(57)【要約】  本発明は、線状ポリヌクレオチド中の１〜６０ヌクレオチド長である単位配列のタンデムリピートの回数を増加させるための熱サイクル法を提供する。本発明は、少なくとも１つの線状プローブポリヌクレオチドが固定化されている表面を持つ固体基板であって、前記少なくとも１つの線状プローブポリヌクレオチドが、１〜６０ヌクレオチド長である単位配列の少なくとも２回のタンデムリピートを含む固体基板も提供する。上述の固体基板を使って被検試料中の線状標的ポリヌクレオチド配列の存在を決定する方法も提供される。
2021514635.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
線状ポリヌクレオチド中の１〜６０ヌクレオチド長である単位配列のタンデムリピートの回数を増加させるための熱サイクル法であって、以下の工程を含む方法：
ｉ）１〜６０ヌクレオチド長である単位配列の少なくとも２回のタンデムリピートを含む一本鎖プライマーポリヌクレオチドが固定化されている表面を持つ固体基板を用意する工程、
ｉｉ）前記固定化されたプライマーポリヌクレオチドを、前記プライマーポリヌクレオチドの単位配列に相補的である少なくとも２回のタンデムリピートを含む一本鎖テンプレートポリヌクレオチドと、単位配列とその相補鎖との間のミスマッチ二重鎖形成を許すハイブリダイゼーション条件下で、前記テンプレートポリヌクレオチドの５’オーバーハングが生成し、その５’オーバーハングが前記プライマーポリヌクレオチドの単位配列に相補的である少なくとも１回のタンデムリピートを含むように、接触させる工程、および
ｉｉｉ）前記ミスマッチ二重鎖を耐熱性５’→３’ポリメラーゼおよびヌクレオチドと、５’→３’方向のポリヌクレオチド伸長を許す伸長条件下で接触させる工程。
【請求項２】
１〜６０ヌクレオチド長である単位配列の少なくとも２回のタンデムリピートを含む一本鎖線状プライマーポリヌクレオチドが固定化されている表面を持つ前記固体基板は、１〜６０ヌクレオチド長である単位配列の少なくとも２回のタンデムリピートを含む二本鎖線状プライマーポリヌクレオチドを、前記固体基板の表面に固定化すること、および前記二本鎖線状プライマーポリヌクレオチドを変性させることで前記一本鎖線状プライマーポリヌクレオチドを得ることによって用意される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３】
以下の工程をさらに含む、上記請求項のいずれか一項に記載の方法：
ｉｖ）ｉｉｉ）の二重鎖を、変性条件下で変性させることで、固定化された一本鎖ポリヌクレオチドを生成させる工程、および
ｖ）工程ｉｉ）〜工程ｉｉｉ）を少なくとも１回繰り返すことで、前記固定化されたポリヌクレオチド中のタンデムリピートの回数を増加させる工程。
【請求項４】
前記固定化されたプライマーポリヌクレオチドは、前記単位配列の少なくとも２回、少なくとも５回、少なくとも１０回、または少なくとも１５回のタンデムリピートを含む、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの線状プローブポリヌクレオチドが固定化されている表面を持つ固体基板であって、前記少なくとも１つの線状プローブポリヌクレオチドが、１〜６０ヌクレオチド長である単位配列の少なくとも２回のタンデムリピートを含む固体基板。
【請求項６】
前記線状ポリヌクレオチドは前記表面に共有結合または非共有結合によって固定化され、随意に、前記線状ポリヌクレオチドは、前記表面の化学修飾された領域に非共有結合的に固定化される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法または固体基板。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドはリンカーによって前記表面に固定化される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法または固体基板。
【請求項８】
前記表面は、
ｉ）線状プローブポリヌクレオチドが固定化されている、複数の離間した不連続な領域、および
ｉｉ）前記離間した不連続な領域の間にあって、線状プローブポリヌクレオチドを実質的に含まない、領域間区域
を含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の固体基板。
【請求項９】
前記線状プローブポリヌクレオチドが固定化されている前記離間した不連続な領域はアレイを形成する、請求項５〜８のいずれか一項に記載の固体基板。
【請求項１０】
複数の同一線状プローブポリヌクレオチドが単一の離間した不連続な領域内に固定化されている、請求項５〜９のいずれか一項に記載の固体基板。
【請求項１１】
複数の離間した不連続な領域のそれぞれが相異なる線状プローブポリヌクレオチドを含有する、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の固体基板。
【請求項１２】
前記線状プローブポリヌクレオチドが前記単位配列の少なくとも３回のタンデムリピートを含む、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の固体基板。
【請求項１３】
前記単位配列は２〜９個のヌクレオチドを有するマイクロサテライト配列である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法または固体基板。
【請求項１４】
前記単位配列は１０〜６０個のヌクレオチドを有するミニサテライト配列である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法または固体基板。
【請求項１５】
前記線状ポリヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡである、上記請求項のいずれか一項に記載の方法または固体基板。
【請求項１６】
前記表面は、ガラス、シリカ、金、グラフェンもしくは酸化グラフェン、エポキシ、プラスチック、金属、ゲルマトリックス、テンプレートストリッピングによって作製された金属、またはそれらの複合材料を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の方法または固体基板。
【請求項１７】
前記リンカーは、シランリンカー分子、ビオチン−ストレプトアビジン複合体、チオール−Ａｕリンカー、シリコンへのＳｉ−Ｃ共有結合、シリコンへのＳｉ−Ｏ共有結合、シリコンへのＳｉ−Ｎ共有結合、ナノ粒子リンカー、または動的共有結合を含む、請求項１６に記載の方法または固体基板。
【請求項１８】
被検試料中の線状標的ポリヌクレオチド配列の存在を決定するための方法であって、以下の工程を含む方法：
ｉ）請求項５〜１７のいずれか一項に記載の固体基板であって、前記固定化された線状プローブポリヌクレオチドの単位配列が、関心対象の線状標的ポリヌクレオチド配列の配列に相補的な核酸配列を含む、固体基板を用意する工程、
ｉｉ）被検試料を、前記固定化された線状プローブポリヌクレオチドと、前記線状標的ポリヌクレオチド配列と前記固定化された線状プローブポリヌクレオチドの単位配列の相補的部分との間の二重鎖形成を許す条件下で接触させる工程、および
ｉｉｉ）前記被検試料内に前記標的ポリヌクレオチド配列が存在することを示す二重鎖形成を検出する工程。
【請求項１９】
前記被検試料は、血液、唾液、脳脊髄液、胸水、乳汁、リンパ液、喀痰、精液または針吸引物試料である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
二重鎖形成は、蛍光インターカレーター、蛍光タグ付きＤＮＡ、フルオレセイン、酸化還元タグ付きＤＮＡ、フェロセン、ナノ粒子または磁気的にタグ付けされたＤＮＡを使って検出される、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線状ポリヌクレオチド中の１〜６０ヌクレオチド長である単位配列のタンデムリピートの回数を増加させるための熱サイクル法を提供する。本発明は、少なくとも１つの線状プローブポリヌクレオチドが固定化されている表面を持つ固体基板であって、前記少なくとも１つの線状プローブポリヌクレオチドが、１〜６０ヌクレオチド長である単位配列の少なくとも２回のタンデムリピートを含む固体基板も提供する。上述の固体基板を使って被検試料中の線状標的ポリヌクレオチド配列の存在を決定する方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
被検試料中の標的ポリヌクレオチド配列の存在を決定するための方法は、基礎研究において日常的に使われていると共に、診断法および治療法においても大いに有用である。配列が明確なポリヌクレオチドのライブラリーは、セキュリティー用途で、識別子（ＤＮＡバーコード）としても使用しうる。
【０００３】
被検試料中の標的ポリヌクレオチド配列（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）の有無は、当技術分野において知られるいくつかの方法を使って、容易に決定することができる。そのような方法の非限定的な例には、インサイチューハイブリダイゼーション、マイクロアレイ解析、ＰＣＲおよび次世代シーケンシングなどがある。そのような方法は、例えば疾患のバイオマーカーまたは治療標的の同定またはモニタリングなどに有用であることが判明している。
【０００４】
インサイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、標識されたＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブと、無傷の染色体、細胞または組織切片中の正常ポリヌクレオチド配列または異常ポリヌクレオチド配列との相補的ペアリングに基づいている。ＩＳＨは免疫組織化学と類似しているので、解剖病理学に応用することができる他の分子生物学的技法と比べて、組織病理学者との相性がよい。これには、主にホモジナイズされた組織試料から抽出されたポリヌクレオチドとのプローブハイブリダイゼーションに基づく他の分子生物学的技法との対比で、形態学的に同定可能な細胞または細胞構造内での標的ポリヌクレオチド配列の局在化および可視化を可能にするというユニークな利点がある。
【０００５】
ポリヌクレオチドアレイまたは単にＤＮＡアレイとは、特異的ＤＮＡ配列が、ある表面において、２次元（また時には３次元）アレイ状に、ＤＮＡが共有結合的または非共有結合的に表面に取り付けられるような形で付着または合成される、一群の技術である。典型的な使用では、ＤＮＡアレイは標識されたポリヌクレオチドの混合物の溶液をプローブするために使用され、アレイ上の「プローブ」への、それら「標的」の（ハイブリダイゼーションによる）結合は、溶液中のポリヌクレオチド種の相対濃度を測定するために使用される。極めて多数のＤＮＡスポットへと一般化することにより、アレイは、溶液中のいくらでも大きな数の異なるポリヌクレオチド配列を定量するために使用することができる。代替的標識戦略の一つは、ハイブリダイズした化学種が形成されてから、その化学種を標識することである。この技法の２つの利点は、標的プローブが標識化を必要としないこと、および標的の非存在下ではシグナルが生成しないことである。欠点は、表面に結合されているプローブあたり１つのハイブリダイゼーションイベント、したがって１つのシグナリングイベントしかなく、それが全体として、この技法の感度を制限することである。
【０００６】
疾患状態ＤＮＡまたは疾患状態ＲＮＡの最も一般的な解析方法は、ポリマー連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）に基づくアッセイの使用である。生物学的試料はＤＮＡを含有するだろうが、通常は濃度レベルが非常に低いので、検出することは困難である。ＰＣＲは、ＤＮＡを、または関心対象の配列を内包するＤＮＡのより特異的な領域を増幅するために使用される。ＰＣＲ産物は多種多様な方法による解析に供されるが、そのような方法としては、例えば、フラグメントをアガロースゲルでサイズに基づいて分離し、フラグメントのバンドを臭化エチジウム染色およびＵＶ光によって可視化するための、電気泳動を挙げることができる。あるいは、リアルタイム（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（リアルタイムＰＣＲ）は、定量（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）としても知られており、標的ＤＮＡ分子の増幅を、従来のＰＣＲの場合のようにその終点においてではなく、ＰＣＲ中に、すなわちリアルタイムでモニターする。
【０００７】
サンガーシーケンシングは、鎖終結法としても知られており、インビトロＤＮＡ複製中のＤＮＡポリメラーゼによる非天然鎖終結ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）の選択的取込みに基づくＤＮＡシーケンシングの技法である。ＮＧＳはサンガーシーケンシングであるが、いくつかの試料について同時に並行して実行される。
【０００８】
ＩＳＨ、ＰＣＲおよびＮＧＳは、ＤＮＡおよびＲＮＡの機能を解明するための強力な技法であり、したがって優れた診断ツールである。しかしこれらの技法は、綿密な試料調製、多段階プロセスおよび専門的な機器使用を必要とする。対照的に、マイクロアレイは、疾患状態を示すＤＮＡ／ＲＮＡを同定するための、より簡易化されたアプローチを提供し、それゆえに、迅速な結果を与え、患者の治療法の決定に関して情報を提供するための、優れた「ポイントオブケア」診断ツールである。しかしマイクロアレイは、通例、感度のレベルに制約がある。典型的には、表面に結合されているプローブあたり１つのハイブリダイゼーションイベントしか起こらず、それがハイブリダイゼーション反応あたり１つのシグナリングイベントをもたらすからである。
【０００９】
被検試料中の標的ポリヌクレオチド配列の存在を決定するための改良された方法が必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、タンデムリピートを含む固定化されたポリヌクレオチド配列の酵素的伸長のための新規方法を開発した。本方法は、１つ以上の固定化されたポリヌクレオチド配列を持ち、固定化されたポリヌクレオチド配列のそれぞれが複数のタンデムリピートを含む、マイクロアレイなどの固体基板を生成させるために使用することができる。有利なことに、これらの固体基板は、固定化されたポリヌクレオチド（本明細書では表面に結合された「プローブポリヌクレオチド」とも記載する）のそれぞれが標的配列に対して複数の結合部位を提供するので、前記リピート配列に相補的な標的ポリヌクレオチド配列の存在を、当技術分野で知られている他の基板よりも高い感度レベルで検出するために使用することができる。
【００１１】
本発明は、ＤＮＡハイブリダイゼーションに基づく検出系で生じるノイズ対シグナル比の根本的課題を解消する。というのも、シグナルは本発明ではもはや制限因子ではない表面被覆率に依存するからである。言い換えると、本発明は、背景ノイズに対するシグナルの検出を改良するので、先行技術の感度の問題を克服する。有利なことに、これは、検出の正確度を増加させることができ、かつ／またはデータ収集が増強されるので、検出方法において、感度の低い（例えば安価な）検出器を使用することを可能にしうる。
【００１２】
本発明は応用範囲が広く、いくつかの異なる標的ポリヌクレオチド検出技術において役立ちうる。例えば本発明は、一塩基ミスマッチ検出、ＳＮＰ検出、遺伝子シーケンシング技術および医学的診断（例えばＢＡＴ２５リピート配列ＤＮＡプローブを用いるリンチ症候群などの結腸直腸がんの迅速診断）に関連して使用しうる。また本発明は、分子診断、例えばバイオマーカーの検出、治療応答、疾患層別化、およびポイントオブケア応用との関連においても使用しうる。
【００１３】
線状ポリヌクレオチド中の１〜６０ヌクレオチド長である単位配列のタンデムリピートの回数を増加させるための熱サイクル法であって、以下の工程を含む方法が提供される：
ｉ）１〜６０ヌクレオチド長である単位配列の少なくとも２回のタンデムリピートを含む一本鎖プライマーポリヌクレオチドが固定化されている表面を持つ固体基板を用意する工程、
ｉｉ）前記固定化されたプライマーポリヌクレオチドを、前記プライマーポリヌクレオチドの単位配列に相補的である少なくとも２回のタンデムリピートを含む一本鎖テンプレートポリヌクレオチドと、単位配列とその相補鎖との間のミスマッチ二重鎖形成を許すハイブリダイゼーション条件下で、前記テンプレートポリヌクレオチドの５’オーバーハングが生成し、その５’オーバーハングが前記プライマーポリヌクレオチドの単位配列に相補的である少なくとも１回のタンデムリピートを含むように、接触させる工程、および
ｉｉｉ）前記ミスマッチ二重鎖を、耐熱性５’→３’ポリメラーゼおよびヌクレオチドと、５’→３’方向のポリヌクレオチド伸長を許す伸長条件下で接触させる工程。
【００１４】
好適には、１〜６０ヌクレオチド長である単位配列の少なくとも２回のタンデムリピートを含む一本鎖線状プライマーポリヌクレオチドが固定化されている表面を持つ前記固体基板は、１〜６０ヌクレオチド長である単位配列の少なくとも２回のタンデムリピートを含む二本鎖線状プライマーポリヌクレオチドを、前記固体基板の表面に固定化すること、および前記二本鎖線状プライマーポリヌクレオチドを変性させることで前記一本鎖線状プライマーポリヌクレオチドを得ることによって用意される。
【００１５】
好適には、本方法は以下の工程をさらに含む：
ｉｖ）ｉｉｉ）の二重鎖を、変性条件下で変性させることで、固定化された一本鎖ポリヌクレオチドを生成させる工程、および
ｖ）工程ｉｉ）〜工程ｉｉｉ）を少なくとも１回繰り返すことで、前記固定化されたポリヌクレオチド中のタンデムリピートの回数を増加させる工程。
【００１６】
好適には、前記固定化されたプライマーポリヌクレオチドは、前記単位配列の少なくとも２回、少なくとも５回、少なくとも１０回、または少なくとも１５回のタンデムリピートを含む。
【００１７】
少なくとも１つの線状プローブポリヌクレオチドが固定化されている表面を持つ固体基板であって、前記少なくとも１つの線状プローブポリヌクレオチドが、１〜６０ヌクレオチド長である単位配列の少なくとも２回のタンデムリピートを含む固体基板が提供される。
【００１８】
好適には、前記表面は以下の要素を含む：
ｉ）線状プローブポリヌクレオチドが固定化されている、複数の離間した不連続な領域、および
ｉｉ）前記離間した不連続な領域の間にあって、線状プローブポリヌクレオチドを実質的に含まない、領域間区域。
【００１９】
好適には、前記線状プローブポリヌクレオチドが固定化されている前記離間した不連続な領域は、アレイを形成する。
【００２０】
好適には、単一の離間した不連続な領域内に、複数の同一線状プローブポリヌクレオチドが固定化される。
【００２１】
好適には、複数の離間した不連続な領域がそれぞれ、相異なる線状プローブポリヌクレオチドを含有する。
【００２２】
好適には、前記線状プローブポリヌクレオチドは、単位配列の少なくとも３回のタンデムリピートを含む。
【００２３】
好適には、前記単位配列は２〜９個のヌクレオチドを有するマイクロサテライト配列である。
【００２４】
好適には、前記単位配列は１０〜６０個のヌクレオチドを有するミニサテライト配列である。
【００２５】
好適には、前記線状ポリヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡである。
【００２６】
好適には、前記表面は、ガラス、シリカ、金、グラフェンもしくは酸化グラフェン、エポキシ、プラスチック、金属、ゲルマトリックス、テンプレートストリッピングによって作製された金属、またはそれらの複合材料を含む。
【００２７】
好適には、前記線状ポリヌクレオチドは共有結合または非共有結合によって前記表面に固定化される。随意に、線状ポリヌクレオチドは前記表面の化学修飾された領域に非共有結合的に固定化される。
【００２８】
好適には、前記ポリヌクレオチドは前記表面にリンカーによって固定化される。
【００２９】
好適には、前記リンカーは、シランリンカー分子、ビオチン−ストレプトアビジン複合体、チオール−Ａｕリンカー、シリコンへのＳｉ−Ｃ共有結合、シリコンへのＳｉ−Ｏ共有結合、シリコンへのＳｉ−Ｎ共有結合、ナノ粒子リンカー、または動的共有結合を含む。
【００３０】
被検試料中の線状標的ポリヌクレオチド配列の存在を決定するための方法であって、以下の工程を含む方法が提供される：
ｉ）固定化された線状プローブポリヌクレオチドの単位配列が、関心対象の線状標的ポリヌクレオチド配列の配列に相補的である核酸配列を含む、本明細書記載の固体基板を用意する工程、
ｉｉ）被検試料を、前記固定化された線状プローブポリヌクレオチドと、前記線状標的ポリヌクレオチド配列と前記固定化された線状プローブポリヌクレオチドの単位配列の相補的部分との間の二重鎖形成を許す条件下で接触させる工程、および
ｉｉｉ）前記被検試料内に前記標的ポリヌクレオチド配列が存在することを示す二重鎖形成を検出する工程。
【００３１】
好適には、被検試料は、血液、唾液、脳脊髄液、胸水、乳汁、リンパ液、喀痰、精液または針吸引物試料である。
【００３２】
好適には、二重鎖形成は、蛍光インターカレーター、蛍光タグ付きＤＮＡ、フルオレセイン、酸化還元タグ付きＤＮＡ、フェロセン、ナノ粒子または磁気的にタグ付けされたＤＮＡを使って検出される。
【００３３】
本願の明細書および特許請求の範囲を通して、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」および「ｃｏｎｔａｉｎ（含有する）」という単語ならびにそれらのバリエーションは、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ（含むが、それらに限定されないこと）」を意味し、それらは、他の部分、付加物、構成要素、整数または工程を除外すること（および除外しないこと）を意図していない。
【００３４】
本願の明細書および特許請求の範囲を通して、単数形は、文脈上別段の必要がある場合を除き、複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、文脈上別段の必要がある場合を除き、その明細は単数であることだけでなく複数であることも想定していると理解されるべきである。
【００３５】
本発明の特定態様、特定実施形態または特定実施例と共に記載される特徴、整数、特性、化合物、化学部分または化学基は、本明細書に記載する他のどの態様、実施形態または実施例にも、それとは不適合である場合を除き、適用することができると理解すべきである。
【００３６】
本明細書において言及される特許文献、科学文献および技術文献は、出願時点において当業者が入手することのできた知識を証明している。本明細書において言及する発行された特許、公開された特許出願および係属中の特許出願ならびに他の刊行物の全開示は、ここに、それぞれが参照により組み込まれることを明確かつ個別に示されているかのように、参照により組み込まれる。矛盾が生じる場合は本開示が優先されることになる。
【００３７】
本明細書において別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が関係する技術分野における通常の技能を有する者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）およびＨａｌｅ  ａｎｄ  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、本発明において使用される用語の多くの一般的辞書を当業者に提供する。本明細書に記載するものと類似するまたは等価な方法および材料はいずれも、本発明の実施において有用であるが、好ましい方法および材料を本明細書に記載する。したがって、すぐ下に定義される用語は、明細書全体を参照することによって、より完全に説明される。また、本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないことが明らかである場合を除き、複数の指示対象を包含する。別段の表示がある場合を除き、それぞれ、ポリヌクレオチドは左から右に５’から３’に向かって記述され、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシに向かって記述される。本発明は、記載する特定の方法、プロトコールおよび試薬類に限定されないと理解すべきである。というのも、それらは、当業者がどのような状況でそれらを使用するかに応じて、さまざまでありうるからである。
【００３８】
本発明のさまざまな態様を以下にさらに詳しく説明する。
【００３９】
以下に、本発明の実施形態を、添付の図面を参照して、さらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】表面限局的なＰＣＲベースの反応によって多重リピート配列ＤＮＡを生産するために必要となる表面機能化工程を図解した概略図である。ｉ）二官能性リンカーの固定化、ｉｉ）５’−アミノ修飾オリゴシードの取付け、ｉｉｉ）オリゴシード相補鎖のハイブリダイゼーション、ｉｖ）長いＤＮＡブラシを得るための、固定化されたｄｓＤＮＡのＰＣＲベースの伸長。センシング用途には、複数の標的配列を持つ長い反復単一鎖ＤＮＡを得るために、ｅｘｔＤＮＡ表面を変性させる必要がある。
【図２】Ａ）標準的なＰＣＲエッペンドルフチューブに適合するように切断された、オリゴシードで機能化されたシリコンウェーハと、Ｂ）表面に固定化されたオリゴシードの酵素的伸長機序の概略とを示している。
【図３】Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎが適用されたａ）ｄｓＤＮＡおよびｂ）ｅｘｔＤＮＡを持つ表面の蛍光像。ｃ）前記２つの表面間の蛍光強度の差異を浮き彫りにする棒グラフ。ｄ）伸長されたｄｓＤＮＡが円形の島に限局されている、パターン形成されたＤＮＡ表面の蛍光像。上記のデータは、ａ）、ｂ）およびｃ）でのガラス／シロキサン／アミドリンカー表面での［ＧＡＴＣ］ｎ配列の形成に関するデータ、およびガラス／シロキサン／ストレプトアビジン−ビオチンリンカーでの、フォトリソグラフィーでパターン形成された［Ｇ：Ｃ］ｎ配列の形成に関するデータである。
【図４】Ａ）伸長された［ＧＡＴＣ］の、水中で９０℃における脱ハイブリダイゼーションによってガラス表面から取り除かれたｓｓＤＮＡのＡＦＭ像である。ＤＮＡ試料を、劈開したばかりのマイカ基板上にコーミングし、タッピングモードで撮像した。Ｂ）ｓｓＤＮＡに予想される寸法が確認される単一ＤＮＡ鎖の高さプロファイル。
【図５】ＣＦＴＲ変異時にフェニルアラニンアミノ酸の欠失によって起こる遺伝子形状の変化を表す１４。
【図６】Ｔｇｏ−Ｐｏｌ  Ｚ３  ｅｘｏ−および［ＧＣＡＴＣＴＴＴＣＧ（配列番号１）］２／［ＣＧＴＡＧＡＡＡＧＣ（配列番号：２）］２による２０サイクルの加熱−冷却サイクル伸長を表す。Ａ）アガロースゲル：レーン１は２０サイクル後の伸長産物；Ｂ）ＵＶ−Ｖｉｓプロット；およびＣ）バンドの強度をラダーと比較した最高強度のパーセンテージとして表す伸長産物のＩｍａｇｅＪ解析。Ｌ＝ＤＮＡラダー。
【図７】Ａ）ＣＦＴＲ配列に関して長いｅｘｔＤＮＡとの比較で短いオリゴマーで修飾された表面の差異を浮き彫りにする蛍光強度の棒グラフ、およびＢ）異なる表面のそれぞれの蛍光像。
【図８】Ｔｇｏ−Ｐｏｌ  Ｚ３  ｅｘｏ−および［ＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣ（配列番号３）］２／［ＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ（配列番号４）］２による２０サイクルの加熱−冷却サイクル伸長；Ａ）アガロースゲル：レーン１は２０サイクル後の伸長産物；Ｂ）ＵＶ−Ｖｉｓプロット；Ｃ）バンドの強度をラダーと比較した最高強度のパーセンテージとして表す伸長産物のＩｍａｇｅＪ解析。Ｌ＝ＤＮＡラダー；およびＤ）サンガーシーケンシング結果。
【図９】溶液伸長されたＤＮＡのＡＦＭ像、ならびにｄｓＤＮＡに予想される寸法が確認されるＤＮＡ鎖の平均高および平均長。
【図１０】Ａ）ＢＡＴ２５配列に関して長いｅｘｔＤＮＡとの比較で短いオリゴシードで修飾された表面の差異を浮き彫りにする蛍光強度の棒グラフ、およびＢ）異なる表面のそれぞれの蛍光像。
【図１１】ＢＡＴ２５配列用の表面から脱ハイブリダイズさせた長い一本鎖ｅｘｔＤＮＡのＡＦＭ像、ならびにｓｓＤＮＡに予想される寸法が確認される単一ＤＮＡ鎖の平均高および平均長。
【図１２】Ａ）１）ＧＡＴＣ、２）ＣＦＴＲおよび３）ＢＡＴ２５に関するアガロースゲル長比較と、Ｂ）短いオリゴシードとｅｘｔＤＮＡとの間の差異を浮き彫りにする、各配列で修飾された表面に関する蛍光強度の比較。
【図１３】ＤＡＰＩで染色した表面とＰＧで染色した表面の蛍光強度の比較。
【図１４】Ａ）ＴＥ緩衝液中およびＨ２Ｏ中のｅｘｔＤＮＡおよびＰＧの蛍光強度；Ｂ）ＰＧ／ＴＥ溶液中のｅｘＤＮＡの蛍光像；およびＣ）ＰＧ／Ｈ２Ｏ溶液中のｅｘｔＤＮＡの蛍光像。
【図１５】さまざまなＰＧ結合時間に関する蛍光強度。
【図１６】二酸化ケイ素表面で成長させたｅｘｔＤＮＡの蛍光強度。
【図１７】ガラス表面上でＢＡＴ２５配列を伸長した場合の接触角の変化。ＢＡＴ２５配列については、表３を参照されたい。
【図１８】ミスマッチの数が異なる標的による、伸長されたＢＡＴ２５表面の蛍光の変化。これはＶＮＴＲ配列中の少数のミスマッチを検出するための方法の感度を実証している。ＢＡＴ２５プローブと再ハイブリダイズさせるミスマッチ配列については、表５を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明者らは、表面に固定化されたリポートオリゴヌクレオチド配列（オリゴシード）を酵素的に伸長させるための方法をつきとめた。本発明者らは、意外にも、固定化されたオリゴシードは、オリゴシードが固体支持体に固定化されている場合には、典型的な加熱−冷却サイクルによるＰＣＲを使って伸長させうることを明らかにした。本方法は、リンカー分子を介して表面に直接固定化された長いＤＮＡブラシをもたらす（概要については図１を参照されたい）。続いてｓｓＤＮＡへの変性と標的相補的ＤＮＡとの再ハイブリダイゼーションとを行うことにより、表面上の短いｄｓＤＮＡと比較して、蛍光強度の増加がもたらされる。伸長は、プローブ分子あたりの標的結合部位の数を増加させ、したがって標的検出を増加させる。
【００４２】
本発明者らは、本方法の汎用性が極めて高いことを明らかにした。前記表面、リンカーおよびＤＮＡ配列は所望の用途に合わせてそれぞれ変更することができるからである。本明細書の実施例の項で実証するように、２つの異なるリンカーおよび２つの異なる固体支持基板を使って、３つの異なるオリゴシードを本方法で伸長させることに成功した。本明細書に提示するデータは、伸長されたｄｓＤＮＡ試料における蛍光シグナルが、それより短いｄｓＤＮＡ鎖と比較して増加していることを、明瞭に実証している。また、これらのデータは、記載の方法が光学（ガラス）デバイスへの組込みにも電子（シリコン）デバイスへの組込みにも適していることを、明瞭に例証している。
【００４３】
熱サイクル法
本発明者らは、６０ヌクレオチド長までの単位配列のタンデムリピートを含む固定化された線状ポリヌクレオチドを、熱サイクル法を使って生成させることができる方法を、ここにつきとめた。この発見は、標的ポリヌクレオチド配列に対していくつかの結合部位を有する固定化されたポリヌクレオチドプローブを生成させるための新しい方法をもたらし、よって例えばアレイフォーマットでのそのような方法の感度を改良する大きな可能性を秘めている。
【００４４】
「熱サイクル法」とは、多数の反復サイクルを伴い、各サイクルが第１温度から第２（またはさらなる）温度への温度変化を含む方法をいう。熱サイクル法の周知の例にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）がある。
【００４５】
本明細書にいう「核酸配列」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」およびそれらのバリエーションは、規則的な配列または不規則な配列の複数のヌクレオチドを指すために、相互可換的に使用される。ポリヌクレオチドは、典型的には、一本鎖または二本鎖（二重鎖）であるが、三本（三重）鎖または四本（四重／ｉ−モチーフ）鎖を含有する高次構造をとる場合や、適切な条件下で異なる遺伝子座にこれらのコンフィギュレーションの組合せを含有する場合もある。ポリヌクレオチドは短くても長くてもよい。ポリヌクレオチドは少なくとも２つの隣接ヌクレオチドを有する。
【００４６】
ヌクレオチド配列は、ゲノム起源、合成起源または組換え起源であることができ、二本鎖または一本鎖（センス鎖またはアンチセンス鎖に相当するもの）であることができる。「ヌクレオチド配列」という用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、およびＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）、ならびに例えばヌクレオチド類似体を使用するなどして生成させたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を包含する。言い換えると、修飾ＤＮＡ塩基または修飾ＲＮＡ塩基も包含される。それゆえ、ポリヌクレオチドは１つまたは複数の修飾ＤＮＡ塩基または修飾ＲＮＡ塩基を含みうる。特定部位に複数の修飾を保持するポリヌクレオチドは合成生物学、ナノ材料の製作、生物分析用途および配列決定用途に応用される。例えばＤＮＡは、その３つの構成部分−リン酸結合、糖環および核酸塩基のいずれかまたはすべてを化学修飾することができる。さまざまな修飾ヌクレオチドがデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）またはホスホラミダイト誘導体として市販されている。これらの修飾ヌクレオチドおよび他の修飾ヌクレオチドは、ｄＮＴＰとして合成し、ＤＮＡまたはＲＮＡに酵素的に挿入するか、ホスホラミダイトとして合成し、ＤＮＡまたはＲＮＡに自動ＤＮＡ合成によって挿入することができる。
【００４７】
ヌクレオチド残基は通常、天然に存在するプリン塩基、すなわちアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、ヒポキサンチン（Ｉ）およびキサンチン（Ｘ）、ならびにピリミジン塩基、すなわちシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）から誘導される。ヌクレオチド類似体は、ポリヌクレオチド配列内の位置の１つ以上に使用することができ、そのようなヌクレオチド類似体は、例えば塩基部分および／または糖部分および／またはリン酸結合部分で修飾されている。ヌクレオチド類似体は、それがポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを妨げず、テンプレートとしても基質としてもポリメラーゼによって許容されるのであれば、どれでも使用することができる。
【００４８】
本明細書に提示する核酸配列は、従来どおり、５’から３’に向かって（左から右へ）記述される。「線状ポリヌクレオチド」とは、分岐もしていないし、環化もしていない（すなわち３’端は５’端と環化していない）ポリヌクレオチドをいう。
【００４９】
一例において、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。別の一例において、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。ＤＮＡまたはＤＮＡは、天然塩基または修飾塩基を、それらの組合せを含めて、含みうる。当技術分野では修飾塩基がいくつか知られているので、当業者は適切な修飾塩基を容易に同定することができる。
【００５０】
線状ポリヌクレオチド中の１〜６０ヌクレオチド長である単位配列のタンデムリピートの回数を増加させる熱サイクル法が提供される。
【００５１】
熱サイクル法の開始時点において、線状プライマーポリヌクレオチドは単位配列の少なくとも２つのコピーを含む。単位配列は１〜６０ヌクレオチド長である。線状ポリペプチドは、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上などの同じ単位配列を含みうる（すなわち、線状ポリペプチドは同じ単位配列のリピートを複数回含みうる）。これは、少なくとも２０コピー、少なくとも２５コピー、少なくとも３０コピー、少なくとも３５コピー、少なくとも４０コピー、少なくとも４５コピー、少なくとも５０コピー、少なくとも５５コピー、少なくとも６０コピー、少なくとも６５コピー、少なくとも７０コピー、少なくとも７５コピー、少なくとも８０コピー、少なくとも８５コピー、少なくとも９０コピー、少なくとも９５コピーまたは少なくとも１００コピーの単位配列を含みうる。反復される単位配列はタンデムでありうる（すなわち、それらを「タンデムリピート」ということができる）。タンデムリピートは、あるヌクレオチドのパターン（この場合は単位配列）が繰り返され、それらの繰返しが互いに直接隣接している場合に、ポリヌクレオチド配列中に生じる。一例として、単位配列がＡＴＴＣＧであるとすると、単位配列の２回のタンデムリピートをポリヌクレオチドは、配列ＡＴＴＣＧＡＴＴＣＧ（配列番号５）を含み、単位配列の３回のタンデムリピートを含むポリヌクレオチドは配列ＡＴＴＣＧＡＴＴＣＧＡＴＴＣＧ（配列番号６）を含み、単位配列の４回のタンデムリピートを含むポリヌクレオチドは配列ＡＴＴＣＧＡＴＴＣＧＡＴＴＣＧＡＴＴＣＧ（配列番号７）を含むなどということになる。タンデムリピートの回数は単位配列の「コピー数」ということもできる。
【００５２】
単位配列は塩基の任意の順列を有しうる。線状ポリヌクレオチド中でタンデムに反復されうる一般的な単位配列の非限定的な例としては、以下の配列が挙げられる：（ＡＴ）ｎ、（ＧＣ）ｎ、（ＧＧＣ）ｎ、（ＣＡＧ）ｎ、（ＧＣＡＴ）ｎ、（ＧＡＴＣ）ｎ、（ＡＡＡＧ）ｎ、（ＡＡＡＡＡＡＡＡＧ）ｎ（配列番号８）、（ＡＣＴＧＡＴＣＡＧＣ）ｎ（配列番号９）、ここで（ｘｘｘｘ）は単位配列を表し、ｎはタンデムリピートの回数を表し（すなわちｎ＝単位配列コピー数）。
【００５３】
単位配列は１〜６０ヌクレオチド長である。それゆえに単位配列は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２，２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７もしくは５８個、または少なくとも５９個のヌクレオチドを含みうる（いずれの場合も上限は６０個のヌクレオチドである）。
【００５４】
一例において、単位配列は２〜９個のヌクレオチドを有するマイクロサテライト配列である。あるいは、単位配列は１０〜６０個のヌクレオチドを有するミニサテライト配列でありうる。
【００５５】
本方法は、ポリヌクレオチド中の単位配列のタンデムリピートの回数を増加させる。言い換えると、出発ポリヌクレオチド（すなわち、最初の固定化プライマーポリヌクレオチド）が（ＡＴＴＣＧという）単位配列をタンデムに２つ（すなわちＡＴＴＣＧＡＴＴＣＧ（配列番号５）を）有するとすると、本方法は、これをタンデムに少なくとも３つ（すなわちＡＴＴＣＧＡＴＴＣＧＡＴＴＣＧ（配列番号６））に増加させることになる。同様に、出発ポリヌクレオチドが前記単位配列の３つのタンデムリピート（すなわちＡＴＴＣＧＡＴＴＣＧＡＴＴＣＧ（配列番号６））を有するとすると、本方法はこれを少なくとも４回のタンデムなリピート（すなわちＡＴＴＣＧＡＴＴＣＧＡＴＴＣＧＡＴＴＣＧ（配列番号７））に増加させるなどということになる。
【００５６】
タンデムリピートはゲノムＤＮＡ中に自然に存在する。それらは、１０〜６０ヌクレオチド長である単位配列のリピートについては「ミニサテライト」と称され、２〜９ヌクレオチド長である単位配列のリピートについては「マイクロサテライト」と称される。タンデムリピートの回数はコピー数と称される。可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）は、個体間でコピー数が変動するタンデムリピートである。ＤＮＡフィンガープリント法におけるＶＮＴＲ解析は、現代の科学捜査および身元照合、ならびに病原体、真菌および植物の種タイピングにおいて、非常に貴重である。トリヌクレオチドリピートの異常は、ハンチントン病（ＣＡＧ）、フリードライヒ運動失調症（ＧＡＡ）、筋緊張性ジストロフィー（ＣＴＧ）および脆弱Ｘ症候群（ＣＧＧ）を含む遺伝子疾患と関連する。
【００５７】
本方法は以下の工程を含む：
ｉ）１〜６０ヌクレオチド長である単位配列の少なくとも２回のタンデムリピートを含む一本鎖プライマーポリヌクレオチドが固定化されている表面を持つ固体基板を用意する工程。
「固体基板」とは、１つ以上の剛性表面または半剛性表面を有する材料または材料群を指す。多くの態様において、固体基板の少なくとも１つの表面は実質的に平坦（または平面的）であるだろう。別の態様では、異なるポリヌクレオチドが固定化されている領域を、例えばウェル、隆起した領域、エッチングされた溝、またはそれらの組合せを使うなどして、物理的に分離することが望ましいかもしれない。別の態様によれば、固体基板は、ビーズ、樹脂、ゲル、マイクロスフェアまたは他の幾何学的コンフィギュレーションの形態をとりうる。それゆえに基板は、半固体基板（例えばゲルまたは他のマトリックス）および／または多孔性基板（例えばナイロンメンブレンまたは他のメンブレン）を含みうる。
【００５８】
一本鎖プライマーポリヌクレオチドが固定化される固体基板の表面は、任意の適切な材料、例えば限定するわけではないが、ガラス、ポリアクリルアミド被覆ガラス、エポキシ、セラミックス、溶融シリカ、シリコン、石英、さまざまなプラスチック、金または銀などの金属（例えばテンプレートストリッピングによって作製された金または銀などの金属）、ナイロン、ゲルマトリックス、グラフェンまたは酸化グラフェンから構成されうる。これらの材料の組合せまたは複合材料も考えられる。
【００５９】
固体基板の表面には、１〜６０ヌクレオチド長である単位配列の少なくとも２回のタンデムリピートを含む一本鎖プライマーポリヌクレオチドが固定化されている。「プライマーポリヌクレオチド」とは、ポリメラーゼ連鎖反応のプライマーとしての、熱サイクル法におけるポリヌクレオチドの機能を指す。「プライマーポリヌクレオチド」は一本鎖である。したがってこれは、少なくとも部分的に相補的なポリヌクレオチド配列とハイブリダイズし、よって、固定化されたプライマーポリヌクレオチド配列の伸長を開始させて、固定化された配列中のタンデムリピートの回数を増加させることができる。
【００６０】
一本鎖プライマーポリヌクレオチドは、任意の適切な固定化手段を使って、固体基板の表面に固定化される。ポリヌクレオチドを表面に固定化するには、リンカー（または他の任意の手段）を使用しうる。適切な表面化学を使ってポリヌクレオチドを表面に固定化してもよい（例えばインクジェットプリンティング技法またはインクジェットスポッティング技法のいずれかに適合する表面化学）。
【００６１】
一例において、線状ポリヌクレオチドは共有結合または非共有結合によって表面に固定化される。線状ポリヌクレオチドは、表面の化学修飾された領域に、非共有結合的に固定化されうる。
【００６２】
適切なリンカー／表面（または表面化学）の組合せは当技術分野では周知である。例えば線状ポリヌクレオチドは、固体基板の表面へのポリヌクレオチドの固定化に使用しうる官能基で修飾された１つ以上のヌクレオチド類似体を含んでよく、その官能基はフレキシブルなリンカーまたはリジッドなリンカーによってヌクレオチドに取り付けうる。例示的官能基として、スクシンイミジルエステル修飾ラベルと共有結合的に反応するアミン、アルキン修飾ラベルと共有結合的に反応するアジド、アジド修飾ラベルと共有結合的に反応するアルキン、抗ジゴキシゲニン抗体と強い非共有結合的相互作用を形成するジゴキシゲニン、または蛍光色素などのレポーター基で、ビオチンコンジュゲートラベルによって非共有結合的に、もしくはタンパク質上に共有結合的に、標識されたアビジンもしくはストレプトアビジンと強い非共有結合的相互作用を形成するビオチンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。具体例として、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、５−アミノアリルシトシン、５−アミノアリルウラシル、７−デアザ−７−プロパルギルアミノアデニン、７−デアザ−７−プロパルギルアミノグアニン、５−プロパルギルアミノシトシン、５−プロパルギルアミノウラシル、８−［（６−アミノ）ヘキシル−ビオチン］−アミノアデノシン、γ−［Ｎ−（ビオチン−６−アミノ−ヘキサノイル）］−７−プロパルギルアミノ−７−デアザアデニン、γ−［Ｎ−（ビオチン−６−アミノヘキサノイル）］−５−アミノアリル−ウラシル、γ−［Ｎ−（ビオチン−６−アミノ−ヘキサノイル−６−アミノヘキサノイル）］−５−（３−アミノアリル）−ウラシル、ジゴキシゲニン−Ｘ−５−アミノアリル−ウラシル、５−（３−アジドプロピル）−ウラシル、５−アジド−ＰＥＧ４−ウラシル、５−アジド−ＰＥＧ４−シトシン、５−（オクタ−１，７−ジインイル）−ウラシル、５−（オクタ−１，７−ジインイル）−シトシン（５−Ｃ８−アルキン−Ｃ）、５−ジベンジルシクロオクチル−ＰＥＧ４−ウラシル、５−ジベンジルシクロオクチル−ＰＥＧ４−シトシン、５−ｔｒａｎｓ−シクロオクテン−ＰＥＧ４−ウラシル、またはこれらの任意の組合せが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。適切なリンカーとして、シランリンカー分子、ビオチン−ストレプトアビジン複合体、チオール−Ａｕリンカー、シリコンへのＳｉ−Ｃ共有結合、シリコンへのＳｉ−Ｏ共有結合、シリコンへのＳｉ−Ｎ共有結合、ナノ粒子リンカー、または動的共有結合が挙げられる。
【００６３】
官能基／リンカーは、典型的には、一本鎖線状ポリヌクレオチドの５’端に取り付けられる（または少なくとも、固体基板の表面への線状ポリヌクレオチドの５’端の固定化を可能にするような形で、線状ポリヌクレオチドに取り付けられる）。
【００６４】
タンデムリピートは、典型的には、固定化された一本鎖プライマーポリヌクレオチドの３’末端に位置する。いくつかの例では、タンデムリピートが、線状ポリヌクレオチドの（５’→３’方向に）最後のヌクレオチドを構成しうる。
【００６５】
本方法は以下の工程をさらに含む：
ｉ）前記固定化されたプライマーポリヌクレオチドを、前記プライマーポリヌクレオチドの単位配列に相補的である少なくとも２回のタンデムリピートを含む一本鎖テンプレートポリヌクレオチドと、単位配列とその相補鎖との間のミスマッチ二重鎖形成を許すハイブリダイゼーション条件下で、前記テンプレートポリヌクレオチドの５’オーバーハングが生成し、その５’オーバーハングが前記プライマーポリヌクレオチドの単位配列に相補的である少なくとも１回のタンデムリピートを含むように、接触させる工程。
【００６６】
この工程を、本明細書では、「アニーリング工程」、「ハイブリダイゼーション工程」、またはそのバリエーションともいう。
【００６７】
この文脈において、「プライマーポリヌクレオチドの単位配列に相補的である少なくとも２回のタンデムリピートを含む一本鎖テンプレートポリヌクレオチド」とは、「テンプレートポリヌクレオチド」（または「テンプレート」）と記載することもできる。
【００６８】
テンプレートポリヌクレオチドは、プライマーポリヌクレオチドの単位配列に相補的である少なくとも２回のタンデムリピートを含む。「相補的」という用語は、当技術分野におけるその通常の文脈において使用される。一例として、プライマーポリヌクレオチドの単位配列が５’  ＡＴＣＧ  ３’であるとすると、テンプレートポリヌクレオチドのタンデムリピートは５’  ＣＧＡＴ  ３’となる（すなわち、テンプレートポリヌクレオチドは少なくとも２回のタンデムリピートを含むことになるので、配列５’  ＣＧＡＴＣＧＡＴ  ３’を含むことになる）。言い換えると、この例では、テンプレートおよびプライマー中のタンデムリピートは１００％相補的である。
【００６９】
テンプレートポリヌクレオチドが３回以上のタンデムリピートを持つ場合、本発明は、少なくとも３’端の２回のタンデムリピートがプライマーポリヌクレオチド中の対応するタンデムリピートに１００％相補的である（そしてさらなるタンデムリピートはプライマーポリヌクレオチド中の対応するタンデムリピートに１００％または１００％未満相補的である）テンプレートポリヌクレオチド配列を包含する。言い換えると、固定化されたプライマー鎖の３’端が、テンプレート鎖に相補的である少なくとも２回のリピートを有するのであれば、テンプレート鎖の残りの部分は１００％相補的である必要はない。
【００７０】
固定化されたプライマーポリヌクレオチドを、単位配列とその相補鎖との間のミスマッチ二重鎖形成を許すハイブリダイゼーション条件下で、テンプレートポリヌクレオチドと接触させる。この文脈において、「接触させる」とは、プライマーポリヌクレオチドとテンプレートポリヌクレオチドとの間の、例えば本方法の後続の熱サイクル工程のための適当な緩衝液および容器における、直接的な接触を指す。適切な緩衝液および容器は周知であり、例えばＰＣＲ緩衝液およびＰＣＲエッペンドルフチューブが挙げられる。
【００７１】
プライマーポリヌクレオチドをテンプレートポリヌクレオチドと適当なハイブリダイゼーション条件下で接触させると、相補的配列（すなわち、プライマーポリヌクレオチドの（１つまたは複数の）単位配列とテンプレートヌクレオチドの相補的タンデムリピートと）がハイブリダイズして二重鎖を形成することになる。プライマーポリヌクレオチドとテンプレートポリヌクレオチドはそれぞれ少なくとも２回のタンデムリピートを有し、プライマーリピートとテンプレートリピートとは互いに相補的であるから、テンプレートポリヌクレオチドとプライマーポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションは、反応のうちのあるパーセンテージにおいて、結果として生じるポリヌクレオチド二重鎖が相補的配列のすべてで位置合わせできているわけではない位置ずれしたアラインメントをもたらす（図２参照）。言い換えると、ミスマッチ二重鎖形成が起こる（ここで「ミスマッチ」とは、それぞれプライマーポリヌクレオチドおよびテンプレートポリヌクレオチドにおける単位配列およびタンデムリピートの相補的配列のすべての間で完全なわけではないアラインメントを指す）。図２に示すように、テンプレートポリヌクレオチドの５’オーバーハングであって、プライマーポリヌクレオチドの単位配列に相補的である少なくとも１回のタンデムリピートを含む５’オーバーハングが生成しうる。その場合、これは、固定化されたプライマーポリヌクレオチドを伸長させ、よって、固定化された線状ポリヌクレオチド中のタンデムリピートの回数を増加させるための、熱サイクル法におけるテンプレートとして役立ちうる。
【００７２】
本明細書にいう「ハイブリダイゼーション条件」とは、使用される試薬および反応条件（例えば温度、時間など）を指す。これはハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する条件を記述する。通例、ハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェントまたは中等度でありうる。本明細書記載の方法との関連において使用されるハイブリダイゼーション条件は、ミスマッチ二重鎖形成を許し、それゆえに中等度またはストリンジェントでありうる。好ましくは、固定化されたポリヌクレオチドの単位配列とテンプレートオリゴヌクレオチドの相補的配列との間のハイブリダイゼーションは、６５℃以下において安定な二重鎖を形成するだろう。６５℃までの温度、例えば５５℃〜６５℃の温度において、随意に１〜３０秒の期間にわたって、ミスマッチ二重鎖が形成されうることが好ましい。
【００７３】
中等度の条件およびストリンジェントな条件は当業者には知られており、入手可能な参考文献（例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９，６．３．１−６．３．６）に見出すことができる。上記の文献には水性の方法および非水性の方法が記載されており、それらはどちらも使用することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい一例は、約４５℃の６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーションと、それに続く、５０℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳにおける１回以上の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもう一つの好ましい例は、約４５℃の６×ＳＳＣにおけるハイブリダイゼーションと、それに続く、５５℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳにおける１回以上の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらにもう一つの好ましい例は、約４５℃の６×ＳＳＣにおけるハイブリダイゼーションと、それに続く、６０℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳにおける１回以上の洗浄である。好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約４５℃の６×ＳＳＣにおけるハイブリダイゼーションと、それに続く、６５℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳにおける１回以上の洗浄である。特に好ましいストリンジェンシー条件（およびある分子が本発明のハイブリダイゼーション制限内にあるかどうかを決定するためにどんな条件を適用すべきかについて実施者が確信を持てない場合に使用すべき条件）は、６５℃で０．５モル濃度のリン酸ナトリウム、７％（ｗ／ｖ）ＳＤＳと、それに続く、６５℃の０．２×ＳＳＣ、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳでの１回以上の洗浄である。
【００７４】
本方法は以下の工程をさらに含む：
ｉｉｉ）前記ミスマッチ二重鎖を、耐熱性５’→３’ポリメラーゼおよびヌクレオチドと、５’→３’方向のポリヌクレオチド伸長を許す伸長条件下で接触させる工程。
【００７５】
この工程を、本明細書では、「伸長工程」またはそのバリエーションともいう。
【００７６】
「接触させる」という用語は上に定義したが、この文脈でも同様に適用される。それゆえに、これは、ミスマッチ二重鎖と耐熱性５’→３’ポリメラーゼ（およびヌクレオチド）との間の、例えば本方法の後続の熱サイクル工程のための適当な緩衝液および容器における、直接的な接触を指す。適切な緩衝液および容器は周知であり、例えばＰＣＲ緩衝液およびＰＣＲエッペンドルフチューブが挙げられる。
【００７７】
入手可能な周知の耐熱性５’→３’ポリメラーゼはいくつかあり、本明細書記載の方法ではそれらを使用しうる。ポリメラーゼは、伸長反応に必要な長時間にわたるインキュベーション中もその活性が実質的に保たれるように、耐熱性であり安定性が高いことが好ましい。ポリメラーゼは好ましくは高い処理能力を有する。ポリメラーゼは非特異的ヌクレアーゼ活性を呈さないことが好ましい。ポリメラーゼは、好ましくは、良好な忠実度を有するが、テンプレートとしても基質としても、ある範囲のヌクレオチド類似体を許容することもできる。
それゆえに、効率の良い校正活性を持つ高忠実度ポリメラーゼは不適切である。好ましくは、ポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠き［３’→５’エキソ（−）］、そのため、校正機能がないので低い忠実度を有する。当業者であれば、ある特定ポリメラーゼが上に定義した必要な性質を有するかどうかを決定することができる。例示的ポリメラーゼとしては、Ｔｇｏ−Ｐｏｌ  Ｚ３  ｅｘｏ（−）［Ｊｏｚｗｉａｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  １２：３５−３７］、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ（−）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ（−）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｐｆｕ  ｅｘｏ（−）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＴａｑポリメラーゼ（多くの供給業者）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。一例において、選り抜きのポリメラーゼは、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）ファミリーＢポリメラーゼ（Ｔｇｏ−Ｐｏｌ）酵素変異体Ｚ３である。
【００７８】
熱サイクル反応のための適当なヌクレオチドは当技術分野では周知である。
【００７９】
ミスマッチ二重鎖、ポリメラーゼおよびヌクレオチド間の接触は、５’→３’方向のポリヌクレオチド伸長を許す伸長条件下で行われる。本明細書にいう「伸長条件」とは、使用される試薬および反応条件（例えば温度、時間など）を指す。これはプライマーポリヌクレオチドを伸長させるための条件を記述する。適当な伸長条件は当技術分野では周知である。好ましくは、伸長は約６５℃〜７５℃の温度で、随意に３０〜１２０秒の期間にわたって、行われる。適当な条件は、例えばＷｈｉｔｆｉｅｌｄ  ＣＪ，Ｔｕｒｌｅｙ  ＡＴ，Ｔｕｉｔｅ  ＥＭ，Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  ＢＡ，Ｐｉｋｅ  ＡＲ．「Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌｏｎｇ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｕｎｉｔｓ」Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２０１５，５４（３１），８９７１−８９７４に見出しうる。
【００８０】
本方法の工程ｉ）〜ｉｉｉ）は少なくとも１回繰り返しうる。これらの工程を繰り返すために、工程ｉｉｉ）によって生成した伸長された二重鎖を変性させて、一本鎖の伸長された固定化ポリヌクレオチドを生成させる。そうすれば、一本鎖ポリヌクレオチドは、工程ｉ）〜ｉｉｉ）の反復サイクルにおいて、プライマーポリヌクレオチドとして働きうる。反復サイクルの数を変動させることで、異なる長さのポリヌクレオチドを得ることができる。平均ポリヌクレオチド長は、温度、１工程あたりの時間の長さ、およびサイクル数によって制御される。
【００８１】
それゆえに、工程ｉｉｉ）によって生成する伸長された二重鎖は、その二重鎖の一本鎖ポリヌクレオチドへの解離を可能にする変性条件に供しうる。これを、本明細書では、「融解工程」ともいう。適当な変性条件は当技術分野では周知であり、これには、伸長された二重鎖を約７５〜１００℃の温度、好ましくは約９０〜９８℃の温度に、随意に約１５〜３０秒にわたって、供することが含まれる。
【００８２】
それゆえに、本方法は、以下の工程をさらに含みうる：
ｉｖ）ｉｉｉ）の二重鎖を、変性条件下で変性させることで、固定化された一本鎖ポリヌクレオチドを生成させる工程、および
ｖ）工程ｉｉ）〜工程ｉｉｉ）を少なくとも１回繰り返すことで、前記固定化されたポリヌクレオチド中のタンデムリピートの回数を増加させる工程。
【００８３】
ここまでに記載した方法は、出発材料として、１〜６０ヌクレオチド長である単位配列の少なくとも２回のタンデムリピートを含む一本鎖線状プライマーポリヌクレオチドが固定化されている表面を持つ固体基板を提供する。この出発材料は、１〜６０ヌクレオチド長である単位配列の少なくとも２回のタンデムリピートを含む二本鎖線状プライマーポリヌクレオチドが固定化されている表面を持つ固体基板から誘導することができ、その二本鎖線状プライマーポリヌクレオチドを変性させると、本方法のための固定化された一本鎖線状プライマーポリヌクレオチド出発材料が生成する。
【００８４】
適切な変性条件は本明細書の他の項に記載する。
【００８５】
それゆえに、１〜６０ヌクレオチド長である単位配列の少なくとも２回のタンデムリピートを含む一本鎖線状プライマーポリヌクレオチドが固定化されている表面を持つ固体基板は、以下の工程によって提供されうる：
ａ）１〜６０ヌクレオチド長である単位配列の少なくとも２回のタンデムリピートを含む二本鎖線状プライマーポリヌクレオチドを固体基板の表面に固定化する工程、および
ｂ）前記二本鎖線状プライマーポリヌクレオチドを変性させて、前記一本鎖線状プライマーポリヌクレオチドを得る工程。
【００８６】
１〜６０ヌクレオチド長である単位配列の少なくとも２回のタンデムリピートを含む二本鎖線状プライマーポリヌクレオチドを、本明細書では、「オリゴシード」ともいう。
【００８７】
工程ｉ）の固定化されたプライマーポリヌクレオチドは、単位配列の少なくとも２回のタンデムリピートを含む。上で述べたように、ポリヌクレオチドは、単位配列の少なくとも２回から少なくとも１００回までのタンデムリピートを有しうる。一例において、固定化されたプライマーポリヌクレオチドは、単位配列の少なくとも２回、少なくとも５回、少なくとも１０回、または少なくとも１５回のタンデムリピートを含む。
【００８８】
固体基板
少なくとも１つの線状プローブポリヌクレオチドが固定化されている表面を持つ固体基板も提供される（ここで、前記少なくとも１つの線状プローブポリヌクレオチドは、１〜６０ヌクレオチド長である単位配列の少なくとも２回のタンデムリピートを含む）。
【００８９】
前記固体基板は上述の熱サイクル法によって生成させることができ、ここでは、最初の固定化線状プライマーポリヌクレオチドが、その単位配列のタンデムリピートの回数が増加するように伸長され、伸長された線状ポリヌクレオチドが固体基板上に固定化された線状プローブポリヌクレオチドに対応する（伸長された線状ポリヌクレオチドを本明細書では固体基板上に固定化された線状プローブポリヌクレオチドという）。あるいは、線状プローブポリヌクレオチドを（例えば溶液中で）生成させた後、その線状プローブポリヌクレオチドを固体基板の表面に固定化することによって、固体基板を得てもよい。
【００９０】
線状プライマーポリヌクレオチドに関して提供した定義は、文脈上特に別段の言明がある場合を除き、線状プローブポリヌクレオチドにも等しく適用される。同様に、固体基板（またはその表面）に関して提供した定義も、文脈上特に別段の言明がある場合を除き、（固体基板の存在を必要とする）本明細書記載の方法に適用される。
【００９１】
線状プローブポリヌクレオチドは、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上などの同じ単位配列を含みうる（すなわち、線状ポリヌクレオチドは同じ単位配列のリピートを何回か含みうる）。これは、少なくとも２０コピー、少なくとも２５コピー、少なくとも３０コピー、少なくとも３５コピー、少なくとも４０コピー、少なくとも４５コピー、少なくとも５０コピー、少なくとも５５コピー、少なくとも６０コピー、少なくとも６５コピー、少なくとも７０コピー、少なくとも７５コピー、少なくとも８０コピー、少なくとも８５コピー、少なくとも９０コピー、少なくとも９５コピー、少なくとも１００コピー、少なくとも１１０コピー、少なくとも１２０コピー、少なくとも１４０コピー、少なくとも１５０コピー、少なくとも１６０コピー、少なくとも１７０コピー、少なくとも１８０コピー、少なくとも１９０コピー、少なくとも２００コピー、または少なくとも２５０コピーなどの単位配列を含みうる。
【００９２】
本発明の固体基板の表面は、以下の要素を含みうる：
ｉ）線状プローブ（またはプライマー）ポリヌクレオチドが固定化されている、複数の離間した不連続な領域、および
ｉｉ）前記離間した不連続な領域の間にあって、線状プローブ（またはプライマー）ポリヌクレオチドを実質的に含まない、領域間区域。
【００９３】
線状（プローブまたはプライマー）ポリヌクレオチドは、基板の表面の、本明細書において「離間した不連続な領域」と呼ばれる領域に、固定化されうる。この術語は、表面の領域であって、異なるポリヌクレオチド（または同じポリヌクレオチドのコピー）が固定化されていてもよい前記表面の空間的に離れた他の領域とは異なる領域を指すために使用される。それゆえに、表面は複数の離間した不連続な領域を含むことができ、そのそれぞれは、離間した各領域が隣接する「離間した不連続な領域」から光学的に分離されうる（すなわち光学的に解像可能である）ように（ある領域から生じた任意の光学的シグナルが、その隣接領域とは光学的に区別可能または識別可能であるように）空間的に離れている。離間した不連続な領域は、離間した不連続な領域の間に、線状プローブポリヌクレオチドを実質的に含まない領域間区域を設けることによって、空間的に離される。そのような「領域間区域」は、典型的には、本明細書記載の線状ポリヌクレオチド（または他の高分子構造）がそのような領域には結合しないというという意味で、不活性である。いくつかの例において、そのような領域間区域は、ブロッキング剤、例えば他のポリマー、酸化物、「化学的に非反応性／非適合性の部位」などで処理しうる。
【００９４】
「離間した不連続な領域」と「領域間区域」との区別は、これらの区域における表面化学によって決定されうる（離間した不連続な領域では表面化学が適切な線状ポリヌクレオチドの固定化を可能にするのに対し、領域間区域の表面化学はそうではない）。あるいは、表面化学は離間した不連続な領域と領域間区域の両者について同じであって、それらの間の区別は、表面の一定の領域に線状ポリヌクレオチドを配置（固定化）すること（これにより離間した不連続な領域が生成する）によって決定されてもよく、その場合は、線状ポリヌクレオチドが配置（固定化）されていない領域が、「領域間区域」になる。
【００９５】
離間した不連続な領域のそれぞれは、固体基板の表面上で所定の位置を有しうる。離間した不連続な領域のそれぞれの間に要求される間隔は、固定化されたポリヌクレオチドから生成する任意の（直接的または間接的）シグナルを光学的に解像または測定するために使用される方法および装置に依存するだろう。これは、本明細書記載の線状ポリヌクレオチドを１つだけ固定化できるサイズを有しうる。あるいは、複数の（例えば少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個の）同一線状プローブ（またはプライマー）ポリヌクレオチドを、単一の離間した不連続な領域内に固定化してもよい。
【００９６】
そのような領域の適切な空間的分離を決定し、そのような領域のサイズを決定するための方法は、当技術分野では周知である。
【００９７】
離間した不連続な領域は、領域が所定の場所を有する事実上任意のパターンで、すなわちシグナル収集機能およびデータ解析機能の効率を向上させる任意の規則的アレイで、表面に配列されうる。そのようなパターンとして、同心円状の領域、らせん状パターン、直線構成パターン、六角形パターンなどが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。好ましくは、領域は直線構成パターンまたは六角形パターンで配列される。
【００９８】
それゆえに、線状プローブポリヌクレオチドが固定化されている離間した不連続な領域は、アレイ、例えばマイクロアレイを形成しうる。
【００９９】
固体基板の表面は、離間した不連続な領域のそれぞれが相異なる線状プローブポリヌクレオチドを含有する複数の離間した不連続な領域を含みうる。言い換えると、固体基板の表面には、少なくとも２つの相異なる線状プローブポリヌクレオチド（異なる離間した不連続な領域に固定されたもの）が存在しうる。
【０１００】
本明細書にいう「複数」とは、１より多いこと、すなわち２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上などを指す。これは、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５または少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００などを包含する。
【０１０１】
線状ポリヌクレオチド（例えば線状プローブポリヌクレオチドまたは線状プライマーポリヌクレオチド）中のタンデムリピートの回数（および「単位配列」のサイズと配列）は、本明細書の他の項で、詳しく議論した。本明細書の他の項でも述べたとおり、本明細書記載の線状ポリヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡでありうる。あるいは、それらはＲＮＡまたはｃＤＮＡであってもよい。
【０１０２】
本明細書記載の線状ポリヌクレオチド（プライマーポリヌクレオチドであるかプローブポリヌクレオチドであるかを問わない）の単位配列は、所望する任意の配列、例えば診断に関連する任意のヌクレオチド配列を含みうる。
【０１０３】
関連する非限定的な例として、疾患の診断に役立つ配列、例えばＢＡＴ２５などのマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）、例えば嚢胞性線維症においてＣＦＴＲ遺伝子に生じる一塩基変異または多塩基変異が挙げられる。したがって、関連する単位配列は５’  ＧＣＡＴＣＴＴＴＣＧ  ３’（配列番号１）（嚢胞性線維症におけるＣＦＴＲ遺伝子に由来する；ＣＦＴＲ遺伝子の３塩基フレームシフト変異から生成する）、５’  ＡＧＡ  ＴＡＣ  ＡＴＴ  ＧＡＣ  ＣＴＴ’３（配列番号１０）（ワルファリンの代謝に影響を及ぼすＣＹＰ４５０肝臓酵素ＣＹＰ２９Ｃ＊２／＊３に由来する；一塩基変異に相当する）、または５’  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＣＧＴ  ＧＴＴ  ＣＡＡ’３（配列番号１１）、またはその他多くの配列（上に具陳した配列の相補鎖である配列を含む）でありうる。当業者は関心対象の配列を容易に同定することができ、関心対象の遺伝子（変異）（またはその相補鎖）はその配列内に含まれる。ワルファリン遺伝子解析に関する適当な配列の例は、Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｊ，Ｃａｕｄｌｅ  Ｋ，Ｇｏｎｇ  Ｌ，Ｗｈｉｒｌ−Ｃａｒｒｉｌｌｏ  Ｍ，Ｓｔｅｉｎ  Ｃ，Ｓｃｏｔｔ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＣＰＩＣ）Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ−Ｇｕｉｄｅｄ  Ｗａｒｆａｒｉｎ  Ｄｏｓｉｎｇ：２０１７  Ｕｐｄａｔｅ」Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１７  Ｓｅｐ  １；１０２（３）：３９７−４０４；Ｓｔｕｂｂｉｎｓ  ＭＪ，Ｈａｒｒｉｅｓ  ＬＷ，Ｓｍｉｔｈ  Ｇ，Ｔａｒｂｉｔ  ＭＨ，Ｗｏｌｆ  ＣＲ．「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ＣＹＰ２Ｃ９  ｌｏｃｕｓ」Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９９６；６（５）：４２９−３９；Ｒｅｔｔｉｅ  ＡＥ，Ｗｉｅｎｋｅｒｓ  ＬＣ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ＦＪ，Ｔｒａｇｅｒ  ＷＦ，Ｋｏｒｚｅｋｗａ  ＫＲ．「Ｉｍｐａｉｒｅｄ（Ｓ）−ｗａｒｆａｒｉｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｃａｔａｌｙｓｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｒ１４４Ｃ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ＣＹＰ２Ｃ９」Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９９４  Ｆｅｂ；４（１）：３９−４２；Ｓｔｅｗａｒｄ  ＤＪ，Ｈａｉｎｉｎｇ  ＲＬ，Ｈｅｎｎｅ  ＫＲ，Ｄａｖｉｓ  Ｇ，Ｒｕｓｈｍｏｒｅ  ＴＨ，Ｔｒａｇｅｒ  ＷＦ，ｅｔ  ａｌ．「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｗａｒｆａｒｉｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＹＰ２Ｃ９＊３」Ｖｏｌ．７，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９９７．ｐ．３６１−７；およびＬｅｅ  ＣＲ，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ＪＡ，Ｐｉｅｐｅｒ  ＪＡ．「Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ２Ｃ９  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ：ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｄａｔａ」Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００２  Ａｐｒ；１２（３）：２５１−６３に見出すことができる。
【０１０４】
被検試料中の線状標的配列の存在を決定するための方法
本明細書記載の固体基板は、関心対象の線状標的配列が被検試料内に存在するか（否か）を決定するために使用しうる。固体基板は（１つまたは複数の）線状プローブポリヌクレオチドが固定化されている表面を有する。線状プローブポリヌクレオチドは単位配列の少なくとも２回のタンデムリピートを含む。各単位配列は、各単位配列の少なくとも一部分が関心対象の線状標的配列に相補的な核酸配列を含む場合には、関心対象の相補的線状標的配列のためのプローブとして（言い換えると結合部位として）作用しうる。それゆえに本明細書記載の固体基板は、固定化されたプローブポリヌクレオチドのそれぞれがいくつかの標的結合部位を含むので、被検試料中の標的ポリヌクレオチド配列の検出感度が改良された検出技術を提供する。
【０１０５】
それゆえに、被検試料中の線状標的ポリヌクレオチド配列の存在を決定するための方法であって、以下の工程を含む方法が提供される：
ｉ）固定化された線状プローブポリヌクレオチドの単位配列が、関心対象の線状標的ポリヌクレオチド配列の配列に相補的である核酸配列を含む、本明細書の他の項に記載する固体基板を用意する工程、
ｉｉ）被検試料を、前記固定化された線状プローブポリヌクレオチドと、前記線状標的ポリヌクレオチド配列と前記固定化された線状プローブポリヌクレオチドの単位配列の相補的部分との間の二重鎖形成を許す条件下で接触させる工程、および
ｉｉｉ）前記被検試料内に前記標的ポリヌクレオチド配列が存在することを示す二重鎖形成を検出する工程。
【０１０６】
線状標的ポリヌクレオチドは任意の関心対象のポリヌクレオチド配列でありうる。線状標的ポリヌクレオチド配列は、線状プローブポリヌクレオチドの単位配列の相補的部分とハイブリダイズする能力を有しなければならず、それゆえに、適当な線状プローブポリヌクレオチドが固体基板上に固定化されなければならない。例えば、線状標的ポリヌクレオチドが配列５’  ＡＴＣＧＡＡ  ３’を有するのであれば、線状プローブポリヌクレオチドの単位配列は配列５’  ＴＴＣＧＡＴ  ３’を含むべきである。当業者は、線状標的ポリヌクレオチドにとって適当な単位配列を容易に同定することができる。
【０１０７】
固定化された線状プローブポリヌクレオチドの単位配列は、それゆえに、関心対象の線状標的ポリヌクレオチド配列の配列に相補的である核酸配列を含む。この例において、単位配列は、関心対象の線状標的ポリヌクレオチドの配列に相補的ではない他の（追加）核酸も含むことができる。この例において、単位配列中の追加核酸は、固定化された線状プローブポリヌクレオチド中の標的結合部位間の「スペーサー」として作用しうる。
【０１０８】
もう一つの例において、単位配列は、関心対象の線状標的ポリヌクレオチド配列の配列に相補的な核酸配列からなる（すなわち単位配列は、上記の例とは対照的に、「追加核酸」を含まない）。
【０１０９】
線状標的ポリヌクレオチドは、被検試料中の、より長いポリヌクレオチド分子の一部でありうる。それゆえ、本明細書にいう「線状標的ポリヌクレオチド」は、固定化された線状プローブポリヌクレオチドと共に二重鎖を形成するポリヌクレオチドの全長（または配列）を限定するものではなく、固定化された線状プローブポリヌクレオチドの単位配列中の対応する配列にハイブリダイズする能力を有する配列（したがって、関心対象であるおよび／または情報を与える（例えば診断／予後に役立つ）被検試料中の配列）を指すにすぎない。それゆえにこれは、被検試料中の、より長い配列の一部でありうる。
【０１１０】
被検試料は、関心対象の線状標的ポリヌクレオチドを含有しうる任意の適当な試料でありうる。「被検試料」とは通常、生物源、環境源、医療源または患者源からの材料の分量であって、その中での関心対象の線状標的ポリヌクレオチドの検出または測定が求められるものを意味する。一方において、これは、標本または培養物（例えば微生物培養物）を包含するものとする。他方において、これは、生物学的試料および環境試料をどちらも包含するものとする。試料は合成起源の標本を含みうる。生物学的試料は、ヒトを含む動物の体液、固形物（例えば糞便）または組織、ならびに液状および固形の食品および飼料の製品および原材料、例えば乳製品、野菜、食肉および食肉副産物、ならびに廃棄物でありうる。生物学的試料は、患者から採取された材料を、例えば限定するわけではないが、培養物、血液、唾液、脳脊髄液、胸水、乳汁、リンパ液、喀痰、精液、針吸引物などを包含しうる。生物学的試料は、さまざまな科の家畜、ならびに野生化した動物または野生動物、例えば限定するわけではないが、有蹄類、熊、魚、齧歯類などの動物から得ることができる。環境試料には、表層物（ｓｕｒａｆａｃｅ  ｍａｔｔｅｒ）、土壌、水および産業試料などの環境材料、ならびに食品および乳製品を加工する機器、装置、設備、道具、使い捨ての物品および使い捨てではない物品から得られる試料が含まれる。これらの例を、本発明に適用することができる試料タイプの限定とみなしてはならない。
【０１１１】
二重鎖形成を検出するための標準的方法はいくつか知られている。それらには、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ、ＤＡＰＩまたはｓｙｂｅｒｇｒｅｅｎなどの蛍光インターカレーター、蛍光タグ付きＤＮＡ、フルオレセイン、酸化還元タグ付きＤＮＡ、フェロセン、ナノ粒子または磁気的にタグ付けされたＤＮＡの使用が含まれる。そのような標準的方法は、例えば「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｓｉｌｖｅｒ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ」Ｂ．Ｆｏｕｌｔｉｅｒ；Ｌ．Ｍｏｒｅｎｏ−Ｈａｇｅｌｓｉｅｂ；Ｄ．Ｆｌａｎｄｒｅ；Ｊ．Ｒｅｍａｃｌｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  １５２，Ｉｓｓｕｅ  １，ＩＥＥ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ−Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００５，ｐ．３−１２；およびＫａｖｉｔａ  Ｖ，による総説「ＤＮＡ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ」Ｊ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ＆Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉ  ２０１７，７：２；またはＭｉｋｋｅｌｓｅｎ，Ｓ．Ｒ．（１９９６）「Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｃｍｉｃａｌ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ，８：１５−１９において議論されている。
【０１１２】
二重鎖形成の検出は、被検試料内に標的ポリヌクレオチド配列が存在することを示す。
【０１１３】
被検試料中の標的ヌクレオチド結合分子の存在を決定するための方法
本明細書記載の固体基板は、関心対象の標的ヌクレオチド結合分子が被検試料内に存在するか（否か）を決定するためにも使用しうる。固体基板は（１つまたは複数の）線状プローブポリヌクレオチドが固定化されている表面を有する。線状プローブポリヌクレオチドは単位配列の少なくとも２回のタンデムリピートを含む。各単位配列は、各単位配列の少なくとも一部分が関心対象の標的ヌクレオチド結合分子に対する結合配列として作用する核酸配列を含む場合には、関心対象の標的ヌクレオチド結合分子のためのプローブとして（言い換えると結合部位として）作用しうる。関心対象の標的ヌクレオチド結合分子は、特異的ヌクレオチド配列（本明細書記載の単位配列によって表されうるもの）に結合する任意の分子（例えばタンパク質）でありうる。それゆえに本明細書記載の固体基板は、固定化されたプローブポリヌクレオチドのそれぞれがいくつかの標的結合部位を含むので、被検試料中の関心対象のヌクレオチド結合分子の検出感度が改良された検出技術を提供する。
【０１１４】
それゆえに、被検試料中のヌクレオチド結合分子の存在を決定するための方法であって、以下の工程を含む方法が提供される：
ｉ）固定化された線状プローブポリヌクレオチドの単位配列が、関心対象のヌクレオチド結合分子に対する結合部位である核酸配列を含む、本明細書の他の項に記載する固体基板を用意する工程、
ｉｉ）被検試料を、前記固定化された線状プローブポリヌクレオチドと、前記ヌクレオチド結合分子と、固定化された線状プローブポリヌクレオチドの単位配列のうち、その結合部位として作用する部分との間の結合を許す条件下で接触させる工程、および
ｉｉｉ）固定化された線状プローブポリヌクレオチドとヌクレオチド結合分子との間の結合を検出する工程であって、結合が、被検試料内に前記ヌクレオチド結合分子が存在することを示す工程。
【０１１５】
ヌクレオチド結合分子は、線状プローブポリヌクレオチドの単位配列の適当な部分に結合する能力を有する、任意の関心対象分子でありうる。非限定的な例として、転写因子、ＤＮＡ修復タンパク質またはヒストンが挙げられる。適当な線状プローブポリヌクレオチドを固体基板上に固定化しなければならない。例えば前記ヌクレオチド結合分子が配列５’  ＡＴＣＧＡＡ  ３’に結合するのであれば、線状プローブポリヌクレオチドの単位配列は５’  ＡＴＣＧＡＡ  ３’を含むべきである。適当な単位配列は当業者であれば容易に同定することができる。
【０１１６】
被検試料は、関心対象のヌクレオチド結合分子を含有しうる任意の適当な試料でありうる。「被検試料」とは通常、生物源、環境源、医療源または患者源からの材料の分量であって、その中での関心対象のヌクレオチド結合分子の検出または測定が求められるものを意味する。一方において、これは、標本または培養物（例えば微生物培養物）を包含するものとする。他方において、これは、生物学的試料および環境試料をどちらも包含するものとする。試料は合成起源の標本を含みうる。生物学的試料は、ヒトを含む動物の体液、固形物（例えば糞便）または組織、ならびに液状および固形の食品および飼料の製品および原材料、例えば乳製品、野菜、食肉および食肉副産物、ならびに廃棄物でありうる。生物学的試料は、患者から採取された材料を、例えば限定するわけではないが、培養物、血液、唾液、脳脊髄液、胸水、乳汁、リンパ液、喀痰、精液、針吸引物などを包含しうる。生物学的試料は、さまざまな科の家畜、ならびに野生化した動物または野生動物、例えば限定するわけではないが、有蹄類、熊、魚、齧歯類などの動物から得ることができる。環境試料には、表層物、土壌、水および産業試料などの環境材料、ならびに食品および乳製品を加工する機器、装置、設備、道具、使い捨ての物品および使い捨てではない物品から得られる試料が含まれる。これらの例を、本発明に適用することができる試料タイプの限定とみなしてはならない。
【０１１７】
ヌクレオチド結合分子と線状プローブポリヌクレオチドとの間の結合を検出するための当技術分野で知られている標準的方法はいずれも、本発明との関連において使用しうる［例えば「Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Δ−［Ｒｕ（ｂｐｙ）２ｄｐｐｚ］２＋ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ  ＤＮＡ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅ  ｍｅｔａｌｌｏｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１２  Ｖｏｌｕｍｅ  ４，Ｎｏ  ８，６１５−６２０；Ｈａｎｇ  Ｓｏｎｇ，Ｊｅｎｓ  Ｔ．Ｋａｉｓｅｒ＆Ｊａｃｑｕｅｌｉｎｅ  Ｋ．Ｂａｒｔｏｎ；または「Ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ｓｅｎｓｏｒ」
Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１，８３（９），３５２８−３２．Ｗａｎｇ  Ｊ，Ｏｎｏｓｈｉｍａ  Ｄ，Ａｋｉ  Ｍ，Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｙ，Ｋａｊｉ  Ｎ，Ｔｏｋｅｓｈｉ  Ｍ，Ｂａｂａ  Ｙ．；またはＡｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，２０１１，４（１），１０５−１２８．「Ｍｅｔａｌ  Ｉｏｎ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ＤＮＡｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」Ｘｉａｏ−Ｂｉｎｇ  Ｚｈａｎｇ，Ｒｏｎｇ−Ｍｅｉ  Ｋｏｎｇ，ａｎｄ  Ｙｉ  Ｌｕ］。
【０１１８】
２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントまたは類似性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使って達成することができる。好ましい一実施形態において、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは，ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手することができる）中のＧＡＰプログラムを使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびに４０、５０、６０、７０または８０のギャップウェイト（ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ）および１、２、３、４、５または６の長さウェイト（ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）を使って決定される。特に好ましいパラメータセット（および、ある分子が本発明の配列同一性または相同性制限内にあるかどうかを決定するためにどんなパラメータを適用すべきかについて実施者が確信を持てない場合に使用すべきもの）は、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスとギャップペナルティ（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）１２、ギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｄ  ｐｅｎａｌｔｙ）４およびフレームシフトギャップペナルティ（ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）５である。
【０１１９】
あるいは、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み入れられているＭｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７）のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ（ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ）１２およびギャップペナルティ４を使って決定することもできる。
【０１２０】
本明細書に記載する核酸配列およびタンパク質配列は、例えば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するなどの目的で、公共データベースに対して検索を実行するための「クエリー配列」として使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使って行うことができる。本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るには、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア（ｓｃｏｒｅ）＝１００、ワード長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝１２で、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行うことができる。本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るには、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を行うことができる。比較のためのギャップ付きアラインメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）に記載のｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合は、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。＜ｈｔｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ＞を参照されたい。
【０１２１】
本発明の態様は以下の非限定的な実施例によって実証される。
【実施例】
【０１２２】
１．ＡＰＥＧＤＭＥＳリンカーによる固体ガラス表面へのｓｓＤＮＡの共有結合的固定化
顕微鏡ガラススライドをまずアセトン、ＩＰＡおよびｎａｎｏｐｕｒｅ水で浄化し、次にＯ２プラズマで処理することにより、残留有機夾雑物をすべて除去し、ＯＨ基を持つ表面を活性化した８。次に、その表面を、トルエン中、８０℃で一晩加熱することにより、アセタール保護アルデヒドを末端に持つシロキサンリンカーＡＰＥＧＤＭＥＳ（配列番号１２）（アセタールポリエチレングリコールジメチルエトキシシラン）で修飾した。ＡＰＥＧＤＭＥＳ修飾により、末端アセタール保護アルデヒド表面が得られる。これは、１０％酢酸水溶液中で簡単に除去されて、リンカーの上端にアルデヒド官能性を提示した。そのアルデヒドリンカーとＤＮＡ鎖上のアミノ官能性との間の還元的アミノ化反応を容易にするためにシアノ水素化ホウ素ナトリウムを使って、アミノ修飾オリゴシード５’−ＮＨ２−［ＧＡＴＣ］５−３’を、アルデヒド表面に共有結合的にカップリングした。次に、オリゴシードで機能化された表面をｎａｎｏｐｕｒｅ水で３０分間洗浄し、０．５×ＰＢＳ緩衝液で洗浄することで、物理的に吸着しているＤＮＡ鎖をすべて除去した。その結果、短いｓｓＤＮＡが表面に共有結合で係留された。
【０１２３】
２．固定化されたオリゴシードの生成およびそのＰＣＲ伸長
実施例１において生成させた共有結合的に係留された短いｓｓＤＮＡを、次に、その相補的鎖５’−［ＣＴＡＧ］５−３’とハイブリダイズさせることにより、ＰＣＲベースの酵素的伸長反応に必要な２０塩基の出発オリゴシード二重鎖を形成させた。ｄｓＤＮＡ表面をさらにｎａｎｏｐｕｒｅ水および０．５×ＰＢＳ緩衝液中ですすいだ。次に、既報（Ｐｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗ  ２０１５）のようにサーモコッカス・ゴルゴナリウス・ファミリーＢポリメラーゼ（Ｔｇｏ−Ｐｏｌ）酵素変異体Ｚ３を使って、ＤＮＡ鎖に対してＰＣＲベースの加熱−冷却伸長サイクルを行った。手順は報告された溶液ベースの加熱−冷却法と同様に行ったが、ここでは、加熱−冷却ブロックを使った熱サイクリング用の標準的ＰＣＲエッペンドルフチューブに収まるように、オリゴシード修飾シリコンチップを０．５ｃｍ２に切断した（図２Ａ参照）。試薬類、Ｚ３酵素、ｄＮＴＰおよび緩衝液の総体積は、シリコンの表面が常時浸されていることを保証するのに十分な１８０μＬであった。まず、９５℃に加熱することによって短いｄｓＤＮＡを脱ハイブリダイズさせた後、再ハイブリダイゼーションのために５５℃に冷却した。しかし、リピートＣＡＴＧ／ＧＴＡＣ配列によって常に完全に対応した二重鎖が形成されるわけではなく、表面からＤＮＡを伸長させるには、このミスマッチを利用する。再ハイブリダイズすると、相補的鎖は１、２または３単位分シフトすることができ（安定な二本鎖を形成するには、８塩基２単位リピートの二重鎖が最低限必要だと仮定）、これにより、ＤＮＡポリメラーゼ伸長に適した５’−オーバーハングが生じる。次に、７２℃でＤＮＡ伸長を行う。ここでは、表面に結合されている配列に酵素が対応するＮＴＰを付加することにより、ＤＮＡ二重鎖の長さを、位置ずれしたリピート単位の数だけ増加させる。固定化されたＤＮＡの長さの増加は表面から離れるｚ方向に起こり、短いオリゴシードの表面充填密度は維持される。７００塩基長前後のＤＮＡブラシを得るために、この加熱−冷却法は、２０サイクルまで繰り返される（図２）。
【０１２４】
３．伸長されたポリヌクレオチド配列の可視化
同じ表面積内に充填されたＤＮＡ塩基数の増加の可視化は、ｄｓＤＮＡにインターカレートする蛍光色素Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ（ＰＧ）の添加によって実証された。ＰＧはｄｓＤＮＡに結合すると＞１０００倍の蛍光増加を呈する。保存液の２００倍希釈液中で３０分間インキュベートした後に、酵素処理した表面は、図３ａ）および図３ｂ）に示すとおり、２０サイクルの加熱−冷却後に、表面上の無処理出発オリゴシード鎖と比較して、蛍光強度の増加を示した。
【０１２５】
蛍光の変化は、肉眼でもわかるものの（図３ａおよび図３ｂ）、２つのＰｉｃｏｇｒｅｅｎ標識表面でＩｍａｇｅＪソフトウェアを使って積分密度解析を行えば、より明白である（図３ｃ）。伸長反応は、表面付着点あたりのＰｉｃｏｇｒｅｅｎ結合部位の数を劇的に増加させるので、蛍光強度が増加する。短いオリゴシード表面とｅｘｔＤＮＡ表面との間には、プローブ分子あたりのＰＧ結合部位の数が増加したことに起因する明確な差異があった。
【０１２６】
蛍光強度の増加は、ＤＮＡが表面から伸長されたことの優れた指標である。ＤＮＡ長の増加をさらに確認するために、表面のｅｘｔＤＮＡを脱ハイブリダイズさせ、表面に共有結合されていない長い相補的鎖を表面から取り除き、収集した。脱ハイブリダイゼーションのために、９５℃に加熱したｎａｎｏｐｕｒｅ水にｅｘｔＤＮＡ表面を２回浸漬した。５μＬの試料を採取し、それを劈開したばかりのマイカ上に、フレキシブルなＤＮＡ鎖を引き伸ばすことが知られている分子コーミングによってのせることにより、ＡＦＭを使って長いＤＮＡを可視化した１０。ｓｓＤＮＡのＡＦＭ像は図４ａに見ることができる。ｓｓＤＮＡ鎖の多くは表面上で凝集しており、これはｓｓＤＮＡにはよく見られることであるが１１、一部の単一鎖では０．５ｎｍの平均高が見られ（図４ｂ参照）、これはｓｓＤＮＡの既報の寸法に匹敵する１２。ｓｓＤＮＡ鎖の平均長の解析は１６０〜３００ｂｐの範囲を与え、表面からのオリゴシードの伸長の成功が確認された。表面から得られる鎖の長さは、溶液ベースの伸長からアガロースゲルで観察されるものよりも短かった。いかなる特定理論にも束縛されることは望まないが、これは、表面の立体障害性が酵素の十分な移動を制限し、それが反応速度の低減につながるからかもしれない。
【０１２７】
４．ＣＴＦＲ遺伝子配列検出
リピート配列を持つ長いＤＮＡブラシは、疾患における一塩基ミスマッチを区別することができ、ＤＮＡバイオセンシングにとって理想的である。多くの疾患はＤＮＡ配列の差異の原因となる遺伝子中の変異の結果である１４。特定配列同士を弁別するためのプラットフォームは、疾患の早期検出または欠陥タイプの決定を可能にする。
【０１２８】
このタイプのデバイスがとりわけ有益であるだろう非限定的な例の一つは、ＣＦＴＲ遺伝子として知られる嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子である。ＣＦＴＲ遺伝子はタンパク質をコードし、それは、細胞を出入りする塩化物イオンの輸送を制御するためのチャネルとして働くことで、粘膜生産のための含水量を管理する。このタンパク質は肺および膵臓におけるナトリウム制御にも必要である。ＣＦＴＲにみられる最も一般的なフレームシフト変異は、デルタＦ５０８として知られている塩基ＣＴＴの３塩基欠失であり、これは、アミノ酸フェニルアラニンの除去による遺伝子コーディングの変化をもたらす（図５参照）。アミノ酸の欠失は、遺伝子形状の完全なゆがみをもたらし、それがイオンチャネルの破綻を引き起こす。機能するイオンチャネルがない場合、膵臓、肺および他の臓器を裏打ちする細胞は、濃厚な粘液を生成し、それが気道および腺の封鎖をもたらす。この変化を早期に検出すれば即時の処置が可能になり、疾患の影響が低減して生活の質が改善されるだろう。そこで、表面からの伸長法で試す次の配列として、ＣＦＴＲデルタＦ５０８変異に関するＤＮＡ配列を選んだ。
【０１２９】
この具体的配列をこの方法を使って伸長させうることを保証するために、まず、ＣＦＴＲ配列を本明細書で述べるように溶液中で伸長させた。表１に記載のアミノ修飾プローブおよび標的ＤＮＡ配列から二重鎖を形成させた。
【０１３０】
【表１】
2021514635.tif 000003
【０１３１】
ＤＮＡ産物をアガロースゲル電気泳動によって解析し（図６ａ）、ＩｍａｇｅＪ解析ソフトウェアを使って３００ｂｐのモーダル長（ｍｏｄａｌ  ｌｅｎｇｔｈ）が決定された。このＤＮＡ配列の長さはＧＡＴＣ配列の場合よりも短く、濃度も低かった。しかし、これは１プローブ鎖あたり３０リピート配列を与える長さには伸長しているので、引き続き表面からの伸長を試みた。
【０１３２】
表面に固定化されたオリゴシードの伸長が可能であることと、伸長された配列が増大した蛍光シグナルを呈することがどちらも確証されたので、変異後に３塩基ミスマッチフレームシフト（太字）５’  ＧＣＡＴＴＣＧＡＧＣ  ３’（配列番号１５）をもたらすＣＴＦＲ遺伝子である配列５’  ＧＣＡＴＣＴＴＴＣＧ  ３’（配列番号１）のオリゴシードでガラススライドを調製した。嚢胞性線維症の早期検出を助けるために塩基配列中のこのシフトを迅速に解析することができるかどうかは、明らかに、診断上重要だろう。
【０１３３】
ＣＦＴＲオリゴシード配列をガラス表面に固定化し、２０サイクルにわたる酵素的伸長のための反応条件に供した。表面にＰＧを添加した後、蛍光像を得たところ、ｅｘｔＤＮＡ試料では蛍光強度の増加が観察された（図７参照）。ｅｘｔＤＮＡは短いオリゴシードと比較して増加した蛍光強度を呈したが、その差異はＧＡＴＣ配列の場合ほど大きくはなかった。いかなる特定理論にも束縛されることは望まないが、これは、溶液中のＣＦＴＲ配列がＧＡＴＣ配列ほどにはうまく伸長せず、それゆえに、ＰＧが結合するためのＤＮＡ  ｂｐが少なく、それが結果として、ＧＡＴＣ表面と比べて蛍光強度の減少をもたらしたという事実の結果であるだろう。
【０１３４】
異なる表面修飾の疎水性を調べるために、ｓｓＤＮＡ表面、ｄｓＤＮＡ表面およびｅｘｔＤＮＡ表面のそれぞれの接触角を決定した（表２参照）。ｄｓＤＮＡの場合、接触角は３２．３３°であった。表面からの伸長後は、接触角が７３．１１°まで劇的に増加した。いかなる特定理論にも束縛されることは望まないが、疎水性の大幅な増加は、ＤＮＡ塩基の疎水性に起因すると考えられる。短いオリゴマーの二重鎖コンフォメーションでは、塩基がどの水分子からも遮蔽されているが、長いＤＮＡでは、構造の剛性が下がるため、より多くの塩基が水滴と接触でき、疎水性末端単層と接触角の増加をもたらすのだろう１５。
【０１３５】
【表２】
2021514635.tif 000004
【０１３６】
本明細書記載のアプローチは、標的遺伝子の細長く密に充填されたアレイを提供することによって蛍光応答を増強することができ、一塩基ミスマッチおよび少数塩基ミスマッチの早期検出が期待できる。
【０１３７】
５．シリコン表面でのｓｓＤＮＡの共有結合による固定化および伸長
シリコン表面、２５ｍｍ２のｎ型Ｓｉ＜１１１＞ウェーハを、上述のガラススライドの場合と同様に浄化し、修飾した。長く一続きになった１０個のＴ塩基からなる診断上重要なもう一つのオリゴシード配列５’−［ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ］２−３’（配列番号１６）を、類似するシロキサン化学によって固定化した後、酵素的に伸長することで、多重リピートを得た。この場合は、連続するＴが転写ミスで延長されまたは短縮された時に起こる一塩基の誤取込みゆえに、標的配列が重要である。これは、結腸直腸がんの発症に関与する潜在的ＭＳＩ標的の一例である［例えばＡｒｑ  Ｂｒａｓ  Ｃｉｒ  Ｄｉｇ．２０１２  Ｏｃｔ−Ｄｅｃ；２５（４）：２４０−４「Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ−−ＭＳＩ  ｍａｒｋｅｒｓ（ＢＡＴ２６，ＢＡＴ２５，Ｄ２Ｓ１２３，Ｄ５Ｓ３４６，Ｄ１７Ｓ２５０）ｉｎ  ｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ」Ｌｏｓｓｏ  ＧＭ１，Ｍｏｒａｅｓ  Ｒｄａ  Ｓ，Ｇｅｎｔｉｌｉ  ＡＣ，Ｍｅｓｓｉａｓ−Ｒｅａｓｏｎ  ＩＴ参照］。
【０１３８】
この伸長された表面の蛍光データは、ガラス表面と同じく増幅された応答を呈した。
【０１３９】
６．配列［Ｇ１０：Ｃ１０］の共有結合的固定化およびガラス表面からの伸長
ビオチン／ストレプトアビジン基板界面を使って、標的ｓｓＤＮＡが基板表面の小さな島に限局されるようにガラス基板にパターン形成した［例えばＮａｋａｍｕｒａ  Ｓ，Ｍｉｔｏｍｏ  Ｈ，Ａｉｚａｗａ  Ｍ，Ｔａｎｉ  Ｔ，Ｍａｔｓｕｏ  Ｙ，Ｎｉｉｋｕｒａ  Ｋ，Ｐｉｋｅ  ＡＲ，Ｎａｙａ  Ｎ，Ｓｈｉｓｈｉｄｏ  Ａ，Ｉｊｉｒｏ  Ｋ．「ＤＮＡ  Ｂｒｕｓｈ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｖｅｒｔｉｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｒｏｄ  Ａｒｒａｙｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｅｎｓｉｔｙ」ＡＣＳ  Ｏｍｅｇａ，２０１７，２（５），２２０８−２２１３を参照されたい］。これは、Ｚ３酵素の処理能力が、基板のタイプ、またはリンカー層内にタンパク質ストレプトアビジンを伴う、より複雑な機能化アプローチによって妨害されないことを実証する。ハイブリダイゼーションおよび伸長を既述のように行った後、その表面にＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ色素を適用した。図３ｄの蛍光像は、ＤＮＡの区域が蛍光を呈するのに対し、その間の剥き出しのトラックは非応答性であることを示している。これは、すべてのＤＮＡスポットが異なる配列であるアプローチのマルチプレックス化が可能であることの直接的証拠である。ＤＮＡが表面に係留されたまま長さを増やしていることを確認するために、表面を水中（１ｍＬ×２）で９５℃に加熱することにより、表面上の最終ｄｓＤＮＡを脱ハイブリダイズさせた。それゆえに、表面に結合していないこの相補的鎖が、２つの加熱洗浄液中に表面から取り出される。合わせた洗浄液から５μＬの試料をとり、劈開したばかりのマイカ上に、フレキシブルな分子を引き伸ばす試みとして分子コーミングによってスポッティングすることにより、ＡＦＭを使って長いｓｓＤＮＡの存在を確認した。ｓｓＤＮＡ鎖は互いに凝集しているようである。これはマイカ表面のｓｓＤＮＡにはよく見られることであるが、一部の単一鎖では０．５ｎｍの平均高が観察され、これはｓｓＤＮＡについて報告された以前の寸法と類似している。長さ解析を単一鎖で行ったところ、１６０〜３００ｂｐの範囲を与えたことから、表面からの伸長の成功が確認された。溶液における［ＧＡＴＣ］５／［ＣＴＡＧ］５の伸長は、アガロースゲル電気泳動およびＡＦＭで観察したところ、平均７５０ｂｐの平均長をもたらした。
【０１４０】
興味深いことに、接触角測定は、最初のオリゴシードｄｓＤＮＡ表面の２５．６°から、酵素的に伸長されたｄｓＤＮＡ表面の７４．８°への増加を呈した。
【０１４１】
７．Ｂａｔ２５配列の伸長
マイクロサテライト不安定性ＭＳＩは、遺伝性結腸直腸がんを持つ患者における腫瘍の大半およびいくつかの散発性結腸直腸がんに見出される遺伝的不安定性のマーカーである１６。ＭＳＩは、同じ患者からの正常なＤＮＡアレルと比較して腫瘍細胞では欠失または挿入ゆえにアレル長に差異を呈するノンコーディングモノヌクレオチドリピート配列である。ＭＳＩ同定に使用されるモノヌクレオチドリピートマーカーのなかで最もよく使用されるものの一つは、ポリＴリピート単位であるＢＡＴ２５配列である。ＢＡＴ２５配列は正常ＤＮＡとの比較なしで使用することができ、ＭＳＩを呈する事実上すべての腫瘍において著しい塩基欠失を伴う１６。ＭＳＩのタイプを理解することによって腫瘍タイプの同定が可能になり、患者の化学療法応答を予想することができる。迅速な診断および処置を可能にするために、迅速、高感度かつ再現性の高いＭＳＩ同定方法が必要とされている。
【０１４２】
ＭＳＩ認識のための現在の方法では、モノヌクレオチドリピートマーカーＢＡＴ２５およびＢＡＴ２６ならびにジヌクレオチドリピートマーカーＤ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６およびＤ１７Ｓ２５０という５つのマイクロサテライトマーカーがスクリーニングされる特別に設計されたパネル、すなわちベセスダパネルが使用される。これらのマーカーのうちの２〜５つが変異していると、それらの患者は高いマイクロサテライト不安定性ＭＳＩ−Ｈを有するとみなされる。しかし、このパネルの一貫した特異性および感度には食い違いがあり、それが、この試験の信頼性を制限している１７。
【０１４３】
それゆえに、本明細書記載の伸長法によるＭＳＩの同定は、診断時間を減少させ、感度を増加させるだろう。アレイで使用すれば、一つのＤＮＡ試料から複数のＭＳＩマーカーを同時にスクリーニングすることができるだろう。
ＢＡＴ２５モノヌクレオチドリピート配列を使って、このマイクロサテライト不安定性検出方法の効率を試験した。ＢＡＴ２５オリゴシードを形成させるために使用したプローブおよび標的鎖を表３に示す。表面からの伸長を試みる前に、溶液中でアミノ修飾二重鎖の伸長を試した。
【０１４４】
【表３】
2021514635.tif 000005
【０１４５】
ＢＡＴ２５伸長産物をゲル電気泳動によって解析したところ（図８ａ参照）、２０００ｂｐのモーダル長を有した。ＤＮＡサンガーシーケンシングは、ＧＡＴＣ−ｂｉｏｔｅｃｈにより、ＢＡＴ２５配列の５−サイクル伸長産物で実行された（図８ｄ参照）。シーケンシング結果から、ＤＮＡポリメラーゼによる各塩基の正確な取込みが確認された。ＧＡＴＣ配列およびＣＦＴＲ配列についてはＤＮＡシーケンシングを達成できなかった。いかなる特定理論にも束縛されることは望まないが、これはおそらく、ＧＣリッチなＤＮＡ配列に付随する課題によるものだろう。ＧＡＴＣ配列とＣＦＴＲ配列はどちらも５０％のＧＣ含量を含む。
【０１４６】
ＢＡＴ２５配列のＤＮＡ長は、ＧＡＴＣ配列およびＣＦＴＲ配列と比べて長く、６１８ｎｇ／μＬの高濃度では改良された伸長を示した。ｂｐ長は約７５０ｂｐ〜３０００ｂｐに及び、これは、ｄｓＤＮＡ伸長産物のＡＦＭ解析でも確認された（図９）。ｄｓＤＮＡの平均高は０．８７ｎｍと算出され、ＤＮＡ長は１３０〜１５００の範囲にあり、ゲル解析と合致した。
アミノ修飾オリゴシードの取付け後に、ＢＡＴ２５配列を表面から伸長させた。ＰＧを添加すると、ｅｘｔＤＮＡでは短い固定化オリゴシードと比較して蛍光の増加が明らかになった（図１０参照）。
【０１４７】
ＣＦＴＲ配列の場合と同じ接触角測定値の増加がＢＡＴ２５  ｅｘｔＤＮＡ配列でも観察された。
【０１４８】
【表４】
2021514635.tif 000006
【０１４９】
二本鎖の伸長されたＤＮＡ（ｄｓｅｘｔＤＮＡ）鎖を下記８．５で述べるように脱ハイブリダイズさせ、ＡＦＭ解析のために劈開したばかりのマイカにコーミングした（図１１参照）。一本鎖ＡＴリッチＤＮＡはフォールディングおよびスタッキングを起こしやすいので１８，１９、多くの鎖が凝集しているようだったが、いくつかの鎖は細長く、高さおよび長さ解析に利用することができた。平均した単一鎖の高さは０．５ｎｍ、平均長は７０ｎｍで、２００ｂｐに対応した。
【０１５０】
ＢＡＴ２５配列では、増強された蛍光強度が、ＧＡＴＣ配列とＣＦＴＲ配列のどちらで観測されたものよりも大きかった。ＧＡＴＣ配列、ＣＦＴＲ配列およびＢＡＴ２５配列についてゲル電気泳動および蛍光強度を比較することにより（図１２参照）、溶液中でも、表面からでも、より長い伸長が確認された。
【０１５１】
ＢＡＴ２５配列の伸長は、研究した他の配列と比べて最も強い蛍光強度の増加を呈し、医学的にも重要なので、本デバイスのセンシング用途のさらなる検討には、ＢＡＴ２５配列を使用した。
【０１５２】
【表５】
2021514635.tif 000007
【０１５３】
８．パラメータの最適化
短いオリゴシードと比べてｅｘｔＤＮＡでは蛍光強度の差異が区別されたものの、感度および信頼性を改良するために、いくつかのパラメータを実行した。
【０１５４】
ＰＧは塩基対とは無関係なｄｓＤＮＡインターカレーターであることが確立されている。配列特異的である他の蛍光色素候補は、ｅｘｔＤＮＡ試料の蛍光強度変化をさらに増強するだろう。ＢＡＴ２５配列はＡＴリッチなので、蛍光着色剤ＤＡＰＩをその適合性について解析した。ＤＡＰＩはｄｓＤＮＡ中のＡＴ領域への結合時に蛍光が２０倍増加するので、よく使われる着色剤である２０。ＤＡＰＩ溶液を表面に２０分間のせ、励起波長３６０ｎｍで蛍光像を得て、蛍光強度の相違を観察した（図１３）。ｅｘｔＤＮＡ試料の蛍光強度（ＦＩ）は短いｄｓＤＮＡより低かった。ＰＧを使った場合のｄｓＤＮＡとｅｘｔＤＮＡとの差異は、一貫して、より大きく観察されたので、ＰＧの使用を続けた。
【０１５５】
ＰＧは、従来、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液ＴＥ中で使用されているが２１、ＰＧ−ＴＥ溶液を表面にのせるといくつかの塩スポットが見られ、ＰＧをｎａｎｏｐｕｒｅ  Ｈ２Ｏ中で沈着させると、これらの塩スポットは見られなかった（図１４ｂ参照）。また、Ｈ２Ｏ中ではＰＧのＦＩが、ＰＧがＴＥ中にある場合よりも有意に高かったこともあり、その後の研究では、ＰＧをＨ２Ｏに溶解した。
多くの論文が、ＰＧの結合時間はＤＮＡと相互作用すればほとんど即時であると述べているが２１、表面に局在化したＤＮＡの場合、ＤＮＡへのＰＧのインターカレーションが起こるには、それよりは長い時間を要するだろう。ＰＧをさまざまな時間にわたってｅｘｔＤＮＡ表面にのせて、蛍光強度を比較した（図１５参照）。５分増加するごとにＦＩが連続して増加した後、２０分を超えるとＦＩが減少した。そこで、以降の検討では、ＰＧを２０分間にわたって表面にのせてから、洗浄した。
表面からの伸長はすべて、まず、切断されたガラス顕微鏡スライド上で行った。同じ現象が異なる表面でも観察されるかどうかを知るために、伸長プロトコールをシリコンウェーハ上で行った。伸長法を０．５ｃｍ２に切断したｐ型（１００）シリコンウェーハで実行し、蛍光イメージングのためにその表面にＰＧを適用した（図１６参照）。短いｄｓＤＮＡからｅｘｔＤＮＡへと蛍光の増加が観察されたが、その差異はガラス表面で見られたものよりは小さかった。それでもなお、ｅｘｔＤＮＡでは依然として明瞭な増強があり、本伸長法の汎用性が浮き彫りになった。配列だけでなく表面も所望の用途に合わせることができる。
【０１５６】
９．結果の考察
本明細書記載の方法は、標的検出を増強するために、表面での複数のプローブＤＮＡ配列の合成を可能にする。本発明は、リピート単位を持つＤＮＡの溶液中での迅速な合成を可能にするＤＮＡの酵素的合成方法を利用する（特許番号ＧＢ１７０００５３１．５）。リピート単位は、関心対象の分子、例えば疾患状態を示すＤＮＡフラグメントの結合領域と適合するように調整することができる。変性（二本鎖ＤＮＡの巻戻し）後は、各単一鎖ＤＮＡが垂直軸に複数の結合部位を有するので、表面に結合されているプローブ鎖あたりの結合機会を最大化する。相補的な標的フラグメントとの結合は、表面上の短いｄｓＤＮＡと比較して、蛍光強度の増加をもたらす。伸長はプローブ分子あたりの標的結合部位の数を、したがって標的検出感度および診断感度を増加させる。
【０１５７】
本発明者らは、本発明が優れた感度を有することを実証し、よって分子診断学における重要な課題の一つ、すなわち背景ノイズに対するシグナルの検出に対処する。シグナル生成が増強されるので、本発明の感度は、数の少ない標的ＤＮＡ分子の検出に活用する道があり、その結果として、ＰＣＲなどの高価で時間のかかる試料調製技術を長時間使用する必要がなくなる。あるいは、本発明の真のコスト−ベネフィットはデータ収集の増強にありうる。これは、その結果として、必要とされる検出器の感度およびシグナル処理が少なくてすむことを意味し、診断デバイスの可搬性の改良を促す。この技術を組み込んだポイントオブケアデバイスは、より安価なパーツ、ソフトウェアおよび設計要素を使って経済的に製造することができ、最終的には総合的経済支出を低減することができるだろう。ポイントオブケアデバイスは、ここに提示されるような実現技術の恩恵を受けて、安価に製造できるようになり、ポータブルな実現に適したものになるだろう。
【０１５８】
実験材料および実験方法
化学試薬
化学試薬はすべてＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、受け取ったときの状態のまま、それ以上精製することなく使用した。ガラススライドはＨｅｎｓｏ  Ｌａｂｗａｒｅ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ（中国杭州）から購入した。ＡＰＥＧＤＭＥＳはＮｅｗＣｈｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄから購入した。ＤＮＡはＥｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ドイツ・エーバースベルク）から購入した。Ｔｇｏ−Ｐｏｌ  Ｚ３  ｅｘｏ−は、自社で調製し、精製した。（Ｊｏｚｗｉａｋｏｗｓｋｉ，Ｓ．Ｋ．＆Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｂ．Ａ．「Ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｆａｍｉｌｙ−Ｂ  ａｒｃｈａｅａｌ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １２，３５−３７（２０１１）、Ｅｖａｎｓ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．「Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｕｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ａｒｃｈａｅｏｎ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｉｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２８，１０５９−１０６６（２０００））。
【０１５９】
プライマーテンプレートアニーリング
伸長用のプライマー二重鎖を調製した：ＤＮＡアニーリング緩衝液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ）をオリゴマーに加え、９５℃に１０分間加熱した。二重鎖溶液を室温まで徐冷し、−２０℃で保存した。
【０１６０】
ＤＮＡポリメラーゼ
伸長にはＴｇｏ−Ｐｏｌ  Ｚ３  ｅｘｏ−ＤＮＡ  ポリメラーゼを使用した。この酵素は、古細菌ファミリーＢポリメラーゼの低忠実度変異体に属し、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が除去されてフィンガードメインに変更されている。
【０１６１】
溶液中でのＤＮＡ伸長
０．５μＭ  ＤＮＡ二重鎖、２００ｎＭ  Ｔｇｏ−Ｐｏｌ  Ｚ３  ｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８，２５℃）、１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２０ｍＭ  ＭｇＳＯ４）、および０．５ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）（ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＴＰ）を混合した。加熱−冷却熱サイクルは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｅｒｉｔｔ  ９６ウェルサーマルサイクラーで、以下のサイクルにわたって行った：
サイクル数（２０）×９５℃で３０秒、５５℃で３０秒および７２℃で２分。
反応後は溶液を４℃に冷却した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（２５）（ＱＩＡＧＥＮ、英国マンチェスター）を製造者のプロトコールに従って使用することで、ＤＮＡ伸長産物を精製した。
【０１６２】
アガロースゲル電気泳動
ＤＮＡ伸長産物をＴＢＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ、ホウ酸およびＮａ２ＥＤＴＡ．２Ｈ２Ｏ）におけるゲル電気泳動によって解析した。１％アガロース（Ｍｅｌｆｏｒｄ、英国イプスウィッチ）を１％ＴＢＥ緩衝液に加え、完全に溶解するまで加熱した。そのゲル混合物を５０℃に冷却し、ゲル化セットに注ぎ込んで固化させた。ＤＮＡラダー１ｋｂおよび１ｋｂ＋（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にローディング色素（２．５％Ｆｉｃｏｌｌ−４００、１１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３．３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０、２５℃）、０．０１７％ＳＤＳおよび０．０１５％ブロモフェノールブルー）を添加した。２μＬのゲルローディング色素をＤＮＡ試料（２０ｎｇ／μＬ）に加え、ゲルのウェルにローディングした。ゲルを１００Ｖ、１００ｍＡ、１０Ｗで約１時間泳動した。ゲルを臭化エチジウムの５μｇ／ｍＬ溶液で後染色し、ＵＶトランスイルミネーターを使って可視化した。
【０１６３】
ＵＶ
ＵＶ−Ｖｉｓ分光法はＮａｎｏｄｒｏｐを使って行った。分光計はｎａｎｏｐｕｒｅ  Ｈ２Ｏをブランク試料とした。
【０１６４】
表面の前処理
ガラススライドまたはｎ型Ｓｉ＜１１１＞ウェーハをダイシングすることで０．５ｃｍ２チップにした。それらのチップをアセトン、ＩＰＡおよびＮＰ−Ｈ２Ｏで拭い、アセトン、ＩＰＡおよびＮＰ−Ｈ２Ｏ中で逐次的に１５分間超音波処理し、Ｎ２で乾燥させた。それらのチップを１５分間のＯ２プラズマ処理に付した。
【０１６５】
ＡＰＥＧＤＭＥＳリンカーを介したオリゴシードＤＮＡの取付け
浄化済みチップを６５℃に予熱したＡＰＥＧＤＭＥＳ／トルエン溶液（２３３μＭ、３ｍＬ）に１６時間浸漬した。それらのチップをトルエン、エタノールおよびＮＰ−Ｈ２Ｏで逐次的に３回洗浄してから、１２０℃の真空乾燥機に４０分間入れた。１０％酢酸溶液中のアミノタグ付きＤＮＡプローブ溶液（４０μＬ、１００μＭ）を、湿潤環境において１時間、チップ上にドロップキャストした。５０％ＭｅＯＨ溶液中のＮａＣＮＢＨ３（４０μＬ、１６μＭ）を、湿潤環境においてさらに２時間、プローブ溶液の上にのせた。それらのチップをリン酸緩衝食塩水（０．５×）および過剰の水で洗浄することで、過剰のＤＮＡ分子をすべて除去した。チップを窒素の気流で乾燥させた。
【０１６６】
ＤＮＡハイブリダイゼーション
ＰＢＳ緩衝液（０．５×）中の相補的ＤＮＡ標的溶液（４０μＬ、２００ｎＭ）を、湿潤環境において１５分間、シリコンチップ上にドロップキャストした。チップをＰＢＳ緩衝液（０．５×）で３０分間洗浄し、ＮＰ−Ｈ２Ｏで３０分間洗浄した後、窒素気流下で乾燥させた。
【０１６７】
表面からのＤＮＡ伸長
加熱−冷却サイクルのために、チップを、以下の必要な溶液と共にエッペンドルフに入れた：２００ｎＭ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８，２５℃）、１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２０ｍＭ  ＭｇＳＯ４）、および０．５ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）（ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＴＰ）。加熱−冷却熱サイクルは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｅｒｉｔｔ  ９６ウェルサーマルサイクラーで、以下のサイクルにわたって行った：
サイクル数（２０）×９５℃で３０秒、５５℃で３０秒および７２℃で２分。
反応後は溶液を４℃に冷却した。チップを溶液から取り出し、ＮＰ−Ｈ２Ｏ中で３０分間洗浄し、窒素気流下で乾燥させた。
【０１６８】
ビオチン−ストレプトアビジン−ビオチンリンカーを介したオリゴシードＤＮＡの取付け
ガラス表面をピラニア溶液で浄化した後、Ｈ２Ｏで洗浄し、乾燥させた。湿度＜２５％で、乾燥トルエン中の２−カルボメトキシエチルトリクロロシランの溶液を加えた。１時間後に、そのガラスをアセトン、エタノール、次にＨ２Ｏで洗浄し、次にＨＣｌで満たして、一晩放置した。そのガラスをＨ２Ｏで十分に洗浄し、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ中の５０ｍＭ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよび１ｍＭアミン−ＰＥＧ２−ビオチンで覆った。１時間後に、ガラスを洗浄し、次に、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９中の０．１ｍｇ／ｍＬストレプトアビジン５０μＬを表面にピペッティングした。１時間後に、ガラスを洗浄した後、ＵＶフォトマスクおよびＵＶ照射を使ってパターン形成した。次に、表面を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９で洗浄し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９および２００ｍＭ  ＮａＣｌ中の１μＭ  Ｃ１５−ビオチン５０μＬを同じスポットに加えた。１時間後に、表面を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで洗浄し、５０μＬの１μＭ  Ｇ１５  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９および２００ｍＭ  ＮａＣｌを加えた。１時間後に、ガラス表面を洗浄し、重合溶液、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．６中の０．５ｍＭ  ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、２００ｎＭ  Ｔｇｏ−Ｐｏｌ  Ｚ３  ｅｘｏ−、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２で満たし、反応溶液の除去および１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９および２００ｍＭ  ＮａＣｌによる洗浄で、反応を停止させた。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを使って表面を染色した。
【０１６９】
蛍光顕微鏡イメージング
試料を、フィルター４４に設定し、Ｐｌａｎ−ＮＥＯＦＬＵＡＲ  １０×／０．３対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ）を装着したＡｘｉｏｓｈｏｐ  ２  ｐｌｕｓ（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）イメージプラットフォームにのせた。試料をｅｂｑ１００水銀ランプ（ＬＥＪ、ドイツ）からの４９０ｎｍで励起し、ＡｘｉｏＣａｍ  ＨＲｍ（Ｚｅｉｓｓ）を使って撮像した。
【０１７０】
ＡＦＭ
粘着テープを使ってマイカ表面の最上層を劈開した。５μＬのＤＮＡ試料（２ｎｇ／μＬまたは４ｎｇ／μＬ）を、ＤＮＡがマイカ表面を横切って流れることが可能になるように、２５°の角度で保持されたマイカ表面にのせた。５分後に、５μＬのｎａｎｏｐｕｒｅ  Ｈ２ＯをＤＮＡ試料の上に、ここでも２５°の角度で滴下した。表面の上に穏やかなＮ２気流を通してから、層流下で１時間、さらに乾燥させた。ＡＦＭ像は、干渉を低減するためにアイソレーションテーブル（Ｖｅｅｃｏ  Ｉｎｃ．、Ｍｅｔｒｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ）上で、Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｖとｎａｎｏｓｃｏｐｅコントローラー（Ｖｅｃｃｏ  Ｉｎｓｔｒｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｍｅｔｒｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ、カリフォルニア州サンタバーバラ）を使って得た。ソフトウェアＮａｎｏＳｃｏｐｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  １．８を使ってデータを得た。
【０１７１】
接触角
接触角の測定はＫＳＶ  Ｃａｍ  １０１（ＫＳＶ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．、フィンランド）で内蔵のＣＡＭ  ２００８ソフトウェアを使って行った。ＮＰ−Ｈ２Ｏの液滴１μＬを表面に滴下した。前記ソフトウェアを使って表面上の水滴の角度を見積もった。各試料について１０回の測定値を得た。液滴の左側の角度と右側の角度の差異が２°を超える場合は、収集した測定値を破棄した。平均値から２標準偏差を超えて離れている測定値も破棄した。
【０１７２】
読者は、本願に関連して本明細書と同時にまたは本明細書以前に提出され、本明細書と共に公開されているすべての書類および文書に留意されたい。そのような書類および文書のすべての内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７３】
本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書および図面をいずれも含む）に開示される特徴はすべて、かつ／またはそうして開示された任意の方法またはプロセスの工程はすべて、そのような特徴および／または工程の少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除き、任意の組み合わせで組み合わせうる。
【０１７４】
本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書および図面をいずれも含む）に開示される各特徴は、別段の明記がある場合を除き、同じ目的、等価な目的または類似する目的に役立つ代替的特徴で置き換えうる。したがって、別段の明記がある場合を除き、開示される各特徴は、一般的な一連の等価な特徴または類似する特徴の一例にすぎない。
【０１７５】
本発明は上述したどの実施形態の詳細にも限定されない。本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書および図面をいずれも含む）に開示される特徴の任意の新規な１つもしくは任意の新規な組合せ、またはそうして開示された任意の方法もしくはプロセスの任意の新規な１つもしくは任意の新規な組合せに及ぶ。
【０１７６】
参考文献
1  Gong, P. & Levicky, R. DNA surface hybridization regimes. Proceedings of the National Academy of Sciences 105, 5301-5306 (2008).
2  Metzker, M. L. Sequencing technologies − the next generation. Nature Reviews Genetics 11, 31 (2009).
3  Valignat, M.-P., Theodoly, O., Crocker, J. C., Russel, W. B. & Chaikin, P. M. Reversible self-assembly and directed assembly of DNA-linked micrometer-sized colloids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 4225-4229 (2005).
4  Bracha, D., Karzbrun, E., Shemer, G., Pincus, P. A. & Bar-Ziv, R. H. Entropy-driven collective interactions in DNA brushes on a biochip. Proceedings of the National Academy of Sciences 110, 4534-4538 (2013).
5  Wang, C. et al. DNA microarray fabricated on poly(acrylic acid) brushes-coated porous silicon by in situ rolling circle amplification. Analyst 137, 4539-4545 (2012).
6  Jozwiakowski, S. K. & Connolly, B. A. A Modified Family-B Archaeal DNA Polymerase with Reverse Transcriptase Activity. ChemBioChem 12, 35-37 (2011).
7  Whitfield, C. J., Turley, A. T., Tuite, E. M., Connolly, B. A. & Pike, A. R. Enzymatic Method for the Synthesis of Long DNA Sequences with Multiple Repeat Units. Angewandte Chemie International Edition 54, 8971-8974, doi:10.1002/anie.201502971 (2015).
8  Terpilowski, K. & Rymuszka, D. Surface properties of glass plates activated by air, oxygen, nitrogen and argon plasma. Glass Physics and Chemistry 42, 535-541 (2016).
9  Dragan, A. I. et al. Characterization of PicoGreen Interaction with dsDNA and the Origin of Its Fluorescence Enhancement upon Binding. Biophysical Journal 99, 3010-3019 (2010).
10  Li, J. et al. A convenient method of aligning large DNA molecules on bare mica surfaces for atomic force microscopy. Nucleic Acids Research 26, 4785-4786 (1998).
11  Hansma, H. G., Sinsheimer, R. L., Li, M.-Q. & Hansma, P. K. Atomic force microscopy of single-and double-stranded DNA. Nucleic Acids Research 20, 3585-3590 (1992).
12  Hansma, H. G., Revenko, I., Kim, K. & Laney, D. E. Atomic Force Microscopy of Long and Short Double-Stranded, Single-Stranded and Triple-Stranded Nucleic Acids. Nucleic Acids Research 24, 713-720 (1996).
13  Mattheyses, A. L., Simon, S. M. & Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science 123, 3621-3628 (2010).
14  R. A. Bartoszewski et al. A Synonymous Single Nucleotide Polymorphism in ΔF508 CFTR alters the Secondary Structure of the mRNA and the Expression of the Mutant Protein. J. Bio. Chem 285, 28741-28748 (2010).
15  Costa, D., Miguel, M. G. & Lindman, B. Responsive Polymer Gels:Double-Stranded versus Single-Stranded DNA. The Journal of Physical Chemistry B 111, 10886-10896 (2007).
16  Zhou, X.-P. et al. Determination of the replication error phenotype in human tumors without the requirement for matching normal DNA by analysis of mononucleotide repeat microsatellites. Genes, Chromosomes and Cancer 21, 101-107 (1998).
17  Umar, A. et al. Revised Bethesda Guidelines for Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer (Lynch Syndrome) and Microsatellite Instability. Journal of the National Cancer Institute 96, 261-268 (2004).
18  Luzzati, V., Mathis, A., Masson, F. & Witz, J. Structure transitions observed in DNA and poly A in solution as a function of temperature and pH. Journal of Molecular Biology 10, 28-41 (1964).
19  Mills, J. B., Vacano, E. & Hagerman, P. J. Flexibility of single-stranded DNA: use of gapped duplex helices to determine the persistence lengths of Poly(dT) and Poly(dA)11Edited by B. Honig. Journal of Molecular Biology 285, 245-257 (1999).
20  Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-Specific Fluorescent Probe. Biotechnic & Histochemistry 70, 220-233 (1995).
21  Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T. & Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen Reagent and Development of a Fluorescence-Based Solution Assay for Double-Stranded DNA Quantitation. Analytical Biochemistry 249, 228-238 (1997).
22  Dodge, A., Turcatti, G., Lawrence, I., de Rooij, N. F. & Verpoorte, E. A Microfluidic Platform Using Molecular Beacon-Based Temperature Calibration for Thermal Dehybridization of Surface-Bound DNA. Analytical Chemistry 76, 1778-1787 (2004).
23  Lockett, M. R. & Smith, L. M. Fabrication and Characterization of DNA Arrays Prepared on Carbon-on-Metal Substrates. Analytical Chemistry 81, 6429-6437 (2009).
24  Eda, G., Fanchini, G. & Chhowalla, M. Large-area ultrathin films of reduced graphene oxide as a transparent and flexible electronic material. Nature Nanotechnology 3, 270 (2008).
25  Le, L. T., Ervin, M. H., Qiu, H., Fuchs, B. E. & Lee, W. Y. Graphene supercapacitor electrodes fabricated by inkjet printing and thermal reduction of graphene oxide. Electrochemistry Communications 13, 355-358 (2011).
26  He, Q. et al. Centimeter-Long and Large-Scale Micropatterns of Reduced Graphene Oxide Films: Fabrication and Sensing Applications. ACS Nano 4, 3201-3208 (2010).
27  Mohanty, N. & Berry, V. Graphene-Based Single-Bacterium Resolution Biodevice and DNA Transistor: Interfacing Graphene Derivatives with Nanoscale and Microscale Biocomponents. Nano Letters 8, 4469-4476 (2008).
【図１】
2021514635.tif 000008
【図２】
2021514635.tif 000009
【図３】
2021514635.tif 000010
【図４】
2021514635.tif 000011
【図５】
2021514635.tif 000012
【図６】
2021514635.tif 000013
【図７】
2021514635.tif 000014
【図８】
2021514635.tif 000015
【図９】
2021514635.tif 000016
【図１０】
2021514635.tif 000017
【図１１】
2021514635.tif 000018
【図１２】
2021514635.tif 000019
【図１３】
2021514635.tif 000020
【図１４】
2021514635.tif 000021
【図１５】
2021514635.tif 000022
【図１６】
2021514635.tif 000023
【図１７】
2021514635.tif 000024
【図１８】
2021514635.tif 000025
【配列表】
2021514635000001.app
【国際調査報告】
2021514635.tif 000026
2021514635.tif 000027
2021514635.tif 000028
2021514635.tif 000029