(57)【要約】  本明細書では、操作Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による、分子ワクチン構築物が提示される。ワクチン構築物はまた、宿主細胞内のサイトカインなど、異種遺伝子の発現をモジュレートするための、リガンド誘導性操作遺伝子スイッチ系も含みうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１または複数の免疫応答誘導性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする、天然に存在しないポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記１または複数のＨＢＶポリペプチドが、ＨＢＶコアペプチド、ＨＢＶ表面ペプチド、ＨＢＶ  Ｐｏｌペプチド、ＨＢＶ  ＨＢＳＰ／ＨＢｘペプチド、ＫＫリンカー、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
（ｉ）前記ＨＢＶコアペプチドが、表３に示されるコアペプチド配列のうちのいずれか１つを有するか、
（ｉｉ）前記ＨＢＶ表面ペプチドが、表３に示される表面ペプチド配列のうちのいずれか１つを有するか、
（ｉｉｉ）前記ＨＢＶ  Ｐｏｌペプチドが、表３に示されるＰｏｌペプチド配列のうちのいずれか１つを有するか、
（ｉｖ）前記ＨＢＶ  ＨＢＳＰ／ＨＢｘペプチドが、表３に示されるＨＢＳＰ／ＨＢｘペプチド配列のうちのいずれか１つを有するか、
（ｖ）前記ＫＫリンカーが、表３に示されるペプチド配列のうちのいずれか１つを、表３に示される他の任意のペプチド配列へと接続するか、または
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）の任意の組合せである、
請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含み、異種遺伝子発現の誘導性制御のための遺伝子スイッチ系をコードする、１または複数のポリヌクレオチドをさらに含むポリヌクレオチドであって、異種遺伝子発現が、前記遺伝子スイッチ系により調節され；前記異種遺伝子が、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記遺伝子スイッチ系が、エクジソン受容体ベースの（ＥｃＲベースの）遺伝子スイッチ系である、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
細胞内の異種遺伝子の発現を調節する方法であって、
（ａ）前記細胞へと、
（ｉ）抑制性遺伝子スイッチまたは誘導性遺伝子スイッチ、および
（ｉｉ）発現が、前記遺伝子スイッチにより調節される異種免疫応答誘導性遺伝子であって、１または複数のＨＢＶポリペプチドのうちの少なくとも１つをコードする異種免疫応答誘導性遺伝子
を含む、１または複数のポリヌクレオチドを導入するステップと；
（ｂ）前記細胞を、前記異種免疫応答誘導性遺伝子の発現を抑制または誘導するのに十分な量の化合物へと曝露するステップと
を含む方法。
【請求項７】
前記遺伝子スイッチが、エクジソン受容体（ＥｃＲ）、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核内受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用性タンパク質１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用性タンパク質１４、およびファルネソール受容体のうちの少なくとも１つに由来する、リガンド結合性ドメインを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）ＨＢＶ  ＨＢｘドメイン、およびＨＢＶ  Ｐｏｌドメイン、ＨＢＶコアドメイン、ＨＢＶプレコアドメイン、もしくはＨＢＶ表面ドメインのうちの少なくとも１つ；または
（ｂ）プレコアドメイン、およびＨＢＶ  Ｐｏｌドメイン、ＨＢＶ  ＨＢｘドメイン、もしくはＨＢＶ表面ドメインのうちの少なくとも１つ
を含むポリペプチド構築物。
【請求項９】
（ｉ）前記ＨＢＶ  ＨＢｘドメインが、配列番号９８に示される配列を有するか；
（ｉｉ）前記ＨＢＶ  Ｐｏｌドメインが、野生型ＨＢＶ  Ｐｏｌドメインと比較した、少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含むか；
（ｉｉｉ）前記ＨＢＶ表面ドメインが、プレＳ１ドメイン、プレＳ２ドメイン、およびＳドメインのうちの少なくとも１つを含むか；または
（ｉｖ）これらの任意の組合せである、
請求項８に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１０】
（ｉ）前記ＨＢＶ  Ｐｏｌドメインが、配列番号９９に示される配列を有するか、
（ｉｉ）前記ＨＢＶ表面ドメインが、配列番号１００に示される配列を有するか、
（ｉｉｉ）前記ＨＢＶコアドメインおよび前記ＨＢＶプレコアドメイン（「コア部分」）が、配列番号１０１に示される配列を有するか、または
（ｉｖ）これらの任意の組合せである、請求項８または９に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１１】
ＳＨＢ（Ｅｎｖ）ドメイン、ＨＢｅＡｇドメイン、ＨＢｘドメイン、およびＰｏｌドメインの各々を含む、請求項８から１０のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１２】
（ｉ）前記ＳＨＢ（Ｅｎｖ）ドメインが、配列番号１０２に示される配列を有し、
（ｉｉ）前記ＨＢｅＡｇドメインが、配列番号１０３に示される配列を有し、
（ｉｉｉ）前記ＨＢｘドメインが、配列番号１０４に示される配列を有し、
（ｉｖ）前記Ｐｏｌドメインが、配列番号１０５に示される配列を有する、
請求項１１に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１３】
配列番号１０６に示される配列を有する、請求項８から１２のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１４】
剛直性リンカーをさらに含む、請求項８から１３のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、配列番号１１２に示される配列を有する、請求項８から１４のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１６】
１または複数のＨＢＶ  ＨＢｘリンカー、ならびにコアドメイン、表面ドメイン、およびＰｏｌドメインのうちの少なくとも１つを含み、前記コアドメイン、前記表面ドメイン、および前記Ｐｏｌドメインのうちの１つのドメインが、前記１または複数のＨＢｘリンカーにより、前記コアドメイン、前記表面ドメイン、および前記Ｐｏｌドメインのうちの別のドメインへと接続された、ポリペプチド構築物。
【請求項１７】
（ｉ）前記表面ドメインが、ＨＢＶプレＳ１ドメイン、ＨＢＶプレＳ２ドメイン、およびＨＢＶ  Ｓドメインのうちの少なくとも１つを含むか；
（ｉｉ）前記１または複数のＨＢＶ  ＨＢｘリンカーが、表３のＨＢｘ−１、ＨＢｘ−２、ＨＢｘ−３、ＨＢｘ−４、ＨＢｘ−５、もしくはＨＢｘ−６のうちのいずれか１つに示される配列を含むか；または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である、
請求項１６に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１８】
前記コアドメインが、前記表面ドメインと隣接する、請求項１６または１７に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１９】
前記表面ドメインが、プレＳ１ドメイン、プレＳ２ドメイン、Ｓドメイン、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項２０】
配列番号１０７に示される配列を有する、請求項１６から１９のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項２１】
アンキリン様リピートドメイン、および１または複数のＨＢＶペプチドを含むポリペプチド構築物。
【請求項２２】
（ｉ）前記アンキリン様リピートタンパク質が、ヒトアンキリン様リピートタンパク質であり、
（ｉｉ）前記１または複数のＨＢＶペプチドが、表３のアミノ酸配列のうちのいずれか１つに示される配列を有する、
請求項２１に記載のポリペプチド構築物。
【請求項２３】
前記１または複数のＨＢＶペプチドが、コアペプチド、表面ペプチド、Ｐｏｌペプチド、およびＨＢＳＰ／ＨＢｘペプチドのうちの１または複数を含む、請求項２１または２２に記載のポリペプチド構築物。
【請求項２４】
（ｉ）前記コアペプチドが、表３のコアアミノ酸配列のうちのいずれか１つに示される配列を有するか；
（ｉｉ）前記表面ペプチドが、表３の表面アミノ酸配列のうちのいずれか１つに示される配列を有するか；
（ｉｉｉ）前記Ｐｏｌペプチドが、表３のＰｏｌアミノ酸配列のうちのいずれか１つに示される配列を有するか；
（ｉｖ）前記ＨＢＳＰ／ＨＢｘペプチドが、表３のＨＢＳＰ／ＨＢｘアミノ酸配列のうちのいずれか１つに示される配列を有するか；または
（ｖ）これらの任意の組合せである
請求項２３に記載のポリペプチド構築物。
【請求項２５】
配列番号１０８に示される配列を有する、請求項２１から２４のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項２６】
表３に示される少なくとも２つのＨＢＶアミノ酸配列を含み、前記少なくとも２つのＨＢＶアミノ酸配列が、ペプチドリンカーにより接続され、前記ペプチドリンカーが、ＫＫリンカーである、ポリペプチド構築物。
【請求項２７】
前記少なくとも２つのＨＢＶアミノ酸配列が、表３に示されるコアペプチド、表面ペプチド、Ｐｏｌペプチド、およびＨＢＳＰ／ＨＢｘペプチドのうちの少なくとも１つを含む、請求項２６に記載のポリペプチド構築物。
【請求項２８】
前記少なくとも２つのＨＢＶアミノ酸配列が、表３に示されるアミノ酸配列の各々を含む、請求項２６または２７に記載のポリペプチド構築物。
【請求項２９】
配列番号１０９に示される配列を有する、請求項２６から２８のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
【請求項３０】
請求項８から２９のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３１】
請求項１から５および３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３２】
アデノウイルスベクターである、請求項３１に記載のベクター。
【請求項３３】
前記アデノウイルスベクターが、ゴリラアデノウイルスベクターである、請求項３２に記載のベクター。
【請求項３４】
ワクチンにおける使用のための、請求項１から５および３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項８から２９のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物、または請求項３１から３３のいずれか一項に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表への参照
電子的に提出され、本出願により出願された配列表（名称：２５８４＿１６１ＰＣ０１＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５；サイズ：３７２，５１４バイト；作成日：２０１９年３月５日）の内容は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示の分野
本開示は、バイオインフォマティクスおよびタンパク質操作における、発展的原理の使用を介してデザインされた、改善型広域スペクトルＨＢＶ分子ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００３】
慢性Ｂ型肝炎は、複数のウイルス（ＨｅｐＢまたはＨＢＶ）遺伝子型を伴う疾患である。ＨＢＶの遺伝子型／遺伝子亜型は、肝疾患の重症度および抗ウイルス治療に対する応答など、臨床的特徴およびウイルス学的特徴の差違との関連が、ますます大きくなっている。ＨＢＶの感染は、肝硬変、肝不全、および肝細胞癌（ＨＣＣ）を結果としてもたらしうる肝炎を引き起こす。ＨＢＶの診断は、血清学的所見に基づく。慢性ＨＢＶ感染には、治癒が存在しない。現在利用可能な処置選択肢は、肝硬変の進行およびウイルスの複製を緩徐化し、ＨＣＣおよび肝不全の発生率を低減することを目的とする。
【０００４】
本開示は、バイオインフォマティクスおよびタンパク質操作における発展的原理の使用を介してデザインされた改善型広域スペクトルＨＢＶ分子ワクチンに関する。これらの新規のＨＢＶワクチンは、ＨＢＶ関連疾患に対する治療用ワクチンとして使用することができる。
【０００５】
参照による組込み
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、参照により具体的かつ個別に組み込まれることが指し示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書では、少なくとも１または複数の免疫応答誘導性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする、天然に存在しない（non-naturally occurring）ポリヌクレオチドが提示される。
【０００７】
一部の実施形態では、前記天然に存在しないポリヌクレオチドは、前記１または複数のＨＢＶポリペプチドを含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、前記１または複数のＨＢＶポリペプチドは、ＨＢＶコアペプチドを含む。一部の実施形態では、前記ＨＢＶコアペプチドは、表３に示されるコアペプチド配列のうちのいずれか１つを有する。一部の実施形態では、前記１または複数のＨＢＶペプチドは、ＨＢＶ表面ペプチドを含む。一部の実施形態では、前記ＨＢＶ表面ペプチドは、表３に示される表面ペプチド配列のうちのいずれか１つを有する。一部の実施形態では、前記１または複数のＨＢＶペプチドは、ＨＢＶ  Ｐｏｌペプチドを含む。一部の実施形態では、前記ＨＢＶ  Ｐｏｌペプチドは、表３に示されるＰｏｌペプチド配列のうちのいずれか１つを有する。一部の実施形態では、前記１または複数のＨＢＶペプチドは、ＨＢＶ  ＨＢＳＰ／ＨＢｘペプチドを含む。一部の実施形態では、前記ＨＢＶ  ＨＢＳＰ／ＨＢｘペプチドは、表３に示されるＨＢＳＰ／ＨＢｘペプチド配列のうちのいずれか１つを有する。一部の実施形態では、前記１または複数のＨＢＶペプチドは、ＫＫリンカーを含む。一部の実施形態では、前記ＫＫリンカーは、表３に示されるペプチド配列のうちのいずれか１つを、表３に示される他の任意（any other）のペプチド配列へと接続する。
【０００８】
本明細書では、本明細書で提示されるポリヌクレオチドのうちのいずれかを含み、異種遺伝子発現の誘導性制御のための遺伝子スイッチ系をコードする、１または複数のポリヌクレオチドをさらに含むポリヌクレオチドであって、異種遺伝子発現が、前記遺伝子スイッチ系により調節され；前記異種遺伝子が、本明細書で記載されるポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む、ポリヌクレオチドが提示される。一部の実施形態では、前記遺伝子スイッチ系は、エクジソン受容体ベースの（ＥｃＲベースの）遺伝子スイッチ系である。一部の実施形態では、前記１または複数のＨＢＶポリペプチドは、ワクチンにおける使用のためのＨＢＶポリペプチドである。
【０００９】
本明細書では、本明細書で提示されるポリヌクレオチドのうちのいずれかを含むベクターが提示される。一部の実施形態では、前記ベクターは、アデノウイルスベクターである。一部の実施形態では、前記アデノウイルスベクターは、ゴリラアデノウイルスベクターである。
【００１０】
本明細書では、細胞内の異種遺伝子の発現を調節する方法であって、前記細胞へと、（ｉ）抑制性遺伝子スイッチまたは誘導性遺伝子スイッチ、および（ｉｉ）発現が、前記遺伝子スイッチにより調節される異種免疫応答誘導性遺伝子であって、１または複数のＨＢＶポリペプチドのうちの少なくとも１つをコードする異種免疫応答誘導性遺伝子を含む、１または複数のポリヌクレオチドを導入するステップと；前記細胞を、前記異種免疫応答誘導性遺伝子の発現を抑制または誘導するのに十分な量の化合物へと曝露するステップとを含む方法が提示される。
【００１１】
一部の実施形態では、前記標的細胞は、本明細書で記載される、細胞内の異種遺伝子の発現を調節する方法における哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、前記遺伝子スイッチは、エクジソン受容体（ＥｃＲ）、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核内受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用性タンパク質１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用性タンパク質１４、およびファルネソール（famesol）受容体のうちの少なくとも１つに由来する、リガンド結合性ドメインを含む。
【００１２】
本明細書では、本明細書で記載されるポリペプチド構築物のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドが提示される。本明細書ではまた、前記ポリヌクレオチドを含むベクターも提示される。一部の実施形態では、前記ベクターは、アデノウイルスベクターである。一部の実施形態では、前記アデノウイルスベクターは、ゴリラアデノウイルスベクターである。
【００１３】
本明細書では、少なくとも１つのＨＢＶペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターであって、アデノウイルスベクターであるベクターが提示される。
【００１４】
本明細書では、少なくとも１つのＨＢＶペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターであって、前記ベクターが、アデノウイルスベクターであり、前記アデノウイルスベクターが、ゴリラアデノウイルスベクターである、ベクターが提示される。
【００１５】
本明細書では、ＨＢＶ  ＨＢｘドメイン、およびＨＢＶ  Ｐｏｌドメイン、ＨＢＶコアドメイン、ＨＢＶプレコアドメイン、またはＨＢＶ表面ドメインのうちの少なくとも１つを含むポリペプチド構築物が提示される。本明細書ではまた、プレコアドメイン、およびＨＢＶ  Ｐｏｌドメイン、ＨＢＶ  ＨＢｘドメイン、またはＨＢＶ表面ドメインのうちの少なくとも１つを含むポリペプチド構築物も提示される。一部の実施形態では、前記ＨＢＶ  ＨＢｘドメインは、配列番号９８に示される配列を有する。一部の実施形態では、前記ＨＢＶ  Ｐｏｌドメインは、野生型ＨＢＶ  Ｐｏｌドメインと比較した、少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含む。一部の実施形態では、前記欠失は、前記野生型ＨＢＶ  Ｐｏｌドメインの欠失部分を含み、前記欠失部分は、アミノ酸５３８〜５４４またはアミノ酸７１０〜７４２のうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、前記欠失部分は、アミノ酸５３８〜５４４およびアミノ酸７１０〜７４２の両方を含む。一部の実施形態では、前記ＨＢＶ  Ｐｏｌドメインは、配列番号９９に示される配列を有する。一部の実施形態では、前記ＨＢＶ表面ドメインは、プレＳ１ドメイン、プレＳ２ドメイン、およびＳドメインのうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、前記ＨＢＶ表面ドメインは、ＨＢＶ  Ｓドメインを含む。一部の実施形態では、前記表面ドメインは、配列番号１００に示される配列を有する。一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、ＨＢＶコアドメインをさらに含む。一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、コア部分を含み、前記コア部分は、前記ＨＢＶコアドメインと、前記ＨＢＶプレコアドメインとを含む。一部の実施形態では、前記コア部分は、配列番号１０１に示される配列を有する。一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、ＳＨＢ（Ｅｎｖ）ドメイン、ＨＢｅＡｇドメイン、ＨＢｘドメイン、およびＰｏｌドメインの各々を含む。一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、Ｎ末端から、Ｃ末端へと、前記ＳＨＢ（Ｅｎｖ）ドメイン、ＨＢｅＡｇドメイン、ＨＢｘドメイン、およびＰｏｌドメインの構造を含む。一部の実施形態では、前記ＳＨＢ（Ｅｎｖ）ドメインは、配列番号１０２に示される配列を有する。一部の実施形態では、前記ＨＢｅＡｇドメインは、配列番号１０３に示される配列を有する。一部の実施形態では、前記ＨＢｘドメインは、配列番号１０４に示される配列を有する。一部の実施形態では、前記Ｐｏｌドメインは、配列番号１０５に示される配列を有する。一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、配列番号１０６に示される配列を有する。
【００１６】
本明細書では、１または複数のＨＢＶ  ＨＢｘリンカー、ならびにコアドメイン、表面ドメイン、およびＰｏｌドメインのうちの少なくとも１つを含み、前記コアドメイン、前記表面ドメイン、および前記Ｐｏｌドメインのうちの１つのドメインが、前記１または複数のＨＢｘリンカーにより、前記コアドメイン、前記表面ドメイン、および前記Ｐｏｌドメインのうちの別のドメインへと接続された、ポリペプチド構築物が提示される。一部の実施形態では、前記表面ドメインは、ＨＢＶプレＳ１ドメイン、ＨＢＶプレＳ２ドメイン、およびＨＢＶ  Ｓドメインのうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、前記１または複数のＨＢＶ  ＨＢｘリンカーは、複数のＨＢＶ  ＨＢｘリンカーを含む。一部の実施形態では、前記複数のＨＢＶ  ＨＢｘリンカーのうちの、少なくとも２つは、アミノ酸配列が異なる。一部の実施形態では、前記ＨＢＶ  ＨＢｘリンカーは、表３のＨＢｘ−１、ＨＢｘ−２、ＨＢｘ−３、ＨＢｘ−４、ＨＢｘ−５、またはＨＢｘ−６のうちのいずれか１つに示される配列を有する。一部の実施形態では、前記コアドメインは、前記表面ドメインと隣接する。一部の実施形態では、前記表面ドメインは、プレＳ１ドメインを含む。一部の実施形態では、前記表面ドメインは、前記１または複数のＨＢｘリンカーのうちの１つにより、前記コアドメインへと接続される。一部の実施形態では、前記Ｐｏｌドメインは、表面ドメインと隣接する。一部の実施形態では、前記表面ドメインは、プレＳ１ドメイン、プレＳ２ドメイン、およびＳドメインのうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、前記表面ドメインは、前記プレＳ１ドメインを含み、前記ＰｏｌドメインのＮ末端部分は、前記プレＳ１ドメインと隣接する。一部の実施形態では、前記Ｐｏｌドメインの、前記Ｎ末端部分は、前記１または複数のＨＢｘリンカーのうちの１つにより、前記プレＳ１ドメインへと接続される。一部の実施形態では、前記表面ドメインは、前記プレＳ２ドメインを含み、前記ＰｏｌドメインのＮ末端部分は、前記プレＳ２ドメインと隣接する。一部の実施形態では、前記Ｐｏｌドメインの、前記Ｎ末端部分は、前記１または複数のＨＢｘリンカーのうちの１つにより、前記プレＳ２ドメインへと接続される。一部の実施形態では、前記表面ドメインは、前記プレＳ２ドメインを含み、前記ＰｏｌドメインのＣ末端部分は、前記プレＳ２ドメインと隣接する。一部の実施形態では、前記Ｐｏｌドメインの、前記Ｃ末端部分は、前記１または複数のＨＢｘリンカーのうちの１つにより、前記プレＳ２ドメインへと接続される。一部の実施形態では、前記表面ドメインは、前記Ｓドメインを含み、前記ＰｏｌドメインのＣ末端部分は、前記Ｓドメインと隣接する。一部の実施形態では、前記Ｐｏｌドメインの、前記Ｃ末端部分は、前記１または複数のＨＢｘリンカーのうちの１つにより、前記Ｓドメインへと接続される。一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、配列番号１０７に示される配列を有する。
【００１７】
本明細書では、アンキリン様リピートドメイン、および１または複数のＨＢＶペプチドを含むポリペプチド構築物が提示される。一部の実施形態では、前記アンキリン様リピートタンパク質は、ヒトアンキリン様リピートタンパク質である。一部の実施形態では、前記１または複数のＨＢＶペプチドは、表３のアミノ酸配列のうちのいずれか１つに示される配列を有する。一部の実施形態では、前記１または複数のＨＢＶペプチドは、コアペプチド、表面ペプチド、Ｐｏｌペプチド、およびＨＢＳＰ／ＨＢｘペプチドのうちの１または複数を含む。一部の実施形態では、前記１または複数のＨＢＶペプチドは、コアペプチドを含み、前記コアペプチドは、表３のコアアミノ酸配列のうちのいずれか１つに示される配列を有する。一部の実施形態では、前記１または複数のＨＢＶペプチドは、表面ペプチドを含み、前記表面ペプチドは、表３の表面アミノ酸配列のうちのいずれか１つに示される配列を有する。一部の実施形態では、前記１または複数のＨＢＶペプチドは、Ｐｏｌペプチドを含み、前記Ｐｏｌペプチドは、表３のＰｏｌアミノ酸配列のうちのいずれか１つに示される配列を有する。一部の実施形態では、前記１または複数のＨＢＶペプチドは、ＨＢＳＰ／ＨＢｘペプチドを含み、前記ＨＢＳＰ／ＨＢｘペプチドは、表３のＨＢＳＰ／ＨＢｘアミノ酸配列のうちのいずれか１つに示される配列を有する。一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、配列番号１０８に示される配列を有する。
【００１８】
本明細書では、表３に示される少なくとも２つのＨＢＶアミノ酸配列を含み、前記少なくとも２つのＨＢＶアミノ酸配列が、ペプチドリンカーにより接続され、前記ペプチドリンカーが、ＫＫリンカーである、ポリペプチド構築物が提示される。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのＨＢＶアミノ酸配列は、表３に示されるコアペプチド、表面ペプチド、Ｐｏｌペプチド、およびＨＢＳＰ／ＨＢｘペプチドのうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのＨＢＶアミノ酸配列は、表３に示されるアミノ酸配列の各々を含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列の前記各々は、前記ＫＫリンカーにより、アミノ酸配列の前記各々のうちの、別のアミノ酸配列へと接続される。一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、配列番号１０９に示される配列を有する。一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリペプチド構築物のうちのいずれかは、ワクチンにおける使用のためのポリペプチド構築物である。本明細書ではまた、本明細書で記載されるポリペプチド構築物のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドも提示される。本明細書ではまた、前記ポリヌクレオチドを含むベクターも提示される。一部の実施形態では、前記ベクターは、アデノウイルスベクターである。一部の実施形態では、前記アデノウイルスベクターは、ゴリラアデノウイルスベクターである。
【００１９】
図面の簡単な説明
本開示の特徴は、特に、付属の特許請求の範囲において明示されている。本開示の特徴および利点についてのよりよい理解は、本開示の原理が用いられる、例示的な実施形態を明示する、以下の詳細な記載および付属の図面を参照することにより得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】慢性ＨＢＶ感染についての概略図である。
【図２】慢性ＨＢＶ感染の過程を示す概略図である。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｂ型肝炎ウイルスについての概略図である。ＨＢＶ  ＤＮＡは、３．２ｋｂの、環状、エンベロープ型で、部分的に二本鎖のＤＮＡゲノムである。ＨＢＶは、４つの遺伝子（Ｓ、Ｃ、Ｐ、およびＸ）を有する。Ｓ遺伝子は、小型表面タンパク質（Ｓ）、中型表面タンパク質（Ｓ＋プレＳ２）、および大型表面タンパク質（Ｓ＋プレＳ２＋プレＳ１）からなる、エンベロープ（脂質二重層）表面タンパク質（ＨＢｓＡｇ）をコードする。Ｃ遺伝子は、カプシドタンパク質またはコアタンパク質をコードする。Ｃ遺伝子は、プレコア領域およびコア領域を有する。翻訳が、プレコア領域で開始される場合、タンパク質は、ＨＢｅＡｇである。翻訳が、コア領域で開始される場合、タンパク質は、ＨＢｃＡｇである。Ｐ遺伝子は、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）をコードする。Ｘ遺伝子は、ｘタンパク質（ＨＢｘＡｇ）をコードする。図３Ｂは、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムについての概観である。ＨＢＶゲノムは、ＴＰ、ＳＰ、ＲＴ、およびＲＨを含むＰｏｌ（８３２アミノ酸）；プレＳ１（１０８アミノ酸）；プレＳ２（５５アミノ酸）；Ｓ（２２６アミノ酸）；プレＣ（２９アミノ酸）；Ｃ（１８３アミノ酸）；ならびにＨＢｘ（１５４アミノ酸）を含む。図３Ｃは、ポリメラーゼコア、コアエンベロープ（プレＳ１、Ｓ２、Ｓ）、ＨＢｅ、およびＨＢｘタンパク質を含む、いくつかの重複ウイルスタンパク質をコードする、ＨＢＶについての概略図を示す。図３Ｄは、ポリメラーゼコア、コアエンベロープ（プレＳ１、Ｓ２、Ｓ）、ＨＢｅ、およびＨＢｘタンパク質を含む、いくつかの重複ウイルスタンパク質をコードする、ＨＢＶゲノムについての概略図を示す。
【図３Ｂ】同上。
【図３Ｃ】同上。
【図３Ｄ】同上。
【図４】ＨＢＶ感染機構についての概観を示す図である。
【図５】ＨＢＶワクチン抗原をデザインするために実施される、全体の概略的ワークフローを示す図である。
【図６】ＨＢＶデザイン１〜５についての構造概略図である。ＨＢＶデザイン１および２は、クレードＤコンセンサスに基づきデザインした。ＨＢＶデザイン３のために、ヒトアンキリン様リピート（ＡＬＲ）タンパク質足場（ＰＤＢコード：１ＱＹＭ）ペプチドを、ヘリックス／ループ領域に、タンデムにグラフトした。２つのＡＬＲ足場を使用し、切断可能リンカー（ＶＳＱＴＳＫＬＴＲ）により接続した。ＨＢＶデザイン４エピトープは、ＫＫリンカーにより隔てた。ＨＢＶデザイン５では、異なるリンカーを使用して、ペプチドを接続した。
【図７】ＮＫ細胞およびＴ細胞を活性化させることにより、免疫応答を促進する、ＩＬ−１２についての概観を示す図である。
【図８】多様なＩＬ−１２リガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系の、多様な構造的構成要素を示す図である。
【図９Ａ】図９Ａは、ＮｅｔＭＨＣ  ４．０による、ＨＢｅについての抗原性予測を示す図である。予測される強い結合ペプチドおよび弱い結合ペプチドの結合指数を、ペプチドの位置に対してプロットした。図９Ｂは、ＮｅｔＭＨＣ  ４．０による、ＨＢｅについての抗原性予測を示す。ピークを同定するために、一階微分および二階微分を、密度プロット上で利用した。図９Ｃは、ＨＢＶ亜型にわたるカバレッジを決定するために、コンセンサス配列に対してアライメントされたアミノ酸配列を示す。
【図９Ｂ】同上。
【図９Ｃ】同上。
【図１０】異なるＨＢＶタンパク質の融合ドメインを強調する、ＴＧ１０５０およびＨＢＶデザイン１についての概略表示である。相同性モデルを使用して、デザインをさらに評価した。
【図１１】ＨＢｘペプチドと連結された、３つの主要タンパク質（コアタンパク質、表面スプライス変異体タンパク質、およびポリメラーゼタンパク質）全てからなる、ＨＢＶデザイン２についての概略図表示である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、コアＨＢＶタンパク質ドメインの構造を示す図である。図１２Ｂは、ＨＢＶプレＳ１ペプチドおよびＨＢＶプレＳ２ペプチドの構造を示す。図１２Ｃは、ＨＢＶ  ＨＢｘの構造を示す。図１２Ｄは、４つのコアペプチド−ＭＨＣ複合体の構造を示す。
【図１２Ｂ】同上。
【図１２Ｃ】同上。
【図１２Ｄ】同上。
【図１３】多重エピトープ抗原に基づく、ＨＢＶデザイン４についての相同性モデルを示す図である。
【図１４】ＲＮＡ  ｑＰＣＲ相対発現アッセイのために作出された、短鎖プライマーおよび長鎖プライマーならびにプローブのセットを示す、例示的概略図である。特異的プライマーは、各ＨＢＶ抗原デザインについてデザインした。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ＨＢＶデザイン１と、ＴＧ１０５０対照との、コア配列の比較を示す図である。図１５Ｂは、ＨＢＶデザイン１と、ＴＧ１０５０対照との配列比較を示す。図１５Ｃは、ＨＢＶデザイン１と、ＴＧ１０５０対照との配列比較を示す。
【図１５Ｂ】同上。
【図１５Ｃ】同上。
【図１６】ＨＢＶデザイン５についての概略表示である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
以下の記載および例は、本開示の実施形態について、詳細に例示する。
【００２２】
本開示は、本明細書で記載される特定の実施形態に限定されず、そのようなものとして、変動しうることを理解されたい。当業者は、本開示には、変動および改変がなされ、これらは、その範囲内に包含されることを認識するであろう。
【００２３】
全ての用語は、それらが、当業者により理解される通りに理解されることを意図する。そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【００２４】
本明細書で使用される節の小見出しは、構成上の目的だけのものであり、記載される主題を限定するものとみなすべきではない。
【００２５】
本開示の多様な特色は、単一の実施形態の文脈で記載しうるが、特色はまた、個別に提示される場合もあり、任意の適切な組合せで提示される場合もある。逆に、本明細書では、明確さのために、本開示を、個別の実施形態の文脈で記載しうるが、本開示はまた、単一の実施形態でも、実施することができる。
【００２６】
以下の定義は、当技術分野における定義を補完し、本出願へと方向付けられ、いかなる関連または非関連の案件、例えば、共同所有される、いかなる特許または出願にも帰属しない。本明細書で記載される方法および材料と、同様または同等である、任意の方法および材料を、本開示の試験の実施において使用しうるが、本明細書では、好ましい材料および方法について記載する。したがって、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態について記載することだけを目的とするものであり、限定的であることを意図するものではない。
【００２７】
定義
本出願では、そうでないことが別段に言明されない限りにおいて、単数形の使用は、複数形を含む。本明細書で使用される通り、そうでないことが文脈により明確に指示されない限りにおいて、単数形の「ある（a）」、「ある（an）」、および「その」は、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。
【００２８】
本出願では、そうでないことが言明されない限りにおいて、「または」の使用は、「および／または」を意味する。本明細書で使用される、「および／または」および「これらの任意の組合せ」という用語、ならびにそれらの文法的同等物は、互換的に使用することができる。これらの用語は、任意の組合せが、具体的に想定されることを伝達しうる。例示だけを目的として述べると、以下の、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」または「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはこれらの任意の組合せ」という語句は、「個別のＡ；個別のＢ；個別のＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；ＡおよびＣ；ならびにＡ、Ｂ、およびＣ」を意味しうる。文脈により、選言的使用が言及されない限りにおいて、「または」という用語は、接続的に使用することもでき、選言的に使用することもできる。
【００２９】
さらに、「〜を含むこと」という用語のほか、「〜を含む」、「〜を含む」、および「含まれた」など、他の形態の使用も、非限定的である。
【００３０】
本明細書における、「一部の実施形態」、「ある実施形態」、「一実施形態」、または「他の実施形態」への言及は、実施形態との関連で記載される、特定の特色、構造、または特徴が、本開示の、少なくとも一部の実施形態には含まれるが、全ての実施形態には、必ずしも含まれないことを意味する。
【００３１】
本明細書および特許請求の範囲で使用される「〜を含むこと（comprising）」（「〜を含む（comprise）」および「〜を含む（comprises）」など、「〜を含むこと（comprising）」の任意の形態）、「〜を有すること」（「〜を有する（have）」および「〜を有する（has）」など、「〜を有すること」の任意の形態）、「〜を含むこと（including）」（「〜を含む（include）」および「〜を含む（includes）」など、「〜を含むこと（including）」の任意の形態）、または「〜を含有すること」（「〜を含有する（contain）」および「〜を含有する（contains）」など、「〜を含有すること」の任意の形態）という語は、包含的またはオープンエンドであり、さらなる、列挙されていない要素または方法ステップを除外しない。本明細書で論じられる任意の実施形態は、本開示の任意の方法または組成物に関して実施することが可能であり、この逆も成り立つことが想定される。さらに、本開示の組成物を使用して、本開示の方法を達成することができる。
【００３２】
基準数値に関して、本明細書で使用される、「約」という用語、およびその文法的同等物は、数値自体、およびこの数値から±１０％の範囲の値を含みうる。
【００３３】
「約」または「およそ」という用語は、当業者により決定される、特定の値についての、許容可能な誤差範囲内であって、部分的に、値がどのようにして測定または決定されるのか、すなわち、測定系の限界に依存する誤差範囲内を意味する。例えば、「約」は、当技術分野における慣行に従い、１標準偏差または１標準偏差を超える範囲内を意味しうる。代替的に、「約」は、所与の値の、最大で２０％、例えば、最大で１０％、最大で５％、または最大で１％の範囲も意味しうる。別の例では、「約１０」の量は、１０および９〜１１の任意の量を含む。さらに別の例では、基準数値との関係における「約」という用語はまた、値±この値から１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の範囲も含む。代替的に、特に、生物学的系または生物学的過程に関して、「約」という用語は、値の桁数内、好ましくは、５倍以内、より好ましくは２倍以内も意味しうる。特定の値を、本出願および特許請求の範囲において記載する場合、そうでないことが言明されない限りにおいて、特定の値について、許容可能な誤差範囲内を意味する「約」という用語を仮定すべきである。
【００３４】
本明細書で使用される「単離」という用語およびその文法的同等物は、その天然環境からの核酸の摘出を意味する。本明細書で使用される「精製」という用語およびその文法的同等物は、分子または組成物が、天然から摘出されたもの（ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡを含む）であれ、合成されたもの（ｃＤＮＡを含む）であれ、かつ／または検査室条件下で増幅されたのであれ、純度が増大しており、この場合、「純度」とは、相対的用語であり、「絶対純度」ではないことを意味する。一方、核酸およびタンパク質は、希釈剤またはアジュバントと共に製剤化される場合があるが、実際的な目的では、単離されているものとしうることを理解されたい。例えば、核酸は、細胞への導入のために使用する場合、許容可能な担体または希釈剤と混合することが典型的である。本明細書で使用される「実質的に精製された」という用語およびその文法的同等物は、核酸、ポリペプチド、タンパク質、または他の化合物が、天然では会合する、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、および他の分子を本質的に含まない、すなわち、約５０％を超えて含まない、約７０％を超えて含まない、約９０％を超えて含まない、核酸配列、ポリペプチド、タンパク質または他の化合物を指す。
【００３５】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド構築物」、「遺伝子」、「遺伝子構築物」、「異種遺伝子」、およびこれらの文法的同等物は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである、任意の長さのヌクレオチドまたは核酸のポリマー形態を指す。この用語は、分子の一次構造だけを指す。したがって、この用語は、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、三重鎖ＤＮＡのほか、二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡも含む。この用語はまた、例えば、ポリヌクレオチドのメチル化および／またはキャッピングによる修飾形態、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形態も含みうる。用語はまた、天然のものではないヌクレオチドまたは合成ヌクレオチドのほか、ヌクレオチド類似体を含む分子を含むことも意図する。本明細書で開示または想定される核酸配列およびベクターは、細胞へと、トランスフェクション、形質転換、または形質導入により導入することができる。
【００３６】
本明細書で使用される、「トランスフェクション」、「形質転換」、または「形質導入」とは、物理的方法または化学的方法を使用することによる、１または複数の外因性ポリヌクレオチドの、宿主細胞への導入を指す。当技術分野では、多くのトランスフェクション法が公知であり、例えば、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿法（例えば、Murray E. J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)を参照されたい）；ＤＥＡＥ−デキストラン法；電気穿孔法；カチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション法；タングステン粒子促進型遺伝子銃法（Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)）;およびリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈殿法（Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)）を含む。ファージベクターまたはウイルスベクターは、それらの多くが市販されている、適切なパッケージング細胞内で、感染性粒子を増殖させた後で、宿主細胞へと導入することができる。
【００３７】
本明細書で使用される、「ポリペプチド」、「ペプチド」、「ポリペプチド構築物」、「ペプチド構築物」、およびこれらの文法的同等物は、アミノ酸残基のポリマーを指す。「成熟タンパク質」とは、全長タンパク質であり、任意選択で、グリコシル化または所与の細胞内環境内のタンパク質に典型的な他の修飾を含むタンパク質である。本明細書で開示されるポリペプチドおよびタンパク質（これらの機能的部分および機能的変異体を含む）は、１または複数の、天然に存在するアミノ酸の代わりに、合成アミノ酸を含みうる。当技術分野では、このような合成アミノ酸が公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α−アミノ−ｎ−デカン酸、ホモセリン、Ｓ−アセチルアミノメチルシステイン、ｔｒａｎｓ−３−ヒドロキシプロリンおよびｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、４−アミノフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリン、β−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン−２−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’−ベンジル−Ｎ’−メチルリシン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジルリシン、６−ヒドロキシリシン、オルニチン、α−アミノシクロペンタンカルボン酸、α−アミノシクロヘキサンカルボン酸、α−アミノシクロヘプタンカルボン酸、α−（２−アミノ−２−ノルボルナン）カルボン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、およびα−ｔｅｒｔ−ブチルグリシンを含む。本開示は、操作細胞内の、本明細書で記載されるポリペプチドの発現が、ポリペプチド構築物の、１または複数のアミノ酸の翻訳後修飾と関連しうることをさらに想定する。翻訳後修飾の非限定例は、リン酸化、アセチル化およびホルミル化を含むアシル化、グリコシル化（Ｎ連結型およびＯ連結型を含む）、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化およびエチル化を含むアルキル化、ユビキチン化、ピロリドンカルボン酸の付加、ジスルフィド架橋の形成、硫酸化、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、ファルネシル化、ゲラニル化、グリピオン化、リポイル化、およびヨード化を含む。
【００３８】
核酸および／または核酸配列は、天然または人工で、共通の先祖核酸または先祖核酸配列に由来する場合、「相同」である。タンパク質および／またはタンパク質配列は、それらのコードＤＮＡが、天然または人工で、共通の先祖核酸または先祖核酸配列に由来する場合、「相同」である。相同な分子は、相同体と称する場合がある。例えば、本明細書で記載される、任意の天然タンパク質は、任意の利用可能な突然変異誘発法により修飾することができる。発現させると、この突然変異核酸は、元の核酸によりコードされるタンパク質と相同なポリペプチドをコードする。相同性は一般に、２つまたはこれを超える核酸またはタンパク質（またはこれらの配列）の間の配列同一性から推定される。相同性を確立するのに有用な配列の間の同一性の、正確な百分率は、問題の核酸およびタンパク質と共に変動するが、少なくとも２５％の配列同一性を使用して、相同性を確立する。高レベルの配列同一性、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％、またはこれを超える配列同一性もまた、相同性を確立するのに使用することができる。本明細書では、配列同一性百分率を決定するための方法（例えば、デフォルトパラメータを使用する、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）について記載するが、これらは、一般に利用可能である。
【００３９】
ポリペプチドの、２つの核酸配列またはアミノ酸配列の文脈において、本明細書で使用される、「同一」または「配列同一性」という用語およびその文法的同等物は、指定された比較域にわたり、最大の照応関係についてアライメントされた場合に同じである、２つの配列内の残基を指す。本明細書で使用される「比較域」とは、少なくとも約２０、通例、約５０〜約２００、より通例では、約１００〜約１５０の連続する位置によるセグメントであって、２つの配列を、最適にアライメントした後で、その中の配列を、同じ数の、連続する位置による基準配列と比較しうるセグメントを指す。当技術分野では、比較のための配列アライメント法が周知である。比較のための最適な配列アライメントは、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズム；Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)のアライメントアルゴリズム；Pearson and Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A., 85:2444 (1988)の類似性検索法；これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ  Ｃａｌｉｆ．によるＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム内のＣＬＵＳＴＡＬ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．における、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡを含むがこれらに限定されない）により行うことができ、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムについては、Higgins and Sharp, Gene, 73:237-244 (1988)およびHiggins and Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989)、Corpet et al., Nucleic Acids Res., 16:10881-10890 (1988)、Huang et al., Computer Applications in the Biosciences, 8:155-165 (1992)、およびPearson et al., Methods in Molecular Biology, 24:307-331 (1994)により十分に記載されている。アライメントはまた、目視および手作業のアライメントにより実施されることも多い。実施形態の１つのクラスでは、本明細書のポリペプチドは、例えば、デフォルトパラメータを使用する、ＢＬＡＳＴＰ（もしくはＣＬＵＳＴＡＬ、または他の任意の利用可能なアライメントソフトウェア）により測定される通り、基準ポリペプチドまたはこの断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９８％の９９％、または１００％同一である。同様に、核酸はまた、出発核酸に照らして記載することもでき、例えば、それらは、例えば、デフォルトパラメータを使用する、ＢＬＡＳＴＮ（もしくはＣＬＵＳＴＡＬ、または他の任意の利用可能なアライメントソフトウェア）により測定される通り、基準核酸またはこの断片と５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９８％、９９％、または１００％同一でありうる。１つの分子が、大型の分子に対して、ある特定の百分率の配列同一性を有するという場合、これは、２つの分子が最適にアライメントされれば、小型の分子内の、前記百分率の残基は、２つの分子が最適にアライメントされた順序に従い、大型の分子内にマッチ残基を見出すことを意味する。
【００４０】
核酸配列またはアミノ酸配列に対して適用される「実質的に同一な」という用語およびその文法的同等物は、核酸配列またはアミノ酸配列が、上記で記載したプログラム、例えば、標準的なパラメータを使用するＢＬＡＳＴを使用する基準配列と比較して、少なくとも９０％の配列同一性、またはこれを超える配列同一性、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。例えば、ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のための）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列のために、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)を参照されたい）。配列同一性百分率は、２つの最適にアライメントされた配列を、比較域にわたり比較することにより決定し、比較域内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのために、基準配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる。百分率は、同一な核酸塩基またはアミノ酸残基が、両方の配列内で生じる位置の数を決定して、マッチさせた位置の数を求め、マッチさせた位置の数を、比較域内の位置の総数で除し、結果に、１００を乗じて、配列同一性百分率を求めることにより計算する。複数の実施形態では、実質的な同一性は、少なくとも約５０残基の長さの配列の領域にわたり、少なくとも約１００残基の領域にわたり存在し、複数の実施形態では、配列は、少なくとも約１５０残基にわたり、実質的に同一である。複数の実施形態では、配列は、コード領域の全長にわたり、実質的に同一である。
【００４１】
「発現ベクター」または「ベクター」とは、細胞内のポリヌクレオチドの複製の自律的単位として挙動する（すなわち、それ自身の制御下における複製が可能である）か、または宿主細胞の染色体への挿入により複製が可能となる、任意の遺伝子エレメント、例えば、プラスミド、染色体、ウイルス、トランスポゾンであって、接合させたセグメントの複製および／または発現をもたらすように、それへと、別のポリヌクレオチドセグメントを接合させた遺伝子エレメントである。適切なベクターは、プラスミド、トランスポゾン、バクテリオファージ、およびコスミドを含むがこれらに限定されない。ベクターは、所望の宿主細胞中へのベクターのライゲーションまたは挿入を実施し、接合させたセグメントの発現を実施するのに必要なポリヌクレオチド配列を含有しうる。このような配列は、宿主生物に応じて異なり、転写を実施するプロモーター配列、転写を増加させるエンハンサー配列、リボソーム結合性部位の配列、および転写翻訳終結配列を含む。代替的に、発現ベクターは、ベクターの、宿主細胞のＤＮＡ配列へのライゲーションまたは組込みを伴わずに、その中でコードされる核酸配列の産物を、直接発現させることが可能でありうる。一部の実施形態では、ベクターは、宿主細胞内で複製することが可能であり、適切な選択的圧の存在下で、宿主細胞内のＤＮＡの染色体外セグメントとして存続する、「エピソーム発現ベクター」または「エピソーム」である（例えば、Conese et al., Gene Therapy, 11:1735-1742 (2004)を参照されたい）。代表的な、市販のエピソーム発現ベクターは、エプスタイン−バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）複製起点（ｏｒｉＰ）を用いるエピソームプラスミドを含むがこれらに限定されない。ベクターである、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ７、ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐｃＤＮＡ３．１およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐＢＫ−ＣＭＶは、ＥＢＮＡ１およびｏｒｉＰの代わりに、Ｔ抗原およびＳＶ４０の複製起点を使用する、エピソームベクターの非限定的な例を表す。ベクターはまた、選択用マーカー遺伝子も含みうる。
【００４２】
本明細書で使用される、「アデノウイルス」という用語は、アデノウイルスの生活環に参与する能力を保持し、例えば、破壊（例えば、超音波処理）、変性（例えば、熱または溶媒の使用）、または架橋（例えば、ホルマリン架橋を介する）により、物理的に不活化されていない、アデノウイルスを指す。「アデノウイルスの生活環」は、（１）ウイルスの、細胞への結合および侵入、（２）アデノウイルスゲノムへの転写およびアデノウイルスタンパク質への翻訳、（３）アデノウイルスゲノムの複製、ならびに（４）ウイルス粒子のアセンブリーを含む（例えば、Fields Virology, 5th ed., Knipe et al. (eds.), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2006)を参照されたい）。本明細書で使用される、「アデノウイルスベクター」という用語は、アデノウイルスゲノムが、アデノウイルスゲノムに照らして非天然である核酸配列に適合するように操作されたアデノウイルスを指す。典型的に、アデノウイルスベクターは、例えば、アデノウイルスへの遺伝子導入のための、非天然の核酸配列の挿入に適合するように、アデノウイルスのアデノウイルスゲノムへと、１または複数の突然変異（例えば、欠失、挿入、または置換）を導入することにより作出される。
【００４３】
本明細書で使用される「選択用マーカー遺伝子」という用語は、核酸配列を発現させる細胞を、対応する選択用薬剤の存在下で、これと順方向または逆方向に、特異的に選択することを可能とする核酸配列を指す。当技術分野では、適切な選択用マーカー遺伝子が公知であり、例えば、国際特許出願公開第１９９２／０８７９６号パンフレットおよび同第１９９４／２８１４３号パンフレット、Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567 (1980)、O’Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527 (1981)、Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072 (1981)、Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1 (1981)、Santerre et al., Gene, 30: 147 (1984)、Kent et al., Science, 237: 901-903 (1987)、Wigler et al., Cell, 11: 223 (1977)、Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026 (1962)、Lowy et al., Cell, 22: 817 (1980)、ならびに米国特許第５，１２２，４６４号明細書および同第５，７７０，３５９号明細書において記載されている。
【００４４】
本明細書で使用される「コード配列」とは、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのセグメントを指す。領域または配列には、５’末端の近傍では、開始コドンが結合し、３’末端の近傍では、終止コドンが結合する。コード配列はまた、オープンリーディングフレームと称することもできる。
【００４５】
本明細書で使用される「作動可能に連結された」とは、ＤＮＡセグメントの、別のＤＮＡセグメントへの、物理的な連結および／または機能的な連結であって、セグメントが、それらの意図される方式で機能することを可能とするような連結を指す。遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列は、それが、例えば、プロモーター、エンハンサー、および／またはサイレンサーなどの調節配列に、ＤＮＡ配列の転写のモジュレーションを、直接的または間接的に可能とする方式で連結されている場合に、調節配列に作動可能に連結されている。例えば、ＤＮＡ配列は、それが、プロモーターの転写開始部位に対して、下流において、転写開始部位に対して、適正なリーディングフレーム内で、プロモーターへとライゲーションされており、ＤＮＡ配列を通して、転写の伸長が進行することを可能とする場合に、プロモーターに作動可能に連結されている。エンハンサーまたはサイレンサーは、それが、それぞれ、ＤＮＡ配列の転写を増加または減少させるように、ＤＮＡ配列へとライゲーションされている場合に、遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。エンハンサーおよびサイレンサーは、ＤＮＡ配列のコード領域の上流に位置する場合もあり、この下流に位置する場合もあり、この中に埋め込まれている場合もある。シグナル配列が、ポリペプチドの分泌に参与するプレタンパク質として発現する場合、シグナル配列のＤＮＡは、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている。ＤＮＡ配列の、調節配列への連結は、典型的に、適切な制限部位におけるライゲーションにより、または当業者に公知の制限エンドヌクレアーゼを使用して、配列内に挿入された、アダプターまたはリンカーを介して達せられる。
【００４６】
本明細書で使用される「〜を誘導する」、「誘導」という用語、およびその文法的同等物は、転写調節因子によりもたらされる、核酸配列の転写、プロモーターの活性、および／またはプロモーターの発現の、何らかの基礎転写レベルと比べた上昇を指す。
【００４７】
「転写調節因子」という用語は、ある特定の環境条件下で、プロモーター駆動性ＤＮＡ配列の転写を防止もしくは阻害するように作用する生化学的エレメント（例えば、リプレッサータンパク質または核阻害性タンパク質）、または、ある特定の環境条件下で、プロモーター駆動性ＤＮＡ配列の転写を可能とするか、もしくは刺激するように作用する生化学的エレメント（例えば、インデューサーまたはエンハンサー）を指す。
【００４８】
本明細書で使用される「エンハンサー」という用語は、例えば、それが作動可能に連結された核酸配列の転写を増大させるＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、核酸配列のコード領域から、何キロベースも離れて位置することが可能であり、調節因子の結合、ＤＮＡのメチル化パターン、またはＤＮＡ構造の変化を媒介しうる。当技術分野では、様々な異なる供給源に由来する、多数のエンハンサーが周知であり、クローニングされたポリヌクレオチドとして、またはクローニングされたポリヌクレオチド内で利用可能である（例えば、ＡＴＣＣなどの寄託先のほか、他の商業的供給源または個人的供給源から）。プロモーター（一般に使用されるＣＭＶプロモーターなど）を含む、多数のポリヌクレオチドはまた、エンハンサー配列も含む。エンハンサーは、コード配列の上流に位置する場合もあり、この中に位置する場合もあり、この下流に位置する場合もある。「Ｉｇエンハンサー」という用語は、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座内にマップされるエンハンサー領域に由来するエンハンサーエレメント（このようなエンハンサーは、例えば、重鎖（ミュー）５’側エンハンサー、軽鎖（カッパ）５’側エンハンサー、カッパイントロンエンハンサーおよびミューイントロンエンハンサー、ならびに３’側エンハンサーを含む）を指す（一般に、Paul W. E. (ed), Fundamental Immunology, 3rd Edition, Raven Press, New York (1993), pages 353-363、および米国特許第５，８８５，８２７号明細書を参照されたい）。
【００４９】
「プロモーター」とは、コード配列の転写を誘発する、ポリヌクレオチドの領域を指す。プロモーターは、ＤＮＡの、同じ鎖上の、遺伝子の転写開始部位の近傍であり、かつ、上流に（センス鎖の５’側領域に向かって）位置する。あるプロモーターが、細胞内の全ての状況において活性であるので、構成的であるのに対し、他のプロモーター、例えば、誘導性プロモーターは、特異的刺激に応答して調節され、活性となる。本明細書で使用される「プロモーター活性」という用語およびその文法的同等物は、その活性が測定されるプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現の程度を指す。プロモーター活性は、例えば、ノーザンブロット解析により、産生されるＲＮＡ転写物の量を決定することにより、直接的に測定することもでき、プロモーターに連結されたレポーター核酸配列など、連結された核酸配列によりコードされる産物の量を決定することにより、間接的に測定することもできる。
【００５０】
本明細書で使用される「誘導性プロモーター」とは、転写調節因子、例えば、生物因子または非生物因子の存在または非存在により、活性へと誘導されるプロモーターを指す。誘導性プロモーターは、それらに作動可能に連結した遺伝子の発現が、生物または特に、組織の発生の、ある特定の段階において、オンまたはオフにされうるため、有用である。誘導性プロモーターの非限定例は、アルコール調節性プロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、発症機序調節性プロモーター、温度調節性プロモーター、および光調節性プロモーターを含む。誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチの一部または遺伝子スイッチでありうる。誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチのリガンド誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。場合によって、遺伝子スイッチは、それらの各々が、参照によりその全体において組み込まれる、国際特許出願第２００１／０７０８１６号パンフレット；同第２００２／０２９０７５号パンフレット；同第２００２／０６６６１３号パンフレット；同第２００２／０６６６１４号パンフレット；同第２００２／０６６６１２号パンフレット；同第２００２／０６６６１５号パンフレット；同第２００３／０２７２６６号パンフレット；同第２００３／０２７２８９号パンフレット；同第２００５／１０８６１７号パンフレット；同第２００９／０４５３７０号パンフレット；同第２００９／０４８５６０号パンフレット；同第２０１０／０４２１８９号パンフレット；同第２０１０／０４２１８９号パンフレット；同第２０１１／１１９７７３号パンフレット号パンフレット；および同第２０１２／１２２０２５号パンフレット；ならびに米国特許第７，０９１，０３８号明細書；同第７，７７６，５８７号明細書；同第７，８０７，４１７号明細書；同第８，２０２，７１８号明細書；同第８，１０５，８２５号明細書；同第８，１６８，４２６号明細書；同第７，５３１，３２６号明細書；同第８，２３６，５５６号明細書；同第８，５９８，４０９号明細書；同第８，７１５，９５９号明細書；同第７，６０１，５０８号明細書；同第７，８２９，６７６号明細書；同第７，９１９，２６９号明細書；同第８，０３０，０６７号明細書；同第７，５６３，８７９号明細書；同第８，０２１，８７８号明細書；同第８，４９７，０９３号明細書；同第７，９３５，５１０号明細書；同第８，０７６，４５４号明細書；同第９，４０２，９１９号明細書；同第９，４９３，５４０号明細書；同第９，２４９，２０７号明細書；および同第９，４９２，４８２号明細書において記載されている系のうちのいずれかの、エクジソンベースの受容体による構成要素から選択しうるが、これらに限定されない。
【００５１】
「遺伝子スイッチ（gene switch）」または「遺伝子スイッチ（genetic switch）」という用語は、プロモーターと関連する応答エレメントの組合せを指し、例えば、１または複数のリガンドの存在下で、応答エレメントおよびプロモーターを組み込んだ遺伝子の発現をモジュレートする、ＥｃＲベースの系を指す。緊密に調節された誘導性遺伝子発現系または遺伝子スイッチは、遺伝子治療、細胞内の、大スケールのタンパク質の作製、細胞ベースのハイスループットのスクリーニングアッセイ、機能的なゲノミクス、ならびにトランスジェニック植物およびトランスジェニック動物における形質の調節など、多様な適用に有用である。このような誘導性遺伝子発現系は、リガンド誘導性異種遺伝子発現系を含みうる。
【００５２】
「Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾン系」とは、ＤＮＡ配列を、脊椎動物の染色体へと導入するための合成ＤＮＡトランスポゾン系を指す。系についての、一部の例示的な実施形態については、例えば、米国特許第６，４８９，４５８号明細書、同第８，２２７，４３２号明細書、同第９，２２８，１８０号明細書、および国際公開第２０１６／１４５１４６号パンフレットにおいて記載されている。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポザーゼおよびＳＢトランスポゾンから構成される。複数の実施形態では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系は、ＳＢ１１トランスポゾン系、ＳＢ１００Ｘトランスポゾン系、またはＳＢ１１０トランスポゾン系を含みうる。
【００５３】
「トランスポゾン」または「転移性エレメント」（ＴＥ）とは、ゲノム内のその位置を変化させ、場合によって、突然変異を創出するか、または復帰させ、細胞のゲノムサイズを変更するベクターＤＮＡ配列である。転移は、ＴＥの重複を結果としてもたらすことが多い。クラスＩのＴＥは、２段階でコピーされる：まず、クラスＩのＴＥは、ＤＮＡからＲＮＡへと転写され、次いで、産生されたＲＮＡは、ＤＮＡへと逆転写される。次いで、この、コピーされたＤＮＡは、ゲノム内の新たな位置に挿入される。逆転写ステップは、ＴＥ自身によりコードされうる逆転写酵素により触媒される。レトロトランスポゾンの特徴は、ＨＩＶなどのレトロウイルスと同様である。クラスＩＩのＴＥによるカットアンドペースト転移機構は、ＲＮＡ中間体を伴わない。転移は、いくつかのトランスポザーゼ酵素により触媒される。あるトランスポザーゼは、ＤＮＡ内の任意の標的部位に非特異的に結合するのに対し、他のトランスポザーゼは、特異的ＤＮＡ配列標的に結合する。トランスポザーゼは、標的部位において、互い違いの（staggered）切断をもたらす結果として、５’側または３’側における、一本鎖のＤＮＡ突出（粘着（sticky）末端）をもたらす。このステップは、ＤＮＡトランスポゾンを切り出し、次いで、ＤＮＡトランスポゾンは、新たな標的部位へとライゲーションされるが、この過程は、ギャップを埋めるＤＮＡポリメラーゼの活性と、糖リン酸骨格をつなぎ合わせるＤＮＡリガーゼの活性とを伴う。これは、標的部位の重複を結果としてもたらす。ＤＮＡトランスポゾンの挿入部位は、標的ＤＮＡ内が互い違いに切断され、ＤＮＡポリメラーゼにより埋められることにより創出されうる短い直接リピート、およびそれに後続する、トランスポザーゼによるＴＥの切出しに重要な一連の逆位リピートにより同定されうる。カットアンドペーストＴＥは、ドナー部位は既に複製されているが、標的部位はまだ複製されていない、細胞周期のＳ期において、転移が生じる場合に重複しうる。転移は、クラスＩ  ＴＥおよびクラスＩＩ  ＴＥのいずれにおいても、自律型転移または非自律型転移として分類することができる。自律型ＴＥが、それ自身で移動しうるのに対し、非自律型ＴＥは、移動するのに、別のＴＥの存在を必要とする。これは、非自律型ＴＥが、トランスポザーゼ（クラスＩＩの場合）または逆転写酵素（クラスＩの場合）を欠くためであることが多い。
【００５４】
「トランスポザーゼ」とは、トランスポゾンの末端に結合し、カットアンドペースト機構または複製性転移機構による、トランスポゾンの、ゲノムの別の部分への移動を触媒する酵素を指す。
【００５５】
本明細書で使用される「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」とは、細胞媒介性免疫において、中心的な役割を果たす、リンパ球の種類である。「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）など、他のリンパ球と区別されうる。
【００５６】
「ヘルパーＴ細胞」（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞の、血漿細胞およびメモリーＢ細胞への成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫過程において、他の白血球を支援する。これらの細胞はまた、細胞表面上において、ＣＤ４糖タンパク質を発現するために、ＣＤ４＋  Ｔ細胞としても公知である。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上で発現する、ＭＨＣクラスＩＩ分子により、ペプチド抗原を提示されると、活性化する。活性化すると、ヘルパーＴ細胞は、急速に分裂し、活性の免疫応答を調節するか、またはこれらを支援する、サイトカインと呼ばれる、小型のタンパク質を分泌する。これらの細胞は、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ９、ＴＨ１７、ＴＨ２２、またはＴＦＨ（濾胞性ヘルパーＴ細胞）を含む、いくつかの亜型であって、異なるサイトカインを分泌して、異なる種類の免疫応答を容易とする、いくつかの亜型のうちの１つへと分化しうる。ＡＰＣからのシグナル伝達は、Ｔ細胞を、特定の亜型へと方向付ける。
【００５７】
「細胞傷害性Ｔ細胞」（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）または「細胞傷害性Ｔリンパ球」は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また、移植拒絶にも関与している。これらの細胞はまた、それらの表面において、ＣＤ８糖タンパク質を発現するので、ＣＤ８＋  Ｔ細胞としても公知である。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在する、ＭＨＣクラスＩ分子と会合する抗原に結合することにより、それらの標的を認識する。調節性Ｔ細胞により分泌される、ＩＬ−１０、アデノシン、および他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞は、アネルギー状態へと不活化される場合があり、これにより、自己免疫疾患を防止する。
【００５８】
「メモリーＴ細胞」は、感染が消失した後で、長期にわたり存続する、抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。メモリーＴ細胞は、それらのコグネイト抗原へと再曝露されると、多数のエフェクターＴ細胞へと急速に拡大増殖し、これにより、免疫系に、過去の感染に対する「メモリー」をもたらす。メモリーＴ細胞は、３つの亜型：セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）および２種類のエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋細胞の場合もあり、ＣＤ８＋細胞の場合もある。メモリーＴ細胞は、典型的には細胞表面タンパク質である、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、および／またはＣＣＲ７を発現する。
【００５９】
かつては、サプレッサーＴ細胞として公知であった、「調節性Ｔ細胞」（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持において役割を果たす。調節性Ｔ細胞の主要な役割は、Ｔ細胞媒介性免疫を遮断して、免疫反応を終了させ、胸腺内の陰性選択過程を回避した自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【００６０】
「ナチュラルキラーＴ細胞」（ＮＫＴ細胞（自然免疫系のナチュラルキラー細胞と混同しないこと））は、獲得免疫系を、自然免疫系と橋渡しする。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子により提示されるペプチド抗原を認識する従来のＴ細胞と異なり、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄと呼ばれる分子により提示される糖脂質抗原を認識する。活性化すると、これらの細胞は、Ｔヘルパー（ＴＨ）細胞および細胞傷害性Ｔ（ＴＣ）細胞の両方に帰せられた機能（すなわち、サイトカインの産生および細胞溶解性／細胞殺滅分子の放出）を果たしうる。ＮＫＴ細胞はまた、一部の腫瘍細胞およびヘルペスウイルスに感染した細胞を認識し、これらを消失させることも可能である。
【００６１】
「養子Ｔ細胞移入」とは、腫瘍特異的Ｔ細胞の単離およびｅｘ  ｖｉｖｏにおける拡大増殖であって、ワクチン接種単独または患者の天然の腫瘍応答により得られうる数の細胞より大きな数のＴ細胞を達成する、単離および拡大増殖を指す。次いで、それらの免疫系に、がんに攻撃し、これらを死滅させうるＴ細胞を介して、残りの腫瘍を圧倒する能力をもたらそうとする試みにおいて、がんを伴う患者へと、腫瘍特異的Ｔ細胞を輸注する。がん処置のための、養子Ｔ細胞療法の多くの形態であって、腫瘍浸潤リンパ球またはＴＩＬを培養する形態と、１つの特定のＴ細胞またはクローンを単離および拡大増殖させる形態とが使用されており、なお、腫瘍を強力に認識し、これらに攻撃するように操作されたＴ細胞を使用する形態も使用されている。
【００６２】
本明細書で使用される「抗体」とは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を指す。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、Ｂ細胞の単一のクローンにより産生され、同じエピトープに結合する抗体を指す。これに対し、「ポリクローナル抗体」とは、異なるＢ細胞により産生され、同じ抗原の異なるエピトープに結合する抗体の集団を指す。全抗体は、典型的に、４つのポリペプチド：重（Ｈ）鎖ポリペプチドの２つの同一なコピー、および軽（Ｌ）鎖ポリペプチドの２つの同一なコピーからなる。重鎖の各々は、１つのＮ末端の可変（ＶＨ）領域と、３つのＣ末端の定常（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）領域とを含有し、各軽鎖は、１つのＮ末端の可変（ＶＬ）領域と、１つのＣ末端の定常（ＣＬ）領域とを含有する。軽鎖および重鎖の各対の可変領域は、抗体の抗原結合性部位を形成する。ＶＨ領域と、ＶＬ領域とは、各領域が、それらの配列が比較的保存されている、４つのフレームワーク領域を含む、共通の一般的な構造を有する。フレームワーク領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により接続されている。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として公知である、３つのＣＤＲは、抗原への結合の一因となる、抗体の「超可変領域」を形成する。
【００６３】
「抗体様分子」は、例えば、パートナーに選択的に結合することが可能な、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーであるタンパク質でありうる。ＭＨＣ分子およびＴ細胞受容体は、このような分子である。一実施形態では、抗体様分子は、ＴＣＲである。一実施形態では、ＴＣＲは、そのＭＨＣへの結合アフィニティーを増大させるように改変されている。
【００６４】
本明細書では、「抗体の断片」、「抗体断片」、「抗体の機能的断片」、「抗原結合性部分」という用語、またはこれらの文法的同等物を、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の、１または複数の断片または部分を意味するように、互換的に使用する（一般に、Holliger et al., Nat. Biotech., 23(9):1126-1129 (2005)を参照されたい）。抗体断片は、例えば、１もしくは複数のＣＤＲ、可変領域（またはこの部分）、定常領域（またはこの部分）、またはこれらの組合せを含むことが所望される。抗体断片の非限定例は、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ストーク領域におけるジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）抗体の単一のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる、Ｆｖ断片；（ｉｖ）２つのドメインを、単一のポリペプチド鎖として合成することを可能とする合成リンカーにより接合された、Ｆｖ断片の２つのドメイン（すなわち、ＶＬおよびＶＨ）からなる一価分子である、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); and Osbourn et al., Nat. Biotechnol., 16: 778 (1998)を参照されたい）；ならびに（ｖ）各ポリペプチド鎖が、同じポリペプチド鎖上のＶＨとＶＬとの間の対合を可能とするには短すぎるペプチドリンカーにより、ＶＬへと接続されたＶＨを含み、これにより、２つの機能的な抗原結合性部位を有する二量体分子を作出するように、異なるＶＨ−ＶＬポリペプチド鎖上の相補的ドメインの間の対合を駆動する、ポリペプチド鎖の二量体である、ダイアボディーを含む。当技術分野では、抗体断片が公知であり、例えば、米国特許第８，６０３，９５０号明細書において、より詳細に記載されている。
【００６５】
「抗原認識部分」または「抗原認識ドメイン」とは、抗原に特異的に結合する分子または分子の部分を指す。一実施形態では、抗原認識部分は、抗体、抗体様分子、またはこれらの断片であり、抗原は、腫瘍抗原である。
【００６６】
「保存的アミノ酸置換」または「保存的突然変異」という用語は、１つのアミノ酸の、共通の特性を伴う、別のアミノ酸による置き換えを指す。個別のアミノ酸の間の共通の特性を規定する、機能的な方式は、相同な生物の、対応するタンパク質の間の、アミノ酸変化の標準化頻度を解析することである（Schulz, G. E. and Schirmer, R. H., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)）。このような解析に従い、群内のアミノ酸が、互いと優先的に交換され、したがって、全体的なタンパク質構造に対するそれらの影響において、最も互いと相似する、アミノ酸群を規定することができる（Schulz, G. E. and Schirmer, R. H.、前出）。保存的突然変異の例は、上記の亜群内のアミノ酸のアミノ酸置換、例えば、正の電荷を維持しうるような、リシンによる、アルギニンの置換、およびこの逆の置換；負の電荷を維持しうるような、グルタミン酸による、アスパラギン酸の置換、およびこの逆の置換；遊離−ＯＨを維持しうるような、セリンによる、トレオニンの置換；ならびに遊離−ＮＨ２を維持しうるような、グルタミンによる、アスパラギンの置換を含む。代替的に、または加えて、機能的変異体は、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を伴う、基準タンパク質のアミノ酸配列を含みうる。
【００６７】
「非保存的突然変異」という用語は、異なる群の間のアミノ酸置換、例えば、リシンによるトリプトファンの置換、またはフェニルアラニンによるセリンの置換などを伴う。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物学的活性に干渉したり、これを阻害したりしないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物学的活性が、親タンパク質と比較して増大するように、機能的変異体の生物学的活性を増強しうる。
【００６８】
「アンキリン」という用語は、内在性膜タンパク質の、スペクトリン−アクチンベースの膜細胞骨格への接合を媒介する、アダプタータンパク質のファミリーを指す。アンキリンは、スペクトリンのベータサブユニット、および内在性膜タンパク質の、少なくとも１２のファミリーに対する結合性部位を有する。この連結は、細胞膜の完全性を維持し、細胞膜内の、特異的なイオンチャネル、イオン交換体、およびイオン輸送体にアンカリングするのに必要とされる。アンキリンは、４つの機能的ドメイン：２４のタンデムアンキリンリピートを含有するＮ末端ドメイン、スペクトリンに結合する中央ドメイン、アポトーシスに関与するタンパク質に結合する死ドメイン、異なるアンキリンタンパク質の間で高度に可変的な、Ｃ末端調節ドメインを含有する。２４のタンデムアンキリンリピートは、広範にわたる膜タンパク質の認識の一因となる。これらの２４のリピートは、１〜１４リピートの範囲の、３つの、構造的に顕著に異なる結合性部位を含有する。これらの結合性部位は、互いに対して半独立性であり、組み合わせて使用することができる。部位が、膜タンパク質に結合するのに使用する相互作用は、非特異性であり、水素結合、疎水性相互作用、および静電相互作用からなる。配列は、アミノ酸の特性を保存しなくてもよいので、これらの非特異性相互作用は、アンキリンに、広範にわたるタンパク質を認識する特性を与える。半独立性とは、結合性部位が使用されない場合、結合の全体に対して、大きな影響を及ぼさないことを意味する。これらの２つの特性の組合せは、アンキリンが認識しうるタンパク質の、大きなレパートリーをもたらす。哺乳動物では、アンキリンは、３つの遺伝子（ＡＮＫ１、ＡＮＫ２、およびＡＮＫ３）によりコードされる。各遺伝子は、代替的スプライシングを介して、複数のタンパク質をもたらす。
【００６９】
本明細書で言及される「増殖性疾患」とは、細胞の過剰な増殖および／または細胞マトリックスの過剰な代謝回転が、がんを含む疾患の発症機序に著明に寄与する、という統一的概念を指す。
【００７０】
本明細書で使用される「患者」または「対象」とは、がんなどの増殖性障害を伴うと診断されるか、またはこれを有するかもしくは発症することが疑われる哺乳動物対象を指す。一部の実施形態では、「患者」という用語は、がんなどの増殖性障害を発症する可能性が平均より高い哺乳動物対象を指す。例示的な患者は、ヒト、類人猿、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、齧歯動物、および本明細書で開示される療法から利益を得うる、他の哺乳動物でありうる。例示的なヒト患者は、男性および／または女性でありうる。本明細書では、「それを必要とする患者」または「それを必要とする対象」を、例えば慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染であるが、これに限定されない疾患または障害を伴うと診断されているか、またはこれを有することか疑われる患者とみなす。
【００７１】
本明細書では、「〜を投与すること」は、本明細書で記載される、１または複数の組成物を、患者または対象に施すこととみなす。例を目的として、限定せずに述べると、組成物の投与、例えば、注射は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、または筋内（ｉ．ｍ．）注射により実施することができる。１または複数のこのような経路を利用することができる。非経口投与は、例えば、ボーラス注射による場合もあり、時間経過にわたる、漸次的な灌流による場合もある。代替的に、または共時的に、投与は、経口経路による投与でありうる。加えて、投与はまた、ボーラスまたは細胞ペレットのデポ手術による場合もあり、医療用デバイスの設置による場合もある。ある実施形態では、本開示の組成物は、本明細書で記載される核酸配列を発現する操作細胞もしくは宿主細胞、または本明細書で記載される、少なくとも１つの核酸配列を含むベクターを、増殖性障害を処置または防止するのに有効な量で含みうる。医薬組成物は、本明細書で記載される標的細胞集団を、１または複数の、薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含みうる。このような組成物は、中性緩衝生理食塩液、リン酸緩衝生理食塩液などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含みうる。
【００７２】
本明細書で使用される「処置」、「〜を処置すること」という用語、またはそれらの文法的同等物は、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを指す。複数の実施形態では、効果は、治療的である、すなわち、効果は、疾患および／または疾患に帰せられうる有害症状を、部分的または完全に治癒させる。この目的で、本発明の方法は、本発明の核酸配列を発現する宿主細胞、または本発明の核酸配列を含むベクターを含む、治療有効量の組成物を投与するステップを含む。
【００７３】
「治療有効量」、「治療的量」、「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」という用語、またはそれらの文法的同等物は、所望の治療結果を達成するのに必要な投与量において、必要な期間にわたり有効な量を指す。治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに１つまたは複数の対象において所望の応答を誘発する、本明細書で記載される組成物の能力などの因子に従い変動しうる。投与される、本開示の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および状態の個別差を考慮して、医師により決定されうる。
【００７４】
代替的に、本明細書で記載される、１または複数の組成物の、患者または対象への投与の、薬理学的効果および／または生理学的効果は、「予防的」な場合もある、すなわち、効果は、疾患またはその症状を、完全に、または部分的に予防する場合もある。「予防有効量」とは、所望の予防結果（例えば、疾患の発症の防止）を達成するのに必要な投与量において、必要な期間にわたり有効な量を指す。
【００７５】
ＨＢＶ分子ワクチン
Ｂ型肝炎（ＨｅｐＢ）とは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）により引き起こされる、潜在的に致死性の肝感染である。ＨＢＶは、慢性感染を引き起こす場合があり、人々を、肝硬変および肝がんによる死の危険性に陥れる。ＨＢＶの進化は、遺伝子型の地理的分布により顕示される。ＨＢＶの遺伝子型／遺伝子亜型は、肝疾患の重症度および抗ウイルス治療に対する応答など、臨床的特徴およびウイルス学的特徴の差違との関連が、ますます大きくなっている。配列を比較すると、ＨＢＶは、各々の地理的分布が、顕著に異なる、８つの遺伝子型（Ａ〜Ｈ）へと分類される。研究者らは、異なるＨＢＶ遺伝子型とＨＢＶ疾患の重症度および転帰との関連を相関させている。
【００７６】
ＨＢＶは、肝臓指向性の大きな、二本鎖ＤＮＡウイルスである。ＨＢＶ  ＤＮＡは、３．２ｋｂの、環状、エンベロープ型で、部分的に二本鎖のＤＮＡゲノム（図３Ａ〜３Ｄ）である。ＨＢＶは、４つの遺伝子（Ｓ、Ｃ、Ｐ、およびＸ）を有する。Ｓ遺伝子は、小型表面タンパク質（Ｓ）、中型表面タンパク質（Ｓ＋プレＳ２）、および大型表面タンパク質（Ｓ＋プレＳ２＋プレＳ１）からなる、エンベロープ（脂質二重層）表面タンパク質（ＨＢｓＡｇ）をコードする。Ｃ遺伝子は、カプシドタンパク質またはコアタンパク質をコードする。Ｃ遺伝子は、プレコア領域およびコア領域を有する。翻訳が、プレコア領域で開始される場合、タンパク質は、ＨＢｅＡｇである。翻訳が、コア領域で開始される場合、タンパク質は、ＨＢｃＡｇである。Ｐ遺伝子は、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）をコードする。Ｘ遺伝子は、ｘタンパク質（ＨＢｘＡｇ）（図３Ａ〜３Ｄ）をコードする。ＨＢＶゲノムは、ＴＰ、ＳＰ、ＲＴ、およびＲＨを含むＰｏｌ（８３２アミノ酸）；プレＳ１（１０８アミノ酸）；プレＳ２（５５アミノ酸）；Ｓ（２２６アミノ酸）；プレＣ（２９アミノ酸）；Ｃ（１８３アミノ酸）；ならびにＨＢｘ（１５４アミノ酸）（図３Ａ〜３Ｄ）を含む。
【００７７】
急性ＨＢＶ感染は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、およびコア抗原である、ＨＢｃＡｇに対する、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）抗体の存在により特徴づけられる。感染の初期において、患者はまた、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）についても血清陽性である。ＨＢｅＡｇは、通例、高レベルのウイルス複製のマーカーである。ＨＢｅＡｇの存在は、感染個体の血液および体液が、高度に感染性であることを指し示す。慢性感染は、ＨＢｓＡｇの、少なくとも６カ月間にわたる存続（ＨＢｅＡｇの併存を伴うか、または伴わない）により特徴づけられる。ＨＢｓＡｇの存続は、老齢において、慢性肝疾患および肝がん（肝細胞癌）を発症する危険性についての、主要なマーカーである。
【００７８】
Ｂ型肝炎ウイルスは、体外で、少なくとも７日間にわたり生存しうる。この期間中、ウイルスは、それが、ワクチンにより防御されていない人の体内に侵入する場合、やはり、感染を引き起こしうる。Ｂ型肝炎ウイルスのインキュベーション期間は、平均で７５日間であるが、３０〜１８０日間で変動しうる。ウイルスは、感染後３０〜６０日間以内に検出される場合があり、存続し、慢性Ｂ型肝炎へと発症しうる。高度の流行地域では、Ｂ型肝炎は、母体から、出生時の小児へと拡散する（周産期伝染）か、または、とりわけ、生後最初の５年間において、感染小児から、非感染小児へと、水平伝染（感染血液への曝露）を介して拡散することが、最も一般的である。慢性感染の発症は、それらの母体から、または５歳以前に感染した乳児において、極めて一般的である。Ｂ型肝炎はまた、感染血および多様な体液への経皮曝露または粘膜曝露によるほか、唾液、月経液、膣液、および精液を介しても拡散する。また、Ｂ型肝炎の性伝染も、一般に生じうる。成人における感染は、症例の５％未満において、慢性肝炎をもたらす。ウイルスの伝染はまた、医療状況における、または薬物を注射する者の間の、注射針およびシリンジの再使用を介しても生じうる。加えて、感染は、医療手順、手術手順、および歯科手順において生じる場合もあり、タトゥーの彫込みを介して生じる場合もあり、感染血で汚染されたカミソリおよび類似の対象物の使用を介して生じる場合もある。
【００７９】
大半の人々は、急性感染期に、症状を経ない。しかし、一部の人々は、皮膚および眼の黄染（黄疸）、暗色尿、極度の疲労、悪心、嘔吐、ならびに腹痛を含む、数週間続く症状を伴う、急性疾病を呈する。急性肝炎を伴う人のうちの、小さなサブセットは、急性肝不全を発症する場合があり、これは、死をもたらしうる。一部の人々では、Ｂ型肝炎ウイルスはまた、慢性肝感染も引き起こす場合があり、これは、その後、肝硬変（肝臓の瘢痕化）または肝がんへと増悪しうる。感染が、慢性となる可能性は、感染する年齢に依存する。Ｂ型肝炎ウイルスに感染する、６歳未満の小児は、慢性感染を発症する可能性が最も高い。１歳時に感染した乳児のうちの８０〜９０％が、慢性感染を発症し；６歳以前に感染した小児のうちの３０〜５０％が、慢性感染を発症する。成人では、成人になって感染したが、他の点では健常な者のうちの５％未満が、慢性感染を発症し；慢性感染した成人のうちの２０〜３０％が、肝硬変および／または肝がんを発症する（図１および図２）。
【００８０】
急性Ｂ型肝炎のための特別な処置は存在しない。したがって、ケアは、嘔吐および下痢により失われた体液の置き換えを含む、快適さおよび十分な栄養バランスの維持を目的とする。慢性Ｂ型肝炎感染は、経口抗ウイルス剤を含む薬により処置されうる。処置（例えば、肝臓移植またはＩＦＮ−αヌクレオチド類似体）は、肝硬変の進行を緩徐化し、肝がんの発生率を低減し、長期にわたる生存を改善する。近年のより発展的な治療用ワクチン（すなわち、ＧＳ−４７７７、Ｇｉｌｅａｄ；ＡＢＸ２０３、Ａｂｉｖａｘ）は、臨床試験の２／３相で不奏効であった。しかし、大半の人々では、処置は、Ｂ型肝炎感染を治癒させず、ウイルスの複製を抑制するにとどまる。したがって、Ｂ型肝炎の処置を始めた人々は、それを、一生続けなければならない。多くの資源制約的状況下では、Ｂ型肝炎の診断および処置へのアクセスは、依然として限定されている。
【００８１】
推定２億５，７００万人が、慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染（表面抗原の検出を介する陽性の確認）と共に生活している。２０１５年に、Ｂ型肝炎感染は、最多の死亡原因を、肝不全または肝がんとする、８８万７，０００人の死者を結果としてもたらした。現在、ＨＢＶワクチンは、症例のうちの９５％において、感染を防止し、これにより、Ｂ型肝炎ウイルスに起因する感染、肝がん、および慢性疾患を防止する。しかし、複数のＨＢＶ亜型に対する広域カバレッジ、および肝がんに対する機能性を伴う、ＨＢＶワクチンを開発することが、依然として強く必要とされている。本開示は、バイオインフォマティクス法およびタンパク質操作法に基づく、新規のＨＢＶワクチン抗原に関する。これらの新規のＨＢＶワクチン候補物質は、ＨＢＶおよびＨＢＶ関連疾患に対する治療用ワクチンとして使用することができる。
【００８２】
処置選択肢
慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染の標準治療（ＳＯＣ）は、ＰＥＧ−ＩＦＮおよび／またはヌクレオチド類似体を含む。しかし、ｃｃｃＤＮＡならびに免疫寛容および免疫疲弊は、遷延しうる（図４）。ＨＢＶの感染は、肝硬変、肝不全、および肝細胞癌（ＨＣＣ）を結果としてもたらしうる、肝炎を引き起こす。ＨＢＶの診断は、血清学的所見に基づく。実際、ウイルスＤＮＡ、ウイルス抗原、およびこれらのそれぞれの抗体は、血清中に見出すことができる。ＨＢＶは、ＨＢｓＡｇ上に見出される、共通の抗原決定基（ａ）と、２つの相互に排他的な決定基対（ｄ／ｙおよびｗ／ｒ）とに基づき、４つの主要な血清型（ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ、ａｙｗ）へと細分される。ゲノムの全ヌクレオチド配列変動に従い、１０の公知の遺伝子型（Ａ〜Ｊ）と、４０の公知の遺伝子亜型が存在する。遺伝子型は、顕著に異なる地理的分布を有し、異なる遺伝子型は、異なる疾患重症度、合併症の異なる経過および可能性、ならびに処置、および、おそらくは、ワクチン接種に対する異なる応答を示す。血清型と、遺伝子型とは、必ずしも、対応しない（例えば、遺伝子型Ｄは、１０の遺伝子亜型を有する）。
【００８３】
現在、慢性ＨＢＶ感染には、治癒が存在しない。処置選択肢は、肝硬変の進行およびウイルスの複製を緩徐化し、ＨＣＣおよび肝不全の発生率を低減することを目的とする。現行の処置は、２つの主要な類型：（１）免疫調節剤薬物、すなわち、主に、免疫系をブーストし、ウイルス感染細胞と戦うようにデザインされた、Ｉ型インターフェロン（インターフェロンアルファおよびＰＥＧ化インターフェロンアルファ）；ならびに（２）ヌクレオシド類似体（ラミブジン、エンテカビル、およびテルビブジン）、およびヌクレオチド類似体（アデフォビル、ジピボキシル、およびテノフォビル）を含む抗ウイルス薬へと分けられ、ウイルス複製に対する干渉を目的とする。ＨＢＶ感染による死者数は、現在のところ、毎年ほぼ７０万人であり、ＨＩＶおよび結核と同等である。新たなＨＢＶ感染率は、低下しつつあるが、肝炎による総死亡者数の増大は、新たな処置選択肢の開発を、火急に必要とする。
【００８４】
治療法
表面タンパク質（Ｓ）、コアタンパク質（Ｃ）、およびポリメラーゼタンパク質（Ｐｏｌ）に由来するＨＢＶエピトープは、感染時に、Ｔ細胞によりターゲティングされ、これは、ＨＢＶに対する細胞性免疫応答を媒介する。ＭＨＣ−ＩエピトープおよびＭＨＣ−ＩＩエピトープを含む、ＨＢＶ  Ｘタンパク質（ＨＢｘ）は、ウイルス性の発症機序および癌発症に関与する、多機能性の調節タンパク質である。本明細書で記載されるＨＢＶワクチンデザインは、潜在的なＴ細胞エピトープを有する、全ての主要構成要素を含む。具体的に、本明細書では、Ｐｏｌ、コア、Ｅｎｖ、およびＨＢｘにおいて、遺伝子改変（点突然変異の情報）およびトランケーションを伴う、２つの、異なる、固有のデザインを含むＨＢＶワクチンが提示される。本明細書ではまた、固有にデザインされた多重エピトープ構築物（すなわち、細胞傷害性Ｔリンパ球）であって、特異性ペプチドを、ヒトタンパク質足場へとグラフトされ、ＨＢＶ感染を制御し、除去するために必要とされる、細胞性免疫応答を刺激しうる、帯電ジペプチドにより連結された、多重エピトープ構築物も提示される。
【００８５】
本明細書では、ＨＢＶ感染を処置する、多様な遺伝子治療法が提示される。例えば、表１には、ＨＢＶの、免疫系媒介型制御を改善するのに使用される、戦略の一部が記載される。本明細書ではまた、ＨＢＶ治療用ワクチン、プライム／ブースト型ＤＮＡベースワクチンの高度デザインであって、プライミングのための、ＨＢＶの主要構成要素（ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｘＡｇ、ＨＢｅＡｇ、およびＨＢ  ＰｏｌＡｇ）による、免疫原性領域の組合せと、ブースティングのための、アゴニストＣＤ８  Ｔ細胞エピトープの組合せとを包含する高度デザインも提示される。
【００８６】
本明細書では、ＨＢＶ組換えワクチンの組成物、キット、およびこれを含むシステム、ならびにこれを作る方法が提示される。本開示におけるＨＢＶ組換えワクチン（例えば、ＨＢＶデザイン１〜５）は、ＨＢｅ、ＨＢｘ、ＬＨＢｓ、Ｐｏｌ、およびＨＢＳＰに対するタンパク質操作を介して操作される。各ＨＢＶワクチンの抗原デザインは、バイオインフォマティクス解析およびコンピュータによるタンパク質操作法を使用して、本発明者により選択されたコンビナトリアルガイダンス（例えば、コンセンサス配列に、より緊密にマッチする抗原配列の選択、抗原性の予測、ならびにＭＨＣ−Ｉへの結合、およびＴ細胞活性化後におけるサイトカインの産生をもたらしうるＴ細胞エピトープマッピング）を介してその着想を得た。本明細書で提示される、ＨＢＶワクチンデザインについての、全体的なワークフローを、図５に示し、実施例１で、さらに詳述する。本開示は、多重欠失ゴリラアデノベクター（ＧＣ４６）内に構築された、５つのＨＢＶ抗原デザイン（ＨＢＶデザイン１〜５）を提示する。
【００８７】
４つの抗原デザイン（ＨＢＶデザイン１〜４）および対照抗原を合成し、アデノベクター構築のための発現プラスミド（ｐＡｄＳｈｕｔｔｌｅ）へとクローニングした（図６）。ＨＢＶデザインを解析して、異なるリンカーが、異なるエピトープの予測をもたらすのかどうかについて評価した。初期抗原スクリーニングは、一過性のトランスフェクションにおける、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの抗原発現、単球由来の樹状細胞についての、一過性のトランスフェクション研究における、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの抗原プロセシングおよび抗原提示について査定した。図６に示される通り、ＨＢＶデザイン１および２は、クレードＤコンセンサスに基づきデザインした。コアペプチド（８）、表面ペプチド（８）、ポリメラーゼペプチド（８）、ＨＢｘペプチド（６）、およびＨＢＰＳペプチド（２）に由来する、３２のＨＢＶペプチドは、免疫原性データ、質量分析などなどの、実験データおよび機能データを有する文献からキュレートした（表４）。ＨＢＶデザイン３のために、ヒトアンキリン様リピート（ＡＬＲ）タンパク質足場（ＰＤＢコード：１ＱＹＭ）ペプチドを、ヘリックス／ループ領域に、タンデムにグラフトした。２つのＡＬＲ足場を使用し、切断可能リンカーである、ＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号１１１）により接続した。ＡＬＲタンパク質は、一般に、発現が高度であり、高安定性を有する。したがって、ＡＬＲタンパク質を、ＨＢＶペプチドのための足場として使用して、新規のＣＴＬを創出した。ＨＢＶデザイン４エピトープは、ＫＫリンカーにより隔てた（図６）。ＲＮＡ  ｑＰＣＲ相対発現アッセイのために、５’−ＴＧＣＣＡＡＧＡＧＴＧＡＣＧＴＧＴＣＣＡ−３’（配列番号１１０）を、スプライスプライマーとして使用し、５’−ＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＧＧ−３’（配列番号１２８）を、スプライスプローブとして使用した。各抗原についてデザインされた、特異的プライマーを、リバースプライマーとして使用した（図１４）。
【００８８】
【表１】
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【００８９】
送達系
ゴリラアデノウイルスによるシャトルベクター
本開示の、ある特定の態様は、１または複数の免疫応答誘導性ＨＢＶポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを対象とする。ある特定の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。特定の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクターである。アデノウイルスは、一般に、ヒトにおいて、良性の病態と関連し、ヒトを含む様々な種から単離されているアデノウイルスのゲノムについては、広範に研究されている。アデノウイルスは、中程度のサイズ（９０〜１００ｎｍ）で、エンベロープを伴わず、約３６ｋｂの二本鎖ＤＮＡを含有する、二十面体ウイルスである。アデノウイルスのカプシドは、ウイルスによる細胞への感染の早期段階の、鍵となる相互作用を媒介し、アデノウイルスの生活環の終端において、アデノウイルスゲノムをパッケージングするために必要とされる。カプシドは、２４０のヘキソン、１２のペントンベースタンパク質、および１２の線維を含む、２５２カプソマーを含む（Ginsberg et al., Virology, 28: 782-83 (1966)）。ヘキソンは、３つの同一なタンパク質、すなわち、ポリペプチドＩＩを含む（Roberts et al., Science, 232: 1148-51 (1986)）。ペントンベースは、５つの同一なタンパク質を含み、線維は、３つの同一なタンパク質を含む。タンパク質ＩＩＩａ、ＶＩ、およびＩＸは、アデノウイルスのコート内に存在し、ウイルスカプシドを安定化させると考えられる（Stewart et al., Cell, 67: 145-54 (1991)；およびStewart et al., EMBO J., 12(7): 2589-99 (1993)）。カプシドタンパク質の発現は、ｐＩＸを例外として、アデノウイルスポリメラーゼタンパク質に依存する。したがって、アデノウイルス粒子の主要構成要素は、ポリメラーゼタンパク質遺伝子が存在し、発現する場合に限り、ゲノムから発現する。
【００９０】
アデノウイルスの、いくつかの特徴は、それらを、治療適用（すなわち、「遺伝子治療」）のために、またはワクチン適用のための、抗原送達系としての使用のために、遺伝子素材を、細胞へと導入するための理想的な媒体とする。例えば、アデノウイルスは、高力価（例えば、約１０１３粒子単位（ｐｕ））で作製することができ、遺伝子素材を、非複製用細胞および複製用細胞へと導入することができる。アデノウイルスゲノムは、大量の外因性ＤＮＡ（最大で、約８ｋｂ）を運ぶように操作することができ、アデノウイルスカプシドは、さらに長い配列の導入を強化しうる（Curiel et al., Hum. Gene Ther., 3: 147-154 (1992)）。加えて、アデノウイルスは、一般に、宿主細胞の染色体へと組み込まれず、直鎖状エピソームとして維持され、これにより、組換えアデノウイルスが、正常な細胞機能に干渉する可能性を最小化する。
【００９１】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるアデノウイルスは、ゴリラから単離される。２つの種である、ヒガシゴリラ（Gorilla beringei）およびニシゴリラ（Gorilla gorilla）の中には、広く認知された、４つのゴリラ亜種が存在する。ニシゴリラ種は、亜種である、ニシローランドゴリラ（Gorilla gorilla gorilla）およびクロスリバーゴリラ（Gorilla gorilla diehli）を含む。ヒガシゴリラ種は、亜種である、マウンテンゴリラ（Gorilla beringei beringei）およびヒガシローランドゴリラ（Gorilla beringei graueri）を含む（例えば、Wilson and Reeder, eds., Mammalian Species of the World, 3rd ed., Johns Hopkins University Press, Baltimore, Maryland (2005)を参照されたい）。一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスは、マウンテンゴリラ（Gorilla beringei beringei）から単離される。
【００９２】
多様なゴリラアデノウイルスまたはゴリラアデノウイルスベクターについては、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第２０１３／０５２８３２号パンフレット；同第２０１３／０５２８１１号パンフレット；および同第２０１３／０５２７９９号パンフレットにおいて記載されている。
【００９３】
いくつかのこのようなアデノウイルスのゲノムが解析されており、アデノウイルスは、それらの各々が、アデノウイルスを固有に規定するのに用いられる、多数の部分配列、すなわち、核酸配列である、配列番号１〜１０、およびアミノ酸配列である、配列番号１１〜２０を含む、例えば、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、または配列番号２５の核酸配列を有しうることが決定されている。配列番号６〜１０は、それぞれ、配列番号１６〜２０のアミノ酸配列をコードする。配列番号１〜５は、それぞれ、配列番号６〜１０の核酸配列のサブセットである。配列番号１１〜１５は、それぞれ、配列番号１６〜２０のアミノ酸配列のサブセットである。
【００９４】
アデノウイルスは、アデノウイルスベクター、例えば、遺伝子送達媒体として使用されるように、既に公知のアデノウイルスと同じ方式で改変されうる。アデノウイルスおよびアデノウイルスベクターは、複製コンピテント型の場合もあり、条件付き複製コンピテント型の場合もあり、複製欠損型の場合もある。
【００９５】
複製コンピテント型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、典型的な宿主細胞内、すなわち、典型的に、アデノウイルスが感染することが可能な細胞内で複製されうる。複製コンピテント型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、宿主細胞内のウイルス複製を阻害しないアデノウイルスゲノム内に、野生型アデノウイルスと比較した、１または複数の突然変異（例えば、１または複数の欠失、挿入、および／または置換）を有しうる。例えば、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスまたはアデノウイルスゲノムの繁殖に必須ではない、Ｅ３領域として公知の、アデノウイルス早期領域の、部分的欠失または完全な欠失を有しうる。
【００９６】
条件付き複製型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、所定の条件下で、複製されるように操作された、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターである。例えば、複製に必須の遺伝子機能、例えば、アデノウイルス早期領域によりコードされる遺伝子機能は、誘導性転写制御配列、抑制性転写制御配列、または組織特異性転写制御配列、例えば、プロモーターに作動可能に連結することができる。このような実施形態では、複製は、転写制御配列と相互作用する、特異性因子の存在または非存在を必要とする。条件付き複製型アデノウイルスベクターについては、米国特許第５，９９８，２０５号明細書において、さらに記載されている。
【００９７】
複製欠損型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、例えば、典型的な宿主細胞、とりわけ、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターに感染させるヒトにおける宿主細胞内でアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターが複製されないような、１または複数の、複製に必須の遺伝子機能または遺伝子領域の欠損の結果として、複製に必要とされる、アデノウイルスゲノムの、１または複数の遺伝子機能または遺伝子領域の補完を必要とするアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターである。
【００９８】
本明細書で使用される、遺伝子機能またはゲノム領域の欠損は、その核酸配列の一部または全部が破壊された（例えば、欠失させた）遺伝子の機能（例えば、遺伝子産物の機能が、少なくとも約２分の１、５分の１、１０分の１、２０分の１、３０分の１、または５０分の１に低減されるように）を消失させるか、または損なうのに十分な、アデノウイルスゲノムの遺伝子的素材の破壊（例えば、欠失）として規定される。完全な遺伝子領域の欠失は、複製に必須の遺伝子機能の破壊に必要とされない。しかし、１または複数のトランス遺伝子のために、アデノウイルスゲノム内に、十分なスペースをもたらす目的で、１または複数の遺伝子領域の大部分の除去が所望される場合がある。遺伝子素材の欠失が好ましいが、付加または置換による遺伝子素材の突然変異もまた、遺伝子機能を破壊するために適切である。複製に必須の遺伝子機能は、アデノウイルスの複製（例えば、繁殖）に必要とされる遺伝子機能であり、例えば、アデノウイルス早期領域（例えば、Ｅ１領域、Ｅ２領域、およびＥ４領域）、後期領域（例えば、Ｌ１領域、Ｌ２領域、Ｌ３領域、Ｌ４領域、およびＬ５領域）、ウイルスのパッケージングに関与する遺伝子（例えば、ＩＶａ２遺伝子）、およびウイルス関連ＲＮＡ（例えば、ＶＡ−ＲＮＡ−１および／またはＶＡ−ＲＮＡ−２）によりコードされる。
【００９９】
アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターが、複製コンピテントであれ、複製欠損であれ、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの少なくとも一部を保持する。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、タンパク質コード領域およびタンパク質非コード領域を含む、アデノウイルスゲノムの任意の部分を含みうる。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスタンパク質をコードする、少なくとも１つの核酸配列を含むことが所望される。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、例えば、早期領域遺伝子（すなわち、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、および／またはＥ４領域）のうちのいずれか１つによりコードされるタンパク質、またはウイルス構造タンパク質をコードする、後期領域遺伝子（すなわち、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５領域）のうちのいずれか１つによりコードされるタンパク質など、任意の適するアデノウイルスタンパク質をコードする核酸配列を含みうる。
【０１００】
アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、ｐＩＸタンパク質、ＤＮＡポリメラーゼタンパク質、ペントンタンパク質、ヘキソンタンパク質、および／または線維タンパク質をコードする、１または複数の核酸配列を含むことが所望される。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスタンパク質の、全長アミノ酸配列をコードする、全長核酸配列を含みうる。代替的に、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスタンパク質の、全長アミノ酸配列の部分をコードする、全長核酸配列の部分を含みうる。
【０１０１】
核酸配列の「部分」は、少なくとも１０ヌクレオチド（例えば、約１０〜約５０００ヌクレオチド）を含む。好ましくは、核酸配列の「部分」は、１０またはこれを超える（例えば、１５もしくはこれを超える、２０もしくはこれを超える、２５もしくはこれを超える、３０もしくはこれを超える、３５もしくはこれを超える、４０もしくはこれを超える、４５もしくはこれを超える、５０もしくはこれを超える、または１００またはこれを超える）ヌクレオチドを含むが、５，０００未満の（例えば、４９００もしくはこれ未満、４０００もしくはこれ未満、３０００もしくはこれ未満、２０００もしくはこれ未満、１０００もしくはこれ未満、８００もしくはこれ未満、５００もしくはこれ未満、３００もしくはこれ未満、または１００もしくはこれ未満の）ヌクレオチドを含む。好ましくは、核酸配列の部分は、約１０〜約３５００ヌクレオチド（例えば、約１０、２０、３０、５０、１００、３００、５００、７００、１０００、１５００、２０００、２５００、または３０００ヌクレオチド）、約１０〜約１０００ヌクレオチド（例えば、約２５、５５、１２５、３２５、５２５、７２５、または９２５ヌクレオチド）、もしくは約１０〜約５００ヌクレオチド（例えば、約１５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１５０、１７５、２５０、２７５、３５０、３７５、４５０、４７５、４８０、４９０、４９５、または４９９ヌクレオチド）、または前出の値のうちの、任意の２つにより規定される範囲である。より好ましくは、核酸配列の「部分」は、約３２００ヌクレオチド以下（例えば、約１０〜約３２００ヌクレオチド、約１０〜約３０００ヌクレオチド、もしくは約３０〜約５００ヌクレオチド、または前出の値のうちの、任意の２つにより規定される範囲）を含む。
【０１０２】
アミノ酸配列の「部分」は、少なくとも３アミノ酸（例えば、約３〜約１，２００アミノ酸）を含む。好ましくは、アミノ酸配列の「部分」は、３またはこれを超える（例えば、５もしくはこれを超える、１０もしくはこれを超える、１５もしくはこれを超える、２０もしくはこれを超える、２５もしくはこれを超える、３０もしくはこれを超える、４０もしくはこれを超える、または５０またはこれを超える）アミノ酸を含むが、１，２００未満の（例えば、１，０００もしくはこれ未満、８００もしくはこれ未満、７００もしくはこれ未満、６００もしくはこれ未満、５００もしくはこれ未満、４００もしくはこれ未満、３００もしくはこれ未満、２００もしくはこれ未満、または１００もしくはこれ未満の）アミノ酸を含む。好ましくは、アミノ酸配列の部分は、約３〜約５００アミノ酸（例えば、約１０、１００、２００、３００、４００、または５００アミノ酸）、約３〜約３００アミノ酸（例えば、約２０、５０、７５、９５、１５０、１７５、または２００アミノ酸）、もしくは約３〜約１００アミノ酸（例えば、約１５、２５、３５、４０、４５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５、または９９アミノ酸）、または前出の値のうちの、任意の２つにより規定される範囲である。より好ましくは、アミノ酸配列の「部分」は、約５００アミノ酸以下（例えば、約３〜約４００アミノ酸、約１０〜約２５０アミノ酸、もしくは約５０〜約１００アミノ酸、または前出の値のうちの、任意の２つにより規定される範囲）を含む。
【０１０３】
アデノウイルスｐＩＸタンパク質は、アデノウイルスカプシド内に存在し、ヘキソン九量体相互作用を強化することが示されており、全長ゲノムをパッケージングするために必須である（例えば、Boulanger et al., J. Gen. Virol., 44: 783-800 (1979); Horwitz M.S., “Adenoviridae and their replication” in Virology, 2nd ed., B.N. Fields et al. (eds.), Raven Press, Ltd., New York, pp. 1679-1721 (1990), Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6: 1733-1739 (1987)および van Oostrum et al, J. Virol., 56: 439-448 (1985)を参照されたい）。その、アデノウイルス構造への寄与に加えて、ｐＩＸはまた、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）活性の刺激などの転写特性を呈することも示されている（例えば、Lutz et al., J. Virol., 71(7): 5102-5109 (1997)を参照されたい）。アデノウイルスｐＩＸタンパク質の全部または一部をコードする核酸配列は、例えば、配列番号６および配列番号１を含む。全長ｐＩＸタンパク質またはその一部を含むアミノ酸配列は、例えば、配列番号１６および配列番号１１を含む。
【０１０４】
アデノウイルスＤＮＡポリメラーゼタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのいずれにおいても、ウイルスのＤＮＡ複製に必須である。ポリメラーゼは、アデノウイルスＤＮＡの５’末端へと共有結合的に接合した末端タンパク質（ＴＰ）の前駆体（ｐＴＰ）との複合体として共精製される（Field et al., J. Biol. Chem., 259: 9487-9495 (1984)）。アデノウイルスＤＮＡポリメラーゼおよびｐＴＰのいずれも、Ｅ２領域によりコードされる。ポリメラーゼタンパク質は、ｐＩＸを除く、全ての構造タンパク質の発現に必要とされる。ポリメラーゼタンパク質の遺伝子配列を伴わなければ、ポリメラーゼタンパク質は、産生されない。結果として、ウイルスゲノムは、複製されず、主要後期プロモーターは、活性化せず、カプシドタンパク質も発現しない。アデノウイルスＤＮＡポリメラーゼタンパク質の全部または一部をコードする核酸配列は、例えば、配列番号７および配列番号２を含む。全長アデノウイルスＤＮＡポリメラーゼまたはその一部を含むアミノ酸配列は、例えば、配列番号１７および配列番号１２を含む。
【０１０５】
アデノウイルスヘキソンタンパク質は、アデノウイルスのカプシド内で、最も大型、かつ、最も豊富なタンパク質である。ヘキソンタンパク質は、ウイルスカプシドのアセンブリー、カプシドの二十面体の対称性（これが、カプシド容量およびＤＮＡパッケージングサイズを規定する）の決定、およびカプシドの完全性に必須である。加えて、ヘキソンは、アデノウイルスベクターの中和を低減するための改変のための、第１の標的である（例えば、Gall et al., J. Virol., 72: 10260-264 (1998)およびRux et al., J. Virol., 77(17): 9553-9566 (2003)を参照されたい）。ヘキソンタンパク質の、主要な構造特徴は、血清型にわたり、アデノウイルスにより共有されているが、ヘキソンタンパク質は、血清型間で、サイズおよび免疫学的特性が異なる（Jornvall et al., J. Biol. Chem., 256(12): 6181-6186 (1981)）。１５のアデノウイルスヘキソンタンパク質の比較は、ヘキソンの、主要な抗原領域および血清型特異性領域が、ループ１および２（すなわち、それぞれ、ＬＩまたはｌ１、およびＬＩＩまたはｌ２）であり、この中には、アデノウイルス血清型の間で、長さおよび配列が変動する、７つの、個別の超可変領域（ＨＶＲ１〜ＨＶＲ７）が存在することを明らかにした（Crawford-Miksza et al., J. Virol., 70(3): 1836-1844 (1996)）。アデノウイルスヘキソンタンパク質の全部または一部をコードする核酸配列は、例えば、配列番号９および配列番号４を含む。全長アデノウイルスヘキソンタンパク質、またはその一部を含むアミノ酸配列は、例えば、配列番号１９および配列番号１４を含む。
【０１０６】
アデノウイルス線維タンパク質は、３つのドメイン：テール、シャフト、およびノブを有する、アデノウイルスＩＶ型ポリペプチドのホモ三量体である（Devaux et al., J. Molec. Biol., 215: 567-88 (1990), Yeh et al., Virus Res., 33: 179-98 (1991)）。線維タンパク質は、ノブドメインおよびシャフトドメインを介して、細胞表面上の受容体への、一次ウイルス結合を媒介する（Henry et al., J. Virol., 68(8): 5239-46 (1994)）。三量体化のためのアミノ酸配列は、線維のアミノ末端（テール）が、ペントンベースと、適正に会合するのに必要であると考えられる、ノブ内に位置する（Novelli et al., Virology, 185: 365-76 (1991)）。細胞受容体を認識し、ペントンベースに結合することに加えて、線維は、血清型の識別にも寄与する。異なるアデノウイルス血清型に由来する線維タンパク質は、大幅に異なる（例えば、Green et al., EMBO J., 2: 1357-65 (1983), Chroboczek et al., Virology, 186: 280-85 (1992)；およびSignas et al., J. Virol., 53: 672-78 (1985)を参照されたい）。したがって、線維タンパク質は、アデノウイルスの生活環に重要な、複数の機能を有する。アデノウイルス線維タンパク質の全部または一部をコードする核酸配列は、例えば、配列番号１０および配列番号５を含む。全長アデノウイルス線維タンパク質、またはその一部を含むアミノ酸配列は、例えば、配列番号２０および配列番号１５を含む。
【０１０７】
アデノウイルスペントンベースタンパク質は、二十面体カプシドの頂点に位置し、５つの、同一な単量体を含む。ペントンベースタンパク質は、二十面体カプシドの、複数のファセット上で、ヘキソンタンパク質を架橋する構造をもたらし、線維タンパク質が、カプシド内に組み込まれるために必須のインターフェースをもたらす。ペントンベースの各単量体は、ＲＧＤトリペプチドモチーフを含有する（Neumann et al., Gene, 69: 153-157 (1988)）。ＲＧＤトリペプチドは、αｖインテグリンへの結合を媒介し、ペントンベースのＲＧＤ配列内に点突然変異を有するアデノウイルスは、細胞に感染する、それらの能力が制限される（Bai et al., J. Virol., 67: 5198-5205 (1993)）。したがって、ペントンベースタンパク質は、カプシドのアーキテクチャーおよびウイルス−細胞間相互作用の最大限の効率に必須である。アデノウイルスペントンベースタンパク質の全部または一部をコードする核酸配列は、例えば、配列番号８および配列番号３を含む。全長アデノウイルスペントンベースタンパク質、またはその一部を含むアミノ酸配列は、例えば、配列番号１８および配列番号１３を含む。
【０１０８】
本明細書で記載される、核酸配列またはアミノ酸配列の「同一性」は、目的の核酸配列またはアミノ酸配列を、基準の核酸配列またはアミノ酸配列と比較することにより決定しうる。結果として目的の配列をもたらすように、基準配列内で、変化させられ、かつ／または修飾される（例えば、点突然変異、挿入、または欠失などにより）、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数をカウントする。このような変化の総数を、目的の配列の全長から減じ、差を、目的の配列の長さで除し、百分率として表す。最適のアライメントを得、２つまたはこれを超える配列の間の同一性を計算するための、多数の数学的アルゴリズムが公知であり、多数の、利用可能なソフトプログラムへと組み込まれている。このようなプログラムの例は、ＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗ、Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅ、およびＡＬＩＧＮ（核酸配列およびアミノ酸配列のアライメントのための）、ＢＬＡＳＴプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ  ２．１、ＢＬ２ＳＥＱ、およびこれらの最新バージョン）、およびＦＡＳＴＡプログラム（例えば、ＦＡＳＴＡ３ｘ、ＦＡＳＴＭ、およびＳＳＥＡＲＣＨ）（配列アライメントおよび配列類似性の検索のための）を含む。配列アライメントアルゴリズムはまた、例えば、Altschul et al., J. Molecular Biol., 215(3): 403-410 (1990), Beigert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(10): 3770-3775 (2009), Durbin et al., eds., Biological Sequence Analysis: Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, UK (2009), Soding, Bioinformatics, 21(7): 951-960 (2005), Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402 (1997)およびGusfield, Algorithms on Strings, Trees and Sequences, Cambridge University Press, Cambridge UK (1997)においても開示されている。
【０１０９】
アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、前述の配列のうちの、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ全てを、単独で、または任意の組合せで含みうる。この点で、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、前述の配列のうちの、任意の２つの、任意の組合せ、前述の配列のうちの、任意の３つの、任意の組合せ、前述の配列のうちの、任意の４つの、任意の組合せ、または前述の配列の５つ全てを含みうる。
【０１１０】
本明細書で論じられる通り、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、複製コンピテント型の場合もあり、条件付き複製型の場合もあり、複製欠損型の場合もある。好ましくは、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、複製欠損型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターが、繁殖のために（例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために）、アデノウイルスゲノムの、１または複数の領域の、少なくとも１つの、複製に必須の遺伝子機能の補完を必要とするように、複製欠損型である。
【０１１１】
複製欠損型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、繁殖のための、アデノウイルスゲノムの、１または複数の領域内の、１または複数の、複製に必須の遺伝子機能の欠損を引き起こすのに適する、任意の方式で改変することができる。アデノウイルスゲノムの、１または複数の領域の、１または複数の、複製に必須の遺伝子機能の欠損の補完とは、欠損させた、複製に必須の遺伝子機能をもたらす、外因性手段の使用を指す。このような補完は、例えば、細胞、および／または、破壊された、複製に必須の遺伝子機能をコードする、外因性ＤＮＡ（例えば、ヘルパーアデノウイルス）の補完を使用することにより、任意の適切な方式でなされうる。
【０１１２】
アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの、早期領域（すなわち、Ｅ１〜Ｅ４領域）だけ、アデノウイルスゲノムの、後期領域（すなわち、Ｌ１〜Ｌ５領域）だけ、アデノウイルスゲノムの、早期領域および後期領域の両方、または全てのアデノウイルス遺伝子（すなわち、高容量アデノベクター（ＨＣ−Ａｄ））のうちの、１または複数の、複製に必須の遺伝子機能を欠損させることができる。Morsy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 965-976 (1998); Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 1645-1650 (1997);およびKochanek et al., Hum. Gene Ther., 10: 2451-2459 (1999)を参照されたい。複製欠損型アデノウイルスベクターの例は、米国特許第５，８３７，５１１号明細書；同第５，８５１，８０６号明細書；同第５，９９４，１０６号明細書；同第６，１２７，１７５号明細書；同第６，４８２，６１６号明細書；および同第７，１９５，８９６号明細書、ならびに国際特許出願公開第１９９４／０２８１５２号パンフレット、同第１９９５／００２６９７号パンフレット、同第１９９５／０１６７７２号パンフレット、同第１９９５／０３４６７１号パンフレット、同第１９９６／０２２３７８号パンフレット、同第１９９７／０１２９８６号パンフレット、同第１９９７／０２１８２６号パンフレット、および同第２００３／０２２３１１号パンフレットにおいて開示されている。
【０１１３】
アデノウイルスゲノムの早期領域は、Ｅ１領域、Ｅ２領域、Ｅ３領域、およびＥ４領域を含む。Ｅ１領域は、Ｅ１Ａ亜領域およびＥ１Ｂ亜領域を含み、Ｅ１領域内の、複製に必須の遺伝子機能の、１または複数の欠損は、Ｅ１Ａ亜領域およびＥ１Ｂ亜領域の一方または両方における、複製に必須の遺伝子機能の、１または複数の欠損、これにより、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターが、繁殖するために（例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために）、アデノウイルスゲノムの、Ｅ１Ａ亜領域および／またはＥ１Ｂ亜領域の補完を必要とする。Ｅ２領域は、Ｅ２Ａ亜領域およびＥ２Ｂ亜領域を含み、Ｅ２領域内の、複製に必須の遺伝子機能の、１または複数の欠損は、Ｅ２Ａ亜領域およびＥ２Ｂ亜領域の一方または両方における、複製に必須の遺伝子機能の、１または複数の欠損を含むことが可能であり、これにより、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターが、繁殖するために（例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために）、アデノウイルスゲノムの、Ｅ２Ａ亜領域および／またはＥ２Ｂ亜領域の補完を必要とする。
【０１１４】
Ｅ３領域は、Ｅ３領域の、一部または全部の欠失が、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターが、繁殖するために（例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために）、Ｅ３領域内の、任意の遺伝子機能の補完を必要としないように、複製に必須の遺伝子機能を含まない。本開示の文脈では、Ｅ３領域は、ヒトアデノウイルス５のＥ３領域に由来する、１２．５Ｋのタンパク質（ＮＣＢＩ基準配列：ＡＰ＿０００２１８）に対する、高度の相同性を伴うタンパク質をコードするオープンリーディングフレームで始まり、ヒトアデノウイルス５のＥ３領域に由来する、１４．７Ｋのタンパク質（ＮＣＢＩ基準配列：ＡＰ＿０００２２４．１）に対する、高度の相同性を伴うタンパク質をコードするオープンリーディングフレームで終わる領域として規定される。Ｅ３領域は、一部または全部を欠失させることもでき、一部または全部を保持することもできる。欠失のサイズは、そのゲノムが、最適のゲノムパッケージングサイズに、緊密にマッチする、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを保持するように、微調整することができる。大型の欠失は、アデノウイルス内またはアデノウイルスゲノム内の、大型の異種核酸配列の挿入に適合するであろう。本開示の一実施形態では、Ｅ３領域内に存在する、Ｌ４ポリアデニル化シグナル配列は、保持される。
【０１１５】
Ｅ４領域は、複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。ＯＲＦ６を除き、場合によって、ＯＲＦ３を除く、Ｅ４領域のオープンリーディングフレームの全てを欠失させた、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターが、繁殖するために（例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために）、Ｅ４領域内の、任意の遺伝子機能の補完を必要としない。逆に、Ｅ４領域の、ＯＲＦ６の破壊または欠失であり、場合によって、ＯＲＦ３の破壊または欠失を伴い（例えば、Ｅ４領域の、ＯＲＦ６および／またはＯＲＦ３に基づく、複製に必須の遺伝子機能を欠損させ）、Ｅ４領域、または天然のＥ４プロモーター、ポリアデニル化配列、および／もしくは右側のＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）の、他のオープンリーディングフレームのうちのいずれかの、破壊または欠失を伴うか、または伴わない、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターが、繁殖するために（例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために）、Ｅ４領域の補完（具体的には、Ｅ４領域のうちの、ＯＲＦ６および／またはＯＲＦ３の補完）を必要とする。アデノウイルスゲノムの後期領域は、Ｌ１領域、Ｌ２領域、Ｌ３領域、Ｌ４領域、およびＬ５領域を含む。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターはまた、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）内の突然変異であって、国際特許出願公開第２０００／０００６２８号パンフレットにおいて論じられている通り、所望の場合、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを、複製欠損型としうる突然変異も有しうる。
【０１１６】
複製に必須の遺伝子機能の、１または複数の欠損を含有する、アデノウイルスゲノムの、１または複数の領域は、１または複数のアデノウイルスゲノムの早期領域、すなわち、任意選択で、Ｅ３領域の一部または全部における欠失を伴う、Ｅ１領域、Ｅ２領域、および／またはＥ４領域であることが所望される。
【０１１７】
複製欠損型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターはまた、宿主細胞内のウイルス複製を阻害しないアデノウイルスゲノム内に、野生型アデノウイルスと比較した、１または複数の突然変異（例えば、１または複数の欠失、挿入、および／または置換）も有しうる。したがって、複製に必須の遺伝子機能の、１または複数の欠損に加えて、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、複製に必須ではない、他の点でも欠損させることができる。例えば、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスまたはアデノウイルスゲノムの繁殖に必須ではない、Ｅ３領域として公知の、アデノウイルス早期領域の、部分的欠失または完全な欠失を有しうる。
【０１１８】
一実施形態では、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、複製欠損型であり、繁殖のために（例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために）、最大で、アデノウイルスゲノムのＥ１領域またはＥ４領域の補完を必要とする。したがって、複製欠損型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、繁殖のために（例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために）、少なくとも１つの、アデノウイルスゲノム（Ｅ１欠損アデノウイルスベクターを表示した）のＥ１Ａ亜領域および／またはＥ１Ｂ領域、またはアデノウイルスゲノム（Ｅ４欠損アデノウイルスベクターを表示した）のＥ４領域の、複製に必須の遺伝子機能の補完を必要とする。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の、少なくとも１つの、複製に必須の遺伝子機能（複製に必須の、全ての遺伝子機能であることが所望される）と、アデノウイルスゲノム（Ｅ１／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターを表示した）の、非必須Ｅ３領域の、少なくとも１つの遺伝子機能とを欠損させることができる。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の、少なくとも１つの、複製に必須の遺伝子機能（複製に必須の、全ての遺伝子機能であることが所望される）、およびアデノウイルスゲノム（Ｅ３／Ｅ４欠損アデノウイルスベクターを表示した）の、非必須Ｅ３領域の、少なくとも１つの遺伝子機能を欠損させることができる。
【０１１９】
一実施形態では、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、複製欠損型であり、繁殖のために（例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために）、最大で、アデノウイルスゲノムのＥ２領域、好ましくはＥ２Ａ亜領域の補完を必要とする。したがって、複製欠損型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、繁殖のために（例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために）、少なくとも１つの、アデノウイルスゲノム（Ｅ２Ａ欠損アデノウイルスベクターを表示した）のＥ２Ａ亜領域の、複製に必須の遺伝子機能の補完を必要とする。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域の、少なくとも１つの、複製に必須の遺伝子機能（複製に必須の、全ての遺伝子機能であることが所望される）、およびアデノウイルスゲノム（Ｅ２Ａ／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターを表示した）の、非必須Ｅ３領域の、少なくとも１つの遺伝子機能を欠損させることができる。
【０１２０】
一実施形態では、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、複製欠損型であり、繁殖のために（例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために）、アデノウイルスゲノムのＥ１領域およびＥ４領域の補完を必要とする。したがって、複製欠損型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、繁殖のために（例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために）、アデノウイルスゲノム（Ｅ１／Ｅ４欠損アデノウイルスベクターを表示した）のＥ１領域およびＥ４領域の両方の、少なくとも１つの、複製に必須の遺伝子機能の補完を必要とする。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の、少なくとも１つの、複製に必須の遺伝子機能（複製に必須の、全ての遺伝子機能であることが所望される）、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の、少なくとも１つの、複製に必須の遺伝子機能、およびアデノウイルスゲノム（Ｅ１／Ｅ３／Ｅ４欠損アデノウイルスベクターを表示した）の、非必須Ｅ３領域の、少なくとも１つの遺伝子機能を欠損させることができる。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、好ましくは、最大で、繁殖のために、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の補完を必要とするが、繁殖のために、アデノウイルスゲノムの、他の任意の欠損の補完を必要としない。より好ましくは、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、最大で、繁殖のために、アデノウイルスゲノムのＥ１領域およびＥ４領域の補完を必要とするが、繁殖のために、アデノウイルスゲノムの、他の任意の欠損の補完を必要としない。
【０１２１】
アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの、複数の、複製に必須の遺伝子機能を欠損させた場合（例えば、Ｅ１／Ｅ４欠損アデノウイルスベクター）は、単一の、複製に必須の遺伝子機能を欠損させた、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクター（例えば、Ｅ１欠損アデノウイルスベクター）により達成されるウイルス増殖と同様の、補完細胞系内のウイルス増殖をもたらす、スペーサー配列を含みうる。スペーサー配列は、少なくとも約１５塩基対（例えば、約１５ヌクレオチド〜約１２，０００ヌクレオチドの間）、好ましくは、約１００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド、より好ましくは、約５００ヌクレオチド〜約８，０００ヌクレオチド、なおより好ましくは、約１，５００ヌクレオチド〜約６，０００ヌクレオチドであり、最も好ましくは、約２，０００〜約３，０００ヌクレオチドの長さ、または前出の値のうちの、任意の２つにより規定される範囲の配列など、所望の長さである、任意の、１または複数のヌクレオチド配列を含有しうる。スペーサー配列は、アデノウイルスゲノムに照らして、コード配列の場合もあり、非コード配列の場合もあり、天然配列の場合もあり非天然配列の場合もあるが、複製に必須の機能を、欠損させた領域へと復帰させない。スペーサーはまた、発現カセットも含有しうる。より好ましくは、スペーサーは、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターに照らして非天然である、ポリアデニル化配列および／またはポリアデニル化遺伝子を含む。アデノウイルスベクター内の、スペーサーの使用については、例えば、米国特許第５，８５１，８０６号明細書、および国際特許出願公開第１９９７／０２１８２６号パンフレットにおいて、さらに記載されている。
【０１２２】
アデノウイルスゲノムの全部または一部、例えば、アデノウイルスゲノムのＥ１領域、Ｅ３領域、およびＥ４領域を除去することにより、結果として得られるアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスカプシドへとパッケージングされる能力を保持しながら、外因性核酸配列のインサートを許容することが可能である。外因性核酸配列は、位置への挿入が、アデノウイルス粒子またはアデノウイルスベクター粒子の形成を可能とする限りにおいて、アデノウイルスゲノム内の、任意の位置に挿入されうる。外因性核酸配列は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域内、Ｅ３領域内、またはＥ４領域内に位置させることが好ましい。
【０１２３】
本開示の、複製欠損型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、複製欠損型のアデノウイルス内またはアデノウイルスベクター内に存在しない遺伝子機能をもたらす、補完細胞系内で産生されうるが、高力価のウイルスベクター株を発生させるための、適切なレベルにおける、ウイルスの繁殖のために必要とされる。このような補完細胞系は、公知であり、２９３細胞（例えば、Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59-72 (1977)に記載されている）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（例えば、国際特許出願公開第１９９７／０００３２６号パンフレット、ならびに米国特許第５，９９４，１２８号明細書および同第６，０３３，９０８号明細書に記載されている）、および２９３−ＯＲＦ６細胞（例えば、国際特許出願公開第９５／３４６７１号パンフレットおよびBrough et al., J. Virol., 71: 9206-9213 (1997)に記載されている）を含むがこれらに限定されない。本開示の、複製欠損型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを作製するのに適する、他の補完細胞系は、その発現が、宿主細胞内のウイルス増殖を阻害するトランス遺伝子をコードする、アデノウイルスベクターを繁殖させるように作出された補完細胞（例えば、米国特許出願公開第２００８／０２３３６５０号明細書を参照されたい）を含む。さらなる、適切な補完細胞については、例えば、米国特許第６，６７７，１５６号明細書および同第６，６８２，９２９号明細書、および国際特許出願公開第２００３／０２０８７９号パンフレットにおいて記載されている。場合によって、細胞内ゲノムは、その遺伝子産物が、複製欠損型アデノウイルスベクターの欠損の全てを補完する、核酸配列を含む必要がない。複製欠損型アデノウイルスベクター内で欠如する、１または複数の、複製に必須の遺伝子機能は、ヘルパーウイルス、例えば、複製欠損型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの複製に必要とされる、１または複数の必須遺伝子機能を、トランスで供給する、アデノウイルスベクターにより供給されうる。代替的に、本発明のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、本発明の、複製欠損型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクター内で欠如する、１または複数の、複製に必須の遺伝子機能を補完する、非天然の、複製に必須の遺伝子を含みうる。例えば、Ｅ１／Ｅ４欠損アデノウイルスベクターは、異なるアデノウイルス（例えば、本発明のアデノウイルスもしくはアデノウイルスベクターと異なる血清型のアデノウイルス、または本発明のアデノウイルスもしくはアデノウイルスベクターと異なる種のアデノウイルス）から得られるか、またはこれらに由来する、Ｅ４  ＯＲＦ  ６をコードする核酸配列を含有するように操作することができる。
【０１２４】
アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、トランス遺伝子をさらに含みうる。本明細書では、「トランス遺伝子」という用語は、非天然の核酸配列を発現させて、タンパク質（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）を産生するように、適切な調節エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結された、非天然の核酸配列として規定される。調節エレメント（例えば、プロモーター）は、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターに対して、天然の場合もあり、非天然の場合もある。
【０１２５】
「非天然の」核酸配列とは、天然に存在する位置における、アデノウイルスの天然に存在する核酸配列ではない、任意の核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、またはｃＤＮＡ配列）である。したがって、非天然の核酸配列は、アデノウイルス内で、天然で見出されうるが、アデノウイルスゲノム内の、非天然の位置に位置し、かつ／または非天然のプロモーターに作動可能に連結されうる。本開示の文脈では、「非天然の核酸配列」、「異種核酸配列」、および「外因性核酸配列」という用語は、同義であり、互換的に使用することができる。非天然の核酸配列は、好ましくは、ＤＮＡであり、好ましくは、タンパク質をコードする（すなわち、１または複数のタンパク質をコードする、１または複数の核酸配列である）。
【０１２６】
非天然の核酸配列は、哺乳動物を、疾患について、予防的に、または治療的に処置するのに使用されうる、治療用タンパク質をコードしうる。適切な治療用タンパク質の例は、サイトカイン、毒素、腫瘍抑制性タンパク質、増殖因子、ホルモン、受容体、マイトジェン、免疫グロブリン、神経ペプチド、神経伝達物質、および酵素を含む。代替的に、非天然の核酸配列は、病原体（例えば、細菌またはウイルス）の抗原をコードすることが可能であり、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、ワクチンとして使用することができる。
【０１２７】
ウイルスベースの送達系
本開示はまた、本明細書で記載される核酸を挿入したウイルスのベースの系などの送達系も提供する。代表的なウイルス発現ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベースのベクター、レンチウイルスベースのベクター、レトロウイルスベクター、およびヘルペスウイルスベースのベクターを含むがこれらに限定されない。ある実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、トランス遺伝子の、娘細胞における、長期にわたる、安定的な組込みおよびその繁殖を可能とするので、長期にわたる遺伝子導入を達成するのに適するツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖性細胞に形質導入しうるという点で、マウス白血病ウイルスなど、がんレトロウイルスに由来するベクターに優る追加の利点を有する。レンチウイルスベクターはまた、低免疫原性という追加の利点も有する。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。一般に、かつ、複数の実施形態では、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１または複数の選択用マーカーを含有する。
【０１２８】
さらなる、適切なベクターは、宿主細胞のＤＮＡへと、ランダムに組み込まれる場合もあり、発現ベクターと、宿主細胞の染色体との特異的組換えを可能とする組換え部位を含む場合もある、組込み用発現ベクターを含む。このような組込み用発現ベクターは、宿主細胞の染色体の内因性発現制御配列を用いて、所望のタンパク質の発現をもたらしうる。部位特異的に組み込むベクターの例は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）（例えば、ｐｃＤＮＡ（商標）５／ＦＲＴ）製のｆｌｐ−ｉｎ系、またはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐＥｘｃｈａｎｇｅ−６  Ｃｏｒｅ  Ｖｅｃｔｏｒｓにおいて見出されうるｃｒｅ−ｌｏｘ系などのｃｒｅ−ｌｏｘ系の構成要素を含む。宿主細胞染色体へとランダムに組み込まれるベクターの例は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐｃＤＮＡ３．１（Ｔ抗原の非存在下で導入される場合）、およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）製のｐＣＩまたはｐＦＮ１０Ａ（ＡＣＴ）ＦＬＥＸＩ（商標）を含む。さらなるプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的に、プロモーターエレメントは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域内に位置するが、多数のプロモーターは、開始部位の下流にも、機能的なエレメントを含有することが近年示されている。エレメントが、互いに対して逆位であるか、または移動している場合にも、プロモーター機能が保存されるように、プロモーターエレメントの間のスペーシングは、柔軟であることが多い。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が減衰し始める前に、プロモーターエレメントの間のスペーシングが、５０ｂｐの距離まで増大する場合がある。個別のエレメントは、転写を活性化させるように、プロモーターに応じて、共作動的に機能する場合もあり、独立に機能する場合もあると考えられる。
【０１２９】
適切なプロモーターの１つの例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即初期プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それへと作動的に連結された、任意のポリヌクレオチド配列の、高レベルの発現を駆動することが可能である、強力な構成的プロモーター配列である。
【０１３０】
しかし、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルス即初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターのほか、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどであるがこれらに限定されない、ヒト遺伝子プロモーターを含むがこれらに限定されない、他の構成的プロモーター配列もまた、使用することができる。さらに、本開示は、構成的プロモーターの使用に限定されないものとする。誘導性プロモーターもまた、本開示の一部として想定される。誘導性プロモーターの使用は、このような発現が所望される場合に、それが作動的に連結されたポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、または発現が所望されない場合に、発現をオフにすることが可能な分子スイッチをもたらす。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターを含むがこれらに限定されない。
【０１３１】
レポーター遺伝子を、トランスフェクトされた可能性がある細胞を同定し、調節配列の機能性について査定するために使用することができる。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエントの生物または組織において存在しないか、またはこれらにより発現せず、その発現が、何らかの、容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により顕在化されるポリペプチドをコードする遺伝子である。ＤＮＡを、レシピエント細胞へと導入した後の適切な時点において、レポーター遺伝子の発現についてアッセイする。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子（例えば、Ui-Tei et al., FEBS Letters 479: 79-82 (2000)）を含みうる。適切な発現系が周知であり、公知の技法を使用して調製することもでき、市販品を購入することもできる。一般に、最高レベルのレポーター遺伝子の発現を示す、最小限の５’側フランキング領域を伴う構築物は、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子へと連結し、薬剤を、プロモーター駆動型転写をモジュレートする能力について査定するのに使用することができる。
【０１３２】
当技術分野では、遺伝子を細胞へと導入し発現させる方法が公知である。発現ベクターの文脈では、ベクターを、当技術分野における任意の方法により、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞へと、たやすく導入することができる。例えば、発現ベクターは、宿主細胞へと、物理的手段により導入することもでき、化学的手段により導入することもでき、生物学的手段により導入することもできる。
【０１３３】
ポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション法、遺伝子銃法、マイクロインジェクション法、電気穿孔法などを含む。当技術分野では、ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を作製するための方法が周知である。例えば、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001))を参照されたい。複数の実施形態では、ポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションまたはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクションである。
【０１３４】
目的のポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための生物学的方法は、ＤＮＡベクターおよびＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクターと、とりわけ、レトロウイルスベクターとは、遺伝子を、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞へと挿入するための、最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどに由来しうる。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号明細書および同第５，５８５，３６２号明細書を参照されたい。
【０１３５】
非ウイルスベースの送達系
【０１３６】
ポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための化学的手段は、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合型ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系などのコロイド分散系を含む。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける、送達媒体としての使用のための、例示的なコロイド状系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
【０１３７】
核酸の、宿主細胞への導入（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける）のために、脂質製剤の使用が想定される。別の態様では、核酸は、脂質と会合させることができる。脂質と会合させた核酸は、リポソームの脂質二重層内に散在する、水性のリポソーム内部に封入することもでき、リポソームおよびオリゴヌクレオチドのいずれとも会合する連結分子を介して、リポソームへと接合させることもでき、リポソーム内に取り込むこともでき、リポソームと複合体化させることもでき、脂質を含有する溶液中に分散させることもでき、脂質と混合することもでき、脂質と組み合わせることもでき、脂質中の懸濁液として含有することもでき、ミセルと共に含有するかもしくは複合体化させることもでき、または他の形で脂質と会合させることもできる。脂質、脂質／ＤＮＡ、または脂質／発現ベクターに関連する組成物は、溶液中の、任意の特定の構造に限定されない。例えば、組成物は、ミセルとしての二重層構造内に存在する場合もあり、「コラプシング」構造を伴う二重層構造内に存在する場合もある。組成物はまた、単に、溶液中に散在させ、おそらく、サイズまたは形状が均質ではない凝集物を形成する場合もある。脂質とは、天然脂質の場合もあり、合成脂質の場合もある、脂肪性物質である。例えば、脂質は、天然では、細胞質内で発生する脂肪性液滴のほか、長鎖脂肪族炭化水素、ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドなど、それらの誘導体を含有する化合物のクラスを含む。
【０１３８】
使用に適する脂質は、市販元から購入することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．から購入することができ、ジセチルリン酸（「ＤＣＰ」）は、Ｋ  ＆  Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）から購入することができ、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから購入することができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ａｌａ．）から購入することができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質原液は、約−２０℃で保存することができる。クロロホルムは、メタノールよりたやすく蒸発するので、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」とは、封入された脂質の二重層または脂凝集物の作出により形成される、様々な単一の脂質媒体および多層性脂質媒体を包含する、一般的な用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部の水性媒質を伴う小胞構造を有するものとして特徴づけることができる。多層性リポソームは、水性媒質により分離された複数の脂質層を有する。多層性リポソームは、リン脂質を、過剰量の水溶液中に懸濁させると、自発的に形成される。脂質成分は、閉止構造を形成する前に、自己転移を経、脂質二重層の間に、水および溶解させた溶質を取り込む（Ghosh et al., Glycobiology 5: 505-10 (1991)）。しかし、溶液中に通常の小胞構造と異なる構造を有する組成物もまた、包含される。例えば、脂質は、ミセル構造を取る場合もあり、脂質分子による不均質の凝集物として存在する場合もある。また、リポフェクタミン−核酸複合体も想定される。
【０１３９】
場合によって、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、ＤＮＡ配列を、脊椎動物の染色体へと導入するための、合成ＤＮＡトランスポゾン系を指す、「Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾン系」など、非ウイルスベースの送達系を使用して、細胞へと導入することもできる。系の、一部の例示的な実施形態については、例えば、米国特許第６，４８９，４５８号明細書、同第８，２２７，４３２号明細書において記載されている。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポザーゼおよびＳＢトランスポゾンから構成される。複数の実施形態では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系は、ＳＢ１１トランスポゾン系、ＳＢ１００Ｒトランスポゾン系、またはＳＢ１１０トランスポゾン系を含みうる。
【０１４０】
ＤＮＡトランスポゾンは、１つのＤＮＡ部位から、別のＤＮＡ部位へと、単純なカットアンドペースト方式で転座する。転移は、規定されたＤＮＡセグメントを、１つのＤＮＡ分子から切り出し、同じＤＮＡ分子内もしくはゲノム内、または異なるＤＮＡ分子内もしくはゲノム内の別の部位へと移動させる、正確な過程である。他のＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポザーゼと同様、ＳＢトランスポザーゼも、トランスポゾンを、レシピエントＤＮＡ配列内の、ＴＡジヌクレオチド塩基対へと挿入する。挿入部位は、同じＤＮＡ分子内の別の部位の場合もあり、別のＤＮＡ分子（または染色体）内の場合もある。ヒトゲノムを含む哺乳動物ゲノムには、約２億カ所のＴＡ部位が存在する。ＴＡ挿入部位は、トランスポゾン組込みの過程において、重複される。このＴＡ配列の重複は、転移の顕著な特徴であり、一部の実験では、機構を確認するのに使用される。トランスポザーゼは、トランスポゾン内でコードされる場合もあり、トランスポザーゼは、別の供給源、例えば、ＤＮＡ供給源またはｍＲＮＡ供給源により供給される場合もあり、この場合、トランスポゾンは、非自律型エレメントとなる。非自律型トランスポゾンは、挿入の後、独立では切出しおよび再挿入を行いえないため、遺伝子ツールとして最も有用である。ＳＢトランスポゾンは、脊椎動物のゲノムへの遺伝子の導入および遺伝子治療のための非ウイルスベクターとして使用することが想定されている。
【０１４１】
外因性核酸を、宿主細胞へと導入するか、または細胞を、本開示の阻害剤へと、他の形で曝露するのに使用される方法にかかわらず、宿主細胞内の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。このようなアッセイは、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲなど、当業者に周知の分子アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）、または薬剤を同定するための、本明細書で記載されるアッセイであって、本開示の範囲内に収まるアッセイにより、特定のペプチドの有無を検出するアッセイなどの「生化学的」アッセイを含む。
【０１４２】
複数の実施形態では、ＳＢ１１トランスポゾン系、ＳＢ１００Ｘトランスポゾン系、ＳＢ１１０トランスポゾン系、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Wilson et al, “PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells,” Molecular Therapy 15:139-145 (2007)を参照されたい）、および／またはｐｉｇｇｙＢａｔトランスポゾン系（例えば、Mitra et al., “Functional characterization of piggyBat from the bat Myotis lucifugus unveils an active mammalian DNA transposon,” Proc. Natl. Acad. Sci USA 110:234-239 (2013)を参照されたい）を使用して、本明細書で説明される改変エフェクター細胞および他の遺伝子エレメントを、細胞へと送達する。さらなるトランスポザーゼおよびトランスポゾン系については、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４８９，４５８号明細書、同第６，６１３，７５２号明細書、同第７，１４８，２０３号明細書、同第７，９８５，７３９号明細書、同第８，２２７，４３２号明細書、同第９，２２８，１８０号明細書、米国特許公開第２０１１／０１１７０７２号明細書、Mates et al., Nat Genet, 41(6):753-61 (2009). doi: 10.1038/ng.343. Epub 2009 May 3, Gene Ther., 18(9):849-56 (2011). doi: 10.1038/gt.2011.40. Epub 2011 Mar 31 およびIvics et al., Cell. 91(4):501-10, (1997)において提示されている。
【０１４３】
さらなる、適切な非ウイルス系は、宿主細胞のＤＮＡへと、ランダムに組み込まれる場合もあり、発現ベクターと、宿主細胞の染色体との特異的組換えを可能とする組換え部位を含む場合もある、組込み用発現ベクターを含みうる。トランス遺伝子の、所定の遺伝子座への組込みのターゲティングが、多くの適用に所望される目標である。まず、部位特異的リコンビナーゼの第１の組換え部位を、ゲノム部位に、ランダムに、または所定の位置に挿入する。続いて、細胞に、目的の遺伝子またはＤＮＡ、ならびに第２の組換え部位およびリコンビナーゼの供給源（リコンビナーゼを発現させる、発現プラスミド、ＲＮＡ、タンパク質、またはウイルス）を保有するプラスミドをトランスフェクトする。第１の組換え部位と第２の組換え部位との組換えは、プラスミドＤＮＡの組込みをもたらす。
【０１４４】
このような組込み用発現ベクターは、宿主細胞の染色体の内因性発現制御配列を用いて、所望のタンパク質の発現をもたらしうる。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド上の配列であって、組込み部位を挟む配列と相同な配列の存在により、組込みのターゲティングを促進する。例えば、本明細書で記載されるドナーポリヌクレオチドを使用する、組込みのターゲティングは、従来のトランスフェクション法、例えば、相同組換えにより、遺伝子のノックアウトまたはノックインを創出するのに使用される技法に従い達成することができる。他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド上の配列であって、組込み部位を挟む配列と相同な配列の存在、および部位特異的リコンビナーゼの存在下で、細胞を、ドナーポリヌクレオチドと接触させることの両方により、組込みのターゲティングを促進する。部位特異的リコンビナーゼ、または、単に、リコンビナーゼとは、その適合性の組換え部位の間の、保存的な部位特異的組換えを触媒するポリペプチドを意味する。本明細書で使用される部位特異的リコンビナーゼは、天然ポリペプチドのほか、活性を保持する誘導体、変異体、および／または断片、ならびに天然ポリヌクレオチド、活性を保持するリコンビナーゼをコードする誘導体、変異体、および／または断片を含む。
【０１４５】
本明細書ではまた、宿主細胞内において異種遺伝子を組み込むための系であって、１または複数の遺伝子発現カセットを含む系も提示される。場合によって、系は、第１のポリペプチド構築物をコードする、第１のポリヌクレオチドを含む、第１の遺伝子発現カセットを含む。他の場合には、系は、第２のポリペプチド構築物をコードする、第２のポリヌクレオチドを含む、第２の遺伝子発現カセットを含みうる。さらに他の場合には、系は、第３の遺伝子発現カセットを含みうる。一実施形態では、遺伝子発現カセットのうちの１つは、（ｉ）トランス活性化ドメイン；（ｉｉ）核内受容体リガンド結合性ドメイン；（ｉｉｉ）ＤＮＡ結合性ドメイン；、および（ｉｖ）エクジソン受容体結合性ドメインのうちの１または複数をコードする、遺伝子スイッチポリヌクレオチドを含みうる。別の実施形態では、系は、前記宿主細胞を、セリンリコンビナーゼの存在下で、少なくとも前記第１の遺伝子発現カセットと接触させると、前記異種遺伝子が、前記宿主細胞へと組み込まれるように、組換え接合部位およびセリンリコンビナーゼをさらに含む。
【０１４６】
場合によって、系は、前記宿主細胞を、前記リガンドの存在下で接触させると、前記異種遺伝子が、前記宿主細胞内で発現するように、リガンドをさらに含む。１つの場合には、系はまた、組換え接合部位も含む。場合によって、１つの組換え接合部位は、ファージゲノム組換え接合部位（ａｔｔＰ）または細菌ゲノム組換え接合部位（ａｔｔＢ）である。１つの場合には、宿主細胞は、真核細胞である。別の場合には、宿主細胞は、ヒト細胞である。さらなる場合には、宿主細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。
【０１４７】
プロモーター
「プロモーター」とは、コード配列の転写を誘発する、ポリヌクレオチドの領域を指す。プロモーターは、ＤＮＡの、同じ鎖上の、遺伝子の転写開始部位の近傍であり、かつ、上流に（センス鎖の５’側領域に向かって）位置する。あるプロモーターが、細胞内の全ての状況において活性であるので、構成的であるのに対し、他のプロモーター、例えば、誘導性プロモーターは、特異的刺激に応答して調節され、活性となる。さらに他のプロモーターは、Ｔ細胞特異的プロモーターを含むがこれらに限定されない、組織特異的プロモーターまたは活性化プロモーターである。
【０１４８】
本明細書で使用される「プロモーター活性」という用語およびその文法的同等物は、その活性が測定されるプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現の程度を指す。プロモーター活性は、例えば、ノーザンブロット解析により、産生されるＲＮＡ転写物の量を決定することにより、直接的に測定することもでき、プロモーターに連結されたレポーター核酸配列など、連結された核酸配列によりコードされる産物の量を決定することにより、間接的に測定することもできる。
【０１４９】
本明細書で使用される「誘導性プロモーター」とは、転写調節因子、例えば、生物因子または非生物因子の存在または非存在により、活性へと誘導されるプロモーターを指す。誘導性プロモーターは、それらに作動可能に連結された遺伝子の発現が、生物、または、特に、組織の発生の、ある特定の段階において、オンまたはオフにされうるため、有用である。誘導性プロモーターの例は、アルコール調節性プロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、発症機序調節性プロモーター、温度調節性プロモーター、および光調節性プロモーターである。一実施形態では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチの一部である。誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチのリガンド誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。場合によって、遺伝子スイッチは、それらの各々が、参照によりその全体において組み込まれる、ＰＣＴ／米国出願第２００１／００９０５０号明細書（国際公開第２００１／０７０８１６号パンフレット）；米国特許第７，０９１，０３８号明細書；同第７，７７６，５８７号明細書；同第７，８０７，４１７号明細書；同第８，２０２，７１８号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００１／０３０６０８号明細書（国際公開第２００２／０２９０７５号パンフレット）；米国特許第８，１０５，８２５号明細書；同第８，１６８，４２６号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５２３５号明細書（国際公開第２００２／０６６６１３号パンフレット）；米国特許出願公開第１０／４６８，２００号明細書（米国公開第２０１２０１６７２３９号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５７０６号明細書（国際公開第２００２／０６６６１４号パンフレット）；米国特許第７，５３１，３２６号明細書；同第８，２３６，５５６号明細書；同第８，５９８，４０９号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５０９０号明細書（国際公開第２００２／０６６６１２号パンフレット）；米国特許第８，７１５，９５９号明細書（米国公開第２００６０１００４１６号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５２３４号明細書（国際公開第２００３／０２７２６６号パンフレット）；米国特許第７，６０１，５０８号明細書；同第７，８２９，６７６号明細書；同第７，９１９，２６９号明細書；同第８，０３０，０６７号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５７０８号明細書（国際公開第２００２／０６６６１５号パンフレット）；米国特許出願公開第１０／４６８，１９２号明細書（米国公開第２０１１０２１２５２８号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５０２６号明細書（国際公開第２００３／０２７２８９号パンフレット）；米国特許第７，５６３，８７９号明細書；同第８，０２１，８７８号明細書；同第８，４９７，０９３号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００５／０１５０８９号明細書（国際公開第２００５／１０８６１７号パンフレット）；米国特許第７，９３５，５１０号明細書；同第８，０７６，４５４号明細書；ＰＣＴ／米国出願第５２００８／０１１２７０号明細書（国際公開第２００９／０４５３７０号パンフレット）；米国特許出願公開第１２／２４１，０１８号明細書（米国公開第２００９０１３６４６５号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００８／０１１５６３号明細書（国際公開第２００９／０４８５６０号パンフレット）；米国特許出願公開第１２／２４７，７３８号明細書（米国公開第２００９０１２３４４１号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００９／００５５１０号明細書（国際公開第２０１０／０４２１８９号パンフレット）；米国特許出願公開第１３／１２３，１２９号明細書（米国公開第２０１１０２６８７６６号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２０１１／０２９６８２号明細書（国際公開第２０１１／１１９７７３号パンフレット）；米国特許出願公開第１３／６３６，４７３号明細書（米国公開第２０１３０１９５８００号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２０１２／０２７５１５号明細書（国際公開第２０１２／１２２０２５号パンフレット）；および米国特許第９，４０２，９１９号明細書において記載されている系のうちのいずれかの、エクジソンベースの受容体による構成要素から選択しうるが、これらに限定されない。
【０１５０】
本明細書では、対象へと、少なくとも２つの機能的タンパク質またはこれらの部分；少なくとも１つのプロモーター；および少なくとも１つの操作組換え部位を含む、本明細書で記載されるポリペプチド配列をコードする、ポリヌクレオチドを含む、少なくとも１つの非ウイルスベクターを投与するステップを含み；前記少なくとも１つのプロモーターが、前記少なくとも２つの機能的タンパク質の発現を駆動する、方法が提示される。場合によって、少なくとも１つのプロモーターは、構成的プロモーターでありうる。場合によって、少なくとも１つのプロモーターは、組織特異的プロモーターでありうる。場合によって、少なくとも１つのプロモーターは、誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチである。他の場合には、少なくとも１つのプロモーターが、誘導性であることが可能であり、少なくとも１つのプロモーターが、活性化特異的でありうる、プロモーターの組合せを用いることができる。
【０１５１】
誘導性プロモーターは、前記少なくとも２つの遺伝子の発現の、用量調節性制御のために、リガンドを用いる。場合によって、リガンドは、ｅｃｄｙステロイド、９−ｃｉｓ−レチノイン酸、レチノイン酸の合成類似体、Ｎ，Ｎ’−ジアシルヒドラジン、オキサゾリン、ジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン、Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジン、Ｎ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジン、Ｎ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジン、アルニドケトン、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド、８−Ｏ−アセチルハルパジド、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−スルフェート（sulfate）（ＥＣＨＳ）、７−ケトコレステロール−３−スルフェート（sulfate）、フラメゾール、胆汁酸、１，１−ビホスホネート（biphosphonate）エステル、若年性ホルモンＩＩＩ、ＲＧ−１１５８１９（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−メチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド−）、ＲＧ−１１５９３２（（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、およびＲＧ−１１５８３０（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、ならびにこれらの任意の組合せからなる群から選択することができる。
【０１５２】
一部の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、非誘導性プロモーターである。場合によって、プロモーターは、組織特異的プロモーターでありうる。本明細書では、「組織特異的」とは、組織または細胞型のサブセット内の、遺伝子発現の調節を指す。場合によって、組織特異的プロモーターは、プロモーターが、生物の、ある特定の組織または細胞型における発現だけを駆動するように、空間的に調節することができる。他の場合には、組織特異的プロモーターは、プロモーターが、生物の発生時を含む時間にわたり、細胞型または組織における発現を、示差的に駆動するように、時間的に調節することができる。場合によって、組織特異的プロモーターは、空間的に、かつ、時間的に調節される。ある特定の実施形態では、組織特異的プロモーターは、ある特定の細胞型内で、構成的に、または特定の時点または細胞型の特定の段階において、間欠的に活性化する。例えば、組織特異的プロモーターは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞など、特異的細胞が活性化する場合に活性化するプロモーターでありうる。Ｔ細胞は、様々な形で、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子により、ペプチド抗原と共に提示される場合に活性化しうる。
【０１５３】
１つの場合には、少なくとも１つのプロモーターは、操作プロモーターまたはこの変異体である。本明細書で記載される通り、プロモーターは、ＩＬ−２に由来する最小プロモーター配列と、以下：活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）応答エレメント；ＮＦＩＬ２Ｄ応答エレメント、ＮＦｋＢ／ＴＣＦ応答エレメント、ＮＦ＿ＡＴ／ＮＦＩＬ２Ｂ応答エレメント、またはＮＦＩＬ２Ａ／ＯＣＴ応答エレメントのうちの１または複数とを組み込みうる。応答エレメントの例については、その全体において本明細書に組み込まれる、Mattila et al., EMBO J. 9(13):4425-33 (1990)において記載されている。
【０１５４】
一部の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、ＩＬ−２コアプロモーター（配列番号２６）を含む。一実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、ＩＬ−２最小プロモーター（配列番号２７）を含む。別の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、ＩＬ−２エンハンサー／プロモーター変異体（配列番号２６〜２８）を含む。さらに別の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、ＮＦ−κＢ結合部位（配列番号３０〜３２）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、（ＮＦ−κＢ）１−ＩＬ２プロモーター変異体（配列番号３０）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、（ＮＦ−κＢ）３−ＩＬ２プロモーター変異体（配列番号３１）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、（ＮＦ−κＢ）６−ＩＬ２プロモーター変異体（配列番号３２）を含む。一実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、１×活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）応答エレメント−ＩＬ２プロモーター変異体（配列番号３３）を含む。別の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、３×ＮＦＡＴ応答エレメント（配列番号３４〜３５）を含む。さらに別の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、６×ＮＦＡＴ応答エレメント−ＩＬ２プロモーター変異体（配列番号３６〜３９）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、ヒトＥＦ１Ａ１プロモーター変異体（配列番号４０〜４１）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、ヒトＥＦ１Ａ１プロモーター／エンハンサー（配列番号４２）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、ヒトＵＢＣプロモーター（配列番号４３）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、６部位ＧＡＬ４誘導性近位因子結合エレメント（ＰＦＢ）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、合成最小プロモーター１（誘導性プロモーター）（配列番号４４）を含む。
【０１５５】
本明細書で記載される、ＩＬ−１２発現のリガンド誘導性制御のための、遺伝子スイッチの使用は、例えば、発現の調節および治療指数の改善を可能とすることにより、ＩＬ−１２の安全性プロファイルを改善しうる。しかし、遺伝子スイッチを使用する、リガンド用量依存性のＩＬ−１２の発現のための条件は、活性化リガンド（例えば、ベレジメクス）の存在または非存在である。ある特定の実施形態では、誘導ＩＬ−１２発現に対する、さらなる条件付け制御も想定される。Ｔ細胞活性化特異的プロモーターの制御下にある遺伝子スイッチ構成要素が提供される。これは、遺伝子スイッチの制御下にある、トランス遺伝子の、ベレジメクス制御型発現に必要な遺伝子スイッチ構成要素の条件付け（例えば、Ｔ細胞の活性化）発現を結果としてもたらす。一部の実施形態では、これは、ベレジメクスが、存在し、Ｔ細胞が、活性化している場合における、腫瘍特異的Ｔ細胞による、ＩＬ−１２またはＩＬ−１５などのサイトカインの優先的な発現を結果としてもたらす。これは、遺伝子スイッチに制御される、トランス遺伝子発現の局在化レベルの上昇をもたらしうる。
【０１５６】
例えば、遺伝子スイッチ構成要素の、Ｔ細胞活性化特異的発現は、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）応答エレメントを含むプロモーターにより制御することができる。ＮＦＡＴ転写因子は、エフェクターＴ細胞状態の、鍵となるモジュレーターである。ＮＦＡＴは、疲弊を漸進的に駆動する、早期転写チェックポイントである。ＮＦＡＴは、ＴＣＲの刺激後に、Ｔ細胞内で迅速に活性化し、適切な共刺激シグナル伝達により誘導されて、ＡＰ−１と共に、タンパク質複合体を形成し、エフェクター遺伝子およびＴ細胞機能を調節する。ＮＦＡＴ応答エレメントは、他の最小プロモーター配列（例えば、ＩＬ２最小プロモーター）と融合させて、Ｔ細胞の活性化に応答した、トランス遺伝子の発現を駆動することができる。
【０１５７】
活性化特異的プロモーターの他の例は、インターロイキン２（ＩＬ２）プロモーターおよびプログラム細胞死（ＰＤ）１（ＣＤ２７９）プロモーターを含むがこれらに限定されない。遺伝子スイッチ構成要素はまた、炎症促進性シグナル伝達経路のＮＦ−κＢなど、他の核内因子に対する結合性部位を、最小プロモーター配列（例えば、ＩＬ２）へと融合させることにより、免疫細胞の活性化時にも、条件付けで発現させることができる。
【０１５８】
ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＩＬ−２コアプロモーター、ＩＬ−２最小プロモーター、ＩＬ−２エンハンサー／プロモーター変異体、（ＮＦ−κＢ）１−ＩＬ２プロモーター変異体、（ＮＦ−κＢ）３−ＩＬ２プロモーター変異体、（ＮＦ−κＢ）６−ＩＬ２プロモーター変異体、１×ＮＦＡＴ応答エレメント−ＩＬ２プロモーター変異体、３×ＮＦＡＴ応答エレメント−ＩＬ２プロモーター変異体、６×ＮＦＡＴ応答エレメント−ＩＬ２プロモーター変異体、ヒトＥＥＦ１Ａ１プロモーター変異体、ヒトＥＥＦ１Ａ１プロモーター／エンハンサー、ヒトＵＢＣプロモーター、および合成最小プロモーター１のうちの、任意の１または複数でありうる。ある特定の実施形態では、プロモーターヌクレオチドは、配列番号２６〜４４を含みうる。
【０１５９】
遺伝子スイッチ
本明細書では、遺伝子スイッチポリペプチド、リガンド誘導性遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを組み込む方法およびシステムが提示される。ある特定の態様では、本開示は、異種遺伝子発現の誘導性制御のための遺伝子スイッチ系をコードする、１または複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって、異種遺伝子発現が、前記遺伝子スイッチ系により調節され；前記異種遺伝子が、本明細書で開示される、１または複数の免疫応答誘導性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドを対象とする。
【０１６０】
「遺伝子スイッチ」という用語は、プロモーターと関連する応答エレメントの組合せを指し、例えば、１または複数のリガンドの存在下で、応答エレメントおよびプロモーターを組み込んだ遺伝子の発現をモジュレートする、ＥｃＲベースの系を指す。緊密に調節された誘導性遺伝子発現系または遺伝子スイッチは、遺伝子治療、細胞内の、大スケールのタンパク質の作製、細胞ベースのハイスループットのスクリーニングアッセイ、機能的なゲノミクス、ならびにトランスジェニック植物およびトランスジェニック動物における形質の調節など、多様な適用に有用である。このような誘導性遺伝子発現系は、リガンド誘導性異種遺伝子発現系を含みうる。
【０１６１】
ＥｃＲベースの遺伝子スイッチの初期形は、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）ＥｃＲ（ＤｍＥｃＲ）ポリペプチドおよびマウス（Mus musculus）ＲＸＲ（ＭｍＲＸＲ）ポリペプチドを使用し、これらの受容体が、ステロイドであるポナステロンＡの存在下で、哺乳動物細胞系およびトランスジェニックマウスにおいて、レポーター遺伝子をトランス活性化させることを示した（Christopherson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(14):6314-18 (1992); No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(8):3346-51 (1996)）。その後、Suhr et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(14):7999-8004 (1998)）は、非ステロイド系のエクジソンアゴニストであるテブフェノジドが、外因性ヘテロ二量体パートナーの非存在下で、カイコ（Bombyx mori）ＥｃＲ（ＢｍＥｃＲ）を介して、哺乳動物細胞内のレポーター遺伝子の、高レベルのトランス活性化を誘導することを示した。
【０１６２】
ＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９７／０５３３０号明細書（国際公開第９７／３８１１７号パンフレット）およびＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９９／０８３８１号明細書（国際公開第９９／５８１５５号パンフレット）は、外因性遺伝子の発現をモジュレートするための方法であって、外因性遺伝子およびエクジソン応答エレメントを含むＤＮＡ構築物が、それに対するリガンドの存在下で、かつ、任意選択で、サイレントパートナーとして作用することが可能な受容体の存在下で、エクジソン応答エレメントに結合して、遺伝子発現を誘導するエクジソン受容体を含む、第２のＤＮＡ構築物により活性化する方法について開示している。この例では、エクジソン受容体を、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）から単離した。典型的に、このような系は、最適の活性化をもたらすために、サイレントパートナー、好ましくはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の存在を必要とする。哺乳動物細胞内では、昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）は、哺乳動物レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）と、ヘテロ二量体化し、これにより、標的遺伝子または異種遺伝子の発現を、リガンド依存的に調節するのに使用することが可能である。ＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９８／１４２１５号明細書（国際公開第９９／０２６８３号パンフレット）は、カイコガであるカイコ（Bombyx mori）から単離されたエクジソン受容体が、外因性の二量体パートナーを必要とせずに、哺乳動物系内で機能的であることについて開示している。
【０１６３】
米国特許第６，２６５，１７３号明細書は、受容体のステロイド／甲状腺スーパーファミリーの多様なメンバーを、遺伝子発現系における使用のための、ＵＳＰの、少なくとも二量体化ドメインを含むキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）ウルトラスピラクル受容体（ＵＳＰ）またはこの断片と組み合わせうることについて開示している。米国特許第５，８８０，３３３号明細書は、植物において使用された、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）のＥｃＲおよびウルトラスピラクル（ＵＳＰ）によるヘテロ二量体系であって、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合性ドメインが、２つの異なるハイブリッドタンパク質上に位置する、ヘテロ二量体系について開示している。これらの場合の各々では、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合性ドメイン（ＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９８／１４２１５号明細書における通りに、天然のＥｃＲとして、またはＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９７／０５３３０号明細書における通りに、修飾ＥｃＲとして）を、単一の分子へと組み込み、ＵＳＰまたはＲＸＲである、他のヘテロ二量体パートナーを、それらの天然状態において使用した。
【０１６４】
ＰＣＴ国際特許出願／米国出願第０１／０９０５号明細書は、トランス活性化ドメインと、ＤＮＡ結合ドメインとを２つの異なるタンパク質上に置くことにより互いから隔てた、エクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系が、リガンドの非存在下で、バックグラウンド活性の大幅な低減を結果としてもたらし、リガンドの存在下で、バックグラウンドを上回る活性の著明な増大を結果としてもたらすことについて開示している。この２ハイブリッド系は、ＰＣＴ／米国出願第９７／０５３３０号明細書およびＰＣＴ／米国出願第９８／１４２１５号明細書において開示されている、２つの系と比較して、著明に改善された誘導性遺伝子発現モジュレーション系である。２ハイブリッド系は、ＤＮＡ結合性ドメインが、遺伝子上のＤＮＡ結合性部位に結合すると、トランス活性化ドメインが、プロモーターを、より効果的に活性化させるように、相互作用タンパク質の対が、転写活性化ドメインを、ＤＮＡ結合性ドメインに対して、より好適な位置に置く能力を利用すると考えられる（例えば、米国特許第５，２８３，１７３号明細書を参照されたい）。２ハイブリッド遺伝子発現系は、核内受容体ポリペプチドへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインをコードする、第１の遺伝子発現カセット、および異なる核内受容体ポリペプチドへと融合させたトランス活性化ドメインをコードする、第２の遺伝子発現カセットである、２つの遺伝子発現カセットを含む。リガンドの存在下では、第１のポリペプチドの、第２のポリペプチドとの相互作用を促進するコンフォメーション変化が誘導され、これにより、ＤＮＡ結合性ドメインと、トランス活性化ドメインとの二量体化が結果としてもたらされると考えられる。ＤＮＡ結合性ドメインおよびトランス活性化ドメインは、２つの異なる分子上に存在するので、リガンドの非存在下では、バックグラウンド活性が、大幅に低減される。
【０１６５】
別の驚くべき発見は、２ハイブリッド系のある特定の改変がまた、ステロイド性リガンド、例えば、ポナステロンＡ（「ＰｏｎＡ」）またはムリステロンＡ（「ＭｕｒＡ」）と比較した場合に、非ステロイド性リガンド、例えば、ジアシルヒドラジンに対する感受性の改善ももたらすことであった。すなわち、ステロイドと比較した場合、非ステロイド性リガンドは、低リガンド濃度で、より大きな遺伝子転写活性をもたらした。さらに、２ハイブリッド系は、非修飾ＲＸＲを切り替えパートナーとして使用する場合に生じうる、ＲＸＲの過剰発現に起因する一部の副作用も回避する。好ましい２ハイブリッド系では、ＥｃＲまたはＲＸＲの、天然のＤＮＡ結合性ドメインおよびトランス活性化ドメインは除去され、結果として、これらのハイブリッド分子は、細胞内に存在する、他のステロイドホルモン受容体との相互作用の可能性を低下させ、これにより、副作用の低減を結果としてもたらす。
【０１６６】
エクジソン受容体（ＥｃＲ）とは、核内受容体スーパーファミリーのメンバーであり、サブファミリー１、群Ｈ（本明細書では、「群Ｈ核内受容体」と称する）へと分類される。各群のメンバーは、Ｅ（リガンド結合）ドメイン内で、４０〜６０％のアミノ酸同一性を共有する（Laudet et al., A Unified Nomenclature System for the Nuclear Receptor Subfamily, 1999; Cell 97: 161-163）。エクジソン受容体に加えて、この核内受容体サブファミリー１、群Ｈの他のメンバーは、ユビキタス受容体（ＵＲ）、オーファン受容体１（ＯＲ−１）、ステロイドホルモン核内受容体１（ＮＥＲ−１）、ＲＸＲ相互作用性タンパク質１５（ＲＩＰ−１５）、肝臓ｘ受容体β（ＬＸＲβ）、ステロイドホルモン受容体様タンパク質（ＲＬＤ−１）、肝臓ｘ受容体（ＬＸＲ）、肝臓ｘ受容体α（ＬＸＲα）、ファルネソイドｘ受容体（ＦＸＲ）、受容体相互作用性タンパク質１４（ＲＩＰ−１４）、およびファルネソール受容体（ＨＲＲ−１）を含む。
【０１６７】
場合によって、誘導性プロモーターは、Ｉｎｔｒｅｘｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。場合によって、遺伝子スイッチは、それらの各々が、参照によりその全体において組み込まれる、ＰＣＴ／米国出願第２００１／００９０５０号明細書（国際公開第２００１／０７０８１６号パンフレット）；米国特許第７，０９１，０３８号明細書；同第７，７７６，５８７号明細書；同第７，８０７，４１７号明細書；同第８，２０２，７１８号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００１／０３０６０８号明細書（国際公開第２００２／０２９０７５号パンフレット）；米国特許第８，１０５，８２５号明細書；同第８，１６８，４２６号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５２３５号明細書（国際公開第２００２／０６６６１３号パンフレット）；米国特許出願公開第１０／４６８，２００号明細書（米国公開第２０１２０１６７２３９号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５７０６号明細書（国際公開第２００２／０６６６１４号パンフレット）；米国特許第７，５３１，３２６号明細書；同第８，２３６，５５６号明細書；同第８，５９８，４０９号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５０９０号明細書（国際公開第２００２／０６６６１２号パンフレット）；米国特許第８，７１５，９５９号明細書（米国公開第２００６０１００４１６号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５２３４号明細書（国際公開第２００３／０２７２６６号パンフレット）；米国特許第７，６０１，５０８号明細書；同第７，８２９，６７６号明細書；同第７，９１９，２６９号明細書；同第８，０３０，０６７号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５７０８号明細書（国際公開第２００２／０６６６１５号パンフレット）；米国特許出願公開第１０／４６８，１９２号明細書（米国公開第２０１１０２１２５２８号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５０２６号明細書（国際公開第２００３／０２７２８９号パンフレット）；米国特許第７，５６３，８７９号明細書；同第８，０２１，８７８号明細書；同第８，４９７，０９３号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００５／０１５０８９号明細書（国際公開第２００５／１０８６１７号パンフレット）；米国特許第７，９３５，５１０号明細書；同第８，０７６，４５４号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００８／０１１２７０号明細書（国際公開第２００９／０４５３７０号パンフレット）；米国特許出願公開第１２／２４１，０１８号明細書（米国公開第２００９０１３６４６５号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００８／０１１５６３号明細書（国際公開第２００９／０４８５６０号パンフレット）；米国特許出願公開第１２／２４７，７３８号明細書（米国公開第２００９０１２３４４１号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００９／００５５１０号明細書（国際公開第２０１０／０４２１８９号パンフレット）；米国特許出願公開第１３／１２３，１２９号明細書（米国公開第２０１１０２６８７６６号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２０１１／０２９６８２号明細書（国際公���第２０１１／１１９７７３号パンフレット）；米国特許出願公開第１３／６３６，４７３号明細書（米国公開第２０１３０１９５８００号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２０１２／０２７５１５号明細書（国際公開第２０１２／１２２０２５号パンフレット）；および米国特許第９，４０２，９１９号明細書において記載されている系のうちのいずれかの、エクジソンベースの受容体による構成要素から選択しうるが、これらに限定されない。
【０１６８】
宿主細胞内の、異種遺伝子およびインターロイキンの発現をモジュレートするための系であって、本明細書で開示される遺伝子スイッチポリペプチドを発現させるポリヌクレオチドを含む系が提供される。
【０１６９】
一部の実施形態では、宿主細胞内の、異種遺伝子およびサイトカインの発現をモジュレートするための系であって、第１のポリペプチドをコードする、第１のポリヌクレオチドを含む、第１の遺伝子発現カセット；第２のポリペプチドをコードする、第２のポリヌクレオチドを含む、第２の遺伝子発現カセット；およびリガンドを含み、前記宿主細胞を、前記リガンドの存在下で、前記第１の遺伝子発現カセットおよび前記第２の遺伝子発現カセットと接触させると、前記異種遺伝子および前記サイトカインが、前記宿主細胞内で発現するように、前記第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが、（ｉ）トランス活性化ドメイン；（ｉｉ）ＤＮＡ結合性ドメイン；および（ｉｉｉ）リガンド結合性ドメイン；（ｉｖ）前記異種遺伝子；ならびに（ｖｉ）前記サイトカインのうちの１または複数を含む系である。場合によって、異種遺伝子は、本明細書で記載される抗原結合性ポリペプチドを含む。場合によって、サイトカインは、少なくとも１つの、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、またはこれらの変異体もしくは組合せを含む。場合によって、サイトカインは、インターロイキンである。場合によって、インターロイキンは、ＩＬ１２、ＩＬ２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ならびにこれらの機能的な変異体および断片のうちの少なくとも１つである。一部の実施形態では、サイトカインは、膜結合型の場合もあり、分泌型の場合もある。他の実施形態では、サイトカインは、細胞内サイトカインでありうる。インターロイキンは、膜結合型ＩＬ−１５（ｍｂＩＬ−１５）、ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαとの融合体を含みうる。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、本明細書で記載される改変エフェクター細胞を用いて共発現させうる膜結合型キメラＩＬ−１５である。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、全長ＩＬ−１５Ｒα、またはこの機能的な断片もしくは変異体とインフレームで融合させた全長ＩＬ−１５（例えば、天然ＩＬ−１５ポリペプチド）またはこの断片もしくは変異体を含む。場合によって、ＩＬ−１５は、リンカーを介して、ＩＬ−１５Ｒαへと間接的に連結される。場合によって、ｍｂＩＬ−１５は、Hurton et al., “Tethered IL-15 augments antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T cells,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113(48):E7788-E7797 (2016)において記載されている通りである。別の態様では、インターロイキンは、ＩＬ−１２を含みうる。一部の実施形態では、ＩＬ−１２は、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）、プロテアーゼ感受性ＩＬ−１２、不安定化ＩＬ−１２、膜結合型ＩＬ−１２、または挿入ＩＬ−１２である。一部の実施形態では、ＩＬ−１２は、マウスＩＬ−１２サブユニットベータ（ｐ４０）（配列番号２０６）である。一部の実施形態では、ＩＬ−１２は、マウスのＩＬ−１２サブユニットアルファ（ｐ３５）（配列番号２０７）である。場合によって、ＩＬ−１２変異体は、それらの全てが、参照によりそれらの全体において組み込まれる、国際公開第２０１５／０９５２４９号パンフレット、国際公開第２０１６／０４８９０３号パンフレット、および国際公開第２０１７／０６２９５３号パンフレットにおいて記載されている通りである。
【０１７０】
本明細書では、遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記遺伝子スイッチポリペプチドが、ａ）核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｂ）核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、第２の遺伝子スイッチポリペプチドとが、リンカーにより接続されている、ポリヌクレオチドが提示される。場合によって、リンカーは、本明細書で記載されるリンカー、例えば、ＧＳＧリンカー、フューリンリンク（furinlink）、Ｆ／Ｔ２Ａ、Ｔ２Ａ、ｐ２Ａ、ＧＳＧ−ｐ２Ａなどの２Ａリンカー、ならびにこれらの変異体および誘導体でありうる。他の場合には、リンカーは、ＩＲＥＳでありうる。
【０１７１】
場合によって、ＤＮＡ結合性ドメイン（ＤＢＤ）は、本明細書で記載されるＤＢＤ、例えば、ＧＡＬ４（ＧＡＬ４  ＤＢＤ）、ＬｅｘＡＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核内受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、細菌ＬａｃＺ  ＤＢＤ、および酵母ＤＢＤのうちの少なくとも１つを含む。トランス活性化ドメインは、本明細書で記載されるトランス活性化ドメイン、例えば、ＶＰ１６トランス活性化ドメイン、ｐ５３トランス活性化ドメイン、およびＢ４２酸性活性化因子トランス活性化ドメインのうちの１つを含みうる。核内受容体リガンド結合性ドメインは、エクジソン受容体（ＥｃＲ）、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核内受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用性タンパク質１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用性タンパク質１４、およびファルネソール受容体のうちの少なくとも１つを含みうる。
【０１７２】
場合によって、ポリペプチドリンカーまたはリボソームスキッピング配列により接続された遺伝子スイッチポリペプチドは、遺伝子発現に対する、用量依存性のリガンド誘導性制御の、リガンド誘導性遺伝子スイッチと比較した改善を呈するが、この場合、遺伝子スイッチポリペプチドは、ＩＲＥＳなど、非コード配列により接続されている。場合によって、２Ａリンカーにより接続された遺伝子スイッチポリペプチドは、異種遺伝子発現に対する、用量依存性のリガンド誘導性制御の、遺伝子スイッチと比較した改善を呈するが、この場合、前記遺伝子スイッチポリペプチドは、ＩＲＥＳにより隔てられている。
【０１７３】
一部の実施形態では、遺伝子スイッチは、ＶＰ１６トランス活性化ドメインを含む。一実施形態では、遺伝子スイッチは、エクジソン受容体（ＥｃＲ）、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核内受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用性タンパク質１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用性タンパク質１４、およびファルネソール受容体のうちの少なくとも１つを含む。別の実施形態では、遺伝子スイッチのＤＮＡ結合性ドメインは、ＧＡＬ４（ＧＡＬ４  ＤＢＤ）、ＬｅｘＡＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核内受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、細菌ＬａｃＺ  ＤＢＤ、および酵母ＤＢＤのうちの少なくとも１つを含む。さらに別の場合には、遺伝子スイッチは、ウルトラスピラクルタンパク質（ＵＳＰ）、レチノイド受容体Ｘ（ＲＸＲ）、これらの機能的な断片および変異体のうちの少なくとも１つをさらに含み、この場合、前記これらの機能的な断片および変異体は、ＥｃＲの少なくとも１つに結合することが可能である。
【０１７４】
本明細書で記載されるポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、操作細胞内で発現させることができる。本明細書では、操作細胞とは、その天然状態または内因性状態から改変された細胞である。操作細胞の例は、例えば、遺伝子スイッチポリペプチド、目的の遺伝子（ＧＯＩ）、細胞タグ、異種遺伝子、ならびに本明細書で記載される、他の任意のポリペプチドおよびポリヌクレオチドをコードするように改変された（例えば、ポリヌクレオチドの、細胞へのトランスフェクションにより）、本明細書で記載される細胞である。
【０１７５】
リガンド
一部の実施形態では、誘導性遺伝子スイッチの調節のために使用されるリガンドは、以下：
Ｎ−［（１Ｒ）−１−（１，１−ジメチルエチル）ブチル］−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−３，５−ジメチルベンゾヒドラジド（ベレジメクスともまた称する）、（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，９Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）−１７−［（２Ｓ，３Ｒ）−３，６−ジヒドロキシ−６−メチルヘプタン−２−イル］−２，３，１４−トリヒドロキシ−１０，１３−ジメチル−２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７−デカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−６−オン；Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−［（３Ｒ）−２，２−ジメチル−３−ヘキサニル］−２−エチル−３−メトキシベンゾヒドラジド；５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；２−メトキシ−ニコチン酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ペンチル）−Ｎ’−（４−エチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（２，２−ジメチル−１−フェニル−プロピル）−Ｎ’−（４−エチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ペンチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；および３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ペンチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのうちのいずれかから選択しうるがこれらに限定されない。
【０１７６】
場合によって、エクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子スイッチの、用量調節性制御のために使用されるリガンドは、エクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ、ムリステロンＡなどのｅｃｄｙステロイド、９−ｃｉｓ−レチノイン酸、レチノイン酸の合成類似体、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０１３，８３６号明細書；同第５，１１７，０５７号明細書；同第５，５３０，０２８号明細書；および同第５，３７８，７２６号明細書、ならびに米国出願公開第２００５／０２０９２８３号明細書および同第２００６／００２０１４６号明細書において開示されているＮ，Ｎ’−ジアシルヒドラジンなどのＮ，Ｎ’−ジアシルヒドラジン；米国出願公開第２００４／０１７１６５１号明細書において記載されているオキサゾリン；欧州出願第４６１，８０９号明細書において開示されているジベンゾイルアルキルシアノヒドラジンなどのジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン；米国特許第５，２２５，４４３号明細書において開示されているＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジンなどのＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジン；欧州出願第２３４，９９４号明細書において開示されているＮ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジンなどのＮ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジン；米国特許第４，９８５，４６１号明細書において記載されているＮ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジンなどのＮ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジン；米国出願公開第２００４／００４９０３７号明細書において記載されているアルニドケトンなどのアルニドケトン；３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド、８−Ｏ−アセチルハルパジド、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−スルフェート（sulfate）（ＥＣＨＳ）、７−ケトコレステロール−３−スルフェート（sulfate）、フラメゾール、胆汁酸、１，１−ビホスホネート（biphosphonate）エステル、若年性ホルモンＩＩＩなどを含む、他の類似の材料のうちのいずれかから選択しうるがこれらに限定されない。本開示において有用なジアシルヒドラジンリガンドの例は、ＲＧ−１１５８１９（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−メチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、ＲＧ−１１５９３２（（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、およびＲＧ−１１５８３０（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）を含む。例えば、それらのいずれもが参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１２／１５５，１１１号明細書およびＰＣＴ出願／米国出願第２００８／００６７５７号明細書を参照されたい。
【０１７７】
サイトカイン
ある特定の実施形態では、本明細書で提示されるＨＢＶワクチン抗原は、他のサイトカインと共に、共送達され、かつ／または共発現しうる（例えば、同じＨＢＶ抗原送達ベクターの一部として、または別個のベクターを介して）。本明細書では、遺伝子スイッチポリペプチドおよびサイトカイン、またはこれらの変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらを組み込む方法および系が提示される。サイトカインとは、細胞のシグナル伝達に関与する、約５〜２０ｋＤａの間の、小型タンパク質の類別である。一部の場合には、サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、または腫瘍壊死因子を含む。一部の実施形態では、ケモカインは、細胞の遊走を導く、化学誘引物質としての役割を果たし、４つのサブファミリー：ＣＸＣ、ＣＣ、ＣＸ３Ｃ、およびＸＣへと分類される。例示的なケモカインは、ＣＣサブファミリー：ＣＣＬ１、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９（またはＣＣＬ１０）、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、およびＣＣＬ２８；ＣＸＣサブファミリー：ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、およびＣＸＣＬ１７；ＸＣサブファミリー：ＸＣＬ１およびＸＣＬ２；ならびにＣＸ３ＣサブファミリーであるＣＸ３ＣＬ１に由来するケモカインを含む。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、本明細書で提示されるＨＢＶワクチン抗原は、他のインターフェロンと共に、共送達され、かつ／または共発現しうる（例えば、同じＨＢＶ抗原送達ベクターの一部として、または別個のベクターを介して）。インターフェロン（ＩＦＮ）は、Ｉ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、およびＩＦＮ−ω）、ＩＩ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−γ）、およびＩＩＩ型インターフェロンを含む。一部の実施形態では、ＩＦＮ−αは、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、およびＩＦＮＡ２１を含む、約１３の亜型へとさらに分類される。
【０１７９】
ある特定の実施形態では、本明細書で提示されるＨＢＶワクチン抗原は、他のインターロイキンと共に、共送達され、かつ／または共発現しうる（例えば、同じＨＢＶ抗原送達ベクターの一部として、または別個のベクターを介して）。インターロイキンは、白血球（leukocyte）または白血球（white blood cell）により発現され、Ｔリンパ球およびＢリンパ球ならびに造血細胞の発生および分化を促進する。例示的なインターロイキンは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５、およびＩＬ−３６を含む。一部の実施形態では、インターロイキンは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、またはＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαとの融合体である。
【０１８０】
一部の態様では、インターロイキンは、ＩＬ−１２を含みうる。一部の実施形態では、ＩＬ−１２は、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）、プロテアーゼ感受性ＩＬ−１２、不安定化ＩＬ−１２、膜結合型ＩＬ−１２、または挿入ＩＬ−１２である。一部の実施形態では、ＩＬ−１２は、マウスＩＬ−１２サブユニットベータ（ｐ４０）（配列番号２０６）である。場合によって、ＩＬ−１２変異体は、それらの全てが、参照によりそれらの全体において組み込まれる、国際公開第２０１５／０９５２４９号パンフレット、国際公開第２０１６／０４８９０３号パンフレット、国際公開第２０１７／０６２９５３号パンフレットにおいて記載されている通りである。
【０１８１】
一部の実施形態では、インターロイキンは、ｍｂＩＬ−１５を含む。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、本明細書で記載される改変エフェクター細胞を用いて共発現させうる、膜結合型キメラＩＬ−１５である。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、全長ＩＬ−１５Ｒα、またはこれらの機能的な断片もしくは変異体とインフレームで融合させた、全長ＩＬ−１５（例えば、天然ＩＬ−１５ポリペプチド）、またはこれらの断片もしくは変異体を含む。場合によって、ＩＬ−１５を、ＩＬ−１５Ｒαへと、リンカーを介して、間接的に連結する。場合によって、ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５Ｒαへと、リンカーを介して、間接的に連結される。場合によって、ｍｂＩＬ−１５は、Hurton et al., 2016において記載されている通りである。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、本明細書で提示されるＨＢＶワクチン抗原は、他の腫瘍壊死因子と共に、共送達され、かつ／または共発現しうる（例えば、同じＨＢＶ抗原送達ベクターの一部として、または別個のベクターを介して）。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）とは、アポトーシスをモジュレートするサイトカインの群である。一部の場合には、ＴＮＦファミリー内には、ＴＮＦα、リンホトキシンアルファ（ＬＴ−アルファ）、リンホトキシンベータ（ＬＴ−ベータ）、Ｔ細胞抗原であるｇｐ３９（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＦＡＳＬ、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、およびＴＮＦ放出型アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）を含むがこれらに限定されない、約１９のメンバーが存在する。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、本明細書で提示されるＨＢＶワクチン抗原は、他のコロニー刺激因子と共に、共送達され、かつ／または共発現しうる（例えば、同じＨＢＶ抗原送達ベクターの一部として、または別個のベクターを介して）。コロニー刺激因子（ＣＳＦ）とは、造血幹細胞の表面上の受容体タンパク質と相互作用する、分泌糖タンパク質であって、その後、細胞の増殖および特異的種類の血液細胞への分化をモジュレートする分泌糖タンパク質である。一部の場合には、ＣＳＦは、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、またはプロメガポエチンを含む。
【０１８４】
一部の実施形態では、サイトカインは、本明細書で記載されるキメラ抗原受容体と共に共発現する膜結合型サイトカインである。一部の実施形態では、１または複数の、本明細書で記載される方法は、サイトカインの投与をさらに含む。一部の場合には、サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、または腫瘍壊死因子を含む。一部の場合には、１または複数の本明細書で記載される方法は、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、または腫瘍壊死因子から選択されるサイトカインの投与をさらに含む。一部の場合には、１または複数の、本明細書で記載される方法は、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαとの融合体、ＩＬ−２１、ＩＦＮγ、またはＴＮＦ−αから選択されるサイトカインの投与をさらに含む。
【０１８５】
インターロイキン１２
特定の実施形態では、本明細書で提示されるＨＢＶワクチン抗原は、インターロイキン１２と共に、共送達され、かつ／または共発現しうる（例えば、同じＨＢＶ抗原送達ベクターの一部として、または別個のベクターを介して）。インターロイキン１２（ＩＬ−１２）とは、抗原の刺激に応答して、樹状細胞、マクロファージ、好中球、およびヒトＢリンパ芽球様細胞（ＮＣ−３７）により、天然で産生されるインターロイキンである。ＩＬ−１２は、４つのアルファヘリックスによるバンドルから構成される。ＩＬ−１２は、２つの別個の遺伝子である、ＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）およびＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０）によりコードされる、ヘテロ二量体のサイトカインである。活性のヘテロ二量体（ｐ７０と称する）およびｐ４０のホモ二量体は、タンパク質の合成後に形成される。ＩＬ−１２は、免疫系の、最強の調節因子である。ＩＬ−１２は、ＮＫ細胞およびＴ細胞を活性化させることにより、免疫応答を促進する（図１８）。
【０１８６】
本明細書では、ＨＢＶ組換えワクチンの組成物、キット、およびこれを含むシステム、ならびにこれを作る方法が提示される。本開示は、多重欠失ゴリラアデノベクター（ＧＣ４６）（配列番号６１〜６３）内に構築された、ＨＢＶ抗原デザイン（ＨＢＶデザイン１〜５）を提示する。本明細書ではまた、遺伝子スイッチポリペプチドおよびＩＬ−１２、またはこれらの変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれを組み込む方法およびシステム（図８）も提示される。
【０１８７】
リンカー
また、本明細書で記載されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現および機能性を促進するリンカーを含む構築物も開示される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドリンカーは、本明細書で記載されるポリヌクレオチド内で用いることができる。ポリヌクレオチドリンカーは、本明細書で記載されるポリヌクレオチドを含むベクターと適合性である末端構造を創出するように付加されうる、所望の制限部位を含有する、ＤＮＡの二本鎖セグメントでありうる。場合によって、ポリヌクレオチドリンカーは、本明細書で記載されるポリヌクレオチドを含むベクターを修飾するために有用でありうる。例えば、ポリヌクレオチドリンカーを含む、ベクターの修飾は、複数のクローニング部位の変化、またはポリヒスチジンテールの付加でありうる。ポリヌクレオチドリンカーはまた、平滑末端インサートＤＮＡの末端を、制限酵素により切断され、粘着末端を伴うベクターへのクローニングに適応させるのに使用することもできる。ポリヌクレオチドリンカーの使用は、ベクターへの平滑末端ライゲーションより効率的な場合があり、後段の適用において、インサートを、ベクターから放出する方法をもたらしうる。場合によって、インサートは、治療適用に有用なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列でありうる。場合によって、リンカーは、切断可能リンカーでありうる。
【０１８８】
ポリヌクレオチドリンカーは、オリゴマーでありうる。ポリヌクレオチドリンカーは、ＤＮＡ二本鎖、ＤＮＡ一本鎖、またはこれらの組合せでありうる。場合によって、リンカーは、ＲＮＡでありうる。場合によって、ポリヌクレオチドリンカーは、Ｔ４リガーゼにより、本明細書で記載されるポリヌクレオチドを含むベクターへとライゲーションすることができる。ライゲーションを容易とするために、過剰量のポリヌクレオチドリンカーを、インサートおよびベクターを含む組成物へと添加することができる。場合によって、リンカーを導入する前に、インサートおよびベクターを前処理する。例えば、メチラーゼによる前処理により、インサートＤＮＡの望ましくない切断を防止することができる。
【０１８９】
ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドによりコードされる、２つまたはこれを超えるポリペプチドは、介在リンカーポリペプチドをコードする介在配列により隔てることができる。本明細書では、ポリヌクレオチドによりコードされる、２つまたはこれを超えるポリペプチドを隔てるアミノ酸配列を指す、「介在リンカーポリペプチド」という用語は、膜貫通ドメインを、細胞表面ポリペプチド（例えば、天然ポリペプチドのトランケート型変異体を含む）へと接続するように、本明細書で開示されるポリペプチド構築物内に、任意選択で組み入れられる、アミノ酸の配列を指す、「ペプチドリンカー」という用語と区別される。ある特定の場合には、介在リンカーは、易切断性介在リンカーポリペプチドである。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能リンカーまたはリボソームスキッピングリンカーである。一部の実施形態では、切断可能リンカーまたはリボソームスキッピングリンカー配列は、２Ａ、ＧＳＧ−２Ａ、ＧＳＧリンカー、ＳＧＳＧリンカー、フューリンリンク、ならびにこれらの変異体および誘導体からなる群から選択される。一部の実施形態では、２Ａリンカーは、ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｆ２Ａリンカー、またはＥ２Ａリンカーである。一部の実施形態では、目的のポリペプチドは、易切断性介在リンカーポリペプチドにより連結された、融合タンパク質として発現する。ある特定の実施形態では、易切断性介在リンカーポリペプチドは、Ｆ／Ｔ２Ａ、Ｔ２Ａ、ｐ２Ａ、２Ａ、ＧＳＧ−ｐ２Ａ、ＧＳＧリンカー、およびフューリンリンク変異体のうちの、任意の１または複数でありうる。２０１７年５月１８日に公表された、ＰＣＴ／米国出願第２０１６／０６１６６８号明細書（国際公開第２０１７０８３７５０号パンフレット）において開示されるリンカー（ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列）は、参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、リンカーポリペプチドは、下記の表に開示されたリンカーポリペプチドを含む。
【０１９０】
【表２−１】
2021514666.tif 000003
【０１９１】
【表２−２】
2021514666.tif 000004
【０１９２】
一部の実施形態では、介在リンカーポリペプチドは、ホイットローリンカー（配列番号６４）、ＧＳＧリンカー（配列番号６６）、ＳＧＳＧリンカー（配列番号６７）、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号６８）、フューリン切断部位／フューリンク（Furlink）１（配列番号６９）、Ｆｍｄｖリンカー（配列番号７０）、トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス２Ａ領域（Ｔ２Ａ）（配列番号７１）、フューリン−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ（配列番号７２）、フューリン−ＳＧＳＧ−Ｔ２Ａ（配列番号７３）、ブタテッショウウイルス１  ２Ａ領域（Ｐ２Ａ）（配列番号７４）、ＧＳＧ−Ｐ２Ａ（配列番号７５）、Ａ型ウマ鼻炎ウイルス２Ａ領域（Ｅ２Ａ）（配列番号７６）、または口蹄疫ウイルス２Ａ領域（Ｆ２Ａ）（配列番号７８）のアミノ酸配列との、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（表２）。場合によって、介在リンカーポリペプチドは、リンカー（配列番号６５、７９〜８０）のアミノ酸配列との、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。場合によって、ウイルス２Ａ配列を使用することができる。２Ａエレメントは、５〜１００塩基対を有するＩＲＥＳより短くなりうる。場合によって、２Ａ配列は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または１００ヌクレオチドの長さを有しうる。２Ａを連結された遺伝子は、単一のオープンリーディングフレーム内で発現させることができ、「自己切断」は、２ＡポリペプチドＣ末端の、最後の２つのアミノ酸であるＧ−Ｐ間で、共翻訳的に生じることが可能であり、等量の共発現タンパク質をもたらす。
【０１９３】
ウイルス２Ａ配列は、約２０アミノ酸でありうる。場合によって、ウイルス２Ａ配列は、コンセンサスモチーフである、Ａｓｐ−Ｖａｌ／Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを含有しうる。コンセンサスモチーフ配列は、共翻訳的に作用しうる。例えば、グリシン残基とプロリン残基との、正常なペプチド結合の形成を防止することができ、これは、リボソームスキッピングおよび新生ポリペプチドの切断を結果としてもたらしうる。この効果は、等モルレベルで、複数の遺伝子をもたらしうる。
【０１９４】
２Ａペプチドは、単一のオープンリーディングフレーム内の、複数のタンパク質の、その後、リボソームスキッピング機構を介して、個別のポリペプチドへと切断されうる、ポリペプチドへの翻訳を可能としうる（Funston et al., J. Gen. Virol. 89(Pt 2):389-96 (2008)）。一部の実施形態では、２Ａ配列は、Ｆ／Ｔ２Ａ、Ｔ２Ａ、ｐ２Ａ、２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、およびＢｍＣＰＶ２Ａ、ＢｍＩＦＶ２Ａ、ならびにこれらの任意の組合せを含みうる。
【０１９５】
場合によって、ベクターは、ＩＲＥＳ配列および２Ａリンカー配列を含みうる。他の場合には、２Ａペプチドと連結された、複数の遺伝子の発現は、２Ａペプチドに前置されたスペーサー配列（ＧＳＧ）により容易とすることができる。場合によって、構築物は、スペーサー、リンカー、アダプター、プロモーター、またはこれらの組合せを組み合わせうる。例えば、リンカーは、異なる２Ａペプチドと共に、スペーサー（ＳＧＳＧリンカーまたはＧＳＧリンカーまたはホイットローリンカー）およびフューリンリンカー（Ｒ−Ａ−Ｋ−Ｒ）切断部位を有しうる。スペーサーは、Ｉ−Ｃｅｕｉでありうる。場合によって、リンカーは、操作することができる。例えば、リンカーは、疎水性などの化学的特徴を含むようにデザインすることができる。場合によって、少なくとも２つのリンカー配列は、同じタンパク質をもたらしうる。他の場合には、複数のリンカーを、ベクター内で使用することができる。例えば、目的の遺伝子は、少なくとも２つのリンカーにより隔てることができる。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドによりコードされる、２つまたはこれを超えるポリペプチドは、リンカーポリペプチドをコードする介在配列により隔てることができる。ある特定の場合には、リンカーは、易切断性リンカーである。一部の実施形態では、目的のポリペプチドは、易切断性介在リンカーポリペプチドにより連結された、融合タンパク質として発現する。ある特定の実施形態では、易切断性リンカーポリペプチドは、下記で記載されるフューリンリンク、ｆｍｄｖ、ｐ２ａ、ＧＳＧ−ｐ２ａ、および／またはｆｐ２ａのうちの、任意の１つまたは２つでありうる。場合によって、リンカーは、ＡＰＶＫＱＧＳＧ（配列番号９６）である。
【０１９７】
ある特定の場合には、リンカーポリペプチドは、アミノ酸配列「ＲＡＫＲ」（配列番号８６）を含みうる。ある特定の場合には、フューリンリンカーポリペプチドは、「ＣＧＴＧＣＡＡＡＧＣＧＴ」（配列番号６９）または「ＡＧＡＧＣＴＡＡＧＡＧＧ」（配列番号１３０）を含むポリヌクレオチド配列によりコードされうる。
【０１９８】
一部の実施形態では、リンカーは、本明細書で記載されるポリヌクレオチド内で用いることができる。リンカーは、可動性（flexible）リンカー、剛直性（rigid）リンカー、ｉｎ  ｖｉｖｏ切断可能リンカー、またはこれらの任意の組合せでありうる。場合によって、リンカーは、機能的ドメインを、併せて連結する（可動性リンカーおよび剛直性リンカーの場合のように）場合もあり、ｉｎ  ｖｉｖｏ切断可能リンカーの場合のように、機能的ドメインを、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて放出する場合もある。
【０１９９】
リンカーは、生物学的活性を改善し、発現収率を増大させ、所望の薬物動態プロファイルを達成しうる。リンカーはまた、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、またはチオエーテル（thioesther）も含みうる。
【０２００】
場合によって、本明細書で記載されるリンカー配列は、可動性リンカーを含みうる。可動性リンカーは、接合されるドメインが、ある程度の移動または相互作用を必要とする場合に適用することができる。可動性リンカーは、小型、非極性（例えば、Ｇｌｙ）、または極性（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）のアミノ酸から構成されうる。可動性リンカーは、Ｇｌｙ残基およびＳｅｒ残基の連なりから主になる配列（「ＧＳ」リンカー）を有しうる。可動性リンカーの例は、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎの配列（配列番号１５０）を有しうる。コピー数である「ｎ」を調整することにより、この例示的ＧＳリンカーの長さを最適化して、機能的ドメインの適切な分離を達成することもでき、必要なドメイン間相互作用を維持することもできる。ＧＳリンカーのほかに、他の可動性リンカーも、組換え融合タンパク質に用いることができる。場合によって、可動性リンカーはまた、ＧｌｙおよびＳｅｒなど、小型アミノ酸または極性アミノ酸に富む場合もあるが、可動性を維持するように、ＴｈｒおよびＡｌａなど、さらなるアミノ酸を含有する場合もある。他の場合には、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの極性アミノ酸を使用して、可溶性を改善することができる。
【０２０１】
本明細書で記載されるリンカー配列内に組み入れられる可動性リンカーは、良好な可動性および可溶性をもたらすように、ＧｌｙおよびＳｅｒなど、小型アミノ酸または極性アミノ酸に富む場合がある。可動性リンカーは、ある特定の移動または相互作用が、融合タンパク質ドメインに所望される場合に適切でありうる。加えて、可動性リンカーは、非可動性構造を有さない場合もあるが、機能的ドメイン間の距離を保持する、受動的リンカーとして用いられる場合もある。可動性リンカーの長さを調整して、適正なフォールディングを可能とすることもでき、融合タンパク質の最適な生物学的活性を可能とすることもできる。
【０２０２】
本明細書で記載されるリンカーは、場合によって、剛直性リンカーをさらに含みうる。剛直性リンカーを用いて、ポリペプチドのドメイン間で、一定の距離を維持することができる。剛直性リンカーの例は、少数を挙げれば、アルファヘリックス形成リンカー、Ｐｒｏに富む配列、（ＸＰ）ｎ、Ｘ−Ｐｒｏ骨格、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２〜５）でありうる。剛直性リンカーは、場合によって、αヘリックス構造を取ることにより、または複数のＰｒｏ残基を含有することにより、比較的剛直な構造を呈しうる。
【０２０３】
本明細書で記載されるリンカーは、場合によって、切断可能でありうる。他の場合に、リンカーは、切断可能でない。切断可能でないリンカーは、ｉｎ  ｖｉｖｏ過程またはｅｘ  ｖｉｖｏ過程を通して、１つの分子として作用するように、機能的ドメインを、共有結合的に、一体に接合しうる。リンカーはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても切断可能でありうる。切断可能リンカーは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、遊離の機能的ドメインを放出させるように導入することができる。切断可能リンカーは、少数を挙げれば、還元試薬、プロテアーゼの存在により切断することができる。例えば、ジスルフィド結合の還元を用いて、切断可能リンカーを作製することができる。ジスルフィドリンカーの場合、グルタチオンなど、チオールとのジスルフィド交換を介する切断イベントが、切断をもたらしうるであろう。他の場合には、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、組換え融合タンパク質内のリンカーの切断はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏの、病理学的状態（例えば、がんまたは炎症）下、特異的な細胞内または組織内で発現する場合もあり、ある特定の細胞区画内に拘束される場合もある、プロテアーゼによっても実行されうる。場合によって、切断可能リンカーは、切断のターゲティングを可能としうる。例えば、多くのプロテアーゼの特異性は、拘束区画内のリンカーの緩徐な切断をもたらしうる。切断可能リンカーはまた、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、またはチオエーテルも含みうる。例えば、ヒドラゾンは、血清中の安定性を付与しうる。他の場合には、ヒドラゾンは、酸性区画内の切断を可能としうる。酸性区画は、最大で７のｐＨを有しうる。リンカーはまた、チオエーテルも含みうる。チオエーテルは、非還元性でありうる。チオエーテルは、細胞内タンパク質分解のためにデザインすることができる。
【０２０４】
ある特定の実施形態では、ｆｍｄｖリンカーポリペプチドは、配列番号８７と、少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一でありうる配列を含む。ある特定の実施形態では、ｆｍｄｖリンカーポリペプチドは、２つまたはこれを超える融合タンパク質を連結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの１または複数である。ある特定の場合には、ｆｍｄｖリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の核酸配列によりコードされうる。場合によって、ｆｍｄｖをコードするＯＲＦは、配列番号７０）の配列を含むか、またはこれからなる。ある特定の実施形態では、ｆｍｄｖをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７０と、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。
【０２０５】
ある特定の場合には、リンカーポリペプチドは、「ｐ２ａ」リンカーでありうる。ある特定の実施形態では、ｐ２ａポリペプチドは、配列番号９１と、少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一でありうる配列を含みうる。ある特定の実施形態では、ｐ２ａリンカーポリペプチドは、２つまたはこれを超える融合タンパク質を連結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの１または複数でありうる。場合によって、ｐ２ａリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の核酸配列によりコードされうる。ある特定の実施形態では、ｐ２ａをコードするＯＲＦは、配列番号７４の配列を含むか、またはこれからなる。ある特定の場合には、ｐ２ａをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７４の場合もあり、これと、少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一な場合もある。
【０２０６】
場合によって、リンカーポリペプチドは、「ＧＳＧ−ｐ２ａ」リンカーでありうる。ある特定の実施形態では、ＧＳＧ−ｐ２ａリンカーポリペプチドは、配列番号９２と、少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一でありうる配列を含みうる。ある特定の実施形態では、ＧＳＧ−ｐ２ａリンカーポリペプチドは、２つまたはこれを超える融合タンパク質を連結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの１または複数でありうる。場合によって、ＧＳＧ−ｐ２ａリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の核酸配列によりコードされうる。ＧＳＧ  ｐ２ａをコードするＯＲＦは、配列番号７５の配列を含みうる。場合によって、ＧＳＧ−ｐ２ａをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７５の場合もあり、これと、少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一な場合もある。
【０２０７】
リンカーポリペプチドは、本明細書で提示される「ｆｐ２ａ」リンカーでありうる。ある特定の実施形態では、ｆｐ２ａリンカーポリペプチドは、配列番号９５と、少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一でありうる配列を含みうる。ある特定の場合には、ｆｐ２ａリンカーポリペプチドは、２つまたはこれを超える融合タンパク質を連結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの１または複数でありうる。場合によって、ｆｐ２ａリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の核酸配列によりコードされうる。ある特定の実施形態では、ｆｐ２ａリンカーをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７８の場合もあり、これと、少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一な場合もある。
【０２０８】
場合によって、リンカーは、操作することができる。例えば、リンカーは、疎水性などの化学的特徴を含むようにデザインすることができる。場合によって、少なくとも２つのリンカー配列は、同じタンパク質をもたらしうる。配列は、配列番号８２、９６、または９７のポリペプチド配列と、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一でありうるか、またはほぼこれらの比率で同一でありうる。他の場合には、複数のリンカーを、ベクター内で使用することができる。例えば、本明細書で記載される、目的の遺伝子と、１または複数の遺伝子スイッチポリペプチド配列とは、少なくとも２つのリンカーにより隔てることができる。場合によって、遺伝子は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または最大で１０のリンカーにより隔てることができる。
【０２０９】
リンカーは、操作リンカーでありうる。リンカーをデザインする方法は、コンピュータ計算による方法でありうる。場合によって、コンピュータ計算による方法は、グラフ法を含みうる。コンピュータ計算法を使用して、データベースから導出された三次元ペプチド構造のライブラリーから、適切なペプチドを検索することができる。例えば、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）を使用して、リンカーの選択されたアミノ酸の間の間隔の距離を測ることができる。
【０２１０】
一部の実施形態では、フューリンポリペプチドおよび２Ａポリペプチドを含むポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドが提供されるが、この場合、フューリンポリペプチドおよび２Ａポリペプチドは、少なくとも３つの疎水性アミノ酸を含むポリペプチドリンカーにより接続されている。場合によって、少なくとも３つの疎水性アミノ酸は、グリシン（Ｇｌｙ）（Ｇ）、アラニン（Ａｌａ）（Ａ）、バリン（Ｖａｌ）（Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ）（Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）（Ｉ）、プロリン（Ｐｒｏ）（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）（Ｆ）、メチオニン（Ｍｅｔ）（Ｍ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）（Ｗ）からなるリストから選択される。場合によって、ポリペプチドリンカーはまた、１または複数のＧＳリンカー配列、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＳＧ）ｎ、（ＧＳＧ）ｎ、および（ＳＧＳＧ）ｎ［配列中、ｎは、０〜１５の任意の数でありうる］も含みうる。
【０２１１】
ポリペプチド構築物の発現の改善を得る方法であって、第１の機能的ポリペプチドおよび第２の機能的ポリペプチドを含む前記ポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドを用意するステップであって、前記第１の機能的ポリペプチドと、第２の機能的ポリペプチドとが、配列ＡＰＶＫＱとの、少なくとも６０％の同一性を伴う配列を含むリンカーポリペプチドにより接続されている、ステップと；宿主細胞内で、前記ポリヌクレオチドを発現させるステップであって、ポリペプチド構築物の発現の、配列ＡＰＶＫＱとの、少なくとも６０％の同一性を伴う配列を含むリンカーポリペプチドを有さない、対応するポリペプチド構築物と比較した改善を結果としてもたらすステップとを含む方法が提供される。
【０２１２】
ＩＲＥＳエレメント
本明細書ではまた、本明細書で記載されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現および機能性を容易とする、ＩＲＥＳエレメントを含む構築物も開示される。本明細書で使用される「内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）」という用語は、内部リボソーム進入部位を意味することが意図されうる。ＩＲＥＳ配列を含むベクター内では、第１の遺伝子が、その独自の５’−ＵＴＲを伴う機構である、キャップ依存性のリボソーム走査により翻訳されうるのに対し、後続の遺伝子の翻訳は、リボソームの、ＩＲＥＳへの直接的な動員により、キャップ非依存的に達せられうる。ＩＲＥＳ配列は、真核リボソームが結合し、５’キャップ末端に結合せずに、翻訳を開始することを可能としうる。ＩＲＥＳ配列は、１つの転写物からの、複数の遺伝子の発現を可能としうる（Mountford and Smith 1995）。
【０２１３】
本明細書で使用される「キャップ（ＣＡＰ）」または「キャップ（ｃａｐ）」という用語は、一般に、真核生物ｍＲＮＡの５’末端へと、３’−５’連結された、７−メチルグアノシン（７ｍｅＧ−ｐｐｐ−Ｇ）である修飾ヌクレオチドであって、このｍＲＮＡからのタンパク質の発現時に、正常な翻訳開始経路内で必要とされるエレメントとして用いられる修飾ヌクレオチドを指す。
【０２１４】
ある特定の場合には、ＩＲＥＳ領域は、ピコルナウイルス、脳心筋炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスのＩＲＥＳ配列など、ウイルスに由来しうる。他の場合には、ＩＲＥＳ領域は、脳心筋炎ウイルスに由来しうる。本明細書で使用される「ＥＭＣＶ」または「脳心筋炎ウイルス」という用語は、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）の属の、脳心筋炎ウイルス種の、任意のメンバーである単離株または株を指す。例は、ＥＭＣＶ−Ｒ（リュッカート）株ウイルス、コロンビアＳＫウイルスである。場合によって、真核開始因子４Ｇ、免疫グロブリン重鎖結合性タンパク質、ｃ−ｍｙｃがん原遺伝子、血管内皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子１のＩＲＥＳ、またはこれらの任意の組合せまたは修飾など、細胞性ＩＲＥＳエレメントを使用することができる。場合によって、細胞性ＩＲＥＳは、ウイルスＩＲＥＳと比較した場合の、遺伝子発現の増大を有しうる。
【０２１５】
ウイルスのＩＲＥＳ配列、細胞性ＩＲＥＳ配列、またはこれらの組合せを、ベクター内で用いることができる。ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）またはポリオウイルス（ＰＶ）に由来しうる。場合によって、ＩＲＥＳエレメントは、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ブタテッショウウイルス１（ＰＴＶ−１）、愛知ウイルス（ＡｉＶ）、セネカバレーウイルス（ＳＶＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）、潜伏期ヒトサイトメガロウイルス（ｐＵＬ１３８）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＮＡ−１）、ヘルペスウイルスマレック病（ＭＤＶＲＬＯＲＦ９）、ＳＶ４０ポリシストロニック１９Ｓ（ＳＶ４０１９Ｓ）、ムギクビレアブラムシ（Rhopalosiphum padi）ウイルス（ＲｈＰＶ）、クリケット麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）、ウスジロエダシャク（Ectropis obliqua）ピコルナ様ウイルス（ＥｏＰＶ）、チャバネアオカメムシ（Plautia stali）腸ウイルス（ＰＳＩＶ）、サシガメ属（Triatoma）ウイルス（ＴｒＶ）、ミツバチ麻痺病シシストウイルス（ＩＡＰＶ、ＫＢＶ）、ブラックカラン復帰ウイルス（ＢＲＶ）、テンジクアオイ属（Pelargonium）斑入りウイルス（ＰＦＢＶ）、ハイビスカス退緑斑ウイルス（ＨＣＲＳＶ）、アブラナ科感染トバモウイルス（ＣｒＴＭＶ）、ジャガイモ葉巻ウイルス（ＰＬＲＶ）、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、ジアルジアウイルス（ＧＬＶ）、リーシュマニア属（Leishmania）ＲＮＡウイルス１（ＬＲＶ−１）、およびこれらの組合せまたは修飾からなる群から選択される。場合によって、ＩＲＥＳは、Ａｐａｆ−１、ＸＩＡＰ、ＨＩＡＰ２／ｃ−ＩＡＰ１、ＤＡＰ５、Ｂｃｌ−２、ｃ−ｍｙｃ、ＣＡＴ−１、ＩＮＲ、分化ＬＥＦ−１、ＰＤＧＦ２、ＨＩＦ−１ａ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＢｉＰ、ＢＡＧ−１、ＣＩＲＰ、ｐ５３、ＳＨＭＴ１、ＰＩＴＳＬＲＥｐ５８、ＣＤＫ１、Ｒｐｒ、ｈｉｄ、ｈｓｐ７０、ｇｒｉｍ、ｓｋｌ、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ、ｄＦｏｘＯ、ｄＩｎＲ、Ａｄｈ−Ａｄｈｒ、ＨＳＰ１０１、ＡＤＨ、ＵＲＥ−２，ＧＰＲ１、ＮＣＥ１０２、ＹＭＲ１８１ａ、ＭＳＮ１、ＢＯＩ１、ＦＬＯ８、ＧＩＣ１、およびこれらの任意の組合せまたは修飾からなる群から選択される。ＩＲＥＳエレメントを、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の間に組み入れる場合、翻訳の開始は、第１のＯＲＦ内の、カノニカルの５’−ｍ７ＧｐｐｐＮキャップ依存性機構、およびＩＲＥＳエレメントの下流における、第２のＯＲＦ内の、キャップ非依存性の機構により生じうる。
【０２１６】
場合によって、遺伝子を、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）により連結することができる。ＩＲＥＳは、複数の遺伝子の、同時的な発現を可能としうる。例えば、ＩＲＥＳ配列は、単一のｍＲＮＡ転写物からの、複数のタンパク質の産生を許容しうる。リボソームは、ＩＲＥＳに、５’キャップ非依存的に結合し、翻訳を開始することが可能である。
【０２１７】
場合によって、ＩＲＥＳ配列は、５００塩基対でありうるか、またはほぼこの長さでありうる。ＩＲＥＳ配列は、３００塩基対〜１０００塩基対でありうる。例えば、ＩＲＥＳは、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００塩基対の長さでありうる。
【０２１８】
場合によって、ＩＲＥＳ配列を含む、ベクター内の下流遺伝子の発現を、低減することができる。例えば、ＩＲＥＳ配列に後続する遺伝子は、ＩＲＥＳ配列に先行する遺伝子に対して、発現が低減されうる。発現の低減は、先行する遺伝子に対する、１％〜９９％の低減でありうる。
【０２１９】
発現を調節する方法
一実施形態では、操作細胞内の異種遺伝子の発現を調節する方法が提供される。異種遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、抗原結合性ポリペプチド、および異種遺伝子が提供される。場合によって、ポリヌクレオチドは、図１〜１６のうちのいずれか１つにおいて描示されている、１または複数の遺伝子発現カセット内にある。別の場合には、ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを介して、操作細胞へと組み込まれる。ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターを含みうる。非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンを含みうる。他の場合には、ポリヌクレオチドは、リコンビナーゼまたは遺伝子編集法を介して、操作細胞へと組み込まれる。リコンビナーゼの例は、本明細書で記載されるセリンリコンビナーゼである。遺伝子編集法の例は、ＣＲＩＳＰＲ系またはＡｒｇｎｏｎａｕｔｅ系を含みうる。本明細書における「ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集系」または「ＣＲＩＳＰＲ系」とは、ＤＮＡ配列の変化を、ゲノムの特異的領域へとターゲティングするための、任意のＲＮＡ誘導型のＣａｓタンパク質媒介性過程を指す。本明細書における「Ａｒｇｏｎａｕｔｅ遺伝子編集系」とは、ＤＮＡ配列の変化を、ゲノムの特異的領域へとターゲティングするための、任意の一本鎖ＤＮＡ誘導型のＡｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ媒介性過程を指す。
【０２２０】
医薬組成物および投与量
本開示は、本明細書で記載される、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターと、このための担体（例えば、薬学的に許容される担体）とを含む組成物を提示する。組成物は、担体、好ましくは、生理学的に（例えば、薬学的に）許容可能な担体と、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターとを含む、生理学的に許容される（例えば、薬学的に許容される）組成物であることが所望される。本開示の文脈内では、任意の適切な担体の使用が可能であり、当技術分野では、このような担体が周知である。担体の選出しは、部分的に、組成物の特定の使用（例えば、動物への投与）、および組成物を投与するのに使用される、特定の方法により決定されるであろう。理想的には、複製欠損型アデノウイルスベクターの文脈では、医薬組成物は、好ましくは、複製コンピテント型のアデノウイルスを含まない。医薬組成物は、任意選択で、滅菌でありうる。
【０２２１】
適切な組成物は、抗酸化剤、緩衝剤、および静菌剤を含有しうる、水性および非水性の、等張性滅菌溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存剤を含みうる、水性および非水性の滅菌懸濁液を含む。組成物は、アンプルおよびバイアルなど、単位用量または複数回投与用量の密封容器により提示しうるが、使用の直前における、滅菌液体担体、例えば、水の添加だけを必要とする、凍結乾燥（freeze-dried（lyophilized））状態で保管することもできる。即席溶液および即席懸濁液は、滅菌粉末、滅菌顆粒、および滅菌錠剤から調製することができる。好ましくは、担体は、緩衝生理食塩液である。より好ましくは、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを、投与の前の損傷から保護するように製剤化された、組成物の部分である。例えば、組成物は、ガラス容器、シリンジ、または注射針など、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを、調製、保管、または投与するのに使用されるデバイス上における、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの喪失を低減するように製剤化することができる。組成物は、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの、光感受性および／または温度感受性を低下させるように製剤化することができる。この目的で、組成物は、好ましくは、例えば、上記で記載した液体担体など、薬学的に許容される液体担体、ならびにポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、ポリ（ビニルピロリドン）、トレハロース、およびこれらの組合せからなる群から選択される安定化剤を含む。このような組成物の使用は、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの保管寿命を延長し、その投与を容易とするであろう。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを含有する組成物については、例えば、米国特許第６，２２５，２８９号明細書、米国特許第６，５１４，９４３号明細書、および国際特許出願公開第２０００／０３４４４４号パンフレットにおいて、さらに記載されている。
【０２２２】
組成物はまた、形質導入効率を増強するようにも製剤化することができる。加えて、当業者は、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターが、他の治療剤または生物学的活性薬剤と共に、組成物中に存在しうることも理解するであろう。例えば、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける投与と関連する、腫脹および炎症を低減するように、イブプロフェンまたはステロイドなど、炎症を制御する因子も、組成物の一部でありうる。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを使用して、抗原をコードする核酸配列を、宿主へと送達する場合、免疫系刺激因子またはアジュバント、例えば、インターロイキン、リポ多糖、または二本鎖ＲＮＡを投与して、抗原に対する、任意の免疫応答を増強または修飾することができる。既存の感染を処置し、かつ／または遺伝子導入手順と関連する感染など、将来の感染の危険性を低減するように、抗生剤、すなわち、殺微生物剤および殺真菌剤も存在しうる。
【０２２３】
本明細書の一部の実施形態では、対象における投与のための、本明細書で開示される、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む組成物が開示される。場合によって、本明細書で開示される、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをコードし、任意選択で、サイトカインおよび／またはさらなる治療剤を含有する、改変エフェクター細胞組成物が開示される。場合によって、本明細書にはまた、エフェクター細胞を改変するための、キメラ抗原受容体の発現を調節するための、遺伝子スイッチポリペプチドをコードするベクターも含まれる。
【０２２４】
一部の場合には、改変エフェクター細胞または遺伝子スイッチポリペプチドおよびキメラ抗原受容体をコードするベクターによる医薬組成物を、活性化合物の、薬学的に使用されうる調製物への加工を容易とする、賦形剤および補助剤を含む、１または複数の生理学的に許容される担体を使用する、常套的な形で製剤化する。適正な製剤は、選択される投与経路に依存する。本明細書で記載される医薬組成物の概要については、例えば、Remington: The Science and Practice ofPharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; and Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 1999)において見出される。
【０２２５】
医薬組成物は、任意選択で、例だけを目的として述べると、従来の混合工程、溶解工程、顆粒化工程、糖衣錠化工程、研和工程、乳化工程、カプセル化工程、封入工程、または圧縮工程など、従来の方式で製造される。
【０２２６】
ある特定の実施形態では、組成物はまた、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、および塩酸などの酸；水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、およびトリス−ヒドロキシメチルアミノメタンなどの塩基を含む、１または複数のｐＨ調整剤または緩衝剤；ならびにクエン酸塩／デキストロース、炭酸水素ナトリウム、および塩化アンモニウムなどの緩衝液も含みうる。このような酸、塩基、および緩衝剤は、組成物のｐＨを、許容可能な範囲で維持するのに必要とされる量で組み入れられる。
【０２２７】
他の実施形態では、組成物はまた、組成物のオスモル濃度を、許容可能な範囲に収めるのに必要とされる量の、１または複数の塩も含みうる。このような塩は、ナトリウムカチオン、カリウムカチオン、またはアンモニウムカチオンと、塩化物アニオン、クエン酸アニオン、アスコルビン酸アニオン、ホウ酸アニオン、リン酸アニオン、重炭酸アニオン、硫酸アニオン、チオ硫酸アニオン、または亜硫酸水素アニオンとを有する塩を含み、適切な塩は、塩化ナトリウム塩、塩化カリウム塩、チオ硫酸ナトリウム塩、亜硫酸水素ナトリウム塩、および硫酸アンモニウム塩を含む。
【０２２８】
本明細書で記載される医薬組成物は、経口投与経路、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋内、脳内、脳室内、関節内、腹腔内、または頭蓋内）投与経路、鼻腔内投与経路、口腔内投与経路、舌下投与経路、または直腸内投与経路を含むがこれらに限定されない、任意の適切な投与経路により投与される。一部の場合には、医薬組成物を、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋内、脳内、脳室内、関節内、腹腔内、または頭蓋内）投与のために製剤化する。
【０２２９】
本明細書で記載される医薬組成物を、処置される個体による経口の服用のための、水性経口分散液、液体、ゲル、シロップ、エリキシル、スラリー、懸濁液など、固体経口剤形、エアゾール剤、制御放出製剤、即時融解製剤、発泡製剤、凍結乾燥製剤、錠剤、粉剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、多粒子製剤、即時放出製剤と制御放出製剤との混合剤を含むがこれらに限定されない、任意の適切な剤形へと製剤化する。一部の実施形態では、医薬組成物を、カプセル剤へと製剤化する。一部の実施形態では、医薬組成物を、溶液（例えば、静脈内投与のための）へと製剤化する。場合によって、医薬組成物を、輸注液として製剤化する。場合によって、医薬組成物を、注射液として製剤化する。
【０２３０】
本明細書で記載される、固体の医薬剤形は、任意選択で、本明細書で記載される化合物と、適合性の担体、結合剤、充填剤、懸濁剤、芳香剤、甘味剤、崩壊剤、分散剤、界面活性剤、滑沢剤、着色剤、希釈剤、可溶化剤、保湿剤、可塑化剤、安定化剤、浸透増強剤、湿潤剤、消泡剤、抗酸化剤、保存剤、またはこれらの１もしくは複数の組合せなど、１または複数の薬学的に許容される添加剤とを含む。
【０２３１】
さらなる他の態様では、Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition (2000)において記載されている手順など、標準的なコーティング手順を使用して、組成物の周囲に、薄膜コーティングを施す。一部の実施形態では、組成物を、粒子（例えば、カプセルによる投与のための）へと製剤化し、粒子の一部または全部をコーティングする。一部の実施形態では、組成物を、粒子（例えば、カプセルによる投与のための）へと製剤化し、粒子の一部または全部をマイクロカプセル化する。一部の実施形態では、組成物を、粒子（例えば、カプセルによる投与のための）へと製剤化し、粒子の一部または全部をマイクロカプセル化せず、アンコーティングする。
【０２３２】
ある特定の実施形態では、本明細書で提示される組成物はまた、微生物活性を阻害する、１または複数の保存剤も含みうる。適切な保存剤は、メルフェンおよびチオメルサールなどの水銀含有物質；安定化二酸化塩素；ならびに塩化ベンザルコニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、および塩化セチルピリジニウムなどの四級アンモニウム化合物を含む。
【０２３３】
「消泡剤」は、加工時における発泡であって、水性分散液の凝固、薄膜完成品中の気泡を結果としてもたらすか、または、一般に、加工を損なう発泡を低減する。例示的な抗発泡剤は、シリコンエマルジョン（ｓｉｌｉｃｏｎ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）またはセスキオレイン酸（sesquoleate）ソルビタンを含む。
【０２３４】
「抗酸化剤」は、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびトコフェロールを含む。ある特定の実施形態では、抗酸化剤は、必要とされる場合、化学的安定性を増強する。
【０２３５】
本明細書で記載される製剤は、抗酸化剤、金属キレート化剤、チオールを含有する化合物、および他の一般的な安定化剤から利益を得る場合がある。このような安定化剤の例は、（ａ）約０．５％〜約２％ｗ／ｖのグリセロール、（ｂ）約０．１％〜約１％ｗ／ｖのメチオニン、（ｃ）約０．１％〜約２％ｗ／ｖのモノチオグリセロール、（ｄ）約１ｍＭ〜約１０ｍＭのＥＤＴＡ、（ｅ）約０．０１％〜約２％ｗ／ｖのアスコルビン酸、（ｆ）０．００３％〜約０．０２％ｗ／ｖのポリソルベート８０、（ｇ）０．００１％〜約０．０５％ｗ／ｖのポリソルベート２０、（ｈ）アルギニン、（ｉ）ヘパリン、（ｊ）硫酸デキストラン、（ｋ）シクロデキストリン、（ｌ）ポリ硫酸ペントサン、および他のヘパリノイド、（ｍ）マグネシウムおよび亜鉛などの二価カチオン、または（ｎ）これらの組合せを含むがこれらに限定されない。
【０２３６】
「結合剤」は、凝集性の性質を付与し、例えば、アルギン酸およびその塩；カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース（例えば、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標））、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、Ｋｌｕｃｅｌ（登録商標））、エチルセルロース（例えば、Ｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標））、および結晶セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標））などのセルロース誘導体；微晶質デキストロース；アミロース；ケイ酸マグネシウムアルミニウム；多糖酸；ベントナイト；ゼラチン；ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー；クロスポビドン；ポビドン；デンプン；アルファデンプン；トラガント、デキストリン、スクロース（例えば、Ｄｉｐａｃ（登録商標））、グルコース、デキストロース、糖蜜、マンニトール、ソルビトール、キシリトール（例えば、Ｘｙｌｉｔａｂ（登録商標））、およびラクトースなどの糖；アカシア、トラガント、ガッティガム、イサポールハスクの粘液、ポリビニルピロリドン（例えば、Ｐｏｌｙｖｉｄｏｎｅ（登録商標）ＣＬ、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）ＣＬ、Ｐｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標）ＸＬ−１０）、カラマツ由来のアラビノガラクタン（arabogalactan）、Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標）、ポリエチレングリコール、蝋、アルギン酸ナトリウムなどの天然ガムまたは合成ガムを含む。
【０２３７】
「担体」または「担体材料」は、医薬中で一般に使用される任意の賦形剤を含み、イブルチニブおよび抗がん剤の化合物など、本明細書で開示される化合物との適合性、ならびに所望の剤形の放出プロファイル特性に基づき選択されるものとする。例示的な担体材料は、例えば、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、滑沢剤、保湿剤、希釈剤などを含む。「薬学的に適合性の担体材料」は、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、カルシウム乳酸、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コレステロール、コレステロールエステル、カゼイン酸ナトリウム、ダイズレシチン、タウロコール酸、ホスファチジルコリン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、セルロースおよびセルロースコンジュゲート、糖、ステアロイル乳酸ナトリウム、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、アルファデンプンなどを含みうるがこれらに限定されない。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995)、Hoover, John E., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975、Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980、およびPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins1999)を参照されたい。
【０２３８】
「分散剤」および／または「粘性モジュレーティング剤」は、液体培地または顆粒化法またブレンド法を介して、薬物の拡散および均質性を制御する材料を含む。一部の実施形態では、これらの薬剤はまた、コーティングマトリックスまたはエローディングマトリックスの有効性も促進する。例示的な拡散促進剤／分散剤は、例えば、親水性ポリマー、電解質、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ；市販品では、Ｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標）として公知である）、ａｎｄ例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、ＨＰＣ、ＨＰＣ−ＳＬ、およびＨＰＣ−Ｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば、ＨＰＭＣ  Ｋ１００、ＨＰＭＣ  Ｋ４Ｍ、ＨＰＭＣ  Ｋ１５Ｍ、およびＨＰＭＣ  Ｋ１００Ｍ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（carboxymethylcellulose sodium）、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＡＳ）、非晶質セルロースなど、炭水化物ベースの分散剤、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、酸化エチレンおよびホルムアルデヒドを伴う、４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノールポリマー（チロキサポールとしてもまた公知である）、ポロキサマー（例えば、酸化エチレンと、酸化プロピレンとのブロックコポリマーである、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ  Ｆ６８（登録商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ  Ｆ８８（登録商標）、およびＰｌｕｒｏｎｉｃｓ  Ｆ１０８（登録商標））；およびポロキサミン（例えば、酸化プロピレンおよび酸化エチレンの、エチレンジアミンへの逐次的付加から導出される四官能性ブロックコポリマーである、Ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ  ９０８（登録商標）（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）としてもまた公知のＴｅｔｒｏｎｉｃ  ９０８（登録商標））、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、またはポリビニルピロリドンＫ３０、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ−６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは、約３００〜約６０００、または約３３５０〜約４０００、または約７０００〜約５４００の分子量を有しうる）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、例えば、トラガントガムおよびアカシアガム、グアルガムなどのガム、キサンタンガムを含むキサンタン、糖、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース誘導体、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、ポビドン、カルボマー、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アルギン酸塩、キトサン、およびこれらの組合せを含む。セルロースまたはトリエチルセルロースな��の可塑化剤もまた、分散剤として使用することができる。特に、リポソーム分散液中および自己乳化分散液中で有用な分散剤は、ジミリストイルホスファチジルコリン、鶏卵に由来する天然ホスファチジルコリン、鶏卵に由来する天然ホスファチジルグリセロール、コレステロール、およびイソプロピルミリスチン酸である。
【０２３９】
１または複数のエロージョン促進剤の、１または複数の拡散促進剤との組合せもまた、本組成物中で使用することができる。
【０２４０】
「希釈剤」という用語は、送達の前に、目的の化合物を希釈するのに使用される化合物を指す。希釈剤はまた、より安定的な環境をもたらしうるため、化合物を安定化させるのにも使用することができる。当技術分野では、緩衝液中に溶解させた塩（これはまた、ｐＨの制御または維持ももたらしうる）を、リン酸緩衝生理食塩液溶液を含むがこれらに限定されない希釈剤として用いる。ある特定の実施形態では、希釈剤は、組成物のバルクを増大させて、圧縮を容易とするか、またはカプセルの充填のための均質なブレンドに十分なバルクを創出する。このような化合物は、例えば、ラクトース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）などの結晶セルロース；二塩基性リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物；リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム；無水ラクトース、噴霧乾燥ラクトース；アルファデンプン、Ｄｉ−Ｐａｃ（登録商標）（Ａｍｓｔａｒ）などの圧縮糖；マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースベースの希釈剤、粉砂糖；一塩基性硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物；乳酸カルシウム三水和物、デキストレート（dextrate）；加水分解シリアル固形、アミロース；粉末セルロース、炭酸カルシウム；グリシン、カオリン；マンニトール、塩化ナトリウム；イノシトール、ベントナイトなどを含む。
【０２４１】
「充填剤」は、ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、セルロース  粉末、デキストロース、デキストレート（dextrate）、デキストラン、デンプン、アルファデンプン、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコールなどの化合物を含む。
【０２４２】
「滑沢剤」および「流動促進剤」とは、材料の接着または摩擦を防止、低減、または阻害する化合物である。例示的な滑沢剤は、例えば、ステアリン酸、水酸化カルシウム、滑石、フマル酸ステアリルナトリウム、鉱物油などの炭化水素、または水素化ダイズ油（Ｓｔｅｒｏｔｅｘ（登録商標））などの水素化植物油、高脂肪酸、ならびにアルミニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛など、それらのアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール、滑石、蝋、Ｓｔｅａｒｏｗｅｔ（登録商標）、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、ナトリウム酢酸、塩化ナトリウム、ロイシン、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ−４０００）、またはＣａｒｂｏｗａｘ（商標）などのメトキシポリエチレングリコール、ナトリウムオレイン酸、安息香酸ナトリウム、ベヘン酸グリセリル、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウムまたはラウリル硫酸ナトリウム、Ｓｙｌｏｉｄ（商標）、Ｃａｂ−Ｏ−Ｓｉｌ（登録商標）などのコロイド状シリカ、トウモロコシデンプンなどのデンプン、シリコーン油、界面活性剤などを含む。
【０２４３】
「可塑化剤」とは、マイクロカプセル化材料を軟化させるのに使用される化合物、またはマイクロカプセル化材料の脆性を低下させるフィルムコーティングである。適切な可塑化剤は、例えば、ＰＥＧ  ３００、ＰＥＧ  ４００、ＰＥＧ  ６００、ＰＥＧ  １４５０、ＰＥＧ  ３３５０、およびＰＥＧ  ８００などのポリエチレングリコール、ステアリン酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロース、およびトリアセチンを含む。一部の実施形態では、可塑化剤はまた、分散剤または保湿剤としても機能しうる。
【０２４４】
「可溶化剤」は、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート（doccusate）、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ｎ−ブタノール、イソプロピルアルコール、コレステロール、胆汁塩、ポリエチレングリコール２００〜６００、グリコフロール、トランスクトール、プロピレングリコール、およびジメチルイソソルビドなどの化合物を含む。
【０２４５】
「安定化剤」は、任意の抗酸化薬剤、緩衝液、酸、保存剤などの化合物を含む。
【０２４６】
「懸濁剤」は、ポリビニルピロリドン、例えば、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、またはポリビニルピロリドンＫ３０、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは、約３００〜約６０００、または約３３５０〜約４０００、または約７０００〜約５４００の分子量を有しうる）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシメチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、例えば、トラガントガムおよびアカシアガム、グアルガムなどのガム、キサンタンガムを含むキサンタン、糖、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなどのセルロース誘導体、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、ポビドンなどの化合物を含む。
【０２４７】
「界面活性剤」は、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート（docusate）、Ｔｗｅｅｎ  ６０またはＴｗｅｅｎ  ８０、トリアセチン、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、モノオレイン酸ソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリソルベート（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）、ポロキサマー、胆汁塩、モノステアリン酸グリセリン、酸化エチレンと酸化プロピレンとのコポリマー、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＢＡＳＦ）などの化合物を含む。他の一部の界面活性剤は、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルおよび植物油、例えば、ポリオキシエチレン（６０）水素化ヒマシ油；ならびにポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびアルキルフェニルエーテル、例えば、オクトキシノール１０、オクトキシノール４０を含む。一部の実施形態では、界面活性剤は、物理的安定性を増強するか、または他の目的で、組み入れることができる。
【０２４８】
「粘性増強剤」は、例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボマー、ポリビニルアルコール、アルギン酸塩、アカシア、キトサン、およびこれらの組合せを含む。
【０２４９】
「保湿剤」は、オレイン酸、モノステアリン酸グリセリン、ソルビタンモノオレイン酸、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ナトリウムドクセート（docusate）、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート（doccusate）、トリアセチン、Ｔｗｅｅｎ  ８０、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、アンモニウム塩などの化合物を含む。
【０２５０】
キット／製品
本明細書の、ある特定の実施形態では、本明細書で記載される、１または複数の方法による使用のためのキットおよび製品が開示される。このようなキットは、バイアル、試験管など、１または複数の容器であって、容器の各々が、本明細書で記載される方法において使用される個別のエレメントのうち１つを含む容器を受容するように区画化されたキャリングケース、パッケージ、または容器を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含む。一実施形態では、容器は、ガラスまたはプラスチックなど、様々な材料から形成されている。
【０２５１】
本明細書で提示される製品は、パッケージング材料を含有する。医薬パッケージング材料の例は、ブリスターパック、ボトル、試験管、バッグ、容器、ボトル、ならびに選択される製剤と、意図される投与方式および処置方式とに適する、任意のパッケージング材料を含むがこれらに限定されない。
【０２５２】
キットは、典型的に、内容物を列挙する表示、および／または使用のための指示書、ならびに使用のための指示書を伴う添付文書を含む。典型的に、指示書のセットもまた、組み入れられると予想される。
【０２５３】
一部の実施形態では、表示は、容器上に貼付されているか、または容器に付随する。一実施形態では、表示を形成する文字、数、または他の記号が、容器自体へと接着されているか、鋳造されているか、またはエッチングされている場合、表示は容器上に貼付されており、表示はまた、容器を保持する、レセプタクルまたはキャリングケース内に、例えば、パッケージ添付文書として存在する場合、容器に付随する。一実施形態では、表示は、内容物が、具体的な治療適用に使用されるものであることを指し示すのに使用される。表示はまた、内容物の、本明細書で記載される方法などにおける使用のための指示も指し示す。
【実施例】
【０２５４】
これらの例は、例示的な目的だけで提示されるものであり、本明細書で提示される特許請求の範囲を限定しようとするものではない。
【０２５５】
[実施例１]
ＨＢＶワクチンデザインのための、抗原バイオインフォマティクスワークフロー
本明細書で提示される、ＨＢＶワクチンの抗原デザインは、バイオインフォマティクス解析およびコンピュータによるタンパク質操作法の使用を介してもたらされる、本発明者により選択されたコンビナトリアルガイダンスを介してその着想を得た。ＨＢＶ抗原の配列は、遺伝子型Ｄのタンパク質配列、抗原性の予測、ならびにＭＨＣ−Ｉへの結合、およびＴ細胞活性化後におけるサイトカインの産生をもたらしうる広域カバレッジを伴うＴ細胞エピトープマッピングに基づき選択した。本明細書で提示される、ＨＢＶワクチンデザインについての、全体的なワークフローを、図５に示し、下記で、さらに詳述する。
【０２５６】
コンセンサス配列の取得
ＨＢＶゲノムは、ポリメラーゼタンパク質、コアタンパク質、エンベロープ（プレＳ１、Ｓ２、Ｓ）タンパク質、ＨＢｅタンパク質、およびＨＢｘタンパク質を含む、いくつかの重複ウイルスタンパク質（図３Ａ〜３Ｄ）をコードする。コンセンサスアミノ酸配列は、Ａ亜型、Ｃ亜型、およびＤ亜型について、Ｂ型肝炎ウイルスデータベース（ＨＢＶｄｂ）から得た。
【０２５７】
結合アフィニティーの予測
ＮｅｔＭＨＣ  ４．０を、各コンセンサス配列へと適用して、全ての、主要なＭＨＣ−Ｉ対立遺伝子（ＨＬＡ−Ａ０１０１、ＨＬＡ−Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ０３０１、ＨＬＡ−Ａ２４０２、ＨＬＡ−Ａ２６０１、ＨＬＡ−Ｂ０７０２、ＨＬＡ−Ｂ０８０１、ＨＬＡ−Ｂ２７０５、ＨＬＡ−Ｂ３９０１、ＨＬＡ−Ｂ４００１、ＨＬＡ−Ｂ５８０１、およびＨＬＡ−Ｂ１５０１）に対する結合アフィニティーを予測した。ＮｅｔＭＨＣ  ４．０は、人工ニューラルネットワークを使用して、ペプチド配列の結合アフィニティーを予測する。この解析は、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｃ、およびＤにわたり実施した。ランクの０．５％（強い結合剤）および２％（弱い結合剤）において、任意の閾値を設定した。予測結合アフィニティーが、９９．５％を超えるペプチドを、強い結合剤として分類し、予測結合アフィニティーが、９８％を超えるペプチドを、弱い結合剤として分類した。ペプチド配列内の、各アミノ酸の位置を抽出し、密度曲線（図９Ａ）を作成するのに使用した。これらの密度曲線を使用して、強い結合剤および弱い結合剤に対するピーク（図９Ｂ）を決定するために、一階微分および二階微分を計算した。最後に、これらの位置の和集合を使用して、応答を誘発する可能性が高いアミノ酸配列を抽出した（図９Ｃ）。
【０２５８】
[実施例２]
ＨＢＶ分子ワクチンのデザイン
本明細書で記載されるＨＢＶワクチンは、以下のＨＢＶデザイン１〜５操作タンパク質（遺伝子改変を伴うペプチド）を含む。デザインが完成したら、各デザインについての完全な配列を、ＮｅｔＭＨＣ予測にかけて、Ａ遺伝子型、Ｃ遺伝子型、およびＤ遺伝子型（実施例１）に対して、抗原性およびカバレッジを評価した。本明細書で記載されるワクチンを、現在、臨床試験下にある、アデノウイルスベースの免疫療法用のＨＢＶワクチンであって、（ａ）トランケート型コア、（ｂ）改変ポリメラーゼ、および（ｃ）２つのエンベロープドメインから構成される、固有の大型融合タンパク質をコードするＨＢＶワクチンであるＴＧ１０５０に対して比較した。ＴＧ１０５０のコア領域から、プレコアを除き、そのポリメラーゼを、４つの点突然変異と共に、３つのセグメントへと分割して、ワクチン構築物の安定性を改善した（Ｐｏｌ１、Ｐｏｌ２、およびＰｏｌ３；Δアミノ酸５３８〜５４４およびΔアミノ酸７１０〜７４２；ならびに突然変異Ｄ６８９Ｈ、Ｖ７６９Ｙ、Ｔ７７６Ｙ、Ｄ７７７Ｈ）。２つの、選択されたエンベロープドメインを、図５に示される通り、これらのポリメラーゼセグメントの間に挿入した。ＴＧ１０５０ポリメラーゼの、Ｅｎｖ１配列およびＥｎｖ２配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ（Ｙ０７５８７．１）から得、ＴＧ１０５０のコア配列は、ＨＢＶ  ＤＢ（ＡＢ０４８７０１）から得た。
【０２５９】
５つの抗原デザイン（ＨＢＶデザイン１〜５）および対照抗原を合成し、アデノベクター構築のための発現プラスミド（ｐＡｄＳｈｕｔｔｌｅ）へとクローニングした（図６）。初期抗原スクリーニングは、一過性のトランスフェクションにおける、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの抗原発現、単球由来の樹状細胞についての、一過性のトランスフェクション研究における、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの抗原プロセシングおよび抗原提示について査定した。図１７に示される通り、ＨＢＶデザイン１および２は、クレードＤコンセンサスに基づきデザインした。コア（８）、表面（８）、ポリメラーゼ（８）、ＨＢｘ（６）、およびＨＢＰＳ（２）に由来する、３２のＨＢＶペプチドは、免疫原性データ、質量分析などなどの、実験データおよび機能データを有する文献からキュレートした（表３）。ＨＢＶデザイン３のために、ヒトアンキリン様リピート（ＡＬＲ）タンパク質足場（ＰＤＢコード：１ＱＹＭ）ペプチドを、ヘリックス／ループ領域に、タンデムにグラフトした。２つのＡＬＲ足場を使用し、切断可能リンカー（ＶＳＱＴＳＫＬＴＲ；配列番号１１１）により接続した。ＡＬＲタンパク質は、一般に、発現が高度であり、高安定性を有する。したがって、ＡＬＲタンパク質を、ＨＢＶペプチドのための足場として使用して、新規のＣＴＬを創出した。ＨＢＶデザイン４エピトープは、ＫＫリンカーにより隔てた（図６）。
【０２６０】
ＨＢＶデザイン１
このデザインでは、ＨＢＶ  Ｄ遺伝子型タンパク質配列（ＨＢＶ  ＤＢ：ＡＢ０４８７０１）を使用した。ＨＢＶタンパク質についての抗原性予測解析（実施例１）および相同性モデルが、このデザインを導いた。ＨＢＶデザイン１と、ＴＧ１０５０との比較を、タンパク質抗原についての相同性モデルと共に、図１０に示し、配列比較を、図１５Ａ〜１５Ｃに示す。このデザインは、４つ天然ＨＢＶ抗原：（１）１６５〜３８２アミノ酸の拡張Ｅｎｖ２／Ｓ領域；（２）アミノ酸１〜１５１のコア領域、およびプレコア領域；（３）アミノ酸１〜１５４のＨＢｘ領域；ならびに（４）ポリメラーゼ（アミノ酸３３９〜８３２）；アミノ酸５３８〜５４４、７１０〜７４２のｄｅｌを含有した。ＴＧ１０５０比較配列は、２つのＨＢＶ抗原を、ポリメラーゼと融合させた、第３のエンベロープペプチドと共に有した。
【０２６１】
このデザインは、エンベロープ、コア、ＨＢｘ、およびポリメラーゼの逆転写酵素ドメインに由来する、完全なタンパク質ドメインを包含した。ＴＧ１０５０比較配列は、改変ポリメラーゼドメインへと融合させた、トランケート型コアおよびエンベロープペプチドを有したが、ＨＢｘ配列はコードしなかった。
【０２６２】
異なるＨＢＶドメインを、１つの長いオープンリーディングフレームとして、継目なしに、一体に融合させた。ＴＧ１０５０比較配列は、トランケーションならびに欠失を伴い、２つだけのドメイン（コアおよびポリメラーゼ）を有した。ＴＧ１０５０比較配列は、エンベロープペプチドの、ポリメラーゼドメイン内の、ランダムな挿入を有した。
【０２６３】
エンベロープタンパク質ドメインおよびポリメラーゼドメインにトランケーションを施した。このデザインでは、エンベロープタンパク質の、Ｃ末端領域だけを使用した。逆転写酵素の、Ｃ末端領域だけを組み入れた。完全なＲＮアーゼＨドメインを組み入れた。逆転写酵素機能を不活化させるようにΔＲＴ活性モチーフ（５３８〜５４４：６アミノ酸）、およびΔＲＮアーゼＨモチーフ（７１０〜７４２：３２アミノ酸）にトランケーションを施した。
【０２６４】
ＨＢＶデザイン１の新規性：総じて、ＨＢＶデザイン１は、ＴＧ１０５０と比較して、プレコア領域およびコア領域の両方と共に、拡張Ｅｎｖ２／Ｓ領域を有した。ＴＧ１０５０と異なり、ＨＢＶデザイン１はまた、ＨＢｘドメインも含有した。Ｎ末端トランケート型ポリメラーゼもまた、ＴＧ１０５０と同様の欠失と共に使用した。
【０２６５】
ＨＢＶデザイン２
このデザインは、図１１に描示される通り、ＨＢｘペプチドと連結された、コアタンパク質、表面スプライス変異体タンパク質、およびポリメラーゼタンパク質を含む、３つの主要タンパク質全てからなった。選択されたタンパク質構成要素は、１つの長いオープンリーディングフレームを作るように、一体に融合させた。このデザインは、以下：（ａ）機能的ゲノミクスデータ（ＨＢＶｄｂ：ＡＢ  ０４８７０１）；（ｂ）Ｔ細胞エピトープの予測（実施例１）；および（ｃ）図１２Ａ〜１２Ｄに例示される、入手可能なＨＢＶタンパク質構造についての解析に基づいた。ＴＧ１０５０比較配列およびＨＢＶデザインデザイン１と比較すると、このデザインは、以下の通りに、さらなるタンパク質ドメインおよび／または改変タンパク質ドメイン：（ａ）トランケート型Ｃ末端；（ｂ）表面タンパク質のスプライス変異体（プレＳ１およびプレＳ２、Ｓ）；（ｃ）分割型のＰｏｌ  Ｎ末端断片およびＰｏｌ  Ｃ末端断片；ならびに（ｄ）６つのＨＢｘペプチドを有する。タンパク質ドメインは、ＨＢＶの感染性を回避するようにシャッフルし、ＨＢＶデザイン２は、ＴＧ１０５０比較配列およびＨＢＶデザイン１と異なる順序づけスキームを使用した。
【０２６６】
ＨＢＶデザイン３
このデザインは、合計３２のＣＴＬ特異性エピトープ（表３）を含有する多重エピトープに基づき、以下：（１）複数の免疫学的アッセイおよびイムノプロテオミクスに基づく文献の精査；ならびに（２）ＩＥＤＢ；（３）ＮｅｔＭＨＣ  ４．０によるエピトープ予測から選択された。ヒトアンキリン様リピートタンパク質（ＰＤＢコード：１ＱＹＭ）を、３２のペプチドをグラフトしリピート領域を置き換える足場として選択した。このデザインについての相同性モデル（図１３）を作成したが、これは、ペプチドをグラフトされたアンキリン足場が、全体的な三次構造を保持しうることを示唆した。３２の、グラフトされたＣＴＬエピトープを接続する、足場骨格のアミノ酸は、十分なリンカーとして用いられうる。
【０２６７】
ＨＢＶデザイン４
このデザインは、デザイン３と同じ、コア、表面、Ｐｏｌ、ＨＢｘ、およびＨＢＳＰに由来する、３２のＣＴＬエピトープ（表３）から構成された。ペプチドは、足場へとグラフトする代わりに、帯電したジペプチドＫＫ残基リンカーによりアセンブルした。
【０２６８】
【表３】
2021514666.tif 000005
【０２６９】
ＨＢＶデザイン５
このデザインは、デザイン１と同様であり、融合体の構成要素（配列番号１１２および１１３；表６；図１６）の間に、剛直性リンカー（ＥＡＡＡＫ）２（配列番号１２９）を有する。
【０２７０】
ＲＮＡ  ｑＰＣＲ相対発現アッセイのために、５’−ＴＧＣＣＡＡＧＡＧＴＧＡＣＧＴＧＴＣＣＡ−３’（配列番号１１０）を、スプライスプライマーとして使用し、５’−ＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＧＧ−３’（配列番号１２８）を、スプライスプローブとして使用した。各抗原についてデザインされた、特異的プライマーを、リバースプライマーとして使用した（図１４）。Ａ５４９細胞に、リポトランスフェクトし（表４）、ＨＴ１０８０細胞に、ヌクレオフェクトした（表５）。
【０２７１】
【表４】
2021514666.tif 000006
【０２７２】
【表５】
2021514666.tif 000007
【０２７３】
[実施例３]
ＨＢＶワクチンについての免疫原性試験
抗原の全ては、多重欠失型ゴリラアデノベクター内で構築および作製して、実験のほか、臨床研究のためのＧＭＰ製造へと移行しうるプレＧＭＰ株のための、調査研究用材料を作出した（図６）。
【０２７４】
樹状細胞へのトランスフェクションに最適のプラスミド濃度を決定する。慢性ＰＨＢＶ患者に由来するＴ細胞を活性化させる、異なる抗原デザインの能力を評価する。ＨＢＶ感染した患者の試料に対する、抗原デザインの免疫原性を評価する。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける試験計画は、マウスのｉｎ  ｖｉｖｏにおいて免疫原性研究（例えば、「自家ブースト」の実行可能性の証拠、投与経路（ＩＭ対ＳＣ）を含む、単回投与研究、反復投与研究）を行い、慢性ＨＢＶ感染のマウスモデル、および、最終的には、ＨＣＣのマウスモデルにおいて、免疫原性研究を行うことである。
【０２７５】
単球由来の樹状細胞は、標準的プロトコールに従い、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４により作出する。単球由来の樹状細胞に、異なるＨＢＶ抗原構築物を感染させ、３７℃で、２４時間にわたり、ベクターと共にインキュベートする。細胞を洗浄し、１０ｎｇ／ｍｌのｒｈｕＴＮＦ−αにより、一晩にわたり成熟させた。細胞の成熟は、フローサイトメトリー（ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ）により評価する。サイトカインの産生は、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、およびＭＣＰ１について評価する。単球由来の樹状細胞を、自家Ｔ細胞と共に、１：１０の比で、１０日間にわたり共培養する。外因性ｒｈｕＩＬ−２（２００Ｕ／ｍｌ）、ｒｈｕＩＬ−７、およびｒＨｕＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）を、３、５、および７日目に添加する。ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＣＸＣＬ−１０、ＣＸＣＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１２ｐ７０、およびＭＣＰ１について、サイトカインの分泌を評価する。Ｔ細胞についての活性化マーカーは、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、およびＬＡＧ３である。樹状細胞およびＴ細胞の活性化に基づき、免疫原性が最も大きな抗原デザインを選択し、ＨＢＶ感染した患者の試料に対する、抗原デザインの免疫原性を評価する。
【０２７６】
具体的実施形態についての、前出の記載は、本発明の一般的な性格を、完全に明らかにするので、当技術分野の技術の範囲内にある知見を適用することにより、他の実施者も、本発明の一般的な概念から逸脱しない限りにおいて、不要な実験を伴わずに、このような具体的実施形態を、たやすく改変し、かつ／または多様な適用に適応させることができる。したがって、このような適応および改変は、本明細書において提示される教示および指針に基づき、開示される実施形態の均等物の意義および範囲の中にあることが意図される。本明細書の用語法または表現法が、教示および指針に照らして、当業者により解釈されるように、本明細書における表現法または用語法は、説明を目的とするものであり、限定を目的とするものではないことが理解されるものとする。
【０２７７】
当業者には、本発明の他の実施形態も、本明細書の検討、および本明細書で開示される本発明の実施から明らかであろう。本明細書および例は、例示的なものであるに過ぎず、本発明の、真の範囲および精神は、後続の特許請求の範囲により指し示されることが意図される。
【０２７８】
本出願は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、２０１８年３月６日に出願された、米国仮出願第６２／６３９，３５４号に対する優先権を主張する。
【０２７９】
実施形態
Ｅ１．少なくとも１または複数の免疫応答誘導性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする、天然に存在しないポリヌクレオチド。
Ｅ２．前記１または複数のＨＢＶポリペプチドが、ＨＢＶコアペプチドを含む、Ｅ１に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ３．前記ＨＢＶコアペプチドが、表３に示されるコアペプチド配列のうちのいずれか１つを有する、Ｅ２に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ４．前記１または複数のＨＢＶポリペプチドが、ＨＢＶ表面ペプチドを含む、Ｅ１からＥ３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ５．前記ＨＢＶ表面ペプチドが、表３に示される表面ペプチド配列のうちのいずれか１つを有する、Ｅ４に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ６．前記１または複数のＨＢＶポリペプチドが、ＨＢＶ  Ｐｏｌペプチドを含む、Ｅ１からＥ５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ７．前記ＨＢＶ  Ｐｏｌペプチドが、表３に示されるＰｏｌペプチド配列のうちのいずれか１つを有する、Ｅ６に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ８．前記１または複数のＨＢＶポリペプチドが、ＨＢＶ  ＨＢＳＰ／ＨＢｘペプチドを含む、Ｅ１からＥ７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ９．前記ＨＢＶ  ＨＢＳＰ／ＨＢｘペプチドが、表３に示されるＨＢＳＰ／ＨＢｘペプチド配列のうちのいずれか１つを有する、Ｅ８に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１０．前記１または複数のＨＢＶポリペプチドが、ＫＫリンカーを含む、Ｅ１からＥ９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１１．前記ＫＫリンカーが、表３に示されるペプチド配列のうちのいずれか１つを、表３に示される他の任意のペプチド配列へと接続する、Ｅ１０に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１２．Ｅ１からＥ１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含み、異種遺伝子発現の誘導性制御のための遺伝子スイッチ系をコードする、１または複数のポリヌクレオチドをさらに含むポリヌクレオチドであって、異種遺伝子発現が、前記遺伝子スイッチ系により調節され；前記異種遺伝子が、Ｅ１からＥ１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド。
Ｅ１３．前記遺伝子スイッチ系が、エクジソン受容体ベースの（ＥｃＲベースの）遺伝子スイッチ系である、Ｅ１からＥ１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１４．前記１または複数のＨＢＶポリペプチドが、ワクチンにおける使用のためのＨＢＶポリペプチドである、Ｅ１からＥ１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１５．Ｅ１からＥ１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
Ｅ１６．アデノウイルスベクターである、Ｅ１５に記載のベクター。
Ｅ１７．前記アデノウイルスベクターが、ゴリラアデノウイルスベクターである、Ｅ１６に記載のベクター。
Ｅ１８．細胞内の異種遺伝子の発現を調節する方法であって、前記細胞へと、（ｉ）抑制性遺伝子スイッチまたは誘導性遺伝子スイッチ、および（ｉｉ）発現が、前記遺伝子スイッチにより調節される異種免疫応答誘導性遺伝子であって、１または複数のＨＢＶポリペプチドのうちの少なくとも１つをコードする異種免疫応答誘導性遺伝子を含む、１または複数のポリヌクレオチドを導入するステップと；前記細胞を、前記異種免疫応答誘導性遺伝子の発現を抑制または誘導するのに十分な量の化合物へと曝露するステップとを含む方法。
Ｅ１９．前記標的細胞が、哺乳動物細胞である、Ｅ１８に記載の方法。
Ｅ２０．前記遺伝子スイッチが、エクジソン受容体（ＥｃＲ）、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核内受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用性タンパク質１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用性タンパク質１４、およびファルネソール受容体のうちの少なくとも１つに由来する、リガンド結合性ドメインを含む、Ｅ１８またはＥ１９に記載の方法。
Ｅ２１．少なくとも１つのＨＢＶペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターであって、アデノウイルスベクターであるベクター。
Ｅ２２．少なくとも１つのＨＢＶペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターであって、前記ベクターが、アデノウイルスベクターであり、前記アデノウイルスベクターが、ゴリラアデノウイルスベクターである、ベクター。
Ｅ２３．ＨＢＶ  ＨＢｘドメイン、およびＨＢＶ  Ｐｏｌドメイン、ＨＢＶコアドメイン、ＨＢＶプレコアドメイン、またはＨＢＶ表面ドメインのうちの少なくとも１つを含むポリペプチド構築物。
Ｅ２４．プレコアドメイン、およびＨＢＶ  Ｐｏｌドメイン、ＨＢＶ  ＨＢｘドメイン、またはＨＢＶ表面ドメインのうちの少なくとも１つを含むポリペプチド構築物。
Ｅ２５．前記ＨＢＶ  ＨＢｘドメインが、配列番号９８に示される配列を有する、Ｅ２３またはＥ２４に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ２６．前記ＨＢＶ  Ｐｏｌドメインが、野生型ＨＢＶ  Ｐｏｌドメインと比較した、少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含む、Ｅ２３からＥ２５のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ２７．前記欠失が、前記野生型ＨＢＶ  Ｐｏｌドメインの欠失部分を含み、前記欠失部分が、アミノ酸５３８〜５４４またはアミノ酸７１０〜７４２のうちの少なくとも１つを含む、Ｅ２６に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ２８．前記欠失部分が、アミノ酸５３８〜５４４およびアミノ酸７１０〜７４２の両方を含む、Ｅ２７に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ２９．前記ＨＢＶ  Ｐｏｌドメインが、配列番号９９に示される配列を有する、Ｅ２８に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ３０．前記ＨＢＶ表面ドメインが、プレＳ１ドメイン、プレＳ２ドメイン、およびＳドメインのうちの少なくとも１つを含む、Ｅ２３からＥ２９のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ３１．前記ＨＢＶ表面ドメインが、ＨＢＶ  Ｓドメインを含む、Ｅ３０に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ３２．前記ＨＢＶ表面ドメインが、配列番号１００に示される配列を有する、Ｅ３０またはＥ３１に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ３３．ＨＢＶコアドメインをさらに含む、Ｅ２４からＥ３２のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ３４．コア部分を含み、前記コア部分が、前記ＨＢＶコアドメインと、前記ＨＢＶプレコアドメインとを含む、Ｅ２３またはＥ３３に記載のポリペプチド。
Ｅ３５．前記コア部分が、配列番号１０１に示される配列を有する、Ｅ３４に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ３６．ＳＨＢ（Ｅｎｖ）ドメイン、ＨＢｅＡｇドメイン、ＨＢｘドメイン、およびＰｏｌドメインの各々を含む、Ｅ２３またはＥ３３に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ３７．Ｎ末端から、Ｃ末端へと、前記ＳＨＢ（Ｅｎｖ）ドメイン、ＨＢｅＡｇドメイン、ＨＢｘドメイン、およびＰｏｌドメインの構造を含む、Ｅ３６に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ３８．前記ＳＨＢ（Ｅｎｖ）ドメインが、配列番号１０２に示される配列を有する、Ｅ３６またはＥ３７に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ３９．前記ＨＢｅＡｇドメインが、配列番号１０３に示される配列を有する、Ｅ３６またはＥ３７に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ４０．前記ＨＢｘドメインが、配列番号１０４に示される配列を有する、Ｅ３６またはＥ３７に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ４１．前記Ｐｏｌドメインが、配列番号１０５に示される配列を有する、Ｅ３６またはＥ３７に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ４２．配列番号１０６に示される配列を有する、Ｅ３６またはＥ３７に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ４３．剛直性リンカーをさらに含む、Ｅ３６またはＥ３７に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ４４．前記ポリペプチドが、配列番号１１２に示される配列を有する、Ｅ３６またはＥ３７に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ４５．１または複数のＨＢＶ  ＨＢｘリンカー、ならびにコアドメイン、表面ドメイン、およびＰｏｌドメインのうちの少なくとも１つを含み、前記コアドメイン、前記表面ドメイン、および前記Ｐｏｌドメインのうちの１つのドメインが、前記１または複数のＨＢｘリンカーにより、前記コアドメイン、前記表面ドメイン、および前記Ｐｏｌドメインのうちの別のドメインへと接続された、ポリペプチド構築物。
Ｅ４６．前記表面ドメインが、ＨＢＶプレＳ１ドメイン、ＨＢＶプレＳ２ドメイン、およびＨＢＶ  Ｓドメインのうちの少なくとも１つを含む、Ｅ４５に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ４７．前記１または複数のＨＢＶ  ＨＢｘリンカーが、複数のＨＢＶ  ＨＢｘリンカーを含む、Ｅ４５またはＥ４６に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ４８．前記複数のＨＢＶ  ＨＢｘリンカーのうちの、少なくとも２つが、アミノ酸配列が異なる、Ｅ４７に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ４９．前記ＨＢＶ  ＨＢｘリンカーが、表３のＨＢｘ−１、ＨＢｘ−２、ＨＢｘ−３、ＨＢｘ−４、ＨＢｘ−５、またはＨＢｘ−６のうちのいずれか１つに示される配列を有する、Ｅ４５からＥ４８のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ５０．前記コアドメインが、前記表面ドメインと隣接する、Ｅ４５からＥ４９のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ５１．前記表面ドメインが、プレＳ１ドメインを含む、Ｅ５０に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ５２．前記表面ドメインが、前記１または複数のＨＢｘリンカーのうちの１つにより、前記コアドメインへと接続された、Ｅ５０またはＥ５１に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ５３．前記Ｐｏｌドメインが、表面ドメインと隣接する、Ｅ４５からＥ５２のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ５４．前記表面ドメインが、プレＳ１ドメイン、プレＳ２ドメイン、およびＳドメインのうちの少なくとも１つを含む、Ｅ５３に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ５５．前記表面ドメインが、前記プレＳ１ドメインを含み、前記ＰｏｌドメインのＮ末端部分が、前記プレＳ１ドメインと隣接する、Ｅ５４に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ５６．前記Ｐｏｌドメインの、前記Ｎ末端部分が、前記１または複数のＨＢｘリンカーのうちの１つにより、前記プレＳ１ドメインへと接続された、Ｅ５５に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ５７．前記表面ドメインが、前記プレＳ２ドメインを含み、前記ＰｏｌドメインのＮ末端部分が、前記プレＳ２ドメインと隣接する、Ｅ５６に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ５８．前記Ｐｏｌドメインの、前記Ｎ末端部分が、前記１または複数のＨＢｘリンカーのうちの１つにより、前記プレＳ２ドメインへと接続された、Ｅ５７に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ５９．前記表面ドメインが、前記プレＳ２ドメインを含み、前記ＰｏｌドメインのＣ末端部分が、前記プレＳ２ドメインと隣接する、Ｅ５８に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ６０．前記Ｐｏｌドメインの、前記Ｃ末端部分が、前記１または複数のＨＢｘリンカーのうちの１つにより、前記プレＳ２ドメインへと接続された、Ｅ５９に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ６１．前記表面ドメインが、前記Ｓドメインを含み、前記ＰｏｌドメインのＣ末端部分が、前記Ｓドメインと隣接する、Ｅ６０に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ６２．前記Ｐｏｌドメインの、前記Ｃ末端部分が、前記１または複数のＨＢｘリンカーのうちの１つにより、前記Ｓドメインへと接続された、Ｅ６１に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ６３．配列番号１０７に示される配列を有する、Ｅ４５からＥ６２のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ６４．アンキリン様リピートドメイン、および１または複数のＨＢＶペプチドを含むポリペプチド構築物。
Ｅ６５．前記アンキリン様リピートタンパク質が、ヒトアンキリン様リピートタンパク質である、Ｅ６４に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ６６．前記１または複数のＨＢＶペプチドが、表３のアミノ酸配列のうちのいずれか１つに示される配列を有する、Ｅ６４またはＥ６５に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ６７．前記１または複数のＨＢＶペプチドが、コアペプチド、表面ペプチド、Ｐｏｌペプチド、およびＨＢＳＰ／ＨＢｘペプチドのうちの１または複数を含む、Ｅ６４からＥ６６のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ６８．前記１または複数のＨＢＶペプチドが、コアペプチドを含み、前記コアペプチドが、表３のコアアミノ酸配列のうちのいずれか１つに示される配列を有する、Ｅ６７に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ６９．前記１または複数のＨＢＶペプチドが、表面ペプチドを含み、前記表面ペプチドが、表３の表面アミノ酸配列のうちのいずれか１つに示される配列を有する、Ｅ６７に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ７０．前記１または複数のＨＢＶペプチドが、Ｐｏｌペプチドを含み、前記Ｐｏｌペプチドが、表３のＰｏｌアミノ酸配列のうちのいずれか１つに示される配列を有する、Ｅ６７に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ７１．前記１または複数のＨＢＶペプチドが、ＨＢＳＰ／ＨＢｘペプチドを含み、前記ＨＢＳＰ／ＨＢｘペプチドが、表３のＨＢＳＰ／ＨＢｘアミノ酸配列のうちのいずれか１つに示される配列を有する、Ｅ６７に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ７２．配列番号１０８に示される配列を有する、Ｅ６５からＥ７１のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ７３．表３に示される少なくとも２つのＨＢＶアミノ酸配列を含み、前記少なくとも２つのＨＢＶアミノ酸配列が、ペプチドリンカーにより接続され、前記ペプチドリンカーが、ＫＫリンカーである、ポリペプチド構築物。
Ｅ７４．前記少なくとも２つのＨＢＶアミノ酸配列が、表３に示されるコアペプチド、表面ペプチド、Ｐｏｌペプチド、およびＨＢＳＰ／ＨＢｘペプチドのうちの少なくとも１つを含む、Ｅ７３に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ７５．前記少なくとも２つのＨＢＶアミノ酸配列が、表３に示されるアミノ酸配列の各々を含む、Ｅ７３またはＥ７４に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ７６．アミノ酸配列の前記各々が、前記ＫＫリンカーにより、アミノ酸配列の前記各々のうちの、別のアミノ酸配列へと接続された、Ｅ７５に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ７７．配列番号１０９に示される配列を有する、Ｅ７３からＥ７５のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ７８．ワクチンにおける使用のための、Ｅ２３からＥ７７のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
Ｅ７９．Ｅ２５からＥ７８のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド。
Ｅ８０．Ｅ７９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
Ｅ８１．アデノウイルスベクターである、Ｅ８０に記載のベクター。
Ｅ８２．前記アデノウイルスベクターが、ゴリラアデノウイルスベクターである、Ｅ８１に記載のベクター。
【０２８０】
配列
本明細書では、本明細書で提示される実施形態に含まれる、ある特定の配列の代表的リストが提示される（表６）。
【０２８１】
【表６−１】
2021514666.tif 000008
【０２８２】
【表６−２】
2021514666.tif 000009
【図１】
2021514666.tif 000010
【図２】
2021514666.tif 000011
【図３Ａ】
2021514666.tif 000012
【図３Ｂ】
2021514666.tif 000013
【図３Ｃ】
2021514666.tif 000014
【図３Ｄ】
2021514666.tif 000015
【図４】
2021514666.tif 000016
【図５】
2021514666.tif 000017
【図６】
2021514666.tif 000018
【図７】
2021514666.tif 000019
【図８】
2021514666.tif 000020
【図９Ａ】
2021514666.tif 000021
【図９Ｂ】
2021514666.tif 000022
【図９Ｃ】
2021514666.tif 000023
【図１０】
2021514666.tif 000024
【図１１】
2021514666.tif 000025
【図１２Ａ】
2021514666.tif 000026
【図１２Ｂ】
2021514666.tif 000027
【図１２Ｃ】
2021514666.tif 000028
【図１２Ｄ】
2021514666.tif 000029
【図１３】
2021514666.tif 000030
【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
2021514666.tif 000033
【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021514666.tif 000037
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2021514666.tif 000039
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