(57)【要約】  本発明の一態様にしたがって標的化タンパク質で改変されたミトコンドリアは、効果的に標的に送達されうる。さらに、改変ミトコンドリアに結合された関心のタンパク質が細胞に送達されたとき、さまざまな活性が示されうる。改変ミトコンドリアは、効果的に癌組織死を引き起こすことができ、したがって、抗癌剤としても使用することができる。さらに、改変ミトコンドリアに結合される関心のタンパク質によってさまざまな活性が示され、したがって、改変ミトコンドリアはさまざまな疾患の処置に適用されうる。さらに、本発明の一態様にしたがう、関心のタンパク質を含む融合タンパク質および標的化タンパク質を含む融合タンパク質は、ミトコンドリアを改変するために使用することができる。さらに、融合タンパク質で改変されたミトコンドリアは、標的細胞においてさまざまな作用を示す。
2021521819.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリアの外膜に外来タンパク質が結合されている改変ミトコンドリア。
【請求項２】
ミトコンドリアは細胞または組織から単離される、請求項１に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項３】
細胞が、体細胞、生殖細胞、幹細胞およびその組み合わせからなる群から選択される任意の１つである、請求項２に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項４】
外来タンパク質が、細胞の内部および外部で機能することのできる所望のタンパク質を含む、請求項１に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項５】
外来タンパク質がミトコンドリアアンカリングペプチドを含む、請求項１に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項６】
外来タンパク質がミトコンドリア外膜に、ミトコンドリアアンカリングペプチドによって結合されている、請求項５に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項７】
ミトコンドリアアンカリングペプチドが、ミトコンドリア膜タンパク質中に存在するタンパク質のＮ末端領域またはＣ末端領域を含む、請求項６に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項８】
ミトコンドリア膜タンパク質中に存在するタンパク質のＮ末端領域またはＣ末端領域が、ミトコンドリア外膜上に位置する、請求項７に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項９】
ミトコンドリア膜タンパク質中に存在するタンパク質が、ＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０、ＯＭ４５、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘおよびＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択される任意の１つである、請求項７に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項１０】
アンカリングペプチドが、ＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０およびＯＭ４５からなる群から選択される任意の１つのＮ末端領域を含む、請求項７に記載の改変ミトコンドリア。
変ミトコンドリア。
【請求項１１】
ミトコンドリアアンカリングペプチドが、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘおよびＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択される任意の１つのＣ末端領域を含む、請求項７に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項１２】
外来タンパク質が、ミトコンドリアアンカリングペプチドならびに細胞の内部および外部で機能することのできる所望のタンパク質を含む融合タンパク質である、請求項１に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項１３】
所望のタンパク質が、細胞において活性を示す活性タンパク質、細胞に存在するタンパク質、および細胞膜に存在するリガンドまたは受容体に結合する能力を有するタンパク質からなる群から選択される任意の１つである、請求項１２に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項１４】
所望のタンパク質が、ｐ５３、グランザイムＢ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、ＰＤＣＤ５、Ｅ２Ｆ、ＡＰ−１（Ｊｕｎ／Ｆｏｓ）、ＥＧＲ−１、網膜芽細胞腫（ＲＢ）、ホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、Ｅ−カドヘリン、ニューロフィブロミン−２（ＮＦ−２）、ポリ［ＡＤＰ−リボース］合成酵素１（ＰＡＲＰ−１）、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）、腫瘍壊死因子受容体関連因子（ＴＲＡＦ）、ＲＡＦキナーゼ阻害タンパク質（ＲＫＩＰ）、ｐ１６、ＫＬＦ−１０、ＬＫＢ１、ＬＨＸ６、Ｃ−ＲＡＳＳＦ、ＤＫＫ−３ＰＤ１、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃからなる群から選択される任意の１つである、請求項１３に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項１５】
外来タンパク質が、ＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０またはＯＭ４５のＮ末端領域に連結された所望のタンパク質である、請求項１２に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項１６】
外来タンパク質が、
Ｎ末端−ＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０またはＯＭ４５のＮ末端領域−所望のタンパク質−Ｃ末端
の順で連結されている、請求項１５に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項１７】
外来タンパク質が、真核細胞中のタンパク質分解酵素によって認識されるアミノ酸配列、またはユビキチンもしくはそのフラグメントを、アンカリングペプチドと所望のタンパク質の間にさらに含む、請求項１６に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項１８】
ユビキチンフラグメントが、配列番号７１のアミノ酸配列のＣ末端Ｇｌｙ−Ｇｌｙを含み、該Ｃ末端から連続する３〜７５アミノ酸を含む、請求項１７に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項１９】
外来タンパク質が、所望のタンパク質とユビキチンまたはそのフラグメントの間にリンカーをさらに含む、請求項１７に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項２０】
リンカーが１〜１５０アミノ酸からなる、請求項１９に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項２１】
リンカーが、グリシンおよびセリンからなる５〜５０アミノ酸からなる、請求項２０に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項２２】
リンカーが（Ｇ４Ｓ）ｎであり、ここで、ｎは１〜１０の整数である、請求項２１に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項２３】
細胞膜に存在するリガンドまたは受容体に結合する能力を有するタンパク質が、腫瘍細胞表面上に存在するリガンドまたは受容体である、請求項１３に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項２４】
腫瘍細胞表面上に存在するリガンドまたは受容体が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、メラノーマ抗原Ｅ（ＭＡＧＥ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、膜結合型ムチン１（ＭＵＣ−１）、前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、サービビン（survivin）、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ１）、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ２）、ブラキウリ（Brachyury）、メソテリン（Mesothelin）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ−２）、ＥＲＢＢ２、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、ＦＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＡＣＰＰ、ＣＰＴ１Ａ、ＩＦＮＧ、ＣＤ２７４、ＦＯＬＲ１、ＥＰＣＡＭ、ＩＣＡＭ２、ＮＣＡＭ１、ＬＲＲＣ４、ＵＮＣ５Ｈ２  ＬＩＬＲＢ２、ＣＥＡＣＡＭ、ネクチン−３、またはその組み合わせからなる群から選択される任意の１つである、請求項２３に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項２５】
外来タンパク質が、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘおよびＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択される任意の１つのＣ末端に連結されている、請求項１２に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項２６】
外来タンパク質が、
Ｎ末端−所望のタンパク質−ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘおよびＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択される任意の１つのＣ末端領域−Ｃ末端
の順で連結されている、請求項２５に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項２７】
外来タンパク質が、所望のタンパク質と、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘおよびＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択される任意の１つのＣ末端領域との間に、リンカーをさらに含む、請求項２６に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項２８】
リンカーが１〜１５０アミノ酸からなる、請求項２７に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項２９】
リンカーが、グリシンおよびセリンからなる５〜５０アミノ酸からなる、請求項２８に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項３０】
リンカーが（Ｇ４Ｓ）ｎであり、ここで、ｎは１〜１０の整数である、請求項２１に記載の改変ミトコンドリア。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれかに記載される改変ミトコンドリアを有効成分として含む医薬組成物。
【請求項３２】
医薬組成物が癌の予防または治療用である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
癌が、胃癌、肝臓癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、子宮頸癌、甲状腺癌、喉頭癌、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽腫、網膜芽細胞腫、頭頸部癌、唾液腺癌およびリンパ腫からなる群から選択される任意の１つである、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
細胞の内部および外部で機能することのできる所望のタンパク質を含む外来タンパク質の細胞内および細胞外送達手段としての改変ミトコンドリアの使用。
【請求項３５】
外来タンパク質がミトコンドリア外膜アンカリングペプチドを含み、ミトコンドリア外膜に該外膜アンカリングペプチドによって結合されており、細胞の内部および外部に送達される、請求項３４に記載の改変ミトコンドリアの使用。
【請求項３６】
ミトコンドリア外膜アンカリングペプチドならびに細胞の内部および外部で機能することのできる所望のタンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項３７】
ミトコンドリアアンカリングペプチドが、ミトコンドリア外膜に存在するタンパク質のＮ末端またはＣ末端配列を含む、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
ミトコンドリア外膜アンカリングペプチドが、ＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０、ＯＭ４５、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘおよびＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択される任意の１つである、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
所望のタンパク質が、ｐ５３、グランザイムＢ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、ＰＤＣＤ５、Ｅ２Ｆ、ＡＰ−１（Ｊｕｎ／Ｆｏｓ）、ＥＧＲ−１、網膜芽細胞腫（ＲＢ）、ホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、Ｅ−カドヘリン、ニューロフィブロミン−２（ＮＦ−２）、ポリ［ＡＤＰ−リボース］合成酵素１（ＰＡＲＰ−１）、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）、腫瘍壊死因子受容体関連因子（ＴＲＡＦ）、ＲＡＦキナーゼ阻害タンパク質（ＲＫＩＰ）、ｐ１６、ＫＬＦ−１０、ＬＫＢ１、ＬＨＸ６、Ｃ−ＲＡＳＳＦ、ＤＫＫ−３ＰＤ１、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃからなる群から選択される任意の１つである、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
ミトコンドリア外膜アンカリングペプチドが、ＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０またはＯＭ４５であるとき、ミトコンドリア外膜アンカリングペプチドおよび所望のタンパク質がＮ末端からＣ末端へと連結されている、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項４１】
ミトコンドリア外膜アンカリングペプチドが、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘおよびＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択される任意の１つであるとき、所望のタンパク質およびミトコンドリア外膜アンカリングペプチドがＮ末端からＣ末端へと連結されている、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項４２】
融合タンパク質が、ユビキチンもしくはそのフラグメントを、ミトコンドリア外膜アンカリングペプチドと所望のタンパク質の間にさらに含む、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項４３】
融合タンパク質が、真核細胞中のタンパク質分解酵素によって認識されるアミノ酸配列を、ミトコンドリア外膜アンカリングペプチドと所望のタンパク質の間にさらに含む、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項４４】
請求項３６〜４３のいずれかに記載される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４５】
原核細胞、またはユビキチン分解酵素もしくはタンパク質分解酵素を持たない真核細胞に、請求項４４に記載されるポリヌクレオチドを導入するステップ；および
融合タンパク質を取得するステップ
を含む、請求項３６〜４３のいずれかに記載される融合タンパク質を製造する方法。
【請求項４６】
細胞膜に存在するリガンドまたは受容体に結合する能力を有する標的標的化タンパク質、およびミトコンドリア外膜アンカリングペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項４７】
ミトコンドリア外膜アンカリングペプチドが、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘおよびＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択される任意の１つである、請求項４６に記載の融合タンパク質。
【請求項４８】
細胞膜に存在するリガンドまたは受容体に結合する能力を有する標的標的化タンパク質、およびミトコンドリア外膜アンカリングペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へと連結されている、請求項４６に記載の融合タンパク質。
【請求項４９】
細胞膜に存在するリガンドまたは受容体に結合する能力を有する標的標的化タンパク質が、抗体またはそのフラグメントである、請求項４８に記載の融合タンパク質。
【請求項５０】
抗体のフラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖおよびＦ（ａｂ）２からなる群から選択される任意の１つである、請求項４９に記載の融合タンパク質。
【請求項５１】
請求項４６〜５０のいずれかに記載される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５２】
単離されたミトコンドリアを、請求項３６〜４３のいずれかに記載される融合タンパク質、および／または請求項４６〜５０のいずれかに記載される融合タンパク質と混合するステップを含む、改変ミトコンドリアの作製方法。
【請求項５３】
請求項３６〜４１のいずれかに記載される融合タンパク質および／または請求項４６〜５０のいずれかに記載される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを真核細胞に導入することにより形質転換した細胞から改変ミトコンドリアを調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリアを改変することのできる融合タンパク質、融合タンパク質により改変されたミトコンドリア、およびそれを有効成分として含む医薬組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、細胞内エネルギー源であるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の合成および調節に与る真核細胞の細胞オルガネラである。ミトコンドリアはさまざまなインビボ代謝経路、例えば細胞シグナル伝達、細胞分化、細胞死、ならびに細胞サイクルおよび細胞増殖の調節に関与する。ミトコンドリアは、独自のゲノムを有する、細胞のエネルギー代謝における中心的な役割を果たすオルガネラである。ミトコンドリアは、電子伝達および酸化的リン酸化プロセスによってエネルギーを産生し、アポトーシスシグナル伝達経路における関与において重要な役割を果たす。
【０００３】
ミトコンドリアの機能低下によるエネルギー産生の低下がさまざまな疾患を引き起こすことが報告されている。ミトコンドリアのゲノムおよびプロテオームの変異によって電子伝達連鎖反応の機能が低下した場合、ＡＴＰ産生の低下、過剰な活性酸素産生、カルシウム調節機能の低下等が起こる。このような場合、ミトコンドリアの膜透過性に変化が生じ、アポトーシス機能が異常に起こり得、癌および不治の疾患が引き起こされうる。
【０００４】
したがって、ミトコンドリア機能不全によりもたらされることが報告されているヒト疾患として、ミトコンドリア関連遺伝子疾患（Wallace DC 1999）、糖尿病（Maechler P 2001）、心臓疾患（Sorescu D 2002）、老人性痴呆症、例えばパーキンソン病またはアルツハイマー病（Lin MT 2006）、ならびにさまざまな癌（Petros JA, 2005）および癌転移（Ishikawa K, 2008）等が報告されている。さらに、２００種類を超えるさまざまな癌に共通して見られる特徴には、アポトーシス機能の異常、炎症反応の増加、および異常代謝の増加が含まれた。これらのプロセスはいずれも、ミトコンドリアの機能に密接に関連し、癌とミトコンドリアの関係に関心が持たれている。
【０００５】
ところで、正常細胞は電子伝達系プロセスによってグルコース１モル当たり３６のＡＴＰを産生するが、癌細胞は正常細胞と異なり、十分な酸素条件下に解糖によってグルコース１モル当たり２ＡＴＰを産生する（好気的解糖）ことが知られる。したがって、癌細胞は正常細胞とは異なり、急速な細胞増殖に必要なアミノ酸、脂質、核酸等を産生するために、エネルギーに関して非効率的な解糖プロセスを用いることが知られている。そのため、癌細胞は正常細胞よりも酸素を少なく必要とし、乳酸をより多量に産生することが知られている。
【０００６】
したがって、癌細胞において起こる異常代謝による癌微小環境の組成変化、機能不全ミトコンドリアが原因のアポトーシス阻害、および炎症反応の増加、ならびに癌細胞中の異常代謝反応は、癌増殖において非常に重要な役割を果たしている。したがって、そのような特徴を利用する代謝に関連する抗癌剤を開発することは、従来の抗癌剤の副作用および経済的問題を解消することのできる優れた方法でありうる。
【０００７】
細胞中に存在するミトコンドリアを単離し、それで細胞をインビトロで処理したとき、またはミトコンドリアを体内に導入したときに、ミトコンドリアは細胞に入り込むことが知られている。この現象を利用して、ミトコンドリア機能不全により引き起こされる疾患を処置するために、細胞から単離された正常なミトコンドリアを体内に導入すること、または、特に、ミトコンドリアを担体として使用して特定のタンパク質を細胞に効果的に送達することによって疾患を処置することが可能であるが、これについての報告は未だなされていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、さまざまな薬理学的作用を示すことのできるタンパク質を細胞中に効果的に送達する手段としてミトコンドリアを使用できることを示すことによって、効果的なタンパク質送達システムを提供することである。さらに、本発明の目的は、薬剤を効果的に送達するための組換えタンパク質を提供すること、およびそれを用いて作製された改変ミトコンドリアを提供することである。さらに、本発明の目的は、改変ミトコンドリアを有効成分として含む医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、外来タンパク質がミトコンドリア外膜に結合された改変ミトコンドリアが提供される。さらに、改変ミトコンドリアを調製するために、ミトコンドリア外膜アンカリングペプチドおよび所望の薬理学的タンパク質を含む融合タンパク質が提供される。さらに、抗体またはそのフラグメントおよびミトコンドリア外膜アンカリングペプチドを含む融合タンパク質が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
外来タンパク質が結合されたミトコンドリアが人体に投与されると、外来タンパク質は細胞中に効果的に送達されうる。さらに、細胞中に送達された薬理学的に活性なタンパク質によって、損なわれた細胞の機能が修復されうる。さらに、薬理学的活性タンパク質を含む外来タンパク質が結合されたミトコンドリアが細胞中に送達されると、細胞において薬理学的活性タンパク質がミトコンドリアから解離され、有用な役割が期待されうる。さらに、抗体フラグメントを含む改変ミトコンドリアは、標的細胞に効果的に送達されうる。特に、癌組織表面上に存在するタンパク質を標的とする抗体のフラグメントがミトコンドリア表面に結合される場合、改変ミトコンドリアは効果的に癌細胞中に送達されうる。したがって、改変ミトコンドリアの導入は、細胞の損なわれた電子伝達系を回復しうるだけでなく、改変ミトコンドリアに結合された薬理学的活性タンパク質によってさまざまな疾患を予防または治療しうる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ｐＴＡ−ｐ５３の作製方法を示す図である。
【図２】図２は、ｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−ｐ５３ベクターの作製方法を示す図である。
【図３】図３は、大腸菌におけるＵＢ−ｐ５３タンパク質の発現を示す。
【図４】図４は、ｐＥＴ１１Ｃ−ＴＯＭ７０−ＵＢ−ｐ５３ベクターの作製方法を示す図である。
【図５】図５は、大腸菌におけるＴＯＭ７０−ＵＢ−ｐ５３タンパク質の発現を示す。
【図６】図６は、ｐＥＴ１１Ｃ−ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３ベクターの作製方法を示す図である。
【図７】図７は、大腸菌におけるＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３タンパク質の発現を示す。
【図８】図８は、ｐＥＴ１１Ｃ−ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ｐ５３ベクターの作製方法を示す。
【図９】図９は、大腸菌におけるＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ｐ５３タンパク質の発現を示す。
【図１０】図１０は、ｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−ｐ５３−ＴＯＭ７ベクターの作製方法を示す。
【図１１】図１１は、大腸菌におけるＵＢ−ｐ５３−ＴＯＭ７タンパク質の発現を示す。
【図１２】図１２は、ｐＣＭＶ−ｐ５３−ｍｙｃ／Ｈｉｓベクターの作製方法を示す図である。
【図１３】図１３は、形質転換ＣＨＯにおけるｐ５３−ｍｙｃ／Ｈｉｓタンパク質の発現を示す。
【図１４】図１４は、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ｐ５３タンパク質を精製し、次いでそれを確認した結果を示す。
【図１５】図１５は、精製されたＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ｐ５３タンパク質を示す図である。
【図１６】図１６は、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３タンパク質を精製し、次いでそれを確認した結果を示す。
【図１７】図１７は、精製されたＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３タンパク質を示す図である。
【図１８】図１８は、ＵＢ−ｐ５３タンパク質を精製し、次いでそれを確認した結果を示す。
【図１９】図１９は、精製されたＵＢ−ｐ５３タンパク質を示す図である。
【図２０】図２０は、ＵＢ−ｐ５３−ＴＯＭ７タンパク質を精製し、次いでそれを確認した結果を示す。
【図２１】図２１は、精製されたＵＢ−ｐ５３−ＴＯＭ７タンパク質を示す図である。
【図２２】図２２は、ｐＴＡ−グランザイムＢベクターの作製方法を示す。
【図２３】図２３は、ｐＥＴ１１Ｃ−ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−グランザイムＢベクターの作製方法を示す。
【図２４】図２４は、大腸菌におけるＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−グランザイムＢタンパク質の発現を示す。
【図２５】図２５は、ｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−グランザイムＢ−ＴＯＭ７ベクターの作製方法を示す。
【図２６】図２６は、大腸菌におけるＵＢ−グランザイムＢ−ＴＯＭ７タンパク質の発現を示す。
【図２７】図２７は、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−グランザイムＢタンパクの精製の結果を示す。
【図２８】図２８は、精製されたＵＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−グランザイムＢタンパク質を示す図である。
【図２９】図２９は、ｐＴＡ−ＲＫＩＰベクターの作製方法を示す。
【図３０】図３０は、ｐＥＴ１１Ｃ−ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＲＫＩＰベクターの作製方法を示す。
【図３１】図３１は、大腸菌におけるＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＲＫＩＰタンパク質の発現を示す。
【図３２】図３２は、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＲＫＩＰタンパク質の精製の結果を示す。
【図３３】図３３は、精製されたＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＲＫＩＰタンパク質を示す図である。
【図３４】図３４は、ｐＴＡ−ＰＴＥＮベクターの作製方法を示す。
【図３５】図３５は、ｐＥＴ１１Ｃ−ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＰＴＥＮベクターの作製方法を示す。
【図３６】図３６は、大腸菌におけるＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＰＴＥＮタンパク質の発現を示す。
【図３７】図３７は、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＰＴＥＮタンパク質の精製の結果を示す。
【図３８】図３８は、精製されたＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＰＴＥＮタンパク質を示す図である。
【図３９】図３９は、ＵＢ−ＧＦＰ−ＴＯＭ７タンパク質を精製し、次いでそれを確認した結果を示す。
【図４０】図４０は、精製されたＵＢ−ＧＦＰ−ＴＯＭ７タンパク質を示す図である。
【図４１】図４１は、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＧＦＰタンパク質を精製し、次いでそれを確認した結果を示す。
【図４２】図４２は、精製されたＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＧＦＰタンパク質を示す図である。
【図４３】図４３は、ｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−ｓｃＦｖＨＥＲ２−ＴＯＭ７ベクターの作製方法を示す。
【図４４】図４４は、大腸菌におけるＵＢ−ｓｃＦｖＨＥＲ２−ＴＯＭ７タンパク質の発現を示す。
【図４５】図４５は、ｐＣＭＶ−ｓｃＦｖＨＥＲ２−ＴＯＭ７−ｍｙｃ／Ｈｉｓベクターの作製方法を示す。
【図４６】図４６は、形質転換ＣＨＯにおけるｓｃＦｖＨＥＲ２−ＴＯＭ７−ｍｙｃ／Ｈｉｓタンパク質の発現を示す。
【図４７】図４７は、ＵＢ−ＳｃＦｖＨＥＲ２−ＴＯＭ７タンパク質の精製の結果を示す。
【図４８】図４８は、精製されたＵＢ−ＳｃＦｖＨＥＲ２−ＴＯＭ７タンパク質を示す図である。
【図４９】図４９は、ｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−ｓｃＦｖＭＥＬ−ＴＯＭ７ベクターの作製方法を示す。
【図５０】図５０は、大腸菌におけるＵＢ−ｓｃＦｖＭＥＬ−ＴＯＭ７タンパク質の発現を示す。
【図５１】図５１は、ｐＣＭＶ−ｓｃＦｖＭＥＬ−ＴＯＭ７−ｍｙｃ／Ｈｉｓベクターの作製方法を示す。
【図５２】図５２は、形質転換ＣＨＯにおけるｓｃＦｖＭＥＬ−ＴＯＭ７−ｍｙｃ／Ｈｉｓタンパク質の発現を示す。
【図５３】図５３は、ｐＣＭＶ−ｓｃＦｖＰＤ−Ｌ１−ＴＯＭ７−ｍｙｃ／Ｈｉｓベクターの作製方法を示す。
【図５４】図５４は、形質転換ＣＨＯにおけるｓｃＦｖＰＤ−Ｌ１−ＴＯＭ７−ｍｙｃ／Ｈｉｓタンパク質の発現を示す。
【図５５】図５５は、ミトコンドリア外膜に蛍光タンパク質が結合するかを確認する図である。この場合、ミトコンドリアはMitoTracker CMXRosで染色されて赤色を呈し、ＴＯＭ７０−ＵＢ−ＧＦＰは緑色を呈する。その２つの部分が重なった領域は黄色を呈する。この場合、図５５ａの倍率は２００倍であり、図５５ｂの倍率は６００倍である。
【図５６】図５６は、外来ミトコンドリア外膜に結合した組換えタンパク質ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３およびＵＢ−ｐ５３−ＴＯＭ７を、ウエスタンブロット分析によって確認した結果を示す。
【図５７】図５７は、外来ミトコンドリアを単離し、ミトコンドリアを細胞に導入した後に、ミトコンドリア濃度による細胞内導入の程度を蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。
【図５８】図５８は、皮膚癌細胞の増殖に対する正常ミトコンドリアの作用を確認する図である。
【図５９】図５９は、皮膚癌細胞における活性酸素種（ＲＯＳ）産生の抑制に対する正常ミトコンドリアの作用を確認する図である。
【図６０】図６０は、薬剤耐性に対する正常ミトコンドリアの作用を確認する図である。
【図６１】図６１は、細胞における抗酸化物質遺伝子の発現に対する正常ミトコンドリアの作用を確認する図である。
【図６２】図６２は、癌細胞転移に関与する遺伝子の発現に対する正常ミトコンドリアの作用を示す図である。
【図６３】図６３は、組換えタンパク質ｐ５３の外来ミトコンドリア外膜上の結合、および組換えタンパク質ｐ５３の細胞への導入を確認する方法を示す図である。
【図６４】図６４は、組換えタンパク質ｐ５３が外来ミトコンドリア外膜上に結合したこと、およびｐ５３が細胞内に導入されたことを確認する図である。この場合、倍率は２００倍である。
【図６５】図６５は、組換えタンパク質ｐ５３が外来ミトコンドリア外膜上に結合したこと、およびｐ５３が細胞内に導入されたことを確認する図である。この場合、倍率は６００倍である。
【図６６】図６６は、細胞に導入されるｐ５３が結合した改変ミトコンドリアのアポトーシス能力を、胃癌細胞株を用いて確認する方法を示す図である。
【図６７ａ】図６７ａは、胃癌細胞に導入されるｐ５３が結合した改変ミトコンドリアのアポトーシス能力のＴＵＮＥＬアッセイによる確認の図である。この場合、倍率は６００倍である。
【図６７ｂ】図６７ｂは、胃癌細胞に導入されるｐ５３が結合した改変ミトコンドリアのアポトーシス能力の蛍光測定による確認の図である。
【図６８】図６８は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において、ＲＫＩＰを結合した改変ミトコンドリアによる癌細胞転移抑制作用を確認する図である。
【図６９】図６９は、癌細胞を標的とする一本鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）抗体が細胞において発現されたことを確認する図である。
【図７０】図７０は、癌細胞を標的とする一本鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）抗体が発現され、細胞中に存在するミトコンドリアに結合したことを、免疫細胞化学（ＩＣＣ）実験法で確認する図である。この場合、倍率は２００倍である。
【図７１】図７１は、癌細胞を標的とする一本鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）抗体が発現され、細胞中に存在するミトコンドリアに結合したことを、免疫細胞化学（ＩＣＣ）実験法で確認する図である。この場合、倍率は６００倍である。
【図７２】図７２は、癌細胞を標的とする一本鎖可変フラグメント抗体が結合したミトコンドリアの胃癌細胞株への導入の効果を比較する図である。
【図７３】図７３は、改変ミトコンドリアを用いる動物実験スケジュールを示す図である。
【図７４】図７４は、腫瘍組織の増大を視覚的に観察する写真である。
【図７５】図７５は、ミトコンドリアおよび改変ミトコンドリアの投与後のマウスの体重変化を確認する図である。
【図７６】図７６は、ミトコンドリアおよび改変ミトコンドリアの投与後の腫瘍サイズを確認する図である。
【図７７】図７７は、ＴＯＭ−ＵＢ−ｐ５３タンパク質が結合した改変ミトコンドリアがＡ４３１細胞の増殖の抑制に効果的であることを確認する図である。
【図７８】図７８は、単離されたミトコンドリアの機能をＡＴＰ量によって確認する図である。
【図７９】図７９は、単離されたミトコンドリアの機能を膜電位によって確認する図である。
【図８０】図８０は、単離されたミトコンドリアの傷害の程度をミトコンドリアＲＯＳ（ｍＲＯＳ産生）の測定によって確認する図である。
【図８１ａ】図８１ａは、ミトコンドリア外膜に存在するタンパク質の構造、およびＴＯＭ７０、ＴＯＭ２０またはＯＭ４５のＮ末端領域のアミノ酸配列を示す図である。
【図８１ｂ】図８１ｂは、ＴＯＭ５、ＴＯＭ７、ＦＩｓ１、ＶＡＭＰ１Ｂ、Ｃｙｔｂ５、ＢＣＬ−２またはＢＣＬ−ＸのＣ末端領域のアミノ酸配列を示す図である。
【図８２】図８２は、外膜アンカリングペプチドとユビキチンの間のリンカーの存否によって所望のタンパク質が解離されるかを確認する図である。
【図８３】図８３は、改変ミトコンドリアに結合した所望のタンパク質が細胞においてミトコンドリアから分離されることを確認する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明を以下、詳細に説明する。
本発明の一側面は、外来タンパク質がミトコンドリア外膜に結合された改変ミトコンドリアを提供する。
【００１３】
ミトコンドリアは、哺乳動物から取得され得、ヒトから取得され得る。特に、ミトコンドリアは細胞または組織から単離され得る。例えば、ミトコンドリアは、体細胞、生殖細胞または幹細胞から取得され得る。さらに、ミトコンドリアは、ミトコンドリアの生物学的活性が正常な細胞から取得される正常なミトコンドリアでありうる。さらに、ミトコンドリアは、インビトロで培養されうる。
【００１４】
さらに、ミトコンドリアは、自己、同種他家、異種対象から取得され得る。特に、自己ミトコンドリアは、対象自身の組織または細胞から取得されるミトコンドリアをさす。さらに、同種他家ミトコンドリアは、対象と同じ種に属するがアレルの遺伝子型の異なる対象から取得されるミトコンドリアをさす。さらに、異種ミトコンドリアは、対象とは異なる種に属する対象から取得されるミトコンドリアをさす。
【００１５】
特に、体細胞は、筋肉細胞、肝細胞、神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、脂肪細胞、骨細胞、白血球、リンパ球、血小板、または粘膜細胞でありうる。さらに、生殖細胞は、減数分裂および有糸分裂する細胞であり、精子または卵子でありうる。さらに、幹細胞は、間葉系幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄幹細胞、神経幹細胞、角膜上皮幹細胞、および組織由来幹細胞からなる群から選択される任意の１つでありうる。この場合、間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜および胎盤からなる群から選択される任意の１つでありうる。
【００１６】
一方、ミトコンドリアを特定の細胞から単離する場合、ミトコンドリアは、さまざまな既知の方法で、例えば、特定のバッファー液を用いるか、または電位差および磁場等を利用して単離することができる。
【００１７】
本書において、用語「外来タンパク質」とは、細胞の内部および外部で機能することのできる所望のタンパク質を含むタンパク質をいう。この場合、外来タンパク質は、ミトコンドリア内に存在しないタンパク質であり、組換えタンパク質でありうる。特に、外来タンパク質は、ミトコンドリアアンカリングペプチドおよび所望のタンパク質を含みうる。さらに、外来タンパク質は、ミトコンドリアアンカリングペプチドおよび所望のタンパク質を含む組換え融合タンパク質でありうる。この場合、外来タンパク質は、ミトコンドリアアンカリングペプチドを含みうる。好ましくは、ミトコンドリアアンカリングペプチドは、ミトコンドリア外膜上に位置することができるペプチドでありうる。したがって、外来タンパク質は、ミトコンドリアアンカリングペプチドによってミトコンドリア外膜に結合することができる。ミトコンドリアアンカリングペプチドは、ミトコンドリア膜タンパク質中に存在するタンパク質のＮ末端領域またはＣ末端領域を含むペプチドであり得、ミトコンドリアタンパク質外膜に存在するタンパク質のＮ末端領域またはＣ末端領域は、ミトコンドリアの外膜上に位置しうる。この場合、アンカリングペプチドは、ミトコンドリアシグナル配列をさらに含みうる。
【００１８】
ミトコンドリア膜タンパク質中に存在するタンパク質の例は、ＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０、ＯＭ４５、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘおよびＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択される任意の１つでありうる。特に、ミトコンドリアアンカリングペプチドがＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０およびＯＭ４５からなる群から選択される任意の１つに由来する場合、それはＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０およびＯＭ４５のＮ末端領域を含みうる。ミトコンドリアアンカリングペプチドの例は、配列番号７５の酵母由来ＴＯＭ７０、または配列番号７６のヒト由来ＴＯＭ７０でありうる。他の例は、配列番号７７の酵母由来ＴＯＭ２０、または配列番号７８のヒト由来ＴＯＭ２０でありうる。他の例は、配列番号７９の酵母由来ＯＭ４５でありうる。
【００１９】
さらに、ミトコンドリアアンカリングペプチドが、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘおよびＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択される任意の１つに由来する場合、それは、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘおよびＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択される任意の１つのＣ末端領域を含みうる。ミトコンドリアアンカリングペプチドの例は、配列番号８０の酵母由来ＴＯＭ５、または配列番号８１のヒト由来ＴＯＭ５でありうる。他の例は、配列番号８２の酵母由来ＴＯＭ７、または配列番号８３のヒト由来ＴＯＭ７でありうる。他の例は、配列番号８４の酵母由来ＴＯＭ２２、または配列番号８５のヒト由来ＴＯＭ２２でありうる。他の例は、配列番号８６の酵母由来Ｆｉｓ１、または配列番号８７のヒト由来Ｆｉｓ１でありうる。他の例は、配列番号８８のヒト由来Ｂｃｌ−２αでありうる。他の一例は、配列番号８９の酵母由来ＶＡＭＰ１、または配列番号９０のヒト由来ＶＡＭＰ１でありうる。
【００２０】
この場合、外来タンパク質中に含まれる細胞の内部および外部で機能することのできる所望のタンパク質は、細胞において活性を示す活性タンパク質、細胞に存在するタンパク質、および細胞膜に存在するリガンドまたは受容体に結合する能力を有するタンパク質からなる群から選択される任意の１つでありうる。
【００２１】
活性タンパク質または細胞に存在するタンパク質の例は、ｐ５３、グランザイムＢ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、ＰＤＣＤ５、Ｅ２Ｆ、ＡＰ−１（Ｊｕｎ／Ｆｏｓ）、ＥＧＲ−１、網膜芽細胞腫（ＲＢ）、ホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、Ｅ−カドヘリン、ニューロフィブロミン−２（ＮＦ−２）、ポリ［ＡＤＰ−リボース］合成酵素１（ＰＡＲＰ−１）、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）、腫瘍壊死因子受容体関連因子（ＴＲＡＦ）、ＲＡＦキナーゼ阻害タンパク質（ＲＫＩＰ）、ｐ１６、ＫＬＦ−１０、ＬＫＢ１、ＬＨＸ６、Ｃ−ＲＡＳＳＦ、ＤＫＫ−３ＰＤ１、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃからなる群から選択される任意の１つでありうる。所望のタンパク質が上記群から選択されるとき、所望のタンパク質は、ＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０またはＯＭ４５のＮ末端領域を含むアンカリングペプチドに連結されうる。
【００２２】
前記のような融合タンパク質は、以下の順で連結されうる：
Ｎ末端−ＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０またはＯＭ４５のＮ末端領域を含むアンカリングペプチド−所望のタンパク質−Ｃ末端。
【００２３】
さらに、外来タンパク質は、真核細胞中のタンパク質分解酵素によって認識されるアミノ酸配列、またはユビキチンもしくはそのフラグメントを、ミトコンドリアアンカリングペプチドと所望のタンパク質の間にさらに含みうる。真核細胞中のタンパク質分解酵素とは、真核細胞に存在するタンパク質を分解する酵素をさす。この場合、外来タンパク質はタンパク質を分解する酵素により認識されるアミノ酸配列を含むので、ミトコンドリア外膜に結合された外来タンパク質は、細胞においてアンカリングペプチドおよび所望のタンパク質に分解されうる。
【００２４】
この場合、ユビキチンフラグメントは、配列番号７１のアミノ酸配列のＣ末端Ｇｌｙ−Ｇｌｙを含み得、該Ｃ末端から連続する３〜７５アミノ酸を含み得る。さらに、外来タンパク質は、所望のタンパク質とユビキチンまたはそのフラグメントの間にリンカーをさらに含み得る。この場合、リンカーは１〜１５０アミノ酸からなりうるか、または１０〜１００アミノ酸からなりうるか、または２０〜５０アミノ酸からなりうるが、それに限定されない。リンカーは、２０のアミノ酸から適当に選択されるアミノ酸からなり得、好ましくはグリシンおよび／またはセリンからなり得る。リンカーは例えば、グリシンおよびセリンからなる５〜５０アミノ酸からなり得る。リンカーの例は、（Ｇ４Ｓ）ｎであり得、ここで、ｎは１〜１０の整数であり、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり得る。
【００２５】
さらに、細胞膜に存在するリガンドまたは受容体に結合する能力を有するタンパク質は、腫瘍細胞表面上に存在するリガンドまたは受容体でありうる。この場合、腫瘍細胞表面上に存在するリガンドまたは受容体は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、メラノーマ抗原Ｅ（ＭＡＧＥ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、膜結合型ムチン１（ＭＵＣ−１）、前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、サービビン（survivin）、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ１）、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ２）、ブラキウリ（Brachyury）、メソテリン（Mesothelin）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ−２）、ＥＲＢＢ２、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、ＦＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＡＣＰＰ、ＣＰＴ１Ａ、ＩＦＮＧ、ＣＤ２７４、ＦＯＬＲ１、ＥＰＣＡＭ、ＩＣＡＭ２、ＮＣＡＭ１、ＬＲＲＣ４、ＵＮＣ５Ｈ２  ＬＩＬＲＢ２、ＣＥＡＣＡＭ、ネクチン−３、およびその組み合わせからなる群から選択される任意の１つでありうるが、それに限定されない。
【００２６】
さらに、細胞膜に存在するリガンドまたは受容体に結合する能力を有するタンパク質は、前記群から選択される任意の１つに結合する抗体またはそのフラグメントでありうる。特に、抗体のフラグメントとは、抗体と同じ相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するフラグメントをさす。これは特に、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２またはその組み合わせでありうる。
【００２７】
この場合、所望のタンパク質は、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘおよびＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択される任意の１つのＣ末端領域を含むアンカリングペプチドに連結され得、外来タンパク質は以下の順で連結されうる：
Ｎ末端−所望のタンパク質−ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘおよびＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択される任意の１つのＣ末端領域を含むアンカリングペプチド−Ｃ末端。
【００２８】
さらに、外来タンパク質は、所望のタンパク質と、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘおよびＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択される任意の１つのＣ末端領域との間に、リンカーをさらに含みうる。この場合、リンカーは前記のとおりである。この場合、所望のタンパク質である、活性タンパク質、細胞に存在するタンパク質、および細胞膜に存在するリガンドまたは受容体に結合する能力を有するタンパク質等は、前記のとおりである。
【００２９】
所望のタンパク質の一形態において、特定の細胞を標的とする抗体またはそのフラグメントが、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘおよびＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択される任意の１つのＣ末端領域を含むアンカリングペプチドに連結された形態にありうる。そのような所望のタンパク質が結合された改変ミトコンドリアは、特定の標的に容易に導入されることができるので、ミトコンドリアは特定の細胞中に効果的に導入されることができる。
【００３０】
改変ミトコンドリアの一態様は、１つまたはそれ以上の所望のタンパク質が結合された形態でありうる。特に、ｐ５３を含む所望のタンパク質および抗ＨＥＲ−２抗体またはそのフラグメントを含む所望のタンパク質が結合された形態でありうる。そのような改変ミトコンドリアは、ミトコンドリアを、ＨＥＲ−２発現癌細胞へ効果的に送達しうる。さらに、癌細胞は、改変ミトコンドリアに結合されたｐ５３によって効果的に死滅されうる。
【００３１】
１つまたはそれ以上の活性タンパク質を含む所望のタンパク質は、改変ミトコンドリアの目的に応じて、構成されミトコンドリアと結合されうる。さらに、細胞を標的とする所望のタンパク質は、標的細胞に応じたさまざまな方法で構成されうる。
【００３２】
本発明の他の一側面において、前記改変ミトコンドリアを有効成分として含む医薬組成物が提供される。この場合、医薬組成物の用途は、癌の予防または治療でありうる。この場合、癌は、胃癌、肝臓癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、子宮頸癌、甲状腺癌、喉頭癌、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽腫、網膜芽細胞腫、頭頸部癌、唾液腺癌およびリンパ腫からなる群から選択される任意の１つでありうる。
【００３３】
特に、ｐ５３のように活性タンパク質が腫瘍細胞を殺す場合、または増殖を抑制するタンパク質がミトコンドリアに結合される場合、ｐ５３が結合された改変ミトコンドリアは抗癌剤として使用されうる。さらに、癌細胞の転移を抑制することのできるＲＫＩＰのようなタンパク質がミトコンドリアに結合される場合、ＲＫＩＰが結合された改変ミトコンドリアは腫瘍転移阻害剤として使用されうる。癌細胞の増殖を抑制する、または癌細胞におけるリン酸化反応を制御する、または癌細胞の転移を抑制するタンパク質である、グランザイムＢ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、ＰＤＣＤ５、Ｅ２Ｆ、ＡＰ−１（Ｊｕｎ／Ｆｏｓ）、ＥＧＲ−１、網膜芽細胞腫（ＲＢ）、ホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、Ｅ−カドヘリン、ニューロフィブロミン−２（ＮＦ−２）、ポリ［ＡＤＰ−リボース］合成酵素１（ＰＡＲＰ−１）、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）、腫瘍壊死因子受容体関連因子（ＴＲＡＦ）、ｐ１６、ＫＬＦ−１０、ＬＫＢ１、ＬＨＸ６、Ｃ−ＲＡＳＳＦ、ＤＫＫ−３ＰＤ１、およびその組み合わせからなる群から選択される任意の１つがミトコンドリアに結合される場合、該活性タンパク質が結合された改変ミトコンドリアは抗癌剤として使用されうる。
【００３４】
さらに、医薬組成物において、ミトコンドリアは、０．１μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ〜４５０μｇ／ｍｌ、または０．５μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌの濃度で含まれうるが、それに限定されない。ミトコンドリア含有量を上記範囲とした場合、投与時のミトコンドリア用量調節が容易となり得、患者の疾患症状の改善度が向上され得る。この場合、ミトコンドリアの用量は、単離されたミトコンドリアの膜タンパク質の定量によるミトコンドリアの定量によって決定されうる。特に、単離されたミトコンドリアは、ブラッドフォードタンパク質アッセイ（James D. McCullyによる文献（J Vis Exp. 2014; (91): 51682）によって定量されうる。
【００３５】
さらに、医薬組成物において、ミトコンドリアに結合される活性タンパク質は、０．１μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ〜４５０μｇ／ｍｌ、または０．５μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌの濃度で含まれうるが、それに限定されない。活性タンパク質含有量を上記範囲とした場合、投与時の活性タンパク質用量調節が容易となり得、患者の疾患症状の改善度が向上され得る。
【００３６】
さらに、医薬組成物において、ミトコンドリアを特定の細胞に送達することのできる標的化タンパク質は、０．１μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ〜４５０μｇ／ｍｌ、または０．５μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌの濃度で含まれうるが、それに限定されない。標的化タンパク質含有量を上記範囲とした場合、投与時の標的化タンパク質用量調節が容易となり得、患者の疾患症状の改善度が向上され得る。
【００３７】
特に、本発明の医薬組成物は、被投与個体の体重に基づいて１回当たり０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ、０．１〜４ｍｇ／ｋｇ、または０．２５〜２．５ｍｇ／ｋｇのミトコンドリア量で投与されうるが、それに限定されない。すなわち、医薬組成物を、癌組織を有する個体の体重に基づく改変ミトコンドリア量が前記範囲となるように投与することが、細胞活性の点で最も好ましい。さらに、医薬組成物は、１〜１０回、３〜８回、または５〜６回、好ましくは５回投与されうる。この場合、投与間隔は１〜７日、または２〜５日、好ましくは３日でありうる。
【００３８】
さらに、本発明の医薬組成物は、癌に罹る可能性があるかまたは癌に罹っているヒトまたは他の哺乳動物に投与されうる。さらに、医薬組成物は、静脈内投与されうる注射可能な製剤、または局所投与されうる注射可能な製剤であってよく、好ましくは注射用製剤でありうる。
【００３９】
したがって、注射可能製剤の流通中の安定性を確保するために、本発明の医薬組成物は、注射可能な製剤中に使用しうる緩衝液、例えば酸水溶液またはホスフェートによる組成物ｐＨの調節によって、物理的または化学的安定性の高い注射可能な製剤として調製しうる。
【００４０】
特に、本発明の医薬組成物は、注射用水を含みうる。注射用水は、注射可能な固体製剤を溶解するため、または水溶性注射可能製剤を希釈するために調製される蒸留水で、グルコース注射液、キシリトール注射液、Ｄ−マンニトール注射液、フルクトース注射液、食塩液、デキストラン４０注射液、デキストラン７０注射液、アミノ酸注射液、リンガー液、乳酸−リンガー液、ｐＨ３．５〜７．５のリン酸緩衝液、リン酸二水素ナトリウム−クエン酸緩衝液等でありうる。
【００４１】
さらに、本発明の医薬組成物は、安定剤または溶解助剤を含みうる。例えば、安定剤は、ナトリウムピロスルファイトまたはエチレンジアミン四酢酸であってよく、溶解助剤は、塩酸、酢酸、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムまたは水酸化カリウムであってよい。
【００４２】
さらに、本発明は、前記医薬組成物を個体に投与することを含む、癌を予防または治療する方法を提供する。ここで、個体は、哺乳動物、好ましくはヒトでありうる。
【００４３】
本発明の一側面は、単離されたミトコンドリアを、活性タンパク質を含む所望のタンパク質、および／または標的標的化タンパク質を含む所望のタンパク質と混合するステップを含む、改変ミトコンドリアを調製する方法を提供する。
【００４４】
この場合、所望のタンパク質とミトコンドリアは、適当な比で混合しうる。例えば、所望のタンパク質：ミトコンドリアの混合比は、重量比で１：１００〜１００：１でありうる。特に、該混合比は、１：１０、１：５、１：４、１：３、１：２または１：１でありうる。さらに、該比は、１０：１、５：１、４：１、３：１または２：１でありうる。
【００４５】
本発明の他の一側面において、前記所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを真核細胞に導入することによって形質転換した細胞から改変ミトコンドリアを調製する方法が提供される。特に、前記ポリヌクレオチドを、原核細胞、またはユビキチン分解酵素もしくはタンパク質分解酵素を持たない真核細胞に導入するステップ、および融合タンパク質を取得するステップを含む、前記融合タンパク質を調製する方法が提供される。この調製方法は、所望のタンパク質が、真核細胞中のタンパク質分解酵素によって認識されるアミノ酸配列またはユビキチンもしくはそのフラグメントを含まない場合に適当である。
【００４６】
本発明の他の一側面において、所望のタンパク質は、原核細胞または原核細胞抽出物を用いて調製されうる。さらに、ユビキチン分解酵素もしくはタンパク質分解酵素を持たない真核細胞、または真核細胞抽出物を用いて改変ミトコンドリアを調製する方法が提供される。
【００４７】
本発明の他の一側面において、外来タンパク質送達手段としてのミトコンドリアの使用が提供される。特に、改変ミトコンドリアは、細胞内部および外部で機能することのできる所望のタンパク質を含む外来タンパク質の細胞内および細胞外送達の手段として使用されうる。ミトコンドリアは、細胞に効果的に導入され得、この場合、細胞への送達が望まれる外来タンパク質は、細胞に効果的に送達されうる。この場合、ミトコンドリアは、効果的なタンパク質送達系として使用されうる。所望のタンパク質は前記のとおりである。
【００４８】
本発明の他の一側面は、ミトコンドリア外膜アンカリングペプチドおよび所望のタンパク質を含む融合タンパク質を提供する。この場合、所望のタンパク質は前記のとおりである。
【００４９】
本書において、用語「ミトコンドリア外膜アンカリングペプチド」は、ミトコンドリアの外膜に存在するタンパク質のＮ末端またはＣ末端でありうる。ミトコンドリア外膜アンカリングペプチドは、ミトコンドリア外膜に特異的に存在するアミノ酸配列を有しうる。この場合、ミトコンドリア外膜アンカリングペプチドは、本発明において開示される融合タンパク質がミトコンドリア外膜に結合されるのを可能にする。この場合、ミトコンドリア外膜アンカリングペプチドは、ミトコンドリア外膜標的化ペプチドと同じ意味で用いられうる。
【００５０】
さらに、ミトコンドリア外膜アンカリングペプチドは、本発明において開示される融合タンパク質がミトコンドリア内部に入るのを防ぐ。ミトコンドリア外膜に存在するＴＯＭ（外膜のトランスロカーゼ）複合体は、ミトコンドリア標的配列および１つの外膜アンカリングドメインをアミノ末端に有し、カルボキシ末端の大部分が細胞質に露出された構造を有しうる（図８１ａ）。ミトコンドリア外膜に存在するＴＯＭ（外膜のトランスロカーゼ）複合体は、ミトコンドリア標的配列および１つの外膜アンカリングドメインをカルボキシル末端に有し、また、アミノ末端の大部分が細胞質に露出された構造を有しうる（図８１ｂ）。さらに、ミトコンドリア外膜に存在するタンパク質は、真核細胞中に存在するミトコンドリアに存在するタンパク質から選択されうる。例えば、それは、酵母、動物細胞またはヒト細胞中に存在するミトコンドリア外膜に存在するタンパク質から選択されうる。
【００５１】
この場合、ミトコンドリア外膜に存在するタンパク質の例は、ＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０、ＯＭ４５、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘおよびＶＡＭＰ１Ｂ、またはそのフラグメントからなる群から選択される任意の１つのタンパク質でありうる。この場合、ミトコンドリア外膜アンカリングペプチドは、ＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０、ＯＭ４５、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘおよびＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択される任意の１つのタンパク質のフラグメントでありうる。この場合、外膜アンカリングペプチドは、ミトコンドリア外膜に存在するＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０、ＯＭ４５、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘおよびＶＡＭＰ１ＢのＣ末端またはＮ末端ポリペプチドでありうる。
【００５２】
特に、ミトコンドリア外膜アンカリングペプチドが所望のタンパク質のＮ末端に融合される場合、ミトコンドリア外膜アンカリングペプチドは、ＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０およびＯＭ４５からなる群から選択されるタンパク質の末端配列を含みうる。それは好ましくは、ＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０およびＯＭ４５からなる群から選択されるタンパク質のＮ末端配列でありうる。ミトコンドリア外膜アンカリングペプチドの態様は前記のとおりである。
【００５３】
さらに、ミトコンドリア外膜アンカリングペプチドが所望のタンパク質のＣ末端に融合される場合、外膜標的化タンパク質は、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸおよびＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択されるタンパク質の末端配列を含みうる。それは好ましくは、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸおよびＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択されるタンパク質のＣ末端でありうる。ミトコンドリア外膜アンカリングペプチドの態様は前記のとおりである。
【００５４】
本書において、用語「活性タンパク質」は、生理学的活性を示すタンパク質でありうる。そのような活性タンパク質の一態様は、低下した機能を有するタンパク質、または損傷癌細胞に存在する改変されたタンパク質でありうる。活性タンパク質の一態様は、細胞の活性を高めるタンパク質でありうる。そのような活性タンパク質の態様は前記のとおりである。
【００５５】
融合タンパク質は、ミトコンドリア外膜標的化タンパク質および所望のタンパク質がＮ末端からＣ末端へと連結されたタンパク質でありうる。この場合、それは、ユビキチン、またはユビキチンプロテアーゼ特異的切断部位（グリシン−グリシン）を有するそのフラグメントを、ミトコンドリア外膜標的化タンパク質と所望のタンパク質の間にさらに含みうる。この場合、それは、ユビキチンプロテアーゼによる切断を促進するために、親水性および極性アミノ酸のセリン、グリシンおよびスレオニンを含むリンカーを、ミトコンドリア外膜標的化タンパク質とユビキチンタンパク質の間にさらに含みうる。
【００５６】
本書において、用語「ユビキチン」とは、ＵＢとも称される、タンパク質分解プロセスに関与するタンパク質をいう。ユビキチンの例は、人体に存在するユビキチン、または酵母に存在するユビキチンでありうる。人体に存在するユビキチンは７６アミノ酸からなる。この場合、ユビキチンは成熟型で用いられうる。本書において、用語「成熟型」とは、シグナルペプチドが取り除かれた形態のタンパク質を意味しうる。
【００５７】
さらに、ユビキチンプロテアーゼまたはＵＢＰ（ユビキチン特異的プロテアーゼ）と称される酵素は、真核細胞に天然に存在し、細胞においてユビキチンのＣ末端アミノ酸グリシン−グリシン部位の切断によって、所望のタンパク質の自然な分解を誘導しうる。
【００５８】
この場合、ユビキチンのフラグメントは、ユビキチンＣ末端のＧｌｙ−Ｇｌｙアミノ酸を含み得、該Ｃ末端から連続する３〜７５アミノ酸を含み得る。特に、ユビキチンのフラグメントの例は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、またはＬｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙでありうる。さらに、ユビキチンのフラグメントは、配列番号７１のアミノ酸配列を有しうる。
【００５９】
ミトコンドリア外膜標的化タンパク質および所望のタンパク質を含む融合タンパク質は、ミトコンドリア活性を改変する融合タンパク質とも称しうる。そのような融合タンパク質は、下記構造の任意の１つを有しうる：
＜構造式１＞
Ｎ末端−ミトコンドリア外膜アンカリングペプチド−所望のタンパク質−Ｃ末端
＜構造式２＞
Ｎ末端−ミトコンドリア外膜アンカリングペプチド−ユビキチンまたはそのフラグメント−所望のタンパク質−Ｃ末端
＜構造式３＞
Ｎ末端−ミトコンドリア外膜アンカリングペプチド−リンカー１−ユビキチンまたはそのフラグメント−所望のタンパク質−Ｃ末端
＜構造式４＞
Ｎ末端−ミトコンドリア外膜アンカリングペプチド−ユビキチンまたはそのフラグメント−リンカー２−所望のタンパク質−Ｃ末端
＜構造式５＞
Ｎ末端−ミトコンドリア外膜アンカリングペプチド−リンカー１−ユビキチンまたはそのフラグメント−リンカー２−所望のタンパク質−Ｃ末端
【００６０】
上記構造式１〜５において、外膜アンカリングペプチドは、ＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０およびＯＭ４５からなる群から選択されるタンパク質の末端配列であり得、所望のタンパク質は、ｐ５３、グランザイムＢ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、ＰＤＣＤ５、Ｅ２Ｆ、ＡＰ−１（Ｊｕｎ／Ｆｏｓ）、ＥＧＲ−１、網膜芽細胞腫（ＲＢ）、ホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、Ｅ−カドヘリン、ニューロフィブロミン−２（ＮＦ−２）、ポリ［ＡＤＰ−リボース］合成酵素１（ＰＡＲＰ−１）、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）、腫瘍壊死因子受容体関連因子（ＴＲＡＦ）、ＲＡＦキナーゼ阻害タンパク質（ＲＫＩＰ）、ｐ１６、ＫＬＦ−１０、ＬＫＢ１、ＬＨＸ６、Ｃ−ＲＡＳＳＦおよびＤＫＫ−３ＰＤ１からなる群から選択される任意の１つでありうる。
【００６１】
この場合、リンカー１および２はそれぞれ、１〜１００、１〜８０、１〜５０、または１〜３０アミノ酸からなるポリペプチドであり得、好ましくは、セリン、グリシンもしくはスレオニンのみまたはその組み合わせからなる１〜３０のアミノ酸からなるポリペプチドであり得る。さらに、リンカー１または２はそれぞれ、５〜１５アミノ酸からなるポリペプチドであり得、好ましくは、セリン、グリシンもしくはスレオニンのみまたはその組み合わせからなる５〜１５アミノ酸からなるポリペプチドであり得る。リンカーの例は、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号７０）でありうる。
【００６２】
＜構造式６＞
Ｎ末端−所望のタンパク質−ミトコンドリア外膜アンカリングペプチド−Ｃ末端
＜構造式７＞
Ｎ末端−所望のタンパク質−ユビキチンまたはそのフラグメント−ミトコンドリア外膜アンカリングペプチド−Ｃ末端
＜構造式８＞
Ｎ末端−所望のタンパク質−リンカー１−ユビキチンまたはそのフラグメント−ミトコンドリア外膜アンカリングペプチド−Ｃ末端
＜構造式９＞
Ｎ末端−所望のタンパク質−ユビキチンまたはそのフラグメント−リンカー２−ミトコンドリア外膜アンカリングペプチド−Ｃ末端
＜構造式１０＞
Ｎ末端−所望のタンパク質−リンカー１−ユビキチンまたはそのフラグメント−リンカー２−ミトコンドリア外膜標的化ペプチド−Ｃ末端
【００６３】
上記構造式６〜１０において、外膜アンカリング係留ペプチドは、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘ、およびＶＡＰＭ１Ｂからなる群から選択されるタンパク質の末端配列であり得、所望のタンパク質は、ｐ５３、グランザイムＢ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、ＰＤＣＤ５、Ｅ２Ｆ、ＡＰ−１（Ｊｕｎ／Ｆｏｓ）、ＥＧＲ−１、網膜芽細胞腫（ＲＢ）、ホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、Ｅ−カドヘリン、ニューロフィブロミン−２（ＮＦ−２）、ポリ［ＡＤＰ−リボース］合成酵素１（ＰＡＲＰ−１）、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）、腫瘍壊死因子受容体関連因子（ＴＲＡＦ）、ＲＡＦキナーゼ阻害タンパク質（ＲＫＩＰ）、ｐ１６、ＫＬＦ−１０、ＬＫＢ１、ＬＨＸ６、Ｃ−ＲＡＳＳＦ、ＤＫＫ−３ＰＤ１、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃからなる群から選択される任意の１つでありうる。この場合、リンカー１または２は前記のとおりである。
【００６４】
本発明の一側面は、ミトコンドリア外膜アンカリングペプチドおよび所望のタンパク質を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００６５】
さらに、本発明の一側面は、所望のタンパク質を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入されたベクターを提供する。
【００６６】
さらに、本発明の一側面は、所望のタンパク質を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入されたベクターが導入された宿主細胞を提供する。
【００６７】
本発明の一側面は、標的標的化タンパク質およびミトコンドリア外膜標的化タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。
【００６８】
この場合、標的標的化タンパク質およびミトコンドリア外膜アンカリングペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へと連結されうる。ここで、ミトコンドリア外膜アンカリングペプチドは、ＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０、ＯＭ４５、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘおよびＶＡＭＰ１Ｂからなる群から選択される任意の１つでありうる。
【００６９】
本書において、用語「標的」とは、改変ミトコンドリアを送達すべき場所をいう。標的の例は、癌細胞でありうる。特に、標的の例は、癌細胞表面上に存在するバイオマーカーでありうる。特に、標的は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）でありうる。この場合、腫瘍関連抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、メラノーマ抗原Ｅ（ＭＡＧＥ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、膜結合型ムチン１（ＭＵＣ−１）、前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、サービビン、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ１）、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ２）、ブラキウリ、メソテリン、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ−２）、ＥＲＢＢ２、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、ＦＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＡＣＰＰ、ＣＰＴ１Ａ、ＩＦＮＧ、ＣＤ２７４、ＦＯＬＲ１、ＥＰＣＡＭ、ＩＣＡＭ２、ＮＣＡＭ１、ＬＲＲＣ４、ＵＮＣ５Ｈ２  ＬＩＬＲＢ２、ＣＥＡＣＡＭ、ネクチン−３、およびその組み合わせからなる群から選択される任意の１つでありうる。
【００７０】
本書において、用語「標的標的化タンパク質」は、前記標的に結合することのできるタンパク質配列でありうる。この場合、標的標的化タンパク質の一態様は、癌細胞表面上に存在するバイオマーカーに結合するタンパク質でありうる。この場合、癌細胞表面上に存在するバイオマーカーの例は、ＩＣＡＭ２、ＮＣＡＭ１、ＬＲＲＣ４、ＵＮＣ５Ｈ２  ＬＩＬＲＢ２、ＣＥＡＣＡＭ，またはネクチン−３でありうるが、それに限定されない。この場合、標的標的化タンパク質は、前記外来タンパク質に含まれうる。
【００７１】
標的標的化タンパク質の例は、抗体またはそのフラグメントでありうる。特に、それは、腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントでありうる。さらに、抗体のフラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖおよびＦ（ａｂ）２からなる群から選択される任意の１つでありうる。
【００７２】
標的標的化タンパク質の例は、上皮成長因子受容体に結合することのできるｓｃＦｖＨＥＲでありうる。他の例は、メラノーマを標的とすることのできるｓｃＦｖＭＥＬでありうる。他の例は、癌細胞表面において過剰発現するＰＤ−Ｌ１に結合することのできるｓｃＦｖＰＤ−Ｌ１でありうる。他の例は、癌細胞表面において過剰発現するＰＤＬ−１に結合することのできるＰＤ−１でありうる。
【００７３】
本発明の一態様は、ユビキチンまたはそのフラグメントを、標的標的化タンパク質およびミトコンドリア外膜標的化タンパク質の間にさらに含みうる。ミトコンドリア標的標的化タンパク質および所望のタンパク質を含む融合タンパク質は、ミトコンドリア活性を改変する融合タンパク質と称されうる。そのような融合タンパク質は、下記構造の任意の１つを有しうる：
＜構造式１１＞
Ｎ末端−標的標的化タンパク質−ミトコンドリア外膜アンカリングペプチド−Ｃ末端
＜構造式１２＞
Ｎ末端−標的標的化タンパク質−ユビキチンまたはそのフラグメント−ミトコンドリア外膜アンカリングペプチド−Ｃ末端
＜構造式１３＞
Ｎ末端−標的標的化タンパク質−リンカー１−ユビキチンまたはそのフラグメント−ミトコンドリア外膜アンカリングペプチド−Ｃ末端
＜構造式１４＞
Ｎ末端−標的標的化タンパク質−ユビキチンまたはそのフラグメント−リンカー２−ミトコンドリア外膜アンカリングペプチド−Ｃ末端
＜構造式１５＞
Ｎ末端−標的標的化タンパク質−リンカー１−ユビキチンまたはそのフラグメント−リンカー２−ミトコンドリア外膜アンカリングペプチド−Ｃ末端
【００７４】
上記構造式１１〜１５において、外膜アンカリングペプチドは、ＴＯＭ５、ＴＯＭ６、ＴＯＭ７、ＴＯＭ２２、Ｆｉｓ１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘ、およびＶＡＰＭ１Ｂからなる群から選択されるタンパク質の末端配列であり得、標的標的化タンパク質は、腫瘍関連抗原、ＣＤ１９、ＣＤ２０、メラノーマ抗原Ｅ（ＭＡＧＥ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、膜結合型ムチン１（ＭＵＣ−１）、前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、サービビン、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ１）、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ２）、ブラキウリ、メソテリン、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ−２）、ＥＲＢＢ２、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、ＦＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＡＣＰＰ、ＣＰＴ１Ａ、ＩＦＮＧ、ＣＤ２７４、ＦＯＬＲ１、ＥＰＣＡＭ、ＩＣＡＭ２、ＮＣＡＭ１、ＬＲＲＣ４、ＵＮＣ５Ｈ２  ＬＩＬＲＢ２、ＣＥＡＣＡＭ、ネクチン−３、およびその組み合わせからなる群から選択される任意の１つでありうる。さらに、標的標的化タンパク質は、腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントでありうる。この場合、リンカー１または２、およびタンパク質分解酵素によって認識されるアミノ酸配列は、前記のとおりである。
【００７５】
＜構造式１６＞
Ｎ末端−ミトコンドリア外膜アンカリングペプチド−標的標的化タンパク質−Ｃ末端
＜構造式１７＞
Ｎ末端−ミトコンドリア外膜アンカリングペプチド−ユビキチンまたはそのフラグメント−標的標的化タンパク質−Ｃ末端
＜構造式１８＞
Ｎ末端−ミトコンドリア外膜アンカリングペプチド−リンカー１−ユビキチンまたはそのフラグメント−標的標的化タンパク質−Ｃ末端
＜構造式１９＞
Ｎ末端−ミトコンドリア外膜アンカリングペプチド−ユビキチンまたはそのフラグメント−リンカー２−標的標的化タンパク質−Ｃ末端
＜構造式２０＞
Ｎ末端−ミトコンドリア外膜アンカリングペプチド−リンカー１−ユビキチンまたはそのフラグメント−リンカー２−標的標的化タンパク質−Ｃ末端
【００７６】
上記構造式１６〜２０において、外膜アンカリングペプチドは、ＴＯＭ２０、ＴＯＭ７０およびＯＭ４５からなる群から選択される任意の１つでありうる。さらに、標的標的化タンパク質、ユビキチンまたはそのフラグメント、およびリンカー１または２は、前記のとおりである。
【００７７】
本発明の一側面は、標的標的化タンパク質を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００７８】
さらに、本発明の一側面は、標的標的化タンパク質を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入されたベクターを提供する。
【００７９】
さらに、本発明の一側面は、標的標的化タンパク質を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入されたベクターが導入された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞でありうる。この場合、好ましくは、真核細胞は、ユビキチンを分解する酵素が取り除かれた株でありうる。
【００８０】
さらに、本発明の一側面は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの真核細胞への導入によって形質転換した細胞から改変ミトコンドリアを調製する方法を提供する。
【実施例】
【００８１】
本発明の理解を助けるために、以下、好ましい実施形態を示す。しかしながら、以下の実施例は、単に本発明の理解を容易にするために示すので、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
Ｉ．ミトコンドリア外膜アンカリングペプチド、リンカー、ユビキチンおよび所望のタンパク質を含む融合タンパク質の調製
実施例１．  ｐ５３を含む融合タンパク質の調製
実施例１．１．  ｐ５３遺伝子の増幅
組換えタンパク質においてヒトｐ５３を発現させるために、ヒト上皮細胞から全ＲＮＡを抽出し、そこからｃＤＮＡを合成した。具体的には、ヒト皮膚線維芽細胞を、５％二酸化炭素および３７℃の条件下に１０％血清培地中で培養した（１×１０６細胞）。その後、培養液を除去し、細胞にＰＢＳバッファー液を加えて２回洗い、ＲＮＡ抽出試薬（Trizol試薬、Thermo Fisher Scientific）０．５ｍｌを直接加えた。ＲＮＡ抽出試薬を加えた混合物を周囲温度で１０分間置き、その後、０．１ｍｌのクロロホルムを加え、１５秒間攪拌した後、約１２０００×ｇで１０分間遠心分離した。次いで、分離された上清を取り、同体積のイソプロピルアルコールを加えて、再び１２０００×ｇで１０分間遠心分離した。その後、液体を除去し、７５％エタノールで１回洗い、ＲＮＡを周囲温度で乾燥した。
【００８２】
ＲＮＡａｓｅを含まない精製蒸留水約５０μｌを加え、分光光度計を用いてＲＮＡの量と純度を測定した。ｃＤＮＡを合成するために、精製された全ＲＮＡ２μｇを、７０℃で５分間のオリゴｄＴとの結合反応に付した。その後、１０×逆転写反応バッファー液、１０ｍＭ ｄＮＴＰ、ＲＮＡｓｅ阻害剤、およびＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Enzynomics, Korea）を加え、ｃＤＮＡ合成反応を４２℃で６０分間行った。その後、逆転写酵素を７２℃に５分間の加熱により失活させ、次いで、ＲＮａｓｅＨを加えて一本鎖ＲＮＡを除去し、それをｐ５３遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として用いた。
【００８３】
ヒト皮膚線維芽細胞からのシグナルペプチド配列が除去されたｐ５３の遺伝子を得るために、アミノ末端グルタミン酸からコードするプライマー（Ｔ２ｐ５３）、およびカルボキシル末端からコードするプライマー（Ｘｐ５３）を合成し、上記のように調製されたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。各プライマーの配列を表１に記載する。
【００８４】
【表１】
2021521819.tif 000003
【００８５】
０．２ｐｍｏｌのＴ２ｐ５３プライマーおよび０．２ｐｍｏｌのＸｐ５３プライマーを、ｄＮＴＰ ０．２ｎＭ、１×AccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー液（Invitrogen, USA）および１単位のAccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと混合した。その後、ポリメラーゼ連鎖反応装置において、９５℃で４０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間の増幅反応を４０サイクル行った。反応後、約１．２ｋｂｐの増幅ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル上の電気泳動によって単離し、次いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてpGEM-T easy（Promega, USA）ベクターに挿入した。そのように得られたＤＮＡのシーケンシングの結果、ヒトｐ５３タンパク質をコードするｃＤＮＡが得られたことが確認された。得られたｐ５３遺伝子はｐＴＡ−ｐ５３と称し、その塩基配列は配列番号３の塩基配列と同じである（図１）。
【００８６】
実施例１．２．  ｐ５３の大腸菌発現ベクターの作製
実施例１．２．１．  プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−ｐ５３の作製
ユビキチンが融合した形態のｐ５３タンパク質を調製するために、下記の発現ベクターを作製した。ユビキチン遺伝子を得るために、ＮｄｅＵＢプライマーおよびＴ２ＵＢプライマーを作製した。各プライマーの配列を表２に示す。
【００８７】
【表２】
2021521819.tif 000004
【００８８】
０．２ｐｍｏｌのＮｄｅＵＢプライマーおよび０．２ｐｍｏｌのＴ２ＵＢプライマーを、ｄＮＴＰ ０．２ｎＭ、１×AccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー液（Invitrogen, USA）および１単位のAccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと混合した。その後、ポリメラーゼ連鎖反応装置において、９５℃で４０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間の増幅反応を２５サイクル行って、ユビキチン（ＵＢ）遺伝子を得た。増幅ユビキチン遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩおよびＳａｃＩＩで切断し、プラスミドｐＴＡ−ｐ５３を制限酵素ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩで切断した。その後、約２１０ｂｐおよび１２００ｂｐのＤＮＡ断片を２％アガロースゲル上の電気泳動によってそれぞれ取得し、次いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＥＴ１５ｂベクターに挿入して、プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−ｐ５３を得た（図２）。この場合、ＵＢ−ｐ５３は、配列番号６の塩基配列で表された。
【００８９】
プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−ｐ５３を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。その後、形質転換株を、抗生物質アンピシリンを添加したLuria-Bertani（ＬＢ）固体培地において培養し、得られたコロニーをＬＢ液体培地中で３７℃の条件下に培養した。ＯＤ６００の吸光度が約０．２の細胞密度に達したら、ＩＰＴＧを、１ｍＭの終濃度となるように加え、その後さらに約４時間の震盪培養を行った。
【００９０】
遠心分離によって大腸菌細胞の部分を取得し、細胞を破壊してＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。図３に示すように、約６０ｋＤａの大きさのユビキチン融合ｐ５３タンパク質が発現されたことが確認された。この場合、図３のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は大腸菌をＩＰＴＧ添加の４時間後に破壊した後に遠心分離した沈殿物を示し、レーン２は大腸菌破壊の後に遠心分離した上清を示す。
【００９１】
実施例１．２．２．  プラスミドｐＥＴ１１ｃ−ＴＯＭ７０−ＵＢ−ｐ５３の作製
ミトコンドリア外膜に結合するＴＯＭ７０およびユビキチンが融合した形態のｐ５３タンパク質を調製するために、ＴＯＭ７０およびユビキチンが融合した形態のｐ５３を発現することのできる発現ベクターを作製した。ＴＯＭ７０およびユビキチン遺伝子を得るために、ＮｄｅＴＯＭ７０プライマー、ＴＯＭ７０−ＡＳプライマー、ＴＯＭ７０ＵＢ−ＳプライマーおよびＴ２ＵＢ−ＡＳプライマーを作製した。各プライマーの配列を表３に示す。
【００９２】
【表３】
2021521819.tif 000005
【００９３】
ＴＯＭ７０遺伝子を得るために、０．２ｐｍｏｌのＮｄｅＴＯＭ７０プライマーおよび０．２ｐｍｏｌのＴＯＭ７０−ＡＳプライマーを、ｄＮＴＰ ０．２ｎＭ、１×AccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー液（Invitrogen, USA）および１単位のAccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと混合した。その後、ポリメラーゼ連鎖反応装置において、９５℃で４０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間の増幅反応を２５サイクル行って、ＴＯＭ７０遺伝子を得た。増幅ＤＮＡ断片はＮ−ＴＯＭ７０と称した。上記実施例１．２．１．で得たプラスミドｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−ｐ５３を鋳型として使用し、０．２ｐｍｏｌのＴＯＭ７０ＵＢ−Ｓプライマーおよび０．２ｐｍｏｌのＴ２ＵＢ−ＡＳプライマーを加え、ｄＮＴＰ ０．２ｎＭ、１×AccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー液（Invitrogen, USA）および１単位のAccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを混合した。その後、ポリメラーゼ連鎖反応装置において、９５℃で４０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間の増幅反応を２５サイクル行って、ＵＢ遺伝子を得た。増幅ＤＮＡ断片はＣ−ＵＢと称した。
【００９４】
増幅されたＤＮＡのＮ−ＴＯＭ７０およびＣ−ＵＢを鋳型として使用し、０．２ｐｍｏｌのＮｄｅＴＯＭ７０プライマー、０．２ｐｍｏｌのＴ２ＵＢ−ＡＳプライマーを、ｄＮＴＰ ０．２ｎＭ、１×AccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー液（Invitrogen, USA）および１単位のAccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと混合した。その後、ポリメラーゼ連鎖反応装置において、９５℃で４０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間の増幅反応を２５サイクル行って、増幅ＴＯＭ７０が融合されたユビキチン遺伝子ＴＯＭ７０−ＵＢを得た。
【００９５】
増幅ＴＯＭ７０−ＵＢ遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩおよびＳａｃＩＩで切断し、プラスミドｐＴＡ−ｐ５３をＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩで切断し、約３３０ｂｐおよび１５００ｂｐのＤＮＡ断片を２％アガロースゲル上の電気泳動によってそれぞれ取得した。次いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、制限酵素ＮｄｅＩおよびＳａｌＩで切断したｐＥＴ１１ｃベクターに挿入して、プラスミドｐＥＴ１１ｃ−ＴＯＭ７０−ＵＢ−ｐ５３を得た（図４）。この場合、ＴＯＭ７０−ＵＢ−ｐ５３は、配列番号１１の塩基配列で表された。
【００９６】
プラスミドｐＥＴ１１ｃ−ＴＯＭ７０−ＵＢ−ｐ５３を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。その後、形質導入株を、抗生物質アンピシリンを添加したLuria-Bertani（ＬＢ）固体培地において培養し、得られたコロニーを、３７℃の震盪インキュベーター内でＬＢ液体培地中で培養した。ＯＤ６００の吸光度が約０．２の細胞密度に達したら、ＩＰＴＧを、１ｍＭの終濃度となるように加え、その後さらに約４時間の震盪培養を行った。
【００９７】
遠心分離によって大腸菌細胞の部分を取得し、細胞を破壊してＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。図５に示すように、ＴＯＭ７０およびユビキチンが融合した形態の約６２ｋＤａの大きさのｐ５３タンパク質が発現されたことが確認された。この場合、レーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は大腸菌をＩＰＴＧ添加の４時間後に破壊した後に遠心分離した上清を示す。
【００９８】
実施例１．２．３．  プラスミドｐＥＴ１１ｃ−ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３の作製
ミトコンドリア外膜に結合するＴＯＭ７０、リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７０））およびユビキチンが融合した形態のｐ５３タンパク質を調製するために、ＴＯＭ７０、リンカーおよびユビキチンが融合した形態のｐ５３タンパク質を発現することのできる発現ベクターを作製した。ＴＯＭ７０に連結したリンカー遺伝子を得るために、ＴＯＭ７０（Ｇ）３−ＡＳプライマー、（Ｇ）３ＵＢ−Ｓプライマー、Ｘｐ５３（ｎｏＴ）プライマーを作製した。各プライマーの配列を表４に示す。
【００９９】
【表４】
2021521819.tif 000006
【０１００】
上記実施例１．２．２．で得たプラスミドｐＥＴ１１ｃ−ＴＯＭ７０−ＵＢ−ｐ５３を鋳型として使用し、０．２ｐｍｏｌのＮｄｅＴＯＭ７０プライマーおよび０．２ｐｍｏｌのＴＯＭ７０（Ｇ）３−ＡＳプライマーを加え、ｄＮＴＰ ０．２ｎＭ、１×AccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー液（Invitrogen, USA）および１単位のAccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを混合した。その後、ポリメラーゼ連鎖反応装置において、９５℃で４０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間の増幅反応を２５サイクル行って、遺伝子ＴＯＭ７０およびリンカーが連結した遺伝子ＴＯＭ７０−Ｇ３を得た。さらに、上記実施例１．２．１．で得たプラスミドｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−ｐ５３を鋳型として使用し、０．２ｐｍｏｌの（Ｇ）３ＵＢ−Ｓプライマーおよび０．２ｐｍｏｌのＸｐ５３（ｎｏＴ）プライマーを、ｄＮＴＰ ０．２ｎＭ、１×AccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー液（Invitrogen, USA）および１単位のAccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと混合した。
【０１０１】
その後、ポリメラーゼ連鎖反応装置において、９５℃で４０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間の増幅反応を２５サイクル行って、ｐ５３がユビキチン遺伝子と融合されたＵＢ−ｐ５３を得た。増殖ＴＯＭ７０−Ｇ３遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、増幅ＵＢ−ｐ５３遺伝子を制限ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断し、１００ｂｐおよび１５００ｂｐのＤＮＡ断片を２％アガロースゲル上の電気泳動によってそれぞれ取得した。次いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、制限酵素ＮｄｅＩおよびＳａｌＩで切断したｐＥＴ１１ｃベクターに挿入して、プラスミドｐＥＴ１１ｃ−ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３を得た（図６）。この場合、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３は、配列番号１５の塩基配列で表された。
【０１０２】
プラスミドｐＥＴ１１ｃ−ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。次いで、形質転換株を、抗生物質アンピシリンを添加したLuria-Bertani（ＬＢ）固体培地において培養し、得られたコロニーを、３７℃の条件下にＬＢ液体培地中で培養した。ＯＤ６００の吸光度が約０．２の細胞密度に達したら、ＩＰＴＧを、１ｍＭの終濃度となるように加え、その後さらに約４時間の震盪培養を行った。
【０１０３】
遠心分離によって大腸菌細胞の部分を取得し、細胞を破壊してＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。図７に示すように、ＴＯＭ７０、リンカーおよびユビキチンが融合した形態の約６２ｋＤａの大きさのｐ５３タンパク質が発現されたことが確認された。この場合、レーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は大腸菌をＩＰＴＧ添加の４時間後に破壊した後に遠心分離した沈殿物を示し、レーン２は大腸菌破壊の後に遠心分離した上清を示す。
【０１０４】
実施例１．２．４．  プラスミドｐＥＴ１１ｃ−ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ｐ５３の作製
ミトコンドリア外膜に結合するＴＯＭ７０、およびリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７０））が融合した形態のｐ５３タンパク質を調製するために、ＴＯＭ７０およびリンカーが融合した形態のｐ５３を発現することのできる発現ベクターを作製した。ＴＯＭ７０およびリンカーが融合したｐ５３遺伝子を得るために、プライマー（Ｂ（Ｇ）３ｐ５３）を作製した。プライマーの配列を表５に示す。
【０１０５】
【表５】
2021521819.tif 000007
【０１０６】
上記実施例１．２．２．で得たプラスミドｐＥＴ１１ｃ−ＴＯＭ７０−ＵＢ−ｐ５３を鋳型として使用し、０．２ｐｍｏｌのＮｄｅＴＯＭ７０プライマーおよび０．２ｐｍｏｌのＴＯＭ７０（Ｇ）３−ＡＳプライマーを加え、ｄＮＴＰ ０．２ｎＭ、１×AccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー液（Invitrogen, USA）および１単位のAccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを混合した。その後、ポリメラーゼ連鎖反応装置において、９５℃で４０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間の増幅反応を２５サイクル行って、ＴＯＭ７０遺伝子を得た。増幅ＤＮＡ断片は、ＴＯＭ７０−Ｇ３と称した。
【０１０７】
上記実施例１．２．１．で得たプラスミドｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−ｐ５３を鋳型として使用し、０．２ｐｍｏｌのＢ（Ｇ）３ｐ５３プライマーおよび０．２ｐｍｏｌのＸｐ５３（ｎｏＴ）プライマーを、ｄＮＴＰ ０．２ｎＭ、１×AccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー液（Invitrogen, USA）および１単位のAccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと混合した。その後、ポリメラーゼ連鎖反応装置において、９５℃で４０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間の増幅反応を２５サイクル行った。増幅ＤＮＡ断片は、Ｇ３−ｐ５３と称した。
【０１０８】
増幅ＤＮＡ断片ＴＯＭ７０−Ｇ３をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ＤＮＡ断片Ｇ３−５３を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断した。次いで、約１５０ｂｐおよび１３００ｂｐのＤＮＡ断片を２％アガロースゲル上の電気泳動によってそれぞれ取得し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、制限酵素ＮｄｅＩおよびＳａｌＩで切断したｐＥＴ１１ｃベクターに挿入して、プラスミドｐＥＴ１１ｃ−ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ｐ５３を得た（図８）。この場合、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧ）３−ｐ５３は、配列番号１７の塩基配列で表された。
【０１０９】
プラスミドｐＥＴ１１ｃ−ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ｐ５３を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。次いで、形質転換株を、抗生物質アンピシリンを添加したLuria-Bertani（ＬＢ）固体培地において培養し、得られたコロニーを、３７℃の震盪インキュベーター内でＬＢ液体培地中で培養した。ＯＤ６００の吸光度が約０．２の細胞密度に達したら、ＩＰＴＧを、１ｍＭの終濃度となるように加え、その後さらに約４時間の震盪培養を行った。
【０１１０】
遠心分離によって大腸菌細胞の部分を取得し、細胞を破壊してＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。図９に示すように、ＴＯＭ７０が融合した形態の約６０ｋＤａの大きさのｐ５３タンパク質が発現されたことが確認された。この場合、レーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は大腸菌をＩＰＴＧ添加の４時間後に破壊した後に遠心分離した沈殿物を示し、レーン２は大腸菌破壊の後に遠心分離した上清を示す。
【０１１１】
実施例１．２．５．  ｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−ｐ５３−ＴＯＭ７
ユビキチン、およびミトコンドリア外膜に結合するＴＯＭ７０が融合した形態のｐ５３タンパク質を調製するために、ユビキチン、ｐ５３およびＴＯＭがこの順序で融合した形態のｐ５３を発現することのできる発現ベクターを作製した。ＴＯＭ７０およびユビキチンが融合したｐ５３遺伝子を得るために、Ｘｐ５３（ｎｏＴ）プライマー、ＸＴＯＭ７プライマー、およびＬＴＯＭ７プライマーを作製した。各プライマーの配列を表６に示す。
【０１１２】
【表６】
2021521819.tif 000008
【０１１３】
上記実施例１．２．１．で得たプラスミドｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−ｐ５３を鋳型として使用し、０．２ｐｍｏｌのＮｄｅＵＢプライマーおよび０．２ｐｍｏｌのＸｐ５３（ｎｏＴ）プライマーを加え、ｄＮＴＰ ０．２ｎＭ、１×AccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー液（Invitrogen, USA）および１単位のAccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを混合した。その後、ポリメラーゼ連鎖反応装置において、９５℃で４０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間の増幅反応を２５サイクル行って、ＵＢ−ｐ５３遺伝子を得た。さらに、前記のように作製したｃＤＮＡを鋳型として使用し、０．２ｐｍｏｌのＸＴＯＭ７プライマーおよび０．２ｐｍｏｌのＬＴＯＭ７プライマーを、ｄＮＴＰ ０．２ｎＭ、１×AccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー液（Invitrogen, USA）および１単位のAccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと混合した。
【０１１４】
その後、ポリメラーゼ連鎖反応装置において、９５℃で４０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間の増幅反応を４０サイクル行って、ＴＯＭ７遺伝子を得た。増幅ＤＮＡ断片ＵＢ−ｐ５３を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断し、増幅ＴＯＭ７遺伝子を制限酵素ＸｈｏＩおよびＳａｌＩで切断した。約１５００ｂｐおよび１５０ｂｐのＤＮＡ断片を２％アガロースゲル上の電気泳動によってそれぞれ取得し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＥＴ１５ｂベクターに挿入して、プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−ｐ５３−ＴＯＭ７を得た（図１０）。この場合、ＵＢ−ｐ５３−ＴＯＭ７は、配列番号２１の塩基配列で表された。
【０１１５】
プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−ｐ５３−ＴＯＭ７を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。次いで、形質転換株を、抗生物質アンピシリンを添加したLuria-Bertani（ＬＢ）固体培地において培養し、得られたコロニーを、３７℃の条件下にＬＢ液体培地中で培養した。ＯＤ６００の吸光度が約０．２の細胞密度に達したら、ＩＰＴＧを、０．５ｍＭの終濃度となるように加え、その後さらに約４時間の震盪培養を行った。
【０１１６】
遠心分離によって大腸菌細胞の部分を取得し、細胞を破壊してＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。図１１に示すように、ユビキチンおよびＴＯＭ７が融合した形態の約６０ｋＤａの大きさのｐ５３タンパク質が発現されたことが確認された。この場合、レーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は大腸菌をＩＰＴＧ添加の４時間後に破壊した後に遠心分離した沈殿物を示し、レーン２は大腸菌破壊の後に遠心分離した上清を示す。
【０１１７】
実施例１．２．６．  哺乳動物発現ベクターｐＣＭＶ−ｐ５３−ｍｙｃ／Ｈｉｓの作製
ｐ５３を発現することのできる動物細胞用発現ベクターを作製した。ｐ５３遺伝子を得るために、Ｒｐ５３プライマーを作製した。プライマーの配列を表７に示す。
【０１１８】
【表７】
2021521819.tif 000009
【０１１９】
上記実施例１．２．１．で得たプラスミドｐＥＴ−ＵＢ−ｐ５３を鋳型として使用し、０．２ｐｍｏｌのＲｐ５３プライマーおよび０．２ｐｍｏｌのＸｐ５３（ｎｏＴ）プライマーを、ｄＮＴＰ ０．２ｎＭ、１×AccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー液（Invitrogen, USA）および１単位のAccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと混合した。その後、ポリメラーゼ連鎖反応装置において、９５℃で４０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間の増幅反応を２５サイクル行って、ｐ５３遺伝子を得た。
【０１２０】
増幅ｐ５３遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断し、約１３００ｂｐのＤＮＡ断片を２％アガロースゲル上の電気泳動によって取得し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断したｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／Ｈｉｓ Ａベクターに挿入して、プラスミドｐＣＭＶ−ｐ５３−ｍｙｃ／Ｈｉｓを得た（図１２）。この場合、ｐ５３−ｍｙｃ／Ｈｉｓは、配列番号２３の塩基配列で表された。
【０１２１】
プラスミドｐＣＭＶ−ｐ５３−ｍｙｃ／Ｈｉｓを用いて、動物細胞ＣＨＯを形質転換し、細胞を破壊し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行い、抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いるウエスタンブロットによる検出を行った。図１３に示すように、約５５ｋＤａの大きさのｐ５３タンパク質が発現されたことが確認された。この場合、レーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は、動物細胞ＣＨＯへのトランスフェクションが行われ、細胞が破壊され、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動が行われ、抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いるウエスタンブロットによる確認が行われたことを示す。
【０１２２】
実施例１．３．  ｐ５３を含む融合タンパク質の単離および精製
実施例１．３．１．  大腸菌から誘導された組換えＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ｐ５３タンパク質の単離および精製
組換えＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ｐ５３タンパク質を発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の産生株をＬＢ液体培地に播種し、３７℃の条件下に培養した。ＯＤ６００の吸光度が０．４に達したら、０．５ｍＭのＩＰＴＧを加え、さらに４時間の震盪培養を行って、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ｐ５３タンパク質を発現させた。
【０１２３】
培養終了後、細胞を遠心分離によって回収し、回収細胞をＰＢＳで１回洗った後、ＰＢＳ溶液を用いて懸濁させ、懸濁細胞を超音波破砕装置を用いる破壊プロセスに付した。破壊細胞を高速遠心分離器を用いて遠心分離し、不溶性画分を回収し、回収不溶性画分を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ｐＨ８．０溶液を用いて３回洗った。その後、６Ｍグアニジン、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０溶液に溶解し、０．４５μｍフィルターを用いて濾過し、予め充填したニッケルクロマトグラフィーカラムにロードして、一次精製を行った。
【０１２４】
ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ｐ５３タンパク質を含む溶液をロードし、次いで、未結合の不純物が検出されなくなるまで、８Ｍ尿素、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾールのｐＨ８．０溶液を用いる洗浄液を流し、８Ｍ尿素、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾールのｐＨ８．０溶液を、イミダゾール濃度を５０ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭに変えて使用して、タンパク質を溶出させた（図１４）。この場合、図１４のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１はニッケルアフィニティークロマトグラフィーのローディングサンプルを示す。レーン２はニッケルアフィニティー樹脂に結合しなかったものを示す。レーン３〜４は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／５０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン５〜７は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／１００ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン８〜９は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／２５０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン１０〜１１は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／５００ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。
【０１２５】
ニッケルクロマトグラフィーから回収した溶出液を、浸透圧の原理を利用するＰＢＳとの溶液交換に付した。溶液交換の終了後、溶出液を遠心分離して上清を回収し、回収溶出液のタンパク質量をタンパク質定量法によって測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。図１５に示すように、確認が終わったら、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ｐ５３タンパク質を液体窒素で冷却し、−８０℃の極低温冷凍庫内で保管した。この場合、レーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は、ＰＢＳバッファー液での透析によって得たＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ｐ５３タンパク質を示す。
【０１２６】
実施例１．３．２．  大腸菌から誘導された組換えＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３タンパク質の単離および精製
ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３組換えタンパク質を発現する大腸菌を用いて、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３タンパク質を、実施例１．３．１と同じ方法で単離し精製した。結果として、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３タンパク質を溶出させた（図１６）。この場合、図１６のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１はニッケルアフィニティークロマトグラフィーのローディングサンプルを示す。レーン２はニッケルアフィニティー樹脂に結合しなかったものを示す。レーン３は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／５０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン４〜７は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／１００ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン８〜１１は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／２５０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。
【０１２７】
回収溶出液のタンパク質量をタンパク質定量法によって測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。図１７に示すように、確認が終わったら、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３タンパク質を液体窒素で冷却し、−８０℃の極低温冷凍庫内で保管した。この場合、図１７のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は、ＰＢＳバッファー液での透析によって得たＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３タンパク質を示す。
【０１２８】
実施例１．３．３．  大腸菌から誘導された組換えＵＢ−ｐ５３タンパク質の単離および精製
ユビキチンが融合した成熟型のＵＢ−ｐ５３タンパク質を発現するＢＬ２１（ＤＥ３）の産生株をＬＢ液体培地に播種し、３７℃の震盪インキュベーター内で培養した。ＯＤ６００の吸光度が０．４の達したら、０．５ｍＭのＩＰＴＧを加え、さらに４時間の震盪培養を行って、ユビキチンが融合した成熟型のＵＢ−ｐ５３タンパク質タンパク質を発現させた。
【０１２９】
その後、ＵＢ−ｐ５３タンパク質を、実施例１．３．１と同じ方法で単離し精製した。結果として、ＵＢ−ｐ５３タンパク質を溶出させた（図１８）。この場合、図１８のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１はニッケルアフィニティークロマトグラフィーのローディングサンプルを示す。レーン２はニッケルアフィニティー樹脂に結合しなかったものを示す。レーン３は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／５０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン４〜６は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／１００ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン７〜９は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／２５０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン１０〜１１は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／５００ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。
【０１３０】
回収溶出液のタンパク質量をタンパク質定量法によって測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。図１９に示すように、確認が終わったら、ＵＢ−ｐ５３タンパク質を液体窒素で冷却し、−８０℃の極低温冷凍庫内で保管した。この場合、図１９のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は、ＰＢＳバッファー液での透析によって得たＵＢ−ｐ５３タンパク質を示す。
【０１３１】
実施例１．３．４．  大腸菌から誘導された組換えＵＢ−ｐ５３−ＴＯＭ７タンパク質の単離および精製
ユビキチンが融合した成熟型のＵＢ−ｐ５３−ＴＯＭ７タンパク質を発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の産生株をＬＢ液体培地に接種し、３７℃の条件下に培養した。ＯＤ６００の吸光度が０．４の達したら、０．５ｍＭのＩＰＴＧを加え、さらに４時間の震盪培養を行って、ユビキチンが融合した成熟形態のＵＢ−ｐ５３−ＴＯＭ７タンパク質を発現させた。
【０１３２】
その後、ＵＢ−ｐ５３−ＴＯＭ７タンパク質を、実施例１．３．１と同じ方法で単離し精製した。結果として、ＵＢ−ｐ５３−ＴＯＭ７タンパク質を溶出させた（図２０）。この場合、図２０のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１はニッケルアフィニティークロマトグラフィーのローディングサンプルを示す。レーン２はニッケルアフィニティー樹脂に結合しなかったものを示す。レーン３は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン４は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／５０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン５〜７は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／１００ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン８〜９は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／２５０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン１０〜１１は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／５００ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。
【０１３３】
回収溶出液のタンパク質量をタンパク質定量法によって測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。図２１に示すように、確認が終わったら、ＵＢ−ｐ５３タンパク質を液体窒素で冷却し、−８０℃の極低温冷凍庫内で保管した。この場合、図２１のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は、ＰＢＳバッファー液での透析によって得たＵＢ−ｐ５３−ＴＯＭ７タンパク質を示す。
【０１３４】
実施例２．  グランザイムＢを含む融合タンパク質の調製
実施例２．１．  グランザイムＢ遺伝子の増幅
組換えタンパク質においてヒトグランザイムＢを発現させるために、ヒトナチュラルキラー細胞から全ＲＮＡを抽出し、そこからｃＤＮＡを合成した。具体的には、ヒトナチュラルキラー細胞を、５％二酸化炭素および３７℃の条件下に１０％血清培地中で培養した（１×１０６細胞）。その後、ＲＮＡを、実施例１．１．と同じ方法で取得し、それをグランザイムＢ遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として用いた。
【０１３５】
ヒトナチュラルキラー細胞からのシグナルペプチド配列が除去されたグランザイムＢの遺伝子を得るために、アミノ末端イソロイシンからコードするＴ２ＧＺＭＢプライマー、およびカルボキシル末端からコードするＸＧＺＭＢ（ｎｏＴ）プライマーを合成し、上記のように調製されたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。各プライマーの配列を表８に記載する。
【０１３６】
【表８】
2021521819.tif 000010
【０１３７】
上記のように合成したｃＤＮＡを鋳型として使用し、０．２ｐｍｏｌのＴ２ＧＺＭＢプライマーおよび０．２ｐｍｏｌのＸＧＺＭＢ（ｎｏＴ）プライマーを、ｄＮＴＰ ０．２ｎＭ、１×AccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー液（Invitrogen, USA）および１単位のAccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと混合した。その後、ポリメラーゼ連鎖反応装置において、９５℃で４０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間の増幅反応を４０サイクル行った。反応後、約７００ｂｐの増幅ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル上の電気泳動によって単離し、次いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてpGEM-T easy（Promega, USA）ベクターに挿入した。そのように得られたＤＮＡのシーケンシングの結果、ヒトグランザイムＢタンパク質をコードするｃＤＮＡが得られたことが確認された。得られたグランザイムＢ遺伝子はｐＴＡ−グランザイムＢと称し、グランザイムＢ遺伝子は配列番号２６の塩基配列で表された（図２２）。
【０１３８】
実施例２．２．  グランザイムＢタンパク質の大腸菌発現ベクターの作製
実施例２．２．１．  プラスミドｐＥＴ１１ｃ−ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−グランザイムＢの作製
ミトコンドリア外膜に結合するＴＯＭ７０、リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）およびユビキチンが融合した形態のグランザイムＢタンパク質を調製するために、ＴＯＭ７０、リンカーおよびユビキチンが融合した形態のグランザイムＢタンパク質を発現することのできる発現ベクターを作製した。
【０１３９】
上記実施例２．１．で得たプラスミドｐＴＡ−グランザイムＢ遺伝子を制限酵素ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩで切断し、約７００ｂｐのＤＮＡ断片を２％アガロースゲル上の電気泳動によって取得した。次いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、制限酵素ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＥＴ１１ｃ−ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−（ｐ５３）ベクターに挿入して、プラスミドｐＥＴ１１ｃ−ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−グランザイムＢ（配列番号２７）を得た（図２３）。
【０１４０】
プラスミドｐＥＴ１１ｃ−ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−グランザイムＢを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。次いで、形質転換株を、抗生物質アンピシリンを添加したLuria-Bertani（ＬＢ）固体培地において培養し、得られたコロニーを、３７℃の震盪インキュベーター内でＬＢ液体培地中で培養した。ＯＤ６００の吸光度が約０．２の細胞密度に達したら、ＩＰＴＧを、１ｍＭの終濃度となるように加え、その後さらに約４時間の震盪培養を行った。
【０１４１】
遠心分離によって大腸菌細胞の部分を取得し、細胞を破壊してＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。図２４に示すように、ＴＯＭ７０、リンカーおよびユビキチンが融合した形態の約３５ｋＤａの大きさのグランザイムＢタンパク質が発現されたことが確認された。この場合、図２４のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は大腸菌をＩＰＴＧ添加の４時間後に破壊した後に遠心分離した沈殿物を示し、レーン２は大腸菌破壊の後に遠心分離した上清を示す。
【０１４２】
実施例２．２．２．  プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−グランザイムＢ−ＴＯＭ７の作製
ユビキチン、およびミトコンドリア外膜に結合するＴＯＭ７が融合した形態のグランザイムＢタンパク質を調製するために、ユビキチン、グランザイムＢおよびＴＯＭがこの順序で融合した形態のグランザイムＢタンパク質を発現することのできる発現ベクターを作製した。
【０１４３】
上記実施例２．１．で得たプラスミドｐＴＡ−グランザイムＢ遺伝子を制限酵素ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩで切断し、約７００ｂｐのＤＮＡ断片を２％アガロースゲル上の電気泳動によって取得した。それを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、制限酵素ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−（ｐ５３）−ＴＯＭ７ベクターに挿入して、プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−グランザイムＢ−ＴＯＭ７を得た（図２５）。ここで、ＵＢ−グランザイムＢ−ＴＯＭ７は、配列番号２８の塩基配列で表された。
【０１４４】
プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−グランザイムＢ−ＴＯＭ７を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。次いで、形質転換株を、抗生物質アンピシリンを添加したLuria-Bertani（ＬＢ）固体培地において培養し、得られたコロニーを、３７℃の条件下にＬＢ液体培地中で培養した。ＯＤ６００の吸光度が約０．２の細胞密度に達したら、ＩＰＴＧを、０．５ｍＭの終濃度となるように加え、その後さらに約４時間の震盪培養を行った。
【０１４５】
遠心分離によって大腸菌細胞の部分を取得し、細胞を破壊してＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。図２６に示すように、ユビキチンおよびＴＯＭ７が融合した形態の約３５ｋＤａの大きさのグランザイムＢタンパク質が発現されたことが確認された。この場合、図２６のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は大腸菌をＩＰＴＧ添加の４時間後に破壊した後に遠心分離した沈殿物を示し、レーン２は大腸菌破壊の後に遠心分離した上清を示す。
【０１４６】
実施例２．３．  大腸菌から誘導された組換えＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−グランザイムＢタンパク質の単離および精製
ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−グランザイムＢタンパク質を、実施例１．３．１．と同じ方法で単離および精製した。結果として、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−グランザイムＢタンパク質を溶出させた（図２７）。この場合、図２７のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１はニッケルアフィニティークロマトグラフィーのローディングサンプルを示す。レーン２はニッケルアフィニティー樹脂に結合しなかったものを示す。レーン３および４は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／５０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン５〜７は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／１００ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン８〜９は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／２５０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。
【０１４７】
回収溶出液のタンパク質量をタンパク質定量法によって測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。図２８に示すように、確認が終わったら、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−グランザイムＢタンパク質を液体窒素で冷却し、−８０℃の極低温冷凍庫内で保管した。この場合、図２８のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は、ＰＢＳバッファー液での透析によって得たＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−グランザイムＢタンパク質を示す。
【０１４８】
実施例３．  ＲＫＩＰを含む融合タンパク質の調製
実施例３．１．  ＲＫＩＰ遺伝子の増幅
組換えタンパク質においてヒトＲＫＩＰ（Ｒａｆキナーゼ阻害タンパク質）遺伝子を発現させるために、ヒト上皮細胞から全ＲＮＡを抽出し、そこからｃＤＮＡを合成した。ヒト上皮線維芽細胞を、５％二酸化炭素および３７℃の条件下に１０％血清培地中で培養した（１×１０６細胞）。その後、ＲＮＡを、実施例１．１．と同じ方法で取得し、それをＲＫＩＰ遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として用いた。
【０１４９】
ヒト皮膚線維芽細胞からのシグナルペプチド配列が除去されたＲＫＩＰの遺伝子を得るために、アミノ末端プロリンからコードするＴ２ＲＫＩＰプライマー、およびカルボキシル末端からコードするＸＲＫＩＰ（ｎｏＴ）プライマーを合成し、上記のように調製されたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。各プライマーの配列を表９に記載する。
【０１５０】
【表９】
2021521819.tif 000011
【０１５１】
上記のように合成したｃＤＮＡを鋳型として使用し、０．２ｐｍｏｌのＴ２ＲＫＩＰプライマーおよび０．２ｐｍｏｌのＸＲＫＩＰ（ｎｏＴ）プライマーを、ｄＮＴＰ ０．２ｎＭ、１×AccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー液（Invitrogen, USA）および１単位のAccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと混合した。その後、ポリメラーゼ連鎖反応装置において、９５℃で４０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間の増幅反応を４０サイクル行った。反応後、約５６０ｂｐの増幅ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル上の電気泳動によって単離し、次いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてpGEM-T easy（Promega, USA）ベクターに挿入した。そのように得られたＤＮＡのシーケンシングの結果、ヒトＲＫＩＰタンパク質をコードするｃＤＮＡが得られたことが確認された。得られたＲＫＩＰ遺伝子はｐＴＡ−ＲＫＩＰと称し（図２９）、ＲＫＩＰ遺伝子の塩基配列は配列番号３１の塩基配列で表された。
【０１５２】
実施例３．２．  ＲＫＩＰタンパク質の大腸菌発現ベクターの作製
実施例３．２．１．  プラスミドｐＥＴ１１ｃ−ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＲＫＩＰの作製
ミトコンドリア外膜に結合するＴＯＭ７０、リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）およびユビキチンが融合した形態のＲＫＩＰタンパク質を調製するために、ＴＯＭ７０、リンカーおよびユビキチンが融合した形態のＲＫＩＰを発現することのできる発現ベクターを作製した。
【０１５３】
上記実施例３．１．で得たプラスミドｐＴＡ−ＲＫＩＰを制限酵素ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩで切断し、約５６０ｂｐのＤＮＡ断片を２％アガロースゲル上の電気泳動によって取得し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、制限酵素ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＥＴ１１ｃ−ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−（ｐ５３）ベクターに挿入して、プラスミドｐＥＴ１１ｃ−ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＲＫＩＰを得た（図３０）。ここで、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＲＫＩＰは配列番号３２の塩基配列で表された。
【０１５４】
プラスミドｐＥＴ１１ｃ−ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＲＫＩＰを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。次いで、形質転換株を、抗生物質アンピシリンを添加したLuria-Bertani（ＬＢ）固体培地において培養し、得られたコロニーを、３７℃の震盪インキュベーター内でＬＢ液体培地中で培養した。ＯＤ６００の吸光度が約０．２の細胞密度に達したら、ＩＰＴＧを、０．５ｍＭの終濃度となるように加え、その後さらに約４時間の震盪培養を行った。
【０１５５】
遠心分離によって大腸菌細胞の部分を取得し、細胞を破壊してＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。図３１に示すように、ＴＯＭ７０、リンカーおよびユビキチンが融合した形態の約３３ｋＤａの大きさのＲＫＩＰタンパク質が発現されたことが確認された。この場合、図３１のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は大腸菌をＩＰＴＧ添加の４時間後に破壊した後に遠心分離した沈殿物を示し、レーン２は大腸菌破壊の後に遠心分離した上清を示す。
【０１５６】
実施例３．３．  大腸菌から誘導された組換えＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＲＫＩＰタンパク質の単離および精製
組換えＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＲＫＩＰを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の産生株をＬＢ液体培地に播種し、３７℃の条件下に培養した。ＯＤ６００の吸光度が０．３に達したら、それを冷蔵庫に入れて培養液の温度を下げ、インキュベーターの温度を１８℃に変更し、その後、０．５ｍＭのＩＰＴＧを加え、さらに１日間の震盪培養を行って、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＲＫＩＰタンパク質を発現させた。
【０１５７】
その後、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＲＫＩＰタンパク質を、実施例１．３．１．と同じ方法で単離および精製した。結果として、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＲＫＩＰタンパク質を溶出させた（図３２）。この場合、図３２のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１はニッケルアフィニティークロマトグラフィーのローディングサンプルを示す。レーン２はニッケルアフィニティー樹脂に結合しなかったものを示す。レーン３は、５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン４〜６は、５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／５０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン７〜８は、５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／１００ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン９〜１０は、５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／１７５ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン１１〜１３は、５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／２５０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン１４〜１６は、５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／５００ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。
【０１５８】
回収溶出液のタンパク質量をタンパク質定量法によって測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。図３３に示すように、確認が終わったら、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＲＫＩＰタンパク質を液体窒素で冷却し、−８０℃の極低温冷凍庫内で保管した。この場合、図３３のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は、ＰＢＳバッファー液での透析によって得たＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＲＫＩＰタンパク質を示す。
【０１５９】
実施例４．  ＰＴＥＮを含む融合タンパク質の調製
実施例４．１．  ＰＴＥＮ遺伝子の増幅
組換えタンパク質においてヒトＰＴＥＮ（ホスファターゼテンシンホモログ）を発現させるために、ヒト上皮細胞から全ＲＮＡを抽出し、そこからｃＤＮＡを合成した。線維芽細胞（ヒト皮膚線維芽細胞）を、５％二酸化炭素および３７℃の条件下に１０％血清培地中で培養した（１×１０６細胞）。その後、ＲＮＡを、実施例１．１．と同じ方法で取得し、それをＰＴＥＮ遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として用いた。
【０１６０】
ヒト皮膚線維芽細胞からのシグナルペプチド配列が除去されたＰＴＥＮの遺伝子を得るために、アミノ末端スレオニンからコードするＴ２ＰＴＥＮプライマー、およびカルボキシル末端からコードするＸＰＴＥＮ（ｎｏＴ）プライマーを合成し、上記のように調製されたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。各プライマーの配列を表１０に記載する。
【０１６１】
【表１０】
2021521819.tif 000012
【０１６２】
上記のように作製したｃＤＮＡを鋳型として使用し、０．２ｐｍｏｌのＴ２ＰＴＥＮプライマーおよび０．２ｐｍｏｌのＸＰＴＥＮ（ｎｏＴ）プライマーを、ｄＮＴＰ ０．２ｎＭ、１×AccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー液（Invitrogen, USA）および１単位のAccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと混合した。その後、ポリメラーゼ連鎖反応装置において、９５℃で４０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間の増幅反応を４０サイクル行った。反応後、約１２００ｂｐの増幅ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル上の電気泳動によって単離し、次いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてpGEM-T easy（Promega, USA）ベクターに挿入した。そのように得られたＤＮＡのシーケンシングの結果、ヒトＲＫＩＰタンパク質をコードするｃＤＮＡが得られたことが確認された。得られたＰＴＥＮ遺伝子はｐＴＡ−ＰＴＥＮと称し（図３４）、ＰＴＥＮの塩基配列は配列番号３５の塩基配列で表された。
【０１６３】
実施例４．２．  ＰＴＥＮタンパク質の大腸菌発現ベクターの作製
実施例４．２．１．  プラスミドｐＥＴ１１ｃ−ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＰＴＥＮの作製
ミトコンドリア外膜に結合するＴＯＭ７０、リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）およびユビキチンが融合した形態のＰＴＥＮタンパク質を調製するために、ＴＯＭ７０、リンカーおよびユビキチンが融合した形態のＰＴＥＮ遺伝子を発現することのできる発現ベクターを作製した。
【０１６４】
上記実施例４．１．で得たプラスミドｐＴＡ−ＰＴＥＮ遺伝子を制限酵素ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩで切断し、約１２００ｂｐのＤＮＡ断片を２％アガロースゲル上の電気泳動によって取得した。次いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、制限酵素ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＥＴ１１ｃ−ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−（ｐ５３）ベクターに挿入して、プラスミドｐＥＴ１１ｃ−ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＰＴＥＮを得た（図３５）。ここで、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＰＴＥＮは配列番号３６の塩基配列で表された。
【０１６５】
プラスミドｐＥＴ１１ｃ−ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＰＴＥＮを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。次いで、形質転換株を、抗生物質アンピシリンを添加したLuria-Bertani（ＬＢ）固体培地において培養し、得られたコロニーを、３７℃の条件下にＬＢ液体培地中で培養した。ＯＤ６００の吸光度が約０．２の細胞密度に達したら、ＩＰＴＧを、０．５ｍＭの終濃度となるように加え、その後さらに約４時間の震盪培養を行った。
【０１６６】
遠心分離によって大腸菌細胞の部分を取得し、細胞を破壊してＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。図３６に示すように、ＴＯＭ７０、リンカーおよびユビキチンが融合した形態の約７３ｋＤａの大きさのＲＫＩＰタンパク質が発現されたことが確認された。この場合、図３６のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は大腸菌をＩＰＴＧ添加の４時間後に破壊した後に遠心分離した沈殿物を示し、レーン２は大腸菌破壊の後に遠心分離した上清を示す。
【０１６７】
実施例４．３．  大腸菌から誘導された組換えＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＰＴＥＮタンパク質の単離および精製
組換えＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＰＴＥＮタンパク質を、実施例１．３．１．と同じ方法で単離および精製した。結果として、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＰＴＥＮタンパク質を溶出させた（図３７）。この場合、図３７のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１はニッケルアフィニティークロマトグラフィーのローディングサンプルを示す。レーン２はニッケルアフィニティー樹脂に結合しなかったものを示す。レーン３は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン４は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／５０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン５〜８は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／１００ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン９〜１０は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／２５０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン１１１は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／５００ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。
【０１６８】
回収溶出液のタンパク質量をタンパク質定量法によって測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。図３８に示すように、確認が終わったら、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＰＴＥＮタンパク質を液体窒素で冷却し、−８０℃の極低温冷凍庫内で保管した。この場合、図３８のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は、ＰＢＳバッファー液で透析して得たＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＰＴＥＮタンパク質を示す。
【０１６９】
実施例５．  ミトコンドリア外膜タンパク質、ユビキチンおよびＧＦＰを含む融合タンパク質の調製
実施例５．１．  大腸菌から誘導された組換えＵＢ−ＧＦＰ−ＴＯＭ７タンパク質の単離および精製
ユビキチンが融合した成熟型のＵＢ−ＧＦＰ−ＴＯＭ７タンパク質を発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の産生株をＬＢ液体培地に播種し、３７℃の条件下に培養した。ＯＤ６００の吸光度が０．３に達したら、それを冷蔵庫に入れて培養液の温度を下げ、インキュベーターの温度を１８℃に変更し、その後、０．５ｍＭのＩＰＴＧを加え、さらに１日間の震盪培養を行って、ユビキチンが融合した成熟型のＧＦＰ−ＴＯＭ７タンパク質を発現させた。
【０１７０】
培養終了後、細胞を遠心分離によって回収し、回収細胞をＰＢＳで１回洗った後、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０溶液を用いて懸濁させ、懸濁細胞を超音波破砕装置を用いる破壊プロセスに付した。破壊細胞を高速遠心分離器を用いて遠心分離し、上清を回収し、回収上清を０．４５μｍフィルターを用いて濾過し、予め充填したニッケルクロマトグラフィーカラムにロードして、一次精製を行った。
【０１７１】
ユビキチンが融合した成熟型のＵＢ−ＧＦＰ−ＴＯＭ７タンパク質を含む破壊溶液をロードし、次いで、未結合の不純物が検出されなくなるまで、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールのｐＨ８．０溶液を用いる洗浄液を流し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾールのｐＨ８．０溶液を使用する濃度勾配によってタンパク質を溶出させた（図３９）。この場合、図３９のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１はニッケルアフィニティークロマトグラフィーのローディングサンプルを示す。レーン２はニッケルアフィニティー樹脂に結合しなかったものを示す。レーン３は、５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン４は、５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／５５ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン５は、５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／６０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン６は、５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／６５ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン７は、５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／７０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン８は、５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／７５ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン９は、５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／８０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン１０は、５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／８５ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン１１は、５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／９０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン１２は、５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／９５ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン１３は、５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／１００ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン１４は、５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／１０５ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。
【０１７２】
溶出液中のイミダゾールを除去するために、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０溶液中で浸透圧の原理を利用して透析を行った（図４０）。確認された最終的なＵＢ−ＧＦＰ−ＴＯＭ７タンパク質を液体窒素で冷却し、−８０℃の極低温冷凍庫内で保管した。この場合、図４０のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は、融合タンパク質画分の混合後に５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ溶液で透析して得たタンパク質を示す。
【０１７３】
実施例５．２．  大腸菌から誘導された組換えＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＧＦＰタンパク質の単離および精製
組換えタンパク質ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＧＦＰを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の産生株をＬＢ液体培地に播種し、３７℃の条件下に培養した。ＯＤ６００の吸光度が０．３に達したら、それを冷蔵庫に入れて培養液の温度を下げ、インキュベーターの温度を１８℃に変更し、その後、０．５ｍＭのＩＰＴＧを加え、さらに１日間の震盪培養を行って、組換えタンパク質ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＧＦＰを発現させた。
【０１７４】
培養終了後、細胞を遠心分離によって回収し、回収細胞をＰＢＳで１回洗った後、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０溶液を用いて懸濁させ、懸濁細胞を超音波破砕装置を用いる破壊プロセスに付した。破壊細胞を高速遠心分離器を用いて遠心分離し、上清を回収し、回収上清を０．４５μｍフィルターを用いて濾過し、予め充填したニッケルクロマトグラフィーカラムにロードして、一次精製を行った。
【０１７５】
組換えタンパク質ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＧＦＰを含む破壊溶液を、ニッケル樹脂充填カラムにロードし、次いで、未結合の不純物が検出されなくなるまで、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールのｐＨ８．０溶液を用いる洗浄液を流した。次いで、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾールのｐＨ８．０溶液を、イミダゾール濃度を５０ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭに変えて使用してタンパク質を溶出させた（図４１）。この場合、図４１のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１はニッケルアフィニティークロマトグラフィーのローディングサンプルを示す。レーン２はニッケルアフィニティー樹脂に結合しなかったものを示す。レーン３は、５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン４は、５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／５０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン５〜８は、５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／１００ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン９〜１１は、５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／２５０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン１２は、５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／５００ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。
【０１７６】
ニッケルクロマトグラフィーから回収した溶出液を、浸透圧の原理を利用するＰＢＳバッファー液との溶液交換に付した。溶液交換の終了後、回収された最終タンパク質ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＧＦＰをタンパク質定量およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。図４２に示すように、確認が終わったら、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＧＦＰタンパク質を液体窒素で冷却し、−８０℃の極低温冷凍庫内で保管した。この場合、図４２のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は、ＰＢＳバッファー液で透析して得たＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＧＦＰタンパク質を示す。
【０１７７】
ＩＩ．ミトコンドリア外膜標的化タンパク質および標的標的化タンパク質を含む融合タンパク質の調製
実施例６．  ｓｃＦｖＨＥＲ２を含む融合タンパク質の調製
実施例６．１．  ｓｃＦｖＨＥＲ２遺伝子の合成
組換えタンパク質においてヒトｓｃＦｖＨＥＲ２を発現させるために、Bionics Co., Ltd.から遺伝子合成依頼によって入手したｓｃＦｖＨＥＲ２遺伝子をｐＵＣ５７−ｓｃＦｖＨＥＲ２と称し、ｓｃＦｖＨＥＲの塩基配列は配列番号３７の塩基配列と同じであった。
【０１７８】
実施例６．２．  ｓｃＦｖＨＥＲ２タンパク質発現ベクターの作製
実施例６．２．１．  ｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−ｓｃＦｖＨＥＲ２−ＴＯＭ７
ユビキチン、およびミトコンドリア外膜に結合するＴＯＭ７が融合した形態のｓｃＦｖＨＥＲ２タンパク質を調製するために、ユビキチンおよびＴＯＭ７が融合した形態のｓｃＦｖＨＥＲ２遺伝子を発現することのできる発現ベクターを作製した。
【０１７９】
上記実施例６．１．で得たプラスミドｐＵＣ５７−ｓｃＦｖＨＥＲ２遺伝子を制限酵素ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩで切断し、約７５０ｂｐのＤＮＡ断片を２％アガロースゲル上の電気泳動によって取得し、次いで、それを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、制限酵素ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−（ｐ５３）−ＴＯＭ７ベクターに挿入して、プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−ｓｃＦｖＨＥＲ２−ＴＯＭ７を得た（図３９）。この場合、ＵＢ−ｓｃＦｖＨＥＲ２−ＴＯＭ７は配列番号３８の塩基配列で表された。
【０１８０】
プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−ｓｃＦｖＨＥＲ２−ＴＯＭ７を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。次いで、形質転換株を、抗生物質アンピシリンを添加したLuria-Bertani（ＬＢ）固体培地において培養し、得られたコロニーを、３７℃の条件下にＬＢ液体培地中で培養した。ＯＤ６００の吸光度が約０．２の細胞密度に達したら、ＩＰＴＧを、１ｍＭの終濃度となるように加え、その後さらに約４時間の震盪培養を行った。
【０１８１】
遠心分離によって大腸菌細胞の部分を取得し、細胞を破壊してＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。図４４に示すように、ユビキチンおよびＴＯＭ７が融合した形態の約３５ｋＤａの大きさのｓｃＦｖＨＥＲ２タンパク質が発現されたことが確認された。この場合、図４４のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は大腸菌をＩＰＴＧ添加の４時間後に破壊した後に遠心分離した沈殿物を示し、レーン２は大腸菌破壊の後に遠心分離した上清を示す。
【０１８２】
実施例６．２．２．  ｐＣＭＶ−ｓｃＦｖＨＥＲ２−ＴＯＭ７−ｍｙｃ／Ｈｉｓの作製
ミトコンドリア外膜に結合するＴＯＭ７が融合した形態のｓｃＦｖＨＥＲ２タンパク質を調製するために、ＴＯＭ７が融合した形態のｓｃＦｖＨＥＲ２を発現することのできる動物細胞用の発現ベクターを作製した。ＴＯＭ７およびｓｃＦｖＨＥＲ２遺伝子を得るために、ＲｓｃＦｖＨＥＲ２プライマーおよびＸＴＯＭ７（ｎｏＴ）プライマーを合成した。各プライマーの配列を表１１に記載する。
【０１８３】
【表１１】
2021521819.tif 000013
【０１８４】
上記実施例６．２．１において得たプラスミドｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−ｓｃＦｖＨＥＲ２−ＴＯＭ７を鋳型として使用し、０．２ｐｍｏｌのプライマー（ＲｓｃＦｖＨＥＲ２）および０．２ｐｍｏｌのプライマー（ＸＴＯＭ７（ｎｏＴ））を、ｄＮＴＰ ０．２ｎＭ、１×AccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー液（Invitrogen, USA）および１単位のAccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと混合した。その後、ポリメラーゼ連鎖反応装置において、９５℃で４０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間の増幅反応を２５サイクル行って、遺伝子ｓｃＦｖＨＥＲ２−ＴＯＭ７を得た。増幅ｓｃＦｖＨＥＲ２−ＴＯＭ７遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断し、それぞれ約８５０ｂｐのＤＮＡ断片を１％アガロースゲル上の電気泳動によって取得し、次いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断したｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／Ｈｉｓ Ａベクターに挿入して、プラスミドｐＣＭＶ−ｓｃＦｖＨＥＲ２−ＴＯＭ７−ｍｙｃ／Ｈｉｓを得た（図４５）。
【０１８５】
この場合、ｓｃＦｖＨＥＲ２−ＴＯＭ７−ｍｙｃ／Ｈｉｓは配列番号４１の塩基配列で表された。それを、プラスミドｐＣＭＶ−ｓｃＦｖＨＥＲ２−ＴＯＭ７−ｍｙｃ／Ｈｉｓを用いて、動物細胞ＣＨＯにトランスフェクトし、細胞を破壊してＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行い、抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いるウエスタンブロットによって示した。図４６に示すように、ＴＯＭ７が融合した形態の約３５ｋＤａの大きさのｓｃＦｖＨＥＲ２タンパク質が発現されたことが確認された。この場合、図４６のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は、動物細胞ＣＨＯへのトランスフェクションが行われ、細胞が破壊され、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動が行われ、抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いるウエスタンブロットによる確認が行われたことを示す。
【０１８６】
実施例６．３．  大腸菌から誘導された組換えＵＢ−ｓｃＦｖＨＥＲ２−ＴＯＭ７タンパク質の単離および精製
ＵＢ−ｓｃＦｖＨＥＲ２−ＴＯＭ７タンパク質を、実施例１．３．１．と同じ方法で単離および精製した。結果として、ＵＢ−ｓｃＦｖＨＥＲ２−ＴＯＭ７タンパク質を溶出させた（図４７）。この場合、図４７のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１はニッケルアフィニティークロマトグラフィーのローディングサンプルを示す。レーン２はニッケルアフィニティー樹脂に結合しなかったものを示す。レーン３は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン４〜５は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／５０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン６〜８は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／１００ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン９〜１０は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／２５０ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。レーン１１は、８Ｍ尿素／５０ｍＭリン酸Ｎａ／５００ｍＭ ＮａＣｌ／５００ｍＭイミダゾール溶液による溶出の結果を示す。
【０１８７】
回収溶出液のタンパク質量をタンパク質定量法によって測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。図４８に示すように、確認が終わったら、ＵＢ−ＳｃＦｖＨＥＲ２−ＴＯＭ７タンパク質を液体窒素で冷却し、−８０℃の極低温冷凍庫内で保管した。この場合、図４８のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は、ＰＢＳバッファー液で透析して得たＵＢ−ｓｃＦｖＨＥＲ２−ＴＯＭ７タンパク質を示す。
【０１８８】
実施例７．  ｓｃＦｖＭＥＬを含む融合タンパク質の調製
実施例７．１．  ｓｃＦｖＭＥＬ遺伝子の合成
組換えタンパク質においてメラノーマに対する抗体フラグメントとしてのヒトｓｃＦｖＭＥＬを発現させるために、Bionics Co., Ltd.から遺伝子合成依頼によって入手したｓｃＦｖＭＥＬ遺伝子をｐＵＣ５７−ｓｃＦｖＭＥＬと称し、ｓｃＦｖＭＥＬの塩基配列は配列番号４２の塩基配列と同じであった。
【０１８９】
実施例７．２．  ｓｃＦｖＭＥＬタンパク質発現ベクターの作製
実施例７．２．１．  ｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−ｓｃＦｖＭＥＬ−ＴＯＭ７の作製
ユビキチン、およびミトコンドリア外膜に結合するＴＯＭ７が融合した形態のｓｃＦｖＭＥＬタンパク質を調製するために、ユビキチンおよびＴＯＭ７が融合した形態のｓｃＦｖＭＥＬを発現することのできる発現ベクターを作製した。
【０１９０】
実施例７．１．で得たプラスミドｐＵＣ５７−ｓｃＦｖＭＥＬ遺伝子を制限酵素ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩで切断し、約７５０ｂｐのＤＮＡ断片を２％アガロースゲル上の電気泳動によって取得し、次いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、制限酵素ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−（ｐ５３）−ＴＯＭ７ベクターに挿入して、プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−ｓｃＦｖＭＥＬ−ＴＯＭ７を得た（図４９）。この場合、ＵＢ−ｓｃＦｖＭＥＬ−ＴＯＭ７は配列番号４３の塩基配列で表された。
【０１９１】
プラスミドｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−ｓｃＦｖＭＥＬ−ＴＯＭ７を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。次いで、形質転換株を、抗生物質アンピシリンを添加したLuria-Bertani（ＬＢ）固体培地において培養し、得られたコロニーを、３７℃の震盪インキュベーター内でＬＢ液体培地中で培養した。ＯＤ６００の吸光度が約０．２の細胞密度に達したら、ＩＰＴＧを、１ｍＭの終濃度となるように加え、その後さらに約４時間の震盪培養を行った。
【０１９２】
遠心分離によって大腸菌細胞の部分を取得し、細胞を破壊してＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。図５０に示すように、ユビキチンおよびＴＯＭ７が融合した形態の約３５ｋＤａの大きさのｓｃＦｖＭＥＬタンパク質が発現されたことが確認された。この場合、図５０のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は大腸菌をＩＰＴＧ添加の４時間後に破壊した後に遠心分離した沈殿物を示し、レーン２は大腸菌破壊の後に遠心分離した上清を示す。
【０１９３】
実施例７．２．２．  ｐＣＭＶ−ｓｃＦｖＭＥＬ−ＴＯＭ７−ｍｙｃ／Ｈｉｓの作製
ミトコンドリア外膜に結合するＴＯＭ７が融合した形態のｓｃＦｖＭＥＬタンパク質を調製するために、ＴＯＭ７が融合した形態のｓｃＦｖＭＥＬを発現することのできる動物細胞用の発現ベクターを作製した。ＴＯＭ７およびｓｃＦｖＭＥＬ遺伝子を得るために、プライマー（ＲｓｃＦｖＭＥＬ）を合成した。プライマーの配列を表１２に記載する。
【０１９４】
【表１２】
2021521819.tif 000014
【０１９５】
実施例６．２．１．において得たプラスミドｐＥＴ１５ｂ−ＵＢ−ｓｃＦｖＭＥＬ−ＴＯＭ７を鋳型として使用し、０．２ｐｍｏｌのＲｓｃＦｖＭＥＬプライマーおよび０．２ｐｍｏｌのＸＴＯＭ７（ｎｏＴ）プライマーを、ｄＮＴＰ ０．２ｎＭ、１×AccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー液（Invitrogen, USA）および１単位のAccuPrime Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと混合した。その後、ポリメラーゼ連鎖反応装置において、９５℃で４０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間の増幅反応を２５サイクル行って、ｓｃＦｖＭＥＬ−ＴＯＭ７を得た。増幅ｓｃＦｖＭＥＬ−ＴＯＭ７遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断し、約８５０ｂｐのＤＮＡ断片を１％アガロースゲル上の電気泳動によって取得した。次いで、それを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断したｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／Ｈｉｓ Ａベクターに挿入して、プラスミドｐＣＭＶ−ｓｃＦｖＭＥＬ−ＴＯＭ７−ｍｙｃ／Ｈｉｓを得た（図５１）。ここで、ｓｃＦｖＭＥＬ−ＴＯＭ７−ｍｙｃ／Ｈｉｓは配列番号４
の塩基配列で表された。
【０１９６】
それを、プラスミドｐＣＭＶ−ｓｃＦｖＭＥＬ−ＴＯＭ７−ｍｙｃ／Ｈｉｓを用いて、動物細胞ＣＨＯにトランスフェクトし、細胞を破壊してＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行い、抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いるウエスタンブロットによって示した。図５２に示すように、ＴＯＭ７が融合した形態の約３５ｋＤａの大きさのｓｃＦｖＭＥＬタンパク質が発現されたことが確認された。この場合、図５２のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は、動物細胞ＣＨＯへのトランスフェクションが行われ、細胞が破壊され、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動が行われ、抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いるウエスタンブロットによる確認が行われたことを示す。
【０１９７】
実施例８．  ｓｃＦｖＰＤ−Ｌ１を含む融合タンパク質の調製
実施例８．１．  ｓｃＦｖＰＤ−Ｌ１遺伝子の合成
組換えタンパク質においてヒトｓｃＦｖＰＤ−Ｌ１を発現させるために、Bionics Co., Ltd.から遺伝子合成依頼によって入手したｓｃＦｖＰＤ−Ｌ１遺伝子をｐＵＣ５７−ｓｃＦｖＰＤ−Ｌ１と称し、その塩基配列は配列番号４６の塩基配列と同じであった。
【０１９８】
実施例８．２．  ｓｃＦｖＰＤ−Ｌ１タンパク質発現ベクターの作製
実施例８．２．１．  ｐＣＭＶ−ｓｃＦｖＰＤ−Ｌ１−ＴＯＭ７−ｍｙｃ／Ｈｉｓの作製
ミトコンドリア外膜に結合するＴＯＭ７が融合した形態のｓｃＦｖＰＤ−Ｌ１タンパク質を調製するために、ユビキチンおよびＴＯＭ７が融合した形態のｓｃＦｖＰＤ−Ｌ１を発現することのできる動物細胞用の発現ベクターを作製した。
【０１９９】
プラスミドｐＵＣ５７−ｓｃＦｖＰＤ−Ｌ１を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断し、約７６０ｂｐのＤＮＡ断片を１％アガロースゲル上の電気泳動によって取得た。次いで、それを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＣＭＶ−（ｓｃＦｖＭＥＬ）−ＴＯＭ７−ｍｙｃ／Ｈｉｓベクターに挿入して、プラスミドｐＣＭＶ−ｓｃＦｖＰＤ−Ｌ１−ＴＯＭ７−ｍｙｃ／Ｈｉｓを得た（図５３）。この場合、ｓｃＦｖＰＤ−Ｌ１−ＴＯＭ７−ｍｙｃ／Ｈｉｓは配列番号４７の塩基配列で表された。
【０２００】
それを、プラスミドｐＣＭＶ−ｓｃＦｖＰＤ−Ｌ１−ＴＯＭ７−ｍｙｃ／Ｈｉｓを用いて、動物細胞ＣＨＯにトランスフェクトし、細胞を破壊してＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行い、抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いるウエスタンブロットによって示した。図５４に示すように、ＴＯＭ７が融合した形態の約３５ｋＤａの大きさのｓｃＦｖＰＤ−Ｌ１タンパク質が発現されたことが確認された。この場合、図５４のレーンＭはタンパク質分子量マーカーを示し、レーン１は、動物細胞ＣＨＯへのトランスフェクションが行われ、細胞が破壊され、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動が行われ、抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いるウエスタンブロットによる確認が行われたことを示す。
【０２０１】
III．  融合タンパク質が結合された改変ミトコンドリアの作製
実施例９．  改変ミトコンドリアの作製
ミトコンドリア外膜結合部位と融合された蛍光タンパク質がミトコンドリア外膜に結合するかを確認するために、以下の実験を行った。まず、臍帯由来の間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ）から遠心分離法によってミトコンドリアを単離した。次いで、それをMitoTracker CMXRos Redで染色した。それを、前記の大腸菌から精製された組換えタンパク質ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＧＦＰと混合し、周囲温度で約３０分間インキュベートした。
【０２０２】
その後、未反応タンパク質を遠心分離により除去し、ＰＢＳバッファー液で２回洗った。その後、ミトコンドリアに結合した形態の蛍光タンパク質を、蛍光顕微鏡を用いて観察した。対照群として、ミトコンドリア外膜結合部位を含まない精製ＧＦＰタンパク質を用いた。結果として、ミトコンドリア外膜結合部位と融合された蛍光タンパク質（ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＧＦＰ）は、臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ）のミトコンドリアと同じ場所に位置したことが確認された（図５５ａ、図５５ｂ）。
【０２０３】
実施例１０．  組換えタンパク質ｐ５３の、外来ミトコンドリア外膜に結合する能力の確認
臍帯由来間葉系幹細胞から遠心分離法によって単離されたミトコンドリアを、精製組換えタンパク質ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３またはＵＢ−ｐ５３−ＴＯＭ７と混合し、４℃の反応条件下に１時間、１：１の比で結合させた。対照群として、タンパク質と混合しないミトコンドリアを用いた。ミトコンドリアとｐ５３の間の結合親和性を、ウエスタンブロット試験法によって確認した（図５６）。
【０２０４】
まず、ミトコンドリアとｐ５３タンパク質を結合させ、その後、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、ミトコンドリア、またはｐ５３が結合したミトコンドリアを沈殿物の形態で得た。ミトコンドリアと結合しなかったタンパク質を、ＰＢＳで２回洗うことによって除去し、洗われた沈殿物をタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、次いでウエスタンブロットに付した。ウサギ抗ｐ５３抗体を一次抗体として使用し、抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰを二次抗体として使用した。ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３またはＵＢ−ｐ５３−ＴＯＭ７と結合したミトコンドリアの試験群に期待される分子量である６０ｋＤａの大きさと同じ位置のバンドを確認し、タンパク質と結合しなかったミトコンドリア単独の対照群と比較した（図５６）。
【０２０５】
ＩＶ．  活性タンパク質が結合した改変ミトコンドリアの活性の確認
実施例１１．  外来ミトコンドリアの単離および細胞内導入
臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ）から遠心分離法によってミトコンドリアを単離した。単離ミトコンドリアをMitotracker CMX Rosで染色し、単離ミトコンドリアの濃度および総量をＢＣＡ定量法によって確認し、０μｇ、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、５０μｇ、１００μｇのミトコンドリアを胃癌細胞株ＳＮＵ−４８４細胞に遠心法によって導入した。試験の結果、細胞へのミトコンドリアの導入の程度は、ミトコンドリア量に濃度依存的であったことが蛍光顕微鏡によって確認された（図５７）。
【０２０６】
実施例１２．  癌細胞に対する正常ミトコンドリアの作用の確認
正常細胞由来のミトコンドリアが、癌細胞増殖およびＲＯＳ産生に対してどのように作用するかを調べるために、以下の実験を行った。まず、肝細胞（ＷＲＬ−６８）、線維芽細胞、および臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ）を、ミトコンドリアドナー細胞として選択した。細胞からミトコンドリアを遠心分画法によってそれぞれ単離した。ミトコンドリアレシピエント細胞として用いた癌細胞は、皮膚表皮癌細胞のＡ４３１細胞株であった。この場合、皮膚表皮癌細胞にミトコンドリアを、濃度にしたがい遠心力を利用して送達した（韓国特許出願番号１０−２０１７−０１５１５２６）。
【０２０７】
導入の２４、４８および７２時間後に、皮膚表皮癌細胞の増殖および活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を観察した。結果として、さまざま器官に由来する正常細胞から取得されたミトコンドリアが癌細胞に導入されたとき、濃度に依存して癌細胞増殖抑制効果があったことが確認された。さらに、正常ミトコンドリアの濃度に依存して、癌細胞におけるＲＯＳ産生が抑制されたことが確認された（図５８および５９）。
【０２０８】
実施例１３．  薬剤耐性に対する正常ミトコンドリアの作用の確認
正常細胞由来のミトコンドリアが癌細胞に導入されたとき、癌細胞の特徴である薬剤耐性、抗酸化遺伝子の発現、癌転移に対してどのように作用するかを、以下の方法で調べた。まず、正常肝細胞（ＷＲＬ−６８）をミトコンドリアドナー細胞とし、細胞からミトコンドリアを遠心分画法によって単離し、ミトコンドリアを使用した。ミトコンドリアレシピエント細胞として用いる癌細胞として、肝臓癌細胞株のＨｅｐＧ２細胞を使用した。ミトコンドリアを肝臓癌細胞に、濃度にしたがい遠心力を利用して送達し、抗癌剤ドキソルビシンに対する薬剤耐性の観察の結果として、ミトコンドリアを受け取った癌細胞株は、より高い薬剤感受性を示したことを確認した（図６０）。
【０２０９】
実施例１４．  抗酸化効果に対する正常ミトコンドリアの作用の確認
正常細胞から単離されたミトコンドリアを濃度にしたがい肝臓癌細胞株のＨｅｐＧ２細胞に導入したとき、抗酸化タンパク質である酵素カタラーゼおよびＳＯＤ−２（スーパーオキシドジスムターゼー２遺伝子の癌細胞における発現が増加したことが確認された（図６１）。
【０２１０】
実施例１５．  癌細胞転移に対する正常ミトコンドリアの作用の確認
転移に関して、ＥＭＴ（上皮間葉転換）に関与する遺伝子の１つであるα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）遺伝子の発現があったかを確認した。この場合、ミトコンドリアを受け取った肝臓癌細胞の場合、ミトコンドリアを受け取らなかった肝臓癌細胞と比較して、α−ＳＭＡタンパク質の発現が、ミトコンドリア濃度に依存して顕著に低下したことがわかった。一方、細胞接着タンパク質の１つであるＥ−カドヘリンタンパク質は、ミトコンドリア濃度に依存して増加した（図６２）。癌細胞に導入された正常ミトコンドリアによって、癌転移に関与することが知られるタンパク質の変化がもたらされ、したがって癌細胞の転移にも作用することが確認された。
【０２１１】
実施例１６．  組換えタンパク質ｐ５３の外来ミトコンドリア外膜上の結合および細胞への導入の確認
ミトコンドリアを臍帯由来間葉系幹細胞から遠心分離法によって単離し、Mitotracker CMX Rosで染色し、精製組換えタンパク質ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３またはＵＢ−ｐ５３−ＴＯＭ７と混合し、１：１の比で、４℃の反応条件下に１時間インキュベートし、その後、遠心分離して未反応タンパク質を除去し、ＰＢＳバッファー液で２回洗った後、ｐ５３タンパク質が結合した形態のミトコンドリアを胃癌細胞株ＳＮＵ−４８４細胞に遠心法によって導入した（図６３）。この場合、対照群は、ミトコンドリアを用いない群、およびミトコンドリアを単独で用いる群と設定した。１日間の培養後、細胞に導入された外来ミトコンドリアに結合されたｐ５３タンパク質を、免疫細胞化学（ＩＣＣ）により蛍光顕微鏡で観察した。
【０２１２】
ウサギ抗ｐ５３抗体を一次抗体として使用し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ Alexa Fluor 488を二次抗体として使用した。結果として、外来ミトコンドリア（赤に染色）に結合されたＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３（緑に染色）またはＵＢ−ｐ５３−ＴＯＭ７（緑に染色）タンパク質が、細胞への導入の間に外来ミトコンドリアが導入された細胞の細胞質中に位置したことが確認された（図６４、２００倍、および図６５、４００倍）。結果として、組換えタンパク質がミトコンドリアによって細胞に容易に導入されたことがわかった。
【０２１３】
実施例１７．  癌細胞株におけるｐ５３結合ミトコンドリアの活性の確認
実施例１７．１．  胃癌細胞株を用いての、細胞に導入されたｐ５３結合外来ミトコンドリアのアポトーシス能力の確認
臍帯由来間葉系幹細胞から遠心分離法によって単離されたミトコンドリアを、大腸菌から精製された組換えタンパク質ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３またはＵＢ−ｐ５３−ＴＯＭ７と混合し、４℃の反応条件下に１時間、１：１の比で結合させた。対照群として、ＴＯＭ７０を含まないＵＢ−ｐ５３タンパク質、およびユビキチンを含まないＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ｐ５３を用いた。未結合タンパク質を遠心分離およびＰＢＳによる洗浄プロセスによって除去し、タンパク質が結合したミトコンドリアを、ｐ５３遺伝子の変異によってｐ５３能力を欠く胃癌細胞株ＳＮＵ−４８４に遠心によって導入した（図６６）。１日間の培養後、４％パラホルムアルデヒドによる固定を１時間行い、次いで、浸透化溶液（０．１％ Triton-X-100を含む０．１％クエン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．４）を用いて細胞の浸透化を誘導し、ＴＵＮＥＬ溶液（in situ細胞死検出キット、TMR RED, Roche）と３７℃で１時間反応させた。
【０２１４】
ＴＵＮＥＬ分析法において、核酸の断片化（ＤＮＡ断片化）が起こった部分は赤色に染まり、アポトーシスが起こったことを示す。対照群と比較して、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ｕｂ−ｐ５３またはｐ５３−ＴＯＭ７が結合したミトコンドリアが導入された細胞において、対照群と異なり、赤に染色された部分が多く観察され、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３またはＵＢ−ｐ５３−ＴＯＭ７が結合したミトコンドリアによってアポトーシスが引き起こされたことが示された。特に、ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３の形態のタンパク質が結合したミトコンドリアによるアポトーシスの誘導がより大きかったことが確認された（図６７ａ）。
【０２１５】
実施例１７．２．  ルシフェラーゼの結合による、ｐ５３結合外来ミトコンドリアのアポトーシス能力の確認
レシピエント細胞において送達されたＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３タンパク質の生物学的活性が、実施例５．２．において得られたミトコンドリアに結合した形態のＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３タンパク質のレシピエント細胞への送達後に維持されるかを確認するために、レポーター遺伝子を用いる細胞ベースの分析を行った。ｐ５３タンパク質は転写因子であるから、ｐ５３転写因子が結合することのできる塩基配列ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹ（ここで、ＲはＧまたはＡを表し、ＷはＡまたはＴを表し、ＹはＣまたはＴを表す）が６回繰り返された遺伝子を、下記の配列で合成した。Ｐ５３−プロモーター−Ｓの塩基配列は、以下のとおり（５’−ＧＧＧ  ＣＡＴ  ＧＣＴ  ＣＧＧ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＣＣＧ  ＧＧＣ  ＡＴＧ  ＣＴＣ  ＧＧＧ  ＣＡＴ  ＧＣＣ  ＣＧＧ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＴＣＧ  ＧＧＣ  ＡＴＧ  ＣＣＣ−３’）（配列番号９１）であり、Ｐ５３−プロモーター−ＡＳの塩基配列は、以下のとおり（５’−ＧＧＧ  ＣＡＴ  ＧＣＣ  ＣＧＡ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＣＣＧ  ＧＧＣ  ＡＴＧ  ＣＣＣ  ＧＡＧ  ＣＡＴ  ＧＣＣ  ＣＧＧ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＣＣＧ  ＡＧＣ  ＡＴＧ  ＣＣＣ−３’）（配列番号９２）である。
【０２１６】
５μｇの合成遺伝子Ｐ５３−プロモーター−Ｓおよび５μｇの合成遺伝子Ｐ５３−プロモーター−ＡＳを７０℃で２０分間インキュベートして二重螺旋遺伝子の合成を促進し、次いでポリヌクレオチドＴ４キナーゼ酵素を用いてリン酸化反応を誘導した。リン酸化が誘導された二重螺旋遺伝子を、制限酵素ＳｍａＩで切断したｐＧＬ３ベクターに挿入し、ｐ５３転写因子が結合することのできる塩基配列（ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹ）が６回繰り返された遺伝子をレポーター遺伝子ルシフェラーゼと結合させてプラスミドｐ６ｘｐ５３−Ｌｕｃを作製した。プラスミドｐ６ｘｐ５３−Ｌｕｃ、およびβ−ガラクトシダーゼ発現ベクターであるプラスミドｐＲＳＶｂ−ｇａｌを、ヒト腎臓細胞のＨＥＫ２９３細胞にリポフェクタミン法によって導入した。
【０２１７】
６時間後、ＨＥＫ２９３細胞を、１０μｇのミトコンドリアと、５μｇ、１０μｇおよび２０μｇのＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３タンパク質がそれぞれ結合した組み合わせで処理した。この場合、対照群として、細胞をＰＢＳまたはｐ５３タンパク質がそれぞれ結合した１０μｇのミトコンドリアで処理した。処理した細胞を１８時間培養した後、ルシフェラーゼ活性を測定し分析した。この場合、形質導入の効果を補正するために、β−ガラクトシダーゼ活性の測定によって得た値で除したルシフェラーゼ値を補正ルシフェラーゼ値として決定した。
【０２１８】
１０μｇのミトコンドリアと、５μｇ、１０μｇおよび２０μｇのＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３タンパク質がそれぞれ結合した組み合わせで処理した細胞においてルシフェラーゼ値が高かったことが確認された。したがって、ｐ５３タンパク質は細胞内に入って活性を示したことが確認された（図６７ｂ）。
【０２１９】
実施例１８．  癌細胞株の転移を低減する、細胞に導入されたＲＫＩＰ結合外来ミトコンドリアの能力の確認
臍帯由来間葉系幹細胞から遠心分離法によって単離されたミトコンドリアを、精製組換えタンパク質ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＲＫＩＰと混合し、４℃の反応条件下に１時間、１：１の比で結合させた。タンパク質が結合したミトコンドリアを、ＲＫＩＰタンパク質の減少によって転移能が高まっていることが知られている乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に遠心によって導入した。
【０２２０】
癌細胞の転移能を確認するために、トランスウェルプレートを用いる細胞浸潤アッセイを行った。孔サイズ８μｍのトランスウェル上部チャンバーを、３７℃で３０分間、マトリゲルでコートした。試験群として、単独のミトコンドリアを導入したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、およびＲＫＩＰタンパク質が結合したミトコンドリアを導入したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いた。無血清培地を入れたトランスウェル上部チャンバーに各細胞を１×１０５個入れ、１０％ウシ血清を含む培地を下部チャンバーに入れた。３７℃で１２時間培養後、４％パラホルムアルデヒドで１時間固定した後、マトリゲルを通過した細胞を１％クリスタルバイオレットで染色した。
【０２２１】
顕微鏡で観察した結果、紫に染まった細胞が上部チャンバー下の膜において観察され、これは細胞転移が起こったプロセスであるということができる。単独のミトコンドリアで処理した試験群、およびＲＫＩＰ結合ミトコンドリアで処理した試験群において、処理を行わなかった対照群と比較して、紫に染まった細胞が減少したことが確認された。４つの部分をランダムに選択し、染色細胞の数を測定し、グラフにプロットした（図６８）。
【０２２２】
ＩＶ．  標的標的化タンパク質が結合した改変ミトコンドリアの送達率の確認
実施例１９．  癌細胞を標的とする一本鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）抗体の細胞内発現の確認、および細胞におけるミトコンドリアとの結合の確認
ｐＣＭＶ−ＳｃＦｖ−ＨＥＲ２−ＴＯＭ７またはｐＣＭＶ−ＳｃＦｖ−ＭＥＬ−ＴＯＭ７またはｐＣＭＶ−ＳｃＦｖ−ＰＤ−Ｌ１−ＴＯＭ７を動物細胞内で発現させるために、リポフェクタミンＬＴＸおよびＰＬＵＳまたはリポフェクタミン２０００を用いてＤＮＡをＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。対照群として、ＧＦＰ−ＴＯＭ７ ＤＮＡを用いた。それらが細胞内で発現され、同じ細胞内でミトコンドリアに結合することを確認するために、トランスフェクトした細胞からサイトゾルおよびミトコンドリアを遠心分離法によって単離し、ＢＣＡアッセイを用いて同じタンパク質量に調節してＰＡＧＥ電気泳動を行い、結果をウエスタンブロットによって観察した。モノクローナルｃ−ｍｙｃ抗体を一次抗体として使用し、抗マウスＩｇＧ ＨＲＰを二次抗体として使用した。
【０２２３】
ＳｃＦｖ−ＨＥＲ２−ＴＯＭ７またはＳｃＦｖ−ＭＥＬ−ＴＯＭ７タンパク質のバンドが、期待された３５ｋＤａのサイズで確認された。すべてミトコンドリア層において確認されたことに基づき、細胞において、トランスフェクトされ発現されたタンパク質はＴＯＭ７によって細胞中のミトコンドリアに結合したと考えることができた（図６９）。
【０２２４】
次に、細胞において発現された標的タンパク質が、同じ細胞においてミトコンドリアに結合したことを確認するために、細胞中の発現されたＳｃＦｖ−ＨＥＲ２−ＴＯＭ７、ｓｃＦｖ−ＭＥＬ−ＴＯＭ７またはｐＣＭＶ−ＰＤ−Ｌ１−ＴＯＭ７タンパク質を、免疫細胞化学（ＩＣＣ）試験法を用いて蛍光顕微鏡で観察した。モノクローナルｃ−ｍｙｃ抗体を一次抗体として使用し、ヤギ抗マウスＩｇＧ Alexa Fluor 488を二次抗体として使用した。細胞中のミトコンドリアをMitotracker CMX Rosで染色した。結果として、発現されたＳｃＦｖ−ＨＥＲ２−ＴＯＭ７、ＳｃＦｖ−ＭＥＬ−ＴＯＭ７またはＳｃＦｖ−ＰＤ−Ｌ１−ＴＯＭ７タンパク質は細胞中でミトコンドリアと同じ場所に位置し、ミトコンドリアに結合したことが確認された（図７０および７１）。
【０２２５】
実施例２０．  癌細胞を標的とする一本鎖可変フラグメント抗体が結合したミトコンドリアの単離、および胃癌細胞株におけるミトコンドリアの導入の比較
ｐＣＭＶ−ＳｃＦｖ−ＨＥＲ２−ＴＯＭ７またはｐＣＭＶ−ＳｃＦｖ−ＰＤ−Ｌ１−ＴＯＭ７をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞からミトコンドリアを単離した。対照群として、形質転換していないＣＨＯ細胞のミトコンドリアを単離して使用した。各細胞から単離されたミトコンドリアを、Mitotracker CMX Rosで染色した。同量のミトコンドリアで胃癌細胞株ＳＮＵ−４８４を処理し、翌日、ミトコンドリアの細胞導入の程度を蛍光顕微鏡を用いて比較し確認した。対照群と比較して、ＳｃＦｖ−ＨＥＲ２−ＴＯＭ７またはＳｃＦｖ−ＰＤ−Ｌ１−ＴＯＭ７が結合したミトコンドリアは、対照群から得たミトコンドリアよりも多く癌細胞に導入されたことが確認された（図７２）。したがって、標的タンパク質が結合したミトコンドリアは、単独のミトコンドリアよりも容易に癌細胞に導入されることがわかった。
【０２２６】
ＶＩ．  活性タンパク質が結合した改変ミトコンドリアのインビボ活性の確認
実施例２１．  異種移植モデル（ＳＮＵ−４８４）の作製、および試験材料の投与
実施例２１．１．  癌細胞の準備
実験日に、胃癌細胞株のＳＮＵ−４８４細胞株を、マウス当たり５×１０６細胞とするように準備した。細胞の培地を除去し、ＰＢＳを加えて細胞を洗った。トリプシン−ＥＤＴＡ液で細胞を解離させ、細胞を５０ｍＬチューブに入れてＰＢＳバッファー液で２回洗った後、２０ｍＬのＰＢＳを加え、細胞の数および生存性を調べた。測定された細胞数に基づいてマウス当たりの細胞数を５×１０６細胞に調節し、細胞を群に分けることによって準備した。マウス当たりの移植体積は、同じ１００μＬとなるよう調節した。対照群として、１００μＬの癌細胞単独の群を用意した。
【０２２７】
実施例２１．２．  試験材料の調製
前記のように臍帯血間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリアを、タンパク質濃度に基づきマウス当たり５０μｇの量で移植用に準備した。単独のミトコンドリアを投与する群の場合は、ミトコンドリアを、癌細胞を混合した１００μＬのＰＢＳとよく混合することによって準備した。改変ミトコンドリア群の場合は、準備したその量のミトコンドリアを癌細胞と混合する前に、エッペンドルフチューブ内でＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３タンパク質と１：１の濃度比で混合し、周囲温度で１時間置いた。反応時間の経過後、２００００×ｇで１０分間の遠心分離によって上清を除去し、タンパク質が結合したミトコンドリア（ＭＴ＋ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３）のペレットを得た。それをＰＢＳバッファー液で２回洗った後、ｐ５３タンパク質が結合したミトコンドリア（ＭＴ＋ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３）を、癌細胞を混合した１００μＬのＰＢＳとよく混合することによって準備した。
【０２２８】
実施例２１．３．  試験動物の準備、および試験材料の移植
群によって準備される移植サンプル用に、マトリゲル（ＢＤ）をＰＢＳと同じ量で加え、細胞と軽く混ぜて、マウス当たり２００μＬの試験材料を調製した。この場合、操作はすべて氷上で行った。モデル作製のために、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（雌、７週齢）をRAONBIOから購入し、癌細胞移植のためにイソフルラン吸入により麻酔し、右背部域（動物に基づく）をアルコール綿で消毒した。その後、注射液を入れた１ｍｌ注射器を用いて試験動物の右背部域に２００μＬを皮下投与した。投与後、動物の体重および腫瘍サイズを週２回測定し、３週間まで観察を続けて結果を分析した（図７３）。
【０２２９】
実施例２１．４．  腫瘍形成の確認
腫瘍の長軸長および短軸長を計測し下記式に当てはめることにより腫瘍体積を計算した。
＜数式１＞
長軸×短軸×短軸×０．５＝腫瘍体積（ｍｍ３）
【０２３０】
実施例２１．５．  生理学的および形態学的変化の観察
抗癌剤候補の投与によるマウスの生理学的および形態学的変化を観察するために、癌細胞および試験材料の投与時から、体積および腫瘍サイズの変化を週に２回測定した（図７４）。
【０２３１】
マウス体重を秤で測定し、週２回測定した値を用いて群による変化を分析した（図７５）。ミトコンドリアを注射しなかった群、単独のミトコンドリアを投与した群、および改変ミトコンドリアを注射した群の間に、３週間の間、体重変化の有意な差は無かったことが確認された。腫瘍の長軸長（長さ）および短軸長（幅）をカリパスで計測し、上記数式１に当てはめることによって、腫瘍サイズを計算した。週２回測定した値を用いて、群による変化を分析した（図７６）。ミトコンドリアで処置しなかった群において腫瘍サイズは経時的に有意に増加したが、ミトコンドリアを投与したマウスの場合は、経時的な腫瘍サイズ増加は緩徐化したことがわかった。さらに、ｐ５３タンパク質が結合したミトコンドリアを投与した群においては、単独のミトコンドリアを投与した群と比較して、腫瘍サイズ増加が有意に緩徐化したことが確認された（図７６）。
【０２３２】
実施例２２．  皮膚癌細胞の増殖抑制に対する改変ミトコンドリアの効果の確認
上記のように得たｐ５３が結合したミトコンドリアを、皮膚癌細胞であるＡ４３１細胞に遠心法によって送達し、Ａ４３１細胞の増殖を観察した。この場合、対照群として生理食塩液を使用し、対照試験群として、ｐ５３タンパク質を融合していない等量のミトコンドリアを使用した。アポトーシスを誘導するタンパク質であるｐ５３タンパク質が結合したミトコンドリアは、対照群、および単独のミトコンドリアを用いた群と比較して、Ａ４３１細胞の増殖を有意に抑制できることが確認された（図７６）。
【０２３３】
Ｖ．  単離されたミトコンドリアの活性の確認
実施例２３．  単離されたミトコンドリアの機能の確認：ＡＴＰ量
臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ）から細胞内ミトコンドリアを単離するために、シリンジを用いてホモジナイズして細胞を破壊し、次いで連続的遠心分離を行ってミトコンドリアを得た。単離されたミトコンドリアの機能を確認するために、単離されたミトコンドリアのミトコンドリアタンパク質濃度をＢＣＡアッセイによって定量して、５μｇのミトコンドリアを準備した。CellTiter-Glo発光キット（Promega, Madison, WI）を用いて、ミトコンドリア中のＡＴＰ量を確認した。
【０２３４】
準備したミトコンドリアを１００μｌのＰＢＳと混合し、９６ウェルプレート中に準備し、対照群としてのミトコンドリアを含まない１００μｌのＰＢＳと比較した。キットに含まれる１００μｌの試験溶液を同じように加え、撹拌機内で２分間よく混合し反応させた後、周囲温度で１０分間反応させ、その後、発光マイクロプレートリーダーを用いてＡＴＰ量を測定した。ミトコンドリアを含めた場合、対象群と比較してＡＴＰが多かったことが確認され、ミトコンドリアの機能が確認された（図７８）。
【０２３５】
実施例２４．  単離されたミトコンドリアの機能の確認：膜電位
単離されたミトコンドリアの膜電位を確認するために、ＪＣ−１色素（分子プローブ、カタログ番号1743159）を使用した。用意したミトコンドリアを５０μｌのＰＢＳ中に混合し、９６ウェルプレートに準備した。対照群としてのミトコンドリアを含まないＰＢＳ（５０μｌ）群、およびＣＣＣＰ（R&D systems, CAS 555-60-2）処理群を準備した。ミトコンドリアのイオノフォアであるＣＣＣＰは、ミトコンドリア膜電位の脱分極によってミトコンドリアの機能を阻害する。ＣＣＣＰ群を５０μＭで、単離されたミトコンドリアと室温で１０分間反応させた。
【０２３６】
その後、それをＪＣ−１色素（２μＭ）と、同じ方法で反応させ、膜電位の変化によって生じる濃度にしたがって異なるスペクトルを示すという性質を利用して、吸光度を測定した。それは低濃度ではモノマーとして存在し緑色蛍光を発し、高濃度では色素が凝集して（Ｊ−凝集体）赤色蛍光を発する。緑色吸光度と赤色吸光度の比を計算することにより、ミトコンドリア膜電位を分析した。反応の終了後、蛍光マイクロプレートリーダーを用いてミトコンドリア膜電位を調べた（モノマー：励起４８５／蛍光５３０、Ｊ−凝集体：励起５３５／蛍光５９０）。結果を図７９に示す。
【０２３７】
実施例２５．  ｍＲＯＳ産生測定による単離されたミトコンドリアの傷害度の確認
前記のように準備した５μｇのミトコンドリアが傷害されているかを確認するために、単離されたミトコンドリア中のミトコンドリア活性酸素種を分析することのできるMitoSOX red指示薬（Invitrogen, カタログ番号M36008）の色素を使用した。準備したミトコンドリアを５０μｌのＰＢＳと混合し、９６ウェルプレートに準備し、対照群としてのミトコンドリアを含まない５０μｌのＰＢＳと比較した。MitoSOX red色素を１０μＭの濃度となるように５０μｌのＰＢＳと混合し、９６ウェルプレートに入れ（終濃度５μＭ）、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で２０分間反応させた。反応の終了後、ミトコンドリア中のＲＯＳ量をマイクロプレートリーダーを用いて測定した（励起５１０／蛍光５８０）。結果を図８０に示す。
【０２３８】
ＶＩ．  細胞外部および内部でのミトコンドリア外膜タンパク質に結合した所望のタンパク質の解離の確認
実施例２６．  細胞外部でのミトコンドリア外膜タンパク質に結合した所望のタンパク質の解離の確認
ミトコンドリアと結合した活性タンパク質を細胞に導入したとき、所望のタンパク質を遊離形態で得るために、ユビキチンタンパク質がミトコンドリア外膜タンパク質と所望のタンパク質の間に挿入された形態の融合タンパク質（ＴＯＭ７０−ＵＢ−ｐ５３またはＴＯＭ−ＵＢ−ＧＦＰ）を大腸菌から調製した。ユビキチン配列がユビキチン切断酵素ＵＢＰ１によって切断されるかを確認するために、組換え融合タンパク質ＴＯＭ７０−ＵＢ−ｐ５３をＵＢＰ１酵素と３７℃で１時間反応させた。
【０２３９】
その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動による分析を行った結果、ＵＢＰ１による融合タンパク質からのユビキチンタンパク質の解離は全く起こらなかったことが確認された。これは、構造的にミトコンドリア外膜タンパク質の妨害現象であると考えられ、したがって、アミノ酸グリシンおよびセリンからなるリンカータンパク質をミトコンドリア外膜タンパク質とユビキチンタンパク質の間に挿入し、新たな融合タンパク質（ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３またはＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＧＦＰ）を大腸菌から精製によって得、前記のようにＵＢＰ１酵素と３７℃で１時間反応させた。結果として、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって、ユビキチンの３’末端がＵＢＰ１酵素によって切断され、期待のとおりｐ５３タンパク質だけが解離されたことが確認された（図８２）。
【０２４０】
実施例２６．  細胞内部でのミトコンドリア外膜タンパク質に結合した所望のタンパク質の解離の確認
上記実施例において得た融合タンパク質（ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ｐ５３またはＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＧＦＰ）がミトコンドリアと結合した状態で細胞に入ったとき、細胞中に存在するユビキチン切断酵素によって活性タンパク質が解離されるかを観察した。まず、臍帯血間葉系細胞から得たミトコンドリアと融合タンパク質ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ＵＢ−ＧＦＰをマイクロチューブ内で１時間反応させて結合させ、その後、未結合融合タンパク質を遠心分離により除去し、ＰＢＳバッファー液で２回洗った。この場合、ユビキチンが除かれている融合タンパク質（ＴＯＭ７０−（ＧＧＧＧＳ）３−ｐ５３）を対照群として使用した。
【０２４１】
次いで、ミトコンドリアと結合したタンパク質を、乳癌細胞株のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に遠心法によって導入した。１日後、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を破壊して、ミトコンドリア部分とサイトゾル部分とに重さの違いを利用してそれぞれ分画した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびウエスタンブロット分析による分析の結果、ユビキチンが含まれる融合タンパク質の場合、ミトコンドリア外膜タンパク質から解離されたＧＦＰタンパク質、リンカータンパク質およびユビキチンがサイトゾル部分に多く検出されたことがわかり、ユビキチンが除かれている融合タンパク質の場合は、ミトコンドリア外膜タンパク質およびリンカータンパク質と結合した形態のＧＦＰタンパク質がミトコンドリア画分に多く検出されたことがわかった（図８３）。
【０２４２】
結果として、ミトコンドリアと結合した、ミトコンドリア外膜タンパク質−リンカー−ユビキチン−活性タンパク質を細胞に導入した場合、ユビキチンおよび活性タンパク質の連結部位が切断され、解離された活性タンパク質は細胞質に放出されたことがわかり、したがって、有用なタンパク質を細胞に効果的に送達する手段の１つとしての送達ビヒクルとして、ミトコンドリアを使用できることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７ａ】
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【図６７ｂ】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１ａ】
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【図８１ｂ】
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【図８２】
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【図８３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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