(57)【要約】  架橋されたヒアルロナンを含む滅菌ヒドロゲル組成物であって、分子量が２００ｋＤａ未満である抽出可能なヒアルロナンの量が、ヒアルロナンの総量に対して１５ｗｔ％未満である、滅菌ヒドロゲル組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋されたヒアルロナンを含む滅菌ヒドロゲル組成物であって、分子量が２００ｋＤａ未満である抽出可能なヒアルロナンの量が、ヒアルロナンの総量に対して１５ｗｔ％未満であることを特徴とする、滅菌ヒドロゲル組成物。
【請求項２】
前記抽出可能なヒアルロナンが、還元抽出または保存的抽出の使用により前記滅菌ヒドロゲル組成物から抽出可能であるヒアルロナンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記架橋されたヒアルロナンが、式Ｉ
ＨＡ−Ｌ−ＨＡ（Ｉ）
（式中、各ＨＡは、式ＩＩによるヒアルロナンまたはその塩を表し、
【化１】
2021526934.tif 000015
（式中、ｎは１より大きい整数であり、式ＩＩの繰り返し単位の繰り返し数を決定する）
Ｌはリンカーであり、式ＩＩによる繰り返し単位中の１つのＯＨ部分と置き換わることで各ＨＡと共有結合し、
Ｌは分子ＬＨ２に由来し、分子ＬＨ２はヒトにおいて天然に発生する分子であるか、ヒトにおいて天然に発生する分子のコンジュゲートである）
による構造を有する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記リンカーＬが、内因性分子の、非遺伝毒性かつ非細胞毒性の断片である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記分子ＬＨ２が、グルタチオン、システアミン、システイン、ホモ−システイン、ベータ−システイン、システインを含むペプチド、システアミンおよびアミノ酸のコンジュゲート、ならびにそれらのジスルフィド二量体からなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
少なくとも１つの局所麻酔剤をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記局所麻酔剤が、リドカイン、アルチカイン、プリロカイン、クロロプロカイン、アルチカインおよびそれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
非毒性の安定剤をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
少なくとも１つのヒアルロン酸分解阻害剤をさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記阻害剤が、１，２，３，４，６−ペンタ−Ｏ−ガロイルグルコース、アピゲニン、ベータ−エスシン、カルトリン、ｃｉｓ−ヒノキレジノール（ＣＨＲ）、エキナシン、エイコサトリエン酸（Ｃ２０：３）、フェノプロフェン、金チオリンゴ酸ナトリウム、ゴシポール、ヘパリン、リン酸ヘスペリジン、インドメタシン、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−カルニチン、Ｌ−アミノカルニチン、ミオクリシン（金チオリンゴ酸ナトリウム）、Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）およびＮ−アルファ−ｐ−トシル−Ｌ−リシンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）、リン酸化ヘスペリジン、ポリ（４−スチレン−スルホン酸ナトリウム）（Ｔ−ＰＳＳ）、リン酸ポリエストラジオール、リン酸ポリフロレチン、ＰＳ５３（ヒドロキノン／スルホン酸／ホルムアルデヒドポリマー）、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（Ｎ−ＰＳＳ）、硫酸化２−ヒドロキシフェニルモノラクトビオシド、硫酸化ヒドロキノンジガラクトシド、硫酸化ベルバスコース、プランテオースおよびネオマイシンオリゴ糖、テトラデシル硫酸ナトリウム（ＴＤＳＳ）、１つの二重結合を有するＣ１４：１からＣ２４：１の不飽和脂肪酸、尿トリプシン阻害剤（ＵＴＩ）、ウロリチンＢ、ＷＳＧ、もしくはグリチルレチン酸、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
生体適合性の多糖の群から選択される未修飾のポリマー、好ましくは未修飾のヒアルロナンをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
粘性かつ親水性の生体適合性の多価アルコール、好ましくはグリセロールをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物の、美容上の使用。
【請求項１４】
医薬としての使用のための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
軟部組織充填剤としての使用のための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、架橋されたヒアルロナンを含む滅菌ヒドロゲル組成物、および軟部組織充填剤としての使用のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロナンは、ＨＡと略され、ヒアルロン酸とも呼ばれ、Ｄ−グルクロン酸およびΝ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから構成される繰り返し二糖単位を有する、天然に発生する多糖である。ヒアルロナンまたはヒアルロン酸という用語は、多くの場合、その塩、例えばヒアルロン酸ナトリウムと同義的に使用される。
【０００３】
高分子量のヒアルロナンは、皮膚に天然に存在し、その粘弾性特性および水を吸収する傾向が非常に高いことも周知である。その特性は、皮膚の弾性に大いに寄与する。ヒアルロナンの、生体適合性、忍容性、および非毒性であるという特性および質を考慮して、すでに１０年を超えて、医学および美容分野、特に審美的処置における多数の用途において、この化合物からこのようにして利益が得られてきた。例えば、ヒアルロナンは、検討される領域における真皮への直接注入によって皺を充填するために使用される（皮膚充填剤としての使用）。
【０００４】
高度に精製された生物発酵性起源の非修飾ヒアルロナンは、完全に生体適合性であり、内因性ヒアルロン酸と同一のものである。しかし、ヒアルロナンは、ヒトの身体の組織に高度に適合し、水に対する親和性が高く、強力な保湿機能を発揮するという利点を有するにもかかわらず、十分な生体力学的特性を有しない。ヒアルロナンが皮膚組織に注入される場合、ヒトの身体の組織中に存在するヒアルロニダーゼ（酵素的分解）およびフリーラジカル（化学的分解）の両方による、速やかなインビボの分解が起こる。
【０００５】
ヒアルロナンのインビボの分解を減速させ、その化学的、物理的、および生物学的特性を修飾し、さらに保管中の製剤の分解および熱、したがって、滅菌に対する耐性を増大させる、無数の解決手段が提案されている。
【０００６】
これらの手法は、典型的には、ヒアルロナンの化学的修飾を伴い、例えば、化学的、酵素的、または光化学的手段によるヒアルロナンの架橋が挙げられる。これらの架橋されたヒアルロナンゲルは、多様な調製工程により得ることができる。一般的には、これらの工程には２つの主要なステップが必要であり、第１は、ヒアルロナンを水溶液へと変換するためにヒアルロナンを水和させることからなり、第２は、それらの架橋を導入することが可能である薬剤（「架橋剤」とも称される）の存在下で前記水溶液のヒアルロナン分子を架橋することを目的とする。架橋剤の例には、ホルムアルデヒド、ジビニルスルホン、ビスカルボジイミド、およびエポキシドが挙げられる。他の解決手段には、ヒアルロナンをポリペプチドのような巨大な基で修飾して、細胞接着またはヒドロゲルへの自己集合を導入することが挙げられる。
【０００７】
皮膚充填剤の製造について、架橋剤は、エポキシド、例えばブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）もしくは１，２，７，８−ジエポキシオクタン（ＤＥＯ）、アルデヒド、またはポリビニルスルホン、例えばジビニルスルホン（ＤＶＳ）から最も一般的に選択され、したがって、天然に合成されるものである。
【０００８】
残念なことに、ヒアルロナンの化学的修飾は、免疫原性がもともと低く非毒性の非修飾ヒアルロナンでは観察されない副作用および異物反応をもたらす。市販のヒアルロナン軟部組織充填剤の大半では、架橋剤としてＢＤＤＥが使用されている。ＢＤＤＥに存在するエポキシド基は反応性があるため、軟部組織充填剤に残留している未反応のＢＤＤＥは、遺伝毒性作用を有することがある。よって、製造中に高価なさらなる精製および試験手順が必要となるため、皮膚充填剤中のＢＤＤＥは、微量（２百万分率未満）で維持される必要がある。ＢＤＤＥ架橋された充填剤の安全性プロファイルは、長期の臨床経験により支持されているが（Ｄｅ  Ｂｏｕｌｌｅ，Ｇｌｏｇａｕら、２０１３年、Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  １，４−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ  ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｆｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆｉｌｌｅｒｓ，Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｕｒｇ（３９巻）：１７５８〜１７６６頁）、ＢＤＤＥにはなお、いくつかの安全性の懸念が提起されることがある（Ｃｈｏｉ，Ｙｏｏら、２０１５年、Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｂｙ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ｐａｒｔ  Ａ（１０３Ａ巻）：３０７２〜３０８０頁）。
【０００９】
ＢＤＤＥに関連した遺伝毒性のリスクにより、患者の生涯にわたり適用されることのある市販の皮膚充填剤製品、例えばＪｕｖｅｄｅｒｍ（登録商標）の年間用量は、１年あたり２０ｍｌに制限される。市販の皮膚充填剤製品であるＲｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）の投与は、適用１回あたり容積６ｍｌに制限される。類似の制限が、ＤＶＳ架橋されたヒアルロン酸を含む軟部組織充填剤に適用される。
【００１０】
化学修飾に伴う別の問題は、ヒアルロナンが所望される架橋度を達成するために架橋反応中に供されなければならない、厳しい反応条件、例えばアルカリ性ｐＨ値および高温（５０℃を越える）の必要性である。ヒアルロナンの分子量は、酸性ｐＨ（ｐＨ４未満）またはアルカリ性ｐＨ（ｐＨ１０を超える）への曝露中に加水分解されるため、低減することが周知である。さらに、ヒアルロナンは、４０℃を超えるより高い温度で分解される（Ｔｒｏｎｃｏｓｏら、２０１６年、Ａ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｏｄｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ，ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔｈｅｓｉｓ，ｈｔｔｐ：／／ｕｕ．ｄｉｖａ−ｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／ｓｍａｓｈ／ｇｅｔ／ｄｉｖａ２：９５４３７２／ＦＵＬＬＴＥＸＴ０１．ｐｄｆからオンラインでのアクセスが可能；Ｓｔｅｒｎら、２００７年、Ｔｈｅ  ｍａｎｙ  ｗａｙｓ  ｔｏ  ｃｌｅａｖｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ（２５巻）：５３７〜５５７頁；ＴｏｋｉｔａおよびＯｋａｍｏｔｏ、１９９６年、Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．（３２巻）：１０１１〜１０１４頁）。分子量が約２００ｋＤａ未満である低分子量のヒアルロナン断片は、炎症誘発性作用を有することがさらに周知である（Ｎａｏｒ、２０１６年、Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ：Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＣＤ４４，ＲＨＡＭＭ）Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７巻：３９頁；Ｍｏｎｓｌｏｗら、２０１５年、Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ−ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｓｗｅｅｔ  ｓｐｏｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６巻：２３１頁）。
【００１１】
ＷＯ２０１４／０６４６３２では、内因性リンカー分子を使用した、安定化されたヒアルロナンを用いた軟部組織充填剤が記載されているが、架橋工程では、ヒアルロナンを活性化させるための非内因性化学物質が必要とされる（本出願において疑似天然架橋と記載される）。ポリアミンはすべての生物において比較的高濃度で存在する内因性分子であるが、これらの作用物質は、過剰に存在する場合に驚くべき程度の毒性を示すことが見出されている（ＨｏｅｔおよびＮｅｍｅｒｙ、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．；２７８巻、Ｌ４１７〜Ｌ４３３頁（２０００年）を参照されたい）。
【００１２】
ＷＯ２０１３／０８６０２４では、ジアミン架橋剤（例えばヘキサメチレンジアミン）およびマルチアミン架橋剤（例えば３−［３−（３−アミノ−プロポキシ）−２，２−ビス（３−アミノ−プロポキシメチル）−プロポキシ］−プロピルアミン）により架橋されたヒアルロナンを含む軟部組織充填剤が記載されている。内因性リンカー分子の使用は、この記載においては言及されていない。架橋は、好ましくは、ｐＨ４からｐＨ７、および２０℃から３７℃の範囲の温度の、緩やかな条件下で実施されると記載されている。しかし、例においては、調製には数日かかり、開始材料は低分子量のヒアルロナン（例えば、分子量が例えば約１００ｋＤａであるか、平均分子量が例えば３１０ｋＤａであるポリマー）である。よって、低分子量ＨＡ断片の形成は予防されない。ＷＯ２０１３／０８６０２４では、充填剤製品のレオロジー挙動の最適化に着目され、生体適合性の増大については着目されなかった。
【００１３】
ＷＯ２０１４／１８１１４７Ａ１およびＷＯ２０１６／００５７８５Ａ１では、架橋のためにトリメタリン酸塩を使用した、安定化されたＨＡを用いた皮膚充填剤が記載されており、結果として内因性二リン酸基により架橋されたＨＡ分子が記載されている。しかし、架橋工程中、ヒアルロン酸は、５０℃の高温で３時間、およびさらには最大７０℃で７２時間、著しいアルカリ性ｐＨ（ｐＨ１１）に曝露される。これらの厳しい条件下で、低分子量ＨＡ断片の形成は避けられない（Ｔｒｏｎｃｏｓｏら、２０１６年、Ａ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｏｄｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ，ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔｈｅｓｉｓ；ｈｔｔｐ：／／ｕｕ．ｄｉｖａ−ｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／ｓｍａｓｈ／ｇｅｔ／ｄｉｖａ２：９５４３７２／ＦＵＬＬＴＥＸＴ０１．ｐｄｆからオンラインでのアクセスが可能；Ｓｔｅｒｎら、２００７年、Ｔｈｅ  ｍａｎｙ  ｗａｙｓ  ｔｏ  ｃｌｅａｖｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ（２５巻）：５３７〜５５７頁；ＴｏｋｉｔａおよびＯｋａｍｏｔｏ、１９９６年、Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．（３２巻）：１０１１〜１０１４頁）。これらの低分子量ＨＡ断片が、ヒトの皮膚における生分解中にゲルデポーから放出される場合、これらは炎症反応を引き起こすことがある。
【００１４】
結果として、例えば軟部組織との生体適合性が高いが、天然のヒアルロナンよりも分解への耐性がより高い軟部組織充填剤として使用可能な、安定化されたヒアルロナンを含む組成物を提供する必要性がなお存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
よって、本発明の目的は、生体適合性が高く、分解への耐性が高い組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、架橋されたヒアルロナンを含む滅菌ヒドロゲル組成物であって、分子量が２００ｋＤａ未満である抽出可能なヒアルロナンの量が、ヒアルロナンの総量に対して１５ｗｔ％未満である、滅菌ヒドロゲル組成物を提供する。
【００１７】
本滅菌組成物は、軟部組織充填剤として移植または注入することができるヒドロゲルである。低分子量のヒアルロナンの含有量が低いと、生体適合性は確実に良好となり、架橋によりヒアルロナンの急速なインビボの分解が妨げられる。
【００１８】
好ましい一実施形態では、架橋されたヒアルロナンは、式Ｉ：
ＨＡ−Ｌ−ＨＡ（Ｉ）
（式中、各ＨＡは、式ＩＩによるヒアルロナンまたはそのナトリウム塩を表し、
【００１９】
【化１】
2021526934.tif 000002
（式中、ｎは１より大きい整数であり、式ＩＩの繰り返し単位の繰り返し数を決定する）
Ｌはリンカーであり、式ＩＩによる繰り返し単位中の１つのＯＨ部分と置き換わることで各ＨＡと共有結合し、
Ｌは分子ＬＨ２に由来し、分子ＬＨ２はヒトにおいて天然に発生する分子であるか、ヒトにおいて天然に発生する分子のコンジュゲートである）
による構造を有する。
【００２０】
架橋されたヒアルロナンは、式ＩＩＩの部分構造を含む
【００２１】
【化２】
2021526934.tif 000003
（式中、Ｌは分子ＬＨ２に由来し、分子ＬＨ２はヒトにおいて天然に発生する分子であるか、ヒトにおいて天然に発生する分子のコンジュゲートである）。したがって、リンカーＬは、ＨＡ繰り返し単位中のグルクロン酸のカルボン酸基と共有結合する。
【００２２】
架橋されたヒアルロナンは、複合ポリマーであることが理解され、式ＩからＩＩＩは、模式的なものとして理解されよう。架橋されたヒアルロナン中の任意のヒアルロナン（ＨＡ）は、リンカーＬの結合によるいくつかの修飾を有してもよく、すなわち、式Ｉは、いかなるＨＡ鎖も１つのリンカーのみを有し得るように限定するものではない。架橋されたヒアルロナンは、２つを超えるＨＡ鎖を含んでもよい。複数の繰り返し単位を含む各ＨＡ鎖は、第２のＨＡまたはいくつかの修飾単位と結合するための１つの修飾単位を、同一の第２の鎖または他のＨＡ鎖と結合するＨＡ鎖の任意の位置に含有してもよい。
【００２３】
好ましい一実施形態では、架橋されたヒアルロナン中の繰り返し単位の０．５から１０モル％は、架橋に寄与し、例えばリンカーＬと共有結合を形成する。換言すると、架橋された単位の程度は、０．５から１０モル％であってもよい。
【００２４】
好ましい一実施形態では、架橋されたヒアルロナンは、修飾されたヒアルロナンの反応生成物であり、修飾されたヒアルロナンは、架橋のための反応基、例えばチオール基を供給する内因性分子で修飾される。この実施形態では、修飾されたヒアルロナンの修飾度は、好ましくは約３モル％から約１０モル％の範囲である。修飾度の上限は１０モル％であり、これによりヒアルロナンの実用的な特徴（例えば生体適合性、膨潤挙動）を維持することが可能となる。修飾度の下限は約３モル％であり、これは安定化された粘性の高いゲルの形成のために不可欠であると考えられる。結果として、架橋されたヒアルロナン中の架橋された単位の程度は、好ましくは３から１０モル％である。
【００２５】
リンカーＬは、ヒトにおいて天然に発生する分子ＬＨ２、またはヒトにおいて天然に発生する分子のコンジュゲートである分子ＬＨ２に由来する。よって、リンカーＬは、天然の分子から２つの水素原子を減じることにより、形式的に得られる。化学的に言えば、分子ＬＨ２は、ＨＡと、例えば求核置換により反応する。ヒトにおいて天然に発生する分子は、内因性分子と称されることもある。好ましい一実施形態では、Ｌは、内因性分子の、非遺伝毒性かつ非細胞毒性の断片である。
【００２６】
一実施形態では、分子ＬＨ２はアミノ酸、ペプチド、ホルモン、二次情報伝達物質、シグナリング分子、またはそれらのコンジュゲートである。内因性分子ＬＨ２は２つのアミノ基を含んでもよく、ＨＡ−Ｌ−ＨＡ構造は式ＩＩＩにより確立され、アミノ基は、ＨＡ繰り返し単位のカルボン酸基とアミド結合を形成する。
【００２７】
一実施形態では、リンカーＬは、グルタチオン、システアミン、システイン、ホモ−システイン、ベータ−システイン、システインを含むペプチド、システアミンおよびアミノ酸のコンジュゲート、またはそれらのジスルフィド二量体（それらの混合されたジスルフィド二量体を含む）である分子ＬＨ２の分子の断片を含むか、またはそれに由来する。ヒトにおいて天然に発生するこれらの分子に由来する架橋されたヒアルロナンは、好ましくは式ＩＩＩの分類に入り、ＨＡ繰り返し単位のカルボン酸基とアミド結合を形成する。代わりに、グルタチオンおよびシステイン誘導体は、エステル結合によって任意のアルコール基と結合を形成することもある。リンカーを含有するこれらのチオール基は、本実施形態のために特に有用であり、架橋されたヒアルロナンは、架橋のための反応基を有する分子、好ましくは内因性分子で修飾されたヒアルロナン誘導体の反応生成物である。チオール基は、酸化の際に分子内および分子間ジスルフィド結合を形成し得る反応基である。よって、この実施形態では、架橋されたヒアルロナンは、チオール修飾されたヒアルロナンの酸化生成物である。
【００２８】
別の実施形態では、内因性分子ＬＨ２は、尿素である。
【００２９】
本組成物は、ヒアルロナンの分子量（ＭＷ）分布が、分子量が２００ｋＤａ未満である抽出可能なヒアルロナンの量がヒアルロナンの総量に対して１５ｗｔ％未満であることを示す点をさらに特徴とする。
【００３０】
ヒアルロナンの分子量は、架橋されていない状態で決定されることが理解される。実際、架橋されたヒアルロナンを含むヒドロゲル組成物は、典型的には、遊離の、すなわち架橋されていないヒアルロナンをある程度の量含む。多数のヒドロゲルでは、遊離ヒアルロナンは、組成物の一部として積極的に添加される。一方、遊離ヒアルロナンは、ヒドロゲルの調製中に未架橋のままであり得、または、滅菌ヒドロゲルを入手するための処理中にヒアルロナン鎖の分解の際に遊離され得る。
【００３１】
架橋されたヒアルロナンを含む組成物中の抽出可能なヒアルロナンの分子量分布を確かめるために、異なる手法を適用することができる。好ましい一実施形態では、抽出可能なヒアルロナンは、還元抽出により、または保存的抽出により決定することができる。
【００３２】
還元抽出では、調査される組成物を、結合を逆転させた後に遊離ヒアルロナンを抽出することにより、すなわち、例えばジスルフィド架橋されたヒアルロナンの還元により、分析する（例３）。この方法は、リンカーの切断を含み、その結果、ヒアルロナンネットワークは粘性のヒアルロナン溶液に変換される。この方法は、架橋が酸化の際に生じるヒドロゲルに容易に適用可能であるが、この方法は、一部の架橋剤、すなわちＢＤＤＥ架橋されたヒアルロナンには適用され得ない。変換についての反応条件（すなわち還元条件）により、ＨＡが低分子量でさらに蓄積されることがある。したがって、分子量が２００ｋＤａ未満である遊離ヒアルロナンの量は、典型的には、この方法ではより高い。
【００３３】
保存的抽出では、遊離ヒアルロナンを、架橋されたヒアルロナンネットワークを処理することなく調査することができる（例６）。この手法は、架橋剤とは無関係に適用可能である。ヒドロゲルは、溶媒系を用いてインキュベートされ、振盪される。よって、遊離ヒアルロナンは液相へと漏出し、一方、架橋されたＨＡはゲル相にとどまる。液状の上清相を分離し、分子量分布について分析する。
【００３４】
一部の場合では、調査される組成物に類似して架橋されずに調製された比較組成物中で、ヒアルロナンの分子量分布を調査することが、代わりに可能であり得る（例３を参照されたい）。しかし、この手法には、ヒドロゲルの製造工程についての詳細な知識が必要とされる。
【００３５】
ヒアルロナンについて示された分子量（ＭＷ）は、典型的には、集団中のすべての分子の平均を表す。文献では、ＭＷは、通常は、量平均分子量として表される。それにもかかわらず、ヒアルロナン試料、例えば上記のように抽出された遊離ヒアルロナンのＭＷ分布を調査し、例えばＭＷ＜２００ｋＤａのヒアルロナンの実際量または分率を決定することが可能である。
【００３６】
ＭＷ分布は、以下に例示されるようなサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析により調査することができる。当業者は、分子量分布について、他の手法で同程度の値に達し得ることを理解するであろう。例えば、アガロースゲル電気泳動は、水平ゲルチャンバーおよびマーカーとしてＨＡ分子量ラダーを使用したアガロースゲル中で、ヒアルロナンの異なるＭＷ画分を分離するのに使用することができ、次いで、染色されたゲルを例えばＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｅｔ／Ｗｅｌｃｏｍｅ）に続けてＣｏｗｍａｎら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１７巻、２０１１年、５０〜５６頁）による分子質量算出を使用して、濃度測定について分析する。続けて、ＭＷ＜２００ｋＤａのヒアルロナンの量を決定することができる。本発明によるヒドロゲル組成物では、その量は、組成物中のヒアルロナンの総量に対して最大１５ｗｔ％である。基準量、すなわちヒアルロナンの総量は、任意の分子量の架橋されたおよび遊離のヒアルロナンを含む、組成物中のすべてのヒアルロナンを含む。典型的には、この量は、組成物中のヒアルロナンの濃度により示されるか、慣例の方法により決定することができる。
【００３７】
実施例では、ＭＷ＜２００ｋＤａのヒアルロナンの分率が、本発明による多様なヒドロゲル組成物中、最大１５ｗｔ％であったことが示されている（例３）。対照的に、ＴＭＰ架橋されたゲルについて記載されている架橋の条件（ＷＯ２０１６／００５７８５Ａ１による）の結果、ヒアルロナンの分率は、総ヒアルロナンに対して３０ｗｔ％であった（比較例４）。また、現行技術水準のＢＤＤＥ架橋されたヒアルロナン組成物と比較すると、低分子量の量に関して改善が示される（例６）。よって、炎症性のヒアルロナンオリゴマーの分率が低いため、生体適合性が改善された製剤が提供される。
【００３８】
本発明による組成物のＭＷ決定は、例３では特定の貯蔵寿命（室温で保存）の後に実施され、一方で比較例４では、滅菌される前にも調査された。一般的には、低分子量のヒアルロナンの分率は、加工（滅菌）および保管中に増大する傾向がある。類似した傾向が、ヒドロゲル特性（濃度、ｐＨ、モル浸透圧濃度）の類似した任意の架橋されたヒアルロナン組成物について予測される。よって、現行技術水準によるヒドロゲルでは、架橋後のＭＷ＜２００ｋＤａのヒアルロナンの実質的な分率は、なおさらに増大し得る。一般的に、滅菌ヒドロゲル組成物へと加工された直後には、低分子量のヒアルロナンの分率は組成物に対して最大１５ｗｔ％と小さいことが望ましい。
【００３９】
好ましい実施形態では、本発明による組成物は生体適合性に優れ、毒性の可能性がある架橋剤が存在しないため、本組成物は１年あたり２０ｍＬを超える用量で適用されてもよい。よって、本組成物は、大用量の充填剤が必要とされる用途、例えば豊胸術、または複数の領域への適用を必要とする患者のために好適である。結果として、本組成物の使用の１つは、美容上の使用である。しかし、適用性は皮膚充填に限定されない。よって、別の態様では、本組成物は、医薬品の使用のため、軟部組織充填剤としての使用のために提供される。
【００４０】
そのような使用（治療用または美容上）は、軟部組織充填剤としての、または組織増強のための、本発明による組成物の使用を指し得る。そのような使用には、好ましくは、例えば注入または移植によるヒトへの用途が挙げられるが、適用性はヒトに限定されない。
【００４１】
別の態様では、本発明は、本発明による組成物を、例えばシリンジからの注入により特定の軟部組織部位に導入するステップを含む、方法に関する。本方法は、治療用および美容上目的のための、軟部組織充填剤としての、または組織増強のための組成物の使用に関する。
【００４２】
一実施形態では、これらの態様による使用または方法は、本ヒドロゲル組成物を、シリンジから経皮、骨膜上または皮下注入によりヒトの組織部位へと導入するステップを含む。
【００４３】
本ヒドロゲル組成物は、局所麻酔剤および／または多様な他の成分、例えば成長因子、ビタミン、多価アルコール、ハロゲン化アルカリ金属、無機物、抗酸化剤、アミノ酸、補酵素、セラミックス粒子（例えばカルシウムヒドロキシルアパタイト粒子）、ポリマー粒子、ポリマー（例えばポリエチレングリコール、グリコサミノグリカン、ラブリシン、多糖、およびそれらの誘導体）、タンパク質（例えばエラスチン、コラーゲン、ケラチン、絹フィブロイン）、抗セルライト剤、抗瘢痕化剤、抗炎症剤、抗刺激剤、血管収縮剤、抗出血剤（例えば止血剤および抗線溶剤）、テンション剤、抗アクネ剤、色素沈着剤、抗色素沈着剤、消炎剤、抗リウマチ剤、抗ウイルス剤、抗感染症剤、防腐剤、化学療法剤、細胞増殖抑制剤、抗アレルギー剤、抗静脈怒張剤；鎮痛剤、抗生物質、抗真菌剤、鎮痙剤、抗ヒスタミン剤、痔疾を処置するための薬剤、皮膚を処置するための治療剤、および保湿剤から選択される１つもしくは複数の成分を含んでもよい。
【００４４】
局所麻酔剤を本ヒドロゲル組成物に添加することは、注入の際の疼痛を緩和する能力がある点から、特に望ましい。局所麻酔剤には、リドカイン、アルチカイン、プリロカイン、クロロプロカイン、アルチカインまたはそれらの組合せ、ならびにそれらの塩が挙げられる。好ましくは、麻酔剤は、酸付加塩の形態である、例えばリドカインＨＣｌのような、リドカインである。
【００４５】
好ましい一実施形態では、本組成物は、生体適合性の多糖の群から選択される、未修飾のポリマーをさらに含む。好ましくは、未修飾の多糖は、未修飾のヒアルロナン（ＨＡ）である。未修飾の、または遊離とも称されるヒアルロナンは、本ヒドロゲル組成物を補完することができる。未修飾のＨＡは、一般的には、針またはカニューラから製品を注入するのに必要とされる押出力を低減することにより注入を確実に容易なものとするために、軟部組織充填剤に潤滑剤として添加される。好ましくは、組成物の製造のために使用される遊離ヒアルロナンの原材料は、分子量が約１，０００ｋＤａから約３，５００ｋＤａの範囲である。しかし、安定化されていないヒアルロナンは急速に分解されるため、当業者は、本組成物の軟部組織充填剤としてのインビボの性能は、架橋されたポリマーおよび基礎となるチオール修飾されたヒアルロナンの特性により主に発揮されることを理解するであろう。未修飾の多糖は、架橋されたポリマーよりも低い濃度で含まれることが好ましい。例示的には、未修飾のヒアルロナンは、３ｍｇ／ｍＬから７ｍｇ／ｍＬ、例えば５ｍｇ／ｍＬの濃度で組成物中に含まれ、ここで濃度は、好ましくは塩、例えばヒアルロン酸ナトリウムの濃度を指す。
【００４６】
一実施形態では、架橋されたヒアルロナンは、式ＩＶによる少なくとも１つのサブユニットを含む
【００４７】
【化３】
2021526934.tif 000004
（式中、ＲＤおよびＲＤ１と表現される水素原子の総数の少なくとも１％は、２Ｈ（重水素）である）。このことは、分子のさらなる安定化をもたらす。
【００４８】
別の実施形態では、本発明の組成物は、少なくとも０．１モルの、少なくとも１つの重水素に富むヒアルロン酸を含有する。
【００４９】
組成物は、非毒性の安定剤をさらに含んでもよい。
【００５０】
軟部組織充填剤としての有効性を伸ばすために、本組成物は、少なくとも１つのヒアルロン酸分解阻害剤をさらに含んでもよい。
【００５１】
前記阻害剤は、１，２，３，４，６−ペンタ−Ｏ−ガロイルグルコース、アピゲニン、ベータ−エスシン、カルトリン、ｃｉｓ−ヒノキレジノール（ＣＨＲ）、エキナシン、エイコサトリエン酸（Ｃ２０：３）、フェノプロフェン、金チオリンゴ酸ナトリウム、ゴシポール、ヘパリン、リン酸ヘスペリジン、インドメタシン、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−カルニチン、Ｌ−アミノカルニチン、ミオクリシン（金チオリンゴ酸ナトリウム）、Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）およびＮ−アルファ−ｐ−トシル−Ｌ−リシンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）、リン酸化ヘスペリジン、ポリ（４−スチレン−スルホン酸ナトリウム）（Ｔ−ＰＳＳ）、リン酸ポリエストラジオール、リン酸ポリフロレチン、ＰＳ５３（ヒドロキノン／スルホン酸／ホルムアルデヒドポリマー）、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（Ｎ−ＰＳＳ）、硫酸化２−ヒドロキシフェニルモノラクトビオシド、硫酸化ヒドロキノンジガラクトシド、硫酸化ベルバスコース、プランテオースおよびネオマイシンオリゴ糖、テトラデシル硫酸ナトリウム（ＴＤＳＳ）、１つの二重結合を有するＣ１４：１からＣ２４：１の不飽和脂肪酸、尿トリプシン阻害剤（ＵＴＩ）、ウロリチンＢ、ＷＳＧ、もしくはグリチルレチン酸、またはそれらの組合せからなる群から選択されてもよい。
【００５２】
本組成物はまた、粘性かつ親水性の生体適合性のアルコール、好ましくはグリセロールを、好ましくは０．５〜５重量／体積％で含んでもよい。
【００５３】
本発明の一実施形態では、本組成物は、架橋されたヒアルロナンを、本組成物の重量に対して０．１から５ｗｔ％の量で含む。
【００５４】
さらに、本ヒドロゲル組成物の主成分は水であることが理解されよう。好ましくは、注入のための水または精製水が、本組成物を製造するために使用される。そのうえ、本組成物は、６．７から７．８の範囲である生理学的に許容できるｐＨを示すために緩衝されてもよいことが認められよう。好適な緩衝剤は当業者に周知であり、例えばリン酸緩衝液が挙げられる。本組成物は、処置される対象（例えば、ヒト）の細胞外液の正常な重量オスモル濃度と類似した、生理学的に許容できる重量オスモル濃度も示す。よって、本組成物は、重量オスモル濃度が２５０〜３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲であってもよく、重量オスモル濃度を調節するためのさらなる溶質、例えば塩化ナトリウム、塩化カルシウム、および／または塩化カリウムを含んでもよい。
【００５５】
本発明によるヒドロゲル組成物は滅菌されており、これは現行技術水準の手法により達成することができる。オートクレーブを用いた加熱湿熱滅菌は標準的な方法の１つであり、これはゲルを１２１℃でおよそ１５〜２０分間、高圧の飽和蒸気に供するステップを含む。より短時間（例えば約１分と５分との間）およびより高温（例えば約１３０℃と１３５℃との間）での高圧蒸気滅菌により、ゲル中のヒアルロナン分子の分子量をより良好に保存できるであろう（Ｆｅｄｅｇａｒｉ  ｗｈｉｔｅｐａｐｅｒ、ＵＳ２０１６／０２２０７２９を参照されたい）。他の高圧蒸気滅菌パラメーターの最適化（例えば、生成物の速やかな冷却を確実にすること）は、ポリマーの分子量を保存するためにさらに有利であろう（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｅｒｉｆｌｏｗ．ｃｏｍ／ｅｎ／ｎｅｗｓ／Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ−ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ−ａｃｉｄ）。
【００５６】
ヒドロゲル組成物という用語は、本明細書で使用される場合、固体および流体（液体）の特徴を両方とも有する組成物を説明するものとして理解される。一方、ヒドロゲルは注入可能であってもよく、すなわち、流体様の挙動を示す。他方では、ヒドロゲルはある特定の形態を維持するために十分に硬いもの（または剛性）であり得、例えば、ヒドロゲルは、前もって形成された移植片、糸、またはフィラメントの形態で提供されてもよい。よって、ヒドロゲルという用語は、定量的な手法における組成物のレオロジー特性を限定するものではない。
【００５７】
医薬品、化粧品または医療用具である、本ヒドロゲル組成物が使用されてもよい。ヒドロゲルは、好ましくは針またはカニューラからの注入により、適用部位、好ましくは軟部組織に移植される。代わりに、ヒドロゲルは、外科手技によって移植されてもよい。ヒドロゲルは、一度適用されると、（ヒドロゲル）移植片またはデポーと称される。本発明によるヒドロゲルは、生体適合性であり、吸収可能な（すなわち生分解性の）移植片を形成する。よって、本発明によるヒドロゲルは、軟部組織充填剤として使用可能である。
【００５８】
生体材料、例えば安定化されたヒアルロナンを含む軟部組織充填剤は、注入可能なヒドロゲル組成物を用いて、増強が望まれる組織部位に送達される。軟部組織の充填に関する使用または方法の目的には、軟部（皮膚）組織を増強すること、先天異常、後天性欠損または美容的欠損を修正することが挙げられる。
【００５９】
本ヒドロゲル組成物は元の容積に基づく充填作用および移植片の膨潤性を有するため、その主な作用は純粋に物理的なものである。よって、いかなる生理学的または薬学的相互作用もなければ、本使用は美容上のものと分類され得、本組成物は、化粧品または医療用具として考えられ得る。本発明によるヒドロゲル組成物の使用が美容上のものであると考えられ得る用途には、例えば老化の徴候を低減させること、例えば、
−  非手術的に女性の生殖器を若返らせる目的のための、外陰部または膣の組織への用途
−  真皮、皮下、または骨膜上への用途
が挙げられる。
【００６０】
例示的には、本ヒドロゲル組成物は、美容目的のため、例えば皺を充填するため、皮膚欠損を処置するため、顔または身体（例えば、乳房、耳たぶ）の容積減少を復元するため、蜂巣炎におけるくぼみを低減させるため、涙溝の変形を処置するため、顔または身体の外形の成形（例えば、臀部増大、腰部増強、腓腹部増強）のため、陰茎増大（陰茎周囲増大、陰茎亀頭増強）のための（方法において）使用されてもよい。
【００６１】
他の場合では、軟部組織の充填および増強の結果、疾患を処置または予防することができる、すなわち、疾患の症状は低減され、緩和され、および／または発症（再発）が予防される。軟部組織欠損により引き起こされた疾患は、ヒドロゲルを適用することによる、周囲の組織の一時的および／または局所的な構造の充填、制動、支持または増強による利益を受けることができる。本ヒドロゲル組成物が処置または予防のために使用され得る疾患には、例えば、
−  中足骨痛、拇指球の脂肪体の疼痛疾患であり、本発明によるヒドロゲルの使用が、拇指球軟部組織の脂肪体に適用され得る、
−  尿と糞便の失禁、この徴候に対して、本発明によるヒドロゲルが括約筋を画定する組織に適用され得る、
−  外陰部萎縮（また、閉経後性器尿路症候群）、この徴候に対して、本発明によるヒドロゲルは、腟の粘膜および前庭への注入によって外陰腟の領域に適用され得、ならびに／もしくは大陰唇増強に対して適用され得、大陰唇の再建により、両方の大陰唇が確実に密接に接触し、外陰部の内部構造が保護されることとなる、
−  声帯の障害、
−  静脈弁の機能不全、または
−  顔面脂肪萎縮症、瘢痕の減衰もしくは形態学的な非対称性もしくは変形（先天性、もしくは、例えば胸部もしくは顔の外傷もしくは手術の結果として生じたもの）、これらの徴候のために、本ヒドロゲルは再建目的で適用される、
が挙げられる。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
上の好ましい一実施形態で論じられているように、架橋されたヒアルロナンは、修飾されたヒアルロナンの反応生成物であり、修飾されたヒアルロナンは、架橋のための反応基、例えばチオール基を供給する内因性分子で修飾される。以下では、チオール修飾されたヒアルロナン、酸化生成物である架橋されたヒアルロナン、ならびに同一のものを含む組成物の調製に関するさらなる詳細を示す。
【００６３】
ヒアルロナンのグルクロン酸部分のカルボキシル基と修飾剤との間のエステル結合またはアミド結合の形成による、修飾剤の導入が好ましい（上の式ＩＩＩを参照されたい）。修飾剤は、チオール基を、ジスルフィド結合の形態で、または合成工程で保護されたチオール基として含んでもよい。
【００６４】
好ましい一実施形態では、修飾剤は、ヒアルロナン中のグルクロン酸部分のカルボキシル基に、アミド結合によって結合する。したがって、修飾剤は、ヒアルロナン中のグルクロン酸部分のカルボキシル基と、チオール基を含む修飾剤とでアミド結合を形成することが可能である、少なくとも１つのアミノ基を含む。例えば、チオール修飾されたヒアルロナンは、ヒアルロナン−システアミンコンジュゲートであり、システアミンは、ヒアルロナンにアミド結合によって結合する。
【００６５】
同様に、修飾剤を担持する他のチオール基は、修飾剤のアミノ基（一級または二級アミノ基、好ましくは一級アミノ基）と、ヒアルロナン中のグルクロン酸部分のカルボキシル基との間のアミド結合形成によってチオール修飾されたヒアルロナンを合成するために使用されてもよい。修飾剤の可能性があるものには、例えばシステアミン、システイン、またはホモシステインの誘導体が挙げられ、システアミン、システイン、またはホモシステインのアミノ基は、アミノ酸のカルボキシル基と連結する。これらの誘導体は、好ましくは、Ｎ−保護されたアミノ酸を使用することにより合成される。
【００６６】
低分子量の修飾剤は、ヒアルロナンに独自の物理化学的特性を可能な限り保護することが好ましい。本発明による組成物のために有用である架橋可能なチオール修飾されたヒアルロナンを得るための好適な低分子量の修飾剤は、好ましくはグルタチオン、システインおよびホモシステインを含む群からさらに選択される。
【００６７】
好適なリンカーＬまたは天然に発生する分子ＬＨ２の非限定的な例は：
−  シスタミン、システアミンのジスルフィド二量体、すなわち式ＶのＬ
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−（Ｖ）
−  酸化グルタチオン、グルタチオンのジスルフィド二量体、すなわち式ＶＩのＬＨ２
【００６８】
【化４】
2021526934.tif 000005
−  シスチン、システインのジスルフィド二量体、すなわち式ＶＩＩのＬＨ２
【００６９】
【化５】
2021526934.tif 000006
−  ホモシスチン、ホモシステインのジスルフィド二量体、すなわち式ＶＩＩＩのＬＨ２
【００７０】
【化６】
2021526934.tif 000007
−  天然に発生する分子であるシスタミンと天然に発生するアミノ酸のコンジュゲートである、シスタミンのアミノ酸誘導体、すなわち、式（ＩＸ）のＬＨ２
【００７１】
【化７】
2021526934.tif 000008
（式中、両方のＸは同一であっても互いに異なってもよく（対称のまたは非対称の誘導体）、Ｘの性質は、アミノ酸次第である。一実施形態では、両方のＸは水素原子であり、すなわち、対称なグリシン誘導体である）；
−  尿素、すなわち、式ＸのＬＨ２。
【００７２】
【化８】
2021526934.tif 000009
【００７３】
本発明によるヒドロゲル組成物において使用される架橋されたヒアルロナンは、以下のように製造されてもよい：第１に、ヒアルロナンを、架橋のための反応基、例えばチオール基を有する内因性分子で修飾する。システアミン、システインおよびグルタチオンは、ヒトにおいて天然に発生するそのような非遺伝毒性の内因性分子の例である。例えば、システアミン（ＨＡ−システアミン）およびグリシニル−システアミン（ＨＡ−グリシニル−システアミン）で修飾されたジスルフィドの形成により架橋可能な、チオール修飾されたヒアルロナンの適切な部分構造は、それぞれ、式ＸＩ
【００７４】
【化９】
2021526934.tif 000010
および式ＸＩＩ
【００７５】
【化１０】
2021526934.tif 000011
に示されている。
【００７６】
反応は、ヒアルロン酸の分子質量に悪影響を与えない、例えば温度が４０℃未満であり、曝露時間があれば、ｐＨ１１以上およびｐＨ４未満の範囲のｐＨ値に非常に制限される条件下で実施される。
【００７７】
Ａｅｓｃｈｌｉｍａｎｎ（ＥＰ１  １１５  ４３３  Ｂ１）では、ヒアルロナンの分子量を損なわず、インビボで忍容性良好であり生分解性であるヒアルロナン分子をさらに提供する、ヒアルロナンの官能基化の方法が記載されている。この方法は、架橋のための異なる末端官能基、例えばチオール基を有するヒアルロナンを生成するために使用される。これらの側鎖は、活性なエステル中間体を使用して、グルクロン酸部分のカルボキシル基への、アミンを含有する一級（保護）チオール基のカルボジイミド媒介性の連結、またはジアミノまたはジヒドラジド配位子を含有するジスルフィド結合により、ヒアルロナンへと導入される。次いで、ジスルフィド結合の中間生成物は還元され、保護チオール基を有する中間生成物は、保護基を除去することにより脱保護される。
【００７８】
ＥＰ０  ５８７  ７１５では、水不溶性のアニオン性多糖を合成するための方法であって、少なくとも１つのポリアニオン性多糖（例えばヒアルロナン）を水性混合物中に溶解させるステップ；ポリアニオン性多糖を、活性化剤、例えばＥＤＣもしくはＥＴＣのようなジイミドまたはＢＯＰで活性化するステップ；活性化されたポリアニオン性多糖を、修飾化合物、例えば１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ）または１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物で修飾するステップ；および活性化されたポリアニオン性多糖を好適な求核剤（例えばアミノチオール）と反応させて、所望の不溶性組成物を形成するステップによる、方法が開示されている。その発明者らはポリアニオン性多糖のＢＯＰ活性化の１つの主な利点は、ポリアニオン性多糖の分子量が求核剤との連結の際に低減されないことであると述べている。
【００７９】
システアミンによるヒアルロン酸の有効かつ制御された官能基化のための、ＤＭＴ−ＭＭによるトリアジン媒介性のアミド化が、Ｂｏｒｋｅらにおいて記載されている。他のカップリング試薬（例えばＥＤＣ媒介性の置換）と比較して、反応条件が緩やかであり多糖鎖の分解が最小限であることは、この群のカップリング試薬を使用する利点として挙げられている（Ｂｏｒｋｅら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  １１６巻（２０１５年）４２〜５０頁）。Ｌｉａｎｇらは、ＣＤＭＴおよびＮＭＭの存在下でのシスタミンによるカルボキシレート側鎖のアミド化反応とそれに続く、ＤＴＴによる還元反応による、チオール基のヒアルロナンへの導入を記載している（Ｌｉａｎｇら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  １３２巻（２０１５年）４７２〜４８０頁）。
【００８０】
現行技術水準では、滅菌ヒドロゲル組成物の調製の過程における架橋中のヒアルロナンの分子量の保存については言及されていない。
【００８１】
次いで、修飾されたヒアルロナンはなお未架橋のまま精製され、沈殿、クロマトグラフィーおよび透析のような異なる方法により非常に有効に精製することが可能となる。
【００８２】
次いで、修飾および精製されたヒアルロナンは、架橋され、粘性の高いゲルを形成する。そのときには、粘性の高い水性ゲルに慣例的に適用される唯一の精製方法である透析によってゲルをさらに精製する必要はない。架橋についての条件は、リンカーの性質次第である。ヒアルロナンが反応性チオール基を有する内因性分子で修飾される場合、架橋には、チオール基を酸化して分子内および分子間ジスルフィド結合を形成するステップを伴う。
【００８３】
ゲルは、一旦シリンジに充填されると、滅菌される必要がある。
【実施例】
【００８４】
実施例１：尿素を用いた架橋
８ｇのヒアルロン酸ナトリウムを、７２ｇの生理食塩水に溶解させる。０．２Ｍの１６ｇのＨＣｌに４ｇの尿素を溶解させ、別途、溶液を調製する。調製した２つの溶液を、最終溶液が均質となるまで混合し；ｐＨを測定するが、ｐＨは３．５から４の範囲内でなければならない。
【００８５】
生成物を３５（＋／−２）℃で２０〜２４時間、恒温装置にかけ、過剰な尿素を次いで除去し；精製したら、得られた生成物のｐＨを測定し、このｐＨは５．５から７．５であった。
【００８６】
本生成物をシリンジに充填し、オートクレーブで滅菌する。
【００８７】
実施例２：シスタミンを用いた架橋
ヒドロゲルを調製するために、ＭＷが少なくとも約７００ｋＤａであるＨＡ−システアミン粉末を、水性媒体中に溶解させる。ＭＷが少なくとも１０００ｋＤａである未修飾のＨＡ、および任意選択で局所麻酔剤、例えばリドカインＨＣｌを、この溶液に添加する。次いで、ジスルフィド結合の形成によるＨＡ−システアミンの架橋を、緩やかな酸化条件（ｐＨ７．４、Ｏ２の存在下）、および室温で行って、軟部組織充填剤のために好適なヒドロゲルを得る。ゲルのさらなる精製（例えば、透析による）は、必要とされない。ヒドロゲルをシリンジに充填し、オートクレーブで滅菌する。
【００８８】
ＴＨ−２６０４１７−１、ＴＨ−２７０２１７−２、ＴＨ−２２０３１７−２およびＴＨ−０７０２１７−２の調製
滅菌ヒドロゲル組成物ＴＨ−２６０４１７−１の調製について、３５８０ｍｇのＨＡ−システアミン（ＭＷ  ７３０ｋＤａ）、６００ｍｇのリドカインＨＣｌおよび１１６０ｍｇのＮａＣｌを、注入のために、１８５ｇの水に、機械的撹拌下、室温で約３時間溶解させた。次いで、１０００ｍｇのヒアルロン酸ナトリウム（ＭＷ  ２４００ｋＤａ）を室温でさらに約３時間、撹拌を続けながら、溶液に添加した。次いで、ｐＨ１１のリン酸緩衝液を、最終量が２００ｇの製剤となるまで添加した。溶液を約１５分間均質化させた。終夜の室温でのインキュベーション後、すでに架橋されたヒドロゲルを１ｍｌのガラスシリンジに充填し、高圧蒸気滅菌によって滅菌した。滅菌ヒドロゲルは、ｐＨが約７．７であり、重量オスモル濃度が２７０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲であった。
【００８９】
ＴＨ−２７０２１７−２およびＴＨ−０７０２１７−２を、より小さいバッチサイズ（５０ｇ）であること以外は同一の方法により、製造した。滅菌ヒドロゲル組成物ＴＨ−２２０３１７−２を、ＭＷが約９００ｋＤａであるＨＡ−システアミン原材料を用いたこと以外は滅菌ヒドロゲル組成物ＴＨ−２７０２１７−２およびＴＨ−０７０２１７−２と同一の方法により、製造した。
【００９０】
ＴＨ−２６０４１７−２の調製
滅菌ヒドロゲル組成物ＴＨ−２６０４１７−２の調製について、３５８０ｍｇのＨＡ−システアミン（ＭＷ  ７３０ｋＤａ）、６００ｍｇのリドカインＨＣｌおよび１１６０ｍｇのＮａＣｌを、注入のために、１８５ｇの水に、機械的撹拌下、室温で約３時間溶解させた。次いで、１０００ｍｇのヒアルロン酸ナトリウム（ＭＷ  １３００ｋＤａ）を、室温でさらに約３時間、撹拌を続けながら、溶液に添加した。ｐＨ１１のリン酸緩衝液を、次いで、最終量が２００ｇの製剤となるまで添加した。溶液を約１５分間均質化させた。終夜の室温でのインキュベーション後、すでに架橋されたヒドロゲルを１ｍｌのガラスシリンジに充填し、高圧蒸気滅菌によって滅菌した。滅菌ヒドロゲルは、ｐＨが約７．７であり、重量オスモル濃度が２７０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲であった。
【００９１】
ＴＨ−２６０９１７＿２００の調製
滅菌ヒドロゲル組成物ＴＨ−２６０９１７＿２００の調製について、３５８０ｍｇのＨＡ−システアミンナトリウム塩（ＭＷ  ７３０ｋＤａ、修飾度１５１μｍｏｌ／ｇのポリマー）、６００ｍｇのリドカインＨＣｌおよび１１６０ｍｇのＮａＣｌを、注入のために、１８５ｇの水に、機械的撹拌下、室温で約３時間溶解させた。次いで、１０００ｍｇのヒアルロン酸ナトリウム（ＭＷ  ２４００ｋＤａ）を、室温でさらに約３時間、撹拌を続けながら、溶液に添加した。次いで、ｐＨ１１のリン酸緩衝液を、最終量が２００ｇの製剤となるまで添加した。溶液を約１５分間均質化させた。終夜の室温でのインキュベーション後、すでに粘性の高いゲルに、２００μｍのメッシュサイズのフィルタープレートで圧力をかけた。ヒドロゲルを１ｍｌのガラスシリンジに充填し、高圧蒸気滅菌によって滅菌した（１２１℃／１５分間）。滅菌ヒドロゲルは、ｐＨが約７．５であり、重量オスモル濃度が２７０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲であった。
【００９２】
ＴＨ−２５０４１７−１の調製
滅菌ヒドロゲル組成物ＴＨ−２５０４１７−１の調製について、２６８５ｍｇのＨＡ−システアミン（ＭＷ  ７３０ｋＤａ）、４５０ｍｇのリドカインＨＣｌおよび８７０ｍｇのＮａＣｌを、ｐＨ３、８５．５ｇのリン酸緩衝液に、機械的撹拌下、室温で終夜溶解させた。次いで、ＨＡ−システアミンを含む溶液のｐＨを、アルカリ性リン酸緩衝液の添加によってｐＨ７．６に調節し、２．７％（ｍ／ｍ）のＨＡ−システアミンを含む溶液を得た。１０分間の均質化の後、溶液を終夜撹拌することなく室温でインキュベートした。次に、架橋されたゲルに、２００μｍのメッシュサイズのフィルタープレートで圧力をかけた。ＭＷが２４００ｋＤａである１．５％（ｍ／ｍ）のヒアルロン酸ナトリウムを含有する、ｐＨ６．７の１０ｍＭのリン酸緩衝液中溶液を調製した。次いで、ＭＷが２４００ｋＤａである１．５％（ｍ／ｍ）のヒアルロン酸ナトリウムを含有する、ｐＨ６．７の１０ｍＭのリン酸緩衝液中溶液１部を、篩分され架橋されたヒドロゲル２部に添加した。１０分間の機械的混合の後に続いて、最終生成物を１ｍｌのガラスシリンジに充填し、高圧蒸気滅菌によって滅菌した。滅菌ヒドロゲルは、ｐＨが約７．４であり、重量オスモル濃度が２７０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲であった。
【００９３】
ＴＨ−２５０４１７−２の調製
滅菌ヒドロゲル組成物ＴＨ−２５０４１７−２の調製について、２６８５ｍｇのＨＡ−システアミン（ＭＷ  ７３０ｋＤａ）、４５０ｍｇのリドカインＨＣｌおよび８７０ｍｇのＮａＣｌを、１０３．５ｇ、ｐＨ３のリン酸緩衝液に、機械的撹拌下、室温で終夜溶解させた。次いで、ＨＡ−システアミンを含む溶液のｐＨを、アルカリ性リン酸緩衝液の添加によってｐＨ７．６に調節し、２．２％（ｍ／ｍ）のＨＡ−システアミンを含む溶液を得た。１０分間の均質化の後、溶液を終夜撹拌することなく室温でインキュベートした。次に、架橋されたゲルに、２００μｍのメッシュサイズのフィルタープレートで圧力をかけた。ＭＷが１３００ｋＤａである２．５％（ｍ／ｍ）のヒアルロン酸ナトリウムを含有する、ｐＨ６．７の１０ｍＭのリン酸緩衝液中溶液を調製した。ＭＷが１３００ｋＤａである２．５％（ｍ／ｍ）のヒアルロン酸ナトリウムを含有する、ｐＨ６．７の１０ｍＭのリン酸緩衝液中溶液１部を、次いで、篩分され架橋されたヒドロゲル３部に添加した。１０分間の機械的混合の後に続いて、最終生成物を１ｍｌのガラスシリンジに充填し、高圧蒸気滅菌によって滅菌した。滅菌ヒドロゲルは、ｐＨが約７．６であり、重量オスモル濃度が２７０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲であった。
【００９４】
ＴＨＭ−０４０７１７−１−５３の調製
滅菌ヒドロゲル組成物ＴＨＭ−０４０７１７−１−５３の調製について、７５０ｍｇのＨＡ−システアミンナトリウム塩（ＭＷ  ７３０ｋＤａ、修飾度１５１μｍｏｌ／ｇのポリマー）、４５０ｍｇのヒアルロン酸ナトリウム（ＭＷ  ２４００ｋＤａ）、４５０ｍｇのリドカインＨＣｌおよび７９５ｍｇのＮａＣｌを、１３２ｇ、注入のための０．０１ＭのＨＣｌに、機械的撹拌下、室温で約２１時間溶解させた。次いで、ｐＨ１２．５のリン酸緩衝液を、最終量が１５０ｇの製剤となるまで添加した。溶液を約１５分間均質化させた。終夜の室温でのインキュベーション後、すでに粘性の高いヒドロゲルを１ｍｌのガラスシリンジに充填し、高圧蒸気滅菌によって滅菌した。滅菌ヒドロゲルは、ｐＨが７．３であり、重量オスモル濃度が２６７ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇであった。
【００９５】
実施例３  ジスルフィド架橋されたＨＡを含む滅菌ヒドロゲル組成物における抽出可能なＨＡのＭＷの測定
試料の調製（還元抽出）
ジスルフィド架橋されたＨＡおよび遊離ＨＡを含むヒドロゲルの滅菌後、還元剤をヒドロゲルに添加し、ジスルフィド結合を定量的に破壊した。次いで、還元（未架橋）型の修飾されたＨＡおよび遊離ＨＡのＭＷ分布を同時に決定した。約９００ｍｇのヒドロゲルを、注入のために、１５００ｍｇの水で希釈し、続けて還元剤（２５００ｍｇのＴＣＥＰ．ＨＣｌ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（注入のための２．５ｍｇ／ｍｌの水））を添加してジスルフィド架橋を切断した。３時間の還元の後、４００ｍｇの反応溶液を、５０μｌ、５ＮのＨＣｌで酸性化させた。遊離ＨＡおよび修飾されたヒアルロナンを、エタノールで沈殿させた。沈殿物を遠心分離により回収し、続けて、遊離チオール部分に対するキャッピング剤（２−（２−アミノエチルジスルファニル）ピリジン−３−カルボン酸）を２ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する４ｍｌの水溶液に可溶化させた。室温での３時間のインキュベーション後、試料をＰＢＳでさらに希釈した。
【００９６】
分子量の決定
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析のために、試料溶液をＳＥＣ溶離液で希釈して、０．１ｍｇ／ｍｌの最終ＨＡ濃度を得た。一連の高感度の検出器、すなわちフォトダイオードアレイＵＶ、光散乱（ＲＡＬＳおよびＬＡＬＳの両方）、屈折率および粘度検出器を備えたＶｉｓｃｏｔｅｋ  ＴＤＡｍａｘ温調付きマルチ検出器ＳＥＣシステムを、測定のために使用した。屈折率検出器で試料の濃度を記録して、それぞれの分布曲線を得た。光散乱検出器と組み合わせて、分子量ＭＷを決定した。
【００９７】
結果
例２により調製された、滅菌ヒドロゲル組成物中の低ＭＷ分率（ＭＷ＜２００ｋＤａ）のＨＡは、試料を室温で示された日数保存した後、８％から１５％の範囲であることが見出された（表１）。
【００９８】
【表１】
2021526934.tif 000012
【００９９】
実施例４（比較）  ＷＯ２０１６／００５７８５Ａ１に記載されているような、ＴＭＰ（トリメタリン酸塩）と架橋されるのに不可欠な反応条件下での、ヒアルロン酸の分子量の低減
水和ステップ
最初の分子量が２．４ＭＤａであるヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）を、０．０１ＭのＮａＯＨに、９０ｍｇ／ｍｌの最終濃度で、２．５時間、機械で均質化させながら水和させた（ｐＨ１１）。
【０１００】
模擬架橋ステップ
水和ステップ中に得られた混合物の１試料を、４８時間、７０℃でインキュベートした。ヒアルロナン主鎖の分解を、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液を使用して中和することにより停止させた。
【０１０１】
分子量の決定
開始材料として使用されるヒアルロン酸ナトリウム、水和ステップ後のヒアルロン酸ナトリウム、および架橋ステップを模倣するステップ中に得られたすべての３つの試料の分子量を決定した。
【０１０２】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析のために、試料溶液をＳＥＣ溶離液で希釈して、０．１ｍｇ／ｍｌの最終ＨＡ濃度を得た。一連の高感度の検出器、すなわちフォトダイオードアレイＵＶ、光散乱（ＲＡＬＳおよびＬＡＬＳの両方）、屈折率および粘度検出器を備えたＶｉｓｃｏｔｅｋ  ＴＤＡｍａｘ温調付きマルチ検出器ＳＥＣシステムを、測定のために使用した。屈折率検出器で試料の濃度を記録して、それぞれの分布曲線を得た。光散乱検出器と組み合わせて、ＨＡの分子量Ｍｗを決定した。
【０１０３】
結果
高温および高ｐＨ値への曝露により、ＨＡの低ＭＷ分率が増大することが見出された。ｐＨ１１および７０℃で４８時間後、低ＭＷ分率は３０％であった。低ＭＷ分率は、最終軟部組織充填剤製剤を製造するために不可欠である滅菌ステップ中にさらに増大すると予測される。
【０１０４】
【表２】
2021526934.tif 000013
【０１０５】
実施例５  ジスルフィド架橋されたＨＡを含む滅菌ヒドロゲル組成物のインビボの滞留時間
滅菌ヒドロゲル組成物ＴＨ−２５０４１７−１およびＴＨ−２６０４１７−１（例２および３を参照されたい）の分解動態を、１製剤あたり合計１２匹の雌Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの背部皮膚へと皮内注入した後、２ヶ月にわたり決定した。適用された充填剤デポーの容積を、ＭＲＴスキャンで監視した。開始時点のデポーの容積に対する平均のデポーの容積を算出した。移植後１０８日目では、平均の相対的なデポー容積は、ＴＨ−２６０４１７−１で１１５％、およびＴＨ−２５０４１７−１で１０６％であり、ジスルフィド架橋されたＨＡを含む両方の滅菌ヒドロゲル組成物は分解に対する耐性が高いことを示していた。
【０１０６】
実施例６  ジスルフィド架橋されたＨＡを含む組成物と、現行技術水準のＢＤＤＥ架橋されたＨＡを含む組成物との間の、ＨＡのＭＷ分布の比較
ジスルフィド架橋されたＨＡ（シスタミン架橋されたＨＡ）を含む、調査された組成物
修飾度がポリマー１ｇあたりチオール基１４７μｍｏｌであるチオール修飾されたヒアルロナン（ＭＷ  ７３０ｋＤａ）を、１７．９ｍｇ／ｍＬの架橋されたＨＡ−システアミンナトリウム塩、３ｍｇ／ｍＬのリドカインＨＣｌ、および５ｍｇ／ｍＬの未修飾のヒアルロン酸ナトリウム（ＭＷ  １．９４ＭＤａ）を含む組成物を製造するために使用した。ｐＨおよび重量オスモル濃度を生理学的に許容できる値に調節するために、ヒドロゲルに、１０ｍＭのリン酸緩衝液および９５ｍＭのＮａＣｌをさらに含めた。簡潔には、ＨＡ−システアミンナトリウム塩、ヒアルロン酸ナトリウム、リドカインＨＣｌ、および塩化ナトリウムを、室温で８時間撹拌することにより、０．０１ＭのＨＣｌに溶解させた。ｐＨ１２．１、１００ｍＭのリン酸緩衝液１部を、ｐＨを７．４へと調節するための溶液９部に添加し、続けて、チオール修飾されたヒアルロナンの遊離チオール基と過酸化水素とのモル比が２：１となるように希釈した過酸化水素溶液を添加することにより、架橋を開始した。室温で架橋させた４８時間後、ヒドロゲルを篩分し、１ｍｌのガラスシリンジに充填し、高圧蒸気滅菌によって滅菌した。組成物中、架橋されたポリマーの、滅菌後に減少した分子量の平均（ＭＲＰＭＷ）は６１０ｋＤａであった。滅菌ヒドロゲルは、ｐＨが７．５であり、重量オスモル濃度が２９６ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇであった。
【０１０７】
ＢＤＤＥ架橋されたＨＡを含む、調査された組成物
ＢＤＤＥ架橋されたＨＡ（ＭＷ  ２．７ＭＤａ）を２３ｍｇ／ｍｌの濃度で含む滅菌ヒドロゲルを得た。ヒドロゲルは、ｐＨ７であり、重量オスモル濃度が２９８ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇであった。
【０１０８】
保存的抽出による、ＭＷ決定のための試料の調製
両方のヒドロゲル組成物を、以下のように調査した。約２００ｍｇのヒドロゲルを、１８００ｍｇのＰＢＳで希釈した。４時間の遊離ＨＡの物理的な（「保存的な」）抽出後、分散体を遠心分離にかけ、続けて上清を回収した。
【０１０９】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析のために、上清をＳＥＣ溶離液で希釈して、約０．１ｍｇ／ｍｌの最終ＨＡ濃度を得た。一連の高感度の検出器、すなわちフォトダイオードアレイＵＶ、光散乱（ＲＡＬＳおよびＬＡＬＳの両方）、屈折率および粘度検出器を備えたＶｉｓｃｏｔｅｋ  ＴＤＡｍａｘ温調付きマルチ検出器ＳＥＣシステムを、測定のために使用した。屈折率検出器で試料の濃度を記録して、それぞれの分布曲線を得た。光散乱検出器と組み合わせて、分子量ＭＷを決定した。
【０１１０】
結果
【０１１１】
【表３】
2021526934.tif 000014
ジスルフィド架橋されたＨＡを含む滅菌ヒドロゲルの抽出されたＨＡ（５．２ｍｇ／ｍＬ）の濃度は、ヒドロゲルの調製中に組成物に添加された未修飾のＨＡ（５ｍｇ／ｍＬ）の濃度と非常によく一致した。このことは、修飾されたＨＡで、ヒドロゲルの調製中に依然として未架橋であるものもヒアルロナン鎖の分解の際に放出されたものも有意な量で存在しなかったため、架橋工程が両方とも非常に有効かつ緩やかなものであったことを示す。最初の測定（表３）を、ヒドロゲル製造の１ヶ月後以内に実施した。８ヶ月後の再度の測定では、抽出されたＨＡの濃度にも、２００ｋＤａ未満のＭＷ分率にも、増大が示されなかった。分子量が２００ｋＤａ未満である抽出可能なヒアルロナンの量は、ヒアルロナンの総量（修飾されたおよび未修飾のＨＡを含む）に対して１ｗｔ％未満であった。
【０１１２】
対照的に、ＢＤＤＥ架橋されたＨＡを含むヒドロゲル中、抽出されたＨＡの全濃度は７．５ｍｇ／ｍｌであり、このことは、ヒドロゲル製造のために使用されたＨＡの約３分の１が依然として未架橋であるか、架橋中、滅菌中および保存中のヒアルロナン鎖の分解の際に放出されたことを意味する。生成物の製造中に積極的に添加された遊離ＨＡの濃度は、製造元により明示されていなかった。分子量が２００ｋＤａ未満である抽出可能なヒアルロナンの量は、ヒアルロナンの総量に対して２３ｗｔ％であった。
【０１１３】
実施例７  ビス（グリシル）−シスタミン二塩酸塩の調製
シスタミン二塩酸塩（１ｇ、４．４４ｍｍｏｌ）およびＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−グリシン（１．５９ｇ、９．１０ｍｍｏｌ）の、乾燥ジクロロメタン：ＴＨＦ＝１：１（２０ｍＬ）中混合物に、最初にトリエチルアミン（１２７０μＬ、９．１６ｍｍｏｌ）を添加し、続けてＥＤＣ＊ＨＣｌ（１．７５ｇ、９．１０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン中溶液を添加した。反応溶液を、５時間、周囲温度で撹拌し、次いで揮発分を減圧下で蒸発させた。残留物を酢酸エチル（２５０ｍＬ）中にとり、１ｎのＨＣｌ（２×５０ｍＬ）、半飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）および水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、揮発分を減圧下で蒸発させ、Ｎ−Ｂｏｃ保護されたビス（グリシル）−シスタミンを、無色の油状物として得た。収量：１．５７５ｇ（８８％）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.97 (s, 1H, NH), 5.53 (s, 1H, NH), 3.81 (d, J=5.8 Hz, 2H, α-CH2), 3.58 (aq, J=6.3 Hz, 2H, -CH2-NH-), 2.82 (t, 2H, -CH2-S- ), 1.45 (s, 9H, -CH3 t-Bu); m/z = 467.1 [M+H]+, 489.1 [M+Na]+.
【０１１４】
Ｎ−Ｂｏｃ保護されたビス（グリシル）−シスタミン（３００ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（５ｍＬ）中溶液に、塩化アセチル（３００μＬ、４．２０ｍｍｏｌ）を添加した。発熱反応が終了した後、混合物を密封フラスコ中で５時間、周囲温度で撹拌し、次いで、トルエン（２ｍＬ）を添加し、揮発分を生成物が沈殿するまで蒸発させた。白色の固体を、吸引濾過によって単離し、ｎ−ペンタン（２×５ｍＬ）で洗浄した。収量：１４６ｍｇ（６７％）。ｍ．ｐ．＝１８４℃（分解）；1H NMR (400 MHz, D2O) δ 3.81 (s, 2H, α-CH2), 3.59 (at, J=6.3 Hz, 2H, -CH2-NH), 2.88 (at, 2H, -CH2-S- ); m/z = 266.9 [M+H]+, 288.9 [M+Na]+.
【０１１５】
ビス（グリシル）−シスタミン二塩酸塩は、ヒアルロナン−グリシル−システアミンナトリウム塩（ＨＡ−ＧＬＹＣ）の調製を可能にする修飾剤である。この修飾されたヒアルロナンは、架橋されたヒアルロナンＨＡ−Ｌ−ＨＡを形成し、リンカーＬＨ２は、形式的に、アミノ酸のグリシンおよびシスタミンのコンジュゲート（すなわち、式（ＩＸ）のＬＨ２、式中、ＲはＨである）に由来する。
【０１１６】
実施例８  架橋されたヒアルロナン−グリシル−システアミンを含むヒドロゲル組成物の製剤化および特徴付け
１７．９ｍｇ／ｍＬの架橋されたヒアルロナン−グリシル−システアミンナトリウム塩（ＨＡ−ＧＬＹＣ）および５ｍｇ／ｍＬの未修飾のヒアルロン酸ナトリウムを含む滅菌ヒドロゲル組成物を製造した。簡潔には、５３７ｍｇのＨＡ−ＧＬＹＣ（乾燥重量、ＭＭＷ  ６１０ｋＤａ、修飾度１６２μｍｏｌ／ポリマーのｇ）および１５０ｍｇのヒアルロン酸ナトリウム（乾燥重量、ＭＭＷ  ２．４ＭＤａ）を、２６ｇ、０．０１ＭのＨＣｌ（ＮａＣｌを含む）に、機械的撹拌下、室温で約５時間溶解させた。１９．０２ｇのこの溶液に、ｐＨ１１．８５、２．１１５ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液を添加して、ｐＨを約ｐＨ７．４に調節した。次いで、２７３μＬの０．３％Ｈ２Ｏ２溶液を添加し、混合物を１５分間、周囲温度で均質化し、次いで架橋のために終夜放置した。架橋されたヒドロゲルを、１ｍＬのガラスシリンジに充填し、高圧蒸気滅菌によって滅菌した。滅菌ヒドロゲルは、ｐＨ約７．２であった。
【０１１７】
実施例９  架橋されたヒアルロナン−ホモシステインを含むヒドロゲル組成物の製剤化および特徴付け
１７．９ｍｇ／ｍＬの架橋されたヒアルロナン−ホモシステインナトリウム塩（ＨＡ−ＨＣＹＳ）および５ｍｇ／ｍＬの未修飾のヒアルロン酸ナトリウムを含む滅菌ヒドロゲル組成物を製造した。簡潔には、５３７ｍｇのＨＡ−ＨＣＹＳ（乾燥重量、ＭＭＷ  ６１０ｋＤａ、修飾度１３６μｍｏｌ／ポリマーのｇ）および１５０ｍｇのヒアルロン酸ナトリウム（乾燥重量、ＭＭＷ  ２．４ＭＤａ）を、２６ｇ、０．０１ＭのＨＣｌ（ＮａＣｌを含む）に、機械的撹拌下、室温で約５時間溶解させ、続いて気泡を除去するために１時間の静止時間をとった。２３．６８ｇの溶液に、ｐＨ１２．０４、２．６３ｍｌ、１００ｍＭのリン酸緩衝液を添加して、溶液のｐＨを約ｐＨ７．２に調節した。混合物を、架橋のために４８時間、室温で放置し、次いで架橋されたヒドロゲルを１ｍＬのガラスシリンジに充填し、高圧蒸気滅菌によって滅菌した。滅菌ヒドロゲルは、ｐＨ約７．０であった。
【国際調査報告】
2021526934.tif 000016
2021526934.tif 000017
2021526934.tif 000018