現している細胞の同定および／または選択を容易にし得る追加的な細胞表面タンパク質を取り込む。ある特定の実施形態は、目的の一次遺伝子（例えば、フォリスタチン遺伝子）と共に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）等、蛍光マーカータンパク質を取り込む。１種または複数種の追加的なレポーター遺伝子が含まれる場合、レポーター遺伝子および／または他のいずれかの目的の遺伝子から目的の一次遺伝子（例えば、フォリスタチン遺伝子）を分離する、ＩＲＥＳ配列または２Ａエレメントも含まれていてよい。
【０１３１】
ある特定の実施形態は、１種または複数種の選択可能マーカーをコードする遺伝子を用いることができる。例として、選択的培養培地において育成されている形質転換された宿主細胞の生存または成長に必要な因子をコードする薬物耐性のための遺伝子等、真核細胞または原核細胞において有効な選択可能マーカーを挙げることができる。例示的な選択遺伝子は、抗生物質または他の毒素、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシン、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）、ウアバイン、ブラストサイジン、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか、栄養要求性欠損を補完するか、または補給するタンパク質をコードし、これらは別々のプラスミドに存在し、ウイルスベクターとのコトランスフェクションによって導入することができる。一実施形態では、遺伝子は、メトトレキセート耐性を付与する変異体ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする。ある特定の他の実施形態は、トランスフェクトされた細胞のタグ付けおよび検出または精製に使用することができる１種または複数種の細胞表面受容体（例えば、低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ））、または形質導入タグ系として有用な他の斯かる受容体をコードする遺伝子を用いることができる。例えば、Ｌａｕｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０００年３月；７巻（３号）：４３０〜７頁を参照されたい。
【０１３２】
レトロウイルスベクター等、ある特定のウイルスベクターは、１種または複数種の異種プロモーター、エンハンサー、またはその両方を用いる。ある特定の実施形態では、レトロウイルスまたはレンチウイルス５’ＬＴＲ由来のＵ３配列は、ウイルス構築物におけるプロモーターまたはエンハンサー配列と置き換えることができる。ある特定の実施形態は、ウイルスベクターの５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲ配列の間に位置し、目的の遺伝子（例えば、フォリスタチン遺伝子）に作動可能に連結した、「内部」プロモーター／エンハンサーを用いる。
【０１３３】
「機能的関係性」および「作動可能に連結された」は、プロモーターおよび／またはエンハンサーが、適切な調節分子と接触されると、遺伝子（例えば、フォリスタチン遺伝子）の発現が影響されることになるように、遺伝子（例えば、フォリスタチン遺伝子）が、プロモーターおよび／またはエンハンサーに関して正確な位置および配向性にあることを限定することなく意味する。パッケージング細胞株におけるウイルスＲＮＡゲノムの発現を調節する（例えば、増加させる、減少させる）、感染した標的細胞における選択された目的の遺伝子の発現を調節する、またはその両方を行う、いかなるエンハンサー／プロモーターの組み合わせも使用することもできる。
【０１３４】
プロモーターは、ポリメラーゼ結合および転写が起こることを可能にするＤＮＡ配列によって形成される発現制御エレメントである。プロモーターは、選択された目的の遺伝子の開始コドンの上流（５’）に位置し（典型的に、約１００〜１０００ｂｐ以内）、それが作動可能に連結されたコードポリヌクレオチド配列の転写および翻訳を制御する、非翻訳配列である。プロモーターは、誘導性または構成的となることができる。誘導性プロモーターは、その制御下で、温度変化等、培養条件の何らかの変化に応答して、ＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始する。プロモーターは、一方向性または双方向性となることができる。双方向性プロモーターを使用して、２種の遺伝子、例えば、フォリスタチンなどの目的の遺伝子および選択マーカーを同時発現させることができる。あるいは、同じベクターにおいて反対の配向性で、異なる遺伝子の発現をそれぞれ制御する２個のプロモーターを含む双方向性プロモーター構成を利用することができる。
【０１３５】
ポリヌクレオチドコード配列にプロモーターを作動可能に連結するための方法と同様に、種々のプロモーターが本技術分野で公知である。ネイティブプロモーター配列および多くの異種プロモーターの両方を使用して、選択された目的の遺伝子の発現を方向付けることができる。ある特定の実施形態は、一般に、ネイティブプロモーターと比較して、所望のタンパク質のより優れた転写およびより高い収量を可能にすることから、異種プロモーターを用いる。
【０１３６】
ある特定の実施形態は、異種ウイルスプロモーターを用いることができる。斯かるプロモーターの例として、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびサルウイルス４０（ＳＶ４０）等、ウイルスのゲノムから得られるプロモーターが挙げられる。ある特定の実施形態は、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーター、または目的の遺伝子（例えば、フォリスタチン遺伝子）のネイティブ配列に関連したプロモーター等、異種哺乳動物プロモーターを用いることができる。典型的に、プロモーターは、活性化されたＢリンパ球、形質Ｂ細胞、メモリーＢ細胞または他のリンパ球標的細胞等、標的細胞と適合性である。
【０１３７】
ある特定の実施形態は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＩＩＩプロモーターのうち１種または複数種を用いることができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの適した選択は、例えば、その全体を参照により本明細書に組み込む、ＰａｕｌｅおよびＷｈｉｔｅ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．、２８巻、１２８３〜１２９８頁、２０００年に見出すことができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＩＩＩプロモーターは、その下流ＲＮＡコード配列を転写するようにそれぞれＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩを方向付けることができる、いずれかの合成または操作されたＤＮＡ断片も含む。さらに、ウイルスベクターの一部として使用されるＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩまたはＩＩＩ）プロモーター（単数または複数）は、誘導性となることができる。いずれか適した誘導性Ｐｏｌ  ＩＩまたはＩＩＩプロモーターを、本明細書に記載されている方法と共に使用することができる。例示的なＰｏｌ  ＩＩまたはＩＩＩプロモーターは、これらそれぞれの全体を参照により本明細書に組み込む、ＯｈｋａｗａおよびＴａｉｒａ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１１巻、５７７〜５８５頁、２０００年；ならびにＭｅｉｓｓｎｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２９巻、１６７２〜１６８２頁、２００１年に提供されている、テトラサイクリン応答性プロモーターを含む。
【０１３８】
使用することができる構成的プロモーターの非限定例として、ユビキチンのプロモーター、ＣＭＶプロモーター（例えば、Ｋａｒａｓｕｙａｍａら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．１６９巻：１３頁、１９８９年を参照）、β−アクチン（例えば、Ｇｕｎｎｉｎｇら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８４巻：４８３１〜４８３５頁、１９８７年を参照）、伸長因子−１アルファ（ＥＦ−１アルファ）プロモーター、ＣＡＧプロモーターおよびｐｇｋプロモーター（例えば、これらのそれぞれを参照により本明細書に組み込む、Ａｄｒａら、Ｇｅｎｅ  ６０巻：６５〜７４頁、１９８７年）；Ｓｉｎｇｅｒ−Ｓａｍら、Ｇｅｎｅ  ３２巻：４０９〜４１７頁、１９８４年；およびＤｏｂｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０巻：２６３５〜２６３７頁、１９８２年を参照）が挙げられる。組織特異的プロモーターの非限定例として、ｌｃｋプロモーター（例えば、Ｇａｒｖｉｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８巻：３０５８〜３０６４頁、１９８８年；およびＴａｋａｄｅｒａら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９巻：２１７３〜２１８０頁、１９８９年を参照）、ミオゲニンプロモーター（Ｙｅｅら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ７巻：１２７７〜１２８９頁、１９９３年）およびｔｈｙｌプロモーター（例えば、Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎら、Ｇｅｎｅ  １  １３巻：２０７〜２１４頁、１９９２年を参照）が挙げられる。
【０１３９】
プロモーターの追加的な例として、Ｂリンパ球において機能的である、ユビキチン−Ｃプロモーター、ヒトμ重鎖プロモーターまたはＩｇ重鎖プロモーター（例えば、ＭＨ）、およびヒトκ軽鎖プロモーターまたはＩｇ軽鎖プロモーター（例えば、ＥＥＫ）が挙げられる。ＭＨプロモーターは、マトリクス会合領域が隣接するｉＥμエンハンサーが先行する、ヒトμ重鎖プロモーターを含有し、ＥＥＫプロモーターは、イントロンエンハンサー（ｉＥκ）、マトリクス会合性領域および３’エンハンサー（３Ｅκ）が先行する、κ軽鎖プロモーターを含有する（例えば、Ｌｕｏら、Ｂｌｏｏｄ．１  １３巻：１４２２〜１４３１頁、２００９年および米国特許出願公開第２０１０／０２０３６３０号を参照）。したがって、ある特定の実施形態は、これらのプロモーターまたはエンハンサーエレメントのうち１種または複数種を用いることができる。
【０１４０】
一実施形態では、ある１つのプロモーターは、選択可能マーカーの発現を駆動し、第２のプロモーターは、目的の遺伝子（例えば、フォリスタチン遺伝子）の発現を駆動する。例えば、一実施形態では、ＥＦ−１アルファプロモーターは、選択マーカー（例えば、ＤＨＦＲ）の産生を駆動し、ミニチュアＣＡＧプロモーター（例えば、Ｆａｎら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０巻：２２７３〜２２８５頁、１９９９年を参照）は、目的の遺伝子（例えば、フォリスタチン）の発現を駆動する。
【０１４１】
上に記す通り、ある特定の実施形態は、内部エンハンサー等、エンハンサーエレメントを用いて、目的の遺伝子の発現を増加させる。エンハンサーは、その転写を増加させるようにプロモーターに作用する、通常約１０〜３００ｂｐの長さのＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサー配列は、ιεμエンハンサー、ιεκイントロンエンハンサーおよび３’εκエンハンサー等、哺乳動物遺伝子（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、インスリン）に由来することができる。複製起点の後側におけるＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ  １００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側におけるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む、真核生物ウイルス由来のエンハンサーも含まれる。エンハンサーは、抗原特異的ポリヌクレオチド配列に対する位置５’または３’においてベクターへとスプライスすることができるが、好ましくは、プロモーターから５’の部位に位置する。当業者であれば、所望の発現パターンに基づき適切なエンハンサーを選択するであろう。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、プロモーターは、目的の遺伝子（例えば、フォリスタチン遺伝子）の誘導性発現を可能にするように選択される。テトラサイクリン応答性系およびｌａｃオペレーター・リプレッサー系を含む、誘導性発現のための多数の系が、本技術分野で公知である。プロモーターの組み合わせを使用して、目的の遺伝子（例えば、フォリスタチン遺伝子）の所望の発現を得ることができることも企図される。当業者であれば、目的の生物および／または標的細胞における遺伝子の所望の発現パターンに基づきプロモーターを選択することができるであろう。
【０１４３】
ある特定のウイルスベクターは、ウイルス粒子へのゲノムウイルスＲＮＡの取り込みを促進するためのシス作用性パッケージング配列を含有する。例として、ｐｓｉ−配列が挙げられる。斯かるシス作用性配列は、本技術分野で公知である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されているウイルスベクターは、２種またはそれよりも多い遺伝子を発現することができ、これは、例えば、配列内リボソーム進入配列（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＩＲＥＳ）エレメント（参照により本明細書に組み込む米国特許第４，９３７，１９０号）もしくは２Ａエレメントまたはその両方等、同時発現を容易にするエレメントを取り込むことにより、第１の遺伝子を越えて別々の遺伝子のそれぞれに作動可能に連結した内部プロモーターを取り込むことにより達成することができる。単に説明として、単一のベクターが、所望の特異性を有する免疫グロブリン分子の各鎖をコードする配列を含む場合、ＩＲＥＳまたは２Ａエレメントを使用することができる。例えば、第１のコード領域（重鎖または軽鎖のいずれかをコード）は、プロモーターからすぐ下流に位置することができ、第２のコード領域（他方の鎖をコード）は、第１のコード領域から下流に位置することができ、ＩＲＥＳまたは２Ａエレメントは、第１および第２のコード領域の間に、好ましくは、第２のコード領域に直接先行して位置する。他の実施形態では、ＩＲＥＳまたは２Ａエレメントは、レポーター遺伝子、選択可能マーカー、細胞表面タンパク質、または免疫機能を増強する遺伝子等、無関係の遺伝子の同時発現に使用される。使用することができるＩＲＥＳ配列の例は、脳脊髄炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ）、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）、コクサッキーウイルス（ＣＳＶ）、ポリオウイルス（ＰＯＬＩＯ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびペスチウイルス（例えば、豚コレラウイルス（ＨＯＣＶ）およびウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ））のＩＲＥＳエレメントを限定することなく含む（例えば、これらそれぞれの全体を参照により本明細書に組み込む、Ｌｅら、Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  １２巻：１３５〜１４７頁、１９９６年；およびＬｅら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻：３６２〜３６９頁、１９９７年を参照）。２Ａエレメントの一例として、口蹄疫ウイルス由来のＦ２Ａ配列が挙げられる。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供されているベクターは、所望の結果を達成するための追加的な遺伝的エレメントも含有する。例えば、ある特定のウイルスベクターは、ＨＩＶ−１  ｆｌａｐシグナル等、標的細胞におけるウイルスゲノムの核侵入を容易にするシグナルを含むことができる。さらに別の例として、ある特定のウイルスベクターは、ｔＲＮＡアンバーサプレッサー配列等、標的細胞におけるプロウイルス組込み部位の特徴付けを容易にするエレメントを含むことができる。ある特定のウイルスベクターは、目的の遺伝子（例えば、フォリスタチン遺伝子）の発現を増強するように設計された１種または複数種の遺伝的エレメントを含有することができる。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス応答性エレメント（ＷＲＥ）を構築物中に配置することができる（例えば、これらそれぞれの全体を参照により本明細書に組み込む、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７４巻：３６６８〜３６８１頁、１９９９年；およびＤｅｇｌｏｎら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１巻：１７９〜１９０頁、２０００年を参照）。別の例として、ニワトリβ−グロビンインスレーターが、構築物中に含まれていてもよい。このエレメントは、メチル化およびヘテロクロマチン化効果による標的細胞における組み込まれたＤＮＡのサイレンシングの確率を低下させることが示されてきた。加えて、インスレーターは、染色体上の組込み部位における周囲のＤＮＡ由来のプラスのまたはマイナスの位置的効果から内部エンハンサー、プロモーターおよび外因的遺伝子を遮蔽することができる。ある特定の実施形態は、これらの遺伝的エレメントのそれぞれを用いる。別の実施形態では、本明細書に提供されているウイルスベクターは、発現を増加させるための遍在性クロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）を含有することもできる（例えば、Ｚｈａｎｇ  Ｆら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１０年９月；１８巻（９号）：１６４０〜９頁を参照）。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供されているウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス）は、主に、選択された細胞型を標的化するために、１種または複数種の選択されたウイルス糖タンパク質またはエンベロープタンパク質により「シュードタイプ化」されている。シュードタイプ化は、一般に、細胞表面ウイルス粒子上への１種または複数種の異種ウイルス糖タンパク質の取り込みを指し、これは多くの場合、ウイルス粒子を、その通常の標的細胞とは異なる選択された細胞に感染させることができる。「異種」エレメントは、ウイルスベクターのＲＮＡゲノムが由来するウイルス以外のウイルスに由来する。典型的に、ウイルスベクターの糖タンパク質コード領域は、それ自身の糖タンパク質の発現を防止するための欠失による等、遺伝的に変更されている。単に説明として、ＨＩＶ由来レンチウイルスベクター由来のエンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１および／またはｇｐ１２０は典型的に、異種ウイルス糖タンパク質によるシュードタイプ化の前に欠失されている。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、Ｂリンパ球を標的化する異種ウイルス糖タンパク質によりシュードタイプ化される。ある特定の実施形態では、ウイルス糖タンパク質は、休止または静止状態Ｂリンパ球の選択的感染または形質導入を可能にする。ある特定の実施形態では、ウイルス糖タンパク質は、Ｂリンパ球形質細胞、形質芽球および活性化されたＢ細胞の選択的感染を可能にする。ある特定の実施形態では、ウイルス糖タンパク質は、静止状態Ｂリンパ球、形質芽球、形質細胞および活性化されたＢ細胞の感染または形質導入を可能にする。ある特定の実施形態では、ウイルス糖タンパク質は、Ｂ細胞慢性リンパ球白血病細胞の感染を可能にする。一実施形態では、ウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇによりシュードタイプ化される。別の実施形態では、異種ウイルス糖タンパク質は、Ｅｄｍｏｎｔｏｎ麻疹ウイルス等の麻疹ウイルスの糖タンパク質に由来する。ある特定の実施形態は、麻疹ウイルス糖タンパク質ヘマグルチニン（Ｈ）、融合タンパク質（Ｆ）またはその両方をシュードタイプ化する（例えば、これらそれぞれの全体を参照により本明細書に組み込む、Ｆｒｅｃｈａら、Ｂｌｏｏｄ．１  １２巻：４８４３〜５２頁、２００８年；およびＦｒｅｃｈａら、Ｂｌｏｏｄ．１  １４巻：３１７３〜８０頁、２００９年を参照）。一実施形態では、ウイルスベクターは、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）によりシュードタイプ化される。一実施形態では、ウイルスベクターは、ネコ内在性レトロウイルス（ＲＤ１１４）によりシュードタイプ化される。一実施形態では、ウイルスベクターは、ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）によりシュードタイプ化される。一実施形態では、ウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）によりシュードタイプ化される。一実施形態では、ウイルスベクターは、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）によりシュードタイプ化される。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、特定の細胞型へとベクターを標的化するように機能する１個または複数種の可変領域（例えば、重鎖および軽鎖可変領域）等、埋伏された抗体結合ドメインを含む。
【０１４７】
ウイルスベクターの生成は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年））、Ｃｏｆｆｉｎら（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９７年））および「ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ａｌａｎ  Ｊ．  Ｃａｎｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０００年））に記載されている通り、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、ＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列決定の標準技法を限定することなく含む、本技術分野で公知のいずれか適した遺伝子操作技法を使用して達成することができる。
【０１４８】
本技術分野で公知のいずれか種々の方法を使用して、そのゲノムがウイルスベクターのＲＮＡコピーを含む、適したレトロウイルス粒子を産生することができる。一方法として、ウイルスベクターは、所望の標的細胞特異性で、ウイルス粒子へのウイルスベクターに基づき、ウイルスゲノムＲＮＡをパッケージするパッケージング細胞株に導入することができる。パッケージング細胞株は典型的に、トランスで、構造ｇａｇタンパク質、酵素ｐｏｌタンパク質およびエンベロープ糖タンパク質を含む、ウイルス粒子へのウイルスゲノムＲＮＡのパッケージングおよび標的細胞の感染に要求されるウイルスタンパク質をもたらす。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、パッケージング細胞株は、ある特定の必要なまたは所望のウイルスタンパク質（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ）を安定に発現する（例えば、参照により本明細書に組み込む、米国特許第６，２１８，１８１号を参照）。ある特定の実施形態では、パッケージング細胞株は、本明細書に記載されている麻疹ウイルス糖タンパク質配列を含む、必要なまたは所望のウイルスタンパク質（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、糖タンパク質）のある特定のものをコードするプラスミドを一過性にトランスフェクトされる。例示的な一実施形態では、パッケージング細胞株は、ｇａｇおよびｐｏｌ配列を安定に発現し、次いでこの細胞株は、ウイルスベクターをコードするプラスミドおよび糖タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトされる。所望のプラスミドの導入後に、ウイルス粒子は、採取され、超遠心分離による等、それに見合うように加工されて、ウイルス粒子の濃縮ストックを達成する。例示的なパッケージング細胞株は、２９３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  Ｘ）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｄ１７（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １８３）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）およびＣｆ２Ｔｈ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４３０）細胞株を含む。
【０１５０】
治療剤
本明細書において、「目的の遺伝子」または「遺伝子」または「目的の核酸」は、標的トランスフェクト細胞において発現されるべき導入遺伝子を指す。特定の実施形態では、遺伝子は、フォリスタチン遺伝子である。用語「遺伝子」を使用することができるが、この用語は、ゲノムＤＮＡに見出される遺伝子であることを含意するものではなく、用語「核酸」と互換的に使用される。一般に、目的の核酸は、治療剤（例えば、フォリスタチン）のコードに適した核酸を提供し、ｃＤＮＡまたはＤＮＡを含むことができ、イントロンを含んでも含まなくてもよいが、一般に、イントロンを含まない。他の箇所に記されている通り、目的の核酸は、標的細胞において目的のタンパク質を有効に発現させるための発現制御配列に作動可能に連結される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されているベクターは、１種または複数種の目的の遺伝子を含むことができ、例えば、本明細書に記載されている内部プロモーターを使用して組織化され得る免疫グロブリンの重鎖および軽鎖等、２、３、４もしくは５種またはそれよりも多い目的の遺伝子を含むことができる。
【０１５１】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」の言及は、本明細書において、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡを指定する。この用語は典型的に、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチド、またはどちらかの型のヌクレオチドの改変された形態である、少なくとも１０塩基の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの一本および二本鎖形態を含む。目的の核酸または遺伝子は、目的のタンパク質をコードするいずれかの核酸となることができる。
【０１５２】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている実施形態のいずれか１つは、フォリスタチンタンパク質である目的の遺伝子を利用することができる。フォリスタチンタンパク質は、一部の実施形態では、配列番号１〜４に示されるフォリスタチンタンパク質のうちのいずれか１つであってもよい。よって、一部の実施形態では、本明細書に記載されているように、遺伝子改変Ｂ細胞に送達される治療剤は、フォリスタチンタンパク質であってもよい。
【０１５３】
フォリスタチン
様々な態様では、本開示は、フォリスタチン（例えば、１または複数のフォリスタチンペプチド）を発現するように操作されたＢ細胞に関する。本明細書において、用語「フォリスタチン」は、フォリスタチン（ＦＳＴ）タンパク質のファミリーおよび任意の種に由来するフォリスタチン関連タンパク質を指す。フォリスタチンは、高等動物のほとんど全ての組織で発現される自己分泌糖タンパク質である。フォリスタチンは、最初に、卵胞液から単離され、下垂体前葉からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の分泌を阻害するタンパク質画分として同定され、したがって、ＦＳＨ抑制タンパク質（ＦＳＰ）として設計された。次に、その主要な機能は、例えば、アクチビン、下垂体前葉においてＦＳＨの分泌を増強するパラクリンホルモンを含むＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーの結合および中和であることが決定された。
【０１５４】
一部の実施形態では、用語「フォリスタチンポリペプチド」または「フォリスタチン」は、フォリスタチンファミリーの任意の天然に存在するポリペプチドおよび例えば、リガンド結合（例えば、ミオスタチン、ＧＤＦ−１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ）またはヘパリン結合を含む、有用な活性を保持する、それらの任意のバリアント（変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態）を含むポリペプチドを指すために使用される。例えば、一部の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、フォリスタチンポリペプチドの配列に対して少なくとも約８０％同一である配列、好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれより高い割合の同一性を有する、任意の公知のフォリスタチンの配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含んでもよい。
【０１５５】
フォリスタチンは、ｍＲＮＡの選択的スプライシングおよびタンパク質の可変グリコシル化に基づいて、３１〜４９ｋＤａの分子量の範囲を有する単鎖ポリペプチドである。フォリスタチン（ＦＳＴ）をコードするヒト遺伝子は、染色体５ｑ１１．２上に５３２９ｂｐにわたって６つのエクソンを有し、２つの主な転写物：転写物バリアントＦＳＴ３４４（１１２２ｂｐ）および転写物ＦＳＴ３１７（１３８６ｂｐ）を生じる。ＦＳＴにおけるエクソン１は、フォリスタチンシグナルペプチドをコードし、エクソン２は、フォリスタチンＮ末端ドメインをコードし、エクソン３〜５のそれぞれは、フォリスタチンモジュールをコードする。選択的スプライシングによって、エクソン６Ａ（ＦＳＴ３４４における酸性領域をコードする）またはエクソン６Ｂ（ＦＳＴ３１７のストップコドンの２つの塩基を含有する）のいずれか１つを利用する（Shimasaki,  S.  et  al.,  1988）。
【０１５６】
このような選択的にスプライシングされたｍＲＮＡ（ＦＳＴ３４４およびＦＳＴ３１７）によって、２９個のアミノ酸シグナルペプチドの除去後に、それぞれ３１５個のアミノ酸（すなわち、ＦＳＴ３１５）および２８８個のアミノ酸（すなわち、ＦＳＴ２８８）の２つのフォリスタチンタンパク質が産生され、フォリスタチン３１５は、タンパク質分解によってフォリスタチン３０３（ＦＳＴ３０３）へとさらに分解され得る。アミノ酸配列の分析によって、ネイティブのヒトフォリスタチンポリペプチドが、５つのドメイン（Ｎ末端側から）：シグナル配列ペプチド（配列番号１のアミノ酸１〜２９）、Ｎ末端ドメイン（ＦＳＮ）（配列番号１のアミノ酸３０〜９４）、フォリスタチンドメインＩ（ＦＳＤＩ）（配列番号１のアミノ酸９５〜１６４）、フォリスタチンドメインＩＩ（ＦＳＤＩＩ）（配列番号１のアミノ酸１６８〜２３９）、およびフォリスタチンドメインＩＩＩ（ＦＳＤＩＩＩ）（配列番号１のアミノ酸２４５〜３１６）を含むことが明らかになった。PNAS,  U.S.A.,  1988,  Vol.  85,  No  12,  pp  4218-4222を参照されたい。
【０１５７】
ヒトフォリスタチン−２８８（ＦＳＴ２８８）前駆体（すなわち、ＦＳＴ３１７）は、以下のアミノ酸配列を有し、シグナルペプチドを太字で示し、Ｎ末端ドメイン（ＦＳＮ）を一重下線で示し、かつフォリスタチンドメインＩ〜ＩＩＩ（ＦＳＩ、ＦＳＩＩ、ＦＳＩＩＩ）を二重下線で示す。
【化１】
2021515576.tif 000003
【０１５８】
プロセシングした（成熟した）ヒトフォリスタチンバリアント（ＦＳＴ２８８）は、以下のアミノ酸配列を有し、Ｎ末端ドメインを一重下線で示し、フォリスタチンドメインＩ〜ＩＩＩを二重下線で示す。さらに、第１のシステインの前の最初のアミノ酸ＧまたはＮのいずれかを、結果の如何にかかわらず、プロセシングすることによって除去するかまたは意図的に排除することができ、斯かる僅かにより小さいポリペプチドを含むポリペプチドがさらに含まれることが認識される。
【化２】
2021515576.tif 000004
【０１５９】
ヒトフォリスタチン−３１５（ＦＳＴ３１５）前駆体（すなわち、ＦＳＴ３４４）は、以下のアミノ酸配列を有し、シグナルペプチドを太字で示し、Ｎ末端ドメイン（ＦＳＮ）を一重下線で示し、フォリスタチンドメインＩ〜ＩＩＩ（ＦＳＩ、ＦＳＩＩ、ＦＳＩＩＩ）を二重下線で示す（ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＨ０４１０７．１；３４４個のアミノ酸）。
【化３】
2021515576.tif 000005
【０１６０】
プロセシングした（成熟した）ヒトＦＳＴ３１５は、以下のアミノ酸配列を有し、Ｎ末端ドメインを一重下線で示し、フォリスタチンドメインＩ〜ＩＩＩを二重下線で示す。さらに、第１のシステインの前の最初のアミノ酸ＧまたはＮのいずれかを、結果の如何にかかわらず、プロセシングすることによって除去するかまたは意図的に排除することができ、斯かる僅かにより小さいポリペプチドを含むポリペプチドがさらに含まれることが認識される。
【化４】
2021515576.tif 000006
【０１６１】
本開示のフォリスタチンポリペプチドは、フォリスタチンタンパク質の任意の天然に存在するドメインおよび有用な活性を保持するそのバリアント（例えば、変異体、断片、およびペプチド模倣形態）を含んでもよい。例えば、ＦＳＴ３１５およびＦＳＴ２８８が、両方のアクチビン（アクチビンＡおよびアクチビンＢ）およびミオスタチン（および密接にかかわるＧＤＦ１１）に対して高い親和性を有し、フォリスタチンドメイン（例えば、ＦＳＮおよびＦＳＤＩ〜ＩＩＩ）が斯かるＴＧＦ−βリガンドの結合に関与すると考えられることは周知である。しかし、このような３つのドメインはそれぞれ、このようなＴＧＦ−βリガンドに対する異なる親和性を有する場合があると考えられる。例えば、ある研究は、唯一のＮ末端ドメイン（ＦＳＮ）と２つのＦＳＤＩドメインをタンデムに含むポリペプチド構築物が、ミオスタチンに対する高い親和性を保持することを実証し、遺伝子発現によってマウスへと導入された場合に、アクチビンに対する親和性をほとんど保持しないかまたは親和性を保持せず、全身の筋肉の成長を促進したことを実証した（Nakatani  et  al.,  The  FASEB  Journal,  Vol.  22477-487  (2008)）。
【０１６２】
したがって、本開示は、部分的に、天然に存在するＦＳＴタンパク質（例えば、ミオスタチンに対する高親和性を維持する一方で、アクチビンに対する親和性が有意に低減した）に対する所与のＴＧＦ−βリガンドの選択的結合および／または阻害を実証するバリアントフォリスタチンタンパク質を包含する。
【０１６３】
よって、この開示は、Ｂ細胞を遺伝子改変するための本開示の治療剤（例えば、フォリスタチン）をコードするポリヌクレオチド（単離されたかまたは精製されたかまたは純粋なポリヌクレオチド）、斯かるポリヌクレオチドを含むベクター（クローニングベクターおよび発現ベクターを含む）、および本開示に従って、ポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換されたかトランスフェクトされた細胞（例えば、宿主細胞）を提供する。ある特定の実施形態では、本開示に開示されている実施形態のいずれか１つは、配列番号１〜４のフォリスタチンポリペプチドから選択されるフォリスタチン（例えば、Ｂ細胞において発現するための）を利用し得る。ある特定の実施形態では、本開示に開示されている実施形態のいずれか１つは、ヒトフォリスタチンＦＳＴ３４４スプライス部位バリアントであるフォリスタチン（例えば、Ｂ細胞において発現するための）を利用し得る。ある特定の実施形態では、本開示の目的のタンパク質（例えば、フォリスタチン）をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が企図される。目的のタンパク質をコードする発現カセットも本発明において企図される。
【０１６４】
本開示はまた、本開示のポリヌクレオチドを含むベクターに関し、特に、組換え発現構築物に関する。一実施形態では、本開示は、本開示のタンパク質（例えば、フォリスタチン）をコードするポリヌクレオチドを、斯かるタンパク質コード配列の転写、翻訳およびプロセシングを引き起こすまたは容易にする他のポリヌクレオチド配列と共に含むベクターを企図する。原核生物および真核生物宿主による使用に適切なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９年）に記載されている。例示的なクローニング／発現ベクターは、その中に含有されているポリヌクレオチドの増幅、移入および／または発現に適した、本技術分野で公知のプラスミド、ファージミド、ファスミド（ｐｈａｓｍｉｄ）、コスミド、ウイルス、人工染色体またはいずれかの核酸ビヒクルに基づくことができる、クローニングベクター、シャトルベクターおよび発現構築物を含む。
【０１６５】
本明細書において、ウイルスベクターに関して他のことが記載されていない限り、「ベクター」は、それに連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。例示的なベクターは、プラスミド、ミニサークル、トランスポゾン（例えば、スリーピングビューティートランスポゾン）、酵母人工染色体、自己複製ＲＮＡおよびウイルスゲノムを含む。ある特定のベクターは、宿主細胞において自律的に複製することができる一方、他のベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込み、これにより、宿主ゲノムと共に複製されることができる。加えて、ある特定のベクターは、本明細書において、発現制御配列に操作可能に連結された核酸配列を含有する（したがって、発現制御配列は、このような配列の発現を方向付けることができる）、「組換え発現ベクター」（または単純に、「発現ベクター」）と称される。ある特定の実施形態では、発現構築物は、プラスミドベクターに由来する。説明のための構築物は、アンピシリン耐性遺伝子、ポリアデニル化シグナルおよびＴ７プロモーター部位をコードする核酸配列を有する、改変ｐＮＡＳＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）；ＣＨＥＦ１プロモーターを有するｐＤＥＦ３８およびｐＮＥＦ３８（ＣＭＣ  ＩＣＯＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；ならびにＣＭＶプロモーターを有するｐＤ１８（Ｌｏｎｚａ）を含む。他の適した哺乳動物発現ベクターが周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９５年；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記参照を参照；例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪのカタログも参照されたい）。
【０１６６】
融合タンパク質の増強された産生レベルの促進に適した調節制御下でジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）コード配列を含む、有用な構築物を調製することができ、そのようなレベルは、適切な選択薬剤（例えば、メトトレキセート）の適用後の遺伝子増幅に起因する。一実施形態では、転位に成功したＢ細胞を濃縮するための、メトトレキセート（ＭＴＸ）におけるインキュベーションと組み合わせた、薬物耐性ＤＨＦＲと共に治療用遺伝子（例えば、ＦＳＴ）をコードする二機能性トランスポゾンの使用は、より強力な産物を生成する。
【０１６７】
一般に、組換え発現ベクターは、上述の通り、宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点および選択可能マーカー、ならびに下流構造配列の転写を方向付けるための高度に発現される遺伝子に由来するプロモーターを含むであろう。本開示に係るポリヌクレオチドと作動可能に連結されたベクターは、クローニングまたは発現構築物を生じる。例示的なクローニング／発現構築物は、本開示のポリヌクレオチドに作動可能に連結した、少なくとも１個の発現制御エレメント、例えば、プロモーターを含有する。エンハンサー、因子特異的結合部位、ターミネーターおよびリボソーム結合部位等、追加的な発現制御エレメントも、本開示に係るベクターおよびクローニング／発現構築物において企図されている。本開示に係るポリヌクレオチドの異種構造配列は、翻訳開始および終止配列と適切な位相でアセンブルされる。よって、例えば、本明細書に提供されているコード核酸は、宿主細胞において斯かるタンパク質を発現するための組換え発現構築物として、種々の発現ベクター構築物（例えば、ミニサークル）のいずれか１種に含まれていてよい。
【０１６８】
適切なＤＮＡ配列（複数可）は、例えば、種々の手順によってベクターに挿入することができる。一般に、ＤＮＡ配列は、本技術分野で公知の手順によって適切な制限エンドヌクレアーゼ切断部位（複数可）に挿入される。ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼその他が関与する酵素反応のための、クローニング、ＤＮＡ単離、増幅および精製のための標準技法、ならびに様々な分離技法が企図されている。多数の標準技法が、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．  Ａｓｓｏｃ．  Ｉｎｃ．  ＆  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ、１９９３年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ、１９８９年）；Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ、１９８２年）；Ｇｌｏｖｅｒ（編）（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ第ＩおよびＩＩ巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ、１９８５年）；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（編）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ、１９８５年）；他に記載されている。
【０１６９】
発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を方向付けるための少なくとも１個の適切な発現制御配列（例えば、構成的プロモーターまたは調節型プロモーター）に操作可能に連結される。斯かる発現制御配列の代表例として、上述の通り、真核細胞またはそのウイルスのプロモーターが挙げられる。プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター、カナマイシンベクター、または選択可能マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択することができる。真核生物プロモーターは、ＣＭＶ最初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、ならびにマウスメタロチオネイン−ｌを含む。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者の技能水準内にあり、本開示に係るタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結した少なくとも１個のプロモーターまたは調節型プロモーターを含むある特定の特に好まれる組換え発現構築物の調製は、本明細書に記載されている。
【０１７０】
本開示のポリヌクレオチドのバリアントも企図されている。バリアントポリヌクレオチドは、本明細書に記載されている定義された配列のポリヌクレオチドの１種と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．９％同一である、または約６５〜６８℃における０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムもしくは約４２℃における０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミドのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、定義された配列の当該ポリヌクレオチドの１種とハイブリダイズする。ポリヌクレオチドバリアントは、本明細書に記載されている機能性を有する結合ドメインまたはその融合タンパク質をコード
する能力を保持する。
【０１７１】
用語「ストリンジェント」は、本技術分野で一般的にストリンジェントとして理解されている条件を指すように使用されている。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは主に、温度、イオン強度、およびホルムアミド等の変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、約６５〜６８℃における０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、または約４２℃における０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミドである（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ｅｔ  ａｉ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年を参照）。よりストリンジェントな条件（より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミドまたは他の変性剤等）を使用することもできる；しかし、ハイブリダイゼーションの速度が影響されるであろう。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが関係する場合、追加的な例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、３７℃（１４塩基オリゴヌクレオチドのため）、４８℃（１７塩基オリゴヌクレオチドのため）、５５℃（２０塩基オリゴヌクレオチドのため）および６０℃（２３塩基オリゴヌクレオチドのため）での、６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナトリウムにおける洗浄を含む。
【０１７２】
本開示のさらなる態様は、本開示のポリヌクレオチドまたはベクター／発現構築物（例えば、フォリスタチンポリヌクレオチドまたはベクター／発現構築物）のいずれかで形質転換もしくはトランスフェクトされたまたは他の仕方でこれを含有する、宿主細胞を提供する。本開示のポリヌクレオチドまたはクローニング／発現構築物は、形質転換、トランスフェクションおよび形質導入を含む、本技術分野で公知のいずれかの方法（例えば、本明細書中に開示される方法のうちのいずれかのもの）を使用して、適した細胞に導入される。宿主細胞は、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法を含むｅｘ  ｖｉｖｏ細胞療法を受ける被験体の細胞を含む。本開示に係るポリヌクレオチド、ベクターまたはタンパク質を有する場合の本開示の態様として企図されている真核生物宿主細胞は、被験体自身の細胞（例えば、ヒト患者自身の細胞）に加えて、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（発現される多価結合分子のグリコシル化パターンを改変することができる改変ＣＨＯ細胞を含む、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号を参照）、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−７等）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｎ細胞、３Ｔ３細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞、ならびに本開示に係るタンパク質またはペプチドの発現および必要に応じて単離において有用であることが本技術分野で公知の他のいずれかの真核細胞を含む。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、または本開示に係るタンパク質またはペプチドの発現および必要に応じて単離に適することが本技術分野で公知のいずれかの原核細胞を含む原核細胞も企図されている。原核細胞からのタンパク質またはペプチドの単離において、特に、封入体からタンパク質を抽出するための本技術分野で公知の技法を使用することができることが企図されている。適切な宿主の選択は、本明細書における教示から、当業者の技能範囲内にある。本開示の融合タンパク質をグリコシル化する宿主細胞が企図されている。
【０１７３】
用語「組換え宿主細胞」（または単純に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターを含有する細胞を指す。斯かる用語が、特定の対象細胞のみならず、斯かる細胞の後代も指すように意図されることを理解されたい。ある特定の改変が、変異または環境的影響のいずれかにより後継世代において起こり得るため、斯かる後代は、実際には、親細胞と同一でない場合があるが、依然として、本明細書における用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択または特定の遺伝子の増幅に適切であるように改変された従来の栄養培地において培養することができる。温度、ｐＨその他等、発現に選択された特定の宿主細胞のための培養条件は、当業者には容易に明らかとなるであろう。様々な哺乳動物細胞培養系を用いて、組換えタンパク質を発現させることもできる。哺乳動物発現系の例として、Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１年）Ｃｅｌｌ  ２３巻：１７５頁によって記載されているサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株、ならびに適合性ベクターを発現することができる他の細胞株、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適したプロモーターおよび必要に応じてエンハンサーを、また、いずれか必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列、ならびに５’隣接非転写配列、例えば、多価結合タンパク質発現構築物の調製を考慮して本明細書に記載されているものも含むであろう。ＳＶ４０スプライスおよびポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列を使用して、要求される非転写遺伝的エレメントを提供することができる。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクションまたはエレクトロポレーションを含む、当業者には馴染みがあるであろう種々の方法によってもたらすことができる（Ｄａｖｉｓら（１９８６年）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）。
【０１７４】
細胞および組成物
一実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｂ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化／分化され、本明細書に記載されている治療剤（例えば、フォリスタチン）を発現するようにトランスフェクトされた。一実施形態では、本明細書に記載されている改変Ｂ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化／分化され、本明細書に記載されている治療剤（例えば、フォリスタチン）を発現するように操作された（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９媒介性導入遺伝子組込み等、標的化導入遺伝子組込みアプローチを使用して）。一実施形態では、組成物は、形質Ｂ細胞へと分化しており、トランスフェクトまたは他の仕方で操作されており、１種または複数種の目的のタンパク質（例えば、フォリスタチン）を発現する、Ｂ細胞を含む。本開示のトランスフェクトまたは他の仕方で操作され活性化されたＢ細胞集団等、標的細胞集団は、単独で、または希釈剤および／またはサイトカインもしくは細胞集団等の他の構成成分と組み合わせた医薬組成物として投与することができる。
【０１７５】
一実施形態では、１種または複数種の目的のタンパク質（例えば、フォリスタチン）を発現するように操作された改変Ｂ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性化／分化後に、改変Ｂ細胞が特定の化学誘引物質に対して最適な遊走能を有する時点で、培養物から収集される。一部の実施形態では、最適な遊走能は、Ｂ細胞培養の７日目、８日目または９日目となることができる。一部の実施形態では、最適な遊走能は、トランスフェクションまたは操作後のＢ細胞培養の５日目、６日目または７日目となることができる。一部の実施形態では、最適な遊走能は、トランスフェクションもしくは操作後のＢ細胞培養の８日目、またはトランスフェクションもしくは操作後の培養における８日目よりも後となることができる（例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日目にまたは２０日目よりも後に）。一部の実施形態では、最適な遊走能は、Ｂ細胞培養の１０日目より前となることができる。一部の実施形態では、最適な遊走能は、トランスフェクションまたは操作後のＢ細胞培養の８日目より前となることができる。一部の実施形態では、最適な遊走能は、Ｂ細胞培養の６日目または７日目となることができる。一部の実施形態では、最適な遊走能は、トランスフェクションまたは操作後のＢ細胞培養の４日目または５日目となることができる。一部の実施形態では、最適な遊走能は、Ｂ細胞培養の９日目より前となることができる。一部の実施形態では、最適な遊走能は、トランスフェクションまたは操作後のＢ細胞培養の７日目より前となることができる。一部の実施形態では、最適な遊走能は、ＣＸＣＬ１２への改変Ｂ細胞ホーミングに最適である。一部の実施形態では、最適な遊走能は、改変Ｂ細胞の１回または複数回の投与を受けている被験体の骨髄への改変Ｂ細胞ホーミングに最適である。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、培養における約７日目〜約９日目に、ＣＸＣＬ１２および／または被験体の骨髄への最適な遊走能で、被験体への投与のために収集される。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、トランスフェクションまたは操作後の培養における約５日目〜約７日目に、ＣＸＣＬ１２および／または被験体の骨髄への最適な遊走能で、被験体への投与のために収集される。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、培養における約１０日目より前に、ＣＸＣＬ１２および／または被験体の骨髄への最適な遊走能で、被験体への投与のために収集される。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、トランスフェクションまたは操作後の培養における約８日目より前に、ＣＸＣＬ１２および／または被験体の骨髄への最適な遊走能で、被験体への投与のために収集される。一部の実施形態では、最適な遊走能は、ＣＸＣＬ１３への改変Ｂ細胞ホーミングに最適である。一部の実施形態では、最適な遊走能は、改変Ｂ細胞の１回または複数回の投与を受けている被験体における炎症部位への改変Ｂ細胞ホーミングに最適である。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、培養における約６日目または約７日目に、ＣＸＣＬ１３および／または被験体における炎症部位への最適な遊走能で、被験体への投与のために収集される。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、トランスフェクションまたは操作後の培養における約���日目または約５日目に、ＣＸＣＬ１３および／または被験体における炎症部位への最適な遊走能で、被験体への投与のために収集される。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、培養における約１０日目より前に、ＣＸＣＬ１３および／または炎症部位への最適な遊走能で、被験体への投与のために収集される。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、トランスフェクションまたは操作後の培養における約８日目より前に、ＣＸＣＬ１３および／または炎症部位への最適な遊走能で、被験体への投与のために収集される。
【０１７６】
一部の実施形態では、最適な遊走能は、ＣＸＣＬ１２およびＣＸＣＬ１３の両方への改変Ｂ細胞ホーミングに最適である。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ細胞培養の７日目に、ＣＸＣＬ１２およびＣＸＣＬ１３の両方へのホーミングに最適な遊走能で、収集される。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、トランスフェクションまたは操作後のＢ細胞培養の５日目に、ＣＸＣＬ１２およびＣＸＣＬ１３の両方へのホーミングに最適な遊走能で、収集される。
【０１７７】
一部の実施形態では、Ｂ細胞の少なくとも約２０％が、走化性アッセイにおいて、特定の化学誘引物質へと遊走するときに、操作されたＢ細胞が収集される。例えばであって、例に限定されるべきではないが、Ｂ細胞の少なくとも約２０％が、走化性アッセイにおいて、ＣＸＣＬ１２へと遊走するときに、操作されたＢ細胞（例えば、ＦＳＴを産生する）を収集することができる。または、別の非限定例では、Ｂ細胞の少なくとも約２０％が、走化性アッセイにおいて、ＣＸＣＬ１３へと遊走するときに、操作されたＢ細胞（例えば、ＦＳＴを産生する）を収集することができる。さらに、Ｂ細胞の少なくとも約３０％が、走化性アッセイにおいて、特定の化学誘引物質（例えば、ＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＬ１３）へと遊走するときに、またはＢ細胞の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％もしくは少なくとも約７０％が、走化性アッセイにおいて、特定の化学誘引物質（例えば、ＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＬ１３）へと遊走するときに、操作されたＢ細胞（例えば、ＦＳＴを産生する）を収集することができる。さらに、Ｂ細胞の７０％超が、走化性アッセイにおいて遊走するときに、操作されたＢ細胞（例えば、ＦＳＴを産生する）を収集することができる。斯かる走化性アッセイは、本技術分野で公知である。
【０１７８】
簡潔に説明すると、本開示の細胞組成物は、トランスフェクトされており、本明細書に記載されている治療剤（例えば、フォリスタチン）を発現している、分化および活性化されたＢ細胞集団を、１種または複数種の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含むことができる。斯かる組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水、乳酸リンゲル溶液その他等のバッファー；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール等の炭水化物；タンパク質；ポリペプチド、またはグリシン等のアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオン等のキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存料を含むことができる。本開示の組成物は、好ましくは、静脈内または皮下投与のために製剤化される。
【０１７９】
一実施形態では、細胞組成物は、投与の前に純度に関して評価される。別の実施形態では、細胞組成物は、治療剤産生の頑強性に関して検査される。一実施形態では、細胞組成物は、無菌性に関して検査される。別の実施形態では、細胞組成物は、レシピエント被験体に適合することを確認するためにスクリーニングされる。
【０１８０】
一実施形態では、操作されたＢ細胞集団は、被験体への投与の前に、ポリクロナリティーに関して評価される。一部の実施形態では、最終細胞産物のポリクロナリティーを確実にすることは、重要な安全性パラメータである。具体的には、優勢なクローンの出現は、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍発生または自己免疫性疾患に潜在的に寄与するものとして考慮され得る。ポリクロナリティーは、本技術分野で公知のまたは本明細書に記載されているいずれかの手段によって評価することができる。例えば、一部の実施形態では、ポリクロナリティーは、操作されたＢ細胞集団において発現されるＢ細胞受容体の配列決定（例えば、ディープシークエンシング）によって評価される。Ｂ細胞受容体は、Ｂ細胞発生において変化を起こして、Ｂ細胞の間で特有のものとなるため、本方法は、どの程度の数の細胞が同じＢ細胞受容体配列を共有するか（これらがクローナルであることを意味する）を定量化することを可能にする。よって、一部の実施形態では、同じＢ細胞受容体配列を発現する操作されたＢ細胞集団におけるＢ細胞が多くなるにつれて、集団のクロナリティーが高くなり、したがって、被験体への投与に対する集団の安全性が低くなる。逆に、一部の実施形態では、同じＢ細胞受容体配列を発現する操作されたＢ細胞集団におけるＢ細胞が少なくなるにつれて、集団のクロナリティーは低くなり（すなわち、ポリクロナリティーが高くなり）、よって、被験体への投与に対する集団の安全性が高くなる。
【０１８１】
一部の実施形態では、操作されたＢ細胞は、十分にポリクローナルであることが決定された後に、被験体に投与される。例えば、最終集団における特定のＢ細胞クローンが、総Ｂ細胞集団の約０．２％超を構成しないことが決定された後に、操作されたＢ細胞を被験体に投与することができる。最終集団における特定のＢ細胞クローンが、総Ｂ細胞集団の約０．１％超、または総Ｂ細胞集団の約０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％もしくは約０．０４％超を構成しないことが決定された後に、操作されたＢ細胞を被験体に投与することができる。特定の実施形態では、最終集団における特定のＢ細胞クローンが、総Ｂ細胞集団の約０．０３％超を構成しないことが決定された後に、操作されたＢ細胞（例えば、（フォリスタチン）を産生する）が被験体に投与される。
【０１８２】
一実施形態では、細胞組成物は、４℃で貯蔵および／または発送される。別の実施形態では、細胞組成物は、貯蔵および／または発送のために凍結される。細胞組成物は、例えば、−２０℃または−８０℃で凍結することができる。一実施形態では、細胞組成物を凍結するステップは、液体窒素を含む。一実施形態では、細胞組成物は、速度制御フリーザーを使用して凍結される。したがって、本明細書に記載されている方法は、解凍ステップをさらに含むことができる。
【０１８３】
使用方法
本発明の一態様は、治療剤（例えば、フォリスタチン）を発現するように操作された改変Ｂ細胞の送達による治療剤（例えば、フォリスタチン）のｉｎ  ｖｉｖｏ送達に関する。特定の実施形態では、フォリスタチンを発現するように改変されたＢ細胞を、慢性疾患および障害を処置および／もしくは予防する方法においてならびに／または患者の筋肉のサイズもしくは強度を増加させる方法において使用する。
【０１８４】
本明細書に記載されている改変Ｂ細胞は、処置または予防されるべき疾患または障害に適切な様式で投与することができる。
【０１８５】
投与の分量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度等の因子によって決定されるであろうが、適切な投与量は、臨床治験によって決定することができる。
【０１８６】
一実施形態では、単回用量の改変Ｂ細胞が、被験体に投与される。一実施形態では、２またはそれよりも多い用量の改変Ｂ細胞が、被験体に逐次投与される。一実施形態では、３用量の改変Ｂ細胞が、被験体に逐次投与される。一実施形態では、ある用量の改変Ｂ細胞が、被験体に毎週、隔週、毎月、隔月、年四回、半年毎に、毎年または隔年投与される。一実施形態では、改変Ｂ細胞によって産生される治療剤の量が減少する場合、第２のまたはその後の用量の改変Ｂ細胞が、被験体に投与される。
【０１８７】
一実施形態では、所望の量（例えば、有効量）の治療剤（例えば、フォリスタチン）が被験体において検出されるまで、ある用量の改変Ｂ細胞が、ある特定の頻度（例えば、毎週、隔週、毎月、隔月または年四回）で被験体に投与される。一実施形態では、治療剤（例えば、フォリスタチン）の量は、被験体においてモニターされる。一実施形態では、改変Ｂ細胞によって産生される治療剤の量が、所望の量を下回って減少する場合、その後の用量の改変Ｂ細胞が、被験体に投与される。一実施形態では、所望の量は、所望の効果を生じる範囲である。例えば、筋ジストロフィー（例えば、ベッカー型筋ジストロフィー）を処置するための方法において、フォリスタチンの所望の量は、改変Ｂ細胞を受ける被験体の血漿中の量であり得る。一部の実施形態では、所望の量は、被験体によってある特定レベルの体重増加が得られるフォリスタチンの量であり得る。一部の実施形態では、所望の量は、被験体によってある特定レベルの強度の増加が得られるフォリスタチンの量であり得る。一部の実施形態では、所望の量は、ある特定レベルの被験体の体重の増加が得られるフォリスタチンの量であり得る。
【０１８８】
「有効量」または「治療量」が示されている場合、投与されるべき本開示の組成物の正確な量は、医師によって、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および患者（被験体）の状態の個体差を考慮しつつ決定することができる。Ｂ細胞組成物は、適切な投与量（複数可）で複数回投与することもできる。細胞は、免疫療法において一般的に公知の注入技法を使用することにより投与することができる（例えば、Rosenberg  et  al.,  New  Eng.  J.  of  Med.  319:1676,  1988を参照されたい）。
【０１８９】
特定の患者に最適な投与量および処置レジメンは、疾患の徴候に関して患者をモニターし、それに従って処置を調整することにより、医学技術分野の当業者によって決定することができる。処置は、生物学的試料（例えば、血漿などの体液または組織試料）における治療剤（例えば、フォリスタチン）のレベルの測定後に調整することもでき、処置有効性の評価に使用することもでき、処置は、それに従って、増加または減少するように調整することができる。
【０１９０】
本開示の一部の態様では、多用量レジメンのための改変Ｂ細胞の最適な投与量は、被験体のためのＢ細胞の最適な単回用量濃度を先ず決定し、最適な単回用量濃度に存在するＢ細胞の数を減少させて、改変Ｂ細胞の最適に満たない単回用量濃度をもたらし、改変Ｂ細胞の最適に満たない単回用量濃度の２またはそれよりも多い投与量をこの被験体に投与することにより決定することができる。一部の態様では、改変Ｂ細胞の最適に満たない単回用量濃度の２、３またはそれよりも多い投与量が、被験体に投与される。一部の態様では、被験体への改変Ｂ細胞の最適に満たない単回用量濃度の２、３またはそれよりも多い投与量の投与は、改変Ｂ細胞が発現するように操作される治療用ポリペプチドの相乗的ｉｎ  ｖｉｖｏ産生をもたらす。一部の態様では、最適に満たない単回用量濃度は、最適な単回用量濃度の１／２、または３、４、５、６、７、８、９、１０分の１または１０分の１未満を含む。一部の態様では、治療用ポリペプチドは、フォリスタチンである。
【０１９１】
本開示の一部の態様では、１０６個／キログラム（患者あたり１０６〜１０１１個）の範囲内の、より少ない数の本開示のトランスフェクトされたＢ細胞を投与することができる。ある特定の実施形態では、Ｂ細胞は、１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、５×１０１１または１×１０１２個の細胞が被験体に投与される。Ｂ細胞組成物は、これらの範囲内の投与量で複数回投与することができる。細胞は、治療法を受ける患者に対して自家または異種（例えば、同種異系）であってよい。所望に応じて、処置は、免疫応答の誘導および注入されたＢ細胞の生着を増強するために、本明細書に記載されているマイトジェン（例えば、ＰＨＡ）またはリンホカイン、サイトカイン、および／またはケモカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１α、ＢＡＦＦ等）の投与を含むこともできる。
【０１９２】
対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸注、植え込みまたは移植によるものを含む、いずれか簡便な様式で実行することができる。本明細書に記載されている組成物は、皮下に、皮内に、腫瘍内に、結節内に（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌｌｙ）、髄内に、髄腔内に、筋肉内に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射により、または腹腔内に、患者に投与することができる。本明細書に記載されている組成物は、神経系へと直接的に、患者に投与することができる。一実施形態では、本開示のＢ細胞組成物は、皮内または皮下注射によって患者に投与される。別の実施形態では、本明細書に記載されているＢ細胞組成物は、好ましくは、ｉ．ｖ．注射によって投与される。Ｂ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、骨髄または感染部位へと直接的に注射することができる。
【０１９３】
さらに別の実施形態では、医薬組成物は、制御放出系において送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９巻：１５２７〜１５３３頁；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７年、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｆ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．１４巻：２０１頁；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０年；Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８巻：５０７頁；Ｓａｕｄｅｋら、１９８９年、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．３２１巻：５７４頁を参照）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、１９７４年、ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ
Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，  Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、１９８４年、ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ、１９８３年；Ｊ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｓｃｉ．  Ｒｅｖ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２３巻：６１頁を参照；Ｌｅｖｙら、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８巻：１９０頁；Ｄｕｒｉｎｇら、１９８９年、Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．２５巻：３５１頁；Ｈｏｗａｒｄら、１９８９年、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１巻：１０５頁も参照されたい）。さらに別の実施形態では、制御放出系は、治療標的に近接して配置することができ、これにより、全身性用量の一部のみを要求する（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、１９８４年、ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．、第２巻、１１５〜１３８頁を参照）。
【０１９４】
本開示のＢ細胞組成物は、いずれかの数のマトリクスを使用して投与することもできる。マトリクスは、組織工学の文脈内で長年利用されてきた（例えば、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｌａｎｚａ、ＬａｎｇｅｒおよびＣｈｉｃｋ（編））、１９９７年を参照）。本開示は、Ｂ細胞を支持および維持するための人工リンパ系臓器として作用するという新規文脈内で斯かるマトリクスを利用する。したがって、本開示は、組織工学における有用性を実証したマトリクス組成物および製剤を利用することができる。したがって、本開示の組成物、デバイスおよび方法において使用することができるマトリクスの種類は、実質的に無制限であり、生物学的および合成マトリクスの両方を含むことができる。特定の一例では、米国特許第５，９８０，８８９号；同第５，９１３，９９８号；同第５，９０２，７４５号；同第５，８４３，０６９号；同第５，７８７，９００号；または同第５，６２６，５６１号によって表記されている組成物およびデバイスが利用される。マトリクスは、哺乳動物宿主に投与される場合、生体適合性であることに一般的に関連する特色を含む。マトリクスは、天然および／または合成材料から形成され得る。マトリクスは、インプラント等、動物の身体内に永続的な構造もしくは取り外し可能な構造を残すことが望ましい場合、非生分解性となることができる；または生分解性となることができる。マトリクスは、スポンジ、インプラント、チューブ、テルファ（ｔｅｌｆａ）パッド、繊維、中空繊維、凍結乾燥された構成成分、ゲル、粉末、多孔性組成物またはナノ粒子の形態を取ることができる。加えて、マトリクスは、徐放の播種細胞または産生サイトカインまたは他の活性薬剤を可能にするように設計することができる。ある特定の実施形態では、本開示のマトリクスは、可撓性かつ弾性であり、無機塩、水性の流体、および酸素を含む溶解したガス状作用物質等の物質に対して透過性である半固体足場として記載することができる。
【０１９５】
マトリクスは、本明細書において、生体適合性物質の一例として使用されている。しかし、本開示は、マトリクスに限定されず、よって、マトリクス（単数または複数）という用語が現れる場合は常に、このような用語は、細胞の保持または細胞の横断を可能にし、生体適合性であり、物質それ自体が半透膜であるようにこの物質を通って直接的にまたは特定の半透性物質と併せて使用されて、巨大分子の横断を許すことができるデバイスおよび他の物質を含むものと解読されるべきである。
【０１９６】
本開示のある特定の実施形態では、本明細書に記載されている方法または本技術分野で公知の他の方法を使用してトランスフェクトおよび活性化されたＢ細胞は、抗ウイルス剤等の薬剤、化学療法、照射、シクロスポリン、ビスルフィン（ｂｉｓｕｌｆｉｎ）、ボルテゾミブ、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸塩およびＦＫ５０６等の免疫抑制剤、抗体、またはキャンパス、抗ＣＤ３抗体または他の抗体療法等の他の免疫除去剤（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）、サイトキシン（ｃｙｔｏｘｉｎ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒｉｂｉｎｅ）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、ならびに照射による処置が挙げられるがこれらに限定されない、いずれかの数の関連する処置モダリティと併せて（例えば、その前に、それと同時にまたはその後に）患者に投与される。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリン（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）、プロテアソーム（ボルテゾミブ）のいずれかを阻害する、または増殖因子誘導性シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Ｌｉｕら、Ｃｅｌｌ  ６６巻：８０７〜８１５頁、１９９１年；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｉｍｍｕｎ．７３巻：３１６〜３２１頁、１９９１年；Ｂｉｅｒｅｒら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎ．５巻：７６３〜７７３頁、１９９３年；Ｉｓｏｎｉｅｍｉ（上記参照））。さらなる実施形態では、本開示の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビン、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド等の化学療法剤、またはＯＫＴ３もしくはキャンパス等の抗体のいずれかを使用したＴ細胞除去療法と併せて（例えば、その前に、それと同時にまたはその後に）患者に投与される。一実施形態では、本開示の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）等、Ｂ細胞除去療法の後に投与される。一実施形態では、本開示の細胞組成物は、ボルテゾミブ等の薬剤を使用したＢ細胞除去療法の後に投与される。例えば、一実施形態では、被験体は、高用量化学療法による標準処置に続いて、末梢血幹細胞移植を受けることができる。ある特定の実施形態では、移植後に、被験体は、本開示の拡大増殖された免疫細胞の注入を受ける。追加的な実施形態では、拡大増殖された細胞は、外科手術の前または後に投与される。
【０１９７】
患者に投与されるべき上述の処置の投与量は、処置されている状態および処置のレシピエントの正確な性質と共に変動するであろう。ヒト投与のための投与量のスケーリングは、本技術分野で許容される実施に従って行うことができる。
【０１９８】
改変Ｂ細胞は、様々な疾患および障害の処置または予防において使用することができる。特定の実施形態では、フォリスタチンを発現するように改変されたＢ細胞は、患者の筋肉のサイズまたは強度を増加させる方法において使用される。例えば、本開示は、被験体の筋肉のサイズまたは強度を増加させる方法であって、フォリスタチンポリペプチドを発現するＢ細胞の有効量を投与するステップを含む方法を提供する。筋肉のサイズまたは強度の増加は、一般的に、被験体全体を通して生じ得るか、または標的化された筋肉において生じ得る。筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、エメリドレフュス型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、脊椎硬直症候群、ウルリッヒ症候群、福山型筋ジストロフィー、ウォーカーワールブルク症候群、筋−眼−脳病、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー）、先天性筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー（スタイナート病）、非ジストロフィー性ミオトニー、周期性麻痺  脊髄性筋萎縮症、家族性筋萎縮性側索硬化症、遺伝性運動感覚性ニューロパチー、シャルコーマリートゥース病、慢性炎症性ニューロパチー、遠位型ミオパチー、筋細管／中心核ミオパチー、ネマリンミオパチー、ミニコア病、中心コア病、デスミノパチー、封入体筋炎、ミトコンドリアミオパチー、先天性筋無力症候群、ポリオ後筋機能障害、ならびにEmery  (2002)  The  Lancet,  359:687-695およびKhurana  et  al.  (2003)  Nat.  Rev.  Drug  Disc.,  2:379-386に記載されている障害、炎症性筋障害（例えば、封入体筋炎）、筋損傷または筋外傷、筋廃用（長期の床上安静または四肢固定の後に起こり得る）ならびに加齢、がんまたは様々な種類の慢性疾患の結果としての筋萎縮または筋衰弱を含む種々の筋障害の場合にあり得るように、標的化された筋肉は、損傷するか、筋衰弱するかまたは欠損し得る。例えば、一部の例では、筋肉は、筋肉減少症により、損傷するか、筋衰弱するか、または欠損し得る。一部の例では、筋肉は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）により、損傷するか、筋衰弱するか、または欠損し得る。一部の例では、筋肉は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）により、損傷するか、筋衰弱するか、または欠損し得る。一部の例では、筋肉は、ポンペ病により、損傷するか、筋衰弱するか、または欠損し得る。本方法は、健康である筋肉において、筋肉のサイズまたは強度を増加させることもできる。
【０１９９】
一部の実施形態では、本開示は、個体における疾患または障害を処置するための方法であって、フォリスタチンを発現するように遺伝子改変されたＢ細胞（例えば、フォリスタチン＋ＦＳＴ３４４転写物バリアントを発現するＢ細胞）を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む方法を提供する。
【０２００】
一部の実施形態では、本開示は、個体における筋障害を処置するための方法であって、フォリスタチンを発現するように遺伝子改変されたＢ細胞（例えば、フォリスタチン＋ＦＳＴ３４４転写物バリアントを発現するＢ細胞）を、斯かる筋障害を有する、またはこれを有すると疑われる被験体に投与するステップを含み、筋障害が筋ジストロフィーである方法を提供する。一部の実施形態では、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、エメリドレフュス型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、脊椎硬直症候群、ウルリッヒ症候群、福山型筋ジストロフィー、ウォーカーワールブルク症候群、筋−眼−脳病、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー（スタイナート病）、非ジストロフィー性ミオトニー、周期性麻痺  脊髄性筋萎縮症、家族性筋萎縮性側索硬化症、遺伝性運動感覚性ニューロパチー、シャルコーマリートゥース病、慢性炎症性ニューロパチー、遠位型ミオパチー、筋細管／中心核ミオパチー、ネマリンミオパチー、ミニコア病、中心コア病、デスミノパチー、封入体筋炎、ミトコンドリアミオパチー、先天性筋無力症候群、ポリオ後筋機能障害、ならびにEmery  (2002)  The  Lancet,  359:687-695およびKhurana  et  al.  (2003)  Nat.  Rev.  Drug  Disc.,  2:379-386に記載されている障害から選択される。
【０２０１】
一部の実施形態では、本開示は、個体における筋障害を処置するための方法であって、フォリスタチンを発現するように遺伝子改変されたＢ細胞（例えば、フォリスタチン＋ＦＳＴ３４４転写物バリアントを発現するＢ細胞）を、斯かる筋障害を有する、またはこれを有すると疑われる被験体に投与するステップを含み、筋障害が炎症性筋障害である方法を提供する。一部の実施形態では、炎症性筋障害は、封入体筋炎である。
【０２０２】
一部の実施形態では、本開示は、個体における筋障害を処置するための方法であって、フォリスタチンを発現するように遺伝子改変されたＢ細胞（例えば、フォリスタチン＋ＦＳＴ３４４転写物バリアントを発現するＢ細胞）を、斯かる筋障害を有する、またはこれを有すると疑われる被験体に投与するステップを含み、筋障害が筋損傷または筋外傷である方法を提供する。
【０２０３】
一部の実施形態では、本開示は、個体における筋障害を処置するための方法であって、フォリスタチンを発現するように遺伝子改変されたＢ細胞（例えば、フォリスタチン＋ＦＳＴ３４４転写物バリアントを発現するＢ細胞）を、斯かる筋障害を有する、またはこれを有すると疑われる被験体に投与するステップを含み、筋障害が筋廃用（例えば、長期の床上安静または四肢固定の後に起こり得る）である方法を提供する。
【０２０４】
一部の実施形態では、本開示は、個体における筋障害を処置するための方法であって、フォリスタチンを発現するように遺伝子改変されたＢ細胞（例えば、フォリスタチン＋ＦＳＴ３４４転写物バリアントを発現するＢ細胞）を、斯かる筋障害を有する、またはこれを有すると疑われる被験体に投与するステップを含み、筋障害が加齢、がんまたは様々な種類の慢性疾患の結果としての筋萎縮または筋衰弱から選択される方法を提供する。
【０２０５】
一部の実施形態では、本開示は、軽度、中程度または重度の筋衰弱、筋消耗、および／または独立歩行への効果を示す個体を処置するための方法であって、フォリスタチンを発現するように遺伝子改変されたＢ細胞（例えば、フォリスタチン＋ＦＳＴ３４４転写物バリアントを発現するＢ細胞）を、被験体に投与するステップを含む方法を提供する。
【０２０６】
一部の実施形態では、本開示は、軽度、中程度もしくは重度の筋脆弱性、筋肥大、筋偽性肥大、関節拘縮、骨格変形、心筋症、嚥下障害、腸および膀胱の機能障害、筋虚血、認知障害、行動機能障害、社会化機能障害、脊柱側弯症、ならびに／または呼吸機能の障害を示す個体を処置するための方法であって、フォリスタチンを発現するように遺伝子改変されたＢ細胞（例えば、フォリスタチン＋ＦＳＴ３４４転写物バリアントを発現するＢ細胞）を被験体に投与するステップを含む方法を提供する。
【０２０７】
特定の実施形態では、本開示は、個体における筋ジストロフィーを処置するための方法であって、フォリスタチンを発現するように遺伝子改変されたＢ細胞（例えば、フォリスタチン＋ＦＳＴ３４４転写物バリアントを発現するＢ細胞）を、ベッカー型筋ジストロフィーを有する、またはこれを有することが疑われる被験体に投与するステップを含む方法を提供する。
【０２０８】
一部の実施形態では、単回の最大有効用量のフォリスタチン＋Ｂ細胞（例えば、フォリスタチン＋ＦＳＴ３４４転写物バリアントを発現するＢ細胞）が、被験体に投与される。一部の実施形態では、２またはそれよりも多い用量のフォリスタチン＋Ｂ細胞（例えば、フォリスタチン＋ＦＳＴ３４４転写物バリアントを発現するＢ細胞）が、被験体に投与され、これにより、生着したフォリスタチン＋Ｂ細胞の量を最大化する。一部の実施形態では、被験体に投与される２またはそれよりも多い用量のフォリスタチン＋Ｂ細胞（例えば、フォリスタチン＋ＦＳＴ３４４転写物バリアントを発現するＢ細胞）は、単回の最大有効用量のフォリスタチン＋Ｂ細胞よりも少ないフォリスタチン＋Ｂ細胞を含む。一部の実施形態では、２またはそれよりも多い用量のフォリスタチン＋Ｂ細胞（例えば、フォリスタチン＋ＦＳＴ３４４転写物バリアントを発現するＢ細胞）が、最大有効単回用量のフォリスタチン＋Ｂ細胞を下回るフォリスタチン＋Ｂ細胞の投与量で被験体に投与される場合、その結果としてのフォリスタチン産生の相乗的増加が起こる。一実施形態では、被験体へフォリスタチン＋Ｂ細胞を投与するステップは、健康な対照被験体に見られる正常レベルのフォリスタチンをもたらす。一実施形態では、被験体へフォリスタチン＋Ｂ細胞を投与するステップは、被験体における正常レベルを超えるフォリスタチンをもたらす。一実施形態では、被験体へフォリスタチン＋Ｂ細胞（例えば、フォリスタチン＋ＦＳＴ３４４転写物バリアントを発現するＢ細胞）を投与するステップは、対象の強度を増加させる。一実施形態では、被験体へフォリスタチン＋Ｂ細胞（例えば、フォリスタチン＋ＦＳＴ３４４転写物バリアントを発現するＢ細胞）を投与するステップは、正常レベルと比較して、被験体の強度を増加させる。一実施形態では、被験体へフォリスタチン＋Ｂ細胞（例えば、フォリスタチン＋ＦＳＴ３４４転写物バリアントを発現するＢ細胞）を投与するステップは、被験体の強度の損失を防止する。
【実施例】
【０２０９】
（実施例１）
フォリスタチンを発現するＢ細胞の生成
ヒトフォリスタチン（ＦＳＴ）の転位および発現のためのスリーピングビューティートランスポゾンおよびトランスポサーゼ構築物を生成した。Ｂ細胞におけるＦＳＴ遺伝子組込みおよび発現を達成するためにトランスポゾンをアセンブルした。本発明者らは、Ｂ細胞における高レベル発現を達成するために、ヒト免疫グロブリン遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサーエレメントからなるＥＥＫプロモーター、ならびに以前に記載された他の調節エレメントを使用した。ＦＳＴ転位および発現に関して検査するために、２名の別々のドナーからヒトＢ細胞を単離し、Ｂ細胞培養培地における培養において拡大増殖させ、５％のＣＯ２を有する３７℃のインキュベーターでインキュベートし、３日目に、ｐＫＴ２／ＥＥＫ−ＦＳＴ３４４プラスＳＢ１００ｘトランスポサーゼをコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの２、５、８、および１１日後に調製された（すなわち、培養の５、７、１１、および１４日目）細胞ライセートは、野生型のトランスフェクトされていない細胞よりも有意に増加したＦＳＴを含有し、このことは、拡大増殖させたヒトＢ細胞における高レベルＦＳＴ発現を達成するためのＳＢトランスポゾン系の有効性を実証した（図５Ａ）。注目すべきことに、ＦＳＴ発現は、５日目からやや低下した後（初期のエピソームＦＳＴ発現によるものと考えられる）、７〜１４日目から持続し、このことは、構築物のＢ細胞への安定した組込みを示唆した。実際に、ＲＴ−ＰＣＲにより、Ｂ細胞ゲノムへのＦＳＴ挿入の安定な組込みが確認された（図５Ｂ）。このようなＦＳＴ発現Ｂ細胞は、以下の実施例においてＦＳＴ＋Ｂ細胞と称される。
【０２１０】
（実施例２）
ＦＳＴのｉｎ  ｖｉｖｏ産生
本開示に従って操作されたＢ細胞がＦＳＴ産生のｉｎ  ｖｉｖｏでの増加を促進することができるかどうかを決定するために、本発明者らは、実施例１で生成したＦＳＴ＋Ｂ細胞を野生型マウスに注射した。
【０２１１】
具体的には、４匹のマウスは、０日目に、ビヒクル（５００μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））または５００μｌまでビヒクル（ＰＢＳ）中で希釈された２×１０６個のヒトＦＳＴ＋Ｂ細胞の静脈内（尾静脈）注射を受けた。さらに、−７日目に、ＣＤ４＋Ｔ細胞に関して富化した３×１０６個の一次自家末梢血細胞を、マウスの腹腔内に（ｉ．ｐ．）注入して、ｐＫＴ２／ＥＥＫ−ＦＳＴプラスＳＢ１００ｘトランスポサーゼをコードするｍＲＮＡ転位Ｂ細胞に関するサポートを提供した。本発明者らは、ＦＳＴ＋Ｂ細胞で処置したマウスの血漿中でヒトＦＳＴの２倍の増加を観察し、ヒトＢ細胞養子移入成功の強力な証拠を示した（図１）。ＦＳＴレベルは、注入後およそ２８日目にピークとなり、３５日目までにほぼ正常レベルまで下降した。ＦＳＴ欠損動物において実行されなかったが、にもかかわらず、本実験の結果は、ｗｔマウスへの高度に強力なＦＳＴ＋Ｂ細胞集団の導入後に達成することができるヒトＦＳＴのレベルの例を提供する。本発明者らは、ＦＳＴの血漿中レベルが、ヒトＩｇＧの血漿中レベルと相関することを見出し、よって、ＦＳＴ＋Ｂ細胞の養子移入および生着の証拠を示した（図２Ａ〜２Ｄ）。
【０２１２】
ＦＳＴ＋Ｂ細胞が、処置したマウスに何らかの効果を有するかどうかを決定するために、本発明者らは、注入の３５日後に、対照マウスおよびＦＳＴ＋Ｂ細胞で処置したマウスの体重をモニターした。図３に示されているように、ＦＳＴ＋Ｂ細胞は、ビヒクル対照で処置したマウスより、平均４．１％（０．９グラム）多く成長した。さらに、体重増加は、前肢グリップ試験（ビヒクル対照と比較して、ＦＳＴ＋Ｂ細胞で処置したマウスで１６％の改善）（図４Ａ）；四肢グリップ試験（ビヒクル対照と比較して、ＦＳＴ＋Ｂ細胞で処置したマウスで２３％の改善）（図４Ｂ）；およびハンギング試験（ビヒクル対照と比較して、ＦＳＴ＋Ｂ細胞で処置したマウスで２３％の改善）（図４Ｃ）における著しい強度の改善に対応する。
【０２１３】
よって、このようなデータによって、Ｂ細胞を本明細書に開示されている方法において使用し、ＦＳＴを発現させて被験体に送達し、体重増加および強度の改善を誘導することができることが実証される。
【０２１４】
上述の様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書で参照されているおよび／または出願データシートに列挙されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は全て、それらの全体を参照により本明細書に組み込む。さらに別の実施形態を提供するために様々な特許、出願および刊行物の概念を用いることが必要であれば、実施形態の態様を改変することができる。
【０２１５】
上述の詳細な説明を踏まえて、実施形態に上述および他の変化を為すことができる。一般に、次の特許請求の範囲において、使用されている用語は、特許請求の範囲を明細書および特許請求の範囲に開示されている特異的な実施形態に限定するものと解釈するべきではないが、斯かる特許請求の範囲が権利を有する均等の全範囲と共にあらゆる可能な実施形態を含むものと解釈するべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図１】
2021515576.tif 000007
【図２Ａ−Ｂ】
2021515576.tif 000008
【図２Ｃ−Ｄ】
2021515576.tif 000009
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ−Ｃ】
2021515576.tif 000012
【図５】
2021515576.tif 000013
【配列表】
2021515576000001.app
【国際調査報告】
2021515576.tif 000014
2021515576.tif 000015
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