(57)【要約】  いくつかの態様は、グリコフォリンＡに結合する抗体などの抗原結合タンパク質に関する。ある態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、かかる抗体の結合フラグメントおよび誘導体、ならびにグリコフォリンＡに特異的に結合するポリペプチドである。いくつかの態様は、親和性成熟抗原結合タンパク質に関する。いくつかの態様は、次世代シークエンシングを用いて、親和性成熟候補を予測、スクリーニングまたはその他の方法で特徴づける。さらに、そのような抗体、抗体フラグメントおよび誘導体ならびにポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリヌクレオチドを含む細胞、そのような抗体、抗体フラグメントおよび誘導体ならびにポリペプチドを作製する方法、ならびにそのような抗体、抗体フラグメントおよび誘導体ならびにポリペプチドを使用する方法が開示される。
2021522812.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコフォリンＡに結合するための抗原結合タンパク質であって、
少なくとも第１の軽鎖相補的決定領域（ＬＣ ＣＤＲ１）および第２の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣ ＣＤＲ２）を含む可変軽鎖ドメイン；および
少なくとも第１の重鎖相補的決定領域（ＨＣ ＣＤＲ１）および第２の重鎖ＣＤＲ（ＨＣ ＣＤＲ２）を含む可変重鎖ドメインを含み、
ここで、該抗原結合タンパク質が一本鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）であり、ヒトグリコフォリンＡおよびカニクイザルグリコフォリンＡの少なくとも１つに結合することができ、
該抗原結合タンパク質が、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法または放射免疫アッセイによって測定される約１ｎＭから約１００ｎＭの解離定数(Ｋｄ)でヒトグリコフォリンＡに結合し、そして
該抗原結合タンパク質が、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法または放射免疫アッセイによって測定される抗原結合タンパク質よりも大きなＫｄを有する抗原結合タンパク質をコードする親アミノ酸配列から親和性成熟している、
抗原結合タンパク質。
【請求項２】
抗原結合タンパク質が、抗体結合フラグメント体（Ｆａｂ）を含み、ここで、ＦａｂがヒトグリコフォリンＡおよびカニクイザルグリコフォリンＡの両方に結合し、Ｆａｂが約１０μＭから０．１ｎＭの間の解離定数でヒトグリコフォリンＡに結合する、請求項１記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３】
ＬＣ ＣＤＲ２が、ＬＮＲＬＨ（配列番号２９８）、ＬＳＲＴＳ（配列番号２９５）、ＮＴＲＴＳ（配列番号２９６）、ＮＴＲＰＳ（配列番号２９７）、ＮＴＲＬＡ（配列番号２９９）、ＮＳＲＬＳ（配列番号３００）、ＬＳＲＶＳ（配列番号３０１）、ＬＮＲＶＳ（配列番号３０２）、ＬＮＲＬＳ（配列番号３０３）、ＮＳＲＬＨ（配列番号３０４）、ＳＳＲＬＳ（配列番号３０５）、ＳＳＲＶＳ（配列番号３０６）、ＳＮＲＬＨ（配列番号３０７）、ＮＴＲＶＳ（配列番号３０８）、ＳＮＲＶＳ（配列番号３０９）、ＨＳＲＬＳ（配列番号３１０）、ＳＳＲＬＡ（配列番号３１１）、ＦＮＲＶＮ（配列番号３１２）、ＬＮＲＭＳ（配列番号３１３）、ＬＮＲＩＳ（配列番号３１４）およびＬＳＨＰＨ（配列番号３１５）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の抗原結合タンパク質。
【請求項４】
ＣＤＲＬ２が、配列番号２４６、２４３、２４４、２４５および２４７−２６３のうち何れか１つから選択される配列を含む、請求項３記載の抗原結合タンパク質。
【請求項５】
該タンパク質が、可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列中の対応する位置にあるＶＳＫＬＤの配列を含む親配列から成熟している、請求項３記載の抗原結合タンパク質。
【請求項６】
ＨＣ ＣＤＲ１が、ＲＭＴＹＩＬ（配列番号２７８）、ＲＡＴＹＩＬ（配列番号２６９）、ＲＮＩＹＩＬ（配列番号２７０）、ＫＹＴＹＩＬ（配列番号２７１）、ＶＨＴＹＩＬ（配列番号２７２）、ＲＮＶＦＩＬ（配列番号２７３）、ＲＮＩＹＬＬ（配列番号２７４）、ＲＫＴＹＩＬ（配列番号２７５）、ＬＮＶＹＩＬ（配列番号２７６）、ＫＡＴＹＩＬ（配列番号２７７）、ＫＴＶＹＩＬ（配列番号２７９）、ＫＨＶＹＩＬ（配列番号２８０）、ＲＮＩＴＭＩＬ（配列番号２８１）、ＫＤＴＹＩＬ（配列番号２８２）、ＩＮＳＹＩＬ（配列番号２８３）、ＱＨＴＹＩＬ（配列番号２８４）およびＲＨＳＹＩＬ（配列番号２８５）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の抗原結合タンパク質。
【請求項７】
該タンパク質が、アミノ酸配列中の対応する位置にあるＫＤＴＹＭＬの配列を含む親配列から成熟している、請求項６記載の抗原結合タンパク質。
【請求項８】
ＣＤＲ Ｈ１が、配列番号２２７、２１７−２２６および２２８−２３３の何れか１つから選択される配列を含む、請求項６記載の抗原結合タンパク質。
【請求項９】
第１の軽鎖相補的決定領域１（ＣＤＲＬ１）が、ＦＲＮＮＫ（配列番号２８７）、ＦＲＮＳＫ（配列番号２８８）、ＦＫＮＧＫ（配列番号２８９）、ＦＲＮＡＫ（配列番号２９０）、ＦＲＴＧＫ（配列番号２９１）、ＦＫＮＤＫ（配列番号２９２）およびＹＫＮＧＫ（配列番号２９３）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
ＣＤＲＬ１が、配列番号２３５−２４１のいずれか１つから選択される配列を含む、請求項９記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
タンパク質が、アミノ酸配列中の対応する位置にあるＹＳＮＧＫＴの配列を含む親配列から成熟している、請求項９記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
抗原結合タンパク質が、１０Ｆ７、Ｔｅｒ１１９、ＣＬＢ−ｅｒｙ−１（ＡＭＥ−１）、ＥＰＲ８２００、ＹＴＨ８９．１、ＥＰＲ８１９９、ＪＣ１５９、ＧＹＰＡ／２８０、ａｂ４０８４４、ＨＩ２６４、ＧＰＨＮ０２、ＪＣ１５９、ＳＰＭ５９９、ＥＰＲ８２００、ＧＹＰＡ／１７２５Ｒ、ａｂ１１２２０１、ａｂ１１４３３０、ａｂ２１９８９６、ＢＲＩＣ２５６またはそれらのフラグメントもしくは誘導体の１つまたはそれ以上とグリコフォリンＡへの結合について競合する、請求項１記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
抗原結合タンパク質が、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原または少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントに融合され、該少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原または少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントが多発性硬化症に関連している、請求項１から１２のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
抗原結合タンパク質が少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントに融合され、該少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントが、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の免疫原性フラグメント、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）の免疫原性フラグメントおよび／またはミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）の免疫原性フラグメントを含む、請求項１３記載の抗原タンパク質。
【請求項１５】
少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントが、配列番号１６９−１７５および１８６−２０２の少なくとも１つを含む、請求項１４記載の抗原タンパク質。
【請求項１６】
少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントが、配列番号１６９、１７１−１７３、１７５および１８８−２０２の少なくとも１つを含む、請求項１４記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１７】
多発性硬化症の処置に用いるための、請求項１３から１６のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質の使用。
【請求項１８】
抗原結合タンパク質が、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原または少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントに融合され、該少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原または少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントが、１型糖尿病に関連している、請求項１から１２のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１９】
抗原結合タンパク質が、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントに融合され、該少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントが、プロインスリン、インスリン、プレプロインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ−６５（ＧＡＤ−６５またはグルタミン酸デカルボキシラーゼ２）、ＧＡＤ−６７、グルコース−６ホスファターゼ２、膵島特異的グルコース６ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）、インスリノーマ関連タンパク質２β（ＩＡ−２β）、ＩＣＡ６９、ＩＣＡ１２（ＳＯＸ−１３）、カルボキシペプチダーゼＨ、イモージェン３８、ＧＬＩＭＡ３８、クロモグラニンＡ、ＨＳＰ−６０、カルボキシペプチダーゼＥ、ペリフェリン、グルコーストランスポーター２、肝細胞癌−腸−膵臓／膵臓関連タンパク質、Ｓ１００β、グリア線維性酸性タンパク質、再生遺伝子ＩＩ、膵臓十二指腸ホメオボックス１、筋強直性ジストロフィーキナーゼおよびＳＳＴ Ｇ−タンパク質共役受容体１−５の１以上の免疫原性フラグメントを含む、請求項１７記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２０】
少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントが、配列番号２０４−２１４の少なくとも１つを含む、請求項１８記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２１】
１型糖尿病の処置に用いるための、請求項１８から２０のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質の使用。
【請求項２２】
抗原結合タンパク質が、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原または少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントに融合され、該少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原または少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントがセリアック病に関連している、請求項１から１２のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２３】
抗原結合タンパク質が、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントに融合され、該少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントが、グルテン、組織グルタミン転移酵素、高分子量グルテニン、低分子量グルテニン、アルファ−グリアジン、ガンマ−グリアジン、オメガ−グリアジン、ホルデイン、セカリン、アベニンおよびそれらの脱アミド体の１以上の免疫原性フラグメントを含む、請求項２２記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２４】
少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントが、配列番号１８２−１８５および２１５の少なくとも１つを含む、請求項２３記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２５】
セリアック病の処置における使用のための、請求項２２から２４のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２６】
請求項１３から１６のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質を含む組成物を対象に投与することを含む、多発性硬化症の処置方法。
【請求項２７】
請求項１８から２０のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質を含む組成物を対象に投与することを含む、１型糖尿病の処置方法。
【請求項２８】
請求項２２から２４のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質を含む組成物を対象に投与することを含む、セリアック病の処置方法。
【請求項２９】
請求項１記載の抗体結合タンパク質を親和性成熟させるための方法であって、
非特異的結合体のファージライブラリーを枯渇させること、ここで、該ファージライブラリーは複数のファージを含み、各ファージは候補親和性成熟抗体または抗体フラグメントを発現するものであり；
枯渇させたライブラリーを標的抗原に暴露すること；
洗浄により標的抗原に結合しないファージを除去すること；
標的抗原に結合しているファージを増幅すること；
曝露、除去および増幅工程を複数回繰り返して、高親和性候補抗体または抗体フラグメントを発現するファージによる標的抗原の結合をもたらす選択圧を誘導すること；および
次世代シークエンシングを用いて、高親和性候補抗体または抗体フラグメントをスクリーニングすること
を含む、方法。
【請求項３０】
ＥＬＩＳＡを用いて高親和性候補抗体または抗体フラグメントをスクリーニングすること、および可溶性形態で発現される高親和性候補抗体または抗体フラグメントの能力を評価することの１以上をさらに含んでいる、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
グリコフォリンＡに結合するための抗原結合タンパク質であって、
少なくとも第１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣ ＣＤＲ）１および第２の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣ ＣＤＲ２）を含む第１の可変ドメイン；および
少なくとも第２の重鎖相補性決定領域（ＨＣ ＣＤＲ）１および第２の重鎖ＣＤＲ（ＨＣ ＣＤＲ２）を含む第２の可変ドメインを含み、
ここで、該抗原結合タンパク質が、一本鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）であり、ヒトグリコフォリンＡおよびカニクイザルグリコフォリンＡの両方に結合することができ、
該抗体結合フラグメント（Ｆａｂ）が、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法または放射免疫アッセイにより測定される約２０ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でヒトグリコフォリンＡに結合し、そして
該抗体結合フラグメント（Ｆａｂ）が、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法または放射免疫アッセイにより測定される該抗体結合フラグメント（Ｆａｂ）よりも大きなＫｄを有する親配列から親和性成熟している、
抗原結合タンパク質。
【請求項３２】
配列番号２４３−２６４の１以上と少なくとも約９５％同一性である軽鎖可変ドメインを含む、抗原結合タンパク質。
【請求項３３】
配列番号２３５−２４２の１以上と少なくとも約９５％同一性である軽鎖可変ドメインを含む、抗原結合タンパク質。
【請求項３４】
ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（配列番号４９）を含む軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１；および
Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（配列番号５０）を含む軽鎖ＣＤＲ２を含み、
ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は、それぞれ天然アミノ酸であり；
Ｘ２がＹであり、Ｘ３がＹであり、Ｘ４がＹであり、そしてＸ５がＮであるとき、Ｘ１がＫではなく；
Ｘ１がＫであり、Ｘ３がＹであり、Ｘ４がＹであり、そしてＸ５がＮであるとき、Ｘ２がＹではなく；
Ｘ１がＫであり、Ｘ２がＹであり、Ｘ４がＹであり、そしてＸ５がＮであるとき、Ｘ３がＹではなく；
Ｘ１がＫであり、Ｘ２がＹであり、Ｘ３がＹであり、そしてＸ５がＮであるとき、Ｘ４がＹではなく；かつ
Ｘ１がＫであり、Ｘ２がＹであり、Ｘ３がＹであり、そしてＸ４がＹであるとき、Ｘ５がＮではない、
抗原結合タンパク質。
【請求項３５】
軽鎖ＣＤＲ１が、
ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１がＦ、ＷおよびＹから選択され、Ｘ２がＦ、Ｗ、ＹおよびＱから選択される）（配列番号５１）、
ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１がＦ、ＷおよびＹから選択され、Ｘ２がＦ、ＷおよびＹから選択される）（配列番号５３）、
ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１がＦまたはＹであり、Ｘ２がＦ、ＷおよびＹから選択される）（配列番号５５）、および
ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１がＦまたはＹであり、Ｘ２がＦである）（配列番号５７）からなる群より選択される配列を含み、
軽鎖ＣＤＲ２が、
Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３がＨおよびＹから選択され、Ｘ４がＨ、ＲおよびＫから選択され、そしてＸ５が天然アミノ酸である）（配列番号５２）、
Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３がＨであり、Ｘ４がＨまたはＲであり、そしてＸ５が天然アミノ酸である）（配列番号５４）、
Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３がＨであり、Ｘ４がＨであり、そしてＸ５が天然アミノ酸である）（配列番号５６）、および
Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３がＨであり、Ｘ４がＨであり、そしてＸ５がＶまたはＤである）（配列番号５８）からなる群より選択される配列を含む、
請求項３４記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３６】
ＱＱＦＴＳＳＰＹＴ（配列番号４５）を含む軽鎖ＣＤＲ３をさらに含む、請求項１５記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３７】
ＧＹＴＦＮＳＹＦＭＨ（配列番号４６）を含む重鎖ＣＤＲ１または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；
ＧＭＩＲＰＮＧＧＴＴＤＹＮＥＫＦＫＮ（配列番号４７）を含む重鎖ＣＤＲ２または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；ならびに
ＷＥＧＳＹＹＡＬＤＹ（配列番号４８）を含む重鎖ＣＤＲ３または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体
をさらに含む、請求項３４から３６のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３８】
配列番号３と少なくとも約９０％同一性である重鎖可変ドメインをさらに含む、請求項３４から３７のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３９】
配列番号３と少なくとも約９５％同一性である重鎖可変ドメインをさらに含む、請求項３４から３７のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質。
【請求項４０】
配列番号３と少なくとも約９９％同一性である重鎖可変ドメインをさらに含む、請求項３４から３７のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質。
【請求項４１】
配列番号３と少なくとも約９０％同一性である重鎖可変ドメイン、および
配列番号１と少なくとも約９０％同一性である軽鎖可変ドメイン
を含む、抗原結合タンパク質。
【請求項４２】
配列番号３と少なくとも約９５％同一性である重鎖可変ドメイン、および
配列番号１と少なくとも約９５％同一性である軽鎖可変ドメイン
を含む、抗原結合タンパク質。
【請求項４３】
配列番号３と少なくとも約９９％同一性である重鎖可変ドメイン、および
配列番号１と少なくとも約９９％同一性である軽鎖可変ドメイン
を含む、抗原結合タンパク質。
【請求項４４】
配列番号４−４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、抗原結合タンパク質。
【請求項４５】
配列番号５、９、１１、１２、１４、１８、１９、２０、２１、２２、２４、２７、２８、３１、３８および４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、抗原結合タンパク質。
【請求項４６】
配列番号２１のアミノ酸配列を含む、抗原結合タンパク質。
【請求項４７】
配列番号４２のアミノ酸配列を含む、抗原結合タンパク質。
【請求項４８】
少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原または少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントをさらに含む、請求項３４から４７のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質を含む、免疫寛容を誘導するための組成物。
【請求項４９】
少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原を含み、ここで、該少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原が、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ＭＰＢの１または複数のフラグメント、ＭＯＧの１以上のフラグメント、およびＰＬＰの１以上のフラグメントの少なくとも１つを含む、請求項４８記載の組成物。
【請求項５０】
少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントを含み、ここで、該少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントが、配列番号１６９−１７５および１８６−２０２の少なくとも１つを含む、請求項４８記載の組成物。
【請求項５１】
少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントを含み、ここで、該少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントが、配列番号１６９、１７１−１７３、１７５および１８８−２０２の少なくとも１つを含む、請求項４８記載の組成物。
【請求項５２】
多発性硬化症の処置に用いるための、請求項４８から５１のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５３】
少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原を含み、ここで、該少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原が、インスリン、プロインスリン、プレプロインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ−６５（ＧＡＤ−６５またはグルタミン酸デカルボキシラーゼ２）、ＧＡＤ−６７、グルコース−６ホスファターゼ２、膵島特異的グルコース６ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）、インスリノーマ関連タンパク質２β（ＩＡ−２β）、ＩＣＡ６９、ＩＣＡ１２ （ＳＯＸ−１３）、カルボキシペプチダーゼＨ、イモージェン３８、ＧＬＩＭＡ３８、クロモグラニンＡ、ＨＳＰ−６０、カルボキシペプチダーゼＥ、ペリフェリン、グルコーストランスポーター２、肝細胞癌−腸−膵臓／膵臓関連タンパク質、Ｓ１００β、グリア線維性酸性タンパク質、再生遺伝子ＩＩ、膵臓十二指腸ホメオボックス１、筋強直性ジストロフィーキナーゼおよびＳＳＴ Ｇ−タンパク質共役受容体１−５の少なくとも１つを含む、請求項４８記載の組成物。
【請求項５４】
少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントを含み、ここで、該少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントが、配列番号２０４−２１４の少なくとも１つを含む、請求項４８記載の組成物。
【請求項５５】
１型糖尿病の処置に用いるための、請求項５３または５４記載の組成物。
【請求項５６】
少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原を含み、ここで、該少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原が、組織グルタミン転移酵素、高分子量グルテニン、低分子量グルテニン、グルテン、アルファ−グリアジン、ガンマ−グリアジン、オメガ−グリアジン、ホルデイン、セカリン、アベニンおよびそれらの脱アミド体の少なくとも１つを含む、請求項４８記載の組成物。
【請求項５７】
少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントを含み、ここで、該少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントが、配列番号１８２−１８５および２１５の少なくとも１つを含む、請求項４８記載の組成物。
【請求項５８】
セリアック病の処置に用いるための、請求項５６および５７のいずれか一項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年５月７日出願の米国仮特許出願第６２／６６８，１３２号、２０１９年２月１４日出願の米国仮特許出願第６２／８０５，８４９号および２０１９年４月５日出願の米国仮特許出願第６２／８２９，９２０号に基づく優先権の利益を主張し、それら各出願の内容全体を、引用により本明細書に包含させる。
【０００２】
配列表への参照
ＥＦＳ−ＷｅｂによりＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出した配列表は、３５ Ｕ.Ｓ.Ｃ．§ １．５２(ｅ)に従い引用により本明細書中に包含させる。配列表のＡＳＣＩＩテキストファイル名は、ＡＮＯＫ０３６ＷＯ＿ＳＴ２５であり、ＡＳＣＩＩテキストファイルの作成日は２０１９年４月２９日であり、ＡＳＣＩＩテキストファイルのサイズは１９７キロバイトである。
【背景技術】
【０００３】
背景
赤血球（ＲＢＣ）としても知られるエリスロサイトは、哺乳動物血液中で最も豊富な細胞タイプであり、固有の細胞表面マーカーセットを発現する。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本発明組成物およびこれに関連する方法は、以下に詳細に記載され、当業者によって行われる特定の実施を記載している。しかしながら、それらはまた、別の当事者によるそれらの実施の指示を含み得ることが理解されるべきである。したがって、“抗ヒトグリコフォリンＡ抗原結合構築物を投与する”などの実施は、“抗ヒトグリコフォリンＡ抗原結合構築物の投与を指示する”ことを含む。
【０００５】
いくつかの態様において、少なくとも第１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣ ＣＤＲ１）および第２の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣ ＣＤＲ２）を含む可変軽鎖ドメインならびに少なくとも第１の重鎖相補性決定領域（ＨＣ ＣＤＲ１）および第２の重鎖ＣＤＲ（ＨＣ ＣＤＲ２）を含む可変重鎖ドメインを含むグリコフォリンＡに結合するための抗原結合タンパク質であって、ここで、該抗原結合タンパク質は、ヒトグリコフォリンＡおよびカニクイザルグリコフォリンＡのうち少なくとも１つに結合することができ、該抗原結合タンパク質は、約１ｎＭから約１００ｎＭの解離定数（Ｋｄ）でヒトグリコフォリンＡに結合する、抗原結合タンパク質を提供する。
【０００６】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質よりも大きなＫｄを有する抗原結合タンパク質をコードする親アミノ酸配列から親和性成熟されている。いくつかの態様において、Ｋｄは、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法または放射免疫アッセイによって測定される。
【０００７】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は完全長抗体ではない。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、定常領域を含まない。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、天然抗体よりも少ない可変ドメインを有する。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、ｓｃＦｖではない。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は抗体結合フラグメント(Ｆａｂ）を含み、ここで、該ＦａｂはヒトグリコフォリンＡおよびカニクイザルグリコフォリンＡの両方に結合し、Ｆａｂは約１０μＭから０．１ｎＭの間の解離定数でヒトグリコフォリンＡに結合する。
【０００８】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、ヒトおよび／またはカニクイザルグリコフォリンＡに結合することができるＦａｂを含むか、または本質的にそれから構成されている。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、配列ＬＮＲＬＨ（配列番号２９８）の軽鎖ＣＤＲ２を有する。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、配列ＲＭＴＹＩＬ（配列番号２７８）の重鎖ＣＤＲ１を有する。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、配列ＦＲＮＮＫ（配列番号２８７）の軽鎖ＣＤＲ１を有する。
【０００９】
いくつかの態様において、ＬＣ ＣＤＲ２は、ＬＮＲＬＨ（配列番号２９８）、ＬＳＲＴＳ（配列番号２９５）、ＮＴＲＴＳ（配列番号２９６）、ＮＴＲＰＳ（配列番号２９７）、ＮＴＲＬＡ（配列番号２９９）、ＮＳＲＬＳ（配列番号３００）、ＬＳＲＶＳ（配列番号３０１）、ＬＮＲＶＳ（配列番号３０２）、ＬＮＲＬＳ（配列番号３０３）、ＮＳＲＬＨ（配列番号３０４）、ＳＳＲＬＳ（配列番号３０５）、ＳＳＲＶＳ（配列番号３０６）、ＳＮＲＬＨ（配列番号３０７）、ＮＴＲＶＳ（配列番号３０８）、ＳＮＲＶＳ（配列番号３０９）、ＨＳＲＬＳ（配列番号３１０）、ＳＳＲＬＡ（配列番号３１１）、ＦＮＲＶＮ（配列番号３１２）、ＬＮＲＭＳ（配列番号３１３）、ＬＮＲＩＳ（配列番号３１４）およびＬＳＨＰＨ（配列番号３１５）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様は、上記の配列と少なくとも約９０％、約９５％または約９８％相同性であるＬＣ ＣＤＲ２に関する。いくつかの態様において、ＣＤＲＬ２は、配列番号２４６、２４３、２４４、２４５および２４７−２６３のいずれか１つから選択される配列を含む。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列中の対応する位置にＶＳＫＬＤの配列を含む親配列から成熟される。
【００１０】
いくつかの態様において、ＨＣ ＣＤＲ１は、ＲＭＴＹＩＬ（配列番号２７８）、ＲＡＴＹＩＬ（配列番号２６９）、ＲＮＩＹＩＬ（配列番号２７０）、ＫＹＴＹＩＬ（配列番号２７１）、ＶＨＴＹＩＬ（配列番号２７２）、ＲＮＶＦＩＬ（配列番号２７３）、ＲＮＩＹＬＬ（配列番号２７４）、ＲＫＴＹＩＬ（配列番号２７５）、ＬＮＶＹＩＬ（配列番号２７６）、ＫＡＴＹＩＬ（配列番号２７７）、ＫＴＶＹＩＬ（配列番号２７９）、ＫＨＶＹＩＬ（配列番号２８０）、ＲＮＩＴＭＩＬ（配列番号２８１）、ＫＤＴＹＩＬ（配列番号２８２）、ＩＮＳＹＩＬ（配列番号２８３）、ＱＨＴＹＩＬ（配列番号２８４）およびＲＨＳＹＩＬ（配列番号２８５）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様は、上記の配列と少なくとも約９０％、約９５％または約９８％相同性であるＨＣ ＣＤＲ１に関する。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、アミノ酸配列中の対応する位置にＫＤＴＹＭＬの配列を含む親配列から成熟される。いくつかの態様において、ＣＤＲ Ｈ１は、配列番号２２７、２１７−２２６および２２８−２３３のいずれか１つから選択される配列を含む。
【００１１】
いくつかの態様において、第一の軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）は、ＦＲＮＮＫ（配列番号２８７）、ＦＲＮＳＫ（配列番号２８８）、ＦＫＮＧＫ（配列番号２８９）、ＦＲＮＡＫ（配列番号２９０）、ＦＲＴＧＫ（配列番号２９１）、ＦＫＮＤＫ（配列番号２９２）およびＹＫＮＧＫ（配列番号２９３）から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様は、上記の配列と少なくとも約９０％、約９５％または約９８％相同性であるＬＣ ＣＤＲ１に関する。いくつかの態様において、ＣＤＲＬ１は、配列番号２３５−２４１のいずれか１つから選択される配列を含む。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、アミノ酸配列中の対応する位置にＹＳＮＧＫＴの配列を含む親配列から成熟される。
【００１２】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、グリコフォリンＡへの結合について、１０Ｆ７、Ｔｅｒ１１９、ＣＬＢ−ｅｒｙ−１（ＡＭＥ−１）、ＥＰＲ８２００、ＹＴＨ８９．１、ＥＰＲ８１９９、ＪＣ１５９、ＧＹＰＡ／２８０、ａｂ４０８４４、ＨＩ２６４、ＧＰＨＮ０２、ＪＣ１５９、ＳＰＭ５９９、ＥＰＲ８２００、ＧＹＰＡ／１７２５Ｒ、ａｂ１１２２０１、ａｂ１１４３３０、ａｂ２１９８９６、ＢＲＩＣ２５６またはそれらのフラグメントもしくは誘導体の１以上と競合する。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、上記の抗体とは異なるエピトープを標的とするが、その標的に対して、上記のものより高い親和性を有する。
【００１３】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原(immunogenic tolerogenic antigen)または少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントに融合されており、ここで、該少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原または少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントは多発性硬化症と関連している。
【００１４】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントに融合されており、ここで、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の免疫原性フラグメント、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）の免疫原性フラグメントおよび／またはミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）の免疫原性フラグメントを含む。いくつかの態様において、ＭＢＰのフラグメントは、ＰＬＰのフラグメントと組み合わせて用いられる。いくつかの態様において、ＭＯＧのフラグメントは、ＰＬＰのフラグメントと組み合わせて用いられる。いくつかの態様において、ＭＯＧのフラグメントは、ＭＢＰのフラグメントと組み合わせて用いられる。いくつかの態様において、寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントは、配列番号１６９−１７５および１８６−２０２の少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントは、配列番号１６９、１７１−１７３、１７５および１８８−２０２の少なくとも１つを含む。いくつかの態様は、上記の配列に対して少なくとも約９０％、約９５％または約９８％の相同性を有する抗原の免疫原性フラグメントに関する。また、多発性硬化症の処置における使用のためのＭＳ関連抗原に融合した抗原結合タンパク質の使用も提供する。ＭＳを処置する方法も提供する。
【００１５】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原または少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントと融合されており、ここで、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原または少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントは、１型糖尿病と関連している。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントに融合されており、ここで、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントは、以下の１以上の免疫原性フラグメントを含む：プロインスリン、インスリン、プレプロインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ−６５（ＧＡＤ−６５またはグルタミン酸デカルボキシラーゼ２）、ＧＡＤ−６７、グルコース−６ホスファターゼ２、膵島特異的グルコース６ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）、インスリノーマ関連タンパク質２β（ＩＡ−２β）、ＩＣＡ６９、ＩＣＡ１２（ＳＯＸ−１３）、カルボキシペプチダーゼＨ、イモージェン３８、ＧＬＩＭＡ３８、クロモグラニンＡ、ＨＳＰ−６０、カルボキシペプチダーゼＥ、ペリフェリン、グルコーストランスポーター２、肝細胞癌−腸−膵臓／膵臓関連タンパク質、Ｓ１００β、グリア線維性酸性タンパク質、再生遺伝子ＩＩ、膵臓十二指腸ホメオボックス１、筋強直性ジストロフィーキナーゼおよびＳＳＴ Ｇ−タンパク質共役受容体１−５。いくつかの態様において、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントは、配列番号２０４−２１４の少なくとも１つを含む。いくつかの態様は、上記の配列に対して少なくとも約９０％、約９５％または約９８％の相同性を有する抗原の免疫原性フラグメントに関する。特定の態様において、異なる抗原からのフラグメントの組み合わせも同様に用いられる。例えば、インスリンのフラグメントまたはプロインスリンのフラグメントは、ＩＡ−２のフラグメント、ＧＡＤ−６５のフラグメントおよび／またはＧＡＤ−６７のフラグメントと組み合わせて用いられ得る。また、Ｉ型糖尿病の処置における使用のための、Ｉ型糖尿病関連抗原に融合した抗原結合タンパク質の使用も提供する。Ｉ型糖尿病を処置する方法も提供する。
【００１６】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原または少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントに融合されており、ここで、該少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原または少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントはセリアック病に関連している。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントに融合されており、ここで、該少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントは、以下の１以上の免疫原性フラグメントを含む：グルテン、組織グルタミン転移酵素、高分子量グルテニン、低分子量グルテニン、アルファ−グリアジン、ガンマ−グリアジン、オメガ−グリアジン、ホルデイン、セカリン、アベニンおよびそれらの脱アミド体。いくつかの態様において、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントは、配列番号１８２−１８５および２１５の少なくとも１つを含む。いくつかの態様は、上記の配列と少なくとも約９０％、約９５％または約９８％相同性である抗原の免疫原性フラグメントに関する。いくつかの態様において、抗原の組み合わせもまた用いられる。例えば、いくつかの態様において、グリアジンのフラグメントが用いられる。さらなる態様において、天然グリアジンおよび脱アミド化グリアジンフラグメントが用いられる。いくつかの態様において、セリアック病の処置に用いるためのセリアック病関連抗原に融合された抗原結合タンパク質の使用も提供される。セリアック病の処置方法も提供される。
【００１７】
抗体結合タンパク質の親和性成熟方法もまた提供する。いくつかの態様において、該方法は、非特異的結合体のファージライブラリーを枯渇させることを含み、ここで、該ファージライブラリーは、複数のファージを含み、各ファージは候補親和性成熟抗体または抗体フラグメントを発現する。いくつかの態様において、該方法は、除去されたライブラリーを標的抗原に曝露し、標的抗原に結合していないファージを除去し（例えば、洗浄または他の分離方法によって）、および標的抗原に結合しているファージを増幅することを含む。いくつかの態様において、曝露、除去および増幅工程は複数回繰り返される。例えば、いくつかの態様において、それらは２、３、４、５、６、７、８、９または１０回繰り返される。いくつかの態様において、繰り返しは、高親和性候補抗体または抗体フラグメントを発現するファージによる標的抗原の結合をもたらす選択圧を誘導する。いくつかの態様において、高親和性候補抗体または抗体フラグメントをスクリーニングする。いくつかの態様において、スクリーニングは、次世代シークエンシングを用いて実施する。いくつかの態様において、スクリーニングは、ＥＬＩＳＡを用いて実施する。いくつかの態様において、要すれば、ＮＧＳおよびＥＬＩＳＡを用いて高親和性候補抗体または抗体フラグメントをスクリーニングすること、および／または可溶性形態で発現される高親和性候補抗体または抗体フラグメントの能力を評価することの１以上をさらに含んでいてよい。
【００１８】
いくつかの態様において、少なくとも第１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣ ＣＤＲ）１および第２の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣ ＣＤＲ２）を含む第１の可変ドメインならびに少なくとも第２の重鎖相補性決定領域（ＨＣ ＣＤＲ）１および第２の重鎖ＣＤＲ（ＨＣ ＣＤＲ２）を含む第２の可変ドメインを含む、グリコフォリンＡに結合するための抗原結合タンパク質であって、該抗原結合タンパク質が、ヒトおよびカニクイザルグリコフォリンＡの両方に結合し得る、抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法または放射免疫アッセイにより測定される約２０ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でヒトグリコフォリンＡに結合する。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法または放射免疫アッセイにより測定されるように、抗原結合タンパク質より大きいＫｄを有する親配列から親和性成熟される。
【００１９】
いくつかの態様において、配列番号２４３−２６４の１以上と少なくとも約９５％同一である軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、配列番号２３５−２４２の１以上と少なくとも約９５％同一である軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（配列番号４９）を含む軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１およびＸ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（配列番号５０）を含む軽鎖ＣＤＲ２を含む抗原結合タンパク質であって、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５がそれぞれ、天然アミノ酸であり、Ｘ２がＹであり、Ｘ３がＹであり、Ｘ４がＹであり、かつＸ５がＮであるとき、Ｘ１がＫではなく；Ｘ１がＫであり、Ｘ３がＹであり、Ｘ４がＹであり、かつＸ５がＮであるとき、Ｘ２がＹではなく；Ｘ１がＫであり、Ｘ２がＹであり、Ｘ４がＹであり、かつＸ５がＮであるとき、Ｘ３がＹではなく；Ｘ１がＫであり、Ｘ２がＹであり、Ｘ３がＹであり、かつＸ５がＮであるとき、Ｘ４がＹではなく；そして、Ｘ１がＫであり、Ｘ２がＹであり、Ｘ３がＹであり、かつＸ４がＹであるとき、Ｘ５がＮではない、抗原結合タンパク質を提供する。
【００２０】
いくつかの態様において、軽鎖ＣＤＲ１が、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１がＦ、ＷおよびＹから選択され、Ｘ２がＦ、Ｗ、ＹおよびＱから選択される）（配列番号５１）、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１がＦ、ＷおよびＹから選択され、Ｘ２がＦ、ＷおよびＹから選択される）（配列番号５３）、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１がＦまたはＹであり、Ｘ２がＦ、ＷおよびＹから選択される）（配列番号５５）、およびＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１がＦまたはＹであり、Ｘ２がＦである）（配列番号５７）からなる群より選択される配列を含み、軽鎖ＣＤＲ２が、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３がＨおよびＹから選択され、Ｘ４がＨ、ＲおよびＫから選択され、Ｘ５が天然アミノ酸である）（配列番号５２）、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３がＨであり、Ｘ４がＨまたはＲであり、Ｘ５が天然アミノ酸である）（配列番号５４）、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３がＨであり、Ｘ４がＨであり、Ｘ５が天然アミノ酸である）（配列番号５６）、およびＸ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３がＨであり、Ｘ４がＨであり、Ｘ５がＶまたはＤである）（配列番号５８）からなる群より選択される配列を含む。
【００２１】
いくつかの態様において、請求項１５記載の抗原結合タンパク質は、ＱＱＦＴＳＳＰＹＴ（配列番号４５）を含む軽鎖ＣＤＲ３をさらに含む。
【００２２】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、ＧＹＴＦＮＳＹＦＭＨ（配列番号４６）または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体を含む重鎖ＣＤＲ１、ＧＭＩＲＰＮＧＧＴＴＤＹＮＥＫＦＫＮ（配列番号４７）または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体を含む重鎖ＣＤＲ２ならびにＷＥＧＳＹＹＡＬＤＹ（配列番号４８）または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体を含む重鎖ＣＤＲ３をさらに含む。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号３と少なくとも約９０％同一である重鎖可変ドメインをさらに含む。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号３と少なくとも約９５％同一である重鎖可変ドメインをさらに含む。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号３と少なくとも約９９％同一である重鎖可変ドメインをさらに含む。
【００２３】
いくつかの態様において、配列番号３と少なくとも約９０％同一である重鎖可変ドメインおよび配列番号１と少なくとも約９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、配列番号３と少なくとも約９５％同一である重鎖可変ドメインおよび配列番号１と少なくとも約９５％同一である軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、配列番号３と少なくとも約９９％同一である重鎖可変ドメインおよび配列番号１と少なくとも約９９％同一である軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を提供する。
【００２４】
いくつかの態様において、配列番号４−４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、配列番号５、９、１１、１２、１４、１８、１９、２０、２１、２２、２４、２７、２８、３１、３８および４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質を提供する。一態様において、配列番号２１のアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質を提供する。一態様において、配列番号４２のアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質を提供する。
【００２５】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質を含み、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原または少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントをさらに含む、免疫寛容を誘導するための組成物を提供する。いくつかの態様において、該組成物は、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原を含み、ここで、該少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ＭＰＢのフラグメント（複数可）、ＭＯＧのフラグメント（複数可）およびＰＬＰのフラグメント（複数可）の少なくとも１つを含む。
【００２６】
いくつかの態様において、組成物は、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原を含み、ここで、該少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原は、インスリン、プロインスリン、プレプロインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ−６５（ＧＡＤ−６５またはグルタミン酸デカルボキシラーゼ２）、ＧＡＤ−６７、グルコース−６ホスファターゼ２、膵島特異的グルコース６ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）、インスリノーマ関連タンパク質２β（ＩＡ−２β）、ＩＣＡ６９、ＩＣＡ１２（ＳＯＸ−１３）、カルボキシペプチダーゼＨ、イモージェン３８、ＧＬＩＭＡ３８、クロモグラニンＡ、ＨＳＰ−６０、カルボキシペプチダーゼＥ、ペリフェリン、グルコーストランスポーター２、肝細胞癌−腸−膵臓／膵臓関連タンパク質、Ｓ１００β、グリア線維性酸性タンパク質、再生遺伝子ＩＩ、膵臓十二指腸ホメオボックス１、筋強直性ジストロフィーキナーゼおよびＳＳＴ Ｇ−タンパク質共役受容体１−５の少なくとも１つを含む。
【００２７】
いくつかの態様において、組成物は、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原を含み、ここで、該少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原は、組織グルタミン転移酵素、高分子量グルテニン、低分子量グルテニン、グルテン、アルファ−グリアジン、ガンマ−グリアジン、オメガ−グリアジン、ホルデイン、セカリン、アベニンおよびそれらの脱アミド体の少なくとも１つを含む。
【００２８】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質を提供する。疾患、病状および障害の処置方法を提供する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（配列番号４９）を含む軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１およびＸ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（配列番号５０）を含む軽鎖ＣＤＲ２（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５が、それぞれ天然アミノ酸である）を含むか、または本質的にそれからなる。いくつかの態様において、Ｘ２がＹであり、Ｘ３がＹであり、Ｘ４がＹであり、かつＸ５がＮであるとき、Ｘ１はＫではない。ある態様において、Ｘ１がＫであり、Ｘ３がＹであり、Ｘ４がＹであり、かつＸ５がＮであるとき、Ｘ２はＹではない。ある態様において、Ｘ１がＫであり、Ｘ２がＹであり、Ｘ４がＹであり、かつＸ５がＮであるとき、Ｘ３はＹではない。ある態様において、Ｘ１がＫであり、Ｘ２がＹであり、Ｘ３がＹであり、かつＸ５がＮであるとき、Ｘ４はＹではない。ある態様において、Ｘ１がＫであり、Ｘ２がＹであり、Ｘ３がＹであり、かつＸ４がＹであるとき、Ｘ５はＮではない。いくつかの態様において、軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１はＦ、ＷおよびＹから選択され、Ｘ２はＦ、Ｗ、ＹおよびＱから選択される）（配列番号５１）を含む。ある態様において、軽鎖ＣＤＲ２は、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３はＨおよびＹから選択され、Ｘ４はＨ、ＲおよびＫから選択され、Ｘ５は天然アミノ酸である）（配列番号５２）を含む。ある態様において、軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１はＦ、ＷおよびＹから選択され、Ｘ２はＦ、ＷおよびＹから選択される）（配列番号５３）を含む。ある態様において、軽鎖ＣＤＲ２は、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３はＨであり、Ｘ４はＨまたはＲであり、Ｘ５は天然アミノ酸である）（配列番号５４）を含む。いくつかの態様において、軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１はＦまたはＹであり、Ｘ２はＦ、ＷおよびＹから選択される）（配列番号５５）を含む。ある態様において、軽鎖ＣＤＲ２は、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３はＨであり、Ｘ４はＨであり、Ｘ５は天然アミノ酸である）（配列番号５６）を含む。ある態様において、軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１はＦまたはＹであり、Ｘ２はＦである）（配列番号５７）を含む。ある態様において、軽鎖ＣＤＲ２は、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３はＨであり、Ｘ４はＨであり、Ｘ５はＶまたはＤである）（配列番号５８）を含む。
【００２９】
ある態様において、抗原結合タンパク質は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（配列番号４９）または１、２、３もしくは４個のアミノ酸置換（例えば、保存的置換）を含むその変異体を含む軽鎖ＣＤＲ１；および、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（配列番号５０）または１、２、３もしくは４個のアミノ酸置換（例えば、保存的置換）を含むその変異体を含む軽鎖ＣＤＲ２を含むか、または本質的にそれからなり、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は、それぞれ天然アミノ酸である。ある態様において、軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１はＦ、ＷおよびＹから選択され、Ｘ２はＦ、Ｗ、ＹおよびＱから選択される）（配列番号５１）または１、２、３もしくは４個のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、軽鎖ＣＤＲ２は、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３はＨおよびＹから選択され、Ｘ４はＨ、ＲおよびＫから選択され、Ｘ５は天然アミノ酸である）（配列番号５２）または１、２、３もしくは４個のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。ある態様において、軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１はＦ、ＷおよびＹから選択され、Ｘ２はＦ、ＷおよびＹから選択される）（配列番号５３）または１、２、３もしくは４個のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、軽鎖ＣＤＲ２は、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３はＨであり、Ｘ４はＨまたはＲであり、Ｘ５は天然アミノ酸である）（配列番号５４）または１、２、３もしくは４個のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。ある態様において、軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１はＦまたはＹであり、Ｘ２はＦ、ＷおよびＹから選択される）（配列番号５５）または１、２、３もしくは４個のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、軽鎖ＣＤＲ２は、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３はＨであり、Ｘ４はＨであり、Ｘ５は天然アミノ酸である）（配列番号５６）または１、２、３もしくは４個のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。ある態様において、軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１はＦまたはＹであり、Ｘ２はＦである）（配列番号５７）または１、２、３もしくは４個のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、軽鎖ＣＤＲ２は、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３はＨであり、Ｘ４はＨであり、Ｘ５はＶまたはＤである）（配列番号５８）または１、２、３もしくは４個のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。
【００３０】
いくつかの態様において、本発明はまた、軽鎖ＣＤＲ３を含む抗原結合タンパク質も提供する。ある態様において、軽鎖ＣＤＲ３は、ＱＱＦＴＳＳＰＹＴ（配列番号４５）を含む。ある態様において、軽鎖ＣＤＲ３は、１、２、３もしくは４個のアミノ酸置換を含む配列番号４５の変異体を含む。
【００３１】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質はまた、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および／または重鎖ＣＤＲ３も含む。ある態様において、重鎖ＣＤＲ１はＧＹＴＦＮＳＹＦＭＨ（配列番号４６）を含む。ある態様において、重鎖ＣＤＲ２はＧＭＩＲＰＮＧＧＴＴＤＹＮＥＫＦＫＮ（配列番号４７）を含む。ある態様において、重鎖ＣＤＲ３はＷＥＧＳＹＹＡＬＤＹ（配列番号４８）を含む。いくつかの態様において、本発明はまた、配列番号４６を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４７を含む重鎖ＣＤＲ２および／または配列番号４８を含む重鎖ＣＤＲ３の変異体も提供し、ここで該変異体は、１、２、３もしくは４個のアミノ酸置換を含む。
【００３２】
ある態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号３と少なくとも７０％（例えば、７０−７５％、７５−８０％、８０−８５％、８５−９０％、９０−９５％、９５−１００％、およびその中の重複範囲）同一である重鎖可変ドメインを含む。ある態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号１と少なくとも７０％（例えば、７０−７５％、７５−８０％、８０−８５％、８５−９０％、９０−９５％、９５−１００％、およびその中の重複範囲）同一である軽鎖可変ドメインを含む。
【００３３】
ある態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号４−４２の１以上のアミノ酸配列を含む。
【００３４】
ある態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号４−４２と少なくとも７０％（例えば、７０−７５％、７５−８０％、８０−８５％、８５−９０％、９０−９５％、９５−１００％、およびその中の重複範囲）同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号５、９、１１、１２、１４、１８、１９、２０、２１、２２、２４、２７、２８、３１、３８および／または４２を含む。一態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号２１を含む。一態様において、抗原結合タンパク質は配列番号４２を含む。
【００３５】
また、いくつかの態様において、ヒト化抗原結合タンパク質も提供する。いくつかのそのような態様において、抗原結合タンパク質は、以下の１以上を含む：（ａ）配列番号１３１−１４０から選択される第１のヒト軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ１）；（ｂ）配列番号１４１−１４８から選択される軽鎖フレームワーク領域のヒトＦＲ２；（ｃ）配列番号１４９−１５６から選択される軽鎖のヒトＦＲ３；（ｄ）配列番号１５７−１６２から選択される軽鎖のヒトＦＲ４；（ｅ）配列番号１０９−１１５から選択される第１のヒト重鎖フレームワーク領域（ＦＲ１）；（ｆ）配列番号１１６−１１９から選択される重鎖のヒトＦＲ２；（ｇ）配列番号１２０−１２７から選択される重鎖のヒトＦＲ３；および／または（ｈ）配列番号１２８−１３０から選択される重鎖のヒトＦＲ４。ある態様において、抗原結合タンパク質は、ヒト定常領域を含む。ある態様において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３および／またはＩｇＧ４であり得る。一態様において、ヒト定常領域はＩｇＧ１である。
【００３６】
ある態様において、抗原結合タンパク質は完全長抗体であるが、他の態様において、抗原結合タンパク質は、抗体の抗原結合フラグメントである。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖ＦｖまたはｓｃＦｖ、ジスルフィド結合したＦｖ、Ｖ ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディ（intrabody）、ＩｇＧ−ＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、四量体、三量体（triabody）、二量体、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含む。
【００３７】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、グリコフォリンＡ（ＧＰＡ）に特異的に結合する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、ヒトＧＰＡ、カニクイザルＧＰＡ、ブタＧＰＡ、イヌＧＰＡ、マウスＧＰＡおよび／またはラットＧＰＡの１以上に特異的に結合する（例えば、抗原結合タンパク質は二重特異性または多重特異性である）。一態様において、結合は、ヒトＧＰＡに特異的である。ある態様において、抗原結合タンパク質は、１．０ｎＭより大きい（１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１２．０、１４．０、２０、５０またはそれ以上およびその中の重複範囲の）ＫｄでヒトＧＰＡに結合する。いくつかのそのような態様において、結合親和性は、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法および／または放射免疫アッセイにより測定される。
【００３８】
ある態様において、抗原結合タンパク質は親和性成熟されている。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、１０Ｆ７、Ｔｅｒ１１９、ＣＬＢ−ｅｒｙ−１（ＡＭＥ−１）、ＥＰＲ８２００、ＹＴＨ８９．１、ＥＰＲ８１９９、ＪＣ１５９、ＧＹＰＡ／２８０、ａｂ４０８４４、ＨＩ２６４、ＧＰＨＮ０２、ＪＣ１５９、ＳＰＭ５９９、ＥＰＲ８２００、ＧＹＰＡ／１７２５Ｒ、ａｂ１１２２０１および／またはＢＲＩＣ２５６の１以上の親和性成熟変異体である。一態様において、抗原結合タンパク質は、１０Ｆ７の親和性成熟変異体である。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、１０Ｆ７、Ｔｅｒ１１９、ＣＬＢ−ｅｒｙ−１（ＡＭＥ−１）、ＥＰＲ８２００、ＹＴＨ８９．１、ＥＰＲ８１９９、ＪＣ１５９、ＧＹＰＡ／２８０、ａｂ４０８４４、ＨＩ２６４、ＧＰＨＮ０２、ＪＣ１５９、ＳＰＭ５９９、ＥＰＲ８２００、ＧＹＰＡ／１７２５Ｒ、ａｂ１１２２０１、ＢＲＩＣ２５６、それらのフラグメントおよび／またはそれらの誘導体とＧＰＡとの結合について競合する。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、１０Ｆ７、ＣＬＢ−ｅｒｙ−１（ＡＭＥ−１）、ＥＰＲ８２００、ＹＴＨ８９．１、ＥＰＲ８１９９、ＪＣ１５９、ＧＹＰＡ／２８０、ａｂ４０８４４、ＨＩ２６４、ＧＰＨＮ０２、ＳＰＭ５９９、ＧＹＰＡ／１７２５Ｒ、ａｂ１１２２０１、ａｂ１１４３３０、ａｂ２１９８９６、ＢＲＩＣ２５６、それらのフラグメントおよび／またはそれらの誘導体の、ヒトＧＰＡへの結合を少なくとも１０％（例えば、１０−１５％、１５−２０％、２０−２５％、２５−３０％、３０−４０％、４０−５０％、５０−６０％、６０−７０％、７０−８０％、８０−９０％、９０−１００％、およびその中の重複範囲）阻害する。一態様において、結合の阻害は、少なくとも約５０％である。
【００３９】
いくつかの態様において、配列番号５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７６、７８、８０、８１、８３、８５、８７、８８、９０、９１、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７および１０８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；ならびに／または配列番号６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７５、７７、７９、８２、８４、８６、８９、９２、９４、９７、１００、１０３および１０６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２を含む、ヒトＧＰＡに特異的に結合するヒト化親和性成熟抗原結合タンパク質を提供する。
【００４０】
また、いくつかの態様において、以下の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個を含む、ヒトＧＰＡに特異的に結合する抗原結合タンパク質も提供する：（ａ）配列番号５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７６、７８、８０、８１、８３、８５、８７、８８、９０、９１、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７および１０８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７５、７７、７９、８２、８４、８６、８９、９２、９４、９７、１００、１０３および１０６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号４５または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体を含む軽鎖ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号４６または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体を含む重鎖ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号４７または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体を含む重鎖ＣＤＲ２；（ｆ）配列番号４８または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体を含む重鎖ＣＤＲ３；（ｇ）配列番号１３１−１４０から選択される第１のヒト軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ１）、配列番号１４１−１４８から選択される軽鎖フレームワーク領域のヒトＦＲ２、配列番号１４９−１５６から選択される軽鎖のヒトＦＲ３、および配列番号１５７−１６２から選択される軽鎖のヒトＦＲ４；（ｈ）配列番号１０９−１１５から選択される第１のヒト重鎖フレームワーク領域（ＦＲ１）、配列番号１１６−１１９から選択される重鎖のヒトＦＲ２、配列番号１２０−１２７から選択される重鎖のヒトＦＲ３、および配列番号１２８−１３０から選択される重鎖のヒトＦＲ４；（ｉ）ヒト重鎖定常領域；および／または、（ｊ）ヒト軽鎖定常領域。
【００４１】
いくつかの態様において、本発明はまた、本明細書に記載の抗原結合タンパク質をコード化する単離ポリヌクレオチドを提供する。ある態様において、該単離ポリヌクレオチドは、配列番号１−４２の１以上と少なくとも７０％（例えば、２５−５０％、５０−７５％、７５−１００％、１００−１５０％、またはそれ以上およびその中の重複範囲）同一のポリペプチドをコードする。いくつかの態様において、本発明はまた、本明細書に記載のポリヌクレオチドの１以上を含むベクターも提供する。さらに、本明細書に記載のベクターを含む宿主細胞株（例えば、ＣＨＯ、ｋ１ＳＶ、ＸＣｅｅｄ、ＣＨＯＫ１ＳＶおよびＧＳ−ＫＯ）も、いくつかの態様において提供される。
【００４２】
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の産生方法であって、抗原結合タンパク質が産生される条件下で本明細書に記載の細胞株を培養し、抗原結合タンパク質を回収することを含む、抗原結合タンパク質の産生方法を提供する。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、１以上の軽鎖および１以上の重鎖を含む。いくつかの態様において、重鎖および軽鎖は、別個のベクターにコード化されるが、他の態様において、重鎖および軽鎖は、同じベクターにコード化される。
【００４３】
本明細書に記載の抗原結合タンパク質を含む医薬組成物は、いくつかの態様において提供される。ある態様において、薬学的に許容される担体も提供される。ある態様において、医薬組成物は、静脈内投与のために剤形される。
【００４４】
いくつかの態様において、免疫寛容を誘導する組成物を提供する。ある態様において、組成物は、本明細書に記載の抗原−タンパク質および少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原または少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントを含むか、または本質的にそれからなる。ある態様において、寛容誘導性抗原は、対象が寛容誘導性抗原に曝露されたときに、該対象において望ましくない免疫応答を誘発することができる。一態様において、寛容誘導性抗原は、内因性抗原（例えば、自己抗原（複数か））または外因性抗原（例えば、外来抗原（複数可））であり得る。別の態様において、寛容誘発性抗原は、移植レシピエントが望ましくない免疫応答（例えば、移植拒絶）を発症する外来移植抗原、患者が望ましくない免疫応答（例えば、アレルギー性応答または過敏症）を発症する外来食品、動物、植物または環境抗原、患者が望ましくない免疫反応（例えば、過敏症および／または治療活性の低下）を発症する治療薬、患者が望ましくない免疫反応（例えば、自己免疫疾患）を発症する自己抗原であり得る。いくつかの態様において、送達ベクター（例えば、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクター）を、治療薬を送達するために用いるが、それ自体が免疫応答を誘導することができる。したがって、いくつかの態様によれば、そのようなベクターの少なくとも一部に対する免疫寛容を誘導する組成物および方法が提供される。
【００４５】
いくつかの態様において、本明細書に記載の処置方法および／または組成物の使用は、以下の条件の１以上の予防または処置のために提供される：移植拒絶反応、１型糖尿病、セリアック病および／または多発性硬化症。処置方法では、有効量の組成物が対象（例えば、ヒトまたは家畜）に送達される。望ましくない免疫応答がいくつかの態様で開示されているが、他の態様は、非免疫状態（例えば、エリスロサイトへの組成物の標的化から利益を得る状態）を処置するために用いられる。ある態様において、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の診断方法および診断用途も提供する。特定の態様において、投与用の１以上の化合物および装置（注射器、容器、吸入器など）、ならびに使用説明書を含むキットを提供する。
【００４６】
いくつかの態様において、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、その免疫原性断片および免疫原性のミモトープの少なくとも１つを含む。ある態様において、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントは、配列番号１６９−１７５および１８６−２０２の少なくとも１つを含む。いくつかのそのような態様において、多発性硬化症の処置における組成物の使用を提供する。
【００４７】
いくつかの態様において、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原は、インスリン、プロインスリン、プレプロインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ−６５（ＧＡＤ−６５またはグルタミン酸デカルボキシラーゼ２）、ＧＡＤ−６７、グルコース−６ホスファターゼ２、膵島特異的グルコース６ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）、インスリノーマ関連タンパク質２β（ＩＡ−２β）、ＩＣＡ６９、ＩＣＡ１２（ＳＯＸ−１３）、カルボキシペプチダーゼＨ、イモージェン３８、ＧＬＩＭＡ３８、クロモグラニンＡ、ＨＳＰ−６０、カルボキシペプチダーゼＥ、ペリフェリン、グルコーストランスポーター２、肝細胞癌−腸−膵臓／膵臓関連タンパク質、Ｓ１００β、グリア線維性酸性タンパク質、再生遺伝子ＩＩ、膵臓十二指腸ホメオボックス１、筋強直性ジストロフィーキナーゼ、ＳＳＴ Ｇ−タンパク質共役受容体１−５、その免疫原性フラグメント、およびその免疫原性ミモトープの少なくとも１つを含む。ある態様において、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントは、配列番号２０４−２１４の少なくとも１つを含む。いくつかのそのような態様において、１型糖尿病の処置における組成物の使用を提供する。
【００４８】
いくつかの態様において、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原は、組織グルタミン転移酵素、高分子量グルテニン、低分子量グルテニン、グルテン、アルファ−グリアジン、ガンマ−グリアジン、オメガ−グリアジン、ホルデイン、セカリン、アベニン、それらの脱アミド体、その免疫原性フラグメント、およびその免疫原性ミモトープの少なくとも１つを含む。ある態様において、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントは、配列番号１８２−１８５および２１５の少なくとも１つを含む。いくつかのそのような態様において、セリアック病の処置における組成物の使用を提供する。
【００４９】
いくつかの態様において、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原は、ＭＨＣクラスＩタンパク質、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、マイナーな血液型抗原、ＲｈＣＥ、Ｋｅｌｌ、Ｋｉｄｄ、Ｄｕｆｆｙ、Ｓｓ、その免疫原性フラグメント、およびその免疫原性ミモトープの少なくとも１つを含む。いくつかのそのような態様において、移植拒絶の処置または予防における組成物の使用を提供する。
【００５０】
いくつかの態様によれば、ＲＡＴＹＩＬ、ＲＮＩＹＩＬ、ＫＹＴＹＩＬ、ＶＨＴＹＩＬ、ＲＮＶＦＩＬ、ＲＮＩＹＬＬ、ＲＫＴＹＩＬ、ＬＮＶＹＩＬ、ＫＡＴＹＩＬ、ＲＭＴＹＩＬ、ＫＴＶＹＩＬ、ＫＨＶＹＩＬ、ＲＮＩＴＭＩＬ、ＫＤＴＹＩＬ、ＩＮＳＹＩＬ、ＱＨＴＹＩＬ、ＲＨＳＹＩＬ（配列番号２６９−２８５）およびそれらの組合せから選択されるアミノ酸を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ Ｈ１）を含む抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、アミノ酸配列中の対応する位置にＫＤＴＹＭＬ（配列番号２８６）の配列を含む親配列から成熟される。
【００５１】
さらなる態様は、ＦＲＮＮＫ、ＦＲＮＳＫ、ＦＫＮＧＫ、ＦＲＮＡＫ、ＦＲＴＧＫ、ＦＫＮＤＫ、ＹＫＮＧＫ（配列番号２８７−２９３）およびそれらの組合せから選択されるアミノ酸配列を含む第１の軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１ａ）を含む抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、アミノ酸配列中の対応する位置にＹＳＮＧＫＴ（配列番号２９４）の配列を含む親配列から成熟される。
【００５２】
さらに追加の態様は、ＬＳＲＴＳ、ＮＴＲＴＳ、ＮＴＲＰＳ、ＬＮＲＬＨ、ＮＴＲＬＡ、ＮＳＲＬＳ、ＬＳＲＶＳ、ＬＮＲＶＳ、ＬＮＲＬＳ、ＮＳＲＬＨ、ＳＳＲＬＳ、ＳＳＲＶＳ、ＳＮＲＬＨ、ＮＴＲＶＳ、ＳＮＲＶＳ、ＨＳＲＬＳ、ＳＳＲＬＡ、ＦＮＲＶＮ、ＬＮＲＭＳ、ＬＮＲＩＳ、ＬＳＨＰＨ（配列番号２９５−３１５）およびそれらの組合せから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ２）を含む抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、ＣＤＬＲ２は、アミノ酸配列中の対応する位置にＶＳＫＬＤ（配列番号３１６）の配列を含む親配列から成熟される。
【００５３】
いくつかの態様において、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＬ１ａおよび／またはＣＤＲＬ２を含む抗原結合タンパク質は、ヒト標的抗原およびカニクイザル標的抗原に結合する。いくつかの態様において、ヒト標的抗原およびカニクイザル標的抗原は、グリコフォリンＡである。いくつかの態様において、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＬ１ａおよび／またはＣＤＲＬ２を含む抗原結合タンパク質は、寛容が望まれる抗原に結合される。
【００５４】
いくつかの態様において、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原または少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントにＮＧＳ融合（例えば、組み換え的に結合、化学的に結合など）または他の結合を用いて親和性成熟させた抗原結合タンパク質を含む、免疫寛容を誘導するための組成物を提供する。いくつかの態様において、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ＭＰＢのフラグメント（複数可）、ＭＯＧのフラグメント（複数可）およびＰＬＰのフラグメント（複数可）の少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントは、配列番号１６９−１７５および１８６−２０２の少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントは、配列番号１６９、１７１−１７３、１７５および１８８−２０２の少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、そのような態様は、多発性硬化症の処置における使用のためのものである。
【００５５】
さらなる態様において、組成物は、ＮＧＳおよび少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原を用いて親和性成熟された抗原結合タンパク質を含み、ここで、該少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原が、インスリン、プロインスリン、プレプロインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ−６５（ＧＡＤ−６５またはグルタミン酸デカルボキシラーゼ２）、ＧＡＤ−６７、グルコース−６ホスファターゼ２、膵島特異的グルコース６ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）、インスリノーマ関連タンパク質２α（ＩＡ−２α）、ＩＣＡ６９、ＩＣＡ１２（ＳＯＸ−１３）、カルボキシペプチダーゼＨ、イモージェン３８、ＧＬＩＭＡ３８、クロモグラニンＡ、ＨＳＰ−６０、カルボキシペプチダーゼＥ、ペリフェリン、グルコーストランスポーター２、肝細胞癌−腸−膵臓／膵臓関連タンパク質、Ｓ１００α、グリア線維性酸性タンパク質、再生遺伝子ＩＩ、膵臓十二指腸ホメオボックス１、筋強直性ジストロフィーキナーゼおよびＳＳＴ Ｇ−タンパク質共役受容体１−５の少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントを含み、ここで、該少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントが配列番号２０４−２１４を含む。ある態様において、かかる組成物は、１型糖尿病の処置に用いるためものである。
【００５６】
さらなる態様において、組成物は、ＮＧＳおよび少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原を用いて親和性成熟された抗原結合タンパク質を含み、ここで、該少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原は、組織グルタミン転移酵素、高分子量グルテニン、低分子量グルテニン、グルテン、アルファ−グリアジン、ガンマ−グリアジン、オメガ−グリアジン、ホルデイン、セカリン、アベニンおよびそれらの脱アミド体の少なくとも１つを含む。ある態様において、組成物は、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントを含み、ここで、該少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントは、配列番号１８２−１８５および２１５を含む。ある態様において、かかる組成物は、セリアック病の処置に用いるためのものである。
【００５７】
本明細書中、多発性硬化症、１型糖尿病またはセリアック病の処置法であって、ＮＧＳおよびＭＳ、Ｔ１Ｄまたはセリアック病に関連付けられた抗原もしくは免疫原性フラグメントを用いて親和性成熟された抗原結合タンパク質を対象に投与することを含む、処置方法を提供する。
【００５８】
また、本明細書中、抗体もしくは抗体フラグメントを親和性成熟させて標的に対する親和性を高める方法であって、非特異的結合体のファージライブラリーを枯渇させ（ここで、該ファージライブラリーは、複数のファージを含み、各ファージが候補の親和性成熟した抗体もしくは抗体フラグメントを発現する）、枯渇したライブラリーを標的抗原に曝露し、洗浄により標的抗原に結合していないファージを除去し、標的抗原に結合しているファージを増幅させ、曝露、除去および増幅工程を複数回繰り返して、高親和性候補抗体または抗体フラグメントを発現するファージによる標的抗原の結合をもたらす選択圧を誘導し、そして次世代シークエンシングを用いて高親和性候補抗体または抗体フラグメントをスクリーニングすることを含む方法を提供する。
【００５９】
いくつかの態様において、該方法は、ＥＬＩＳＡを用いて高親和性候補抗体または抗体フラグメントをスクリーニングすること、および高親和性候補抗体または抗体フラグメントが可溶性形態で発現される能力を評価することの１以上をさらに含んでいてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１Ａ−１Ｃは、親和性成熟キャンペーンに用いられたヒト化１０Ｆ７抗体の配列を示す。図１Ａは、追加の（follow-on）親和性成熟のための限定されない抗体配列として選択されたヒト化抗体クローン（“ｍ１０”）の定常領域および可変領域の軽鎖および重鎖の配列を示す。親和性成熟キャンペーンにおける相補性決定領域の無作為化された抗原結合残基を、太字および下線で示す。図１Ｂは、ＫａｂａｔおよびＣｌｏｔｈｉａスキームに従って、可変領域の軽鎖および重鎖のＣＤＲ、ならびにパラトーム（Paratome）抗原結合領域（ＡＢＲ）の位置を示す。図１Ｃは、ＴＲＩＭ（トリヌクレオチド突然変異誘発）によって生成された５つの別個のファージディスプレイライブラリーを示す。
【図２】図２は、いくつかの態様に従って用いられる親和性成熟選択プロセスの概略を示す。ファージディスプレイライブラリーを、組換えビオチン化ヒトグリコフォリンＡ（ＧＰＡ）に対して３回選択し、その後ＥＬＩＳＡによりさらにスクリーニングした。陽性クローンを配列決定し、組換え発現させ、精製し、そしてそれらの親和性を、ＥＬＩＳＡ、バイオレイヤー干渉法、表面プラズモン共鳴およびフローサイトメトリーアッセイによって特徴付けた。
【図３】図３は、親和性成熟したｆＡｂの軽鎖可変ドメインの配列を示す。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の無作為化された抗原結合残基を、太字および下線で示す。
【図４】図４は、３−１０３抗体可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）の配列解析を示す。
【図５】図５は、本明細書に記載の抗体（フラグメントを含む）の親和性成熟の限定されない模式図を示す。
【図６】図６は、抗体を親和性成熟させるために用いられる方法フローの限定されない概略図を示す。
【図７】図７は、本明細書に記載のような選択スキームの限定されない態様を示す。
【図８】図８Ａ−８Ｃは、ＣＤＲ−Ｌ１ｂライブラリーの成熟キャンペーンに関連するデータを示す。図８Ａは、成熟化キャンペーンからのヒットの収斂配列（convergence sequence）を示す。図８Ｂは、様々なＣＤＲ領域が同定された３−１０３の概略リボン図を示す。図８Ｃは、親抗体フラグメント（非成熟）と比較した、候補成熟抗体フラグメントのヒトエリスロサイトへの結合の程度を示す。
【図９】図９Ａ−９Ｉは、ＣＤＲＬ１ｂライブラリーからスクリーニングされ得られた抗体の増強された親和性に対する配列濃縮度（fold sequence enrichment）に関連するデータを示す。野生型３−１０３を、参考のために矢印で示す。
【図１０】図１０Ａ−１０Ｄは、培養上清から単離されたＣＤＲＬ１ａクローンに関するデータを示す。図１０Ａは、親抗体フラグメント（未成熟）と比較した、候補成熟抗体フラグメントのヒトエリスロサイトへの結合の程度を示す。図１０Ｂは、成熟キャンペーンからのヒットの収斂配列を示す。図１０Ｃは、ＥＬＩＳＡおよびＮＧＳにより同定された配列の数および親和性の比較を示す。図１０Ｄは、ＥＬＩＳＡまたはＮＧＳ法によって同定され、可溶性Ｆａｂとして発現され得る配列の割合の内訳を、ヒトエリスロサイトに対する親和性によって分類して示す（特記−このグラフは、親和性によって試験されたそれらのＦａｂの内訳を示しており、すべての親和性範囲にわたるＦａｂの種類の合計は１００％に等しい）。
【図１１】図１１Ａ−１１Ｆは、ＣＤＲＬ１ａライブラリーからスクリーニングされた得られた抗体の増強された親和性に対する配列濃縮度に関連するデータを示す。野生型３−１０３を、参考のために矢印で示す。
【図１２】図１２Ａ−１２Ｄは、培養上清から単離されたＣＤＲＬ２クローンに関連するデータを示す。図１２Ａは、親抗体フラグメント（未成熟）と比較した、候補成熟抗体フラグメントのヒトエリスロサイトへの結合の程度を示す。図１２Ｂは、成熟化キャンペーンからのヒットの収斂配列を示す。図１２Ｃは、ＥＬＩＳＡおよびＮＧＳによって同定された配列の数および親和性の比較を示す。図１２Ｄは、ＥＬＩＳＡ法またはＮＧＳ法によって同定され、可溶性Ｆａｂとして発現され得る配列の割合の内訳を、ヒトエリスロサイトに対する親和性によって分類して示す（特記−このグラフは、親和性によって試験されたそれらのＦａｂの内訳を示しており、すべての親和性範囲にわたるＦａｂの種類の合計は１００％に等しい）。
【図１３】図１３Ａ−１３Ｆは、第１ラウンドから第３ラウンドまでのスクリーニングアウトプット（output）からのＣＤＲＬ２ライブラリーからの配列の濃縮度に関連するデータを示す。野生型３−１０３を、参考のために矢印で示す。
【図１４】図１４Ａ−１４Ｄは、培養上清から単離されたＣＤＲＨ１クローンに関するデータを示す。図１４Ａは、親抗体フラグメント（未成熟）と比較して、候補成熟抗体フラグメントのヒトエリスロサイトへの結合の程度を示す。図１４Ｂは、成熟キャンペーンからのヒットの収斂配列を示す。図１４Ｃは、ＥＬＩＳＡおよびＮＧＳによって同定された配列の数および親和性の比較を示す。図１４Ｄは、ＥＬＩＳＡ法またはＮＧＳ法によって同定され、可溶性Ｆａｂとして発現され得る配列の割合の内訳を、ヒトエリスロサイトに対するそれらの親和性によって分類して示す（特記−このグラフは、親和性によって試験されたそれらのＦａｂの内訳を示しており、すべての親和性範囲にわたるＦａｂの種類の合計は１００％に等しい）。
【図１５】図１５Ａ−１５Ｆは、第１ラウンドから第３ラウンドまでのスクリーニングアウトプットからのＣＤＲＨ１ライブラリーからの配列の関連する濃縮度を示す。野生型３−１０３を参考のために矢印で示す。
【図１６】図１６Ａ−１６Ｄは、培養上清から単離されたＣＤＲＨ２クローンに関連するデータを示す。図１６Ａは、親抗体フラグメント（未成熟）と比較した、候補成熟抗体フラグメントのヒトエリスロサイトへの結合の程度を示す。図１６Ｂは、成熟キャンペーンからのヒットの収斂配列を示す。図１６Ｃは、ＥＬＩＳＡ、マニュアル変異設計およびＮＧＳによって同定された配列の数および親和性の比較を示す。図１６Ｄは、ＥＬＩＳＡ法、マニュアル変異設計法またはＮＧＳ法によって同定され、可溶性Ｆａｂとして発現され得る配列の割合の内訳を、ヒトエリスロサイトに対する親和性によって分類して示す（特記−このグラフは、親和性によって試験されたそれらのＦａｂの内訳を示しており、全ての親和性範囲にわたるＦａｂの種類の合計は１００％に等しい）。
【図１７】図１７Ａ−１７Ｉは、第１ラウンドから第３ラウンドまでのスクリーニング結果からのＣＤＲＨ２ライブラリーからの配列の関連する濃縮度を示す。野生型３−１０３を参考のために矢印で示す。
【図１８】図１８Ａ−１８Ｂは、ヒト（１８Ａ）またはカニクイザル（１８Ｂ）エリスロサイトへの、ＣＤＲＬ１ａ、Ｌ２およびＨ１ライブラリーから選択されたクローンの結合に関連するデータを示す。
【図１９】図１９は、示されたＣＤＲライブラリーからの増強された親和性の効率の分析を示す。
【図２０】図２０は、選択されたクローンの配列ならびにヒトおよびカニクイザルの親和性に関連するデータを示す。
【図２１】図２１Ａ−２１Ｆは、ＥＬＩＳＡベース技術または次世代シークエンシング（ＮＧＳ）ベース技術のいずれかによる抗体親和性の増強の比較に関連して、先行する図に示されたデータのまとめを提供する。
【図２２】図２２は、赤血球上の標的に対する親和性の増加と疾患重篤度の改善とを相関付けるデータを示す。
【図２３】図２３Ａ−２３Ｃは、親和性改善に相関する選択された配列の濃縮の評価に関連するデータを示す。図２３Ａは、様々なライブラリーからの配列濃縮度対親和性の散布図を示す。図２３Ｂは、野生型および野生型様配列のために濃縮されたライブラリー１からの親和性データを示す。図２３Ｃは、非親配列のために濃縮され、増強された親和性を示したライブラリー４からの親和性データを示す。
【図２４】図２４は、ヒト赤血球に対して増強された親和性を示した選択クローンを用いたカニクイザルエリスロサイトに対する親和性データを示す。
【図２５】図２５Ａ−２５Ｂは、野生型（Ａ）に対する増強された親和性を示すクローン（Ｂ）についての動態解析データを示す。
【図２６】図２６は、ＥＬＩＳＡおよびＮＧＳスクリーニング法で比較した追加のまとめグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
詳細な説明
グリコフォリンＡに結合する抗原結合タンパク質
赤血球（ＲＢＣ）としても知られるエリスロサイトは、哺乳動物血液において最も豊富な細胞タイプである。それらは、小さな円盤状の無核の両面中窪み円盤状（biconcave）の細胞であり、その主な機能は、組織間で酸素および二酸化炭素を運搬することである。赤血球は、ヒト血液型抗原、グリコフォリン、バンド３およびルイス抗原を含む細胞表面マーカーの特徴的なセットを発現している。
【００６２】
ヒトグリコフォリンＡ（ＧＰＡ）は、ＧＹＰＡ遺伝子（ＣＤ２３５ａ）によってコードされるタンパク質であり、高度にグリコシル化された細胞外ドメインを有する単一の膜貫通ドメインタンパク質を意味する。グリコフォリンＡは、ＲＢＣにより赤血球系細胞（erythroid cell）および血液中にのみに発現される。
【００６３】
いくつかの態様は、グリコフォリンＡに結合する抗体のような抗原結合タンパク質に関する。ある態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、グリコフォリンＡに特異的に結合する、完全長ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、かかる抗体の結合フラグメントおよび誘導体、ならびにポリペプチドである。いくつかの態様は、親和性成熟抗原結合タンパク質に関する。さらに、そのような抗体、抗体フラグメントおよび誘導体およびポリペプチドをコードする核酸、かかるポリヌクレオチドを含む細胞、かかる抗体、抗体フラグメントおよび誘導体およびポリペプチドの作製方法、ならびにかかる抗体、抗体フラグメントおよび誘導体およびポリペプチドの使用方法が記載されている。
【００６４】
高度に相同性のＧＰＡおよびグリコフォリンＢ（ＧＰＢ）は、遺伝子重複事象後に他方から一方が派生した２つの遺伝子によってコードされている。ＧＰＢの２６個のＮ末端アミノ酸の配列は、ＧＰＡのＮ末端の２つの対立遺伝子のうち一方と同一である。ＧＰＡおよびＧＰＢは、高度にグリコシル化された細胞外ドメインを有する単一の膜貫通ドメインタンパク質である。ＧＰＡおよびＧＰＢは、赤血球膜内で結合することが見出されている。ある態様において、抗原結合タンパク質は、単量体形態でＧＰＡに結合する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、二量体形態でＧＰＡに結合する。ある態様において、抗原結合タンパク質はＧＰＢに結合する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、単量体形態でＧＰＢに結合する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、二量体形態でＧＰＢに結合する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、ＧＰＡおよびＧＰＢのヘテロ二量体に結合する。
【００６５】
グリコフォリンは、いくつかの血液型抗原、例えば、ＧＰＡ上のＭおよびＮ血液型抗原、ならびにＧＰＢ上のＮ、Ｓおよびｓ抗原を運ぶ。さらに、グリコフォリンは、血液型に依存しない抗原を運び、血液型に依存しない分子上に常に存在するこのようなエピトープを標的とするいくつかのマウスモノクローナル抗体が存在する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、分子によって運ばれる血液型抗原とは無関係に赤血球上のＧＰＡを認識する。ある態様において、抗原結合タンパク質の反応性は、血液型表現型がＭ＋Ｎ＋、Ｍ−Ｎ＋、またはＭ＋Ｎ−であるかどうかに関係なく同じである。ある態様において、抗原結合タンパク質は、このタンパク質によって運ばれる血液型決定因子とは関係のないＧＰＡのエピトープを認識する。
【００６６】
ある態様において、抗原結合タンパク質は、単一の種のＧＰＡに結合する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、ヒト、カニクイザル、ブタ、イヌ、マウスおよびラットを含むがこれらに限定されない、１種以上のＧＰＡに結合する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、ヒトＧＰＡに結合する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、カニクイザルＧＰＡに結合する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、ヒトＧＰＡおよびカニクイザルＧＰＡに結合する。
【００６７】
抗原結合タンパク質
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質を提供する。本明細書で用いる用語“抗原結合タンパク質”とは、その通常の意味を有し、また、抗原に結合する抗原結合フラグメント、および要すれば、抗原結合フラグメントが抗原への抗原結合タンパク質の結合を促進するコンフォメーションを採用するのを可能にする足場またはフレームワーク部分を含むタンパク質を意味する。ある態様において、抗原はＧＰＡまたはそのフラグメントである。ある態様において、抗原結合フラグメントは、抗原に結合する抗体からの少なくとも１つのＣＤＲを含む。ある態様において、抗原結合フラグメントは、抗原に結合する抗体の重鎖または抗原に結合する抗体の軽鎖からの３つのＣＤＲのすべてを含む。さらにある態様において、抗原結合フラグメントは、抗原に結合する抗体の重鎖に由来する３個のＣＤＲおよび軽鎖に由来する３個のＣＤＲのすべての６個のＣＤＲを含む。ある態様において、抗原結合フラグメントは、抗原に結合する抗体からの１個、２個、３個、４個、５個または６個のＣＤＲを含み、いくつかの態様において、ＣＤＲは、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲの何れかの組合せであり得る。ある態様において、抗原結合フラグメントは抗体フラグメントである。
【００６８】
抗原結合タンパク質の限定されない例としては、抗体、抗体フラグメント（例えば、抗体の抗原結合フラグメント）、抗体誘導体および抗体類縁体が挙げられる。さらなる具体例としては、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ナノボディ（例えば、ラクダ重鎖抗体のＶＨドメイン；ＶＨＨフラグメント）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆｄフラグメントおよび相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。これらの分子は、ヒト、マウス、ラット、ウサギもしくはブタ、イヌまたはラクダなどの何れかの哺乳動物由来のものであり得る。抗体フラグメントは、インタクトな抗体と標的抗原との結合について競合してよく、該フラグメントは、インタクトな抗体の改変（例えば、酵素的または化学的切断）によって産生されるか、または組換えＤＮＡ技術もしくはペプチド合成を用いて新たに（デノボで）合成され得る。抗原結合タンパク質は、例えば、移植されたＣＤＲまたはＣＤＲ誘導体を有する代替タンパク質足場または人工足場を含み得る。そのような足場には、例えば、抗原結合タンパク質の三次元構造を安定化するために導入された変異を含む抗体由来足場、ならびに例えば、生体適合性ポリマーを含む完全合成足場が含まれるが、これらに限定されない。さらに、ペプチド抗体模倣体（“ＰＡＭ”）、ならびにフィブロネクチン成分を足場として利用する抗体模倣体に基づく足場を用いることができる。
【００６９】
ある態様において、抗原結合タンパク質は、単一のポリペプチド鎖または複数のポリペプチド鎖に組み込まれた１以上の抗体フラグメントを含む。例えば、抗原結合タンパク質としては、二重特異性抗体；イントラボディ；ドメイン抗体（ペプチドリンカーにより連結された単一のＶＬもしくはＶＨドメインまたは２以上のＶＨドメイン）；マキシボディ（Ｆｃ領域に融合された２つのｓｃＦｖ）；三量体；四量体；ミニボディ（ＣＨ３ドメインに融合されたｓｃＦｖ）；ペプチボディ（Ｆｃ領域に結合された１以上のペプチド）；線形抗体（相補的軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムＦｄセグメント(ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１））；小型モジュラー免疫医薬品（small modular immunopharmaceutical）；および、免疫グロブリン融合タンパク質（例えば、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ、ＩｇＧ−Ｆａｂ、２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ、４ｓｃＦｖ−ＩｇＧ、ＶＨ−ＩｇＧ、ＩｇＧ−ＶＨおよびＦａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
ある態様において、抗原結合タンパク質は、免疫グロブリンの構造を有する。本明細書で用いる用語“免疫グロブリン”は、その通常の意味を有し、また、各四量体が２つの同一ポリペプチド鎖対を含み、各対が、１つの“軽”鎖（約２５ｋＤａ）および１つの“重”鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有する、四量体分子も意味し得る。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識を担う約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を定義する。
【００７１】
軽鎖および重鎖内では、可変領域（Ｖ）および定常領域（Ｃ）は、約１２個以上のアミノ酸の“Ｊ”領域によって結合されており、重鎖はまた約１０個以上のアミノ酸の“Ｄ”領域を含む。各軽／重鎖対の可変領域は、インタクトな免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように抗体結合部位を形成する。
【００７２】
免疫グロブリン鎖は、相補性決定領域またはＣＤＲとも称される３つの超可変領域によって結合された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同一の一般的構造を示す。Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖および重鎖の両方とも、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。
【００７３】
ヒト軽鎖は、カッパおよびラムダ軽鎖として分類される。本明細書でも用いる用語“軽鎖”は、その通常の意味を有し、また、アミノ末端からカルボキシル末端へ、単一の免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）および単一の免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むポリペプチドも意味し得る。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）およびイプシロン（ε）に分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして定義する。本明細書で用いる用語“重鎖”は、その通常の意味を有し、アミノ末端からカルボキシル末端へ、単一の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）および要すれば免疫グロブリン重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）を含むポリペプチドを意味し得る。ＩｇＧクラスは、さらにサブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に分類される。ＩｇＡクラスは、さらにサブクラス、すなわちＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分類される。ＩｇＭには、サブクラスＩｇＭ１およびＩｇＭ２が含まれるが、これに限定されない。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体の重鎖は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を有するが、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体の重鎖は、４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）を有する。免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、サブタイプを含む何れかの免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインの間（すなわち、軽鎖と重鎖の間）および抗体重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合を介して共に連結されている。
【００７４】
ある態様において、抗原結合タンパク質は抗体である。本明細書で用いる用語“抗体”は、その通常の意味を有し、何れかのアイソタイプのインタクトな免疫グロブリンも意味し、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体および二重特異性抗体が含まれる。インタクトな抗体は、一般的に、少なくとも２つの完全長重鎖および２つの完全長軽鎖を含む。抗体配列は、単一種のみに由来してもよいか、または“キメラ”であってよく、すなわち抗体の異なる部分が、以下でさらに説明するように２つの異なる種に由来してもよい。特記しない限り、用語“抗体”は、該抗体が２つの完全長軽鎖および重鎖からなる抗体と同じかまたは類似の結合および／または機能を保持する場合、２つの実質的に完全長の重鎖および２つの実質的に完全長の軽鎖を含む抗体も含む。例えば、重鎖および／または軽鎖のＮ末端および／またはＣ末端に１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の置換、挿入または欠失を有する抗体は、該抗体が、２つの完全長重鎖および２つの完全長軽鎖を含む抗体と同じかまたは類似の結合および／または機能を保持する場合、その定義に包含される。さらに、明示的に除外されない限り、抗体には、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体および合成抗体が含まれる。ある態様において、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が提供される。本明細書で用いる用語“ポリクローナル抗体”は、その通常の意味を有し、また、組成および結合特異性が一般的に大きく異なる抗体の集団を意味し得る。本明細書で用いる用語“モノクローナル抗体”（“ｍＡｂ”）は、その通常の意味を有し、同一の配列を有する抗体の集団のうち１以上も意味し得る。モノクローナル抗体は、抗原の特定のエピトープで該抗原に結合する。
【００７５】
ある態様において、抗原結合タンパク質は、抗体の“フラグメント”または“抗原結合フラグメント”である。本明細書で用いる用語“抗体フラグメント”は、その通常の意味を有し、また、ＧＰＡへの特異的抗原結合を供するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも１つのＣＤＲを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメントも意味し得る。抗体フラグメントは、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって生成され得る。
【００７６】
ある態様において、Ｆａｂフラグメントを提供する。Ｆａｂフラグメントは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインを有する一価フラグメントであり；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合される２つのＦａｂフラグメントを有する二価フラグメントであり；Ｆｄフラグメントは、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有し；Ｆｖフラグメントは、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを有し；そして、ｄＡｂフラグメントは、１つのＶＨドメイン、１つのＶＬドメインまたはＶＨもしくはＶＬドメインの抗原結合フラグメントを有する。ある態様において、これらの抗体フラグメントは、単一ドメイン抗体、単鎖抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、二量体、三量体、四量体、Ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖに組み込まれ得る。ある態様において、抗体は、本明細書の表２に示される少なくとも１つのＣＤＲを含む。
【００７７】
また、本発明は、いくつかの態様において、一本鎖可変フラグメントを提供する。本明細書で用いる用語“一本鎖可変フラグメント”（“ｓｃＦｖ”）は、その通常の意味を有し、また、ＶＬおよびＶＨ領域が、リンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）を介して結合されて連続的なタンパク質鎖を形成する融合タンパク質も意味し、ここで、リンカーは、タンパク質鎖がそれ自体折り畳まれて一価の抗原結合部位を形成するのに十分な長さである。明確にするために、特記しない限り、“一本鎖可変フラグメント”は、本明細書で定義される抗体または抗体フラグメントではない。二量体は、２つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であり、ここで、各ポリペプチド鎖は、同じ鎖の２つのドメイン間を対合させるには短すぎるか、または対合させ得ない構成であり、故に、各ドメインを別のポリペプチド鎖の相補性ドメインと対合させるのを可能にする、リンカーによって結合されたＶＨおよびＶＬドメインを含む。いくつかの態様に従い、二量体の２つのポリペプチド鎖が同一である場合、その対合により得られる二量体は、２つの同一の抗原結合部位を有し得る。異なる配列を有するポリペプチド鎖を用いて、２つの異なる抗原結合部位を有する二量体を作製することができる。同様に、三量体および四量体は、それぞれ３つおよび４つのポリペプチド鎖を含み、それぞれ３つおよび４つの抗原結合部位を形成する（これらは同じであっても異なっていてもよい）抗体である。
【００７８】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、１以上のＣＤＲを含む。本明細書で用いる用語“ＣＤＲ”は、その通常の意味を有し、また、抗体可変配列内の相補性決定領域（“最小認識単位”または“超可変領域”とも称される）も意味し得る。ＣＤＲは、抗原結合タンパク質が目的とされる特定の抗原に特異的に結合することを可能にする。３つの重鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）および３つの軽鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）がある。２つの鎖のそれぞれのＣＤＲは、通常、フレームワーク領域によって整列され、標的タンパク質上の特定のエピトープまたはドメインに特異的に結合する構造を形成している。Ｎ末端からＣ末端へ、天然軽鎖および重鎖可変領域は両方とも、通常、これらの要素を以下の順に含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。これらの各ドメインを構成するアミノ酸の割り当ては、番号付けシステムに従って行われる。この番号付けシステムは、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987年および1991年、NIH、Bethesda、MD）、またはChothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883に定義されている。特定の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）は、このシステムを用いて同定され得る。免疫グロブリン鎖中のアミノ酸についての他の番号付けシステムは、ＩＭＧＴ（登録商標）(the international ImMunoGeneTics information system; Lefranc et al, Dev. Comp. Immunol. 29:185-203; 2005）およびＡＨｏ（Honegger and Pluckthun, J. Mol. Biol. 309(3):657-670; 2001）を含む。１以上のＣＤＲを共有結合または非共有結合のいずれかで分子に組み込んで、それを抗原結合タンパク質にすることができる。
【００７９】
ある態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、より大きなポリペプチド鎖の一部として１以上のＣＤＲを含む。ある態様において、抗原結合タンパク質は、１以上のＣＤＲを別のポリペプチド鎖に共有結合させる。ある態様において、抗原結合タンパク質は、１以上のＣＤＲを非共有結合的に組み込むことができる。ある態様において、抗原結合タンパク質は、生体適合性フレームワーク構造に組み込まれた、本明細書に記載のＣＤＲの少なくとも１つを含み得る。ある態様において、生体適合性フレームワーク構造は、局在化した表面領域における抗原（例えば、ＣＤＲ、可変領域など）に結合するアミノ酸の１以上の配列を表示することができる、立体配座的に安定な構造的支持体、またはフレームワーク、または足場を形成するのに十分なポリペプチドまたはその部分を含む。このような構造は、天然ポリペプチドまたはポリペプチド“折り畳み”（構造モチーフ）であり得るか、または天然ポリペプチドまたは折り畳みと比べて、アミノ酸の付加、欠失および／または置換などの１以上の修飾を有し得る。態様に応じて、これらの足場は、ヒト、非ヒト霊長動物または他の哺乳動物、他の脊椎動物、無脊椎動物、植物、細菌またはウイルスなどの様々な種の（または複数種の）ポリペプチドに由来し得る。
【００８０】
態様に応じて、生体適合性フレームワーク構造は、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質足場または骨格に基づいている。いくつかのかかる態様において、それらのフレームワーク構造は、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルジノスタチン、シトクロムｂ、ＣＰ１ジンクフィンガー、ＰＳＴ１、コイルドコイル、ＬＡＣＩ−Ｄ１、Ｚドメインおよび／またはテンダミスタットドメインに基づく。
【００８１】
ある態様において、２以上の結合部位を有する抗原結合タンパク質も提供する。いくつかの態様において、結合部位は、互いに同一であるが、ある態様において、結合部位は互いに異なる。例えば、抗体は、通常、２つの同一の結合部位を有するが、“二重特異性”または“二機能性”抗体は、２つの異なる結合部位を有する。二重特異性抗原結合タンパク質または抗体の２つの結合部位は、同じまたは異なるタンパク質標的上に存在し得る２つの異なるエピトープに結合し得る。
【００８２】
本明細書で用いる用語“キメラ抗体”は、その通常の意味を有し、１つの抗体に由来する１以上の領域および１以上の他の抗体に由来する１以上の領域を含む抗体も意味する。ある態様において、ＣＤＲの１以上は、抗ＧＰＡ抗体に由来する。いくつかの態様において、ＣＤＲの全ては、抗ＧＰＡ抗体に由来する。ある態様において、２以上の抗ＧＰＡ抗体に由来するＣＤＲを混合し、マッチさせてキメラ抗体とする。例えば、キメラ抗体は、第１の抗ＧＰＡ抗体の軽鎖に由来するＣＤＲ１、第２の抗ＧＰＡ抗体の軽鎖に由来するＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに第３の抗ＧＰＡ抗体に由来する重鎖に由来するＣＤＲを含み得る。さらに、本明細書に記載の抗原結合タンパク質のフレームワーク領域は、同じ抗ＧＰＡ抗体の１つ、ヒト抗体などの１以上の異なる抗体、またはヒト化抗体に由来し得る。キメラ抗体の一例では、重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体と同一であるか、相同であるか、あるいはそれに由来し、鎖の残り（複数可）は、別の種由来の抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体と同一であるか、相同であるか、あるいはそれらに由来する。本明細書中、所望の生物学的活性を示すそのような抗体のフラグメントも提供する。
【００８３】
ある態様において、抗原結合タンパク質は、表１に記載のＶＨドメインアミノ酸配列の何れかと少なくとも９０％同一性を有する重鎖可変ドメインを含んで提供される。ある態様において、抗原結合タンパク質は、表１に記載のＶＨドメインアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９５％同一性を有する重鎖可変ドメインを含む。ある態様において、抗原結合タンパク質は、表１に記載のＶＨドメインアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９９％同一性を有する重鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、重鎖可変ドメインは、表１に記載のＶＨドメインアミノ酸配列のいずれかに１以上の追加の変異を有し得るが、ＧＰＡへの特異的結合を保持する。いくつかの態様において、重鎖可変ドメインは、表１に記載のＶＨドメインアミノ酸配列のいずれかに１以上の追加の変異を有し得るが、ＧＰＡへの特異的結合が改善されている。
【００８４】
ある態様において、抗原結合タンパク質は、表１に記載のＶＬドメインアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９０％同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。ある態様において、抗原結合タンパク質は、表１に記載のＶＬドメインアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９５％同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。ある態様において、抗原結合タンパク質は、表１に記載のＶＬドメインアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９９％同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、軽鎖可変ドメインは、表１に記載のＶＬドメインアミノ酸配列のいずれかに１以上の追加の変異を有し得るが、ＧＰＡへの特異的結合を保持する。いくつかの態様において、軽鎖可変ドメインは、表１に記載のＶＬドメインアミノ酸配列のいずれかに１以上の追加の変異を有し得るが、ＧＰＡへの特異的結合が改善されている。
【００８５】
ある態様において、抗原結合タンパク質は、表１に記載のＶＨドメインアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９０％同一性を有する重鎖可変ドメイン、および表１に記載のＶＬドメインアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９０％同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。ある態様において、抗原結合タンパク質は、表１に記載のＶＨドメインアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９５％同一性を有する重鎖可変ドメイン、および表１に記載のＶＬドメインアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９５％同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。ある態様において、抗原結合タンパク質は、表１に記載のＶＨドメインアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９９％同一性を有する重鎖可変ドメイン、および表１に記載のＶＬドメインアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９９％同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。
【００８６】
ある態様において、抗原結合タンパク質は、表１に記載のＶＨドメインアミノ酸配列のいずれかを有する重鎖可変ドメインおよび表１に記載のＶＬドメインアミノ酸配列のいずれかを有する軽鎖可変ドメインを含む。ある態様において、軽鎖可変ドメインは、表１に記載の軽鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、重鎖可変ドメインは、表１に記載の重鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００８７】
ある態様において、軽鎖可変ドメインは、表１に記載のポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列によりコード化されるアミノ酸配列を含む。ある態様において、軽鎖可変ドメインは、表１に記載の配列から選択される軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの補体に中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコード化されるアミノ酸配列を含む。ある態様において、軽鎖可変ドメインは、表１に記載の配列からなる群より選択される軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコード化されるアミノ酸配列を含む。
【００８８】
ある態様において、重鎖可変ドメインは、表１に記載の配列から選択される重鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、重鎖可変ドメインは、表１に記載の配列から選択される重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの補体に中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコード化されるアミノ酸配列を含む。ある態様において、重鎖可変ドメインは、表１に記載の配列からなる群より選択される重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコード化されるアミノ酸配列を含む。
【００８９】
【表１】
2021522812.tif 000003
【表２】
2021522812.tif 000004
【表３】
2021522812.tif 000005
【表４】
2021522812.tif 000006
【表５】
2021522812.tif 000007
【００９０】
ある態様において、表２に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２またはＶＨ ＣＤＲ３配列と比較して、各ＣＤＲにおいて１、２または３個のアミノ酸残基の置換、欠失および／または挿入と同一またはそれを含むアミノ酸配列を有する１以上のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２および／またはＶＨ ＣＤＲ３ドメインを含む抗原結合タンパク質を提供する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、表２に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２またはＶＬ ＣＤＲ３配列と比較して、各ＣＤＲにおいて１、２または３個のアミノ酸残基置換、欠失および／または挿入と同一またはそれを含むアミノ酸配列を有する１以上のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２および／またはＶＬ ＣＤＲ３を含む。ある態様において、抗原結合タンパク質は、表２に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２またはＶＨ ＣＤＲ３配列と比較して、各ＣＤＲにおける１、２または３個のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入と同一またはそれを含むアミノ酸配列を有する１以上のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２および／またはＶＨ ＣＤＲ３、および表２に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２またはＶＬ ＣＤＲ３配列と比較して、各ＣＤＲにおける１、２または３個のアミノ酸残基の置換、欠失および／または挿入と同一またはそれを含むアミノ酸配列を有する１以上のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２および／またはＶＬ ＣＤＲ３を含む。ある態様において、抗原結合タンパク質は、表２に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２またはＶＨ ＣＤＲ３配列と比較して、各ＣＤＲにおける１、２または３個のアミノ酸残基の置換、欠失および／または挿入と同一またはそれを含むアミノ酸配列を有する１つのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２および／またはＶＨ ＣＤＲ３、および表２に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２またはＶＬ ＣＤＲ３配列と比較して、各ＣＤＲにおける１、２または３個のアミノ酸残基の置換、欠失および／または挿入と同一またはそれを含むアミノ酸配列を有する１つのＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２および／またはＶＬ ＣＤＲ３を含む。ある態様において、抗原結合タンパク質は、表２に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３配列と比較して、各ＣＤＲにおける１、２または３個のアミノ酸残基の置換、欠失および／または挿入と同一またはそれを含むアミノ酸配列を有する２つのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２および／またはＶＨ ＣＤＲ３、および表２に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２またはＶＬ ＣＤＲ３配列と比較して、各ＣＤＲにおける１、２または３個のアミノ酸残基の置換、欠失および／または挿入と同一またはそれを含むアミノ酸配列を有する２つのＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２および／またはＶＬ ＣＤＲ３を含む。ある態様において、抗原結合タンパク質は、表２に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３配列と比較して、約ＣＤＲにおける１、２または３個のアミノ酸残基の置換、欠失および／または挿入と同一またはそれを含むアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３、および表２に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２またはＶＬ ＣＤＲ３配列と比較して、各ＣＤＲにおける１、２または３個のアミノ酸残基の置換、欠失および／または挿入と同一またはそれを含むアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含む。ある態様において、抗原結合タンパク質は、表２に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３配列のいずれかと同一のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含む。ある態様において、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２および／またはＶＬ ＣＤＲ３は、表２に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２および／またはＶＬ ＣＤＲ３配列のいずれかにおいて１以上のさらなる変異を有していてもよいが、ＧＰＡ（例えば、態様に応じて、ヒトＧＰＡおよび／またはマウスおよび／またはカニクイザル）への特異的な結合を保持している。いくつかの態様において、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２および／またはＶＬＣＤＲ３は、表２に記載のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２および／またはＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかにおいて１以上の追加の変異を有していてもよいが、ＧＰＡ（例えば、態様に応じて、ヒトＧＰＡおよび／またはマウスおよび／またはカニクイザル）への改善された特異的結合を有する。いくつかの態様において、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２および／またはＶＨ ＣＤＲ３は、表２に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２および／またはＶＨ ＣＤＲ３配列のいずれかにおいて１以上の追加の変異を有していてもよいが、ＧＰＡ（例えば、態様に応じて、ヒトＧＰＡおよび／またはマウスおよび／またはカニクイザル）への特異的結合を保持する。いくつかの態様において、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２および／またはＶＨ ＣＤＲ３は、表２に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２および／またはＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかにおいて１以上の追加の変異を有していてもよいが、ＧＰＡ（例えば、態様に応じて、ヒトＧＰＡおよび／またはマウスおよび／またはカニクイザル）への改善された特異的結合を有する。
【００９１】
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【００９２】
抗原結合タンパク質のヒト化
いくつかの態様において、ヒト化抗原結合タンパク質を提供する。本明細書で用いる用語“ヒト化抗原結合タンパク質”は、その通常の意味を有し、また、ヒト化抗原結合タンパク質が、ヒト対象に投与されたときに、非ヒト種抗原結合タンパク質と比較して、免疫応答を誘発する可能性が低い、および／または重篤度の低い免疫応答を誘発するような、１以上のアミノ酸置換、欠失および／または付加によって非ヒト種由来の抗原結合タンパク質の配列と異なる配列を有する抗原結合タンパク質も意味する。ある態様において、非ヒト種抗原結合タンパク質の重鎖および／または軽鎖のフレームワークおよび／または定常ドメイン内の特定のアミノ酸は、ヒト化抗原結合タンパク質を生成するために変異される。別の態様において、ヒト抗原結合タンパク質からの定常ドメイン（複数可）は、非ヒト種の可変ドメイン（複数可）に融合される。別の態様において、非ヒト抗原結合タンパク質の１以上のＣＤＲ配列中の１以上のアミノ酸残基は、ヒト対象に投与されたときに非ヒト抗原結合タンパク質の免疫原性の可能性を低下させるために改変され、ここで、改変されたアミノ酸残基は、抗原結合タンパク質のその抗原への免疫特異的結合に主に関与する残基ではないか、または行われるアミノ酸配列への改変は、ヒト化された抗原結合タンパク質の抗原への結合が、非ヒト抗原結合タンパク質の抗原への結合と比較して有意に変化しないように、保存的な改変である。
【００９３】
いくつかの態様によれば、抗原結合タンパク質のヒト化は、非ヒト抗原結合タンパク質のＣＤＲ、およびある態様において、ヒト可変領域フレームワーク領域およびヒト定常領域上のこれらのＣＤＲのみを再結合させることを含むＣＤＲ移植を含む。いくつかの態様において、この変化は、免疫原性を実質的に減少させるか、または排除する。いくつかの態様において、全体的な免疫原性は低下するが、アロタイプまたはイディオタイプの違いは依然として存在し得る。態様に応じて、元の抗原結合タンパク質のいくつかのフレームワーク残基を保存する必要がある場合がある。そのようなフレームワーク残基は、コンピューターモデリングを介して同定することが可能であり、または既知の抗原結合部位構造を比較することによって潜在的に同定され得る。抗原結合に影響を与える可能性のある残基は、いくつかのグループに分類される。第１のグループは、抗原部位表面に隣接している残基を含み、したがって、抗原と直接接触し得る。これらの残基は、いくつかの態様において、アミノ末端残基およびＣＤＲに隣接する残基を含む。第２のグループは、いくつかの態様において、ＣＤＲまたは抗原結合タンパク質中の別のペプチド鎖と接触することにより、ＣＤＲの構造または相対的な配列を変化させ得る残基を含む。いくつかの態様によれば、第３のグループは、可変ドメインの構造的完全性に影響を与え得る埋もれた側鎖を有するアミノ酸を含む。
【００９４】
ある態様において、抗原結合タンパク質は、表３〜４に例示されたＦＲ（フレームワーク領域）の限定されない態様の１以上をさらに含む。ある態様において、抗原結合タンパク質は、表３に例示される重鎖ＦＲ１配列、重鎖ＦＲ２配列、重鎖ＦＲ３配列および重鎖ＦＲ４配列の１以上を含む。ある態様において、抗原結合タンパク質は、表４に示される軽鎖ＦＲ１配列、軽鎖ＦＲ２配列、軽鎖ＦＲ３配列および軽鎖ＦＲ４配列の１以上を含む。ある態様において、表３および表４のＦＲ領域の任意の１以上は、本明細書に提供されるＣＤＲ配列の任意の１以上と組み合わせることができる。したがって、ある態様において、６つのＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）および８つのＦＲ（例えば、ＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３、ＨＦＲ４、ＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３およびＬＦＲ４）を含む抗原結合タンパク質を提供する。
【００９５】
【表９】
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【００９６】
【表１０】
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【００９７】
抗原結合タンパク質の親和性成熟
ある態様において、標的抗原に対する増加した親和性を有する抗原結合タンパク質を提供する。ある態様において、標的抗原はグリコフォリンＡである。ある態様において、表１に記載のＣＤＲの１以上の親和性成熟は、ＣＤＲの維持、鎖シャッフリング、大腸菌の変異株の使用、ＤＮＡシャッフリング、ファージディスプレイおよび追加のＰＣＲ技術を含むがこれらに限定されない、多数の親和性成熟プロトコールによって得られる。
【００９８】
親和性は、様々な技術、例えば、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ））、または表面プラズモン共鳴アッセイもしくは他のメカニズムの動態ベースのアッセイ（例えば、BIACORE（登録商標）分析またはOctet（登録商標）分析（forteBIO））、および間接結合アッセイなどの他の方法、競合結合アッセイ蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー（例えば、ゲルろ過）などの、これらに限定されない技術を用いて決定することができる。これらのおよび他の方法は、検査される成分の１以上のラベルを利用してもよく、および／または発色性、蛍光性、発光性または同位体ラベルを含むがこれらに限定されない様々な検出方法を用いてもよい。競合結合アッセイの一例としては、漸増量の非標識抗原の存在下での標識抗原と抗原結合タンパク質とのインキュベーション、および標識抗原に結合した抗原結合タンパク質の検出を含む放射免疫アッセイが挙げられる。特定の抗原に対する抗原結合タンパク質の親和性および結合オフレートは、スキャッチャードプロット分析によるデータから決定することができる。第２の抗原結合タンパク質との競合もまた、放射免疫アッセイを用いて決定することができる。この場合、抗原は、標識された化合物に結合した抗原結合タンパク質と、標識されていない第２の抗原結合タンパク質の漸増量の存在下でインキュベートされる。
【００９９】
１０−７Ｍ以下の平衡解離定数（以下に定義の、ＫＤまたは対応するＫＤ）値により決定される強い結合親和性を有する抗原に結合する場合、抗原結合タンパク質は、ＧＰＡなどの抗原に“特異的に結合する”。ヒトＧＰＡに特異的に結合する抗原結合タンパク質は、他の種のＧＰＡにも同様に同じ親和性または異なる親和性で結合することができる可能性がある。
【０１００】
ある態様において、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満または５ｘ１０−１３Ｍ未満（値が小さいほど結合親和性が高いことを示す）の平衡解離定数またはＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）でＧＰＡに特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはフラグメント）を提供する。ある態様において、約１０−７Ｍ未満、約１０−８Ｍ未満、約１０−９Ｍ未満、約１０−１０Ｍ未満、約１０−１１Ｍ未満、約１０−１２Ｍ未満、約１０−１３Ｍ未満または約５ｘ１０−１３Ｍ未満の平衡解離定数またはＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）でＧＰＡに特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供する。
【０１０１】
ある態様において、約１０−７Ｍから約１０−８Ｍ、約１０−８Ｍから約１０−９Ｍ、約１０−９Ｍから約１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍから約１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍから約１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍから約１０−１３Ｍの平衡解離定数またはＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）でＧＰＡに特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体フラグメント）を提供する。ある態様において、１０−７Ｍから１０−８Ｍ、１０−８Ｍから１０−９Ｍ、１０−９Ｍから１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍから１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍから１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍから１０−１３Ｍの平衡解離定数またはＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）、およびエンドポイントを含む、列挙の間の解離定数を有する、ＧＰＡに特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供する。
【０１０２】
同一または重複エピトープを有する抗原結合タンパク質は、しばしば、抗原（例えば、ヒトＧＰＡ）への結合について競合し得る。従って、ある態様において、抗原結合タンパク質１０Ｆ７、Ｔｅｒ１１９（抗原結合タンパク質がマウスＧＰＡと交差反応するような態様において）、ＣＬＢ−ｅｒｙ−１（ＡＭＥ−１）、ＥＰＲ８２００、ＹＴＨ８９．１、ＥＰＲ８１９９、ＪＣ１５９、ＧＹＰＡ／２８０、ａｂ４０８４４、ＨＩ２６４、ＧＰＨＮ０２、ＳＰＭ５９９、ＧＹＰＡ／１７２５Ｒ、ａｂ１１２２０１、ＢＲＩＣ２５６またはそれらのフラグメントもしくは誘導体と競合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗体フラグメント）を提供する。本明細書で用いる“競合する”または“競合”は、その通常の意味を有し、また、標的上の同じエピトープまたは結合部位について競合する抗原結合タンパク質を意味し得る。そのような競合は、対照抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗体フラグメント）が試験抗原結合タンパク質の特異的結合を防止または阻害するアッセイによって決定することができる。多数の競合結合アッセイを用いて、試験分子が結合について対照分子と競合するかどうかを決定することができる。用い得るアッセイの例としては、固相直接または間接放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ、ルミネックス（Luminex）および表面プラズモン共鳴が挙げられる。競合阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下で固体表面または細胞に結合した標識リガンドの量を決定することにより測定することができる。通常、試験抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合アッセイによって同定された抗原結合タンパク質または抗体（競合する抗原結合タンパク質または抗体）には、対照抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質および立体障害が生じるために対照抗原結合タンパク質により結合されるエピトープに十分に近位の隣接エピトープに結合する抗原結合タンパク質が含まれる。通常、競合抗原結合タンパク質が過剰に存在するとき、標的抗原への対照抗原結合タンパク質の特異的結合を少なくとも４０−４５％、４５−５０％、５０−５５％、５５−６０％、６０−６５％、６５−７０％、７０−７５％または７５％以上（または、列記の数値間の任意の阻害割合）阻害（例えば、低減）し得る。ある態様において、結合は、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％阻害される。ある態様において、結合は、少なくとも８０−８５％、８５−９０％、９０−９５％、９５−９７％または９７％以上（最大１００％阻害を含む）阻害される。
【０１０３】
抗原結合タンパク質をコードする核酸
本発明の抗原結合タンパク質を、特に、化学合成または組換え発現技術によって、タンパク質（例えば、抗体）の合成のための当技術分野で公知の何らかの方法により製造することができる。
【０１０４】
いくつかの態様において、本発明の抗原結合タンパク質をコードする核酸を提供する。用語“ポリヌクレオチド”、“オリゴヌクレオチド”および“核酸”は、本明細書中互換的に用いられ、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類縁体を用いて生成されたＤＮＡまたはＲＮＡの類縁体（例えば、ペプチド核酸および非天然ヌクレオチド類縁体）ならびにそれらのハイブリッドを含む。核酸は、例えば、抗原結合タンパク質の全部または一部をコードするポリヌクレオチド、例えば、抗体の一本鎖または両鎖、またはフラグメント、誘導体、ムテイン（mutein）もしくはその変異体、ハイブリダイゼーションプローブとして用いるのに十分なポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定、分析、変異もしくは増幅するためのＰＣＲプライマーまたはシークエンシングプライマー、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、ならびに上記の相補的配列を含む。核酸は、所望の使用または機能のために適当な任意の長さにすることができ、１以上の追加の配列、例えば調節配列を含み、および／またはより大きな核酸、例えばベクターの一部にすることができる。当業者は、遺伝子コードの縮重のために、本明細書に記載のポリペプチド配列の各々が、多数の他の核酸配列によってコードされていることを理解し得る。本発明は、本明細書に記載の各抗原結合タンパク質をコードする各変性ヌクレオチド配列を提供する。
【０１０５】
変異体抗原結合タンパク質
本明細書に記載の抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、例えば、ランダム突然変異誘発および／または部位特異的突然変異誘発（例えば、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的突然変異誘発）によって改変され、非変異ポリヌクレオチドと比較して、１以上のヌクレオチド置換、欠失および／または挿入を含む改変ポリヌクレオチドを作成することができる。これらのおよび他の方法を用いて、非誘導体化抗体と比較して、例えば、所望の特性、例えば、所望の標的に対する親和性、アビディティまたは特異性の増加、インビボまたはインビトロでの活性または安定性の増加、あるいはインビボでの副作用の低減などを有する抗原結合タンパク質の誘導体を作製することができる。他の態様において、本発明の核酸に導入される変異は、それがコードするポリペプチドの生物学的活性を有意に変化させない。
【０１０６】
いくつかの態様において、本発明の抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはそのフラグメント）は、抗原結合タンパク質が同じかまたはよりよい（例えば、より高い親和性、より低いＫｄの）所望の結合特異性を保持する場合、少なくとも１つのアミノ酸置換を有していてもよい。従って、ある態様において、抗原結合タンパク質の構造への改変を提供する。ある態様において、抗原結合タンパク質（例えば、抗体であるが、これに限定されない）は、本明細書の表２に記載のＣＤＲ配列から、それぞれ独立して５、４、３、２、１または０個の単一アミノ酸の付加、置換および／または欠失によって異なる配列を含む。これらは、抗体の所望の結合能を破壊しない保存的または非保存的であり得るアミノ酸置換を含み得る。保存的アミノ酸置換は、一般的に、生物学的システムでの合成ではなく化学的ペプチド合成によって組み込まれる、非天然アミノ酸残基を含み得る。これらには、ペプチド模倣体およびアミノ酸部位の他の逆または反転形態（reversed or inverted form）が含まれる。保存的アミノ酸置換はまた、その位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷にほとんどまたは全く影響を及ぼさないような、天然アミノ酸残基を標準残基（normative residue）で置換することを含み得る。
【０１０７】
非保存的置換は、異なる物理的特性（例えば、サイズ、極性、疎水性、荷電、Ｌ−アイソフォームのＤ−アイソフォームとの置換など）を有する別のクラスのメンバーのアミノ酸またはアミノ酸模倣体の１つのクラスのメンバー交換を含み得る。ある態様において、そのような置換された残基は、非ヒト抗体と相同である抗原結合タンパク質の領域、または該分位の非相同性領域に導入され得る。
【０１０８】
所望のアミノ酸置換の限定されない例は、以下である：（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させるもの、（２）酸化に対する感受性を減少させるもの、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させるもの、（４）結合親和性を変化させるものおよび／または（５）そのようなポリペプチドに他の物理化学的または機能的特性を付与または改変するもの。例えば、いくつかの態様において、アミノ酸の置換は、グリコシル化などの翻訳後修飾の傾向を減少させる（または増加させる）ことができる。そのような態様において、翻訳後修飾の程度は、所定の用途のために所望のレベルに調整することができる。ある態様において、単一または複数のアミノ酸置換（ある態様において、保存的アミノ酸置換）は、天然配列（ある態様において、分子間接触を形成するドメイン（複数可）の外側のポリペプチドの部分）において行われ得る。ある態様において、保存的アミノ酸置換は、一般的に、親配列の構造的特性を実質的に変化させ得ない（例えば、置換アミノ酸は、親配列中に生じるらせんを破壊する傾向がないか、または親配列を特徴づける他のタイプの二次構造を破壊する傾向がない）。
【０１０９】
抗原結合タンパク質をコードするベクター
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の核酸の１以上を含むベクターをさらに提供する。本明細書で用いる用語“ベクター”は、その通常の意味を有し、また、それに連結された別の核酸を細胞内に導入するために使用できる核酸を意味する。ベクターの１つのタイプは“プラスミド”であり、これは、追加の核酸セグメントをライゲーションすることができる直鎖状または環状の二本鎖ＤＮＡ分子を意味する。別のタイプのベクターは、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）であり、ここで、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに導入することができる。ある態様において、ベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を含む細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他の態様において、ベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。“発現ベクター”は、選択されたポリヌクレオチドの発現を指示することができるベクタータイプである。ヌクレオチド配列は、調節配列がそのヌクレオチド配列の発現（例えば、発現のレベル、タイミングまたは位置）に影響を与える場合、調節配列に“作動可能に連結”されている。“調節配列”は、それが作動可能に連結されている核酸の発現（例えば、発現のレベル、タイミングまたは位置）に影響を与える核酸である。調節配列は、例えば、調節された核酸に直接、または１以上の他の分子（例えば、調節配列および／または核酸に結合するポリペプチド）の作用を介して、その効果を発揮することができる。調節配列の例としては、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）が挙げられる。
【０１１０】
本発明の組換え発現ベクターは、発現のために用いられる宿主細胞に基づいて選択される１以上の調節配列を含み、これは、発現される核酸配列に作動可能に連結されている。調節配列は、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指向するもの（例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモーターおよびサイトメガロウイルスプロモーター）、特定の宿主細胞においてヌクレオチド配列のみの発現を指向するもの（例えば、組織特異的調節配列、Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci. 11:287, Maniatis et al., 1987, Science 236:1237参照のこと、それらの内容全体を引用により本明細書に包含させる）および特定の処置または病状に応答してヌクレオチド配列の誘導性発現を指向するもの（例えば、哺乳動物細胞におけるメタロチオニンプロモーターならびに原核生物系および真核生物系の両方におけるテトラサイクリン応答性（tet-responsive）および／またはストレプトマイシン応答性プロモーター（同文献参照））。態様に応じて、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要因に依存し得る。本発明の発現ベクターは、それにより、本明細書に記載の核酸によってコードされる融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチドを産生するために宿主細胞に導入され得る。
【０１１１】
抗原結合タンパク質を発現する宿主細胞
ある態様において、本明細書に記載の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞を提供する。本明細書で用いる用語“宿主細胞”は、その通常の意味を有し、また、核酸、例えば、本明細書に記載の抗原結合タンパク質をコードする核酸を発現するために使用され得る細胞も意味する。宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞（および／または溶解物または転写および／または翻訳活性成分、例えば、そのような細胞に由来する無細胞系）であり得る。原核生物宿主細胞としては、ある態様において、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば大腸菌またはバチルスが挙げられる。真核細胞としては、ある態様において、単細胞真核生物（例えば、酵母または他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコまたはトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞または昆虫細胞）、またはハイブリドーマが挙げられる。好適な哺乳動物宿主細胞株の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはその誘導体、例えば、無血清培地中で増殖するVeggie ＣＨＯおよび関連細胞株、またはＤＨＦＲが欠損しているＣＨＯ株ＤＸＢ−１１が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の追加のＣＨＯ細胞株には、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−６１）、ＥＭ９（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１８６１）およびＵＶ２０（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１８６２）が含まれる。追加の宿主細胞としては、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７系統（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、ＡＭ−１／Ｄ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、アフリカ緑猿腎臓細胞株ＣＶ１由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、２９３、２９３ ＥＢＮＡまたはＭＳＲ ２９３などのヒト胚性腎細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換された霊長動物細胞株、正常二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養に由来する細胞株、初代外植片、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
いくつかの態様において、宿主細胞は、ポリペプチドをコードする核酸で形質転換またはトランスフェクトされ、それにより、宿主細胞中で発現させることができる培養細胞である。本明細書で用いる用語“組換え宿主細胞”は、その通常の意味を有し、また、発現される核酸で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞も意味する。宿主細胞はまた、核酸を含むが、核酸と作動可能に連結されるように調節配列が宿主細胞に導入されない限り、核酸を所望のレベルで発現しない細胞であり得る。本明細書で用いる用語“宿主細胞”は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫を指す意味する。ある種の改変が、例えば、突然変異または環境の影響により、後続の世代で発生する可能性があり、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書で用いる用語の範囲内に含まれる。ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核生物または真核生物細胞に導入することができる。哺乳動物細胞の安定したトランスフェクションの場合、用いる発現ベクターおよびトランスフェクション技術によっては、ごく一部の細胞のみが外来ＤＮＡをそのゲノムに組み込むことができる。これらの組み込み要素（integrant）を同定し、選択するために、態様によっては、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を、目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入することができる。選択可能なマーカーのさらなる例としては、薬剤耐性を付与するもの（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサート）が含まれる。導入された核酸で安定的にトランスフェクトされた細胞は、他の方法の中でも、薬物選択（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存し、他の細胞は死滅する）によって同定することができる。
【０１１３】
ある態様において、宿主細胞は、例えば、抗体重鎖由来ポリペプチドをコードする第１のベクターおよび抗体軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２のベクターのような、２つの発現ベクターと共トランスフェクトされる。いくつかのそのような態様において、２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等の発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含み得る。あるいは、例えば、抗体重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、かつ発現することができる単一ベクターを用いることができる。いくつかのそのような態様において、軽鎖は、過剰な毒性のない重鎖を回避するために、重鎖の前に配置される。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
【０１１４】
抗原結合タンパク質が動物によって産生され、化学的に合成され、または組換え的に発現された場合、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインＡ後の特定の抗原に対する親和性、およびサイズ排除クロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって精製されてもよい。さらに、抗原結合タンパク質は、精製を容易にするために、本明細書に記載されているか、または別の方法で知られている異種ポリペプチド配列に融合させることができる。ある態様において、ポリペプチドに融合または化学的に結合された（共有結合および非共有結合の両方を含む）抗原結合タンパク質を提供する。本発明の融合または複合化された抗原結合タンパク質は、精製を強化するために用いられ得る。さらに、本発明の抗原結合タンパク質は、精製を促進するために、ペプチドなどのマーカー配列に融合され得る。ある態様において、マーカーアミノ酸配列は、融合タンパク質の精製を容易にするために、ｐＱＥベクター中に提供されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドである。精製に有用な他のペプチドタグの限定されない例としては、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する“ＨＡ”タグおよび“フラグ”タグが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
コンジュゲート
いくつかの態様において、本発明の抗原結合タンパク質と別の分子の複合体を提供する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、１以上の非タンパク質性化合物に複合体化される。非タンパク質性化合物の限定されない例としては、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、毒素および／または放射性物質などの化学療法剤が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗原結合タンパク質の他の誘導体は、本発明の抗原結合タンパク質の他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合または凝集複合体を含む。ある態様において、抗原結合タンパク質は、１以上の治療剤と複合体化される。複合体化に適した治療剤の限定されない例としては、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、抗体フラグメント、低分子薬物、生理活性ペプチド、生理活性タンパク質および／または生理活性生体分子が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、完全長抗原、その抗原性および／または免疫原性フラグメント、またはその抗原性および／または免疫原性ミモトープを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される抗原結合タンパク質と抗原性成分との複合体を提供する。
【０１１６】
本明細書で用いる用語“複合体（コンジュゲート）”または“分子融合”は、その通常の意味を有し、また、共有結合、静電イオン、電荷を含むがこれらに限定されない化学結合による直接的または間接的な結合を意味する。ある態様において、コンジュゲーションは、化学結合によって維持されるユニットを生成する。本明細書で用いる用語“直接コンジュゲーション”は、その通常の意味を有し、また、中間リンカーまたは化学基の有無にかかわらず、分子への化学結合を意味する。本明細書で用いる、間接的コンジュゲーションは、その通常の意味を有し、また、担体への化学的結合を意味する。ある態様において、本明細書に記載の抗原結合タンパク質と第２のポリペプチドまたはタンパク質との間に分子融合が形成される。ある態様において、融合は、抗原結合タンパク質と、互いに直接結合した別の成分とを含む。他の態様において、融合体は、抗原結合タンパク質と、互いに間接的に（例えば、リンカーを介して）複合体化した別の成分を含む。リンカーの限定されない例としては、ペプチド、ポリマー、アプタマー、核酸および／または粒子が挙げられるが、これらに限定されない。ある態様において、粒子は、微粒子、ナノ粒子、ポリマーソーム、リポソームまたはミセルである。ある態様において、ポリマーは天然または合成である。ある態様において、ポリマーは直鎖状または分岐状である。抗原結合タンパク質と第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質は、ポリペプチドの分子融合の一例であり、融合タンパク質は、ポリペプチドが互いに直接結合しているか、または一端もしくは両端に介在するリンカー配列および／またはさらなる配列を有するポリペプチドを含む。リンカーへの結合（conjugation）は、共有結合またはイオン結合を介し得る。
【０１１７】
いくつかの態様において、コンジュゲートは、リンカーの使用の有無にかかわらず、抗原結合タンパク質の別の分子への共有結合によって達成される。そのような複合体の形成は、当業者の技術の範囲内であり、複合体を達成するための様々な技術が知られており、特定の技術の選択は、複合体化される材料によって導かれる。以下にさらに記載するように、イオン化可能な側鎖を含むポリペプチド（Ｃ末端またはＮ末端）へのアミノ酸の付加、すなわちアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、システイン、ヒスチジンまたはチロシンを含み、ポリペプチド配列の活性部分に含まれないアミノ酸は、それらのプロトン化されていない状態で、ポリマー、すなわちホモまたはヘテロ−二官能性ＰＥＧに結合した反応性基との様々な生体共役反応（bioconjugation）に関与する強力な求核試薬として機能する。
【０１１８】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質の共有結合修飾体を提供する。態様に応じて、共有結合修飾体は、いくつかの態様において、化学合成によって、または抗原結合タンパク質の酵素的または化学的切断によって行われる。他の態様において、抗原結合タンパク質の共有結合修飾は、抗体の標的アミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって分子に導入される。
【０１１９】
ある態様において、抗原結合タンパク質のシステイニル残基を、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのアルファ−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を与える。ある態様において、ヨード試薬を用いる。さらなる態様では、システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、アルファ−ブロモ−ベータ−(５−イミドゾイル)プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリ安息香酸、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応により誘導体化される。
【０１２０】
ある態様において、抗原結合タンパク質のヒスチジル残基は、この薬剤がヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるため、ｐＨ５．５−７．０のジエチルピロカーボネートとの反応によって誘導体化される。ある態様において、パラブロモフェナシルブロミドが誘導体化に用いられる；そのような態様において、反応は、好ましくは、ｐＨ６．０で０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行われる。
【０１２１】
ある態様において、抗原結合タンパク質のリシル末端残基およびアミノ末端残基をコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。ある態様において、これらの反応剤との誘導体化は、リシニル残基の電荷を反転させる効果を有する。α−アミノ含有残基および／またはｅ−アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬の限定されない例としては、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル、リン酸ピリドキサール、ピリドキサール、クロロボロハイドライド、トリニトロベンゼンスルホン酸、０−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオンおよびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
ある態様において、抗原結合タンパク質のアルギニル残基は、例えば、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンおよび／またはニンヒドリンなどの１つまたは複数の従来の試薬との反応によって修飾される。ある態様において、アルギニル残基の誘導体化は、一般的に、グアニジン官能基の高いｐＫａのために、アルカリ条件下で行われる。そのような態様において、これらの試薬は、リシンのε−アミノ基ならびにアルギニンε−アミノ基と反応し得る。
【０１２３】
ある態様において、抗原結合タンパク質のチロシル残基の特異的修飾が行われる。そのようないくつかの態様において、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応により、スペクトル標識がチロシル残基に導入される。ある態様において、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンは、それぞれ、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成するために用いられる。チロシル残基は、Ｉ１２５またはＩ１３１を用いてヨウ素化され、放射免疫アッセイで用いるための標識タンパク質を調製する。
【０１２４】
ある態様において、抗原結合タンパク質のカルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４,４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）（式中、ＲおよびＲ’は、異なるアルキル基である）との反応により選択的に修飾される。さらに、ある態様において、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換される。
【０１２５】
ある態様において、抗原結合タンパク質のグルタミニルおよび／またはアスパラギニル残基は、対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基のそれぞれに脱アミド化される。態様に応じて、これらの残基は、中性または塩基性条件下で脱アミド化される。ある態様において、抗原結合タンパク質は、これらの残基の１以上の脱アミド化形態を含む。
【０１２６】
本発明の抗原結合タンパク質の他の例示的な修飾としては、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化、Ｎ末端アミンのアセチル化ならびに／または任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２７】
ある態様において、抗原結合タンパク質の共有結合修飾は、グリコシドを抗体に化学的または酵素的にカップリングすることを含む。ある態様において、これらの手順は、Ｎ−またはＯ−連結グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞における抗体の産生を必要としないという点で有利である。用いられるカップリングモードに応じて、糖（複数可）は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニンもしくはヒドロキシプロリンのような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンのような芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合されてもよい。
【０１２８】
エリスロサイト細胞表面への結合
ある態様において、抗原結合タンパク質は、赤血球（erythrocyte）に結合する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、単一の赤血球に結合する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、ヒト、カニクイザル、ブタ、イヌ、マウスおよび／またはラットを含むがこれらに限定されない、１以上の種の赤血球を結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒト赤血球を結合する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、カニクイザル赤血球に結合する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、ヒト赤血球およびカニクイザル赤血球に結合する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、ヒト赤血球およびカニクイザル赤血球に同様の特異性で特異的に結合する。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、赤血球細胞表面に結合する抗原結合タンパク質を提供する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、細胞形態を変化させることなく、赤血球細胞表面に結合する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、細胞質内移動を伴わずに赤血球細胞表面に結合する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、結合した赤血球のアポトーシスを引き起こすことなく、赤血球細胞表面に結合する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、インビボで特異的に赤血球に結合する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、エクスビボで特異的に赤血球に結合する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質と赤血球との間の平衡結合測定によって決定される約１０μＭから０．１ｎＭの間の解離定数を有する。
【０１３０】
ある態様において、抗原結合タンパク質は、非共有結合的に赤血球に結合する。ある態様において、抗原結合タンパク質は、非共有結合的かつ特異的に赤血球に結合し、他の血液成分に特異的に結合しない。いくつかのそのような態様において、他の血液成分は、血液タンパク質、アルブミン、フィブロネクチン、血小板および／または白血球の１以上である。いくつかのそのような態様において、他の血液成分は、一般的なヒトから採取された血液サンプルに見出される実質的にすべての成分である。血液サンプルについて、用語“実質的にすべて”とは、通常は存在するが、非常に低濃度の付随成分を除外して、そうしなければ生じる生物学的に利用可能なリガンドの力価の有効な低下をさせることがない成分を意味する。
【０１３１】
抗原結合タンパク質の診断的使用
ある態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、生物学的サンプル中のＧＰＡの存在を検出するのに有用である。本明細書で用いる用語“検出”とは、定量的または定性的検出を包含する。ある態様において、生物学的サンプルは、細胞または組織を含む。ある態様において、生物学的サンプル中のＧＰＡの存在を検出する方法を提供する。いくつかのそのような態様において、該方法は、抗原結合タンパク質とＧＰＡとの結合に許容される条件下で生物学的サンプルを抗原結合タンパク質と接触させ、抗原結合タンパク質とＧＰＡとの間に複合体が形成されるかどうかを検出することを含む。かかる方法には、ウェスタンブロット、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、“サンドイッチ”免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ免疫アッセイおよび免疫組織化学（ＩＨＣ）などの当技術分野でよく知られている抗原結合アッセイが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３２】
ある態様において、抗原結合タンパク質は標識される。標識（ラベル）には、直接的に検出されるラベルまたは部位（蛍光ラベル、発色ラベル、電子密度ラベル、化学発光ラベル放射性ラベルなど）、ならびに間接的に検出される酵素またはリガンドなどの部分、例えば酵素反応または分子相互作用を介して検出される部分が含まれるが、これらに限定されない。例示的な標識には、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１３１Ｉ、希土類キレートまたはフルオレセインおよびその誘導体のようなフルオロフォア、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼおよび細菌性ルシフェラーゼ、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼまたはマイクロペルオキシダーゼのような色素前駆体を酸化するために過酸化水素を用いる酵素と結合された、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼのようなヘテロ環式オキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定なフリーラジカルなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３３】
ある態様において、抗原結合タンパク質は、不溶性マトリックス上に固定化される。固定化は、本明細書に記載の抗原結合タンパク質を、溶液中に遊離したままのＧＰＡから分離することを伴う。これは、常套的には、水不溶性マトリックスもしくは表面への吸着、または共有結合（例えば、グルタルアルデヒド架橋を用いる）によって、アッセイ手順の前に抗原結合タンパク質を不溶化すること、あるいは抗原結合タンパク質とＧＰＡとの複合体形成後に抗原結合タンパク質を不溶化すること、例えば、免疫沈降によって、のいずれかによって達成される。
【０１３４】
寛容誘導性（Tolerogenic）組成物
いくつかの態様において、本明細書に記載の１以上の抗原結合タンパク質および１以上の寛容誘導性抗原を含む寛容誘導性組成物を提供する。ある態様において、寛容誘導性組成物は、本明細書に記載の１以上の抗原結合タンパク質を介してエリスロサイトに特異的に結合し、寛容誘導性抗原は免疫系に提示され、それにより抗原特異的寛容性を誘導する。本明細書で用いる“寛容誘導性抗原”とは、免疫応答（例えば、適応免疫応答）の受容体、例えば、Ｔ細胞受容体、主要組織適合性複合体クラスＩおよびＩＩ、Ｂ細胞受容体または抗体などの標的として機能する何らかの物質である。ある態様において、寛容誘導性抗原は、体内（例えば、“自己（self）”、“自己（auto）”または“内因性”）に由来し得る。さらなる態様において、寛容誘導性抗原は、例えば、吸入、摂取、注射または移植、経皮投与などによって体内に侵入した、体外（“非自己”、”外来”または“外因性”）に由来し得る。ある態様において、外因性抗原は、体内で生化学的に修飾され得る。外来抗原には、食物抗原、動物抗原、植物抗原、環境抗原、治療薬ならびに同種移植片中に存在する抗原が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３５】
いくつかの態様において、本明細書に記載の寛容誘導性組成物は、例えば、移植拒絶の処置、治療剤に対する免疫応答、自己免疫疾患および食物アレルギーなどの他の用途のために用いられる。
【０１３６】
いくつかの態様において、本明細書に記載の寛容誘導性組成物は、抗原特異的な望ましくない免疫応答を調節するため、特に下方制御するために用いられる。
【０１３７】
いくつかの態様において、本明細書に記載の寛容誘導性組成物は、自己免疫および関連する病状、アレルギー、炎症性免疫応答およびアナフィラキシーを引き起こす、患者内で内因的に生成された抗体（例えば、患者に投与された外因性抗体ではない）、ペプチドなどを含む、望ましくないタンパク質に特異的に結合し、循環から排除するために用いられる。
【０１３８】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、自己抗原および外来抗原に対する望ましくない免疫応答を処置するための寛容誘導性組成物および方法を提供し、該方法は以下を含むがこれらに限定されない：移植レシピエントが望ましくない免疫応答（例えば、移植拒絶）を生じる外来移植抗原、患者が望ましくない免疫応答（例えば、アレルギーまたは過敏症）を発症する外来抗原、患者が望ましくない免疫応答（例えば、過敏症および／または治療活性の低下）を発症する治療剤、患者が望ましくない免疫応答（例えば、自己免疫疾患）を発症する自己抗原。いくつかの態様において、治療剤は、例えば、遺伝子治療ベクターの使用によって送達される。いくつかのそのような態様において、免疫応答は、そのようなベクターの一部および／またはそのカーゴ（例えば、治療剤）に対して生じ得る。従って、いくつかの態様において、寛容性が望まれる抗原は、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（および対応する変異形−１、−２、−５、−６、−８、−９および／または他のパルボウイルス）、レンチウイルスならびにレトロウイルスを含むが、これらに限定されない、遺伝子治療ベクターを含む。
【０１３９】
本発明の方法および寛容誘導性組成物を用いて処置され得る自己免疫疾患状態としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）；急性間質性アレルギー性腎炎（薬物アレルギー）；急性壊死性出血性白質脳炎；アジソン病；円形脱毛症；全身性脱毛症；強直性脊椎炎；若年性関節炎；乾癬性関節炎；リウマチ性関節炎；アトピー性皮膚炎；自己免疫性再生不良性貧血；自己免疫性胃炎；自己免疫性肝炎；自己免疫性下垂体炎；自己免疫性卵胞炎；自己免疫性精巣炎；自己免疫性多内分泌腺症候群１型；自己免疫性多内分泌腺症候群２型；自己免疫性甲状腺炎；ベーチェット病；閉塞性細気管支炎；類天疱瘡；セリアック病；チャーグ-ストラウス症候群；慢性炎症性脱髄性多発神経障害；瘢痕性類天疱瘡；クローン病；コクサッキー心筋炎；ジューリング疱疹状皮膚炎；真性糖尿病（１型糖尿病）；結節性紅斑；後天性表皮水疱症、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）；巨大細胞心筋炎；グッドパスチャー症候群；グレーブス病；ギランバレー症候群；橋本脳炎；橋本甲状腺炎；ＩｇＧ４関連硬化性疾患；ランバート・イートン症候群；混合性結合組織病；ムッハ・ハーベルマン病；多発性硬化症；重症筋無力症；視神経炎；視神経脊髄炎；パーキンソン病；尋常性天疱瘡および変異形；悪性貧血；下垂体自己免疫疾患；多発性筋炎；心膜切開後症候群(postpericardiotomy syndrome）；早発卵巣不全；原発性胆汁性肝硬変；原発性硬化性胆管炎；乾癬；リウマチ性心臓病；シェーグレン症候群；全身性エリテマトーデス；全身性硬化症；潰瘍性大腸炎；未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）；ブドウ膜炎；白斑症；ならびに、ウェゲナー肉芽腫症。
【０１４０】
本発明の方法および寛容誘導性組成物を用いて処置され得る自己免疫疾患状態の特定の群としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：急性壊死性出血性白質脳炎；アジソン病；乾癬性関節炎；リウマチ性関節炎；自己免疫性再生不良性貧血；自己免疫性下垂体炎；自己免疫性胃炎；自己免疫性多内分泌腺症候群１型；類天疱瘡；セリアック病；コクサッキー心筋炎；ジューリング疱疹状皮膚炎；真性糖尿病（１型糖尿病）；後天性表皮水疱症；巨大細胞心筋炎；グッドパスチャー症候群；グレーブス病；橋本甲状腺炎；混合性結合組織病；多発性硬化症；重症筋無力症；視神経脊髄炎；パーキンソン病；悪性貧血；尋常性天疱瘡および変異形；下垂体自己免疫疾患；早発卵巣不全；リウマチ性心臓病；全身性硬化症；シェーグレン症候群；全身性エリテマトーデス；および、白斑症。
【０１４１】
食物抗原などの、望ましくない免疫応答が発生する寛容誘導性抗原を用いる態様では、例えば、ピーナッツ、リンゴ、牛乳、卵白、卵黄、マスタード、セロリ、エビ、小麦（および他の穀類）、イチゴおよびバナナに対する反応に対して処置を提供することができる。
【０１４２】
いくつかの態様により、患者を検査して、望ましくない免疫反応が生じた外来抗原を特定することができ、その寛容誘導性抗原に基づいて、寛容誘導性組成物（抗原結合タンパク質および本明細書に記載の１以上の寛容誘導性抗原を含む）を開発することができる。
【０１４３】
試験
免疫調節における効果は、例えば、本明細書に記載の寛容誘導性組成物の投与に応答して（宿主マウスに移植された）ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋細胞の増殖を、寛容誘導性抗原単独および／またはビークルの投与と比較して測定することによって試験することができる。いくつかの態様によれば、本明細書に記載の寛容誘導性組成物は、この方法で試験されると、寛容誘導性抗原単独またはビークルと比較して、ＯＴ−Ｉ細胞増殖の増加を示し、免疫寛容性の誘導の指標であるＣＤ８＋ Ｔ細胞クロスプライミングの増加を示す。機能的エフェクター表現型に拡張されているＴ細胞を、拡張されて欠失しているＴ細胞と区別するために、増殖しているＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を、枯渇の分子的特徴［プログラムされた細胞死−１（ＰＤ−１）、ＦａｓＬなど］、ならびにアポトーシスおよびそれ故に欠失の特徴としてのアネキシン−Ｖ結合について、表現型分析することができる。ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞はまた、寛容誘導性抗原に対する機能的非応答性、したがって免疫寛容性を実証するために、アジュバントを用いた寛容誘導性抗原暴露に対する応答性を評価することもできる。そのために、宿主マウスへの寛容誘導性組成物の投与後に抗原暴露を行った後に、細胞を炎症性指標について分析する。いくつかの態様によれば、本明細書に記載の寛容誘導性組成物は、この方法で試験された場合、対照群と比較して、ＯＶＡに対する炎症性ＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の顕著に低いレベル（例えば、バックグラウンド）を示し、従って、免疫寛容を示す。
【０１４４】
いくつかの態様によれば、体液性免疫応答は、寛容誘導性抗原単独またはビークルのみの投与と比較して、本明細書に記載の１以上の寛容誘導性抗原を包含する本明細書に記載の耐性抗原組成物を投与し、得られた抗体のレベルを測定することによって試験することができる。いくつかの態様によれば、このようにして試験したとき、本発明の寛容誘導性組成物は、それらの投与およびビークル投与に応答する抗体形成の顕著に低い（例えば、バックグラウンド）レベルを示し、寛容誘導性抗原単独の投与に応答する抗体形成の有意に高いレベルを示す。低下した抗体形成は、免疫寛容性の誘導の指標である。
【０１４５】
寛容誘導性抗原に対する寛容化の有効性は、体液性免疫応答を参照して上記のように試験することができ、ここで、本明細書に記載の寛容誘導性組成物による処置（複数可）の数週間後に、対象群を寛容誘導性抗原単独の投与により曝露し、次いで、寛容誘導性抗原に対する抗体のレベルを測定する。いくつかの態様によれば、この方法で試験したときの本発明の寛容誘導性組成物は、前処理されていない群と比較して、そのような寛容誘導性組成物で前処理された群において、寛容誘導性抗原による暴露に応答する低レベルの抗体形成を示す。
【０１４６】
疾患に焦点を当てた実験モデルには、１型糖尿病の自己免疫および寛容性のＮＯＤ（または非肥満糖尿病）マウスモデル、およびヒト炎症性脱髄性疾患である多発性硬化症のＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎）モデルが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様によれば、そのようなモデルは、本明細書に記載の寛容誘導性組成物を用いて、寛容性の効果的な誘導を実証することができる。
【０１４７】
投与
いくつかの態様によれば、本発明の寛容誘導性組成物は、治療的有効投与量、例えば、上記の疾患状態の処置を提供するのに十分な用量で投与される。本発明の寛容誘導性組成物またはその薬学的に許容される塩の投与は、同様の有用性を提供する薬剤の許容される投与方法のいずれかを介して行うことができる。
【０１４８】
ヒト投与量レベルは、本発明の寛容誘導性化合物についてまだ最適化されていないが、これらは、最初は、マウスに約１０μｇ〜約１００μｇの用量で投与され得る。一般に、個々のヒト用量は、体重１ｋｇ当たり約０．０１〜２０．０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．３〜２．０ｍｇ／ｋｇである。処置は、１日または数日間行うことができ、数日、１〜数週間、または１〜数ヶ月の間隔で繰り返すことができる。投与は、単回投与として（例えば、ボーラスとして）、または最初のボーラスに続いて、時間の経過とともに、例えば、１〜７日間、完全用量の残りの部分を連続的に注入することができる。活性化合物の投与量は、以下のいずれかまたはすべてに依存して変わり得る：処置すべき対象および病状、苦痛の重症度、投与方法およびスケジュールならびに処方する医師の判断。投与量は、寛容誘導性抗原、抗体、抗体フラグメント（または本明細書に記載の他の抗原結合フラグメント）の分子量ならびにリンカーの大きさにも依存して変化し得ることが理解され得る。
【０１４９】
本発明の寛容誘導性組成物は、単独で、または他の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて投与され得る。態様に応じて用いられる一般的な投与経路としては、経口、局所、経皮、注射（筋肉内、静脈内または動脈内）などが挙げられるが、これらに限定されない。態様に応じて、製剤は、要すれば、従来の医薬担体または賦形剤および本発明の寛容誘導性組成物またはその薬学的に許容される塩を含み得る。さらに、これらの寛容誘導性組成物は、本発明の寛容誘導性組成物において用いられる抗原に対応する治療用タンパク質、ペプチド、抗体または抗体様分子が含まれるが、これらに限定されない、他の薬剤、医薬剤、担体など、ならびに免疫調節剤として作用することができ、より具体的には葉酸拮抗薬、免疫抑制剤、凍結抑制剤、有糸分裂阻害剤、および抗代謝物、またはそれらの組み合わせを含む、Ｂ細胞に対して阻害効果を有し得る他の活性剤を含み得る。
【０１５０】
一般に、意図される投与方法によって、薬学的に許容される組成物は、本発明の寛容誘導性組成物を重量比で約０．１％〜約９５％含有し、残りは適切な薬学的賦形剤、担体等である。例えば、いくつかの態様において、薬学的に許容される組成物は、本明細書に記載の寛容誘導性組成物を、約０．１重量％〜約１重量％、約１重量％〜約５重量％、約５重量％〜約１５重量％、約１５重量％〜約２５重量％、約２５重量％〜約５０重量％、約５０重量％〜約７５重量％、約７５重量％〜約９５重量％の量（エンドポイントを含む、記載の範囲間の何れの量も含む）で含有する。非毒性担体から構成されるバランスで０．００５％〜約９５％の範囲で活性成分を含む投与量形態または組成物を調製することができる。例えば、いくつかの態様において、投与量形態は、約０．００５％〜約０．０１％、約０．０１％〜約０．０５％、約０．０５％〜約０．１％、約０．１％〜約１％、約１％〜約５％、約５％〜約１５％、約１５％〜約２５％、約２５％〜約５０％、約５０％〜約７５％、約７５％〜約９５％の量（エンドポイントを含む、記載の範囲間の何れの量も含む）の活性成分を含み得る。
【０１５１】
液体の薬学的に投与可能な寛容誘導性組成物は、例えば、本発明の活性な寛容誘導性組成物（例えば、凍結乾燥粉末）および要すれば薬学的アジュバントを、担体、例えば水（注射用の水）、生理食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール、グリコール、エタノール等（ガラクトースを除く）に溶解、分散などして、それにより溶液または懸濁液を形成することによって調製することができる。所望により、投与される医薬組成物はまた、湿潤剤、乳化剤、安定化剤、可溶化剤、ｐＨ緩衝剤等の非毒性の補助物質、例えば酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノラウレート、酢酸トリエタノールアミンおよびオレイン酸トリエタノールアミン等、浸透圧調製物質（オスモライト）、アミノ酸、糖および炭水化物、タンパク質およびポリマー、塩、界面活性剤、キレート剤および酸化防止剤、防腐剤および特定のリガンドなどを微量含有していてもよい。
【０１５２】
寛容誘導性抗原
本明細書に記載の抗原結合タンパク質を含む寛容誘導性組成物に用いられる寛容誘導性抗原は、タンパク質またはペプチドであり得、例えば、寛容性抗原は、完全または部分的な治療剤、完全長の移植タンパク質またはそのペプチド、完全長の自己抗原またはそのペプチド、完全長のアレルゲンまたはそのペプチドおよび／または核酸、または前記寛容誘導性抗原の模倣物であり得る。あるカテゴリーまたは特定の疾患もしくは反応に関連する特定の寛容誘導性抗原のリストは、その寛容誘導性抗原が別のカテゴリーの一部と見なされること、または別の疾患もしくは反応に関連することを排除するものではない。
【０１５３】
本発明の実施に用いられる寛容誘導性抗原は、以下の１以上であり得る。
・抗体フラグメントならびに抗体および抗体フラグメントの融合タンパク質ならびに遺伝子治療用ベクターを含む、タンパク質、ペプチド、抗体および抗体様分子である治療剤。これらには、ヒト、非ヒト（マウス等）および非天然（すなわち、人工）タンパク質、抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ウイルスおよびウイルス様粒子、ならびにフィブロネクチン、ＤＡＲＰｉｎｓ、ノッティン（knottin）等の非抗体結合足場が含まれる。
・移植レシピエントが望ましくない免疫応答を生じるヒト同種移植抗原。
・望ましくない自己免疫反応を引き起こす自己抗原。自己抗原は、患者（例えば、自己免疫患者）において内因性起源であるが、本発明の寛容誘導性組成物に用いるポリペプチドは、態様によっては、外因的に合成されてもよい（供給源から精製され、濃縮されるのとは対照的に）。
・患者が望ましくない免疫応答を経験する食物抗原、動物抗原、植物抗原および環境抗原などの外来抗原。治療用タンパク質もまた、その外因性起源のために外来抗原とみなされ得るが、本発明の説明を明確にする目的で、そのような治療薬は別個のグループとして記載される。同様に、植物抗原または動物抗原は、食べられて食物抗原とみなされ得て、環境抗原は、植物に由来するものであってもよい。しかしながら、これらは外来抗原とみなされる。当業者は、特に詳細な説明および実施例に照らして、本発明の寛容誘導性組成物に用いられ得る寛容誘導性抗原を理解することができるので、単純にするために、そのような潜在的に重複するグループのすべてを区別して記載し、定義する試みはされない。
【０１５４】
寛容誘導性抗原は、完全タンパク質、完全タンパク質の一部、ペプチドなどであり得て、リンカーおよび／または抗原結合部位に結合するために（上記のように）誘導体化されてよく、変異および／または保存的置換を含んでよく、特に配列同一性を維持し得て、および／または脱シアル化されてもよい。
【０１５５】
寛容誘導性抗原が治療用タンパク質、ペプチド、抗体または抗体様分子である態様において、特定の寛容誘導性抗原としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：アバタセプト、アブシキシマブ、アダリムマブ、アデノシンデアミナーゼ、アドトラスツズマブエムタンシン、アガルシダーゼアルファ、アガルシダーゼベータ、アルデスルキン（Aldeslukin）、アルグルセラーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、α−１−プロテイナーゼ阻害剤、アナキンラ、アニストレプラーゼ（アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼアクチベーター複合体）、アンチトロンビンIII、抗胸腺細胞グロブリン、アルテプラーゼ（Ateplase）、ベバシズマブ、ビバリルジン、ボツリヌス毒素Ａ型、ボツリヌス毒素Ｂ型、Ｃ１−エステラーゼ阻害剤、カナキヌマブ（Canakinumab）、カルボキシペプチダーゼＧ２（グルカルピダーゼ、ボラクサーゼ（Voraxaze））、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、コラゲナーゼ、ガラガラヘビ免疫Ｆａｂ（Crotalidae immune Fab）、ダルベポエチン−α、デノスマブ、ジゴキシン免疫Ｆａｂ、ドルナーゼアルファ、エクリズマブ、エタネルセプト、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フィブリノーゲン、フィルグラスチム、ガルスルファーゼ（Galsulfase）、ゴリムマブ、酢酸ヒストレリン、ヒアルロニダーゼ、イデュルスルファーゼ（Idursulphase）、イミグルセラーゼ、インフリキシマブ、インスリン［組換えヒトインスリン（“ｒＨｕインスリン”）およびウシインスリンを含む］、インターフェロン−α２ａ、インターフェロン−α２ｂ、インターフェロン−β１ａ、インターフェロン−β１ｂ、インターフェロン−γ１ｂ、イピリムマブ、Ｌ−アルギナーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、Ｌ−メチオナーゼ、ラクターゼ、ラロニダーゼ、レピルジン／ヒルジン、メカセルミン、メカセルミンリンファベート（Mecasermin rinfabate）、メトキシナタリズマブ、オクトレオチド、オファツムマブ、オプレルベキン、膵アミラーゼ、膵リパーゼ、パパイン、Ｐｅｇ−アスパラギナーゼ、Ｐｅｇ−ドキソルビシンＨＣｌ、Ｐｅｇ−エポエチン−β、ペグフィルグラスチム、Ｐｅｇ−インターフェロン−α２ａ、Ｐｅｇ−インターフェロン−α２ｂ、ペグロティカーゼ、ペグビソマント、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、プロテインＣ、ラスブリカーゼ（ウリカーゼ）、サクロシダーゼ、サケカルシトニン、サルグラモスチム、ストレプトキナーゼ、テネクテプラーゼ、テリパラチド、トシリズマブ（アトリズマブ）、トラスツズマブ、１型α−インターフェロン、ウステキヌマブ、ｖＷ因子。治療用タンパク質は、天然の供給源（例えば、濃縮および精製されたもの）から得ることができ、または合成されたもの、例えば、組換え的に得ることができ、一般的にはＩｇＧモノクローナルまたはフラグメントもしくは融合体である抗体治療薬を含む。
【０１５６】
特定の治療用タンパク質、ペプチド、抗体または抗体様分子には、アブシキシマブ、アダリムマブ、アガルシダーゼアルファ、アガルシダーゼベータ、アルデスロイキン（Aldeslukin）、アルグルコシダーゼアルファ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、インフリキシマブ、インスリン（ｒＨｕインスリンを含む）、Ｌ−アスパラギナーゼ、ラロニダーゼ、ナタリズマブ、オクトレオチド、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）またはラスブリカーゼ（ウリカーゼ）、および一般的にはそれらの様々な形態のＩｇＧモノクローナル抗体が含まれるが、それらに限定されない。
【０１５７】
いくつかの態様では、止血剤（例えば、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子）、インスリン（ｒＨｕインスリンを含む）および非ヒト治療薬ウリカーゼ、ＰＡＬおよびアスパラギナーゼを利用する。
【０１５８】
いくつかの態様において、治療剤は、例えば、遺伝子治療ベクターの使用によって送達される。いくつかのそのような態様では、かかるベクターの一部および／またはそのカーゴ（例えば、治療剤）に対して免疫応答が生じ得る。したがって、いくつかの態様において、寛容性が望まれる抗原は、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（および対応する変異体−１、−２、−５、−６、−８、−９および／または他のパルボウイルス）、レンチウイルスおよびレトロウイルスを含むが、これらに限定されない、遺伝子治療ベクターを含む。
【０１５９】
血液学（hematology）および移植における望ましくない免疫応答には、自己免疫性再生不良性貧血、移植拒絶（一般的に）および移植片対宿主疾患（骨髄移植拒絶）が含まれる。寛容誘導性抗原がヒト同種移植片移植抗原である態様において、特定の配列は、以下から選択され得る：様々なＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩハプロタイプタンパク質のサブユニット（例えば、組織交差適合試験において同定されたドナー／レシピエントの違い）、ならびにＲｈＣＥ、Ｋｅｌｌ、Ｋｉｄｄ、ＤｕｆｆｙおよびＳｓを含むマイナー血液群抗原上の単一アミノ酸多型。このような寛容誘導性組成物は、所与のドナー／レシピエントペアに対して個別に調製することができる。
【０１６０】
寛容誘導性抗原が自己抗原である態様において、特定の寛容誘導性抗原（およびそれらが関連する自己免疫疾患）が選択され得る。
【０１６１】
１型糖尿病において、抗原としては、インスリン、プロインスリン、プレプロインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ−６５（ＧＡＤ−６５またはグルタミン酸デカルボキシラーゼ２）、ＧＡＤ−６７、グルコース−６ホスファターゼ２（ＩＧＲＰまたは膵島特異的グルコース６ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）およびインスリノーマ関連タンパク質２β（ＩＡ−２β）が挙げられるが、これらに限定されない。他の抗原としては、ＩＣＡ６９、ＩＣＡ１２（ＳＯＸ−１３）、カルボキシペプチダーゼＨ、イモージェン３８、ＧＬＩＭＡ３８、クロモグラニンＡ、ＨＳＰ−６０、カルボキシペプチダーゼＥ、ペリフェリン、グルコーストランスポーター２、肝細胞癌−腸−膵臓／膵臓関連タンパク質、Ｓ１００β、グリア線維性酸性タンパク質、再生遺伝子ＩＩ、膵臓十二指腸ホメオボックス１、筋強直性ジストロフィーキナーゼ、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質、およびＳＳＴ Ｇタンパク質共役受容体１〜５、またはかかる抗原のいずれかの免疫原性フラグメントもしくは部分が挙げられる。インスリンは、自己抗原としても治療用タンパク質抗原としても特徴づけられる抗原の一例であることが特記される。例えば、ｒＨｕインスリンおよびウシインスリンは、治療用タンパク質抗原（望ましくない免疫攻撃の対象）であるのに対し、内因性ヒトインスリンは自己抗原（望ましくない免疫攻撃の対象）である。内因性ヒトインスリンは、医薬組成物に用いることができないため、本発明の寛容誘導性組成物の特定の態様では、組換え体が用いられる。
【０１６２】
いくつかの態様において、本発明の寛容誘導性組成物において有用な外因的に得られた形態を含むヒトインスリンは、以下の配列を有する（UNIPROT P01308）：MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN （配列番号１６３)。
【０１６３】
いくつかの態様において、本発明の寛容誘導性組成物において有用な外因的に得られた形態を含むＧＡＤ−６５は、以下の配列を有する（UNIPROT Q05329）：MASPGSGFWSFGSEDGSGDSENPGTARAWCQVAQKFTGGIGNKLCALLYGDAEKPAESGGSQPPRAAARKAACACDQKPCSCSKVDVNYAFLHATDLLPACDGERPTLAFLQDVMNILLQYVVKSFDRSTKVIDFHYPNELLQEYNWELADQPQNLEEILMHCQTTLKYAIKTGHPRYFNQLSTGLDMVGLAADWLTSTANTNMFTYEIAPVFVLLEYVTLKKMREIIGWPGGSGDGIFSPGGAISNMYAMMIARFKMFPEVKEKGMAALPRLIAFTSEHSHFSLKKGAAALGIGTDSVILIKCDERGKMIPSDLERRILEAKQKGFVPFLVSATAGTTVYGAFDPLLAVADICKKYKIWMHVDAAWGGGLLMSRKHKWKLSGVERANSVTWNPHKMMGVPLQCSALLVREEGLMQNCNQMHASYLFQQDKHYDLSYDTGDKALQCGRHVDVFKLWLMWRAKGTTGFEAHVDKCLELAEYLYNIIKNREGYEMVFDGKPQHTNVCFWYIPPSLRTLEDNEERMSRLSKVAPVIKARMMEYGTTMVSYQPLGDKVNFFRMVISNPAATHQDIDFLIEEIERLGQDL （配列番号１６４)。
【０１６４】
いくつかの態様において、本発明の寛容誘導性組成物において有用な外因的に得られた形態を含むＩＧＲＰは、以下の配列を有する（UNIPROT QN9QR9）：MDFLHRNGVLIIQHLQKDYRAYYTFLNFMSNVGDPRNIFFIYFPLCFQFNQTVGTKMIWVAVIGDWLNLIFKWILFGHRPYWWVQETQIYPNHSSPCLEQFPTTCETGPGSPSGHAMGASCVWYVMVTAALSHTVCGMDKFSITLHRLTWSFLWSVFWLIQISVCISRVFIATHFPHQVILGVIGGMLVAEAFEHTPGIQTASLGTYLKTNLFLFLFAVGFYLLLRVLNIDLLWSVPIAKKWCANPDWIHIDTTPFAGLVRNLGVLFGLGFAINSEMFLLSCRGGNNYTLSFRLLCALTSLTILQLYHFLQIPTHEEHLFYVLSFCKSASIPLTVVAFIPYSVHMLMKQSGKKSQ （配列番号１６５)。
【０１６５】
いくつかの態様において、本発明の寛容誘導性組成物において有用な外因的に得られた形態を含むヒトプロインスリンは、以下の配列を有する：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN （配列番号２０３)。
【０１６６】
態様に応じて、１型糖尿病を処置するための本発明の寛容誘導性組成物に有用なペプチド／エピトープは、寛容誘導性組成物において個別に、または寛容誘導性組成物のカクテルにおいて共に、以下の配列のいくつかまたは全てを含む：
・ヒトプロインスリン１−７０：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQ （配列番号２０４)；
・ヒトプロインスリン９−７０：SHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQ （配列番号２０５)；
・ヒトプロインスリン９−３８：SHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQ （配列番号２０６)；
・ヒトプロインスリン１−３８：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQ （配列番号２０７)；
・ヒトプロインスリン９−２３：SHLVEALYLVCGERG （配列番号２０８)；
・ヒトプロインスリン４５−７１(Ｃ１３−Ａ６)：GGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQC （配列番号２０９)；
・ヒトプロインスリンＣ２４−Ａ１：LALEGSLQKRG （配列番号２１０)；
・ヒトプロインスリンＣ１９−Ａ３：GSLQPLALEGSLQKRGIV （配列番号２１１)；
・ヒトプロインスリンＣ１３−３２：GGGPGAGSLQPLALEGSLQK （配列番号２１２)；
・ヒトプロインスリンＢ９−Ｃ４：SHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAED （配列番号２１３)；
・ヒトプロインスリンＣ２２−Ａ５：QPLALEGSLQKRGIVEQ （配列番号２１４)。
【０１６７】
橋本甲状腺炎およびグレーブス病を含む甲状腺の自己免疫疾患において、主要抗原としては、サイログロブリン（ＴＧ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）および甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の抗原としては、ナトリウムヨウ素共輸送体（ＮＩＳ）およびメガリンが挙げられる。甲状腺関連眼症および皮膚症において、ＴＳＨＲを含む甲状腺自己抗原に加えて、抗原は、インスリン様増殖因子１受容体である。副甲状腺機能低下症において、主要抗原はカルシウム感受性受容体である。
【０１６８】
アジソン病において、主要抗原としては、２１−ヒドロキシラーゼ、１７α−ヒドロキシラーゼおよびＰ４５０側鎖切断酵素（Ｐ４５０ｓｃｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の抗原には、ＡＣＴＨ受容体、Ｐ４５０ｃ２１およびＰ４５０ｃ１７が含まれる。
【０１６９】
早発卵巣不全において、主要抗原としては、ＦＳＨ受容体およびα−エノラーゼが挙げられるが、これに限定されない。
【０１７０】
自己免疫性下垂体炎または下垂体の自己免疫疾患において、主要抗原としては、下垂体特異的タンパク質因子（ＰＧＳＦ）１ａおよび２が挙げられるが、これらに限定されない。別の抗原は、２型ヨードチロニンデヨージナーゼである。
【０１７１】
多発性硬化症において、主要抗原としては、ミエリン塩基性タンパク質（“ＭＢＰ”）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（“ＭＯＧ”）およびミエリンプロテオリピドタンパク質（“ＰＬＰ”）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７２】
本発明の寛容誘導性組成物において有用な外因的に得られた形態を含むＭＢＰは、以下の配列（UNIPROT P02686）を有する：MGNHAGKRELNAEKASTNSETNRGESEKKRNLGELRTTSEDNEVFGEADANQNNGTSSQDTAVTDSKRTADPKNAWQDAHPADPGSRPHLIRLFSRDAPGREDNTFKDRPSESDELQTIQEDSAATSESLDVMASQKRPSQRHGSKYLATASTMDHARHGFLPRHRDTGILDSIGRFFGGDRGAPKRGSGKDSHHPARTAHYGSLPQKSHGRTQDENPVVHFFKNIVTPRTPPPSQGKGRGLSLSRFSWGAEGQRPGFGYGGRASDYKSAHKGFKGVDAQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR （配列番号１６６)。
【０１７３】
本発明の寛容誘導性組成物において有用な外因的に得られた形態を含むＭＯＧは、以下の配列を有する（UNIPROT Q16653）：MASLSRPSLPSCLCSFLLLLLLQVSSSYAGQFRVIGPRHPIRALVGDEVELPCRISPGKNATGMEVGWYRPPFSRVVHLYRNGKDQDGDQAPEYRGRTELLKDAIGEGKVTLRIRNVRFSDEGGFTCFFRDHSYQEEAAMELKVEDPFYWVSPGVLVLLAVLPVLLLQITVGLIFLCLQYRLRGKLRAEIENLHRTFDPHFLRVPCWKITLFVIVPVLGPLVALIICYNWLHRRLAGQFLEELRNPF （配列番号１６７)。
【０１７４】
本発明の寛容誘導性組成物において有用な外因的に得られた形態を含むＰＬＰは、以下の配列を有する（UNIPROT P60201）：MGLLECCARCLVGAPFASLVATGLCFFGVALFCGCGHEALTGTEKLIETYFSKNYQDYEYLINVIHAFQYVIYGTASFFFLYGALLLAEGFYTTGAVRQIFGDYKTTICGKGLSATVTGGQKGRGSRGQHQAHSLERVCHCLGKWLGHPDKFVGITYALTVVWLLVFACSAVPVYIYFNTWTTCQSIAFPSKTSASIGSLCADARMYGVLPWNAFPGKVCGSNLLSICKTAEFQMTFHLFIAAFVGAAATLVSLLTFMIAATYNFAVLKLMGRGTKF （配列番号１６８)。
【０１７５】
多発性硬化症を処置するための本発明の寛容誘導性組成物に有用なペプチド／エピトープは、寛容誘導性組成物において個別に、または寛容誘導性組成物の組合せ（例えば、カクテル）において共に、以下の２〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０（およびこの中の重複範囲）の配列のいくつかまたは全てを含む：
・MBP13-32：KYLATASTMDHARHGFLPRH （配列番号１６９)；
・MBP83-99：ENPWHFFKNIVTPRTP （配列番号１７０)；
・MBP111-129：LSRFSWGAEGQRPGFGYGG （配列番号１７１)；
・MBP146-170：AQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR （配列番号１７２)；
・MOG1-20：GQFRVIGPRHPIRALVGDEV （配列番号１７３)；
・MOG35-55：MEVGWYRPPFSRWHLYRNGK （配列番号１７４)；
・PLP139-154：HCLGKWLGHPDKFVGI （配列番号１７５)；
・MOG35-55：MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK （配列番号１８６)；
・MOG30-60：KNATGMEVGWYRSPFSRVVHLYRNGKDQDAE （配列番号１８７)；
・MBP83-99：ENPVVHFFKNIVTPRTP (配列番号１８８)；
・MOG35-55：MEVGWYRPPFSRVVHLYRNGK (配列番号１８９)；
・MBP82-98：DENPVVHFFKNIVTPRT (配列番号１９０)；
・MBP82-99:DENPVVHFFKNIVTPRTP (配列番号１９１)；
・MBP82-106：DENPVVHFFKNIVTPRTPPPSQGKG (配列番号１９２)；
・MBP87-106：VHFFKNIVTPRTPPPSQGKG （配列番号１９３)；
・MBP131-155：ASDYKSAHKGLKGVDAQGTLSKIFK （配列番号１９４)；
・PLP41-58：GTEKLIETYFSKNYQDYE （配列番号１９５)；
・PLP89-106：GFYTTGAVRQIFGDYKTT （配列番号１９６)；
・PLP95-116：AVRQIFGDYKTTICGKGLSATV （配列番号１９７)；
・PLP178-197：NTWTTCQSIAFPSKTSASIG （配列番号１９８)；
・PLP190-209：SKTSASIGSLCADARMYGVL （配列番号１９９)；
・MOG11-30：PIRALVGDEVELPCRISPGK （配列番号２００)；
・MOG21-40：ELPCRISPGKNATGMEVGWY （配列番号２０１)；
・MOG64-86：EYRGRTELLKDAIGEGKVTLRIR （配列番号２０２)。
【０１７６】
リウマチ性関節炎において、主要抗原としては、コラーゲンＩＩ、免疫グロブリン結合タンパク質、免疫グロブリンＧのフラグメント結晶化領域、二本鎖ＤＮＡ、ならびにフィブリン／フィブリノーゲン、ビメンチン、コラーゲンＩおよびＩＩ、およびアルファ−エノラーゼを含む、リウマチ性関節炎の病理に関与するタンパク質の天然形態およびシトルリン化された形態が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７７】
自己免疫性胃炎において、主要抗原はＨ＋、Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅである。
【０１７８】
悪性貧血において、主要抗原は内因性因子である。
【０１７９】
セリアック病において、主要抗原としては、組織グルタミン転移酵素ならびにグルテンまたはグルテン様タンパク質の天然および脱アミド化形態、例えばアルファ−、ガンマ−およびオメガ−グリアジン、グルテニン、ホルデイン、セカリンおよびアベニンが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、例えば、セリアック病の主要抗原はアルファ−グリアジンであるが、アルファ−グリアジンは、アルファ−グリアジンのグルタミンをグルタミン酸に変換する組織グルタミン転移酵素による脱アミド化を介して、体内でより免疫原性に変化することを理解し得る。従って、アルファグリアジンは元々は外来食物抗原であるが、体内で修飾されてより免疫原性になると、態様によっては自己抗原として特徴付けることができる。
【０１８０】
白斑症において、主要抗原はチロシナーゼ、およびチロシナーゼ関連タンパク質１および２である。
【０１８１】
本発明の寛容誘導性組成物において有用な外因的に得られた形態を含むＭＡＲＴ１、Ｔ細胞１によって認識されるメラノーマ抗原、Ｍｅｌａｎ−Ａは、以下の配列を有する（UNIPROT Q16655）：MPREDAHFIYGYPKKGHGHSYTTAEEAAGIGILTVILGVLLLIGCWYCRRRNGYRALMDKSLHVGTQCALTRRCPQEGFDHRDSKVSLQEKNCEPVVPNAPPAYEKLSAEQSPPPYSP （配列番号１７６)。
【０１８２】
本発明の寛容誘導性組成物において有用な外因的に得られた形態を含むチロシナーゼは、以下の配列を有する（UNIPROT P14679）：MLLAVLYCLLWSFQTSAGHFPRACVSSKNLMEKECCPPWSGDRSPCGQLSGRGSCQNILLSNAPLGPQFPFTGVDDRESWPSVFYNRTCQCSGNFMGFNCGNCKFGFWGPNCTERRLLVRRNIFDLSAPEKDKFFAYLTLAKHTISSDYVIPIGTYGQMKNGSTPMFNDINIYDLFVWMHYYVSMDALLGGSEIWRDIDFAHEAPAFLPWHRLFLLRWEQEIQKLTGDENFTIPYWDWRDAEKCDICTDEYMGGQHPTNPNLLSPASFFSSWQIVCSRLEEYNSHQSLCNGTPEGPLRRNPGNHDKSRTPRLPSSADVEFCLSLTQYESGSMDKAANFSFRNTLEGFASPLTGIADASQSSMHNALHIYMNGTMSQVQGSANDPIFLLHHAFVDSIFEQWLRRHRPLQEVYPEANAPIGHNRESYMVPFIPLYRNGDFFISSKDLGYDYSYLQDSDPDSFQDYIKSYLEQASRIWSWLLGAAMVGAVLTALLAGLVSLLCRHKRKQLPEEKQPLLMEKEDYHSLYQSHL （配列番号１７７)。
【０１８３】
本発明の寛容誘導性組成物において有用な外因的に得られた形態を含むメラノサイトタンパク質ＰＭＥＬ、ｇｐ１００は、以下の配列を有する（UNIPROT P40967）：MDLVLKRCLLHLAVIGALLAVGATKVPRNQDWLGVSRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDCWRGGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYVWKTWGQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGSRSYVPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQPLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRALVVTHTYLEPGPVTAQVVLQAAIPLTSCGSSPVPGTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAESTGMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAAQVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSFSVTLDIVQGIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIMPGQEAGLGQVPLIVGILLVLMAVVLASLIYRRRLMKQDFSVPQLPHSSSHWLRLPRIFCSCPIGENSPLLSGQQV （配列番号１７８)。
【０１８４】
重症筋無力症において、主要抗原はアセチルコリン受容体である。
【０１８５】
尋常性天疱瘡および変異形において、主要抗原としては、デスモグレイン３、１および４が挙げられるが、これらに限定されない。他の抗原としては、ペンファキシン、デスモコリン、プラコグロビン、パープラキン、デスモプラキンおよびアセチルコリン受容体が挙げられる。
【０１８６】
類天疱瘡において、主要抗原としては、ＢＰ１８０およびＢＰ２３０が挙げられるが、これらに限定されない。他の抗原はプレクチンおよびラミニン５を含む。
【０１８７】
ジューリング疱疹状皮膚炎において、主要抗原としては、筋内膜および組織グルタミン転移酵素が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８８】
後天性表皮水疱症において、主要抗原はコラーゲンＶＩＩである。
【０１８９】
全身性硬化症において、主要抗原としては、マトリックスメタロプロテイナーゼ１および３、コラーゲン特異的分子シャペロン熱ショックタンパク質４７、フィブリリン−１ならびにＰＤＧＦ受容体が挙げられるが、これらに限定されない。他の抗原としては、Ｓｃｌ−７０、Ｕ１ ＲＮＰ、Ｔｈ／Ｔｏ、Ｋｕ、Ｊｏ１、ＮＡＧ−２、セントロメアタンパク質、トポイソメラーゼＩ、核小体タンパク質、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩ、ＰＭ−Ｓｌｃ、フィブリラリンならびにＢ２３が挙げられる。
【０１９０】
混合型結合組織疾患において、主要抗原はＵ１ｓｎＲＮＰである。
【０１９１】
シェーグレン症候群において、主要抗原としては、核抗原ＳＳ−ＡおよびＳＳ−Ｂが挙げられるが、これらに限定されない。他の抗原としては、フォドリン、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼおよびトポイソメラーゼ、ムスカリン受容体ならびにＦｃ−ガンマ受容体ＩＩＩｂが挙げられる。
【０１９２】
全身性エリテマトーデスにおいて、主要抗原としては、“スミス抗原”を含む核タンパク質、ＳＳ−Ａ、高移動度グループボックス１（ＨＭＧＢ１）、ヌクレオソーム、ヒストンタンパク質および二本鎖ＤＮＡ（それに対して疾患過程で自己抗体が作られる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９３】
グッドパスチャー症候群において、主要抗原としては、コラーゲンＩＶを含む糸球体基底膜膜タンパク質が挙げられるが、これに限定されない。
【０１９４】
リウマチ性心疾患において、主要抗原は心臓ミオシンである。
【０１９５】
自己免疫性多内分泌腺症候群１型抗原としては、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ、ヒスチジンデカルボキシラーゼ、システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ、トリプトファンヒドロキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、肝Ｐ４５０チトクロムＰ４５０１Ａ２および２Ａ６、ＳＯＸ−９、ＳＯＸ−１０、カルシウム感受性受容体タンパク質、ならびに１型インターフェロン、インターフェロンアルファ、ベータおよびガンマが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９６】
視神経脊髄炎において、主要抗原はＡＱＰ４である。
【０１９７】
本発明の寛容誘導性組成物において有用な外因的に得られた形態を含むアクアポリン−４は、以下の配列を有する（UNIPROT P55087）：MSDRPTARRWGKCGPLCTRENIMVAFKGVWTQAFWKAVTAEFLAMLIFVLLSLGSTINWGGTEKPLPVDMVLISLCFGLSIATMVQCFGHISGGHINPAVTVAMVCTRKISIAKSVFYIAAQCLGAIIGAGILYLVTPPSVVGGLGVTMVHGNLTAGHGLLVELIITFQLVFTIFASCDSKRTDVTGSIALAIGFSVAIGHLFAINYTGASMNPARSFGPAVIMGNWENHWIYWVGPIIGAVLAGGLYEYVFCPDVEFKRRFKEAFSKAAQQTKGSYMEVEDNRSQVETDDLILKPGVVHVIDVDRGEEKKGKDQSGEVLSSV （配列番号１７９)。
【０１９８】
ブドウ膜炎において、主要抗原としては、網膜Ｓ−抗原または“Ｓ−アレスチン”ならびに光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）またはレチノール結合タンパク質３が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９９】
本発明の寛容誘導性組成物において有用な外因的に得られた形態を含むＳ−アレスチンは、以下の配列を有する（UNIPROT P10523）：MAASGKTSKSEPNHVIFKKISRDKSVTIYLGNRDYIDHVSQVQPVDGVVLVDPDLVKGKKVYVTLTCAFRYGQEDIDVIGLTFRRDLYFSRVQVYPPVGAASTPTKLQESLLKKLGSNTYPFLLTFPDYLPCSVMLQPAPQDSGKSCGVDFEVKAFATDSTDAEEDKIPKKSSVRLLIRKVQHAPLEMGPQPRAEAAWQFFMSDKPLHLAVSLNKEIYFHGEPIPVTVTVTNNTEKTVKKIKAFVEQVANVVLYSSDYYVKPVAMEEAQEKVPPNSTLTKTLTLLPLLANNRERRGIALDGKIKHEDTNLASSTIIKEGIDRTVLGILVSYQIKVKLTVSGFLGELTSSEVATEVPFRLMHPQPEDPAKESYQDANLVFEEFARHNLKDAGEAEEGKRDKNDVDE （配列番号１８０)。
【０２００】
本発明の寛容誘導性組成物において有用な外因的に得られた形態を含むＩＲＢＰは、以下の配列を有する（UNIPROT P10745）：MMREWVLLMSVLLCGLAGPTHLFQPSLVLDMAKVLLDNYCFPENLLGMQEAIQQAIKSHEILSISDPQTLASVLTAGVQSSLNDPRLVISYEPSTPEPPPQVPALTSLSEEELLAWLQRGLRHEVLEGNVGYLRVDSVPGQEVLSMMGEFLVAHVWGNLMGTSALVLDLRHCTGGQVSGIPYIISYLHPGNTILHVDTIYNRPSNTTTEIWTLPQVLGERYGADKDVVVLTSSQTRGVAEDIAHILKQMRRAIVVGERTGGGALDLRKLRIGESDFFFTVPVSRSLGPLGGGSQTWEGSGVLPCVGTPAEQALEKALAILTLRSALPGVVHCLQEVLKDYYTLVDRVPTLLQHLASMDFSTVVSEEDLVTKLNAGLQAASEDPRLLVRAIGPTETPSWPAPDAAAEDSPGVAPELPEDEAIRQALVDSVFQVSVLPGNVGYLRFDSFADASVLGVLAPYVLRQVWEPLQDTEHLIMDLRHNPGGPSSAVPLLLSYFQGPEAGPVHLFTTYDRRTNITQEHFSHMELPGPRYSTQRGVYLLTSHRTATAAEEFAFLMQSLGWATLVGEITAGNLLHTRTVPLLDTPEGSLALTVPVLTFIDNHGEAWLGGGVVPDAIVLAEEALDKAQEVLEFHQSLGALVEGTGHLLEAHYARPEVVGQTSALLRAKLAQGAYRTAVDLESLASQLTADLQEVSGDHRLLVFHSPGELVVEEAPPPPPAVPSPEELTYLIEALFKTEVLPGQLGYLRFDAMAELETVKAVGPQLVRLVWQQLVDTAALVIDLRYNPGSYSTAIPLLCSYFFEAEPRQHLYSVFDRATSKVTEVWTLPQVAGQRYGSHKDLYILMSHTSGSAAEAFAHTMQDLQRATVIGEPTAGGALSVGIYQVGSSPLYASMPTQMAMSATTGKAWDLAGVEPDITVPMSEALSIAQDIVALRAKVPTVLQTAGKLVADNYASAELGAKMATKLSGLQSRYSRVTSEVALAEILGADLQMLSGDPHLKAAHIPENAKDRIPGIVPMQIPSPEVFEELIKFSFHTNVLEDNIGYLRFDMFGDGELLTQVSRLLVEHIWKKIMHTDAMIIDMRFNIGGPTSSIPILCSYFFDEGPPVLLDKIYSRPDDSVSELWTHAQVVGERYGSKKSMVILTSSVTAGTAEEFTYIMKRLGRALVIGEVTSGGCQPPQTYHVDDTNLYLTIPTARSVGASDGSSWEGVGVTPHVVVPAEEALARAKEMLQHNQLRVKRSPGLQDHL （配列番号１８１)。
【０２０１】
寛容誘導性抗原が、それに対して望ましくない免疫応答が生じ得る外来抗原、例えば食物抗原である態様において、特定の抗原としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・ピーナッツ由来：コナラチン（Ara h 1）、アレルゲンＩＩ（Ara h 2）、ピーナッツアグルチニン、コングルチン（Ara h 6）；
○ コンアラキンは、例えば、UNIPROT Q6PSU6として同定された配列を有する。
・りんご由来：３１ｋｄａの主要アレルゲン／疾患抵抗性タンパク質ホモログ（Mal d 2）、脂質転移タンパク質前駆体（Mal d 3）、主要アレルゲン Mal d 1.03D（Mal d 1）；
・ミルク由来：α−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）、ラクトトランスフェリン；キウイ由来：アクチニジン（Act c 1、Act d 1）、フィトシスタチン、タウマチン様タンパク質（Act d 2）、キウェリン（Act d 5）；
・卵白由来：オボムコイド、オボアルブミン、オボトランスフェリンおよびリゾチーム；
・卵黄由来：リベチン、アポビチリンおよびボスベチン；
・マスタード由来：２Ｓアルブミン（Sin a 1）、１１Ｓグロブリン（Sin a 2）、脂質転移タンパク質（Sin a 3）、プロフィリン（Sin a 4）；
・セロリ由来：プロフィリン（Api g 4）、高分子量糖タンパク質（Api g 5）；
・エビ由来：Pen a 1アレルゲン（Pen a 1）、アレルゲンPen m 2（Pen m 2）、トロポミオシン速筋（fast）型アイソフォーム；
・小麦および／または他の穀物由来：高分子量グルテニン、低分子量グルテニン、アルファ−、ガンマ−およびオメガ−グリアジン、ホルデイン、セカリンおよび／またはアベニン；
○ セリアック病を処置するための本発明の寛容誘導性組成物において有用なペプチド／エピトープは、寛容誘導性組成物において個別に、または寛容誘導性組成物の組合せ（例えば、カクテル）において共に、以下の２〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０（およびこの中の重複範囲）またはそれ以上の配列のいくつかまたは全てを含む：
− ＤＱ−２関連、アルファ−グリアジン“３３マー”天然型：
LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF （配列番号１８２)
− ＤＱ−２関連、アルファ−グリアジン“３３マー”脱アミド化型：
LQLQPFPQPELPYPQPELPYPQPELPYPQPQPF （配列番号１８３)
− ＤＱ−８関連、アルファ−グリアジン：
QQYPSGQGSFQPSQQNPQ （配列番号１８４)
− ＤＱ−８関連、オメガ−グリアジン (小麦、U5UA46)：
QPFPQPEQPFPW （配列番号１８５)
−アルファ−グリアジン “１５マー”フラグメント：
ELQPFPQPELPYPQP （配列番号２１５)
・イチゴ由来：主要イチゴアレルギー Fra a 1-E (Fra a 1)；および
・バナナ由来：プロフィリン（Mus xp 1）。
【０２０２】
パーキンソン病において、主要抗原はアルファシヌクレインである。本発明の寛容誘導性組成物において有用な外因的に得られた形態を含むアルファシヌクレインは、以下の配列を有する（UNIPROT P37840）：MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA（配列番号２１６)。
【０２０３】
寛容誘導性抗原が、それに対して望ましくない免疫応答が生じる外来抗原、例えば動物抗原、植物抗原および環境抗原である態様において、特定の抗原は、例えば以下であり得る：以下に由来するタンパク質またはペプチドを含む、ネコ、マウス、イヌ、ウマ、ハチ、ダスト、木およびアキノキリンソウ（goldenrod）：
・雑草（ブタクサアレルゲンamb a 1、2、3、5, 6、および Amb t 5；ブタクサ Che a 2、5；ならびに、その他の雑草アレルゲン Par j 1、2、3、および Par o 1を含む）。
・草（主要アレルゲン Cyn d 1、7および12；Dac g 1、2および5；Hol I 1.01203；Lol p 1、2、3、5および11；Mer a 1；Pha a 1；Poa p 1および5を含む）。
・ブタクサおよび他の雑草（ナガバギシギシ（curly dock）、シロザ（lambs quarters）、ピグウィード（pigweed）、プランテン、ヒメスイバ（sheep sorrel）およびヤマヨモギ（sagebrush）を含む）、草（バミューダ、ジョンソン、ケンタッキー、オーチャード、スウィートヴァーナルおよびティモシー草を含む）、樹木（梓（catalpa）、エルム、ヒッコリー、オリーブ、ピーカン、シカモアおよびクルミ（walnut）を含む）からの花粉；
・ダスト（Der p 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、14、15、18、20、21および23などのヤケヒョウヒダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）種からの主要なアレルゲン；Der f 1、2、3、6、7、10、11、13、14、15、16、18、22および24などのコナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farina）種からの主要なアレルゲン；Blo t 1、2、3、4、5、6、10、11、12、13、19および21などのネッタイタマニクダニ（Blomia tropicalis）種からの主要なアレルゲン；また、シワチリダニ（Euroglyphus maynei）からのアレルゲン Eur m 2、ケナガコナダニ（Tyrophagus putrescentiae）からのTyr p 13、ならびにアレルゲンBla g 1、2および4；ゴキブリからのPer a 1、3および7を含む）；
・ペット（ネコ、イヌ、げっ歯動物および家畜を含む；主要なネコアレルゲンには、Fel d 1〜8、ネコIgA、BLa g 2およびネコアルブミンが含まれる；主要なイヌアレルゲンには、Can f 1〜6およびイヌアルブミンが含まれる）；
・主なアレルゲンApi m 1〜12を含むハチ刺傷、および
・真菌類（アスペルギルス属およびペニシリウム属種、ならびにアルテルナリア・アルテルナータ（Alternaria alternata）、ダビディエラ・タシアナ（Davidiella tassiana）およびトリコフィトン・ルブルム（Trichophyton rubrum）種由来のアレルゲンを含む）。
【０２０４】
当業者には理解されるように、患者は、望ましくない免疫応答が生じた寛容誘導性抗原を同定するために試験され得て、タンパク質、ペプチド等を、その寛容誘導性抗原に基づいて開発し、本発明の寛容誘導性組成物に組み込むことができる。
【０２０５】
以下に記載される限定されない実施例において用いられる方法および材料は、本明細書に記載の態様を限定するものとして読まれるべきではない。
【実施例】
【０２０６】
実施例１：マウス抗体１０Ｆ７のヒト化
マウスから単離された抗ヒトグリコフォリンＡ（ＧＰＡ）抗体（１０Ｆ７）（Bigbee et al., 1983）を、エリスロサイト標的化の候補として選択した。１０Ｆ７は、血液型に関係なく、ヒト集団の１００％に結合する。結合特性を改善するために１０Ｆ７を親和性成熟させる前に、この抗体を最初に抗体フラグメント形に変換してヒト化した。マウス１０Ｆ７抗体の重鎖および軽鎖を、マウス相補的決定領域（ＣＤＲ）とヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を移植することによりヒト化し、Ｆａｂ抗体フラグメント（“ｆＡｂ”）として１０個の候補抗体配列を作製した。構造および親和性を維持するために、逆変異を導入した。これらのｆＡｂ抗体を発現させ、精製し、動態結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴）によりヒトＧＰＡへの結合について、およびフローサイトメトリーによりヒト赤血球への結合について評価した。図１Ａは、選択された抗体配列（“クローンｍ１０”と呼ばれる）の定常領域および可変領域の軽鎖および重鎖を示し、これらは、後続の親和性成熟のために選択された。実施例２の親和性成熟キャンペーンで変異した候補ＧＰＡ結合残基を、太字および下線で示す。
【０２０７】
実施例２：１０Ｆ７親和性成熟キャンペーン
ライブラリー設計および構築
ヒトＧＰＡと物理的に接触すると考えられているＣＤＲ中のアミノ酸である、１０Ｆ７の推定抗原結合領域（ＡＢＲ）を同定するために、パラトームアルゴリズムを用いた計算構造ベースのモデリングを用いた。図１Ｂは、KabatおよびClothiaのスキームに従って、可変領域の軽鎖および重鎖の相補性決定領域、ならびにParatome ABRの位置を示している。これらのＡＢＲをＣＤＲとアラインメントし、軽鎖および重鎖における同定されたＡＢＲ残基を、１０Ｆ７を親和性成熟させるために５つの別個のライブラリーで無作為化した（図１Ｃ）。親和性成熟スクリーニングのためのファージディスプレイライブラリーは、ＴＲＩＭ（トリヌクレオチド変異誘発）−ライブラリーのカスタマイズ可能な無作為化のための予め組み立てられたトリヌクレオチドブロックのアセンブリ−を用いて、GeneArt/ThermoFisher Scientificによって作成された。
【０２０８】
選択プロセス
得られたｆＡｂライブラリーをＭ１３バクテリオファージ上に表示し、以前にストレプトアビジンコートした磁気ビーズに結合した組換えビオチン化ヒトＧＰＡに対して３ラウンドの選択を行った。ＧＰＡに対する親和性を高めたｆＡｂ抗体クローンの選択を促進するために、ＧＰＡ濃度およびライブラリービーズ結合時間を減少させることにより、選択プロセスの強度を選択の各連続ラウンドで増加させた。第３ラウンドの選択後、選択されたライブラリーアウトプットは、個々のｆＡｂクローンを同定し、それらのＧＰＡ結合特性を特徴付けるために、ヒトＧＰＡに対するＥＬＩＳＡによってスクリーニングされた。ＧＰＡに結合するクローンは、主にｆＡｂの軽鎖可変領域に焦点を当てて配列決定を行った。図２に選択プロセスの概略を示す。
【０２０９】
合計１４のキャンペーンが完了し、各ライブラリーから同定されたヒット数の合計を表５に示す。ライブラリーの最初のレビューでは、Ｌ１＋Ｌ２ ＣＤＲライブラリー（軽鎖CDR1およびCDR2 ABRに変異を含む）がヒトＧＰＡに対する高い親和性を示すことが確認された。図３は、親和性成熟したｆＡｂの軽鎖可変ドメインの配列を示し（他の全てのドメインは野生型１０Ｆ７−Ｍ１０と同じである）、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の無作為化されたＡＢＲ残基を太字および下線で示す。
【０２１０】
【表１１】
2021522812.tif 000013
【０２１１】
特性評価およびランク付け
配列確認されたクローンを、ＨＥＫ細胞において可溶性形態（ファージに融合されていない）で組換え的に発現させ、精製した。全てのクローンを分析ＳＥＣで評価し、特性評価の前にＦａｂが＞９７％のモノマーであることを確認した。ヒトＧＰＡに対するトップヒットの親和性を、ヒトエリスロサイトに対するＥＬＩＳＡ、バイオレイヤー干渉法、表面プラズモン共鳴およびフローサイトメトリーアッセイによって特徴付けた。また、開始（非親和性成熟１０Ｆ７−Ｍ１０）も対照として特徴付けた。この分析の結果を表６に示し、特にクローンＬ１＋２−１７およびＬ１＋２−３９は、ヒトＧＰＡに対して予想外に高い親和性を示した。
【０２１２】
【表１２】
2021522812.tif 000014
【表１３】
2021522812.tif 000015
【０２１３】
実施例３：次世代シークエンシングベースの親和性成熟
概要
本実施例は、方法および得られる抗体、血液型群抗原に関係なくヒトエリスロサイトに結合する候補抗体またはそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ）の発見に関する。別の目標は、特に、成功した候補がカニクイザル（cyno）ホモログタンパク質に対しても交差反応性を有するように、種間交差反応性を達成することであった。翻訳後修飾に依存せずに、ヒトとcynoの標的タンパク質骨格の両方に結合する高親和性クローンを同定するために、親和性成熟キャンペーンが開発された。ファージディスプレイされたコンビナトリアルｓｃｆｖライブラリーは、親ＦａｂのＣＤＲのそれぞれを個別に無作為化するように設計された。各ＣＤＲライブラリーは、その後、交差反応性を維持し、翻訳後修飾の違いが結合に影響を与えないことを確実にするために、ヒトおよびcynoの標的タンパク質のいくつかの変異体に対してパニングされた。次世代シークエンシング（ＮＧＳ）をベースとした一次スクリーニングを開発し、親和性成熟ヒットを同定した。ＮＧＳスクリーンのデータをｓｃｆｖ−ｐｈａｇｅ ＥＬＩＳＡスクリーンのデータと比較したところ、どちらのスクリーンも各キャンペーンの上位ヒットを特定していたが、ＮＧＳ分析により選択の成功に関するより広い洞察が得られたことが分かった。ＮＧＳを介してファージパニングの各ラウンドのアウトプットをプロファイリングすることにより、配列モチーフの漸増濃縮がより容易に検出され、親和性の向上をよりよく予測することができた。また、このデータは、ＮＧＳアプローチが従来のＥＬＩＳＡアプローチよりも効率的にヒット数を特定でき、労力およびコストを削減できたことを示す。この合理化された方法を実施することにより、本発明者らは、ヒト赤血球およびカニクイザル（ｃｙｎｏ）赤血球に対してそれぞれ６倍および１６倍のＦａｂを親和性成熟させ、試験したすべての血液型に対する高親和性結合を達成することができた。
【０２１４】
発見およびヒト化
マウスをｃｙｎｏＲＢＣで免疫し、ｃｙｎｏグリコフォリンＡでブーストしたハイブリドーマキャンペーン中に、３−１０３と呼ばれるＩｇＧ抗体が見いだされた。本明細書に記載の方法は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、または任意のそのような抗体クラスのサブタイプを含む種々の抗体タイプに適用可能であることが特記される。いくつかの態様において、本発明の方法は、単なる一例として、ＩｇＧ２ａなどのＩｇＧ２抗体に特に適している。３−１０３抗体の重鎖および軽鎖を、候補構築物を作成するために、マウスＣＤＲをヒトフレームワーク領域に移植することによってヒト化した。可溶性Ｆａｂとしての抗体の構造、親和性および改善された大腸菌発現を維持するために、逆突然変異を導入した。これらの構築物を、可溶性Ｆａｂとして発現させ、精製し、ヒトおよびｃｙｎｏ ＧＰＡと赤血球との安定性アッセイおよび動態アッセイによって評価した。クローンＭ１（“３−１０３Ｍ１”）を、さらなる親和性成熟のために選択した。
【０２１５】
ライブラリー設計および構築
コンピューターモデリングを用いて、予測されたＣＤＲ残基を同定した。予測された軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２と重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２とを標的化し、無作為化するように合理的にライブラリーを設計し、親和性成熟スクリーニング用に５つのライブラリーを作成した。遺伝子をGeneArtで合成し、scfv-phageコンビナトリアルライブラリーの作成のためにpBs-3-103M1-CMVd1ベクターにクローニングした。
【０２１６】
選択プロセス
ライブラリーをファージディスプレイし、ビオチニル化組換えヒトＧＰＡ、組換えカニクイザルＧＰＡおよび赤血球から抽出されたヒトＧＰＡ（抽出物）に対して３ラウンドの選択を行った。ビオチニル化抗原に結合したScfv-phageをストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズで捕捉した。それぞれがＧＰＡの３つの形態で選択されること、および各ライブラリーが両方の抗原種の組み合わせを見い出し得るようにするために、９つの異なる選択条件を各ライブラリーに対して実行した。各選択ラウンド後、抗原タイプまたは濃度を変更し、ライブラリーと抗原の結合インキュベーション時間を減少させた。第３ラウンドの選択後、ライブラリーアウトプットをGeneWizによるAmpliconEZ NGS解析のために送り、ファージアウトプットをscfv-ファージスポットＥＬＩＳＡで並列にスクリーニングした。ＥＬＩＳＡでの陽性ヒットを、適切な可変領域のサンガー配列決定法により確認した。
【０２１７】
ＮＧＳ解析
GeneWiz AmpliconEZサービスを用いて、ＮＧＳベースのアンプリコン配列決定を行った。アミノ酸固有の配列頻度の解析を行った。各配列の濃縮倍を、各配列の頻度をファージディスプレイまたは選択の前のラウンドで観察された頻度で割ることによって計算した。合計の濃縮倍スコアもまた、全選択ラウンドにわたる配列の濃縮を考慮して計算した。濃縮度の合計は、少なくとも２回の選択ラウンドの濃縮倍を加算して計算した。クローンは通常、第３ラウンドのアウトプット vs 第２ラウンドのアウトプット ＋ 第３ラウンドのアウトプット vs 第１ラウンドのアウトプット ＋ 第３ラウンドの濃縮倍の合計によってランク付けされた。配列は、それらが全クローンのスコアの中央値を超える合計濃縮倍スコアを有する場合、さらなる特性評価のためにヒットとして選択された。例えば、ある比較条件からの上位ヒットのリストの合計濃縮倍の中央値が３２であった場合、一般的に合計濃縮倍スコアが３２を超えるクローンを組換え発現用に選択した。配列を、潜在的な配列ライアビリィティ（グリコシル化部位、Ａｓｎ脱アミド化およびＡｓｐ異性化）についてさらに評価し、潜在的なライアビリィティを有する配列を除外した。
【０２１８】
特徴付けおよびランキング
ＮＧＳおよびＥＬＩＳＡにより同定されたトップ配列を、ＨＥＫ細胞において可溶性Ｆａｂとしてハイスループット方式で発現させた。上清中のＦａｂ濃度をバイオレイヤー干渉法（BLI/Octet（登録商標）分析）で定量し、上清中のクローンをフローサイトメトリーでヒト赤血球への親和性について試験した。上位にランクされたクローンを、ＣＨ１樹脂で精製し、フローサイトメトリーでヒト赤血球およびカニクイザル赤血球との結合性を特徴付けた。
【０２１９】
ライブラリーパ二ング
図７は、ライブラリーパニングプロトコールの限定されない概略図を示す。所与のＣＤＲライブラリーは、いくつかの態様により、３回（またはそれ以上）の選択ラウンドを受ける。ラウンド１は、３種の濃度の標的抗原で実施される。候補抗体の何らかの標的を用いることができる。限定されない例として、いくつかの態様により、他の標的または種を用いることができるが、標的としてヒトグリコフォリンＡまたはカニクイザルグリコフォリンＡを用いて選択を実施した。所与のラウンドのアウトプット力価は、後続のラウンドの開始抗原濃度を選択するために用いられる。この試験では、１×１０６〜１×１０８ＣＦＵ／ｍＬの第一ラウンドアウトプット力価を生成する最低抗原濃度の条件が選択された。抗原濃度は、（抗原が変更されない限り）後続の各ラウンドで１０分の１に低減させた。さらなる態様において、異なる濃度低減を用いることができ、例えば、２倍、５倍、８倍、１２倍、１５倍、２０倍、５０倍などである。抗原を選択的（alternating）にする場合（例えば、ヒトからカニクイザルまたはその逆）、抗原濃度を、ラウンド間で一定に保持した。ビオチン−抗原複合体へのライブラリーの結合インキュベーションは、選択の各連続するラウンド毎に減少したが、ストレプトアビジンビーズの捕捉時間および洗浄は一定に保持した。
【０２２０】
結果および考察
上記の通り、ヒトおよびカニクイザルグリコフォリンＡの両方に結合する同定された抗体の種々のＣＤＲに基づいて親和性成熟キャンペーンを行った。図４は、３−１０３と呼ばれるグリコフォリンＡの両種に結合することができる候補抗体の模式図である。Ｆａｂが生成され、ヒト化し、スクリーニングし、ｈＦ−３−１０３Ｍ１を、高度に交差反応性のクローンとして同定した。図４は、３−１０３Ｍ１のＶＬ鎖およびＶＨ鎖の配列アラインメントを示し、親和性成熟の標的とされたいくつかのＣＤＲ領域を特定する。
【０２２１】
図５は、親和性成熟プロトコールの概略図を示す。Ｆａｂのファージライブラリーは、ライブラリーから非特異的結合体を除去するために、ストレプトアビジン（ＳＡ）ビーズと共にライブラリーをインキュベートすることにより、最初に枯渇させる。次に、枯渇したライブラリーを、ビオチン−ヒトグリコフォリンＡコーティングＳＡビーズと共にインキュベートする。ファージライブラリーに適用される抗原濃度の連続的低減と同時にインキュベーション時間の低減を介して、グリコフォリンＡに対するより高い親和性を有する抗体フラグメントを同定するための選択圧を適用する。これにより、標的に対してより親和性の高いＦａｂを同定することができる。グリコフォリンＡビーズに結合したファージは、その後のスクリーニングラウンド用に増幅される。この概略図では、３ラウンドのスクリーニングが実施されるが、いくつかの態様において、より多くのスクリーニングラウンドを実施し得る。３ラウンド後、アウトプット候補Ｆａｂを、ＥＬＩＳＡベースの方法およびＮＧＳベースの方法の両方で評価する。最後に、ヒットを可溶性Ｆａｂとして特徴付ける。図６は、抗体または抗体フラグメントを親和性成熟させるためにいくつかの態様に従って用いられるワークフロー経路の概略図を示す。
【０２２２】
材料および方法において上記のように、図７は、高親和性Ｆａｂを同定するために用いられる選択スキームの限定されない例を示す。ここに示されているのは、ＣＤＲＬ１Ｂライブラリーの選択プロセスである。上記のように、ラウンド１は、３種の濃度のヒトグリコフォリンＡ標的抗原で行った。特定のラウンドのアウトプット力価は、後続のラウンドの開始抗原濃度を選択するために用いられる。このアプローチにより、各ラウンドのアウトプットは、標的に対する親和性が低い抗体または抗体フラグメントを候補集団から選択的に除くべきである。高い親和性を示す候補は、その後、特徴付けられ得る。
【０２２３】
図８Ａ〜８Ｃは、ＣＤＲＬ１Ｂ親和性成熟キャンペーンに適用される選択プロセスのアウトプットに関連するデータを示す。図８Ａは、重み付きコンセンサス配列の概略図を示す。選択プロセスは、ライブラリーが、野生型（未成熟）配列（ＴＹＬＨ）に類似した配列に収斂することを示した。また、アミノ酸残基２および４は、この選択キャンペーンに基づいて、実質的に−Ｙ−Ｈとして固定されていることが明らかである。図８Ｂは、ＣＤＲ１Ｂの位置がボックスで識別された抗体の模式的なリボン構造を示す。候補のその後の特徴付けは、ヒットの半数以上が可溶性ｆＡｂとして発現しないことを示した。さらに、図８Ｃの結合アッセイ結果で示されるように、発現したものは、親ｆＡｂ（一般的に矢印で識別される）よりもヒトまたはカニクイザルＲＢＣのいずれに対しても有意に改善された親和性を有していなかった。親ｆＡｂと比べて低下したＭＦＩを生じる多くの曲線があり、これはヒトエリスロサイト（標的グリコフォリンＡを発現する）への親和性が低いことを示している。追加のデータは、図７に示された選択スキームのアウトプットパラメータのそれぞれについて、ヒト赤血球に対する配列濃縮倍 vs. 親和性をグラフにした図９Ａ〜９Ｉに示される。合計濃縮度スコア（Sum Fold Enrichment score）もまた、選択のすべてのラウンドにわたる配列の濃縮度を考慮して計算された。濃縮度の合計は、少なくとも２ラウンドの選択で得られた濃縮倍を加算して計算した。クローンは通常、ラウンド３アウトプット vs ラウンド２アウトプット＋ラウンド３アウトプット vs ラウンド１アウトプット＋ラウンド３アウトプットの濃縮度の合計によってランク付けされた。配列は、合計濃縮倍スコアが全クローンの中央値スコア以上であれば、さらに特徴付けを行うためにヒットとして選択された。一例として、図９Ａは、ラウンド１アウトプットＡ（ｈＧＰＡ抽出物２００ｐｍｏｌ）における親和性と比較して、図７のラウンド３アウトプット１（右上のボックス−ｈＧＰＡ抽出物、２０ｆｍｏｌ）から得られる親和性に関連するデータを示す。同様に、図９Ｂは、第１ラウンドのアウトプットＡと比較した、図７の第３ラウンドのアウトプット２のデータを示している。図８Ｃに示された結合データと同様に、これらの散布図は、このキャンペーン中に濃縮された配列の大部分が、野生型の親Ｆａｂ（矢印で示される）と比較して、ヒトエリスロサイトに対して同様の親和性を示すことを示している。これらのデータはさらに、親Ｆａｂ配列も選択中に濃縮されたことを強く示している。このことは、ＣＤＲＬ１のこのドメインが、抗原への結合をサポートするＦａｂの構造的または他の特性における、その潜在的な役割を維持するために保存される必要があるかもしれないという最初の仮説を補強する。
【０２２４】
図１０Ａ〜１０Ｄは、図７の選択プロセスを経て実行されたクローンの特徴をまとめたデータを示すが、ＣＤＲＬ１ａライブラリーを利用している。図１０Ａは、多数のＣＤＲＬ１ａクローンが、親Ｆａｂ（一般的に矢印で示される）と比較して、ヒトエリスロサイトに対する親和性が増強された抗体を生成したことを示す。図１０Ｂは、ライブラリーから選択されたヒットの収斂配列の模式図を示す。図１０Ｃは、ＥＬＩＳＡベースの方法（黒丸）、あるいは本明細書に記載の（そして本実施例で用いた）ＮＧＳベースの方法によって同定された抗体フラグメントの親和性を比較したデータを示す。これらのデータは、より多くの高親和性抗体がＮＧＳを用いて同定されていることを示す。数値が大きいのは、少なくとも部分的には、ＮＧＳベースの方法が提供するスループットが大きいためである。ＥＬＩＳＡ法を用いた場合には６〜８個であったのに対し、４０個近くの配列がスクリーニングされた。さらに、これらの抗体の多くは、低ｎＭ親和性範囲にあり、これはＥＬＩＳＡで同定されたＦａｂの多くよりも高い親和性であった。図１０Ｄは、図１０Ｃのデータを、ヒトエリスロサイトに対する親和性範囲別に分類したＮＧＳまたはＥＬＩＳＡ一次スクリーニングから同定されたクローンの割合として示している（特記−全ての親和性範囲におけるＦａｂの種類の合計は１００％に等しい）。示されているように、ＥＬＩＳＡを用いた場合は約３８％であったのに対し、ＮＧＳを用いて同定された配列の約１０％は、ヒトエリスロサイトに対して＜６ｎＭの親和性を有している。しかしながら、６〜１０ｎＭまたは＞１０ｎＭの親和性では、ＮＧＳ法を用いて同定された配列の割合は、ＥＬＩＳＡ法を用いて発現された配列の割合よりも大きかった。ＥＬＩＳＡスクリーンは、ＮＧＳスクリーンよりも同定したクローンが５倍少なかったが、このライブラリーで同定されたクローンのより高い割合は、ヒトエリスロサイトに対する６ｎＭ未満のＥＣ５０を有する高親和性結合体であった。これらの同じ高親和性クローンがＮＧＳスクリーンによっても同定されたことに留意することが重要である。図１１Ａ〜１１Ｆは、ＣＤＲＬ１ａ候補の濃縮倍に関連するデータを示す。上記の通り、各パネルは、濃縮倍を決定するための選択スキームからの特定のアウトプット比較に関連している。図１１Ａは、ラウンド３のアウトプット１とラウンド２のアウトプット１との比較に関連するデータを示している。図８のデータとは対照的に、図１１Ａ〜１１Ｆのデータは、選択／成熟プロセスの結果として、標的に対する親和性が増強されており、親配列が親和性成熟クローンに凌駕されたことを示している。特に、データポイントの多くは、親Ｆａｂ（矢印で示されている）と比較して、ｎＭ範囲の親和性値（例えば、標的に対するより高い親和性）にシフトしている。従って、ＮＧＳ法を用いた成熟キャンペーンおよび選択プロセスにより、標的に対する親和性が増強されたＦａｂが同定された。ＮＧＳベースの方法のより迅速な性質、および同定されたより高い親和性を有するＦａｂを考慮して、いくつかの態様において、ＮＧＳベースの方法の使用は、より低コストで、候補抗体のよりロバストなスクリーニングを提供し得る。
【０２２５】
図１２Ａ〜１２Ｄは、図７の選択プロセスを経て実行されたクローンの特徴をまとめたデータを示すが、ＣＤＲＬ２ライブラリーを利用している。図１２Ａは、多数のＣＤＲＬ２クローンが、親Ｆａｂ（一般的に矢印で示される）と比較して、ヒトエリスロサイトに対して増強された親和性を有する抗体を生成したことを示す。図１２Ｂは、ライブラリーからの選択されたヒットの収斂配列の模式図を示す。図１２Ｃは、本明細書に記載の（そして本実施例で使用された）ＮＧＳベースの方法と比較した、ＥＬＩＳＡベースの方法（黒丸）によって同定された抗体フラグメントの親和性のデータを示す。上記のように、これらのデータは、より多くの高親和性抗体がＮＧＳを用いて同定され、ＮＧＳ法の方がより高いスループットを有し、４５個以上の候補クローンが得られることを示している。図１２Ｄは、図１２Ｃのデータをヒトエリスロサイトに対する親和性によって分類したＮＧＳおよびＥＬＩＳＡ一次スクリーニングから同定されたクローンの割合として示している。示されているように、ＥＬＩＳＡを用いて同定された配列の約２５％と比較して、ＮＧＳを用いて同定された配列の約４０％近くが＜６ｎＭの親和性を有した。６〜１０ｎＭの親和性を有するものおよび１０ｎＭを超える親和性を有するものは、ＥＬＩＳＡ法とＮＧＳ法の間で類似していた。図１３Ａ〜１３Ｆは、ＣＤＲＬ２候補の濃縮倍に関するデータを示す。ここでも、多くの候補が顕著な濃縮を示し、野生型（矢印）と比較して高い親和性を示す。
【０２２６】
図１４Ａ〜１４Ｄは、図７の選択プロセスを経て実行されたクローンの特徴をまとめたデータを示すが、ＣＤＲＨ１ライブラリーを利用している。図１４Ａは、親Ｆａｂと比較して、ＣＤＲＨ１クローンからのヒトエリスロサイトに対する親和性の広い分布を示す。図１４Ｂは、ライブラリーからの選択されたヒットの収斂配列の模式図を示す。図１４Ｃは、ＥＬＩＳＡベースの方法（黒丸）と、本明細書に記載の（そして本実施例で使用された）ＮＧＳベースの方法（三角形）とによって同定された抗体フラグメントの親和性を比較したデータを示す。上記のように、これらのデータは、より多くの高親和性抗体がＮＧＳを用いて同定され、ＮＧＳ法はより高いスループットを有し、３０個以上の候補クローンが得られることを示している。図１４Ｄは、図１４Ｃのデータをヒトエリスロサイトに対する親和性によって分類したＮＧＳおよびＥＬＩＳＡ一次スクリーニングから同定されたクローンの割合として示している。示されているように、ＮＧＳを用いて同定された＜６ｎＭを有する配列の数は、ＥＬＩＳＡを用いて同定された配列の数の約２倍であった。６〜１０ｎＭの親和性を有するものおよび１０ｎＭを超える親和性を有するものは、発現が２つの方法間で類似していた。図１５Ａ〜１５Ｆは、ＣＤＲＨ１候補の濃縮倍に関するデータを示す。ここでも、多くの候補が、野生型（矢印）と比較して高い親和性を示す。これらのデータは、いくつかの態様により、ＮＧＳベースの方法が、標的に対して増強された親和性を示す抗体または抗体フラグメントの同定の成功を予測するのに非常に効率的であるという概念を支持する。
【０２２７】
図１６Ａ〜１６Ｄは、図７の選択プロセスを経て実行されたクローンの特徴をまとめたデータを示すが、ＣＤＲＨ２ライブラリーを利用している。図１６Ａは、親Ｆａｂと比較して、ＣＤＲＨ２クローンからのヒトエリスロサイトに対する親和性の広い分布を示す。図１６Ｂは、ライブラリーからの選択されたヒットの収斂配列の模式図を示す。図１６Ｃは、ＥＬＩＳＡベースの方法（黒丸）と、本明細書に記載の（そして本実施例で使用された）ＮＧＳベースの方法（三角形）とによって同定された抗体フラグメントの親和性を、マニュアル変異設計された配列（四角）と比較したデータを示す。上記のように、これらのデータは、より多くの高親和性抗体がＮＧＳを用いて同定され、ＮＧＳ法がＥＬＩＳＡ法またはマニュアル法と比較してより大きなスループットを有することを示している。図１６Ｄは、図１６Ｃのデータをヒトエリスロサイトに対する親和性によって分類したＮＧＳおよびＥＬＩＳＡ一次スクリーニングから同定されたクローンの割合として示している。示されているように、ＮＧＳを用いて同定された＜６ｎＭの親和性を有する配列の数は、ＥＬＩＳＡを用いて同定された配列よりも多く、マニュアル変異よりも２倍以上多かった。６〜１０ｎＭの親和性を有するものおよび１０ｎＭを超える親和性を有するものは、発現がＮＧＳ法とＥＬＩＳＡ法との間で類似していた。ヒトエリスロサイトに対する＜６ｎＭのＥＣ５０を有する高親和性クローンの割合には多少のばらつきがあったが、２つのスクリーニングフォーマット間でのクローンの減少には実質的な差はなく、これはこの実験で分析したすべてのライブラリーアウトプットについて当てはまった。最も低い親和性範囲では、マニュアル手段が、ＥＬＩＳＡ法およびＮＧＳ法の両方を上回った。しかしながら、他のＣＤＲライブラリーで見られるように、スループットが高く、高親和性クローンの同定率が高いほど、ＮＧＳが非常に効率的な方法であることを示している。図１７Ａ〜１７Ｉは、ＣＤＲＨ２候補の濃縮倍に関連するデータを示す。Ｈ１ライブラリーと同様に、候補の多くは、野生型Ｆａｂ（矢印）と比較して増強された親和性を示す。これらのデータは、いくつかの態様により、ＮＧＳベースの方法が、標的に対して増強された親和性を示す抗体または抗体フラグメントの同定の成功を予測するのに非常に効率的であるという概念を支持する。
【０２２８】
図１８Ａ〜１８Ｂは、ヒト（１８Ａ）およびカニクイザル（１８Ｂ）エリスロサイトの両方に結合するための増強された標的親和性を有する選択されたクローンの能力に関するデータを示す。明らかな通り、多数のクローンが、両種のエリスロサイトへの結合を示し、クローンの大部分は、野生型の親Ｆａｂと比較して、標的に対する増強された親和性を示す。
【０２２９】
図１９は、本実施例で試験した各ライブラリーの効率の比較を示す。全体で合計３０５のヒットを特徴付け、計１３６ヒットがエリスロサイト結合に対する増強された効力を示し、Ｌ２ライブラリーでは、５２ヒットが改善された親和性を示し、０．３８の頻度を示した。したがって、Ｌ２は、ヒトおよびカニクイザルエリスロサイトに対する最高の親和性成熟ヒットを産生することに最も成功したライブラリーであった。
【０２３０】
図２０は、カニクイザルおよびヒトエリスロサイトの両方についてＦＡＣＳによって測定された親和性に関連するデータをまとめたものである。親和性成熟キャンペーンの目標は、ヒトエリスロサイトに対する一桁のｎＭ親和性（１〜９ｎＭ）を有することであった。右端の列に示すように、少なくとも１０個の同定されたクローンに対して、一桁のｎＭの親和性（２．５〜４．４ｎＭ）が達成された。右から２番目の列も、カニクイザルエリスロサイトに対する増強された親和性を示す。
【０２３１】
図２１Ａ〜２１Ｆは、ＥＬＩＳＡ 対 ＮＧＳによって評価された配列の親和性（および量）に関連するまとめデータを示す。上記のデータをまとめると、図２１Ａ、２１Ｃおよび２１Ｅは、ＮＧＳによるスクリーニングの１つの利点が、広範囲の親和性をカバーするクローンのより広いパネルをスクリーニングできることであることを示している。有利には、成熟キャンペーンに費やされるコストと時間を削減することができる。また、最も高い親和性を示すクローンは、ＥＬＩＳＡとＮＧＳの両方でスクリーニングされており、２つの方法による品質管理を行うことができる。さらに、同定された高親和性クローンの割合には多少のばらつきがあるが（例えば、ヒトエリスロサイトに対する親和性が６ｎＭ未満）、２つのスクリーニング形式間で候補の減少に有意な差はない。したがって、本実施例は、ＮＧＳベースの方法を用いて、親和性成熟候補をスクリーニングすることの特定の利点を示している。
【０２３２】
実施例３Ａ：次世代シークエンシングベースの親和性成熟に関するさらなるデータ
上記実施例３をさらに改良して、赤血球膜タンパク質であるグリコフォリンＡに特異的なフラグメント抗体（ｆＡｂ）を同定するための試験を行った。Ｆａｂ構築物は、ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）エリスロサイト（それぞれ、ｈＲＢＣまたはｃＲＢＣと称される）に対してそれぞれ６倍および１６倍の親和性成熟であった。血液型群抗原に関係なく、エリスロサイトに交差反応性の高親和性結合が達成された。親和性成熟ヒットを同定するために、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）をベースとした一次スクリーニングを開発した。ＮＧＳ法は従来のＥＬＩＳＡ法よりも効率的にヒットを同定できるだけでなく、より少ない労力およびコストで効率的にヒットを同定できることが証明された。ＥＬＩＳＡ法とＮＧＳ法の概要を以下の表６に示す。
【０２３３】
【表１４】
2021522812.tif 000016
【０２３４】
方法
実施例３に上記の通り、コンビナトリアルscFv−ファージライブラリーを、各ＣＤＲを個別に無作為化するように設計した。候補抗体の選択を、交差反応性を維持するために、ヒトおよびカニクイザル標的抗原の両方を用いて行った。さらに、翻訳後修飾に関係なく、結合するクローンの選択を確実にするために、複数の抗原フォーマットを用いた。結合候補の同定には、ＮＧＳおよびＥＬＩＳＡの両方の一次スクリーニングを用いた。得られたクローンは、最初にヒトエリスロサイトに対する親和性で順位付けされ、次にカニクイザルエリスロサイトに対する親和性で順位付けされた。最後に、両種からの標的タンパク質への結合速度を、Octetのバイオレイヤー干渉法により測定した。選択方法を図５にまとめた。
【０２３５】
結果
図２２は、親和性および寛容性応答との間の相関関係に関連するデータを示す。上記のように、抗原、そのフラグメントまたはそれらのミモトープは、本明細書に記載のように結合部位に付着させることができる。抗原は、それぞれがグリコフォリンＡに対して異なる親和性を有する２つの異なるＦａｂのうちの１つに融合された。Ｆａｂ ２．０は、Ｆａｂ １．０の親和性と比較して、標的に対して約２００倍高い親和性を有する。疾患の重篤度は、抗原−Ｆａｂ融合体の投与後の動物においてスコア化され、抗原特異的免疫応答の指標として用いた。図に示すように、エリスロサイトに対する親和性が２００倍高いＦａｂ−２．０は、疾患重篤度の有意かつ持続的な低下を誘導した。対照的に、より低い親和性のＦａｂ（Ｆａｂ １．０）は、疾患重篤度をわずかに低下させるだけであった。したがって、いくつかの態様により、高親和性候補結合体をスクリーニングして同定する方法は、改善された抗原特異的免疫寛容をもたらすそれらの結合体と相関している。
【０２３６】
図２３Ａ〜２３Ｃは、濃縮することができ、また親和性の改善に相関する配列のタイプに関連する。図２３Ａは、ライブラリー１およびライブラリー４からの配列濃縮倍に対する試験したクローンの親和性のプロットを示す。ライブラリー１は、主に親（ＷＴまたは野生型）および野生型様配列に対して濃縮された。図２３Ｂは、ライブラリー１からのクローンのヒトエリスロサイトへの結合を示しており、フローサイトメトリーによって測定されたＦａｂ結合シグナルの蛍光強度として図示される。示されているように、このクローン集団の選択は、ヒトエリスロサイトに対する親和性の改善には至らなかった（クローンの結合親和性のプロットは、野生型曲線と比較して右シフトされる）。対照的に、ライブラリー４での選択は成功し、図２３Ｃに示すように、クローンのフローサイトメトリー親和性曲線が野生型曲線と比較して左にシフトしており、ヒトエリスロサイトに対する親和性が高いことを示している。このライブラリーは、野生型の親配列と比較して、ヒトエリスロサイトに対する親和性が約６倍高いクローンを産生した。
【０２３７】
上記のように、ヒトおよびカニクイザルの両種に対する交差反応性を有するクローンを選択するために、ヒト抗原およびカニクイザル抗原を用いてスクリーニングを行った。図２４は、ｈＲＢＣに対して親和性の改善を示したクローンは、ｃｙｎｏ（ｃＲＢＣ）に対しても親和性の改善を示したことを示すデータを示す。フローサイトメトリーは、結合を評価するために用いられ、上位のクローンは、野生型と比較してｃＲＢＣに対して約１６倍高い親和性を示した。有利には、いくつかの態様において、そのようなクローンは、前臨床（例えば、霊長動物研究）およびヒト臨床治験作業に用いることができる。
【０２３８】
改善された親和性の根底にあるメカニズムをさらに解明するために、Octet バイオレイヤー干渉法を用いて、結合動態を評価した。Ｆａｂ結合動態のセンソグラムを図２５Ａ−２５Ｂに示す。図２５Ａは野生型の動態データを示し、図２５Ｂは選択されたより高い親和性のクローンのデータを示す。矢印で示されるように、オフレートは、試験した２つのクローン間で異なり、２５Ｂのより高い親和性クローンのオフレートは、野生型よりも約４倍遅い。いくつかの態様において、増強された親和性はまた、結合定数（例えば、結合体がその標的にどれだけ迅速に結合するかを示す“オンレート”）のような別の動態特性に関連し得る。
【０２３９】
実施例３で上記のように、ＮＧＳ一次スクリーニングは、有利には、クローンのより高いサンプリング率およびより広い範囲の親和性を提供する。上記の実施例３からのデータはその内訳と共に図２６に示され、用いたスクリーニング方法に基づいて上位パフォーマンスのクローンが、標的親和性目標を満たしたクローンおよび親和性目標を満たさなかったクローンに内訳されている。図２６に示すように、そして実施例３で上記のように、ＥＬＩＳＡおよびＮＧＳの両スクリーニングは、高親和性結合体を同定することができた。さらに、いくつかの態様により、ＥＬＩＳＡによって見出された上位ヒットのすべて、または実質的にすべてが、ＮＧＳによっても同定され得る。有利には、ＮＧＳによるアプローチは、成熟キャンペーンに費やされるコストおよび時間を削減することができる。また、最高の親和性を示すクローンは、ＥＬＩＳＡおよびＮＧＳスクリーニングの両方で同定されたため、２つの方法による品質管理を実施することができる。従って、実施例３および３Ａは、親和性成熟候補をＮＧＳベースの方法を用いてスクリーニングすることの特定の利点を示す限定されない例である。
【０２４０】
さらなる限定されない態様を以下に記載する。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質が提供され、該タンパク質は以下を含む：ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（配列番号４９）を含む軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１およびＸ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（配列番号５０）を含む軽鎖ＣＤＲ２（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ、天然アミノ酸であり；Ｘ２がＹであり、Ｘ３がＹであり、Ｘ４がＹであり、かつＸ５がＮであるとき、Ｘ１はＫではなく；Ｘ１がＫであり、Ｘ３がＹであり、Ｘ４がＹであり、かつＸ５がＮであるとき、Ｘ２はＹではなく；Ｘ１がＫであり、Ｘ２がＹであり、Ｘ４がＹであり、かつＸ５がＮであるとき、Ｘ３はＹではなく；Ｘ１がＫであり、Ｘ２がＹであり、Ｘ３がＹであり、かつＸ５がＮであるとき、Ｘ４はＹではなく；Ｘ１がＫであり、Ｘ２がＹであり、Ｘ３がＹであり、かつＸ４がＹであるとき、Ｘ５はＮではない）。
【０２４１】
いくつかの態様において、軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され、Ｘ２は、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＱから選択される）（配列番号５１）を含み；軽鎖ＣＤＲ２は、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３は、ＨおよびＹから選択され、Ｘ４は、Ｈ、ＲおよびＫから選択され、そしてＸ５は、天然アミノ酸である）（配列番号５２）を含む。
【０２４２】
いくつかの態様において、軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され、Ｘ２は、Ｆ、ＷおよびＹから選択される）（配列番号５３）を含み；軽鎖ＣＤＲ２は、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３はＨであり、Ｘ４はＨまたはＲであり、そしてＸ５は、天然アミノ酸である）（配列番号５４）を含む。
【０２４３】
いくつかの態様において、軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１は、ＦまたはＹであり、Ｘ２は、Ｆ、ＷおよびＹから選択される）（配列番号５５）を含み；軽鎖ＣＤＲ２は、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３はＨであり、Ｘ４はＨであり、そしてＸ５は、天然アミノ酸である）（配列番号５６）を含む。
【０２４４】
いくつかの態様において、軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１は、ＦまたはＹであり、Ｘ２はＦである）（配列番号５７）を含み；軽鎖ＣＤＲ２は、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３はＨであり、Ｘ４はＨであり、そしてＸ５は天然アミノ酸である）（配列番号５６）を含む。
【０２４５】
いくつかの態様において、軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１は、ＦまたはＹであり、Ｘ２はＦである）（配列番号５７）を含み；軽鎖ＣＤＲ２は、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３はＨであり、Ｘ４はＨであり、そしてＸ５はＶまたはＤである）（配列番号５８）を含む。
【０２４６】
いくつかの態様において、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（配列番号４９）を含む軽鎖ＣＤＲ１およびＸ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（配列番号５０）を含む軽鎖ＣＤＲ２（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ、天然アミノ酸である）を含む、抗原結合タンパク質を提供する。
【０２４７】
いくつかの態様において、軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され、Ｘ２は、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＱから選択される）（配列番号５１）を含み；軽鎖ＣＤＲ２は、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３は、ＨおよびＹから選択され、Ｘ４は、Ｈ、ＲおよびＫから選択され、そしてＸ５は天然アミノ酸である）（配列番号５２）を含む。
【０２４８】
いくつかの態様において、軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され、Ｘ２は、Ｆ、ＷおよびＹから選択される）（配列番号５３）を含み；軽鎖ＣＤＲ２は、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３はＨであり、Ｘ４はＨまたはＲであり、Ｘ５は天然アミノ酸である）（配列番号５４）を含む。
【０２４９】
いくつかの態様において、軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１は、ＦまたはＹであり、Ｘ２は、Ｆ、ＷおよびＹから選択される）（配列番号５５）を含み；軽鎖ＣＤＲ２は、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３はＨであり、Ｘ４はＨであり、そしてＸ５は天然アミノ酸である）（配列番号５６）を含む。
【０２５０】
いくつかの態様において、軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１は、ＦまたはＹであり、Ｘ２はＦである）（配列番号５７）を含み；軽鎖ＣＤＲ２は、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３はＨであり、Ｘ４はＨであり、そしてＸ５は天然アミノ酸である）（配列番号５６）を含む。
【０２５１】
いくつかの態様において、軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（式中、Ｘ１は、ＦまたはＹであり、Ｘ２はＦである）（配列番号５７）を含み；軽鎖ＣＤＲ２は、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（式中、Ｘ３はＨであり、Ｘ４はＨであり、そしてＸ５はＶまたはＤである）（配列番号５８）を含む。
【０２５２】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、ＱＱＦＴＳＳＰＹＴ（配列番号４５）を含む軽鎖ＣＤＲ３をさらに含む。
【０２５３】
いくつかの態様において、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（配列番号４９）を含む軽鎖ＣＤＲ１または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体；およびＸ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（配列番号５０）を含む軽鎖ＣＤＲ２または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ、天然アミノ酸である）を含む、抗原結合タンパク質を提供する。
【０２５４】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（配列番号５１）または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体（式中、Ｘ１は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され、Ｘ２は、Ｆ、Ｗ、ＹおよびＱから選択される）を含み；軽鎖ＣＤＲ２は、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（配列番号５２）または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体（式中、Ｘ３は、ＨおよびＹから選択され、Ｘ４は、Ｈ、ＲおよびＫから選択され、そしてＸ５は天然アミノ酸である）を含む。
【０２５５】
いくつかの態様において、軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（配列番号５３）または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体（式中、Ｘ１は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され、Ｘ２は、Ｆ、ＷおよびＹから選択される）を含み；軽鎖ＣＤＲ２は、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（配列番号５４）または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体（式中、Ｘ３はＨであり、Ｘ４はＨまたはＲであり、Ｘ５は天然アミノ酸である）を含む。
【０２５６】
いくつかの態様において、軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（配列番号５５）または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体（式中、Ｘ１は、ＦまたはＹであり、Ｘ２は、Ｆ、ＷおよびＹから選択される）を含み；軽鎖ＣＤＲ２は、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（配列番号５６）または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体（式中、Ｘ３はＨであり、Ｘ４はＨであり、そしてＸ５は天然アミノ酸である）を含む。
【０２５７】
いくつかの態様において、軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（配列番号５７）または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体（式中、Ｘ１は、ＦまたはＹであり、Ｘ２はＦである）を含み；軽鎖ＣＤＲ２は、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（配列番号５６）または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体（式中、Ｘ３はＨであり、Ｘ４はＨであり、そしてＸ５は天然アミノ酸である）を含む。
【０２５８】
いくつかの態様において、軽鎖ＣＤＲ１は、ＲＡＳＳＮＶＸ１Ｘ２ＭＹ（配列番号５７）または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体（式中、Ｘ１は、ＦまたはＹであり、Ｘ２はＦである）を含み；軽鎖ＣＤＲ２は、Ｘ３Ｘ４ＴＳＸ５ＬＡＳ（配列番号５８）または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体（式中、Ｘ３はＨであり、Ｘ４はＨであり、そしてＸ５はＶまたはＤである）を含む。
【０２５９】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質はまた、ＱＱＦＴＳＳＰＹＴ（配列番号４５）を含む軽鎖ＣＤＲ３または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体も含む。
【０２６０】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質はまた、ＧＹＴＦＮＳＹＦＭＨ（配列番号４６）を含む重鎖ＣＤＲ１；ＧＭＩＲＰＮＧＧＴＴＤＹＮＥＫＦＫＮ（配列番号４７）を含む重鎖ＣＤＲ２；および、ＷＥＧＳＹＹＡＬＤＹ（配列番号４８）を含む重鎖ＣＤＲ３も含む。
【０２６１】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質はまた、ＧＹＴＦＮＳＹＦＭＨ（配列番号４６）または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体を含む重鎖ＣＤＲ１；ＧＭＩＲＰＮＧＧＴＴＤＹＮＥＫＦＫＮ（配列番号４７）を含む重鎖ＣＤＲ２または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体を含む重鎖ＣＤＲ２；および、ＷＥＧＳＹＹＡＬＤＹ（配列番号４８）または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体を含む重鎖ＣＤＲ３も含む。
【０２６２】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質はまた、配列番号３と少なくとも約９０％同一である重鎖可変ドメインも含む。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質はまた、配列番号３と少なくとも約９５％同一である重鎖可変ドメインも含む。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質はまた、配列番号３と少なくとも約９９％同一である重鎖可変ドメインも含む。
【０２６３】
いくつかの態様において、配列番号３と少なくとも約９０％同一である重鎖可変ドメインおよび配列番号１と少なくとも約９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を提供する。
【０２６４】
いくつかの態様において、配列番号３と少なくとも約９５％同一である重鎖可変ドメインおよび配列番号１と少なくとも約９５％同一である軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を提供する。
【０２６５】
いくつかの態様において、配列番号３と少なくとも約９９％同一である重鎖可変ドメインおよび配列番号１と少なくとも約９９％同一である軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を提供する。
【０２６６】
いくつかの態様において、配列番号４−４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質を提供する。
【０２６７】
いくつかの態様において、配列番号５、９、１１、１２、１４、１８、１９、２０、２１、２２、２４、２７、２８、３１、３８および４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質を提供する。
【０２６８】
いくつかの態様において、配列番号２１のアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、配列番号４２のアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質はヒト化されている。
【０２６９】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質はまた、（ａ）配列番号１３１−１４０から選択される第１のヒト軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ１）、配列番号１４１−１４８から選択される軽鎖フレームワーク領域のヒトＦＲ２、配列番号１４９−１５６から選択される軽鎖のヒトＦＲ３、および配列番号１５７−１６２から選択される軽鎖のヒトＦＲ４；ならびに（ｂ）配列番号１０９−１１５から選択される第１のヒト重鎖フレームワーク領域（ＦＲ１）、配列番号１１６−１１９から選択される重鎖のヒトＦＲ２、配列番号１２０−１２７から選択される重鎖のヒトＦＲ３、および配列番号１２８−１３０から選択される重鎖のヒトＦＲ４を含む。
【０２７０】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、ヒト定常領域を含む。いくつかの態様において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３および／またはＩｇＧ４からなる群より選択される。いくつかの態様において、定常領域はＩｇＧ１である。
【０２７１】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、完全長抗体である。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、抗体の抗原結合フラグメントである。
【０２７２】
ある態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィド結合したＦｖ、Ｖ ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディ、ＩｇＧ−ＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、四量体、三量体、二重特異性抗体、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含む。
【０２７３】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、グリコフォリンＡ（ＧＰＡ）に特異的に結合する。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、ヒトＧＰＡ、カニクイザルＧＰＡ、ブタＧＰＡ、ウシＧＰＡ、マウスＧＰＡまたはラットＧＰＡの１以上のに結合する。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、ヒトＧＰＡに特異的に結合する。
【０２７４】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、約１．０から約１００ｎＭのＫｄでヒトＧＰＡに結合する。いくつかの態様において、Ｋｄは、約１．０ｎＭまたはそれ以上（例えば、それ以下）である。いくつかの態様において、結合親和性は、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法または放射免疫アッセイにより測定される。
【０２７５】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、親和性成熟されている。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、１０Ｆ７の親和性成熟変異体である。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、１０Ｆ７、Ｔｅｒ１１９、ＣＬＢ−ｅｒｙ−１（ＡＭＥ−１）、ＥＰＲ８２００、ＹＴＨ８９．１、ＥＰＲ８１９９、ＪＣ１５９、ＧＹＰＡ／２８０、ａｂ４０８４４、ＨＩ２６４、ＧＰＨＮ０２、ＪＣ１５９、ＳＰＭ５９９、ＥＰＲ８２００、ＧＹＰＡ／１７２５Ｒ、ａｂ１１２２０１、ａｂ１１４３３０、ａｂ２１９８９６、ＢＲＩＣ２５６またはそれらのフラグメントもしくは誘導体との結合についてＧＰＡと競合する。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、ヒトＧＰＡへの、１０Ｆ７、Ｔｅｒ１１９、ＣＬＢ−ｅｒｙ−１（ＡＭＥ−１）、ＥＰＲ８２００、ＹＴＨ８９．１、ＥＰＲ８１９９、ＪＣ１５９、ＧＹＰＡ／２８０、ａｂ４０８４４、ＨＩ２６４、ＧＰＨＮ０２、ＳＰＭ５９９、ＧＹＰＡ／１７２５Ｒ、ａｂ１１２２０１、ＢＲＩＣ２５６またはそれらのフラグメントもしくは誘導体の結合を少なくとも約５０％阻害する。
【０２７６】
いくつかの態様において、ヒトグリコフォリンＡ（ＧＰＡ）に特異的に結合し、配列番号５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７６、７８、８０、８１、８３、８５、８７、８８、９０、９１、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７および１０８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７５、７７、７９、８２、８４、８６、８９、９２、９４、９７、１００、１０３および１０６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２を含む抗原結合タンパク質を提供し、ここで、抗原結合タンパク質は、親和性成熟であり、ヒト化されている。
【０２７７】
いくつかの態様において、ヒトグリコフォリンＡ（ＧＰＡ）に特異的に結合し、（ａ）配列番号５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７６、７８、８０、８１、８３、８５、８７、８８、９０、９１、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７および１０８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７５、７７、７９、８２、８４、８６、８９、９２、９４、９７、１００、１０３および１０６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；（ｃ）ＱＱＦＴＳＳＰＹＴ（配列番号４５）または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体を含む軽鎖ＣＤＲ３；（ｄ）ＧＹＴＦＮＳＹＦＭＨ（配列番号４６）または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体を含む重鎖ＣＤＲ１；（ｅ）ＧＭＩＲＰＮＧＧＴＴＤＹＮＥＫＦＫＮ（配列番号４７）または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体を含む重鎖ＣＤＲ２；（ｆ）ＷＥＧＳＹＹＡＬＤＹ（配列番号４８）または１、２、３もしくは４個の保存的アミノ酸置換を含むその変異体を含む重鎖ＣＤＲ３；（ｇ）配列番号１３１−１４０から選択される第１のヒト軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ１）、配列番号１４１−１４８から選択される軽鎖フレームワーク領域のヒトＦＲ２、配列番号１４９−１５６から選択される軽鎖のヒトＦＲ３、および配列番号１５７−１６２から選択される軽鎖のヒトＦＲ４；（ｈ）配列番号１０９−１１５から選択される第１のヒト重鎖フレームワーク領域（ＦＲ１）、配列番号１１６−１１９から選択される重鎖のヒトＦＲ２、配列番号１２０−１２７から選択される重鎖のヒトＦＲ３、および配列番号１２８−１３０から選択される重鎖のヒトＦＲ４；（ｉ）ヒト重鎖定常領域；および、（ｊ）ヒト軽鎖定常領域を含む抗原結合タンパク質を提供する。
【０２７８】
いくつかの態様において、本発明の抗原結合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
【０２７９】
いくつかの態様において、配列番号１−４２からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、配列番号１−４２からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。。いくつかの態様において、配列番号１−４２からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％同一のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。。いくつかの態様において、かかるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの態様において、ベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、細胞株は、ＣＨＯ、ｋ１ＳＶ、ＸＣｅｅｄ、ＣＨＯＫ１ＳＶおよびＧＳ−ＫＯからなる群より選択される。
【０２８０】
いくつかの態様において、ＧＰＡに特異的に結合する抗原結合タンパク質を製造する方法であって、抗原結合タンパク質が産生される条件下で細胞株を培養し；そして、抗原結合タンパク質を回収することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、１以上の軽鎖および１以上の重鎖を含み、ここで、該重鎖および軽鎖は別個のベクターにコードされている。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、１以上の軽鎖および１以上の重鎖を含み、ここで、該重鎖および軽鎖は、同じベクターにコードされている。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【０２８１】
いくつかの態様において、免疫寛容を誘導し、抗原結合タンパク質および少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原または少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントを含む、組成物を提供する。
【０２８２】
いくつかの態様において、組成物は、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原を含み、ここで、該少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ＭＰＢのフラグメント（複数可）、ＭＯＧのフラグメント（複数可）およびＰＬＰのフラグメント（複数可）の少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントを含み、ここで、該少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントは、配列番号１６９−１７５および１８６−２０２の少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントを含み、ここで、該少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントは、配列番号１６９、１７１−１７３、１７５および１８８−２０２の少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、組成物は、多発性硬化症の処置に用いるためのものである。いくつかの態様において、かかる組成物を対象に投与することを含む多発性硬化症の処置方法が提供される。
【０２８３】
いくつかの態様において、組成物は、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原を含み、ここで、該少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原は、インスリン、プロインスリン、プレプロインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ−６５（ＧＡＤ−６５またはグルタミン酸デカルボキシラーゼ２）、ＧＡＤ−６７、グルコース−６ホスファターゼ２、膵島特異的グルコース６ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）、インスリノーマ関連タンパク質２β（ＩＡ−２β）、ＩＣＡ６９、ＩＣＡ１２（ＳＯＸ−１３）、カルボキシペプチダーゼＨ、イモージェン３８、ＧＬＩＭＡ３８、クロモグラニンＡ、ＨＳＰ−６０、カルボキシペプチダーゼＥ、ペリフェリン、グルコーストランスポーター２、肝細胞癌−腸−膵臓／膵臓関連タンパク質、Ｓ１００β、グリア線維性酸性タンパク質、再生遺伝子ＩＩ、膵臓十二指腸ホメオボックス１、筋強直性ジストロフィーキナーゼおよびＳＳＴ Ｇ−タンパク質共役受容体１−５の少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントを含み、ここで、該少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントは、配列番号２０４−２１４を含む。いくつかの態様において、組成物は、１型糖尿病の処置に用いるためのものである。いくつかの態様において、かかる組成物を対象に投与することを含む１型糖尿病の処置方法が提供される。
【０２８４】
いくつかの態様において、組成物は、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原を含み、ここで、該少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原は、組織グルタミン転移酵素、高分子量グルテニン、低分子量グルテニン、グルテン、アルファ−グリアジン、ガンマ−グリアジン、オメガ−グリアジン、ホルデイン、セカリン、アベニンおよびそれらの脱アミド体の少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントを含み、ここで、該少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントは、配列番号１８２−１８５および２１５を含む。いくつかの態様において、組成物は、セリアック病の処置に用いるためのものである。いくつかの態様において、かかる組成物を対象に投与することを含むセリアック病の処置方法が提供される。
【０２８５】
いくつかの態様において、組成物は、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原を含み、ここで、該少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原は、ＭＨＣクラスＩタンパク質、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、マイナーな血液型抗原、ＲｈＣＥ、Ｋｅｌｌ、Ｋｉｄｄ、ＤｕｆｆｙおよびＳｓの少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、組成物は、移植拒絶の予防または処置に用いるためのものである。いくつかの態様において、かかる組成物を対象に投与することを含む移植拒絶の処置方法が提供される。
【０２８６】
いくつかの態様において、本発明の組成物の使用は、抗原結合タンパク質に結合される目的の抗原に対して免疫寛容を誘導するのに用いるためである。
【０２８７】
いくつかの態様において、ＲＡＴＹＩＬ、ＲＮＩＹＩＬ、ＫＹＴＹＩＬ、ＶＨＴＹＩＬ、ＲＮＶＦＩＬ、ＲＮＩＹＬＬ、ＲＫＴＹＩＬ、ＬＮＶＹＩＬ、ＫＡＴＹＩＬ、ＲＭＴＹＩＬ、ＫＴＶＹＩＬ、ＫＨＶＹＩＬ、ＲＮＩＴＭＩＬ、ＫＤＴＹＩＬ、ＩＮＳＹＩＬ、ＱＨＴＹＩＬおよびＲＨＳＹＩＬから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ Ｈ１）を含む抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、該タンパク質は、アミノ酸配列の対応する位置にＫＤＴＹＭＬの配列を含む親配列から成熟する。いくつかの態様において、ＣＤＲ Ｈ１は、配列番号２１７−２３３または２６９−２８５から選択される１つの配列を含む。
【０２８８】
いくつかの態様において、ＦＲＮＮＫ、ＦＲＮＳＫ、ＦＫＮＧＫ、ＦＲＮＡＫ、ＦＲＴＧＫ、ＦＫＮＤＫおよびＹＫＮＧＫから選択されるアミノ酸配列を含む第１の軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１ａ）を含む抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、該タンパク質は、アミノ酸配列の対応する位置にＹＳＮＧＫＴの配列を含む親配列から成熟する。いくつかの態様において、ＣＤＲＬ１ａは、配列番号２３５−２４１または２８７−２９３から選択される１つの配列を含む。
【０２８９】
いくつかの態様において、ＬＳＲＴＳ、ＮＴＲＴＳ、ＮＴＲＰＳ、ＬＮＲＬＨ、ＮＴＲＬＡ、ＮＳＲＬＳ、ＬＳＲＶＳ、ＬＮＲＶＳ、ＬＮＲＬＳ、ＮＳＲＬＨ、ＳＳＲＬＳ、ＳＳＲＶＳ、ＳＮＲＬＨ、ＮＴＲＶＳ、ＳＮＲＶＳ、ＨＳＲＬＳ、ＳＳＲＬＡ、ＦＮＲＶＮ、ＬＮＲＭＳ、ＬＮＲＩＳおよびＬＳＨＰＨから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ２）を含む抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、該タンパク質は、アミノ酸配列の対応する位置にＶＳＫＬＤの配列を含む親配列から成熟する。いくつかの態様において、ＣＤＲＬ２は、配列番号２４３−２６３または２９５−３１５から選択される１つの配列を含む。
【０２９０】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、ヒト標的抗原およびカニクイザル標的抗原に結合する。いくつかの態様において、ヒト標的抗原およびカニクイザル標的抗原は、グリコフォリンＡである。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、耐性が望まれる抗原に対して融合される。
【０２９１】
いくつかの態様において、免疫寛容を誘導し、本発明の抗原結合タンパク質を含み、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原または少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントをさらに含む、組成物を提供する。
【０２９２】
いくつかの態様において、組成物は、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原を含み、ここで、該少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ＭＰＢのフラグメント（複数可）、ＭＯＧのフラグメント（複数可）およびＰＬＰのフラグメント（複数可）の少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントを含み、ここで、該少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントは、配列番号１６９−１７５および１８６−２０２を少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントを含み、ここで、該少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントは、配列番号１６９、１７１−１７３、１７５および１８８−２０２の少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、組成物は、多発性硬化症の処置に用いるためのものである。
【０２９３】
いくつかの態様において、組成物は、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原を含む、ここで、該少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原は、インスリン、プロインスリン、プレプロインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ−６５（ＧＡＤ−６５またはグルタミン酸デカルボキシラーゼ２）、ＧＡＤ−６７、グルコース−６ホスファターゼ２、膵島特異的グルコース６ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）、インスリノーマ関連タンパク質２β（ＩＡ−２β）、ＩＣＡ６９、ＩＣＡ１２（ＳＯＸ−１３）、カルボキシペプチダーゼＨ、イモージェン３８、ＧＬＩＭＡ３８、クロモグラニンＡ、ＨＳＰ−６０、カルボキシペプチダーゼＥ、ペリフェリン、グルコーストランスポーター２、肝細胞癌−腸−膵臓／膵臓関連タンパク質、Ｓ１００β、グリア線維性酸性タンパク質、再生遺伝子ＩＩ、膵臓十二指腸ホメオボックス１、筋強直性ジストロフィーキナーゼおよびＳＳＴ Ｇ−タンパク質共役受容体１−５の少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントを含み、ここで、該少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントは配列番号２０４−２１４を含む。いくつかの態様において、組成物は、１型糖尿病の処置に用いるためのものである。
【０２９４】
いくつかの態様において、組成物は、少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原を含み、ここで、該少なくとも１つの免疫原性寛容誘導性抗原は、組織グルタミン転移酵素、高分子量グルテニン、低分子量グルテニン、グルテン、アルファ−グリアジン、ガンマ−グリアジン、オメガ−グリアジン、ホルデイン、セカリン、アベニンおよびそれらの脱アミド体の少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントを含み、ここで、該少なくとも１つの寛容誘導性抗原の免疫原性フラグメントは、配列番号１８２−１８５および２１５を含む。いくつかの態様において、組成物は、セリアック病の処置に用いるためのものである。
【０２９５】
いくつかの態様において、目的の抗原に対して免疫寛容を誘導し、該目的の抗原が抗原結合タンパク質に融合している、本発明の組成物を提供する。
【０２９６】
いくつかの態様において、抗体または抗体フラグメントを標的に対して増強された親和性を有するように親和性成熟させる方法であって、非特異的結合体のファージライブラリーを枯渇させること、ここで該ファージライブラリーは複数のファージを含み、各ファージは候補の親和性成熟抗体または抗体フラグメントを発現しており；枯渇したライブラリーを標的抗原に曝露すること；洗浄により標的抗原に結合していないファージを除去すること；標的抗原に結合しているファージを増幅すること；曝露、除去および増幅ステップを複数回繰り返して、高親和性候補抗体または抗体断片を発現するファージによる標的抗原の結合をもたらす選択圧を誘導すること；および、次世代シークエンシングを用いて高親和性候補抗体または抗体フラグメントをスクリーニングすること、を含む方法を提供する。
【０２９７】
いくつかの態様において、該方法は、ＥＬＩＳＡを用いて高親和性候補抗体または抗体フラグメントをスクリーニングすること、および可溶性形態で発現される高親和性候補抗体または抗体フラグメントの能力を評価することのうち１以上をさらに含んでいてもよい。
【０２９８】
上記は、明確さと理解を目的として説明および実施例によりいくらか詳細に記載されているが、本発明の精神から逸脱することなく改変が可能であることは、当技術分野の当業者により理解され得る。したがって、本明細書に記載される形態は、例示に過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図したものではなく、むしろ、本発明の態様の真の範囲および精神に伴うすべての改変および代替案も網羅することを明確に理解され得る。
【０２９９】
上記の態様の特定の特徴および局面の様々な組合せまたは下位組合せが行われ、本発明の１以上の範囲内に収まることが企図される。さらに、ある態様に関連した任意の特定の特徴、局面、方法、特性、特徴、品質、属性、要素などの本明細書の記載は、本明細書に記載の他のすべての態様において用いられ得る。したがって、記載された態様の様々な特徴および局面は、記載された発明の様々な形式を形成するために、互いに組み合わせたり、置き換えたりできることが理解されるべきである。したがって、本明細書に記載の本発明の範囲は、上記の特定の記載された態様によって限定されるべきではないことが意図される。さらに、本発明は、様々な改変および代替形態の影響を受けやすいが、その特定の例が図面に示されており、本明細書に詳細に記載されている。しかしながら、本発明は、記載された特定の形態または方法に限定されるべきではなく、逆に、本発明は、記載された様々な態様および添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に該当する全ての改変、等価物および代替物を網羅するものであることが理解されるべきである。本明細書に記載されるいかなる方法も、記載順で実行される必要はない。本明細書に記載の方法は、当業者によって実行される特定の動作を含むが、明示的にまたは暗示的に、それらの動作に関する何らかの第三者の指示を含めることもできる。例えば、“抗原結合タンパク質を投与する”などの行為は、“抗原結合タンパク質の投与を指示する”ことを含む。さらに、本明細書の特徴または局面がマーカッシュ群の観点で記載されている場合、当業者は、本記載が、それによりマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはサブグループのメンバーの観点で記載されていることも認識し得る。
【０３００】
本明細書に記載の範囲はまた、任意のおよびすべての重複、下位範囲およびそれらの組合せを包含する。語句“〜まで”、“少なくとも”、“より大きい”、“より小さい”、“間”などは、列挙された数値を含む。用語“約”または“およそ”などが先行する数字には、記載された数字が含まれる。例えば、“約９０％”には“９０％”が含まれる。ある態様において、少なくとも９５％の相同性は、対照配列に対して９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の相同性を含む。さらに、配列がヌクレオチド配列またはアミノ酸配列 “を含む”と記載されるとき、そのような言及は、特記しない限り、その配列が記載された配列“を含む”、“からなる”または“から本質的になる”ことも含む。
【０３０１】
本出願において用いられる用語および語句、およびその変形、とりわけ特許請求の範囲で用いられる用語および語句は、特記しない限り、限定的なものではなく、制限のないものとして解釈されるべきである。上記の例として、用語“含む”は、“限定することなく、〜を含む”、“〜を含むが、これに限定されない”などを意味するように解釈されるべきである。
【０３０２】
不定冠詞“１つの（ａまたはａｎ）”は、複数を除外するものではない。例えば、分子量の値および範囲を定義するために本明細書で用いられる用語“約”は、示された値および／または範囲の限界が、例えば、±２０％以内、例えば、±１０％以内で変動し得ることを意味する。数値の前に“約”を用いると、その数値自体を含む。例えば、“約５”は、“５”を明示的に支持する。範囲で提供される数値は、重複する範囲およびその間の整数を含む；例えば、１〜４と５〜７の範囲は、例えば、１〜７、１〜６、１〜５、２〜５、２〜７、４〜７、１、２、３、４、５、６および７を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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