(57)【要約】  腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第１の結合ドメインと；腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に結合することができる第２の結合ドメインと；免疫細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第３の結合ドメインとを含む三重特異性抗原結合タンパク質が提供される。三重特異性抗原結合タンパク質の作製方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
三重特異性抗原結合タンパク質であって：
ａ）腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第１の結合ドメインと；
ｂ）腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に結合することができる第２の結合ドメインと；
ｃ）免疫細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第３の結合ドメインとを含み、
前記第１の結合ドメインが、低下した親和性で腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に結合して、非腫瘍細胞又は前記細胞表面タンパク質の可溶型への結合を抑制する、三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２】
三重特異性抗原結合タンパク質であって：
ａ）腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第１の結合ドメインと；
ｂ）腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に結合することができる第２の結合ドメインと；
ｃ）免疫細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第３の結合ドメインとを含み、
前記第１及び第２の結合ドメインが、低下した親和性で標的抗原に結合して、非腫瘍細胞への結合を抑制する、三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３】
前記腫瘍細胞の前記細胞表面タンパク質が、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＥＡ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＰＳＭＡ、ＦＡＰ及びＨＥＲ２からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４】
前記第１の結合ドメインが、前記腫瘍細胞上のＢＣＭＡに結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項５】
前記腫瘍細胞の前記細胞表面免疫チェックポイントタンパク質が、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＧＡＬ９、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項６】
前記第２の結合ドメインが、前記腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１に結合する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項７】
前記第３の結合ドメインが、前記免疫細胞上のＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ８９、ＣＤ６４又はＣＤ３２ａに結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項８】
前記第３の結合ドメインが、前記免疫細胞上のＣＤ３に結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項９】
前記第１の結合ドメインの親和性が、約１ｎＭ〜約１００ｎＭである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
前記第２の結合ドメインの親和性が、約１ｎＭ〜約１００ｎＭである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
前記第１の結合ドメインの親和性が、約１０ｎＭ〜約８０ｎＭである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
前記第２の結合ドメインの親和性が、約１０ｎＭ〜約８０ｎＭである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
前記第１及び第２の結合ドメインが、同じ細胞上の標的抗原に結合して、結合アビディティーを増大させる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
前記第１の結合ドメインが、前記腫瘍細胞の前記細胞表面タンパク質に対する低い親和性を有して、健康な細胞又は前記細胞表面タンパク質の可溶型への架橋を低減する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１５】
前記第２の結合ドメインが、前記腫瘍細胞の前記細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に対する低い親和性を有して、健康な細胞への架橋を低減する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１６】
前記第１及び第２の結合ドメインが、各々、前記腫瘍細胞の前記標的抗原に対する低い親和性を有し、前記三重特異性抗原結合タンパク質が、健康な細胞への架橋と比較して向上した前記腫瘍細胞への架橋を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１７】
前記第１及び第２の結合ドメインが、同じ細胞上の標的抗原に結合して、健康な組織への標的外結合を低減する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１８】
前記第１、第２及び第３の結合ドメインが、低下した標的外結合を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１９】
前記腫瘍細胞の前記細胞表面タンパク質が、健康な細胞上に存在しないか、又は腫瘍細胞と比較して発現が限定されている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２０】
前記第２の結合ドメインが、前記腫瘍細胞の前記細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に対する低い親和性を有して、健康な細胞に対するチェックポイント阻害を低減する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２１】
前記第１、第２及び第３の結合ドメインが抗体を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２２】
前記第１、第２及び第３の結合ドメインが、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ又はＦａｂ断片を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２３】
前記第２の結合ドメインが一価である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２４】
前記第３の結合ドメインが一価である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２５】
前記第１、第２及び第３の結合ドメインが、１つ以上のリンカーによって互いに連結されている、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２６】
前記三重特異性抗原結合タンパク質が、約７５ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２７】
前記三重特異性抗原結合タンパク質が、分子量≦約６０ｋＤａの抗原結合タンパク質と比較して増大した血清半減期を有する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２８】
三重特異性抗原結合タンパク質であって：
ａ）腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第１の結合ドメインと；
ｂ）前記腫瘍細胞の表面上のＰＤ−Ｌ１に結合することができる第２の結合ドメインと；
ｃ）Ｔ細胞の表面上のＣＤ３に結合することができる第３の結合ドメインとを含み、
前記第１及び第２の結合ドメインが、低下した親和性で腫瘍細胞の細胞表面タンパク質及びＰＤ−Ｌ１に結合して、非腫瘍細胞への結合を抑制する、三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２９】
前記腫瘍細胞の前記細胞表面タンパク質が、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＥＡ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＰＳＭＡ、ＦＡＰ及びＨＥＲ２からなる群から選択される、請求項２８に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３０】
前記第１の結合ドメインが、前記腫瘍細胞上のＢＣＭＡに結合する、請求項２９に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３１】
前記第１の結合ドメインの親和性が、約１ｎＭ〜約１００ｎＭである、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３２】
前記第２の結合ドメインの親和性が、約１ｎＭ〜約１００ｎＭである、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３３】
前記第１の結合ドメインの親和性が、約１０ｎＭ〜約８０ｎＭである、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３４】
前記第２の結合ドメインの親和性が、約１ｎＭ〜約８０ｎＭである、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３５】
前記第１及び第２の結合ドメインが、同じ細胞上の標的抗原に結合して、結合アビディティーを増大させる、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３６】
前記第１の結合ドメインが、前記腫瘍細胞の前記細胞表面タンパク質に対する低い親和性を有して、健康な細胞又は前記細胞表面タンパク質の可溶型への架橋を低減する、請求項２８〜３５のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３７】
前記第２の結合ドメインが、前記腫瘍細胞の表面上のＰＤ−Ｌ１に対する低い親和性を有して、健康な細胞への架橋を低減する、請求項２８〜３６のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３８】
前記第１及び第２の結合ドメインが、各々、前記腫瘍細胞の前記標的抗原に対する低い親和性を有し、前記三重特異性抗原結合タンパク質が、健康な細胞への架橋と比較して向上した前記腫瘍細胞への架橋を有する、請求項２８〜３７のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３９】
前記第１及び第２の結合ドメインが、同じ細胞上の標的抗原に結合して、健康な組織康への標的外結合を低減する、請求項２８〜３８のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４０】
前記第１、第２及び第３の結合ドメインが、低下した標的外結合を有する、請求項２８〜３９のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４１】
前記腫瘍細胞の前記細胞表面タンパク質が、健康な細胞上に存在しないか、又は腫瘍細胞と比較して発現が限定されている、請求項２８〜４０のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４２】
前記第２の結合ドメインが、前記腫瘍細胞の表面上のＰＤ−Ｌ１に対する低い親和性を有して、健康な細胞に対するチェックポイント阻害を低減する、請求項２８〜４１のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４３】
前記第１、第２及び第３の結合ドメインが抗体を含む、請求項２８〜４２のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４４】
前記第１、第２及び第３の結合ドメインが、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ又はＦａｂ断片を含む、請求項２８〜４３のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４５】
前記第２の結合ドメインが一価である、請求項２８〜４４のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４６】
前記第３の結合ドメインが一価である、請求項２８〜４５のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４７】
前記第１、第２及び第３の結合ドメインが、１つ以上のリンカーによって互いに連結されている、請求項２８〜４６のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４８】
前記三重特異性抗原結合タンパク質が、約７５ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有する、請求項２８〜４７のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４９】
前記三重特異性抗原結合タンパク質が、分子量≦約６０ｋＤａの抗原結合タンパク質と比較して増大した血清半減期を有する、請求項２８〜４８のいずれか一項に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項５０】
ａ）腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第１の抗体結合ドメインと；
ｂ）腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に結合することができる第２の抗体結合ドメインと；
ｃ）免疫細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第３の抗体結合ドメインと：を含む三重特異性抗原結合タンパク質。
［請求項５０］
２つの異なる鎖を含む三重特異性抗原結合タンパク質であって：
ａ）一方の鎖は、少なくとも１つの追加の結合ドメインに連結されるＦａｂ断片の少なくとも１つの重鎖（Ｆｄ断片）を含み；
ｂ）他方の鎖は、少なくとも１つの追加の結合ドメインに連結されるＦａｂ断片の少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含み、
前記Ｆａｂドメインは、場合により、前記追加の結合ドメインが場合により連結される特異的なヘテロ二量体化足場として機能し、前記結合ドメインは、異なる特異性を有する、三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項５１】
前記追加の結合ドメインがｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである、請求項５０に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項５２】
前記三重特異性結合タンパク質が：
ｉ）腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第１の結合ドメインと；
ｉｉ）腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に結合することができる第２の結合ドメインと；  
ｉｉｉ）免疫細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第３の結合ドメインとを含む、
請求項５０に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項５３】
前記追加の結合ドメインが、前記Ｆａｂ断片の前記重鎖又は軽鎖の前記Ｎ末端又はＣ末端に連結される、請求項５０に記載の三重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項５４】
対象に治療的有効量の三重特異性抗原結合タンパク質を投与することを含む、前記対象における癌の処置方法であって、前記三重特異性抗原結合タンパク質が：
ａ）腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第１の結合ドメインと；
ｂ）腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に結合することができる第２の結合ドメインと；
ｃ）免疫細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第３の結合ドメインとを含み、
前記第１及び第２の結合ドメインが、低下した親和性で標的抗原に結合して、非腫瘍細胞への結合を抑制する、方法。
【請求項５５】
前記腫瘍細胞の前記細胞表面タンパク質が、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＥＡ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＰＳＭＡ、ＦＡＰ及びＨＥＲ２からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記第１の結合ドメインが前記腫瘍細胞上のＢＣＭＡに結合する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記腫瘍細胞の前記細胞表面免疫チェックポイントタンパク質が、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＧＡＬ９、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２からなる群から選択される、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記第２の結合ドメインが、前記腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１に結合する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記第３の結合ドメインが、前記免疫細胞上のＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ８９、ＣＤ６４又はＣＤ３２ａに結合する、請求項５４〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記第３の結合ドメインが、前記免疫細胞上のＣＤ３に結合する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記癌が、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、黒色腫、ＥＢＶ関連癌及びＢ細胞リンパ腫、並びに白血病からなる群から選択される、請求項５４〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
腫瘍細胞の細胞表面タンパク質及び／又は腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に結合することができる抗原結合ドメインを特定するエクスビボ方法であって、前記方法が：
ａ）癌を患う患者から腫瘍細胞を単離することと；
ｂ）前記腫瘍細胞を抗原結合ドメインのパネルと接触させることと；
ｃ）前記抗原結合ドメインのそれらの標的抗原に対する結合親和性を決定することと；
ｄ）対照抗原結合ドメインに対してより弱い親和性を有する抗原結合ドメインを選択することと
を含む、方法。
【請求項６３】
ｅ）前記選択された抗原結合ドメインを三重特異性抗原結合タンパク質に組み込むステップを更に含む、請求項６２に記載のエクスビボ方法。
【請求項６４】
腫瘍細胞の細胞表面タンパク質及び腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質の一方又は両方に結合することができる抗原結合ドメインを特定するエクスビボ方法であって、前記方法が：
ａ）癌を患う患者から、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又は骨髄血漿細胞（ＰＣ）及び自家骨髄浸潤Ｔ細胞を単離することと；
ｂ）前記ＰＢＭＣ又はＰＣを三重特異性抗原結合タンパク質のパネルと接触させることであって、前記三重特異性抗原結合タンパク質の第１のドメインがＴ細胞上のＣＤ３に結合し、前記三重特異性抗原結合タンパク質の第２のドメインが腫瘍細胞の細胞表面タンパク質及び／又は腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に結合する、接触させることと；
ｃ）免疫介在性癌細胞殺傷に対する１つ以上の三重特異性抗原結合タンパク質の効果を測定することによって、癌細胞の薬物殺傷を決定することと；
ｄ）免疫介在性癌細胞殺傷を誘導するそれらの能力に基づいて前記三重特異性抗原結合タンパク質を選択することと、を含む、方法。
【請求項６５】
免疫介在性癌細胞殺傷に対する三重特異性抗原結合タンパク質の効果が、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出を含む、請求項６４に記載のエクスビボ方法。
【請求項６６】
免疫介在性癌細胞殺傷に対する三重特異性抗原結合タンパク質の効果が、枯渇した標的癌細胞の数を含む、請求項６４に記載のエクスビボ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、三重特異性抗原結合タンパク質の組成物及び作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
二重特異性Ｔ細胞結合因子は、ＣＤ３を介してＴ細胞を活性化し、腫瘍発現抗原にそれらを架橋し、免疫シナプス形成及び腫瘍細胞溶解を誘導する。二重特異性Ｔ細胞結合因子は、液体腫瘍を有する患者において治療的有効性を示している；しかしながら、それらは全ての患者に有益ではない。抗腫瘍免疫はＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路により媒介される免疫抑制によって制限され、既存の二重特異性Ｔ細胞結合因子から利益を得ない患者は、該患者のＴ細胞がＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を介してアネルギー化されるため非応答者であり得る。免疫チェックポイント分子、例えばＰＤ−Ｌ１を遮断するモノクローナル抗体の使用は、免疫系を腫瘍に向けるベースラインＴ細胞特異的免疫応答を増大させるのに役立ち得る。しかしながら、免疫チェックポイント分子の機能の混乱は、抑制されない免疫応答及び毒性を患者にもたらす免疫学的耐性の不均衡に繋がり得る。
【０００３】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及び癌細胞表面免疫チェックポイントの二重標的化は、治療的有効性を向上させ、主要な回避機構を制限し、腫瘍標的選択性を増大させ、低下した全身毒性及び改善された治療指数をもたらすと考えられる。にもかかわらず、これらの戦略は、典型的には、免疫チェックポイントに対する低下した親和性、及び腫瘍関連抗原に対する高い親和性に依存している。これらの戦略は、正常な組織上のＴＡＡの発現、又は、治療的抗体がインビボで、意図される腫瘍細胞標的に到達するのを妨げる「抗原シンク」を形成し得る細胞表面抗原の脱落に関連した問題に対処できていない（例えば、Ｐｉｃｃｉｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．ｍＡｂｓ，７（５）：９４６−９５６，２０１５；Ｈｅｒｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，１３２（２３）：２４８４−２４９４，２０１８参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
患者における免疫学的耐性及び毒性の不均衡を最小限にする一方で、腫瘍上の免疫チェックポイント分子を選択的に阻害すると共に、免疫細胞をより効率的に腫瘍に動員する能力を有する多重特異性抗体が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、腫瘍抗原及び免疫細胞動員抗原に対して特異性を有する三重特異性抗原結合タンパク質を提供する。
【０００６】
本発明は、ＣＤ３を介してＴ細胞に結合し及びＴ細胞を活性化し、腫瘍特異的抗原に結合し、免疫チェックポイント経路を阻害する三重特異性Ｔ細胞結合因子に関する。免疫系が細胞を無差別に攻撃することを防止するために、三重特異性抗原結合タンパク質は、免疫チェックポイントに低い親和性で結合して、ＰＤ−Ｌ１のような細胞表面免疫チェックポイントタンパク質からの急速な解離を可能にする。腫瘍関連抗原と免疫チェックポイントタンパク質ＰＤ−Ｌ１への同時結合は、アビディティーを付与し、腫瘍細胞上に存在する抗原への結合をもたらす。このことは、腫瘍細胞において優勢な抗原を有する及び有さない細胞のより良好な区別を可能にする。
【０００７】
更に、本発明は、ＰＤ−Ｌ１の親和性調節変異体のアレイと対にされた、低い親和性を有する抗腫瘍関連抗原部分から構成される三重特異性抗原結合タンパク質の能力における親和性とアビディティーとの組み合わされた役割を評価して、生理学的条件下での選択的な腫瘍標的化を促進する。
【０００８】
更に、本発明は、本発明の三重特異性抗原結合タンパク質の効率的な生成及び開発を可能にする、多機能性組換え抗原結合タンパク質フォーマットを記載する。これらの多機能性抗原結合タンパク質フォーマットは、Ｆａｂ断片の重鎖（Ｆｄ断片）及び軽鎖（Ｌ）の効率的なヘテロ二量体化特性を利用して足場を形成し、それに対して追加の機能が、ｓｃＦｖ及び単一ドメイン抗原結合タンパク質を含むがこれらに限定されない追加の結合剤によって組み込まれる。
【０００９】
本発明の一態様では、ａ）腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第１の結合ドメインと；ｂ）腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に結合することができる第２の結合ドメインと；ｃ）免疫細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第３の結合ドメインと：を含み、第１の結合ドメインは、低下した親和性で腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に結合して、非腫瘍細胞又は細胞表面タンパク質の可溶型への結合を抑制する、三重特異性抗原結合タンパク質が提供される。
【００１０】
本発明の一態様では、ａ）腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第１の結合ドメインと；ｂ）腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に結合することができる第２の結合ドメインと；ｃ）免疫細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第３の結合ドメインと：を含み、第１及び第２の結合ドメインは、低下した親和性で標的抗原に結合して、非腫瘍細胞への結合を抑制する、三重特異性抗原結合タンパク質が提供される。
【００１１】
特定の実施形態では、腫瘍細胞の細胞表面タンパク質は、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＥＡ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＰＳＭＡ、ＦＡＰ及びＨＥＲ２からなる群から選択される。
【００１２】
特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、腫瘍細胞上のＢＣＭＡに結合する。
【００１３】
特定の実施形態では、腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質は、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＧＡＬ９、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２からなる群から選択される。
【００１４】
特定の実施形態では、第２の結合ドメインは、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１に結合する。
【００１５】
特定の実施形態では、第３の結合ドメインは、免疫細胞上のＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ８９、ＣＤ６４又はＣＤ３２ａに結合する。
【００１６】
特定の実施形態では、第３の結合ドメインは、免疫細胞上のＣＤ３に結合する。
【００１７】
特定の実施形態では、第１の結合ドメインの親和性は、約１ｎＭ〜約１００ｎＭである。
【００１８】
特定の実施形態では、第２の結合ドメインの親和性は、約１ｎＭ〜約１００ｎＭである。
【００１９】
特定の実施形態では、第１の結合ドメインの親和性は、約１０ｎＭ〜約８０ｎＭである。
【００２０】
特定の実施形態では、第２の結合ドメインの親和性は、約１０ｎＭ〜約８０ｎＭである。
【００２１】
特定の実施形態では、第１及び第２の結合ドメインは、同じ細胞上の標的抗原に結合して、結合アビディティーを増大させる。
【００２２】
特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に対する低い親和性を有して、健康な細胞又は細胞表面タンパク質の可溶型への架橋を低減する。
【００２３】
特定の実施形態では、第２の結合ドメインは、腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に対する低い親和性を有して、健康な細胞への架橋を低減する。
【００２４】
特定の実施形態では、第１及び第２の結合ドメインは、各々、腫瘍細胞の標的抗原に対する低い親和性を有し、ここで三重特異性抗原結合タンパク質は、健康な細胞への架橋と比較して向上した腫瘍細胞への架橋を有する。
【００２５】
特定の実施形態では、第１及び第２の結合ドメインは、同じ細胞上の標的抗原に結合して、健康な組織への標的外結合を低減する。
【００２６】
特定の実施形態では、第１、第２及び第３の結合ドメインは、低下した標的外結合を有する。
【００２７】
特定の実施形態では、腫瘍細胞の細胞表面タンパク質は、健康な細胞上に存在しないか、又は腫瘍細胞と比較して発現が限定されている。
【００２８】
特定の実施形態では、第２の結合ドメインは、腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に対する低い親和性を有して、健康な細胞に対するチェックポイント阻害を低減する。
【００２９】
特定の実施形態では、第１、第２及び第３の結合ドメインは、抗体を含む。
【００３０】
特定の実施形態では、第１、第２及び第３の結合ドメインは、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ又はＦａｂ断片を含む。
【００３１】
特定の実施形態では、第２の結合ドメインは一価である。
【００３２】
特定の実施形態では、第３の結合ドメインは一価である。
【００３３】
特定の実施形態では、第１、第２及び第３の結合ドメインは、１つ以上のリンカーによって互いに連結されている。
【００３４】
特定の実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質は、約７５ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有する。
【００３５】
特定の実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質は、分子量≦約６０ｋＤａの抗原結合タンパク質と比較して増大した血清半減期を有する。
【００３６】
本発明の一態様では、ａ）腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第１の結合ドメインと；ｂ）腫瘍細胞の表面上のＰＤ−Ｌ１に結合することができる第２の結合ドメインと；ｃ）Ｔ細胞の表面上のＣＤ３に結合することができる第３の結合ドメインと：を含み、第１及び第２の結合ドメインは、低下した親和性で腫瘍細胞の細胞表面タンパク質及びＰＤ−Ｌ１に結合して、非腫瘍細胞への結合を抑制する、三重特異性抗原結合タンパク質が提供される。
【００３７】
特定の実施形態では、腫瘍細胞の細胞表面タンパク質は、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＥＡ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＰＳＭＡ、ＦＡＰ及びＨＥＲ２からなる群から選択される。
【００３８】
特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、腫瘍細胞上のＢＣＭＡに結合する。
【００３９】
特定の実施形態では、第１の結合ドメインの親和性は、約１ｎＭ〜約１００ｎＭである。
【００４０】
特定の実施形態では、第２の結合ドメインの親和性は、約１ｎＭ〜約１００ｎＭである。
【００４１】
特定の実施形態では、第１の結合ドメインの親和性は、約１０ｎＭ〜約８０ｎＭである。
【００４２】
特定の実施形態では、第２の結合ドメインの親和性は、約１ｎＭ〜約８０ｎＭである。
【００４３】
特定の実施形態では、第１及び第２の結合ドメインは、同じ細胞上の標的抗原に結合して、結合アビディティーを増大させる。
【００４４】
特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に対する低い親和性を有して、健康な細胞又は細胞表面タンパク質の可溶型への架橋を低減する。
【００４５】
特定の実施形態では、第２の結合ドメインは、腫瘍細胞の表面上のＰＤ−Ｌ１に対する低い親和性を有して、健康な細胞への架橋を低減する。
【００４６】
特定の実施形態では、第１及び第２の結合ドメインは、各々、腫瘍細胞の標的抗原に対する低い親和性を有し、ここで三重特異性抗原結合タンパク質は、健康な細胞への架橋と比較して向上した腫瘍細胞への架橋を有する。
【００４７】
特定の実施形態では、第１及び第２の結合ドメインは、同じ細胞上の標的抗原に結合して、健康な組織への標的外結合を低減する。
【００４８】
特定の実施形態では、第１、第２及び第３の結合ドメインは、低下した標的外結合を有する。
【００４９】
特定の実施形態では、腫瘍細胞の細胞表面タンパク質は、健康な細胞上に存在しないか、又は腫瘍細胞と比較して発現が限定されている。
【００５０】
特定の実施形態では、第２の結合ドメインは、腫瘍細胞の表面上のＰＤ−Ｌ１に対する低い親和性を有して、健康な細胞へのチェックポイント阻害を低減する。
【００５１】
特定の実施形態では、第１、第２及び第３の結合ドメインは、抗体を含む。
【００５２】
特定の実施形態では、第１、第２及び第３の結合ドメインは、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ又はＦａｂ断片を含む。
【００５３】
特定の実施形態では、第２の結合ドメインは一価である。
【００５４】
特定の実施形態では、第３の結合ドメインは一価である。
【００５５】
特定の実施形態では、第１、第２及び第３の結合ドメインは、１つ以上のリンカーによって互いに連結されている。
【００５６】
特定の実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質は、約７５ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有する。
【００５７】
特定の実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質は、分子量≦約６０ｋＤａの抗原結合タンパク質と比較して増大した血清半減期を有する。
【００５８】
本発明の一態様では、ａ）腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第１の抗体結合ドメインと；ｂ）腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に結合することができる第２の抗体結合ドメインと；ｃ）免疫細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第３の抗体結合ドメインと：を含む三重特異性抗原結合タンパク質が提供される。
【００５９】
本発明の一態様では、２つの異なる鎖を含み、ａ）一方の鎖は、少なくとも１つの追加の結合ドメインに連結されるＦａｂ断片の少なくとも１つの重鎖（Ｆｄ断片）を含み；ｂ）他方の鎖は、少なくとも１つの追加の結合ドメインに連結されるＦａｂ断片の少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含み、Ｆａｂドメインは、場合により、追加の結合ドメインが場合により連結される特異的なヘテロ二量体化足場として機能し、結合ドメインは、異なる特異性を有する、三重特異性抗原結合タンパク質が提供される。
【００６０】
特定の実施形態では、追加の結合ドメインは、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである。
【００６１】
特定の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、ｉ）腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第１の結合ドメインと；ｉｉ）腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に結合することができる第２の結合ドメインと；ｉｉｉ）免疫細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第３の結合ドメインと：を含む。
【００６２】
特定の実施形態では、追加の結合ドメインは、Ｆａｂ断片の重鎖又は軽鎖のＮ末端又はＣ末端に連結される。
【００６３】
本発明の一態様では、治療的有効量の三重特異性抗原結合タンパク質を対象に投与することを含む、対象における癌の処置方法が提供され、三重特異性抗原結合タンパク質は、ａ）腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第１の結合ドメインと；ｂ）腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に結合することができる第２の結合ドメインと；ｃ）免疫細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第３の結合ドメインと：を含み、第１及び第２の結合ドメインは、低下した親和性で標的抗原に結合して、非腫瘍細胞への結合を抑制する。
【００６４】
特定の実施形態では、腫瘍細胞の細胞表面タンパク質は、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＥＡ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＰＳＭＡ、ＦＡＰ及びＨＥＲ２からなる群から選択される。
【００６５】
特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、腫瘍細胞上のＢＣＭＡに結合する。
【００６６】
特定の実施形態では、腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質は、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＧＡＬ９、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２からなる群から選択される。
【００６７】
特定の実施形態では、第２の結合ドメインは、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１に結合する。
【００６８】
特定の実施形態では、第３の結合ドメインは、免疫細胞上のＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ８９、ＣＤ６４又はＣＤ３２ａに結合する。
【００６９】
特定の実施形態では、第３の結合ドメインは、免疫細胞上のＣＤ３に結合する。
【００７０】
特定の実施形態では、癌は、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、黒色腫、ＥＢＶ関連癌及びＢ細胞リンパ腫、並びに白血病からなる群から選択される。
【００７１】
本発明の一態様では、腫瘍細胞の細胞表面タンパク質及び／又は腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に結合することができる抗原結合ドメインを特定するエクスビボ方法が提供され、該方法は、ａ）癌を患う患者から腫瘍細胞を単離することと；ｂ）腫瘍細胞を抗原結合ドメインのパネルと接触させることと；ｃ）抗原結合ドメインのそれらの標的抗原に対する結合親和性を決定することと；ｄ）対照抗原結合ドメインに対してより弱い親和性を有する抗原結合ドメインを選択することと：を含む。
【００７２】
特定の実施形態では、エクスビボ方法は、ｅ）選択された抗原結合ドメインを三重特異性抗原結合タンパク質に組み込むステップを更に含む。
【００７３】
本発明の一態様では、腫瘍細胞の細胞表面タンパク質及び腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質の一方又は両方に結合することができる抗原結合ドメインを特定するエクスビボ方法が提供され、該方法は、ａ）癌を患う患者から、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又は骨髄血漿細胞（ＰＣ）及び自家骨髄浸潤Ｔ細胞を単離することと；ｂ）ＰＢＭＣ又はＰＣを三重特異性抗原結合タンパク質のパネルと接触させることであって、三重特異性抗原結合タンパク質の第１のドメインはＴ細胞上のＣＤ３に結合し、三重特異性抗原結合タンパク質の第２のドメインは腫瘍細胞の細胞表面タンパク質及び／又は腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に結合する、接触させることと；ｃ）免疫介在性癌細胞殺傷に対する１つ以上の三重特異性抗原結合タンパク質の効果を測定することによって、癌細胞の薬物殺傷を決定することと；ｄ）免疫介在性癌細胞殺傷を誘導するそれらの能力に基づいて三重特異性抗原結合タンパク質を選択することと：を含む。
【００７４】
特定の実施形態では、免疫介在性癌細胞殺傷に対する三重特異性抗原結合タンパク質の効果は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出を含む。
【００７５】
特定の実施形態では、免疫介在性癌細胞殺傷に対する三重特異性抗原結合タンパク質の効果は、枯渇した標的癌細胞の数を含む。
【００７６】
本発明の前述及び他の特徴及び利点は、付随する図面を伴う以下の説明的な実施形態の詳細な記載からより深く理解されるであろう。特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を有する本特許又は特許出願公開の複製は、要求に応じて、必要な手数料を支払うことによって事務所（Ｏｆｆｉｃｅ）により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本発明の三重特異性抗原結合タンパク質の交換可能な性質を概略的に示す。
【図２】細胞培養液中で発現した８つの異なる多重特異性抗原結合コンストラクトに関する分子量（ｋＤａ）、濃度（ｍｇ／ｍＬ）、純度（％モノマー）及び収率（ｍｇ／Ｌ発現培養液）を示す。
【図３】分析サイズ排除クロマトグラフィーにより測定された、細胞培養液中で発現した４つの異なる多重特異性抗原結合コンストラクトの純度を示す。
【図４Ａ−Ｃ】ＣＤ３（図４Ａ）、ＢＣＭＡ（図４Ｂ）及びＰＤ−Ｌ１（図４Ｃ）に対するＢＣＭＡ−ＰＤ−Ｌ１−ＣＤ３三重特異性抗原結合タンパク質のＥＬＩＳＡ結合データを示す。
【図５】ＢＣＭＡ−ＣＤ３に対する三重特異性及び二重特異性抗体の同時結合のＥＬＩＳＡデータを示す。
【図６】ＣＤＲ１−００５のＣＤ３結合アームがＴ細胞活性化を誘導する能力を示す。Ｔ細胞増殖は、固定化抗ＣＤ３（プレート表面上）と共に４８時間インキュベートしたＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に関して定量化された。このインキュベーション期間後、ＷＳＴ−１試薬を加え、形成されたホルマザン染料を５時間まで定量化した。
【図７】ＣＤＲ１−００７が、Ｈ９２９骨髄腫細胞の結合時にＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の用量依存的な活性化を誘導したが、癌細胞の非存在下（Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞＋ＨＥＫ２９３細胞）では誘導しなかったことを示す。Ｔ細胞活性化はＩＬ−２サイトカイン産生により測定され、Ｔ細胞活性化の一般的な陽性対照としてフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を使用した。
【図８】二重特異性ＣＤＲ１−００８タンデムｓｃＦｖ  ＢＣＭＡ／ＣＤ３と比較した、三重特異性ＣＤＲ１−００７で処理時の、Ｈ９２９骨髄腫細胞と共に共培養した後にヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＴ細胞の増大した活性化を示す。Ｔ細胞活性化は、ＩＬ−２サイトカイン産生により測定した。
【図９Ａ−Ｂ】三重特異性ＣＤＲ１−００７及び二重特異性ＣＤＲ１−００８タンデムｓｃＦｖ  ＢＣＭＡ／ＣＤ３（図９Ａ）並びに三重特異性ＣＤＲ１−００７及び二重特異性ＣＤＲ１−０２０  ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ３（図９Ｂ）により媒介された、Ｈ９２９骨髄腫細胞の再指向されたＴ細胞殺傷の直接比較を示す。Ｈ９２９骨髄腫細胞の再指向されたＴ細胞殺傷は、乳糖デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイにより決定した。
【図１０Ａ−Ｂ】三重特異性Ｆａｂ−ｓｃＦｖ分子のＢＣＭＡ−ＰＤ−Ｌ１（図１０Ａ）又はＢＣＭＡ−ＣＤ３（図１０Ｂ）のいずれかに対する同時結合のＥＬＩＳＡデータを示す。各結合部位は、異なる位置で評価された。
【図１１Ａ−Ｂ】代替的な三重特異性フォーマット及び代替的な結合配列のＢＣＭＡ−ＰＤ−Ｌ１（図１１Ａ）又はＢＣＭＡ−ＣＤ３（図１１Ｂ）のいずれかに対する同時結合のＥＬＩＳＡデータを示す。
【図１２Ａ−Ｂ】各結合部位が異なる位置で評価される、Ｈ９２９骨髄腫細胞により媒介される三重特異性Ｆａｂ−ｓｃＦｖ分子の再指向されたＴ細胞殺傷の比較（図１２Ａ）、並びに代替的な三重特異性フォーマット及び代替的な結合配列（図１２Ｂ）を示す。Ｈ９２９骨髄腫細胞の再指向されたＴ細胞殺傷は、乳糖デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイにより決定した。
【図１３】抗体の連続希釈物を使用してＥＬＩＳＡにより測定した、固定化ヒトＰＤ−Ｌ１に対する非常に様々な結合プロファイルを有する三重特異性抗体の収集物を示す。
【図１４Ａ−Ｂ】三重特異性ＣＤＲ１−００７及びＣＤＲ１−０１１（図１４Ａ）並びに三重特異性ＣＤＲ１−００７及びＣＤＲ１−０１７（図１４Ｂ）により媒介されたＨ９２９骨髄腫細胞の濃度依存性殺傷の直接比較を示す。用いたエフェクターと標的細胞の比は、５：１（Ｔ細胞：Ｈ９２９細胞）であった。細胞を化合物と共に２４時間インキュベートした後、細胞培地中に放出されたＬＤＨを測定した。
【図１５】三重特異性抗体の画像ベースのエクスビボ試験に使用された異なる多発性骨髄腫患者の骨髄サンプル中の異なる細胞集団の百分率を示す。
【図１６Ａ−Ｃ】多発性骨髄腫患者からの骨髄組織においてエクスビボで評価した、ＰＤ−Ｌ１に対する異なる親和性を有する三重特異性抗体が、Ｔ細胞と正常細胞の架橋を回避する能力を示す。新たに診断された多発性骨髄腫患者（図１６Ａ）、再発多発性骨髄腫患者（図１６Ｂ）及び多再発多発性骨髄腫患者（図１６Ｃ）からのサンプルを使用した。
【図１７Ａ−Ｃ】二重特異性対照及び二重特異性対照と抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせと比較した、新たに診断された（図１７Ａ）、再発（図１７Ｂ）及び多再発（図１７Ｃ）多発性骨髄腫患者からのＴ細胞を活性化する三重特異性ＣＤＲ１−０１７の能力を示す。
【図１８】示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）により決定した三重特異性分子の熱安定性を示す。
【図１９Ａ−Ｂ】３７℃における高濃度のＣＤＲ１−００７（図１９Ａ）、ＣＤＲ１−０１１（図１９Ｂ）、ＣＤＲ１−０１７（図１９Ｃ）に関する安定性データを示す。
【図２０Ａ−Ｂ】ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞、並びに癌細胞株Ｈ９２９細胞（図２０Ａ）、Ｒａｊｉ細胞（図２０Ｂ）及びＨＣＴ１１６細胞（図２０Ｃ）に対する結合時に三重特異性及び二重特異性抗体がＩＬ−２サイトカイン産生を誘導する能力を示す。
【図２１Ａ−Ｂ】様々な三重特異性及び二重特異性抗体（図２１Ａ）並びに対応する説明図（図２１Ｂ）を概略的に示す。
【図２２】三重特異性ＣＤＲ１−０１７が、ＣＤ１３８又はＣＤ２６９、ＣＤ３１９に関して染色された標的細胞集団にＣＤ３＋Ｔ細胞を再指向させる能力を示す。ＣＤＲ１−０１７は、中実四角形で表され、二重特異性対照、ＣＤＲ１−００８は、中空四角形で表される。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
ｉ）腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第１の結合ドメインと；ｉｉ）腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に結合することができる第２の結合ドメインと；ｉｉｉ）免疫細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第３の結合ドメインと：を有する三重特異性抗原結合タンパク質が提供される。三重特異性抗原結合タンパク質を生成し、スクリーニングする方法も提供される。三重特異性抗原結合タンパク質を用いた癌の処置方法又は標的腫瘍細胞殺傷も提供される。
【００７９】
特定の態様では、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、第１の結合ドメインにより標的化される腫瘍細胞表面タンパク質に対して低い親和性を有し、第２の結合ドメインにより標的化される腫瘍細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に対して低い親和性を有する。低い親和性の相互作用は、腫瘍細胞又は組織と比較して、健康な組織に対する三重特異性抗原結合タンパク質の標的外結合を低減する。
【００８０】
特定の態様では、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、第１の結合ドメインにより標的化される腫瘍細胞表面タンパク質及び第２の結合ドメインにより標的化される腫瘍細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に対して増大したアビディティーを有する。増大したアビディティーは、両方の細胞表面タンパク質が同じ細胞上に存在する場合に生じる。増大したアビディティーの相互作用は、健康な組織に対する三重特異性抗原結合タンパク質の標的外結合を低減し、標的腫瘍細胞への優先的な結合を確実にする（例えば、Ｐｉｃｃｉｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．ｍＡｂｓ，７（５）：９４６−９５６，２０１５；Ｋｌｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１（１）：７１−７５，２０１３参照）。
【００８１】
本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質は、本質的にモジュラーであるように設計されている。三重特異性抗原結合タンパク質は、腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に結合することができる第２の結合ドメインと免疫細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第３の結合ドメインとを含む不変のコア領域を含んでもよい。このコア二重特異性抗原結合タンパク質は、腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる、追加の第１の結合ドメインを有し得る。コア領域は不変のままであるが、第１の結合ドメインは、処置される癌タイプ又は標的化される腫瘍細胞に応じて変更され得る。例示的な実施形態では、コア領域は、腫瘍細胞の表面上のＰＤ−Ｌ１に結合することができる第２の結合ドメインと、Ｔ細胞の表面上のＣＤ３に結合することができる第３の結合ドメインとを有する。例示的な実施形態では、モジュラーな第１の結合ドメインは、腫瘍細胞の表面上のＢＣＭＡに結合することができる。
【００８２】
一般に、本明細書に記載される細胞及び組織培養液、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及びタンパク質及び核酸化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法は周知であり、当該技術分野にて一般に使用されている。本明細書に提供される方法及び技術は、一般に、特に示されない限り、当該技術分野で周知の従来の方法、並びに本明細書全体において引用及び考察される一般的な及びより特定の参照に記載されているように行われる。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様書に従って、当該技術分野で通常達成され、又は本明細書に記載されるように行われる。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、並びに医薬品（ｍｅｄｉｃｉｎｅ）及び薬（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）化学に関連して使用される命名法、並びにそれらの研究室手順及び技術は周知であり、当該技術分野で通常使用されている。化学合成、化学分析、医薬製剤、調製及び送達、並びに患者の処置に、標準的な技術が使用される。
【００８３】
本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用される科学及び技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有する。任意の潜在的な曖昧さが存在する場合、本明細書に提供される定義が、任意の辞書又は外部の定義に先行する。文脈が特に必要としない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含むものとする。「又は」の使用は、特に明記しない限り「及び／又は」を意味する。用語「含んでいる」、並びに例えば「含む」及び「含まれる」等の他の形態の使用は、限定をするものではない。
【００８４】
本発明がより容易に理解され得るために、最初に特定の用語が定義される。
【００８５】
抗原結合タンパク質
本明細書で使用される場合、用語「抗体」又は「抗原結合タンパク質」は、抗原又はエピトープに特異的に結合し、又は免疫学的に反応する免疫グロブリン分子を指し、ポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方、並びに、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）及び単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディー）断片を含むがこれらに限定されない機能的抗体断片を含む。用語「抗体」は、免疫グロブリンの遺伝学的に操作された、又は別様に修飾された形態、例えばイントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、タンデムジ−ｓｃＦｖ、タンデムトリ−ｓｃＦｖ）等を含む。特に明記しない限り、用語「抗体」は、その機能的抗体断片を包含すると理解するべきである。
【００８６】
本明細書で使用されるＦａｂ断片は、軽鎖（ＣＬ）の可変軽（ＶＬ）ドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖断片と、重鎖の可変重（ＶＨ）ドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む抗体断片である。
【００８７】
本明細書で使用される場合、用語「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」は、抗原特異性及び結合親和性を付与する、抗体可変領域内のアミノ酸の不連続配列を指す。一般に、各重鎖可変領域内に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３）が存在し、各軽鎖可変領域内に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３）が存在する。「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」は、当該技術分野では、重鎖及び軽鎖の可変領域の非ＣＤＲ部分を指すことが知られている。一般に、各重鎖可変領域内に４つのＦＲ（ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３及びＦＲ−Ｈ４）が存在し、各軽鎖可変領域内に４つのＦＲ（ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３及びＦＲ−Ｌ４）が存在する。
【００８８】
所定のＣＤＲ又はＦＲのアミノ酸配列の正確な境界は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，」  ５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ  ２７３，９２７−９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６），「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｃｏｎｔａｃｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ，」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２，７３２−７４５．（「Ｃｏｎｔａｃｔ」番号付けスキーム）、Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｍ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，「ＩＭＧＴ  ｕｎｉｑｕｅ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｖ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ，」Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３  Ｊａｎｕａｒｙ；２７（１）：５５−７７（「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）、及びＨｏｎｅｇｇｅｒ  Ａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ，「Ｙｅｔ  ａｎｏｔｈｅｒ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌ，」Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２００１  Ｊｕｎ．８；３０９（３）：６５７−７０、（ＡＨｏ番号付けスキーム）により記載されたものを含む、複数の周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定することができる。
【００８９】
所定のＣＤＲ又はＦＲの境界は、特定に使用されるスキームに応じて変動し得る。例えば、Ｋａｂａｔスキームは構造的アラインメントに基づく一方、Ｃｈｏｔｈｉａスキームは構造的情報に基づく。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａスキームの両方の番号付けは、最も一般的な抗体領域配列の長さに基づき、挿入は挿入文字、例えば「３０ａ」によって収容され、いくつかの抗体内に削除が出現する。２つのスキームは、異なる位置に特定の挿入及び削除（「ｉｎｄｅｌ」）を配置し、特異の番号付けをもたらす。Ｃｏｎｔａｃｔスキームは、複合体結晶構造の分析に基づき、多くの点でＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームと類似している。
【００９０】
従って、特に指定しない限り、所定の抗体又はその領域、例えばその可変領域の「ＣＤＲ」若しくは「相補性決定領域」、又は個々の特定されたＣＤＲ（例えば、「ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２）は、既知のスキームのいずれかにより定義される１つの（又は特異的な）相補性決定領域を包含すると理解するべきである。同様に、特に指定しない限り、所定の抗体又はその領域、例えばその可変領域の「ＦＲ」若しくは「フレームワーク領域」、又は個々の特定されたＦＲ（例えば、「ＦＲ−Ｈ１」、「ＦＲ−Ｈ２」は、既知のスキームのいずれかにより定義される１つの（又は特異的な）フレームワーク領域を包含すると理解するべきである。ある場合には、例えばＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＣｏｎｔａｃｔ方法により定義されるＣＤＲ等、特定のＣＤＲ又はＦＲの特定に関するスキームが明示される。他の場合では、ＣＤＲ又はＦＲの特定のアミノ酸配列が付与される。
【００９１】
本明細書で使用される場合、用語「親和性」は、抗体の抗原結合部位と、それが結合するエピトープとの間の相互作用の強度を指す。当業者が容易に理解するように、抗体又は抗原結合タンパク質親和性は、解離定数（ＫＤ）としてモル濃度（Ｍ）で報告され得る。多くの抗体は、１０−６〜１０−９Ｍの範囲のＫＤ値を有する。高親和性抗体は、１０−９Ｍ（１ナノモル、ｎＭ）以下のＫＤ値を有する。例えば、高親和性抗体は、約１ｎＭ〜約０．０１ｎＭの範囲のＫＤ値を有し得る。高親和性抗体は、約１ｎＭ、約０．９ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．７ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．２ｎＭ又は約０．１ｎＭのＫＤ値を有し得る。超高親和性抗体は、１０−１２Ｍ（１ピコモル、ｐＭ）以下のＫＤ値を有する。
【００９２】
低〜中親和性抗体は、約１０−９Ｍ（１ナノモル、ｎＭ）を超えるＫＤ値を有する。例えば、低〜中親和性抗体は、約１ｎＭ〜約１００ｎＭの範囲のＫＤ値を有し得る。低親和性抗体は、約１０ｎＭ〜約１００ｎＭの範囲のＫＤ値を有し得る。低親和性抗体は、約１０ｎＭ〜約８０ｎＭの範囲のＫＤ値を有し得る。低親和性抗体は、約１０ｎＭ、約１５ｎＭ、約２０ｎＭ、約２５ｎＭ、約３０ｎＭ、約３５ｎＭ、約４０ｎＭ、約４５ｎＭ、約５０ｎＭ、約５５ｎＭ、約６０ｎＭ、約６５ｎＭ、約７０ｎＭ、約７５ｎＭ、約８０ｎＭ、約８５ｎＭ、約９０ｎＭ、約９５ｎＭ、約１００ｎＭ又は１００ｎＭ超のＫＤ値を有し得る。
【００９３】
本発明の抗原結合ドメインは、それらの標的抗原に対して約１０−４Ｍ、約１０−４Ｍ、約１０−５Ｍ、約１０−６Ｍ、約１０−７Ｍ、約１０−８Ｍ、約１０−９Ｍ、約１０−１０Ｍ、約１０−１１Ｍ、約１０−１２Ｍ又は約１０−１３Ｍの結合親和性を有し得る。
【００９４】
抗原結合ドメインが特異的な抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は当業者が精通した他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機器で分析）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ  Ｊ  １７，３２３−３２９（２０００））、及び伝統的な結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｓ  ２８，２１７−２２９（２００２））により測定することができる。
【００９５】
本明細書で使用される場合、用語「アビディティー」は、抗体−抗原相互作用の全体的な強度を指す。アビディティーは、個々の非共有結合相互作用の複数の親和性の累積強度である。同時結合相互作用の数が増大すると共に、総結合アビディティーが増大し、それにより、より安定な相互作用がもたらされる。
【００９６】
本発明の三重特異性抗原結合タンパク質は、三重特異性抗原結合タンパク質のドメインを連結するための１つ以上のリンカーを含み得る。三重特異性抗原結合タンパク質は、Ｆａｂ鎖を２つのｓｃＦｖｓに共有結合的に接続する２つの可撓性ペプチドリンカーを含み得る。Ｆａｂ鎖とｓｃＦｖｓを接続するリンカーは、非免疫原性であると考えられるグリシン−セリン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）から構成されてもよい。
【００９７】
リンカーの実例的な例としては、グリシンポリマー（Ｇｌｙ）ｎ；グリシン−セリンポリマー（ＧｌｙｎＳｅｒ）ｎ（ここでｎは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７又は８の整数である）；グリシン−アラニンポリマー；アラニン−セリンポリマー；及び当該技術分野で既知の他の可撓性リンカーが挙げられる。
【００９８】
グリシン及びグリシン−セリンポリマーは比較的構造化されていないため、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質のような融合タンパク質のドメイン間の中性テザーとして機能することが可能であり得る。グリシンは他の小さい側鎖のアミノ酸と比較してｐｈｉ−ｐｓｉ空間に有意に接近し、より長い側鎖を有する残基よりも遥かに制限されていない（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１：１１７３−１４２（１９９２））。当業者は、特定の実施形態における三重特異性抗原結合タンパク質の設計が、全部又は一部が可撓性であるリンカーを含んでもよく、例えばリンカーは、可撓性リンカーストレッチと、所望の構造を提供するために比較的低い可撓性を与える１つ以上のストレッチとを含み得ることを認めるであろう。
【００９９】
しかしながら、リンカー配列は、例えば、ヒトＣＨ１及びＣκ配列の始まりに対応するアミノ酸ストレッチ、又はヒトＩｇＧのヒンジ領域の下部に対応するアミノ酸ストレッチを使用して、天然リンカー配列に類似するように選択され得る。
【０１００】
ｓｃＦｖ部分内のＶＬとＶＨドメインを接続するペプチドリンカーの設計は可撓性リンカーであり、これは一般に、小さい非極性又は極性残基、例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ及びＴｈｒ等から構成される。ｓｃＦｖ部分の可変ドメインを接続する特に例示的なリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーであり、ここで４はモチーフの反復の例示的な数である。
【０１０１】
他の例示的なリンカーとしては、以下のアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない：ＧＧＧ；ＤＧＧＧＳ；ＴＧＥＫＰ（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：５５２５−５５３０（１９９７））；ＧＧＲＲ；（ＧＧＧＧＳ）ｎ、ここでｎ＝１、２、３、４又は５（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１１５６−１１６０（１９９６））；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：１０６６−１０７０（１９９０））；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８））、ＧＧＲＲＧＧＧＳ；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ；及びＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，１０１（４）：１６３７−１６４４（２００３））。あるいは、可撓性リンカーは、タンパク質及びペプチドの３Ｄ構造をモデリングすることができるコンピュータープログラムを使用して、又はファージディスプレイ方法により、合理的に設計することができる。
【０１０２】
多重特異性抗原結合フォーマット
本発明の一実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質は、少なくとも１つのＦａｂドメインを含む。Ｆａｂドメインは、追加の結合ドメインが連結され得る特異的なヘテロ二量体化足場として機能し得る。Ｆａｂ断片の重鎖（Ｆｄ断片）及び軽鎖（Ｌ）の天然の及び効率的なヘテロ二量体化特性は、Ｆａｂ断片を理想的な足場とする。追加の結合ドメインは、別のＦａｂドメイン、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂを含むがこれらに限定されない数個の異なるフォーマットにあり得る。
【０１０３】
Ｆａｂ断片の各鎖は、追加の結合ドメインを用いてＮ又はＣ末端で延長することができる。鎖は、哺乳動物細胞内で共発現されてもよく、ここで宿主細胞結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）シャペロンが重鎖−軽鎖ヘテロ二量体（Ｆｄ：Ｌ）の形成を駆動する。これらのヘテロ二量体は安定であり、結合剤の各々は、それらの特異的親和性を保持する。そのような三重特異性抗原結合タンパク質の生成に関する例示的な実施形態では、上記の結合部位の少なくとも１つは、特異的なヘテロ二量体化足場としても機能するＦａｂ断片である。次いで、２つの残りの結合部位は、ｓｃＦｖｓ又はｓｄＡｂｓとして、異なるＦａｂ鎖に融合され、ここで各鎖は、例えば、追加のｓｃＦｖ又はｓｄＡｂドメインを用いてＣ末端で延長することができる（例えば、Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６５（１２）：７０５０−７０５７，２０００；Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１７：１９３−２０２，２００１参照）。
【０１０４】
腫瘍抗原及びＴ細胞動員抗原（例えば、ＣＤ３）に対する結合特異性を有する２つのＦａｂドメインを含む多重特異性抗原結合タンパク質は、記載されている（例えば、米国特許第２０１５０２７４８４５  Ａ１号明細書参照）。
【０１０５】
本発明の三重特異性抗原結合タンパク質足場の利点は、約７５〜１００ｋＤａの中間分子サイズである。ブリナツモマブ、二重特異性Ｔ細胞結合因子（ＢｉＴＥ）は、再発又は難治性急性リンパ性白血病を有する患者において卓越した結果を示している。その小さいサイズ（６０ｋＤａ）のために、ブリナツモマブは数時間の短い血清半減期により特徴付けられ、従って連続注入が必要である（米国特許第７，１１２，３２４  Ｂ１号明細書参照）。本発明の三重特異性抗原結合タンパク質は、より小さい二重特異性抗体、例えばブリナツモマブのようなＢｉＴＥと比較して有意に長い半減期を有し、従って、それらの好ましい半減期により連続注入を必要としないことが期待される。中間サイズの分子は、腎臓クリアランスを回避し、改善された腫瘍蓄積に十分な半減期を提供し得る。本発明の三重特異性抗原結合タンパク質は、他の小さい二重特異性フォーマットと比較して、増大した血漿半減期を有する一方で、尚、腫瘍浸透能力を保持する。
【０１０６】
ヘテロ二量体化単位としてＦａｂｓを使用する追加の利点は、Ｆａｂ分子は血清中に豊富に存在するため、対象に投与された際に非免疫原性であり得ることである。
【０１０７】
例示的な二重特異性及び三重特異性抗原結合タンパク質配列を下記の表１に列挙する。配列は、図２及び図２１Ａ〜図２１Ｂの抗原結合タンパク質に対応する。
【０１０８】
【表１】
2021515806.tif 000002
【０１０９】
【表２】
2021515806.tif 000003
【０１１０】
【表３】
2021515806.tif 000004
【０１１１】
【表４】
2021515806.tif 000005
【０１１２】
【表５】
2021515806.tif 000006
【０１１３】
【表６】
2021515806.tif 000007
【０１１４】
【表７】
2021515806.tif 000008
【０１１５】
【表８】
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【０１１６】
【表９】
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【０１１７】
【表１０】
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【０１１８】
【表１１】
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【０１１９】
【表１２】
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【０１２０】
【表１３】
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【０１２１】
【表１４】
2021515806.tif 000015
【０１２２】
追加の例示的な三重特異性フォーマットも使用することができる。例えば、三重特異性Ｔ細胞活性化コンストラクト（Ｔｒｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  Ｃｅｌｌ−Ａｃｔｉａｔｉｏｎｇ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）（ＴｒｉＴＡＣ）フォーマットを使用することができる。ＴｒｉＴＡＣフォーマットは、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ及びＦａｂドメインの混合物を含むが、３つのドメインの全てが１つの抗体分子中で使用されなくてもよい。ＴｒｉＴＡＣフォーマット抗体は、少なくとも１つの半減期延長ドメイン、例えば、ヒト血清アルブミン結合ドメインを含んでもよい。ＴｒｉＴＡＣフォーマット及び例示的なＴｒｉＴＡＣ抗体の例は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６１８７５９４号パンフレット及び国際公開第２０１８０７１７７７Ａ１号パンフレットに更に記載されている。
【０１２３】
腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に対する結合ドメイン
腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第１の結合ドメインを有する三重特異性抗原結合タンパク質が提供される。三重特異性抗原結合タンパク質の第１の結合ドメインは、細胞表面タンパク質の活性を阻害することができ、免疫細胞を腫瘍細胞に特異的に動員する手段として機能する。標的化され得る腫瘍細胞上の細胞表面タンパク質の例としては、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＥＡ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＰＳＭＡ、ＦＡＰ及びＨＥＲ２が挙げられるがこれらに限定されない。例示的な腫瘍細胞タンパク質はＢＣＭＡである。
【０１２４】
腫瘍細胞上の細胞表面タンパク質に対する結合特異性を有する二重特異性抗原結合タンパク質の例としては、米国特許第２０１３０２７３０５５  Ａ１号明細書、米国特許第９，１５０，６６４  Ｂ２号明細書、米国特許第２０１５０３６８３５１  Ａ１号明細書、米国特許第２０１７０２１８０７７  Ａ１号明細書、Ｈｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｅｕｋｅｎｍｉａ，３１：１７４３−１７５１（２０１７））、及びＳｅｃｋｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，３１（３）：３９６−４１０（２０１７））が挙げられる。
【０１２５】
三重特異性抗原結合タンパク質の第１の結合ドメインの結合親和性は、非腫瘍又は健康な組織への三重特異性抗原結合タンパク質の標的外結合を低減するために低いものであり得る。第１の結合ドメインの結合親和性は、約１ｎＭ〜約１００ｎＭの範囲であり得る。第１の結合ドメインの結合親和性は、約１ｎＭ〜約８０ｎＭの範囲であり得る。第１の結合ドメインの結合親和性は、約１０ｎＭ〜約８０ｎＭの範囲であり得る。
【０１２６】
ＢＣＭＡ抗原結合ドメイン配列は、下記の表２と、腫瘍細胞上の細胞表面タンパク質に結合することができる結合ドメインの例として国際公開第２０１６０９４３０４号パンフレット及び国際公開第２０１０１０４９４９号パンフレットとに列挙されている。配列は、三重特異性抗原結合タンパク質の一部として、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂフォーマットのいずれかで使用され得る。
【０１２７】
【表１５】
2021515806.tif 000016
【０１２８】
腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に対する結合ドメイン
腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に結合することができる第２の結合ドメインを有する三重特異性抗原結合タンパク質が提供される。三重特異性抗原結合タンパク質の第２の結合ドメインは、細胞表面免疫チェックポイントタンパク質の活性を阻害することができ、それにより、排除されるべき標的腫瘍細胞の免疫抑制シグナルを阻害する。標的化され得る腫瘍細胞上の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質の例としては、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＧＡＬ９、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２が挙げられるがこれらに限定されない。例示的な免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ−Ｌ１である。
【０１２９】
例示的な実施形態では、本発明の三重特異性抗原結合タンパク質は、腫瘍細胞の細胞表面上のＰＤ−Ｌ１に結合する。プログラム細胞死受容体１は、活性化Ｔ細胞上で誘導される阻害受容体であり、消耗したＴ細胞上で発現される。ＰＤ１−ＰＤ−Ｌ１相互作用は、少なくとも部分的に免疫機能障害の状態の原因であり得、また、ブリナツモマブ療法から利益を得ない増大したレベルのＰＤ−Ｌ１を有する急性リンパ性白血病患者における、低下したＢｉＴＥ有効性に関与している（Ｋｒｕｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，３０（２）：４８４−４９１（２０１６））。
【０１３０】
三重特異性抗原結合タンパク質の第２の結合ドメインは、標的からの急速な解離を可能にするように、低い親和性で細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に結合するように設計される。この方法で、三重特異性抗原結合タンパク質は、健康な組織上の免疫チェックポイントタンパク質と結合しない可能性があり、それによりオフターゲット効果を回避する。
【０１３１】
三重特異性抗原結合タンパク質の第２の結合ドメインの結合親和性は、約１ｎＭ〜約１００ｎＭの範囲であり得る。第１の結合ドメインの結合親和性は、約１ｎＭ〜約８０ｎＭの範囲であり得る。第１の結合ドメインの結合親和性は、約１０ｎＭ〜約８０ｎＭの範囲であり得る。
【０１３２】
腫瘍細胞上の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に対して結合特異性を有する二重特異性抗原結合タンパク質の例としては、国際公開第２０１７１０６４５３  Ａ１号パンフレット、国際公開第２０１７２０１２８１  Ａ１号パンフレット及びＨｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，８：５７９６４，２０１７が挙げられる。
【０１３３】
ＰＤ−Ｌ１抗原結合ドメイン配列は、下記の表３と、腫瘍細胞上の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質に結合することができる結合ドメインの例として国際公開第２０１７１４７３８３号パンフレット及び米国特許第２０１３０１２２０１４  Ａ１号明細書とに列挙されている。配列は、三重特異性抗原結合タンパク質の一部として、Ｆａｂ又はｓｃＦｖフォーマットのいずれかで使用され得る。
【０１３４】
【表１６】
2021515806.tif 000017
【０１３５】
免疫細胞の細胞表面タンパク質に対する結合ドメイン
免疫細胞の細胞表面タンパク質に結合することができる第３の結合ドメインを有する三重特異性抗原結合タンパク質が提供される。三重特異性抗原結合タンパク質の第３の結合ドメインは、排除されるべき標的腫瘍細胞に免疫細胞を特異的に動員することができる。動員され得る免疫細胞の例としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、好中球細胞、単球及びマクロファージが挙げられるが、これらに限定されない。免疫細胞の動員に使用され得る表面タンパク質の例としては、ＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ８９、ＣＤ６４及びＣＤ３２ａが挙げられるが、これらに限定されない。免疫細胞の例示的な細胞表面タンパク質の例は、ＣＤ３である。
【０１３６】
例示的なＣＤ３抗原結合ドメインは、下記の表４と、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６０８６１９６号パンフレット及び国際公開第２０１７２０１４９３号パンフレットとに列挙されている。
【０１３７】
【表１７】
2021515806.tif 000018
【０１３８】
腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質及び腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に対する低下した結合親和性
三重特異性抗原結合タンパク質は、標的腫瘍細胞の細胞表面タンパク質（例えば、ＢＣＭＡ）に対する低下した結合親和性及び標的腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質（例えば、ＰＤ−Ｌ１）に対する低下した結合親和性を有する。個々の各結合ドメインの結合親和性は、三重特異性抗原結合タンパク質が非腫瘍又は健康な組織に対して低下した標的外結合を有し得るようなものである。標的に対する（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）結合は、標的腫瘍細胞が標的免疫チェックポイントタンパク質及び標的細胞表面タンパク質の両方を発現している場合に改善される。２つのドメインの組み合わされた結合アビディティーは、三重特異性抗原結合タンパク質が、健康な組織よりも特異的に、両方の抗原を発現する標的腫瘍に結合する筈であるようなものである。三重特異性抗原結合タンパク質は、標的腫瘍への生産的結合を達成するために、標的腫瘍細胞の細胞表面タンパク質への高親和性結合に依存する必要はない。例として、限定するものではないが、ＢＣＭＡは、腫瘍細胞の表面上に、及び細胞表面抗原ＢＣＭＡの可溶型として見出され得る。ＢＣＭＡは、膜貫通領域にてγ−セクレターゼにより切断され、ＢＣＭＡ細胞外ドメインの可溶型（ｓＢＣＭＡ）をもたらす。ｓＢＣＭＡは、リガンドＡＰＲＩＬのデコイとして作用し得、細胞表面抗原ＢＣＭＡのこの血清可溶型は、抗体−抗原シンクをもたらす可能性がある。従って、高親和性抗ＢＣＭＡ抗体は、低親和性抗体よりもｓＢＣＭＡ干渉を受けやすい可能性がある（例えば、Ｔａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．７（１１）：１１８７−１１９９，２０１５及びＳａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．１５８（６）；７２７７３８，２０１２参照）。拡大すると、標的腫瘍細胞上の他の細胞表面タンパク質も、非腫瘍細胞の表面上に発現し得る。非腫瘍細胞上の細胞表面タンパク質の存在は、抗体−抗原シンクとして作用し得、腫瘍細胞への結合に利用可能な抗体の量を低下させる。従って、本明細書に開示される三重特異性抗原結合タンパク質のような治療的抗体は、細胞表面タンパク質に対して低い又は中程度の結合親和性を有する場合、抗体−抗原シンクの影響を受けにくい可能性がある。この同じ原理が標的腫瘍細胞の細胞表面免疫チェックポイントタンパク質にも当てはまる可能性がある。
【０１３９】
抗原結合ポリペプチドの発現
一態様において、本明細書に開示される結合ポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドが提供される。これらのポリヌクレオチドを発現することを含む、結合ポリペプチドの作製方法も提供される。
【０１４０】
本明細書に開示される結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、典型的には、所望の量の特許請求される抗体、又はその断片を産生するのに使用され得る宿主細胞内に導入するための発現ベクターに挿入される。従って、特定の態様では、本発明は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、このベクター及びポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
【０１４１】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、本明細書では、所望の遺伝子を細胞内に導入し、発現させるための媒体として、本発明に従って使用されるベクターを意味する。当業者に既知のように、このようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス及びレトロウイルスからなる群から容易に選択することができる。一般に、本発明に適合するベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローン化を容易にする適切な制限部位、並びに真核生物又は原核生物細胞内への進入及び／又は該細胞内での複製の能力を含むであろう。
【０１４２】
多数の発現ベクター系を本発明の目的のために使用することができる。例えば、ベクターの１クラスは、ウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（例えば、ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、ＭＯＭＬＶ等）又はＳＶ４０ウイルス等の動物ウイルス由来のＤＮＡ要素を利用する。その他は、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロニック系の使用を含む。加えて、それらの染色体中にＤＮＡが組み込まれた細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することにより選択することができる。マーカーは、栄養要求性宿主への原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）又は銅等の重金属への耐性を提供することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるべきＤＮＡ配列に直接結合されるか、又は共形質転換により同じ細胞内に導入されてもよい。追加の要素も、ｍＲＮＡの最適な合成のために必要であり得る。これらの要素は、シグナル配列、スプライスシグナル、並びに転写プロモーター、エンハンサー及び終結シグナルを含み得る。いくつかの実施形態では、クローン化された可変領域遺伝子は、上記のように合成された重鎖及び軽鎖定常領域遺伝子（例えば、ヒト定常領域遺伝子）と共に発現ベクターに挿入される。
【０１４３】
別の実施形態において、結合ポリペプチドは、ポリシストロニックコンストラクトを使用して発現され得る。そのような発現系では、例えば抗体の重鎖及び軽鎖等の目的の複数の遺伝子産物が、単一のポリシストロニックコンストラクトから生成され得る。このシステムは、有利には内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を使用して、真核生物宿主細胞において比較的高レベルのポリペプチドを提供する。適合性のＩＲＥＳ配列は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９３，９８０号明細書に開示されている。当業者は、そのような発現系を使用して、本出願に開示される全範囲のポリペプチドを効果的に生成できることを認識するであろう。
【０１４４】
より一般的には、抗体又はその断片をコードするベクター又はＤＮＡ配列が調製されると、発現ベクターは適切な宿主細胞に導入され得る。即ち、宿主細胞は形質転換され得る。宿主細胞へのプラスミドの導入は、当業者に周知の様々な技術によって達成することができる。これらには、トランスフェクション（電気泳動及びエレクトロポレーションを含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープＤＮＡを用いた細胞融合、マイクロインジェクション、及び無傷のウイルスによる感染が含まれるが、これらに限定されない。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｃｈａｐｔｅｒ  ２４．２，ｐｐ．４７０−４７２  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．１９８８）を参照されたい。宿主へのプラスミド導入は、エレクトロポレーションによるものであり得る。形質転換された細胞は、軽鎖及び重鎖の産生に適切な条件下で増殖され、重鎖及び／又は軽鎖タンパク質合成についてアッセイされる。例示的なアッセイ技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化セルソーター分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学等が含まれる。
【０１４５】
本明細書で使用する場合、用語「形質転換」は、遺伝子型を変化させ、結果としてレシピエント細胞の変化をもたらす、レシピエント宿主細胞へのＤＮＡの導入を指すように広い意味で使用されるものとする。
【０１４６】
これらの同じ道筋に沿って、「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を使用して構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターで形質転換された細胞を指す。組換え宿主からポリペプチドを単離するプロセスの説明において、用語「細胞」及び「細胞培養液」は、特に明記しない限り、抗体の供給源を示すために交換可能に使用される。換言すれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、スピンダウンした全細胞から、又は培地と懸濁細胞の両方を含む細胞培養液からのいずれかを意味し得る。
【０１４７】
一実施形態では、抗体発現に使用される宿主細胞株は、哺乳動物起源である。当業者は、そこで発現される所望の遺伝子産物に最も適した特定の宿主細胞株を決定することができる。例示的な宿主細胞株には、ＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶ−１（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原を有するＣＶ−１の誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、２９３（ヒト腎臓）等が含まれるがこれらに限定されない。一実施形態では、細胞株は、そこから発現された抗体のグリコシル化の変化、例えばアフコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を提供する（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ）又はＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞株（Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）細胞）（Ｂｉｏｗａ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．））。宿主細胞株は、典型的には、商業サービス、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから、又は出版された文献から入手可能である。
【０１４８】
インビトロ生成により、大量の所望のポリペプチドを与えるスケールアップが可能となる。組織培養条件下での哺乳動物細胞培養の技術は、当該技術分野で知られており、例えばエアリフト反応器若しくは連続撹拌反応器での均質懸濁培養、又は例えば中空繊維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ又はセラミックカートリッジでの固定化若しくは捕捉された細胞培養が含まれる。必要及び／又は望ましい場合、ポリペプチドの溶液は、慣用のクロマトグラフィー法、例えばゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロース上でのクロマトグラフィー及び／又は（免疫）親和性クロマトグラフィーにより精製することができる。
【０１４９】
本発明で特徴とされる抗原結合タンパク質をコードする遺伝子はまた、細菌又は酵母又は植物細胞等の非哺乳動物細胞で発現させることができる。これに関して、細菌等の様々な単細胞非哺乳動物微生物、即ち培養又は発酵で増殖させることができるものも形質転換できることが認識されるであろう。形質転換しやすい細菌には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）又はサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の株等の腸内細菌科；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）；肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）；レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、及びインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のメンバーが含まれる。更に、細菌内で発現された場合、タンパク質は封入体の一部となり得ることが理解されるであろう。タンパク質は分離、精製された後、機能性分子に組み立てられる必要がある。
【０１５０】
原核生物に加えて、真核微生物も使用され得る。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、又は一般的なパン酵母は、真核生物微生物の中でも最も一般的に使用されているが、多数の他の株も一般的に入手可能である。酵母類（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）での発現には、プラスミドＹＲｐ７、例えば（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ，１０：１５７（１９８０））が一般的に使用される。このプラスミドは、トリプトファンで成長する能力を欠く酵母の変異株、例えばＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６又はＰＥＰ４−１の選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子を既に含んでいる（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７））。次に、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ１損傷の存在は、トリプトファンの非存在下での増殖による形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。
【０１５１】
抗原結合タンパク質の投与方法
抗原結合タンパク質（例えば、本明細書に開示される三重特異性抗原結合タンパク質）を調製し、対象に投与する方法は、当業者に周知であるか、又は当業者によって容易に決定される。本開示の抗原結合タンパク質の投与経路は、経口、非経口、吸入又は局所によるものであり得る。本明細書で使用される非経口という用語は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸又は膣内投与を含む。これらの投与形態は全て、本開示の範囲内であると明確に企図されているが、投与形態は、注射、特に静脈内又は動脈内注射又は点滴用の溶液であろう。通常、注射に適した医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸又はクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、場合により安定剤（例えば、ヒトアルブミン）等を含み得る。しかしながら、本明細書の教示に適合する他の方法では、修飾された抗体は、有害な細胞集団の部位に直接送達することができ、それにより治療剤への罹患組織の曝露を増加させる。
【０１５２】
非経口投与のための調製物には、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、及び乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、乳濁液又は懸濁液が含まれる。本開示の組成物及び方法において、薬学的に許容され得る担体は、０．０１〜０．１Ｍ若しくは０．０５Ｍリン酸緩衝液、又は０．８％生理食塩水を含むがこれらに限定されない。他の一般的な非経口ビヒクルには、リン酸ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンガー、固定油等が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体及び栄養補給剤、リンガーのデキストロースに基づくもの等の電解質補給剤等が含まれるがこれらに限定されない。保存剤及び他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等も存在し得る。より具体的には、注射用途に適した医薬組成物には、無菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び無菌注射溶液又は分散液の即時調製のための無菌粉末が含まれる。そのような場合、組成物は無菌でなければならず、シリンジ注入が容易に行える程度に流動性でなければならない。それは、製造及び保管の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から保護されるべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。
【０１５３】
微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成することができる。等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等の多価アルコール、又は塩化ナトリウムも組成物に含めることができる。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含めることによってもたらされ得る。
【０１５４】
いずれの場合でも、無菌注射溶液は、活性化合物（例えば、それ自体又は他の活性薬剤と組み合わせた活性化合物）を、必要に応じて、本明細書に列挙した成分の１つ以上の組み合わせと共に、必要量で適切な溶媒中に組み込んだ後、ろ過滅菌を行うことにより調製することができる。一般に、分散液は、基本的な分散媒及び上記に列挙したものからの必要な他の成分を含む無菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことにより調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製方法は、典型的には、真空乾燥及び凍結乾燥を含み、これにより、活性成分の粉末と、以前に滅菌ろ過した溶液からの任意の追加の所望の成分が得られる。注射用製剤は処理され、アンプル、バッグ、ボトル、シリンジ又はバイアル等の容器に充填され、当該技術分野で既知の方法に従って無菌条件下で密封される。更に、調製物は、同時係属中の米国特許出願第０９／２５９，３３７号明細書及び米国特許出願第０９／２５９，３３８号明細書（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているようなキットの形態で包装及び販売されてもよい。そのような製品は、関連する組成物が自己免疫障害又は腫瘍性障害を患うか、又はその素因がある対象を処置するために有用であることを示すラベル又は添付文書を含むことができる。
【０１５５】
上記の状態の処置のための本開示の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物、及び処置が予防的又は治療的であるかを含む多くの異なる要因に応じて変化する。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も処置することができる。安全性及び有効性を最適化するために、当業者に既知の日常的な方法を使用して処置投与量を滴定することができる。
【０１５６】
抗原結合タンパク質を用いた受動免疫の場合、投与量は、例えば、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常には宿主の体重の０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ等）であり得る。例えば、投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ体重又は１０ｍｇ／ｋｇ体重、又は１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、例えば、少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。上記範囲の中間の用量もまた、本開示の範囲内であることが意図される。対象は、そのような用量を毎日、隔日、毎週、又は経験的分析によって決定された任意の他のスケジュールに従って投与され得る。例示的な処置は、例えば、少なくとも６ヶ月の長期間にわたる複数の投薬量での投与を含む。追加の例示的な処置計画は、２週間に１回又は月に１回、又は３〜６ヶ月に１回の投与を含む。例示的な投与スケジュールは、連続した日に１〜１０ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇ、隔日に３０ｍｇ／ｋｇ又は毎週６０ｍｇ／ｋｇを含む。いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する２つ以上の抗原結合タンパク質が同時に投与され、その場合、投与される各抗原結合タンパク質の投与量は示された範囲内に入る。
【０１５７】
本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、複数の機会に投与され得る。単回投与の間隔は、毎週、毎月又は毎年とすることができる。患者の修飾結合ポリペプチド又は抗原の血中レベルを測定することによって示されるように、間隔は不規則であることもある。いくつかの方法では、投与量は、１〜１０００μｇ／ｍｌ、いくつかの方法では２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿修飾抗原結合タンパク質濃度を達成するように調整される。あるいは、抗原結合タンパク質は、徐放製剤として投与することができ、その場合、より少ない頻度の投与が必要とされる。抗原結合タンパク質の場合、投与量と頻度は患者の抗原結合タンパク質の半減期によって異なる。一般に、ヒト化抗体は最も長い半減期を示し、キメラ抗体及び非ヒト抗体が続く。
【０１５８】
投与量及び投与頻度は、処置が予防的であるか治療的であるかによって異なり得る。予防的用途では、本発明の抗原結合タンパク質又はそのカクテルを含む組成物は、患者の耐性を高めるために、まだ病状になっていない患者に投与される。そのような量は、「予防的有効量」であると定義される。この使用では、正確な量は患者の健康状態と一般的な免疫に依存するが、一般的には１用量あたり０．１〜２５ｍｇ、特に１用量あたり０．５〜２．５ｍｇの範囲である。比較的低い投与量が長期間にわたって比較的不定期な間隔で投与される。一部の患者は、一生涯処置を受け続ける。治療用途では、比較的短い間隔で比較的高い投与量（例えば、１用量あたり約１〜４００ｍｇ／ｋｇの抗体、５〜２５ｍｇの投与量は放射性免疫複合体でより一般的に使用され、細胞毒素−薬物修飾抗体ではより高い用量である）が、疾患の進行が軽減若しくは終了するまで、又は患者が疾患の症状の部分的若しくは完全な改善を示すまで、必要になる場合がある。その後、患者に予防計画を施すことができる。
【０１５９】
本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、場合により、処置（例えば、予防的又は治療的）を必要とする障害又は状態の処置に有効である他の薬剤と組み合わせて投与することができる。本開示の９０Ｙ標識修飾抗体の有効な単回処置用量（即ち、治療的有効量）は、約５〜約７５ｍＣｉ、例えば約１０〜約４０ｍＣｉの範囲である。１３１Ｉ修飾抗体の有効な単回処置非骨髄切除投与量は、約５〜約７０ｍＣｉ、例えば約５〜約４０ｍＣｉの範囲である。１３１Ｉ標識抗体の有効な単回処置切除投与量（即ち、自家骨髄移植が必要な場合がある）は、約３０〜約６００ｍＣｉ、例えば約５０〜約５００ｍＣｉの範囲である。キメラ抗体と組み合わせて、マウス抗体に対して循環半減期が長いため、１３１Ｉ標識キメラ抗体の非骨髄除去投与量の有効な単回処置は、約５〜約４０ｍＣｉの範囲、例えば約３０ｍＣｉ未満である。例えば、１１１Ｉｎ標識のイメージング基準は、典型的には約５ｍＣｉ未満である。
【０１６０】
抗原結合タンパク質は上記のように投与することができるが、別の実施形態では、抗原結合タンパク質を一次療法として他の点では健康な患者に投与できることを強調しなければならない。そのような実施形態において、抗原結合タンパク質は、正常若しくは平均の赤血球予備能（ｒｅｄ  ｍａｒｒｏｗ  ｒｅｓｅｒｖｅ）を有する患者、並びに／又は１つ以上の他の治療を受けていない、及び経験していない患者に投与され得る。本明細書で使用する場合、補助療法と併せて又は組み合わせて修飾抗体又はその断片を投与することは、治療及び開示された抗体の逐次、同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）、同延、同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）、併用、又は同時期投与又は適用を意味する。当業者は、併用治療計画の様々な構成要素の投与又は適用が、処置の全体的な有効性を増強するようにタイミング調整され得ることを理解するであろう。当業者（例えば、経験豊富な腫瘍学者）は、選択された補助療法及び本明細書の教示に基づいて、過度の実験を行うことなく、効果的な併用治療計画を容易に見分けることができるであろう。
【０１６１】
前述したように、本開示の抗原結合タンパク質、その免疫反応性断片又は組換え体は、哺乳動物疾患のインビボ処置のために、薬学的有効量で投与され得る。この点から、開示された抗原結合タンパク質は、活性薬剤の投与を容易にし、その安定性を促進するように処方されることが認識されるであろう。
【０１６２】
本開示による医薬組成物は、典型的には、生理食塩水、非毒性緩衝液、保存料等の薬学的に許容され得る非毒性の無菌担体を含む。本出願の目的のために、治療剤にコンジュゲートされた又はコンジュゲートされていない修飾抗原結合タンパク質、その免疫反応性断片又は組換え体の薬学的有効量は、抗原への有効な結合を達成するために、及び利益を達成するために、例えば疾患若しくは障害の症状を改善するために、又は物質若しくは細胞を検出するために十分な量を意味すると見なされるものとする。腫瘍細胞の場合、修飾結合ポリペプチドは、典型的には、腫瘍細胞又は免疫反応性細胞上の選択された免疫反応性抗原と相互作用することができ、それらの細胞の死の増加をもたらすであろう。もちろん、本開示の医薬組成物は、薬学的有効量の修飾結合ポリペプチドを提供するために、単回又は複数回用量で投与されてもよい。
【０１６３】
本開示の範囲を踏まえて、本開示の抗原結合タンパク質は、治療的又は予防的効果を生じるのに十分な量で、前述の処置方法に従ってヒト又は他の動物に投与され得る。本開示の抗原結合タンパク質は、既知の技術に従って本開示の抗体を従来の薬学的に許容され得る担体又は希釈剤と組み合わせることによって調製される従来の剤形で、そのようなヒト又は他の動物に投与され得る。薬学的に許容され得る担体又は希釈剤の形態及び特性は、それが組み合わされる活性成分の量、投与経路及び他の周知の変数により決定されることが当業者により認められるであろう。当業者は更に、本開示に記載される１つ以上の種の結合ポリペプチドを含むカクテルが特に有効であると判明し得ることを認識するであろう。
【０１６４】
本明細書で定義される医薬組成物の生物学的活性は、例えば、以下の実施例に記載されるような細胞毒性アッセイにより、国際公開第９９／５４４４０号パンフレットに、又はＳｃｈｌｅｒｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５），１−１２）により決定される。本明細書で使用される「有効性」又は「インビボ有効性」は、例えば標準化されたＮＣＩ応答基準を使用する、本発明の医薬組成物による治療への応答を指す。本発明の医薬組成物を使用する治療の成功又はインビボ有効性は、意図する目的に対する組成物の有効性、即ち組成物が所望の効果、即ち病的細胞、例えば腫瘍細胞の枯渇を引き起こす該組成物の能力を指す。インビボ有効性は、白血球数、分画（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｓ）、蛍光活性化細胞選別、骨髄穿刺を含むがこれらに限定されない、各々の疾患実体のための確立された標準的な方法によってモニターされ得る。加えて、様々な疾患固有の臨床化学パラメーター及び他の確立された標準的な方法を使用することができる。更に、コンピューター支援断層撮影法、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影法（例えば、国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の基準に基づく応答評価［Ｃｈｅｓｏｎ  Ｂ  Ｄ，Ｈｏｒｎｉｎｇ  Ｓ  Ｊ，Ｃｏｉｆｆｉｅｒ  Ｂ，Ｓｈｉｐｐ  Ｍ  Ａ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｒ  Ｉ，Ｃｏｎｎｏｒｓ  Ｊ  Ｍ，Ｌｉｓｔｅｒ  Ｔ  Ａ，Ｖｏｓｅ  Ｊ，Ｇｒｉｌｌｏ−Ｌｏｐｅｚ  Ａ，Ｈａｇｅｎｂｅｅｋ  Ａ，Ｃａｂａｎｉｌｌａｓ  Ｆ，Ｋｌｉｐｐｅｎｓｔｅｎ  Ｄ，Ｈｉｄｄｅｍａｎｎ  Ｗ，Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ  Ｒ，Ｈａｒｒｉｓ  Ｎ  Ｌ，Ａｒｍｉｔａｇｅ  Ｊ  Ｏ，Ｃａｒｔｅｒ  Ｗ，Ｈｏｐｐｅ  Ｒ，Ｃａｎｅｌｌｏｓ  Ｇ  Ｐ．Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｔｏ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．  ＮＣＩ  Ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９９９  Ａｐｒｉｌ；１７（４）：１２４４］）、陽電子放射断層撮影スキャニング、白血球数、分画、蛍光活性化細胞選別、骨髄穿刺、リンパ節生検／組織学、及び様々なリンパ腫に固有の臨床化学パラメーター（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ）及び他の確立された標準的な方法を使用することができる。
【０１６５】
癌の処置方法
本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質を使用する、癌を患う対照における癌の処置方法が提供される。本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質を使用する、腫瘍細胞の標的化及び殺傷方法も提供される。
【０１６６】
本発明の三重特異性抗原結合タンパク質の第１の結合ドメインは、腫瘍細胞に関連した細胞表面タンパク質に特異的に結合する。例示的な実施形態では、細胞表面腫瘍タンパク質は、健康な細胞に存在しないか、又は腫瘍細胞と比較して有意に少ない。本発明の三重特異性抗原結合タンパク質は、そのような腫瘍抗原を保持する腫瘍細胞に優先的に付着する。特定の腫瘍細胞に関連した細胞表面タンパク質の例としては、ＣＤ３３（ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）細胞上で高度に発現する細胞表面タンパク質）、ＣＤ２０（Ｂ細胞リンパ腫及び白血病上で高度に発現する細胞表面タンパク質、ＢＣＭＡ（多発性骨髄腫細胞上で高度に発現する細胞表面タンパク質）、ＣＤ１９（ＡＬＬ（急性リンパ性白血病）上で高度に発現する細胞表面タンパク質）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６７】
本明細書に記載される方法の他の適切な修正及び適合が、本明細書に開示される実施形態の範囲から逸脱することなく、適切な同等物を使用して行われ得ることが当業者に容易に明らかとなるであろう。これで特定の実施形態を詳細に説明したが、以下の実施例を参照することによってより明確に理解されるであろう。これらの実施例は、例示のみを目的として含まれ、限定することを意図しない。
【実施例】
【０１６８】
実施例１−例示的な三重特異性抗原結合タンパク質の設計、発現及び精製
背景
三重特異性抗原結合タンパク質治療学の開発における主な課題は、開発可能性に望ましい属性を維持する一方、非常に様々な異なる生物学的及び薬理的特性を支持し得る、構造的に多様な選択肢からの分子フォーマットの選択である。そのような属性は、高い熱安定性、高い溶解度、低い凝集傾向、低い粘度、化学的安定性及び高い発現レベル（グラム／リットルの力価）を含む。
【０１６９】
単一宿主細胞内の複数（３つ）の軽鎖及び重鎖の共発現による三重特異性抗原結合タンパク質の産生は、所望の三重特異性抗原結合タンパク質の低収率と、誤対合された、密接に関連する汚染物質の除去の困難さにより非常に大きな課題であり得る。ＩｇＧベースの三重特異性抗原結合タンパク質においては、重鎖は所望のヘテロ二量体と共にホモ二量体を形成する。加えて、軽鎖は、非同族重鎖と誤対合し得る。その結果、複数の鎖の共発現は、多数の望ましくない種（所望の三重特異性抗原結合タンパク質以外の）、及び従って低い産生収率をもたらし得る。
【０１７０】
三重特異性分子の構築のための抗体の選択
ＳＰ３４及びＯＫＴ３に由来する２つの異なる抗ＣＤ３抗体を、二重特異性及び三重特異性分子の構築のための結合アームとして使用した。両方の抗体は、Ｔ細胞を活性化するそれらの能力により特徴付けられ、癌の処置に使用され得る治療的二重特異性抗体の生成に使用されている。
【０１７１】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の中和のために、腫瘍免疫回避の主要な機構、抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＫＮ０３５（Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１７；３：１７００４）及び特許出願の国際公開第２０１７１４７３８３号パンフレットの配列番号９を、二重特異性及び三重特異性抗体を生成するために選択した。マウス抗体Ｃ１１Ｄ５．３及び単一ドメイン抗体、２６９Ａ３７３４６（国際公開第２０１８０２８６４７号パンフレットに記載）を、二重特異性及び三重特異性分子の構築においてＢＣＭＡを標的化する実体として使用した。Ｃ１１Ｄ５．３は、血漿細胞を含むＢ細胞の１つ以上のサブセットの表面上のＢＣＭＡ、及び可溶性受容体に特異的に結合し、また多発性骨髄腫及び形質細胞腫上に発現したＢＣＭＡに効率的に結合する（国際公開第２０１６０９４３０４Ａ２号パンフレットに記載）。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する追加の抗体は、トラスツズマブ、ＨＥＲ２陽性転移性乳癌の処置のための抗ＨＥＲ２ヒト化モノクローナル抗体（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ、４２１（６９２４）：７５６−７６０（２００３））、及び、フィラデルフィア染色体陰性再発又は難治性Ｂ−細胞前駆体急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の処置に適応するブリナツモマブ、二重特異性Ｔ細胞エンハンサーモノクローナル抗体を含む。
【０１７２】
三重特異性分子及び二重特異性対照のアセンブリー
抗ＢＣＭＡ抗体Ｃ１１Ｄ５．３、特許出願の国際公開第２０１７１４７３８３号パンフレットの配列番号９の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、及び抗ＣＤ３抗体ＳＰ３４は、２つの異なるフォーマット：１）単一のタンパク質鎖上のペプチドリンカーによって接続された２つのｓｃＦｖ断片を含むタンデムｓｃＦｖ融合物、及び２）ｓｃＦｖがＦａｂ部分の軽鎖又は重鎖Ｃ末端融合物のいずれかとして組み立てられた、ＦａｂのＣ末端鎖へのｓｃＦｖ融合物。非常に安定であり、効率的なヘテロ二量体化足場であるＦａｂフォーマットを使用して、組換え二重特異性及び三重特異性抗体誘導体を生成した（Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ｄｅｃ  １５；１６５（１２）：７０５０−７）。下記の表５は、タンデムｓｃＦｖ融合物又はＦａｂ分子のＣ末端に連結されたｓｃＦｖのいずれかとしてのコンストラクト及び結合部分の位置を列挙している。
【０１７３】
【表１８】
2021515806.tif 000019
【０１７４】
Ｆａｂ−ｓｃＦｖ三重特異性分子における抗原結合部位の位置
抗原結合部位の位置が結合活性及び／又は免疫細胞殺傷を腫瘍細胞に再指向させる効率に影響を及ぼし得るか否かを検討するために、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ融合物を構築して、各抗原結合部位を３つの可能な位置で調べた：１）Ｆａｂ、２）Ｆａｂ軽鎖のＣ末端に連結されたｓｃＦｖ、及び３）Ｆａｂ重鎖のＣ末端に連結されたｓｃＦｖ。下記の表６は、様々な位置に結合部分を有するコンストラクトをリストする。
【０１７５】
【表１９】
2021515806.tif 000020
【０１７６】
代替的な三重特異性フォーマットの設計
他の抗体フォーマット又は異なる抗原結合配列が本発明の三重特異性抗体を生成するための要件を満たすことができるか否かを検討するために（例えば、生物学との価数の一致、異なる標的への結合活性の保持、異なる標的に同時に結合する能力及び免疫細胞を腫瘍細胞に物理的に連結する能力）、例示的な三重特異性分子は、異なる結合配列、異なるフォーマット（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、Ｆａｂ又はＦｃベースの）及びそれらの組み合わせを使用して組み立てられた。
【０１７７】
Ｆａｂベースのコンストラクトの場合、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂをＦａｂのＣ末端領域に融合させた。Ｆｃベースのコンストラクトの場合、ｓｃＦｖをＦｃ領域又は軽鎖のＣ末端領域へのＮ又はＣ末端融合物として組み立てた。ノブイントゥーホール（Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）（ＫＩＨ）技術を用いて、Ｆｃ部分のヘテロ二量体化を促進し、三重特異性分子の正しい形成を妨げる鎖の誤対合を回避した。下記の表７は、代替的な三種特異性フォーマットを有するコンストラクトをリストする。
【０１７８】
【表２０】
2021515806.tif 000021
【０１７９】
発現
異なる抗体鎖（即ち、重鎖及び軽鎖）をコードする合成遺伝子は、Ｔｗｉｓｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎで構築され、ＨＥＫ  ２９３  ６Ｅ細胞における一過性発現のために発現ベクターに別々にクローン化された。発現ベクターＤＮＡは、従来のプラスミドＤＮＡ精製方法（例えば、Ｑｉａｇｅｎ  ＨｉＳｐｅｅｄプラスミドマキシキット、ｃａｔ．＃１２６６２）を用いて調製した。特定の各フォーマットの収量及び純度を評価するために、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞で発現されたいくつかの例示的な三重特異性抗原結合タンパク質フォーマット。
【０１８０】
三重特異性抗原結合タンパク質及び二重特異性抗原結合タンパク質対照は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ  ４０ｋＤ直鎖状）を用いて懸濁液で培養されたＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞における各々の哺乳動物発現ベクターの一過性共トランスフェクションによって発現された。ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  Ｆ１７培地に１．７×１０６細胞／ｍＬで播種した。最終生産量の各ｍＬのＤＮＡは、補充なしの５０μＬ培地にＤＮＡとＰＥＩを別個に加えることによって調製された。両方の画分を混合し、ボルテックスし、１５分間静置したところ、ＤＮＡ：ＰＥＩ比は１：２．５（１μｇ  ＤＮＡ／ｍＬ細胞）になった。細胞とＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を一緒にした後、振とう装置（３７℃、５％ＣＯ２、８０％ＲＨ）に置かれた適切な容器に移した。２４時間後、２５μＬのＴｒｙｐｔｏｎｅ  Ｎ１を最終生産量の１ｍＬ毎に加えた。
【０１８１】
７日後、細胞を遠心分離により収集し、滅菌ろ過した。抗原結合タンパク質は親和性ステップで精製された。Ｆａｂベースのコンストラクトの親和性精製のために、６  ＣＶ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化したタンパク質ＣＨカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃４９４３２０００５）に上清をロードした。タンデムｓｃＦｖは、Ｃａｐｔｏ  Ｌカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃１７５４７８１５を使用して精製した。同じ緩衝液で洗浄した後、１００ｍＭクエン酸（ｐＨ３．０）で段階的に溶出することにより、抗原結合タンパク質をカラムから溶出した。所望の抗原結合タンパク質を含む画分を、１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９．０）で１：１０の比で直ちに中和した後、プールし、透析し、遠心分離により濃縮した。
【０１８２】
濃縮及びＰＢＳ緩衝液に対する透析の後、精製されたタンパク質の含有量及び純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びサイズ排除ＨＰＬＣによって評価した。ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞で発現させた後、タンパク質を１回の捕捉ステップで精製し、分析サイズ排除クロマトグラフィーで分析した。
【０１８３】
図２は、異なる組み合わせで互いに付着された１つ又はいくつかのｓｃＦｖ及び／又はＦａｂモジュールを特徴とする様々な多機能タンパク質を示す。ｓｃＦｖ断片は、安定性、発現レベル、及び凝集傾向に大きなばらつきを示した。従って、好ましい生物物理学的特性を有するｓｃＦｖｓ断片に由来するため、分子００１〜００４を参照として使用した（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１０  Ｍａｒ  １９；２８５（１２）：９０５４−９０６６）。その結果、様々な二重特異性及び三重特異性フォーマットが哺乳動物細胞にて高レベルで発現し、抗原結合タンパク質は主にモノマー型であり、タンパク質のクリッピング又は断片化は観察されないことが示された（図３）。
【０１８４】
実施例２−三重特異性分子及び二重特異性対照がそれらの標的に結合する能力
結合ＥＬＩＳＡアッセイを行って、例示的な三重特異性抗原結合タンパク質がそれらの対応する標的に結合したか否かを決定した。三重特異性抗体ＣＤＲ１−００７を、その抗原に結合するその能力について評価した。４ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度へのＣＤＲ−００７の段階希釈物を、ヒトＰＤ−Ｌ１  Ｈｉｓタグ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、＃Ｃ３１５）、組換えヒトＢＣＭＡ  Ｆｃキメラ（ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞内の一過性発現によりインハウスで生成）及びＣＤ３εＨｉｓタグ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、＃Ｃ５７８）の細胞外ドメインへの結合に関してＥＬＩＳＡで試験し、それらの各々は９６ウェルプレートに被覆された。三重特異性抗体は、ヤギ抗κ−ＬＣ抗体ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃Ａ１８８５３）により検出した。図４Ａ〜４Ｃは、三重特異性抗体が３つの標的に結合する能力を確認する、ＣＤＲ１−００７の濃度依存性結合を示す。
【０１８５】
加えて、三重特異性及び二重特異性抗体を、ＢＣＭＡ及びＣＤ３に同時に結合するそれらの能力について二重結合ＥＬＩＳＡを用いて評価した。手短に言えば、抗体分子ＣＤＲ１−００５、ＣＤＲ１−００７及びＣＤＲ１−００８の連続希釈物を、組換えヒトＢＣＭＡ  Ｆｃキメラ（ＨＥＫ２９３−６Ｅでの一過性トランスフェクション後に発現）で被覆した９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに加え、その後、組換えヒトＣＤ３εＨｉｓタグタンパク質（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ５７８）と二次結合させた。抗Ｈｉｓ抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ａｂ１１８７）を使用して抗原対への同時結合を検出した。図５は、ＢＣＭＡ及びＣＤ３に対する二重特異性及び三重特異性分子の濃度依存性結合を示す。これらのデータは、二重特異性及び三重特異性抗体が、同等にＢＣＭＡ及びＣＤ３に同時に結合することを確認した。
【０１８６】
実施例３−ＣＤ３結合アームがＴ細胞の増殖を誘導する能力
ヒトＴリンパ球上の抗原受容体分子を、ＣＤ３（Ｔ３）分子複合体を用いて細胞表面上に非共有結合的に関連させた。抗ＣＤ３モノクローナル抗体とのこの複合体の摂動は、Ｔ細胞活性化を誘導し得るが、この能力は、結合親和性、エピトープ、価数、抗体フォーマット等の特定の特性に依存する。
【０１８７】
融合タンパク質において異なる抗原結合部位を連結して二重特異性抗体を生成すると、親抗体と比較してそれらの標的抗原に対する親和性が低下することが多い。従って、Ｔ細胞結合因子のＣＤ３結合アームを評価する際には、機能性を確保するために慎重な配慮が必要である。ＣＤ３アゴニスト抗体がＴ細胞を活性化する能力を評価する最も一般的な方法の１つは、インビトロ刺激時のＴ細胞増殖を測定することである。
【０１８８】
本発明のＣＤ３結合アーム設計を、ＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の細胞増殖を引き起こすその能力について分析した。抗体ＣＤＲ１−００５を、０．０１〜１μｇ／ｍＬの範囲の最終濃度で９６ウェルプレート表面に被覆した。プレート表面上に固定化した抗ＣＤ３は、Ｔ細胞上のＣＤ３の架橋を促進し、それ故、可溶性抗体よりも良好な刺激物質であった。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞白血病株Ｅ６−１細胞を完全ＲＰＭＩ培地中で１×１０６（生存）細胞／ｍｌに調整し、１００μｌのこの細胞縣濁液を、陰性対照としての抗体を有する及び有さない、固定化抗ＣＤ３を有する９６ウェルプレート内にピペットで注入し、３７℃及び５％  ＣＯ２で４８時間インキュベートした。このインキュベーション期間後、１０μｌ／ウェルのＷＳＴ−１細胞増殖試薬（Ｒｏｃｈｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５０１５９４４００１）を培養液に加え、３７℃及び５％  ＣＯ２で５時間までインキュベートした。形成したホルマザン染料を５時間のインキュベーションまでのいくつかの時点で、参照波長としての４５０ｎｍ及び６２０ｎｍで測定した。
【０１８９】
図６に示すように、ホルマザン染料形成は、５時間のインキュベーション後に最大に達し、ＣＤＲ１−００５中のＣＤ３結合アームで刺激されたＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞は、最低濃度０．１μｇ／ｍＬにおいてさえも、抗ＣＤ３刺激のないものより多く増殖することを示した。これにより、Ｔ細胞活性化を誘導するＣＤ３結合アーム設計の適切さが確認された。
【０１９０】
実施例４−ヒト多発性骨髄腫細胞の存在下又は非存在下での三重特異性抗体により媒介されるＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞のＩＬ−２サイトカイン産生
三重特異性抗体ＣＤＲ１−００７を、骨髄腫癌細胞の結合時にＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞においてＩＬ−２サイトカイン産生を誘導するその能力について分析した。Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６−１  Ｔ細胞（エフェクター）を、１０、１００又は２００ｎＭ  ＣＤＲ１−００７の存在下で、ＮＣＩ−Ｈ９２９ヒト多発性骨髄腫細胞（標的）又はヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞と共培養し、エフェクターと標的細胞の比は５：１であった。加えて、陽性対照としてのＴ細胞の非特異的刺激のために、Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６−１  Ｔ細胞を１μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）の有無で共培養した。
【０１９１】
３７℃、５％ＣＯ２で１８時間のインキュベーション後、アッセイプレートを１０００×ｇで１０分間遠心分離し、その後の分析のために上清を新しい９６ウェルプレートに移した。ヒトＩＬ−２サイトカインの定量化は、Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−２  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．８８−７０２５）を使用して、製造業者の指示に従って行った。
【０１９２】
図７に示すように、三重特異性抗体ＣＤＲ１−００７は、Ｈ９２９骨髄腫細胞との結合時、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞によるＩＬ−２サイトカイン産生を強力に誘導した。ＣＤＲ１−００７は、ＨＥＫ２９３細胞と共培養した場合、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞によるＩＬ−２産生を誘導しなかった。これは、ＣＤＲ１−００７の活性が、癌細胞の結合によって引き起こされることを示している。
【０１９３】
実施例５−三重特異性及び二重特異性抗体がヒトＣＤ３＋Ｔ細胞及びＨ９２９多発性骨髄腫細胞との結合時にＩＬ−２サイトカイン産生を誘導する能力
三重特異性抗体ＣＤＲ１−００７を、骨髄腫癌細胞の結合時に、単離されたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞においてＩＬ−２サイトカイン産生を誘導する能力について、二重特異性タンデムｓｃＦｖ  ＢＣＭＡ−ＣＤ３（ＣＤＲ１−００８）と直接比較した。手短に言えば、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７９１１）を製造業者の指示に従って使用して、ＰＢＭＣからヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を分離した。１×１０５個の単離されたＣＤ３＋Ｔ細胞（エフェクター）を、ＮＣＩ−Ｈ９２９ヒト多発性骨髄腫細胞（標的）と、エフェクターと標的細胞の比が５：１で、１〜１００ｎＭの範囲の濃度の抗体の存在下で共培養した。３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした後、アッセイプレートを上記の実施例４に記載されているように処理した。
【０１９４】
図８に示すように、三重特異性抗体ＣＤＲ１−００７は、二重特異性ＣＤＲ１−００８よりも効率的に、単離されたヒトＴ細胞によるＩＬ−２サイトカインの濃度依存的産生を誘導した。これらの結果は、三重特異性抗体ＣＤＲ１−００７におけるＰＤ−Ｌ１の追加の結合部位が、二重特異性ＣＤＲ１−００８と比較して、より強力なＴ細胞活性化に寄与することを示した。
【０１９５】
実施例６−Ｈ９２９骨髄腫細胞の抗体媒介による再指向されたＴ細胞の細胞毒性（ＬＤＨ放出アッセイ）
三重特異性抗体ＣＤＲ１−００７を、Ｈ９２９ヒト多発性骨髄腫細胞のＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導する能力について二重特異性抗体ＢＣＭＡ／ＣＤ３（ＣＤＲ１−００８−図９Ａ）及びＰＤ−Ｌ１／ＣＤ３（ＣＤＲ１−０２０−図９Ｂ）と直接比較した。手短に言えば、単離されたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞及びＮＣＩ−Ｈ９２９ヒト多発性骨髄腫細胞を、二重特異性又は三重特異性抗体の存在下で、実施例５に記載したように共インキュベートした。正確な比較のために、全ての抗体コンストラクトを、８ｐＭ〜２００ｎＭの範囲の最終濃度で同じモル濃度に調整した。
【０１９６】
３７℃、５％ＣＯ２での２４時間のインキュベーション後、ヒト骨髄腫細胞のＴ細胞媒介細胞毒性を、Ｐｉｅｒｃｅ  ＬＤＨ細胞毒性アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．８８９５４）を使用して測定した。正規化のために、Ｈ９２９ヒト多発性骨髄腫細胞の最大の殺傷（ＬＤＨの１００％放出に対応）を、実験ウェルで使用されたのと同じ数のＨ９２９細胞（２０，０００細胞）を溶解緩衝液でインキュベートすることによって得た。最小溶解は、試験抗体なしでＣＤ３＋Ｔ細胞と共培養されたＨ９２９細胞によって放出されたＬＤＨとして定義された。抗体によって媒介されるＨ９２９骨髄腫細胞殺傷の濃度応答曲線は、三重特異性及び二重特異性抗体の濃度に対して正規化されたＬＤＨ放出値をプロットすることによって得られた。ＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して、曲線を４パラメーターの非線形回帰シグモイドモデルにフィッティングすることで計算された。
【０１９７】
図９Ａ及び９Ｂに示すように、三重特異性抗体ＣＤＲ１−００７は、その二重特異性対応物ＣＤＲ１−００８及びＣＤＲ１−０２０よりも強力にＨ９２９骨髄腫細胞の溶解を誘導した。これらの結果は、癌細胞抗原のみを標的とする二重特異性コンストラクトと比較して、より強力で効果的な癌細胞のＴ細胞媒介性殺傷をもたらすＰＤ−Ｌ１遮断と組み合わせたＢＣＭＡを標的とする相乗効果を示唆している。
【０１９８】
実施例７：他の三重特異性分子
以前の実施例に記載された三重特異性ＣＤＲ１−００７の効果が、１）各結合部位が異なる位置で評価される三重特異性Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、並びに２）、代替的な抗体フォーマット及び／又は異なる抗原結合配列：に伝達可能であるか否かを次に検討した。
【０１９９】
三重特異性抗体分子を、異なる標的に結合するそれらの能力について二重結合ＥＬＩＳＡを用いて試験した。手短に言えば、０．０１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲の最終濃度への三重特異性分子（及びＣＤＲ１−００７対照）の連続希釈物を、組換えヒトＢＣＭＡ  Ｆｃキメラ（ＨＥＫ２９３−６Ｅでの一過性トランスフェクション後に発現）で被覆された９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに加え、その後、組換えヒトＣＤ３εＨｉｓタグタンパク質（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ５７８）又は組換えヒトＰＤ−Ｌ１  Ｈｉｓタグタンパク質（ＨＥＫ２９３−６Ｅでの一過性トランスフェクション後に発現）との二次結合させた。抗原対への同時結合を、抗Ｈｉｓ抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ａｂ１１８７）を介して検出した。図１０Ａ及び１０Ｂは、三重特異性分子のＢＣＭＡ−ＰＤ−Ｌ１（図１０Ａ）及びＢＣＭＡ−ＣＤ３（図１０Ｂ）への濃度依存的結合を示し、各結合部位の位置がＦａｂ−ｓｃＦｖコンストラクトで評価された。図１１Ａ及び１１Ｂは、ＢＣＭＡ−ＰＤ−Ｌ１（図１１Ａ）及びＢＣＭＡ−ＣＤ３（図１１Ｂ）への濃度依存性結合を示し、代替的な抗体フォーマット及び異なる抗原結合配列を評価した。これらのデータは、三重特異性抗体が３つの異なる標的への結合活性を保持する能力を確認した。
【０２００】
次に、異なる三重特異性コンストラクトを、Ｈ９２９ヒト多発性骨髄腫細胞のＴ細胞媒介性殺傷を誘導する能力について評価した。最終濃度１００ｎＭ及び２ｎＭの三重特異性抗体を、実施例６に記載したように、単離されたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞及びＮＣＩ−Ｈ９２９ヒト多発性骨髄腫細胞とインキュベートした。殆どの代替的な三重特異性分子は、Ｈ９２９多発性骨髄腫細胞のＴ細胞媒介性殺傷を同等に誘導することができることが見出された（図１２Ａ及び１２Ｂ）。
【０２０１】
実施例８−抗ＰＤ−Ｌ１抗体親和性変異体
上記の実施例は、ＰＤ−Ｌ１シグナルの遮断が、三重特異性抗体の抗ＢＣＭＡ（腫瘍抗原結合アーム）及びＣＤ３結合アームと相乗作用して腫瘍を強力に排除し得ることを示した。ＰＤ−Ｌ１は癌細胞上で過剰発現していたが、多くの正常組織での発現により、標的に対する、腫瘍外（ｏｆｆ−ｔｕｍｏｒ）の毒性が生じるか、又は三重特異性抗体の治療効果を最小限にし得る抗原シンクが生じる可能性がある。この実施例では、ＰＤ−Ｌ１に対する親和性が低下した癌細胞上のＰＤ−Ｌ１とＢＣＭＡを共標的化する三重特異性Ｔ細胞結合因子抗体が生成された。これらの特徴は、腫瘍細胞への三重特異性抗体の選択的結合を促進した。
【０２０２】
手短に言えば、ＣＤＲ１−００７のＰＤ−Ｌ１結合アームの分子モデルは、完全に自動化されたタンパク質構造ホモロジーモデリングサーバー（ウェブサイト：ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｗｉｓｓｍｏｄ）を使用して生成され、結合に重要であると思われるＣＤＲ領域の溶媒露出残基を、アラニンへの突然変異について選択した（Ｍ．−Ｐ．Ｌｅｆｒａｎｃ，２００２；ウェブサイト：ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ，Ａ．Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，２００１；ウェブサイト：ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／〜ａｎｔｉｂｏｄｙ）。表８は、ＰＤ−Ｌ１結合アームの親和性を低下させる候補として、ＣＤＲ１−００７のＣＤＲ領域に導入されたアラニン変異を示している。テンプレートとして１０ナノグラムのＣＤＲ１−００７発現ベクター、１０μｍｏｌの１．５μｌ変異プライマー、及び製造業者の指示に従って使用されるＱ５部位特異的変異誘発キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ０５５４Ｓ）を使用して、アラニン変異を生成した。得られた変異体をＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞に共トランスフェクトし、実施例１に記載したように三重特異性変異体の発現のために培養した。０．５ｎｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度への抗体の連続希釈物を、９６ウェルプレートに被覆されたヒトＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインへの結合についてＥＬＩＳＡにより試験した。
【０２０３】
【表２１】
2021515806.tif 000022
【０２０４】
図１３に示すように、三重特異性変異体の濃度応答曲線は、固定化ＰＤ−Ｌ１に対して異なる結合プロファイルを示し、広範囲の結合親和性を示した。三重特異性分子ＣＤＲ１−００７、ＣＤＲ１−０１１及びＣＤＲ１−０１７は、高、中、低の親和性範囲を表すと見なされ、Ｆｒｉｇｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９８５  Ｍａｒ  １８；７７（２）：３０５−１９）に記載されているような競合ＥＬＩＳＡによる溶液中の親和性特徴付けに選択された。最初に、固定濃度の三重特異性抗体（Ａｂ）と様々な濃度のＰＤ−Ｌ１抗原（Ａｇ）の混合物を、平衡に達するまで十分な時間インキュベートした。次に、ＰＤ−Ｌ１被覆プレートを使用した古典的な間接ＥＬＩＳＡにより、平衡状態で不飽和のままであった（ＰＤ−Ｌ１抗原に関連しない）三重特異性抗体の濃度を測定した。ウェルに被覆された抗原の量と、ＥＬＩＳＡのインキュベーション時間は、ＥＬＩＳＡ中に溶液中の平衡が大幅に変更されず、三重特異性ＰＤ−Ｌ１複合体（Ｘ）の解離を回避するようなものであった。Ｋｄは、次の式を使用してスキャッチャードプロットから計算された。
［ｘ］／［Ａｇ］＝（［Ａｇ］−［ｘ］）／Ｋｄ
【０２０５】
【表２２】
2021515806.tif 000023
【０２０６】
親和性測定を確認するために、三重特異性コンストラクトＣＤＲ１−００７及びＣＤＲ１−０１７の抗ＰＤ−Ｌ１結合アームの結合親和性は、ＫｉｎＥｘＡ  ３２００（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＳＡ）フロー蛍光光度計を使用するＫｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＫｉｎＥｘＡ（登録商標））によっても測定した。この研究は、抗体濃度を固定し、平衡状態で抗原ＰＤ−Ｌ１の濃度を変えたサンプル中の遊離抗体を測定するように設計されており、反応混合物は１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で実行された。測定は、２００ｐＭのＣＤＲ１−００７と、５ｎＭ〜５ｐＭ（２倍連続希釈）の濃度のＰＤ−Ｌ１抗原とを含むサンプルを使用して行われた。三重特異性ＣＤＲ１−０１７の場合、１ｎＭの抗体と、ＰＤ−Ｌ１抗原の１００ｎＭ〜１００ｐＭの２倍連続希釈物を使用して測定を行った。平衡滴定及び速度論データは、ＫｉｎＥｘＡ  Ｐｒｏソフトウェア（バージョン４．２．１０；Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して１：１の可逆的結合モデルに適合させて、Ｋｄを決定した。Ｋｄ値は、三重特異性ＣＤＲ１−００７では２１．７〜４２ｐＭ、三重特異性ＣＤＲ１−０１７では９．４〜２０．６ｎＭの範囲と予測された。全体として、ＫｉｎＥｘＡによるＫｄ測定値は、競合ＥＬＩＳＡによる溶液の親和性特徴付け及びＳＰＲ実験によって得られたいくつかの予備値（ここでは記載せず）によって決定されたものよりも低くなった。ＫｉｎＥｘＡからの親和性データにより、ＣＤＲ１−０１７とＣＤＲ１−００７（ＷＴ）の間のＰＤ−Ｌ１に対する親和性の約１０００倍の違いが検証された。
【０２０７】
ＢＣＭＡに対する三重特異性抗体ＣＤＲ１−００７の親和性は、ＭｉｃｒｏＳｃａｌｅ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＭＳＴ）を使用して更に決定された。ヒトＢＣＭＡを蛍光色素で標識し、２ｎＭの一定濃度に維持した。結合反応は、ＰＢＳ  ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１％ＢＳＡで、５００ｎＭ〜１５．３ｐＭ（２倍連続希釈）の最終濃度で２ｎＭの蛍光標識ＢＣＭＡ及びＣＤＲ１−００７を含むサンプルで実行された。サンプルは、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ  ＮＴ．１１５  Ｐｉｃｏで２５℃で、５％のＬＥＤパワーと４０％のレーザーパワーで分析された。三重特異性抗体とＢＣＭＡの間の相互作用は、大きな振幅（９〜１０単位）と高い信号対雑音比（１０．７〜１４．９）を示し、最適なデータ品質を示した。ＢＣＭＡ結合アームの結合親和性は、２つの異なる測定で８．５〜９．９ｎＭであると決定された。付着又は凝集の影響は検出されなかった。
【０２０８】
実施例９−ＰＤ−Ｌ１に対して異なる結合親和性を有する三重特異性抗体によって誘導されたＨ９２９骨髄腫細胞の再指向されたＴ細胞の細胞毒性
ＰＤ−Ｌ１に対して異なる結合親和性を有する三重特異性抗体を、Ｈ９２９ヒト多発性骨髄腫細胞のＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導する能力について比較した。実施例５に記載したように、８ｐＭ〜２００ｎＭの範囲の最終濃度の三重特異性抗体ＣＤＲ１−００７、ＣＤＲ１−０１１及びＣＤＲ１−０１７を、単離されたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞及びＮＣＩ−Ｈ９２９ヒト多発性骨髄腫細胞とインキュベートした。図１４Ａ及び図１４Ｂに示すように、全ての三重特異性抗体はＨ９２９骨髄腫細胞の強力な溶解を誘導し、ＥＣ５０値はＰＤ−Ｌ１に対する見かけの親和性と一致した。
【０２０９】
実施例１０−三重特異性抗原結合タンパク質を用いたエクスビボアッセイ
多発性骨髄腫細胞株及び正常な供血者からのＰＢＭＣ又は精製Ｔ細胞を使用するインビトロアッセイは、多発性骨髄腫患者の骨髄の免疫抑制環境の複雑さと影響を完全に反映しなかったため、いくつかの制限があった。従って、インビトロアッセイよりも患者の状況をより忠実に模倣した多発性骨髄腫患者からの骨髄穿刺液を使用して、エクスビボアッセイを行った。このために、新たに診断された患者、再発患者及び多再発骨髄腫患者から採取した骨髄穿刺液から、新たに取得した（冷凍で保存していない）細胞を調製した。得られた単核細胞懸濁液を分析して、フローサイトメトリーを介してマーカー陽性細胞の百分率を決定した。次に、単核細胞懸濁液を、５％ＣＯ２を補充した３７℃の１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培養液中、三重特異性化合物及び関連する対照の存在下で３８４ウェルイメージングプレートに入れた。７２時間までのインキュベーション時間の後、Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１７  Ｊｕｎ；１３（６）：６８１−６９０に記載されているように、培養に免疫蛍光染色と自動顕微鏡プラットフォームを使用したイメージングが続いた。全ての化合物を４つの濃度と５つの技術的複製でアッセイした。画像に基づくエクスビボ試験で評価された化合物は、ＰＤ−Ｌ１に対する高、中及び低親和性（各々）に対応するＣＤＲ１−００７、ＣＤＲ１−０１１及びＣＤＲ１−０１７、二重特異性対照（ＣＤＲ１−００８）、二重特異性抗体ＣＤＲ１−００８の組み合わせ、抗ＰＤ−Ｌ１阻害剤アベルマブ（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１７．１７（４）：５１５−５２３）、並びに陰性対照としてのＰＢＳであった。
【０２１０】
骨髄サンプル中の異なる細胞集団は、形質細胞についてはＣＤ１３８、ＣＤ２６９又はＣＤ３１９、Ｔ細胞についてはＣＤ３及び単球についてはＣＤ１４に対する蛍光タグ付き抗体を用いて分類された。各患者サンプルの骨髄穿刺液のフローサイトメトリー分析により、細胞集団の百分率が異なり、骨髄サンプルの形質細胞の百分率（４％〜最大５８％）と多発性骨髄腫疾患の病状との間に強い一貫性があることが明らかになった（図１５）。
【０２１１】
ＰＤ−Ｌ１に対して異なる親和性を有する三重特異性抗体が、Ｔ細胞と正常細胞の架橋を回避する能力を、エクスビボで評価した。患者サンプルと試験化合物を含むイメージングプレートを２４時間インキュベートし、ＤＡＰＩ染色由来の核検出に基づいて、蛍光タグ付き抗体と正常細胞を使用してＣＤ３＋細胞を特定した（細胞外マーカーＣＤ３、ＣＤ１３８、ＣＤ２６９、ＣＤ３１９又はＣＤ１４の染色ではない）。ＣＤ３＋細胞と正常細胞との相互作用は、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１７  Ｊｕｎｅ；１３（６）：６８１−６９０に記載されている相互作用スコアに基づいて評価した。新たに診断された（図１６Ａ）、再発（図１６Ｂ）、及び多再発（図１６Ｃ）骨髄腫患者のサンプルで、ＣＤＲ１−００７及びＣＤＲ１−０１１とインキュベートされたＣＤ３＋細胞と正常細胞の間で細胞間相互作用の増加が観察された。重要なことに、ＣＤＲ１−０１７はＣＤ３＋細胞と正常細胞の相互作用を増加させなかった。これは、ＰＤ−Ｌ１に対する親和性の低下が、ＰＤ−Ｌ１のみを発現する正常細胞への三重特異性ＣＤＲ１−０１７の結合を首尾よく低下させたことを示す。
【０２１２】
次に、ＣＤＲ１−０１７三重特異性抗体が、ＣＤ１３８、ＣＤ２６９又はＣＤ３１９に関して染色された標的細胞集団にＣＤ３＋Ｔ細胞を再指向させる能力について評価した。図２２に示すように、三重特異性抗体ＣＤＲ１−０１７（中実四角形）は、二重特異性抗体ＣＤＲ１−００８（中空四角形）よりも効率的に様々な多発性骨髄腫患者からのサンプルのＴ細胞と形質細胞の間の相互作用を増加させた。これらの結果は、三重特異性抗体ＣＤＲ１−０１７におけるＰＤ−Ｌ１に対する追加の結合部位が、二重特異性抗体ＣＤＲ１−００８と比較して、Ｔ細胞のより効率的な再指向に貢献することを示唆した。
【０２１３】
異なる読み出しにおいて、Ｔ細胞活性化は、試験化合物の存在下でＣＤ３＋集団上のＣＤ２５発現強度を定量化することにより評価された。図１７Ａ〜１７Ｃは、ＣＤＲ１−０１７が、細胞集団の比率の違いに関係なく、新たに診断された、再発、及び多再発患者のＴ細胞を強力に活性化したことを示した。実際、ＣＤＲ１−０１７は、ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体で達成されたＴ細胞活性化のレベル、及び抗ＰＤ−Ｌ１とＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性の組み合わせによって得られたＴ細胞活性化のレベルを大幅に上回った。
【０２１４】
この実験は、ＣＤＲ１−０１７がＴ細胞を癌細胞に効率的に再指向させ、同時にＰＤ−Ｌ１を発現する細胞によって作製される潜在的な「抗原シンク」を回避しながら、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断を介してＴ細胞の局所活性化を誘導することを実証した。総合して、これらの結果は、併用療法の相乗的利益を特に腫瘍細胞に指向させる実行可能な戦略として、腫瘍抗原と共にＣＤ３及びＰＤ−Ｌ１を標的とする三重特異性抗体を確立した。
【０２１５】
実施例１１：熱安定性評価
本発明の抗体を用いた熱アンフォールディング実験は、２つの方法を用いて行われた：１）従来の示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）；及び２）ｎａｎｏＤＳＦ。手短に言えば、ＤＳＦ実験では、線形温度ランプを適用してタンパク質サンプルをほどき、蛍光色素（ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ）と、加熱時に溶媒にさらされた疎水性パッチとの相互作用に基づいてタンパク質のアンフォールディングを検出した。ＤＳＦによる熱アンフォールディング実験の代表的なデータを図１８に示す。サンプルは、加熱速度３℃／分で２５〜９８℃の温度勾配を用いて、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液中で２〜３μＭの範囲の濃度で測定した。ＣＤＲ１−００７、ＣＤＲ１−０１１及びＣＤＲ１−０１７は、７４℃でアンフォールディングの遷移を伴う高い安定性を示した。ｎａｎｏＤＳＦ実験では、７つの三重特異性抗体と２つのＦａｂが１．６〜５μＭの範囲の濃度で測定され、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ  ＮＴ．Ｐｌｅｘ（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ）を使用して、１℃／分の加熱速度で２０〜９５℃の温度勾配にさらされた。ｎａｎｏＤＳＦデータとμＤＳＣデータのＴｍデータを比較すると、方法間で良好な一致が見られ、ＣＤＲ１−００７、ＣＤＲ１−００１１及びＣＤＲ１−０１７で単一のアンフォールディング事象が検出された。ＤＳＦで測定されたＴｍが高いのは、走査速度が速いためである。
【０２１６】
実施例１２：三重特異性抗体を用いた安定性研究
三重特異性抗体のオリゴマー化／断片化傾向を評価するために、ＣＤＲ１−００７、ＣＤＲ１−０１１及びＣＤＲ１−０１７を製剤緩衝液（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（１０ｍＭリン酸塩、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ）ｐＨ６．５中で１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、３７℃で２週間インキュベートした。モノマータンパク質、凝集体及び低分子量種の定量化のために、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、１４日間のインキュベーションの前後にサンプルを分析した。ＴＳＫｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＳＷ２０００カラム（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でのＨＰＬＣにより、モノマーを非モノマー種から分割した。モノマータンパク質の百分率は、モノマーピークの面積を全生成物ピークの総面積で割ったものとして計算された。
【０２１７】
全ての三重特異性サンプルは、３７℃で２週間のインキュベーション後、非最適化緩衝液中で良好な安定性を示した。図１９は、ＣＤＲ１−００７（図１９Ａ）、ＣＤＲ１−０１１（図１９Ｂ）及びＣＤＲ１−０１７（図１９Ｃ）のサイズ排除クロマトグラフィー分析を示す。メインピークは、約７．８分後にカラムから溶出したモノマータンパク質に割り当てられ（予想された溶出時間と一致）、モノマーと凝集体のピーク、及び断片間の良好な分割が得られた。インキュベーション前の三重特異性タンパク質サンプルのモノマー含有量は、ＣＤＲ１−００７及びＣＤＲ１−０１１の場合は約９４％、ＣＤＲ１−０１７の場合は９２％であった。３７℃で２週間インキュベートした後の非最適化緩衝液でのサンプルのモノマー損失は、全てのサンプルで約４％であった。追加のピークは、既定の分子量の凝集体及び低分子量種に割り当てられた。
【０２１８】
実施例１３：異なるＴＡＡに特異性を有する三重特異性抗体が、癌細胞株の結合時にＴ細胞を活性化する能力
異なる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する３つの三重特異性抗体を、関連する癌細胞株の結合時に、単離されたヒトＣＤ３＋細胞においてＩＬ−２サイトカイン産生を誘導するそれらの能力について評価した。ＣＤ３、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１９に対する特異性を有する抗体ＣＤＲ１−０６１、並びにＣＤ３、ＰＤ−Ｌ１及びＨＥＲ２に対する特異性を有するＣＤＲ１−０８を、ＩＬ−２産生の関数として測定される、Ｔ細胞を活性化する能力について、それらの各々の二重特異性対照（ＣＤＲ１−０６３及びＣＤＲ１−０８３）と直接比較した。ＢＣＭＡに特異性を有する三重特異性抗体ＣＤＲ１−００７及び二重特異性対照ＣＤＲ１−００８も参照として含まれていた。
【０２１９】
手短に言えば、実施例４及び５に記載したようにＰＢＭＣからヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を単離し、１×１０５個の単離ＣＤ３＋Ｔ細胞（エフェクター）を、５：１のエフェクターと標的細胞の比で、０．１ｎＭ及び２ｎＭの抗体濃度の存在下で、ＮＣＩ−Ｈ９２９ヒト多発性骨髄腫細胞、Ｂ細胞リンパ腫株Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−８６（商標））及びヒト結腸直腸癌細胞株ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２４７（商標）と共インキュベートした。図２０は、異なる三重特異性抗体及びそれら各々の二重特異性対照の存在下で、Ｈ９２９多発性骨髄腫細胞（図２０Ａ）、Ｒａｊｉリンパ腫細胞（図２０Ｂ）及びＨＣＴ１１６細胞（図２０Ｃ）と共培養したＴ細胞の上清で測定されたＩＬ−２を示す。これらの実験の結果は、３つ全ての三重特異性抗体が、二重特異性対照よりも効率的に、単離されたヒトＴ細胞によるＩＬ−２サイトカインの産生を誘導したことを示している。これは、この手法をいくつかの悪性腫瘍で効果的に使用して、ＰＤ−Ｌ１が媒介するヒトＴ細胞活性化の阻害を救済できることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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