(57)【要約】本開示は、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患の治療のための、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物及びその製剤に関する。ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物は、病原体タンパク質に由来する異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに任意選択のスペーサーによって結合される、２０アミノ酸超、好ましくは環状のＢ細胞エピトープペプチドを有する。これらのペプチド免疫原構築物及びその製剤は、ワクチン接種宿主において、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチドを指向して、ＩｇＥ分泌に関与するＢリンパ球上の膜結合型ＩｇＥと交差反応する高度の特異性抗体の生成を刺激することができる。ワクチン接種宿主におけるペプチド免疫原構築物及びその製剤によって誘導される抗体は、ＩｇＥを発現するＢ細胞のアポトーシスを誘導し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介して、ワクチン接種宿主の抗原特異的ＩｇＥ及び総ＩｇＥレベルを減少させ、ＩｇＥ媒介型アレルギー性病理を効果的に治療することができる。【選択図】図２
2021515744.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
（Ｔｈ）ｍ−（Ａ）ｎ−（ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片）−Ｘ
または
（ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片）−（Ａ）ｎ−（Ｔｈ）ｍ−Ｘ
または
（Ｔｈ）ｍ−（Ａ）ｎ−（ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片）−（Ａ）ｎ−（Ｔｈ）ｍ−Ｘ
［式中、
Ｔｈは異種Ｔヘルパーエピトープであり、
Ａは異種スペーサーであり、
（ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片）は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤの中央分子内ループからの約２０〜約４０アミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープであり、
Ｘはアミノ酸のα−ＣＯＯＨまたはα−ＣＯＮＨ２であり、
ｍは１〜約４であり、
ｎは０〜約１０である］で表される、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物。
【請求項２】
前記ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片が、配列番号５、６、８、及び９からなる群から選択される、請求項１に記載のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物。
【請求項３】
前記Ｔｈエピトープが、配列番号５９〜８７からなる群から選択される、請求項１または２のいずれかに記載のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物。
【請求項４】
前記ペプチド免疫原構築物が、配列番号８８〜９５、９８〜１２４、及び１３０からなる群から選択される、請求項１に記載のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物。
【請求項５】
配列番号１または配列番号２のＩｇＥ  ＥＭＰＤ配列からの約２０〜約４０アミノ酸残基を含むＢ細胞エピトープ、
配列番号５９〜８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴヘルパーエピトープ、ならびに
アミノ酸Ｌｙｓ−、Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、（α，ε−Ｎ）Ｌｙｓ、及びε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１２９）からなる群から選択される任意選択の異種スペーサーを含む、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物であって、前記Ｂ細胞エピトープが直接、または前記任意選択の異種スペーサーによって、前記Ｔヘルパーエピトープに共有結合している、前記ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物。
【請求項６】
前記Ｂ細胞エピトープが、配列番号５、６、８、及び９からなる群から選択される、請求項５に記載のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物。
【請求項７】
前記Ｔヘルパーエピトープが、配列番号５９〜８７からなる群から選択される、請求項５に記載のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物。
【請求項８】
前記任意選択の異種スペーサーが、（α，ε−Ｎ）Ｌｙｓ、またはε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１２９）である、請求項５に記載のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物。
【請求項９】
前記Ｔヘルパーエピトープが前記Ｂ細胞エピトープのアミノ末端に共有結合している、請求項５に記載のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物。
【請求項１０】
前記Ｔヘルパーエピトープが前記任意選択の異種スペーサーによって前記Ｂ細胞エピトープのアミノ末端に共有結合している、請求項５に記載のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のペプチド免疫原構築物を含む組成物。
【請求項１２】
ａ．請求項１〜１０のいずれかに記載のペプチド免疫原構築物と、
ｂ．薬学的に許容される送達ビヒクル及び／またはアジュバントと、を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
ａ．前記ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物が、配列番号８８〜９５、９８〜１２４、及び１３０からなる群から選択され、
ｂ．前記ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物が、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合されて安定化免疫刺激性複合体を形成している、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれかに記載のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の前記Ｂ細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片。
【請求項１５】
前記ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物に結合している、請求項１４に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれかに記載のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の前記Ｂ細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれかに記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患の治療及び／または予防のための、膜結合型ＩｇＥ（すなわちＩｇＥ  ＥＭＰＤ）の細胞外膜近位ドメインを標的とするペプチド免疫原構築物及びそのユニバーサルワクチンとしての製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）媒介型アレルギー性疾患としても知られるアレルギーは、環境内の何かに対する免疫系の過敏症によって誘起される数多くの病態であり、大半の人々には問題がほとんど生じないか皆無であるのが一般的である。これらの疾患として、薬物アレルギー、食物アレルギー、及び昆虫アレルギー、アレルギー性鼻炎（花粉症）、アトピー性皮膚炎、アレルギー性喘息、結膜炎、湿疹、蕁麻疹（発疹）、ならびにアナフィラキシーが挙げられる（ウェブサイト：en.wikipedia.org/wiki/Allergy）。多様な症状は多くの場合アレルギーに起因するものであり、目の充血、かゆみを伴う発疹、くしゃみ、鼻水、息切れ、または腫れを含み得る。
【０００３】
アレルギー性疾患の有病率は増加している。２０世紀初頭、アレルギーは稀な病気であると見られていた。しかしながら、それ以降、いくつかの要因がきっかけとなり、アレルギー性疾患の有病率は飛躍的に増加した。最も一般的なものは呼吸器系の症状であり、集団全体の最大３０％が罹患している。世界保健機関（ＷＨＯ）の統計によると、鼻炎の罹患者は世界中で何億人にものぼり、喘息の罹患者は２億３，５００万人と推定されている（ウェブサイト：www.who.int/mediacentre/factsheets/fs307/en/index.html）。アレルギー性疾患の社会的コストは相当なものであるが、その主たる原因は、アレルギー性鼻結膜炎の有病率の高さと、それに伴う生産性の損失による。スウェーデンの研究では、鼻炎に起因する生産性損失のコストは、スウェーデン単独で年間２７億ユーロと推定され、またアメリカの研究では、鼻炎がアメリカの雇用者にとって最も費用のかかる疾患であることが立証された（Larsen JN, et al., 2016）。
【０００４】
アレルギー反応は異常に活発な免疫応答であり、本来は身体に無害である種類の抗原、すなわちアレルゲンを免疫系が脅威と知覚して撃退する（ウェブサイト：en.wikipedia.org/wiki/Allergen）。具体的にアレルゲンとは、ＩｇＥ応答によってアトピー性個体のＩ型過敏症反応を刺激することが可能な抗原である。チリダニの排泄物、花粉、ペットのフケ、特定の食品、または化学的／物理的刺激物などのさまざまな起源にアレルゲンを認めることができる。食物アレルギーは食物過敏症ほど一般的ではないが、ピーナッツ（マメ科植物）、ナッツ、シーフード、及び貝などの一部の食品は、多数の人にとって深刻なアレルギーの原因となる。
【０００５】
アレルギーは、一般的なアレルゲンに対する適応免疫応答の初回刺激によって起こる全身性免疫疾患である。ＩｇＥは、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患の誘発に関与するＩ型過敏症反応の媒介において中心的な役割を果たす。ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患は、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体と好酸球性炎症の存在を特徴とする。アレルギー反応は、アレルゲン曝露後数分以内に発生する即時反応と、数時間後に発生する後期反応との二相性である。即時反応は、細胞表面の高親和性受容体に結合したＩｇＥの架橋時に、事前形成された伝達物質（例えば、ヒスタミン、プロテアーゼ、ケモカイン、ヘパリン）が好塩基球及びマスト細胞から放出されることによって誘起される。後期アレルギー反応は、好酸球、好塩基球、好中球、及び単核細胞などの炎症細胞の動員及び誘引によって誘起される。
【０００６】
アレルギー傾向のある個体では、アレルゲンにより血清中の遊離免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）とアレルゲン特異的ＩｇＥ合計のレベル上昇が生じる。アレルゲン特異的ＩｇＥ媒介型Ｉ型過敏症は、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患の病因の中心をなす（図１）。ＩｇＥは、マスト細胞及び好塩基球といったエフェクター細胞の表面にある高親和性受容体ＩｇＥ受容体ＦｃεＲＩに結合することにより、これらの細胞を感作する。マスト細胞のＦｃεＲＩにすでに結合しているＩｇＥに抗原が結合すると、結合したＩｇＥの架橋、及び下層のＦｃεＲＩの凝集を誘起する。架橋された受容体は、シグナル伝達カスケード及び急速な脱顆粒を起こす。マスト細胞及び好塩基球は貯蔵されたヒスタミンを放出し、続いてブラジキニン、プロスタグランジン、ロイコトリエン、サイトカイン、及びその他の炎症性伝達物質を合成及び放出する。これらはさらに、アレルギーの症状を生じさせる炎症細胞を誘引して活性化し、Ｂ細胞によるＩｇＥの生合成を上方制御して、感受性の増強を促進する。ＩｇＥ−ＦｃεＲＩ相互作用及び脱顆粒事象は、Ｉ型アレルギー反応及びアトピー性喘息の発症にとって重要である。
【０００７】
他の免疫グロブリンアイソタイプと同様に、ＩｇＥには分泌型血清免疫グロブリン形態と膜結合型形態（ｍＩｇＥ）の２つの形態が存在する。マウス及びヒトのｍＩｇＥの膜アンカーペプチドをコードする遺伝子セグメントに関する研究によれば、ｍＩｇＥと分泌型ＩｇＥとの違いは、（１）形質膜に広がる２５の疎水性非荷電アミノ酸残基からなる中央の保存的ストレッチ；（２）Ｃ末端側の細胞質尾部；及び（３）ｍＩｇＥの膜アンカーセグメントのＮ末端細胞外部分という３つの余剰領域がｍＩｇＥに含まれていることにある。ヒトでは、Ｂリンパ球の表面にあるｍＩｇＥのイプシロン鎖には、短鎖アイソフォームと長鎖アイソフォームの両方が存在する。短鎖アイソフォームは、ＩｇＥ  ＥＭＰＤと称するｍＩｇＥの細胞外膜近位ドメインにある１５のアミノ酸で構成され、長鎖アイソフォームは、５２のアミノ酸残基からなる追加セグメントで構成されており、ＥＭＰＤ内のアミノ酸は合計６７である。これらの２種のアイソフォームは、ＣＨ４エキソンの３´末端側のドナー部位と、ＣＨ４エキソンの約２０００ヌクレオチド下流に位置する、１５６ｂｐ離れた２つのアクセプター部位の間の選択的スプライシングの結果として生成される。長鎖型の転写産物は、ＩＬ−４とＣＤ４０で処理したＩｇＥ産生骨髄腫細胞及び扁桃腺Ｂ細胞において短鎖型の１００倍のレベルで検出されているが（Peng et al. 1992及びZhang et al 1992）、短鎖型はタンパク質レベルでは検出されなかった（Peng et al, 1992）。ＩｇＥ  ＥＭＰＤはｍＩｇＥ型に特異的であり、分泌された血清ＩｇＥには認められなかった（図２）。
【０００８】
ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患の治療に関する現行の臨床ガイドラインには、患者教育、アレルゲン回避、薬物療法、アレルゲンを用いた免疫療法、及びＩｇＥの治療標的の組合せが含まれるが、このような治療選択肢には限界がある。例えば、アレルゲン回避は、実行可能ならば適応があるが、実際には、アレルゲン回避単独では適切な症状制御の達成は困難である。また、安全かつ安価な薬物がアレルギー症状の治療に利用可能であるが、このような薬物による症状制御は不十分であることが多くの患者で報告されている。重要な点として、薬物療法は疾患の進行には効果がなく、症状が収まらない限り、繰り返し治療を投与する必要がある（多くの場合、一生涯を意味する）。古典的なアレルゲンを用いた免疫療法のみが疾患を緩和する可能性があり、最適な治療戦略であると考えられている。
【０００９】
アレルゲンを用いた免疫療法（ＡＩＴ）は、その後のアレルゲンへの再曝露時に症状を抑制するため漸増用量のアレルゲンの皮下注射を伴う。自然曝露条件下では粘膜の免疫系に提示されるアレルゲンの量は比較的少ないが、効率的にアレルギー反応が刺激され、数分以内にアレルギー症状が現れる。対照的に、免疫療法としてアレルゲンが投与される場合、アレルゲンの量は比較的多く、免疫療法で投与される１回の用量は、自然曝露による推定最大年間摂取量の約１００倍に相当する。体内への異なる侵入経路と異なる量を組み合わせると、アレルゲンに対する免疫寛容の誘導により応答する免疫系に大幅な影響を及ぼす。
【００１０】
ＡＩＴの本来の投与形態は皮下注射によるものであり、この治療計画は従来から（１）初期の増量期と（２）後続の維持期という２段階で実施される。増量期は、寛容性を徐々に高め、患者の感受性を注意深く評価する目的で、漸増用量を投与する個別の滴定である。次に、最大許容用量または推奨最大用量のうち、最初に到達した方のいずれかを維持期全体にわたり投与する。
【００１１】
ＡＩＴにおいて（１）免疫偏向と（２）制御性Ｔ細胞の誘導という２つのメカニズムが主要な役割を果たすと考えられている。免疫偏向と制御性Ｔ細胞による相対的な寄与は確定されていないが、最終結果として、アレルゲンへの曝露に応答してアレルギー反応を起こす能力の減少、場合によっては排除も生じる。
【００１２】
免疫偏向とは、Ｔｈ２細胞を抑制してアレルゲン特異的Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）細胞を動員し、刺激するという、アレルゲン曝露に対する改変された免疫学的応答を表す用語である。Ｔｈ１細胞は、Ｂ細胞を刺激してＩｇＥではなくＩｇＧを生成するインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）を生成するが、ＩｇＧはアレルギー反応の誘因にはなり得ない。
【００１３】
制御性Ｔ細胞は、免疫応答の調節に作用する多様なＴ細胞群である。ＡＩＴ後に、末梢血中のアレルゲン特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の増加が実証されている。これらの細胞は、インターロイキン（ＩＬ）−１０及びトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βを生成し、また局所Ｔｈ２細胞応答を抑制し、かつＩｇＧ４（ＩＬ１０アイソタイプスイッチ因子）及びＩｇＡ（ＴＧＦ−βアイソタイプスイッチ因子）に有利になるように抗体のクラススイッチを誘導する可能性をもつ。アレルゲン特異的ＩｇＧ４抗体は、Ｔｈ２細胞へのアレルゲン提示を妨害し、さらにマスト細胞及び好塩基球のアレルゲン誘導活性化を遮断し、それによりアレルギー反応を著しく減衰させる。
【００１４】
抗原を用いた免疫療法は効果的であり得るが、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患のＡＩＴに関連する重大な問題と未充足ニーズが存在する。第１に、ＡＩＴの注射は、迅速かつ適切に治療しないと、重症、さらには致命的となり得るようなアレルギー反応を誘発するリスクは小さいため、すべて診療室で行われる。第２に、ＡＩＴによる疾患緩和の態様は、少数のアレルゲン製品についてのみ臨床的に実証されているにすぎない。第３に、特異的アレルゲンの構造はごくわずかしか示されておらず、アレルゲンの定義は主に、感受性の高い個体でＩｇＥ応答の誘発が可能であるという機能的基準に基づいている。したがって、アレルギー患者の大半は比較的限られた数の主要なアレルゲンに特異的なＩｇＥ抗体を有しているとはいえ、アレルゲンは一般に、個々の患者の免疫系によって定義され、そのような何らかの免疫原性タンパク質（抗原）が潜在的なアレルゲンとなる。第４に、あらゆる患者がアレルゲン分子及びエピトープに関して独特の感作パターンを有している。第５に、市販されているアレルゲン製品はすべて、花粉、ハウスダストのダニ培養物、動物の毛及び／またはフケ、または昆虫の毒などの天然原料に由来するアレルゲン源物質の水抽出によって製造されており、そのような天然原料の組成は本質的に変動する。したがって、ＡＩＴに使用されるアレルゲン製品は汎用的なものではなく、その組成、ＩｇＥ結合力価、及び製造業者間の品質管理の程度が異なる。有効な国際基準はない。これは、製造業者の製品の効果が患者によって異なる可能性があり、その結果、アレルゲン製品ごとに臨床結果を直接推定することはできない。
【００１５】
アレルゲンを用いた免疫療法：アレルギー治療の未来に関する最新版レビューは参照により本明細書に含まれ（Drug Discovery Today Volume 21, Issue 1, January 2016, p. 26-37）、本背景技術の項で行った主張については全付属書類で参照することができる。
【００１６】
ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患の治療に関しては、ＡＩＴに加えて、ＩｇＥ分子の治療標的が研究されてきた。
【００１７】
抗ＩｇＥモノクローナル抗体を用いた血清可溶性ＩｇＥの治療標的は、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患の治療に効果的であることが示されている。現在、組換えヒト化モノクローナル抗体であるオマリズマブ（ＸＯＬＡＩＲ（登録商標））が、成人及び青年における中等度から重度の持続性アレルギー性喘息の治療用に承認されている。オマリズマブは、循環する未結合の遊離ＩｇＥに結合することでアレルギーカスケードを停止し、免疫エフェクター細胞の表面にあるＩｇＥ  ＦｃεＲＩへの結合を防止する。オマリズマブを使用した治療は、遊離ＩｇＥレベルの顕著な低下と細胞性ＩｇＥ受容体の下方制御をもたらす（Chang et al, 2007）。オマリズマブによる治療は有効であることが示されているが、限界がある。具体的には、オマリズマブは血清中の遊離ＩｇＥを中和することはできるが、ＩｇＥ生成には影響を与えない。したがって、血清ＩｇＥの十分な抑制を維持するには、頻繁かつ慢性的にオマリズマブを投与する必要がある。
【００１８】
ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患の治療については、膜結合型ＩｇＥの細胞外膜近位ドメイン（ＩｇＥ  ＥＭＰＤ）の治療標的も研究されている。追加の共刺激シグナルがない状態でＢ細胞受容体（ＢＣＲ）が架橋されると、Ｂ細胞アポトーシスを生じさせることができる。ＢＣＲの架橋によるＢ細胞のアポトーシス減少は、未成熟Ｂ細胞のメカニズムを広範に説明するものであり、このメカニズムによって自己反応性Ｂ細胞はＢ細胞レパートリーから除去される。４７Ｈ４（Brightbill et al. 2010）、４Ｂ１２及び２６Ｈ２（Chen et al. 2010）などの抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤモノクローナル抗体は、ＩｇＥ  ＢＣＲを架橋させ、ｍＩｇＥを発現するＢ細胞のアポトーシスを誘起することが示されている（図２）。Brightbill et alはまた、Ｎ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ感染症及びアレルギー性喘息モデル（Chen et al. 2010）で観察されるように、４７Ｈ４の治療的ｉｎ  ｖｉｖｏ送達が、所定のＩｇＥ応答を低下させる可能性があることも発見した。ＩｇＥ系統Ｂ細胞を減少させ、血清ＩｇＥを低下させるため、ＩｇＥ−ＥＭＰＤ、特に追加の５２アミノ酸の長鎖領域内のものを標的とするいくつかの抗体及びエピトープが研究及び同定されている（Chen et al. 2010、Chang et al. 2015、Chen et al. 2002）。あるグループは、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片をインサートとして保持する担体としてＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ）を使用した、ＢＡＬＢ／ｃマウスでの特異的ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体反応の誘導を報告した。クローニング構築物は自発的にウイルス様粒子（ＶＰＬ）に組み立てられ、ＶＬＰの「スパイク」の先端に種々のＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片が提示され、免疫原性を獲得する。免疫されたマウスの血清から精製したＩｇＧ抗体は、ＢＣＲ依存性カスパーゼ経路を介したｍＩｇＥ．ＦｃＬを発現するＲａｍｏｓ細胞のアポトーシス、ならびに精製したマウス脾臓ＮＫ細胞をエフェクター細胞として使用したｍＩｇＥ．ＦｃＬ発現Ａ２０細胞における抗体依存性細胞媒介型細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘起することができた（Lin et al. 2012）。上記の手法は、アレルギー治療用のワクチン開発に一定の関心を生み出した。しかしながら、抗原及び送達系による、担体ＶＬＰを標的とする抗体のほとんどを生成する抗原発現系は煩雑であり、産業用途及び臨床用途に適用可能である有効なワクチン開発に最適であるとは言い難い。
【００１９】
上記の観点から、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患を治療及び／または予防するための免疫治療的手法の開発には、アレルゲン非依存性である、ＩｇＥに対して非常に特異的な免疫応答を誘発できる、患者に簡単に投与される、厳格な適正製造基準（ＧＭＰ）に基づいて製造できる、及び過去１００年間のＡＩＴ診療に代わる世界規模での利用に対応する費用対効果があるといった未充足のニーズが存在する。
【００２０】
参考文献：
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15. “Allergy” Wikipedia, The Free Encyclopedia, website address: en.wikipedia.org/wiki/Allergy (accessed August 18, 2017).
16. website: en.wikipedia.org/wiki/Allergen)
【発明の概要】
【００２１】
本開示は、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患の治療及び／または予防のための、膜結合型ＩｇＥ（ＩｇＥ  ＥＭＰＤ）の細胞外膜近位ドメインを標的とする個々のペプチド免疫原構築物に関する。本開示はまた、ペプチド免疫原構築物を含有する組成物、ペプチド免疫原構築物を製造及び使用する方法、ならびにペプチド免疫原構築物によって生成する抗体に関する。
【００２２】
本開示のペプチド免疫原構築物は、約２０アミノ酸以上を含有する。ペプチド免疫原構築物は、完全長ＩｇＥ  ＥＭＰＤの６７アミノ酸の配列（配列番号１）からのＢ細胞エピトープを含む。Ｂ細胞エピトープは、病原体タンパク質に由来する異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに任意選択の異種スペーサーによって結合し得る。本開示のペプチド免疫原構築物は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤを指向する高特異性抗体の生成を刺激し、組換えＩｇＥ  ＥＭＰＤ含有タンパク質、ｍＩｇＥを保持するＢ細胞上のＩｇＥ  ＥＭＰＤ、及び／またはヒトＩｇＧ１のＦｃ部分及びヒト膜結合型ＩｇＥのＩｇＥ  ＥＭＰＤを含有する組換え可溶性ＩｇＥ  ＥＭＰＤタンパク質（「γ１−ｅｍ６７」と称する）に結合することができる。本開示のペプチド免疫原構築物は、アレルゲン非依存性であり費用対効果の高いユニバーサル免疫療法として、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患に罹患している患者全般に使用することができる。
【００２３】
ペプチド免疫原構築物のＢ細胞エピトープ部分は、完全長ＩｇＥ  ＥＭＰＤ配列（配列番号１）からのアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、完全長ＩｇＥ  ＥＭＰＤ配列（配列番号１）の付番に従い、内因性システイン（Ｃ１８〜Ｃ３９）によって形成される内部分子内ループを含む配列を有する。特定の具体的な実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ−１−３９（配列番号５）、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ−７−４０（配列番号６）、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ−１９−３８（配列番号８）、またはＩｇＥ  ＥＭＰＤ−１−４０（配列番号９）のアミノ酸配列を有する。
【００２４】
本開示のペプチド免疫原構築物は、病原性タンパク質に由来する異種Ｔｈエピトープアミノ酸配列（例えば配列番号５９〜８７）を含有し得る。特定の実施形態では、異種Ｔｈエピトープは、天然の病原体、例えば、ジフテリア毒素（配列番号６３）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（配列番号６４）、コレラ毒素（配列番号６６）に由来するものである。他の実施形態では、異種Ｔｈエピトープは、麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ１〜５）またはＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ１〜３）に由来し、単一配列か混成配列（例えば配列番号７０、６９及び７１）かのどちらかの形態にある理想人工Ｔｈエピトープである。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ペプチド免疫原構築物は、任意選択の異種スペーサーによって異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに結合された、ＩｇＥ  ＥＭＰＤからのＢ細胞エピトープを含有する。特定の実施形態では、ペプチド免疫原構築物は、病原性タンパク質に由来する異種Ｔｈエピトープ（配列番号５９〜８７）に任意選択の異種スペーサーによって結合された、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ−１−４０からの約２０超のアミノ酸（例えば配列番号９）を有するＢ細胞抗原性部位を含有する。いくつかの実施形態では、任意選択の異種スペーサーは、２つのアミノ酸及び／またはペプチドを一緒に結合できる分子または化学構造である。特定の実施形態では、スペーサーは、天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸またはその組合せである。具体的な実施形態では、ペプチド免疫原構築物は、配列番号８８〜９５、９８〜１２４、及び１３０のアミノ酸配列を有する。
【００２６】
本開示はさらに、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を含有する組成物に関する。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、１つより多いＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を含有する。特定の実施形態では、組成物は、患者の広範な遺伝的背景を対象範囲に含めるためにＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｇ１−Ｃ３９ペプチド免疫原構築物の混合物（例えば、配列番号８８〜９５、９８〜１２４、及び１３０の任意の組合せ）を含有する。ペプチド免疫原構築物の混合物を含有する組成物は、単一のペプチド免疫原構築物のみを含有する組成物と比較して、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患の治療のためにワクチンで免疫付与したときのレスポンダー率より高い百分率につながり得る。
【００２７】
本開示はさらに、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患の治療及び／または予防のための、ワクチン製剤を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＣｐＧオリゴマーと、ペプチド免疫原複合体を含有する組成物とを混合することで静電会合によって形成された安定化免疫刺激性複合体の形態で本開示のペプチド免疫原構築物を含有する。そのような安定化免疫刺激性複合体は、ペプチド免疫原構築物の免疫原性をさらに増強することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、アジュバント、例えば、ミョウバンゲル（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ）、リン酸アルミニウム（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）を含めた無機塩、またはＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ５１もしくは７２０を含めた油中水型エマルションを含有する。
【００２８】
本開示はさらに、本開示のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を指向する抗体に関する。特に、本開示のペプチド免疫原構築物は、対象に投与されると、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ−１−５２アミノ配配列（配列番号２）、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ  １−６７アミノ酸配列（配列番号１）、及びそれらの断片（例えば配列番号５及び６）に関して交差反応性である高特異性抗体の生成を刺激することができる。ペプチド免疫原構築物によって生成する高特異性抗体は、組換えＩｇＥ  ＥＭＰＤ含有タンパク質、γ１−ｅｍ６７、及び／または膜結合型ＩｇＥを保持するＢ細胞上のＩｇＥ  ＥＭＰＤに関して交差反応性である。本開示の抗体は、免疫原性増強のために採用される異種Ｔｈエピトープを指向することがあったとしてもあまりなく、高い特異性でＩｇＥ  ＥＭＰＤに結合するが、このことは、そのようなペプチド抗原性増強のために使用される従来のタンパク質または他の生物学的担体とは極めて対照的である。
【００２９】
本開示には、本開示のペプチド免疫原構築物及び／またはペプチド免疫原構築物を指向する抗体を使用してＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患を治療及び／または予防する方法も含まれる。いくつかの実施形態では、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患を治療及び／または予防する方法は、本開示のペプチド免疫原構築物を含有する組成物を宿主に投与することを含む。特定の実施形態では、本方法に利用される組成物は本開示のペプチド免疫原構築物を、ＣｐＧオリゴマーなどの負に帯電したオリゴヌクレオチドとの静電会合による安定な免疫刺激性複合体の形態で含有し、この複合体にはＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患を有する患者への投与のために、任意選択的にアジュバントとしての無機塩または油がさらに補充されている。本開示の方法はさらに、投薬計画、剤形、及びＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患の危険性があるかまたはそれを有する宿主にペプチド免疫原構築物を投与するための投与経路を含む。  
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患経路のメカニズムを示す図である。ナイーブ成熟Ｂ細胞は、膜結合型ＩｇＭ（ｍＩｇＥ）の発現により生じる。アレルゲンに遭遇すると、これらの細胞は、必要な共刺激シグナル及びサイトカインをＢ細胞に提供する同種ヘルパーＴ（ＴＨ）細胞の補助により活性状態になる。ＩＬ−４及びＩＬ−１３などの過剰のサイトカインに補助され、活性化されたアレルゲン特異的Ｂ細胞は、クラススイッチング組換えにより、ｍＩｇＥを発現するＩｇＥ関与型Ｂ細胞になる。このようなＩｇＥ関与型Ｂ細胞は、最終的にＩｇＥ分泌型形質細胞に分化する。ＩｇＥ分泌型形質細胞のほとんどは短命であり、炎症部位に移動した後、消滅するが、いくつかの長命の細胞は骨髄の対応するニッチに移動する。形質細胞から分泌されるアレルゲン特異的ＩｇＥは、血液の好塩基球及び組織のマスト細胞の表面にある高親和性ＩｇＥ．Ｆｃ受容体、ＦｃεＲＩに結合する。ＦｃεＲＩに結合したＩｇＥのアレルゲン誘導凝集は、好塩基球またはマスト細胞の脱顆粒、ならびにヒスタミン、ロイコトリエン、ＰＧＤ２、トリプターゼ、及び種々のサイトカインなどの伝達物質の放出を刺激し、即時過敏症を誘発し、ＴＨ２細胞及び好酸球などの種々の細胞型の動員を促進する。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは、分泌型ＩｇＥと膜結合型ＩｇＥ（ｍＩｇＥ）との構造的差異、及びＩｇＥ  ＥＭＰＤの標的化によりｍＩｇＥ  Ｂ細胞が減少する原理を示す図である。図２Ａは、ＩｇＥが分泌型ＩｇＥと膜結合型ＩｇＥ（ｍＩｇＥ）という２つの形態で表されることを示す。分泌型ＩｇＥは、ＦｃεＲＩによって好塩基球及びマスト細胞の細胞表面に捕捉されるが、ｍＩｇＥはＢ細胞受容体の一部としてＩｇＥ関与型Ｂ細胞にのみ存在する。ｍＩｇＥの細胞外膜近位ドメイン（ＥＭＰＤ）は、ＣＨ４ドメインと膜貫通領域との間の６７アミノ酸のペプチドセグメント（配列番号１）であり、ｍＩｇＥ  Ｂ細胞にのみ存在する。下線のアミノ酸は、ＥＭＰＤの短鎖アイソフォームに認められる残基を表す。ＩｇＥ  ＥＭＰＤの独自性により、ｍＩｇＥ及びｍＩｇＥ  Ｂ細胞を標的とする誘引部位が与えられた。図２Ｂは、ＩｇＥ  ＥＭＰＤを標的とすることによりｍＩｇＥ  Ｂ細胞を減少させ、新しいＩｇＥ分泌型形質細胞へと分化する前に、アレルゲン特異的ＩｇＥ生成の抑制が誘起されるメカニズムを示す。生存期間が限定される既存のＩｇＥ分泌型形質細胞は最終的に消滅し、その結果、総ＩｇＥ及びアレルゲン特異的ＩｇＥは徐々に低下する。
【図３】図３は、本明細書に開示される特定の実施形態に従うワクチン製剤の発見から商品化（工業化）までの開発過程を示すフローチャートである。本開示は、本図に要約するような、ペプチド免疫原設計、ペプチド組成物設計、ワクチン製剤設計、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能的抗原性試験設計、ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性及び有効性試験設計、ならびに臨床プロトコール設計を含む。各工程の詳細な評価及び分析から一連の実験へと進み、安全かつ有効なワクチン製剤の商品化に到達する。
【図４】図４は、種々のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物（配列番号８８〜９４、９６、及び９７）で免疫したモルモットにおける８週間にわたる抗体反応の動態を示すグラフである。血清は１０倍段階希釈により１：１００〜１：１０００００に希釈した。ＥＬＩＳＡプレートを、ウェルあたり０．５μｇペプチドのＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−３９ペプチド（配列番号５）で被覆した。Ｌｏｇ１０で表される試験した血清の力価を、カットオフＡ４５０を０．５に設定したＡ４５０の線形回帰分析によって算出した。
【図５】図５は、種々のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物（配列番号８８〜９４、９６、及び９７）で産生される種々の精製ポリクローナル抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体の滴定曲線を示すグラフである。ＥＬＩＳＡプレートを、組換えＩｇＥ  ＥＭＰＤ（配列番号１）を含むタンパク質、γ１−ｅｍ６７（配列番号１）で被覆した。プロテインＡクロマトグラフィーによってモルモット血清から精製したポリクローナル抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体を４倍段階希釈により１００μｇ／ｍＬから０．０２３８ｎｇ／ｍＬまで希釈した。各ポリクローナル抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体のＥＣ５０を、最大の結合有効性を示す免疫原構築物、配列番号８９及び９３を用いて、４パラメータロジスティック曲線近似による非線形回帰によって算出した。
【図６Ａ】図６Ａ〜図６Ｃには、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ免疫原構築物で免疫した動物からプールした、モルモット血清から精製したポリクローナル抗体の、ｍＩｇＥ．ＦｃＬ（左側）またはｍＩｇＥ．ＦｃＳ（右側）を発現するＲａｍｏｓ細胞株細胞への結合を示すフローサイトメトリーヒストグラムが記載されている。プロテインＡクロマトグラフィーによってモルモット血清から精製したポリクローナル抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体を１０μｇ／ｍＬで使用した。配列番号８８〜９４を有する免疫原構築物は、２０アミノ酸残基より小さいＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｂエピトープペプチドサイズを有する免疫原構築物９６及び９７と比較したとき、ｍＩｇＥＬ  Ｂ細胞に相当な結合を示した。図６Ａには、配列番号８８〜９０のＩｇＥ  ＥＭＰＤ免疫原構築物を指向するポリクローナル抗体からのヒストグラムが記載されている。
【図６Ｂ】図６Ｂには、配列番号９１〜９３のＩｇＥ  ＥＭＰＤ免疫原構築物を指向するポリクローナル抗体からのヒストグラムが記載されている。
【図６Ｃ】図６Ｃには、配列番号９４、９６、及び９７のＩｇＥ  ＥＭＰＤ免疫原構築物を指向するポリクローナル抗体からのヒストグラムが記載されている。
【図７】図７は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物（配列番号８８〜９３）を指向する種々のポリクローナル抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体によって誘導される、ｍＩｇＥ．ＦｃＬを発現するＲａｍｏｓ細胞のアポトーシスを示すグラフである。アポトーシスのレベルはアネキシンＶ＋／ＰＩ−％で表す。プロテインＡクロマトグラフィーによってモルモット血清から精製したポリクローナル抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体を２倍段階希釈により１０００から６２．５ｎｇ／ｍＬまで希釈した。ヒト化抗ＩｇＥモノクローナル抗体であるＸＯＬＡＩＲ（登録商標）を陽性対照として使用した。グラフの下にポリクローナル抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体の各組のＥＣ５０を示しており、これは、ｍＩｇＥＬ  Ｂ細胞のアポトーシス誘導で最大の有効性を示す配列番号８８、９０、及び９３を有する免疫原構築物を用いて、４パラメータロジスティック曲線近似による非線形回帰によって算出した。
【図８】図８は、エフェクター／標的比１／３０で、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ免疫原構築物（配列番号８８〜９３）を指向するポリクローナル抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体によって誘導される、ｍＩｇＥ．ＦｃＬを発現するＲａｍｏｓ細胞の抗体依存性細胞媒介型細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す棒グラフである。プロテインＡクロマトグラフィーによってモルモット血清から精製したポリクローナル抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体を１０μｇ／ｍＬで使用した。ＩＬ−２刺激マウス脾臓細胞をエフェクター細胞として使用し、マウス抗ＩｇＥモノクローナル抗体５Ｄ５を陽性対照として使用した。
【図９】図９は、モルモットからの免疫血清による、ＩｇＥ  ＥＭＰＤのアミノ酸９〜５０を対象範囲とする重複１０ｍｅｒペプチドを使用したＥＬＩＳＡによる精密特異性分析のためのエピトープマッピングを示す模式図である。血清試料中の抗体が認識する優勢なエピトープは、ＩｇＥ  ＥＭＰＤのループ構造を表す領域に特異的であった。この模式図は、天然のＩｇＥ  ＥＭＰＤのアミノ酸Ｃ１８とＣ３９との間の分子内ジスルフィド架橋によって形成される内部ループを示す。血清を１：１０００に希釈し、エピトープマッピングを行った。ＥＬＩＳＡプレートを、１０ｍｅｒペプチド（ウェルあたり０．５μｇペプチド）で被覆した。反応部位は、配列番号８８、８９、９３、９６、及び９７の免疫原構築物で過去に免疫され、それに応じて標識されたモルモットから採取した免疫血清試料を使用してエピトープマッピング試験によって同定した。
【図１０】図１０は、本開示のペプチド免疫原構築物による免疫付与に続く、パパイン誘導一次及び二次免疫応答を評価するための実験計画を示す模式図である。ヒトＩＧＨＥノックインハイブリッドマウスに、０週目、３週目、及び５週目の３回、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を筋肉内（ｉｍ）接種した。一次ＩｇＥ応答モデルでは、１０週目にパパイン／ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄでマウスに皮下（ｓｃ）攻撃接種し、１２週目にパパイン特異的ヒトＩｇＥ（ｈＩｇＥ）を測定した（図１３に示す）。二次ＩｇＥ応答では、１６週目に再度パパイン／ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄでマウスに皮下攻撃接種し、１８週目にパパイン特異的ヒトＩｇＥ（ｈＩｇＥ）を測定した（図１４に示す）。免疫されたマウスの血清をさらに、抗ＩｇＥ抗体生成（図１１）及び血清ＩｇＥの変化（図１２）についての試験を通じて試験した。
【図１１】図１１は、図１０に示す実験計画を使用した２０週間の抗ＩｇＥ抗体生成の動態を示すグラフである。具体的には、グラフは、指定用量（免疫付与あたり１００μＬ）でＩｇＥ  ＥＭＰＤ免疫原構築物（配列番号８８または９３）を０週目、３週目、及び５週目の３回、筋肉内接種し、１０週目及び１６週目にパパイン／ＴｉｔｅｒＭａｘで皮下に攻撃接種したヒトＩＧＨＥノックインハイブリッドマウス（ｈＩＧＨＥ×Ｂａｌｂ／ｃ、ｎ＝群あたり８匹）における抗体反応を示す。マウス血清は４倍段階希釈により１：１００〜１：（４．１９×１０８）に希釈した。ＥＬＩＳＡプレートを、組換えＩｇＥ  ＥＭＰＤを含むタンパク質、γ１−ｅｍ６７で被覆した。希釈係数のＬｏｇ（ＥＣ５０）で表される試験した血清の力価を、４パラメータロジスティック曲線近似による非線形回帰によって算出した。
【図１２】図１２は、図１０に示す実験計画を使用した２０週間の血清ＩｇＥの変化を示すグラフである。具体的には、グラフは、指定用量（免疫付与あたり１００μＬ）でＩｇＥ  ＥＭＰＤ免疫原構築物（配列番号８８または９３）を０週目、３週目、及び５週目の３回、筋肉内接種し、１０週目及び１６週目にパパイン／ＴｉｔｅｒＭａｘで皮下に攻撃接種したヒトＩＧＨＥノックインハイブリッドマウス（ｈＩＧＨＥ×Ｂａｌｂ／ｃ、ｎ＝群あたり８匹）におけるＩｇＥの血清レベルを示す。血清ＩｇＥはヒトＩｇＥ（ｈＩｇＥ）定量ＥＬＩＳＡで測定した。マウス血清は１：２０に希釈した。Ｕ２６６骨髄腫細胞から精製したｈＩｇＥを使用して、標準曲線を作成した。ＩｇＥ濃度は、４パラメータロジスティック曲線近似を使用して、非線形回帰により生成した標準曲線にＡ４５０を内挿することにより算出した。
【図１３】図１３は、図１０に示す実験計画を使用して１２週目に測定された一次ＩｇＥ応答におけるパパイン特異的ヒトＩｇＥ（ｈＩｇＥ）生成の抑制を示すグラフである。具体的には、ヒトＩＧＨＥノックインハイブリッドマウス（ｈＩＧＨＥ×Ｂａｌｂ／ｃ、ｎ＝群あたり８匹）に、指定用量（免疫付与あたり１００μＬ）でＩｇＥ  ＥＭＰＤ免疫原構築物（配列番号８８または９３）を０週目、３週目、及び５週目の３回、筋肉内接種した。血清パパイン特異的ｈＩｇＥは定量ＥＬＩＳＡで測定した。マウス血清は１：１０に希釈した。モノクローナルキメラパパイン特異的ｈＩｇＥを使用して、標準曲線を作成した。パパイン特異的ｈＩｇＥ濃度は、４パラメータロジスティック曲線近似を使用して、非線形回帰により生成した標準曲線にＡ４５０を内挿することにより算出した。
【図１４】図１４は、図１０に示す実験計画を使用して１８週目に測定された二次ＩｇＥ応答におけるパパイン特異的ヒトＩｇＥ（ｈＩｇＥ）生成の抑制を示す。具体的には、ヒトＩＧＨＥノックインハイブリッドマウス（ｈＩＧＨＥ×Ｂａｌｂ／ｃ、ｎ＝群あたり８匹）に、指定用量（免疫付与あたり１００μＬ）でＩｇＥ  ＥＭＰＤ免疫原構築物（配列番号８８または９３）を０週目、３週目、及び５週目の３回、筋肉内接種した。血清パパイン特異的ｈＩｇＥは定量ＥＬＩＳＡで測定した。マウス血清は１：１０に希釈した。モノクローナルキメラパパイン特異的ｈＩｇＥを使用して、標準曲線を作成した。パパイン特異的ｈＩｇＥ濃度は、４パラメータロジスティック曲線近似を使用して、非線形回帰により生成した標準曲線にＡ４５０を内挿することにより算出した。
【図１５】図１５は、本開示のペプチド免疫原構築物による免疫付与に続く、パパイン誘導感作及びリコール免疫応答を評価するための実験計画を示す模式図である。ヒトＩＧＨＥノックインハイブリッドマウスを、０週目にパパイン／ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄで皮下（ｓｃ）感作させた後、３週目、６週目、及び８週目の３回、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物により筋肉内接種した。１２週目にＰＢＳ溶液中のパパインを皮内足蹠注射することにより、パパイン特異的免疫リコール応答を誘発した。実験の０〜６週目に総ＩｇＥ及びパパイン特異的ＩｇＥ／ＩｇＧのレベルを評価し（図１６）、１２週目、１３週目、及び１４週目にパパイン特異的ＩｇＥのレベルを評価した（図１７）。
【図１６】図１６は、図１５に示す実験計画を使用した、ヒトＩＧＨＥノックインハイブリッドマウスすべてのパパインによる感作転帰を示すグラフが記載されている。Ｌｏｇ（ＥＣ５０）とヒトＩｇＥ（ｎｇ／ｍＬ）で表されるパパイン特異的マウスＩｇＧ力価を、６週間にわたり検出した。加えて、バイスタンダーの活性化により、総ＩｇＥレベル（ｎｇ／ｍＬ）が増加した。
【図１７】図１７は、図１５に示す実験計画を使用した、１２週目、１３週目、及び１４週目のパパイン特異的ヒトＩｇＥ（ｈＩｇＥ）生成の抑制を示すグラフである。具体的には、グラフは、４００μｇ／ｍＬ（免疫付与あたり１００μＬ）の配列番号８８または９３を３週目、６週目、及び８週目の３回、筋肉内接種し、感作されたヒトＩＧＨＥノックインハイブリッドマウス（ｈＩＧＨＥ×Ｂａｌｂ／ｃ、ｎ＝群あたり８匹）におけるパパイン特異的リコール応答を示す。血清パパイン特異的ｈＩｇＥは定量ＥＬＩＳＡで測定した。マウス血清は１：１０に希釈した。モノクローナルキメラパパイン特異的ｈＩｇＥ（ｎｇ／ｍＬ）を使用して、標準曲線を作成した。パパイン特異的ｈＩｇＥ濃度は、４パラメータロジスティック曲線近似を使用して、非線形回帰により生成した標準曲線にＡ４５０を内挿することにより算出した。
【図１８】図１８Ａ及び図１８Ｂは、投与あたり３０、１００、３００、及び１０００μｇという４通りの投薬量のＩｇＥ  ＥＭＰＤ免疫原構築物（配列番号８８）とプラセボ対照製剤を指定用量で０週目、３週目、及び６週目に接種したカニクイザルにおけるプロトタイプ免疫療法アレルギーワクチン製剤の免疫原性を示すグラフである。これはＥＬＩＳＡにより抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ力価ついてアッセイしたものである。図１８Ａは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ  ５１及びＣｐＧ  ＯＤＮを含有する製剤で免疫したマカクにおける抗体反応を示している。図１８Ｂは、ＡＤＪＵＰＨＯＳ及びＣｐＧ  ＯＤＮを含有する製剤で免疫したマカクにおける抗体反応を示している。
【図１９】図１９は、３００μｇ／ｍＬ（免疫付与あたり５００μＬ）の免疫原構築物（配列番号１２５または１２６）を０週目、３週目、６週目の３回、筋肉内接種されたカニクイザル（群あたり雄２及び雌２）における２０週間にわたる抗体反応の動態を示すグラフである。マカク血清は４倍段階希釈により１：１００〜１：（４．１９×１０８）に希釈した。ＥＬＩＳＡプレートを、配列番号５で被覆した。希釈係数のＬｏｇ１０で表される試験した血清の力価を、４パラメータロジスティック曲線近似による非線形回帰によって算出した。カットオフは、１：１００希釈の血清試料すべての平均Ａ４５０の２倍に設定した。
【図２０】図２０は、３００μｇ／ｍＬ（免疫付与あたり５００μＬ）のＩｇＥ  ＥＭＰＤ免疫原構築物（配列番号１２５または１２６）を０週目、３週目、６週目の３回、筋肉内接種されたカニクイザル（群あたり雄２及び雌２）における２０週間にわたるＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭ抗体反応の動態を示す。マカク血清は４倍段階希釈により１：１００〜１：（４．１９×１０８）に希釈した。ＥＬＩＳＡプレートを、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−３９ペプチド（配列番号５）で被覆した。Ｌｏｇ１０で表される力価は、試験した各血清のデータから作成された４パラメータロジスティック曲線にカットオフを内挿することにより算出した。カットオフは、１：１００希釈の血清試料すべての平均Ａ４５０の２倍に設定した。
【図２１】図２１は、３００μｇ／ｍＬ（免疫付与あたり５００μＬ）のＩｇＥ  ＥＭＰＤ免疫原構築物（配列番号１２５または１２６）を０週目、３週目、６週目の３回、筋肉内接種されたカニクイザル（群あたり雄２及び雌２）における２０週間にわたる血清ＩｇＥレベルの変化を示すグラフである。血清ＩｇＥレベルはマカクＩｇＥ定量ＥＬＩＳＡで測定した。マカク血清は１：２０に希釈した。マカクＩｇＥを使用して、標準曲線を作成した。ＩｇＥ濃度は、４パラメータロジスティック曲線近似を使用して、非線形回帰により生成した標準曲線にＡ４５０を内挿することにより算出した。結果は平均±ＳＤである。両側仮説による対応のあるｔ検定を使用して、０週目までの統計的差異を特定した：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本開示は、膜結合型ＩｇＥの細胞外膜近位ドメイン（ＥＭＰＤ）（すなわちＩｇＥ  ＥＭＰＤ）を標的とするペプチド免疫原構築物に関する。本開示はまた、ペプチド免疫原構築物を含有する組成物、ペプチド免疫原構築物を製造及び使用する方法、ならびにペプチド免疫原構築物によって免疫付与される宿主が生成する抗体に関する。
【００３２】
本開示のペプチド免疫原構築物は、約２０アミノ酸以上を含有する。ペプチド免疫原構築物は、完全長ＩｇＥ  ＥＭＰＤの６７アミノ酸の配列（配列番号１）からのＢ細胞エピトープを含む。Ｂ細胞エピトープは、病原体タンパク質に由来する異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに任意選択の異種スペーサーによって結合し得る。本開示のペプチド免疫原構築物は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤを指向する高特異性抗体の生成を刺激し、組換えＩｇＥ  ＥＭＰＤ含有タンパク質γ１−ｅｍ６７、及び／またはｍＩｇＥを保持するＢ細胞上のＩｇＥ  ＥＭＰＤに結合することができる。本開示のペプチド免疫原構築物は、アレルゲン非依存性であり費用対効果の高いユニバーサル免疫療法として、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患に罹患している患者全般に使用することができる。
【００３３】
ペプチド免疫原構築物のＢ細胞エピトープ部分は、完全長ＩｇＥ  ＥＭＰＤ配列（配列番号１）からのアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、完全長ＩｇＥ  ＥＭＰＤ配列（配列番号１）の付番に従い、内因性システイン（Ｃ１８〜Ｃ３９）によって形成されるＩｇＥ  ＥＭＰＤの内部分子内ループを含む配列を有する。特定の具体的な実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ−１−３９（配列番号５）、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ−７−４０（配列番号６）、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ−１９−３８（配列番号８）、またはＩｇＥ  ＥＭＰＤ−１−４０（配列番号９）のアミノ酸配列を有する。
【００３４】
本開示のペプチド免疫原構築物は、病原性タンパク質に由来する異種Ｔｈエピトープアミノ酸配列（例えば配列番号５９〜８７）を含有し得る。特定の実施形態では、異種Ｔｈエピトープは、天然の病原体、例えば、ジフテリア毒素（配列番号６３）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（配列番号６４）、コレラ毒素（配列番号６６）に由来するものである。他の実施形態では、異種Ｔｈエピトープは、麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ１〜５）またはＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ１〜３）に由来し、単一配列（例えば、配列番号６０、６７、７２、及び７３）か混成配列（例えば、配列番号７０、６９及び７１）かのどちらかの形態にある理想人工Ｔｈエピトープである。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ペプチド免疫原構築物は、任意選択の異種スペーサーによって異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに結合された、ＩｇＥ  ＥＭＰＤからのＢ細胞エピトープを含有する。任意選択の異種スペーサーは、２つのアミノ酸及び／またはペプチドを一緒に結合できる分子または化学構造であり得る。特定の実施形態では、スペーサーは、天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸またはその組合せである。
【００３６】
特定の実施形態では、ペプチド免疫原構築物は、病原性タンパク質に由来する異種Ｔｈエピトープ（配列番号５９〜８７）に任意選択の異種スペーサーによって結合された、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ−１−４０からの約２０超のアミノ酸（例えば配列番号９）を有するＢ細胞抗原性部位を含有する。具体的な実施形態では、ペプチド免疫原構築物は、配列番号８８〜９５、９８〜１２４、及び１３０のアミノ酸配列を有する。
【００３７】
本開示はさらに、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を含有する組成物に関する。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、１つより多いＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を含有する。特定の実施形態では、組成物は、患者の広範な遺伝的背景を対象範囲に含めるために、異なるＴｈエピトープに結合したＩｇＥ  ＥＭＰＤ−１−３９のＢ細胞エピトープ部分を含むペプチド免疫原構築物の混合物（例えば、配列番号９８〜１２４の任意の組合せ）を含有する。ペプチド免疫原構築物の混合物を含有する組成物は、単一のペプチド免疫原構築物のみを含有する組成物と比較して、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患の治療のためにワクチンで免疫付与したときのレスポンダー率より高い百分率につながり得る。
【００３８】
本開示はさらに、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患の治療及び／または予防のための、ワクチン製剤を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＣｐＧオリゴマーと、ペプチド免疫原複合体を含有する組成物とを混合することで静電会合によって形成された安定化免疫刺激性複合体の形態で本開示のペプチド免疫原構築物を含有する。そのような安定化免疫刺激性複合体は、ペプチド免疫原構築物の免疫原性をさらに増強することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、アジュバント、例えば、ミョウバンゲル（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ）、リン酸アルミニウム（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）を含めた無機塩、またはＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ５１もしくは７２０を含めた油中水型エマルションを含有する。
【００３９】
本開示はさらに、本開示のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を指向する抗体に関する。特に、本開示のペプチド免疫原構築物は、ペプチド免疫原構築物のＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｂ細胞エピトープ部分に関して交差反応性である高特異性抗体の生成を刺激することができる。本開示の抗体は、免疫原性増強のために採用される異種Ｔｈエピトープを指向することがあったとしてもあまりなく、高い特異性でＩｇＥ  ＥＭＰＤに結合するが、このことは、そのようなペプチド抗原性増強のために使用される従来のタンパク質または他の生物学的担体を使用して製造される抗体とは極めて対照的である。したがって、本開示のペプチド免疫原構築物は、他のペプチドまたはタンパク質免疫原と比較して、高いレスポンダー率で、自己抗原に対する免疫寛容を破壊することができる。
【００４０】
特定の実施形態では、ペプチド免疫原構築物が対象に投与されると、抗体は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ−１−５２アミノ配配列（配列番号２）、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ−１−６７アミノ酸配列（配列番号１）、及びそれらの断片（例えば配列番号５及び６）を指向し、特異的に結合する。ペプチド免疫原構築物によって生成する高特異性抗体は、可溶性ＩｇＥ  ＥＭＰＤ含有ペプチド及びタンパク質、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ含有融合ペプチド及びタンパク質γ１−ｅｍ６７、及び／または膜結合型ＩｇＥを保持するＢ細胞上のＩｇＥ  ＥＭＰＤに関して交差反応性である。生成された抗体は、ｍＩｇＥを発現するＢリンパ球上のＩｇＥ  Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）に結合し、架橋させることができる。このような架橋は、アポトーシス及び抗体依存性細胞媒介型細胞傷害（ＡＤＣＣ）などの細胞溶解効果を誘導し、血清ＩｇＥ生成の低減をもたらす。
【００４１】
それらの独特の特徴及び特性に基づいて、本開示の抗体は、原因となるアレルゲン（複数可）に関係なく、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患を治療するユニバーサルな免疫治療的手法を提供することができる。
【００４２】
本開示はさらに、本開示のペプチド免疫原構築物、組成物、及び抗体の製造方法に関する。本開示の方法は、原因となるアレルゲン（複数可）に関係なくＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患を治療する方法に使用できるペプチド免疫原構築物及び構築物を含有する組成物の低コストの製造及び品質管理を提供する。
【００４３】
本開示にはさらに、本開示のペプチド免疫原構築物及び／またはペプチド免疫原構築物を指向する抗体を使用して、原因となるアレルゲン（複数可）に関係なくＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患を治療及び／または予防する方法も含まれる。いくつかの実施形態では、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患を治療及び／または予防する方法は、本開示のペプチド免疫原構築物を含有する組成物を宿主に投与することを含む。特定の実施形態では、本方法において利用される組成物は本開示のペプチド免疫原構築物を、ＣｐＧオリゴマーなどの負に帯電したオリゴヌクレオチドとの静電会合による安定な免疫刺激性複合体の形態で含有し、さらにＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患を有する患者への投与のためにアジュバントを補充することができる。本開示の方法はさらに、投薬計画、剤形、及びＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患の危険性があるかまたはそれを有する宿主にペプチド免疫原構築物を投与するための投与経路を含む。
【００４４】
本明細書中で使用される節の見出しは、単なる構成上の目的のためのものにすぎず、記載されている主題を限定していると解釈すべきでない。本願中で引用される全ての参考文献または参考文献の一部は、参照によりそれらの全体があらゆる目的のために本明細書に明示的に援用される。
【００４５】
特に説明がない限り、本明細書中で使用する全ての科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には複数形の意味が含まれており、但し、そうでないことが文脈によって明らかに示されている場合を除く。同様に、「または」という単語には「及び」を含むことを意図しており、但し、そうでないことが文脈によって明らかに示されている場合を除く。したがって、「ＡまたはＢを含む」という語句は、Ａ、またはＢ、またはＡとＢを含むことを意味する。さらに、ポリペプチドに対して与えられる全てのアミノ酸サイズ及び全ての分子量または分子質量値がおおよそのものであり説明のために提供されていることは理解される。本明細書に記載のものと類似するまたは等価である方法及び材料を本開示の方法の実施または検査に使用することはできるが、以下では好適な方法及び材料が記載されている。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。対立がある場合には用語の説明を含めて本明細書が優先されることになる。加えて、本明細書に開示される材料、方法及び実施例は例示であるにすぎず、限定を意図していない。
【００４６】
ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物
本開示は、直接、または任意選択の異種スペーサーによって、異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに共有結合された、ＩｇＥ  ＥＭＰＤからのアミノ酸配列を有するＢ細胞エピトープを含有するペプチド免疫原構築物を提供する。
【００４７】
「ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物」または「ペプチド免疫原構築物」という語句は、本明細書中で使用される場合、（ａ）６７アミノ酸配列の完全長ＩｇＥ  ＥＭＰＤ（配列番号１）からの約２０アミノ酸残基以上を有するＢ細胞エピトープ；（ｂ）異種Ｔｈエピトープ；及び（ｃ）任意選択の異種スペーサーを含有する、ペプチドを指す。
【００４８】
特定の実施形態では、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物は、以下の式で表すことができる。
【００４９】
ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物は、式：
（Ｔｈ）ｍ−（Ａ）ｎ−（ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片）−Ｘ
または
（ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片）−（Ａ）ｎ−（Ｔｈ）ｍ−Ｘ
または
（Ｔｈ）ｍ−（Ａ）ｎ−（ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片）−（Ａ）ｎ−（Ｔｈ）ｍ−Ｘ
［式中、
Ｔｈは異種Ｔヘルパーエピトープであり、
Ａは異種スペーサーであり、
（ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片）は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤからの約２０〜約４０アミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープであり、
Ｘはアミノ酸のα−ＣＯＯＨまたはα−ＣＯＮＨ２であり、
ｍは１〜約４であり、
ｎは０〜約１０である］で表すことができる。
【００５０】
本開示のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物は、いくつかの原理に基づいて設計及び選択された。これらの原理のいくつかは、以下のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の採用を含む：
ｉ．自己分子であるため、それ自体は非免疫原性である；
ｉｉ．タンパク質担体または強力なＴヘルパーエピトープ（複数可）によって免疫原性を付与することができる；
ｉｉｉ．免疫原性が付与され宿主に投与されたとき、
ａ．ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド配列（Ｂ細胞エピトープ）に対するが、タンパク質担体またはＴヘルパーエピトープ（複数可）に対するものではない高力価抗体を誘発する；
ｂ．免疫された宿主の免疫寛容を破壊し、ｍＩｇＥ．ＦｃＬを発現するＣＨＯ細胞から精製された組換えタンパク質として、またはｍＩｇＥ．ＦｃＬをコードする組換えＤＮＡでトランスフェクトされた、ｍＩｇＥを保持するＢ細胞（例えば、Ｒａｍｏｓ）の膜上のいずれかで、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ（配列番号１）と交差反応性の高い特異性抗体を生成する；
ｃ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及びＩｇＥを発現するＢリンパ球のアポトーシスを誘導可能な高特異性抗体を生成する（実施例６）；
ｄ．血液中のＩｇＥ基礎レベルのｉｎ  ｖｉｖｏ低下と、アレルゲンの攻撃接種による初回免疫及び追加免疫時に抗原特異的ＩｇＥレベルの大幅な低下をもたらすことが可能な高特異性抗体を生成する（実施例８〜１１）。
【００５１】
本開示のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物及びその製剤は、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患に罹患している患者におけるＩｇＥ媒介型アレルギー性病理を緩和または排除するワクチンとして効果的に機能することができる。
【００５２】
本開示のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の種々の構成要素について以下でさらに詳細に説明する。
【００５３】
ａ．ＩｇＥ  ＥＭＰＤのＢ細胞エピトープ
本開示は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチドに特異性であり、ＩｇＥの分泌に関与するヒトＢ細胞上で発現される膜結合型ＩｇＥに交差反応性である、高力価ポリクローナル抗体の生成のための新規ペプチド組成物に関する。合理的な設計努力によるペプチド組成物の部位特異性は、担体タンパク質上の無関係な部位を指向する抗体の生成を最小限に抑える。
【００５４】
「ＩｇＥ」という用語は、本明細書中で使用される場合、分泌型ＩｇＥ、膜結合型ＩｇＥ、及びそれらの断片を含む、任意の形態の免疫グロブリンＥを指す。分泌型及び膜結合型のＩｇＥを図２Ａに示す。
【００５５】
「ｍＩｇＥ」という用語は、本明細書中で使用される場合、特に、膜結合型のＩｇＥ及びその断片を指す。いくつかの実施形態では、ｍＩｇＥは、Ｉｇイプシロン鎖Ｃ領域２型−ヒト（断片）；アクセッション番号ＰＨ１２１５として報告されたアミノ酸配列を有する、ヒトにおける膜結合型のＩｇＥである。膜結合型ＩｇＥを図２Ａ（右側）に示す。
【００５６】
「ＩｇＥ  ＥＭＰＤ」という用語は、本明細書中で使用される場合、膜結合型ＩｇＥ（ｍＩｇＥ）の細胞外膜近位ドメイン（ＥＭＰＤ）及びその断片を指す。ＩｇＥ  ＥＭＰＤはＣεｍＸとも称され、ＣＨ４ドメインとＣ末端膜アンカー膜貫通ペプチドとの間に位置し、ｍＩｇＥ  Ｂ細胞にのみ認められる。ＩｇＥのＥＭＰＤは、「短鎖」アイソフォームが使用するスプライシングアクセプター部位の１５６−ｂｐ上流でのεＲＮＡ転写産物の選択的スプライシングから生じる。ヒトＩｇＥの完全長「長鎖」ＥＭＰＤアイソフォームは、６７アミノ酸長（配列番号１）であり、「短鎖」アイソフォームには存在しない５２アミノ酸（配列番号２）を含む。膜結合型ＩｇＥを、ＥＭＰＤ部分を拡大した図２Ａに示す。完全長ＩｇＥ  ＥＭＰＤのアミノ酸配列（配列番号１）及びその断片（配列番号２〜５８及び１２７）を表１に示す。
【００５７】
ＩｇＥ  ＥＭＰＤは、ＩｇＥ  ＥＭＰＤの６７アミノ酸配列及び５２アミノ酸配列（それぞれ配列番号１及び２）のアミノ酸付番に基づいて、内因性システイン（Ｃ１８〜Ｃ３９）間の分子内ループを含む。ＩｇＥの内部分子内ループを図９に示す。
【００５８】
ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物のＢ細胞エピトープは、ＩｇＥ  ＥＭＰＤまたはその一部の分子内ループ構造を含む。特定の実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、ＩｇＥ  ＥＭＰＤの約２０〜約４０アミノ酸を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物のＢ細胞エピトープ部分のアミノ酸配列は、完全長ＩｇＥ  ＥＭＰＤ（配列番号１）からの約２０〜約４０アミノ酸残基を含む。特定の実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、完全長ＩｇＥ  ＥＭＰＤ（配列番号１）の付番に従い、内因性システイン（Ｃ１８〜Ｃ３９）によって形成されるＩｇＥ  ＥＭＰＤの内部分子内ループからのアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態では、Ｂ細胞エピトープの配列は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤの分子内ループ構造のＣ末端側の残基３８のＡｒｇ（Ｒ）、３９のＣｙｓ（Ｃ）、または４０のＨｉｓ（Ｈ）で終わる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、表１に示すように、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ−１−３９（配列番号５）、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ−７−４０（配列番号６）、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ−１９−３８（配列番号８）、またはＩｇＥ  ＥＭＰＤ−１−４０（配列番号９）のアミノ酸配列を有する。
【００６１】
本開示のＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片にはさらに、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド（配列番号５、６、８、及び９）及びそれらの２０超のアミノ酸断片の免疫学的機能性類縁体または相同体も含まれる。ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチドの免疫学的機能性類縁体または相同体及びその２０超のアミノ酸断片には、元のペプチドと実質的に同じ免疫原性を保持する変異体が含まれる。免疫学的機能性類縁体は、アミノ酸位置における保存的置換；全体電荷の変更；別の部分との共有結合；またはアミノ酸の付加、挿入、もしくは欠失；及び／またはその任意の組合せを有し得る。
【００６２】
ｂ．異種Ｔヘルパー細胞エピトープ（Ｔｈエピトープ）
本開示は、直接、または任意選択の異種スペーサーによって、異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに共有結合された、ＩｇＥ  ＥＭＰＤからのＢ細胞エピトープを含有する、ペプチド免疫原構築物を提供する。
【００６３】
ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物中の異種ＴｈエピトープはＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片の免疫原性を増強し、これが、合理的なデザインによって最適化された標的Ｂ細胞エピトープ（すなわち、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片）を指向する特異的な高力価抗体の生成を促進する。
【００６４】
本明細書中で使用する「異種」という用語は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤの野生型配列の一部でないまたはそれと相同的でないアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を指す。したがって、異種Ｔｈエピトープは、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ中に天然に認められないアミノ酸配列に由来するＴｈエピトープである（つまり、ＴｈエピトープはＩｇＥ  ＥＭＰＤに対して自家ではない）。ＴｈエピトープはＩｇＥ  ＥＭＰＤに対して異種であるため、異種ＴｈエピトープをＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片に共有結合される場合にＩｇＥ  ＥＭＰＤの天然アミノ酸配列はＮ末端側またはＣ末端側のどちらの方向にも伸長されない。
【００６５】
本開示の異種Ｔｈエピトープは、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ中に天然に認められるアミノ酸配列を有さない任意のＴｈエピトープであり得る。Ｔｈエピトープは、複数の種のＭＨＣクラスＩＩ分子に対する無差別的結合モチーフを有する場合もある。特定の実施形態では、Ｔヘルパー細胞を最大限に活性化させて免疫応答の開始及び調節をもたらすべく、Ｔｈエピトープは複数の無差別的ＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフを含む。Ｔｈエピトープは好ましくはそれ自体では免疫サイレントであり、つまり、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物によって生成した抗体のうちＴｈエピトープに向かって指向することになるものがあったとしてもほとんどなく、それゆえ、標的とするＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片のＢ細胞エピトープを指向する非常に集中的な免疫応答が可能になる。
【００６６】
本開示のＴｈエピトープとしては、限定されないが、表２中に例示されているような外来病原体に由来するアミノ酸配列（配列番号５９〜８７）が挙げられる。さらに、エピトープには、理想人工Ｔｈエピトープ及び混成理想人工Ｔｈエピトープ（例えば配列番号６０及び配列番号６７〜７３）が含まれる。混成配列（例えば配列番号６８〜７１）として提示される異種Ｔｈエピトープペプチドは、その特定ペプチドの相同体の可変残基を基準としてペプチドの枠組み内での特定位置に表されるアミノ酸残基の混合物を含有する。混成ペプチドの組立体は、合成工程中に１つの特定のアミノ酸の代わりに指定の保護されたアミノ酸の混合物を特定位置に加えることによって１工程で合成され得る。そのような混成異種Ｔｈエピトープペプチド組立体は、多様な遺伝的背景を有する動物に対する広いＴｈエピトープ対象範囲を可能にすることができる。異種Ｔｈエピトープペプチドの代表的な混成配列としては、表２に示される配列番号６８〜７１が挙げられる。本発明のエピトープペプチドは、遺伝的に多様な個体群からの動物及び患者に対して広範な反応性及び免疫原性を示す。
【００６７】
Ｔｈエピトープを含むＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片と一緒に単一の固相ペプチド合成において同時に製造される。Ｔｈエピトープには、Ｔｈエピトープの免疫学的類縁体も含まれる。免疫学的Ｔｈ類縁体としては、免疫増強性類縁体、交差反応性類縁体、及びＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片に対する免疫応答を増強または刺激するのに十分なこれらのＴｈエピトープのいずれかのセグメントが挙げられる。
【００６８】
Ｔｈエピトープペプチドの機能性免疫学的類縁体も有効であり、本発明の一部として含まれる。機能性免疫学的Ｔｈ類縁体は、ＴｈエピトープのＴｈ刺激機能を本質的に変化させないＴｈエピトープにおける１〜約５アミノ酸残基の保存的置換、追加、欠失及び挿入を含み得る。保護的置換、追加及び挿入は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片について上述した天然または非天然アミノ酸を使用して成し遂げられ得る。表２には、Ｔｈエピトープペプチドの機能性類縁体の別の変形形態が特定されている。特にＭｖＦ１及びＭｖＦ２  Ｔｈの配列番号６０及び配列番号６７は、各々Ｎ及びＣ末端における２つのアミノ酸の欠失（配列番号６０及び配列番号６７）または包含（配列番号７０及び配列番号７２）によってアミノ酸フレームに差異があるという点で、ＭｖＦ４及びＭｖＦ５の配列番号７０及び配列番号７２の機能性類縁体である。これらの２つの類似配列系列間での差異は、これらの配列の中に含まれているＴｈエピトープの機能に影響を与えないものである。したがって、機能性免疫学的Ｔｈ類縁体には、麻疹ウイルス融合タンパク質ＭｖＦ１〜４  Ｔｈ（配列番号６０、６７、６８、７０及び７２）に由来する及び肝炎表面タンパク質ＨＢｓＡｇ１〜３  Ｔｈ（配列番号６９、７１及び７３）に由来するＴｈエピトープのいくつかの変異型が含まれる。
【００６９】
ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物中のＴｈエピトープは、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド断片のＮまたはＣ末端側において共有結合し得る。いくつかの実施形態では、ＴｈエピトープはＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド断片のＮ末端側に共有結合している。他の実施形態では、ＴｈエピトープはＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド断片のＣ末端側に共有結合している。特定の実施形態では、１つより多いＴｈエピトープがＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片に共有結合している。１つより多いＴｈエピトープがＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片に結合している場合、各Ｔｈエピトープは同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有し得る。加えて、１つより多いＴｈエピトープがＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片に結合している場合にＴｈエピトープは任意の順序で配置できる。例えば、Ｔｈエピトープが連続的にＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片のＮ末端側に結合し得るか、もしくは連続的にＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片のＣ末端側に結合し得るか、または１つのＴｈエピトープがＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片のＮ末端側に共有結合し得るが、一方で別のＴｈエピトープがＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片のＣ末端側に共有結合する。ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片と関連するＴｈエピトープの並び方に制限はない。
【００７０】
いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープは直接ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片に共有結合している。他の実施形態では、Ｔｈエピトープは、以下にさらに詳しく説明する異種スペーサーによってＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片に共有結合している。
【００７１】
ｃ．異種スペーサー
本開示のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物は、任意選択で、ＩｇＥ  ＥＭＰＤからのＢ細胞エピトープを異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに共有結合する異種スペーサーを含有する。
【００７２】
上に述べたとおり、「異種」という用語は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤの天然型配列の一部でない、またはそれと相同的でないアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を指す。したがって、異種スペーサーをＩｇＥ  ＥＭＰＤからのＢ細胞エピトープに共有結合する場合、スペーサーがＩｇＥ  ＥＭＰＤ配列に対して異種であるためＩｇＥ  ＥＭＰＤの天然アミノ酸配列はＮ末端側またはＣ末端側のどちらの方向にも伸長されない。
【００７３】
スペーサーは、２つのアミノ酸及び／またはペプチド同士を結合することができる任意の分子または化学構造である。スペーサーは用途によって長さまたは極性が様々であり得る。スペーサーの結合は、アミドまたはカルボニル結合によるものであり得るが、他の官能性も同様に可能である。スペーサーは化合物、天然に存在するアミノ酸、または天然に存在しないアミノ酸を含み得る。
【００７４】
スペーサーはＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物に構造的特徴を提供することができる。構造的にスペーサーはＴｈエピトープとＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片のＢ細胞エピトープとの物理的に分離する。スペーサーによる物理的分離は、ＴｈエピトープをＢ細胞エピトープと結合することによって作り出される何らかの人工的二次構造を妨害することができる。加えて、スペーサーによるエピトープの物理的分離はＴｈ細胞及び／またはＢ細胞応答間の干渉をなくすことができる。さらに、スペーサーを、ペプチド免疫原構築物の二次構造を作り出すまたは改変するように設計することができる。例えば、ＴｈエピトープとＢ細胞エピトープとの分離を強化するために、柔軟なヒンジとして機能するようにスペーサーを設計できる。柔軟なヒンジスペーサーは、提示されたペプチド免疫原と適切なＴｈ細胞及びＢ細胞とのより効率的な相互作用を可能にしてＴｈエピトープ及びＢ細胞エピトープに対する免疫応答を強化することもできる。屈曲性ヒンジをコードする配列の例は免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域にみられ、これはプロリンに富むことが多い。スペーサーとして使用することができる特に有用な１つの屈曲性ヒンジは、配列Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（配列番号１２８）によって提供され、式中、Ｘａａは任意のアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸である。
【００７５】
スペーサーはＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物に機能的特徴も提供することができる。例えば、スペーサーは、ペプチド免疫原構築物の溶解性に影響を与え得るものであるＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の全体電荷を変更させるように設計され得る。加えて、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の全体電荷を変更させることで他の化合物及び試薬とのペプチド免疫原構築物の結合能力に影響を及ぼす可能性がある。以下にさらに詳しく述べているが、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物から静電結合によってＣｐＧオリゴマーなどの高荷電オリゴヌクレオチドとの安定な免疫刺激性複合体を形成することができる。ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の全体電荷は、これらの安定な免疫刺激性複合体の形成にとって重要である。
【００７６】
スペーサーとして使用することができる化合物としては、限定されないが、（２−アミノエトキシ）酢酸（ＡＥＡ）、５−アミノ吉草酸（ＡＶＡ）、６−アミノカプリン酸（Ａｈｘ）、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＡＥＥＡ、ミニ−ＰＥＧ１）、１２−アミノ−４，７，１０−トリオキサドデカン酸（ミニ−ＰＥＧ２）、１５−アミノ−４，７，１０，１３−テトラオキサペンタ−デカン酸（ミニ−ＰＥＧ３）、トリオキサトリデカン−スクシンアミド酸（Ｔｔｄｓ）、１２−アミノ−ドデカン酸、Ｆｍｏｃ−５−アミノ−３−オキサペンタン酸（Ｏ１Ｐｅｎ）などが挙げられる。
【００７７】
天然に存在するアミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンが挙げられる。
【００７８】
天然に存在しないアミノ酸としては、限定されないが、ε−Ｎリジン、β−アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サイロキシン、γ−アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリン、アミノ安息香酸、６−アミノカプリン酸（Ａｃａ；６−アミノヘキサン酸）、ヒドロキシプロリン、メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、３−ニトロ−チロシン、ピログルタミン酸などが挙げられる。
【００７９】
ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物中のスペーサーは、Ｔｈエピトープ及びＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチドのＮまたはＣ末端側のどちらかに共有結合し得る。いくつかの実施形態では、スペーサーはＴｈエピトープのＣ末端及びＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチドのＮ末端側に共有結合している。他の実施形態では、スペーサーはＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチドのＣ末端側及びＴｈエピトープのＮ末端側に共有結合している。特定の実施形態では、例えば１つ以上のＴｈエピトープがペプチド免疫原構築物中に存在する場合に、１つより多いスペーサーが使用され得る。１つより多いスペーサーを使用する場合、各スペーサーは互いに同じものまたは異なるものであってよい。加えて、１つより多いＴｈエピトープがペプチド免疫原構築物中に存在する場合、Ｔｈエピトープはスペーサーで分離することができ、Ｔｈエピトープは、ＴｈエピトープをＢ細胞エピトープから分離するために使用されるスペーサーと同じまたは異なるものであってよい。ＴｈエピトープまたはＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片に関するスペーサーの配置に制限はない。
【００８０】
特定の実施形態では、異種スペーサーは、天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸である。他の実施形態では、スペーサーは天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸を１つより多く含有する。具体的な実施形態では、スペーサーは、Ｌｙｓ−、Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、（α，ε−Ｎ）Ｌｙｓ、またはε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１２９）である。
【００８１】
ｄ．ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の具体的な実施形態
特定の実施形態では、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物は、以下の式：
（Ｔｈ）ｍ−（Ａ）ｎ−（ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片）−Ｘ
または
（ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片）−（Ａ）ｎ−（Ｔｈ）ｍ−Ｘ
または
（Ｔｈ）ｍ−（Ａ）ｎ−（ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片）−（Ａ）ｎ−（Ｔｈ）ｍ−Ｘ
［式中、
Ｔｈは異種Ｔヘルパーエピトープであり、
Ａは異種スペーサーであり、
（ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片）は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤからの約２０〜約４０アミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープであり、
Ｘはアミノ酸のα−ＣＯＯＨまたはα−ＣＯＮＨ２であり、
ｍは１〜約４であり、
ｎは０〜約１０である］で表すことができる。
【００８２】
特定の実施形態では、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物中の異種Ｔｈエピトープは、表２に示される配列番号５９〜８７及びその組合せのいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物は、１つより多いＴｈエピトープを含有する。
【００８３】
特定の実施形態では、任意選択の異種スペーサーは、Ｌｙｓ−、Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、（α，ε−Ｎ）Ｌｙｓ、ε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１２９）及びその組合せのいずれかから選択される。具体的な実施形態では、異種スペーサーはε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１２９）である。
【００８４】
特定の実施形態では、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片は配列番号１または２からの約２０〜約４０アミノ酸残基を有する。具体的な実施形態では、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片は、完全長ＩｇＥ  ＥＭＰＤ（配列番号１）の付番に従い、内因性システイン（Ｃ１８〜Ｃ３９）によって形成されるＩｇＥ  ＥＭＰＤの内部分子内ループからのアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態では、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片は、表１に示すように、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ−１−３９（配列番号５）、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ−７−４０（配列番号６）、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ−１９−３８（配列番号８）、またはＩｇＥ  ＥＭＰＤ−１−４０（配列番号９）のアミノ酸配列を有する。
【００８５】
特定の実施形態では、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物は、表３に示される配列番号８８〜１３０のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。具体的な実施形態では、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物は、配列番号８８〜９５、９８〜１２４、及び１３０のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。
【００８６】
ｅ．変異体、相同体、及び機能性類縁体
ＩｇＥ  ＥＭＰＤタンパク質の望ましいエピトープに対する抗体を誘導する及び／またはそれと交差反応する上記免疫原性ペプチドの変異体及び類縁体を使用することもできる。対立形質に関する、種に関する及び誘導される変異体を含めて類縁体は、しばしば保存的置換によって、１つ、２つまたはいくつかの位置において天然に存在するペプチドとは異なっているのが典型的である。類縁体は典型的には天然ペプチドとの少なくとも８０％または９０％の配列同一性を呈する。いくつかの類縁体は、１つ、２つまたはいくつかの位置に非天然アミノ酸またはＮもしくはＣ末端アミノ酸の改変も含む。
【００８７】
機能性類縁体である変異体は、アミノ酸位置での保存的置換；全体電荷の変更；別の部分との共有結合；またはアミノ酸の付加、挿入もしくは欠失；及び／またはその任意の組合せを有し得る。
【００８８】
保存的置換とは、１つのアミノ酸残基が、類似する化学的性質を有する別のアミノ酸残基の代わりに用いられている場合をいう。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが含まれ、極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが含まれ、正に帯電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれ、負に帯電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。
【００８９】
特定の実施形態では、機能性類縁体は、元のアミノ酸配列との少なくとも５０％の同一性を有する。別の実施形態では、機能性類縁体は、元のアミノ酸配列との少なくとも８０％の同一性を有する。さらに別の実施形態では、機能性類縁体は、元のアミノ酸配列との少なくとも８５％の同一性を有する。さらに別の実施形態では、機能性類縁体は、元のアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する。
【００９０】
変異体には、リン酸化された残基に対する変形形態も含まれる。例えば、変異体はリン酸化ペプチド内に異なる残基を含み得る。変異体である免疫原性ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチドには、偽リン酸化ペプチドも含まれ得る。偽リン酸化ペプチドは、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチドのリン酸化されたセリン、スレオニン及びチロシン残基のうちの１つ以上を酸性アミノ酸残基、例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸で置き換えることによって生成する。
【００９１】
組成物
本開示はさらに、本開示のＩｇＥ  ＥＭＰＤ免疫原構築物を含む組成物を提供する。
【００９２】
ａ．ペプチド組成物
本開示のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を含有する組成物は、液体または固体の形態であり得る。液体組成物は、水、緩衝剤、溶媒、塩及び／またはＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の構造的もしくは機能的特性を変化させない他の任意の許容される試薬を含み得る。ペプチド組成物は、本開示のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の１つ以上を含有し得る。
【００９３】
ｂ．医薬組成物
本開示はさらに、本開示のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物に関する。
【００９４】
医薬組成物は、薬学的に許容される送達システムの中に担体及び／または他の添加物を含有し得る。したがって、医薬組成物は、薬学的有効量のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物と共に、薬学的に許容される担体、アジュバント及び／または他の賦形剤、例えば、希釈剤、添加剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤などを含有し得る。
【００９５】
医薬組成物は、何ら特異的抗原作用を自ら有することなくＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物に対する免疫応答を加速させる、延長するまたは増強させるように作用する１つ以上のアジュバントを含有し得る。医薬組成物に使用されるアジュバントには、油、油エマルション、アルミニウム塩、カルシウム塩、免疫刺激性複合体、細菌派生体及びウイルス派生体、ビロソーム、炭水化物、サイトカイン、ポリマー微粒子が含まれ得る。特定の実施形態では、アジュバントは、ミョウバン（リン酸アルミニウムカリウム）、リン酸アルミニウム（例えば、ＡＤＪＵ−ＰＨＯＳ（登録商標））、水酸化アルミニウム（例えばＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標））、リン酸カルシウム、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、フロイント完全アジュバント、ＭＦ５９、アジュバント６５、Ｌｉｐｏｖａｎｔ、ＩＳＣＯＭ、リポシン、サポニン、スクアレン、Ｌ１２１、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＱＳ２１、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（登録商標）ＩＳＡ３５、ＩＳＡ５０Ｖ、ＩＳＡ５０Ｖ２、ＩＳＡ５１、ＩＳＡ２０６、ＩＳＡ７２０、リポソーム、リン脂質、ペプチドグリカン、リポ多糖（ＬＰＳ）、ＡＳＯ１、ＡＳＯ２、ＡＳＯ３、ＡＳＯ４、ＡＦ０３、親油性リン脂質（リピドＡ）、ガンマイヌリン、アルガムリン、グルカン、デキストラン、グルコマンノン、ガラクトマンナン、レバン、キシラン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）ならびにその他のアジュバント及び乳化剤から選択され得る。
【００９６】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ５１（油中水エマルションの製造のための植物油及びモノオレイン酸マンニドからなる油系アジュバント組成物）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（ポリソルベート８０またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートとしても知られる）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド及び／またはその任意の組合せを含有する。他の実施形態では、医薬組成物は、ＥｍｕｌｓｉｇｅｎまたはＥｍｕｌｓｉｇｅｎ  Ｄをアジュバントとする水中油中水型（すなわちｗ／ｏ／ｗ）エマルションである。
【００９７】
医薬組成物は、薬学的に許容される添加剤または賦形剤を含むこともある。例えば、医薬組成物は、酸化防止剤、結合剤、緩衝剤、増量剤、担体、キレート剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、フィラー、ゲル化剤、ｐＨ緩衝剤、保存剤、可溶化剤、安定化剤などを含有し得る。
【００９８】
医薬組成物は、即放性または持続放出性製剤として製剤化され得る。加えて、医薬組成物は、免疫原捕捉及び微粒子との共投与によって全身の、または局所粘膜の免疫性を誘導するために製剤化され得る。そのような送達システムは当業者によって容易に決定される。
【００９９】
医薬組成物は、液体溶液か懸濁液かのどちらかとしての注射剤として調製され得る。ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を含有する液体ビヒクルを注射前に調製することもできる。医薬組成物は、任意の好適な適用様式、例えば、ｉ．ｄ．、ｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、鼻腔内、経口、皮下などで、及び任意の好適な送達装置で投与され得る。特定の実施形態では、医薬組成物は、静脈内、皮下、皮内または筋肉内投与のために製剤化される。経口及び鼻腔内適用を含めた他の投与様式に適した医薬組成物を調製することもできる。
【０１００】
医薬組成物はまた、好適な単位剤形で製剤化され得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、体重１ｋｇあたり約０．１μｇ〜約１ｍｇのＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を含有する。医薬組成物の有効量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるのかまたは動物であるのか、投与される他の医薬、及び治療が予防的であるのかまたは治療的であるのかを含めた多種多様な因子によって様々である。通常、患者はヒトであるが、遺伝子導入哺乳動物を含めた非ヒト哺乳動物を治療することもできる。医薬組成物は、多回用量で送達される場合、便宜的に単位剤形ごとに適切な量に分割されてもよい。投与する投薬量は、治療分野でよく知られているように対象の年齢、体重及び全身の健康によって決まるであろう。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は１つより多いＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を含有する。１つより多いＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の混合物を含有する医薬組成物は、構築物の免疫効果の相乗的増強を可能にする。１つより多いＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物は、ＭＨＣクラスＩＩ対象範囲が広いのでより大きな遺伝的個体群においてより有効であり得、したがってＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物に対する免疫応答の改善をもたらすことができる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、配列番号８８〜９５、９８〜１２４、及び１３０（表３）ならびにその相同体、類縁体及び／または組合せから選択されるＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を含有する。
【０１０３】
特定の実施形態では、ＭＶＦ及びＨＢｓＡｇに由来する混成形態の異種Ｔｈエピトープ（配列番号６８及び６９）を有するＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物（配列番号１０７及び１０８）を、等モル比で混合し、ワクチン製剤に使用することで、多様な遺伝的背景をもつワクチン宿主集団に対象範囲を最大化することができる。本発明のペプチド組成物にＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｇ１−Ｃ３９及びＡ７−Ｃ４０免疫原構築物（配列番号８８〜９５）の相乗的増強が観察され、そのような構築物（例えば、配列番号９５）によって誘発される抗体反応は、大部分（９０％超）がＩｇＥ  ＥＭＰＤのＢ細胞エピトープペプチド（配列番号２）に対する望ましい交差反応に集中しており、免疫原性増強のために採用される異種Ｔｈエピトープを指向することがあったとしてもほとんどない（実施例７、表７）。このことは、そのようなペプチド抗原性増強のために使用されるＫＬＨなどの従来のタンパク質または他の生物学的担体とは極めて対照的である。
【０１０４】
他の実施形態では、例えば、アジュバントとしてミョウバンゲル（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ）またはリン酸アルミニウム（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）を含めた無機塩と接触させ、懸濁ワクチン製剤を形成した、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の混合物であるペプチド組成物を含む医薬組成物をワクチン宿主への投与に使用した。
【０１０５】
ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物は、投与時に宿主において免疫応答を誘発し、抗体を生成するために使用することができる。
【０１０６】
ｃ．免疫刺激性複合体
本開示はさらに、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物をＣｐＧオリゴヌクレオチドとの免疫刺激性複合体の形態で含有する医薬組成物に関する。そのような免疫刺激性複合体は、アジュバントとして及びペプチド免疫原安定化剤として作用するのに特に適合している。免疫刺激性複合体は微粒子の形態にあり、これがＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原を免疫系の細胞に効率的に提示して免疫応答を生むことができる。免疫刺激性複合体を非経口投与のための懸濁液として製剤化してもよい。また、非経口投与後に宿主の免疫系の細胞へＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原を効率的に送達するために、免疫刺激性複合体を、無機塩または系中でゲル化するポリマーと組み合わせた懸濁液としてのｗ／ｏエマルジョンの形態で製剤化してもよい。
【０１０７】
ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物と、アニオン性分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはその組合せとを静電会合によって複合化させることによって、安定化免疫刺激性複合体を形成することができる。安定化免疫刺激性複合体を免疫原送達システムとしての医薬組成物の中に組み込んでもよい。
【０１０８】
特定の実施形態では、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物は、５．０〜８．０の範囲のｐＨにおいて正に帯電しているカチオン性部分を含有するように設計される。ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物または構築物の混合物のカチオン性部分の正味の電荷は、配列内でリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）の各々に電荷ａ＋１を割り当て、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）に電荷ａ−１を割り当て、他のアミノ酸に０の電荷を割り当てることによって算出される。電荷をＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物のカチオン性部分の中で加算し、正味の平均電荷として表す。好適なペプチド免疫原は、正味の平均正電荷が＋１であるカチオン性部分を有する。好ましくは、ペプチド免疫原は＋２よりも大きい範囲の正味の正電荷を有する。いくつかの実施形態では、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物のカチオン性部分は異種スペーサーである。特定の実施形態では、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物のカチオン性部分は、スペーサー配列が（α，ε−Ｎ）Ｌｙｓ、ε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１２９）である場合に＋４の電荷を有する。
【０１０９】
本明細書に記載の「アニオン性分子」は、５．０〜８．０の範囲のｐＨにおいて負に帯電している任意の分子を指す。特定の実施形態では、アニオン性分子はオリゴマーまたはポリマーである。オリゴマー上またはポリマー上の正味の負電荷は、オリゴマー中のホスホジエステルまたはホスホロチオエート基の各々に電荷ａ−１を割り当てることによって算出される。好適なアニオン性オリゴヌクレオチドは、８〜６４ヌクレオチド塩基を有する一本鎖ＤＮＡ分子であり、ＣｐＧモチーフの繰り返し回数が１〜１０の範囲である。好ましくは、ＣｐＧ免疫刺激性一本鎖ＤＮＡ分子は１８〜４８ヌクレオチド塩基を含有し、ＣｐＧモチーフの繰り返し回数が３〜８の範囲である。
【０１１０】
より好ましくは、アニオン性オリゴヌクレオチドは式：５’Ｘ１ＣＧＸ２３’で表され、式中、Ｃ及びＧはメチル化されておらず、Ｘ１は、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）及びＴ（チミン）からなる群から選択され、Ｘ２はＣ（シトシン）またはＴ（チミン）である。あるいは、アニオン性オリゴヌクレオチドは式：５’（Ｘ３）２ＣＧ（Ｘ４）２３’で表され、式中、Ｃ及びＧはメチル化されておらず、Ｘ３は、Ａ、ＴまたはＧからなる群から選択され、Ｘ４はＣまたはＴである。
【０１１１】
得られる免疫刺激性複合体は、大きさが典型的には１〜５０ミクロンの範囲である粒子の形態にあり、相対電荷化学量論及び相互作用種の分子量を含めた多くの因子の関数である。微粒子化された免疫刺激性複合体は、生体内での特異的免疫応答のアジュバント化及び上方制御をもたらすという利点を有する。加えて、安定化免疫刺激性複合体は、油中水エマルション、無機塩懸濁液及びポリマーゲルを含めて様々なプロセスで医薬組成物を調製するのに適している。
【０１１２】
本開示はさらに、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患の治療及び予防のための、ワクチン製剤を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、ＣｐＧオリゴマーと、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物（例えば、配列番号８８〜９５、９８〜１２４、及び１３０）の混合物を含有するペプチド組成物とを混合することで静電会合によって形成された安定化免疫刺激性複合体を含む医薬組成物は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原性をさらに増強し、配列番号１または２のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチドに対する抗体を誘発して、ｍＩｇＥを発現するＢ細胞に結合し、それらの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及びアポトーシスを誘導する（実施例６）。
【０１１３】
さらに他の実施形態では、医薬組成物は、任意選択的に、ワクチン宿主への投与用に安全性要素の高いアジュバントとしてミョウバンゲル（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ）またはリン酸アルミニウム（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）を含めた無機塩と混合し、懸濁ワクチン製剤を形成した、ＣｐＧオリゴマーとの安定化免疫刺激性複合体形態であるＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の混合物（例えば、配列番号８〜９０、９４、９５、９８〜１２４、及び１３０の任意の組合せ）を含有する。
【０１１４】
抗体
本開示はさらに、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物によって誘発される抗体を提供する。
【０１１５】
本開示は、ワクチン接種宿主におけるレスポンダー率が高く、自己抗原に対する免疫寛容を破壊できる膜結合型ＩｇＥを標的とする高力価抗体を誘発可能である、設計が最適で、製造における費用効果が高いＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物及びその製剤を提供する。ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物によって生成される抗体は、可溶性ペプチド、融合タンパク質、またはＩｇＥを保持するＢ細胞に存在するＩｇＥのいずれかであるＩｇＥ−ＥＭＰＤタンパク質に対して高親和性を有する。生成された抗体は、ｍＩｇＥを発現するＢリンパ球上のＩｇＥ  ＢＣＲに結合し、架橋させ、アポトーシス及びＡＤＣＣなどの細胞溶解効果を誘導することができる。膜結合型ＩｇＥ  Ｂリンパ球のアポトーシス減少により、血清ＩｇＥの生成がさらに低下する。したがって、本開示のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物及びその製剤によって生成されるアポトーシス誘導ＩｇＥ  ＥＭＰＤ特異性抗体によるヒトｍＩｇＥ  Ｂ細胞の標的化は、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患に対する新規治療及びワクチンを提供する。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、抗体を誘発するためのＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物は、麻疹ウイルス融合（ＭＶＦ）タンパク質（配列番号７３）及びその他（配列番号５９〜８７）などの病原性タンパク質に由来する異種Ｔｈエピトープに任意選択のスペーサーによって結合された、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド（配列番号１）に由来する中央分子内ループ構造を対象範囲とする２０〜４０のアミノ酸を含有するＢ細胞エピトープをもつＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド（例えば、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｇ１−Ｃ３９（配列番号５）、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ａ７−Ｈ４０（配列番号６）、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｈ１９−Ｒ３８（配列番号８）、及びＩｇＥ  ＥＭＰＤのＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｇ１−Ｈ４０（配列番号９）のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド）のハイブリットを含む。ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物のＢ細胞エピトープとＴｈエピトープは共に作用して、組換えＩｇＥ  ＥＭＰＤ含有タンパク質（例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分とヒト膜結合型ＩｇＥのＩｇＥ  ＥＭＰＤ、γ１−ｅｍ６７をコードする組換えＤＮＡをトランスフェクトした安定Ｆｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞株から精製）として、または膜結合型ＩｇＥを保持する細胞の膜（例えば、ｍＩｇＥ．ＦｃＬをコードする組換えＤＮＡをトランスフェクトしたＲａｍｏｓ細胞株）のいずれかで、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−５２（配列番号２）、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−６７タンパク質（配列番号１）と交差反応性である高特異性抗体の生成を刺激する。
【０１１７】
例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの担体タンパク質、またはジフテリアトキソイド（ＤＴ）及び破傷風トキソイド（ＴＴ）タンパク質などの他の担体タンパク質への化学結合など、ペプチドを免疫増強する従来の方法では、通常、担体タンパク質を指向する大量の抗体を生成させる。したがって、そのようなペプチド−担体タンパク質ワクチンの主な欠陥は、免疫原によって生成される抗体の大半（９０％超）が、担体タンパク質ＫＬＨ、ＤＴ、またはＴＴを指向する非機能性抗体であり、エピトープ抑制を引き起こし得ることである。
【０１１８】
ペプチドを免疫増強する従来の方法とは異なり、本開示のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物によって生成される抗体は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片に高特異性で結合し、異種Ｔｈエピトープまたは任意選択の異種スペーサーを指向する抗体があったとしてもほとんどない。特に、ワクチン接種動物において誘発されるポリクローナル抗体は、図９に示すように、ＩｇＥ  ＥＭＰＤのループ構造を対象範囲とする中央領域に高特異性で結合する。
【０１１９】
方法
本開示はまた、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物、組成物及び医薬組成物を製造及び使用する方法に関する。
【０１２０】
ａ．ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を製造する方法
本開示のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物は、当業者によく知られている化学合成法によって作ることができる（例えば、Fields et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User’s Guide, ed. Grant, W. H. Freeman &Co., New York, NY, 1992, p.77を参照されたい）。ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓペプチド合成装置モデル４３０Ａまたは４３１において側鎖保護アミノ酸を使用して、ｔ−ＢｏｃかＦ−ｍｏｃかのどちらかの化学で保護されたα−ＮＨ２による固相合成の自動Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ技術を用いて合成され得る。Ｔｈエピトープのためのコンビナトリアルライブラリーペプチドを含むＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の調製は、所与の可変位置での結合のための代替アミノ酸の混合物を提供することによって成し遂げられ得る。
【０１２１】
所望のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の完全な組立て後に、樹脂からペプチドを切り離すための標準的手順に従って樹脂を処理することができ、アミノ酸側鎖上の官能基をデブロッキングすることができる。遊離ペプチドをＨＰＬＣで精製することができ、生化学的に、例えばアミノ酸分析または配列決定によって、特性評価することができる。ペプチドのための精製及び特性評価の方法は当業者によく知られている。
【０１２２】
この化学プロセスによって生成するペプチドの質を制御及び規定することができ、その結果、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の再現性、免疫原性及び収率を保証することができる。固相ペプチド合成によるＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の製造についての詳細な説明は実施例１に示される。
【０１２３】
意図する免疫学的活性の保持を可能にする構造可変性の範囲は、低分子薬による特異的薬物活性、または生物由来薬物と共に生成する大型分子に認められる所望の活性及び不要な毒性の保持のために許容される構造可変性の範囲よりもはるかに順応性があることが見出された。それゆえ、ペプチド類縁体は、意図的に設計されたものであっても、合成プロセスの誤りによって意図したペプチドに類似するクロマトグラフィー上及び免疫学上の特性を有する欠失配列副生成物の混合物として不可避的に生成したものであっても、所望のペプチドの精製された調製物と同じくらい有効であることが多い。設計された類縁体及び意図しない類縁体混合物は、これらのペプチドを採用する最終製品の再現性及び有効性を保証すべく製造プロセスと生成物評価プロセスとの両方を監視するために鑑識的品質管理手順が展開される限りにおいて、有効である。
【０１２４】
核酸分子、ベクター及び／または宿主細胞を含む組換えＤＮＡ技術を用いてＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を作ることもできる。したがって、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物及びその免疫学的機能性類縁体をコードする核酸分子も本発明の一部として本開示に包含される。同様に、核酸分子を含んでいる発現ベクターを含めたベクター、及びベクターを含有する宿主細胞も本発明の一部として本開示に包含される。
【０１２５】
様々な例示的実施形態は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物及びその免疫学的機能性類縁体を製造する方法も包含する。例えば、方法は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物及び／またはその免疫学的機能性類縁体をコードする核酸分子を含有する発現ベクターを含有する宿主細胞を、ペプチド及び／または類縁体が発現する条件の下でインキュベートするステップを含み得る。より長い合成ペプチド免疫原をよく知られている組換えＤＮＡ技術で合成することができる。そのような技術は、よく知られている標準的マニュアルに詳細なプロトコールと共に示されている。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するには、アミノ酸配列を逆翻訳して、好ましくは遺伝子を発現させる生物に最適なコドンを有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を得る。次に、合成遺伝子を、典型的にはペプチド及び必要に応じた任意の調節エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって作る。合成遺伝子を好適なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞にトランスフェクトする。その後、選択された発現システム及び宿主に適した好適な条件の下でペプチドを発現させる。ペプチドは、精製され、標準的方法で特徴づけられる。
【０１２６】
ｂ．免疫刺激性複合体を製造する方法
様々な例示的実施形態は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物とＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）分子とを含んでいる免疫刺激性複合体を製造する方法も包含する。安定化免疫刺激性複合体（ＩＳＣ）は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物のカチオン性部分とポリアニオン性ＣｐＧ  ＯＤＮ分子とに由来する。自己組織化システムは電荷の静電中和によって推し進められる。アニオン性オリゴマーに対するＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物のカチオン性部分の分子電荷比率の化学量論によって会合の程度が決まる。ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物とＣｐＧ  ＯＤＮとの非共有結合性静電会合は完全に再現可能なプロセスである。ペプチド／ＣｐＧ  ＯＤＮ免疫刺激性複合体は凝集するが、これが免疫系の「プロフェッショナル」抗原提示細胞（ＡＰＣ）への提示を促し、かくして複合体の免疫原性がさらに増強される。これらの複合体は、製造中の品質管理のために特徴づけするのが簡単である。ペプチド／ＣｐＧ  ＩＳＣは生体内で十分に許容される。ＣｐＧ  ＯＤＮとＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片由来のペプチド免疫原構築物とを含むこの新規微粒子システムは、ＣｐＧ  ＯＤＮ使用に関連する全般的なＢ細胞分裂促進性を活用しながらも均衡のとれたＴｈ−１／Ｔｈ−２型応答を増進するように設計された。
【０１２７】
本開示の医薬組成物の中のＣｐＧ  ＯＤＮは、相反する電荷の静電中和によって媒介されるプロセスにおいて免疫原に１００％結合してミクロンサイズの微粒子を形成している。微粒子形態は、ＣｐＧ投薬量を従来のＣｐＧアジュバント使用と比較して著しく低減し、有害な自然免疫応答の可能性をより低くし、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む代替の免疫原プロセシング経路を促進する。結果としてそのような製剤は概念上新規なものであり、代替機序による免疫応答の刺激を促進することによる潜在的利点を提供する。
【０１２８】
ｃ．医薬組成物を製造する方法
様々な例示的実施形態は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物も包含する。特定の実施形態では、医薬組成物は、油中水エマルション及び無機塩との懸濁を使用する。
【０１２９】
ＩｇＥ  ＥＭＰＤ凝集の防止も投与のための目標の一部としながら医薬組成物を大きな個体群によって使用されるものにするためには、安全性はもう１つの考慮すべき重要な因子となる。臨床試験中の多くの製剤のためにヒトにおいて油中水エマルションが使用されているとはいえ、ミョウバンはその安全性ゆえに製剤に使用するための主要なアジュバントであり続けている。それゆえ、ミョウバン及びその無機塩であるリン酸アルミニウム（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）は臨床応用のための配合物においてアジュバントとして頻繁に使用される。
【０１３０】
他のアジュバント及び免疫刺激剤としては、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−ＤＭＰ、多量体型または単量体型アミノ酸、例えばポリグルタミン酸またはポリリジンが挙げられる。そのようなアジュバントは、他の特異的免疫刺激剤、例えばムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標）または他の細菌細胞壁成分と共に使用することもできるし、またはそれなしで使用することもできる。水中油エマルションとしては、５％のスクアレンと０．５％のＴｗｅｅｎ８０と０．５％のＳｐａｎ８５とを含有し（場合によって様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含有し）マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に製剤化したものであるＭＦ５９（Ｖａｎ  Ｎｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．のＷＯ９０／１４８３７を参照されたく、これをもって参照によりその全体を援用する）；１０％のスクアレンと０．４％のＴｗｅｅｎ８０と５％のプルロニックブロックポリマーＬ１２１とｔｈｒ−ＭＤＰとを含有しサブミクロンのエマルションに微小流体化したかあるいはボルテックスに掛けてより大きな粒径のエマルションを生成したものであるＳＡＦ；及び２％のスクアレンと０．２％のＴｗｅｅｎ８０と、モノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコラート（ＴＤＭ）及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群から選択される１つ以上の細菌細胞壁成分とを含有する、Ｒｉｂｉ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）が挙げられる。他のアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）ならびにサイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２及びＩＬ−１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられる。
【０１３１】
アジュバントの選択は、アジュバントを含有する免疫原性製剤の安定性、投与経路、投薬スケジュール、ワクチン接種する種におけるアジュバントの有効性によって決まり、ヒトにおいて薬学的に許容されるアジュバントは、関係する規制機関によってヒトへの投与が承認されているまたは承認されるものである。例えば、ミョウバン、ＭＰＬまたは不完全フロイントアジュバント（Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32: 173-186 (1998)、これをもって参照によりその全体を援用する）は、単独で、または場合によってそのあらゆる組合せがヒト投与に適している。
【０１３２】
組成物は、動物またはヒトへの投与のための医薬組成物を製剤化するために一般的に使用されるビヒクルとして定義される薬学的に許容される無毒性の担体または希釈剤を含み得る。希釈剤は、合剤の生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理リン酸緩衝食塩水、リンガー液、デキストロース溶液及びハンクス液である。加えて、医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または無毒性の非治療的非免疫原性安定化剤などをさらに含んでもよい。
【０１３３】
医薬組成物はさらに、大きなゆっくりと代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、キトサンのような多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸及びコポリマー（例えば、ラテックス官能化セファロース、アガロース、セルロースなど）、多量体型アミノ酸、アミノ酸コポリマー、ならびに脂質凝集物（例えば油滴またはリポソーム）を含み得る。加えて、これらの担体は免疫刺激剤（すなわちアジュバント）として機能し得る。
【０１３４】
本発明の医薬組成物はさらに、好適な送達ビヒクルを含み得る。好適な送達ビヒクルとしては、限定されないが、ウイルス、細菌、生分解性微小球、微粒子、ナノ粒子、リポソーム、コラーゲン、ミニペレット及び渦巻体（cochleates）が挙げられる。
【０１３５】
ｄ．医薬組成物を使用する方法
本開示には、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物を使用する方法も含まれる。
【０１３６】
特定の実施形態では、薬物アレルギー、食物アレルギー、及び昆虫アレルギー、アレルギー性鼻炎（花粉症）、アトピー性皮膚炎、アレルギー性喘息、結膜炎、湿疹、蕁麻疹（発疹）、ならびにアナフィラキシーを含むが、それに限定されるわけではない免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）媒介型アレルギー性疾患の治療及び／または予防のために、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物を使用することができる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本方法は、薬理学的有効量のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を含む医薬組成物を、それを必要とする宿主に投与することを含む。特定の実施形態では、本方法は、薬理学的有効量のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を含む医薬組成物を、温血動物（例えば、ヒト、カニクイザル、マウス）に投与し、組換えＩｇＥ  ＥＭＰＤ含有タンパク質（例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分とヒト膜結合型ＩｇＥのＩｇＥ  ＥＭＰＤ、γ１−ｅｍ６７をコードする組換えＤＮＡをトランスフェクトした安定Ｆｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞株から精製）として、または膜結合型ＩｇＥを保持する細胞の膜（例えば、ｍＩｇＥ．ＦｃＬをコードする組換えＤＮＡをトランスフェクトしたＲａｍｏｓ細胞株）のいずれかで、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−５２ペプチド（配列番号２）、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ  １−６７タンパク質（配列番号１）と交差反応性である高特異性抗体を誘発することを含む。
【０１３８】
特定の実施形態では、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物を使用して、ＩｇＥ  ＥＭＰＤを指向する抗体を誘発することにより、ＩｇＥ媒介型疾患を治療及び／または予防することができる。このような抗体は、（ａ）ｍＩｇＥを発現するＢ細胞に結合し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及びアポトーシスを誘導する；（ｂ）ｉｎ  ｖｉｖｏで血液中のＩｇＥ基礎レベルを低下させる；（ｃ）ｉｎ  ｖｉｖｏで血液中の抗原特異的ＩｇＥレベルを低下させる；及び（ｄ）ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患に罹患している患者におけるＩｇＥ媒介型アレルギー性病理を緩和または排除することができる。
【０１３９】
ｅ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイ及びｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の概念実証試験
ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物によって生成される抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイに使用することができる。このような機能アッセイとして、以下が挙げられるが、それに限定されるわけではない：
（ａ）ｍＩｇＥ．ＦｃＬを発現するＣＨＯ細胞から精製した組換えタンパク質としてのＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−５２ペプチド（配列番号１）へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合（実施例３）；
（ｂ）ＩｇＥ．ＦｃＬをコードする組換えＤＮＡをトランスフェクトしたＢ細胞株Ｒａｍｏｓ由来の膜結合型ＩｇＥを保持する細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合（実施例３）；
（ｃ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）（実施例６）；
（ｄ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ＩｇＥを保持するＢリンパ球のアポトーシスの誘導（実施例６）；
（ｅ）ワクチン接種宿主の血液中のＩｇＥ基礎レベルが低下を示すことによる有効性のｉｎ  ｖｉｖｏ実証（実施例８〜１０）；
（ｆ）アレルゲンの攻撃接種による初回免疫及び追加免疫時に抗原特異的ＩｇＥレベルが低下を示すことによる有効性のｉｎ  ｖｉｖｏ実証（実施例８〜１０）。
【０１４０】
本開示により、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物及びその製剤は、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患に罹患している患者におけるＩｇＥ媒介型アレルギー性病理を緩和または排除するワクチンとして効果的に機能することができる。
【０１４１】
具体的な実施形態
（１）式：
（Ｔｈ）ｍ−（Ａ）ｎ−（ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片）−Ｘ
または
（ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片）−（Ａ）ｎ−（Ｔｈ）ｍ−Ｘ
または
（Ｔｈ）ｍ−（Ａ）ｎ−（ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片）−（Ａ）ｎ−（Ｔｈ）ｍ−Ｘ
［式中、
Ｔｈは異種Ｔヘルパーエピトープであり、
Ａは異種スペーサーであり、
（ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片）は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤの中央分子内ループからの約２０〜約４０アミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープであり、
Ｘはアミノ酸のα−ＣＯＯＨまたはα−ＣＯＮＨ２であり、
ｍは１〜約４であり、
ｎは０〜約１０である］で表される、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物。
【０１４２】
（２）前記ＩｇＥ  ＥＭＰＤ断片が、配列番号５、６、８、及び９からなる群から選択される、（１）に記載のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物。
【０１４３】
（３）前記Ｔｈエピトープが、配列番号５９〜８７からなる群から選択される、（１）または（２）のいずれかに記載のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物。
【０１４４】
（４）前記ペプチド免疫原構築物が、配列番号８８〜９５、９８〜１２４、及び１３０からなる群から選択される、（１）に記載のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物。
【０１４５】
（５）
配列番号１または配列番号２のＩｇＥ  ＥＭＰＤ配列からの約２０〜約４０アミノ酸残基を含むＢ細胞エピトープ、
配列番号５９〜８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴヘルパーエピトープ、ならびに
アミノ酸Ｌｙｓ−、Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、（α，ε−Ｎ）Ｌｙｓ、及びε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１２９）からなる群から選択される任意選択の異種スペーサーを含む、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物であって、
前記Ｂ細胞エピトープが直接、または前記任意選択の異種スペーサーによって、前記Ｔヘルパーエピトープに共有結合している、前記ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物。
【０１４６】
（６）前記Ｂ細胞エピトープが、配列番号５、６、８、及び９からなる群から選択される、（５）に記載のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物。
【０１４７】
（７）前記Ｔヘルパーエピトープが、配列番号５９〜８７からなる群から選択される、（５）に記載のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物。
【０１４８】
（８）前記任意選択の異種スペーサーが、（α，ε−Ｎ）Ｌｙｓ、またはε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１２９）である、（５）に記載のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物。
【０１４９】
（９）前記Ｔヘルパーエピトープが前記Ｂ細胞エピトープのアミノ末端に共有結合している、（５）に記載のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物。
【０１５０】
（１０）前記Ｔヘルパーエピトープが前記任意選択の異種スペーサーによって前記Ｂ細胞エピトープのアミノ末端に共有結合している、（５）に記載のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物。
【０１５１】
（１１）（１）〜（１０）のいずれかに記載のペプチド免疫原構築物を含む組成物。
【０１５２】
（１２）ａ．（１）〜（１０）のいずれかに記載のペプチド免疫原構築物と、
ｂ．薬学的に許容される送達ビヒクル及び／またはアジュバントと、を含む、医薬組成物。
【０１５３】
（１３）ａ．前記ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物が、配列番号８８〜９５、９８〜１２４、及び１３０からなる群から選択され、
ｂ．前記ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物が、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合されて安定化免疫刺激性複合体を形成している、（１２）に記載の医薬組成物。
【０１５４】
（１４）（１）〜（１０）のいずれかに記載のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の前記Ｂ細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片。
【０１５５】
（１５）前記ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物に結合している、（１４）に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片。
【０１５６】
（１６）（１）〜（１０）のいずれかに記載のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の前記Ｂ細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片。
【０１５７】
（１７）（１４）〜（１６）のいずれかに記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片を含む、組成物。
【０１５８】
使用される手順の詳細な説明を、以下の実施例に示す。以下の実施例は、本発明を例示するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するために利用されるべきではない。
【実施例】
【０１５９】
実施例１
ＩｇＥ  ＥＭＰＤ関連ペプチドの合成及びその製剤の調製
ａ．ＩｇＥ  ＥＭＰＤ関連ペプチドの合成
ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の開発成果に含まれる、デザイナーＩｇＥ  ＥＭＰＤ関連ペプチドの合成方法について記載する。血清学アッセイ、実験室試験研究及び現場研究に有用な小スケール量、ならびに医薬組成物の工業／商業生産に有用な大スケール（キログラム）量でペプチドを合成した。有効なＩｇＥ系アレルギーワクチンの使用に最適なペプチド構築物のスクリーニング及び選択のために、長さ約２０〜約７０アミノ酸の配列を有する広いレパートリーのＩｇＥ  ＥＭＰＤ関連抗原性ペプチドを設計した。
【０１６０】
様々な血清学アッセイにおいてエピトープマッピングのために採用した代表的な完全長ＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−６７（配列番号１）、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−５２（配列番号２）、ならびにＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−１７（配列番号７）、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ１９−３８（配列番号８）、及び種々の１０−ｍｅｒペプチド（配列番号１０〜５８）を含むＩｇＥ  ＥＭＰＤセグメントを表１に示す（配列番号１〜５８）。
【０１６１】
選択されたＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｂ細胞エピトープペプチドを、表２（配列番号５９〜８７）で特定される麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ）、Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質（ＨＢｓＡｇ）インフルエンザ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、及びＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスを含む病原体タンパク質に由来する注意深く設計されたヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープに合成的に結合することによってＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を作製した。Ｔｈエピトープを単一配列（配列番号５９〜６７及び７２〜８７）かコンビナトリアルライブラリー（配列番号６８〜７１）かのどちらかに使用してそれらの各々のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の免疫原性を増強した。
【０１６２】
１００超のペプチド構築物から選択された代表的なＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物は表３で特定される（配列番号８８〜１２４及び１３０）。
【０１６３】
抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体の検出及び／または測定のための免疫原性試験または関連する血清学検査のために使用されるペプチドはすべて、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌｓ  ４３０Ａ、４３１及び／または４３３のペプチド合成装置によってＦ−ｍｏｃ化学を用いて小スケールで合成した。各ペプチドは独立した合成によって固相担体上で、Ｎ末端のＦ−ｍｏｃ保護及び三官能性アミノ酸の側鎖保護基を有して製造した。完成したペプチドを固体担体から切り離し、側鎖保護基を９０％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で除去した。合成ペプチド調製物をマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析で評価して、アミノ酸が正しく含まれていることを確認した。各合成ペプチドを逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）でも評価して合成プロファイル及び調製物の濃度を確認した。合成プロセスの厳密な制御（カップリング効率のステップごとの追跡を含む）にもかかわらず、アミノ酸の挿入、欠失、置換及び中途停止を含めた伸長サイクル中の意図しない事象のためにペプチド類縁体も生成した。このため、合成された調製物は典型的には目的とするペプチドと一緒に複数のペプチド類縁体を含んでいた。
【０１６４】
そのような意図しないペプチド類縁体を含んでいるにもかかわらず、得られる合成されたペプチド調製物はなおも、免疫診断（抗体捕捉抗原として）及び医薬組成物（ペプチド免疫原として）を含めた免疫学的用途における使用に適していた。典型的にはそのようなペプチド類縁体は、意図的に設計されたものであっても、副生成物の混合物として合成プロセスによって生成したものであっても、これらのペプチドを採用する最終製品の再現性及び有効性を保証すべく製造プロセスと生成物評価プロセスとの両方を監視するために鑑識的品質管理手順が展開される限りにおいて、所望のペプチドの精製された調製物と同じくらい有効であることが多い。数百〜数千グラム量での大スケールペプチド合成を、カスタマイズされた自動ペプチド合成装置ＵＢＩ２００３などで１５〜５０ミリモルスケールで行った。
【０１６５】
活性成分を臨床試験のための最終医薬組成物に使用するために、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ関連ペプチド構築物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって浅い溶離勾配の下で精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、アミノ酸分析及びＲＰ−ＨＰＬＣによって純度及び同一性に関して特性評価した。
【０１６６】
ｂ．ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を含有する組成物の調製
油中水型エマルション及び無機塩との懸濁液を採用する製剤を調製した。大規模集団によって使用され、かつ予防も投与の目的の一部である医薬組成物を設計するには、安全性も考慮すべき重要な要素になる。臨床試験では医薬組成物の多くで油中水型エマルションをヒトに使用しているが、未だ安全性の理由からミョウバンが医薬組成物で使用される主要アジュバントである。したがって、臨床用途向け調製において、アジュバントとしてミョウバンまたはその無機塩ＡＤＪＵＰＨＯＳ（リン酸アルミニウム）が頻繁に使用される。
【０１６７】
簡潔には、以下に記載する各試験群で指定されている製剤は一般に、全種類のデザイナーＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を含有していた。１００超のデザイナーＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を最初にモルモットで、免疫原のＢ細胞エピトープペプチドを表す対応するＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチドとの相対免疫原性について評価し、さらに配列番号１〜１２６のものから選択された異なるペプチドで被覆したプレートを用いたＥＬＩＳＡアッセイにより種々の相同ペプチド間の血清学的交差反応性の評価を行った。
【０１６８】
ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物は、指定したような可変量のペプチド構築物で、（ｉ）ヒト用途の承認済み油Ｓｅｐｐｉｃ  Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ  ５１との油中水型エマルションに調製するか、または（ｉｉ）無機塩ＡＤＪＵＰＨＯＳ（リン酸アルミニウム）またはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（ミョウバン）と混合して調製した。組成物は、典型的にはＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を約２０〜８００μｇ／ｍＬの水に溶解することにより調製し、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ  ５１を用いて油中水型エマルション（１：１体積）に製剤化するか、またはミネラル塩もしくはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（ミョウバン）（１：１体積）と製剤化した。組成物を室温で約３０分間維持し、免疫付与前にボルテックスで約１０〜１５秒間混合した。一部の動物を２〜３用量の特異的組成物で免疫付与した。これは、０週目（初回免疫）及び初回免疫後週数（ｗｐｉ）３（追加免疫）で投与し、任意選択的に５または６ｗｐｉに筋肉内経路で２回目の追加免疫を行った。次に、選択したＢ細胞エピトープペプチド（複数可）を用いて、これらの免疫された動物を試験し、製剤に存在する種々のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の免疫原性を評価し、加えて関連する標的ペプチドまたはタンパク質との交差反応性を評価した。次に、モルモットにおける初回スクリーニングで免疫原性が強力であったこれらのＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を、油中水型エマルション、無機塩及びミョウバン系製剤の両方で、霊長類において免疫付与プロトコールに示す指定期間にわたる投薬計画を実施してさらに試験した。
【０１６９】
最も有望なＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物のみをさらに広範に評価した後、最終製剤に組み込んで、ＩｇＥ媒介型疾患患者における治験薬の申請及び臨床試験に備え、ＧＬＰ基準前臨床試験の免疫原性試験、持続期間試験、毒性試験、及び有効性試験を行った。
【０１７０】
実施例２
血清学アッセイ及び試薬
合成ペプチド構築物及びその製剤の機能的免疫原性を評価するための血清学アッセイ及び試薬を以下に詳細に記載する。
【０１７１】
ａ．抗体特異性分析のための、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−５２、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−３９、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−１７、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ１９−３８、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ７−４０ペプチドに基づくＥＬＩＳＡ試験
以下の実施例に記載の免疫血清試料を評価するためのＥＬＩＳＡアッセイを開発した。これを以下で説明する。ｐＨ９．５の１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３緩衝液中（特に記載がない限り）２μｇ／ｍＬ（特に記載がない限り）の標的ペプチドＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−５２、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−３９、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−１７、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ１９−３８、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ７−４０など（例えば、配列番号２及び５〜８）１００μＬにより、９６ウェルプレートのウェルを３７℃で１時間、個別に被覆した。
【０１７２】
ペプチド被覆したウェルをＰＢＳ中３重量％のゼラチン２５０μＬと共に３７℃で１時間インキュベートして非特異的なタンパク質結合部位をブロッキングし、続いて０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し、乾燥させた。分析対象の血清を、２０体積％の標準ヤギ血清、１重量％のゼラチン、及び０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含有するＰＢＳで１：２０（特に記載のない限り）に希釈した。希釈した検体（例えば、血清、血漿）１００マイクロリットル（１００μＬ）を各ウェルに加え、３７℃で６０分間反応させた。次に、未結合抗体を除去するために、ＰＢＳ中０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０でウェルを６回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合種（例えば、マウス、モルモット、またはヒト）特異的ヤギ抗ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭを、陽性ウェルに形成された抗体／ペプチド抗原複合体と結合する標識トレーサーとして使用した。ＰＢＳ中０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含有する１体積％の標準ヤギ血清にて、事前に滴定した最適希釈でペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ＩｇＧ１００マイクロリットルを各ウェルに加え、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。ＰＢＳ中０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０でウェルを６回洗浄し、未結合抗体を除去して、クエン酸ナトリウム緩衝液中０．０４重量％の３´，３´，５´，５´−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と０．１２体積％の過酸化水素を含有する基質混合物１００μＬとさらに１５分間反応させた。この基質混合物を使用して、着色生成物を形成することによりペルオキシダーゼ標識を検出した。１００μＬの１．０Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加により反応を停止し、４５０ｎｍでの吸光度（Ａ４５０）を決定した。種々のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチドワクチン製剤を与えたワクチン接種動物の抗体価の決定では、１：１００から１：１０，０００までの１０倍段階希釈の血清、または１：１００〜１：４．１９ｘ１０８の４倍段階希釈の血清を試験し、Ｌｏｇ１０で表される試験血清の力価を、カットオフＡ４５０を０．５に設定したＡ４５０の線形回帰分析によって算出した。
【０１７３】
ｂ．Ｔｈペプチドに基づくＥＬＩＳＡ試験によるＴｈペプチドに対する抗体反応性の評価
ｐＨ９．５の１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３緩衝液中（特に記載がない限り）２μｇ／ｍＬ（特に記載がない限り）のＴｈペプチド１００μＬにより、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルを、類似するＥＬＩＳＡ法において３７℃で１時間個別に被覆し、上記の通り実施した。種々のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチドワクチン製剤を与えたワクチン接種動物の抗体価の決定では、１：１００〜１：１０，０００の１０倍段階希釈の血清を試験し、Ｌｏｇ１０で表される試験血清の力価を、カットオフＡ４５０を０．５に設定したＡ４５０の線形回帰分析によって算出した。
【０１７４】
ｃ．Ｂ細胞エピトープクラスター１０ｍｅｒペプチドに基づくＥＬＩＳＡ試験による、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ及びＩｇＥ  ＣＨ４に対する（膜に対するヒトＩｇＥ  ＣＨ４）精密特異性分析及びエピトープマッピングの評価
免疫された宿主における抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体の精密特異性分析は、エピトープマッピングによって決定した。簡潔には、９６ウェルプレートのウェルを、ウェルごとに０．１ｍＬあたり０．５μｇのＩｇＥ  ＥＭＰＤ  １０ｍｅｒペプチド（配列番号１０〜５８）で個別に被覆した後、１００μＬの血清試料（ＰＢＳで１：１００に希釈）を上記の抗体ＥＬＩＳＡ法の工程に従って２連の１０ｍｅｒプレートウェル中でインキュベートした。ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物のＢ細胞エピトープ、及び免疫された宿主の免疫血清からの抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体の関連する精密特異性分析を、スペーサーまたはＴｈ配列（配列番号１）のない対応するＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−５２ペプチド、または関連性のない対照ペプチドで試験し、追加の反応性と特異性を確認した。
【０１７５】
ｄ．免疫原性評価
実験的ワクチン接種プロトコールに従って、免疫前及び免疫血清試料を動物対象もしくはヒト対象または動物から採取し、５６℃で３０分間加熱して血清補体因子を不活化した。ワクチン製剤の投与後、プロトコールに従って血液試料を得て、特異的標的部位（複数可）に対する免疫原性を評価した。段階希釈した血清を試験し、陽性力価を希釈度の逆数のＬｏｇ１０で表した。標的抗原内の目的のＢ細胞エピトープ配列を指向する高力価抗体を誘発すると同時に、望ましいＢ細胞応答の増強をもたらすために採用されるヘルパーＴ細胞エピトープ配列に対する抗体反応性を低度から無視できる程度に維持する能力によって、個々のワクチン製剤の免疫原性を評価した。
【０１７６】
ｅ．マウス血清中のヒトＩｇＥレベルを評価するためのイムノアッセイ
捕捉抗体である抗ヒトＩｇＥ、ＨＰ６０６１（Ａｂｃａｍ）と検出抗体であるビオチン標識抗ヒトＩｇＥ、ＨＰ６０２９（Ａｂｃａｍ）を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡでｈｕＩＧＨＥノックインマウスのヒトＩｇＥレベルを測定した。簡潔には、ＨＰ６０６１を被覆用緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中１００ｎｇ／ウェルで９６ウェルプレートに固定し、４℃で一晩インキュベートした。被覆したウェルを２００μＬ／ウェルのアッセイ用希釈液（ＰＢＳ中０．５％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、０．０２％のＰｒｏＣｌｉｎ  ３００）で室温にて１時間ブロッキングした。プレートを２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。精製したＵ２６６  ＩｇＥを使用して、５％マウス血清を含むアッセイ用希釈液における標準曲線（２倍段階希釈で０〜８００ｎｇ／ｍＬの範囲）を作成した。５０μＬの希釈血清（１：２０）と標準物質を被覆したウェルに加えた。室温で１時間インキュベートを実施した。全てのウェルを吸引し、２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液で６回洗浄した。捕捉されたヒトＩｇＥを１００μＬの検出抗体溶液（アッセイ用希釈液中５０ｎｇ／ｍｌのビオチン標識ＨＰ６０２９）と共に室温で１時間インキュベートした。その後、結合したビオチン−ＨＰ６０２９を、ストレプトアビジンポリ−ＨＲＰ（１：１０，０００希釈、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して１時間検出した（１００μＬ／ウェル）。全てのウェルを吸引し、２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液で６回洗浄した。最後に、ウェルを１００μＬ／ウェルのＮｅＡ−Ｂｌｕｅ  ＴＭＢ基質（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）で発色させ、１００μＬ／ウェルの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加によって反応を停止させた。ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、４パラメータロジスティック曲線近似を生成することにより標準曲線を作成し、試験した全試料のＩｇＥ濃度を算出するために使用した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用したデータ比較にはスチューデントのｔ検定を使用した。
【０１７７】
ｆ．マウス血清中のパパイン特異的ＩｇＥレベルを評価するためのイムノアッセイ
被覆材料であるパパインと検出抗体であるビオチン標識抗ヒトＩｇＥ、ＨＰ６０２９（Ａｂｃａｍ）を使用した直接ＥＬＩＳＡでｈｕＩＧＨＥノックインマウスに出現するパパイン特異的ＩｇＥを測定した。簡潔には、パパインを被覆用緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中５００ｎｇ／ウェルで９６ウェルプレートに固定し、４℃で一晩インキュベートした。被覆したウェルを２００μＬ／ウェルのアッセイ用希釈液（ＰＢＳ中０．５％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、０．０２％のＰｒｏＣｌｉｎ  ３００）で室温にて１時間ブロッキングした。プレートを２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。モノクローナルヒトキメラパパイン特異的ＩｇＥ（ＡｌｌｅｒＭＡｂｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を使用して、１０％マウス血清を含むアッセイ用希釈液における標準曲線（２倍段階希釈で０〜３０ｎｇ／ｍＬの範囲）を作成した。５０μＬの希釈血清（１：１０）と標準物質を被覆したウェルに加えた。室温で１時間インキュベートを実施した。全てのウェルを吸引し、２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液で６回洗浄した。捕捉されたヒトＩｇＥを１００μＬの検出抗体溶液（アッセイ用希釈液中５０ｎｇ／ｍｌのビオチン標識ＨＰ６０２９）と共に室温で１時間インキュベートした。その後、結合したビオチン−ＨＰ６０２９を、ストレプトアビジンポリ−ＨＲＰ（１：１０，０００希釈、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して１時間検出した（１００μＬ／ウェル）。全てのウェルを吸引し、２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液で６回洗浄した。最後に、ウェルを１００μＬ／ウェルのＮｅＡ−Ｂｌｕｅ  ＴＭＢ基質（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）で発色させ、１００μＬ／ウェルの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加によって反応を停止させた。ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、４パラメータロジスティック曲線近似を生成することにより標準曲線を作成し、試験した全試料のパパイン特異的ＩｇＥ濃度を算出するために使用した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用したデータ比較にはスチューデントのｔ検定を使用した。
【０１７８】
ｇ．マカク血清中のＩｇＥレベルを評価するためのイムノアッセイ
捕捉抗体である抗ヒトＩｇＥ、ＭＢ１０−５Ｃ４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）と検出抗体であるビオチン標識ポリクローナル抗マカクＩｇＥ（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡでカニクイザルのマカクＩｇＥレベルを測定した。簡潔には、ＭＢ１０−５Ｃ４を被覆用緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中１００ｎｇ／ウェルで９６ウェルプレートに固定し、４℃で一晩インキュベートした。被覆したウェルを２００μＬ／ウェルのアッセイ用希釈液（ＰＢＳ中０．５％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、０．０２％のＰｒｏＣｌｉｎ  ３００）で室温にて１時間ブロッキングした。プレートを２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。精製したマカクＩｇＥを使用して、１０％マカク血清を含むアッセイ用希釈液における標準曲線（２倍段階希釈で０〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲）を作成した。１００μＬの希釈血清（１：１０）と標準物質を被覆したウェルに加えた。室温で１時間インキュベートを実施した。全てのウェルを吸引し、２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液で６回洗浄した。捕捉されたヒトＩｇＥを１００μＬの検出抗体溶液（アッセイ用希釈液中５０ｎｇ／ｍｌのビオチン標識ＨＰ６０２９）と共に室温で１時間インキュベートした。その後、結合したビオチン−ＨＰ６０２９を、ストレプトアビジンポリ−ＨＲＰ（１：１０，０００希釈、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して１時間検出した（１００μＬ／ウェル）。全てのウェルを吸引し、２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液で６回洗浄した。最後に、ウェルを１００μＬ／ウェルのＮｅＡ−Ｂｌｕｅ  ＴＭＢ基質（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）で発色させ、１００μＬ／ウェルの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加によって反応を停止させた。ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、４パラメータロジスティック曲線近似を生成することにより標準曲線を作成し、試験した全試料のＩｇＥ濃度を算出するために使用した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用したデータ比較にはスチューデントのｔ検定を使用した。
【０１７９】
実施例３
動物におけるＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物及びその製剤によって誘発される抗体の機能的特性の評価
免疫された宿主からの免疫血清または精製抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体を、組換え可溶性ＩｇＥ  ＥＭＰＤタンパク質への結合能、及びｍＩｇＥ．ＦｃＬ（ＣＨ２からＣＭまで、ＥＭＰＤを含む）またはｍＩｇＥ．ＦｃＳ（ＣＨ２からＣＭまで、ＥＭＰＤなし）のいずれかをコードする組換えＤＮＡをトランスフェクトしたＲａｍｏｓ細胞株への結合能について試験した。
【０１８０】
ａ．細胞
Ｒａｍｏｓ細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入し、１０％の加熱不活化ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；完全ＲＰＭＩ培地）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で増殖させた。Ｒａｍｏｓ細胞に、ｍＩｇＥ．ＦｃＬまたはｍＩｇＥ．ＦｃＳをコードする組換えＤＮＡをトランスフェクトした。ｍＩｇＥ．ＦｃＬを発現するＲａｍｏｓ細胞に、ＥＭＰＤを含めた、ＣＨ２から細胞質ペプチドに及ぶｍＩｇＥε鎖である長鎖アイソフォームのセグメントをコードするＤＮＡセグメントをトランスフェクトした。ｍＩｇＥ．ＦｃＳを発現するＲａｍｏｓ細胞に、ＥＭＰＤを除いた、ＣＨ２から細胞質ペプチドに及ぶｍＩｇＥε鎖である短鎖すなわち通常アイソフォームのセグメントをコードするＤＮＡセグメントをトランスフェクトした。ｍＩｇＥ．ＦｃＬまたはｍＩｇＥ．ＦｃＳを発現するＲａｍｏｓ細胞の安定なトランスフェクタントを、４００ｍｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した完全なＲＭＰＩ１６４０培地中に維持した。
【０１８１】
ｂ．ＥＬＩＳＡ試験のための組換え可溶性ＩｇＥ  ＥＭＰＤタンパク質の調製
組換え可溶性ＩｇＥ  ＥＭＰＤタンパク質を発現するＦｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞に、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分及びヒト膜結合型ＩｇＥのＩｇＥ  ＥＭＰＤ、γ１−ｅｍ６７をコードするＤＮＡセグメントをトランスフェクトした。安定なＦｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯトランスフェクタントを、１０％の加熱不活化ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；完全ＩＭＤＭ培地）を補充したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に維持した。γ１−ｅｍ６７タンパク質を、製造業者の指示に従い、プロテインＡセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して培養培地から精製した。
【０１８２】
ｃ．免疫血清からのポリクローナル抗体の精製
種々の免疫血清からのポリクローナルＩｇＧを、製造業者の指示に従い、プロテインＡセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。
【０１８３】
ｄ．Ｂ細胞上での可溶性ＩｇＥ  ＥＭＰＤタンパク質またはｍＩｇＥ．ＦｃＬへのポリクローナル抗体による結合
免疫された各動物からの精製ポリクローナル抗体が（ａ）組換えγ１−ｅｍ６７タンパク質（上記）に結合する相対活性をＥＬＩＳＡによって、または（ｂ）ｍＩｇＥ．ＦｃＬを発現するＲａｍｏｓ細胞に結合する相対活性を蛍光フローサイトメトリー分析によって調べた。９６ウェルマイクロプレートはＮａｌｇｅ  ＮＵＮＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製であり、光学測定用は平底（Ｃａｔ．４４２４０４）、細胞インキュベート用はＶ底（Ｃａｔ．２４９５７０）を使用した。光学密度をＶｅｒｓａＭａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み取った。蛍光染色剤をＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩサイトメーター（ＤＢ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出し、結果データを付属のＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアで取得した。ＥＬＩＳＡとＦＡＣＳからの結合データをＰｒｉｓｍ  ６ソフトウェアにインポートして定量分析を行った。より具体的には、ウェルあたり０．１ｍＬ中２×１０５細胞のアリコートをＶ底マイクロプレートに加え、遠心分離し、液体を廃棄した。種々の濃度の抗体試料１００μＬアリコートと共に細胞を氷上で１時間インキュベートした。細胞を１回洗浄し、３００ｇで５分間遠心分離し、１００μＬのヤギＦ（ａｂ）２抗種特異的ＩｇＧ  Ｆｃ−ＦＩＴＣ（２５０ｎｇ／ｍＬ）と共に氷上で３０分間染色した。細胞を１回洗浄し、遠心分離後に液体を廃棄した。各ウェルに２００μＬアリコートの結合用緩衝液を加え、微量希釈チューブに移し、フローサイトメトリー分析を行った。試料あたり１０，０００細胞の注入量を基準として、結合強度（蛍光強度の幾何平均、ＧｅｏＭＦＩ）をＦＡＣＳで読み取った。
【０１８４】
ｅ．アポトーシスアッセイ
ｍＩｇＥ．ＦｃＬ（５×１０５細胞／ｍＬ）を安定的に発現するＲａｍｏｓ細胞を、完全ＲＰＭＩ１６４０培地中の精製免疫抗体または対照抗体と共に３７℃で１時間インキュベートした。次に、最終濃度１０μｇ／ｍＬの二次抗体、モルモットＩｇＧのＦｃに特異的なヤギＦ（ａｂ´）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で細胞を処理し、３７℃でさらに２４時間インキュベートした。細胞のアポトーシスの程度を以下の方法で分析した。アネキシンＶを用いたアッセイでは、細胞を染色溶液に１５分間、暗所、室温で再懸濁することでホスファチジルセリン（ＰＳ）の曝露を測定した。染色液には、１／２００に希釈したＦＩＴＣ標識アネキシンＶ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、ならびに１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭのＮａＣｌ、及び５ｍＭのＣａＣｌ２を含む緩衝液中２．５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）が含有されてた。染色細胞をＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で分析した。アネキシンＶ陽性及びＰＩ陰性と定義されるアポトーシス細胞の比率をドットプロット分析で取得した。
【０１８５】
ｆ．抗体依存性細胞傷害アッセイ（ＡＤＣＣ）
ＲＢＣ溶解用緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を使用して、赤血球の低浸透圧ショックを繰り返すことにより、Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌、６〜８週齢）の脾臓から脾臓リンパ球を単離した。赤血球を除去した後、脾臓リンパ球を３×１０６細胞／ｍＬで、５０μＭの２−ＭＥ及び１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ）を補充した完全ＲＰＭＩ培地中にて３日間培養した。ｍＩｇＥ．ＦｃＬを発現するＲａｍｏｓ細胞（標的細胞）をＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中のＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により３７℃で１０分間標識した。低温完全ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄した後、１０５細胞／ｍＬに細胞を調整した。完全ＲＰＭＩ培地２００μｌ中標識細胞２０，０００個のアリコートを、対応する免疫血清から精製したポリクローナルＩｇＧ抗体１０μｇ／ｍＬにより３７℃で３０分間被覆した後、ＩＬ−２活性化脾臓リンパ球（エフェクター細胞）とＥ／Ｔ比３０で混合した。２４時間のインキュベート後、全細胞を２．５μｇ／ｍＬの７アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により氷上で１５分間染色した後、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。生存標的細胞は、ドットプロット分析でＣＦＳＥ陽性及び７−ＡＡＤ陰性と定義された。所定のＥ／Ｔ比での溶解標的細胞の比率は、１００×［（抗体非依存性対照中の生存標的細胞の比率−試料中の生存標的細胞の比率）／抗体非依存性対照中の生存標的細胞の比率］であった。
【０１８６】
実施例４
安全性試験、免疫原性試験、毒性試験、及び有効性試験に使用する動物
ａ．モルモット：
雌雄の成熟ナイーブ成体Ｄｕｎｃａｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（３００〜３５０ｇ／ＢＷ）で免疫原性試験を実施した。実験には群あたり少なくとも３匹のモルモットを使用した。Ｄｕｎｃａｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（８〜１２週齢；Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）に関わるプロトコールを、ＩＡＣＵＣ申請の承認下で、委託動物施設及び責任者であるＵｎｉｔｅｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．（ＵＢＩ）で実施した。
【０１８７】
ｂ．カニクイザル：
雌雄の成体サル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、約４齢；Ｊｏｉｎｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｕｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ）における免疫原性試験及び反復投与毒性試験を、ＩＡＣＵＣ申請の承認下で、委託動物施設及び責任者であるＵＢＩで実施した。
【０１８８】
ｃ．ｈＩＧＨＥノックインマウス：
Ｃ５７ＢＬ／Ｂ６遺伝的背景の相同遺伝子ターゲティングにより、ＩＧＨＧ１遺伝子をヒトＩＧＨＥ遺伝子に置換したマウス系統は、ヒトの分泌型及び膜結合型のＩｇＥを発現する（Ｌｕ，ｅｌ  ａｌ．，２０１５）。ｈＩＧＨＥマウスは、マウスＩＧＨＧ１転写要素の調節制御下でヒトＩｇＥを発現し、ヒト調節要素の選択的ＲＮＡスプライシングによってヒト膜結合型ＩｇＥを発現する。８〜１０週齢という早期に、血液中に血清ＩｇＥが検出された。一次／記憶免疫応答の予防モデル、及び感作／リコール免疫応答の治療モデルには、混合ｈＩＧＨＥ×Ｂａｌｂ／ｃ背景の幼若仔（１０〜１２週齢）を使用した。いずれの試験も、ＩＡＣＵＣ申請の承認下で、委託動物施設（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｔａｉｗａｎ）及び責任者であるＵＢＩで実施した。
【０１８９】
血清ヒトＩｇＥのＥＬＩＳＡアッセイによる抗体反応、ならびに抗原攻撃接種時の血清総ＩｇＥレベル及び抗原特異的ＩｇＥの低下の証拠に関して、１６週間にわたる筋肉内ワクチン接種の効果が観察された。
【０１９０】
免疫付与する前に、本実施例で上記した方法に従って、個々の動物からの血清試料を血清ヒトＩｇＥの存在について試験した。種及びプロトコールに応じて、ワクチン製剤の用量あたりのＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物で各動物を免疫した。
【０１９１】
実施例５
モルモット、トランスジェニックノックインマウス、及びカニクイザルにおける、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド構築物の最終製品を選択する免疫原性評価のためのワクチン製剤
各実験に使用される医薬組成物及びワクチン製剤について以下でさらに詳細に説明する。簡潔には、各試験群に指定された製剤は一般に、種類の異なるスペーサー（例えば、ペプチド構築物の溶解度を増強するεＫまたはＫＫＫ）によってＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチドのセグメントが結合されたあらゆる種類のデザイナーＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド構築物と、デザイナーペプチド構築物のＮ末端側でＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチドセグメント（複数可）と結合される麻疹ウイルス融合タンパク質及びＢ型肝炎表面抗原に由来する２組の人工Ｔヘルパーエピトープを含む無差別的ヘルパーＴ細胞エピトープの変形とを含んでいた。１００超のデザイナーＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド構築物を最初にモルモットでＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−５２との相対免疫原性について、さらにＩｇＥを保持するＢ細胞（Ｒａｍｏｓ細胞株）上の膜ＩｇＥとの交差反応性について評価した。ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド構築物は、指定したような可変量のペプチド構築物で、ヒトワクチン用途の承認済み油であるＳｅｐｐｉｃ  Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ  ５１との油中水型エマルションに調製するか、または無機塩ＡＤＪＵＰＨＯＳまたはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（ミョウバン）と混合して調製した。ワクチンは通常、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド構築物を約２０〜８００μｇ／ｍＬの水に溶解することにより調製し、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ  ５１を用いて油中水型エマルション（１：１体積）に製剤化するか、または無機塩ＡＤＪＵＰＨＯＳもしくはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（ミョウバン）（１：１体積）と製剤化した。ワクチン製剤を室温で約３０分間維持し、免疫前にボルテックスで約１０〜１５秒間混合した。
【０１９２】
動物を２〜３用量の特異的ワクチン製剤で免疫付与した。これは、０週目（初回免疫）及び初回免疫後週数（ｗｐｉ）３（追加免疫）で投与し、任意選択的に５または６ｗｐｉに筋肉内経路で２回目の追加免疫を行った。次に、これらの免疫された動物を試験し、ワクチン製剤に存在する種々の合成ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原の免疫原性を評価し、加えてＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−５２との交差反応性を評価した。次に、モルモットにおける初回スクリーニングで免疫原性が強力であったこれらのＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原を、油中水型エマルション、無機塩及びミョウバン系製剤の両方で、マカク属において免疫付与プロトコールに示す指定期間にわたる投薬計画を実施してさらに試験した。
【０１９３】
最も有望なＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原候補のみを、ＡＤＣＣを媒介する免疫血清の能力、ｍＩｇＥを保持するＢ細胞のアポトーシス、トランスジェニックノックインマウス及びマカクにおける、自己ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗原をもつ同じ種の寛容性を破壊する能力によってさらに広範に評価した後、最終ワクチン製剤に組み込んで、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患患者における治験薬の申請及び臨床試験に備え、ＧＬＰ基準免疫原性試験、持続期間試験、毒性試験、及び概念関連有効性試験を行った。
【０１９４】
実施例６
ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患の治療のためのＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−３９ペプチド免疫原構築物を組み込んだ多成分ワクチン製剤の設計原理、スクリーニング、同定、機能的特性の評価、及び最適化
図２Ａ及び図２Ｂは、ＩｇＥ  ＥＭＰＤの標的化によりｍＩｇＥ  Ｂ細胞が減少する原理を示している。ＩｇＥは、分泌型ＩｇＥと膜結合型ＩｇＥ（ｍＩｇＥ）という２つの形態で表される（図２Ａ、それぞれ左と右）。分泌型ＩｇＥは、ＦｃＲＩによって好塩基球及びマスト細胞の細胞表面に捕捉されるが、ｍＩｇＥはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）の一部としてＩｇＥ関与型Ｂ細胞にのみ存在する。ｍＩｇＥの細胞外膜近位ドメイン（ＥＭＰＤ）は、ｍＩｇＥ  Ｂ細胞にのみ存在する、ＣＨ４ドメインと膜貫通領域との間の６７アミノ酸のペプチドセグメント（配列番号１）である。ＩｇＥ  ＥＭＰＤの独自性により、ｍＩｇＥを保持するＢ細胞を標的とする誘引部位が与えられた。ＩｇＥ  ＥＭＰＤの標的化によるｍＩｇＥ  Ｂ細胞の減少により、新しいＩｇＥ分泌型形質細胞へと分化する前に、アレルゲン特異的ＩｇＥ生成の抑制が可能になる（図２Ｂ）。生存期間が限定される既存のＩｇＥ分泌型形質細胞は徐々に消滅し、その結果、総ＩｇＥ及びアレルゲン特異的ＩｇＥは徐々に低下する。
【０１９５】
図３は、本明細書に開示される特定の実施形態に従うワクチン製剤の発見から商品化（工業化）までの開発過程を示すフローチャートである。本開示は、ここに要約するような、ペプチド免疫原設計、ペプチド組成物設計、ワクチン製剤設計、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能的抗原性設計、ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性及び有効性試験設計、ならびに臨床プロトコール設計を含む。驚くべきことに、各工程の詳細な評価から一連の実験を進めることで、安全かつ有効なワクチン製剤の最終的な商品化に到達する。
【０１９６】
工程の全体概要を以下に記載する。
【０１９７】
ａ．設計履歴
各ペプチド免疫原構築物または免疫療法生成物には、その特異的疾患メカニズム及び治療介入に必要となる標的タンパク質（複数可）に基づいた固有の設計重点と手法が必要とされる。設計の判断材料とする標的には、疾患経路に関与する細胞タンパク質、または病原体に由来するいくつかのタンパク質が関与し得る感染作用物質を含み得る。研究から商品化までの過程は非常に長期にわたり、通常は完了までに１０年以上を要する。
【０１９８】
標的分子を選択した後は、広範な血清学的検証過程が必要である。治療介入の対象となる標的分子内のＢ細胞及びＴ細胞のエピトープならびに機能的部位（複数可）の同定は、免疫原構築物の設計にとって重要である。標的Ｂ細胞エピトープを認識した後、種々のＴヘルパー支持体（担体タンパク質または好適なＴヘルパーペプチド）を導入した小動物における連続したパイロット免疫原性試験を実施し、デザイナーペプチドの医薬組成物によって誘発される抗体の機能的特性を評価する。次に、標的種の動物においてそのような血清学的応用を実施し、誘発される抗体の免疫原性及び機能的特性をさらに検証する。すべての試験は、免疫された宿主から採取した血清を用いて複数の並行群で実施し、評価する。免疫原性及び設計方針をさらに検証するため、標的種、またはヒト医薬組成物の場合には非ヒト霊長類における初期免疫原性試験もさらに実施する。次に、ペプチド構築物を組合せて使用し、それぞれの製剤設計に合わせて調製する場合、標的ペプチドを種々の混合物に調製し、ペプチド構築物間のそれぞれの相互作用に関連する機能的特性の微妙な相違を評価する。追加評価の後、最終的なペプチド構築物、ペプチド組成物、及びそれらの製剤を、各製剤それぞれの物理的パラメータと併せて確定してから最終的な製品開発過程に進む。
【０１９９】
ｂ．ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患患者を治療する可能性のある医薬組成物のためのＩｇＥ  ＥＭＰＤ由来ペプチド免疫原構築物の設計及び検証
医薬組成物に組み込むための最も強力なペプチド構築物を生成するには、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｂ細胞エピトープペプチド（配列番号５〜８）（表１）、及び種々の病原体に由来する無差別Ｔヘルパーエピトープまたはさらに設計された人工Ｔヘルパーエピトープ（配列番号５９〜８７）（表２）の広いレパートリーから、モルモットにおける免疫原性試験のためのＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を作製した。
【０２００】
ｉ）免疫原設計の標的領域としてのＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｇ１−Ｈ４０の選択。
ＩｇＥは、分泌型ＩｇＥと膜結合型ＩｇＥ（ｍＩｇＥ）という２つの形態で表される。分泌型ＩｇＥは、ＦｃＲＩによって好塩基球及びマスト細胞の細胞表面に捕捉されるが、ｍＩｇＥはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）の一部としてＩｇＥ関与型Ｂ細胞にのみ存在する。ｍＩｇＥの完全長細胞外膜近位ドメイン（ＥＭＰＤ）は、ｍＩｇＥ  Ｂ細胞にのみ存在する、ＣＨ４ドメインと膜貫通領域との間の６７アミノ酸のペプチドセグメント（配列番号１）である。生存期間が限定される既存のＩｇＥ分泌型形質細胞は徐々に消滅し、その結果、総ＩｇＥ及びアレルゲン特異的ＩｇＥは徐々に低下する。モルモットの免疫原性について試験した多数のペプチド免疫原構築物のうち、一連のＩｇＥ  ＥＭＰＤ由来ペプチド免疫原構築物（配列番号８８〜９３）を作製して、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−５２（配列番号２）に由来する代表的なＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｂ細胞エピトープペプチドと、代表的なＴｈエピトープペプチドＵＢＩＴｈ（登録商標）１（配列番号７２）とを組み込み、表４に示す、プレート被覆したＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−３９（配列番号５）ペプチドを使用してモルモットにおける免疫原性試験を行った。３方向の６種のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物で高免疫原性が認められた。そのうち、ＵＢＩＴｈ（登録商標）１  Ｔｈエピトープペプチドは、Ｃ末端側（配列番号８８及び９１）もしくはＮ末端側（配列番号８９、９０、及び９２）のいずれかで、またはスペーサーリンカーのεＫをもつＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｂ細胞エピトープペプチドのＣ末端側とＮ末端側の両方で（配列番号９３）ＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｂ細胞エピトープペプチドに結合されている。構築物設計において高免疫原性を可能にするために、より長鎖のリンカーεＫ−ＫＫＫ（配列番号１２９）を含むＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物も採用した（例えば配列番号９４〜９７）。
【０２０１】
ＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｂ細胞エピトープペプチドの短い方の断片（配列番号７及び８）はさらに、免疫原性のためにＵＢＩＴｈ（登録商標）１（それぞれ配列番号９６及び９７）などのＴヘルパーエピトープペプチドによって増強した。しかしながら、これらの構築物が誘発する抗体は、表５に示すように、ＩｇＥ  ＥＭＰＤへの結合能が弱かった（例えば、配列番号５、６、７、及び８をもつ長い断片に対して）。配列番号９６及び９７の構築物はさらに、線形エピトープマッピング試験で示されるように、非常に制限された結合プロファイルをもつ抗体を誘発した。これは、それぞれ配列番号２５（アミノ酸８〜１７）及び配列番号３９（アミノ酸２２〜３１）の１０ｍｅｒペプチドにのみ反応性が認められた。さらに、配列番号９６及び９７の構築物の誘発された抗体は、ｍＩｇＥ−Ｂ細胞アポトーシスの誘導に不可欠である、最小限のｍＩｇＥ−Ｂ細胞結合効果（図６Ｃに示す）を有することが認められた。
【０２０２】
ｉｉ）病原体に由来する異種Ｔヘルパーエピトープのランク付け、及び選択されたＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｂ細胞エピトープペプチドの免疫原性を増強するＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物設計へのその包含
表２には、マウス、ラット、モルモット、ヒヒ、マカクなどからの多種において、Ｂ細胞エピトープの免疫原性を増強する相対力価について試験した合計２９の異種Ｔｈエピトープ（配列番号５９〜８７）が列挙されている。
【０２０３】
εＫスペーサーによって個々の無差別Ｔヘルパーエピトープ（配列番号８８、９８〜１２４、及び１３０）と結合されたＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−３９  Ｂ細胞エピトープペプチド（配列番号５）を含むＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の代表的な試験を、モルモットにおける免疫原性試験について実施し、表６に示すように、それぞれの異種Ｔヘルパーエピトープの相対有効性をランク付けした。いくつかのＴｈエピトープの高いＢエピトープ増強能により、モルモットの単回免疫付与のみを行った後の初回免疫後３週（３ｗｐｉ）で得られる結果を用いて、２９の異なるＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物をランク付けした。選択したＴｈエピトープはすべてＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｂ−エピトープペプチドの免疫原性を増強する能力を有していたが、最も強力な構築物は配列番号８８の構築物であり、最小は配列番号１０１の構築物であることが認められた。
【０２０４】
霊長類を含む異なる種において、あらゆるＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の免疫原性を綿密に調整することで、Ｔｈペプチドの最終的な選択と最終ワクチン製剤開発の成功が確保される。
【０２０５】
ｉｉｉ）対応する完全長及びＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｇ１−Ｃ３９ペプチドとの抗体反応性に関するＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｇ１−Ｃ３９ペプチド免疫原構築物の免疫原性の評価。
【０２０６】
図４は、種々のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物（配列番号８８〜９４、９６、及び９７）で免疫したモルモットにおける８週間にわたる抗体反応の動態を示している。血清は１０倍段階希釈により１：１００〜１：１０，０００，０００に希釈した。ＥＬＩＳＡプレートを、ウェルあたり０．５μｇペプチドのＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−３９ペプチド（配列番号５）で被覆した。Ｌｏｇ１０で表される試験血清の力価を、カットオフＡ４５０を０．５に設定したＡ４５０ｎｍの線形回帰分析によって算出した。
【０２０７】
図５は、種々のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物（配列番号８８〜９４、９６、及び９７）で産生される種々の精製ポリクローナル抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体の滴定曲線を示す。ＥＬＩＳＡプレートを、配列番号１の配列を含む組換えＩｇＥ  ＥＭＰＤを含むタンパク質、γ１−ｅｍ６７で被覆した。プロテインＡクロマトグラフィーによってモルモット血清から精製したポリクローナル抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体を４倍段階希釈により１００μｇ／ｍＬから０．０２３８ｎｇ／ｍＬまで希釈した。ポリクローナル抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体の各調製物のＥＣ５０を、４パラメータロジスティック曲線近似による非線形回帰によって算出した。
【０２０８】
図４と５の両方に示されているように、他の多くの設計から選択された配列番号８８〜９４のペプチド免疫原構築物は、大半が４より高いＬｏｇ１０力価という高免疫原性を示した。図５に示すように、各群からの精製抗体を使用したＥＣ５０の正確な測定値は、０．０２１１１〜０．０８８９２μｇ／ｍＬであり、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−３９及びＩｇＥ  ＥＭＰＤ７−４０の長鎖Ｂ細胞エピトープペプチドを含むＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物（配列番号８８〜９４）は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−１７またはＩｇＥ  ＥＭＰＤ１９−３８などのＩｇＥ  ＥＭＰＤの短鎖Ｂ細胞エピトープペプチド（２０残基長未満）を含むペプチド免疫原構築物（配列番号９６及び９７）と比較してかなり高い免疫原性を示す。
【０２０９】
Ｂ細胞とＴｈエピトープの間に長鎖スペーサーを含むＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物はさらに、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｂ細胞エピトープペプチド設計の場合と同様に免疫原性を著しく低下させた（配列番号９４対８９それぞれのＥＣ５０は０．０８８９２対０．０２３６８）。２０残基長より長いＢ細胞エピトープペプチドのうち、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−３９が設計上、最適であることが判明したため、以下の実施例では、代表的なペプチド免疫原の設計にＢ細胞エピトープペプチドとしてこれを使用し、種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイ及びｉｎ  ｖｉｖｏ有効性評価によりさらなる評価を行った。
【０２１０】
ｉｖ）ＩｇＥ分泌へのＢ細胞分化に関与する、ＩｇＥを保持するＢ細胞に抗体結合するためのＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の免疫原性の評価。
図６Ａ〜６Ｃは、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ免疫原構築物（配列番号８８〜９７）で免疫した動物群ごとにプールした、モルモット血清からの精製ポリクローナル抗体による、ｍＩｇＥ．ＦｃＬまたはｍＩｇＥ．ＦｃＳを発現するＲａｍｏｓ細胞株に由来するＢ細胞への結合を示している（サイトフルログラフ染色の方法については、実施例２を参照）。プロテインＡクロマトグラフィーによってモルモット血清から精製したポリクローナル抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体を１０μｇ／ｍＬで使用した。
【０２１１】
標的配列のＥＭＰＤ断片を欠失するｍＩｇＥ．ＦＣｓ  Ｒａｍｏｓ細胞株由来の細胞とのバックグラウンド結合の低さが、全群からの精製抗体に認められ、これはこの細胞結合アッセイの高特異性を示す。図６Ａ〜６Ｃに示すように、配列番号８８〜９４、９６、及び９７のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物で免疫された動物から生成される抗体は、ｍＩｇＥ．ＦＣＬ  Ｒａｍｏｓ細胞株の細胞に対して異なる結合親和性を有した。特に、長鎖Ｂ細胞エピトープペプチドＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−３９（配列番号８８〜９４）を含むＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物から生成される抗体は、２０残基未満のＢ細胞エピトープペプチドを含むＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物（配列番号９６〜９７）から生成される抗体と比較して、ｍＩｇＥ．ＦＣＬ  Ｒａｍｏｓ細胞株細胞の高いｍＩｇＥ結合を示した。加えて、短鎖スペーサー（εＫ）をもつＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物から生成される抗体は、長鎖スペーサー（εＫ−ＫＫＫ；配列番号１２９）をもつ構築物と比較して、ｍＩｇＥ．ＦＣＬ  Ｒａｍｏｓ細胞株細胞のｍＩｇＥ結合性が高かった。これは図６Ａの配列番号８９の結果を図６Ｃの配列番号９４の結果と比較することで認識することができる。
【０２１２】
ポリクローナル抗体群のＥＣ５０値とＩｇＥを保持する細胞の陽性結合比率（％）との間に負の相関が認められた。ＩｇＥを保持するＢ細胞結合の比率は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の免疫原性の抗体交差反応性と機能的有効性の両方を評価するための重要な機能パラメータである。
【０２１３】
ｖ）ＩｇＥ分泌へのＢ細胞分化に関与するＩｇＥを保持するＢ細胞のアポトーシスを誘導する高力価の抗体を生成する能力についてのＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の免疫原性の評価。
図７は、ｍＩｇＥ．ＦｃＬを発現するＲａｍｏｓ細胞の細胞表面上で、用量依存的にＩｇＥ  ＥＭＰＤ免疫原構築物（配列番号８８〜９３）で産出されるポリクローナル抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体の種々の調製物によりアポトーシスが誘導されることを示す。プロテインＡクロマトグラフィーによってモルモット血清から精製したポリクローナル抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体を２倍段階希釈により１０００から６２．５ｎｇ／ｍＬまで希釈した。ヒト化抗ＩｇＥモノクローナル抗体であるＸｏｌａｉｒ（登録商標）を陽性対照として使用した。ポリクローナル抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体の各組のＥＣ５０を、４パラメータロジスティック曲線近似による非線形回帰によって算出した。
【０２１４】
図７に示すように、Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）（ＩｇＥ分子のＦｃ受容体結合ＣＨ３ドメインを標的とする抗ＩｇＥモノクローナル抗体）は、有効性が最も高いことを示す最低ＥＣ５０値（１２１．４ｎｇ／ｍＬ）を示す一方、血清中に存在すると、血清ＩｇＥによる中和により、このようなアポトーシスを誘導する力価がすべて中和される。選択された試験済みＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物（配列番号８８〜９３）には、固有のＥＭＰＤ標的領域配列への結合により、血清ＩｇＥ干渉のない高アポトーシス誘導力価を示す２７７．５〜５３６ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値が観察された。このようなＩｇＥを保持するＢ細胞は、ＩｇＥ分泌へのＢ細胞分化に関与する細胞である。
【０２１５】
ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物（例えば、配列番号８８〜９３）を用いた宿主の免疫付与によるこれらの細胞のアポトーシスの誘導は、アレルギー性疾患の主因であるＩｇＥの血清減少をもたらすＩｇＥ合成の抑制を誘発する。
【０２１６】
ｖｉ）ＩｇＥ分泌へのＢ細胞分化に関与するＩｇＥを保持するＢ細胞の抗体依存性細胞媒介型細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発する高力価の抗体を生成する能力についてのＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物の免疫原性の評価。
図８は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤの異なる免疫原構築物（配列番号８８〜９３）によって生成されるポリクローナル抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体の種々の調製物が、エフェクター／標的比３０で、ｍＩｇＥ．ＦｃＬを発現するＲａｍｏｓ細胞に対してＡＤＣＣを誘導できたことを示している。プロテインＡクロマトグラフィーによってモルモット血清から精製したポリクローナル抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体を１０μｇ／ｍＬで使用した。ＩＬ−２刺激マウス脾臓細胞をエフェクター細胞として使用した。マウス抗ＩｇＥモノクローナル抗体５Ｄ５分泌型を陽性対照として使用した。
【０２１７】
図８に示すように、２０超のアミノ酸残基（配列番号８８〜９３）を有する長鎖Ｂ細胞エピトープペプチドをもつペプチド免疫原構築物はすべて、ＩｇＥ分泌へのＢ細胞分化に関与しているＩｇＥを保持するＢ細胞のＡＤＣＣを誘導した。これはそのようなペプチド免疫原構築物による宿主の免疫付与時にＩｇＥ血清レベルが減少及び抑制したことを示す。
【０２１８】
ｖｉｉ）種々の無差別ＴヘルパーエピトープをもつＩｇＥ  ＥＭＰＤ由来ペプチド免疫原構築物を使用することによるＭＨＣ対象範囲の拡張。
多様な遺伝的背景の患者を治療するための医薬組成物を設計する場合、多様な遺伝的背景をもつ最大限の集団を対象範囲とする設計が可能であることが重要である。ＭＶＦまたはＨＢｓＡｇに由来する無差別Ｔヘルパーエピトープは、このような免疫原性の増強を提供する最も強力なものの一つであるため、このような２つのヘルパーＴエピトープを含むペプチド構築物の組合せを設計することで、相乗的な免疫原性効果が可能になる。同じＢ細胞エピトープをもつ２つのペプチド免疫原構築物の混合物は、それぞれの個々のペプチド構築物によって誘発される免疫応答と比較した場合、相当な免疫応答を誘発すると予測される。
【０２１９】
ｖｉｉｉ）種々のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物によって誘発される免疫血清（９ｗｐｉ）による精密な特異性分析のためのエピトープマッピング
ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を含むＩｇＥ−ＥＭＰＤワクチンの設計は、機能的及び構造的標的である、ＩｇＥ−ＥＭＰＤの中央領域にあるＣ１８−Ｃ３９の特別なループ構造を中心とした。この構造に基づく設計は、免疫原性標的として天然細胞外ループ構造を保持することを目的としている。
【０２２０】
１−１７（配列番号７）、１９−３８（配列番号８）、１−３９（配列番号５）、及び７−４０（配列番号６）という４つの代表的なＩｇＥ−ＥＭＰＤペプチド断片を使用して、Ｂ細胞エピトープペプチドのＮ末端側またはＣ末端側でＵＢＩＴｈ（登録商標）１（配列番号７２）またはＵＢＩＴｈ（登録商標）２（配列番号７３）と結合されたＢ細胞エピトープペプチドを設計し、プロトタイプのペプチド免疫原を形成した。εＫリンカーまたはεＫ−ＫＫＫ（配列番号１２９）スペーサーをＢ細胞とＴｈエピトープの間に使用して、表３に示すペプチド免疫原構築物（配列番号８８〜９７）を形成した。アミノ酸（ａａ）１−３９及び７−４０のペプチド断片はすべて、環化によるＣ１８〜Ｃ３９拘束ループ構造で設計した。
【０２２１】
１−１７（配列番号７）、１９−３８（配列番号８）、１−３９（配列番号５）、及び７−４０（配列番号６）の個々のＩｇＥ−ＥＭＰＤ  Ｂ細胞エピトープペプチドをプレート被覆に使用したＥＬＩＳＡ試験で、対応するペプチド免疫原構築物（配列番号９６、９７、８８、８９、９３）で免疫したモルモットから得た高免疫血清の抗体反応性を評価した。配列番号８８、８９、及び９３の構築物が、４つすべてのＩＧＥ  ＥＭＰＤ  Ｂ細胞エピトープペプチドに対して高力価抗体を誘導したが、ＩｇＥ−ＥＭＰＤ１−１７（配列番号９６）及びＩｇＥ−ＥＭＰＤ１９−３８（配列番号９７）ペプチド免疫原構築物によって誘導されるモルモット抗血清は、対応するＢ細胞エピトープペプチド（例えば、配列番号７または８）との抗体反応性のみを有する一方、対応しない隣接エピトープからのＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｂ細胞エピトープペプチド（配列番号８または７）に対する交差反応性がなかった。これは、免疫原性の高特異性、すなわち設計された免疫原構築物がＩｇＥ−ＥＭＰＤの対応するＢ細胞エピトープドメインと反応する特異性抗体を誘導可能であることを示す（表５）。
【０２２２】
抗体結合部位（複数可）を標的領域内の特異的残基に配置する精密エピトープマッピング試験（表５）では、ＩｇＥ  ＣＨ４のＣ末端から最初の８アミノ酸及びＩｇＥ−ＥＭＰＤの１〜５０アミノ酸配列領域を対象範囲とする、５０種の重複する１０ｍｅｒペプチド（配列番号１０〜５８）を合成した。これらの１０ｍｅｒペプチドを固相免疫吸着剤として９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに個別に被覆した。プールしたモルモット抗血清を検体希釈用緩衝液にて希釈率１：１００にし、１０ｍｅｒペプチドで被覆したプレートウェルに２．０μｇ／ｍＬ加えた後、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄用緩衝液でプレートウェルを洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ複合ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ／Ｇを加え、３０分間インキュベートした。再度ＰＢＳで洗浄後、基質をウェルに追加して、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで吸光度４５０ｎｍを測定し、試料を２連で分析した。ＩｇＥ−ＥＭＰＤペプチド免疫原が誘発した免疫血清と、対応するＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｂ細胞エピトープペプチドで被覆したウェルとの結合が最大の抗体結合シグナルを表す。
【０２２３】
精密エピトープマッピングの結果は、ＩｇＥ−ＥＭＰＤ１９−３８由来のペプチド免疫原構築物（配列番号９７、非環化線状Ｂ細胞エピトープ、Ｈ１９−Ｒ３８を含む）からのプールされたモルモット血清が、ＩｇＥ−ＥＭＰＤの中央領域に位置するＩｇＥ  ＥＭＰＤ２２−３１ペプチド（配列番号３９）を認識することを示した。また、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド１９−３８（配列番号８）、１−３９（配列番号５）、及び７−４０（配列番号６）とも反応したが、１−１７（配列番号７）とは反応しなかった。
【０２２４】
ＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−１７（配列番号９６、非環化線状Ｂ細胞エピトープ、Ｇ１−Ｌ１７）によって誘導される抗血清は、ＩｇＥのＮ末端領域のＩｇＥ  ＥＭＰＤ８−１７（配列番号２５）、ならびにＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−１７（配列番号７）、１−３９（配列番号５）、及び７−４０（配列番号６）を認識したが、１９−３８（配列番号８）ペプチドは認識しなかった。ＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−１７（配列番号９６）及びＩｇＥ  ＥＭＰＤ１９−３８（配列番号９７）免疫原構築物によって誘導される抗血清は交差反応性がなかった。
【０２２５】
興味深いことに、Ｎ末端側（配列番号８９）またはＣ末端側（配列番号８８）いずれかでＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｂ細胞エピトープペプチドに結合されたＵＢＩＴｈ（登録商標）１エピトープをもつ２つの対応するＩｇＥ−ＥＭＰＤ１−３９免疫原構築物は、まったく異なるエピトープ結合パターンを認識する免疫血清を生成した。免疫原構築物（配列番号８９、ＵＢＴｈ１がペプチドのＮ末端側に位置する）によって誘導される免疫血清は、ＩｇＥ−ＥＭＰＤのＣ末端領域近傍にあるａａ３０−３９の１種の１０ｍｅｒペプチド（配列番号４７）とのみ強く反応した。また、Ｎ末端領域（配列番号２７）のＩｇＥ  ＥＭＰＤ９−１８と弱く反応した。
【０２２６】
しかしながら、他のＩｇＥ−ＥＭＰＤ１−３９免疫原構築物（配列番号８８、ＵＢＴｈ１がＣ末端側に位置する）では、誘導される抗血清は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ９−１９（配列番号２７及び２８）；ＩｇＥ  ＥＭＰＤ１９−３１（配列番号３７、３８、３９、及び４０）及びＩｇＥ  ＥＭＰＤ３０−４３（配列番号４８、４９、５０、５１、及び５２）で表される３つの不連続な線状エピトープと強く反応した。ペプチド免疫原構築物（配列番号８８）ははるかに強い免疫原性を示し、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物（配列番号８９）よりもはるかに広い表面と反応した。ペプチド免疫原構築物（配列番号８８）がはるかに強い免疫原性を伴うという知見は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物（配列番号８９）よりもＩｇＥを発現するリンパ球に対してＡＤＣＣ及びアポトーシス活性がはるかに強いことも明らかにした。
【０２２７】
ＩｇＥ−ＥＭＰＤ７−４０免疫原構築物（配列番号９３、２つのＵＢＴｈ１がＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｂ細胞エピトープペプチドのＮ末端側とＣ末端側の両方に位置する）に関しては、配列番号３５〜４１のペプチドが対象範囲とするＩｇＥ  ＥＭＰＤ１８−３３と、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ２９−４３（配列番号４５〜５１）の領域にあるペプチドと強く反応するという点でＩｇＥ−ＥＭＰＤ１−３９によって認識されるものと類似する２つの主要な抗原領域を、誘導される抗血清が認識した。ＩｇＥ−ＥＭＰＤ７−４０免疫原構築物（配列番号９３）は、ＩｇＥ−ＥＭＰＤ１−３９免疫原構築物（配列番号８８、ＵＢＴｈ１がＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｂ細胞エピトープペプチドのＣ末端側にある）と類似する抗原決定基領域を共有する。ＩｇＥ−  ＥＭＰＤ１−３９（配列番号８８）は、複数の機能アッセイによって示されるように、設計された全ペプチド免疫原構築物の中で最大の有効性を示した。このことは、ＩｇＥ−ＥＭＰＤの細胞外膜タンパク質上の３つ以上のＢ細胞エピトープペプチドが対象範囲である広い表面を認識する高結合ポリクローナル抗体をこの免疫原構築物が誘発するという点で、精密エピトープマッピングで示された結果と相関する。ＩｇＥ  ＥＭＰＤ３０−４３（配列番号４７〜５１）エピトープ領域は、非常に重要なＢ細胞エピトープ領域を表し、抗体媒介型アポトーシス及びＡＤＣＣに感受性である、ＩｇＥを保持するＢ細胞基底膜に近接するループ構造のＣ末端領域に位置する。加えて、環状ループ構造は、その非環状対応物よりも高品質の免疫原構築物を提示する（表５、配列番号８８対配列番号８８非環状）。
【０２２８】
要約すると、設計された合成ＩｇＥ−ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物（ＩｇＥ  ＥＭＰＤ１−３９、配列番号８８）と（ＩｇＥ  ＥＭＰＤ７−４０、配列番号９３）のいずれも、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ内のループ構造で表されるＢ細胞エピトープペプチドをもち、これには、頑強な免疫応答を誘導するＵＢＩＴｈ（登録商標）１エピトープペプチドが結合され、中央ループ構造のＣ末端領域に位置することから細胞膜に近接する、ＩｇＥ  ＥＭＰＤタンパク質の新たなエピトープ領域（ａａ２９−４３）を標的とするポリクローナル抗体を生成し、可能な限り多くの膜ＩｇＥの架橋により、ＩｇＥを発現するＢリンパ球を減少させるＡＤＣＣ及びアポトーシスの誘導が可能である（表５）。
【０２２９】
実施例７
ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物のＢ細胞エピトープを限定的に指向することが認められた集中型抗体反応
標的Ｂ細胞エピトープペプチドのそれぞれの担体タンパク質への化学的結合によって、そのようなＢ細胞エピトープペプチドを指向する免疫応答を増強するために使用される担体タンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはジフテリアトキソイド（ＤＴ）及び破傷風トキソイド（ＴＴ）タンパク質などの他の担体タンパク質）はすべて、免疫される宿主において、増強する担体タンパク質を指向する抗体の９０％超を誘発し、標的Ｂ細胞エピトープを指向する抗体の１０％未満を誘発することはよく知られている。
【０２３０】
したがって、本発明のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物によって誘発される抗体の特異性を評価することは関心の対象である。Ｂ細胞エピトープ（配列番号５）がスペーサー配列εＫ−ＫＫＫ（配列番号１２９）によって異種Ｔ細胞エピトープＵＢＩＴｈ（登録商標）１（配列番号７２）に結合された代表的なＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物（配列番号９４）を調製し、免疫原性評価を行った。ＵＢＩＴｈ（登録商標）１（Ｂエピトープ免疫増強に使用されるＴヘルパーペプチド）をプレートに被覆し、免疫されたモルモットの血清を用いて、免疫増強に使用されるＵＢＩＴｈ（登録商標）１ペプチドとの交差反応性を試験した。表７は、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物（配列番号９４）から生成される抗体が、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ（配列番号５）の対応する標的Ｂエピトープに対して高免疫原性を有し、すべてではないものの大半の免疫血清がＵＢＩＴｈ（登録商標）１ペプチド（配列番号７２）に対して非反応性であることが認められたことを示す。
【０２３１】
要約すると、注意深く選択されたＴヘルパーエピトープと結合された標的Ｂ細胞エピトープを組み込んだ免疫原の設計により、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｂ細胞エピトープのみを標的とし、免疫応答の増強にＴｈエピトープを使用しない抗体を誘発する集中的かつ無害な免疫応答が生成される。医薬組成物の設計では、免疫原が生成する免疫応答がより特異的であるほど、それが組成物に与える安全性プロファイルは高くなる。したがって、本発明のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物は、その標的に対する特異性は高いが極めて強力である。
【０２３２】
実施例８
予防的モデルと治療的モデル両方の免疫療法アレルギーワクチンが遺伝子改変ノックインマウスの血清ＩｇＥレベルに与える効果
ＨｕＩＧＨＥ×Ｂａｌｂ／ｃノックインマウスのＦ１子孫である、ヒトＩｇＥを発現する遺伝子操作マウスを使用した概念実証試験において、配列番号８８及び配列番号９３のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物を選択し、一次及び二次／記憶応答でのＩｇＥ生成を評価した。
【０２３３】
最初にＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原の初回−追加免疫を実施した後、アレルゲン（例えば、パパイン）攻撃接種による感作を行った。８匹の動物（ｎ＝８）をそれぞれ６つの治療群と１つのプラセボ群、合計７群に割り付けた。２つのペプチド免疫原のそれぞれについて、０週目、３週目、及び５週目にｉ．ｍ．経路により、９（低）、１８（中）、及び４０（高）μｇ／用量という用量の異なる３つの下位群を設計した。ペプチド免疫原をＩＳＡ  ５１ＶＧ及びＣｐＧのアジュバントと製剤化し、免疫応答を増強する。プラセボ群のマウスには、０週目、３週目、及び５週目に製剤溶液のビヒクルのみを筋肉内に注射した。１０週目と１６週目に、プラセボ群を含む全動物群を皮下経路により５０μｇのパパインとＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄアジュバントで感作させた（図１０）。
【０２３４】
２つのペプチド免疫原による抗体反応（γ１−εｍ６７融合タンパク質に対するＩｇＧ力価）を、実施例２に記載するようなＥＬＩＳＡアッセイにより決定した。０週目、３週目、５週目に種々の用量で免疫した６つの治療群において、全マウスが頑強な抗体反応を示した。ＥＬＩＳＡデータは、抗体価が高い全治療群からの血清試料が３週目から組換えγ１−εｍ６７融合タンパク質に特異的に結合し、２０週目まで高力価を維持したことを示している（図１１）。対照的に、プラセボ群のマウスは、組換えγ１−εｍ６７融合タンパク質に対する特異性抗体を生成しなかった。これらの結果は、全治療群が、ＩｇＥを発現するＢリンパ球を標的とする潜在的な能力をもつ抗ＩｇＥ−ＥＭＰＤ抗体を生成し、ＩｇＥ生成の阻害をもたらすことを示している。図１１は、２０週間の全試験期間を通じて高抗体価が維持されたことを示している。これらの結果はさらに、ペプチド免疫原（配列番号８８及び配列番号９３）が特異的免疫応答を誘導する点で非常に免疫原性が高く、低用量群（９μｇ／用量）でも２つのワクチン免疫原のそれぞれから高力価の抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体を生成することも示している。
【０２３５】
実施例２に記載のアッセイ手順を用いて、血清基礎ＩｇＥレベル及びアレルゲン特異的ＩｇＥレベルを測定することにより、免疫マウスからの一次応答及び記憶応答でのＩｇＥ生成に与える免疫付与効果を調べた。ワクチン接種前及び接種後の血清基礎ＩｇＥレベルを図１２に示す。これは、全治療群のマウス血清基礎ＩｇＥレベルが、プラセボ群の対応する時点のものと比較して徐々に低下することを実証した。感作前の１０週目に、６つの治療群すべてで基礎ＩｇＥレベルが最低レベルまで低下したが、プラセボ群の基礎血清ＩｇＥレベルは顕著には変化しなかった。この結果は、１０週目に、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物（配列番号８８または９３のいずれか）を含有するワクチン製剤を投与された動物において、全治療群における基礎ＩｇＥ生成が、プラセボ群と比較した場合に著しく抑制されたことを示す。図１２はさらに、１０週目と１６週目に２回のアレルゲン感作を行った後も、２０週の試験期間にわたって全治療群の基礎血清ＩｇＥレベルが抑制されたことも示している。
【０２３６】
１２週目の初回免疫と１８週目の２回目の感作でパパインにより誘導されたアレルゲン特異的ＩｇＥ生成をそれぞれ図１３及び図１４に示す。これらの結果は、両方のペプチド免疫原構築物（配列番号８８及び９３）が、プラセボ群と比較した場合、初回免疫後及び二次アレルゲン感作後の両方で、パパイン特異的ＩｇＥレベルを著しく抑制できたことを示している。２つのペプチド免疫原のいずれにおいても、３つの用量レベル間に実質的な差異は観察されなかった。図１３に示すように、本試験において、１２週目の一次応答でのアレルゲン特異的ＩｇＥの生成時、ペプチド免疫原（配列番号８８）は（配列番号９３）よりもわずかに優る機能を示した。両方のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物は、一次応答と記憶応答の両方でプラセボ群と比較した場合、アレルゲン特異的ＩｇＥ生成の著しい抑制を示した（図１３及び１４）。
【０２３７】
ＩｇＥを発現するＢ細胞を標的としてＩｇＥ生成を抑制し、ＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患を治療するＩｇＥ−ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物（配列番号８８及び配列番号９３）の潜在的な治療効果をさらに調べるために、これら２つのペプチド免疫原構築物がＨｕＩＧＨＥノックインマウスの感作／リコール応答に与える効果を評価する追加のプロトコールを設計した。６匹の動物を２つの治療群（Ｎ＝６）それぞれに、４匹の動物をプラセボ群（Ｎ＝４）に割り付け、合計３群にした。ペプチドワクチン接種前と接種後の２回、それぞれ５０μｇパパイン／ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄアジュバントを０週目に皮下経路で１２週目に足蹠経路で全群のマウスに与え感作させた。３週目、６週目、及び８週目に、２つのペプチド免疫原構築物のうち１つを含有する製剤４０μｇ／０．１ｍＬによる初回−追加免疫付与計画を両方の治療群で評価し、プラセボ群にはアジュバントビヒクルのみを投与した（図１５を参照）。
【０２３８】
結果は、パパインに感作させたプラセボを含む全群が、２週間後に全３群で高力価のパパイン特異的ＩｇＧを誘発し、６週目（観察期間の最後）まで高力価を維持することを示した。総血清ＩｇＥとパパイン特異的ＩｇＥのレベルはいずれも２週目で最大レベルに達し、その後３週目まで徐々に減少し、６週目でベースラインに戻った（図１６）。
【０２３９】
ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物によるワクチン接種は、γ１−εｍ６７融合タンパク質を特異的に認識する高力価抗体を誘発した。３週目、６週目、及び８週目にペプチド免疫原を３回注射した後、誘発される抗体ＩｇＧ力価（抗γ１−εｍ６７または抗ＩｇＥ−ＥＭＰＤに対するもの）は着実に上昇し、１０週目で最大レベルに達した（データは示さず）。１２週目の２回目のパパイン感作時には、２つの治療群はいずれもパパイン特異的ＩｇＥレベルの上昇を示さなかったが、プラセボ群ではパパイン特異的ＩｇＥレベルが１２週目及び１３週目に著しく増加した後、１４週目に低下した（データは示さず）。
【０２４０】
試験結果は、配列番号８８及び９３のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの記憶Ｂ細胞のリコール増殖応答を防止する特異的体液性免疫応答を誘導でき、それにより、プラセボ群と比較した場合に１２週目のパパインのリコールによって引き起こされるパパイン特異的ＩｇＥ生成が完全に遮断されたことを示している（図１７）。全体的に本試験は、本開示のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物が抗体反応を誘導して、一次感作からのアレルゲン特異的血清ＩｇＥの生成を阻害するだけでなく、二次アレルゲン攻撃接種によりリコールされるアレルゲン特異的血清ＩｇＥを着実に抑制することを示している。本試験結果は、本開示の発明が、喘息などのＩｇＥ媒介型アレルギー性疾患の治療に対して有効な可能性のある治療ワクチンを提供することを実証している。アレルゲン特異的ＩｇＥを減衰させる治療効果を綿密に検討したところ、両方のペプチド免疫原（配列番号８８及び配列番号９３）は、アレルゲン特異的ＩｇＥ生成の阻害において類似する有効性を示した。
【０２４１】
実施例９
カニクイザルにおけるプロトタイプの免疫療法アレルギーワクチン製剤の免疫原性評価による用量及び製剤試験
ａ．全体目標：
本試験の目的は、選択したＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物、配列番号８８による筋肉内免疫付与が、２０週間にわたり免疫原性に与える効果を評価することであった。ヒト試験の実施前に、プロトタイプのＩｇＥ−ＥＭＰＤペプチドワクチン製剤及び投薬計画の免疫原性を評価するため、動物モデルとしてカニクイザルを選択した。代表的なペプチド免疫原構築物（配列番号８８）を、２つの一般的に使用される製剤に製剤化した。第１の製剤では、配列番号８８のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物をＣｐＧで安定化免疫刺激性複合体にした後、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ５１と混合して油中水型エマルションを形成した（試験パートＡ）。第２の製剤では、配列番号８８のＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原構築物をＣｐＧで安定化免疫刺激性複合体にした後、ＡＤＪＵＰＨＯＳで懸濁製剤を形成した（試験パートＢ）。この包括的な免疫原性試験では、各製剤で、３０μｇ、１００μｇ、３００μｇ、１０００μｇ／用量からなる４通りの投薬を評価した。
【０２４２】
ｂ．プロトコールの概要
２．５〜４．０ｋｇの成体カニクイザルを選択し、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原が免疫原性及びマカク血清ＩｇＥレベルに与える効果を評価した。合計２０匹のマカクを１０群に分け、プラセボ対照動物（ｎ＝２）にはアジュバントのみ（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ  ５１とＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド）または（ＡＤＪＵＰＨＯＳとＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド）を注射した。実験動物に、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原（配列番号８８）を群あたり３０、１００、３００、及び１，０００μｇの用量で注射した（動物あたりワクチン体積合計５００μＬ；ｎ＝群あたり２匹、雄１及び雌１）。０週目、３週目、及び６週目に合計３回の筋肉内免疫付与を施した。０週目、３週目、６週目、８週目、１０週目、１２週目、１４週目、１６週目、２０週目、及び２４週目の免疫原性及び血清ＩｇＥレベルについて全マカクを監視した。
【０２４３】
ｃ．抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体価の決定
０週目、３週目、６週目、８週目、１０週目、１２週目、１４週目、１６週目、２０週目、及び２４週目に全動物から採血した。採血ごとに血清を分離し、γ１−ｃｙｎｏ  ｅｍ６７  ＥＬＩＳＡを使用して抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体価を決定した。プラセボ治療した動物は、検出可能な抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体価がほとんどないか、皆無であった（図１８Ａ及び１８Ｂ）。しかし、３回の免疫付与を受けた動物はすべて、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｂエピトープに対して検出可能なＩｇＧ抗体価を示し、８〜１２週目にピーク力価が得られた。このような特異的反応性は、２４週間の試験全体を通じて用量依存的に維持された（図１８Ａ及び１８Ｂ）。１０００μｇ用量の製剤は、それぞれの製剤でペプチド免疫原がＩＳＡ５１ＶまたはＡＤＪＵＰＨＯＳアジュバントよりも過剰になるため、いずれの製剤でもγ１−ｃｙｎｏ  εｍ６７組換えタンパク質に対する抗血清力価が高い、用量あたり０．５ｍＬ中３００μｇが最も至適であることが全動物で認められた。この結果は、ＩＳＡ５１／ＣｐＧ  ＯＤＮを含有する製剤が、ＡＤＪＵＰＨＯＳ／ＣｐＧ  ＯＤＮを含有する製剤と比較して、免疫原性の結果が高いことを示している。ＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｂ細胞エピトープに対する抗体反応は、各ペプチド免疫原の追加免疫に伴って増強され、その後、抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ力価は経時的に徐々に低下した。著しく高い抗血清力価が、２４週間の試験全体を通じて維持された（図１８Ａ及び１８Ｂ）。
【０２４４】
実施例１０
カニクイザルにおける代用免疫療法アレルギーワクチンの有効性実証
ａ．全体目標：
本試験の目的は、ヒトＩｇＥ生成を綿密に模倣した動物モデルであるカニクイザルにおいて、自己ｍＩｇＥに由来する配列であるＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原による筋肉内免疫付与が、２０週間にわたり免疫原性及び血清ＩｇＥレベルに与える効果を評価することであった。非ヒト霊長類（例えば、新世界及び旧世界ザル、ならびに類人猿）のｍＩｇＥのＩｇＥ  ＥＭＰＤは進化的に保存されており、他の種（例えば、齧歯類、ウサギ、及びイヌ）において当該ＩｇＥ  ＥＭＰＤ対応配列は認められなかった。カニクイザルのＩｇＥ  ＥＭＰＤのアミノ酸配列（配列番号１２７）は、ヒトＩｇＥ  ＥＭＰＤのアミノ酸配列（配列番号２）と高い配列同一性（９０％）を有している。
【０２４５】
ｂ．プロトコールの概要
２．５〜４．０ｋｇの成体カニクイザルを選択し、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原が免疫原性及びマカク血清ＩｇＥレベルに与える効果を評価した。合計１２匹のマカクを３群に分け、プラセボ対照動物（ｎ＝４、雄２及び雌２）にはアジュバントのみ（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ  ５１とＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド）を注射した。実験動物に、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原（配列番号１２５または１２６）を動物あたり３００μｇの用量で注射した（動物あたりワクチン体積合計５００μＬ；ｎ＝群あたり４匹、雄２及び雌２）。０週目、３週目、及び６週目に合計３回の筋肉内免疫付与を施した。０週目、３週目、６週目、８週目、１０週目、１２週目、１４週目、１６週目、１８週目、及び２０週目の免疫原性及び血清ＩｇＥレベルについて全マカクを監視した。
【０２４６】
ｃ．抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体価の決定
０週目、３週目、６週目、８週目、１０週目、１２週目、１４週目、１６週目、１８週目、及び２０週目に全動物から採血した。採血ごとに血清を分離し、γ１−ｃｙｎｏ  ｅｍ６７  ＥＬＩＳＡを使用して抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体価の決定を行った。プラセボ治療した動物は、検出可能な抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体価が皆無であった（図１９）。しかし、配列番号１２５または配列番号１２６のいずれかによる３回の免疫付与を受けた動物はすべて、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ  Ｂエピトープに対して検出可能なＩｇＧ抗体価を示し、８〜１２週目にピーク力価が得られた（図１９）。このような特異的反応性は、２０週間の試験全体を通じて維持された。加えて、免疫された動物はすべて、２０週間にわたって特異的ＩｇＭ及びＩｇＡ抗体価を示した（図２０）。
【０２４７】
ｄ．血清ＩｇＥレベルの測定
０週目、３週目、６週目、８週目、１０週目、１２週目、１４週目、１６週目、１８週目、及び２０週目に全動物から採血した。採血ごとに血清を分離し、定量的マカクＩｇＥ  ＥＬＩＳＡを使用して血清ＩｇＥの測定を行った。プラセボ群での基礎ＩｇＥレベルは、生存局面の期間中に変化した。配列番号１２５を投与した群で観察されたＩｇＥの減少は統計的に有意であったが、配列番号１２６を投与した群でも監視期間中にＩｇＥ減少の傾向を示した（図１９）。
【０２４８】
ｅ．結果
代用モデルにおいて、ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原が、成体カニクイザルの血清試料の自己ｍＩｇＥに対する免疫原性及び血清ＩｇＥ濃度に与える効果を評価した。本概念実証試験では、各群４匹の動物にＣｐＧ  ＯＤＮとＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ  ５１との混合物をプラセボ対照として投与し、８匹の成体カニクイザル（ｎ＝群あたり４匹）には、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）で独自の免疫刺激性複合体（ＩＳＣ）に複合化し、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ  ５１アジュバントで製剤化した３００μｇのマカクＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原、配列番号１２５または１２６のいずれかで０週目、３週目、及び６週目に免疫付与した。配列番号１２５及び１２６はそれぞれ、ヒトＩｇＥ  ＥＭＰＤ免疫原、配列番号９３及び８８の対応物である。ＣｐＧ  ＯＤＮ／Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ  ５１製剤を用いた２つのマカク由来免疫原は、全動物において強力な抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ  ＩｇＧ抗体反応をもたらした（図１９）。さらに、全動物がＩｇＥ  ＥＭＰＤに対するＩｇＭ抗体及びＩｇＡ抗体を発現した（図２０）。マカクの基礎血清ＩｇＥの減少傾向も観察された（図２１）。注射部位の副作用は認められなかった。本試験は、ＵＢＩＴｈ（登録商標）Ｔ細胞エピトープが増強された、自己由来の配列である合成ＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原（配列番号１２５及び１２６）が、強力な抗ＩｇＥ  ＥＭＰＤ抗体反応を誘発して、ＩｇＥ生成の抑制及びマカクの基礎血清ＩｇＥレベルの減少傾向をもたらすことを実証した。
【０２４９】
ｆ．結論
２０週間にわたりＩｇＥ  ＥＭＰＤペプチド免疫原（配列番号１２５及び１２６）またはプラセボ対照を筋肉内経路でカニクイザルに３回注射した。動物は全体的に良好な忍容性を示し、免疫寛容が破壊された。免疫されたマカクはすべて、ＩｇＥ  ＥＭＰＤ構築物の対応するＢ細胞エピトープに対する強力かつ持続的なＩｇＧ（最大１０５）及びＩｇＡ（最大１０４）抗体価の発現と共に、一過性の特異的ＩｇＭ抗体を発現した。あらゆる応答者に基礎ＩｇＥレベルの減少が観察された。これらの結果は、抗体が膜結合型ＩｇＥを発現するＢ細胞を標的とし、引き続きＩｇＥ生成を抑制させるという抗ＩｇＥ−ＥＭＰＤ抗体の作用モードを裏付けている。
【０２５０】
【表１】
2021515744.tif 000003
【０２５１】
【表２】
2021515744.tif 000004
【０２５２】
【表３】
2021515744.tif 000005
【０２５３】
【表４】
2021515744.tif 000006
【０２５４】
【表５】
2021515744.tif 000007
【０２５５】
【表６】
2021515744.tif 000008
【０２５６】
【表７】
2021515744.tif 000009
【０２５７】
【表８】
2021515744.tif 000010
【０２５８】
【表９】
2021515744.tif 000011
【０２５９】
【表１０】
2021515744.tif 000012
【０２６０】
【表１１】
2021515744.tif 000013
【図１】
2021515744.tif 000014
【図２】
2021515744.tif 000015
【図３】
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【図４】
2021515744.tif 000017
【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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