(57)【要約】  ブタ胎児をブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の感染から保護するための方法。この方法は、雌ブタ動物を雄ブタ動物と繁殖させることを含む。雌ブタ動物は、そのＣＤ１６３遺伝子の両方のアレルに修飾染色体配列を含み、修飾染色体配列は、そのＣＤ１６３遺伝子のアレルにいかなる修飾染色体配列も含まない雌ブタ動物のＰＲＲＳＶ感染に対する感受性と比較して、雌ブタ動物のＰＲＲＳＶ感染に対する感受性を低減する。雄ブタ動物は、少なくとも１つの野生型ＣＤ１６３アレルを含む。【選択図】図２４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタ胎児をブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の感染から保護するための方法であって、前記方法が、雌ブタ動物を雄ブタ動物と繁殖させることを含み、
前記雌ブタ動物が、そのＣＤ１６３遺伝子の両方のアレルに修飾染色体配列を含み、前記修飾染色体配列が、そのＣＤ１６３遺伝子の前記アレルにいかなる修飾染色体配列も含まない雌ブタ動物のＰＲＲＳＶ感染に対する感受性と比較して、前記雌ブタ動物のＰＲＲＳＶ感染に対する感受性を低減し、
前記雄ブタ動物が、少なくとも１つの野生型ＣＤ１６３アレルを含む、方法。
【請求項２】
前記雄ブタ動物が、２つの野生型ＣＤ１６３アレルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記修飾染色体配列が、１型ＰＲＲＳＶウイルス、２型ＰＲＲＳＶ、または１型および２型ＰＲＲＳＶウイルスの両方に対する前記雌ブタ動物の感受性を低減する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記修飾染色体配列が、ＮＶＳＬ  ９７−７８９５、ＫＳ０６−７２１０９、Ｐ１２９、ＶＲ２３３２、ＣＯ９０、ＡＺ２５、ＭＬＶ−ＲｅｓＰＲＲＳ、ＫＳ６２−０６２７４、ＫＳ４８３（ＳＤ２３９８３）、ＣＯ８４、ＳＤ１３−１５、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、０３−１０５９、０３−１０６０、ＳＤ０１−０８、４３５３ＰＺ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＰＲＲＳＶ分離株に対する前記雌ブタ動物の感受性を低減する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記雌ブタ動物が、遺伝子編集された雌ブタ動物を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記雌ブタ動物が、ホーミングエンドヌクレアーゼを使用して遺伝子編集されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ホーミングエンドヌクレアーゼが、設計されたホーミングエンドヌクレアーゼを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ホーミングエンドヌクレアーゼが、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）系、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、リコンビナーゼ融合タンパク質、メガヌクレアーゼ、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記雌ブタ動物が、ＣＲＩＳＰＲ系を使用して遺伝子編集されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記雌ブタ動物が、前記ＣＤ１６３遺伝子の両方のアレルに同じ修飾染色体配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記雌ブタ動物が、前記ＣＤ１６３遺伝子の第１のアレルに第１の修飾染色体配列と、前記ＣＤ１６３遺伝子の第２のアレルに第２の修飾染色体配列と、を含み、前記第１および第２の修飾染色体配列が互いに異なる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記雌ブタ動物の前記ＣＤ１６３遺伝子の各アレルが、挿入、欠失、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記雌ブタ動物の前記ＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つのアレルが、欠失を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記雌ブタ動物の前記ＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つのアレルが、挿入を含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記修飾染色体配列が、前記修飾染色体配列を欠く雌ブタ動物におけるＣＤ１６３タンパク質産生または活性と比較して、ＣＤ１６３タンパク質産生または活性を低減する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記修飾染色体配列が、前記雌ブタ動物による実質的に機能性ＣＤ１６３タンパク質の産生をもたらさない、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記雌ブタ動物が、ＣＤ１６３タンパク質を産生しない、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記雌ブタ動物の前記ＣＤ１６３遺伝子の各アレルが、エクソン７における修飾、エクソン８における修飾、エクソン７もしくはエクソン８と連続するイントロンにおける修飾、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記雌ブタ動物の前記ＣＤ１６３遺伝子の一方または両方のアレルが、前記ＣＤ１６３遺伝子のエクソン７における修飾を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
エクソン７における前記修飾が、欠失を含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記欠失が、フレーム内欠失を含む、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
エクソン７における前記修飾が、挿入を含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記雌ブタ動物の前記ＣＤ１６３遺伝子の前記アレルの一方または両方における前記修飾染色体配列が、ミスコードをもたらす、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ミスコードが、前記ＣＤ１６３遺伝子の前記アレルにおける前記ミスコードの下流に未成熟終止コドンをもたらす、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記雌ブタ動物における前記ＣＤ１６３遺伝子の前記アレルのうちの少なくとも１つが、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対挿入とともに、同じアレル上の参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４７までの１２４塩基対欠失、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの１２３塩基対欠失、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４７と３，１４８との間の１塩基対挿入、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１５９までの１３０塩基対欠失、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１６１までの１３２塩基対欠失、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド１，５２５からヌクレオチド３，０３０までの１５０６塩基対欠失、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８と３，１４９との間の７塩基対挿入、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対欠失、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの１３７３塩基対欠失、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対欠失、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失（欠失配列は、ヌクレオチド４８８から始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、参照配列番号４７と比較してエクソン７にヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのさらなる１２９塩基対欠失がある）、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの２８塩基対欠失、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対欠失、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失（欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対挿入で置き換えられる）、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの１７２０塩基対欠失、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの４５２塩基対欠失、
およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される修飾を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記修飾が、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対挿入とともに、同じアレル上の参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失を含み、前記２塩基対挿入が、ジヌクレオチドＡＧを含み、
前記修飾が、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４７と３，１４８との間に１塩基対挿入を含み、前記１塩基対挿入が、単一のアデニン残基を含み、
前記修飾が、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９との間の７塩基対挿入を含み、前記７塩基対挿入が、配列ＴＡＣＴＡＣＴ（配列番号１１５）を含み、
前記修飾が、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失を含み、前記欠失した配列が、ヌクレオチド４８８から始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、参照配列番号４７と比較してエクソン７中にヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのさらなる１２９塩基対欠失があり、前記１２塩基対挿入が、配列ＴＧＴＧＧＡＧＡＡＴＴＣ（配列番号１１６）を含むか、または
前記修飾が、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失を含み、前記欠失した配列が、ヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対挿入で置き換えられ、前記１１塩基対挿入が、配列ＡＧＣＣＡＧＣＧＴＧＣ（配列番号１１７）を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記雌ブタ動物における前記ＣＤ１６３遺伝子の前記アレルのうちの少なくとも１つが、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９との間の７塩基対挿入、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対挿入とともに、同じアレル上の参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失（欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対挿入で置き換えられる）、
およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される修飾を含む、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記雌ブタ動物が、
（ａ）前記ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルに、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９との間の７塩基対挿入、および
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対挿入とともに、前記ＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルに、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失、
（ｂ）参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失（欠失配列は、前記ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルにおけるヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対挿入で置き換えられる）、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対挿入とともに、前記ＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルに、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失、
（ｃ）前記ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルに、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９との間の７塩基対挿入、および
前記ＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルに、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失、または
（ｄ）参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失（欠失配列は、前記ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルにおけるヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対挿入で置き換えられる）、および
前記ＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルに、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記雌ブタ動物が、
（ａ）前記ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルに、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９との間の７塩基対挿入、および
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対挿入とともに、前記ＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルに、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失、または
（ｂ）参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失（欠失配列は、前記ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルにおけるヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対挿入で置き換えられる）、
参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対挿入とともに、前記ＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルに、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記雌ブタ動物の前記ＣＤ１６３遺伝子の前記アレルが、前記挿入または欠失の外側の前記染色体配列の領域において、配列番号４７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する染色体配列を含む、請求項１２〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記雌ブタ動物が、前記ＣＤ１６３遺伝子の一方または両方のアレルに、配列番号９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、または１１９を含む染色体配列を含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記雌ブタ動物が、前記ＣＤ１６３遺伝子の一方または両方のアレルに、配列番号９９、１０２、１０３、または１１３を含む染色体配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記雌ブタ動物が、
（ａ）前記ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルに配列番号９９を含む染色体配列、および前記ＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルに配列番号１０３を含む染色体配列と、
（ｂ）前記ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルに配列番号１１３を含む染色体配列、および前記ＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルに配列番号９９を含む染色体配列と、
（ｃ）前記ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルに配列番号９９を含む染色体配列、および前記ＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルに配列番号１０２を含む染色体配列と、
（ｄ）前記ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルに配列番号１１３を含む染色体配列、および前記ＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルに配列番号１０２を含む染色体配列と、を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記雌ブタ動物が、
（ａ）前記ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルに配列番号９９を含む染色体配列、および前記ＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルに配列番号１０３を含む染色体配列、または
（ｂ）前記ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルに配列番号１１３を含む染色体配列、および前記ＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルに配列番号９９を含む染色体配列を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記繁殖が、前記ＣＤ１６３遺伝子の単一のアレルに修飾染色体配列を含む１体以上の胎児を産生する、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記胎児が、野生型雌ブタ動物の子宮内の胎児と比較して、子宮内でのＰＲＲＳＶ感染に対する感受性を低減した、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記繁殖が、前記雌ブタ動物と前記雄ブタ動物との交配を含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記繁殖が、前記雄動物から得られた精子を用いた前記雌動物の人工授精を含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記繁殖が、受精卵を前記雌ブタ動物の生殖路に移すことを含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記受精卵が、前記雄ブタ動物から得られた精子を用いた前記卵母細胞のインビトロ受精によって生成された、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記インビトロ受精は、前記雄ブタ動物から得られた精子を有する卵母細胞の細胞質内注入を含む、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子的に提出された配列表の参照
配列表の公式コピーは、２０１８年３月２７日に作成され、１７５．５キロバイトのサイズを有する「配列表１８０５４ＷＯ」という名前のファイルを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出される。このＡＳＣＩＩ形式の文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ブタ胎児をブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）感染から保護するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）は、北米、欧州、およびアジアで最も経済的に重要なブタの疾患であり、北米の生産者は年間およそ６億ドルを費やしている（Ｈｏｌｔｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の感染によって引き起こされる臨床疾患症候群は、１９８７年に米国で最初に報告され（Ｋｅｆｆａｂｅｒ，１９８９）、その後１９９０年に欧州で報告された（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。ＰＲＲＳＶの感染は、咳および発熱、妊娠後期の生殖不全、および成長能力の低減を含む呼吸器疾患をもたらす。ウイルスはまた、生涯にわたる亜臨床感染を維持しながら、様々な多菌疾患症候群相互作用にも関与する（Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。損失は、若いブタにおける呼吸器疾患、成長能力の不良、生殖不全、および子宮内感染の結果である（Ｋｅｆｆａｂｅｒ，１９８９）。
【０００４】
この疾患の生殖形態は、流産、死胎、および新生児の呼吸器疾患の結果であるの損失の推定４５％を占めている。その最も重度の形態では、生殖ＰＲＲＳは、雌親の死亡率の増加とともに、胎児／新生児の９０％の死亡率をもたらし得る。ＰＲＲＳの生殖形態は、１１４日の妊娠期間の約９０日で、妊娠中の未経産ブタまたは経産ブタの感染後に起こる（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｒｏｗｌａｎｄ，２０１０）。母体マクロファージにおける複製の初期段階の後、ウイルスは、胎盤を横断し、増殖的に胎児に感染し始める。ウイルスは、最初は少数の胎児のみに感染し、胎児から胎児へのウイルスの水平伝播が続く（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。ウイルスが胎盤を横断する正確な機序は未知のままであるが、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ）について以前に記載されている感染した「トロイの木馬」マクロファージと類似している可能性がある（Ｃａｆｒｕｎｙ，１９９６）。成体動物における肺胞マクロファージとは異なり、胎児におけるＰＲＲＳＶ複製の原発部位は、胸腺である（Ｒｏｗｌａｎｄ，２００３）。ブタ胎児は、妊娠の約７０日で免疫適格性になるため、ＰＲＲＳＶ感染は、機能性Ｂ細胞およびＴ細胞を含有する胎児免疫環境において起こる（Ｒｏｗｌａｎｄ，２００３、Ｒｏｗｌａｎｄ，２０１０）。
【０００５】
子宮内感染で生存するブタは、下流生産期においてウイルスの連続的な供給源となり、固有に感染した集団をもたらす（Ｒｏｗｌａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，２００３）。生殖疾患の最も重度の形態は、非定型ＰＲＲＳＶと称される強毒性分離株の群と関連する（Ｈａｌｂｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、Ｍｅｎｇｅｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。興味深いことに、非定型ＰＲＲＳＶ分離株の多くは、ＰＲＲＳワクチン接種された農場から出現した（Ｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。２００６年、高病原性ＰＲＲＳＶ（ＨＰ−ＰＲＲＳＶ）と呼ばれる非定型ウイルスが中国に現れ、その国のブタ集団を減少させ続けている（Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。標準的な商業繁殖施設には、約５，０００匹の経産ブタが収容されているため、高死亡率の生殖ＰＲＲＳの発生は、壊滅的な影響を及ぼす可能性がある。ブタ肉生産および食料安全保障の持続可能性を確保するために、生殖ＰＲＲＳの制御のための解決策は、依然として優先事項である。ワクチンは、主にウイルスの構造タンパク質内の遺伝的多様性のために疾患を制御することができなかった（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。実際には、集中的なバイオセキュリティ対策は、生殖集団を保護する唯一の手段を提供する。
【０００６】
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）は、マウス乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス、サル出血熱ウイルス、およびウマ動脈炎ウイルスとともにアルテリウイルス科に属する。構造的には、アルテリウイルスは、トガウイルスに類似するが、コロナウイルスと同様に、共通のリーダーおよびポリＡ尾部を有するサブゲノムｍＲＮＡのネストされた３’共末端セットを介して複製する。アルテリウイルスは、マクロファージの屈性、重症疾患および持続性感染を引き起こす能力を含む、ウイルス病原性に関連する重要な特性を共有する（Ｐｌａｇｅｍａｎｎ，１９９６）。北米ウイルスと欧州ウイルスとの間の分子比較は、すべてのＰＲＲＳＶ分離株を、それぞれ２型または１型の２つの遺伝子型のうちの１つに配置する。２つの遺伝子型は、ヌクレオチドレベルで約７０％の同一性のみを有するが（Ｎｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、両方ともＣＤ１６３陽性細胞に対する屈性を共有し、長期感染を確立し、同様の臨床徴候を生じる。
【０００７】
ＣＤ１６３は、膜貫通ドメインおよび短い細胞質尾部とともに、９つのスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメインおよび２つのスペーサードメインからなる１３０ｋＤａの１型膜タンパク質である（Ｆａｂｒｉｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ブタＣＤ１６３は、ペプチドシグナル配列をコードする１７個のエクソン、続いて９個のＳＲＣＲドメイン、２つのリンカードメイン（ＳＲＣＲ  ６およびＳＲＣＲ  ９の後に位置するプロリンセリンスレオニン（ＰＳＴ）ドメインとも称される）、ならびに細胞質ドメイン、続いて短い細胞質尾部を含有する。ＣＤ１６３の表面発現は、単球−マクロファージ系統の細胞に限定される。ＣＤ１６３は、ウイルス受容体として機能することに加えて、正常な恒常性を維持することに関連するいくつかの重要な機能を示す。例えば、感染または組織損傷に続いて、ＣＤ１６３は、スカベンジャー分子として機能し、血液からハプトグロビン−ヘモグロビン複合体を除去する（Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。結果として生じるヘム分解生成物は、関連する炎症反応を調節する（Ｆａｂｒｉｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＨｂＨｐスカベンジングは、ＣＤ１６３の主要な機能であり、ＳＲＣＲ３に位置する（Ｍａｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＨｂＨｐ分解に続いてマクロファージによって放出される代謝生成物は、ビリルビン、ＣＯ、および遊離鉄を含む。ＣＤ１６３の１つの重要な機能は、遊離ヘモグロビンから生じる酸化毒性の防止である（Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｓｏａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０００８】
Ｃ１６３の他の重要な機能としては、赤芽球付着（ＳＲＣＲ２）、ＴＷＥＡＫ（腫瘍壊死因子様弱アポトーシス誘導因子）受容体（ＳＲＣＲ１〜４および６〜９）であること、細菌受容体（ＳＲＣＲ５）であること、およびアフリカブタウイルス受容体であることが挙げられる（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｔｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。ＣＤ１６３はまた、免疫調節物質としての潜在的な役割も有する（Ｖａｎ  Ｇｏｒｐ  ｅｔ  ａｌ．２０１０で論じられている）。
【０００９】
ＣＤ１６３は、最初にＣａｌｖｅｒｔ  ｅｔ．ａｌ．（２００７）によってＰＲＲＳＶの受容体として説明された。サル、ヒト、イヌ、およびマウスを含む様々な種からのＣＤ１６３  ｃＤＮＡによる非許容細胞株のトランスフェクションは、ＰＲＲＳＶ感染に対して細胞を許容させることができる（Ｃａｌｖｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＣＤ１６３に加えて、第２の受容体タンパク質であるＣＤ１６９（シアロアドヘシンまたはＳＩＧＬＥＣ１としても知られる）は、ビリオンの表面上の主要タンパク質であるＧＰ５−マトリックス（Ｍ）ヘテロ二量体との初期相互作用の形成に関与する一次ＰＲＲＳＶ受容体であると特定された（Ｄｅｌｐｕｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。このモデルでは、エンドソーム区画内のＣＤ１６３とＧＰ２、３、４ヘテロ三量体とのその後の相互作用は、ウイルスゲノムの細胞質への脱殻および放出を媒介する（Ｖａｎ  Ｂｒｅｅｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ａｌｌｅｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。肺胞マクロファージのＰＲＲＳＶ感染を説明する以前のモデルは、マクロファージの表面上の原発性ウイルス受容体としてＳＩＧＬＥＣ１（ＣＤ１６９）を特定したが、ＳＩＧＬＥＣ  １−／−ブタを使用する以前の研究は、野生型ブタと比較してウイルス複製に差を示さなかった（Ｐｒａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。これらの結果は、表面ＣＤ１６９およびＣＤ１６３を欠くＰＲＲＳＶ抵抗性細胞株が、ＣＤ１６３プラスミドでのトランスフェクション後にウイルス複製をサポートしたことを示す以前のインビトロ研究をサポートした（Ｗｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００１０】
ＰＲＲＳＶの病因（特に分子レベルで）および動物流行病学の両方の多くの特徴は理解されておらず、したがって制御努力を困難にする。現在、生産者はしばしば、修飾された生の弱毒化株または不活化ウイルスワクチンでブタにＰＲＲＳＶに対するワクチン接種を行うが、現在のワクチンはしばしば、満足のいく保護を提供しない。これは、株の変異および免疫系の不十分な刺激の両方に起因する。利用可能なＰＲＲＳＶワクチンの有効性に関する懸念に加えて、現在使用されている修飾された生ワクチンが、個々のブタおよびブタの群れにおいて持続し、突然変異を蓄積し得るという強力な証拠があり（Ｍｅｎｇｅｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）、これは、ブタの実験感染後の毒性の野生分離株で実証されている（Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。さらに、ワクチンウイルスは、ワクチン接種された雄ブタの精液中で流出することが示されている（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ−Ｈｅｎｎｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。ワクチン接種の代替として、一部の専門家は、繁殖群れにおける「試験および除去」戦略を提唱している（Ｄｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。この戦略の成功的使用は、ＰＲＲＳＶに急性または持続的に感染しているすべてのブタの除去、続いてウイルスの再導入を防ぐための厳格な制御に依存する。この戦略に関連する困難性および多くの費用は、持続性ＰＲＲＳＶ感染の病因についてほとんど知られておらず、したがって、持続的に感染したブタを特定するための信頼できる技術が存在しないことである。
【００１１】
見られるように、動物におけるＰＲＲＳＶ抵抗性を誘導するための戦略の開発に対する必要性が、当該技術分野に存在する。また、子宮内でＰＲＲＳＶ感染から胎児を保護するための技術、および母体から胎児へのＰＲＲＳＶの伝播を防止するための技術も特に必要とされている。
【発明の概要】
【００１２】
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の感染からブタ胎児を保護するための方法が提供される。この方法は、雌ブタ動物を雄ブタ動物と繁殖させることを含む。雌ブタ動物は、そのＣＤ１６３遺伝子の両方のアレルに修飾染色体配列を含み、修飾染色体配列は、そのＣＤ１６３遺伝子のアレルにいかなる修飾染色体配列も含まない雌ブタ動物のＰＲＲＳＶの感染に対する感受性と比較して、雌ブタ動物のＰＲＲＳＶの感染に対する感受性を低減する。雄ブタ動物は、少なくとも１つの野生型ＣＤ１６３アレルを含む。
【００１３】
他の目的物および特徴は、部分的には明らかであり、部分的には以下で指摘される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＣＤ１６３を修飾するために使用される標的化ベクターおよびＣＲＩＳＰＲ。パネルＡは、ＣＲＩＳＰＲを使用する修飾のために標的とされたＣＤ１６３遺伝子の野生型エクソン７、８、および９を示す。パネルＢは、ブタエクソン７（ＣＤ１６３のブタドメインＳＲＣＲ５）を、ＣＤ１６３ＬのヒトＳＲＣＲ８をコードするＤＮＡに置き換えるように設計された標的化ベクターを示す。この標的化ベクターを、Ｇ４１８による薬物選択を伴うトランスフェクションに使用した。ロングレンジ、左アーム、および右アームアッセイのためのＰＣＲプライマーは、１２３０、３７５２、８７９１、７７６５、および７７７５について矢印で標識される。パネルＣは、パネルＢに示されるものと同一であるが、Ｎｅｏカセットが除去された標的化ベクターを示す。この標的化ベクターを使用して、既にネオマイシン抵抗性であった細胞中のＣＤ１６３を標的とした。小欠失アッセイに使用されるプライマーを矢印で示し、ＧＣＤ１６３ＦおよびＧＣＤ１６３Ｒと標識する。パネルＤは、ＣＲＩＳＰＲによって標的とされるエクソンを強調する。ＣＲＩＳＰＲ１０、１３１、２５６、および２８２の位置は、エクソン７上の下向きの矢印によって表される。ＣＲＩＳＰＲ番号は、イントロン６およびエクソン７のイントロン−エクソン接合部からの塩基対の数を表す。
【図２】図２は、ＣＤ１Ｄを修飾するために使用される標的化ベクターおよびＣＲＩＳＰＲ。パネルＡは、ＣＲＩＳＰＲによる修飾のために標的とされたＣＤ１Ｄ遺伝子の野生型エクソン３、４、５、６、および７を示す。パネルＢは、エクソン３を選択可能なマーカーＮｅｏに置き換えるように設計された標的化ベクターを示す。この標的化ベクターをＣＲＩＳＰＲと組み合わせてＣＤ１Ｄを修飾した。ロングレンジ、左アーム、および右アームアッセイのためのＰＣＲプライマーを、３９９１、４３６３、７３７３、および１２８０６について矢印で標識する。パネルＣは、ＣＲＩＳＰＲによって標的とされるエクソンを示す。ＣＲＩＳＰＲ４８００、５３５０、５６２０、および５６２６の位置は、エクソン３上の下向き矢印によって表される。小欠失アッセイに使用されるプライマーを矢印で例示し、ＧＣＤ１ＤＦおよびＧＣＤ１ＤＲと標識する。
【図３】図３は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＳＣＮＴによるＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄノックアウトブタの生成。Ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびドナーＤＮＡによるトランスフェクション後の体細胞中のＣＤ１６３の標的欠失。野生型（ＷＴ）遺伝子型は、６５４５塩基対（ｂｐ）バンドをもたらす。レーン１〜６は、Ｃａｓ９およびＮｅｏを含有するドナーＤＮＡを伴うＣＲＩＳＰＲ１０による単一トランスフェクションからの６つの異なるコロニーを表す。レーン１、４、および５は、１５００〜２０００ｂｐの大きなホモ接合欠失を示す。レーン２は、より小さいホモ接合欠失を表す。レーン３および６は、ＷＴアレル、ならびに両方のアレルの小欠失または両アレル修飾のいずれかを表す。各コロニーの正確な修飾は、ＳＣＮＴに使用されるコロニーの配列決定によってのみ決定された。いくつかのレーンにおける薄いＷＴバンドは、隣接するＷＴコロニーからの胎児線維芽細胞の交差汚染を表し得る。ＮＴＣ＝テンプレート対照なし。Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびドナーＤＮＡによるトランスフェクション後の体細胞中のＣＤ１Ｄの標的欠失。ＷＴ遺伝子型は、８７２９ｂｐバンドをもたらす。レーン１〜４は、ＣＤ１Ｄの５００〜２０００ｂｐ欠失を有するコロニーを表す。レーン４は、ＷＴコロニーであるように見える。ＮＴＣ＝テンプレート対照なし。Ｃ）試験中にＳＣＮＴによって産生されたＣＤ１６３ノックアウトブタの画像。この雄ブタは、ＣＤ１６３のホモ接合性１５０６ｂｐ欠失を含有する。Ｄ）試験中に産生されたＣＤ１Ｄブタの画像。これらのブタは、ＣＤ１Ｄの１６５３ｂｐ欠失を含有する。Ｅ）ＣＤ１６３の１５０６ｂｐ欠失を含む２匹のＳＣＮＴ同腹子の遺伝子型。レーン１〜３（同腹子６３）およびレーン１〜４（同腹子６４）は、各同腹子からの各子ブタの遺伝子型を表す。経産ブタは、ＳＣＮＴ胚のレシピエント雌を示し、ＷＴは、ＷＴ対照を表す。ＮＴＣ＝テンプレート対照なし。Ｆ）ＣＤ１Ｄの１６５３ｂｐ欠失を含む２匹のＳＣＮＴ同腹子の遺伝子型。レーン１〜７（同腹子１５８）およびレーン１〜４（同腹子１５９）は、各子ブタの遺伝子型を表す。
【図４】図４は、ブタ胚におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の効果。Ａ）異なる濃度のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を接合体に注入した後の胚盤胞形成の頻度。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の毒性は、１０ｎｇ／μＬで最低であった。Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、接合体に導入されると、胚盤胞におけるｅＧＦＰの発現を正常に妨害することができる。元の倍率×４。Ｃ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して生成されるｅＧＦＰ上の突然変異の種類：ＷＴ遺伝子型（配列番号１６）、＃１（配列番号１７）、＃２（配列番号１８）、および＃３（配列番号１９）。
【図５】図５は、ブタ胚における標的化ＣＤ１６３中のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の効果。Ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系によってＣＤ１６３上で生成された突然変異の例：ＷＴ遺伝子型（配列番号２０）、＃１−１（配列番号２１）、＃１−４（配列番号２２）、および＃２−２（配列番号２３）。ＤＮＡ配列決定によって検査したすべての胚は、ＣＤ１６３に突然変異を示した（１８／１８）。ＣＲＩＳＰＲ１３１は、太字で強調表示される。Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系によって引き起こされるホモ接合欠失の配列決定読み取り。画像は、ＣＤ１６３の２ｂｐ欠失を有するパネルＡからの＃１〜４を表す。
【図６】図６は、２種類のＣＲＩＳＰＲで導入した場合のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の効果。Ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を接合体として注入した胚盤胞におけるＣＤ１６３のＰＣＲ増幅。レーン１、３、６、および１２は、２つの異なるＣＲＩＳＰＲ間の設計された欠失を示す。Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を接合体として注入した胚盤胞におけるＣＤ１ＤのＰＣＲ増幅。ＣＤ１Ｄは、ＣＤ１６３（３／２３）と比較して、ゲル電気泳動によって決定されるように欠失頻度が低かった；レーン１、８、および１５は、ＣＤ１Ｄにおける明らかな欠失を示す。Ｃ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、ＣＤ１６３およびｅＧＦＰを標的とする２つのＣＲＩＳＰＲをシステムに提供したとき、２つの遺伝子を標的とすることに成功した。ＣＤ１６３およびｅＧＦＰの修飾を示す：ＣＤ１６３  ＷＴ（配列番号２４）、ＣＤ１６３＃１（配列番号２５）、ＣＤ１６３＃２（配列番号２６）、ＣＤ１６３＃３（配列番号２７）、ｅＧＦＰ  ＷＴ（配列番号２８）、ｅＧＦＰ＃１−１（配列番号２９）、ｅＧＦＰ＃１−２（配列番号３０）、ｅＧＦＰ＃２（配列番号３１）、およびｅＧＦＰ＃３（配列番号３２）。
【図７】図７は、接合体に注入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系によって生成されたＣＤ１６３ノックアウトブタ。Ａ）ノックアウトブタからのＣＤ１６３のＰＣＲ増幅；同腹子６７−２および６７−４において欠失の明確な兆候が検出された。Ｂ）代理母を伴うＣＤ１６３ノックアウトブタの画像。すべての動物は健康であり、異常の兆候を示さない。Ｃ）ＣＤ１６３ノックアウトブタの遺伝子型。野生型（ＷＴ）配列を配列番号３３として示す。２匹の動物（同腹子６７−１（配列番号３４）および６７−３（配列番号３７）由来）は、ＣＤ１６３にホモ接合欠失または挿入を担持している。他の２匹の動物（同腹子６７−２および６７−４由来）は、ＣＤ１６３の両アレル修飾を担持している：＃６７−２  Ａ１（配列番号３５）、＃６７−２  Ａ２（配列番号３６）、＃６７−４  Ａ１（配列番号３８）、および＃６７−４  ａ２（配列番号３９）。欠失は、Ｃａｓ９系とともに２つの異なるＣＲＩＳＰＲを導入することによって引き起こされた。ＣＤ１６３の接合体注入からの動物は、モザイク遺伝子型を示さなかった。
【図８】図８は、接合体に注入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系によって生成されたＣＤ１Ｄノックアウトブタ。Ａ）ノックアウトブタ由来のＣＤ１ＤのＰＣＲ増幅；１６６−１は、ＣＤ１Ｄのモザイク遺伝子型を示す。１６６−２、１６６−３、および１６６−４は、増幅子のサイズの変化を示さないが、増幅子の配列決定により、修飾が明らかになった。ＷＴ  ＦＦ＝野生型胎児線維芽細胞。Ｂ）ロングレンジアッセイのＰＣＲ増幅は、子ブタ１６６−１および１６６−２における１つのアレルの明確な欠失を示した。Ｃ）代理母を伴うＣＤ１Ｄノックアウトブタの画像。Ｄ）ＣＤ１Ｄノックアウトブタ、ＷＴ（配列番号４０）、＃１６６−１．１（配列番号４１）、＃１６６−１．２（配列番号４２）、＃１６６−２（配列番号４３）、＃１６６−３．１（配列番号４４）、＃１６６−３．２（配列番号４５）、および＃１６６−４（配列番号４６）の配列データ。エクソン３におけるａｔｇ開始コドンは、太字、また小文字で示される。
【図９】図９は、急性ＰＲＲＳＶ感染中の臨床徴候。ＣＤ１６３＋／＋（ｎ＝６）およびＣＤ１６３−／−（ｎ＝３）の呼吸徴候および発熱の有無を日次評価した結果。
【図１０】図１０は、急性ＰＲＲＳＶ感染中の肺組織病理。野生型およびノックアウトブタ由来のＨおよびＥ染色組織の代表的な顕微鏡写真。左パネルは、単核細胞の浮腫および浸潤を示す。ノックアウトブタの右パネルは、正常な肺の肺構造を示す。
【図１１】図１１は、様々な遺伝子型におけるウイルス血症。ＣＤ１６３−／−子ブタデータは、Ｘ軸に沿って配置されていることに留意されたい。
【図１２】図１２は、ヌル、野生型、および特徴付けられていないアレルブタにおける抗体産生。
【図１３−１】図１３は、個々のブタにおけるＣＤ１６３の細胞表面発現。特徴付けられていないＡ、特徴付けられていないＢ、およびＣＤ１６３＋／＋パネルの右側に現れる線は、ＣＤ１６３抗体を表し、一方、これらのパネルの左側に現れる線は、無抗体対照（バックグラウンド）である。ＣＤ１６３−／−動物において、ＣＤ１６３染色は、バックグラウンド対照と重複し、特徴付けられていないアレルにおけるＣＤ１６３染色は、ＷＴレベルとバックグラウンドとの間のおよそ半分であることに留意されたい（これは対数尺度であるため、約１  ０％未満であることにも留意されたい）。
【図１３−２】同上。
【図１３−３】同上。
【図１３−４】同上。
【図１４】図１４は、３匹の代表的なブタおよび無抗体対照由来の肺胞マクロファージ上のＣＤ１６９のレベル（ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１６９）。
【図１５】図１５は、種々の遺伝子型におけるウイルス血症。Δ４３アミノ酸子ブタデータは、Ｘ軸に沿っていることに留意されたい。
【図１６−１】図１６は、参照配列（配列番号４７）として使用される野生型ＣＤ１６３エクソン７〜１０のゲノム配列。配列は、エクソン７の上流からエクソン１  ０の最後の塩基まで３０００ｂｐを含む。下線付き領域は、それぞれエクソン７、８、９、および１０の位置を示す。
【図１６−２】同上。
【図１７】図１７は、ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）上の表面ＣＤ１６３のレベルによって測定されるように、いくつかのＣＤ１６３染色体修飾、各修飾についての予測タンパク質生成物、および各修飾についての相対的マクロファージ発現を示すＣＤ１６３修飾の図。黒色領域は、イントロンを示し、白色領域は、エクソンを示す。斜線領域は、ブタエクソン７のホモログであるｈＣＤ１６３Ｌ１エクソン１１模倣物を示す。灰色領域は、ＰＧＫ  Ｎｅｏ構築物を有する合成イントロンを示す。
【図１８】図１８は、ブタＣＤ１６３タンパク質および遺伝子配列の図。Ａ）ＣＤ１６３タンパク質ＳＲＣＲ（楕円）およびＰＳＴ（四角）ドメイン、ならびに対応する遺伝子エクソン。Ｂ）ブタＣＤ１６３  ＳＲＣＲ５（配列番号１２０）とヒトＣＤ１６３Ｌ１  ＳＲＣＲ８（配列番号１２１）ホモログとの比較。
【図１９−１】図１９は、野生型およびＣＤ１６３修飾ブタ由来のＰＡＭ上のＣＤ１６３およびＣＤ１６９の表面発現の代表的な結果。パネルＡ〜Ｅは、図１７に例示されるＣＤ１６３修飾の結果を示す。ｄ７（１４６７）およびｄ７（１２８０）のプールデータをパネルＤに示す。
【図１９−２】同上。
【図２０】図２０は、野生型およびＣＤ１６３修飾ブタにおける血清ハプトグロビンレベル。
【図２１】図２１は、野生型およびＨＬ１１ｍ  ＰＡＭの、２型ＰＲＲＳＶ分離株感染に対する相対的寛容性。
【図２２】図２２は、１型および２型ＰＲＲＳＶ分離株によるＣＤ１６３修飾ブタの感染。
【図２３】図２３は、２型ウイルスに感染したＷＴおよびＣＤ１６３修飾ブタのウイルス負荷。
【図２４】図２４は、ＰＲＲＳＶによる母体感染後の胎児転帰。左の数字は、各雌親を示す（「雌親番号」、以下の表１６を参照）。括弧内の各雌親数の下は、ｌｏｇ１０テンプレート／反応として測定した血清中のＰＲＲＳ  ＰＣＲの結果である。「Ｎ」は、ＰＲＲＳＶ核酸に対して陰性である（Ｃｔ＞３９）。胎児は、各子宮角内の数および相対位置によって識別される。アスタリスクは、腹水から得られた胎児ＰＣＲ試料を識別する。各胎児の下の数は、胎仔血清中のＰＲＲＳ  ＰＣＲの結果である（ｌｏｇ１０テンプレート／反応）。各円内の数は、解剖学的病理の存在を指す：１）正常胎児、２）小さな胎児、３）胎盤の剥離および／または壊死などの胎盤変化、４）メコニウム染色胎児、５）胎児は死亡し壊死している。小文字は、個々の胎児の遺伝子型を識別する（表１６を参照）。キー：ａ，Ａ／Ａ；ｂ，Ｃ／Ａ；ｃ，Ｂ／Ａ；ｄ，Ｅ／Ａ；ｅ，Ｂ／Ｃ；ｆ，Ｂ／Ｄ；ｇ，Ｄ／Ｃ；ｈ，Ｄ／Ｄ；ｉ，Ｅ／Ｃ；ｊ，Ｅ／Ｄ；ＮＤ、胎児が壊死したため決定されず；ｎｄ、遺伝子型は決定されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）感染からブタ胎児を保護するための方法を対象とする。ＣＤ１６３遺伝子の両方のアレルに不活性化突然変異を有するブタは、ＰＲＲＳＶ感染に抵抗性がある。ＣＤ１６３陽性胎児（例えば、１つまたは２つの野生型ＣＤ１６３アレルを有する胎児）は、雌親がＣＤ１６３遺伝子の両方のアレルにおいて不活性化突然変異を有する限り、子宮内でＰＲＲＳＶ感染から保護できることが予期せず見出されている。したがって、例えば、ＣＤ１６３遺伝子の両方のアレルにおいて不活性化突然変異を有する雌親は、２つの野生型ＣＤ１６３アレルを有する交配雄であってもよく、結果として生じるヘテロ接合胎児は、ＰＲＲＳＶ感染から保護される。
【００１６】
定義
本発明の要素またはその好ましい実施形態を導入する場合、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「ｓａｉｄ」という冠詞は、１つ以上の要素が存在することを意味することが意図される。
【００１７】
「および／または」という用語は、項目のうちのいずれか１つ、項目の任意の組み合わせ、またはこの用語が関連付けられるすべての項目を意味する。
【００１８】
本明細書で使用される「繁殖」という用語は、受精が生じるように雄性配偶子と雌性配偶子とが結合することを指す。そのような結合は、交配（交尾）によって、またはインビトロもしくはインビボの人工方法によってもたらすことができる。そのような人工的方法としては、人工授精、外科的補助人工授精、インビトロ受精、細胞質内精子注入、透明帯開孔法、受精卵細胞のインビトロ培養、卵巣移植、および卵巣分割が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「繁殖」という用語は、受精卵を雌動物の生殖管に移すことも含む。
【００１９】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、包括的であることが意図され、列挙された要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味する。
【００２０】
用語「ＣＲＩＳＰＲ」は、「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復」を表す。ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系を含む。
【００２１】
「Ｃａｓ」という用語は、「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質」を指す。Ｃａｓタンパク質としては、Ｃａｓ９ファミリーメンバータンパク質、Ｃａｓ６ファミリーメンバータンパク質（例えば、Ｃｓｙ４およびＣａｓ６）、ならびにＣａｓ５ファミリーメンバータンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
「Ｃａｓ９」という用語は、概して、野生型Ｃａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９）と少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指し得る。例示的なＣａｓ９配列は、米国特許公開第２０１６／００４６９６３号の配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６によって提供される。米国特許公開第２０１６／００４６９６３号の配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６は、ここで参照により本明細書に組み込まれる。「Ｃａｓ９」は、（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の）野生型Ｃａｓ９ポリペプチドと最大で約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指し得る。「Ｃａｓ９」は、欠失、挿入、置換、バリアント、突然変異、融合、キメラ、またはそれらの任意の組み合わせなどのアミノ酸変化を含むことができる、Ｃａｓ９タンパク質の野生型または修飾形態を指し得る。
【００２３】
「Ｃａｓ５」という用語は、概して、野生型の例示的なＣａｓ５ポリペプチド（例えば、Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のＣａｓ５）と少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指し得る。例示的なＣａｓ５配列が、米国特許公開第２０１６／００４６９６３号の図４２に提供される。米国特許公開第２０１６／００４６９６３号の図４２は、ここで参照により本明細書に組み込まれる。「Ｃａｓ５」は、概して、野生型Ｃａｓ５ポリペプチド（例えば、Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のＣａｓ５）と少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指し得る。「Ｃａｓ５」は、欠失、挿入、置換、バリアント、突然変異、融合、キメラ、またはそれらの任意の組み合わせなどのアミノ酸変化を含むことができる、Ｃａｓ５タンパク質の野生型または修飾形態を指し得る。
【００２４】
「Ｃａｓ６」という用語は、概して、野生型の例示的なＣａｓ６ポリペプチド（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ６）と少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指し得る。例示的なＣａｓ６配列が、米国特許公開第２０１６／００４６９６３号の図４１に提供される。米国特許公開第２０１６／００４６９６３号の図４１は、ここで参照により本明細書に組み込まれる。「Ｃａｓ６」は、概して、野生型Ｃａｓ６ポリペプチド（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来）と少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指し得る。「Ｃａｓ６」は、欠失、挿入、置換、変異体、突然変異、融合、キメラ、またはそれらの任意の組み合わせなどのアミノ酸変化を含むことができる、Ｃａｓ６タンパク質の野生型または修飾形態を指し得る。
【００２５】
「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９」または「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系」という用語は、Ｃａｓ９タンパク質またはその誘導体、ならびにＣａｓ９のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の機能を提供し得る１つ以上の非コードＲＮＡを含む、遺伝子操作のためのプログラム可能なヌクレアーゼ系を指す。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、個別に使用することができるか、または「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）を産生するために組み合わせることができる。ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡは、ゲノム標的に相補的な配列を提供する。
【００２６】
本明細書におけるヌクレオチドｘからヌクレオチドｙまでのヌクレオチド配列における欠失への言及は、範囲内のすべてのヌクレオチド（ｘおよびｙを含む）が欠失されていることを意味する。したがって、例えば、「配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失」という語句は、ヌクレオチド３，３１７および３，１４７を含むヌクレオチド３，３１７〜３，１４７の各々が欠失していることを意味する。
【００２７】
動物の疾患に対する「抵抗性」は、動物の特徴であり、動物は、ブタ動物とＰＲＲＳＶとの相互作用などの動物病原体相互作用の結果である疾患症状を回避する。すなわち、病原体は、動物疾患および関連する疾患症状を引き起こすことを防止するか、または代替的に、臨床徴候の発生率および／もしくは重症度を低減する、または臨床症状を低減する。当業者は、本明細書に開示される方法が、病原体発作から動物を保護するための当該技術分野で入手可能な他の組成物および方法とともに使用され得ることを理解するであろう。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「遺伝子編集する」、「遺伝子編集された」、「遺伝的に編集された」、および「遺伝子編集エフェクター」は、「分子ハサミ」、「ホーミングエンドヌクレアーゼ」、または「標的化エンドヌクレアーゼ」とも称される、天然に存在するまたは人工的に操作されたヌクレアーゼを有するホーミング技術の使用を指す。ヌクレアーゼは、ゲノム中の所望の位置で特異的な二本鎖染色体切断（ＤＳＢ）を作成し、場合によっては、細胞の内因性機構を利用して、相同組み換え（ＨＲ）および／または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の天然プロセスによる誘導された切断を修復する。遺伝子編集エフェクターとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系）、およびメガヌクレアーゼ（例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼとして再操作されたメガヌクレアーゼ）が挙げられる。この用語はまた、例えば、変化が欠失または比較的小さい挿入（典型的には２０ｎｔ未満）であり、かつ／または外来種からＤＮＡを導入しない場合を含む、トランスジェニック手順および技術の使用も含む。この用語はまた、初期遺伝子編集動物からの性交または無性増殖によって作成されたものなどの子孫動物も包含する。
【００２９】
「ゲノム操作する」、「遺伝子操作する」、「遺伝子操作された」、「遺伝子改変された」、「遺伝子改変」、「ゲノム修飾」、「ゲノム修飾」、および「ゲノム修飾された」という用語は、特定の核酸配列を欠失、挿入、突然変異、または置換することによってゲノムを改変することを指し得る。改変は、遺伝子または位置特異的であり得る。ゲノム操作は、ヌクレアーゼを使用して核酸を切断し、それによって改変のための部位を生成することができる。非ゲノム核酸の操作も企図される。ヌクレアーゼドメインを含有するタンパク質は、核酸標的化核酸と複合体を形成することによって標的核酸に結合し、切断することができる。一例では、切断は、標的核酸中に二本鎖切断を導入することができる。核酸は、例えば、内因性非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構によって修復することができる。さらなる例では、核酸片を挿入することができる。核酸標的化核酸および部位特異的ポリペプチドの修飾は、ゲノム操作のために使用される新しい機能を導入することができる。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「ホーミングＤＮＡ技術」、「ホーミング技術」、および「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、指定された分子が、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）メガヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系）を含む指定されたＤＮＡ配列を標的とすることを可能にする任意の機序を含む。
【００３１】
本明細書における「抵抗性の増加」および「感受性の低減」という用語は、限定されないが、病原体感染に関連する臨床徴候または臨床症状の発生率および／または重症度の統計的に有意な低減を意味する。例えば、「抵抗性の増加」または「感受性の低減」は、未修飾染色体配列を有する対照動物と比較して、ＣＤ１６３遺伝子タンパク質中の修飾染色体配列を含む動物におけるＰＲＲＳＶ感染に関連する臨床徴候または臨床症状の発生率および／または重症度の統計的に有意な低減を指し得る。「臨床症状の統計的に有意な低減」という用語は、限定されないが、修飾された対象群における少なくとも１つの臨床症状の発生率が、感染性薬剤による曝露後の非修飾対照群よりも少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％低いことを意味する。
【００３２】
「ノックアウト」とは、遺伝子の構造または調節機構の破壊を意味する。ノックアウトは、標的化ベクター、置換ベクター、もしくはヒット・アンド・ランベクターの相同組み換え、または遺伝子トラップベクターのランダム挿入によって生成されてもよく、遺伝子機能の完全、部分的、または条件付きの喪失をもたらす。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「突然変異」という用語は、野生型配列と比較した、例えば、遺伝子またはコードＤＮＡ配列（ＣＤＳ）などのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の改変を含む。この用語は、限定されないが、置換、挿入、フレームシフト、欠失、反転、転座、重複、スプライスドナー部位突然変異、点突然変異等を含む。
【００３４】
本明細書において、「臨床徴候の発生率および／または重症度の低減」または「臨床症状の低減」とは、限定されないが、野生型感染と比較して、群内の感染対象の数を低減すること、感染の臨床徴候を示す対象の数を低減もしくは排除すること、または１つ以上の対象に存在する任意の臨床徴候の重症度を低減することを意味する。例えば、これらの用語は、感染症の任意の臨床徴候、肺病理学、ウイルス血症、抗体産生、病原体負荷の低減、病原体の脱落、病原体伝達の低減、またはＰＲＲＳＶの症状である任意の臨床徴候の低減を包含する。好ましくは、これらの臨床徴候は、ＣＤ１６３遺伝子に修飾を有しない、感染した対象と比較して、本発明の１匹以上の動物において少なくとも１０％低減される。より好ましくは、本発明の対象において、臨床徴候は少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％低減される。
【００３５】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、その同族標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥの結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には３３〜３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともいくらかの配列相同性を示す。ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、所定のヌクレオチド配列に結合するように、例えば、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識らせん領域の操作（１つ以上のアミノ酸の改変）を介して「操作」することができる。したがって、操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、非天然に存在するタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が主に合理的な基準から生じる、自然に存在しないタンパク質である。設計のための合理的な基準は、既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計および結合データの情報を記憶するデータベース内の情報を処理するための置換ルールおよびコンピューター化アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。またＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６、およびＷＯ０３／０１６４９６、ならびに米国公開第２０１１／０３０１０７３号も参照されたい。
【００３６】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、１つ以上のジンクフィンガーを通じて配列特異的にＤＮＡに結合するタンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインであり、これは、亜鉛イオンの配位によって構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。
【００３７】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、自然に見出されないタンパク質であり、その産生は、主にファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択などの経験過程から生じる。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号、米国特許第５，９２５，５２３号、米国特許第６，００７，９８８号、米国特許第６，０１３，４５３号、米国特許第６，２００，７５９号、ＷＯ９５／１９４３１、ＷＯ９６／０６１６６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ９８／５４３１１、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／６０９７０、０１／８８１９７、ＷＯ０２／０９９０８４、および米国公開第２０１１／０３０１０７３号を参照されたい。
【００３８】
以下に、様々な他の用語が定義される。
【００３９】
ブタ胎児をＰＲＲＳＶ感染から保護するための方法
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）感染からブタ胎児を保護するための方法が提供される。この方法は、雌ブタ動物を雄ブタ動物と繁殖させることを含む。雌ブタ動物は、そのＣＤ１６３遺伝子の両方のアレルに修飾染色体配列を含み、修飾染色体配列は、そのＣＤ１６３遺伝子のアレルにいかなる修飾染色体配列も含まない雌ブタ動物のＰＲＲＳＶ感染に対する感受性と比較して、雌ブタ動物のＰＲＲＳＶ感染に対する感受性を低減する。雄ブタ動物は、少なくとも１つの野生型ＣＤ１６３アレルを含む。
【００４０】
本明細書に記載される方法において、修飾染色体配列は、ＰＲＲＳＶ感染に関連するＣＤ１６３タンパク質機能が損なわれる、低減される、または排除されるように改変される配列であり得る。したがって、本明細書に記載される方法で使用される雌ブタ動物は、「ノックアウト」動物と称され得る。
【００４１】
雄ブタ動物は、２つの野生型ＣＤ１６３アレルを含むことができる。
【００４２】
本明細書で使用される「野生型ＣＤ１６３アレル」という用語は、ＣＤ１６３アレルの配列が、自然に見出される配列であること、またはＣＤ１６３アレルの配列が、ＣＤ１６３活性を実質的に損なわない１つ以上の突然変異（例えば、挿入、欠失、もしくは置換）を含むことを意味する。したがって、野生型ＣＤ１６３アレルは、それらの多型または突然変異が実質的にＣＤ１６３活性を損なわない限り、多型および／または突然変異を含み得る。
【００４３】
本明細書に記載される方法を使用して、胎児は、種々の１型および２型ＰＲＲＳＶ分離株を含む、１型および２型ＰＲＲＳＶウイルスの両方から保護される。
【００４４】
したがって、本明細書に記載される方法において、修飾染色体配列は、１型ＰＲＲＳＶウイルス、２型ＰＲＲＳＶ、または１型および２型ＰＲＲＳＶウイルスの両方に対する雌ブタ動物の感受性を低減することができる。
【００４５】
修飾染色体配列は、ＮＶＳＬ  ９７−７８９５、ＫＳ０６−７２１０９、Ｐ１２９、ＶＲ２３３２、ＣＯ９０、ＡＺ２５、ＭＬＶ−ＲｅｓＰＲＲＳ、ＫＳ６２−０６２７４、ＫＳ４８３（ＳＤ２３９８３）、ＣＯ８４、ＳＤ１３−１５、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、０３−１０５９、０３−１０６０、ＳＤ０１−０８、４３５３ＰＺ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＰＲＲＳＶ分離株に対する雌ブタ動物の感受性を低減することができる。
【００４６】
雌ブタ動物は、遺伝子編集された雌ブタ動物を含むことができる。
【００４７】
遺伝子編集された雌ブタ動物は、ホーミングエンドヌクレアーゼを使用して編集された動物であり得る。ホーミングエンドヌクレアーゼは、天然に存在するエンドヌクレアーゼであってもよいが、好ましくは、エンドヌクレアーゼがＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の染色体配列を標的とするように設計されたＤＮＡ認識配列を有する合理的に設計された非天然に存在するホーミングエンドヌクレアーゼである。
【００４８】
したがって、ホーミングエンドヌクレアーゼは、設計されたホーミングエンドヌクレアーゼであり得る。ホーミングエンドヌクレアーゼは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）系、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、リコンビナーゼ融合タンパク質、メガヌクレアーゼ、またはそれらのいずれかの組み合わせを含み得る。
【００４９】
ホーミングヌクレアーゼは、好ましくはＣＲＩＳＰＲ系を含む。本明細書に記載される方法で使用するための雌ブタ動物を作成するために使用することができるＣＲＩＳＰＲ系の例としては、限定されないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ５、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ６が挙げられる。遺伝子編集された動物を生成するためのＣＲＩＳＰＲ系の使用は、以下でさらに論じられる。
【００５０】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、雌ブタ動物は、ＣＤ１６３遺伝子の両方のアレルにおいて同じ修飾染色体配列を含むことができる。
【００５１】
代替的に、雌ブタ動物は、ＣＤ１６３遺伝子の第１のアレルに第１の修飾染色体配列と、ＣＤ１６３遺伝子の第２のアレルに第２の修飾染色体配列と、を含み、第１および第２の修飾染色体配列は互いに異なる。
【００５２】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、雌ブタ動物のＣＤ１６３遺伝子の各アレルは、挿入、欠失、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【００５３】
例えば、雌ブタ動物のＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つのアレルは、欠失を含むことができる。
【００５４】
ＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つのアレルは、フレーム内欠失を含むことができる。
【００５５】
雌ブタ動物のＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つのアレルは、挿入を含むことができる。
【００５６】
本明細書に記載される方法において、修飾染色体配列は、好ましくは、修飾染色体配列を欠く雌ブタ動物におけるＣＤ１６３タンパク質産生または活性と比較して、ＣＤ１６３タンパク質産生または活性を低減する。
【００５７】
好ましくは、修飾染色体配列は、雌ブタ動物による機能性ＣＤ１６３タンパク質の産生を実質的にもたらさない。「実質的に機能性ＣＤ１６３タンパク質がない」とは、動物、子孫、または細胞内のＣＤ１６３タンパク質のレベルが検出不可能であるか、または検出可能である場合、修飾染色体配列を含まない動物、子孫、または細胞内で観察されるレベルよりも少なくとも約９０％低い、好ましくは少なくとも約９５％低い、より好ましくは少なくとも約９８％低い、およびさらにより好ましくは少なくとも約９９％低いことを意味する。
【００５８】
例えば、本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、雌ブタ動物は、ＣＤ１６３タンパク質を産生しない。
【００５９】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、雌ブタ動物のＣＤ１６３遺伝子の各アレルは、エクソン７における修飾、エクソン８における修飾、エクソン７もしくはエクソン８と連続するイントロンにおける修飾、またはそれらのいずれかの組み合わせを含むことができる。
【００６０】
例えば、雌ブタ動物のＣＤ１６３遺伝子の一方または両方のアレルは、ＣＤ１６３遺伝子のエクソン７における修飾を含むことができる。
【００６１】
エクソン７における修飾は、欠失を含むことができる。
【００６２】
雌ブタ動物のＣＤ１６３遺伝子のアレルが欠失を含む、本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、欠失は、フレーム内欠失を含むことができる。
【００６３】
エクソン７における修飾は、挿入を含むことができる。
【００６４】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、雌ブタ動物のＣＤ１６３遺伝子の一方または両方のアレルにおける修飾染色体配列は、ミスコードをもたらし得る。
【００６５】
修飾染色体配列がＣＤ１６３遺伝子のアレルにおけるミスコードをもたらす場合、ミスコードは、ＣＤ１６３遺伝子のアレルにおけるミスコードの下流に未成熟終止コドンをもたらし得る。
【００６６】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、雌ブタ動物におけるＣＤ１６３遺伝子のアレルのうちの少なくとも１つは、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対挿入、および同じアレル上の参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４７までの１２４塩基対欠失、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの１２３塩基対欠失、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４７と３，１４８との間の１塩基対挿入、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１５９までの１３０塩基対欠失、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１６１までの１３２塩基対欠失、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド１，５２５からヌクレオチド３，０３０までの１５０６塩基対欠失、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９との間の７塩基対挿入、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対欠失、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの１３７３塩基対欠失、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対欠失、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失（欠失配列は、ヌクレオチド４８８で始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７にさらなる１２９塩基対欠失が存在する）、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの２８塩基対欠失、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対欠失、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失（欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対挿入で置き換えられる）、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの１７２０塩基対欠失、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの４５２塩基対欠失、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される修飾を含む。
【００６７】
雌ブタ動物におけるＣＤ１６３遺伝子のアレルのうちの少なくとも１つは、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失を含むことができる。
【００６８】
雌ブタ動物におけるＣＤ１６３遺伝子のアレルのうちの少なくとも１つは、同じアレル上の参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失とともに、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対挿入を含むことができる。
【００６９】
修飾が、同じアレル上の参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失とともに、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対挿入を含む場合、この２塩基対挿入は、ジヌクレオチドＡＧを含み得る。
【００７０】
雌ブタ動物におけるＣＤ１６３遺伝子のアレルのうちの少なくとも１つは、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４７までの１２４塩基対欠失を含むことができる。
【００７１】
雌ブタ動物におけるＣＤ１６３遺伝子のアレルのうちの少なくとも１つは、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの１２３塩基対欠失を含むことができる。
【００７２】
雌ブタ動物におけるＣＤ１６３遺伝子のアレルのうちの少なくとも１つは、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４７と３，１４８との間に１塩基対挿入を含むことができる。
【００７３】
修飾が、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４７と３，１４８との間に１塩基対挿入を含む場合、この１塩基対挿入は、単一のアデニン残基を含み得る。
【００７４】
雌ブタ動物におけるＣＤ１６３遺伝子のアレルのうちの少なくとも１つは、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１５９までの１３０塩基対欠失を含むことができる。
【００７５】
雌ブタ動物におけるＣＤ１６３遺伝子のアレルのうちの少なくとも１つは、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１６１までの１３２塩基対欠失を含むことができる。
【００７６】
雌ブタ動物におけるＣＤ１６３遺伝子のアレルのうちの少なくとも１つは、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド１，５２５からヌクレオチド３，０３０までの１５０６塩基対欠失を含むことができる。
【００７７】
雌ブタ動物におけるＣＤ１６３遺伝子のアレルの少なくとも１つは、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９との間に７塩基対挿入を含むことができる。
【００７８】
修飾が、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９との間に７塩基対挿入を含む場合、この７塩基対挿入は、配列ＴＡＣＴＡＣＴ（配列番号１１５）を含み得る。
【００７９】
雌ブタ動物におけるＣＤ１６３遺伝子のアレルのうちの少なくとも１つは、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対欠失を含むことができる。
【００８０】
雌ブタ動物におけるＣＤ１６３遺伝子のアレルのうちの少なくとも１つは、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの１３７３塩基対欠失を含むことができる。
【００８１】
雌ブタ動物におけるＣＤ１６３遺伝子のアレルのうちの少なくとも１つは、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対欠失を含むことができる。
【００８２】
雌ブタ動物におけるＣＤ１６３遺伝子のアレルの少なくとも１つは、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失を含むことができ、欠失配列は、ヌクレオチド４８８から始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、参照配列番号４７と比較してエクソン７にヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのさらなる１２９塩基対欠失がある。
【００８３】
修飾が、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対欠失を含み、欠失した配列が、ヌクレオチド４８８から始まる１２塩基対挿入で置き換えられ、参照配列番号４７と比較してエクソン７中にヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのさらなる１２９塩基対欠失がある場合、１２塩基対挿入は、配列ＴＧＴＧＧＡＧＡＡＴＴＣ（配列番号１１６）を含むことができる。
【００８４】
雌ブタ動物におけるＣＤ１６３遺伝子のアレルのうちの少なくとも１つは、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの２８塩基対欠失を含むことができる。
【００８５】
雌ブタ動物におけるＣＤ１６３遺伝子のアレルのうちの少なくとも１つは、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対欠失を含むことができる。
【００８６】
雌ブタ動物におけるＣＤ１６３遺伝子のアレルのうちの少なくとも１つは、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失を含むことができ、欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対挿入で置き換えられる。
【００８７】
修飾が、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失を含み、欠失した配列が、ヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対挿入で置き換えられる場合、１１塩基対挿入は、配列ＡＧＣＣＡＧＣＧＴＧＣ（配列番号１１７）を含むことができる。
【００８８】
雌ブタ動物におけるＣＤ１６３遺伝子のアレルのうちの少なくとも１つは、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの１７２０塩基対欠失を含むことができる。
【００８９】
雌ブタ動物におけるＣＤ１６３遺伝子のアレルのうちの少なくとも１つは、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの４５２塩基対欠失を含むことができる。
【００９０】
例えば、雌ブタ動物におけるＣＤ１６３遺伝子のアレルのうちの少なくとも１つは、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９との間の７塩基対挿入、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対挿入、同じアレル上の参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失（欠失配列は、ヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対挿入で置き換えられる）からなる群から選択される修飾、およびそれらのいずれかの組み合わせを含む。
【００９１】
雌ブタ動物におけるＣＤ１６３遺伝子は、本明細書に記載される修飾染色体配列の任意の組み合わせを含むことができる。
【００９２】
例えば、雌ブタ動物は、ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルに、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９との間の７塩基対挿入、およびＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルに、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失とともに、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対挿入を含むことができる。
【００９３】
雌ブタ動物は、ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルに、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失（欠失配列は、ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルにおいてヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対挿入で置き換えられる）、およびＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルに、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失とともに、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対挿入を含むことができる。
【００９４】
雌ブタ動物は、ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルに、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９との間の７塩基対挿入、およびＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルに、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失を含むことができる。
【００９５】
雌ブタ動物は、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対欠失（欠失配列は、ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルにおいてヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対挿入で置き換えられる）、ＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルに、参照配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失を含むことができる。
【００９６】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、雌ブタ動物のＣＤ１６３遺伝子のアレルは、挿入または欠失の外側の当該染色体配列の領域に、配列番号４７と少なくとも８０％の配列同一性を有する染色体配列を含むことができる。
【００９７】
雌ブタ動物のＣＤ１６３遺伝子のアレルは、挿入または欠失の外側の当該染色体配列の領域に、配列番号４７と少なくとも８５％の配列同一性を有する染色体配列を含むことができる。
【００９８】
雌ブタ動物のＣＤ１６３遺伝子のアレルは、挿入または欠失の外側の当該染色体配列の領域に、配列番号４７と少なくとも９０％の配列同一性を有する染色体配列を含むことができる。
【００９９】
雌ブタ動物のＣＤ１６３遺伝子のアレルは、挿入または欠失の外側の当該染色体配列の領域に、配列番号４７と少なくとも９５％の配列同一性を有する染色体配列を含むことができる。
【０１００】
雌ブタ動物のＣＤ１６３遺伝子のアレルは、挿入または欠失の外側の当該染色体配列の領域に、配列番号４７と少なくとも９８％の配列同一性を有する染色体配列を含むことができる。
【０１０１】
雌ブタ動物のＣＤ１６３遺伝子のアレルは、挿入または欠失の外側の当該染色体配列の領域に、配列番号４７と少なくとも９９％の配列同一性を有する染色体配列を含むことができる。
【０１０２】
雌ブタ動物のＣＤ１６３遺伝子のアレルは、挿入または欠失の外側の当該染色体配列の領域において、配列番号４７と少なくとも９９．９％の配列同一性を有する染色体配列を含むことができる。
【０１０３】
雌ブタ動物のＣＤ１６３遺伝子のアレルは、挿入または欠失の外側の当該染色体配列の領域に、配列番号４７と少なくとも１００％の配列同一性を有する染色体配列を含むことができる。
【０１０４】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、雌ブタ動物は、ＣＤ１６３遺伝子の一方または両方のアレルに配列番号９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、または１１９を含む染色体配列を含むことができる。
【０１０５】
例えば、雌ブタ動物は、ＣＤ１６３遺伝子の一方または両方のアレルに配列番号９９、１０２、１０３、または１１３を含む染色体配列を含むことができる。
【０１０６】
雌ブタ動物におけるＣＤ１６３遺伝子のアレルは、配列番号９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、または１１９を含む染色体配列の任意の組み合わせを含むことができる。したがって、雌ブタ動物は、ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルに、配列番号９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、または１１９のうちのいずれか１つを含む染色体配列、およびＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルに、配列番号９８、９９、１００、１０１、１０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、または１１９のうちのいずれか１つを含む染色体配列を含むことができる。
【０１０７】
例えば、雌ブタ動物は、ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルに配列番号９９を含む染色体配列、およびＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルに配列番号１０３を含む、染色体配列を含むことができる。
【０１０８】
雌ブタ動物は、ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルに配列番号１１３を含む染色体配列、およびＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルに配列番号９９を含む染色体配列を含むことができる。
【０１０９】
雌ブタ動物は、ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルに配列番号９９を含む染色体配列、およびＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルに配列番号１０２を含む染色体配列を含むことができる。
【０１１０】
雌ブタ動物は、ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルに配列番号１１３を含む染色体配列、およびＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルに配列番号１０２を含む染色体配列を含むことができる。
【０１１１】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、繁殖は、ＣＤ１６３遺伝子の単一アレル内に修飾染色体配列を含む、１体以上の胎児を産生する。本明細書に記載される方法で使用される雌ブタ動物は、そのＣＤ１６３遺伝子の両方のアレルにおける修飾染色体配列を含むため、雌ブタ動物を、少なくとも１つの野生型ＣＤ１６３アレルを含む雄ブタ動物と繁殖させることは、雌ブタ動物からの修飾染色体配列を含むＣＤ１６３アレル、および雄ブタ動物からの野生型ＣＤ１６３アレルを遺伝した胎児を産生する。したがって、この繁殖は、修飾ＣＤ１６３染色体配列に対してヘテロ接合性である胎児を産生する。雄動物が２つの野生型ＣＤ１６３アレルを含む場合、繁殖の結果として産生される胎児のすべては、修飾ＣＤ１６３染色体配列に対してヘテロ接合性となる。
【０１１２】
繁殖によって産生された胎児は、野生型雌ブタ動物における子宮内の胎児と比較して、子宮内でのＰＲＲＳＶ感染に対する感受性を低減するであろう。
【０１１３】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、繁殖は、雌ブタ動物と雄ブタ動物との交配（交尾）を含むことができる。
【０１１４】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、繁殖は、雄動物から得られる精子を用いた雌動物の人工授精を含むことができる。
【０１１５】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおいて、繁殖は、受精卵を雌ブタ動物の生殖管に移すことを含むことができる。
【０１１６】
繁殖が、受精卵を雌ブタ動物の生殖管に移すことを含む方法において、受精卵は、雄ブタ動物から得られる精子を用いた卵母細胞のインビトロ受精によって生成することができる。
【０１１７】
インビトロ受精は、雄ブタ動物から得られる精子を用いた卵母細胞の細胞質内注入を含むことができる。
【０１１８】
繁殖が受精卵を雌ブタ動物の生殖管に移すことを含む場合、卵母細胞は、そのＣＤ１６３遺伝子の両方のアレルにおける修飾染色体配列を含むように、雌ブタ動物に由来する卵母細胞であり得る。代替的に、卵母細胞は、そのＣＤ１６３遺伝子の両方のアレルにおける修飾染色体配列を含む異なる雌ブタ動物に由来する卵母細胞であってもよく、修飾染色体配列は、そのＣＤ１６３遺伝子のアレルにおけるいかなる修飾染色体配列も含まない雌ブタ動物のＰＲＲＳＶ感染に対する感受性と比較して、動物のＰＲＲＳＶ感染に対する感受性を低減する。したがって、例えば、そのＣＤ１６３遺伝子の両方のアレルに修飾染色体配列を有する任意の卵母細胞（例えば、Ｃ１６３遺伝子の両方のアレルのノックアウト）を使用することができる。
【０１１９】
しかしながら、繁殖が受精卵を雌ブタ動物の生殖路に移すことを含む場合、卵母細胞は、そのＣＤ１６３遺伝子のアレル内に任意の修飾染色体配列を含む必要はない。２つの野生型ＣＤ１６３アレルを含有する卵母細胞を使用することができる。２つの野生型ＣＤ１６３アレルを含有する卵母細胞は、雄ブタ動物から得られた精子で受精することができ、精子は２つの野生型ＣＤ１６３アレルを含み、２つの野生型ＣＤ１６３アレルを含有する受精卵細胞を作成する。そのような受精卵細胞（２つの野生型ＣＤ１６３アレルを含む）が、そのＣＤ１６３遺伝子の両方のアレルにおける修飾染色体配列を含む雌ブタ動物の生殖管に移される場合、得られた胎児は、ＰＲＲＳＶ感染から保護される。
【０１２０】
代替的に、繁殖が受精卵を雌ブタ動物の生殖管に移すことを含む場合、受精卵は、そのＣＤ１６３遺伝子の単一アレル内に修飾染色体配列を含むことができる。そのような受精卵はまた、そのＣＤ１６３遺伝子の両方のアレルにおける修飾染色体配列を含む雌ブタ動物の生殖路に受精卵を移すときにＰＲＲＳＶ感染から保護される胎児を産生する。
【０１２１】
したがって、繁殖が雌ブタ動物の生殖路に受精卵を移すことを含む場合、受精卵は、そのＣＤ１６３遺伝子の両方のアレルにおける修飾染色体配列を含むことができる（例えば、そのＣＤ１６３遺伝子の両方のアレルのノックアウト）、そのＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルのみに修飾染色体配列を含むことができる、または野生型ＣＤ１６３アレルのみを含むことができる。
【０１２２】
親和性タグ
「親和性タグ」は、ペプチド親和性タグまたは核酸親和性タグのいずれかであり得る。「親和性タグ」という用語は、概して、分子に結合し得る（例えば、小分子、タンパク質、または共有結合によって結合し得る）タンパク質または核酸配列を指す。親和性タグは、非天然配列であり得る。ペプチド親和性タグは、ペプチドを含むことができる。ペプチド親和性タグは、分割系の一部となり得るものであり得る（例えば、２つの不活性ペプチド断片は、トランスで一緒に結合して、活性親和性タグを形成することができる）。核酸親和性タグは、核酸を含むことができる。核酸親和性タグは、（例えば、ハイブリダイゼーションを通じて）既知の核酸配列に選択的に結合することができる配列であり得る。核酸親和性タグは、タンパク質に選択的に結合することができる配列であり得る。親和性タグは、天然タンパク質に融合され得る。親和性タグは、ヌクレオチド配列に融合され得る。
【０１２３】
場合によっては、１つ、２つ、または複数の親和性タグを天然タンパク質またはヌクレオチド配列に融合することができる。インビトロまたはインビボ転写の方法を使用して、親和性タグを核酸標的化核酸に導入することができる。核酸親和性タグは、例えば、化学タグ、ＲＮＡ結合タンパク質結合配列、ＤＮＡ結合タンパク質結合配列、親和性タグ付きポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列、合成ＲＮＡアプタマー、または合成ＤＮＡアプタマーを含み得る。化学核酸親和性タグの例としては、限定されないが、ビオチン、蛍光染料、ジゴキセギニンを含有するリボヌクレオトリホスフェートが挙げられる。タンパク質結合核酸親和性タグの例としては、限定されないが、ＭＳ２結合配列、Ｕ１Ａ結合配列、ステムループ結合タンパク質配列、ｂｏｘＢ配列、ｅＩＦ４Ａ配列、またはＲＮＡ結合タンパク質によって認識される任意の配列が挙げられる。核酸親和性タグ付きオリゴヌクレオチドの例としては、限定されないが、ビオチン化オリゴヌクレオチド、２，４−ジニトロフェニルオリゴヌクレオチド、フルオレセインオリゴヌクレオチド、および一次アミン共役オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１２４】
核酸親和性タグは、ＲＮＡアプタマーであり得る。アプタマーとしては、テオフィリン、ストレプトアビジン、デキストランＢ５１２、アデノシン、グアノシン、グアニン／キサンチン、７−メチル−ＧＴＰに結合するアプタマー、アルギニン、シトルリン、バリン、トリプトファン、シアノコバラミン、Ｎ−メチルメソポルフィリンＩＸ、フラビン、ＮＡＤに結合するアプタマーなどのアミノ酸アプタマー、およびトブラマイシン、ネオマイシン、リビドマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ビオマイシン、およびクロラムフェニコールに結合するアプタマーなどの抗生物質アプタマーが挙げられる。
【０１２５】
核酸親和性タグは、部位特異的ポリペプチドによって結合することができるＲＮＡ配列を含むことができる。部位特異的ポリペプチドは、条件的に酵素的に不活性であり得る。ＲＮＡ配列は、Ｉ型、ＩＩ型、および／またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のメンバーによって結合することができる配列を含み得る。ＲＮＡ配列は、ＲＡＭＰファミリーメンバータンパク質によって結合することができる。ＲＮＡ配列は、Ｃａｓ９ファミリーメンバータンパク質、Ｃａｓ６ファミリーメンバータンパク質（例えばＣｓｙ４、Ｃａｓ６）によって結合することができる。ＲＮＡ配列は、Ｃａｓ５ファミリーメンバータンパク質（例えば、Ｃａｓ５）によって結合することができる。例えば、Ｃｓｙ４は、高親和性（Ｋｄ約５０ｐＭ）で特定のＲＮＡヘアピン配列に結合することができ、ヘアピンに対する部位３’においてＲＮＡを切断することができる。
【０１２６】
核酸親和性タグは、部位特異的ポリペプチドによって結合することができるＤＮＡ配列を含むことができる。部位特異的ポリペプチドは、条件的に酵素的に不活性であり得る。ＤＮＡ配列は、Ｉ型、ＩＩ型、および／またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のメンバーによって結合することができる配列を含むことができる。ＤＮＡ配列は、アルゴノートタンパク質によって結合することができる。ＤＮＡ配列は、ジンクフィンガードメイン、ＴＡＬＥドメイン、または任意の他のＤＮＡ結合ドメインを含有するタンパク質によって結合することができる。
【０１２７】
核酸親和性タグは、リボザイム配列を含むことができる。好適なリボザイムとしては、ペプチジルトランスフェラーゼ２３  ＳｒＲＮＡ、ＲｎａｓｅＰ、グループＩイントロン、グループＩＩイントロン、ＧＩＲ１分岐リボザイム、リードザイム、ヘアピンリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ＨＤＶリボザイム、ＣＰＥＢ３リボザイム、ＶＳリボザイム、ｇｌｍＳリボザイム、ＣｏＴＣリボザイム、および合成リボザイムが挙げられる。
【０１２８】
ペプチド親和性タグは、追跡または精製に使用することができるタグ（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏなどの蛍光タンパク質；Ｈｉｓタグ（例えば、６ＸＨｉｓタグ）；ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグ；ＧＳＴタグ；ＭＢＰタグ；キチン結合タンパク質タグ；カルモジュリンタグ；Ｖ５タグ；ストレプトアビジン結合タグ等）を含むことができる。
【０１２９】
核酸およびペプチド親和性タグの両方は、ビオチンまたはジギトキシンなどの小分子タグ、および例えば、フルオロセイン、ローダミン、アレクサフルオロ色素、シアニン３色素、シアニン５色素などの蛍光標識タグを含むことができる。
【０１３０】
核酸親和性タグは、核酸（例えば、核酸標的化核酸）に対して５’に位置することができる。核酸親和性タグは、核酸に対して３’に位置することができる。核酸親和性タグは、核酸に対して５’および３’に位置することができる。核酸親和性タグは、核酸内に位置することができる。ペプチド親和性タグは、ポリペプチド配列に対してＮ末端に位置することができる。ペプチド親和性タグは、ポリペプチド配列に対してＣ末端に位置することができる。ペプチド親和性タグは、ポリペプチド配列に対してＮ末端およびＣ末端に位置することができる。複数の親和性タグは、核酸および／またはポリペプチド配列に融合することができる。
【０１３１】
捕捉剤
本明細書で使用される場合、「捕捉剤」は、一般に、ポリペプチドおよび／または核酸を精製することができる薬剤を指し得る。捕捉剤は、生物学的に活性な分子または物質であり得る（例えば、自然にまたは合成に見出される任意の生物学的物質であり、限定されないが、細胞、ウイルス、細胞下粒子、タンパク質が挙げられ、より具体的には、抗体、免疫グロブリン、抗原、リポタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質複合体、（ストレプト）アビジン−ビオチン複合体、リガンド、受容体、または小分子、アプタマー、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、オリゴ糖、多糖、脂質多糖、細胞代謝物、ハプテン、薬理学的に活性な物質、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、および糖を含む。いくつかの実施形態では、捕捉剤は、親和性タグを含むことができる。いくつかの実施形態では、捕捉剤は、目的の標的ポリペプチドまたは核酸に優先的に結合することができる。捕捉剤は、混合物中に自由に浮遊することができる。捕捉剤は、粒子（例えば、ビーズ、マイクロビーズ、ナノ粒子）に結合することができる。捕捉剤は、固体表面または半固体表面に結合することができる。いくつかの場合において、捕捉剤は、標的に不可逆的に結合される。他の場合において、捕捉剤は、標的に可逆的に結合する（例えば、標的が溶出可能である場合、またはイミダゾールなどの化学物質の使用によって）。
【０１３２】
ＤＮＡ結合ポリペプチド
部位特異的組み込みは、例えば、宿主生物のゲノムにおいて、特定のヌクレオチド配列を認識し、それに結合することが可能な因子を使用することによって達成することができる。例えば、多くのタンパク質は、部位特異的な方法でＤＮＡを認識し、それに結合することが可能なポリペプチドドメインを含む。ＤＮＡ結合ポリペプチドによって認識されるＤＮＡ配列は、「標的」配列と称され得る。部位特異的な方法でＤＮＡを認識し、それに結合することが可能なポリペプチドドメインは、ドメインが元々単離されたタンパク質以外のポリペプチドで発現しても、概して正しく折り畳まれ、部位特異的な方法でＤＮＡに結合するように独立して機能する。同様に、ＤＮＡ結合ポリペプチドによる認識および結合のための標的配列は、特に標的配列が位置する部位が可溶性細胞タンパク質（例えば、遺伝子）にアクセス可能であることが知られている部位である場合に、大きなＤＮＡ構造（例えば、染色体）に存在する場合でも、概して、そのようなポリペプチドによって認識および結合することができる。
【０１３３】
天然に存在するタンパク質から同定されるＤＮＡ結合ポリペプチドは、典型的には、別個のヌクレオチド配列またはモチーフ（例えば、コンセンサス認識配列）に結合するが、異なるヌクレオチド配列またはモチーフを認識するために多くのそのようなＤＮＡ結合ポリペプチドを修飾するための方法が存在し、当該技術分野において既知である。ＤＮＡ結合ポリペプチドとしては、例えば、限定されないが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパー、ＵＰＡ  ＤＮＡ結合ドメイン、ＧＡＬ４、ＴＡＬ、ＬｅｘＡ、Ｔｅｔリプレッサー、ＬａｃＩ、およびステロイドホルモン受容体が挙げられる。
【０１３４】
例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ジンクフィンガーであり得る。個々のジンクフィンガーモチーフは、ロングレンジのＤＮＡ部位のいずれかを標的とし、特異的に結合するように設計することができる。正準Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２（および非正準Ｃｙｓ３Ｈｉｓ）ジンクフィンガーポリペプチドは、標的ＤＮＡ二重らせんの主要溝にαらせんを挿入することによってＤＮＡに結合する。ジンクフィンガーによるＤＮＡの認識はモジュラーであり、各フィンガーは、主に標的における３つの連続する塩基対、およびポリペプチド媒介認識におけるいくつかの重要な残基と接触する。標的化エンドヌクレアーゼに複数のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含めることによって、標的化エンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性がさらに増加し得る（したがって、それによって付与される任意の遺伝子調節効果の特異性も増加し得る）。例えば、Ｕｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：６４６−５１を参照されたい。したがって、宿主細胞に導入される標的化エンドヌクレアーゼが宿主細胞のゲノム内で固有であるＤＮＡ配列と相互作用するように、１つ以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合ポリペプチドを操作し、利用してもよい。
【０１３５】
好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択される標的部位に結合するように操作されるという点で非天然に存在する。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１、Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０３０，２１５号、同第６，７９４，１３６号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，０７０，９３４号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２５３，２７３号、および米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００５／０２６７０６１号を参照されたい。
【０１３６】
操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有することができる。操作方法としては、限定されないが、合理的な設計および様々なタイプの選択が挙げられる。合理的な設計は、例えば、三重鎖（または四重鎖）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、各三重鎖または四重鎖ヌクレオチド配列は、特定の三重鎖または四重鎖配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と会合する。例えば、米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。
【０１３７】
ファージディスプレイおよび２つのハイブリッド系を含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号、ならびにＷＯ９８／３７１８６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／８８１９７、およびＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、ＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
【０１３８】
加えて、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／または多指ジンクフィンガータンパク質は、例えば、５アミノ酸長以上のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を使用して一緒に連結されてもよい。例示的なリンカー配列６アミノ酸長以上については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。
【０１３９】
標的部位の選択：ＺＦＰおよび融合タンパク質（およびそれらをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に既知であり、米国特許第６，１４０，０８１号、同第５，７８９，５３８号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、ＷＯ９５／１９４３１、ＷＯ９６／０６１６６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ９８／５４３１１、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／６０９７０、ＷＯ０１／８８１９７、ＷＯ０２／０９９０８４、ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６、およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されている。
【０１４０】
加えて、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／または多指ジンクフィンガータンパク質は、例えば、５アミノ酸長以上のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を使用して一緒に連結されてもよい。例示的なリンカー配列６アミノ酸長以上については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。
【０１４１】
本明細書に記載される方法で使用するためのブタ雌動物が、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して遺伝子編集されている場合、雌動物は、標的ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子、および任意に、少なくとも１つのアクセサリーポリヌクレオチドを胚または細胞に導入することを含むプロセスを使用して作成することができる。この方法は、胚または細胞をインキュベートして、ジンクフィンガーヌクレアーゼの発現を可能にすることをさらに含み、ジンクフィンガーヌクレアーゼによって標的染色体配列に導入される二本鎖切断は、エラーが生じやすい非相同末端結合ＤＮＡ修復プロセスまたは相同性指向ＤＮＡ修復プロセスによって修復される。標的ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術を使用して生殖細胞系発達に関連するタンパク質をコードする染色体配列を編集する方法は、迅速、正確、かつ非常に効率的である。
【０１４２】
代替的に、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ＧＡＬ４由来のＤＮＡ結合ドメインである。ＧＡＬ４は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるモジュラートランスアクチベーターであるが、他の多くの生物においてトランスアクチベーターとしても機能する。例えば、Ｓａｄｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：５６３−４を参照されたい。この調節系において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるガラクトース代謝経路の酵素をコードする遺伝子の発現は、利用可能な炭素源によって厳密に調節される。Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（１９８７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５１：４５８−７６。これらの代謝酵素の転写制御は、陽性調節タンパク質ＧＡＬ４と、ＧＡＬ４が特異的に結合する１７ｂｐの対称ＤＮＡ配列（上流活性化配列（ＵＡＳ））との間の相互作用によって媒介される。
【０１４３】
天然ＧＡＬ４は、９９ｋＤａの分子量を有する８８１アミノ酸残基からなる。ＧＡＬ４は、機能的に自律的なドメインを含み、その組み合わせられた活性が、インビボでのＧＡＬ４の活性を説明する。Ｍａ  ａｎｄ  Ｐｔａｓｈｎｅ（１９８７）Ｃｅｌｌ  ４８：８４７−５３）、Ｂｒｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｔａｓｈｎｅ（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４３（３  Ｐｔ２）：７２９−３６。ＧＡＬ４のＮ末端６５アミノ酸は、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインを含む。Ｋｅｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１：６９９−７０４、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：３５３−５。配列特異的結合は、ＤＮＡ結合ドメイン内に存在する６つのＣｙｓ残基によって配位される二価カチオンの存在を必要とする。配位カチオン含有ドメインは、ＤＮＡらせんの主要溝との直接接触を介して、１７ｂｐ  ＵＡＳの各末端で保存されたＣＣＧ三重鎖と相互作用し、認識する。Ｍａｒｍｏｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：４０８−１４。タンパク質のＤＮＡ結合機能は、活性化ドメインが転写を誘導することができるように、プロモーターの近傍にＣ末端転写活性化ドメインを位置付ける。
【０１４４】
使用することができる追加のＤＮＡ結合ポリペプチドとしては、例えば、限定されないが、ＡＶＲＢＳ３誘導性遺伝子由来の結合配列、ＡＶＲＢＳ３誘導性遺伝子由来のコンセンサス結合配列、またはそこから操作された合成結合配列（例えば、ＵＰＡ  ＤＮＡ結合ドメイン）、ＴＡＬ、ＬｅｘＡ（例えば、Ｂｒｅｎｔ＆Ｐｔａｓｈｎｅ（１９８５）、上記）、ＬａｃＲ（例えば、Ｌａｂｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３３４３−５６、Ｂａｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８（１２）：５０７２−６を参照）、ステロイドホルモン受容体（Ｅｌｌｌｉｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１５１７−１２１）、Ｔｅｔリプレッサー（米国特許第６，２７１，３４１号）、およびテトラサイクリン（Ｔｃ）の非存在下ではなく存在下でｔｅｔオペレーター配列に結合する突然変異したＴｅｔリプレッサー、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合ドメイン、ならびにＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（１７）：８１８０−４に記載される調節系の成分（ＧＡＬ４、ホルモン受容体、およびＶＰ１６の融合体を利用する）が挙げられる。
【０１４５】
本明細書に記載される方法および組成物に使用されるヌクレアーゼのうちの１つ以上のＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するかまたは操作された（非天然に存在する）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含むことができる。例えば、米国特許公開第２０１１／０３０１０７３号を参照されたい。
【０１４６】
代替として、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ系を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含むことができる。
【０１４７】
（ＣＲＩＳＰＲ関連）系は、ウイルス攻撃から防御するための適応免疫系として細菌および古細菌において進化した。ウイルスに曝露すると、ウイルスＤＮＡの短いセグメントがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込まれる。ＲＮＡは、ウイルス配列を含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一部分から転写される。ウイルスゲノムに相補的な配列を含有するそのＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）のウイルスゲノム内の配列への標的化を媒介する。Ｃａｓタンパク質は切断し、それによってウイルス標的をサイレンシングする。最近、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、真核細胞におけるゲノム編集に適合されている。部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）の導入は、２つの内因性ＤＮＡ修復機序−非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同性指向修復（ＨＤＲ）のいずれかを介して標的配列の改変を可能にする。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系はまた、標的配列を改変することなく、転写抑制および活性化を含む遺伝子調節に使用されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に基づく標的遺伝子調節は、例えば、酵素的に不活性なＣａｓ９（触媒能のないＣａｓ９としても知られる）を使用することができる。
【０１４８】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、系のＲＮＡ成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復）遺伝子座、およびタンパク質をコードするＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座を含む（Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１５６５−１５７５、Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：４８２−４９６、Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６．Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ  １：７、Ｈａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００５．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．１：ｅ６０）。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、Ｃａｓ遺伝子の組み合わせ、ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介核酸切断の特異性をプログラミングすることができる非コードＲＮＡ要素を含有する。
【０１４９】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられる系のうちの１つであり、４つの連続的なステップで天然の標的ＤＮＡ二本鎖切断を実行する。第１に、２つの非コードＲＮＡ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ、およびｔｒａｃｒＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写する。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズし、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの処理を媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、標的認識の追加の要件である、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣にある標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のワトソン・クリック塩基対合を介してＣａｓ９を標的ＤＮＡに誘導する。最後に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖切断を作成する。
【０１５０】
標的挿入および欠失を作成するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の使用のために、２つの非コードＲＮＡ（ｃｒＲＮＡおよびＴｒａｃｒＲＮＡ）は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と称される単一のＲＮＡによって置き換えられ得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップからなる：（ｉ）「適応」と呼ばれるプロセスにおける、将来の攻撃を防止するための、ＣＲＩＳＰＲアレイへの外因性ＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連タンパク質の発現、ならびにアレイの発現および処理、続いて（ｉｉｉ）外来核酸に対するＲＮＡ媒介性干渉。細菌細胞において、いくつかのＣａｓタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の自然な機能に関与し、外来ＤＮＡの挿入等の機能において役割を果たす。
【０１５１】
Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能性誘導体」であり得る。天然配列ポリペプチドの「機能性誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通の定性的生物学的特性を有する化合物である。「機能性誘導体」としては、限定されないが、対応する天然配列ポリペプチドと共通の生物学的活性を有することを条件として、天然配列の断片、天然配列ポリペプチドの誘導体、およびその断片が挙げられる。本明細書で企図される生物活性は、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能性誘導体の能力である。「誘導体」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合的修飾、およびそれらの融合体の両方を包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の好適な誘導体としては、限定されないが、Ｃａｓタンパク質またはその断片の突然変異体、融合体、共有結合的修飾が挙げられる。Ｃａｓタンパク質またはその断片を含むＣａｓタンパク質、ならびにＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体は、細胞から得ることができるか、または化学的に合成されるか、またはこれら２つの手順の組み合わせによって得ることができる。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞、またはＣａｓタンパク質を天然に産生し、内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するか、もしくは外因性導入核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であってもよく、この核酸は、内因性Ｃａｓと同じであるか、または異なるＣａｓをコードする。いくつかの場合において、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。
【０１５２】
本明細書に記載される方法で使用するためのブタ雌動物が、ＣＲＩＳＰＲ系を使用して遺伝子編集されている場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して、ブタ雌動物を生成することができる。Ｃａｓ９を使用してゲノム配列を編集するために、タンパク質を細胞に直接送達することができる。代替的に、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡを細胞に送達することができるか、またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡの発現を提供する遺伝子を細胞に送達することができる。加えて、標的特異的ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのいずれかは、細胞に直接送達することができ、または標的特異的ｇＲＮＡは、細胞に送達することができる（これらのＲＮＡは、代替的に、これらのＲＮＡを発現するように構築された遺伝子によって産生することができる）。標的部位の選択およびｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡの設計は、当該技術分野で周知である。ｇＲＮＡの構築およびクローニングの考察は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ／ｃｒｉｓｐｒ／ｗｐ−ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０１４／０５／ＣＲＩＳＰＲ−Ｒｅａｇｅｎｔ−Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｒｅｖ２０１４０５０９．ｐｄｆにおいて見出すことができる。
【０１５３】
ＤＮＡ結合ポリペプチドは、宿主生物のゲノム核酸内に含まれる標的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、それに結合することができる。標的ヌクレオチド配列の任意の数の別個のインスタンスは、いくつかの実施例において、宿主ゲノム中に見出され得る。標的ヌクレオチド配列は、生物のゲノム内で希少であり得る（例えば、標的配列の約１０個未満、約９個未満、約８個未満、約７個未満、約６個未満、約５個未満、約４個未満、約３個未満、約２個未満、または約１個のコピーがゲノム内に存在し得る）。例えば、標的ヌクレオチド配列は、生物のゲノム内の固有部位に位置し得る。標的ヌクレオチド配列は、例えば、限定されないが、互いに関連してゲノム全体にランダムに分散してもよく、ゲノム内の異なる連結基内に位置してもよく、同じ連結基内に位置してもよく、異なる染色体上に位置してもよく、同じ染色体上に位置してもよく、生物内の同様の条件下で発現される部位でゲノム内に位置してもよく（例えば、同じ、または実質的に機能的に同一の調節因子の制御下で）、ゲノム内で互いに密接に位置してもよい（例えば、標的配列は、ゲノム遺伝子座で連結体として組み込まれた核酸内に含まれてもよい）。
【０１５４】
標的化エンドヌクレアーゼ
標的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、それに結合するＤＮＡ結合ポリペプチドは、キメラポリペプチド上の標的配列への特異的結合を付与するように、キメラポリペプチド内に含まれ得る。実施例では、そのようなキメラポリペプチドは、例えば限定されないが、これらのポリペプチドが上述されるように、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、および／またはリガーゼポリペプチドを含み得る。ＤＮＡ結合ポリペプチドならびにヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、および／またはリガーゼポリペプチドを含むキメラポリペプチドはまた、例えば限定されないが、キメラタンパク質中の機能性ポリペプチド間に位置するスペーサー配列、リーダーペプチド、融合タンパク質をオルガネル（例えば、核）に標的とするペプチド、細胞酵素によって切断されるポリペプチド、ペプチドタグ（例えば、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ等）、ならびにキメラポリペプチドの機能を妨げない他のアミノ酸配列などの他の機能性ポリペプチドモチーフおよび／またはドメインを含んでもよい。
【０１５５】
キメラポリペプチド中の機能性ポリペプチド（例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチドおよびヌクレアーゼポリペプチド）は、作動可能に連結され得る。キメラポリペプチドの機能性ポリペプチドは、キメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子を作成するように、少なくともフレーム内で互いにライゲーションされた機能性ポリペプチドをコードする単一のポリヌクレオチドからのそれらの発現によって作動可能に連結され得る。代替的に、キメラポリペプチドの機能性ポリペプチドは、他の手段、例えば、独立して発現したポリペプチドの架橋によって作動可能に連結することができる。
【０１５６】
標的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、それに結合するＤＮＡ結合ポリペプチド、またはガイドＲＮＡは、天然の単離されたタンパク質（またはその突然変異体）内に含まれ得、天然の単離されたタンパク質またはその突然変異体はまた、ヌクレアーゼポリペプチドを含む（またリコンビナーゼおよび／またはリガーゼポリペプチドも含み得る）。そのような単離されたタンパク質の例としては、ＴＡＬＥＮ、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ、Ｈｉｎ、Ｔｒｅ、およびＦＬＰリコンビナーゼ）、ＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、およびメガヌクレアーゼが挙げられる。
【０１５７】
本明細書で使用される場合、「標的化エンドヌクレアーゼ」という用語は、ＤＮＡ結合ポリペプチドまたはガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼポリペプチドを含む天然または操作された分単離されたタンパク質およびその突然変異体、ならびにＤＮＡ結合ポリペプチドまたはガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼを含むキメラポリペプチドを指す。ＣＤ１６３遺伝子座内に含まれる標的化ヌクレオチド配列を特異的に認識し、それに結合するＤＮＡ結合ポリペプチドまたはガイドＲＮＡを含む任意の標的エンドヌクレアーゼ（例えば、標的配列が、遺伝子座における天然配列内に含まれるため、または標的配列が、例えば、組み換えによって遺伝子座内に導入されているためのいずれか）を使用することができる。
【０１５８】
好適なキメラポリペプチドのいくつかの例としては、限定されないが、以下のポリペプチドの組み合わせが挙げられる：ジンクフィンガーＤＮＡ結合ポリペプチド；ＦｏｋＩヌクレアーゼポリペプチド；ＴＡＬＥドメイン；ロイシンジッパー；転写因子ＤＮＡ結合モチーフ；例えば限定されないが、ＴＡＬＥＮ、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ、Ｈｉｎ、ＲｅｃＡ、Ｔｒｅ、およびＦＬＰリコンビナーゼ）、ＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、メガヌクレアーゼから単離されたＤＮＡ認識および／または切断ドメイン、ならびに当業者に既知の他のドメイン。特定の例としては、部位特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドおよびヌクレアーゼポリペプチドを含むキメラタンパク質が挙げられる。キメラポリペプチドは、キメラポリペプチドを目的の特定のヌクレオチド配列に標的とするように、キメラポリペプチド内に含まれるＤＮＡ結合ポリペプチドの認識配列を改変するために当業者に既知の方法によって操作され得る。
【０１５９】
キメラポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガー、ＴＡＬエフェクタードメイン等）、およびヌクレアーゼ（切断）ドメインを含むことができる。切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼからの切断ドメイン、またはＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼからの切断ドメインに対して異種であり得る。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインを誘導することができる例示的なエンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、２００２−２００３  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．、およびＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断する追加の酵素が既知である（例えば、５１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮＡｓｅ  Ｉ、マイクロコッカルヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ、Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３を参照）。これらの酵素（またはそれらの機能的断片）のうちの１つ以上を、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として使用することができる。
【０１６０】
同様に、切断ハーフドメインは、切断活性のために二量体化を必要とする、上述の任意のヌクレアーゼまたはその一部分に由来することができる。一般に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、切断には２つの融合タンパク質が必要である。代替的に、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。２つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得るか、または各切断ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得る。加えて、２つの融合タンパク質の標的部位は、好ましくは互いに関連して配置され、それにより２つの融合タンパク質のそれぞれの標的部位への結合が、互いに空間的配向で切断ハーフドメインを配置し、これが例えば二量体化によって、切断ハーフドメインが機能的切断ドメインを形成することを可能にする。したがって、標的部位の近縁は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチドによって分離され得る。しかしながら、任意の整数のヌクレオチド、またはヌクレオチド対は、２つの標的部位間（例えば、２〜５０ヌクレオチド対以上）に介在することができる。一般に、切断部位は、標的部位間にある。
【０１６１】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、（認識部位で）ＤＮＡに配列特異的に結合し、例えば、１つ以上の外因性配列（ドナー／導入遺伝子）が結合（標的）部位またはその付近に組み込まれるように、結合部位またはその付近でＤＮＡを切断することができる。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素Ｆｏｋ  Ｉは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチド、他方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、および同第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２７５−４２７９、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２７６４−２７６８、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８８３−８８７、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照されたい。したがって、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）と、操作されても操作されなくてもよい、１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインとを含むことができる。
【０１６２】
切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、Ｆｏｋ  Ｉである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０，５７０−１０，５７５。したがって、本開示の目的のために、開示される融合タンパク質に使用されるＦｏｋ  Ｉ酵素の部分は、切断ハーフドメインと見なされる。したがって、ジンクフィンガー−Ｆｏｋ  Ｉ融合体を使用した細胞配列の標的二本鎖切断および／または標的置換のために、各々がＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を使用して、触媒活性切断ドメインを再構築することができる。代替的に、ＤＮＡ結合ドメインおよび２つのＦｏｋ  Ｉ切断ハーフドメインを含有する単一のポリペプチド分子を使用することもできる。
【０１６３】
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持するか、または機能的切断ドメインを形成するために多量体化（例えば、二量体化）する能力を保持するタンパク質の任意の部分であり得る。
【０１６４】
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、米国特許公開第２００７／０１３４７９６号に記載されている。追加の制限酵素はまた、分離可能な結合および切断ドメインを含有し、これらは本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照されたい。
【０１６５】
切断ドメインは、例えば、米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００６／０１８８９８７号、および同第２００８／０１３１９６２号に記載されるように、ホモ二量体化を最小化または防止する１つ以上の操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン突然変異体とも称される）を含むことができる。
【０１６６】
代替的に、ヌクレアーゼは、いわゆる「分割酵素」技術を使用して、核酸標的部位でインビボで組み立てられ得る（例えば、米国特許公開第２００９／００６８１６４号を参照）。そのような分割酵素の成分は、別個の発現構築物上で発現されてもよく、または、個々の成分が、例えば、自己切断２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列によって分離される１つのオープンリーディングフレーム内で連結され得る。成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。
【０１６７】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
キメラポリペプチドは、外因性核酸またはドナーＤＮＡが組み込まれ得る標的部位特異的二本鎖ＤＮＡ切断を送達するように設計され得る、カスタム設計のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含むことができる（米国特許公開第２０１０／０２５７６３８号を参照）。ＺＦＮは、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）からの非特異的切断ドメインおよびジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインポリペプチドを含有するキメラポリペプチドである。例えば、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．１５：４８１−９、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：３６１６−２０、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１１５６−６０、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８８３−７、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７ｂ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１２８７５−９、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７ｃ）Ｇｅｎｅ  ２０３：４３−９、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７９：４８９−９５、Ｎａｈｏｎ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｈ（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：１２３３−９、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：６７４−８１を参照されたい。ＺＦＮは、非正準ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むことができる（米国特許公開第２００８／０１８２３３２号を参照）。ＤＮＡを切断し、二本鎖切断を導入するために、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメインを介して二量体化しなければならない。したがって、そのようなエンドヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼドメインを含有するＺＦＮはまた、標的ＤＮＡを切断するためにヌクレアーゼドメインの二量体化を必要とする。Ｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３４：１１９１−７、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：３３６１−９。ＺＦＮの二量体化は、２つの隣接する、反対に配向したＤＮＡ結合部位によって促進することができる。同文献。
【０１６８】
宿主の少なくとも１つのＣＤ１６３遺伝子座への外因性核酸の部位特異的組み込み方法は、宿主の細胞にＺＦＮを導入することを含み得、ＺＦＮは、標的ヌクレオチド配列を認識してそれに結合し、標的ヌクレオチド配列は、宿主の少なくとも１つのＣＤ１６３遺伝子座内に含まれる。ある特定の例では、標的ヌクレオチド配列は、少なくとも１つのＣＤ１６３遺伝子座以外の任意の他の位置で宿主のゲノム内に含まれない。例えば、ＺＦＮのＤＮＡ結合ポリペプチドは、（例えば、ＣＤ１６３遺伝子座を配列決定することによって）少なくとも１つのＣＤ１６３遺伝子座内で同定された標的ヌクレオチド配列を認識し、それに結合するように操作され得る。宿主の細胞にＺＦＮを導入することを含む、宿主の少なくとも１つのＣＤ１６３性能遺伝子座への外因性核酸の部位特異的組み込みのための方法はまた、細胞に外因性核酸を導入することを含んでもよく、少なくとも１つのＣＤ１６３遺伝子座を含む宿主の核酸への外因性核酸の組み換えは、ＺＦＮの標的配列への部位特異的認識と結合（およびその後のＣＤ１６３遺伝子座を含む核酸の切断）によって促進される。
【０１６９】
ＣＤ１６３遺伝子座での組み込みのための任意の外因性核酸
ＣＤ１６３遺伝子座における組み込みのための外因性核酸としては、少なくとも１つのＣＤ１６３遺伝子座における部位特異的組み込みのための外因性核酸、例えば限定されないが、ＯＲＦ、標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、および前述のいずれかまたは両方のうちの少なくとも１つを含むベクターが挙げられる。したがって、特定の核酸は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、構造的ヌクレオチド配列、および／またはＤＮＡ結合ポリペプチド認識および結合部位を含む。
【０１７０】
部位特異的統合のための任意の外因性核酸分子
上述のように、外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」とも呼ばれる）の挿入は、例えば、ポリペプチドの発現、突然変異体遺伝子の補正、または野生型遺伝子の発現の増加のために提供される。ドナー配列は、典型的には、それが配置されるゲノム配列と同一ではないことが容易に明らかになるであろう。ドナー配列は、目的の場所で効率的な相同性指向性修復（ＨＤＲ）を可能にするために、相同性の２つの領域に隣接する非相同性配列を含有することができる。加えて、ドナー配列は、細胞クロマチンにおける目的の領域と相同でない配列を含有するベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞クロマチンと相同性のいくつかの不連続領域を含有することができる。例えば、通常、目的の領域に存在しない配列の標的挿入のために、当該配列は、ドナー核酸分子内に存在し、目的の領域内の配列と相同性の領域に隣接することができる。
【０１７１】
ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖または二本鎖であり得、直鎖状または環状形態で細胞に導入することができる。例えば、米国特許公開第２０１０／００４７８０５号、同第２０１１／０２８１３６１号、同第２０１１／０２０７２２１号、および同第２０１３／０３２６６４５号を参照されたい。直鎖状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に既知の方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護され得る。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基が直鎖状分子の３’末端に付加され、かつ／または自己相補性オリゴヌクレオチドが一方または両方の末端にライゲーションされる。例えば、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：４９５９−４９６３、Ｎｅｈｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：８８６−８８９を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するための追加の方法としては、限定されないが、末端アミノ基の付加、および例えば、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、およびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間結合の使用が挙げられる。
【０１７２】
ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーター、および抗生物質抵抗性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞内に導入することができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として導入され得るか、リポソームもしくはポロキサマーなどの薬剤と複合体化された核酸として導入され得るか、またはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、およびインテグラーゼ欠陥レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達され得る。
【０１７３】
ドナーは、概して、その発現が組み込み部位における内因性プロモーター、すなわち、ドナーが組み込まれる内因性遺伝子（例えば、ＣＤ１６３）の発現を駆動するプロモーターによって駆動されるように組み込まれる。しかしながら、ドナーは、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成的プロモーター、または誘導性もしくは組織特異的プロモーターを含んでもよいことが明らかとなる。
【０１７４】
さらに、発現には必要ではないが、外因性配列はまた、転写または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列、および／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。
【０１７５】
ＣＤ１６３遺伝子座を修飾するために、部位特異的に少なくとも１つのＣＤ１６３遺伝子座に組み込まれ得る外因性核酸としては、例えば限定されないが、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、農学的遺伝子を含む核酸、ＲＮＡｉ分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、またはＣＤ１６３遺伝子を破壊する核酸が挙げられる。
【０１７６】
外因性核酸は、ＣＤ１６３遺伝子座を修飾するために、ＣＤ１６３遺伝子座に組み込むことができ、核酸は、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、それによりそのヌクレオチド配列は、ＣＤ１６３遺伝子座からの宿主内で発現される。いくつかの実施例では、目的のポリペプチド（例えば、外来タンパク質）は、市販量の目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から発現されている。そのような実施例では、目的のポリペプチドは、宿主細胞、組織、またはバイオマスから抽出され得る。
【０１７７】
標的エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子
標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、標的化エンドヌクレアーゼ内に含まれるポリペプチドをコードする天然ヌクレオチド配列の操作（例えば、ライゲーション）によって操作され得る。例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチドを含むタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＤＮＡ結合ポリペプチドに対応する遺伝子のヌクレオチド配列を識別するために検査され得、そのヌクレオチド配列は、ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列のエレメントとして使用され得る。代替的に、例えば、遺伝子コードの変性に従って、標的化エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列を使用して、標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を推定してもよい。
【０１７８】
標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む例示的な核酸分子において、ヌクレアーゼポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列の最後のコドン、およびＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列の第１のコドンは、例えば、イントロンまたは「ＳＴＯＰ」をコードすることなく、任意の数のヌクレオチド三重鎖によって分離され得る。同様に、ＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列の最後のコドン、およびヌクレアーゼポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列の第１のコドンは、任意の数のヌクレオチド三重鎖によって分離されてもよい。ヌクレアーゼポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列、およびＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列の最後のコドン（すなわち、核酸配列中の３’末端）は、位相レジスタにおいて、それに直接連続するさらなるポリヌクレオチドコード配列の第１のコドンと融合され得るか、または合成ヌクレオチドリンカー（例えば、融合を達成するために使用され得るヌクレオチドリンカー）によってコードされるような短いペプチド配列以下のペプチド配列によって分離され得る。そのようなさらなるポリヌクレオチド配列の例として、例えば限定されないが、タグ、標的化ペプチド、および酵素切断部位が挙げられる。同様に、第１および第２のポリヌクレオチド配列の５’末端（核酸配列中）の第１のコドンは、位相レジスタにおいて、それに直接隣接するさらなるポリヌクレオチドコード配列の最後のコドンと融合されてもよく、または短いペプチド配列だけでそこから分離されてもよい。
【０１７９】
標的化エンドヌクレアーゼにおける機能性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチドおよびヌクレアーゼポリペプチド）を分離する配列は、例えば、任意の配列からなり得、その結果、コードされるアミノ酸配列は、標的化エンドヌクレアーゼの翻訳を著しく改変する可能性が低い。既知のヌクレアーゼポリペプチドおよび既知のＤＮＡ結合ポリペプチドの自律性のため、介在する配列は、これらの構造のそれぞれの機能を干渉しない。
【０１８０】
他のノックアウト方法
当該技術分野で既知の様々な他の技法を使用して、ノックアウト動物を作製するために遺伝子を不活性化する、および／または核酸構築物を動物に導入してファウンダー動物を産生し、ノックアウトまたは核酸構築物がゲノムに組み込まれる動物株を作製することができる。そのような技法としては、限定されないが、原核マイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号）、生殖細胞株へのレトロウイルス媒介遺伝子移入（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，６１４８−１６５２）、胚幹細胞への遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５６，３１３−３２１）、胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，１８０３−１８１４）、精子媒介遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９，１４２３０−１４２３５、Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．１８，１９−２３）、および体細胞、例えば、卵丘もしくは乳房細胞、または成体、胎児、もしくは胚幹細胞のインビトロ形質転換、続いて核移植（Ｗｉｌｍｕｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５，８１０−８１３およびＷａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９４，３６９−３７４）が挙げられる。原核マイクロインジェクション、精子媒介遺伝子移入、および体細胞核移入は、特に有用な技法である。ゲノム修飾された動物は、その生殖系細胞を含むすべての細胞が修飾を有する動物である。その修飾においてモザイクである動物を産生する方法を使用する場合、動物は、近交系であってもよく、ゲノム修飾された子孫が選択されてもよい。クローニングは、例えば、その細胞が胚盤胞状態で修飾される場合にモザイク動物を作製するために使用され得るか、または単一細胞が修飾される場合にゲノム修飾が行われ得る。性的に成熟しないように修飾された動物は、使用される特定のアプローチに応じて、修飾のためにホモ接合またはヘテロ接合であり得る。特定の遺伝子がノックアウト修飾によって不活性化される場合、ホモ接合性が通常必要となる。特定の遺伝子がＲＮＡ干渉または優性陰性戦略によって不活性化される場合、ヘテロ接合性は、しばしば十分である。
【０１８１】
典型的には、胚／接合体マイクロインジェクションでは、核酸構築物またはｍＲＮＡが受精卵に導入され、１つまたは２つの細胞受精卵が、精子頭からの遺伝子材料を含有する核構造として使用され、卵子は、原形質内で可視である。原核段階受精卵は、インビトロまたはインビボで得ることができる（すなわち、ドナー動物の卵管から外科的に回収される）。インビトロ受精卵は、以下のように産生することができる。例えば、ブタ卵巣は、屠場で収集し、輸送中２２〜２８℃で維持することができる。卵巣は、濾胞吸引のために洗浄および単離することができ、４〜８ｍｍの範囲の濾胞は、１８ゲージ針を使用し、真空下で５０ｍＬの円錐形遠心管に吸引することができる。濾胞液および吸引された卵母細胞は、市販のＴＬ−ＨＥＰＥＳ（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ、Ｖｅｒｏｎａ、Ｗｉｓ．）で予備フィルターを通して洗い流すことができる。コンパクトな卵丘に囲まれた卵母細胞を選択し、３８．７℃および５％ＣＯ２で加湿空気中でおよそ２２時間、０．１ｍｇ／ｍＬのシステイン、１０ｎｇ／ｍＬの表皮成長因子、１０％のブタ卵胞液、５０μＭの２−メルカプトエタノール、０．５ｍｇ／ｍＬのｃＡＭＰ、それぞれ１０ＩＵ／ｍＬの妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）、およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）が補充されたＴＣＭ−１９９卵母細胞成熟培地（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，Ｗｉｓ．）に配置することができる。その後、卵母細胞を、ｃＡＭＰ、ＰＭＳＧ、またはｈＣＧを含有しない新鮮なＴＣＭ−１９９成熟培地に移動させ、さらに２２時間インキュベートすることができる。成熟卵母細胞は、０．１％ヒアルロニダーゼ中で１分間ボルテックスすることによって、それらの卵丘細胞を除去することができる。
【０１８２】
ブタの場合、成熟卵母細胞は、Ｍｉｎｉｔｕｂｅ５ウェル受精皿中の５００μＬのＭｉｎｉｔｕｂｅ  ＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ培地系（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，Ｗｉｓ．）において受精することができる。インビトロ受精（ＩＶＦ）の準備として、採取したばかりの雄ブタ精液または凍結した雄ブタ精液を洗浄し、ＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ培地中で４０万個の精子に再懸濁させることができる。精子濃度は、コンピューター支援精液分析（ＳＰＥＲＭＶＩＳＩＯＮ、Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，Ｗｉｓ．）によって分析することができる。最終インビトロ授精は、雄ブタに応じて、およそ４０の運動精子／卵母細胞の最終濃度で１０μＬ体積で行うことができる。すべての受精卵細胞は、５．０％ＣＯ２雰囲気中３８．７℃で６時間インキュベートすることができる。授精の６時間後、推定接合体をＮＣＳＵ−２３中で２回洗浄し、０．５ｍＬの同じ培地に移動させることができる。このシステムは、１０〜３０％の多精子受精率で、ほとんどの雄ブタにわたって日常的に２０〜３０％の胚盤胞を産生することができる。
【０１８３】
直鎖状核酸構築物またはｍＲＮＡは、原核の１つにまたは細胞質に注入することができる。次いで、注入された卵をレシピエント雌に（例えば、レシピエント雌の卵管に）移し、レシピエント雌において発育させて、トランスジェニックまたは遺伝子編集動物を産生することができる。特に、インビトロ受精卵は、１５，０００×ｇで５分間遠心分離して堆積脂質に分離することができ、原核の可視化を可能にする。胚は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＦＥＭＴＯＪＥＴインジェクターを使用して注入することができ、胚盤胞形成まで培養することができる。胚切断および胚盤胞形成の速度および品質を記録することができる。
【０１８４】
胚は、非同期レシピエントの子宮に外科的に移植することができる。典型的には、１００〜２００個（例えば、１５０〜２００個）の胚は、５．５インチのＴＯＭＣＡＴ（登録商標）カテーテルを使用して卵管の膨大部−峡部接合部に堆積することができる。手術後、妊娠のリアルタイム超音波検査を行うことができる。
【０１８５】
体細胞核移植において、胚芽細胞、胎児線維芽細胞、成体耳線維芽細胞、または上記の核酸構築物を含む顆粒球細胞などのトランスジェニックまたは遺伝子編集細胞を切除卵母細胞に導入して、複合細胞を確立することができる。卵母細胞は、極性体付近の部分的透明帯切開法によって、次いで解離領域で細胞質を押し出すことによって切除することができる。典型的には、鋭い傾斜した先端を有する注入ピペットを使用して、減数分裂２で停止した切除卵細胞にトランスジェニックまたは遺伝子編集細胞を注入する。いくつかの記法において、減数分裂２で停止した卵母細胞は、卵子と称される。ブタまたはウシ胚を産生した後（例えば、卵母細胞を融合および活性化することによって）、胚は、活性化の約２０〜２４時間後にレシピエント雌の卵管に移される。例えば、Ｃｉｂｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０，１２５６−１２５８および米国特許第６，５４８，７４１号、同第７，５４７，８１６号、同第７，９８９，６５７号、または同第６，２１１，４２９号を参照されたい。ブタについては、レシピエント雌は、胚の移植のおよそ２０〜２１日後に妊娠を確認することができる。
【０１８６】
標準的な繁殖技法を使用して、初期のヘテロ接合ファウンダー動物から不活性化された遺伝子に対してホモ接合性である動物を作成することができる。しかしながら、ホモ接合性は必要とされない場合がある。本明細書に記載される遺伝子編集ブタは、目的の他のブタと繁殖させることができる。
【０１８７】
遺伝子編集動物が生成されると、内因性核酸の不活性化は、標準的な技法を使用して評価することができる。初期スクリーニングは、不活性化が行われたか否かを決定するためにサザンブロット分析によって達成することができる。サザン分析の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ；Ｎ．Ｙ．のセクション９．３７〜９．５２を参照されたい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法はまた、初期スクリーニングＰＣＲにおいて使用することができ、ＰＣＲは、標的核酸が増幅される手順または技法を指す。一般に、目的の領域の末端またはそれ以降の配列情報を用いて、増幅されるテンプレートの反対側の鎖と配列が同一であるかまたは類似するオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。ＰＣＲは、ＤＮＡならびにＲＮＡ（全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡ由来の配列を含む）からの特定の配列を増幅するために使用することができる。プライマーは、典型的には１４〜４０ヌクレオチド長であるが、１０ヌクレオチド〜数百ヌクレオチド長の範囲であってもよい。ＰＣＲは、例えば、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５に記載されている。核酸はまた、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、自己持続的配列複製、または核酸配列に基づく増幅によって増幅することもできる。例えば、Ｌｅｗｉｓ（１９９２）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  １２，１、Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４、およびＷｅｉｓｓ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１２９２を参照されたい。胚盤胞段階では、胚を、ＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション、およびスプリンケレットＰＣＲによる分析のために個々に処理することができる（例えば、Ｄｕｐｕｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００２）９９：４４９５を参照）。
【０１８８】
干渉ＲＮＡ
様々な干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）系が知られている。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、相同遺伝子転写生成物の配列特異的分解を誘導する。ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）は、ｄｓＲＮＡを小２１〜２３ヌクレオチド低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に代謝する。ＲＩＳＣは、二本鎖ＲＮＡｓｅ（ｄｓＲＮＡｓｅ、例えば、Ｄｉｃｅｒ）およびｓｓＲＮＡｓｅ（例えば、Ａｒｇｏｎａｕｔ  ２またはＡｇｏ２）を含有する。ＲＩＳＣは、切断可能な標的を見出すためのガイドとしてアンチセンス鎖を利用する。ｓｉＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の両方が知られている。遺伝子編集動物における遺伝子を不活性化する方法は、標的遺伝子および／または核酸の発現が低減されるように、標的遺伝子および／または核酸に対するＲＮＡ干渉を誘導することを含む。
【０１８９】
例えば、外因性核酸配列は、ポリペプチドをコードする核酸に対してＲＮＡ干渉を誘導することができる。例えば、標的ＤＮＡに相同な二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用して、そのＤＮＡの発現を低減することができる。ｓｉＲＮＡのための構築物は、例えば、Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６、Ｒｏｍａｎｏ  ａｎｄ  Ｍａｓｉｎｏ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：３３４３、Ｃｏｇｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：３１５３、Ｃｏｇｏｎｉ  ａｎｄ  Ｍａｓｉｎｏ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９９：１６６、Ｍｉｓｑｕｉｔｔａ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１４５１、およびＫｅｎｎｅｒｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｈｅｗ（１９９８）Ｃｅｌｌ  ９５：１０１７に記載されるように産生され得る。ｓｈＲＮＡの構築物は、ＭｃＩｎｔｙｒｅ  ａｎｄ  Ｆａｎｎｉｎｇ（２００６）ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１によって記載されるように産生することができる。一般に、ｓｈＲＮＡは、相補領域を含有する一本鎖ＲＮＡ分子として転写され、短いヘアピンをアニールして形成することができる。
【０１９０】
特定の遺伝子に向けられた単一の個々の機能的ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを見出す確率は高い。例えば、ｓｉＲＮＡの特定の配列の予測可能性は、約５０％であるが、それらのうちの少なくとも１つが有効であることを十分に確信して、いくつかの干渉ＲＮＡを作製してもよい。
【０１９１】
インビトロ細胞、インビボ細胞、またはＣＤ１６３をコードする遺伝子に対して指向されるＲＮＡｉを発現する家畜動物などの遺伝子編集動物を使用することができる。ＲＮＡｉは、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＲＩＳＣ、およびｍｉＲＮＡからなる群から選択され得る。
【０１９２】
誘導系
誘導系を使用して、ＣＤ１６３遺伝子を不活性化することができる。遺伝子の不活性化の空間的および時間的制御を可能にする様々な誘導系が知られている。いくつかは、ブタ動物においてインビボで機能することが証明されている。
【０１９３】
誘導系の一例は、核酸の転写を調節するために使用することができるテトラサイクリン（ｔｅｔ）−オンプロモーター系である。この系において、突然変異したＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）は、単純ヘルペスウイルスＶＰ  １６トランス活性化タンパク質の活性化ドメインに融合して、ｔｅｔまたはドキシサイクリン（ｄｏｘ）によって調節されるテトラサイクリン制御転写活性化剤（ｔＴＡ）を作成する。抗生物質の非存在下では、転写は最小限であるが、ｔｅｔまたはｄｏｘの存在下では、転写が誘導される。代替の誘導系としては、エクジソン系またはラパマイシン系が挙げられる。エクジソンは、その産生がエクジソン受容体のヘテロ二量体および超音波遺伝子（ＵＳＰ）の生成物によって制御される昆虫脱皮ホルモンである。発現は、エクジソンまたはムリステロンＡなどのエクジソンの類似体での処置によって誘導される。誘導系を誘発するために動物に投与される薬剤は、誘導剤と称される。
【０１９４】
テトラサイクリン誘導系およびＣｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系（構成的または誘導性のいずれか）は、より一般的に使用される誘導系のうちにある。テトラサイクリン誘導系は、テトラサイクリン制御トランスアクチベーター（ｔＴＡ）／リバースｔＴＡ（ｒｔＴＡ）を伴う。インビボでこれらの系を使用する方法は、遺伝子編集された動物の２つの系統を生成することを伴う。１つの動物系統は、選択されたプロモーターの制御下でアクチベーター（ｔＴＡ、ｒｔＴＡ、またはＣｒｅリコンビナーゼ）を発現する。別の系統の動物は、目的の遺伝子（または改変される遺伝子）の発現が、ｔＴＡ／ｒｔＴＡトランスアクチベーターの標的配列の制御下にある（またはｌｏｘＰ配列に隣接している）アクセプターを発現する。動物のうちの２匹を交配させることで、遺伝子発現の制御をもたらす。
【０１９５】
テトラサイクリン依存性調節系（ｔｅｔ系）は、２つの成分、すなわち、テトラサイクリン依存性様式で下流ｃＤＮＡの発現を制御するテトラサイクリン制御トランスアクチベーター（ｔＴＡまたはｒｔＴＡ）およびｔＴＡ／ｒｔＴＡ依存性プロモーターに依存する。テトラサイクリンまたはその誘導体（ドキシサイクリンなど）が存在しない場合、ｔＴＡは、ｔｅｔＯ配列に結合し、ｔＴＡ依存性プロモーターの転写活性化を可能にする。しかしながら、ドキシサイクリンの存在下では、ｔＴＡは、その標的と相互作用することができず、転写は生じない。テトラサイクリンまたはドキシサイクリンが転写下方制御を可能にするため、ｔＴＡを使用するｔｅｔ系は、ｔｅｔ−ＯＦＦと称される。テトラサイクリンまたはその誘導体の投与は、インビボでの導入遺伝子発現の時間的制御を可能にする。ｒｔＴＡは、ドキシサイクリンの不在下では機能しないが、トランス活性化のためのリガンドの存在を必要とするｔＴＡのバリアントである。したがって、このｔｅｔ系は、ｔｅｔ−ＯＮと呼ばれる。ｔｅｔ系は、例えば、レポーター遺伝子、癌遺伝子、またはシグナル伝達カスケードに関与するタンパク質をコードするいくつかの導入遺伝子の誘導性発現のためにインビボで使用されている。
【０１９６】
Ｃｒｅ／ｌｏｘ系は、２つの遠隔Ｃｒｅ認識配列、すなわちｌｏｘＰ部位間の交差による部位特異的組み換えを触媒する、Ｃｒｅリコンビナーゼを使用する。２つのｌｏｘＰ配列間に導入されるＤＮＡ配列（ｆｌｏｘｅｄ  ＤＮＡと称される）は、Ｃｒｅ媒介組み換えによって切除される。（組織もしくは細胞特異的プロモーターを用いた）空間制御、または（誘導系を用いた）時間制御のいずれかを使用して、トランスジェニックおよび／または遺伝子編集動物におけるＣｒｅ発現の制御は、２つのｌｏｘＰ部位間のＤＮＡ切除の制御をもたらす。１つの用途は、コンディショナル遺伝子不活性化（コンディショナルノックアウト）のためである。別のアプローチは、タンパク質過剰発現のためのアプローチであり、ｆｌｏｘｅｄ停止コドンは、プロモーター配列と目的のＤＮＡとの間に挿入される。遺伝子編集された動物は、Ｃｒｅが発現されるまで導入遺伝子を発現せず、ｆｌｏｘｅｄ停止コドンの切除につながる。この系は、Ｂリンパ球における組織特異的発癌および制御された抗原受容体発現に適用されている。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼも開発されている。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼは、外因性リガンドの投与によってのみ活性化される。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼは、元のＣｒｅリコンビナーゼおよび特異的リガンド結合ドメインを含有する融合タンパク質である。Ｃｒｅリコンビナーゼの機能活性は、融合タンパク質中のこの特異的ドメインに結合することができる外部リガンドに依存する。
【０１９７】
インビトロ細胞、インビボ細胞、または誘導系の制御下でＣＤ１６３遺伝子を含む家畜動物などの遺伝子編集された動物を使用することができる。動物の染色体修飾は、ゲノムまたはモザイクであり得る。誘導系は、例えば、Ｔｅｔ−Ｏｎ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、Ｃｒｅ−ｌｏｘ、およびＨｉｆ１αからなる群から選択され得る。
【０１９８】
ベクターおよび核酸
ノックアウト目的のため、遺伝子の不活性化のため、遺伝子の発現を得るため、または他の目的のために、様々な核酸を細胞に導入してもよい。本明細書で使用される場合、核酸という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および核酸類似体、ならびに二本鎖または一本鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス一本鎖）である核酸を含む。核酸類似体は、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾されて、例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解性を改善することができる。塩基部分における修飾は、デオキシチミジンの場合デオキシウリジン、ならびにデオキシシチジンの場合５−メチル−２’−デオキシシチジンおよび５−ブロモ−２’−ドキシシチジンを含む。糖部分の修飾は、リボース糖の２’ヒドロキシルの修飾を含み、２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−アリル糖を形成する。デオキシリボースホスフェート骨格は、モルホリノ核酸を産生するように修飾することができ、各塩基部分は、６員のモルホリノ環またはペプチド核酸に連結され、デオキシリン酸骨格が偽ペプチド骨格に置き換えられ、４つの塩基が保持される。Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．７（３）：１８７およびＨｙｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４：５を参照されたい。加えて、デオキシリン酸塩骨格は、例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート骨格、ホスホロアミダイト、またはアルキルホスホトリエステル骨格と置き換えることができる。
【０１９９】
標的核酸配列は、プロモーターなどの調節領域に作動可能に連結され得る。調節領域は、ブタ調節領域であり得るか、または他の種由来であり得る。本明細書で使用される場合、作動可能に連結されるとは、標的核酸の転写を可能にするかまたは容易にするような方法で、核酸配列に対する調節領域の位置決めを指す。
【０２００】
任意のタイプのプロモーターは、標的核酸配列に作動可能に連結され得る。プロモーターの例としては、限定されないが、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および特定の刺激に応答性または非応答性のプロモーターが挙げられる。好適な組織特異的プロモーターは、β細胞における核酸転写物の優先発現をもたらし得、例えば、ヒトインスリンプロモーターを含む。他の組織特異的プロモーターは、例えば、肝細胞または心臓組織において優先的な発現をもたらし得、それぞれ、アルブミンまたはα−ミオシン重鎖プロモーターを含み得る。有意な組織または時間的特異性を有しない核酸分子の発現を促進するプロモーターを使用することができる（すなわち、構成的プロモーター）。例えば、βアクチンプロモーター、例えば、ニワトリβアクチン遺伝子プロモーター、ユビキチンプロモーター、ミニＣＡＧプロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、または３−リン酸グリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ならびにウイルスプロモーター、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを使用することができる。例えば、ニワトリβアクチン遺伝子プロモーターとＣＭＶエンハンサーとの融合は、プロモーターとして使用することができる。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：５６３およびＫｉｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：８２１を参照されたい。
【０２０１】
核酸構築物において有用であり得る追加の調節領域としては、ポリアデニル化配列、翻訳制御配列（例えば、内部リボソーム侵入セグメント、ＩＲＥＳ）、エンハンサー、誘導性エレメント、またはイントロンが挙げられるが、これらに限定されない。そのような調節領域は、転写、ｍＲＮＡの安定性、翻訳効率等に影響を与えることによって発現を増加させ得るが、必要ではない場合がある。そのような調節領域は、所望に応じて核酸構築物に含まれて、細胞における核酸の最適な発現を得ることができる。しかしながら、そのような追加の要素なしに、十分な発現を得ることができる場合がある。
【０２０２】
シグナルペプチドまたは選択可能なマーカーをコードする核酸構築物が使用され得る。シグナルペプチドは、コードされたポリペプチドが特定の細胞位置（例えば、細胞表面）に向けられるように使用することができる。選択可能なマーカーの非限定的な例としては、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、およびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。そのようなマーカーは、培養物中の安定した形質転換体を選択するのに有用である。他の選択可能なマーカーとしては、緑色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質などの蛍光ポリペプチドが挙げられる。
【０２０３】
選択可能なマーカーをコードする配列は、例えば、ＣｒｅまたはＦｌｐなどのリコンビナーゼの認識配列に隣接することができる。例えば、選択可能なマーカーを、ｌｏｘＰ認識部位（Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識される３４ｂｐ認識部位）またはＦＲＴ認識部位に隣接させて、選択可能なマーカーを構築物から切り出すことができる。Ｃｒｅ／ｌｏｘ技術のレビューについては、Ｏｒｂａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９２）８９：６８６１およびＢｒａｎｄ  ａｎｄ  Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ（２００４）６：７を参照されたい。選択可能なマーカー遺伝子によって中断されたＣｒｅまたはＦｌｐ活性化導入遺伝子を含有するトランスポゾンを使用して、導入遺伝子の条件付き発現を有する動物を得ることもできる。例えば、マーカー／導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターは、Ｆ０動物（例えば、ブタ）におけるマーカーのユビキタスまたは組織特異的発現をもたらすであろうユビキタスまたは組織特異的のいずれかであり得る。導入遺伝子の組織特異的活性化は、例えば、マーカー中断導入遺伝子をユビキタスに発現するブタを、組織特異的様式でＣｒｅもしくはＦｌｐを発現するブタに交配することによって、またはマーカー中断導入遺伝子を組織特異的様式で発現するブタを、ＣｒｅもしくはＦｌｐリコンビナーゼをユビキタスに発現するブタに交配することによって達成することができる。導入遺伝子の制御された発現またはマーカーの制御された切除は、導入遺伝子の発現を可能にする。
【０２０４】
外因性核酸は、ポリペプチドをコードすることができる。ポリペプチドをコードする核酸配列は、コードされたポリペプチドの後続の操作を容易にする（例えば、局在化または検出を容易にする）ように設計された「タグ」をコードするタグ配列を含むことができる。タグ配列は、コードされたタグがポリペプチドのカルボキシルまたはアミノ末端のいずれかに位置するように、ポリペプチドをコードする核酸配列に挿入され得る。符号化タグの非限定的な例としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎ．）が挙げられる。
【０２０５】
核酸構築物は、ＳｓｓＩ  ＣｐＧメチラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓ．）を使用してメチル化することができる。一般に、核酸構築物は、緩衝液中のＳ−アデノシルメチオニンおよびＳｓｓＩ  ＣｐＧ−メチラーゼとともに３７℃でインキュベートすることができる。ハイパーメチル化は、１単位のＨｉｎＰ１Ｉエンドヌクレアーゼで１時間、３７℃でインキュベートし、アガロースゲル電気泳動によってアッセイすることによって確認することができる。
【０２０６】
核酸構築物は、様々な技法を使用して、例えば、卵母細胞または卵子などの生殖細胞、前駆細胞、成体幹細胞または胚幹細胞、原始生殖細胞、ＰＫ−１５細胞などの腎臓細胞、島細胞、β細胞、肝臓細胞、または真皮線維芽細胞などの線維芽細胞を含む、任意のタイプの胚細胞、胎児細胞、または成体動物細胞に導入することができる。技術の非限定的な例としては、トランスポゾン系、細胞に感染し得る組み換えウイルス、あるいは細胞に核酸を送達することができるリポソーム、またはエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、もしくはリン酸カルシウム沈殿などの他の非ウイルス方法の使用が挙げられる。
【０２０７】
トランスポゾン系において、核酸構築物の転写単位、すなわち、外因性核酸配列に作動可能に連結された調節領域は、トランスポゾンの反転反復に隣接している。核酸をマウス、ヒト、およびブタ細胞を含む細胞に導入するために、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（米国特許第６，６１３，７５２号および米国公開第２００５／０００３５４２号を参照）、Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ（Ｍｉｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：６８７３）、Ｔｏｌ２（Ｋａｗａｋａｍｉ（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ７、Ｍｉｎｏｓ（Ｐａｖｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ２）、Ｈｓｍａｒ１（Ｍｉｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００７））Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２７：４５８９）、およびＰａｓｓｐｏｒｔを含むいくつかのトランスポゾン系が開発された。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンが特に有用である。トランスポサーゼは、タンパク質として送達することができる、外因性核酸と同じ核酸構築物上でコードすることができる、別個の核酸構築物上に導入することができる、またはｍＲＮＡ（例えば、インビトロで転写され、キャップされたｍＲＮＡ）として提供することができる。
【０２０８】
インスレーター配列はまた、外因性核酸の発現を維持し、宿主遺伝子の望ましくない転写を阻害するために、核酸構築物に含まれてもよい。例えば、米国公開第２００４／０２０３１５８号を参照されたい。典型的には、インスレーター配列は、転写ユニットの各側面に隣接し、トランスポゾンの逆方向反復の内部にある。インスレーター配列の非限定的な例としては、マトリックス結合領域（ＭＡＲ）型インスレーター配列およびボーダー型インスレーター配列が挙げられる。例えば、米国特許第６，３９５，５４９号、同第５，７３１，１７８号、同第６，１００，４４８号、および同第５，６１０，０５３号、ならびに米国公開第２００４／０２０３１５８号を参照されたい。
【０２０９】
核酸をベクターに組み込むことができる。ベクターは、担体から標的ＤＮＡに移動するように設計された任意の特定のＤＮＡセグメントを含む広義用語である。ベクターは、エピソーム、プラスミド、またはさらにはウイルス／ファージＤＮＡセグメントなどのゲノムまたは他の標的ＤＮＡ配列へのＤＮＡ挿入をもたらすために必要な成分のセットである、発現ベクターまたはベクター系と称され得る。動物における遺伝子送達に使用されるウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、および組み込みファージウイルス）、ならびに非ウイルスベクター（例えば、トランスポゾン）などのベクター系は、２つの基本的成分を有する：１）ＤＮＡ（またはｃＤＮＡに逆転写されるＲＮＡ）で構成されるベクター、ならびに２）トランスポサーゼ、リコンビナーゼ、またはベクターおよびＤＮＡ標的配列の両方を認識し、ベクターを標的ＤＮＡ配列に挿入する他のインテグラーゼ酵素からなるベクター。ベクターは、最も多くの場合、１つ以上の発現制御配列を含む１つ以上の発現カセットを含有し、発現制御配列は、別のＤＮＡ配列またはｍＲＮＡの転写および／または翻訳をそれぞれ制御および調節するＤＮＡ配列である。
【０２１０】
多くの異なるタイプのベクターが既知である。例えば、プラスミドおよびウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターは、既知である。哺乳類発現プラスミドは、典型的には、複製起点、好適なプロモーターおよび任意のエンハンサー、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、ならびに５’隣接非転写配列を有する。ベクターの例としては、プラスミド（別のタイプのベクターの担体であってもよい）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（例えば、修飾ＨＩＶ−１、ＳＩＶ、またはＦＩＶ）、レトロウイルス（例えば、ＡＳＶ、ＡＬＶ、またはＭｏＭＬＶ）、およびトランスポゾン（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｐ要素、Ｔｏｌ−２、Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ、ｐｉｇｇｙＢａｃ）が挙げられる。
【０２１１】
本明細書で使用される場合、核酸という用語は、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成（例えば、化学的に合成された）ＤＮＡ、ならびに天然に存在するおよび化学的に修飾された核酸、例えば、合成塩基または代替骨格を含む、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を指す。核酸分子は、二本鎖または一本鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス一本鎖）であり得る。
【０２１２】
本発明を詳細に説明した後、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲から逸脱することなく、修飾および変形が可能であることが明らかであろう。
【実施例】
【０２１３】
本発明をさらに例示するために、以下の非限定的な実施例が提供される。
【０２１４】
実施例１：インビトロ由来卵母細胞および胚から遺伝子操作されたブタを産生するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の使用
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ９）系内の成分などのホーミングエンドヌクレアーゼを説明する最近の報告は、ブタにおける遺伝子操作（ＧＥ）が現在、より効率的であり得ることを示唆している。標的ホーミングエンドヌクレアーゼは、ゲノム内の特定の位置で二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導し得、ドナーＤＮＡが提供される場合、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によるランダム突然変異または相同組み換え（ＨＲ）の刺激のいずれかを引き起こすことができる。ＨＲを介したゲノムの標的修飾は、ドナーＤＮＡが標的化ヌクレアーゼとともに提供される場合、ホーミングエンドヌクレアーゼで達成することができる。体細胞に特定の修飾を導入した後、これらの細胞を使用して、ＳＣＮＴを介して様々な目的のＧＥブタを産生した。したがって、ホーミングエンドヌクレアーゼは、ＧＥブタを生成する際に有用なツールである。異なるホーミングエンドヌクレアーゼの中で、それが防御機構として使用される原核生物から適合されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、有効なアプローチであるように見える。自然において、Ｃａｓ９系は、３つの成分、標的配列に相補的な領域（シス抑制ＲＮＡ［ｃｒＲＮＡ］）、ｃｒＲＮＡに相補的な領域（トランス活性化ｃｒＲＮＡ［ｔｒａｃｒＲＮＡ］）を含有するＲＮＡ、およびこの複合体中の酵素タンパク質成分Ｃａｓ９を含有するＲＮＡ（約２０塩基）を必要とする。単一のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を構築して、塩基対のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの役割を果たすことができる。ｇＲＮＡ／タンパク質複合体は、ゲノムを走査し、ｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡに相補的な領域でＤＳＢを触媒することができる。他の設計ヌクレアーゼとは異なり、目的の遺伝子を標的とするために必要な試薬を構築するように短いオリゴマーのみを設計する必要がある一方で、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮを組み立てるために一連のクローニングステップが必要である。
【０２１５】
遺伝子破壊のための現在の標準的な方法とは異なり、設計されたヌクレアーゼの使用は、ＧＥの出発物質として接合体を使用する機会を提供する。家畜における遺伝子破壊のための標準的な方法は、培養細胞におけるＨＲ、およびその後の体細胞核移植（ＳＣＮＴ）による胚の再構築を伴う。ＳＣＮＴを介して産生されたクローン動物は、発達不良の兆候を示すことがあるため、ＳＣＮＴ／ＧＥファウンダー動物の子孫は、典型的には、ファウンダー動物が実験に使用された場合に生じる可能性のある混乱するＳＣＮＴ異常および表現型を避けるために研究に使用される。齧歯類と比較して妊娠期間が長く、ブタの住居コストが高くなることを考慮すると、繁殖の必要性が低減するために時間とコストのメリットがある。最近の報告書は、ブタ接合体へのＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの直接注入が、内因性遺伝子を破壊し、所望の突然変異を有するブタを産生する可能性があることを実証した。しかしながら、約１０％のブタのみが、標的遺伝子の両アレル修飾を示し、一部のブタは、モザイク遺伝子型を呈した。最近の記事は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が、発生中の胚における突然変異を誘発し、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮよりも高い効率でＧＥブタを産生することができることを実証した。しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系から産生されたＧＥブタは、モザイク遺伝子型も有した。加えて、上記の研究はすべて、実験のためにインビボ由来の接合体を使用し、これは十分な数の接合体を得るために労働集約および多数の経産ブタを必要とする。
【０２１６】
本実施例は、インビトロ由来の接合体の注入および体細胞の修飾に続くＳＣＮＴの両方を介してＧＥブタを生成する際にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用するための効率的なアプローチを説明する。２つの内因性遺伝子（ＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄ）および１つの導入遺伝子（ｅＧＦＰ）を標的とし、それぞれＳＣＮＴまたはＲＮＡ注入にはインビトロ由来の卵母細胞または接合体のみを使用した。ＣＤ１６３は、ブタ産業に著しい経済損失をもたらすことが知られているウイルスである、ブタの生殖および呼吸器症候群ウイルスによる生産的感染に必要であると思われる。ＣＤ１Ｄは、非古典的な主要組織適合性複合体タンパク質と見なされ、インバリアントナュラルキラーＴ細胞への脂質抗原の提示に関与する。これらの遺伝子を欠くブタは、農業および生物医学のモデルとなるように設計された。ｅＧＦＰ導入遺伝子を、事前の概念実験および方法の最適化の標的として使用した。
【０２１７】
材料および方法
化学物質および試薬
別段の記載がない限り、本研究で使用される化学物質はすべて、Ｓｉｇｍａから購入された。
【０２１８】
特定のＣＲＩＳＰＲを構築するためのｇＲＮＡの設計
ガイドＲＮＡを、野生型ＣＤ１６３に固有であり、ドメインスワップ標的化ベクター（後述）中に存在しないＣＤ１６３のエクソン７内の領域に対して設計し、それによりＣＲＩＳＰＲは、野生型ＣＤ１６３内でＤＳＢをもたらすが、ドメインスワップ標的化ベクター中ではＤＳＢをもたらさない。標的化ベクターが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓｐｙ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を改変する単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を導入する４つの場所のみが存在した。以下を含む４つの標的すべてを選択した：
【０２１９】
（配列番号１）
2021526353.tif 000003
（ＣＲＩＳＰＲ  １０）、
（配列番号２）
2021526353.tif 000004
（ＣＲＩＳＰＲ  １３１）、
（配列番号３）
2021526353.tif 000005
（ＣＲＩＳＰＲ  ２５６）、および
（配列番号４）
2021526353.tif 000006
（ＣＲＩＳＰＲ  ２８２）。
ＰＡＭは、各ｇＲＮＡにおける太字フォントによって識別することができる。
【０２２０】
ＣＤ１Ｄ突然変異について、ＣＲＩＳＰＲ標的の検索は、一次転写物の最初の１０００ｂｐ以内のコード鎖に任意に限定された。しかしながら、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ［２６］（「Ｐｉｇ」反復ライブラリ）は、一次転写物の塩基９４３から始まる反復要素を特定した。次いで、ＣＲＩＳＰＲ標的の検索は、一次転写物の最初の９４２ｂｐに限定された。最後のＳｐｙ  ＰＡＭが塩基８７３に位置するため、検索は、一次転写物の最初の８７３ｂｐにさらに限定された。第１の標的（ＣＲＩＳＰＲ  ４８００）は、それが、一次転写物
（
2021526353.tif 000007
（配列番号５））中の塩基４２に位置する開始コドンと重複するために選択された。任意に選択された領域
（
2021526353.tif 000008
（配列番号６）および
2021526353.tif 000009
（配列番号７））内の第１の選択に対して最も遠位であったため、２つの追加の標的（ＣＲＩＳＰＲ  ５６２０および５６２６）を選択した。これらの標的は重複する。開始コドンに関連して、最も近位のＳｐｙ  ＰＡＭは、視覚的評価によって決定されるように、広範囲にホモポリマー配列を含有する単純な配列に位置した。第４の標的（ＣＲＩＳＰＲ  ５３５０）を選択したのは、第１の標的選択と関連して、広範なホモポリマー領域
（
2021526353.tif 000010
（配列番号８）を含有しない最も近位の標的であったためである。設計されたｃｒＲＮＡの特異性は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて類似のブタ配列を検索することによって確認された。オリゴヌクレオチド（表１）をアニールし、２つの発現カセット、ヒトコドン最適化Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ｈＳｐｙ）Ｃａｓ９、およびキメラガイドＲＮＡを含有するｐ３３０Ｘベクターにクローニングした。Ｐ３３０Ｘを、ＢｂｓＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で、Ｚｈａｎｇ実験プロトコル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｒｉｓｐｒ／ｚｈａｎｇ／）に従って消化した。
【０２２１】
ｅＧＦＰを標的とするために、ｅＧＦＰコード配列を標的とする２つの特異的ｇＲＮＡを、ｅＧＦＰ開始コドンの最初の６０ｂｐ内で設計した。ｅＧＦＰ１およびｅＧＦＰ２  ｇＲＮＡの両方が、アンチセンス鎖上にあり、ｅＧＦＰ１は、開始コドンを直接標的とした。ｅＧＦＰ１  ｇＲＮＡ配列は、
2021526353.tif 000011
（配列番号９）であり、ｅＧＦＰ２  ｇＲＮＡ配列は、
2021526353.tif 000012
（配列番号１０）であった。
【表１】
2021526353.tif 000013
【０２２２】
ＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄ遺伝子のドナーＤＮＡの合成
ブタＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄの両方を、後のトランスフェクションのために使用されるであろう胎児線維芽細胞から単離されたＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、標的化ベクターとトランスフェクションされた細胞株との間の同種適合を確実にした。簡潔には、順方向プライマーＣＴＣＴＣＣＣＴＣＡＣＴＣＴＡＡＣＣＴＡＣＴＴ（配列番号１１）および逆方向プライマーＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＡＣＡＴＧＧＣＣＡＧＴＣ（配列番号１２）を使用するＬＡタグを使用して、ＣＤ１６３の９５３８ｂｐ断片を増幅した。断片をＤＮＡ配列で検証し、ドメインスワップ標的化ベクターを構築するために使用した（図１）。このベクターは、エクソン１１由来のヒトＣＤ１６３Ｌと同じアミノ酸配列をコードするように、エクソン７内に３３個の点突然変異を含んでいた。置換エクソンは、３１５ｂｐであった。加えて、後続のイントロンを、Ｃｒｅ−リコンビナーゼ（Ｃｒｅ）で除去することができ、保持されたｌｏｘＰ部位を内包するときに以前に正常なスプライシングを実証した選択可能なマーカー遺伝子を収容した修飾ミオスタチンイントロンＢで置き換えた（Ｗｅｌｌｓ、未発表の結果）。構築物の長アームは、３４６９ｂｐであり、ドメインスワップＤＳエクソンを含んでいた。短アームは、１５７８ｂｐであり、エクソン７および８を含んでいた（図１、パネルＢ）。このプラスミドを使用して、第１のトランスフェクション実験におけるエクソン７のコード領域の置き換えを試み、選択可能なマーカー（Ｇ４１８）を介した標的化事象の選択を可能にした。標的化が生じる場合、Ｃｒｅ−リコンビナーゼによりマーカーを欠失させることができる。次いで、ＣＤ１６３  ＤＳ標的化ベクターを、Ｃｒｅ欠失できないＮｅｏで破壊されたＳＩＧＬＥＣ１遺伝子を既に含有する細胞株とともに使用するように修飾した。この標的化ベクターでは、Ｎｅｏカセット、ｌｏｘＰおよびミオスタチンイントロンＢを除去し、ＤＳエクソンのみをＷＴ長および短アームで残した（図１、パネルＣ）。
【０２２３】
ブタＣＤ１Ｄのゲノム配列を、順方向プライマーＣＴＣＴＣＣＣＴＣＡＣＴＣＴＡＡＣＣＴＡＣＴＴ（配列番号１３）および逆方向プライマーＧＡＣＴＧＧＣＣＡＴＧＴＧＡＧＡＧＡＡＡＴＡ（配列番号１４）を使用してＬＡタグで増幅し、８７２９ｂｐ断片を得た。断片をＤＮＡ配列決定し、図２に示される標的化ベクターを構築するために使用した。Ｎｅｏカセットは、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの制御下にあり、選択のために導入されたｌｏｘＰ配列に隣接している。構築物の長アームは４８３２ｂｐであり、短アームは３５６３ｂｐであり、エクソン６および７を含んでいた。成功したＨＲが発生した場合、エクソン３、４、および５が除去され、Ｎｅｏカセットに置き換えられる。ＮＨＥＪ修復が誤って発生した場合、エクソン３は中断される。
【０２２４】
胎児線維芽細胞収集
ブタ胎児組織を妊娠３５日目に収集して、細胞株を作成した。大きな白色家畜雑種から、２つの野生型（ＷＴ）雄および雌胎児線維芽細胞株を確立した。これらの研究には、Ｎｅｏカセット（ＳＩＧＬＥＣ１−／−遺伝子）を含有するように以前に修飾された雄および雌胎児線維芽細胞も使用した。胎児線維芽細胞を、わずかな修飾を加えて記載のとおりに収集し、各胎児からの組織ミンチを、２０ｍＬの消化培地（２００単位／ｍＬのコラーゲナーゼおよび２５Ｋｕｎｉｔｚ単位／ｍＬのＤＮＡｓｅＩが補充された、Ｌ−グルタミンおよび１ｇ／ＬのＤ−グルコース［Ｃｅｌｌｇｒｏ］を含有するダルベッコ改変イーグル培地［ＤＭＥＭ］）中、３８．５℃で５時間消化した。消化後、胎児線維芽細胞を洗浄し、ＤＭＥＭ、１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、および４０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンで培養した。一晩培養後、細胞をトリプシン処理し、１０％ジメチルスルホキシドでＦＢＳ中のアリコート中−８０℃で凍結して、液体窒素中に保存した。
【０２２５】
細胞トランスフェクションおよび遺伝子型決定
トランスフェクション条件は、実質的に、以前に報告されたとおりであった。ドナーＤＮＡを、常に１μｇの一定量で、様々な量のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミド（以下に列挙する）とともに使用した。トランスフェクションの前に、ドナーＤＮＡをＭＬＵＩ（ＣＤ１６３）（ＮＥＢ）またはＡＦＬＩＩ（ＣＤ１Ｄ）（ＮＥＢ）で直鎖状にした。確立された細胞株の性別は、トランスフェクションの前に先に記載されたＰＣＲによって決定した。雄細胞株および雌細胞株の両方をトランスフェクトし、トランスフェクション間で一緒にゲノム修飾データを分析した。同様の継代数（２〜４）の胎児線維芽細胞株を２日間培養し、１５％ＦＢＳ、２．５ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子、および１０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシンが補充された、Ｌ−グルタミンおよび１  ｇ／ＬのＤ−グルコース（Ｃｅｌｌｇｒｏ）を含有するＤＭＥＭ中で７５％〜８５％の培養密度に成長させた。線維芽細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄し、トリプシン化した。細胞が分離するとすぐに、細胞をエレクトロポレーション培地（７５％細胞塩［１２０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．６、５Ｍｍ  ＭｇＣｌ２］）および２５％Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗い流した。細胞濃度は、血球測定器を使用して定量化した。細胞を６００×ｇで５分間ペレット化し、１×１０６の濃度でエレクトロポレーション培地に再懸濁した。各エレクトロポレーションは、２５０ＶでＢＴＸ  ＥＣＭ２００１を通じて投与される３つの（１ｍｓｅｃ）矩形波パルスを有する２ｍｍギャップキュベット中の２００μＬの細胞を使用した。エレクトロポレーション後、細胞を上述のＤＭＥＭ中に再懸濁した。選択のために、トランスフェクションの２４時間後に６００μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加し、培地を７日目に変更した。トランスフェクション後、１４日目にコロニーを採取した。Ｇ４１８選択を使用した場合、胎児線維芽細胞を１０，０００細胞／プレートで、Ｇ４１８選択を使用しなかった場合、５０細胞／プレートで播種した。胎児線維芽細胞コロニーを、オートクレーブ真空グリースによって各コロニーの周囲に密封された１０ｍｍのオートクレーブクローニングシリンダーを適用することによって収集した。コロニーをＰＢＳで洗い流し、トリプシンを介して収穫し、次いでＤＭＥＭ培養培地に再懸濁した。再懸濁したコロニーの一部（１／３）を９６ウェルＰＣＲプレートに移し、残りの（２／３）細胞を２４ウェルプレートのウェル内で培養した。細胞ペレットを６μＬの溶解緩衝液（４０ｍＭのトリス、ｐＨ８．９、０．９％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．４ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ［ＮＥＢ］）に再懸濁し、細胞溶解のために６５℃で３０分間インキュベートし、続いて８５℃で１０分間インキュベートしてプロテイナーゼＫを不活性化した。
【０２２６】
ＤＳならびに大小の欠失についてのＰＣＲスクリーニング
ＨＲ指向性修復の検出。ロングレンジＰＣＲを使用して、ＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄのいずれかの突然変異を同定した。３つの異なるＰＣＲアッセイを使用して、ＨＲ事象を同定した。ドナーＤＮＡ内のＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄ配列から右側または左側の内因性ＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄ配列に及ぶ領域のＰＣＲ増幅、ならびに設計されたドナーＤＮＡを包含するＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄの大領域を増幅したロングレンジＰＣＲ。外因性Ｎｅｏ配列の付加から生じる、１．８ｋｂ（ＣＤ１Ｄ）または３．５ｋｂ（ＣＤ１６３）のいずれかのＰＣＲ生成物のサイズの増加は、遺伝子のＨＲ指向性修復の証拠とみなされた。すべてのＰＣＲ条件には、９５℃で２分間の初期変性、続いて９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、および６８℃で７〜１０分の３３サイクルが含まれた。製造者の推奨に従って、すべてのアッセイにＬＡ  ｔａｑを使用した。プライマーを表２に示す。
【表２】
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【０２２７】
小欠失アッセイ（ＮＨＥＪ）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系によって導入された突出切断部位に隣接するＣＤ１６３またはＣＤ１ＤのＰＣＲ増幅によって、小さな欠失を決定した。アンプリコンのサイズは、ＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄについてそれぞれ４３５ｂｐおよび１２４４ｂｐであった。胚および胎児線維芽細胞の両方からの溶解物を、ＬＡ  ｔａｑでＰＣＲ増幅した。アッセイのＰＣＲ条件は、９５℃で２分間の初期変性、続いて９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、および７２℃で１分の３３サイクルであった。トランスフェクト細胞の遺伝子型決定のために、アガロースゲル電気泳動によってＰＣＲアンプリコンを分離することによって、挿入および欠失（ＩＮＤＥＬ）を同定した。胚遺伝子型決定のために、結果として生じるＰＣＲ生成物をその後、ＰＣＲで使用される順方向プライマーを使用して小欠失を同定するためにＤＮＡ配列決定した。プライマー情報を表３に示す。
【表３】
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【０２２８】
体細胞核移植（ＳＣＮＴ）
ＳＣＮＴ胚を産生するために、地域の屠場からの経産ブタ由来卵母細胞（ＡＲＴ，Ｉｎｃ．）または未経産ブタ由来卵母細胞のいずれかを使用した。経産ブタ由来卵母細胞を、成熟培地（２．９ｍＭのＨｅｐｅｓ、５μｇ／ｍＬのインスリン、１０ｎｇ／ｍＬの表皮成長因子［ＥＧＦ］、０．５μｇ／ｍＬのブタ卵胞刺激ホルモン［ｐ−ＦＳＨ］、０．９１ｍＭのピルビン酸塩、０．５ｍＭのシステイン、１０％のブタ卵胞液、および２５ｎｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含むＴＣＭ−１９９）中で一晩出荷し、２４時間後に新鮮な培地に移した。４０〜４２時間の成熟後、卵母細胞を、０．１％ヒアルロニダーゼの存在下でボルテックスすることによって卵母細胞から除去した。インビトロ受精（ＩＶＦ）のために、以下に記載されるように、未経産ブタ由来卵母細胞を成熟させた。操作中、卵母細胞を、７．０μｇ／ｍＬのサイトカラシンＢが補充された操作培地（０．６ｍＭのＮａＨＣＯ３、２．９ｍＭのＨｅｐｅｓ、３０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｎｇ／ｍＬのゲンタマイシン、および３ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを有するＴＣＭ−１９９［Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ］（浸透圧濃度３０５ｍＯｓｍ））中に配置した。おそらく中期ＩＩプレートを含有する隣接細胞質の一部分とともに極性体を除去し、ドナー細胞を薄いガラス毛細管を使用してペリビテリン空間内に配置した。次いで、再構築された胚を、ＢＴＸ電気細胞マニピュレータ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して、１．２ｋＶ／ｃｍの２つのＤＣパルス（１秒間隔）で３０秒間、融合培地（０．３Ｍマンニトール、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．５ｍ  Ｍ  Ｈｅｐｅｓ）中で融合させた。融合後、融合胚を２００μＭのチメロサールで１０分間暗闇で、および８ｍＭのジチオスレイトールで３０分間完全に活性化した。次いで、前述のように、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤である０．５μＭ  Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ（Ｓ７８１７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、修飾ブタ接合培地ＰＺＭ３−ＭＵ１中で１４〜１６時間インキュベートした。
【０２２９】
体外受精（ＩＶＦ）
ＩＶＦについては、思春期前の未経産ブタ由来の卵巣を屠場（Ｆａｒｍｌａｎｄ  Ｆｏｏｄｓ  Ｉｎｃ．）から得た。１０ｍＬのシリンジに取り付けられた１８ゲージの皮下針を使用して、中サイズ（３〜６ｍｍ）の卵胞から未成熟卵母細胞を吸引した。次いで、均等に暗い細胞質を有する卵母細胞および無傷の周囲の卵丘細胞を、成熟のために選択した。約５０個の卵丘卵母細胞複合体を、加湿空気中、３．０５ｍＭのグルコース、０．９１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．５７ｍＭのシステイン、１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、０．５μｇ／ｍＬの黄体形成ホルモン（ＬＨ）、０．５μｇ／ｍＬのＦＳＨ、１０ｎｇ／ｍＬのゲンタマイシン（ＡＰＰ  Ｐｈａｒｍ）、および０．１％のポリビニルアルコールを含む、５００μＬの成熟培地ＴＣＭ−１９９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するウェル中に４２〜４４時間、３８．５℃、５％ＣＯ２で配置した。成熟の終わりに、０．１％ヒアルロニダーゼの存在下で３分間ボルテックスすることによって、周囲の卵丘細胞を卵母細胞から除去した。次いで、インビトロで成熟した卵母細胞を、２５〜３０個の卵母細胞群のＩＶＦ培地（１１３．１ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、７．５ｍＭのＣａＣｌ２、１１ｍＭのグルコース、２０ｍＭのトリス、２ｍＭのカフェイン、５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および２ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］を含有する修飾トリス緩衝培地）の５０μＬ液滴に入れた。１００μＬの冷凍精液ペレットを、０．１％ＢＳＡが補充された３ｍＬのダルベッコＰＢＳ中で解凍した。冷凍ＷＴまたは新鮮なｅＧＦＰ精液のいずれかを、６０％Ｐｅｒｃｏｌｌ中で２０分間、６５０３ｇで洗浄し、遠心分離によって１０分間修飾トリス緩衝培地中で洗浄した。いくつかの場合において、以前に記載されたｅＧＦＰ導入遺伝子のために採取したばかりのヘテロ接合精液を、ＰＢＳ中で３回洗浄した。次いで、精液ペレットをＩＶＦ培地で０．５×１０６細胞／ｍＬに再懸濁した。５０マイクロリットルの精液懸濁液を、卵母細胞を有する液滴に導入した。配偶子を、空気中の５％ＣＯ２の雰囲気中３８．５℃で５時間、共インキュベートした。受精後、胚をＰＺＭ３−ＭＵ１中３８．５℃および空気中５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０２３０】
胚移植
ＧＥ  ＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄブタを産生するために生成された胚を、最初の発情後の１日目（ＳＣＮＴ）または６日目（接合体注入）のいずれかで代理母に移植した。６日目の移植について、接合体を、１０ｎｇ／ｍＬのｐｓ４８（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．）の存在下でＰＺＭ３−ＭＵ１中でさらに５日間培養した。胚を、代理母の卵管の膨大部−狭部接合部に外科的に移植した。
【０２３１】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のＲＮＡのインビトロ合成
インビトロ転写のためのテンプレートＤＮＡを、ＰＣＲを使用して増幅した（表４）。細胞トランスフェクション実験に使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドは、ＰＣＲのテンプレートとして機能した。接合体においてＣａｓ９を発現させるために、ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ  Ｕｌｔｒａキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してＣａｓ９のｍＲＮＡを産生した。次いで、ポリ（Ａ）テーリングキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、ポリＡシグナルをＣａｓ９  ｍＲＮＡに添加した。ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（Ａｍｂｉｏｎ）によって産生した。合成されたＲＮＡの品質を１．５％アガロースゲル上で可視化し、次いで１０ｎｇ／μＬの最終濃度（ｇＲＮＡおよびＣａｓ９の両方）まで希釈し、３μＬアリコートに分配した。
【表４】
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【０２３２】
接合体における設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のマイクロインジェクション
Ｃａｓ９およびｇＲＮＡをコードするメッセンジャーＲＮＡを、ＦｅｍｔｏＪｅｔマイクロインジェクター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて、受精後１４時間（推定接合体）に注入した。Ｎｉｋｏｎ倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）の加熱したステージ上の操作培地でマイクロインジェクションを行った。次いで、注入した接合体を、さらなる使用まで１０ｎｇ／ｍＬのｐｓ４８でＰＺＭ３−ＭＵ１に移した。
【０２３３】
統計解析
修飾ゲノムを有するコロニーの数を１として分類し、ゲノムの修飾のないコロニーを０として分類した。Ｐ値０．０５が有意であると見なされるＰＲＯＣ  ＧＬＭ（ＳＡＳ）を使用することによって、差異を決定した。平均を最小二乗平均として計算した。データは、数値平均±ＳＥＭとして提示される。
【０２３４】
結果
体細胞におけるＣＤ１６３およびＣＤ１ＤのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ノックアウト
ＣＤ１６３を標的とする４つの異なるＣＲＩＳＰＲプラスミド（ガイド１０、１３１、２５６、および２８２）の効率を、２μｇ／μＬのドナーＤＮＡの量で試験した（表５）。ＣＲＩＳＰＲ２８２は、ＣＲＩＳＰＲ１０および２５６処置よりも有意に多くの平均コロニー形成をもたらした（Ｐ＜０．０５）。上記のロングレンジＰＣＲアッセイから、当初意図されていたとおりのＨＲによるＤＳの代わりに、５０３ｂｐ〜最大１５０６ｂｐの範囲の大きな欠失が見出された（図３、パネルＡ）。これは、他のＤＮＡ編集系を用いた以前の報告では、ブタにおいてＺＦＮを使用して６〜３３３ｂｐのはるかに小さな欠失を示したため、予想されなかった。ＣＲＩＳＰＲ１０および４つすべてのＣＲＩＳＰＲの混合物は、ＣＲＩＳＰＲ２５６および２８２よりも修飾ゲノムを有するコロニーの数が多かった（表５、Ｐ＜０．００２）。ＣＲＩＳＰＲ１０およびＮｅｏを含有するがＣＤ１６３と相同性がないプラスミドによるトランスフェクションは、大きな欠失を提示するコロニーをもたらさなかった。興味深いことに、ドナーＤＮＡをいかなるＣＲＩＳＰＲも伴わずに導入したときに、１つのモノアレル欠失も検出された。このアッセイは、トランスフェクトされた体細胞内のアガロースゲル上で検出できなかった配列決定による任意の潜在的な小さな欠失がスクリーニングされなかったため、突然変異速度の過小評価を表す可能性が高い。
【表５】
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【０２３５】
最初の目標は、Ｃ１６３のＨＲによるドメインスワップ（ＤＳ）標的化イベントを得ることであったが、ＣＲＩＳＰＲは、ＣＤ１６３を標的化する効率を増加させなかった。この標的化ベクターの種々の組み合わせは、従来のトランスフェクションによってＨＲによりＣＤ１６３を修飾するために使用されており、３３９９コロニーをスクリーニングした後に標的化事象をもたらさなかったことに留意されたい（Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｐｒａｔｈｅｒ、非公開結果）。ＣＲＩＳＰＲ１０およびＤＳ標的化ベクターをドナーＤＮＡとしてトランスフェクションすることによって導入しようとした３３個すべての突然変異を含有するＨＲから生じる完全ＤＳを用いて、２匹のブタを得た。
【０２３６】
次に、薬物選択なしのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘発突然変異の効率を試験した。本研究で使用される胎児線維芽細胞株は、Ｎｅｏ抵抗性カセットの組み込みおよびＳＩＧＬＥＣ１のノックアウトを既に有していた。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９とドナーＤＮＡの比率が、ゲノム修飾を増加させるか、または高濃度で毒性効果をもたらすかどうかも試験した。前の実験では、それが多数の総コロニーおよび修飾ゲノムを有するコロニーのパーセンテージの増加をもたらしたため、この試験のためにＣＲＩＳＰＲ１３１を選択した。ＣＲＩＳＰＲ１３１  ＤＮＡの量を３：１から２０：１に増加させることは、胎児線維芽細胞生存率に有意な影響を及ぼさなかった。ＮＨＥＪによって修飾されたゲノムを有するコロニーのパーセントは、様々なＣＲＩＳＰＲ濃度間で有意差はなかったが、１０：１の比率で最も多くのＮＨＥＪを有した（表６、Ｐ＝０．３３）。ドナーＤＮＡに対するＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡの最も高い比率（２０：１）であっても、ＨＲは観察されなかった。
【表６】
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【０２３７】
この経験に基づいて、体細胞におけるＣＤ１Ｄの標的破壊が試みられた。４つの異なるＣＲＩＳＰＲを設計し、雄細胞および雌細胞の両方において試験した。ＣＤ１Ｄの修飾は、適用されたＣＲＩＳＰＲのうちの３つから検出することができるが、ＣＲＩＳＰＲ  ５３５０の使用は、アガロースゲル電気泳動によって検出するのに十分な大きさの欠失を有するＣＤ１Ｄの修飾をもたらさなかった（表７）。興味深いことに、ドナーＤＮＡが提供されたが、ＨＲを通じて遺伝的変化は得られなかった。しかしながら、ＣＤ１６３ノックアウト実験と同様の大きな欠失が観察された（図３、パネルＢ）。ドナーＤＮＡとともにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用しなかった場合、大きな欠失を伴うＣＤ１Ｄの標的修飾は検出されなかった。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導標的化からのＣＤ１Ｄの修飾は、細胞の雄コロニーおよび雌コロニーにおいてそれぞれ４／１２１および３／２８であった。トランスフェクションデータには、アガロースゲル電気泳動によって検出可能なＩＮＤＥＬのみが含まれた。
【表７】
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【０２３８】
ＧＥ細胞を使用したＳＣＮＴによるＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄブタの産生
ＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄの修飾を提示する細胞をＳＣＮＴに使用して、ＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄノックアウトブタを産生した（図３）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系でトランスフェクトした雄および雌胎児線維芽細胞からのＳＣＮＴ胚を用いて、７回の胚移植（ＣＤ１６３  表８）、６回の胚移植（ＣＤ１６３−Ｎｅｏなし）、および５回の胚移植（ＣＤ１Ｄ）を行った。レシピエント未経産ブタのうち６匹（ＣＤ１６３）、２匹（ＣＤ１６３−Ｎｅｏなし）、および４匹（ＣＤ１Ｄ）（表９）は、期間まで妊娠したままであり、妊娠率は８５．７％であった。それぞれ３３．３％および８０％である。ＣＤ１６３レシピエントのうち、５匹は帝王切開で健康な子ブタを分娩した。１匹（Ｏ０４４）は、自然に分娩した。同腹子の大きさは、１〜８であった。生後成長障害のため、４匹のブタを安楽死させた。重篤な口蓋裂のため、１匹の子ブタを安楽死させた。残りのすべての子ブタは、健康に見える（図３、パネルＣ）。図３、パネルＢに記載されるＣＲＩＳＰＲ１０およびドナーＤＮＡでトランスフェクトした胎児線維芽細胞から得られた雄ブタの２同腹子は、ＣＲＩＳＰＲ１０に隣接するエクソン７において３０ｂｐ欠失、および前のイントロンの追加の１４７６ｂｐ欠失を有し、したがって、ＣＤ１６３のイントロン６／エクソン７接合部を除去した（図３、パネルＥ）。遺伝子型および予測される翻訳を表１０に要約する。以前に修飾されたＳＩＧＬＥＣ１細胞のＣＤ１６３−Ｎｅｏなしトランスフェクションから１匹の雄子ブタおよび１匹の雌同腹子（４匹の子ブタ）を得た。ＳＩＧＬＥＣ１およびＣＤ１６３については、５匹すべての子ブタをダブルノックアウトした。雄子ブタは、ＣＤ１６３の両アレル修飾を有し、一方のアレル上のエクソン７に２８ｂｐ欠失、およびエクソン７の部分欠失ならびにエクソン８の完全欠失を含む他方のアレルおよび進行するイントロン上に１３８７ｂｐ欠失を有したため、イントロンエクソン接合部を除去した。雌子ブタは、一方のアレル上に１１ｂｐ挿入を伴う１３８２ｂｐ欠失および他方のアレル上に１７２０ｂｐのＣＤ１６３の欠失を含む、ＣＤ１６３の両アレル突然変異を有した。ＣＤ１６３修飾および予測翻訳の要約は、表１０に見出すことができる。ＣＲＩＳＰＲ修飾によるＣＤ１Ｄ修飾および予測翻訳の要約は、表１１に見出すことができる。簡潔に述べると、１匹の雌および２匹の雄同腹子が生まれ、１３匹の子ブタが生まれた。一匹の子ブタは、生後すぐに死亡した。１３匹の子ブタのうちの１２匹は、ＣＤ１Ｄの両アレル欠失またはホモ接合欠失のいずれかを含有した（図３、パネルＦ）。１匹の子ブタは、ＷＴであった。
【表８】
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【表９】
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【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１１】
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【０２３９】
ブタ接合体におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の効率
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用した体細胞におけるＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄの標的破壊に基づいて、このアプローチをブタ胚発生に適用した。まず、発生中の胚におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の有効性を試験した。ｅＧＦＰを標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を、ｅＧＦＰ導入遺伝子に対してヘテロ接合性の雄ブタ由来の精液で受精した接合体に導入した。注入後、ｅＧＦＰを発現する後続の胚をモニターした。様々な濃度のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を試験し、送達されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の細胞毒性を観察した（図４、パネルＡ）；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９注入後の胚発生は、対照と比較して低かった。しかしながら、検査したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のすべての濃度は、ｅＧＦＰ発現を有する胚がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９注入群において見出されなかったため、ｅＧＦＰの修飾の生成に有効であった（図４、パネルＢ）；非注入対照胚のうち、６７．７％は緑色であり、ｅＧＦＰの発現を示した。個々の胚盤胞を遺伝子型決定した場合、ＣＲＩＳＰＲ結合部位付近の小さな突然変異を同定することが可能であった（図４、パネルＣ）。毒性および有効性に基づいて、１０ｎｇ／μＬのｇＲＮＡおよびＣａｓ９  ｍＲＮＡを以下の実験に使用した。
【０２４０】
ＣＤ１６３を標的とするように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分を推定接合体に導入したところ、後続の胚盤胞における遺伝子の標的編集が観察された。ＣＤ１６３の突然変異について個々の胚盤胞を遺伝子型決定したところ、すべての胚に特異的な突然変異が認められた（１００％ＧＥ効率）。より重要なことに、ホモ接合または両アレル修飾で胚が見出され得る一方で（それぞれ８／１８および３／１８）（図５）、モザイク（単一アレル修飾）遺伝子型も検出された（４／１８胚）。プールからのいくつかの胚（８／１０）に、２ｎｇ／μＬのＣａｓ９および１０ｎｇ／μＬのＣＲＩＳＰＲを注入し、突然変異誘発の効率に差は見出されなかった。次に、インビトロ結果に基づいて、異なるｇＲＮＡを表す２つのＣＲＩＳＰＲを導入して、胚発生中にＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄを破壊し、標的遺伝子の特異的欠失を誘導した。その結果、２つのガイドを導入することによって、ＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄの設計された欠失を誘導することに成功することができた。設計された欠失は、導入された２つのガイド間のゲノム配列を除去する欠失として定義される。ＣＤ１６３を標的とする２つのＣＲＩＳＰＲを受けた胚のうち、１つを除くすべての胚は、ＣＤ１６３の標的修飾をもたらした。加えて、１３個の胚のうち５個は、ＣＤ１６３上に設計された欠失を有することが見出され（図６、パネルＡ）、１３個の胚のうち１０個は、ホモ接合または両アレル様式のいずれかでＣＤ１６３の修飾を有するように見えた。すべての胚（２３／２３）がＣＤ１Ｄの修飾を示したため、２つのＣＲＩＳＰＲを用いたＣＤ１Ｄの標的化も有効であった。しかしながら、ＣＤ１Ｄの設計された欠失は、２つの胚においてのみ見出すことができた（２／２３）（図６、パネルＢ）。２３個のうち５個は、モザイク遺伝子型を有することも見出されたが、残りの胚は、ＣＤ１Ｄのホモ接合または両アレル修飾のいずれかを有した。最後に、同じ胚内のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系によって複数の遺伝子を標的とすることができるかどうかを試験した。この目的のために、ＣＤ１６３およびｅＧＦＰの両方を標的とすることを、ヘテロ接合ｅＧＦＰ精液で受精した接合体において行った。注入した胚からの胚盤胞をＣＤ１６３およびｅＧＦＰについて遺伝子型決定したところ、胚発生中にＣＤ１６３およびｅＧＦＰが正常に標的とされたことが見出された。配列決定結果は、複数のＣＲＩＳＰＲをＣａｓ９とともに導入することによって、複数の遺伝子を標的とすることができることを実証した（図６、パネルＣ）。
【０２４１】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９注入接合体からのＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄ突然変異体の産生
前回のインビトロ試験の成功に基づいて、いくつかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９注入された接合体を産生し、レシピエントあたり４６〜５５個の胚盤胞を移植した（この数は、インビトロ由来の胚からブタを産生するのに有効であることが示されているため）。４つの胚移植を行い（ＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄについて各々２つ）、各修飾については妊娠を得た。ＣＤ１６３上に修飾を有する４匹の健康なブタを産生した（表８）。すべての子ブタ、レシピエント経産ブタＩＤ  Ｏ０８３からの同腹子６７は、ＣＤ１６３のホモ接合または両アレル修飾のいずれかを示した（図７）。２匹の子ブタは、送達された２つのＣＲＩＳＰＲによるＣＤ１６３の設計された欠失を示した。すべての子ブタは健康であった。ＣＤ１Ｄに関して、１回の妊娠はまた、４匹の子ブタ（レシピエント経産ブタ識別番号Ｏ１６５からの同腹子１６６）、１匹の雌および３匹の雄も産生した（表９）。１匹の子ブタ（１６６−１）は、開始コドンを含有するエクソン３を完全に除去した３６２ｂｐ欠失を含む、ＣＤ１Ｄのモザイク突然変異を担持した（図８）。１匹の子ブタは、一方のアレルに２ｂｐミスマッチを伴う６ｂｐ挿入を含み、他方のアレルに大きな欠失を伴っていた。追加の２匹の子ブタは、両アレル単一ｂｐ挿入を有した。ＣＤ１６３について、モザイク突然変異は検出されなかった。
【０２４２】
考察
ＧＥブタの産生効率の向上は、農業およびバイオ医療のためにより多くのＧＥブタを提供することによって広範な影響を与える可能性がある。上述のデータは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用することにより、特異的突然変異を有するＧＥブタを高効率で産生できることを示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を、体細胞および移植前胚の両方において遺伝子を編集するために適用することに成功した。
【０２４３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を体細胞に導入した場合、ＮＨＥＪによる標的遺伝子の標的破壊を誘導することに成功したが、ＨＲによる標的化能力を増加させなかった。体細胞における個々のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の標的化効率は可変であり、これは、ガイドの設計が標的化効率に影響を及ぼし得ることを示した。具体的には、ＣＲＩＳＰＲ５３５０およびＣａｓ９を体細胞に導入したとき、ＣＤ１Ｄの標的修飾を見つけることは不可能であった。これは、ブタを産生する前に複数のｇＲＮＡを設計し、それらの効率を検証することが有益であり得ることを示唆している。ドナーＤＮＡの存在によるＨＲ指向性修復が欠如している理由はまだ不明である。ＣＲＩＳＰＲおよびドナーＤＮＡでトランスフェクトした８８６コロニー（ＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄの両方）をスクリーニングした後、１つのコロニーのみが部分的ＨＲ事象の証拠を有した。結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が導入されたドナーＤＮＡと連携して標的遺伝子に予期しない大きな欠失を引き起こしたが、これらの２つの特定の標的化ベクターのＨＲ効率を増加させなかったことを実証した。しかしながら、大きな欠失観察のための具体的な機序は知られていない。我々のグループからの以前の報告では、ドナーＤＮＡをＺＦＮで効果的に使用して、ＨＲ指向性修復を誘導できることが示唆された。同様に、ドナーＤＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系で使用した場合、標的化効率の増加が見られたが、完全なＨＲ指向性修復は観察されなかった。ＺＦＮを使用する以前の研究では、ＺＦＮによって誘導されたＤＳＢの後に導入されたドナーＤＮＡの部分的な組み換えが見出されたため、標的修飾は、ＨＲおよびＮＨＥＪの組み合わせを通じて生じ得ることが観察された。１つの説明は、ＨＲおよびＮＨＥＪ経路が独立していないが、ホーミングエンドヌクレアーゼによって誘導されたＤＳＢ後に修復プロセスを完了するために一緒に作用することができることであり得る。より高い濃度のＣＲＩＳＰＲは、体細胞における標的化効率を向上させることができるが、これらの実験結果において統計学的差異は見出されなかった。これは、ＣＲＩＳＰＲがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系における制限因子であることを示唆し得るが、さらなる検証が必要である。標的細胞を使用して、ＳＣＮＴを介してＧＥブタを産生することに成功した。これはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の適用が、クローニングされる細胞の能力に影響を与えないことを示す。健康上の問題のため、数匹の子ブタを安楽死させたが、これはＳＣＮＴ由来の子ブタでは珍しくない。
【０２４４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を接合体注入によって発生中の胚に導入すると、ほぼ１００％の胚およびブタが標的遺伝子にＩＮＤＥＬを含有し、この技術が胚発生中に非常に有効であることを実証した。この研究中に観察された効率は、胚発生中にホーミングエンドヌクレアーゼを利用した他の研究で報告された頻度を上回る。胚盤胞段階に到達する胚の数の減少は、本研究で導入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の濃度が胚に毒性を有する可能性があることを示唆した。送達系のさらなる最適化は、胚の生存能を増加させ、したがって、プロセスの全体的な効率を改善し得る。ここで観察されるほぼ１００％の突然変異誘発率は、ブタにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ノックアウトにおける以前の報告とは異なっていたが、試験間の効率の差は、選択されたガイドと標的との組み合わせであり得る。本研究では、より低い濃度のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（各１０ｎｇ／μＬ）が、胚の発生およびＧＥブタの産生における突然変異の生成に有効であった。この濃度は、ブタ接合体において以前に報告された濃度よりも低い（Ｃａｓ９は１２５ｎｇ／μＬおよびＣＲＩＳＰＲは１２．５ｎｇ／μＬ）。より低いＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分の濃度は、発生中の胚に過剰量の核酸を導入することが毒性となり得るため、発生中の胚に有益であり得る。いくつかのモザイク遺伝子型は、インビトロアッセイからＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９注入胚に見られたが、アプローチを通して産生された１匹の子ブタのみがモザイク遺伝子型を有した。潜在的には、モザイク遺伝子型が、接合体においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用する主なハードルであると考えられたため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分を含む注入は、他のホーミングエンドヌクレアーゼの導入よりも有効であり得る。本結果によって実証されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用する別の利点は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を注入したＩＶＦ由来の接合体から産生されたＣＤ１６３ノックアウトブタが失われなかったことであるが、ＳＣＮＴから得られた数匹の子ブタは、数日後に安楽死された。これは、ノックアウトブタを生成する際にＳＣＮＴの必要性を回避するだけでなく、ＳＣＮＴに関連する一般的な健康問題を克服する可能性があることを示唆している。接合体へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｍＲＮＡの注入が最適化されたので、今後の実験にはドナーＤＮＡの同時注入も含まれるであろう。
【０２４５】
本研究は、２つのＣＲＩＳＰＲとＣａｓ９を接合体に導入することにより、発生中の胚における染色体欠失を誘導し、意図される欠失、すなわち、２つのＣＲＩＳＰＲガイド間の特異的欠失を有するブタを産生することができることを実証する。この設計された欠失は、ＮＨＥＪによって引き起こされるランダムな事象に依存するのではなく、欠失のサイズを指定することが可能であるため、有益であり得る。具体的には、ホーミングエンドヌクレアーゼによって引き起こされる３の倍数のヌクレオチドの挿入／欠失が存在する場合、突然変異はむしろ、フレームシフトが発生しないため、低形質突然変異をもたらし得る。しかしながら、２つのＣＲＩＳＰＲを導入することによって、より大きな欠失を引き起こすことが可能であり、これがより高い確率で非機能性タンパク質を生成する。興味深いことに、ＣＤ１Ｄ  ＣＲＩＳＰＲは、ＣＤ１６３よりもゲノム内のより大きな面積にわたって設計され、ＣＤ１６３  ＣＲＩＳＰＲ１０と１３１との間に１２４ｂｐの距離があり、ＣＤ１ＤについてはＣＲＩＳＰＲ  ４８００と５３５０との間に５５０ｂｐの距離があった。ＣＲＩＳＰＲ間のより長い距離は、研究において示されるように、欠失の生成にあまり有効ではなかった。しかしながら、本研究は、限られた数の観察のみを含み、ここでは取り上げない個々のＣＲＩＳＰＲの有効性を考慮する必要があるため、ＣＲＩＳＰＲ間の距離と意図された欠失を引き起こす確率との間の関係を検証する必要がある。
【０２４６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系はまた、同じ胚内の２つの遺伝子を同時に標的化するのにも有効であり、唯一の追加のステップは、ｃｒＲＮＡを有する１つの追加のＣＲＩＳＰＲの導入であった。これは、他のホーミングエンドヌクレアーゼと比較して、複数の遺伝子を破壊する容易さを示す。これらの結果は、この技術が補償効果を有し得る遺伝子クラスターまたは遺伝子ファミリーを標的とするために使用され得ることを示唆し、したがって、すべての遺伝子が破壊されない限り、個々の遺伝子の役割を決定することが困難であることを証明する。結果は、体細胞における遺伝子標的化の効率を増加させることによって、および直接接合体注入によって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術をＧＥブタの生成に適用することができることを実証する。
【０２４７】
実施例２：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において修飾染色体配列を有するブタにおけるＰＲＲＳＶに対する抵抗性の増加
ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）は、世紀の最後の四半世紀にわたってブタ業界を蹂躙してきた。ウイルス侵入のモードに関する推測には、ＳＩＧＬＥＣ１およびＣＤ１６３の両方が含まれている。ＳＩＧＬＥＣ１のノックアウトは、ウイルス曝露に対する応答に影響を与えなかったが、本実施例において、ＣＤ１６３ヌル動物が、ＰＲＲＳＶ感染のすべての特徴である感染、肺病理、ウイルス血症、または抗体産生の臨床的徴候を示さないことが示されている。ＰＲＲＳＶ侵入メディエーターが確認されているだけでなく、同様に作成された動物が食品供給に入ることが許された場合、著しい経済的損失および動物の苦痛を防ぐための戦略が説明されている。
【０２４８】
材料および方法
遺伝子型決定
遺伝子型決定は、ＤＮＡ配列決定およびｍＲＮＡ配列決定の両方に基づいた。雄親の遺伝子型は、一方のアレルにおいて１１ｂｐ欠失を有し、これを翻訳すると、ドメイン５に４５個のアミノ酸を予測し、結果としてアミノ酸６４で未成熟終止コドンをもたらした。他方のアレルにおいて、エクソン７に２ｂｐ付加およびエクソン７の前のイントロンに３７７ｂｐ欠失が存在し、これは翻訳されると、ドメイン５の最初の４９個のアミノ酸を予測し、結果としてアミノ酸８５で未成熟終止コードをもたらした。１匹の経産ブタは、一方のアレルにおいて７ｂｐ付加を有し、これを翻訳すると、ドメイン５の最初の４８個のアミノ酸を予測し、結果としてアミノ酸７０で未成熟終止コドンをもたらした。他方のアレルは、特徴付けられておらず（Ａ）、これは、ＰＣＲまたはロングレンジ６．３ｋｂのＰＣＲのいずれによってもエクソン７からのバンドが存在しなかったためであった。他の３匹の経産ブタはクローンであり、エクソン７における１２９ｂｐ欠失を有し、ドメイン５由来の４３アミノ酸の欠失をもたらすと予測される。他方のアレルは、特徴付けられていなかった（Ｂ）。
【０２４９】
培養下のＰＲＲＳＶの成長およびブタの感染のためのウイルス接種源の産生は、認可されたＩＢＣ適用９７３に含められている。
ＰＲＲＳＶの基準株、分離株ＮＶＳＬ  ９７−７８９５（ＧｅｎＢａｎｋ＃  ＡＦ３２５６９１  ２００１−０２−１１）を認可されたＩＢＣプロトコル９７３に記載されるように増殖させた。この研究室分離株は、実験研究において約２０年間使用されてきた（Ｌａｄｉｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。第２の分離株を、前に記載されるように（Ｐｒａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、第２試行、ＫＳ０６−７２１０９に使用した。
【０２５０】
ＰＲＲＳＶによるブタの感染
ＰＲＲＳＶのための標準化感染プロトコルを、ブタの感染のために使用した。３週齢の子ブタに、筋肉内（ＩＭ）および鼻腔内（ＩＮ）経路によって投与されたおよそ１０４  ＴＣＩＤ５０のＰＲＲＳウイルスを接種した。ブタを毎日モニターし、病気の症状を呈するものを、ＣＭＧ獣医師の推奨に従って処置する。重篤な窮迫を示し、感染に屈する危険にあるブタは人道的に安楽死させ、試料を収集する。スタッフおよび獣医は、評価または治療における偏りを排除するために、ブタの遺伝的状態について知らされていなかった。ＰＲＲＳＶは、感染中に体液中に存在するため、血液試料を収集し、各ブタにおいてウイルス血症の量または程度を決定するために測定するまで−８０℃で保存した。実験の終わりに、ブタの体重を測定し、人道的に安楽死させ、組織を収集し、１０％緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋し、理事会認定病理学者による病理組織診断のために処理した。
【０２５１】
曝露させたブタの表現型スコアリング
ブタの表現型を、毎日以下のように盲検的にスコア化した：ブタの態度は？態度スコア：０：ＢＡＲ、１：ＱＡＲ、２：わずかに抑うつ、３：抑うつ、４：瀕死。ブタの体調は？体調スコア：１：やせ衰えた、２：やせた、３：理想、４：太った、５：脂肪過多／肥満。ブタの直腸温度は？正常体温１０１．６〜１０３．６°Ｆ（発熱と考えられる≧１０４°Ｆ）。跛行があるか（グレード）？どの肢？関節腫張れおよび蹄病変について肢を評価する（蹄の底部および側面をチェックする）。跛行スコア：１：跛行なし、２：歩くときわずかに不均等、一部の関節に拘縮が見られるが跛行なし、３：軽度の跛行、歩行中のわずかな足のひきずり、４：中度の跛行、つま先接触する不自由さを含む明らかな足のひきずり、５：重度の跛行、肢への体重負担なし、立つ／歩くために激励が必要である。呼吸困難があるか（グレード）？口を開けた呼吸があるか？鼻汁があるか（鼻汁の色、鼻汁の量：軽度／中度／重度）？動物の咳に気付いたか？眼漏があるか？呼吸スコア：０：正常、１：ストレスを受けたとき（取り扱いを受けたとき）軽度の呼吸困難および／または頻呼吸、２：安静時に軽度の呼吸困難および／または頻呼吸、３：ストレスを受けたとき（取り扱いを受けたとき）中度の呼吸困難および／または頻呼吸、４：安静時に中度の呼吸困難および／または頻呼吸、５：ストレスを受けたとき（取り扱いを受けたとき）重度の呼吸困難および／または頻呼吸、６：安静時に重度の呼吸困難および／または頻呼吸。下痢（グレード）または嘔吐の証拠はあるか？血液または粘液があるか？下痢スコア：０：気付ける糞便なし、１：正常便、２：軟便であるが形あり（ソフトクリームヨーグルト稠度、牛糞形成）、３：微粒子糞便物質を有する褐色／黄褐色の液体下痢、４：微粒子糞便物質のない褐色／黄褐色の液体下痢、５：水と同様に見える液体下痢。
【０２５２】
このスコアリングシステムは、Ｄｒ．Ｍｅｇａｎ  ＮｉｅｄｅｒｗｅｒｄｅｒによってＫＳＵで開発され、以下の刊行物に基づく（Ｈａｌｂｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５、Ｍｅｒｃｋ、Ｍｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｐａｔｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈａｃｋｅｒ，１９８９、Ｗｉｎｃｋｌｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｅｎ，２００１）。スコアおよび温度を、処理として遺伝子型に基づき分離したＡＮＯＶＡを用いることにより分析した。
【０２５３】
ＰＲＲＳＶウイルス血症の測定
ウイルス血症は、２つのアプローチによって決定した。ウイルス滴定を、１：１０段階希釈の血清を９６ウェルプレート中のコンフルエントＭＡＲＣ−１４５細胞に添加することによって実施した。血清を、前に記載されるように、８％ウシ胎仔血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアンホテリシンＢが補充されたイーグル最小必須培地中で希釈した（Ｐｒａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。細胞を、４日のインキュベーション後に、細胞変性効果の存在について、顕微鏡を使用することにより検査した。細胞変性効果を示す最高希釈を滴定終点としてスコア化した。全ＲＮＡを、ウイルス核酸を測定するためにＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＭａｇＭＡＸ−９６ウイルスＲＮＡ単離キットを使用することにより、血清から単離した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を、Ｔｅｔｒａｃｏｒｅ製のＥＺ−ＰＲＲＳＶ  ＭＰＸ  ４．０キットを使用することにより、ＣＦＸ−９６リアルタイムＰＣＲシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で、製造者の説明書に従い実施した。各反応物（２５μＬ）は、５．８μＬの血清由来のＲＮＡを含んだ。検量線をキット（Ｔｅｔｒａｃｏｒｅ）で供給したＲＮＡ対照の段階希釈を調製することによって構築した。ＰＣＲあたりのテンプレートの数を報告する。
【０２５４】
ＰＡＭ細胞のＳＩＧＬＥＣ１およびＣＤ１６３染色
肺を切除し、約１００ｍＬの冷リン酸緩衝生理食塩水で満たすことにより、ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）を収集した。リン酸緩衝生理食塩水洗浄液を回収した後、細胞をペレット化し、５ｍＬ冷リン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁させ、氷上で保存した。およそ１０７のＰＡＭを、５ｍＬの様々な抗体（抗ブタＣＤ１６９（クローン３Ｂ１１／１１；ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）；抗ブタＣＤ１６３（クローン２Ａ１０／１１；ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ））が希釈されたリン酸緩衝生理食塩水中で５％ウシ胎仔血清および０．１％ナトリウムアジドとともに、３０分間氷上でインキュベートした。細胞を洗浄し、１／１００希釈の、染色バッファー中で希釈させたフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁させ、３０分間氷上でインキュベートした。少なくとも１０４の細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターおよびＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用することにより分析した。
【０２５５】
ＰＲＲＳＶ特異的Ｉｇの測定
ＰＲＲＳＶ特異的Ｉｇを測定するために、組み換えＰＲＲＳＶ  Ｎタンパク質を細菌中で発現させ（Ｔｒｉｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、磁性Ｌｕｍｉｎｅｘビーズにキット（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用することによりコンジュゲートさせた。Ｎタンパク質結合ビーズを、１０％ヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水中で２，５００ビーズ／５０μＬまで希釈し、９６ウェル丸底ポリスチレンプレートのウェルに入れた。血清を、１０％ヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水中１：４００で希釈し、５０μＬを２連のウェルに添加し、３０分間穏やかに振盪しながら、室温でインキュベートした。次に、プレートを１０％ヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し（３×）、５０μＬのビオチン−ＳＰコンジュゲートアフィニティ精製ヤギ抗ブタ二次抗体（ＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）またはビオチン標識アフィニティ精製ヤギ抗ブタＩｇＭ（ＫＰＬ）（１０％ヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水中２μｇ／ｍｌまで希釈されている）を添加した。３０分のインキュベーション後、プレートを洗浄し（３×）、その後、５０μＬのストレプトアビジン−コンジュゲートフィコエリトリン（１０％ヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水中、２μｇ／ｍＬ（Ｍｏｓｓ，Ｉｎｃ．））を添加した。プレートを３０分後に洗浄し、ミクロスフェアを１００μＬの１０％ヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁させ、ＭＡＧＰＩＸおよびＬｕｍｉｎｅｘ  ｘＰＯＮＥＮＴ４．２ソフトウェアを使用することにより分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を報告する。
【０２５６】
結果
ＣＤ１６３における突然変異をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して、実施例１において以上で記載されるとおりに作成した。いくらかのファウンダー動物を接合体注入および体細胞核移植から産生した。これらのファウンダーのいくらかを交配させ、研究のための子孫を作成した。単一のファウンダー雄を２つの遺伝子型を有する雌と交配させた。ファウンダー雄（６７−１）は、１つのアレル上のエクソン７における１１ｂｐ欠失および他のアレルのエクソン７における２ｂｐ付加（および前のイントロンにおける３７７ｂｐ欠失）を有し、ヌル動物（ＣＤ１６３−／−）であることが予測された。１匹のファウンダー雌（６５−１）は１つのアレルにおけるエクソン７における７ｂｐ付加および特徴付けられていない対応するアレルを有し、よって、ノックアウトについてヘテロ接合性であることが予測された（ＣＤ１６３−／？）。第２のファウンダー雌遺伝子型（クローンである３匹の動物）は、まだ特徴付けられていないアレルおよびエクソン７における１２９ｂｐ欠失を有するアレルを含んだ。この欠失は、ドメイン５における４３アミノ酸の欠失となると予測される。これらの動物間の交配により、すべての子ブタが雄豚由来のヌルアレルおよび雌ブタ由来の４３アミノ酸欠失または特徴付けられていないアレルの１つのいずれか受け継ぐと言う結果となった。ウイルス曝露についての陽性対照として機能した野生型子ブタに加えて、これにより４つの追加の遺伝子型が産生された（表１２）。
【表１２】
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【０２５７】
離乳時に、遺伝子編集された子ブタおよび野生型同年齢子ブタを、ＰＲＲＳＶ曝露のためにＫａｎｓａｓ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙに輸送した。ＰＲＲＳＶ曝露を前に記載されるように行った（Ｐｒａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。子ブタを３週齢で曝露施設に持ち込み、単一群として維持した。すべての実験を施設動物使用およびバイオセイフティー委員会の認可後に開始した。順化後、ブタを、ＭＡＲＣ−１４５細胞上で増殖させた（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、ＰＲＲＳＶ分離株、ＮＶＳＬ９７−７８９５（Ｌａｄｉｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）に曝露させた。ブタを、およそ１０５  ＴＣＩＤ５０のウイルスに曝露させた。接種材料の半分を筋肉内に送達させ、残りを鼻腔内に送達させた。すべての感染ブタを単一群として維持し、これにより、同じおりの感染した個体からのウイルスの連続曝露が可能になった。血液試料を、感染後３５日までの様々な日および終了、３５日目に収集した。ブタを剖検し、組織を１０％緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋し、病理組織診断のために処理した。感染の過程で記録されたＰＲＲＳＶ関連の臨床徴候には、呼吸困難、不快感、倦怠感、および発熱が含まれた。研究期間にわたる臨床徴候についての結果を図９にまとめて示す。予想どおり、野生型Ｗｉｌｄ  Ｔｙｐｅ（ＣＤ１６３＋／＋）ブタは、ＰＲＲＳＶ感染の初期徴候を示し、これは、５日目と１４日目との間でピークとなり、研究の残りの間、群内で存続した。発熱ブタのパーセンテージは、約１０日目にピークとなった。対照的に、Ｎｕｌｌ（ＣＤ１６３−／−）子ブタは、試験期間全体にわたって臨床徴候の証拠を示さなかった。急性ＰＲＲＳＶ感染中の呼吸徴候は、肺における著しい組織病理学的変化に反映される（表９）。野生型ブタの感染は、単核細胞の浸潤を伴う間質性浮腫を含むＰＲＲＳと一致する組織病理を示した（図１０）。対照的に、ヌル（ＣＤ１６３−／−）ブタには、肺変化の証拠はなかった。様々な遺伝子型の試料サイズは小さいが、それでも、平均スコアは、野生型では３．８５（ｎ＝７）、特徴付けられていないＡでは１．７５（ｎ＝４）、特徴付けられていないＢでは１．３３（ｎ＝３）、ならびにヌル（ＣＤ１６３−／−）では０（ｎ＝３）であった。
【表１３】
2021526353.tif 000026
【０２５８】
ピーク臨床徴候は、血液中のＰＲＲＳＶのレベルと相関した。ウイルス核酸の測定を、血清からの全ＲＮＡの単離、続いて市販の逆転写酵素リアルタイムＰＲＲＳＶ  ＰＣＲ試験（Ｔｅｔｒａｃｏｒｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用することによるＰＲＲＳＶ  ＲＮＡの増幅により実施した。検量線を、ＲＴ−ＰＣＲキットにおいて供給されるＰＲＲＳＶ  ＲＮＡ対照の段階希釈を調製することによって生成し、結果をテンプレート数／５０μＬ  ＰＣＲ反応として標準化した。ＰＲＲＳＶ分離株は、野生型ＣＤ１６３＋／＋ブタにおいて、ＰＲＲＳＶウイルス血症についての過程に従った（図１１）。ウイルス血症は４日目に明らかになり、１１日目にピークに達し、研究の終わりまで減少した。対照的にウイルスＲＮＡは、ＣＤ１６３−／−ブタにおいて、研究期間中のどの時点でも検出されなかった。ウイルス血症と一致して、ヌルおよび特徴付けられていないアレルブタによる抗体産生は１４まで検出可能であり、２８日目まで増加した。ヌル動物においては、抗体産生はなかった（図１２）。まとめると、これらのデータにより、野生型ブタはＰＲＲＳＶ複製をサポートし、ＰＲＲＳと一致する臨床徴候が生じたことが示される。対照的に、ノックアウトされたブタは、ブタが接種され、常に同じおりの感染した個体に曝露されても、ウイルス血症および臨床徴候を生じなかった。
【０２５９】
研究の終わりに、ブタ肺胞マクロファージを肺洗浄により除去し、前に記載されるように、ＳＩＧＬＥＣ１（ＣＤ１６９、クローン３Ｂ１１／１１）およびＣＤ１６３（クローン２Ａ１０／１１）の表面発現のために染色した（Ｐｒａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。相対的に高いレベルのＣＤ１６３発現が、ＣＤ１６３＋／＋野生型動物上で検出された（図１３）。対照的に、ＣＤ１６３−／−ブタは、バックグラウンドレベルの抗ＣＤ１６３染色を示したにすぎず、よって、ノックアウト表現型が確認された。別のマクロファージマーカーＣＤ１６９についての発現レベルは、野生型およびノックアウトブタの両方について同様であった（図１４）。ＭＨＣ  ＩＩおよびＣＤ１７２を含む他のマクロファージ表面マーカーは、両方の遺伝子型について同じであった（データ示さず）。
【０２６０】
試料サイズは小さかったが、他の３つの遺伝子型のブタ（特徴付けられていないＡ  １．３２ｋｇ±０．１７、ｎ＝４；特徴付けられていないＢ  １．２０ｋｇ±０．１６、ｎ＝３；ヌル１．２１ｋｇ±０．１６、ｎ＝３）に対して、野生型ブタは、実験の過程にわたって体重が増えにくい傾向にあった（１日当たりの平均体重増加０．８１ｋｇ±０．３３、ｎ＝７）。
【０２６１】
第２の試行では、６匹の野生型、６匹のΔ４３アミノ酸、および６匹の、特徴付けられていないアレル（Ｂ）を有するブタを、ＫＳ０６−７２１０９を使用して、子ブタに接種することを除き、以上で記載されるとおりに曝露させた。ＮＶＳＬデータと同様に、野生型および特徴付けられていないＢ子ブタは、ウイルス血症を発症した。しかしながら、Δ４３アミノ酸ブタでは、ＫＳ０６は、ウイルス血症という結果にならなかった（図１５、表７）。
【０２６２】
意味と結論
ブタ産業にとって最も臨床的に関連する疾患はＰＲＲＳである。ワクチン接種プログラムは、ほとんどのブタ病原体を防止または寛解することに成功しているが、ＰＲＲＳＶはより挑戦的であることが分かっている。ここでは、ＣＤ１６３がこのウイルス株に対する侵入メディエーターとして同定されている。ファウンダー雄ブタが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を接合体に注入することによって作成されたため（Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、導入遺伝子は存在しない。さらに、経産ブタ（これもＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いることにより作成される）由来のアレルの１つは導入遺伝子を含まない。したがって、子ブタ＃４０は、一方のアレルにおいて７ｂｐ付加および他のアレルにおいて１１ｂｐ欠失を保有するが、導入遺伝子を保有しない。ＣＤ１６３のこれらのウイルス抵抗性アレルは、ブタゲノムが約２８億ｂｐであることを考えると小さなゲノム編集を表す（Ｇｒｏｅｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。同様に作成された動物が食物供給に導入されると、著しい経済的損失を防ぐことができる。
【０２６３】
実施例３：ヒトＣＤ１６３様相同性ＳＲＣＲドメイン８と置き換えられたＣＤ１６３  ＳＲＣＲドメイン５を有するブタにおける遺伝子型１ブタ繁殖・ＰＲＲＳウイルスに対する増加した抵抗性
ＣＤ１６３は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の主要受容体であると考えられる。この研究では、ブタを以下の遺伝子型の１つを有するように遺伝子編集（ＧＥ）した：ＣＤ１６３の完全ノックアウト（ＫＯ）、ＣＤ１６３スカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン５内欠失、またはＳＲＣＲドメイン５の、ヒトＣＤ１６３様（ｈＣＤ１６３Ｌ１）ＳＲＣＲ８ドメインのホモログをコードする合成エクソンによる置き換え（ドメインスワップ）。ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）の免疫表現型検査により、ＫＯまたはＳＲＣＲドメイン５欠失を有するブタは、ＣＤ１６３を発現せず、ＰＡＭは、ＰＲＲＳＶ感染をサポートしなかったことが示された。ｈＣＤ１６３Ｌ１ドメイン８ホモログを有するブタ由来のＰＡＭは、ＣＤ１６３を発現し、２型の複製をサポートしたが、１型遺伝子型ウイルスをサポートしなかった。代表的な１型および２型ウイルスによるＣＤ１６３改変ブタの感染でも同様の結果が得られた。１型および２型ウイルスは、受容体としてのＣＤ１６３を必要とすることを含み、いくつかのレベルでは、遺伝学的におよび表現型的に同様であると考えられるとしても、結果から、ＣＤ１６３分子の認識においてＰＲＲＳＶ遺伝子型の間には明確な差があることが示される。
【０２６４】
材料および方法
ブタＣＤ１６３遺伝子のゲノム修飾
動物およびウイルスが関与する実験を、動物科学協会連盟研究および教育における農業動物のケアと使用のためのガイド（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅａｃｈｉｎｇ）、ＵＳＤＡ動物福祉法および動物福祉規則に従って実施し、Ｋａｎｓａｓ  Ｓｔａｔｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ施設内実験動物委員会および施設内バイオセイフティー委員会の認可を受けた。本研究で使用されるＣＤ１６３における突然変異を、前の実施例において上術したように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して作成した。突然変異を図１７に図示する。図１７に示される、図示されたゲノム領域は、ブタＣＤ１６３遺伝子のイントロン６からイントロン８の配列に及ぶ。図１７に図示されるイントロンおよびエクソンは、縮尺どおりに描かれていない。予測されるタンパク質生成物は、各ゲノム構造の右に示される。ＰＡＭ上の表面ＣＤ１６３のレベルにより測定される相対マクロファージ発現は、図１７の右端に示される。黒色領域は、イントロンを示し；白色領域は、エクソンを示し；斜線領域は、ｈＣＤ１６３Ｌ１エクソン１１模倣物、ブタエクソン７のホモログを示し；灰色領域は、図１７に示されるようにＰＧＫ  Ｎｅｏ構築物を有する合成イントロンを示す。
【０２６５】
図１７に示されるＣＤ１６３遺伝子構築物ＫＯ−ｄ７（１１）は、エクソン７においてヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対欠失を有する。ＣＤ１６３遺伝子構築物ＫＯ−ｉ７（２）は、エクソン７においてヌクレオチド３，１４９と３，１５０の間の２塩基対挿入、ならびにエクソン７の上流のイントロンにおいて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対欠失を有する。これらの編集は、フレームシフト突然変異および未成熟終止コドンを引き起こすと予測され、ＳＲＣＲ５の部分翻訳のみおよびＫＯ表現型という結果となる。他の３つの突然変異は、エクソン７における欠失を生じた。まず、ｄ７（１２９）は、エクソン７においてヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までの１２９塩基対欠失を有する。ｄ７（１２９）コンストラクトはまた、エクソン６においてヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの欠失を有し、欠失配列は、１２ｂｐ挿入で置き換えられる。他の２つの欠失構築物、ｄ７（１４６７）およびｄ７（１２８０）は、図１７で示されるようにエクソン７および８の完全欠失を有する。ｄ７（１４６７）は、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対欠失を有し、ｄ７（１２８０）は、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対欠失を有する。これらの欠失構築物について、他のＣＤ１６３エクソンは無傷のままであった。
【０２６６】
図１７に示される最後の構築物、ＨＬ１１ｍを、エクソン７を欠失させ、これを、ヒトＣＤ１６３様１タンパク質のＳＲＣＲ８のホモログをコードする合成エクソンで置き換えるターゲティングイベントを用いて産生した（ｈＣＤ１６３Ｌ１ドメイン８は、ｈＣＤ１６３Ｌ１エクソン１１によってコードされる）。ＳＲＣＲ８ペプチド配列を、ブタエクソン７配列において３３ヌクレオチドを変化させることによって作成した。ネオマイシンカセットを、修飾のためのスクリーニングを可能にするために合成エクソンに含めた。配列番号１１８は、参照配列番号４７の同じ領域に対応する領域においてＨＬ１１ｍ構築物のヌクレオチド配列を提供する。
【０２６７】
ブタＣＤ１６３タンパク質および遺伝子の図が図１８に提供される。ＣＤ１６３タンパク質ＳＣＲＣ（楕円）およびＰＳＴ（四角）ドメインが、対応する遺伝子エクソンとともに、図１８のパネルＡで示される。ブタＣＤ１６３  ＳＲＣＲ５（配列番号１２０）およびヒトＣＤ１６３  ＳＲＣＲ８ホモログ（配列番号１２１）についてのペプチド配列比較を図１８のパネルＢに示す。図は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ３１１７１６（ブタＣＤ１６３）およびＧＱ３９７４８２（ｈＣＤ１６３−Ｌ１）に基づく。
【０２６８】
ウイルス
この実施例で使用されるウイルスのパネルを表１４に列挙する。分離株をＭＡＲＣ−１４５細胞上で増殖させ、滴定した（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。滴定のために、各ウイルスを、７％ＦＢＳ、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（それぞれ８０単位／ｍＬおよび８０μｇ／ｍＬ）、３μｇ／ｍＬ  ＦＵＮＧＩＺＯＮＥ（アンホテリシンＢ）、および２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳが補充されたＭＥＭ中、１：１０で段階希釈した。希釈試料を４連で、９６ウェルプレートにおいてコンフルエントＭＡＲＣ−１４５細胞に、２００μＬ／ウェルの最終体積まで添加し、４日間３７℃で５％ＣＯ２においてインキュベートした。滴定終点は、細胞変性効果（ＣＰＥ）を有する最後のウェルとして同定した。５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を、前述の方法（Ｒｅｅｄ  ａｎｄ  Ｍｕｅｎｃｈ  １９３８）を使用して計算した。
【表１４】
2021526353.tif 000027
【０２６９】
肺胞マクロファージの感染
マクロファージの調製および感染は、前述のように実施した（Ｇａｕｄｒｅａｕｌｔ，ｅｔ  ａｌ．，２００９およびＰａｔｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００８）。安楽死させたブタから肺を除去し、１００ｍＬ冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を気管に注ぎ込むことによって洗浄した。気管をクランプし、肺を穏やかにマッサージした。肺胞内容物を５０ｍＬの遠心管に注ぎ入れ、氷上で保存した。ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）を、１２００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によって沈降させた。ペレットを冷滅菌ＰＢＳ中に再懸濁させ、１回洗浄した。細胞ペレットを、４５％ＲＰＭＩ１６４０、４５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、および１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む凍結培地中に再懸濁させ、使用するまで液体窒素中で保存した。凍結細胞を氷上で解凍し、カウントし、培地（１０％ＦＢＳ、ＰｅｎＳｔｒｅｐ、およびＦＵＮＧＩＺＯＮＥで補充されたＲＰＭＩ１６４０；ＲＰＭＩ−ＦＢＳ）中で５×１０５細胞／ｍＬに調整した。およそ１０３  ＰＡＭ／ウェルを９６ウェルプレートに添加し、一晩、３７℃で５％ＣＯ２においてインキュベートした。細胞を軽く洗浄して、非付着細胞を除去した。ウイルスの１：１０段階希釈物を、３連ウェルに添加した。一晩のインキュベーション後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、１０分間８０％アセトンで固定した。乾燥後、ウェルを、１％魚ゼラチンを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ＦＧ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中１：１０００で希釈したＰＲＲＳＶ  Ｎ−タンパク質特異的ＳＤＯＷ−１７ｍＡｂ（Ｒｕｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）で染色した。３７℃での３０分のインキュベーション後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ−ＦＧ中１：２００で希釈したＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ４８８標識抗マウスＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。プレート３０分間、暗闇で３７℃にてインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡下で観察した。５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）／ｍＬを、前に記載される方法に従って計算した（Ｒｅｅｄ  ａｎｄ  Ｍｕｅｎｃｈ  １９３８）。
【０２７０】
ＰＡＭ上のＣＤ１６９およびＣＤ１６３表面発現の測定
ＣＤ１６９およびＣＤ１６３の表面発現の染色を、前述のように実施した（Ｐｒａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。およそ１×１０６のＰＡＭを１２ｍｍ×７５ｍｍのポリスチレンフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）管に入れ、Ｆｃ受容体をブロックするために１０％正常マウス血清を有する、１ｍｌのＰＢＳ中で、１５分間室温でインキュベートした。細胞を遠心分離によってペレット化し、５μＬのＦＩＴＣコンジュゲートマウス抗ブタＣＤ１６９ｍＡｂ（クローン３Ｂ１１／１１；ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）および５μＬのＰＥコンジュゲートマウス抗ブタＣＤ１６３  ｍＡｂ（クローン：２Ａ１０／１１、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）中に再懸濁させた。３０分のインキュベーション後、細胞を２回、１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ（ＢＳＡ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）で洗浄し、ＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ５ソフトウェア（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて直ちに分析した。各試料について、少なくとも１０，０００個の細胞を分析した。
【０２７１】
ＰＲＲＳウイルス血症の測定
ＲＮＡを、５０μＬの血清から、Ａｍｂｉｏｎ  ＭａｇＭＡＸ９６ウイルス単離キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、製造者の指示に従って単離した。ＰＲＲＳＶ  ＲＮＡを、製造者の指示に従って実施される、ＥＺ−ＰＲＲＳＶ  ＭＰＸ４．０  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ標的特異的試薬（Ｔｅｔｒａｃｏｒｅ）を用いて定量した。各プレートは、ＲＴ−ＰＣＲ試薬とともに使用するために設計されＴｅｔｒａｃｏｒｅ定量化標準および対照セットを含んだ。ＰＣＲを、ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で、９６ウェルフォーマットで、推奨されるサイクリングパラメータを使用して実施した。ＰＣＲアッセイ結果を、ｌｏｇ１０  ＰＲＲＳＶ  ＲＮＡコピー数／５０μＬ反応体積として報告し、これは、コピー数／ｍＬの血清に近似する。時間に伴うウイルス血症のための曲線下面積（ＡＵＣ）をＷｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．００を使用して計算した。
【０２７２】
ＰＲＲＳＶ抗体の測定
ＰＲＲＳＶヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質に対する抗体の検出のためのミクロスフェア蛍光イムノアッセイ（ＦＭＩＡ）を、前に記載されるように実施した（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。組み換えＰＲＲＳＶ  Ｎタンパク質を、カルボキシル化Ｌｕｍｉｎｅｘ  ＭＡＧＰＬＥＸポリスチレンミクロスフェアビーズに、製造者の指示に従って結合させた。ＦＭＩＡでは、１０％ヤギ血清を有する５０μＬ  ＰＢＳ（ＰＢＳ−ＧＳ）中に懸濁させたおよそ２５００の抗原コートビーズを９６ウェルポリスチレン丸底プレートの各ウェルに入れた。血清をＰＢＳ−ＧＳ中１：４００で希釈し、５０μＬを各ウェルに添加した。プレートを箔で包み、３０分間、室温で穏やかに振盪させながらインキュベートした。プレートを磁石上に起き、ビーズを３回、１９０μＬのＰＢＳ−ＧＳで洗浄した。ＩｇＧの検出のために、５０μＬのビオチン−ＳＰコンジュゲートアフィニティ精製ヤギ抗ブタ二次抗体（ＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をＰＢＳ−ＧＳ中２μｇ／ｍＬまで希釈し、１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを室温で３０分間インキュベートし、３回洗浄し、続いて、５０μＬのストレプトアビジンコンジュゲートフィコエリトリン（ＰＢＳ−ＧＳ中２μｇ／ｍＬ；ＳＡＰＥ）を添加した。３０分後、ミクロスフェアを洗浄し、１００μＬのＰＢＳ−ＧＳ中に再懸濁させ、ＭＡＧＰＩＸ機器（ＬＵＭＩＮＥＸ）およびＬＵＭＩＮＥＸ  ｘＰＯＮＥＮＴ４．２ソフトウェアを使用して分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を最低１００のミクロスフェアビーズで計算した。
【０２７３】
ハプトグロビン（ＨＰ）の測定
血清中のＨｐの量を、ブタ特異的Ｈｐ  ＥＬＩＳＡキット（Ｇｅｎｗａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）を使用して測定し、工程は製造者の説明書に従って実施した。血清試料を、１Ｘ希釈剤溶液中１：１０，０００で希釈し、プレコート抗ブタＨｐ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上２連でピペット操作し、室温で１５分間インキュベートし、その後、３回洗浄した。抗Ｈｐ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートを各ウェルに添加し、暗闇で室温にて１５分間インキュベートした。プレートを洗浄し、１００μＬ発色基質溶液を各ウェルに添加した。暗闇で１０分間インキュベートした後、１００μＬの停止液を各ウェルに添加した。プレートを、Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａフィルターベースマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）上で４５０ｎｍにて読み取った。
【０２７４】
結果
ＣＤ１６３修飾ブタ由来のＰＡＭの表現型特性
肺洗浄材料における細胞の前方および側方散乱特性を使用して、細胞の単核亜集団についてゲートした。図１７に示される異なる染色体修飾の代表的なＣＤ１６９およびＣＤ１６３染色結果を図１９に示す。図１９のパネルＡに提示される代表例では、ＷＴブタ由来の９１％超のＰＡＭが、ＣＤ１６９およびＣＤ１６３の両方に対して陽性であった。この研究で使用された１２匹のＷＴブタに対する結果は、平均８５＋／−８％の二重陽性細胞を示した。図１９のパネルＢに示されるように、ＣＤ１６３  ＫＯブタ由来のＰＡＭは、ＣＤ１６３の証拠を示さなかったが、正常表面レベルのＣＤ１６９を保持した。ｄ７（１４６７）およびｄ７（１２８０）欠失遺伝子型に由来するＣＤ１６３ポリペプチドは、ＰＡＭ表面に固定された修飾ＣＤ１６３ポリペプチドを産生するはずであると予測されたが、免疫染色結果は、ＣＤ１６３の表面発現を示さなかった（図１９、パネルＤを参照）。ＭＡｂ  ２Ａ１０は、最初の３つのＳＲＣＲドメインに位置するエピトープを認識するため、検出なしは、免疫反応性エピトープの欠失の結果ではなかった。ｄ７（１２９）遺伝子型は、ＳＲＣＲ５において４３アミノ酸欠失を有すると予測された（図１７を参照）。図１９のパネルＣに提示される実施例では、２．４％の細胞のみが二重陽性象限に含まれた。本研究で使用した９匹のｄ７（１２９）ブタ由来のＰＡＭの分析は、０％〜３．６％（平均＝０．９％）の範囲の二重陽性細胞のパーセンテージを示した。ＣＤ１６９の表面発現は、ＷＴ  ＰＡＭと同様のままであった。本研究の目的のために、ＫＯ、ｄ７（１４６７）、ｄ７（１２８０）、およびｄ７（１２９）遺伝子型を有するブタをすべて、ＣＤ１６３−ヌル表現型を有するものとして分類した。
【０２７５】
ｈＣＤ１６３Ｌ１ドメイン８ペプチド配列ＨＬ１１ｍを含むＣＤ１６３修飾は、ＰＡＭ上でＣＤ１６３＋およびＣＤ１６９＋の二重発現を示した（図１９のパネルＥ）。しかしながら、本研究で分析したすべてのＨＬ１１ｍブタにおいて、ＣＤ１６３の表面発現は、ＷＴ  ＰＡＭと比べて著しく低減された。ＣＤ１６３のレベルは、連続する発現上に位置し、検出不能ＣＤ１６３から中レベルのＣＤ１６３を有するブタまでの範囲となった。図１９のパネルＥに示される例では、およそ６０％の細胞が二重陽性象限にあり、４０％の細胞は、ＣＤ１６９についてのみ染色された。合計２４匹のＨＬ１１ｍブタ由来のＰＡＭの分析は、３８＋／−１２％のＰＡＭ細胞がＣＤ１６９についてのみ陽性であり、５４＋／−１４％が二重陽性（ＣＤ１６９＋ＣＤ１６３＋）であったことを示した。
【０２７６】
ＷＴおよびＣＤ１６３修飾ブタにおける循環ハプトグロビンレベル
捕捉分子として、ＣＤ１６３は、ＨｂＨｐ複合体を血液から除去する責任がある（Ｆａｂｒｉｅｋ，ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、およびＭａｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。血清中のＨｐのレベルは、ＣＤ１６３発現マクロファージの全機能特性を決定するための好都合な方法を提供する。ＷＴ、ＨＬ１１ｍおよびＣＤ１６３ヌルブタ由来の血清中のＨｐレベルを、３〜４週齢で、ＰＲＲＳＶ感染直前に測定した。図２０に提示される結果は、ＷＴブタ由来の血清が最低量のＨｂを有したことを示した（平均Ａ４５０＝２３＋／−０．１８、ｎ＝１０）。各群の平均および標準偏差は、ＷＴ、０．２３＋／−０．１８、ｎ＝１０；ＨＬ１１ｍ、１．６３＋／−０．８、ｎ＝１１；および２．０６＋／−０．５７、ｎ＝９、ヌル群であった。ヌル群は、ＣＤ１６３を発現しなかった遺伝子型から構成された（ＣＤ１６３ヌル表現型ブタ）。Ｈｐ測定を単一のＥＬＩＳＡプレート上で実施した。同じ文字を持つ群では、有意な差はなかった（ｐ＞０．０５、クラスカル・ワリス一元配置ＡＮＯＶＡ、かつ、ダネット事後検定）。ＷＴブタに対する平均Ａ４５０値は、ＨＬ１１ｍおよびＣＤ１６３−ヌルブタのものと有意に異なった（ｐ＜０．０５）。ＨＬ１１ｍ群の平均Ａ４５０値は、ＣＤ１６３−ヌル群と比べて低かったが（Ａ４５０＝１．６＋／０．８対２．１＋／−０．６）、この差は統計的に有意ではなかった。ＨｂＨｐとＣＤ１６３との間の相互作用は、ＳＲＣＲ３を介して起こるため（Ｍａｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、ＷＴブタと比較してＨＬ１１ｍブタでの増加した循環Ｈｐは、Ｈｂ／Ｈｐに対するＣＤ１６３の親和性の低減の結果である可能性は低いが、ＣＤ１６３＋マクロファージの数の低減、ならびに、残りのマクロファージ上のＣＤ１６３発現の低減という結果の帰結であった（図１９のパネルＥを参照）。
【０２７７】
１型および２型ウイルスによるＰＡＭの感染
ＰＲＲＳＶについてのＣＤ１６３改変ブタの寛容性を最初に、ＰＡＭ細胞をインビトロで６の１型および９の２型ＰＲＲＳＶ分離株の一団に感染させることにより評価した（ウイルスのリストについては、表１４を参照）。一団内のウイルスは、異なる遺伝子型、ならびにヌクレオチドおよびペプチド配列、病態形成、および単離の年における違いを表す。表１５に提示されるデータは、各ＣＤ１６３遺伝子型群について３匹のブタ由来のＰＡＭを使用した実験の結果を示す。列挙されるウイルスは、表１４に列挙されるＰＲＲＳＶ分離株に対応する。結果は、感染したＰＡＭのパーセントの平均＋／−標準偏差として示される。ＣＤ１６３−ヌルＰＡＭは、ｄ７（１２９）アレルを発現するブタ由来であった（ＰＡＭ上のＣＤ１６３遺伝子構築物およびＣＤ１６３発現については、それぞれ図１７および１９を参照）。
【表１５】
2021526353.tif 000028
【０２７８】
予想どおり、ＷＴ  ＰＡＭはすべてのウイルスに感染した。対照的に、ＣＤ１６３−ヌル表現型ブタは、すべてのウイルス感染に対して陰性であった。ＨＬ１１ｍブタからのＰＡＭの応答において、顕著な差が観察された。１型ウイルスのいずれもＨＬ１１ｍＰＡＭに感染することができなかったが、２型の一団のすべてのウイルスは、ＷＴ  ＰＡＭと比較してはるかに低いパーセンテージではあるものの、ＨＬ１１ｍ  ＰＡＭに感染した。
【０２７９】
寛容性もまた、同じ２型ウイルスについて、ＷＴとＨＬ１１ｍ  ＰＡＭの間のウイルス滴定終点を比較することにより評価した。その結果を、２匹のＷＴおよび２匹のＨＬ１１ｍブタについて示す（図２１）。ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０値は、同じウイルス試料によるマクロファージ培養物の感染に基づいて計算した。感染結果は、各遺伝子型から２匹の異なるブタを表す。感染のために使用したウイルスを表１４に列挙する。ＨＬ１１ｍブタ由来のＰＡＭについてのｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０値は、同じウイルスに感染したＷＴ  ＰＡＭと比較して１〜３ログ低かった。唯一の例外は、修飾生ウイルスワクチン株の感染であった。まとめると、結果は、ＨＬ１１ｍブタ由来のＰＡＭが、２型ウイルスへの感染に対して低減した感受性または寛容性を有することを示唆している。
【０２８０】
ＣＤ１６３修飾ブタの１型および２型ウイルス感染
ＷＴ（丸）、ＨＬ１１ｍ（四角）、およびＣＤ１６３−ヌル（三角）ブタを、代表的な１型（ＳＤ１３−１５）（図２２、パネルＡ、左グラフ）および２型（ＮＶＳＬ  ９７−７８９５）（図２２、パネルＡ、右グラフ）ウイルスにより感染させた。ヌル表現型ブタは、ＫＯおよびｄ（１５６７）アレルに由来した（図１７を参照）。同じウイルスを接種された３つの遺伝子型からのブタを１つのおり内で混ぜ合わせ、これによりＣＤ１６３修飾ブタをＷＴ同じおりの個体から排出されたウイルスへの連続曝露が可能になった。代表的な１型ウイルスに感染したブタの数は、ＷＴ（ｎ＝４）、ＨＬ１１ｍ（ｎ＝５）、およびヌル（ｎ＝３）；ならびに２型ウイルス：ＷＴ（ｎ＝４）、ＨＬ１１ｍ（ｎ＝４）、およびヌル（ｎ＝３）。図２２に示されるように、１型または２型ウイルスのいずれかに感染したＣＤ１６３ヌルブタは、すべての時点でウイルス血症に対して陰性であり、血清変換しなかった。予想どおり、ＷＴブタは増殖性感染され、両方のウイルスについて感染後７日に１０６テンプレート／５０μＬ  ＰＣＲ反応に到達する平均ウイルス血症レベルを有した。１４日までに、すべてのＷＴブタは血清変換された（図２２、パネルＢを参照）。ＰＡＭ感染結果と一致して（表１５）、１型ウイルスに感染した５匹のＨＬ１１ｍブタは、ウイルス血症またはＰＲＲＳＶ抗体の証拠を示さなかった。２型分離株ＮＶＳＬに感染したすべてのＨＬ１１ｍブタは、感染をサポートし、血清変換された（図２２、パネルＢ）。ＨＬ１１ｍブタの低減された許容値の存在は不明であった。４匹のＨＬ１１ｍブタのうち３匹の平均ウイルス血症は、ＷＴブタと同様であった。しかしながら、１匹のＨＬ１１ｍブタ、＃１０１（図２２、パネルＡ右グラフの白四角）については、ウイルス血症はＨＬ１１ｍ遺伝子型群の他のブタと比較して著しく低減した。ブタ＃１０１についてのウイルス血症の３〜４ｌｏｇ低減についての説明は明らかにならなかったが、いくらかのＨＬ１１ｍブタはＰＲＲＳＶに対してより寛容でなくなる可能性があることが示唆され、インビトロＰＡＭ感染結果をサポートする観察となった（表１５）。すべてのブタに同じ量のウイルスを接種し、ＷＴブタと混ぜ合わせたままであったため、ブタ＃１０１におけるより低いウイルス血症は、より低い量のウイルスを受けたまたはより低い曝露の結果ではなかった。マクロファージのフローサイトメトリーは、ブタ＃１０１のＣＤ１６３発現が他のＨＬ１１ｍブタに匹敵したことを示した（データ示さず）。エクソン１１模倣配列において配列の差はなかった。
【０２８１】
ＮＶＳＬ  ９７−７８９５およびＫＳ０６−７２１０９の２つのウイルスを使用して、追加のウイルス感染試験を実施した。その結果を図２３に示す。感染後３５日間、ブタを追跡し、感染後３、７、１１、１４、２１、２８、および３５日に行ったウイルス血症測定に対する曲線下面積（ＡＵＣ）としてデータを報告した。図２３に示されるように、ＮＶＳＬでは、ＮＶＳＬに感染した７匹のＷＴブタの平均ＡＵＣ値は１６８＋／−８であり、７匹のＨＬ１１ｍブタでは１６５＋／−１５であった。ＫＳ０６では、６匹のＷＴおよび６匹のＨＬ１１ｍブタの平均ＡＵＣ値は、それぞれ１５６＋／−９および１６３＋／−１３であった。両方のウイルスについて、ＷＴとＨＬ１１ｍブタとの間に統計的に有意な差はなかった（ｐ＞０．０５）。まとめると、結果は、ＨＬ１１ｍブタが１型ＰＲＲＳＶ感染をサポートできなかったが、２型ウイルス感染に対する寛容性を維持したことを示した。インビトロで２型分離株に感染させたＨＬ１１ｍブタ由来のＰＡＭのＰＲＲＳＶ寛容性の低減が存在しても、この差はブタには変換されなかった。図２３に示される結果では、ウイルス量は、３５日の感染期間にわたって各ブタの曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することによって決定した。ＡＵＣ計算は、感染後０、４、７、１０、１４、２１、２８、および３５日に行ったｌｏｇ１０ＰＣＲウイルス血症測定値を用いて実施した。水平線は、平均および標準偏差を示す。キー：ＷＴ＝野生型ブタ、ＨＬ１１＝ＨＬ１１ｍ遺伝子型ブタ、Ｎｕｌｌ＝ＣＤ１６３−ヌル遺伝子型。
【０２８２】
考察
ＣＤ１６３は、血液から過剰なＨｂを捕捉し、組織損傷に応じて炎症を調節するために重要なマクロファージ表面タンパク質である。これはまた、ウイルス受容体としても機能する。ＣＤ１６３は、炎症促進応答および抗炎症応答の両方に関与する（Ｖａｎ  Ｇｏｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＣＤ１６３陽性マクロファージは、代替的活性化Ｍ２群のマクロファージ（高い食作用性および抗炎症を有するものと一般に説明される）内に入れられる。Ｍ２マクロファージは、機械的組織損傷または感染後の浄化および修復に関与する（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。抗炎症能力において、ＣＤ１６３発現は、ＩＬ−１０などの抗炎症タンパク質によって上方調節される（Ｓｕｌａｈｉａｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００２）。炎症中、ＣＤ１６３は、血液からの循環ヘムを除去することによって酸化を低減することにより炎症を減少させる。ビルベルディン、ビリルビン、および一酸化炭素などのヘム分解生成物は、強力な抗炎症分子である（Ｓｏａｒｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｃｈ，２００９およびＪｅｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。炎症促進性能力では、マクロファージ表面上のＣＤ１６３の抗ＣＤ１６３抗体または細菌による架橋により、炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦαおよびＩＬ−１βの局所放出が起こる（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｅｕｖｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９およびＦａｂｒｉｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０２８３】
ＣＤ１６３を欠くＧＥブタは、２型ＰＲＲＳＶ分離株の複製をサポートできない（Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。この研究では、インビトロ感染試験は、ＣＤ１６３ヌル表現型マクロファージの、１型および２型ＰＲＲＳＶ分離株の広範な一団に対する抵抗性を実証し、さらに潜在的に、すべてのＰＲＲＳＶ分離株を含むように抵抗性が拡大される（表１５）。ＣＤ１６３−ヌル表現型マクロファージの、１型および２型ウイルスに対する抵抗性をインビボで確認した（図２２および図２３）。これらの結果に基づいて、文献において前に記載された他のＰＲＲＳＶ受容体の寄与（Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｙｏｏ，２０１５）を排除することができる。例えば、Ｓｈａｎｍｕｋｈａｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）は、ＣＤ１５１プラスミドでトランスフェクトした非寛容性ＢＨＫ細胞が、ＰＲＲＳＶ複製をサポートする能力を獲得し、ポリクローナル抗ＣＤ１５１抗体とのインキュベーションが、ＭＡＲＣ−１４５細胞の感染を著しく低減することを示した。加えて、元々ブタインフルエンザウイルスの増殖に使用するために開発されたサル細胞株ＳＪＰＬは、ＰＲＲＳＶ複製をサポートすることが以前に示された（Ｐｒｏｖｏｓｔ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＳＪＰＬ細胞株の重要な特性には、ＣＤ１５１の存在、ならびにシアロアドヘシンおよびＣＤ１６３の欠如が含まれた。まとめると、これらのデータは、ＣＤ１５１の存在だけでＰＲＲＳＶ複製をサポートするのに十分であるという説得力のある証拠を提供した。ＣＤ１６３ヌル表現型を有するマクロファージおよびブタにおけるＰＲＲＳＶ感染の欠如を示す本研究の結果は、ＰＲＲＳＶの代替受容体としてのＣＤ１５１が生物学的に関連しないことを示す。
【０２８４】
ＰＲＲＳＶ表面上でＧＰ２ａ、ＧＰ３、ＧＰ４ヘテロ三量体複合体の一部を形成するウイルスタンパク質ＧＰ２ａおよびＧＰ４は、プルダウンアッセイにおいて、ＧＰ２およびＧＰ４プラスミドでトランスフェクトされた細胞からＣＤ１６３と共沈させることができる（Ｄａｓ，ｅｔ  ａｌ．，２００９）。おそらく、ＧＰ２およびＧＰ４は、１つ以上のＣＤ１６３  ＳＲＣＲドメインとの相互作用を形成する。ブタＳＲＣＲ５とｈＣＤ１６３−Ｌ１  ＳＲＣＲ８由来のホモログとの間のドメインスワップを含むブタＣＤ１６３  ｃＤＮＡ骨格を組み込んだインビトロ感染性アッセイはさらに、１型ウイルスによって利用される領域をＳＲＣＲ５に限局させた（Ｖａｎ  Ｇｏｒｐ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＧＰ２／ＧＰ４とＣＤ１６３との間の安定した相互作用がＳＲＣＲ５を介して起こることを推測するのは興味深い。ＧＰ３およびＧＰ５などの追加のウイルス糖タンパク質は、ウイルス−受容体複合体をさらに安定化させ得るか、または共受容体分子として機能し得る。ＳＲＣＲ５に対する要求を、この研究ではＨＬ１１ｍアレル（ブタエクソン７において３３ｂｐ置換を作製することによりＣＤ１６３Ｌ１  ＳＲＣＲ８ドメインスワップを再構築した）を有するマクロファージおよびブタに感染させることによって調査した。ＨＬ１１ｍアレルには、遺伝子改変について陽性の細胞を選択するためにネオマイシンカセットも含まれた（図１７）。ＷＴ  ＰＡＭと比べて低減したレベルではあるが、ＨＬ１１ｍブタは、ＰＡＭ上でＣＤ１６３を発現した（図１９、パネルＡおよびＥを比較）。低減された発現は、おそらくネオマイシンカセットの存在のためであり、それは、エクソン１１模倣物と続くイントロンの間に位置した。ＨＬ１１ｍブタは、１型ウイルス感染に対して寛容ではなく、ＳＲＣＲ５の重要性を確認された。しかしながら、ＨＬ１１ｍマクロファージおよびＨＬ１１ｍブタは、２型ウイルス感染をサポートしなかった。ウイルス滴定および感染率結果に基づいて、ＨＬ１１ｍブタ由来のＰＡＭは、ＷＴマクロファージと比べてウイルスに対する寛容性の全体的な減少を示した（表１５および図１７）。寛容性の減少は、修飾ＣＤ１６３タンパク質に対するウイルスの親和性の低減とともに、ＨＬ１１ｍマクロファージ上のＣＤ１６３のレベルの低減に起因し得る。２型ウイルスがＳＲＣＲ５の要件を有し、Ｌ１  ＳＲＣＲ８が好適な置換物として機能することができると仮定すると、より低い親和性は、ヒトＳＲＣＲ８とブタＳＲＣＲ５との間のペプチド配列の差によって説明され得る（図１８、パネルＢを参照）。しかしながら、ＰＡＭの低減された寛容性は、ブタには変換されなかった。ＨＬ１１ｍブタの平均ウイルス血症は、ＷＴブタと比べて有意に異ならなかった（図２３）。ＰＡＭに加えて、血管内、中隔、およびリンパ系組織マクロファージのＰＲＲＳＶ感染は、ウイルス血症に寄与する（Ｌａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７およびＭｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＨＬ１１ｍブタにおける全体的なウイルス量を維持する際の、これらのおよび他のＣＤ１６３陽性細胞集団の潜在的寄与は、さらなる研究に値する。
【０２８５】
ＳＲＣＲドメインの欠失を有するＣＤ１６３プラスミドが、ＨＥＫ細胞において安定して発現されるにもかかわらず（Ｖａｎ  Ｇｏｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、ｄ７（１４６７）およびｄ７（１２８０）におけるエクソン７および８の欠失は、ＣＤ１６３の検出可能な表面発現の欠如をもたらした（図１９、パネルＤ）。フローサイトメトリーに使用される２Ａ１０ｍＡＢは、３つのＮ末端ＳＲＣＲドメイン（Ｖａｎ  Ｇｏｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、かつおそらく７番目および８番目のドメイン（Ｓａｎｃｈｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９）を認識するため、検出なしは、突然変異タンパク質中の２Ａ１０エピトープの除去によるものではなかった。少量のＣＤ１６３発現が一部のｄ７（１２９）ブタ由来のＰＡＭ上で検出できたが（図１９、パネルＣを参照されたい）、発現されたタンパク質の量は、ＰＡＭまたはブタにおいてＰＲＲＳＶ感染をサポートするには十分ではなかった。エクソン７および８欠失突然変異体におけるＣＤ１６３発現の不在は、完全には理解されていないが、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質分解の結果である可能性が高い。
【０２８６】
２００３年に、ＣＤ１６３は、アフリカブタ熱ウイルスの受容体として同定された（ＡＳＦＶ；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｔｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。この結論は、感染したマクロファージが成熟ＣＤ１６３陽性表現型を有し、２Ａ１０などの抗ＣＤ１６３抗体がインビトロでマクロファージのＡＳＦＶ感染をブロックするという観察に基づいた。ＣＤ１６３−ヌルブタがＡＳＦＶ感染に抵抗性があるかどうかは決定されていない。
【０２８７】
ＰＲＲＳＶ受容体への修飾を組み込む細胞培養モデルは、ＰＲＲＳＶ侵入、複製、および病態形成の機序に関する貴重な洞察を提供した。この研究の独自の一態様は、受容体修飾ブタを使用するインビボでの並行実験の実施であった。この研究は、世界のブタ産業に常に直面する最も深刻な疾患のうちの１つに対する予防的療法を開発する可能性に重要な影響を与える。
【０２８８】
実施例４：母体ＣＤ１６３のノックアウトは、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）感染から胎児を保護する。
上記の実施例１〜３は、ＣＤ１６３遺伝子の完全ノックアウト（ＫＯ）を有するブタが、マクロファージ上でＣＤ１６３発現を欠き、ＰＲＲＳＶ感染をサポートしないことを実証する（Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７も参照）。ＣＤ１６３発現は優性形質であり、古典的なメンデル様式で遺伝するため、正常なＣＤ１６３発現および機能を有する子孫は、ＫＯ  ＣＤ１６３−／−雌ブタを野生型（ＷＴ）ＣＤ１６３＋／＋雄と交配させることによって誘導することができる。この研究のために、雌親のＣＤ１６３  ＫＯ遺伝子型の存在が、ＰＲＲＳＶによる母体感染後の胎児を保護するのに十分であるかどうかを判断するために、ＣＤ１６３  ＫＯ未経産ブタをＷＴ雄ブタと繁殖させ、ヘテロ接合性ＣＤ１６３＋／−胎児を産生した。本研究では、妊娠１０９日後または母体感染後２０日後に回復したＣＤ１６３陽性胎児を、ＣＤ１６３受容体の完全ノックアウトを有する雌親において、ＰＲＲＳＶから完全に保護した。結果は、農業にとって経済的困難の主な原因であるＰＲＲＳＶ関連生殖疾患を排除するための実用的な手段を実証している。
【０２８９】
材料および方法
ＣＤ１６３遺伝子編集。ＫＯアレルのすべてを生成するために使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９方法は、上記実施例１〜３に詳細に記載されている。実施例１〜３に記載されるように生成され、表１６に記載されるアレルを有する野生型動物およびノックアウト、またはヘテロ接合性動物を、本実施例に記載される実験に使用した。これらのアレルの各々は、実施例１〜３およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／０２３５７０号に記載され、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。アレルＢ、Ｄ、およびＥの特異的編集は、Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４にも記載されており、アレルＣにおける特異的編集（２ｂｐ挿入）は、Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６に記載されている。表１６に記載されるすべてのアレルは、ＤＮＡ配列決定に基づいて同定された。ノックアウト遺伝子型は、実施例２において上述されるように、抗ＣＤ１６３  ｍＡｂ、２Ａ１０で肺胞マクロファージを染色することによって測定されるＣＤ１６３発現の不在によって確認された。
【表１６】
2021526353.tif 000029
【０２９０】
ＰＲＲＳＶ感染
本研究で使用されるＰＲＲＳＶ株ＮＶＳＬ９７−７８９５（ＮＶＳＬ）は、ＰＲＲＳ中絶ストームを経験していた米国アイオワ州南東部の群れから１９９７年に単離された実験室株である（Ｈａｌｂｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。低継代分離株として維持されたウイルスを増殖させ、ＭＡＲＣ−１４５細胞上で滴定した。妊娠８９〜９１日目に、５ｍＬの培養培地に希釈した１０５ＴＣＩＤ５０のウイルスを未経産ブタに接種した。接種材料の半分を筋肉内注入により投与し、残りを鼻腔内投与した。すべての未経産ブタは、同じおりの感染した個体により流出されたウイルスへの連続曝露を可能にする環境で維持された。感染の前、接種の７日後（ｄｐｉ）、および安楽死の時点で、血液試料を未経産ブタから採取した。ＰＲＲＳＶ核酸を、血清から全ＲＮＡを単離し、続いて逆転写酵素リアルタイムＰＲＲＳＶ  ＰＣＲ（Ｔｅｔｒａｃｏｒｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）によって測定した。ＲＴ−ＰＣＲキットに供給される定量化標準を使用して、検量線を生成した。その結果は、ｌｏｇ１０テンプレート／２５μＬ反応物として報告され、これはウイルスＲＮＡテンプレート／血液１ｍＬの数に近似する。
【０２９１】
結果
本研究で使用されるノックアウトアレルの詳細な説明を、上記の表１６に示す。各ノックアウトアレルは、エクソン７における突然変異を有し、これはｍＲＮＡにおけるコドンフレームシフト、続いて未成熟終止コドンをもたらすと予測された。ＷＴとＣＤ１６３  ＫＯ親との間の交配が、表１７に要約される。陽性感染対照として機能した３匹の雌親の第１群は、ＣＤ１６３＋／＋胎児を身ごもるＣＤ１６３＋／＋雌親（＋＋／＋＋群）であった。第２群（−−／＋−）は、ＣＤ１６３＋／−胎児を身ごもったＣＤ１６３−／−雌親であった。この群では、ＣＤ１６３−／−雌親は、ＰＲＲＳ複製をサポートすることができず、一方、ＣＤ１６３＋／−胎児は、ＰＲＲＳ感染に対する感受性を保持する。最後に、第３群（−−／−−）は、ＣＤ１６３−／−胎児を身ごもったＣＤ１６３−／−雌親で構成された。最後の群では、雌親と胎児の両方が感染に抵抗性を持つ必要があった。
【表１７】
2021526353.tif 000030
【０２９２】
感染した野生型（ＷＴ）雌親における臨床徴候には、無気力および一過性の不快感が含まれた。ＫＯ雌親は、臨床徴候を示さなかった。研究期間中、１匹のＷＴ雌親Ｎｏ．１３９は、妊娠１０６日で堕胎した（１５ｄｐｉ）。７ｄｐｉで測定したＰＲＲＳＶ核酸は、５．５ｌｏｇ１０テンプレート／反応の雌親１３９のウイルス血症レベルを示し、生産的ＰＲＲＳＶ感染の存在を実証した。１５〜２０ｄｐｉの間、残りのすべての雌親を安楽死させ、子宮角を直ちに除去した。各角の先端から、胎児および胎盤を除去し、解剖病理の存在について評価した。各胎児から血液試料を採取した。血液が得られなかった場合は、腹腔から流体試料を採取した。各雌親から回収された胎児の数を表１７に列挙する。ＣＤ１６３  ＷＴ群（＋＋／＋＋）（堕胎した雌親を含む）では、胎児数は１６、１４、および１２（平均＝１４．０）であった。ＣＤ１６３＋／−胎児（−−／＋−群）を身ごもったＣＤ１６３  ＫＯ雌親は、１４、１７、および１１体の胎児を産生した（平均＝１３．６）。ＣＤ１６３  ＫＯ胎児（−−／−−群）を身ごもったＣＤ１６３  ＫＯ雌親では、胎児の数は７および９であった。胎児ウイルス血症および肉眼所見の結果を図２４および表１８に要約する。
【表１８】
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【０２９３】
図２４は、ＰＲＲＳＶによる母体感染後の胎児転帰の各々を示す。左の数字は、各雌親を特定する。括弧内の各雌親の下は、ｌｏｇ１０テンプレート／反応として測定した血清中のＰＲＲＳ  ＰＣＲの結果である。「Ｎ」は、ＰＲＲＳＶ核酸に対して陰性である（Ｃｔ＞３９）。胎児は、各子宮角内の数および相対位置によって識別される。アスタリスクは、腹水から得られた胎児ＰＣＲ試料を識別する。各胎児の下の数は、胎仔血清中のＰＲＲＳ  ＰＣＲの結果である（ｌｏｇ１０テンプレート／反応）。各円内の数は、解剖病理の存在を指す：１）正常胎児、２）小さな胎児、３）胎盤の剥離および／または壊死などの胎盤変化、４）メコニウム染色胎児、５）胎児は死亡し壊死している。小文字は、個々の胎児の遺伝子型を識別する（表１７を参照）。キー：ａ，Ａ／Ａ；ｂ，Ｃ／Ａ；ｃ，Ｂ／Ａ；ｄ，Ｅ／Ａ；ｅ，Ｂ／Ｃ；ｆ，Ｂ／Ｄ；ｇ，Ｄ／Ｃ；ｈ，Ｄ／Ｄ；ｉ，Ｅ／Ｃ；ｊ，Ｅ／Ｄ；ＮＤ、胎児が壊死したため決定されず；ｎｄ、遺伝子型は決定されなかった。
【０２９４】
解剖学的レベルでは、２匹のＣＤ１６３  ＷＴ（＋＋／＋＋）雌親、Ｎｏ．１３８およびＮｏ．１４０に由来する胎児の５０％および７２％が、正常胎児よりも小さい（全胎児の１１％）、胎盤が剥離または壊死した胎児（１４％）、メコニウム染色（７％）、ならびに死亡して壊死した胎児（２５％）を含む、ある程度の病理を示した。病理観察は、生殖ＰＲＲＳの典型である。同腹子はＰＲＲＳＶ感染率が高く、胎児の９２％がＰＲＲＳＶ核酸の存在について陽性であることを示した。ＷＴ雌親からの胎児のＰＣＲ結果は、胎児ＰＲＲＳＶ感染の２つの重要な特性を示す。第１に、血清中で検出されたウイルスの濃度には胎児間で大きなばらつきがあり、胎児が異なる時期に感染する結果となった。第２に、ウイルス血症のレベルは、常に病理と相関していなかった。例えば、雌親Ｎｏ．１３８の胎児Ｎｏ．５は、高いレベルのウイルス血症を有していた（７．３ｌｏｇ１０テンプレート／反応）が、胎児は影響を受けていないように見えた。ウイルス血症と病理との間の相違の原因は不明である。１つの可能性は、胎児病理学が、母体側に生じる組織損傷の結果であり、胎児ウイルス血症のレベルとは関係しないことである。この分野では、これらの正常でありながら感染した新生児の子ブタは「スーパーシェダー」として機能することができ、生産システム全体でＰＲＲＳＶの迅速な普及を促進する。−／＋群（雌親Ｎｏ．８４、８７、１２２）では、他の同腹子よりも小さい２体の胎児を除き、すべての胎児が正常に見えた。通常のサイズよりも小さい胎児は、胎盤の表面積を減少させ、したがって発達胎児の成長を制限する子宮角内の混雑の結果である可能性が高い。−−／＋−群のすべての雌親および胎児は、ＰＲＲＳＶ核酸の存在に対して陰性であった。最後の群−−／−−では、目に見える病理はなく、すべての雌親（Ｎｏ．８６および１２１）および胎児は、ＰＲＲＳＶ核酸に対して陰性であった。
【０２９５】
本研究の結果は、雌親内にＣＤ１６３が存在しないことがＰＲＲＳＶ感受性胎児を保護するのに十分であることを明確に実証している。ＣＤ１６３  ＫＯ雌親由来のＣＤ１６３陽性子孫は、出生直後にウイルスに感受性であるが、子宮内のＰＲＲＳＶからの保護は、経済的損失および動物の苦痛の主要な原因を排除する手段を提供する。
【０２９６】
本明細書に開示される実施例は例示として提供され、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０２９７】
上記を考慮すると、本発明のいくつかの目的が達成され、他の有利な結果が達成されることが分かる。
【０２９８】
本発明の範囲から逸脱することなく、上記の生成物および方法において様々な変更を行うことができるため、上記の説明に含まれ、添付の図面に示されるすべての事項は、限定的な意味ではなく例示的であると解釈されることが意図される。
参考文献
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Ｅｔｚｅｒｏｄｔ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１３．ＣＤ１６３  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｓｐｅｃｔｓ．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ＆  ｒｅｄｏｘ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  １８，２３５２−２３６３．
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Ｇｒａｖｅｒｓｅｎ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１２．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＤ１６３  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｈｉｇｈｌｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０，１５５０−１５５８．
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Ｋｅｙ，Ｋ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＯＲＦ５  ｇｅｎｅ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｓ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８３，２４９−２６３  （２００１）．
Ｋｉｍ，Ｈ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９３．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  （ＰＲＲＳ）  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ａ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＡ−１０４  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １３３，４７７−４８３．
Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ．４０９：１９８−２０１．
Ｋｗｏｎ  ＤＮ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉａｌｌｅｌｉｃ  ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ  ｐｉｇｓ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ２０１３；  ３：１９８１．
Ｌａｄｉｎｉｇ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１５．Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｔｙｐｅ  ２  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ  ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ  ｐｒｅｇｎａｎｔ  ｇｉｌｔｓ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ２０３，２４−３５．
Ｌａｉ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−１，３−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｐｉｇｓ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２；  ２９５：１０８９−１０９２．
Ｌａｉ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｅａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｉｇｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｒｅｐｒｏｄ  Ｂｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２００３；  １：８２．
Ｌａｉ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｐｉｇｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｄｏｎｏｒｓ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００３；  ５：２３３−２４１．
Ｌａｗｓｏｎ  ＳＲ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｎｏｔｏｂｉｏｔｉｃ  ｐｉｇｓ：ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＭＡＣ−３８７  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ａｔ  ２１  ｄａｙｓ  ｐｏｓｔ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．５１：１０５−１１３．
Ｌｅｅ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｐｉｇｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＲＡＧ２  ａｎｄ  ａｃｃｏｍｐａｎｙｉｎｇ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２０１４；  １１１：７２６０−７２６５．
Ｌｅｅ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｉｇｌｅｔｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅｄ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｗｉｔｈ  ＧＭ−ＣＳＦ．Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ  ２０１３；  ８０：１４５−１５４．
Ｌｉ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｒａｔ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１３；  ３１：６８１−６８３．
Ｌｉｌｌｉｃｏ  ＳＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｖｅ  ｐｉｇｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｆｒｏｍ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｅｄ  ｚｙｇｏｔｅｓ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ２０１３；  ３：２８４７．
Ｍａｃｈａｔｙ  Ｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｏｏｃｙｔｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ  ｒｅａｇｅｎｔ，ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ．Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  １９９７；  ５７：１１２３−１１２７．
Ｍａｄｓｅｎ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，２００４．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ−ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＤ１６３．Ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｄｏｍａｉｎ  ｒｅｇｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７９：５１５６１−５１５６７．
Ｍｅｎｇｅｌｉｎｇ，Ｗ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｅｘｐｏｓｉｎｇ  ｐｒｅｇｎａｎｔ  ｇｉｌｔｓ  ｔｏ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  （ＰＲＲＳ）  ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｆｉｅｌｄ  ｃａｓｅｓ  ｏｆ  “ａｔｙｐｉｃａｌ”  ＰＲＲＳ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．５９，１５４０−１５４４  （１９９８）．
Ｍｅｒｃｋ，Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｒｃｋｍａｎｕａｌｓ．ｃｏｍ／ｖｅｔ／ａｐｐｅｎｄｉｘｅｓ／ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｇｕｉｄｅｓ／ｎｏｒｍａｌ＿ｒｅｃｔａｌ＿ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ＿ｒａｎｇｅｓ．ｈｔｍｌ．
Ｍｉａｏ，Ｙ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，２００９．Ｃｅｎｔｒｏｓｏｍｅ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｏｏｃｙｔｅ  ａｇｉｎｇ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ５０，６６６−６７１．
Ｍｏｒｇａｎ  ＳＢ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｌｕｎｇ  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  ｏｆ  Ｐｉｇｓ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ  Ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｒｅｅ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｔｙｐｅ  １  ＰＲＲＳ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｏｆ  Ｖａｒｙｉｎｇ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｔｒａｎｓｂｏｕｎｄ  Ｅｍｅｒｇ  Ｄｉｓ．Ｎｏｖ  １０．ｐｐ  １−１１．
Ｎｅｌｓｅｎ  ＣＪ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ：ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｗｏ  ｃｏｎｔｉｎｅｎｔｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，２７０−２８０．
Ｎｅｕｍａｎｎ  ＥＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｃｏｎｏｍｉｃ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｏｎ  ｓｗｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ．Ｊ  Ａｍ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ  ２００５；  ２２７：３８５−３９２．
Ｎｉｕ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ  ｖｉａ  Ｃａｓ９／ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｏｎｅ−ｃｅｌｌ  ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｃｅｌｌ  ２０１４；  １５６：８３６−８４３．
Ｐａｔｉｅｎｃｅ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８９．Ｓｗｉｎｅ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ，ｉｎ：Ｃｅｎｔｅｒ，Ｐ．Ｓ．（Ｅｄ．），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎ，Ｓａｓｋａｔｏｏｎ，ＣＡ，ｐｐ．１４９−１７１．
Ｐａｔｔｏｎ  ＪＰ，ｅｔ  ａｌ．，２００８．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ１６３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．１４０：１６１−１７１．
Ｐｌａｇｅｍａｎｎ，Ｐ．Ｇ．Ｗ．Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ−ｅｌｅｖａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｉｎ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ，Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−  Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐｐ  １１０５−１１２０  （１９９６）．
Ｐｒａｔｈｅｒ  ＲＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎ  （Ｓｎ／ＳＩＧＬＥＣ１／ＣＤ１６９）  ｉｓ  ｎｏｔ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ／  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２０１３；  ８７：９５３８−９５４６．
Ｐｒａｔｈｅｒ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１３．Ａｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎ  （Ｓｎ／ＳＩＧＬＥＣ１／ＣＤ１６９）  ｉｓ  ｎｏｔ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ／ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８７，９５３８−９５４６．
Ｐｒｏｖｏｓｔ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ  ｔｏ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｆｒｏｍ  ＭＡＲＣ−１４５  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ｖｉｒｏｌ  Ｊ．９：２６７．
Ｒｅｅｄ  ＪＬ，ｅｔ  ａｌ．，１９３８．Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｆｉｆｔｙ  ｐｅｒｃｅｎｔ  ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｙｇｉｅｎｅ  ２７：４９３−４９７．
Ｒｏｓｓ  ＪＷ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｑｕａｒｅ−ｗａｖｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｆｅｔａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ  ２０１０；  １９：６１１−６２０．
Ｒｏｗｌａｎｄ，Ｒ．Ｒ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ：ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ  ａｎｄ  ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｖｉｒｕｓ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｉｇｓ  ｗｉｔｈ  ＶＲ−２３３２，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５９，２６２−２６６  （１９９９）．
Ｒｏｗｌａｎｄ，Ｒ．Ｒ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｓｍ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｉｇｓ  ｏｒｉｇｉｎａｌｌｙ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｕｔｅｒｏ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９６，２１９−２３５  （２００３）．
Ｒｏｗｌａｎｄ，Ｒ．Ｒ．Ｒ．Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＰＲＲＳＶ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｌａｔｅ  ｇｅｓｔａｔｉｏｎ  ｐｉｇ  ｆｅｔｕｓ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５４，１１４−１２２  （２０１０）．
Ｒｏｗｌａｎｄ，Ｒ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１２．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  （ＰＲＲＳ）  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３，２６０．
Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ｔｈｅ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ２Ａ１０  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ１６３  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６２：５２３０−５２３７．
Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｔｏｒｒｅｓ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，２００３．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ＣＤ１６３  ｏｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｔｏ  Ａｆｒｉｃａｎ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．１４８：２３０７−２３２３．
Ｓｃｈａｅｒ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２００６ａ．Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ＣＤ１６３  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−ｈｅｍｅ  ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｎｏｎｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｔｏ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９９，９４３−９５０．
Ｓｃｈａｅｒ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，２００６ｂ．ＣＤ１６３  ｉｓ  ｔｈｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｎａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ．Ｂｌｏｏｄ  １０７，３７３−３８０．
Ｓｃｈａｅｒ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，２００６ｃ．Ｈｅｍｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｓｅｐｓｉｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ７７，４３２−４３６．
Ｓｈａｎｍｕｋｈａｐｐａ，Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，２００７．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣＤ１５１，Ａ  ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ，ｉｎ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｖｉｒｏｌ  Ｊ．４：６２．
Ｓｈｉｍｏｚａｗａ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｃｌｏｎｅｄ  ｍｉｃｅ  ａｒｅ  ｎｏｔ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｅｎｙ．Ｇｅｎｅｓｉｓ  ２００２；  ３４：２０３−２０７．
Ｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ−ｂａｓｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ，ｄｅｍｏｇｒａｐｈｉｃａｌ，ａｎｄ  ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ２  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８４，８７００−８７１１  （２０１０）．
Ｓｍｉｔ，ＡＦＡ，ｅｔ  ａｌ．，ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ  Ｏｐｅｎ−３．０．１９９６−２０１０．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ：ｏｐｅｎ−４．０．５  （ＲＭＬｉｂ：２０１４０１３１  ａｎｄ  Ｄｆａｍ：１．２）．ｈｔｔｐ：／／  ｗｗｗ．ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ．ｏｒｇ＆ｇｔ．ＣＤ１６３：ａｃｃｅｓｓｅｄ  Ｊｕｌｙ  ２５，２０１４；  ＣＤ１Ｄ：ａｃｃｅｓｓｅｄ  Ａｕｇｕｓｔ  ２７，２０１３．
Ｓｏａｒｅｓ  ＭＰ，ｅｔ  ａｌ．，２００９．Ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１：ｆｒｏｍ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．１５：５０−５８．
Ｓｔｅｉｎ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ４  ｐｏｔｅｎｔｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍａｎｎｏｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ：ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：２８７−２９２．
Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，２０１５．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｓｅｒｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｃｏｍｍｏｎ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｆｅｒａｌ  ｐｉｇｓ  ｉｎ  Ｈａｗａｉｉ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ２００７  ａｎｄ  ２０１０．Ａｃｃｅｐｔｅｄ  ｆｏｒ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｗｉｌｄｌｉｆｅ  Ｄｉｓ  ５１：２３９−２３４３．
Ｓｕｌａｈｉａｎ  ＴＨ１，ｅｔ  ａｌ．，２００２．２００２．Ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ＣＤ１６３，ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＩＬ−１０  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｔｏ  ｐ１５５．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ．２０００  １２：１３１２−１３２１．
Ｔｅｒｎｓ  ＭＰ，ｅｔ  ａｌ．，ＣＲＩＳＰＲ−ｂａｓｅｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２０１１；  １４：３２１−３２７．
Ｔｉａｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｆａｔａｌ  ＰＲＲＳＶ  ｖａｒｉａｎｔｓ：ｕｎｐａｒａｌｌｅｌｅｄ  ｏｕｔｂｒｅａｋｓ  ｏｆ  ａｔｙｐｉｃａｌ  ＰＲＲＳ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｎｉｑｕｅ  ｈａｌｌｍａｒｋ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２，ｅ５２６  （２００７）．
Ｔｒｉｂｌｅ，Ｂ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１２．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ２．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８６，１３５０８−１３５１４．
Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ａｍｅｒｉｃａｎｓ，２０１０．７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，
Ｖａｎ  Ｂｒｅｅｄａｍ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｒｙ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ２０１０；  ９１：１６５９−１６６７．
Ｖａｎ  Ｂｒｅｅｄａｍ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１０．Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｒｙ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ９１，１６５９−１６６７．
Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｅｕｖｅｌ  ＭＭ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ  １６３  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ：ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  ＣＤ１６３  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．６６：８５８−８６６．
ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｆｆ  ＭＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ’ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ’  ｂｕｆｆｅｒ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９２；  ２０：２９０２．
Ｖａｎ  Ｇｏｒｐ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１０．Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＤ１６３，ａ  Ｊａｃｋ−ｏｆ−ａｌｌ−ｔｒａｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４７，１６５０−１６６０．
Ｖａｎ  Ｇｏｒｐ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ１６３  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．８４：３１０１−３１０５．
Ｗａｌｔｅｒｓ  ＥＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｉｎｇ  ｓｗｉｎｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｏ  Ｍｅｄ  ２０１３；  １１０：２１２−２１５．
Ｗａｎｇ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｅｌｌ  ２０１３；  １５３：９１０−９１８．
Ｗｅｌｃｈ  ＳＫ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０．Ａ  ｂｒｉｅｆ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ＣＤ１６３  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ＰＲＲＳＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．１５４：９８−１０３．
Ｗｅｌｌｓ，Ｋ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１４．Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｉｇｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｏｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ９１，７８．
Ｗｅｌｌｓ，Ｋ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ＣＤ１６３  ＳＲＣＲ  ｄｏｍａｉｎ  ５  ｗｉｔｈ  ａ  ＣＤ１６３−ｌｉｋｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｉｇｓ  ｔｏ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ１  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ２  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  （ＰＲＲＳ）  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ  （２０１７）．
Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｍｙｓｔｅｒｙ  ｓｗｉｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ：ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ  ｖｉｒｕｓ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  １３，１２１−１３０．
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【表１９−１】
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【表１９−２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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