(57)【要約】本発明は、フィブロネクチン腎症、遺伝性コプロポルフィリン症などの遺伝性疾患を有する患者を治療するための方法及び組成物を提供する。遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更することによって疾患関連遺伝子（複数可）を調整するための方法及び組成物も提供する。2021521101.tif 000030
2021521101.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブロネクチン腎症を有する対象を治療する方法であって、ＦＮ１遺伝子の発現を低減することができる表３からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
細胞中のＦＮ１遺伝子の発現を低減する方法であって、前記ＦＮ１遺伝子の調節配列領域（ＲＳＲ）またはその一部分に関連する１つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表３からの化合物の有効量を前記細胞に導入する工程を含む、前記方法。
【請求項３】
前記化合物が、スムーズンドアゴニスト、クリゾチニブ、ＢＧＪ３９８、ＡＺＤ２８５８、及びベシル酸アムロジピンからなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
遺伝性コプロポルフィリン症を有する対象を治療する方法であって、ＣＰＯＸ遺伝子の発現を増加させることができる表４からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項５】
細胞中のＣＰＯＸ遺伝子の発現を増加させる方法であって、前記ＣＰＯＸ遺伝子の調節配列領域（ＲＳＲ）またはその一部分に関連する１つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表４からの化合物の有効量を前記細胞に導入する工程を含む、前記方法。
【請求項６】
前記化合物が、１７−ＡＡＧ、塩化コバルト、ＳＫＬ２００１、ＦＩＣＺ、及びプレドニゾンからなる群から選択される、請求項４または請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＳＥＲＰＩＮＣ１欠損症を有する対象を治療する方法であって、ＳＥＲＰＩＮＣ１遺伝子の発現を増加させることができる表５からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項８】
細胞中のＳＥＲＰＩＮＣ１遺伝子の発現を増加させる方法であって、前記ＳＥＲＰＩＮＣ１遺伝子の調節配列領域（ＲＳＲ）またはその一部分に関連する１つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表５、表１４、表１５、または表１６からの化合物の有効量を前記細胞に導入する工程を含む、前記方法。
【請求項９】
前記化合物が、ＯＳＩ−０２７、ＰＦ０４６９１５０２、ＣＰ−６７３４５１、エキノマイシン、及びパクリチニブ（ＳＢ１５１８）からなる群から選択される、請求項７または請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
アラジール症候群を有する対象を治療する方法であって、ＪＡＧ１遺伝子及び／またはＮＯＴＣＨ２遺伝子の発現を増加させることができる表６からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１１】
細胞中のＪＡＧ１遺伝子及び／またはＮＯＴＣＨ２遺伝子の発現を増加させる方法であって、前記ＪＡＧ１遺伝子及び／または前記ＮＯＴＣＨ２遺伝子の調節配列領域（ＲＳＲ）またはその一部分に関連する１つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表６からの化合物の有効量を前記細胞に導入する工程を含む、前記方法。
【請求項１２】
前記化合物が、メレスチニブ及びトルセトラピブからなる群から選択される、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
糖原病１ｂを有する対象を治療する方法であって、ＳＬＣ３７Ａ４遺伝子の発現を増加させることができる表７からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１４】
細胞中のＳＬＣ３７Ａ４遺伝子の発現を増加させる方法であって、前記ＳＬＣ３７Ａ４遺伝子の調節配列領域（ＲＳＲ）またはその一部分に関連する１つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表７からの化合物の有効量を前記細胞に導入する工程を含む、前記方法。
【請求項１５】
前記化合物が、エキノマイシン、プレドニゾン、ＣＰ−６７３４５１、及び塩化コバルトからなる群から選択される、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
急性間欠性ポルフィリン症を有する対象を治療する方法であって、ＨＭＢＳ遺伝子の発現を増加させることができる表８からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１７】
細胞中のＨＭＢＳ遺伝子の発現を増加させる方法であって、前記ＨＭＢＳ遺伝子の調節配列領域（ＲＳＲ）またはその一部分に関連する１つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表８からの化合物の有効量を前記細胞に導入する工程を含む、前記方法。
【請求項１８】
前記化合物が、ソトラスタウリンである、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＬＥＣＴ２アミロイドーシスを有する対象を治療する方法であって、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現を低減することができる表９からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２０】
細胞中のＬＥＣＴ２遺伝子の発現を低減する方法であって、前記ＬＥＣＴ２遺伝子の調節配列領域（ＲＳＲ）またはその一部分に関連する１つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表９からの化合物の有効量を前記細胞に導入する工程を含む、前記方法。
【請求項２１】
前記化合物が、カルシトロール、１７−ＡＡＧ、及びリタオナビル（Ｒｉｔａｏｎａｖｉｒ）からなる群から選択される、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＡＰＯＬ１関連糸球体疾患を有する対象を治療する方法であって、ＡＰＯＬ１遺伝子の発現を低減することができる表１０または表１６からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２３】
細胞中のＡＰＯＬ１遺伝子の発現を低減する方法であって、前記ＡＰＯＬ１遺伝子の調節配列領域（ＲＳＲ）またはその一部分に関連する１つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表１０または表１６からの化合物の有効量を前記細胞に導入する工程を含む、前記方法。
【請求項２４】
前記化合物が、ニトロフラントイン、クリゾチニブ、モメロテニブ（Ｍｏｍｅｌｏｔｅｎｉｂ）、及びモメロテニブ代謝産物Ｍ２１からなる群から選択される、請求項２２または請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ジルベール症候群またはクリグラーナジャーＩＩ型を有する対象を治療する方法であって、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子の発現を増加させることができる表１１からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２６】
細胞中のＵＧＴ１Ａ１遺伝子の発現を増加させる方法であって、前記ＵＧＴ１Ａ１遺伝子の調節配列領域（ＲＳＲ）またはその一部分に関連する１つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表１１からの化合物の有効量を前記細胞に導入する工程を含む、前記方法。
【請求項２７】
前記化合物が、ＦＩＣＺ、カルトゲニン、ｍｅＢＩＯ、ＣＰ−６７３４５１、ＢＡＭ７、及びＥＷ−７１９７からなる群から選択される、請求項２５または請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
脂質異常症を有する対象を治療する方法であって、ＬＤＬＲ遺伝子の発現を増加させることならびに／あるいはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子及び／またはＰＣＳＫ９遺伝子の発現を低減することができる表１２からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２９】
細胞中のＡＮＧＰＴＬ３、ＬＤＬＲ、及びＰＣＳＫ９遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を調整する方法であって、前記ＡＮＧＰＴＬ３、ＬＤＬＲ、またはＰＣＳＫ９遺伝子の調節配列領域（ＲＳＲ）またはその一部分に関連する１つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表１２または表１３からの化合物の有効量を前記細胞に導入する工程を含む、前記方法。
【請求項３０】
前記化合物が、ＷＹＥ−１２５１３２、ピフィスリン−ｕ、ＬＹ２９４００２、ＳＧＩ−１７７６、プレラデナント、及びＣＯ−１６８６からなる群から選択される、請求項２８または請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
レット症候群を有する対象を治療する方法であって、ＭＥＣＰ２遺伝子の発現を増加させることができる表１７、表１８または表１９からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項３２】
レット症候群を有する対象を治療する方法であって、ＭＥＣＰ２遺伝子の発現を増加させることができる表１７、表１８または表１９からの化合物の有効量を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項３３】
前記化合物が、１７−ＡＡＧである、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記対象が、ヒトである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月６日出願の米国仮特許出願第６２／６５３，７６０号に対する優先権及びその利益を主張し、その内容は参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本開示は、ヒトにおける、フィブロネクチン腎症、遺伝性コプロポルフィリン症などの、ニーズが満たされていない遺伝性疾患の治療のための組成物及び方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
背景
継承遺伝性疾患は、致命的であり得るか、または重大な医療介入を必要とする状態をもたらし得る。継承遺伝性疾患の中で、稀な継承遺伝性疾患は、より大きな医学的課題を表している。現在、遺伝性疾患、特に稀な遺伝性疾患の療法にアプローチする能力は限られている。そのような疾患について、細胞シグナル伝達経路の制御は、魅力的な戦略を表す。疾患遺伝子を制御するシグナル伝達経路を操作することによって、遺伝子の発現は、所望の治療効果を達成するように変更され得るか、またはさらに微調整され得る。遺伝子発現の一見わずかな変化さえ、疾患に対して大きな影響を有することが示されている。
【０００４】
したがって、本発明は、ニーズが満たされていない遺伝性疾患のための新規の治療方法を提供する。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本発明は、多数の疾患関連遺伝子に関連する遺伝子シグナル伝達ネットワーク（複数可）のマッピング及び特定を開示する。遺伝子シグナル伝達ネットワーク（複数可）の構成成分を摂動させることによって、本発明者らは、そのような遺伝子の発現を調整するために利用され得る新規の標的、化合物及び／または方法を特定した。そのような方法及び組成物を使用して、フィブロネクチン腎症、遺伝性コプロポルフィリン症などの遺伝性疾患のための様々な療法を開発することができる。
【０００６】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＮ１遺伝子の発現を低減することができる表３からの化合物の有効量を対象に投与することによって、フィブロネクチン腎症を有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＮ１遺伝子の調節配列領域（ＲＳＲ）またはその一部分に関連する１つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表３からの化合物の有効量を細胞に導入することによって、細胞中のＦＮ１遺伝子の発現を低減する方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、スムーズンドアゴニスト、クリゾチニブ、ＢＧＪ３９８、ＡＺＤ２８５８、及びベシル酸アムロジピンからなる群から選択される。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＰＯＸ遺伝子の発現を増加させることができる表４からの化合物の有効量を対象に投与することによって、遺伝性コプロポルフィリン症を有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＰＯＸ遺伝子の調節配列領域（ＲＳＲ）またはその一部分に関連する１つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表４からの化合物の有効量を細胞に導入することによって、細胞中のＣＰＯＸ遺伝子の発現を増加させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、１７−ＡＡＧ、塩化コバルト、ＳＫＬ２００１、ＦＩＣＺ、及びプレドニゾンからなる群から選択される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＥＲＰＩＮＣ１遺伝子の発現を増加させることができる表５、表１４、表１５、または表１６からの化合物の有効量を対象に投与することによって、ＳＥＲＰＩＮＣ１欠損症を有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＥＲＰＩＮＣ１遺伝子の調節配列領域（ＲＳＲ）またはその一部分に関連する１つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表５、表１４、表１５、または表１６からの化合物の有効量を細胞に導入することによって、細胞中のＳＥＲＰＩＮＣ１遺伝子の発現を増加させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、ＯＳＩ−０２７、ＰＦ０４６９１５０２、ＣＰ−６７３４５１、エキノマイシン、及びパクリチニブ（ＳＢ１５１８）からなる群から選択される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＪＡＧ１遺伝子及び／またはＮＯＴＣＨ２遺伝子の発現を増加させることができる表６からの化合物の有効量を対象に投与することによって、アラジール症候群を有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＪＡＧ１遺伝子及び／またはＮＯＴＣＨ２遺伝子の調節配列領域（ＲＳＲ）またはその一部分に関連する１つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表６からの化合物の有効量を細胞に導入することによって、細胞中のＪＡＧ１遺伝子及び／またはＮＯＴＣＨ２遺伝子の発現を増加させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、メレスチニブ及びトルセトラピブからなる群から選択される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＬＣ３７Ａ４遺伝子の発現を増加させることができる表７からの化合物の有効量を対象に投与することによって、糖原病１ｂを有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＬＣ３７Ａ４遺伝子の調節配列領域（ＲＳＲ）またはその一部分に関連する１つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表７からの化合物の有効量を細胞に導入することによって、細胞中のＳＬＣ３７Ａ４遺伝子の発現を増加させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、エキノマイシン、プレドニゾン、ＣＰ−６７３４５１、及び塩化コバルトからなる群から選択される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＨＭＢＳ遺伝子の発現を増加させることができる表８からの化合物の有効量を対象に投与することによって、急性間欠性ポルフィリン症を有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＨＭＢＳ遺伝子の調節配列領域（ＲＳＲ）またはその一部分に関連する１つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表８からの化合物の有効量を細胞に導入することによって、細胞中のＨＭＢＳ遺伝子の発現を増加させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、ソトラスタウリンである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現を低減することができる表９からの化合物の有効量を対象に投与することによって、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスを有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＬＥＣＴ２遺伝子の調節配列領域（ＲＳＲ）またはその一部分に関連する１つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表９からの化合物の有効量を細胞に導入することによって、細胞中のＬＥＣＴ２遺伝子の発現を低減する方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、カルシトロール、１７−ＡＡＧ、及びリタオナビル（Ｒｉｔａｏｎａｖｉｒ）からなる群から選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＡＰＯＬ１遺伝子の発現を低減することができる表１０または表１６からの化合物の有効量を対象に投与することによって、ＡＰＯＬ１関連糸球体疾患を有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＡＰＯＬ１遺伝子の調節配列領域（ＲＳＲ）またはその一部分に関連する１つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表１０または表１６からの化合物の有効量を細胞に導入することによって、細胞中のＡＰＯＬ１遺伝子の発現を低減する方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、ニトロフラントイン、クリゾチニブ、モメロテニブ（Ｍｏｍｅｌｏｔｅｎｉｂ）、及びモメロテニブ代謝産物Ｍ２１からなる群から選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子の発現を増加させることができる表１１からの化合物の有効量を対象に投与することによって、ジルベール症候群またはクリグラーナジャーＩＩ型を有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子の調節配列領域（ＲＳＲ）またはその一部分に関連する１つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表１１からの化合物の有効量を細胞に導入することによって、細胞中のＵＧＴ１Ａ１遺伝子の発現を増加させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、ＦＩＣＺ、カルトゲニン、ｍｅＢＩＯ、ＣＰ−６７３４５１、ＢＡＭ７、及びＥＷ−７１９７からなる群から選択される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＬＤＬＲ遺伝子の発現を増加させることならびに／あるいはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子及び／またはＰＣＳＫ９遺伝子の発現を低減することができる表１２または表１３からの化合物の有効量を対象に投与することによって、脂質異常症を有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＡＮＧＰＴＬ３、ＬＤＬＲ、またはＰＣＳＫ９遺伝子の調節配列領域（ＲＳＲ）またはその一部分に関連する１つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる表１２または表１３からの化合物の有効量を細胞に導入することによって、細胞中のＡＮＧＰＴＬ３、ＬＤＬＲ、及びＰＣＳＫ９遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を調整する方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、ＷＹＥ−１２５１３２、ピフィスリン−ｕ、ＬＹ２９４００２、ＳＧＩ−１７７６、プレラデナント、及びＣＯ−１６８６からなる群から選択される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭＥＣＰ２遺伝子の発現を増加させることができる表１５からの化合物の有効量を対象に投与する工程を含む、レット症候群を有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＭＥＣＰ２遺伝子の発現を増加させることができる表１５からの化合物の有効量を対象に投与する工程を含む、レット症候群を有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、１７−ＡＡＧである。
【００１７】
ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
前述のならびに他の目的、特徴、及び利点は、付属の図面において図示されるように、本開示の特定の実施形態の以下の説明から明らかになるであろう。図面は、必ずしも原寸であるとは限らず、代わりに、本開示の様々な実施形態の原理を示すことに重点が置かれている。
【００１９】
【図１】核中の染色体のパッケージング、染色体が組織化される局在性位相ドメイン、ＴＡＤ中の絶縁近傍、及び最後に特定の疾患遺伝子の周りのシグナル伝達中心（複数可）の配置の例を示す。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは、絶縁近傍のＣＴＣＦ境界の線形及び３Ｄ配置を示す。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、直列絶縁近傍及びそのような絶縁近傍に形成された遺伝子ループを示す。
【図４】より大きな絶縁近傍内に含まれる絶縁近傍の概念、及び各々において起こり得るシグナル伝達を示す。
【図５】転写因子、シグナル伝達タンパク質、及び／またはクロマチン調節因子を含む、シグナル伝達中心の構成成分を示す。
【図６】ＨＵ４２８２一次ヒト肝細胞中のｓｉＲＮＡによる７２時間のｍＴＯＲ阻害後の、ＰＰＩＡと比較したＳＥＲＰＩＮＣ１  ｍＲＮＡの倍率変化の増加を示す。
【図７】ＤＭＳＯ対照と比較した、ＨＵ４２８２一次ヒト肝細胞中の化合物３０８（ＯＳＩ−０２７）及び化合物３０９（ＰＦ０４６９１５０２）での７２時間の処理後の、ＳＥＲＰＩＮＣ１  ｍＲＮＡの用量依存的倍率変化の増加を示す。
【図８】１０μＭの１７−ＡＡＧでの処理後のマウス肝細胞中のＭＥＣＰ２  ｍＲＮＡの倍率変化の増加を示す。
【図９】１０μＭの１７−ＡＡＧでの処理後のマウス肝臓におけるＭＥＣＰ２  ｍＲＮＡの倍率変化の増加を示す。
【図１０Ａ】ドナー１から単離された肝細胞からの、指示された投与量の１７−ＡＡＧまたはＤＭＳＯでの処理後のヒト肝細胞中のＭＥＣＰ２  ｍＲＮＡの倍率変化の増加を示す。
【図１０Ｂ】ドナー２から単離された肝細胞からの、指示された投与量の１７−ＡＡＧまたはＤＭＳＯでの処理後のヒト肝細胞中のＭＥＣＰ２  ｍＲＮＡの倍率変化の増加を示す。
【図１１】３．３ｕＭのモメロチニブまたはＤＭＳＯでの処理後の一次ヒト肝細胞中のＡＰＯＬ１  ｍＲＮＡの倍率変化を示す。
【図１２】３．３ｕＭのモメロチニブ（ＭＭＢ）、Ｍ２１モメロチニブ代謝産物（Ｍ２１）、またはＤＭＳＯでの処理後の一次ヒト肝細胞中のＡＰＯＬ１  ｍＲＮＡの倍率変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
I．導入及び定義
本開示は、ヒトにおける、フィブロネクチン腎症、遺伝性コプロポルフィリン症などの遺伝性疾患の治療のための組成物及び方法を提供する。具体的には、本開示は、ＦＮ１、ＣＰＯＸなどの疾患関連遺伝子（複数可）の調整のための化合物及び関連する使用を提供する。
【００２１】
本開示はまた、遺伝子シグナル伝達ネットワーク（ＧＳＮ）の変更、摂動、及び最終的な調節制御を包含する。そのような遺伝子シグナル伝達ネットワークは、生物系のゲノムの絶縁近傍内で見出されるゲノムシグナル伝達中心を含む。遺伝子発現を調整する化合物は、１つ以上の遺伝子シグナル伝達ネットワークを調整することによって作用し得る。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「遺伝子シグナル伝達ネットワーク」または「ＧＳＮ」は、特定の遺伝子、例えば、遺伝子中心ネットワークからのシグナル伝達事象のうちのいずれかまたは全てに関連する生体分子のセットを含む。ヒトゲノム中に２０，０００を超えるタンパク質コード遺伝子が存在するため、少なくともこの多くの遺伝子シグナル伝達ネットワークが存在する。またいくつかの遺伝子が非コード遺伝子である範囲で、数は大幅に増加する。遺伝子シグナル伝達ネットワークは、標準タンパク質カスケード及びフィードバックループとしてマップされる正準シグナル伝達経路とは異なる。
【００２３】
伝統的に、シグナル伝達経路は、標準生化学技法を使用して特定され、大部分は、カスケード中の次のタンパク質生成物により駆動される事象をシグナル伝達する１つのタンパク質生成物を有する線形カスケードである。これらの経路は、二股に分かれ得るか、またはフィードバックループを有し得るが、焦点は、もっぱらタンパク質レベルに置かれている。
【００２４】
本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワーク（ＧＳＮ）は、タンパク質コード及び非タンパク質コードシグナル伝達分子、ゲノム構造、染色体占有率、染色体リモデリング、生物系の状態、ならびにそのような遺伝子シグナル伝達ネットワークを含む任意の生物系の摂動に関連する成果の範囲を考慮して、生物学的シグナル伝達を定義するための異なるパラダイムを表す。
【００２５】
ゲノムアーキテクチャは、静的ではないが、本開示のＧＳＮのフレームワークを定義することにおいて重要な役割を果たす。そのようなアーキテクチャは、染色体組織化及び修飾の概念、位相関連ドメイン（ＴＡＤ）、絶縁近傍（ＩＮ）、ゲノムシグナル伝達中心（ＧＳＣ）、シグナル伝達分子及びそれらの結合モチーフまたは部位、ならびに当然のことながら、ゲノムアーキテクチャ内でエンコードされる遺伝子を含む。
【００２６】
「絶縁近傍」（ＩＮ）という用語は、本明細書で使用される場合、コヒーシンによって共占有されるＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）を含み、絶縁近傍中の遺伝子ならびに絶縁近傍の近位にある遺伝子の発現に影響を及ぼし得る、染色体配列中の２つの相互作用部位のルーピングによって形成される染色体構造を指す。
【００２７】
「ゲノムシグナル伝達中心」、すなわち「シグナル伝達中心」という用語は、本明細書で使用される場合、その絶縁近傍内または複数の絶縁近傍中の遺伝子の調節に関与するシグナル伝達分子／シグナル伝達タンパク質の状況特異的複合アセンブリに結合することができる領域を含む絶縁近傍内の領域を指す。
【００２８】
本開示は、疾患関連標的遺伝子（複数可）に関連するＧＳＮの結合性のより決定的なセットを明確化することによって、フィブロネクチン腎症、遺伝性コプロポルフィリン症などの遺伝性疾患に対処するための微調整された機構を提供する。
【００２９】
ゲノムアーキテクチャ
細胞は、細胞シグナル伝達をゲノムのアーキテクチャに結合する数千のエレメントを使用して遺伝子発現を制御する。ゲノムシステムアーキテクチャは、ＤＮＡ、ＲＮＡ転写物、クロマチンリモデラー、及びシグナル伝達分子を含む。
【００３０】
染色体
染色体は、ヒトのＤＮＡの大部分を含むゲノムアーキテクチャの最大サブユニットである。特定の染色体構造は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｎｉｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １６７，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １７，２０１６に記載されるように、遺伝子対照において重要な役割を果たすことが観察された。イントロン（「非コード領域」）は、タンパク質結合部位及び他の調節構造を提供するが、エクソンは、非コード領域と相互作用して遺伝子発現を調節する転写因子などのシグナル伝達分子をエンコードする。染色体上の非コード領域内のＤＮＡ部位はまた、互いに相互作用して、ループ状構造を形成する。これらの相互作用は、発達を通して保存され、遺伝子活性化及び抑制において重要な役割を果たす染色体足場を形成する。相互作用は、染色体間でめったに起こらず、通常は染色体の同じドメイン内に存在する。
【００３１】
原位置ハイブリダイゼーション技法及び顕微鏡は、個々の相間染色体が、核の小部分を占有する傾向があり、この細胞小器官全体に広がらないことを明らかにした。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｒｅｍｅｒ  ａｎｄ  Ｃｒｅｍｅｒ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２，ａ００３８８９，２０１０を参照されたい。この小さい表面積の占有は、染色体間の相互作用を低減し得る。
【００３２】
位相関連ドメイン（ＴＡＤ）
「位相関連ドメイン」（ＴＡＤ）という用語は、本明細書で使用される場合、染色体のモジュラー組織化を表し、異なる細胞型の生物によって共有される境界を有する構造を指す。位相関連ドメイン（ＴＡＤ）（あるいは位相ドメインとしても知られる）は、哺乳類染色体構造のサブユニットである階層ユニットである。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８５（７３９８）：３７６−８０，２０１２、Ｆｉｌｉｐｐｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：１４，２０１４、Ｇｉｂｃｕｓ  ａｎｄ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，４９（５）：７７３−８２，２０１３、Ｎａｕｍｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，４２（６１６１）：９４８−５３，２０１３を参照されたい。ＴＡＤは、遺伝子及び調節エレメントが生産的ＤＮＡ−ＤＮＡ接触を成すのを可能にする微小環境を画定する、メガベースサイズの染色体領域である。ＴＡＤは、ＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用頻度によって定義される。ＴＡＤの境界は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８５（７３９８）：３７６−８０，２０１２、Ｎｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８５（７３９８）：３８１−５，２０１２に記載されるように、比較的少ないＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用が起こる領域からなる。ＴＡＤは、遺伝子発現調節因子として機能する構造的染色体ユニットを表す。
【００３３】
ＴＡＤは、約７つ以上のタンパク質コード遺伝子を含有し、異なる細胞型によって共有される境界を有し得る。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｍａｌｌｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５（３）：３８７−９４，２０１３を参照されたい。単一ＴＡＤ内の遺伝子の発現は通常相関しているため、いくつかのＴＡＤは、活性遺伝子を含有し、他のものは抑制された遺伝子を含有する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃａｖａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０（３）：２９０−９，２０１３を参照されたい。ＴＡＤ内の配列は、互いを高頻度で見出し、一致したＴＡＤワイドヒストンクロマチンシグネチャー、発現レベル、ＤＮＡ複製タイミング、ラミナ会合、及び染色中心会合を有する。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８５（７３９８）：３７６−８０，２０１２、Ｌｅ  Ｄｉｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２８：２１５１−６２，２０１４、Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８５（７３９８）：３７６−８０，２０１２、Ｗｉｊｃｈｅｒｓ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：９５８−６９，２０１５を参照されたい。
【００３４】
ＴＡＤ内の遺伝子ループ及び他の構造は、転写因子（ＴＦ）、コヒーシン、及び１１−ジンクフィンガータンパク質（ＣＴＣＦ）、転写リプレッサーの活性に影響を及ぼす。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂａｒａｎｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１１１（３）：８８９−９，２０１４を参照されたい。ＴＡＤ内の構造は、エンハンサー結合ＴＦが、順にプロモーター部位においてＲＮＡポリメラーゼＩＩに結合する共因子、例えば、メディエーターに結合したときに産生されるコヒーシン関連エンハンサー・プロモーターループを含む。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｃｅｌｌ，１５２（６）：１２３７−５１，２０１３、Ｌｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｒｏｅｄｅｒ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４６：４３−６８，２００５、Ｓｐｉｔｚ  ａｎｄ  Ｆｕｒｌｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３（９）：６１３−２６，２０１２、Ｄｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５９（２）：３７４−３８７，２０１４、Ｌｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４６：４３−６８，２０１２を参照されたい。コヒーシン負荷因子Ｎｉｐｐｅｄ−Ｂ様タンパク質（ＮＩＰＢＬ）は、メディエーターに結合し、これらのエンハンサー・プロモーターループにおいてコヒーシンを負荷する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋａｇｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４６７（７３１４）：４３０−５，２０１０を参照されたい。
【００３５】
ＴＡＤは、調べた全てのヒト細胞型において同様の境界を有し、エンハンサー・遺伝子相互作用を拘束する。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５１８：３３１−３３６，２０１５、Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８５：３７６−３８０，２０１２を参照されたい。ゲノムのこのアーキテクチャは、なぜ大部分のＤＮＡ接触がＴＡＤ内で起こり、エンハンサー・遺伝子相互作用が染色体間でめったに起こらないかを説明するのを助ける。しかしながら、ＴＡＤは、ＴＡＤ内で特定のエンハンサー・遺伝子相互作用に影響を及ぼす分子機構に対する部分的な洞察を提供するにすぎない。
【００３６】
長期のゲノム接触は、ＴＡＤを活性区画と非活性区画とに分離する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ−Ａｉｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２６：２８９−９３，２００９を参照されたい。ＴＡＤ境界の間に形成されたループは、特定の配列対の間に安定して再現性よく形成された最長範囲の接触を表すと思われる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８５（７３９８）：３７６−８０，２０１２を参照されたい。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本開示の方法を使用して、ＴＡＤ中に位置する遺伝子からの遺伝子発現を変更する。いくつかの実施形態では、ＴＡＤ領域を修飾して、本明細書に定義されるように、または本明細書に記載される方法を使用して定義可能であるように、非正準経路の遺伝子発現を変更する。
【００３８】
絶縁近傍
本明細書に記載される場合、「絶縁近傍」（ＩＮ）は、染色体配列中の２つの相互作用部位のルーピングによって形成された染色体構造として特定される。これらの相互作用部位は、ＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）を含み得る。これらのＣＴＣＦ部位は、多くの場合、コヒーシンによって共占有される。これらのコヒーシン関連染色体構造の完全性は、絶縁近傍中の遺伝子ならびに絶縁近傍の近位にある遺伝子の発現に影響する。「近傍遺伝子」は、絶縁近傍内に位置する遺伝子である。近傍遺伝子は、コードまたは非コードであり得る。
【００３９】
絶縁近傍アーキテクチャは、一緒になって直接または間接的にＤＮＡループを形成する少なくとも２つの境界によって定義される。任意の絶縁近傍の境界は、一次上流境界及び一次下流境界を含む。そのような境界は、任意の絶縁近傍の最も外側の境界である。しかしながら、任意の絶縁近傍ループ内では、二次ループが形成され得る。そのような二次ループは、存在する場合、一次絶縁近傍に対して、二次上流境界及び二次下流境界によって定義される。一次絶縁近傍が複数の内部ループを含有する場合、ループは、一次ループの一次上流境界に対して、例えば、二次ループ（一次ループ内の第１のループ）、三次ループ（一次ループ内の第２のループ）、四次ループ（一次ループ内の第３のループ）などと付番される。
【００４０】
絶縁近傍は、位相関連ドメイン（ＴＡＤ）及び他の遺伝子ループ内に位置し得る。ＴＡＤは、ＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用頻度によって定義され、平均０．８Ｍｂであり、およそ７タンパク質コード遺伝子を含有し、生物の異なる細胞型によって共有される境界を有する。Ｄｏｗｅｎによれば、ＴＡＤ内の遺伝子の発現は、ある程度相関しており、したがっていくつかのＴＡＤは活性遺伝子を有する傾向があり、他のものは抑制された遺伝子を有する傾向がある。Ｄｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１４  Ｏｃｔ  ９；１５９（２）：３７４−３８７。
【００４１】
絶縁近傍は、染色体に沿って連続した実体として存在し得るか、または非絶縁近傍配列領域によって分離され得る。絶縁近傍は、ＤＮＡルーピング領域が接合された場合にのみ定義されるように線形に重複し得る。絶縁近傍は、３〜１２遺伝子を含み得るが、それらは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３またはそれ以上の遺伝子を含有し得る。
【００４２】
「最小絶縁近傍」は、少なくとも１つの近傍遺伝子、ならびにプロモーター及び／またはエンハンサー及び／またはリプレッサー領域など、近傍遺伝子の発現もしくは抑制を促進する、関連した調節配列領域（複数可）（ＲＳＲ）を有する絶縁近傍である。調節配列領域は、絶縁近傍境界と一致またはさらには重複し得ることが企図される。本明細書で使用される場合、調節配列領域としては、限定されないが、染色体に沿った領域、区分、部位または区域が挙げられ、それによって近傍遺伝子の発現を変更するために、シグナル伝達分子との相互作用が起こる。本明細書で使用される場合、「シグナル伝達分子」は、タンパク質、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、有機小分子、脂質、糖または他の分子にかかわらず、染色体上の調節配列領域と直接または間接的に相互作用する、任意の実態である。調節配列領域（ＲＳＲ）はまた、「ゲノムシグナル伝達中心」または「ＧＳＣ」とも称され得る。
【００４３】
特殊化シグナル伝達分子の１つのカテゴリーは、転写因子である。「転写因子」は、標的遺伝子、例えば、近傍遺伝子の転写を増加するかまたは減少するかにかかわらず変更するシグナル伝達分子である。
【００４４】
本開示に従い、近傍遺伝子は、染色体に沿って任意の数の上流または下流遺伝子を有し得る。任意の絶縁近傍内に、一次近傍遺伝子に対する１つ以上、例えば、１、２、３、４またはそれ以上の上流及び／または下流近傍遺伝子が存在し得る。「一次近傍遺伝子」は、染色体に沿った特定の絶縁近傍内で最も一般に見出される遺伝子である。一次近傍遺伝子の上流近傍遺伝子は、一次近傍遺伝子と同じ絶縁近傍内に位置し得る。一次近傍遺伝子の下流近傍遺伝子は、一次近傍遺伝子と同じ絶縁近傍内に位置し得る。
【００４５】
本開示は、遺伝子または遺伝子変異体の浸透度を変更する方法を提供する。本明細書で使用される場合、「浸透度」は、その変異体遺伝子の関連した特性（表現型）も呈する遺伝子の特定の変異体（例えば、野生型であるか否かにかかわらず、突然変異、対立遺伝子または一般遺伝子型）を担持する個体の割合である。いくつかの疾患の状況において、疾患を引き起こす突然変異の浸透度は、臨床症状を呈する突然変異を有する個体の割合として測定した。結果として、任意の遺伝子または遺伝子変異体の浸透度は、連続体上に存在する。
【００４６】
絶縁近傍は、同じ制御機構下で遺伝子をグループ分けする機能的単位であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５９：３７４−３８７（２０１４）に記載されている。絶縁近傍は、図１に示されるＴＡＤなどの、より高次の染色体構造の機構的背景を提供する。絶縁近傍は、図１に示されるコヒーシンによって共占有される２つの相互作用するＣＴＣＦ部位のルーピングによって形成された染色体構造である。これらの構造の完全性は、局所遺伝子の適切な発現に重要である。一般に、１〜１０の遺伝子は、各遺伝子内に３つの遺伝子の中央値を有する各近傍においてクラスター化される。同じ絶縁近傍によって制御される遺伝子は、ＤＮＡの二次元図から容易に明らかではない。ヒトにおいて、中央サイズが１８６ｋｂである２５ｋｂ〜９４０ｋｂのサイズ範囲内に約１３，８０１の絶縁近傍が存在する。絶縁近傍は、異なる細胞型の間で保存される。より大きなＩＮ内で発生するより小さなＩＮは、ネスト絶縁近傍（ＮＩＮ）と称される。ＴＡＤは、単一のＩＮからなり得るか、または図２Ｂに示されるように１つのＩＮ及び１つのＮＩＮ及び２つのＮＩＮからなり得る。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「境界」という用語は、特徴、エレメント、または特性が終了または開始する場所を示す点、限界、または範囲を指す。したがって、「絶縁近傍境界」は、染色体上の絶縁近傍の範囲を定める境界を指す。本開示に従い、絶縁近傍は、少なくとも２つの絶縁近傍境界、一次上流境界及び一次下流境界によって定義される。「一次上流境界」は、一次近傍遺伝子の上流に位置する絶縁近傍境界を指す。「一次下流境界」は、一次近傍遺伝子の下流に位置する絶縁近傍境界を指す。同様に、図２Ｂに示されるように二次ループが存在する場合、それらは、二次上流境界及び下流境界によって定義される。「二次上流境界」は、一次絶縁近傍内の二次ループの上流境界であり、「二次下流境界」は、一次絶縁近傍内の二次ループの下流境界である。二次境界の方向性は、一次絶縁近傍の方向性に従う。
【００４８】
絶縁近傍境界の構成成分は、２つの境界のルーピングを容易にするアンカー領域及び関連因子（例えば、ＣＴＣＦ、コヒーシン）においてＤＮＡ配列を含み得る。アンカー領域におけるＤＮＡ配列は、少なくとも１つのＣＴＣＦ結合部位を含み得る。ＣｈＩＰ−ｅｘｏ技法を使用する実験は、４つのＣＴＣＦ結合モジュールを含有する５２ｂｐのＣＴＣＦ結合モチーフを明らかにした（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｏｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｒｃｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：２８３−２９３，２０１１の図１を参照）。絶縁近傍境界におけるＤＮＡ配列は、絶縁体を含有し得る。場合によっては、絶縁近傍境界はまた、エンハンサー・プロモーター相互作用部位などの調節配列領域と一致または重複し得る。
【００４９】
本開示のいくつかの実施形態では、絶縁近傍境界の崩壊または変更は、境界における特定のＤＮＡ配列（例えば、ＣＴＣＦ結合部位）を変更することによって達成され得る。例えば、絶縁近傍境界における既存のＣＴＣＦ結合部位は、欠失、突然変異、または逆転され得る。代替として、新たなＣＴＣＦ結合部位は、新たな絶縁近傍を形成するために導入され得る。他の実施形態では、絶縁近傍境界の崩壊または変更は、境界におけるヒストン修飾（例えば、メチル化、脱メチル化）を変更することによって達成され得る。他の実施形態では、絶縁近傍境界の崩壊または変更は、境界へのＣＴＣＦ及び／またはコヒーシンの結合を変更（例えば、ブロッキング）することによって達成され得る。絶縁近傍境界が調節配列領域と一致または重複する場合、絶縁近傍境界の崩壊または変更は、調節配列領域（ＲＳＲ）またはＲＳＲ関連シグナル伝達分子の結合を変更することによって達成され得る。
【００５０】
絶縁近傍からの発現を制御する：シグナル伝達中心
歴史的に、「シグナル伝達中心」という用語は、細胞環境の変化に反応する細胞の群を説明するために使用されている。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｕｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７２：１１５−１２５（１９９５）を参照されたい。同様に、「シグナル伝達中心」という用語は、本明細書で使用される場合、シグナル伝達タンパク質またはシグナル伝達分子（例えば、転写因子）などの定義された生体分子のセットと相互作用して、遺伝子発現を状況特異的な方法で調節する生存生物の定義された領域を指す。
【００５１】
シグナル伝達中心は、絶縁近傍の活性を調節することが発見された。これらの領域は、ヒトゲノム中でどの遺伝子が発現されるか、及び発現のレベルを制御する。シグナル伝達中心の構造的完全性の喪失は、遺伝子発現の脱調節の一因となり、潜在的に疾患を引き起こす。
【００５２】
シグナル伝達中心は、転写因子の高度に状況特異的な複合アセンブリによって結合されたエンハンサーを含む。これらの因子は、細胞シグナル伝達を通して部位に動員される。シグナル伝達中心は、相互作用して三次元転写因子ハブマクロ複合体を形成する複数の遺伝子を含む。シグナル伝達中心は、一般に、生物学的機能によって組織化されたループ中の１〜４遺伝子に関連している。
【００５３】
各シグナル伝達中心の組成物は、転写因子のアセンブリ、転写装置、及びクロマチン調節因子を含む固有の組成物を有する。シグナル伝達中心は、高度に状況特異的であり、シグナル伝達経路を標的とすることによって薬物が反応を制御できるようにする。
【００５４】
複数のシグナル伝達中心は、相互作用して、同じ絶縁近傍内で異なる遺伝子の組み合わせを制御することができる。
【００５５】
シグナル伝達分子の結合部位
シグナル伝達分子について、一連のコンセンサス結合部位、または結合部位の結合モチーフは、本発明者によって特定された。これらのコンセンサス配列は、シグナル伝達分子の、または１つ以上のシグナル伝達分子を含む複合体の染色体、遺伝子、またはポリヌクレオチドに沿った結合部位を反映する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、結合部位は、複数のシグナル伝達分子または分子の複合体に関連している。
【００５７】
エンハンサー
「エンハンサー」という用語は、本明細書で使用される場合、転写因子によって結合されたときに、関連遺伝子の転写を強化する調節ＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、ヒトにおける細胞型特異的遺伝子発現プログラムを制御する遺伝子調節エレメントである。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｕｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｗｙｓｏｃｋａ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ＴＩＧ  ２８，２７６−２８４，２０１２、Ｈｅｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６：１４４−１５４，２０１５、Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５７：１３−２５，２０１４、Ｏｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｒｃｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：２８３−２９３，２０１１、Ｒｅｎ  ａｎｄ  Ｙｕｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｓｙｍｐｏｓｉａ  ｏｎ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ，８０：１７−２６，２０１５を参照されたい。エンハンサーは、一般に数百塩基対の長さであり、共活性化因子及びＲＮＡポリメラーゼＩＩを動員して遺伝子を標的とする複数の転写因子によって占有されるＤＮＡのセグメントである。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｕｌｇｅｒ  ａｎｄ  Ｇｒｏｕｄｉｎｅ，Ｃｅｌｌ，１４４：３２７−３３９，２０１１、Ｓｐｉｔｚ  ａｎｄ  Ｆｕｒｌｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３：６１３−６２６，２０１２、Ｔｊｉａｎ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｅｌｌ，７７：５−８，１９９４を参照されたい。ＤＮＡのこれらの領域から転写されたエンハンサーＲＮＡ分子はまた、ＤＮＡ及びＲＮＡに結合することができる転写因子を「捕捉」する。複数のエンハンサーを有する領域は、「スーパーエンハンサー」である。「スーパーエンハンサー」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞同一性を定義する遺伝子の発現を駆動する転写エンハンサーのクラスターを指す。
【００５８】
絶縁近傍は、正常な遺伝子の活性化及び抑制の両方に極めて重要な特定のエンハンサー・遺伝子相互作用のための微小環境を提供する。転写エンハンサーは、２０，０００を超えるタンパク質コード遺伝子を制御して、全てのヒト細胞中の細胞型特異的遺伝子発現プログラムを維持する。数万のエンハンサーが、任意の所与のヒト細胞型で活性であると推定される。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、ＥＮＣＯＤＥ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８９，５７−７４，２０１２、Ｒｏａｄｍａｐ  Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５１８，３１７−３３０，２０１５を参照されたい。エンハンサー及びそれらの関連因子は、これらの遺伝子のプロモーターにルーピングすることによって、上流または下流に位置する遺伝子の発現を調節し得る。細胞識別子の転写制御と染色体構造の制御との間の関係に関する洞察を得るために実行されたコヒーシンＣｈＩＡ−ＰＥＴ研究は、スーパーエンハンサー及びそれらの関連遺伝子の大部分が、コヒーシンによって共占有されたＣＴＣＦ部位と相互作用することによって接続された大きなループ内で起こることを明らかにする。そのようなスーパーエンハンサードメイン（ＳＤ）は、通常、ＳＤ内の１つの遺伝子に対してループする１つのスーパーエンハンサーを含有し、ＳＤは、ＳＤ内の遺伝子に対するスーパーエンハンサー活性を制限すると思われる。絶縁近傍中のスーパーエンハンサー及びそれらの標的遺伝子の正しい会合は、単一スーパーエンハンサーの誤標的が、疾患を引き起こすのに十分であるため、極めて重要である。Ｇｒｏｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５７（２）：３６９−８１，２０１４を参照されたい。
【００５９】
疾患関連非コード変化の大部分は、エンハンサーの近位で起こり、したがってこれらのエンハンサー標的遺伝子に影響を及ぼし得る。したがって、エンハンサーに対する特異性を付与する特徴を解読することは、調整性遺伝子発現に重要である。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｅｒｎｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７３，４３−４９，２０１１、Ｆａｒｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５１８，３３７−３４３，２０１５、Ｈｎｉｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５５，９３４−９４７，２０１３、Ｍａｕｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，１１９０−１１９５，２０１２を参照されたい。研究は、エンハンサー・遺伝子相互作用の特異性の一部が、エンハンサーにおけるＤＮＡ結合転写因子と、プロモーターにおける特定のパートナー転写因子との相互作用に起因し得ることを示唆する。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｕｔｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｄｏｎａｇａ，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１５，２５１５−２５１９，２００１、Ｃｈｏｉ  ａｎｄ  Ｅｎｇｅｌ，Ｃｅｌｌ，５５，１７−２６，１９８８、Ｏｈｔｓｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２，５４７−５５６，１９９８を参照されたい。エンハンサー中及びプロモーター近位領域中のＤＮＡ配列は、単一細胞中で発現される様々な転写因子に結合する。これら２つの部位において結合される多様な因子は、大きな共因子複合体と相互作用し、互いに相互作用してエンハンサー・遺伝子特異性をもたらす。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｚａｂｉｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５１８：５５６−５５９，２０１５を参照されたい。
【００６０】
いくつかの実施形態では、エンハンサー領域を標的化して、遺伝子シグナル伝達ネットワーク（ＧＳＮ）を変更または明確化することができる。
【００６１】
絶縁体
「絶縁体」という用語は、本明細書で使用される場合、エンハンサーが、それらの間に位置しているときに遺伝子を活性化する能力をブロックし、特定のエンハンサー・遺伝子相互作用に寄与する調節エレメントを指す。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７４：５０５−５１４，１９９３、Ｇｅｙｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏｒｃｅｓ，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ６：１８６５−１８７３，１９９２、Ｋｅｌｌｕｍ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｄｌ，Ｃｅｌｌ  ６４：９４１−９５０，１９９１、Ｕｄｖａｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １８５：３４１−３５８，１９８５を参照されたい。絶縁体は、転写因子ＣＴＣＦによって結合されるが、全てのＣＴＣＦ部位が絶縁体として機能するとは限らない。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９８：３８７−３９６，１９９９、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３：１９８−２０３，２０１５を参照されたい。絶縁体として機能するＣＴＣＦ部位のサブセットを区別する特徴は、以前に理解されていない。
【００６２】
エンハンサー、プロモーター及び絶縁体に結合するタンパク質のゲノムワイドマップは、これらのエレメントの間で起こる物理的接触の知識とともに、特定のエンハンサー・遺伝子相互作用を生じる機構の理解に対するさらなる洞察を提供する。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｐｅｌｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４９０−５０３，２０１２、ＤｅＭａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３：１２２４−１２３４，２０１３、Ｄｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５９：３７４−３８７，２０１４、Ｆｕｌｌｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ６：１８６５−１８７３，２００９、Ｈａｎｄｏｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４３：６３０−６３８，２０１１、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ−Ｃｒｅｍｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５３：１２８１−１２９５，２０１３、Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １６３：１６１１−１６２７，２０１５を参照されたい。エンハンサー結合タンパク質は、それらがこれらのＣＴＣＦ−ＣＴＣＦループ内の遺伝子のみと相互作用する傾向があるように制約される。したがって、これらのループアンカーを形成するＣＴＣＦ部位のサブセットは、図２Ｂに示されるように、ループの外側のエンハンサー及び遺伝子から、ループ内のエンハンサー及び遺伝子を絶縁するように機能する。いくつかの実施形態では、絶縁体領域は、遺伝子シグナル伝達ネットワーク（ＧＳＮ）を変更または明確化するために標的され得る。
【００６３】
コヒーシン及びＣＴＣＦ関連ループ及びアンカー部位／領域
ＣＴＣＦ相互作用は、ループを形成する同じ染色体上の部位を結合し、それらは一般に、１Ｍｂ未満の長さである。転写は、ループ内及び外側の両方で起こるが、この転写の性質は、２つの領域間で異なる。研究は、エンハンサー関連転写が、ループ内でより顕著であることを示す。したがって、絶縁体状態は、ＣＴＣＦループアンカーにおいて特異的に富化される。したがって、ＣＴＣＦループは、遺伝子がループ内の中心に位置する傾向を有する遺伝子不良領域を包囲するか、またはＣＴＣＦループの外側の遺伝子密集領域を除外するかのいずれかである。ＣＴＣＦループは、それらの隣接領域に対して低減したエクソン密度を呈する。遺伝子オントロジー分析は、ＣＴＣＦループ内に位置する遺伝子が、刺激への反応のために、また細胞外血漿膜及び小嚢細胞局在のために富化されることを明らかにする。一方で、ループのちょうど外側の接する隣接領域内に存在する遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子と同様の発現パターンを呈する。すなわち、これらの遺伝子は、平均してループに包囲された遺伝子よりも高度に発現され、それらの発現パターンにおいてあまり細胞株特異的ではなく、細胞株にわたってそれらの発現レベルの変化が少ない。参照によりその全体が組み込まれる、Ｏｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１７：２５２，２０１６を参照されたい。
【００６４】
アンカー領域は、絶縁近傍の立体配座に影響を及ぼすＣＴＣＦの結合部位である。アンカー部位の欠失は、通常は転写的にサイレントである遺伝子の活性化をもたらし得、それによって疾患表現型をもたらす。実際に、体細胞突然変異は、発がん関連絶縁近傍のループアンカー部位において共通している。ループアンカー領域のＣＴＣＦ  ＤＮＡ結合モチーフは、がん細胞の最も変更されたヒト転写因子結合配列であることが観察された。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｎｉｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １６７，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １７，２０１６を参照されたい。
【００６５】
アンカー領域は、細胞発達中に大部分が維持され、特にヒト及び霊長類の生殖系において保存されることが観察された。実際に、アンカー領域のＤＮＡ配列は、絶縁近傍の一部ではないＣＴＣＦ結合部位よりもＣＴＣＦアンカー領域において保存される。したがって、コヒーシンをＣｈＩＡ−ＰＥＴの標的として使用して、両方の位置を特定することができる。
【００６６】
コヒーシンはまた、ゲノムのＣＴＣＦ結合領域と関連付けられ、これらのコヒーシン関連ＣＴＣＦ部位のうちのいくつかは、遺伝子活性化を促進するが、他のものは絶縁体として機能し得る。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８５（７３９８）：３７６−８０，２０１２、Ｐａｒｅｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３２（３）：４２２−３３，２００８、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ−Ｃｒｅｍｉｎｓ  ａｎｄ  Ｃｏｒｃｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，５０（４）：４６１−７４，２０１３）、Ｓｅｉｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３（１２）：２０６６−７７，２０１３、Ｗｅｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４５１（７１８０）：７９６−８０１，２００８）を参照されたい。コヒーシン及びＣＴＣＦは、ＴＡＤ内の大きなループ下部構造と関連付けられ、コヒーシン及びメディエーターは、ＣＴＣＦ結合領域内で形成するより小さいループ構造と関連付けられる。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、ｄｅ  Ｗｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５０１（７４６６）：２２７−３１，２０１３、Ｃｒｅｍｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５３（６）：１２８１−９５，２０１３、Ｓｏｆｕｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ，３２（２４）：３１１９−２９，２０１３を参照されたい。いくつかの実施形態では、コヒーシン及びＣＴＣＦ関連ループ及びアンカー部位／領域は、遺伝子シグナル伝達ネットワーク（ＧＳＮ）を変更または明確化するために標的され得る。
【００６７】
遺伝子変異体
シグナル伝達中心内の遺伝子変異は、例えば、Ｈｎｉｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １６７，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １７，２０１６に記載されているように、染色体上のタンパク質結合を崩壊させることによって疾患の一因となることが知られている。絶縁近傍の形成を干渉するＣＴＣＦアンカー領域の配列の変異は、遺伝子活性化及び抑制の脱調節をもたらすことが観察される。様々な遺伝的機構及び後成的機構によって引き起こされるＣＴＣＦ機能不全は、発病につながり得る。したがって、いくつかの実施形態では、１つ以上の前向きな治療結果をもたらすために、そのような変異体駆動型病因学と関連付けられる任意の１つ以上の遺伝子シグナル伝達ネットワーク（ＧＳＮ）を変更することが有益である。
【００６８】
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）
ほとんどの疾患関連ＳＮＰは、シグナル伝達中心の付近に位置する。例えば、ＳＮＰの９４．２％が、シグナル伝達中心を含む非コード領域中で発生する。いくつかの実施形態では、ＳＮＰは、１つ以上のＧＳＮからのシグナル伝達を研究及び／または変更するために変更される。
【００６９】
シグナル伝達分子
シグナル伝達分子は、正準であるか、または本明細書に定義される、もしくは本明細書に記載される方法を使用して定義可能である遺伝子シグナル伝達ネットワーク経路細胞かにかかわらず、細胞シグナル伝達経路において機能する任意のタンパク質を含む。転写因子は、シグナル伝達分子のサブセットである。シグナル伝達及びマスター転写因子のある特定の組み合わせをエンハンサー領域と関連付けて、遺伝子の発現に影響を及ぼす。マスター調節因子は、特定の組織中の転写因子を指向する。例えば、血液中では、ＧＡＴＡ転写因子が、Ｗｎｔ細胞シグナル伝達経路のＴＣＦ７Ｌ２を指向するマスター調節因子である。肝臓中では、ＨＮＧ４が、系統組織及びパターンにおけるＳＭＡＤを指向するマスター調節因子である。
【００７０】
転写調節は、所与の遺伝子がどのくらいの頻度で転写されるかを制御するのを可能にする。転写因子は、転写開始の条件を多少好ましいものにすることによって転写物が産生される速度を変更する。転写因子は、シグナル伝達経路を選択的に変更し、これはシグナル伝達中心によって発現する遺伝子に影響を及ぼす。シグナル伝達中心は、転写調節因子の構成成分である。いくつかの実施形態では、シグナル伝達分子は、本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークのシグナル伝達を明確化または変更するために使用され、標的とされ得る。
【００７１】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．６２／５０１，７９５の表１８は、様々な細胞シグナル伝達経路において機能する転写因子（ＴＦ）及び／またはクロマチンリモデリング因子（ＣＲ）として作用するものを含む、シグナル伝達分子の一覧を提供する。本明細書に記載される方法を使用して、絶縁近傍内でエンコードされる一次近傍遺伝子の調節配列領域に関連する１つ以上のシグナル伝達分子の発現を阻害または活性化することができる。したがって、これらの方法は、未治療対照と比較して、治療剤による治療時に差次的に発現される１つ以上の一次近傍遺伝子のシグナル伝達シグネチャーを変更することができる。
【００７２】
転写因子
「転写因子」という用語は、本明細書で使用される場合、標的遺伝子、例えば、近傍遺伝子の転写を増加するかまたは減少するかにかかわらず変更するシグナル伝達分子である。転写因子は、一般に、エンハンサーに結合し、共活性化因子及びＲＮＡポリメラーゼＩＩを動員して遺伝子を標的とすることによって遺伝子発現を調節する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｗｈｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５３（２）：３０７−３１９，２０１３を参照されたい。転写因子は、「エンハンサー」に結合して、ゲノム全体に分散された調節エレメントに結合することによって細胞特異的転写プログラムを刺激する。
【００７３】
ヒトゲノム中に約１８００の既知の転写因子が存在する。リボソームＲＮＡ複合体などのタンパク質または核酸分子の結合部位を提供する染色体のＤＮＡ上にエピトープが存在する。マスター調節因子は、上記の細胞シグナル伝達及び下記のＤＮＡを通して転写因子の組み合わせを指向する。これらの特徴は、次のシグナル伝達中心の位置の決定を可能にする。いくつかの実施形態では、転写因子を使用するかまたは標的として、本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更または明確化することができる。
【００７４】
マスター転写因子
マスター転写因子は、細胞型特異的エンハンサーを結合及び確立する。マスター転写因子は、追加のシグナル伝達タンパク質、例えば他の転写因子をエンハンサーに動員して、シグナル伝達中心を形成する。２３３ヒト細胞型及び組織の候補マスターＴＦの地図は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｄ′Ａｌｅｓｓｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５，７６３−７７５（２０１５）に記載されている。いくつかの実施形態では、マスター転写因子を使用するかまたは標的として、本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更または明確化することができる。
【００７５】
シグナル伝達転写因子
シグナル伝達転写因子は、それらがそうすることを可能にするタンパク質ドメインを含むため、細胞間を移動するホメオタンパク質などの転写因子である。Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ、Ｈｏｘａ５、Ｈｏｘｂ４、Ｈｏｘｃ８、Ｅｍｘ１、Ｅｍｘ２、Ｏｔｘ２及びＰａｘ６などのホメオタンパク質は、シグナル伝達転写因子として作用することができる。ホメオタンパク質Ｅｎｇｒａｉｌｅｄは、他のホメオタンパク質において同様に存在すると考えられる内在化及び分泌シグナルを有する。この特性は、転写因子であることに加えて、ホメオタンパク質がシグナル伝達分子として作用するのを可能にする。ホメオタンパク質は、特徴付けられた細胞外機能を欠いており、それらのパラクリン標的が細胞内であるという認識につながる。ホメオタンパク質が転写、及び場合によっては翻訳を調節する能力は、パラクリン作用に影響を及ぼす可能性が最も高い。Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ  ａｎｄ  Ｊｏｌｉｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００３を参照されたい。いくつかの実施形態では、シグナル伝達転写因子を使用するかまたは標的として、本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更または明確化することができる。
【００７６】
クロマチン修飾
クロマチンリモデリングは、ヒストン修飾に関連する１０００を超えるタンパク質によって調節される。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１１２（１２）：３８４１−３８４６（２０１５）を参照されたい。クロマチン調節因子は、修飾されたヒストンでマークされたゲノム領域に関連する特定のタンパク質のセットである。例えば、ヒストンは、ある特定のリジン残基：Ｈ３Ｋ２０ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ２、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３、Ｈ３Ｋ９ｍｅ２、及びＨ３Ｋ９ｍｅ３において修飾され得る。ある特定のヒストン修飾は、シグナル伝達分子によって結合するために使用可能であるゲノムの領域をマークする。例えば、以前の研究は、活性エンハンサー領域がＨ３Ｋ２７ａｃを有するヌクレオソームを含み、活性プロモーターがＨ３Ｋ２７ａｃを有するヌクレオソームを含むことを観察した。さらに、転写された遺伝子は、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ２を有するヌクレオソームを含む。ＣｈＩＰ−ＭＳを実施して、特定のヒストン修飾に関連するクロマチン調節因子タンパク質を特定することができる。ある特定の修飾されたヒストンに特異的な抗体を有するＣｈＩＰ−ｓｅｑを使用して、シグナル伝達分子によって結合されたゲノムの領域を特定することもできる。いくつかの実施形態では、クロマチン修飾酵素またはタンパク質を使用するかまたは標的として、本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更または明確化することができる。
【００７７】
調節配列領域に由来するＲＮＡ
タンパク質コード遺伝子のエンハンサー、シグナル伝達中心、及びプロモーターなどの多くの活性調節配列領域（ＲＳＲ）は、非コードＲＮＡを産生することが知られている。活性調節配列領域またはその近位で産生される転写物は、付近の遺伝子の転写調節において実装されている。最近の報告は、エンハンサー関連ＲＮＡ（ｅＲＮＡ）が、エンハンサー活性の強力な指標であることを実証した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．２０１６  Ａｐｒ；１７（４）：２０７−２３を参照されたい）。さらに、活性調節配列領域からの非コードＲＮＡは、これらの領域への転写因子の結合を促進することに関与することが示されている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｉｇｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５  Ｎｏｖ  ２０；３５０（６２６３）：９７８−８１）。これは、そのようなＲＮＡが、シグナル伝達中心のアセンブリ及び近傍遺伝子の調節に重要であり得ることを示唆している。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の調節配列領域に由来するＲＮＡを使用するかまたは標的として、本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更または明確化することができる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、調節配列領域に由来するＲＮＡは、エンハンサー関連ＲＮＡ（ｅＲＮＡ）であり得る。いくつかの実施形態では、調節配列領域に由来するＲＮＡは、プロモーター関連ＲＮＡであり得、プロモーター上流転写（ＰＲＯＭＰＴ）、プロモーター関連長ＲＮＡ（ＰＡＬＲ）、及びプロモーター関連小ＲＮＡ（ＰＡＳＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる実施形態では、調節配列領域に由来するＲＮＡとしては、転写開始部位（ＴＳＳ）関連ＲＮＡ（ＴＳＳａ−ＲＮＡ）、転写開始ＲＮＡ（ｔｉＲＮＡ）、及びターミネーター関連小ＲＮＡ（ＴＡＳＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
いくつかの実施形態では、調節配列領域に由来するＲＮＡは、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）（すなわち、＞２００ヌクレオチド）であり得る。いくつかの実施形態では、調節配列領域に由来するＲＮＡは、中間非コードＲＮＡ（すなわち、約５０〜２００ヌクレオチド）であり得る。いくつかの実施形態では、調節配列領域に由来するＲＮＡは、短い非コードＲＮＡ（すなわち、約２０〜５０ヌクレオチド）であり得る。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法及び化合物によって調整され得るｅＲＮＡは、以下の特徴のうちの１つ以上を特徴とし得る。（１）ヒストン３のリジン４上の高レベルのモノメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ１）及びヒストン３のリジン４上の低レベルのトリメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）を有する領域から転写される、（２）ヒストン３のリジン２７上の高レベルのアセチル化（Ｈ３Ｋ２７ａｃ）を有するゲノム領域から転写される、（３）ヒストン３のリジン３６上の低レベルのトリメチル化（Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３）を有するゲノム領域から転写される、（４）ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）について富化されたゲノム領域から転写される、（５）ｐ３００共活性化因子などの転写共調節因子について富化されたゲノム領域から転写される、（６）低密度のＣｐＧ島を有するゲノム領域から転写される、（７）それらの転写がＰｏｌ  ＩＩ結合部位から開始され、二方向に伸長される、（８）ｅＲＮＡをエンコードする進化的に保存されたＤＮＡ配列、（９）短い半減期、（１０）低減レベルのスプライシング及びポリアデニル化、（１１）シグナル伝達時に動的に調節される、（１２）ｍＲＮＡ発現付近のレベルに正に相関する、（１３）極めて高い組織特異性、（１４）選好的に核及びクロマチン結合される、及び／または（１５）エキソソームによって分解される。
【００８１】
本明細書に記載される方法及び化合物によって調整され得るｅＲＮＡの非限定的な例としては、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｊｅｂａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１２  Ｓｅｐ  ６；４８９（７４１４）（例えば、図５ａに関する補足データファイル）及びＡｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１４  Ｍａｒ  ２７；５０７（７４９３）：４５５−４６１（例えば、補足的な表Ｓ３、Ｓ１２、Ｓ１３、Ｓ１５及び１６）に記載されるものが挙げられる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法または化合物によって調整され得るプロモーター関連ＲＮＡは、以下の特徴のうちの１つ以上を特徴とし得る。（１）高レベルのＨ３Ｋ４ｍｅ１及び低〜中レベルのＨ３Ｋ４ｍｅ３を有する領域から転写される、（２）高レベルのＨ３Ｋ２７ａｃを有するゲノム領域から転写される、（３）Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３を有しないか、または低レベルのＨ３Ｋ３６ｍｅ３を有するゲノム領域から転写される、（４）ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）について富化されたゲノム領域から転写される、（５）高密度のＣｐＧ島を有するゲノム領域から転写される、（６）それらの転写は、Ｐｏｌ  ＩＩ結合部位から開始され、センス鎖（すなわち、ｍＲＮＡ）から反対方向または二方向に伸長される、（７）短い半減期、（８）低減レベルのスプライシング及びポリアデニル化、（９）選好的に核結合及びクロマチン結合される、及び／または（１０）エキソソームによって分解される。
【００８３】
本明細書に記載される方法及び組成物を使用して、調節配列領域に由来するＲＮＡを調整して、本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更または明確化することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法及び化合物を使用して、調節配列領域に由来するＲＮＡの産生及び／または機能を阻害することができる。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどのハイブリダイジングオリゴヌクレオチドを使用して、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）もしくはＲＮａｓｅ  Ｈ媒介性切断を介して関心対象のＲＮＡの活性を阻害するか、またはＲＮＡへの様々なシグナル伝達分子の結合を物理的にブロックすることができる。例示的なハイブリダイジングオリゴヌクレオチドとしては、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．９，５１８，２６１及びＷＯ２０１４／０４０７４２に記載されるものを挙げることができる。ハイブリダイジングオリゴヌクレオチドは、化学的に修飾されたまたは未修飾のＲＮＡ、ＤＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはＲＮＡ及びＤＮＡの組み合わせ、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチドをエンコードする核酸ベクター、またはそのようなベクターを担持するウイルスとして提供され得る。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのゲノム編集ツールを使用して、ＲＮＡの転写を制御するか、またはＲＮＡ自体を分解する調節配列領域中の特定のＤＮＡエレメントを削除することができる。他の実施形態では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのゲノム編集ツールを使用して、調節配列領域中の特定のエレメントに結合し、関心対象のＲＮＡの転写をブロックすることができる。さらなる実施形態では、ブロモドメイン及び末端外ドメイン（ＢＥＴ）阻害剤（例えば、ＪＱ１、Ｉ−ＢＥＴ）を使用して、ＢＥＴタンパク質Ｂｒｄ４によるヒストンアセチル化の阻害を通してＲＮＡ転写を低減することができる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法及び化合物を使用して、調節配列領域に由来するＲＮＡの産生及び／または機能を増加させることができる。いくつかの実施形態では、関心対象のＲＮＡを模倣する外因性合成ＲＮＡは、細胞に導入され得る。合成ＲＮＡは、ＲＮＡ、ＲＮＡをエンコードする核酸ベクター、またはそのようなベクターを担持するウイルスとして提供され得る。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのゲノム編集ツールを使用して、外因性合成ＲＮＡを調節配列領域中の特定部位につなぐことができる。そのようなＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体のガイドＲＮＡに融合することができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、調節配列領域に由来するＲＮＡの調整は、標的遺伝子の発現を増加させる。いくつかの実施形態では、調節配列領域に由来するＲＮＡの調整は、標的遺伝子の発現を低減する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物によって調整されるＲＮＡとしては、肝臓細胞（例えば、肝細胞）中の標的遺伝子の調節配列領域に由来するＲＮＡが挙げられる。
【００８７】
ゲノム系の摂動
本明細書に記載される標的遺伝子に関連した遺伝子シグナル伝達ネットワーク（ＧＳＮ）、ゲノムシグナル伝達中心（ＧＳＣ）、及び／または絶縁近傍（ＩＮ）のうちの１つ以上の構成成分の挙動は、そのようなネットワーク、中心、及び／または近傍を含む系を摂動刺激と接触させることによって変更され得る。潜在的刺激としては、小分子、抗体、タンパク質、ペプチド、脂質、脂肪、核酸などの外因性生体分子、または放射線、ｐＨ、温度、イオン強度、音、光などの環境刺激を挙げることができる。
【００８８】
本開示は、より良く定義された遺伝子シグナル伝達ネットワーク（ＧＳＮ）の明確化だけでなく、結果として生物系に関するより良い理解のための発見ツールとして役立つ。本開示は、潜在的な治療成果の演繹的な予測、遺伝性疾患、障害、または病態の治療、毒性、不良な半減期、不良な生物学的利用能、有効性の欠失もしくは喪失、または薬物動態的もしくは薬力学的リスクなどの新たな薬物または既知の薬物に関連する１つ以上の治療不利益の低減または除去に関与したことがない新規の化合物または標的の特定を可能にする方法で、遺伝子レベルで遺伝子シグナル伝達を適切に定義する能力を可能にする。
【００８９】
正準細胞シグナル伝達経路の遺伝子発現を変更することによる疾患の治療は、有効であることが示されている。遺伝子発現の小さな変化でさえ、疾患に対して大きな影響を有し得る。例えば、細胞死抑制に影響を及ぼすシグナル伝達経路につながるシグナル伝達中心の変化が疾患に関連している。本開示は、ＧＳＮの結合性のより決定的なセットを明確化することによって、遺伝性疾患を含む疾患に対処するための微調整された機構を提供する。疾患を治療する方法は、その疾患に関連する遺伝子に関与するシグナル伝達中心を修飾することを含み得る。そのような遺伝子は、本明細書に記載される方法を使用して明確化されることを除いて、現在は疾患に関連していない場合がある。
【００９０】
摂動刺激は、小分子、既知の薬物、生物学的刺激、ワクチン、薬草調製物、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ及びアンチセンスオリゴヌクレオチド）、遺伝子もしくは細胞療法製品、または他の治療製品であり得る。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、摂動刺激を加えて、標的遺伝子に関連するＧＳＮ、ゲノムシグナル伝達中心、及び／または絶縁近傍を摂動させることを含む。標的遺伝子発現の変化を引き起こす摂動刺激は、関連したＧＳＮの結合性を通知し、関連疾患、障害または病態に対する潜在的な標的及び／または治療を提供することができる。
【００９２】
下流標的
ある特定の実施形態では、遺伝子シグナル伝達ネットワークの遺伝子の下流産生物を標的とする刺激が投与される。代替として、刺激は、少なくとも１つの下流標的の下流発現に影響を及ぼす遺伝子シグナル伝達ネットワークを崩壊させる。いくつかの実施形態では、遺伝子は、表１に列挙される遺伝子である。
【００９３】
ｍＲＮＡ
単一の絶縁近傍に関連する、または複数の絶縁近傍にわたる単一または複数の遺伝子シグナル伝達ネットワーク（ＧＳＮ）の摂動は、コヒーシンを含むアンカー部位の喪失に起因して、絶縁近傍の境界を変更することによって単一の遺伝子または複数の遺伝子セットの転写に影響を及ぼし得る。摂動刺激は、ＲＮＡ発現及び／またはｍＲＮＡ内の一次転写物中の配列、すなわち、エクソンもしくはスプライシングによって除去されるエクソン、すなわちイントロン間のＲＮＡ配列の修飾をもたらし得る。結果として、そのような変化は、遺伝子の遺伝子シグナル伝達ネットワーク内のシグナル伝達分子のセットのメンバーを変更することができ、それによって遺伝子シグナル伝達ネットワークの変異体を定義する。
【００９４】
タンパク質
単一の絶縁近傍に関連する、または複数の絶縁近傍にわたる単一または複数の遺伝子シグナル伝達ネットワークの摂動は、単一の遺伝子またはゲノムシグナル伝達中心の一部である複数の遺伝子セット、ならびにゲノムシグナル伝達中心の下流にあるものの翻訳に影響を及ぼし得る。摂動は、翻訳されたタンパク質の阻害をもたらし得る。
【００９５】
最近傍遺伝子
摂動刺激は、一次近傍遺伝子の上流または下流に位置し得る一次最近傍遺伝子の発現を変更するために、シグナル伝達分子との相互作用を引き起こし得る。近傍遺伝子は、染色体に沿って任意の数の上流または下流遺伝子を有し得る。任意の絶縁近傍内に、一次近傍遺伝子に対する１つ以上、例えば、１、２、３、４またはそれ以上の上流及び／または下流近傍遺伝子が存在し得る。「一次近傍遺伝子」は、染色体に沿った特定の絶縁近傍内で最も一般に見出される遺伝子である。一次近傍遺伝子の上流近傍遺伝子は、一次近傍遺伝子と同じ絶縁近傍内に位置し得る。一次近傍遺伝子の下流近傍遺伝子は、一次近傍遺伝子と同じ絶縁近傍内に位置し得る。
【００９６】
追加の定義
「類似体」という用語は、本明細書で使用される場合、基準化合物に構造的に関連し、基準化合物と共通の機能的活性を共有する化合物を指す。
【００９７】
「生物学的」という用語は、本明細書で使用される場合、微生物、植物、動物、またはヒト細胞などの様々な天然源から作製された医薬製品を指す。
【００９８】
「境界」という用語は、本明細書で使用される場合、特徴、エレメント、または特性が終了または開始する場所を示す点、限界、または範囲を指す。
【００９９】
「化合物」という用語は、本明細書で使用される場合、単剤もしくはその薬学的に許容される塩、または生物活性剤もしくは薬物を指す。
【０１００】
「誘導体」という用語は、本明細書で使用される場合、基準化合物とは構造が異なるが、基準分子の本質的特性を保持する。
【０１０１】
「下流近傍遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、一次近傍遺伝子と同じ絶縁近傍内に位置し得る一次近傍遺伝子の下流にある遺伝子を指す。
【０１０２】
「遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、生物、例えば染色体のゲノムアーキテクチャの単位またはセグメントを指す。遺伝子は、コードまたは非コードであり得る。遺伝子は、連続または非連続ポリヌクレオチドとしてエンコードされ得る。遺伝子は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【０１０３】
「ゲノム系アーキテクチャ」という用語は、本明細書で使用される場合、個体のゲノムの組織化を指し、染色体、位相関連ドメイン（ＴＡＤ）、及び絶縁近傍を含む。
【０１０４】
「マスター転写因子」という用語は、本明細書で使用される場合、標的遺伝子、例えば近傍遺伝子の転写を増加するかまたは減少するかにかかわらず変更し、細胞型特異的エンハンサーを確立する、シグナル伝達分子を指す。マスター転写因子は、他の転写因子などの追加のシグナル伝達タンパク質をエンハンサーに動員して、シグナル伝達中心を形成する。
【０１０５】
「調整する」という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子産生物の標的遺伝子及び／または活性の発現における変更（例えば、増加または減少）を指す。
【０１０６】
「近傍遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、絶縁近傍内に位置する遺伝子を指す。
【０１０７】
「浸透度」という用語は、本明細書で使用される場合、その変異体遺伝子の関連した特性（表現型）も呈する遺伝子の特定の変異体（例えば、野生型であるか否かにかかわらず、突然変異、対立遺伝子、または一般遺伝子型）を担持する個体の割合を指し、いくつかの状況では、臨床症状を呈する、したがって連続体上に存在する突然変異を有する個体の割合として測定される。
【０１０８】
「ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、最も多くの場合、ペプチド結合によって一緒に結合される（天然または非天然の）アミノ酸残基のポリマーを指す。本明細書で使用される場合、この用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。場合によっては、エンコードされるポリペプチドは、約５０アミノ酸よりも小さく、ポリペプチドは、ペプチドと呼ばれる。ポリペプチドがペプチドである場合、少なくとも約２、３、４、または少なくとも５アミノ酸残基長となる。
【０１０９】
「一次近傍遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、染色体に沿った特定の絶縁近傍内で最も一般に見出される遺伝子を指す。
【０１１０】
「一次下流境界」という用語は、本明細書で使用される場合、一次近傍遺伝子の下流に位置する絶縁近傍境界を指す。
【０１１１】
「一次上流境界」という用語は、本明細書で使用される場合、一次近傍遺伝子の上流に位置する絶縁近傍境界を指す。
【０１１２】
「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼによる遺伝子の転写が始まる場所を定義し、どのＤＮＡ鎖が転写されるかを示す転写の方向を定義するＤＮＡ配列を指す。
【０１１３】
「調節配列領域」という用語は、本明細書で使用される場合、限定されないが、染色体に沿った領域、区分、または区域が挙げられ、それによって近傍遺伝子の発現を変更するために、シグナル伝達分子との相互作用が起こる。
【０１１４】
「リプレッサー」という用語は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡに結合する任意のタンパク質を指し、転写の速度を減少させることによって遺伝子の発現を調節する。
【０１１５】
「二次下流境界」という用語は、本明細書で使用される場合、一次絶縁近傍内の二次ループの下流境界を指す。
【０１１６】
「二次上流境界」という用語は、本明細書で使用される場合、一次絶縁近傍内の二次ループの上流境界を指す。
【０１１７】
「シグナル伝達分子」という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、有機小分子、脂質、糖、または他の分子にかかわらず、染色体上の調節配列領域と直接または間接的に相互作用する、任意の実態を指す。
【０１１８】
「シグナル伝達転写因子」という用語は、本明細書で使用される場合、標的遺伝子、例えば近傍遺伝子の転写を増加するかまたは減少するかにかかわらず変更し、細胞−細胞シグナル伝達分子としても作用する、シグナル伝達分子を指す。
【０１１９】
「小分子」という用語は、本明細書で使用される場合、生物学的過程の調節を助けることができる低分子量薬物、すなわち、５０００ダルトン未満の有機化合物を指す。
【０１２０】
「対象」及び「患者」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、本開示による組成物での治療が提供される動物を指す。
【０１２１】
「治療剤」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患を治癒するか、または疾患の症状を改善する能力を有する物質を指す。
【０１２２】
「治療（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）または治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）成果」という用語は、本明細書で使用される場合、ＧＳＣまたはＧＳＮの摂動の結果として生じる任意の結果または効果（正、負またはヌル）を指す。治療成果の例には、疾患もしくは障害に関連する望ましくない病態もしくは負の病態の改良もしくは改善、副作用もしくは症状の軽減、疾患もしくは障害の治癒、またはＧＳＣもしくはＧＳＮの摂動に関連する任意の改良が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２３】
「治療（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）または治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）不利益」という用語は、本明細書で使用される場合、望ましくない、有害である、または治療法の正の成果を軽減する治療または治療レジームに関連する特徴または特性を指す。治療不利益の例には、例えば、毒性、不良な半減期、不良な生物学的利用能、有効性の欠失もしくは喪失、または薬物動態もしくは薬力学的リスクが含まれる。
【０１２４】
「上流近傍遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、一次近傍遺伝子と同じ絶縁近傍内に位置し得る一次近傍遺伝子の上流にある遺伝子を指す。
【０１２５】
正準細胞シグナル伝達経路
当該技術分野において詳述される正準経路と本明細書に定義される遺伝子シグナル伝達ネットワーク（ＧＳＮ）との間にいくらかの重複が存在し得、かつそうなる可能性が最も高いことが理解される。
【０１２６】
正準経路は、経路をわたってある程度のメンバーの混乱（クロストーク）を許容するが、本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークの（ＧＳＮ）は、遺伝子レベルにおいて定義され、その遺伝子を発現する細胞、組織、臓器、または臓器系の任意の数の刺激または摂動に基づいて特徴付けられる。したがって、ＧＳＮの性質は、構造的（例えば、遺伝子）かつ状況的（例えば、機能、例えば、発現プロファイル）に定義される。また２つの異なる遺伝子シグナル伝達ネットワークは、メンバーを共有し得るが、依然として摂動の性質がそれらを区別し得ることにおいて固有である。したがって、治療的研究及び開発を支持する生物系の機能の明確化における遺伝子シグナル伝達ネットワークの価値。
【０１２７】
正準経路と遺伝子シグナル伝達ネットワークとの間の関連付けが、これまで行われたことがないことを意図しないことを理解すべきであり、実際に、反対も同様である。さらなる化学的洞察のための２つのシグナル伝達パラダイムをつなげるために、正準シグナル伝達経路パラダイムを本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークと比較することは有益となるであろう。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、転写（ＳＴＡＴ）経路のヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）／シグナル伝達因子及び活性化因子を変更することを伴う。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路は、多様なサイトカイン及び増殖因子の主要なメディエーターである。サイトカインは、免疫反応を調整する調節分子である。ＪＡＫは、通常はサイトカイン受容体などの細胞表面受容体と関連付けられる細胞内の非受容体チロシンキナーゼのファミリーである。哺乳動物は、４つのＪＡＫ：ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、及びチロシンキナーゼ２（ＴＹＫ２）を有することが知られている。細胞表面におけるサイトカインまたは増殖因子の、それぞれの受容体への結合は、ＪＡＫのトランスリン酸化を開始し、それが下流ＳＴＡＴを活性化する。ＳＴＡＴは、活性化されるまで細胞質中に常駐する潜伏性転写因子である。７つの哺乳類ＳＴＡＴ：ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５（ＳＴＡＴ５Ａ及びＳＴＡＴ５Ｂ）、ならびにＳＴＡＴ６が存在する。活性化されたＳＴＡＴは核に転位し、ここでそれらが他の核タンパク質と複合体化し、特定の配列に結合して標的遺伝子の発現を調節する。したがって、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路は、細胞外シグナルを転写反応に翻訳する直接機序を提供する。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路によって調節される標的遺伝子は、免疫性、増幅、分化、アポトーシス及び発がんに関与する。ＪＡＫの活性化はまた、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を活性化することもできる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路を変更することを伴う。ＭＡＰＫ経路は、細胞膜における受容体からのシグナルを核に伝達する細胞中のシグナル伝達分子（例えば、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、及びＥＲＫ）の鎖を伴う。この経路は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｔｒｋ  Ａ／Ｂ、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）及びＰＤＧＦＲなどの受容体結合チロシンキナーゼによって活性化され得る。ＭＡＰＫシグナル伝達経路は、細胞ストレス応答、細胞分化、細胞分裂、細胞増殖、炎症、代謝、運動及びアポトーシスを含む多数の細胞過程を調節する上で不可欠である。ＭＡＰＫは、主要な経路標的：ＥＲＫ１／２、ＥＲＫ５、ＪＮＫ、及びｐ３８キナーゼと相互作用する。ＭＡＰＫは、Ｃ−ｍｙｃ、ＣＲＥＢ、及びＣ−Ｆｏｓを含むいくつかの転写因子の活性を調節する。ＭＡＰＫはまた、ＰＩ３Ｋネットワーク、ＮＦ−κＢ、及びＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路などの他の経路と相互作用する。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）媒介性シグナル伝達経路を変更することを伴う。ＰＤＧＦＲは、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ファミリーのメンバーの細胞表面チロシンキナーゼ受容体である。ＰＤＧＦＲの２つのアイソフォーム、ＰＤＧＦＲα、及びＰＤＧＦＲβが存在する。２つの受容体アイソフォームは、ＰＤＧＦ二量体に結合すると二量体化し、キナーゼの活性化につながる。ＰＤＧＦＲは、細胞増殖、細胞分化、細胞成長及び発達を調節するために重要である多数のシグナル伝達経路を媒介する。ＰＤＧＦＲ媒介シグナル伝達経路の阻害は、ＰＤＧＦ、ａｎｇ１／２、及びＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの発現の低減と相関している。ＰＤＧＦは、ＰＩ３−Ｋ活性化のための既知の刺激であるため、ＰＤＧＦＲを阻害することは、ＰＩ３−Ｋシグナル伝達カスケードの活性化の低下につながり得る。生理学及び医学におけるＰＤＧＦ及びＰＤＧＦＲの役割は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｎｄｒａｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００８  Ｍａｙ  １５；２２（１０）：１２７６−３１２でレビューされている。
【０１３１】
本開示に従って変更され得る他の正準経路としては、２−アラキドノイルグリセロール生合成経路、２−オキソカルボン酸代謝経路、５ＨＴ１型受容体媒介シグナル伝達経路、５ＨＴ２型受容体媒介シグナル伝達経路、５ＨＴ３型受容体媒介シグナル伝達経路、５ＨＴ４型受容体媒介シグナル伝達経路、５−ヒドロキシトリプタミン生合成経路、５−ヒドロキシトリプタミン分解経路、アバカビル輸送及び代謝経路、ＡＢＣトランスポーター経路、ＡＢＣファミリータンパク質媒介輸送経路、ＡＣＥ阻害剤経路、酢酸塩利用経路、アセチルコリン合成経路、依存性ＰＫＡの活性化経路、アクチビンベータシグナル伝達経路、アデニン及びヒポキサンチンサルベージ経路、アドヘレンスジャンクション経路、アディポサイトカインシグナル伝達経路、脂肪生成経路、アドレナリン及びノルアドレナリン生合成経路、心筋細胞中のアドレナリン作動性シグナル伝達経路、終末糖化産物（ａｇｅ／ｒａｇｅ）経路、終末糖化産物受容体シグナル伝達経路、アフラトキシンｂ１代謝経路、ａｇｅ／ｒａｇｅ経路、ＡＨＲ経路、ＡＫＴシグナル伝達経路、アラニン及びアスパラギン酸塩代謝経路、アラニン生合成経路、アルドステロン合成及び分泌経路、アルドステロン調節ナトリウム再吸収経路、アラントイン分解経路、同種移植片拒絶経路、全トランス型レチノイン酸シグナル伝達経路、ａｌｐ２３ｂシグナル伝達経路、アルファ６ベータ４シグナル伝達経路、アルファアドレナリン作動性受容体シグナル伝達経路、アルファ６ベータ４インテグリン経路、アルファ−リノレン酸代謝経路、アルツハイマー病−アミロイドセクレターゼ経路、アルツハイマー病−プレセニリン経路、アミノ酸抱合経路、アミノ糖及びヌクレオチド糖代謝経路、アミノアシル−ｔＲＮＡ生合成経路、アミノ酪酸塩分解経路、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ経路、ＡＭＰＫシグナル伝達経路、アナンダミド生合成経路、アナンダミド分解経路、アンドロゲン受容体シグナル伝達経路、アンドロゲン／エストロゲン／プロゲステロン生合成経路、血管新生経路、アンジオポエチン−Ｔｉｅ２シグナル伝達経路、ｇタンパク質によるアンジオテンシンＩＩ刺激シグナル伝達及びベータ−アレスチン経路、ＭＨＣによる抗原プロセッシング及び提示経路、アポトーシス調整及びシグナル伝達経路、ＨＳＰ７０によるアポトーシス調整経路、アポトーシスシグナル伝達経路、細胞死受容体によるアポトーシス経路、アポトーシス実行段階経路、アラキドン酸エポキシゲナーゼ／エポキシドヒドロラーゼ経路、アラキドン酸代謝経路、アルギニン及びプロリン代謝経路、アルギニン生合成経路、アリピプラゾール代謝経路、アリールアミン代謝経路、アスコルビン酸塩及びアルダレート（ａｌｄａｒａｔｅ）代謝経路、アスコルビン酸塩分解経路、アスパラギン及びアスパラギン酸塩生合成経路、アスパラギンＮ結合グリコシル化経路、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩代謝経路、ＲＮＡポリメラーゼ−ＩＩ開始複合体のアセンブリ経路、ＡＴＭ経路、ＡＴＰ合成経路、軸索ガイダンス経路、ネトリン介在性の軸索ガイダンス経路、セマフォリン介在性の軸索ガイダンス経路、ｓｌｉｔ／ｒｏｂｏ介在性の軸索ガイダンス経路、Ｂ細胞活性化経路、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）経路、Ｂ細胞受容体シグナル伝達経路、上皮細胞の細菌侵入経路、基本転写因子経路、塩基除去修復経路、Ｂ細胞発生経路、Ｂ細胞受容体経路、Ｂ細胞受容体複合体経路、ベンゾ経路、ベータ１アドレナリン作動性受容体シグナル伝達経路、ベータ２アドレナリン作動性受容体シグナル伝達経路、ベータ３アドレナリン作動性受容体シグナル伝達経路、ベータ−アラニン代謝経路、胆汁酸及び胆汁塩代謝経路、胆汁分泌経路、スカベンジャー受容体によるリガンドの結合及び取り込み経路、生体アミン合成経路、アミノ酸の生合成経路、不飽和脂肪酸の生合成経路、ビオチン生合成経路、ブレイクリー（ｂｌａｋｅｌｙ）ネットワーク経路、凝血カスケード経路、血液凝固経路、ｂｍｐ／アクチビンシグナル伝達−ショウジョウバエ経路、骨形態形成タンパク質経路、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）経路、ＢＲＣＡ１経路、ブプロピオン分解経路、ブタン酸塩代謝経路、ブチロシン及びネオマイシン生合成経路、酪酸塩誘発ヒストンアセチル化経路、カドヘリンシグナル伝達経路、カフェイン代謝経路、心細胞中のカルシウム調節経路、カルシウムシグナル伝達経路、ｃＡＭＰ経路、炭水化物消化及び吸収経路、炭素代謝経路、心筋収縮経路、心筋前駆細胞分化経路、カルニチン代謝経路、カスパーゼカスケード経路、哺乳動物フラビン含有モノオキシゲナーゼの触媒サイクル経路、ＣＣＫＲシグナル伝達マップ経路、マクロファージ中のＣＣＲ５経路、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞系統経路、ＣＤ４０シグナル伝達経路、ＣＤＫ５経路、細胞接着分子（ｃａｍ）経路、細胞周期チェックポイント経路、細胞周期経路、細胞分化−メタ経路、細胞結合組織化経路、血管壁における細胞表面相互作用経路、ＣＧＭＰ−ＰＫＧシグナル伝達経路、化学発がん経路、ケモカインシグナル伝達経路、コレステロール生合成経路、コリン作動性シナプス経路、コリスミ酸塩生合成経路、クロマチンリモデリング経路、サーカディアンクロック系経路、サーカディアン同調経路、クエン酸回路（ＴＣＡ回路）経路、ｃ−ｍｅｔ経路、コバラミン生合成経路、コデイン及びモルヒネ代謝経路、コエンザイムＡ生合成経路、コエンザイムＡ結合カルニチン代謝経路、コルヒチン代謝経路、集合管酸分泌経路、補体及び凝固カスケード経路、コリ回路経路、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）経路、ＣＤ２８ファミリーによる共刺激経路、ＣＲＥＢ経路、ＣＴＬ媒介性アポトーシス経路、ＣＴＬＡ４シグナル伝達経路、シアノアミノ酸代謝経路、サイクリン及び細胞周期調節経路、システイン及びメチオニン代謝経路、システイン生合成経路、サイトカインネットワーク経路、サイトカイン−サイトカイン受容体相互作用経路、サイトカイン及び炎症反応経路、細胞質リボソームタンパク質経路、ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅによる細胞骨格調節経路、細胞質ＤＮＡセンシング経路、デノボプリン生合成経路、デノボピリミジンデオキシリボヌクレオチド生合成経路、デノボピリミジンリボヌクレオチド生合成経路、カルシウムチャネルの開口を誘発するシナプス前終末の脱分極経路、ジクロフェナク代謝経路、分化経路、難消化性炭水化物代謝経路、拡張型心筋症経路、フィブリン塊の溶解経路、サーカディアンオルソログで日中調節された遺��子経路、ｄｉｖ色なし（ｄｉｖ  ｎｏ  ｃｏｌｏｒｓ）経路、ｄｉｖ経路、ＤＮＡ損傷バイパス経路、ＤＮＡ損傷反応経路、ＤＮＡ損傷回復経路、ＤＮＡメチル化及び転写抑制経路、ＤＮＡ修復機構経路、ＤＮＡ複製経路、ドーパミン代謝経路、ドーパミン受容体媒介シグナル伝達経路、ドーパミン作動性シナプス経路、背腹軸形成経路、ＤＰＰシグナル伝達経路、ＤＰＰ−ＳＣＷシグナル伝達経路、薬物代謝経路、薬物代謝−シトクロムｐ４５０経路、ｄｓｃａｍ相互作用経路、Ｅ２Ｆ／ＭＩＲＨＧ１フィードバック−ループ欠失経路、ＥＢＶ  ＬＭＰ１シグナル伝達経路、ＥＣＭ受容体相互作用経路、一酸化窒素作用経路、ｐｉｐ２加水分解作用経路、ＥＧＦ経路、ＥＧＦ受容体シグナル伝達経路、エイコサノイド合成経路、電子伝達系経路、軟骨内骨化経路、内分泌及び他の因子調節性カルシウム再吸収経路、エンドサイトーシス経路、内胚葉分化経路、内因性カンナビノイドシグナル伝達経路、エンドセリン経路、エンドセリンシグナル伝達経路、エネルギー代謝経路、エンケファリン放出経路、ｅｎｏｓシグナル伝達経路、エフリン−ＥＰＨＲシグナル伝達経路、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）経路、ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ感染における上皮細胞シグナル伝達経路、上皮密着結合経路、ＥＰＯ受容体シグナル伝達経路、ＥＲＢＢシグナル伝達経路、ＥＲＫシグナル伝達経路、エリスロポエチン経路、エストロゲンシグナル伝達経路、エーテル脂質代謝経路、真核生物転写開始経路、真核生物翻訳伸長経路、真核生物翻訳開始経路、真核生物翻訳終止経路、ＦＡＫ１シグナル伝達経路、Ｆａｓシグナル伝達経路、脂肪消化及び吸収経路、脂肪酸経路、脂肪酸ベータ酸化経路、脂肪酸生合成経路、脂肪酸分解経路、脂肪酸伸長経路、脂肪酸代謝経路、脂肪酸オメガ酸化経路、ＦＧＦ経路、ＦＧＦシグナル伝達経路、繊維芽細胞成長因子−１（ＦＧＦ１）経路、フラビン生合成経路、ＦＬＴ３シグナル伝達経路、フルオロピリミジン活性経路、接着斑経路、葉酸生合成経路、葉酸代謝経路、卵胞刺激ホルモン経路、フィブリン塊形成経路、ホルミルテトラヒドロギ酸生合成経路、Ｆｏｘｏシグナル伝達経路、フルクトースガラクトース代謝経路、Ｇタンパク質シグナル伝達経路、Ｇ１−Ｓ細胞周期制御経路、Ｇ１３シグナル伝達経路、ＧＡＢＡ合成経路、ＧＡＢＡ−Ｂ受容体ＩＩシグナル伝達経路、ガラクトース代謝経路、ガンマ−アミノ酪酸合成経路、ガングリオスフィンゴ脂質代謝経路、ギャップ結合トラフィッキング及び調節経路、胃酸分泌経路、ガストリン経路、ＧＢＢシグナル伝達経路、一般的転写経路、グレリン経路、グリア細胞分化経路、グロボスフィンゴ脂質代謝経路、グルコガンシグナル伝達経路、グルココルチコイド及びミネラルコルチコイド代謝経路、グルココルチコイド受容体シグナル伝達経路、グルコース恒常性経路、グルクロン酸抱合経路、グルタミン酸作動性シナプス経路、グルタミングルタミン酸塩変換経路、グルタチオン代謝経路、グリカン分解経路、グリセロ脂質代謝経路、グリセロリン脂質生合成経路、グリセロリン脂質代謝経路、グリシン代謝経路、グリコーゲン代謝経路、解糖／糖新生経路、グリコサミノグリカン生合成−ヘパラン硫酸／ヘパリン経路、グリコサミノグリカン生合成−ケラタン硫酸経路、グリコサミノグリカン分解経路、グリコサミノグリカン代謝経路、スフィンゴ糖脂質生合成−ガングリオ系経路、スフィンゴ糖脂質生合成−グロボ系経路、スフィンゴ糖脂質生合成−ラクト及びネオラクト系経路、グリオキシル酸及びジカルボン酸代謝経路、性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体経路、ＧＰ１Ｂ−ＩＸ−Ｖ活性化シグナル伝達経路、ＧＰＣＲ経路、ＧＰＣＲ下流シグナル伝達経路、ＧＰＣＲリガンド結合経路、ＧＰＶＩ媒介性活性化カスケード経路、顆粒球接着及び血管外遊出経路、グランザイム経路、成長ホルモンシグナル伝達経路、ＧＳＫ  ３シグナル伝達経路、ヘッジホッグシグナル伝達経路、多能性幹細胞からの造血経路、造血細胞系統経路、造血幹細胞分化経路、ヘム生合成経路、Ｂ型肝炎経路、Ｃ型肝炎経路、ヘテロ三量体Ｇタンパク質シグナル伝達−Ｇｉアルファ及びＧｓアルファ媒介性経路、ヘテロ三量体ｇタンパク質シグナル伝達−桿体外節光シグナル伝達経路、ヘキソース輸送経路、ＨＧＦ経路、ＨＩＦ−１シグナル伝達経路、ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路、ヒスタミンｈ１受容体媒介シグナル伝達経路、ヒスタミンｈ２受容体媒介シグナル伝達経路、ヒスタミン合成経路、ヒスチジン生合成経路、ヒストン修飾経路、相同組換え経路、ＨＴＬＶ−Ｉ感染経路、ヒト補体系経路、ｈｉｆ活性化を介した低酸素応答経路、ＩＤシグナル伝達経路、ＩＧＦ１Ｒシグナル伝達経路、ＩＬ１及び肥満における巨核細胞経路、ＩＬ−１シグナル伝達経路、ＩＬ−１０経路、ＩＬ１７シグナル伝達経路、ＩＬ−２シグナル伝達経路、ＩＬ−２２経路、ＩＬ−３シグナル伝達経路、ＩＬ−４シグナル伝達経路、ＩＬ−５シグナル伝達経路、ＩＬ−６経路、ＩＬ−７シグナル伝達経路、ＩＬ−９シグナル伝達経路、ＩＬＫシグナル伝達経路、ケモカイン及びサイトカインシグナル伝達によって媒介される炎症経路、Ｔｒｐチャネルの炎症メディエーター調節経路、
炎症反応経路、Ａ型インフルエンザウイルス感染経路、ｉｎｏｓシグナル伝達経路、イノシトールリン酸代謝経路、インスリン受容体経路、インスリン抵抗性経路、インスリン分泌経路、インスリン／ＩＧＦ−プロテインキナーゼｂシグナル伝達カスケード経路、インスリン様成長因子−２  ｍＲＮＡ結合タンパク質経路、インテグリンアルファＩＩｂベータ３シグナル伝達経路、インテグリン細胞シグナル伝達経路、インテグリン細胞表面相互作用経路、インテグリン媒介性細胞接着経路、インターフェロン経路、インターフェロンアルファ／ベータシグナル伝達経路、インターフェロン型Ｉシグナル伝達経路、インターフェロン−ガンマシグナル伝達経路、インターロイキンシグナル伝達経路、インターロイキン−１（ＩＬ−１）経路、インターロイキン−１プロセシング経路、インターロイキン−１１シグナル伝達経路、インターロイキン−２（ＩＬ−２）経路、インターロイキン−３経路、インターロイキン−４（ＩＬ−４）経路、インターロイキン−５（ＩＬ−５）経路、インターロイキン−６（ＩＬ−６）経路、インターロイキン−７（ＩＬ−７）経路、インターロイキン−９（ｉｌ−９）経路、細胞内カルシウムシグナル伝達経路、イオンチャネル型グルタミン酸受容体経路、ＩＰ３経路、イソロイシン生合成経路、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路、ＪＮＫ経路、キネシン経路、ＫＩＴ受容体経路、アテローム形成におけるＬＤＬ酸化経路、レプチン（ｌｅｐ）経路、レプチンシグナル伝達経路、ロイシン生合成経路、白血球経内皮遊走経路、リノール酸代謝経路、脂質消化経路、リポ酸塩＿生合成経路、寿命調節−哺乳動物経路、寿命調節−複数種経路、長期増強経路、リシン生合成経路、リシン分解経路、リソソーム経路、マンノース代謝経路、ＭＡＰＫカスケード経路、ＭＡＰキナーゼによって媒介されるＭＡＰＫ標的／核事象経路、マトリックスメタロプロテアーゼ経路、メラトニン代謝及び作用経路、メタ生体内変化経路、炭水化物の代謝経路、一酸化窒素の代謝経路、ヌクレオチドの代謝経路、ポルフィリンの代謝経路、水溶性ビタミン及び共因子の代謝経路、シトクロムｐ４５０による生体外物質の代謝経路、代謝型グルタミン酸受容体グループＩ経路、代謝型グルタミン酸受容体グループＩＩ経路、代謝型グルタミン酸受容体グループＩＩＩ経路、メチオニン生合成経路、メチル化経路、メチルクエン酸回路経路、メチルマロニル経路、ミネラル吸収経路、ｍｉＲＮＡ生物発生経路、ミスマッチ修復経路、ミトコンドリアアポトーシス経路、ミトコンドリア遺伝子発現経路、ミトコンドリアｌｃ−脂肪酸ベータ−酸化経路、有糸分裂Ｇ１−Ｇ１／Ｓ期経路、有糸分裂Ｇ２−Ｇ２／Ｍ期経路、モノアミンＧＰＣＲ経路、モノアミン輸送経路、ｍＲＮＡキャッピング経路、ｍＲＮＡ編集経路、ｍＲＮＡプロセシング経路、ｍＲＮＡスプライシング経路、ｍＲＮＡ監視経路、ｍＴＯＲシグナル伝達経路、ムスカリン性アセチルコリン受容体１及び３シグナル伝達経路、ムスカリン性アセチルコリン受容体２及び４シグナル伝達経路、筋形成経路、子宮筋弛緩及び収縮経路、Ｎ−アセチルグルコサミン代謝経路、ＮＡＤ生合成ＩＩ経路、ナノ物質誘発性アポトーシス経路、ナノ粒子誘起性オートファジー細胞死経路、ナ���粒子誘起性の調節されたネクローシス経路、ナチュラルキラー細胞媒介性細胞毒性経路、神経突起伸長のためのｎｃａｍシグナル伝達経路、ネフリン相互作用経路、ネトリン−１シグナル伝達経路、神経堤分化経路、神経活性リガンド受容体相互作用経路、シナプス間隙における神経伝達物質クリアランス経路、神経伝達物質放出サイクル経路、グリア細胞における神経伝達物質取り込み及び代謝経路、神経栄養因子シグナル伝達経路、ＮＦＡＴ及び心肥大経路、ＮＦ−カッパｂシグナル伝達経路、ＮＦ−カッパｂシグナル伝達経路、ＮＧＦ経路、原形質膜からのＴＲＫＡを介したＮＧＦシグナル伝達経路、Ｎ−グリカン生合成経路、ニコチン酸塩及びニコチンアミド代謝経路、クロム親和性細胞上のニコチン活性経路、ドーパミン作動性ニューロン上のニコチン活性経路、ニコチン分解経路、ニコチン代謝経路、ニコチン薬力学的経路、ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル伝達経路、ニフェジピン活性経路、窒素代謝経路、ＮＬＲタンパク質経路、ｎｏｄ様受容体シグナル伝達経路、非相同末端結合経路、ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路、Ｎｒｆ２経路、核受容体経路、ヌクレオソームアセンブリ経路、ヌクレオチド除去修復経路、ヌクレオチドＧＰＣＲ経路、ヌクレオチド代謝経路、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン経路、ｏ−抗原生合成経路、ｏ−グリカン生合成経路、嗅覚伝達経路、オンコスタンチンｍシグナル伝達経路、１炭素代謝経路、オピオイドプロダイノルフィン経路、オピオイドプロエンケファリン経路、オピオイドプロオピオメラノコルチン経路、オルニチン分解経路、骨芽細胞シグナル伝達経路、破骨細胞シグナル伝達経路、オステオポンチンシグナル伝達経路、卵巣ステロイド産生経路、シトクロムｐ４５０による酸化経路、酸化的リン酸化経路、酸化ストレス経路、オキシトシン受容体媒介シグナル伝達経路、オキシトシンシグナル伝達経路、ｐ３８  ＭＡＰＫシグナル伝達経路、ｐ５３フィードバックループ１経路、ｐ５３フィードバックループ２経路、ｐ５３媒介性アポトーシス経路、ｐ５３シグナル伝達経路、ｐａｋ経路、膵臓分泌経路、パントテン酸塩生合成経路、パーキン−ユビキチンプロテアソーム系経路、アクアポリンによる受動輸送経路、ＰＤＧＦシグナル伝達経路、ペントース及びグルクロン酸相互変換経路、ペントースリン酸経路、ペプチドＧＰＣＲ経路、ペプチドグリカン生合成経路、テトラコサノイル−ｃｏＡのペルオキシゾームベータ−酸化経路、ペルオキシゾーム脂質代謝経路、百日咳経路、ファゴソーム経路、化合物の第Ｉ相機能化経路、第Ｉ相生体内変化経路、第ＩＩ相抱合経路、フェニル酢酸分解経路、フェニルアラニン生合成経路、フェニルアラニン  代謝経路、フェニルエチルアミン分解経路、フェニルプロピオン酸分解経路、ホスファチジルイノシトールシグナル伝達系経路、ホスホリパーゼＤシグナル伝達経路、光シグナル伝達経路、ＰＩ３キナーゼ経路、Ｂリンパ球におけるＰＩ３Ｋシグナル伝達経路、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達経路、ＰＩＰ３活性化ＡＫＴシグナル伝達経路、プラスミノーゲン活性化カスケード経路、血小板活性化経路、露出したコラーゲンへの血小板接着経路、血小板凝集経路、血小板恒常性経路、ポリオール経路、ポルフィリン及びクロロフィル代謝経路、ＰＰＡＲシグナル伝達経路、一次胆汁酸生合成経路、原発性巣状分節性糸球体硬化症ＦＳＧ経路、キャッピングされたイントロン含有プレｍＲＮＡのプロセッシング経路、キャッピングされたイントロン無しのプレｍＲＮＡのプロセッシング経路、プロゲステロン媒介性卵成熟経路、プロラクチンシグナル伝達経路、プロリン生合成経路、プロパン酸代謝経路、プロスタグランジン合成及び調節経路、プロテアソーム経路、プロテアソーム  分解経路、タンパク質消化及び吸収経路、タンパク質排出経路、タンパク質折り畳み経路、近位尿細管重炭酸再生経路、ＰＲＰＰ生合成経路、ＰＴＥＮ経路、プリン代謝経路、ピリドキサールリン酸サルベージ経路、ピリドキサール−５−リン酸生合成経路、ピリミジン代謝経路、ピルビン酸代謝経路、ｒａｃ１経路、破骨細胞におけるｒａｎｋシグナル伝達経路、ｒａｎｋｌ／ｒａｎｋ経路、ｒａｐ１シグナル伝達経路、ｒａｓシグナル伝達経路、Ｒａｓ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路、核因子カッパ−ｂリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）経路、アクチン細胞骨格の調節経路、アポトーシスの調節経路、オートファジーの調節経路、ＤＮＡ複製の調節経路、脂肪細胞における脂肪分解の調節経路、微小管細胞骨格の調節経路、ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達の調節経路、接着結合のリモデリング経路、レニン分泌経路、レニン−アンジオテンシン系経路、呼吸電子輸送経路、レチノール代謝経路、逆行性エンドカンナビノイドシグナル伝達経路、ＲｈｏファミリーＧＴＰａｓｅ経路、Ｒｈｏａ経路、真核生物におけるリボソーム生物発生経路、ＲＩＧ−Ｉ様受容体シグナル伝達経路、ＲＮＡ分解経路、ＲＮＡポリメラーゼＩ経路、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写経路、ＲＮＡ輸送経路、ＲＮＡｉ経路、ｓ−アデノシルメチオニン生合成経路、唾液分泌経路、サルベージピリミジンデオキシリボヌクレオチド経路、サルベージピリミジンリボヌクレオチド経路、ＳＣＷシグナル伝達経路、セレン代謝及びセレノプロテイン経路、セレン微量栄養素ネットワーク経路、セレン化合物代謝経路、セマフォリン相互作用経路、セリン及びトレオニン代謝経路、セリングリシン生合成経路、セロトニン作動性シナプス経路、セロトニンｈｔｒ１グループ及びｆｏｓ経路、セロトニン受容体２及びＥＬＫ−ＳＲＦ／ｇａｔａ４シグナル伝達経路、セロトニン受容体２及びＳＴＡＴ３シグナル伝達経路、セロトニン受容体４／６／７及びＮＲ３Ｃシグナル伝達経路、セロトニン輸送体活性経路、シグナル増幅経路、シグナル調節タンパク質経路、Ｓ１Ｐ受容体のシグナル変換経路、ＥＧＦＲによるシグナル伝達経路、インスリン受容体によるシグナル伝達経路、ＰＤＧＦによるシグナル伝達経路、ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅによるシグナル伝達経路、ｒｏｂｏ受容体によるシグナル伝達経路、ＶＥＧＦによるシグナル伝達経路、ギャップ結合におけるシグナル伝達経路、肝細胞成長因子受容体のシグナル伝達経路、幹細胞のシグナル伝達調節多能性経路、膠芽腫におけるシグナル伝達経路、ＮＧＦによるシグナル伝達経路、ＳＭＡＤシグナル伝達ネットワーク経路、小リガンドＧＰＣＲ経路、小胞輸送におけるＳＮＡＲＥ相互作用経路、スフィンゴ脂質（ＳＭ）シ��ナル伝達経路、スフィンゴ脂質代謝経路、スプライセオソーム経路、デンプン及びスクロース代謝経路、ｓｔａｔシグナル伝達経路、ＳＴＡＴ３経路、スタチン経路、ステロイド生合成経路、ステロイドホルモン生合成経路、ステロール調節エレメント結合タンパク質経路、横紋筋収縮経路、コハク酸からプロピオン酸への変換経路、硫酸同化経路、硫酸化生体内変化反応経路、硫黄代謝経路、硫黄リレー系経路、ｓｕｍｏ経路、シナプス小胞経路、ケトン体の合成及び分解経路、ＤＮＡの合成経路、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）経路、タモキシフェン代謝経路、ｔａｒｂａｓｅ経路、ラパマイシンの標的経路、味覚情報変換経路、タウリン及びヒポタウリン代謝経路、ＴＣＡ及び尿素回路経路、Ｔ細胞抗原受容体経路、Ｔ細胞受容体及び共刺激シグナル伝達経路、テロメア維持経路、テルペノイド骨格生合成経路、テトラヒドロ葉酸生合成経路、心肥大に関連するＴＦＳ調節ｍｉＲＮＡ経路、ＴＧＦ−ベータ経路、ＴＧＦ−ベータ受容体シグナル伝達経路、ＴＨＣ分化経路、チアミン生合成経路、チアミン代謝経路、トレオニン生合成経路、胸腺間質性リンパ球新生因子経路、胸腺間質性リンパ球新生因子（ｔｓｌｐ）経路、甲状腺刺激ホルモン（ｔｓｈ）経路、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体シグナル伝達経路、ｔｉｅ２／ｔｅｋシグナル伝達経路、密着結合経路、ＴＮＦアルファシグナル伝達経路、アポトーシスのＴＮＦ関連弱誘導因子経路、ＴＮＦシグナル伝達経路、ＴＮＦスーパーファミリー経路、アポトーシスのＴＮＦ関連弱誘導因子（ｔｗｅａｋ）経路、ｔｏｌｌ受容体シグナル伝達経路、ｔｏｌｌ様受容体経路、ＴＰ５３ネットワーク経路、Ｔｒａｆ経路、ｔｒａｉｌ経路、ｂｚｉｐ転写因子による転写調節経路、Ｎｒｆ２による転写活性化経路、白血球の経内皮遊走経路、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）受容体経路、翻訳因子経路、電気シナプスにわたる伝達経路、グルコース及び他の糖の輸送経路、アクアポリンによる脂肪細胞から肝臓へのグリセロールの輸送経路、ビタミンの輸送経路、トランス硫化経路、トランス硫化経路及び１炭素代謝経路、トリアシルグリセリド合成経路、トリアシルグリセロール代謝経路、ｔＲＮＡアミノアシル化経路、トリプトファン生合成経路、トリプトファン代謝経路、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファ経路、
肝ＮＫ細胞の殺腫瘍作用経路、ｔｗｅａｋ経路、ＩＩ型糖尿病経路、ＩＩ型インターフェロンシグナル伝達経路、ＩＩＩ型インターフェロンシグナル伝達経路、チロシン及びトリプトファン生合成経路、チロシン生合成経路、チロシン代謝経路、ユビキノン及び他のテルペノイド−キノン生合成経路、ユビキチン媒介性タンパク質分解経路、ユビキチンプロテアソーム経路、折り畳まれていないタンパク質応答経路、アミノ基の尿素回路及び代謝経路、バリン生合成経路、血管平滑筋収縮経路、バソプレシン合成経路、バソプレシン調節水再吸収経路、ＶＥＧＦシグナル伝達経路、ビタミンａ及びカロテノイド代謝経路、ビタミンｂ１２代謝経路、ビタミンｂ６生合成経路、ビタミンｂ６代謝経路、ビタミンｄ代謝経路、ビタミン消化及び吸収経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路、キサンチン及びグアニンサルベージ経路、ならびに／または亜鉛恒常性経路が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
ＩＩ．ニーズが満たされていない疾患
いくつかの実施形態では、疾患、障害、または病態は、満たされていない治療ニーズを有するものから選択され得る。表１は、治療ニーズが満たされていない疾患の例及び治療のために標的化するための提案された遺伝子を提供する。
【０１３３】
（表１）ニーズが満たされていない疾患
2021521101.tif 000003
【０１３４】
いくつかの実施形態では、ニーズが満たされていない疾患は鎌状赤血球症（ＳＣＤ）であり、これは、治療オプションが限られた重症で稀な血液疾患である。ＳＣＤは、米国において約１００，０００人の患者及びヨーロッパにおいて約６０，０００人の患者の大きな希少疾病の指標を有する。この疾患は、血管閉塞、溶血性貧血、多臓器不全につながる炎症／血管損傷に起因する、平均寿命が２０〜３０年減少する壊滅的な罹患率及び死亡率を引き起こす。具体的には、脳において、脳卒中（梗塞または出血）が生じ、麻痺、神経認知欠損、または死亡を引き起こし得る。具体的には、肺において、急性胸部症候群、肺高血圧症、及び／または肺炎が生じ得る。具体的には、腎臓において、血尿、腎機能障害、及び／または腎不全が生じ得る。具体的には、骨及び関節において、骨髄梗塞、骨髄炎、及び無血管性壊死／骨壊死が生じ得る。具体的には、肝臓／胆嚢において、肝障害、胆石、及び／または肝不全が生じ得る。具体的には、眼において、出血、失明、網膜剥離、及び／または網膜症が生じ得る。具体的には、心臓において、心肥大及び／または心不全が生じ得る。具体的には、脾臓において、萎縮（自家脾臓摘出）が生じ得る。具体的には、皮膚上で、くるぶしのうっ血性潰瘍及び／または指炎が生じ得る。具体的には、男性において、持続勃起症が生じ得る。具体的には、女性において、有害な妊娠結果が生じ得る。
【０１３５】
現在の治療としては、Ｌ−グルタミン及びヒドロキシ尿素が挙げられる。現在ＳＣＤの治療パイプラインにおいて主要な薬物としては、トリカグレロール（ｔｒｉｃａｇｒｅｌｏｒ）、Ｓｅｌ−Ｇ１、ＧＢＴ−４４０、及びレンチグロビンが挙げられる。ＨＩＦ安定剤（ｓｔａｉｌｉｚｅｒ）、トリコシック（ｔｒｉｃｈｏｓｉｃ）、ＨＤＡＣ−１／２阻害剤、ＰＲＭＴ−５阻害剤、ＥｄＸ−１７、ＬＳＤ−１阻害剤、ＭＢＤ阻害剤、ＰＢ−０４及びパノビノスタットは、ＳＣＤの治療のためのＨｂＦ誘導の有望性を示している。Ａｅｓ−１０７、ＰＮＱ−１０３、ＭＸ−１５２０及びＳＣＤ−１０１は、ＳＣＤの治療のための抗鎌状剤としての有望性を示している。ＰＦ−４４４７９４３は、ＳＣＤの治療のための抗付着剤としての有望性を示している。ＶＢＰ−１５及びＮＫＴＴ−１２０は、ＳＣＤの治療のための抗炎症剤としての有望性を示している。いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、上記に提供される化合物のうちの少なくとも１つ、または参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．６２／５０１，７９５の表１９〜表２６、表２８から選択される少なくとも１つの刺激を使用して、シグナル伝達中心及び／または絶縁近傍を調整することによって、ＳＣＤの治療を提供する。いくつかの実施形態では、選択された化合物または刺激は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．６２／５０１，７９５の表１〜表９から選択される少なくとも１つの遺伝子を標的とし、ＳＣＤの表現型の救出をもたらす。
【０１３６】
ＩＩＩ．組成物及び方法
いくつかの実施形態では、本開示は、表１に列挙されるものなどの１つ以上の標的遺伝子の発現を調整するための組成物及び方法を提供する。本明細書に記載される組成物及び方法を使用して、標的遺伝子（複数可）に関連する疾患、障害または病態を治療または予防することができる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子（複数可）に関連する疾患、障害または病態は、表１に列挙されるものである。
【０１３７】
「対象」及び「患者」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、本開示による組成物での治療が提供される動物を指す。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、対象は、１つ以上の標的遺伝子に関連する疾患、障害または病態が診断されている可能性があるか、またはその症状を有し得る。他の実施形態では、対象は、１つ以上の標的遺伝子に関連する疾患、障害または病態にかかりやすい場合があるか、またはその危険性があり得る。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、対象は、標的遺伝子内またはその付近に１つ以上の突然変異を有し得る。いくつかの実施形態では、対象は、標的遺伝子の１つの機能的対立遺伝子及び１つの変異対立遺伝子を有し得る。いくつかの実施形態では、対象は、標的遺伝子の２つの変異対立遺伝子を有することができる。変異（複数可）は、標的遺伝子から産生されるタンパク質のレベルまたは活性を変化させ得る。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、対象は、健康な対象と比較して、標的遺伝子から産生されるタンパク質の欠損を有し得る。これは、タンパク質活性を損なうか、タンパク質安定性を低減するか、または遺伝子の発現を減少させる変異に起因し得る。したがって、本明細書に記載される組成物及び方法を使用して、関連する疾患、障害または病態の表現型を救出するために標的遺伝子の発現を増加させることができる。他の実施形態では、対象は、健康な対象と比較して、タンパク質の過剰な産生、または望ましくない活性を有するタンパク質の産生を有し得る。これは、機能獲得変異、分解過程の障害、または発現の誤調節によって引き起こされ得る。したがって、本明細書に記載される組成物及び方法を使用して、関連する疾患、障害または病態の表現型を救出するために標的遺伝子の発現を減少させることができる。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物及び方法を使用して、細胞中の標的遺伝子の発現を変更することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、マウス細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞である。
【０１４２】
遺伝子発現の変化は、当該技術分野において既知であり、本明細書に記載される様々な技法、例えばＲＮＡ−ｓｅｑ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで評価され得る。遺伝子発現の変化は、治療した細胞または対象における標的遺伝子発現のレベルを、未治療または対照の細胞または対象における発現のレベルと比較することによって決定され得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物及び方法は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、約２５％〜約５０％、約４０％〜約６０％、約５０％〜約７０％、約６０％〜約８０％、約８０％〜約１００％、約１００％〜約１２５％、約１００〜約１５０％、約１５０％〜約２００％、約２００％〜約３００％、約３００％〜約４００％、約４００％〜約５００％、または５００％超の標的遺伝子の発現の増加を引き起こす。いくつかの実施形態では、本開示の組成物及び方法は、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１２倍、約１５倍、約１８倍、約２０倍、約２５倍、または３０倍超の標的遺伝子の発現の倍率変化を引き起こす。いくつかの実施形態では、本開示の組成物及び方法は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、約２５％〜約５０％、約４０％〜約６０％、約５０％〜約７０％、約６０％〜約８０％、８０％超、またはさらには９０％、９５％、もしくは９９％超の標的遺伝子の発現の低減を引き起こす。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物及び方法によって誘導される標的遺伝子の発現の増加は、対象における関連する疾患、障害または病態の１つ以上の徴候または症状を予防または緩和するのに十分であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物及び方法によって誘導される標的遺伝子の発現の低減は、対象における関連する疾患、障害または病態の１つ以上の徴候または症状を予防または緩和するのに十分であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物及び方法によって誘導される遺伝子のセットの発現の変化は、対象における関連する疾患、障害または病態の１つ以上の徴候または症状を予防または緩和するのに十分であり得る。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本開示は、染色体２ｑ３５上のＦＮ１遺伝子によってエンコードされる、フィブロネクチンの沈着によって引き起こされる、フィブロネクチン腎症の治療または予防のための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で教示される少なくとも１つの化合物または方法は、ＦＮ１遺伝子の発現を制御することに関与するシグナル伝達中心（複数可）を変更することによって、フィブロネクチンのレベルを低減する。フィブロネクチンレベルの低減は、フィブロネクチン腎症の表現型を救出するのに十分であり得る。ある特定の実施形態では、ＦＮ１発現を低減することができる化合物は、スムーズンドアゴニスト、クリゾチニブ、ＢＧＪ３９８、ＡＺＤ２８５８、ベシル酸アムロジピン、ＰＨＡ−６６５７５２、ＯＳＵ−０３０１２、ｂｍｓ−９８６０９４（ｉｎｘ−１８９）、アファチニブ、ＬＤＮ１９３１８９、ソトラスタウリン、ＳＫＬ２００１、チボザニブ、セジラニブ（ｃｅｄｉｒａｎｄｉｂ）、カルシトリオール、リモナバント、メレスチニブ、ＢＭＰ４、及びＧＤＦ２（ＢＭＰ９）から選択される。いくつかの実施形態では、スムーズンドアゴニストは、ＦＮ１の発現を低減するために、ヘッジホッグ／スムーズンド経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、クリゾチニブは、ＦＮ１の発現を低減するために、ｃ−ＭＥＴ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＢＧＪ３９８は、ＦＮ１の発現を低減するために、ＦＧＦＲ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＡＺＤ２８５８は、ＦＮ１の発現を低減するために、ＧＳＫ−３経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ベシル酸アムロジピンは、ＦＮ１の発現を低減するために、カルシウムチャネル経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＰＨＡ−６６５７５２は、ＦＮ１の発現を低減するために、ｃ−ＭＥＴ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＯＳＵ−０３０１２は、ＦＮ１の発現を低減するために、ＰＤＫ−１経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、アファチニブは、ＦＮ１の発現を低減するために、ＥＧＦＲ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＬＤＮ１９３１８９は、ＦＮ１の発現を低減するために、ＴＧＦ−Ｂ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ソトラスタウリンは、ＦＮ１の発現を低減するために、ＰＫＣ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＳＫＬ２００１は、ＦＮ１の発現を低減するために、ＷＮＴ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、チボザニブは、ＦＮ１の発現を低減するために、タンパク質チロシンキナーゼ／ＲＴＫ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、セジラニブは、ＦＮ１の発現を低減するために、タンパク質チロシンキナーゼ／ＲＴＫ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、カルシトリオールは、ＦＮ１の発現を低減するために、ビタミンＤ受容体経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、リモナバントは、ＦＮ１の発現を低減するために、カンナビノイド受容体経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、メレスチニブは、ＦＮ１の発現を低減するために、ｃ−ＭＥＴ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、ＦＮ１の発現を低減するために、ＴＧＦ−Ｂ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）は、ＦＮ１の発現を低減するために、ＴＧＦ−Ｂ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、本開示は、染色体３ｑ１１．２上のＣＰＯＸ遺伝子によってエンコードされる、酵素コプロポルフィリノーゲンオキシダーゼの欠損によって引き起こされる、遺伝性コプロポルフィリン症の治療または予防のための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で教示される少なくとも１つの化合物または方法は、ＣＰＯＸ遺伝子の発現を制御することに関与するシグナル伝達中心（複数可）を変更することによって、コプロポルフィリノーゲンオキシダーゼのレベルを上昇させる。コプロポルフィリノーゲンオキシダーゼのレベルの上昇は、遺伝性コプロポルフィリン症の表現型を救出するのに十分であり得る。ある特定の実施形態では、ＣＰＯＸ発現を増加させることができる化合物は、サリドマイド、グリコピロレート、ＭＫ−０７５２、ボスチニブ、ネファゾドン、コルチコステロン、デフェロキサミンメシル酸塩、ＧＺＤ８２４ジメシル酸塩、ＸＭＵ−ＭＰ−１、プレドニゾン、ＦＩＣＺ、ＳＫＬ２００１、塩化コバルト、及び１７−ＡＡＧ（タネスピマイシン）から選択される。いくつかの実施形態では、サリドマイドは、ＣＰＯＸの発現を増加させるために、ＮＦ−ｋＢ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、グリコピロレートは、ＣＰＯＸの発現を増加させるために、アセチルコリン受容体経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＭＫ−０７５２は、ＣＰＯＸの発現を増加させるために、ＮＯＴＣＨシグナル伝達経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ボスチニブは、ＣＰＯＸの発現を増加させるために、Ｓｒｃ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ネファゾドンは、ＣＰＯＸの発現を増加させるために、カルシウムシグナル伝達経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、コルチコステロンは、ＣＰＯＸの発現を増加させるために、ミネラルコルチコイド受容体経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、デフェロキサミンメシル酸塩は、ＣＰＯＸの発現を増加させるために、低酸素活性化経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＧＺＤ８２４ジメシル酸塩は、ＣＰＯＸの発現を増加させるために、ＡＢＬ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＸＭＵ−ＭＰ−１は、ＣＰＯＸの発現を増加させるために、Ｈｉｐｐｏ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、プレドニゾンは、ＣＰＯＸの発現を増加させるために、ＧＲシグナル伝達経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＦＩＣＺは、ＣＰＯＸの発現を増加させるために、アリール炭水化物受容体経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＳＫＬ２００１は、ＣＰＯＸの発現を増加させるために、ＷＮＴ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、塩化コバルトは、ＣＰＯＸの発現を増加させるために、低酸素活性化経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、１７−ＡＡＧ（タネスピマイシン）は、ＣＰＯＸの発現を増加させるために、細胞周期／ＤＮＡ損傷；代謝酵素／プロテアーゼ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本開示は、染色体１ｑ２５．１上のＳＥＲＰＩＮＣ１遺伝子によってエンコードされる、アンチトロンビン（以前はアンチトロンビンＩＩＩとして既知）の欠損によって引き起こされる、ＳＥＲＰＩＮＣ１欠損症の治療または予防のための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で教示される少なくとも１つの化合物または方法は、ＳＥＲＰＩＮＣ１遺伝子の発現を制御することに関与するシグナル伝達中心（複数可）を変更することによって、アンチトロンビンのレベルを上昇させる。アンチトロンビンのレベルの上昇は、ＳＥＲＰＩＮＣ１欠損症の表現型を救出するのに十分であり得る。ある特定の実施形態では、ＳＥＲＰＩＮＣ１発現を増加させることができる化合物は、ＣＰ−６７３４５１、エキノマイシン、パクリチニブ、アムバチニブ、クレノラニブ、ＩＮＮＯ−２０６（アルドキソルビシン）、モメロチニブ、サリドマイド、及びピフィスリン−μから選択される。いくつかの実施形態では、ＣＰ−６７３４５１は、ＳＥＲＰＩＮＣ１の発現を増加させるために、ＰＤＧＦＲ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、エキノマイシンは、ＳＥＲＰＩＮＣ１の発現を増加させるために、低酸素活性化経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、パクリチニブは、ＳＥＲＰＩＮＣ１の発現を増加させるために、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、アムバチニブは、ＳＥＲＰＩＮＣ１の発現を増加させるために、ＰＤＧＦＲ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、クレノラニブは、ＳＥＲＰＩＮＣ１の発現を増加させるために、ＰＤＧＦＲ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＩＮＮＯ−２０６（アルドキソルビシン）は、ＳＥＲＰＩＮＣ１の発現を増加させるために、細胞周期／ＤＮＡ損傷経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、モメロチニブは、ＳＥＲＰＩＮＣ１の発現を増加させるために、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、サリドマイドは、ＳＥＲＰＩＮＣ１の発現を増加させるために、ＮＦ−ｋＢ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ピフィスリン−μは、ＳＥＲＰＩＮＣ１の発現を増加させるために、ｐ５３経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、本開示は、染色体２０ｐ１２．２上のＪＡＧ１遺伝子及び染色体１ｐ１２上のＮＯＴＣＨ２遺伝子によってそれぞれエンコードされる、ｊａｇｇｅｄ  １リガンド及び／またはＮｏｔｃｈ２受容体の欠損によって引き起こされる、アラジール症候群の治療または予防のための組成物及び方法を提供する。ほとんどのアラジール症候群患者は、ｊａｇｇｅｄ  １においてハプロ不全を有し、一部はＮｏｔｃｈ２の欠損も有する。いくつかの実施形態では、本明細書で教示される少なくとも１つの化合物または方法は、ＪＡＧ１遺伝子及び／またはＮＯＴＣＨ２遺伝子の発現を制御することに関与するシグナル伝達中心（複数可）を変更することによって、ｊａｇｇｅｄ  １及びＮｏｔｃｈ２のレベルを上昇させる。ＪＡＧ１及び／またはＮｏｔｃｈ２のレベルの上昇は、アラジール症候群の表現型を救出するのに十分であり得る。ある特定の実施形態では、ＪＡＧ１及び／またはＮＯＴＣＨ２発現を増加させることができる化合物は、両方の遺伝子の発現を増加させるために、メレスチニブ及びトルセトラピブから選択される。ある特定の実施形態では、化合物は、ＬＤＮ１９３１８９、ＬＤＮ２１２８５４、サリドマイド、フェンホルミン、エンザスタウリン、ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）、ＢＭＰ２、ＩＮＮＯ−２０６（アルドキソルビシン）、アムバチニブ、ＢＭＰ４及びＢＡＹ  ８７−２２４３から選択されて、ＪＡＧ１のシグナル伝達中心（複数可）を変更してＪＡＧ１の発現を増加させる。代替として、化合物は、ジボテンタン及び７４０Ｙ−Ｐから選択されて、ＮＯＴＣＨ２のシグナル伝達中心（複数可）を変更してＮＯＴＣＨ２発現を増加させる。いくつかの実施形態では、ＬＤＮ１９３１８９は、ＪＡＧ１またはＮＯＴＣＨ２の発現を増加させるために、ＴＧＦ−Ｂ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＬＤＮ−２１２８５４は、ＪＡＧ１またはＮＯＴＣＨ２の発現を増加させるために、ＴＧＦ−Ｂ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、サリドマイドは、ＪＡＧ１またはＮＯＴＣＨ２の発現を増加させるために、ＮＦ−ｋＢ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、フェンホルミンは、ＪＡＧ１またはＮＯＴＣＨ２の発現を増加させるために、ＡＭＰＫ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、エンザスタウリンは、ＪＡＧ１またはＮＯＴＣＨ２の発現を増加させるために、エピジェネティクス；ＴＧＦ−ベータ／Ｓｍａｄ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）は、ＪＡＧ１またはＮＯＴＣＨ２の発現を増加させるために、ＴＧＦ−Ｂ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ２は、ＪＡＧ１またはＮＯＴＣＨ２の発現を増加させるために、ＴＧＦ−Ｂ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＩＮＮＯ−２０６（アルドキソルビシン）は、ＪＡＧ１またはＮＯＴＣＨ２の発現を増加させるために、細胞周期／ＤＮＡ損傷経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、メレスチ���ブは、ＪＡＧ１またはＮＯＴＣＨ２の発現を増加させるために、ｃ−ＭＥＴ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、アムバチニブは、ＪＡＧ１またはＮＯＴＣＨ２の発現を増加させるために、ＰＤＧＦＲ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、ＪＡＧ１またはＮＯＴＣＨ２の発現を増加させるために、ＴＧＦ−Ｂ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＢＡＹ  ８７−２２４３は、ＪＡＧ１またはＮＯＴＣＨ２の発現を増加させるために、低酸素活性化経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ジボテンタンは、ＪＡＧ１またはＮＯＴＣＨ２の発現を増加させるために、ＧＰＣＲ／Ｇタンパク質経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、７４０Ｙ−Ｐは、ＪＡＧ１またはＮＯＴＣＨ２の発現を増加させるために、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本開示は、染色体１１ｑ２３．３上の遺伝子ＳＬＣ３７Ａ４によってエンコードされる、グルコース−６−リン酸トランスロカーゼ（Ｇ６ＰＴ）の欠損によって引き起こされる、糖原病１ｂを治療または予防するための組成物及び方法を提供する。コード領域ＳＬＣ３７Ａ４における変異は、部分的に機能的なタンパク質につながり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で教示される少なくとも１つの化合物または方法は、ＳＬＣ３７Ａ４遺伝子の発現を制御することに関与するシグナル伝達中心（複数可）を変更することによって、グルコース−６−リン酸トランスロカーゼのレベルを上昇させる。グルコース−６−リン酸トランスロカーゼ（Ｇ６ＰＴ）のレベルの上昇は、糖原病１ｂの表現型を救出するのに十分であり得る。ある特定の実施形態では、ＳＬＣ３７Ａ４発現を増加させることができる化合物は、エキノマイシン、プレドニゾン、ＣＰ−６７３４５１、塩化コバルト、アムバチニブ、パクリチニブ、Ｒ７８８（フォスタマチニブ、二ナトリウム六水和物、ＧＺＤ８２４ジメシル酸塩、コルチコステロン、デキサメタゾン、ＴＮＦ−α（ＴＮＦ−ａ）、サリドマイド、及びＩＧＦ−１から選択される。いくつかの実施形態では、エキノマイシンは、ＳＬＣ３７Ａ４の発現を増加させるために、低酸素活性化経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、プレドニゾンは、ＳＬＣ３７Ａ４の発現を増加させるために、ＧＲシグナル伝達経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＣＰ−６７３４５１は、ＳＬＣ３７Ａ４の発現を増加させるために、ＰＤＧＦＲ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、塩化コバルトは、ＳＬＣ３７Ａ４の発現を増加させるために、低酸素活性化経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、アムバチニブは、ＳＬＣ３７Ａ４の発現を増加させるために、ＰＤＧＦＲ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）は、ＳＬＣ３７Ａ４の発現を増加させるために、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、Ｒ７８８（フォスタマチニブ二ナトリウム六水和物）は、ＳＬＣ３７Ａ４の発現を増加させるために、タンパク質チロシンキナーゼ／ＲＴＫ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＧＺＤ８２４ジメシル酸塩は、ＳＬＣ３７Ａ４の発現を増加させるために、ＡＢＬ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、コルチコステロンは、ＳＬＣ３７Ａ４の発現を増加させるために、ミネラルコルチコイド受容体経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、デキサメタゾンは、ＳＬＣ３７Ａ４の発現を増加させるために、グルココルチコイド受容体経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＴＮＦ−ａは、ＳＬＣ３７Ａ４の発現を増加させるために、ＮＦ−ｋＢ、ＭＡＰＫ、アポトーシス経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、サリドマイド���、ＳＬＣ３７Ａ４の発現を増加させるために、ＮＦ−ｋＢ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−１は、ＳＬＣ３７Ａ４の発現を増加させるために、ＩＧＦ−１Ｒ／ＩｎｓＲ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、本開示は、染色体１１ｑ２３．３上のＨＭＢＳ遺伝子によってエンコードされる、ヒドロキシメチルビランシンターゼ（ＨＭＢＳ）の欠損によって引き起こされる、急性間欠性ポルフィリン症の治療または予防のための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で教示される少なくとも１つの化合物または方法は、ＨＭＢＳ遺伝子の発現を制御することに関与するシグナル伝達中心（複数可）を変更することによって、ＨＭＢＳのレベルを上昇させる。ＨＭＢＳのレベルの上昇は、急性間欠性ポルフィリン症の表現型を救出するのに十分であり得る。いくつかの実施形態では、ＨＭＢＳ発現を増加させることができる化合物は、ソトラスタウリンである。いくつかの実施形態では、ソトラスタウリンは、ＨＭＢＳの発現を増加させるために、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）シグナル伝達経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本開示は、染色体５ｑ３１．１上のＬＥＣＴ２遺伝子によってエンコードされる、白血球走化性因子２（ＬＥＣＴ２）タンパク質の沈着によって引き起こされる、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスの治療または予防のための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で教示される少なくとも１つの化合物または方法は、ＬＥＣＴ２遺伝子の発現を制御することに関与するシグナル伝達中心（複数可）を変更することによって、ＬＥＣＴ２のレベルを低下させる。ＬＥＣＴ２のレベルの低減は、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスの表現型を救出するのに十分であり得る。いくつかの実施形態では、ＬＥＣＴ２発現を低減することができる化合物は、カルシトリオール、１７−ＡＡＧ（タネスピマイシン）、リトナビル、ＴＦＰ、ｂ−エストラジオール、リファンピシン、トルセトラピブ、ジボテンタン、リモナバント、ＯＳＵ−０３０１２、アファチニブ、ＮＳＣ２２８１５５、グルコース、ＡＰＳ−２−７９、ホルボール１２１３−ジブチラート、プレドニゾン、７４０  Ｙ−Ｐ、ベシル酸アムロジピン、及びダラプラジブから選択される。いくつかの実施形態では、カルシトリオールは、ＬＥＣＴ２の発現を低減するために、ビタミンＤ受容体経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、１７−ＡＡＧ（タネスピマイシン）は、ＬＥＣＴ２の発現を低減するために、細胞周期／ＤＮＡ損傷；代謝酵素／プロテアーゼ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＴＦＰは、ＬＥＣＴ２の発現を低減するために、Ｐ５３経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ｂ−エストラジオールは、ＬＥＣＴ２の発現を低減するために、ＥＲ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、リファンピシンは、ＬＥＣＴ２の発現を低減するために、ＰＸＲ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ジボテンタンは、ＬＥＣＴ２の発現を低減するために、ＧＰＣＲ／Ｇタンパク質経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、リモナバントは、ＬＥＣＴ２の発現を低減するために、カンナビノイド受容体経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＯＳＵ−０３０１２は、ＬＥＣＴ２の発現を低減するために、ＰＤＫ−１経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、アファチニブは、ＬＥＣＴ２の発現を低減するために、ＥＧＦＲ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＮＳＣ２２８１５５は、ＬＥＣＴ２の発現を低減するために、ＥＧＦＲ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、グルコースは、ＬＥＣＴ２の発現を低減するために、代謝／解糖経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＡＰＳ−２−７９は、ＬＥＣＴ２の発現を低減するために、ＭＡＰＫ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ホルボール１２１３−ジブチラートは、ＬＥＣＴ２の発現を低減するために、ＰＫＣ経路中の少なく���も１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、プレドニゾンは、ＬＥＣＴ２の発現を低減するために、ＧＲ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、７４０Ｙ−Ｐは、ＬＥＣＴ２の発現を低減するために、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ベシル酸アムロジピンは、ＬＥＣＴ２の発現を低減するために、カルシウムチャネル経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本開示は、染色体２２ｑ１２．３上のＡＰＯＬ１遺伝子によってエンコードされる、アポリポタンパク質Ｌ１（ＡＰＯＬ１）のリスク変異体によって引き起こされる、ＡＰＯＬ１関連糸球体疾患の治療または予防のための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で教示される少なくとも１つの化合物または方法は、ＡＰＯＬ１遺伝子の発現を制御することに関与するシグナル伝達中心（複数可）を変更することによって、ＵＤＰ−グリクロノシルトランスフェラーゼ（ｇｌｙｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）のレベルを低下させる。ＡＰＯＬ１のレベルの低減は、ＡＰＯＬ１関連糸球体疾患の表現型を救出するのに十分であり得る。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＬ１発現を低減することができる化合物は、ニトロフラントイン及びクリゾチニブから選択される。いくつかの実施形態では、ニトロフラントインは、ＡＰＯＬ１の発現を低減するために、抗生物質経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、クリゾチニブは、ＡＰＯＬ１の発現を低減するために、ｃ−ＭＥＴ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本開示は、染色体２ｑ３７．１上のＵＧＴ１Ａ１遺伝子によってエンコードされる、ウリジン５’−二リン酸（ＵＤＰ）−グリクロノシルトランスフェラーゼであるジルベール症候群及び／またはクリグラーナジャーＩＩ型の治療または予防のための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で教示される少なくとも１つの化合物または方法は、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子の発現を制御することに関与するシグナル伝達中心（複数可）を変更することによって、ＵＤＰ−グリクロノシルトランスフェラーゼのレベルを上昇させる。ＵＤＰ−グリクロノシルトランスフェラーゼのレベルの上昇は、ジルベール症候群及び／またはクリグラーナジャーＩＩ型の表現型を救出するのに十分であり得る。ある特定の実施形態において、化合物または刺激は、ＦＩＣＺ、カルトゲニン、ｍｅＢＩＯ、ＣＰ−６７３４５１、ＢＡＭ７、ＥＷ−７１９７、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）、ピフィスリン−ａ、ＬＹ２９４００２、ＢＭＳ−７５４８０７、ベキサロテン、クリゾチニブ、ＡＲＮ−５０９、エキノマイシン、ＪＮＪ−３８８７７６０５、オメプラゾール、ＲＯ４９２９０９７、モメロチニブ、ＢＩＲＢ７９６、ＡＺＤ６７３８、セマガセスタット、グリメピリド、ＡＺＤ１４８０、クリプトタンシノン、ＧＷ４０６４、ＬＲＨ−１アンタゴニスト、ＰＮＤ−１１８６、クレノラニブ、ＥＢ１０８９、ソトラスタウリン、コルチコステロン、ＧＺＤ８２４ジメシル酸塩、ネタルスジル、Ｒ７８８（フォスタマチニブ二ナトリウム六水和物）、オキソグラウシン、エバセトラピブ、ＬＹ２５８４７０２、メレスチニブ、ＣＩ−４ＡＳ−１、ダサチニブ、ロロフィリン（ＫＷ−３９０２）、ＩＷＰ−２、Ｔ０９０１３１７、リトナビル、ＢＩＯ、アムバチニブ、ＦＲＡＸ５９７、抗ミュラー管ホルモン、Ｗｎｔ３ａ、デセルノチニブ、ドルソモルフィン、エトミデート、及びＧＤＣ−０８７９から選択される。いくつかの実施形態では、ＦＩＣＺは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、アリール炭水化物受容体経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、カルトゲニンは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＴＧＦ−Ｂ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ｍｅＢＩＯは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、アリール炭水化物受容体経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＣＰ−６７３４５１は、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＰＤＧＦＲ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＢＡＭ７は、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＢＣＬ２経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＥＷ−７１９７は、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＴＧＦ−Ｂ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ピフィスリン−ａは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ｐ５３経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＬＹ２９４００２は、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＢＭＳ−７５４８０７は、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＩＧＦ−１Ｒ／ＩｎｓＲ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ベキサロテンは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＲＸＲ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、クリゾチニブは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ｃ−ＭＥＴ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＡＲＮ−５０９は、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、アンドロゲン受容体経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、エキノマイシンは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、低酸素活性化経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＪＮＪ−３８８７７６０５は、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ｃ−ＭＥＴ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、オメプラゾールは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、プロトンポンプ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＲＯ４９２９０９７は、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＮＯＴＣＨ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、モメロチニブは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＢＩＲＢ  ７９６は、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＭＡＰＫ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＡＺＤ６７３８は、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＡＴＭ／ＡＴＲ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、セマガセスタットは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、Ｎｏｔｃｈ、神経シグナル伝達；幹細胞／Ｗｎｔ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、グリメピリドは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、カリウムチャネル経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＡＺＤ１４８０は、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、クリプトタンシノンは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＧＷ４０６４は、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＦＸＲ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＬＲＨ−１アンタゴニストは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＬＨＲ−１経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＰＮＤ−１１８６は、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＦＡＫ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、クレノラニブは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＰＤＧＦＲ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形���では、ＥＢ１０８９は、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ビタミンＤ受容体経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ソトラスタウリンは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＰＫＣ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、コルチコステロンは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ミネラルコルチコイド受容体経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＧＺＤ８２４ジメシル酸塩は、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＡＢＬ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ネタルスジルは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＲＯＣＫ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、Ｒ７８８（フォスタマチニブ二ナトリウム六水和物）は、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、タンパク質チロシンキナーゼ／ＲＴＫ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、オキソグラウシンは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＬＹ２５８４７０２は、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、Ｓ６Ｋ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、メレスチニブは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ｃ−ＭＥＴ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＣＩ−４ＡＳ−１は、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、アンドロゲン受容体経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ダサチニブは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＡＢＬ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＩＷＰ−２は、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＷＮＴ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、Ｔ０９０１３１７は、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＬＸＲ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＢＩＯは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、Ｐａｎ−ＧＳＫ−３経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、アムバチニブは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＰＤＧＦＲ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＦＲＡＸ５９７は、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＰＡＫ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、抗ミュラー管ホルモンは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＴＧＦ−Ｂ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３ａは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＷＮＴ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、デセルノチニブは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ドルソモルフィンは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＡＭ���Ｋ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、エトミデートは、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＧＡＢＡ作動性受容体経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。いくつかの実施形態では、ＧＤＣ−０８７９は、ＵＧＴ１Ａ１の発現を増加させるために、ＭＡＰＫ経路中の少なくとも１つの構成成分を摂動させる。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本開示は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）の欠陥、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）中の機能変異の増加、及びアンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）の発現の増加と関連付けられている、脂質異常症の治療または予防のための組成物及び方法を提供する。ＬＤＬＲは、染色体１９ｐ１３．２上のＬＤＬＲ遺伝子によってエンコードされ、ＰＣＳＫ９は、染色体１ｐ３２．３上のＰＣＳＫ９遺伝子によってエンコードされ、ＡＮＧＰＴＬ３は、染色体１ｐ３１．３上のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってエンコードされる。いくつかの実施形態では、本明細書で教示される少なくとも１つの化合物または方法は、ＬＤＬＲ、ＰＣＳＫ９及び／またはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を制御することに関与するシグナル伝達中心（複数可）を変更することによって、ＬＤＬ受容体のレベルを上昇させ、かつ／またはＰＣＳＫ９及び／もしくはＡＮＧＰＴＬ３のレベルを低下させる。ＬＤＬ受容体のレベルの上昇ならびに／またはＰＣＳＫ９及び／もしくはＡＮＧＰＴＬ３のレベルの低下は、高い総コレステロール、高いＬＤＬ−Ｃ、または高いトリグリセリドを含む、複数の異常をもたらすリポタンパク質代謝の障害を含む、脂質異常症の表現型を救出するのに十分であり得る。ある特定の実施形態では、ＬＤＬＲ発現を増加させること、ならびに／またはＰＣＳＫ９及び／もしくはＡＮＧＰＴＬ３発現を減少させることができる化合物は、ＷＹＥ−１２５１３２（ＷＹＥ−１３２）及びピフィスリン−μから選択される。ある特定の実施形態では、化合物は、ＳＧＩ−１７７６、プレラデナント及びＣＯ−１６８６（ロシレチニブ）から選択されて、ＡＮＧＰＴＬ３を減少させ、ＬＤＬＲを増加させる。代替として、化合物は、ＬＤＬＲを増加させ、ＰＣＳＫ９を減少させるために、ＬＹ２９４００２であってもよい。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、本開示は、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）の欠陥と関連付けられている、レット症候群の治療または予防のための組成物及び方法を提供する。ＭＥＣＰ２は、染色体Ｘｑ２８上のＭＥＣＰ２遺伝子によってエンコードされる。いくつかの実施形態では、本明細書で教示される少なくとも１つの化合物または方法は、ＭＥＣＰ２の発現を制御することに関与するシグナル伝達中心（複数可）を変更することによって、ＭＥＣＰ２のレベルを上昇させる。ＭＥＣＰ２のレベルの上昇は、レット症候群の表現型を救出するのに十分であり得る。ある特定の実施形態では、ＭＥＣＰ２発現を増加させることができる化合物は、１７−ＡＡＧ（タネスピマイシン）／ＫＯＳ−９５３である。
【０１５５】
小分子
いくつかの実施形態では、標的遺伝子の発現を調整するために使用される化合物は、小分子を含み得る。本明細書で使用される場合、「小分子」という用語は、生物学的過程の調節を助けることができる低分子量薬物、すなわち、５０００ダルトン未満の有機化合物を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される小分子化合物をゲノム系に適用して、標的遺伝子に関連する遺伝子シグナル伝達ネットワークの構成成分（例えば、転写因子、シグナル伝達タンパク質）と干渉させ、それにより標的遺伝子の発現を調整する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される小分子化合物をゲノム系に適用して、絶縁近傍の境界を変更、及び／または標的遺伝子に関連するシグナル伝達中心を崩壊させ、それにより標的遺伝子の発現を調整する。
【０１５６】
小分子スクリーニングを実施して、絶縁近傍のシグナル伝達中心を通して作用する小分子を特定して、標的遺伝子の発現を調整し得る遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更することができる。例えば、既知のシグナル伝達アゴニスト／アンタゴニストが投与され得る。信用できるヒットは、シグナル伝達中心を通して作用し、標的遺伝子の発現を調整することが知られている小分子によって特定され、検証される。
【０１５７】
ポリペプチド
いくつかの実施形態では、標的遺伝子の発現を変更するための化合物は、ポリペプチドを含む。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、最も多くの場合、ペプチド結合によって一緒に結合される（天然または非天然の）アミノ酸残基のポリマーを指す。本明細書で使用される場合、この用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。場合によっては、エンコードされるポリペプチドは、約５０アミノ酸よりも小さく、ポリペプチドは、ペプチドと呼ばれる。ポリペプチドがペプチドである場合、少なくとも約２、３、４、または少なくとも５アミノ酸残基長となる。したがって、ポリペプチドとしては、遺伝子産生物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片、ならびに前述の他の同等物、変異体、及び類似体が挙げられる。ポリペプチドは、単一分子であり得るか、または二量体、三量体、もしくは四量体などの多分子複合体であり得る。それらはまた、一本鎖または多鎖ポリペプチドも含み得、会合または結合され得る。ポリペプチドという用語はまた、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【０１５８】
抗体
いくつかの実施形態では、標的遺伝子の発現を変更するための化合物は、抗体を含む。一実施形態では、本明細書に記載される抗体、抗体断片、それらの変異体または誘導体を含む本開示の抗体は、標的遺伝子に関連する遺伝子シグナル伝達ネットワークの少なくとも１つの構成成分と特異的に免疫反応性である。
【０１５９】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、最も広義に使用され、それらが所望の生物活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、少なくとも２つの無傷抗体から形成された二重特異性抗体）、及びダイアボディなどの抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、主にアミノ酸系分子であるだけでなく、糖部分を有するなど、１つ以上の修飾も含み得る。
【０１６０】
「抗体断片」は、無傷抗体の一部分を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、及びＦｖ断片、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。抗体のパパイン消化は、それぞれが単一の抗原結合部位を持つ「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を産生する。残基「Ｆｃ」断片もまた産生され、その名前は、それが容易に結晶化する能力を反映する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有しながら依然として抗原に架橋することができる、Ｆ（ａｂ′）２断片が得られる。本開示の抗体は、これらの断片のうちの１つ以上を含み得る。本明細書の目的に関しては、「抗体」は、重及び軽可変ドメイン、ならびにＦｃ領域を含み得る。
【０１６１】
「未変性抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、いくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。
【０１６２】
本明細書で使用される場合、「可変ドメイン」という用語は、配列が抗体間で大きく異なり、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性において使用される特定の抗体ドメインを指す。本明細書で使用される場合、「Ｆｖ」という用語は、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含有する抗体断片を指す。この領域は、緊密な非共有結合性会合にある１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。
【０１６３】
任意の脊椎動物種由来の抗体「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κとλと呼ばれる２つの明確に異なる型のいずれかに割り当てることができる。抗体は、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当てられ得る。無傷抗体には５つの主要なクラス、すなわち：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２にさらに分けられ得る。
【０１６４】
本明細書で使用される場合、「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、ＶＨ及びＶＬ抗体ドメインの融合タンパク質を指し、これらのドメインは一緒に、単一のポリペプチド鎖に結合される。いくつかの実施形態では、Ｆｖポリペプチドリンカーは、ｓｃＦｖが、抗原結合のための所望の構造を形成できるようにする。
【０１６５】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、これらの断片は、同じポリペプチド鎖内の軽鎖可変ドメインＶＬに接続した重鎖可変ドメインＶＨを含む。同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させて、２つの抗原結合部位を生成させる。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）にさらに詳述されており、これらの各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６６】
本開示の抗体は、当該技術分野において既知の方法によって産生されるか、または本出願に記載されるポリクローナルまたはモノクローナルまたは組み換えであり得る。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の細胞（またはクローン）の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は、同一であり、及び／または同じエピトープに結合するが、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る想定される変異体は除外され、そのような変異体は、一般に、少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【０１６７】
「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示すものであり、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されないものとする。本明細書におけるモノクローナル抗体には、重鎖及び／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種であるが、鎖（複数可）の残りが、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにそのような抗体の断片が含まれる。
【０１６８】
「ヒト化」型の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの抗体からの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の抗体からの超可変領域からの残基によって置き換えられる、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。
【０１６９】
「超可変領域」という用語は、抗体を参照して本明細書で使用されるとき、抗原結合に関与するアミノ酸残基を含む抗体の抗原結合ドメイン内の領域を指す。超可変領域内に存在するアミノ酸は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の構造を決定する。本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」は、その標的抗原またはエピトープに相補的である構造を含む抗体の領域を指す。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、抗体模倣体であり得る。「抗体模倣体」という用語は、抗体の機能または効果を模倣し、それらの分子標的に特異的に高い親和性で結合する任意の分子を指す。そのようなものとして、抗体模倣体は、ナノボディなどを含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、抗体模倣体は、当該技術分野において既知のものであり得、アフィボディ分子、アフィリン、アフィチン、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、Ｆｙｎｏｍｅｒ及びＫｕｎｉｔｚ、ならびにドメインペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、抗体模倣体は、１つ以上の非ペプチド領域を含み得る。
【０１７２】
本明細書で使用される場合、「抗体変異体」という用語は、未変性抗体と比較してアミノ酸配列、組成物または構造にいくつかの相違を含む、構造及び／または機能において抗体に似ている生体分子を指す。
【０１７３】
モノクローナルであるかポリクローナルであるかにかかわらず、抗体の調製は当該技術分野において既知である。抗体の産生のための技法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ″Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ″，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８  ａｎｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ″Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ″Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。
【０１７４】
本開示の抗体は、それらの標的分子（複数可）、それらを生成するために使用される抗原、それらの機能（アゴニストとしてもしくはアンタゴニストとして）及び／またはそれらが機能する細胞ニッチを特徴とし得る。
【０１７５】
抗体機能の測定は、インビトロまたはインビボで正常な生理的条件下、標準に対して行われ得る。測定はまた、抗体の存在または非存在に対して行われ得る。そのような測定方法には、血清または血液などの組織または流体中の標準測定、例えば、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、活性アッセイ、レポーターアッセイ、ルシフェラーゼアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アレイ、遺伝子アレイ、リアルタイム逆転写酵素（ＲＴ）ＰＣＲなどが含まれる。
【０１７６】
本開示の抗体は、結合を介して（可逆的または不可逆的に）１つ以上の標的部位にそれらの効果を及ぼす。理論に束縛されるものではないが、抗体の結合部位を表す標的部位は、最も多くの場合、タンパク質またはタンパク質ドメインまたは領域によって形成される。しかしながら、標的部位はまた、糖、脂質、核酸分子または任意の他の形態の結合エピトープなどの生体分子を含み得る。
【０１７７】
代替として、または追加として、本開示の抗体は、結合またはコンジュゲートされた薬物ペイロードを特定の標的部位に送達または輸送するように作用する、リガンド模倣体または非伝統的なペイロードキャリアとして機能し得る。
【０１７８】
本開示の抗体によって引き出される変化は、細胞中の新形態変化をもたらし得る。本明細書で使用される場合、「新形態変化」は、新たなまたは異なる変化または変更である。そのような変化は、細胞外、細胞内及び細胞間シグナル伝達を含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、本開示の化合物または薬剤は、タンパク分解性事象を変更または制御するように作用する。そのような事象は、細胞内または細胞外であり得る。
【０１８０】
本開示の抗体、ならびにそれらを生成するために使用される抗原は、主にアミノ酸系分子である。これらの分子は、「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」であり得る。
【０１８１】
本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は、２〜５０個以上のアミノ酸を有するアミノ酸系分子を指す。特別な指示語が、より小さいペプチドに適用され、「ジペプチド」は、２つのアミノ酸分子を指し、「トリペプチド」は、３つのアミノ酸分子を指す。５０を超える連続アミノ酸を有するアミノ酸系分子は、ポリペプチドまたはタンパク質とみなされる。
【０１８２】
「アミノ酸」及び「アミノ酸」という用語は、全て天然に存在するＬ−α−アミノ酸ならびに非天然に存在するアミノ酸を指す。アミノ酸は、以下のような１文字または３文字のいずれかの指示語によって特定され：アスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）、イソロイシン（Ｉｌｅ：Ｉ）、トレオニン（Ｔｈｒ：Ｔ）、ロイシン（Ｌｅｕ：Ｌ）、セリン（Ｓｅｒ：Ｓ）、チロシン（Ｔｙｒ：Ｙ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ：Ｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ：Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ：Ｐ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ：Ｈ）、グリシン（Ｇｌｙ：Ｇ）、リジン（Ｌｙｓ：Ｋ）、アラニン（Ａｌａ：Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ：Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ：Ｃ）、トリプトファン（Ｔｒｐ：Ｗ）、バリン（Ｖａｌ：Ｖ）、グルタミン（Ｇｌｎ：Ｑ）、メチオニン（Ｍｅｔ：Ｍ）、アスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ）、アミノ酸は、最初にそれぞれ３文字コード及び１文字コードによって挿入句的に列挙される。
【０１８３】
ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション機構を介して機能するものを含むオリゴヌクレオチドは、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ構築物（ｓｉＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡなどを含む）、アプタマー及びリボザイムなどの一本鎖または二本鎖にかかわらず、標的遺伝子に関連する遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更するために、または摂動刺激として使用され得る。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を使用して、標的遺伝子の発現を調節する経路に関与するシグナル伝達分子をノックダウンすることができ、それにより発現は、シグナル伝達分子の非存在下で変更される。例えば、経路が標的遺伝子の発現を負に調節することが特定されると、その経路の構成成分（例えば、受容体、プロテインキナーゼ、転写因子）は、ＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）でノックダウンされ、遺伝子の発現を強化することができる。同様に、経路が標的遺伝子の発現を正に調節することが特定されると、その経路の構成成分（例えば、受容体、プロテインキナーゼ、転写因子）は、ＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）でノックダウンされ、遺伝子の発現を低減することができる。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、２つ以上のハイブリダイジングオリゴヌクレオチドを使用して、同じ経路において２つ以上の構成成分を標的とするか、または異なる経路からの２つ以上の構成成分を標的として、標的遺伝子発現を変更することができる。そのような複合療法は、標的遺伝子の発現を調節する複数のシグナル伝達分子及び／または経路を同時にブロックすることによって、付加的または相乗的効果を達成することができる。
【０１８６】
そのようなオリゴヌクレオチドはまた、治療薬としても役立ち得るため、それらの治療負債及び治療成果は、それぞれ本開示の遺伝子シグナル伝達ネットワークを調べることによって改善または予測され得る。
【０１８７】
ゲノム編集アプローチ
ある特定の実施形態では、標的遺伝子の発現は、標的遺伝子に関連する絶縁近傍（複数可）及び／またはゲノムシグナル伝達中心（複数可）を定義する染色体領域を変更することによって調整され得る。
【０１８８】
絶縁近傍に付随する遺伝子発現を変更する方法は、シグナル伝達中心を変更すること（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを使用して、シグナル伝達中心結合部位を変化させるか、または突然変異した場合に修復／置換する）ことを含む。これらの変更は、早期の／不適切な細胞死経路の活性化（多くの免疫障害の鍵となる）、過少／過剰な遺伝子産生物の産生（可変抵抗器仮説としても知られる）、過少／過剰な酵素の細胞外分泌の産生、系統分化の防止、系統経路の切り替え、幹細胞性の促進、自己調節フィードバックループで開始または干渉、細胞代謝におけるエラーの開始、不適切な刷り込み／遺伝子サイレンシング、及び傷のあるクロマチン状態の形成を含む、様々な結果をもたらし得る。追加として、当該技術分野において周知のものを含むゲノム編集アプローチを使用して、コヒーシンネックレスを変更するか、または遺伝子及びエンハンサーを動かすことによって新たなシグナル伝達中心を作成することができる。
【０１８９】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるゲノム編集アプローチは、部位特異的ヌクレアーゼを使用して、ゲノム内の特定の位置に一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断を導入する方法を含み得る。そのような切断は、相同指向型修復（ＨＤＲ）及び非相同末端接合（ＮＨＥＪ）などの内因性細胞プロセスであり得、定期的に修復される。ＨＤＲは、本質的に、相同ＤＮＡ配列の存在下で二本鎖ＤＮＡ切断を修復する誤りのない機構である。ＨＤＲの最も一般的な形態は、相同組換えである。それは、特定のＤＮＡ配列を切断ポイントで挿入または置換するためのテンプレートとして、相同配列を利用する。相同ＤＮＡ配列のテンプレートは、内因性配列（例えば、姉妹染色分体）または外因性もしくは供給された配列（例えば、プラスミドもしくはオリゴヌクレオチド）であり得る。そのようなものとして、ＨＤＲを利用して、所望の領域における置換または挿入などの精密な変更を導入することができる。対照的に、ＮＨＥＪは、二本鎖切断から生じるＤＮＡ末端を直接接合する誤りがちな修復機構であり、切断部位においていくつかのヌクレオチドを喪失、付加または突然変異させる可能性がある。得られる小さな欠失または挿入（「インデル」と呼ばれる）または突然変異は、遺伝子発現を崩壊または強化し得る。追加として、同じＤＮＡ上に２つの切断が存在する場合、ＮＨＥＪは、介在セグメントの欠失または逆転につながり得る。そのため、ＮＨＥＪを利用して、切断部位に挿入、欠失または突然変異を導入することができる。
【０１９０】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、ＣＴＣＦアンカー部位を欠失し、そのアンカー部位に関連する絶縁近傍内の遺伝子発現を調整することができる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｎｉｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １６７，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １７，２０１６を参照されたい。絶縁近傍の境界の崩壊は、関連したシグナル伝達中心の適切な機能に必要な相互作用を防止する。欠失した近傍境界に直ぐ隣接する発現遺伝子の変化もまた、そのような崩壊に起因して観察されている。
【０１９１】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、既存のＣＴＣＦアンカー部位を修飾することができる。例えば、既存のＣＴＣＦアンカー部位は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ及び１つ以上のガイドＲＮＡを有するＮＨＥＪを誘導することによって突然変異もしくは逆転され得るか、または触媒不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素及び１つ以上のガイドＲＮＡと標的結合することによってマスクされ得る。既存のＣＴＣＦアンカー部位の変更は、既存の絶縁近傍の形成を崩壊させ、これらの絶縁近傍内に位置する遺伝子の発現を変更し得る。
【０１９２】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、新たなＣＴＣＦアンカー部位を導入することができる。ＣＴＣＦアンカー部位は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、１つ以上のガイドＲＮＡ、及びＣＴＣＦアンカー部位の配列を含有するドナーテンプレートを有する選択部位にＨＤＲを誘導することによって導入され得る。新たなＣＴＣＦアンカー部位の導入は、新たな絶縁近傍を作成する、及び／または既存の絶縁近傍を変更することができ、それがこれらの絶縁近傍の隣に位置する遺伝子の発現に影響を及ぼし得る。
【０１９３】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、シグナル伝達中心結合部位を変えることによってシグナル伝達中心を変更することができる。例えば、シグナル伝達中心結合部位が、関連した転写因子とのシグナル伝達中心のアセンブリに影響を及ぼす突然変異を含む場合、突然変異部位は、供給された訂正ドナーテンプレートの存在下でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ及び１つ以上のガイドＲＮＡを使用して、突然変異またはその付近に二本鎖ＤＮＡ切断を導入することによって修復され得る。
【０１９４】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、絶縁近傍（例えば、エンハンサー）内の領域に結合することによって近傍遺伝子の発現を調整し、転写をブロックすることができる。そのような結合は、シグナル伝達中心への転写因子の動員及び転写の開始を防止し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＤＮＡを切断しない触媒不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であり得る。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、これらの遺伝子のコード領域における短い欠失の導入を介して近傍遺伝子の発現をノックダウンすることができる。修復されたとき、そのような欠失は、フレームシフトをもたらし、遺伝子によって産生されたｍＲＮＡ中に早期停止コドン、続いてナンセンス変異依存分解機構を介してｍＲＮＡ分解を導入する。これは、シグナル伝達経路の活性化及び抑制構成成分の発現の調整に有用であり得、表１に列挙されるものなどの疾患遺伝子を含むこれらの経路の制御下で、遺伝子発現の減少または増加をもたらす。
【０１９６】
他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、結合ネックレスを変更するか、または遺伝子及びエンハンサーを動かすこともできる。
【０１９７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを利用して、特定の配列を標的とし、標的核酸を分解する細菌適応免疫系である。それらは、ゲノム編集及び／または転写調整の分野における様々な適用における使用のために適応されている。当該技術分野において既知または本明細書に開示される酵素またはオルソログのうちのいずれかを、ゲノム編集のために本明細書における方法で利用することができる。
【０１９８】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系であり得る。Ｃａｓ９は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）及びＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と一緒に機能して、二本鎖ＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼである。２つのＲＮＡを操作して、ｃｒＲＮＡの３′端をｔｒａｃｒＲＮＡの５′端にリンカーループを用いて接続することによって、単一分子ガイドＲＮＡを形成することができる。Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、ＲＮＡプログラム可能なゲノム編集に有用であることを示し、国際特許出願第ＷＯ２０１３／１７６７７２は、部位特異的遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系の多くの例及び適用を提供し、これらは参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅａｓ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓに由来するものが含まれる。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系であり得る。Ｃｐｆ１は、単一のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり、ＩＩ型系と対照的にｔｒａｃｒＲＮＡが欠如している。Ｃｐｆ１は、４または５ヌクレオチド５′オーバーハングを有するねじれ型ＤＮＡ二本鎖切断を産生する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１５  Ｏｃｔ  ２２；１６３（３）：７５９−７１は、ゲノム編集適用において使用され得るＣｐｆ１エンドヌクレアーゼの例を提供する。例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系には、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、アシダミノコッカス種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、及びラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に由来するものが含まれる。
【０２００】
ある特定の実施形態では、１つまたは他のヌクレアーゼドメインを不活化するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼのニッカーゼ変異体を使用して、ＣＲＩＳＰＲ媒介性ゲノム編集の特異性を高めることができる。ニッカーゼは、ＨＤＲ対ＮＨＥＪを促進することが示されている。ＨＤＲは、個々のＣａｓニッカーゼから向けられることもあれば、標的エリアに隣接するニッカーゼの対を用いて向けられることもある。
【０２０１】
ある特定の実施形態では、触媒不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、標的領域（例えば、ＣＴＣＦアンカー部位またはエンハンサー）に結合し、それらの機能を干渉し得る。Ｃａｓ９及びＣｐｆ１などのＣａｓヌクレアーゼは、２つのヌクレアーゼドメインを包含する。触媒部位における重要な残基を突然変異させることは、標的部位にのみ結合するが、切断をもたらさらない変異体を作成する。染色体領域（例えば、ＣＴＣＦアンカー部位またはエンハンサー）への結合は、絶縁近傍またはシグナル伝達中心の適切な形成を崩壊させ、したがって標的領域の隣に位置する遺伝子の変化した発現につながり得る。
【０２０２】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素に融合された追加の機能的ドメイン（複数可）を含み得る。機能的ドメインは、転写活性化、転写抑制、ＤＮＡメチル化、ヒストン修飾、及び／またはクロマチンリモデリングを含むが、これらに限定されないプロセスに関与し得る。そのような機能的ドメインには、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４もしくはＫＲＡＢ、ＳＩＤもしくはＳＩＤ４Ｘ）、転写リプレッサー、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、ヒストンリモデラー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、クリプトクロム、光誘導性／制御可能ドメインまたは化学的誘導性／制御可能ドメインが含まれるが、これらに限定されない。
【０２０３】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、以下のうちの１つまたは組み合わせとして細胞または患者に投与され得る：１つ以上のポリペプチド、ポリペプチドをエンコードする１つ以上のｍＲＮＡ、またはポリペプチドをエンコードする１つ以上のＤＮＡ。
【０２０４】
ガイド核酸
ある特定の実施形態では、ガイド核酸を使用して、関連したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素の活性を標的核酸内の特定の標的配列に指向することができる。ガイド核酸は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素とのそれらの結合によって、ガイド核酸及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体に対する標的特異性を提供し、したがってガイド核酸は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素の活性を指向することができる。
【０２０５】
一態様では、ガイド核酸は、ＲＮＡ分子であり得る。一態様では、ガイドＲＮＡは、単一分子ガイドＲＮＡであり得る。一態様では、ガイドＲＮＡは、化学的に修飾され得る。
【０２０６】
ある特定の実施形態では、複数のガイドＲＮＡは、ゲノム内の異なる部位において複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性活性を媒介するために提供され得る。
【０２０７】
ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、１つ以上のＲＮＡ分子またはＲＮＡ配列をエンコードする１つ以上のＤＮＡとして細胞または患者に投与され得る。
【０２０８】
リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素及びガイド核酸は各々、細胞または患者に別個に投与され得る。
【０２０９】
別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、１つ以上のガイド核酸と予め複合体化され得る。次に、予め複合体化された材料を細胞または患者に投与することができる。このような予め複合体化された材料は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として知られている。
【０２１０】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ある特定の実施形態では、本開示のゲノム編集アプローチは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の使用を伴う。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＤＮＡ切断ドメインに結合している遺伝子操作ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインから構成されたモジュラータンパク質である。典型的なＤＮＡ切断ドメインは、ＩＩ型エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインである。ＦｏｋＩは二量体としてのみ機能することから、ＺＦＮの対は、対向ＤＮＡ鎖上の同族の標的「半部位（ｈａｌｆ−ｓｉｔｅ）」配列に対し、それら２つが触媒活性のＦｏｋＩドメインが二量体化できるようにするための正確な間隔を開けて結合するように操作されなければならない。それ自体は配列特異性を有しないＦｏｋＩドメインが二量体化すると、ＺＦＮ半部位間でゲノム編集の開始ステップとしてのＤＮＡ二本鎖切断がもたらされる。
【０２１１】
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
ある特定の実施形態では、本開示のゲノム編集アプローチは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の使用を伴う。ＴＡＬＥＮは、別のフォーマットのモジュラーヌクレアーゼに相当し、これはＺＦＮと同様に、操作されたＤＮＡ結合ドメインをヌクレアーゼドメインに融合することによって生成され、同時並行的に作動して標的化されたＤＮＡ切断を達成する。ＺＦＮ中のＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガーモチーフからなるが、ＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質に由来し、これは本来植物細菌性病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ種において説明されている。ＴＡＬＥは、３３〜３５アミノ酸リピートの直列アレイから構成され、各リピートは、典型的には長さ最大２０ｂｐの標的ＤＮＡ配列内で単一の塩基対を認識し、標的配列の全長は最大４０ｂｐとなる。各リピートのヌクレオチド特異性は、位置１２及び１３にちょうど２つのアミノ酸を含む反復可変残基（ＲＶＤ）によって決定される。塩基グアニン、アデニン、シトシン及びチミンは、それぞれ４つのＲＶＤ：Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｉｌｅ、Ｈｉｓ−Ａｓｐ及びＡｓｎ−Ｇｌｙによって主に認識される。これは、ジンクフィンガーの場合よりもはるかに簡略な認識コードを構成するため、ヌクレアーゼ設計に関してはジンクフィンガーをしのぐ優位性に相当する。それでもＺＦＮと同様、ＴＡＬＥＮのタンパク質−ＤＮＡ相互作用は特異性において絶対的ではないため、ＴＡＬＥＮも、ＦｏｋＩドメインの偏性ヘテロ二量体変異体の使用による恩恵を受けてオフターゲット活性を低減している。
【０２１２】
ＩＶ．製剤及び送達
薬学的組成物
本開示に従い、組成物は薬学的組成物として調製され得る。そのような組成物は、１つ以上の活性成分、及び最も多くの場合、薬学的に許容される賦形剤を含む必要がある。
【０２１３】
本開示による薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の追加の成分の相対量は、治療される対象の識別、サイズ、及び／または病態に応じて、さらには組成物が投与される経路に応じて異なり得る。例えば、組成物は、０．１％〜９９％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。例として、組成物は、０．１％〜１００％、例えば０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬学的組成物は、少なくとも１つのペイロードを含み得る。非限定例として、薬学的組成物は、１、２、３、４または５つのペイロードを含み得る。
【０２１５】
本明細書に提供される薬学的組成物に関する説明は、ヒトへの投与に好適な薬学的組成物を主に対象としているが、そのような組成物が、一般に任意の他の動物への、例えば非ヒト動物、例えば非ヒト哺乳動物への投与に好適であることは、当業者によって理解されるであろう。組成物を様々な動物への投に好適にするためのヒトへの投与に好適な薬学的組成物の修飾は、十分に理解されており、通常の技能を有する獣薬理学者は、存在する場合は単に通常の実験によって、そのような修飾を設計及び／または実施することができる。薬学的組成物の投与が企図される対象には、ヒト及び／または他の霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、ラットなどの商業的に関連する哺乳動物を含む哺乳動物、家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、及び／または七面鳥などの商業的に関連する鳥類を含む鳥類が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者または対象に投与される。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、組成物は、哺乳動物細胞に投与される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、マウス細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞である。
【０２１８】
製剤
本開示の製剤には、限定されないが、生理食塩水、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、ウイルスベクターでトランスフェクトされた細胞（例えば、対象中への移動または移植のための）及びそれらの組み合わせが含まれ得る。
【０２１９】
本明細書に記載される薬学的組成物の製剤は、薬理学の分野において既知の、または今後開発される任意の方法によって調製され得る。本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、少なくとも１つの活性成分及び任意に１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を指す。
【０２２０】
一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤及び／または１つ以上の他の補助成分と関連付けるステップを含む。
【０２２１】
本明細書に記載される組成物の製剤は、薬理学の分野において既知の、または今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤及び／または１つ以上の他の補助成分と関連付け、その後、必要であれば、及び／または望ましい場合、製品を所望の単回もしくは多回投与単位に成形及び／または梱包するステップを含む。
【０２２２】
本開示による薬学的組成物は、バルクで、単一単位用量として、及び／または複数の単一単位用量として調製、梱包、及び／または販売され得る。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、既定量の活性成分を含む薬学的組成物の個別量を指す。活性成分の量は、対象に投与されるであろう活性成分の投与量及び／または例えば、そのような投与量の半分もしくは３分の１などのそのような投与量の便利な画分にほぼ等しい。
【０２２３】
本開示による薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の追加の成分の相対量は、治療される対象の識別、サイズ、及び／または病態に応じて、さらには組成物が投与される経路に応じて異なり得る。例えば、組成物は、０．１％〜９９％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。例として、組成物は、０．１％〜１００％、例えば０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
【０２２４】
賦形剤及び希釈剤
いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋であり得る。いくつかの実施形態では、賦形剤は、ヒト及び獣医用途の使用のために承認されている。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局によって承認され得る。いくつかの実施形態では、賦形剤は、医薬品グレードのものであり得る。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、及び／または国際薬局方の基準を満たし得る。
【０２２５】
賦形剤には、本明細書で使用される場合、所望の特定の投薬形態に適するように、任意かつ全ての溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散剤もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤などが含まれるが、これらに限定されない。薬学的組成物を製剤化するための様々な賦形剤及びその組成物を調製するための技法は、当該技術分野において既知である（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６を参照）。従来の賦形剤媒体の使用は、例えば任意の望ましくない生物学的効果をもたらすか、またはそうでなければ薬学的組成物の任意の他の構成成分（複数可）と有害に相互作用することによって、任意の従来の賦形剤媒体が物質またはその誘導体と両立し得ない場合を除いて、本開示の範囲内で企図され得る。
【０２２６】
例示的な希釈剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉糖など、及び／またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２７】
不活性成分
いくつかの実施形態では、薬学的組成物製剤は、少なくとも１つの不活性成分を含み得る。本明細書で使用される場合、「不活性成分」という用語は、製剤に含まれる薬学的組成物の活性成分の活性に寄与しない１つ以上の薬剤を指す。いくつかの実施形態では、本開示の製剤で使用され得る不活性成分のうちの全てまたはいくつかが、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認され得るか、どれも承認されない場合がある。
【０２２８】
一実施形態では、薬学的組成物は、以下などであるがこれらに限定されない少なくとも１つの不活性成分を含む：１，２，６−ヘキサントリオール；１，２−ジミリストイル−Ｓｎ−グリセロ−３−（ホスホ−Ｓ−（１−グリセロール））；１，２−ジミリストイル−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１，２−ジオレオイル−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１，２−ジパルミトイル−Ｓｎ−グリセロ−３−（ホスホ−Ｒａｃ−（１−グリセロール））；１，２−ジステアロイル−Ｓｎ−グリセロ−３−（ホスホ−Ｒａｃ−（１−グリセロール））；１，２−ジステアロイル−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；１−Ｏ−トリルビグアニド；２−エチル−１，６−ヘキサンジオール；酢酸；氷酢酸；無水酢酸；アセトン；アセトン重亜硫酸ナトリウム；アセチル化ラノリンアルコール；アセチル化モノグリセリド；アセチルシステイン；ＤＬ−アセチルトリプトファン、；アクリレーツコポリマー；アクリル酸−アクリル酸イソオクチルコポリマー；アクリル系接着剤７８８；活性炭；Ａｄｃｏｔｅ  ７２Ａ１０３；粘着テープ；アジピン酸；Ａｅｒｏｔｅｘ樹脂３７３０；アラニン；凝集アルブミン；コロイド状アルブミン；ヒトアルブミン；アルコール；無水アルコール；変性アルコール；希釈アルコール；Ａｌｆａｄｅｘ；アルギン酸；アルキルアンモニウムスルホン酸ベタイン；アルキルアリールスルホン酸ナトリウム；アラントイン；アリル．アルファ．−イオノン；アーモンド油；アルファ−テルピネオール；アルファ−トコフェロール；Ｄｌ−酢酸アルファ−トコフェロール；Ｄｌ−アルファ−トコフェロール；酢酸アルミニウム；アルミニウムクロルヒドロキシアラントイネート；水酸化アルミニウム；水酸化アルミニウム−スクロース、水和物；水酸化アルミニウムゲル；水酸化アルミニウムゲルＦ  ５００；水酸化アルミニウムゲルＦ  ５０００；モノステアリン酸アルミニウム；酸化アルミニウム；アルミニウムポリエステル；ケイ酸アルミニウム；オクテニルコハク酸デンプンアルミニウム；ステアリン酸アルミニウム；塩基性酢酸アルミニウム；無水硫酸アルミニウム；Ａｍｅｒｃｈｏｌ  Ｃ；Ａｍｅｒｃｈｏｌ−Ｃａｂ；アミノメチルプロパノール；アンモニア；アンモニア溶液；強アンモニア溶液；酢酸アンモニウム；水酸化アンモニウム；ラウリル硫酸アンモニウム；硫酸アンモニウムノノキシノール−４；Ｃ−１２〜Ｃ−１５の直鎖一級アルコールエトキシレートのアンモニウム塩；硫酸アンモニウム；Ａｍｍｏｎｙｘ；Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃ−２；Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃ−９；アネトール；無水クエン酸；無水デキストロース；無水ラクトース；無水クエン酸三ナトリウム；アニス油；Ａｎｏｘｉｄ  Ｓｂｎ；消泡剤；アンチピリン；アパフルラン；杏仁油Ｐｅｇ−６エステル；アクアフォー；アルギニン；アラセル；アスコルビン酸；パルミチン酸アスコルビル；アスパラギン酸；バルサムペルー；硫酸バリウム；ミツロウ；合成ミツロウ；べへネス−１０；ベントナイト；塩化ベンザルコニウム；ベンゼンスルホン酸；塩化ベンゼトニウム；臭化ベンゾドデシニウム；安息香酸；ベンジルアルコール；安息香酸ベンジル；塩化ベンジル；ベータデクス；ビバプシド；次没食子酸ビス��ス；ホウ酸；ブロクリナト；ブタン；ブチルアルコール；メチルビニルエーテル／無水マレイン酸コポリマー（１２５０００Ｍｗ）のブチルエステル；ステアリン酸ブチル；ブチル化ヒドロキシアニソール；ブチル化ヒドロキシトルエン；ブチレングリコール；ブチルパラベン；酪酸；Ｃ２０〜４０  Ｐａｒｅｔｈ−２４；カフェイン；カルシウム；炭酸カルシウム；塩化カルシウム；グルセプト酸カルシウム；水酸化カルシウム；乳酸カルシウム；カルコブトロール；カルジアミドナトリウム；カルキセト酸三ナトリウム；カルテリドールカルシウム；カナダバルサム；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド；カプリル酸／カプリン酸／ステアリン酸トリグリセリド；キャプタン；Ｃａｐｔｉｓｏｌ；カラメル；カルボマー１３４２；カルボマー１３８２；カルボマー９３４；カルボマー９３４ｐ；カルボマー９４０；カルボマー９４１；カルボマー９８０；カルボマー９８１；Ｂ型カルボマーホモポリマー（架橋アリルペンタエリスリトール）；Ｃ型カルボマーホモポリマー（架橋アリルペンタエリスリトール）；二酸化炭素；カルボキシビニルコポリマー；カルボキシメチルセルロース；カルボキシメチルセルロースナトリウム；カルボキシポリメチレン；カラギーナン；カラギーナン塩；ひまし油；セダーリーフ油；セルロース；微結晶セルロース；セラシント−Ｓｅ；セレシン；セテアレス−１２；セテアレス−１５；セテアレス−３０；セテアリルアルコール／セテアレス−２０；セテアリルエチルヘキサノエート；セテス−１０；セテス−２；セテス−２０；セテス−２３；セトステアリルアルコール；塩化セトリモニウム；セチルアルコール；セチルエステルワックス；パルミチン酸セチル；塩化セチルピリジニウム；クロロブタノール；クロロブタノール半水和物；無水クロロブタノール；クロロクレゾール；クロロキシレノール；コレステロール；コレス；コレス−２４；クエン酸塩；クエン酸；クエン酸一水和物；クエン酸水和物；コカミドエーテル硫酸塩；酸化コカミン；ココベタイン；ココジエタノールアミド；ココモノエタノールアミド；ココアバター；ココ−グリセリド；ココナッツ油；水添ココナッツ油；水添ココナッツ油／パーム核油グリセリド；ココイルカプリロカプラート；コラエキス；コラーゲン；顔料懸濁液；トウモロコシ油；綿実油；クリーム基材；クレアチン；クレアチニン；クレゾール；クロスカルメロースナトリウム；クロスポビドン；硫酸銅；無水硫酸銅；シクロメチコン；シクロメチコン／ジメチコンコポリオール；システイン；システイン塩酸塩；無水システイン塩酸塩；Ｄｌ−システイン；Ｄ＆ＣレッドＮｏ．２８；Ｄ＆ＣレッドＮｏ．３３；Ｄ＆ＣレッドＮｏ．３６；Ｄ＆ＣレッドＮｏ．３９；Ｄ＆ＣイエローＮｏ．１０；ダルファムプリジン；Ｄａｕｂｅｒｔ  １−５  Ｐｅｓｔｒ（Ｍａｔｔｅ）１６４ｚ；デシルメチルスルホキシド；Ｄｅｈｙｄａｇ  Ｗａｘ  Ｓｘ；デヒドロ酢酸；Ｄｅｈｙｍｕｌｓ  Ｅ；安息香酸デナトニウム；デオキシコール酸；デキストラン；デキストラン４０；デキストリン；デキストロース；デキストロース一水和物；デキストロース溶液；ジアトリゾ酸；ジアゾリジニル尿素；ジクロロベンジルアルコール；ジクロロジフルオロメタ��；ジクロロテトラフルオロエタン；ジエタノールアミン；ピロカルボン酸ジエチル；セバシン酸ジエチル；ジエチレングリコールモノエチルエーテル；フタル酸ジエチルヘキシル；アミノ酢酸ジヒドロキシアルミニウム；ジイソプロパノールアミン；アジピン酸ジイソプロピル；ジリノール酸ジイソプロピル；ジメチコン３５０；ジメチコンコポリオール；ジメチコンＭｄｘ４−４２１０；ジメチコン医療用流体３６０；ジメチルイソソルビド；ジメチルスルホキシド；ジメチルアミノエチルメタクリレート−ブチルメタクリレート−メチルメタクリレートコポリマー；ジメチルジオクタデシルアンモニウムベントナイト；ジメチルシロキサン／メチルビニルシロキサンコポリマー；ジノセブアンモニウム塩；Ｄｌ−ジパルミトイルホスファチジルグリセロール；ジプロピレングリコール；ココアンホジ酢酸二ナトリウム；スルホコハク酸ラウレス二ナトリウム；スルホコハク酸ラウリル二ナトリウム；スルホサリチル酸二ナトリウム；ジソフェニン；ジビニルベンゼンスチレンコポリマー；Ｄｍｄｍヒダントイン；ドコサノール；ドクサートナトリウム；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ  ２８０−２５１６；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ  ３８７−２５１６；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ  ８０−１１９６；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ  ８７−２０７０；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ  ８７−２１９４；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ  ８７−２２８７；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ  ８７−２２９６；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ  ８７−２８８８；Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ  ８７−２９７９；エデト酸カルシウム二ナトリウム；エデト酸二ナトリウム；無水エデト酸二ナトリウム；エデト酸ナトリウム；エデト酸；卵リン脂質；エントスホン；エントスホンナトリウム；エピラクトース；エピテトラサイクリン塩酸塩；エッセンスブーケ９２００；エタノールアミン塩酸塩；酢酸エチル；オレイン酸エチル；エチルセルロース；エチレングリコール；エチレン酢酸ビニルコポリマー；エチレンジアミン；エチレンジアミン二塩酸塩；エチレン−プロピレンコポリマー；エチレン−酢酸ビニルコポリマー（２８％酢酸ビニル）；エチレン−酢酸ビニルコポリマー（９％酢酸ビニル）；ヒドロキシステアリン酸エチルヘキシル；エチルパラベン；ユーカリプトール；エキサメタジン；食用脂；硬質脂；脂肪酸エステル；脂肪酸ペンタエリスリトールエステル；脂肪酸；クエン酸脂肪アルコール；脂肪アルコール；Ｆｄ＆ＣブルーＮｏ．１；Ｆｄ＆ＣグリーンＮｏ．３；Ｆｄ＆ＣレッドＮｏ．４；Ｆｄ＆ＣレッドＮｏ．４０；Ｆｄ＆ＣイエローＮｏ．１０（リストから除外）；Ｆｄ＆ＣイエローＮｏ．５；Ｆｄ＆ＣイエローＮｏ．６；塩化第二鉄；酸化第二鉄；香料８９−１８６；香料８９−２５９；香料Ｄｆ−１１９；香料Ｄｆ−１５３０；風味増強剤；イチジク香料８２７１１８；ラズベリー香料Ｐｆｃ−８４０７；香料Ｒｈｏｄｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｎｏ．Ｒｆ  ４５１；フルオロクロロ炭化水素；ホルムアルデヒド；ホルムアルデヒド溶液；分画ココナッツ油；芳香剤３９４９−５；芳香剤５２０ａ；芳香剤６．００７；芳香剤９１−１２２；芳香剤９１２８−Ｙ；芳香剤９３４９８ｇ；バルサムパイン芳香剤Ｎｏ．５１２４；ブーケ芳香剤１０３２８；ケモデルム芳香剤６４０１−Ｂ；ケモデルム芳香剤６４１��；クリーム芳香剤Ｎｏ．７３４５７；芳香剤Ｃｓ−２８１９７；芳香剤Ｆｅｌｔｏｎ  ０６６ｍ；芳香剤Ｆｉｒｍｅｎｉｃｈ  ４７３７３；芳香剤Ｇｉｖａｕｄａｎ  Ｅｓｓ  ９０９０／１ｃ；芳香剤Ｈ−６５４０；ハーブ芳香剤１０３９６；芳香剤Ｎｊ−１０８５；芳香剤Ｐ  Ｏ  Ｆｌ−１４７；芳香剤Ｐａ  ５２８０５；芳香剤Ｐｅｒａ  Ｄｅｒｍ  Ｄ；芳香剤Ｒｂｄ−９８１９；芳香剤Ｓｈａｗ  Ｍｕｄｇｅ  Ｕ−７７７６；芳香剤Ｔｆ  ０４４０７８；芳香剤Ｕｎｇｅｒｅｒ  Ｈｏｎｅｙｓｕｃｋｌｅ  Ｋ  ２７７１；芳香剤Ｕｎｇｅｒｅｒ  Ｎ５１９５；フルクトース；酸化ガドリニウム；ガラクトース；ガンマシクロデキストリン；ゼラチン；架橋ゼラチン；ゼルフォームスポンジ；ゲランガム（低級アシル）；ゲルバ７３７；ゲンチジン酸；ゲンチジン酸エタノールアミド；グルセプト酸ナトリウム；グルセプト酸ナトリウム二水和物；グルクロノラクトン；グルクロン酸；Ｄｌ−グルタミン酸，；グルタチオン；グリセリン；水素化ロジンのグリセロールエステル；クエン酸グリセリル；イソステアリン酸グリセリル；ラウリル酸グリセリル；モノステアリン酸グリセリル；オレイン酸グリセリル；オレイン酸グリセリル／プロピレングリコール；パルミチン酸グリセリル；リシノール酸グリセリル；ステアリン酸グリセリル；ステアリン酸グリセリル−ラウレス−２３；ステアリン酸グリセリル／ステアリン酸Ｐｅｇ；ステアリン酸グリセリル／ステアリン酸Ｐｅｇ−１００；ステアリン酸グリセリル／ステアリン酸Ｐｅｇ−４０；ステアリン酸グリセリル−ステアラミドエチルジエチルアミン；トリオレイン酸グリセリル；グリシン；グリシン塩酸塩；ジステアリン酸グリコール；ステアリン酸グリコール；グアニジン塩酸塩；グアーガム；ヘアコンディショナー（１８ｎ１９５−１ｍ）；ヘプタン；ヘタスターチ；へキシレングリコール；高密度ポリエチレン；ヒスチジン；ヒトアルブミンマイクロスフェア；ヒアルロン酸ナトリウム；炭化水素；可塑化炭化水素ゲル；塩酸；希釈塩酸；ヒドロコルチゾン；ヒドロゲルポリマー；過酸化水素；水添ひまし油；水添パーム油；水添パーム／パーム核油Ｐｅｇ−６エステル；水素化ポリブテン６３５−６９０；
水酸化物イオン；ヒドロキシエチルセルロース；ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸；ヒドロキシメチルセルロース；ヒドロキシオクタコサニルヒドロキシステアレート；ヒドロキシプロピルセルロース；ヒドロキシプロピルメチルセルロース２９０６；ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン；ヒプロメロース２２０８（１５０００Ｍｐａ．Ｓ）；ヒプロメロース２９１０（１５０００Ｍｐａ．Ｓ）；ヒプロメロース；イミド尿素；ヨウ素；ヨードキサム酸；イオフェタミン塩酸塩；アイルランド苔エキス；イソブタン；イソセテス−２０；イソロイシン；イソオクチルアクリレート；イソプロピルアルコール；イソステアリン酸イソプロピル；ミリスチン酸イソプロピル；ミリスチン酸イソプロピル−ミリスチルアルコール；パルミチン酸イソプロピル；ステアリン酸イソプロピル；イソステアリン酸；イソステアリルアルコール；等張塩化ナトリウム溶液；  Ｊｅｌｅｎｅ；カオリン；Ｋａｔｈｏｎ  Ｃｇ；Ｋａｔｈｏｎ  Ｃｇ  ＩＩ；乳酸塩；乳酸；Ｄｌ−乳酸；Ｌ−乳酸；ラクトビオン酸；ラクトース；ラクトース一水和物；ラクトース水和物；ラネス；ラノリン；ラノリンアルコール−鉱油；ラノリンアルコール；無水ラノリン；ラノリンコレステロール；ラノリンノニオン誘導体；エトキシル化ラノリン；水添ラノリン；塩化ラウラコニウム；酸化ラウルアミン；ラウルジモニウム加水分解動物コラーゲン；ラウレス硫酸塩；ラウレス−２；ラウレス−２３；ラウレス−４；ラウリン酸ジエタノールアミド；ラウリン酸ミリスチン酸ジエタノールアミド；ラウロイルサルコシン；乳酸ラウリル；硫酸ラウリル；ラベンダーの開花先端部分；レシチン；未漂白レシチン；卵レシチン；水添レシチン；水添ダイズレシチン；ダイズレシチン；レモン油；ロイシン；レブリン酸；リドフェニン；軽油；軽油（８５  Ｓｓｕ）；リモネン（＋／−）−、リポコールＳｃ−１５；リジン；酢酸リジン；リジン一水和物；ケイ酸マグネシウムアルミニウム；ケイ酸アルミウニムマグネシウム水和物；塩化マグネシウム；硝酸マグネシウム；ステアリン酸マグネシウム；マレイン酸；マンニトール；マプロフィックス；メブロフェニン；改良型医療用接着剤Ｓ−１５；医療用消泡エマルションＡ−Ｆ；メドロン酸二ナトリウム；メドロン酸；メグルミン；メントール；メタクレゾール；メタリン酸；メタンスルホン酸；メチオニン；メチルアルコール；メチルグルセス−１０；メチルグルセス−２０；メチルグルセス−２０セスキステアレート；メチルグルコースセスキステアレート；ラウリル酸メチル；メチルピロリドン；サリチル酸メチル；ステアリン酸メチル；メチルボロン酸；メチルセルロース（４０００Ｍｐａ．Ｓ）；メチルセルロース；メチルクロロイソチアゾリノン；メチレンブルー；メチルイソチアゾリノン；メチルパラベン；微結晶ワックス；鉱油；モノ及びジグリセリド；クエン酸モノグリセリド；モノチオグリセロール；マルチステロールエキス；ミリスチルアルコール；乳酸ミリスチル；ミリスチル−．ガンマ．−塩化ピコリニウム；Ｎ−（カルバモイル−メトキシＰｅｇ−４０）−１，２−ジステアロイル−セファリンナトリウム；Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド；ナイアシンアミド；��オキシム；硝酸；窒素；ノノキシノールヨウ素；ノノキシノール−１５；ノノキシノール−９；ノルフルラン；オートミール；オクタデセン−１／マレイン酸コポリマー；オクタン酸；オクチサレート；オクトキシノール−１；オクトキシノール−４０；オクトキシノール−９；オクチルドデカノール；オクチルフェノールポリメチレン；オレイン酸；オレス−１０／オレス−５；オレス−２；オレス−２０；オレイルアルコール；オレイン酸オレイル；オリーブ油；オキドロネート二ナトリウム；オキシキノリン；パーム核油；パルミタミンオキシド；パラベン；パラフィン；白色軟質パラフィン；Ｐａｒｆｕｍ  Ｃｒｅｍｅ  ４５／３；ピーナッツ油；精製ピーナッツ油；ペクチン；  ステアリン酸／ステアリン酸Ｐｅｇ６−３２グリコール；Ｐｅｇ植物油；ステアリン酸Ｐｅｇ−１００；ラウリン酸Ｐｅｇ−１２グリセリル；ステアリン酸Ｐｅｇ−１２０グリセリル；ジオレイン酸Ｐｅｇ−１２０メチルグルコース；Ｐｅｇ−１５コカミン；ジステアリン酸Ｐｅｇ−１５０；ステアリン酸Ｐｅｇ−２；イソステアリン酸Ｐｅｇ−２０ソルビタン；Ｐｅｇ−２２メチルエーテル／ドデシルグリコールコポリマー；ステアリン酸Ｐｅｇ−２５プロピレングリコール；ジラウリン酸Ｐｅｇ−４；ラウリン酸Ｐｅｇ−４；Ｐｅｇ−４０ひまし油；ジイソステアリン酸Ｐｅｇ−４０ソルビタン；Ｐｅｇ−４５／ドデシルグリコールコポリマー；オレイン酸Ｐｅｇ−５；ステアリン酸Ｐｅｇ−５０；Ｐｅｇ−５４水添ひまし油；イソステアリン酸Ｐｅｇ−６；Ｐｅｇ−６０ひまし油；Ｐｅｇ−６０水添ひまし油；Ｐｅｇ−７メチルエーテル；Ｐｅｇ−７５ラノリン；ラウリン酸Ｐｅｇ−８；ステアリン酸Ｐｅｇ−８；ステアリン酸ペグオキソール７；ペンタデカラクトン；ココ酸ペンタエリスリトール；ペンテト酸五ナトリウム；ペンテト酸カルシウム三ナトリウム；ペンテト酸；ペパーミント油；パーフルトレン；香水（Ｐｅｒｆｕｍｅ）２５６７７；香水ブーケ；香水Ｅ−１９９１；香水Ｇｄ５６０４；香水Ｔａｎａ  ９０／４２  Ｓｃｂａ；香水Ｗ−１９５２−１；ワセリン；白色ワセリン；石油蒸留物；フェノール；液状フェノール；フェノニップ；フェノキシエタノール；フェニルアラニン；フェニルエチルアルコール；酢酸フェニル水銀；硝酸フェニル水銀；卵ホスファチジルグリセロール；リン脂質；卵リン脂質；ホスフォリポン９０ｇ；リン酸；パインニードル油（Ｐｉｎｕｓ  Ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）；ピペラジン六水和物；プラスチベース−５０ｗ；ポラクリリン；塩化ポリドロニウム；ポロキサマー１２４；ポロキサマー１８１；ポロキサマー１８２；ポロキサマー１８８；ポロキサマー２３７；ポロキサマー４０７；ポリ（ビス（Ｐ−カルボキシフェノキシ）無水プロパン）：セバシン酸；末端ブロック化ポリ（ジメチルシロキサン／メチルビニルシロキサン／メチル水素シロキサン）ジメチルビニルまたはジメチルヒドロキシまたはトリメチル；ポリ（Ｄｌ−乳酸−コ−グリコール酸）、（５０：５０；ポリ（Ｄｌ−乳酸−コ−グリコール酸）、末端化エチルエステル（５０：５０；ポリアクリル酸（２５００００Ｍｗ）；ポリブテン（１４００Ｍｗ）；ポリカルボフィル；ポリエステル；ポリエステルポリアミン��ポリマー；ポリエステルレーヨン；ポリエチレングリコール１０００；ポリエチレングリコール１４５０；ポリエチレングリコール１５００；ポリエチレングリコール１５４０；ポリエチレングリコール２００；ポリエチレングリコール３００；ポリエチレングリコール３００−１６００；ポリエチレングリコール３３５０；ポリエチレングリコール４００；ポリエチレングリコール４０００；ポリエチレングリコール５４０；ポリエチレングリコール６００；ポリエチレングリコール６０００；ポリエチレングリコール８０００；ポリエチレングリコール９００；酸化鉄黒（１％未満）を含有する高密度ポリエチレン；硫酸バリウム（２０〜２４％）を含有する低密度ポリエチレン；ポリエチレンＴ；ポリエチレンテレフタレート；ポリガラクチン；オレイン酸ポリグリセリル−３、オレイン酸ポリグリセリル−４、ポリヒドロキシエチルメタクリレート；ポリイソブチレン；ポリイソブチレン（１１０００００Ｍｗ）；ポリイソブチレン（３５０００Ｍｗ）；ポリイソブチレン１７８−２３６；ポリイソブチレン２４１−２９４；ポリイソブチレン３５−３９；低分子量ポリイソブチレン；中分子量ポリイソブチレン；ポリイソブチレン／ポリブテン接着剤；ポリラクチド；ポリオール；ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン１８００；ポリオキシエチレンアルコール；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンプロピレン；ポリオキシル２０セトステアリルエーテル；ポリオキシル３５ひまし油；ポリオキシル４０水添ひまし油；ステアリン酸ポリオキシル４０；ステアリン酸ポリオキシル４００；パルミトステアリン酸ポリオキシル６及びポリオキシル３２；ジステアリン酸ポリオキシル；ステアリン酸ポリオキシルグリセリル；ポリオキシルラノリン；パルミチン酸ポリオキシル；ステアリン酸ポリオキシル；ポリプロピレン；ポリプロピレングリコール；ポリクオタニウム−１０；ポリクオタニウム−７（７０／３０  アクリルアミド／Ｄａｄｍａｃ；ポリシロキサン；ポリソルベート２０；ポリソルベート４０；ポリソルベート６０；ポリソルベート６５；ポリソルベート８０；ポリウレタン；ポリ酢酸ビニル；ポリビニルアルコール；ポリ塩化ビニル；ポリ塩化ビニル−ポリ酢酸ビニルコポリマー；ポリビニルピリジン；けし油；カリ；酢酸カリウム；カリウムミョウバン；重炭酸カリウム；重亜硫酸カリウム；塩化カリウム；クエン酸カリウム；水酸化カリウム；メタ重亜硫酸カリウム；二塩基性リン酸カリウム；一塩基性リン酸カリウム；カリウム石鹸；ソルビン酸カリウム；ポビドンアクリレートコポリマー；ポビドンヒドロゲル；ポビドンＫ１７；ポビドンＫ２５；ポビドンＫ２９／３２；ポビドンＫ３０；ポビドンＫ９０；ポビドンＫ９０ｆ；ポビドン／エイコセンコポリマー；ポビドン；Ｐｐｇ−１２／Ｓｍｄｉコポリマー；Ｐｐｇ−１５ステアリルエーテル；ジステアリン酸Ｐｐｇ−２０メチルグルコースエーテル；オレイン酸Ｐｐｇ−２６；Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｗａｔ；プロリン；プロムルゲンＤ；プロムルゲンＧ；プロパン；Ｐｒｏｐｅｌｌａｎｔ  Ａ−４６；没食子酸プロピル；炭酸プロピレン；プロピレングリコール；二酢酸プロピレングリコール；ジカプリル酸プロピレ��グリコール；モノラウリル酸プロピレングリコール；モノパルミトステアリン酸プロピレングリコール；パルミトステアリン酸プロピレングリコール；リシノール酸プロピレングリコール；プロピレングリコール／ジアゾリジニル尿素／メチルパラベン／プロピルパラベン；プロピルパラベン；硫酸プロタミン；タンパク質加水分解物；Ｐｖｍ／Ｍａコポリマー；クオタニウム−１５；Ｃｉｓ型クオタニウム−１５；クオタニウム−５２；Ｒａ−２３９７；Ｒａ−３０１１；サッカリン；サッカリンナトリウム；無水サッカリンナトリウム；ベニバナ油；Ｓｄアルコール３ａ；Ｓｄアルコール４０；Ｓｄアルコール４０−２；Ｓｄアルコール４０ｂ；セピネオＰ６００；セリン；ゴマ油；シアバター；シラスティックブランド医療グレードチューブ；シリコーンＡ型シラスティック医療用接着剤；歯科用シリカ；シリコン；二酸化ケイ素；コロイド状二酸化ケイ素；シリコーン；シリコーン接着剤４１０２；シリコーン接着剤４５０２；シリコーン接着剤Ｂｉｏ−Ｐｓａ  Ｑ７−４２０１；シリコーン接着剤Ｂｉｏ−Ｐｓａ  Ｑ７−４３０１；シリコーンエマルション；シリコーン／ポリエステルフィルムストリップ；シメチコン；シメチコンエマルション；シポンＬｓ  ２０ｎｐ；ソーダ灰；酢酸ナトリウム；無水酢酸ナトリウム；アルキル硫酸ナトリウム；アスコルビン酸ナトリウム；安息香酸ナトリウム；重炭酸ナトリウム；重硫酸ナトリウム；重亜硫酸ナトリウム；ホウ酸ナトリウム；ホウ酸ナトリウム十水和物；炭酸ナトリウム；炭酸ナトリウム十水和物；炭酸ナトリウム一水和物；セトステアリル硫酸ナトリウム；塩素酸ナトリウム；塩化ナトリウム；塩化ナトリウム注射液；静菌性塩化ナトリウム注射液；コレステリル硫酸ナトリウム；クエン酸ナトリウム；ココイルサルコシン酸ナトリウム；デスオキシコール酸ナトリウム；亜ジチオン酸ナトリウム；ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム；ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム；グルコン酸ナトリウム；水酸化ナトリウム；次亜塩素酸ナトリウム；ヨウ化ナトリウム；乳酸ナトリウム；Ｌ−乳酸ナトリウム；ラウレス−２硫酸ナトリウム；ラウレス−３硫酸ナトリウム；ラウレス−５硫酸ナトリウム；ラウロイルサルコシン酸ナトリウム；ラウリル硫酸ナトリウム；ラウリルスルホ酢酸ナトリウム；
メタ重亜硫酸ナトリウム；硝酸ナトリウム；リン酸ナトリウム；リン酸ナトリウム二水和物；二塩基性リン酸ナトリウム；二塩基性無水リン酸ナトリウム；二塩基性リン酸ナトリウム二水和物；二塩基性リン酸ナトリウム七水和物；一塩基性リン酸ナトリウム；一塩基性無水リン酸ナトリウム；一塩基性リン酸ナトリウム二水和物；一塩基性リン酸ナトリウム一水和物；ポリアクリレートナトリウム（２５０００００Ｍｗ）；ピロリン酸ナトリウム；カルボン酸ナトリウムピロリドン；グリコール酸ナトリウムデンプン；コハク酸ナトリウム六水和物；硫酸ナトリウム；無水硫酸ナトリウム；硫酸ナトリウム十水和物；亜硫酸ナトリウム；スルホコハク酸化ウンデシル酸ナトリウムモノアルキロールアミド；酒石酸ナトリウム；チオグリコール酸ナトリウム；チオリンゴ酸ナトリウム；チオ硫酸ナトリウム；無水チオ硫酸ナトリウム；トリメタリン酸ナトリウム；キシレンスルホン酸ナトリウム；Ｓｏｍａｙ  ４４；ソルビン酸；ソルビタン；イソステアリン酸ソルビタン；モノラウリル酸ソルビタン；モノオレイン酸ソルビタン；モノパルミチン酸ソルビタン；モノステアリン酸ソルビタン；セスキオレイン酸ソルビタン；トリオレイン酸ソルビタン；トリステアリン酸ソルビタン；ソルビトール；ソルビトール溶液；ダイズ粉；ダイズ油；スペアミント油；鯨ロウ；スクアラン；安定化オキシクロロ錯体；２−エチルヘキサン酸第一スズ；塩化第一スズ；無水塩化第一スズ；フッ化第一スズ；酒石酸第一スズ；デンプン；アルファデンプン１５００；トウモロコシデンプン；塩化ステラルコニウム；ヘクトライト／炭酸プロピレンステラルコニウム；ステアルアミドエチルジエチルアミン；ステアレス−１０；ステアレス−１００；ステアレス−２；ステアレス−２０；ステアレス−２１；ステアレス−４０；ステアリン酸；ステアリン酸ジエタノールアミド；ステアルオキシトリメチルシラン；ステアルトリモニウム加水分解動物コラーゲン；ステアリルアルコール；吸入用滅菌水；スチレン／イソプレン／スチレンブロックコポリマー；サクシマー；コハク酸；スクラロース；スクロース；ステアリン酸スクロース；スクロースポリエステル；スルファセタミドナトリウム；スルホブチルエーテル．ベータ．−シクロデキストリン；二酸化硫黄；硫酸；スルファクトールＱ；Ｄ−タガトース；タルク；トール油；牛脂グリセリド；酒石酸；Ｄｌ−酒石酸；テノックス；テノックス−２；Ｔｅｒｔ−ブチルアルコール；Ｔｅｒｔ−ブチル過酸化水素；Ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン；テトラキス（２−メトキシイソブチルイソシアニド）銅（Ｉ）テトラフルオロホウ酸塩；オルトケイ酸テトラプロピル；テトロホスミン；テオフィリン；チメロサール；トレオニン；チモール；スズ；二酸化チタン；トコフェロール；トコフェルソラン；高カロリー輸液、脂質エマルション；トリアセチン；トリカプリリン；トリクロロモノフルオロメタン；トリデセス−１０；ラウリル硫酸トリエタノールアミン；トリフルオロ酢酸；中鎖トリグリセリド；トリヒドロキシステアリン；リン酸トリラネス−４；リン酸トリラウレス−４；クエン酸三ナトリウム二水和物；Ｈｅｄｔａ三ナトリウム；トリトン７２０；トリトンＸ−２００；トロラ���ン；トロマンタジン；トロメタミン（ＴＲＩＳ）；トリプトファン；チロキサポール；チロシン；ウンデシレン酸；ユニオン７６  Ａｍｓｃｏ−Ｒｅｓ  ６０３８；尿素；バリン；植物油；水添植物油グリセリド；水添植物油；ベルセタミド；ビスカリン；ビスコース／コットン；ビタミンＥ；乳化ワックス；Ｗｅｃｏｂｅｅ  Ｆｓ；白色セレシンワックス；白色ワックス；キサンタンガム；亜鉛、酢酸亜鉛；炭酸亜鉛；塩化亜鉛；及び酸化亜鉛。
【０２２９】
本明細書に開示される薬学的組成物製剤は、カチオンまたはアニオンを含み得る。一実施形態では、製剤は、限定されないが、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｇ＋、及びそれらの組み合わせなどの金属カチオンを含む。非限定例として、製剤は、ポリマー及び金属カチオンとの複合体を含み得る（例えば、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２６５，３８９号及び同第６，５５５，５２５号を参照）。
【０２３０】
製剤はまた、１つ以上の薬学的に許容される塩を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、開示される化合物の誘導体を指し、本化合物は、既存の酸または塩基部分を（例えば、遊離塩基基を好適な有機酸と反応させることによって）その塩形態に変換することによって修飾される。薬学的に許容される塩の例には、アミンなどの塩基性残基の好物または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機酸などが含まれるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素塩、塩化水素塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ性土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含む、非毒性アンモニウム、四級アンモニウム、及びアミンカチオンが挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩としては、例えば、非毒性無機酸または有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩が挙げられる。
【０２３１】
溶媒和物は、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶化、または沈殿によって調製され得る。好適な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物、及び三水和物）、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ′−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ′−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２−（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２−ピロリドン、ベンジル安息香酸塩などである。水が溶媒である場合、溶媒和物は、「水和物」と称される。
【０２３２】
Ｖ．投与及び投薬
投与
「投与する」及び「導入する」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、細胞または対象への薬学的組成物の送達を指す。対象への送達の場合、薬学的組成物は、肝細胞などの所望の部位における導入細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって送達され、それにより所望の効果（複数可）がもたらされる。
【０２３３】
方法の一態様では、薬学的組成物は、限定されないが、経腸（腸の中）、胃腸、硬膜外（ｅｐｉｄｕｒａｌ）（硬膜の中）、経口（口を介して）、経皮、硬膜外（ｐｅｒｉｄｕｒａｌ）、脳内（大脳の中）、脳室内（脳室の中）、上皮（皮膚の上に適用）、皮内（皮膚自体の中）、皮下（皮膚の下）、経鼻投与（鼻を通して）、静脈内（静脈の中）、静脈内ボーラス、点滴、動脈内（動脈の中）、筋内（筋肉の中）、心内（心臓の中）、骨内注入（骨髄の中）、髄腔内（脊柱管の中）、腹腔内（腹腔の中に注入または注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼を通して）、空洞内注射（病理的空洞の中）、腔内（陰茎の基部の中）、膣内投与、子宮内、羊水外投与、経皮（全身分配のための無傷の皮膚を通した拡散）、経粘膜（粘膜を通した拡散）、経腟、吹送（スノーティング）、舌下、口唇下、坐薬、点眼薬（結膜の上）、点耳薬中、耳（耳の中または耳を介して）、頬（頬に向かって指向される）、結膜、皮膚、歯（１本または複数の歯に）、電気浸透、洞内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質性、腹部内、羊水内、動脈内、胆管内、気管支内、髄液嚢内、軟骨内（軟骨内）、仙骨内（馬尾内）、槽内（大槽小脳延髄槽内）、角膜間（角膜内）、歯冠内、冠内（冠状動脈内）、海綿体内（陰茎の海綿体の膨張性空間内）、円板内（ディスク内）、管内（腺管内）、十二指腸内（十二指腸内）、硬膜内（硬膜内または硬膜下）、上皮内（上皮へ）、食道内（食道へ）、胃内（胃内）、歯肉内（歯肉内）、回腸内（省庁の遠位部分内）、病変内（局在化病変内または直接導入）、腔内（管の腔内）、リンパ内（リンパ内）、髄内（骨の髄腔内）、髄膜内（髄膜内）、心筋内（心筋内）、眼内（目内）、卵巣内（卵巣内）、心膜内（心膜内）、胸膜内（胸膜内）、前立腺内（前立腺内）、肺内（肺またはその気管支内）、鼻腔内（鼻または眼窩腔内）、脊髄内（脊柱内）、関節滑液嚢内（関節の滑液腔内）、腱内（腱内）、精巣内（精巣内）、髄腔内（任意のレベルの脳脊髄軸での脳脊髄液内）、胸腔内（胸郭内）、管内（臓器の管内）、腫瘍内（腫瘍内）、鼓室内（中耳内）、血管内（１本または複数の血管内）、心室内（心室内）、イオン泳動（可溶性塩のイオンが身体の組織中に移行する電流によって）、灌水（開放創または体腔を浸すまたは洗い流す）、喉頭（咽頭の上に直接）、鼻腔胃（鼻を通して胃の中に）、密封包帯法（後に領域を密封する包帯によって被覆される局所経路投与）、眼部（外眼部に）、中咽頭（口及び咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸（局所または全身効果のために経口的または経鼻的に吸入することによって気道内）、眼球後（脳端の後ろまたは眼球の後ろ）、心筋内（心筋に入る）、軟組織、クモ膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤（胎盤を通るかまたは胎盤全体）、経気管（気管の壁を通る）、経鼓膜（鼓室全体または鼓室を通る）、尿管（尿管へ）、尿道（尿道へ）、膣、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆汁灌流、心臓灌流、フォトフェレーシス及び脊柱などの経路を介して投与され得る。
【０２３４】
投与様式には、注射、注入、点滴、及び／または摂取が含まれる。「注射」には、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、心室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、及び胸骨内の注射及び注入が含まれる。いくつかの例において、経路は静脈内である。細胞の送達に関しては、注射または注入による投与を行うことができる。
【０２３５】
細胞は、全身的に投与することができる。「全身投与」、「全身的に投与される」、「末梢投与」及び「末梢的に投与される」という表現は、標的部位、組織、または臓器に直接ではない形で投与することを指し、それにより、代わりに対象の循環系に侵入し、したがって代謝及び他の類似プロセスに供される。
【０２３６】
投薬
「有効量」という用語は、特定の疾患及び／または病態の少なくとも１つ以上の徴候または症状を予防または軽減するために必要な活性成分の量を指し、所望の効果を提供するための組成物の十分な量に関連する。そのため、「治療有効量」という用語は、典型的な対象に投与したときに特定の効果を促進するのに十分である活性成分を含む、活性成分または組成物の量を指す。また、有効量は、疾患の症状発生の予防または遅延、疾患の症状の経過の変更（例えば、以下に限定されないが、疾患の症状の進行を遅らせること）、または疾患の症状の反転に十分な量も含むと考えられる。任意の所与の場合について、適切な「有効量」は、当業者により、通常の実験を用いて決定され得ると理解されている。
【０２３７】
薬学的、診断的、または予防的組成物は、疾患、障害及び／または病態を予防、治療、管理、または診断するために有効な任意の量及び任意の投与経路を使用して対象に投与され得る。必要とされる正確な量は、対象の人種、年齢、及び全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式などに応じて対象ごとに異なり得る。対象は、ヒト、哺乳動物、または動物であり得る。組成物は典型的には、投与の容易性及び投与量の均一性のために単一剤形で製剤化される。しかしながら、総１日使用量は、合理的な医療判断の範囲内で担当医師により決定され得ることが理解されるであろう。任意の特定の個体についての具体的な治療有効用量レベル、予防有効用量レベル、または適切な診断用量レベルは、治療される障害及び障害の重篤度；用いられる具体的なペイロードの活性；用いられる具体的な組成物；患者の年齢、体重、全体的な健康、性別及び食事；投与の時間及び投与の経路；治療の期間；活性成分と組み合わせて、または同時に使用される薬物、ならびに医療分野で周知の同様の要因を含む、様々な要因に依存する。
【０２３８】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、１日あたり対象の体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇを、１日１回以上送達して、所望の治療的、診断的、または予防的効果を得るために十分な投与量レベルで投与され得る。
【０２３９】
組成物の所望の投与量は、１回のみ、１日３回、１日２回、１日１回、２日に１回、３日に１回、毎週、２週間ごと、３週間ごと、または４週間ごとに送達され得る。ある特定の実施形態では、所望の投与量は、多回投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４回、またはそれ以上の投与）を使用して送達され得る。多回投与を用いる場合、本明細書に記載されるものなどの分割投与レジメンが使用され得る。本明細書で使用される場合、「分割用量」は、「単一単位用量」または全日用量の２用量以上への分割、例えば「単一単位用量」の２回以上の投与である。本明細書で使用される場合、「単一単位用量」は、１用量／１回／単一経路／単一接触点、すなわち単一投与事象で投与される任意の治療約の用量である。
【０２４０】
フィブロネクチン腎症、遺伝性コプロポルフィリン症などの遺伝性疾患の治療のためのゲノムシグナル伝達中心（ＧＳＣ）または全体遺伝子シグナル伝達ネットワーク（ＧＳＮ）の摂動のための組成物及び方法が、本明細書に記載される。本開示の１つ以上の実施形態の詳細が、添付の以下の記載で説明される。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の材料及び方法を本開示の実践または試験において使用することもできるが、好ましい材料及び方法は、これから説明される。本開示の他の特徴、目的及び利点は、その説明から明らかになるであろう。この説明において、単数形は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数形も含む。他に特段の定めのない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾する場合、本説明が制御する。
【０２４１】
本開示はさらに、以下の非限定的な実施例によって例示される。
【実施例】
【０２４２】
ＶＩＩ．実施例
実施例１．実験手順
Ａ．ヒト肝細胞細胞培養
ヒト肝細胞は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌからの２名のドナー（すなわち、ＭＧＨ５４及びＭＧＨ６３）、ならびにＬｏｎｚａからの１名のドナー（すなわちＨＵＭ４１１１Ｂ）から取得した。凍結保存した肝細胞を、平板培地中で１６時間培養し、維持培地に４時間移した。無血清培地上で２時間培養し、次いで化合物を添加した。遺伝子発現分析の前に、肝細胞を無血清培地上で１６時間維持した。一次ヒト肝細胞を、液体窒素冷凍庫（約−１３０℃）の気相中で保存した。
【０２４３】
一次ヒト肝細胞を播種するために、細胞のバイアルをＬＮ２冷凍庫から回収し、３７℃の水浴中で解凍し、氷のかけらのみが残るまで優しく旋回させた。１０ｍＬの血清学的ピペットを使用して、細胞をバイアルから優しく分注し、２０ｍＬの冷解凍培地を含有する５０ｍＬのコニカルチューブの側面下に優しく分注した。バイアルを約１ｍＬの解凍培地ですすぎ、リンスをコニカルチューブに添加した。最大２バイアルを、２０ｍＬの解凍培地の１つのチューブに添加することができる。
【０２４４】
コニカルチューブ（複数可）を優しく２〜３回反転させ、４℃で１０分間１００ｇで制動力を低減して（例えば、９のうち４）遠心分離した。解凍培地をゆっくりゆっくり吸引して、ペレットを避ける。４ｍＬの冷平板培地を、側面の下にゆっくり添加し（２バイアルを１つのチューブに複合する場合、８ｍＬ）、バイアルを優しく数回反転させて細胞を再懸濁した。
【０２４５】
１００μＬの十分に混合された細胞が４００μＬの希釈トリパンブルーに添加されるまで、細胞を氷上で保持し、優しく反転させることによって混合した。血球計数器（またはＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ）を使用して細胞をカウントし、生存性及び１ｍＬあたりの生細胞を記録した。細胞を所望の濃度に希釈し、コラーゲンＩで被覆したプレート上に播種した。細胞をゆっくり優しくプレートの上に、一度に１〜２ウェルのみに分注した。残りの細胞を、優しく反転させることによって頻繁にチューブ内で混合した。細胞を、６ｍＬの冷平板培地（１０ｃｍ）中にプレートあたり約８．５×１０６細胞で播種した。代替として、６ウェルプレートの場合、ウェルあたり約１．５×１０６（１ｍＬ培地／ウェル）、１２ウェルプレートの場合、ウェルあたり７×１０５（０．５ｍＬ／ウェル）、または２４ウェルプレートの場合、ウェルあたり３．７５×１０５（０．５ｍＬ／ウェル）で細胞を播種した。
【０２４６】
全ての細胞及び培地をプレートに添加した後、プレートをインキュベーターに移し（３７℃、５％のＣＯ２、約９０％の湿度）、前後に、次いで左右に各々数回揺らして、細胞をプレートまたはウェル全体に均一に分布させた。プレート（複数可）をプレーティング後最初の１時間にわたって１５分ごとに再度揺らした。プレーティングの約４時間後（または細胞を午後にプレーティングした場合は朝一番に）、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、完全維持培地を添加した。一次ヒト肝細胞を維持培地中で維持し、毎日新鮮な培地に移した。
【０２４７】
Ｂ．ヒト肝細胞の枯渇及び化合物処理
上記のように培養したヒト肝細胞を、２４ウェルフォーマットでプレーティングし、５００μＬの量の平板培地中にウェルあたり３７５，０００細胞を添加した。治療の４時間前に、細胞をＰＢＳで洗浄し、培地を新鮮な遺伝培地（完全）または修飾された維持培地のいずれかに変えた。
【０２４８】
化合物ストックを、１０００×最終濃度で調製し、２段階希釈で培地に添加して、細胞に添加したときに化合物が溶液から沈殿するリスクを低減し、妥当なピペット量を保証した。１つずつ、各化合物を温かい（約３７℃）修飾された維持培地中で最初に１０倍希釈し（初期希釈＝ＩＤ）、ボルテックスすることによって混合し、ＩＤを細胞培養物中に１００倍希釈した（例えば、０．５ｍＬの培地を含有する２４プレートの１ウェル中に５．１μＬ）。プレートを慎重に旋回させることによって混合し、全てのウェルを処理した後、インキュベーターに一晩戻した。所望される場合、別個のプレート／ウェルをビヒクルのみの対照及び／または正の対照で処理した。マルチウェルプレートを使用する場合、対照を各プレート上に含めた。約１８時間後、細胞をさらなる分析、例えば、ＣｈＩＰ−ｓｅｑ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、ＡＴＡＣ−ｓｅｑなどのために採取した。
【０２４９】
Ｃ．マウス肝細胞細胞培養及び化合物処理
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝細胞（Ｆ００５１５２冷凍保存）を、４５ドナーのプールとしてＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴから購入した。細胞を、０．５ｍＬ培地中２００Ｋ細胞／ウェルで２４時間、コラーゲンで被覆した２４ウェルプレート上のＩｎｖｉｔｒｏＧＲＯ  ＣＰ齧歯類培地（Ｚ９９００２８）及びＴｏｒｐｅｄｏ齧歯類抗生物質ミックス（Ｚ９９０２７）中にプレーティングした。１０ｍＭのＤＭＳＯ中の化合物ストックを、１０μＭに（１％のＤＭＳＯの最終濃度で）希釈し、生物学的三重複で細胞上に適用した。２０時間後に培地を取り除き、細胞をさらなる分析、例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲのために処理した。
【０２５０】
Ｄ．培地組成
解凍培地は、６ｍＬの等張パーコール及び１４ｍＬの高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１１９６５または同様のもの）を含有していた。平板培地は、１００ｍＬのＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ａ１２１７６０１、フェノールレッドなし）、ならびに５ｍＬのＦＢＳ、１０μＬのデキサメタゾン、及び３．６ｍＬのプレーティング／維持カクテルを含有するＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ平板培地からの補足パック＃ＣＭ３０００を含有していた。ストックトリパンブルー（０．４％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１５２５０）を、ＰＢＳ中で１：５に希釈した。Ｎｏｒｍｏｃｉｎを、解凍培地及び平板培地の両方に１：５００で添加した。
【０２５１】
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ完全維持培地は、補足パック＃ＣＭ４０００（１μＬのデキサメタゾン及び４ｍＬの維持カクテル）ならびに１００ｍＬのＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ａ１２１７６０１、フェノールレッドなし）を含有していた。
【０２５２】
修飾された維持培地は、刺激因子（デキサメタゾン、インスリンなど）を有しておらず、１００ｍＬのＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ａ１２１７６０１、フェノールレッドなし）、２ｍＭまで１ｍＬのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ＃Ｇ７５１３）、１５ｍＭまで１．５ｍＬのＨＥＰＥＳ（ＶＷＲ＃Ｊ８４８）、及び各々５０Ｕ／ｍＬの最終濃度まで０．５ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１５１４０）を含有していた。
【０２５３】
Ｅ．ＤＮＡ精製
ＤＮＡ精製は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１１２（１２）：３８４１−３８４６（２０１５）補助情報に記載されるように行った。１ミリリットルの２．５Ｍグリシンを、固定細胞の各プレートに添加し、５分間インキュベートしてホルムアルデヒドをクエンチした。細胞をＰＢＳで２回洗浄した。細胞を４℃で５分間、１，３００ｇでペレット化した。次いで、４×１０７細胞を各チューブ内に収集した。細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含有する１ｍＬの氷冷Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０溶解緩衝液で、氷上で５分間優しく溶解した（緩衝液レシピは以下に提供される）。細胞溶解物を、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０溶解緩衝液中の２４％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクロースで形成された２．５量のスクロースクッションの上に積層した。この試料を４℃で１０分間、１８，０００ｇで遠心分離して、核ペレットを単離した（上澄みは、細胞質画分を表していた）。核ペレットをＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡで１回洗浄した。核ペレットを０．５ｍＬのグリセロール緩衝液で優しく再懸濁し、続いて等量の核溶解緩衝液で氷上で２分間インキュベートした。この試料を４℃で２分間、１６，０００ｇで遠心分離して、クロマチンペレットを単離した（上澄みは、核可溶性画分を表していた）。クロマチンペレットをＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡで２回洗浄した。クロマチンペレットを−８０℃で保存した。
【０２５４】
Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０溶解緩衝液は、１０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０５％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０を含有していた。グリセロール緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、７５ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．８５ｍＭのＤＴＴ、及び５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロールを含有していた。核溶解緩衝液は、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．６）、１ｍＭのＤＴＴ、７．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．３ＭのＮａＣｌ、１Ｍの尿素、及び１％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０を含有していた。
【０２５５】
Ｆ．クロマチン免疫沈降シーケンシング（ＣｈＩＰ−ｓｅｑ）
一次肝細胞及びＨｅｐＧ２細胞について以下のプロトコルを使用してＣｈＩＰ−ｓｅｑを実施して、組成物を決定し、シグナル伝達中心の位置を確認した。
【０２５６】
ｉ．細胞架橋
２×１０７細胞を、ＣｈＩＰ−ｓｅｑの各実行に使用した。２ｍＬの新鮮な１１％ホルムアルデヒド（ＦＡ）溶液を、１５ｃｍプレート上の２０ｍＬの培地に添加して、１．１％の最終濃度に到達させた。プレートを短時間旋回させ、室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートした。インキュベーションの最後に、ＦＡを、１ｍＬの２．５Ｍグリシンをプレートに添加し、室温で５分間インキュベートすることによってクエンチした。培地を１Ｌビーカーに破棄し、細胞を２０ｍＬの氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳ（１０ｍＬ）をプレートに添加し、細胞をプレートから掻き落とした。細胞を１５ｍＬのコニカルチューブに移し、チューブを氷上に置いた。プレートを、追加の４ｍＬのＰＢＳで洗浄し、１５ｍＬのチューブ内で細胞と複合した。チューブを５分間、１，５００ｒｐｍ、４℃で卓上遠心分離機で遠心分離した。ＰＢＳを吸引し、細胞を液体窒素中で急速冷凍した。ペレットを、使用準備が整うまで−８０℃で保存した。
【０２５７】
ｉｉ．予ブロック磁気ビーズ
３０μＬのプロテインＧビーズ（反応あたり）を、１．５ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに添加した。ビーズを、磁気分離によって室温で３０秒間収集した。ビーズを、４℃で１０分間、回転器上でビーズをインキュベートし、ビーズを磁石で収集することによって、１ｍＬのブロッキング溶液で３回洗浄した。５μｇの抗体を、ブロッキング溶液中の２５０μＬのビーズに添加した。混合物を透明なチューブに移し、４℃で一晩回転させた。翌日に、抗体を含有する緩衝液を取り除き、ビーズを、４℃で１０分間、回転器上でビーズをインキュベートし、ビーズを磁石で収集することによって、１．１ｍＬのブロッキング溶液で３回洗浄した。ビーズを、５０μＬのブロッキング溶液中に再懸濁し、使用準備が整うまで氷上で保持した。
【０２５８】
ｉｉｉ．細胞溶解、ゲノム断片化、及びクロマチン免疫沈降
ＣＯＭＰＬＥＴＥ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤カクテルを、使用前に溶解緩衝液１（ＬＢ１）に添加した。５０ｘ溶液の場合、１錠を１ｍＬのＨ２Ｏに溶解した。カクテルを−２０℃でアリコート中に保存した。細胞を各チューブ内での８ｍＬのＬＢ１中に再懸濁し、４℃で１０分間、回転器上でインキュベートした。核を、４℃で５分間、１，３５０ｇで遠心沈殿した。ＬＢ１を吸引し、細胞を、各チューブ内での８ｍＬのＬＢ２中に再懸濁し、４℃で１０分間、回転器上でインキュベートした。
【０２５９】
ＣＯＶＡＲＩＳ（登録商標）Ｅ２２０ＥＶＯＬＵＴＩＯＮ（商標）超音波処理器を、高細胞数についての製造元の推奨に従ってプログラムした。ＨｅｐＧ２細胞を１２分間音波処理し、一次肝細胞試料を１０分間音波処理した。溶解物を清潔な１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、チューブを４℃で１０分間、２０，０００ｇで遠心分離して残屑をペレット化した。上澄みを、予め結合された抗体を有する予めブロックされたプロテインＧビーズを含有する２ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに移した。５０μＬの上澄みをインプットとして保存した。インプット材料を、使用準備が整うまで−８０℃で保持した。チューブを４℃で一晩、ビーズで回転させた。
【０２６０】
ｉｖ．洗浄、溶出、及び架橋逆転
全ての洗浄ステップは、チューブを４℃で５分間回転させることによって実施した。洗浄ステップごとに、ビーズを清潔なＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに移した。ビーズを、磁石を使用して１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ内で収集した。ビーズを１．１ｍＬの音波処理緩衝液で２回洗浄した。磁気スタンドを使用して、磁気ビーズを収集した。ビーズを１．１ｍＬの洗浄緩衝液２で２回洗浄し、磁気スタンドを再度使用して、磁気ビーズを収集した。ビーズを１．１ｍＬの洗浄緩衝液３で２回洗浄した。全ての残留洗浄緩衝液３を取り除き、ビーズを１．１ｍＬのＴＥ＋０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００緩衝液で１回洗浄した。残留ＴＥ＋０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００緩衝液を取り除き、ビーズをＴＥ緩衝液で毎回３０秒間にわたって２回洗浄した。残留ＴＥ緩衝液を取り除き、ビーズを３００μＬのＣｈＩＰ溶出緩衝液中に再懸濁した。２５０μＬのＣｈＩＰ溶出緩衝液を、５０μＬのインプットに添加し、チューブを６５℃で１時間、ビーズで回転させた。インプット試料を６５℃のオーブンで一晩、回転させずにインキュベートした。ビーズを含むチューブを磁石上に置き、溶出液を新鮮なＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに移した。溶出液を６５℃のオーブンで一晩、回転させずにインキュベートした。
【０２６１】
ｖ．クロマチン抽出及び沈降
インプット及び免疫沈降（ＩＰ）試料を新鮮なチューブに移し、３００μＬのＴＥ緩衝液をＩＰ及びインプット試料に添加して、ＳＤＳを希釈した。ＲＮａｓｅ  Ａ（２０ｍｇ／ｍＬ）をチューブに添加し、チューブを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、３μＬの１ＭのＣａＣｌ２及び７μＬの２０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを添加し、５５℃で１．５時間インキュベートした。ＭａＸｔｒａｃｔ高密度２ｍＬゲルチューブ（Ｑｉａｇｅｎ）を、室温で３０秒間、全速での遠心分離によって調製した。６００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを各プロテイナーゼＫ反応に添加し、約１．２ｍＬの混合物中でＭａＸｔｒａｃｔチューブに移した。チューブを室温で５分間、１６，０００ｇで回転させた。水相を２つの清潔なＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄチューブに移し（各チューブに３００μＬ）、１．５μＬのグリコーゲン、３０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム、及び９００μＬのエタノールを添加した。混合物を−２０℃で一晩または−８０℃で１時間沈降させ、４℃で２０分間、最大速度で遠心沈殿させた。エタノールを取り除き、チューブを４℃で５分間、最大速度で遠心沈殿させることによって、ペレットを１ｍＬの７５％エタノールで洗浄した。エタノールの残余を取り除き、ペレットを室温で５分間乾燥させた。２５μＬのＨ２Ｏを各免疫沈降（ＩＰ）及びインプットペレットに添加し、５分間放置し、短時間ボルテックスした。両方のチューブからのＤＮＡを組み合わせ、各試料について５０μＬのＩＰ及び５０μＬのインプットＤＮＡを得た。１μＬのこのＤＮＡを使用し、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃Ｑ３２８５４）を使用してプルダウンＤＮＡの量を測定した。免疫沈降材料の全量は、数ｎｇ（ＴＦの場合）〜数百ｎｇ（クロマチン修飾の場合）の範囲であった。６μＬのＤＮＡをｑＲＴ−ＰＣＲを使用して分析して、富化を決定した。必要に応じてＤＮＡを希釈した。富化が良好であった場合、残りをＤＮＡシーケンシングのためのライブラリー調製に使用した。
【０２６２】
ｖｉ．ＤＮＡシーケンシングのためのライブラリー調製
Ｉｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｏｌｉｇｏｓ（ＮＥＢ、＃６６０９Ｓ）を使用するＩｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  ＤＮＡライブラリー調製キット（ＮＥＢ、＃Ｅ７６４５）を使用して、製造元の指示に従い、以下の修正とともにライブラリーを調製した。ライブラリー調製のための残りのＣｈＩＰ試料（約４３μＬ）及び１μｇのインプット試料を、プロトコルの末端修復部分の前に５０μＬの量にした。接着プレートシール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃ＡＢ０５５８）で密封し、少なくとも１つの空のウェルを異なる試料の間に残した９６ウェルの半スカート状ＰＣＲプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃ＡＢ１４００）において、加熱した蓋を有するＰＣＲマシンで末端修復反応を実行した。未希釈のアダプターをインプット試料に使用し、１：１０に希釈したアダプターを５〜１００ｎｇのＣｈＩＰ材料に使用し、１：２５に希釈したアダプターを５ｎｇ未満のＣｈＩＰ材料に使用した。加熱した蓋を取り外したＰＣＲマシンで連結反応を実行した。アダプター連結されたＤＮＡを、清潔なＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに移し、Ｈ２Ｏを使用して量を９６．５μＬにした。
【０２６３】
ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、＃Ｂ２３３１７）を使用して、２００〜６００ｂｐのＣｈＩＰ断片を選択した。３０μＬのビーズを９６．５μＬのＣｈＩＰ試料に添加して、６００ｂｐより長い断片に結合させた。より短い断片を新鮮なＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに移した。１５μＬのビーズを添加して、２００ｂｐより長いＤＮＡに結合し、新鮮に調製された７５％エタノールを使用して、ビーズをＤＮＡで２回洗浄した。１７μＬの０．１Ｘ  ＴＥ緩衝液を使用して、ＤＮＡを溶出した。約１５μＬを収集した。
【０２６４】
３μＬのサイズ選択されたインプット試料及びＣｈＩＰ試料の全て（１５μＬ）をＰＣＲに使用した。サイズ選択されたＤＮＡの量は、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイを使用して測定した。約５〜１０ｎｇのサイズ選択されたＤＮＡを有するインプット試料及びＣｈＩＰ試料については７サイクル、及び５ｎｇ未満のサイズ選択されたＤＮＡを有する場合は１２サイクルにわたってＰＣＲを実行した。ＰＣＲ産生物（２５μＬ）の半分を、製造元の指示に従い、２２．５μＬのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、＃Ａ６３８８０）で精製した。ＰＣＲ産生物を、１７μＬの０．１Ｘ  ＴＥ緩衝液で溶出し、ＰＣＴ産生物の量をＱｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイを使用して測定した。５ｎｇ未満のＰＣＲ産生物を有する試料の残りの半分について、追加の４サイクルのＰＣＲを実行し、ＤＮＡを２２．５μＬのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを使用して精製した。濃度を測定して、収率の増加が存在したかどうかを決定した。両方の半分を複合し、Ｈ２Ｏを使用して量を最大５０μＬにした。
【０２６５】
２回目のＤＮＡの精製は、１７μＬの０．１Ｘ  ＴＥ中の４５μＬのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを使用して実行し、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイを使用して、最終収率を測定した。このプロトコルは、２０ｎｇから１ｍｇのＰＣＲ産生物を産生する。ライブラリーの質を、必要に応じて、製造元の推奨に基づいて高感度ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  ＤＮＡキット（Ａｇｉｌｅｎｔ、＃５０６７−４６２６）を使用し、１μＬの各試料をＨ２Ｏで希釈することによって検証した。
【０２６６】
ｖｉｉ．試薬
１１％のホルムアルデヒド溶液（５０ｍＬ）は、１４．９ｍＬの３７％ホルムアルデヒド（最終濃度１１％）、１ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ（最終濃度０．１Ｍ）、１００μＬの０．５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）（最終濃度１ｍＭ）、５０μＬの０．５Ｍ  ＥＧＴＡ（ｐＨ８）（最終濃度０．５ｍＭ）、及び２．５ｍＬの１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）（最終濃度５０ｍＭ）を含有していた。
【０２６７】
ブロッキング溶液は、ＰＢＳ中の０．５％のＢＳＡ（ｗ／ｖ）及び１００ｍＬのＰＢＳ中の５００ｍｇのＢＳＡを含有していた。ブロッキング溶液は、使用の最大約４日前に調製してもよい。
【０２６８】
溶解緩衝液１（ＬＢ１）（５００ｍＬ）は、２５ｍＬの１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１４ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１００％グリセロール溶液、２５ｍＬの１０％ＮＰ−４０、及び１２．５ｍＬの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有していた。ｐＨを７．５に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。
【０２６９】
溶解緩衝液２（ＬＢ２）（１０００ｍＬ）は、１０ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）、４０ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、及び２ｍＬの０．５Ｍ  ＥＧＴＡ（ｐＨ８．０）を含有していた。ｐＨを８．０に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。
【０２７０】
音波処理緩衝液（５００ｍＬ）は、２５ｍＬの１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１４ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍＬの５％Ｎａ−デオキシコール酸塩、及び５ｍＬの１０％ＳＤＳを含有していた。ｐＨを７．５に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。
【０２７１】
プロテイナーゼ阻害剤は、ＬＢ１、ＬＢ２、及び音波処理緩衝液に含まれていた。
【０２７２】
洗浄緩衝液２（５００ｍＬ）は、２５ｍＬの１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、３５ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍＬの５％Ｎａ−デオキシコール酸塩、及び５ｍＬの１０％ＳＤＳを含有していた。ｐＨを７．５に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。
【０２７３】
洗浄緩衝液３（５００ｍＬ）は、１０ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）、１ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１２５ｍＬの１Ｍ  ＬｉＣｌ溶液、２５ｍＬの１０％ＮＰ−４０、及び５０ｍＬの５％Ｎａ−デオキシコール酸塩を含有していた。ｐＨを８．０に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。
【０２７４】
ＣｈＩＰ溶出緩衝液（５００ｍＬ）は、２５ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）、１０ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１０％ＳＤＳ、及び４１５ｍＬのｄｄＨ２Ｏを含有していた。ｐＨを７．５に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。
【０２７５】
Ｇ．ＣｈＩＰ−ｓｅｑ結果の分析
各試料からの全てのパスフィルタ読み出し値を、デフォルトオプションを有するｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ  ０．４．４を使用して配列決定アダプターでトリミングした。トリミングした読み出し値を、デフォルトパラメーターを有するｂｗａバージョン０．７．１５（Ｌｉ（２０１３）ａｒＸｉｖ：１３０３．３９９７ｖ１）を使用して、ヒトゲノム（ｈｓ３８ｄ１／ＧＣＡ＿０００７８６０７５．２とマージしたアセンブリＧＲＣｈ３８／ＧＣＡ＿０００００１４０５．１５“ｎｏ  ａｌｔ”分析セット）に対してマップした。整列した読み出し重複を、ｐｉｃａｒｄ  ２．９．０（ｈｔｔｐ：／／ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｈｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｐｉｃａｒｄ）を使用して評価し、ＭＡＰＱ＜２０またはそれらの適合している標準ＳＡＭフラグ０ｘ１８０４を有する読み出し値を破棄した。標準ＱＣ（読み出し完全性、マッピング統計、ライブラリー複雑性、断片バイアス）を適用して、不満足な試料を除去した。ＭＡＣＳ２バージョン２．１．０を使用して、試料を全細胞抽出物対照と比較することによって、濃縮ＣｈＩＰ−ｓｅｑピークを同定し（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．（２００８）９（９）：Ｒ１３７）、有意なピークを０．０１未満の調節したｐ値を有するものとして選択した。既知の重複する既知の反復的な「ブラックリスト」領域（ＥＮＣＯＤＥ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｎａｔｕｒｅ（２０１２）４８９（７４１４：５７−７４）を破棄した。また、ＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルを読み出し深さによって正規化し、ＵＣＳＣブラウザーを使用して可視化した。
【０２７６】
Ｈ．ＲＮＡ−ｓｅｑ
このプロトコルは、以下のプロトコルの修飾バージョンである。ＭａｇＭＡＸ  ｍｉｒＶａｎａ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ単離キットユーザーガイド（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＃ＭＡＮ００１１１３１  Ｒｅｖ  Ｂ．０）、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡ磁気単離モジュール（Ｅ７４９０）、及びＩｌｌｕｍｉｎａ用ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＲＮＡライブラリー調製キット（Ｅ７４２０）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＃Ｅ７４９０１）。
【０２７７】
ＭａｇＭａｘ  ｍｉｒＶａｎａキット指示書（１４〜１７頁の「細胞からＲＮＡを単離する」と題されるセクション）を、培養物中の細胞から全ＲＮＡを単離するために使用した。接着細胞を含有するマルチウェルプレート（通常は２４ウェルプレート）のウェルあたり２００μＬの溶解結合混合物を使用した。
【０２７８】
ｍＲＮＡ単離及びライブラリー調製のために、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡ磁気単離モジュール及びＤｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｅｐキットを使用した。上記の細胞から単離されたＲＮＡを定量化し、５０μＬのヌクレアーゼ不含水中５００μｇの各試料中で調製した。このプロトコルは、微量遠心管または９６ウェルプレート中で実行することができる。
【０２７９】
８０％エタノールを新たに調製し、全ての溶出を０．１Ｘ  ＴＥ緩衝液中で行う。Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰビーズを必要とするステップの場合、ビーズを使用前に室温にした。試料の量を最初に測定し、ビーズを分注した。セクション１．９Ｂ（１．９Ａではない）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｏｌｉｇｏｓ（＃Ｅ６６０９）に使用した。ＰＣＲ富化を開始する前に、Ｑｕｂｉｔ（ＤＮＡ高感度キット、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ＃Ｑ３２８５４）を使用して、ｃＤＮＡを定量化した。ＰＣＲ反応を１２サイクルにわたって実行した。
【０２８０】
ＰＣＲ反応の精製（ステップ１．１０）後、Ｑｕｂｉｔ  ＤＮＡ高感度キットを使用して、ライブラリーを定量化した。１μＬの各試料を１〜２ｎｇ／μＬに希釈して、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（ＤＮＡ高感度キット、Ａｇｉｌｅｎｔ＃５０６７−４６２６）上で実行した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒが清浄でなかった場合（およそ３００ｂｐの１つの狭いピーク）、０．９Ｘまたは１．０Ｘのビーズ：試料比を使用して、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズクリーンアップステップを繰り返した。次いで、試料をＱｕｂｉｔで再度定量化し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で再度実行した（１〜２ｎｇ／μＬ）。
【０２８１】
ＩＮＴＡＣＴ精製された核または新皮質核全体からの核ＲＮＡを、ｃＤＮＡに変換し、Ｎｕｇｅｎ  Ｏｖａｔｉｏｎ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖ２で増幅させた。ライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２５００を使用してシーケンシングした。
【０２８２】
Ｉ．ＲＮＡ−ｓｅｑデータ分析
各試料からの全てのパスフィルタ読み出し値を、ＳＴＡＲバージョン２．５．３ａ（アラインメントパラメータａｌｉｇｎＩｎｔｒｏｎＭｉｎ＝２０；ａｌｉｇｎＩｎｔｒｏｎＭａｘ＝１００００００；ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｉｓｍａｔｃｈＮｍａｘ＝９９９；ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｉｓｍａｔｃｈＮｏｖｅｒＬｍａｘ＝０．０５；ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＴｙｐｅ＝ＢｙＳＪｏｕｔ；ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｕｌｔｉｍａｐＮｍａｘ＝２０；ａｌｉｇｎＳＪｏｖｅｒｈａｎｇＭｉｎ＝８；ａｌｉｇｎＳＪＤＢｏｖｅｒｈａｎｇＭｉｎ＝１；ａｌｉｇｎＭａｔｅｓＧａｐＭａｘ＝１００００００）を介した２つのパスマッピングを使用して、ヒトゲノム（ｈｓ３８ｄ１／ＧＣＡ＿０００７８６０７５．２とマージしたアセンブリＧＲＣｈ３８／ＧＣＡ＿０００００１４０５．１５“ｎｏ  ａｌｔ”分析セット）に対してマップした（Ｄｏｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２０１２）２９（１）：１５−２１）。ヒトＧＥＮＣＯＤＥ遺伝子セットリリース２４からの参照転写注釈に基づいて、ゲノムアラインメントをトランスクリプトームアラインメントに変換した（Ｈａｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．（２０１２）２２（９）：１７６０−１７７４）。独自のマルチマップされたトランスクリプトームアラインメントを使用して、遺伝子レベルの存在量推定値を、鎖認識の様式のＲＳＥＭバージョン１．３．０（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｄｅｗｅｙ，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２０１１）１２：３２３）を使用して、かつ信頼区間サンプリング計算を含んで計算して、基礎となるベイズモデルからの存在量（カウント及び正規化ＦＰＫＭ−百万個のマップされた断片あたりのエクソンのキロベースあたりの断片）の事後平均推定値（ＰＭＥ）に到達した。標準ＱＣ（読み出し完全性、マッピング統計、ライブラリー複雑性、断片バイアス）を適用して、不満足な試料を除去した。ＤＥＳｅｑ２バージョン１．１６．１によって実行した負の二項モデルを使用して、差次的遺伝子発現を計算した（Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．（２０１４）１５（１２）：５５０）。ＰＭＥカウントデータ（明示的にモデル化した複製対汎実験（ｐａｎ−ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）対照）、正規化した中央値比を使用して、最大事後確率ではなく最尤推定を使用して、かつ許容可能な調節したｐ値を決定するときに、クックの距離カットオフの使用を無効にして、Ｌｏｇ２倍率変化及び有意値を計算した。有意に差次的な遺伝子を、０．０１未満の調節したｐ値、１以上または−１以下のｌｏｇ２倍率変化、及び１以上のＰＭＥ  ＦＰＫＭを有する少なくとも１つの複製を有する遺伝子として割り当てた。また、ＲＮＡ−ｓｅｑシグナルを読み出し深さによって正規化し、ＵＣＳＣブラウザーを使用して可視化した。
【０２８３】
Ｊ．ＡＴＡＣ−ｓｅｑ
肝細胞を一晩播種し、次いで血清及び他の因子を取り除いた。２〜３時間後、細胞を化合物で処理し、一晩インキュベートした。細胞を採取し、核を転位反応のために調製した。５０，０００ビーズ結合した核を、Ｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｎｅｕｒｏｎ  ８６，１３６９−１３８４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、）に記載されるように、Ｔｎ５トランスポザーゼ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＦＣ−１２１−１０３０）を使用して転位させた。９〜１２サイクルのＰＣＲ増幅後、ライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００上でシーケンシングした。伸長を有するバーコード化されたプライマーを使用して、７２℃で５分間ＰＣＲを実施し、次いで最終ＰＣＲ産生物をシーケンシングした。
【０２８４】
各試料から得られた全ての読み出し値を、データ分析にＰｈｒｅｄスコア≧２０及び読み出し長≧３０を必要とするｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ０．４．１を使用してトリミングした。トリミングした読み出し値を、Ｂｏｗｔｉｅ２（バージョン２．２．９）を使用し、パラメーター：−ｔ−ｑ−Ｎ１−Ｌ２５−Ｘ２０００  ｎｏ−ｍｉｘｅｄ  ｎｏ−ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔを用いて、ヒトゲノム（ｈｇ１９ビルド）に対してマップした。全てのマップされていない読み出し値、固有にマップされていない読み出し値及びＰＣＲ重複を取り除いた。全てのＡＴＡＣ−ｓｅｑピークを、ＭＡＣＳ２を使用し、パラメーター：−−ｎｏｌａｍｂｄａ−ｎｏｍｏｄｅｌ−ｑ  ０．０１−−ＳＰＭＲを用いて呼び出した。ＡＴＡＣ−ｓｅｑシグナルを、ＵＣＳＣゲノムブラウザーにおいて可視化した。注釈の付いたプロモーター（ＲｅｆＳｅｑ、Ｅｎｓｅｍｂｌｅ及びＵＣＳＣ  Ｋｎｏｗｎ  Ｇｅｎｅデータベースの複合）から少なくとも２ｋｂ離れたＡＴＡＣ−ｓｅｑピークを、遠位ＡＴＡＣ−ｓｅｑピークとして選択した。
【０２８５】
Ｋ．ｑＲＴ−ＰＣＲ
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｎｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０７（４０）１７３１５−１７３２０（２０１０）に記載されるように、ｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析の前に、細胞培地を取り除き、ＲＮＡ抽出のためにＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ９６  ＱＩＡｃｕｂｅ  ＨＴキットカタログ番号７４１７１）と置き換えた。ＲＮｅａｓｙ９６キット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７４１８２）を使用し、ＲＮＡ抽出のために細胞を処理した。Ｔａｑｍａｎ  ｑＰＣＲ分析の場合、製造元の指示に従い、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ：４３６８８１３または４３６８８１４）を使用してｃＤＮＡを合成した。ｑＲＴ−ＰＣＲを、６０℃のアニーリングを用いたＢｉｏＲａｄからのｉＱ５  Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  ｒｔＰＣＲ検出システムを使用して、ｃＤＮＡで実施した。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのＴａｑｍａｎプローブを使用して、試料を増幅させた。
【０２８６】
ｑＲＴ−ＰＣＲによって測地される発現の倍率変化の分析を、以下の技法を使用して実施した。対照はＤＭＳＯであり、処理は選択された化合物（ＣＰＤ）であった。内部対照は、ＧＡＰＤＨまたはＢ−アクチン（もしくは別途示される）であり、関心対象の遺伝子は標的である。最初に、正規化のために以下４つの条件：ＤＭＳＯ：ＧＡＰＤＨ、ＤＭＳＯ：標的、ＣＰＤ：ＧＡＰＤＨ、及びＣＰＤ：標的の平均を計算した。次に、（ＤＭＳＯ：標的）−（ＤＭＳＯ：ＧＡＰＤＨ）＝ΔＣＴ対照及び（ＣＰＤ：標的）−（ＣＰＤ：ＧＡＰＤＨ）＝ΔＣＴ実験を使用して対照及び処理の両方のΔＣＴを計算して、内部対照（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化した。次いで、ΔＣＴ実験−ΔＣＴ対照によってΔΔＣＴを計算した。２−（ΔΔＣＴ）によって発現倍率変化を計算した（本明細書に提供されるＲＮＡ−Ｓｅｑ結果によって２倍発現変化が示された）。
【０２８７】
いくつかの例では、ＲＱ最小値及びＲＱ最大値もまた報告される。ＲＱ最小及びＲＱ最大は、それぞれ試験試料中の遺伝子発現の最小及び最大相対レベルである。それらは分析設定における信頼レベルセットを使用して計算され、信頼レベルは１標準偏差（ＳＤ）に設定された。これらの値は、以下のように標準偏差を使用して計算した：ＲＱ最小＝２−（ΔΔＣＴ−ＳＤ）、及びＲＱ最大＝２−（ΔΔＣＴ＋ＳＤ）
【０２８８】
Ｌ．ペアエンドタグシーケンシング（ＣｈＩＰ−ＰＥＴ）によるクロマチン相互作用分析
ＣｈＩＡ−ＰＥＴは、各々が参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｐｅｌｅｖ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２２，４９０−５０３、Ｆｕｌｌｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  ４６２，５８−６４、Ｇｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３７９１／３７７０、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ  １４８，８４−９８、及びＤｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ  １５９，３７４−３８７において以前に記載されているように実施される。手短に言えば、胚幹（ＥＳ）細胞（最大１×１０８細胞）を、室温で２０分間１％ホルムアルデヒドで処理し、次いで０．２Ｍグリシンを使用して中和する。架橋クロマチンは、音波処理によって３００〜７００ｂｐのサイズ長に断片化される。抗ＳＭＣ１抗体（Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ３００−０５５Ａ）を使用して、ＳＭＣ１結合されたクロマチン断片を富化する。ＣｈＩＰ  ＤＮＡの部分を、濃度定量化のため、及び定量的ＰＣＲを使用する富化分析のために抗体で被覆されたビーズから溶出される。ＣｈＩＡ−ＰＥＴライブラリー構築の場合、ＣｈＩＰ  ＤＮＡ断片は、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して末端修復される。ＣｈＩＰ  ＤＮＡ断片を２アリコートに分割し、リンカーＡまたはリンカーＢのいずれかを断片端部に連結する。２つのリンカーは、ヌクレオチドバーコードとして使用される２つのヌクレオチドが異なる（リンカーＡはＣＧ、リンカーＢはＡＴ）。リンカー連結後、２つの試料を複合し、２０ｍＬ量で希釈して、異なるＤＮＡ−タンパク質複合体間の連結を最小化することによって近位連結のために調製される。近位連結反応は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で実施し、２２℃で２０時間揺らすことなくインキュベートする。近位連結中に、同じリンカー配列を有するＤＮＡ断片は、同じクロマチン複合体内で連結され、これがホモ二量体リンカー組成を有する連結産生物を生成した。しかしながら、異なるクロマチン複合体からＤＮＡ断片間のキメラ連結もまた起こり得、したがってホモ二量体リンカー組成を有する連結産生物を産生する。これらのホモ二量体リンカー産生物を使用して、非特異的連結の頻度を評価し、次いで取り除かれる。
【０２８９】
ｉ．１日目
ＣｈＩＰについて記載されるように細胞を架橋した。冷凍細胞ペレットを、使用準備が整うまで−８０℃の冷凍庫で保存した。このプロトコルは、６つの１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ中で冷凍された少なくとも３×１０８細胞（チューブあたり５０００万細胞）を必要とした。６つの１００μＬプロテインＧ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（各ＣｈＩＡ−ＰＥＴ試料について）を、氷上の６つの１．５ｍＬエッペンドルフチューブに添加した。ビーズを１．５ｍＬのブロッキング溶液で３回洗浄し、各洗浄ステップの間に４℃で１０分間回転させながらインキュベートして、効率的なブロッキングを可能にした。プロテインＧ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓを、６つのチューブの各々において２５０μＬのブロッキング溶液中に再懸濁し、１０μｇのＳＭＣ１抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ａ３００−０５５Ａ）を各チューブに添加した。ビーズ−抗体混合物を、４℃で回転させながら一晩インキュベートした。
【０２９０】
ｉｉ．２日目
ビーズを１．５ｍＬのブロッキング溶液で３回洗浄して、未結合のＩｇＧを取り除き、毎回４℃で１０分間、回転させながらインキュベートした。Ｓｍｃ１結合されたビーズを、１００μＬのブロッキング溶液中に再懸濁し、４℃で保存した。最終溶解緩衝液１（試料あたり８ｍＬ）を、５０ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル溶液を溶解緩衝液１（ＬＢ１）（１：５０）に添加することによって調製した。８ｍＬの最終溶解緩衝液１を、各冷凍細胞ペレット（試料あたり８ｍＬ×６）に添加した。細胞を完全に再懸濁し、上下にピペットすることによって氷上で解凍した。細胞懸濁液を、４℃で１０分間回転させながら再度インキュベートした。懸濁液を４℃で５分間、１，３５０ｇで遠心分離した。同時に、最終溶解緩衝液２（試料あたり８ｍＬ）を、５０ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル溶液を溶解緩衝液２（ＬＢ２）（１：５０）に添加することによって調製した。
【０２９１】
遠心分離後、上澄みを破棄し、上下にピペットすることによって、核を８ｍＬの最終溶解緩衝液２中に完全に再懸濁した。細胞懸濁液を、４℃で１０分間回転させながらインキュベートした。懸濁液を４℃で５分間、１，３５０ｇで遠心分離した。インキュベーション及び遠心分離中に、最終溶解緩衝液（試料あたり１５ｍＬ）を、５０ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル溶液を音波処理緩衝液（１：５０）に添加することによって調製した。上澄みを破棄し、上下にピペットすることによって、核を１５ｍＬの最終音波処理緩衝液中に完全に再懸濁した。核抽出物を、氷上の１５の１ｍＬ  Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｅ２２０音波処理チューブに抽出した。１０μＬのアリコートを使用して、ゲル上の音波処理されていないクロマチンのサイズをチェックした。
【０２９２】
Ｃｏｖａｒｉｓ音波処理器を、製造元の指示に従ってプログラムした（２０００万細胞あたり１２分＝１２×１５＝３時間）。試料を上記のように順次シーケンシングした。目標は、クロマチンＤＮＡを２００〜６００ｂｐに切断することであった。音波処理断片が大きすぎた場合、擬陽性がより頻繁になった。音波処理された核抽出物を、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ中に分注した。１．５ｍＬの試料を４℃で１０分間、完全速度で遠心分離した。上澄み（ＳＮＥ）を新しい予め冷却された５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ中にプールし、音波処理緩衝液で１８ｍＬの量にした。２つの５０μＬのチューブを、インプットとして、また断片のサイズをチェックするために取った。２５０μＬのＣｈＩＰ溶出緩衝液を添加し、逆架橋は６５℃で一晩、オーブン内で起こる。架橋の逆転後、音波処理断片のサイズをゲル上で決定した。
【０２９３】
３ｍＬの音波処理抽出物を、６つの清潔な１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブの各々において、ＳＭＣ１抗体を有する１００μＬのプロテインＧビーズに添加した。ＳＮＥ−ビーズ混合物を含有するチューブを、４℃で一晩回転させながらインキュベートした（１４〜１８時間）。
【０２９４】
ｉｉｉ．３日目
ＳＮＥ−ビーズ混合物の量の半分（１．５ｍＬ）を、６つの予め冷却されたチューブの各々に添加し、磁石を使用してＳＮＥを取り除いた。チューブを以下のように順次洗浄した。１）１．５ｍＬの音波処理緩衝液を添加し、ビーズを再懸濁して、結合するために４℃で５分間回転させた後、液体を取り除いた（ステップを２回実施した）；２）１．５ｍＬの高塩音波処理緩衝液を添加し、ビーズを再懸濁して、結合するために４℃で５分間回転させた後、液体を取り除いた（ステップを２回実施した）；３）１．５ｍＬの高塩音波処理緩衝液を添加し、ビーズを再懸濁して、結合するために４℃で５分間回転させた後、液体を取り除いた（ステップを２回実施した）；４）１．５ｍＬのＬｉＣｌ緩衝液を添加し、細胞を再懸濁して、結合するために５分間回転させながらインキュベートした後、液体を取り除いた（ステップを２回実施した）；５）１．５ｍＬの１Ｘ  ＴＥ＋０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用して、結合するために５分間細胞を洗浄した後、液体を取り除き、１．５ｍＬの氷冷ＴＥ緩衝液を使用して、結合するために３０秒間細胞を洗浄した後、液体を取り除いた（ステップを２回実施した）。６つのチューブ全てからのビーズを、１Ｘ氷冷ＴＥ緩衝液の１つの１，０００μＬチューブ中で順次再懸濁した。
【０２９５】
ＣｈＩＰ−ＤＮＡを以下のプロトコルを使用して定量化した。ビーズの１０（体積）パーセントまたは１００μＬを、磁石を使用して新たな１．５ｍＬチューブに移した。ビーズを３００μＬのＣｈＩＰ溶出緩衝液に再懸濁し、チューブを６５℃で１時間、ビーズで回転させた。ビーズを含むチューブを磁石上に置き、溶出液を新鮮なＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに移した。溶出液を６５℃のオーブンで一晩、回転させずにインキュベートした。免疫沈降試料を新鮮なチューブに移し、３００μＬのＴＥ緩衝液を免疫沈降及びインプット試料に添加して希釈した。５μＬのＲＮａｓｅ  Ａ（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、チューブを３７℃で３０分間インキュベートした。
【０２９６】
インキュベーションに続いて、３μＬの１Ｍ  ＣａＣｌ２及び７μＬの２０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを添加し、５５℃で１．５時間インキュベートした。ＭａＸｔｒａｃｔ高密度２ｍＬゲルチューブ（Ｑｉａｇｅｎ）を、室温で３０秒間、全速でそれらを遠心分離することによって調製した。６００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを、核プロテイナーゼＫ反応に添加した。約１．２ｍＬの混合物をＭａＸｔｒａｃｔチューブに移した。チューブを室温で５分間、１６，０００ｇで回転させた。水相を２つの清潔なＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄチューブに移し（各チューブに３００μＬ）、１μＬのグリコーゲン、３０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム、及び９００μＬのエタノールを添加した。混合物を−２０℃で一晩または−８０℃で１時間沈降させた。
【０２９７】
混合物を４℃で２０分間、最大速度で遠心沈降させ、エタノールを取り除き、チューブを４℃で５分間、最大速度で遠心沈殿させることによって、ペレットを１ｍＬの７５％エタノールで洗浄した。エタノールの残余を全て取り除き、ペレットを室温で５分間乾燥させた。Ｈ２Ｏを各チューブに添加する。各チューブを５分間放置し、短時間ボルテックスした。両方のチューブからのＤＮＡを組み合わせ、５０μＬのＩＰ及び１００μＬのインプットＤＮＡを得た。
【０２９８】
収集されたＤＮＡの量を、Ｑｕｂｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ｑ３２８５６）を使用してＣｈＩＰによって定量化した。１μＬのインターカレーター色素を各測定１μＬの試料と複合した。キットに付随する２つの標準物を使用した。ビーズのわずか１０％からのＤＮＡを測定した。９００μＬのビーズ懸濁液中の約４００ｎｇのクロマチンを、ｑＰＣＲによって測定されるエンハンサー及びプロモーターにおける良好な富化によって得た。
【０２９９】
ｉｖ．３日目または４日目
ＣｈＩＰ−ＤＮＡの末端鈍化を、以下のプロトコルを使用してビーズ上で実施した。残りのクロマチン／ビーズを、ピペットによって分割し、４５０μＬのビーズ懸濁液を２つのチューブに分注した。ビーズを磁石上で収集した。上澄みを取り除き、次いでビーズを以下の反応混合物中に再懸濁した：７０μＬの１０Ｘ  ＮＥＢ緩衝液２．１（ＮＥＢ、Ｍ０２０３Ｌ）、７μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、６１５．８μＬのｄＨ２０、及び７．２μＬの３Ｕ／μＬのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２０３Ｌ）。ビーズを３７℃で４０分間回転させながらインキュベートした。ビーズを磁石で収集し、次いでビーズを１ｍＬの氷冷ＣｈＩＡ−ＰＥＴ洗浄緩衝液で３回洗浄した（各洗浄あたり３０秒）。
【０３００】
ビーズ上Ａ−テーリングを、下記のようにＫｌｅｎｏｗ（３´〜５´エキソ−）マスターミックスを調製することによって実施した：７０μＬの１０Ｘ  ＮＥＢ緩衝液２、７μＬの１０ｍＭ  ｄＡＴＰ、６１６μＬのｄＨ２０、及び７μＬの３Ｕ／μＬのＫｌｅｎｏｗ（３´〜５´エキソ−）（ＮＥＢ、Ｍ０２１２Ｌ）。混合物を３７℃で５０分間回転させながらインキュベートした。ビーズを磁石で収集し、次いでビーズを１ｍＬの氷冷ＣｈＩＡ−ＰＥＴ洗浄緩衝液で３回洗浄した（各洗浄あたり３０秒）。
【０３０１】
リンカーを氷上で優しく解凍した。リンカーを、優しくピペットすることによって水と、次いでＰＥＧ緩衝液と十分混合した後、優しくボルテックスした。次いで、チューブあたり１３９４μＬのマスターミックス及び６μＬのリガーゼを添加し、反転によって混合した。パラフィルムをチューブ上に置き、チューブを１６℃で一晩（少なくとも１６時間）回転させながらインキュベートした。ビオチン化リンカーを、以下の反応混合物を設定し、試薬を以下の順に添加することによって、ビーズ上でＣｈＩＰ−ＤＮＡに連結した。１１１０μＬのｄＨ２０、４μＬの２００ｎｇ／μＬのビオチン化架橋リンカー、ＰＥＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有する２８０μＬの５Ｘ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液、及び６μＬの３０Ｕ／μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）。
【０３０２】
ｖ．５日目
エキソヌクレアーゼλ／エキソヌクレアーゼＩ  Ｏｎ−Ｂｅａｄ消化を、以下のプロトコルを使用して実施した。ビーズを磁石で収集し、１ｍＬの氷冷ＣｈＩＡ−ＰＥＴ洗浄緩衝液で３回洗浄する（各洗浄あたり３０秒）。洗浄緩衝液をビーズから取り除き、次いで以下の反応混合物中に再懸濁した：７０μＬの１０Ｘ  λヌクレアーゼ緩衝液（ＮＥＢ、Ｍ０２６２Ｌ）、６１８μＬのヌクレアーゼ不含ｄＨ２０、６μＬの５Ｕ／μＬ  λエキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２６２Ｌ）、及び６μＬのエキソヌクレアーゼＩ（ＮＥＢ、Ｍ０２９３Ｌ）。反応物を３７℃で１時間回転させながらインキュベートした。ビーズを磁石で収集し、ビーズを１ｍＬの氷冷ＣｈＩＡ−ＰＥＴ洗浄緩衝液で３回洗浄した（各洗浄あたり３０秒）。
【０３０３】
全ての残留緩衝液を取り除き、ビーズを３００μＬのＣｈＩＰ溶出緩衝液中に再懸濁することによって、クロマチン複合体をビーズから溶出した。ビーズを含むチューブを６５℃で１時間回転させた。チューブを磁石上に置き、溶出液を新鮮なＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに移した。溶出液を６５℃のオーブンで一晩、回転させずにインキュベートした。
【０３０４】
ｖｉ．６日目
溶出された試料を新鮮なチューブに移し、３００μＬのＴＥ緩衝液を添加してＳＤＳを希釈した。３μＬのＲＮａｓｅ  Ａ（３０ｍｇ／ｍＬ）をチューブに添加し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、３μＬの１Ｍ  ＣａＣｌ２及び７μＬの２０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを添加し、チューブを５５℃で１．５時間再度インキュベートした。ＭａＸｔｒａｃｔ高密度２ｍＬゲルチューブ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、室温で３０秒間、全速でチューブを遠心分離することによって、材料を沈降させ、ペレット化（ｐｅｌｌａｔｅｄ）した。６００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを各プロテイナーゼＫ反応に添加し、約１．２ｍＬの混合物中でＭａＸｔｒａｃｔチューブに移した。チューブを室温で５分間、１６，０００ｇで回転させた。
【０３０５】
水相を２つの清潔なＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄチューブに移し（各チューブに３００μＬ）、１μＬのグリコーゲン、３０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム、及び９００μＬのエタノールを添加した。混合物を−８０℃で１時間沈降させた。チューブを４℃で３０分間、最大速度で遠心沈降させ、エタノールを取り除いた。チューブを４℃で５分間、最大速度で遠心沈殿させることによって、ペレットを１ｍＬの７５％エタノールで洗浄した。エタノールの残余を取り除き、ペレットを室温で５分間乾燥させた。３０μＬのＨ２Ｏをペレットに添加し、５分間放置する。ペレット混合物を短時間ボルテックスし、遠心沈降させてＤＮＡを収集した。
【０３０６】
Ｑｕｂｉｔ及びＤＮＡ高感度ＣｈＩＰを実施して、近位連結されたＤＮＡ産生物を定量化し、その質を評価した。約１２０ｎｇの産生物が得られた。
【０３０７】
ｖｉｉ．７日目
次いで、Ｎｅｘｔｅｒａ断片化（ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）の構成成分を調製した。１００ｎｇのＤＮＡを、１２．５μＬの２Ｘ断片化緩衝液（Ｎｅｘｔｅｒａ）、１μＬのヌクレアーゼ不含ｄＨ２Ｏ、２．５μＬのＴｎ５酵素（Ｎｅｘｔｅｒａ）、及び９μＬのＤＮＡ（２５ｎｇ）を含有する４つの２５μＬ反応物中に分割した。反応物の各々の断片化を、品質管理のためにＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で分析した。
【０３０８】
反応物を５５℃で５分間、次いで１０℃で１０分間インキュベートした。２５μＬのＨ２Ｏを添加し、断片化されたＤＮＡをＺｙｍｏカラムを使用して精製した。３５０μＬの結合緩衝液を試料に添加し、混合物をカラム中に装填して、１３，０００ｒｐｍで３０秒間回転させた。フロースルーを再適用し、カラムを再度回転させた。カラムを２００μＬの洗浄緩衝液で２回洗浄し、１分間回転させて膜を乾燥させた。カラムを清潔なエッペンドルフチューブに移し、２５μＬの溶出緩衝液を添加した。チューブを１分間遠心沈降させた。このステップを別の２５μＬの溶出緩衝液で繰り返した。全ての断片化されたＤＮＡを１つのチューブに複合した。
【０３０９】
ＣｈＩＡ−ＰＥＴを、以下のステップを使用してストレプトアビジンビーズ上で固定化した。２Ｘ  Ｂ＆Ｗ緩衝液（４０ｍＬ）を、核酸のカップリングのために以下のように調製した：４００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（１０ｍＭ最終）、８０μＬの１Ｍ  ＥＤＴＡ（１ｍＭ最終）、１６ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ（２Ｍ最終）、及び２３．５２ｍＬのｄＨ２Ｏ。１Ｘ  Ｂ＆Ｗ緩衝液（４０ｍＬ全量）を、２０ｍＬのｄＨ２Ｏを２０ｍＬの２Ｘ  Ｂ＆Ｗ緩衝液に添加することによって調製した。
【０３１０】
ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０を３０分間室温にし、３０μＬのビーズを新たな１．５ｍＬチューブに移した。ビーズを１５０μＬの２Ｘ  Ｂ＆Ｗ緩衝液で２回洗浄した。ビーズを１００μＬのｉＢｌｏｃｋ緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中に再懸濁し、混合した。混合物を室温で４５分間、回転器上でインキュベートした。
【０３１１】
Ｉ−ＢＬＯＣＫ試薬を、０．２％のＩ−Ｂｌｏｃｋ試薬（０．２ｇ）、１Ｘ  ＰＢＳまたは１Ｘ  ＴＢＳ（１０ｍＬの１０Ｘ  ＰＢＳまたは１０Ｘ  ＴＢＳ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（５０μＬ）、及びＨ２Ｏを１００ｍＬまで含有するように調製した。１０Ｘ  ＰＢＳ及びＩ−ＢＬＯＣＫ試薬をＨ２Ｏに添加し、混合物を４０秒間マイクロ波処理した（沸騰させない）後、撹拌した。溶液を冷却した後、Ｔｗｅｅｎ−２０を添加した。溶液は不透明なままであったが、粒子は溶解された。使用するために溶液を室温に冷却した。
【０３１２】
ビーズのインキュベーション中に、５００ｎｇの剪断ゲノムＤＮＡを５０μＬのＨ２Ｏ及び５０μＬの２Ｘ  Ｂ＆Ｗ緩衝液に添加した。ビーズがｉＢＬＯＣＫ緩衝液でのインキュベーションを終えたとき、それらを２００μＬの１Ｘ  Ｂ＆Ｗ緩衝液で２回洗浄した。洗浄緩衝液を破棄し、１００μＬの剪断ゲノムＤＮＡを添加した。混合物を室温で３０分間回転させながらインキュベートした。ビーズを２００μＬの１Ｘ  Ｂ＆Ｗ緩衝液で２回洗浄した。断片化ＤＮＡを、等量の２Ｘ  Ｂ＆Ｗ緩衝液とともにビーズに添加し、室温で４５分間、回転させながらインキュベートした。ビーズを５００μＬの２ｘＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ緩衝液（毎回３０秒）で５回洗浄し、続いて５００ｍＬの１Ｘ  Ｂ＆Ｗ緩衝液で２回洗浄し、各洗浄後に室温で５分間、回転させながらインキュベートした。ビーズを優しく再懸濁し、チューブを磁石上に置くことによって、Ｑｉａｇｅｎキットからの１００μＬの溶出緩衝液（ＥＢ）で１回洗浄した。上澄みをビーズから取り除き、それらを３０μＬのＥＢ中に再懸濁した。
【０３１３】
ペアエンドシーケンシングライブラリーを、以下のプロトコルを使用してビーズ上に構築した。１０μＬのビーズを、１０サイクルの増幅でＰＣＲにより試験した。５０μＬのＰＣＲ混合物は、１０μＬのビーズＤＮＡ、１５μＬのＮＰＭ混合物（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｎｅｘｔｅｒａキットから）、５μＬのＰＰＣ  ＰＣＲプライマー、５μＬのＩｎｄｅｘプライマー１（ｉ７）、５μＬのＩｎｄｅｘプライマー２（ｉ５）、及び１０μＬのＨ２Ｏを含有した。以下のサイクル条件を使用して、ＰＣＲを実施した：７２℃で３分間、次いで９８℃で１０秒間、６３℃で３０秒間、及び７２℃で５０秒間の１０〜１２サイクル、ならびに７２℃で５分間の最終延長でＤＮＡを変性させる。サイクルの数を調整して、４つの２５μＬの反応物とともに合計約３００ｎｇのＤＮＡを得た。ＰＣＲ産生物は、不明確な量の時間にわたって４℃で保持され得る。
【０３１４】
ＰＣＲ産生物を、ＡＭＰｕｒｅビーズを使用してクリーンアップした。ビーズを使用する前に３０分間室温にさせた。５０μＬのＰＣＲ反応物を新たなＬｏｗ−Ｂｉｎｄチューブに移し、（１．８ｘ量）９０μＬのＡＭＰｕｒｅビーズを添加した。混合物を十分にピペットし、室温で５分間インキュベートした。磁石を３分間使用してビーズを収集し、上澄みを取り除いた。３００μＬの新鮮に調製された８０％エタノールを磁石上のビーズに添加し、エタノールを慎重に破棄した。洗浄を繰り返し、次いで全てのエタノールを取り除いた。ビーズを磁石ラック上で１０分間乾燥させた。１０μＬのＥＢをビーズに添加し、十分に混合して、室温で５分間インキュベートした。溶出液を収集し、１μＬの溶出液をＱｕｂｉｔ及びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒに使用した。
【０３１５】
ライブラリーをクローン化して、以下のプロトコルを使用して複雑性を検証した。１μＬのライブラリーを１：１０で希釈した。ＰＣＲ反応を下記のように実施した。Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターにアニールするプライマーを選択した（Ｔｍ＝５２．２℃）。ＰＣＲ反応混合物（全量：５０μＬ）は、以下を含有した：１０μＬの５Ｘ  ＧｏＴａｑ緩衝液、１μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、５μＬの１０μＭプライマーミックス、０．２５μＬのＧｏＴａｑポリメラーゼ、１μＬの希釈したテンプレートＤＮＡ、及び３２．７５μＬのＨ２Ｏ。以下のサイクル条件を使用して、ＰＣＲを実施した：９５℃で２分間、及び以下の条件で２０サイクル、ＤＮＡを変性させる：９５℃で６０秒間、５０℃で６０秒間、及び７２℃で３０秒間、７２℃で５分間の最終延長。ＰＣＲ産生物は、不明確な量の時間にわたって４℃で保持され得る。
【０３１６】
ＰＣＲ産生物を、ｐＧＥＭ（登録商標）Ｔ−Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）プロトコルで連結した。５μＬの２Ｘ  Ｔ４  Ｑｕｉｃｋリガーゼ緩衝液、１μＬのｐＧＥＭ（登録商標）Ｔ−Ｅａｓｙベクター、１μＬのＴ４リガーゼ、１μＬのＰＣＲ産生物、及び２μＬのＨ２Ｏを、全量１０μＬまで複合した。産生物を室温で１時間インキュベートし、２μＬを使用して星コンピテント細胞を形質転換した。２００μＬの５００μＬの細胞をＳＯＣ培地にプレーティングした。翌日、Ｔ７プロモータープライマーを使用して、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングのための２０コロニーを選択する。６０％クローンは、完全なアダプターを有し、１５％が部分的アダプターを有していた。
【０３１７】
ｖｉｉｉ．試薬
１０試料のプロテインＧ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｙｎａｌカタログ番号１０００３Ｄからのものであった。ブロッキング溶液（５０ｍＬ）は、５０ｍＬのｄｄＨ２Ｏに溶解された０．２５ｇのＢＳＡ（０．５％のＢＳＡ、ｗ／ｖ）を含有し、使用前に４℃で２日間保存した。
【０３１８】
溶解緩衝液１（ＬＢ１）（５００ｍＬ）は、２５ｍＬの１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１４ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１００％グリセロール溶液、２５ｍＬの１０％ＮＰ−４０、及び１２．５ｍＬの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有した。ｐＨを７．５に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。溶解緩衝液２（ＬＢ２）（１０００ｍＬ）は、１０ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）、４０ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、及び２ｍＬの０．５Ｍ  ＥＧＴＡ（ｐＨ８．０）を含有した。ｐＨを８．０に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。
【０３１９】
音波処理緩衝液（５００ｍＬ）は、２５ｍＬの１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１４ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍＬの５％Ｎａ−デオキシコール酸塩、及び５ｍＬの１０％ＳＤＳを含有した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。高塩音波処理緩衝液（５００ｍＬ）は、２５ｍＬの１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、３５ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍＬの５％Ｎａ−デオキシコール酸塩、及び５ｍＬの１０％ＳＤＳを含有した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。
【０３２０】
ＬｉＣｌ洗浄緩衝液（５００ｍＬ）は、１０ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）、１ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１２５ｍＬの１Ｍ  ＬｉＣｌ溶液、２５ｍＬの１０％ＮＰ−４０、及び５０ｍＬの５％Ｎａ−デオキシコール酸塩を含有した。ｐＨを８．０に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。
【０３２１】
ＣｈＩＰ  ＤＮＡの量を定量化するために使用した溶出緩衝液（５００ｍＬ）は、２５ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）、１０ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１０％ＳＤＳ、及び４１５ｍＬのｄｄＨ２Ｏを含有した。ｐＨを８．０に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。
【０３２２】
ＣｈＩＡ−ＰＥＴ洗浄緩衝液（５０ｍＬ）は、５００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（最終１０ｍＭ）、１００μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）（最終１ｍＭ）、５ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ（最終５００ｍＭ）、及び４４．４ｍＬのｄＨ２Ｏを含有した。
【０３２３】
Ｍ．ＨｉＣｈＩＰ
ＣｈＩＡ−ＰＥＴの代替として、ＨｉＣｈＩＰを使用して、クロマチン相互作用及び立体配座を分析した。ＨｉＣｈＩＰは、ＣｈＩＡ−ＰＥＴよりも少ない細胞を必要とする。
【０３２４】
ｉ．細胞架橋
上のＣｈＩＰプロトコルに記載されるように細胞を架橋した。架橋した細胞を、−８０℃でペレットとして保存するか、または細胞を急速冷凍した直後にＨｉＣｈＩＰに使用した。
【０３２５】
ｉｉ．溶解及び制限
１５００万個の架橋細胞を５００μＬの氷冷Ｈｉ−Ｃ溶解緩衝液中に再懸濁し、４℃で３０分間回転させた。１５００万より多くの細胞量の場合、ペレットを接触生成のために半分に分割し、次いで音波処理のために組み合えた。細胞を２５００ｇで５分間遠心沈降し、上澄みを破棄した。ペレット化した核を、５００μＬの氷冷Ｈｉ−Ｃ溶解緩衝液で１回洗浄した。上澄みを取り除き、ペレットを１００μＬの０．５％ＳＤＳ中に再懸濁した。再懸濁液を６２℃で１０分間インキュベートし、次いで２８５μＬのＨ２Ｏ及び５０μＬの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加して、ＳＤＳをクエンチした。再懸濁液を十分に混合し、３７℃で１５分間インキュベートした。５０μＬの１０Ｘ  ＮＥＢ緩衝液２及び３７５ＵのＭｂｏＩ制限酵素（ＮＥＢ、Ｒ０１４７）を混合物に添加して、３７℃で２時間回転させることによってクロマチンを消化した。より下位の出発物質の場合、より少ない制限酵素を使用し、１５μＬを１０００〜１５００万細胞、８μＬを５００万細胞、及び４μＬを１００万細胞に使用した。熱（６２℃で２０分間）を使用して、ＭｂｏＩを不活化した。
【０３２６】
ｉｉｉ．ビオチン組み込み及び近位連結
制限断片オーバーハングを満たし、ＤＮＡ端部をビオチンでマークするために、３７．５μＬの０．４ｍＭビオチン−ｄＡＴＰ（Ｔｈｅｒｍｏ１９５２４０１６）、１．５μＬの１０ｍＭ  ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、ならびに１０μＬの５Ｕ／μＬ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、大きな（Ｋｌｅｎｏｗ）断片（ＮＥＢ、Ｍ０２１０）を複合することによって、５２μＬの充填マスターミックスを反応させた。混合物を、３７℃で１時間回転させながらインキュベートした。
【０３２７】
９４８μＬの連結マスターミックスを添加した。連結マスターミックスは、１０ｍＭ  ＡＴＰを含む１５０μＬの１０Ｘ  ＮＥＢ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ、Ｂ０２０２）、１２５μＬの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、３μＬの５０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１０μＬの４００Ｕ／μＬ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２０２）、及び６６０μＬの水を含有した。混合物を、室温で４時間回転させながらインキュベートした。核を２５００ｇで５分間ペレット化し、上澄みを取り除いた。
【０３２８】
ｉｖ．音波処理
音波処理の場合、ペレットを核溶解緩衝液中で最大１０００μＬにした。試料をＣｏｖａｒｉｓミリチューブに移し、ＤＮＡを製造元の推奨するパラメーターでＣｏｖａｒｉｓ（登録商標）Ｅ２２０Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（商標）を使用して剪断した。各チューブ（１５００万細胞）を以下の条件下で４分間音波処理した。充填レベル５、デューティサイクル５％、ＰＩＰ１４０、及びサイクル／バースト２００。
【０３２９】
ｖ．プレクリアリング、免疫沈降、ＩＰビーズ捕捉、及び洗浄
試料を４℃で１５分間、１６，１００ｇで清澄化した。試料を各々約４００μＬの２つのチューブに分割し、７５０μＬのＣｈＩＰ希釈緩衝液を添加した。Ｓｍｃ１ａ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ａ３００−０５５Ａ）の場合、試料をＣｈＩＰ希釈緩衝液中で１：２に希釈して、０．３３％のＳＤＳ濃度を達成した。６０μＬのプロテインＧビーズを、ＣｈＩＰ希釈緩衝液中１０００万細胞ごとに洗浄した。ビーズ（プレクリアリング及び捕捉のため）及び抗体の量を、異なる量の細胞出発物質について直線的に調節した。プロテインＧビーズをチューブあたり５０μＬ（ＨｉＣｈＩＰあたり１００μＬ）の希釈緩衝液中に再懸濁した。試料を４℃で１時間回転させた。試料を磁石上に置き、上澄みを新たなチューブに移した。７．５μｇの抗体を１０００万細胞ごとに添加し、混合物を４℃で一晩回転させながらインキュベートした。別の６０μＬのプロテインＧビーズを、ＣｈＩＰ希釈緩衝液中１０００万細胞ごとに添加した。プロテインＧビーズを、５０μＬの希釈緩衝液（ＨｉＣｈＩＰあたり１００μＬ）中に再懸濁し、試料に添加して、４℃で２時間回転させた。ビーズを低塩洗浄緩衝液、高塩洗浄緩衝液、及びＬｉＣｌ洗浄緩衝液で各々３回洗浄した。５００μＬの洗浄緩衝液を添加し、試料を磁石に対して動かすことによってビーズを前後に２回振り、次いで上澄みを取り除くことによって、磁石上で室温で洗浄を実施した。
【０３３０】
ｖｉ．ＣｈＩＰ  ＤＮＡ溶出
ＣｈＩＰ試料ビーズを１００μＬの新鮮なＤＮＡ溶出緩衝液中に再懸濁した。試料ビーズを室温で１０分間回転させながらインキュベートし、続いて３７℃で３分間振とうさせながらインキュベートした。ＣｈＩＰ試料を磁石上に置き、上澄みを新鮮なチューブに取り除いた。別の１００μＬのＤＮＡ溶出緩衝液をＣｈＩＰ試料に添加し、インキュベーションを繰り返した。ＣｈＩＰ試料の上澄みを再度取り除き、新たなチューブに移した。約２００μＬのＣｈＩＰ試料が存在していた。１０μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）を各試料に添加し、５５℃で４５分間振とうさせながらインキュベートした。温度を６７℃に高め、試料を少なくとも１．５時間振とうさせながらインキュベートした。ＤＮＡをＺｙｍｏ精製し（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、＃Ｄ４０１４）、１０μＬの水に溶出した。ポストＣｈＩＰ  ＤＮＡを定量化して、ライブラリーを正しいサイズ分布で生成するために必要とされるＴｎ５の量を推定した。これは、接触ライブラリーを適切に生成し、試料を過剰に音波処理せず、材料をストレプトアビジンビーズ上で頑強に捕捉したと推測した。１０００万細胞でのＳＭＣ１  ＨｉＣｈＩＰは、１５ｎｇ〜５０ｎｇのポストＣｈＩＰ  ＤＮＡの予想収率を有していた。１５０ｎｇより多くのポストＣｈＩＰ  ＤＮＡを有するライブラリーの場合、材料を除外し、最大１５０ｎｇをビオチン捕捉ステップに取り入れた。
【０３３１】
ｖｉｉ．Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングのためのビオチンプルダウン及び調製
ビオチンプルダウンのための調製のために、５μＬのストレプトアビジンＣ−１ビーズをＴｗｅｅｎ洗浄緩衝液で洗浄した。ビーズを１０μＬの２Ｘビオチン結合緩衝液中に再懸濁し、試料に添加した。ビーズを室温で１５分間、回転させながらインキュベートした。ビーズを磁石上で分離し、上澄みを破棄した。５００μＬのＴｗｅｅｎ洗浄緩衝液を添加することによってビーズを２回洗浄し、５５℃で２分間振とうさせながらインキュベートした。ビーズを１００μＬの１Ｘ（２Ｘから希釈した）ＴＤ緩衝液中で洗浄した。ビーズを２５μＬの２Ｘ  ＴＤ緩衝液、各５０ｎｇのポストＣｈＩＰ  ＤＮＡについて２．５μＬのＴｎ５、及び水中で５０μＬの量まで再懸濁した。
【０３３２】
Ｔｎ５は、４μＬの最大量を有していた。例えば、２５ｎｇのＤＮＡ転位の場合、１．２５μＬのＴｎ５を添加し、一方で１２５ｎｇのＤＮＡ転位の場合、４μＬのＴｎ５を使用した。正しい量のＴｎ５を使用して、適切なサイズ分布をもたらした。過剰転位された試料は、より短い断片を有し、より低いアラインメント率を呈していた（接合部は断片端部に近かった）。過小転位された試料は、大き過ぎてＩｌｌｕｍｉｎａシーケンサー上で適切にクラスター化することができない断片を有する。ライブラリーを５サイクルで増幅させ、ライブラリーの転位のレベルに関係なく、深くシーケンシングされ、適切なサイズ分布を達成するために十分な複雑性を有していた。
【０３３３】
ビーズを５５℃で１０分間、合間に振とうさせながらインキュベートした。試料を磁石上に置き、上澄みを取り除いた。５０ｍＭ  ＥＤＴＡを試料に添加し、５０℃で３０分間インキュベートした。次いで、試料を迅速に磁石上に置き、上澄みを取り除いた。試料を５０℃で３分間、５０ｍＭ  ＥＤＴＡで２回洗浄し、次いで磁石から迅速に取り除いた。試料を５５℃で２分間、Ｔｗｅｅｎ洗浄緩衝液中で２回洗浄し、次いで磁石から迅速に取り除いた。試料を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄した。
【０３３４】
ｖｉｉｉ．ＰＣＲ及びＰＣＲ後サイズ選択
ビーズを５０μＬのＰＣＲマスターミックス中に懸濁した（デュアルＩｎｄｅｘアダプター＃１５０５５２８９を有するＩｌｌｕｍｉｎａからのＮｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  ＤＮＡライブラリー調製キット＃１５０２８２１２）。ＰＣＲを以下のプログラムを使用して実施した。２つの方法のうちの１つを使用して、サイクル数を推定した。（１）最初の５サイクル（７２℃で５分間、９８℃で１分間、９８℃で１５秒間、６３℃で３０秒間、７２℃で１分間）を、通常のＰＣＲ上で実施し、次いで産生物をビーズから取り除いた。次いで、０．２５Ｘ  ＳＹＢＲグリーンを添加し、試料をｑＰＣＲ上で実行した。試料を指数的増幅の開始時に取り出した。または（２）反応をＰＣＲ上で実行し、ポストＣｈＩＰ  Ｑｕｂｉｔからの材料の量に基づいてサイクル数を推定した（５０ｎｇ超は５サイクルで実行するが、およそ５０ｎｇは６サイクルで実行され、２５ｎｇは７サイクルで実行され、１２．５ｎｇは８サイクルで実行されるなど）。
【０３３５】
ライブラリーを磁石上に置き、新たなチューブに溶出した。ライブラリーをＺｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈからのキットを使用して精製し、１０μＬの水に溶出した。ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを用いて両側サイズ選択を実施した。ＰＣＲ後、ライブラリーを磁石上に置き、新たなチューブに溶出した。次いで、２５μＬのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを添加し、上澄みを保持して７００ｂｐ未満の断片を捕捉した。上澄みを新たなチューブに移し、１５μＬの新鮮なビーズを添加して、３００ｂｐより大きい断片を捕捉した。ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズから１０μＬの水中に最終溶出を実施した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用してライブラリーの質を検証した。
【０３３６】
ｉｘ．緩衝液
Ｈｉ−Ｃ溶解緩衝液（１０ｍＬ）は、１００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０μＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、２００μＬの１０％ＮＰ−４０、２００μＬの５０Ｘプロテアーゼ阻害剤、及び９．６８ｍＬの水を含有した。核溶解緩衝液（１０ｍＬ）は、５００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、１ｍＬの１０％ＳＤＳ、２００μＬの５０Ｘプロテアーゼ阻害剤、及び８．３ｍＬの水を含有した。ＣｈＩＰ希釈緩衝液（１０ｍＬ）は、１０μＬの１０％ＳＤＳ、１．１ｍＬの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２４μＬの５００ｍＭ  ＥＤＴＡ、１６７μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、３３４μＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、及び８．３６５ｍＬの水を含有した。低塩洗浄緩衝液（１０ｍＬ）は、１００μＬの１０％ＳＤＳ、１ｍＬの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、４０μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、２００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００μＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、及び８．３６ｍＬの水を含有した。高塩洗浄緩衝液（１０ｍＬ）は、１００μＬの１０％ＳＤＳ、１ｍＬの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、４０μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、２００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、及び７．６６ｍＬの水を含有した。ＬｉＣｌ洗浄緩衝液（１０ｍＬ）は、１００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５００μＬの５Ｍ  ＬｉＣｌ、１ｍＬの１０％ＮＰ−４０、１ｍＬの１０％Ｎａ−デオキシコール酸塩、２０μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、及び７．３８ｍＬの水を含有した。
【０３３７】
ＤＮＡ溶出緩衝液（５ｍＬ）は、２５０μＬの新鮮な１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、５００μＬの１０％ＳＤＳ、及び４．２５ｍＬの水を含有する。Ｔｗｅｅｎ洗浄緩衝液（５０ｍＬ）は、２５０μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、１０ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、２５０μＬの１０％Ｔｗｅｅｎ−２０、及び３９．４５ｍＬの水を含有した。２Ｘビオチン結合緩衝液（１０ｍＬ）は、１００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０μＬの０．５Ｍ、４ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ、及び５．８８ｍＬの水を含有した。２Ｘ  ＴＤ緩衝液（１ｍＬ）は、２０μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０μＬの１Ｍ  ＭｇＣｌ２、２００μＬの１００％ジメチルホルムアミド、及び７７０μＬの水を含有した。
【０３３８】
Ｎ．肝細胞への投与のための薬物希釈
肝細胞の化合物処理の前に、ＤＭＳＯ中０．１ｍＭのストック薬物を０．９ｍＬのＤＭＳＯと混合することによって、ＤＭＳＯ中の１００ｍＭストック薬物を１０ｍＭに希釈して、最終量を１．０ｍＬにした。５μＬの希釈薬物を各ウェルに添加し、薬物のウェルあたり０．５ｍＬの培地を添加した。各薬物を三重に分析した。５μＬの薬物を４５μＬの培地に添加し、５０μＬを細胞上の４５０μＬの培地に添加することによって、１０００ｘまでの希釈を実施した。
【０３３９】
生物活性化合物もまた、肝細胞に投与した。１ｍＬのＤＭＳＯ中の生物活性化合物の１０００ｘストックを得るために、０．１ｍＬの１０，０００Ｘストックを０．９ｍＬのＤＭＳＯと複合した。
【０３４０】
Ｏ．ｓｉＲＮＡノックダウン
一次ヒト肝細胞を、２４ウェルフォーマット（ウェルあたり１μＬ）でＲＮＡｉＭＡＸ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号１３７７８０３０）を使用し、６ｐｍｏｌ  ｓｉＲＮＡを有するｓｉＲＮＡで逆トランスフェクトした。翌朝、培地を取り除き、修飾された維持培地でさらに２４時間置き換えた。処理全体は４８時間続き、この時点で培地を取り除き、ＲＮＡ抽出のためにＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ９６  ＱＩＡｃｕｂｅＨＴキットカタログ番号７４１７１）と置き換えた。細胞をｑＲＴ−ＰＣＲ分析のために処理し、次いで標的ｍＲＮＡのレベルを測定した。
【０３４１】
ｓｉＲＮＡをＤｈａｒｍａｃｏｎから取得し、全て関心対象の特定の遺伝子内で別個の部位を標的とするように設計された４つのｓｉＲＮＡ二重鎖のプールであった（「ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ」）。
【０３４２】
Ｐ．マウス研究
６マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ株）の群（雄３及び雌３）に、候補化合物を１日１回４連続日にわたって経口強制栄養を介して投与する。４日目の最後の投与から４時間後にマウスを屠殺した。肝臓、脾臓、腎臓、脂肪、血漿を含む臓器を収集する。マウス肝臓組織を液体窒素中で粉砕し、小さいマイクロチューブに分注した。ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１５５９６０２６）をチューブに添加して、組織試料からの細胞溶解を促進した。次いで、崩壊した組織を含有するＴＲＩｚｏｌ溶液を遠心分離し、上澄み相を収集する。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７４１８２）を使用して、全ＲＮＡを上澄みから抽出し、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して標的ｍＲＮＡレベルを分析した。
【０３４３】
実施例２．刺激された肝細胞についてのＲＮＡ−ｓｅｑ研究
標的遺伝子発現を調整する小分子を特定するために、一次ヒト肝細胞を単一培養として調製し、少なくとも１つの小分子化合物を細胞に適用した。
【０３４４】
ＲＮＡ−ｓｅｑを実施して、肝細胞中の標的遺伝子の発現に対する化合物の効果を決定した。摂動されていた細胞系中の発現レベルを非摂動系中の発現レベルで除算することによって、倍率変化を計算した。０．０５以下のｐ値を有する発現の変化を有意であるとみなした。
【０３４５】
肝細胞のシグナル伝達中心を摂動するために使用される化合物は、表２に列挙される少なくとも１つの化合物を含む。表中で、化合物はそれらのＩＤ、標的、経路、及び薬学的作用とともに列挙される。摂動シグナルとして選択された大部分の化合物は、当該技術分野において少なくとも１つの正準細胞経路を調整することが知られている。いくつかの化合物を、有効性の欠失に起因して第ＩＩＩ相臨床評価において失格した化合物から選択した。
【０３４６】
（表２）ＲＮＡ−ｓｅｑ中で使用される化合物
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【０３４７】
実施例３．疾患、障害及び病態の治療の特定
ＲＮＡ−ｓｅｑデータの分析は、標的遺伝子の発現の有意な変化を引き起こした多数の化合物を明らかにした。有意性を、ＣＰＯＸを除く全ての標的について、１以上のＦＰＫＭ、０．５以上のｌｏｇ２（倍率変化）、及び０．０５以下のｑ値として定義した。少なくとも１つの選択した標的遺伝子を有意に調整した化合物についてのＲＮＡ−ｓｅｑ結果を表３〜表１２に示す。
【０３４８】
表３は、フィブロネクチン腎症に関連するフィブロネクチンをエンコードするＦＮ１の発現を有意に減少させることが観察された化合物についてのｌｏｇ２倍率変化を提供する。
【０３４９】
（表３）ＦＮ１についてのＲＮＡ−ｓｅｑ結果
2021521101.tif 000011
【０３５０】
表４は、遺伝性コプロポルフィリン症に関連するコプロポルフィリノーゲンオキシダーゼをエンコードするＣＰＯＸの発現を有意に増加させることが観察された化合物についてのｌｏｇ２倍率変化を提供する。有意性を、０．５以上のＦＰＫＭ、０．３以上のｌｏｇ２（倍率変化）、及び０．０５以下のｑ値として定義した。
【０３５１】
（表４）ＣＰＯＸについてのＲＮＡ−ｓｅｑ結果
2021521101.tif 000012
【０３５２】
表５は、ＳＥＲＰＩＮＣ１欠損症に関連するアンチトロンビンをエンコードするＳＥＲＰＩＮＣ１の発現を有意に増加させることが観察された化合物についてのｌｏｇ２倍率変化を提供する。
【０３５３】
（表５）ＳＥＲＰＩＮＣ１についてのＲＮＡ−ｓｅｑ結果
2021521101.tif 000013
【０３５４】
表６は、アラジール症候群に関連するｊａｇｇｅｄ  １及びＮｏｔｃｈ  ２をそれぞれエンコードするＪＡＧ１及び／またはＮＯＴＣＨ２の発現を有意に増加させることが観察された化合物についてのｌｏｇ２倍率変化を提供する。太字の化合物は、ＪＡＧ１及びＮＯＴＣＨ２の両方を有意に調整する化合物を表す。
【０３５５】
（表６）ＪＡＧ１及びＮＯＴＣＨ２についてのＲＮＡ−ｓｅｑ結果
2021521101.tif 000014
【０３５６】
上述のように、ＬＤＮ１９３１８９、ＬＤＮ−２１２８５４、サリドマイド、フェンホルミン、エンザスタウリン、ＧＤＦ２（ＢＭＰ９）、ＢＭＰ２、アムバチニブ、ＢＭＰ４、及びＢＡＹ  ８７−２２４３、及びＩＮＮＯ−２０６（アルドキソルビシン）は、ＪＡＧ１のみを有意に調整することが観察され、ジボテンタン及び７４０  Ｙ−Ｐは、ＮＯＴＣＨ２のみを有意に調整することが観察された。メレスチニブ及びトルセトラピブは、ＪＡＧ１及びＮＯＴＣＨ２の両方を有意に調整することが観察された。
【０３５７】
表７は、糖原病１ｂに関連するグルコース−６−リン酸トランスロカーゼ（Ｇ６ＰＴ）をエンコードするＳＬＣ３７Ａ４の発現を著しく増加させることが観察された化合物についてのｌｏｇ２倍率変化を提供する。
【０３５８】
（表７）ＳＬＣ３７Ａ４についてのＲＮＡ−ｓｅｑ結果
2021521101.tif 000015
【０３５９】
表８は、急性間欠性ポルフィリン症に関連するヒドロキシメチルビランシンターゼをエンコードするＨＭＢＳの発現を有意に増加させることが観察された化合物についてのｌｏｇ２倍率変化を提供する。
【０３６０】
（表８）ＨＭＢＳについてのＲＮＡ−ｓｅｑ結果
2021521101.tif 000016
【０３６１】
表９は、ＬＥＣＴ２アミロイドーシスに関連する白血球細胞由来ケモタキシン２をエンコードするＬＥＣＴ２の発現を有意に減少させることが観察された化合物についてのｌｏｇ２倍率変化を提供する。
【０３６２】
（表９）ＬＥＣＴ２についてのＲＮＡ−ｓｅｑ結果
2021521101.tif 000017
【０３６３】
表１０は、ＡＰＯＬ１関連糸球体疾患に関連するアポリポタンパク質Ｌ１をエンコードするＡＰＯＬ１の発現を有意に減少させることが観察された化合物についてのｌｏｇ２倍率変化を提供する。
【０３６４】
（表１０）ＡＰＯＬ１についてのＲＮＡ−ｓｅｑ結果
2021521101.tif 000018
【０３６５】
表１１は、ジルベール症候群及びクリグラーナジャーＩＩ型に関連するＵＤＰグリクロノシルトランスフェラーゼファミリー１メンバーＡ１をエンコードするＵＧＴ１Ａ１の発現を著しく増加させることが観察された化合物についてのｌｏｇ２倍率変化を提供する。
【０３６６】
（表１１）ＵＧＴ１Ａ１についてのＲＮＡ−ｓｅｑ結果
2021521101.tif 000019
【０３６７】
表１２は、脂質異常症に関連する、低密度リポタンパク質受容体をエンコードするＬＤＬＲの発現を有意に増加させること、ならびに／またはアンジオポエチン様３及びプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型をエンコードするＡＮＧＰＴＬ３及び／もしくはＰＣＳＫ９の発現を減少させることが化合物についてのｌｏｇ２倍率変化を提供する。
【０３６８】
（表１２）ＡＮＧＰＴＬ３、ＬＤＬＲ及びＰＣＳＫ９についてのＲＮＡ−ｓｅｑ結果
2021521101.tif 000020
【０３６９】
表１３は、脂質異常症に関連するアンジオポエチン様３をエンコードするＡＮＧＰＴＬ３の発現を有意に減少させることが観察された追加の化合物についてのｌｏｇ２倍率変化を提供する。
【０３７０】
（表１３）ＡＮＧＰＴＬ３についてのＲＮＡ−ｓｅｑ結果
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2021521101.tif 000022
【０３７１】
本明細書における結果は、有意な治療効果を有することが表３〜表１３に示される化合物を使用して、標的遺伝子に関連する疾患の表現型を救出することができるという証拠を提供する。標的遺伝子と同じ経路内の、または同じシグナル伝達中心によって制御される追加の遺伝子は、表３〜表１３の化合物によって調整されてもよい。
【０３７２】
実施例４：肝細胞中のＳＥＲＰＩＮＣ１の上方制御
化合物を、ＳＥＲＰＩＮＣ１／ＡＴ  ＩＩＩ欠損症の潜在的な治療を特定するための、ＳＥＲＰＩＮＣ１  ｍＲＮＡの上方制御について、肝細胞中で試験した。表１４〜表１６は、選択した化合物で処置された一次ヒト肝細胞及びマウス肝細胞の定量的ＰＣＲ結果、ならびに選択した化合物で処置されたＭＧＨ５４細胞のＲＮＡ  ｓｅｑ結果を示す。図６は、非標的対照ｓｉＲＮＡ（ＮＴＣ）と比較して、ｍＴＯＲ及びＮＦＫＢに対して標的とされるｓｉＲＮＡによる７２時間の処置後のＳＥＲＰＩＮＣ１  ｍＲＮＡの上方制御を示す。図７は、ＤＭＳＯ対照と比較して、化合物３０８（ＯＳＩ−０２７）及び化合物３０９（ＰＦ０４６９１５０２）による処置に応答した、ＳＥＲＰＩＮＣ１の用量依存的上方制御を示す。
【０３７３】
（表１４）
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【０３７４】
（表１５）
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【０３７５】
（表１６）
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【０３７６】
実施例５：選択した化合物によるＭＥＣＰ２の上方制御。
１７−ＡＡＧを、ＭＥＣＰ２  ｍＲＮＡの上方制御について肝細胞中で試験した。１７−ＡＡＧによる処置は、ＤＭＳＯ対照と比較して、ｑＰＣＲによって検出されるように、マウス肝細胞（図８）及びマウス肝臓（図９）中のＭＥＣＰ２  ｍＲＮＡの増加をもたらした。２つのドナーからの一次ヒト肝細胞は、１７−ＡＡＧで処置した場合、ＭＥＣＰ２  ｍＲＮＡの用量依存的増加を示した（図１０Ａ及び１０Ｂ）。追加の化合物を、ヒト肝細胞中のＭＥＣＰ２  ｍＲＮＡの誘導について試験した（表１７〜表１９）。
【０３７７】
（表１７）
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【０３７８】
（表１８）
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【０３７９】
（表１９）
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【０３８０】
実施例６：選択した化合物によるＡＰＯＬ発現の下方制御。
３．３μＭのモメロテニブ（図１１）またはモメロテニブ代謝産物Ｍ２１（図１２）による処置時の、一次ヒト肝細胞中のＡＰＯＬ  ｍＲＮＡの下方制御を観察した。１０μＭ用量でＡＰＯＬ  ｍＲＮＡの下方制御を示した上記のＲＮＡｓｅｑによって追加の化合物を特定した（表２０）。
【０３８１】
（表２０）
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【０３８２】
等価物及び範囲
当業者であれば、慣用的な実験のみを使用して、本明細書に記載される本開示による特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認し得るであろう。本開示の範囲は上記の説明に限定されるものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載される。
【０３８３】
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」などの冠詞は、特に逆が示されない限り、またはさもなければ文脈から明らかである場合を除き、１つ以上を意味し得る。群の１つ以上のメンバー間に「または」を含む特許請求の範囲または説明は、特に逆が示されない限り、またはさもなければ文脈から明らかである場合を除き、群のメンバーのうちの１つ、２つ以上、または全てが所与の製品またはプロセスに存在する、それに採用される、ないしは別の方法でそれに関連する場合に満たされると考えられる。本開示は、群のうちの正確に１つのメンバーが、所与の製品またはプロセスに存在する、それに採用される、ないしは別の方法でそれに関連する実施形態を含む。本開示は、群のメンバーのうちの２つ以上、または全体が所与の製品またはプロセスに存在する、それに採用される、ないしは別の方法でそれに関連する実施形態を含む。
【０３８４】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、制約がないことが意図され、追加の要素またはステップの包含を可能にするが、その必要がないことにも留意する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が本明細書で使用される場合、したがって「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語もまた包含され、開示される。
【０３８５】
範囲が与えられている場合、エンドポイントは含まれる。さらに、特に記載されない限り、またはさもなければ文脈及び当業者の理解から明らかである場合を除き、範囲として表される値は、文脈が明確に示さない限り、その範囲の下限の単位の１０分の１まで、本開示の異なる実施形態の指定された範囲内の任意の特定の値または下位範囲をとることができることを理解する。
【０３８６】
加えて、先行技術内に入る本開示の任意の特定の実施形態は、請求項のいずれか１つ以上から明示的に除外され得ることを理解する。そのような実施形態は、当業者に既知であるとみなされるため、それらは、除外が本明細書に明示的に記載されていない場合でも除外され得る。本開示の組成物のいずれの特定の実施形態（例えば、任意の抗生物質、治療成分または活性成分；任意の産生方法；任意の使用方法など）も、先行技術の存在に関連するかどうかに関わらず、あらゆる理由により、任意の１つ以上の特許請求の範囲から除外することができる。
【０３８７】
使用されている単語は、限定ではなく説明の単語であり、添付の特許請求の範囲の権限内で、そのより広い態様において本開示の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく変更が行われてもよいことを理解されたい。
【０３８８】
本開示は、いくつかの記載される実施形態に関してある程度の長さ及びある程度の特定性で説明されてきたが、任意のそのような特定事項または実施形態または任意の特定の実施形態に限定されるべきであることを意図しないが、添付の特許請求の範囲を参照して、先行技術を考慮してそのような特許請求の範囲の最も広義の可能な解釈を提供するもの、したがって、本発明の意図される範囲を有効に包含するものとして解釈される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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