(57)【要約】  少なくとも１つのノロウイルス抗原と、コレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）又は熱不安定性大腸菌外毒素ＬＴ（ＬＴＢ）のＢサブユニットなどのＡＢ５毒素の少なくとも１つのＢサブユニットである少なくとも１つのアジュバントを含む免疫原性組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノロウイルス感染を予防及び／又は治療する方法、及び／又はノロウイルス感染の重症度を軽減するための方法における使用のための免疫原性組成物であって、前記免疫原性組成物は、少なくとも１つのノロウイルス抗原及びＡＢ５毒素の少なくとも１つのＢサブユニットを含み、ここで、使用は、皮内、筋肉内及び皮下投与から選択される、免疫原性組成物の非経口投与を含む、免疫原性組成物。
【請求項２】
前記Ｂサブユニトが、コレラ毒素のＢサブユニット（ＣＴＢ）である、及び／又は大腸菌熱不安定性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＬＴＢ）である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記組成物が、前記毒素のＡサブユニットを含まない、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記Ｂサブユニットが、前記組成物のアジュバントである、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記Ｂサブユニットが抗原であり、前記少なくとも１つのノロウイルス抗原及び前記Ｂサブユニットが混合ワクチンの成分である、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
少なくとも１つのノロウイルス抗原、及びアジュバントとしてのコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１つのノロウイルス抗原が、ノロウイルスＶＰ１タンパク質であるか、又はそれを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記免疫原性組成物が遺伝子型群Ｉノロウイルスの抗原及び遺伝子型群ＩＩノロウイルスの抗原を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記免疫原性組成物が、前記少なくとも１つのノロウイルス抗原を含むか、又はそれからなるノロウイルスウイルス様粒子（ノロウイルスＶＬＰ）を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記免疫原性組成物が、遺伝子型群ＩノロウイルスのＶＬＰ及び遺伝子型群ＩＩノロウイルスのＶＬＰを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記ＣＴＢが五量体ＣＴＢであり、及び／又は前記ＬＴＢが五量体ＬＴＢであり、好ましくはＢサブユニットが五量体ＣＴＢである、請求項２又は６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
２つ以上の遺伝子型群ＩＩノロウイルス抗原、好ましくは２つ以上の異なるＶＬＰを含み、ここで、第１のＶＬＰは、第１の遺伝子型群ＩＩノロウイルス抗原を含むか又はそれからなり、第２のＶＬＰは、第２の遺伝子型群ＩＩノロウイルス抗原を含むか又はそれからなる、請求項１から１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
遺伝子型ＩＩ．４ノロウイルス抗原及び遺伝子型ＩＩ．１７ノロウイルス抗原を含み、好ましくは遺伝子型ＩＩ．４ノロウイルス抗原のＶＬＰ及び遺伝子型ＩＩ．１７ノロウイルス抗原のＶＬＰを含む、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
遺伝子型群Ｉノロウイルス抗原を含むか又はそれからなるＶＬＰ、遺伝子型群ＩＩノロウイルス抗原を含むか又はそれからなるＶＬＰ、及びアジュバントとしてのＣＴＢを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
遺伝子型群Ｉノロウイルス抗原を含むか又はそれからなるＶＬＰ、遺伝子型群ＩＩノロウイルス抗原を含むか又はそれからなるＶＬＰ、及びアジュバントとしてのＬＴＢを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
遺伝子型Ｉ．１又はＩ．４ノロウイルス抗原を含むか又はそれからなるＶＬＰ、遺伝子型ＩＩ．４ノロウイルス抗原を含むか又はそれからなるＶＬＰ、及びアジュバントとしてのＣＴＢを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記遺伝子型群Ｉノロウイルス抗原及び前記遺伝子型群ＩＩノロウイルス抗原を、１：１から１：６、好ましくは１：１．５から１：５、より好ましくは１：２から１：４の質量比範囲で含む、請求項８、１０、及び１４から１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記組成物が、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩を含まない、請求項１から１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
哺乳動物、好ましくはヒトにおけるノロウイルス感染を予防及び／又は治療する方法、及び／又は重症度を軽減するための方法における使用のための、請求項１から１８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
少なくとも１つのノロウイルス抗原及びＡＢ５毒素の少なくとも１つのＢサブユニットを含む免疫原性組成物。
【請求項２１】
請求項２から１９のいずれか一項でさらに定義される、請求項２０に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
哺乳動物、好ましくはヒトにおける、ノロウイルス感染及び細菌性病原体による感染を予防及び／又は治療する方法における使用のための免疫原性組成物であって、前記免疫原性組成物が、前述の請求項のいずれかに定義されるノロウイルス抗原と、前記細菌性病原体に対する免疫応答を生じさせることができる細菌ＡＢ５毒素のＢサブユニットとを含む、免疫原性組成物。
【請求項２３】
使用が、皮内、筋肉内又は皮下投与などの、免疫原性組成物の非経口投与を含む、請求項２２に記載の使用のための免疫原性組成物。
【請求項２４】
請求項１から２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物及び好ましくは薬学的に許容される担体を含む、抗ノロウイルスワクチン又は薬学的組成物。
【請求項２５】
哺乳動物、好ましくはヒトにおける、好ましくは非経口投与による、ノロウイルス感染を予防及び／又は治療する方法における使用のための、請求項２４に記載の抗ノロウイルスワクチン又は薬学的組成物。
【請求項２６】
コレラ菌又は大腸菌から選択される細菌性病原体による哺乳動物における感染を予防及び／又は治療する方法におけるさらなる使用のための、請求項２４又は２５に記載の抗ノロウイルスワクチン又は薬学的組成物。
【請求項２７】
哺乳動物、好ましくはヒトにおける、ノロウイルス感染及び細菌性病原体による感染を予防及び／又は治療する方法における使用のための混合ワクチンであって、前記ワクチンが、前述の請求項のいずれかに定義されるノロウイルス抗原と、前記細菌性病原体に対する免疫応答を生じさせることができる細菌ＡＢ５毒素のＢサブユニットと、薬学的に許容される担体とを含む、混合ワクチン。
【請求項２８】
請求項２４から２６のいずれか一項に記載の抗ノロウイルスワクチン及び好ましくは薬学的に許容される担体を含む抗ノロウイルスワクチンの単回投与剤形であって、前記剤形が、１０から１０００μｇ、好ましくは３０から３００μｇ、より好ましくは５５から１５０μｇの前記少なくとも１つ又は複数のノロウイルス抗原を含む、単回投与剤形。
【請求項２９】
ノロウイルス遺伝子型群ＩＩ抗原によってノロウイルス遺伝子型群Ｉ抗原に対する対象における免疫応答の干渉を低減するための、ＡＢ５毒素のＢサブユニットの使用。
【請求項３０】
ノロウイルス遺伝子型群ＩＩ抗原によってノロウイルス遺伝子型群Ｉ抗原に対する対象における免疫応答の干渉を低減するための、ＣＴＢの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野  
本発明は、１つ又は複数のノロウイルス（ＮｏＶ）抗原（複数可）及びアジュバントを含む免疫原性組成物、特に、１つ又は複数のＮｏＶ抗原と、アジュバントとしてのコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）及び／又は大腸菌熱不安定性エンテロトキシンＢサブユニット（ＬＴＢ）とを含む組成物に関する。本発明はまた、１つ又は複数のノロウイルス（ＮｏＶ）抗原（複数可）及び細菌外毒素のサブユニットＢである１つ又は複数の細菌抗原（複数可）を含む免疫原性組成物に関する。さらに、本発明は、免疫原性組成物を含む抗ＮｏＶワクチン、及びＮｏＶ感染の予防、治療、若しくは重症度を軽減する方法、又はヒト対象においてＮｏＶ感染に対する免疫を付与するための方法に関する。さらに、本発明は、対象におけるＮｏＶ感染により引き起こされる胃腸炎の予防、治療、又は重症度を軽減する方法における使用のための、免疫原性組成物、及び免疫原性組成物を含む抗ＮｏＶワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ノロウイルスは、世界的に大流行している胃腸炎の主な原因である。それらは、５歳以下の子供の２億の症例を含む、年間６億８，５００万件の症例の原因となっている（ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ／ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ．ｈｔｍｌ）。現在まで、ノロウイルスワクチンは市販されていない。また、ノロウイルス培養の確立されたプロトコルはなく、このことはノロウイルスワクチン開発の進行を著しく遅延させている。また、循環するノロウイルスの遺伝子変化のスピードが速いため、２〜４年ごとに新たなノロウイルス株が出現し、大流行を引き起こし、これらの課題に対処するために必要なワクチンと治療法の開発を複雑にしている（de Graaf, M, van Beek, J, & Koopmans, PG, 2016, Nature Rev Microbiol, 14: 421-433）。ＧＩ及びＧＩＩに代表される遺伝子型群（ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ）が過去２０年間の大多数の大流行の主な原因であり（Matthews et al., 2012, Epidemiol. Infect, 140: 1161-1172）、ＧＩＩ遺伝子型群の遺伝子型４（ＧＩＩ．４）が流行していることは明らかである。例えば、２０１４年以降、東アジアでは新しいＧＩＩ．１７株の出現が報告されているほか、古いＧＩＩ．４株の再出現も報告されている（Chan et al, 2015, Nat Commun, doi: 10.1038/ncomms10061; Choi et al, 2017, Food Environ Virol, doi: 10.1007/s12560-017-9278-4）。最も好ましいアプローチは多価ワクチンであるため、このように常に変化し続ける状況は、効率的なワクチン組成物を定義することに複雑さを加えている。現在のノロウイルスワクチンの開発は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）サブユニットワクチンの使用に依存している（最新の総説については以下を参照：Tan, M. & Jiang, X., 2014, Hum. Vaccin Immunother, 10:1449-1456; Debbink, K., Lindesmith, L. & Baric, R.S., 2014, Clin Infect Dis, 58:1746-1752; Ramani, S., Estes, M.K. & Atmar, R.L., 2016, PLoS Pathog, 12:e1005334）。ノロウイルスＶＬＰベースのワクチンの安全性と免疫原性に関する臨床データの蓄積には大きな進展がある（Ball et al, 1999, Gastroenterology, 117:40-48; Tacket et al, 2003, Clin Immunol, 108:241-247; Lindesmith et al, 2015, PLoS Med, 12:e1001807）。第１のＶＬＰ二価ワクチン（ＧＩ．２＋ＧＩＩ．４  ＶＬＰ又は株）は第ＩＩｂ相臨床試験に達しており（臨床試験データベース  ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０２６６９１２１の参考文献ＮＣＴ０２６６９１２１）、他のいくつかのワクチンは前臨床研究において開発中である（Springer, MJ, et al., 2016, Vaccine, 34:1452-1458; Ball, J. et al., 2017, PLOS One, 12: e0177310；総説については、Cortes-Penfield, NW, et al., 2017, Clin. Ther., pii: S0149-2918(17)30769-5を参照）。
【０００３】
健常成人を対象とした無作為化対照二重盲検臨床試験の結果に関する最近の発表では、いくつかの試験されたアジュバント（ＭＰＬ、ミョウバン）は、免疫原性に影響を与えず、異なるＶＬＰの混合物中の異なるノロウイルス遺伝子型間の干渉を防止しないが、ノロウイルスＶＬＰを安定化させるために使用することができる（例えば、ミョウバン）ことを実証した（Leroux-Roels, G (2018), The Journal of Infectious Diseases, 217(4), 597-607, doi: 10.1093/infdis/jix572. [Epub ahead of print]）。さらに、ミョウバンは良好なＴｈ２応答を誘導するが、細胞性Ｔｈ１免疫応答を刺激する能力はほとんどないことが知られている。また、アジュバントとしてのミョウバンは、ＩｇＥ産生の増加、アレルゲン性（Gupta et al., 1995, In: Powel MF, Newman MJ (eds). Vaccine design: The subunit and adjuvant approach.  NY, Plenum Press, 229-248; Goto, N, et al., 1993, Vaccine, 11:914-918; Bergfors E, et al., 2005, Eur J Pediatr., 164:691-697）及び細胞毒性を引き起こす可能性がある。ミョウバンベースのワクチンは一般に忍容性が高いという事実にもかかわらず、ミョウバンは体内で長期間持続する生体内持続性を有し、リンパ器官に移行したり、脳に蓄積する能力があるため、懸念が高まっている。アジュバントとしてのミョウバンとその副作用の総説については、以下を参照のこと：Petrovsky, N & Aguilar, JC., 2004, Immunol. &Cell Biol., 82:488-496; Gherardi RK, et al., 2014, Front. Neurol, 6:4; Gherardi RK, et al, 2016, Morphologie, 100:85-94。
【０００４】
免疫原性の高いＶＬＰの形でのＶＰ１抗原の使用は、上記の問題に部分的に対処する機会を開いた。しかしながら、現在のところ、ワクチン開発の進歩はやや遅く、ノロウイルス感染からの確実な防御を提供できる新しい免疫原性組成物を提供することによってこの問題に対処するには、より多くの努力が必要である。ＶＬＰ含有ワクチンの性能をさらに向上させ、ワクチン製剤中のミョウバンに代わる、あるいは少なくともミョウバンの量を減らすことができる適切な非毒性アジュバントを見つけることは、この課題に対処するのに役立つであろう。タンパク質性のアジュバントが、より高い用量で使用される場合、それ自体に対する免疫応答を誘発することによって抗原としても機能し、ノロウイルス以外の病原体、好ましくは細菌性病原体によって引き起こされる胃腸炎の予防又は重症度の低下を提供することができるならば、有利であろう。
【０００５】
従来技術における別の問題は、以下のジレンマである。ノロウイルス感染に対する広範囲の免疫を提供するために、遺伝子型群Ｉノロウイルス由来の抗原及び遺伝子型群ＩＩノロウイルス由来の抗原などの抗原混合物を含むワクチンが検討された。しかしながら、第２の抗原の存在による１つの抗原に対する抗原応答の干渉がしばしば観察される。結果として、２つ以上の抗原を組み合わせることによって意図された広域性免疫を達成することは困難である。したがって、抗原間の免疫応答の干渉が抑制された、２つ以上の異なる抗原を含む抗原性組成物及びワクチンを実現することが望ましいであろう。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、ノロウイルス（ＮｏＶ）抗原に対して抗原性であり、かつ任意に、細菌性病原体に対しても抗原性である抗原性組成物及びそれらを含むワクチンを提供することである。また、ＮｏＶ感染から対象を防御することができるか、又はＮｏＶ感染を予防及び／若しくは治療することができるか、又はＮｏＶ感染の重症度を軽減する抗原性組成物、及びそれらを含むワクチンを提供することも目的である。また、遺伝子型群Ｉ及び遺伝子型群ＩＩのＮｏＶによるＮｏＶ感染から対象を防御することができるか、又は遺伝子型群Ｉ及び遺伝子型群ＩＩのＮｏＶによるＮｏＶ感染を予防及び／若しくは治療することができるか、又は遺伝子型群Ｉ及び遺伝子型群ＩＩのＮｏＶによるＮｏＶ感染の重症度を軽減する抗原性組成物、及びそれらを含むワクチンを提供することも目的である。バランスのとれた体液性免疫応答及び細胞性免疫応答を提供する抗原性組成物及びそれらを含むワクチンを提供することは、さらなる目的である。アジュバントとしてのミョウバンの含有量が少なくても、あるいは全くミョウバンを含まない場合でも十分な免疫原性を有し、かつ／又は組成物若しくはワクチンに含まれる複数の抗原の干渉を抑制する抗原性組成物及びそれらを含むワクチンを提供することをさらに目的とする。組成物又はワクチン中の抗原（複数可）に対する対象におけるＴｈ１免疫応答を増加させるための免疫原性組成物及びワクチンを提供することは、さらなる目的である。
【０００７】
発明の一般的な説明
したがって、本発明は以下を提供する。
（１）少なくとも１つのノロウイルス抗原及びアジュバントを含む免疫原性組成物。
（２）前記少なくとも１つのノロウイルス抗原が、ノロウイルスＶＰ１タンパク質であるか、又はそれを含む、項目（１）に記載の免疫原性組成物。
（３）前記免疫原性組成物が遺伝子型群Ｉノロウイルスの抗原及び遺伝子型群ＩＩノロウイルスの抗原を含む、項目（１）又は（２）のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（４）前記免疫原性組成物が、前記少なくとも１つのノロウイルス抗原を含むか、又はそれからなるノロウイルスウイルス様粒子（ノロウイルスＶＬＰ）を含む、項目（１）から（３）のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（５）前記免疫原性組成物が、遺伝子型群ＩノロウイルスのＶＬＰ及び遺伝子型群ＩＩノロウイルスのＶＬＰを含む、項目（１）から（４）のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（６）前記免疫原性組成物が、ノロウイルス遺伝子型群Ｉ抗原を含む、好ましくはそれからなるＶＬＰ、及びノロウイルス遺伝子型群ＩＩ抗原を含む、好ましくはそれからなるＶＬＰを含む、項目（１）から（５）のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（７）前記アジュバントがコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）である、項目（１）から（６）のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（８）前記組成物が、前記少なくとも１つのノロウイルス抗原及び前記ＣＴＢを、１：０．１から１：５、好ましくは１：０．２から１：３、より好ましくは１：０．５から１：２の質量比範囲で含む、項目（７）に記載の免疫原性組成物。
（９）前記ＣＴＢが五量体ＣＴＢである、項目（７）及び（８）のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（１０）前記免疫原性組成物がさらなるアジュバントを含む、項目（１）から（９）のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（１１）前記さらなるアジュバントがミョウバンである、項目（１０）に記載の免疫原性組成物。
（１２）前記組成物がミョウバンなどの添加アルミニウム塩を含まない、項目（１）から（１０）のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（１３）前記ＣＴＢ及び前記さらなるアジュバントが、１：２００から１０：１、好ましくは１：１００から５：１、より好ましくは１：３０から１：１の質量比範囲で存在する、項目（１０）又は（１１）に記載の免疫原性組成物。
（１４）ノロウイルスＶＬＰを抗原として、ＣＴＢをアジュバントとして含む、項目（１）から（１３）のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（１５）遺伝子型群Ｉノロウイルス抗原を含むか又はそれからなるＶＬＰ、遺伝子型群ＩＩノロウイルス抗原を含むか又はそれからなるＶＬＰ、及びアジュバントとしてのＣＴＢを含む、項目（１）から（１４）のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（１６）遺伝子型Ｉ．１又はＩ．４ノロウイルス抗原を含むか又はそれからなるＶＬＰ、遺伝子型ＩＩ．４ノロウイルス抗原を含むか又はそれからなるＶＬＰ、及びアジュバントとしてのＣＴＢを含む、項目（１）から（１５）のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（１７）前記遺伝子型群Ｉノロウイルス抗原及び前記遺伝子型群ＩＩノロウイルス抗原を、１：１から１：６、好ましくは１：１．５から１：５、より好ましくは１：２から１：４の質量比範囲で含む、項目（１５）のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（１８）前記遺伝子型Ｉ．１又はＩ．４ノロウイルス抗原及び前記遺伝子型ＩＩ．４ノロウイルス抗原を、１：１から１：６、好ましくは１：１．５から１：５、より好ましくは１：２から１：４の質量比範囲で含む、項目（１６）に記載の免疫原性組成物。
（１９）前記アジュバントが、コレラ毒素のＢサブユニット（ＣＴＢ）及び／又は大腸菌熱不安定性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＬＴＢ）などの、ＡＢ５毒素のＢサブユニットである、項目（１）に記載の免疫原性組成物。
（２０）ＡＢ５毒素の前記Ｂサブユニットが、以下の項目（Ａ）から（Ｉ）のいずれか一項以上又はすべてに従って定義されるタンパク質であり、かつ／又はＡＢ５毒素の前記Ｂサブユニットが、以下の項目（Ａ’）から（Ｉ’）のいずれか一項以上又はすべてに従って定義されるタンパク質である、項目（１９）に記載の免疫原性組成物。
（２１）前記組成物が、前記ＣＴＢ、前記ＬＴＢ、又は前記ＡＢ５毒素のＡサブユニットを含まない、項目（７）から（９）、（１３）から（１６）、（２０）、（２２）、（２４）、及び（２８）のいずれか一項以上に記載の免疫原性組成物。
（２２）ノロウイルスウイルス様粒子（ノロウイルスＶＬＰ）、好ましくは遺伝子型群ＩノロウイルスのＶＬＰ及び／又は遺伝子型群ＩＩノロウイルスのＶＬＰ、及びアジュバントとしてのＡＢ５毒素の少なくとも１つのＢサブユニットを含む免疫原性組成物。
（２３）前記ＶＬＰが、以下の項目（ａ）から（ｋ）で定義される（ａ）ＮｏＶ抗原（複数可）を含むか又はそれからなる、項目（２２）に記載の免疫原性組成物。
（２４）ＡＢ５毒素の前記Ｂサブユニットが、以下の項目（Ａ）から（Ｉ）のいずれか一項において定義されるタンパク質であるＣＴＢであり、又はＡＢ５毒素の前記Ｂサブユニットが、以下の項目（Ａ’）から（Ｉ’）のいずれかで定義されるタンパク質であるＬＴＢであり、好ましくは、前記Ｂサブユニットが、前記ＣＴＢである、項目（２１）又は（２２）に記載の免疫原性組成物。
（２５）前記免疫原性組成物が、ノロウイルス遺伝子型群Ｉ抗原（複数可）を含む、好ましくはそれからなるＶＬＰ、及びノロウイルス遺伝子型群ＩＩ抗原（複数可）を含む、好ましくはそれからなるＶＬＰを含む、項目（２２）から（２４）のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（２６）前記ノロウイルス遺伝子型群Ｉ抗原（複数可）が遺伝子型Ｉ．４抗原であり、前記ノロウイルス遺伝子型群ＩＩ抗原（複数可）が遺伝子型ＩＩ．４抗原である、項目（２５）に記載の免疫原性組成物。
（２７）哺乳動物、好ましくはヒトにおけるノロウイルス感染を予防及び／又は治療する方法における使用のための項目（１）から（２６）のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（２８）哺乳動物、好ましくはヒトにおける、ノロウイルス感染及び細菌性病原体による感染を予防及び／又は治療する方法における使用のための免疫原性組成物であって、前記免疫原性組成物が、項目（１）から（２６）のいずれかに定義されるノロウイルス抗原と、前記細菌性病原体に対する免疫応答を生じさせることができる細菌ＡＢ５毒素のＢサブユニットとを含む、免疫原性組成物。
（２９）使用が、対象への免疫原性組成物の非経口投与を含む、項目（２７）又は（２８）に記載の使用のための免疫原性組成物。
（３０）前記非経口投与が静脈内投与である、項目（２９）に記載の使用のための免疫原性組成物。
（３１）前記非経口投与が皮内、筋肉内又は皮下投与である、項目（２９）に記載の使用のための免疫原性組成物。
（３２）前記免疫原性組成物が、好ましくは項目（２４）、（２５）及び（２６）のいずれか一項で定義される通りである、項目（３１）に記載の使用のための免疫原性組成物。
（３３）使用が、対象への免疫原性組成物の鼻腔内、経口、舌下又は頬側投与を含む、項目（２７）又は（２８）に記載の使用のための免疫原性組成物。
（３４）項目（１）から（３３）のいずれか一項に記載の免疫原性組成物及び好ましくは薬学的に許容される担体を含む、抗ノロウイルスワクチン又は薬学的組成物。
（３５）非経口投与、特に皮内、筋肉内又は皮下投与などにより、対象におけるノロウイルス感染を治療若しくは予防する方法、又は対象におけるノロウイルス感染の重症度を軽減するための方法における使用のための、項目（３４）に記載の抗ノロウイルスワクチン又は薬学的組成物。
（３６）ＮｏＶ感染によって引き起こされる胃腸炎を治療又は予防又はその重症度を軽減する方法、好ましくは予防する方法における使用のための、項目（３４）又は（３５）に記載の抗ノロウイルスワクチン又は薬学的組成物。
（３７）対象における抗原（複数可）に対するＴｈ１免疫応答を改善することができるか、又は抗原（複数可）に対するＴｈｅ２免疫応答に対するＴｈ１免疫応答の比率を増加させることができる、項目（３４）、（３５）又は（３６）に記載のノロウイルスワクチン又は薬学的組成物。
（３８）項目（３４）から（３７）のいずれか一項に記載の抗ノロウイルスワクチン及び薬学的に許容される担体を含む抗ノロウイルスワクチンの単回投与剤形であって、前記剤形が、１０から１０００μｇ、好ましくは３０から３００μｇ、より好ましくは５５から１５０μｇの前記少なくとも１つ又は複数のノロウイルス抗原を含む、単回投与剤形。
（３９）ノロウイルス感染及び細菌性病原体による感染の予防又は治療における使用のためのワクチンであって、前記ワクチンが、前述の項目のいずれか一項に記載の少なくとも１つのノロウイルス抗原と、前記細菌性病原体に対する免疫応答を生じさせることができるＡＢ５毒素のＢサブユニットとを含む、ワクチン。
（４０）前記細菌性病原体がコレラ菌及び大腸菌の群から選択される、項目（３９）に記載のワクチン。
（４１）項目（１）から（３３）のいずれか一項で定義された免疫原性組成物、又は項目（３４）、（３５）、（３６）、（３７）若しくは（３９）に記載のワクチン、又は（３８）に記載の単一剤形を対象に投与することを含む、ノロウイルス感染を予防又は治療する方法。
（４２）ノロウイルス遺伝子型群ＩＩ抗原によってノロウイルス遺伝子型群Ｉ抗原に対する対象における免疫応答の干渉を低減するための、細菌ＡＢ５毒素のＢサブユニットの使用。これらの抗原は、ノロウイルス遺伝子型群Ｉ抗原及びノロウイルス遺伝子型群ＩＩ抗原を含む免疫原性組成物中に存在し得る。
（４３）細菌ＡＢ５毒素の前記Ｂサブユニットが、好ましくは項目（２１）及び／又は（２４）で定義されるようなＣＴＢ又はＬＴＢである、項目（４２）の使用。
（４４）組成物が、ＡＢ５毒素のＡサブユニットを含まず、アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム、ミョウバン）を含まない、項目（１）から（３３）のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（４５）対象において、項目（１）から（３３）のいずれか一項で定義された１つ又は複数のノロウイルス抗原を含む免疫原性組成物に対するＴｈ１免疫応答を改善するための、好ましくは、前記１つ又は複数のノロウイルス抗原に対しての、対象におけるＴｈ１免疫応答のＴｈ２免疫応答に対する比率を増加させるための、細菌ＡＢ５毒素のＢサブユニットの使用。
【０００８】
本発明の免疫原性組成物は、少なくとも１つのノロウイルス抗原とは別に、ＣＴＢ又はＬＴＢなどのＡＢ５毒素の少なくとも１つのＢサブユニットを含む。本発明者らは、ノロウイルス（ＮｏＶ）抗原に対して免疫原性であり、特に非経口投与された場合に驚くほど高い免疫原性活性を有する免疫原性組成物及びそれらを含むワクチンを見出した。特に、本発明の抗原性組成物及びワクチンは、組織血液型抗原（ＨＢＧＡ）の供給源としてのブタ胃ムチン（ＰＧＭ）へのＮｏＶ  ＶＬＰの結合をブロックするＮｏＶ  ＧＩ特異的血清抗体を生成する高い能力を有する。本発明者らはまた、アジュバントとしてのＣＴＢ又はＬＴＢの使用が、それを含まない免疫原性組成物と比較して、及び／又はアジュバントとしてミョウバンを含む免疫原性組成物と比較して、よりバランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２免疫応答を得ることができることを見出した。ＣＴＢ又はＬＴＢなどのＡＢ５毒素のＢサブユニットは、特に非経口投与した場合、ミョウバンよりもはるかに強いＴｈ１免疫応答を刺激する。Ｅｓｔｅｓらによると、これは驚くべき発見であり（J. Inf. Diseases, 18 (2000) S367-S373）、ノロウイルスＶＬＰの経口送達のためのアジュバントとしてのＣＴの使用は、より強力なＴｈ２免疫応答を導く。Ｔｈ１細胞は、細菌及びウイルスなどの細胞内寄生体に対する応答を生成し、Ｔｈ２細胞は、細胞外寄生体に対する免疫応答を生成する（Mosmann TR et al., 1986, J Immunol., 136:2348-2357; O’Garra A & Arai N,2000, Trends Cell Biol., 10:542-550）。強力なＴｈ１免疫応答は、ノロウイルスに対するワクチンのような抗ウイルスワクチンにとって重要な品質パラメーターである。
【０００９】
本発明者らはさらに、本発明で使用されるアジュバントが、第２の遺伝子型群又は遺伝子型のＮｏＶ抗原の同時投与により、第１の遺伝子型群又は遺伝子型のＮｏＶ抗原に対する免疫応答に対する抑制効果（干渉）を低減及び逆転させ、さらに、体液性免疫反応を高めることができることを見出した。特に、本発明者らは、本発明で使用されるアジュバントが、ＮｏＶ遺伝子型群ＩＩ抗原の同時投与により、ＮｏＶ遺伝子型群Ｉ抗原に対する免疫応答に対する抑制効果を低減及び逆転させることを見出した。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】上のパネルは、ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ）ＶＬＰとＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ）ＶＬＰ（それぞれ１ｍｋｇ用量）の混合物のみ、又は組換えＣＴＢ（ｒＣＴＢ、１ｍｋｇ（マイクログラム、μｇ））若しくは水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３、５０ｍｋｇ）と製剤化した混合物による、ＢＡＬＢ／ｃマウスの２回（０日目と２１日目）の筋肉内（ＩＭ）免疫化後のノロウイルス（ＮｏＶ）ＧＩ．４特異的血清ＩｇＧ力価の結果を示している。中央のパネルは、上記のように免疫化され、ＥＬＩＳＡで測定されたマウスのプールされた血清中のＮｏＶ  ＧＩ．４特異的ＩｇＧ免疫応答の進行の動態を示している。下のパネルは、組織血液型抗原（ＨＢＧＡ）の供給源としてのブタ胃ムチン（ＰＧＭ）へのＧＩ．４  ＶＬＰの結合をブロックするＮｏＶ  ＧＩ．４特異的血清抗体の能力を示している。ブロッキング指数（％）は次のように計算された。１００％−（ＯＤ［血清あり］／ＯＤ［血清なし］ｘ１００％）。
【図２】上のパネルは、ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ）ＶＬＰとＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ）ＶＬＰ（それぞれ１ｍｋｇ用量）の混合物のみ、又は組換えＣＴＢ（ｒＣＴＢ、１ｍｋｇ）若しくは水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３、５０ｍｋｇ）と製剤化した混合物による、ＢＡＬＢ／ｃマウスの２回（０日目と２１日目）の筋肉内（ＩＭ）免疫化後のノロウイルス（ＮｏＶ）ＧＩＩ．４特異的血清ＩｇＧ力価の結果を示している。中央のパネルは、上記のように免疫化され、ＥＬＩＳＡで測定されたマウスのプールされた血清中のＮｏＶ  ＧＩＩ．４特異的ＩｇＧ免疫応答の進行の動態を示している。下のパネルは、組織血液型抗原（ＨＢＧＡ）の供給源としてのブタ胃ムチン（ＰＧＭ）へのＧＩＩ．４  ＶＬＰの結合をブロックするＮｏＶ  ＧＩＩ．４特異的血清抗体の能力を示している。ブロッキング指数（％）は次のように計算された。１００％−（ＯＤ［血清あり］／ＯＤ［血清なし］ｘ１００％）。
【図３】上のパネルは、ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ）ＶＬＰとＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ）ＶＬＰ（それぞれ１ｍｋｇ用量）の混合物のみ、又は組換えＣＴＢ（ｒＣＴＢ、１ｍｋｇ）若しくは水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３、５０ｍｋｇ）と製剤化した混合物による、ＢＡＬＢ／ｃマウスの２回（０日目と２１日目）の皮内（ＩＤ）免疫化後のノロウイルス（ＮｏＶ）ＧＩ．４特異的血清ＩｇＧ力価の結果を示している。中央のパネルは、上記のように免疫化され、ＥＬＩＳＡで測定されたマウスのプールされた血清中のＮｏＶ  ＧＩＩ．４特異的ＩｇＧ免疫応答の進行の動態を示している。下のパネルは、組織血液型抗原（ＨＢＧＡ）の供給源としてのブタ胃ムチン（ＰＧＭ）へのＧＩＩ．４  ＶＬＰの結合をブロックするＮｏＶ  ＧＩＩ．４特異的血清抗体の能力を示している。ブロッキング指数（％）は次のように計算された。１００％−（ＯＤ［血清あり］／ＯＤ［血清なし］ｘ１００％）。
【図４】上のパネルは、ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ）ＶＬＰとＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ）ＶＬＰ（それぞれ１ｍｋｇ用量）の混合物のみ、又は組換えＣＴＢ（ｒＣＴＢ、１ｍｋｇ）若しくは水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３、５０ｍｋｇ）と製剤化した混合物による、ＢＡＬＢ／ｃマウスの２回（０日目と２１日目）の皮内（ＩＤ）免疫化後のノロウイルス（ＮｏＶ）ＧＩＩ．４特異的血清ＩｇＧ力価の結果を示している。中央のパネルは、上記のように免疫化され、ＥＬＩＳＡで測定されたマウスのプールされた血清中のＮｏＶ  ＧＩＩ．４特異的ＩｇＧ免疫応答の進行の動態を示している。下のパネルは、組織血液型抗原（ＨＢＧＡ）の供給源としてのブタ胃ムチン（ＰＧＭ）へのＧＩＩ．４  ＶＬＰの結合をブロックするＮｏＶ  ＧＩＩ．４特異的血清抗体の能力を示している。ブロッキング指数（％）は次のように計算された。１００％−（ＯＤ［血清あり］／ＯＤ［血清なし］ｘ１００％）。
【図５】上のパネルは、ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ）ＶＬＰとＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ）ＶＬＰ（それぞれ１ｍｋｇ用量）の混合物のみ、又は組換えＣＴＢ（ｒＣＴＢ、１ｍｋｇ）と製剤化した混合物による、ＢＡＬＢ／ｃマウスの２回（０日目と２１日目）の鼻腔内（ＩＮ）免疫化後のノロウイルス（ＮｏＶ）ＧＩ．４特異的血清ＩｇＧ力価の結果を示している。中央のパネルは、上記のように免疫化され、ＥＬＩＳＡで測定されたマウスのプールされた血清中のＮｏＶ  ＧＩ．４特異的ＩｇＧ免疫応答の進行の動態を示している。下のパネルは、組織血液型抗原（ＨＢＧＡ）の供給源としてのブタ胃ムチン（ＰＧＭ）へのＧＩ．４  ＶＬＰの結合をブロックするＮｏＶ  ＧＩ．４特異的血清抗体の能力を示している。ブロッキング指数（％）は次のように計算された。１００％−（ＯＤ［血清あり］／ＯＤ［血清なし］ｘ１００％）。
【図６】上のパネルは、ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ）ＶＬＰとＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ）ＶＬＰ（それぞれ１ｍｋｇ用量）の混合物のみ、又は組換えＣＴＢ（ｒＣＴＢ、１ｍｋｇ）と製剤化した混合物による、ＢＡＬＢ／ｃマウスの２回（０日目と２１日目）の鼻腔内（ＩＮ）免疫化後のノロウイルス（ＮｏＶ）ＧＩＩ．４特異的血清ＩｇＧ力価の結果を示している。中央のパネルは、上記のように免疫化され、ＥＬＩＳＡで測定されたマウスのプールされた血清中のＮｏＶ  ＧＩＩ．４特異的ＩｇＧ免疫応答の進行の動態を示している。下のパネルは、組織血液型抗原（ＨＢＧＡ）の供給源としてのブタ胃ムチン（ＰＧＭ）へのＧＩＩ．４  ＶＬＰの結合をブロックするＮｏＶ  ＧＩＩ．４特異的血清抗体の能力を示している。ブロッキング指数（％）は次のように計算された。１００％−（ＯＤ［血清あり］／ＯＤ［血清なし］ｘ１００％）。
【図７Ａ】図は、ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ）ＶＬＰとＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ）ＶＬＰ（それぞれ１ｍｋｇ用量）の混合物のみ、又は組換えＣＴＢ（ｒＣＴＢ、１ｍｋｇ）と製剤化した混合物による、ＢＡＬＢ／ｃマウスの２回（０日目と２１日目）の筋肉内（ＩＭ）免疫化後のノロウイルス（ＮｏＶ）ＧＩ．４特異的（図７Ａ）及びＧＩＩ．４特異的（図７Ｂ）血清ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ力価の結果を示している。陽性対照として、５０ｍｋｇのＡｌ（ＯＨ）３とＶＬＰの混合物を使用した。
【図７Ｂ】図は、ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ）ＶＬＰとＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ）ＶＬＰ（それぞれ１ｍｋｇ用量）の混合物のみ、又は組換えＣＴＢ（ｒＣＴＢ、１ｍｋｇ）と製剤化した混合物による、ＢＡＬＢ／ｃマウスの２回（０日目と２１日目）の筋肉内（ＩＭ）免疫化後のノロウイルス（ＮｏＶ）ＧＩ．４特異的（図７Ａ）及びＧＩＩ．４特異的（図７Ｂ）血清ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ力価の結果を示している。陽性対照として、５０ｍｋｇのＡｌ（ＯＨ）３とＶＬＰの混合物を使用した。
【図８Ａ】図は、ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ）ＶＬＰとＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ）ＶＬＰ（それぞれ１ｍｋｇ用量）の混合物のみ、又は組換えＣＴＢ（ｒＣＴＢ、１ｍｋｇ）と製剤化した混合物による、ＢＡＬＢ／ｃマウスの２回（０日目と２１日目）の皮内（ＩＤ）免疫化後のノロウイルス（ＮｏＶ）ＧＩ．４特異的（図８Ａ）及びＧＩＩ．４特異的（図８Ｂ）血清ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ力価の結果を示している。陽性対照として、５０ｍｋｇのＡｌ（ＯＨ）３とＶＬＰの混合物を使用した。
【図８Ｂ】図は、ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ）ＶＬＰとＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ）ＶＬＰ（それぞれ１ｍｋｇ用量）の混合物のみ、又は組換えＣＴＢ（ｒＣＴＢ、１ｍｋｇ）と製剤化した混合物による、ＢＡＬＢ／ｃマウスの２回（０日目と２１日目）の皮内（ＩＤ）免疫化後のノロウイルス（ＮｏＶ）ＧＩ．４特異的（図８Ａ）及びＧＩＩ．４特異的（図８Ｂ）血清ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ力価の結果を示している。陽性対照として、５０ｍｋｇのＡｌ（ＯＨ）３とＶＬＰの混合物を使用した。
【図９Ａ−Ｂ】相同ノロウイルス（ＮｏＶ）ＶＰ１抗原特異的血清ＩｇＧ及び皮下（ＳＣ）免疫化マウスにおけるブロッキング活性。個々の、連続希釈した血清試料を、ＧＩ．４（Ａ）及びＧＩＩ．４Ａｏｍｏｒｉ（Ｃ）に対するＥＬＩＳＡで５週目の抗体レベルについて分析した。グループごとにプールされ、２倍に滴定された血清試料が、ＧＩ．４（Ｂ）及びＧＩＩ．４（Ｄ）ＶＬＰに対する遺伝子型特異的ブロッキング（中和）活性について、ブタ胃ムチン（ＰＧＭ）ベースのブロッキングアッセイを使用して試験された。ブロッキング指数（％）は１００％−［（ＶＬＰと血清を含むウェルのＯＤ／血清を含まないウェルのＯＤ、「最大結合」）×１００％］として計算された。ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ）とＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ）ＶＬＰ（それぞれ１０ｍｋｇ用量又は１０ｍｋｇのＧＩ．４と３５ｍｋｇのＧＩＩ．４）の混合物のみ、又は組換えＣＴＢ（ｒＣＴＢ、１０ｍｋｇ）と製剤化した混合物によるＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化。陽性対照として、５０ｍｋｇのＡｌ（ＯＨ）３とＶＬＰの混合物を使用した。
【図９Ｃ−Ｄ】相同ノロウイルス（ＮｏＶ）ＶＰ１抗原特異的血清ＩｇＧ及び皮下（ＳＣ）免疫化マウスにおけるブロッキング活性。個々の、連続希釈した血清試料を、ＧＩ．４（Ａ）及びＧＩＩ．４Ａｏｍｏｒｉ（Ｃ）に対するＥＬＩＳＡで５週目の抗体レベルについて分析した。グループごとにプールされ、２倍に滴定された血清試料が、ＧＩ．４（Ｂ）及びＧＩＩ．４（Ｄ）ＶＬＰに対する遺伝子型特異的ブロッキング（中和）活性について、ブタ胃ムチン（ＰＧＭ）ベースのブロッキングアッセイを使用して試験された。ブロッキング指数（％）は１００％−［（ＶＬＰと血清を含むウェルのＯＤ／血清を含まないウェルのＯＤ、「最大結合」）×１００％］として計算された。ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ）とＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ）ＶＬＰ（それぞれ１０ｍｋｇ用量又は１０ｍｋｇのＧＩ．４と３５ｍｋｇのＧＩＩ．４）の混合物のみ、又は組換えＣＴＢ（ｒＣＴＢ、１０ｍｋｇ）と製剤化した混合物によるＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化。陽性対照として、５０ｍｋｇのＡｌ（ＯＨ）３とＶＬＰの混合物を使用した。
【図１０Ａ−Ｂ】相同ノロウイルス（ＮｏＶ）ＶＰ１抗原特異的血清ＩｇＧ及び筋肉内（ＩＭ）免疫化マウスにおけるブロッキング活性。個々の、連続希釈した血清試料を、ＧＩ．４（Ａ）及びＧＩＩ．４Ａｏｍｏｒｉ（Ｃ）に対するＥＬＩＳＡで５週目の抗体レベルについて分析した。グループごとにプールされ、２倍に滴定された血清試料が、ＧＩ．４（Ｂ）及びＧＩＩ．４（Ｄ）ＶＬＰに対する遺伝子型特異的ブロッキング（中和）活性について、ブタ胃ムチン（ＰＧＭ）ベースのブロッキングアッセイを使用して試験された。ブロッキング指数（％）は１００％−［（ＶＬＰと血清を含むウェルのＯＤ／血清を含まないウェルのＯＤ、「最大結合」）×１００％］として計算された。ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ）とＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ）ＶＬＰ（それぞれ１０ｍｋｇ用量又は１０ｍｋｇのＧＩ．４と３５ｍｋｇのＧＩＩ．４）の混合物のみ、又は組換えＣＴＢ（ｒＣＴＢ、１０ｍｋｇ）と製剤化した混合物によるＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化。陽性対照として、５０ｍｋｇのＡｌ（ＯＨ）３とＶＬＰの混合物を使用した。
【図１０Ｃ−Ｄ】相同ノロウイルス（ＮｏＶ）ＶＰ１抗原特異的血清ＩｇＧ及び筋肉内（ＩＭ）免疫化マウスにおけるブロッキング活性。個々の、連続希釈した血清試料を、ＧＩ．４（Ａ）及びＧＩＩ．４Ａｏｍｏｒｉ（Ｃ）に対するＥＬＩＳＡで５週目の抗体レベルについて分析した。グループごとにプールされ、２倍に滴定された血清試料が、ＧＩ．４（Ｂ）及びＧＩＩ．４（Ｄ）ＶＬＰに対する遺伝子型特異的ブロッキング（中和）活性について、ブタ胃ムチン（ＰＧＭ）ベースのブロッキングアッセイを使用して試験された。ブロッキング指数（％）は１００％−［（ＶＬＰと血清を含むウェルのＯＤ／血清を含まないウェルのＯＤ、「最大結合」）×１００％］として計算された。ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ）とＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ）ＶＬＰ（それぞれ１０ｍｋｇ用量又は１０ｍｋｇのＧＩ．４と３５ｍｋｇのＧＩＩ．４）の混合物のみ、又は組換えＣＴＢ（ｒＣＴＢ、１０ｍｋｇ）と製剤化した混合物によるＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化。陽性対照として、５０ｍｋｇのＡｌ（ＯＨ）３とＶＬＰの混合物を使用した。
【図１１】唾液ＨＢＧＡベースのアッセイにおけるＧＩＩ．４−９９  ＮｏＶ  ＶＬＰ結合のクロスブロッキング。免疫化されたグループのプールされた血清を、唾液ＨＢＧＡに対するＧＩＩ．４−１９９９  ＶＬＰの結合をブロックする能力について分析した。ブロッキング指数（％）は１００％−［（ＶＬＰと血清を含むウェルのＯＤ／血清を含まないウェルのＯＤ、「最大結合」）×１００％］として計算された。すべてのワクチン用量（Ｘ−３５ｍｋｇのＧＩＩ．４のみ、及びＸＶＩ−ＰＢＳを除く）は、１０ｍｋｇのＧＩ．４＋３５ｍｋｇのＧＩＩ．４  ＶＬＰを含む。ＸＩ及びＸＩＩは、ＶＬＰに加えて５０ｍｋｌのＡｌ（ＯＨ）３を含み；ＸＩＩＩ及びＸＩＶは１０ｍｋｇのＣＴＢを含む。
【図１２】ＧＩ．４（Ｃｈｉｂａ）ＶＬＰとＧＩＩ．４（Ａｏｍｏｒｉ）ＶＬＰ（それぞれ１又は１０ｍｋｇ用量）の混合物のみ、又は植物性組換えＣＴＢ（ＣＴＢ、１又は１０ｍｋｇ）のみ若しくは水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３、５０ｍｋｇ）と組み合わせて製剤化した混合物による、ＢＡＬＢ／ｃマウスの２回（０日目と２１日目）の筋肉内（ＩＭ）免疫化後の血清ＩｇＧ力価。左のパネルはＮｏＶ  ＧＩ．４特異的ＩｇＧ免疫応答を示し、中央のパネルはＮｏＶ  ＧＩＩ．４特異的ＩｇＧ免疫応答を示し、右のパネルはＣＴＢ特異的ＩｇＧ免疫応答を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
ノロウイルスは、非エンベロープ一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。それらはカリシウイルス科に属する。ノロウイルス粒子の重要な構造成分は、ＶＰ１タンパク質である。ＮｏＶ粒子のサイズは、直径２３〜４０ｎｍの間で変化する。サイズに応じて、ウイルス粒子あたりのＶＰ１分子の数は、通常６０分子又は１８０分子のいずれかである（ｈｔｔｐ：／／ｖｉｒａｌｚｏｎｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／１９４）。ノロウイルスには５つの異なる遺伝子型群（ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＩＩ、ＧＩＶ、ＧＶ）があり、さらに遺伝子型に分類できる。ノロウイルスの例は、Ｎｏｒｗａｌｋウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ０９３７９７．１）、ＧＩ．１株Ａｉｃｈｉ／１２４−８９／ＪＰ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ８３４１３０）、ＧＩ．２株Ｆｕｎａｂａｓｈｉ２５８／９６／ＪＰ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＣ０５５１６）、Ｍａｒｙｌａｎｄウイルス（ＭＶ、ＡＹ０３２６０５）、ＧＩ．３株Ｓｈｉｍｉｚｕ／ＫＫ２８６６／ＪＰ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＩＩ７３７６５）、ＧＩＩ．１７株Ｃ１４２／１９７８／ＧＵＦ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＧＩ１７５９２）、ＧＩ．４株Ｃｈｉｂａ４０７／８７／ＪＰ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ８２１０６）、ＧＩ．７株ＴＣＨ−０６０／ＵＳＡ／２００３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＥＱ７７２８２）、ＧＩＩ．４株ＮＬ／２０１４／ＧＩＩ．４／Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ０１（ＧｅｎｅＢａｎｋ：ＣＲＬ４６９６１）、ＧＩＩ．４株Ａｏｍｏｒｉ２／２００６／ＪＰ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＧ７０４４６）、ＧＩＶ．１株Ａｈｒｅｎｓｈｏｏｐ２４６／ＤＥＵ／２０１２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＮ６１３１５）、ＧＩＩ．１７株ＪＰ／２００２／Ｓａｉｔａｍａ／Ｔ８７（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＩＩ７３７４７）、Ｊｅｎａウイルス（ＪＶ、ＡＪ０１０９９）、ＧＩＩ．４株Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＶ０８７９５）、ＧＩＩ．３株Ｋａｓｈｉｗａ３３６／００／ＪＰ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＺ６６７７４）、ＧＩＩ．１７株ＪＰ／２０１３／／Ｓａｉｔａｍａ５２０３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＲ６３７１５）、Ｓｅｔｏウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０３１０１３）である。他の多くのノロウイルス株があり、その完全なゲノムは公的に利用可能なデータベース（ｗｗｗ．ｖｉｐｒｂｒｃ．ｏｒｇ）で注釈が付けられている。表１Ａ及びＢに、いくつかのＮｏＶ株を示す。
【００１２】
本発明のＮｏＶ抗原
本発明の免疫原性組成物は、少なくとも１つのノロウイルス（ＮｏＶ）抗原及び少なくとも１つのアジュバントを含む。本発明によるＮｏＶ抗原はタンパク質である。ＮｏＶ抗原は、一般にＮｏＶキャプシドタンパク質又はその断片若しくは誘導体である。ＮｏＶキャプシドタンパク質は、ＶＰ１及びＶＰ２タンパク質であり、それにより、ＶＰ１タンパク質、それらの断片及び誘導体は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成し得るので、本発明における抗原としての使用に好ましい。ただし、ＶＰ２は、免疫原性組成物に含まれていてもよい。表１Ｂは、いくつかのＮｏＶ株のＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１〜７８）を含む。わかるように、ＶＰ１タンパク質の間にはかなりのばらつきがある。したがって、本発明の抗原及びＶＰ１タンパク質は、自然界に存在するＮｏＶの特定の抗原又はＶＰ１タンパク質に限定されず、そのような特定の抗原又はＶＰ１タンパク質の断片、誘導体及び融合タンパク質を網羅する。
【００１３】
本発明のＮｏＶ抗原又はＶＰ１タンパク質は、
（ａ）配列番号１〜７８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列；又は
（ｂ）配列番号１〜７８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも３００個、好ましくは少なくとも４００個、より好ましくは少なくとも４５０個、さらにより好ましくは少なくとも５００個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列；又は
（ｃ）配列番号１〜７８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも３００個、好ましくは少なくとも４００個、より好ましくは少なくとも４５０個、さらにより好ましくは少なくとも５００個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列；又は
（ｄ）配列番号１〜７８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列；又は
（ｅ）少なくとも３００個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、配列番号１〜７８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも３００個の連続したアミノ酸残基の少なくともセグメントと、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列；又は
（ｆ）少なくとも４００個、好ましくは少なくとも４５０個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、配列番号１〜７８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも４００個、好ましくは少なくとも４５０個のそれぞれの連続したアミノ酸残基の少なくともセグメントと、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列；又は
（ｇ）少なくとも５００個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、配列番号１〜７８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも５００個の連続したアミノ酸残基の少なくともセグメントと、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列；又は
（ｈ）配列番号１〜７８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列と比較して、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜６０個、より好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらにより好ましくは１〜１０個のアミノ酸残基の欠失、置換、付加、又は挿入を有するアミノ酸配列；又は
（ｉ）少なくとも３００個のアミノ酸残基の長さを有し、配列番号１〜７８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも３００個の連続したアミノ酸残基のセグメントと比較して、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜６０個、より好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらにより好ましくは１〜１０個のアミノ酸の欠失、置換、付加、又は挿入を有するアミノ酸配列；又は
（ｊ）少なくとも４００個、好ましくは少なくとも４５０個のアミノ酸残基の長さを有し、配列番号１〜７８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも４００個、好ましくは少なくとも４５０個のそれぞれの連続したアミノ酸残基のセグメントと比較して、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜６０個、より好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらにより好ましくは１〜１０個のアミノ酸の欠失、置換、付加、又は挿入を有するアミノ酸配列；又は
（ｋ）少なくとも５００個のアミノ酸残基の長さを有し、配列番号１〜７８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも５００個の連続したアミノ酸残基のセグメントと比較して、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜６０個、より好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらにより好ましくは１〜１０個のアミノ酸の欠失、置換、付加、又は挿入を有するアミノ酸配列
のタンパク質であり得る。
【００１４】
上記で定義された抗原又はタンパク質は、アミノ酸残基の数に関して、５５０アミノ酸残基、好ましくは５２０アミノ酸残基の最大長を有し得る。
【００１５】
配列番号１〜７８は、本明細書において「参照配列」とも呼ばれる。「タンパク質アミノ酸配列…」という言葉に続く定義は、タンパク質のアミノ酸配列全体（その一部だけではない）を定義する。「配列番号１〜７８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列」という表現は、「セグメント」又は「部分」に明示的な参照がなされない限り、それぞれ配列番号１〜７８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列全体を意味する。アミノ酸配列の「セグメント」又は「部分」は、言及されるアミノ酸配列の任意の所与の数のアミノ酸残基の連続したアミノ酸残基の部分配列（又は断片）である。アミノ酸配列の長さは、それが構成されるアミノ酸残基の数によって測定される。アミノ酸配列の同一性は、インターネットから自由にアクセス可能なタンパク質配列検索及びアラインメントプログラム、例えばＰＲＯＴＥＩＮ  ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＝Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）及びＥｘＰＡＳｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｉｍ／）によって決定することができる。配列アライメントツールの包括的なリストは、ｈｔｔｐ：／／ｍｏｌｂｉｏｌ−ｔｏｏｌｓ．ｃａ／Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．ｈｔｍで見つけることができる。
【００１６】
ＮｏＶ抗原は、任意のＮｏＶ遺伝子型群のＮｏＶ  ＶＰ１タンパク質、そのようなタンパク質の断片、該タンパク質若しくは断片の誘導体、又は上記の項目（ａ）から（ｋ）に定義されるＮｏＶ  ＶＰ１タンパク質若しくは誘導体のアミノ酸配列を含むタンパク質であり得る。好ましくは、抗原は、遺伝子型群Ｉ、ＩＩ又はＩＶの抗原、特に遺伝子型群Ｉ、ＩＩ又はＩＶのＶＰ１タンパク質である。
【００１７】
抗原又はタンパク質は、上記の参照配列と比較して、アミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を有していてもよい。これらの中でも、欠失、置換、付加が好ましい。上記のそのような変更の数は、すべての欠失、置換、付加、挿入の合計を指す。用語「挿入」は、参照配列のアミノ酸配列内の挿入、すなわち、Ｃ末端又はＮ末端での付加を除いた挿入に関する。付加という用語は、参照配列のアミノ酸配列のＣ末端又はＮ末端での付加を意味する。欠失は、参照配列の末端又は内部アミノ酸残基の欠失であり得る。
【００１８】
ＮｏＶ  ＶＰ１タンパク質などのタンパク質抗原の断片は、自然界で発見された任意のＮｏＶのＶＰ１タンパク質又は表１Ｂに与えられたものうちの少なくとも３００個、好ましくは少なくとも４００個、より好ましくは少なくとも４５０個、さらに好ましくは少なくとも５００個の連続したアミノ酸残基の長さを有する任意のタンパク質断片であり得る。断片は、上記の項目（ｂ）で定義されているとおりであるが、参照配列よりも少ないアミノ酸残基を有するものであってもよい。好ましいように、組成物が抗原としてＶＬＰを含む場合、ＶＬＰを形成する抗原は、ＶＬＰを形成するのに十分な長さを有していなければならない。ＶＬＰが形成されているかどうかは、電子顕微鏡（Laue M & Bannert N. , 2010, J Applied Microbiol., 109:1159-1168; Harris JR, 1999, Methods Mol Biol., 117:13-30; Pogan R et al., 2018, J Phys.: Condens. Matter, 30: 064006）又はサイズ排除クロマトグラフィー（Effio CL et al., 2016, Vaccine, 34:1259-1267）などの確立された方法によって決定することができる。
【００１９】
ＶＰ１タンパク質の誘導体又は断片の誘導体は、項目（ｄ）から（ｋ）のいずれかにおいて上記で定義されたとおりであり得る。ＮｏＶ抗原若しくはＶＰ１タンパク質を含むタンパク質、又はその断片若しくは誘導体は、それぞれ、抗原又はＶＰ１タンパク質、断片又は誘導体、及びシグナル配列又は精製タグなどの付加されたドメイン又は配列ストレッチを含む融合タンパク質であり得る。このような付加されたドメイン又は配列ストレッチは、ＶＰ１タンパク質、断片又は誘導体のＮ末端又はＣ末端に付加されてもよく、３０個以下、好ましくは２０個以下、より好ましくは１０個以下のアミノ酸残基からなり得る。抗原が、ＰＥＧ化などの共有結合した非タンパク質性共有結合修飾を含むことも可能である。
【００２０】
本発明における使用のためのＮｏＶ抗原、例えばＶＰ１タンパク質又はその断片若しくは誘導体は、自然界で発見された任意のＮｏＶからのものであってもよく、好ましくは、抗原は、ＮｏＶ遺伝子型群Ｉ、ＩＩ又はＩＶの抗原である。抗原は、表１Ａ又はＢに列挙されているものなど、任意のＮｏＶ遺伝子型群及び／又は任意の遺伝子型のものであり得る。一実施形態では、ＮｏＶ抗原は、遺伝子型群Ｉ  ＮｏＶからのものである。別の実施形態では、ＮｏＶ抗原は、遺伝子型群ＩＩ  ＮｏＶからのものである。これらの遺伝子型群の中で、本発明の組成物は、少なくとも遺伝子型群ＩＩのＮｏＶの抗原を含み得る。上記の項目（ａ）から（ｋ）のいずれか１つの所定のＮｏＶ抗原は、項目（ａ）から（ｋ）の定義が適用される配列番号について、表１Ａ又は１Ｂに示されている遺伝子型群及び／又は遺伝子型のＮｏＶ抗原と考えられる。所与のＮｏＶ抗原が、項目（ａ）から（ｋ）の定義に従って、複数の遺伝子型群又は遺伝子型に属していてもよい場合、それは、例えば、それぞれの参照配列の全長にわたって、より高い配列同一性を有する遺伝子型群又は遺伝子型の抗原である。
【００２１】
遺伝子型群ＩのＮｏＶ抗原は、
（ａ’）配列番号１〜２２のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるアミノ酸配列；又は
（ｂ’）配列番号１〜２２のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも３００個、好ましくは少なくとも４００個、より好ましくは少なくとも５００個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列；又は
（ｃ’）配列番号１〜２２のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも３００個、好ましくは少なくとも４００個、より好ましくは少なくとも５００個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列；又は
（ｄ’）配列番号１〜２２のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列；又は
（ｅ’）少なくとも３００個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、配列番号１〜２２のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも３００個の連続したアミノ酸残基の少なくともセグメントと、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列；又は
（ｆ’）少なくとも４００個、好ましくは少なくとも４５０個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、配列番号１〜２２のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも４００個、好ましくは少なくとも４５０個のそれぞれの連続したアミノ酸残基の少なくともセグメントと、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列；又は
（ｇ’）少なくとも５００個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、配列番号１〜２２のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも５００個の連続したアミノ酸残基の少なくともセグメントと、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列；又は
（ｈ’）配列番号１〜２２のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列と比較して、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜６０個、より好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらにより好ましくは１〜１０個のアミノ酸の欠失、置換、付加、又は挿入を有するアミノ酸配列；又は
（ｉ’）少なくとも３００個のアミノ酸残基の長さを有し、配列番号１〜２２のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも３００個の連続したアミノ酸残基のセグメントと比較して、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜６０個、より好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらにより好ましくは１〜１０個のアミノ酸の欠失、置換、付加、又は挿入を有するアミノ酸配列；又は
（ｊ’）少なくとも４００個、好ましくは少なくとも４５０個のアミノ酸残基の長さを有し、配列番号１〜２２のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも４００個、好ましくは少なくとも４５０個のそれぞれの連続したアミノ酸残基のセグメントと比較して、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜６０個、より好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらにより好ましくは１〜１０個のアミノ酸の欠失、置換、付加、又は挿入を有するアミノ酸配列；又は
（ｋ’）少なくとも５００個のアミノ酸残基の長さを有し、配列番号１〜２２のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも５００個の連続したアミノ酸残基のセグメントと比較して、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜６０個、より好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらにより好ましくは１〜１０個のアミノ酸の欠失、置換、付加、又は挿入を有するアミノ酸配列
のタンパク質であり得る。
【００２２】
遺伝子型群ＩＩのＮｏＶ抗原は、「配列番号１〜２２のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列」が「配列番号２３〜７５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列」に置き換えられていることを除いて、上記の項目（ａ’）から（ｋ’）で定義されたタンパク質であり得る。遺伝子型群ＩＶのＮｏＶ抗原は、「配列番号１〜２２のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列」が「配列番号７６〜７８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列」に置き換えられていることを除いて、上記の項目（ａ’）から（ｋ’）で定義されたタンパク質であり得る。
【００２３】
遺伝子型群Ｉの抗原は、以下の遺伝子型のいずれか１つ又は複数のものであり得る：Ｉ．１、Ｉ．２、Ｉ．３、Ｉ．４、Ｉ．５、Ｉ．６、Ｉ．７、Ｉ．８、又はＩ．９。遺伝子型群ＩＩの抗原は、以下の遺伝子型のいずれか１つ又は複数のものであり得る：ＩＩ．１、ＩＩ．２、ＩＩ．３、ＩＩ．４、ＩＩ．５、ＩＩ．６、ＩＩ．７、ＩＩ．８、ＩＩ．１２、ＩＩ．１３、ＩＩ．１４、ＩＩ．１７、ＩＩ．２１、ＩＩ．２２、ＩＩ．２４、又はＩＩ．２５。遺伝子型群ＩＶの抗原は、以下の遺伝子型のいずれか１つ又は複数のものであり得る：ＩＶ．１又はＩＶ．３。
【００２４】
遺伝子型Ｉ．１（ＧＩ．１）のＮｏＶ抗原は、「配列番号１〜２２のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列」が「配列番号５又は６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列」に置き換えられていることを除いて、上記の項目（ａ’）から（ｋ’）で定義されたタンパク質であり得る。表１Ｂに列挙されている他の任意の遺伝子型のＮｏＶ抗原は、前文の配列番号を、それぞれの遺伝子型に対して表１Ａ又は１Ｂで与えられたもので置き換えることによってそれに応じて定義される。例えば、遺伝子型Ｉ．４（ＧＩ．４）のＮｏＶ抗原は、配列番号１３又は１４のアミノ酸配列について、上記の項目（ａ’）から（ｋ’）で定義されたタンパク質であり得る。遺伝子型ＩＩ．４のＮｏＶ抗原は、配列番号４０−５４のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列について、上記の項目（ａ’）から（ｋ’）で定義されたタンパク質であり得る。遺伝子型ＩＩ．６のＮｏＶ抗原は、配列番号５６−５８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列について、上記の項目（ａ’）から（ｋ’）で定義されたタンパク質であり得る。
【００２５】
遺伝子型群ＩのＮｏＶ抗原の中では、遺伝子型Ｉ．１及びＩ．４のものが好ましく、遺伝子型Ｉ．４のものがより好ましい。遺伝子型群ＩＩのＮｏＶ抗原の中でも、遺伝子型ＩＩ．１（ＧＩＩ．１）、ＩＩ．４（ＧＩＩ．４）、ＩＩ．６（ＧＩＩ．６）、ＩＩ．１７（ＧＩＩ．１７）のものが好ましく、遺伝子型ＩＩ．１（ＧＩＩ．１）、ＩＩ．４（ＧＩＩ．４）、ＩＩ．６（ＧＩＩ．６）のものがより好ましく、本発明においては、遺伝子型ＩＩ．４のものがさらに好ましい。
【００２６】
本発明において使用されるアジュバント
本発明の免疫原性組成物は、少なくとも１つのＮｏＶ抗原とは別に、少なくとも１つのアジュバント（「ワクチンアジュバント」とも呼ばれる）を含む。アジュバントは、対象への投与後に免疫応答を増強する薬理学的又は免疫学的薬剤であり、これは一般に抗体の力価を高め、免疫防御をより長く持続させることにつながる。アジュバントはまた、免疫応答を調節する可能性があり、例えば、細胞性免疫応答と体液性免疫応答の間のバランスに影響を与える可能性がある。ワクチンアジュバントは、多くの研究出版物や総説記事に記載されている（Lee S. & Nguen MT., 2015, Immune Netw., 15:51-57; Di Pasquale A et al., 2015, Vaccines, 3:320-343; Cimica, V, & Galarza, JM., 2017, Clin. Immunol., 183:99-108; McKee AS & Marrack P., 2017, Curr. Opin. Immunol., 47:44-51）。しかし、現在、ヒトへの使用が承認されているワクチンに使用されているアジュバントはごくわずかである。これらのアジュバントには、アルミニウム塩、水中油型エマルジョン（ＭＦ５９及びＡＳ０３）が含まれ、さらにいくつかは臨床試験で試験されている（ＣｐＧ、Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ、ＰｏｌｙＩ：Ｃ、ＡＳ１、ＡＳ２、ＩＳＣＯＳ及びＩＳＣＯＭＭＡＴＲＩＸ（Lee S. & Nguen MT., 2015, Immune Netw., 15:51-57）。アジュバントは、その作用機序及び／又は好ましい適用経路によってしばしば分類される。それらの作用機序に続いて、アジュバントのいくつかは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストのグループに属する。アジュバント又はアジュバントクラスの例は次のとおりである：ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）アゴニスト、例えばＣｐＧ（ＴＬＲ９アゴニスト）、ポリ（Ｕ）（ＴＬＲ７／８アゴニスト）、モノホスホリル脂質Ａ又はＭＰＬＡ（ＴＬＲ４アゴニスト）などの細菌内毒素誘導体など。
【００２７】
細菌外毒素及びそれらの融合物はまた、ワクチン組成物においてアジュバントとして作用し得る。いくつかの細菌外毒素は免疫原性研究で使用されている。これらには、バクテリアコレラ菌によって生成され、２つのサブユニット：毒性サブユニットＡ（ＣＴＡ）及びホモ五量体構造を形成する非毒性サブユニットＢ（ＣＴＢ）からなるコレラ毒素（ＣＴ）が含まれる（Lemcer, WI & Tsai, B. 2003, Trends Biochem. Sci., 28:639-645; Chinnapen, DJ, et al., 2007, FEMS Microbiol. Le., 266:129-137; Wernick, NL, et al., 2010, Toxins 2:310-325）。ＣＴと三次構造及び四次構造の点で同一又は非常に類似している別の細菌外毒素は、大腸菌の熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）である。ＣＴとＬＴは相同性が高く、約８０％の相同性を示す。ＣＴ様エンテロトキシンの総説については、Basset, C et al., 2010, Toxins, 2:1774-17795を参照。ＣＴと同様に、ＬＴはまた、２つのサブユニット−毒性サブユニットＡ（ＬＴＡ）と五量体構造を形成する非毒性サブユニットＢ（ＬＴＢ）で構成される。非毒性のＬＴ変異体及びその誘導体は、アジュバントとして機能し得る（総説については、Ma, Y, 2016, Expert Rev. Vaccines, 15 :1361-1371を参照のこと）。ＬＴ及びＣＴは、構造的に分類することができ、ＡＢ５多量体タンパク質又はＡＢ５毒素として当技術分野で知られており、単一の触媒Ａサブユニット及び五量体Ｂオリゴマーから構成される（Burnett, WN, 1994, Structure, 2:151-158）。ＡＢ５毒素の総説については、Merritt, EA & Hol, WG., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol., 5:165-171; Beddoe T, et al., 2010 Trends Biochem. Sci.. 35:411-418を参照。
【００２８】
ＬＴＢは、ＣＴＢと同様に、動物実験で、粘膜アジュバントとして、及び非経口投与のために、目的の抗原との融合物としてうまく使用された（Zhang, J, et al., 2016, Vaccine, 34:622-629; Marchioro, SB, et al., 2014, Vaccine, 32:4689-4694）。増加したレベルのＥＴＥＣコロニー形成因子とＬＴＢ／ＣＴＢハイブリッドタンパク質を発現する不活化組換え大腸菌で構成される、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）に対する経口投与ワクチンの安全性と免疫原性を評価する臨床試験は、ハイブリッドＬＴＢ／ＣＴＢタンパク質の存在は安全性プロファイルを変更しないが、免疫応答の強度と質を向上させることを示した（Lundgren, A, etal., 2013, Vaccine, 31:1163-1170）。ノロウイルス抗原と組み合わせた粘膜アジュバントとしての細菌外毒素の使用は、熱不安定性大腸菌毒素ＬＴとその非毒性変異体Ｒ１９２Ｇについて過去に記載されている（Nicollier-Jamot, B, et al., 2004, Vaccine,  22:1079-86; Clements, JD  & Norton, EB, 2018, mSphere, 3:e00215-18）。ＵＳ７５２７８０１には、非毒性のＬＴ変異体ＬＴＫ６３又はＬＴＲ７２の使用が記載されている。本発明では、外毒素の変異体バージョンではなく、それらのＢサブユニト、好ましくは組換え起源のものに対して、及びＡサブユニットの非存在下でのワクチン投与の非経口送達経路に対して優先度が与えられる。
【００２９】
本発明の一実施形態では、使用されるアジュバント（又は共抗原）はＣＴＢである。本発明で使用可能なＣＴＢは、
（Ａ）配列番号７９〜９６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるアミノ酸配列；又は
（Ｂ）配列番号７９〜９６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも９０個、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸残基のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列；又は
（Ｃ）配列番号７９〜９６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも９０個、好ましくは少なくとも１００個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列；又は
（Ｄ）配列番号７９〜９６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列；又は
（Ｅ）少なくとも９０個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、配列番号７９〜９６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも９０個の連続したアミノ酸残基の少なくともセグメントと、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列；又は
（Ｆ）少なくとも１００個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、配列番号７９〜９６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも１００個の連続したアミノ酸残基の少なくともセグメントと、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列；又は
（Ｇ）配列番号７９〜９６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列と比較して、１〜１５個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらにより好ましくは１〜３個のアミノ酸残基の欠失、置換、付加、又は挿入を有するアミノ酸配列；又は
（Ｈ）少なくとも９０個のアミノ酸残基の長さを有し、配列番号７９〜９６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも９０個の連続したアミノ酸残基のセグメントと比較して、１〜１５個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらにより好ましくは１〜３個のアミノ酸の欠失、置換、付加、又は挿入を有するアミノ酸配列；又は
（Ｉ）少なくとも１００個のアミノ酸残基の長さを有し、配列番号７９〜９６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも１００個の連続したアミノ酸残基のセグメントと比較して、１〜１５個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらにより好ましくは１〜３個のアミノ酸の欠失、置換、付加、又は挿入を有するアミノ酸配列
のタンパク質であり得る。
【００３０】
本発明の別の実施形態では、使用されるアジュバント（又は共抗原）はＬＴＢである。本発明において使用可能なＬＴＢは、
（Ａ’）配列番号９７〜１００のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるアミノ酸配列；又は
（Ｂ’）配列番号９７〜１００のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも９０個、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸残基のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列；又は
（Ｃ’）配列番号９７〜１００のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも９０個、好ましくは少なくとも１００個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列；又は
（Ｄ’）配列番号９７〜１００のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列；又は
（Ｅ’）少なくとも９０個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、配列番号９７から１００のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも９０個の連続したアミノ酸残基の少なくともセグメントと、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列；又は
（Ｆ’）少なくとも１００個のアミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、配列番号９７から１００のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも１００個の連続したアミノ酸残基の少なくともセグメントと、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列；又は
（Ｇ’）配列番号９７から１００のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列と比較して、１〜１５個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらにより好ましくは１〜３個のアミノ酸残基の欠失、置換、付加、又は挿入を有するアミノ酸配列；又は
（Ｈ’）少なくとも９０個のアミノ酸残基の長さを有し、配列番号９７〜１００のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも９０個の連続したアミノ酸残基のセグメントと比較して、１〜１５個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらにより好ましくは１〜３個のアミノ酸の欠失、置換、付加、又は挿入を有するアミノ酸配列；又は
（Ｉ’）少なくとも１００個のアミノ酸残基の長さを有し、配列番号９７〜１００のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも１００個の連続したアミノ酸残基のセグメントと比較して、１〜１５個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらにより好ましくは１〜３個のアミノ酸の欠失、置換、付加、又は挿入を有するアミノ酸配列
のタンパク質であり得る。
【００３１】
項目（ａ）から（ｋ）の文言に関して上記に与えられた定義は、上記の項目（Ａ）から（Ｉ）及び（Ａ’）から（Ｉ’）にも適用される。上記のように、アミノ酸配列の「セグメント」又は「部分」は、参照配列のアミノ酸配列の任意の所与の数のアミノ酸残基の連続したアミノ酸残基の部分配列（又は断片）である。アミノ酸配列の長さは、それが構成されるアミノ酸残基の数によって測定される。アミノ酸配列同一性は、本発明の抗原に関連して上記のように決定され得る。同様に、配列同一性は上記で定義されたように決定される。また、上記で定義したアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入に関する上記の定義も同様に適用される。
【００３２】
好ましくは、上記の項目（Ａ）から（Ｉ）で定義されるものなど、本発明において使用されるＣＴＢは、例えばＣＴにおいてＣＴＢが有するように五量体四次構造を有する。ＣＴＢが単量体であることとは対照的に、五量体四次構造を形成するかどうかは、ＭＡＬＤＩ質量分析、非変性ゲルクロマトグラフィーを使用して、又はサイズ排除クロマトグラフィーによって決定することができる。これらの方法は当業者に知られている。別の実施形態では、ＣＴＢは単量体ＣＴＢである。
【００３３】
上記で定義されたＣＴＢの２つ以上の変異体を、本発明の免疫原性組成物において組み合わせることができる。そのような場合、本明細書で開示される任意の量又は混合比は、本発明によるすべてのＣＴＢ変異体の合計を指す。
【００３４】
同様に、上記の項目（Ａ’）から（Ｉ’）で定義されるような本発明で使用されるＬＴＢは、例えばＬＴにおいてＬＴＢが有するように五量体四次構造を有する。ＬＴＢが単量体であることとは対照的に、五量体四次構造を形成するかどうかは、ＭＡＬＤＩ質量分析、非変性ゲルクロマトグラフィーを使用して、又はサイズ排除クロマトグラフィーによって決定することができる。これらの方法は当業者に知られている。別の実施形態では、ＬＴＢは単量体ＬＴＢである。
【００３５】
上記で定義されたＬＴＢの２つ以上の変異体を、本発明の免疫原性組成物において組み合わせることができる。そのような場合、本明細書で開示される任意の量又は混合比は、本発明によるすべてのＬＴＢ変異体の合計を指す。
【００３６】
さらなる代替において、本発明の免疫原性組成物において、上記で定義された１つ又は複数のＣＴＢを、上記で定義された１つ又は複数のＬＴＢと組み合わせてもよい。そのような場合、本明細書で開示される任意の量又は混合比は、すべてのＬＴＢ及びすべてのＣＴＢ変異体の合計を指す。
【００３７】
本発明における使用のためのＣＴＢのアミノ酸配列の例が、表２に提供される。本発明における使用のためのＬＴＢのアミノ酸配列の例が、表３に提供される。突然変異などの改変は、ＣＴＢ若しくはＬＴＢの発現収量などのいくつかの特性を変化させるために、又はそれが発現される細胞若しくは植物の所望のコンパートメントにおいてそれを発現させるために行われ得る。さらに、又はこれに代えて、精製タグが付加され得る。
【００３８】
ワクチンアジュバントとして、又は抗原として、及び抗原融合としてのＣＴＢの使用は、総説論文に記載されている（Holgren, J, et al., 1994, Am. J. Trop. Med. Hyg., 50:42-54; Lebens, M. & Holmgren, J. 1994, Dev. Biol. Stand., 82:215-227; Sun, JB., et al., 2010, Scand.J. Immunol., 71:1-11; Baldauf KJ, et al., 2015, Toxins, 7:974-996; Stratmann, T., 2015, Vaccines, 3, 579-596）。ＣＴＢは通常、粘膜（主に経口又は鼻腔内）の送達経路のワクチンに使用される。ＣＴＢは、粘膜経路を介して投与されたワクチンにおいて、体液性免疫応答を誘発することが知られている（Holmgren et al., 2005, Immunol. Lett., 97:181-188; Holgren et al., 2003, Expert Rev. Vaccines, 2:205-217）。コレラ毒素を、粘膜アジュバントとして、植物製ノーウォークウイルスＶＬＰに適用した場合にも同様の効果が示された（Velaskuez et al., 2010, Clinical & Vaccine Immunol., 17:1850-1858）。しかしながら、バキュロウイルス産生ノロウイルスＶＬＰと組み合わせたアジュバントとしてのＣＴＢの使用は、経口的に送達された場合に粘膜免疫応答を増加させないようである（Huo, Y et al., 2015, Mol. Immunol., 68:367-72）。組換えＣＴＢ（Ｆｌａｒｅｂｉｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＬＬＣ、ＵＳＡ）と組み合わせた植物製ＶＬＰの鼻腔内送達についても同様のデータが得られた（実施例４、図５及び図６を参照）。
【００３９】
驚くべきことに、本発明で見られるように、ＣＴＢを有するＮｏＶ  ＶＬＰなどのＮｏＶ抗原は、非経口的に送達された場合（筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）又は皮内（ＩＤ）など）、はるかに良好な結果を示した。免疫応答は、水酸化アルミニウムの含有量が（質量の点で）はるかに高い製剤によって生成された免疫応答と同等であり、時にはそれよりも高かった（実施例１及び２、図１〜４を参照）。粘膜送達経路によって適用された同様のワクチン及び投与量では、はるかに弱い免疫応答をもたらした。本発明者らは、非経口送達（皮内、皮下又は筋肉内）のための、ノロウイルス抗原、特にＶＬＰとのアジュバントとしての、ＣＴＢなどのＡＢ５毒素のＢサブユニットの使用が、ノロウイルスＶＬＰ単独又はＡｌ（ＯＨ）３と組み合わせたものと比較して、免疫応答の強さと質を増加させることを見出した。したがって、本発明はまた、ミョウバンを含まないか、又は先行技術よりも少ない量でミョウバンを含む抗原性組成物及びワクチンを提供する（Leroux-Roels et al. (2018), The Journal of Infectious Diseases, 217(4), 597-607）。
【００４０】
したがって、ＣＴＢ又はＬＴＢなどの細菌ＡＢ５毒素のＢサブユニットは、ノロウイルス遺伝子型群ＩＩ抗原によるノロウイルス遺伝子型群Ｉ抗原に対する対象における免疫応答の干渉を低減するために使用することができる。これらの抗原は、ノロウイルス遺伝子型群Ｉ抗原及びノロウイルス遺伝子型群ＩＩ抗原を含む免疫原性組成物中に存在し得る。
【００４１】
したがって、哺乳動物、好ましくはヒトにおける、ノロウイルス感染及び細菌性病原体による感染を予防及び／又は治療するために、細菌ＡＢ５毒素のＢサブユニットはまた、本明細書に記載されている１つ又は複数のＮｏＶ抗原を含む免疫原性組成物の成分として使用することができる。さらに、細菌ＡＢ５毒素のＢサブユニットは、対象において、本明細書で定義される１つ又は複数のノロウイルス抗原を含む免疫原性組成物に対するＴｈ１免疫応答を改善するために使用することができる。好ましくは、細菌ＡＢ５毒素のＢサブユニットは、本明細書に記載される１つ又は複数のノロウイルス抗原に対する、対象におけるＴｈ１免疫応答のＴｈ２免疫応答に対する比率を増加させるために使用することができる。これらの用途において、ＣＴＢ又はＬＴＢは、ＡＢ５毒素の好ましいＢサブユニットである。
【００４２】
本発明で使用するためのＣＴＢは、商業的供給源から入手することができる。ＣＴＢは、大腸菌のような原核生物や緑色植物のような真核生物を含むさまざまな生物において、野生型バージョン、又は収量、安定性、翻訳後修飾などの特性を向上させた変異型バージョンとして、又は抗原への融合物の形態で発現させることができる（Miata, T., et al., 2012, Vaccine; 30(28):4225-32; Hamorsky, KT., et al., 2013, PLoS Negl Trop Dis., 7(3):e2046; Hamorsky, KT., et al., 2015, Sci Rep. 2015 Jan 23;5:8003; Stratmann, T., 2015, Vaccines, 3, 579-596)。さらに、ＣＴＢは、抗原について以下に記載されたように、及び実施例６に記載されたように、植物において類似的に発現され得る。これにより、表２に示すような任意の改変又は変異を施すことができる。本発明の重要な実施形態では、免疫原性組成物又はワクチンは、ミョウバン（水酸化アルミニウム）を含まない。
【００４３】
本発明における使用のためのＬＴＢは、商業的供給源から入手することができる（例えば、ピキア・パストリスにおいて生成されたメルク組換えＬＴＢによって供給される、カタログ番号Ｅ８６５６）。ＬＴＢは、大腸菌のような原核生物又は酵母及び緑色植物のような真核生物を含むさまざまな生物において、野生型バージョン、又は収量、安定性、翻訳後修飾などの特性を向上させた変異型バージョンとして、又は抗原への融合物の形態で発現させることができる（Pillai, D, et al., 1996, FEBS Lett., 387:23-26; Lim, JG, et al., 2009, J. Microbiol. Biotechnol., 19:502-510; Wagner, B, et al., 2004, J. Immunol. Methods,  287:203-215; Sim, JS, et al., 2009, Plant Mol. Biol. Rep., 27:388-399; Soh, HS, et al., 2015, SpringerPlus, 4:148）。さらに、ＬＴＢは、抗原について以下に記載されるように、及び実施例６に記載されるように、植物において類似的に発現され得る。これにより、表３に示すような任意の改変又は変異を施すことができる。
【００４４】
本発明の免疫原性組成物
本発明の免疫原性組成物は、少なくとも１つのＮｏＶ抗原及びアジュバントを含む。それは、３つの異なるＮｏＶ抗原などの複数のＮｏＶ抗原に対して同時に、哺乳動物における免疫応答を生成するために、２つ以上のＶＰ１タンパク質などの２つ以上の異なるＮｏＶ抗原を含み得る。本発明の組成物において使用されるＮｏＶ抗原（複数可）は、本発明のワクチンを使用して哺乳動物における免疫化が達成されるべきである１つ又は複数のＮｏＶに依存する。哺乳動物において感染を引き起こすＮｏＶが進化するにつれて、組成物中で使用される抗原は、健康リスクと考えられるＮｏＶに対して、対象における免疫応答を引き起こすように変更又は適合され得る。上記のように、本発明の組成物は、ＧＩ、ＧＩＩ又はＧＩＶなどの任意のＮｏＶ遺伝子型群からのＮｏＶ抗原を含み得る。組成物は、これらの遺伝子型群のいずれかからの１つのＮｏＶ抗原を含み得る。しかしながら、抗原が１つだけ含まれている場合、この抗原は遺伝子型群ＩＩからのものである可能性がある。これは、この遺伝子型群のＮｏＶが、過去数年間に健康リスクをより頻繁に引き起こしているためである。好ましくは、本発明の組成物は、２つ以上の異なるＮｏＶ遺伝子型群の抗原であり得る２つ以上の異なるＮｏＶ抗原を含む。好ましい実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、２つの異なるＮｏＶ遺伝子型群からの少なくとも２つのＮｏＶ抗原、好ましくはＮｏＶ遺伝子型群Ｉからの抗原及びＮｏＶ遺伝子型群ＩＩの抗原を含む。さらなる実施形態では、免疫原性組成物は、１つのＮｏＶ遺伝子型群からの、好ましくは遺伝子型群ＩＩの２つ以上の抗原を含む。本発明の組成物（及びワクチン）において、表１Ａ又は１Ｂに列挙される任意の遺伝子型群Ｉ  ＮｏＶからの抗原を、表１Ａ又は１Ｂに列挙される任意の遺伝子型群ＩＩ  ＮｏＶからの抗原と組み合わせることができる。もちろん、遺伝子型群Ｉ、遺伝子型群ＩＩ又は別の遺伝子型群（例えば表１Ａ又はＢのもの）からのさらなる抗原を本発明の組成物に加えることが可能である。
【００４５】
本発明の組成物に使用される抗原の遺伝子型に関しては、特に制限はない。遺伝子型群Ｉの好ましい遺伝子型は、遺伝子型Ｉ．１及びＩ．４である。遺伝子型群ＩＩの好ましい遺伝子型は、遺伝子型ＩＩ．４及びＩＩ．１７である。遺伝子型群ＩＩのより好ましい遺伝子型は、遺伝子型ＩＩ．４である。本発明の組成物が遺伝子型群Ｉ及びＩＩの両方からの抗原を含む場合、遺伝子型Ｉ．４からの抗原及び遺伝子型ＩＩ．４の抗原を組み合わせてもよい。上記のように、抗原は、好ましくはＶＰ１タンパク質である。本発明の組成物が２つ以上のＮｏＶ抗原又はＶＰ１タンパク質を含む場合、それぞれは、上記の項目（ａ）から（ｋ）で定義されたとおりであり得る。
【００４６】
ＮｏＶ遺伝子型群Ｉからの抗原がＮｏＶ遺伝子型群ＩＩからの抗原と組み合わされる実施形態に関して、免疫原性組成物の以下の例が言及され得る：
遺伝子型Ｉ．１の抗原及び遺伝子型ＩＩ．１の抗原を含む組成物；
遺伝子型Ｉ．１の抗原及び遺伝子型ＩＩ．４の抗原を含む組成物；
遺伝子型Ｉ．１の抗原及び遺伝子型ＩＩ．６の抗原を含む組成物；
遺伝子型Ｉ．４の抗原及び遺伝子型ＩＩ．１の抗原を含む組成物；
遺伝子型Ｉ．４の抗原及び遺伝子型ＩＩ．４の抗原を含む組成物；
遺伝子型Ｉ．４の抗原及び遺伝子型ＩＩ．１７の抗原を含む組成物；
遺伝子型Ｉ．４の抗原及び遺伝子型ＩＩ．２の抗原を含む組成物；
遺伝子型Ｉ．１の抗原及び遺伝子型ＩＩ．１７の抗原を含む組成物；
遺伝子型Ｉ．１の抗原及び遺伝子型ＩＩ．２の抗原を含む組成物；
及び
遺伝子型Ｉ．４の抗原及び遺伝子型ＩＩ．６の抗原を含む組成物。
【００４７】
好ましいのは、免疫原性組成物が遺伝子型Ｉ．１又はＩ．４（ＧＩ．４）の抗原及び遺伝子型ＩＩ．４（ＧＩＩ．４）又はＩＩ．１７の抗原を含む実施形態である。より好ましいのは、免疫原性組成物が遺伝子型Ｉ．１又はＩ．４（ＧＩ．４）の抗原及び遺伝子型ＩＩ．４（ＧＩＩ．４）の抗原を含む実施形態である。これらのすべての実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書に記載される１つ又は複数のアジュバントをさらに含む。
【００４８】
上記のように、免疫原性組成物は、さらなる実施形態では、１つのＮｏＶ遺伝子型群からの、好ましくは遺伝子型群ＩＩの２つ以上の抗原を含み得る。免疫原性組成物は、遺伝子型群ＩＩノロウイルスの第１の遺伝子型の抗原及び遺伝子型群ＩＩノロウイルスの第２の遺伝子型の抗原など、遺伝子型群ＩＩノロウイルスの２つの異なる抗原を含み得る。例えば、組成物は、遺伝子型ＩＩ．１  ＮｏＶの抗原（例えば、ＶＰ１タンパク質）及び遺伝子型ＩＩ．４  ＮｏＶの抗原（例えば、ＶＰ１タンパク質）を含み得る。あるいは、組成物は、遺伝子型ＩＩ．１  ＮｏＶの抗原（例えば、ＶＰ１タンパク質）及び遺伝子型ＩＩ．１７  ＮｏＶの抗原（例えば、ＶＰ１タンパク質）を含み得る。あるいは、組成物は、遺伝子型ＩＩ．４  ＮｏＶの抗原（例えば、ＶＰ１タンパク質）及び遺伝子型ＩＩ．１７  ＮｏＶの抗原（例えば、ＶＰ１タンパク質）を含み得る。遺伝子型群ＩＩのＮｏＶ抗原は、「配列番号１〜２２のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列」が「配列番号２３〜７５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列」に置き換えられていることを除いて、上記の項目（ａ’）から（ｋ’）で定義されたタンパク質であり得る。遺伝子型ＩＩ．１、ＩＩ．４及びＩＩ．１７の抗原は、これらの配列番号から選択され得る。
【００４９】
上記で定義された（例えば、項目（ｂ）から（ｋ）における）抗原の誘導体は、天然抗原（例えば、配列番号１〜７８）が属する遺伝子型群及び／又は遺伝子型の抗原と見なされる。このルールを使用して、ＶＰ１タンパク質などの抗原が２つの異なる遺伝子型群又は遺伝子型に属している可能性がある場合、抗原又は誘導体は、配列番号１〜７８のいずれか１つのものなどの天然ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列の全長にわたってアミノ酸配列同一性の点で、抗原又は誘導体が最も類似している遺伝子型群又は遺伝子型に属する。
【００５０】
本発明の免疫原性組成物は、好ましくは、抗原（複数可）としてＮｏＶウイルス様粒子（ノロウイルスＶＬＰ又はＮｏＶ  ＶＬＰ）を含む。ＶＬＰは、ウイルス構造タンパク質（複数可）からなるウイルス粒子であるが、ウイルス核酸は含まない。ノロウイルスの場合、ＶＬＰは、構造タンパク質ＶＰ１又はＶＰ１とＶＰ２タンパク質（又は本明細書に記載されている任意の断片若しくは誘導体）からなる。本発明で使用されるＶＬＰは、抗原としてＮｏＶキャプシドタンパク質、特に本明細書で定義されるＶＰ１を含むか、又はそれからなる。ＶＬＰは、上記の項目（ａ）から（ｋ）のいずれか１つで定義されるタンパク質を含むか、又はそれからなり得る。したがって、上記の項目（ａ）から（ｋ）のタンパク質は、好ましくは、ＶＬＰを形成することができる。ここで、ＶＬＰは、一般に、少なくとも６０個のＶＰ１分子、好ましくは少なくとも８０個のＶＰ１分子、より好ましくは少なくとも１００個のＶＰ１分子を含む。より好ましい実施形態では、ＶＬＰは、項目（ａ）から（ｋ）のいずれか１つで定義されある少なくとも６０個のタンパク質分子、好ましくは項目（ａ）から（ｋ）のいずれか１つで定義される少なくとも８０個のタンパク質分子、より好ましくは、項目（ａ）から（ｋ）のいずれか１つで定義される少なくとも１００個のタンパク質分子を含む。
【００５１】
本発明の免疫原性組成物は、遺伝子型群Ｉノロウイルス抗原及び遺伝子型群ＩＩノロウイルス抗原を、１：１から１：６、好ましくは１：１．５から１：５、より好ましくは１：２から１：４の質量比範囲で含む。別の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、遺伝子型群Ｉノロウイルス抗原及び遺伝子型群ＩＩノロウイルス抗原を、３：１から１：３、好ましくは２：１から１：２、より好ましくは１．５：１から１：１．５、さらにより好ましくは１．２：１から１：１．２の質量比範囲で含む。
【００５２】
ＶＬＰは、上記の項目（ａ）から（ｋ）のいずれか１つで定義されるタンパク質又はさらなる成分を含む。さらなる成分は、項目（ａ）から（ｋ）のいずれか１つで定義されるような、ＮｏＶ  ＶＰ２タンパク質又は別の（すなわち、異なる）ＮｏＶ抗原であり得る。項目（ａ）から（ｋ）のいずれか１つで定義されているように、ＶＬＰが２つの異なる抗原を含むことが可能である。しかしながら、２つ以上の異なる抗原がＶＬＰとして組成物に含められる場合、第１の抗原のＶＬＰが第２の抗原のＶＬＰと組み合わされることが、免疫原性組成物中の２つの抗原の含有量をより良好に制御することができるので好ましい。
【００５３】
上記のように、本発明の免疫原性組成物は、好ましくは、遺伝子型群Ｉからの抗原及び遺伝子型群ＩＩの抗原などの、２つ以上（又は３つ以上）の異なるＮｏＶ遺伝子型群からの抗原を含む。本発明の組成物は、これらの抗原のそれぞれを含む又はそれらからなるＶＬＰを含み得る。好ましくは、組成物は、第１の遺伝子型群（例えば、遺伝子型群Ｉ）のＮｏＶ抗原を含むか又はそれからなるＶＬＰ、及び第２の遺伝子型群（例えば、遺伝子型群ＩＩ）のＮｏＶ抗原を含むか又はそれからなるＶＬＰを含む。遺伝子型群ＩからのＮｏＶ抗原のＶＬＰが、遺伝子型群ＩＩからの抗原のＶＬＰと組み合わされる実施形態に関して、以下の免疫原性組成物が例として言及され得る：
遺伝子型Ｉ．１の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰ、及び遺伝子型ＩＩ．１の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰを含む組成物；
遺伝子型Ｉ．１の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰ、及び遺伝子型ＩＩ．４の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰを含む組成物；
遺伝子型Ｉ．１の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰ、及び遺伝子型ＩＩ．６の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰを含む組成物；
遺伝子型Ｉ．１の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰ、及び遺伝子型ＩＩ．２の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰを含む組成物；
遺伝子型Ｉ．１の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰ、及び遺伝子型ＩＩ．１７の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰを含む組成物；
遺伝子型Ｉ．４の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰ、及び遺伝子型ＩＩ．１の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰを含む組成物；
遺伝子型Ｉ．４の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰ、及び遺伝子型ＩＩ．４の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰを含む組成物；及び
遺伝子型Ｉ．４の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰ、及び遺伝子型ＩＩ．６の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰを含む組成物；
遺伝子型Ｉ．４の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰ、及び遺伝子型ＩＩ．２の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰを含む組成物；
遺伝子型Ｉ．４の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰ、及び遺伝子型ＩＩ．１７の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰを含む組成物。
【００５４】
好ましい実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、遺伝子型Ｉ．４抗原のＶＬＰ及び遺伝子型ＩＩ．４抗原のＶＬＰを含み、それにより、それぞれの抗原は、ＶＰ１タンパク質であり得る。別の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、遺伝子型Ｉ．１抗原のＶＬＰ及び遺伝子型ＩＩ．４抗原のＶＬＰを含み、それにより、それぞれの抗原は、ＶＰ１タンパク質であり得る。これらのすべての実施形態では、各抗原は、上記の項目（ａ）から（ｋ）で定義されたとおり（しかし、示された遺伝子型からのもの）であり得る。
【００５５】
本発明の免疫原性組成物は、遺伝子型群ＩのＶＬＰ及び遺伝子型群ＩＩのＶＬＰを、１：１から１：６、好ましくは１：１．５から１：５、より好ましくは１：２から１：４の質量比範囲で含む。別の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、遺伝子型群ＩのＶＬＰ及び遺伝子型群ＩＩのＶＬＰを、３：１から１：３、好ましくは２：１から１：２、より好ましくは１．５：１から１：１．５、さらにより好ましくは１．２：１から１：１．２の質量比範囲で含む。
【００５６】
上記のように、本発明はまた、１つのＮｏＶ遺伝子型群から、好ましくは遺伝子型群ＩＩの２つ以上の抗原を含む免疫原性組成物を提供する。したがって、本発明の免疫原性組成物は、遺伝子型群ＩＩ  ＮｏＶの第１の遺伝子型の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰ、及び遺伝子型群ＩＩ  ＮｏＶの第２の遺伝子型の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰを含み得る。より詳細には、本発明の免疫原性組成物は、遺伝子型ＩＩ．１の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰ、及び遺伝子型ＩＩ．４の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰを含み得る。あるいは、免疫原性組成物は、遺伝子型ＩＩ．１の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰ、及び遺伝子型ＩＩ．１７の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰを含み得る。あるいは、免疫原性組成物は、遺伝子型ＩＩ．４の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰ、及び遺伝子型ＩＩ．１７の抗原からなるか又はそれを含むＶＬＰを含み得る。
【００５７】
本発明はまた、哺乳動物、好ましくはヒトにおける、ノロウイルス感染及び細菌性病原体による感染を予防及び／又は治療する方法における使用のための免疫原性組成物であって、前記免疫原性組成物が、上記で定義されたノロウイルス抗原、好ましくは上記で定義されたＮｏＶ  ＶＬＰと、前記細菌性病原体に対する免疫応答を生じさせることができる細菌ＡＢ５毒素のＢサブユニットとを含む、免疫原性組成物を提供する。細菌ＡＢ５毒素のＢサブユニットは、上記で定義したように、ＣＴＢ又はＬＴＢ、好ましくはＣＴＢであり得る。そのような免疫原性組成物は、ノロウイルス感染及び細菌性病原体による感染を予防及び／又は治療するための混合ワクチンであり得るか、又は混合ワクチンとして使用され得る。ＮｏＶ抗原の量、前記Ｂサブユニット及びその比率は、本明細書で言及されている通りであり得る。
【００５８】
上記のすべての実施形態について、本発明の免疫原性組成物は、好ましくは、ＮｏＶ抗原をコードする核酸を含まない。
【００５９】
本発明の免疫原性組成物は、上記の少なくとも１つのＮｏＶ抗原及び上記の少なくとも１つのアジュバントを成分として含む。組成物は、組成物がヒトなどの哺乳動物に投与される場合、本発明の抗原（複数可）に対する免疫応答を生じるという点で免疫原性である。さらに、適切な担体又は賦形剤が前記組成物中に存在してもよい。組成物は、成分を、任意に適切な担体中で、所望の量及び混合比で、単に混合することによって得ることができる。適切な担体は、水又は水溶液であってもよく、適切なｐＨ、例えば６から８、好ましくは６．７から７．５などの適切なｐＨであるべきである。水溶液は、水とは別に、緩衝剤、等張化剤及び／又は必要に応じて防腐剤を含んでもよい。
【００６０】
免疫原性組成物は、少なくとも１つのＮｏＶ抗原及びＡＢ５毒素のＢサブユニット（ＣＴＢなど）を、１：０．１から１：５、好ましくは１：０．２から１：３、より好ましくは１：０．５から１：２の質量比範囲で含有してもよい。ＣＴＢは、上記の（Ａ）から（Ｉ）に定義されているＣＴＢである。複数のＮｏＶ抗原が存在する場合、これらの値はすべてのＮｏＶ抗原の合計に適用される。複数のＣＴＢが存在する場合、これらの値はすべてのＣＴＢ又はＣＴＢ変異体の合計に適用される。組成物にＬＴＢが含まれている場合、これらの比率の範囲はＬＴＢに対して同様に適用される。
【００６１】
組成物は、追加のアジュバントなどのさらなる所望の成分を含み得る。追加のアジュバントの例は、ワクチンのための一般に知られているアジュバントである水酸化アルミニウム（ミョウバン）又は他のアルミニウム塩である。組成物は、１：２００から１０：１、好ましくは１：１００から５：１、より好ましくは１：３０から１：１の質量比範囲でＣＴＢ及びさらなるアジュバントを含み得る。複数の追加のアジュバントが含まれている場合、これらの値は、ＡＢ５毒素のＢサブユニット（ＣＴＢなど）以外のすべてのアジュバントの合計に関連している。
【００６２】
組成物が、ＡＢ５毒素のＢサブユニット（ＣＴＢなど）と、水酸化アルミニウム（ａｌｕｍ）のようなアルミニウム塩の両方をさらなるアジュバントとして含む場合、組成物は、ＡＢ５毒素のＢサブユニットとアルミニウム塩を、１：５０から２０：１、好ましくは１：２０から１０：１、より好ましくは１：５から５：１、さらにより好ましくは１：１から５：１の質量比範囲で含み得る。一実施形態では、免疫原性組成物（及びワクチン）は、水酸化アルミニウム（ミョウバン）などのアルミニウム塩を含まない。
【００６３】
組成物が、ＣＴＢと、水酸化アルミニウム（ａｌｕｍ）のようなアルミニウム塩の両方をさらなるアジュバントとして含む場合、組成物は、ＣＴＢとアルミニウム塩を、１：５０から２０：１、好ましくは１：２０から１０：１、より好ましくは１：５から５：１、さらにより好ましくは１：１から５：１の質量比範囲で含み得る。一実施形態では、免疫原性組成物（及びワクチン）は、水酸化アルミニウム（ミョウバン）などのアルミニウム塩を含まない。
【００６４】
組成物は、液体又は固体であり得る。それが液体である場合、それは水中の溶液又は水性緩衝液であり得る。それが固体である場合、それは、本発明のＮｏＶ抗原、好ましくは本発明のＮｏＶ  ＶＬＰと、本発明で使用されるアジュバント（ＣＴＢなど）の混合物であり得る。好ましい固体形態は、凍結乾燥形態である。
【００６５】
本発明の免疫原性組成物を調製するために、１つ又は複数の抗原を、好ましくはＶＬＰの形態で、好ましくは適切な担体若しくは培体中で又はそれを用いてアジュバント（複数可）と混合され得る。好ましくは、第１の遺伝子型群又は遺伝子型の抗原を含むか、又はそれからなるＶＬＰと、第２の遺伝子型群又は遺伝子型の抗原を含むか、又はそれからなるＶＬＰとを、適切な担体又は培体を用いて混合し、続いてアジュバントが添加され得る。担体又は媒体は、水又は溶液などの水性媒体であり得る。水性媒体は、ｐＨを制御するための緩衝液を含み得、生理食塩水及び／又は他の添加物を含み得る。添加物は、スクロース、グリセロール、トレハロースであり得るが、これらに限定されない。抗原は、本発明の免疫原性組成物又はワクチンが製造されるまで、水性媒体中に保存され得る。長期間保管する場合は、凍結又は凍結乾燥させてもよい。免疫原性組成物の製造後、例えば滅菌濾過により滅菌され、保管してもよい。保管は、液体形態であり得るか又は凍結され得る。また、凍結乾燥後、乾燥粉末として保存してもよい。
【００６６】
免疫原性組成物及びワクチンの凍結乾燥は、当技術分野でよく知られている。典型的には、組成物は、凍結乾燥プロセス中に本発明の抗原及び／又はアジュバントを保護し、かつ望ましい特性を有する粉末を得るための薬剤の存在下で凍結乾燥される。スクロース、マンニトール、トレハロース又はラクトース（１０〜２００ｍｇ／ｍＬの初期濃度で存在する）のような糖類は、タンパク質抗原の凍結保護（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）及び凍結保護（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）のために一般的に使用され、望ましい特性を有する凍結乾燥ケーキ又は粉末を得るために使用される。凍結乾燥された組成物は、より安定であり得る。噴霧乾燥又は噴霧凍結乾燥などの他の乾燥技術も使用され得る。
【００６７】
本発明の免疫原性組成物は、好ましくは、ＡＢ５毒素のＡサブユニットを含まず、かつ／又はアルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム、ミョウバン）を含まない。
【００６８】
本発明のワクチン
本発明のワクチンは、本発明の免疫原性組成物を、対象への投与に適した形態で、又は投与前に対象への投与に適した形態にすることが容易にできる形態で含む。例えば、ワクチンは、所定量の水又は水溶液、懸濁液又は乳濁液を添加することにより、投与前に再構成することができる固形製剤であり得る。一般に、ワクチンは、免疫原性組成物とは別に、１つ又は複数の薬学的賦形剤又は担体を含む。賦形剤は、液体又は固体であり得る。液体賦形剤としては、限定されないが、水、アルコール、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。他の可能な賦形剤には、限定されないが、防腐剤及び抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、緩衝物質などの他の添加物が含まれる。本発明の免疫原性組成物は、それ自体、本発明の意味でのワクチンであり得る。
【００６９】
ワクチンは抗ＮｏＶワクチンである。それは同時に薬学的組成物でもある。ワクチンは一般に、対象のＮｏＶ感染を予防若しくは治療するため、又はＮｏＶ感染の重症度を抑制するために使用される。本発明はまた、一般的に、本発明の免疫原性組成物又はワクチンを対象に投与することを含む、ノロウイルス感染を予防若しくは治療する方法、又はＮｏＶ感染の重症度を抑制する方法を提供する。ＮｏＶが予防若しくは治療され得るか、又はＮｏＶ感染の重症度が抑制され得る対象は、哺乳動物、好ましくはヒトである。ヒトでは、子供と大人の両方がＮｏＶ感染の予防又は治療の対象となり得る。ヒトでは、子供は人生の早い段階で予防接種を受けることが好ましい。ヒトの対象は、１６歳までの子供とされている。好ましくは、ＮｏＶワクチンは、１〜１６歳、好ましくは２〜１４歳、より好ましくは３〜１２歳の子供に使用される。
【００７０】
ワクチンは一般に注射によって対象に投与されるため、ノロウイルスワクチンは一般に液体の水性製剤である。しかしながら、ノロウイルスワクチンは、投与前に水又は水性媒体で再構成される凍結乾燥形態などの固体形態であってもよい。
【００７１】
本発明のワクチンは、好ましくは非経口的に対象に投与される。非経口投与は、静脈内、皮内、筋肉内又は皮下投与であり得る。好ましいのは、皮内投与、筋肉内投与又は皮下投与であり、より好ましくは皮内投与及び筋肉内投与である。一実施形態では、ワクチンは皮内に投与される。別の実施形態では、ワクチンは筋肉内に投与される。
【００７２】
ワクチンがヒト対象に投与される場合、又は本発明の方法において、ＮｏＶ抗原は、１０〜１０００μｇ、好ましくは３０〜３００μｇ、より好ましくは５５〜１５０μｇのＮｏＶ抗原の量で投与される。ワクチンに複数のＮｏＶ抗原が含まれている場合、これらの量は個々の抗原の量の合計に関連する。ワクチンが遺伝子型群Ｉの抗原と遺伝子型群ＩＩの抗原を含む場合、遺伝子型群ＩＩ抗原の量は、遺伝子型群Ｉ抗原の量と同じであってもよいし、それ以上であってもよい。質量の観点から、遺伝子型群ＩＩ抗原の量は、遺伝子型群Ｉ抗原の量の１．５〜６倍、好ましくは２．０〜５倍、より好ましくは２．５〜４．５倍、さらにより好ましくは３．０〜４．０倍であり得る。
【００７３】
ワクチンは、所望の量のワクチンを含む容器中に、単回投与又は複数回投与の形態で包装され得る。好ましいのは、単回投与形態であり、ここで、単回投与は上記のようなＮｏＶ抗原の投与量を含む。単回投与形態は、１０〜１００００μｇ、好ましくは３０〜３００μｇ、より好ましくは５５〜１５０μｇのＮｏＶ抗原を含み得る。ワクチンが遺伝子型Ｉの抗原と遺伝子型ＩＩの抗原を含む場合、これらの抗原の比率は、前のパラグラフにおいて定義された通りであってもよい。
【００７４】
ワクチンは、ＮｏＶ感染に対する免疫を改善するために、対象に１回又は２回投与され得る。ワクチンを２回投与する場合、２回目の投与は、ワクチンの１回目の投与から２〜８週間以内、好ましくは３〜５週間以内に行ってもよい。
【００７５】
また、本発明のワクチンは、ＮｏＶに対するだけでなく、他のウイルスに対する免疫防御を生成するための他の感染性疾患に対する抗原も含み得る。例えば、ＮｏＶとロタウイルスに対する防御を生成するために、ワクチンにロタウイルス抗原を含めることが考えられる。
【００７６】
本発明者らは、本発明のアジュバント自体が抗原として作用し、それに対して哺乳動物、好ましくはヒトにおいて免疫応答を生じさせることができることを見出した。本発明のアジュバントは、ＣＴＢ又はＬＴＢなどのＡＢ５毒素のＢサブユニットである。ＣＴＢとＬＴＢは、それぞれコレラ菌と大腸菌から発現されるか、又はそれらに由来するタンパク質である。この知見は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける、ノロウイルス感染及び細菌性病原体による感染を予防及び／又は治療するための混合ワクチンであって、前記ワクチンが、前述の請求項のいずれかで定義されるノロウイルス抗原と、これらの細菌性病原体に対する免疫応答を生じさせることができる細菌ＡＢ５毒素のＢサブユニットとを含む混合ワクチンを提供する可能性を切り開く。賦形剤、投与経路、投与されるＮｏＶ抗原の量、投与されるＢサブユニットの量などに関して、免疫原性組成物及びワクチンに関する上記の条件は、この実施形態にも適用される。
【００７７】
一実施形態では、ワクチンは、水酸化アルミニウム（ミョウバン）などのアルミニウム塩を含まない。別の実施形態では、ワクチンは、細菌ＡＢ５毒素のＡサブユニットを含まない、すなわちＡサブユニットを含まない。さらなる実施形態では、ワクチンは、水酸化アルミニウム（ミョウバン）のようなアルミニウム塩を含まず、細菌ＡＢ５毒素のＡサブユニットも含まない。これらの好ましい実施形態は、本明細書に記載された他の好ましい実施形態、例えば、使用される抗原及び抗原の組み合わせの好ましい実施形態と組み合わせることができる。
【００７８】
本明細書では、免疫原性組成物、ワクチン又は薬学的組成物は、ＡＢ５タンパク質（毒素）（Ａサブユニットを含む）の含有量が、Ｂタンパク質（一般的にはＢサブユニットのみからなるＢ５五量体）の含有量の最大１％であれば、ＡＢ５毒素（ＣＴ又はＬＴなど）のＡサブユニットを含まないか、又はＡサブユニットを含まないものとされる。Ｂタンパク質（又はＢ５五量体）の含有量と比較したＡＢ５タンパク質の含有量は、Ｂサブユニット含有試料のタンパク質、免疫原性組成物のタンパク質、又はワクチンのタンパク質を非還元ＳＤＳゲル電気泳動を使用して分離し（Laemmli, U. K., 1970, Nature, 227: 680-685）、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ  ６．０．１ソフトウェアを搭載したＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、クーマシー染色ゲル上で分離されたＢサブユニット含有タンパク質を検出し、ＡＢ５タンパク質とＢタンパク質（例えば、Ｂ５五量体）のバンドの曲線下面積を決定することによって決定することができる。ＡＢ５タンパク質の曲線下面積がＢタンパク質（例えば、Ｂ５五量体）の曲線下面積の最大１％の場合、ＡＢ５タンパク質の含有量は、Ｂタンパク質（例えば、Ｂ５五量体）の含有量の最大１％であると見なされる（すなわち、Ｂサブユニット含有試料は、Ａサブユニットを含まない）。ゲル上のＡＢ５タンパク質及びＢタンパク質（例えば、Ｂ５タンパク質）のバンドの位置は、これらのタンパク質の既知の分子量とゲル上の位置に基づき、必要に応じて適切な分子量マーカーを使用して、当業者によって決定され得る。
【００７９】
組成物又はワクチン（又は試料）が、ＡＢ５毒素の２つ以上の異なるＢサブユニットを含む場合、上記の試験は、各Ｂサブユニットを含む試料について別々に、又は同じゲル上で実施することができる。ＡＢ５タンパク質の曲線下面積の合計がＢタンパク質の曲線下面積の合計の最大１％である場合、組成物、ワクチン又は試料はＡサブユニットを含まない。
【００８０】
ＮｏＶ抗原の生成
上記のＮｏＶ抗原は、哺乳動物細胞、昆虫細胞及び植物を含む異なる生成宿主で発現され、精製することができる（総説について： Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S. & Chen, Q. 2010, Exp. Rev. Vaccines, 9:299-307）。バキュロウイルス発現系を用いた昆虫細胞（Jiang, X. et al., 1992, J.Virol., 66:6527-6532; Prasad BVV, Hardy D, Estes M. 2000, J. Infect. Dis., 181:S317-S321; Huhti, L., et al., 2010, Arch. Virol., 155:1855-1858; Koho, T., et al., 2012, J. Virol. Methods, 181:6-11; Huhti, L., et al., 2013, Arch. Virol., 158:933-942；ＷＯ２０１３１９２６０４）及び植物（Santi L. et al., 2008, Vaccine, 26:1846-1854; Lai, H. & Chen, Q. 2012, Plant Cell Rep., 31:573-584）について、信頼性の高いＮｏＶ抗原及びＮｏＶ  ＶＬＰの精製プロトコルとその改変が記載されている。ＮｏＶ  ＶＬＰの生成に関しては、ＥＰ２６０１９７０も検討され得る。昆虫細胞及び植物細胞から単離されたＶＬＰの構造及び免疫原性には違いは観察されないが、ＶＬＰ生成のための好ましい系は、植物組織から単離された抗原又はＶＬＰ中のバキュロウイルス不純物を回避することができるため、植物ベースのものである。さらに、植物ベースの一過性発現系は、バキュロウイルス系とは異なり、容易に拡張可能である。ベンサミアナタバコの植物においてウイルスＶＬＰを容易に発現させることができる（Zahin, M. et al., 2016, PLoS One, 11(8):e0160995）ｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）（Gleba et al., 2005, Vaccine, 23:17-18; Marillonnet et al., 2005, Nat. Biotechnol., 23:718-723; Gleba et al., Curr. Opin. Biotechnol., 2007, 18:134-141; Klimyuk, V., et al., 2014, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 375:127-154）と呼ばれる植物ウイルスベースの発現系を使用して、多くのＮｏＶ抗原遺伝子を植物で発現させることに成功した。植物で発現が行われ、ＶＬＰの形成が確認された、種々の遺伝子型のＮｏＶ抗原（ＶＰ１タンパク質）のリストを表１Ｂに示す。
【００８１】
より詳細には、本発明の抗原は、標準的な発現系におけるタンパク質発現の既知の方法によって生成され得る。抗原を生成するために、抗原をコードするヌクレオチド配列を適切な宿主生物で発現させることができる。目的のタンパク質を生成し、精製するために使用可能な方法は、先行技術に記載されており、任意のそのような方法が使用され得る。真核生物発現系が使用される場合、抗原のコード化配列中に１つ又は複数のイントロンが挿入され得る。
【００８２】
特に効率的な発現方法は、先行技術でも知られている植物発現系である。植物において本発明による抗原をコードする目的のヌクレオチド配列の発現を達成する可能性のある方法は、抗原をコードするヌクレオチド配列を含む自己複製（ウイルス）レプリコンの使用である。植物ウイルス発現系は、ＷＯ２０１２０１９６６０、ＷＯ２００８０２８６６１、ＷＯ２００６００３０１８、ＷＯ２００５０７１０９０、ＷＯ２００５０４９８３９、ＷＯ２００６０１２９０６、ＷＯ０２１０１００６、ＷＯ２００７１３７７８８又はＷＯ０２０６８６６４などの多くの刊行物に記載されており、これらの文献にはさらに多くの刊行物が引用されている。一過性発現のために、ＤＮＡ分子などの核酸分子を植物又は植物部分に導入するためのさまざまな方法が知られている。アグロバクテリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）は、核酸分子（ベクター）又は核酸構築物を植物にトランスフェクトするために、例えば、アグロインフィルトレーション又はアグロバクテリア懸濁液の噴霧によって使用することができる。参考文献として、ＷＯ２０１２０１９６６０、ＷＯ２０１４１８７５７１、又はＷＯ２０１３１４９７２６を参照されたい。
【００８３】
抗原の強力な発現が望まれる実施形態では、抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物は、植物細胞内で複製してウイルスベクターのレプリコンを形成することができるウイルスベクターをコードしてもよい。複製されるために、ウイルスベクター及びレプリコンは、植物細胞に存在する核酸ポリメラーゼ、例えばレプリコンから発現されたウイルスポリメラーゼによって認識され得る複製起源を含み得る。ＲＮＡウイルスベクター（「ＲＮＡレプリコン」と呼ばれる）の場合、レプリコンは、後者が植物細胞核に導入された後のＤＮＡ構築物から、植物細胞内で活性なプロモーターの制御下で転写することにより形成され得る。ＤＮＡレプリコンの場合、レプリコンは、例えばＷＯ００／１７３６５及びＷＯ９９／２２００３に記載されているように、ＤＮＡ構築物中のウイルスレプリコンをコードする配列に隣接する２つの組換え部位間の組換えによって形成され得る。レプリコンがＤＮＡ構築物によってコードされる場合、ＲＮＡレプリコンが好ましい。ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスベクター（ＤＮＡ又はＲＮＡレプリコン）の使用は、長年にわたって文献に広く記載されている。いくつかの例としては、以下の特許公報がある。ＷＯ２００８０２８６６１、ＷＯ２００７１３７７８８、ＷＯ２００６００３０１８、ＷＯ２００５０７１０９０、ＷＯ２００５０４９８３９、ＷＯ０２０９７０８０、ＷＯ０２０８８３６９、ＷＯ０２０６８６６４。ＤＮＡウイルスベクターの例は、ジェミニウイルスに基づくものである。本発明においては、植物ＲＮＡウイルス、特にプラスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスに基づくウイルスベクター又はレプリコンを好ましく使用することができる。したがって、ウイルスレプリコンは、プラスセンス一本鎖ＲＮＡレプリコンであり得る。そのようなウイルスベクターの例は、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）及びポテックスウイルスＸ（ＰＶＸ）に基づくものである。「に基づく」とは、ウイルスベクターが、これらのウイルスの複製に関与するレプリカーゼ及び／又は他のタンパク質などの複製システムを使用することを意味する。ポテックスウイルスベースのウイルスベクター及び発現系は、ＥＰ２０６１８９０又はＷＯ２００８／０２８６６１に記載されている。
【００８４】
抗原は、多細胞植物又はその一部、特に高等植物又はその一部で発現され得る。単子葉植物と双子葉植物（作物）の両方を使用することができる。タンパク質を発現させるために使用可能な一般的な植物としては、タバコ及びベンサミアナタバコが挙げられる。しかしながら、他の多くも同様に用いることができる。
【００８５】
一般に、抗原は、植物又は植物の部分の細胞のサイトゾルで発現され得る。この場合、目的のタンパク質を特定のコンパートメントに誘導するシグナルペプチドは、酵素には付加されない。あるいは、抗原又はＶＰ１タンパク質を、植物の葉緑体中で発現させるか、又は植物の葉緑体中に標的化するか、又は細胞外空間に分泌させることもできる；これらの場合、プラスチド輸送ペプチド又は細胞外空間を標的とするためのシグナル配列などのＮ末端プレ配列が、目的のタンパク質としての抗原のＮ末端又はＣ末端、好ましくはＣ末端に付加される。
【００８６】
次のステップでは、抗原を発現した植物から発現された抗原を含む植物材料が収穫される。植物材料は、例えば、葉、根、塊茎、若しくは種子、又は葉、根、塊茎、若しくは種子の破砕された（ｃｒｕｓｈｅｄ）、ミルにかけられた（ｍｉｌｌｅｄ）、若しくは粉砕された（ｃｏｍｍｉｎｕｔｅｄ）生成物であり得る。次いで、抗原が、水性緩衝液を使用して植物材料から抽出され得る。これは、植物材料が均質化されること、及び不溶性材料が遠心分離又は濾過によって除去されることを含み得る。抗原を含む可溶性成分は、水性緩衝液中に抽出されて、水性緩衝液中に抗原溶液を生成する。水性緩衝液は、無機酸若しくは有機酸又はそれらの塩を含んでいてもよく、本発明の組成物としての水溶液は、以下に定義されるようなｐＨを有し得る。さらに、水性緩衝液は、塩及び／又はスルフヒドリル化合物を含み得る。次いで、得られた抗原調製物中の抗原を、クロマトグラフィー法などのタンパク質精製の標準的な方法を使用してさらに精製することができる。
【００８７】
ＶＰ１タンパク質又は誘導体である抗原は、ＶＬＰを形成することができる。これらのＶＬＰは、一般的に、抽出及び精製に使用される水性緩衝液中で自発的に形成される。ＶＬＰの形成は、電子顕微鏡を使用して確認できる。
【００８８】
本発明の免疫原性組成物が２つ以上のＮｏＶ抗原を含む場合、２つ以上の抗原は、別々に発現及び精製され、次いで組成物を調製するときに所望の比率で混合され得る。また、同じ植物細胞又は植物中で２つ以上の抗原を共発現させ、それらを混合物として一緒に精製することも可能である。
【００８９】
ＡＢ５毒素のＢサブユニットの生成
ＣＴＢ又はＬＴＢなどのＡＢ５毒素のＢサブユニットは、上記のように商業的に入手することができる。あるいは、それらは、ＮｏＶ抗原について上述したのと同様に、哺乳動物細胞、昆虫細胞及び植物を含む異なる産生宿主から発現及び精製され得る。発現されたＣＴＢ及びＬＴＢは、通常、自発的にＢ５五量体に集合する。上記の「本発明で使用されるアジュバント」の項では、ＣＴＢ及びＬＴＢのようなＡＢ５毒素についての複数の参照が与えられる。
【実施例】
【００９０】
実施例１
植物材料からのノロウイルスＶＬＰの精製
ノロウイルスＶＰ１  ＶＬＰは、ＧＩＩ．４Ａｏｍｏｒｉ株について、以下に説明するように精製されている。５週齢のベンサミアナタバコ植物に、ベンサミアナタバコ植物でウイルスＶＬＰを容易に発現させることができる（Zahin, M. et al., 2016, PLoS One, 11(8):e0160995）、ＴＭＶベースの組み立てられたｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）ベクター（Gleba et al., 2005, Vaccine, 23:17-18; Marillonnet et al., 2005, Nat. Biotechnol., 23:718-723; Gleba et al., Curr. Opin. Biotechnol., 2007, 18:134-141; Klimyuk, V., et al., 2014, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 375:127-154）を保有する希釈したアグロバクテリウム・ツメファシエンス培養物を真空浸潤（８０−１００ｍｂａｒで３〜４分）させた。植物材料は、浸潤後６〜１４日後に収穫した。浸潤後７〜８日後の収穫時点では、ＧＩＩ．４株の最高の発現レベルをもたらしている。
【００９１】
緑色のバイオマスを、２体積の中性緩衝液（すなわち、１５ｇのバイオマス及び３０ｍＬの１００ｍＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのＮａ２Ｓ２Ｏ５  ｐＨ７．５）の存在下でホモジナイズした。清澄化のために、植物ホモジネートを１５．０００×ｇで２０分間遠心分離した。得られた抽出物は、ミリポア（登録商標）ガラス繊維フィルター（ＡＰ２５）を使用してろ過することにより、さらに清澄化された。
【００９２】
高分子量成分を、超遠心分離（１５０．０００×ｇ、９０分）で沈降させた。ペレットを、２０ｍＭのヒスチジン、１３７ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ６．０の１ｍＬに懸濁し、１５．０００ｘｇで２０分間の遠心分離によって清澄化した。ＶＬＰ含有上清を、３０％スクロースクッション（２０ｍＭのヒスチジン、１３７ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ６．５中）の上に置いた。超遠心分離を１５０．０００×ｇで９０分間行った。得られたペレットを２０ｍＭのヒスチジン、１３７ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ６．５に再懸濁した。ＶＬＰの形成は、光散乱分析を用いたＳＥＣ−ＨＰＬＣによって確認された。
【００９３】
実施例２
筋肉内（ＩＭ）送達経路を使用した、マウスにおける精製ＶＰ１  ＶＬＰの免疫原性
研究動物
ＢＡＬＢ／ｃ  Ｏｌａ／Ｈｓｄ雌マウス（Ｅｎｖｉｇｏ、オランダ）は、常温で動物施設に出荷された。動物は、免疫化の１〜２週間前に順応させ、７週齢で免疫化した。健康モニタリングデータの概要フォームは、マウスの出荷時に提供されていた。動物の健康（病気の臨床的兆候）と福祉は、動物施設のスタッフによって毎日監視された。すべての手順は、フィンランド国立動物実験委員会のガイドラインに従って承認され、実行された。
【００９４】
免疫化の手順
マウスは、免疫化及び関連する処置の時間のために、イソフルラン（Ａｔｔａｎｅ（登録商標）ｖｅｔ）の吸入により麻酔をかけた。動物は、研究の開始時に体重を測定し、グループのタトゥーでマークし、耳のピアスによって個別にマークした。糞便試料を、研究開始時（０週目）と研究終了日（５週目（ｗｋ５））に採取した。免疫化前の０週目及び３週目に、尾部血液試料（５ｍｋｌ容量をＰＢＳで１：１００に希釈したもの）を採取した。被験物質は、０．３ｍｌのインスリン注射器（（２９Ｇ×１／２”−０．３３×１２ｍｍ）を用いて、尾側の硬くなった筋肉にＩＭ投与された（容量５０ｍｋｌ）。
【００９５】
終了手順及び試料採取
動物の体重は、終了時に記録された。糞便試料を採取し、プールし、１０％懸濁液を調製した後、使用するまで−８０℃で保存した。マウスを１ｍｇ／ｋｇメデトミジン（Ｄｏｒｂｅｎｅ（登録商標）１ｍｇ／ｍｌ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏｓ  Ｓｙｖａ）及び７５ｍｇ／ｋｇケタミン（Ｋｅｔａｌａｒ（登録商標）５０ｍｇ／ｍｌ、Ｐｆｉｚｅｒ）で麻酔し、腋窩（脇の下）部から終末部全血を採取することによって、マウスを終了させた。個別に採取した全血試料の血清を分離し、使用するまで−２０℃で保存した。脾臓を採取し、単細胞懸濁液を調製した。グループごとにプールされた細胞を等分し、使用するまで液体窒素中で凍結保存した。
【００９６】
我々は、ノロウイルス（ＮｏＶ）ＧＩ．４  Ｃｈｉｂａ及びＧＩＩ．４  Ａｏｍｏｒｉウイルス様粒子（ＶＬＰ）の精製された植物生成形態の免疫原性と、筋肉内（ＩＭ）経路を介したコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ、Ｆｌａｒｅｂｉｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＬＬＣ、ＵＳＡ）アジュバントの効果を決定した。さらに、対照として、水酸化アルミニウム［Ａｌ（ＯＨ）３、ミョウバン］のアジュバント効果を評価した。完全に精製された組換えＮｏＶ  ＶＬＰを、ＰＢＳ（ｐＨ７．３）中で０週目と３週目に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに２回ＩＭ投与した。各Ｎｏｖ  ＶＬＰの１ｍｋｇ（マイクログラム又はμｇ）の用量は、単独で、又は１ｍｋｇのＣＴＢアジュバントと組み合わせて、又は５０ｍｋｇのミョウバンアジュバントと組み合わせて投与された。先行研究の担体のみ（ＰＢＳ）で免疫化したマウス試料に加えて、１ｍｋｇのＣＴＢのみを投与したマウスを陰性対照として使用した。すべてのマウスは、研究の５週目に終了させた。体液性（抗体）免疫応答は、ＥＬＩＳＡベースのアッセイによって分析され、細胞媒介性（Ｔ細胞）免疫応答は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析された。免疫化に使用されるＮｏＶ  ＧＩ．４  Ｃｈｉｂａ及びＧＩＩ．４  Ａｏｍｏｒｉ  ＶＬＰは、植物中で生成され、標準の精製技術を使用してＩｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社の研究室で完全に精製された。タンパク質の濃度及び純度を決定し、粒子を電子顕微鏡下で調べた。ＶＬＰストック（ＰＢＳ−（１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ６．５）中の約１ｍｇ／ｍｌのＶＬＰ）は、使用するまで＋４℃に保たれた。望ましい濃度での最初の免疫化に先立って、ＮｏＶ  ＶＬＰタンパク質ストックをＰＢＳ  ｐＨ７．３（Ｌｏｎｚａ  ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｃａｔ．ＢＥ１７−５１６Ｆ）で希釈し、使用するまで＋４℃で保存した。
【００９７】
免疫学的アッセイで使用される対照抗原として、模擬調製物ｍａｇｎＩＣＯＮ／Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ、バッチ番号ＴＩ０７０−ｐＩＣＨ５６１２２  ＳｍＳｃ１、製造日（ＤＯＭ）４／２０／２０１６が使用された。ＮｏＶ特異的交差反応性免疫応答を検出するために使用される、ＮｏＶ  ＧＩ．１、ＧＩ．３、ＧＩＩ．４−１９９９、ＧＩＩ．４  Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ（ＮＯ）、ＧＩＩ．４  Ｓｙｄｎｅｙ（ＳＹＤ）、及びＧＩＩ．１２  ＶＬＰは、以前に記載されているように、ＶＲＣ研究室によってバキュロウイルス−昆虫細胞発現系で生成された（Huhti et al. 2010）。交差反応分析に使用されるＧＩＩ．１７  ＶＬＰは、ＩＣＯＮ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社によって、植物中で生成され、精製された。
【００９８】
アジュバント
組換えコレラ菌血清型Ｏ１由来のコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）サブユニットは、Ｆｌａｒｅｂｉｏ（バッチ＃０３２８５、表２に示す配列番号８３）によって製造され、凍結乾燥タンパク質として提供された。製造者の指示に従い、滅菌Ａｑｕａ  Ｓｔｅｒｉｌｉｓａｔａ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｋａｂｉ）を用いて１ｍｇ／ｍｌに溶解することにより再構成し、使用前に一定分量で−２０℃で保存した。このアジュバントは、これらの実施例において「ｒＣＴＢ」と呼ばれる。それを、免疫化の１日前にワクチン抗原調製物に添加し、混合物を＋４℃で一晩保存した。
【００９９】
水酸化アルミニウムゲルアジュバント（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）アジュバント２％、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、＃ｖａｃ−ａｌｕ−２５０）が、すぐに使用できるゲル懸濁液として提供された。ミョウバンを、免疫化の１日前にワクチン抗原調製物に添加し、混合物を＋４℃で一晩保存した。
【０１００】
研究アッセイ
体液性免疫反応アッセイ
血清中の抗原特異的（Ｎｏｖ  ＧＩ．４  Ｃｈｉｂａ、ＧＩＩ．４  Ａｏｍｏｒｉ）ＩｇＧ、ＩｇＧ１、及びＩｇＧ２ａの力価を、以前に記載されているように、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって試験した（Blazevic et al., 2011, Vaccine, 29:81268133; Tamminen et al., 2012, Immunology, 135:89-99）。血清ＩｇＧ模擬応答（ａｎｔｉｍａｇｎＩＣＯＮ／Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）は、１：２００希釈でＥＬＩＳＡによって試験された。
【０１０１】
動態は、０週目と３週目に、個々のマウスから採取された尾部血液試料から分析された。投与された抗原調製物に含まれていないＮｏＶ  ＶＬＰ遺伝子型に対する血清ＩｇＧ抗体の交差反応性は、ＥＬＩＳＡによって決定された。プールされた糞便懸濁液を、同型のＮｏＶ  ＩｇＧ抗体について分析した。
【０１０２】
ブタ胃ムチン（ＰＧＭ）ベースの相同ブロッキングアッセイ（Lindesmith et al., 2012, J. Virol., 86:873-883）及びヒトＡ型唾液ベースのクロスブロッキングアッセイを使用して、前述のように、推定ＮｏＶ受容体であるヒト組織血液型抗原（ＨＢＧＡ）に対するＮｏＶ  ＶＬＰの結合をブロックする免疫血清の能力を決定した（Uusi-Kerttula et al., 2014, Microbes Infect., 16:472-480）。
【０１０３】
ＩＭ送達ＧＩ．４及びＧＩＩ．４抗原に対する免疫応答についての実験結果が、それぞれ図１及び２に示される。両方の図において、上のパネルは血清ＩｇＧ力価を示している；中央のパネルはプールされた血清で発生したノロウイルス特異的ＩｇＧ免疫応答の動態を示し、下のパネルはＮｏＶ特異的血清のブロッキング効率を示している。詳細については、図面の説明を参照のこと。
【０１０４】
実施例３
皮内（ＩＤ）送達経路を使用した、マウスにおける精製ＶＰ１  ＶＬＰの免疫原性
皮内送達ワクチンの免疫原性を試験するためのマウス、抗原製剤及び測定は、実施例２に記載されているように準備され、実施された。ＩＤ送達ＧＩ．４及びＧＩＩ．４抗原に対する免疫応答についての実験結果が、それぞれ図３及び４に示される。両方の図において、上のパネルは血清ＩｇＧ力価を示している；中央のパネルはプールされた血清で発生したノロウイルス特異的ＩｇＧ免疫応答の動態を示し、下のパネルはＮｏＶ特異的血清のブロッキング効率を示している。詳細については、図面の説明を参照のこと。
【０１０５】
実施例４
鼻腔内（ＩＮ）送達経路を使用した、マウスにおける精製ＶＰ１  ＶＬＰの免疫原性
鼻腔内送達ワクチンの免疫原性を試験するためのマウス、抗原製剤及び測定は、実施例２に記載されているように準備され、実施された。ＩＮ送達ＧＩ．４及びＧＩＩ．４抗原に対する免疫応答についての実験結果は、対応して図５及び６に示される。両方の図において、上のパネルは血清ＩｇＧ力価を示している；中央のパネルはプールされた血清で発生したノロウイルス特異的ＩｇＧ免疫応答の動態を示し、下のパネルはＮｏＶ特異的血清のブロッキング効率を示している。詳細については、図面の説明を参照のこと。
【０１０６】
実施例５
皮下（ＳＣ）送達経路を使用した、マウスにおける精製ＶＰ１  ＶＬＰの免疫原性
皮下送達ワクチンの免疫原性を試験するためのマウス、抗原製剤及び測定は、実施例２に記載されているように準備され、実施された。ＳＣ送達ＧＩ．４及びＧＩＩ．４抗原に対する免疫応答についての実験結果は、図９に示される。詳細については、図面の説明を参照のこと。
【０１０７】
実施例６
植物における組換え外毒素Ｂサブユニットの生成
細菌のＩ型外毒素（コレラ毒素及び大腸菌の熱不安定性毒素）のＢサブユニットは、以下のようにして精製されている。５週齢のベンサミアナタバコ植物に、ベンサミアナタバコ植物において細菌のＩ型外毒素のＢサブユニットを容易に発現させることができる（Hamorsky et al., 2013, PLoS Negl Trop Dis. 7(3):e2046; Hamorsky et al., 2015, Sci Rep. 5:8003）ＴＭＶベースの組み立てられたｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）ベクター（Gleba et al., 2005, Vaccine, 23:17-18; Marillonnet et al., 2005, Nat. Biotechnol., 23:718-723; Gleba et al., Curr. Opin. Biotechnol., 2007, 18:134-141; Klimyuk, V., et al., 2014, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 375:127-154）を保有する希釈されたアグロバクテリウムツメファシエンス培養物を真空浸潤させた。植物材料は、浸潤後６〜１４日後に収穫した。緑色のバイオマスを、２体積の中性緩衝液（すなわち、１５ｇのバイオマス及び３０ｍＬの１００ｍＭのＴｒｉｓ、６０ｍＭアスコルビン酸、０．５ＭのＮａＣｌ  ｐＨ７．５）の存在下でホモジナイズした。清澄化のために、植物ホモジネートを１５．０００×ｇで２０分間遠心分離した。得られた抽出物は、ミリポア（登録商標）ガラス繊維フィルター（ＡＰ２５）を使用してろ過することにより、さらに清澄化された。組換え外毒素Ｂサブユニットは、J. L. Tayot et al, 1981, Eur J Biochem 113:249-258に記載された手順を使用して、リソ−ＧＭ１ガングリオシド−スフェロシル（登録商標）カラム上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。サブユニットＢ五量体の形成は、サイズ排除クロマトグラフィーによって確認された。
【０１０８】
実施例７
ワクチン製剤における組換え外毒素Ｂサブユニットの使用
任意の起源のＣＴＢ又はＬＴＢ、好ましくは植物中で生成された組換えＣＴＢ又はＬＴＢを、本発明の免疫原性及びワクチン製剤に使用することができる。外毒素Ｂサブユニット及びノロウイルスＶＬＰの用量に応じて、ＬＴＢ又はＣＴＢはアジュバントの機能を果たす（図７−８を参照）が、それ自体に免疫応答を引き起こすことによって抗原特性も示す（図１２、右パネルを参照）。
【０１０９】
表１Ａ．この発明においてクローニングされたノロウイルスキャプシドタンパク質配列。
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【０１１０】
表１Ｂ．配列番号及びアミノ酸配列を有するノロウイルスキャプシドタンパク質。
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【０１１１】
表２．コレラエンテロトキシンサブユニットＢ配列。
変異及び修飾は、太字のアミノ酸配列で示される。
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【０１１２】
1: Miyata T, Oshiro S, Harakuni T, Taira T, Matsuzaki G, Arakawa T. Physicochemically stable cholera toxin B subunit pentamer created by peripheral molecular constraints imposed by de novo-introduced intersubunit disulfide crosslinks. Vaccine. 2012 Jun 13; 30(28):4225-32.
2: Bakhshi B, Boustanshenas M, Ghorbani M. A single point mutation within the coding sequence of cholera toxin B subunit will increase its expression yield. Iran Biomed J. 2014 Jul; 18(3):130-5. PubMed PMID: 24842138; PubMed Central PMCID: PMC4048476.
3: Hamorsky KT, Kouokam JC, Bennett LJ, Baldauf KJ, Kajiura H, Fujiyama K, Matoba N. Rapid and scalable plant-based production of a cholera toxin B subunit variant to aid in mass vaccination against cholera outbreaks. PLoS Negl Trop Dis. 2013;7(3):e2046.
4: Hamorsky KT, Kouokam JC, Jurkiewicz JM, Nelson B, Moore LJ, Husk AS, Kajiura H, Fujiyama K, Matoba N. N-glycosylation of cholera toxin B subunit in Nicotiana benthamiana: impacts on host stress response, production yield and vaccine potential. Sci Rep. 2015 Jan 23;5:8003. 
5: US20140286986, Title: Polypeptides having immunoactivating activity and methods of producing the same, Published: 25. Sept. 2014, Applicant: University Of Louisville Research Foundation, Inc. 
【０１１３】
表３．大腸菌熱不安定性エンテロトキシンサブユニットＢの配列。
変異及び修飾は、太字のアミノ酸配列で示される。
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【０１１４】
２０１８年２月１５日及び２０１８年１２月２１日にそれぞれ出願された欧州特許出願第１８  １５７  ０３１．８号及び第１８  ２１５  ６７６．０号の内容は、明細書全体、特許請求の範囲及び図を含めて、本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
2021514391.tif 000043
【図８Ｂ】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図９Ｃ−Ｄ】
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【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１０Ｃ−Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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