(57)【要約】  本開示の実施形態は、病原性Ｔ細胞などの活性化Ｔ細胞を選択的に標的としてそれらを無力にする、工学的に操作された自己／同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）発現Ｔ細胞に関する。本キメラ受容体は、それらの発現が活性化Ｔ細胞を示す例えば４−１ＢＢ、ＯＸ４０およびＣＤ４０Ｌを標的とするための部分を含む。特定実施形態では、活性化Ｔ細胞に関連する状態を、ＡＤＲをコードする細胞の養子Ｔ細胞移入を使って防止または処置する方法がある。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドは
（１）ＯＸ４０特異的リガンド、４−１ＢＢ特異的リガンド、ＣＤ４０Ｌ特異的リガンド、またはそれらの機能的誘導体のうちの１つ以上が、
（２）Ｔ細胞活性化を促進するシグナリングドメイン
に作動的に連結されているものを含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドがＯＸ４０特異的リガンドを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが４−１ＢＢ特異的リガンドを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドがＣＤ４０Ｌ特異的リガンドを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ＯＸ４０特異的リガンドが、ＯＸ４０Ｌ、ＯＸ４０を標的とする抗体、ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ融合物、またはそれらの組合せである、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記４−１ＢＢ特異的リガンドが、４−１ＢＢＬ、４−１ＢＢを標的とする抗体、４−１ＢＢＬ−Ｆｃ融合物、またはそれらの組合せである、請求項１および請求項３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ＣＤ４０Ｌ特異的リガンドが、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌを標的とする抗体、ＣＤ４０−Ｆｃ融合物、またはＣＤ４０Ｌへの特異的結合能を有する他の任意の工学的に操作されたタンパク質である、請求項１および請求項４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが１つ、２つまたはそれ以上の共刺激ドメインをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが（１）と（２）の間のスペーサーをコードする配列をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記スペーサーが１０〜２２０アミノ酸長である、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記スペーサーが抗体による表面検出を促進する配列を有する、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記スペーサーが抗Ｆｃ  Ａｂで検出可能である、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記スペーサーがＩｇＧ  Ｆｃ部分を含む、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドがキメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体またはその両方をさらにコードする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびキメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体またはその両方をコードするポリヌクレオチド上に２Ａ要素またはＩＲＥＳ要素がある、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記キメラ抗原受容体が１つ、２つまたはそれ以上の共刺激ドメインを含む、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドがベクター上に存在する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記ベクターがウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
細胞中に存在する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
前記細胞が真核細胞または細菌細胞である、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記細胞が免疫細胞である、請求項２０または請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記細胞が工学的に操作される、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記Ｔ細胞が１つ以上のキメラ抗原受容体を含む、請求項２４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
前記キメラ抗原受容体が１つ、２つまたはそれ以上の共刺激ドメインを含む、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
前記Ｔ細胞が１つ以上の工学的に操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、請求項２４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによって発現されるポリペプチド。
【請求項２９】
（１）ＯＸ４０特異的リガンド、４−１ＢＢ特異的リガンド、ＣＤ４０のうちの１つ以上が、
（２）Ｔ細胞活性化を促進するシグナリングドメイン
に作動的に連結されているものを含むポリペプチド。
【請求項３０】
前記Ｔ細胞活性化を促進するシグナリングドメインが、ＣＤ３ゼータサブユニット、ＤＡＰ１２、Ｆｃ受容体、またはそれらの組合せに由来する、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが１つ、２つまたはそれ以上の共刺激ドメインをさらに含む、請求項２９または請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２９〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むキメラ受容体発現細胞。
【請求項３３】
免疫細胞である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
工学的に操作される、請求項３２または請求項３３に記載の細胞。
【請求項３５】
前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項３３に記載の細胞。
【請求項３６】
前記Ｔ細胞がＣＡＲ形質導入Ｔ細胞である、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３７】
前記Ｔ細胞がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）形質導入Ｔ細胞である、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３８】
１つ以上の遺伝子の内因性発現を欠くように工学的に操作される、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３９】
４−１ＢＢ、ＯＸ４０および／またはＣＤ４０Ｌの内因性発現を欠くように工学的に操作される、請求項３８に記載の細胞。
【請求項４０】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼを使って工学的に操作される、請求項３８または請求項３９に記載の細胞。
【請求項４１】
細胞リポジトリに収容される、請求項３２〜４０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４２】
免疫エフェクター細胞に請求項１〜２７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドをトランスフェクトする工程を含む、細胞治療用の細胞を調製する方法。
【請求項４３】
前記細胞を細胞リポジトリに寄託する工程をさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
１つ以上のキメラ抗原受容体および／または１つ以上の組換えＴ細胞受容体を発現するように前記細胞を改変する工程をさらに含む、請求項４２または請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
有効量の前記細胞を、それを必要とする個体に提供する工程をさらに含む、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞が前記個体に関して同種である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
個体を医学的状態に関して同種治療用細胞で処置する方法であって、治療有効量の同種細胞を前記個体に提供する工程を含み、該細胞は（１）ＯＸ４０特異的リガンド、４−１ＢＢ特異的リガンド、ＣＤ４０Ｌ特異的リガンド、またはそれらの機能的誘導体のうちの１つ以上が（２）Ｔ細胞活性化を促進するシグナリングドメインに作動的に連結されているものを含むポリペプチドを発現する方法。
【請求項４８】
前記細胞が細胞リポジトリから取得される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞が１つ以上のキメラ抗原受容体および／または１つ以上の組換えＴ細胞受容体を発現する、請求項４７または請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
個体における同種細胞、同種組織または同種臓器の拒絶を回避する方法であって、前記個体に有効量の、活性化Ｔ細胞上に選択的に存在する化合物を標的とする細胞外ドメインを含みかつＣＤ３ゼータを含む工学的に操作されたキメラ受容体を発現する同種免疫細胞を送達する工程を含み、前記送達工程が前記個体において以下をもたらす方法：
（１）前記個体における内因性アロ反応性Ｔ細胞の阻害、および／または
（２）前記個体におけるＮＫ細胞活性化の抑制。
【請求項５１】
前記同種細胞がキメラ受容体を発現する同種免疫細胞である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記同種細胞がキメラ抗原受容体または工学的に操作されたＴ細胞受容体を発現する、請求項５０または請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記同種免疫細胞が、前記個体における組織移植および／または臓器移植の前、間および／または後に、前記個体に送達される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記活性化Ｔ細胞が病原性Ｔ細胞である、請求項５０〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
個体において活性化Ｔ細胞を選択的に標的とする方法であって、前記個体に有効量の、工学的に操作されたキメラ受容体を発現する免疫細胞を提供する工程を含み、該キメラ受容体が
（１）活性化Ｔ細胞上に選択的に存在する化合物を標的とする細胞外ドメイン、および
（２）Ｔ細胞活性化を促進するシグナリングドメイン
を含む方法。
【請求項５６】
前記Ｔ細胞活性化を促進するシグナリングドメインが、ＣＤ３ゼータサブユニット、ＤＡＰ１２、Ｆｃ受容体、またはそれらの組合せに由来する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記活性化Ｔ細胞が病原性Ｔ細胞である、請求項５５または請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
個体における活性化Ｔ細胞に関連する医学的状態を防止または処置する方法であって、前記個体に有効量の、前記活性化Ｔ細胞を選択的に標的とする工学的に操作されたキメラ受容体を発現する免疫細胞を送達する工程を含み、該キメラ受容体が以下を含む方法：
（１）活性化Ｔ細胞上に選択的に存在する化合物を標的とする細胞外ドメイン、および
（２）Ｔ細胞活性化を促進するシグナリングドメイン。
【請求項５９】
前記キメラ受容体が１つ、２つまたはそれ以上の共刺激ドメインをさらに含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記医学的状態が自己免疫障害である、請求項５８または請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記医学的状態が、移植片拒絶、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、自己免疫性大腸炎、またはそれらの組合せを含む、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
個体における同種Ｔ細胞、同種組織または同種臓器のＮＫ細胞媒介性宿主拒絶を回避する方法であって、前記個体に有効量の、活性化Ｔ細胞上に選択的に存在する化合物を標的とする細胞外ドメインを含みかつＴ細胞活性化を促進するシグナリングドメインも含む工学的に操作されたキメラ受容体を発現する免疫細胞を提供する工程を含む方法。
【請求項６３】
前記工学的に操作されたキメラ受容体を発現する免疫細胞が同種Ｔ細胞である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記免疫細胞がキメラ抗原受容体または工学的に操作されたＴ細胞受容体を発現する、請求項６２または請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記個体に提供される工学的に操作されたキメラ受容体を発現する免疫細胞の量が１ｍ２あたり１０２〜１０１２個の範囲にある、請求項６２〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記キメラ受容体を発現する細胞が、個体に、全身性にまたは局所的に提供される、請求項４７〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
免疫細胞がＴ細胞である、請求項４７〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記免疫細胞が前記個体に１回送達されるか、２回以上送達される、請求項４７〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１８年４月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／６６２，８１７号に基づく優先権を主張し、この仮特許出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［連邦政府の後援による研究または開発に関する陳述］
本発明は、米国国立衛生研究所および米国国立がん研究所によって交付されたＰ５０  ＣＡ１２６７５２の下に米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
本開示の実施形態には、少なくとも免疫学、細胞生物学、分子生物学および医学の分野が含まれる。
【背景技術】
【０００４】
移植を受けている患者または第三者由来の治療用細胞を投与されている患者では、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の無用な活性化が、しばしば、生命を脅かす同種免疫反応を促進し、それが移植された臓器／組織の拒絶または移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＧｖＨＤ）の発生につながる。同様に、自己反応性Ｔ細胞の無用な活性化も、真性糖尿病、自己免疫性大腸炎および多発性硬化症などの壊滅的自己免疫状態につながる場合がある。現在、これらの疾患の大半は、病原性Ｔ細胞を選択的に排除することができないので、根治可能ではない。その代わりに、患者は免疫抑制薬で処置されることが多いが、これは患者を免疫不全状態にするので、患者は感染症および悪性形質転換を起こしやすくなる。
【０００５】
本開示は、既製の（ｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ）細胞を利用することを含む、安全で効果的な組織移植および養子細胞移入という、当技術分野における長年のニーズに対し、免疫系の無用な活性化ゆえの病原性状態を制御する移入細胞の能力を強化することによる解決策を提供する。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、免疫活性化に起因する病原性状態を制御するための、養子移入に利用される細胞に関する組成物および方法に向けられる。本組成物および方法は自家細胞および同種（allogeneic）細胞に適用される。いくつかの手段はレシピエント個体における同種細胞の反応性を低減するためにとりうるが、それらの細胞は依然として、それらを外来と認識して拒絶をもたらし治療的利益を制限するレシピエントの免疫系（主にＴ細胞およびＮＫ細胞）の標的となるだろう。
【０００７】
本開示は、活性化された病原性Ｔ、ＮＫ−ＴおよびＮＫ細胞の存在に関連する医学的状態を防止または処置するために、それらの細胞を標的とするように養子療法細胞を改変することによって、この課題を克服する。特定実施形態において、本組成物および方法は、休止Ｔ細胞を温存しつつ病原性Ｔ細胞を選択的に標的とする受容体を発現する細胞を使った養子Ｔ細胞移入を利用する。具体的実施形態において、移入用の養子Ｔ細胞は、Ｔ細胞上のその存在が病原性Ｔ細胞を示す特定の標的分子を発現する病原性Ｔ細胞を標的とするキメラ分子を発現するように工学的に操作される。特定実施形態において、本開示は、病原性Ｔ細胞の選択的標的化のための自己／同種免疫防御受容体（ａｕｔｏ／ａｌｌｏ−ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＡＤＲ）に関する。
【０００８】
本開示の特定実施形態には、工学的に操作された同種Ｔ細胞を宿主個体における排除から保護する方法であって、その個体に、ＡＤＲを装備した細胞を提供することによる方法が含まれる。実施形態には、例えば組織移植または臓器移植を受けている個体における同種免疫反応を回避する方法も含まれる。
【０００９】
特定実施形態において、本開示に包含される細胞は、それらが同種レシピエントを含むレシピエントにおいて生残することが可能になるように改変されているか、そのように改変することができる。具体的事例において、養子細胞療法用の細胞（Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞などを含む）は「既製品として」（Ｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ）利用するのに適している。ここで、既製品とは、リポジトリ、すなわちバンクに保有されている細胞であって、具体的目的のためにそれを必要とする個体に（さらなる改変を加えてまたはさらなる改変を加えずに）提供されうるものを指す。多くの場合、その個体は、細胞の元の由来源である個体ではない。このようにして利用される細胞は、ＡＤＲを発現するように事前に製造しておいてもよい。ただし、いくつかの事例では、細胞はバンクから取得された後に、ＡＤＲを発現するように改変される。また、バンクに預けられている細胞はＣＡＲまたは組換えＴＣＲを発現しても発現しなくてもよく、あるいはバンクから取得した細胞を、その後に、ＣＡＲまたは組換えＴＣＲを発現するように改変してもよい。このような実施により、宿主による免疫拒絶を伴うことなく、必要になるたびに患者特異的産物を製造する必要もなく、第三者由来の治療用細胞を使用することが容易になる。
【００１０】
特定実施形態には、以下をコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチドがある：（１）ＯＸ４０特異的リガンド、４−１ＢＢ特異的リガンド、ＣＤ４０Ｌ特異的リガンド、またはそれらの機能的誘導体のうちの１つ以上が、（２）Ｔ細胞活性化を促進するシグナリングドメインに作動的に連結されているもの。このポリヌクレオチドは、ＯＸ４０特異的リガンド、４−１ＢＢ特異的リガンド、またはＣＤ４０Ｌ特異的リガンドを含みうる。ＯＸ４０特異的リガンドは、ＯＸ４０Ｌ、ＯＸ４０を標的とする抗体、ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ融合物、もしくはそれらの組合せ、またはＯＸ４０への特異的結合能を有する他の任意の工学的に操作されたタンパク質でありうる。４−１ＢＢ特異的リガンドは、４−１ＢＢＬ、４−１ＢＢを標的とする抗体、４−１ＢＢＬ−Ｆｃ融合物、もしくはそれらの組合せ、または４−１ＢＢへの特異的結合能を有する他の任意の工学的に操作されたタンパク質でありうる。ＣＤ４０Ｌ特異的リガンドは、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌを標的とする抗体、ＣＤ４０−Ｆｃ融合物、もしくはＣＤ４０Ｌへの特異的結合能を有する他の任意の工学的に操作されたタンパク質、またはそれらの組合せでありうる。少なくとも特定の事例において、ポリヌクレオチドは、（１）と（２）との間の、例えば１０〜２２０アミノ酸長などの、スペーサーをコードする配列を、さらに含む。スペーサーは抗体による表面検出を促進する配列を有しうる。例えばスペーサーは抗Ｆｃ  Ａｂによる検出が可能である。スペーサーはＩｇＧ  Ｆｃ部分を含みうる。
【００１１】
特定実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、またはその両方を、さらにコードしうる。ポリヌクレオチドは、ベクター上に存在するもの、例えばウイルスベクター（レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクター）上または非ウイルスベクター（プラスミド、トランスポゾンなど）上に存在するものを含めて、任意の形態をとりうる。特定の事例において、ポリヌクレオチドは、真核細胞または細菌細胞を含む細胞中に存在する。細胞はＴ細胞などの免疫細胞でありうる。細胞は工学的に操作されうる。細胞は１つ以上のキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）および／または１つ以上の工学的に操作されたＴ細胞受容体（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＣＲ）を含みうる。
【００１２】
本開示に包含される任意のポリヌクレオチドによって発現されるポリペプチドは、本開示の一部として含まれる。特定実施形態には、以下を含むポリペプチドがある：（１）ＯＸ４０特異的リガンド、４−１ＢＢ特異的リガンド、およびＣＤ４０のうちの１つ以上が、（２）Ｔ細胞活性化を促進するシグナリングドメインに作動的に連結されているもの。Ｔ細胞活性化を促進するシグナリングドメインは、ＣＤ３ゼータサブユニット、ＤＡＰ１２、Ｆｃ受容体、またはそれらの組合せに由来しうる。
【００１３】
本開示によって包含される任意の細胞は本開示の一部である。具体的実施形態において、キメラ受容体発現細胞はいずれも、本明細書において想定される任意のポリヌクレオチドおよび／または本明細書において想定される任意のポリペプチドを含む細胞を含めて、本開示の一部である。細胞は工学的に操作された細胞であってよい。細胞は、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞および／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）形質導入Ｔ細胞を含む、Ｔ細胞などの免疫細胞でありうる。具体的実施形態において、細胞は、１つ以上の遺伝子の内因性発現を欠くように、例えば４−１ＢＢ、ＯＸ４０および／またはＣＤ４０Ｌのうちの１つ以上を欠くように、工学的に操作される。細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼを使って、工学的に操作されうる。あるいは、例えば小胞体または他の細胞内区画にアンカリングされた特異的抗体または受容体でＡＤＲリガンドを捕捉することなどによって、ＡＤＲリガンドの表面発現が防止されるように細胞を工学的に操作してもよい。
【００１４】
一実施形態には、個体における同種細胞、同種組織または同種臓器の拒絶を回避する方法であって、その個体に有効量の、活性化Ｔ細胞上に選択的に存在する化合物を標的とする細胞外ドメインを含みかつＣＤ３ゼータを含む工学的に操作されたキメラ受容体を発現する同種免疫細胞を送達する工程を含み、前記送達工程が前記個体において以下をもたらす方法がある：（１）個体における内因性アロ反応性Ｔ細胞の阻害、および／または（２）個体におけるＮＫ細胞活性化の抑制。具体的実施形態において、同種細胞はキメラ受容体を発現する同種免疫細胞である。同種細胞は、キメラ抗原受容体および／または工学的に操作されたＴ細胞受容体を発現しうる。同種免疫細胞は、個体における組織移植および／または臓器移植の前、間および／または後に、個体に送達されうる。具体的事例において、活性化Ｔ細胞は病原性Ｔ細胞である。
【００１５】
一実施形態には、個体において活性化Ｔ細胞を選択的に標的とする方法であって、その個体に有効量の、工学的に操作されたキメラ受容体を発現する細胞を提供する工程を含み、該キメラ受容体が以下を含む方法がある：（１）活性化Ｔ細胞上に選択的に存在する化合物を標的とする細胞外ドメイン、および（２）Ｔ細胞活性化を促進するシグナリングドメイン。Ｔ細胞活性化を促進するシグナリングドメインは、ＣＤ３ゼータサブユニット、ＤＡＰ１２、Ｆｃ受容体、任意のＩＴＡＭ含有配列、またはそれらの組合せに由来しうる。具体的事例において、活性化Ｔ細胞は病原性Ｔ細胞である。
【００１６】
特定の実施形態には、個体における活性化Ｔ細胞に関連する医学的状態を防止または処置する方法であって、その個体に有効量の、前記活性化Ｔ細胞を選択的に標的とする工学的に操作されたキメラ受容体を発現する免疫細胞を送達する工程を含み、該キメラ受容体が以下を含む方法がある：（１）活性化Ｔ細胞上に選択的に存在する化合物を標的とする細胞外ドメイン、および（２）Ｔ細胞活性化を促進するシグナリングドメイン。医学的状態は、自己免疫障害、例えば移植片拒絶、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、自己免疫性大腸炎、またはそれらの組合せなどの自己免疫障害でありうる。
【００１７】
一実施形態には、個体における同種Ｔ細胞、同種組織または同種臓器のＮＫ細胞媒介性宿主拒絶を回避する方法であって、その個体に有効量の、活性化Ｔ細胞上に選択的に存在する化合物を標的とする細胞外ドメインを含みかつＴ細胞活性化を促進するシグナリングドメインも含む工学的に操作されたキメラ受容体を発現する免疫細胞を提供する工程を含む方法がある。工学的に操作されたキメラ受容体を発現する免疫細胞は、特定の事例では、同種Ｔ細胞である。免疫細胞は、キメラ抗原受容体および／または工学的に操作されたＴ細胞受容体を発現しうる。個体に提供される工学的に操作されたキメラ受容体を発現する免疫細胞の量は、１ｍ２あたり１０２〜１０１２個の範囲にありうる。キメラ受容体を発現する細胞は、個体に、全身性にまたは局所的に提供されうる。免疫細胞はＴ細胞でありうる。免疫細胞は個体に１回送達されるか、２回以上送達されうる。
【００１８】
上記では、以下の詳細な説明がより良く理解されうるように、本開示の特徴および技術的利点をかなり幅広く概説した。以下に、本願特許請求の範囲の主題を形成するさらなる特徴および利点を記載する。開示される概念および具体的実施形態が、その設計と同じ目的を実行するために、他の構造を改変または設計するための基礎として容易に利用されうることを、当業者は認識すべきである。そのような等価な構築物が添付の特許請求の範囲に記載される要旨および範囲から逸脱しないことも、当業者は理解すべきである。本明細書に開示される設計に特有であると考えられる新規な特徴は、構成についても、操作方法についても、さらなる目的および利点と共に、以下の説明を添付の図面と関連付けて検討すれば、より良く理解されるだろう。ただし、図のそれぞれは例示および説明を目的として提供されているに過ぎず、本開示の範囲の画定を意図していないことは、明確に理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本開示をより完全に理解するために、以下に挙げる説明を添付の図面と併せて解釈されたい。
【００２０】
【図１Ａ−Ｅ】ＡＤＲは、免疫細胞の細胞表面上に発現されて、それぞれの標的に対する細胞傷害性を増進することができる。（図１Ａ）ＡＤＲの概略。ＧＦＰは随意である。（図１Ｂ）細胞表面におけるＡＤＲの発現。（図１Ｃ）形質導入後のＡＤＲ  Ｔ細胞の増殖。（図１Ｄ）ＡＤＲリガンドを発現する標的細胞に対するＡＤＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性。（図１Ｅ）４−１ＢＢ  ＡＤＲを発現する野生型Ｔ細胞と４−１ＢＢ  ＫＯ  Ｔ細胞の増殖および４−１ＢＢ＋標的に対するそれらの細胞傷害性の対比。これは、Ｔ細胞上のＡＤＲリガンドをノックアウトすることで増殖と細胞傷害性をさらに強化できることを示しており、Ｔ細胞におけるＡＤＲとそのリガンドの共発現はＡＤＲ−Ｔ細胞の増殖にも機能にも必要でないことを実証している。
【００２１】
【図２Ａ−Ｅ】活性化Ｔ細胞でのＡＤＲリガンドの選択的発現が、ＡＤＲ  Ｔ細胞によるそれらの選択的排除を可能にする。（図２Ａ〜Ｃ）ＴＣＲ刺激後の休止Ｔ細胞と活性化Ｔ細胞でのＡＤＲリガンドの発現の対比。（図２Ｄ）休止ＣＤ４＋Ｔ細胞および休止ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＡＤＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性の欠如。（図２Ｅ）４８時間の共培養後のＡＤＲ  Ｔ細胞による活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞および活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の排除。
【００２２】
【図３Ａ−Ｆ】ＭＬＲモデルにおいて、４−１ＢＢ  ＡＤＲの発現はＴ細胞を免疫拒絶から保護する。（図３Ａ）１：１０のＡＤＲ  Ｔ：ＰＢＭＣ比での同種ＰＢＭＣとの共培養後に、ＡＤＲを共発現するＴＣＲＫＯ  Ｔ細胞が拒絶から保護されることを示す代表的ドットプロット。（図３Ｂ〜Ｃ）共培養中のドナーＴ細胞及び同種Ｔ細胞の絶対数。（図３Ｄ−Ｆ）ウイルス特異的ＡＤＲ  Ｔ細胞についても同じ。
【００２３】
【図４Ａ−Ｃ】インビトロでの混合リンパ球反応において、ＡＤＲの発現はウイルス特異的同種Ｔ細胞を免疫拒絶から保護する。（図４Ａ）ＡＤＲ  ＶＳＴがレシピエント同種ＰＢＭＣによる免疫拒絶から保護されることを示す代表的ドットプロット。  （図４Ｂ−Ｃ）ＭＬＲ中のさまざまな時点におけるレシピエントＴ細胞及びドナーＶＳＴの絶対数。
【００２４】
【図５】ＡＤＲ  ＶＳＴは抗ウイルス機能を保つ。ＡＤＲ  ＶＳＴを、ウイルスペプミックス（ｐｅｐｍｉｘ）をパルスした単球と共培養した。ＡＤＲ  ＶＳＴは無改変ＶＳＴと同等によくウイルス感染細胞を排除することが、単球数によって示された。
【００２５】
【図６Ａ−Ｈ】活性化ＮＫ細胞はＡＤＲリガンドをアップレギュレートし、ＡＤＲ  Ｔ細胞によって選択的に標的化されうる。（図６Ａ〜Ｂ）休止ＮＫ細胞と活性化ＮＫ細胞での４−１ＢＢ発現の対比。（図６Ｃ）４−１ＢＢ  ＡＤＲ  Ｔ細胞と２４時間共培養した後の休止ＮＫ細胞と活性化ＮＫ細胞の残存数の対比。（図６Ｄ）ＭＨＣを欠くＡＤＲ  Ｔ細胞は、ＮＫ細胞の増殖を制御することにより、同種ＰＢＭＣによる免疫拒絶から保護される。（図６Ｅ）共培養中のドナーＴ細胞および同種ＮＫ細胞の絶対数。（図６Ｆ）１：１のＥ：Ｔ比での４８時間の共培養時に、ＭＨＣを欠くＡＤＲ  Ｔ細胞は、ＮＫ細胞による免疫拒絶に抵抗する。（図６Ｇ〜Ｈ）ＡＤＲ  Ｔ細胞は、ＰＢＭＣとのＭＬＲ中に、アロ反応性ＮＫ細胞の増殖を制御する。（図６Ｈ）ＮＫ細胞の絶対数がプロットされている。
【００２６】
【図７Ａ−Ｅ】ＡＤＲ発現はインビボでの免疫拒絶から同種Ｔ細胞を保護する。（図７Ａ）ＨＬＡ−Ａ２＋ドナーからのＴ細胞が亜致死線量照射後にマウスに与えられ、続いて４日後に同種ＨＬＡ−Ａ２−Ｔ細胞が投与された、免疫拒絶のマウスモデルの概略。（図７Ｂ−Ｃ）ＨＬＡ−Ａ２−ドナーからの対照Ｔ細胞は１８日目までに拒絶されたが、ＡＤＲ発現細胞は保護された。（図７Ｃ）さまざまな時点におけるＨＬＡ−Ａ２＋ドナーおよびＨＬＡ−Ａ２−ドナーからのＴ細胞の絶対数。（図７Ｄ）同種Ｔ細胞の代わりにドナー１からのＰＢＭＣ全体（Ｔ細胞とＮＫ細胞をどちらも含有するもの）をマウスに与えた、改変型インビボモデル。（図７Ｅ）ＡＤＲ  Ｔ細胞が、免疫拒絶から保護されると共に、致死的ＧｖＨＤの急激な発生からマウスを保護したことを示す、代表的フロープロット。
【００２７】
【図８Ａ−Ｅ】ＣＡＲとＡＤＲを共発現させても両受容体の機能は維持される。（図８Ａ）ＡＤＲとＣＡＲを共発現する免疫細胞の概略図。（図８Ｂ）細胞表面でのＣＡＲとＡＤＲの共発現。（図８Ｃ）ＮＡＬＭ−６（ＣＤ１９＋ＣＡＲ標的）に対するＣＡＲ−ＡＤＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性。（図８Ｄ）活性化Ｔ細胞（ＡＤＲ標的）に対するＣＡＲ−ＡＤＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性。（図８Ｅ）両方の細胞標的と同時に共培養した時の両標的に対するＣＡＲ−ＡＤＲ  Ｔ細胞の細胞傷害活性。
【００２８】
【図９Ａ−Ｅ】ＣＡＲ−ＡＤＲ  Ｔ細胞は免疫拒絶から保護され、強力な抗腫瘍活性を発揮する。（図９Ａ）マウスモデルの概略。ドナー１からの同種Ｔ細胞とｂ２ｍＫＯ  ＮＡＬＭ６を２４時間の間をあけてマウスに与え、次にドナー２からのＣＡＲ−ＡＤＲ  Ｔ細胞を単回投与した。（図９Ｂ）末梢血におけるドナー２からのＴ細胞の動態。（図９Ｃ）実験群におけるドナー１のＴ細胞の動態。（図９Ｄ）マウスにおける白血病負荷。（図９Ｅ）マウスの総生存率。
【００２９】
【図１０Ａ−Ｃ】固形腫瘍モデルにおいて、ＣＡＲ−ＡＤＲ  Ｔ細胞は免疫拒絶から保護され、強力な抗腫瘍活性を発揮する。（図１０Ａ）マウスモデルの概略。ドナー１からの同種Ｔ細胞とｂ２ｍＫＯ神経芽細胞腫細胞株ＣＨＬＡ２５５を２４時間の間をあけてマウスに与え、次にドナー２からのＣＡＲ−ＡＤＲ  Ｔ細胞を単回投与した。（図１０Ｂ）ドナー２のＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞はＤ１８までに拒絶されたが、ＣＡＲ−ＡＤＲ  Ｔ細胞は同種拒絶に抵抗し、末梢血中に存続した。（図１０Ｃ）マウスにおける腫瘍量。＊はＡＴＣ＋ＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ群における異種ＧｖＨＤ関連死を示す。
【００３０】
【図１１Ａ−Ｅ】ＴＣＲノックアウトＣＡＲ−ＡＤＲ  Ｔ細胞は免疫拒絶から保護され、強力な抗腫瘍活性を発揮する。（図１１Ａ）マウスモデルの概略。ドナー１からの同種Ｔ細胞とｂ２ｍＫＯ  ＮＡＬＭ６を２４時間の間をあけてマウスに与え、次にドナー２からのＴＣＲ編集ＣＡＲ−ＡＤＲ  Ｔ細胞を単回投与した。（図１１Ｂ）末梢血におけるドナー２からのＴ細胞の動態。（図１１Ｃ）実験群におけるドナー１  Ｔ細胞の動態。（図１１Ｄ）マウスにおける白血病負荷。（図１１Ｅ）マウスの総生存率。
【００３１】
【図１２Ａ−Ｄ】ＡＤＲ  Ｔ細胞はマウスを致死的異種ＧｖＨＤから保護する。（図１２Ａ）モデルの概略。（図１２Ｂ）インビボでのＦＦｌｕｃ標識ＡＤＲ  Ｔ細胞の増殖。（図１２Ｃ）マウスにおける体重の増減の動態。（図１２Ｄ）マウスの総生存率。
【００３２】
【図１３Ａ−Ｇ】ＣＤ２８細胞内シグナリングドメインを持つ第２世代のＡＤＲ（ＡＤＲ．２８ゼータ）。（図１３Ａ）ＡＤＲ．２８ゼータの構造。（図１３Ｂ−Ｃ）標的発現細胞株に対するＡＤＲ．２８ゼータのインビトロ細胞傷害性。（図１３Ｄ−Ｇ）ＡＤＲ．２８ゼータはマウスを異種ＧｖＨＤから保護した。（図１３Ｄ）モデルの概略。（図１３Ｅ）インビボでのＦＦＬｕｃ標識ＡＤＲ．２８ゼータＴ細胞の増殖。（図１３Ｆ）マウスの体重の増減の動態。（図１３Ｇ）マウスの総生存率。
【００３３】
【図１４】がんにおけるＡＤＲ発現細胞の細胞傷害性。（左）ＨＤＬＭ−２ホジキンリンパ腫細胞に対する４−１ＢＢ  ＡＤＲ発現Ｔ細胞の細胞傷害性。（右）Ｋ５６２慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＣＭＬ）細胞に対する４−１ＢＢ  ＡＤＲ発現Ｔ細胞の細胞傷害性。１：１のエフェクター対標的比で４８時間共培養した時の腫瘍細胞の絶対数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本明細書において使用される「ａ」および「ａｎ」という単語は、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）という単語と合わせて本明細書で使用される場合には、特許請求の範囲を含めて、「１つ以上」を表す。本発明のいくつかの実施形態は、本発明の１つ以上の要素、方法工程および／または方法からなるか、または本発明の１つ以上の要素、方法工程および／または方法から本質的になる。本明細書に記載される任意の方法および組成物は、本明細書に記載される他の任意の方法または組成物に関して履行することができると想定される。
【００３５】
本明細書の全体を通して、文脈上別段の必要がある場合を除き、「含む」という単語（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓおよびｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、言明された工程もしくは要素または工程もしくは要素の群の包含を含意するが、他のいかなる工程もしくは要素または工程もしくは要素の群の除外も含意しないと理解されるだろう。「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）とは、「からなる」という表現に続くものを含み、それに限定されることを意味する。したがって「からなる」という表現は、列挙された要素が必要または必須であること、および他の要素は存在しえないことを示す。「から本質的になる」（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）とは、この表現の後に列挙される要素をいずれも含み、列挙される要素に関して本開示において明記された活性または作用に干渉も寄与もしない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「から本質的になる」という表現は、列挙された要素は必要または必須であるが、他の要素は随意ではなく、列挙された要素の活性または作用に影響を及ぼすかどうかに依存して、存在しうるか、または存在しえないことを示す。
【００３６】
本明細書の全体を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定実施形態」、「関連実施形態」、「特定の実施形態」、「追加の実施形態」もしくは「さらなる実施形態」またはそれらの組合せへの言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造または特色が、本発明の少なくとも一実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書のさまざまな場所に現れる前記の表現は、必ずしもすべてが同じ実施形態に言及しているわけではない。さらにまた、特定の特徴、構造または特色は、１つ以上の実施形態において、任意の適切な方法で組み合わされうる。
【００３７】
本明細書において使用される「対象」という用語は、一般に、任意の種類の医学的状態に関する治療を必要としている個体を指す。対象は任意の種類の動物であることができる。対象は、ある方法または物質の目的となる任意の生物対象または動物対象であることができ、哺乳動物、例えばヒト、実験動物（例えば霊長類、ラット、マウス、ウサギ）、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シチメンチョウ、およびニワトリ）、ハウスホールドペット（例えばイヌ、ネコ、および齧歯類動物）、ウマ、およびトランスジェニック非ヒト動物を含む。対象は、例えば疾患（これは医学的状態と呼んでもよい）、例えば１つ以上の感染性疾患、１つ以上の遺伝子障害、１つ以上のがん、またはそれらの任意の組合せを有するまたは有すると疑われる、患者であることができる。疾患は病原性でありうる。対象は、抗生物質処置を受けているか、受けたことがあってもよい。対象は無症候性であってもよい。対象は健常個体であってもよい。「個体」という用語も、少なくともいくつかの事例では、相互可換的に使用されうる。本明細書にいう「対象」または「個体」は、医療施設に収容されていてもされていなくてもよく、医療施設の外来患者として処置されてもよい。個体はインターネットを経由して１つ以上の医薬組成物を受け取っていてもよい。個体には、任意の齢のヒトまたは非ヒト動物を含みうるので、成人と年少者（すなわち小児）および乳幼児を含み、胎内の個体も含む。個体は任意の血統および性別でありうる。この用語が医学的処置の必要を暗示することは意図していないので、個体は、自由意志により、または非自発的に、臨床試験であるか基礎科学研究に資するものであるかを問わず、実験の一部でありうる。
【００３８】
本明細書において使用される「工学的に操作された」という用語は、天然には存在せず、人工的に、例えば当技術分野において標準的な遺伝子組換え技法によって、生成させた分子を指す。
【００３９】
本開示に関して「有効量」または「治療有効量」とは、個体に投与された場合に、活性化Ｔ細胞の標的化を可能にし、かつ／または医学的状態の徴候および／もしくは症状を緩和し、または医学的状態を防止する、細胞の量を指す。投与される実際の量は、機能的免疫細胞が医学的状態に対して薬理学的活性を呈するインビトロまたはインビボのどちらかで行われる試験に基づいて決定することができる。
【００４０】
［Ｉ．自己／同種免疫防御受容体ならびにその組成物および使用］
本開示は、病原性Ｔ細胞を含む活性化Ｔ細胞の選択的標的化を提供する合成キメラ受容体分子を包含する。これらの工学的に操作された分子は合成分子であり、組換え技術によって生産されうる。これらの分子は、活性化病原性Ｔ細胞を含む活性化Ｔ細胞を、例えば高い特異性で標的とする、自己／同種免疫防御受容体ということができる。
【００４１】
特定実施形態において、自己／同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）は、活性化Ｔ細胞上でアップレギュレートされる１つ以上の化合物を標的とする実体を含む。活性化Ｔ細胞上でアップレギュレートされる化合物は任意の１つまたはその組合せであってよいが、具体的実施形態では、ＯＸ４０、４−１ＢＢおよびＣＤ４０Ｌが活性化Ｔ細胞上でアップレギュレートされ、それらが、ＡＤＲが標的としている対象である。ＡＤＲは、特定実施形態では、細胞を受容する個体に関して同種（allogenic）である同種免疫細胞上に存在する。別の例では、ＡＤＲを、自家Ｔ細胞上、異種細胞上、および／または合成細胞上に発現させる。
【００４２】
（Ａ．自己／同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）分子）
ＡＤＲ分子は合成的な非天然分子であって、人工的に生産され、少なくとも（１）活性化Ｔ細胞上に選択的に存在する化合物を標的とする細胞外ドメイン（具体的実施形態では、細胞外ドメインは、活性化Ｔ細胞上でアップレギュレートされる１つ以上の化合物を標的とするタンパク質またはその機能的フラグメントもしくは誘導体である）であって、（２）Ｔ細胞活性化を促進するシグナリングドメイン、例えばＣＤ３ゼータサブユニット、ＤＡＰ１２、およびＦｃ受容体に由来するもの、または他のＩＴＡＭ含有配列などに、作動的に連結されているものを含む。ＡＤＲ分子は、要素（１）および（２）を含むか、それらの要素からなるか、またはそれらの要素から本質的になりうる。少なくとも特定の事例において、ＡＤＲはＩ型膜貫通タンパク質の１つ以上の構成成分および／またはＩＩ型膜貫通タンパク質の１つ以上の構成成分を含む。
【００４３】
具体的実施形態において、ＡＤＲ分子では、細胞外ドメインが、活性化Ｔ細胞上の関連タンパク質に選択的に結合するタンパク質を含む。例えばＡＤＲ細胞外ドメインは活性化Ｔ細胞上の受容体に対するリガンドを含みうるか、ＡＤＲ細胞外ドメインは活性化Ｔ細胞上のリガンドに対する受容体を含みうる。
【００４４】
具体的実施形態において、ＡＤＲ分子では、細胞外ドメインが、ＯＸ４０に対するリガンド、４−１ＢＢに対するリガンド、および／またはＣＤ４０を含む。これらの特定例では、活性化Ｔ細胞上の関連タンパク質が、それぞれＯＸ４０、４−１ＢＢ、およびＣＤ４０Ｌである。代替的実施形態では、活性化Ｔ細胞上の他の特定組成物を標的とする。例えば、Ｔ細胞の細胞表面でアップレギュレートされる他の活性化マーカー（例えばＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１など）を、同様のアプローチを使って標的とすることができる。そのような事例では、対応するＡＤＲ分子は、４−１ＢＢ／ＯＸ４０特異的リガンドではなく、それぞれＣＤ６９リガンド、ＣＤ２５リガンド、もしくはＣＤ７１リガンド、または抗体由来の標的化部分を有するだろう。
【００４５】
いくつかの事例では、活性化していないＴ細胞とは対照的に、ＯＸ４０の発現がアップレギュレートされている活性化Ｔ細胞を標的とする。これらの活性化Ｔ細胞を標的とするために、ＡＤＲには、活性化Ｔ細胞を標的とすることができるように、ＯＸ４０のリガンドを利用することができるだろう。ＯＸ４０に対するリガンドがＡＤＲにおいて利用される事例において、ＯＸ４０に対するリガンドは、例えば少なくともＯＸ４０Ｌ、ＯＸ４０に結合する抗体（またはその機能的フラグメント）、ＦｃとＯＸ４０Ｌとの融合物、またはそれらの機能的誘導体もしくはフラグメントなど、ＯＸ４０に対する任意の適切なリガンドでありうる。ＯＸ４０Ｌは、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー４（ｔａｘ転写活性化糖タンパク質（ｔａｘ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）１、３４ｋＤａ）、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２５２、ＴＮＦＳＦ４、ＴＸＧＰ１、ＯＸ−４０Ｌ、またはｇｐ３４とも呼ばれる。
【００４６】
いくつかの事例では、活性化していないＴ細胞とは対照的に、４−１ＢＢの発現がアップレギュレートされている活性化Ｔ細胞を標的とする。これらの活性化Ｔ細胞を標的とするために、ＡＤＲには、活性化Ｔ細胞を標的とすることができるように、４−１ＢＢのリガンドを利用することができるだろう。４−１ＢＢに対するリガンドがＡＤＲにおいて利用される事例において、４−１ＢＢに対するリガンドは、例えば４−１ＢＢＬ、４−１ＢＢを標的とする抗体（またはその機能的フラグメント）、Ｆｃと４−１ＢＢＬとの融合物、またはそれらの機能的誘導体もしくはフラグメントなど、４−１ＢＢに対する任意の適切なリガンドでありうる。
【００４７】
特定の事例では、活性化していないＴ細胞とは対照的に、ＣＤ４０Ｌの発現がアップレギュレートされている活性化Ｔ細胞を標的とする。これらの活性化Ｔ細胞を標的とするために、ＡＤＲには、活性化Ｔ細胞を標的とすることができるように、ＣＤ４０Ｌに対する受容体を利用することができるだろう。ＣＤ４０Ｌに対する受容体がＡＤＲにおいて利用される事例において、ＡＤＲは、ＣＤ４０（これはＢｐ５０、ＣＤＷ４０、ＴＮＦＲＳＦ５、またはｐ５０と呼ぶこともできる）、ＣＤ４０Ｌを標的とする抗体（またはその機能的フラグメント）、またはそれらの機能的誘導体もしくはフラグメントを含みうる。
【００４８】
いくつかの事例において、ＡＤＲ分子は、活性化Ｔ細胞の標的化を促進するために、２つ以上の細胞外ドメインを含む。そのような組合せは、活性化Ｔ細胞全般の標的化を強化しうるか、活性化Ｔ細胞の特定のサブセットの特異的標的化を可能にしうる。例えばＡＤＲは、ＯＸ４０または４−１ＢＢのどちらか一方を発現する活性化Ｔ細胞の標的化を可能にするために、同じＡＤＲ分子中の細胞外ドメインとして、ＯＸ４０Ｌと４−１ＢＢＬの両方を含みうる。このような組合せの例は、ＯＸ４０または４−１ＢＢのどちらか一方を発現する活性化Ｔ細胞を、それらの活性化Ｔ細胞がＣＤ４０Ｌも発現するかどうかとは関わりなく、選択的に標的とするだろう。同様にＡＤＲは、ＣＤ４０ＬまたはＯＸ４０のどちらか一方を発現する活性化Ｔ細胞を、それらの活性化Ｔ細胞が４−１ＢＢも発現するかどうかとは関わりなく標的とするために、ＣＤ４０とＯＸ４０Ｌの両方を含みうる。
【００４９】
ＡＤＲ分子では、細胞外ドメインが、ＡＤＲ分子の一部である構成成分を含む、１つ以上の構成成分に作動的に連結されうる。そのような構成成分の一つは、Ｔ細胞活性化中に下流シグナリングを媒介するタンパク質でありうる。特定実施形態において、ＡＤＲは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ２４７、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ３Ｈ、ＣＤ３Ｑ、ＣＤ３Ｚ、ＩＭＤ２５、Ｔ３Ｚ、またはＴＣＲＺともいう）またはその機能的フラグメントもしくは誘導体を含む。ＣＤ３ゼータはＴ細胞活性化中に下流のＩＴＡＭ由来シグナリングを媒介する。他のＩＴＡＭ含有シグナリングドメインとしては、ＤＡＰ１２、Ｆｃ受容体、他のＣＤ３サブユニットなどに由来するものを挙げることができる。シグナリングドメインは、別のドメインを介して、ＡＤＲに非共有結合的に連結されていてもよい。
【００５０】
特定実施形態において、ＡＤＲは、ＣＤ３ゼータと活性化Ｔ細胞上でアップレギュレートされる１つ以上の化合物を標的とする細胞外タンパク質との間に、スペーサーを含む。他の事例では、スペーサーは利用されない。スペーサーは、ＡＤＲが有しうるどの機能に対しても不活性であるか、実質上ほとんどまたは全く寄与しない配列を含みうる。一方、他の事例では、スペーサーは、例えば、ＡＤＲの機能を強化し、かつ／またはＡＤＲを検出可能にすることおよび／もしくはＡＤＲを阻害の標的にすることを可能にする配列を含む。具体的実施形態において、スペーサーは、ＡＤＲを発現する細胞の検出を容易にするコード化されたタンパク質配列を含む。例えばスペーサーは、例えば抗Ｆｃ  Ａｂを使った細胞の表面検出を可能にするであろうＦｃ領域またはそのフラグメントをコードしうる。特定実施形態において、スペーサーは、例えばＩＩ型膜貫通タンパク質（４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ）とＩ型ＡＤＲバックボーン（ＴＭ、シグナリングドメイン）との連結によって引き起こされる潜在的な立体障害などを回避するために、リガンド結合ドメインと膜との間の分離を提供する。スペーサーは、一例として約１０〜２２０アミノ酸など、任意の適切な長さを有しうる。スペーサーの長さは、１０〜２２０、１０〜２００、１０〜１５０、１０〜１００、１０〜５０、２５〜２００、２５〜１５０、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜２００、５０〜１５０、５０〜１２５、５０〜１００、５０〜７５、７５〜２００、７５〜１５０、７５〜１００、１００〜２００、１００〜１７５、１００〜１５０、１００〜１２５、１２５〜２００、１２５〜１７５、１２５〜１５０、１５０〜２００、１５０〜１７５、１７５〜２００などの範囲にありうる。スペーサーは約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０または２２０アミノ酸長でありうる。他の事例では、スペーサーは１０アミノ酸未満または２００アミノ酸超である。
【００５１】
いくつかの事例において、ＡＤＲは、ＡＤＲを発現する細胞からのサイトカイン生産を強化する１つ、２つ、３つまたはそれ以上の共刺激ドメインを含む。共刺激ドメインは、例えばＣＤ２８、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ３０、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０などといった共刺激タンパク質の細胞内シグナリングドメインに由来しうる。一例に過ぎないが、ＡＤＲが４−１ＢＢＬを含む場合、ＡＤＲの共刺激ドメインは４−１ＢＢからのものであってもそうでなくてもよい。
【００５２】
いくつかの実施形態において、ＡＤＲは、ＡＤＲのＣＤ３ゼータ構成成分が細胞内に位置し、かつ活性化Ｔ細胞上でアップレギュレートされる１つ以上の化合物を標的とする細胞外ドメインが細胞外に位置することを可能にするものである限り、いかなる種類であってもよい膜貫通ドメインを含むだろう。別の例では、ＡＤＲが、活性化Ｔ細胞上のそれぞれのリガンドに結合し、ＴＣＲを架橋することによって細胞傷害性を増進することができる、可溶性タンパク質（例えばＡＤＲ−ＣＤ３  Ｔ細胞エンゲージャータンパク質）である。細胞外ドメインが膜貫通ドメインを有する表面タンパク質（例えばＣＤ４０）からのものである場合、ＡＤＲは、対応する内因性分子からの膜貫通ドメインを含みうる。ＡＤＲ分子が１つ以上の共刺激ドメインを含むいくつかの事例では、膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ；ＴＭ）は、その共刺激ドメインを有する同じ内因性分子からのものでありうる。ＴＭの例としては、ＣＤ３、ＣＤ８α、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ４などからのものが挙げられる。
【００５３】
ＡＤＲポリペプチドの一例において、構成成分は、Ｎ末端（Ｎ）からＣ末端（Ｃ）に向かって特定の順序をとりうる。一般的ＡＤＲの場合、受容体は以下のうちの１つ（一例に過ぎない）を含むことができ、ここで細胞外ドメインは活性化Ｔ細胞上の関連タンパク質に選択的に結合するタンパク質を含む：
Ｎ−細胞外ドメイン−シグナリングドメイン−Ｃ
Ｎ−細胞外ドメイン−ＣＤ３ゼータ−Ｃ
Ｎ−細胞外ドメイン−スペーサー−ＣＤ３ゼータ−Ｃ
Ｎ−細胞外ドメイン−スペーサー−共刺激ドメイン−ＣＤ３ゼータ−Ｃ
Ｎ−細胞外ドメイン−スペーサー−２つの共刺激ドメイン−ＣＤ３ゼータ−Ｃ
Ｎ−２つの細胞外ドメイン−スペーサー−共刺激ドメイン−ＣＤ３ゼータ−Ｃ
Ｎ−２つの細胞外ドメイン−スペーサー−２つの共刺激ドメイン−ＣＤ３ゼータ−Ｃ
【００５４】
どの事例においても、膜貫通ドメインはスペーサーに対してＣ末端側でありうる。Ｉ型膜貫通タンパク質バックボーン（例えば膜貫通ドメイン、シグナリングドメイン、ＣＤ３ゼータ）上のＩＩ型リガンド（例えばＯＸ４０Ｌおよび４−１ＢＢＬ）の発現を促進するために、Ｎ末端にシグナルペプチドを利用してもよい。
【００５５】
いくつかの事例において、ＡＤＲは１つ以上の検出可能マーカー、例えば比色用マーカー、蛍光マーカーおよび／または放射性マーカーなどを含む。例として緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質などが挙げられる。
【００５６】
ＡＤＲはタンパク質として合成的に生成させうるが、ＡＤＲはポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドによって発現されるポリペプチドの形態をとりうる。ＡＤＲポリヌクレオチドおよびＡＤＲポリペプチドを生産するための組換え技術は当技術分野では知られている。
【００５７】
特定の事例において、ＡＤＲポリヌクレオチドは、発現コンストラクト中にあるか、またはベクター上に存在する発現コンストラクトの一部であり、ベクターはウイルスベクターまたは非ウイルスベクターでありうる。非ウイルスベクターの例としてプラスミドが挙げられる。ウイルスベクターの例としては、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。ＡＤＲを発現するベクターはいずれも、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞などの免疫細胞を含む真核細胞における発現を可能にするために、適当な要素を有するだろう。それら適当な要素としてはプロモーターなどが挙げられる。
【００５８】
４−１ＢＢ  ＡＤＲ（配列番号１）
MEFGLSWLFLVAILKGVQCGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRTSAAAGGGGSGGGGSGGGGSMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFTYGVQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHKVYITADKQKNGIKVNFKTRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
【００５９】
ＯＸ４０  ＡＤＲ（配列番号２）
MEFGLSWLFLVAILKGVQCQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVLESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRTSAAAGGGGSGGGGSGGGGSMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFTYGVQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHKVYITADKQKNGIKVNFKTRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
【００６０】
ＣＤ４０Ｌ  ＡＤＲ（配列番号３）
MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRTSAAAGGGGSGGGGSGGGGSMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFTYGVQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHKVYITADKQKNGIKVNFKTRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
【００６１】
特定の実施形態において、活性化Ｔ細胞を標的とする細胞外ドメインは、抗体またはその機能的フラグメントもしくは誘導体を含む。本明細書において使用される「抗体」という用語は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体は、自然源または組換え源に由来するインタクトな免疫グロブリンであることができ、インタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分であることもできる。抗体は典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体など、さまざまな形態で存在しうる（Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）。
【００６２】
いくつかの事例において、ＡＤＲの細胞外ドメインは抗体フラグメントを含む。「抗体フラグメント」という用語は、インタクトな抗体の一部分を指し、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント、線状抗体、ｓｃＦｖ抗体、ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【００６３】
ＡＤＲには合成抗体が使用されうる。本明細書において使用される「合成抗体」という用語は、組換えＤＮＡ技術を使って生成される抗体、例えば本明細書に記載するようにバクテリオファージによって発現される抗体を指す。この用語は、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成させた抗体を意味し、そのＤＮＡ分子は抗体タンパク質をまたは抗体を指定するアミノ酸配列を発現し、そのＤＮＡ配列またはアミノ酸配列は、当技術分野において利用可能であり周知である合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使って得られたものであるとも解釈されるべきである。
【００６４】
（Ｂ．ＡＤＲを発現する細胞）
養子移入に使用される同種細胞は、レシピエント個体による免疫反応ゆえに、その効力が限定的になりがちである。いくつかの事例において、細胞には、例えば移植片対宿主病を防止するために、内因性ＴＣＲを（例えばＣＲＩＳＰＲを使って）除去するための改変を加えうるが、それに代えて、抗ウイルス活性を保つために、ウイルス特異的Ｔ細胞（インタクトな細胞またはＣＡＲ／ＴＣＲ改変された細胞）を利用することもでき、特定の病理学的状態ではそれが有用である。そのようなＶＳＴは、それらのＴＣＲがより強くウイルス抗原に制限されるので、その移植片対宿主活性は極めて限定的であるが、レシピエントによる有害反応は依然として受けやすい。
【００６５】
合成ＡＤＲ分子を発現するように改変されることによって同種使用のために改良された細胞は、本開示に包含される。したがって本開示には、ＡＤＲを、ポリヌクレオチドとして、また細胞の表面に発現されたＡＤＲポリペプチドとして、保持する細胞が含まれる。特定の事例では、既製品としての使用（ｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ  ｕｓｅ）のためにリポジトリにおいて維持されることを目的として、ＡＤＲ発現細胞が生産される。細胞は、既にＡＤＲを発現するように構成された状態でリポジトリに収容されてもよいし、バンクに収容されていて、リポジトリからの回復後に、ＡＤＲを発現するように構成させてもよい。ＡＤＲ分子を生成させるには特定の細胞、例えば細菌細胞を利用しうるが、ＡＤＲを保持する他の細胞、例えば真核細胞を活性化Ｔ細胞の標的化を含む本開示の方法に使用することができる。本明細書に示すとおり、ＡＤＲ発現免疫細胞は、活性化Ｔ細胞を選択的に排除し、ＡＤＲ発現免疫細胞は、アロ反応性Ｔ細胞による細胞溶解から保護される。
【００６６】
ＡＤＲ分子を発現する細胞はどんな種類であってもよいが、具体的実施形態では、それらは、ＡＤＲを発現するように改変されていて、それゆえに天然には見いだされない、免疫細胞、例えば免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、または該系統から派生した細胞株、もしくは細胞傷害活性を有するように工学的に操作された細胞株である。集団のうちの少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％がＡＤＲ発現細胞である集団を含めて、非天然ＡＤＲ発現細胞の集団が想定される。細胞は、一例として合成ＡＤＲポリヌクレオチドの標準的なトランスフェクションまたは形質導入方法の標準的な方法によって生成させうる。
【００６７】
いくつかの事例において、ＡＤＲ分子を発現するように改変されるＡＤＲ分子は、ＡＤＲ以外の別の工学的に操作された非天然分子を有するように既に工学的に操作されていてもよく、あるいは後から、ＡＤＲ以外の別の工学的に操作された非天然分子を有するように工学的に操作される。例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または工学的に操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞は、そうすることで、それらの細胞を宿主拒絶から保護し、それゆえにそれらの治療力価を増加させることができる。１つ以上のＣＡＲおよび／または１つ以上のＴＣＲを発現する細胞を、１つ以上のＡＤＲを発現するように工学的に操作してもよいし、１つ以上のＡＤＲを発現する細胞を、１つ以上のＣＡＲおよび／または１つ以上のＴＣＲを発現するように工学的に操作してもよい。したがって、いくつかの事例では、ＡＤＲが、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲとは異なるベクター上で発現され、別の事例では、ＡＤＲ分子が、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲと同じベクター上で発現される。ＡＤＲが（一例として）ＣＡＲと同じベクター上で発現される事例において、ＡＤＲ発現とＣＡＲ発現は同じまたは異なる調節要素からの指示を受けうる。どの事例においても、ＡＤＲとＣＡＲは、それらの間に２Ａなどの切断可能な要素を持つ、単一のポリペプチドとして発現されうる。
【００６８】
ＡＤＲ発現細胞がＣＡＲまたはＴＣＲも発現する事例において、ＣＡＲまたはＴＣＲは任意の特定抗原を標的としうる。ＣＡＲが使用される事例において、ＣＡＲは第１世代、第２世代、第３世代などでありうる。ＣＡＲは、具体的事例において、二重特異性でありうる。
【００６９】
いくつかの事例では、ＡＤＲ分子を発現する細胞が、例えば１つ以上の内因性分子の発現を欠くように工学的に操作されるなど、工学的に操作される。具体的事例では、細胞が、本来であれば細胞のきょうだい殺し（ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ）を促進するであろう１つ以上の内因性遺伝子の発現を欠くように、工学的に操作される。具体的事例では、ＡＤＲ分子を発現する細胞が、例えば４−１ＢＢまたはＯＸ４０の発現を欠くように、工学的に操作される。一例に過ぎないが、細胞の工学的操作はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって行いうる。
【００７０】
［ＩＩ．自己／同種免疫防御受容体を使用する方法］
本開示の実施形態には、任意の目的で、個体に有効量のＡＤＲ発現細胞を提供する方法が含まれる。方法には、任意の目的で、個体における活性化Ｔ細胞の選択的標的化を提供することが含まれる。活性化Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞を有効量のＡＤＲ発現免疫細胞、例えばＡＤＲ発現Ｔ細胞に曝露することによって、標的化される。そのような曝露は、例えば、その結果として生じる応用を、１つ以上有しうる。
【００７１】
いくつかの実施形態において、ＡＤＲは、活性化Ｔ細胞以外の活性化免疫細胞、例えば活性化Ｂ細胞を選択的に標的とするために使用され（これはループス、関節リウマチなどの場合のように無用なＢ細胞を制御するのに役立つだろう）、また自然免疫の活性化（例えばマクロファージ活性化症候群など）も標的とする。別の実施形態では、ＡＤＲが、例えば４−１ＢＢまたはＯＸ４０またはＣＤ４０Ｌなどといったそれぞれに対応する標的を発現する悪性細胞を、特異的に標的とするために利用される。
【００７２】
有効量のＡＤＲ発現細胞を個体に提供するためのレジメンは、治療もしくは防止のために、または使用方法とは無関係に、細胞を送達する人もしくは人々によって、知られているか、または決定されうる。例えば防止の場合、細胞は、１つ以上の症状の検出に先だって送達されるか、または１つ以上の症状を検出した後ではあるが、さらなる症状が発生および／または悪化する前に送達されうる。処置の場合、個体には、１つ、２つまたはそれ以上の症状が発生した後、そして場合によっては臨床的診断後に、有効量の細胞が提供されうる。
【００７３】
本方法の具体的態様において、個体には、治療有効量の細胞の単回投与を行うか、または治療有効量の細胞の複数回の送達、例えば１、２、３、４、５、６、７日、または１、２、３、もしくは４週、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ヶ月、または１、２、３、４、５年もしくはそれ以上、またはそれらの間の任意の範囲などの間隔での複数回の送達を行いうる。投与間の時間は単一のレジメン内でも変動しうる。
【００７４】
ＡＤＲ発現細胞の投与は、局所的投与または全身性投与を含めて、個体への任意の適切な経路によることができる。具体的実施形態において、ＡＤＲ発現細胞は、例えば静脈内送達、経口送達、経直腸送達、外用、筋肉内送達、注入によって送達、経腸送達、経鼻送達、吸入によって送達、舌下送達、バッカル送達、経皮送達、または皮下送達される。細胞は、ボーラスとして送達されてもよいし、そうでなくてもよい。複数回投与の場合、細胞は、異なる送達経路で個体に提供されてもよいし、そうでなくてもよい。細胞が個体に送達される場合、それらは薬学的に許容される担体または賦形剤に入れて送達されうる。ＡＤＲ発現細胞の用量に関する特定例としては、１０４細胞／ｍ２、１０５細胞／ｍ２、１０６細胞／ｍ２、１０７細胞／ｍ２、１０８細胞／ｍ２、１０９細胞／ｍ２、１０１０細胞／ｍ２、１０１１細胞／ｍ２、または１０１２細胞／ｍ２およびそれらの間の範囲が挙げられる。
【００７５】
（Ａ．既製品としての使用（ｕｓｅ  ｆｏｒ  ｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ）の実施形態）
本開示は、既製品としての利用が可能な、例えば細胞の最初の取得源となった個体とは異なる個体において使用する目的でリポジトリから取得することができる、養子移入用の細胞を包含する。細胞は、リポジトリに寄託される前に既にＡＤＲを発現していてもよいし、後でＡＤＲを発現するように改変されてもよい。細胞は、養子移入のためのどの種類の免疫エフェクター細胞であってもよい。リポジトリに寄託する前の細胞またはリポジトリから取得した後の細胞は、例えば腫瘍特異的受容体（例えばＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現するように改変されうる。
【００７６】
本明細書の他の項で示すように、ＡＤＲを発現する細胞は、休止Ｔ細胞を温存しつつ、活性化されたＴ細胞およびＮＫ細胞を選択的に標的とする。ＡＤＲは、インビトロでＴ細胞および／またはＮＫ細胞によって媒介される免疫拒絶から同種Ｔ細胞を保護すると共に、インビボでの免疫拒絶からＴ細胞を保護する。そうすることでＡＤＲは、工学的に操作された抗腫瘍受容体（一例としてＣＡＲ）の機能に干渉しない。ＡＤＲとＣＡＲを共発現するＴ細胞はインビトロで腫瘍と活性化Ｔ細胞をどちらも効率よく排除することができるからである。本開示はさらに、ＣＡＲとＡＤＲとを共発現する「既製の」Ｔ細胞を使用して、同じマウスに存在する同種Ｔ細胞からの免疫拒絶に対する抵抗性を保ちつつ、マウスモデルにおけるインビボでの抗がん活性を提供する。一例として、図１４では、４−１ＢＢ  ＡＤＲが４−１ＢＢ＋腫瘍細胞に対して有効であり、ＡＤＲを４−１ＢＢ発現悪性腫瘍に対する治療モダリティとして使用できることが示されている。
【００７７】
特定実施形態において、「既製の」治療用細胞は、免疫拒絶に抵抗するためにＡＤＲを発現し、内因性ＴＣＲ特異性（例えばウイルス抗原または腫瘍抗原に対する特異性）を保っているか、または内因性ＴＣＲが工学的に操作された抗腫瘍受容体、例えば１つ以上のＣＡＲおよび／または１つ以上の組換えＴＣＲで置き換えられている。
【００７８】
具体的実施形態において、既製の細胞はリポジトリに収容され、リポジトリへの寄託前または寄託後に、具体的目的のための改変を受けうる。例えばＡＤＲ発現Ｔ細胞は、リポジトリに収容され、例えば組織移植後または臓器移植後に移植片拒絶を防止するために、すぐ使える状態にありうる。ＡＤＲ発現Ｔ細胞はリポジトリに収容され、例えばウイルス感染またはがんに対抗するために、選択されるか、またはネイティブＴＣＲもしくはトランスジェニックＴＣＲで工学的に操作されうる。ＡＤＲ発現Ｔ細胞はリポジトリに収容され、がんまたは病原性感染に向けられたＣＡＲの形質導入を受けうる。ＡＤＲ発現細胞はリポジトリに収容され、患者の具体的腫瘍によって発現される具体的ながん関連抗原またはネオ抗原に向けられた１つ以上のＣＡＲおよび／または１つ以上のＴＣＲの形質導入を受けうる。
【００７９】
いくつかの事例では、特にＡＤＲ発現細胞そのものがアロ反応性ではない場合に、宿主の拒絶免疫細胞を破壊することによって固形臓器移植の拒絶を防止するためにバンクに預けられた同種細胞が利用される。
【００８０】
リポジトリに収容される細胞はレシピエント個体に関して同種でありうるが、代替的実施形態では、リポジトリに収容される細胞がレシピエント個体にとって自家である。例えば、がんを持つ個体は、後に、例えばがんが寛解状態を脱した場合などに使用するために、リポジトリに寄託されたＡＤＲ発現Ｔ細胞を有しうる。他の事例では、自家ＡＤＲ発現細胞が、自己免疫障害を処置するためにリポジトリに収容される。
【００８１】
（Ｂ．自己免疫障害における使用）
個体における内因性自己反応性Ｔ細胞の無用な活性化は、例えば真性糖尿病、自己免疫性大腸炎および多発性硬化症など、その個体にとって壊滅的な自己免疫疾患につながりうる。特定実施形態では、個体における内因性自己反応性Ｔ細胞を阻害することによって自己免疫障害（またはその潜在的発生）に影響を及ぼすＡＤＲ発現免疫細胞を個体において使用することにより、１つ以上の自己免疫障害が防止または処置される。具体的実施形態において、そのようなＡＤＲ発現細胞の使用は、個体において、休止状態にある非病原性のナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞を温存する。したがって本開示の特定の方法では、ＡＤＲを発現するように改変された特定細胞を利用し、その特定細胞は、病原性Ｔ細胞を含む活性化Ｔ細胞を標的とし、それによって活性化Ｔ細胞の破壊を開始させるのに十分な量で、個体に提供される。
【００８２】
無用な特異性を持つＴ細胞のインビボ活性化は病原性の原因となる場合があり、特定実施形態において、１つ以上のＡＤＲを発現する細胞は、活性化Ｔ細胞を標的とする。いくつかの事例において、ＡＤＲ発現細胞は、活性化Ｔ細胞のサブセットである病原性細胞を標的とする。
【００８３】
特定の事例では、活性化Ｔ細胞によって推進される生命を脅かす衰弱状態（例えば臓器拒絶、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、自己免疫性大腸炎、ループス、関節リウマチなど）をＡＤＲ発現Ｔ細胞の養子Ｔ細胞移入を使って、防止または反転させるために、ＡＤＲ発現Ｔ細胞を使用することができる。
【００８４】
いくつかの事例において、ＡＤＲ発現Ｔ細胞は、１つ以上の自己免疫障害の処置または防止を促進するＡＤＲ以外の組成物も１つ以上含む。
【００８５】
いくつかの事例において、ＡＤＲ発現Ｔ細胞を提供される個体には、１つ以上の自己免疫障害を防止または処置するために、１つ以上の追加治療が与えられる。個体には、１つ以上の免疫抑制薬、例えばグルココルチコイド、細胞分裂阻害薬、抗体および／またはイムノフィリンに作用する薬物などを与えてもよく、与えなくてもよい。上記に加えて、または上記に代えて、個体には１つ以上の適当なワクチンを与えてもよい。
【００８６】
いくつかの事例において、個体には自己免疫障害のリスクがあり、自己免疫障害の発症を防止するために、あるいは発症を遅延させかつ／または例えば重症度および／もしくは持続時間などといった１つ以上の症状を和らげるために、有効量のＡＤＲ発現細胞が提供される。自己免疫障害のリスクがある個体とは、例えば、個人歴または家族歴を有する者、特定の民族の女性などである。個体は、ある自己免疫障害を有していてよく、いくつかの事例では、別の自己免疫障害を防止し、または重症度および／もしくは持続時間を低減し、またはその発症を遅延させることを望んでいる。
【００８７】
ＡＤＲ発現細胞で防止または処置されうる自己免疫障害の例として、少なくとも以下が挙げられる：アカラシア；アジソン病；成人スティル病；無ガンマグロブリン血症；円形脱毛症；アミロイドーシス；強直性脊柱炎；抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎；抗リン脂質症候群；自己免疫性血管性浮腫；自己免疫性自律神経障害；自己免疫性脳脊髄炎；自己免疫性肝炎；自己免疫性内耳疾患（Autoimmune inner ear disease：ＡＩＥＤ）；自己免疫性心筋炎；自己免疫性卵巣炎；自己免疫性睾丸炎；自己免疫性膵炎；自己免疫性網膜症；自己免疫性じんま疹；軸索性およびニューロン性ニューロパチー（Axonal&neuronal neuropathy：ＡＭＡＮ）；バロー病；ベーチェット病；良性粘膜類天疱瘡；水疱性類天疱瘡；キャッスルマン病（Castleman disease：ＣＤ）；セリアック病；シャーガス病；慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy：ＣＩＤＰ）；慢性再発性多巣性骨髄炎（Chronic recurrent multifocal osteomyelitis：ＣＲＭＯ）；チャーグ・ストラウス症候群（Churg-Strauss Syndrome：ＣＳＳ）または好酸球性肉芽腫症（Eosinophilic Granulomatosis：ＥＧＰＡ）；瘢痕性類天疱瘡；コーガン症候群；寒冷凝集素症；先天性心ブロック；コクサッキー心筋炎；クレスト症候群；クローン病；疱疹状皮膚炎；皮膚筋炎；デビック病（視神経脊髄炎）；円板状ループス；ドレスラー症候群；子宮内膜症；好酸球性食道炎（Eosinophilic esophagitis：ＥｏＥ）；好酸球性筋膜炎；結節性紅斑；本態性混合クリオグロブリン血症；エバンス症候群；線維筋痛症；線維化性肺胞炎；巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）；巨細胞性心筋炎；糸球体腎炎；グッドパスチャー症候群；多発血管炎性肉芽腫症；グレーブス病；ギラン・バレー症候群；橋本甲状腺炎；溶血性貧血；ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（Henoch-Schonlein purpura：ＨＳＰ）；妊娠性疱疹または妊娠性類天疱瘡（pemphigoid gestationis：ＰＧ）；化膿性汗腺炎（Hidradenitis Suppurativa：ＨＳ）（反対型ざ瘡）；低ガンマグロブリン血症；ＩｇＡ腎症；ＩｇＧ４関連硬化性疾患；免疫性血小板減少性紫斑病（Immune thrombocytopenic purpura：ＩＴＰ）；封入体筋炎（Inclusion body myositis：ＩＢＭ）；間質性膀胱炎（Interstitial cystitis：ＩＣ）；若年性関節炎；若年性糖尿病（１型糖尿病）；若年性筋炎（Juvenile myositis：ＪＭ）；川崎病；ランバート・イートン症候群；白血球破壊性血管炎；扁平苔癬；硬化性苔癬；木質制結膜炎；線状ＩｇＡ病（Linear IgA disease：ＬＡＤ）；ループス；慢性ライム病；メニエール病；顕微鏡的多発血管炎（Microscopic polyangiitis：ＭＰＡ）；混合結合組織病（Mixed connective tissue disease：ＭＣＴＤ）；モーレン潰瘍；ムッハ・ハーベルマン病；多巣性運動ニューロパチー（Multifocal Motor Neuropathy：ＭＭＮ）またはＭＭＮＣＢ；多発性硬化症；重症筋無力症；筋炎；ナルコレプシー；新生児ループス；視神経脊髄炎；好中球減少症；眼瘢痕性類天疱瘡；視神経炎；回帰性リウマチ（Palindromic rheumatism：ＰＲ）；ＰＡＮＤＡＳ；腫瘍随伴性小脳変性症（Paraneoplastic cerebellar degeneration：ＰＣＤ）；発作性夜間ヘモグロビン尿症（Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria：ＰＮＨ）；パリー・ロンベルク症候群；毛様体扁平部炎（周辺部ぶどう膜炎）；パーソネージ・ターナー症候群（Parsonnage-Turner syndrome）；天疱瘡；末梢性ニューロパチー；静脈周囲性脳脊髄炎；悪性貧血（Pernicious anemia：ＰＡ）；ＰＯＥＭＳ症候群；結節性多発動脈炎；多腺性症候群Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型；リウマチ性多発筋痛症；多発性筋炎；心筋梗塞後症候群；心膜切開後症候群；原発性胆汁性肝硬変；原発性硬化性胆管炎；プロゲステロン皮膚炎；乾癬；乾癬性関節炎；赤芽球癆（Pure red cell aplasia：ＰＲＣＡ）；壊疽性膿皮症；レイノー現象；反応性関節炎；反射性交感神経性ジストロフィー；再発性多発軟骨炎；下肢静止不能症候群（Restless legs syndrome：ＲＬＳ）；後腹膜線維症；リウマチ熱；関節リウマチ；サルコイドーシス；シュミット症候群；強膜炎；強皮症；シェーグレン症候群；精子精巣自己免疫（Sperm&testicular autoimmunity）；全身硬直症候群（Stiff person syndrome：ＳＰＳ）；亜急性細菌性心内膜炎（Subacute bacterial endocarditis：ＳＢＥ）；スザック症候群；交感性眼炎（Sympathetic ophthalmia：ＳＯ）；高安動脈炎；側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎；血小板減少性紫斑病（Thrombocytopenic purpura：ＴＴＰ）；トローザ・ハント症候群（Ｔｏｌｏｓａ−Ｈｕｎｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＴＨＳ）；横断性脊髄炎；１型糖尿病；潰瘍性大腸炎（Ulcerative colitis：ＵＣ）；未分化結合組織疾患（Undifferentiated connective tissue disease：ＵＣＴＤ）；ぶどう膜炎；血管炎；白斑；フォークト・小柳・原田病；およびウェゲナー肉芽腫症（または多発血管炎性肉芽腫症（Granulomatosis with Polyangiitis：ＧＰＡ））。
【００８８】
（Ｃ．ＮＫ細胞を排除するための使用）
ＡＤＲ発現免疫細胞は、ＮＫ細胞を排除することが望ましい事例において、ＮＫ細胞を排除するために利用しうる。本明細書において実証されるように、特定の免疫細胞上のＡＤＲの存在は、ＨＬＡｌｏｗ細胞またはＨＬＡ不適合細胞の迅速な拒絶の媒介に関与するＮＫ細胞に対する特異的細胞傷害活性をもたらす。したがって、例えば特定の個体への同種細胞の養子移入を利用することができるようにＨＬＡｌｏｗ細胞またはＨＬＡ不適合細胞を維持することが望ましい状況では、ＡＤＲ発現細胞の使用により、ＮＫ細胞の活性化およびＨＬＡ不適合細胞の拒絶が回避される。具体的には、本明細書において示されるように、ＡＤＲを発現するＴ細胞の共培養は、ＮＫ細胞の排除につながり、したがってＡＤＲ発現同種Ｔ細胞のＮＫ細胞媒介性宿主拒絶を相殺する。
【００８９】
（Ｄ．同種細胞／組織／臓器移植の生着を促進するための使用）
アロ反応性Ｔ細胞の活性化回避の具体的一態様では、主としてレシピエントからのアロ反応性Ｔ細胞の集団によって媒介される、移植を受けている個体における同種細胞、同種組織または同種臓器の拒絶を回避しうる。レシピエントのアロ反応性Ｔ細胞の活性化は、そのような拒絶を回避するための措置を講じなければ、例えば生着不全につながるだろう。それゆえに、特定実施形態において、細胞、組織または臓器を個体に移植する方法では、細胞、組織または臓器のそれぞれの移植前、移植中および／または移植後に、有効量のＡＤＲ発現細胞の送達を利用する。いくつかの事例において、ＡＤＲ発現細胞それ自体は、移植の対象である各細胞、組織または臓器の一部ではないが、他の事例では、ＡＤＲ発現細胞が各細胞、組織または臓器の一部である。
【００９０】
移植用の組織は、例えば少なくとも皮膚、角膜、骨、腱、心臓弁、静脈、または動脈など、どの種類であってもよい。移植用の臓器は、例えば心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、腸、および胸腺など、どの種類であってもよい。
【００９１】
特定実施形態において、ＡＤＲ発現細胞は、以下の二面的アプローチとして、個体における同種細胞の使用を強化する：（１）個体における内因性アロ反応性Ｔ細胞を阻害する、および（２）個体におけるＮＫ細胞媒介性拒絶を抑制する。したがってＡＤＲ分子は、個体において、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ−Ｔ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞（mucosal associated invariant T cell：ＭＡＩＴ）および他の細胞傷害性細胞などといった同種治療用細胞、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、トランスジェニックＴＣＲなどの工学的に操作されたコンストラクトを発現するものを含めて、あらゆるタイプの第三者由来の治療用細胞の個体における存続および活性を強化することができる。
【００９２】
（Ｅ．同種細胞／組織／臓器移植中の移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の予防または処置における使用）
アロ反応性Ｔ細胞の活性化を回避するもう一つの具体的態様では、同種細胞、同種組織または同種臓器の移植を受けている個体における、生命を脅かす同種免疫反応を回避しうる。そのような移植物は、ドナーアロ反応性Ｔ細胞を含有し、それらドナーアロ反応性Ｔ細胞は、それらの活性化を回避するための措置を講じなければ、例えば移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の発生を誘発するだろう。それゆえに、特定実施形態において、細胞、組織または臓器を個体に移植する方法では、細胞、組織または臓器のそれぞれの移植前、移植中および／または移植後に、有効量のＡＤＲ発現細胞の送達を利用する。いくつかの事例において、ＡＤＲ発現細胞それ自体は、移植の対象である各細胞、組織または臓器の一部ではないが、他の事例では、ＡＤＲ発現細胞が各細胞、組織または臓器の一部である。
【００９３】
移植用の組織は、例えば少なくとも皮膚、角膜、骨、腱、心臓弁、静脈、または動脈など、どの種類であってもよい。移植用の臓器は、例えば心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、腸、および胸腺など、どの種類であってもよい。
【００９４】
（ＩＩＩ．ＡＤＲ発現細胞の生産）
ＡＤＲ分子を発現する細胞は、いずれも当技術分野では常法でありうるさまざまな方法で生産されうる。生産方法は、ＡＤＲ分子を発現するように改変される細胞を取得することを含みうる。また、生産方法はＡＤＲ分子の生成も含みうる。
【００９５】
（Ａ．Ｔ細胞の供給源）
本開示のＡＤＲ発現Ｔ細胞の増殖および遺伝子改変に先だって、Ｔ細胞の供給源を対象から取得しうる。そのような取得工程は、本方法の一部であってもよいし、本方法の一部でなくてもよい。いくつかの事例において、改変されるＴ細胞の取得とそれらの操作は、ＡＤＲ発現Ｔ細胞を個体に提供する団体とは異なる団体によって行われうる。Ｔ細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む、いくつかの供給源から取得することができる。本開示の特定の実施形態では、当技術分野において利用可能な多くのＴ細胞株を使用しうる。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、対象から収集された１単位の血液から、当技術分野において知られる多くの技法、例えばＦｉｃｏｌｌ（商標）分離を使って取得することができる。一実施形態において、個体の循環血からの細胞はアフェレーシスによって取得される。アフェレーシス産物は、典型的には、例えば、Ｔ細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含有する。一実施形態において、アフェレーシスによって収集された細胞は、血漿画分を除去し、後続の処理工程のために細胞を適当な緩衝液または培地に入れるために、洗浄されうる。一実施形態において、細胞はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替的実施形態において、洗浄溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠いてもよく、またはすべてではないにしても多くの二価カチオンを欠きうる。当技術分野における通常の技能を有する者にはすぐに理解されるであろうが、洗浄工程は、当業者に知られる方法によって、例えば半自動「フロースルー」遠心機（例えばＣｏｂｅ  ２９９１細胞処理装置、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５）を製造者の説明書に従って使用することによって、達成されうる。洗浄後は、細胞を、例えばＣａ２＋非含有Ｍｇ２＋非含有ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ、または緩衝剤を含むもしくは緩衝剤を含まない他の食塩溶液など、さまざまな生体適合性緩衝液に再懸濁しうる。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない構成成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁してもよい。
【００９６】
別の一実施形態では、Ｔ細胞が末梢血リンパ球から、赤血球を溶解し、単球を、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配での遠心分離によって、または対向流遠心エルトリエーションによって、枯渇させることにより、単離される。Ｔ細胞の具体的亜集団、例えばＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を、ポジティブセレクション法またはネガティブセレクション法によってさらに単離することができる。
【００９７】
ネガティブセレクションによるＴ細胞集団の濃縮は、ネガティブセレクションされる細胞にユニークな表面マーカーに向けられた抗体の組合せを使って達成することができる。一方法は、ネガティブセレクションされる細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用するネガティブ磁気免疫接着またはネガティブフローサイトメトリーによる細胞選別および／または細胞選択である。例えば、ネガティブセレクションによってＣＤ４＋細胞を濃縮するには、モノクローナル抗体のカクテルが、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。特定の実施形態では、典型的にはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、およびＦｏｘＰ３＋を発現する制御性Ｔ細胞を濃縮またはポジティブセレクションすることが望ましいだろう。あるいは、特定の実施形態では、抗Ｃ２５コンジュゲートビーズまたは他の類似する選択方法によって、制御性Ｔ細胞を枯渇させる。
【００９８】
ポジティブまたはネガティブセレクションによる所望の細胞集団の単離に関して、細胞の濃度および表面（例えばビーズなどの粒子）はさまざまであることができる。特定の実施形態では、細胞とビーズとの最大限の接触を保証するために、ビーズと細胞を一つに混合する体積は著しく減少させる（すなわち細胞の濃度を増加させる）ことが望ましいだろう。例えば一実施形態では、２０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。一実施形態では、１０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。さらなる一実施形態では、１億細胞超／ｍｌが使用される。さらなる一実施形態では、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。さらにもう一つの実施形態では、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。さらなる実施形態では、１億２５００万または１億５０００万細胞／ｍｌの濃度を使用することができる。高濃度の使用は、増加した細胞収量、細胞活性化および細胞増殖をもたらすことができる。別の一実施形態では、低い細胞濃度を使用することが望ましい場合もありうる。Ｔ細胞と表面（例えばビーズなどの粒子）の混合物を著しく希釈することにより、粒子と細胞の間の相互作用が最小限に抑えられる。
【００９９】
刺激用のＴ細胞を洗浄工程後に凍結することもできる。理論に束縛されることは望まないが、凍結とそれに続く融解の工程は、細胞集団中の顆粒球を除去し、単球もある程度は除去することにより、より一様な産物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄工程後に、細胞を凍結溶液に懸濁しうる。多くの凍結溶液および凍結パラメータが当技術分野では知られている。特定の実施形態では、凍結保存細胞を本明細書に記載するように融解、洗浄し、本発明の方法を使った活性化の前に、室温で１時間休止させる。
【０１００】
本明細書に記載する増殖した細胞が必要になるかもしれない時点に先だつ期間に対象から血液試料またはアフェレーシス産物を収集することも、本開示との関連において想定される。このように、増殖させる細胞の供給源は、任意の必要な時点で収集することができ、所望の細胞、例えばＴ細胞を単離して、後に、Ｔ細胞治療が有益であるだろう多くの疾患または状態、例えば本明細書に記載するもののＴ細胞治療において使用するために、凍結することができる。一実施形態において、血液試料またはアフェレーシスは、総じて健常な対象から採取される。特定の実施形態において、血液試料またはアフェレーシスは、疾患を発生させるリスクはあるがまだ疾患を発生させていない総じて健常な対象から採取され、関心対象の細胞が単離され、後で使用するために凍結される。特定の実施形態では、Ｔ細胞を増殖させ、凍結し、後で使用しうる。特定の実施形態では、本明細書に記載する特定疾患の診断後まもなく、ただしあらゆる処置の前に、試料が患者から収集される。さらなる一実施形態において、細胞は、例えば限定するわけではないが、ナタリズマブ、エファリズマブなどの作用物質、抗ウイルス剤、化学治療、放射線、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸およびＦＫ５０６、抗体、または他の免疫アブレーション剤、例えばＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、サイトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、および放射線照射などによる処置など、多くの関連処置モダリティに先だって、対象からの血液試料またはアフェレーシスから単離される。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼであるカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）、成長因子誘導性シグナリングにとって重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Liu et al, Cell 66:807-815, 1991、Henderson et al, Immun. 73:316-321, 1991、Bierer et al, Curr.Opin.Immun. 5:763-773, 1993）。さらなる一実施形態では、細胞が患者のために単離され、後に、骨髄移植もしくは幹細胞移植、あるいはフルダラビンなどの化学治療剤、外部ビーム放射線治療（external-beam radiation therapy：ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体を使ったＴ細胞アブレーション治療と一緒に（例えば事前に、同時に、または事後に）使用するために、凍結される。別の一実施形態では、細胞を事前に単離し、後に、ＣＤ２０と反応する作用物質、例えばリツキサンなどのＢ細胞アブレーション治療に続く処置に使用するために、凍結することができる。
【０１０１】
（Ｂ．Ｔ細胞の活性化および増殖）
ＡＤＲを発現させるためのＴ細胞の遺伝子改変の前であれ後であれ、Ｔ細胞は、一般に例えば米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載の方法を使って、活性化し、増殖させることができる。一般的には、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する作用物質とＴ細胞表面上の共刺激分子を刺激するリガンドとが取り付けられている表面との接触によって、本開示のＴ細胞を増殖させる。そのようなプロセスは当技術分野では知られている。別の例では、事前の活性化なしでＡＤＲを発現するように、Ｔ細胞を改変することができる。
【０１０２】
（Ｃ．ＡＤＲ分子の生成）
次に、ＡＤＲをコードするポリヌクレオチドについて概説すると、ＡＤＲ分子をコードする核酸配列は、当技術分野で知られる組換え法を使って、例えば当該遺伝子を発現する細胞からのライブラリーをスクリーニングすることによって、または当該遺伝子を含むことが知られているベクターから当該遺伝子を取り出すことによって、またはそれを含有する細胞および組織から標準的技法を使って直接単離することによって、取得することができる。あるいは、関心対象のＡＤＲポリヌクレオチドを、クローニングするのではなく、合成的に生産することもできる。
【０１０３】
手短に要約すると、ＡＤＲをコードする合成ポリヌクレオチドの発現は、典型的には、ＡＤＲポリペプチドまたはその一部分をコードする核酸をプロモーターに作動的に連結し、そのコンストラクトを発現ベクターに組み込むことによって達成される。ベクターは真核生物における複製および組込みに適しうる。典型的クローニングベクターは、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、開始配列、ならびに所望の核酸配列の発現を調節するのに役立つプロモーターを含有する。
【０１０４】
ＡＤＲポリヌクレオチドは、いくつかのタイプのベクターにクローニングすることができる。例えば、限定するわけではないがプラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドなどのベクターに、核酸をクローニングすることができる。特に興味深いベクターとして、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、およびシークエンシングベクターが挙げられる。
【０１０５】
さらに、発現ベクターはウイルスベクターの形態で細胞に提供されうる。ウイルスベクター技術は当技術分野において周知であり、例えばSambrook et al.（2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York）ならびに他のウイルス学および分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。一般に、適切なベクターは、少なくとも１種の生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つ以上の選択可能マーカーを含有する（例えばＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；および米国特許第６，３２６，１９３号）。
【０１０６】
哺乳動物細胞への遺伝子移入のためにウイルスベースの系がいくつか開発されている。例えば、レトロウイルスは遺伝子送達系のための便利なプラットホームになる。選択された遺伝子を、当技術分野において知られている技法を使って、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次に、組換えウイルスを単離し、インビボまたはエクスビボのいずれかで対象の細胞に送達することができる。当技術分野ではレトロウイルス系がいくつか知られている。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。当技術分野ではアデノウイルスベクターがいくつか知られている。一実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。
【０１０７】
追加のプロモーター要素、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位から３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、いくつかのプロモーターは開始部位の下流にも機能的要素を含有することが最近になって明らかにされている。プロモーター要素間の間隔は融通が利く場合が多いので、各要素を互いに逆にするか移動させても、プロモーター機能は維持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、５０ｂｐまではプロモーター要素間の間隔を増やしても、活性の低下は始まらない。プロモーターによって、個々の要素は協調してまたは独立して機能することにより、転写を活性化できるようである。
【０１０８】
適切なプロモーターの一例は前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、そこに作動的に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルな発現を駆動することができる強い構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の一例は、伸長成長因子（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）−１アルファ（ＥＦ−１アルファ）である。しかし、限定するわけではないが、例えばシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バー・ウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えば限定するわけではないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよびクレアチンキナーゼプロモーターなどといった、他の構成的プロモーター配列も使用しうる。さらに本発明は構成的プロモーターの使用に限定されるものではない。誘導性プロモーターは本発明の一部として想定される。誘導性プロモーターの使用は、それが作動的に連結されているポリヌクレオチド配列の発現を、そのような発現が望ましい場合にはオンにし、発現が望ましくない場合には発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１０９】
ＡＤＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、トランスフェクションまたはウイルスベクターによる感染に付そうとする細胞の集団からの発現細胞の同定および選択を促進するために、選択可能マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子またはその両方も含有することができる。別の態様では、選択可能マーカーを別個のＤＮＡ断片上に乗せて、それを共トランスフェクション手順において使用してもよい。選択可能マーカーにもレポーター遺伝子にも、宿主細胞における発現を可能にするための適当な調節配列が隣接しうる。有用な選択可能マーカーとしては、例えばｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【０１１０】
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞を同定するため、および調節配列の機能性を評価するために、使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物またはレシピエント組織には存在しないかレシピエント生物またはレシピエント組織によって発現されず、しかも何らかの容易に検出できる特性、例えば酵素活性によって、その発現が顕在化されうるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡをレシピエント細胞中に導入した後、適切な時点でアッセイされる。適切なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼもしくは分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子または緑色蛍光タンパク質遺伝子を挙げることができる（例えばUi-Tei et al.,2000 FEBS Letters 479:79-82）。適切な発現系は周知であり、既知の技法を使って調製するか、商業的に入手しうる。一般に、最も高レベルのレポーター遺伝子発現を示す最小の５’隣接領域を持つコンストラクトが、プロモーターと同定される。そのようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され、プロモーターが駆動する転写を調整する能力について作用物質を評価するために使用されうる。
【０１１１】
ＡＤＲポリヌクレオチドを細胞中に導入してそこで発現させる方法は当技術分野では知られている。発現ベクターの場合は、ベクターを、当技術分野における任意の方法によって、宿主細胞、例えば哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞または昆虫細胞中に、容易に導入することができる。例えば発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的手段によって宿主細胞中に移入することができる。
【０１１２】
ＡＤＲポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション、パーティクルボンバードメント、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を生産するための方法は当技術分野において周知である。例えばSambrook et al.（2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York）を参照されたい。宿主細胞中にポリヌクレオチドを導入するための一方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
【０１１３】
関心対象のＡＤＲポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入するための生物学的方法としてはＤＮＡベクターおよびＲＮＡベクターが挙げられる。ウイルスベクター、とりわけレトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞中に遺伝子を挿入するために最も広く使用される方法になっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来することができる。例えば米国特許第５，３５０，６７４号および同第５，５８５，３６２号参照。
【０１１４】
宿主細胞中にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段としては、コロイド分散系、例えば高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および脂質ベースの系、例えば水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソームが挙げられる。インビトロおよびインビボで送達媒体として使用される例示的コロイド系は、リポソーム（例えば人工膜小胞）である。
【０１１５】
非ウイルス送達系を利用する事例において、例示的送達媒体はリポソームである。宿主細胞中に（インビトロ、エクスビボまたはインビボで）核酸を導入するための脂質製剤の使用が想定される。別の一態様では、核酸を脂質と会合させてもよい。脂質と会合した核酸は、リポソームの水性内部に封入されているか、リポソームの脂質二重層内に散在しているか、リポソームとオリゴヌクレオチドとの両方と会合する連結分子によってリポソームに取り付けられているか、リポソームに捕捉されているか、リポソームとの複合体を形成しているか、脂質を含有する溶液に分散しているか、脂質と混合されているか、脂質と組み合わされているか、脂質に懸濁物質として含有されているか、ミセルと共に含有されているか、ミセルとの複合体を形成しているか、または他の形で脂質と会合していてよい。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター会合組成物は、溶解状態にあるどの特定構造にも限定されない。例えばそれらは、ミセルとして存在するか、または「崩壊した（collapsed）」構造を有する二重層構造で存在しうる。それらは、溶液中に単に散在していて、場合によってはサイズまたは形状が一様でない集合体を形成していてもよい。脂質は、脂肪状の物質であって、天然脂質であっても合成脂質であってもよい。例えば脂質には、細胞質中に天然に存在する脂肪滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体、例えば脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドを含有する化合物クラスが含まれる。
【０１１６】
使用に適した脂質は、商業的供給源から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）から入手することができ、ジセチルホスフェート（「ＤＣＰ」）はＫ＆Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ニューヨーク州プレーンビュー）から入手することができ、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから入手することができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質はＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（アラバマ州バーミングハム）から入手しうる。クロロホルム中またはクロロホルム／メタノール中の脂質の保存溶液は約−２０℃で貯蔵することができる。クロロホルムはメタノールより容易に蒸発するので、クロロホルムが唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は閉じた脂質二重層または脂質集合体の生成によって形成されるさまざまなシングルラメラおよびマルチラメラ脂質媒体を包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重層膜と内側の水性媒質とによる小胞構造を有すると特徴づけることができる。マルチラメラリポソームは水性媒質によって隔てられた複数の脂質層を有する。それらはリン脂質を過剰の水性溶液に懸濁すると自発的に形成される。脂質構成成分は、閉じた構造を形成する前に自己再配置を起こし、脂質二重層の間に水と溶解した溶質とを捕捉する（Ghosh et al.,1991 Glycobiology 5:505-10）。ただし、通常の小胞構造とは異なる溶解状態の構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質はミセル構造をとるか、単に一様でない脂質分子の集合体として存在しうる。リポフェクタミン−核酸複合体も想定される。
【０１１７】
いくつかの例では、ＡＤＲ分子が細胞の内因性核酸中に組み込まれうる。コンストラクトが特定の座位に組み込まれることが望まれる場合は、相同組換えのための標的部位を用意しうる。例えば、相同組換えに関して当技術分野において知られている材料および方法を使って、内因性遺伝子をノックアウトし、それを（同じ遺伝子座または他のどこかにおいて）、コンストラクトがコードしている遺伝子で置き換えることができる。相同組換えには、オメガ（ＯＭＥＧＡ）ベクターまたはＯ−ベクターのどちらかを使用しうる。相同組換えを促進するためにゲノム中の特異的部位を標的とし切断するには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、および他の部位特異的ヌクレアーゼを使用しうる。
【０１１８】
ＡＤＲ発現コンストラクトを含むように工学的に操作されている例示的Ｔ細胞は、選択的条件下での培養で成長させ、次に、コンストラクトを有するものとして選択された細胞を増殖させ、例えば宿主細胞におけるコンストラクトの存在を決定するためのポリメラーゼ連鎖反応などを使って、さらに分析しうる。工学的に操作された宿主細胞が同定されたら、次にそれらを計画したとおりに使用することができ、例えば培養下に増殖させ、宿主生物に導入しうる。
【０１１９】
細胞の性質に応じて、細胞は、多種多様な方法で、宿主生物、例えば哺乳動物に導入しうる。具体的態様では、細胞を腫瘍部位に導入しうるが、代替的実施形態では、細胞ががんにホーミングするか、または感染組織にホーミングするように細胞が改変される。使用される細胞の数はいくつかの状況、導入の目的、細胞の寿命、使用されるプロトコール、例えば投与回数、細胞の倍加能力、組換えコンストラクトの安定性などに依存するだろう。細胞は分散系として適用することができ、一般的には、目的の部位またはその近傍に注入される。細胞は生理学的に許容される培地中に存在しうる。
【０１２０】
ＤＮＡの導入が組込みをもたらすことはすべての事例で必要なわけではない。状況によっては、導入されたＤＮＡの一過性の維持で十分でありうる。こうすることで短期効果を得ることができ、細胞が宿主に導入された後、予め決定された時間後に、例えば細胞が特定部位にホーミングすることができた後に、細胞をオンにすることができるだろう。
【実施例】
【０１２１】
本開示の特定実施形態をより詳しく例示するために、以下の実施例を提示する。ただし、決して、これらが幅広い本開示の範囲を限定すると見なしてはならない。
【０１２２】
［実施例１  病原性Ｔ細胞の選択的標的化のための自己／同種免疫防御受容体］
本明細書には、正常Ｔ細胞上に発現させた自己／同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）を使って病原性Ｔ細胞を特異的に標的とするための、新規アプローチが開示される。ＡＤＲ発現Ｔ細胞は活性化Ｔ細胞だけを見つけて排除し、循環リンパ球の大半を構成する休止状態で非病原性のナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞は温存する。
【０１２３】
ＡＤＲによって媒介される標的化という概念は、活性化の２４時間以内にＴ細胞がその細胞表面において共刺激遺伝子４−１ＢＢ、ＯＸ４０および／またはＣＤ４０Ｌを一過性にアップレギュレートするという知見に基づいている。４−１ＢＢ、ＯＸ４０および／またはＣＤ４０Ｌの発現は、Ｔ細胞が活発に細胞傷害性である場合にのみ維持され、ＴＣＲシグナリングが止まると、４〜５日以内に徐々にダウンレギュレートされる。注目すべきことに、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞がより強度の４−１ＢＢ発現を示したのに対し、ＣＤ４＋Ｔ細胞はＯＸ４０および／またはＣＤ４０Ｌを優先的に発現した。活性化Ｔ細胞の他には、ＡＤＲリガンドは活性化ＮＫ細胞と、他のいくつかの重要でない補充可能な細胞サブセットにだけ発現しうる。４−１ＢＢ、ＯＸ４０およびＣＤ４０Ｌのこの発現パターンは、これらの遺伝子を、重要な免疫組織および非免疫組織を永続的に損傷することを回避しつつ活性化細胞を高い特異性で標的とするための魅力的な標的にする。
【０１２４】
これらの活性化Ｔ細胞を標的とすることの実現可能性を探るために、ガンマレトロウイルスベクターＳＦＧ中にコードされるＣＤ３ζ鎖にスペーサーを介して直接接続された４−１ＢＢ特異的リガンド、ＯＸ４０特異的リガンドまたはＣＤ４０Ｌ特異的受容体で構成されるように、自己／同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）を設計した。スペーサー領域は、ａ）ＩＩ型タンパク質４−１ＢＢＬおよびＯＸ４０ＬをＡＤＲのＩ型バックボーンに組み込むことを可能にするために、そしてｂ）ＦＡＣＳ染色による細胞表面上のＡＤＲの検出を容易にするために、組み込んだ。このコンストラクトによるＴ細胞の形質導入は、細胞表面でのＡＤＲ発現を効率よく強制した。これらのＡＤＲ  Ｔ細胞は、４−１ＢＢ、ＯＸ４０およびＣＤ４０Ｌ発現細胞に対して強力でロバストな細胞傷害性を有し、標的細胞の９０〜９９％を４８時間以内に排除した。これらの結果は、機能的な４−１ＢＢ、ＯＸ４０およびＣＤ４０Ｌ特異的ＡＤＲ  Ｔ細胞を生成させることの実現可能性を実証している。
【０１２５】
Ｔ細胞におけるＡＤＲシグナリングは結果として４−１ＢＢ、ＯＸ４０およびＣＤ４０Ｌをアップレギュレートすることで、きょうだい殺しを促進し、エフェクター細胞の増殖を妨げるので、エフェクターＴ細胞におけるＡＤＲ標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム破壊の効果を探った。本発明者らは、このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９アプローチがＣＤ７特異的ＣＡＲを発現する初代ヒトＴ細胞のきょうだい殺しを防止できることを、以前に示していた。これに関連して、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使って、４−１ＢＢ発現をＡＤＲ  Ｔ細胞の約７０％においてノックアウトすることができ、それらは一貫して、細胞傷害性に影響を及ぼすことなく、４−１ＢＢ＋標的細胞との共培養後４８時間の時点で、ＡＤＲ  Ｔ細胞増殖を、２倍超増加させた。
【０１２６】
次に、活性化Ｔ細胞を選択的に排除するＡＤＲ  Ｔ細胞の能力を試験した。４−１ＢＢ、ＯＸ４０、およびＣＤ４０Ｌ  ＡＤＲ  Ｔ細胞を、蛍光標識した休止Ｔ細胞またはＣＤ３／ＣＤ２８活性化Ｔ細胞と共培養した。残存生ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、細胞計数ビーズを使ってフローサイトメトリーで定量した。４−１ＢＢ、ＯＸ４０またはＣＤ４０Ｌ特異的ＡＤＲを発現するＴ細胞との７２時間の共培養後に、休止自家Ｔ細胞に対する反応性はなかった（図２Ｂ）。対照的に、４−１ＢＢ  ＡＤＲ  Ｔ細胞とＣＤ３／ＣＤ２８活性化Ｔ細胞との共培養では、大半のＣＤ８＋Ｔ細胞と一部のＣＤ４＋Ｔ細胞とが、４８時間以内に排除された。ＯＸ４０  ＡＤＲ  Ｔ細胞とのインキュベーションは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の相反的に高レベルな枯渇と、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の控えめな枯渇とをもたらした。ＣＤ４０Ｌ  ＡＤＲ  Ｔ細胞は、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に対して中程度の細胞傷害効果を生じたが、ＣＤ８＋Ｔ細胞には効果が見られなかった。活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＯＸ４０、ＣＤ４０Ｌおよび４−１ＢＢ  ＡＤＲ  Ｔ細胞の差異的標的化プロファイルは、各Ｔ細胞サブセット上のＯＸ４０、ＣＤ４０Ｌおよび４−１ＢＢ発現の強さおよび動態に観察された相違と相関する。ＡＤＲのこの特性は、アロ反応性Ｔ細胞または自己反応性Ｔ細胞のどちらかを必要に応じて優先的に標的とするために利用することができる。それゆえにＡＤＲ発現は、Ｔ細胞が、活性化（病原性）Ｔ細胞は特異的に標的とするが、休止細胞は温存することを可能にし、それらの臨床的使用が示唆される。
【０１２７】
ＡＤＲを発現するウイルス特異的Ｔ細胞（virus-specific T cell：ＶＳＴ）がインビトロ混合リンパ球反応（mixed lymphocyte reaction：ＭＬＲ）アッセイにおいて、同種拒絶に抵抗することができるかどうかを評価した。ＣＭＶ特異的Ｔ細胞をＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーから生成させ、対照非形質導入ＶＳＴまたはＡＤＲ形質導入ＶＳＴをアロ反応性ＨＬＡ−Ａ２＋ＰＢＭＣと、１：２の細胞対細胞比で混合した。次に、本発明者らは、それらの細胞を１２日間培養した。共培養の終了時に対照ＶＳＴはＨＬＡ−Ａ２＋ＰＢＭＣによってほとんど完全に排除されていたのに対し、４−１ＢＢ  ＡＤＲまたはＯＸ４０  ＡＤＲのどちらか一方を発現するＶＳＴは拒絶に抵抗した。総合すると、これらの結果は、新たに開発されたＡＤＲプラットホーム実施形態を使って活性化Ｔ細胞を標的とすることの実現可能性および選択性を実証している。
【０１２８】
［実施例２  ＮＫ細胞の選択的標的化のための自己／同種免疫防御受容体］
ＡＤＲは、ＨＬＡｌｏｗ細胞またはＨＬＡ不適合細胞の迅速な拒絶を媒介するキー細胞集団であるＮＫ細胞に対して、特異的細胞傷害活性を呈する。
【０１２９】
ＮＫ細胞は、抗腫瘍および抗ウイルス免疫監視機構の一部として、ＨＬＡ不適合細胞またはＨＬＡ発現量が低い細胞を認識することができる。したがって、免疫充足（immunoreplete）患者への同種細胞の養子移入は、ＮＫ細胞の活性化と、ＨＬＡ不適合細胞の拒絶をもたらす。ここでは、４−１ＢＢおよびＯＸ４０特異的自己／同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）を発現するＴ細胞の共培養が、ＮＫ細胞の排除につながり、したがってＡＤＲを装備した同種Ｔ細胞のＮＫ細胞媒介性宿主拒絶を相殺するであろうことを示す。それゆえに、ＡＤＲはアロ反応性Ｔ細胞応答を阻害するだけでなく、ＮＫ細胞媒介性拒絶も抑制し、「既製の」治療用Ｔ細胞の存続および活性を強化するためのＡＤＲの応用がさらに裏付けられる。
【０１３０】
［実施例３  ＡＤＲ発現Ｔ細胞は標的細胞を排除する］
ＡＤＲは、免疫細胞の細胞表面上に発現されて、それぞれの標的に対する細胞傷害性を増進することができる。図１ＡにＡＤＲの概略の一例を図解する（ＧＦＰなどの標識は随意である）。Ｔ細胞表面でのＡＤＲの発現を確認した（図１Ｂ）。細胞は対照と同等に増殖した（図１Ｃ）。（図１Ｄ）ＡＤＲ発現Ｔ細胞は、対応するＡＤＲリガンドを発現する標的細胞に対して細胞傷害性であった（図１Ｄ）。図１Ｅは、４−１ＢＢ  ＡＤＲを発現する野生型Ｔ細胞と４−１ＢＢ  ＫＯ  Ｔ細胞の増殖、および４−１ＢＢ＋標的に対するそれらの細胞傷害性を、対比して示している。Ｔ細胞上のＡＤＲリガンドをノックアウトすることによって増殖および細胞傷害性をさらに強化することができ、ＡＤＲとそのリガンドがＴ細胞上に共発現することは、ＡＤＲ−Ｔ細胞の増殖または機能にとって必要でない（図１Ｅ）。
【０１３１】
活性化Ｔ細胞でのＡＤＲリガンドの選択的発現が、ＡＤＲ  Ｔ細胞によるそれらの選択的排除を可能にする。ＴＣＲ刺激後の休止Ｔ細胞と活性化Ｔ細胞でのＡＤＲリガンドの発現が、対比して決定される（図２Ａ〜図２Ｃ）。休止ＣＤ４＋Ｔ細胞および休止ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＡＤＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性はなかったが、４８時間の共培養後のＡＤＲ  Ｔ細胞による活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞および活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の排除はあった（図２Ｅ）。
【０１３２】
一例として、４−１ＢＢ  ＡＤＲの発現はＭＬＲモデルにおいてＴ細胞を免疫拒絶から保護する。１：１０のＡＤＲ  Ｔ：ＰＢＭＣ比での同種ＰＢＭＣとの共培養後に、ＡＤＲを共発現するＴＣＲＫＯ  Ｔ細胞が拒絶から保護されることを示す代表的ドットプロット（図３Ａ）。共培養中のドナーＴ細胞およびＰＢＭＣにおける同種Ｔ細胞の絶対数（図３Ｂ〜図３Ｃ）は、ウイルス特異的ＡＤＲ  Ｔ細胞でも同じである（図３Ｄ〜図３Ｆ）。
【０１３３】
ＡＤＲの発現は、インビトロでの混合リンパ球反応において、ウイルス特異的同種Ｔ細胞を免疫拒絶から保護する。ＡＤＲ  ＶＳＴがレシピエント同種ＰＢＭＣによる免疫拒絶から保護されることを示す代表的ドットプロット（図４Ａ）。ＭＬＲ中のさまざまな時点におけるレシピエントＴ細胞およびドナーＶＳＴの絶対数を図４Ｂおよび図４Ｃに掲載する。
【０１３４】
図５において、ＡＤＲ  ＶＳＴは抗ウイルス機能を保っている。ＡＤＲ  ＶＳＴを、ウイルスペプミックスをパルスした単球と共培養した。ＡＤＲ  ＶＳＴは無改変ＶＳＴと同等によくウイルス感染細胞を排除することが、単球数によって示された。
【０１３５】
活性化ＮＫ細胞はＡＤＲリガンドをアップレギュレートし、ＡＤＲ  Ｔ細胞によって選択的に標的化されうる。休止ＮＫ細胞と活性化ＮＫ細胞では、４−１ＢＢの発現が確認される（図６Ａ〜図６Ｂ）。４−１ＢＢ  ＡＤＲ  Ｔ細胞と２４時間共培養した後の休止ＮＫ細胞と活性化ＮＫ細胞の残存数が対比して決定される（図６Ｃ）。図６Ｄにおいて、ＭＨＣを欠くＡＤＲ  Ｔ細胞は、ＮＫ細胞の増殖を制御することにより、同種ＰＢＭＣによる免疫拒絶から保護される。図６Ｅでは共培養中のドナーＴ細胞および同種ＮＫ細胞の絶対数が決定される。１：１のＥ：Ｔ比での４８時間の共培養時に、ＭＨＣを欠くＡＤＲ  Ｔ細胞は、ＮＫ細胞による免疫拒絶に抵抗する（図６Ｆ）。ＡＤＲ  Ｔ細胞は、ＰＢＭＣとのＭＬＲ中に、アロ反応性ＮＫ細胞の増殖を制御する（図６Ｇ）。図６ＨにはＮＫ細胞の絶対数がプロットされている。
【０１３６】
ＡＤＲ発現はインビボで同種Ｔ細胞を免疫拒絶から保護する。図７Ａには、ＨＬＡ−Ａ２＋ドナーからのＴ細胞が亜致死線量照射後にマウスに与えられ、続いて４日後に同種ＨＬＡ−Ａ２−Ｔ細胞が投与された、免疫拒絶のマウスモデルの一例が示されている。ＨＬＡ−Ａ２−ドナーからの対照Ｔ細胞は１８日目までに拒絶されたが、ＡＤＲ発現細胞は保護された（図７Ｂ）。さまざまな時点におけるＨＬＡ−Ａ２＋ドナーおよびＨＬＡ−Ａ２−ドナーからのＴ細胞の絶対数が決定された（図７Ｃ）。図７Ｄに示す改変型インビボモデルでは、同種Ｔ細胞の代わりにドナー１からのＰＢＭＣ全体（Ｔ細胞とＮＫ細胞をどちらも含有するもの）をマウスに与えた。図７Ｅの代表的フロープロットは、ＡＤＲ  Ｔ細胞が、免疫拒絶から保護されると共に、致死的ＧｖＨＤの急激な発生からマウスを保護したことを示している。
【０１３７】
ＣＡＲとＡＤＲを共発現させても両受容体の機能は維持される。図８ＡはＡＤＲとＣＡＲを共発現する免疫細胞の図解の一例である。細胞表面でのＣＡＲとＡＤＲの共発現が確認された（図８Ｂ）。図８Ｃには、標的の一例として、ＮＡＬＭ−６（ＣＤ１９＋ＣＡＲ標的）に対するＣＡＲ−ＡＤＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性が示されている。図８Ｄでは活性化Ｔ細胞（ＡＤＲ標的）に対するＣＡＲ−ＡＤＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性も決定された。図８Ｅでは、両方の細胞標的と同時に共培養した時の両標的に対するＣＡＲ−ＡＤＲ  Ｔ細胞の細胞傷害活性が実証されている。
【０１３８】
ＣＡＲ−ＡＤＲ  Ｔ細胞は免疫拒絶から保護され、強力な抗腫瘍活性を発揮する。マウスモデルおよびレジメンの一例を図９Ａに図示する。レジメンの一例として、ドナー１からの同種Ｔ細胞とｂ２ｍＫＯ  ＮＡＬＭ６を２４時間の間をあけてマウスに与え、次にドナー２からのＣＡＲ−ＡＤＲ  Ｔ細胞を単回投与した。末梢血におけるドナー２からのＴ細胞の動態を図９Ｂに示し、実験群におけるドナー１のＴ細胞の動態を図９Ｃに掲載する。図９Ｄはマウスにおける白血病負荷を示しており、マウスの総生存率も決定された（図９Ｅ）。
【０１３９】
図１３Ａ〜図１３Ｃ。固形腫瘍モデルにおいて、ＣＡＲ−ＡＤＲ  Ｔ細胞は免疫拒絶から保護され、強力な抗腫瘍活性を発揮する。マウスモデルと処置の一例の概略を図１０Ａに示す。ここでは、ドナー１からの同種Ｔ細胞とｂ２ｍＫＯ神経芽細胞腫細胞株ＣＨＬＡ２５５を２４時間の間をあけてマウスに与え、次にドナー２からのＣＡＲ−ＡＤＲ  Ｔ細胞を単回投与した。ドナー２のＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞はＤ１８までに拒絶されたが、ＣＡＲ−ＡＤＲ  Ｔ細胞は同種拒絶に抵抗して、末梢血中に存続した（図１０Ｂ）。マウスにおける腫瘍量を図１３Ｃに示す。ここで、＊はＡＴＣ＋ＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ群における異種ＧｖＨＤ関連死を示す。
【０１４０】
ＴＣＲノックアウトＣＡＲ−ＡＤＲ  Ｔ細胞は免疫拒絶から保護され、強力な抗腫瘍活性を発揮する。ドナー１からの同種Ｔ細胞とｂ２ｍＫＯ  ＮＡＬＭ６を２４時間の間をあけてマウスに与え、次にドナー２からのＴＣＲ編集ＣＡＲ−ＡＤＲ  Ｔ細胞を単回投与したマウスモデルの概略を掲載する（図１１Ａ）。末梢血におけるドナー２からのＴ細胞の動態を掲載する（図１１Ｂ）。実験群におけるドナー１  Ｔ細胞の動態を示す（図１１Ｃ）。マウスにおける白血病負荷（図１１Ｄ）およびマウスの総生存率（図１１Ｅ）を掲載する。
【０１４１】
ＡＤＲ  Ｔ細胞はマウスを致死的異種ＧｖＨＤから保護する。モデルの概略を図１２Ａに掲載し、インビボでのＦＦＬｕｃ標識ＡＤＲ  Ｔ細胞の増殖を実証する（図１２Ｂ）。マウスにおける体重の増減の動態を決定した（図１２Ｃ）。マウスの総生存率を図示する（図１２Ｄ）。
【０１４２】
（一例として）ＣＤ２８細胞内シグナリングドメインを持つ第２世代のＡＤＲ（「ＡＤＲ．２８ｚｅｔａ」）を利用した。ＡＤＲ．２８ｚｅｔａの構造の一例を図示する（図１３Ａ）。標的発現細胞に対するＡＤＲ．２８ｚｅｔａのインビトロ細胞傷害性を決定した（（図１３Ｂおよび図１３Ｃ）。ＡＤＲ．２８ｚｅｔａはマウスを異種ＧｖＨＤラインから保護した（図１３Ｂ）。モデルの概略（図１３Ｄ）を示す。インビボでのＦＦＬｕｃ標識ＡＤＲ．２８ゼータＴ細胞の増殖を確認した（図１３Ｅ）。マウスの体重の増減の動態（図１３Ｆ）およびマウスの総生存率（図１３Ｇ）を決定した。
【０１４３】
本開示およびその利点を詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲によって規定される設計の要旨および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更、置換および改変をここに加えることができることを理解すべきである。さらにまた、本願の範囲は、本明細書に記載したプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法および工程の特定実施形態に限定されるものではない。当技術分野における通常の技能を有する者には容易に理解されるであろうとおり、対応する本明細書記載の実施形態と実質的に同じ機能を果たすまたは実質的に同じ結果を達成する既存のまたは今後開発されるプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、または工程は、本開示に従って利用されうる。したがって、添付の特許請求の範囲は、そのようなプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法または工程をその範囲内に包含するものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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