(57)【要約】  本発明は、病原性免疫応答と関連する疾患及び状態を処置するための組成物(例えば、リポソーム)並びにこのような組成物を製剤化する方法及び投与する方法を提供する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
50〜250ナノメートル(nm)の平均径を有するリポソームの集団を含む組成物であって、リポソームの集団が、
(i)0.3以上の平均不飽和度指数、及び
(ii)リポソーム当たり平均で200〜15,000個の2-(1H-インドール-3-イルカルボニル)-4-チアゾールカルボン酸メチルエステル(ITE)又はその塩の分子
を含む、組成物。
【請求項２】
リポソームの集団が、飽和脂質種、不飽和脂質種及びコレステロールを含む脂質混合物を含み、不飽和脂質種が、不飽和結合を含み、脂質混合物の少なくとも50%を占める、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
不飽和脂質種が、2つの脂質テイルを含み、一方又は両方の脂質テイルが、少なくとも1つの不飽和結合を含む、請求項2に記載の組成物。
【請求項４】
飽和脂質種が、ポリ(エチレングリコール)(PEG)にコンジュゲートしている、請求項1から3のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
飽和脂質種が、PEG2000-DSPEである、請求項4に記載の組成物。
【請求項６】
PEG2000-DSPEが、少なくとも20個の(エチレングリコール)単位の長さを有するPEG鎖を含む、請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
一方又は両方の脂質テイルが、単一の不飽和結合を含む、請求項3から6のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
一方又は両方の脂質テイルが、複数の不飽和結合を含む、請求項3から6のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
脂質混合物は、26%〜34%がコレステロールである、請求項2に記載の組成物。
【請求項１０】
50〜250nmの平均径を有するリポソームの集団を含む組成物であって、リポソームの集団が、
(i)26%〜34%がコレステロールである脂質混合物、及び
(ii)リポソーム当たり平均で200〜15,000個のITE又はその塩の分子
を含む、組成物。
【請求項１１】
リポソームの集団が、0.3以上の平均不飽和度指数を備える、請求項10に記載の組成物。
【請求項１２】
リポソームの集団が、飽和脂質種及び不飽和脂質種を含む脂質混合物を含み、不飽和脂質種が、不飽和結合を含み、脂質混合物の少なくとも50%を占める、請求項10又は11に記載の組成物。
【請求項１３】
不飽和脂質種が、
(i)一方又は両方の脂質テイルが少なくとも1つの不飽和結合を含む、2つの脂質テイル、又は
(ii)少なくとも1つの不飽和結合を含む、1つの脂質テイル
を含む、請求項12に記載の組成物。
【請求項１４】
一方又は両方の脂質テイルが、単一の不飽和結合を含む、請求項13に記載の組成物。
【請求項１５】
一方又は両方の脂質テイルが、複数の不飽和結合を含む、請求項13に記載の組成物。
【請求項１６】
飽和脂質種が、PEGにコンジュゲートしている、請求項11から15のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
飽和脂質種が、PEG2000-DSPEである、請求項16に記載の組成物。
【請求項１８】
50〜250nmの平均径を有するリポソームの集団を含む組成物であって、リポソームの集団が、
(i)飽和脂質種、不飽和脂質種及びコレステロールを含む脂質混合物であり、不飽和脂質種が、不飽和結合を含み、脂質混合物の少なくとも50%を占める、脂質混合物、及び
(ii)リポソーム当たり平均で200〜15,000個のITE又はその塩の分子
を含む、組成物。
【請求項１９】
コレステロールが、脂質混合物の26%〜34%を含む、請求項18に記載の組成物。
【請求項２０】
リポソームの集団が、0.3以上の平均不飽和度指数を備える、請求項18又は19に記載の組成物。
【請求項２１】
不飽和脂質種が、2つの脂質テイルを含み、一方又は両方の脂質テイルが、少なくとも1つの不飽和結合を含む、請求項18から20のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
一方又は両方の脂質テイルが、単一の不飽和結合を含む、請求項21に記載の組成物。
【請求項２３】
一方又は両方の脂質テイルが、複数の不飽和結合を含む、請求項21に記載の組成物。
【請求項２４】
飽和脂質種が、PEGにコンジュゲートしている、請求項18から23のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
飽和脂質種が、PEG2000-DSPEである、請求項24に記載の組成物。
【請求項２６】
不飽和脂質種が、1つの脂質テイルを含み、脂質テイルが、少なくとも1つの不飽和結合を含む、請求項18から20のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
リポソームの集団が、1:10〜100:1の抗原対ITEの質量比で、抗原をさらに含む、請求項1から26のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
リポソームの集団が、1:200〜25:1の抗原対ITEのモル比で、ペプチド抗原をさらに含む、請求項1から27のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
リポソームの集団が、1:5000〜4:1の抗原対ITEのモル比で、タンパク質抗原をさらに含む、請求項1から28のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
50〜250ナノメートル(nm)の平均径を有するリポソームの集団を含む組成物であって、リポソームの集団が、
(i)リポソーム当たり平均で200〜15,000個のITE又はその塩の分子、及び
(ii)1:10〜100:1の抗原対ITEの質量比の抗原
を含む、組成物。
【請求項３１】
リポソームの集団が、0.3以上の平均不飽和度指数を備える、請求項30に記載の組成物。
【請求項３２】
リポソームの集団が、26%〜34%の間のコレステロールモル分率を有する脂質混合物を含む、請求項30又は31に記載の組成物。
【請求項３３】
リポソームの集団が、飽和脂質種及び不飽和脂質種を含む脂質混合物を含み、不飽和脂質種が、不飽和結合を含み、脂質混合物の少なくとも50%を占める、請求項30から32のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
不飽和脂質種が、2つの脂質テイルを含み、一方又は両方の脂質テイルが、少なくとも1つの不飽和結合を含む、請求項33に記載の組成物。
【請求項３５】
一方又は両方の脂質テイルが、単一の不飽和結合を含む、請求項34に記載の組成物。
【請求項３６】
一方又は両方の脂質テイルが、複数の不飽和結合を含む、請求項34に記載の組成物。
【請求項３７】
不飽和脂質種が、1つの脂質テイルを含み、脂質テイルが、少なくとも1つの不飽和結合を含む、請求項30から33のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
飽和脂質種が、PEGにコンジュゲートしている、請求項33から37のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
飽和脂質種が、PEG2000-DSPEである、請求項38に記載の組成物。
【請求項４０】
抗原が、配列番号1〜81からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド抗原である、請求項27から39のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
抗原が、自己免疫障害に関連する、請求項27から40のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
自己免疫障害が、関節リウマチ、多発性硬化症、I型糖尿病、重症筋無力症、クローン病、潰瘍性大腸炎及びセリアック病からなる群から選択される、請求項41に記載の組成物。
【請求項４３】
抗原が、治療用タンパク質又はその部分である、請求項27から42のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
抗原が、ウイルス遺伝子治療ベクターの表面構成成分である、請求項27から40のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
抗原が、アデノウイルス随伴ウイルス(AAV)のカプシド、カプシドタンパク質又はそれらのペプチド断片である、請求項44に記載の組成物。
【請求項４６】
抗原が、治療剤を含み、治療剤が、
(i)治療用タンパク質又はペプチド、
(ii)ウイルス又はカプシドタンパク質若しくはペプチド、及び/あるいは
(iii)(i)及び/又は(ii)をコードするポリヌクレオチド
である、請求項27から45のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４７】
AAVが、DNAを含む、請求項45又は46に記載の組成物。
【請求項４８】
DNAが、一本鎖DNA(ssDNA)である、請求項47に記載の組成物。
【請求項４９】
ssDNAが、cDNA又はその断片をコードする、請求項48に記載の組成物。
【請求項５０】
ssDNAが、ヒトcDNA又はその断片をコードする、請求項49に記載の組成物。
【請求項５１】
AAVが、RNAを含む、請求項45又は46に記載の組成物。
【請求項５２】
RNAが、マイクロRNA(miRNA)である、請求項51に記載の組成物。
【請求項５３】
抗原が、治療用タンパク質である、請求項27から45のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５４】
治療用タンパク質が、抗体又はその断片である、請求項53に記載の組成物。
【請求項５５】
治療用タンパク質が、IgG1、IgG2、IgG4、単鎖可変断片(scFv)又はそれらの断片を含む、請求項54に記載の組成物。
【請求項５６】
治療用タンパク質が、IgG1/κ又はその断片である、請求項55に記載の組成物。
【請求項５７】
治療用タンパク質が、IgG2/κ又はその断片である、請求項55に記載の組成物。
【請求項５８】
治療用タンパク質が、IgG4/κ又はその断片である、請求項55に記載の組成物。
【請求項５９】
治療用タンパク質が、二重特異性抗体又はその断片である、請求項54から58のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６０】
治療用タンパク質が、キメラ抗体又はその断片である、請求項54から59のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６１】
治療用タンパク質が、インフリキシマブ、オビルトキサキシマブ、シルツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、バシリキシマブ、リツキシマブ及びアブシキシマブからなる群から選択される、請求項60に記載の組成物。
【請求項６２】
治療用タンパク質が、ヒト化抗体又はその断片である、請求項54から59のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６３】
治療用タンパク質が、マウス抗体又はその断片である、請求項54から59のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６４】
リポソームの集団が、-10〜-50mvの平均ゼータ電位を有する、請求項1から62のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６５】
自己免疫障害を有する対象を処置する方法であって、請求項1から64のいずれか一項に記載の組成物を、治療有効量で、対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項６６】
投与が、静脈内、皮下、皮内、経皮、関節内、肺又は粘膜投与である、請求項65に記載の方法。
【請求項６７】
投与される組成物の用量が、50μg〜15mgのITEを含む、請求項65又は66に記載の方法。
【請求項６８】
投与される組成物の用量が、500μg〜10mgのITEを含む、請求項67に記載の方法。
【請求項６９】
自己免疫障害が、関節リウマチ、多発性硬化症、I型糖尿病、重症筋無力症、炎症性腸疾患及びセリアック病からなる群から選択される、請求項65から68のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
自己免疫障害が、関節リウマチである、請求項69に記載の方法。
【請求項７１】
寛容原性リポソームの集団を合成する方法であって、
(i)2つ以上の脂質種を混合して、
(a)0.3以上の平均不飽和度指数、
(b)26%〜34%の間のコレステロールモル分率、及び/又は
(c)飽和脂質種及び不飽和脂質種であり、不飽和脂質種が不飽和結合を含み脂質混合物の少なくとも50%を占める、飽和脂質種及び不飽和脂質種
を含む脂質混合物を形成するステップ、
(ii)溶媒中に溶解されたITEを、脂質質量の0.4%〜0.7%の量で、脂質混合物に添加するステップ、
(iii)ITEを含有する脂質混合物をエタノール溶液に溶解させ、これを水性相に添加して、粗製リポソームを形成するステップ、並びに
(iv)粗製リポソームを2つ以上のフィルターを通して押出し、それによって、寛容原性リポソームの集団を合成するステップ
を含む方法。
【請求項７２】
寛容原性リポソームの集団が、請求項1から64のいずれか一項に記載の組成物である、請求項71に記載の方法。
【請求項７３】
脂質混合物に添加する前にITEが溶解される溶媒が、DMSOであり、脂質混合物及びITEが溶解される溶媒が、少なくとも50%のエタノールである、請求項71又は72に記載の方法。
【請求項７４】
エタノール溶液中の脂質混合物の最終脂質濃度が、40ミリモル〜80ミリモルの間である、請求項71から73のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
水性相が、抗原を含む、請求項74に記載の方法。
【請求項７６】
治療剤で処置される対象における免疫応答を妨げるリスクを低減する方法であって、請求項43から64のいずれか一項に記載の組成物を、対象における治療剤の免疫原性を低下させるのに十分な量で、対象に投与し、それによって、免疫応答を妨げるリスクを低減する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原性免疫応答と関連する疾患及び状態を処置するための寛容原性リポソーム(例えば、ナノサイズのリポソーム)並びにこのような組成物を製剤化する方法及び投与する方法を特徴とする。
【０００２】
配列表
本出願は配列表を含み、この配列表は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ASCIIコピーは、2019年2月26日に作成され、51172-002WO3_Sequence_Listing_2.26.19_ST25と称され、サイズは20,219バイトである。
【背景技術】
【０００３】
ヒト免疫系には、先天性アーム及び適応性アームが含まれ、後者は、体液性(抗体媒介性)構成成分及び細胞構成成分からなる。適応性免疫応答は、免疫応答の適切な標的である、疾患を引き起こす微生物、例えば、寄生生物、細菌及びウイルスに関連する抗原と、免疫系によって標的とされるべきではない、自己に関連する抗原との間を識別しなければならない。適応性免疫系の多様性を生じる機序では、この区別がなされない。むしろ、寛容化として言及されるプロセスは、自己反応性免疫細胞が、発生の初期に消失する原因である。寛容の減退が生じるか、又はそれに続いて宿主(自己)抗原に対する寛容を失うことは、自己免疫疾患、すなわち、1つ又は多くの器官(例えば、脳、末梢神経系、肝臓、腎臓、膵臓、消化管、関節、皮膚、眼及び耳)に影響を及ぼし得る状態の多様な集まりに関連する。
【０００４】
自己免疫疾患を有する患者における自己抗原に対する寛容の回復が長く求められているが、今のところ達成し難い治療目標である。様々な製剤及び投与経路で、疾患関連自己抗原を投与することは、自己免疫疾患の動物モデルにおいて疾患を抑制するのに有効であるが(例えば、マウス及びラットにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性糖尿病のNODマウスモデル)、ヒト患者において試験される場合には、期待外れの結果となった。
【０００５】
免疫細胞への寛容原性シグナルの送達、又は抗原及び寛容原性シグナルの同時送達は、動物データに支持された有望なアプローチであるが、これらは、潜在的な治療有用性についての結果を導き出すためにヒトにおいて未だ十分に試験されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
自己免疫疾患に対する既存の治療は、免疫を全体的に抑制するか(例えば、メトトレキサート、アザチオプリン又はレフルノミドのような抗増殖剤)、適応性免疫系の1つのアームを標的とするか(例えば、B細胞枯渇抗体であるリツキシマブ)、又は炎症促進性シグナルを全体的に抑制するか(例えば、インフリキシマブ及びアダリムマブのような抗腫瘍壊死因子アルファ抗体)のいずれかである。よって、この分野には、病原性免疫、例えば、自己免疫疾患、移植拒絶及び移植片対宿主病の原因である1つ以上の自己抗原に対する寛容を選択的に回復させるための改良された治療戦略に関する必要性が存在する。
【０００７】
ペプチド及びタンパク質療法並びに遺伝子療法(ウイルスベクターを使用して送達されることが多い)を含む種々の革新的な医療処置は、患者の免疫系を、非自己(foreign)と認識されることが多い新たな抗原(ネオ抗原)に曝露することを必要とする。このような非天然治療用組成物を患者に反復投与することは、免疫認識とその次に治療有効性の損失を誘発する可能性があり、且つアナフィラキシーのような危険な副作用を誘導する場合もある。ネオ抗原の免疫認識を妨げる及び/又はこのような免疫原性治療用組成物に対する免疫原性寛容を選択的に強化するための改良された方法及び組成物に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、抗原提示細胞(例えば、免疫系の抗原提示細胞、例えば樹状細胞)による取込みのために製剤化され得るか、あるいは処置される疾患に応じて又は有効性を増強するために免疫寛容が誘導されるべき治療用タンパク質若しくはウイルスベクターに応じて選択される、1つ以上の抗原と共に同時送達され得る、親油性アリール炭化水素受容体アゴニスト(例えばITE)の有効な送達によって、治療用タンパク質又は遺伝子療法のベクターに関連するネオ抗原の免疫認識を妨げるか又は元に戻すために、及び、そうしなければ潜在的に免疫原性の、治療用組成物に対する寛容の誘導又は維持のために、免疫系、例えば自己免疫の病態を処置するための寛容原性リポソーム(例えば、ナノサイズのリポソーム)を特徴とする。
【０００９】
第1の態様では、本発明は、リポソームの集団を含む組成物を特徴とする。リポソームの集団は、50〜250ナノメートル(nm;例えば、50〜250nm、50〜200nm、50〜150nm、75〜125nm、80〜120nm、90〜110nm、又は95〜105nm、例えば、約60nm、約70nm、約80nm、約90nm、約95nm、約100nm、約105nm、約110nm、約120nm、又は約125nm)の平均径を有し得る。リポソームの集団は、0.3以上(例えば0.4以上)の平均不飽和度指数及びリポソーム当たり平均で200〜15,000個の2-(1H-インドール-3-イルカルボニル)-4-チアゾールカルボン酸メチルエステル(ITE)又はその塩の分子をさらに有し得る。一部の実施形態では、リポソームの集団は、0℃〜70℃の平均相転移温度を有する。一部の実施形態では、リポソームの集団は、飽和脂質種及び不飽和脂質種(例えばモノ不飽和脂質種)を含む脂質混合物を含み、不飽和脂質種は、不飽和結合を有し、脂質混合物の少なくとも50%(例えば、モルパーセンテージで、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%又は少なくとも75%)を占める。一部の実施形態では、不飽和脂質種は、2つの脂質テイルを有し、一方又は両方の脂質テイルが単一の不飽和結合を含む。一部の実施形態では、不飽和脂質種は、天然源、例えば卵又はダイズに由来し、脂質の混合物(例えば、脂肪酸鎖長が異なる)を含み得る。代替の実施形態では、不飽和脂質種は、合成により生成され、単一の定義されたリン脂質化合物からなる。
【００１０】
一部の実施形態では、リポソームの集団は、-60℃〜80℃の平均相転移温度を有する。一部の実施形態では、リポソームの集団は、飽和脂質種及び不飽和脂質種(例えばモノ不飽和脂質種)を含む脂質混合物を含み、不飽和脂質種は、不飽和結合を有し、脂質混合物の少なくとも20%(例えば、質量で又はモルパーセンテージで、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%又はそれより高い割合)を占める。一部の実施形態では、不飽和脂質種は、2つの脂質テイルを有し、一方又は両方の脂質テイルが単一の不飽和結合を含む。一部の実施形態では、不飽和脂質種は、天然源、例えば卵又はダイズに由来し、脂質の混合物を含み得る。代替の実施形態では、不飽和脂質種は、合成により生成され、単一の定義されたリン脂質化合物からなる。
【００１１】
別の態様では、本発明は、50〜250nm(例えば、75〜125nm又は90〜120nm)の平均径を有するリポソームの集団を含む組成物であって、リポソームの集団が、0℃〜70℃の平均相転移温度を有し、リポソーム当たり平均で150〜15,000個(例えば、200〜15,000個)のITE又はその塩の分子を有する、組成物を特徴とする。一部の実施形態では、リポソームの集団は、0.3以上(例えば0.4以上)の平均不飽和度指数を有する。一実施形態では、リポソームの集団は、飽和脂質種及び不飽和脂質種を含む脂質混合物から生成され、不飽和脂質種は、不飽和結合を含み、脂質混合物の少なくとも20%(例えば、少なくとも50%)を占める。一部の実施形態では、不飽和脂質種は、2つの脂質テイルを含み、一方又は両方の脂質テイルは、単一の不飽和結合を含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのリン脂質種の頭部は、少なくとも20個のエチレングリコール単位のポリ(エチレングリコール)鎖の共有結合によって修飾される。
【００１２】
さらに別の態様では、本発明は、50〜250nm(例えば、75〜125nm、又は90〜120nm)の平均径を有するリポソームの集団を含む組成物を特徴とする。このリポソームの集団は、飽和脂質種及び不飽和脂質種を有する脂質混合物を含み得、不飽和脂質種は、不飽和結合を含み、脂質混合物の少なくとも50%を占める。このリポソームの集団は、リポソーム当たり平均で150〜15,000個のITEの分子を有し得る。一部の実施形態では、リポソームの集団は、0℃〜70℃の平均相転移温度を有する。さらに又はあるいは、リポソームの集団は、0.3以上の平均不飽和度指数を有し得る。一部の実施形態では、不飽和脂質種は、2つの脂質テイルを含み、一方又は両方の脂質テイルは、単一の不飽和結合を有する。一部の実施形態では、不飽和炭素-炭素結合は、脂質の遊離末端(例えば、グリセロールに共有結合していない末端)から少なくとも3番目の炭素-炭素結合(例えば、3番目、4番目、5番目、7番目、8番目、9番目、10番目、11番目又は12番目の炭素-炭素結合)である。一部の実施形態では、不飽和炭素-炭素結合は、卵PCにおけるように、脂質の遊離末端から9番目の炭素-炭素結合である。
【００１３】
先述の態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、リポソームの集団は、抗原対ITEの質量比が1:10〜100:1(例えば、1:10〜10:1)の抗原をさらに含み得る。さらに又はあるいは、リポソームの集団は、抗原対ITEのモル比が25:1〜1:200(抗原が8〜50アミノ酸長のペプチドである場合)又はモル比が4:1〜1:5000(抗原がタンパク質である場合)の抗原をさらに含み得る。複数のタンパク質のアセンブリー(例えばウイルスカプシド)では、質量比及びモル比は、これらの範囲を超えてもよい。
【００１４】
別の態様では、本発明は、50〜250ナノメートル(nm;例えば、75〜125nm、又は90〜120nm)の平均径を有するリポソームの集団の組成物を特徴とし、リポソームの集団は、(i)リポソーム当たり平均で150〜15,000個のITE又はその塩の分子、及び(ii)抗原対ITEの質量比が1:10〜100:1(例えば、1:10〜10:1)の抗原を有する。一部の実施形態では、リポソームの集団は、0.3以上の平均不飽和度指数を有する。さらに又はあるいは、リポソームの集団は、0℃〜70℃の平均相転移温度を含む。一部の実施形態では、リポソームの集団は、飽和脂質種及び不飽和脂質種を有する脂質混合物を含み、不飽和脂質種は、不飽和結合を有し、脂質混合物の少なくとも50%を占める。一部の実施形態では、不飽和脂質種は、2つの脂質テイルを含み、各脂質テイルは、単一の不飽和結合を含む。
【００１５】
一部の実施形態では、抗原は、ペプチド抗原(例えば、自己免疫障害、例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、I型糖尿病、重症筋無力症、炎症性腸疾患又はセリアック病に関連するペプチド抗原)である。ペプチドは、1つ以上の翻訳後の変化、例えば、グリコシル化、脂質化又はアミノ酸側変化(例えば、アルギニン若しくはリシンのシトルリンへの変化)の修飾を含み得る。例えば、一部の実施形態では、ペプチド抗原は、配列番号1〜81のいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチド抗原は、配列番号1〜81のいずれかと少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、関節リウマチに関連する(例えば、シトルリン化ベータフィブリノーゲンペプチド、シトルリン化II型コラーゲンペプチド、シトルリン化フィラグリンペプチド又はシトルリン化ビメンチンペプチド(例えば、配列番号1〜4のうちのいずれかのアミノ酸配列を有する))。一部の実施形態では、抗原及び/又はペプチドは、1型糖尿病又は成人の潜在性自己免疫性糖尿病(LADA)に関連する(例えば、プレプロインスリンペプチド、IA-2ペプチド、ホグリン(phogrin)ペプチド、IGRPペプチド、GAD65ペプチド又はクロモグラニンAペプチド、例えば、配列番号5〜81のうちのいずれかのアミノ酸配列を有する抗原)。
【００１６】
一部の実施形態では、本発明は、治療剤(例えば、組換えタンパク質、例えば第VIII因子)に対して対象を寛容化する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、治療剤を対象とする免疫応答(例えば、サイトカイン分泌、抗体生成など)を低減する方法を提供する。一部の実施形態では、寛容が達成されるべき抗原は、治療剤、例えば治療用組換えタンパク質又はその一部である。
【００１７】
一部の実施形態では、抗原は、核酸(すなわち、遺伝子療法ベクター)を送達するために使用されるベクターに由来する。遺伝子療法ベクターとしては、天然及び操作されたウイルスベクター並びに非ウイルスタンパク質、糖タンパク質、脂質、多糖及び核酸をパッケージングし、ヌクレアーゼから核酸を保護するために、及び/又は特定の器官若しくは細胞型に対して核酸を標的化するために使用される他の天然又は非天然ポリマーが挙げられる。核酸は、遺伝子又は遺伝子の部分をコードしてもよく、又は、核酸は、例えばCRISPR(クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート)の遺伝子編集技術におけるように、内在性遺伝子を修復する(correct)ために使用されるDNA断片を含んでもよい。処置を受けている患者の免疫系によって認識され得る遺伝子療法ベクターの任意の構成成分(すなわち、任意のネオ抗原)は、免疫寛容の誘導によって、遺伝子療法の有用性を改善することができる抗原を構成する。
【００１８】
一部の実施形態では、治療剤は、免疫原性である。一部の実施形態では、治療剤は、治療用タンパク質又はペプチドである。一部の実施形態では、治療剤は、ウイルス又はそのカプシドタンパク質である。他の実施形態では、治療剤は、治療用タンパク質若しくはペプチド及び/又はウイルス若しくはそのカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００１９】
一部の実施形態では、治療剤は、ウイルスベクター、例えばAAV、又はそのカプシドタンパク質である。一部の実施形態では、ウイルスベクター、例えばAAVは、DNAを含む。一部の実施形態では、DNAは、一本鎖DNA(ssDNA)、例えばcDNA又はその断片(例えば、ヒトcDNA又はその断片)である。他の実施形態では、ウイルスベクター、例えばAAVは、RNAを含む。一部の実施形態では、RNAは、マイクロRNA(miRNA)である。
【００２０】
先述の実施形態のいずれかでは、リポソームの集団は、-10〜-50mvの平均ゼータ電位を有する。代替の実施形態では、リポソームの集団は、+10〜+40mvの平均ゼータ電位を有する。あるいは、リポソームの集団は、-50〜+40mvの平均ゼータ電位を有する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、自己免疫障害を有する対象を治療する方法を特徴とする。この方法は、先述の実施形態のいずれかの組成物を治療有効量で対象に投与するステップを含み得る。投与は、経口、静脈内、皮下、皮内(例えば表皮内)、経皮、関節内、肺又は粘膜投与であり得る。一部の実施形態では、投与される組成物の用量は、50μg〜15mgのITE、(例えば、75μg〜10mg、75μg〜7.5mg、100μg〜7.5mg、150μg〜5mg、200μg〜5mg、又は250μg〜2.5mgのITE、例えば、50μg〜100μg、100μg〜150μg、150μg〜200μg、200μg〜250μg、250μg〜300μg、300μg〜350μg、350μg〜400μg、400μg〜450μg、450μg〜500μg、500μg〜600μg、600μg〜700μg、700μg〜800μg、800μg〜900μg、900μg〜1.0mg、1.0mg〜5.0mg、5.0mg〜10mg又は10mg〜15mgのITE)を含む。一部の実施形態では、対象は、自己免疫疾患、例えば、I型糖尿病、関節リウマチ若しくはセリアック病などを有するか又はそれを発症するリスクを有し(例えば、遺伝的素因、家族歴若しくは血清学的バイオマーカーに基づく)、あるいは潜在的に抗原性の治療用ペプチド、タンパク質、ウイルスベクター、核酸又は細胞組成物で処置される予定の者である。これらの実施形態のいずれかでは、リポソーム又はその組成物は、治療用タンパク質若しくはペプチド(例えば抗体)又はその部分(例えば、図13に記載されている治療用タンパク質又はその一部)を含み得る。
【００２２】
一部の実施形態では、投与される組成物の用量は、1μg〜10mgのITE、(例えば、10μg〜10mg、50μg〜5mg、100μg〜1mg、150μg〜500μg、200μg〜400μg、又は250μg〜250μgのITE、例えば、1μg〜10μg、10μg〜50μg、50μg〜100μg、100μg〜150μg、150μg〜200μg、200μg〜250μg、250μg〜300μg、300μg〜350μg、350μg〜400μg、400μg〜450μg、450μg〜500μg、500μg〜600μg、600μg〜700μg、700μg〜800μg、800μg〜900μg、900μg〜1.0mg、1.0mg〜5.0mg、又は5.0mg〜10mgのITE)を含む。一部の実施形態では、対象は、関節リウマチ若しくは1型糖尿病を有するか、又はそれを発症するリスクを有する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、治療用組成物(例えば、図13に列挙されている組成物のうちのいずれか)と関連する1つ以上のネオ抗原に対する免疫寛容を誘導し、それによって、利益の中でもとりわけ、薬物動態(例えば、半減期を延長すること)、送達(例えば、ウイルスによる形質導入の効率を増加させること)、複数回用量での処置レジメンの有効性(そうでなければ、免疫応答の遮断を誘導することになる)及び処置(例えば、図13に列挙されている組成物のうちのいずれか)の安全性(例えば、アレルギー反応を防止する)を改善することによって、ペプチド、タンパク質又は遺伝子療法の有効性及び安全性を改善する方法を特徴とする。この方法は、前述の実施形態のいずれかの投与経路により、前述の実施形態のいずれかの組成物を、治療有効量で対象に投与するステップを含み得る。
【００２４】
別の態様では、本発明は、寛容原性リポソーム(例えば、ナノサイズのリポソーム)の集団を合成するか又は製造する方法を特徴とする。この方法は、以下のステップ:(i)2つ以上の脂質種を混合して脂質混合物を形成するステップを含み、脂質混合物は、(a)0.3以上の平均不飽和度指数、(b)0℃〜70℃の平均相転移温度、又は(c)飽和脂質種及び不飽和脂質種であり、不飽和脂質種が不飽和結合を含み脂質混合物の少なくとも50%を占める、飽和脂質種及び不飽和脂質種、を含む。ステップ(ii)は、ITEを脂質混合物に添加するステップを含み、ITEは、乾燥粉末として、又は溶媒、例えばジメチルスルホキシド(DMSO)中に溶解されて、脂質の質量で0.4%〜1%、例えば、0.5%〜1%、0.55%〜0.95%、0.6%〜0.85%、若しくは0.65%〜0.75%の量のITEを脂質混合物(エタノール中に溶解される)に添加するかのいずれかである。ステップ(iii)は、ITEを含有する脂質混合物(エタノール溶液中に溶解される)を水性相に添加し、混合して粗製リポソームを形成するステップを含む。次に、ステップ(iv)は、粗製リポソームを押し出して(例えば、選択された孔径のフィルターを通して)、ナノ粒子状寛容原性リポソーム(例えば、定義されたサイズ範囲、例えば直径50〜250nmの)の集団を形成するステップを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子状寛容原性リポソームの集団は、先述の態様のいずれかの組成物である。一部の実施形態では、リポソームの水性の内部は、1つ以上の抗原を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】図1Aは、様々な濃度のPEG2000-DSPEに対するPEG2000-DSPEミセルにおけるITEカプセル化の有効性を示すチャートである(実施例5を参照のこと)。
【図１Ｂ】図1Bは、ITE負荷に対する、変化するコレステロールモルパーセンテージ及び卵PC濃度の影響を示すチャートである(実施例5を参照のこと)。
【図２】様々な濃度のTPGSに対するTPGSミセルにおけるITEカプセル化の有効性を示すグラフである。
【図３Ａ】マウスの脾臓から単離した樹状細胞における卵PCリポソーム由来ITE又は対照によって誘導されるCyp1a1 mRNA発現(図4A)及びCyp1b1 mRNA発現(図4B)を示すグラフのセットである。ITEを含まないリポソームを、粒子濃度で、ITEリポソームに正規化した。
【図３Ｂ】マウスの脾臓から単離した樹状細胞における卵PCリポソーム由来ITE又は対照によって誘導されるCyp1a1 mRNA発現(図4A)及びCyp1b1 mRNA発現(図4B)を示すグラフのセットである。ITEを含まないリポソームを、粒子濃度で、ITEリポソームに正規化した。
【図４】インビトロでMOGを負荷したナノ粒子で刺激した後の2D2マウスの脾細胞の増殖を示すグラフである。MOGを含まないリポソームを、粒子濃度で、MOGを有する対応物に正規化した。
【図５】実施例6に記載されている、空の(すなわち、プレーンな)卵PCリポソーム(黒丸)、ITEを有する卵PCリポソーム(青い四角)、又はITE及びMOGを有する卵PCリポソーム(緑の三角)で処置したマウスにおけるEAEの進行を示すグラフである。簡潔には、リポソームをHepes緩衝液中に懸濁させ、150μLを7日目に5匹のマウスの群に静脈内投与した(眼窩後部に)。ITEを負荷したリポソームは、1用量当たり7μgのITEを含有した。MOG35-55を負荷したリポソームは、1用量当たり4μgのペプチドを含有した。EAEの臨床徴候について、10日目に開始し、実験の最終日である24日まで継続して、マウスを毎日モニターした。EAEを以下のようにスコア化した:0は疾患の徴候なし、1は尾の緊張の喪失、2は後肢不全麻痺、3は後肢麻痺、4は四肢麻痺、5は瀕死。平均スコア及び平均値の標準誤差を、5匹のマウスの各群について計算した。
【図６】上記及び実施例6に記載されている、空の卵PCリポソーム(黒丸)、ITEを有する卵PCリポソーム(青い四角)、又はITE及びMOGを有する卵PCリポソーム(緑の三角)でインビボにて処置した後に、MOG35-55でエクスビボにて再刺激した際の脾臓由来の細胞の増殖を示す。
【図７Ａ】IL-17陽性T細胞(図7A)及びIFNγ陽性T細胞(図7B)のパーセントにより測定した、エフェクターT細胞のCNSへの浸潤に対する実施例6に記載の処置の効果を示すグラフのセットである。
【図７Ｂ】IL-17陽性T細胞(図7A)及びIFNγ陽性T細胞(図7B)のパーセントにより測定した、エフェクターT細胞のCNSへの浸潤に対する実施例6に記載の処置の効果を示すグラフのセットである。
【図８Ａ】実施例6に記載したように処置したマウスのCNSにおける抗原特異的Treg(図10A)及びTr1細胞(図10B)の増加を示すグラフのセットである。
【図８Ｂ】実施例6に記載したように処置したマウスのCNSにおける抗原特異的Treg(図10A)及びTr1細胞(図10B)の増加を示すグラフのセットである。
【図９Ａ】疾患開始(疾患防止モデル)の1日前に開始したリポソーム(プレーン、II型コラーゲンを負荷、ITEを負荷、及びITE+負荷II型コラーゲンを負荷)による疾患防止に対する、累積重症度スコア及びコラーゲン関節炎を有するマウスの関節炎の肢の数を示すグラフである。
【図９Ｂ】疾患開始(疾患防止モデル)の1日前に開始したリポソーム(プレーン、II型コラーゲンを負荷、ITEを負荷、及びITE+負荷II型コラーゲンを負荷)による疾患防止に対する、累積重症度スコア及びコラーゲン関節炎を有するマウスの関節炎の肢の数を示すグラフである。
【図１０Ａ】疾患開始(疾患防止モデル)の1日前に処置したマウスにおいて、血清中の抗II型コラーゲンIgG2a抗体力価に関するITE+CIIを負荷したリポソームによる処置の効果、関節におけるqPCRによって定量したFoxP3及びIL10のmRNA発現レベル、並びに脾臓におけるCII反応性CD4+エフェクターT細胞の出現頻度をそれぞれ示すグラフのセットである。
【図１０Ｂ】疾患開始(疾患防止モデル)の1日前に処置したマウスにおいて、血清中の抗II型コラーゲンIgG2a抗体力価に関するITE+CIIを負荷したリポソームによる処置の効果、関節におけるqPCRによって定量したFoxP3及びIL10のmRNA発現レベル、並びに脾臓におけるCII反応性CD4+エフェクターT細胞の出現頻度をそれぞれ示すグラフのセットである。
【図１０Ｃ】疾患開始(疾患防止モデル)の1日前に処置したマウスにおいて、血清中の抗II型コラーゲンIgG2a抗体力価に関するITE+CIIを負荷したリポソームによる処置の効果、関節におけるqPCRによって定量したFoxP3及びIL10のmRNA発現レベル、並びに脾臓におけるCII反応性CD4+エフェクターT細胞の出現頻度をそれぞれ示すグラフのセットである。
【図１０Ｄ】疾患開始(疾患防止モデル)の1日前に処置したマウスにおいて、血清中の抗II型コラーゲンIgG2a抗体力価に関するITE+CIIを負荷したリポソームによる処置の効果、関節におけるqPCRによって定量したFoxP3及びIL10のmRNA発現レベル、並びに脾臓におけるCII反応性CD4+エフェクターT細胞の出現頻度をそれぞれ示すグラフのセットである。
【図１１Ａ】疾患開始(疾患治療モデル)後32日目に開始したリポソーム(プレーン、II型コラーゲンを負荷、ITEを負荷、及びITE+負荷II型コラーゲンを負荷)による治療に対するコラーゲン関節炎を有するマウスの応答を示すグラフのセットである。累積重症度スコア(11A)、関節炎の肢の数(11B)及び足の厚さの平均(11C)を示す。
【図１１Ｂ】疾患開始(疾患治療モデル)後32日目に開始したリポソーム(プレーン、II型コラーゲンを負荷、ITEを負荷、及びITE+負荷II型コラーゲンを負荷)による治療に対するコラーゲン関節炎を有するマウスの応答を示すグラフのセットである。累積重症度スコア(11A)、関節炎の肢の数(11B)及び足の厚さの平均(11C)を示す。
【図１１Ｃ】疾患開始(疾患治療モデル)後32日目に開始したリポソーム(プレーン、II型コラーゲンを負荷、ITEを負荷、及びITE+負荷II型コラーゲンを負荷)による治療に対するコラーゲン関節炎を有するマウスの応答を示すグラフのセットである。累積重症度スコア(11A)、関節炎の肢の数(11B)及び足の厚さの平均(11C)を示す。
【図１２Ａ】疾患開始(疾患治療モデル)後32日目から処置したマウスの血清中の抗II型コラーゲンIgG2a及びIgG2b抗体力価に対するITE+CIIを負荷したリポソームによる処置の効果を示すグラフのセットである。
【図１２Ｂ】疾患開始(疾患治療モデル)後32日目から処置したマウスの血清中の抗II型コラーゲンIgG2a及びIgG2b抗体力価に対するITE+CIIを負荷したリポソームによる処置の効果を示すグラフのセットである。
【図１３−１】様々な認可された治療用抗体の概要の表である。
【図１３−２】様々な認可された治療用抗体の概要の表である。
【図１３−３】様々な認可された治療用抗体の概要の表である。
【図１３−４】様々な認可された治療用抗体の概要の表である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
詳細な説明
本発明は、疾患、例えば自己免疫疾患(例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、I型糖尿病、重症筋無力症、炎症性腸疾患及びセリアック病)に対する処置として有用な寛容原性リポソーム(例えば、ナノ粒子状リポソーム)を特徴とする。さらに、本発明は、治療用ペプチド及びタンパク質、ウイルス遺伝子療法ベクター、核酸治療薬及び細胞治療(例えば、輸血による)を含む潜在的に免疫原性の治療用組成物の安全且つ有効な投与(反復投与を含む)を提供する。寛容原性リポソームを使用して、移植された器官(例えば、腎臓、肝臓、肺、心臓又は骨髄移植)の拒絶を低減又は防止し、移植片対宿主病を防止又は処置することもできる。特に、本発明は、関連抗原と一緒に、抗原提示細胞、例えば樹状細胞に対する寛容原性剤として、寛容を誘導するアリール炭化水素受容体リガンドである2-(1H-インドール-3-イルカルボニル)-4-チアゾールカルボン酸メチルエステル(ITE)又はその塩を有効に有するよう構成された脂質組成物を有するリポソームを特徴とする。
【００２７】
定義
他に定義されていなければ、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって、且つ本出願において使用される用語のうちの多くに関する一般的手引きを当業者に与える公開された文書を参照して、通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に示されたものと参照された刊行物のものの間にいずれかの矛盾する定義がある事象では、本明細書で提供される定義が支配することになる。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「ナノサイズのリポソーム」及び「リポソーム」は、50〜250ナノメートル(nm)の間の直径を有する球状の膜結合ベシクルを指す。特定の実施形態では、リポソームは単層であるが、多層リポソームも有用であり本発明に包含される。リポソームの直径は、当技術分野で公知の任意の好適な方法、例えば、動的光散乱(DLS;例えば、ZetaSizer機器を使用する;Malvern Panalytical, Malvern, UK)、ブラウン運動の分析(例えば、NanoSight機器によって提供されるようなナノ粒子トラッキング分析;Malvern Panalytical, Malvern, UK)などを使用して測定することができる。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「ミセル」は、両親媒性分子(例えば両親媒性ポリマー)のアセンブリーによって形成される疎水性コア及び親水性シェルによって特徴付けられる実質的に球状の粒子を指す。ある特定の実施形態では、両親媒性ポリマーが好適な溶媒(例えば水性溶液)中で臨界閾値濃度を超える場合、ミセルが、コア-シェル構造へと自己アセンブルする。外側の(親水性)部分は、ポリエチレングリコールであり得る(例えば、PEG-500、PEG-1000、PEG-2000、PEG-3000、PEG-5000であり、数字はおよその分子量を指す)。(ポリ[エチレングリコール]の各エチレングリコール単位は、44Daプラス非繰り返し末端基に寄与し、故に、PEG-1000は、約22個のエチレングリコール単位を含有する)。両親媒性物質の内側の部分は、脂質、ポリマー、アミノ酸、芳香族化合物、又は組合せであり得る。ミセルの例としては、ポリマー-脂質ミセル(例えば、外側のポリエチレングリコール及び内側の脂肪酸、例えばオレイン酸を含む)、ポリマー-リン脂質ミセル(例えば、ハイブリッドポリマーミセル(例えば、外側の親水性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、及び内側の比較的疎水性のポリマー、例えばポリ(D,L-ラクチド)を含む)が挙げられる。両親媒性物質の親水性部分及び疎水性部分は、標準的な結合化学を使用して、種々の化学基によって接合し得る。例えば、PEGは、ホスホグリセロールを介して脂質に接合し得る。アミド、エステル及び他の連結も当技術分野で公知である。ミセルを形成するのに好適な両親媒性物質は、種々の供給元(例えば、Avanti Polar Lipids、Millipore-Sigma)から市販されている。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「コレステロール」は、広義のコレステロール、すなわち、リン脂質と組み合わせてリポソームを形成することができる関連するステロール及びその誘導体を指す。すなわち、「コレステロール」は、コレステロール様分子、例えばフィトステロール(例えば、β-シトステロール又はスチグマステロール)を包含する。用語「コレステロール」はまた、グリセロールのsn-1又はsn-2位がコレステロールに(リンカーを介して)共有結合により結合しており、他の位置は脂肪酸鎖に結合しているステロール修飾リン脂質を包含する。その全体が本明細書に組み込まれる、Huang及びSzoka、J. Am. Chem. Soc. 2008、130(46):15702〜15712頁を参照のこと。リポソームを形成するのに好適なステロール修飾リン脂質は、Avanti Polar Lipids(Alabaster、Alabama)から市販されている。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「脂質混合物」は、リポソームのレシピで使用される、モノ及び/又はジアシルリン脂質(総称して、リン脂質)のコレステロールとの混合物を指す。様々な頭部(グリセロールに結合している)又は様々なアシル鎖(エステル化されてグリセロールとなる)を有するリン脂質を、様々な比で、コレステロールと組み合わせて、所望の特徴(例えば、有効且つ安定なITE負荷)を有するリポソームを生成することができる。脂質混合物中の脂質構成成分は、パーセントで表現される(すなわち、リポソームの脂質構成成分が合計100%になる)脂質種のモル比で特徴付けることができる。例えば、39mMのリン脂質A(65%)、3mMのリン脂質B(5%)及び18mMのコレステロール(30%)からなるリポソーム混合物は、65:5:30の混合物である。有用な脂質混合物に関する範囲が本明細書に提供される。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「不飽和度指数」は、すべてのリン脂質種及びコレステロール(すなわち、脂質混合物のすべての構成成分)を考慮した、脂肪酸当たりの二重結合の数の重量平均を指す。脂肪酸鎖における第1の二重結合は、全重量(1)を割り当てられる。第2の二重結合は、同じリン脂質の第2の脂肪酸中に存在する場合は、0.4重量を、又は異なるリン脂質中に存在する場合は、0.5重量を割り当てられる。同じ脂肪酸中のさらなる二重結合は、第1の不飽和結合の重量の1/4、1/8、1/16などを与えられる(すなわち、1、0.5又は0.4の1/4、1/8、1/16など)。例えば、等モル量の2つのリン脂質種を有し、一方の種が2つの飽和脂肪酸テイルを有し、他方の種が1つの飽和テイル及び1つのモノ不飽和テイル(すなわち、4つの脂肪酸テイルのうちの1つが、単一の結合において不飽和である)を有するリポソームは、0.25の不飽和度指数を有する。同じ2つのリン脂質から作製され、30%のコレステロールと組み合わされ、35:35:30のモル比となるリポソームは、0.175の不飽和度指数を有する。等モル量の2つの脂質種を有し、一方の種が2つの飽和脂肪酸テイルを有し、他方の種が2つのモノ不飽和テイルを有するリポソームは、0.35(0.25+0.10、すなわち、第1の不飽和脂肪酸テイルが1×0.25重量を、第2の不飽和脂肪酸テイルが0.4×0.25重量を構成する)の不飽和度指数を有する。等モル量の2つの脂質種を有し、一方の種が2つの飽和脂肪酸テイルを有し、他方の種が1つのモノ不飽和テイル及び1つのジ不飽和テイルを有するリポソームは、0.375(0.25+0.10+0.025)の不飽和度指数を有する。さらなる例は、詳細な説明に提供する。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、本明細書に記載の処置又は予防の方法を必要とする任意の哺乳動物を含む。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。このような処置又は予防を必要とする他の哺乳動物としては、イヌ、ネコ又は他の飼育動物、ウマ、家畜、非ヒト霊長類を含む実験動物などが挙げられる。対象は、雄であっても雌であってもよい。一実施形態では、対象は、自己免疫疾患を有する。他の実施形態では、対象は、潜在的に免疫原性のペプチド、タンパク質又は遺伝子療法を受けるべきである。対象は、処置又は予防的治療が有益であり得る任意の年齢であってもよい。例えば、一部の実施形態では、対象は、0〜5歳、5〜10歳、10〜20歳、20〜30歳、30〜50歳、50〜70歳、又は70歳を超える年齢である。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「ネオ抗原」は、免疫系によって認識され、免疫応答を誘導することが可能である、治療剤(例えば、ペプチド、タンパク質又は遺伝子療法)と関連する分子又は分子の部分を指す。免疫応答の性質は、体液性(例えば、機能を阻害するか、半減期を短縮するか又は分解を誘発するネオ抗原に対する抗体を中和する)であっても、細胞性(例えば、ネオ抗原に由来するペプチドのT細胞受容体による認識)であっても、又はその両方であってもよい。ネオ抗原に対する免疫応答は、一般的に、治療有効性を妨げる。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子療法」は、内在性遺伝子の発現を補充するか、修復するか(例えば、遺伝子編集若しくは標的化組換えによって)若しくは変更する(例えば、オリゴヌクレオチド誘導性エクソンスキッピング又はRNA干渉によって)ように、又はがん治療の場合には、がん細胞の脆弱性を利用するように設計された新規機能を提供するように、設計される、任意の核酸ベースの治療剤(天然ヌクレオチドから構成されるか又は非天然ヌクレオチドから構成される)を指す。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子療法ベクター」は、遺伝子療法の細胞浸透度を保護するか(例えばヌクレアーゼから)、導くか(例えば、標的細胞若しくは組織に)、増強するか(例えば、ウイルスによる形質導入によって)又はそうでなければ遺伝子療法の有効性を改善するように設計される、遺伝子療法用組成物の構成成分を指す。しばしば、遺伝子療法ベクターの1つ以上の構成成分は、免疫応答を誘導することが可能である、非天然の要素を含む。ウイルス遺伝子療法ベクターは、遺伝子療法ベクターのうちの1つの重要なカテゴリーを構成する。最も広く使用されるウイルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス及びワクシニアウイルスが挙げられ、そのすべては、複数のバリアントを有する。
【００３７】
本明細書で使用される場合、その組成物の「有効量」又は「有効用量」は、例えば、選択された投与形態、投与経路及び/又は投与スケジュールに従って、細胞又は生物に送達された場合に、所望の生物学的(例えば免疫学的)及び/又は薬理学的効果を達成するのに十分な量を指す。当業者によって認識されるように、有効である特定の組成物の絶対量は、所望の生物学的又は薬理学的目標(例えば、治療有効性の改善若しくは治療効果の延長)、送達される薬剤、標的組織、投与経路、処置される対象の年齢及びサイズ、疾患のステージなどの要因に応じて変わる場合がある。当業者は、「有効量」を細胞と接触させるか又は単回用量で若しくは複数回用量の使用により対象に投与することができることをさらに理解するであろう。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「処置」又はその文法上の派生語は、疾患の進行を低下させること、疾患症状の重症度を低下させること、疾患症状の進行を遅らせること、疾患症状を取り除くこと、又は疾患の発症を遅延させることなどとして定義される。
【００３９】
本明細書で使用される場合、疾患若しくは障害の用語「防止」又はその文法上の派生語は、疾患の発症のリスクを低減すること、疾患の発症を遅延させること、若しくは疾患の重症度を低下させること、又はそれらの任意の組合せのいずれかとして定義される。防止的治療は、典型的には、障害、例えば自己免疫障害を発症するリスクが増大している(一般的集団と比較して)が、疾患診断に対する基準を未だ満たしていない対象に投与される。対象は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載の任意の好適な方法に従って、障害(例えばHLAハプロタイプ)に関連するDNAバリアント(突然変異を含む)を特定することによって、その障害を発症する「リスクがある」と特徴付けることができる。あるいは、対象は、障害の将来の発症と関連する任意のバイオマーカー(例えば自己抗体)に対して対象が陽性である場合に、障害を発症する「リスクがある」と特徴付けることができる。さらに又はあるいは、対象は、その対象が障害の家族歴を有する場合に、その障害を発症する「リスクがある」と特徴付けることができる。治療用ペプチド、タンパク質、ウイルス遺伝子療法ベクター、核酸又は細胞に対する免疫応答の「防止」は、その治療剤への免疫応答を遮断すること、低減すること若しくは遅延させること、又はそれらの任意の組合せのいずれかを意味する。
【００４０】
用語「薬学的に許容される」は、哺乳動物、例えばヒトへの投与に対する安全性を意味する。一部の実施形態では、薬学的に許容される組成物は、連邦政府の規制当局(例えば、米国食品医薬品局)若しくは州政府によって承認されているか、又は動物における、より詳細にはヒトにおける使用について米国薬局方若しくは他の一般的に認識されている薬局方に列挙されている。
【００４１】
用語「担体」は、希釈剤、アジュバント、保存剤若しくは他の賦形剤、又はそれと一緒に本発明のリポソーム組成物が保存される及び/若しくは投与されるビヒクルを指す。好適な薬学的担体の例は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co., Easton, PA.、第2版、2005に記載されている。
【００４２】
用語「a」及び「an」は、「1つ以上の(one or more of)」を意味する。例えば、「遺伝子(a gene)」は、1つ以上のこのような遺伝子を表すと理解される。このように、用語「a」及び「an」、「1つ以上の(one or more of a(or an))」、及び「少なくとも1つの(at least one of a(or an))」は、本明細書において交換可能に使用される。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、他に指定されていなければ、参照値から±10%のばらつき以内の値を指す。
【００４４】
様々な情報源又は参照文献の間の定義における何らかの矛盾には、本明細書で定義される定義が支配することになる。
【００４５】
組成物
本発明は、対象の免疫系の寛容に対して有効なITEを負荷するために構成される脂質組成物を有する、ナノメートルサイズの範囲のリポソームであって、寛容が誘導される1つ以上の抗原を有し得るリポソームを提供する。一部の実施形態では、本発明の組成物は、異なる手段(例えば遊離薬物)によって送達される場合に治療上有効であるものと比較して、より少ない全ITEを対象に送達することが可能である。一部の実施形態では、リポソームの集団は、リポソーム当たり平均で150〜15,000個のITEの分子(例えば、200〜12,500個のITEの分子、250〜10,000個のITEの分子、300〜7,500個のITEの分子、350〜5,000個のITEの分子、400〜2,500個のITEの分子、又は450〜1,000個のITEの分子、例えば、100〜200個のITEの分子、200〜500個のITEの分子、500〜1,000個のITEの分子、1,000〜2,500個のITEの分子、2,500〜5,000個のITEの分子、5,000〜7,500個のITEの分子、7,500〜10,000個のITEの分子、又は10,000〜15,000個のITEの分子)を有する。
【００４６】
本発明のリポソームは、ナノサイズのリポソームであり得る。特定の実施形態では、リポソームの集団は、50〜500nm(例えば、60〜250nm、70〜200nm、80〜150nm、85〜125nm、90〜110nm、又は95〜105nm、例えば、約60nm、約70nm、約80nm、約90nm、約95nm、約100nm、約105nm、約110nm、約120nm、又は約125nm)の平均(例えば、平均値又はメジアン)径を有する。
【００４７】
寛容原性リポソームは、-10mv〜-50mv(例えば、-15mv〜-45mv、-20mv〜-40mv、又は-25mv〜-35mv、例えば、-10mv〜-15mv、-15mv〜-20mv、-20mv〜-25mv、-25mv〜-30mv、-30mv〜-35mv、-35mv〜-40mv、-40mv〜-45mv、又は-45mv〜-50mv、例えば、約-10mv、約-15mv、約-20mv、約-25mv、約-30mv、約-35mv、約-40mv、約-45mv、又は約-50mv)の表面電荷(すなわち、ゼータ電位)を有し得る。あるいは、寛容原性リポソームは、+10mv〜+50mv(例えば、+15mv〜+45mv、+20mv〜+40mv、又は+25mv〜+35mv、例えば、+10mv〜+15mv、+15mv〜+20mv、+20mv〜+25mv、+25mv〜+30mv、+30mv〜+35mv、+35mv〜+40mv、+-40mv〜+45mv、又は+45mv〜+50mv、例えば、約+10mv、約+15mv、約+20mv、約+25mv、約+30mv、約+35mv、約+40mv、約+45mv、又は約+50mv)の陽性表面電荷を有し得る。寛容原性リポソームは、ゼータ電位が-10mv〜+10mvの間の中性範囲内にあってもよい。
【００４８】
脂質
本発明のリポソームは、ITEの有効な負荷及び送達(例えば、免疫系の樹状細胞への)を可能にする脂質組成物によって特徴付けられる。本発明者らは、リポソームが、(i)高い割合の1つ以上の不飽和(例えばモノ不飽和)脂肪酸テイル(例えば、一方又は両方のテイルが、少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含有する)、及び(ii)狭い濃度範囲内のコレステロールを有する脂質混合物から作製され、リポソームの安定性の延長(例えば、3カ月以上)も両立させながら脂質二重層内に治療有効濃度のITEを独自に与えることを発見した。不飽和脂肪酸テイルを有するこのような脂質としては、例えば、卵ホスホコリン(卵PC)、ダイズホスホコリン(ダイズPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(DOPS)、並びに、例えばオレイン酸、パルミトレイン酸及びcis-バクセン酸を含有する、リン脂質が挙げられる。卵PCは、その2つの脂肪酸テイルのうちの1つに二重結合を有し、一方、DOPC、DOPS、オレイン酸、パルミトレイン酸及びcis-バクセン酸はそれぞれ、その2つの脂肪酸テイルの両方に1つの二重結合を有する。ダイズPCは、1つの脂肪酸鎖上に2つの二重結合を有する。卵PC、DOPC及びDOPSの代表的な構造を以下に示す。
【００４９】
【表１】
2021515037.tif 000003
【００５０】
ITEを負荷した寛容原性リポソームの合成において有用な脂質としては、10〜25炭素長(例えば、10〜20、12〜18、又は14〜16炭素長、例えば、10〜12、12〜14、14〜16、16〜18、18〜20、又は20〜25炭素長、例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25を超える炭素長)の脂肪酸テイルを有するものが挙げられる。一部の実施形態では、本発明のリポソームの脂質は、それぞれ14を超える炭素長の1つ又は2つの脂肪酸テイルを有する。好ましい実施形態では、脂質混合物の少なくとも50%は、不飽和脂質(すなわち、その脂肪酸テイルのうちの少なくとも1つにおいて少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を有する)を含む。このような不飽和脂質としては、例えば、卵PC、ダイズPC、DOPC及びDOPSが挙げられる。
【００５１】
単一の不飽和脂肪酸鎖リン脂質はまた、例えば、モノ不飽和リゾホスファチジルコリン(リゾPC)種、例えば、1-(10Z-ヘプタデセノイル)-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(17:1 リゾPC)及び1-ヒドロキシ-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(2-18:1 リゾPC)を含むITEを製剤化するのに有用である。
【００５２】
リポソームの不飽和度指数は、リン脂質(モノ-又はジ-アシル)及びコレステロール又はコレステロール代替物を含むすべての脂質の存在に基づいて脂質混合物中の不飽和脂質の量を定量するために、本明細書において使用される用語である。不飽和度指数は、混合物中に存在する不飽和結合の割合に基づくが、(i)後続の不飽和結合よりも、第1の不飽和結合により重く重みをおき、(ii)同じ脂肪酸鎖における2つの不飽和結合よりも、同じリン脂質の両方の脂肪酸における単一の不飽和結合に重みをおき、且つ(iii)単一のリン脂質においてよりも、異なるリン脂質における不飽和結合に重みをおく。不飽和度指数に寄与するリン脂質を計算するための重み係数を、以下の表にまとめる。リン脂質1及び2は、リポソームを作製するために1:1の比で組み合わされた2つの仮定のジアシルリン脂質を指す(コレステロールからのいかなる寄与も無視する)。FA1及びFA2は、各リン脂質の2つの脂肪アシル鎖を指す。モノアシルリン脂質(例えばリゾPC)は、FA2=0でスコア化されることになる。表中のスコア化した重量は、他のリン脂質組成物にも拡大され得る。
【００５３】
【表２】
2021515037.tif 000004
【００５４】
不飽和度指数は、リポソームを作製するために使用される脂質混合物のすべての脂質構成成分を考慮に入れる。好ましい実施形態では、リポソームは、1つ以上のリン脂質に加えて、コレステロールを含有する。以下の表は、すべて30%コレステロールにおいて(モル比)、いくつかの例示的なリポソームレシピについて、どのようにして不飽和度指数が計算されるかを示す。不飽和C=C結合の重み係数を上記に示す。例えば、表の第1列では、DSPEは不飽和結合を有さず(スコア:0)、卵PCは、2つの脂肪酸鎖のうちの1つにおいて単一の不飽和結合を有し(スコア1×0.5=0.5)且つ65%のモル比で存在し、一方、コレステロールは、脂質全体に対して計数するが、不飽和度指数には寄与しない(スコア:0)。積演算  0.5(卵PCのスコア)×0.65(卵PCのモル比)=0.325、これは列1における脂質混合物中の不飽和度指数である。
【００５５】
【表３】
2021515037.tif 000005
【００５６】
本明細書に記載のリポソームの部分として有用なモノ不飽和脂肪酸の概要を以下にまとめる。
【００５７】
【表４】
2021515037.tif 000006
【００５８】
本発明のリポソームを製剤化する際に有用であり得る他の脂質としては、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC);1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC);1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](PEG2000-DSPE);及びD-アルファ-トコフェロールポリ(エチレングリコール)-1000スクシネート(TPGS-1000)が挙げられる。
【００５９】
外側に面するリン脂質の頭部は、免疫細胞との相互作用に影響を及ぼし得る。例えば、L-セリンで終わるリン脂質(ホスファチジルセリン種)は、免疫細胞において寛容を誘導することができる。この特性は、アポトーシスにおけるホスホ-L-セリンリン脂質の自然の役割を反映する。通常、ホスファチジルセリンは、細胞膜の内葉(層)中に位置する。しかし、ホスファチジルセリンは、アポトーシス細胞又は細胞断片の外葉に出現し、ここで、食細胞中で寛容応答を誘導する。よって、ある特定の実施形態では、L-セリンで終わるリン脂質、例えば、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(DOPS)は、寛容原性リポソームの有用な構成成分である。
【００６０】
ある特定のリゾ-リン脂質(リゾPL、例えば、リゾホスファチジルコリン又はリゾPC)は、DCに寛容原性シグナルをもたらすことができる(Kabarowskiら、Biochem. Pharmacol. 2002、64:161〜167頁;Peterら、J. Biol. Chem. 2008、283:5296〜5305頁、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。よって、ある特定の実施形態では、リゾPL、特に不飽和側鎖を有するリゾPLはまた、寛容原性リポソームを製剤化する際に有用である。
【００６１】
1つ以上の不飽和(例えばモノ不飽和)脂質種は、全脂質の少なくとも50%(モル基準で)を占める場合がある。一部の実施形態では、不飽和(例えばモノ不飽和)脂質種は、リポソームの全脂質の少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、又は少なくとも75%(例えば、リポソームの全脂質の50%〜60%、60%〜65%、65%〜70%、70%〜75%、又は75%〜80%、例えば、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、又は約80%)を占める場合がある。一部の実施形態では、不飽和脂質種は、全脂質の少なくとも25%を占める。
【００６２】
不飽和度指数は、脂質混合物中の不飽和結合の程度の代替の尺度である。一部の実施形態では、リポソームの集団は、0.3以上(例えば、少なくとも0.3、少なくとも0.35、少なくとも0.4、少なくとも0.45、少なくとも0.5、少なくとも0.55、少なくとも0.6、又は少なくとも0.65、例えば、0.3〜0.4、0.4〜0.5、0.5〜0.6、0.6〜0.7、例えば、約0.3、約0.35、約0.4、約0.45、約0.5、約0.55、約0.6、又は約0.65)の平均不飽和度指数を有する。
【００６３】
さらに又はあるいは、リポソームは、ITEの負荷及び送達のために並びにITEを負荷したリポソームの長期安定性のために適する特定の相転移温度によって特徴付けられる脂質組成物を有し得る。一部の実施形態では、リポソームの集団の脂質組成物の平均相転移温度は、0℃〜70℃(例えば、0℃〜5℃、5℃〜-10℃、10℃〜20℃、20℃〜30℃、30℃〜40℃、40℃〜50℃、50℃〜60℃、又は60℃〜65℃、例えば、約0℃、約5℃、約10℃、約20℃、約30℃、約40℃、約50℃、約60℃、約65℃、又は約70℃)である。
【００６４】
寛容原性リポソームは、当技術分野で公知の又は本明細書に記載の任意の好適な方法を使用して作製することができる。一部の実施形態では、ITEは、ミセル転移(例えば、実施例2に記載されているように)によってリポソーム中に負荷される。他の実施形態では、ITEは、エタノール注入(例えば、実施例3に記載されているように)によってリポソーム中で製剤化される。例えば、脂質は、所望の比で組み合わされ、DMSO中でITEを添加する前に、エタノール中に溶解され得る。添加されるITEの体積は、一部の実施形態では、脂質/エタノール溶液の体積の10%を超えない(例えば、9%、8%、7%、6%又は5%を超えない)。ITEは、撹拌しながら、35〜65℃(脂質混合物に基づいて選択した温度)に加熱することによって、10〜30分で脂質混合物中に溶解させることができる。次いで、得られる脂質/ITE/エタノール溶液を、予め温めた抗原を含有するHBS溶液中に移すことができる(例えば、0.001〜10mg/mL、例えば、0.005〜5mg/mL、例えば、約0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.15mg/mL、0.20mg/mL、0.25mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL、8.0mg/mL、9.0mg/mL、又は10mg/mLの濃度で)。リポソームを水性抗原溶液の周りに形成させながら(すなわち、カプセル化しながら)35〜65℃(脂質混合物に基づいて)で撹拌した後、従来の押出し技法を使用して、混合物を一連のポリカーボネート膜に通して、多層の膜を規定サイズ(膜の孔径に基づく)の単層リポソームに変換し、サイズ分布を均一にする。リポソームを複数の200nm及び/又は100nm孔径の膜に首尾よく通すことにより、直径がおよそ90〜100nmの狭い分布(多分散指数<0.05)を有するナノ粒子状のリポソームを得ることができる。リポソームのコアの外側に存在する可溶性抗原を、任意の好適な方法(例えば、濾過、透析又は遠心分離)によってリポソーム懸濁液の外側に流し出すことができる。
【００６５】
自己免疫疾患に関する抗原
一部の実施形態では、本明細書において提供されるリポソームは、1つの又は少数の特異性抗原の寛容化に焦点を当てるために、ITEと同時に製剤化される抗原を含む(例えば、リポソームの水性コア内に)。疾患の原因又はそれ以外では望ましくない免疫応答を誘発する抗原は、ペプチド又はタンパク質(翻訳後修飾を含む)、脂質、ウイルス遺伝子療法ベクター及び核酸からなる。1つ以上の抗原を、リポソーム内でITEと同時に製剤化することができ、又はこれに代えて、2つの抗原が化学的に不適合である場合、それぞれが少なくとも1つの抗原を有し且つすべてがITEを有する2つ以上のリポソーム集団が、生成され得る。
【００６６】
関節リウマチの抗原
リポソームは、組成物が処置すべく構成される病原性免疫応答と関連する任意の抗原を含み得る。例えば、関節リウマチの患者におけるT及びB細胞の自己免疫反応を開始するタンパク質としては、ビメンチン(変異したビメンチンを含む)、フィブリノーゲン、アルファエノラーゼ及びコラーゲンが挙げられ、これらはいずれも、アルギニン又はリシンの代わりに、翻訳後に生じたシトルリンを含有し得る。免疫応答は、これらのタンパク質の翻訳後に修飾されたバリアントを対象とする頻度が高い。これらの最も一般的なタンパク質修飾は、アルギニンの非標準的アミノ酸シトルリンへの酵素による脱イミノ化(ペプチジルアルギニンデイミナーゼによる)、又はリシンのカルバミル化により生じる。関節リウマチの診断のためのシトルリン化ペプチドの使用は周知である。例えば、WO2007/123976は、関節リウマチの診断のための、シトルリン化ペプチドを含むビメンチンペプチドを開示し、WO2007/017556は、関節リウマチの診断のための、シトルリン化ペプチドを含む、II型コラーゲンペプチドを開示し、WO2008/090360は、関節リウマチの診断のための、シトルリン化ペプチドを含む、エノラーゼペプチドの使用について開示する。本発明の抗原として使用することができる関節リウマチ関連抗原としては、タンパク質である、アグリカン、アルファエノラーゼ、II型コラーゲン、ベータフィブリノーゲン、フィラグリン及びビメンチンが挙げられる。これらのタンパク質を製剤化する代替案として、T細胞応答の標的として特定される免疫原性ペプチドを寛容原性リポソーム中で製剤化することができる。関連するペプチド配列は、文献において提供されている(例えば、米国特許出願公開第2016/0024183号)。前述の刊行物のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６７】
US2016/0024183に開示されている具体的な関節リウマチのペプチドは、シトルリン化ベータフィブリノーゲンペプチドCitPAPPPISGGGYCitACit(配列番号1)、シトルリン化II型コラーゲンペプチドACitGLTGCitPGDAK(配列番号2)、シトルリン化フィラグリンペプチドHQCHQESTCitGRSRGRCGRSGS(配列番号3)、シトルリン化ビメンチンペプチドSAVRACitSSVPGVRK(配列番号4)並びにそれらの断片及び組合せを含む。
【００６８】
1型糖尿病の抗原
1型糖尿病及び成人の潜在性自己免疫性糖尿病(LADA)に関連する抗原としては、タンパク質であるプレプロインスリン並びにそのプロセシングされた形態であるプロインスリン及びインスリン;グルタミン酸デカルボキシラーゼ65及び67(GAD65及びGAD67);イモージェン-38;膵島特異的グルコース-6-ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質(IGRP);チロシンホスファターゼ様自己抗原又はインスリノーマ抗原2(同義語:IA-2;ICA512, PTPRN);IA-2β(同義語:ホグリン、ICA512、PTPRN2);膵島細胞抗原69(ICA69);カルボキシペプチダーゼH;亜鉛輸送体8(ZnT8);クロモグラニンAが挙げられる。
【００６９】
その一部は組換え系で発現すること又はリポソーム中で製剤化することが困難である、上記で列挙したタンパク質に加えて又はその代替として、1型糖尿病及びLADAの処置のために、リポソームを寛容化する際に、ペプチドを使用することができる。
【００７０】
有用なプレプロインスリンペプチドは、U.S.6,562,943に開示されており、QPLALEGSLQK(配列番号5)、及びその配列と重複するペプチド、例えば、GGGPGAGSLQPLALEGSLQK(配列番号6)、C19-A3として知られているGSLQPLALEGSLQKRGIV(配列番号7)、又はQPLALEGSLQKRGIVEQ(配列番号8)を含む。
【００７１】
さらなるプレプロインスリンペプチドは、U.S.2007/0129307に開示されており、ALWMRLLPL(配列番号9);HLVEALYLV(配列番号10);B9-23として知られているSHLVEALYLVCGERG(配列番号11);又はDLQVGQVEL(配列番号12)を含む。
【００７２】
有用なIA-2ペプチドは、U.S.6,562,943に開示されており、VSSQFSDAAQASP(配列番号13)、並びに最大5つのN末端アミノ酸及び/又は最大11個のC末端アミノ酸に隣接するVSSQFSDAAQASP(配列番号13)を含有するペプチド、例えば、SRVSSVSSQFSDAAQASPSSHSST(配列番号14);SSVSSQFSDAAQASP(配列番号15);SVSSQFSDAAQASPS(配列番号16);SVSSQFSDAAQASPSSHSS(配列番号17);SVSSQFSDAAQASPSSHSSTPSWC(配列番号18);VSSQFSDAAQASPSS(配列番号19);VSSVSSQFSDAAQASPSSHSS(配列番号20);VSSQFSDAAQASPSSHSSTPSWCE(配列番号21)を含む。
【００７３】
あるいは、IA-2ペプチドは、TQETRTL(配列番号22)、又は最大8個のN末端アミノ酸及び/若しくは最大5個のC末端アミノ酸に隣接するTQETRTL(配列番号22)、例えば、SFYLKNVQTQETRTLTQFH(配列番号23);FYLKNVQTQETRTLTQFHF(配列番号24);YLKNVQTQETRTL(配列番号25);YLKNVQTQETRTLTQ(配列番号26);LKNVQTQETRTLTQF(配列番号27);KNVQTQETRTLTQFH(配列番号28);VQTQETRTLTQFHF(配列番号29);又はTQETRTLTQFHF(配列番号30)であり得る。
【００７４】
あるいは、IA-2ペプチドは、AYQAEPNT(配列番号31)、又は最大9個のN末端アミノ酸及び/若しくは最大11個のC末端アミノ酸に隣接するAYQAEPNT(配列番号31)、例えば、LAKEWQALCAYQAEPNT(配列番号32);LAKEWQALCAYQAEPNTCATAQGE(配列番号33);WQALCAYQAEPNTCATAQ(配列番号34);LCAYQAEPNTCATAQG(配列番号35);AYQAEPNTCATAQ(配列番号36);又はAYQAEPNTCATAQGEGNIK(配列番号37)であり得る。
【００７５】
あるいは、IA-2ペプチドは、CTVIVMLT(配列番号38)、又は最大10個のN末端アミノ酸及び/若しくは最大8個のC末端アミノ酸に隣接するCTVIVMLT(配列番号38)、例えば、DFWQMVWESGCTVIVMLT(配列番号39);FWQMVWESGCTVIVMLTPLV(配列番号40);WQMVWESGCTVIVMLT(配列番号41);MVWESGCTVIVMLTPL(配列番号42);MVWESGCTVIVMLTPLVEDGV(配列番号43);ESGCTVIVMLTPLVEDG(配列番号44);ESGCTVIVMLTPLVEDGV(配列番号45);SGCTVIVMLTPLVEDGVK(配列番号46);GCTVIVMLTPLVED(配列番号47);又はCTVIVMLTPLVEDG(配列番号48)であり得る。
【００７６】
あるいは、IA-2ペプチドは、FEFALTAVAEE(配列番号49)、又は最大4つのN末端アミノ酸及び/若しくは最大7個のC末端アミノ酸に隣接するFEFALTAVAEE(配列番号49)、例えば、SKDQFEFALTAVAEEVNA(配列番号50);SKDQFEFALTAVAEEVNAILK(配列番号51);DQFEFALTAVAEE(配列番号52);DQFEFALTAVAEEVNAI(配列番号53);又はFEFALTAVAEEVNAILKA(配列番号54)であり得る。
【００７７】
あるいは、IA-2ペプチドは、KVESSPSRSDY(配列番号55)、又は最大2つのN末端アミノ酸及び/若しくは最大11個のC末端アミノ酸に隣接するKVESSPSRSDY(配列番号55)、例えば、KLKVESSPSRSDYINAS(配列番号56);KLKVESSPSRSDYINASPIIEHDP(配列番号57);LKVESSPSRSDY(配列番号58);LKVESSPSRSDYINASPII(配列番号59);KVESSPSRSDYI(配列番号60);及びKVESSPSRSDYINASPIIEHDP(配列番号61)であり得る。
【００７８】
あるいは、IA-2ペプチドは、U.S.2007/0129307A1に開示されているペプチドのうちの1つであってもよく、SLSPLQAEL(配列番号62);LLPPLLEHL(配列番号63);GLLYLAQEL(配列番号64);VLAGYGVEL(配列番号65);TLLTLLQLL(配列番号66);SLAAGVKLL(配列番号67);又はVLLTLVALA(配列番号68)を含む。
【００７９】
ペプチドはまた、ホグリンペプチド、IGRPペプチド、IAPPペプチド、GAD65ペプチド又はクロモグラニンAペプチドであり得る。有用なホグリンペプチドは、U.S.2007/0129307A1に開示されており、LLLLLLLLL(配列番号69);LLLLLPPRV(配列番号70);GMAELMAGL(配列番号71);LMAGLMQGV(配列番号72);RLYQEVHRL(配列番号73)、及びSLLDFRRKV(配列番号74)を含む。有用なIGRPペプチドは、U.S.2007/0129307A1に開示されており、FLWSVFMLI(配列番号75);FLFAVGFY(配列番号76);及びRLLCALTSL(配列番号77)を含む。有用なIAPPペプチドは、U.S.2007/0129307A1に開示されており、KLQVFLIVL(配列番号78)及びFLIVLSVAL(配列番号79)を含む。有用なGAD65ペプチドは、WO2016162495:TVYGAFDPLLAVAD(配列番号80)、及びWE-14として知られているクロモグラニンAペプチドWSKMDQLAKELTAE(配列番号81)に開示されている。
【００８０】
前述の刊行物のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８１】
抗原は、上記抗原又はその断片のいずれかと、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるポリペプチドを含有するタンパク質でもあり得る。
【００８２】
上記抗原(以下の表にも列挙されている)は、リポソーム中でITEと同時に製剤化し、1型糖尿病を発症する高いリスクを有するか、又は1型糖尿病を最近発症したか、又はLADAを有する患者を処置するために使用することができる。
【００８３】
【表５】
2021515037.tif 000007
2021515037.tif 000008
【００８４】
ペプチド、タンパク質、及び遺伝子療法に対して寛容化するための抗原
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、抗原(例えば、治療剤、例えば、治療用タンパク質、ウイルスベクター又はナノ粒子と関連する抗原)を含む(例えば、カプセル化する)リポソームを特徴とする。このような実施形態は、例えば、そうでなければ対象が有害な免疫応答を生じる可能性のある抗原に、対象を寛容化するために使用することができる。
【００８５】
一部の実施形態では、本明細書において特徴とされるリポソーム中にカプセル化される抗原は、ネオ抗原である。一部の実施形態では、ネオ抗原に対する免疫は、治療のための曝露に先立つ場合がある。例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)及びヘルペスウイルスは、遍在する。よって、これらのウイルス、又はその修飾されたバージョンを遺伝子療法ベクターとして使用する場合、これらは、ウイルスによる形質導入を妨げる可能性のある、既存の免疫に遭遇する場合がある。また、ウイルスに再度曝露することにより(遺伝子療法の形態で)、より強力な免疫応答を誘発する場合が多い。
【００８６】
一部の実施形態では、ネオ抗原は、治療剤のいずれかの部分(例えば、ペプチド、タンパク質、遺伝子療法又はナノ粒子のいずれかの部分)に由来し得る。ネオ抗原の具体的構造(例えばペプチド配列)が十分に定義されていない場合、治療剤のより大きな断片がリポソーム中で製剤化され、ネオ抗原をもたらし得る。あるいは、治療用ペプチド、タンパク質、ウイルスコートタンパク質又はウイルスの全体が、リポソーム中にカプセル化され得る。
【００８７】
一部の実施形態では、本明細書に記載の治療剤(例えば、本発明のリポソーム中にカプセル化される抗原を含み、ITEも有する治療剤)によって処置することができる疾患又は障害は、以下に限定されないが、自己免疫疾患、アレルギー性疾患(例えば、環境因子、例えば動物のフケ、花粉、イエダニ、虫刺されなどに対するアレルギー、及びナッツ、卵製品、魚介類、穀類などに対する食物アレルギー)、遺伝性疾患(タンパク質補充療法又は遺伝子療法によって処置される)、器官移植(免疫拒絶に、又は骨髄移植の場合には、移植片対宿主病に関連する)、及びペプチド又はタンパク質治療薬によって処置される多種多様な他の疾患(例えば糖尿病)を含み得る。
【００８８】
一部の実施形態では、治療剤(例えば、本発明のリポソーム中にカプセル化される抗原を含み、ITEも有する治療剤)、組成物(例えば、本発明のリポソーム組成物)又は本明細書に記載の方法によって処置することができる自己免疫疾患としては、以下に限定されないが、関節及び結合組織に影響を及ぼす疾患(例えば、強直性脊椎炎、関節リウマチ、若年性突発性関節炎、乾癬性関節炎及び混合性結合組織疾患)、並びに脳に影響を及ぼす疾患(例えば、多発性硬化症及び視神経脊髄炎)、内分泌器官に影響を及ぼす疾患(例えば、I型糖尿病、成人の潜在性自己免疫性糖尿病(LADA)、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病、橋本甲状腺炎及びアディソン病)、消化管に影響を及ぼす疾患(例えば、自己免疫性萎縮性胃炎、悪性貧血、セリアック病、及び炎症性腸疾患(クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む))、皮膚に影響を及ぼす疾患(例えば、乾癬、強皮症、円形脱毛症、アトピー性皮膚炎、尋常性天疱瘡及び水疱性類天疱瘡)、筋肉に影響を及ぼす疾患(例えば、重症筋無力症、ギランバレー症候群及び多発性/皮膚筋炎)、心臓に影響を及ぼす疾患(例えばリウマチ熱)、肝臓に影響を及ぼす疾患(例えば、自己免疫性肝炎及び原発性硬化性胆管炎)、感覚器官に影響を及ぼす疾患(例えば、自己免疫性ブドウ膜炎及びベーチェット病)、血液又は骨髄に影響を及ぼす疾患(例えば、自己免疫溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病及び特発性白血球減少症)、肺に影響を及ぼす疾患(例えばグッドパスチャー症候群)、腎臓に影響を及ぼす疾患(例えば、糸球体腎炎を含む自己免疫性腎炎)、脈管構造に影響を及ぼす疾患(例えばウェゲナー肉芽腫症)、末梢神経系に影響を及ぼす疾患(例えば慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー)、並びに多臓器の関与によって特徴付けられる疾患(例えば、全身性エリテマトーデス及びシューグレン症候群)が挙げられる。
【００８９】
遺伝子療法による処置に関する疾患
一部の実施形態では、遺伝子療法によって処置することができ(例えば、ウイルス遺伝子療法ベクターの投与によって)、したがって、前処置若しくは現在の処置、又はITE及び抗原を含むリポソーム組成物を寛容化することによる治療後処置から利益を得ることができる疾患又は障害としては、以下に限定されないが、リソソーム蓄積疾患/障害、例えば、Santavuori-Haltia病(小児性神経セロイドリポフスチン沈着症1型)、ヤンスキー-ビールショースキー病(遅発型小児性神経セロイドリポフスチン沈着症、2型)、バッテン病(若年型神経セロイドリポフスチン症、3型)、クーフス病(神経セロイドリポフスチン症、4型)、フォンギールケ病(糖原病、Ia型)、糖原病、Ib型、ポンペ病(糖原病、II型)、フォーブス病又はコリ病(糖原病、III型)、ムコリピドーシスII(I細胞病)、ムコリピドーシスIII(偽性ハーラーポリジストロフィー)、ムコリピドーシスIV(シアロリピドーシス)、シスチン症(成人非腎症型)、シスチン症(小児性腎症型)、シスチン症(若年性又は青年性腎症型)、サラ病/小児型シアル酸蓄積障害、及びサポシン欠損;脂質及びスフィンゴ脂質分解の障害、例えば、GM1ガングリオシドーシス(小児性、遅発型小児性/若年性、及び成人型/慢性)、テイサックス病、サンドホフ病、GM2ガングリオシドーシス、Abバリアント、ファブリー病、ゴーシェ病、I、II及びIII型、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病(早発型及び遅発型)、ニーマンピック病、A、B、C1及びC2型、ファーバー病、及びウォルマン病(コレステリルエステル蓄積症);ムコ多糖分解の障害、例えばハーラー症候群(MPSI)、シャイエ症候群(MPS IS)、ハーラーシャイエ症候群(MPS IH/S)、ハンター症候群(MPS II)、サンフィリポA症候群(MPS IIIA)、サンフィリポB症候群(MPS IIIB)、サンフィリポC症候群(MPS IIIC)、サンフィリポD症候群(MPS IIID)、モルキオA症候群(MPS IVA)、モルキオB症候群(MPS IVB)、マロトーラミー症候群(MPS VI)、及びスライ症候群(MPS VII);糖タンパク質分解の障害、例えば、アルファマンノース症、ベータマンノース症、フコシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、ムコリピドーシスI(シアリドーシス)、ガラクトシアリドーシス、シンドラー病、及びII型シンドラー病/神崎病;並びに白質ジストロフィー疾患/障害、例えば、無ベータリポ蛋白血症、新生児副腎白質ジストロフィー、カナバン病、脳腱黄色腫症、ペリツェウスメルツバッヘル病、タンジール病、レフサム病(小児性及び古典的形態)、酸性マルターゼ欠損症(例えば、ポンペ病、糖原病2型、リソソーム蓄積症);カルニチン欠損症;カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損症;脱分枝酵素欠損症(例えば、コリ病又はフォーブス病、糖原病3型);乳酸デヒドロゲナーゼ欠損症(例えば、糖原病11型);ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症;ホスホフルクトキナーゼ欠損症(例えば、垂井病、糖原病7型)、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症(例えば、糖原病9型)、ホスホグリセリン酸ムターゼ欠損症(例えば、糖原病10型)、ホスホリラーゼ欠損症(例えば、マッカードル病、筋ホスホリラーゼ欠損症、糖原病5型)、ゴーシェ病(例えば、第1染色体、酵素グルコセレブロシダーゼが影響を受ける)、軟骨無形成症(例えば、第4染色体、線維芽細胞成長因子受容体3が影響を受ける)、ハンチントン病(例えば、第4染色体、ハンチンチン)、ヘモクロマトーシス(例えば���第6染色体、HFEタンパク質)、嚢胞性線維症(例えば、第7染色体、CFTR)、フリートライヒ運動失調症(第9染色体、フラタキシン)、ベスト病(第11染色体、VMD2)、鎌状赤血球症(第11染色体、ヘモグロビン)、フェニルケトン尿症(第12染色体、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ)、マルファン症候群(第15染色体、フィブリリン)、筋緊張性ジストロフィー(第19染色体、筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ)、副腎白質ジストロフィー(X染色体、ペルオキシソーム中のリグノセロイル-CoAリガーゼ)、デュシェンヌ筋ジストロフィー(X染色体、ジストロフィン)、レット症候群(X染色体、メチルCpG結合タンパク質2)、レーベル遺伝性視神経症(ミトコンドリア、呼吸器タンパク質)、ミトコンドリア脳症、乳酸アシドーシス及び脳卒中(MELAS)(ミトコンドリア、トランスファーRNA)、尿素回路の酵素欠損、鎌状赤血球貧血、筋細管ミオパチー、血友病B、リポタンパク質リパーゼ欠損症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、クリグラーナジャー症候群、ムコリピドーシスIV、ニーマンピック病A、サンフィリポA、サンフィリポB、サンフィリポC、サンフィリポD、ベータ-地中海貧血症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、並びに脂質及びスフィンゴ脂質分解、ムコ多糖分解、糖タンパク質分解における欠損の結果である疾患又は障害、白質ジストロフィーなどが挙げられる。
【００９０】
ウイルスベクター
本発明によって提供されるリポソームは、1つ以上のウイルス(例えばウイルスベクター)、又はその部分、例えば、カプシドタンパク質又はカプシドタンパク質の免疫原性ペプチド断片を含み(例えば、カプセル化し)得る。使用され得るウイルスベクターの例(例えば、本発明の方法が、対象において寛容をもたらす治療剤において)は、当技術分野で公知である及び/又は本明細書に記載されている。好適なウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス(HSV)に基づくベクター、アデノウイルスに基づくベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)に基づくベクター、AAV-アデノウイルスキメラベクター、ワクシニアウイルスに基づくベクター及びセンダイウイルスに基づくベクターが挙げられる。
【００９１】
一部の実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、レトロウイルスに基づく場合がある。レトロウイルス(例えば、レトロウイルス科(Retroviridiae)ファミリーに属するウイルス)は、一本鎖陽性センスRNAゲノムを有し、多種多様な宿主細胞に感染することが可能である。感染の際に、レトロウイルスのゲノムは、宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、自身の逆転写酵素を使用して、そのRNAゲノムからDNAを精製する。次いで、ウイルスのDNAは、宿主DNAと一緒に複製され、ウイルス及び宿主の遺伝子を翻訳及び転写する。レトロウイルスベクターは、ウイルス複製能力がなくなるように操作され得る。このように、レトロウイルスベクターは、インビボでの安定した遺伝子移入に特に有用であると考えられる。本発明において有用なレトロウイルスベクターの例は、例えば、米国特許出願公開第20120009161号、同第20090118212号及び同第20090017543号に見出すことができ、このウイルスベクター及びそれらを作製する方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９２】
レンチウイルスベクターは、本明細書で提供されるようなウイルスベクターの生成に使用することができるレトロウイルスベクターの例である。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染する能力、遺伝子送達ベクターのより有効な方法を構成する特性を有する(例えば、Durandら、Viruses. 2011年2月;3(2):132〜159頁を参照のこと)。レンチウイルスの例としては、HIV(ヒト)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)及びビスナウイルス(ヒツジのレンチウイルス)が挙げられる。他のレトロウイルスとは異なり、HIVに基づくベクターは、そのパッセンジャー遺伝子を非分裂細胞中に組み込むことが知られている。本発明において有用なレンチウイルスベクターの例は、例えば、米国特許出願公開第20150224209号、同第20150203870号、同第20140335607号、同第20140248306号、同第20090148936号及び同第20080254008号に見出すことができ、そのウイルスベクター及びそれらを作製する方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９３】
一部の実施形態では、単純ヘルペスウイルス(HSV)に基づくウイルスベクターは、本明細書で提供されるように使用するのに好適である。多くの複製欠損HSVベクターは、複製を妨げる1つ以上の中間-初期遺伝子を除去するための欠失を含む。ヘルペスベクターの利点は、長期のDNA発現をもたらすことができる潜伏期に侵入する能力、及び最大25kbの外因性DNAを収容することができる大きなウイルスDNAゲノムである。本発明において有用なHSVに基づくベクターの説明については、例えば、そのウイルスベクター及びそれらを作製する方法についての説明が参照によりその全体として組み込まれる、米国特許第5,837,532号、同第5,846,782号、同第5,849,572号及び同第5,804,413号、並びに国際特許出願第WO91/02788号、同第WO96/04394号、同第WO98/15637号及び同第WO99/06583号を参照のこと。
【００９４】
一部の実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、アデノウイルス(Ad)に基づいてもよい。アデノウイルスは、インビボで、DNAを種々の異なる標的細胞型に移入することができる非エンベロープウイルスである。このウイルスは、ウイルスの複製に必要とされる選択遺伝子を欠失させることによって複製欠損にされ得る。消費可能な非複製に必須のE3領域も、より大きなDNAの挿入に対するさらなる余地を可能とするために欠失されることが多い。アデノウイルスベクターは高い力価で生成することができ、DNAを複製細胞及び非複製細胞に効率的に移入することができる。レンチウイルスとは異なり、アデノウイルスのDNAは、ゲノムには組み込まれず、したがって、細胞分裂中には複製されないが、代わりに、宿主の複製機構を使用して宿主細胞の核内で複製する。
【００９５】
本発明において特徴とされるウイルスベクターに基づくアデノウイルスは、任意の起源、任意の下位群、任意のサブタイプ、サブタイプの混合物、又は任意の血清型を形成することができる。例えば、アデノウイルスは、下位群A(例えば、血清型12、18及び31)、下位群B(例えば、血清型3、7、11、14、16、21、34、35及び50)、下位群C(例えば、血清型1、2、5及び6)、下位群D(例えば、血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22〜30、32、33、36〜39、及び42〜48)、下位群E(例えば血清型4)、下位群F(例えば、血清型40及び41)、分類されない血清型(例えば、血清型49及び51)、又は他の任意のアデノウイルス血清型のものであり得る。アデノウイルス血清型1〜51は、American Type Culture Collection(ATCC、Manassas、VA)から入手可能である。非C群アデノウイルス、及びさらに非ヒトアデノウイルスも、複製欠損アデノウイルスベクターを調製するために使用することができる。本発明において有用な非C群アデノウイルスベクター、非C群アデノウイルスベクターを生成する方法、及び非C群アデノウイルスベクターを使用する方法は、例えば、米国特許第5,801,030号、同第5,837,511号及び同第5,849,561号、並びに国際特許出願第WO97/12986号及び同第WO98/53087号に開示されている。任意のアデノウイルス、キメラアデノウイルスでさえも、アデノウイルスベクターに関するウイルスゲノムの供給源として使用することができる。例えば、ヒトアデノウイルスは、複製欠損アデノウイルスベクターに関するウイルスゲノムの供給源として使用することができる。本発明において有用なアデノウイルスベクターのさらなる例は、米国特許出願公開第20150093831号、同第20140248305号、同第20120283318号、同第20100008889号、同第20090175897号及び同第20090088398号に見出すことができ、そのウイルスベクター及びそれらを作製する方法についての記載は、参照によりその全体が組み込まれる。
【００９６】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、AAVにも基づき得る。AAVベクターは、治療用途、例えば本明細書に記載のものにおいて使用するのに特に興味深いものであった。AAVは、ヒト疾患を引き起こすことが知られていないDNAウイルスである。一般的に、AAVは、効率的な複製のために、ヘルパーウイルス(例えば、アデノウイルス又はヘルペスウイルス)との同時感染、又はヘルパー遺伝子の発現を必要とする。AAVは、特定の部位で宿主細胞のゲノムに安定的に感染し、レトロウイルスよりもより予測可能となる能力を有するが、しかし、一般的には、ベクターのクローニング能は4.9kbである。遺伝子療法適用において使用されてきたAAVベクターは、欠失した親ゲノムのおよそ96%を一般に有しており、その結果、DNA複製及びパッケージングに関する認識シグナルを含む末端反復配列(ITR)のみが残る。本発明において有用なAAVベースのベクターの説明については、例えば、そのウイルスベクター及びそれらを作製する方法が参照によりその全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第8,679,837号、同第8,637,255号、同第8,409,842号、同第7,803,622号及び同第7,790,449号、並びに米国特許出願公開第0150065562号、同第20140155469号、同第20140037585号、同第20130096182号、同第20120100606号及び同第20070036757号を参照のこと。AAVベクターは、組換えAAVベクターであってもよい。AAVベクターはまた、自己相補的(sc)AAVベクターであってもよく、これらは、例えば、米国特許出願公開第2007/01110724号及び同第2004/0029106号、並びに米国特許第7,465,583号及び同第7,186,699号に記載されており、そのベクター及び生成方法は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９７】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物に含まれるウイルスベクター(例えば、AAVベクター)は、RNA分子を送達するように構成される。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、低分子干渉RNA(siRNA)を送達するよう構成される。他の実施形態では、ウイルスベクターは、マイクロRNA(miRNA)、短ヘアピン型RNA(shRNA)、mRNA、又は低分子活性化RNA(saRNA)を送達するように構成される。代替の実施形態では、ウイルスベクターは、一本鎖DNA(ssDNA)を含むDNA分子(cDNA又はその断片をコードしていてもよい)を送達するように構成される。
【００９８】
ウイルスベクターのベースとなるAAVは、任意の血清型又は血清型の混合物であり得る。AAVの血清型は、AAVl、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVl0、及びAAVllを含む。例えば、ウイルスベクターが血清型の混合物をベースとする場合、ウイルスベクターは、1つのAAV血清型(例えば、AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及び11のうちのいずれか1つから選択される)から得られるカプシドシグナル配列と、異なる血清型(例えば、AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及び11のうちのいずれか1つから選択される)からのパッケージング配列を含有し得る。したがって、本明細書で提供される方法又は組成物のうちのいずれか1つの一部の実施形態では、AAVベクターはAAV 2/8ベクターである。本明細書で提供される方法又は組成物のうちのいずれか1つの他の実施形態では、AAVベクターはAAV 2/5ベクターである。
【００９９】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、アルファウイルスに基づき得る。アルファウイルスとしては、シンドビス(及びVEEV)ウイルス、アウラウイルス、ババンキウイルス(Babanki virus)、バーマフォレストウイルス(Barmah Forest virus)、ベバルウイルス、カバソウウイルス(Cabassou virus)、チクングニアウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エバーグレードウイルス(Everglades virus)、フォートモーガンウイルス(Fort Morgan virus)、ゲタウイルス、ハイランドJウイルス(Highlands J virus)、キジラガチウイルス(Kyzylagach virus)、マヤロウイルス、メトリウイルス(Me Tri virus)、ミデルバーグウイルス(Middelburg virus)、マッソダスペドラスウイルス(Masso das Pedras virus)、ムカンボウイルス、ヌドゥムウイルス、オニョンニョンウイルス、ピクスナウイルス、リオネグロウイルス、ロスリバーウイルス、サケ膵臓病ウイルス(Salmon pancreas disease virus)、セムリキ森林ウイルス、ミナミゾウアザラシウイルス(Southern elephant seal virus)、トナテウイルス(Tonate virus)、トロカラウイルス(Trocara virus)、ウナウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス及びワタロアウイルスが挙げられる。一般的には、このようなウイルスのゲノムは、宿主細胞の細胞質内で翻訳され得る非構造的タンパク質(例えばレプリコン)及び構造的タンパク質(例えば、カプシド及びエンベロープ)をコードする。ロスリバーウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス(SFV)及びベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)はすべて、導入遺伝子の送達のためのウイルスベクターを開発するために使用されてきた。偽型ウイルスは、アルファウイルスのエンベロープ糖タンパク質とレトロウイルスのカプシドを組み合わせることによって形成することができる。アルファウイルスベクターの例は、米国特許出願公開第20150050243号、同第20090305344号及び同第20060177819号に見出すことができ、このベクター及びそれらを作製する方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ウイルスベクターを使用して、遺伝子編集を含む種々の目的で導入遺伝子を送達することができ、本明細書で提供される方法及び組成物にも適用可能である。
【０１００】
ウイルスベクター:治療用タンパク質又はその部分
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、本明細書で提供される治療用タンパク質又はその部分をコードする導入遺伝子を含み得る。このようなタンパク質の例としては、以下に限定されないが、不溶解性又は注入可能な治療用タンパク質、酵素、酵素補因子、ホルモン、血液又は血液凝固因子、サイトカイン及びインターフェロン、成長因子、アディポカイン、モノクローナル抗体などが挙げられる。
【０１０１】
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、酵素をコードする導入遺伝子を含んでもよい(例えば酵素補充療法用)。このような酵素の例としては、以下に限定されないが、リゾチーム、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、アスパラギナーゼ、ウリカーゼ、グリコシダーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ヘパリナーゼ、ヘパラナーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、リシン及びリガーゼが挙げられる。酵素の他の例としては、以下に限定されないが、イミグルセラーゼ(例えばCEREZYME(商標))、a-ガラクトシダーゼA(a-gal A)(例えば、アガルシダーゼベータ、FABRYZYME)、酸a-グルコシダーゼ(GAA)(例えば、アグルコシダーゼアルファ、LUMIZYME(商標)、MYOZYME(商標))、及びアリールスルファターゼB(例えば、ラロニダーゼ、ALDURAZYME(商標)、イデュルスルファーゼ、ELAPRASE(商標)、アリールスルファターゼB、NAGLAZYME(商標))を含む、酵素補充療法に使用されるものが挙げられる。
【０１０２】
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、血液又は血液凝固因子をコードする導入遺伝子を含み得る。このような血液又は血液凝固因子の例としては、以下に限定されないが、第I因子(フィブリノーゲン)、第II因子(プロトロンビン)、組織因子、第V因子(プロアクセレリン、不安定因子)、第VII因子(安定因子、プロコンベルチン)、第VIII因子(抗血友病グロブリン)、第IX因子(クリスマス因子、血漿トロンボプラスチン構成成分)、第X因子(スチュワート-プロワー因子)、第Xa因子、第XI因子、第XII因子(ハーゲマン因子)、第XIII因子(フィブリン安定化因子)、フォンウィルブランド因子、フォンヘルデブラント因子、プレカリクレイン(フレッチャー因子)、高分子量キニノーゲン(HMWK)(フィッツジェラルド因子)、フィブロネクチン、フィブリン、トロンビン、抗トロンビン、例えば、抗トロンビンIII、ヘパリン補因子II、プロテインC、プロテインS、プロテインZ、プロテインZ関連プロテアーゼ阻害剤(ZPI)、プラスミノーゲン、アルファ2-抗プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤-1(PAI1)、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤-2(PAI2)、がん凝血原、及びエポエチンアルファ(Epogen、Procrit)が挙げられる。
【０１０３】
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、サイトカインをコードする導入遺伝子を含み得る。このようなサイトカインの例としては、以下に限定されないが、リンフォカイン、インターロイキン及びケモカイン、1型サイトカイン、例えばIFN-y、TGF-b、並びに2型サイトカイン、例えばIL-4、IL-10及びIL-13が挙げられる。
【０１０４】
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、成長因子をコードする導入遺伝子を含み得る。このような成長因子の例としては、以下に限定されないが、アドレノメデュリン(AM)、アンジオポエチン(Ang)、自己分泌型細胞運動刺激因子、骨形成タンパク質(BMP)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、上皮成長因子(EGF)、エリスロポエチン(EPO)、線維芽細胞成長因子(FGF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、成長分化因子-9(GDF9)、肝細胞成長因子(HGF)、肝がん由来成長因子(HDGF)、インスリン様成長因子(IGF)、マイグレーション刺激因子、ミオスタチン(GDF-8)、神経成長因子(NGF)及び他のニューロトロフィン、血小板由来成長因子(PDGF)、トロンボポエチン(TPO)、トランスフォーミング成長因子アルファ(TGF-α)、トランスフォーミング成長因子ベータ(TGF-β)、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)、血管内皮成長因子(VEGF)、Wntシグナル経路、胎盤成長因子(PIGF)、[(ウシ胎児ソマトトロピン)](FBS)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6及びIL-7が挙げられる。
【０１０５】
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アディポカインをコードする導入遺伝子を含み得る。このようなアディポカインの例としては、以下に限定されないが、レプチン及びアディポネクチンが挙げられる。
【０１０６】
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、受容体、シグナル伝達タンパク質、細胞骨格タンパク質、足場タンパク質、転写因子、構造タンパク質、膜タンパク質、細胞質タンパク質、結合タンパク質、核タンパク質、分泌タンパク質、ゴルジタンパク質、小胞体タンパク質、ミトコンドリアタンパク質及び小胞タンパク質のうちの1つ以上をコードする導入遺伝子を含み得る。
【０１０７】
さらに、ウイルスベクターは、他の治療用タンパク質、例えば、脂質及びスフィンゴ脂質分解の障害(例えば、ガラクトシダーゼ1、ヘキソサミニダーゼA、ヘキソサミニダーゼA及びB、GM2活性化タンパク質、8-ガラクトシダーゼA、グルコセレブロシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼA、ガラクトシルセラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、NPCI、酸セラミダーゼ、リゾリーマル酸リパーゼ);ムコ多糖分解の障害(例えば、L-イズロニダーゼ、イズロネートスルファターゼ、ヘパランN-スルファターゼ、N-アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル-CoA-グルコサミニダーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、アセチルグルコサミン-6-スルファターゼ、ガラクトサミン-6-スルファターゼ、アリールスルファターゼB、グルクロニダーゼ);糖タンパク質分解の障害(例えば、マンノシダーゼ、マンノシダーゼ、1-フコシダーゼ、アスパルチルグリコサミニダーゼ、ノイラミニダーゼ、リソソーム保護タンパク質、リソソーム8-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、リソソーム8-N-アセチルガラクトサミニダーゼ);リソソーム蓄積症障害(例えば、パルミトイル-タンパク質チオエステラーゼ、少なくとも4つのサブタイプ、リソソーム膜タンパク質、未知、グルコース-6-ホスファターゼ、グルコース-6-リン酸転位酵素、酸マルターゼ、脱分枝酵素アミロ-1,6グルコシダーゼ、N-アセチルグルコサミン-1-ホスホトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミン-1-ホスホトランスフェラーゼ、ガングリオシドシアリダーゼ(ノイラミニダーゼ)、リソソームシスチン輸送タンパク質、リソソームシスチン輸送タンパク質、リソソームシスチン輸送タンパク質、シアル酸輸送タンパク質サポシン、A、B、C、D)及び白質ジストロフィー(例えば、ミクロソームトリグリセリド転移タンパク質/アポリポタンパク質B、ペルオキシソーム膜転移タンパク質、ペルオキシン、アスパルトアシラーゼ、ステロール-27-ヒドロキシラーゼ、プロテオリピドタンパク質、ABCトランスポーター、ペルオキシソーム膜タンパク質3又はペルオキシソーム生物発生因子1、フィタン酸オキシダーゼ)に関連するタンパク質の機能的バージョンをコードする導入遺伝子を含み得る。
【０１０８】
ウイルスベクター:遺伝子編集
一部の実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクター(例えば、本発明の方法及び組成物を使用して、寛容が誘導され得る治療剤として使用され得るウイルスベクター)は、遺伝子編集に使用することができる。このような実施形態では、ウイルスベクターの導入遺伝子は、遺伝子編集の導入遺伝子である。このような導入遺伝子は、遺伝子編集プロセスに関与する構成成分をコードする。一般的には、このようなプロセスは、ゲノムDNAに、長期に及ぶか又は永続的な修飾、例えば、標的DNAの挿入、置換え、突然変異誘発又は除去をもたらす。遺伝子編集は、目的のDNA配列をコードする核酸の送達及びエンドヌクレアーゼを使用してゲノムDNAにおける標的部位に目的の配列を挿入することを含み得る。よって、遺伝子編集の導入遺伝子は、挿入のために、目的のDNA配列をコードするこれらの核酸を含み得る。一部の実施形態では、挿入のためのDNA配列は、本明細書で提供される治療用タンパク質のうちのいずれか1つをコードするDNA配列又はその一部である。あるいは又はさらに、遺伝子編集の導入遺伝子は、遺伝子編集プロセスを実行する1つ以上の構成成分をコードする核酸を含み得る。本明細書で提供される遺伝子編集の導入遺伝子は、エンドヌクレアーゼ及び/又はガイドRNAなどをコードしてもよい。
【０１０９】
エンドヌクレアーゼは、ゲノムの所望の位置で、二本鎖DNAに切断を生じさせ、宿主細胞の機序を使用して、相同組換え、非相同末端結合などを使用して切断を修復することができる。遺伝子編集のために使用することができるエンドヌクレアーゼの分類は、以下に限定されないが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)及びホーミングエンドヌクレアーゼを含む。本明細書で提供されるウイルスベクターの遺伝子編集の導入遺伝子は、本明細書で提供されるエンドヌクレアーゼのうちのいずれか1つをコードしてもよい。
【０１１０】
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、メガヌクレアーゼをコードする導入遺伝子を含み得る。メガヌクレアーゼは、一般的には、DNA配列(14〜40塩基対)を認識及び切断する能力によって特徴付けられる。さらに、公知の技法、例えば、突然変異誘発及びハイスループットスクリーニング及びコンビナトリアルアセンブリーを使用して、タンパク質のサブユニットを会合又は融合させることができるカスタムメガヌクレアーゼを作成することができる。メガヌクレアーゼの例は、米国特許第8,802,437号、同第8,445,251号及び同第8,338,157号、並びに米国特許出願公開第20130224863号、同第20110113509号及び同第20110033935号に見出すことができ、これらのメガヌクレアーゼは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１１】
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする導入遺伝子を含み得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、典型的には、核酸分子内の特異的標的部位に結合するジンクフィンガードメイン、及び結合ドメインによって結合した標的部位内又はその近位の核酸分子を切断する核酸切断ドメインを含む。典型的な操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼは、3〜6個の個々のジンクフィンガーモチーフ及び9塩基対〜18塩基対の範囲の長さの結合標的部位を有する結合ドメインを含む。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、切断のために、所与の核酸分子において任意の所望の配列を実際に標的とするよう設計され得る。例えば、所望の特異性を有するジンクフィンガー結合ドメインは、公知の特異性の個々のジンクフィンガーモチーフを組み合わせることによって設計することができる。DNAに結合したジンクフィンガータンパク質Zif268の構造について、この分野の研究の多くが情報を提供しており、64個の可能な塩基対トリプレットのそれぞれに対してジンクフィンガーを得て、次いで、これらのモジュラージンクフィンガーを混合及びマッチングして、任意の所望の配列特異性を有するタンパク質を設計するという概念が記載されている(Pavletich N P, Pabo C O(May 1991). 「Zinc finger-DNA recognition:crystal structure of a Zif268-DNA complex at 2.1 A」. Science 252(5007):809〜17頁、この内容の全体は本明細書に組み込まれる)。一部の実施形態では、細菌又はファージディスプレイを用いて、所望の核酸配列、例えば、所望のエンドヌクレアーゼ標的部位を認識するジンクフィンガードメインを開発する。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、一部の実施形態では、融合しているか又はそうでなければリンカー、例えばポリペプチドリンカーを介して互いにコンジュゲートしているジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ドメインを含む。リンカーの長さにより、ジンクフィンガードメインによって結合した核酸配列からの切断の距離が決定され得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼの例は、米国特許第8,956,828号、同第8,921,112号、同第8,846,578号、同第8,569,253号に見出すことができ、これらのジンクフィンガーヌクレアーゼは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)をコードする導入遺伝子を含み得る。TALENは、特異的なDNA結合ドメインを一般的なDNA切断ドメインに融合させることによって生成される人工的制限酵素である。任意の所望のDNA配列に結合するよう設計され得るDNA結合ドメインは、植物に感染する特定の細菌によって排出されるDNA結合タンパク質である、転写アクチベーター様(TAL)エフェクターからのものである。転写アクチベーター様エフェクター(TALE)を操作して、任意のDNA配列に事実上結合するか又はDNA切断ドメインと組み合わせて、アレイ中に一緒に接合することができる。同様に、TALENを使用して、ジンクフィンガーヌクレアーゼを設計することができる。TALENの例は、米国特許第8,697,853号、並びに米国特許出願公開第20150118216号、同第20150079064号及び同第20140087426号に見出すことができ、これらのTALENは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１３】
CRISPR(クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート)/Casシステムも遺伝子編集のためのツールとして使用することができる。CRISPR/Casシステムでは、ガイドRNA(gRNA)は、ゲノムに又はエピソームに(例えばプラスミド上に)コードされる。gRNAは、エンドヌクレアーゼ、例えばCas9エンドヌクレアーゼと複合体を形成し、その後転写を行う。次いで、複合体は、DNA標的配列へとgRNAの特異性決定配列(SDS)によってガイドされ、典型的には細胞のゲノムに位置する。Cas9又はCas9エンドヌクレアーゼは、Cas9タンパク質を含むRNAガイドエンドヌクレアーゼ、又はその断片を指す(例えば、Cas9の活性若しくは不活性DNA切断ドメイン又は部分的に不活性なDNA切断ドメイン(例えば、Cas9ニッカーゼ)、及び/又はCas9のgRNA結合ドメインを含むタンパク質)。Cas9は、自己対非自己を識別する助けとなるために、CRISPR繰り返し配列における短いモチーフ(PAM又はプロトスペーサー隣接モチーフ)を認識する。Cas9エンドヌクレアーゼ配列及び構造は、当業者に周知である(例えば、「Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyo- genes.」Ferretti J. J.、McShan W. M.、Ajdic D. J.、Savic D. J.、Savic G.、Lyon K.、Primeaux C.、Sezate S.、Suvorov A. N.、Kenton S.、Lai H. S.、Lin S. P.、Qian Y.、Jia H. G.、Najar F. Z.、Ren Q.、Zhu H.、Song L. expand/collapse author list McLaughlin R. E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658〜4663頁(2001);「CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.」 Deltcheva E.、Chylin- ski K.、Sharma C. M.、Gonzales K.、Chao Y.、Pirzada Z. A.、Eckert M. R.、Vogel J.、Charpentier E.、Nature 471:602〜607頁(2011);及び「A programmable dual-RNA-guidedDNAendo- nuclease in adaptive bacterial immunity.」 Jinek M.、Chylinski K.、Fonfara I.、Hauer M.、Doudna J. A.、Charpentier E. Sci- ence 337:816〜821頁(2012)を参照のこと)。単一のガイドRNA(「sgRNA」、又は単に「gNRA」)を、crRNAとtracrRNAの両方の態様を単一のRNA種へと組み込むために操作することができる。例えば、Jinek M.、Chylinski K.、Fonfara I.、Hauer M.、Doudna J. A.、Charpentier E. Science 337:816〜821頁(2012)を参照のこと。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする導入遺伝子を含み得る。
【０１１４】
Cas9オルソログについては、以下に限定されないが、化膿性連鎖球菌(S. pyogenes)及びS. サーモフィラス(S. thermophilus)を含む様々な種において記載されてきた。さらに適切なCas9エンドヌクレアーゼ及び配列は、当業者にとって明らかであり、このようなCas9エンドヌクレアーゼ及び配列は、Chylinski、Rhun及びCharpentier、「The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems」(2013)RNA Biology 10:5、726〜737頁に開示されている生物及び遺伝子座に由来するCas9配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子編集の導入遺伝子は、野生型Cas9、断片又はCas9バリアントをコードする。「Cas9バリアント」は、天然に存在するようなCas9野生型エンドヌクレアーゼとは同一ではないCas9の機能を有する任意のタンパク質である。一部の実施形態では、Cas9バリアントは、野生型Cas9、又はその断片と相同性を共有する。Cas9バリアントは、一部の実施形態では、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)又はS. サーモフィラスのCas9タンパク質と少なくとも40%の配列同一性を有し、Cas9の機能性を保持する。好ましくは、配列同一性は、少なくとも90%、95%、又はそれより高い割合である。より好ましくは、配列同一性は、少なくとも98%又は99%の配列同一性である。本明細書で提供される方法のいずれか1つにおいて使用するためのCas9バリアントのうちのいずれか1つの一部の実施形態では、配列同一性は、アミノ酸配列の同一性である。Cas9バリアントは、Cas9二量体、Cas9融合タンパク質、Cas9断片、最小化したCas9タンパク質、切断ドメインを含まないCas9バリアント、gRNAドメインを含まないCas9バリアント、Cas9リコンビナーゼ融合対、fCas9、FokI-dCas9なども含む。このようなCas9バリアントの例は、例えば、米国特許出願公開第20150071898号及び同第20150071899号に見出すことができ、これらのCas9タンパク質及びCas9バリアントについての記載は、参照により本明細書に組み込まれる。Cas9バリアントは、Cas9ニッカーゼも含み、これは、Cas9の単一のエンドヌクレアーゼドメインを不活性化する変異を含む。このようなニッカーゼは、二本鎖の切断とは逆に、標的核酸における一本鎖の切断を含み得る。Cas9バリアントはまた、Cas9ヌルヌクレアーゼ、1つのヌクレアーゼドメインが変異によって不活性化されるCas9バリアントを含む。さらなるCas9バリアント及び/又はさらなるCas9バリアントを特定する方法の例は、米国特許出願公開第20140357523号、同第20150165054号及び同第20150166980号に見出すことができ、Cas9タンパク質、Cas9バリアント及びこれらの特定方法に関するこれらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
Cas9バリアントのさらに他の例は、ニッカーゼ活性のみを有する、Cas9D10Aとして知られている変異形態を含む。Cas9D10Aは、遺伝子座が、隣接するDNAニックを生じるように設計された、対合したCas9複合体によって標的とされる場合に、標的特異性の点で魅力的である。Cas9バリアントの別の例は、ヌクレアーゼ欠損Cas9(dCas9)である。HNHドメインにおける変異H840A及びRuvCドメインにおける変異D10Aは、切断活性を不活性化するが、DNA結合を妨げはしない。したがって、このバリアントを使用して、切断なしにゲノムの任意の領域を配列特異的に標的とすることができる。代わりに、様々なエフェクタードメインと融合させることによって、dCas9を遺伝子サイレンシング又は活性化のツールとして使用することができる。遺伝子編集の導入遺伝子は、一部の実施形態では、本明細書で提供されるCas9バリアントのうちのいずれか1つをコードし得る。
【０１１６】
部位特異的切断(例えば、ゲノムを修飾するため)のために、RNAによってプログラミング可能なエンドヌクレアーゼ、例えばCas9を使用する方法は当技術分野で公知である(例えば、Cong, L.ら Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339、819〜823頁(2013);Mali, P.ら RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339、823〜826頁(2013);Hwang, W.Y.ら Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31、227〜229頁(2013);Jinek, M. ら RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2、e00471(2013);Dicarlo, J.E.ら Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research(2013);Jiang, W.ら RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31、233〜239頁(2013)を参照のこと)。
【０１１７】
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ホーミングエンドヌクレアーゼをコードする導入遺伝子を含み得る。ホーミングエンドヌクレアーゼは、少ない又は唯一の位置で、これらを合成するために使用されるゲノムDNAの加水分解を触媒し、これによって、対立遺伝子の出現頻度を増大させながら、宿主内にそれらの遺伝子を水平方向に伝達することができる。ホーミングエンドヌクレアーゼは、一般的に、長い認識配列を有し、それによって、ランダム切断の確率が低くなる。1つの対立遺伝子は、伝達の前に、遺伝子(ホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子+、HEG+)を有するが、他の対立遺伝子は有さず(HEG-)、酵素切断を受けやすい。酵素は、一旦合成されると、HEG対立遺伝子の染色体を切断し、組換え、未損傷のDNA対立遺伝子、エンドヌクレアーゼに関する遺伝子を含有するHEG+を使用して、反対のパターンを得る細胞内DNA修復系からの応答を開始する。よって、遺伝子は、最初はそれを有さなかった別の対立遺伝子に複製され、連続的に伝播する。ホーミングエンドヌクレアーゼの例は、例えば、米国特許出願公開第20150166969号及び米国特許第9,005,973号に見出すことができ、これらのホーミングエンドヌクレアーゼは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１８】
導入遺伝子の配列は、発現制御配列も含み得る。発現制御DNA配列は、プロモーター、エンハンサー及びオペレーターを含み、一般的には、発現コンストラクトが利用される発現系に基づいて選択される。一部の実施形態では、プロモーター及びエンハンサー配列は、遺伝子の発現を増加させる能力について選択されるが、一方、オペレーター配列は、遺伝子の発現を調節する能力について選択され得る。導入遺伝子は、宿主細胞において相同組換えを容易にする、好ましくは促進する配列も含み得る。導入遺伝子は、宿主細胞において複製に必須の配列も含み得る。
【０１１９】
例示的な発現制御配列として、プロモーター配列、例えば、サイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター及びシミアンウイルス40プロモーター、並びに他に本明細書で開示されているか又はその他に当技術分野で公知の任意の他の種類のプロモーターが挙げられる。一般的に、プロモーターは、所望の発現産物をコードする配列の上流(すなわち、5')に作動可能に連結している。導入遺伝子は、コード配列の下流(すなわち、3')に作動可能に連結している好適なポリアデニル化配列(例えば、SV40又はヒト成長ホルモン遺伝子ポリアデニル化配列)も含み得る。
【０１２０】
ITE化学量論に対する抗原
抗原及び処置される疾患の種類に応じて、様々な抗原対ITE比を使用することができる。一部の例では、抗原対ITEの質量比は、1:10〜100:1(例えば、1:5〜50:1、1:4〜20:1、又は1:3〜10:1、例えば、1:10〜1:8、1:8〜1:6、1:6〜1:4、1:4〜1:2、1:2〜1:1、1:1〜2:1、2:1〜3:1、3:1〜4:1、4:1〜5:1、5:1〜10:1、10:1〜20:1、20:1〜30:1、30:1〜40:1、40:1〜50:1、50:1〜60:1、60:1〜80:1、又は80:1〜100:1、例えば、約1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20:1:10、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、又は100:1)である。一部の実施形態では、抗原対ITEのモル比は、1:5000〜25:1(例えば、1:2000〜20:1、1:1000〜15:1、又は1:500〜10:1、例えば、1:2000〜1:1000、1:1000〜1:500、1:500〜1:200、1:200〜1:50、1:50〜1:30、1:30〜1:20、1:20〜1:10、1:10〜1:5、1:5〜1:4、1:4〜1:3、1:3〜1:2、1:2〜1:1、1:1〜2:1、2:1〜3:1、3:1〜4:1、4:1〜5:1、5:1〜10:1、10:1〜20:1、20:1〜50:1、50:1〜100:1、100:1〜500:1、500:1〜2000:1、又は2000:1〜5000:1、例えば、約1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20:1:10、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、又は100:1)である。
【０１２１】
処置及び防止の方法
本明細書に記載の組成物及び方法は、特に、治療的免疫調節から利益を得る患者(例えばヒト)を処置するための(例えば、免疫応答の抑制を必要とする患者、例えば自己免疫障害を有する対象)、又は障害(例えば、自己免疫障害)の発症の発生を防止するための使用である。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物(例えばリポソーム組成物)及び方法によって処置することができる疾患又は障害としては、以下に限定されないが、自己免疫疾患、アレルギー性疾患(例えば、環境因子、例えば動物のフケ、花粉、イエダニ、虫刺されなどに対するアレルギー、及びナッツ、卵製品、魚介類、穀類などに対する食物アレルギー)、遺伝性疾患(タンパク質補充療法又は遺伝子療法によって処置される)、器官移植(免疫拒絶に、又は骨髄移植の場合には、移植片対宿主病に関連する)、及びペプチド又はタンパク質治療薬によって処置される多種多様な他の疾患(例えば糖尿病)が挙げられる。
【０１２２】
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物(例えば本発明のリポソーム組成物)又は方法によって処置することができる自己免疫疾患としては、以下に限定されないが、関節及び結合組織に影響を及ぼす疾患(例えば、強直性脊椎炎、関節リウマチ、若年性突発性関節炎、乾癬性関節炎及び混合性結合組織疾患)、並びに脳に影響を及ぼす疾患(例えば、多発性硬化症及び視神経脊髄炎)、内分泌器官に影響を及ぼす疾患(例えば、I型糖尿病、成人の潜在性自己免疫性糖尿病(LADA)、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病、橋本甲状腺炎及びアディソン病)、消化管に影響を及ぼす疾患(例えば、自己免疫性萎縮性胃炎、悪性貧血、セリアック病、及び炎症性腸疾患(クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む))、皮膚に影響を及ぼす疾患(例えば、乾癬、強皮症、円形脱毛症、アトピー性皮膚炎、尋常性天疱瘡及び水疱性類天疱瘡)、筋肉に影響を及ぼす疾患(例えば、重症筋無力症、ギランバレー症候群及び多発性/皮膚筋炎)、心臓に影響を及ぼす疾患(例えばリウマチ熱)、肝臓に影響を及ぼす疾患(例えば、自己免疫性肝炎及び原発性硬化性胆管炎)、感覚器官に影響を及ぼす疾患(例えば、自己免疫性ブドウ膜炎及びベーチェット病)、血液又は骨髄に影響を及ぼす疾患(例えば、自己免疫溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病及び特発性白血球減少症)、肺に影響を及ぼす疾患(例えばグッドパスチャー症候群)、腎臓に影響を及ぼす疾患(例えば、糸球体腎炎を含む自己免疫性腎炎)、脈管構造に影響を及ぼす疾患(例えばウェゲナー肉芽腫症)、末梢神経系に影響を及ぼす疾患(例えば慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー)、並びに多臓器の関与によって特徴付けられる疾患(例えば、全身性エリテマトーデス及びシューグレン症候群)が挙げられる。
【０１２３】
この方法は、処置を必要とする患者を選択するステップ及び本明細書に記載の組成物のうちの1つ以上を患者に投与するステップを含む。処置を必要とする対象は、例えば、その医師によって特定することができる。
【０１２４】
本明細書に記載の組成物の1つ以上の治療有効量を、標準的方法によって、例えば、1つ以上の投与経路によって、例えば米国食品医薬品局(FDA、例えば、world wide web address fda.gov/cder/dsm/DRG/drg00301.htmを参照のこと)に現在認可されている投与経路のうちの1つ以上によって、投与することができる。寛容原性リポソーム又はその医薬組成物は、全身的に又は局所的に、例えば、静脈、皮下、皮内(表皮内を含む)、関節内、肺又は粘膜(鼻を含む)経路を介して非経口的に投与することができる。一部の実施形態では、組成物は、肝内に、脳内に、筋肉内に、経皮的に、動脈内に、腹腔内に、傷害内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、髄腔内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、腫瘍内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、経口的に、局所的に、経皮的に、吸入によって、エアゾール投与によって、注射によって、移植によって、注入によって(例えば、連続的注入によって)、カテーテルによって、灌流によって、又はクリームで投与され得る。
【０１２５】
患者に投与されるリポソームの量は、抗原及び/又はITEの濃度に応じて変化し得る。一部の実施形態では、単回用量のリポソームにおけるITEの量は、約50μg〜15mgの間(例えば、75μg〜100μg、100μg〜150μg、150μg〜300μg、300μg〜500μg、500μg〜750μg、750μg〜1500μg、1500μg〜5000μg、又は5000μg〜15000μg)である。例えば、単回用量のリポソームにおけるITEの量は、100μg〜1000μg(例えば、200μg〜800μg、例えば、約200μg、約300μg、約400μg、約500μg、約600μg、約700μg、約800μg、約1000μg、又は約1500μg)であり得る。
【０１２６】
寛容原性リポソームの医薬組成物は、意図した投与経路に好適な任意の濃度のものであり得る。
【０１２７】
一部の実施形態では、寛容原性リポソームの単一の単位用量(例えば、ITEの前述の量のうちのいずれかを含有する単回用量)は、1011〜1016個のリポソーム(例えば、1011〜1016個のリポソーム、1011〜1015個のリポソーム、1012〜1014個のリポソーム、又は約1013個のリポソーム、例えば、1011〜1012個のリポソーム、1012〜1013個のリポソーム、1013〜1014個のリポソーム、1014〜1015個のリポソーム、又は1015〜1016個のリポソーム、例えば1012〜1015個のリポソーム、5.0×1013〜1.0×1014個のリポソーム、例えば約8×1013個のリポソーム)を含み得る。
【０１２８】
組成物は、数週間、数カ月又は数年の処置期間の経過にわたり、1回又は複数回投与され得る(例えば、疾患関連自己抗原に対する寛容が誘導されるまで)。一部の例では、組成物は、1日に1回、1週間に5回、1週間に4回、1週間に3回、1週間に2回、2週間毎に1回、3週間毎に1回、毎月、2カ月毎に、1年に5回、1年に4回、1年に3回、1年に2回、又は1年に1回、対象に投与される。
【０１２９】
以下の実施例は、本明細書に記載の実施形態の範囲を限定するものではない。当業者は、本発明の趣旨及び範囲に包含されることが意図される以下の実施例において修正がなされ得ることを認識するであろう。
【実施例】
【０１３０】
以下の実施例に記載するように、ITE及び/又はミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)抗原を含有するナノ粒子状リポソームの様々な製剤を合成し、キャラクタリゼーションし、自己免疫の動物モデルにおいて試験した。
【０１３１】
[実施例1]
ITEを負荷したミセルの製剤及びキャラクタリゼーション
2-(1H-インドール-3-イルカルボニル)-4-チアゾールカルボン酸メチルエステル(ITE)は、ナノ粒子形態(例えば、金及びPLGAナノ粒子及び多くの従来のリポソーム組成物を含む)で製剤化することが困難である有効なアリール炭化水素受容体アゴニストである。1つの寄与因子は、水(約115マイクロモル)、メタノール(約3ミリモル)及びエタノール(約3.3ミリモル)を含む多くの従来の溶媒における親油性ITEの低溶解度である。ITEはまた、自己凝集する傾向が高い。
【０１３２】
この実施例は、DSPE-PEG、TPGS、及びこれらの混合物を使用して、ITEをミセル中に負荷する例示的な方法を提供し、それぞれのキャラクタリゼーションを本明細書において提供する。
【０１３３】
方法1:DSPE-PEGミセル
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](PEG2000-DSPE、Avanti Polar Lipids カタログ番号880120)を、ホウケイ酸ガラス管中のクロロホルムに溶解させ、15、20、25、30、35又は40mMのいずれかの濃度とした(それぞれバッチ1〜6)。ITE(1mgの粉末)を各PEG2000-DSPE/クロロホルム溶液0.5mlに添加し、ボルテックスで混合し、ITEが完全に溶解するまで50℃で断続的に加熱し、透明の溶液を得た。次いで、クロロホルムを窒素下で蒸発させ、ガラス管の内側に薄膜を残した。ガラス管を一晩凍結乾燥させ、すべての微量なクロロホルムを除去した。ガラス壁に乾燥させたPEG2000-DSPE/ITE膜を、0.5mlのHEPES緩衝生理食塩水(HBS;pH6.5)に添加することによって、水和させた。脂質膜の完全な懸濁液は、ボルテックスし、浴型超音波処理器(FS20D、Fisher Scientific)中で手短に超音波処理することによって完成させた。得られたミセルを10,000gで10分間遠心分離し、0.2ミクロンのポリエーテルスルホン(PES)フィルターを通して、すべてのカプセル化されていないか又は沈殿したITEを除去した。次いで、Malvern Zetasizerを使用して、サイズ、多分散性及び電荷に関してミセルをキャラクタリゼーションした。ミセル調製物をメタノール:酢酸(99:1、v/v)中に溶解させることによって、負荷したITEの量を決定した。ITEは、355ナノメートルの光を吸収し、その波長を脂質は吸収しないため、ITE濃度の分光光度法による測定が可能となる。355ナノメートルの吸光度に対するITE濃度に関する標準曲線を作成し、ITE負荷を測定するために使用した。ITEカプセル化を、ミセルにカプセル化された出発ITE(1mg)の分数として計算した。ITEが寄与した最終ミセル質量のパーセントとして、ITE負荷を計算した。結果を以下の表1にまとめ、図1に示す。
【０１３４】
【表６】
2021515037.tif 000009
【０１３５】
ミセルのサイズは、PEG2000-DSPEの濃度によって有意に変化しなかったが、多分散性は、脂質濃度が高いほど低かった。目視による観察により、バッチ1には目に見えるITE沈殿が存在したが、バッチ6には存在しなかったため、PEG2000-DSPE濃度が高いほど、より多くのITEを保有することができたことが示された。図1に示されているように、バッチ1のミセル(15mMの脂質)は最も低いカプセル化効率(11.3%)を有したが、バッチ4(30mMの脂質)は最も高いカプセル化効率を有したため(29.8%)、ITE測定によりこの観察について確認された。
【０１３６】
方法2:TPGSミセル
D-α-トコフェロールポリエチレングリコール1000スクシネート(TPGS-1000;Millipore-Sigma カタログ番号57668)を、15、25、35、45、55、65及び75mg/mlの濃度で、ホウケイ酸ガラス管中のクロロホルム0.5mlに溶解させた(それぞれバッチ1〜7)。1ミリグラムのITEを各管に添加し、以下の表2に示されているように、1.33%〜6.67%(w/w)まで変化するITE:TPGS-1000の比を得た。ITEとTPGSをボルテックスすることによってクロロホルム中に溶解させた。窒素気流下でクロロホルムを蒸発させ、ITEの薄膜と脂質をガラス管の壁に沈着させた。試料を一晩凍結乾燥させ、すべての微量のクロロホルムを除去した。試料を、ボルテックスすることによって、1mlのHBSで再水和させ、断続的に加熱し、膜を完全に溶解させるために超音波処理した。試料を50℃で45分間インキュベートした。ミセルを10,000gで10分間遠心分離し、次いで、0.22μのPESフィルターを通して濾過し、すべてのカプセル化されていないITEを除去した。方法1におけるように、サイズ、電荷及びITE負荷に関してミセルをキャラクタリゼーションした。
【０１３７】
【表７】
2021515037.tif 000010
【０１３８】
ミセルのサイズ(約12.5〜17nmの直径)は、TPGS-1000の濃度又はITE負荷によって有意に変化しなかったが、多分散性は、表2に示されているように、TPGS-1000濃度が増加するにつれて低下した。図2に示されているように、ミセル中に負荷されたITEの量及びパーセントは、TPGS-1000濃度と共に連続的に増加した。試験した最も高いTPGS-1000濃度で(75mg/mL;49.6mM)、703マイクログラムのITEを負荷した(出発量の70.3%)。
【０１３９】
TPGS-1000ミセルの全体的特徴(サイズ、ITE負荷)は、PEG2000-DSPEミセルに類似していた。しかし、最も高いTPGS-1000脂質濃度によって、すべてのミセル製剤について最も高いITE負荷が得られ、最も低い分散性を有した。
【０１４０】
方法3:混合ミセル
方法1及び2(PEG2000-DSPE及びTPGS-1000)において使用した2つの脂質を様々な比で組み合わせて、混合ミセルを合成した。総脂質濃度は50mg/mLミセルに固定した。以下のPEG2000-DSPE:TPGS-1000比(w/w):0.1、0.25、0.5、1、1.5及び2を調製した。最初に、2つの脂質を秤量し、ガラス管中のクロロホルム0.5mLに溶解させた。次に、ITE 1mgをクロロホルム溶液に添加し、激しくボルテックスして溶解させ、断続的に50℃まで加熱し、必要であれば超音波処理した。ITEが一旦完全に溶解されたら、窒素ガスの気流下で室温にてクロロホルムを蒸発させ、乾燥ガラス管を一晩凍結乾燥させ、すべての残っている微量のクロロホルムを除去した。脂質/ITEフィルムを、上記のように、HBS 1.0mL中で再水和させた。1時間後、調製物を10,000gで10分間遠心分離し、0.22μmのPESフィルターを通して濾過した。上記のように、ミセルのキャラクタリゼーションを実施した。
【０１４１】
以下の表3に示されているように、サイズ及び分散性は、バッチ間で有意に変化しなかった。TPGS-1000の分率が高くなるにつれて、ミセルにおけるITE負荷がより多くなる傾向があった。2つの最も高い負荷(40.1%及び37%)は、上位2つのTPGS-1000レベル(バッチ1及び2)で達成された。
【０１４２】
【表８】
2021515037.tif 000011
【０１４３】
PEG2000-DSPE及びTPGS-1000から構成された混合ミセルは、それらの単一の脂質による対応物と実質的に異ならなかった。しかし、脂質濃度(50mg/ml)を考慮すると、2つの(又はそれより多い)脂質から構成されるミセルは、薬学的特性、例えば、インビボ半減期、薬物放出速度、異なる細胞区画(例えば、サイトゾル対エンドソーム)への薬物放出、及び樹状細胞の表面との相互作用を最適化する際の柔軟性の増加をもたらす。
【０１４４】
[実施例2]
ミセル転移を使用するITEが負荷されたリポソーム
凝集傾向分子である、ITEは、水性溶液と接触すると沈殿するため、飽和脂質(例えば、DMPC:コレステロール、又はDSPC:コレステロール)から構成されるリポソームにおけるITEのカプセル化によっては、満足のいく結果が得られなかった。少量のDMSO(最終体積の1%未満)中に添加された場合でさえ、ITEは沈殿した。ITEを溶媒和させるための種々の尺度、例えば、pH変化又はウシ血清アルブミン(ITEに対する結合表面として)の添加について試験したが、これらの方法では、ITEは可溶化できなかった。この問題を回避するために、予め形成したリポソームとITEを負荷したミセルの融合を試みた。
【０１４５】
実施例1におけるようにミセルを調製した(バッチ6、表1)。Batzri及びKorn、Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes 1973, 298(4):1015〜19頁に記載されているように、エタノール注入法を使用して、DSPC:コレステロール(3:2w/w)でリポソームを調製した。脂質を0.250mLのエタノールに溶解させた。次いで、エタノール溶液を(2mL)のHEPES緩衝生理食塩水(pH6.5)中に注入し、30分間撹拌した。得られる多層ベシクルを、65℃で、400、200及び100nmのポリカーボネートフィルターを通して連続的に押出し、PD-10カラムで精製した。次いで、リポソームを、65℃で、脂質濃度に基づいて(PEG:DSPC 12:1)のモル比で、ITEを負荷したPEG-DSPEミセルと混合し、1時間インキュベートした。実施例1におけるように、サイズ及び電荷についてリポソームを分析した。メタノール:酢酸(99:1 v/v)中にリポソームを溶解させることによって、ITE含有量を測定した。355ナノメートルの吸光度を使用して、ITE濃度を定量した。リポソーム中のITEの量を、リポソームを作製するために使用したミセルにおけるITEの量で除し、分数に100を掛けてパーセントITE転移を得た(すなわち、リポソームに対するITEのミセル転移の効率)。
【０１４６】
平均サイズ133.7±34.5nmを有するナノ粒子の単一の集団を、リポソームへのミセル転移後に観察し、転移手順後にすべての遊離ミセルを除去することに成功したことを示した。リポソームのサイズ及びサイズ分布は、ミセル転移ステップによって本質的に変化しなかった。ミセルからリポソームへのITE転移の効率は、97.6%であった。ミセル転移前のリポソームの電荷は、-4.28ミリボルト(mv)であり、ミセル添加後に-28.2mvまで低下し、リポソーム表面に負に帯電したPEGが存在することを示した。結果を以下の表4にまとめる。
【０１４７】
【表９】
2021515037.tif 000012
【０１４８】
主として飽和脂質から構成されるリポソームにおけるITEのカプセル化は実行可能である。このようなリポソームにITEを直接的に負荷することを試みる場合に観察されたITEの沈殿は、ミセル転移を使用して回避され得る製造上の障害である、脂質によるITE溶媒和の比較的遅い速度に対するITEの自己会合の迅速速度論を反映し得る。
【０１４９】
[実施例3]
ITE +/- MOG35-55を負荷した卵ホスファチジルコリン(PC)リポソーム
ミセル転移手順によってITEをミセル中及びリポソーム中に負荷することができ、脂質選択に柔軟性を与えることができるが、ITEをリポソーム中に直接負荷する方法も利点を有する。主に(>50質量%)、完全に飽和した脂質(例えば、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン;DMPC、又は1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン;DSPC)から構成されるリポソーム中に、ITE(1質量%の脂質)が負荷される初期の実験では、一致しないITE負荷がもたらされ、ITE沈殿の頻度が高かった。卵ホスファチジルコリン(卵PC)は、2つの脂肪酸を有する分子の非均質の集団からなり、そのうちの1つは、その生理化学的特性に影響を及ぼす不飽和炭素-炭素二重結合を含む。この理由のために、卵PCを含有するリポソームは、飽和脂肪酸鎖で構成されるリポソームよりも膜流動性が高く、「漏出しやすい」傾向がある。
【０１５０】
リポソームを、モル比が30:15:2の3つの脂質、すなわち卵PC、コレステロール及びPEG2000-DSPEを使用してエタノール注入によって作製した。指定した比の合計92.61mgの脂質を秤量し(61.61mgの卵-PC、15.47mgのコレステロール、及び14.96mgのPEG2000-DSPE)、清潔な4mLのガラスバイアルに添加した。無水エタノール(250μL)を脂質に添加し、小さな磁気撹拌棒を使用して、37〜45℃のホットプレート上で約5分間、混合物を撹拌した。混合物をホットプレート上から取り除き、さらに20〜30分間撹拌した。脂質が溶解されたら、DMSO中の保存液からピペッティングすることによって、総脂質重量(926μg)の1%に等しい量で、ITEを添加した(15.34μLを添加した)。最大DMSO体積は、出発エタノール体積の8%を超えなかった(この場合には20μL)。脂質/ITE混合物を、35〜40℃で断続的に撹拌しながら15分間又はITEが溶解するまで加熱した。ITEが溶解するのを待っている間に、2mLのHEPES緩衝生理食塩水(HBS、pH6.5)を35〜40℃に温めた。
【０１５１】
リポソーム中でITEとMOG35-55を同時に製剤化するために、MOG35-55(アミノ酸配列:MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)を、0.05、0.2、0.5及び1mg/mlの濃度でHBS中に溶解させ、ITE/MOG35-55リポソームを作製した。
【０１５２】
脂質/ITE/エタノール溶液を、撹拌しながら、温めたHBS(MOG35-55を含むか又は含まない)中に予め温めたパスツールピペットで素早く移した。混合物を37〜45℃で30分間撹拌した。押し出し機(Mini-Extruder、Avanti Polar Lipids)を使用して、リポソームを、約100nmの直径の所望のサイズ範囲に縮小した。温めた押し出し機中で(35〜40℃)、リポソーム溶液を、400、200及び100nmの単一のポリカーボネート(PC)膜に、それぞれ11回連続して通した。押し出したリポソームを氷水浴中に浸すことによって冷却した。45分後に、リポソームを、PD-10カラム(Sephadex G25M、GE Healthcare)を使用してクロマトグラフィーにより精製し、最終体積が4mLのHBS中に溶出した。リポソームを、0.2μmのPESフィルターを通して滅菌濾過し、HBS中で4℃にて保存した。
【０１５３】
Malvern Zetasizerを使用して、サイズ、サイズ分布及び電荷についてリポソームをキャラクタリゼーションした。それぞれ4つの種類のリポソーム:ITEもMOG35-55も含まないブランク(プレーン)リポソーム(略称:PL)、ITEを負荷したリポソーム(ITE-L)、MOG35-55を負荷したリポソーム(MOG-L)及びITEとMOG35-55を負荷したリポソーム(ITE-MOG-L)を含む、リポソームの3つのバッチを調製した(B1、B2、B3)。バッチ1、2、及び3におけるリポソームのサイズ、サイズ分布及び電荷は、以下の表5に示されるように、非常に類似していた。粒径の範囲は90〜110nmであり、ITE-MOG-Lでは、小さいが一致したサイズ縮小を伴った。ゼータ電位もMOGを負荷したリポソームにおいて適度に負の電荷が少なかった(前者の-25〜-32mvに対して、後者では-20〜-24mv)。
【０１５４】
【表１０】
2021515037.tif 000013
【０１５５】
ペイロード分子(ITE、MOG35-55)の負荷を測定するために、リポソームをメタノール:酢酸(99:1v/v)中に溶解させ、実施例1に記載したように、分光光度法によりITEを定量した。microBCAキット(ThermoFisher Scientific、カタログ番号23235)又はCBQCA Protein Quantitationキット(ThermoFisher Scientific、カタログ番号C6667)を使用して、MOG35-55濃度を測定した。表6に示されているように、ITEのカプセル化は、バッチ間で一致し(出発ITEの17〜24%がカプセル化された)、MOG35-55の同時カプセル化は、ITE負荷を妨げなかった(ITE-Lにおける平均ITEカプセル化:19.8%、ITE-MOG-Lにおける平均ITEカプセル化:23.5%)。
【０１５６】
【表１１】
2021515037.tif 000014
【０１５７】
安定性評価を実施し、ここで、バッチ1からのリポソームをHBS中で4℃にて1カ月間保存し、再アッセイした。以下の表7及び8に示されているように、1カ月の保存後のバッチ1のリポソームの再分析により、物理的パラメーターに有意な変化がなかったことが明らかになった。
【０１５８】
【表１２】
2021515037.tif 000015
【０１５９】
【表１３】
2021515037.tif 000016
【０１６０】
カプセル化効率に関するITEの出発濃度の効果を評価し、結果を以下の表9に提供する。
【０１６１】
【表１４】
2021515037.tif 000017
【０１６２】
結論
リポソーム中にITEを直接カプセル化する以前の試みは(例えば、DSPC、DMPC、又はHEPC及びコレステロールを使用する)、リポソーム形成中又はそのすぐ後のいずれかには、ITEカプセル化の低効率(2%以下)のために成功せず、ITE沈殿を伴うことが多かった。しかし、卵PCリポソームの特徴により、ITE(及びMOG35-55)の直接的製剤化が可能となった。100マイクロリットル当たりに負荷されたITEの量(すなわち、マウスに対する典型的な用量体積)は、治療閾値を超えている。さらに、卵PCリポソームは、2〜8℃で冷蔵した場合に、6カ月を超えても安定である。
【０１６３】
[実施例4]
ITEを負荷した1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)リポソーム
少なくとも50%の卵PCを用いて作製したリポソームは、卵PCにおける1つの不飽和炭素-炭素二重結合の結果として、飽和リン脂質を用いて作製したリポソームよりも膜流動性が高い。2つの不飽和結合を有するリン脂質を使用して作製されたリポソームが、さらに高い流動性を示し、より効率的にITEを負荷するかどうかを決定するために、各脂肪酸鎖に単一の不飽和結合を有する1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)をリポソームとして使用した。実施例3に記載した方法を使用して、モル比30:15:2で3つの脂質:1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、コレステロール、及びPEG2000-DSPEを使用して、エタノール注入法によってリポソームを作製した。
【０１６４】
DOPCリポソームの2つのバッチを、出発脂質の0.5%又は1.0%(w/w)で添加したITEを用いて調製した。卵PCリポソームの2つのバッチを、ITE負荷を比較するために並行して作製した。以下の表10に示されているように、両方のITE比で、卵PCリポソームにおけるよりも、DOPCリポソームにおいて、より多くのITEがカプセル化された。0.75%のITE:脂質(w/w)で、カプセル化効率は、DOPCリポソームにおいて51.8%であるのに対し、卵PCリポソームでは34.1%であった。0.5%のITE:脂質(w/w)で、カプセル化効率は、DOPCリポソームにおいて66.7%であるのに対し、卵PCリポソームでは54.1%であった。よって、ITE負荷に関する膜流動性についての正の影響は、1つのモノ不飽和脂肪酸を有するリン脂質の存在(総脂質の50%超を占める)を超えて、2つのモノ不飽和脂肪酸鎖を有するリン脂質の存在(総脂質の50%超を占める)まで及ぶ。
【０１６５】
【表１５】
2021515037.tif 000018
【０１６６】
不飽和リン脂質として卵PCを用いる次の実験は、0.5重量%のITEにおける再現可能な60〜65%のITE負荷効率を示す。また、60又は65mMの脂質濃度(初期の実験の40mMに対して)は、ここで、より大きなリポソームバッチの製造を可能とする。
【０１６７】
[実施例5]
リポソームにおけるITEのカプセル化に対する飽和及び不飽和脂質の効果の比較
この研究の目的は、規定した脂質濃度範囲内の様々なモル比を試験し、薬物負荷及び長期安定性に関して最良のリポソーム特徴をもたらす卵PC、コレステロール及びmPEG2000-PEの組合せを見つけることであった。さらに、ITEカプセル化に対し、不飽和脂質と飽和脂質とでの使用効果をより理解するために、HEPC中に不飽和炭素-炭素結合が存在しないことによってのみ卵PCと異なる(すなわち、卵PCでは1つのモノ不飽和脂肪酸であるのに対し、HEPCは2つの飽和脂肪酸鎖を有する)、卵PC(HEPC)(18:0)の水素付加形態を使用してリポソームを調製した。
【０１６８】
研究設計:
各脂質について以下の範囲で脂質比を変化させた:
卵PC又はHEPC:約53〜72mol%
コレステロール:約25〜44mol%
PEG2000-PE:1.5〜6.25mol%
試験したすべてのバッチについて、総脂質質量に対して、ITEを0.5重量%に固定した。DMSO保存液からITEを添加した。沈殿/凝集のすべての兆候について、バッチを毎日観察した。
【０１６９】
【表１６】
2021515037.tif 000019
【０１７０】
方法
追加の脂質のいずれの作用も排除するために、40mMの脂質濃度を使用して、卵PCを使用する標準的レシピ(表を参照のこと)と同じモル比(HEPC:コレステロール:PEG2000PE(3:1.5:0.2))を使用して、HEPCリポソームを製剤化した。卵PCを使用して作製される通常のバッチに対するように、ITEを0.5%w/wで負荷した。LIPEX押し出し機を使用して、HEPCリポソームを作製した(3mL、40mM)。押出し後、押出し中のITE沈殿について、ポリカーボネート膜をチェックした。
【０１７１】
観察
押出しはスムースに進行したが、ITEの大多数は、ポリカーボネート膜上に沈殿したことが分かった。この結果は、DSPC及びDMPCに関する本発明者らの以前の観察と一致した。同じ方法で作製した卵PCのバッチでは、60及び65mMの脂質濃度を使用した場合でさえ、ITE沈殿の証拠はなかった。押出し後、HEPCリポソームをPD-10精製ステップに供し、0.22μmのPESフィルターを通して最終的に濾過した。最終濾過ステップでは、HEPCリポソームを使用した場合に、フィルター上にITEが沈殿したことが分かった。再度、このことは、0.5%のITE(w/w)の卵PCリポソームに関しては起こらなかった。最後に、HEPCリポソームにおけるITE負荷について測定した。卵PCバッチは、通常、およそ60%のITE負荷を示すが、HEPCリポソームは、2.37%のITE負荷しか示さなかった。表11は、観察の概要を示す。
【０１７２】
【表１７】
2021515037.tif 000020
【０１７３】
コレステロールの効果
コレステロールのモル比は、ITE負荷効率に影響を及ぼす。以下の表は、表11の9つのリポソームバッチのコレステロールと卵PCの濃度(モル比、パーセントとして表す)を示す。
【０１７４】
【表１８】
2021515037.tif 000021
【０１７５】
結果
【０１７６】
【表１９】
2021515037.tif 000022
【０１７７】
表14及び図1Bに示されているように、薬物負荷は、30%〜32%の間のコレステロールモルパーセンテージを有するリポソームバッチで最も高く、最も高いコレステロールモルパーセント(43.86%)を有するバッチCL-1で最も低く、2番目に高いコレステロールモルパーセント(38.17%)を有するバッチCL-7で2番目に低い。ITEは、1週間以内に、これらのリポソームバッチの両方から沈殿した。ITEが沈殿した第3のバッチは、36%のコレステロールモル比を有するCL-4であった。ITE負荷は、このバッチにおいて比較的効率的であったが、高コレステロールによりリポソーム安定性が制限される。最も効率的なITE負荷は、30.07%のコレステロールを有するバッチCL-3で観察され、1カ月(観察の限界)を超えても安定であった。
【０１７８】
結論
表11にまとめた観察から明らかであるように、飽和脂質は、リポソームにおけるITEのカプセル化に対して好ましくない。製剤中の他の脂質の比及び相対量が同じままであれば、飽和脂質は、効率的且つ安定なITEのカプセル化に好ましい。
【０１７９】
さらに、コレステロール濃度は、ITEの負荷効率及び安定性に影響を及ぼし、最適な結果は、30%に近いコレステロールモル比で観察された。
【０１８０】
[実施例6]
ITEを負荷したリポソームは、インビトロで、樹状細胞におけるアリール炭化水素受容体(AHR)調節遺伝子の発現を誘導する。
樹状細胞(DC)を、CD11cに対する抗体でコーティングした磁気ビーズを使用して、健康なC57Bl/6Jマウスの脾臓細胞集団全体から単離した(Pan-DC単離キット、Miltenyi Biotec)。DCを計数し、ウェル当たり100,000〜200,000個の細胞で、プラスチック組織培養ウェルにプレーティングした。
【０１８１】
リポソーム(ブランク又はITE負荷)又は遊離ITEを、1nMのITE濃度でDCに添加し、37℃で6時間インキュベートした。次いで、DCを溶解し、mRNAを単離し、AHR調節遺伝子であるCyp1a1及びCyp1b1の発現をRT-PCRで測定した。データは、6つの試料の平均値±SEMを示す。卵PCのITE負荷リポソームについての結果を図3に示す。
【０１８２】
[実施例7]
ペプチドを負荷したリポソームは、インビトロでT細胞の増殖を誘導する
MOG35-55に特異的なトランスジェニック2D2 T細胞レパートリー(TCR)を発現する2D2マウスから脾細胞を採取し、自由に送達した(遊離MOG)、卵PCリポソームに単独で負荷した(MOG-L)、又は卵PCリポソームに負荷し、さらにITE負荷卵PCリポソームで刺激した(ITE用量1μg)、10μgのMOGで、インビトロで刺激した。Cell Titer Blue細胞増殖アッセイを使用して、37℃で72時間インキュベーションした後に、細胞増殖を評価した。データは、4つの試料の平均値±SEMを示す。結果を図4に示す。遊離MOG又はMOGのみのリポソームで刺激した脾細胞は2D2細胞増殖を誘導し、MOGペプチドのT細胞への提示を示した。MOGリポソーム及びITEリポソームと共にインキュベートした2D2脾細胞はT細胞の増殖を誘導せず、ITEが、増殖性T細胞の応答を抑制していることを示した。
【０１８３】
[実施例8]
寛容原性リポソームによる実験的自己免疫性脳脊髄炎の処置
実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症のマウスモデルであり、広範囲の自己免疫障害の多くの病原性基盤を共有する。この実施例は、本発明のナノ粒子状リポソームによるEAEの処置を例証し、「結論」の項目で議論されるように、CD4エフェクターT細胞の抑制及び制御性T細胞(Treg)及びTr1細胞の誘導によって特徴付けられる免疫寛容を生じることによって、本発明が、公知の技術と比較して、疾患進行に対して予期せぬ効力をもたらすことを明らかにする。
【０１８４】
方法
完全フロインドアジュバント(CFA)における200μgのMOG35-55を皮下注射することによって、C57BL/6マウスにおいて、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘導した。さらに、200ngの百日咳毒素(Sigma-Aldrich)を、0日目と2日目に腹腔内(i.p.)投与した。
【０１８５】
Hepes緩衝液中に懸濁させた卵PCリポソーム(ブランク、ITE負荷、又はITE + MOG35-55負荷)を、7日目に、5匹のマウスの群に、150μLで静脈内投与した(眼窩後部に)。ITE及びITE+MOGを負荷したリポソームを投与し、その結果、用量当たり7μgのITEが送達され、ITE+MOGを負荷したリポソームは、4μgのMOG35-55ペプチドを含有した。EAEの臨床徴候について、10日目に開始し、実験の最終日である24日まで継続して、マウスを毎日モニターした。EAEを以下のようにスコア化した:0は疾患の徴候なし、1は尾の緊張の喪失、2は後肢不全麻痺、3は後肢麻痺、4は四肢麻痺、5は瀕死。平均スコア及び平均値の標準誤差を、5匹のマウスの各群について計算した。この実験の結論では、脳、リンパ節及び脾臓を直近に安楽死させたマウスから採取し(他に注記していなければ、各群からのすべてのマウスを分析した)、3つの異なるリポソーム製剤の免疫学的効果を評価するために、以下の実験を実施した:
(i)脾臓を単一の細胞懸濁液中に分離し、1、10又は100μg/mLの濃度でMOG35-55ペプチドにより刺激し、免疫学的リコールを測定した。MTT細胞増殖アッセイを使用して、72時間後に、細胞増殖を測定した。
(ii)脳及び脊髄を採取し、単一の細胞懸濁液中に分離した。磁気ビーズを使用してCD4+ T細胞を単離し、透過処理し、固定し、インターロイキン17(IL-17)及びインターフェロンガンマ(IFNγ)に対する抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。群当たり4〜5匹のマウスからの細胞を分析した。
(iii)上記(ii)からの脳及び脊髄由来のCD4+ T細胞をMOG35-55特異的四量体(MOG35-55を負荷した多量体化MHCIIタンパク質)、並びにFoxP3、CD25、Lag3及びCD49bに対する抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。群当たり4〜5匹のマウスからの細胞を分析した。
【０１８６】
結果
図5に示されているように、ITEリポソーム単独での処置は、些細な効果しか示さなかったが、ITE+MOGリポソームでの処置では、空のリポソーム(プレーン-L)で処置したマウスと比較して、EAEの症状が有意に軽快した。ITE及びMOG35-55を負荷したリポソームで処置したマウスにおける適応免疫細胞の寛容を確認するために、脾臓及びリンパ節からリンパ球を採取し、エクスビボで、MOG35-55ペプチドにより再刺激した。図6に示されているように、ITE及びMOG35-55を負荷したリポソームで処置したマウスから採取した脾細胞は、対照のリポソームで処置したマウスからリンパ球よりも増殖が少なかった。
【０１８７】
様々な組織からのリンパ球の表現型を評価し、ITE及びMOG35-55を負荷したリポソームが、調節性の表現型に対するエフェクターからリンパ球プロファイルを歪めたかどうかを明らかにした。ITE及びMOG35-55を負荷したリポソームで処置したマウスは、空のリポソームで処置したマウス及びITEを負荷したリポソームで処置したマウスと比較して、IL-17+及びIFNγ+エフェクターT細胞のCNSへ浸潤に有意な低減を示した(図7A及び7B)。さらに、ITE及びMOG35-55を負荷したリポソームで処置したマウスは、脳及び脊髄において、抗原特異的FoxP3+制御性T細胞及びFoxP3- Tr1制御性T細胞の拡大を示した。
【０１８８】
結論
ITE及びMOG35-55を負荷したリポソームは、中枢神経系において、エフェクターT細胞の浸潤及び制御性T細胞の拡大の抑制を伴うマウスのEAEの症状を軽快させた。リポソームにおけるITEのカプセル化は、以前に記載された金のナノ粒子よりも、実質的により有効であった。Yesteら(PNAS 2012)は、EAEを処置するために、ITE及びMOG35-55を負荷した金のナノ粒子を使用した。また、Quintanaら(PNAS 2010)は、本発明で使用したよりも28倍高い用量である、マウス当たり200μgのITEを毎日投与することにより(i.p.又は経口)、同じマウスモデルでEAEが軽快させたことを示した。最後に、Quintanaら(Nature 2008)は、最も有効な公知のAHRアゴニストである2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ジオキシン(TCDD)が、1μgの用量でEAEを軽快させたが、100ngでは軽快しなかったことを示した。ITEをTCDDと比較するほとんどのインビボ研究では、後者は、約1,000倍有効である。したがって、製剤化されていないTCDDに対するリポソームITEの約10倍高い効力は、驚くべきものであり、本発明のリポソーム製剤の効力を強調する。
【０１８９】
[実施例9]
寛容原性ナノ粒子の投与によるマウスのコラーゲン関節炎の防止
コラーゲン関節炎は、その簡便性及び再生可能性のために広く使用される、ヒト関節リウマチの動物モデルである。動物をII型コラーゲン(CII)(通常、関節軟骨で発現される;以下に記載した実験では、ウシのCIIを使用した)で免疫化した。このモデルは、ヒトの関節リウマチを特徴付ける先天性及び適応性免疫機序の多くを再現しており、処置を試験し(腫瘍壊死因子抗体のように)、次に、ヒトの治療を開発するために使用されてきた。
【０１９０】
方法
関節炎の疾患予防モデルを、C57/Bl6マウスにおいて、3ステップで誘導した。0日目に、完全フロインドアジュバント中のウシCII(bCII)で、マウスを免疫化し、皮下(s.c.)投与した。不完全フロインドアジュバント中に懸濁させたbCllによる2回目のs.c.免疫化を21日目に続け、24日目にリポ多糖(25マイクログラム)を腹腔内注射により投与した。関節炎の疾患治療モデルを、C57/Bl6マウスにおいて、2ステップで誘導した。0日目に、完全フロインドアジュバント中のウシCII(bCII)で、マウスを免疫化し、皮下(s.c.)投与した。不完全フロインドアジュバント中に懸濁させたbCllによる2回目のs.c.免疫化を21日目に続けた。
【０１９１】
8〜10匹のマウスの4つの群(他に留意されていなければ)に、プレーンリポソーム、bCllのみを負荷したリポソーム、ITEのみを負荷したリポソーム、並びにITE及びbCllを負荷したリポソーム(群E)を、尾静脈注射により、1週間に2回投与した。ナイーブマウスは、CIIで免疫化せず、処置を受けなかった。処置は、20%〜30%のマウスが関節炎を発症した1日前(疾患防止実験)又は30〜35日目(疾患治療実験)に開始した。
【０１９２】
疾患の存在(群当たりの発生率)及び累積疾患スコアについて、マウスを毎日評価した。最初の3週間、週に1回マウスを秤量し、次いで、24日目に週に2回の秤量を開始した。足の厚さを週に2回測定した。両方の実験で同じ測定値を収集した。
【０１９３】
疾患防止実験では、46日目にマウスを安楽死させ、疾患処置実験では、88日目にマウスを安楽死させた。血中の抗CII抗体の力価、関節におけるFoxP3の発現レベル及びCIIペプチドを検出するTr1(制御性T)細胞の数(CII四量体及びTr1マーカーに対する染色を組み合わせて測定される)を含む、組織病理学的且つ免疫学的分析のために、血液、リンパ節、脾臓及び関節を採取した。
【０１９４】
群間の統計的に有意な差(一元ANOVAに基づく)をアスタリスクでマークした。1つのアスタリスクは、P<0.05レベルで有意であることを示す。2つのアスタリスクは、P<0.01のレベルで有意、3つのアスタリスクは、P<0.001のレベルで有意であることを示す。
【０１９５】
結果
疾患防止モデルでは、ITE及びCIIを負荷したリポソームで処置したマウスは、最も少ない累積スコアと関節炎の肢の数を経験した(すべての測定間隔で統計的に有意)(図9A及び9B)。ITE及びCIIを負荷したリポソームで処置したマウスはまた、他の処置群よりも低いIgG2a抗体の力価(図10A)、並びに関節におけるFoxP3及びIL10 mRNAの発現の増加(図10B及び10C)を示した。CII応答性CD4+エフェクターT細胞の出現頻度も、空のリポソームと比較して、ITE及びCIIを負荷したリポソームで処置したマウスの脾臓で低下した(図10D)。
【０１９６】
治療モデルでは、マウスの20〜30%が関節炎を発症した後に、処置を開始した。防止モデルでは、ITE及びCIIを負荷したリポソームによる処置により、進行中のコラーゲン関節炎が軽快する。具体的には、ITE及びCIIを負荷したリポソームで処置したマウスは、より低い累積重症度スコア(図11A)、関節炎の肢の数(図11B)及び足の厚さの平均(図11C)を示した。ITE及びCIIを負荷したリポソームで処置したマウスも、他の処置群よりも低い力価のIgG2a及びIgG2b抗体を示した(図12A及び12B)。
【０１９７】
結論
ITE及びCIIを負荷したリポソームは、コラーゲン関節炎の疾患予防及び治療モデルにおいて有効であった。作用機序は、制御性T細胞の刺激、エフェクターT細胞の抑制及び自己抗体レベルの抑制に関与した。
【０１９８】
他の実施形態
この明細書において言及されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、参照により組み込まれる個々の刊行物又は特許出願がそれぞれ、具体的且つ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９９】
本発明をその具体的実施形態に関連して説明してきたが、さらなる改変が可能であること、この出願が、一般的に、本発明の原理に従い、本発明が関連する技術分野内で公知であるか又は慣行されており、前記に示した必須の構成要件に適用することができ、請求項の範囲に従う本開示からの逸脱を含む、本発明の任意の変形、使用又は改案を網羅することを意図することが理解されよう。
【０２００】
他の実施形態は、特許請求の範囲内にある。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2021515037.tif 000024
【図２】
2021515037.tif 000025
【図３Ａ】
2021515037.tif 000026
【図３Ｂ】
2021515037.tif 000027
【図４】
2021515037.tif 000028
【図５】
2021515037.tif 000029
【図６】
2021515037.tif 000030
【図７Ａ】
2021515037.tif 000031
【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
2021515037.tif 000033
【図８Ｂ】
2021515037.tif 000034
【図９Ａ】
2021515037.tif 000035
【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
2021515037.tif 000037
【図１０Ｂ】
2021515037.tif 000038
【図１０Ｃ】
2021515037.tif 000039
【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
2021515037.tif 000045
【図１３−１】
2021515037.tif 000046
【図１３−２】
2021515037.tif 000047
【図１３−３】
2021515037.tif 000048
【図１３−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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