(57)【要約】  この開示は、とりわけ、トランスジェニックニワトリを提供する。いくつかの実施形態において、トランスジェニックニワトリは、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、（ａ）ＣＤＲ３が３０〜６０アミノ酸長さの範囲内にあり、少なくとも２つのシステイン残基を含む重鎖可変ドメインをコードする核酸を含む機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子と、（ｂ）当該機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子に作動可能に連結され、遺伝子変換によって、ヌクレオチド配列を（ａ）の重鎖可変ドメインをコードする核酸に供与する複数の偽遺伝子と、を含み、偽遺伝子が、機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子の上流または下流にある、Ｂ細胞を含む。【選択図】図２
2021526830.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニックニワトリであって、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、
（ａ）ＣＤＲ３が、３０〜６０アミノ酸長さの範囲にあり、少なくとも２つのシステイン残基を含む重鎖可変ドメインをコードする核酸を含む機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子と、
（ｂ）前記機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子に作動可能に連結され、遺伝子変換によって、ヌクレオチド配列を（ａ）の前記重鎖可変ドメインをコードする核酸に供与する複数の偽遺伝子と、を含み、前記偽遺伝子が、前記機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子の上流または下流にある、Ｂ細胞を含む、トランスジェニックニワトリ。
【請求項２】
前記ニワトリの非Ｂ細胞が、ＶＨセグメント、Ｄクラスター、Ｊセグメント、および複数の上流偽遺伝子を含む内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、前記Ｄクラスター内の各Ｄセグメントが、３０〜６０アミノ酸長さの範囲内の異なる配列をコードし、少なくとも２つ）のシステイン残基を含む、請求項１に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項３】
前記ニワトリの非Ｂ細胞が、（ａ）の前記機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子および（ｂ）の前記偽遺伝子を含む、請求項１または２に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項４】
前記偽遺伝子が、（ａ）の前記重鎖可変ドメインのＣＤＲ３領域に対応する配列を含まない、請求項１〜３のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項５】
前記偽遺伝子が、遺伝子変換によって、（ａ）の前記重鎖可変ドメインのＣＤＲ３領域のコード配列を多様化する配列を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項６】
遺伝子変換によって、（ａ）の前記重鎖可変ドメインのＣＤＲ３領域のコード配列を多様化する前記偽遺伝子の配列が、３０〜６０アミノ酸配列長さの範囲内にあるアミノ酸配列をコードし、少なくとも２つのシステイン残基を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項７】
（ａ）の前記重鎖可変ドメインが、自律型重鎖（ＡＨＣ）可変ドメインである、請求項１〜６に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項８】
（ａ）の前記ＡＨＣ可変ドメインが、３０〜６０アミノ酸長さであり、少なくとも２つのシステイン残基を含むＣＤＲ３を有するラクダ化ヒト重鎖可変ドメインである、請求項７に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項９】
（ａ）の前記ＡＨＣ可変ドメインが、ラクダ化ヒトモノクローナル抗体である、請求項７に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１０】
（ａ）の前記ＡＨＣ可変ドメインが、ヒト生殖系列重鎖Ｖセグメント、３０〜６０アミノ酸長さの範囲内のアミノ酸配列をコードし、少なくとも２つのシステイン残基を含むＤセグメントによってコードされ、前記ＡＨＣ可変ドメインが、最大１０のラクダ化アミノ酸置換を含む、請求項７に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１１】
（ｂ）の前記偽遺伝子が、ヒト生殖系列抗体配列をコードする、請求項１〜１０のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１２】
前記偽遺伝子が、６００ヌクレオチド未満の長さである、請求項１１に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１３】
前記偽遺伝子が、３００〜６００ヌクレオチドの長さである、請求項１〜１２のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１４】
前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、ＣＨ１欠失を含む重鎖をコードする、請求項１〜１３のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１５】
前記ニワトリのゲノムが、ノックアウトされた軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１６】
前記動物のゲノムが、定常領域を含むが可変領域を含まない短縮型軽鎖をコードする軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１７】
動物が、前記遺伝子座についてホモ接合性である、請求項１〜１６のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１８】
動物が、前記遺伝子座についてヘテロ接合性である、請求項１〜１７のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１９】
（ａ）請求項１〜１８のいずれかに記載のトランスジェニック動物を抗原で免疫化することと、
（ｂ）前記動物から、前記抗原に特異的に結合する抗体を得ることと、を含む、方法。
【請求項２０】
前記抗体が、ポリクローナルである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体が、モノクローナルである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
（ｃ）前記トランスジェニック動物のＢ細胞を使用してハイブリドーマを作製することと、
（ｄ）前記ハイブリドーマをスクリーニングして、前記抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを同定することと、をさらに含む、請求項１９〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
（ｃ）ハイブリドーマを作製せずにＢ細胞をスクリーニングして、前記抗原に特異的に結合する抗体を産生するＢ細胞を同定することをさらに含む、請求項１９〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
ＰＣＲを使用して、前記トランスジェニック動物のＢ細胞から少なくとも前記重鎖可変領域をコードする核酸を増幅することと、前記増幅された核酸を使用して組換え抗体を発現させることと、をさらに含む、請求項１９〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体が、自律型重鎖（ＡＨＣ）可変ドメイン抗体である、請求項１〜１８のいずれかに記載のトランスジェニック動物によって産生される、モノクローナルまたはポリクローナル抗体。
【請求項２６】
請求項１〜１８のいずれかに記載の動物から単離された、Ｂ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１８年７月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／６８４，６６９号の優先権を主張し、この出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
天然ニワトリ抗体の重鎖のＣＤＲ３領域は、２つのＤセグメントが、ＶＤＪ組換え後に重鎖遺伝子座に頻繁に組み込まれるように思われるため、概して、非常に長くなり得る。ニワトリ抗体の重鎖が長いＣＤＲ３に対応する能力は、ニワトリが、「長い」ＣＤＲ、特に空洞、例えば、酵素の活性部位の隙間、ＧＰＣＲのリガンド結合部位、またはイオンチャネルのポケットなどに伸び得るノブまたは隆起を有する長いＣＤＲを有する改変抗体を発現するための魅力的なシステムにする。そのような「長いＣＤＲ３」抗体を産生するようにニワトリを遺伝子操作する際の課題の１つは、ニワトリがその領域において余分な多様性を持つ抗体集団を産生するように、その領域を多様化する方法である。
【０００３】
本開示の特定の態様は、多様化された超長システインに富む重鎖ＣＤＲ３領域を有する抗体、例えば、重鎖のみの抗体を産生するトランスジェニック動物に関する。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、とりわけ、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、（ａ）ＣＤＲ３が３０〜６０アミノ酸長さの範囲内にあり、少なくとも２つのシステイン残基を含む重鎖可変ドメインをコードする核酸を含む機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子と、（ｂ）当該機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子に作動可能に連結され、遺伝子変換によって、ヌクレオチド配列を（ａ）の重鎖可変ドメインをコードする核酸に供与する複数の偽遺伝子と、を含み、偽遺伝子が、機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子の上流または下流にある、Ｂ細胞を含むトランスジェニックニワトリを提供する。
【０００５】
そのような動物では、重鎖可変ドメインをコードする核酸は、体細胞超変異によって、および任意に、偽遺伝子による遺伝子変換を介して変異し、多様な「節のある」ＣＤＲ３を有する抗体を発現する機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子をもたらし得、「節のある」ＣＤＲ３は比較的長く、抗体結合表面にノブまたは隆起を形成する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
当業者は、以下に記載される図面が例示目的のみであることを理解するだろう。図面は、いかなる方法においても本教示の範囲を限定することを意図するものではない。
【０００７】
【図１】ＢＬＶ１Ｈ１２  Ｆａｂの結晶構造を示す。この抗体には、ジスルフィドが豊富な「ノブ」を備えた超長二本ベータ鎖の茎が含まれている。
【図２】節のあるＣＤＲ３を持つ重鎖がトランスジェニックニワトリのＢ細胞でどのように多様化するかを示す。この例では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、（ａ）ＣＤＲ３が３０〜６０アミノ酸長さの範囲内にあり、少なくとも２つのシステイン残基（「節のある機能的可変ドメイン」または「ｋｆＶ」）を含む重鎖可変ドメインをコードする核酸を含む機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子と、（ｂ）機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子に作動可能に連結され、遺伝子変換によって、ヌクレオチド配列を（ａ）の重鎖可変ドメインをコードする核酸に供与する複数の偽遺伝子（Ｐ１〜Ｐ４）と、を含み、偽遺伝子が、機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子の上流または下流にある。この例では、遺伝子変換によって、重鎖可変ドメインのＣＤＲ３領域のコード配列を多様化する偽遺伝子は、３０〜６０アミノ酸長さの範囲内にあり、少なくとも２つのシステイン残基（アスタリスクで示されている）を含むアミノ酸配列もコードする。
【０００８】
定義
「決定する」、「測定する」、「評価する（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、および「アッセイする」という用語は、任意の形態の測定を指すために本明細書において互換的に使用され、ある要素が存在するかどうかを決定することを含む。これらの用語は、定量的および／または定性的決定の両方を含む。評価は、相対的または絶対的であってもよい。「〜の存在を決定すること」は、存在する何かの量を決定すること、ならびにそれが存在するのかどうかを決定することを含む。
【０００９】
「遺伝子」という用語は、プロモータ領域、コード配列、および３’ＵＴＲからなる核酸配列を指す。
【００１０】
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００１１】
「核酸」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖または二本鎖およびそれらの化学修飾を包含する。「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。
【００１２】
「作動可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方によって影響を与えられるように、単一の核酸フラグメント上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモータは、そのコード配列の発現に影響を与えることができる（すなわち、コード配列がプロモータの転写制御下にある）場合、コード配列と作動可能に連結されている。同様に、イントロンがコード配列に作動可能に連結されている場合、イントロンは、ｍＲＮＡからスプライシングされて、コード配列の発現を提供する。「連結されていない」は、会合される遺伝的要素が互いに密接に会合しておらず、一方の機能が他方に影響を与えないことを意味する。
【００１３】
「ホモ接合性」という用語は、同一の対立遺伝子が相同染色体上の同じ遺伝子座に存在することを示す。対照的に、「ヘテロ接合性」は、異なる対立遺伝子が相同染色体上の同じ遺伝子座に存在することを示す。トランスジェニック動物は、トランスジーンについてホモ接合性であるか、または相同染色体上の同じ遺伝子座に対応物がない場合、トランスジーンについてヘミ接合性であり得る。
【００１４】
遺伝子に関する「内因性」という用語は、遺伝子が細胞に固有であること、すなわち、遺伝子が非改変細胞のゲノム内の特定の遺伝子座に存在することを示す。内因性遺伝子は、野生型細胞のその遺伝子座に存在する野生型遺伝子であり得る（自然界に見られるように）。内因性遺伝子は、ゲノム内に野生型遺伝子と同じ遺伝子座に存在する場合、改変内因性遺伝子であり得る。そのような改変内因性遺伝子の例は、外来核酸が挿入される遺伝子である。内因性遺伝子は、核ゲノム、ミトコンドリアゲノムなどに存在し得る。
【００１５】
「構築物」という用語は、特定のヌクレオチド配列（複数可）の発現を目的として生成されたか、または他の組換えヌクレオチド配列の構築に使用される組換え核酸、一般に組換えＤＮＡを指す。構築物は、ベクターまたはゲノムに存在し得る。
【００１６】
「組換え」という用語は、宿主細胞に自然には発生しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。組換え分子は、自然には発生しない方法で一緒に連結された２つ以上の自然に発生する配列を含有し得る。組換え細胞は、組換えポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含有する。細胞が組換え核酸を受け取る場合、その核酸は、細胞に対して「外因性」である。
【００１７】
「選択可能なマーカー」という用語は、導入された核酸またはベクターを含有するそれらの宿主の選択を容易にすることを可能にする、宿主において発現することができるタンパク質を指す。選択可能なマーカーの例には、抗菌剤（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、またはクロラムフェニコール）に対する耐性を付与するタンパク質、宿主細胞に栄養上の利点などの代謝上の利点を付与するタンパク質、ならびに細胞に機能的または表現型の利点（例えば、細胞分裂）を付与するタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが産生されるプロセスを指す。このプロセスには、転写および翻訳の両方が含まれる。
【００１９】
細胞への核酸配列の挿入に関する文脈において、「導入する」という用語は、「トランスフェクション」および「形質転換」、ならびに細胞に核酸を導入する他の全ての方法を含み、核酸配列は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアＤＮＡ）に取り込まれ得るか、または自律レプリコンに変換されるか、または一過性に発現され得る。
【００２０】
「コード配列」という用語は、転写および翻訳されると、適切な調節要素の制御下に置かれたときに、例えば、インビボでタンパク質を産生する核酸配列を指す。本明細書で使用される場合、コード配列は、連続的なＯＲＦを有し得るか、またはイントロンもしくは非コード配列の存在によって中断されたＯＲＦを有し得る。この実施形態において、非コード配列は、プレｍＲＮＡからスプライシングされて、成熟ｍＲＮＡを産生する。
【００２１】
ある遺伝子座を別の遺伝子座で置き換えるという文脈での「置き換える」という用語は、単一のステッププロトコルまたは複数のステッププロトコルを指す。
【００２２】
細胞への核酸配列の挿入に関する文脈において、「導入された」という用語は、「トランスフェクション」、または「形質転換」、または「形質導入」を意味し、真核細胞または原核細胞への核酸配列の取り込みについての言及を含み、核酸配列は、細胞内に一過性に存在し得るか、または細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアＤＮＡ）に取り込まれ得、自律レプリコンに変換される。
【００２３】
細胞への核酸配列の挿入に関する文脈において、「導入された」という用語は、「トランスフェクション」、または「形質転換」、または「形質導入」を意味し、真核細胞または原核細胞への核酸配列の取り込みについての言及を含み、核酸配列は、細胞内に一過性に存在し得るか、または細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアＤＮＡ）に取り込まれ得、自律レプリコンに変換される。
【００２４】
「複数」という用語は、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも５０００、少なくとも１０，０００、もしくは少なくとも５０，０００、またはそれ以上を指す。ある特定の場合において、複数は、少なくとも１０〜５０を含む。他の実施形態において、複数は、少なくとも５０〜１，０００であり得る。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、細胞に関してであり、インビトロで培養される細胞を指す。動物が単離された細胞を含有すると記載されている場合、それらの単離された細胞は、インビトロで培養され、次いで動物に移植された。
【００２６】
「子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）」または「子孫（ｏｆｆ−ｓｐｒｉｎｇ）」という用語は、特定の動物または細胞に由来し、その子孫であるすべての将来の世代を指す。したがって、子孫、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、世代などがこの定義に含まれるように、任意の連続する世代の動物の子孫が本明細書に含まれる。
【００２７】
「トランスジェニック動物」という語句は、外来核酸（すなわち、動物に固有ではない組換え核酸）を含有する細胞を含む動物を指す。外来核酸は、動物のすべての細胞、または動物のすべてではないがいくつかの細胞に存在し得る。外来核酸分子は、「トランス遺伝子」と呼ばれ、１つ以上の遺伝子、ｃＤＮＡなどを含有し得る。トランス遺伝子を初期胚からの受精卵母細胞または受精細胞に挿入することによって、結果として生じるトランスジェニック動物は完全にトランスジェニックであり得、安定して外来核酸をその生殖系列に伝達することができる。あるいは、外来核酸は、それを含有する組換え細胞または組織を動物に移入して、例えば、移植して、部分的にトランスジェニック動物を産生することによって導入され得る。あるいは、トランスジェニック動物は、遺伝子改変された体細胞からの核の移入によって、または胚性幹細胞もしくは始原生殖細胞などの遺伝子改変された多能性細胞の移入によって産生され得る。キメラ動物は、生殖系列内の別の動物によって供与された細胞を有し得、その場合、動物の子孫は、供与された細胞内の染色体に対してヘテロ接合性であり得る。供与された細胞が外因性核酸（すなわち、細胞に内因性ではない核酸）を含有する場合、キメラ動物の子孫は、「トランスジェニック」であり得、「トランスジェニック」動物は、外来核酸（すなわち、動物に固有ではない組換え核酸）を含有する細胞からなる動物である。外来核酸分子は、本明細書では「トランス遺伝子」と呼ばれ得る。
【００２８】
「ハイブリッド動物」、「トランスジェニックハイブリッド動物」などの語句は、本明細書では互換的に使用されて、ある特定の特質を有する第１の動物とある特定の特質を有する第２の動物との交配から得られた動物を意味する。例えば、本開示のハイブリッド動物は、共通軽鎖を産生する第１のトランスジェニック動物と、合成重鎖を産生する第２のトランスジェニック動物との交配から得られたトランスジェニック子孫を指し得る。ハイブリッド動物は、免疫化され、抗原特異性抗体の産生源として使用され得る。
【００２９】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書において互換的に使用される。これらの用語は当業者に十分に理解されており、抗原に特異的に結合する１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。抗体の一形態は、抗体の基本構造単位を構成する。この形態は四量体であり、各対が１本の軽鎖および１本の重鎖を有する２対の同一の抗体鎖からなる。各対では、軽鎖および重鎖の可変領域は一緒に抗原への結合に関与し、定常領域は抗体のエフェクター機能に関与する。
【００３０】
認識されている免疫グロブリンのポリペプチドには、カッパおよびラムダの軽鎖、ならびにアルファ、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロン、およびミューの重鎖、または他の種における等価物が含まれる。完全長の免疫グロブリン「軽鎖」（約２５ｋＤａまたは約２１４アミノ酸の）は、ＮＨ２末端における約１１０アミノ酸の可変領域、およびＣＯＯＨ末端におけるカッパまたはラムダの定常領域を含む。完全長の免疫グロブリン「重鎖」（約５０ｋＤａまたは約４４６アミノ酸の）は、同様に可変領域（約１１６アミノ酸の）および前述の重鎖定常領域の１つ、例えば、ガンマ（約３３０アミノ酸の）を含む。
【００３１】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語には、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびＦｄフラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、ならびに抗体および非抗体タンパク質の抗原結合部分を含む融合タンパク質を含むが、これらに限定されない、抗原への特異的な結合を保持する任意のアイソタイプの抗体または免疫グロブリン、抗体のフラグメントが含まれる。抗体は、例えば、放射性同位体、検出可能な生成物を産生する酵素、蛍光タンパク質等を用いて検出可能なように標識され得る。抗体は、特異的結合対のメンバー、例えばビオチン（ビオチン−アビジン特異的結合対のメンバー）などの他の部分とさらに複合体化することができる。抗体はまた、限定されないが、ポリスチレンプレートまたはビーズ等を含む固体支持体に結合させてもよい。この用語には、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、およびまたは抗原への特異的結合を保持する他の抗体フラグメント、およびモノクローナル抗体もまた包含される。
【００３２】
抗体は、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、および（Ｆａｂ’）２、ならびに二機能性（すなわち、二重特異性）ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８７，１７（１）：１０５−１１１）および単鎖（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８８，８５（１６）：５８７９−５８８３およびＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８８，２４２（４８７７）：４２３−４２６、これらは、参照により本明細書に組み込まれる）。（一般的には、Ｈｏｏｄら、“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、Ｂｅｎｊａｍｉｎ、Ｎ．Ｙ．、２ｎｄ  ｅｄ１９８４およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｏｄ，Ｎａｔｕｒｅ．１９８６，３２３（６０８３）：１５−１６を参照されたい）を含む様々な他の形態で存在し得る。
【００３３】
「キメラ抗体」は、抗体の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子が、典型的には遺伝子操作することによって、異なる種に属している抗体可変および定常領域遺伝子から構築されている抗体を指す。例えば、ニワトリまたはウサギモノクローナル抗体からの遺伝子の可変セグメントは、ガンマ１およびガンマ３などのヒト定常セグメントに結合され得る。療法用キメラ抗体の例は、ニワトリまたはウサギ抗体からの可変または抗原結合ドメイン、およびヒト抗体からの定常またはエフェクタードメインから構成されているハイブリッドタンパク質であるが（例えば、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．デポジットアクセッション番号ＣＲＬ９６８８の細胞によって作製された抗Ｔａｃキメラ抗体）、他の哺乳動物種も使用され得る。
【００３４】
「偽遺伝子」という用語は、開始および／または停止コドンを含有する場合も含まない場合もあるオープンリーディングフレームを含有する非転写核酸領域を説明するために使用される。アミノ酸配列は、オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列をインシリコで翻訳して、アミノ酸配列を産生することができるという意味で、偽遺伝子によって「コード」され得る。重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の文脈では、偽遺伝子は、プロモータ領域、組換えシグナル配列、またはリーダー配列を含有しない。
【００３５】
「上流」および「下流」という用語は、転写の方向に関して使用される。
【００３６】
「特異的な結合」という用語は、異なる検体の均質な混合物中に存在する特定の検体に優先的に結合する抗体の能力を指す。ある特定の実施形態において、特異的な結合の相互作用によって、試料中の望ましい検体と望ましくない検体とが区別され、いくつかの実施形態において、約１０〜１００倍またはそれ以上を超えて（例えば、約１０００〜１０，０００倍を超えて）区別するであろう。
【００３７】
ある特定の実施形態において、抗体／検体の複合体において特異的に結合する場合、抗体と検体との間の親和性は、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ未満、または約１０−１２Ｍ未満のＫＤ（解離定数）を特徴とする。
【００３８】
重抗体鎖または軽抗体鎖の「可変領域」は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤ３、およびフレームワーク領域（ＣＤＲは、「相補性決定領域」を指す）を含有する鎖のＮ末端成熟ドメインである。抗体の重鎖および軽鎖の両方が、可変ドメインを含有する。すべてのドメイン、ＣＤＲ、および残基番号は、配列アラインメントおよび構造知識に基づいて割り当てられる。フレームワークおよびＣＤＲ残基の同定および番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９８，２７８（２）：４５７−４７９）によって記載されている通りである。
【００３９】
ＶＨは、抗体重鎖の可変ドメインである。ＶＬは、抗体軽鎖の可変ドメインである。
【００４０】
「遺伝子」および「遺伝子座」という用語は、本明細書において互換的に使用される。どちらの用語も、遺伝子が活性転写されている、または無傷であることを意味しない。どちらの用語も、不活性化された遺伝子を包含する。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「キメラ」ニワトリは、少なくとも２つの供給源からのかなりの数の遺伝的に異なる細胞を含有するニワトリである。キメラ動物は、ある動物からの細胞を別の動物の胚に移植することによって、または培養細胞（例えば、改変されたゲノムを有する）を胚に移植することによって作製され得る。移植された細胞は、宿主胚に組み込まれる前に培養物から収集され得る。胚は動物に成長し、結果として生じる動物は、宿主からの細胞、ならびに移植された細胞を含有し得る。供与された細胞が外因性核酸（すなわち、細胞に内因性ではない核酸）を含有する場合、キメラ動物の子孫は、「トランスジェニック」であり得、「トランスジェニック」動物は、外来核酸（すなわち、動物に固有ではない組換え核酸）を含有する細胞からなる動物である。外来核酸分子は、本明細書では「トランス遺伝子」と呼ばれ得る。
【００４２】
「不活性化」という用語は、遺伝子によってコードされたタンパク質が発現されないという意味で発現されない遺伝子を示すことを意図する。遺伝子は、遺伝子のコード配列および／または調節配列の一部を除去することによって不活性化され得る。破壊された、例えば、「ノックアウト」遺伝子は、不活性化遺伝子の一種である。発現されたヒト免疫グロブリン配列によって置き換えられている発現された内因性配列を含有したことのある遺伝子座は、不活性化された内因性遺伝子を含有する。そのため、発現されたヒト免疫グロブリン配列を含有する遺伝子座は、内因性免疫グロブリン遺伝子がヒト免疫グロブリン配列によって置き換えられた場合、不活性化された内因性免疫グロブリン遺伝子を有し得る。多くの場合、これは、内因性配列をノックアウトし（例えば、配列の少なくとも一部を削除することによって）、次いで、内因性配列によって占められていたことのある位置にヒト免疫グロブリン配列を挿入することによって行うことができる。
【００４３】
「組換え」という用語は、宿主細胞に自然には発生しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。組換え分子は、自然には発生しない方法で一緒に連結された２つ以上の自然に発生する配列を含有し得る。組換え細胞は、組換えポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含有する。細胞が組換え核酸を受け取る場合、その核酸は、細胞に対して「外因性」である。
【００４４】
「遺伝的に連結された」という用語は、減数分裂中に遺伝的要素が一緒に遺伝する傾向があるように、同じ染色体上に存在する２つの遺伝的要素を指す（すなわち、要素は、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満の組換え頻度を有する）。互いに密接に連結している２つの遺伝的要素は、染色体の乗換え事象（または「組換え」）中に異なる染色分体に分離される可能性が低くなる。組換え中に２つの遺伝的に連結された要素が分離される可能性は、２つの要素間の配列の量に依存し、「組換え頻度」と呼ばれる可能性のパーセンテージに計算され得る。
【００４５】
「自律型重鎖可変ドメイン」という用語は、すなわち、自律的に凝集することなく、およびまたは関連する軽鎖なしに、折りたたまれて、抗原に自律的に結合することができる、重鎖可変ドメインを指す。「重鎖のみ」または「ＨＣＯ」抗体、サメ抗体、ＶＨＨ抗体、ラクダ科動物、および単一ドメイン抗体はすべて、自律型重鎖可変ドメインを含む抗体の例である。そのような抗体を産生するためのいくつかの戦略は、Ｊａｎｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００６  １０３：１５１３０−５）、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６  ２６：３７７−９０）、Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５  １７５：３７６９−７９）、およびＮｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００３  １０９：９３−１０１）において概説される。自律型重鎖可変ドメインは、ＶＨ抗体の可変ドメインにラクダ化置換を導入することによって作製され得る。
【００４６】
例示的な実施形態の説明
本主題発明をさらに説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、当然のことながら、それ自体変化し得ることを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのものであり、限定的であることは意図されないこともまた理解されたい。
【００４７】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値と下限値の間の、文脈上そうではないと明確に指示されない限りは下限値の単位の１０分の１までの各介在値、およびその記載される範囲内の任意の他の記載値または介在値が、本発明に包含されることを理解されたい。
【００４８】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料をここで説明する。本明細書で言及される全ての刊行物は、刊行物が引用されることに関連して方法かつ／または材料を開示および説明するために参照により本明細書に組み込まれる。
【００４９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「１つの細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は、複数の細胞を含み、「１つの候補薬剤（ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ａｇｅｎｔ）」への言及は、１つ以上の候補薬剤および当業者に既知のその等価物などへの言及を含む。特許請求の範囲は任意の要素を排除するように作成されてもよいことにさらに留意されたい。そのため、この記述は、特許請求の要素の列挙に関連して、「唯一」、「のみ」などのような排他的な用語の使用、または「否定的な」限定の使用のための先行詞として役割を果たすことを意図している。
【００５０】
本明細書に論じられる公開物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためだけに提供される。本明細書内のいずれのものも、先行の発明という理由によりそのような公開物に先立する権利がないという了解として解釈されるべきではない。さらに、示されている公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、別個に確認する必要があり得る。
【００５１】
本明細書に引用される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用される関連する方法および／または材料を開示かつ記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示に関するものであり、本発明が先行発明のためにその刊行物に先行する権限を有しないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、示されている公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、別個に確認する必要があり得る。
【００５２】
本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に説明され例証された個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るか、または組み合わせられ得る個別の要素および特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙されたイベントの順序で、または論理的に可能な他の順序で実施することができる。
【００５３】
上記のように、トランスジェニック動物が、提供される。ある特定の実施形態において、動物は、比較的少数の軽鎖遺伝子を有する任意の非ヒト動物、またはそれらの一次抗原レパートリーを開発するために遺伝子変換を用いる動物であり得、そのため、動物は、様々な任意の異なる動物であり得る。一実施形態において、動物は、トリ、例えば、ニワトリまたはシチメンチョウなどのキジ目のメンバー、あるいはアヒルまたはガチョウなどのガンカモ目のメンバー、あるいは哺乳動物、例えば、ウサギなどのウサギ目動物（ｌａｇｏｍｏｒｐｈ）、またはウシ、ヒツジ、ブタ、もしくはヤギなどの家畜であり得る。
【００５４】
本開示のいくつかは、１つ以上のトランス遺伝子を含有するトランスジェニックニワトリに関する。多くの動物の免疫グロブリン遺伝子座のヌクレオチド配列が知られており、同じく、そのような動物のゲノムを改変するための方法も知られているため、下記の一般的な概念は、任意の好適な動物、特に一次抗原レパートリーを開発するために遺伝子変換を用いる動物に容易に適合され得る。転写された免疫グロブリン重鎖または軽鎖遺伝子の可変領域と、異なる可変領域を含有する作動可能に連結された（上流の）偽遺伝子との間の遺伝子変換による抗体多様性の生成は、例えば、Ｂｕｔｌｅｒ（Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．１９９８  １７：４３−７０）、Ｂｕｃｃｈｉｎｉ（Ｎａｔｕｒｅ１９８７  ３２６：４０９−１１）、Ｋｎｉｇｈｔ（Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４  ５６：１７９−２１８）、Ｌａｎｇｍａｎ（Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３  １４４：４２２−４６）、Ｍａｓｔｅｌｌｅｒ（Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  １５：１８５−２０６）、Ｒｅｙｎａｕｄ（Ｃｅｌｌ１９８９  ５９：１７１−８３）、およびＲａｔｃｌｉｆｆｅ（Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６  ３０：１０１−１１８）などの様々な公開物に記載されている。
【００５５】
上記のように、トランスジェニックニワトリが、提供される。いくつかの実施形態において、トランスジェニックニワトリは、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、（ａ）ＣＤＲ３が３０〜６０アミノ酸長さの範囲内にあり、少なくとも２つ（例えば、最大１０、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つ）のシステイン残基を含む重鎖可変ドメインをコードする核酸を含む機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子と、（ｂ）当該機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子に作動可能に連結され、遺伝子変換によって、ヌクレオチド配列を（ａ）の重鎖可変ドメインをコードする核酸に供与する複数の偽遺伝子と、を含み、偽遺伝子が、機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子の上流または下流にある、Ｂ細胞を含む。いくつかの実施形態において、ニワトリの非Ｂ細胞は、ＶＨセグメント、Ｄクラスター、Ｊセグメント、および複数の上流偽遺伝子を含む内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、Ｄクラスター内の各Ｄセグメントは、３０〜６０アミノ酸長さの範囲の異なる配列をコードし、少なくとも２つ（例えば、最大１０、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つ）のシステイン残基を含む。これらの実施形態において、（ａ）の機能遺伝子は、Ｂ細胞において、ＶＨセグメント、Ｄクラスター、およびＪセグメント間のＶＤＪ組換えから生じたものであり、から生じたものであり、Ｄクラスター内の各Ｄセグメントは、３０〜６０アミノ酸長さの範囲の異なる配列をコードし、少なくとも２つ（例えば、最大１０、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つ）のシステイン残基を含む。換言すれば、Ｄクラスター内のＤセグメントはすべて、互いに異なり、各Ｄセグメントは、長く、領域内のジスルフィド結合の結果として高度に折りたたまれると予想されるＣＤＲ３配列をコードする。ＶＤＪ組換え中に選択されたＤセグメントは大部分がランダムであるため、異なるＢ細胞が、ＶＤＪ組換え後に異なるＤセグメントを含むため、重鎖ＣＤＲ３配列は、この動物では多様化するべきである。例えば、いくつかの実施形態において、Ｄクラスター内に５０個のＤセグメントがある場合、Ｂ細胞は、体細胞超変異および／遺伝子変換がさらなる変異を行う前に、５０個の重鎖ＣＤＲ３コード配列を含むべきである。重鎖のＣＤＲ３は、いくつかの哺乳動物の成長因子、サイトカイン、およびいくつかの毒素に存在する、「システインノット」または「ノッティン」モチーフを有するべきである。古典的なノッティンは、３つのジスルフィド架橋を有する。天然ニワトリ抗体もまた、Ｈ３にジスルフィドを特徴とするが、通常はより短いＨ３にたった１つの架橋、場合によっては２つの架橋がある。ノットまたはノブを含む抗体は、例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｅｌｌ  １５３：１３７９−１３９３に記載されている。ウシ抗体は、一般に、現在のシステムで維持することができる「茎およびノブ」の構造を有する（例えば、Ｈａａｋｅｎｓｏｎ  Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１９  ９：１２６２およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  上記を参照されたい）。超長ＣＤＲ  Ｈ３領域を有するいくつかのウシ抗体Ｆａｂ断片の結晶構造が公開されている（例えば、Ｗａｎｇ���上記およびＳｔａｎｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１６：ａａｆ７９６２を参照されたい）。これらの抗体のＣＤＲ  Ｈ３領域が、１つのタイプＩβターン、１つの保存されたジスルフィド結合、および３つの逆平行β鎖を含むノブ領域を支持するβリボン茎からなる同じ一般構造を採用することが見出される。支持されているノブ領域は、抗体の他のＣＤＲ  Ｉによって生成される従来の抗原結合表面から遠く離れており、そのため、抗原を凹型エピトープと結合する可能性がある。
【００５６】
他の実施形態において、ニワトリの非Ｂ細胞は、（ａ）の機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子および（ｂ）の偽遺伝子を含む。これらの実施形態において、機能的免疫グロブリン重鎖は、ニワトリのすべての細胞において同じであり得る（ただし、Ｂ細胞においてのみ発現される）。これらの実施形態において、重鎖ＣＤＲ３領域は、体細胞超変異および／遺伝子変換によって多様化され得る。
【００５７】
偽遺伝子は、機能遺伝子の重鎖ＣＤＲ３コード配列を多様化してもしなくてもよい。そのため、いくつかの実施形態において、偽遺伝子は、（ａ）の重鎖可変ドメインのＣＤＲ３領域に対応する配列を含まない。これらの実施形態において、ＣＤＲ３コード配列は、体細胞超変異のみによって多様化され得る。他の実施形態において、偽遺伝子は、遺伝子変換により、（ａ）の重鎖可変ドメインのＣＤＲ３領域のコード配列を多様化する配列を含み得る。これらの実施形態において、遺伝子変換により、（ａ）の重鎖可変ドメインのＣＤＲ３領域のコード配列を多様化する偽遺伝子の配列は、３０〜６０アミノ酸長さの範囲内にあるアミノ酸配列をコードし、少なくとも２つ（例えば、最大１０、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つ）のシステイン残基を含む。換言すれば、偽遺伝子から機能的遺伝子に供与された配列はまた、長く、システインに富むコード配列も含み得る。
【００５８】
任意の実施形態において、機能的重鎖遺伝子によってコードされるＣＤＲ３は、３０〜６０アミノ酸長さの範囲であり、３〜１０のシステイン残基を含む。同様に、偽遺伝子は、３０〜６０アミノ酸長さの範囲内にあり、少なくとも３〜１０のシステイン残基を含むアミノ酸配列をコードし得る。これらの実施形態において、機能的Ｖ領域および偽遺伝子のＨＣ  ＣＤＲ３は、図１に示されるような「ノブおよび茎」構造を有するように設計され得、茎配列は、二次構造予測アルゴリズムを使用して予測され、ノブ配列は、偽遺伝子ごとに異なり得、各偽遺伝子において、ノブをコードする配列は多様であり、ノブ形成を促進するために複数のｃｙｓコドンを含む。多くの例では、配列は、４つ、６つ、８つ、または１０のシステインを有し得る。これらの実施形態において、機能的ＶによってコードされるＣＤＲ３領域は、上記のＷａｎｇの図Ｓ１に示される配列のうちのいずれかであり得、偽遺伝子によってコードされるＣＤＲ３領域は、上記のＷａｎｇの図Ｓ１に示される他のＣＤＲ３配列であり得る。
【００５９】
いくつかの実施形態において、（ａ）の重鎖可変ドメインは、自律型重鎖（ＡＨＣ）可変ドメインであり得る。上記のように、自律型重鎖（ＡＨＣ）可変ドメインを実装し得る多くの方法がある。１つの方法は、例えば、ヒト抗体のラクダ化によるものである。
【００６０】
ヒトおよびマウスからの典型的な「天然」抗体は、重鎖および軽鎖からなる。軽鎖がない場合、これらの抗体の重鎖は、適切に折りたたまれず、凝集する。「ラクダ化」とは、ＶＨドメイン（この用語はヒトおよびマウスＩｇＧからの結合ドメインのタイプを表す）が、それ自体で（すなわち、軽鎖なしで）エピトープに結合することができ、凝集しないように変更されるプロセスを指す。ラクダ科動物（例えば、ラクダ科動物、ラマ科など）は、単一のＮ末端ドメイン（ＶＨＨ）が完全に抗原結合することができる軽鎖を欠く機能的抗体を産生するため、「ラクダ科」という用語は、このプロセスの造語である。これらの自律型重鎖抗体は、高い安定性および溶解性を有する。サメおよび他の軟骨魚もまた、ＶＨＨ抗体を産生する。
【００６１】
従来のＶＨドメインと同様に、自律型重鎖抗体は、免疫グロブリンドメインのコア構造を形成する４つのフレームワーク領域（ＦＲ）と、抗原結合に関与する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。例えば、Ｃｏｎｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｕｐｏｎ  ｔｈｅ  ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｃａｍｅｌ  ＶＨＨ  ｉｎ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ−２  ｔｏ  ｍｉｍｉｃ  ａ  ＶＨ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２００５，３５０：１１２−２５を参照されたい。ヒトおよびラクダ科の可変ドメインの配列比較は、ラクダ科のプロセスにつながり、ヒトＶＨドメインへの凝集抵抗性のＶＨＨドメインのいくつかの特徴的な残基の転移が含まれる。例えば、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，‘Ｃａｍｅｌｉｓｉｎｇ’ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ：ＮＭＲ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ＶＨ  ｄｏｍａｉｎｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，１９９４，３３９：２８５−９０を参照されたい。例えば、ＶＨＨの特徴は、従来のＶＨドメインで保存され、ＶＬドメインを含む疎水性界面の形成に関与する４つのＦＲ２位置（位置３７、４４、４５、および４７；Ｋａｂａｔ番号付け）にアミノ酸置換の存在である。具体的には、ラクダ科動物のＦＲの配列およびヒトＶＨ３ファミリーの配列は、通常はＶＨドメインで高度に保存されている、ＦＲ２の３つの残基（４４、４５、および４７）を除いては、非常に類似していた。例えば、Ｃｏｎｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５を参照されたい。これらの溶媒曝露された残基（そのほとんどはラクダ科動物では親水性である）は、以前の軽鎖界面に位置し、ＶＬドメインとの会合を妨げる。軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の界面によるＶＨの非特異的結合は、フレームワーク２および４（Ｖａｌ３７Ｆ、Ｇ４４Ｅ、Ｌ４５Ｒ、Ｗ４７Ｇ、およびＷ１０３Ｒ）のアミノ酸変異によって防止された。Ｄａ  Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｍｅｌｉｚｅｄ  ｒａｂｂｉｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＶＨ  ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｖｉｆ  ｓｔｒｏｎｇｌｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ  ＨＩＶ−１  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００４  Ｊｕｌ  ９；３４０（３）：５２５−４２を参照されたい。ラクダ化のための他の戦略は、Ｔａｎｈａ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２００６  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｖ（Ｈ）ｓ  ｂｙ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｎｏｖ；１９（１１）：５０３−９およびＤａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｉｎｇｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｓ  ｓｍａｌｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｕｎｉｔｓ：ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｍｅｌｉｚｅｄ，ｈｕｍａｎ  ＶＨ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１９９６  Ｊｕｎ；９（６）：５３１−７を参照されたい。
【００６２】
ＶＨＨをヒト化するための類似の突然変異アプローチも試みられてきた。例えば、Ｃｏｎｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５を参照されたい。Ｖｉｎｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｌ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏ  ｈｕｍａｎｉｚｅ  ａ  ｃａｍｅｌｉｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｎａｎｏｂｏｄｙ  ｓｃａｆｆｏｌｄ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００９，２８４：３２７３−８４も参照されたい。ＶＨＨの親水性の増加は、主に、以前のＶＬ界面の前述の変更に依存するが、ＣＨ１ドメインと接触する従来のＶＨドメイン上にわずかに疎水性のパッチを形成する位置の一部のアミノ酸もまた、ＶＨＨの親水性残基に変更される。例えば、Ｌｅｓｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｂｏｗ  ｍｏｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｌｌ−ａｎｄ−ｓｏｃｋｅｔ  ｊｏｉｎｔ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８  Ｓｅｐ  ８，３３５（６１８６）：１８８−９０を参照されたい。Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ＶＨ  ｄｏｍａｉｎ  ｆｒｏｍ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｃａｍｅｌ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，１９９４  Ｓｅｐ，７（９）：１１２９−３５も参照されたい。
【００６３】
そのため、いくつかの実施形態において、任意のＶＨ抗体は、ＦＲ２の位置３７、４４、４５、および４７、ならびに任意に、ＦＲ４の位置１０３のうちの１つ以上で任意の疎水性残基のラクダ化アミノ酸置換を非疎水性残基（Ｋａｂａｔ番号付け）に作製することによってラクダ化され得る。ラクダ化アミノ酸置換は、非疎水性残基を有する１つ以上の位置での任意の疎水性残基グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、およびトリプトファン（Ｔｒｐ）の置換を含み得る。
【００６４】
重鎖のみの抗体は、自律的重鎖可変ドメインと呼ばれるもの、すなわち、自律的に凝集することなく、およびまたは関連する軽鎖なしに、折りたたまれて、抗原に自律的に結合することができる、重鎖可変ドメインを有する。自律型重鎖可変ドメインを含む抗体を産生するための戦略は、例えば、Ｊａｎｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００６  １０３：１５１３０−５）、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６  ２６：３７７−９０）、Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５  １７５：３７６９−７９）、およびＮｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００３  １０９：９３−１０１）において概説される。
【００６５】
いくつかの実施形態において、（ａ）の自律型重鎖可変ドメインは、３０〜６０アミノ酸長さであり、少なくとも２つ（例えば、最大１０、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つ）のシステイン残基を含むＣＤＲ３を有するラクダ化ヒト重鎖可変ドメインである。この可変ドメインは、ラクダ化ヒトモノクローナル抗体のものであり得、例えば、その多くは当該技術分野で周知である。他の実施形態において、（ａ）の自律型重鎖可変ドメインは、ヒト生殖系列重鎖Ｖセグメント、３０〜６０アミノ酸長さの範囲のアミノ酸配列をコードし、少なくとも２つ（例えば、最大１０、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つ）のシステイン残基を含むＤセグメント、およびヒトＪセグメントによってコードされ、当該可変ドメインは、最大１０のラクダ化アミノ酸置換を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態において、（ｂ）の偽遺伝子は、（任意のＤセグメントを除く）ヒト生殖系列抗体配列をコードする。いくつかの実施形態において、偽遺伝子は、６００ヌクレオチド未満の長さ、例えば、３００〜６００ヌクレオチドの長さである。
【００６７】
いくつかの実施形態において、（ｂ）の偽遺伝子において、ＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３、ならびに、存在する場合、任意にＦＲ４をコードする配列が、組み合わされて、（ａ）の可変ドメイン内の対応するＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３、ならびに任意にＦＲ４をコードする組み合わされた配列と少なくとも９０％同一である。偽遺伝子における各個々のＦＲについて、配列同一性のレベルは、多くの場合、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％または少なくとも９５％であり得る。いくつかの実施形態において、（ｂ）の偽遺伝子においてＣＤＲをコードする配列は、（ａ）の可変ドメインにおいて対応するＣＤＲをコードする配列と９０％以下同一である。換言すれば、いくつかの実施形態において、偽遺伝子によってコードされるＦＷ配列と比較して、偽遺伝子によってコードされるＣＤＲにはより多様性があり得る。
【００６８】
任意の実施形態において、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、ＣＨ１欠失を含む重鎖をコードし得る。これらの実施形態において、動物のゲノムはまた、ノックアウトされた軽鎖免疫グロブリン遺伝子も含み得る。あるいは、動物のゲノムは、定常領域を含むが可変領域を含まない短縮型軽鎖をコードする軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含み得る。
【００６９】
任意の実施形態において、トランスジェニックニワトリは、その遺伝子座についてホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。
【００７０】
（ａ）トランスジェニック動物を抗原で免疫化することと、（ｂ）当該動物から、抗原に特異的に結合する抗体を得ることと、を含む方法も、提供される。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。これらの実施形態において、本方法は、（ｃ）トランスジェニック動物のＢ細胞を使用してハイブリドーマを作製することと、（ｄ）当該ハイブリドーマをスクリーニングして、抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを同定することと、をさらに含み得る。あるいは、本方法は、（ｃ）ハイブリドーマを作製せずにＢ細胞をスクリーニングして、抗原に特異的に結合する抗体を産生するＢ細胞を同定することを含み得る。任意のスクリーニング方法において、本方法は、ＰＣＲを使用して、トランスジェニック動物のＢ細胞から少なくとも重鎖可変領域をコードする核酸を増幅することと、当該増幅された核酸を使用して組換え抗体を発現させることと、を含み得る。
【００７１】
トランスジェニック動物によって産生されるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体も提供され、抗体は多様な毒素様ＨＣ  ＣＤＲ３を有し、いくつかの実施形態において、自律型重鎖（ＡＨＣ）可変ドメイン抗体であり得る。
【００７２】
動物から単離されたＢ細胞も提供される。
【００７３】
トランスジェニック動物は、発現されて（すなわち、転写されて、その後翻訳されるｍＲＮＡを産生する）、抗体の重鎖を産生し、機能的重鎖遺伝子（この場合、これはニワトリであり、他の多くの種がそのすぐ上流にある）に作動可能に連結されている機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子と、複数の異なる偽遺伝子重鎖可変領域と、を含み、偽遺伝子の可変領域は、遺伝子変換によって（すなわち、機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域の配列を偽遺伝子可変領域の配列で置換することによって）機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子の配列を変化させるという点で、機能的免疫グロブリン重鎖に作動可能に連結されている。トランスジェニック動物では、機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域と偽遺伝子可変領域との間の遺伝子変換は、機能的免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域の配列を、可変領域の全長までわずか単一のコドンだけ変更する。ある特定の場合では、偽遺伝子可変領域は、偽遺伝子可変領域から少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）の配列を機能的遺伝子の可変領域に供与し得る。したがって、トランスジェニック動物によって産生された抗体の重鎖は、偽遺伝子可変領域から機能的重鎖遺伝子の可変領域に供与される任意の配列によってコードされている。異なる配列が動物の異なる細胞に供与されるため、動物の抗体レパートリーは、どの配列が偽遺伝子可変領域から機能的遺伝子の可変領域に供与されるかによって決定される。
【００７４】
いくつかの実施形態において、ヒト機能的遺伝子および偽遺伝子のフレームワークセグメントは、互いに同一またはほぼ同一であり得るが、機能的遺伝子および偽遺伝子のＣＤＲセグメントは異なり得、それにより、遺伝子変換が、偽遺伝子と生殖細胞系列配列のＣＤＲセグメント間で起こり得る。さらに、ＣＤＲは、長さが異なり得る。ある特定の実施形態において、重鎖ＣＤＲ１は、６〜１２アミノ酸残基長さの範囲にあり得、重鎖ＣＤＲ２は、４〜１２アミノ酸残基長さの範囲にあり得、重鎖ＣＤＲ３は、３０〜６０アミノ酸残基長さの範囲にあり得るが、これらの範囲外の長さのＣＤＲを有する抗体が想定されている。
【００７５】
いくつかの実施形態において、導入された転写可変領域のヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列はヒトであり得、すなわち、ヒト抗体のヌクレオチドおよび／もしくはアミノ酸配列、または生殖系列配列を含有し得る。これらの実施形態において、ＣＤＲおよびフレームワークの両方がヒトであり得る。他の実施形態において、導入された転写可変領域のヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列はヒトではなく、代わりに、ヒト配列と少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％以上同一であり得る。例えば、ヒト配列と比較して、導入された転写可変領域は、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸置換を含有し得る。任意の生殖系列ヒトＶＨセグメントは、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−３、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−８、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−５、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ３−９、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−４、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、およびＶＨ７−８１の配列から選択され得る。異なる生殖細胞系列配列の説明については、ＰＣＴＷＯ２００５／００５６０４を参照されたい。
【００７６】
いくつかの実施形態において、定常領域を含む重鎖遺伝子座の一部、イントロン領域の一部、および３’ＵＴＲは、動物に対して内因性であり得、機能的遺伝子の可変ドメインを含む重鎖遺伝子座の残り、イントロンの残り、および偽遺伝子は、動物に対して外因性であり得、すなわち、組換え的に作製され、機能的遺伝子が産生され、偽遺伝子が遺伝子変換によって機能的遺伝子に配列を供与することができるような方法で定常ドメイン、部分イントロン、および３’ＵＴＲの近位で動物に導入され得る。ある特定の場合では、動物の重鎖遺伝子座は、作動可能な連結において、イントロン領域と、定常ドメインをコードする領域と、３’非翻訳領域と（イントロン領域、定常ドメインをコードする領域、および３’非翻訳領域は、トランスジェニック動物のゲノムに対して内因性である）、複数の偽遺伝子重鎖可変領域とを含有し得、複数の偽遺伝子重鎖可変領域は、トランスジェニック動物のゲノムに対して外因性である。
【００７７】
ある特定の実施形態において、対象のトランスジェニック動物によって産生された抗体は、内因性定常ドメインおよび動物に対して外因性である可変ドメインを含有し得る。これらの実施形態において、内因性定常領域が用いられ得るため、抗体は依然としてクラススイッチおよび親和性成熟を受け得、これによって動物は、正常な免疫系の発達を受け、正常な免疫応答を開始することができる。特定の実施形態において、トランスジェニックニワトリは、ＩｇＭ、ＩｇＹ、およびＩｇＡをコードする重鎖遺伝子座に３つの内因性定常領域を有する。Ｂ細胞の発達の初期段階では、Ｂ細胞は、ＩｇＭを発現する。親和性成熟が進むにつれて、クラススイッチは、定常領域をＩｇＹまたはＩｇＡに変換する。ＩｇＹは、卵黄に沈着した予備を介して約２００ｍｇのＩｇＹを受け取る成体および初生ヒヨコの両方に体液性免疫を提供する。ＩｇＡは、主にリンパ組織（例えば、脾臓、パイエル板、およびハーダー腺）および卵管に見られる。
【００７８】
軽鎖および／または重鎖遺伝子座に存在する導入された偽遺伝子可変領域の数は変動し得、特定の実施形態において、１〜５０個、例えば、２〜５０個、または１０〜２５個の範囲であり得る。特定の実施形態において、複数の偽遺伝子軽鎖可変領域のうちの少なくとも１個（例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも１０個以上）は、転写された軽鎖可変領域に対して逆配向であり得る。同様に、特定の実施形態において、複数の偽遺伝子重鎖可変領域のうちの少なくとも１個（例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも１０個以上）は、重鎖の転写された可変領域に対して逆配向であり得る。特定の実施形態において、複数の偽遺伝子可変領域は交互の配向ではなく、ある特定の場合には、転写された可変領域に対して反対配向である一連の少なくとも５個または少なくとも１０個の隣接する偽遺伝子領域を含有し得る。一実施形態において、転写された可変領域から最も遠位にある偽遺伝子領域は、転写された可変領域と同じ配向にあり、最も遠位の領域と転写された可変領域との間の偽遺伝子領域は、転写可変領域に対して逆配向にある。
【００７９】
偽遺伝子は、典型的には、転写領域の配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、または少なくとも３００の連続するヌクレオチドの配列を含有する。いくつかの実施形態において、偽遺伝子におけるフレームワーク配列は、機能的遺伝子における対応するフレームワーク配列と少なくとも９０％同一であり、ＣＤＲは、より少ない配列同一性を有する。
【００８０】
上記のトランスジェニック動物は、動物のゲノムを組換え改変することによって作製され得る。トランスジェニック動物、例えば、マウスおよびニワトリなどを産生するための方法は知られており、特に、遺伝子変換を使用する動物のゲノムを改変するための方法がまた知られており（例えば、Ｓａｙｅｇｈ，Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１９９９  ７２：３１−７およびＫａｍｉｈｉｒａ，Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４  ９１：１７１−８９（トリの場合）、ならびにＢｏｓｚｅ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．２００３  １２：５４１−５３およびＦａｎ，Ｐａｔｈｏｌ．Ｉｎｔ．１９９９  ４９：５８３−９４（ウサギの場合）、ならびにＳａｌａｍｏｎｅ  Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６  １２４：４６９−７２（ウシの場合）を参照されたい）、同じくこれらの種の多くの生殖系列免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の構造および／または配列も知られており（例えば、Ｂｕｔｌｅｒ  Ｒｅｖ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈ  １９９８  １７：４３−７０およびＲａｔｃｌｉｆｆｅ  Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００６  ３０：１０１−１１８）、上記の動物は、本開示で供与される通常の方法によって作製され得る。トランスジェニックニワトリを作製するための方法が知られている。例えば、８，５９２，６４４、ＵＳ８，８８９，６６２、Ｃｏｌｌａｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ（Ｐｏｕｌｔ  Ｓｃｉ．２０１５  ９４：７９９−８０３）、ｖａｎ  ｄｅ  Ｌａｖｏｉｒ（Ｎａｔｕｒｅ．２００６  ４４１：７６６−９）、およびＳｃｈｕｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１３  １１０：２０１７０−５を参照されたい。
【００８１】
自律型重鎖（ＡＨＣ）可変ドメインを含む抗体を産生するための方法も、提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、上記のようにトランスジェニック動物を抗原で免疫化することを含み得、抗体がポリクローナルである場合、本方法は、動物の出血からの抗体を単離することを含み得る。動物が共通軽鎖配列についてホモ接合である場合、ポリクローナル抗血清中の抗体のすべては、自律型重鎖（ＡＨＣ）可変ドメイン抗体であるはずである。モノクローナル抗体が所望される場合、本方法は、ｂ）免疫化されたトランスジェニック動物の細胞を使用してハイブリドーマを作製することと、ｃ）ハイブリドーマをスクリーニングして、抗原特異性ハイブリドーマを同定することと、ｄ）抗原特異性ハイブリドーマから抗原特異性抗体を単離することと、を含み得る。あるいは、Ｂ細胞をスクリーニングすることもできる。
【００８２】
ある特定の実施形態において、動物は、ＧＤ２、ＥＧＦ−Ｒ、ＣＥＡ、ＣＤ５２、ＣＤ２０、Ｌｙｍ−１、ＣＤ６、補体活性化受容体（ＣＡＲ）、ＥＧＰ４０、ＶＥＧＦ、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２  ＡＦＰ（アルファ−胎児性タンパク質）、ＢＬｙＳ（ＴＮＦおよびＡＰＯＬ−関連リガンド）、ＣＡ１２５（癌抗原１２５）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＣＤ２（Ｔ細胞表面抗原）、ＣＤ３（ＴＣＲに関連するヘテロ多量体）、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ（インテグリンアルファ−Ｌ）、ＣＤ１４（単球分化抗原））、ＣＤ２０、ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体）、ＣＤ２３（低親和性ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体アルファ鎖）、ＣＤ３０（サイトカイン受容体）、ＣＤ３３（骨髄細胞表面抗原）、ＣＤ４０（腫瘍壊死因子受容体））、ＣＤ４４ｖ６（白血球の接着を仲介する）、ＣＤ５２（ＣＡＭＰＡＴＨ−１）、ＣＤ８０（ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の共刺激因子）、補体構成成分Ｃ５、ＣＴＬＡ、ＥＧＦＲ、エオタキシン（サイトカインＡ１１）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＲ１０、ＨＬＡ  ＣｌａｓｓＩＩ、ＩｇＥ、ＧＰｉｉｂ／ｉｉｉａ（インテグリン）、インテグリンａＶβ３、インテグリンａ４β１およびａ４β７、インテグリンβ２、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６Ｒ（ＩＬ６受容体）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）、ルイス、メソセリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１８、ＮＣＡＭ（神経細胞接着分子）、癌胎児性フィブロネクチン、ＰＤＧＦβＲ（ベータ血小板由来成長因子受容体）、ＰＭＳＡ、腎癌抗原Ｇ２５０、ＲＳＶ、Ｅ−セレクチン、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＮＦα、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ６、ＶＡＰ−１（血管接着タンパク質１）、またはＶＥＧＦなどで免疫化されて、療法用抗体が産生され得る。
【００８３】
抗原は、アジュバントの有無にかかわらず、任意の便利な方法でトランスジェニック宿主動物に投与され得、所定のスケジュールに従って投与され得る。
【００８４】
免疫化後、免疫化されたトランスジェニック動物からの血清または乳汁は、抗原に特異的な医薬品グレードのポリクローナル抗体の精製のために分画され得る。トランスジェニックトリの場合、抗体は、卵黄を分画することによって作製され得る。濃縮された精製免疫グロブリン画分は、クロマトグラフィー（親和性、イオン交換、ゲル濾過など）、硫酸アンモニウムなどの塩、エタノールなどの有機溶媒、またはポリエチレングリコールなどのポリマーによる選択的沈殿によって得ることができる。
【００８５】
モノクローナル抗体を作製するために、抗体産生細胞、例えば、脾臓細胞が、免疫化されたトランスジェニック動物から単離され、ハイブリドーマの産生のために形質転換細胞株との細胞融合に使用され得るか、または抗体をコードするｃＤＮＡが、標準的な分子生物学技術によってクローン化され、トランスフェクトされた細胞で発現され得る。モノクローナル抗体を作製するための手順は、当技術分野で十分に確立されている。例えば、欧州特許出願第０  ５８３  ９８０  Ａ１号、米国特許第４，９７７，０８１号、ＷＯ９７／１６５３７、およびＥＰ０４９１  ０５７  Ｂ１を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。クローン化されたｃＤＮＡ分子からのモノクローナル抗体のインビトロ産生は、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４２：１５９（２０００）、およびＢｕｒｔｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：８７（１９９５）によって記載されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８６】
抗体がまだヒトフレームワーク領域を含有しない場合、本方法は、抗体をヒト化することをさらに含み得、本方法は、抗体の定常ドメインをヒト定常ドメインと交換して、キメラ抗体を作製すること、ならびにある特定の場合には、例えば、ＣＤＲグラフト化またはリサーフェシングなどによって抗体の可変ドメインをヒト化することを含み得る。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒ（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８））、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、米国特許第５，７２３，３２３号、同第５，９７６，８６２号、同第５，８２４，５１４号、同第５，８１７，４８３号、同第５，８１４，４７６号、同第５，７６３，１９２号、同第５，７２３，３２３号、同第５，７６６，８８６号、同第５，７１４，３５２号、同第６，２０４，０２３号、同第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，２２５，５３９号、同第４，８１６，５６７号、ＰＣＴ／：ＵＳ９８／１６２８０、ＵＳ９６／１８９７８、ＵＳ９１／０９６３０、ＵＳ９１／０５９３９、ＵＳ９４／０１２３４、ＧＢ８９／０１３３４、ＧＢ９１／０１１３４、ＧＢ９２／０１７５５、ＷＯ９０／１４４４３、ＷＯ９０／１４４２４、ＷＯ９０／１４４３０、ＥＰ２２９２４６の方法に従って行われ得、各々は、そこに引用されている参考文献を含めて参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【００８７】
そのため、トランスジェニック動物に加えて、トランスジェニック動物を抗原で免疫化することと、トランスジェニック動物から抗原に特異的に結合する抗体を得ることと、を含む方法も提供される。本方法は、トランスジェニック動物の細胞を使用してハイブリドーマを作製することと、ハイブリドーマをスクリーニングして、抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを同定することと、を含み得る。あるいは、Ｂ細胞は、ハイブリドーマを作製せずにスクリーニングされ得る。
【００８８】
抗体の重鎖可変ドメインは、動物の免疫系によって「自然に」作製される。そのような抗体は、ある特定の場合には、宿主細胞によって翻訳後改変（例えば、グリコシル化）され得、トランスジェニック動物の種に特徴的なグリコシル化パターンおよび組成を有し得る。
【００８９】
上記のトランスジェニック動物のいずれかによって産生された抗体の抗原特異性結合領域の配列は、所望される場合、重鎖可変ドメインの多様な集団のコード配列のすべてまたはいずれかがＰＣＲプライマーの単一の対を使用してｃＤＮＡから増幅され得るため、比較的簡単に得られるはずである。各抗体の特異性および親和性は、重鎖可変ドメインのアミノ酸配列によってのみ決定されるべきであるため、同族の軽鎖を同定または配列決定する必要はない。そのため、抗原特異性重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、比較的簡単に得られるはずである。上記のように、場合によっては、抗原特異性重鎖を発現する細胞を選択するために、Ｂ細胞またはハイブリドーマを機能的にスクリーニングすることができる。重鎖可変ドメインコード配列は、Ｂ細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の濃縮または非濃縮集団からまとめて増幅され得る。配列がＢ細胞の非濃縮集団から増幅される場合、抗原特異性可変ドメインをコードする配列は、抗原特異性でない配列よりも高度に発現され（Ｂ細胞の活性化のため）、かつより可変的なクレードに潜在的に属するため、識別可能であるはずである。さらに、これらの重鎖は結合のために特定の軽鎖を必要としないため、フォローアップ作業を実行する前に、どの軽鎖がどの重鎖と対であるかを決定する必要はない。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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