(57)【要約】  本発明は、ＣＤ３７及びＣＤ１９を標的とする二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、並びに関連する分子、それを含む免疫細胞、その組成物、及びそれらの使用方法を提供する。本発明は、疾患又は障害、例えばがんを治療するための方法をさらに提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＣＤ３７結合ドメイン及びＣＤ１９結合ドメインを含む細胞外ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２】
ＣＤ３７結合ドメイン及び／又はＣＤ１９結合ドメインが、抗体、又はその抗原結合断片を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項３】
ＣＤ３７結合ドメイン及び／又はＣＤ１９結合ドメインが単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項２に記載のＣＡＲ。
【請求項４】
ＣＤ１９結合ドメインがＣＤ３７結合ドメイン対するＮ末端に位置している、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項５】
ＣＤ３７結合ドメインがＣＤ１９結合ドメイン対するＮ末端に位置している、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項６】
（ｉｖ）一又は複数の共刺激ドメインをさらに含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項７】
膜貫通ドメインがヒンジ／膜貫通ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項８】
ヒンジ／膜貫通ドメインが、ＣＤ８又は４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通ドメインを含む、請求項７に記載のＣＡＲ。
【請求項９】
ヒンジ／膜貫通ドメインがＣＤ８のヒンジ／膜貫通ドメインを含む、請求項８に記載のＣＡＲ。
【請求項１０】
細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項１１】
細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１０に記載のＣＡＲ。
【請求項１２】
共刺激ドメインが、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、又はＯＸ−４０の共刺激ドメインを含む、請求項６に記載のＣＡＲ。
【請求項１３】
共刺激ドメインが４−１ＢＢの共刺激ドメインを含む、請求項１２に記載のＣＡＲ。
【請求項１４】
配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項１５】
配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のＣＡＲ。
【請求項１６】
ＣＤ３７結合ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項１７】
ＶＨが配列番号１のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のＣＡＲ。
【請求項１８】
ＶＨがＶＬに対するＮ末端に位置している、請求項１６に記載のＣＡＲ。
【請求項１９】
ＶＬがＶＨに対するＮ末端に位置している、請求項１６に記載のＣＡＲ。
【請求項２０】
ＣＤ３７結合ドメインが、配列番号４又は５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項２１】
ＣＤ３７結合ドメインが、配列番号４又は５のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載のＣＡＲ。
【請求項２２】
ＣＤ１９結合ドメインが、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項２３】
ＶＨが配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のＣＡＲ。
【請求項２４】
ＣＤ１９結合ドメインが、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項２５】
ＣＤ１９結合ドメインが、配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載のＣＡＲ。
【請求項２６】
請求項１に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２７】
自殺遺伝子をさらに含む、請求項２６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
シグナル配列をコードする配列をさらに含む、請求項２６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項１に記載のＣＡＲ及び／又は請求項１に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む、免疫細胞。
【請求項３０】
Ｔ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項２９に記載の免疫細胞。
【請求項３１】
ヒト細胞である、請求項２９に記載の免疫細胞。
【請求項３２】
請求項２９に記載の免疫細胞と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項３３】
それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、請求項２９に記載の免疫細胞又はその薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項３４】
がんがＣＤ３７を発現する細胞を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
がんが、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、又は白血病である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫が、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、又はバーキットリンパ腫である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
Ｔ細胞リンパ腫が、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、又は未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
白血病が慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
対象が抗ＣＤ１９療法に対して非応答性である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
対象が抗ＣＤ１９療法を共投与される、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、どちらも参照によりその内容全体が本明細書に組み入れられる、２０１８年６月２２日出願の米国仮特許出願第６２／６８８，７７５号、及び２０１８年１１月８日出願の同第６２／７５７，５６２号の利益を請求する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全内容は本明細書において参照により援用される。ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年６月１９日に作成され、５１２９５−０１８ＷＯ３＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿６．１９．１９＿ＳＴ２５と命名され、大きさは５６，５４５バイトである。
【背景技術】
【０００３】
免疫療法は、患者の免疫系を利用して、がん、自己免疫疾患、又は形質細胞障害などの疾患を治療する。養子細胞移植は、Ｔ細胞などの抗原特異的免疫細胞を使用して、このような疾患を治療する。この療法で使用される免疫細胞は、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現することによって、所望の特異性を示すように改変することができる。ＣＡＲは、選択された標的抗原、ほとんどの場合腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原を発現する標的細胞に細胞毒性Ｔ細胞又はＮＫ細胞応答を向ける方法を提供し、Ｔ細胞受容体の適応であり、ここで、抗原結合ドメインは標的抗原に特異的な抗体の抗原結合ドメインに置き換えられる。Ｔ細胞上に発現したＣＡＲによる標的細胞の表面上の標的抗原の関与は、標的細胞の死滅を促進する。疾患の治療のためのＣＡＲ発現Ｔ細胞の使用は、ＣＡＲＴ細胞免疫療法として知られている。
【０００４】
これまでのところ、２つのＣＡＲ  Ｔ細胞製品が、再発性又は難治性の大細胞リンパ腫の治療に承認されており、そのどちらも、ＣＤ２８共刺激ドメインを有するＣＤ１９：アキシカブタゲンシロロイセルと、４−１ＢＢ共刺激ドメインを有するチサゲンレクロイセルとを標的とする。チサゲンレクロイセルは、小児及び若年成人の再発性又は難治性の急性Ｂ細胞リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の治療にも承認されている。抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞治療は、６０〜８０％の範囲の反応をもたらし、患者のおよそ４０％が長期の完全寛解を達成した。しかしながら、ＣＤ１９抗原標的喪失による疾患の再発は、急性リンパ芽球性（ＡＬＬ）患者と非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）患者の両方を含むすべての患者サブセットで観察されている（Maude et al., N. Engl. J. Med. 371:1507−17, 2014; Evans et al., Br. J. Haematol. 171(2):205−209, 2015; Schuster et al., N. Engl. J. Med. 377(26):2545−2554, 2017）。改善された治療に対する未達成の臨床的必要性が存在する。
【０００５】
さらに、Ｔ細胞リンパ腫の患者は抗ＣＤ１９  ＣＡＲＴ療法の候補ではない。例えば、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）は、非ホジキンリンパ腫全体の１２〜１５％を占める侵攻性の異種腫瘍群である。それらの複雑な不均一性の認識及び再発性の欠陥の発見にもかかわらず、ＰＴＣＬは依然として臨床的ジレンマであり、治療が不十分である。ＣＡＲ  Ｔ免疫療法は、ＡＬＬ及びＢ細胞ＮＨＬにおいて優れた臨床結果を示してきたが、Ｔ細胞悪性腫瘍の治療における成功はまだ実証されていない。
【０００６】
よって、Ｂ及びＴ細胞悪性腫瘍のための新規の又は改善された治療が必要とされる。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、とりわけ、本明細書に記載される疾患又は障害、例えばがんの治療における使用のためのＣＤ３７及びＣＤ１９を標的とする二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
【０００８】
一態様では、本発明は、（ｉ）ＣＤ３７結合ドメイン及びＣＤ１９結合ドメインを含む細胞外ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を特徴とする。
【０００９】
いくつかの実施態様では、ＣＤ３７結合ドメイン及び／又はＣＤ１９結合ドメインには、抗体、又はその抗原結合断片、例えば一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が含まれる。いくつかの実施態様では、ＣＤ１９結合ドメインはＣＤ３７結合ドメインに対するＮ末端に位置し、あるいは、ＣＤ３７結合ドメインはＣＤ１９結合ドメインに対するＮ末端に位置する。
【００１０】
いくつかの実施態様では、ＣＡＲには、（ｉｖ）一又は複数の共刺激ドメインがさらに含まれる。いくつかの実施態様では、膜貫通得ドメインには、例えばＣＤ８又は４−１ＢＢの、ヒンジ／膜貫通ドメインが含まれる。特定の実施態様では、ヒンジ／膜貫通ドメインには、配列番号９のアミノ酸配列を含んでいてもよい、ＣＤ８のヒンジ／膜貫通ドメインが含まれる。
【００１１】
さらなる実施態様では、細胞内シグナル伝達ドメインには、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄの細胞内シグナル伝達ドメインが含まれる。特定の実施態様では、細胞内シグナル伝達ドメインには、配列番号１１のアミノ酸配列を含んでいてもよい、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインが含まれる。いくつかの実施態様では、共刺激ドメインには、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、又はＯＸ−４０の共刺激ドメインが含まれる。特定の実施態様では、共刺激ドメインには、配列番号１０のアミノ酸配列を含んでいてもよい、４−１ＢＢの共刺激ドメインが含まれる。
【００１２】
いくつかの実施態様では、ＣＡＲには、配列番号１５、１６、１９、又は２０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１５、１６、１９、又は２０のアミノ酸配列の配列を含むアミノ酸配列が含まれる。
【００１３】
いくつかの実施態様では、ＣＤ３７結合ドメインには、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号１のアミノ酸配列の配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２のアミノ酸配列の配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とが含まれる。いくつかの実施態様では、ＶＨはＶＬに対するＮ末端に位置し、あるいはＶＬはＶＨに対するＮ末端に位置する。さらなる実施態様では、ＣＤ３７結合ドメインには、配列番号４又は５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号４又は５のアミノ酸配列の配列を含むアミノ酸配列が含まれる。
【００１４】
さらなる実施態様では、ＣＤ１９結合ドメインには、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号１のアミノ酸配列の配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２のアミノ酸配列の配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とが含まれる。いくつかの実施態様では、ＣＤ１９結合ドメインには、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１４のアミノ酸配列の配列を含むアミノ酸配列が含まれる。
【００１５】
別の態様では、本発明は、先の態様のいずれかのＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを特徴とする。
【００１６】
いくつかの実施態様では、ポリヌクレオチドは、自殺遺伝子をさらに含む。いくつかの実施態様では、ポリヌクレオチドは、シグナル配列をコードする配列をさらに含む。
【００１７】
別の態様では、本発明は、先の態様のいずれかのＣＡＲ及び／又はポリヌクレオチドを含む免疫細胞を特徴とする。
【００１８】
いくつかの実施態様では、免疫細胞（例えばヒト細胞）は、Ｔ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
【００１９】
別の態様では、本発明は、先の態様のいずれかの免疫細胞及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を特徴とする。
【００２０】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、先の態様のいずれか一つの免疫細胞、又はその薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を特徴とする。
【００２１】
いくつかの実施態様において、がんはＣＤ３７を発現する。いくつかの実施態様では、がんは、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（例えば、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、又はバーキットリンパ腫）、Ｔ細胞リンパ腫（例えば、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、又は未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ））、又は白血病（例えば、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ））である。
【００２２】
いくつかの実施態様では、対象は、抗ＣＤ１９療法に対して非応答性である。さらなる実施態様では、対象は抗ＣＤ１９療法を共投与される。
【００２３】
定義
便宜上、本明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲で使用されるいくつかの用語及び句の意味を以下に提供する。特に明記されていない限り、又は文脈から暗示されている場合を除き、以下の用語及び句には、以下に提供される意味が含まれる。定義は、特定の実施態様を説明するのを助けるために提供され、技術の範囲は特許請求の範囲によってのみ制限されるため、請求された技術を制限することを意図するものではない。特に定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本技術が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を持つ。当該技術分野における用語の使用法と本明細書で提供されるその定義との間に明らかな矛盾がある場合、明細書内で提供される定義が優先するものとする。
【００２４】
免疫学及び分子生物学の一般的な用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978−0−911910−19−3); Robert S. Porter et al.(eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999−2012 (ISBN 9783527600908); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1−56081−569−8); Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006; Janeway’s Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin’s Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN−1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005;及びCurrent Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)に見ることができ、それぞれの内容はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２５】
「低下する（低下）」、「減少した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」、「減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ」、又は「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」という用語はすべて、統計的に有意な量の減少を意味するために本明細書で使用される。いくつかの実施態様では、「減少する（ｒｅｄｕｃｅ）」、「減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」又は「低下する（低下）」又は「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」とは、典型的には、基準レベルと比較して少なくとも１０％の低下を意味し、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれ以上の低下を含み得る。本明細書で使用される場合、「減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」又は「阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」は、基準レベルと比較して完全阻害又は減少を包含しない。「完全阻害」は、基準レベルと比較して１００％の阻害である。該当する場合、低下は、好ましくは、所与の障害のない個人の正常範囲内であると認められるレベルまで下げることができる。
【００２６】
「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」、「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」、又は「活性化する（ａｃｔｉｖａｔｅ）」という用語はすべて、統計的に有意な量の増加を意味するために本明細書で使用される。いくつかの実施態様では、用語「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」、「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」、又は「活性化する（ａｃｔｉｖａｔｅ）」は、基準レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％の増加又は最大１００％の増加又は金純レベルと比較して１０−１００％の間のあらゆる増加、又は基準レベルと比較して少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍の増加、又は２倍と１０倍の間又はそれ以上のあらゆる増加を意味し得る。マーカー又は症状の文脈では、「増加」は、そのようなレベルでの統計的に有意な増加である。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「対象」とはヒト又は動物を意味する。通常、動物は、霊長類、げっ歯類、家畜、狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類には、例えば、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカク、例えばアカゲザルが含まれる。げっ歯類には、例えば、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ及びハムスターが含まれる。家畜及び狩猟動物には、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、猫種、例えばイエネコ、犬種、例えばイヌ、キツネ、オオカミ、鳥類、例えばニワトリ、エミュー、ダチョウ、及び魚類、例えばマス、ナマズ及びサケが含まれる。いくつかの実施態様では、対象は、哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。用語「個体」、「患者」及び「対象」は、本明細書では互換的に使用される。
【００２８】
好ましくは、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、又はウシである可能性があるが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、疾患、例えばがんの動物モデルを表す対象として有利に使用することができる。対象は、オス又はメスであり得る。
【００２９】
対象は、治療を必要とする状態（例えば、とりわけ、リンパ腫、白血病又は他の種類のがん）又はそのような状態に関連する一若しくは複数の合併症を患っているか又は有すると以前に診断又は同定され、任意で、その状態又はその状態に関連する一若しくは複数の合併症の治療をすでに受けたものであり得る。あるいは、対象は、そのような状態又は関連する合併症を有すると以前に診断されていないものでもあり得る。例えば、対象は、状態又は状態に関連する一若しくは複数の合併症の一又は複数のリスクファクターを示すもの、あるいはリスクファクターを示さないものであり得る。
【００３０】
特定の状態の治療を「必要としている対象」は、その状態を有する対象、その状態を有すると診断された対象、又はその状態を発症するリスクがある対象であり得る。
【００３１】
「疾患」は、動物が恒常性を維持することができず、疾患が改善されない場合に動物の健康が悪化し続ける、動物、例えばヒトの健康状態である。それに対して、動物の「障害」とは、動物が恒常性を維持できる健康状態であるが、動物の健康状態が障害がない場合よりも好ましくない状態のことである。障害は、治療せずに放置しても、必ずしも動物の健康状態をさらに低下させるわけではない。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「腫瘍抗原」及び「がん抗原」は、がん細胞によって異なって発現され、それによってがん細胞を標的とするために利用することができる抗原を指すために交換可能に使用される。がん抗原は、明らかに腫瘍特異的な免疫応答を刺激し得る抗原である。これらの抗原のいくつかは、必ずしも発現されているわけではないが、正常細胞によってコードされている。これらの抗原は、正常細胞では通常は沈黙している（すなわち、発現されていない）もの、分化の特定の段階でのみ発現されるもの、並びに胚及び胎児性抗原などの一時的に発現されるものとして特徴付けることができる。他のがん抗原は、がん遺伝子（例えば、活性化ｒａｓがん遺伝子）、抑制遺伝子（例えば、突然変異体ｐ５３）、及び内部欠失又は染色体転座に起因する融合タンパク質などの突然変異細胞遺伝子によってコードされている。さらに他のがん抗原は、ＲＮＡ及びＤＮＡ腫瘍ウイルスで運ばれるものなどのウイルス遺伝子によってコードされ得る。多くの腫瘍抗原は、多数の固形腫瘍：免疫により定義されるＭＡＧＥ  １、２、＆  ３；ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ２、ムチン（すなわち、ＭＵＣ−１）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）に関して定義された。さらに、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、エプスタインバー（ＥＢＶ）、及びヒトパピローマ（ＨＰＶ）によってコードされるものなどのウイルスタンパク質は、それぞれ肝細胞癌、リンパ腫、及び子宮頸がんの発症に重要であることが示された。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「キメラ」は、少なくとも二つ以上の異なるポリヌクレオチド分子の部分の融合の産物を指す。一実施態様では、用語「キメラ」は、既知の要素又は他のポリヌクレオチド分子の操作を通じて生成される遺伝子発現要素を指す。
【００３４】
いくつかの実施態様では、「活性化」は、検出可能な細胞増殖を誘発するのに十分刺激された免疫細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の状態を指すことがある。いくつかの実施態様では、活性化は、誘発されたサイトカイン産生を指すことがある。他の実施態様では、活性化は、検出可能なエフェクター機能を指すことがある。少なくとも、本明細書で使用される活性化されたＴ細胞又はＮＫ細胞は、増殖性のＴ細胞又はＮＫ細胞である。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「特異的結合」及び「特異的に結合する」という用語は、２つの分子、化合物、細胞及び／又は粒子間の物理的相互作用を指し、第１の実体は、非標的である第３の実体に結合するよりも高い特異性及び親和性で第２の標的、実体に結合する。いくつかの実施態様では、特異的結合は、第２の標的である実体に対する第１の実体の親和性を指すことがあり、これは、同じ条件下で第３の非標的実体の親和性より少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、又はそれ以上である。所与の標的に特異的な試薬は、用いられているアッセイの条件下でその標的に対して特異的結合を示すものである。非限定的な例には、同種の結合パートナー（例えば、Ｔ細胞上に存在する刺激性及び／又は共刺激性分子）タンパク質を認識し、それらと結合する抗体又はリガンドが含まれる。
【００３６】
本明細書で使用される場合の「刺激リガンド」は、抗原提示細胞（ＡＰＣ、例えば、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、人工ＡＰＣ等）上に存在するときに、Ｔ細胞上の同種の結合パートナー（本明細書では「刺激分子」又は「共刺激分子」と称される）と特異的に結合することができ、それにより、免疫応答の増殖、活性化、開始等を含むがこれらに限定されないＴ細胞による一次応答を媒介することができるリガンドを指す。刺激リガンドは、当該技術分野でよく知られており、とりわけ、ペプチドが充填されたＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ分子、抗ＣＤ３抗体、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体、及びスーパーアゴニスト抗ＣＤ２抗体を包含する。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「刺激分子」とは、抗原提示細胞上に存在する同種の刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を意味する。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「共刺激リガンド」には、Ｔ細胞上の同種の共刺激分子と特異的に結合し、それにより、例えばペプチドが充填されたＭＨＣ分子とＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合により提供された一次シグナルに加えて、増殖、活性化、分化等を含むがこれらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供するＡＰＣ上の分子を含む。共刺激リガンドには、限定されないが、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞内接着性分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌ様受容体に結合するアゴニスト又は抗体、及びＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドが含まれ得る。共刺激リガンドには、限定されないが、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体、例えば限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドも含まれ得る。
【００３９】
「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、限定されないが増殖などのＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同種の結合パートナーを指す。共刺激分子には、限定されないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３が含まれる。
【００４０】
一実施態様では、本明細書で使用される場合の用語「工学操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」及びその文法的に同等の語は、ヒトが設計した核酸、例えば、生物のゲノム内の核酸の一又は複数の改変を指すことがある。別の実施態様では、工学操作された、とは、遺伝子の改変、追加、及び／又は欠失を指すことがある。「工学操作された細胞」は、追加された、欠失した、及び／又は改変された遺伝子を有する細胞を指すことがある。本明細書で使用される場合の用語「細胞」又は「工学操作された細胞」及びそれらの文法的に同等の語は、ヒト又は非ヒト動物由来の細胞を指すことがある。
【００４１】
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド分子が、第１のポリヌクレオチド分子が第２のポリヌクレオチド分子の機能に影響を及ぼすように配置されているときは、用語「作用可能に結合」は、第２の転写可能なポリヌクレオチド分子、例えば目的の遺伝子に結合した第１のポリヌクレオチド分子、例えばプロモーターを指す。二つのポリヌクレオチド分子は、単一の近接するポリヌクレオチド分子の一部であってもそうでなくてもよく、隣接していてもそうでなくてもよい。例えば、プロモーターは、そのプロモーターが細胞中の目的の遺伝子の転写を制御又は媒介する場合、目的の遺伝子に作用可能に結合している。
【００４２】
本明細書に記載されるさまざまな実施態様では、記載されている特定のポリペプチドのいずれかのバリアント（天然に存在しても又はそうでなくても）、対立遺伝子、相同体、保存的に修飾されたバリアント、及び／又は保存的置換バリアントが包含されることがさらに検討される。アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列の単一のアミノ酸又はわずかな比率のアミノ酸を改変する核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、又は追加は、改変がアミノ酸の化学的に同様のアミノ酸との置換をもたらし、ポリペプチドの所望の活性を保持する「保存的に修飾されたバリアント」であることを認識するであろう。そのような保存的に修飾されたバリアントは、本開示と一致する多型バリアント、種間相同体、及び対立遺伝子に追加され、それらを除外しない。
【００４３】
所与のアミノ酸は、同様の物理化学的特性を有する残基、例えば、ある脂肪族残基を別の脂肪族残基に置換すること（例えば、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを互いに置換すること）、又はある極性残基を別の極性残基に置換すること（例えば、ＬｙｓとＡｒｇの間、ＧｌｕとＡｓｐの間、又はＧｌｎとＡｓｎの間）により、置き換えられ得る。他のそのような保存的置換、例えば、同様の疎水性特性を有する領域全体の置換が、よく知られている。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドは、本明細書に記載されるアッセイのいずれか１つで試験して、所望の活性、例えば、リガンド媒介受容体活性及び天然又は参照ポリペプチドの特異性が保持されることを確認することができる。
【００４４】
アミノ酸は、側鎖の特性の類似性に従ってグループ化され得る（A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73−75, Worth Publishers, New York (1975)）：（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて以下の群に分けることができる：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つの要素を別のクラスの要素と交換することを必然的に伴うものである。特定の保存的置換には、例えば、以下；ＡｌａをＧｌｙ又はＳｅｒへ；ＡｒｇをＬｙｓへ；ＡｓｎをＧｌｎ又はＨｉｓへ；ＡｓｐをＧｌｕへ；ＣｙｓをＳｅｒへ；ＧｌｎをＡｓｎへ；ＧｌｕをＡｓｐへ；ＧｌｙをＡｌａ又はＰｒｏへ；ＨｉｓをＡｓｎ又はＧｌｎへ；ＩｌｅをＬｅｕ又はＶａｌへ；ＬｅｕをＩｌｅ又はＶａｌへ；ＬｙｓをＡｒｇ、Ｇｌｎ又はＧｌｕへ；ＭｅｔをＬｅｕ、Ｔｙｒ又はＩｌｅへ；ＰｈｅをＭｅｔ、Ｌｅｕ又はＴｙｒへ；ＳｅｒをＴｈｒへ；ＴｈｒをＳｅｒへ；ＴｒｐをＴｙｒへ；ＴｙｒをＴｒｐへ；及び／又はＰｈｅをＶａｌ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換が含まれる。
【００４５】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載されるポリペプチド（又はそのようなポリペプチドをコードする核酸）は、本明細書に記載されるアミノ酸配列のうちの一つの機能的断片であり得る。本明細書で使用される場合、「機能的断片」は、当該技術分野で知られているか又は本明細書で以下に記載されるアッセイに従って、野生型の参照ポリペプチドの活性の少なくとも５０％を保持するペプチドの断片又はセグメントである。機能的断片は、本明細書で開示される配列の保存的置換を含み得る。
【００４６】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載されるポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチド又は分子のバリアントであり得る。いくつかの実施態様では、バリアントは保存的に修飾されたバリアントである。保存的置換バリアントは、例えば天然のヌクレオチド配列の変異により得ることができる。本明細書で参照される場合の「バリアント」とは、天然又は参照ポリペプチドと実質的に相同であるが、一又は複数の欠失、挿入、又は置換のために天然又は参照ポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。バリアントポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然又は参照ＤＮＡ配列と比較したときにヌクレオチドの一又は複数の追加、欠失又は置換を含むが、非バリアントポリペプチドの活性を保持するバリアントタンパク質又はその断片をコードする配列を包含する。広範なＰＣＲに基づく部位特異性変異誘発アプローチは、当該技術分野で知られており、当業者により適用され得る。
【００４７】
バリアントアミノ酸又はＤＮＡ配列は、天然又は参照配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上同一である。天然配列と変異配列の間の相同性の程度（パーセント同一性）は、例えば、ワールドワイドウェブ上でこの目的のために一般的に使用される自由に利用可能なコンピュータープログラム（例えば、デフォルト設定のＢＬＡＳＴｐ又はＢＬＡＳＴｎ）を使用して２つの配列を比較することによって決定することができる。
【００４８】
天然アミノ酸配列の改変は、当業者に知られる多くの技術のいずれかによって達成され得る。変異は、例えば、変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって特定の遺伝子座に導入することができ、天然配列の断片へのライゲーションを可能にする制限部位が隣接している。ライゲーションに続いて、得られた再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、又は欠失を有する類似体をコードする。あるいは、オリゴヌクレオチド指向の部位特異的変異誘発アプローチを使用して、必要な置換、欠失、又は挿入に従って改変された特定のコドンを有する改変されたヌクレオチド配列を提供することができる。そのような改変を作製するための技術は十分に確立されており、例えば、Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, January 1985, 12−19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981)；並びに米国特許第４，５１８，５８４号及び同第４，７３７，４６２号により開示されるものを含み、これらは、参照によりその全文が本明細書に援用される。ポリペプチドの適切なコンフォメーションの維持に関与しないシステイン残基も、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防ぐために、一般にセリンで置換され得る。逆に、システイン結合をポリペプチドに付加して、その安定性を改善するか、又はオリゴマー化を促進することができる。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語「ＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸と定義される。用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書では「核酸」と互換的に使用され、ヌクレオシドのポリマーを指す。典型的には、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合により結合された、ＤＮＡ又はＲＮＡにおいて天然にみられるヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）から構成されている。しかしながら、この用語は、天然に存在する核酸に見られるかどうかにかかわらず、化学的又は生物学的に修飾された塩基、修飾された骨格などを含有するヌクレオシド又はヌクレオシド類似体を含む分子を包含し、そのような分子は特定の用途に好ましい場合がある。この用途がポリヌクレオチドに言及する場合、ＤＮＡ、ＲＮＡの両方、及びそれぞれの場合に一本鎖と二本鎖形態（及び各一本鎖分子の相補体）の両方が提供されることが理解される。本明細書で使用される場合の「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド材料自体及び／又は特定の核酸を生化学的に特徴づける配列情報（すなわち、塩基の略語として使用される一連の文字）を指すことがある。本明細書で示されるポリヌクレオチド配列は、他に明記されない限り、５’から３’方向に示される。
【００５０】
本明細書で使用される場合の用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーを指す。用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書では互換的に使用される。ペプチドは比較的短いポリペプチドであり、通常、長さは約２と６０アミノ酸の間である。本明細書で使用されるポリペプチドは、通常、タンパク質に最も一般的にみられる２０のＬアミノ酸などのアミノ酸を含有する。しかしながら、当該技術分野で知られる他のアミノ酸及び／又はアミノ酸類似体が使用され得る。ポリペプチド中のアミノ酸の一又は複数は、例えば、炭水化物基、リン酸基、脂肪酸基、結合、官能化などのためのリンカーのような化学物質の添加により、修飾され得る。ポリペプチドに共有結合又は非共有結合した非ポリペプチド部分を有するポリペプチドも「ポリペプチド」と考えられる。例示的な修飾には、グリコシル化及びパルミトイル化が含まれる。ポリペプチドは、天然源から精製され、組み換えＤＮＡ技術を使用して生成され、又は従来の固相ペプチド合成等のような化学的手段を通じて合成され得る。本明細書で使用される場合の用語「ポリペプチド配列」又は「アミノ酸配列」は、ポリペプチド材料それ自体及び／又はポリペプチドを生化学的に特徴づける配列情報（すなわち、アミノ酸名の略語として使用される一連の文字又は三文字コード）を指すことがある。本明細書で示されるポリペプチド配列は、他に明記されない限り、Ｎ末端からＣ末端方向に示される。
【００５１】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば二重特異性ＣＡＲポリペプチド）をコードする核酸は、ベクターにより構成される。本明細書に記載される態様のいくつかでは、本明細書に記載される所与のポリペプチドをコードする核酸配列、又はそのモジュールは、ベクターに作用可能に結合している。本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、宿主細胞への送達のため又は異なる宿主細胞間の移入のために設計された核酸コンストラクトを指す。本明細書で使用される場合、ベクターはウイルス性であっても非ウイルス性であってもよい。用語「ベクター」は、適切な制御要素に結合しているときに複製可能であり、遺伝子配列を細胞に移入することができるあらゆる遺伝要素を包含する。ベクターには、限定されないが、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどが含まれ得る。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「発現ベクター」は、ベクター上の転写調節配列に結合した配列からＲＮＡ又はポリペプチドを発現させるベクターを指す。発現された配列は、細胞に対して異種であることが多いが、必ずしもそうではない。発現ベクターは、追加の要素を含んでもよく、例えば、発現ベクターは、二つの複製系を有してもよく、これにより、二つの生物、例えば、発現のためのヒト細胞と、クローニング及び増幅のための原核生物宿主とでの維持が可能になる。用語「発現」は、ＲＮＡ及びタンパク質の産生に関与し、必要に応じてタンパク質を分泌する細胞プロセスを指し、適用可能な場合、例えば、転写、転写物プロセシング、翻訳及びタンパク質折り畳み、修飾及びプロセシングを含むがこれらに限定されない。用語「発現産物」には、遺伝子から転写されたＲＮＡ、及び遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳により得られたポリペプチドが含まれる。用語「遺伝子」は、適切な調節配列に作用可能に結合しているときにｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでＲＮＡに転写されている（ＤＮＡ）核酸配列を意味する。遺伝子は、コード領域の前及び後に、５’未翻訳（５’ＵＴＲ）又は「リーダー」配列及び３’ＵＴＲ又は「トレーラー」配列、並びに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）などの領域を含んでもよく、含まなくてもよい。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「シグナルペプチド」又は「シグナル配列」は、新生タンパク質を小胞体に向けるよう機能する新たに合成されたタンパク質のＮ末端のペプチドを指す。いくつかの実施態様では、シグナルペプチドはＣＤ８シグナルペプチドである。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「ウイルスベクター」は、ウイルス起源の少なくとも一つの要素を含み、ウイルスベクター粒子にパッケージされる能力を有する核酸ベクターコンストラクトを指す。ウイルスベクターは、必須ではないウイルス遺伝子の代わりに、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸を含有し得る。ベクター及び／又は粒子は、核酸をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に移入する目的で用いられ得る。数多くの形態のウイルスベクターが当該技術分野で知られている。
【００５５】
「組み換えベクター」とは、異種核酸配列又はｉｎ  ｖｉｖｏで発現することができる「導入遺伝子」を含むベクターを意味する。本明細書に記載されるベクターは、いくつかの実施態様では、他の適切な組成物及び療法と組み合わせることができることを理解されたい。いくつかの実施態様では、ベクターはエピソームである。適切なエピソームベクターの使用は、対象における目的のヌクレオチドを高コピー数の染色体外ＤＮＡに維持する手段を提供し、それによって染色体統合の潜在的な影響を排除する。
【００５６】
本明細書で使用される場合、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、又は「改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）」は、目的が、疾患又は障害、例えば、急性リンパ芽球性白血病又はその他のがん、疾患、若しくは障害に関連する状態の進行又は重症度を逆転、軽減、改善、阻害、減速、又は停止することである、治療的処置を指す。用語「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」には、状態、疾患又は障害の少なくとも一つの悪影響又は症状を減少させること又は軽減することが含まれる。治療は、一又は複数の症状又は臨床マーカーが減少した場合、通常「有効」である。あるいは、治療は、疾患の進行が減少又は中断された場合、「有効」である。つまり、「治療」には、症状又はマーカーの改善だけでなく、治療がない場合に予想されるものと比較して、症状の進行又は悪化の停止又は少なくとも減速も含まれる。有益な又は所望の臨床結果は、検出可能か検出不可能かに関わらず、一又は複数の症状の軽減、疾患の程度の低減、疾患状態の安定化（つまり悪化しない）、疾患進行の遅延又は減速、病態の改善又は緩和、（部分的又は完全な）寛解、及び／又は死亡率の低下を含むが、これらに限定されない。疾患の「治療」という用語には、疾患の症状や副作用からの救済（緩和治療を含む）を提供することも含まれる。
【００５７】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的組成物」は、薬学的に許容される担体、例えば製薬業界で一般的に使用される担体と組み合わせた活性薬剤を指す。「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又はその他の問題や合併症を伴わずに、人間や動物の組織と接触して使用するのに適しており、合理的な利益／リスク比に見合う化合物、材料、組成物、及び／又は投与形態を指すために本明細書では用いられる。本発明の態様のいずれかのある実施態様では、薬学的に許容される担体は、水以外の担体であり得る。本発明の態様のいずれかのある実施態様では、薬学的に許容される担体は、クレーム、乳液、ゲル、リポソーム、ナノ粒子、及び／又は軟膏であり得る。本発明の態様のある実施態様では、薬学的に許容される担体は、人工的な又は工学操作された担体、例えば活性成分が天然には存在しないとみられる担体であり得る。
【００５８】
本明細書で使用される場合、用語「投与すること（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」は、所望の部位に薬剤の少なくとも部分的送達をもたらす方法又は経路によって本明細書で開示される治療的又は薬学的組成物を対象に配置することを指す。本明細書で開示される薬剤を含む薬学的組成物は、対象において有効な治療をもたらす任意の適切な経路によって投与され得る。
【００５９】
用語「統計的に有意な（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）」又は「有意には（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ）」は、統計的有意性を指し、通常、２標準偏差（２ＳＤ）以上の差を意味する。
【００６０】
動作例を除いて、又は他に示された場合、本明細書で使用される成分又は反応条件の量を表すすべての数字は、すべての場合において「約」という用語によって修正されると理解されるべきである。用語「約」は、パーセンテージに関連して使用されるとき、±１％を意味し得る。
【００６１】
本明細書で使用される場合、用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、示された定義された要素に加えて他の要素も存在し得ることを意味する。「〜を含む」の使用は、限定ではなく包含を示す。
【００６２】
用語「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、実施態様のその説明に記載されていない要素を除く、本明細書に記載される組成物、方法、及びそれらのそれぞれの成分を指す。
【００６３】
本明細書で使用される場合、用語「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、所与の実施態様に必要な要素を指す。この用語は、その技術の実施態様の基本的かつ新規な又は機能的な特性に大きく影響しない追加の要素の存在を許可する。
【００６４】
単数形の「ある」（ａ、ａｎ）及び「該」、「この」（ｔｈｅ）は、文脈が明らかに他を示さない限りは複数の指示対象を含む。同様に、「又は」（ｏｒ）という単語も、文脈が明らかに他を示さない限りは「及び」を含むことが意図される。本明細書に記載されているものと類似又は等価な方法及び物質を本開示の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び物質を下記に記載する。「例えば（ｅ．ｇ．）」という略語は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書では非限定的な例を示すのに使用される。よって、「例えば（ｅ．ｇ．）」という略語は、用語「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」と同義である。
本発明の態様のいずれかのある実施態様では、本明細書に記載される開示は、ヒトをクローン化するためのプロセス、ヒトの生殖細胞系列の遺伝的同一性を修飾するためのプロセス、工業的又は商業的目的のためのヒト胚の使用、又はヒト又は動物に実質的な医学的利益をもたらすことなく苦しむ可能性のある動物及びそのようなプロセスから生じる動物の遺伝的同一性を修飾するためのプロセスには関連しない。
【００６５】
他の用語は、以下の技術のさまざまな態様及び実施態様の記載内に定義される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１Ａ】ＣＤ３７及びＣＤ１９抗体で染色された腫瘍細胞株のＦＡＣＳプロットを示す。ＮＡＬＭ６：急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞株；Ｋ５６２発現ＣＤ１９及びＣＤ３７：ポジティブコントロール；ＪＥＫＯ−１：マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞株；ＲＡＪＩ：バーキットリンパ腫細胞株。
【図１Ｂ】３人のＭＣＬ患者から得たサンプルのＦＡＣＳプロットを示す。
【図１Ｃ】ＭＣＬ患者の細胞上のＣＤ１９及びＣＤ３７の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。それぞれのドットは、別個の異種移植サンプルを表す。（ｎ＝３；表示される中央値）。
【図１Ｄ】ＣＤ３リンパ球にゲートされたＣＬＬ患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）上のＣＤ１９及びＣＤ３７の発現を示す（ｎ＝２０；平均±Ｓ．Ｄ．表示；＊＊＊＊は、ｔ検定によるｐ＜０．０００１を示す）。
【図１Ｅ】ＣＬＬサンプル上のＣＤ１９及びＣＤ３７を示す。ＣＤ３−ＣＤ２０＋Ｂ細胞にゲートされたフローサイトメトリーによるＣＬＬを有する２１人の患者のＣＤ１９及びＣＤ３７の発現レベル。平均±Ｓ．Ｄ．表示。
【図２Ａ】ＣＬＬ  ＰＢＭＣ上のＣＤ１９及びＣＤ３７抗原の分布を示す。各患者サンプルからのＣＤ３−細胞にゲートされた細胞あたりの抗体結合（ＡＢＣ）が示されている。
【図２Ｂ】ＣＤ１９及びＣＤ３７抗原密度を示す。ＣＤ１９の範囲：２４３９６−７０９５２、平均：４３２３８；ＣＤ３７の範囲：８９９２−４６５５０、平均：２３９８９。
【図２Ｃ】組織マイクロアレイからの初代ＡＬＫ陰性（左）及びＡＬＫ陽性（右）ＡＬＣＬ標本におけるＣＤ３７免疫組織化学を示す。
【図３Ａ】ヒト化マウス抗体由来の単鎖可変断片の配向が異なる２つの抗ＣＤ３７第２世代ＣＡＲコンストラクトの概略図を示す：軽鎖から重鎖の配向（ＣＡＲ−３７  Ｌ−Ｈ、上）と重鎖から軽鎖（ＣＡＲ−３７  Ｈ−Ｌ、下）。
【図３Ｂ】ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでの活性化の１０日後の初代ヒトＴ細胞の導入効率の代表的なフロープロットを示す。
【図３Ｃ】３人の健康なドナーからの増殖したＴ細胞には平均３８％（Ｌ−Ｈ）及び７５％（Ｈ−Ｌ）の可変ＣＡＲ−３７発現が含まれていたことを示す。
【図３Ｄ】３８日間にわたる３人の健康なドナーの静的培養条件を使用したＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ活性化及び標的刺激Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖を示す。各矢印は、ＣＤ３７及びＣＤ１９を発現するよう導入されたＫ５６２細胞での抗原刺激を表す。
【図３Ｅ】異なるＣＡＲコンストラクトが導入され、腫瘍細胞と共培養されたＪｕｒｋａｔレポーター（ＮＦＡＴ−Ｌｕｃ）Ｔ細胞の活性化を示す。ルシフェラーゼ活性は１６時間後に測定された。（ＣＤ３−ＣＤ２８ビーズ：ポジティブコントロール）。
【図３Ｆ】ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ１６、ＣＤ１４、ＣＤ５６、及びＣＤ３７抗体又はアイソタイプコントロールで染色された６人の正常ドナーからの全血を示す。３Ｆは、ＣＤ４５＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞にゲートされたＣＤ３７発現を表すヒストグラムを示す。
【図３Ｇ】ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ１６、ＣＤ１４、ＣＤ５６、及びＣＤ３７抗体又はアイソタイプコントロールで染色された６人の正常ドナーからの全血を示す。３Ｇは、ＣＤ４５＋ＣＤ１６＋ＣＤ１４＋単球集団にゲートされたＣＤ３７発現を表すヒストグラムを示す。
【図３Ｈ】ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ１６、ＣＤ１４、ＣＤ５６、及びＣＤ３７抗体又はアイソタイプコントロールで染色された６人の正常ドナーからの全血を示す。３Ｈは、Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋）にゲートされたＣＤ３７発現を表すヒストグラムを示す。
【図３Ｉ】ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ１６、ＣＤ１４、ＣＤ５６、及びＣＤ３７抗体又はアイソタイプコントロールで染色された６人の正常ドナーからの全血を示す。３Ｉは、ＣＤ４５＋ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞にゲートされたＣＤ３７発現を表すヒストグラムを示す。
【図４Ａ】示されているＥ：Ｔ比でのＣＡＲ−３７  Ｈ−Ｌ、ＣＡＲ−１９、又は非導入Ｔ細胞との共培養の２４時間後にフローサイトメトリーにより測定された、ＣＳＦＥ標識された、非刺激の標的Ｔ細胞の数を示す。
【図４Ｂ】ＰＭＡ／イオノマイシンで６時間刺激され、その後、示されているＥ：Ｔ比でのＣＡＲ−３７  Ｈ−Ｌ、ＣＡＲ−１９、又は非導入Ｔ細胞との共培養の２４時間後にフローサイトメトリーにより測定された、ＣＳＦＥ標識されたＴ細胞の数を示す。
【図４Ｃ】示されているＥ：Ｔ比でのＣＡＲ−３７  Ｈ−Ｌ、ＣＡＲ−１９、又は非導入Ｔ細胞との共培養の２４時間後にフローサイトメトリーにより測定されたＪｅｋｏ−１  ＣＢＧ−ＧＦＰ細胞の数を示す。バーは、３人の正常なドナーを代表する１人の正常なドナーからの３つの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．数を示す。
【図４Ｄ】１：１のＥ：Ｔ比で６時間にわたって初代免疫細胞でインキュベートされたＣＡＲ−３７  Ｈ−Ｌ及びＣＡＲ−１９  Ｔ細胞による培地に対するＣＤ１０７ａ及びＩＦＮγの産生が、フローサイトメトリーにより分析されたことを示す。バーは、分析された３人の正常ドナーの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．パーセンテージを示す。
【図５】標的と一晩共培養した後に測定されたＣＡＲ−３７  Ｔ細胞の細胞傷害性能を示す。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、示されているＥ：Ｔ比で示されている腫瘍細胞株と共培養された。ＣＡＲ−３７及びＣＡＲ−１９  Ｔ細胞の濃度の増加は特定の死滅をもたらしたが、コントロール群（ＵＴＤ）では死滅は観察されなかった。細胞傷害性アッセイは、異なる健康なドナーで実施された３つの独立した実験を表す。
【図６Ａ】初代ＣＬＬ腫瘍サンプルでインキュベートされたＣＡＲ−３７  Ｈ−Ｌ、ＣＡＲ−１９、又はＵＴＤ  Ｔ細胞によるサイトカイン産生を示す。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、１：１のＥ：Ｔ比で２４時間にわたって標的細胞でインキュベートされ、培養上清はＬｕｍｉｎｅｘアッセイにより分析された。データは、３人のドナーの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．としてプロットされる。
【図６Ｂ】ＭＣＬ  ＰＤＸ腫瘍サンプルでインキュベートされたＣＡＲ−３７  Ｈ−Ｌ、ＣＡＲ−１９、又はＵＴＤ  Ｔ細胞によるサイトカイン産生を示す。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、１：１のＥ：Ｔ比で２４時間にわたって標的細胞でインキュベートされ、培養上清はＬｕｍｉｎｅｘアッセイにより分析された。データは、３人のドナーの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．としてプロットされる。
【図６Ｃ】１：１のＥ：Ｔ比で２４時間にわたって示されている腫瘍細胞株でインキュベートされたＣＡＲ−３７、ＣＡＲ−１９、又はＵＴＤ  Ｔ細胞によるサイトカイン産生を示し、培養上清はＬｕｍｉｎｅｘアッセイにより分析された。ＣＡＲ−３７群及びＣＡＲ−１９群では有意な複数のサイトカイン産生が確認されたが、ＵＴＤは確認されなかった。３人の正常ドナーが分析され、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．が示されている。
【図６Ｄ】１：１のＥ：Ｔ比で２４時間にわたって示されている腫瘍細胞株でインキュベートされたＣＡＲ−３７、ＣＡＲ−１９、又はＵＴＤ  Ｔ細胞によるＩＬ−６産生を示し、培養上清はＬｕｍｉｎｅｘアッセイにより分析された。３人の健常ドナーが分析され、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．が示されている。
【図７Ａ−Ｃ】ＭＣＬ腫瘍モデルにおけるＣＡＲ−３７  Ｔ細胞の抗ＭＣＬ活性の直接比較を示す。７Ａは、実験概略図を示す。ＮＳＧマウスは、１×１０６  ＪＥＫＯ−１（ＣＢＧ−ＧＦＰ）細胞をＩＶ注射され、異なる時点での腫瘍量についてＢＬＩによってモニターされた。第０日に、マウスは腫瘍量（ＢＬＩ）に基づいて無作為化されて、１×１０６のコントロールＴ細胞（ＵＴＤ）、ＣＡＲ−３７  Ｌ−Ｈ、又はＣＡＲ−３７  Ｈ−Ｌを受けた。７Ｂは、経時的なＪＥＫＯ−１増殖の典型的な生物発光画像を示す。７Ｃは、異なる時点での３つの群のマウス全体の平均放射輝度（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）を示す。グラフは、１群ごとに５匹のマウスを使用した１つの実験を表す。平均±Ｓ．Ｄ．が示されている。
【図７Ｄ】実験計画の概略図を示す。ＮＳＧマウスは、１×１０６  ＪＥＫＯ−１（ＣＢＧ−ＧＦＰ）細胞をＩＶ注射され、異なる時点での腫瘍量についてＢＬＩによってモニターされた。第０日に、マウスは腫瘍量に基づいて無作為化されて（ＢＬＩ）、２×１０６のコントロールＴ細胞（ＵＴＤ）、ＣＡＲ−３７  又はＣＡＲ−３７  Ｈ−Ｌを受けた。
【図７Ｅ】経時的なＪＥＫＯ−１増殖の典型的な生物発光画像を示す。
【図７Ｆ】異なる時点での３つの群のマウス全体の平均的なフラックス（光子／秒）を示す。グラフは、２人の異なる健康なドナーから得られたＣＡＲ  Ｔ細胞で実施された、１群ごとに５匹のマウスを使用した２つの実験を表す。平均±Ｓ．Ｄ．表示。＊＊＊は、二元配置分散分析によるｐ＜０．００１を示す。
【図７Ｇ】出血及びフローサイトメトリー検出によりモニターされたＣＡＲ  Ｔ細胞の絶対数を示す。ＣＡＲＴ注射後１４日目の末梢血中の絶対ＣＡＲ  Ｔ細胞数が示されている。＊は、ｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【図８Ａ】実験計画の概略図を示す。ＮＳＧマウスは、１×１０６  ＭＣＬ患者由来細胞をＩＶ注射され、生物発光イメージング（ＢＬＩ）により腫瘍量について経時的にモニターされた。第０日に、マウスは腫瘍量に基づいて無作為化されて、３×１０６のコントロールＴ細胞（ＵＴＤ）、ＣＡＲ−３７  又はＣＡＲ−３７  Ｈ−Ｌを受けた。
【図８Ｂ】経時的なＭＣＬ異種移植片の典型的なＢＬＩを示す。
【図８Ｃ】異なる時点での３つの群のマウス全体の平均的なフラックス（光子／秒）を示す。グラフは、２人の異なる健康なドナーから得られたＣＡＲ  Ｔ細胞及びプールされたデータで実施された、１群ごとに５匹のマウスを使用した２つの実験を表す。平均±Ｓ．Ｄ．表示（ｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【図８Ｄ】ＣＡＲ  Ｔ細胞の絶対数がフローサイトメトリーを使用して末梢血でモニターされたことを示す。ＣＡＲ  Ｔ細胞の絶対数は、第１４日にプロットされる。
【図９Ａ】ＰＴＣＬ腫瘍細胞株でのＣＤ３７発現を示す。
【図９Ｂ】患者由来のサンプルからの典型的なＦＡＣＳプロットを示す。
【図１０Ａ】１：１のＥ：Ｔ比での示されている腫瘍細胞との共培養の６時間後にフローサイトメトリーにより評価されたＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ６９発現を示す。
【図１０Ｂ】１：１のＥ：Ｔ比での示されている腫瘍細胞との共培養の６時間後にフローサイトメトリーにより評価されたＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ１０７ａ脱顆粒を示す。脱顆粒はＰＭＡポジティブコントロールに関係し、典型定な正常ドナーが示されている。
【図１０Ｃ】ＣＡＲ−３７  Ｔ細胞の細胞傷害性能を示し、これは、異なるＥ：Ｔ比でＨｕｔ７８標的細胞と一晩共培養された後に測定された。細胞傷害性アッセイは、異なる健康なドナーで実施された３つの独立した実験を表す。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．表示。
【図１０Ｄ】ＣＡＲ−３７  Ｔ細胞の細胞傷害性能を示し、これは、異なるＥ：Ｔ比でＦＥＰＤ標的細胞と一晩共培養された後に測定された。細胞傷害性アッセイは、異なる健康なドナーで実施された３つの独立した実験を表す。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．表示。
【図１１Ａ】ｓｃＦｖｓの順序が異なる二つの二重特異性第２世代ＣＡＲコンストラクトの概略図を示す。ＣＡＲ−１９−３７（上）及びＣＡＲ−３７−１９（下）。
【図１１Ｂ】ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでの活性化の１０日後の初代ヒトＴ細胞の導入効率の代表的なフロープロットを示す。
【図１１Ｃ】２人の健康なドナーからのＴ細胞の増殖を示し、これは、平均１９％（ＣＡＲ−１９−３７）及び４８％（ＣＡＲ−３７−１９）の可変ＣＡＲ発現を示した。
【図１２Ａ】異なるＣＡＲコンストラクトが導入され、腫瘍細胞と共培養されたＪｕｒｋａｔレポーター（ＮＦＡＴ−Ｌｕｃ）Ｔ細胞の活性化を示す。ルシフェラーゼ活性は１６時間後に測定された。（ＣＤ３−ＣＤ２８ビーズ：ポジティブコントロール）。
【図１２Ｂ】３０日間にわたる、２人の健康なドナーにおけるＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ活性化及び標的刺激Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖を示す。
【図１２Ｃ】二重特異性ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性能を示し、これは、示されているＥ：Ｔ比で、ＣＤ３７、ＣＤ１９、又は両方が導入されたＫ５６２標的と一晩共培養された後に測定された。細胞傷害性アッセイは、異なる健康なドナーで実施された２つの独立した実験を表す。
【図１２Ｄ】経時的なＮＳＧマウスにおける腫瘍量を示す。ＮＳＧマウスは、１×１０６  ＪＥＫＯ−１（ＣＢＧ−ＧＦＰ）細胞をＩＶ注射され、腫瘍量についてＢＬＩによってモニターされた。第０日に、マウスは腫瘍量（ＢＬＩ）に基づいて無作為化されて、２×１０６のコントロールＴ細胞（ＵＴＤ）、ＣＡＲ−３７、ＣＡＲ−１９、ＣＡＲ−１９−３７又はＣＡＲ−３７−１９を受けた。すべてのＣＡＲＴ細胞群は、同じ割合のＣＡＲ＋細胞及び非導入細胞を有するように正規化された。異なる時点でのマウス全体の平均的なフラックス（光子／秒）が示されている。グラフは、１群ごとに６匹のマウスを使用した１つの実験を示す。
【図１２Ｅ】ＣＡＲ  Ｔ細胞の絶対数を示し、これは、示されている時点でフローサイトメトリーにより末梢血に数えられた。ＣＡＲ  Ｔ細胞の絶対数は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示されている。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
本発明は、ＣＤ３７及びＣＤ１９を標的とする二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを提供する。また、二重特異性ＣＡＲをコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、並びにそれを作製及び使用する方法も記載される。さらに、本明細書に記載される疾患又は障害、例えばがんを二重特異性ＣＡＲ及び本明細書に記載される関連分子を用いて治療する方法が提供される。
【００６８】
キメラ抗原受容体
本明細書に記載される技術は、例えばがんを治療するための、免疫療法における使用のためのＣＤ３７及びＣＤ１９を標的とする二重特異性ＣＡＲを提供する。
【００６９】
本明細書で使用される場合の用語「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」は、工学操作されたＴ細胞受容体を指し、これは、リガンド又は抗原の特異性をＴ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、中枢記憶Ｔ細胞、エフェクター記憶Ｔ細胞又はそれらの組み合わせ）又はＮＫ細胞に移植する。ＣＡＲは、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、又はキメラ免疫受容体としても知られている。さらに、用語「ＣＡＲ」には、本明細書に記載されるような二重特異性ＣＡＲが含まれる。
【００７０】
ＣＡＲは、Ｔ細胞応答の標的となる細胞の表面に発現される標的、例えばポリペプチドに特異的に結合するキメラ細胞外標的結合ドメインを、Ｔ細胞受容体分子の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含むコンストラクト上に配置する。一実施態様では、キメラ細胞外標的結合ドメインは、Ｔ細胞応答の標的となる細胞上に発現した抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメインを含む。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインの特性は、当該技術分野で知られている通り、及び本明細書で開示される通り、さまざまであり得るが、キメラ標的／抗原結合ドメインは、キメラ標的／抗原結合ドメインが標的細胞の表面上の標的／抗原に結合するとき、受容体をシグナル伝達活性化に対して感受性にする。
【００７１】
細胞内シグナル伝達ドメイン、いわゆる「第１世代」に関して、ＣＡＲには、抗原結合時にＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナルのみを提供するものが含まれる。いわゆる「第２世代」のＣＡＲには、共刺激ドメイン（例えばＣＤ２８又はＣＤ１３７）及び活性化（ＣＤ３ζ）ドメインの両方を提供するものが含まれ、いわゆる「第３世代」のＣＡＲには、多数の共刺激（例えばＣＤ２８及びＣＤ１３７）ドメイン及び活性化ドメイン（例えばＣＤ３ζ）を提供するものが含まれる。さまざまな実施態様では、ＣＡＲは、標的／抗原に対して高いアフィニティ又は親和性を有するよう選択されており、例えば、抗体由来の標的又は抗原結合ドメインは、通常、天然に存在するＴ細胞受容体よりも標的抗原に対して高いアフィニティ及び／又は親和性を有する。この特性は、抗体に対して選択できる高い特異性と組み合わされて、ＣＡＲ  Ｔ細胞による非常に特異的なＴ細胞の標的化を提供する。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「ＣＡＲ  Ｔ細胞」又は「ＣＡＲ−Ｔ」は、ＣＡＲを発現するＴ細胞を指す。同様に、「ＣＡＲ  ＮＫ細胞」は、ＣＡＲを発現するＮＫ細胞を指す。Ｔ細胞又はＮＫ細胞で発現した場合、ＣＡＲは、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用して、ＭＨＣに制限されない方法で、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の特異性及び反応性を選択した標的に向け直すことができる。ＭＨＣに制限されていない抗原認識により、ＣＡＲを発現するＴ細胞又はＮＫ細胞は、抗原プロセシングとは無関係に抗原を認識することができ、それにより、腫瘍エスケープの主要なメカニズムを回避することができる。
【００７３】
本明細書で使用される場合、用語「細胞外標的結合ドメイン」は、標的への結合を容易にするのに十分な細胞の外側にみられるポリペプチドを指す。細胞外標的結合ドメインは、その結合パートナー、すなわち標的に特異的に結合する。非限定的な例として、細胞外標的結合ドメインは、抗体の抗原結合ドメイン、又は同族の結合パートナー（例えばＣＤ３７又はＣＤ１９）タンパク質を認識して結合するリガンドを含み得る。この文脈では、リガンドは、タンパク質及び／又は受容体の一部に特異的に結合する分子である。本明細書に記載される方法及び組成物において有用なリガンドの同種の結合パートナーは、通常、細胞の表面上に見られる。リガンド：同種のパートナー結合は、リガンド含有受容体の改変をもたらすか、又は生理学的応答、例えば、シグナル伝達経路の活性化、を活性化することができる。一実施態様では、リガンドは、ゲノムに対して非ネイティブであり得る。場合によっては、リガンドは、少なくとも二つの種にわたって保存された機能を有する。一実施態様では、細胞外標的結合ドメインは非抗体リガンドを含む。
【００７４】
抗体試薬
さまざまな実施態様では、本明細書に記載されるＣＡＲは、細胞外標的結合ドメインとして抗体試薬又はその抗原結合ドメインを含む。
【００７５】
本明細書で使用される場合、用語「抗体試薬」は、少なくとも一つの免疫グロブリン可変ドメイン又は免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、所与の抗原に特異的に結合するポリペプチドを指す。抗体試薬は、抗体、又は抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含み得る。本発明の態様のいずれかのある実施態様では、抗体試薬は、モノクローナル抗体、又はモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含み得る。例えば、抗体には、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）と、軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）が含まれ得る。別の例では、抗体には、二つの重（Ｈ）鎖可変領域と、二つの軽（Ｌ）鎖可変領域が含まれる。用語「抗体試薬」には、抗体の抗原結合断片（例えば、単鎖抗体、Ｆａｂ及びｓＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ＣＤＲ、及びドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（例えば、Wildt et al., Eur J. Immunol. 26(3):629−639, 1996；全文が参照により本明細書に援用される）並びに完全抗体が包含される。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭ（並びにそれらのサブタイプ及び組み合わせ）の構造的特徴を有し得る。抗体は、マウス、ウサギ、ブタ、ラット及び霊長類（ヒト及び非ヒト霊長類）を含むあらゆる起源、並びに霊長類化抗体に由来し得る。抗体は、ミディボディ、ヒト化抗体、キメラ抗体等も含む。完全ヒト抗体結合ドメインは、例えば、当業者に知られる方法を使用してファージディスプレイライブラリーから選択され得る。
【００７６】
ＶＨ及びＶＬ領域は、「フレームワーク領域（ＦＲ）」と呼ばれるより保存度の高い領域が散在する、「相補性決定領域（ＣＤＲ）」と呼ばれる超変異性の領域へとさらに小分割することができる。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は正確に規定されている（Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91−3242、及びChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901−917, 1987を参照のこと。これらはその全文が参照により本明細書に援用される。）。各ＶＨ及びＶＬは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に並ぶ、三つのＣＤＲと四つのＦＲとを含む。
【００７７】
いくつかの実施態様では、抗体又は抗体試薬は、ヒト抗体又はヒト抗体試薬ではない（すなわち、抗体又は抗体試薬はマウスである）が、ヒト化されている。「ヒト化抗体又はヒト化抗体試薬」は、ヒトにおいて天然に生成される抗体又は抗体試薬バリアントとの類似性を増加させるようタンパク質配列レベルで修飾された非ヒト抗体又は非ヒト抗体試薬を指す。抗体をヒト化するための１つのアプローチは、マウス又は他の非ヒトＣＤＲのヒト抗体フレームワークへの移植を用いる。
【００７８】
いくつかの実施態様では、ＣＡＲの細胞外標的結合ドメインは、フレキシブルリンカーペプチドを介して、通常はモノクローナル抗体である抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを融合することにより作成された、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含むか又は本質的にそれからなる。さまざまな実施態様では、ｓｃＦｖは、場合によってはヒンジを介して膜貫通ドメインに、及びＴ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば本明細書に記載されるような工学操作された細胞内シグナル伝達ドメインに融合している。本明細書に記載されるＣＡＲと、それらを選択及びクローニングする方法とに有用な抗体結合ドメインは、当業者によく知られている。
【００７９】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載される技術に有用なＣＡＲは、少なくとも二つの抗原特異的標的領域、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。場合によっては、ＣＡＲは、本明細書に記載されるようなヒンジ／膜貫通ドメインを含む。そのような実施態様では、二つ以上の抗原特異的標的領域は、少なくとも二つの異なる抗原を標的とし、直列に配列され、リンカー配列により分離され得る。別の実施態様では、ＣＡＲは、二つの異なる抗原に特異的な二重特異性ＣＡＲである。
【００８０】
例えば、本明細書に記載されるようなＣＡＲは、ＣＤ３７とＣＤ１９の両方に結合することができる二重特異性ＣＡＲである。ＣＤ３７結合部位及びＣＤ１９結合部位はそれぞれ、抗体試薬、例えば単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み得る。
【００８１】
したがって、二重特異性ＣＡＲのＣＤ３７結合配列は、いくつかの実施態様では、抗体試薬である。他の実施態様では、抗体試薬は抗ＣＤ３７  ｓｃＦｖである。いくつかの実施態様では、抗ＣＤ３７  ｓｃＦｖのＶＨは、配列番号１の配列に相当し、それを含み、又はそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施態様では、抗ＣＤ３７  ｓｃＦｖのＶＬは、配列番号２の配列に相当し、それを含み、又はそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。抗ＣＤ３７  ｓｃＦｖのＶＨは、ＶＬに対するＮ末端に位置することがあり、あるいは、ＶＬはＶＨに対するＮ末端に位置することがある。ＶＬ及びＶＨドメインは、場合によっては、リンカー、例えば配列番号３のリンカーを介して結合され得る。いくつかの実施態様では、抗ＣＤ３７  ｓｃＦｖは、配列番号４又は５の配列に相当し；配列番号４又は５の配列を含み；又は、配列番号４又は５の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。
【００８２】
二重特異性ＣＡＲのＣＤ１９結合配列は、いくつかの実施態様では試薬である。他の実施態様では、抗体試薬は抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖである。いくつかの実施態様では、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖのＶＨは、配列番号１２の配列に相当し、それを含み、又はそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施態様では、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖのＶＬは、配列番号１３の配列に相当し、それを含み、又はそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖのＶＨは、ＶＬに対するＮ末端に位置することがあり、あるいは、ＶＬはＶＨに対するＮ末端に位置することがある。ＶＬ及びＶＨドメインは、場合によっては、リンカー、例えば配列番号３のリンカーを介して結合され得る。いくつかの実施態様では、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖは、配列番号１４の配列に相当し；又は配列番号１４の配列を含み；又は、配列番号１４の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。
【００８３】
標的／抗原
あらゆる細胞表面部分は、ＣＡＲによって標的とされ得る。ほとんどの場合、標的は、Ｔ細胞応答の標的とすることが望まれる細胞上で異なって又は優先的に発現される細胞表面ポリペプチドである。この点について、腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原は、非腫瘍細胞又は組織への付随的損傷を回避又は少なくとも制限する一方、腫瘍細胞を標的とする手段を提供して、魅力的な標的を提供する。
【００８４】
上に記載した通り、二重特異性ＣＡＲの一標的はＣＤ３７である。ＣＤ３７は、４つの疎水性膜貫通ドメインを含有する細胞表面タンパク質である。ＣＤ３７は、免疫細胞上に排他的に発現される。ＣＤ３７は成熟Ｂ細胞上に高度に発現され、Ｔ細胞及び骨髄細胞上に中程度に発現される。ＣＤ３７配列は、数多くの種、例えばヒトＣＤ３７（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：９５１）ポリペプチド（例えば、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＮＰ＿００１０３５１２０．１）及びｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＮＭ＿  ００１０４００３１．１）で知られている。ＣＤ３７は、天然に存在するバリアント、分子、及びそれらの対立遺伝子を含むヒトＣＤ３７を指す。本発明の態様のいずれかのある実施態様では、例えば家畜への適用において、ＣＤ３７は、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ等のＣＤ３７を指すことがある。ヒトＣＤ３７のホモログ及び／又はオルソログは、例えば、ＮＣＢＩオルソログ検索機能を使用して、又は参照ＣＤ３７配列と同様の配列に関する所与の種についての利用可能な配列データを検索して、当業者によってそのような種について容易に同定される。
【００８５】
二重特異性ＣＡＲの第２の標的はＣＤ１９である。ＣＤ１９は、形質細胞を除くすべてのＢ系統細胞及び濾胞性樹状細胞で発現される膜貫通タンパク質である。ＣＤ１９配列は、数多くの種、例えばヒトＣＤ１９（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：９３０）ポリペプチド（例えばＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＢ６０６９７．１）及びＤＮＡ（例えばＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＨ００５４２１．２）で知られている。ＣＤ１９は、天然に存在するバリアント、分子、及びそれらの対立遺伝子を含むヒトＣＤ１９を指す。本発明の態様のいずれかのある実施態様では、例えば家畜への適用において、ＣＤ１９は、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ等のＣＤ１９を指すことがある。ヒトＣＤ１９のホモログ及び／又はオルソログは、例えば、ＮＣＢＩオルソログ検索機能を使用して、又は参照ＣＤ１９配列と同様の配列に関する所与の種についての利用可能な配列データを検索して、当業者によってそのような種について容易に同定される。
【００８６】
ヒンジ及び膜貫通ドメイン
ＣＡＲの結合ドメインの後には、一又は複数の「ヒンジドメイン」が続いてもよく、これは、標的結合ドメインをエフェクター細胞表面から離して配置し、適切な細胞／細胞接触、標的結合及び活性化を可能にするのに役立つ。ＣＡＲは、場合によっては、結合ドメインと膜貫通ドメイン（ＴＭ）との間に一又は複数のヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、又は組み換え起源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域又は改変された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲにおける使用に適した例示的なヒンジドメインには、ＣＤ８（例えばＣＤ８α）、ＣＤ４、ＣＤ２８、及びＣＤ７のような１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域が含まれ、これは、これらの分子の野生型ヒンジ領域であるか、又は改変されている場合がある。一実施態様では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジ領域を含む。
【００８７】
ＣＤ８は、細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞表面に優先的に見られる抗原である。ＣＤ８は、免疫系内の細胞−細胞相互作用を媒介し、Ｔ細胞共受容体として作用する。ＣＤ８は、アルファ（ＣＤ８α又はＣＤ８ａ）及びベータ（ＣＤ８β又はＣＤ８ｂ）鎖からなる。ＣＤ８ａ配列は、数多くの種、例えばヒトＣＤ８ａ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：９２５）ポリペプチド（例えば、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＮＰ＿００１１３９３４５．１）及びｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＮＭ＿  ０００００２．１２）で知られている。ＣＤ８は、天然に存在するバリアント、分子、及びそれらの対立遺伝子を含むヒトＣＤ８を指す。本発明の態様のいずれかのある実施態様では、例えば家畜への適用において、ＣＤ８は、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ等のＣＤ８を指すことがある。ヒトＣＤ８のホモログ及び／又はオルソログは、例えば、ＮＣＢＩオルソログ検索機能を使用して、又は参照ＣＤ８配列と同様の配列に関する所与の種についての利用可能な配列データを検索して、当業者によってそのような種について容易に同定される。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「膜貫通ドメイン」（「ＴＭドメイン」）は、場合によってはヒンジを介して細胞外結合部分を細胞内部分（例えば、存在する場合は、細胞内シグナル伝達ドメイン及び共刺激ドメイン）に融合し、ＣＡＲを免疫エフェクター細胞の形質膜に固定するＣＡＲの一部を指す。膜貫通ドメインは、細胞の形質膜を通過するＣＡＲの一般的に疎水性の領域である。膜貫通ドメインは、膜貫通タンパク質（例えばＩ型膜貫通タンパク質又は他の膜貫通タンパク質）、人工的な疎水性配列、又はそれらの組み合わせの膜貫通領域又はその断片であり得る。特定の例が本明細書に提供され、実施例で使用されているが、他の膜貫通ドメインは当業者には明らかであり、技術の代替の実施態様に関連して使用することができる。選択された膜貫通領域又はその断片は、好ましくは、ＣＡＲの意図される機能に干渉しない。タンパク質又はポリペプチドの膜貫通ドメインに関連して使用される場合、「その断片」とは、タンパク質を細胞表面に固定又は接着するのに十分である膜貫通ドメインの一部を指す。
【００８９】
いくつかの例では、本明細書に記載されるＣＡＲの膜貫通ドメイン又はその断片は、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦｌ）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒ  ａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ  ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及び／又はＮＫＧ２Ｃのアルファ、ベータ又はゼータ鎖の膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインを含む。一実施態様では、膜貫通ドメイン又はその断片は、ＣＤ８の膜貫通ドメインに由来するか又はそれを含む。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「ヒンジ／膜貫通ドメイン」は、ヒンジドメインと膜貫通ドメインの両方を含むドメインを指す。一実施態様では、二重特異性ＣＡＲのヒンジ／膜貫通ドメイン又はその断片は、ＣＤ８のヒンジ／膜貫通ドメインに由来するか又はそれを含む。ＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列又はそのバリアントを含み得る。
【００９１】
共刺激ドメイン
本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲは、場合によっては、共刺激分子の細胞内ドメイン、又は共刺激ドメインを含む。本明細書で使用される場合、用語「共刺激ドメイン」は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。共刺激分子は、抗原への結合時にＴリンパ球の効率的な活性化及び機能に必要とされる第２のシグナルを提供する抗原受容体又はＦｃ受容体以外の細胞表面分子である。そのような共刺激分子の例には、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ  ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０が含まれる。例えば、細胞内ドメインは、４−１ＢＢの細胞内ドメインである。
【００９２】
４−１ＢＢは、膜受容体タンパク質であり、ＣＤ１３７としても知られており、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバーである。４−１ＢＢは、活性化したＴリンパ球上に発現される。４−１ＢＢ配列は、数多くの種、例えば、ヒト４−１ＢＢ（ＴＮＦＲＳＦ９としても知られる）（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３６０４）及びｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿００１５６１．５）で知られている。４−１ＢＢは、天然に存在するバリアント、分子、及びそれらの対立遺伝子を含むヒト４−１ＢＢを指す。本発明の態様のいずれかのある実施態様では、例えば家畜への適用において、４−１ＢＢは、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ等の４−１ＢＢを指すことがある。ヒト４−１ＢＢのホモログ及び／又はオルソログは、例えば、ＮＣＢＩオルソログ検索機能を使用して、又は参照４−１ＢＢ配列と同様の配列に関する所与の種についての利用可能な配列データを検索して、当業者によってそのような種について容易に同定される。
【００９３】
例えば、本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲの４−１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列又はそのバリアントを含み得る。
【００９４】
細胞内シグナル伝達ドメイン
本明細書に記載されるような二重特異性ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、標的抗原に結合する効果的なＣＡＲのメッセージを免疫エフェクター細胞の内部に導入して、エフェクター細胞の機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、細胞傷害性因子のＣＡＲ結合標的細胞への放出を含む増殖及び細胞傷害性活性、又は細胞外ＣＡＲドメインへの抗原結合に続いて引き起こされる他の細胞応答を引き起こすことに関与するＣＡＲポリペプチドの一部を指す。本技術で特に使用される免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）含有細胞内シグナル伝達ドメインの非限定的な例には、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来する物が含まれる。
【００９５】
ＣＤ３は、適切な共刺激（例えば、共刺激分子の結合）と同時に関与するとき、Ｔリンパ球活性化を容易にするＴ細胞共受容体である。ＣＤ３複合体は、４本の異なる鎖からなり；哺乳動物ＣＤ３は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及び２本のＣＤ３ε鎖からなる。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びＣＤ３ζとして知られる分子と結合してＴリンパ球内に活性化シグナルを生成する。完全ＴＣＲ複合体は、ＴＣＲ、ＣＤ３ζ、及び完全ＣＤ３複合体を含む。
【００９６】
任意の態様のある実施態様では、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）からの免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。任意の態様のある実施態様では、ＩＴＡＭは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭの３つのモチーフ（ＩＴＡＭ３）を含む。任意の態様のいくつかの実施態様では、ＣＤ３ζのＩＴＡＭの３つのモチーフは、変異されず、したがって、ナイーブ又は野生型配列を含む。例えば、本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲのＣＤ３ζ配列は、以下に記載されるような配列番号１１の配列、又はそのバリアントを含む。さまざまな実施態様では、そのようなＣＡＲポリペプチドＣＤ３ζ配列は、ナイーブ又は野生型配列である。
【００９７】
ＣＡＲ及びＣＡＲ  Ｔ細胞についてのより詳細な記載は、Maus et al. Blood 2014 123:2624−35; Reardon et al. Neuro−Oncology 2014 16:1441−1458; Hoyos et al. Haematologica 2012 97:1622; Byrd et al. J Clin Oncol 2014 32:3039−47; Maher et al. Cancer Res 2009 69:4559−4562;及びTamada et al. Clin Cancer Res 2012 18:6436−6445に見られ、これらのそれぞれは、その全文が参照により本明細書に援用される。
【００９８】
いくつかの実施態様では、ＣＡＲは、リンカードメインをさらに含む。本明細書で使用される場合、「リンカードメイン」又は「リンカー領域」は、本明細書に記載されるように、ＣＡＲのドメイン／領域のいずれかを一緒に連結する、長さが約２から１００アミノ酸のオリゴ又はポリペプチド領域を指す。いくつかの実施態様では、リンカーは、隣接するタンパク質ドメインが互いに対して自由に移動できるように、グリシン及びセリンなどの可動性残基を含むか、又はそれらから構成され得る。例えば配列番号３のリンカーである。２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないことを確実にすることが望ましい場合は、より長いリンカーを使用してもよい。リンカーは、切断可能であっても切断不能であってもよい。切断可能なリンカーの例には、２Ａリンカー（例えばＴ２Ａ）、２Ａ様リンカー又はその機能的等価物及びそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの実施態様では、リンカー領域は、ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス由来のＴ２Ａである。この技術に使用することができるリンカーの非限定的な例には、Ｐ２Ａ及びＦ２Ａが含まれる。
【００９９】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載されるようなＣＡＲは、例えば非浸潤性イメージング（例えば陽電子放射断層撮影ＰＥＴスキャン）を可能にするため、レポーター分子をさらに含む。レポーター分子を含む二重特異性ＣＡＲでは、第１の細胞外結合ドメイン及び第２の細胞外結合ドメインは、異なるレポーター分子を含んでもよく、同じレポーター分子を含んでもよい。二重特異性ＣＡＲ  Ｔ細胞では、第１のＣＡＲ及び第２のＣＡＲは、異なるレポーター分子を発現してもよく、同じレポーター分子を発現してもよい。別の実施態様では、本明細書に記載されるようなＣＡＲは、単独で又は基質若しくは化学物質（例えば９−［４−［１８Ｆ］フルオロ−３−（ヒドロキシメチル）ブチル］グアニン（［１８Ｆ］ＦＨＢＧ））と組み合わせて画像化され得るレポーター分子（例えばハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ））をさらに含む。別の実施態様では、本明細書に記載されるようなＣＡＲは、非浸潤性技術を使用して容易に画像化され得るナノ粒子（例えば６４Ｃｕ２＋で官能化された金ナノ粒子（ＧＮＰ））をさらに含む。非浸潤性イメージングのＣＡＲ  Ｔ細胞の標識は、例えば、Bhatnagar et al., Integr Biol. (Camb). 5(1):231−238, 2013、及びKeu et al., Sci Transl. Med. 18; 9(373), 2017でレビューされており、これらはその全文が参照により本明細書に援用される。
【０１００】
ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙは、Ｔ細胞又はＮＫ細胞（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞又はＣＡＲ  ＮＫ細胞）上に発現されるＣＡＲを画像化するのに有用な蛍光タグとして本明細書で実証されている。この目的のための蛍光タグとして、当該技術分野で知られている本質的に任意の蛍光タンパク質が使用され得ることが想定されている。臨床用途において、ＣＡＲは、蛍光タグ又は蛍光タンパク質を含む必要はない。
【０１０１】
いくつかの実施態様では、ＣＡＲポリペプチド配列は、配列番号６、７、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０の配列を含む。いくつかの実施態様では、ＣＡＲポリペプチドは、配列番号６、７、１５、１６、１７、１８、１９又は２０の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。
【０１０２】
ＣＡＲをコードする核酸
二重特異性ＣＡＲ  Ｔの生成における使用のための本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸コンストラクト及びベクターも提供される。さまざまな実施態様では、本発明は、それぞれが本発明の二重特異性ＣＡＲ  Ｔ細胞中に発現される多数のタンパク質の別個のコード配列を含むコンストラクトを提供する。これらの別個のコーディング配列は、本明細書に記載されるような切断可能なリンカー配列によって互いに分離され得る。例えば、ウイルス２Ａタンパク質（例えばＴ２Ａ）をコードする配列は、別個の遺伝子間に配置することができ、転写されると、生成されたポリタンパク質の切断を指示することができる。上に示したように、本発明のコンストラクト及びベクターは、数多くの異なる配列の組み合わせのいずれかを含むことができる。
【０１０３】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、自殺遺伝子の発現を含むことができる。これは、投与された細胞の外部の薬物媒介制御を容易にするために行われ得る。例えば、自殺遺伝子の使用により、修飾された細胞は、例えば有害事象の場合に患者から枯渇され得る。一例では、ＦＫ５０６結合ドメインは、カスパーゼ９  アポトーシス促進分子に融合されている。この方法で工学操作されたＴ細胞は、免疫抑制剤タクロリムスに対して感受性にされる。自殺遺伝子の他の例は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ＣＤ２０、チミジレートキナーゼ、切断された前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、切断された低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）、切断されたＣＤ１９、及び修飾Ｆａｓであり、これらは、特定の分子（例えば、ＴＫ＋細胞へのガンシクロビル）又は抗体又は抗体−薬物コンジュゲートの投与による条件付き切除のために誘発され得る。
【０１０４】
本発明の二重特異性ＣＡＲ  Ｔ細胞における発現のためのタンパク質をコードする配列を含むコンストラクトは、ベクター内に含まれ得る。さまざまな実施態様では、ベクターはレトロウイルスベクターである。レンチウイルスなどのレトロウイルスは、遺伝子又は目的のキメラ遺伝子をコードする核酸配列の送達のための簡便なプラットフォームを提供する。選択された核酸配列は、ベクター中に挿入され、当該技術分野で知られている技術を使用してレトロウイルス粒子中にパッケージされ得る。組み換えウイルスは、その後、単離され、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで細胞に送達され得る。レトロウイルス系は当該技術分野でよく知られており、例えば、米国特許第5,219,740号; Kurth and Bannert (2010) “Retroviruses: Molecular Biology, Genomics and Pathogenesis” Calster Academic Press (ISBN:978−1−90455−55−4);及びHu and Pathak Pharmacological Reviews 2000 52:493−512に記載されており、これらのそれぞれは、その全文が参照により本明細書に援用される。ＤＮＡの送達に効率的なレンチウイルス系は、ＯｒｉＧｅｎｅ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから購入することができる。さまざまな実施態様では、タンパク質は、当該技術分野で知られているベクター及び方法を使用してタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターのトランスフェクション又はエレクトロポレーションにより、Ｔ細胞又はＮＫ細胞中に発現される。いくつかの実施態様では、ベクターはウイルスベクター又は非ウイルスベクターである。いくつかの実施態様では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター（例えばレンチウイルスベクター）、アデノウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルスベクターである。代替的な実施態様では、本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲのいずれかのＣＡＲポリペプチドは、ＣＡＲをコードする核酸を含む発現ベクターのトランスフェクション又はエレクトロポレーションを介して哺乳動物細胞中に発現される。トランスフェクション又はエレクトロポレーション法は、当該技術分野で知られている。
【０１０５】
本明細書に記載されるような免疫細胞における二重特異性ＣＡＲポリペプチドの効率的な発現は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、又はタンパク質をコードする核酸の遺伝子産物を検出する標準的なアッセイを使用して評価され得る。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ＦＡＣＳ、ノーザンブロット法、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、又は免疫組織化学が使用され得る。本明細書に記載されるタンパク質は、構成的に発現され得るか又は誘導的に発現され得る。いくつかの例では、タンパク質は、組み換え核酸配列によりコードされる。一実施態様では、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドは、構成定に発現される。一実施態様では、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドは、組み換え核酸配列によりコードされる。
【０１０６】
本発明は、本明細書に記載されるように、ＣＤ３７及びＣＤ１９に特異的に結合する配列を含む細胞外ドメインを含む二重特異性ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む組成物も提供される。
【０１０７】
例えば、本発明は、配列番号６、７、１５、１６、１７、１８、１９又は２０のＣＡＲポリペプチド、又は配列番号６、７、１５、１６、１７、１８、１９又は２０の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含むＣＡＲポリペプチドをコードすることができる核酸を提供する。
【０１０８】
免疫細胞
本技術の一態様は、本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲポリペプチドのいずれか（例えば配列番号１５、１６、１９、又は２０）；又は本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲポリペプチドのいずれかをコードする核酸を含む免疫細胞に関する。一実施態様では、免疫細胞は、抗体、抗体試薬、その抗原結合部分、若しくは本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲのいずれか、又はそのような抗体、抗体試薬、その抗原結合部分、若しくは本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲのいずれかをコードする核酸を含む。本明細書で使用される場合、「免疫細胞」は、免疫応答に役立つ細胞を指す。免疫細胞は、造血由来であり、リンパ球、例えばＢ細胞及びＴ細胞；ナチュラルキラー細胞；骨髄系細胞、例えば単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球を含む。免疫細胞は、Ｔ細胞；ＮＫ細胞；ＮＫＴ細胞；リンパ球、例えばＢ細胞及びＴ細胞；並びに骨髄系細胞、例えば、単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球であり得る。いくつかの実施態様では、免疫細胞はＴ細胞である。他の実施態様では、免疫細胞はＮＫ細胞である。
【０１０９】
本発明で使用することができる免疫細胞（例えば、ヒト免疫細胞）には、ｅｘ  ｖｉｖｏでの修飾及び増殖の後に、細胞が後に投与される対象から得られる自己細胞が含まれる。例えば、免疫細胞は、がん、自己免疫疾患、又は形質細胞障害を有するか又は有すると診断された個体から得ることができる。免疫細胞はまた、細胞の意図されたレシピエントと同じ種の非遺伝的に同一の個体である同種異系ドナーから得ることができる。本発明に有用な免疫細胞には、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。
【０１１０】
Ｔ細胞及びＮＫ細胞を得るための方法は、当該技術分野で知られており、本明細書に記載される工学操作された免疫細胞に有用であり得る。Ｔ細胞及びＮＫ細胞は、典型的には、例えば、静脈穿刺又は埋め込まれたポート若しくはカテーテルを通じた引き抜きによって対象から収集される末梢血から得られる。場合によっては、血液は、白血球アフェレーシスを含むプロセスによって得ることができ、このプロセスでは、対象の血液から白血球が得られ、他の血液成分は対象に戻される。血液又は白血球アフェレーシス製品（フレッシュ又は凍結保存）は、当該技術分野で知られる方法を使用してＴ細胞又はＮＫ細胞を濃縮するために処理される。密度勾配遠心分離（例えば、フィコールを使用）及び／又は向流遠心水簸を実施して、単核細胞（Ｔ細胞又はＮＫ細胞を含む）を濃縮することができる。一例では、Ｔ細胞については、Ｔ細胞を刺激するため及び他の細胞、例えばＢ細胞を枯渇させるために、電磁ビーズ上にコーティングされたＣＤ３／ＣＤ２８抗体、又は例えば細胞表面結合抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体断片（以下参照）を発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を用いるＴ細胞刺激工程がさらに行われ得る。その後、濃縮されたＴ細胞調製物のＴ細胞は遺伝子修飾に供され得る。
【０１１１】
末梢血の代わりに、骨髄、リンパ節、脾臓、及び腫瘍を含む組織をＴ細胞及びＮＫ細胞の供給源として使用することができる。Ｔ細胞及びＮＫ細胞は、ヒト、霊長類、ハムスター、ウサギ、げっ歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、八木、イヌ、又はネコ由来であり得るが、他の哺乳動物細胞が使用されてもよい。任意の態様のある実施態様では、Ｔ細胞及びＮＫ細胞はヒトである。
【０１１２】
免疫細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞は、本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲポリペプチドのいずれか（例えば配列番号１５、１６、１９、又は２０）；又は本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドのいずれかをコードする核酸を含むように工学操作され得る。いくつかの実施態様では、本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲポリペプチドのいずれかは、レンチウイルスベクターに含まれる。レンチウイルスベクターは、感染標準技術を使用して細胞中にＣＡＲポリペプチドを発現させるために使用される。いくつかの実施態様では、免疫細胞（例えばＴ細胞又はＮＫ細胞）は、ＣＤ３７を発現するがんを有する又は有すると診断された個体から得られる。いくつかの実施態様では、免疫細胞は、抗ＣＤ１９及び／又は抗ＣＤ２０療法に非応答性の個体及び／又は抗ＣＤ１９及び／又は抗ＣＤ２０療法を同時に受けている個体から得られる。
【０１１３】
治療法
本発明は、例えばがん、自己免疫疾患若しくは障害、又は形質細胞疾患若しくは障害を含む疾患又は状態の治療及び予防における使用のための方法及び組成物を提供する。これらの方法には、本明細書に記載されるような二重特異性ＣＡＲを含む免疫細胞（例えばＴ細胞又はＮＫ細胞）を使用すること、及び例えばがんを治療するために修飾された免疫細胞を対象に投与することが含まれる。本発明の態様のいずれかのある実施態様では、修飾された免疫細胞（例えば、本明細書に記載されるような一又は複数の追加の修飾を含むＴ細胞又はＮＫ細胞）は、対象への投与前に刺激及び／又は活性化される。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「状態」には、がん、感染症、自己免疫疾患若しくは障害、形質細胞疾患若しくは障害、又は移植に関連する状態が含まれる。疾患又は状態を有する対象は、疾患又は状態を診断する現在の方法を使用して医師により同定される。これらの状態を特徴づけ、診断を助ける疾患又は状態の症状及び／又は合併症は、当該技術分野でよく知られており、疲労、持続性感染症、及び持続性出血が含まれるが、これらに限定されない。例えば疾患又は状態の診断を助けることができる検査には、限定されないが、血液スクリーニング及び骨髄検査が含まれ、所与の状態について当該技術分野で知られている。疾患若しくは状態の家族歴、又は疾患若しくは状態のリスクファクターへの曝露はまた、対象が疾患若しくは状態を有する可能性が高いかどうかを決定すること、又は疾患若しくは状態の診断を行うことを助けることができる。
【０１１５】
本明細書で使用される場合の「がん」は、その独特の特徴、正常な細胞制御の喪失が無秩序な成長、分化の欠如、局所組織浸潤、及び転移をもたらす細胞の過剰増殖を指すことがあり、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、又は固形腫瘍であり得る。白血病の非限定的な例には、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、及び慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）が含まれる。一実施態様では、白血病はＣＬＬである。リンパ腫の非限定的な例には、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、及び未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）が含まれる。一実施態様では、がんは、ＭＣＬ、ＤＬＢＣＬ、ＦＬ、バーキットリンパ腫、ＰＴＣＬ、ＣＴＣＬ、ＡＩＴＬ、又はＡＬＣＬである。固形腫瘍の非限定的な例には、副腎皮質腫瘍、胞状軟部肉腫、癌種、軟骨肉腫、結腸直腸癌、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、卵黄嚢腫瘍、類上皮血管内皮腫、ユーイング肉腫、胚細胞腫瘍（固形腫瘍）、骨及び軟部組織の巨細胞腫、神経膠芽腫、肝芽腫、肝細胞癌、メラノーマ、腎腫瘍、神経芽細胞腫、非横紋筋肉腫軟部肉腫（ＮＲＳＴＳ）、骨肉腫、傍脊椎肉腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、及びウィルムス腫瘍が含まれる。固形腫瘍は、骨、筋肉、又は臓器に見出すことができ、肉腫又は癌種であり得る。本明細書に記載の技術の任意の態様が、本願中に列挙されないがんを含むがんのあらゆるタイプを治療するのに使用され得ると考察される。本明細書で使用される場合、用語「腫瘍」は、例えば悪性タイプ又は良性タイプの細胞又は組織の異常な増殖を指す。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「自己免疫疾患」又は「自己免疫障害」は、自身の免疫系が外来細胞と正常細胞とを識別できないことによって特徴づけられる。この結果、自身の免疫系がプログラム細胞死として自身の正常細胞を標的にする。自己免疫疾患又は障害の非限定的な例には、炎症性関節炎、１型糖尿病、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸疾患、ＳＬＥ、及び血管炎、アレルギー性炎症、例えば、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、及び接触過敏症が含まれる。自己免疫関連疾患又は障害の他の例には、限定されると解釈されるべきではないが、関節リウマチ、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス、グレーブス病（過活動性甲状腺）、橋本甲状腺炎（低活動性甲状腺）、セリアック病、クローン病及び潰瘍性大腸炎、ギラン・バレー症候群、原発性胆汁性硬化症／硬変症、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、レイノー現象、強皮症、シェーグレン症状群、グッドパスツール病、ウェゲナー肉芽腫症、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、慢性疲労症状群ＣＦＳ）、乾癬、自己免疫性アジソン病、強直性脊椎炎、急性散在性脳脊髄炎、抗リン脂質抗体症状群、再生不良性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、眼球クローヌス・ミオクローヌス症状群、視神経炎、オード甲状腺炎、天疱瘡、悪性貧血、イヌにおける多発性関節炎、ライター症状群、高安動脈炎、温式自己免疫性溶血性貧血、ウェゲナー肉芽腫症及び線維筋痛症（ＦＭ）が含まれる。
【０１１７】
形質細胞は、感染と戦うために必要な抗体を産生及び放出するように機能するＢリンパ球から産生する白血球である。本明細書で使用される場合、「形質細胞障害又は疾患」は、形質細胞の異常な増殖によって特徴づけられる。異常な形質細胞は、正常な形質細胞を「押し出す」能力があり、それにより外来性対象、例えばウイルス又は細菌細胞と戦う能力の低下をもたらす。形質細胞障害の非限定的な例には、アミロイドーシス、ワルデンストレームマクログロブリン血症、骨硬化性骨髄腫（ＰＯＥＭＳ症状群）、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）、及び形質細胞骨髄腫が含まれる。
【０１１８】
レンチウイルスなどのレトロウイルスは、遺伝子又は目的のキメラ遺伝子をコードする核酸配列の送達のための簡便なプラットフォームを提供する。選択された核酸配列は、ベクター中に挿入され、当該技術分野で知られている技術を使用してレトロウイルス粒子中にパッケージされ得る。組み換えウイルスは、その後、単離され、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで細胞に送達され得る。レトロウイルス系は当該技術分野でよく知られており、例えば、米国特許第5,219,740号; Kurth and Bannert (2010) “Retroviruses: Molecular Biology, Genomics and Pathogenesis』 Calster Academic Press (ISBN:978−1−90455−55−4);及びHu et al., Pharmacological Reviews 52:493−512, 2000に記載されており、これらのそれぞれは、その全文が参照により本明細書に援用される。ＤＮＡの送達に効率的なレンチウイルス系は、ＯｒｉＧｅｎｅ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから購入することができる。
【０１１９】
本明細書に記載される技術の一態様は、それを必要とする患者に置けるがんを治療する方法に関し、該方法は、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドのいずれかを含む哺乳動物細胞のいずれかの細胞を投与することを含む。
【０１２０】
分化クラスター（ＣＤ）分子は、白血球に存在する細胞表面マーカーである。白血球が分化して成熟すると、そのＣＤプロファイルは変化する。白血球ががん細胞（すなわちリンパ腫）に変わる場合、そのＣＤプロファイルは疾患の診断に重要である。特定の種類のがんの治療及び予後は、がん細胞のＣＤプロファイルの決定に依存している。「Ｘ」がＣＤマーカーである「ＣＤＸ＋」とは、ＣＤマーカーががん細胞に存在することを示し、「ＣＤＸ−」は、マーカーが存在しないことを示す。当業者は、標準的な技術を用いてて、例えばＣＤ分子に結合した市販の抗体を検出するための免疫蛍光法を用いて、がん細胞に存在するＣＤ分子を評価することができる。
【０１２１】
いくつかの実施態様では、がんは、一又は複数のＣＤ分子を発現する。本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲは、ＣＤ３７を発現するがんを治療するのに使用することができる。いくつかの実施態様では、ＣＤ３７＋がんはリンパ種又は白血病である。例えば、リンパ腫は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（例えば、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、又はバーキットリンパ腫）、又はＴ細胞リンパ腫（例えば、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、又は未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ））である。別の例では、白血病は慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）である。
【０１２２】
さらに、がん細胞は、治療に応答して進化し、前記治療を回避するためにそのＣＤプロファイルを変化させることができる。例えば、ＣＤ１９＋白血病又はリンパ腫を有する患者は、抗ＣＤ１９療法で治療することができる。治療後、がん細胞は再発するか、又は治療後に再発し、ＣＤ１９マーカーを発現しなくなり、ＣＤ１９白血病又はリンパ腫を引き起こす。結果として、がんは、もはや抗ＣＤ１９療法によって標的可能ではなくなる。
【０１２３】
抗ＣＤ１９及び／又は抗ＣＤ２０療法に非応答性であるか又は難治性である対象におけるがんを治療するための本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲ（例えばＣＤ３７及びＣＤ１９を標的とするＣＡＲ）を含む免疫細胞を使用する方法も提供される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲ（例えば、ＣＤ３７及びＣＤ１９を標的とするＣＡＲ）を含む免疫細胞は、ＣＤ１９−及び／又はＣＤ２０−であるがんを有する対象においてがんを治療するのに使用される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲ（例えば、ＣＤ３７及びＣＤ１９を標的とするＣＡＲ）を含む免疫細胞は、再発しているか又はＣＤ１９若しくはＣＤ２０をもはや発現しないがんを有する対象においてがんを治療するのに使用される。
【０１２４】
さらに、本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲ（例えばＣＤ３７及びＣＤ１９を標的とするＣＡＲ）を含む免疫細胞は、それを必要とする対象においてがんを治療するのに使用することができ、ここで、対象は、抗ＣＤ１９及び／又は抗ＣＤ２０療法を同時に投与される。
【０１２５】
本発明の態様のいずれかのある実施態様では、二重特異性ＣＡＲを含む免疫細胞（例えばＴ細胞又はＮＫ細胞）は、対象への投与前に刺激及び／又は活性化される。
【０１２６】
投与
いくつかの実施態様では、本明細書に記載される方法は、がん、形質細胞疾患若しくは障害、又は自己免疫疾患若しくは障害を有するか又は有すると診断された対象を、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドのいずれか、又は本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドのいずれかをコードする核酸を含む哺乳動物細胞を用いて治療することに関連する。本明細書で使用される場合の二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞は、記載されるような二重特異性ＣＡＲポリペプチドのいずれか、又は二重特異性ＣＡＲポリペプチドのいずれかをコードする核酸を含む哺乳動物Ｔ又はＮＫ細胞を指す。
【０１２７】
本明細書に記載される組成物は、状態を有するか又は有すると診断された対象に投与され得る。いくつかの実施態様では、本明細書に記載される方法は、状態の症状を軽減するために本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞の有効量を対象に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「状態の症状を軽減すること」は、任意の状態又は状態に関連する症状を改善することである。同等の未治療のコントロールと比較して、そのような減少は、任意の標準的な技術により測定した場合、少なくとも５％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、９９％又はそれ以上である。本明細書に記載される組成物を対象に投与するためのさまざまな手段は、当業者に知られている。一実施態様では、本明細書に記載される組成物は、全身的に又は局所的に投与される。好ましい実施態様では、本明細書に記載される組成物は、静脈内投与される。別の実施態様では、本明細書に記載される組成物は、腫瘍部位に投与される。
【０１２８】
本明細書で使用される場合の用語「有効量」は、疾患又は障害の一又は複数の症状を軽減するのに必要とされる二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞の量を指し、所望の効果を提供するのに十分な量の細胞調製物又は組成物に関する。したがって、用語「治療的有効量」は、典型的な対象に投与されたときに、状態に対抗する特定の効果を提供するのに十分であるＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞の量を指す。本明細書で使用される場合の有効量には、さまざまな文脈において、疾患の症状の発症を遅らせる、疾患の症状の経過を変更する（例えば、状態の進行を遅らせる）、又は状態の症状を逆転させるのに十分な量も含まれる。よって、正確な「有効量」を指定することは、通常、実用的ではない。しかしながら、任意の所与の場合について、適切な「有効量」は、常套的な実験のみを使用して当業者により決定され得る。
【０１２９】
有効量、毒性、及び治療効果は、細胞培養物又は実験動物における標準的な製薬手順によって評価され得る。用法は、用いられる投与形態及び利用される投与経路に応じてさまざまであり得る。毒性作用と治療効果の用量比が治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。大きな治療指数を示す組成物及び方法が好ましい。治療的に有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。また、用量は、細胞培養又は動物モデルで決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大半減阻害を達成する二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するよう、動物モデルで処方され得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。特定の投薬量の効果は、適切なバイオアッセイ、例えば、とりわけ骨髄試験のためのアッセイでモニターされ得る。投薬量は、医師により決定され、必要に応じて、観察される治療効果に適するように調整され得る。
【０１３０】
本技術の一態様では、本明細書に記載される技術は、本明細書に記載されるような二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞、及び任意選択的に薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。薬学的組成物の活性成分は、本明細書に記載されるような二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞を少なくとも含む。いくつかの実施態様では薬学的組成物の活性成分は、本明細書に記載されるような二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞から本質的になる。いくつかの実施態様では薬学的組成物の活性成分は、本明細書に記載されるような二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞からなる。細胞ベースの治療製剤用の薬学的に許容される担体には、生理食塩水及び水性バッファー、リンゲル液、並びに血清アルブミン、ＨＤＬ及びＬＤＬなどの血清成分が含まれる。「添加剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」などのような用語は、本明細書で互換的に使用される。
【０１３１】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載されるような二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞を含む薬学的組成物は、非経口投与形態であり得る。非経口投与形態の投与は、通常、汚染物質に対する患者の自然防御を回避するため、二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞自体以外の成分は、好ましくは無菌であるか、又は患者に投与する前に滅菌することができる。非経口投与形態の例には、限定されないが、注射の準備ができている溶液、注射用の薬学的に許容されるビヒクルに溶解又は懸濁する準備ができている乾燥製品、注射の準備ができている懸濁液、及びエマルションが含まれる。これらはいずれも、投与前に二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞調製物に添加され得る。
【０１３２】
開示されるような二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞の非経口投与形態を提供するために使用することができる適切なビヒクルは、当業者によく知られている。その例には、限定されないが、生理食塩水；グルコース溶液；塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、デキストロース注射、デキストロース及び塩化ナトリウム注射、及び乳酸リンゲル注射を含むがこれらに限定されない水性ビヒクル；エチルアルコール、ポリエチレングリコール、及びプロピレングリコールなどであるがこれらに限定されない水混和性ビヒクル；コーン油、綿実油、落花生油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、及び安息香酸ベンジルなどの非水性ビヒクルが含まれる。
【０１３３】
投与量
本明細書で使用される場合、「単位投与形態」は、適切な１回の投与のための投与量を指す。例として、単位投与形態は、シリンジ又は点滴用バッグなどの送達デバイスに配置される治療剤の量であり得る。一実施態様では、単位投与形態は、単回投与で投与される。別の実施態様では、一を超える単位投与形態が同時に投与され得る。
【０１３４】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞は、単剤療法として投与される。すなわち、その状態に対する別の治療は、対象に同時に投与されない。
【０１３５】
本明細書に記載されるＴ又はＮＫ細胞を含む薬学的組成物は、通常、体重１ｋｇあたり１０４から１０９細胞の投与量で、いくつかの例では体重１ｋｇあたり１０５から１０６細胞の投与量で投与されてよく、それらの範囲内のすべての整数値が含まれる。必要に応じて、Ｔ又はＮＫ細胞組成物は、これらの投与量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法で一般的に知られている注入技術を使用して投与することができる（例えばRosenberg et al., New Eng. J. Med. 319:1676, 1988を参照）。
【０１３６】
ある態様では、二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞を対象に投与し、その後続いて、血液を再採取し（又はアフェレーシスを実施し）、本明細書に記載されているようにそこからＴ細胞又はＮＫ細胞を活性化し、これらの活性化及び増殖したＴ細胞又はＮＫ細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間ごとに複数回行われ得る。ある態様では、Ｔ又はＮＫ細胞は、１０ｃｃから４００ｃｃの血液採取から活性化され得る。ある態様では、Ｔ又はＮＫ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、又は１００ｃｃの血液採取から活性化される。
【０１３７】
投与様式には、例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）注射又は注入が含まれ得る。本明細書に記載される組成物は、経動脈で、腫瘍内で、結節内で、又は髄内で患者に投与され得る。いくつかの実施態様では、Ｔ又はＮＫ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、又は感染部位に直接注射され得る。一実施態様では、本明細書に記載される組成物は、体腔又は体液（例えば、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）、胸膜液、腹水（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｆｌｕｉｄ）、若しくは脳脊髄液）に投与される。
【０１３８】
特定の例示的な態様では、対象は白血球アフェレーシスに供されてもよく、ここで、白血球はｅｘ  ｖｉｖｏで回収、濃縮、又は枯渇されて、目的の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞を選択及び／又は単離する。これらの免疫細胞分離株は、例えば、Ｔ細胞の場合、本明細書に記載されるａＡＰＣ、例えば抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ３  ＣＤＲを発現するａＡＰＣとの接触によって増殖することができ、本技術の一又は複数のＣＡＲコンストラクトが導入され、それによりＣＡＲ  Ｔ細胞が作成されるように治療することができる。それを必要とする対象は、続いて、高用量化学療法とそれに続く末梢血幹細胞移植による標準治療に供され得る。移植後又は移植と同時に、対象は増殖したＣＡＲ  Ｔ細胞又はＮＫ細胞の注入を受けることができる。一実施態様では、増殖した細胞は、手術の前又は後に投与される。
【０１３９】
いくつかの実施態様では、リンパ球枯渇は、本明細書に記載されるような一又は複数のＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞を投与する前に対象に対して実施される。そのような実施態様では、リンパ球枯渇は、一又は複数のメルファラン、シトキサン、シクロホスファミド、及びフルダラビンを投与することを含み得る。
【０１４０】
患者に投与される上記の治療の投与量は、治療される状態の正確な性質及び治療のレシピエントによって異なることになる。ヒト投与のための投与量のスケーリングは、当該技術分野で認められた慣行に従って実施することができる。
【０１４１】
いくつかの実施態様では、単一の治療レジメンが必要とされる。一又は複数のその後の用量又は治療レジメンの投与が実施され得る。たとえば、隔週で３ヶ月間治療した後、１ヶ月に１回、６ヶ月又は１年以上治療を繰り返され得る。いくつかの実施態様では、最初の治療後に追加の治療は投与されない。
【０１４２】
本明細書に記載されるような組成物の投薬量は、医師により決定され、必要に応じて、観察される治療効果に適するように調整され得る。治療の持続期間及び頻度に関して、熟練した臨床医は、治療が治療効果をもたらす時期を決定し、さらに細胞を投与するか、治療を中止するか、治療を再開するか、又は治療計画に他の変更を加えるかを決定するために、対象をモニターするのが一般的である。投与量は、サイトカイン放出症状群などの有害な副作用を引き起こすほど多くてはならない。通常、投与量は、患者の年齢、状態、及び性別に応じてさまざまであり、当業者によって決定されうる。投与量は、合併症が発生した場合に個々の医師によって調整することもできる。
【０１４３】
併用療法
本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞は、他の既知の薬剤及び療法と組み合わせて使用することができる。例えば、対象は、抗ＣＤ１９療法及び／又は抗ＣＤ２０療法をさらに投与され得る。一実施態様では、対象は、抗ＣＤ１９療法及び／又は抗ＣＤ２０療法に耐性がある。別の態様では、対象は、抗ＣＤ１９療法及び／又は抗ＣＤ２０療法を同時に投与される。
【０１４４】
本明細書で使用される場合の「組み合わせて」投与されるとは、対象が障害に苦しんでいる過程で二つ（又はそれ以上）の異なる治療が対象に送達されることを意味し、例えば、対象が障害を有すると診断された後及び障害が治癒若しくは排除される前又は他の理由で治療が中止された後に二つ以上の治療が送達される。いくつかの実施態様では、第２の治療剤の送達が開始されるとき、一つの治療剤の送達はまだ行われているため、投与に関して重複がある。これは、本明細書では、「同時に起こる（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）」又は「同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）」送達と呼ばれることがある。他の実施態様では、他の治療剤の送達が開始される前に一つの治療剤の送達が終了する。どちらの場合の実施態様でも、組み合わせ投与により、治療剤はより効果的である。例えば、第２の治療剤はより効果的である。例えば、第１の治療剤が存在せずに第２の治療剤が投与される場合に見られるよりも、少ない第２の治療剤で同等の効果が見られるか、又は第２の治療剤は症状を大幅に減少させるか、又は、同様の状況が第１の治療剤で見られる。いくつかの実施態様では、送達は、症状の減少、又は障害に関する他のパラメータが、他方の治療剤が存在せずに送達された一方の治療剤で観察されるであろうよりも大きいようなものである。二つの治療剤の効果は、部分的に相加的、完全に相加的、又は相加的以上である場合がある。送達は、送達された第１の治療剤の効果が、第２の治療剤が送達されるときに依然として検出可能であるようなものであり得る。本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞及び少なくとも一つの追加の治療剤は、同時に、同じ若しくは異なる組成物中で、又は逐次的に投与され得る。逐次投与について、本明細書に記載されるＣＡＲ発現免疫細胞は、第１に投与することができ、追加の薬剤を第２に投与することができるか、又は投与の順序は逆でもよい。二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ療法及び／又は他の治療剤、手順又はモダリティは、活動性障害の期間中、又は寛解若しくは活動性の低い疾患の期間中に投与され得る。ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ療法は、別の治療の前に、別の治療と同時に、別の治療の後に、又は障害の寛解中に投与され得る。
【０１４５】
組み合わせて投与されるとき、二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞及び追加の薬剤（例えば第２又は第３の薬剤）、又はそのすべては、個別に、例えば単剤療法として使用されるそれぞれの薬剤の量又は投与量よりも多い、それよりも少ない又はそれと同じ量又は投与量で投与され得る。ある実施態様では、二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞、追加の薬剤（例えば第２又は第３の薬剤）、又はそのすべての投与される量又は投与量は、個別の使用されるそれぞれの薬剤の量又は投与量よりも（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％）少ない。他の実施態様では、所望の効果（例えばがんの治療）をもたらす二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞、追加の薬剤（例えば第２又は第３の薬剤）、又はそのすべての量又は投与量は、同じ治療効果を達成するのに個別に必要なそれぞれの薬剤の量又は投与量よりも少ない（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％少ない）。さらなる実施態様では、本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞は、手術、化学療法、放射線療法、ｍＴＯＲ経路阻害剤、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、及びＦＫ５０６、抗体、又は他の免疫除去剤、例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体又は他の抗体療法、サイトキシン、フルダラビン、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、又はペプチドワクチン、例えばIzumoto et al., J. Neurosurg. 108:963− 971, 2008に記載されているものと組み合わせて治療レジメンで使用することができる。
【０１４６】
例えば、本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞は、抗ＣＤ１９療法と組み合わせて使用することができる。抗ＣＤ１９療法の例には、限定されないが、ブリナツモマブ、コルツキシマブラブタンシン、ＭＯＲ２０８、ＭＥＤＩ−５５１、デニンツズマブマホドチン、タプリツモマバパプトックス、ＸｍＡｂ  ５８７１、ＭＤＸ−１３４２、ＡＦＭ１１、ＤＩ−Ｂ４、アキシカブタゲンシロロイセル、及びチサゲンレクロイセルが含まれる。さらに、本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞は、抗ＣＤ２０療法と組み合わせて使用することができる。抗ＣＤ２０療法の例には、限定されないが、リツキシマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、イブリツモマブ、チウキセタン、トシツモマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、ＩＭＭＵ−１０６、及びＧＡ−１０１が含まれる。
【０１４７】
さらなる実施態様では、本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞は、チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用することができる。例示的なチェックポイント阻害剤には、抗ＰＤ−１阻害剤（ニボルマブ、ＭＫ−３４７５、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、ＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ−５１４）、抗ＣＴＬＡ−４阻害剤（イピリムマブ及びトレメリムマブ）、抗ＰＤ−Ｌ１阻害剤（アテゾリズマブ、アベルマブ（ａｖｅｌｏｍａｂ）、デュルバルマブ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＭＥＤＩ４７３６及びＭＰＤＬ３２８０Ａ）、及び抗ＴＩＭ３阻害剤が含まれる。
【０１４８】
さらなる実施態様では、本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞は、化学療法剤と組み合わせて使用することができる。例示的な化学療法剤には、アントラサイクリン（例えばドキソルビシン（例えばリポソームドキソルビシン））、ビンカアルカロイド（例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、アルキル化剤（例、シクロホスファミド、デカルバジン、メルファラン、イホスファミド、テモゾロミド）、免疫細胞抗体（例えばアレムツザマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、トシツモマブ）、代謝拮抗剤（例えば葉酸拮抗薬、ピリミジン類似体、プリン類似体及びアデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えば、フルダラビン）を含む）、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦＲグルココルチコイド誘発性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）アゴニスト、プロテアソーム阻害剤（例えばアクラシノマイシンＡ、グリオトキシン又はボルテゾミブ）、サリドマイド又はサリドマイド誘導体（例えばレナリドマイド）などの免疫調節剤が含まれる。併用療法での使用が考慮される一般的な化学療法剤には、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標））、ブレオマイシンサルフェート（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、ブスルファン注射（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標））、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）又はＮｅｏｓａｒ（登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（登録商標））、シタラビンリポソーム注射（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））、ダクチノマイシン（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ、Ｃｏｓｍｅｇａｎ）、ダウノルビシン塩酸塩（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、ダウノルビシンシトレートリポソーム注射（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、デキサメタゾン、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、ドキソルビシン塩酸塩（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、エトポシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、フルダラビンホスフェート（Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標））、５−フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標））、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、テザシチビン、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシウレア（Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））、イブルチニブ、（ＩＭＢＲＵＶＩＣＡ（登録商標））、イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標））、イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、Ｌ−アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商��））、６−メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標））、メトトレキサート（Ｆｏｌｅｘ（登録商標））、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、マイロターグ、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、フェニックス（イットリウム９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、カルムスチンインプラントを含むポリフェプロサン２０（Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標））、タモキシフェンシトレート（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））、テニポシド（Ｖｕｍｏｎ（登録商標））、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（Ｔｉｒａｚｏｎｅ（登録商標））、注射用のトポテカン塩酸塩（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ（登録商標））、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、及びビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））が含まれる。例示的なアルキル化剤には、限定されないが、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレア及びトリアゼン）：ウラシルマスタード（Ａｍｉｎｏｕｒａｃｉｌ  Ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎａｃｉｌ（登録商標）、Ｄｅｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｈａｅｍａｎｔｈａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｎｏｒｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｌｏｓｔ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｍｏｓｔａｚａ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ（登録商標））、クロルメチン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｃｌａｆｅｎ（登録商標）、Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、ＲｅｖｉｍｍｕｎｅＴＭ）、イホスファミド（Ｍｉｔｏｘａｎａ（登録商標））、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、ピポブロマン（Ａｍｅｄｅｌ（登録商標）、Ｖｅｒｃｙｔｅ（登録商標））、トリエチレンメラミン（Ｈｅｍｅｌ（登録商標）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）、Ｈｅｘａｓｔａｔ（登録商標））、トリエチレンチオホスホラミン、テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標））、チオテパ（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標））、ブスルファン（Ｂｕｓｉｌｖｅｘ（登録商標）、Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、ロムスチン（ＣｅｅＮＵ（登録商標））、ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））、及びダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））が含まれる。追加の例示的なアルキル化剤には、限定されないが、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標））；テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）及びＴｅｍｏｄａｌ（登録商標））；ダクチノマイシン（アクチノマイシン−Ｄとしても知られる。Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（登録商標））；メルファラン（Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシン、及びフェニルアラニンマスタードとしても知られる。Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）としても知ら��る。Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標））；カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））；ベンダムスチン（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））；ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標）及びＭｙｌｅｒａｎ（登録商標））；カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））；ロムスチン（ＣＣＮＵとしても知られる。ＣｅｅＮＵ（登録商標））；シスプラチン（ＣＤＤＰとしても知られる。Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）及びＰｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）−ＡＱ）；クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））；シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）及びＮｅｏｓａｒ（登録商標））；ダカルバジン（ＤＴＩＣ、ＤＩＣ及びイミダゾールカルボキサミドとしても知られる。ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）としても知られる。Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標））；イホスファミド（Ｉｆｅｘ（登録商標））；プレドヌムスチン（Ｐｒｅｄｎｕｍｕｓｔｉｎｅ）；プロカルバジン（Ｍａｔｕｌａｎｅ（登録商標））；メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード、ムスチン及びメクロエタミン塩酸塩としても知られる。Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標））；ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））；チオテパ（チオホスホアミド、ＴＥＳＰＡ及びＴＳＰＡとしても知られる。Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標））；シクロホスファミド（Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（登録商標））；及びベンダムスチンＨＣ１（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））が含まれる。例示的なｍＴＯＲ阻害剤には、例えば、テムシロリムス；リダホロリムス（以前はデフェロリムス、（ｌＲ，２Ｒ，４５）−４−［（２Ｒ）−２  ［（１Ｒ，９５，１２５，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３５，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０５，３２５，３５Ｒ）−ｌ，１８−ジヒドロキシ−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３、２９，３５−ヘキサメチル−２，３，１０，１４，２０−ペンタオキソ−ｌ  ｌ，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０４’９］  ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−１２−イル］プロピル］−２−メトキシシクロヘキシル  ジメチルホスフィネートとして知られており、ＡＰ２３５７３及びＭＫ８６６９としても知られ、ＰＣＴ出願国際公開第０３／０６４３８３号に記載されている）；エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）又はＲＡＤＯＯｌ）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９、Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ（登録商標））；シマピモド（ｓｉｍａｐｉｍｏｄ）（ＣＡＳ  １６４３０１−５１−３）；エムシロリムス、（５−｛２，４−ビス［（３５，）−３−メチルモルホリン−４−イル］ピリド［２，３−（ｉ］ピリミジン−７−イル｝−２−メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２−アミノ−８−［ｉｒａｗ５，−４−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４−メチル−ピリド［２，３−ＪＪピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ  １０１３１０１−３６−４）；及びＮ��−［ｌ，４−ジオキソ−４−［［４−（４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−ｌ−ベンゾピラン−２−イル）モルホリニウム−４−イル］メトキシ］ブチル］−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−ａ−アスパルチルＬ−セリン−、内塩（ＳＦ１１２６、ＣＡＳ  ９３６４８７−６７−１）、及びＸＬ７６５が含まれる。
例示的な免疫調節剤には、例えば、アフツズマブ（Ｒｏｃｈｅ（登録商標）から入手可能）；ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））；レナリドミド（ＣＣ−５０１３、Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（登録商標））；サリドマイド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標））、アクチミド（ＣＣ４０４７）；及びＩＲＸ−２（インターロイキン１、インターロイキン２、及びインターフェロンγを含むヒトサイトカインの混合物、ＣＡＳ  ９５１２０９−７１−５、ＩＲＸ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから入手可能）含まれる。例示的なアントラサイクリンの例には、例えば、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）及びＲｕｂｅｘ（登録商標））；ブレオマイシン（ｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））；ダウノルビシン（ダウノルビシン塩酸塩、ダウノマイシン、及びルビドマイシン塩酸塩、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））；ダウノルビシンリポソーム（ダウノルビシンシトレートリポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））；ミトキサントロン（ＤＨＡＤ、ＮｏｖａｎｔｒｏｎＴＭ）；イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｉｄａｍｙｃｉｎ  ＰＦＳ（登録商標））；ミトマイシンＣ（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標））；ゲルダナマイシン；ヘルビマイシン；ラビドマイシン；及びデスアセチルラビドマイシンが含まれる。例示的なビンカアルカノイドには、例えば、ビノレルビン酒石酸塩（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、及びビンデシン（Ｅｌｄｉｓｉｎｅ（登録商標）））；ビンブラスチン（ビンブラスチンサルフェート、ビンカロイコブラスチン及びＶＬＢとしても知られる。Ａｌｋａｂａｎ−ＡＱ（登録商標）及びＶｅｌｂａｎ（登録商標））；及びビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））が含まれる。例示的なプロテオソーム阻害剤には、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））；カルフィルゾミブ（ＰＸ−１７１−００７，（５）−４−メチル−Ｎ−（（５）−ｌ−（（（５）−４−メチル−ｌ−（（Ｒ）−２−メチルオキシラン−２−イル）−ｌ−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−ｌ−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）−２−（（５，）−２−（２−モルホリノアセトアミド）−４−フェニルブタンアミド）−ペンタンアミド）；マリゾミブ（ＮＰＴ００５２）；イキサゾミブシトレート（ＭＬＮ−９７０８）；デランゾミブ（ＣＥＰ−１８７７０）；及びＯ−メチル−Ｎ−［（２−メチル−５−チアゾリル）カルボニル］−Ｌ−セリル−Ｏ−メチル−Ｎ−［（ｌｌＳ’）−２−［（２Ｒ）−２−メチル−２−オキシラニル］−２−オキソ−ｌ−（フェニルメチル）エチル］−Ｌ−セリンアミド（ＯＮＸ−０９１２）が含まれる。
【０１４９】
当業者は、使用される化学療法剤を容易に同定することができる（例えば、Physicians’ Cancer Chemotherapy Drug Manual 2014, Edward Chu, Vincent T. DeVita Jr., Jones & Bartlett Learning; Principles of Cancer Therapy, Chapter 85 in Harrison’s Principles of Internal Medicine, 18thedition; Therapeutic Targeting of Cancer Cells: Era of Molecularly Targeted Agents and Cancer Pharmacology, Chs. 28−29 in Abeloff’s Clinical Oncology, 2013 Elsevier; and Fischer D S (ed): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby−Year Book, 2003を参照）。
【０１５０】
一実施態様では、本明細書に記載される二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞は、ＧＩＴＲを標的とする及び／又はＧＩＴＲ機能を調節する分子のレベル及び／又は活性を低下させる分子、Ｔｒｅｇ細胞集団を低下させる分子、ｍＴＯＲ阻害剤、ＧＩＴＲアゴニスト、キナーゼ阻害剤、非受容体チロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、及び／又はＢＴＫ阻害剤と組み合わせて対象に投与される。
【０１５１】
有効性
例えば本明細書に記載される状態の治療における、又は本明細書に記載される応答（例えばがん細胞の減少）を誘発するための二重特異性ＣＡＲ  Ｔ又はＮＫ細胞の有効性は、熟練の臨床医により決定することができる。しかしながら、本明細書に記載される状態の徴候又は症状の一つ又は複数が有益な方法で変化した場合、他の臨床的に認められた症状が改善された場合、又は所望の応答が、例えば、本明細書に記載の方法による治療後少なくとも１０％誘導される場合、治療は、その用語が本明細書で使用される場合の「効果的な治療」と見なされる。有効性は、例えば、本明細書に記載される方法によって治療される状態のマーカー、指標、症状、及び／若しくは発生、又は適切な任意の他の測定可能なパラメータを測定することにより、評価することができる。本明細書に記載される方法による治療は、状態のマーカー又は症状のレベルを、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％又はそれ以上減少させることができる。
【０１５２】
有効性は、入院によって評価されるように個人が悪化しないこと、又は医学的介入（つまり、疾患進行が停止する）の必要性によって測定することもできる。これらの指標を測定する方法は当業者に知られており、本明細書に記載されている。
【０１５３】
治療には、個体又は動物（いくつかの非限定的な例にはヒト又は動物が含まれる）における疾患の治療が含まれ、（１）疾患を抑制すること、例えば、症状（例えば痛み又は炎症）の悪化を防止すること；又は（２）疾患の重症度を緩和すること、例えば症状の退縮を生じさせることが含まれる。疾患の治療の有効量は、それを必要とする対象に投与された場合、その用語が本明細書で定義されるように、その疾患に対して効果的な治療をもたらすのに十分な量を意味する。薬剤の有効性は、状態又は所望の反応の物理的指標を評価することによって決定することができる。そのようなパラメータのいずれか一つ、又はパラメータの任意の組み合わせを測定することによって、投与及び／又は治療の有効性をモニターすることは、当業者の能力の範囲内である。所与のアプローチの有効性は、本明細書に記載の状態の動物モデル、例えばがんの治療において評価することができる。実験動物モデルを使用するとき、治療の有効性は、マーカーの統計的に有意な変化が観察されたときに実証される。
【０１５４】
本出願全体で引用された、参照文献、発行済み特許、公開済み特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む、すべての特許並びにその他の刊行物は、例えば、本明細書に記載される技術に関連して使用され得るそのような刊行物に記載された方法を記載及び開示する目的で、参照により本明細書に明示的に援用される。これらの刊行物は、本出願の出願日より前の開示のためにのみ提供される。この点に関して、いずれも、発明者が先行技術により又はその他の理由によりそのような開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。これらの文書の日付に関するすべての記述又は内容に関する説明は、出願人が入手できる情報に基づいており、これらの文書の日付又は内容の正確性についての承認を構成するものではない。
【０１５５】
本開示の実施態様の記載は、網羅的であること又は本開示を開示された正確な形態に限定することを意図するものではない。本開示の特定の実施態様及び実施例は、例示の目的で本明細書に記載されているが、関連技術の当業者が認識するように、本開示の範囲内でさまざまな同等の修正が可能である。例えば、方法の工程又は機能は所与の順序で提示されているが、代替の実施態様は、異なる順序で機能を実施してもよく、又は機能は実質的に同時に実施されてもよい。本明細書で提供される開示の教示は、必要に応じて他の手順または方法に適用することができる。本明細書に記載されるさまざまな実施態様は、さらなる実施態様を提供するために組み合わせることができる。本開示の態様は、必要に応じて、上記の参考文献及び出願の組成物、機能、及び概念を使用して、本開示のさらにさらなる実施態様を提供するように修正することができる。さらに、生物学的機能同等性を考慮することにより、種類や量の生物学的又は化学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造にいくつかの変更を加えることができる。これら及びその他の変更を詳述な記載に照らして本開示に加えることができる。すべてのそのような修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【０１５６】
先述の実施態様のいずれかの特定の要素は、組み合わされ得るか又は他の実施態様の要素と置き換えられ得る。さらに、本開示の特定の実施態様に関連する利点は、これらの実施態様の文脈に記載されたが、他の実施態様もそのような利点を示す場合があり、すべての実施態様が、本開示の範囲内に入るために必ずしもそのような利点を示す必要はない。
【０１５７】
本明細書に記載される技術は、以下の実施例によってさらに示され、それらの実施例は、決してさらに限定的であると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１５８】
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。本明細書に提供された説明を前提として、他のさまざまな実施態様が実施され得ることが理解される。実施例１〜１１は、本明細書に記載される実験に使用される材料及び方法を提供し、実施例１２〜１９は、結果を実証し、実施例２０は配列表を提供する。
【０１５９】
実施例１  初代ヒトＴ細胞培養
初代Ｔリンパ球の増殖のために、バルクヒトＴ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して活性化させ（第０日）、続いて、２４時間後にＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを導入した。培養の第０日に開始して２０ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ−２を補充した培地中でＴ細胞を培養し、２−３日毎に測定して０．５×１０６／ｍＬの一定した細胞濃度で維持した。機能的アッセイについて、ＣＡＲ  Ｔ細胞を培養の第８−１０日に凍結保存し、解凍時にそれを抗原で直ちに刺激するか又はマウスに注射した。
【０１６０】
実施例２  細胞株及び培養条件
ＪＥＫＯ−１、ＲＡＪＩ及び野生型Ｋ５６２親細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。Ｋ５６２細胞を工学操作してＣＤ３７及びＣＤ１９を発現させた（Ｋ５６２−ＣＤ３７−ＣＤ１９）。いくつかのアッセイについて、細胞株を工学操作して、コメツキムシ緑色（ＣＢＧ）ルシフェラーゼ／高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）を構成的に発現させ、その後、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））でソートして≧９９％の純粋集団（ＣＢＧ−ＧＦＰ＋）を得た。１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン及びストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ培地中で細胞株を培養した。
【０１６１】
実施例３  フローサイトメトリー
以下の抗体を使用した：ＣＤ３７−ＡＰＣ（クローンＭＢ−１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標））、ＣＤ３７−ＢＶ７１１（クローンＭＢ−３７１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））、ＣＤ１９−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（クローンＨＩＢ１９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標））、ＣＤ１９−ＦＩＴＣ（クローン４Ｇ７、ＢＤ）、ＣＤ５−ＢＵＶ７３７（クローンＵＣＨＴ２、ＢＤ）、ＣＤ２０−ＡＰＣ  Ｃｙ７（クローン２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標））、ＣＤ７９ｂ−ＰＥ（クローンＣＢ３−１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標））、ＣＤ３−ＢＶ７８６（クローンＳＫ７、ＢＤ）、ＣＤ３−ＢＶ６０５（クローンＯＫＴ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標））、ＣＤ４５−ＰｅＣｙ７（クローンＨＩ３０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標））、ＣＤ１６−ＰＥ（クローンＢ７３．１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標））、ＣＤ１４−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（クローンＨＣＤ１４、Ｂｉｏｌｏｇｅｎｄ（登録商標））、ＣＤ５６−ＡＰＣ（クローンＨＣＤ５６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標））、ＣＤ３３−ＢＶ５１０（クローンＰ６７．６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標））、ＣＤ１０７ａ−ＡＦ７００（クローンＨ４Ａ３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））、ＣＤ６９−ＡＰＣ（クローンＦＮ５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標））、及びＩＦＮγ−ＦＩＴＣ（クローンＧＺ−４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標））。細胞を暗所において４℃で３０分間染色し、２％のＦＢＳを含むＰＢＳ中で２回洗浄した。取得前にＤＡＰＩを添加して、性細胞にゲートした。細胞あたりの抗体結合（ＡＢＣ）を使用して抗原密度を測定し、ＱｕａｎｔｕｍＴＭ  Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して計算した。
【０１６２】
実施例４  フラトリサイドアッセイ
無記名のヒト健康ドナーロイコパックから精製されたヒトＴ細胞をＣｅｌｌ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標）、カタログ番号００−４９７０−０３）で６時間活性化した。活性化Ｔ細胞及び非活性化Ｔ細胞を製造業者の指示に従ってＣＦＳＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標）、カタログ番号Ｃ３４５５４）で標識し、ＣＡＲ−３７、ＣＡＲ−１９又は同じ正常ドナーから産生された非導入Ｔ細胞と共培養した。２４時間後、フローサイトメトリーを使用して各条件におけるＣＦＳＥ陽性細胞の数を数えた。
【０１６３】
実施例５  免疫細胞の単離、分化、及び共培養アッセイ
３人の正常なドナーからのＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃ９８７Ｒ３６）を用いて単離し、単球をＳｔｅｍＣｅｌｌ（登録商標）キット（カタログ番号１９３５９）を用いて精製した。先述のように  ｉｎ  ｖｉｖｏでＭ１／Ｍ２マクロファージを産生した（Zhang et al., PLoS One. 11(4):e0153550, 2016）。単球、マクロファージ、ＮＫ細胞及びＴ細胞を、１：１のＥ：Ｔ比でＣＡＲ−３７  ＣＡＲ−１９又は非導入Ｔ細胞を用いて６時間培養し、ＣＤ１０７ａ及びＩＦＮγの産生をフローサイトメトリーにより測定した。ＰＭＡ／イオノマイシンをポジティブコントロールとして使用した。値を培地で正規化した。グラフは倍率変化を表す。
【０１６４】
実施例６  細胞傷害性及びサイトカインアッセイ
細胞傷害性アッセイについて、ＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター細胞を、示されている比で１６時間にわたってＣＢＧルシフェラーゼ発現腫瘍標的と共培養した。Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｎｅｏ２発光マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ（登録商標））を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。可溶性サイトカインの分析について、エフェクター細胞を１：１の比で２４時間にわたって腫瘍標的と共培養した。
【０１６５】
ＣＡＲ−３７及びＣＡＲ−１９  Ｔ細胞を、同じドナーからの非導入だが培養され活性化されたＴ細胞を添加することによりＣＡＲ発現について正規化し、各試料において同じ割合のＣＡＲ＋Ｔ細胞を得た。細胞傷害性アッセイについて、パーセント特異的溶解を以下の等式により計算した：％特異的溶解＝（全ＲＬＵ／標的細胞のみＲＬＵ）×１００。サイトカインアッセイについて、製造業者の指示に従ってＬｕｍｉｎｅｘアレイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ、ＦＬＥＸＭＡＰ  ３Ｄ（登録商標））を使用して、細胞非含有上清をサイトカイン発現について分析した。すべてのサンプルはテクニカルデュプリケートで測定した。デュプリケートは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７（バージョン７．０）を用いてグラフ化する前に平均化した。さらに、すべてのアッセイは、試験される固有の健康なドナーのＴ細胞の数に基づき、各実験においてＮで示されるような、バイオロジカルデュプリケート又はトリプリケートで実施した。
【０１６６】
実施例７  Ｊｕｒｋａｔレポーター活性化アッセイ
Ｊｕｒｋａｔ（ＮＦＡＴ−Ｌｕｃ）レポーター細胞（Ｓｉｇｎｏｓｉｓ、ＳＬ−００３２）に異なるＣＡＲコンストラクトを導入した。それらを１：１のＥ：Ｔ比で２４時間にわたってＢ細胞リンパ腫腫瘍細胞又はＮａｌｍ６白血病細胞と共培養した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズをポジティブコントロールとして、培地をネガティブコントロールとして使用した。Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｎｅｏ２発光マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ（登録商標））を用いてルシフェラーゼ活性を１６時間後に測定した。相対活性化をＰＭＡで計算した。
【０１６７】
実施例８  免疫組織化学
パラフィン切片をキシレンで脱パラフィンし、その後、一連のエタノール洗浄とそれに続くＨ２Ｏ洗浄で再水和した。ｐＨ  ６．０の０．０１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー中で１５分間スライドを電子レンジ加熱して抗原回復を実施した。０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）を含有するリン酸緩衝食塩水を用いて洗浄した後、内因性ペルオキシダーゼ活性を３％  Ｈ２Ｏ２で１０分間クエンチした。その後、スライドをＰＢＳ−Ｔで再度洗浄し、Ｎｏｖｏｌｉｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋを用いて２５℃で３０分間ブロックした。ＰＢＳ−Ｔを用いた追加の洗浄の後、１：１５０に希釈した５％  ヤギ血清及びマウス抗ＣＤ３７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、カタログ番号ＭＡ５−１５４９２）を含有するＰＢＳ−Ｔで、２５℃で１時間スライドをインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、スライドをＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｂｏｏｓｔ  ＩＨＣマウス検出試薬で２５℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで再度洗浄し、ＤＡＢ色素源を含有するＤＡＢ希釈剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）でインキュベートした。染色発生後、スライドをＰＢＳ−Ｔで再度洗浄し、ヘマトキシリンで対比染色した。
【０１６８】
実施例９  ＴＭＡ構造
末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）が関与するホルマリン固定パラフィン包埋組織をブリガム・アンド・ウィメンズ病院の病理学部（Department of Pathology at Brigham and Women’s Hospital）のアーカイブから回収した。ドナーブロックからのコア（直径０．６ｍｍ）を、レシピエントブロックに移して、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｃｏｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ／Ｈａｒｖａｒｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒで組織マイクロアレイを作成し、免疫組織化学的染色研究のための４ミクロンの切片を調製するために使用した。
【０１６９】
実施例１０  ｉｎ  ｖｉｖｏ研究
ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ鎖−／−（ＮＳＧ）（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（登録商標））に、記載される投与経路を介してＪＥＫＯ−１細胞株又は患者由来の腫瘍細胞を生着させた。腫瘍の生着が発光によって確認された後、凍結保存したＣＡＲ−３７、ＣＡＲ−１９、又は非導入Ｔ細胞を静脈内注射した。Ａｍｉスペクトルイメージング装置を使用して腫瘍量を定期的にモニターし、Ｄ−ルシフェリン基質溶液（３０ｍｇ／ｍＬ）の腹腔内注射後にＩＤＬソフトウェアｖ．  ４．３．１を用いて分析した。動物は、実験プロトコルに従って、又はＩＡＣＵＣによって定義された事前に指定されたエンドポイントに達したときに安楽死させた。
【０１７０】
実施例１１  統計解析
別途記載がない限り、等分散の正規データには、両側スチューデントのｔ検定又は２元配置分散分析を使用した。Ｐ＜０．０５の場合に有意性を考慮した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７（バージョン７．０）を用いて分析を実施した。
【０１７１】
実施例１２  ＣＡＲの構造及びＴ細胞培養導入
二つの抗ＣＤ３７  ＣＡＲコンストラクトを合成し、ヒトＥＦ−１αプロモーターの制限下で第３世代のレンチウイルスプラスミド骨格にクローニングした。ＣＡＲのすべては、ＣＤ８ヒンジ、４−１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを有する。ベクターは、形質導入効率の列挙を容易にするために、蛍光レポーターｍＣｈｅｒｒｙをコードする第２の導入遺伝子も含有していた。ＩＮＤが除外されたプロトコル下でＭＧＨ血液バンクから購入した無記名ヒト健康ドナーロイコパックからヒトＴ細胞を精製した（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）、カタログ番号１５０６１）。Ｔ細胞の培養の詳細を実施例１に提供する。
【０１７２】
実施例１３  ＣＤ３７はヒトリンパ腫に高度に発現する。
フローサイトメトリーを使用して、白血球及び非ホジキンリンパ腫細胞株Ｎａｌｍ６、Ｊｅｋｏ−１及びＲａｊｉ（図１Ａ）、及び患者由来ＭＣＬ細胞株（図１Ｂ及び１Ｃ）、及び初代患者ＣＬＬ細胞（図１Ｄ）におけるＣＤ３７及びＣＤ１９の発現を調べた。また、ＣＤ３７とＣＤ１９の両方を導入したＫ５６２細胞を産生して、ｖｉｔｒｏ刺激、及び細胞傷害性アッセイのポジティブコントロール用の人工抗原提示細胞として使用した（図１Ａ）。プレＢ細胞由来の白血病細胞（Ｎａｌｍ６）はＣＤ１９を発現したがＣＤ３７を発現せず（図１Ａ）、すべてのリンパ腫細胞は、ＣＤ１９とＣＤ３７の両方を発現した（図１Ａ−１Ｃ）。患者由来のＭＣＬサンプルでは、ゲートされた陽性細胞の平均蛍光強度に基づき、ＣＤ３７の高度で均一な発現を記録し、これはＣＤ１９よりもさらに高いが、この違いは抗体結合の違いやフルオロフォアの輝度を反映している可能性があることが認識されている（図１Ｃ）。
【０１７３】
次に、フローサイトメトリーにより慢性リンパ球性白血病を有する２１人の患者に由来するＰＢＭＣでＣＤ３７及びＣＤ１９の発現を評価し（図１Ｄ）、ＣＤ１９と比較してＣＤ３陰性リンパ球のなかでもより高くより均一なＣＤ３７の発現を再度記録した。ＣＤ３−ＣＤ２０＋Ｂ細胞にゲートされるとき、ＣＤ３７の発現は高く均一なままである（図１Ｅ）。両抗原の抗原密度のレベルを決定するために、これら２１のサンプルのＣＤ１９及びＣＤ３７の発現をビーズを使用して定量化した（図２Ａ）。細胞あたりの抗原密度はＣＤ３７よりもＣＤ１９の方が高いことが観察された（ＣＤ１９については、平均＝３１，８２９±３，２１２の細胞あたりの抗体結合（ＡＢＣ）であるのに対して、ＣＤ３７については２９，６８０±３２３２ＡＢＣであった（図２Ｂ、表１）。
【０１７４】
2021527421.tif 000002
【０１７５】
血液悪性腫瘍を有する患者からの骨髄穿刺液、リンパ節生検、及び末梢血の２９サンプルに基づいて、Ｂ細胞リンパ腫及び正常Ｂ細胞でＣＤ３７の発現を確認したが、正常ドナーからの造血幹細胞、又はｈｅｍａｔｏｇｏｎｅでは確認されなかった（表２）。
【０１７６】
2021527421.tif 000003
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【０１７７】
このデータセットでは、Ｔ細胞悪性腫瘍を有する患者からのサンプルはなかった。よって、ＣＤ３７の発現は、９つの異なるサブタイプからの６７  ＰＴＣＬサンプルのトリプリケートコアを含有する組織マイクロアレイで免疫組織化学的染色を実施することにより、初代末梢Ｔ細胞リンパ腫において評価した。全体として、ＡＩＬＴ１６例中１５例、ＡＬＫ＋未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）１例中１例、ＡＬＫ陰性ＡＬＣＬ１３例中６例、成人性Ｔ細胞白血病６例中２例、ＰＴＣＬ２３例中１８例、特に指定のない場合、腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫１例中１例、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型４例中４例、Ｔ細胞前リンパ球性白血病１例中１例、及び肝脾ガンマ／デルタＴ細胞リンパ腫２例中１例を含む、各サブタイプの患者サンプルでは、少なくとも細胞のサブセットで陽性染色が見られた。ＰＴＣＬ（ＡＬＣＬ）サンプル中のＣＤ３７の典型的な強力な染色を図２Ｃに示す。
【０１７８】
実施例１４  抗ＣＤ３７  ＣＡＲ  Ｔ細胞の生成
４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζと直列になった抗ＣＤ３７ｓｃＦｖ及びＣＤ８膜貫通ドメインからなる二つの抗ＣＤ３７キメラ抗原受容体を設計した（図３Ａ）。可変重鎖及び軽鎖の両方の配向においてｓｃＦｖｓを合成し、ＣＡＲ−３７  Ｌ−Ｈ及びＣＡＲ−３７  Ｈ−Ｌを生成した。導入効率の評価を容易にするために、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光レポーター遺伝子をＣＡＲ配列のＣ末端にある２Ａリボソームスキップ配列の後に組み込んだ。第３世代の自己不活性化レンチウイルスベクターを使用して、一次活性化ヒトＴ細胞への高効率遺伝子導入を両方のコンストラクトで得た（図３Ｂ及び３Ｃ）。ＣＡＲ−３７  Ｔ細胞は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＡＲ−１９）と同等に、最初の１０日間に抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで最初にプライミングした後に増殖を示した。比較として、ＣＡＲ−１９  Ｔ細胞を、ＣＤ８膜貫通ドメインと４−１ＢＢ及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインとを有する同じ骨格に基づいて生成した。ＣＡＲ−３７  Ｔ細胞は、ＣＤ３７及びＣＤ１９を発現するよう導入された照射Ｋ５６２細胞での反復抗原刺激を通じて長期的に増殖し得ることを発見した（図３Ｄ）。次に、Ｊｕｒｋａｔレポーター（ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼ）Ｔ細胞を使用したＣＡＲの活性化を試験した。Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞に異なるＣＡＲコンストラクトを導入した後、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、Ｂ細胞リンパ腫腫瘍細胞、Ｎａｌｍ６白血病細胞、又はネガティブコントロールとしての培地を含むさまざまな刺激で細胞を共培養した。蛍光を測定することにより、抗原刺激に応じた特異的なＴ細胞活性化及びＮＦＡＴ媒介性の蛍光を実証した（図３Ｅ）。このアッセイでは、Ｌ−Ｈ配向における抗ＣＤ３７  ＣＡＲは、Ｈ−Ｌ配向における抗ＣＤ３７  ＣＡＲよりもより確実に、かつＣＤ１９発現腫瘍に応じた抗ＣＤ１９  ＣＡＲと同様のレベルで、活性化を開始するようにみられた。しかしながら、最適なＣＡＲコンストラクトに相当するＮＦＡＴ転座の既知の閾値又は最適量は存在しない。これらのデータは、抗ＣＤ３７  ＣＡＲが特異的な抗原刺激に応じてＴ細胞活性化シグナルを媒介し、抗原刺激に応じて長期的に成長できることを示す。
【０１７９】
ＣＤ３７はＴ細胞及び他の造血単核細胞に発現すると報告されているため、健康なドナーの全血免疫細胞でのＣＤ３７の発現を照合した（図３Ｆ−３Ｉ）。Ｂ細胞でＣＤ３７の高度な発現が観察され、単球では発現は最小限であったが、ＮＫ細胞又はＴ細胞ではそうではなかった。しかしながら、多くのＴ細胞マーカーは活性化と共に変化するため、ＣＡＲ−３７  Ｔ細胞を同じドナーの活性化又は非活性化ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞と共培養することにより、フラトリサイドの可能性を試験した。２４時間後、標的Ｔ細胞の数を分析した。同じ実験でのＪｅｋｏ−１標的細胞に対する予想された細胞傷害性にかかわらず、ＣＡＲ−１９  Ｔ細胞と培養したものと比較して、ＣＡＲ−３７  Ｔ細胞と共培養した標識静止Ｔ細胞（図４Ａ）又は標識活性化Ｔ細胞（図４Ｂ）の数において、有意差は検出されなかった（図４Ｃ）。次に、単球、ＮＫ細胞、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化Ｍ１又はＭ２マクロファージに対するＣＡＲ−３７  Ｔ細胞の脱顆粒及びＩＦＮγ産生を試験した（図４Ｄ）。ＣＡＲ−３７  Ｔ細胞とＣＡＲ−１９  Ｔ細胞との間で脱顆粒又はＩＦＮγ産生における有意差は観察されなかったが、これは、ＣＡＲ−３７  Ｔ細胞により誘発される免疫細胞傷害性の証拠がないことを示す。
【０１８０】
実施例１５  ＣＡＲ−３７  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤ３７陽性腫瘍細胞に応じてロバストなエフェクター機能を示す
ＣＡＲ−３７  Ｔ細胞の抗腫瘍活性を定義するために、リンパ腫細胞株のパネルに対して細胞傷害性アッセイを実施した。１６時間にわたってさまざまなエフェクター対標的の比で、ＣＡＲ−３７  Ｔ細胞をＪｅｋｏ−１、ＯＳＵ−ＣＬＬ、Ｒａｊｉ又はＫ５６２−ＣＤ３７−ＣＤ１９細胞と共培養した（図５）。すべてのＣＡＲ−３７  Ｔ細胞エフェクターは標的細胞を溶解させることができたが、Ｊｕｒｋａｔ活性化アッセイで観察したものとは対照的に、重−軽鎖構成は、抗ＣＤ３７  ＣＡＲ  Ｔ細胞の軽−重構成よりも好ましいものであった。この差は明白であり、試験したすべての腫瘍株と一致していた。特に、ＣＡＲ−３７  Ｈ−Ｌ又はＣＡＲ−１９が導入されたＴ細胞は、これらの標的腫瘍細胞に対して同等の細胞溶解活性を実証し、標的腫瘍細胞のすべては両方の抗原を発現する。
【０１８１】
次に、抗原刺激に応じたサイトカイン産生を分析した。標的細胞での刺激後に異なるＣＡＲコンストラクトにより産生されたサイトカインの異なるパターンを比較した。ＣＡＲ−３７  Ｔ細胞は、腫瘍細胞株（図６Ｃ及び６Ｄ）、初代ＣＬＬ（図６Ａ）及びＭＣＬ患者由来の異種移植（ＰＤＸ）サンプル（図６Ｂ）でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激の後のＴｈ１型サイトカインＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＧＭ−ＣＳＦの抗原特異的産生を実証した。細胞傷害性アッセイと一致して、これらの実験は、ＣＡＲ−３７  Ｌ−Ｈと比較したＣＡＲ−３７  Ｈ−Ｌの抗原特異的エフェクター機能の改善を実証した。
【０１８２】
実施例１６  ＣＡＲ−３７  Ｔ細胞はｉｎ  ｖｉｖｏでＭＣＬ腫瘍を根絶する
ＣＡＲ−３７  Ｈ−ＬはＣＡＲ−３７  Ｌ−Ｈよりも優れている可能性があるが決定的ではないことをｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが示しているため、これらの二つのフォーマットをＭＣＬの異種モデルで比較した。ＮＳＧマウスにルシフェラーゼ発現Ｊｅｋｏ−１（ＣＢＧ−ＧＦＰ＋）細胞を静脈内注射した。７日後、すべてのマウスにおける生物発光イメージング（ＢＬＩ）により疾病負荷を評価し、ＣＡＲ−３７又は非導入（ＵＴＤ）Ｔ細胞を尾静脈注射により投与した。１４日目までに、ＣＡＲ−３７  Ｌ−Ｈ治療動物において部分的な疾患コントロールがなされたが、ＣＡＲ−３７  Ｈ−Ｌ治療マウスでは完全な疾患の根絶がなされ（図７Ａ−７Ｃ）、これにより、ＣＡＲ−３７  Ｌ−ＨよりもＣＡＲ−３７  Ｈ−Ｌの優れた抗原誘発エフェクター機能を確認し、ＣＡＲ−３７  Ｈ−Ｌをその後さらなる実験のため及びｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＡＲ−１９  Ｔ細胞との直接比較のために選択した。
【０１８３】
示されるように、ＭＣＬ細胞株Ｊｅｋｏ−１（ＣＢＧ−ＧＦＰ＋）の静脈内注射の７日後にＣＡＲ  Ｔ細胞をＮＳＧマウスに注射した（図７Ｄ）。腫瘍量を評価するための発光の連続イメージングは、ＣＡＲ−３７  Ｔ細胞及びＣＡＲ−１９  Ｔ細胞の両方について１４日目までに腫瘍の迅速かつ完全な排除を示した。７日目までに腫瘍体積は劇的に減少した（図７Ｅ及び７Ｆ）。フローサイトメトリーにより末梢血でのＣＡＲ  Ｔ−細胞の残留を確認した（図７Ｇ）。第７日ではＣＡＲ−３７  Ｔ細胞がより多く残留していた（ｐ＜０．０５）。
【０１８４】
腫瘍細胞株はＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性の評価にかなり有用ではあるが、原発性の患者腫瘍の異質性及び生態を完全に表さないことが多い。対照的に、腫瘍細胞が患者に直接由来しかつ２−３継代のみ培養されるＰＤＸモデルは、臨床背景により酷似していると考えられる。ＭＣＬのＰＤＸモデルにおけるＣＡＲ−３７（Ｈ−Ｌ構成）の有効性を評価した。１０匹のＮＳＧマウスにルシフェラーゼ発現ＭＣＬ−ＰＤＸ細胞を注射した。ＢＬＩによりＪｅｋｏ−１モデルと同様の疾患生着及び腫瘍量を確認した後、ＣＡＲ−３７、ＣＡＲ−１９又は非導入Ｔ細胞を注射した（図８Ａ）。ＣＡＲ−３７  Ｔ細胞は、ＣＡＲ−１９よりも著しく迅速に、わずか１２日で腫瘍を除去することができたことを観察した（第１２日の時点でｐ＜０．０５）（図８Ｂ及び８Ｃ）。第１４日に回収された末梢血のフローサイトメトリーの評価により、血液中にＣＡＲ  Ｔ細胞が残留することを確認した（図８Ｄ）。まとめると、これらの結果は、腫瘍株とＭＣＬのＰＤＸモデルの両方において、ＣＡＲ−３７  Ｔ細胞がｉｎ  ｖｉｖｏでＢ−細胞ＮＨＬに対して有意な抗腫瘍効果を媒介することを示している。
【０１８５】
実施例１７  Ｔ細胞リンパ腫のＣＤ３７を標的にする
ＰＴＣＬ株及びＰＴＣＬのＰＤＸサンプルにおけるＣＤ３７の表面発現をフローサイトメトリーにより分析した。３つの細胞株（Ｈｕｔ７８、Ｆｅｄｐ及びＳｅａｘ）並びにさまざまなレベルで細胞表面にＣＤ３７を発現する５つのＰＤＸサンプルを同定した（図９Ａ及び９Ｂ、表３）。
【０１８６】
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【０１８７】
これらのＰＴＣＬサンプルとの共培養後のＣＡＲ−３７  Ｔ細胞の活性化を試験した。ＣＤ６９活性化マーカーをゲートされたＣＡＲ＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーにより分析した。ＰＴＣＬ標的細胞と６時間共培養した後、ＣＤ６９のロバストな上方制御が観察された。これはＣＡＲ−３７  Ｔ細胞活性化を示した（図１０Ａ）。興味深いことに、ＣＤ６９の上方制御の程度は、標的細胞のＣＤ３７抗原の増殖レベルとは無関係であった。次に、ＰＴＣＬ標的細胞とのインキュベーション後にＣＡＲ−３７細胞中のＣＤ１０７ａの発現を測定することにより、ＣＡＲ−３７  Ｔ細胞の脱顆粒を試験した（図１０Ｂ）。ＣＤ６９アッセイと一致して、ＰＴＣＬ細胞に応じてＣＡＲ−３７  Ｔ細胞が脱顆粒したことを観察した。これは、ＰＴＣＬに応じたＣＡＲ−３７  Ｔ細胞の活性化を示した。最後に、さまざまなＥ：Ｔ比で実施された細胞傷害性アッセイにより決定されるように、ＣＡＲ−３７  Ｔ細胞はＣＤ３７陽性ＰＴＣＬ細胞株Ｈｕｔ７８及びＦｅｐｄを効果的に溶解させることを観察した（図１０Ｃ及び１０Ｄ）。まとめると、これらの実験は、ＣＡＲ−３７  Ｔ細胞はＴ細胞リンパ腫細胞に対して活性化され、Ｔ細胞リンパ腫細胞を溶解させることを実証した。
【０１８８】
実施例１８ＣＤ１９及びＣＤ３７に対する二重特異性ＣＡＲ  Ｔ細胞
抗原エスケープを回避するための可能な手段は、複数の抗原を認識できるＴ細胞を生成することである（Ruella et al., J. Clin. Invest. 126:3814−26, 2016; Zah et al., Cancer Immunology Research. 4:498−508, 2016）。ＣＤ１９及びＣＤ３７の二重標的化は、Ｂ−ＣＬＬ細胞に効果的な結果をもたらした二重リガンド免疫リポソームアプローチで以前に調査された（Yu et al., Biomaterials. 34:6185−6193, 2013）。ＣＤ１９又はＣＤ３７が単独で又は組み合わせて標的細胞上に存在するときにＴ細胞の活性化を効率的に引き起こし得る二重特異性ＣＡＲを設計した。２つのコンストラクトを生成し、第２世代の４−１ＢＢ−ＣＤ３ζベクターで異なる順序で直列に結合された抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ３７  ｓｃＦｖを用いて試験した（図１１Ａ）。同じＭＯＩを使用した場合でさえも、ＣＡＲ１９−３７  Ｔ細胞は、ＣＡＲ３７−１９と比較して、導入効率が低いことを観察した（図１１Ｂ及び１１Ｃ）。
【０１８９】
二重特異性ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＣＡＲ−１９、ＣＡＲ−３７、二重特異性ＣＡＲ１９−３７、及び二重特異性ＣＡＲ３７−１９のいずれかの抗原に応じて活性化され得るかを決定するために、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ−Ｌｕｃレポーター細胞株を生成し、標的細胞と一晩共培養した後に活性化を分析した。二重特異性ＣＡＲ  Ｔ細胞は、単一の抗原又は両方の抗原のいずれかが標的細胞の表面上に存在するときに高いＮＦＡＴ活性化を示し、単一または両方の抗原が標的細胞の表面に存在する場合、二重特異性ＣＡＲ  Ｔ細胞は高い活性化を示し、それらがＣＤ１９のみ又はＣＤ３７のみにより活性化されたとき、二重特異性ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化シグナルに識別可能な違いはなかった（図１２Ａ）。二重特異性ＣＡＲ  Ｔ細胞は、最初の１０日間に抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで最初にプライミングした後に同等の増殖を示した（図１２Ｂ）。同様に、二重特異性ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＤ１９及びＣＤ３７を発現するＫ５６２での反復抗原刺激を通じて長期的に増殖し得ることを発見した（図１２Ｂ）。初代ヒトＣＡＲ  Ｔ細胞での細胞傷害性アッセイでは、二重特異性ＣＡＲ  Ｔ細胞は、単一の標的又は両方の標的に応答することを観察し、ＣＤ１９又はＣＤ３７に対する細胞傷害性に識別可能な違いはなかった（図１２Ｃ）。最後に、二重特異性コンストラクトを、従来のＣＡＲ−３７及びＣＡＲ−１９  Ｔ細胞と比較して、Ｊｅｋｏ−１腫瘍細胞に対してｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。治療後１４日目までに、部分的な疾患コントロールを示したＣＡＲ−１９−３７を除くすべてのグループで完全な疾患根絶がなされた（図１２Ｄ）。この不一致は、２つの抗原間の構造の違いとＣＡＲコンストラクトのｓｃＦｖの順序に関連している可能性がある。末梢血中のＣＡＲ  Ｔ細胞の残留を、治療の３５日目までにフローサイトメトリーによって確認した（図１２Ｅ）。試験されたすべての時点で、ＣＡＲ−３７、ＣＡＲ−１９、及び最適な腫瘍除去二重特異性ＣＡＲ３７−１９の間に識別可能な違いはなかった。興味深いことに、準最適なＣＡＲ  １９−３７は３５日目でより多く残留していたが、これは腫瘍による持続的な抗原刺激を反映している場合がある。まとめると、これらのデータは、二重特異性ＣＡＲ  Ｔ細胞は表面上に一つ又は両方の抗原を発現する細胞の特異的な標的細胞溶解を引き起こしたこと、及び二重特異性ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＭＣＬ腫瘍に対する単一特異性ＣＡＲ単独と同程度に効果的であることを示している。
【０１９０】
実施例１９  ＮＫ細胞でのＣＡＲ免疫療法
ＣＤ３７発現はＰＴＣＬ（Pereira et al., Mol. Cancer. Ther. 14(7):1650-60, 2015）及び多くのＢ−ＮＨＬで報告されており、よって、ＣＡＲ  Ｔ細胞免疫療法の有望な標的である。しかしながら、活性化Ｔ細胞はＣＤ３７を発現し得るが、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は発現しない。よって、ＮＫ細胞は、ＣＤ１９／ＣＤ３７−ＣＡＲ又はＣＤ３７−ＣＡＲを含むＣＡＲ  Ｔ細胞療法にとって魅力的な細胞傷害性細胞である。ＮＫ細胞は、ＧｖＨＤのリスクを伴わずに抗腫瘍効果を媒介し、Ｔ細胞と比較して短寿命である。このことにより、ＣＡＲ−３７の有無にかかわらず、ＮＫ細胞は同種異系細胞治療製品の有望な源になる。以前の前臨床試験は、ＣＡＲで修飾された初代ヒトＮＫ細胞を、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＨＥＲ２を含むさまざまな抗原に対してリダイレクトし、抗ＣＤ１９  ＣＡＲで修飾された、ドナー由来の、及びハプロタイプ一致のＮＫ細胞が、Ｂ細胞ＡＬＬの臨床試験に入った（ＮＣＴ００９９５１３７、ＮＣＴ０１９７４４７９）。Ｔ細胞の自己標的化は、代わりにＮＫ細胞を使用すること、及び同種異系の源としてＮＫを使用することにより、潜在的に軽減することができる。
【０１９１】
実施例２０  配列
ｓｃＦｖ配列
ＶＨ（アミノ酸１−１１６（配列番号１））、リンカー領域（アミノ酸１１７−１３６（配列番号３））、及びＶＬ（アミノ酸１３７−２４４（配列番号２））を含む抗ＣＤ３７  ｓｃＦｖ  ＶＨ−ＶＬ（配列番号４）。
【０１９２】
ＡＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＤＰＹＹＧＧＴＴＹＮＲＫＦＫＧＲＶＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＶＧＰＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＴＳＥＮＶＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＶＳＳＡＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＨＨＳＤＮＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号４）
【０１９３】
ＶＨ（配列番号１（配列番号４のアミノ酸１−１１６））
ＡＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＤＰＹＹＧＧＴＴＹＮＲＫＦＫＧＲＶＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＶＧＰＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１）
【０１９４】
リンカー領域（配列番号３（配列番号４のアミノ酸１１７−１３６））
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）
【０１９５】
ＶＬ（配列番号２（配列番号４のアミノ酸１３７−２４４））
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＴＳＥＮＶＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＶＳＳＡＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＨＨＳＤＮＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２）
【０１９６】
ＶＬ（アミノ酸１−１０８（配列番号２））、リンカー領域（アミノ酸１０９−１２８（配列番号３））、及びＶＨ（アミノ酸１２９−２４４（配列番号１）を含む抗ＣＤ３７  ｓｃＦｖ  ＶＬ−ＶＨ（配列番号５）。
【０１９７】
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＴＳＥＮＶＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＶＳＳＡＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＨＨＳＤＮＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＤＰＹＹＧＧＴＴＹＮＲＫＦＫＧＲＶＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＶＧＰＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５）
【０１９８】
ＶＬ（配列番号２（配列番号５のアミノ酸１−１０８））
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＴＳＥＮＶＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＶＳＳＡＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＨＨＳＤＮＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２）
【０１９９】
リンカー領域（配列番号３（配列番号５のアミノ酸１０９−１２８））
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）
【０２００】
ＶＨ（配列番号１（配列番号５のアミノ酸１２９−２４４））
ＡＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＤＰＹＹＧＧＴＴＹＮＲＫＦＫＧＲＶＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＶＧＰＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１）
【０２０１】
ＶＬ（アミノ酸１−１０７（配列番号１３））、リンカー領域（アミノ酸１０８−１２８（配列番号３））、及びＶＨ（アミノ酸１２９−２４７（配列番号１２））を含む抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ（配列番号１４）。
【０２０２】
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＱＳＳＬＫＳＲＶＴＩＳＫＤＮＳＫＮＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１４）
【０２０３】
ＶＬ（配列番号１３（配列番号１４のアミノ酸１−１０７））
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１３）
【０２０４】
リンカー領域（配列番号３（配列番号１４のアミノ酸１０８−１２８）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）
【０２０５】
ＶＨ（配列番号１２（配列番号１４のアミノ酸１２９−２４７））
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＱＳＳＬＫＳＲＶＴＩＳＫＤＮＳＫＮＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１２）
【０２０６】
ＤＮＡ配列決定
ＣＤ８シグナル配列（アミノ酸１−２１（配列番号８））；抗ＣＤ３７  Ｌ−Ｈ（アミノ酸２２−２６５（配列番号５））；ＣＤ８ヒンジ及びＴＭドメイン（アミノ酸２６６−３３４（配列番号９））；４−１ＢＢ（アミノ酸３３５−３７６（配列番号１０））；及びＣＤ３ζ（アミノ酸３７７−４８８（配列番号１１））を含むｐＭＧＨ８（ＣＡＲ−３７  Ｌ−Ｈ）−ＣＤ８シグナル／抗ＣＤ３７  Ｌ−Ｈ  ／ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ／４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ（配列番号７）。
【０２０７】
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＴＳＥＮＶＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＶＳＳＡＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＨＨＳＤＮＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＤＰＹＹＧＧＴＴＹＮＲＫＦＫＧＲＶＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＶＧＰＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号７）
【０２０８】
ＣＤ８シグナル配列（配列番号８（配列番号７のアミノ酸１−２１））
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号８）
【０２０９】
抗ＣＤ３７  Ｌ−Ｈ（配列番号５（配列番号７のアミノ酸２２−２６５））
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＴＳＥＮＶＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＶＳＳＡＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＨＨＳＤＮＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＤＰＹＹＧＧＴＴＹＮＲＫＦＫＧＲＶＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＶＧＰＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５）
【０２１０】
ＣＤ８ヒンジ及びＴＭドメイン  配列番号９（配列番号７のアミノ酸２６６−３３４）
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号９）
【０２１１】
４−１ＢＢ（配列番号１０（配列番号７のアミノ酸３３５−３７６））
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１０）
【０２１２】
ＣＤ３ζ（配列番号１１（配列番号７のアミノ酸３７７−４８８））
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１１）
【０２１３】
ＣＤ８シグナル配列（アミノ酸１−２１（配列番号８））；抗ＣＤ３７  Ｈ−Ｌ（アミノ酸２２−２６５（配列番号４））；ＣＤ８ヒンジ及びＴＭドメイン（アミノ酸２６６−３３４（配列番号９））；４−１ＢＢ（アミノ酸３３５−３７６（配列番号１０））；及びＣＤ３ζ（アミノ酸３７７−４８８（配列番号１１））を含むｐＭＧＨ８（ＣＡＲ−３７  Ｈ−Ｌ）−ＣＤ８シグナル／抗ＣＤ３７  Ｈ−Ｌ／ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ／４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ（配列番号６）。
【０２１４】
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＡＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＤＰＹＹＧＧＴＴＹＮＲＫＦＫＧＲＶＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＶＧＰＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＴＳＥＮＶＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＶＳＳＡＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＨＨＳＤＮＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ  配列番号６）
【０２１５】
ＣＤ８シグナル配列（配列番号８（配列番号６のアミノ酸１−２１））
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号８）
【０２１６】
抗ＣＤ３７  Ｈ−Ｌ（配列番号４（配列番号６のアミノ酸２２−２６５））
ＡＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＤＰＹＹＧＧＴＴＹＮＲＫＦＫＧＲＶＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＶＧＰＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＴＳＥＮＶＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＶＳＳＡＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＨＨＳＤＮＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号４）
【０２１７】
ＣＤ８ヒンジ及びＴＭドメイン（配列番号９（配列番号６のアミノ酸２６６−３３４））
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号９）
【０２１８】
４−１ＢＢ（配列番号１０（配列番号６のアミノ酸３３５−３７６））
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１０）
【０２１９】
ＣＤ３ζ（配列番号１１（配列番号６のアミノ酸３７７−４８８））
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１１）
【０２２０】
ＣＤ８シグナル配列（アミノ酸１−２１（配列番号８））；抗ＣＤ１９（アミノ酸２２−２６８（配列番号１４））；リンカー（アミノ酸２６９−２８８（配列番号３））；抗ＣＤ３７  Ｈ−Ｌ（アミノ酸２８９−５３２（配列番号４））；ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ（アミノ酸５３３−６０１（配列番号９））；４−１ＢＢ（アミノ酸６０２−６４３（配列番号１０））、ＣＤ３ζ（アミノ酸６４４−７５５（配列番号１１））を含むｐＭＧＨ９５（ＣＡＲ−１９−３７）−ＣＤ８シグナル／抗ＣＤ１９／抗ＣＤ３７  Ｈ−Ｌ／ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ／４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ（配列番号１５）。
【０２２１】
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＱＳＳＬＫＳＲＶＴＩＳＫＤＮＳＫＮＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＤＰＹＹＧＧＴＴＹＮＲＫＦＫＧＲＶＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＶＧＰＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＴＳＥＮＶＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＶＳＳＡＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＨＨＳＤＮＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１５）
【０２２２】
ＣＤ８シグナル配列（配列番号８（配列番号１５のアミノ酸１−２１））
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号８）
【０２２３】
抗ＣＤ１９（配列番号１４（配列番号１５のアミノ酸２２−２６８）
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＱＳＳＬＫＳＲＶＴＩＳＫＤＮＳＫＮＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１４）
【０２２４】
リンカー領域（配列番号３（配列番号１５のアミノ酸２６９−２８８）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）
【０２２５】
抗ＣＤ３７  Ｈ−Ｌ（配列番号４（配列番号１５のアミノ酸２８９−５３２））
ＡＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＤＰＹＹＧＧＴＴＹＮＲＫＦＫＧＲＶＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＶＧＰＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＴＳＥＮＶＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＶＳＳＡＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＨＨＳＤＮＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号４）
【０２２６】
ＣＤ８ヒンジ及びＴＭドメイン（配列番号９（配列番号１５のアミノ酸５３３−６０１））；
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号９）
【０２２７】
４−１ＢＢ（配列番号１０（配列番号１５のアミノ酸６０２−６４３）），
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１０）
【０２２８】
ＣＤ３ζ（配列番号１１（配列番号１５のアミノ酸６４４−７５５））
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１１）
【０２２９】
ＣＤ８シグナル配列（アミノ酸１−２１（配列番号８））；抗ＣＤ３７  Ｈ−Ｌ（アミノ酸２２−２６５（配列番号４））；リンカー（アミノ酸２６６−２８５（配列番号３））；抗ＣＤ１９（アミノ酸２８６−５３２（配列番号１４））；ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ（アミノ酸５３３−６０１（配列番号９））；４−１ＢＢ（アミノ酸６０２−６４３（配列番号１０））、ＣＤ３ζ（アミノ酸６４４−７５５（配列番号１１））を含むｐＭＧＨ９６（ＣＡＲ−３７−１９）−ＣＤ８シグナル／抗ＣＤ３７  Ｈ−Ｌ／抗ＣＤ１９／ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ／４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ（配列番号１６）。
【０２３０】
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＡＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＤＰＹＹＧＧＴＴＹＮＲＫＦＫＧＲＶＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＶＧＰＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＴＳＥＮＶＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＶＳＳＡＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＨＨＳＤＮＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＱＳＳＬＫＳＲＶＴＩＳＫＤＮＳＫＮＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１６）
【０２３１】
ＣＤ８シグナル配列（配列番号８（配列番号１６のアミノ酸１−２１））；
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号８８）
【０２３２】
抗ＣＤ３７  Ｈ−Ｌ（配列番号４（配列番号１６のアミノ酸２２−２６５））；
ＡＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＤＰＹＹＧＧＴＴＹＮＲＫＦＫＧＲＶＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＶＧＰＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＴＳＥＮＶＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＶＳＳＡＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＨＨＳＤＮＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号４）
【０２３３】
リンカー領域（配列番号３（配列番号１６のアミノ酸２６６−２８５））；
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）
【０２３４】
抗ＣＤ１９（配列番号１４（配列番号１６のアミノ酸２８６−５３２））；
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＱＳＳＬＫＳＲＶＴＩＳＫＤＮＳＫＮＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１４）
【０２３５】
ＣＤ８ヒンジ及びＴＭドメイン（配列番号９（配列番号１６のアミノ酸５３３−６０１））；
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号９）
【０２３６】
４−１ＢＢ（配列番号１０（配列番号１６のアミノ酸６０２−６４３））、
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１０）
【０２３７】
ＣＤ３ζ（配列番号１１（配列番号１６のアミノ酸６４４−７５５））
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１１）
【０２３８】
本出願の配列と対応する配列番号を表４に示す。
【０２３９】
2021527421.tif 000008
2021527421.tif 000009
2021527421.tif 000010
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【０２４０】
本明細書に記載される技術のいくつかの実施態様は、以下の番号を付した段落のいずれかに従って定義することができる。
１．（ｉ）ＣＤ３７結合ドメイン及びＣＤ１９結合ドメインを含む細胞外ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【０２４１】
２．ＣＤ３７結合ドメイン及び／又はＣＤ１９結合ドメインが、抗体、又はその抗原結合断片を含む、段落１に記載のＣＡＲ。
【０２４２】
３．ＣＤ３７結合ドメイン及び／又はＣＤ１９結合ドメインが単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、段落１又は２に記載のＣＡＲ。
【０２４３】
４．ＣＤ１９結合ドメインがＣＤ３７結合ドメイン対するＮ末端に位置している、段落１から３のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２４４】
５．ＣＤ３７結合ドメインがＣＤ１９結合ドメイン対するＮ末端に位置している、段落１から３のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２４５】
６．（ｉｖ）一又は複数の共刺激ドメインをさらに含む、段落１から５のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２４６】
７．膜貫通ドメインがヒンジ／膜貫通ドメインを含む、段落１から６のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２４７】
８．ヒンジ／膜貫通ドメインが、ＣＤ８又は４−１ＢＢのヒンジ／膜貫通ドメインを含む、段落７に記載のＣＡＲ。
【０２４８】
９．ヒンジ／膜貫通ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列を含んでいてもよいＣＤ８のヒンジ／膜貫通ドメインを含む、段落８に記載のＣＡＲ。
【０２４９】
１０．細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、段落１から９のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２５０】
１１．細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号１１のアミノ酸配列を含んでいてもよいＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、段落１０に記載のＣＡＲ。
【０２５１】
１２．共刺激ドメインが、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、又はＯＸ−４０の共刺激ドメインを含む、段落６から１１のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２５２】
１３．共刺激ドメインが、配列番号１０のアミノ酸配列を含んでいてもよい４−１ＢＢの共刺激ドメインを含む、段落１２に記載のＣＡＲ。
【０２５３】
１４．配列番号１５、１６、１９、又は２０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、段落１から１３のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２５４】
１５．配列番号１５、１６、１９、又は２０のアミノ酸配列を含む、段落１４に記載のＣＡＲ。
【０２５５】
１６．ＣＤ３７結合ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む、段落１から１５のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２５６】
１７．ＶＨが配列番号１のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号２のアミノ酸配列を含む、段落１６に記載のＣＡＲ。
【０２５７】
１８．ＶＨがＶＬに対するＮ末端に位置している、段落１６又は１７に記載のＣＡＲ。
【０２５８】
１９．ＶＬがＶＨに対するＮ末端に位置している、段落１６又は１７に記載のＣＡＲ。
【０２５９】
２０．ＣＤ３７結合ドメインが、配列番号４又は５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、段落１から１９のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２６０】
２１．ＣＤ３７結合ドメインが、配列番号４又は５のアミノ酸配列を含む、段落２０に記載のＣＡＲ。
【０２６１】
２２．ＣＤ１９結合ドメインが、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む、段落１から２１のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２６２】
２３．ＶＨが配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号１３のアミノ酸配列を含む、段落２２に記載のＣＡＲ。
【０２６３】
２４．ＣＤ１９結合ドメインが、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、段落１から２３のいずれか一つに記載のＣＡＲ。
【０２６４】
２５．ＣＤ１９結合ドメインが、配列番号１４のアミノ酸配列を含む、段落２４に記載のＣＡＲ。
【０２６５】
２６．段落１から２５のいずれか一つに記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド。
【０２６６】
２７．自殺遺伝子をさらに含む、段落２６に記載のポリヌクレオチド。
【０２６７】
２８．シグナル配列をコードする配列をさらに含む、段落２６又は２７に記載のポリヌクレオチド。
【０２６８】
２９．段落１から２５のいずれか一つに記載のＣＡＲ及び／又は段落２６から２８のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含む免疫細胞。
【０２６９】
３０．Ｔ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、段落２９に記載の免疫細胞。
【０２７０】
３１．ヒト細胞である、段落２９又は３０に記載の免疫細胞。
【０２７１】
３２．段落２９から３１のいずれか一つに記載の免疫細胞と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【０２７２】
３３．それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、段落２９から３１のいずれか一つに記載の免疫細胞又は段落３２に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法。
【０２７３】
３４．がんがＣＤ３７を発現する細胞を含む、段落３３に記載の方法。
【０２７４】
３５．がんが、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、又は白血病である、段落３４に記載の方法。
【０２７５】
３６．Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫が、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、又はバーキットリンパ腫である、段落３５に記載の方法。
【０２７６】
３７．Ｔ細胞リンパ腫が、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、又は未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）である、段落３５に記載の方法。
【０２７７】
３８．白血病が慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）である、段落３５に記載の方法。
【０２７８】
３９．対象が抗ＣＤ１９療法に対して非応答性である、段落３３から３８のいずれか一つに記載の方法。
【０２７９】
４０．対象が抗ＣＤ１９療法を共投与される、段落３３から３９のいずれか一つに記載の方法。
【０２８０】
その他の実施態様
上記発明は、理解を明瞭にする目的で説明及び例示としてある程度詳細に記載されたが、それら記載及び例示は本発明の範囲を限定するものではない。ここに引用したすべての特許文献及び科学文献の開示内容は、参照によりその全体が明示的に包含されている。
【図１Ａ】
2021527421.tif 000013
【図１Ｂ】
2021527421.tif 000014
【図１Ｃ】
2021527421.tif 000015
【図１Ｄ】
2021527421.tif 000016
【図１Ｅ】
2021527421.tif 000017
【図２Ａ】
2021527421.tif 000018
【図２Ｂ】
2021527421.tif 000019
【図２Ｃ】
2021527421.tif 000020
【図３Ａ】
2021527421.tif 000021
【図３Ｂ】
2021527421.tif 000022
【図３Ｃ】
2021527421.tif 000023
【図３Ｄ】
2021527421.tif 000024
【図３Ｅ】
2021527421.tif 000025
【図３Ｆ】
2021527421.tif 000026
【図３Ｇ】
2021527421.tif 000027
【図３Ｈ】
2021527421.tif 000028
【図３Ｉ】
2021527421.tif 000029
【図４Ａ】
2021527421.tif 000030
【図４Ｂ】
2021527421.tif 000031
【図４Ｃ】
2021527421.tif 000032
【図４Ｄ】
2021527421.tif 000033
【図５】
2021527421.tif 000034
【図６Ａ】
2021527421.tif 000035
【図６Ｂ】
2021527421.tif 000036
【図６Ｃ】
2021527421.tif 000037
【図６Ｄ】
2021527421.tif 000038
【図７Ａ】
2021527421.tif 000039
【図７Ｂ】
2021527421.tif 000040
【図７Ｃ】
2021527421.tif 000041
【図７Ｄ】
2021527421.tif 000042
【図７Ｅ】
2021527421.tif 000043
【図７Ｆ】
2021527421.tif 000044
【図７Ｇ】
2021527421.tif 000045
【図８Ａ】
2021527421.tif 000046
【図８Ｂ】
2021527421.tif 000047
【図８Ｃ】
2021527421.tif 000048
【図８Ｄ】
2021527421.tif 000049
【図９Ａ】
2021527421.tif 000050
【図９Ｂ】
2021527421.tif 000051
【図１０Ａ】
2021527421.tif 000052
【図１０Ｂ】
2021527421.tif 000053
【図１０Ｃ】
2021527421.tif 000054
【図１０Ｄ】
2021527421.tif 000055
【図１１Ａ】
2021527421.tif 000056
【図１１Ｂ】
2021527421.tif 000057
【図１１Ｃ】
2021527421.tif 000058
【図１２Ａ】
2021527421.tif 000059
【図１２Ｂ】
2021527421.tif 000060
【図１２Ｃ】
2021527421.tif 000061
【図１２Ｄ】
2021527421.tif 000062
【図１２Ｅ】
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【配列表】
2021527421000001.app
【国際調査報告】
2021527421.tif 000064
2021527421.tif 000065