(57)【要約】  【解決手段】  患者に有効量のＧＳＫ−３β阻害剤、例えば９−ＩＮＧ−４１を投与することからなる悪性リンパ増殖性障害の治療方法が提供される。また、ＧＳＫ−３β阻害剤、例えば９−ＩＮＧ−４１を第２の治療剤または複数の治療剤と組み合わせて投与することからなる悪性リンパ増殖性障害の治療方法も提供される。  【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
その治療を必要とする患者に悪性リンパ増殖性障害を治療する方法であって、前記患者に有効量のＧＳＫ−３β阻害剤を投与する工程を含む方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記悪性リンパ増殖性障害は、悪性Ｂ細胞リンパ増殖性障害である、方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法において、前記悪性Ｂ細胞リンパ増殖性障害は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、リンパ球芽球期慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫、管外縁帯Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、毛細血管白血病、原発性中枢神経系リンパ腫、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ウォルデンストロームマクログロブリン血症／リンパ形成不全リンパ腫、多発性骨髄腫、血漿細胞異形成症、血漿細胞新生物、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、ホジキン病、またはカステルマン病である、方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法において、前記悪性Ｂ細胞リンパ増殖性障害は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、前記びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫は、ダブルヒットリンパ腫である、方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、前記悪性リンパ増殖性障害は、悪性Ｔ細胞リンパ増殖性障害である、方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、前記悪性Ｔ細胞リンパ増殖性障害は、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、管外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、腸管症型Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、未分化大Ｔ／ヌル細胞リンパ腫、皮下パンニクル炎様Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病、Ｔ細胞性大粒径リンパ球白血病、リンパ球芽球期慢性骨髄性白血病、移植後リンパ増殖症候群、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型陽性（ＨＴＬＶ−１＋）成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫（ＡＴＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、または非特定型Ｔ細胞リンパ腫である、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の方法において、前記悪性リンパ増殖性障害は、化学療法抵抗性である、方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の方法において、前記ＧＳＫ−３β阻害剤は、９−ＩＮＧ−４１、チデグルシブ、ＬＹ２０９０３１４、ＣＨＩＲ−９９０２１、ＣＨＩＲ−９８０１４、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＡＲ−Ａ０１１４１８、ＣＧ７０１３３８、またはＣＧ２０２７９６である、方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法において、前記ＧＳＫ−３β阻害剤は、９−ＩＮＧ−４１、チデグルシブ、またはＬＹ２０９０３１４である、方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法において、前記ＧＳＫ−３β阻害剤は、９−ＩＮＧ−４１である、方法。
【請求項１２】
請求項１０記載の方法において、前記ＧＳＫ−３β阻害剤は、チデグルシブである、方法。
【請求項１３】
請求項１０記載の方法において、前記ＧＳＫ−３β阻害剤は、ＬＹ２０９０３１４である、方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法において、前記ＧＳＫ−３β阻害剤は、第２の治療剤と組み合わせて投与される、方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法において、前記第二の治療剤は、サブ治療量で投与される、方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５記載の方法において、前記第二の治療剤は、抗癌剤である、方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の方法において、前記抗癌剤は、アポトーシスモジュレーター、ＣＤＫモジュレーター、またはｍＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋのモジュレーターである、方法。
【請求項１８】
請求項１７記載の方法において、前記抗癌剤は、アポトーシスモジュレーターである、方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の方法において、前記アポトーシスモジュレーターは、Ｂｃｌ−２阻害剤である、方法。
【請求項２０】
請求項１９記載の方法において、前記Ｂｃｌ−２阻害剤は、ベネトクラックス、ＡＢＴ−７３７、またはナビトクラックスである、方法。
【請求項２１】
請求項２０の方法であって、前記Ｂｃｌ−２インヒビターは、ベネトグラックスである、方法。
【請求項２２】
請求項１７記載の方法において、前記抗癌剤は、ＣＤＫモジュレーターである、方法。
【請求項２３】
請求項２２記載の方法において、前記ＣＤＫモジュレーターは、ＣＤＫ９阻害剤である、方法。
【請求項２４】
請求項２３記載の方法において、前記ＣＤＫ９阻害剤は、ＢＡＹ−１１４３５７２、ＬＤＣ００００６７、ダイナシクリブ（ＳＣＨ７２７９６５）、ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ−３８７０３２）、ＡＴ７５１９、Ｐ２７６−００、ＡＺＤ５４３８、ＰＨＡ−７６７４９１、またはＰＨＡ−７９３８８７である、方法。
【請求項２５】
請求項２４記載の方法において、前記ＣＤＫ９阻害剤は、ＢＡＹ−１１４３５７２である、方法。
【請求項２６】
請求項１７記載の方法において、前記抗癌剤は、ｍＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路のモジュレーターである、方法。
【請求項２７】
請求項２６の方法であって、前記ｍＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路のモジュレーターは、ＰＩ３Ｋインヒビターである、方法。
【請求項２８】
請求項２７記載の方法において、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤は、コパンリシブまたはイデラリシブである、方法。
【請求項２９】
請求項２８記載の方法において、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤は、イデラリシブである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年６月５日に出願された米国仮出願第６２／６８０，７３９号に対する優先権の利益を主張し、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、悪性リンパ増殖性障害の治療のために、３−（５−フルオロベンゾフラン−３−イル）−４−（５−メチル−５Ｈ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｆ］インドール−７−イル）ピロール−２，５−ジオンを含むＧＳＫ−３β阻害剤を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
悪性リンパ増殖性障害とは、リンパ球の異常増殖を特徴とする疾患群である。悪性リンパ増殖性障害には、一般的に悪性Ｂ細胞リンパ増殖性障害と悪性Ｔ細胞リンパ増殖性障害の２種類がある。
【０００４】
悪性Ｂ細胞リンパ増殖性障害としては、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、リンパ球芽球期慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫、管外縁帯Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、毛細血管白血病、原発性中枢神経系リンパ腫、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ウォルデンシュトロームマクログロブリン血症／リンパ形成不全リンパ腫、多発性骨髄腫、血漿細胞異形成症、血漿細胞新生物、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、ホジキン病、およびカステルマン病などが挙げられる。
【０００５】
悪性Ｔ細胞リンパ増殖性疾患としては、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、管外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、腸管症型Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、未分化大Ｔ／ヌル細胞リンパ腫、皮下パンニクル炎様Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病、Ｔ細胞性大粒径リンパ球白血病、リンパ球芽球期慢性骨髄性白血病、移植後リンパ増殖症候群、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型陽性（ＨＴＬＶ−１＋）成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫（ＡＴＬ）、Ｔ細胞性前リンパ性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、および非特定型Ｔ細胞リンパ腫などが挙げられる。
【０００６】
グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）はセリン（Ｓ）／スレオニン（Ｔ）キナーゼであり、当初は代謝、特にグリコーゲン生合成の主要な調節因子として記述された。Ｅｍｂｉ  Ｎｅｔ  ａｌ．ウサギ骨格筋から得られたグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３）。また、このキナーゼは、その機能を利用し、糖質の代謝を制御することが明らかになっている。Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８０；１０７：５１９−２７．それ以来、多くの多様な基質の変調を介して、癌や老化、免疫障害、代謝障害、神経障害を含むいくつかの疾患プロセスで役割を果たすことが示される。Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ  Ｃ．善意のＧＳＫ３基質とは何ですか？Ｉｎｔ  Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ．２０１１；２０１１：５０５６０７；Ｇａｏ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．ＧＳＫ３：２型糖尿病とアルツハイマー病のための新規治療法の開発のための重要なターゲット。Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１１；２３：１−１１；Ｗａｎｇ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，ラパマイシン複合体1-およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ3-ベータシグナル伝達経路の哺乳類標的の収束は、先天性炎症反応を調節する。Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１；１８６：５２１７−２６；Ｋｌａｍｅｒ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．炎症を治療するための低分子ＧＳＫ３ｂｅｔａ阻害剤の使用。Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１０；１７：２８７３−８１；Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ  ＥＪ．骨格筋におけるグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３の調節障害とインスリン抵抗性と２型糖尿病の病因。Ｃｕｒｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｖ．２０１０；６：２８５−９３．ＧＳＫ−３は、２つのユビキチンに発現し、高度に保存された２つのアイソフォーム、ＧＳＫ−３αおよびＧＳＫ−３βを有し、基質および機能的効果の両方が共有され、かつ異なる。ＧＳＫ−３βの異常な過剰発現は、様々な固形腫瘍において腫瘍の増殖および化学療法抵抗性を促進することが示される。しかし、ＧＳＫ−３βがＢ細胞リンパ腫の発症、治療抵抗性、生存に及ぼす影響については、Ｂ細胞における代謝チェックポイント調節因子としての機能が知られているにもかかわらず、ほとんど知られていない。Ｊｅｌｌｕｓｏｖａ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．ＧＳＫ３はＢ細胞における代謝チェックポイント調節因子である。Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７；１８：３０３−１２．
【０００７】
ＧＳＫ−３β阻害剤は、ＧＳＫ−３βによって媒介される疾患の臨床経過を潜在的に変化させる能力のために関心がある。いくつかのＧＳＫ−３β阻害剤は、チデグルシブ、ＬＹ２０９０３１４、９−ＩＮＧ−４１、ＣＨＩＲ−９９０２１およびＣＨＩＲ−９８０１４、ＳＢ２１６７６３およびＳＢ４１５２８６、ＡＲ−Ａ０１１４１８、ＣＧ７０１３３８およびＣＧ２０２７９６を含む。Ａｍｙ  Ｗａｌｚ、Ａｎｄｒｅｙ  Ｕｇｏｌｋｏｖ、Ｓｕｎａｎｄａｎａ  Ｃｈａｎｄｒａ、ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｗａｙｓを参照。がんの治療のための標的としてのグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３ｂの再検討、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；２３（８）Ａｐｒｉｌ  １５，２０１７，ＯＦ１−ＯＦ７を参照。
【０００８】
３−（５−フルオロベンゾフラン−３−イル）−４−（５−メチル−５Ｈ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｆ］インドール−７−イル）ピロール−２，５−ジオン（「９−ＩＮＧ−４１」）は、以下の化学構造を有するＧＳＫ−３β阻害剤である。
【化１】
2021527039.tif 000003
【０００９】
９−ＩＮＧ−４１の合成、特性、および／または生物学的活性は、米国特許第８，２０７，２１６号に記載される；Ｇａｉｓｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．、Ｆｒｏｍ  ａ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｌｅａｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−３−ｙｌ−（ｉｎｄｏｌ−３−ｙｌ）ｍａｌｅｉｍｉｄｅｓ  ａｓ  Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  Ｋｉｎａｓｅ  ３β  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  Ｔｈａｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  ２００９，５２，１８５３−１８６３；およびＨｉｌｌｉａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３β  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｉｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  ２０１１，２２：９７８−９８５。９−ＩＮＧ−４１は、脳、肺、乳房、卵巣、膀胱、神経芽腫、腎、膵臓などの特定の癌の治療、および外傷性脳損傷の治療に有用であることが報告される。
【００１０】
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の臨床経過は、１９９０年代後半に抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であるリツキシマブが標準的な化学療法に追加されたことにより、奏効率および生存率が改善されたにもかかわらず、依然として変化する。Ｃｏｉｆｆｉｅｒ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＬＮＨ−９８．５  ｔｒｉａｌ，ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｓｔｕｄｙ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｒｉｔｕｘｉｍａｂ−ＣＨＯＰ  ｔｏ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ＣＨＯＰ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ＤＬＢＣＬ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：ａ  ｓｔｕｄｙ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｇｒｏｕｐｅ  ｄ'Ｅｔｕｄｅｓ  ｄｅｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍｅｓ  ｄｅ  ｌ'Ａｄｕｌｔｅ．Ｂｌｏｏｄ．２０１０；１１６：２０４０−５；Ｆｅｕｇｉｅｒ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒ−ＣＨＯＰ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｌｄｅｒｌｙ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ：ａ  ｓｔｕｄｙ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｇｒｏｕｐｅ  ｄ'Ｅｔｕｄｅ  ｄｅｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍｅｓ  ｄｅ  ｌ'Ａｄｕｌｔｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００５；２３：４１１７−２６．患者の６０％は長期無病生存を享受するが、生物学的に不利な患者のサブセットは化学療法不応性疾患を有し、予後はあまり好ましくない。Ｓｅｈｎ  ＬＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ＣＨＯＰ  ｐｌｕｓ  ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｉｎ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００５；２３：５０２７−３３．特に、ＤＬＢＣＬにおけるｃ−ＭＹＣとＢＣＬ−２の二重転座は、「ダブルヒットリンパ腫」（「ＤＨＬ」）と呼ばれ、標準的なＲ−ＣＨＯＰ（リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン）療法後の転帰が不良であり、長期生存を達成した患者はほとんどいない。Ｐｅｔｒｉｃｈ  ＡＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｍｅｎ  ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｉｎ  ｄｏｕｂｌｅ−ｈｉｔ  ｌｙｍｐｈｏｍａ：ａ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２４：２３５４−６１．
【００１１】
このように、リンパ腫を含む悪性リンパ増殖性疾患を治療するための新しい方法、特にＤＬＢＣＬなどの治療抵抗性リンパ腫を治療するための新しい方法の必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
いくつかの態様において、本開示は、必要としている患者の悪性リンパ増殖性障害を治療する方法を提供し、この方法は、有効量のＧＳＫ−３β阻害剤を当該患者に投与する工程を含む。
【００１３】
いくつかの態様において、本開示は、悪性リンパ増殖性障害が悪性Ｂ細胞リンパ増殖性障害である場合に、有効量のＧＳＫ−３β阻害剤を患者に投与する工程を含む、それを必要とする患者における悪性リンパ増殖性障害を治療する方法を提供する。
【００１４】
いくつかの態様において、本開示は、それを必要とする患者における悪性Ｂ細胞リンパ増殖性障害を治療する方法を提供し、この方法は、ＧＳＫ−３β阻害剤の有効量を前記患者に投与することからなる。ここで、悪性Ｂ細胞リンパ増殖性障害は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、リンパ球芽球期慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫、管外縁帯Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、毛細血管白血病、原発性中枢神経系リンパ腫、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ウォルデンシュトロームマクログロブリン血症／リンパ形成不全リンパ腫、多発性骨髄腫、血漿細胞異形成症、血漿細胞新生物、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、ホジキン病、およびカステルマン病である。
【００１５】
いくつかの態様において、本開示は、悪性Ｂ細胞リンパ増殖性障害がびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である場合に、有効量のＧＳＫ−３β阻害剤を患者に投与する工程を含む、それを必要とする患者における悪性Ｂ細胞リンパ増殖性障害を治療する方法を提供する。
【００１６】
いくつかの態様において、本開示は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫がダブルヒットリンパ腫である場合に、有効量のＧＳＫ−３β阻害剤を前記患者に投与する工程を含む、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を治療する方法を提供する。
【００１７】
いくつかの態様において、本開示は、悪性リンパ増殖性障害が悪性Ｔ細胞リンパ増殖性障害である場合に、有効量のＧＳＫ−３β阻害剤を当該患者に投与する工程を含む、悪性リンパ増殖性障害を必要とする患者における悪性リンパ増殖性障害を治療する方法を提供する。
【００１８】
いくつかの態様において、本開示は、それを必要とする患者における悪性Ｔ細胞リンパ増殖性障害を治療する方法を提供し、この方法は、ＧＳＫ−３β阻害剤の有効量を前記患者に投与する工程を含む。ここで、悪性Ｔ細胞リンパ増殖性障害は、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、管外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、腸管症型Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、未分化大Ｔ／ヌル細胞リンパ腫、皮下パンニクル炎様Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病、Ｔ細胞性大粒径リンパ球白血病、リンパ球芽球期慢性骨髄性白血病、移植後リンパ増殖症候群、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型陽性（ＨＴＬＶ−１＋）成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫（ＡＴＬ）、Ｔ細胞性前リンパ性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、および非特定型Ｔ細胞リンパ腫である。
【００１９】
いくつかの態様において、本開示は、悪性リンパ増殖性障害が化学療法不応性である、上記のいずれかの態様に従った方法を提供する。
【００２０】
いくつかの態様において、本開示は、上記のいずれかの態様に従った方法を提供し、前記ＧＳＫ−３β阻害剤は、９−ＩＮＧ−４１、チデグルシブ、ＬＹ２０９０３１４、ＣＨＩＲ−９９０２１、ＣＨＩＲ−９８０１４、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＡＲ−Ａ０１４１８、ＣＧ７０１３８、またはＣＧ２０２７９６である、方法を提供する。
【００２１】
いくつかの態様において、本開示は、ＧＳＫ−３β阻害剤が９−ＩＮＧ−４１、チデグルシブ、またはＬＹ２００９０３１４である、上記のいずれかの態様に記載の方法を提供する。
【００２２】
いくつかの態様において、本開示は、ＧＳＫ−３β阻害剤が９−ＩＮＧ−４１である、上記のいずれかの態様に記載の方法を提供する。
【００２３】
いくつかの態様において、本開示は、ＧＳＫ−３β阻害剤がチデグルシブである、上記のいずれかの態様に記載の方法を提供する。
【００２４】
いくつかの態様において、本開示は、前記ＧＳＫ−３β阻害剤はＬＹ２０９０３１４である、上記のいずれかの態様に記載の方法を提供する。
【００２５】
いくつかの態様において、本開示は、前記ＧＳＫ−３β阻害剤は、第２の治療剤と組み合わせて投与される、上記のいずれかの態様に記載の方法を提供する。
【００２６】
いくつかの態様において、本開示は、前記ＧＳＫ−３β阻害剤は、第２の治療剤と組み合わせて投与され、前記第２の治療剤は、サブ治療量で投与される、上記のいずれかの態様に記載の方法を提供する。
【００２７】
いくつかの態様において、本開示は、前記ＧＳＫ−３β阻害剤は、第２の治療剤と組み合わせて投与され、前記第２の治療剤は、抗癌剤である、上記のいずれかの態様に記載の方法を提供する。
【００２８】
いくつかの態様において、本開示は、前記ＧＳＫ−３β阻害剤は、抗癌剤と組み合わせて投与され、前記抗癌剤は、アポトーシスモジュレーター、ＣＤＫモジュレーター、またはｍＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路のモジュレーターである、前述の態様に記載の方法を提供する。
【００２９】
いくつかの態様において、本開示は、前記ＧＳＫ−３β阻害剤は、抗癌剤と組み合わせて投与され、前記抗癌剤はアポトーシスモジュレーターである、前述の態様に記載の方法を提供する。
【００３０】
いくつかの態様において、本開示は、前記ＧＳＫ−３β阻害剤は、アポトーシスモジュレーターと組み合わせて投与され、前記アポトーシスモジュレーターは、Ｂｃｌ−２阻害剤である、前述の態様に記載の方法を提供する。
【００３１】
いくつかの態様において、本開示は、ＧＳＫ−３β阻害剤をＢｃｌ−２阻害剤と組み合わせて投与し、前記Ｂｃｌ−２阻害剤は、ベネトクラックス、ＡＢＴ−７３７、またはナビトクラックスである、前述の態様に記載の方法を提供する。
【００３２】
いくつかの態様では、本開示は、ＧＳＫ−３β阻害剤をＢｃｌ−２阻害剤と組み合わせて投与し、前記Ｂｃｌ−２阻害剤はベネトグラックスである、前述の態様に記載の方法を提供する。
【００３３】
いくつかの態様において、本開示は、前記ＧＳＫ−３β阻害剤が抗癌剤と組み合わせて投与される、前記抗癌剤がＣＤＫモジュレーターである、上記のいずれかの態様に記載の方法を提供する。
【００３４】
いくつかの態様において、本開示は、前記ＧＳＫ−３β阻害剤は、ＣＤＫモジュレーターと組み合わせて投与され、前記ＣＤＫモジュレーターは、ＣＤＫ９阻害剤である、前述の態様に記載の方法を提供する。
【００３５】
いくつかの態様において、本開示は、前記ＧＳＫ−３β阻害剤は、ＣＤＫ９阻害剤と組み合わせて投与され、ここで、ＣＤＫ９阻害剤は、ＢＡＹ−１１４３５７２、ＬＤＣ００００６７、Ｄｉｎａｃｉｃｌｉｂ（ＳＣＨ７２７９６５）、ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ−３８７０３２）、ＡＴ７５１９、Ｐ２７６−００、ＡＺＤ５４３８、ＰＨＡ−７６７４９１、またはＰＨＡ−７９３８８７である、上記のいずれかの態様に記載の方法を提供する。
【００３６】
いくつかの態様において、本開示は、前記ＧＳＫ−３β阻害剤は、ＣＤＫ９阻害剤と組み合わせて投与され、ここで、ＣＤＫ９阻害剤は、ＢＡＹ−１１４３５７２である、前述の態様に記載の方法を提供する。
【００３７】
いくつかの態様において、本開示は、前記ＧＳＫ−３β阻害剤は、抗癌剤と組み合わせて投与され、前記抗癌剤は、ｍＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路のモジュレーターである、上記のいずれかの態様に記載の方法を提供する。
【００３８】
いくつかの態様において、本開示は、前記ＧＳＫ−３β阻害剤は、ｍＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路のモジュレーターと組み合わせて投与され、前記ｍＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路のモジュレーターは、ＰＩ３Ｋ阻害剤である、前述の態様に記載の方法を提供する。
【００３９】
いくつかの態様において、本開示は、前記ＧＳＫ−３β阻害剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤と組み合わせて投与され、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、コパンリシブまたはイデラリシブである、前述の態様に記載の方法を提供する。
【００４０】
いくつかの態様において、本開示は、前記ＧＳＫ−３β阻害剤はＰＩ３Ｋ阻害剤と組み合わせて投与され、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤はイデラリシブである、前述の態様に記載の方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１Ａ〜１Ｅは、９−ＩＮＧ−４１処理によるリンパ腫細胞の生存性および増殖を示す。  ９６ウェルプレートウェルあたり１０，０００個の細胞（ＳＵＤＨＬ−４（図１Ｂ）、ＫＰＵＭ−ＵＨ１（図１Ｃ）、Ｋａｒｐａｓ  ４２２（図１Ｄ）、ＴＭＤ８（図１Ｅ））を、未処理のまま、または１μＭの９−ＩＮＧ−４１で処理した後、３回に分けて、１日目、３日目、５日目、および７日目の細胞数をＭＴＳアッセイを用いて算出した。簡潔に言えば、２０μＬのＭＴＳ試薬を細胞に添加し、２時間インキュベートした後、Ｂｉｏｔｅｋプレートリーダーを用いて４９０ｎｍ（Ａ４９０）での吸光度を読み取った。ＯＤ＝４９０ｎｍの吸光度は細胞密度に比例して増加する。エラーバーは、レプリケート間の標準偏差を表す。３日目の生存率を図１Ａに示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｏは、９−ＩＮＧ−４１と組み合わせた化学療法剤を用いたリンパ腫細胞の生存率を示す。１０，０００個の細胞（図１Ａ、Ｆ、Ｋ：Ｄａｕｄｉ；図１Ｂ、Ｇ、Ｌ：ＳＵＤＨＬ−４；図１Ｃ、Ｈ、Ｍ：ＫＰＵＭ−ＵＨ１；図１Ｄ、Ｉ、Ｎ：Ｋａｒｐａｓ４２２；Ｅ、Ｊ、Ｏ：ＴＭＤ８）を９６ウェルプレートのウェルあたりにプレートし、９−ＩＮＧ−４１（０−０．５μＭ）およびＶｅｎｅｔｏｃｌａｘ（０〜５，０００ｎＭ）（図１Ａ〜Ｅ）またはＢＡＹ−１１４３５７２（０〜５０μＭ）（図１Ｆ〜Ｊ）またはイデラリシブ（０〜５０μＭ）（図１Ｋ〜Ｏ）の両方を３回反復で処理した。日後のバイアビリティを、ＭＴＳアッセイを用いて分析した。簡単に言えば、２０μｌのＭＴＳ試薬を細胞に添加し、２時間インキュベートし、Ｂｉｏｔｅｋプレートリーダーを用いて４９０ｎｍでの吸光度を読み取った。無処理対照の平均吸光度を1に設定した後、相対吸光度を計算する。ＯＤ＝４９０ｎｍにおける吸光度は細胞密度に比例して増加する。
【図３】０．５μＭの９−ＩＮＧ−４１を添加した場合と添加していない場合のベネトクラックス、ＢＡＹ１１４３５７２およびイデラリシブのＩＣ５０値を図３に示す。
【図４】図４は、リンパ腫においてＧＳＫ３αおよびＧＳＫ３βのｍＲＮＡおよびタンパク質が過剰発現することを示す。（Ａ）ＧＳＫ３αおよびＧＳＫ３β  ｍＲＮＡが、正常なＢまたはＴリンパ球における低発現と比較して、リンパ腫ラインで過剰発現することを示すリアルタイムＰＣＲ定量。Ｂ）精製された正常ＢまたはＴリンパ球と比較して、ＧＳＫ３αおよびＧＳＫ３βタンパク質もまた、様々なリンパ腫ラインで豊富に発現することを示すウエスタンブロット画像。
【図５】図５は、ＧＳＫ３がリンパ腫細胞の増殖および生存に必須であることを示す。健康なドナーから単離した刺激のない末梢血Ｂリンパ球およびＴリンパ球を正常対照として使用した。様々なＭＣＬおよびＴＣＬライン（Ａ）およびＤＬＢＣＬライン（Ｂ）におけるＧＳＫ３阻害剤９−ＩＮＧ−４１のプロアポトーシス効果。Ｃ）９−ＩＮＧ−４１で処理した様々なリンパ腫細胞株の細胞増殖プロファイル。結果（Ａ−Ｃ）は３つの独立した実験からのものである。
【図６】リンパ腫細胞におけるＧＳＫ３の阻害または欠失は、Ｇ２／Ｍにおける細胞周期の停止をもたらすことを示す。（Ａ）０、１．０および２．０μＭの９−ＩＮＧ−４１で２４時間処理した後の３つの代表的な細胞株Ｊｅｋｏ、ＭｉｎｏおよびＯＣＩ−Ｌｙ３の細胞周期プロファイル。（Ｂ）親Ｌｙ−１細胞およびＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β、ＧＳＫ３αβノックアウトサブクローンの細胞周期プロファイル。インセット。ノックアウトＬｙ−１サブクローンにおけるＧＳＫ３αおよびＧＳＫ３βタンパク質の枯渇を示すウエスタンブロット画像。
【図７】図７は、９−ＩＮＧ−４１によるＧＳＫ３の阻害が、有糸分裂原相停止をもたらすことを示す。（Ａ）有糸分裂の間の連続的な工程（Ｍ１−Ｍ５）の漫画の描写（Ｓｈｕｔｔｅｒｓｔｏｃｋから購入し、改変したもの）。（Ｂ）未処理および１．０μＭの９−ＩＮＧ−４１で２４時間処理したジェコ細胞の代表的なライト染色像。様々な有糸分裂期細胞（Ｍ１−Ｍ５）が未処理の細胞（左のパネル）で容易に識別される一方で、９−ＩＮＧ−４１細胞（右のパネル）では、多数のプロフェーズ（Ｍ１）細胞のみが見られる。（Ｃ）未処理または９−ＩＮＧ−４１で処理したジェコ細胞１００個をカウントしたときに同定された有糸分裂Ｍ１−Ｍ５細胞の数を示す棒グラフ。同様の結果（データは未提示）が、少なくとも４つの異なるリンパ腫細胞株において観察された。
【図８】図８は、ＧＳＫ３βがセントロソームに局在することを示す。（Ａ）ＧＳＫ３βが間期のイエコ細胞の核およびセントロソーム対に局在することを示す免疫蛍光画像。（Ｂ）（Ａ）に示したものをクローズアップ（拡大）した画像。（Ｃ−Ｆ）野生型Ｌｙ−１細胞におけるＧＳＫ３βとペリセントリンのセントロソームへのコロケーションを示す共免疫染色のシングルまたはマルチチャンネル画像。（Ｇ−Ｈ）ＧＳＫ３βヌルのＬｙ−１細胞におけるＧＳＫ３βとペリセントリンの共免疫染色のシングルまたはマルチチャンネル画像は、染色がＧＳＫ３βに特異的であることを示す。（Ｋ）ＧＳＫ３β（緑色）がイエコ細胞の分裂性紡錘体に似た花火のような構造に局在することを示す免疫蛍光画像。（Ｌ）（Ｋ）の有糸分裂細胞のクローズアップ画像。（Ｍ）α−チューブリン（赤）染色による微小管構造とＤＮＡ（青）のオーバーレイ画像。（Ｎ）（Ｍ）のクローズアップ画像。（Ｏ−Ｐ）ＧＳＫ３βヌルＬｙ−１細胞ではＧＳＫ３βの紡錘体構造染色がないことを示す画像。（Ｑ）９−ＩＮＧ−４１で処理したジェコ細胞において、ＧＳＫ３βが分裂紡錘体構造および分極したセントロソームに局在することを示す免疫蛍光画像。（Ｒ）（Ｑ）に示す代表的な有糸分裂細胞のクローズアップ画像。
【図９】図９は、一次リンパ腫患者（Ｐ）細胞におけるＧＳＫ３タンパク質の異常発現および９−ＩＮＧ−４１に対する増殖応答を示す。（Ａ）患者サンプルと正常Ｂ細胞コントロールにおけるＧＳＫ３αおよびＧＳＫ３βタンパク質の過剰発現を示すイムノブロット。Ｐ１：ＭＣＬ、Ｐ２：高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、Ｐ３：濾胞性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫３Ｂ、Ｐ４：ＤＬＢＣＬ、Ｐ５：血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫。（Ｂ）９−ＩＮＧ−４１は、５人の患者サンプルすべてで増殖を抑制した。（Ｃ）各種リンパ腫患者のパラフィン組織切片におけるＧＳＫ３βの免疫組織化学染色。代表的な画像は、異なるリンパ腫サンプルにおけるＧＳＫ３β（茶色の部分）の過剰発現のスペクトルを示す。メチレンブルーのカウンター染色（青色）は、背景にＧＳＫ３β陰性の細胞を示し、抗体陰性のコントロールパネルには、ＧＳＫ３β陰性の細胞を示す。画像は、４０倍の倍率の下で収集した。
【図１０】図１０は、ジェコ由来のキセノグラフトマウスモデルにおける９−ＩＮＧ−４１のインビボでの抗リンパ腫効果を示す。（Ａ）９−ＩＮＧ−４１の治療スケジュールと投与量を示す実験デザイン。（Ｂ）９−ＩＮＧ−４１を未処理または９−ＩＮＧ−４１で処理したキセノグラフトベアリングマウスの生物発光画像。示す画像は、実験終了時（１７日目）に収集した。実験は２回行われ、どちらも同様の結果が得られた。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本開示の一部を形成する以下の詳細な説明を参照することにより、本発明の主題をより容易に理解することができる。本発明は、本明細書に記載および／または示された特定の方法、条件またはパラメータに限定されるものではなく、本明細書で使用される用語は、例示の方法のみで特定の実施形態を説明する目的のためのものであり、請求された発明を限定することは意図されていないことが理解されよう。
【００４３】
本明細書で別段の定義がない限り、本願に関連して使用される科学的および技術的用語は、当技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００４４】
上記および本開示の全体にわたって採用されるように、以下の用語および略語は、別段の指示がない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００４５】
本開示において、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、複数の参照を含み、特定の数値への参照は、文脈が明確に他のことを示さない限り、少なくともその特定の数値を含む。したがって、例えば、「化合物」への参照は、当業者に知られているそのような化合物およびその等価物の１つまたは複数への参照であり、そのような化合物および等価物は、当業者に知られる。本明細書で使用されるように、用語「複数」は、１つ以上を意味する。値の範囲が表現される場合、別の実施形態は、一方の特定の値および／または他方の特定の値を包含する。同様に、値が近似値として表現される場合、前置詞「約」の使用により、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。すべての範囲は、包括的であり、組み合わせ可能である。
【００４６】
本明細書で使用されるように、用語「成分」、「組成物」、「化合物組成物」、「化合物」、「薬物」、「薬理活性剤」、「活性剤」、「治療上の」、「療法」、「治療」、または「薬剤」は、本明細書で互換的に使用され、被験体（ヒトまたは動物）に投与されると、局所的および／または全身的作用によって所望の薬理学的および／または生理学的効果を誘導する化合物または化合物または物質の組成物を指す。
【００４７】
本明細書で使用されるように、用語「治療の」、「治療」または「療法」（およびそれらの異なる形態）には、予防的（例えば、予防的）治療、治癒的または緩和的治療が含まれる。本明細書で使用されるように、「治療」という用語は、状態、疾患または障害の少なくとも１つの悪影響または負の効果または症状を緩和または軽減することを含む。この状態、疾患または障害は、癌であり得る。
【００４８】
上記および本開示全体に採用されるように、用語「有効量」とは、関連する障害、状態、または副作用の治療に関して所望の結果を達成するために必要な用量で、必要な期間だけ有効な量を意味する。本発明の成分の有効量は、選択された特定の化合物、成分または組成物、投与経路、および個人において所望の結果を引き出すための成分の能力だけでなく、緩和されるべき状態の病状または重症度などの要因によっても、患者ごとに異なることが理解されるだろう。ホルモンレベル、年齢、性別、体重、患者の状態、治療されている病理学的状態の重症度、特定の患者に続く同時投薬や特別な食事、および技術に熟練した者が認める他の要因を考慮して、適切な投与量は主治医の裁量に委ねられる。投与量は、改善された治療反応を提供するために調整されても良い。有効量はまた、成分のあらゆる毒性または有害な効果が、治療上有益な効果に勝るものである。
【００４９】
いくつかの実施形態では、有効量は患者の体重に基づく。いくつかの実施形態では、９−ＩＮＧ−４１の有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇである。
【００５０】
上記および本開示全体を通して採用されるように、用語「副治療量」とは、単独の治療剤として投与した場合に効果がない量を指す。
【００５１】
「薬剤学的に許容される」とは、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激性、アレルギー反応、または他の問題のある合併症を伴わない、ヒトおよび動物の組織との接触に適した化合物、材料、組成物、および／または投与形態であって、合理的な利益／リスク比に見合ったものを意味する。
【００５２】
本発明の範囲内で、開示された化合物は、薬学的に許容される塩の形態で調製することができる。"薬剤学的に許容される塩"とは、親化合物がその酸または塩基の塩を作ることによって修飾される、開示された化合物の誘導体を指す。製薬学的に許容される塩の例としては、アミンのような塩基性残基の鉱酸または有機酸塩；カルボン酸のような酸性残基のアルカリまたは有機酸塩；などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。製薬学的に許容される塩としては、例えば、非毒性の無機酸または有機酸から形成された親化合物の従来の非毒性塩または第四級アンモニウム塩が挙げられる。例えば、そのような従来の非毒性塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸に由来するものが含まれる。そして、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸などの有機酸から調製された塩が挙げられる。これらの生理学的に許容される塩は、当技術分野で知られる方法、例えば、遊離のアミン塩基を水性アルコールに過剰に溶解するか、遊離のカルボン酸を水酸化物のようなアルカリ金属塩基で中和するか、またはアミンで中和することによって調製される。
【００５３】
本明細書に記載される化合物は、代替の形態で調製することができる。例えば、多くのアミノ含有化合物は、酸付加塩として使用または調製することができる。しばしば、そのような塩は、化合物の単離および取り扱い特性を改善する。例えば、試薬、反応条件等に応じて、本明細書に記載の化合物は、例えば、それらの塩酸塩またはトシル酸塩として使用または調製することができる。同形の結晶形態、すべてのキラル形態およびラセミ形態、Ｎ−オキシド、水和物、溶媒和物、および酸塩水和物もまた、本発明の範囲内にあることが企図される。
【００５４】
本発明の特定の酸性または塩基性化合物は、ツビタイオンとして存在しても良い。遊離酸、遊離塩基、およびツビテリオンを含む化合物のすべての形態は、本発明の範囲内にあることが企図される。アミノ基およびカルボキシ基の両方を含む化合物が、しばしばそれらのツビテリオンの形態と平衡状態で存在することは、当技術分野でよく知られる。したがって、例えば、アミノ基およびカルボキシ基の両方を含む本明細書に記載された化合物のいずれかは、それらの対応する双性イオンへの参照も含む。
【００５５】
用語「投与する」とは、本発明の化合物または組成物を直接投与すること、または体内で活性化合物または物質の等価量を形成するプロドラッグ、誘導体またはアナログを投与することのいずれかを意味する。
【００５６】
用語「被験体」、「個体」、および「患者」は、本明細書において互換的に使用され、本発明に従った医薬組成物による予防的治療を含む治療が提供される動物、例えばヒトを指す。本明細書で使用される「被験体」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を指す。用語「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」は、本明細書において互換的に使用され、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類（特に高等霊長類）、羊、犬、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、豚、猫、ウサギ、牛、馬、および爬虫類、両生類、鶏、および七面鳥などの非哺乳動物を含む。
【００５７】
本開示は、有効量のＧＳＫ−３β阻害剤をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法を提供する。
【００５８】
本開示の方法を用いて治療され得る悪性リンパ増殖性障害は、悪性Ｂ細胞リンパ増殖性障害、または悪性Ｔ細胞リンパ増殖性障害であり得る。いくつかの実施形態では、悪性リンパ増殖性障害は、悪性Ｂ細胞リンパ増殖性障害である。他の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害は、悪性Ｔ細胞リンパ増殖性障害である。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本開示の方法を用いて治療され得る悪性Ｂ細胞リンパ増殖性障害は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、リンパ球芽球期慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫、管外縁帯Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、毛細血管白血病、原発性中枢神経系リンパ腫、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ウォルデンシュトロームマクログロブリン血症／リンパ形成不全リンパ腫、多発性骨髄腫、血漿細胞異形成症、血漿細胞新生物、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、ホジキン病、およびカステルマン病である。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本開示の方法を用いて治療される悪性Ｂ細胞リンパ増殖性障害は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態では、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫は、ダブルヒットリンパ腫である。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本開示の方法を用いて治療される悪性Ｂ細胞リンパ増殖性障害は、マントル細胞リンパ腫である。
【００６２】
いくつかの実施形態において、本開示の方法を用いて治療され得る悪性Ｔ細胞リンパ増殖性障害は、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、管外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、腸管症型Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、未分化大Ｔ／ヌル細胞リンパ腫、皮下パンニクル炎様Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病、Ｔ細胞性大粒径リンパ球白血病、リンパ球芽球期慢性骨髄性白血病、移植後リンパ増殖症候群、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型陽性（ＨＴＬＶ−１＋）成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫（ＡＴＬ）、Ｔ細胞性前リンパ性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、および非特定型Ｔ細胞リンパ腫
である。
【００６３】
いくつかの実施形態において、本開示の方法を用いて治療される悪性Ｔ細胞リンパ増殖性障害は、Ｔ細胞リンパ腫である。
【００６４】
本開示のいくつかの態様において、悪性リンパ増殖性障害は、化学療法不応性悪性リンパ増殖性障害であっても良い。化学療法不応性悪性リンパ増殖性障害は、１つ以上の化学療法治療に反応しなかった悪性リンパ増殖性障害である。いくつかの実施形態では、化学療法不応性悪性リンパ増殖性障害は、ダブルヒットリンパ腫（すなわち、ｃ−ＭＹＣおよびＢＣＬ−２の二重転座を有するリンパ腫）である。他の実施形態では、難治性悪性リンパ増殖性障害が奏効しなかった化学療法は、Ｒ−ＣＨＯＰ（リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）である。さらに別の実施形態では、難治性悪性リンパ増殖性障害が奏効しなかった化学療法は、モノクローナル抗体、キナーゼ阻害剤、酵素調節剤、およびアポトーシス調節剤を有するか否かを問わず、細胞毒性療法の組み合わせである。
【００６５】
本発明の方法を用いて状態が治療される患者は、動物、好ましくは哺乳動物である。いくつかの実施形態では、患者はヒトである。他の実施形態では、患者はイヌ（すなわち、イヌ）である。さらに他の実施形態では、患者はネコ（すなわち、ネコ）である。好ましい実施形態では、状態が本開示の方法を用いて治療される患者は、ヒトである。
【００６６】
本開示の方法において投与されるＧＳＫ−３β阻害剤は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）の活性を阻害する任意の化合物である。
【００６７】
いくつかの態様において、本開示の方法において投与されるＧＳＫ−３β阻害剤は、９−ＩＮＧ−４１、チデグルシブ、ＬＹ２０９０３１４、ＣＨＩＲ−９９０２１、ＣＨＩＲ−９８０１４、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＡＲ−Ａ０１１４１８、ＣＧ７０１３３８、またはＣＧ２０２７９６である。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本開示の方法において投与されるＧＳＫ−３β阻害剤は、９−ＩＮＧ−４１である。したがって、いくつかの局面において、本開示は、有効量の９−ＩＮＧ−４１を当該患者に投与する工程を含む、それを必要とする患者における悪性リンパ増殖性障害を治療する方法を提供する。
【００６９】
他の実施形態では、本開示の方法において投与されるＧＳＫ−３β阻害剤はチデグルシブであり、本開示は、チデグルシブの有効量を患者に投与する工程を含む、それを必要とする患者における悪性リンパ増殖性障害を治療する方法を提供する。
【００７０】
さらに別の実施形態では、本開示の方法において投与されるＧＳＫ−３β阻害剤はＬＹ２０９０３１４であり、本開示は、ＬＹ２０９０３１４の有効量を前記患者に投与する工程を含む、必要とする患者における悪性リンパ増殖性障害を治療する方法を提供する。
【００７１】
本開示の悪性リンパ増殖性障害を治療する方法において、有効量のＧＳＫ−３β阻害剤を、単独の治療剤として、または１つ以上の他の治療剤と組み合わせて、患者に投与することができる。
【００７２】
いくつかの実施形態において、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＧＳＫ−３β阻害剤を唯一の治療剤として患者に投与することからなる。ＧＳＫ−３β阻害剤が、本開示の方法において投与される唯一の治療上有効な化合物である場合、治療は、単剤療法と称される。いくつかの実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、９−ＩＮＧ−４１を唯一の治療剤として投与する工程を含む。他の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、チデグルシブを唯一の治療剤として投与する工程を含む。さらに別の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＬＹ２０９０３１４を単独治療剤として投与する工程を含む。
【００７３】
他の実施形態において、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、１つまたは複数の他の治療剤と組み合わせてＧＳＫ−３βを投与する工程を含む。ＧＳＫ−３β阻害剤が第２の治療剤と組み合わせて投与される場合、その治療は併用療法と呼ばれる。併用療法では、ＧＳＫ−３β阻害剤と第２の治療薬を同時に患者の体内に導入したり、患者に適用したりする必要はない。併用療法では、ＧＳＫ−３β阻害剤と第二の治療薬が同時に患者の体内に導入されていれば良い。したがって、併用療法は特定の投与スケジュールを意図するものではない。
【００７４】
いくつかの実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、１つ以上の他の治療剤と組み合わせて９−ＩＮＧ−４１を投与する工程を含む。他の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、チデグルシブを１つまたは複数の他の治療剤と組み合わせて投与する工程を含む。さらに別の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＬＹ２０９０３１４を１つまたは複数の他の治療剤と組み合わせて投与する工程を含む。
【００７５】
いくつかの態様において、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、アポトーシス調節剤と組み合わせてＧＳＫ−３β阻害剤を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、アポトーシスモジュレーターと組み合わせて９−ＩＮＧ−４１を投与する工程を含む。他の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、アポトーシスモジュレーターと組み合わせてチデグルシブを投与する工程を含む。さらに別の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、アポトーシスモジュレーターと組み合わせてＬＹ２０９０３１４を投与する工程を含む。
【００７６】
いくつかの局面において、アポトーシスモジュレーターは、Ｂｃｌ−２阻害剤である。例示的なＢｃｌ−２阻害剤としては、ベネトクラックス、ＡＢＴ−７３７、およびナビトクラックスが挙げられる。いくつかの側面において、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、Ｂｃｌ−２阻害剤と組み合わせてＧＳＫ−３β阻害剤を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、Ｂｃｌ−２阻害剤と組み合わせて９−ＩＮＧ−４１を投与する工程を含む。他の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、チデグルシブをＢｃｌ−２阻害剤と組み合わせて投与する工程を含む。さらに別の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、Ｂｃｌ−２阻害剤と組み合わせてＬＹ２０９０３１４を投与する工程を含む。
【００７７】
いくつかの局面では、Ｂｃｌ−２阻害剤は、ベネトクラックス、ＡＢＴ−７３７、またはナビトクラックスである。いくつかの側面において、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＧＳＫ−３β阻害剤をベネトグラックス、ＡＢＴ−７３７、またはナビトグラックスと組み合わせて投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、９−ＩＮＧ−４１をベネトグラックス、ＡＢＴ−７３７またはナビトグラックスと組み合わせて投与する工程を含む。他の実施形態において、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、チデグルシブを、ベネトグラックス、ＡＢＴ−７３７またはナビトグラックスと組み合わせて投与する工程を含む。さらに別の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＬＹ２０９０３１４をベネトグラックス、ＡＢＴ−７３７またはナビトグラックスと組み合わせて投与する工程を含む。
【００７８】
いくつかの局面では、Ｂｃｌ−２阻害剤はベネトグラックスである。他の局面では、Ｂｃｌ−２阻害剤はＡＢＴ−７３７である。さらに他の局面では、Ｂｃｌ−２阻害剤は、ナビトグラックスである。いくつかの局面において、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＧＳＫ−３β阻害剤をベニトグラックスと組み合わせて投与する工程を含む。いくつかの側面において、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＧＳＫ−３β阻害剤をＡＢＴ−７３７と組み合わせて投与する工程を含む。いくつかの側面において、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＧＳＫ−３β阻害剤をナビトグラックスと併用して投与する工程を含む。
【００７９】
いくつかの実施形態において、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、９−ＩＮＧ−４１をナビトグラックスと併用して投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＡＢＴ−７３７と組み合わせて９−ＩＮＧ−４１を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、９−ＩＮＧ−４１をナビトグラックスと併用して投与する工程を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、チデグルシブとベニトグラックスを併用して投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、チデグルシブをＡＢＴ−７３７と組み合わせて投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、チデグルシブとナビトグラックスを併用して投与する工程を含む。
【００８１】
さらに別の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＬＹ２０９０３１４をベネトグラックスと併用して投与する工程を含む。さらに別の実施形態において、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＬＹ２０９０３１４をＡＢＴ−７３７と組み合わせて投与する工程を含む。さらに別の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＬＹ２０９０３１４をナビトグラックスと組み合わせて投与する工程を含む。
【００８２】
いくつかの局面において、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＧＳＫ−３β阻害剤をサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）モジュレーターと組み合わせて投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）モジュレーターと組み合わせて９−ＩＮＧ−４１を投与する工程を含む。他の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、チデグルシブをサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）モジュレーターと組み合わせて投与する工程を含む。さらに別の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）モジュレーターと組み合わせてＬＹ２０９０３１４を投与する工程を含む。
【００８３】
いくつかの局面において、ＣＤＫモジュレーターは、環状依存性キナーゼ９（「ＣＤＫ９」）インヒビターである。例示的なＣＤＫ９阻害剤としては、ＢＡＹ−１１４３５７２、ＬＤＣ００６７、ダイナシクリブ（ＳＣＨ７２７９６５）、ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ−３８７０３２）、ＡＴ７５１９、Ｐ２７６−００、ＡＺＤ５４３８、ＰＨＡ−７６７４９１、またはＰＨＡ−７９３８７が挙げられる。いくつかの態様において、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＣＤＫ９阻害剤と組み合わせてＧＳＫ−３β阻害剤を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＣＤＫ９阻害剤と組み合わせて９−ＩＮＧ−４１を投与する工程を含む。他の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＣＤＫ９阻害剤と組み合わせてチデグルシブを投与する工程を含む。さらに別の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＣＤＫ９阻害剤と組み合わせてＬＹ２０９０３１４を投与する工程を含む。
【００８４】
いくつかの局面において、ＣＤＫ９阻害剤は、ＢＡＹ−１１４３５７２、ＬＤＣ００６７、ダイナシクリブ（ＳＣＨ７２７９６５）、ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ−３８７０３２）、ＡＴ７５１９、Ｐ２７６−００、ＡＺＤ５４３８、ＰＨＡ−７６７４９１、またはＰＨＡ−７９３８８７である。いくつかの態様において、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＢＡＹ−１１４３５７２、ＬＤＣ００６７、Ｄｉｎａｃｉｃｌｉｂ（ＳＣＨ７２７９６５）、ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ−３８７０３２）、ＡＴ７５１９、Ｐ２７６−００、ＡＺＤ５４３８、ＰＨＡ−７６７４９１、またはＰＨＡ−７９３８７と組み合わせてＧＳＫ−３β阻害剤を投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＢＡＹ−１１４３５７２、ＬＤＣ００６７、Ｄｉｎａｃｉｃｌｉｂ（ＳＣＨ７２７９６５）、ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ−３８７０３２）、ＡＴ７５１９、Ｐ２７６−００、ＡＺＤ５４３８、ＰＨＡ−７６７４９１、またはＰＨＡ−７９３８７と組み合わせて、９−ＩＮＧ−４１を投与する工程を含む。他の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＢＡＹ−１１４３５７２、ＬＤＣ００００６７、ダイナシクリブ（ＳＣＨ７２７９６５）、ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ−３８７０３２）、ＡＴ７５１９、Ｐ２７６−００、ＡＺＤ５４３８、ＰＨＡ−７６７４９１、またはＰＨＡ−７９３８８７との組み合わせでチデグルシブを投与する工程を含む。さらに別の実施形態において、悪性リンパ増殖性障害を処置する方法は、ＢＡＹ−１１４３５７２、ＬＤＣ００６７、Ｄｉｎａｃｉｃｌｉｂ（ＳＣＨ７２７９６５）、ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ−３８７０３２）、ＡＴ７５１９、Ｐ２７６−００、ＡＺＤ５４３８、ＰＨＡ−７６７４９１、またはＰＨＡ−７９３８７と組み合わせて、ＬＹ２０９０３１４を投与する工程を含む。
【００８５】
いくつかの局面において、ＣＤＫ９阻害剤は、ＢＡＹ−１１４３５７２である。いくつかの側面において、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＢＡＹ−１１４３５７２と組み合わせてＧＳＫ−３β阻害剤を投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、悪性リンパ増殖性疾患を治療する方法は、９−ＩＮＧ−４１をＢＡＹ−１１４３５７２と組み合わせて投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、チデグルシブをＢＡＹ−１１４３５７２と組み合わせて投与する工程を含む。さらに別の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＬＹ２０９０３１４をＢＡＹ−１１４３５７２と組み合わせて投与する工程を含む。
【００８６】
いくつかの態様において、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＭＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３経路のモジュレーターと組み合わせてＧＳＫ−３β阻害剤を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＭＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３経路のモジュレーターと組み合わせて９−ＩＮＧ−４１を投与する工程を含む。他の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＭＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３経路のモジュレーターと組み合わせてチデグルシブを投与する工程を含む。さらに別の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＭＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３経路のモジュレーターと組み合わせてＬＹ２０９０３１４を投与する工程を含む。
【００８７】
いくつかの側面において、ＭＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３経路のモジュレーターは、ＰＩ３Ｋ阻害剤である。例示的なＰＩ３Ｋ阻害剤には、コパンリシブおよびイデラリシブが含まれる。いくつかの局面において、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＧＳＫ−３β阻害剤をＰＩ３Ｋ阻害剤と組み合わせて投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、９−ＩＮＧ−４１をＰＩ３Ｋ阻害剤と組み合わせて投与する工程を含む。他の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、チデグルシブをＰＩ３Ｋ阻害剤と組み合わせて投与する工程を含む。さらに別の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＬＹ２０９０３１４をＰＩ３Ｋ阻害剤と組み合わせて投与する工程を含む。
【００８８】
いくつかの局面では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はコパンリシブまたはイデラリシブである。いくつかの側面において、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、コパンリシブまたはイデラリシブと組み合わせてＧＳＫ−３β阻害剤を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、コパンリシブまたはイデラリシブと組み合わせて９−ＩＮＧ−４１を投与する工程を含む。他の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、チデグルシブをコパンリシブまたはイデラリシブと組み合わせて投与する工程を含む。さらに別の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、コパンリシブまたはイデラリシブと組み合わせてＬＹ２０９０３１４を投与する工程を含む。
【００８９】
いくつかの局面では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はコパンリシブである。いくつかの側面において、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、コパンリシブと組み合わせてＧＳＫ−３β阻害剤を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、コパンリシブと組み合わせて９−ＩＮＧ−４１を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、チデグルシブとコパンリシブを併用して投与する工程を含む。さらに別の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、コパンリシブと組み合わせてＬＹ２０９０３１４を投与する工程を含む。
【００９０】
いくつかの局面では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はイデラリシブである。いくつかの側面において、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、ＧＳＫ−３β阻害剤をイデラリシブと組み合わせて投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、９−ＩＮＧ−４１をイデラリシブと組み合わせて投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、イデラリシブと組み合わせてチデグルシブを投与する工程を含む。さらに他の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、イデラリシブと組み合わせてＬＹ２０９０３１４を投与する工程を含む。
【００９１】
まだ他の態様において、第２の治療剤は、５−フルオロウラシル、酢酸アビラテロン、アセチルコリン、アド−トラスツズマブ・エムタンシン、アファチニブ、アルデスロイキン、アレクチニブ、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アミノレブリン酸、アナストロゾール、アナストロゾール、アプレピタント、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ・エルウィニア・クリサンテミ、アテゾリズマブ、アキシチニブ、アザシチジン、ベリノスタット、ベンダムスチン、ベンジルイソチオシアネート、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブリナトモマブ、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブレンツキシマブ・ベドチン、ブスルファン、カバジタキセル、カボザンチニブ、カペシタビン、カルボプラチン、カルフィルゾミブ、カルムスチン、セリチニブ、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、クロファラビン、コビメチニブ、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン、ダブラフェニブ、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダラツマブ、ダサチニブ、ダウノルビシン、デシタビン、デフィブロチドナトリウム  デガレリクス、デニレキン・ジフィチトックス（ｄｉｆｔｉｔｏｘ）、デノスマブ、デキサメタゾン、デキサゾキサン、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）、ジヌツキシマブ、ドセタキセル、ドキソルビシン、エロツズマブ、エルトロンボパグ  エンザルツァルタミド、エピルビシン、メシル酸エリブリン、エルロチニブ、エトポシド、エベロリムス、エクセメスタン、フィルグラスチム、リン酸フルダラビン、フルタミド、フルベストラント、フルベストラント  ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、グルカルピダーゼ、酢酸ゴセリン、ヒドロキシ尿素、イブリツモマブチウキセタン、イブルチニブ、イダルビシン、イデラリシブ、イフォスファミド、イマチニブ、イビキモド、インターフェロンアルファ−２ｂ、イピリムマブ、イリノテカン、イクサベピロン、イクサゾミブ、ランレオチド、ラパチニブ、レナリドミド、レンバチニブ、レトロゾール、ロイコボリン。ルプロライド、ロムスチン、メクロレスタミン、酢酸メグストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、マイトキサントロン、ネチツムマブ、ネララビン、ネツピタント、ニロチニブ、ニルタミド、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オパツズマブ、オラパリブ、オマセタキシンメペスクチネート、オシメルチニブ、オキサリプラチン、オゾガミシン、パクリタキセル、パルボシクリブ、パリフェルミン、パミドロネート、パニツムマブ、パノビノスタット、パゾパニブ、ペガスパルガーゼ、ペグインターフェロンアルファ−２ｂ、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド、ペルツズマブ、プレリキサフォー、ポマリドマイド、ポナチニブ。プラトレキサート、プレドニゾン、プロカルバジン、プロプラノロール、塩化ラジウム２２３、ラロキシフェン、ラムシルマブ、ラスブリカーゼ、レゴラフェニブ、リツキシマブ、ロラピタント、ロミデプシン、ロミプロスティム、ラキソリチニブ、シルツキシマブ、シプルセル−Ｔ、ソニデギブ、ソラフェニブ、スニチニブ、タリモジンラヘルパレプベック、タモキシフェン、テモゾロミド、テムシロリムス、サリドマイド、チオグアニン。チオテパ、ティピラシル、トポテカン、トレミフェン、トレミフェン、トシツモマブ、トラベクテジン、トラメチニブ、トラスツズマブ、トレチノイン、トリフリジン、三酢酸ウリジン、バンデタニブ、ベムラフェニブ、ベネトクラックス、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビスモデギブ、ボリノスタット、ジブアフリセプト、ゾレドロン酸のうちの１種または２種以上、およびそれらの製薬学的に許容される塩である。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾンのうちの１つまたは複数である。
【００９２】
いくつかの側面において、ＧＳＫ−３β阻害剤を第２の治療剤と組み合わせて投与することは、所与の治療効果をもたらすために必要な第２の治療剤の量を減少させる。すなわち、いくつかの実施形態では、治療的に有効な治療は、第２の治療剤のサブ治療量（すなわち、単独の治療剤として投与した場合には効果がない量）と組み合わせてＧＳＫ−３β阻害剤を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、ＧＳＫ−３β阻害剤は、アポトーシス調節剤のサブ治療量と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、９−ＩＮＧ−４１は、Ｂｃｌ−２阻害剤のサブ治療量と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、９−ＩＮＧ−４１は、ベネトクラックス、ＡＢＴ−７３７、またはナビトクラックスの亜治療量と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、９−ＩＮＧ−４１は、亜治療量のベネトグラックスと組み合わせて投与される。
【００９３】
他の実施形態では、チデグルシブは、Ｂｃｌ−２阻害剤のサブ治療量と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、チデグルシブは、ベネトグラックス、ＡＢＴ−７３７、またはナビトグラックスの亜治療量と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、チデグルシブは、亜治療量のベネトグラックスと組み合わせて投与される。
【００９４】
さらに別の実施形態では、ＬＹ２０９０３１４は、Ｂｃｌ−２阻害剤のサブ治療量と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、ＬＹ２０９０３１４は、ベネトクラックス、ＡＢＴ−７３７、またはナビトクラックスの亜治療量と組み合わせて投与される。  いくつかの実施形態では、ＬＹ２０９０３１４は、亜治療量のヴェネトグラックスと組み合わせて投与される。
【００９５】
他の実施形態では、ＧＳＫ−３β阻害剤は、ＣＤＫモジュレーターのサブ治療量と組み合わせて投与される。他の実施形態では、ＧＳＫ−３β阻害剤は、ＣＤＫ９阻害剤のサブ治療量と組み合わせて投与される。他の実施形態では、ＧＳＫ−３β阻害剤は、ＣＤＫ９阻害剤のサブ治療量と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、９−ＩＮＧ−４１は、ＣＤＫ９阻害剤のサブ治療量と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、９−ＩＮＧ−４１は、ＢＡＹ−１１４３５７２、ＬＤＣ００６７、Ｄｉｎａｃｉｃｌｉｂ（ＳＣＨ７２７９６５）、ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ−３８７０３２）、ＡＴ７５１９、Ｐ２７６−００、ＡＺＤ５４３８、ＰＨＡ−７６７４９１、またはＰＨＡ−７９３８８７のサブ治療量と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、９−ＩＮＧ−４１は、ＢＡＹ−１１４３５７２のサブ治療量と組み合わせて投与される。
【００９６】
いくつかの実施形態では、チデグルシブは、ＣＤＫ９阻害剤のサブ治療量と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、チデグルシブは、ＢＡＹ−１１４３５７２、ＬＤＣ００６７、ダイナシクリブ（ＳＣＨ７２７９６５）、ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ−３８７０３２）、ＡＴ７５１９、Ｐ２７６−００、ＡＺＤ５４３８、ＰＨＡ−７６７４９１、またはＰＨＡ−７９３８８７のサブ治療量と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、チデグルシブは、サブ治療量のＢＡＹ−１１４３５７２と組み合わせて投与される。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ＬＹ２０９０３１４は、ＣＤＫ９阻害剤のサブ治療量と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、ＬＹ２０９０３１４は、ＢＡＹ−１１４３５７２、ＬＤＣ００００６７、ダイナシクリブ（ＳＣＨ７２７９６５）、ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ−３８７０３２）、ＡＴ７５１９、Ｐ２７６−００、ＡＺＤ５４３８、ＰＨＡ−７６７４９１、またはＰＨＡ−７９３８８７のサブ治療量と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、ＬＹ２０９０３１４は、サブ治療量のＢＡＹ−１１４３５７２と組み合わせて投与される。
【００９８】
いくつかの態様において、ＧＳＫ−３β阻害剤は、ＭＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３経路のモジュレーターのサブ治療量と組み合わせて投与される。いくつかの側面において、ＧＳＫ−３β阻害剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤のサブ治療量と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、９−ＩＮＧ−４１は、ＰＩ３Ｋ阻害剤のサブ治療量と組み合わせて投与される。他の実施形態では、９−ＩＮＧ−４１は、コパンリシブまたはイデラリシブのサブ治療量と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、９−ＩＮＧ−４１は、コパンリシブの亜治療量と組み合わせて投与される。さらに別の実施形態では、９−ＩＮＧ−４１は、イデラリシブの亜治療量と組み合わせて投与される。
【００９９】
いくつかの実施形態では、チデグリシブは、ＰＩ３Ｋ阻害剤のサブ治療量と組み合わせて投与される。他の実施形態では、チデグルシブは、コパンリシブまたはイデラリシブの亜治療量と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、チデグルシブは、コパンリシブの亜治療量と組み合わせて投与される。さらに他の実施形態では、チデグルシブは、イデラリシブの亜治療量と組み合わせて投与される。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ＬＹ２０９０３１４は、ＰＩ３Ｋ阻害剤のサブ治療量と組み合わせて投与される。他の実施形態では、ＬＹ２０９０３１４は、コパンリシブまたはイデラリシブの亜治療量と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、ＬＹ２０９０３１４は、コパンリシブの亜治療量と組み合わせて投与される。さらに他の実施形態では、ＬＹ２０９０３１４は、イデラリシブの亜治療量と組み合わせて投与される。
【０１０１】
ＧＳＫ−３β阻害剤は、ＧＳＫ−３β阻害剤と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤とからなる医薬組成物中に投与されても良い。いくつかの実施形態では、９−ＩＮＧ−４１は、９−ＩＮＧ−４１および少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤からなる医薬組成物中に投与されても良い。他の実施形態では、チデグルシブは、チデグルシブと少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤とからなる医薬組成物中に投与されても良い。他の実施形態では、ＬＹ２０９０３１４は、ＬＹ２０９０３１４および少なくとも１つの薬剤学的に許容される担体または賦形剤からなる医薬組成物中に投与されても良い。同様に、第２の治療剤は、第２の治療剤と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤とからなる医薬組成物中に投与されても良い。製薬学的に許容される担体または賦形剤は、当技術分野で知られる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）を参照。
【０１０２】
いくつかの態様において、ＧＳＫ−３β阻害剤および第２の治療剤は、単一の医薬組成物中に一緒に投与され得る。したがって、いくつかの態様において、本開示は、ＧＳＫ−３β阻害剤と第２の治療剤と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤とからなる医薬組成物に向けられる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＧＳＫ−３β阻害剤；アポトーシス調節剤、ＣＤＫ調節剤、またはｍＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ調節剤のうちの１またはそれ以上；および薬剤学的に許容される担体または賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、９−ＩＮＧ−４１、チデグルシブ、またはＬＹ２０９０３１４のうちの１つ以上、アポトーシスモジュレーター、ＣＤＫモジュレーター、またはｍＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋモジュレーターのうちの１またはそれ以上、および薬剤学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、９−ＩＮＧ−４１、チデグルシブ、またはＬＹ２０９０３１４のうちの１またはそれ以上；Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ、ＢＡＹ−１１４３５７２、またはイデラリシブのうちの１またはそれ以上；および製薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、９−ＩＮＧ−４１、チデグルシブ、またはＬＹ２００９０３１４；Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ；および薬学的に許容される担体または賦形剤のうちの１またはそれ以上を含む。他の実施形態では、医薬組成物は、９−ＩＮＧ−４１、チデグルシブ、またはＬＹ２０９０３１４；ＢＡＹ−１１４３５７２；および薬剤学的に許容されるキャリアまたは賦形剤のうちの１またはそれ以上を含む。さらに別の実施形態では、医薬組成物は、９−ＩＮＧ−４１、チデグルシブ、またはＬＹ２０９０３１４；イデラリシブ；および薬学的に許容される担体または賦形剤のうちの１またはそれ以上を含む。
【０１０３】
医薬組成物および併用療法の代表的な投与方法も提供される。本発明の様々な実施形態は、リンパ腫の治療のためにヒト患者に医薬組成物または併用療法を投与する方法に関する。方法は、一般に受け入れられる投与経路（例えば、経口、静脈内、皮下、非経口、吸入、局所など）によって医薬組成物または組合せ療法を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物または組合せ療法は、経口、静脈内および／または皮下投与され得る。投与は、任意の適切な投与レジメンを用いて行われ得る。適切な投与レジメンは、当技術分野の通常の当業者に知られる。
【０１０４】
本発明の特定の実施形態では、医薬組成物または併用療法は、ヒト患者に１日１回投与されても良い。他の実施形態では、医薬組成物または併用療法は、ヒト患者に１日２回投与されても良い。いくつかの実施形態では、医薬組成物または併用療法は、食事の間にヒト患者に投与されても良い。
【０１０５】
本開示の他の局面では、ＧＳＫ−３β阻害剤は、別の非化学療法的な抗癌剤治療と組み合わせて投与されても良い。いくつかの実施形態では、ＧＳＫ−３β阻害剤は、放射線療法と組み合わせて投与される。したがって、いくつかの実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、放射線療法と組み合わせて９−ＩＮＧ−４１を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、チデグルシブを放射線療法と組み合わせて投与する工程を含む。さらに別の実施形態では、悪性リンパ増殖性障害を治療する方法は、放射線療法と組み合わせてＬＹ２０９０３１４を投与する工程を含む。
［実施例］
【０１０６】
以下の実施例は、本開示の特定の側面をさらに例示するものであり、本開示の範囲を何らかの形で限定することを意図するものではない。
材料−実施例１〜５
【０１０７】
ダウディ（Ｂｕｒｋｉｔ）およびＳＵＤＨＬ−４（生殖中心（ＧＣ）びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ））細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ；ｃｕｌｔｕｒａｔｉｏｎ；ｃｏｌｔｕｒａｔｉｏｎ；ｃｏｌｔｕｒｅ．ＡＴＣＣ）から購入した。ＫＰＵＭ−ＵＨ１（ダブルヒットＤＬＢＣＬ）細胞は、京都府立医科大学黒田純也より入手した。すべての細胞株を無菌的に培養し、水ジャケットインキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｏｒｍａ）中で３７℃、５％ＣＯ２で維持し、０．３ｇ／ｍＬグルタミン、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）を含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、および抗生物質および抗真菌試薬（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ；最終濃度−１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩、および２５０ｎｇ／ｍＬアンホテリシンＢ）を与えた。カルパス４２２（ＧＣ−ＤＬＢＣＬ）細胞はシグマから購入した。ＴＭＤ８（活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ）細胞は、ＮＣＩからＤｒ．Ｌｏｕｉｓ  Ｓｔｏｕｄｔの研究室から入手し、上記のように維持したが、２０％ＦＢＳを用いた。アッセイのためのすべての細胞数は、ＴＣ２０自動細胞カウンター（ＢｉｏＲａｄ）を使用して定量化した。試験したすべてのリンパ腫細胞株は、活性なＧＳＫ−３βを発現する。
【０１０８】
ＶｅｎｅｔｏｃｌａｘおよびＩｄｅｌａｌｉｓｉｂをＳｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。ＢＡＹ−１１４３５７２はアクティブバイオケムから購入した。すべての薬剤をＤＭＳＯに再懸濁した。薬物を含まないＤＭＳＯを無処理対照として使用した。
【実施例１】
【０１０９】
実施例１−生存性および増殖アッセイ（ＭＴＳアッセイ
３日目の細胞生存率および７日間にわたる増殖は、製造業者の指示に従って、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（商標登録）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ試薬（ＭＴＳ）を用いて、９−ＩＮＧ−４１の濃度を変化させて細胞を処理した後に測定した。処理の最後に、９６ウェルプレートに２０μＬの試薬をウェルあたり添加し、３７℃で２−４時間インキュベートした。４９０ｎｍ（Ａ４９０）における吸光度をＰｏｗｅｒｗａｖｅ  ＸＳプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を用いて測定した。
【０１１０】
本研究で使用したすべてのリンパ腫細胞株は、活性なＧＳＫ−３βを発現する。ＳＵＤＨＬ−４、ＫＰＵＭ−ＵＨ１、Ｋａｒｐａｓ  ４２２、またはＴＭＤ８リンパ腫細胞をプレートし、１日目、３日目、５日目および７日目の細胞数をＭＴＳアッセイを用いて測定した。図１を参照。３日目の細胞生存率（図１Ａ）は、１μＭ９−ＩＮＧ−４１処理時に４０〜７０％（ｐ＜０．０５）減少し、ＳＵＤＨＬ−４およびＫＰＵＭ−ＵＨ１は細胞生存率の最も高い減少を示した。１μＭ９−ＩＮＧ−４１に曝露すると、すべてのリンパ腫細胞株は増殖停止を起こし（図１Ｂ−１Ｅ）、７日目にはコントロールと比較して３０％未満の増殖を示した（ｐ＜０．０５）。９−ＩＮＧ−４１の濃度を変化させた（０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、５μＭ、および１０μＭ）リンパ腫細胞の細胞生存率も試験し、生存率の低下は、０．５μＭ以上の９−ＩＮＧ−４１の濃度で見られた。
【実施例２】
【０１１１】
実施例２−ＥｎｚＣｈｅｋ（商標登録）カスパーゼ３アッセイ
ＥｎｚＣｈｅｋカスパーゼ３アッセイ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を製造者の指示に従って実施した。１００，０００個の細胞を１２ウェルプレートにプレートし、９−ＩＮＧ−４１の様々な濃度で２４時間、二重に処理した。処理の終わりに、細胞を２００ｒｃｆで５分間遠心分離し、１Ｘ  ＰＢＳで１回洗浄し、キットで提供された１Ｘ溶解緩衝液５０μＬ中で溶解した。効率的な溶解のために、細胞は１回の凍結融解サイクルを受けた。溶解した細胞は、細胞破片を除去するために再び遠心分離し、上清をアッセイに使用した。Ｚ−ＤＥＶＤ−Ｒ１１０基質を含む２Ｘ基質作業溶液の５０μＬを細胞溶解液に添加し、その後室温で４５分間インキュベートした。このアッセイで使用されるロダミン１１０由来の基質（Ｚ−ＤＥＶＤ−Ｒ１１０）は、非蛍光ビスアミド化合物であり、細胞溶解物中の活性カスパーゼ３と多分カスパーゼ７を介して酵素的に切断されると、２段階のプロセスで蛍光モノアミドに変換され、その後、さらに蛍光Ｒ１１０生成物に変換される。これらの生成物の両方は、その後、対応する波長（励起４９６ｎｍ／発光５２０ｎｍ）でＢｉｏｔｅｋシナジー２蛍光プレートリーダーを使用して測定した。蛍光読取値は、標準ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を介して決定された細胞溶解液中のタンパク質量に正規化した。相対的な蛍光は、無処理対照を１とした後に計算した。
【０１１２】
ＥＮＺＣＨＥＫカスパーゼ３アッセイは、リンパ腫細胞を０．５μＭまたはそれ以上の濃度の９−ＩＮＧ−４１で処理した際に、観察されたカスパーゼ３／７活性の増加を明らかにした。Ｘｅｎｏｇｒａｆｔマウスを用いた薬物動態試験では、２０ｍｇ／ｋｇを静脈内投与すると、３０分以内に血漿中に約８μＭの９−ＩＮＧ−４１濃度が、脳内に約４０μＭの９−ＩＮＧ−４１濃度が得られることが示唆された。Ｕｇｏｌｋｏｖ  Ａ，Ｑｉａｎｇ  Ｗ，Ｂｏｎｄａｒｅｎｋｏ  Ｇ，Ｐｒｏｃｉｓｓｉ  Ｄ，Ｇａｉｓｉｎａ  Ｉ，Ｊａｍｅｓ  ＣＤ，Ｃｈａｎｄｌｅｒ  Ｊ，Ｋｏｚｉｋｏｗｓｋｉ  Ａ，Ｇｕｎｏｓｅｗｏｙｏ  Ｈ，Ｏ'Ｈａｌｌｏｒａｎ  Ｔ，Ｒａｉｚｅｒ  Ｊ，Ｍａｚａｒ  ＡＰ．ＧＳＫ−３阻害剤９−ＩＮＧ−４１とＣＣＮＵの併用療法は、患者由来の異種移植モデルにおける同所性化学抵抗性膠芽腫を治癒させた。Ｔｒａｎｓｌ  Ｏｎｃｏｌ．２０１７；１０：６６９−７８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｔｒａｎｏｎ．２０１７．０６．００３．
【０１１３】
ＭＴＳおよびＥＮＺＣＨＥＫカスパーゼ３アッセイのデータは、９−ＩＮＧ−４１が単剤でリンパ腫細胞株の増殖を阻害し、リンパ腫細胞の生存率を低下させることを示す。理論に拘束されることを意図しないが、これらの結果は、ＧＳＫ−３βを標的とすることで、攻撃性の高いＢ細胞リンパ腫細胞株の増殖と生存率を低下させ、生存シグナルとＤＮＡ損傷応答に変化に富んだ効果を誘導し、最終的にはアポトーシスにつながることを示唆する。これらの効果は、ＤＬＢＣＬ細胞株の由来細胞とは独立したものであった。
【０１１４】
典型的な化学療法抵抗性細胞株であるＤＨＬ細胞株ＫＰＵＭ−ＵＨ１における９−ＩＮＧ−４１の活性は特に興味深いものである。理論に拘束されることを意図しないが、Ｌｕｍｉｎｅｘ分析（後述）は、９−ＩＮＧ−４１が、ｃ−ＭＹＣシグナル伝達のダウンレギュレーションおよびサバイビンの減少を介したアポトーシスの誘導を通じて、ＫＰＵＭ−ＵＨ１細胞株において効果を発揮することを示唆する。このサバイビンのダウンレギュレーションは、この細胞株におけるＮＦ−κＢの変化とは関連せず、またそれによって駆動されているようには見えない。これは、ＧＳＫ−３β抑制がサバイビン効果を介してＮＦ−κＢ介在性アポトーシスにＡＬＬ細胞を感作する急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）において記載されてきたものとは対照的である。Ｈｕ  Ｙ，Ｇｕ  Ｘ，Ｌｉ  Ｒ，Ｌｕｏ  Ｑ，Ｘｕ  Ｙ．を参照。グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β阻害は、小児急性リンパ性白血病細胞の核内因子κＢ  介在性アポトーシスを誘導する。Ｊ  Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０；２９：１５４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／１７５６−９９６６−２９−１５４．
【実施例３】
【０１１５】
実施例３−ウェスタンブロット分析
９−ＩＮＧ−４１単独および９−ＩＮＧ−４１とＶｅｎｅｔｏｃｌａｘまたはＢＡＹ−１１４３５７２のいずれかを組み合わせた場合のウエスタンブロットを介してＫＰＵＭ−ＵＨ１細胞におけるｃ−ＭＹＣレベルを分析した。約１００００万個の細胞を２００ｒｃｆで５分間スピンダウンし、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を補充した５０μｌのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  ＭＡＰ溶解緩衝液で溶解する前にＰＢＳで１回洗浄した。β−メルカプトエタノール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を補充した４Ｘサンプルバッファー中で変性したタンパク質をウェルあたりに装填した。Ｂｉｏ−ＲａｄステインフリーのＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ４−２０％プレキャストゲルを使用した。１４０ボルトで９０分間ゲルを走らせた後、Ｂｉｏ−Ｒａｄゲルイメージャーを用いてステインフリー技術を活性化し、ゲル中に装填された総タンパク質レベルを可視化した。次に、ニトロセルロースターボトランスファーパックおよびシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてタンパク質を膜にトランスファーし、トリス緩衝生理食塩水０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳ−Ｔ）中の５％ｗ／ｖドライミルクを用いて１時間膜をブロックした。その後、膜を５％ＴＢＳ−Ｔ中の５％ＢＳＡで希釈した一次抗体で一晩インキュベートした。その後、膜をＴＢＳ−Ｔで３回（１回の１５分間洗浄と２回の５分間洗浄）洗浄した後、対応するＨＲＰと共役した二次抗体を１時間インキュベートし、前と同様にＴＢＳ−Ｔで洗浄した。最終洗浄後、膜をＰｉｅｒｃｅ  ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光キットを用いて現像し、Ｂｉｏ−Ｒａｄイメージングシステムを用いて可視化した。使用した抗体は、ウサギ抗−ＧＳＫ−３β（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｃａｔ．Ｎｏ：１２４５６）、ウサギ抗−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ−３β（Ｙ２１６）（Ａｂｃａｍ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ａｂ７５７４５）、Ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｃ−ＭＹＣ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｃａｔ．Ｎｏ：５６０５）、ウサギ抗−ｃ−ＭＹＣ（Ｓｅｒ  ６２）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｃａｔ．番号：１３７４８）、ウサギ抗−ｃ−ＭＹＣ（Ｔｈｒ５８）（Ａｂｃａｍ、Ｃａｔ．番号：ａｂ１８５６５５）、マウス抗−β−アクチン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．番号：Ａ５４４１）を１：１０００希釈した。抗ウサギＨＲＰおよび抗マウスＨＲＰ二次抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入し、１：５０００希釈で使用した。必要に応じて、膜をＲＥＳＴＯＲＥ  ＰＬＵＳウエスタンブロットストリッピングバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて１０分間ストリッピングし、ＴＢＳ−Ｔで数回洗浄した後、以前と同様に再ブロッキングし、再プロービングした。バンド強度の定量は、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて行った。ダブルヒットリンパ腫細胞株ＫＰＵＭ−ＵＨ１におけるこれらの実験は、９−ＩＮＧ−４１処理によりｐｈｏｓｐｈｏ−ｃ−ＭＹＣが修飾されることを示唆する。
【実施例４】
【０１１６】
実施例４−ルミネックス分析
ＮＦ−κＢのシグナリング変化［ＭＩＬＬＩＰＬＥＸＭＡＰ  ＮＦ−κＢ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄ  Ｋｉｔ  ６−ｐｌｅｘ  Ｋｉｔ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、分析物：ｃ−ＭＹＣ、ＦＡＤＤ（Ｓｅｒ１９４）、ＩκＢα（Ｓｅｒ３２）、ＩＫＫα／β（Ｓｅｒ１７７／Ｓｅｒ１８１）、ＮＦ−κＢ（Ｓｅｒ５３６）、ＴＮＦＲ１］、ＤＮＡ損傷［ミリプレックスＭＡＰ  ＤＮＡ損傷／遺伝毒性磁気ビーズパネル、ＥＭＤミリポア、分析対象：ＡＴＲ  （ｔｏｔａｌ）、Ｃｈｋ１  （Ｓｅｒ３４５）、Ｃｈｋ２（Ｔｈｒ６８）、Ｈ２Ａ．Ｘ（Ｓｅｒ１３９）、ＭＤＭ２  （ｔｏｔａｌ）、ｐ２１（Ｔｏｔａｌ）、ｐ５３（Ｓｅｒ１５）］、およびａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ［Ｂｉｏ−ｐｌｅｘ  ｐｒｏ  ＲＢＭ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐａｎｅｌ  ２  ａｎｄ  ３、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ａｎａｌｙｔｅｓ：Ｂａｄ、Ｂａｘ／Ｂｃｌ−２ｄｉｍｅｒ、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｉｍ、Ｍｃｌ−１、ａｃｔｉｖｅ  ｃａｓｐａｓｅ  ３、Ｂｃｌ−ｘＬ／Ｂａｋ  ｄｉｍｅｒ、Ｍｃｌ−１／Ｂａｋ  ｄｉｍｅｒ、ｓｕｒｖｉｖｉｎ］は、１μＭ９−ＩＮＧ−４１を４８時間処理した場合に無処理対照と比較して、メーカーの指示に従って、ＦＬＥＸＭＡＰ  ３Ｄ装置を用いたＬｕｍｉｎｅｘマルチプレックス技術を用いて決定した。細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ）およびホスファターゼ阻害剤カクテル２および３（シグマ）を補充したＭＩＬＬＩＰＬＥＸ  ＭＡＰ  Ｌｉｓｓｉｓｓバッファー中で溶解し、ＢＣＡタンパク質の定量後、１５μｇのタンパク質を各ウェルに添加した。すべてのサンプルを二重に実行し、９−ＩＮＧ−４１処理した細胞と非処理対照との間のＭＦＩまたは絶対量の変化を分析し、統計的有意性を決定するために非対数ｔ検定を行った。
【０１１７】
ＮＦ−κＢシグナル伝達の分析は、カルパス４２２細胞株およびＴＭＤ８細胞株において総ｃ−ＭＹＣレベルの有意な減少を示したが、残りの細胞株においてはこのタンパク質の減少の傾向のみを示した。ｐ−Ｈ２Ａ．Ｘ（Ｓｅｒ１３９）の評価を介したＤＮＡ損傷シグナル伝達は、ＳＵＤＨＬ−４およびＫａｒｐａｓ  ４２２細胞株において増加していることが見出された（両方ともｐ＜０．０５）。さらに、９−ＩＮＧ−４１処理時のｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５）の有意な増加が、ＳＵＤＨＬ−４およびＴＭＤ８細胞において観察された。アポトーシスシグナル伝達経路解析の結果、ＴＭＤ８を除くすべてのリンパ腫細胞株において、サバイビンの有意な減少（〜２倍、ｐ＜０．０５）と活性カスパーゼ３の増加が認められた。ＫＰＵＭ−ＵＨ１を除いて、すべてのリンパ腫細胞株は、Ｍｃｌ−１／Ｂａｋダイマーにおいて有意な減少（〜２倍、ｐ＜０．０５）を示し、一方、Ｂｃｌ−ｘｌ／Ｂａｋダイマー発現は、ＴＭＤ８を除くすべての細胞株において有意な減少（〜１．５倍、ｐ＜０．０５）を示した。
【実施例５】
【０１１８】
実施例５−組み合わせの用量応答
Ｄａｕｄｉ、ＳＵＤＨＬ−４、ＫＰＵＭ−ＵＨ１、Ｋａｒｐａｓ  ４２２、またはＴＭＤ８細胞を、一連の濃度の９−ＩＮＧ−４１（０μＭ、０．０５μＭ、０．５μＭ）およびＶｅｎｅｔｏｃｌａｘ（０ｎＭ、０．０５μＭ、０．５μＭ、５ｎＭ、５ｎＭ、５０ｎＭ、５００ｎＭ、５０００ｎＭ）、ＢＡＹ−１１４３５７２（０μＭ、０．００５μＭ、０．０５μＭ、０．５μＭ、５μＭ、５０μＭ）、またはイデラリシブ（０μＭ、０．００５μＭ、０．０５μＭ、０．５μＭ、５μＭ、５０μＭ）のいずれかの濃度で同時に処理した。図２を参照。ＭＴＳアッセイを用いた３日目のバイアビリティを、上述のように決定した。バックグラウンド吸光度をサンプルのＡ４９０から差し引き、ビヒクル／無処理対照のＡ４９０を１とし、残りのサンプルの相対Ａ４９０を計算した。ＩＣ５０は、Ａ４９０が０．添加効果は、９−ＩＮＧ−４１の０．５μＭと組み合わせたときの新規薬剤のＩＣ５０の倍数変化として計算した。
【０１１９】
図３に示すように、９−ＩＮＧ−４１と第２の治療剤を用いた併用療法は、所与の治療効果をもたらすために必要な第２の治療剤の量を減少させることができる。示されるように、０．５μＭの９−ＩＮＧ−４１を用いたＳＵＤＨＬ−４細胞株の組み合わせ治療は、ＶｅｎｅｔｏｃｌａｘのＩＣ５０値の８倍の減少を示した。同様に、ＫＰＵＭＵＨ１細胞株を０．５μＭ９−ＩＮＧ−４１と併用した場合、ＶｅｎｅｔｏｃｌａｘのＩＣ５０値は２倍に減少した。０．５μＭ９−ＩＮＧ−４１を用いたＳＵＤＨＬ−４細胞株の併用処理では、ＢＡＹ−１１４３５７２のＩＣ５０値が８倍に減少した。９−ＩＮＧ−４１を用いた併用処理は、検討した細胞株においてイデラリシブのＩＣ５０値に有意な変化を示さなかった。
【０１２０】
材料および方法−実施例６〜１１
このような研究は、患者からの情報提供を目的としたものではない。このリンパ腫ＳＰＯＲＥ生物試料プロトコールは、ヘルシンキ宣言に基づき、メイヨークリニック機関審査委員会によって承認された。すべての主要な患者サンプルは、脾臓またはリンパ節からの生検組織であった。新鮮な組織サンプルは、細胞懸濁液に穏やかに解離され、フィコール・パケ密度勾配遠心分離に供された。初代リンパ腫細胞は、その後、増殖アッセイに直接使用するか、またはリンパ腫診断確認後、後にウェスタン分析のために−８０℃で保存した。
【０１２１】
本研究で使用したすべてのリンパ腫細胞株は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）またはＤＳＭＺ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ＤＬＢＣＬ（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）株は、１０％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＩＭＤＭ培地で培養した；ＴＣＬ（Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫）およびＭＣＬ（マントル細胞リンパ腫）株は、１０％子牛胎児血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地で維持した。マウスの異種移植モデル化に使用したＪｅｋｏ細胞株は、レンチウイルス導入によりＦｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）で安定的に発現させた。細胞株は定期的にマイコプラズマ感染の有無をチェックし、自家製ＳＮＰベースＰＣＲ法またはＡＴＣＣによるショートタンデムリピートプロファイリングで認証する。
【０１２２】
抗体およびその他の試薬
共通薬剤はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからのものであった。抗ヒトＧＳＫ３α（Ｃａｔ＃４３３７）、ＧＳＫ３β（Ｃａｔ＃１２４５６）、ホスホ−ＧＳＫ３α−Ｓ２１／ＧＳＫ３β−Ｓ９（Ｃａｔ＃９３２７）を含む免疫ブロット用抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入した。免疫蛍光に使用したマウス抗ＧＳＫ３βモノクローナル抗体（クローン７／ＧＳＫ３β、Ｃａｔ＃６１０２０１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗α−チューブリン抗体（クローンＭＤ１Ａ、Ｃａｔ＃Ｔ９０２６）およびウサギ抗ペリセントリン抗体（Ｃａｔ＃ａｂ４４４８）は、それぞれＳｉｇｍａおよびＡｂｃａｍから購入した。Ａｌｅｘａ  ４８８またはＡｌｅｘａ  ５６５コンジュゲート二次抗体は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の製品であった。
【０１２３】
アポトーシスアッセイ
細胞を２４ウェルプレートに５ｘ１０５細胞／ウェルで播種し、指示された濃度の９−ＩＮＧ−４１で４８時間インキュベートした。細胞は、その後、ＦＩＴＣ結合アネキシンＶ（ライフテクノロジーズ）とヨウ化プロピジウムで染色し、ＢＤ  ＦＡＣＳカリバーフローサイトメーター上で分析に続いた。
【０１２４】
ＤＮＡ細胞周期
細胞をコールドエタノールで固定および透過させ、ＲＮａｓｅで処理し、ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）で染色した。染色した細胞を、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ  ＰＲＯソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、ＢＤ  ＦＡＣＳカリバー上で実行した。データは、ＦｌｏｗＪｏ  ｖ．Ｘソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ）を用いて分析した。
【０１２５】
増殖アッセイ
細胞を９６ウェルプレートに１ｘ１０４細胞／ウェルで播種し、指示された濃度の９−ＩＮＧ−４１で４８時間インキュベートした後、チミジン取り込みのために分析される前に、トリチウム標識チミジンで一晩パルシングした。
【０１２６】
ウエスタンイムノブロット法
ウェスタン分析は、ＬＩ−ＣＯＲ試薬システムを使用して、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＣＬＸイメージャー上で、以前に記載され、開発されたように実施した。
【０１２７】
定量ＰＣＲ
リンパ腫細胞株からの全ｍＲＮＡをＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてｃＤＮＡを合成した。その後、ＡＢＩ  ７５００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でＲＴ２  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＯＸ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｑＰＣＲを行った。
【０１２８】
薬剤ＩＣ５０の計算
細胞の生存および増殖に対する９−ＩＮＧ−４１のＩＣ５０をオンラインＩＣ５０計算ツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａａｔｂｉｏ．ｃｏｍ／ｔｏｏｌｓ／ｉｃ５０−ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ／）を用いて計算した。
【０１２９】
免疫組織化学染色
厚さ５μｍのパラフィン切片の免疫組織化学（ＩＨＣ）を標準プロトコールに従って実施した。スライド上の組織切片をキシレンで脱パラフィン化し、一連のアルコールで再水和した後、クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で抗原を回収し、得られたスライドを３０％過酸化水素で内因性ペルオキシダーゼをクエンチした。得られたスライドは、３０％過酸化水素で内因性ペルオキシダーゼをクエンチした。スライドを、抗ＧＳＫ３ｂ抗体（ＢＤ、１：１５０）で２時間室温でインキュベートし、トリス緩衝生理食塩水（各５分間）で３回洗浄し、ビオチン化抗マウス二次抗体（１：２００）で１時間室温でインキュベートした。室温で１時間、ＨＲＰ共役ＡＢＣ複合体（ベクタステイン、ベクターラボラトリーズ）でスライドを処理した後、３，３９−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、ベクターラボラトリーズ）で発色を現像し、メチレンブルーでカウンターステインし、ＤＰＸでマウントし、ニコンエクリプスＴｉ顕微鏡で検査し、イメージ化した。
【０１３０】
ＧＳＫ３βのセントロソームおよび紡錘体局在化のための免疫蛍光染色
セントロソームにおけるＧＳＫ３βとペリセントリンの共免疫染色（図８Ｃ−８Ｊ）のために、我々は、３％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で室温で５分間、サイトスピンスライド上の細胞を固定することにより、不完全固定法を使用した。細胞は、その後、ＰＢＳ中の０．２％トリトンＸ−１００で１０分間浸透させ、１時間ＰＢＳ中の５％ＢＳＡでブロッキングに続いて、４℃で一晩マウス抗ＧＳＫ３β  ｍＡｂとウサギ抗ペリセントリンで免疫染色した。その後、細胞を洗浄し、フルオロクローム共役二次抗体でさらに染色した。
【０１３１】
リンパ腫細胞のサイトスピン調製物上のＧＳＫ３βおよびα−チューブリンの他のすべての免疫染色は、室温で１５分間、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定した後、透過化および上記と同様の染色工程を行った。細胞を、従来のツァイス顕微鏡またはツァイスＬＳＲ  ７８０共焦点顕微鏡で分析し、イメージ化した。
【実施例６】
【０１３２】
実施例６．リンパ腫細胞において、ＧＳＫ３αおよびＧＳＫ３βが過剰発現する。
精製ヒト正常Ｂ・Ｔ細胞およびＤＬＢＣＬ、ＭＣＬ、ＴＣＬリンパ腫細胞株におけるＧＳＫ３αおよびＧＳＫ３βの発現状況を調べた。ＲＴ−ｑＰＣＲにより、ほとんどのリンパ腫細胞株でＧＳＫ３αおよびＧＳＫ３β  ｍＲＮＡの発現量が、正常リンパ球での発現量が低いのに比べて、高いが変動することがわかった（図４Ａ）。ＧＳＫ３タンパク質の発現をウエスタンブロット法で解析したところ、ほとんどのリンパ腫細胞株（Ｌｙ−１９を除く）でＧＳＫ３αタンパク質が強い発現を示したのに対し、ＢおよびＴリンパ球では弱い発現を示した（図４Ｂ、緑色）。同様に、ＧＳＫ３βタンパク質もまた、すべてのリンパ腫細胞株において強く発現したが、正常リンパ球においては非常に弱く発現した（長時間の曝露後に見える；図未提示）（図４Ｂ、赤色）。これらのデータは、ＧＳＫ３タンパク質がほとんどのＢ−およびＴ−リンパ腫細胞株で過剰発現することを示す。
【０１３３】
ウェスタンブロットにより、ＧＳＫ３αおよびＧＳＫ３βタンパク質の両方が、正常リンパ球と同様に、我々のリンパ腫細胞株パネル全体にわたって変動的にリン酸化されることが示された。
【実施例７】
【０１３４】
実施例７．ＧＳＫ３αおよびＧＳＫ３βはリンパ腫細胞において機能的に重要である。
ＧＳＫ３αおよびＧＳＫ３βの両方がリンパ腫細胞において過剰発現しており、両方の酵素が細胞機能に重要な複数のシグナル伝達経路に関与することを考えると、ＧＳＫ３αおよびＧＳＫ３βがリンパ腫細胞の生存および増殖を機能的に支持するかどうかを検討した。ＴＣＬおよびＭＣＬ株を低用量の９−ＩＮＧ−４１で４８時間処理したところ、アポトーシスが誘導された（図５Ａ）；ＤＬＢＣＬ株はより高い濃度を必要とした（図５Ｂ）。対照的に、９−ＩＮＧ−４１の１０．０μＭの濃度であっても、精製正常非刺激Ｔリンパ球または末梢血単核細胞において有意なアポトーシスは検出されなかった。各種リンパ腫細胞株の細胞生存率に対する最大効果（ＩＣ５０）の半分の濃度での９−ＩＮＧ−４１の阻害濃度を算出した（表１）。
【表１】
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【０１３５】
９−ＩＮＧ−４１は、正常リンパ球に影響を与えることなくリンパ腫細胞のアポトーシスを特異的に誘導することができる。リンパ腫細胞増殖におけるＧＳＫ３の役割を調べるために、９−ＩＮＧ−４１の存在下または非存在下でチミジン取り込みアッセイを行った。すべてのＴＣＬおよびＭＣＬ株の増殖率は、１．０μＭという低濃度の９−ＩＮＧ−４１の存在下で大幅に抑制された。ＤＬＢＣＬ株はわずかに高い濃度を必要とした。様々なリンパ腫細胞株の細胞増殖に対する９−ＩＮＧ−４１のＩＣ５０を計算した（表１）。これらのデータは、リンパ腫細胞の増殖と生存にＧＳＫ３活性が重要であることを示す。
【０１３６】
ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ノックアウト技術を用いて、ＧＳＫ３ＡおよびＧＳＫ３Ｂ遺伝子を遺伝的に削除した。
【０１３７】
また、ＧＳＫ３αとＧＳＫ３βの両遺伝子の第１コードエクソンを標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をウェブツール（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）を用いて設計した。ｇＲＮＡ配列（ＧＳＫ３α：ＧＡＣＡＧＡＴＧＣＣＴＴＴＣＣＧＣＣＧＣ；ＧＳＫ３β：ＣＧＧＣＴＴＧＣＡＧＣＴＣＴＣＣＧＣＡＡ）を、ＧＦＰを共発現させたｐｘ４５８  ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）にクローニングした。構築物をヌクレオフェクションキット（Ｌｏｎｚａ、バーゼル、スイス）を用いてリンパ腫細胞にヌクレオフェクションした。３６時間ポストヌクレオフェクション、ＧＦＰを発現する単細胞は、アリアＩＩ  ＦＡＣＳソーター上の１セル／ウェルで９６ウェルプレートに並べ替えた。単細胞サブクローンを２週間培養した後、各サブクローンをＰＣＲおよびＳａｎｇｅｒ'ｓ  ＤＮＡシークエンシングにより遺伝子型を決定した。
【０１３８】
ＣＡＳ９−Ｔ２Ａ−ＧＦＰとｇＲＮＡ特異的ＧＳＫ３ＡまたはＧＳＫ３Ｂ遺伝子エクソン１配列を担持したコンストラクトを一過性に発現させた後、ＧＦＰを発現した単細胞をフローソーティングにより９６ウェルプレートに選別した。２−３週間の培養後、ＧＳＫ３Ａ、ＧＳＫ３Ｂ、またはその両方の遺伝子に特異的な修飾を有する単細胞サブクローンを遺伝子欠失のためにジェノタイピングし、タンパク質欠乏のためにウエスタンブロットを検証した。表２にまとめたように、試験した５つの細胞株すべてから、いくつかのＧＳＫ３Ａヌルノックアウトサブクローンが容易に得られ、ＧＳＫ３ＢヌルサブクローンもＬｙ−１細胞株から得られた。しかし、Ｌｙ−１９、Ｊｅｋｏ、Ｍｉｎｏ、およびＫａｒｐａｓ  ２９９細胞株から２４−３６個の単細胞サブクローンを解析したところ、ノックアウトサブクローンは検出されなかった。ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９は、Ｌｙ−１細胞におけるＧＳＫ３Ｂ遺伝子のバイトリル欠失（１９／２４、７９％）のための非常に効率的なアプローチであるが、試験した他のリンパ腫細胞株（０／２４、０／２４、０／３６、０／２６、０％）ではＧＳＫ３Ｂヌルクローンが存在しなかったことを考えると、これらのデータは、これらの細胞株におけるリンパ腫細胞の生存にＧＳＫ３Ｂが必要であるという結論を支持するものであった。ｓｈＲＮＡノックダウンを用いても同様の結果が観察され、ＧＳＫ３ＢノックダウンはＬｙ−１を除くいくつかのリンパ腫細胞株において致死的であることが示された。
【表２】
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【０１３９】
実施例７．ＧＳＫ３阻害は、リンパ腫細胞におけるＧ２／Ｍ進行をブロックする。
リンパ腫細胞周期動態に対する９−ＩＮＧ−４１の効果を調べた。９−ＩＮＧ−４１処置後、試験したすべてのラインにおいて、処置のわずか２４時間後にＧ２／Ｍでの細胞周期の遮断が見られた（図６Ａ）ことは、ＧＳＫ３活性が有糸分裂の成功した進行に必要であることを示す。このＧ２／Ｍ停止がＧＳＫ３β阻害に特異的に起因するかどうかをさらに決定するために、親（野生型）、ＧＳＫ３Ａ、ＧＳＫ３Ｂ、およびＧＳＫ３Ａ／ＢノックアウトＬｙ−１サブクローンの細胞周期プロファイルを調べた。治療を行わなかった場合、親の野生型およびＧＳＫ３ＡヌルＬｙ−１サブクローンは正常な細胞周期プロファイルを示したが、ＧＳＫ３ＢおよびＧＳＫ３Ａ／ＢノックアウトサブクローンはＧ２／Ｍでの細胞の増加を示した（図６Ｂ）。さらに、ＧＳＫ３Ａ／Ｂダブルノックアウトサブクローンでは、有糸分裂不全に起因すると考えられる多形（＞４Ｎ）細胞の増加も認められた。ＧＳＫ３Ｂ−ｎｕｌｌおよびＧＳＫ３Ａ／Ｂ−ｎｕｌｌ  Ｌｙ−１細胞のこれらの細胞周期異常は、Ｌｙ−１細胞株固有の代償メカニズムを介する可能性が高く、Ｌｙ−１子孫の生存にはほとんど影響を与えない。９−ＩＮＧ−４１処置が、細胞周期進行に対するＧＳＫ３ＢシングルまたはＧＳＫ３Ａ／Ｂ二重欠失の効果をフェノコピーすることは、ＧＳＫ３Ｂがリンパ腫細胞周期Ｇ２／Ｍ進行に重要であること、および９−ＩＮＧ−４１がリンパ腫細胞のための強力な細胞周期遮断剤であることを示す。
【実施例８】
【０１４０】
実施例８．ＧＳＫ３阻害は、リンパ腫細胞を有糸分裂の前段階で停止させる。
Ｇ２／Ｍで停止した細胞は、フローサイトメトリーのヒストグラム（図６Ａ）上では単一のＤＮＡ含有量（４Ｎ）のピークとして現れるが、実際には、成功した細胞分裂に重要なＧ２／Ｍには少なくとも５つの連続したステップ（Ｍ１−Ｍ５）が存在する。これらには、前相（Ｍ１、染色体の凝縮、分裂紡錘体形成開始）、前メタフェース（Ｍ２、核膜破壊、セントロソーム分極）、メタフェース（Ｍ３、染色体対が中間平面に整列）、アナフェース（Ｍ４、娘染色体の分離）、テロフェーズ（Ｍ５、娘核の再形成）、および最終的なサイトキネシス（２つの娘細胞の分離）が含まれる。これらの離散的な工程のそれぞれは、ライト染色された細胞上でユニークな識別可能な核の形態を持つ（図７Ａに描かれる）。どの段階で逮捕されるようになるかを決定するために、未処理および９−ＩＮＧ−４１処理されたジェコ細胞の形態を調べた。図７Ｂ（左パネル）に示されているように、すべてのＭ１−Ｍ５分裂段階は未処理のジェコ細胞で容易に同定されたが、９−ＩＮＧ−４１処理された細胞（右パネル）では、大部分の細胞が、凝縮した染色体の形態と、Ｍ２−Ｍ５形態を持つ同定可能な細胞を伴わずに、プロトフェイズ（Ｍ１）細胞に類似した細胞質染色の減少を示した。１００個の有糸分裂細胞の差動計数によって、有糸分裂細胞のすべての段階（Ｍ１−Ｍ５）は、未処理の細胞で容易に識別可能であることが見出された；９−ＩＮＧ−４１処理の有糸分裂細胞では、原相（Ｍ１）細胞のみが説明された（図７Ｃ）。同様の結果は、ＤＨＬ−６、Ｌｙ−３、Ｍｉｎｏ、Ｋａｒｐａｓ２９９を含む他のリンパ腫株でも観察された。これらの観察は、ＧＳＫ３活性が有糸分裂期の進行に必要であるという結論を支持する。
【実施例９】
【０１４１】
実施例９．ＧＳＫ３βは、リンパ腫細胞のセントロソームおよび有糸分裂紡錘体に局在する。
２つの重要な前相イベント、セントロソーム分極および有糸分裂紡錘体形成におけるＧＳＫ３βの関与を調べた。間期のＪｅｋｏ細胞またはＬｙ−１細胞におけるＧＳＫ３βタンパク質の細胞内局在を免疫蛍光染色で調べた。間期の間期において、ＧＳＫ３βは、ジェコ（Ｊｅｋｏ）細胞では核内に顕著に局在し、細胞質ではセントロソーム様ペアドットに局在した（図８Ａ−Ｂ）。さらに、これらの細胞質のペアドットが実際にセントロソームであることを示すために、不完全固定プロトコルを用いて、まず、ｗｔ  Ｌｙ−１細胞をＧＳＫ３βタンパク質とセントロソームマーカーであるペリセントリンのために染色したところ、細胞質のＧＳＫ３βドットはペリセントリンと完全にコロケーションすることが判明した（図８Ｄ−８Ｆ）。さらに、抗ＧＳＫ３β抗体染色は、ＧＳＫ３ＢヌルＬｙ１細胞においてＧＳＫ３βタンパク質に特異的であることが示された（図８Ｇ−Ｊ）。このことから、ＧＳＫ３βは間期細胞のセントロソームと核に局在していると結論づけた。
【０１４２】
有糸分裂細胞におけるＧＳＫ３βの細胞内局在を決定するために、正常有糸分裂期のジェコ細胞におけるＧＳＫ３βの局在を解析した。ＧＳＫ３β染色（緑色、図８Ｋ−Ｌ）は、中央部に偏光したセントロソームがあり、有糸分裂の紡錘体や微小管が外側に伸びる「花火のような」パターンを示した。α−チューブリンは、ＧＳＫ３βと同様の染色パターン（赤色、図８Ｍ−Ｎ）を示し、ＧＳＫ３βが有糸分裂中に微小管に局在することを示唆する。これらの結果から、ＧＳＫ３βは有糸分裂中にセントロソームや有糸分裂紡錘体に特異的に局在することが示唆された。９−ＩＮＧ−４１で処理したジェコ細胞におけるＧＳＫ３βの局在を決定した（図８Ｑ−Ｒ）。同様の花火のようなＧＳＫ３β染色パターンが、ＧＳＫ３β局在の変化を伴わない全ての原相細胞において観察された。これらのデータをまとめると、ＧＳＫ３βは間期の間にセントロソームと核に局在し（図８Ａ−Ｂ）、有糸分裂の間にセントロソームと有糸分裂性微小管に局在していることが示された（図８Ｋ−Ｌ）。９−ＩＮＧ−４１の処理は、ＧＳＫ３βの局在を変化させず、また、セントロソームの分極や微小管形成にも影響を与えなかった。
【実施例１０】
【０１４３】
実施例１０．リンパ腫患者からの初代細胞におけるＧＳＫ３の発現および標的化
ＭＣＬ、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫グレード３Ｂ、ＤＬＢＣＬ、または血管性免疫芽球性ＴＣＬを有する患者から新鮮に分離された一次リンパ腫細胞におけるＧＳＫ３αおよびＧＳＫ３βタンパク質の発現を調べた。５つのサンプルはすべて、正常血液Ｂ細胞コントロールと比較し、ＧＳＫ３αおよびＧＳＫ３βタンパク質の発現が強かった（図９Ａ）。これらの患者細胞は、９−ＩＮＧ−４１の抗増殖効果にも同様に反応した（図９Ｂ）。様々なタイプのリンパ腫を有する別のコホートの患者からのパラフィンサンプルを、ＧＳＫ３βタンパク質の発現についてＩＨＣでプローブした。図９Ｃに示すように、すべてのサンプルにおいて、ＧＳＫ３βの過剰発現が変動する強度で認められた。Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｐｉａ．ｃａｎｃｅｒｐｋｕ．ｃｎ）の公開データベースから得られた一次ＤＬＢＣＬ患者サンプルのＲＮＡ−Ｓｅｑ解析もまた、正常リンパ球よりもリンパ腫においてＧＳＫ３αおよびＧＳＫ３βの発現が増加することを示した。
【０１４４】
最近発表されたＲＮＡ−Ｓｅｑデータ（Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ｒ，Ｗｒｉｇｈｔ  ＧＷ，Ｈｕａｎｇ  ＤＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｕｓｅ  Ｌａｒｇｅ  Ｂ−Ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１８；３７８（１５）：１３９６−１４０７）の臨床生存データを持つ２３４人のＤＬＢＣＬ患者のコホート［追跡期間中央値は１０．５年（９５％ＣＩ：７．９−未到達）］について解析した。レシーバー操作特性（ＲＯＣ）曲線分析を行い、ＧＳＫ３αとＧＳＫ３βの発現を二分化し、高発現群と低発現群の最適なカットオフ値（ＧＳＫ３αでは１０．５、ＧＳＫ３βでは８．６）を設定した。ＧＳＫ３α高発現群（≧１０．５、ｎ＝１７２）のＯＳは７．８年（９５％ＯＳ：７．２−８．４）であり、ＧＳＫ３α低発現群（＜１０．５、ｎ＝６２）のＯＳは８．９年（９５％ＯＳ：８．２−１０．１）と有意に（ｐ＝０．０３）高かった。同様に、ＧＳＫ３β高発現群（≧８．６、ｎ＝１７０）では７．８年（９５％ＯＳ：７．２−８．２）、ＧＳＫ３β低発現群（＜８．６、ｎ＝６２）では９．７年（９５％ＯＳ：８．６−１１．５）と有意に（ｐ＝０．０００５）高いＯＳが得られた。これらの結果は、ＧＳＫ３αまたはＧＳＫ３βのそれぞれの過剰発現が、より悪い臨床転帰と相関することを示唆する。さらに、グループ化データはまた、ＤＬＢＣＬ患者の大多数がＧＳＫ３αまたはＧＳＫ３βのいずれかの高発現群に分離されることを示し、さらにＧＳＫ３αおよびＧＳＫ３βは一般的にリンパ腫において過剰発現するという結論を検証した。
【実施例１１】
【０１４５】
実施例１１．ヒトリンパ腫のマウス異種移植片におけるＧＳＫ３の標的化
ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子Ｆｌｕｃを発現するジェコ細胞を有するＮＧＳマウスを皮下注射することにより、ＭＣＬ異種移植マウスモデルを樹立した。
【０１４６】
これらの実験で使用したＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスは、ジャクソン研究所（メイン州、バー  ハーバー）から購入した。生後８週齢の同性の８〜１０匹のマウスを右脇腹に５×１０６個のＦｌｕｃを発現するＪｅｋｏ細胞を皮下注射した。腫瘍の移植は、ジェコ細胞接種の４日後にイメージングで確認した。腫瘍移植されたマウスをコントロールおよび治療群に無作為にグループ分けし、その後、未処理または指示されたようにＩＰ注入によって９−ＩＮＧ−４１で処理した。腫瘍体積は、１５ｍｇ／ｍｌのＤ−ロイシフェリン（ミズーリ州、セントルイス、ＧｏｌｄＢｉｏ）２００ｕｌのＩＰ注入の２０分後にＩＶＩＳイメージャー（カリフォルニア州、アラメダ、クセノゲン）で測定し、２．５％イソフルランで麻酔した。すべてのイメージング変数は、比較可能性のために一貫性を維持した。最大の腫瘍がＩＡＣＵＣプロトコルのサイズ制限を満たした時点で実験を終了した。
【０１４７】
２つの独立した実験において、イメージング（通常、腫瘍接種から４日後）によって確認された移植腫瘍を有する８匹および１０匹のマウスを、無作為に対照として、または９−ＩＮＧ−４１処置４０ｍｇ／ｋｇを１日おきにＩＰ投与した（図１０Ａ）。図１０Ｂに示すように、コントロール（未処理）群のマウスは、１７日目までに顕著なルシフェラーゼ活性を有する大きな腫瘍を有した；しかしながら、９−ＩＮＧ−４１処理マウスは、はるかに低いルシフェラーゼ活性を有する小さな腫瘍を有した。これらのデータは、９−ＩＮＧ−４１がＭＣＬのマウスモデルにおいて単剤抗腫瘍活性を有することを実証した。
【実施例１２】
【０１４８】
実施例１２  ９−ＩＮＧ−４１を用いたびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の治療
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫のヒトに９−ＩＮＧ−４１を１日１ｍｇ／ｋｇ投与し、２１日サイクルで６回投与した。治療後、そのヒトのＤＬＢＣＬは寛解する。
【実施例１３】
【０１４９】
実施例１３  ９−ＩＮＧ−４１を用いたマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）の治療
【０１５０】
マントル細胞リンパ腫に苦しむヒトに９−ＩＮＧ−４１を１日３ｍｇ／ｋｇを６回２１日周期で投与した。処置後、ヒトのＭＣＬは寛解する。
【実施例１４】
【０１５１】
実施例１４  ９−ＩＮＧ−４１を用いたＴ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）の治療
Ｔ細胞リンパ腫（非ホジキン）に苦しむヒトに、９−ＩＮＧ−４１を１日２ｍｇ／ｋｇ、２１日サイクルで６回投与する。処置後、このヒトのＴ細胞リンパ腫は寛解する。
【０１５２】
Ｋａｒｍａｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＧＳＫ−３β  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，９−ＩＮＧ−４１，ｒｅｄｕｃｅｓ  ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｈａｌｔｓ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｓ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｇｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｏｖｅｌ  ａｇｅｎｔｓ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７  Ｄｅｃ  ２９；８（７０）：１１４９２４-１１４９３４参照、その参照が本明細書全体に組み込まれる。
【０１５３】
Ｓｅｅ  Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｂｅｎｅｆｉｔ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ，Ｂｌｏｏｄ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｍａｙ  １７，２０１９（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｌｏｏｄｊｏｕｒｎａｌ．ｏｒｇ）；ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ．２０１８８７４５６０参照、その参照が本明細書全体に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2021527039.tif 000014
【図１０】
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【国際調査報告】
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