(57)【要約】ポリヌクレオチドのライブラリーが標的配列に結合した後に正確かつ効率的なハイブリダイゼーションを可能にするように、ポリヌクレオチドのライブラリーに関連する組成物、方法、およびシステムが本明細書で提供される。さらに、ハイブリダイゼーションの改善をもたらすプローブ、遮断薬、添加剤、バッファー、および、方法も本明細書で提供される。そのような組成物および方法は、オフターゲット結合の減少またはワークフロー時間の減少などの次世代配列決定アプリケーションの改良に役立つ。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムＤＮＡを配列決定するための方法であって、前記方法は：
（ａ）少なくとも３０，０００のポリヌクレオチドを含む第１のポリヌクレオチドライブラリーを含む組成物を接触させる工程であって、少なくとも３０，０００のポリヌクレオチドの各々は、ゲノム断片によるハイブリダイゼーションとハイブリダイズされたゲノム断片の配列決定の後で、ポリヌクレオチドライブラリーが、
ポリヌクレオチドに対応するゲノム断片の塩基の少なくとも８０パーセントのリード深度と；
配列決定リードの総数とを、
提供するような量で存在し、ここで、配列決定リードの総数は、理論的なリード深度のポリヌクレオチドに対応するゲノム断片の塩基の各々の１００パーセントをカバーすることができ、
ここで、理論的なリード深度に対する、ポリヌクレオチドに対応するゲノム断片の塩基の少なくとも８０パーセントのリード深度の比は、複数のゲノム断片で少なくとも０．５である、工程；
（ｂ）少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを生成するために、第１のポリヌクレオチドライブラリーに結合する少なくとも１つのゲノム断片を富化する工程；
（ｃ）少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを配列決定する工程；
（ｄ）平均未満のリード深度を有する少なくとも１つの富化されたポリヌクレオチドの１つ以上の位置を特定する工程；
（ｅ）工程ａ−ｃを繰り返す工程であって、少なくとも１５００のポリヌクレオチドを含む第２のポリヌクレオチドライブラリーが組成物に添加され、第２のポリヌクレオチドライブラリーが、平均未満のリード深度を有する１つ以上の位置を含むゲノム断片に結合する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、第２のポリヌクレオチドライブラリーの存在が、平均未満のリード深度を有する１つ以上の位置でリード深度を増加させる、工程、
を含む、方法。
【請求項２】
第１のポリヌクレオチドライブラリーと第２のポリヌクレオチドライブラリーが任意の共通配列を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１のポリヌクレオチドライブラリーと第２のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１つの共通配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第２のポリヌクレオチドライブラリーの存在が、平均未満のリード深度を有する少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドの１つ以上の位置のリード深度を少なくとも１０倍増加させる、請求項１−３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
第２のポリヌクレオチドライブラリーの存在が、平均未満のリード深度を有する少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドの１つ以上の位置のリード深度を少なくとも１００倍増加させる、請求項１−３に記載の方法。
【請求項６】
第１の方法は少なくとも１０００００のポリヌクレオチドを含む、請求項１−５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
第２の方法は少なくとも５０００のポリヌクレオチドを含む、請求項１−６に記載の方法。
【請求項８】
第１の方法は少なくとも１００，０００のポリヌクレオチドを含み、第２の方法は少なくとも５，０００のポリヌクレオチドを含む、請求項１−５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
理論的なリード深度に対する、ポリヌクレオチドに対応するゲノム断片の塩基の少なくとも８０パーセントのリード深度の比は、複数のゲノム断片で少なくとも０．５である、請求項１−８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
配列決定された塩基の少なくとも９０％は、少なくとも９９．５％正確である、請求項１−９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
配列決定された塩基の少なくとも９０％は、少なくとも９９．９％正確である、請求項１−９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
配列決定された塩基の少なくとも９０％は、少なくとも９９．９５％正確である、請求項１−９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
ゲノム断片の各々は約１００塩基から約５００塩基の長さである、請求項１−１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも３０，０００のポリヌクレオチドは少なくとも１０００の遺伝子をコードする、請求項１−１３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも３０，０００のポリヌクレオチドは少なくとも１つのエクソン配列をコードする、請求項１−１４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１５００のポリヌクレオチドは少なくとも１つのエクソン配列をコードする、請求項１−１５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１５００のポリヌクレオチドは少なくとも１０の遺伝子をコードする、請求項１−１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１５００のポリヌクレオチドは少なくとも１００の遺伝子をコードする、請求項１−１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１５００のポリヌクレオチドは少なくとも１つのイントロンをコードする、請求項１−１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１５００のポリヌクレオチドは少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）をコードする、請求項１−１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１】
一塩基多型（ＳＮＰ）はヘテロ接合である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
断片は合成による配列決定を含む方法によって配列決定される、請求項１−２１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２３】
断片はイルミナの配列決定機器で配列決定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも１５００のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、
ここで、すべてよりも少ないポリヌクレオチドが分子タグを含み、ここで、少なくとも５，０００のポリヌクレオチドの各々は、ゲノム断片によるハイブリダイゼーションとハイブリダイズされたゲノム断片の配列決定の後で、
ポリヌクレオチドライブラリーが、
ポリヌクレオチドに対応するゲノム断片の塩基の少なくとも９０パーセントのリード深度と；
配列決定リードの総数とを、
提供するような量で存在し、ここで、配列決定リードの総数は、理論的なリード深度のポリヌクレオチドに対応するゲノム断片の塩基の各々の１００パーセントをカバーすることができ、ここで、理論的なリード深度に対する、ポリヌクレオチドに対応するゲノム断片の塩基の少なくとも９０パーセントのリード深度の比は、少なくとも０．５である、ポリヌクレオチドライブラリー。
【請求項２５】
ポリヌクレオチドの９０％以下が分子タグを含む、請求項２４に記載のポリヌクレオチドライブラリー。
【請求項２６】
ポリヌクレオチドの８０％以下が分子タグを含む、請求項２４または２５に記載のポリヌクレオチドライブラリー。
【請求項２７】
ポリヌクレオチドの５０％以下が分子タグを含む、請求項２４−２６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドライブラリー。
【請求項２８】
ポリヌクレオチドの２５％以下が分子タグを含む、請求項２４−２６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドライブラリー。
【請求項２９】
分子タグがビオチンである、請求項２４−２８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドライブラリー。
【請求項３０】
少なくとも５０００のポリヌクレオチドは少なくとも５０００の遺伝子をコードする、請求項２４−２９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドライブラリー。
【請求項３１】
ポリヌクレオチドライブラリーは少なくとも３００００のポリヌクレオチドを含む、請求項２４−３０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドライブラリー。
【請求項３２】
ポリヌクレオチドライブラリーは少なくとも１０００００のポリヌクレオチドを含む、請求項２４−３０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドライブラリー。
【請求項３３】
核酸を富化するための方法であって、前記方法は：
（ａ）複数のゲノム断片に、請求項２４−３２のいずれか１つのポリヌクレオチドライブラリーを接触させる工程；
（ｂ）少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを生成するために、ポリヌクレオチドライブラリーに結合する少なくとも１つのゲノム断片を富化する工程；および、
（ｃ）少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを配列決定する工程を含む、方法。
【請求項３４】
ポリヌクレオチドライブラリーが、配列決定後に、富化された標的ポリヌクレオチドの塩基に対して少なくとも９０パーセントの固有のリードを提供する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ポリヌクレオチドライブラリーが、配列決定後に、富化された標的ポリヌクレオチドの塩基に対して少なくとも９５パーセントの固有のリードを提供する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
ポリヌクレオチドライブラリーが、平均のリード深度の約１．５倍以内のリード深度を有する富化された標的ポリヌクレオチドの塩基の少なくとも８０パーセントを提供する、請求項３３−３５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３７】
ポリヌクレオチドライブラリーが、平均のリード深度の約１．５倍以内のリード深度を有する富化された標的ポリヌクレオチドの塩基の少なくとも９０パーセントを提供する、請求項３３−３５に記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも５０００のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、
ここで、少なくとも５０００のポリヌクレオチドの各々は、
ｉ）ゲノムライブラリーであって、ゲノム断片、少なくとも１つのインデックス配列、および少なくとも１つのアダプターを各々含むポリヌクレオチドを含んでいる、ゲノムライブラリーと；
ｉｉ）少なくとも１つのポリヌクレオチド遮断薬であって、少なくともアダプター配列の一部に相補的であるが、少なくとも１つのインデックス配列には相補的でない、少なくとも１つのポリヌクレオチド遮断薬とを、
含む組成物を用いるハイブリダイゼーション、ならびに、ハイブリダイズされたゲノム断片の配列決定の後に、
ポリヌクレオチドライブラリーが、
ポリヌクレオチドに対応するゲノム断片の塩基の少なくとも９０パーセントのリード深度と；
配列決定リードの総数とを、
提供するような量で存在し、ここで、配列決定リードの総数は、理論的なリード深度のポリヌクレオチドに対応するゲノム断片の塩基の各々の１００パーセントをカバーすることができ、ここで、理論的なリード深度に対する、ポリヌクレオチドに対応するゲノム断片の塩基の少なくとも９０パーセントのリード深度の比は、少なくとも０．５である、ポリヌクレオチドライブラリー。
【請求項３９】
組成物は４つ以下のポリヌクレオチド遮断薬を含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
ポリヌクレオチド遮断薬は１つ以上のヌクレオチドアナログを含む、請求項３８または３９に記載の組成物。
【請求項４１】
ポリヌクレオチド遮断薬は、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）、または、１つ以上の架橋核酸（ＢＮＡ）を含む、請求項３８−４０のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項４２】
ポリヌクレオチド遮断薬は少なくとも５つのヌクレオチドアナログを含む、請求項３８−４１のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項４３】
ポリヌクレオチド遮断薬は少なくとも１０のヌクレオチドアナログを含む、請求項３８−４１のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項４４】
ポリヌクレオチド遮断薬は少なくとも７８℃のＴｍを有する、請求項３８−４３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項４５】
ポリヌクレオチド遮断薬は少なくとも８０℃のＴｍを有する、請求項３８−４３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項４６】
ポリヌクレオチド遮断薬は少なくとも８２℃のＴｍを有する、請求項３８−４３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項４７】
ポリヌクレオチド遮断薬は８０−９０℃のＴｍを有する、請求項３８−４３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項４８】
ゲノムライブラリーは少なくとも２つの異なるサンプルからのゲノム断片を含む、請求項３８−４７のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項４９】
ゲノムライブラリーは少なくとも１０の異なるサンプルからのゲノム断片を含む、請求項３８−４７のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項５０】
ゲノムライブラリーは少なくとも２つの非同一インデックス配列からのゲノム断片を含む、請求項３８−４９のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項５１】
ゲノムライブラリーは少なくとも１６の非同一インデックス配列からのゲノム断片を含む、請求項３８−４９のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項５２】
ゲノムライブラリーは少なくとも１つの固有の分子識別子（ＵＭＩ）をさらに含むゲノム断片を含んでいる、請求項３８−５１のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項５３】
核酸を富化するための方法であって、前記方法は：
（ａ）複数のゲノム断片に、請求項３８−５２のいずれか１つのポリヌクレオチドライブラリーを接触させる工程；
（ｂ）少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを生成するために、ポリヌクレオチドライブラリーに結合する少なくとも１つのゲノム断片を富化する工程；および、
（ｃ）少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを配列決定する工程を含む、方法。
【請求項５４】
オフターゲット率は２５％未満である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
オフターゲット率は２０％未満である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
少なくとも１つのポリヌクレオチド遮断薬と相補的なアダプターとの間のモル比が５：１以下である、請求項５３−５５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５７】
少なくとも１つのポリヌクレオチド遮断薬と相補的なアダプターとの間のモル比が２：１以下である、請求項５３−５５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５８】
少なくとも１つのポリヌクレオチド遮断薬と相補的なアダプターとの間のモル比が１．５：１以下である、請求項５３−５５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５９】
核酸ハイブリダイゼーション用の組成物であって、前記組成物は：
第１のポリヌクレオチドライブラリー；
第２のポリヌクレオチドライブラリーであって、第１のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である、第２のポリヌクレオチドライブラリー；および、
添加剤であって、添加剤が、気液界面で第１のポリヌクレオチドライブラリーまたは第２のポリヌクレオチドライブラリーの局所濃度を減少させることにより、第２のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドとの第１のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドのオフターゲットハイブリダイゼーションを減少させる、添加剤を含む、組成物。
【請求項６０】
核酸ハイブリダイゼーション用の組成物であって、前記組成物は：
各々が複数のポリヌクレオチドを含む第１のポリヌクレオチドライブラリーと第２のポリヌクレオチドライブラリーであって、第１のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である、第１のポリヌクレオチドライブラリーと第２のポリヌクレオチドライブラリー；および、
油であって、油が、気液界面で第１のポリヌクレオチドライブラリーまたは第２のポリヌクレオチドライブラリーの局所濃度を減少させることにより、第２のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドとの第１のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドのオフターゲットハイブリダイゼーションを減少させる、油、を含む、組成物。
【請求項６１】
添加剤が鉱物油、ヌクレオチド三リン酸、ポリエーテル、または尿素である、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６２】
添加剤は、少なくとも６つの炭素原子を含む炭化水素である、請求項５９−６１のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項６３】
添加剤はシリコンオイルである、請求項５９−６２のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項６４】
油は植物源に由来する、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６５】
組成物はジメチルスルホキシドをさらに含む、請求項５９−６３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項６６】
組成物はホルムアミドを含まない、請求項５９−６４のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項６７】
第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが１０００万未満の塩基である、請求項５９または６６に記載の組成物。
【請求項６８】
第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが１００万未満の塩基である、請求項５９または６６に記載の組成物。
【請求項６９】
第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが５０万未満の塩基である、請求項５９または６６に記載の組成物。
【請求項７０】
第１のポリヌクレオチドライブラリーは少なくとも１つのエクソン配列を含む、請求項５９−６９のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項７１】
第１のポリヌクレオチドライブラリーは少なくとも１０の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項５９−７０のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項７２】
第１のポリヌクレオチドライブラリーは少なくとも１００の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項５９−７０のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項７３】
第１のポリヌクレオチドライブラリーは少なくとも１つのゲノム断片を含む、請求項５９−７２のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項７４】
第１のポリヌクレオチドライブラリーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡを含む、請求項５９−７２のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項７５】
第１のポリヌクレオチドライブラリーはゲノムＤＮＡを含む、請求項５９−７４のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項７６】
オフターゲット核酸ハイブリダイゼーションを減少させるための方法であって、前記方法は：
第１のポリヌクレオチドライブラリーを第２のポリヌクレオチドライブラリーに接触させる工程であって、第１のポリヌクレオチドライブラリーと第２のポリヌクレオチドライブラリーが各々、複数のポリヌクレオチドを含み、および、第１のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である、工程；
少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを生成するために、第２のポリヌクレオチドライブラリーに結合する少なくとも１つのゲノム断片を富化する工程であって、富化する工程は少なくとも１つの吸引工程を含み、および、少なくとも１つの吸引工程は、空気／液体界面の近くの領域から液体のみを吸引することを含む、工程；および、
少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを配列決定する工程を含む、方法。
【請求項７７】
ゲノムＤＮＡを配列決定するための方法であって、前記方法は：
混合物を形成するために複数のゲノム断片と添加物にポリヌクレオチドライブラリーを接触させる工程であって、添加物が、気液界面で混合物中のポリヌクレオチドライブラリーまたはゲノム断片の局所濃度を減少させる、工程；
少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを生成するために、ポリヌクレオチドライブラリーに結合する少なくとも１つのゲノム断片を富化する工程；および、
少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを配列決定する工程を含む、方法。
【請求項７８】
添加剤が油、ヌクレオチド三リン酸、ポリエーテル、または尿素である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
添加剤は鉱物油である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
添加剤の存在はオフターゲット結合を減少させる、請求項７７−７９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８１】
添加物の存在はオフターゲット結合を少なくとも１０％減少させる、請求項７７−８０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８２】
添加物の存在はオフターゲット結合を少なくとも２０％減少させる、請求項７７−８０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８３】
添加物の存在はオフターゲット結合を少なくとも３０％減少させる、請求項７７−８０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８４】
オフターゲット結合はランダムなオフターゲット結合である、請求項８０−８３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８５】
第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが１０００万未満の塩基である、請求項７７−８４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８６】
第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが１００万未満の塩基である、請求項７７−８４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８７】
第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが５０万未満の塩基である、請求項７７−８４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８８】
第１のポリヌクレオチドライブラリーは少なくとも１つのエクソン配列を含む、請求項７７−８７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８９】
第１のポリヌクレオチドライブラリーは少なくとも１０の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項７７−８８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９０】
第１のポリヌクレオチドライブラリーは少なくとも１００の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項７７−８８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９１】
第１のポリヌクレオチドライブラリーは少なくとも１つのゲノム断片を含む、請求項７７−９０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９２】
第１のポリヌクレオチドライブラリーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡを含む、請求項７７−９１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９３】
第１のポリヌクレオチドライブラリーはゲノムＤＮＡを含む、請求項７７−９２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９４】
少なくとも１つの溶媒；
少なくとも１つの界面活性剤；および、
少なくとも１つの増粘剤を含む、
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション用の水性組成物。
【請求項９５】
少なくとも１つの溶媒は、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＤＭＡｃ、またはＨＭＰＡを含む、請求項９４に記載の水性組成物。
【請求項９６】
少なくとも１つの溶媒は、アセトン、メチルエチルケトン、ＴＨＦ、またはジエチルエーテルを含む、請求項９４または９５に記載の水性組成物。
【請求項９７】
少なくとも１つの界面活性剤は、ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、タージトール、またはラウリル硫酸ナトリウムを含む、請求項９４−９６のいずれか１つに記載の水性組成物。
【請求項９８】
少なくとも１つの界面活性剤は、トリアルキルアンモニウム塩を含む、請求項９４−９７のいずれか１つに記載の水性組成物。
【請求項９９】
少なくとも１つの増粘剤は、セルロース、でんぷん、またはその誘導体を含む、請求項９４−９８のいずれか１つに記載の水性組成物。
【請求項１００】
少なくとも１つの増粘剤は、硫酸デキストラン、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、またはフィコールを含む、請求項９４−９９のいずれか１つに記載の水性組成物。
【請求項１０１】
少なくとも１つの増粘剤は１０−４０％（ｗ／ｖ）である、請求項９４−１００のいずれか１つに記載の水性組成物。
【請求項１０２】
少なくとも１つの界面活性剤は、０．００１−０．１％（ｗ／ｖ）である、請求項９４−１０１のいずれか１つに記載の水性組成物。
【請求項１０３】
少なくとも１つの溶媒は水中で１０−３０％（ｖ／ｖ）である、請求項９４−１０２のいずれか１つに記載の水性組成物。
【請求項１０４】
ゲノムＤＮＡを配列決定するための方法であって、前記方法は：
複数のゲノム断片、および請求項９４−１０３のいずれか１つの組成物に、ポリヌクレオチドライブラリーを接触させる工程であって、接触する工程は８時間未満生じる、工程；
少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを生成するために、ポリヌクレオチドライブラリーに結合する少なくとも１つのゲノム断片を富化する工程；および、
少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを配列決定する工程を含む、方法。
【請求項１０５】
接触する工程は５時間未満生じる、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
接触する工程は１時間未満生じる、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
接触する工程は１５分未満生じる、請求項１０４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１８年５月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／６７３，７０４号、２０１９年２月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／８１０，３４３号、２０１９年３月６日に出願された米国仮特許出願第６２／８１４，７４９号、２０１８年５月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／６７５，６４７号、２０１９年２月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／８１０，２９３号、２０１９年３月６日に出願された米国仮特許出願第６２／８１４，７５３号、および２０１９年４月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／８３３，４４０号の利益を主張し、その各々は全体として引用によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
高忠実度および低コストの非常に効率的な化学的遺伝子合成は、バイオテクノロジーや医療において、および基礎的な生物学的研究において中心的な役割を有している。デノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）遺伝子合成は、基礎的な生物学的研究やバイオテクノロジー用途のための強力なツールである。小規模での比較的短い断片の合成のための様々な方法が知られているが、これらの技術には、スケーラビリティ、自動化、速度、精度、およびコストの点でしばしば問題がある。
【０００３】
引用による組み込み
本明細書で言及されるすべての公開物、特許、および特許出願は、あたかも個々の公開物、特許、または特許出願がそれぞれ参照により本明細書に具体的かつ個別に組み込まれるのと同じ程度にまで、参照により本明細書に組み込まれている。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書には、ゲノムＤＮＡを配列決定するための方法が提供され、上記方法は：少なくとも３０，０００のポリヌクレオチドを含む第１のポリヌクレオチドライブラリーを含む組成物を接触させる工程であって、少なくとも３０，０００のポリヌクレオチドの各々は、ゲノム断片によるハイブリダイゼーションとハイブリダイズされたゲノム断片の配列決定の後で、ポリヌクレオチドライブラリーが、ポリヌクレオチドに対応するゲノム断片の塩基の少なくとも８０パーセントのリード深度と；配列決定リードの総数とを提供するような量で存在し、ここで、配列決定リードの総数は、理論的なリード深度のポリヌクレオチドに対応するゲノム断片の塩基の各々の１００パーセントをカバーすることができ、ここで、理論的なリード深度に対する、ポリヌクレオチドに対応するゲノム断片の塩基の少なくとも８０パーセントのリード深度の比は、複数のゲノム断片で少なくとも０．５である、工程；少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを生成するために、第１のポリヌクレオチドライブラリーに結合する少なくとも１つのゲノム断片を富化する工程；少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを配列決定する工程；平均未満のリード深度を有する少なくとも１つの富化されたポリヌクレオチドの１つ以上の位置を特定する工程；工程ａ−ｃを繰り返す工程であって、少なくとも１５００のポリヌクレオチドを含む第２のポリヌクレオチドライブラリーが組成物に添加され、第２のポリヌクレオチドライブラリーが、平均未満のリード深度を有する１つ以上の位置を含むゲノム断片に結合する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、第２のポリヌクレオチドライブラリーの存在が、平均未満のリード深度を有する１つ以上の位置でリード深度を増加させる、工程、を含む。ゲノムＤＮＡを配列決定するための方法が本明細書で提供され、上記方法は：少なくとも３０，０００のポリヌクレオチドを含む第１のポリヌクレオチドライブラリーを含む組成物を接触させる工程であって、少なくとも３０，０００のポリヌクレオチドの各々は、ゲノム断片によるハイブリダイゼーションとハイブリダイズされたゲノム断片の配列決定の後で、ポリヌクレオチドライブラリーが、ポリヌクレオチドに対応するゲノム断片の塩基の少なくとも８０パーセントのリード深度と；配列決定リードの総数とを提供するような量で存在し、ここで、配列決定リードの総数は、理論的なリード深度のポリヌクレオチドに対応するゲノム断片の塩基の各々の１００パーセントをカバーすることができ、ここで、理論的なリード深度に対する、ポリヌクレオチドに対応するゲノム断片の塩基の少なくとも８０パーセントのリード深度の比は、複数のゲノム断片で少なくとも０．５である、工程；少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを生成するために、第１のポリヌクレオチドライブラリーに結合する少なくとも１つのゲノム断片を富化する工程；少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを配列決定する工程；平均未満のリード深度を有する少なくとも１つの富化されたポリヌクレオチドの１つ以上の位置を特定する工程；工程ａ−ｃを繰り返す工程であって、第２のポリヌクレオチドライブラリーが組成物に添加され、第２のポリヌクレオチドライブラリーが、平均未満のリード深度を有する１つ以上の位置を含むゲノム断片に結合する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、第２のポリヌクレオチドライブラリーの存在が、平均未満のリード深度を有する１つ以上の位置でリード深度を増加させる、工程、を含む。第１のポリヌクレオチドライブラリーと第２のポリヌクレオチドライブラリーが任意の共通配列を含まない方法が本明細書でさらに提供される。第１のポリヌクレオチドライブラリーと第２のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１つの共通配列を含まない方法が本明細書でさらに提供される。第２のポリヌクレオチドライブラリーの存在が、平均未満のリード深度を有する少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドの１つ以上の位置のリード深度を少なくとも１０倍増加させる方法が、本明細書でさらに提供される。第２のポリヌクレオチドライブラリーの存在が、平均未満のリード深度を有する少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドの１つ以上の位置のリード深度を少なくとも１００倍増加させる方法が、本明細書でさらに提供される。
【０００５】
少なくとも１５００のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーが本明細書で提供され、ここで、すべてよりも少ないポリヌクレオチドが分子タグを含み、ここで、少なくとも５，０００のポリヌクレオチドの各々は、ゲノム断片によるハイブリダイゼーションとハイブリダイズされたゲノム断片の配列決定の後で、ポリヌクレオチドライブラリーが、ポリヌクレオチドに対応するゲノム断片の塩基の少なくとも９０パーセントのリード深度と；配列決定リードの総数とを提供するような量で存在し、ここで、配列決定リードの総数は、理論的なリード深度のポリヌクレオチドに対応するゲノム断片の塩基の各々の１００パーセントをカバーすることができ、ここで、理論的なリード深度に対する、ポリヌクレオチドに対応するゲノム断片の塩基の少なくとも９０パーセントのリード深度の比は、少なくとも０．５である。さらに、ポリヌクレオチドの９０％以下が分子タグを含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチドの８０％以下が分子タグを含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチドの５０％以下が分子タグを含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチドの２５％以下が分子タグを含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、分子タグがビオチンであるポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、少なくとも５０００のポリヌクレオチドが少なくとも５０００の遺伝子をコードするポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも３０，０００のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１００，０００のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。
【０００６】
核酸を富化するための方法が本明細書で提供され、上記方法は：本明細書に記載されるポリヌクレオチドライブラリーを複数のゲノム断片に接触させる工程；少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを生成するために、ポリヌクレオチドライブラリーに結合する少なくとも１つのゲノム断片を富化する工程；および、少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを配列決定する工程を含む。さらに、ポリヌクレオチドライブラリーが、配列決定後に、富化された標的ポリヌクレオチドの塩基に対して少なくとも９０パーセントの固有のリードを提供する方法も本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチドライブラリーが、配列決定後に、富化された標的ポリヌクレオチドの塩基に対して少なくとも９５パーセントの固有のリードを提供する方法も本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチドライブラリーが平均のリード深度の約１．５倍以内のリード深度を有する富化された標的ポリヌクレオチドの塩基の少なくとも８０パーセントを提供する方法も本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチドライブラリーが平均のリード深度の約１．５倍以内のリード深度を有する富化された標的ポリヌクレオチドの塩基の少なくとも９０パーセントを提供する方法も本明細書で提供される。
【０００７】
少なくとも５０００のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーが本明細書で提供され、ここで、少なくとも５０００のポリヌクレオチドの各々は、ｉ）ゲノムライブラリーであって、ゲノム断片、少なくとも１つのインデックス配列、および少なくとも１つのアダプターを各々含むポリヌクレオチドを含んでいる、ゲノムライブラリーと；および、ｉｉ）少なくとも１つのポリヌクレオチド遮断薬であって、少なくともアダプター配列の一部に相補的であるが、少なくとも１つのインデックス配列には相補的でない、少なくとも１つのポリヌクレオチド遮断薬とを含む組成物を用いるハイブリダイゼーション、および、ハイブリダイズされたゲノム断片の配列決定の後に、ポリヌクレオチドライブラリーは、リードの総数がハイブリダイズされたゲノム断片の塩基の総数の５５倍以下となる条件下で、ゲノム断片の塩基の少なくとも９０パーセントの少なくとも３０フォールドのリード深度を提供する、ような量で存在する。さらに、組成物が４つ以下のポリヌクレオチド遮断薬を含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチド遮断薬が１つ以上のヌクレオチドアナログを含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチド遮断薬が１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチド遮断薬が１つ以上の架橋核酸（ＢＮＡ）を含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチド遮断薬が少なくとも２つのヌクレオチドアナログを含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチド遮断薬が少なくとも５つのヌクレオチドアナログを含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチド遮断薬が少なくとも１０のヌクレオチドアナログを含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチド遮断薬が少なくとも７０℃のＴｍを有するポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチド遮断薬が少なくとも７５℃のＴｍを有するポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチド遮断薬が少なくとも７８℃のＴｍを有するポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチド遮断薬が少なくとも８２℃のＴｍを有するポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチド遮断薬が少なくとも８０−９０℃のＴｍを有するポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチド遮断薬が少なくとも８０℃のＴｍを有するポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ゲノムライブラリーが少なくとも２つの異なるサンプルからのゲノム断片を含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ゲノムライブラリーが少なくとも１０つの異なるサンプルからのゲノム断片を含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ゲノムライブラリーが少なくとも２つの非同一インデックス配列からのゲノム断片を含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ゲノムライブラリーが少なくとも１６の非同一インデックス配列からのゲノム断片を含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ゲノムライブラリーが少なくとも１つの固有の分子識別子（ＵＭＩ）をさらに含むゲノム断片を含んでいるポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。
【０００８】
核酸を富化するための方法が本明細書で提供され、上記方法は：本明細書に記載されるポリヌクレオチドライブラリーを複数のゲノム断片に接触させる工程；少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを生成するために、ポリヌクレオチドライブラリーに結合する少なくとも１つのゲノム断片を富化する工程；および、少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを配列決定する工程を含む。さらに、オフターゲット率が２５％未満である方法も本明細書で提供される。さらに、オフターゲット率が２０％未満である方法も本明細書で提供される。さらに、少なくとも１つのポリヌクレオチド遮断薬と相補的なアダプターとの間のモル比が５：１以下である方法も本明細書で提供される。さらに、少なくとも１つのポリヌクレオチド遮断薬と相補的なアダプターとの間のモル比が２：１以下である方法も本明細書で提供される。さらに、少なくとも１つのポリヌクレオチド遮断薬と相補的なアダプターとの間のモル比が１．５：１以下である方法も本明細書で提供される。
【０００９】
以下を含む、核酸ハイブリダイゼーションのための組成物が本明細書で提供される：第１のポリヌクレオチドライブラリー；第２のポリヌクレオチドライブラリーであって、第１のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である、第２のポリヌクレオチドライブラリー；添加剤であって、添加剤が、気液界面で第１のポリヌクレオチドライブラリーまたは第２のポリヌクレオチドライブラリーの局所濃度を減少させることにより、第２のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドとの第１のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドのオフターゲットハイブリダイゼーションを減少させる、添加剤。さらに、添加剤が鉱物油、ヌクレオチド三リン酸、ポリエーテル、または尿素である組成物も本明細書で提供される。さらに、添加剤が少なくとも６つの炭素原子を含む炭化水素である組成物も本明細書で提供される。さらに、添加剤がシリコンオイルである組成物も本明細書で提供される。さらに、油が植物源に由来する組成物も本明細書で提供される。さらに、組成物がジメチルスルホキシドをさらに含む組成物も本明細書で提供される。さらに、組成物がホルムアミドを含まない組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが１０００万未満の塩基である組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが１００万未満の塩基である組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが５０万未満の塩基である組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１つのエクソン配列を含む組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１０の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１００の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１つのゲノム断片を含む組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーがＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡを含む組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーがゲノムＤＮＡを含む組成物も本明細書で提供される。
【００１０】
本明細書には、核酸ハイブリダイゼーションのための組成物が提供され、上記組成物は：各々が複数のポリヌクレオチドを含む第１のポリヌクレオチドライブラリーと第２のポリヌクレオチドライブラリーであって、第１のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である、第１のポリヌクレオチドライブラリーと第２のポリヌクレオチドライブラリーと、油であって、油が、気液界面で第１のポリヌクレオチドライブラリーまたは第２のポリヌクレオチドライブラリーの局所濃度を減少させることにより、第２のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドとの第１のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドのオフターゲットハイブリダイゼーションを減少させる、油、を含む。さらに、添加剤が鉱物油、ヌクレオチド三リン酸、ポリエーテル、または尿素である組成物も本明細書で提供される。さらに、添加剤が少なくとも６つの炭素原子を含む炭化水素である組成物も本明細書で提供される。さらに、添加剤がシリコンオイルである組成物も本明細書で提供される。さらに、油が植物源に由来する組成物も本明細書で提供される。さらに、組成物がジメチルスルホキシドをさらに含む組成物も本明細書で提供される。さらに、組成物がホルムアミドを含まない組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが１０００万未満の塩基である組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが１００万未満の塩基である組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが５０万未満の塩基である組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１つのエクソン配列を含む組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１０の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１００の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１つのゲノム断片を含む組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーがＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡを含む組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーがゲノムＤＮＡを含む組成物も本明細書で提供される。
【００１１】
オフターゲット核酸ハイブリダイゼーションを減少させるための方法が本明細書で提供され、上記方法は：第１のポリヌクレオチドライブラリーを第２のポリヌクレオチドライブラリーに接触させる工程であって、第１のポリヌクレオチドライブラリーと第２のポリヌクレオチドライブラリーが各々、複数のポリヌクレオチドを含み、および、第１のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である、工程；少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを生成するために、第２のポリヌクレオチドライブラリーに結合する少なくとも１つのゲノム断片を富化する工程であって、富化する工程は少なくとも１つの吸引工程を含み、および、少なくとも１つの吸引工程は、空気／液体界面の近くの領域から液体のみを吸引することを含む、工程；および、少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを配列決定する工程を含む。さらに、添加剤が油、ヌクレオチド三リン酸、ポリエーテル、または尿素である方法も本明細書で提供される。さらに、添加剤が鉱物油である方法も本明細書で提供される。さらに、添加物の存在がオフターゲット結合を減少させる方法も本明細書で提供される。さらに、添加物の存在がオフターゲット結合を少なくとも１０％減少させる方法も本明細書で提供される。さらに、添加物の存在がオフターゲット結合を少なくとも２０％減少させる方法も本明細書で提供される。さらに、添加物の存在がオフターゲット結合を少なくとも３０％減少させる方法も本明細書で提供される。さらに、オフターゲット結合がランダムなオフターゲット結合である方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが１０００万未満の塩基である方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが１００万未満の塩基である方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが５０万未満の塩基である方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１つのエクソン配列を含む方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１０の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１００の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１つのゲノム断片を含む方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーがＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡを含む方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーがゲノムＤＮＡを含む方法も本明細書で提供される。
【００１２】
本明細書には、ゲノムＤＮＡを配列決定するための方法が提供され、上記方法は：混合物を形成するために複数のゲノム断片と添加物にポリヌクレオチドライブラリーを接触させる工程であって、添加物が、気液界面で混合物中のポリヌクレオチドライブラリーまたはゲノム断片の局所濃度を減少させる、工程；少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを生成するために、ポリヌクレオチドライブラリーに結合する少なくとも１つのゲノム断片を富化する工程；および、少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを配列決定する工程を含む。さらに、添加剤が油、ヌクレオチド三リン酸、ポリエーテル、または尿素である方法も本明細書で提供される。さらに、添加剤が鉱物油である方法も本明細書で提供される。さらに、添加物の存在がオフターゲット結合を減少させる方法も本明細書で提供される。さらに、添加物の存在がオフターゲット結合を少なくとも１０％減少させる方法も本明細書で提供される。さらに、添加物の存在がオフターゲット結合を少なくとも２０％減少させる方法も本明細書で提供される。さらに、添加物の存在がオフターゲット結合を少なくとも３０％減少させる方法も本明細書で提供される。さらに、オフターゲット結合がランダムなオフターゲット結合である方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが１０００万未満の塩基である方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが１００万未満の塩基である方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが５０万未満の塩基である方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１つのエクソン配列を含む方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１０の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１００の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１つのゲノム断片を含む方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーがＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡを含む方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーがゲノムＤＮＡを含む方法も本明細書で提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】核酸配列決定データを分析すること、分析された核酸の特定領域を標的とする追加の捕捉プローブポリヌクレオチドライブラリーをスパイクインすること、および、標的領域でリード深度が増加した新しい配列決定データを得ることを含む、概略的なワークフローを描く。
【図１Ｂ】インデックス配列と４つの普遍的な遮断薬ポリヌクレオチドを含む例示的な二重アダプター連結核酸を描く。
【図１Ｃ】部分的に標識された捕捉プローブを使用して、核酸サンプルの富化と配列決定のための例示的なワークフローを描く。
【図２】核酸サンプルの富化と配列決定のための例示的なワークフローを描く。
【図３】ゲノムライブラリーが２つの異なるエクソーム捕捉ライブラリー、疼痛遺伝子を標的とする小さなライブラリーパネル、またはエクソームとパネルライブラリーの組み合わせで富化された後の配列決定カバレッジ対染色体１１における位置のプロットを描く。
【図４Ａ】プローブハイブリダイゼーション中の遮断薬のタイプを比較する、富化および配列決定の分析に関するパーセントオフベイト（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｏｆｆ  ｂａｉｔ）対遮断薬のタイプのプロットを描く。条件は遮断薬を含まないか（−対照）、特定の遮断薬（＋対照）、または普遍的な遮断薬の２つの異なるデザインを含んでいた。
【図４Ｂ】プローブハイブリダイゼーション中の遮断薬のタイプを比較する、富化と配列決定の分析のパーセントオフベイト（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｏｆｆ  ｂａｉｔ）対遮断薬混合物のプロットを描く。条件は遮断薬を含まないか（−対照）、特定の遮断薬（＋対照）、または普遍的な遮断薬の異なる組み合わせが独立して試験された条件を含んでいた。
【図４Ｃ】様々な質量負荷でのプローブハイブリダイゼーション中の遮断薬のタイプを比較する、富化と配列決定の分析のパーセントオフベイト（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｏｆｆ  ｂａｉｔ）対様々なデザインのプロットを描く。
【図４Ｄ】普遍的な遮断薬を用いる富化と配列決定の分析のパーセントオフベイト（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｏｆｆ  ｂａｉｔ）対遮断薬濃度のプロットを描く。
【図４Ｅ】富化と配列決定の分析に関して、パーセントオフベイト（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｏｆｆ  ｂａｉｔ）対様々な量のロックド核酸を含む普遍的な遮断薬のプロットを描く。
【図４Ｆ】富化と配列決定の分析に関して、パーセントオフベイト（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｏｆｆ  ｂａｉｔ）対様々な量の架橋核酸を含む普遍的な遮断薬のプロットを描く。
【図５Ａ】富化と配列決定の分析に関してパーセントオフベイト（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｏｆｆ  ｂａｉｔ）対ビオチンを含むパーセントベイトのプロットを描く。
【図５Ｂ】富化と配列決定の分析に関してＡＴまたはＧＣドロップアウト対ビオチンを含むパーセントベイトのプロットを描く。
【図６Ａ】エクソームライブラリーとより小さな標的化疼痛遺伝子エクソームライブラリーのパフォーマンスを比較する、富化と配列決定の分析に関するＨＳライブラリーサイズ／標的サイズ対ｌｏｇ２（ベイト質量／標的サイズ）のプロットを描く。エクソームライブラリーに関するデータは希釈の線形モデルに適合される。
【図６Ｂ】エクソームライブラリーとより小さな標的化疼痛遺伝子エクソームライブラリーのパフォーマンスを比較する、富化と配列決定の分析に関するＨＳライブラリーサイズ／標的サイズ対ｌｏｇ２（ベイト質量／標的サイズ）のプロットを描く。データは希釈の対数モデルに適合される。
【図７】標的結合ポリヌクレオチドライブラリーを含む標的ポリヌクレオチドを富化するための概要を描く。
【図８】クラスター増幅からのポリヌクレオチドライブラリーの生成の概要を描く。
【図９Ａ】標的化と富化のための１対のポリヌクレオチドを描く。ポリヌクレオチドは、プライマー結合部位と同様に相補的な標的結合（挿入）配列を含む。
【図９Ｂ】標的化と富化のための１対のポリヌクレオチドを描く。ポリヌクレオチドは、相補的な標的配列結合（挿入）配列、プライマー結合部位、および非標的配列を含む。
【図１０Ａ】より大きなポリヌクレオチドの標的配列に対するポリヌクレオチド結合構成を描く。標的配列は、ポリヌクレオチド結合領域よりも短く、ポリヌクレオチド結合領域（または挿入配列）は、標的配列に対して相殺され、隣接する配列の一部にも結合する。
【図１０Ｂ】より大きなポリヌクレオチドの標的配列に対するポリヌクレオチド結合構成を描く。標的配列長さはポリヌクレオチド結合領域以下であり、ポリヌクレオチド結合領域は標的配列を中心にしており、隣接する配列の一部にも結合する。
【図１０Ｃ】より大きなポリヌクレオチドの標的配列に対するポリヌクレオチド結合構成を描く。標的配列はポリヌクレオチド結合領域よりもわずかに長く、ポリヌクレオチド結合領域は、各側にバッファー領域を有する標的配列を中心としている。
【図１０Ｄ】より大きなポリヌクレオチドの標的配列に対するポリヌクレオチド結合構成を描く。標的配列は、ポリヌクレオチド結合領域よりも長く、２つのポリヌクレオチドの結合領域は標的配列にまたがるように重なる。
【図１０Ｅ】より大きなポリヌクレオチドの標的配列に対するポリヌクレオチド結合構成を描く。標的配列は、ポリヌクレオチド結合領域よりも長く、２つのポリヌクレオチドの結合領域は標的配列にまたがるように重なる。
【図１０Ｆ】より大きなポリヌクレオチドの標的配列に対するポリヌクレオチド結合構成を描く。標的配列は、ポリヌクレオチド結合領域よりも長く、２つのポリヌクレオチドの結合領域は標的配列にまたがるように重ならず、ギャップ（４０５）を残す。
【図１０Ｇ】より大きなポリヌクレオチドの標的配列に対するポリヌクレオチド結合構成を描く。標的配列は、ポリヌクレオチド結合領域よりも長く、３つのポリヌクレオチドの結合領域は標的配列にまたがるように重なる。
【図１１】本明細書で開示されるような遺伝子合成のための典型的なプロセスワークフローを実証する工程の図を提示する。
【図１２】コンピュータシステムを例証する。
【図１３】コンピュータシステムの構造を例証するブロック図である。
【図１４】複数のコンピュータシステム、複数の携帯電話および個人用携帯情報端末、ならびにネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）を組み込むように構成されたネットワークを実証する図である。
【図１５】共有仮想アドレスメモリ空間を用いる、マルチプロセッサコンピュータシステムのブロック図である。
【図１６】２５６のクラスターを有するプレートの画像であり、各クラスターは１２１の遺伝子座（ｌｏｃｉ）を有し、ポリヌクレオチドがそこから伸びている。
【図１７Ａ】２４０のクラスターからの２９，０４０の固有のポリヌクレオチドの合成からのプレート全体でのポリヌクレオチド表示（ポリヌクレオチド頻度対存在量、測定された吸光度として）のプロットであり、各クラスターは１２１のポリヌクレオチドを有する。
【図１７Ｂ】それぞれの個々のクラスターでのポリヌクレオチド頻度対存在量吸光度（測定された吸光度として）の測定のプロットであり、対照クラスターはボックスによって識別されている。
【図１８】４つの個々のクラスターでのポリヌクレオチド頻度対存在量（測定された吸光度として）の測定のプロットである。
【図１９Ａ】２４０のクラスターからの２９，０４０の固有のポリヌクレオチドの合成からのプレート全体での頻度対エラー率のプロットであり、各クラスターは１２１のポリヌクレオチドを有する。
【図１９Ｂ】それぞれの個々のクラスターでのポリヌクレオチドエラー率対頻度の測定のプロットであり、対照クラスターはボックスによって識別されている。
【図２０】４つのクラスターでのポリヌクレオチド頻度対エラー率の測定のプロットである。
【図２１】ポリヌクレオチドの数対ポリヌクレオチド当たりのパーセントの尺度としてのＧＣ含有量のプロットである。
【図２２】プローブパネル：ライブラリー１（７５７ｋｂ）およびライブラリー２（８０３ｋｂ）のパフォーマンスを示す富化と配列決定の分析のためのパーセントカバレッジ対リード深度のプロットである。
【図２３Ａ】普遍的な遮断薬の概要である。
【図２３Ｂ】ＬＮＡ遮断薬デザインの概要である。
【図２４】様々なインデックスデザインに関するオンターゲットパフォーマンスのグラフである。
【図２５】様々なパネルサイズに関するオンターゲットパフォーマンスのグラフである。
【図２６Ａ】３０ｘカバレッジを達成する各カスタムパネル中のリードの割合のグラフである。
【図２６Ｂ】各カスタムパネルの均一性（フォールド８０（ｆｏｌｄ−８０））のグラフである。
【図２７Ａ】８１０ｋｂのパネルを使用してパフォーマンスデータを示す。
【図２７Ｂ】１−、８−、または１６プレックス（−ｐｌｅｘ）における３枚のパネルに関する多重化パフォーマンスを示す。
【図２７Ｃ】均一性に対するＰＣＲサイクルの効果を示す。
【図２７Ｄ】捕捉に対するライブラリー入力質量の効果を示す。
【図２８Ａ】カスタムパネル間の再現性を示す。図２８Ａは、８００ｋｂのパネルの質を示す。
【図２８Ｂ】カスタムパネル間の再現性を示す。図２８Ｂは、８００ｋｂのパネルの富化パフォーマンスを示す。
【図２８Ｃ】カスタムパネル間の再現性を示す。図２８Ｃは、同じ合成および異なる増幅内のプローブ表現の再現性を示す。
【図２８Ｄ】カスタムパネル間の再現性を示す。図２８Ｄは、合成間のプローブ表現の再現性を示す。
【図２８Ｅ】カスタムパネル間の再現性を示す。図２８Ｅは、プローブあたりのロット間の再現性捕捉を示す。
【図２８Ｆ】カスタムパネル間の再現性を示す。図２８Ｆ−２８Ｉは、合成間のプローブ標的富化パフォーマンス間の再現性を示す。図２８Ｆは、パーセントオフターゲット捕捉に関するロット間の再現性を示す。
【図２８Ｇ】カスタムパネル間の再現性を示す。図２８Ｆ−２８Ｉは、合成間のプローブ標的富化パフォーマンス間の再現性を示す。図２８Ｇは、重複率に関するロット間の再現性を示す。
【図２８Ｈ】カスタムパネル間の再現性を示す。図２８Ｆ−２８Ｉは、合成間のプローブ標的富化パフォーマンス間の再現性を示す。図２８Ｈは、３０Ｘカバレッジよりも大きな標的塩基の画分に関するロット間の再現性を示す。
【図２８Ｉ】カスタムパネル間の再現性を示す。図２８Ｆ−２８Ｉは、合成間のプローブ標的富化パフォーマンス間の再現性を示す。図２８Ｉは、フォールド８０ベースペナルティ（ｆｏｌｄ−８０  ｂａｓｅ  ｐｅｎａｌｔｙ）に関するロット間の再現性を示す。
【図２９Ａ】カスタムパネルへの内容物の添加または増強の概要である。
【図２９Ｂ】内容物を添加した、および、内容物を添加していないパネルを比較する均一性（フォールド８０）のグラフである。
【図２９Ｃ】内容物を添加した、および、内容物を添加していないパネルを比較する重複率のグラフである。
【図２９Ｄ】内容物を添加した、および、内容物を添加していないパネルを比較する割合のパーセントのグラフである。
【図２９Ｅ】内容物を添加した、および、内容物を添加していないパネルと、コンパレーター富化キットを比較する、パーセント標的カバレッジのグラフである。
【図２９Ｆ】内容物を添加した、および、内容物を添加していないパネルと、コンパレーター富化キットを比較する、フォールド８０ベースペナルティのグラフである。
【図３０Ａ】対照と変異体パネルのデザインを示す。
【図３０Ｂ】プローブパフォーマンスにおけるミスマッチの分布を示す。単一のミスマッチ（グレー）のプローブと複数のミスマッチ（緑の線；ミスマッチの数は左上隅に示される）のプローブに関する相対的な捕捉効率の分布が示される。実線は、ランダムに分布されたミスマッチ（ＲＮＤ）を有するプローブの分布を描き、点線は、連続的なミスマッチ（ＣＯＮＴ）を有するプローブの分布を示す。図３０Ｂは、３、５、１０、または１５のミスマッチ（左から右）を有するプローブのグラフを示す。
【図３０Ｃ】プローブパフォーマンスにおけるミスマッチの分布を示す。単一のミスマッチ（グレー）のプローブと複数のミスマッチ（緑の線；ミスマッチの数は左上隅に示される）のプローブに関する相対的な捕捉効率の分布が示される。実線は、ランダムに分布されたミスマッチ（ＲＮＤ）を有するプローブの分布を描き、点線は、連続的なミスマッチ（ＣＯＮＴ）を有するプローブの分布を示す。図３０Ｃは、２０、３０、または５０のミスマッチ（左から右）を有するプローブのグラフを示す。
【図３０Ｄ】捕捉効率に対する温度の効果を示す。
【図３０Ｅ】ヒトサンプル（図３０Ｅ）からの、および、ヒトゲノム（図３０Ｆ）中のすべてのＣｐＧ島からの４５０の全ゲノムＺｉｋａ単離物のデザインに関する効率予測を示す。
【図３０Ｆ】ヒトサンプル（図３０Ｅ）からの、および、ヒトゲノム（図３０Ｆ）中のすべてのＣｐＧ島からの４５０の全ゲノムＺｉｋａ単離物のデザインに関する効率予測を示す。
【図３１Ａ】基準対適応プローブデザインのグラフを示す。図３１Ａは、オフターゲットパーセント率に関する標準および適応性のあるプローブデザインの比較を示す。
【図３１Ｂ】基準対適応プローブデザインのグラフを示す。図３１Ｂは、選択的なプローブ除去の予測された効果を選択的なプローブ除去の実験結果と関連させるオフターゲットリードのパーセントのプロットを示す。様々な量のパフォーマンスの最も悪いプローブは、エクソーム捕捉ライブラリーから取り除かれた。
【図３１Ｃ】基準対適応プローブデザインのグラフを示す。図３１Ｃは、エクソーム捕捉ライブラリーからのプローブ（塩基／対照）、プローブの０．４％の（増加した）、プローブの１．７％（中程度）、またはプローブの３．３％（強力）の選択的な除去に応じたオフターゲットパーセントのグラフを示す。
【図３２Ａ】単独での、またはＲｅｆＳｅｑパネルが添加されたエクソームパネルのカバレッジにおけるパーセント標的塩基としての深さカバレッジのグラフを示す。
【図３２Ｂ】シングルプレックス実験と８プレックス実験の両方において、標準エクソームパネル対ＲｅｆＳｅｑパネルを組み合わせたエクソームパネルの様々な富化／捕捉配列決定測定基準（ｍｅｔｒｉｃｓ）のグラフを示す。図３２Ｂは、エクソームパネル単独または  ＲｅｆＳｅｑ  パネルを追加したエクソームパネルのオフターゲットパーセントとしての特異度のグラフを示す。
【図３２Ｃ】シングルプレックス実験と８プレックス実験の両方において、標準エクソームパネル対ＲｅｆＳｅｑパネルを組み合わせたエクソームパネルの様々な富化／捕捉配列決定測定基準のグラフを示す。図３２Ｃは、エクソームパネル単独またはＲｅｆＳｅｑパネルを追加したエクソームパネルの均一性のグラフを示す。
【図３２Ｄ】シングルプレックス実験と８プレックス実験の両方において、標準エクソームパネル対ＲｅｆＳｅｑパネルを組み合わせたエクソームパネルの様々な富化／捕捉配列決定測定基準のグラフを示す。図３２Ｄは、エクソームパネル単独またはＲｅｆＳｅｑパネルを追加したエクソームパネルのライブラリーサイズのグラフを示す。
【図３２Ｅ】シングルプレックス実験と８プレックス実験の両方において、標準エクソームパネル対ＲｅｆＳｅｑパネルを組み合わせたエクソームパネルの様々な富化／捕捉配列決定測定基準のグラフを示す。図３２Ｅは、エクソームパネル単独またはＲｅｆＳｅｑパネルを追加したエクソームパネルの重複率のグラフを示す。
【図３２Ｆ】シングルプレックス実験と８プレックス実験の両方において、標準エクソームパネル対ＲｅｆＳｅｑパネルを組み合わせたエクソームパネルの様々な富化／捕捉配列決定測定基準のグラフを示す。図３２Ｆは、エクソームパネル単独またはＲｅｆＳｅｑパネルを追加したエクソームパネルのカバレッジ率のグラフを示す。
【図３３Ａ】核酸が気液界面の近くに集中する、例示的なハイブリダイゼーション反応を示す。
【図３３Ｂ】例示的なハイブリダイゼーション反応を示しており、核酸が添加剤によって気液界面付近に集中するのを防がれている。
【図３３Ｃ】富化および配列決定の分析に関して様々な添加剤を含むオフターゲットパーセント対結合バッファーのプロットを描く。
【図３４Ａ】富化および配列決定の分析に関して異なる添加剤を含むオフターゲットパーセント対様々なバッファーのプロットを描く。
【図３４Ｂ】富化と配列決定の分析に関してパーセントオフベイト対鉱物油の洗浄回数と鉱物油の存在のプロットを描く。
【図３４Ｃ】富化と配列決定の分析に関して鉱物油の異なる洗浄回数と有無を含む条件についてのＡＴドロップアウト対ＧＣドロップアウトのプロットを描く。
【図３４Ｄ】富化と配列決定の分析に関して洗浄バッファー１による異なる洗浄回数と鉱物油の有無を含む条件についてのＨＳライブラリーサイズのプロットを描く。
【図３４Ｅ】富化と配列決定の分析に関して、洗浄バッファー１による異なる洗浄回数と鉱物油の有無を含む条件についてフォールド８０ベースペナルティのプロットを描く。
【図３５Ａ】富化と配列決定の分析に関してパーセントオフベイト対チューブ移動（ｔｕｂｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）およびポリマーＡの存在のプロットを描く。
【図３５Ｂ】富化と配列決定の分析に関してＨＳライブラリーサイズ対チューブ移動およびポリマーＡの存在のプロットを描く。
【図３６】富化と配列決定の分析に関して様々なレベルの撹拌と吸引の方法を含む条件についてオフターゲットパーセントのプロットを描く。
【図３７Ａ】標準または高速ハイブリダイゼーションバッファーのいずれかを使用する、達成されたカバレッジの深さ（３０ｘでの標的塩基％）対様々なハイブリダイゼーション時間のプロットである。
【図３７Ｂ】標準または高速ハイブリダイゼーションバッファーのいずれかを使用する、フォールド８０ベースペナルティ対様々なハイブリダイゼーション時間のプロットである。
【図３７Ｃ】標準または高速ハイブリダイゼーションバッファーのいずれかを使用する、パーセントオフベイト対様々なハイブリダイゼーション時間のプロットである。
【図３７Ｄ】標準または高速ハイブリダイゼーションバッファーのいずれかを使用する、ＨＳライブラリーサイズ対様々なハイブリダイゼーション時間のプロットである。
【図３７Ｅ】標準または高速ハイブリダイゼーションバッファーのいずれかを使用する、重複率対様々なハイブリダイゼーション時間のプロットである。
【図３８】従来のハイブリダイゼーションバッファー対５ー９時間ほどの短時間で完了することができる合理化された標的富化（上）ワークフローを使用する、ワークフローの比較を描く。
【図３９Ａ】フォールド８０ベースペナルティ、オンターゲット率、および３３．１Ｍｂのエクソーム富化プローブライブラリーを有する高速ハイブリダイゼーションバッファーを使用して得られた３０Ｘのカバレッジよりも大きな標的塩基に関する一連のプロットである。
【図３９Ｂ】３３．１Ｍｂのエクソームプローブパネルまたは０．８Ｍｂのカスタムがんパネルのいずれかを使用する１プレックス実験および８プレックス実験に関する３０Ｘ以上のカバレッジを有する標的塩基の画分のプロットである。
【図３９Ｃ】フォールド８０ベースペナルティ対様々なＦＦＰＥサンプルのプロットである。
【図３９Ｄ】重複率の割合対様々なＦＦＰＥサンプルのプロットである。
【図３９Ｅ】２０Ｘを超える標的塩基の割合対様々なＦＦＰＥサンプルのプロットである。
【図３９Ｆ】ＡＴとＧＣのドロップアウト率対様々なＦＦＰＥサンプルのプロットである。
【図３９Ｇ】ＦＦＰＥサンプルに関して染色体１上のカバレッジ（対数対中央値）対位置のプロットである。
【図４０】高速ハイブリダイゼーションバッファーを使用する実験のためのエクソーム定性値と洗浄バッファー１温度のプロットである。
【図４１】アダプターの上部または下部の鎖を標的とする様々な遮断薬デザインに関するパーセントオフベイトのプロットである。
【図４２Ａ】タグメンテーション法と普遍的な遮断薬の様々な構成を用いて生成されたライブラリーのプレハイブリダイゼーション濃度、事前捕捉サイズ、捕捉後濃度、および観察されたサイズのプロットである。
【図４２Ｂ】タグメンテーション法と普遍的なｓｈ弾薬の様々な構成を使用して生成されたライブラリーのための中央値入力サイズとＨＳライブラリーサイズのプロットである。
【図４２Ｃ】タグメンテーション法と普遍的な遮断薬の様々な構成を使用して生成されたライブラリーのフォールド８０ベースペナルティとパーセントオフベイトを含む配列決定測定基準のプロットである。
【図４２Ｄ】タグメンテーション法と普遍的な遮断薬の様々な構成を使用して生成されたライブラリーについて、少なくとも３０倍のカバレッジを持つ標的塩基パーセント、および重複率を含む配列決定測定基準のプロットである。
【図４２Ｅ】タグメンテーション法および普遍的な遮断薬の様々な構成を使用して生成されたライブラリーのＡＴおよびＧＣのドロップアウト率とゼロカバレッジの標的割合を含む配列決定測定基準のプロットである。
【図４３】タグメンテーション法および普遍的な遮断薬の様々な構成を使用して生成されたライブラリーのパーセントオフベイトのプロットである。
【図４４】遮断薬の存在下または不在下での融解曲線のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
大規模なポリヌクレオチドライブラリー内のハイブリダイゼーションイベントを設計、合成、および制御するための方法および組成物が本明細書に提供される。捕捉プローブライブラリーは、ポリヌクレオチドのサンプル集団中の特定の標的配列に結合するように設計および合成され、これにより、診断アッセイ、配列決定、選択アッセイ、またはハイブリダイゼーション工程を必要とする他の方法などの任意の数の下流のアプリケーションが可能となる。ハイブリダイゼーションの全体的効率に寄与する因子としては、捕捉プローブ化学量論／均一性、捕捉プローブ標識化、希釈効果、アダプター二量化、およびハイブリダイゼーション条件が挙げられる。ハイブリダイゼーションの全体的な効率に寄与する別の要因は、空気−水界面における非標的核酸の局所的な濃度である。本明細書のそのような濃度は、添加剤と洗浄方法の存在を通じて制御され、改善されたハイブリダイゼーションを引き起こす。さらに、比較可能な配列決定深度を達成する間に、ハイブリダイゼーション時間の減少を可能にするバッファー組成物も提供される。さらに、オフターゲット（またはオフベイト）リードの割合を減少させる遮断薬ポリヌクレオチドも提供される。
【００１５】
定義
【００１６】
本開示全体にわたって、数値的特徴は範囲形式で示される。範囲形式での記載は単に利便性と簡潔さのためのものに過ぎず、任意の実施形態の範囲に対する確固たる限定として解釈されてはならないということを理解されたい。これに応じて、範囲の記載は、文脈で別段の定めのない限り、すべての可能性のある下位範囲と、下限の単位の小数第２位までのその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると考えられなければならない。例えば、１から６などの範囲の記載は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６などの下位範囲と、例えば、１．１、２、２．３、５、および５．９のその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると考えられなければならない。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。これらの介在する範囲の上限および下限は、より小さな範囲内に独立して含まれてもよく、また、定められた範囲内のあらゆる具体的に除外された限界に従って、本発明内に包含される。定められた範囲が上限および下限の１つまたはその両方を含む場合、これらの含まれた上限および下限のいずれかまたは両方を除く範囲も、文脈から明確に指示されない限り、本発明内に包含される。
【００１７】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載するためのものであり、任意の実施形態を限定することを意図してはいない。本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明白に示していない限り、同様に複数形を含むように意図される。用語「含む」および／または「含むこと」は、本明細書での使用時に、明示された特徴、整数、工程、操作、要素、および／または構成要素の存在を特定するが、１以上の他の特徴、整数、工程、操作、要素、構成要素、および／またはそれらの群の存在または追加を妨げないことが、さらに理解される。本明細書で使用されるように、用語「および／または」は、関連する列挙された項目の１つ以上のあらゆる組み合わせを含む。
【００１８】
別段の定めのない限り、あるいは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用されるように、数あるいは数の範囲に関連して用語「約」とは、明示された数とその数＋／−１０％、あるいはある範囲の列挙された値について列挙された下限の１０％以下と列挙された１０％以上を意味するものと理解されたい。
【００１９】
本明細書で使用されているように、用語「あらかじめ選択された配列（ｐｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「あらかじめ決められた配列（ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、または「あらかじめ定められた配列（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、交換可能に使用される。用語は、ポリマー配列が知られており、ポリマーの合成または組立の前に選択されることを意味する。特に、本発明の様々な態様は、主に核酸分子の調製に関して本明細書に記載されており、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列は知られており、核酸分子の合成または組立の前に選択される。
【００２０】
核酸という用語は、一本鎖の分子と同様に二本鎖または三本鎖の核酸を包含する。二本鎖または三本鎖の核酸において、核酸鎖は同一の広がりをもつ必要はない（すなわち、二本鎖の核酸は、両鎖の全長に沿って二本鎖である必要はない）。核酸配列は、提供される場合、別段の記載がない限り、５’から３’方向に記載される。本明細書に記載される方法は、単離された核酸の生成を提供する。本明細書に記載される方法は、単離および精製された核酸の生成をさらにもたらす。ポリヌクレオチドの長さは、提供される場合、塩基の数として記載され、例えば、ｎｔ（ヌクレオチド）、ｂｐ（塩基）、ｋｂ（キロベース）、またはＧｂ（ギガベース）などと略記される。
【００２１】
合成（すなわち、デノボ合成されるか、化学的に合成する）のポリヌクレオチドの産生のための方法と組成物が本明細書で提供される。オリゴ核酸、オリゴヌクレオチド、オリゴ、およびポリヌクレオチドという用語は全体で同義であると定義される。本明細書に記載される合成されたポリヌクレオチドのライブラリーは、１つ以上の遺伝子または遺伝子断片をコードする複数のポリヌクレオチドをまとめて含むこともある。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリーはコード配列または非コード配列を含む。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリーは複数のｃＤＮＡ配列をコードする。ｃＤＮＡ配列が基づく参照遺伝子配列はイントロンを含むこともあるが、ｃＤＮＡ配列はイントロンを除外する。本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、生物の遺伝子または遺伝子断片をコードすることがある。例示的な生物は、限定されないが、前核生物（例えば細菌）および真核生物（例えばマウス、ウサギ、ヒト、および非ヒト霊長類）を含む。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリーは、１つ以上のポリヌクレオチドを含み、１つ以上のポリヌクレオチドの各々は複数のエクソンの配列をコードする。本明細書に記載されるライブラリー内の各ポリヌクレオチドは異なる配列（すなわち、非同一配列）をコードすることもある。いくつかの例では、本明細書に記載されるライブラリー内のそれぞれのポリヌクレオチドは、ライブラリー内の別のポリヌクレオチドの配列に相補的な少なくとも１つの部分を含む。本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列は、別段の定めのない限り、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むことがある。本明細書に記載されるポリヌクレオチドライブラリーは、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、または１，０００，０００を超えるポリヌクレオチドを含み得る。本明細書に記載されるポリヌクレオチドライブラリーは、１０以下、２０以下、５０以下、１００以下、２００以下、５００以下、１，０００以下、２，０００以下、５，０００以下、１０，０００以下、２０，０００以下、３０，０００以下、５０，０００以下、１００，０００以下、２００，０００以下、５００，０００以下、または１，０００，０００以下のポリヌクレオチドを含み得る。本明細書に記載されるポリヌクレオチドライブラリーは、１０から５００，  ２０から１０００，  ５０から２０００，  １００から５０００，  ５００から１０，０００，  １，０００から５，０００，  １０，０００から５０，０００，  １００，０００から５００，０００、または５０，０００から１，０００，０００のポリヌクレオチドを含み得る。本明細書に記載されるポリヌクレオチドライブラリーは、３７０，０００；４００，０００；５００，０００、またはそれ以上の様々なポリヌクレオチドを含み得る。
【００２２】
ハイブリダイゼーションのための方法
【００２３】
標的核酸（図３３Ａ−図３３Ｃ）に結合する捕捉プローブの効率と精度を改善することを目指したハイブリダイゼーションの方法が本明細書に記載されている。そのような方法は、捕捉プローブライブラリー中の捕捉プローブの個々またはグループの化学量論を変更する工程、代替配列を標的とする捕捉プローブで捕捉プローブライブラリーを補足する工程、核酸塩基アナログを含む遮断ポリヌクレオチドを使用してオフターゲット結合相互作用を防止する工程、および捕捉プローブライブラリーを部分的に標識する工程を含む。さらに、オフターゲット（または、オフベイト）配列決定測定基準を減少させる方法も提供される（図３３Ａ−３３Ｂ）。理論に縛られることなく、オフターゲット率に寄与する因子は、プローブが標的核酸と自由に相互作用／ハイブリダイズする能力、および非ハイブリダイズした非標的核酸を洗い流す効率を含む。これらの因子は、気液界面などの溶液中の核酸の不均一な濃度に影響されることもある。そのようなハイブリダイゼーション反応は、そのような不均一な濃度を防止する添加剤の添加、および／またはそのような溶液の制御された操作によって改善され得る。いくつかの例では、添加物またはバッファーは、ハイブリダイゼーション時間の減少ももたらす（図３８）。そのような改善は、しばしば、より小さいポリヌクレオチドライブラリー（例えば、１Ｍｂ未満）でのオフターゲット率の有意な減少をもたらすが、エクソームライブラリーなどのより大きなライブラリーでも使用される。さらに、例えば、配列決定プロセスの文脈において、ゲノムＤＮＡへのハイブリダイゼーションに使用されるデノボ合成ポリヌクレオチドも本明細書で提供される。例示的な配列決定ワークフロー（図２）の第１の工程では、標的ポリヌクレオチドを含む核酸サンプル（２０８）を機械的または酵素的剪断によって断片化し、断片のライブラリー（２０９）を形成する。プライマー配列および／またはバーコードを随意に含むアダプター（２１５）をライゲーションして、アダプタータグ付きライブラリー（２１０）を形成する。その後、  このライブラリーは、随意に増幅され、標的結合ポリヌクレオチド（２１７）とアダプター（２１５）との間のハイブリダイズを防止する遮断ポリヌクレオチド（２１６）と共に、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする標的結合ポリヌクレオチド（２１７）でハイブリダイズされる。標的ポリヌクレオチド−標的結合ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション対（２１２）の捕捉、および標的結合ポリヌクレオチド（２１７）の除去は、標的ポリヌクレオチド（２１３）の単離／富化を可能にし、これは随意に増幅され、配列決定される（２１４）。いくつかの例では、ハイブリダイゼーション反応への遮断薬の添加は、アダプター間の相互作用を防止することにより、オフターゲット率を減少させる（図１Ｂ）。
【００２４】
本明細書に記載される第１の方法は、捕捉プローブライブラリー中の捕捉プローブの個々のまたはグループのストイキオメトリーを変更する工程を含む。例えば、富化および配列決定の分析が核酸サンプル上で実行され、標的配列の１以上の領域が所望のリード深度未満である（図１Ａ、黒いバー、左）。第２の「スパイクイン」、標的化された、または（標的化された）パネルライブラリーの追加は、これらの平均未満のリード深度領域でのリード深度を増加させる（図１Ａ、黒いバー、右）。そのような領域は、いくつかの例では、より大きな捕捉プローブライブラリー、例えば、エクソームプローブまたは他のライブラリーによって既に標的とされた領域である。代替的に、または組み合わせて、そのような領域は、より大きなプローブライブラリーによって既に標的とされておらず、標的とされたパネルライブラリーは、核酸サンプルの新しい領域に追加の配列決定情報を追加する。例示的なパネルは、いくつかの例では、特定の機能（発生、疾患状態、疼痛、身体的形質、または他の機能）を有する遺伝子、またはイントロンなどの非コード領域を標的とする。いくつかの実施形態では、パネルは、限定されないが、癌、神経変性疾患、およびミトコンドリア障害を含む疾患に関与する標的遺伝子を含む。
【００２５】
本明細書に記載される第２の方法は、ゲノム断片（１０１）にライゲートされたアダプターへの捕捉プローブのオフターゲット結合、または、アダプターアダプターハイブリダイゼーションを防ぐ普遍的な遮断薬の使用を含む（図１Ｂ）。オフターゲットハイブリダイゼーションを防ぐために使用されるアダプター遮断薬は、アダプター（１０２）の一部または全体を標的とすることができる。いくつかの例では、固有のインデックス配列（１０３）を含むアダプター（１０２）の一部に相補的である特定の遮断薬が使用される。アダプタータグ付きゲノムライブラリー（１００）が多くの異なるインデックス配列（１０３）を含むケースでは、インデックス配列（１０３）を標的としないか、またはインデックス配列（１０３）に強くハイブリダイズしない遮断薬を設計することが有益であり得る。例えば、「普遍的な」遮断薬（１０４）は、インデックス配列を含まないアダプター（１０２）の一部を標的とする（インデックス非依存性）し、このことは、採用される異なるインデックス配列の数に関係なく、最小限の数の遮断薬を使用することを可能にする（図１Ｂ）。いくつかの例では、８以下の普遍的な遮断薬が使用される。いくつかの例では、４つの普遍的な遮断薬が使用される。いくつかの例では、３つの普遍的な遮断薬が使用される。いくつかの例では、２つの普遍的な遮断薬が使用される。いくつかの例では、１つの普遍的な遮断薬が使用される。例示的な構成では、４つの普遍的な遮断薬は、少なくとも４、８、１６、３２、６４、９６、または少なくとも１２８の様々なインデックス配列を含むアダプターと共に使用される。いくつかの例では、様々なインデックス配列は、少なくともまたは約４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、または２０を超える塩基対（ｂｐ）を含む。いくつかの例では、普遍的な遮断薬はバーコード配列に結合するようには構成されない。いくつかの例では、普遍的な遮断薬はバーコード配列に部分的に結合する。いくつかの例では、バーコード配列に部分的に結合する普遍的な遮断薬は、アダプター（例えば、ＬＮＡまたはＢＮＡ）に結合するＴｍを増大させるものなどのヌクレオチドアナログを含む。
【００２６】
普遍的な遮断薬は可変サイズのパネルライブラリーと共に使用されてもよい。いくつかの実施形態では、パネルライブラリーは、少なくともまたは約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、１．０、２．０、４．０、８．０、１０．０、１２．０、１４．０、１６．０、１８．０、２０．０、２２．０、２４．０、２６．０、２８．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、または６０．０を超える巨大塩基（Ｍｂ）を含む。
【００２７】
本明細書に記載されているような遮断薬は、オンターゲットパフォーマンスを改善することがある。いくつかの実施形態において、オンターゲットパフォーマンスは、少なくともまたは約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％を超えて改善される。いくつかの実施形態において、オンターゲットパフォーマンスは、様々なインデックスデザインについて、少なくともまたは約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％を超えて改善される。いくつかの実施形態において、オンターゲットパフォーマンスは、様々なパネルサイズについて、少なくともまたは約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％を超えて改善される。
【００２８】
遮断薬は、任意の数の異なる核酸塩基（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、核酸塩基アナログ（非基準）、または非核酸塩基リンカーあるいはスペーサーを含んでいてもよい。例えば、遮断薬は、遮断薬とアダプターとの間のハイブリダイゼーション（Ｔｍ）を増強する１つ以上の核酸塩基アナログまたは他の基を含む。核酸塩基アナログおよび他の基としては、限定されないが、ロックド核酸（ＬＮＡ）、二環式核酸（ＢＮＡ）、Ｃ５修飾ピリミジン塩基、２’−Ｏ−メチル置換ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、スレオース核酸（ＴＮＡ）、キセノン核酸（ＸＮＡ）モルホリノバックボーン修飾塩基、マイナーグローブバインダー（ＭＧＢ）、スペルミン、Ｇクランプ、またはアントラキノン（Ｕａｑ）キャップなどが挙げられる。例では、遮断薬は、２つのポリヌクレオチド鎖を接続するスペーサー要素を含む。いくつかの例では、遮断薬は、表１から選択される１つ以上の核酸塩基アナログを含む。いくつかの例では、そのような核酸塩基アナログは、遮断薬のＴｍを制御するために添加される。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
本明細書に記載される第３の方法は、オフターゲット率を減少させるために、ハイブリダイゼーション反応への１種以上の添加剤の添加を含む。添加剤は、ハイブリダイゼーション中、または洗浄ステップ中などの、ハイブリダイゼーションワークフローの任意の工程で添加される。例示的な構成では、添加剤は、ハイブリダイゼーションバッファー、結合バッファー、洗浄バッファー、またはこれらの任意の組み合わせなどのバッファーに添加される。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションバッファーおよび結合バッファーなどの２つ以上のバッファーに添加される。容器（３００１）内での例示的なハイブリダイゼーション反応（３０００）は図３３Ａに示されており、ここで、核酸ターゲットおよびポリヌクレオチドプローブを含む溶液（３００２）がガス（３００４）と接触し、気液界面（３００５）（例えば、空気−水界面）を形成する。このようなハイブリダイゼーション反応は、気液界面（３００５）に隣接する領域（３００３）における高濃度の核酸によって妨げられることが多く、これは、いくつかの例では、標的核酸に対するプローブの均一なハイブリダイゼーションを制限するか、または洗浄工程において非標的核酸が除去されることを妨げる。添加剤（３００６）などの添加剤の添加は、いくつかの例では、気液界面（３００５）に隣接する領域（３００３）における非標的核酸の濃度を減少させ、その結果、オフターゲット結合が減少する。いくつかの例では、少なくとも１つの添加剤の添加は、ランダムなオフターゲット結合の減少をもたらす。
【００３１】
本明細書に記載される方法は、１つ以上の洗浄工程またはチューブ移動工程を含み得る。いくつかの例では、洗浄またはチューブ移動は添加剤の使用と組み合わされる。いくつかの例では、１、２、３、４、または４を超える洗浄は、固体支持体上の標的配列の捕捉後に実行される。いくつかの例では、１つ以上の洗浄工程はチューブ移動により置換され、ここで、捕捉された標的配列は未使用のチューブまたは他の容器に移される。いくつかの例では、チューブ移動は洗浄工程と組み合わせて使用される。いくつかの例では、１、２、３、４、または、４を超えるチューブ移動は、本明細書に記載される方法中に実行される。
【００３２】
ハイブリダイゼーションのための添加剤は、ポリヌクレオチドの構造または溶解度に影響を与える任意の数の化学剤またはその混合物を含むことができる。ハイブリダイゼーションのための添加剤は、塩、油、ワックス、ヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）、ポリマー、コスモトロピー、カオストロピー、またはポリヌクレオチドの局所濃度に影響を与える他の添加剤を含む。油としては、限定されないが、石油系薬剤（例えば、軽油、ジェット燃料、ガソリン、灯油、ナフサ、石油エーテル、石油スピリッツ、鉱物油、軽鉱物油、白色鉱物油）、植物系油（オリーブ油、植物油、大豆油、または他の植物系油）が挙げられる。いくつかの例では、ポリマーは、疎水性（例えば、ポリシラン）または親水性（ポリエチレングリコールなどのポリエーテル）である。いくつかの例では、油は、アルカン、シクロアルカン、またはシラン（シリコン油）を含む。いくつかの例では、添加剤は、添加剤は、ポリマー量、低蒸気圧、および／または低水溶性ポリマーなどの液体ポリマーを含む。いくつかの例では、カオスモトロピーは、アルコール（例えば、ｎ−ブタノール、エタノール）、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、２−プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、尿素、チオシアン酸塩、または水素結合ネットワークを破壊する他の剤を含む。いくつかの例では、コスモトロピーは、カーボネート、サルフェート、リン酸水素、マグネシウム、リチウム、亜鉛、アルミニウム、または水素結合ネットワークを安定化する他の剤を含む。
【００３３】
本明細書に記載される添加剤は、オフターゲット結合を減少させるのに適切な任意の濃度で存在することがある。そのような濃度は、重量パーセント、体積パーセント、または体積当たりの重量パーセントでしばしば表される。例えば、添加剤は、約０．０００１％、０．０００２％、０．０００５％、０．０００８％、０．００１％、０．００２％、０．００５％、０．００８％、０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．０８％、０．１％、０．２％、０．５％、０．８％、１％、１．２％、１．５％、１．８％、２％、５％、１０％、２０％、または約３０％で存在する。いくつかの例では、添加剤は、０．０００１％以下、０．０００２％以下、０．０００５％以下、０．０００８％以下、０．００１％以下、０．００２％以下、０．００５％以下、０．００８％以下、０．０１％以下、０．０２％以下、０．０５％以下、０．０８％以下、０．１％以下、０．２％以下、０．５％以下、０．８％以下、１％以下、１．２％以下、１．５％以下、１．８％以下、２％以下、５％以下、１０％以下、２０％以下、または３０％以下で存在する。いくつかの例では、添加剤は、少なくとも０．０００１％、０．０００２％、０．０００５％、０．０００８％、０．００１％、０．００２％、０．００５％、０．００８％、０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．０８％、０．１％、０．２％、０．５％、０．８％、１％、１．２％、１．５％、１．８％、２％、５％、１０％、２０％、または少なくとも３０％で存在する。いくつかの例では、添加剤は、０．０００１％−１０％、０．０００２％−５％、０．０００５％−１．５％、０．０００８％−１％、０．００１％−０．２％、０．００２％−０．０８％、０．００５％−０．０２％、または０．００８％−０．０５％で存在する。いくつかの例では、添加剤は０．００５％−０．１％で存在する。いくつかの例では、添加剤は０．０５％−０．１％で存在する。いくつかの例では、添加剤は０．００５％−０．６％で存在する。いくつかの例では、添加剤は１％−３０％、５％−２５％、１０％−３０％、１５％−３０％、または１％−１５％で存在する。液状添加物は総反応量の割合として存在することがある。いくつかの例では、添加剤は、全体積の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、または約９０％である。いくつかの例では、添加剤は、全体積の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、または少なくとも９０％である。いくつかの例では、添加剤は、添加物は全体積の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、または９０％以下である。いくつかの例では、添加剤は、全体積の５％−７５％、５％−６５％、５％−５５％、１０％−５０％、１５％−４０％、２０％−５０％、２０％−３０％、２５％−３５％、５％−３５％、１０％−３５％、または２０％−４０％である。いくつかの例では、添加剤は全体積の２５％−４５％である。
【００３４】
本明細書で提供される第４の方法は、オフターゲット率の減少をもたらす制御された流体移送を含む。理論に縛られることなく、そのような制御された輸送は、標的核酸による非ハイブリダイズ（非標的）核酸の汚染を最小化する。いくつかの例では、制御された輸送は、気液界面などの溶液中の核酸の局所的な不均一な濃度を減少させる。いくつかの例では、非標的核酸は、気液界面（３００５）の近くでより高濃度で存在する。いくつかの例では、界面は空気−水界面である。この方法では、気液界面に隣接する局所領域（３００３）の近傍または局所領域（３００３）内の液体の制御された流体輸送は、ハイブリダイゼーションおよび／または捕捉工程の間に非標的核酸の選択的な除去を提供する。例えば、液体は、すべての液体（３００２）が除去されるまで、連続的にこの局所領域からのみ除去される。局所領域は、いくつかの例では、気液界面近傍の液体の体積として定義され、液体の総体積に関連する。例えば、局所領域の体積は、総体積の上位約１０％である。いくつかの例では、局所領域の体積は、総体積の上位約１％、２％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、または約２５％である。いくつかの例では、局所領域の体積は、総体積の上位約１％−２５％、２％−２０％、５％−１５％、８％−１２％、１０％−２５％、１％−１０％、２０％、または約２５％である。いくつかの例では、液体除去の位置は、気液界面の表面積に依存する。いくつかの例では、より高い界面表面積は、液体が除去される局所領域の体積を減少させる。
【００３５】
標的核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションには、様々な温度および時間が使用される。いくつかの例では、ハイブリダイゼーション温度は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、または少なくとも約９５℃である。いくつかの例では、ハイブリダイゼーション温度は、約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０℃である。いくつかの例では、ハイブリダイゼーション温度は、約４０−５０℃、約４０−８０℃、約５０−７０℃、約５０−８０℃、約６０−９０℃、約５５−７０℃、または約６０−８０℃である。いくつかの例では、プローブは、５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４５分、６０分、または６０分以下、ハイブリダイズされる。いくつかの例では、プローブは、約０．１、０．２、０．３、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または約１２時間ハイブリダイズされる。いくつかの例では、プローブは、約１０分−約８時間、約１５分−約６時間、約２０分−約４時間、約１５分−約２時間、約１０分−約６時間、約３０分−約５時間、約１時間−約８時間、または約２時間−約１０時間、ハイブリダイズされる。
【００３６】
本明細書に記載される方法および組成物で使用される洗浄バッファーには、様々な温度および時間が使用される。いくつかの例では、洗浄は、ハイブリダイズされた核酸が固体支持体に結合されるときに実行される。いくつかの例では、洗浄バッファーは、使用前に約５０、５５、５７、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、または８０℃に予熱される。いくつかの例では、洗浄バッファーは、使用前に約５０−８０、５０−７５、５０−７０、６０−７５、６０−７０、６５−７５、７０−８０、６７−７４、または５５−７５℃に予熱される。いくつかの例では、１回以上の洗浄が行われ、使用される各洗浄バッファーは、同じ温度または異なる温度である。いくつかの例では、第１の洗浄バッファー（または洗浄バッファー１）は、使用前に約５０、５５、５７、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、または８０℃に予熱される。いくつかの例では、第１の洗浄バッファーは、使用前に約５０−８０、約５０−７５、約５０−７０、約６０−７５、約６０−７０、約６５−７５、約７０−８０、約６７−７４、または約５５−７５℃に予熱される。
【００３７】
ハイブリダイゼーション遮断薬
【００３８】
遮断薬は、所望のハイブリダイゼーションＴｍに依存して、任意の数の核酸塩基アナログ（ＬＮＡまたはＢＮＡなど）を含み得る。例えば、遮断薬は２０〜４０の核酸塩基アナログを含む。いくつかの例では、遮断薬は８〜１６の核酸塩基アナログを含む。いくつかの例では、遮断薬は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または少なくとも１２の核酸塩基アナログを含む。いくつかの例では、遮断薬は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または約１６の核酸塩基アナログを含む。いくつかの例では、核酸塩基アナログの数は、遮断薬中の総塩基数の割合として表される。例えば、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１２％、１８％、２４％、３０％、または３０％以上の核酸塩基アナログを含む。いくつかの例では、核酸塩基アナログを含む遮断薬は、各核酸塩基アナログに対して約２℃−約８℃の範囲でＴｍを上昇させる。いくつかの例では、Ｔｍは、各核酸塩基アナログについて、少なくともまたは約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１２℃、約１４℃、または約１６℃の範囲で上昇する。いくつかの例におけるそのような遮断薬は、アダプターの頂部または「センス」鎖に結合するように構成される。いくつかの例におけるそのような遮断薬は、アダプターの底部または「アンチセンス」鎖に結合するように構成される。いくつかの例では、遮断薬のセットは、アダプターの頂部鎖および底部鎖の両方に結合するように構成された配列を含む。いくつかの例では、追加の遮断薬は、アダプター配列の相補体、逆相補体、順相補体、または逆相補体に結合するように構成される。いくつかの例では、頂部（頂部に結合する）または底部鎖（またはその両方）を標的とする遮断薬のセットが設計され、試験され、その後、頂部遮断薬を底部遮断薬に置き換えること、または底部遮断薬を頂部遮断薬に置き換えることなどの最適化が行われる。
【００３９】
遮断薬は、アダプターまたはハイブリダイゼーションＴｍの大きさに応じて、任意の長さであってもよい。例えば、遮断薬は２０−５０塩基の長さである。いくつかの例では、遮断薬は、２５−４５塩基、３０−４０塩基、２０−４０塩基、または３０−５０塩基の長さである。いくつかの例では、遮断薬は２５−３５塩基の長さである。いくつかの例では、遮断薬は、少なくとも２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、または少なくとも３５塩基の長さである。いくつかの例では、遮断薬は２５以下、２６以下、２７以下、２８以下、２９以下、３０以下、３１以下、３２以下、３３以下、３４以下、または３５以下の塩基の長さである。いくつかの例では、遮断薬は、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または約３５塩基の長さである。いくつかの例では、遮断薬は、約５０塩基の長さである。いくつかの例では、アダプタータグ付きゲノムライブラリー断片を標的とする遮断薬のセットは、２つ以上の長さの遮断薬を含む。２つの遮断薬は、いくつかの例では、リンカーと一緒にテザーされる（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）。様々なリンカーは、当該技術分野で周知であり、いくつかの例では、アルキル基、ポリエーテル基、アミン基、アミド基、または他の化学基を含む。いくつかの例では、リンカーは、ホスフェート、チオホスフェート、アミド、または他のバックボーンなどのバックボーンを介して一緒に接続されている（または遮断薬ポリヌクレオチドに取り付けられている）個々のリンカーユニットを含む。例示的な構成では、リンカーは、それぞれがアダプター配列の５’末端を標的とする第１の遮断薬と、アダプター配列の３’末端を標的とする第２の遮断薬との間のインデックス領域にまたがっている。いくつかの例では、キャッピング基は、下流の増幅を防ぐために、遮断薬の５’末端または３’末端に添加される。キャッピング基は、様々な形態で、ポリエーテル、ポリアルコール、アルカン、または増幅を防止する他の非ハイブリダイズ可能な基を含む。そのような基は、いくつかの例では、ホスフェート、チオホスフェート、アミド、または他の骨格によって接続される。いくつかの例では、１つ以上の遮断薬が使用される。いくつかの例では、少なくとも４つの非同一性の遮断薬が使用される。いくつかの例では、第１の遮断薬は、アダプター配列の第１の３’末端にまたがり、第２の遮断薬は、アダプター配列の第１の５’末端にまたがり、第３の遮断薬は、アダプター配列の第２の３’末端にまたがり、および第４の遮断薬は、アダプター配列の第２の５’末端にまたがっている。いくつかの例では、第１の遮断薬は、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または少なくとも３５の塩基の長さである。いくつかの例では、第２の遮断薬は、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または少なくとも３５の塩基の長さである。いくつかの例では、第３の遮断薬は、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または少なくとも３５の塩基の長さである。いくつかの例では、第４の遮断薬は、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または少なくとも３５の塩基の長さである。いくつかの例では、第１の遮断薬、第２の遮断薬、第３の遮断薬、または第４の遮断薬は、核酸塩基アナログを含む。いくつかの例では、核酸塩基アナログはＬＮＡである。
【００４０】
遮断薬のデザインは、アダプター配列に対する所望のハイブリダイゼーションＴｍに影響され得る。いくつかの例では、遮断薬のＴｍを増加または減少させるために、非正規核酸（例えば、ロックド核酸、架橋核酸、または他の非正規核酸またはアナログ）が遮断薬に挿入される。いくつかの例では、遮断薬のＴｍは、非正規アミノ酸を含むポリヌクレオチドのＴｍを計算することに特化したツールを使用して計算される。いくつかの例では、Ｔｍは、Ｅｘｉｑｏｎ（商標）オンライン予測ツールを使用して計算される。いくつかの例では、遮断薬Ｔｍはインシリコで計算される。いくつかの例では、遮断薬Ｔｍは、インシリコで計算され、実験的インビトロ条件と相関している。理論に拘束されることなく、実験的に決定されたＴｍは、塩濃度、温度、添加物の存在、または他の因子などの実験的パラメータによってさらに影響を受けてもよい。いくつかの例では、本明細書に記載されるＴｍは、遮断薬のパフォーマンスを設計または最適化するために使用されるインシリコ決定されたＴｍである。いくつかの例では、Ｔｍ値は、融解曲線分析実験から予測、推定、または決定される。いくつかの例では、遮断薬は、７０℃−９９℃のＴｍを有する。いくつかの例では、遮断薬は、７５℃−９０℃のＴｍを有する。いくつかの例では、遮断薬は、７０℃℃のＴｍを有する。いくつかの例では、遮断薬は、少なくとも７０、７２、７５、７７、８０、８２、８５、８８、９０、または少なくとも９２℃のＴｍを有する。いくつかの例では、遮断薬は、約７０、７２、７５、７７、８０、８２、８５、８８、９０、９２、または約９５℃のＴｍを有する。いくつかの例では、遮断薬は、７８℃−９０℃のＴｍを有する。いくつかの例では、遮断薬は、７９℃−９０℃のＴｍを有する。いくつかの例では、遮断薬は、８０℃−９０℃のＴｍを有する。いくつかの例では、遮断薬は、８１℃−９０℃のＴｍを有する。いくつかの例では、遮断薬は、８２℃−９０℃のＴｍを有する。いくつかの例では、遮断薬は、８３℃−９０℃のＴｍを有する。いくつかの例では、遮断薬は、８４℃−９０℃のＴｍを有する。いくつかの例では、遮断薬のセットは、７８℃−９０℃の平均Ｔｍを有する。いくつかの例では、遮断薬のセットは、８０℃−９０℃の平均Ｔｍを有する。いくつかの例では、遮断薬のセットは、少なくとも８０℃の平均Ｔｍを有する。いくつかの例では、遮断薬のセットは、少なくとも８１℃の平均Ｔｍを有する。いくつかの例では、遮断薬のセットは、少なくとも８２℃の平均Ｔｍを有する。いくつかの例では、遮断薬のセットは、少なくとも８３℃の平均Ｔｍを有する。いくつかの例では、遮断薬のセットは、少なくとも８４℃の平均Ｔｍを有する。いくつかの例では、遮断薬のセットは、少なくとも８６℃の平均Ｔｍを有する。遮断薬Ｔｍは、いくつかの例では、高速ハイブリダイゼーションバッファーおよび／またはハイブリダイゼーションエンハンサーの使用など、本明細書に記載される他の要素の結果として修正される。
【００４１】
アダプター標的に対する遮断薬のモル比は、ハイブリダイゼーション中のオフベイト（およびその後のオフターゲット）率に影響を与えることがある。遮断薬が標的アダプターへの結合時に効率的であればあるほど、必要とされる遮断薬は少なくなる。いくつかの例では、本明細書に記載される遮断薬は、２０：１（遮断薬：標的）未満のモル比で、２０％以下のオフターゲットリードの配列決定結果を達成する。いくつかの例では、２０％以下のオフターゲットリードは、１０：１（遮断薬：標的）未満のモル比で達成される。いくつかの例では、２０％以下のオフターゲットリードは、５：１（遮断薬：標的）未満のモル比で達成される。いくつかの例では、２０％以下のオフターゲットリードは、２：１（遮断薬：標的）未満のモル比で達成される。いくつかの例では、２０％以下のオフターゲットリードは、１．５：１（遮断薬：標的）未満のモル比で達成される。いくつかの例では、２０％以下のオフターゲットリードは、１．２：１（遮断薬：標的）未満のモル比で達成される。いくつかの例では、２０％以下のオフターゲットリードは、１．０５：１（遮断薬：標的）未満のモル比で達成される。
【００４２】
本明細書に記載される第３の方法は、プローブの一部のみを選択的に標識することによってポリヌクレオチドプローブライブラリーの効率を向上させる工程を含む（図１Ｃ）。完全に標識されたポリヌクレオチドプローブのライブラリーを希釈すると、その結果は、オフベイトが増加し、ＨＳライブラリーのサイズが減少することが多い。標的ゲノム配列に対するポリヌクレオチドの総比率を一定に保つことにより、すべての標的ゲノム配列は依然として相補的プローブに結合しており、そのような配列の分子間または分子内ハイブリダイゼーションは減少する。例示的なワークフローでは、サンプルポリヌクレオチドのライブラリー（１０９）は、複数のプローブとハイブリダイゼーションされ、そのいくつかは、標識プローブ（１１８）または非標識プローブ（１１７）である。その後、ハイブリダイゼーション混合物（１１９）は、標識プローブ（１１８）に結合する標的ポリヌクレオチドを単離するために、さらなる精製を受けることがある。標識されたプローブの割合は、用途、ライブラリーサイズ、およびゲノム標的に応じて変化し得る。例えば、全プローブの約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が標識される。いくつかの例では、全プローブの少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または少なくとも９０％のプローブが標識される。いくつかの例では、全プローブの１％以下、５％以下、１０％以下、２０％以下、３０％以下、４０％以下、５０％以下、６０％以下、７０％以下、８０％以下、または９０％以下のプローブが標識される。いくつかの例では、全プローブの１０−９０％、２０−８０％、３０−７０％、４０−５０％、１−４０％、２０−６０％、４０−７０％、５０−９０％、６０−９９％、７０−９９％、または８０−９９％が標識される。いくつかの例では、標識はビオチンまたは他の分子タグなどの分子タグである。いくつかの例では、１５％未満の標識されたプローブを含むポリヌクレオチドプローブライブラリーは、４０％未満のベイトオフをもたらす。いくつかの例では、１５％未満の標識されたプローブを含むポリヌクレオチドプローブライブラリーは、４０％未満のベイトオフをもたらす。プローブの部分的な標識は、ＡＴおよびＧＣのドロップアウトの減少ももたらし得る。例えば、１−５０％の標識されたプローブを含むポリヌクレオチドプローブライブラリーは、１．９％未満のＡＴドロップアウトをもたらす。いくつかの例では、１−５０％の標識プローブを含むポリヌクレオチドプローブライブラリーは、１．３％未満のＧＣドロップアウトをもたらす。いくつかの例では、１２．５−５０％の標識プローブを含むポリヌクレオチドプローブライブラリーは、１．３％未満のＧＣドロップアウトをもたらす。いくつかの例では、１２．５−５０％の標識プローブを含むポリヌクレオチドプローブライブラリーは、１．９％未満のＡＴドロップアウトをもたらす。
【００４３】
ハイブリダイゼーションバッファー
【００４４】
本明細書に記載されるハイブリダイゼーション方法では、任意の数のバッファーが使用され得る。例えば、バッファーは、ポリマー、溶媒、塩、界面活性剤、または他の成分などの多くの化学成分を含む。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションバッファーは、所定の配列決定結果または品質レベルを達成するために必要とされるハイブリダイゼーション時間（例えば、「高速」ハイブリダイゼーションバッファー）を減少させる。いくつかの例では、そのような成分は、改善されたハイブリダイゼーション結果、例えば、オンターゲット率の増加、改善された配列決定結果（例えば、配列決定深度または他の測定基準）、あるいはオフターゲット率の減少などにつながる。そのような成分は、そのような結果を達成するために任意の濃度で導入され得る。いくつかの例では、バッファー成分は特定の順序で添加される。例えば、水が最初に添加される。いくつかの例では、塩は水の後に添加される。いくつかの例では、増粘剤および界面活性剤の後に塩が添加される。いくつかの例では、本明細書に記載されている「高速」ハイブリダイゼーションバッファーなどのハイブリダイゼーションバッファーは、普遍的な遮断薬および液体ポリマー添加剤と組み合わせて使用される。
【００４５】
本明細書に記載されるハイブリダイゼーションバッファーは、溶媒、または２つ以上の溶媒の混合物を含み得る。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションバッファーは、２つの溶媒、３つの溶媒、または３つ以上の溶媒の混合物を含む。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションバッファーは、アルコールと水の混合物を含む。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションバッファーは、ケトンを含む溶媒と水の混合物を含む。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションバッファーはエーテル系溶媒と水の混合物を含む。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションバッファーは、スルホキシド含有溶媒と水の混合物を含む。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションバッファーは、アミド含有溶媒と水の混合物を含む。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションバッファーは、エステル含有溶媒と水の混合物を含む。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションバッファーは、水、エタノール、メタノール、プロパノール、ブタノール、他のアルコール溶媒、またはこれらの混合物などの溶媒を含む。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションバッファーは、アセトン、メチルエチルケトン、２−ブタノン、酢酸エチル、酢酸メチル、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、またはこれらの混合物などの溶媒を含む。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションバッファーは、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＤＭＡ、ＨＭＰＡ、またはこれらの混合物などの溶媒を含む。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションバッファーは、水、ＨＭＰＡ、およびアルコールの混合物を含む。いくつかの例では、２つの溶媒は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：８、１：９、１：１０、１：２０、１：５０、１：１００、または１：５００の比率で存在する。
【００４６】
本明細書に記載されるハイブリダイゼーションバッファーは、ポリマーを含み得る。ポリマーは、限定されないが、増粘剤、ポリマー溶媒、誘電体材料、または他のポリマーを含む。ポリマーは、いくつかの例では、疎水性または親水性である。いくつかの例では、ポリマーはシリコンポリマーである。いくつかの例では、ポリマーは、反復ポリエチレンまたはポリプロピレン単位、またはそれらの混合物を含む。いくつかの例では、ポリマーは、ポリビニルピロリドンまたはポリビニルピリジンを含む。いくつかの例では、ポリマーはアミノ酸を含む。例えば、いくつかの例では、ポリマーはタンパク質を含む。いくつかの例では、ポリマーは、カゼイン、乳タンパク質、ウシ血清アルブミン、または他のタンパク質を含む。いくつかの例では、ポリマーは、ヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。いくつかの例では、ポリマーは、ポリＡ、ポリＴ、Ｃｏｔ−１ＤＮＡ、または他の核酸を含む。いくつかの例では、ポリマーは糖を含む。例えば、いくつかの例では、ポリマーは、グルコース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、または他の糖を含む。いくつかの例では、ポリマーは、セルロースまたはデンプンを含む。いくつかの例では、ポリマーは寒天、カルボキシアルキルセルロース、キサンタン、グアーガム、ローカストビーンガム、ガムカラヤ、ガムトラガカンス、アラビアガムを含む。いくつかの例では、ポリマーは、セルロースまたはデンプンの誘導体、またはニトロセルロース、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、フィコール、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、ポリマーの混合物は、本明細書に記載されるハイブリダイゼーションバッファー中で使用される。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションバッファーはデンハルトの溶液を含む。本明細書に記載されるポリマーは、オフターゲット結合を減少させるのに適切な任意の濃度で存在することがある。そのような濃度は、重量パーセント、体積パーセント、または体積当たりの重量パーセントでしばしば表される。例えば、ポリマーは、約０．０００１％、０．０００２％、０．０００５％、０．０００８％、０．００１％、０．００２％、０．００５％、０．００８％、０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．０８％、０．１％、０．２％、０．５％、０．８％、１％、１．２％、１．５％、１．８％、２％、５％、１０％、２０％、または約３０％で存在する。いくつかの例では、ポリマーは、０．０００１％以下、０．０００２％以下、０．０００５％以下、０．０００８％以下、０．００１％以下、０．００２％以下、０．００５％以下、０．００８％以下、０．０１％以下、０．０２％以下、０．０５％以下、０．０８％以下、０．１％以下、０．２％以下、０．５％以下、０．８％以下、１％以下、１．２％以下、１．５％以下、１．８％以下、２％以下、５％以下、１０％以下、２０％以下、または３０％以下で存在する。いくつかの例では、ポリマーは、少なくとも０．０００１％、０．０００２％、０．０００５％、０．０００８％、０．００１％、０．００２％、０．００５％、０．００８％、０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．０８％、０．１％、０．２％、０．５％、０．８％、１％、１．２％、１．５％、１．８％、２％、５％、１０％、２０％、または少なくとも３０％で存在する。いくつかの例では、ポリマーは、０．０００１％−１０％、０．０００２％−５％、０．０００５％−１．５％、０．０００８％−１％、０．００１％−０．２％、０．００２％−０．０８％、０．００５％−０．０２％、または０．００８％−０．０５％で存在する。いくつかの例では、ポリマーは０．００５％−０．１％で存在する。いくつかの例では、ポリマーは０．０５％−０．１％で存在する。いくつかの例では、ポリマーは０．００５％−０．６％で存在する。いくつかの例では、ポリマーは１％−３０％、５％−２５％、１０％−３０％、１５％−３０％、または１％−１５％で存在する。液体ポリマーは総反応量の割合として存在することがある。いくつかの例では、ポリマーは、全体積の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、または約９０％である。いくつかの例では、ポリマーは、全体積の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、または少なくとも９０％である。いくつかの例では、ポリマーは、添加物は全体積の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、または９０％以下である。いくつかの例では、ポリマーは、全体積の５％−７５％、５％−６５％、５％−５５％、１０％−５０％、１５％−４０％、２０％−５０％、２０％−３０％、２５％−３５％、５％−３５％、１０％−３５％、または２０％−４０％である。いくつかの例では、ポリマーは全体積の２５％−４５％である。いくつかの例では、本明細書に記載されるハイブリダイゼーションバッファーは、普遍的な遮断薬と液体ポリマー添加剤と共に使用される。
【００４７】
本明細書に記載されるハイブリダイゼーションバッファーは、カチオンやアニオンなどの塩を含み得る。例えば、ハイブリダイゼーションバッファーは、一価または二価のカチオンを含む。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションバッファーは、一価または二価のアニオンを含む。いくつかの例では、カチオンは、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、リチウム、トリス、または他の塩を含む。いくつかの例では、アニオンは、硫酸塩、重亜硫酸塩、硫酸水素塩、硝酸塩、塩化物、臭化物、クエン酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、リン酸二水素塩、リン酸水素塩、またはリン酸塩を含む。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションバッファーは、アニオンおよびカチオンの任意の組み合わせを含む塩（例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸カリウム、または他の塩）を含む。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションバッファーは、イオン液体を含む。本明細書に記載される塩は、オフターゲット結合を減少させるのに適切な任意の濃度で存在することがある。そのような濃度は、重量パーセント、体積パーセント、または体積当たりの重量パーセントでしばしば表される。例えば、塩は、約０．０００１％、０．０００２％、０．０００５％、０．０００８％、０．００１％、０．００２％、０．００５％、０．００８％、０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．０８％、０．１％、０．２％、０．５％、０．８％、１％、１．２％、１．５％、１．８％、２％、５％、１０％、２０％、または約３０％で存在する。いくつかの例では、塩は、０．０００１％以下、０．０００２％以下、０．０００５％以下、０．０００８％以下、０．００１％以下、０．００２％以下、０．００５％以下、０．００８％以下、０．０１％以下、０．０２％以下、０．０５％以下、０．０８％以下、０．１％以下、０．２％以下、０．５％以下、０．８％以下、１％以下、１．２％以下、１．５％以下、１．８％以下、２％以下、５％以下、１０％以下、２０％以下、または３０％以下で存在する。いくつかの例では、塩は、少なくとも０．０００１％、０．０００２％、０．０００５％、０．０００８％、０．００１％、０．００２％、０．００５％、０．００８％、０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．０８％、０．１％、０．２％、０．５％、０．８％、１％、１．２％、１．５％、１．８％、２％、５％、１０％、２０％、または少なくとも３０％で存在する。いくつかの例では、塩は、０．０００１％−１０％、０．０００２％−５％、０．０００５％−１．５％、０．０００８％−１％、０．００１％−０．２％、０．００２％−０．０８％、０．００５％−０．０２％、または０．００８％−０．０５％で存在する。いくつかの例では、塩は０．００５％−０．１％で存在する。いくつかの例では、塩は０．０５％−０．１％で存在する。いくつかの例では、塩は０．００５％−０．６％で存在する。いくつかの例では、塩は１％−３０％、５％−２５％、１０％−３０％、１５％−３０％、または１％−１５％で存在する。液体ポリマーは総反応量の割合として存在することがある。いくつかの例では、塩は、全体積の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、または約９０％である。いくつかの例では、塩は、全体積の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、または少なくとも９０％である。いくつかの例では、塩は、添加物は全体積の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、または９０％以下である。いくつかの例では、塩は、全体積の５％−７５％、５％−６５％、５％−５５％、１０％−５０％、１５％−４０％、２０％−５０％、２０％−３０％、２５％−３５％、５％−３５％、１０％−３５％、または２０％−４０％である。いくつかの例では、塩は全体積の２５％−４５％である。
【００４８】
本明細書に記載されるハイブリダイゼーションバッファーは、界面活性剤（または乳化剤）を含み得る。例えば、ハイブリダイゼーションバッファーは、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ＣＴＡＢ、セチルピリジニウム、ベンザルコニウムタージトール（ｔｅｒｇｉｔｏｌ）、脂肪酸スルホン酸塩（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、エチルオキシプロピレングリコール、リグニンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、レシチン、リン脂質、ジアルキルスルホコハク酸塩（例えば、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム）、グリセロールジエステル、ポリエトキシルオクチルフェノール、アビエチン酸、ソルビタンモノエステル、パーフルオロアルカノール、スルホン化ポリスチレン、ベタイン、ジメチルポリシロキサン、または他の界面活性剤を含む。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションバッファーは、硫酸塩、リン酸塩、またはテトラアルキルアンモニウム基を含む。本明細書に記載される界面活性剤は、オフターゲット結合を減少させるのに適切な任意の濃度で存在することがある。そのような濃度は、重量パーセント、体積パーセント、または体積当たりの重量パーセントでしばしば表される。例えば、界面活性剤は、約０．０００１％、０．０００２％、０．０００５％、０．０００８％、０．００１％、０．００２％、０．００５％、０．００８％、０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．０８％、０．１％、０．２％、０．５％、０．８％、１％、１．２％、１．５％、１．８％、２％、５％、１０％、２０％、または約３０％で存在する。いくつかの例では、界面活性剤は、０．０００１％以下、０．０００２％以下、０．０００５％以下、０．０００８％以下、０．００１％以下、０．００２％以下、０．００５％以下、０．００８％以下、０．０１％以下、０．０２％以下、０．０５％以下、０．０８％以下、０．１％以下、０．２％以下、０．５％以下、０．８％以下、１％以下、１．２％以下、１．５％以下、１．８％以下、２％以下、５％以下、１０％以下、２０％以下、または３０％以下で存在する。いくつかの例では、界面活性剤は、少なくとも０．０００１％、０．０００２％、０．０００５％、０．０００８％、０．００１％、０．００２％、０．００５％、０．００８％、０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．０８％、０．１％、０．２％、０．５％、０．８％、１％、１．２％、１．５％、１．８％、２％、５％、１０％、２０％、または少なくとも３０％で存在する。いくつかの例では、界面活性剤は、０．０００１％−１０％、０．０００２％−５％、０．０００５％−１．５％、０．０００８％−１％、０．００１％−０．２％、０．００２％−０．０８％、０．００５％−０．０２％、または０．００８％−０．０５％で存在する。いくつかの例では、界面活性剤は０．００５％−０．１％で存在する。いくつかの例では、界面活性剤は０．０５％−０．１％で存在する。いくつかの例では、界面活性剤は０．００５％−０．６％で存在する。いくつかの例では、界面活性剤は１％−３０％、５％−２５％、１０％−３０％、１５％−３０％、または１％−１５％で存在する。液体ポリマーは総反応量の割合として存在することがある。いくつかの例では、界面活性剤は、全体積の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、または約９０％である。いくつかの例では、界面活性剤は、全体積の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、または少なくとも９０％である。いくつかの例では、界面活性剤は、添加物は全体積の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、または９０％以下である。いくつかの例では、界面活性剤は、全体積の５％−７５％、５％−６５％、５％−５５％、１０％−５０％、１５％−４０％、２０％−５０％、２０％−３０％、２５％−３５％、５％−３５％、１０％−３５％、または２０％−４０％である。いくつかの例では、界面活性剤は全体積の２５％−４５％である。
【００４９】
本明細書に記載される方法で使用されるバッファーは、任意の成分の組み合わせを含み得る。いくつかの例では、本明細書に記載されるバッファーは、ハイブリダイゼーションバッファーである。いくつかの例では、本明細書に記載されるハイブリダイゼーションバッファーは、高速ハイブリダイゼーションバッファーである。そのような高速ハイブリダイゼーションバッファーは、８時間未満、６時間未満、４時間未満、２時間未満、１時間未満、４５分未満、３０分未満、または１５分未満などの低いハイブリダイゼーション時間を可能にする。いくつかの例では、本明細書に記載されるハイブリダイゼーションバッファーは、表２Ａ−２Ｇに記載されるバッファーを含む。いくつかの例では、表１Ａ−１Ｉに記載されるバッファーを高速ハイブリダイゼーションバッファーとして使用してもよい。いくつかの例では、表１Ｂ、１Ｃ、および１Ｄに記載されるバッファーは、高速ハイブリダイゼーションバッファーとして使用されてもよい。いくつかの例では、本明細書に記載される高速ハイブリダイゼーションバッファーは、表１Ｂに記載されている。いくつかの例では、本明細書に記載される高速ハイブリダイゼーションバッファーは、表１Ｃに記載されている。いくつかの例では、本明細書に記載されるような高速ハイブリダイゼーションバッファーが、表１Ｄに記載されている。
【００５０】
【表２】
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【００５１】
【表３】
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【００５２】
【表４】
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【００５３】
【表５】
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【００５４】
【表６】
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【００５５】
【表７】
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【００５６】
【表８】
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【００５７】
【表９】
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【００５８】
【表１０】
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【００５９】
結合バッファーと洗浄バッファーなどのバッファーが本明細書に記載されている。いくつかの例では、結合バッファーはハイブリダイゼーション後に、サンプルポリヌクレオチドとプローブの混合物を調製するために使用される。いくつかの例では、結合バッファーは、カラムまたは他の固体支持体上のサンプルポリヌクレオチドを捕捉する。いくつかの例では、表２Ａ−２Ｉに記載されるバッファーを結合バッファーとして使用されてもよい。いくつかの例では、結合バッファーは、表２Ａ、２Ｈ、および２Ｉに記載されるバッファーを含む。いくつかの例では、本明細書に記載される結合バッファーは、表２Ａに記載されている。いくつかの例では、本明細書に記載される結合バッファーは、表２Ｈに記載されている。いくつかの例では、本明細書に記載される結合バッファーは、表２Ｉに記載されている。いくつかの例では、本明細書に記載されるバッファーは洗浄バッファーとして使用されてもよい。いくつかの例では、洗浄バッファーは、カラムまたは固体支持体から非結合ポリヌクレオチドを取り除くために使用される。いくつかの例では、表１Ａ−２Ｉに記載されるバッファーを洗浄バッファーとして使用されてもよい。いくつかの例では、洗浄バッファーは表２Ｅ、２Ｆ、および２Ｇに記載されるようなバッファーを含む。いくつかの例では、本明細書に記載される洗浄バッファーは、表２Ｅに記載されている。いくつかの例では、本明細書に記載される洗浄バッファーは、表２Ｆに記載されている。いくつかの例では、本明細書に記載される洗浄バッファーは、表２Ｇに記載されている。いくつかの例では、本明細書に記載される組成物と方法と共に使用される洗浄バッファーは、第１の洗浄バッファー（洗浄バッファー１）、第２の洗浄バッファー（洗浄バッファー２）などと記載される。
【００６０】
増幅反応のための小ポリヌクレオチド集団のデノボ合成
【００６１】
表面、例えばプレートからポリヌクレオチドを合成する方法が本明細書に記載される。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド伸長のための遺伝子座（ｌｏｃｉ）のクラスター上で合成され、放出され、その後、増幅反応、例えば、ＰＣＲに供される。クラスターからのポリヌクレオチドの合成の例示的なワークフローが図８に描かれている。シリコンプレート（８０１）は、複数のクラスター（８０３）を含む。各クラスター内には、複数の遺伝子座（８２１）が存在する。ポリヌクレオチドは、クラスター（８０３）からプレート（８０１）上でデノボ合成される（８０７）。ポリヌクレオチドは切断され（８１１）、プレートから除去されることで（８１３）、放出されたポリヌクレオチドの集団（８１５）を形成する。放出されたポリヌクレオチドの集団（８１５）は、その後、増幅され（８１７）、増幅されたポリヌクレオチドのライブラリー（８１９）を形成する。
【００６２】
本明細書に提供される方法は、クラスター上で合成されたポリヌクレオチドの増幅が、そのようなクラスター化された配置を有していない構造体の表面全体にわたるポリヌクレオチドの増幅と比較して、ポリヌクレオチドの表現に対する強化された制御を提供する。いくつかの例では、ポリヌクレオチド伸長のための遺伝子座のクラスター化された配置を有する表面から合成されたポリヌクレオチドの増幅は、大規模なポリヌクレオチド集団の反復合成に起因する表現に対する負の効果を克服するために提供される。大きなポリヌクレオチド集団の反復合成による表現に対する例示的な負の影響としては、限定されないが、高／低ＧＣ含有量、反復配列、後方の（ｔｒａｉｌｉｎｇ）アデニン、二次構造、標的配列結合に対する親和性、またはポリヌクレオチド配列中の修飾されたヌクレオチドに起因する増幅バイアスが挙げられる。
【００６３】
クラスター配置なしでプレート全体にわたってポリヌクレオチドを増幅するのとは対照的なクラスター増幅は、平均値の周りのよりタイトな分布をもたらし得る。例えば、１０万のリードがランダムにサンプリングされている場合、配列ごとに平均８つのリードは、平均から約１．５倍の分布を有するライブラリーをもたらすことになる。場合によっては、単一クラスター増幅は、平均からせいぜい約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、または約２．０倍の分布をもたらす。場合によっては、単一クラスター増幅は、平均から少なくとも約１．０倍、１．２倍、１．３倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、または２．０倍をもたらす。
【００６４】
プレート全体の増幅と比較した場合、本明細書に記載されるクラスター増幅方法は、等価な配列表現のために必要とされる配列決定がより少ないポリヌクレオチドライブラリーをもたらし得る。いくつかの例では、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％より少ない配列決定が必要とされる。いくつかの例では、最大１０％、最大２０％、最大３０％、最大４０％、最大５０％、最大６０％、最大７０％、最大８０％、最大９０％、または最大９５％より少ない配列決定が必要とされる。プレート上での増幅と比較して、クラスター増幅の後に、３０％少ない配列決定が必要とされることもしばしばある。いくつかの例では、ポリヌクレオチドの配列決定は、次世代配列決定などのハイスループット配列決定によって検証される。配列決定ライブラリーの配列決定は、単一分子のリアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング、ポロニーシーケンシング、ライゲーションシーケンシング、可逆的なターミネーターシーケンシング、陽子検出シーケンシング、イオン半導体シーケンシング、ナノポアシーケンシング、電子シーケンシング、パイロシーケンシング、マクサム−ギルバートシーケンシング、連鎖停止反応（例えば、サンガー）シーケンシング、＋Ｓシーケンシング、あるいは合成によるシーケンシングを含む任意の適切なシーケンシング技術を用いて実施可能である。単一のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが同定された回数または「リード」された回数は、配列決定深度またはリード深度として定義される。場合によっては、リード深度は、倍数カバレッジ、例えば、５５倍（または５５Ｘ）カバレッジと呼ばれ、随意に塩基のパーセンテージを記載する。
【００６５】
本明細書に記載されるライブラリーは、増幅後のドロップアウトの数が減少してもよい。いくつかの例では、プレート全体の増幅と比較して、クラスター化された配置からの増幅は、より少ないドロップアウト、または増幅産物の配列決定後に検出されない配列をもたらす。ドロップアウトは、ＡＴおよび／またはＧＣであり得る。いくつかの例では、ドロップアウトの数は、ポリヌクレオチド集団のせいぜい約１％、２％、３％、４％、または５％である。場合によっては、ドロップアウトの数はゼロである。
【００６６】
本明細書に記載されるようなクラスターは、ポリヌクレオチド合成のための離散的で非重複の遺伝子座の集合体を含む。クラスターは、約５０−１０００、７５−９００、１００−８００、１２５−７００、１５０−６００、２００−５００、または３００−４００の遺伝子座を含み得る。いくつかの例では、各クラスターは１２１の遺伝子座を含む。いくつかの例では、各クラスターは、約５０−５００、約５０−２００、約１００−１５０の遺伝子座を含む。いくつかの例では、各クラスターは、少なくとも約５０、１００、１５０、２００、５００、１０００またはそれ以上の遺伝子座を含む。いくつかの例では、単一のプレートは、１００、５００、１００００、２００００、３００００、５００００、１０００００、５０００００、７０００００、１００００００、またはそれ以上の遺伝子座を含む。遺伝子座は、スポット、ウェル、マイクロウェル、チャネル、またはポストであり得る。いくつかの例では、各クラスターは、同一の配列を有するポリヌクレオチドの伸長部を支持する別の特徴の少なくとも１Ｘ、２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、９Ｘ、１０Ｘ、またはそれ以上の余剰を有する。
【００６７】
配列内容物の化学量論を制御したポリヌクレオチドライブラリーの生成
【００６８】
所望のポリヌクレオチド配列の特定の分布を有するように合成されたポリヌクレオチドライブラリーが本明細書で提供される。特定の所望の配列の富化のためにポリヌクレオチドライブラリーを調整することは、改善された下流アプリケーションの結果を提供し得る。例えば、１つ以上の特定の配列は、下流アプリケーションにおけるそれらの評価に基づいて選択され得る。いくつかの例では、評価は、増幅、富化、または検出のための標的配列への結合親和性、安定性、融解温度、生物学的活性、より大きな断片に集合する能力、またはポリヌクレオチドの他の特性である。いくつかの例では、評価は、経験的または先行実験および／またはコンピュータアルゴリズムから予測される。例示的なアプリケーションは、平均的なリード深度よりも小さいリード深度を有するゲノム標的の領域に対応するプローブライブラリー中の配列を増加させることを含む。ポリヌクレオチドライブラリー中の調整のために選択された配列は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９５％以上であり得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリー中の調整のために選択された配列は、配列のせいぜい１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはせいぜい１００％である。場合によっては、選択された配列は、配列の約５−９５％、約１０−９０％、約３０−８０％、約４０−７５％、または約５０−７０％の範囲である。ポリヌクレオチドライブラリーは、調整のために、各選択された配列の頻度について調整可能である。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリーは、より多くの選択された配列に有利である。例えば、選択された配列の増加したポリヌクレオチド頻度が約４０％−約９０％の範囲にあるライブラリーが設計される。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリーは、選択された配列の数が少ないものを含む。例えば、ライブラリーは、選択された配列の増加したポリヌクレオチド頻度が約１０％−約６０％の範囲にあるように設計される。ライブラリーは、選択された配列のより高い頻度およびより低い頻度を有利になるように設計され得る。いくつかの例では、ライブラリーは、均一な配列表現を好む。例えば、ポリヌクレオチドの頻度は、選択された配列の頻度に関して、約１０％−約９０％の範囲で均一である。いくつかの例では、ライブラリーは、配列の約１０％−約９５％の範囲の選択された配列頻度を有するポリヌクレオチドを含む。
【００６９】
調整頻度のための指定された選択された配列を有するポリヌクレオチドライブラリーの生成は、調整頻度内容のための異なる選択された配列を有する少なくとも２つのポリヌクレオチドライブラリーを組み合わせることによって行われてもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも２、３、４、５、６、７、１０、または１０を超えるポリヌクレオチドライブラリーを組み合わせて、指定された選択された配列頻度を有するポリヌクレオチドの集団を生成する。場合によっては、２、３、４、５、６、７、または１０以下のポリヌクレオチドライブラリーは、指定された選択された配列頻度を有する非同一ポリヌクレオチドの集団を生成するために組み合わされる。
【００７０】
本明細書に記載されているように、調整頻度のための選択された配列は、クラスターごとにより少ないまたはより多くのポリヌクレオチドを合成することによって調整される。例えば、少なくとも約２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、または１０００を超える非同一ポリヌクレオチドが１つのクラスター上で合成される。場合によっては、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００以下の非同一ポリヌクレオチドは、単一のクラスター上では合成されない。いくつかの例では、５０−５００の非同一ポリヌクレオチドが単一のクラスター上で合成される。いくつかの例では、１００−２００の非同一ポリヌクレオチドが単一のクラスター上で合成される。いくつかの例では、約１００、約１２０、約１２５、約１３０、約１５０、約１７５、または約２００の非同一ポリヌクレオチドが単一のクラスター上で合成される。
【００７１】
場合によっては、調整回数のための選択された配列は、可変長さの非同一ポリヌクレオチドの合成により調節される。例えば、非同一ポリヌクレオチドの各々の長さは、少なくともまたは少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、２０００のヌクレオチド、またはそれ以上であり得る。合成された非同一ポリヌクレオチドの長さは、最大で、または最大で約２０００、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、５０、４５、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０のヌクレオチド、またはそれ以下である。非同一ポリヌクレオチドの各々の長さは、１０−２０００、１０−５００、９−４００、１１−３００、１２−２００、１３−１５０、１４−１００、１５−５０、１６−４５、１７−４０、１８−３５、および、１９−２５の範囲であり得る。
【００７２】
ポリヌクレオチドプローブ構造
【００７３】
ポリヌクレオチドプローブのライブラリーは、サンプルポリヌクレオチドのより大きな集団において特定の標的配列を富化するために使用することができる。いくつかの例では、ポリヌクレオチドプローブはそれぞれ、１つ以上の標的配列に相補的な標的結合配列、１つ以上の非標的結合配列、および１つ以上のプライマー結合部位、例えば、ユニバーサルプライマー結合部位を含む。相補的であるか、または、少なくとも部分的に相補的である標的結合配列は、いくつかの例では、標的配列に結合（ハイブリダイズ）する。ユニバーサルプライマー結合部位などのプライマー結合部位は、プローブライブラリーの全メンバー、またはメンバーのサブ集団の同時増幅を容易にする。いくつかの例では、プローブまたはアダプターはさらに、バーコード配列またはインデックス配列を構成する。バーコードは、バーコードが関連付けられるポリヌクレオチドのいくつかの特徴を識別することを可能にする核酸配列である。配列決定後、バーコード領域は、コード領域またはサンプルソースに関連付けられる特徴を識別するための指標を提供する。バーコードは、十分な程度の識別を可能にするために、適切な長さ、例えば、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、またはそれ以上の塩基の長さで、設計することができる。複数のバーコード、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のバーコードが、非バーコード配列によって随意に分離された同一の分子上で使用されてもよい。いくつかの実施形態では、複数のバーコードの各バーコードは、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の位置などの少なくとも３つの塩基位置で、複数のバーコードの他のバーコードとは異なる。バーコードの使用は、配列決定（マルチプレックス）などの下流アプリケーションのために、複数のライブラリーをプールして同時に処理することを可能にする。いくつかの例では、少なくとも４、８、１６、３２、４８、６４、１２８、またはそれ以上の５１２のバーコード付きライブラリーが使用される。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、低分子、ペプチド、抗原、金属、またはタンパク質などの１つ以上の分子（または親和性）タグにライゲートされて、関心のある標的配列のその後の捕捉のためのプローブを形成する。いくつかの例では、ポリヌクレオチドの一部のみが分子タグにライゲートされる。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションが可能な相補的な標的結合配列を有する２つのプローブは、二本鎖プローブ対を形成する。ポリヌクレオチドプローブまたはアダプターは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含んでいてもよい。ＵＭＩは、バイアスを導入し得る下流のサンプル処理（例えば、ＰＣＲまたは富化の工程）の前に、初期サンプル濃度または化学量論の内部測定を可能にする。いくつかの例では、ＵＭＩは、１つ以上のバーコード配列を含む。
【００７４】
本明細書に記載されるプローブは、ゲノム中の配列である標的配列に相補的であってもよい。本明細書に記載されるプローブは、ゲノム中のエクソーム配列である標的配列に相補的であってもよい。本明細書に記載されるプローブは、ゲノム中のイントロン配列である標的配列に相補的であってもよい。いくつかの例では、プローブは、標的配列に相補的な標的結合配列と、標的に相補的ではない少なくとも１つの非標的結合配列とを含む。いくつかの例では、プローブの標的結合配列は、約１２０ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１１０、１２０、１２５、１４０、１５０、１６０、１７５、２００、３００、４００、５００、または５００を超えるヌクレオチドの長さである。いくつかの例では、標的結合配列は、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、５０以下、７５以下、１００以下、１２５以下、１５０以下、１７５以下、２００以下、または５００以下のヌクレオチドの長さである。プローブの標的結合配列は、いくつかの例では、約１２０ヌクレオチドの長さ、または約１０、１５、２０、２５、４０、５０、６０、７０、８０、８５、８７、９０、９５、９７、１００、１０５、１１０、１１５、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７５、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、３００、４００、または約５００ヌクレオチドの長さである。標的結合配列は、いくつかの例では、約２０−約４００ヌクレオチドの長さ、または約３０−約１７５、約４０−約１６０、約５０−約１５０、約７５−約１３０、約９０−約１２０、または約１００−約１４０ヌクレオチドの長さである。プローブの非標的結合配列は、いくつかの例では、少なくとも約２０ヌクレオチドの長さ、または少なくとも約１、５、１０、１５、１７、２０、２３、２５、５０、７５、１００、１１０、１２０、１２５、１４０、１５０、１６０、１７５、または約１７５を超えるヌクレオチドの長さである。非標的結合配列はしばしば、約５以下、約１０以下、約１５以下、約２０以下、約２５以下、約５０以下、約７５以下、約１００以下、約１２５以下、約１５０以下、約１７５以下、または約２００以下のヌクレオチドの長さである。プローブの非標的結合配列はしばしば、約２０ヌクレオチドの長さ、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、または約２００ヌクレオチドの長さである。いくつかの例では、非標的結合配列は、約１−約２５０ヌクレオチドの長さ、または約２０−約２００ヌクレオチド、約１０−約１００ヌクレオチド、約１０−約５０ヌクレオチド、約３０−約１００ヌクレオチド、約５−約４０ヌクレオチド、または約１５−約３５ヌクレオチドの長さである。非標的結合配列はしばしば、標的配列に相補的ではない配列を含み、および／またはプライマーと結合するために使用されない配列を含む。いくつかの例では、非標的結合配列は、単一ヌクレオチド、例えば、ポリアデニンまたはポリチミジンの繰り返しを含む。プローブはしばしば、非標的結合配列をまったく含まないか、少なくとも１つの非標的結合配列を含む。いくつかの例では、プローブは１つまたは２つの非標的結合配列を含む。非標的結合配列は、プローブ中の１つ以上の標的結合配列に隣接することもある。例えば、非標的結合配列は、プローブの５’末端または３’末端に位置する。いくつかの例では、非標的結合配列は、分子タグまたはスペーサーに取り付けられている。
【００７５】
本明細書に記載されるように、非標的結合配列はプライマー結合部位であり得る。プライマー結合部位はしばしば、それぞれ少なくとも約２０ヌクレオチドの長さ、または少なくとも約１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、または少なくとも約４０ヌクレオチドの長さである。いくつかの例では、各プライマー結合部位は、約１０以下、約１２以下、約１４以下、約１６以下、約１８以下、約２０以下、約２２以下、約２４以下、約２６以下、約２８以下、約３０以下、約３２以下、約３４以下、約３６以下、約３８以下、または約４０ヌクレオチド以下の長さである。いくつかの例では、各プライマー結合部位は、約１０−約５０ヌクレオチドの長さ、または約１５−約４０、約２０−約３０、約１０−約４０、約１０−約３０、約３０−約５０、または約２０−約６０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは、少なくとも２つのプライマー結合部位を含む。いくつかの例では、プライマー結合部位は、ユニバーサルプライマー結合部位であってもよく、ここで、すべてのプローブは、これらの部位で同一のプライマー結合配列を含む。いくつかの例では、特定の配列およびその逆相補体（例えば、ゲノムＤＮＡの領域）を標的とする一対のポリヌクレオチドプローブは、第１の標的結合配列（９０１）、第２の標的結合配列（９０２）、第１の非標的結合配列（９０３）、および第２の非標的結合配列（９０４）を含む、図９Ａの（９００）で表される。例えば、特定の配列（例えば、ゲノムＤＮＡの領域）に相補的な一対のポリヌクレオチドプローブ。
【００７６】
いくつかの例では、第１の標的結合配列（９０１）は、第２の標的結合配列（９０２）の逆相補体である。いくつかの例では、両方の標的結合配列は、増幅の前に化学的に合成される。代替的な配置では、特定の配列およびその逆相補体（例えば、ゲノムＤＮＡの領域）を標的とする一対のポリヌクレオチドプローブは、第１の標的結合配列（９０１）、第２の標的結合配列（９０２）、第１の非標的結合配列（９０３）、第２の非標的結合配列（９０４）、第３の非標的結合配列（９０６）、および第４の非標的結合配列（９０７）を含む、図９Ｂの（９０５）で表される。いくつかの例では、第１の標的結合配列（９０１）は、第２の標的結合配列（９０２）の逆相補体である。いくつかの例では、１つ以上の非標的結合配列は、ポリアデニンまたはポリチミジンを含む。
【００７７】
本明細書に記載されるプローブは、分子タグを含み得る。いくつかの例では、対の両方のプローブは、少なくとも１つの分子タグで標識される。いくつかの例では、増幅の間に（分子タグを含むプライマーを介して）分子タグをプローブに導入するためにＰＣＲが使用される。いくつかの例では、分子タグは、１以上のビオチン、葉酸、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧタグ、グルタチオン、または本明細書に一致する他の分子タグを含む。いくつかの例では、プローブは５’末端で標識される。いくつかの例では、プローブは３’末端で標識される。いくつかの例では、５’末端と３’末端の両方が分子タグで標識される。いくつかの例では、対の第１のプローブの５’末端は、少なくとも１つの分子タグで標識され、対の第２のプローブの３’末端は、少なくとも１つの分子タグで標識される。いくつかの例では、１つ以上の分子タグとプローブの核酸との間にスペーサーが存在する。いくつかの例では、スペーサーは、アルキル、ポリオールまたはポリアミノ鎖、ペプチド、またはポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、プローブ−標的核酸複合体を捕捉するために使用される固体支持体は、ビーズまたは表面である。いくつかの例では、固体支持体は、ガラス、プラスチック、または分子タグを結合する捕捉部分を含むことができる他の材料を含んでいる。いくつかの例では、ビーズは磁気ビーズである。例えば、ビオチンで標識されたプローブは、ストレプトアビジンを含む磁気ビーズで捕捉される。プローブを核酸のライブラリーと接触させ、標的配列へのプローブの結合を可能にする。いくつかの例では、標的核酸に結合した１つ以上のアダプター配列へのプローブの結合を防止するために、ブロッキングポリ核酸が添加される。いくつかの例では、ブロッキングポリ核酸は、１つ以上の核酸アナログを含む。いくつかの例では、ブロッキングポリ核酸は、１つ以上の位置でチミンの代わりに置き換えられたウラシルを有する。
【００７８】
本明細書に記載されるプローブは、１つ以上の標的核酸配列に結合する相補的な標的結合配列を含み得る。いくつかの例では、標的配列は任意のＤＮＡまたはＲＮＡの核酸配列である。いくつかの例では、標的配列はプローブ挿入物よりも長いことがある。いくつかの例では、標的配列はプローブ挿入物よりも短いことがある。いくつかの例では、標的配列はプローブ挿入物と同じ長さであり得る。例えば、標的配列の長さは、少なくともまたは少なくとも約２、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、５，０００、１２，０００、２０，０００ヌクレオチド、またはそれ以上であり得る。標的配列の長さは、最大でも、または最大でも約２０，０００、１２，０００、５，０００、２，０００、１，０００、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、５０、４５、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、２ヌクレオチド、またはそれ以下であり得る。標的配列の長さは、２−２０，０００、３−１２，０００、５−５，０００、１０−２，０００、１０−１，０００、１０−５００、９−４００、１１−３００、１２−２００、１３−１５０、１４−１００、１５−５０、１６−４５、１７−４０、１８−３５、１９−２５の範囲であり得る。プローブ配列は、特定の遺伝子、疾患、調節経路、または本明細書と一致する他の生物学的機能に関連する配列を標的とすることができる。
【００７９】
本明細書に記載されるプローブは、任意の数の適切な配置で標的配列に結合してもよい。いくつかの例では、単一のプローブ挿入物（１００３）は、より大きなポリ核酸（１０００）中の１つ以上の標的配列（１００２）（図１０Ａ−１０Ｇ）に相補的である。例示的な標的配列はエクソンである。いくつかの例では、１つ以上のプローブは、単一の標的配列を標的とする（図１０Ａ−１０Ｇ）。いくつかの例では、単一のプローブは、２つ以上の標的配列を標的とすることができる。いくつかの例では、プローブの標的結合配列は、標的配列（１００２）および隣接配列（１００１）の両方を標的とする（図１０Ａおよび１０Ｂ）。いくつかの例では、第１のプローブは、標的配列の第１の領域と第２の領域を標的とし、第２のプローブは、標的配列の第２の領域と第３の領域を標的とする（図１０Ｄおよび図１０Ｅ）。いくつかの例では、複数のプローブは単一の標的配列を標的とし、ここで、複数のプローブの標的結合配列は、標的配列の領域に対する相補性に関して重複する１つ以上の配列を含む（図１０Ｇ）。いくつかの例では、いくつかの実施形態では、プローブ挿入物は、標的配列の領域に対する相補性に関して重複しない。いくつかの例では、少なくとも２、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、５０００、１２０００、２００００、または２００００を超えるプローブが単一の標的配列を標的とする。いくつかの例では、単一の標的配列を対象とする４以下のプローブが重複し、または単一の標的配列を対象とする３以下、２以下、１以下のプローブが重複し、または単一の標的配列を対象とするいかなるプローブも重複しない。いくつかの例では、１つ以上のプローブは、１つ以上のギャップを残して、標的配列のすべての塩基を標的とするわけではない（図１０Ｃと図１０Ｆ）。いくつかの例では、標的配列（１００５）の中央付近にある（図１０Ｆ）。いくつかの例では、ギャップ（１００４）は、標的配列（１００５）の５’または３’の端部にある（図１０Ｃ）。いくつかの例では、ギャップは６ヌクレオチドの長さである。いくつかの例では、ギャップは、１以下、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、２０以下、３０以下、４０以下、または５０以下のヌクレオチドの長さである。いくつかの例では、ギャップは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、または少なくとも５０ヌクレオチドの長さである。いくつかの例では、ギャップは、１−５０、１−４０、１−３０、１−２０、１−１０、２−３０、２−２０、２−１０、３−５０、３−２５、３−１０、または３−８ヌクレオチドの長さの範囲内である。いくつかの例では、配列を標的とするプローブのセットは、相補的な配列にハイブリダイズしたときに、セット中のプローブ間で重複する領域を含まない。いくつかの例では、配列を標的とするプローブのセットは、相補的な配列にハイブリダイズしたときに、セット内のプローブ間にギャップを持たない。プローブは、標的配列への均一な結合を最大化するように設計されてもよい。いくつかの例では、プローブは、高または低ＧＣ含有量、二次構造、反復／パリンドロミック配列、またはプローブの標的への結合を妨げる可能性のある他の配列特徴の標的結合配列を最小限に抑えるように設計される。いくつかの例では、単一のプローブは、複数の標的配列を標的とすることができる。
【００８０】
本明細書に記載されるプローブライブラリーは、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、または１，０００，０００を超えるプローブを含んでいてもよい。プローブライブラリーは、１０以下、２０以下、５０以下、１００以下、２００以下、５００以下、１，０００以下、２，０００以下、５，０００以下、１０，０００以下、２０，０００以下、５０，０００以下、１００，０００以下、２００，０００以下、５００，０００以下、または１，０００，０００，０００以下のプローブを含み得る。プローブライブラリーは、１０〜５００、２０〜１０００、５０〜２０００、１００〜５０００、５００〜１０，０００、１，０００〜５，０００、１０，０００〜５０，０００、１００，０００〜５００，０００、または５０，０００〜１，０００，０００のプローブを含み得る。プローブライブラリーは、約３７０，０００；約４００，０００；約５００，０００、またはそれ以上の異なるプローブを含み得る。
【００８１】
次世代配列決定アプリケーション
【００８２】
ポリヌクレオチドライブラリーの下流アプリケーションは次世代配列決定を含み得る。例えば、制御された化学量論のポリヌクレオチドプローブライブラリーによる標的配列の富化は、より効率的な配列決定をもたらす。標的を捕捉するか、標的へハイブリダイズするためのポリヌクレオチドライブラリーのパフォーマンスは、効率、正確さ、および精度を記載する多くの異なる測定基準によって定義されてもよい。例えば、Ｐｉｃａｒｄメトリクス（Ｐｉｃａｒｄ  ｍｅｔｒｉｃｓ）は、ＨＳライブラリーサイズ（リード対から計算される、標的領域に対応するライブラリー内で固有の分子の数）、平均標的カバレッジ（特定のカバレッジに到達する塩基のパーセント）、カバレッジ深度（所定のヌクレオチドを含むリードの数）、倍数富化（標的に一意にマッピングする配列リード／全サンプルにマッピングするリードを、全サンプル長／標的長さで乗算したもの）、パーセントオフベイトベース（プローブ／ベイトのベースに対応しないベースのパーセント）、オフターゲットのパーセント（関心のある塩基に対応しない塩基のパーセント）、標的上で使用可能な塩基、ＡＴまたはＧＣドロップアウト率、フォールド８０ベースペナルティ（非ゼロ標的の８０パーセントを平均カバレッジまで引き上げるのに必要とされるフォールドオーバーカバレッジ）、ゼロカバレッジ標的のパーセント、ＰＦリード（品質フィルターを通過したリードの数）、選択された塩基のパーセント（オンベイト塩基とニアベイト塩基の合計をアラインメントされた塩基の合計で乗算したもの）、重複率、または仕様に一致する他の変数などの変数を含む。
【００８３】
リード深度（配列決定深度またはサンプリング）は、配列に対して配列決定された核酸断片（「リード」）が得られる総回数を表す。理論的なリード深度は、理想化されたゲノム全体にリードが完全に分布していると仮定して、同じヌクレオチドが読み取られる期待回数として定義される。リード深度はカバレッジ率（またはカバレッジ幅）の関数として表される。例えば、１００万塩基のゲノムの１，０００万のリードは、完全に分布した場合、理論的には配列の１００％の１０倍のリード深度をもたらす。実際には、標的配列の割合について所望のリード深度を得るためには、より多くのリード（理論的なリード深度の増加、またはオーバーサンプリング）が必要となることがある。いくつかの例では、配列決定時の効率は、サンプル中の塩基の集団に対するリード対サンプルについて得られた総リードの比率として定義される。いくつかの例では、塩基の集団は、本明細書に記載されるプローブを用いて選択される。いくつかの例では、サンプル中の塩基の集団に対するリード対サンプルについて得られた総リードの比率は、少なくとも０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、または少なくとも０．９５である。いくつかの例では、サンプル中の塩基の集団に対するリード対総リードの比率は、約０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、または約０．９５である。いくつかの例では、サンプル中の塩基の集団に対するリード対総リードの比率は、０．１−０．９、０．２−０．８、０．３−０．７、０．２−０．８、０．３−０．７、０．５−０．７、または０．４−０．７である。いくつかの例では、サンプル中の塩基の集団に対するリード対総リードの比率は、少なくとも０．５である。いくつかの例では、サンプル中の塩基の集団に対するリード対総リードの比率は、少なくとも０．６である。いくつかの例では、サンプル中の塩基の集団に対するリード対総リードの比率は、少なくとも０．７である。いくつかの例では、サンプル中の塩基の集団に対するリード対総リードの比率は、少なくとも０．８である。制御された化学量論的プローブライブラリーを用いる標的配列の富化は、標的配列の所望の％以上の許容されるリード数を有する結果を得るために、より少ない総リード数が必要となるため、下流の配列決定の効率を向上させる。例えば、いくつかの例では、標的配列の５５倍の理論的なリード深度は、配列の少なくとも９０％の少なくとも３０倍のカバレッジをもたらす。いくつかの例では、標的配列の５５倍以下の理論的なリード深度は、配列の少なくとも８０％の少なくとも３０倍のリード深度をもたらす。いくつかの例では、標的配列の５５倍以下の理論的なリード深度は、配列の少なくとも９５％の少なくとも３０倍のリード深度をもたらす。いくつかの例では、標的配列の５５倍以下の理論的なリード深度は、配列の少なくとも９８％の少なくとも１０倍のリード深度をもたらす。いくつかの例では、標的配列の５５倍の理論的なリード深度は、配列の少なくとも９８％の少なくとも２０倍のリード深度をもたらす。いくつかの例では、標的配列の５５倍以下の理論的なリード深度は、配列の少なくとも９８％の少なくとも５倍のリード深度をもたらす。標的とのハイブリダイゼーション中にプローブの富化を増加させることは、リード深度の増加をもたらし得る。いくつかの例では、プローブの濃度を少なくとも１．５倍、２．０倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、５倍、または５倍以上に増加させる。いくつかの例では、プローブの濃度を増加させることで、リード深度の少なくとも１０００％の増加、または２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、５００％、７５０％、１０００％、または１０００％を超える増加をもたらす。いくつかの例では、プローブの濃度を３倍に増加させると、リード深度は１００００％増加する。
【００８４】
オンターゲット率は、所望の標的配列に一致する配列決定リードの割合を表す。いくつかの例では、制御された化学量論的ポリヌクレオチドプローブライブラリーは、少なくとも３０％、または少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または少なくとも９０％のオンターゲット率をもたらす。ターゲット核酸との接触中にポリヌクレオチドプローブの濃度を増加させることは、オンターゲット率の増加をもたらす。いくつかの例では、プローブの濃度を少なくとも１．５倍、２．０倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、５倍、または５倍以上に増加させる。いくつかの実施形態では、プローブ濃度を増加させることは、オンターゲット結合の少なくとも２０％の増加、または１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、または少なくとも５００％の増加をもたらす。いくつかの例では、プローブの濃度を３倍に増加させると、オンターゲット率は２０％増加する。
【００８５】
カバレッジ均一性は、場合によっては、標的配列同一性の関数としてのリード深度として計算される。より高いカバレッジ均一性は、所望のリード深度を得るために必要とされる配列決定リードの数をより少なくする結果となる。例えば、標的配列の特性は、リード深度に影響を与えることがあり、例えば、高または低ＧＣまたはＡＴ含有量、反復配列、後方の（ｔｒａｉｌｉｎｇ）アデニン、二次構造、標的配列結合に対する親和性（増幅、富化、または検出のための）、安定性、融解温度、生物活性、より大きな断片に組み合わせる能力、修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む配列、またはポリヌクレオチドの他の任意の特性などが挙げられる。制御された化学量論ポリヌクレオチドプローブライブラリーを用いて標的配列を富化すると、配列決定後により高いカバレッジ均一性が得られる。いくつかの例では、配列の９５％は、平均ライブラリーリード深度の約１倍以内、または平均ライブラリーリード深度の約０．０５、０．１、０．２、０．５、０．７、１、１．２、１．５、１．７、または約２倍以内であるリード深度を有する。いくつかの例では、配列の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％が、平均の１倍以内のリード深度を有する。
【００８６】
本明細書に記載される方法および組成物は、限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃｆＤＮＡ、胎児ｃｆＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＦＦＰＥ、または他の核酸サンプルを含む特定のサンプルタイプに使用することができる。いくつかの例では、機械的剪断は、アダプターのライゲーション、捕捉、富化、および配列決定のための核酸サンプルを調製するために使用される。いくつかの例では、アダプターのライゲーション、捕捉、富化、および配列決定のための核酸サンプルを調製するために、酵素的切断が使用される。いくつかの例では、異なる組織からのＦＦＰＥサンプルなどのＦＦＰＥサンプルが分析される。組織は、限定されないが、脳、頸部、リンパ節、肺、肝臓、脾臓、心臓、腎臓、皮膚、子宮、精巣、膵臓、腸、結腸、胃、前立腺、または他の組織を含む。いくつかの例では、組織は、固形腫瘍などの癌である。いくつかの例では、固形腫瘍は癌腫である。いくつかの例では、本明細書に記載されるプローブの使用は、本明細書に記載される方法を使用して得られる配列決定データの均一性および感度を増加させる。
【００８７】
ポリヌクレオチドプローブライブラリーを用いた標的核酸の富化
【００８８】
本明細書に記載されるプローブライブラリーは、様々な下流のアプリケーションのために、サンプルポリヌクレオチドの集団中に存在する標的ポリヌクレオチドを富化するために使用され得る。ある種の例では、サンプルは、１つ以上の供給源から得られ、サンプルポリヌクレオチドの集団は単離される。サンプルは、唾液、血液、組織、皮膚、または完全に合成されたソースなどの生物学的ソースから（非限定的な例として）得られる。サンプルから得られた複数のポリヌクレオチドは、断片化され、末端修復され、およびアデニル化されることで、二本鎖サンプル核酸断片を形成する。いくつかの例では、末端修復は、適切なバッファー中でのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ酵素、およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼなどの１つ以上の酵素による処理によって達成される。アダプターへのライゲーションを容易にするためのヌクレオチドオーバーハングが、いくつかの例では、３’−５’エキソマイナスクレノウ断片およびｄＡＴＰで添加される。
【００８９】
アダプターは、サンプルポリヌクレオチド断片の両端に、Ｔ４リガーゼなどのリガーゼを用いてライゲートして、アダプタータグ付きポリヌクレオチド鎖のライブラリーを生成してもよく、アダプタータグ付きポリヌクレオチドライブラリーは、ユニバーサルプライマーなどのプライマーを用いて増幅される。いくつかの例では、アダプターは、１つ以上のプライマー結合部位、１つ以上の移植領域、および１つ以上のインデックス（またはバーコード）領域を含むＹ字型アダプターである。いくつかの例では、１つ以上のインデックス領域は、アダプターの各鎖に存在する。いくつかの例では、移植領域は、フローセル表面に相補的であり、サンプルライブラリーの次世代配列決定を容易にする。いくつかの例では、Ｙ字型アダプターは、部分的に相補的な配列を含む。いくつかの例では、Ｙ字型アダプターは、二本鎖アダプタータグ付きポリヌクレオチド鎖のオーバーハングアデニンにハイブリダイズする単一のチミジンオーバーハングを含む。Ｙ字型アダプターは、切断に抵抗性のある修飾核酸を含み得る。例えば、ホスホロチオエートバックボーンは、オーバーハングチミジンをアダプターの３’末端に取り付けるために使用される。次に、二本鎖サンプル核酸断片のライブラリーを、アダプター遮断薬の存在下で変性させる。アダプター遮断薬は、アダプタータグ付きポリヌクレオチド鎖上に存在するアダプター配列（標的配列の代わりに）へのプローブのオフターゲットハイブリダイゼーションを最小限に抑え、および／またはアダプターの分子間ハイブリダイゼーション（すなわち、「デイジーチェーニング（ｄａｉｓｙ  ｃｈａｉｎｉｎｇ）」）を防ぐ。変性は、いくつかの例では、９６℃、または約８５、８７、９０、９２、９５、９７、９８、または約９９℃で実施される。ポリヌクレオチド標的化ライブラリー（プローブライブラリー）は、いくつかの例では、９６℃、または約８５、８７、９０、９２、９５、９７、９８、または約９９℃で、ハイブリダイゼーション溶液中で変性される。変性されたアダプタータグ付きポリヌクレオチドライブラリーおよびハイブリダイゼーション溶液は、プローブがそれらの相補的な標的配列とハイブリダイズすることを可能にするために、適切な時間および適切な温度でインキュベートされる。いくつかの例では、適切なハイブリダイゼーション温度は、約４５−８０℃、または少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０℃である。いくつかの例では、ハイブリダイゼーション温度は７０℃である。いくつかの例では、好適なハイブリダイゼーション時間は、１６時間、または少なくとも４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２時間、または２２時間以上、または約１２−２０時間である。その後、結合バッファーを、ハイブリダイズされたアダプタータグ付きポリヌクレオチドプローブに添加し、捕捉部分を含む固体支持体を用いて、ハイブリダイズされたアダプタータグ付きポリヌクレオチドプローブを選択的に結合させる。固体支持体をバッファーで洗浄して未結合のポリヌクレオチドを除去した後、溶出バッファーを添加して、富化されたタグ付きポリヌクレオチド断片を固体支持体から放出する。い���つかの例では、固体支持体を２回、または１、２、３、４、５、あるいは６回洗浄する。アダプタータグ付きポリヌクレオチド断片の富化されたライブラリーを増幅し、富化されたライブラリーを配列決定する。
【００９０】
複数の核酸（すなわち、ゲノム配列）をサンプルから得て、断片化し、随意に末端修復し、アデニル化してもよい。アダプターをポリヌクレオチド断片の両端にライゲーションしてアダプタータグ付きポリヌクレオチド鎖のライブラリーを生成し、アダプタータグ付きポリヌクレオチドライブラリーを増幅する。その後、アダプタータグ付きポリヌクレオチドライブラリーを、アダプター遮断薬の存在下で、高温、好ましくは９６℃で変性させる。ポリヌクレオチド標的化ライブラリー（プローブライブラリー）を、高温、好ましくは約９０−９９℃でハイブリダイゼーション溶液中で変性させ、約４５−８０℃で約１０−２４時間、ハイブリダイゼーション溶液中で変性させたタグ付きポリヌクレオチドライブラリーと組み合わせる。その後、結合バッファーを、ハイブリダイズされたタグ付きポリヌクレオチドプローブに添加し、捕捉部分を含む固体支持体を用いて、ハイブリダイズされたアダプタータグ付きポリヌクレオチドプローブを選択的に結合させる。固体支持体をバッファーで１回以上、好ましくは約２回および約５回洗浄して未結合のポリヌクレオチドを除去した後、溶出バッファーを添加して、富化されたアダプタータグ付きポリヌクレオチド断片を固体支持体から放出する。アダプタータグ付きポリヌクレオチド断片の富化されたライブラリーを増幅し、その後、ライブラリーを配列決定する。インキュベーション時間、温度、反応量／濃度、洗浄回数、または本明細書に一致する他の変数などの代替的な変数も、本方法において採用される。
【００９１】
ポリヌクレオチドの集団は、アダプターライゲーションの前に富化されてもよい。一実施例において、ポリヌクレオチドの集団は、サンプルから得られ、断片化され、随意に末端修復され、高温、好ましくは９０−９９℃で変性される。ポリヌクレオチド標的化ライブラリー（プローブライブラリー）を、高温、好ましくは約９０−９９℃でハイブリダイゼーション溶液中で変性させ、約４５−８０℃で約１０−２４時間、ハイブリダイゼーション溶液中で変性させたタグ付きポリヌクレオチドライブラリーと組み合わせる。その後、結合バッファーを、ハイブリダイズされたタグ付きポリヌクレオチドプローブに添加し、捕捉部分を含む固体支持体を用いて、ハイブリダイズされたアダプタータグ付きポリヌクレオチドプローブを選択的に結合させる。固体支持体をバッファーで１回以上、好ましくは約２回および約５回洗浄して未結合のポリヌクレオチドを除去した後、溶出バッファーを添加して、富化されたアダプタータグ付きポリヌクレオチド断片を固体支持体から放出する。富化されたポリヌクレオチド断片をその後、ポリアデニル化し、アダプターをポリヌクレオチド断片の両端にライゲーションしてアダプタータグ付きポリヌクレオチド鎖のライブラリーを生成し、アダプタータグ付きポリヌクレオチドライブラリーを増幅する。その後、アダプタータグ付きポリヌクレオチドライブラリーが配列決定される。
【００９２】
ポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、望ましくない断片にハイブリダイズすることによって、複数のポリヌクレオチドから望ましくない配列をフィルタリングするために使用されてもよい。例えば、複数のポリヌクレオチドをサンプルから得て、断片化し、随意に末端修復し、アデニル化する。アダプターをポリヌクレオチド断片の両端にライゲーションしてアダプタータグ付きポリヌクレオチド鎖のライブラリーを生成し、アダプタータグ付きポリヌクレオチドライブラリーを増幅する。代替的に、サンプルポリヌクレオチドの富化の後に、アデニル化とアダプターのライゲーション工程がその代りに実施される。その後、アダプタータグ付きポリヌクレオチドライブラリーを、アダプター遮断薬の存在下で、高温、好ましくは９０−９９℃で変性させる。望ましくない非標的配列を除去するために設計されたポリヌクレオチドフィルタリングライブラリー（プローブライブラリー）を、高温、好ましくは約９０−９９℃でハイブリダイゼーション溶液中で変性させ、約４５−８０℃で約１０−２４時間、ハイブリダイゼーション溶液中で変性させたタグ付きポリヌクレオチドライブラリーと組み合わせる。その後、結合バッファーを、ハイブリダイズされたタグ付きポリヌクレオチドプローブに添加し、捕捉部分を含む固体支持体を用いて、ハイブリダイズされたアダプタータグ付きポリヌクレオチドプローブを選択的に結合させる。固体支持体をバッファーで１回以上、好ましくは約１回および約５回洗浄して、未結合アダプタータグ付きポリヌクレオチド断片を溶出させる。未結合アダプタータグ付きポリヌクレオチド断片の富化されたライブラリーを増幅し、その後、増幅されたライブラリーを配列決定する。
【００９３】
ポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、特定の機能を有する遺伝子を標的とするように設計されていてもよい。例えば、標的遺伝子は、ミトコンドリア遺伝子である。いくつかの例では、標的遺伝子は、癌または神経変性疾患などの疾患に関与している。
【００９４】
ポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、多数の遺伝子を標的化するように設計されてもよい。いくつかの例では、遺伝子の数は、少なくともまたは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、または１０００以上の遺伝子を含む。いくつかの例では、標的遺伝子のサイズは、少なくともまたは約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、１．０、２．０、４．０、８．０、１０．０、１２．０、１４．０、１６．０、１８．０、２０．０、２２．０、２４．０、２６．０、２８．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、または６０．０を超える巨大塩基（Ｍｂ）である。ポリヌクレオチド標的化ライブラリー中のプローブの数は、いくつかの例では、少なくともまたは約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、１００００００、またはそれ以上のプローブを含む。
【００９５】
改善されたパフォーマンスを備えたポリヌクレオチド標的化ライブラリーが本明細書に記載される。いくつかの例では、ポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、高度に均一な配列を含む。いくつかの例では、ポリヌクレオチド配列は、平均値の少なくともまたは約０．０５、０．１、０．２、０．５、０．７、１、１．２、１．５、１．７、または２倍の範囲内である。いくつかの例では、配列の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％が平均の１倍以内である。いくつかの例では、ポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または少なくとも９０％のオンターゲット率をもたらす。いくつかの例では、ポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、最大でもまたは約０．５％、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、または５．０％の重複率をもたらす。いくつかの例では、ポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、配列の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の少なくとも３０倍のカバレッジをもたらす。いくつかの例では、ポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、配列の少なくとも９５％の少なくとも３０倍のカバレッジをもたらす。いくつかの例では、ポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、配列の少なくとも９９％の少なくとも３０倍のカバレッジをもたらす。
【００９６】
本明細書に記載されるようなポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、多重化反応に使用されてもよい。いくつかの例では、ポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−、８−、９−、１０−、１１−、１２−、１３−、１４−、１５−、１６−、１７−、１８−、１９−、または２０−プレックス富化反応に使用される。いくつかの例では、多重化反応に使用されるポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、パフォーマンスの向上をもたらす。いくつかの例では、多重化反応に使用されるポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、高度に均一な配列を含む。いくつかの例では、ポリヌクレオチド配列は、平均値の少なくともまたは約０．０５、０．１、０．２、０．５、０．７、１、１．２、１．５、１．７、または２倍の範囲内である。いくつかの例では、配列の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％が平均の１倍以内である。いくつかの例では、多重化反応に使用されるポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または少なくとも９０％のオンターゲット率をもたらす。いくつかの例では、多重化反応に使用されるポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、最大でもまたは約０．５％、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、または５．０％の重複率をもたらす。いくつかの例では、多重化反応に使用されるポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、最大でも約２．０％の複製率をもたらす。いくつかの例では、多重化反応に使用されるポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、最大でも約３．０％の複製率をもたらす。いくつかの例では、改善されたパフォーマンスは、パネルサイズには関係ない。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリーは、少なくともまたは約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、１．０、２．０、４．０、８．０、１０．０、１２．０、１４．０、１６．０、１８．０、２０．０、２２．０、２４．０、２６．０、２８．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、または６０．０を超える巨大塩基（Ｍｂ）を含むパネルのパフォーマンスの改善をもたらす。いくつかの例では、改善されたパフォーマンスは、サンプル質量には関係ない。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリーは、少なくともまたは約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、４５００、５０００、または５００以上のナノグラム（ｎｇ）を含むパネルのパフォーマンスの改善をもたらす。
【００９７】
本明細書に記載されるようなポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、非常に正確である。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチド標的化ライブラリーおよび第２のポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、類似の標的富化を含む。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチド標的化ライブラリーおよび第２のポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、類似のプローブ存在量を含む。
【００９８】
本明細書に記載されるようなポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、非常に柔軟でモジュール式である。例えば、ポリヌクレオチド標的化ライブラリーの含有量は添加または強化され得る。含有量を加えることで、カバーされる標的の数を増加させることができ、または含有量を強化することで、特定の領域のカバレッジを増大させることができる。いくつかの例では、少なくともまたは約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、１．０、２．０、４．０、８．０、１０．０、１２．０、１４．０、１６．０、１８．０、２０．０巨大塩基（Ｍｂ）の含有量が追加または強化される。いくつかの例では、含有量の追加または強化により、カバレッジが増加する。いくつかの例では、カバレッジは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９％以上まで改善される。いくつかの例では、添加または強化された含有量を含むポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、高い均一性、高いオンターゲット率、低い重複率、またはこれらの組み合わせを有する。いくつかの例では、添加または強化された含有量を含むポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、高い均一性を有する配列を含む。いくつかの例では、ポリヌクレオチド配列は、平均値の少なくともまたは約０．０５、０．１、０．２、０．５、０．７、１、１．２、１．５、１．７、または２倍の範囲内である。いくつかの例では、配列の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％が平均の１倍以内である。いくつかの例では、添加または強化された含有量を含むポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または少なくとも９０％のオンターゲット率をもたらす。いくつかの例では、添加または強化された含有量を含むポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、最大でもまたは約０．５％、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、または５．０％の重複率をもたらす。
【００９９】
本明細書に記載されるようなポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、捕捉均一性を向上させるように設計されてもよい。例えば、ポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、１．０％未満、１．５％未満、２．０％未満、２．５％未満、３．０％未満、３．５％未満、４．０％未満、４．５％未満、５．０％未満、６．０％未満、６．５％未満、７．０％未満、７．５％未満、８．０％未満、８．５％未満、９．０％未満、９．５％未満、または１０％未満のＡＴドロップアウトをもたらすように設計されている。いくつかの例では、ポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、１．０％未満、１．５％未満、２．０％未満、２．５％未満、３．０％未満、３．５％未満、４．０％未満、４．５％未満、または５．０％未満のＡＴドロップアウトをもたらすように設計されている。いくつかの例では、ポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、１．０％未満、１．５％未満、２．０％未満、２．５％未満、３．０％未満、３．５％未満、４．０％未満、４．５％未満、５．０％未満、６．０％未満、６．５％未満、７．０％未満、７．５％未満、８．０％未満、８．５％未満、９．０％未満、９．５％未満、または１０％未満のＧＣドロップアウトをもたらすように設計されている。いくつかの例では、ポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、１．０％未満、１．５％未満、２．０％未満、２．５％未満、３．０％未満、３．５％未満、４．０％未満、４．５％未満、または５．０％未満のＧＣドロップアウトをもたらすように設計されている。いくつかの例では、改善された捕捉均一性のために設計されたポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、ポリヌクレオチド配列が、平均の少なくともまたは約０．０５、０．１、０．２、０．５、０．７、１、１．２、１．５、１．７、または２倍の範囲内にある結果となる。いくつかの例では、配列の８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％が平均の１倍以内である。いくつかの例では、改善された捕捉均一性のために設計されたポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または少なくとも９０％のオンターゲット率をもたらす。いくつかの例では、改善された捕捉均一性のために設計されたポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、最大でもまたは約０．５％、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、または５．０％の重複率をもたらす。いくつかの例では、改善された捕捉均一性のために設計されたポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、配列の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の少なくとも３０倍のカバレッジをもたらす。いくつかの例では、改善された捕捉均一性のために設計されたポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、配列の少なくとも９５％の少なくとも３０倍のカバレッジをもたらす。いくつかの例では、改善された捕捉均一性のために設計されたポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、配列の少なくとも９９％の少なくとも３０倍のカバレッジをもたらす。いくつかの例では、改善された捕捉均一性のために設計されたポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、配列の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の少なくとも２０倍のカバレッジをもたらす。いくつかの例では、改善された捕捉均一性のために設計されたポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、配列の少なくとも９５％の少なくとも２０倍のカバレッジをもたらす。いくつかの例では、ポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、配列の少なくとも９９％の少なくとも３０倍のカバレッジをもたらす。
【０１００】
ポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、ライブラリーのパフォーマンスに基づいて反復的に最適化されてもよい。いくつかの例では、ポリヌクレオチドはライブラリーから除去される。いくつかの例では、ポリヌクレオチドの一部の除去は、オンターゲット率の増加またはオフターゲット率の減少をもたらす。いくつかの例では、ポリヌクレオチドの約０．１％、０．２％、０．５％、１％、２％、３％、４％、または約５％が除去される。いくつかの例では、ポリヌクレオチドの０．１％以下、０．２％以下、０．５％以下、１％以下、２％以下、３％以下、４％以下、または５％以下のポリヌクレオチドが除去される。いくつかの例では、ポリヌクレオチドの０．０１−１％、０．０２−０．４％、０．３−０．５％、０．２−１．５％、０．５−２％、１−２％、１−５％、２−４％、または０．７−３％が除去される。いくつかの例では、本明細書に記載される方法で使用されるポリヌクレオチドライブラリーから１つ以上のプローブを除去することは、ライブラリーの富化パフォーマンスを改善させる（例えば、オンターゲット率、オフターゲット率、８０倍ベースペナルティ、オフベイト率、％塩基＞３０倍カバレッジ、または他の配列決定指標）。
【０１０１】
高並列デノボ核酸合成
【０１０２】
本明細書では、革新的な合成プラットフォームを作製するために、シリコン上のナノウェル内でポリヌクレオチド合成から遺伝子アセンブリまでの末端間のプロセスの小型化、並列化、および垂直統合を利用するプラットフォームアプローチが提供される。本明細書に記載される装置は、９６ウェルのプレートと同じフットプリントとともに、従来の合成方法と比較して、１００〜１，０００倍スループットを増加させることができるシリコン合成プラットフォームを提供し、１回の高並列化されたラン（ｒｕｎ）で、最大でおよそ１，０００，０００のポリヌクレオチドを産生する。いくつかの例では、本明細書に記載される単一のシリコンプレートは、約６，１００の非同一ポリヌクレオチドの合成を提供する。いくつかの例では、非同一ポリヌクレオチドの各々は、クラスター内に位置する。クラスターは、５０−５００の非同一ポリヌクレオチドを含み得る。
【０１０３】
本明細書に記載される方法は、少なくとも１つのあらかじめ定められた参照核酸配列のあらかじめ定められた変異体を各々コードするポリヌクレオチドのライブラリーの合成を提供する。場合によっては、あらかじめ決められた参照配列はタンパク質をコードする核酸配列であり、変異体ライブラリーは、合成された核酸によってコードされたその後のタンパク質中の単一の残基の複数の様々な変異体が標準的な翻訳プロセスによって生成されるように、少なくとも１つのコドンの変異をコードする配列を含む。核酸配列中の合成された特異的な変化は、ヌクレオチド変化を、重複または平滑端のポリヌクレオチドプライマーに組み入れることにより導入可能である。代替的に、ポリヌクレオチドの集団は、長い核酸（例えば、遺伝子）とその変異体をまとめてコードすることもある。この配置では、長い核酸（例えば、遺伝子）とその変異体を形成するために、ポリヌクレオチドの集団をハイブリダイズして標準的な分子生物学技術にかけることができる。長い核酸（例えば遺伝子）とその変異体が細胞中で発現される場合、異なるタンパク質ライブラリーが生成される。同様に、ＲＮＡ配列（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）あるいはＤＮＡ配列（例えば、エンハンサー、プロモーター、ＵＴＲ、およびターミネーター領域）をコードする変異体ライブラリーの合成のための方法が本明細書で提供される。さらに、本明細書に記載される方法を用いて合成されたライブラリーから選択された変異体の下流のアプリケーションも本明細書で提供される。下流のアプリケーションは、例えば、生化学的な親和性、酵素活性、細胞活性の変化、および病状の治療または予防のための生物学的に関連する機能を増強させた、変異体核酸あるいはタンパク質配列の同定を含む。
【０１０４】
基質
【０１０５】
本明細書には、複数のクラスターを含む基質が提供され、ここで、クラスターはそれぞれ、ポリヌクレオチドの結合と合成を支持する複数の遺伝子座を含む。本明細書で使用されるような「遺伝子座」という用語は、表面から伸長するために単一のあらかじめ定められた配列をコードするポリヌクレオチドに支持を与える構造上の離散領域を指す。いくつかの例では、遺伝子座は、二次元表面、例えば、実質的に平らな表面上にある。いくつかの例では、遺伝子座は、表面上の離散した隆起または沈降部位、例えば、ウェル、マイクロウェル、チャネル、またはポストを指す。いくつかの例では、遺伝子座の表面は、ポリヌクレオチド合成のための少なくとも１つのヌクレオチド、または、好ましくは、ポリヌクレオチドの集団の合成のための同一のヌクレオチドの集団に結合するために活発に機能化される物質を含む。いくつかの例では、ポリヌクレオチドとは、同じ核酸配列をコードするポリヌクレオチドの集団を指す。いくつかの例では、装置の表面は、基質の１つまたは複数の表面を包含する。
【０１０６】
本明細書には、共通の支持体上のアドレス可能な位置で異なるあらかじめ決められた配列を有する複数のポリヌクレオチドの合成を支持する表面を含み得る構造が提供される。いくつかの例では、装置は、２，０００以上；５，０００以上；１０，０００以上；２０，０００以上；３０，０００以上；５０，０００以上；７５，０００以上；１００，０００以上；２００，０００以上；３００，０００以上；４００，０００以上；５００，０００以上；６００，０００以上；７００，０００以上；８００，０００以上；９００，０００以上；１，０００，０００以上；１，２００，０００以上；１，４００，０００以上；１，６００，０００以上；１，８００，０００以上；２，０００，０００以上；２，５００，０００以上；３，０００，０００以上；３，５００，０００以上；４，０００，０００以上；４，５００，０００以上；５，０００，０００以上；１０，０００，０００以上、またはそれ以上の非同一ポリヌクレオチドの合成のための支持を提供する。いくつかの例では、装置は、別の配列をコードする、２，０００以上；５，０００以上；１０，０００以上；２０，０００以上；３０，０００以上；５０，０００以上；７５，０００以上；１００，０００以上；２００，０００以上；３００，０００以上；４００，０００以上；５００，０００以上；６００，０００以上；７００，０００以上；８００，０００以上；９００，０００以上；１，０００，０００以上；１，２００，０００以上；１，４００，０００以上；１，６００，０００以上；１，８００，０００以上；２，０００，０００以上；２，５００，０００以上；３，０００，０００以上；３，５００，０００以上；４，０００，０００以上；４，５００，０００以上；５，０００，０００以上；１０，０００，０００以上、または、それ以上のポリヌクレオチドの合成のための支持を提供する。いくつかの例では、ポリヌクレオチドの少なくとも一部は、同一の配列を有しているか、または同一の配列で合成されるように構成される。
【０１０７】
本明細書には、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、または２０００塩基の長さであるポリヌクレオチドの製造および成長のための方法および装置が提供される。いくつかの例では、形成されるポリヌクレオチドの長さは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、または２２５塩基の長さである。ポリヌクレオチドは、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００塩基の長さであり得る。ポリヌクレオチドは、１０〜２２５塩基の長さ、１２〜１００塩基の長さ、２０〜１５０塩基の長さ、２０〜１３０塩基の長さ、または３０〜１００塩基の長さであり得る。
【０１０８】
いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、基質の別々の遺伝子座で合成され、ここで、遺伝子座はそれぞれ、ポリヌクレオチドの集団の合成を支持する。いくつかの例では、各遺伝子座は、別の遺伝子座で成長したポリヌクレオチドの集団とは異なる配列を有するポリヌクレオチドの集団の合成を支持する。いくつかの例では、装置の遺伝子座は複数のクラスター内に位置する。いくつかの例では、装置は、少なくとも１０、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、２００００、３００００、４００００、５００００、またはそれ以上のクラスターを含む。いくつかの例では、装置は、２，０００以上；５，０００以上；１０，０００以上；１００，０００以上；２００，０００以上；３００，０００以上；４００，０００以上；５００，０００以上；６００，０００以上；７００，０００以上；８００，０００以上；９００，０００以上；１，０００，０００以上；１，１００，０００以上；１，２００，０００以上；１，３００，０００以上；１，４００，０００以上；１，５００，０００以上；１，６００，０００以上；１，７００，０００以上；１，８００，０００以上；１，９００，０００以上；２，０００，０００以上；３００，０００以上；４００，０００以上；５００，０００以上；６００，０００以上；７００，０００以上；８００，０００以上；９００，０００以上；１，０００，０００以上；１，２００，０００以上；１，４００，０００以上；１，６００，０００以上；１，８００，０００以上；２，０００，０００以上；２，５００，０００以上；３，０００，０００以上；３，５００，０００以上；４，０００，０００以上；４，５００，０００以上；５，０００，０００以上；または、１０，０００，０００以上、あるいはそれ以上の別々の遺伝子座を含む。いくつかの例では、装置は、約１０，０００の別々の遺伝子座を含む。単一のクラスター内の遺伝子座の量は、異なる例では変動する。いくつかの例では、クラスターはそれぞれ、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１３０、１５０、２００、３００、４００、５００、１０００、またはそれ以上の遺伝子座を含む。いくつかの例では、クラスターはそれぞれ、約５０−５００の遺伝子座を含む。いくつかの例では、クラスターはそれぞれ、約１００−２００の遺伝子座を含む。いくつかの例では、クラスターはそれぞれ、約１００−１５０の遺伝子座を含む。いくつかの例では、クラスターはそれぞれ、約１０９、１２１、１３０、または１３７の遺伝子座を含む。いくつかの例では、クラスターはそれぞれ、約１９、２０、６１、６４、またはそれ以上の遺伝子座を含む。
【０１０９】
装置で合成された別々のポリヌクレオチドの数は、基質中の利用可能な別の遺伝子座の数に左右され得る。いくつかの例では、装置のクラスター内の遺伝子座の密度は、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約１の遺伝子座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約１０の遺伝子座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約２５の遺伝子座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約５０遺伝子座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約６５の遺伝子座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約７５の遺伝子座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約１００の遺伝子座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約１３０の遺伝子座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約１５０の遺伝子座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約１７５の遺伝子座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約２００の遺伝子座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約３００の遺伝子座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約４００の遺伝子座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約５００の遺伝子座、１ｍｍ２当たり少なくともまたは約１，０００の遺伝子座、またはそれ以上である。いくつかの例では、装置は、１ｍｍ２当たり約１０から約５００の遺伝子座、１ｍｍ２当たり約２５から約４００の遺伝子座、１ｍｍ２当たり約５０から約５００の遺伝子座、１ｍｍ２当たり約１００から約５００の遺伝子座、１ｍｍ２当たり約１５０から約５００の遺伝子座、１ｍｍ２当たり約１０から約２５０の遺伝子座、１ｍｍ２当たり約５０から約２５０の遺伝子座、１ｍｍ２当たり約１０から約２００の遺伝子座、１ｍｍ２当たり約５０から約２００の遺伝子座を含む。いくつかの例では、クラスター内の２つの隣接する遺伝子座の中心からの距離は、約１０μｍから約５００μｍ、約１０μｍから約２００μｍ、または約１０μｍから約１００μｍである。いくつかの例では、隣接する遺伝子座の２つの中心からの距離は、約１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、または１００μｍより長い。いくつかの例では、２つの隣接する遺伝子座の中心からの距離は、約２００μｍ、１５０μｍ、１００μｍ、８０μｍ、７０μｍ、６０μｍ、５０μｍ、４０μｍ、３０μｍ、２０μｍ、または１０μｍ未満である。いくつかの例では、遺伝子座それぞれの幅は、約０．５μｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、または１００μｍである。いくつかの例では、遺伝子座はそれぞれ、約０．５μｍから１００μｍ、約０．５μｍから５０μｍ、約１０μｍから７５μｍ、または約０．５μｍから５０μｍの幅を有する。
【０１１０】
いくつかの例では、装置内のクラスターの密度は、１００ｍｍ２当たり少なくともまたは約１のクラスター、１０ｍｍ２当たり１のクラスター、５ｍｍ２当たり１のクラスター、４ｍｍ２当たり１のクラスター、３ｍｍ２当たり１のクラスター、２ｍｍ２当たり１のクラスター、１ｍｍ２当たり１のクラスター、１ｍｍ２当たり２のクラスター、１ｍｍ２当たり３のクラスター、１ｍｍ２当たり４のクラスター、１ｍｍ２当たり５のクラスター、１ｍｍ２当たり１０のクラスター、１ｍｍ２当たり５０のクラスター、またはそれ以上である。いくつかの例では、装置は、１０ｍｍ２当たり約１のクラスターから１ｍｍ２当たり約１０のクラスターを含む。いくつかの例では、２つの隣接するクラスターの中心からの距離は、約５０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、５００μｍ、１０００μｍ、２０００μｍ、または５０００μｍ未満である。いくつかの例では、２つの隣接するクラスターの中心からの距離は、約５０μｍから約１００μｍ、約５０μｍから約２００μｍから、約５０μｍから約３００μｍ、約５０μｍから約５００μｍ、および約１００μｍから約２０００μｍである。いくつかの例では、２つの隣接するクラスターの中心からの距離は、約０．０５ｍｍから約５０ｍｍ、約０．０５ｍｍから約１０ｍｍ、約０．０５ｍｍから約５ｍｍ、約０．０５ｍｍから約４ｍｍ、約０．０５ｍｍから約３ｍｍ、約０．０５ｍｍから約２ｍｍ、約０．１ｍｍから１０ｍｍ、約０．２ｍｍから１０ｍｍ、約０．３ｍｍから約１０ｍｍ、約０．４ｍｍから約１０ｍｍ、約０．５ｍｍから１０ｍｍ、約０．５ｍｍから約５ｍｍ、または約０．５ｍｍから約２ｍｍである。いくつかの例では、クラスターはそれぞれ、約０．５〜２ｍｍ、約０．５〜１ｍｍ、または約１〜２ｍｍの１寸法に沿った直径または幅を有している。いくつかの例では、クラスターはそれぞれ、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２ｍｍの１寸法に沿った直径または幅を有している。いくつかの例では、クラスターはそれぞれ、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．１５、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２ｍｍの１寸法に沿った内部の直径または幅を有している。
【０１１１】
装置は、例えば、約１００〜２００ｍｍ×約５０〜１５０ｍｍの、およそ標準的な９６ウェルプレートのサイズであり得る。いくつかの例では、装置は、約１０００ｍｍ、５００ｍｍ、４５０ｍｍ、４００ｍｍ、３００ｍｍ、２５０ｎｍ、２００ｍｍ、１５０ｍｍ、１００ｍｍ、または５０ｍｍ以下の直径を有している。いくつかの例では、装置の直径は、約２５ｍｍから１０００ｍｍ、約２５ｍｍから約８００ｍｍ、約２５ｍｍから約６００ｍｍ、約２５ｍｍから約５００ｍｍ、約２５ｍｍから約４００ｍｍ、約２５ｍｍから約３００ｍｍ、または約２５ｍｍから約２００である。装置サイズの非限定な例は、約３００ｍｍ、２００ｍｍ、１５０ｍｍ、１３０ｍｍ、１００ｍｍ、７６ｍｍ、５１ｍｍ、および２５ｍｍを含む。いくつかの例では、装置は、少なくとも約１００ｍｍ２；２００ｍｍ２；５００ｍｍ２；１，０００ｍｍ２；２，０００ｍｍ２；５，０００ｍｍ２；１０，０００ｍｍ２；１２，０００ｍｍ２；１５，０００ｍｍ２；２０，０００ｍｍ２；３０，０００ｍｍ２；４０，０００ｍｍ２；５０，０００ｍｍ２、またはそれ以上の平面の表面積を有している。いくつかの例では、装置の厚さは、約５０ｍｍから約２０００ｍｍ、約５０ｍｍから約１０００ｍｍ、約１００ｍｍから約１０００ｍｍ、約２００ｍｍから約１０００ｍｍ、または約２５０ｍｍから約１０００ｍｍである。装置の厚さの非限定的な例は、２７５ｍｍ、３７５ｍｍ、５２５ｍｍ、６２５ｍｍ、６７５ｍｍ、７２５ｍｍ、７７５ｍｍ、および９２５ｍｍを含む。いくつかの例では、装置の厚さは、直径によって変わり、基質の組成物に左右される。例えば、シリコン以外の物質を含む装置は、同じ直径のシリコン装置とは異なる厚さを有している。装置の厚さは、使用される物質の機械強度によって判定され、取り扱いの間に割れることなく、それ自体の重量を支えるのに十分に厚いものでなければならない。いくつかの例では、構造は、本明細書に記載される複数の装置を含む。
【０１１２】
表面物質
【０１１３】
表面を含む装置が本明細書で提供され、ここで、表面は、あらかじめ決められた位置で、および結果として生じる低いエラー率、低いドロップアウト率、高い収率、および高いオリゴ表現のポリヌクレオチド合成を支持するために修飾される。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるポリヌクレオチド合成のための装置の表面は、デノボポリヌクレオチド合成反応を支持するために、修飾可能な様々な物質から作られる。場合によっては、装置は十分に導電性であり、例えば、装置のすべてまたは一部にわたって、均一な電場を形成することができる。本明細書に記載される装置は可撓性材料を含むこともある。典型的な可撓性材料は、限定されないが、修飾ナイロン、非修飾ナイロン、ニトロセルロース、およびポリプロピレンなどを含む。本明細書に記載される装置は剛性材料を含むこともある。典型的な剛性材料は、限定されないが、ガラス、石英ガラス（ｆｕｓｅ  ｓｉｌｉｃａ）、シリコン、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、プラスチック（例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、およびそれらの混合物など）、ならびに金属（例えば、金、白金など）を含む。本明細書で開示される装置は、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロース系ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ガラス、またはそれらの任意の組み合わせを含む材料から作られることもある。場合によっては、本明細書で開示される装置は、本明細書に列挙された材料または当該技術分野において知られている他の適切な材料の組み合わせで製造される。
【０１１４】
本明細書に記載される典型的な材料の引っ張り強度のリストは以下の通りである：ナイロン（７０ＭＰａ）、ニトロセルロース（１．５ＭＰａ）、ポリプロピレン（４０ＭＰａ）、シリコン（２６８ＭＰａ）、ポリスチレン（４０ＭＰａ）、アガロース（１−１０ＭＰａ）、ポリアクリルアミド（１−１０ＭＰａ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）（３．９−１０．８ＭＰａ）。本明細書に記載される固体支持体は、１〜３００、１〜４０、１〜１０、１〜５、または３〜１１ＭＰａの引っ張り強度を有することができる。本明細書に記載される固体支持体は、約１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２０、２５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、２７０、あるいはそれ以上のＭＰａの引っ張り強度を有することができる。いくつかの例では、本明細書に記載される装置は、テープまたはフレキシブルシートなどの連続的なループまたはリールに格納され得る可撓性材料の形態を取るポリヌクレオチド合成のための固体支持体を含む。
【０１１５】
ヤング率は、荷重下での弾性（復元可能）変形に対する材料の耐性を測定する。本明細書に記載される典型的な材料の剛性のヤング率のリストは以下の通りである：ナイロン（３ＧＰａ）、ニトロセルロース（１．５ＧＰａ）、ポリプロピレン（２ＧＰａ）、シリコン（１５０ＧＰａ）、ポリスチレン（３ＧＰａ）、アガロース（１−１０ＧＰａ）、ポリアクリルアミド（１−１０ＧＰａ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）（１−１０ＧＰａ）。本明細書に記載される固体支持体は、１〜５００、１〜４０、１〜１０、１〜５、または３〜１１ＧＰａのヤング率を有することができる。本明細書に記載される固体支持体は、約１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、２０、２５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、４００、５００ＧＰａ、またはそれ以上のヤング率を有することができる。軟性と剛性の関係は互いに逆であることから、可撓性材料は低ヤング率を有し、荷重下でその形状を大きく変化させる。
【０１１６】
場合によっては、本明細書で開示される装置は二酸化ケイ素の基部と酸化ケイ素の表層を含む。代替的に、装置は酸化ケイ素の基部を有することもある。ここで提供される装置の表面はテクスチャード加工されることもあり、ポリヌクレオチド合成のための全体的な表面積の増加をもたらす。本明細書で開示される装置は、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、８０％、９０％、９５％、または９９％のシリコンを含むこともある。本明細書で開示される装置はシリコン・オン・インシュレーター（ＳＯＩ）ウェハから作られてもよい。
【０１１７】
表面のアーキテクチャ
【０１１８】
本明細書には、隆起したおよび／または陥没した特徴を含む装置が提供される。そのような特徴を有することの１つの利点は、ポリヌクレオチド合成を支持する表面積の増大である。いくつかの例では、隆起したおよび／または陥没した特徴を有する装置は、三次元基質と呼ばれる。いくつかの例では、三次元装置は１つ以上のチャネルを含む。いくつかの例では、１つ以上の遺伝子座はチャネルを含む。いくつかの例では、チャネルは、ポリヌクレオチドシンセサイザーなどの堆積装置による試薬の堆積に利用可能である。いくつかの例では、試薬および／または流体は、１つ以上のチャネルと流体連通してより大きなウェルに集まる。例えば、装置は、クラスターを有する複数の遺伝子座に対応する複数のチャネルを含み、複数のチャネルは、クラスターの１つのウェルと流体連通している。いくつかの方法において、ポリヌクレオチドのライブラリーは、クラスターの複数の遺伝子座において合成される。
【０１１９】
いくつかの例では、その構造は、表面上のポリヌクレオチド合成に関する流れの制御と物質移動経路の制御を可能にするように構成されている。いくつかの例では、装置の構成は、ポリヌクレオチド合成中の物質移動経路、化学暴露時間、および／または洗浄効果の制御ならびにその分布までをも可能にする。いくつかの例では、装置の構成は、例えば、成長中のポリヌクレオチドに充分な体積を提供することによって、奏効率の増加を可能にしており、成長中のポリヌクレオチドによる体積の排除は、ポリヌクレオチドの成長に利用可能なまたは適切な当初利用可能な体積の５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％以下を超える体積を占めることはない。いくつかの例では、三次元構造は、化学暴露の急速な交換を可能にするために流体の流れの管理を可能にする。
【０１２０】
本明細書には、１ｆＭ、５ｆＭ、１０ｆＭ、２５ｆＭ、５０ｆＭ、７５ｆＭ、１００ｆＭ、２００ｆＭ、３００ｆＭ、４００ｆＭ、５００ｆＭ、６００ｆＭ、７００ｆＭ、８００ｆＭ、９００ｆＭ、１ｐＭ、５ｐＭ、１０ｐＭ、２５ｐＭ、５０ｐＭ、７５ｐＭ、１００ｐＭ、２００ｐＭ、３００ｐＭ、４００ｐＭ、５００ｐＭ、６００ｐＭ、７００ｐＭ、８００ｐＭ、９００ｐＭ、またはそれ以上の量のＤＮＡを合成する方法が提供される。いくつかの例では、ポリヌクレオチドライブラリーは、遺伝子の約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の長さに及ぶことがある。遺伝子は、約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％まで変えられることがある。
【０１２１】
非同一ポリヌクレオチドはまとめて、遺伝子の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％に対する配列をコードし得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、遺伝子の５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の配列をコードし得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、遺伝子の８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の配列をコードし得る。
【０１２２】
いくつかの例では、物理構造によって分離が達成される。いくつかの例では、ポリヌクレオチド合成に対する能動領域および受動領域を生成する表面の差次的な官能化によって、隔離が達成される。差次的な官能化はまた、装置表面の疎水性を交互にし、それによって、堆積した試薬の水滴（ｂｅａｄｉｎｇ）または湿りを引き起こす水接触角の効果を作り出すことによって達成される。より大きな構造を利用することで、飛散（ｓｐｌａｓｈｉｎｇ）および隣接するスポットの試薬による別々のポリヌクレオチド合成位置の相互汚染を減らすことができる。いくつかの例では、ポリヌクレオチドシンセサイザーなどの装置が、別々のポリヌクレオチド合成位置に試薬を堆積させるために使用される。三次元の特徴を有する基質は、低いエラー率（例えば、約１：５００、１：１０００、１：１５００、１：２，０００、１：３，０００、１：５，０００、または１：１０，０００未満）で、多数のポリヌクレオチド（例えば、約１０，０００を超える）の合成を可能にする方法で構成される。いくつかの例では、装置は、１ｍｍ２当たり約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、または５００、またはそれを超える特徴の密度で特徴を含む。
【０１２３】
装置のウェルは、基質の別のウェルと同じまたは異なる幅、高さ、および／または体積を有し得る。装置のチャネルは、基質の別のチャネルと同じまたは異なる幅、高さ、および／または体積を有し得る。いくつかの例では、クラスターの幅は、約０．０５ｍｍから約５０ｍｍ、約０．０５ｍｍから約１０ｍｍ、約０．０５ｍｍから約５ｍｍ、約０．０５ｍｍから約４ｍｍ、約０．０５ｍｍから約３ｍｍ、約０．０５ｍｍから約２ｍｍ、約０．０５ｍｍから約１ｍｍ、約０．０５ｍｍから約０．５ｍｍ、約０．０５ｍｍおから０．１ｍｍ、約０．１ｍｍから１０ｍｍ、約０．２ｍｍから１０ｍｍ、約０．３ｍｍから約１０ｍｍ、約０．４ｍｍから約１０ｍｍ、約０．５ｍｍから１０ｍｍ、約０．５ｍｍから約５ｍｍ、または約０．５ｍｍから約２ｍｍである。いくつかの例では、クラスターを含むウェルの幅は、約０．０５ｍｍから約５０ｍｍ、約０．０５ｍｍから約１０ｍｍ、約０．０５ｍｍから約５ｍｍ、約０．０５ｍｍから約４ｍｍ、約０．０５ｍｍから約３ｍｍ、約０．０５ｍｍから約２ｍｍ、約０．０５ｍｍから約１ｍｍ、約０．０５ｍｍから約０．５ｍｍから、約０．０５ｍｍから約０．１ｍｍ、約０．１ｍｍから１０ｍｍ、約０．２ｍｍから１０ｍｍ、約０．３ｍｍから約１０ｍｍ、約０．４ｍｍから約１０ｍｍ、約０．５ｍｍから１０ｍｍ、約０．５ｍｍから約５ｍｍ、または約０．５ｍｍから約２ｍｍである。いくつかの例では、クラスターの幅は、５ｍｍ、４ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．５ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０９ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０７ｍｍ、０．０６ｍｍ、または０．０５ｍｍ未満である。いくつかの例では、クラスターの幅は、約１．０から１．３ｍｍである。いくつかの例では、クラスターの幅は約１．１５０ｍｍである。いくつかの例では、ウェルの幅は、５ｍｍ、４ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．５ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０９ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０７ｍｍ、０．０６ｍｍ、または０．０５ｍｍ未満である。いくつかの例では、ウェルの幅は、約１．０から１．３ｍｍである。いくつかの例では、ウェルの幅は約１．１５０ｍｍである。いくつかの例では、クラスターの幅は約０．０８ｍｍである。いくつかの例では、ウェルの幅は約０．０８ｍｍである。クラスターの幅は、二次元または三次元の基質内のクラスターを指すことがある。
【０１２４】
いくつかの例では、ウェルの高さは、約２０μｍから約１０００μｍ、約５０μｍから約１０００μｍ、約１００μｍから約１０００μｍ、約２００μｍから約１０００μｍ、約３００μｍから約１０００μｍ、約４００μｍから約１０００μｍ、または約５００μｍから約１０００μｍである。いくつかの例では、ウェルの高さは、約１０００μｍ未満、約９００μｍ未満、約８００μｍ未満、約７００μｍ未満、または約６００μｍ未満である。
【０１２５】
いくつかの例では、装置は、クラスター内の複数の遺伝子座に対応する複数のチャネルを含み、チャネルの高さまたは深さは、約５μｍから約５００μｍ、約５μｍから約４００μｍ、約５μｍから約３００μｍ、約５μｍから約２００μｍ、約５μｍから約１００μｍ、約５μｍから約５０μｍ、または約１０μｍから約５０μｍである。いくつかの例では、チャネルの高さは、１００μｍ未満、８０μｍ未満、６０μｍ未満、４０μｍ未満または２０μｍ未満である。
【０１２６】
いくつかの例では、チャネル、遺伝子座（例えば、実質的に平面の基板における）またはチャネルおよび遺伝子座の両方（例えば、遺伝子座がチャネルに対応する三次元装置における）の直径は、約１μｍから約１０００μｍ、約１μｍから約５００μｍ、約１μｍから約２００μｍ、約１μｍから約１００μｍ、約５μｍから約１００μｍ、または約１０μｍから約１００μｍ、例えば、約９０μｍ、８０μｍ、７０μｍ、６０μｍ、５０μｍ、４０μｍ、３０μｍ、２０μｍ、または１０μｍである。いくつかの例では、チャネル、遺伝子座、またはチャネルと遺伝子座の両方の直径は、約１００μｍ、９０μｍ、８０μｍ、７０μｍ、６０μｍ、５０μｍ、４０μｍ、３０μｍ、２０μｍ、または１０μｍ未満である。いくつかの例では、２つの隣接チャネル、遺伝子座、またはチャネルと遺伝子座の中心からの距離は、約１μｍから約５００μｍ、約１μｍから約２００μｍ、約１μｍから約１００μｍ、約５μｍから約２００μｍ、約５μｍから約１００μｍ、約５μｍから約５０μｍ、または約５μｍから約３０μｍ、例えば、約２０μｍである。
【０１２７】
表面修飾
【０１２８】
様々な例において、装置表面または装置表面の選択された部位または領域の１つ以上の化学的および／または物理的な特性を変更するための加算的プロセスまたは減算的プロセスによって、表面の化学的および／または物理的な変さらに、表面修飾が利用される。例えば、表面修飾は、限定されないが、（１）表面の湿潤性を変更すること、（２）表面を官能化すること、つまり、表面官能基を提供する、修飾する、または置換すること、（３）表面を脱官能化すること、つまり、表面官能基を除去すること、（４）そうでなければ、例えばエッチングによって、表面の化学組成を変更すること、（５）表面粗さを増大または低減すること、（６）表面上にコーティング、例えば、表面の湿潤性とは異なる湿潤性を示すコーティングを提供すること、および／または（７）表面上に粒子を堆積させることを含む。
【０１２９】
いくつかの例では、表面の上部の化学層（接着促進剤と呼ばれる）の添加は、基質の表面の遺伝子座の構造化したパターン化を促進する。接着促進に適用される典型的な表面は、限定されないが、ガラス、シリコン、二酸化ケイ素、および窒化ケイ素を含む。いくつかの例では、接着促進剤は、高い表面エネルギーを有する化学物質である。いくつかの例では、基質の表面上に第２の化学層が堆積される。いくつかの例では、第２の化学層は、低い表面エネルギーを有している。いくつかの例では、表面上にコーティングされた化学層の表面エネルギーは、液滴の局在化を支持する。選択されるパターン化の配置によって、遺伝子座の接近および／または遺伝子座での流体接触の領域は変更可能である。
【０１３０】
いくつかの例では、例えば、ポリヌクレオチド合成のために、核酸または他の部分が堆積する装置表面または解明された（ｒｅｓｏｌｖｅｄ）遺伝子座は、滑らかであるか、実質的に平面であり（例えば、二次元）、あるいは隆起したまたは陥没した特徴（例えば、三次元の特徴）などの不規則性を有している。いくつかの例では、装置表面は、化合物の１つ以上の異なる層で修飾される。対象のそのような修飾層は、限定されないが、金属、金属酸化物、ポリマー、小さな有機分子などの無機層および有機層を含む。非限定的なポリマー層は、ペプチド、タンパク質、核酸またはそれらの模倣物（例えば、ペプチド核酸など）、多糖類、リン脂質、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンアミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、ポリアセテート、および本明細書に記載されるか、そうでなければ当該技術分野で知られている他の適切な化合物を含む。いくつかの例では、ポリマーはヘテロポリマーである。いくつかの例では、ポリマーはホモポリマーである。いくつかの例では、ポリマーは官能性部分を含むか、または共役される。
【０１３１】
いくつかの例では、装置の解明された遺伝子座は、表面エネルギーを増加および／または減少させる１つ以上の部分で官能化される。いくつかの例では、ある部分は化学的に不活性である。いくつかの例では、ある部分は、望ましい化学反応、例えば、ポリヌクレオチド合成反応における１つ以上のプロセスを支持するように構成される。表面の表面エネルギー、すなわち、疎水性は、表面に付着するヌクレオチドの親和性を決定するための因子である。いくつかの例では、装置の官能化のための方法は、（ａ）二酸化ケイ素を含む表面を有する装置を提供する工程；および、（ｂ）本明細書に記載されるか、さもなければ当該技術分野で知られている適切なシラン化剤、例えば、有機官能性アルコキシシラン分子を使用して、表面をシラン処理する工程を含む。
【０１３２】
いくつかの例では、有機官能性アルコキシシラン分子は、ジメチルクロロ−オクトデシル−シラン、メチルジクロロ−オクトデシル−シラン、トリクロロ−オクトデシル−シラン、トリメチル−オクトデシル−シラン、トリエチル−オクトデシル−シラン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの例では、装置の表面は、ポリエチレン／ポリプロピレン（ガンマ線照射またはクロム酸酸化、およびヒドロキシアルキル表面への還元によって官能化された）、高度に架橋されたポリスチレン−ジビニルベンゼン（クロロメチル化によって誘導体化され、ベンジルアミン官能面にアミノ化された）、ナイロン（末端のアミノヘキシル基は直接反応性である）で官能化されるか、または還元されたポリテトラフルオロエチレンでエッチングされる。他の方法および官能化剤は、米国特許第５，４７４，７９６号に記載され、これは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
いくつかの例では、装置の表面は、典型的には装置の表面上に存在する反応性の親水性部分を介して、装置の表面にシランを結合するのに有効な反応条件下で、シランの混合物を含む誘導体化組成物との接触によって官能化される。シラン処理は、一般に、自己組織化を介して有機官能性アルコキシシラン分子で表面を覆う。
【０１３４】
当該技術分野において現在知られているように、例えば、表面エネルギーを減少または増加させるための様々なシロキサン官能化試薬をさらに使用することができる。有機官能性アルコキシシランは、それらの有機官能に従って分類され得る。
【０１３５】
本明細書には、ヌクレオシドに結合することができる薬剤のパターン化を含み得る装置が提供される。いくつかの例では、装置は、活性剤でコーティングされてもよい。いくつかの例では、装置は、非活性剤（ｐａｓｓｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）でコーティングされてもよい。本明細書に記載されるコーティング材料への封入のための例示的な活性薬剤は、限定されないが、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド（ＨＡＰＳ）、１１−アセトキシウンデシルトリエトキシシラン、ｎ−デシルトリエトキシシラン、（３−アミノプロピル）トリメトキシシラン、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＯＰＳ）、３−ヨード−プロピルトリメトキシシラン、ブチル−アルデヒドロ−トリメトキシシラン、二量体の２級アミノアルキルシロキサン、（３−アミノプロピル）−ジエトキシ−メチルシラン、（３−アミノプロピル）−ジメチル−エトキシシラン、および、（３−アミノプロピル）−トリメトキシシラン、（３−グリシドキシプロピル）−ジメチル−エトキシシラン、グリシドキシ−トリメトキシシラン、（３−メルカプトプロピル）−トリメトキシシラン、３−４エポキシシクロヘキシル−エチルトリメトキシシラン、および、（３−メルカプトプロピル）−メチル−ジメトキシシラン、アリルトリクロロクロロシラン、７−オクタ−１−エニルトリクロロクロロシラン、あるいはビス（３−トリメトキシシリルプロピルアミンを含む。
【０１３６】
本明細書に記載されるコーティング材料に含まれる典型的な受動剤は、限定されないが、ペルフルオロオクチルトリクロロシラン；トリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチル）トリクロロシラン；１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−フルオロオクチルトリエトキシシラン（ＦＯＳ）；トリクロロ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ  −ペルフロオロオクチル）シラン；ｔｅｒｔ−ブチル−［５−フルオロ−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）インドール−１−イル］−ジメチル−シラン；ＣＹＴＯＰ（商標）；フロリナート（商標）；ペルフロオロオクチルトリクロロシラン（ＰＦＯＴＣＳ）；ペルフロオロオクチルジメチルクロロシラン（ＰＦＯＤＣＳ）；ペルフロオロデシルトリエトキシシラン（ＰＦＤＴＥＳ）；ペンタフルオロフェニル−ジメチルプロピルクロロ−シラン（ＰＦＰＴＥＳ）；ペルフロオロオクチルトリエトキシシラン；ペルフロオロオクチルトリメトキシシラン；オクチルクロロシラン；ジメチルクロロ−オクトデシル−シラン；メチルジクロロ−オクトデシル−シラン；トリクロロ−オクトデシル−シラン；トリメチル−オクトデシル−シラン；トリエチル−オクトデシル−シラン；または、オクタデシルトリクロロシランを含む。
【０１３７】
いくつかの例では、官能化剤は、オクタデシルトリクロロシランなどの炭化水素シランを含む。いくつかの例では、官能化剤は、１１−アセトキシウンデシルトリエトキシシラン、ｎ−デシルトリエトキシシラン、（３−アミノプロピル）トリメトキシシラン、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン、グリシジルオキシプロピル／トリメトキシシランおよびＮ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミドを含む。
【０１３８】
ポリヌクレオチド合成
【０１３９】
ポリヌクレオチド合成のための本開示の方法は、ホスホラミダイト化学作用を含むプロセスを含み得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチド合成は、塩基をホスホラミダイトと結合させることを含む。ポリヌクレオチド合成は、結合条件下でホスホラミダイトの堆積によって塩基を結合させることを含んでもよく、ここで、同じ塩基が随意に、１回を超えて、すなわち、二重の結合でホスホラミダイトと堆積される。ポリヌクレオチド合成は未反応部位のキャッピングを含んでもよい。いくつかの例では、キャッピングは随意である。ポリヌクレオチド合成は、酸化、または、酸化工程あるいは複数の酸化工程を含んでもよい。ポリヌクレオチド合成は、非ブロック化、脱トリチル化、および硫化を含んでもよい。いくつかの例では、ポリヌクレオチド合成は、酸化または硫化のいずれかを含む。いくつかの例では、ポリヌクレオチド合成反応中の１つまたは各々の工程間で、装置は、例えば、テトラゾールまたはアセトニトリルを使用して洗浄される。ホスホラミダイト合成方法における任意の１つの工程に対する時間枠は、約２分、１分、５０秒、４０秒、３０秒、２０秒、および１０秒未満であり得る。
【０１４０】
ホスホラミダイト方法を使用するポリヌクレオチド合成は、亜リン酸塩トリエステル結合の形成のために成長中のポリヌクレオチド鎖へのホスホラミダイト建築ブロック（例えば、ヌクレオシドホスホラミダイト）のその後の追加を含んでもよい。ホスホラミダイトポリヌクレオチド合成は、３’方向から５’方向に進む。ホスホラミダイトポリヌクレオチド合成は、１つの合成サイクル当たり、成長中の核酸鎖への１つのヌクレオチドの制御された追加を可能にする。いくつかの例では、各合成サイクルは結合工程を含む。ホスホラミダイト結合は、活性化されたヌクレオシドホスホラミダイトと、例えば、リンカーを介して基質に結合されたヌクレオシドとの間の亜リン酸塩トリエステル結合の形成を含む。いくつかの例では、ヌクレオシドホスホラミダイトは、起動された装置に提供される。いくつかの例では、ヌクレオシドホスホラミダイトは、アクチベーター（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）とともに装置に提供される。いくつかの例では、ヌクレオシドホスホラミダイトは、基質に結合したヌクレオシドよりも、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍、またはそれ以上の過剰量で、装置に提供される。いくつかの例では、ヌクレオシドホスホラミダイトの追加は、無水環境において、例えば、無水アセトニトリルにおいて実行される。ヌクレオシドホスホラミダイトの追加に続いて、装置は随意に洗浄される。いくつかの例では、結合工程は、随意に、基質へのヌクレオシドホスホラミダイトの追加間の洗浄工程とともに、１回以上追加して繰り返される。いくつかの例では、本明細書で使用されるポリヌクレオチド合成方法は、１、２、３、またはそれ以上の順次的な結合工程を含む。結合前に、多くの場合において、装置に結合されたヌクレオシドは、保護基の除去によって脱保護され、ここで、保護基は重合を防ぐように機能する。一般的な保護基は、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）である。
【０１４１】
結合の後、ホスホラミダイトポリヌクレオチド合成方法は、随意にキャッピング工程を含む。キャッピング工程では、成長中のポリヌクレオチドは、キャッピング剤で処置される。キャッピング工程は、さらなる鎖伸長からの結合後に未反応の基質に結合した５’−ＯＨ基をブロックするのに有用であり、これによって、内部塩基の欠失を伴うポリヌクレオチドの形成を防ぐ。さらに、１Ｈ−テトラゾールで活性化されたホスホラミダイトは、わずかな範囲で、グアノシンのＯ６位置と反応し得る。理論に縛られることなく、Ｉ２／水による酸化で、この副産物は、おそらくＯ６−Ｎ７遊走を介して、脱プリン化を受けることもある。脱プリン部位は、結局、ポリヌクレオチドの最終的な脱保護の間に切断され、したがって、完全長の産物の収率を低下させる。Ｏ６修飾は、Ｉ２／水での酸化前にキャッピング試薬による処置によって除去され得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチド合成の間にキャッピング工程を含めることで、キャッピングのない合成と比較して、エラー率は低下する。一例として、キャッピング工程は、無水酢酸と１−メチルイミダゾールとの混合物で、基質に結合したポリヌクレオチドを処置することを含む。キャッピング工程に続いて、装置は随意に洗浄される。
【０１４２】
いくつかの例では、ヌクレオシドホスホラミダイトの添加後に、および随意にキャッピングと１以上の洗浄工程後に、装置に結合した成長中の核酸は酸化される。酸化工程は、亜リン酸塩トリエステルが、自然発生のリン酸ジエステルのヌクレオシド間の結合の保護された前駆体である、四配位リン酸塩トリエステルへと酸化される。いくつかの例では、成長中のポリヌクレオチドの酸化は、随意に弱塩基（例えば、ピリジン、ルチジン、コリジン）の存在下で、ヨウ素および水による処置によって達成される。酸化は、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドまたは（１Ｓ）−（＋）−（１０−カンファースルホニル）−オキサジリジン（ＣＳＯ）を使用して、無水条件下で実行され得る。いくつかの方法では、キャッピング工程は、酸化に続いて実行される。持続し得る酸化からの残留水が続く結合を阻害することができるため、第２のキャッピング工程は装置の乾燥を可能にする。酸化後に、装置と成長中のポリヌクレオチドは、随意に洗浄される。いくつかの例では、酸化の工程は、ポリヌクレオチドホスホロチオエートを得る硫化工程に置き換えられ、ここで、キャッピング工程は硫化後に実行され得る。限定されないが、３−（ジメチルアミノメチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン、ＤＤＴＴ、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬としても知られている）、およびＮ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）を含む多くの試薬が、効率的な硫黄移動を行うことができる。
【０１４３】
ヌクレオシド取り込みのその後のサイクルが結合を介して生じるようにするために、装置に結合した成長中のポリヌクレオチドの保護された５’末端は除去され、一次ヒドロキシル基が次のヌクレオシドホスホラミダイトと反応する。いくつかの例では、保護基はＤＭＴであり、非ブロック化が、ジクロロメタン中でトリクロロ酢酸とともに生じる。長時間にわたる、または推奨された酸の溶液よりも強力な脱トリチル化を行うことで、固体支持体に結合したポリヌクレオチドの脱プリン化を増大させ、ゆえに、望ましい完全長の産物の収率を低下させることがある。本明細書に記載される本開示の方法および組成物は、望ましくない脱プリン化反応を制限する制御された非ブロック化条件を提供する。いくつかの例では、装置に結合したポリヌクレオチドは、非ブロック化後に洗浄される。いくつかの例では、非ブロック化後の効率的な洗浄は、低いエラー率を有する合成されたポリヌクレオチドに寄与する。
【０１４４】
ポリヌクレオチドの合成のための方法は、典型的には以下の工程の一連の繰り返し（ｉｔｅｒａｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む：活性化された表面、リンカー、または以前に脱保護された単量体と結合するために、保護された単量体の活発に官能化された表面（例えば、遺伝子座）への適用；後に適用される保護された単量体と反応するような、適用された単量体の脱保護；および、結合のための別の保護された単量体の適用。１以上の中間工程は、酸化または硫化を含む。いくつかの例では、１以上の洗浄工程は、工程の１つまたはすべてに先行するかまたはその後に続く。
【０１４５】
ホスホラミダイトベースのポリヌクレオチド合成のための方法は、一連の化学的な工程を含む。いくつかの例では、合成方法の１以上の工程は、試薬のサイクリングを含み、ここで、方法の１以上の工程は、工程に有用な試薬の装置への適用を含む。例えば、試薬は、一連の液体堆積および真空乾燥の工程によって循環させられる。ウェル、マイクロウェル、チャネルなどの三次元の特徴を含む基質のために、試薬は、随意にウェルおよび／またはチャネルを介して装置の１つ以上の領域を通過する。
【０１４６】
本明細書に記載される方法およびシステムは、ポリヌクレオチドの合成のためのポリヌクレオチド合成装置に関する。合成は並行して行われ得る。例えば、少なくともまたは少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１００００、５００００、７５０００、１０００００、またはそれ以上のポリヌクレオチドが並行して合成可能である。並行して合成され得るポリヌクレオチドの総数は、２−１０００００、３−５００００、４−１００００、５−１０００、６−９００、７−８５０、８−８００、９−７５０、１０−７００、１１−６５０、１２−６００、１３−５５０、１４−５００、１５−４５０、１６−４００、１７−３５０、１８−３００、１９−２５０、２０−２００、２１−１５０、２２−１００、２３−５０、２４−４５、２５−４０、３０−３５の間であり得る。当業者は、並行して合成されたポリヌクレオチドの総数が、これらの値のいずれかによって制約される任意の範囲内（例えば、２５−１００）に含まれ得ることを認識する。並行して合成されたポリヌクレオチドの総数は、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲内に含まれ得る。装置内で合成されたポリヌクレオチドの総モル質量またはポリヌクレオチドの各々のモル質量は、少なくともまたは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２５０００、５００００、７５０００、１０００００ピコモル、またはそれ以上であり得る。装置内のポリヌクレオチドの各々の長さまたはポリヌクレオチドの平均長は、少なくともまたは少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００ヌクレオチド、またはそれ以上であり得る。装置内のポリヌクレオチドの各々の長さまたはポリヌクレオチドの平均長は、長くてもまたは長くても約５００、４００、３００、２００、１５０、１００、５０、４５、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０ヌクレオチド、またはそれ以下であり得る。装置内のポリヌクレオチドの各々の長さまたはポリヌクレオチドの平均長は、１０−５００、９−４００、１１−３００、１２−２００、１３−１５０、１４−１００、１５−５０、１６−４５、１７−４０、１８−３５、１９−２５の間であり得る。当業者は、装置内のポリヌクレオチドの各々の長さまたはポリヌクレオチドの平均長が、これらの値のいずれかによって制約される任意の範囲内（例えば、１００−３００）に含まれ得ることを認識する。装置内のポリヌクレオチドの各々の長さまたはポリヌクレオチドの平均長は、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲内に含まれ得る。
【０１４７】
本明細書で提供される表面上のポリヌクレオチド合成のための方法は、高速での合成を可能にする。一例として、１時間につき少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５  ５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００のヌクレオチド、またはそれ以上が合成される。ヌクレオチドは、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウリジンの構築ブロック、またはそれらのアナログ／修飾バージョンを含む。いくつかの例において、ポリヌクレオチドのライブラリーは基質上で並行して合成される。例えば、約または少なくとも約１００；１，０００；１０，０００；３０，０００；７５，０００；１００，０００；１，０００，０００；２，０００，０００；３，０００，０００；４，０００，０００；または５，０００，０００の解明された遺伝子座を含む装置は、少なくとも同じ数の別個のポリヌクレオチドの合成を支援することができ、ここで、別個の配列をコードするポリヌクレオチドは解明された遺伝子座で合成される。いくつかの例において、ポリヌクレオチドのライブラリーは、約３か月、２か月、１か月、３週、１５日、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日、２４時間未満で、本明細書に記載される低いエラー率で装置上に合成される。いくつかの例では、本明細書に記載される基質および方法を用いて低いエラー率で合成されるポリヌクレオチドライブラリーから組み立てられる大きな核酸は、約３か月、２か月、１か月、３週、１５日、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日、２４時間未満で調製される。
【０１４８】
いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、複数のコドン部位にて異なる変異体ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのライブラリーの生成をもたらす。いくつかの例において、ポリヌクレオチドは、１つの部位、２つの部位、３つの部位、４つの部位、５つの部位、６つの部位、７つの部位、８つの部位、９つの部位、１０の部位、１１の部位、１２の部位、１３の部位、１４の部位、１５の部位、１６の部位、１７の部位、１８の部位、１９の部位、２０の部位、３０の部位、４０の部位、５０の部位、またはそれ以上の部位の変異体コドン部位を有し得る。
【０１４９】
いくつかの例において、変異体コドン部位の１以上の部位は隣接することがある。変異体コドン部位の１以上の部位は、隣接せず、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のコドンにより分離され得る。
【０１５０】
いくつかの例において、ポリヌクレオチドは変異体コドン部位の複数の部位を含むことがあり、ここで、変異体コドン部位は互いに隣接しており、変異体コドン部位の伸長部を形成する。いくつかの例において、ポリヌクレオチドは変異体コドン部位の複数の部位を含み得、ここで、変異体コドン部位は互いに隣接していない。いくつかの例において、ポリヌクレオチドは変異体コドン部位の複数の部位を含み得、ここで、変異体コドン部位は互いに隣接しており、変異体コドン部位の伸長部を形成し、変異体コドン部位の一部は互いに隣接していない。
【０１５１】
図面を参照すると、図１１は、より短いポリヌクレオチドからの核酸（例えば、遺伝子）の合成のための例示的なプロセスのワークフローを示す。ワークフローは通常、以下の段階に分けられる：（１）一本鎖ポリヌクレオチドライブラリーのデノボ合成、（２）より大きな断片を形成するためのポリヌクレオチドの結合、（３）エラー補正、（４）品質管理、および（５）輸送。デノボ合成の前に、意図した核酸配列または核酸配列の群が、あらかじめ選択される。例えば、遺伝子の群が生成のためにあらかじめ選択される。
【０１５２】
いったん、生成される大きなポリヌクレオチドが選択されると、ポリヌクレオチドのあらかじめ決められたライブラリーがデノボ合成のために設計される。高密度のポリヌクレオチドアレイを生成するための様々な適切な方法が知られている。ワークフローの例において、装置の表層（１１０１）が提供される。この例において、表面の化学的性質（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）は、ポリヌクレオチド合成プロセスを改善するために変えられる。低い表面エネルギーの領域が液体を弾くために生成され、一方で高い表面エネルギーの領域が液体を引き付けるために生成される。表面自体は平坦な表面の形であるか、または、表面積を増加させる突起またはマイクロウェルなどの形状の変形を含み得る。ワークフローの例において、全体において参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開ＷＯ／２０１５／０２１０８０で開示されるように、選択された高い表面エネルギー分子は、ＤＮＡの化学的性質を支援する二重の機能を果たす。
【０１５３】
ポリヌクレオチドアレイのインサイツの調製は、固体支持体上で生成され、並行して複数のオリゴマーを伸長させるために単一のヌクレオチド伸長プロセスを利用する。ポリヌクレオチドシンセサイザーなどの材料堆積装置は、段階的な様式で試薬を放出するように設計され、その結果、複数の核酸が並行して一度に１つの残基を伸長させ、それによりあらかじめ決められたポリヌクレオチド配列（１１０２）を持つオリゴマーを生成する。いくつかの例において、ポリヌクレオチドはこの段階で表面から切断される。切断は、例えば、アンモニアまたはメチルアミンによる気相切断（ｇａｓ  ｃｌｅａｖａｇｅ）を含む。
【０１５４】
生成されたポリヌクレオチドライブラリーは反応チャンバに配される。この例示的なワークフローにおいて、反応チャンバ（「ナノリアクター」とも呼ばれる）は、シリコンでコーティングされたウェルであり、ＰＣＲ試薬を含み、ポリヌクレオチドライブラリー（１１０３）に降ろされる。ポリヌクレオチドの密閉（１１０４）の前または後に、試薬を加えて、基質からポリヌクレオチドを放出させる。例示的なワークフローにおいて、ポリヌクレオチドは、ナノリアクターの密閉後に放出される（１１０５）。いったん放出されると、一本鎖ポリヌクレオチドの断片は、ＤＮＡの完全長範囲の配列に広がるためにハイブリダイズする。合成されたポリヌクレオチドがそれぞれ、集団中の少なくとも１つの他のポリヌクレオチドと重なる小さな部分を持つように設計されるため、部分的なハイブリダイゼーション（１１０５）が可能である。
【０１５５】
ハイブリダイゼーション後、ＰＣＲ反応が始まる。ポリメラーゼサイクル中、ポリヌクレオチドは相補的断片にアニーリングされ、ギャップはポリメラーゼにより満たされる。各サイクルは、どのポリヌクレオチドが互いに見出されるかにランダムに依存して、様々な断片の長さを増加させる。断片間の相補性は、完全な大きなスパンの二本鎖ＤＮＡの形成を可能にする（１１０６）。
【０１５６】
ＰＣＲが完了した後、ナノリアクターは装置から分離され（１１０７）、ＰＣＲのためのプライマーを有する装置との相互作用のために位置付けられる（１１０８）。密閉後、ナノリアクターはＰＣＲにかけられ（１１０９）、より大きな核酸が増幅される。ＰＣＲ（１１１０）の後、ナノチャンバが開放され（１１１１）、エラー補正試薬が加えられ（１１１２）、チャンバは密封され（１１１３）、エラー補正反応が生じて、二本鎖ＰＣＲ増幅生成物からの相補性が乏しいミスマッチ塩基対および／または鎖を取り除く（１１１４）。ナノリアクターが開放および分離される（１１１５）。エラーを補正した生成物は次に、ＰＣＲおよび分子バーコーディングなどの付加的な処理工程にさらされ、その後輸送（１１２３）のために包装される（１１２２）。
【０１５７】
いくつかの例において、品質管理措置が取られる。エラー補正の後、品質管理工程は、例えば、エラーを補正した生成物の増幅のための配列決定プライマーを有するウェハとの相互作用（１１１６）、エラーを補正した増幅生成物を含むチャンバにウェハを密封すること（１１１７）、および、さらなる回数の増幅を行うこと（１１１８）を含む。ナノリアクターは開放され（１１１９）、生成物はプールされ（１１２０）、配列決定される（１１２１）。許容可能な品質管理の決定が行われた後、包装された生成物（１１２２）は輸送（１１２３）を承認される。
【０１５８】
いくつかの例において、図１１のものなどのワークフローによって生成される核酸は、本明細書に開示される重複プライマーを使用した突然変異誘発にさらされる。いくつかの例において、プライマーのライブラリーは、固体支持体上でインサイツの調製により生成され、並行して複数のオリゴマーを伸長させるための単一のヌクレオチド伸長プロセスを利用する。ポリヌクレオチドシンセサイザーなどの堆積装置は、段階的な様式で試薬を放出するように設計され、複数のポリヌクレオチドが並行して、一度に１つの残基を伸長させ、それによりあらかじめ決められた核酸配列を有するオリゴマーを生成する（１１０２）。
【０１５９】
低いエラー率を有する大きなポリヌクレオチドライブラリー
【０１６０】
提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリー内で合成されたポリヌクレオチドの平均エラー率は、１０００中で１未満、１２５０中で１未満、１５００中で１未満、２０００中で１未満で、３０００中で１未満であるか、またはそれよりも頻度は低い。いくつかの例では、提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリー内で合成されたポリヌクレオチドの平均エラー率は、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／１１００、１／１２００、１／１２５０、１／１３００、１／１４００、１／１５００、１／１６００、１／１７００、１／１８００、１／１９００、１／２０００、１／３０００未満であるか、またはそれよりも低い。いくつかの例では、提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリー内で合成されたポリヌクレオチドの平均エラー率は、１／１０００未満である。
【０１６１】
いくつかの例では、提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリー内で合成されたポリヌクレオチドの総エラー率は、あらかじめ定められた配列と比較して、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／１１００、１／１２００、１／１２５０、１／１３００、１／１４００、１／１５００、１／１６００、１／１７００、１／１８００、１／１９００、１／２０００、１／３０００未満であるか、またはそれよりも低い。いくつかの例では、提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリー内で合成されたポリヌクレオチドに対する総エラー率は、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、または１／１０００未満である。いくつかの例では、提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリー内で合成されたポリヌクレオチドの総エラー率は、１／１０００未満である。
【０１６２】
いくつかの例では、エラー補正酵素は、使用することができる提供された方法およびシステムを使用してライブラリー内で合成されたポリヌクレオチドに使用され得る。いくつかの例では、エラー補正を伴うポリヌクレオチドの総エラー率は、あらかじめ定められた配列と比較して、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／１１００、１／１２００、１／１３００、１／１４００、１／１５００、１／１６００、１／１７００、１／１８００、１／１９００、１／２０００、１／３０００未満、またはそれ以下であり得る。いくつかの例では、提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリー内で合成されたポリヌクレオチドのエラー補正を伴う総エラー率は、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、または１／１０００未満であり得る。いくつかの例では、提供されるシステムおよび方法を使用してライブラリー内で合成されたポリヌクレオチドのエラー補正を伴う総エラー率は、１／１０００未満であり得る。
【０１６３】
エラー率は、遺伝子変異体のライブラリーの産生のための遺伝子合成の値を制限することがある。１／３００のエラー率では、１５００の塩基対遺伝子におけるクローンの約０．７％が正しくなる。ポリヌクレオチド合成からのエラーのほとんどが、フレームシフト突然変異をもたらすことになるため、こうしたライブラリー中のクローンの９９％以上が、完全長タンパク質を生成しない。エラー率を７５％低下させることによって、正しいクローンの画分は４０倍増加する。本開示の方法および組成物は、超並列および時間効率の良い方法で可能になる合成の質の改善とエラー補正方法の適用性の両方のおかげで、一般に観察される遺伝子合成方法よりも低いエラー率での大きなポリヌクレオチドと遺伝子のライブラリーの迅速なデノボ合成を可能にする。したがって、ライブラリーは、ライブラリー全体にわたって、またはライブラリーの８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％  ９９％  ９９．５％  ９９．８％  ９９．９％  ９９．９５％  ９９．９８％  ９９．９９％、またはそれ以上にわたって、塩基の挿入、欠失、置換を伴って、または１／３００、１／４００、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／１２５０、１／１５００、１／２０００、１／２５００、１／３０００、１／４０００、１／５０００、１／６０００、１／７０００、１／８０００、１／９０００、１／１００００、１／１２０００、１／１５０００、１／２００００、１／２５０００、１／３００００、１／４００００、１／５００００、１／６００００、１／７００００、１／８００００、１／９００００、１／１０００００、１／１２５０００、１／１５００００、１／２０００００、１／３０００００、１／４０００００、１／５０００００、１／６０００００、１／７０００００、１／８０００００、１／９０００００、１／１００００００未満、あるいはそれ以下である合計のエラー率で合成され得る。本開示の方法および組成物はさらに、あらかじめ決められた／あらかじめ選択された配列と比較して、エラーのない配列に関連するライブラリーの少なくともサブセットにおいて、ポリヌクレオチドまたは遺伝子の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、９９．９９％、またはそれ以上に関連付けられる低いエラー率での大規模な合成オリゴヌクレオチドおよび遺伝子のライブラリーに関する。いくつかの例では、ライブラリー内の単離した量でのポリヌクレオチドまたは遺伝子の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、９９．９９％、またはそれ以上は、同じ配列を有している。いくつかの例では、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、またはそれ以上の類似性または同一性に関連する、ポリヌクレオチドまたは遺伝子の少なくとも３���％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、９９．９９％、またはそれ以上は、同じ配列を有している。いくつかの例では、ポリヌクレオチドまたは遺伝子上の指定された遺伝子座に関連するエラー率は、最適化される。したがって、大規模なライブラリーの一部としての１つ以上のポリヌクレオチドまたは遺伝子の複数の選択された遺伝子座の所定の遺伝子座はそれぞれ、１／３００、１／４００、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／１２５０、１／１５００、１／２０００、１／２５００、１／３０００、１／４０００、１／５０００、１／６０００、１／７０００、１／８０００、１／９０００、１／１００００、１／１２０００、１／１５０００、１／２００００、１／２５０００、１／３００００、１／４００００、１／５００００、１／６００００、１／７００００、１／８００００、１／９００００、１／１０００００、１／１２５０００、１／１５００００、１／２０００００、１／３０００００、１／４０００００、１／５０００００、１／６０００００、１／７０００００、１／８０００００、１／９０００００、１／１００００００未満、またはそれより低いエラー率を有し得る。様々な例では、そのようなエラーを最適化した遺伝子座は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、３００００、５００００、７５０００、１０００００、５０００００、１００００００、２００００００、３００００００、またはそれ以上の遺伝子座を含み得る。エラーを最適化した遺伝子座は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、３００００、７５０００、１０００００、５０００００、１００００００、２００００００、３００００００、またはそれ以上のポリヌクレオチドまたは遺伝子に分布され得る。
【０１６４】
エラー率は、エラー補正を伴ってまたは伴わずに達成され得る。エラー率は、ライブラリー全体にわたって、またはライブラリーの８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、９９．９９％、またはそれ以上にわたって達成され得る。
【０１６５】
コンピュータシステム
【０１６６】
本明細書に記載されるシステムのいずれかがコンピュータに操作可能に接続され、局所的にまたは遠隔的にコンピュータを介して自動化され得る。様々な例において、本開示の方法およびシステムはさらに、コンピュータシステム上にソフトウェアプログラム、およびその使用を含み得る。従って、材料堆積装置の動作、分配行為、および減圧の作動を編成および同期するなど、機能の分配／減圧／再充填の同期のためのコンピュータ制御は、本開示の範囲内である。コンピュータシステムは、ユーザーに指定された塩基配列と材料堆積装置の位置との間に干渉するようにプログラムされ、基質の指定された領域に正しい試薬を送達する。
【０１６７】
図１２で例証されるコンピュータシステム（１２００）は、媒体（１２１１）および／またはネットワークポート（１２０５）（固定された媒体（１２１２）を有するサーバー（１２０９）に随意に接続可能）からの命令を読み取ることができる論理的な装置として理解され得る。図１２に示されるものなどのシステムは、ＣＰＵ（１２０１）、ディスクドライブ（１２０３）、キーボード（１２１５）および／またはマウス（１２１６）などの随意の入力装置、および随意のモニター（１２０７）を含み得る。データ通信は指示された通信媒体を介して局所位置または遠隔位置のサーバーまで達成され得る。通信媒体は、データを送信および／または受信する任意の手段を含み得る。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、無線接続、またはインターネット接続であり得る。そのような接続は、ワールド・ワイド・ウェブ上での通信を提供することができる。本開示に関するデータは、図１２に例示されるように当事者（１２２２）による受理および／または検討のためにそのようなネットワークまたは接続によって伝達され得ることが想定される。
【０１６８】
図１３は、本開示の例と関連して使用可能なコンピュータシステム（１３００）の第１の例のアーキテクチャを示すブロック図である。図１３に表されるように、例示的なコンピュータシステムは、命令を処理するためのプロセッサ（１３０２）を含み得る。プロセッサの非限定的な例は、以下を含む：Ｉｎｔｅｌ  Ｘｅｏｎ（商標）プロセッサ、ＡＭＤ  Ｏｐｔｅｒｏｎ（商標）プロセッサ、Ｓａｍｓｕｎｇ  ３２−ｂｉｔ  ＲＩＳＣ  ＡＲＭ  １１７６ＪＺ（Ｆ）−Ｓ  ｖ１．０（商標）プロセッサ、ＡＲＭ  Ｃｏｒｔｅｘ−Ａ８  Ｓａｍｓｕｎｇ  Ｓ５ＰＣ１００（商標）プロセッサ、ＡＲＭ  Ｃｏｒｔｅｘ−Ａ８  Ａｐｐｌｅ  Ａ４（商標）プロセッサ、Ｍａｒｖｅｌｌ  ＰＸＡ  ９３０（商標）プロセッサ、または機能的に同等なプロセッサ。実行の複数のスレッドが並列処理に使用可能である。いくつかの例において、複数のプロセッサ、または複数のコアを持つプロセッサも、単一のコンピュータシステム中であろうと、クラスターの中であろうと、または、複数のコンピュータ、携帯電話、および／または個人用携帯情報端末装置を含むネットワーク上のシステムにわたって分布されても、使用可能である。
【０１６９】
図１３に示されるように、高速キャッシュ（１３０４）は、プロセッサ（１３０２）に接続するか、または組み込まれることで、プロセッサ（１３０２）により近年使用されてきたまたは頻繁に使用されている命令またはデータのための高速メモリを提供することができる。プロセッサ（１３０２）は、プロセッサバス（１３０８）によりノースブリッジ（１３０６）に接続される。ノースブリッジ（１３０６）は、メモリバス（１３１２）によりランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）（１３１０）に接続され、プロセッサ（１３０２）によりＲＡＭ（１３１０）へのアクセスを管理する。ノースブリッジ（１３０６）は、チップセットバス（１３１６）によりサウスブリッジ（１３１４）にも接続される。サウスブリッジ（１３１４）は次に、周辺バス（１３１８）に接続される。周辺バスは、例えば、ＰＣＩ、ＰＣＩ−Ｘ、ＰＣＩ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、または他の周辺バスであり得る。ノースブリッジおよびサウスブリッジはしばしば、プロセッサチップセットと称され、周辺バス（１３１８）上でプロセッサと、ＲＡＭと、周辺コンポーネントとの間のデータ転送を管理する。いくつかの代替的なアーキテクチャにおいて、ノースブリッジの機能性は、別個のノースブリッジチップを使用する代わりにプロセッサに組み込まれ得る。いくつかの例においては、システム（１３００）は、周辺バス（１３１８）に取り付けられたアクセラレータカード（１３２２）を含み得る。アクセラレータは、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）または特定の処理を促進するための他のハードウェアを含み得る。例えば、アクセラレータは、適応データの再構成のために、または拡張された設定処理に使用される代数式を評価するために使用され得る。
【０１７０】
ソフトウェアとデータは、外部記憶装置（１３２４）に記憶され、プロセッサにより使用されるＲＡＭ（１３１０）および／またはキャッシュ（１３０４）へとロードされ得る。システム（１３００）は、システムリソースの管理のためのオペレーティングシステムを含み；オペレーティングシステムの非限定的な例は、以下を含む：Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（商標）、ＭＡＣＯＳ（商標）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ  ＯＳ（商標）、ｉＯＳ（商標）、および他の機能的に同等なＯＳ、同様に、本開示の例に従ってデータの記憶と最適化を管理するためのオペレーティングシステム上で実行するアプリケーションソフトウェア。この例において、システム（１３００）はさらに、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）などの外部記憶装置、および分散並列処理に使用され得る他のコンピュータシステムにネットワークインターフェースを提供するために、周辺バスに接続されるネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）（１３２０）および（１３２１）を含む。
【０１７１】
図１４は、複数のコンピュータシステム（１４０２ａ）および（１４０２ｂ）、複数の携帯電話および個人用携帯情報端末（１４０２ｃ）、ならびにネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（１４０４ａ）および（１４０４ｂ）を備えたネットワーク（１４００）を示す略図である。例において、システム（１４０２ａ）、（１４０２ｂ）、および（１４０２ｃ）は、データ記憶を管理し、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（１４０４ａ）および（１４０４ｂ）に記憶されたデータに対するデータアクセスを最適化することができる。数学モデルはこのデータに対して使用可能であり、コンピュータシステム（１４０２ａ）および（１４０２ｂ）、ならびに携帯電話および個人用携帯情報端末システム（１４０２ｃ）にわたって分散並列処理を使用して評価可能である。コンピュータシステム（１４０２ａ）および（１４０２ｂ）、ならびに携帯電話および個人用携帯情報端末システム（１４０２ｃ）は、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（１４０４ａ）および（１４０４ｂ）に記憶されたデータの適応データ再構築に対して並列処理を提供することもできる。図１４は一例のみを示しており、様々な他のコンピュータのアーキテクチャおよびシステムは、本開示の様々な例と共に使用され得る。例えば、ブレードサーバーは並列処理を提供するために使用され得る。プロセッサブレードは、並列処理を提供するためにバックプレーンを介して接続可能である。ストレージも、バックプレーンに接続され得るか、または別のネットワークインターフェースを介してネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）として接続可能である。いくつかの例において、プロセッサは、別個のメモリ空間を維持し、ネットワークインターフェース、バックプレーン、または他のプロセッサによる並列処理のための他のコネクターを通じてデータを伝達することができる。他の例において、プロセッサのいくつかまたはすべてが、共有仮想アドレスメモリ空間を使用することができる。
【０１７２】
図１５は、例に従って共有仮想アドレスメモリ空間を使用するマルチプロセッサコンピュータシステム（１５００）のブロック図である。上記システムは、共有メモリサブシステム（１５０４）にアクセス可能な複数のプロセッサ（１５０２ａ−ｆ）を含む。上記システムは、メモリサブシステム（１５０４）に複数のプログラマブルハードウェアのメモリアルゴリズムプロセッサ（ＭＡＰ）（１５０６ａ−ｆ）を組み込む。各ＭＡＰ（１５０６ａ−ｆ）は、メモリ（１５０８ａ−ｆ）および１以上のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）（１５１０ａ−ｆ）を含み得る。ＭＡＰは設定可能な機能ユニットを提供し、特定のアルゴリズムまたはアルゴリズムの一部は、各プロセッサと密接に協働して処理を行うためにＦＰＧＡ（１５１０ａ−ｆ）に提供され得る。例えば、ＭＡＰは、データモデルに関する代数式を評価し、かつ例における適応性のあるデータの再構築を行なうために使用され得る。この例において、ＭＡＰは各々、このような目的のためのプロセッサすべてにより世界中からアクセス可能である。１つの構成において、各ＭＡＰは、関連するメモリ（１５０８ａ−ｆ）にアクセスするためにダイレクトメモリアクセス（ＤＭＡ）を使用することができ、それにより、各マイクロプロセッサ（１５０２ａ−ｆ）とは別個に、かつこれらから非同期的にタスクを実行することが可能となる。この構成において、ＭＡＰは、アルゴリズムのパイプライン処理（ｐｉｐｅｌｉｎｉｎｇ）および並列実行のために別のＭＡＰに直接結果を供給することができる。
【０１７３】
上記のコンピュータのアーキテクチャおよびシステムは単なる例に過ぎず、様々な他のコンピュータ、携帯電話、および、個人用携帯情報端末のアーキテクチャおよびシステムは、一般的なプロセッサ、コプロセッサ、ＦＰＧＡ、および他のプログラム可能論理回路の任意の組み合わせを使用するシステム、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、および他の処理要素と論理素子を含む例と共に使用可能である。いくつかの例において、コンピュータシステムのすべてまたは一部は、ソフトウェアまたはハードウェアに実装され得る。様々なデータ記憶媒体が、例えばランダムアクセスメモリ、ハードドライブ、フラッシュメモリ、テープドライブ、ディスクアレイ、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）、および他のローカルまたは分散データ記憶装置およびシステムを含む例と共に使用され得る。
【０１７４】
例において、コンピュータシステムは、上記のまたは他のコンピュータのアーキテクチャおよびシステムのいずれかで実行されるソフトウェアモジュールを使用して実施可能である。他の例において、システムの機能は、ファームウェア、図１５で言及されるようなフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）などのプログラム可能論理回路、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、または他の処理要素および論理素子において部分的または完全に実装され得る。例えば、セットプロセッサおよびオプティマイザは、図１３に示されるアクセラレータカード（１３２２）などのハードウェアアクセラレータカードの使用によるハードウェアアクセラレーションで実施され得る。
【０１７５】
実施形態
【０１７６】
ポリヌクレオチドライブラリーが本明細書で提供され、ポリヌクレオチドライブラリーは：少なくとも３００００のポリヌクレオチドを含む第１のポリヌクレオチドライブラリーであって、少なくとも３０，０００のポリヌクレオチドの各々は、ゲノム断片によるハイブリダイゼーションとハイブリダイズされたゲノム断片の配列決定の後で、ポリヌクレオチドライブラリーが、ハイブリダイズされたゲノム断片の第１のセットの塩基の少なくとも８０パーセントの少なくとも２５倍のリード深度と少なくとも４０倍の平均リード深度を提供するような量で存在する、第１のポリヌクレオチドライブラリーと；および、少なくとも１５００のポリヌクレオチドを含む第２のポリヌクレオチドライブラリーであって、少なくとも１，５００のポリヌクレオチドの各々は、ゲノム断片によるハイブリダイゼーションとハイブリダイズされたゲノム断片の配列決定の後で、ポリヌクレオチドライブラリーが、ハイブリダイズされたゲノム断片の第２のセットの塩基の少なくとも８０パーセントの少なくとも１５倍のリード深度と少なくとも２４倍の平均リード深度を提供するような量で存在する、第２のポリヌクレオチドライブラリーと、を含む。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１００，０００のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、第２のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも５，０００のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１００，０００のポリヌクレオチドを含み、および、第２のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも５，０００のポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが、ハイブリダイズされたゲノム断片の第１のセットの塩基の少なくとも９０パーセントの少なくとも２５倍のリード深度と少なくとも４０倍の平均リード深度を提供する、ポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが、ハイブリダイズされたゲノム断片の第１のセットの塩基の少なくとも８０パーセントの少なくとも４０倍のリード深度と少なくとも５０倍の平均リード深度を提供する、ポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、第２のポリヌクレオチドライブラリーが、ハイブリダイズされたゲノム断片の第２のセットの塩基の少なくとも９０パーセントの少なくとも１５倍のリード深度と少なくとも２４倍の平均リード深度を提供する、ポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、第２のポリヌクレオチドライブラリーが、ハイブリダイズされたゲノム断片の第２のセットの塩基の少なくとも８０パーセントの少なくとも２０倍のリード深度と少なくとも３０倍の平均リード深度を提供する、ポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、配列決定された塩基の少なくとも９０％が少なくとも９９．５％正確である、ポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、配列決定された塩基の少なくとも９０％が少なくとも９９．９％正確である、ポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、配列決定された塩基の少なくとも９０％が少なくとも９９．９５％正確である、ポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ゲノム断片の各々が約１００塩基から約５００塩基の長さである、ポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、少なくとも３００００のポリヌクレオチドが少なくとも１０００の遺伝子をコードする、ポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、少なくとも３００００のポリヌクレオチドが少なくとも１つのエクソン配列をコードする、ポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、少なくとも１５００のポリヌクレオチドが少なくとも１つのエクソン配列をコードする、ポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、少なくとも１５００のポリヌクレオチドが少なくとも１０の遺伝子をコードする、ポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、少なくとも１５００のポリヌクレオチドが少なくとも１００の遺伝子をコードする、ポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、少なくとも１５００のポリヌクレオチドが少なくとも１つのイントロンをコードする、ポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、少なくとも１５００のポリヌクレオチドが少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）をコードする、ポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、一塩基多型（ＳＮＰ）がヘテロ接合である、ポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。
【０１７７】
本明細書には、ゲノムＤＮＡを配列決定するための方法が提供され、上記方法は：本明細書に記載されるポリヌクレオチドライブラリーの第１のポリヌクレオチドライブラリーと第２のポリヌクレオチドライブラリーを、複数のゲノム断片に接触させる工程；少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを生成するために、第１のポリヌクレオチドライブラリーまたは第２のポリヌクレオチドライブラリーに結合する少なくとも１つのゲノム断片を富化する工程；および、少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを配列決定する工程を含む。
【０１７８】
本明細書には、ゲノムＤＮＡを配列決定するための方法が提供され、上記方法は：本明細書に記載されるポリヌクレオチドライブラリーの第１のポリヌクレオチドライブラリーを含む組成物を、複数のゲノム断片に接触させる工程；少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを生成するために、第１のポリヌクレオチドライブラリーに結合する少なくとも１つのゲノム断片を富化する工程；少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを配列決定する工程；平均未満のリード深度を有する少なくとも１つの富化されたポリヌクレオチドの１つ以上の位置を特定する工程；工程ａ−ｃを繰り返す工程であって、本明細書に記載されるポリヌクレオチドライブラリーの第２のポリヌクレオチドライブラリーが組成物に添加され、第２のポリヌクレオチドライブラリーが、平均未満のリード深度を有する１つ以上の位置を含むゲノム断片に結合する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、第２のポリヌクレオチドライブラリーの存在が、平均未満のリード深度を有する１つ以上の位置でリード深度を増加させる、工程、を含む。第１のポリヌクレオチドライブラリーと第２のポリヌクレオチドライブラリーが任意の共通配列を含まない方法が本明細書でさらに提供される。第１のポリヌクレオチドライブラリーと第２のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１つの共通配列を含まない方法が本明細書でさらに提供される。第２のポリヌクレオチドライブラリーの存在が、平均未満のリード深度を有する少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドの１つ以上の位置のリード深度を少なくとも１０倍増加させる方法が、本明細書でさらに提供される。第２のポリヌクレオチドライブラリーの存在が、平均未満のリード深度を有する少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドの１つ以上の位置のリード深度を少なくとも１００倍増加させる方法が、本明細書でさらに提供される。
【０１７９】
少なくとも１５００のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーが本明細書で提供され、ここで、すべてよりも少ないポリヌクレオチドが分子タグを含み、ここで、少なくとも５，０００のポリヌクレオチドの各々は、ゲノム断片によるハイブリダイゼーションとハイブリダイズされたゲノム断片の配列決定の後で、ポリヌクレオチドライブラリーが、リードの総数がハイブリダイズされたゲノム断片の塩基の総数の５５倍以下となる条件下で、ハイブリダイズされたゲノム断片の塩基の少なくとも９０パーセントの少なくとも３０倍のリード深度を提供する、ような量で存在する。さらに、ポリヌクレオチドの９０％以下が分子タグを含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチドの８０％以下が分子タグを含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチドの５０％以下が分子タグを含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチドの２５％以下が分子タグを含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、分子タグがビオチンであるポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、少なくとも５０００のポリヌクレオチドが少なくとも５０００の遺伝子をコードするポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも３０，０００のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１００，０００のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。
【０１８０】
核酸を富化するための方法が本明細書で提供され、上記方法は：本明細書に記載されるポリヌクレオチドライブラリーを複数のゲノム断片に接触させる工程；少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを生成するために、ポリヌクレオチドライブラリーに結合する少なくとも１つのゲノム断片を富化する工程；および、少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを配列決定する工程を含む。さらに、ポリヌクレオチドライブラリーが、配列決定後に、富化された標的ポリヌクレオチドの塩基に対して少なくとも９０パーセントの固有のリードを提供する方法も本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチドライブラリーが、配列決定後に、富化された標的ポリヌクレオチドの塩基に対して少なくとも９５パーセントの固有のリードを提供する方法も本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチドライブラリーが平均のリード深度の約１．５倍以内のリード深度を有する富化された標的ポリヌクレオチドの塩基の少なくとも８０パーセントを提供する方法も本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチドライブラリーが平均のリード深度の約１．５倍以内のリード深度を有する富化された標的ポリヌクレオチドの塩基の少なくとも９０パーセントを提供する方法も本明細書で提供される。
【０１８１】
少なくとも５０００のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーが本明細書で提供され、ここで、少なくとも５０００のポリヌクレオチドの各々は、ｉ）ゲノムライブラリーであって、それぞれがゲノム断片、少なくとも１つのインデックス配列、および少なくとも１つのアダプターを含むポリヌクレオチドを含んでいる、ゲノムライブラリーと；および、ｉｉ）少なくとも１つのポリヌクレオチド遮断薬であって、少なくともアダプター配列の一部に相補的であるが、少なくとも１つのインデックス配列には相補的でない、少なくとも１つのポリヌクレオチド遮断薬とを含む組成物を用いるハイブリダイゼーション、ならびに、ハイブリダイズされたゲノム断片の配列決定の後に、ポリヌクレオチドライブラリーは、リードの総数がハイブリダイズされたゲノム断片の塩基の総数の５５倍以下となる条件下で、ゲノム断片の塩基の少なくとも９０パーセントの少なくとも３０倍のリード深度を提供する、ような量で存在する。さらに、組成物が４つ以下のポリヌクレオチド遮断薬を含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチド遮断薬が１つ以上のヌクレオチドアナログを含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。
【０１８２】
さらに、ポリヌクレオチド遮断薬が１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチド遮断薬が１つ以上の架橋核酸（ＢＮＡ）を含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチド遮断薬が少なくとも２つのヌクレオチドアナログを含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチド遮断薬が少なくとも５つのヌクレオチドアナログを含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチド遮断薬が少なくとも１０のヌクレオチドアナログを含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチド遮断薬が少なくとも７０℃のＴｍを有するポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチド遮断薬が少なくとも７５℃のＴｍを有するポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ポリヌクレオチド遮断薬が少なくとも８０℃のＴｍを有するポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ゲノムライブラリーが少なくとも２つの異なるサンプルからのゲノム断片を含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ゲノムライブラリーが少なくとも１０つの異なるサンプルからのゲノム断片を含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ゲノムライブラリーが少なくとも２つの非同一インデックス配列からのゲノム断片を含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ゲノムライブラリーが少なくとも１６の非同一インデックス配列からのゲノム断片を含むポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。さらに、ゲノムライブラリーが少なくとも１つの固有の分子識別子（ＵＭＩ）をさらに含むゲノム断片を含んでいるポリヌクレオチドライブラリーも本明細書で提供される。
【０１８３】
核酸を富化するための方法が本明細書で提供され、上記方法は：本明細書に記載されるポリヌクレオチドライブラリーを複数のゲノム断片に接触させる工程；少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを生成するために、ポリヌクレオチドライブラリーに結合する少なくとも１つのゲノム断片を富化する工程；および、少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを配列決定する工程を含む。さらに、オフターゲット率が２５％未満である方法も本明細書で提供される。さらに、オフターゲット率が２０％未満である方法も本明細書で提供される。さらに、少なくとも１つのポリヌクレオチド遮断薬と相補的なアダプターとの間のモル比が５：１以下である方法も本明細書で提供される。さらに、少なくとも１つのポリヌクレオチド遮断薬と相補的なアダプターとの間のモル比が２：１以下である方法も本明細書で提供される。さらに、少なくとも１つのポリヌクレオチド遮断薬と相補的なアダプターとの間のモル比が１．５：１以下である方法も本明細書で提供される。
【０１８４】
本明細書には、核酸ハイブリダイゼーションのための組成物が提供され、上記組成物は：第１のポリヌクレオチドライブラリー；第２のポリヌクレオチドライブラリーであって、第１のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である、第２のポリヌクレオチドライブラリー；添加剤であって、添加剤が、気液界面で第１のポリヌクレオチドライブラリーまたは第２のポリヌクレオチドライブラリーの局所濃度を減少させることにより、第２のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドとの第１のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドのオフターゲットハイブリダイゼーションを減少させる、添加剤。さらに、添加剤が鉱物油、ヌクレオチド三リン酸、ポリエーテル、または尿素である組成物も本明細書で提供される。さらに、添加剤が少なくとも６つの炭素原子を含む炭化水素である組成物も本明細書で提供される。さらに、添加剤がシリコンオイルである組成物も本明細書で提供される。さらに、油が植物源に由来する組成物も本明細書で提供される。さらに、組成物がジメチルスルホキシドをさらに含む組成物も本明細書で提供される。さらに、組成物がホルムアミドを含まない組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが１０００万未満の塩基である組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが１００万未満の塩基である組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが５０万未満の塩基である組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１つのエクソン配列を含む組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１０の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１００の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１つのゲノム断片を含む組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーがＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡを含む組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーがゲノムＤＮＡを含む組成物も本明細書で提供される。
【０１８５】
本明細書には、核酸ハイブリダイゼーションのための組成物が提供され、上記組成物は：各々が複数のポリヌクレオチドを含む第１のポリヌクレオチドライブラリーと第２のポリヌクレオチドライブラリーであって、第１のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である、油であって、油が、気液界面で第１のポリヌクレオチドライブラリーまたは第２のポリヌクレオチドライブラリーの局所濃度を減少させることにより、第２のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドとの第１のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドのオフターゲットハイブリダイゼーションを減少させる、油、を含む。さらに、添加剤が鉱物油、ヌクレオチド三リン酸、ポリエーテル、または尿素である組成物も本明細書で提供される。さらに、添加剤が少なくとも６つの炭素原子を含む炭化水素である組成物も本明細書で提供される。さらに、添加剤がシリコンオイルである組成物も本明細書で提供される。さらに、油が植物源に由来する組成物も本明細書で提供される。さらに、組成物がジメチルスルホキシドをさらに含む組成物も本明細書で提供される。さらに、組成物がホルムアミドを含まない組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが１０００万未満の塩基である組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが１００万未満の塩基である組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが５０万未満の塩基である組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１つのエクソン配列を含む組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１０の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１００の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１つのゲノム断片を含む組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーがＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡを含む組成物も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーがゲノムＤＮＡを含む組成物も本明細書で提供される。
【０１８６】
オフターゲット核酸ハイブリダイゼーションを減少させるための方法が本明細書で提供され、上記方法は：第１のポリヌクレオチドライブラリーを第２のポリヌクレオチドライブラリーに接触させる工程であって、第１のポリヌクレオチドライブラリーと第２のポリヌクレオチドライブラリーが各々、複数のポリヌクレオチドを含み、および、第１のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのポリヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である、工程；少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを生成するために、第２のポリヌクレオチドライブラリーに結合する少なくとも１つのゲノム断片を富化する工程であって、富化する工程は少なくとも１つの吸引工程を含み、および、少なくとも１つの吸引工程は、空気／液体界面の近くの領域から液体のみを吸引することを含む、工程；および、少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを配列決定する工程を含む。さらに、添加剤が油、ヌクレオチド三リン酸、ポリエーテル、または尿素である方法も本明細書で提供される。さらに、添加剤が鉱物油である方法も本明細書で提供される。さらに、添加物の存在がオフターゲット結合を減少させる方法も本明細書で提供される。さらに、添加物の存在がオフターゲット結合を少なくとも１０％減少させる方法も本明細書で提供される。さらに、添加物の存在がオフターゲット結合を少なくとも２０％減少させる方法も本明細書で提供される。さらに、添加物の存在がオフターゲット結合を少なくとも３０％減少させる方法も本明細書で提供される。さらに、オフターゲット結合がランダムなオフターゲット結合である方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが１０００万未満の塩基である方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが１００万未満の塩基である方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが５０万未満の塩基である方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１つのエクソン配列を含む方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１０の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１００の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１つのゲノム断片を含む方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーがＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡを含む方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーがゲノムＤＮＡを含む方法も本明細書で提供される。
【０１８７】
本明細書には、ゲノムＤＮＡを配列決定するための方法が提供され、上記方法は：混合物を形成するために複数のゲノム断片と添加物にポリヌクレオチドライブラリーを接触させる工程であって、添加物が、気液界面で混合物中のポリヌクレオチドライブラリーまたはゲノム断片の局所濃度を減少させる、工程；少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを生成するために、ポリヌクレオチドライブラリーに結合する少なくとも１つのゲノム断片を富化する工程；および、少なくとも１つの富化された標的ポリヌクレオチドを配列決定する工程を含む。さらに、添加剤が油、ヌクレオチド三リン酸、ポリエーテル、または尿素である方法も本明細書で提供される。さらに、添加剤が鉱物油である方法も本明細書で提供される。さらに、添加物の存在がオフターゲット結合を減少させる方法も本明細書で提供される。さらに、添加物の存在がオフターゲット結合を少なくとも１０％減少させる方法も本明細書で提供される。さらに、添加物の存在がオフターゲット結合を少なくとも２０％減少させる方法も本明細書で提供される。さらに、添加物の存在がオフターゲット結合を少なくとも３０％減少させる方法も本明細書で提供される。さらに、オフターゲット結合がランダムなオフターゲット結合である方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが１０００万未満の塩基である方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが１００万未満の塩基である方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーのサイズが５０万未満の塩基である方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１つのエクソン配列を含む方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１０の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１００の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーが少なくとも１つのゲノム断片を含む方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーがＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡを含む方法も本明細書で提供される。さらに、第１のポリヌクレオチドライブラリーがゲノムＤＮＡを含む方法も本明細書で提供される。
【実施例】
【０１８８】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示する目的で与えられ、いかなる方法でも本発明を制限するようには意図されていない。本明細書に記載される方法とともに、本実施例は、好ましい実施形態の代表するものであり、例証するものであり、および、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。請求項の範囲によって定義される本発明の精神内に包含されるその変化および他の使用が、当業者に想定される。
【０１８９】
実施例１：基質表面の官能化
【０１９０】
ポリヌクレオチドのライブラリーの付着および合成を助けるために、基質を官能化した。基質表面をまず、２０分間、９０％のＨ２ＳＯ４および１０％のＨ２Ｏ２を含むピラニア溶液を使用して湿式洗浄した。基質を、ＤＩ水を含む様々なビーカー中ですすぎ、５分間ＤＩ水のグーズネック形状の蛇口の下で保持して、Ｎ２で乾燥させた。基質をその後、ＮＨ４ＯＨ（１：１００；３ｍＬ：３００ｍＬ）に５分間浸し、ハンドガン（ｈａｎｄｇｕｎ）を使用してＤＩ水ですすぎ、ＤＩ水を含む３つの連続するビーカーの中で各々１分間浸し、その後、ハンドガンを使用してＤＩ水で再びすすいだ。その後、基質表面をＯ２にさらすことにより基質をプラズマ洗浄した。ＳＡＭＣＯ  ＰＣ−３００機器を使用して、下流モードで１分間、２５０ワットでＯ２をプラズマエッチングした。
【０１９１】
以下のパラメータ：０．５−１トール、６０分、７０℃、１３５℃の蒸発器を備えたＹＥＳ−１２２４Ｐ気相蒸着オーブンシステムを使用して、清浄した基質表面をＮ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミドを含む溶液で能動的に官能化した。Ｂｒｅｗｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００Ｘスピンコータを使用して、基質表面をレジストコートした（ｒｅｓｉｓｔ  ｃｏａｔｅｄ）。ＳＰＲ（商標）３６１２フォトレジストを、４０秒間２５００ｒｐｍで基質上でスピンコートした。Ｂｒｅｗｅｒホットプレート上で、９０℃で３０分間、基質を予備焼成した。Ｋａｒｌ  Ｓｕｓｓ  ＭＡ６マスクアライナー機器を使用して、基質をフォトリソグラフィーにさらした。基質を２．２秒間さらし、ＭＳＦ  ２６Ａの中で１分間、展開させた（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）。残りの展開物（ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ）をハンドガンですすぎ、基質を５分間水に浸した。基質をオーブン中で、１００℃  ３０分間焼き、その後、Ｎｉｋｏｎ  Ｌ２００を使用してリソグラフィーの欠損に対する目視検査を行った。デスカム処理を使用してＳＡＭＣＯ  ＰＣ−３００機器を用いて残りのレジストを取り除き、１分間２５０ワットでＯ２プラズマエッチングした。
【０１９２】
基質表面を、１０μＬの軽油と混合したペルフルオロオクチルトリクロロシランの１００μＬの溶液で受動的に官能化した。基質をチャンバに入れ、１０分間ポンプでくみ出し、その後、バルブを閉じてポンプを止め、１０分間放置した。チャンバを通気した。最大パワー（Ｃｒｅｓｔシステム上で９）での超音波処理による７０℃で５００ｍＬのＮＭＰの中で５分間に２回の浸漬を行うことにより、基質をレジスト剥離した。その後、最大パワーでの超音波処理により室温で５００ｍＬのイソプロパノール中に５分間、基質を浸した。基質を、３００ｍＬの２００プルーフエタノール（２００  ｐｒｏｏｆ  ｅｔｈａｎｏｌ）に漬けて、Ｎ２で送風乾燥した。官能化した表面は活性化され、ポリゴヌクレオチド合成のための支持体として役立った。
【０１９３】
実施例２：ポリヌクレオチド合成装置上での５０量体の配列の合成
【０１９４】
二次元ポリヌクレオチド合成装置をフローセルに組み入れ、フローセル（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ「ＡＢＩ３９４  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ」）に接続させた。Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド（Ｇｅｌｅｓｔ）で二次元ポリヌクレオチド合成装置を均一に機能化し、これを使用し、本明細書に記載されるポリヌクレオチド合成方法を用いて５０ｂｐの例示的なポリヌクレオチド（「５０量体（５０−ｍｅｒ）のポリヌクレオチド」）を合成した。
【０１９５】
５０量体の配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載されている通りであった。５’ＡＧＡＣＡＡＴＣＡＡＣＣＡＴＴＴＧＧＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＣＴＴＧＡＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＴＣＧＧＣＡＴ＃＃ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ここで、＃は、チミジン−スクシニルヘキサミドＣＥＤホスホラミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓのＣＬＰ−２２４４）を表し、これは、脱保護中に表面からのポリゴヌクレオチドの放出を可能にする切断可能なリンカーである。
【０１９６】
表３のプロトコルおよびＡＢＩシンセサイザーに従って標準的なＤＮＡ合成化学（結合、キャッピング、酸化、および非ブロック化）を使用して、合成を行った。
【０１９７】
【表１１−１】
2021526366.tif 000013
【０１９８】
【表１１−２】
2021526366.tif 000014
【０１９９】
【表１１−３】
2021526366.tif 000015
【０２００】
ホスホラミダイト／活性化因子の組み合わせを、フローセルを介するバルク試薬の送達と同様に送達した。環境が時間全体にわたり試薬により「湿った」ままであると、乾燥工程を行わなかった。
【０２０１】
フローリストリクターをＡＢＩ  ３９４シンセサイザーから取り除き、より速い流れを可能した。フローリストリクターなしで、アミダイト（ＡＣＮ中で０．１Ｍ）、活性化因子（ＡＣＮ中で０．２５Ｍのベンゾイルチオテトラゾール（「ＢＴＴ」；ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈの３０−３０７０−ｘｘ））、およびＯｘ（２０％のピリジン、１０％の水、および７０％のＴＨＦ中の０．０２ＭのＩ２）の流量は、およそ〜１００ｕＬ／秒、アセトニトリル（「ＡＣＮ」）およびキャッピング試薬（ＣａｐＡとＣａｐＢの１：１の混合物、ここで、ＣａｐＡはＴＨＦ／ピリジン中の無水酢酸であり、ＣａｐＢはＴＨＦ中の１６％の１−メチルイミダゾール（ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ））についてはおよそ〜２００ｕＬ／秒、および、Ｄｅｂｌｏｃｋ（トルエン中の３％のジクロロ酢酸）についてはおよそ〜３００ｕＬ／秒（フローリストリクターですべての試薬に対し〜５０ｕＬ／秒と比較して）であった。酸化剤（Ｏｘｉｄｉｚｅｒ）を完全に押し出す時間を観察し、化学フロー時間のタイミングを適宜調整し、余分なＡＣＮ洗浄を異なる化学物質間に導入した。ポリヌクレオチド合成の後、７５ｐｓｉで一晩、ガス状のアンモニア中でチップを脱保護した。表面に水を５滴加えて、ポリヌクレオチドを再生させた。その後、再生させたポリヌクレオチドを、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒの小さなＲＮＡチップ上で分析した（データは示さない）。
【０２０２】
実施例３：ポリヌクレオチド合成装置上での１００量体の配列の合成
【０２０３】
５０量体の配列の合成について実施例２に記載されるのと同じプロセスを、１００量体のポリヌクレオチド（「１００量体のポリヌクレオチド」；５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＡＣＡＧＡＴＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＴＴＧＣＴＧＴＣＣＡＣＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＡＧＣＣＡＴＡＣＣＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧＣＡＴ＃＃ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’）の合成に使用し、ここで、＃は２つの異なるシリコンチップ上でのチミジン−スクシニルヘキサミドＣＥＤホスホラミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓのＣＬＰ−２２４４）；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２）を表し、第１のシリコンチップはＮ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミドで均一に機能化され、第２のシリコンチップは１１−アセトキシウンデシルトリエトキシシランとｎ−デシルトリエトキシシランの５／９５の混合物で機能化され、表面から抽出されたポリヌクレオチドを、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ機器で分析した（データは示さない）。
【０２０４】
以下の熱サイクルプログラムを使用して、５０ｕＬのＰＣＲ混合物（２５ｕＬのＮＥＢ  Ｑ５  マスターミックス、２．５ｕＬの１０ｕＭフォワードプライマー、２．５ｕＬの１０ｕＭリバースプライマー、表面から抽出した１ｕＬのポリヌクレオチド、および最大５０ｕＬの水）の中で、フォワードプライマー（５’ＡＴＧＣＧＧＧＧＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣ３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）およびリバースプライマー（５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧ３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を使用して、２つのチップからの１０のサンプルすべてをさらに増幅した：９８Ｃ、３０秒；９８Ｃ、１０秒；６３Ｃ、１０秒；７２Ｃ、１０秒；１２のサイクルを繰り返す７２Ｃ、２分
【０２０５】
ＰＣＲ生成物をＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ上でも実行して（データは示さず）、１００量体の位置で急なピークを実証した。次に、ＰＣＲ増幅サンプルをクローン化し、Ｓａｎｇｅｒ配列決定を行った（Ｓａｎｇｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）。表４は、チップ１からのスポット１−５から得たサンプル、およびチップ２からのスポット６−１０から得たサンプルに対するＳａｎｇｅｒ配列決定から生じる結果を要約する。
【０２０６】
【表１２】
2021526366.tif 000016
【０２０７】
ゆえに、高品質および高均一性の合成されたポリヌクレオチドを、異なる界面化学的性質を持つ２つのチップ上で繰り返した。配列決定された１００量体の２６２のうち２３３に対応している全体の８９％が、エラーのない完全な配列であった。
【０２０８】
最後に、表５は、スポット１−１０からのポリヌクレオチドサンプルから得た配列に対するエラー特徴を要約する。
【０２０９】
【表１３】
2021526366.tif 000017
【０２１０】
実施例４：２９，０４０の固有のポリヌクレオチドの並列アセンブリ
【０２１１】
図１６に示すように、各々、平坦なシリコンプレート（１６０１）上に１２１の遺伝子座を含む２５６のクラスター（１６０５）を含む構造体を製造した。クラスターの拡大図１６１０には、１２１個の遺伝子座が示されている。２５６のクラスターの２４０からの遺伝子座は、異なる配列を有するポリヌクレオチドの合成のための取り付けおよび支持体を提供した。ポリヌクレオチドの合成は、実施例３からの一般的な方法を用いて、ホスホラミダイト化学によって行われた。２５６のクラスターのうち１６からの遺伝子座は対照クラスターであった。合成された２９，０４０の固有のポリヌクレオチド（２４０×１２１）の包括的な分布を、図１７Ａに示す。ポリヌクレオチドライブラリーは、高い均一性で合成された。配列の９０％は、平均の４倍以内のシグナルに存在し、１００％の表現を可能にした。分布は、図１７Ｂに示すように、各クラスターについて測定した。４つの代表的なクラスター中で合成された固有のポリヌクレオチドの分布を、図１８に示す。包括的なレベルでは、ランにおけるすべてのポリヌクレオチドが存在し、９９％のポリヌクレオチドは、合成の均一性を示す平均の２倍以内の存在量を有していた。クラスターごとのレベルでもこの同じ観察結果が得られた。
【０２１２】
各ポリヌクレオチドのエラー率は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ遺伝子シーケンサーを用いて決定された。２９，０４０の固有のポリヌクレオチドに対するエラー率の分布を図１９Ａに示し、５００塩基に約１個の割合で平均し、８００塩基に１個の割合で低いエラー率のものもある。図１９Ｂに示すように、各クラスターについて測定した。４つの代表的なクラスターにおける固有のポリヌクレオチドのエラー率分布を、図２０に示す。２９，０４０の固有のポリヌクレオチドのライブラリーは、２０時間未満で合成された。
【０２１３】
２９，０４０の固有のポリヌクレオチドのすべてでのＧＣパーセンテージ対ポリヌクレオチド表現の分析は、ＧＣ含量にもかかわらず合成が均一であることを示した（図２１）。
【０２１４】
実施例５．次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を用いるエクソーム標的化のための制御された化学量論ポリヌクレオチドライブラリーの使用
【０２１５】
１つ以上の遺伝子エクソンと重なる最大３７万以上の非同一ポリヌクレオチドを含む第１のポリヌクレオチドｃＤＮＡ標的化ライブラリー（プローブライブラリー）を、実施例３からの一般的な方法を用いて、ホスホラミダイト化学によって構造体上で設計および合成する。このポリヌクレオチドは、ＰＣＲを用いて（または固相合成の間に直接）ビオチンなどの分子タグにライゲートされ、関心のある標的エクソンのその後の捕獲のためのプローブを形成する。プローブは、ゲノム核酸のライブラリー内の配列にハイブリダイズされ、非結合配列から分離される。非結合プローブは洗い流され、ｃＤＮＡ配列で富化された標的ライブラリーが残る。富化されたライブラリーはＮＧＳを用いて配列決定され、予想される各遺伝子のリードは、遺伝子を標的とするために使用されたｃＤＮＡプローブに応じて測定される。
【０２１６】
標的配列のリードの頻度は、標的配列の豊富さ、プローブの結合、二次構造、または富化にもかかわらず標的配列の配列決定後の表現を減少させる他の因子によって影響を受ける。ポリヌクレオチドライブラリーの化学量論的な対照は、リードの減少につながるポリヌクレオチドプローブ配列の化学量論が増加した第２のポリヌクレオチドｃＤＮＡ標的化ライブラリーを得るために、第１のポリヌクレオチドｃＤＮＡ標的化ライブラリーの化学量論を変更することによって行われる。この第２のｃＤＮＡ標的化ライブラリーは、実施例３の一般的な方法を用いて、ホスホロアミダイト化学によって構造体上で設計および合成され、上記のように標的ゲノムＤＮＡライブラリーの配列エクソンを富化するために使用される。
【０２１７】
実施例６：エクソーム標的化ポリヌクレオチドプローブライブラリーを用いたゲノムＤＮＡ捕捉
【０２１８】
ヒトエクソームを標的とする少なくとも５０万の非同一ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド標的化ライブラリーは、実施例３の一般的な方法を用いるホスホラミダイト化学、および、ライブラリー４を生成するために実施例５の一般的な方法を用いて制御された化学量論によって構造体上で設計および合成された。その後、このポリヌクレオチドをビオチンで標識し、溶解して、エクソームプローブライブラリー溶液を形成した。実施例１６の一般的な方法を用いて、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）サンプルから乾燥したインデックス化ライブラリープールを得た。
【０２１９】
エクソームプローブライブラリー溶液、ハイブリダイゼーション溶液、遮断薬ミックスＡ、および遮断薬ミックスＢを、２秒間パルスボルテックスすることにより混合した。ハイブリダイゼーション溶液を６５℃で１０分間、または沈殿物がすべて溶解するまで加熱し、その後、ベンチトップでさらに５分間室温に戻した。２０μＬのハイブリダイゼーション溶液と４μＬのエクソームプローブライブラリー溶液を薄肉のＰＣＲ  ０．２  ｍＬストリップチューブに添加し、ピペッティングで静かに混合した。組み合わせたハイブリダイゼーション溶液／エクソームプローブ溶液を１０５℃の蓋付きサーマルサイクラーで２分間９５℃に加熱し、すぐに氷上で少なくとも１０分間冷却した。次いで、溶液をベンチトップ上で５分間室温まで冷却した。ハイブリダイゼーション溶液／エクソームプローブライブラリー溶液が冷却されている間に、各ゲノムＤＮＡサンプルに９μｌまで水を加え、薄肉のＰＣＲ  ０．２  ｍＬストリップチューブ内の乾燥インデックス化ライブラリープールに遮断薬ミックスＡを５μｌ、遮断薬ミックスＢを２μｌ加えた。その後、溶液をピペッティングで静かに混合した。プールされたライブラリー／遮断薬チューブを１０５℃の蓋付きサーマルサイクラーで９５℃で５分間加熱し、その後、次の工程に進む前にベンチトップで５分以下、室温に戻した。ハイブリダイゼーションミックス／プローブ溶液をピペッティングで混合し、全２４μＬのプールされたライブラリー／遮断薬チューブに添加した。捕捉反応ウェル全体は、気泡を発生させないように、静かなピペッティングによって混合された。サンプルチューブは、チューブがしっかりと密封されていることを確認するためにパルススピンした。捕捉／ハイブリダイゼーション反応は、８５℃の蓋温度で、ＰＣＲサーモサイクラーで１６時間、７０℃で加熱された。
【０２２０】
結合バッファー、洗浄バッファー１、および洗浄バッファー２を、沈殿物がすべて溶液に溶解するまで４８℃で加熱した。７００μＬの洗浄バッファー２を１回の捕捉ごとにアリコートし、４８℃に予熱した。ストレプトアビジン結合ビーズおよびＤＮＡ精製ビーズを室温で少なくとも３０分間平衡化した。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘなどのポリメラーゼおよび増幅プライマーを氷上で解凍した。いったん試薬を解凍して、試薬を２秒間パルスボルテックスで混合した。捕捉反応あたり５００μＬの８０％エタノールを調製した。ストレプトアビジン結合ビーズを室温で予備平衡化し、均質化するまでボルテックスした。１００μＬのストレプトアビジン結合ビーズを１回の捕捉反応あたり透明な１．５  ｍＬマイクロチューブに添加した。２００μＬの結合バッファーを各チューブに添加し、各チューブをホモジナイズするまでピペッティングで混合した。チューブを磁石スタンドに置いた。ストレプトアビジン結合ビーズを１分以内にペレット化した。チューブを取り出し、ビーズペレットを乱さないように注意しながら、透明な上清を捨てた。チューブを磁石スタンドから取り出し、洗浄をさらに２回繰り返した。３回目の洗浄後、チューブを除去し、透明な上清を捨てた。結合バッファーの最後の２００μＬを添加し、ビーズを均質になるまでボルテックスで再懸濁した。
【０２２１】
ハイブリダイゼーション反応完了後、サーマルサイクラーの蓋を開け、捕捉反応の全量（３６−４０μＬ）を、洗浄したストレプトアビジン結合ビーズに速やかに移した。この混合物を、捕捉反応／ストレプトアビジン結合ビーズ溶液のホモジナイズしたまま維持するのに十分な速度で、シェーカー、ロッカー、またはローテーター上で室温で３０分間混合した。捕捉反応／ストレプトアビジン結合ビーズ溶液は、すべての溶液がチューブの底にあることを確認するために、ミキサーとパルススピンから取り除かれた。サンプルを磁気スタンドに置き、ストレプトアビジン結合ビーズを、１分以内に透明な上清を残して、ペレット化した。この透明な上清を除去して廃棄した。チューブを磁気スタンドから取り出し、２００μＬの洗浄バッファーを室温で添加し、その後、ホモジナイズするまでピペッティングにより混合した。すべての溶液がチューブの底にあることを確認するために、チューブをパルススピンした。サーマルサイクラーを以下の条件でプログラムした（表６）。
【０２２２】
加熱した蓋の温度を１０５°Ｃに設定した。
【０２２３】
【表１４】
2021526366.tif 000018
【０２２４】
増幅プライマー（２．５μＬ）とＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（２５μＬ）などのポリメラーゼを、水／ストレプトアビジン結合ビーズスラリーを入れたチューブに加え、チューブをピペッティングで混合した。その後、チューブを２つの反応に分割した。チューブをパルススピンしてサーマルサイクラーに移し、表６のサイクリングプログラムを開始した。サーマルサイクラープログラムが完了したら、サンプルをブロックから取り出し、すぐに精製に供した。室温で予備平衡化したＤＮＡ精製ビーズをホモジナイズするまでボルテックスした。９０μＬ（１．８倍）のホモジナイズされたＤＮＡ精製ビーズをチューブに添加し、ボルテックスによりよく混合した。チューブを室温で５分間インキュベートし、磁石スタンドに置いた。ＤＮＡ精製ビーズを、１分以内に透明な上清を残して、ペレット化した。透明な上清を捨て、チューブを磁石スタンドに残した。ＤＮＡ精製ビーズのペレットを２００μＬの新しく調製した８０％エタノールで洗浄し、１分間インキュベートし、その後、除去して、エタノールを廃棄した。洗浄は、チューブを磁石スタンド上に置いたまま、１回繰り返し、合計２回の洗浄を行った。残されたすべてのエタノールを除去し、ＤＮＡ精製ビーズペレットを乱さないように注意しながら、１０μＬのピペットで廃棄した。ＤＮＡ精製ビーズペレットを磁石スタンド上で５−１０分間、またはペレットが乾燥するまで、風乾させた。チューブを磁石スタンドから取り出し、３２μＬの水を加え、ホモジナイズするまでピペッティングで混合し、室温で２分間インキュベートした。チューブを３分間、またはビーズが完全にペレット化されるまで、磁気スタンド上に置いた。３０μＬの透明な上清を回収し、ＤＮＡ精製ビーズのペレットを乱さないように注意しながら、清潔な薄肉のＰＣＲ  ０．２  ｍＬストリップチューブに移した。平均断片長は、分析装置で１５０ｂｐ−１０００ｂｐの範囲設定を使用して、約３７５ｂｐ−約４２５ｂｐの間であった。理想的には、最終濃度値は少なくとも約１５  ｎｇ／μＬである。各捕捉は、次世代配列決定（ＮＧＳ）を用いて定量化され、検証された。
【０２２５】
コンパレータエクソーム捕捉キット（コンパレータキットＤ）と比較した、ＮＧＳ測定基準の要約を表７、表８に示す。ライブラリー４は、コンパレータキットＤよりも高い割合でエクソン標的に対応するプローブ（ベイト）を有している。これにより、ライブラリー４を用いて同等の品質およびカバレッジの標的配列を得るための配列決定が少なくなる。
【０２２６】
【表１５】
2021526366.tif 000019
【０２２７】
【表１６】
2021526366.tif 000020
【０２２８】
キットＤとライブラリー４の両方についての重複する標的領域の比較（９６Ｘカバレッジに正規化された総リード）を表９に示す。ライブラリー４はハイブリダイゼーションあたり８サンプルとして処理され、キットＤはハイブリダイゼーションあたり２サンプルとして処理された。さらに、両方のライブラリーについて、重複領域からの一塩基多型およびインフレーム欠失コールを、“Ｇｅｎｏｍｅ  ｉｎ  ａ  Ｂｏｔｔｌｅ”  ＮＡ１２８７８参照データから同定された高信頼度領域と比較した（表１０）。ライブラリー４は、ＳＮＰおよびインデルの同定においてキットＤと同等またはそれ以上のパフォーマンス（インデルの精度がより高い）を示した。
【０２２９】
【表１７】
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【０２３０】
【表１８】
2021526366.tif 000022
【０２３１】
精度は、正の陽性コール対合計（真および偽）陽性コールの比を表す。感度は、真の陽性コール対合計の真の値（真の陽性と偽の陰性）の比を表す。
【０２３２】
実施例７：疼痛遺伝子パネルを有するエクソームプローブ
【０２３３】
実施例６の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：プローブセットの異なる組み合わせを評価した。２つの異なるエクソームプローブライブラリー（エクソーム１およびエクソーム２）、および疼痛に関連する遺伝子を標的とした第２のポリヌクレオチドプローブライブラリー（パネル）を使用した。両方のエクソームパネルは、疼痛遺伝子パネルを混合したものと同様に、個別に評価した。これにより、これらのゲノム領域の追加の配列決定カバレッジが得られた；染色体１１のそのような例示的な領域の１つを図３に示す。この結果は、様々なエクソームパネルと疼痛遺伝子パネルが個別に評価され、染色体１、２、６、および２２などの複数の染色体にまたがる領域について組み合わされた別個の解析と比較した（データは示されていない）。
【０２３４】
実施例８：ロックド核酸を有する普遍的な遮断薬
【０２３５】
実施例６の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：４つのポリヌクレオチド遮断薬を、オフターゲット結合を減少させる能力について別の分析で評価した（図４Ａ）。ＬＮＡを含む普遍的な遮断薬は、特定の遮断薬を用いる陽性対照条件と比較できる程度のパフォーマンスを呈し、２つの異なるインデックス配列で２０％未満のオフベイトを達成した。
【０２３６】
実施例９：ロックド核酸を有する普遍的な遮断薬の組み合わせ
【０２３７】
実施例６の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：４つのポリヌクレオチド遮断薬の異なる組み合わせを、オフターゲット結合を減少させる能力について別の条件下で評価した（図４Ｂ）。ＬＮＡを含む普遍的な遮断薬は、４つの遮断薬（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）がすべて存在する場合に、特定の遮断薬を用いる陽性対照条件と比較できる程度のパフォーマンスを呈し、２０％未満のオフベイトを達成した。
【０２３８】
実施例１０：ロックド核酸を有する普遍的な遮断薬
【０２３９】
実施例６の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：４つのポリヌクレオチド遮断薬を、１または８つの異なるインデックス配列（１プレックスまたは８プレックス）を含む条件下で、オフターゲット結合（図４Ｃ）を減少させる能力について別の条件で評価した。０．１２５ｎｍｏｌのＬＮＡを含む普遍的な遮断薬はそれぞれ、１ｎｍｏｌｅの特異的な遮断薬を用いた陽性対照条件と比較できる程度のパフォーマンスを呈し、１プレックスおよび８プレックスの条件の両方で２０％未満のオフベイトを達成した。ＬＮＡを含む普遍的な遮断薬は、それぞれが質量比で同等の量で存在する場合、特定の遮断薬（２０％以上のベイトオフ）よりも優れたパフォーマンス（２０％未満のベイトオフ）を呈した（図４Ｃ）。
【０２４０】
実施例１１：ロックド核酸を有する普遍的な遮断薬の滴定
【０２４１】
実施例６の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：４つのポリヌクレオチド遮断薬を、オフターゲット結合を減少させる能力について別の条件下で評価した（図４Ｄ）。０．０１ｎｍｏｌｅ未満のＬＮＡを含む普遍的な遮断薬はそれぞれ、２０％以下のベイトオフを達成しました。
【０２４２】
実施例１２：可変量のロックド核酸を含む普遍的な遮断薬
【０２４３】
実施例６の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：可変量のＬＮＡを含む４つのポリヌクレオチド遮断薬を、オフターゲット結合を減少させる能力について別の条件下で評価した（図４Ｅ）。少なくとも８つのＬＮＡを含む普遍的な遮断薬は、特定の遮断薬を用いる陽性対照条件と比較できる程度のパフォーマンスを呈し、２０％未満のオフベイトを達成した。
【０２４４】
実施例１３：架橋核酸を有する普遍的な遮断薬
【０２４５】
実施例６の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：４つの異なるポリヌクレオチド遮断薬セットを、オフターゲット結合を減少させる能力について別の条件下で評価した（図４Ｆ）。ＢＮＡを含む普遍的な遮断薬は、特定の遮断薬を用いる陽性対照条件よりも優れたパフォーマンスを呈し、２７％未満のオフベイトを達成した。
【０２４６】
実施例１４：部分的にビオチン化されたプローブの使用
【０２４７】
実施例６の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得する：ビオチン化エクソームプローブと非ビオチン化エクソームプローブの比率を変えて別々の条件で実行し、パーセントオフベイト率とドロップアウト率を測定した。５０％のビオチン化ベイトのみを含むプローブライブラリーは、２５％未満のパーセントオフベイト率を達成し（図５Ａ）、Ａ／ＴおよびＧ／Ｃのドロップアウト率は２％未満であった（図５Ｂ）。
【０２４８】
実施例１５：希釈較正
【０２４９】
実施例６の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：プローブの希釈度（プローブの質量：標的サイズ）を変化させることによって別々の条件を実行し、ＨＳライブラリーのサイズ：標的サイズを分析した。エクソームライブラリー標的はほぼ線形分布に従っていたが、より小さいパネルは線形に変化しなかった（図６Ａ）。データを動力学的モデルに再適合させると、エクソームと遺伝子パネルの両方が様々な希釈について同じ曲線上で適合する（図６Ｂ）。これにより、所望の捕捉量を達成するためのエクソーム：遺伝子パネルプローブの最適な比率を正確に予測することができた。例えば、エクソームおよび遺伝子ライブラリーの両方について標的の４５％を捕捉するために、遺伝子パネルプローブは、エクソームライブラリーと比較してベイト質量あたり２２％でスパイクインされた。
【０２５０】
実施例１６：カスタムパネルライブラリーのパフォーマンス
【０２５１】
実施例６の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：ゲノムの異なる領域を標的とするために、２つの異なるカスタムプローブパネルライブラリー１（７５７  ｋｂ）とライブラリー２（８０３  ｋｂ）を使用した（図２２）。２つのパネルは、高い割合のオンターゲットリードと、２０％以上のリード深度を持つ高い割合の標的をもたらした（表１０）。ライブラリー１は、９％のオフターゲット率を示した。
【０２５２】
【表１９】
2021526366.tif 000023
【０２５３】
実施例１７：プローブのパフォーマンスの評価と調整
【０２５４】
ポリヌクレオチドプローブのサブセットは、実施例６の捕捉ライブラリーから選択的に取り除かれ、捕捉／配列決定方法は、実施例６の一般的な方法を使用して、同じサンプル上で繰り返される。オンベイトカバレッジ、オフターゲット、フォールド８０ベースペナルティなどの出力測定基準が測定される。このプロセスは、異なるプローブサブセットを用いて反復され、配列決定の結果は相関している。その後、最も良好なパフォーマンスを示すプローブサブセットを組み合わせ、同様の方法で評価する。
【０２５５】
実施例１８：追加のＳＮＰパネルを有するエクソームプローブ
【０２５６】
ポリヌクレオチドプローブのサブセット（パネル）を実施例６の捕捉ライブラリーに選択的に添加し、捕捉／配列決定方法は、実施例６の一般的な方法を用いて同一サンプル上で繰り返される。ポリヌクレオチドのサブセットは、一塩基多型（ＳＮＰ）を含むゲノムの領域を標的とする。パネルは、ヘテロ接合である部位を含むこれらの部位でのリード深度を増加させることにより、ＳＮＰのそれぞれの部位における塩基の同一性を決定することを可能にする。
【０２５７】
実施例１９：イントロンパネル有するエクソームプローブ
【０２５８】
実施例６の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：イントロンを標的とする第２のポリヌクレオチドプローブライブラリーは、エクソームライブラリーと混合される。これにより、これらのゲノム領域の追加の配列決定カバレッジが得られた。データは図示されず。
【０２５９】
実施例２０：架橋核酸を有する普遍的な遮断薬（８−Ｐｌｅｘ）
【０２６０】
実施例６の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：８つの異なるバーコード配列を含むアダプタータグ付きゲノム断片を使用し、４つの異なるポリヌクレオチド遮断薬を使用して、オフターゲット結合を減少させる能力について評価した。
【０２６１】
実施例２１：カスタムパネルを有するエクソームプローブ
【０２６２】
実施例６の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：プローブセットの異なる組み合わせを評価する。２つの異なるエクソームプローブライブラリー（エクソーム１とエクソーム２）が、ゲノムの追加領域を標的とするライブラリー１またはライブラリー２のいずれかと同様に使用される。両方のエクソームパネルを個別に評価するとともに、ライブラリー１またはライブラリー２のパネル互いに混合される。配列決定測定基準が得られ、エクソームおよびライブラリー１またはライブラリー２によって標的とされる領域と同様に、両方のエクソームについて評価される。
【０２６３】
実施例２２．改善されたオンターゲットパフォーマンスを備える普遍的な遮断薬
【０２６４】
普遍的な遮断薬をアダプタータグ付きゲノム断片と一緒に使用した。一例として図２３Ａを参照する。個々のライブラリーを、単一のゲノム源（ＮＡ１２８７８；Ｃｏｒｉｅｌ）および互換性のあるアダプターから生成した。調製された各ライブラリーを、その後、普遍的な遮断薬の不在下または存在下のいずれかで捕捉した。配列決定後、リードを標的塩基の１５０倍にダウンサンプリングし、ＭａｐＱｕａｌｉｔｙフィルター＝２０でＰｉｃａｒｄメトリックツールを使用して評価した。エラーバーは１標準偏差を示す。ｎは≧２である。図２４で見られるように、広範なインデックスデザインでオンターゲットパフォーマンスが改善された。Ｃｏｔ  ＤＮＡ  はすべてのサンプルに存在していた。図２５で見られるように、普遍的な遮断薬を使用して一連のパネルサイズでオンターゲットパフォーマンスが改善された。
【０２６５】
実施例２３．一連のパネルサイズおよび標的領域でのカスタムパネルデザイン
【０２６６】
実施例６の一般的な方法を用いて、を伴う配列決定データを取得した：ライブラリーの詳細が表１２で見られる。簡潔に説明すると、製造業者の推奨事項に従って、シングルプレックスプールあたり５００  ｎｇのｇＤＮＡ（ＮＡ１２８７８；Ｃｏｒｉｅｌｌ）を使用して、本明細書で設計された複数の標的富化パネルを使用して、ハイブリッドキャプチャーを実施した。２ｘ７６ペアエンドのリードを生成するために、ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００／５５０  Ｈｉｇｈ  Ｏｕｔｐｕｔ  ｖ２キットを用いて配列決定を行った。データを標的サイズの１５０倍にダウンサンプリングし、２０のマッピング品質Ｐｉｃａｒｄメトリクスを用いて解析した。Ｎ＝２。パネルは、高い割合のオンターゲットリードと、均一性の改善、および低い重複率をもたらした（表１２）。図２６Ａは、３０倍カバレッジを達成した各パネルのリードの割合を示し、図２６Ｂは、均一性（フォールド−８０）を示している。
【０２６７】
【表２０】
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【０２６８】
実施例２４．マルチプレックス標的富化中のカスタムパネルパフォーマンス
【０２６９】
実施例６の一般的な方法を用いて、を伴う配列決定データを取得した。マルチプレックス標的富化のデータは以下の表１３と図２７Ａで見られる。図２７Ａはカバレッジ分布と累積カバレッジを示しており、図２７Ａの両方のチャートのｘ軸はカバレッジであり、左のチャートのｙ軸はカバレッジのある％塩基であり、右のチャートのｙ軸はカバレッジ＞Ｘである％塩基を有する塩基である。すべてのデータは１５０ｘカバレッジにサブサンプリングした。ＭａｐＱｕａｌｉｔｙフィルター＝２０。配列決定は、２  ｘ  ７６リードを使用してＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）機器で実行された。データは、すべてのレベルのマルチプレキシングに対して高い均一性、マルチプレキシングのレベルが高くなっても変化しない高いオンターゲット率、およびすべてのレベルのマルチプレキシングに対して低い重複率を示す。
【０２７０】
【表２１】
2021526366.tif 000025
【０２７１】
プローブは、高マルチプレックスパフォーマンスを実現するために、固有の分子を最大限に捕捉し、配列決定の重複を最小限に抑えるように設計される。高い捕捉パフォーマンスは、８００ｋｂ、３．３Ｍｂ、および３３．１Ｍｂの固定されたエクソームの３つのパネルで判定された。３０Ｘでの一貫した捕捉カバレッジは、すべてのサンプルとマルチプレキシング条件で観察される（図２７Ｂ）。重複率の増加の大きさは最小であった。８００ｋｂのパネルの場合、重複率は１プレックスと１６プレックスの捕捉の間でそれぞれ１．８％から２．７％に増加し、より大きなパネルでも同様の観察が見られた。パフォーマンスへの影響は、一貫して３０Ｘカバレッジで確認された。
【０２７２】
プローブも、サンプルの質量を増加させることなくマルチプレキシングを支持するように設計された。ハイブリッド捕捉は、本明細書に記載されているエクソーム標的富化パネル（３３．１Ｍｂ）を用いて、製造業者の推奨に従ってシングルプレックス捕捉として５００  ｎｇのライブラリー（ＮＡ１２８７８；Ｃｏｒｉｅｌｌ）を使用して実施された。Ｎ＝２。図２７Ｃは、均一性に対するＰＣＲサイクル数の効果を示す。
【０２７３】
ハイブリッド捕捉は、本明細書に記載されているエクソーム標的富化パネル（３３．１Ｍｂ）を用いて、製造業者の推奨に従い、８プレックスプールあたり１５０  ｎｇ（ライブラリーあたり１８．７５  ｎｇ）または１５００  ｎｇ（ライブラリーあたり１８７．５  ｎｇ）のライブラリー（ＮＡ１２８７８；Ｃｏｒｉｅｌｌ）を使用して実施された。データは、標的サイズの１００Ｘにダウンサンプリングされた；Ｎ＝２。一貫した  ３０Ｘカバレッジは、このシステムが、パフォーマンスを低下させることなく、質量入力量を減少させてマルチプレックスする能力を明確に示している（図２７Ｄ）。
【０２７４】
実施例２５．カスタムパネル再現性
【０２７５】
ロットからロットへのカスタムパネルの再現性を評価するために、実施例６の一般的な方法を用いて配列決定データを取得した。図２８Ａ−２８Ｉで見られるように、カスタムパネルは低いロット間変動を示した。ロットＡとＢは、２回の合成ランを使用して製造された独立したロットであった。各ドットは、１５００倍カバレッジでのＮＧＳ標的富化（図２８Ｂ）後のプローブ存在量（図２８Ａ）またはプローブカバレッジを表す。図２８Ａは、ＮＧＳによって評価された８００ｋｂパネルの一貫した品質を示している。
【０２７６】
約７，４００のプローブ（８００ｋｂ）を含むパネルは、各ロット内に２つの増幅複製（複製物１と複製物２）を伴って、〜１ヶ月間隔で再合成された（Ｌｏｔ１とＬｏｔ２）。図２８Ｃは、同じ合成および異なる増幅内のプローブ表現の再現性を示す。図２８Ｄは、合成間のプローブ表現の再現性を示す。
【０２７７】
図２８Ｅ−図２８Ｉは、標的サイズの１５０倍にダウンサンプリングされ、２０のマッピング品質でＰｉｃａｒｄ  Ｍｅｔｒｉｃｓを使用して分析されたデータを示す。Ｎ＝２。図２８Ｅは、プローブあたりのロット間の再現性捕捉を示す。図２８Ｆ−２８Ｉは、合成間のプローブ標的富化パフォーマンス間の再現性を示す。
【０２７８】
実施例２６．柔軟かつモジュール式のカスタムパネル
【０２７９】
内容物は添加または増強可能である。図２９Ａを参照する。パネルに内容物を加えることで、カバーされる標的の数が増える。パネルに内容物を強化することは、特定の領域のカバレッジを意味する。
【０２８０】
ＲｅｆＳｅｑデータベースに由来する３Ｍｂの追加の標的領域が追加された。このパネルを作成することで、カバレッジが増加し、パフォーマンスは低下しなかった。カバレッジは、ＲｅｆＳｅｑ、ＣＣＤＳ、およびＧＥＮＣＯＤＥのデータベースの９９％以上に改善した。さらに、カスタムパネルは高い均一性とオンターゲット率、および低い重複率を示した（すべての結果は１５０ｘ配列決定に基づく）。
【０２８１】
表１４に見られるようなデータベースのカバレッジは、本明細書に記載されるようなカスタムパネルを使用して増加した。データは、２０１８年５月現在（ＵＣＳＣゲノムブラウザ）の一次ヒトゲノムアセンブリ（代替染色体は除外された）に注釈をつけたデータベースにおけるタンパク質コード領域へのパネル内容物の重複を比較した。Ａ１、Ａ２、およびＩ−１は、様々なベンダーから市販されているコンパレータパネルである。比較は、ＢＥＤｔｏｏｌｓスイートおよび括弧内に示されたゲノムバージョンを用いて行われた。３Ｍｂの内容物を追加することで、ＲｅｆＳｅｑとＧＥＮＣＯＤＥのデータベースのカバレッジを９９％以上に向上させた。
【０２８２】
【表２２】
2021526366.tif 000026
【０２８３】
図２９Ｂ−２９Ｄ  は、パネル１とパネル１＋  フォールドに追加されたコンテンツ（図２９Ｂ）、重複率（図２９Ｃ）、および標的に対するパーセント（図２９Ｄ）のデータを示す。図２９Ｅと図２９Ｆは、標的カバレッジ（図２９Ｅ）とフォールド８０ベースペナルティ（図２９Ｆ）の比較データを示す。
【０２８４】
実施例２７．捕捉に対する３０，０００のプローブの効果
【０２８５】
捕捉に対するミスマッチの効果は、プローブデザインの最適化のために決定された。捕捉効率に対するミスマッチの数と分布の効果を検討するために、２枚のパネル、対照と変異体が設計され、合成された。各パネル（変異体と対照）は２８，７９４のプローブを含んでいた。対照パネルは、ヒトゲノムリファレンスと完全に一致する、本明細書に記載されている方法を用いて設計および合成されたヒトエクソームパネルから選択されたプローブを含む。変異体パネルは、同じプローブを含んでいたが、１−５０のミスマッチがランダムに分布しているか、または１つの連続したストレッチとして含まれていた（図３０Ａ）。対照パネルでは、プローブは標的と相補的になるように設計された。変形パネルでは、１−５０のミスマッチ（黄色）は、プローブに沿ってランダムに導入された（ＲＮＤ）か、または単一の連続的なストレッチ（ＣＯＮＴ）としてすべて一緒に導入された。また、正規化のために、ミスマッチのない３８２の対照プローブが両方のパネルに追加された（灰色で表示）ため、対照プールと変異体プールは合計２９，１７６のプローブを含んでいた。
【０２８６】
図３０Ｂ−３０Ｃは、捕捉効率に対するミスマッチの数を変化させたプローブを示す。単一のミスマッチ（グレー）のプローブと複数のミスマッチ（緑の線；ミスマッチの数は左上隅に示される）のプローブに関する相対的な捕捉効率の分布が示される。実線は、ランダムに分布されたミスマッチ（ＲＮＤ）を有するプローブの分布を描き、点線は、連続的なミスマッチ（ＣＯＮＴ）を有するプローブの分布を示す。５０のミスマッチが１つの連続したストレッチに配置されたプローブは、１０−１５のミスマッチがランダムに分布しているプローブと同様に捕捉し、５０のミスマッチがランダムに分布しているプローブは完全に非効率的であった。
【０２８７】
ＧＣ、完全一致の長さ、およびハイブリダイゼーション温度などの他の因子は、ミスマッチの存在下で捕捉効率を調節することができる。図３０Ｄは、ミスマッチの存在下での捕捉効率に対する温度の影響を示す。
【０２８８】
図３０Ｅ−図３０Ｆは、ヒトサンプルからの４５０の全ゲノムＺｉｋａ単離物（図３０Ｅ）、および、ヒトゲノム中のすべてのＣｐＧ島（図３０Ｆ）のデザインに関するメタゲノムおよび二硫化物の捕捉効率予測を示す。ＣｐＧ島はヒトゲノムｈｇ３８に関するＵＣＳＣ注釈トラックからダウンロードされ、本明細書に記載されるような設計方法を使用して設計された。
【０２８９】
実施例２８．下流アプリケーションのためのプローブ特異性
【０２９０】
第１のパス設計からの実験結果が、除去すべき配列を決定するために使用された適応デザイン。図３１Ａは、困難な標的領域（それぞれ３７Ｋｂと８００Ｋｂ、３つのプローブ、および、〜４％程度のプローブが除去された）を有するパネルにおける、中程度および積極的なオフターゲット減少のためのシングルパスの適応デザイン後の改善を示す。図３１Ｂは、実験（軸）によって測定されたものと比較して、我々のモデルによって予測されたオフターゲットレベルと、それを達成するために各ケースで必要とされるベイトの総数からの割合を示している。図３１Ｃは、本明細書に記載された方法に基づく、ターゲット領域のとりわけハードなセット、様々なレベルのストリンジェンシー、およびベイト除去の有効性に対するカスタムデザインの結果を示す。
【０２９１】
実施例２９．ＲｅｆＳｅｑ設計
【０２９２】
ＲｅｆＳｅｑパネルデザインはｈｇ３８で設計され、ＣＣＤＳ２１、ＲｅｆＳｅｑ全コード領域、およびＧＥＮＣＯＤＥ  ｖ２８塩基コード配列の組み合わせを含んだ。ＲｅｆＳｅｑ単独（Ｅｘｏｍｅ）のサイズは３．５Ｍｂであり、Ｃｏｒｅ  Ｅｘｏｍｅ＋ＲｅｆＳｅｑの組み合わせ（Ｅｘｏｍｅ＋ＲｅｆＳｅｑ）は３６．５Ｍｂであった。実験は、５０  ｎｇのｇＤＮＡ（ＮＡ１２８７８）を１プレックスおよび８プレックスとして３回繰り返してランし、７６ｂｐリードの１５０Ｘ配列決定で評価した。標的ファイルは３６．５Ｍｂであった。
【０２９３】
ＲｅｆＳｅｑパネルデザインを、カバレッジの深さ、特異性、均一性、ライブラリーの複雑さ、重複率、およびカバレッジ率について評価した。図３２Ａは、カバレッジの深さを示す。２０Ｘで９５％を超える標的塩基が観察された。３０Ｘでは９０％を超える標的塩基が観察された。図３２Ｂは、ＲｅｆＳｅｑパネルの特異性を示す。オフターゲットパーセントは０．２未満であった。図３２Ｃは、ＲｅｆＳｅｑパネルの均一性を示す。フォールド８０は１．５未満であった。図３２Ｄは、ライブラリーの複雑さを示す。ライブラリーサイズは３億２，０００万より大きかった。図３２Ｅは、ＲｅｆＳｅｑパネルの重複率を示す。重複率は４％未満であった。図３２ＦはＲｅｆＳｅｑパネルのカバレッジ率を示す。カバレッジ率は０．９−１．１の間であった。図３２Ｆで見られるように、カバレッジ比は１．１未満であった。
【０２９４】
実施例３０：結合バッファー中の様々な添加物を使用した、エクソーム標的化ポリヌクレオチドプローブライブラリーによるゲノムＤＮＡ捕捉
【０２９５】
実施例６の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：異なる添加物を含む様々な結合バッファーを別々の配列決定ランで使用し、３６．７Ｍｂのプローブライブラリーの代わりに０．８Ｍｂのカスタムプローブパネルライブラリーを使用した。配列決定分析の結果が図３３Ｃで見られる。結合バッファーへの鉱物油の添加は、オフターゲットパーセント率の有意な減少をもたらした。結合バッファーに５％のＰＥＧを添加すると、対照ラン（水を添加した）と比較して、オフターゲット率を減少させた。
【０２９６】
実施例３１：バッファー中の鉱物油を使用した、エクソーム標的化ポリヌクレオチドプローブライブラリーによるゲノムＤＮＡ捕捉
【０２９７】
実施例６の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：鉱物油を含む様々なバッファーを別々の配列決定ランで使用し、洗浄回数を変更し、３６．７Ｍｂのプローブライブラリーの代わりに０．８Ｍｂのカスタムプローブパネルライブラリーを使用した。条件を二重にランした。オフターゲットの配列決定分析の結果が図３４Ａで見られる。バッファー１を洗浄する鉱物油の添加、洗浄バッファー２を用いる最初の洗浄、または、洗浄バッファー２を用いる最後の洗浄は、非鉱物油条件に匹敵したオフターゲット率を与えた。ハイブリダイゼーションバッファー、第１の結合バッファー、または最後の結合バッファーへの鉱物油の添加は、オフターゲットパーセント率の有意な減少をもたらした。
【０２９８】
実施例３２：鉱物油と洗浄を使用したエクソーム標的化ポリヌクレオチドプローブライブラリーによるゲノムＤＮＡ捕捉
【０２９９】
実施例６の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：鉱物油を含むハイブリダイゼーションおよび結合バッファーを使用し、洗浄回数を変更し、３６．７Ｍｂのプローブライブラリーの代わりに０．８Ｍｂのカスタムプローブパネルライブラリーを使用した。条件は２−７回複製してランした。配列決定分析の結果が図３４Ｂ−３４Ｅで見られる。鉱物油を使用しない場合（１回の洗浄：３４．８９％  ｖｓ  ４回の洗浄：３８．３１％  図３４Ｂ）、洗浄バッファー１を使用した４回の洗浄は一般に、オフベイトパーセントの低下をもたらした（４回の洗浄：３８．３１％  ｖｓ  １回の洗浄：５６．８６％、鉱物油なし）。洗浄バッファー１による１回の洗浄と組み合わせた鉱物油は、３４．８９％の平均的なオフベイト率をもたらした。鉱物油の添加は一般に  ＧＣ  ドロップアウト率を低下させた（図３４Ｃ、破線の交点は平均値を示す）。追加の洗浄は、鉱物油の添加とは無関係に、ＨＳ  ライブラリーサイズとフォールド８０ベースペナルティのラン対ランのばらつきを減少させた（図３４Ｄと図３４Ｅ）。
【０３００】
実施例３３：液体ポリマーとチューブ移動を用いたエクソーム標的化ポリヌクレオチドプローブライブラリーによるゲノムＤＮＡ捕捉
【０３０１】
実施例６の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：液体ポリマー（ポリマーＡ）添加剤を含むハイブリダイゼーションおよび結合バッファーを使用し、洗浄中に随意にチューブ移動を行い、３６．７Ｍｂのプローブライブラリーの代わりに８００ｋｂおよび４０ｋｂのカスタムプローブパネルライブラリーを独立したランで使用した。ポリマーＡは高分子量の液体ポリマーであり、蒸気圧は１ｍｍＨｇ未満、水溶性は１００ｐｐｂ未満である。条件を二重にランした。洗浄間のチューブ移動および／または液体ポリマーの使用は一般に、４０ｋｂおよび８００ｋｂライブラリーの両方について、ＨＳライブラリーサイズの増加と同様に（図３５Ｂ）、オフベイトのパーセントの減少をもたらした（図３５Ａ）。フォールド８０ベースペナルティおよびＧＣドロップアウトなどの他の変数は比較的影響を受けなかったが、チューブ交換、液体ポリマー添加剤、またはその両方の組み合わせのいずれかの使用は、ＡＴドロップアウトの減少をもたらした（データは示されていない）。
【０３０２】
実施例３４：撹拌および制御された吸引を使用する、エクソーム標的化ポリヌクレオチドプローブライブラリーを用いるゲノムＤＮＡ捕捉
【０３０３】
実施例６の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：異なるレベルの撹拌／混合および吸引の方法を別々の配列決定ランで使用し、３６．７Ｍｂのプローブライブラリーの代わりに０．８Ｍｂのカスタムプローブパネルライブラリーを使用した。高撹拌は混合時にハイブリダイゼーションおよび結合バッファーを短時間でボルテックスすることを含み、低撹拌は混合時にチューブをフリックさせることを含んでいた。上部吸引は、空気−水界面付近の液体のみを採取すること、および、液面が下がるにつれてピペットチップをゆっくりと下降させることを含んでいた。高レベルの撹拌は、低レベルの撹拌と比べてオフターゲット率が増加させた（図３６）。最も低いオフターゲット率は、低い撹拌とチューブの上部からの吸引との組み合わせで達成された。
【０３０４】
実施例３５：高速ハイブリダイゼーションバッファー
【０３０５】
実施例６の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：ゲノムＤＮＡ（ＮＡ１２８７８，  Ｃｏｒｒｉｅｌｌ）  をハイブリダイズし、３３．１  Ｍｂ  のエクソームプローブライブラリーまたは  ８００  ｋｂ  の標的ライブラリーを使用して捕捉する。２つの異なるワークフローを比較する（図３８）。２つの異なるプローブライブラリー（エクソームプローブまたは８００ｋｂのカスタムパネル）を核酸サンプルにハイブリダイゼーションする間、標準バッファーまたは「高速」ハイブリダイゼーションバッファーを使用し、捕捉／ハイブリダイゼーション反応を、８０−９５℃の蓋温度のＰＣＲサーモサイクラー中で、様々な時間（１５分−８時間）５０−７５℃に加熱する。配列決定後に、デフォルト値を有するＰｉｃａｒｄ  ＨＳ＿Ｍｅｔｒｉｃツール（Ｐｃｔ＿Ｔａｒｇｅｔ＿Ｂａｓｅｓ＿３０Ｘ）を配列決定分析に使用する。データは、評価のために標的塩基の１５０倍の生のカバレッジにダウンサンプリングされる。高速ハイブリダイゼーションバッファーを使用することで、５〜９時間で完了するワークフローをもたらす。
【０３０６】
実施例３６：液体ポリマーを備えた高速ハイブリダイゼーションバッファー
【０３０７】
実施例６および１０の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：ゲノムＤＮＡ（ＮＡ１２８７８、Ｃｏｒｒｉｅｌｌ）をハイブリダイズし、３３．１  Ｍｂ  のエクソームプローブライブラリーまたは８００ｋｂの標的ライブラリーを使用して捕捉する。２つの異なるプローブライブラリー（エクソームプローブまたは８００ｋｂのカスタムパネル）を核酸サンプルにハイブリダイゼーションする間、「高速」ハイブリダイゼーションバッファーを液体ポリマーとともに使用し、捕捉／ハイブリダイゼーション反応を、８５℃の蓋温度のＰＣＲサーモサイクラー中で、様々な時間に渡って６５℃で加熱する。配列決定後に、デフォルト値を有するＰｉｃａｒｄ  ＨＳ＿Ｍｅｔｒｉｃツール（Ｐｃｔ＿Ｔａｒｇｅｔ＿Ｂａｓｅｓ＿３０Ｘ）を配列決定分析に使用した。データは、評価のために標的塩基の１５０倍の生のカバレッジにダウンサンプリングされる。いずれのパネルについても、高速ハイブリダイゼーション溶液中での１５分間のハイブリダイゼーションは、１６時間の標準ハイブリダイゼーションと同等の性能を示し、ハイブリダイゼーション時間の増加は、従来のハイブリダイゼーションバッファーを使用した標準プロトコルよりもパフォーマンスを向上させた（図３７Ａ−３７Ｅ）。全体的に、高速ハイブリダイゼーション条件は、低い８０倍ベースペナルティ、高いオンターゲット率、および３０倍を超えて配列決定された標的塩基の９０％以上をもたらした。（図３９Ａ、３９Ｂ）プロトコルはマルチプレックス実験（図３９Ｂ）でも実施された。
【０３０８】
実施例３７：ＦＦＰＥサンプルからのゲノムＤＮＡの捕捉
【０３０９】
実施例８の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：４つの組織をカバーする６つのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルをサンプルとして使用した。ＦＦＰＥサンプルからのゲノムＤＮＡサンプルを、互換性のあるｏｎｅＴＵＢＥ  ＡＦＡ容器を備えたＣｏｖａｒｉｓ  ＡＦＡ機器を用いて機械的に剪断した。機器の設定は、２００−２５０ｂｐのモードでのサイズ分布を標的とするように、ｇＤＮＡ断片化のために調整された。末端修復、Ａテーリング、およびライゲーション後に、インデックス化されたライブラリーを、１６時間のハイブリダイゼーション反応で設定された３３．１Ｍｂの標的領域エクソーム捕捉プローブを用いるマルチプレックス反応（８つのライブラリー、各１８７．５ｎｇ、合計１５００ｎｇ）における捕捉に晒した。サンプルをＮｅｘｔＳｅｑシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上でＮｅｘｔＳｅｑ  ５００／５５０  Ｈｉｇｈ  Ｏｕｔｐｕｔ  ｖ２キットを用いて配列決定し、２×７６ペアエンドリードを生成し、評価のために標的塩基の１５０倍にダウンサンプリングした。２０のマッピング品質を備えたＰｉｃａｒｄ  ＨＳ＿ｍｅｔｒｉｃｓツールをシーケンス解析に使用した。平均値は、すべての観察についてＮ≧３を示した。陽性対照はＡＦＡで剪断されたが、ＦＦＰＥ抽出の対象にはならなかった（表１５）。ＦＦＰＥサンプルの配列決定メトリックを図３９Ｃ−３９Ｇに示す。
【０３１０】
【表２３】
2021526366.tif 000027
【０３１１】
実施例３８：可変洗浄バッファー１温度による高速ハイブリダイゼーションバッファー
【０３１２】
実施例６および１０の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：洗浄バッファー１の温度は結果を配列決定結果を改変するために変えられ、以下に記載されるように、プロトコルが実行された。
【０３１３】
工程１．それぞれおよそ１８７．５ｎｇ（合計して１５００ｎｇ）の８つのサンプルを、０．２ｍｌの薄肉のＰＣＲストリップチューブまたは９６ウェルプレートに移した。エクソーム捕捉プローブパネルを含む４ｕＬ、随意に４ｕＬの第２パネル、８ｕＬの普遍的な遮断薬、５ｕＬの遮断薬溶液／バッファーを添加し、混合物をパルススピンさせ、低熱または無熱で混合物を蒸発させた。
【０３１４】
工程２．表１６に示されるように、９６ウェルのサーマルサイクラーを、以下の条件と、８５°Ｃに設定された加熱された蓋を用いてプログラムされた。
【０３１５】
【表２４】
2021526366.tif 000028
【０３１６】
乾燥したハイブリダイゼーション反応をそれぞれ２０μｌの高速ハイブリダイゼーションバッファーに再懸濁し、フリックさせて混合した。チューブをパルススピンさせて気泡を最小化に抑えた。その後、３０μｌの液体ポリマーをハイブリダイゼーション反応の上部に添加し、チューブをパルススピンさせた。チューブを予熱したサーマルサイクラーに移し、サーモサイクラープログラムの工程２（９５℃で５分間インキュベート）に移した。その後、チューブを６０℃で１５分−４時間、８５℃の蓋を備えたサーマルサイクラーでインキュベートした。４５０μｌの洗浄バッファー１を所望の温度（例えば、７０℃、または所望の配列決定メトリクスに応じて他の温度）に加熱し、７００μｌの洗浄バッファー２を４８℃に加熱した。ストレプトアビジン結合ビーズを少なくとも３０分間室温に平衡化し、混合されるまでボルテックスした。１００μＬのストレプトアビジン結合ビーズを１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブに添加した。各ハイブリダイゼーション反応に対して１本のチューブを調製した。２００μｌの高速結合バッファーをチューブに添加し、ピペッティングで混合した。チューブを磁気スタンド上に１分間置いた後、ビーズペレットを乱すことなく、除去し、透明な上清を廃棄した。その後、チューブを磁気スタンドから取り外した。ペレットは、高速結合バッファーでもう２度、合計３回洗浄した。３回目の洗浄から透明な上清を除去した後、最終的な２００μｌの高速結合バッファーを添加し、ホモジナイズするまでボルテックスによってビーズを再懸濁した。ハイブリダイゼーション反応のチューブを、溶液の混合を維持するのに十分な速度で、シェーカー、ロッカー、またはローテーター上で室温で３０分間、ストレプトアビジン結合ビーズと混合した。
【０３１７】
工程３．ストレプトアビジン結合ビーズとのハイブリダイゼーション反応を含むチューブをミキサーから取り出し、溶液がチューブの底にあることを確認するためにパルススピンさせ、チューブを磁石スタンドに１分間置いた。液体ポリマーを含む透明な上澄みを除去し、ペレットを撹乱しながら廃棄した。チューブを磁石スタンドから取り出し、２００μｌの予熱高速洗浄バッファー１を加え、ピペッティングで混合した。チューブを７０℃で５分間インキュベートし、磁気スタンド上に１分間置いた。ビーズペレットを乱すことなく透明な上清を取り除き、廃棄した。その後、チューブを磁気スタンドから取り出し、追加の２００μｌの予熱高速洗浄バッファー１を添加し、その後、混合して、７０℃で５分間インキュベートした。チューブを、溶液がチューブの底部にあることを確認するためにパルススピンした。ハイブリダイゼーションが完了した後、サーマルサイクラーの蓋を開け、液体ポリマーを含む各ハイブリダイゼーション反応の体積を、洗浄したストレプトアビジン結合ビーズの対応するチューブに迅速に移し、その後、混合した。全体積（＊２００μｌ）を、ハイブリダイゼーション反応ごとに１本の新しい１．５ｍｌマイクロ遠心チューブに移した。チューブを１分間、磁気スタンドに置き、その後、透明な上清を取り除き、廃棄した。チューブを磁気スタンドから取り出し、４８℃の洗浄バッファー２を２００μｌ添加し、ピペッティングで混合し、溶液がチューブの底部にあることを確認するためにパルススピンさせた。チューブを４８℃で５分間インキュベートし、磁気スタンド上に１分間置き、ペレットを乱しながら透明な上清を除去して廃棄した。洗浄工程をもう２回、合計３回の洗浄繰り返した。最後の洗浄後、１０μｌのピペットは、上清の痕跡を除去するために使用された。ペレットを乾燥させることなく、磁気スタンドからチューブを取り出し、４５μｌの水を加えて混合し、氷上でインキュベートした（以下、ストレプトアビジン結合ビーズスラリーと呼ぶ）。
【０３１８】
工程４．サーマルサイクラーを表１７の以下の条件でプログラムし、加熱蓋を１０５℃に設定した。２２．５μｌのストレプトアビジン結合ビーズスラリーを０．２ｍｌの薄肉ＰＣＲストリップチューブに移し、次の工程で使用準備が整うまで氷上で保存した。ストレプトアビジン結合ビーズスラリーを含むチューブにＰＣＲポリメラーゼマスターミックスとアダプター特異的プライマーを添加することによりＰＣＲ混合物を調製し、ピペッティングで混合した。チューブをパルススピンさせ、サーマルサイクラーに移し、サイクリングプログラムを開始する。
【０３１９】
【表２５】
2021526366.tif 000029
【０３２０】
５０μｌ（１．０ｘ）のホモジナイズされたＤＮＡ精製ビーズをチューブに添加し、ボルテックスして混合し、室温で５分間インキュベートした。その後、チューブを１分間磁気プレートに置いた。透明な上清をチューブから取り除いた。ＤＮＡ精製ビーズペレットを１分間、２００μｌの新しく調製された８０％エタノールで洗浄し、その後、エタノールを取り除き、廃棄した。この洗浄は、チューブを磁石プレートに置いたまま、１回繰り返し、合計２回の洗浄を行った。１０μｌのピペットは、ビーズペレットを乱さないことを確認しながら、残留エタノールを除去するために使用された。ビーズペレットを、磁石プレート上で５−１０分間、またはビーズペレットが乾燥するまで、風乾させた。チューブを磁気プレートから取り出し、３２μｌの水を加えた。得られた溶液をピペッティングで混合した後、ホモジナイズして、室温で２分間インキュベートした。その後、チューブを磁気プレート上に置き、３分間、またはビーズが完全にペレット化するまで静置した。富化されたライブラリーを含む透明な上清３０μｌを、清浄な薄壁ＰＣＲ  ０．２ｍｌストリップチューブに移した。
【０３２１】
工程５．富化された各ライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＤＮＡ  ＫｉｔやＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙなどの適切なアッセイを使用して、サイズと品質について検証および、定量化した。その後、サンプルを、分析のためにイルミナ配列決定装置にロードした。サンプリングは  １５０  倍（理論的なリード深度）で行い、マッピングの品質は  ＞２０  だった。様々な高速ハイブリダイゼーション洗浄バッファー１の温度に対する様々なＮＧＳ配列決定測定基準に対する影響を図４０に示す。
【０３２２】
実施例３９：アダプターの鎖を標的とする遮断薬
【０３２３】
修正を伴う実施例８の基本手順を実行した：アダプター配列の上鎖、下鎖、または両方の鎖を標的とする追加の遮断薬が添加された。結果を表１８に示す。「外部」とは、末端とバーコードとの間のアダプターの部分を指す。「内部」とは、バーコードとゲノム挿入物との間のアダプターの部分を指す。オフベイトパーセントを図４１に示す。
【０３２４】
【表２６】
2021526366.tif 000030
【０３２５】
実施例４０：タグメンテーションベースのライブラリー生成の遮断薬
【０３２６】
実施例８の一般的な手順に従って、ゲノムライブラリーを人工トランスポゾンで処理することで、ＤＮＡを断片化して、その断片をアダプター配列でタグ付けして、約３００塩基長さの断片を一度に生成させた。結果として得られた断片のライブラリーは、その後、ＤＮＡ断片の両末端に追加のアダプター配列を付加するプライマーを用いて、限定されたＰＣＲサイクル手順で増幅された。配列決定の前に、アダプターライゲートされたゲノミックライブラリーを、タグメンテーションアダプターのために特別に設計された４つの普遍的な遮断薬（ＤＥＪＬ−１またはＤＥＪＬ−２）；４つの非タグメンテーション普遍的な遮断薬（ＣＤＥＦ）、ゲノム挿入物に隣接するアダプター領域を標的とする２つの普遍的な遮断薬（ＪＬ）、または遮断薬を含まない対照実験（ＮＢ）のいずれかの存在下で、エクソームパネルを用いて富化した。タグメンテーションアダプターを標的とする遮断薬は、１１−１３のロックド核酸（塩基の３２−４５％）、８４−９０℃のＴｍ、２９−３４塩基長さを含んでいた。遮断薬の添加は、オフベイト捕捉の有意な減少をもたらした。オフベイト率は約２５％、ＡＴドロップアウトは約７％、３０Ｘ塩基カバレッジパーセントは約３０％、フォールド８０ベースペナルティは１．６であった。様々なＮＧＳ測定基準のための配列決定後の結果が図４２Ａ−４２Ｅと図４３に示されている。理論に縛られることなく、ｇＤＮＡライブラリーサイズ
【０３２７】
実施例４１：遮断薬中の修飾塩基の位置
【０３２８】
修正を伴う実施例８の基本手順を実行した：４つの普遍的な遮断薬のうち３つは一定に保持され、４つ目の遮断薬はロックド核酸を含む位置のロケーションを変更することによって操作された。すべての遮断薬の設計は、ロックド核酸の配置にかかわらず、少なくとも８２℃の全体的なＴｍを維持した。試験したすべてのデザインは、ロックド核酸の配置に依存しない同等の結果を与えた。ただし、全体のＴｍは少なくとも８２℃であった（データは示されていない）。
【０３２９】
実施例４２：遮断薬および代替的なアダプターデザイン
【０３３０】
修正を伴う実施例８の基本手順を実行した：Ｙアダプターは、「バブル」アダプターまたは「クランプ」アダプターと置き換えられる。遮断薬を使用して捕捉した後、３０Ｘでのパーセント塩基、オフベイト率、ＡＴ／ＧＣドロップアウト、８０倍ベースペナルティ、およびオンターゲットパーセントなどの配列決定メトリクスが測定される。
【０３３１】
実施例４３：液体ポリマーを備えたマルチプレックス高速ハイブリダイゼーションバッファー
【０３３２】
実施例３８の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：１６の異なるソースからのサンプルは、サンプルごとに個別に一意にバーコード化され、高速ハイブリダイゼーションバッファープロトコルを使用して処理される。１６のサンプルの配列決定測定基準は、単一のサンプルのみを使用した実験と比較可能である。
【０３３３】
実施例４４：液体ポリマーを備えたマルチプレックス高速ハイブリダイゼーションバッファー
【０３３４】
実施例３８の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：９６の異なるソースからのサンプルは、サンプルごとに個別に一意にバーコード化され、高速ハイブリダイゼーションバッファープロトコルを使用して処理される。９６のサンプルの配列決定測定基準は、単一のサンプルのみを使用した実験と比較可能である。
【０３３５】
実施例４５：タグメンテーション遮断薬を備えた高速ハイブリダイゼーションバッファー
【０３３６】
実施例３８の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：ライブラリーは実施例４０のタグメンテーション手順を使用して調製された。
【０３３７】
実施例４６：遮断薬および代替手段アダプター設計を備えた速いハイブリダイゼーションバッファー
【０３３８】
実施例３８の一般的な方法を用いて、修飾を伴う配列決定データを取得した：Ｙアダプターは、「バブル」アダプターまたは「クランプ」アダプターと置き換えられる。高速ハイブリダイゼーションバッファーを備える遮断薬を使用して捕捉した後、３０Ｘでのパーセント塩基、オフベイト率、ＡＴ／ＧＣドロップアウト、８０倍ベースペナルティ、およびオンターゲットパーセントなどの配列決定メトリクスが測定される。
【０３３９】
実施例４７：普遍的な遮断薬のための融解曲線分析
【０３４０】
普遍的遮断薬とアダプターライゲートゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）との間のＴｍを経験的に測定するための実験を行った。２７ｎｇ／ｕｌのアダプター、１ｎｍｏｌ／総ｕｌの非修飾全長特異的遮断薬を、０．５ｎｍｏｌ／総ｕｌのＬＮＡ含有遮断薬を備えるｇＤＮＡライブラリーを使用した。適切な成分を１０μＭのＳＹＴＯ９と５０ｎＭのＲＯＸ蛍光色素と混合し、９５℃で変性し、４０°から９５°まで１６時間かけて加熱し、それぞれ０．１°で１分４４秒保持した。熱曲線の間、蛍光をｑＰＣＲシステムで記録し、正規化された導関数（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）としてグラフ化した。（図４４）。この実験では、｛ｇＤＮＡ｝は４５℃まで最大値を提供し、｛ｇＤＮＡ＋非修飾完全長特異的遮断薬｝は５５℃まで最大値を提供し、および、｛ｇＤＮＡ＋ＬＮＡ遮断薬｝は６５℃まで最大値を提供した。
【０３４１】
本発明の好ましい実施形態が本明細書中で示され、記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されているに過ぎないことが当業者に明らかであろう。当業者であれば、多くの変更、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく思いつくだろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替案が、本発明の実施に際して利用され得ることを理解されたい。以下の請求項は本発明の範囲を定義するものであり、この請求項とその均等物の範囲内の方法、および構造体がそれによって包含されるものであるということが意図されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ−１０Ｇ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２８Ｅ】
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【図２８Ｆ】
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【図２８Ｇ】
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【図２８Ｈ】
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【図２８Ｉ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図２９Ｅ】
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【図２９Ｆ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
2021526366.tif 000091
【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
2021526366.tif 000093
【図３０Ｅ】
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【図３０Ｆ】
2021526366.tif 000095
【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
2021526366.tif 000098
【図３２Ａ】
2021526366.tif 000099
【図３２Ｂ】
2021526366.tif 000100
【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
2021526366.tif 000102
【図３２Ｅ】
2021526366.tif 000103
【図３２Ｆ】
2021526366.tif 000104
【図３３Ａ】
2021526366.tif 000105
【図３３Ｂ】
2021526366.tif 000106
【図３３Ｃ】
2021526366.tif 000107
【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
2021526366.tif 000109
【図３４Ｃ】
2021526366.tif 000110
【図３４Ｄ】
2021526366.tif 000111
【図３４Ｅ】
2021526366.tif 000112
【図３５Ａ】
2021526366.tif 000113
【図３５Ｂ】
2021526366.tif 000114
【図３６】
2021526366.tif 000115
【図３７Ａ】
2021526366.tif 000116
【図３７Ｂ】
2021526366.tif 000117
【図３７Ｃ】
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【図３７Ｄ】
2021526366.tif 000119
【図３７Ｅ】
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【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図３９Ｄ】
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【図３９Ｅ】
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【図３９Ｆ】
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【図３９Ｇ】
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【図４０】
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【図４１】
2021526366.tif 000130
【図４２Ａ】
2021526366.tif 000131
【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４２Ｄ】
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【図４２Ｅ】
2021526366.tif 000135
【図４３】
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【図４４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021526366.tif 000139
2021526366.tif 000140
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