(57)【要約】  本明細書において、治療用タンパク質およびペプチドの経口投与のための組成物が提供され、その組成物は、単離された組み換えによって発現されたボーマン−バーク阻害剤（ＢＢＩ）を含み、そしてその組成物は、治療用タンパク質およびペプチドの改善された持続的活性を提供する。当該組成物の使用の方法も、提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
最大１００キロダルトンの治療用ペプチドまたは治療用タンパク質、二価カチオンのキレート化剤、および単離された組み換えによって発現されたボーマン−バーク阻害剤（ＢＢＩ）を含む、経口医薬組成物。
【請求項２】
前記組み換えによって発現されたＢＢＩが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に明記されるものと少なくとも９５％の同一性を共有する、ヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の経口医薬組成物。
【請求項３】
前記組み換えによって発現されたＢＢＩが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に明記されるものと少なくとも９７％の同一性を共有する、ヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の経口医薬組成物。
【請求項４】
前記組み換えによって発現されたＢＢＩが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に明記されるものと少なくとも９９％の同一性を共有する、ヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の経口医薬組成物。
【請求項５】
前記組み換えによって発現されたＢＢＩが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に明記される、ヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の経口医薬組成物。
【請求項６】
前記組み換えによって発現されたＢＢＩが、イースト系発現系で発現される、請求項１に記載の経口医薬組成物。
【請求項７】
前記イースト発現系が、ピキアパストリスである、請求項６に記載の経口医薬組成物。
【請求項８】
前記製剤が、前記ＢＢＩ以外のトリプシン阻害剤をさらに含む、請求項１に記載の経口医薬組成物。
【請求項９】
前記トリプシン阻害剤がＫＴＩ３である、請求項８に記載の経口医薬組成物。
【請求項１０】
前記ＫＴＩ３が化学的に単離され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定された際に少なくとも８５％の純度に精製されており、あるいは、前記ＫＴＩ３が、ＢＣＡ分析によって測定された際に９５％を超えるタンパク質含有量に精製されている、請求項９に記載の経口医薬組成物。
【請求項１１】
前記ＫＴＩ３が、組み換えによって発現されている、請求項９に記載の経口医薬組成物。
【請求項１２】
前記治療用タンパク質が、代謝に関わる疾患または障害を有する被験体を処置する際に有用である、請求項１−１１のいずれか１項に記載の経口医薬組成物。
【請求項１３】
前記治療用ペプチドまたは治療用タンパク質が、インスリン、インフルエンザ赤血球凝集素、インフルエンザノイラミニダーゼ、グルカゴン、インターフェロンガンマ、インターフェロンベータ、インターフェロンアルファ、成長ホルモン、エリトロポイエチン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１アナログ、レプチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、レニン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、凝固因子、反凝固因子、心房性ナトリウム利尿因子、サーファクタントタンパク質Ａ（ＳＰ−Ａ）、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）、サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）、プラスミノーゲン活性化因子、ボンベシン、造血成長因子（コロニー刺激因子、複数）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）タンパク質、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ（正常なＴ細胞発現および分泌の活性化に関する制御）、ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−α）、血清アルブミン、ミューラー阻害物質、リラキシン、マウスゴナドトロピン放出ホルモン、デオキシリボヌクレアーゼ、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、神経栄養因子、神経栄養因子−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）、神経成長因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子、神経成長因子、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子−Ｉと−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩ）、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ−１）、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５、ＩＧＦＢＰ−６、ケラチノサイト成長因子、骨誘導因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、スーパーオキシドジスムターゼ、解離促進因子、ケモカインファミリーメンバー、および補体因子、から成る群から選択される、請求項１−１１のいずれか１項に記載の経口医薬組成物。
【請求項１４】
前記治療用ペプチドまたは治療用タンパク質が、インスリンおよびＧＬＰ−１アナログから成る群から選択される、請求項１３に記載の経口医薬組成物。
【請求項１５】
前記治療用ペプチドまたは治療用タンパク質が、免疫調節剤である、請求項１３に記載の経口医薬組成物。
【請求項１６】
前記治療用ペプチドまたは治療用タンパク質が、グラチラマーアセテートである、請求項１５に記載の経口医薬組成物。
【請求項１７】
前記キレート化剤がＥＤＴＡである、請求項１−１６のいずれか１項に記載の経口医薬組成物。
【請求項１８】
前記製剤が、オイルベースの液体製剤である、請求項１−１７のいずれか１項に記載の経口医薬組成物。
【請求項１９】
モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、またはその混合物の、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）エステルをさらに含む、請求項１８に記載の経口医薬組成物。
【請求項２０】
前記ＰＥＧエステルが、（ａ）モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロール、またはその混合物と；（ｂ）脂肪酸のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）エステルと、の混合物として提供される、請求項１９に記載の経口医薬組成物。
【請求項２１】
前記混合物の部分（ａ）が、Ｃ８−Ｃ１８モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、およびトリアシルグリセロールを含む、請求項２０に記載の経口医薬組成物。
【請求項２２】
前記混合物の部分（ｂ）が、Ｃ８−Ｃ１８脂肪酸の混合物のＰＥＧモノエステルおよびジエステル、遺伝的に結合されたポリペプチドタグ、またはその組み合わせを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記混合物の部分（ａ）が、Ｃ８−Ｃ１８モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、およびトリアシルグリセロールを含み；前記混合物の部分（ｂ）が、Ｃ８−Ｃ１８脂肪酸の混合物のＰＥＧ−３２モノエステルおよびジエステルを含み；前記オイルベースの液体製剤が、（ｃ）遊離ＰＥＧ−３２を含み；そして、前記混合物の部分（ａ）の、前記混合物の部分（ｂ）と（ｃ）の和に対する、重量／重量比は、１０：９０から３０：７０までである、請求項２０に記載の経口医薬組成物。
【請求項２４】
（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が包括的に、前記オイルベースの液体製剤の８〜１６％重量／重量を構成する、請求項２３に記載の経口医薬組成物。
【請求項２５】
前記オイルベースの液体製剤が、遊離ＰＥＧをさらに含む、請求項１８に記載の経口医薬組成物。
【請求項２６】
前記製剤が、ゼラチンおよびグリセロールを含む、請求項１−１７のいずれか１項に記載の経口医薬組成物。
【請求項２７】
非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１８−２６のいずれか１項に記載の経口医薬組成物。
【請求項２８】
前記非イオン性界面活性剤が、ポリソルベートベースの界面活性剤である、請求項２７に記載の経口医薬組成物。
【請求項２９】
前記ポリソルベートベースの界面活性剤が、ポリソルベート８０である、請求項２８に記載の経口医薬組成物。
【請求項３０】
前記ポリソルベート８０が、前記オイルベースの液体製剤の３〜１０％重量／重量を構成する、請求項２９に記載の経口医薬組成物。
【請求項３１】
前記オイルが魚油である、請求項１−３０のいずれか１項に記載の経口医薬組成物。
【請求項３２】
前記オイルベースの液体製剤が、水を含まない、請求項１−３１のいずれか１項に記載の経口医薬組成物。
【請求項３３】
胃の中での分解に抵抗するコーティングをさらに含む、請求項１−３２のいずれか１項に記載の経口医薬組成物。
【請求項３４】
前記コーティングが、ｐＨに対して高感度なカプセルである、請求項３３に記載の経口医薬組成物。
【請求項３５】
前記コーティングが、ソフトゼラチンカプセルである、請求項３３に記載の経口医薬組成物。
【請求項３６】
被験体に治療用タンパク質を経口投与するための、請求項１−３５のいずれか１項に記載の経口医薬組成物。
【請求項３７】
前記経口医薬組成物が、前記被験体における前記治療用ペプチドまたは治療用タンパク質の急速分解を防止する、請求項３６に記載の、使用のための経口医薬組成物。
【請求項３８】
前記経口医薬組成物が、前記被験体における経口投与された治療用ペプチドまたは治療用タンパク質の持続的活性を促進し、または、前記経口医薬組成物が、前記被験体における経口投与された治療用ペプチドまたは治療用タンパク質の持続的生物学的利用能を促進する、請求項３６に記載の、使用のための経口医薬組成物。
【請求項３９】
経口投与された治療用ペプチドまたは治療用タンパク質の前記持続的活性または前記持続的生物学的利用能が、前記単離された組み換えによって発現されたＢＢＩの代わりに化学的に精製されたＢＢＩを含む、それ以外は同一の経口製剤の使用後に得られた持続的活性または持続的生物学的利用能を上回る、請求項３８に記載の、使用のための経口医薬組成物。
【請求項４０】
前記使用が前記ペプチドまたはタンパク質の治療上有効な量を提供し、あるいは、前記ＢＢＩ、または最大１００キロダルトンの前記治療用ペプチドまたは治療用タンパク質、またはその組み合わせが前記製剤で提供され、それは、前記単離された組み換えによって発現されたＢＢＩの代わりに化学的に精製されたＢＢＩを含む、それ以外は同一の経口製剤における治療上有効なものよりも低濃度であり、そして前記使用が、前記披験者において同等の治療効果を達成する、請求項３６に記載の、使用のための経口医薬組成物。
【請求項４１】
被験体に治療用ペプチドまたは治療用タンパク質を経口投与するための方法であって、前記方法は、被験体に請求項１−３５のいずれか１項に記載の経口医薬組成物を投与する工程であって、それによって被験体に治療用タンパク質を投与する、工程を含む、方法。
【請求項４２】
被験体における経口投与された治療用ペプチドまたは治療用タンパク質の分解を防止する方法であって、前記方法は、被験体に請求項１−３５のいずれか１項に記載の経口医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項４３】
被験体における経口投与された治療用ペプチドまたは治療用タンパク質の持続的活性を促進する方法であって、前記方法は、被験体に請求項１−３５のいずれか１項に記載の経口医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項４４】
被験体における経口投与された治療用ペプチドまたは治療用タンパク質の持続的生物学的利用能を促進する方法であって、前記方法は、被験体に請求項１−３５のいずれか１項に記載の経口医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項４５】
被験体に経口製剤でペプチドまたはタンパク質の治療上有効な量を提供する方法であって、前記方法は、最大１００キロダルトンの治療用ペプチドまたは治療用タンパク質、二価カチオンのキレート化剤、および単離された組み換えによって発現されたボーマン−バーク阻害剤（ＢＢＩ）を含む、経口医薬組成物を調製する工程を含み、ここで、前記ＢＢＩ、または前記最大１００キロダルトンの治療用ペプチドまたは治療用タンパク質、またはその組み合わせは、前記単離された組み換えによって発現されたＢＢＩの代わりに化学的に精製されたＢＢＩを含む、それ以外は同一の経口製剤における治療上有効なものよりも低濃度であり、かつ、前記披験体において同等の治療効果を達成する、前記製剤で提供される、方法。
【請求項４６】
前記組み換えによって発現されたＢＢＩが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に明記されるものと少なくとも９５〜９９％の同一性を共有する、ヌクレオチド配列を有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記組み換えによって発現されたＢＢＩが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に明記される、ヌクレオチド配列を有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記組み換えによって発現されたＢＢＩが、イースト発現系で発現される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記イースト発現系が、ピキアパストリスである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記製剤が、前記ＢＢＩ以外のトリプシン阻害剤をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記トリプシン阻害剤がＫＴＩ３である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＫＴＩ３が化学的に単離され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定された際に少なくとも８５％の純度に精製されており、あるいは、前記ＫＴＩ３が、ＢＣＡ分析によって測定された際に９５％を超えるタンパク質含有量に精製されている、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＫＴＩ３が、組み換えによって発現されている、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記治療用タンパク質が、代謝に関わる疾患または障害を有する被験体を処置する際に有用である、請求項４５−５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記治療用ペプチドまたは治療用タンパク質が、インスリン、インフルエンザ赤血球凝集素、インフルエンザノイラミニダーゼ、グルカゴン、インターフェロンガンマ、インターフェロンベータ、インターフェロンアルファ、成長ホルモン、エリトロポイエチン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１アナログ、レプチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、レニン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、凝固因子、反凝固因子、心房性ナトリウム利尿因子、サーファクタントタンパク質Ａ（ＳＰ−Ａ）、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）、サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）、プラスミノーゲン活性化因子、ボンベシン、造血成長因子（コロニー刺激因子、複数）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）タンパク質、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ（通常のＴ細胞発現および分泌の活性化に関する制御）、ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−α）、血清アルブミン、ミューラー阻害物質、リラキシン、マウスゴナドトロピン放出ホルモン、デオキシリボヌクレアーゼ、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、神経栄養因子、神経栄養因子−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）、神経成長因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子、神経成長因子、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子−Ｉと−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩ）、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ−１）、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５、ＩＧＦＢＰ−６、ケラチノサイト成長因子、骨誘導因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、スーパーオキシドジスムターゼ、解離促進因子、ケモカインファミリーメンバー、および補体因子、から成る群から選択される、請求項４５−５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記治療用ペプチドまたは治療用タンパク質が、インスリンおよびＧＬＰ−１アナログから成る群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５７】
前記治療用ペプチドまたは治療用タンパク質が、免疫調節剤である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記治療用ペプチドまたは治療用タンパク質が、グラチラマーアセテートである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記キレート化剤がＥＤＴＡである、請求項４５−５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記製剤が、オイルベースの液体製剤である、請求項４５−５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、またはその混合物の、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）エステルをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＰＥＧエステルが、（ａ）モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロール、またはその混合物と；（ｂ）脂肪酸のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）エステルと、の混合物として提供される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記混合物の部分（ａ）が、Ｃ８−Ｃ１８モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、およびトリアシルグリセロールを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記混合物の部分（ｂ）が、Ｃ８−Ｃ１８脂肪酸の混合物のＰＥＧモノエステルおよびジエステル、遺伝的に結合されたポリペプチドタグ、またはその組み合わせを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記混合物の部分（ａ）が、Ｃ８−Ｃ１８モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、およびトリアシルグリセロールを含み；前記混合物の部分（ｂ）が、Ｃ８−Ｃ１８脂肪酸の混合物のＰＥＧ−３２モノエステルおよびジエステルを含み；前記オイルベースの液体製剤が、（ｃ）遊離ＰＥＧ−３２を含み；そして、前記混合物の部分（ａ）の、前記混合物の部分（ｂ）と（ｃ）の和に対する、重量／重量比は、１０：９０から３０：７０までである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が包括的に、前記オイルベースの液体製剤の８〜１６％重量／重量を構成する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記オイルベースの液体製剤が、遊離ＰＥＧをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６８】
前記製剤が、ゼラチンおよびグリセロールを含む、請求項６０−６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項４５−６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記非イオン性界面活性剤が、ポリソルベートベースの界面活性剤である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ポリソルベートベースの界面活性剤が、ポリソルベート８０である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記ポリソルベート８０が、前記オイルベースの液体製剤の３〜１０％重量／重量を構成する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記オイルが魚油である、請求項４５−７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記オイルベースの液体製剤が、水を含まない、請求項６０−７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
胃の中での分解に抵抗するコーティングをさらに含む、請求項４５−７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記コーティングが、ｐＨに対して高感度なカプセルである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記コーティングが、ソフトゼラチンカプセルである、請求項７５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において、改善された持続的活性を呈する、組み換えプロテアーゼ阻害剤を含む治療用タンパク質の投与のための、経口組成物が提供される。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質／ペプチドベースの薬物は、一般に、胃腸管での分解に影響を受けやすく、および／または、小腸から血流へ生物活性の形態で効率的に吸収されない。インスリン、エキセナチド（ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）、他のホルモン等などの、タンパク質ベースの薬物のための、経口送達される製剤が開発されて来た。
【０００３】
大豆（ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ））に由来するトリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）およびキモトリプシン（ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）阻害剤は、既に入手可能であり、また、ヒトによる消費にとって安全であると考えられている。そのような阻害剤の１つの例は、ＳＢＴＩ（ｓｏｙｂｅａｎ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ダイズトリプシン阻害剤））と名付けられ、トリプシンを阻害するＫＴＩ（Ｋｕｎｉｔｚ  Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（クニッツトリプシン阻害剤））、および、トリプシンとキモトリプシンを阻害するＢＢＩ（Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ボーマン−バーク阻害剤））で構成される。ＳＢＴＩの様々な市販源は既知であり、また、活性成分を単離するための改良された方法は、例えば特許文献１に説明されており、それは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００４】
ペプチドベースの治療薬、特に代謝疾病を標的とする治療薬、の経口送達のためのプラットフォームテクノロジーの提供に関しては、著しい進歩および期待があり、そう仮定すると、現在の最先端技術を超えてそれを改善する能力は、想像するのが困難なほどである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ／２０１３／１１４３６９
【発明の概要】
【０００６】
驚いたことに、現在、既に経口製剤で持続的効率性を提供することが立証されている、ペプチド／タンパク質ベースの治療薬、エンハンサー／スタビライザ、オメガ−３脂肪酸、およびプロテアーゼ阻害剤（複数可）を含む安定的な経口組成物は、プロテアーゼ阻害剤が組み換えソースに由来する場合、さらに改善され得ることが示されている。
【０００７】
精製されたＫＴＩおよびＢＢＩの別々の調製物を得るために化学的に抽出されたＳＢＴＩは、ＢＢＩとＫＴＩの既知数を、経口製剤に含有される時の既知の純度および活性でそれぞれ有し、既知の疾患を処置する際に効果的な、経口のタンパク質治療薬薬含製剤を調製するのに使用されて来た。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、特許文献１では、ＳＢＴＩの精製のための改善された方法が開発されており、そこでは、各生成物が、それ独自の仕様において高レベルの活性で調製され、高分子量（ＭＷ）汚染物質のレベルが最小化され、高純度の業界収量調製が達成された。
【０００８】
驚いたことに、プロテアーゼ阻害剤が組み換えの異種の生成手段から調製される／由来する場合、下流精製工程が化学的に精製されたプロテアーゼと組み換えによって発現されたプロテアーゼ間で共有されるにもかかわらず、結果として生じる治療用タンパク質／ペプチド活性は、組み換えソースが最初のプロテアーゼ生成ソースに使用された際に、より大きくなり、かつより長い間持続されたということが、現在わかっている。
【０００９】
この発明は、最大１００キロダルトンの治療用ペプチドまたは治療用タンパク質と、二価カチオンのキレート化剤と、そして単離された組み換えによって発現されたＢＢＩとを含む、経口医薬組成物を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、組み換えによって発現されたＢＢＩは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に明記されるものと少なくとも９５％の同一性を共有する、ヌクレオチド配列を有する、あるいは、いくつかの実施形態では、組み換えによって発現されたＢＢＩは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に明記されるものと少なくとも９７％の同一性を共有する、ヌクレオチド配列を有する、あるいは、いくつかの実施形態では、組み換えによって発現されたＢＢＩは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に明記されるものと少なくとも９９％の同一性を共有する、ヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、組み換えによって発現されたＢＢＩは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に明記される、ヌクレオチド配列を有する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、組み換えに発現されたＢＢＩは、イースト発現系（ｙｅａｓｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）で発現され、それは、いくつかの実施形態で、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）イースト発現系で発現される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、組み換えによって表現されたＢＢＩは、異種発現系で発現され、ここで  同様物をコードするヌクレオチド配列は、そのような異種発現系として使用されている有機体におけるコドン使用のために、最適化される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、製剤は前記ＢＢＩ以外に、トリプシン阻害剤をさらに含み、それは、いくつかの実施形態ではＫＴＩ３であり、いくつかの実施形態では化学的に精製され、そして、いくつかの実施形態では組み換えによって発現される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、代謝に関わる疾患または障害を有する被験体を処置する際に有用である。いくつかの実施形態では、治療用ペプチドまたは治療用タンパク質は、インスリン、インフルエンザ赤血球凝集素、インフルエンザノイラミニダーゼ、グルカゴン、インターフェロンガンマ、インターフェロンベータ、インターフェロンアルファ、成長ホルモン、エリトロポイエチン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１アナログ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、レニン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、凝固因子、反凝固因子、心房性ナトリウム利尿因子、サーファクタントタンパク質Ａ（ＳＰ−Ａ）、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）、サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）、プラスミノーゲン活性因子、ボンベシン（ｂｏｍｂｅｓｉｎ）、造血成長因子（コロニー刺激因子、複数）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）タンパク質、エンケファリナーゼ（ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎａｓｅ）、ＲＡＮＴＥＳ（通常のＴ細胞発現および分泌の活性化に関する制御）、ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−α）、血清アルブミン、ミューラー阻害物質、リラキシン、マウスゴナドトロピン放出ホルモン、デオキシリボヌクレアーゼ、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、神経栄養因子、神経栄養因子−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）、神経成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞成長因子、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子−Ｉと−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩ）、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ−１）、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５、ＩＧＦＢＰ−６、ケラチノサイト成長因子、骨誘導因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−７、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、スーパーオキシドジスムターゼ、解離促進因子、ケモカインファミリーメンバー、および補体因子から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、治療用ペプチドまたは治療用タンパク質は、インスリンおよびＧＬＰ−１アナログから成る群から選択される。いくつかの実施形態では、治療用ペプチドまたは治療用タンパク質は、インスリンおよびＧＬＰ−１アナログから成る群、レプチン、ＢＭＰ−４を含む骨形成タンパク質、およびＮＧＦ−１を含む神経成長因子、から選択される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、治療用ペプチドまたは治療用タンパク質は、免疫調節剤であり、そしていくつかの実施形態では、治療用ペプチドまたは治療用タンパク質は、グラチラマーアセテートである。いくつかの実施形態では、治療用ペプチドまたは治療用タンパク質は、自己免疫疾患に関連するアレルゲンあるいは抗原に対する、自己耐性を促進するために提供される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、治療用ペプチドまたは治療用タンパク質は、代謝に関わる疾患または障害の発生または深刻度に対し、処置し、緩和し、防止し、低減させる際に有用である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、この発明は、被験体に治療用ペプチドまたは治療用タンパク質を経口で投与するための、薬物としての使用のための、本明細書に説明されるような経口医薬組成物を提供する。
【００１８】
いくつかの態様では、この発明の経口医薬組成物は、被験体における治療用ペプチドまたは治療用タンパク質の急速分解を防止し、あるいはいくつかの実施形態では、被験体における経口投与された治療用ペプチドまたは治療用タンパク質の持続的活性を促進し、あるいはいくつかの実施形態では、被験体における経口投与された治療用ペプチドまたは治療用タンパク質の持続的生物学的利用能を促進する。この態様によれば、およびいくつかの実施形態では、経口投与された治療用ペプチドまたは治療用タンパク質の持続的活性または持続的生物学的利用能は、前記単離された組み換えによって発現されたＢＢＩの代わりに化学的に精製されたＢＢＩを含む、それ以外は同一の経口製剤の使用後に得られた持続的活性または持続的生物学的利用能を、上回る。
【００１９】
いくつかの実施形態では、この発明は、被験体に治療用タンパク質を経口投与するための、本明細書に説明されるような経口医薬組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、経口医薬組成物は、前記被験体における前記治療用ペプチドまたは治療用タンパク質の急速分解を防止する。いくつかの実施形態では、経口医薬組成物は、前記被験体における経口投与された治療用ペプチドまたは治療用タンパク質の持続的活性を促進する。いくつかの実施形態では、経口医薬組成物は、前記被験体における経口投与された治療用ペプチドまたは治療用タンパク質の持続的生物学的利用能を促進する。いくつかの実施形態では、使用は、前記ペプチドまたはタンパク質の治療上有効な量を提供し、ここで、前記ＢＢＩ、または前記最大１００キロダルトンの治療用ペプチドまたは治療用タンパク質、またはその組み合わせが前記製剤で提供され、それは、前記単離された組み換えによって発現されたＢＢＩの代わりに化学的に精製されたＢＢＩを含む、それ以外は同一の経口製剤における治療上有効なものよりも低濃度であり、そして前記使用は、前記披験者において同等の治療効果を達成する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、この発明は、被験体に治療用ペプチドまたは治療用タンパク質を経口投与するための方法を提供し、当該方法は、被験体に本明細書に説明されるような経口医薬組成物を投与する工程であって、それによって被験体に治療用タンパク質を投与する工程を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、この発明は、被験体における、経口投与された治療用ペプチドまたは治療用タンパク質の分解を防止する方法を提供し、前記方法は、被験体に本明細書に説明されるような経口医薬組成物を投与する工程を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、この発明は、被験体における、経口投与された治療用ペプチドまたは治療用タンパク質の持続的活性を促進する方法を提供し、前記方法は、被験体に本明細書に説明されるような経口医薬組成物を投与する工程を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、この発明は、被験体における、経口投与された治療用ペプチドまたは治療用タンパク質の持続的生物学的利用能を促進する方法を提供し、前記方法は、被験体に本明細書に説明されるような経口医薬組成物を投与する工程を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、この発明は、被験体に、ペプチドまたはタンパク質の治療上有効な量を経口製剤で提供する方法を、提供し、前記方法は、最大１００キロダルトンの治療用ペプチドまたは治療用タンパク質、二価カチオンのキレート化剤、および単離された組み換えによって発現されたボーマン−バーク阻害剤（ＢＢＩ）を含む、経口医薬組成物を調製する工程を含み、ここで、前記ＢＢＩ、または前記最大１００キロダルトンの治療用ペプチドまたは治療用タンパク質、またはその組み合わせが前記製剤で提供され、それは、前記単離された組み換えによって発現されたＢＢＩの代わりに化学的に精製されたＢＢＩを含む、それ以外は同一の経口製剤における治療上有効なものよりも低濃度であり、そして前記披験者において同等の治療効果を達成する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
以下の図は、説明としての例によるものであり、主張される発明を制限するものとして解釈されるものではない。
【図１】精製されたｒＢＢＩのクロマトグラム。ＲＰＨＰＬＣ分析の結果が、利用可能な水準の同様物と重ねて示される。
【図２】ＢＣＡによるタンパク質評価。凍結乾燥された粉末サンプルを、定量化のために、重力測定し、それぞれのバッファ（ＳＯＰ番号：ＱＣ−００６）に溶かし、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度にした。ＢＣＡによる、収量タンパク質結果：９４％
【図３】ｒＢＢＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。電気泳動を実施し、ゲルをスキャンし、Ｓｙｎｇｅｎｅのゲルドキュメンテーションシステムを、ソフトウェアとして画像捕捉用のＧｅｎｅｓｙｓ、デンシトメトリー定量化研究用のＧｅｎｅ  ｔｏｏｌと組み合わせて使用し、バンドを定量化した  。１ミリリットル当たり１ミリグラム（ｍｇ／ｍｌ）のサンプルを、２０％のＰｈａｓｔｇｅｌ（商標）にロードした。レーン１：タンパク質マーカー、レーン２、ブランク、レーン３、還元条件下でｒＢＢＩ２μｇ、レーン４、還元条件下でｒＢＢＩ５μｇ、レーン５、還元条件下でｒＢＢＩ１０μｇ、レーン６、ブランク、レーン７、非還元条件下でｒＢＢＩ２μｇ、レーン４、非還元条件下でｒＢＢＩ５μｇ、  レーン５、非還元条件下でｒＢＢＩ１０μｇ。
【図４−１】キモトリプシン阻害アッセイ。結果は、１ｍｇの阻害剤によって阻害された２．３ｍｇのキモトリプシン示すサンプルを実証した。
【図４−２】キモトリプシン阻害アッセイ。結果は、１ｍｇの阻害剤によって阻害された２．３ｍｇのキモトリプシン示すサンプルを実証した。
【図５−１】トリプシン阻害アッセイ。結果は、１ｍｇの阻害剤によって阻害された１．７ｍｇのトリプシン示すサンプルを実証した。
【図５−２】トリプシン阻害アッセイ。結果は、１ｍｇの阻害剤によって阻害された１．７ｍｇのトリプシン示すサンプルを実証した。
【図６】経口インスリン製剤の投与後の、経時的な平均血糖プロファイル。インビボ研究が、自然源に由来した、または組み換え発現技術を用いて加工された、プロテアーゼ阻害剤（ＢＢＩ）で調製された経口インスリン製剤（８ｍｇ）で処置された、空腹状態のブタで行われた。製剤を内視鏡を使用して十二指腸に挿入し、インスリンの最終用量を４ｍｇにした。血糖濃度の判定用に、血液サンプルを、５時間のモニタリング期間に渡って採取した。８ｍｇのインスリンと１５０ｍｇのＥＤＴＡに加えて、各製剤は、特許文献１に説明されようなＳＢＴＩ、または組み換えＢＢＩ（ｒＢＢＩ）１００ｍｇ、ｒＢＢＩ１００ｍｇと２５ｍｇＫＴＩ、またはｒＢＢＩ５０ｍｇとＫＴＩ２５ｍｇを、示されるように含む。組成物を含むｒＢＢＩを投与された各群は、ＳＢＴＩ開始物質から化学的に精製されたＢＢＩを摂取した動物と比較して、循環ブドウ糖レベルのより急激な低下を経験した。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、１以上の治療用ペプチドまたはタンパク質を含む、改善された経口組成物を提供し、ここで、組み換えプロテアーゼ阻害剤であるＢＢＩが同様物に包含され、それは、化学的に精製された同じプロテアーゼ阻害剤を含む組成物を、それぞれの下流精製工程が同等であるにもかかわらず、性能的に驚くほど凌駕する。驚いたことに、現在、既に経口製剤で持続的な効率性を提供することが立証されている、ペプチド／タンパク質ベースの治療薬、エンハンサー／スタビライザ、オメガ−３脂肪酸、およびプロテアーゼ阻害剤（複数可）を含む安定的な経口組成物は、プロテアーゼ阻害剤が組み換えソースに由来する場合、さらに改善され得ることが示されている。
【００２７】
本発明は、オイルベースの液体製剤を含む経口医薬組成物を提供し、ここで、前記オイルベースの液体製剤は、最大１００キロダルトンの治療用ペプチドまたは治療用タンパク質、二価カチオンのキレート化剤、および単離された組み換えによって発現されたＢＢＩを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、組み換えによって発現されたＢＢＩは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に明記されるものと少なくとも９５％の同一性を共有する、ヌクレオチド配列を有し、あるいは、いくつかの実施形態では、組み換えによって発現されたＢＢＩは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に明記されるものと少なくとも９７％の同一性を共有する、ヌクレオチド配列を有し、あるいは、いくつかの実施形態では、組み換えによって発現されたＢＢＩは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に明記されるものと少なくとも９９％の同一性を共有する、ヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、組み換えによって発現されたＢＢＩ。
【００２９】
本明細書において使用される「タンパク質」、「ペプチド」の用語は、交換可能に使用される。どちらの用語も、限定が明示的に示されている場所を除いて、存在するアミノ酸の数についての限定を与えるものとは意図されていない。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本明細書に説明されるような経口製剤は、組み換えによって発現されたＢＢＩを含み、そしていくつかの実施形態では、説明されているように、例えば大豆粉から単離されたＫＴＩ３などの、従来から市販されているＳＢＴＩ調製物から化学的に精製された、追加的なプロテアーゼ阻害剤をさらに含み得る。
【００３１】
本明細書で実施例４に示される通り、サブクリニカルな４ｍｇのインスリン用量を含む経口製剤は、急速な循環血糖レベルについて優れた血糖制御をもたらし、２５ｍｇのｒＢＢＩが製剤に含まれる場合は、その効果は少なくとも３時間を超えて持続された。この効果は、対照動物において測定された効果の期間よりも、７５％長かった。同様に、８ｍｇのインスリンが投与された場合は、ｒＢＢＩ含有製剤は、化学的に抽出されたＳＢＴＩを含む製剤を、性能面で凌駕した。
【００３２】
ｒＢＢＩ含有調製物に存在する、抗キモトリプシン活性に対する抗トリプシン活性の比については、活性は、１．６：１から１：１までの範囲に及んだ。ｒＢＢＩ含有調製物に存在する、抗キモトリプシン活性に対する抗トリプシン活性の比については、活性は、１．５：１から１：１までの範囲に及ぶことが立証もされた。
【００３３】
他に明示が無い限り、本明細書で参照される抗キモトリプシン活性は、キモトリプシンの１ｍｇ当たり４０ＢＴＥＥ単位の活性を有するキモトリプシンを用いて測定され、試験されているタンパク質１ｍｇ当たりの、阻害されるキモトリプシンのｍｇで表現される。ＢＴＥＥはＮ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンエチルエステル（シグマ−アルドリッチ製品番号Ｂ６１２５用の指示を参照）を指す。
【００３４】
他に明示が無い限り、本明細書で参照される抗トリプシン活性は、トリプシン１ｍｇ当たり１０，０００ＢＡＥＥの活性を有するトリプシンを用いて測定され、試験されているタンパク質１ｍｇ当たりの、阻害されるトリプシンのｍｇで表現される。ＢＡＥＥはＮａ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル溶液（シグマ−アルドリッチ製品番号Ｂ４５００用の指示を参照）を指す。例えば、典型的な分析では、１単位は、１ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル単位（ＢＡＥＥ−Ｕ）ずつトリプシン活性を低下させる阻害剤の量に相当する。１ＢＡＥＥ−Ｕは、ｐＨ７．６および２５°Ｃで、吸収度を毎分０．００１ずつ２５３ｎｍに増加させる酵素の量である。例えば、Ｋ．  Ｏｚａｗａ，  Ｍ．  Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，  １９６６，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２４１：３９５５；  ａｎｄ  Ｙ．  Ｂｉｒｋ，  １９７６，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ４５：７００を参照。
【００３５】
追加的な態様では、大豆粉から単離されたＫＴＩ３が提供され、ここで、様々な実施形態で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ブリリアントブルー染色、またはイメージャ定量法（ｉｍａｇｅｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）による測定時のＫＴＩ３は、少なくとも８５％の純度である。
【００３６】
また別の態様では、大豆粉から単離されたＫＴＩ３が提供され、ここで、ＢＣＡ分析による測定時のＫＴＩ３のタンパク質含有量は９５％より多い。
【００３７】
また別の態様では、大豆粉から単離されたＫＴＩ３が提供され、ここで、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイメージャ定量法による評価時のＫＴＩ３は、０．１％未満の高ＭＷ汚染物質を含む。
【００３８】
当業者は、そのタンパク質含有量、汚染物質のレベル、または有効性に関する、上記純度要件の各々が、一般に、ＫＴＩ３が医薬組成物の１以上の他の成分と混合される前に、評価されることを理解するであろう。
【００３９】
さらなる実施形態では、上述の医薬組成物は、胃の中での分解に抵抗するコーティングを含む。より具体的な実施形態では、コーティングは、ｐＨに対して高感度なカプセルであるか、または代替的に、ソフトゼラチンカプセルである。
【００４０】
他の実施形態では、上述の医薬組成物は、活性成分として最大１００キロダルトンの治療用タンパク質をさらに含む。他の実施形態では、活性成分は、ヒトの消化管における分解または不活性化に敏感な、非タンパク分子である。
【００４１】
別の実施形態では、オイルベースの液体製剤を含む、経口医薬組成物が提供され、ここで、オイルベースの液体製剤は、最大１００キロダルトン（ｋＤａ）の治療用タンパク質、二価カチオンのキレート化剤、および本明細書に説明される組み換えＢＢＩ、そして随意に追加的なプロテアーゼ阻害剤を含む。他の実施形態では、液体製剤は、実質的に、最大１００ｋＤａの治療用タンパク質、二価カチオンのキレート化剤、本明細書において説明されるような組み換えＢＢＩ、およびオイルから成る。他の実施形態では、液体製剤は、実質的に、最大１００ｋＤａの治療用タンパク質、二価カチオンのキレート化剤、本明細書において説明されるような組み換えＢＢＩ、オイル、および乳化剤から成る。他の実施形態では、液体製剤は、実質的に、最大１００ｋＤａの治療用タンパク質、二価カチオンのキレート化剤、本明細書において説明されるような組み換えＢＢＩ、オイル、および２つの乳化剤から成る。
【００４２】
別の態様では、オイルベースの液体製剤を含む、経口医薬組成物を供給され、ここで、オイルベースの液体製剤は、前記液体製剤が、液体製剤の１ｍｌ当たり少なくとも５０ｍｇのキモトリプシンが阻害される、抗キモトリプシン活性を有するように、最大１００ｋＤａの治療用タンパク質と、二価カチオンのキレート化剤と、本明細書で説明されるような組み換えＢＢＩと、を含む。他の実施形態では、液体製剤は、液体製剤１ｍｌ当たり、少なくとも３５、４０、４５、５５または６０ｍｇのキモトリプシンが阻害される、抗キモトリプシン活性を有する。さらに他の実施形態では、液体製剤は、液体製剤１ｍｌ当たり、３５−７０、４０−７０、４５−７０、５０−７０、または４０−６０ｍｇの範囲のキモトリプシンが阻害される、抗キモトリプシン活性を有する。他の実施形態では、液体製剤は、液体製剤１ｍｌ当たり、少なくとも２５ｍｇのトリプシンが阻害される、抗トリプシン活性をさらに含む。他の実施形態では、液体製剤は、液体製剤１ｍｌ当たり、少なくとも３０、３５、４０、４５、または５０ｍｇのトリプシンが阻害される、抗トリプシン活性をさらに含む。代替的に、液体製剤は、液体製剤１ｍｌ当たり、２５−５０、３０−５０、３５−５０、２５−４０、または２５−４５ｍｇの範囲のトリプシンが阻害される、抗トリプシン活性をさらに含む。
【００４３】
別の態様では、（ａ）本明細書で説明されるような組み換えＢＢＩ、最大１００キロダルトンの治療用タンパク質、および二価カチオンのキレート化剤の調製物を提供する工程；および、（ｂ）本明細書で説明されるような前記組み換えＢＢＩ、治療用タンパク質、およびキレート化剤を、オイルベースの液体製剤へ混合する工程、を含む、医薬組成物を作り出すための方法が、提供される。さらに、他の含有成分、および存在し得る追加的含有成分についての本明細書に説明される実施形態の各々は、この方法に組み込まれ得る。他の実施形態では、この方法で作り出された医薬組成物が提供される。
【００４４】
本明細書において使用される時の「液体」は、２０°Ｃで、１〜１０００ミリパスカル秒の範囲内の粘性を有する組成物を指す。魚油は、例えば、周囲条件下では液体である。その用語は、オイルベースの溶液、懸濁液およびその組み合わせを含む。
【００４５】
ある実施形態では、ＢＢＩはボーマン−バーク阻害剤を指す；Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０１０５５［データベースアクセス２０１３年１月２８日］）。
【００４６】
ＢＢＩの代表的な前駆体シーケンスは次のとおりである：
【００４７】
【化１】
2021527641.tif 000002
【００４８】
いくつかの実施形態で、本明細書で使用される時のＫＴＩは、ＫＴＩ３を指す。（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０１０７０：データベースアクセス２０１３年１月３日）。ＫＴＩ３の代表的な前駆体シーケンスは次のとおりである：
【００４９】
【化２】
2021527641.tif 000003
【００５０】
いくつかの態様では、ＫＴＩ３は、化学的に精製され、例えば大豆粉から精製されたものとして市販され、本明細書に説明されるような経口組成物に含まれ得る。他の態様では、ＫＴＩ３は同様に組み換えよって生成され得る。
【００５１】
追加的プロテアーゼ阻害剤
【００５２】
当該技術分野で既知のトリプシン阻害剤はトリプシンに特有であり、他方、他は、トリプシン、およびキモトリプシンなどの他のプロテアーゼを阻害する。トリプシン阻害剤は、動物または植物源に由来し得る：例えば、大豆、トウモロコシ、アオイマメ、および他の豆、カボチャ、ヒマワリ、牛および他の動物の膵臓と肺、鶏および七面鳥の卵白、大豆ベースの乳児用調製粉乳、および哺乳類の血液。トリプシン阻害剤はまた、微生物起源であり得る：例えばアンチパイン；Ｈ．  Ｕｍｅｚａｗａ，  １９７６，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ４５，６７８を参照。トリプシン阻害剤はまた、アルギニンまたはリジンミミック（ｌｙｓｉｎｅ  ｍｉｍｉｃ）、あるいは他の合成化合物であり得る：例えば、アリールグアニジン、ベンズアミジン、３，４−ジクロロイソクマリン、ジイソプロピルフルオロホスファート、ガベキサートメシレート、またはフッ化フェニルメタンスルホニル。本明細書に使用される場合、アルギニンまたはリジンミミックは、トリプシンのＰ１ポケットに結合することができ、および／または、トリプシン活性部位機能を妨害することができる化合物である。
【００５３】
ある実施形態では、説明される方法および組成物で活用される追加的トリプシン阻害剤は、アオイマメトリプシン阻害剤とアプロチニン、（別名、膵臓トリプシン阻害剤または基本的な膵臓トリプシン阻害剤［ＢＰＴＩ］；Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ００９７４［データベースアクセス２０１３年１月２日］、Ｋａｚａｌ阻害剤（膵分泌トリプシン阻害剤）、Ｋａｚａｌ阻害剤（膵分泌トリプシン阻害剤）、オボムコイド、アルファ１−抗トリプシン、コルチゾール結合グロブリン、Ｃｅｎｔｅｒｉｎ（［ＳＥＲＰＩＮＡ９／ＧＣＥＴ１（胚芽中心Ｂ細胞発現転写物１）］、ＰＩ−６（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９５）、ＰＩ−８（Ｓｐｒｅｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９９５）、ボマピン（Ｂｏｍａｐｉｎ）、クレードＡセルピン（ｃｌａｄｅ  Ａ  ｓｅｒｐｉｎ）、［例えば、Ｓｅｒｐｉｎａ３（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１２）、Ｓｅｒｐｉｎａ６（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：８６６）、Ｓｅｒｐｉｎａ１２（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１４５２６４）；Ｓｅｒｐｉｎａ１０（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５１１５６）；Ｓｅｒｐｉｎａ７（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６９０６）；Ｓｅｒｐｉｎａ９（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３２７６５７）；Ｓｅｒｐｉｎａ１１（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２５６３９４）；Ｓｅｒｐｉｎａ１３（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３８８００７）；Ｓｅｒｐｉｎａ２（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３９０５０２）；およびＳｅｒｐｉｎａ４（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５１０４）］ユコピン（Ｙｕｋｏｐｉｎ）（Ｓｅｒｐｉｎｂ１２；遺伝子ＩＤ：８９７７７）、アンチパイン、ベンズアミジン、３，４−ジクロロイソクマリン、ジイソプロピルフルオロホスファート、およびガベキサートメシレート、から成る群から選択される。他の実施形態では、上記阻害剤の１つが選択される。
【００５４】
アプロチニンの代表的な前駆体シーケンスは次のとおりである：
【００５５】
【化３】
2021527641.tif 000004
【００５６】
他の実施形態では、説明される方法と組成物で活用されるオイルベースの液体製剤は、組み換えＢＢＩと、単離された、または組み換えのＫＴＩ、あるいは、単離されそして組み換えられたアプロチニンの両方、またはその組み合わせ、を含む。
【００５７】
ある実施形態では、説明される方法と組成物で活用されるｒＢＢＩ、および、ＫＴＩなどの随意の第２のプロテアーゼ阻害剤は、もしあれば、保存料を使用して保管されている。他の実施形態では、ｒＢＢＩと、ＫＴＩなどの随意の第２のプロテアーゼ阻害剤は、保存料を使用せずに調製されそして保管されている。
【００５８】
治療用タンパク質
【００５９】
本明細書に説明される組成物および方法のための治療用タンパク質は、いくつかの実施形態では、説明される医薬組成物への含有前に単離される。これに関する「単離される」は、均質化された組織調製物、またはかなりの量の汚染タンパク質を含む他の形態としての治療用タンパク質の提供を除外する。単離されたタンパク質またはペプチドの好ましい例は、組み換えタンパク質またはペプチドである。より一層好ましい実施形態は、合成タンパク質であり、換言すると、無細胞装置で生産されたタンパク質である。当業者は、本開示に照らして、野生型および変異型の両方の治療用タンパク質が活用され得ることを理解するであろう。
【００６０】
あるタンパク質およびペプチドは、トリプシンおよび／またはキモトリプシンの特異的阻害剤であると知られており、トリプシンおよび／またはキモトリプシン阻害剤であるとして本明細書に説明されるものを含むが、それらに限定されない。そのようなタンパク質は、説明される組成中の治療成分としての使用が意図されておらず、また、本明細書で使用される時の「治療用タンパク質」の定義から除外される。
【００６１】
当業者は、本開示に照らして、様々な治療用タンパク質が、説明される方法と組成物で使用され得ることを理解するであろう。ある実施形態では、治療用タンパク質は、最大１００キロダルトン（ｋＤａ）のサイズで、一般に１〜１００ｋＤａである。より具体的な実施形態では、サイズは最大９０ｋＤａである。他の実施形態では、サイズは最大８０ｋＤａである。他の実施形態では、サイズは最大７０ｋＤａである。他の実施形態では、サイズは最大６０ｋＤａである。他の実施形態では、サイズは最大５０ｋＤａである。好ましくは、サイズは１〜９０ｋＤａである。他の実施形態では、サイズは１〜８０ｋＤａである。他の実施形態では、サイズは１〜７０ｋＤａである。他の実施形態では、サイズは１〜６０ｋＤａである。他の実施形態では、サイズは１〜５０ｋＤａである。
【００６２】
本明細書における使用に適した治療用タンパク質は、（非アミノ酸部分のタンパク質への共有結合によって）修飾された誘導体を含む。例えば、限定ではないが、タンパク質は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、融合タンパク質として遺伝的に付加されたポリペプチド、または既知の保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）／保護基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）による誘導体化によって、修飾されたタンパク質を含む。高ＭＷのＰＥＧは、多機能リンカーを伴って、または伴わずに、ＰＥＧの、Ｎ末端またはＣ末端への部位特異的結合を通して、またはリジン残基に存在するイプシロンアミノ基を介して、治療用タンパク質に結合され得る。追加的に、誘導体は、１以上の非古典的なアミノ酸を含み得る。
【００６３】
ある、より具体的な実施形態では、説明される方法と組成物で活用される治療用タンパク質は、インスリン、インフルエンザ赤血球凝集素、インフルエンザノイラミニダーゼ、グルカゴン、インターフェロンガンマ、インターフェロンベータ、インターフェロンアルファ、成長ホルモン、エリトロポイエチン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１アナログ、レプチン、果粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、レニン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、凝固因子（例えば第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩＣ因子、ＤＣ因子、組織因子（ＴＦ）およびトロンビン）、反凝固因子（例えばタンパク質Ｃ）、心房性ナトリウム利尿因子、サーファクタントタンパク質Ａ（ＳＰ−Ａ）、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）、サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）、プラスミノーゲン活性化因子（例えばウロキナーゼまたはヒトの尿またはヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ））、ボンベシン、造血成長因子（別名コロニー刺激因子、複数）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）タンパク質（例えばＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＮＦβ−２，４−１ＢＢＬ）、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ（正常なＴ細胞発現および分泌の活性化に関する制御）、ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−α）、血清アルブミン、ミューラー阻害物質、リラキシン、マウスゴナドトロピン放出ホルモン、デオキシリボヌクレアーゼ、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、神経栄養因子（例えば脳由来神経栄養因子［ＢＤＮＦ］）、神経栄養因子−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）、神経成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（例えばα−ＦＧＦおよびβ−ＦＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦ−１、ＴＧＦ−２、ＴＧＦ−３、ＴＧＦ−４、およびＴＧＦ−５を含む、ＴＧＦαとＴＧＦβ）、ＮＧＦ−１を含む神経成長因子、インスリン様成長因子−Ｉと−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩ）、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、（ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５、およびＩＧＦＢＰ−６を含む）インスリン様成長因子結合タンパク質、ケラチノサイト成長因子、骨誘導因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、Ｍ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１からＩＬ−１３と、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２３）、スーパーオキシドジスムターゼ、解離促進因子、ケモカインファミリーメンバー（例えば、イオタキシンとＭＣＰ−１）、および補体因子（例えばＣ３とＣ５）から成る群から選択される。
【００６４】
さらに他の態様では、この発明の経口製剤への組み込みのための治療用タンパク質／ペプチドは、例えば、遺伝的欠陥が、代謝経路に不可欠な内因性酵素の構造的欠陥または欠如をもたらす、遺伝性代謝疾患に苦しむ患者における、酵素補充療法（ＥＲＴ）として機能する。これらの代謝障害はその後、基質および／またはその中間体の蓄積をもたらし、病的状態につながる。例えば、そしていくつかの実施形態では、治療用タンパク質／ペプチドは、グルコセレブロシダーゼ、アルファガラクトシダーゼ、酸アルファグルコシダーゼ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼ、アリールスルファターゼＡ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、アルカリフォスファターゼ、ピリドキサール５−ホスフェート、ポルホビリノゲンデアミナーゼ、およびフェニルアラニンアンモニアリアーゼを含み得る。
【００６５】
他の実施形態では、治療用タンパク質／ペプチドは、既存の内因性経路を増大させることにより、または新規の触媒機能を働かせることによって、病的状態の症状を緩和するのに役立つ。そのような治療用酵素は、腫瘍学から神経筋機能障害、止血法、そして美容整形にすら及ぶ、様々な病的状態で成功裡に活用されて来た。例えば、そしていくつかの実施形態では、治療用タンパク質／ペプチドは含み得る
【００６６】
アルテプラーゼ（Ａｌｔｅｐｌａｓｅ）、レテプラーゼ（Ｒｅｔｅｐｌａｓｅ）、テネクテプラーゼ（Ｔｅｎｅｃｔｅｐｌａｓｅ）、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ（Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）、ストレプトキナーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ）、アニストレプラーゼエミナーゼ（Ａｎｉｓｔｒｅｐｌａｃｅ  Ｅｍｉｎａｓｅｓ）、ドロトレコギン−ａ（Ｄｒｏｔｒｅｃｏｇｎｉｎ−ａ）、第ＶＩＩａ因子（Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ）、ヒト凝固因子ＶＩＩａ（ｈｕｍａｎ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ）、Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、カルボキシペプチダーゼラスブリカーゼ（Ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｒａｓｂｕｒｉｃａｓｅ）、アデノシンデアミナーゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、ボツリヌス毒素Ａ型、ヒアルロニダーゼ（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）等。
【００６７】
他の実施形態では、治療用タンパク質／ペプチドは、第ＶＩＩａ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、ｖＷＦ、タンパク質Ｃ、抗トロンビンＩＩＩ、フィブリノーゲン、Ｃ１エステラーゼ阻害剤、アルファ−１プロティナーゼ阻害剤（α１−ＰＩ）、グルコセレブロシダーゼ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ  Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、ヘパランサルフェートスルファターゼ、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、アルファ−グルコシダーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、アルファ−マンノシダーゼ（Ａｌｐｈａ−ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ）、アリールスルファターゼＡ（Ａｒｙｌｓｕｌｐｈａｔａｓｅ  Ａ）、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）、スクラーゼ−イソマルターゼ（Ｓｕｃｒａｓｅ−ｉｓｏｍａｌｔａｓｅ）、アデノシンデアミナーゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ）インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、アルカリフォスファターゼ、ポルホビリノゲンデアミナーゼ、またはその組み合わせを、含み得る。
【００６８】
さらにより具体的な実施形態では、治療用タンパク質はインスリンである。代替的に、治療用タンパク質は、ＧＬＰ−１阻害剤であっても良い。ある、より具体的な実施形態では、治療用タンパク質はエキセナチドである。他の実施形態では、インスリンとエキセナチドの両方が、説明される組成物中に存在する。他の実施形態では、液体製剤は、実質的に、インスリン、エキセナチド、二価カチオンのキレート化剤、単離されたＢＢＩ、およびオイルから成る。他の実施形態では、液体製剤は、実質的に、インスリン、エキセナチド、二価カチオンのキレート化剤、単離されたＢＢＩ、少なくとも１つの乳化剤、およびオイルから成る。さらに他の実施形態では、液体製剤は、実質的に、インスリン、エキセナチド、二価カチオンのキレート化剤、単離されたＫＴＩ３、アプロチニン、およびオイルから成る。さらなる実施形態では、液体製剤は、実質的に、インスリン、エキセナチド、二価カチオンのキレート化剤、単離されたＫＴＩ３、アプロチニン、少なくとも１つの乳化剤、およびオイルから成る。
【００６９】
当業者は、本開示に照らして、様々なタイプのインスリンが、説明される方法と組成物に適していることを理解するだろう。例示的なインスリンタンパク質は、野生型インスリン、および、合成ヒトインスリン、合成ウシインスリン、合成ブタインスリン、合成クジラインスリン、および、インスリンの金属錯体、例えばインスリンの亜鉛錯体、プロタミン亜鉛インスリン、およびグロビン亜鉛、を含む変異インスリンの両方を含むが、それらに限定されない。
【００７０】
例えば、即効性のインスリン、レンテ（ｌｅｎｔｅ）インスリン、セミレンテ（ｓｅｍｉｌｅｎｔｅ）インスリン、ウルトラレンテ（ｕｌｔｒａｌｅｎｔｅ）インスリン、ＮＰＨインスリン、グラルギンインスリン、リスプロ（ｌｉｓｐｒｏ）インスリン、アスパルト（ａｓｐａｒｔ）インスリン、またはインスリンの上記タイプの２以上の組み合わせなどの、様々なクラスのインスリンも利用され得る。
【００７１】
特に好ましい実施形態では、説明される方法と組成物のインスリンは、野生型ヒトインスリン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ０１３０８）である。１１０のアミノ酸のうち、１−２４はシグナルペプチドであり、２５−５４はインスリンＢ鎖を形成し、５７−８７はＣペプチドを形成し、そして９０−１１０はインスリンＡ鎖を形成する。１つの好ましい実施形態では、ヒトインスリンは、細菌細胞中の組み換えタンパク質として作り出される。別の好ましい実施形態では、ヒトインスリンは、合成的に作り出される。
【００７２】
ＧＬＰ−１アナログはまた、当該技術分野ではＧＬＰ−１模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）と呼ばれる。当業者は、本開示に照らして、説明される組成物が、以下のＧＬＰ−１アナログの少なくとも１つを含み得ることを理解するだろう：エキセナチド（Ｂｙｅｔｔａ（商標）ＣＡＳ番号１４１７３２−７６−５）、リキシセナチド（ｌｉｘｉｓｅｎａｔｉｄｅ）（ＣＡＳ番号３２０３６７−１３−３）、リラグルチド（ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）（ＣＡＳ番号２０４６５６−２０−２）、エキセンディン−９（ｅｘｅｎｄｉｎ−９）（ＣＡＳ番号１３３５１４−４３−９）、ＡＣ３１７４（［Ｌｅｕ（１４）］エキセンディン−４、Ａｍｙｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．）、タスポグルチド（ｔａｓｐｏｇｌｕｔｉｄｅ）（ＣＡＳ番号２７５３７１−９４−３）、アルビグルチド（ａｌｂｉｇｌｕｔｉｄｅ）（ＣＡＳ番号７８２５００−７５−８）、セマグルチド（ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅ）（ＣＡＳ番号９１０４６３−６８−２）、ＬＹ２１８９２６５（ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ（商標）；ＣＡＳ番号９２３９５０−０８−７）、およびＣＪＣ−１１３４−ＰＣ（ＣｏｎｊｕＣｈｅｍ（商標）によって製造された組み換えヒトアルブミンに結合する修飾されたエキセンディン−４アナログ）。すべてのＣＡＳ記録は、２０１１年１２月１９日にアクセスされた。このように、ある実施形態では、説明される方法または組成物は、上に列挙されたＧＬＰ−１アナログのいずれかを活用する。他の実施形態では、上に列挙されたＧＬＰ−１アナログの１つが選択される。当業者は、本明細書に提示される所見に照らして、他のＧＬＰ−１アナログもまた、説明される方法と組成物に活用され得ることを、認識するだろう。
【００７３】
いくつかの実施形態では、「治療用ペプチド」または「治療用タンパク質」への言及は、任意のそのような分子を含むように意図され、被験体に提供されると、有益な効果を提供する。いくつかの場合には、分子は、被験体におけるそのような分子の欠如または存在の減少を、置き換えるように機能するという点で、治療用となる。一実施形態では、分子は、外来タンパク質の経口送達によって補われている内因性ヌル変異体の場合においてなどで、欠如しているタンパク質の代替となる。他の実施形態では、内因性タンパク質は、変異させられ、非機能性タンパク質を作り出し、異種機能性タンパク質の経口送達によって補われる。他の実施形態では、異種タンパク質の経口送達は、低内因性レベルに付加的であり、所与のタンパク質の累積的で増強された利用可能性をもたらす結果となる。他の実施形態では、分子は、発現または分泌、あるいは細胞または宿主機能のための重要な要素のその他を提供するシグナル伝達カスケードを刺激する。
【００７４】
乳化剤
【００７５】
本明細書で参照される、乳化剤と界面活性剤の「重量／重量」パーセントは、例えば魚油などの、製剤中のオイル基剤の量を分母として利用する；そのため、５００ｍｇの魚油中の６０ｍｇのＧｅｌｕｃｉｒｅは、他の成分の重量にかかわらず、１２％ｗ／ｗと見なされる。同様に、５００ｍｇの魚油に混合された５０ｍｇのツイーン−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）は、１０％のツイーン−８０と見なされる。
【００７６】
ある実施形態において、説明される方法と医薬組成物に活用されるオイルベースの液体製剤、そして、別の実施形態において、存在するオイルベースの液体製剤の各々は、治療用タンパク質、キレート化剤、およびＢＢＩに加え、例えばモノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、あるいはその混合物のＰＥＧエステルなどの、脂肪酸のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）エステルを含む。より具体的な実施形態では、ＰＥＧエステルは、（ａ）遊離モノアシルグリセロール、遊離ジアシルグリセロール、遊離トリアシルグリセロール、またはそれらの混合物；および、（ｂ）脂肪酸のＰＥＧエステル、例えば、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、またはそれらの混合物、との混合物として提供され得る。この点に関し、用語「モノアシルグリセロール」、「ジアシルグリセロール」、および「トリアシルグリセロール」の各々は、単一の化合物を指す必要は無く、むしろ、例えば、様々な長さの脂肪酸を有するモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、またはトリアシルグリセロールの混合物などの、化合物の混合物を含み得る。ある好ましい実施形態では、例えば一般のＰＥＧエステルに用いられるものである、説明される方法と組成物で活用される、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、またはトリアシルグリセロールは、一般に安全と認められている（ＧＲＡＳ）オイルソースに由来するものである。ＧＲＡＳオイルの例は、ココナツオイル、トウモロコシオイル、ピーナツオイル、大豆オイル、Ｍｙｖａｃｅｔ  ９−４５（Ｃ−１８脂肪酸のジアセチル化モノアシルグリセロール）である。（ａ）のより具体的な実施形態は、Ｃ８−Ｃ１８モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、およびトリアシルグリセロールの混合物である。成分（ｂ）のより具体的な実施形態は、１以上のＣ８−Ｃ１８脂肪酸のＰＥＧモノエステルおよびジエステルの混合物である。
【００７７】
より具体的な実施形態では、液体製剤は、脂肪酸のＰＥＧエステルに加えて、遊離ＰＥＧをさらに含む。さらにより具体的な実施形態では、追加的な、例えばポリソルベートベースの界面活性剤などの非イオン界面活性剤が、ＰＥＧエステルと遊離ＰＥＧに加えて存在する。
【００７８】
説明される方法と組成物のさらにより具体的な実施形態では、液体製剤は次のものを含む：（ａ）Ｃ８−Ｃ１８モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、およびトリアシルグリセロールの混合物；（ｂ）Ｃ８−Ｃ１８脂肪酸の混合物のＰＥＧ−３２モノエステルおよびジエステル；そして（ｃ）遊離ＰＥＧ−３２。さらにより具体的な実施形態では、成分（ａ）の、成分（ｂ）＋（ｃ）の合計に対する重量／重量比は、１０：９０〜３０：７０；より具体的には、１５：８５〜２５：７５；より具体的には、２０：８０、である。ある実施形態では、成分（ａ）−（ｃ）は包括的に、８〜１６％重量／重量比のオイルベースの液体製剤を構成する。より具体的な実施形態では、量は、９〜１５％である。より具体的な実施形態では、量は、１０〜１４％である。より具体的な実施形態では、量は、１１〜１３％である。より具体的な実施形態では、量は１２％である。
【００７９】
他の実施形態では、説明される方法と医薬組成物で活用されるオイルベースの液体製剤は、治療用タンパク質、キレート化剤、およびＢＢＩに加えて、自己乳化成分を含む。自己乳化成分のいくつかの実施形態は、既出の段落で説明される成分の混合物であるが、これらの混合物は、本明細書で使用される用語「自己乳化成分」の定義を限定するものではない。本明細書で使用される「自己乳化成分」は、エマルジョンを自然に形成する成分を指す。一般に、そのような成分は、水性溶媒と接触するとエマルジョンを形成し、微細分散、つまりマイクロエマルジョン（ＳＭＥＤＤＳ）を形成する。そのような成分のある実施形態は、トリアシルグリセロールと親水／親油バランス（ＨＬＢ；Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＷＣ：  ”Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＢ  Ｖａｌｕｅｓ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ｉｏｎｉｃ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ，”  Ｊ  Ｓｏｃ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  ５：２５９  （１９５４）を参照）サーファクタントとの、トリアシルグリセロール混合物を含む。自己乳化成分の他の実施形態は、ワックス状の半固体粘度を有する。
【００８０】
好ましくは、説明される方法と組成物で活用される自己乳化成分のＨＬＢは、１０以上である。他の実施形態では、それは、１１〜１９である。他の実施形態では、それは、１２〜１８である。他の実施形態では、それは、１２〜１７である。他の実施形態では、それは、１２〜１６であり、それはオイル−イン−ウォーター（Ｏ／Ｗ）の乳化剤を示す。他の実施形態では、それは、１３〜１５である。他の実施形態では、それは１４である。自己乳化成分のさらにより具体的な実施形態は、１２〜１６のＨＬＢを有し、そして、ＰＥＧ、遊離トリアシルグリセロール、および遊離ＰＥＧに結合する、中鎖および長鎖のトリアシルグリセロールを含む。他の実施形態では、自己乳化成分は、１２〜１６のＨＬＢを有し、そして、ＰＥＧ、遊離トリアシルグリセロール、および遊離ＰＥＧに結合する、中鎖および長鎖のトリアシルグリセロールの混合物から成る。他の実施形態では、自己乳化成分は、１４のＨＬＢを有し、そして、ＰＥＧ、遊離トリアシルグリセロール、および遊離ＰＥＧに結合する、中鎖および長鎖のトリアシルグリセロールを含む。他の実施形態では、自己乳化成分は、１４のＨＬＢを有し、そして、ＰＥＧ、遊離トリアシルグリセロール、および遊離ＰＥＧに結合する、中鎖および長鎖のトリアシルグリセロールの混合物から成る。
【００８１】
ある、より具体的な実施形態は、（ａ）モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロール、またはそれらの混合物と；そして（ｂ）脂肪酸のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）エステルと、を含む、自己乳化成分を活用する。この点に関し、用語「モノアシルグリセロール」、「ジアシルグリセロール」、および「トリアシルグリセロール」の各々は、単一の化合物を指す必要は無く、むしろ、例えば、様々な長さの脂肪酸を有するモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、またはトリアシルグリセロールの混合物などの、化合物の混合物を含み得る。より具体的な実施形態は、Ｃ８−Ｃ１８モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、およびトリアシルグリセロールの混合物である。成分（ｂ）のより具体的な実施形態は、Ｃ８−Ｃ１８脂肪酸の混合物のＰＥＧモノエステルおよびジエステルの混合物である。
【００８２】
他の、より具体的な実施形態では、自己乳化成分は、遊離ＰＥＧをさらに含む。
【００８３】
説明される組成物および方法での使用のための、あるＰＥＧ部分は、５−１００の間のモノマーを含む。より具体的な実施形態では、ＰＥＧは、１５−５０の間のモノマーを含み得る。より具体的な実施形態では、ＰＥＧは、２５−４０の間のモノマーを含み得る。より具体的な実施形態では、ＰＥＧは、３２のモノマーを含み得る。
【００８４】
説明される方法と組成物のさらにより具体的な実施形態では、そこで使用される自己乳化成分は：（ａ）Ｃ８−Ｃ１８モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、およびトリアシルグリセロールの混合物；（ｂ）Ｃ８−Ｃ１８脂肪酸の混合物のＰＥＧ−３２モノエステルおよびジエステル；そして（ｃ）遊離ＰＥＧ−３２、を含み、また、成分（ａ）の、成分（ｂ）＋（ｃ）に対する重量／重量比は、２０：８０である。ある実施形態では、そのような成分は、８〜１６％重量／重量比のオイルベースの液体製剤を構成する。より具体的な実施形態では、量は、９〜１５％である。より具体的な実施形態では、量は、１０〜１４％である。より具体的な実施形態では、量は、１１〜１３％である。より具体的な実施形態では、量は１２％である。
【００８５】
上記仕様を充足する自己乳化成分の例は、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ（商標）４４／１４、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ（商標）５３／１０、およびＧｅｌｕｃｉｒｅ（商標）５０／１３である。より具体的な実施形態は、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ（商標）４４／１４である。接尾辞４４と１４は、それぞれ、その融点、およびその親水／親油バランス（ＨＬＢ）を指す。Ｇｅｌｕｃｉｒｅ（商標）４４／１４（Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ  ＳＡＳ、Ｓａｉｎｔ−Ｐｒｉｅｓｔ、フランス）は、水素化したココナツオイル（ＰＥＧ−３２を伴う中鎖および長鎖のトリアシルグリセロール）のポリグリコール分解によって得られる。それは、１４の親水／親油バランスを有する。それは、Ｃ８−Ｃ１８モノ−、ジ−、およびトリアシルグリセロールの定義された混和物（２０重量／重量％）と；ＰＥＧ−３２モノエステルおよびジエステル、および遊離ＰＥＧ−３２（８０重量／重量％）と、で構成される。存在する主たる脂肪酸はラウリン酸で、全脂肪酸含有量のうち平均４５％を占める。それは、ヘリカル構造の１２０Åのラメラ相下のＰＥＧエステル画分と、六角形のパッキング下のアシルグリセロール画分で構成される、固体分散体である。Ｇｅｌｕｃｉｒｅ（商標）４４／１４のシミュレーションされた胃腸の脂肪分解の主産物は、ＰＥＧ−３２モノエステルおよびジエステルである。より具体的な実施形態では、説明される組成物は、約１２％のＧｅｌｕｃｉｒｅ４４／１４を唯一の乳化剤として含み、あるいは、他の実施形態では、別の乳化剤と共に含む。他の実施形態では、説明される組成物は、約１２％のＧｅｌｕｃｉｒｅ４４／１４と約１０％のツイーン８０を含む。
【００８６】
非イオン性界面活性剤
【００８７】
ある実施形態では、説明される方法と医薬組成物で活用されるオイルベースの液体製剤は、自己乳化成分に加えて、非イオン性界面活性剤をさらに含む。ある実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート−２０、ポリソルベート−４０、ポリソルベート８０、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシオイル１０、５０、および６０、グリセロールモノステアレート、ポリソルベート４０、６０、６５、および８０、蔗糖脂肪酸エステル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、トライトン（登録商標）−Ｘ−１００、トライトン（登録商標）−Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（商標）、Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ（エチレングリコールエーテル）ｎ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、およびＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、から成る群から選択される。他の実施形態では、上に列挙された非イオン界面活性剤の１つが選択される。
【００８８】
ある、より具体的な実施形態では、説明される方法と組成物で使用される非イオン性界面活性剤は、ポリソルベートベースの界面活性剤である。ポリソルベートベースの界面活性剤の例は、脂肪酸に共有結合するポリエトキシル化ソルビタンに由来する界面活性剤である。ポリソルベートベースの界面活性剤のより具体的な実施形態は、ポリソルベート−２０、ポリソルベート−４０、およびポリソルベート−８０である。
【００８９】
例えば、ポリソルベート８０（ツイーン８０）は、ポリエトキシル化ソルビタンおよびオレイン酸に由来する非イオン性界面活性剤であり、以下の構造を有する：
【００９０】
【化４】
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【００９１】
ポリソルベート８０の場合、右側に示される部分が脂肪酸の混合物であり、（示されるように）６０−７０％のオレイン酸と、主にリノール酸、パルミチン酸、およびステアリン酸である残りを含む。
【００９２】
より具体的な実施形態では、ポリソルベート８０は、説明される方法と組成物で使用されるオイルベースの液体製剤の、３〜１５％重量／重量比を構成する。より具体的な実施形態では、パーセントは、１０〜１４％である。より具体的な実施形態では、パーセントは、７〜１２％である。より具体的な実施形態では、パーセントは１０％、または代替として５％である。
【００９３】
二価カチオンのキレート化剤
【００９４】
説明される方法と組成物で活用される二価カチオンのキレート化剤は、一実施形態では、カルシウム、マグネシウム、およびマンガンイオンの少なくとも１つに高親和性を有する、任意の生理学的に許容可能な化合物である。別の実施形態では、キレート化剤は、シトレート、またはその塩；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、またはその塩（例えば、二ナトリウムＥＤＴＡやカルシウム二ナトリウムＥＤＴＡ）；ＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）、またはその塩；ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、またはその塩；およびＢＡＰＴＡ（１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸）、またはその塩、から成る群から選択される。他の実施形態では、上に列挙されたキレート化剤の１つが活用される。より具体的な実施形態では、キレート化剤はＥＴＤＡである。
【００９５】
オイル
【００９６】
当業者は、本所見に照らして、様々なオイルが、説明される組成物の液相の基剤として活用され得ることを理解するだろう。ある実施形態では、オイルは、周囲温度で液状である任意の生理学的に許容可能なオイルであり得る。
【００９７】
より具体的な実施形態では、オイルは、ω−３脂肪酸を含む。他の実施形態では、ω−３脂肪酸は、ω−３多価不飽和脂肪酸である。別の実施形態では、ω−３脂肪酸は、ω−３、多価不飽和、２２炭素脂肪酸で、４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸とも呼ばれる、ＤＨＡである。別の実施形態では、ω−３脂肪酸は、−−リノレン酸（９，１２，１５−オクタデカトリエン酸）である。別の実施形態では、ω−３脂肪酸は、ステアリドン酸（９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸）である。別の実施形態では、ω−３脂肪酸は、エイコサトリエン酸（ＥＴＡ；１１，１４，１７−エイコサトリエン酸）である。別の実施形態では、ω−３脂肪酸は、エイコサテトラエン酸（８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸）である。一実施形態では、ω−３脂肪酸は、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ；５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸）である。別の実施形態では、ω−３脂肪酸は、エイコサヘキサエン酸（５，７，９，１１，１４，１７−エイコサヘキサエン酸とも呼ばれる）である。別の実施形態では、ω−３脂肪酸は、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ；７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸）である。別の実施形態では、ω−３脂肪酸は、テトラコサヘキサエン酸（６，９，１２，１５，１８，２１−テトラコサヘキサエン酸）である。
【００９８】
他の実施形態では、オイルは、ω−３脂肪酸を含む、天然オイルである。より具体的な実施形態では、オイルは、魚油、キャノーラオイル、アマニオイル、藻オイル（ａｌｇａｌ  ｏｉｌ）、およびヘンプシードオイル（ｈｅｍｐ  ｓｅｅｄ  ｏｉｌ）から成る群から選ばれる。より具体的な実施形態では、オイルは魚油である。魚油のいくつかのタイプが、説明される組成物で試験され、全て同じようにうまく機能することがわかっている。
【００９９】
他の実施形態では、説明される方法または組成物で活用される液体製剤は、水分を含まない。「水分を含まない」というのは、ある実施形態では、水性成分が意図的に全く追加されていない製剤を指す。この製剤は、大気からその成分へと吸収された極微量の水分の存在を、除外しない。別の実施形態では、液体製剤は、水性成分を含まない。さらに他の実施形態では、１以上のオイルは、液体製剤の唯一の液体成分である。より具体的な実施形態では、魚油は、液体製剤の唯一の液体成分である。
【０１００】
コーティング
【０１０１】
当業者は、本所見に照らして、ｐＨに対して高感度な様々なコーティングが、説明される方法と組成物で活用され得ることを理解するだろう。ある実施形態では、被験体の胃の中での組成物の消化を阻害する任意のコーティングが、利用され得る。
【０１０２】
他の実施形態では、コーティングは、生分解性多糖類を含む。他の実施形態では、ヒドロゲルが活用される。他の実施形態では、コーティングは、以下の賦形剤の１つを含む：キトサン、アクアコートＥＣＤコーティング（ａｑｕａｃｏａｔ  ＥＣＤ  ｃｏａｔｉｎｇ）、アゾ−架橋結合ポリマー（ａｚｏ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ）、酢酸フタル酸セルロース、酢酸セルローストリメリテート（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｃｅｔａｔｅ  ｔｒｉｍｅｌｌｉｔａｔｅ）（ＣＡＴ）、酢酸酪酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、またはポリ酢酸ビニルフタレート。
【０１０３】
他の実施形態では、Ｐｕｌｓｉｎｃａｐ（商標）などの徐放性のシステムが活用される。
【０１０４】
好ましい実施形態では、説明されるコーティングされた剤形は、ｐＨが、胃の中の範囲に対してアルカリ性である腸に見られる範囲に到達すると、（オイルベースの製剤を含む）コアを放出する。より具体的な実施形態では、コーティングは、ｐＨに対して高感度なポリマーを含む。様々な実施形態では、単一層または多重層のコーティングのいずれかが、活用され得る。
【０１０５】
一実施形態では、コーティングは腸溶性コーティングである。腸溶性コーティングのための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｓｉｅｐｍａｎｎ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ  ２００５を参照）。より具体的な実施形態では、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（商標）コーティングが、腸溶性コーティングとして活用される。Ｅｕｄｒａｇｉｔ（商標）コーティングは、アクリルポリマーであり、その使用は当技術分野で周知である。
【０１０６】
別の実施形態では、マイクロカプセレーション（ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）が、説明される組成物での耐胃性コーティングとして使用される。マイクロカプセレーションのための方法は、当技術分野で周知である。
【０１０７】
他の実施形態では、コーティングはカプセルであり、そのうち、ゼラチンカプセルがより具体的な実施形態である。オイルベースの製剤をゼラチンカプセルへ挿入するための方法は、当技術分野で周知である。さらに別の実施形態では、コーティングは、ソフトゲルであり、腸溶性のコーティングが施されたカプセルである。
【０１０８】
別の実施形態では、オイルベースの液体製剤を含む、経口医薬組成物が提供され、ここで、オイルベースの液体製剤は、最大１００キロダルトンの治療用タンパク質、二価カチオンのキレート化剤、単離されたキモトリプシン／トリプシン阻害剤、単離されたトリプシン阻害剤、および脂肪酸のＰＥＧエステルを含む。他の実施形態では、液体製剤は、液体製剤１ｍｌ当たり、少なくとも５０ｍｇのキモトリプシンが阻害される、抗キモトリプシン活性を有する。他の実施形態では、液体製剤は、液体製剤１ｍｌ当たり、少なくとも５０ｍｇのキモトリプシンが阻害される、抗キモトリプシン活性、および、液体製剤１ｍｌ当たり、少なくとも２５のトリプシンが阻害される、抗トリプシン活性の、両方を有する。他の実施形態では、遊離ＰＥＧも存在する。他の実施形態では、非イオン性界面活性も存在する。他の実施形態では、液体製剤は、実質的に、最大１００キロダルトンの治療用タンパク質、二価カチオンのキレート化剤、キモトリプシン／トリプシン阻害剤、トリプシン阻害剤、および脂肪酸のＰＥＧエステルから成る。他の実施形態では、液体製剤は、実質的に、最大１００キロダルトンの治療用タンパク質、二価カチオンのキレート化剤、キモトリプシン／トリプシン阻害剤、トリプシン阻害剤、脂肪酸のＰＥＧエステル、および遊離ＰＥＧから成る。他の実施形態では、液体製剤は、実質的に、最大１００キロダルトンの治療用タンパク質、二価カチオンのキレート化剤、キモトリプシン／トリプシン阻害剤、トリプシン阻害剤、脂肪酸のＰＥＧエステル、遊離ＰＥＧ、および非イオン性界面活性剤から成る。
【０１０９】
代表的な製剤
【０１１０】
ある代表的なインスリン製剤は、インスリン、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ４４／１４、ＥＤＴＡ、ＳＢＴＩ、およびアプロチニンを、魚油に含み、カプセルでコーティングされている。ある代表的なエキセナチド製剤は、エキセナチド、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ４４／１４、ＥＤＴＡ、ＳＢＴＩ、およびアプロチニンを、魚油に含み、カプセルでコーティングされている。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本発明は、以下の成分を有する製剤を提供する：８−２０％のＧｅｌｕｃｉｒｅ４４／１４；１カプセル当たり２５−５０ｍｇのｒＢＢＩ、２５−５０ｍｇの単離されたＫＴＩ；１００−２００ｍｇのＥＤＴＡ；そして、１カプセル当たり２−３２ｍｇのインスリン、および／または、１カプセル当たり１５０−６００ｍｃｇのエキセナチドであり得る治療用タンパク質を伴い、これら全てが、０．５−０．７ｍｌの魚油内に組み合わせられている。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、本発明は、以下の成分を有する製剤を提供する：８−２０％のＧｅｌｕｃｉｒｅ４４／１４；１カプセル当たり１２．５−２５ｍｇのｒＢＢＩ、１２．５−２５ｍｇの単離されたＫＴＩ；１００−２００ｍｇのＥＤＴＡ；そして、１カプセル当たり２−３２ｍｇのインスリン、および／または、１カプセル当たり１５０−６００ｍｃｇのエキセナチドであり得る治療用タンパク質を伴い、これら全てが、０．５−０．７ｍｌの魚油内に組み合わせられている。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本発明は、以下の成分を有する製剤を提供する：１カプセル当たり１２．５−２５ｍｇのｒＢＢＩ、１２．５−２５ｍｇの単離されたＫＴＩ；１００−２００ｍｇのＥＤＴＡ；そして、１カプセル当たり２−３２ｍｇのインスリン、および／または、１カプセル当たり１５０−６００ｍｃｇのエキセナチドであり得る治療用タンパク質を伴い、これら全てが、０．５−０．７ｍｌの魚油内に組み合わせられている。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、本発明は、以下の成分を有する製剤を提供する：１カプセル当たり２５−５０ｍｇのｒＢＢＩ、２５−５０ｍｇの単離されたＫＴＩ；１００−２００ｍｇのＥＤＴＡ；そして、１カプセル当たり２−３２ｍｇのインスリン、および／または、１カプセル当たり１５０−６００ｍｃｇのエキセナチドであり得る治療用タンパク質を伴い、これら全てが、０．５−０．７ｍｌの魚油内に組み合わせられている。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本発明は、以下の成分を有する製剤を提供する：１カプセル当たり５０−１００ｍｇのｒＢＢＩ、５０−１００ｍｇの単離されたＫＴＩ；１００−２００ｍｇのＥＤＴＡ；そして、１カプセル当たり２−３２ｍｇのインスリン、および／または、１カプセル当たり１５０−６００ｍｃｇのエキセナチドであり得る治療用タンパク質を伴い、これら全てが、０．５−０．７ｍｌの魚油内に組み合わせられている。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、本発明は、以下の成分を有する製剤を提供する：１カプセル当たり７５−１２５ｍｇのｒＢＢＩ、７５−１２５ｍｇの単離されたＫＴＩ；１００−２００ｍｇのＥＤＴＡ；そして、１カプセル当たり２−３２ｍｇのインスリン、および／または、１カプセル当たり１５０−６００ｍｃｇのエキセナチドであり得る治療用タンパク質を伴い、これら全てが、０．５−０．７ｍｌの魚油内に組み合わせられている。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、説明されるような組み換えＢＢＩとインスリンを含む製剤は、循環血糖レベルのより急速かつ定性的に大幅な低下を実証し、その効果は、大豆調製物から化学的に精製されたＢＢＩを含む製剤で達成されたものより、長い間持続される。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本明細書に説明されるような組み換えＢＢＩと治療用タンパク質またはペプチドベースの治療薬を含む製剤は、大豆調製物から化学的に精製されたＢＢＩを含む製剤で達成されたものより、長期間にわたり、持続的効力という観点から、より大きな治療的枠組みを提供し、このことは、投与後の局所効果において、あるいはいくつかの実施形態では投与後の循環タンパク質／ペプチドレベルにおいて、証明され得る。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に説明されるような組み換えＢＢＩと治療用タンパク質またはペプチドベースの治療薬とを含む製剤は、組み換えＢＢＩの投与後に、同等またはより長期間にわたる持続的効力を提供し、あるいは、同等またはより多い循環タンパク質／ペプチドレベルを提供し、その組み換えＢＢＩ濃度は、他の点では同一の製剤における、大豆調製物から化学的に精製されたＢＢＩの濃度よりも低い。
【０１２０】
この態様によって、およびいくつかの実施形態おいて、本発明の製剤で提供される組み換えＢＢＩ濃度は、他の点では同等または同一の製剤で使用される、大豆調製物から化学的に精製されＢＢＩの濃度よりも、少なくとも３０％、またはいくつかの実施形態では少なくとも３５％、またはいくつかの実施形態では少なくとも４０％、またはいくつかの実施形態では少なくとも４５％、またはいくつかの実施形態では少なくとも５０％、またはいくつかの実施形態では少なくとも５５％、またはいくつかの実施形態では少なくとも６０％またはいくつかの実施形態では少なくとも６５％またはいくつかの実施形態では少なくとも７０％またはいくつかの実施形態では少なくとも７５％、低くなるだろう。
【０１２１】
本発明の製剤に関する「他の点では同等または同一」という用語への言及は、同じ主要成分を考慮するものであり、主要成分として、タンパク質／ペプチド、ＢＢＩまたはＫＴＩプロテアーゼ阻害剤、ＥＤＴＡ、および／または魚油、または魚油由来のω−３脂肪酸が挙げられるが、製剤の他の成分は、当業者によって認識される通りに同等であって良い。
【０１２２】
一実施形態では、以下の成分を有する製剤が提供される：８−２０％のＧｅｌｕｃｉｒｅ４４／１４；１カプセル当たり５０−１００ｍｇのｒＢＢＩ、または、ｒＢＢＩ／単離された、または組み換えのＫＴＩの混合物；１カプセル当たり２０−３０ｍｇのアプロチニン；および１００−２００ｍｇのＥＤＴＡ；そして、１カプセル当たり８−３２ｍｇのインスリン、および／または、１カプセル当たり１５０−６００ｍｃｇのエキセナチドであり得る治療用タンパク質を伴い、これら全てが、０．５−０．７ｍｌの魚油内に組み合わせられる。
【０１２３】
別の実施形態では、魚油に、インスリン、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ４４／１４、ＥＤＴＡ、ｒＢＢＩ、ＫＴＩ、およびアプロチニンを含む、代表的な液体インスリン製剤が提供される。
【０１２４】
他の実施形態では、液体製剤は、実質的に、インスリン、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ４４／１４、ＥＤＴＡ、ｒＢＢＩ、ＫＴＩ、アプロチニン、および魚油から成る。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、製剤は、０．５−０．７ｍｌの魚油に、８ｍｇのインスリン、１２％のＧｅｌｕｃｉｒｅ４４／１４、１５０ｍｇのＥＤＴＡ、合計７５ｍｇのｒＢＢＩとＫＴＩ、および２４ｍｇのアプロチニン；あるいは、いくつかの実施形態では、０．５−０．７ｍｌの魚油に、１６ｍｇのインスリン、１２％のＧｅｌｕｃｉｒｅ４４／１４、１５０ｍｇのＥＤＴＡ、合計７５ｍｇのｒＢＢＩとＫＴＩ、および２４ｍｇのアプロチニン；あるいは、いくつかの実施形態では、０．５−０．７ｍｌの魚油に、１６ｍｇのインスリン、１２％のＧｅｌｕｃｉｒｅ４４／１４、１５０ｍｇのＥＤＴＡ、合計１５０ｍｇのｒＢＢＩとＫＴＩ、および２４ｍｇのアプロチニン；を含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本発明は製剤を提供し、ここで、組成物の、抗トリプシン活性の抗キモトリプシン活性に対する比は、約１．２８：１である。いくつかの実施形態では、前述の量のｒＢＢＩのみを含む製剤が、プロテアーゼ阻害活性に十分であり、これには追加的なプロテアーゼは含まれない。
【０１２７】
他の実施形態では、上記組成物は、非イオン性界面活性剤をさらに含む。より具体的な実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポリソルベートベースの界面活性剤である。さらにより具体的な実施形態では、ポリソルベートベースの界面活性剤は、ポリソルベート８０である。好ましくは、ポリソルベート８０は、３〜１０％重量／重量比のオイルベースの液体製剤を構成する。
【０１２８】
液体製剤は、ソフトゲルであって良く、腸溶性のコーティングが施されたカプセルであって良い。この段落に説明される具体的な製剤は、ある実施形態において、同じ成分を同じ比で含む、尺度増および尺度減された製剤を含む。
【０１２９】
いくつかの代表的な経口エキセナチド製剤は、魚油に、エキセナチド、ＥＤＴＡ、ｒＢＢＩ、ＫＴＩ、およびアプロチニンを含む。他の実施形態では、液体製剤は、実質的に、エキセナチド、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ４４／１４、ＥＤＴＡ、ｒＢＢＩ、ＫＴＩ、アプロチニン、および魚油から成る。より具体的な製剤は、０．５−０．７ｍｌの魚油に、１５０マイクログラム（ｍｃｇ）のエキセナチド、１５０ｍｇのＥＤＴＡ、合計７５ｍｇのｒＢＢＩとＫＴＩ、および２４ｍｇのアプロチニン；０．５−０．７ｍｌの魚油に、３００ｍｃｇのエキセナチド、１５０ｍｇのＥＤＴＡ、合計７５ｍｇのｒＢＢＩとＫＴＩ、および２４ｍｇのアプロチニン；および０．５−０．７ｍｌの魚油に、３００ｍｃｇのエキセナチド、１５０ｍｇのＥＤＴＡ、合計１５０ｍｇのｒＢＢＩとＫＴＩ、および２４ｍｇのアプロチニン、を含むいくつかの実施形態では、前述の量のｒＢＢＩのみを含む製剤が、プロテアーゼ阻害活性に十分であり、これには追加的なプロテアーゼは含まれない。
【０１３０】
さらに具体的な製剤では、組成物の、抗トリプシン活性の抗キモトリプシン活性に対する比は、１．５：１から１：１までである。さらにより具体的な実施形態では、比は、約１．２８：１である。液体製剤は、ソフトゲルであって良く、腸溶性のコーティングが施されたカプセルであって良い。他の実施形態では、上記組成物は、非イオン性界面活性剤をさらに含む。より具体的な実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポリソルベートベースの界面活性剤である。さらにより具体的な実施形態では、ポリソルベートベースの界面活性剤は、ポリソルベート８０である。好ましくは、ポリソルベート８０は、３〜１０％重量／重量比のオイルベースの液体製剤を構成する。液体製剤は、ソフトゲルであって良く、腸溶性のコーティングが施されたカプセルであって良い。
【０１３１】
治療的指標
【０１３２】
他の態様では、本明細書に説明されるｒＢＢＩの使用が、活性成分を被験体に経口投与するための薬物の調製物で、提供される。
【０１３３】
さらに別の態様では、医薬組成物を作り出す方法が提供され：（ａ）本明細書に説明されるｒＢＢＩと活性成分とを含む混合物を精製する工程；および（ｂ）混合物を、薬学的に許容可能な製剤に製剤化する工程、の、工程を含む。
【０１３４】
本明細書で参照されるように、製剤化する工程は、随意に、望ましい医薬組成物に適切な、賦形剤を追加すること、製粉すること、コーティングすること等の工程を含む。これらの工程は、十分に当業者の能力内である。
【０１３５】
ある実施形態では、本明細書に参照される活性成分は、ヒトの消化管における分解または不活性化に敏感である。
【０１３６】
別の態様では、活性成分を被験体に経口投与するための、本明細書に説明される経口医薬組成物が提供される。ある好ましい実施形態では、活性成分は、ヒトの消化管における分解または不活性化に敏感である。より具体的な実施形態では、活性成分は、治療用タンパク質であり得る。他の実施形態では、活性成分は、ヒトの消化管における分解または不活性化に敏感な、非タンパク分子である。
【０１３７】
別の態様では、本明細書に説明される経口医薬組成物の使用が、治療用タンパク質を被験体に経口投与するための薬物の調製物で、提供される。
【０１３８】
別の態様では、被験体に治療用タンパク質を経口投与するための方法を提供し、当該方法は、被験体に本明細書に説明される経口医薬組成物を投与する工程であって、それによって被験体に治療用タンパク質を経口投与する工程を含む。
【０１３９】
別の態様では、ヒトの糖尿病を処置するための、本明細書に説明される医薬組成物が提供され、ここで、いくつかの実施形態では、治療用タンパク質が、様々な実施形態で、インスリン、エキセナチド、またはその組み合わせである。
【０１４０】
さらに別の態様では、ヒトの糖尿病を処置するための、本明細書に説明される成分の組み合わせの使用が、薬物の調製物で提供され、ここで、いくつかの実施形態では、治療用タンパク質が、様々な実施形態で、インスリン、エキセナチド、またはその組み合わせである。
【０１４１】
さらに別の態様では、糖尿病を処置するための方法が提供され、当該方法は、そのような処置を必要とする被験体に、本明細書に説明される医薬組成物を投与する工程を含み、ここで、いくつかの実施形態では、治療用タンパク質が、様々な実施形態で、インスリン、エキセナチド、またはその組み合わせであり、これにより糖尿病を処置するものである。ある実施形態では、被験体はヒト被験体であり、一方、他の実施形態では、被験体はヒト以外の哺乳動物である。
【０１４２】
追加的な態様では、ヒトの不安定型糖尿病を処置するための、本明細書に説明される医薬組成物が提供される。別の態様では、本明細書に説明される医薬組成物は、ヒトの高空腹時血糖レベルを処置するために提供される。
【０１４３】
さらに別の態様では、本明細書に説明される成分の組み合わせの使用が、ヒトの不安定型糖尿病を処置するための薬物の調製物で、提供される。さらに、本明細書に説明される成分の組み合わせの使用が、ヒトの高空腹時血糖レベルを処置するための薬物の調製物で、提供される。
【０１４４】
さらに、不安定型糖尿病を処置する方法が提供され、当該方法は、そのような処置を必要とする被験体に、本明細書に説明される医薬組成物を投与する工程を含み、これによって不安定型糖尿病を処置する。さらに、高空腹時血糖レベルを減じるための方法が提供され、当該方法は、そのような処置を必要とする被験体に、本明細書に説明される医薬組成物を投与する工程を含み、これによって高空腹時血糖を減じる。ある好ましい実施形態では、被験体はヒト被験体である。
【０１４５】
不安定型糖尿病
【０１４６】
当技術分野における熟達した医師は、血糖不安定性としても知られる不安定型糖尿病が、多くの許容可能な標準手順によって診断され得ることを理解するだろう、１つのそのような手順は、Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２００４に見つけられる。この手順では、被験体は、自分達の血糖レベルを、一日に最低２つの毛細血管血糖値で、モニタリングするように依頼される。患者は、全ての測定血糖値、および低血糖症発生に関する詳細を、４週間の期間にわたって、シートに記録する。血糖が＜３．０のｍｍｏｌ／ｌとして記録されるいずれの場合にも、被験体は、どのような症状が起こり、低血糖反応を認識あるいは処置するいずれかのために、第三者からの外部支援が得られたか否かを含む、その出来事に関する詳細を、アンケートに記載するように依頼される。個人が状況のコントロールを失い、低血糖イベントを処置するために外部支援を必要とした場合、反応は深刻であると考えられる。他のそのような方法は、ＭＡＧＥインデックス（Ｓｅｒｖｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ  １９７０）、または「Ｍ値」（Ｓｃｈｌｉｃｈｔｋｒｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ）の計算を含むか、あるいは、継続的な血糖値モニタリングシステム（Ｋｅｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ）を活用する。不安定型糖尿病は、一般に、高空腹時血糖および／または低血糖の発症に関連する。
【０１４７】
本発明は、当業者によって認識されるであろう通り、いずれの形態の糖尿病をも含む、本明細書に説明されるような様々な疾患／障害を処置するための経口組成物を考慮することを理解されたい。
【０１４８】
一実施形態では、「処置すること」または「処置」という用語は、予防ならびに障害寛解処置を含む。「減じること」、「抑えること」、および「阻害すること」という用語は、一般に理解されている減じることという意味を有し、あるいは、疾患、障害、または疾病の、発生、重症度または発症機序を、別の実施形態では減少させること、別の実施形態では遅らせること、別の実施形態では減じることという意味を有する。実施形態では、処置という用語は、疾患、障害、または疾病に関連する症状の、進行の遅延、長期にわたる寛解、発生の低下、または改善を指す。一実施形態では、「処置すること」「減じること」、「抑えること」、または「阻害すること」という用語は、示される疾患、障害、または疾病に関連して、罹患率、死亡率、またはその組み合わせの低下を指す。一実施形態では、「進行」という用語は、範囲または重症度が増加すること、進行すること、増長すること、または悪化すること指す。別の実施形態では、「再発」という用語は、疾患の再発を意味する。一実施形態では、発明の処置の方法は、当該疾患の重症度を下げ、あるいは別の実施形態では、当該疾患に関連する症状を下げ、あるいは別の実施形態では、疾患時に発現されたバイオマーカーの数を減じる。
【０１４９】
一実施形態では、「処置すること」という用語とその含まれる様は、示される疾患、障害、または疾病を有する被験体へ、あるいはいくつかの実施形態では、示される疾患、障害、または疾病に罹患しやすい被験体への、投与を指す。「に罹患しやすい」という用語は、とりわけ、示される疾患の発生率、重症度などの、傾向的または統計的増加に関連する、遺伝的プロファイルあるいは家族関係を指すとみなされるべきである。いくつかの実施形態で、「に罹患しやすい」という用語は、とりわけ、示される疾患の上昇するリスクに関連するライフスタイルを指すとみなされるべきである。いくつかの実施形態では、「に罹患しやすい」という用語は、とりわけ、示される疾患に関連するバイオマーカーの存在を指すとみなされるべきであり、例えば、癌では、癌「に罹患しやすい」という用語は、示される癌のための前癌状態の先駆物質の存在を含み得る。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、「発病機序を減じること」という用語は、特定の疾患、障害または疾病に関連する、組織損傷または器官損傷を減じることを包含することを理解されたい。別の実施形態では、「発病機序を減じること」という用語は、関連する疾患、障害、または疾病の、発生率または重症度を減じることを包含することを理解されたい。別の実施形態では、「発病機序を減じること」という用語は、示される疾患、障害、または疾病について、関連する疾患、障害、または疾病の数、あるいはそれに関する症状を、減じることを包含することを理解されたい。
【０１５１】
医薬組成物を精製する方法
【０１５２】
また、本明細書において、医薬組成物を精製する方法が提供される。ある実施形態では、方法は、溶解Ｇｅｌｕｃｉｒｅ（例えばＧｅｌｕｃｉｒｅ４４／１４）を魚油と随意に組み合わせる工程、混合物を冷却する工程、そして粉末形態でＥＤＴＡ、ＳＢＴＩ、アプロチニン、および治療用タンパク質またはペプチド、例えばインスリン、または他の実施形態ではエキセナチド、を添加する工程を含むが、当業者は、本所見に照らして、他の治療用タンパク質またはペプチドも使用され得ることを理解するだろう。他の実施形態では、方法は、溶解Ｇｅｌｕｃｉｒｅ（例えばＧｅｌｕｃｉｒｅ４４／１４）を魚油と随意に組み合わせる工程、混合物を冷却する工程、そして粉末形態でＥＤＴＡ、ＳＢＴＩ、および治療用タンパク質またはペプチドを添加する工程を含む。ある実施形態では、粉末成分は、列挙される順序で添加される。他の実施形態では、結果として生じる混合物は、随意に混合および／または均質化される。
【０１５３】
本明細書で使用される、「実質的に、〜から成る」は、本発明の範囲を、特定の材料または工程、および特許請求の範囲で主張される発明の基本的かつ新規的特性に実質的に影響を及ぼさないもの、に限定する。
【０１５４】
一実施形態では、「約」という用語は、示される値から、１−１０％のばらつき、あるは別の実施形態では５−１５％、あるいは別の実施形態では１０％まで、あるいは別の実施形態では２５％までのばらつきを指すが、ばらつきが結果として１００％を超える値をもたらすべきではないと、文脈が示す場合を除く。
【０１５５】
本発明のある実施形態では、「重量」は「乾燥重量」を指す。他の実施形態では、「重量」は合計重量を指す。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、「含む」の用語、またはその文法的形式は、本発明の示される成分の包含、ならびに他の活性剤、および製薬業界で既知の、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、皮膚軟化剤、安定剤などの包含を指す。
【０１５７】
一実施形態では、本発明は組み合わされた調製物を提供する。一実施形態では、「組み合わされた調製物」という用語は、上に定義される組み合わせパートナーが、独立して、または異なる組み合わせで、すなわち同時に、並行して、別々に、または連続して使用され得るという意味で、特に「部品のキット」を定義する。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、この発明の組成物は、実質的に、本明細書に説明される任意の形態または実施形態において、本明細書に説明されるような成分で構成される。いくつかの実施形態では、「含む」の用語は、本発明のｒＢＢＩ、および治療用ペプチドまたは治療用タンパク質などの、本明細書に説明される通りに示される成分の包含、ならびに他の活性剤、および製薬業界で既知の、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、皮膚軟化剤、安定剤などの包含を指す。いくつかの実施形態では、「実質的に、〜から成る」という用語は、その唯一の活性成分が、示される、本発明の治療用ペプチドと治療用タンパク質、およびｒＢＢＩである組成物を指す。しかし、製剤を安定させ、保存する等のためのものであるが、示された活性成分の治療効果に直接関与しない、他の化合物が含まれ得、また、他のプロテアーゼ阻害剤が含まれても良いが、ｒＢＢＩの包含が、本発明の治療用ペプチドまたは治療用タンパク質の長期にわたる持続的活性を促進するための組成物の必須構成要素であることは、周知である。いくつかの実施形態では、用語「実質的に、〜から成る」という用語は、同等の作用機序、または同等の分子標的を有する唯一の活性成分が、示される活性成分である組成物を指すが、他の活性成分が組み込まれても良く、そのような二次活性成分は、異なる標的に作用するか、緩和能力で作用し、また、同様物が本発明の治療用ペプチドまたは治療用タンパク質を表し、そして、そのような組成物は、説明されるようなｒＢＢＩをさらに含む。いくつかの実施形態では、用語「実質的に、〜から成る」という用語は、本明細書に説明される、本発明の治療用ペプチドまたは治療用タンパク質の持続的送達／分解の防止を促進するのに役立つｒＢＢＩに加えて、活性成分の放出を助ける成分を指し得る。いくつかの実施形態では、用語「成ること」という用語は、唯一の活性成分としての、本明細書に説明される、本発明の治療用ペプチドまたは治療用タンパク質、ｒＢＢＩ、および薬学的に許容可能な単体または賦形剤を含む、組成物を指す。
【０１５９】
発明のある特徴が本明細書で例示され、説明されてきたが、多くの改良、代替、変更、および等価物が、当業者に発生するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神の範囲内にある、すべてのそのような改良と変更を網羅することが意図されていることを理解されたい。
【０１６０】
添付の特許請求の範囲に明記される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更がなされ得ることが、当業者によって理解されるであろう。当業者は、本明細書に説明される本発明の具体的な実施形態に対する、多くの同等物を認識するであろう、そして、通常の実験のみを使用してそれらを確認できるであろう。そのような等価物は、特許請求の範囲の範囲内に包含されることが意図される。
【０１６１】
本明細書で言及されるすべての出版物、特許、および特許出願は、個々の出版物、または特許が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されていると同程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。明細書と組み込まれた参照との間に矛盾がある場合は、明細書が優先するものとする。本文書内で数値的範囲が示されている時は、終点がその範囲内に含まれる。さらに、別段の指示がない限り、または、文脈および当業者の理解から別段明らかで無い限り、範囲として表される値は、終点の一方または両方を随意に包含または除外して、本発明の異なる実施形態で、文脈による明らかな指示がない限り、当該範囲の下限の単位の１０分の１までで、指定された範囲内の任意の特定の値またはサブ範囲であるとみなされ得ることを、理解されたい。パーセントが、整数の単位を本質的に有する値を参照して示されている場合、結果となる分数は最も近い整数に丸められて良い。
【０１６２】
特許請求の範囲において、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」などの冠詞は、別段の指示が無い限り、または文脈から明らかでない限り、１以上を意味する。群の構成要素間に「または（ｏｒ）」または「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を含む請求項または説明は、反対の指示がない限り、または文脈から明らかでない限り、群の構成要素の１つ、複数、またはすべてが、所与の生成物またはプロセスに、存在する、使用される、またはそうでなければ関連しているとみなされる。本発明は、群のちょうど１つの構成要素が、所与の製品またはプロセスに、存在する、使用される、またはそうでなければ関連する、実施形態を含む。本発明はまた、群の構成要素の１以上、またはすべてが、所与の製品またはプロセスに、存在する、使用される、またはそうでなければ関連する、実施形態を含む。さらに、本発明が、様々な実施形態において、別段の指示がない限り、または当業者に矛盾または不一致が生じることが明らかでない限り、１以上の制限、要素、節、説明用語などが、列挙された請求項の１以上から同じ基本請求項に従属する別の請求項に導入される、すべての変形、組み合わせ、および並べ替えを提供することを理解されたい。要素がリストとして定時される、例えば、マーカッシュグループ形式などの場合、要素の各サブグループもまた、開示され、そして任意の要素がグループから削除され得ることを理解されたい。
【０１６３】
一般に、本発明または本発明の態様が、特定の要素、特徴などを含むと言及される場合、本発明のある実施形態または本発明の態様は、そのような要素、機能などで、構成される、または実質的に構成されることが理解されるべきである。簡潔性を目的に、それらの実施形態は、あらゆる場合において、本明細書のこれらの言葉で具体的に明記されているというわけでは無い。特定の請求項は、便宜上、従属形式で提示されているが、出願人は、独立請求項と、そのような請求項が従属する他の請求項の要素または制限を含めるために、従属請求項を独立形式で書き換える権利を留保し、また、そのような書き換えられた請求項は、それがどのような形式（補正されているか否かにかかわらず）であったとしても、独立形式で書き換えられる前の、従属請求項とすべての点で同等であると見なされる。
【０１６４】
以下の実施例は、本発明のある実施形態を説明し、いかなる方法においても、本発明によって含まれるものの範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１６５】
実験詳細セクション
実施例１：組み換えＢＢＩの生成
素材と方法
組み換えボーマン−バークプロテナーゼ阻害剤（ｒＢＢＩ）の発現のための遺伝子を、コドン最適化し、ピキアパストリス系で合成した。ＢＢＩの分泌発現に使用されたプラスミドは、宿主：ピキアパストリスＧＳ１１５で発現された、ｐＰＩＣ９Ｋピキア発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。バイアス化し最適化したＢＢＩ  ＤＮＡ配列を、ｐＰＩＣ９Ｋプラスミドのサッカロマイセス・セレヴィシエα交配因子プレシーケンスで（ＳＴＥ１３切断部位は削除）インフレームでクローン化し、分泌されるＢＢＩを発現するクローンを得た。
【０１６６】
ＢＢＩのためにピキアパストリス宿主で最適化された核酸配列は、以下のとおりである：
【０１６７】
【化５】
2021527641.tif 000006
【０１６８】
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０１０５５（ＩＢＢ１＿ＳＯＹＢＮ）（１１０ａａ）の大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（大豆（Ｓｏｙｂｅａｎ））から単離されたＢＢＩのアミノ酸配列は、以下のとおりである：
【０１６９】
【化６】
2021527641.tif 000007
【０１７０】
太字は開始コドンを表し、下線はシグナルペプチドを表し、そして斜体部分はプロペプチドを表す。通常フォントの残基指定はＥ００１２４鎖に対応し、その配列に、ピキアでの発現のために遺伝子バイアスと最適化を施し、最適化した遺伝子配列のインシリコ（Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）翻訳はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の配列と同一の配列をもたらした。
【０１７１】
最終的なＤＮＡ配列の３’末端に、２つの終止コドンを追加した（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のイタリック体、太字、下線付きテキスト）。バイアス化し最適化したＢＢＩ  ＤＮＡ配列を、ｐＰＩＣ９Ｋプラスミドのサッカロマイセス・セレヴィシエα交配因子プレシーケンス（ＳＴＥ１３切断部位は削除）でインフレームでクローン化し、分泌されるＢＢＩを発現するクローンを得た。その後、組み換え構造に対して、シーケンシングによって再特徴付けを行った。
【０１７２】
組み換え生成物の発現は、標準技法を介して遂行された。簡潔に説明すると、ピキアを、ＹＰＤ培地で３０℃で振とうにより、ＯＤ６００が０．８から１．０になるまで培養し、その後、細胞を回収、洗浄、懸濁し、１００ｍＭ  ＬｉＣｌで洗浄し、形質転換した。標準形質転換プロトコルが使用された。簡潔に説明すると、その後、ＬｉＣｌ細胞溶液を、洗浄し、滅菌水（５〜１０μｇ；１００〜２００ｎｇ  ／μｌ）に１Ｍ  ＬｉＣｌ単鎖のサーモン精子ＤＮＡ片およびプラスミドＤＮＡ片を含む、５０％ＰＥＧ−４０００溶液に再懸濁した。細胞を３０℃で３０分間インキュベートし、その後、４２℃で２０〜２５分間熱ショックを与え、それから、細胞を洗浄してＹＰＤ培地に再懸濁し、３０℃でインキュベートしてからＹＮＢ−Ｈｉｓ選択プレートに載せ、３０°Ｃでさらに２〜３日間インキュベートした。
【０１７３】
およそ１０００の推定クローンをスクリーニングし、高収率クローンを得た。プロセス最適化のために、およそ５〜６個のクローンを、２００ｍｌ、１Ｌ、および５Ｌの発酵槽バッチ用にスケールアップした。クローンＢ１７から精製された分泌ｒＢＢＩタンパク質を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによるＮ末端およびＣ末端シーケンシングにかけると、観察されたＮ末端およびＣ末端の配列は予想と同一であった。スペクトルデータは、観測された質量が、９９％の均一性で予想された質量と同じであることを確認した。このように、クローンＢ１７からのｒＢＢＩのプロセシングは、シグナルペプチドからの余分な残基を削除または追加することなく、損傷を受けなかった。したがって、クローンＢ１７を潜在的に高収率なクローンとして選択し、スケールアップ用にさらに使用した。
【０１７４】
実施例２：組み換えＢＢＩ生成物の特性付け
Ｂ１７クローンを、２００ｍｌ、５Ｌ、および５０Ｌの尺度で、発現、精製、および素材生成のためにさらに研究し、また、精製タンパク質を、異なる分析法を使用して特徴付けた。
【０１７５】
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を標準技法で実施し、結果を図１に示し、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析と入手可能な標準とを重ねて示す。最終的な精製ＢＢＩは、標準精製されたＢＢＩで観察されたものと同じ保持時間を示した。
【０１７６】
精製ｒＢＢＩから凍結乾燥粉末を調製し、また、標準技法（図２）、還元および非還元条件下での１５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を使用して、総タンパク質含有量のＢＣＡ定量を評価し、そして、クーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ）で染色してタンパク質サイズを確認した（図３）。
【０１７７】
プロテアーゼ阻害剤の酵素活性を組み換え生成物について検証し、実証可能な、キモトリプシン活性の阻害（図４）ならびにトリプシン活性の阻害（図５）を達成した。驚いたことに、これらのアッセイの結果は、大豆から精製された精製ＳＢＴＩと比較した時の、組み換えタンパク質の使用の際の、酵素活性のはるかに大幅な阻害を示した。
【０１７８】
実施例３：組み換えプロテアーゼ阻害剤は驚くべき有効性を提供する。
素材と方法
【０１７９】
空腹状態にある、生後３〜４か月、体重２５〜３０ｋｇの非ＳＰＦ市販ブタ（Ｉｂｅｌｉｎ  Ｆａｒｍ（Ｉｓｒａｅｌ）より入手（ｎ＝８）を、イソフルラン（毎分２ＬのＯ２と３〜５％のイソフルラン）で麻酔し、識別を容易にするためにタグ付けし、挿管した。水へのアクセスは自由であった。動物を左側を下にして寝かせ、製剤を、内視鏡カテーテルを通して、内視鏡誘導下で、直接十二指腸に投与した。この研究は、イスラエル動物実験委員会、保健省（ｔｈｅ  Ｉｓｒａｅｌｉ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ，  Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）による承認を受けて実施された（プロトコル番号ＩＬ−１６−１１−４００）。
【０１８０】
１ｍｌの試験製剤を注射した後に１５０〜１８０ｍｌの空気を注射して、製剤が十二指腸に確実に送達されるようにした。以下の時点で、中心静脈カテーテル（実験の初日に挿入し、必要に応じて交換）から採血を行った：投与の１５分前および直前、そして投与後３時間は１５分おき、そしてその後は投与後３時間２０分（３：２０）後、３時間４０分（３：４０）後、４時間（４：００）後、および４時間３０分（４：３０）後。少量（５μｌ）の血液サンプルを、血糖計による血糖濃度測定に使用した。読み取り値が＜１０ｍｇ／ｄＬの場合はサンプルを再試験し、２つの読み取り値の平均値を出した。処置間には、最低２日間のウォッシュアウト期間（ｗａｓｈｏｕｔ  ｐｅｒｉｏｄ）を設けた。
【０１８１】
試験条件は、１５０ｍｇのＥＤＴＡ、８ｍｇのインスリン、および、本明細書に説明されるように生成された精製組み換えＢＢＩ、または特許文献１に記載されるように、大豆粉から抽出されたＳＢＴＩから精製されたＢＢＩのいずれかで実施した。
【０１８２】
試験条件は以下の表１に記載されているとおりであり、各試験アイテムは、４頭の異なるブタで試験を行った。
【０１８３】
【表１】
2021527641.tif 000008
【０１８４】
すべての試験アイテムを、１ｍＬの魚油で調製し、冷蔵保存した。使用前に、サンプルを室温に戻し、投与前に完全に混合した。
【０１８５】
データ分析には、時間の関数としての循環血糖レベルの評価が含まれた。
【０１８６】
動物は研究期間中観察し、本研究中に異常な臨床的所見が観察されることは無く、動物の体重は研究を通して安定的であった。
【０１８７】
結果：
すべての製剤が、循環血糖レベルの低下をもたらした（図６）が、組み換えＢＢＩの使用は、驚くべきことに、一貫して、持続的な期間にわたる血糖レベルの低下をもたらした。
【０１８８】
以前に示したように、ＳＢＴＩ含有製剤は、３０分以内に、５０ｍｇ／ｄｌから約３５ｍｇ／ｄｌへと循環血糖レベルを低下させたが、投与後３時間を待たずして既に、循環レベルは実質的にベースラインレベルに戻り、さらに、ベースラインレベルへの戻りは漸進的であり、経口投与摂取後わずか１時間で戻り始めた。
【０１８９】
大変驚いたことに、組み換えＢＢＩを提供したすべての群は、循環レベルが、約２０  ｍｇ／ｄｌまで、より急速で定性的により大幅に低下することを実証し、また、この効果は、投与後少なくとも２時間持続し、その後の漸進的増加も明らかであったが、２５ｍｇのＫＴＩを含む１００ｍｇの組み換えＢＢＩ（ｒＢＢＩ）を与えた動物は、４時間経過後も、まだベースラインに戻らず、また、１００ｍｇのｒＢＢＩのみを与えた動物は、投与後３．５時間以上経過するまで、ベースラインに戻らなかった。驚いたことに、５０ｍｇのみのｒＢＢＩとＫＴＩを与えた動物も、投与後３時間以上経過するまで、ベースラインに戻らなかった。
【０１９０】
このように、結果は、驚くべきことに、ｒＢＢＩが、精製ＢＢＩ含有組成物と比較して、循環血糖レベルの低下に対してより効果的であり、優れた効果が潜在的に長期間続くことを、裏付けた。
【０１９１】
実施例４：組み換えプロテアーゼ阻害剤は驚くべき経時的有効性を提供する。
素材と方法
【０１９２】
空腹状態にある、生後３〜４か月、体重２５〜３０ｋｇの非ＳＰＦ市販ブタ（Ｉｂｅｌｉｎ  Ｆａｒｍ（Ｉｓｒａｅｌ）より入手（ｎ＝８）を、イソフルラン（毎分２ＬのＯ２と３〜５％のイソフルラン）で麻酔し、識別容易にするためにタグ付けし、挿管した。水へのアクセスは自由であった。動物を左側を下にして寝かせ、製剤を、内視鏡カテーテルを通して、内視鏡誘導下で、直接十二指腸に投与した。この研究は、イスラエル動物実験委員会、保健省（ｔｈｅ  Ｉｓｒａｅｌｉ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ，  Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）による承認を受けて実施された（プロトコル番号ＩＬ−１６−１１−４００）。
【０１９３】
１ｍｌの試験製剤を注射した後に１５０〜１８０ｍｌの空気を注射して、製剤が十二指腸に確実に送達されるようにした。以下の時点で、中心静脈カテーテル（実験の初日に挿入し、必要に応じて交換）から採血を行った：投与の１５分前および直前、そして投与後３時間は１５分おき、そしてその後は投与後３時間２０分（３：２０）後、３時間４０分（３：４０）後、４時間（４：００）後、４時間３０分（４：３０）後、および５時間（５：００）後。少量（５μｌ）の血液サンプルを、血糖計による血糖濃度測定に使用した。読み取り値が＜１０ｍｇ／ｄＬの場合はサンプルを再試験し、２つの読み取り値の平均値を出した。処置間には、最低２日間のウォッシュアウト期間を設けた。
【０１９４】
試験条件は、１５０ｍｇのＥＤＴＡと４ｍｇのインスリン、そして、本明細書に説明されるように生成された組み換えのＢＢＩの量を増加させながら、実施した。
【０１９５】
試験条件は以下の表２に記載されているとおりであり、各試験アイテムは、７〜８頭の異なるブタで、８〜１０セッションで試験を行った。
【０１９６】
【表２】
2021527641.tif 000009
【０１９７】
すべての試験アイテムを、１ｍＬの魚油で調製し、冷蔵保存した。使用前に、サンプルを室温に戻し、投与前に完全に混合した。
【０１９８】
データ分析にはベースラインからの変化の評価が含まれ、曲線下のベースライン血糖面積（ＡＵＣ）からの変化率が、各処置セッションについて判定された。さらに、血糖測定値の最初の低下から最初の上昇までの時間も、各治療セッションについて判定された。
【０１９９】
動物は研究期間中観察し、本研究中に異常な臨床的所見が観察されることは無く、動物の体重は研究を通して安定的であった。
【０２００】
結果：
実施例３は、プロテアーゼ阻害剤が化学的に精製されたものでは無く組み換えＢＢＩである場合に、８ｍｇのインスリンを経口で投与された被験体において循環血糖レベルのより大幅な低下があったという点で、ｒＢＢＩは、増強された血糖制御を提供することを実証した。ｒＢＢＩの効果をさらに詳しく説明し、結果を広げるために、ｒＢＢＩを最適化し、経時的な効果を評価することが興味の対象となった。この目的に向けて、インスリンは４ｍｇのみを含むが、１２．５、２５、５０、および７５ｍｇのｒＢＢＩを含む経口製剤を、同様に評価した。表３は、これらの研究の結果を提供する：
【０２０１】
【表３】
2021527641.tif 000010
【０２０２】
２５ｍｇのｒＢＢＩで製剤化されたＯＲＭＤ−０８０１による処置後に、ベースライン血糖比ＡＵＣからの最も大幅な低下があり、その後に７５ｍｇのｒＢＢＩを含む製剤が続く。プロテアーゼ阻害剤を含む製剤での処置とプロテアーゼ阻害剤を含まない対照処置に対する、動物の反応を検討すると、ここでも、２５ｍｇのｒＢＢＩ、その後に７５ｍｇのｒＢＢＩを含む製剤が、ベースラインＡＵＣから最大の変化（それぞれ−６，３６９と−４，６４０）をもたらし、それに対応して、対照セッションＡＵＣの計算から最大の変化（それぞれ−４，９８９と−２，９６０）をもたらした。
【０２０３】
効果の持続可能性に関しては、かなり予想外に、ｒＢＢＩ含有製剤は長期にわたる効果をもたらし、試験被験体において、血糖低下の最初の兆候からベースライン値への戻りの最初の兆候までの間が平均１４０分伸びた。この効果は、対照動物において測定された効果の期間よりも、７５％長かった。
【０２０４】
このように、驚くべきことに、そして予期外に、純粋な化学抽出手段からの、または組み換え発現タンパク質の化学精製からの、ＢＢＩについての下流精製工程は、本質的に同一であるが、ＢＢＩのソース材料がｒＢＢＩである場合に、より大幅で持続的な阻害剤活性が、これらの研究で見られた。
【０２０５】
このように、かなり予想外に、組み換えＢＢＩは、単一のプロテアーゼ阻害剤として、持続可能で定性的に大幅な血糖制御を可能にするのに十分であった。
【図１】
2021527641.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2021527641.tif 000020
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