(57)【要約】  目的ポリペプチドおよび免疫グロブリンのヒンジ領域を含む融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドを含む薬学的組成物、および免疫グロブリンのヒンジ領域を融合させる段階を含む目的ポリペプチドの生体持続期間を増加させる方法に関する。
2021535746.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質、および
前記目的タンパク質のＮ−末端、Ｃ−末端、または両末端ともに結合した、計１〜１０個のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域
を含み、
前記１〜１０個のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域は、それぞれＯ−グリコシル化可能なアミノ酸残基を３〜１０個含むポリペプチドである、融合ポリペプチド。
【請求項２】
下記の式で表現される、請求項１に記載の融合ポリペプチド：
Ｎ’−（Ｚ）ｎ−Ｙ−（Ｚ）ｍ−Ｃ’
上記式中、
Ｎ’は、融合ポリペプチドのＮ−末端であり、Ｃ’は、融合ポリペプチドのＣ−末端であり、
Ｙは、目的ポリペプチドであり、
Ｚは、Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域であり、
ｎは、目的ポリペプチドのＮ−末端に結合したＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域の個数であって、０〜１０の整数であり、
ｍは、目的ポリペプチドのＣ−末端に結合したＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域の個数であって、０〜１０の整数であり、
ｎとｍは、同時に０ではなく、
ｎ＋ｍは、融合ポリペプチドに含まれているＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域の総個数であって、１〜１０の整数である。
【請求項３】
前記１〜１０個のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域は、１〜１０個の免疫グロブリンのヒンジ領域または配列番号２３〜１１３のタンパク質中のＯ−グリコシル化可能なアミノ酸残基を３〜１０個含む連続する１０個以上のアミノ酸を含むポリペプチド領域である、請求項１または２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記１〜１０個の免疫グロブリンのヒンジ領域は、それぞれ独立して、免疫グロブリンＤ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｄ；ＩｇＤ）のヒンジ領域および免疫グロブリンＡ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ；ＩｇＡ）のヒンジ領域からなる群より選択されたものである、請求項３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記１〜１０個の免疫グロブリンのヒンジ領域は、それぞれ独立して、以下からなる群より選択されたものである、請求項３または４に記載の融合ポリペプチド：
（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号１のアミノ酸配列中、Ｏ−グリコシル化残基を３個〜７個含む連続する５個以上のアミノ酸を含むポリペプチド、
（３）ＩｇＤ中、前記（１）または（２）のポリペプチドを含む連続する３４個以上のアミノ酸を含むポリペプチド、
（４）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（５）配列番号２のアミノ酸配列中、Ｏ−グリコシル化残基を３個〜８個含む連続する８個以上のアミノ酸を含むポリペプチド、および
（６）ＩｇＡ中、前記（４）または（５）のポリペプチドを含む連続する１９個以上のアミノ酸を含むポリペプチド。
【請求項６】
前記１〜１０個の免疫グロブリンのヒンジ領域は、それぞれ独立して、以下からなる群より選択されたものである、請求項３または４に記載の融合ポリペプチド：
（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号１のアミノ酸配列中、配列番号９を含む連続する５個以上のアミノ酸または配列番号１０を含む連続する７個以上のアミノ酸を含むポリペプチド、
（３）ＩｇＤ中、前記（１）または（２）のポリペプチドを含む連続する３４個以上のアミノ酸を含むポリペプチド、
（４）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（５）配列番号２のアミノ酸配列中、配列番号１２を含む連続する８個以上のアミノ酸を含むポリペプチド、および
（６）ＩｇＡ中、前記（４）または（５）のポリペプチドを含む連続する１９個以上のアミノ酸を含むポリペプチド。
【請求項７】
前記融合ポリペプチド内のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域と結合した目的ポリペプチドは、Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域と結合しない目的ポリペプチドと比較して、体内半減期が１．５倍以上増加したものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えベクターを含む組換え細胞。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換え細胞を培養する段階を含む、目的ポリペプチドおよびＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドの製造方法。
【請求項１２】
生体外で、計１〜１０個のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域を、目的ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端ともに連結させる段階を含み、
前記１〜１０個のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域は、それぞれＯ−グリコシル化可能なアミノ酸残基を３〜１０個含むポリペプチドである、
目的ポリペプチドの体内安定性増進方法。
【請求項１３】
前記１〜１０個のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域は、１〜１０個の免疫グロブリンのヒンジ領域または配列番号２３〜１１３のタンパク質中のＯ−グリコシル化残基を３〜１０個含む連続する１０個以上のアミノ酸を含むポリペプチド領域である、請求項１２に記載の目的ポリペプチドの体内安定性増進方法。
【請求項１４】
前記１〜１０個の免疫グロブリンのヒンジ領域は、それぞれ独立して、免疫グロブリンＤ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｄ；ＩｇＤ）のヒンジ領域および免疫グロブリンＡ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ；ＩｇＡ）のヒンジ領域からなる群より選択されたものである、請求項１３に記載の目的ポリペプチドの体内安定性増進方法。
【請求項１５】
前記１〜１０個の免疫グロブリンのヒンジ領域は、それぞれ独立して、以下からなる群より選択されたものである、請求項１３または１４に記載の目的ポリペプチドの体内安定性増進方法：
（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号１のアミノ酸配列中、Ｏ−グリコシル化残基を３個〜７個含む連続する５個以上のアミノ酸を含むポリペプチド、
（３）ＩｇＤ中、前記（１）または（２）のポリペプチドを含む連続する３４個以上のアミノ酸を含むポリペプチド、
（４）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（５）配列番号２のアミノ酸配列中、Ｏ−グリコシル化残基を３個〜８個含む連続する８個以上のアミノ酸を含むポリペプチド、および
（６）ＩｇＡ中、前記（４）または（５）のポリペプチドを含む連続する１９個以上のアミノ酸を含むポリペプチド。
【請求項１６】
前記１〜１０個の免疫グロブリンのヒンジ領域は、それぞれ独立して、以下からなる群より選択されたものである、請求項１３または１４に記載の目的ポリペプチドの体内安定性増進方法：
（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号１のアミノ酸配列中、配列番号９を含む連続する５個以上のアミノ酸または配列番号１０を含む連続する７個以上のアミノ酸を含むポリペプチド、
（３）ＩｇＤ中、前記（１）または（２）のポリペプチドを含む連続する３４個以上のアミノ酸を含むポリペプチド、
（４）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（５）配列番号２のアミノ酸配列中、配列番号１２を含む連続する８個以上のアミノ酸を含むポリペプチド、および
（６）ＩｇＡ中、前記（４）または（５）のポリペプチドを含む連続する１９個以上のアミノ酸を含むポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドを含む、目的ポリペプチドの欠乏または機能異常に関連する疾病の予防または治療用薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
目的ポリペプチドおよびＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域を含む融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドを含む薬学的組成物、およびＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域を融合させる段階を含む目的ポリペプチドの生体持続期間を増加させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質またはペプチド薬物のほとんどは体内で活性が維持される期間が短く、静脈投与以外の方法での投与時には吸収率が低く、長期間薬物を投与する治療が必要な場合に、これらの薬物を繰り返し短い投与間隔で注射し続けなければならないという不都合があった。このような不都合を解消するために、１回投与で薬物を持続的に放出させる技術の開発が要求される。このような要求に応えるための一環として、持続的放出のための徐放性剤形が開発されている。
【０００３】
例えば、タンパク質またはペプチド薬物を生分解性高分子マトリックスで囲む形態の微細粒子を製造して、その投与時に、マトリックス物質が体内で徐々に分解して除去されながら薬物が徐々に放出されるようにする徐放性剤形に関する研究が活発に行われている。
【０００４】
例えば、米国特許第５，４１６，０１７号には、ヒアルロン酸の濃度が０．０１〜３％のゲルを用いた赤血球形成刺激因子（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）の徐放性注射剤が、日本国特開平１−２８７０４１号には、インスリンをヒアルロン酸の濃度が１％のゲルに含有させた徐放性注射剤、日本国特開平２−２１３号には、カルシトニン、エルカトニン、またはヒト目的ポリペプチドを５％濃度のヒアルロン酸に含有させた徐放性剤形が記載されている。このような剤形において、ヒアルロン酸ゲル内に溶解しているタンパク質薬物は粘度の大きいゲルマトリックスを遅い速度で通過するので、持続的な放出効果を示し得るが、高い粘度によって注射で投与することが容易でなく、注射後に体液によって簡単にゲルが希釈または分解して薬物の放出が１日以上持続しにくいという欠点がある。
【０００５】
一方、疎水性を有するヒアルロン酸誘導体（例えば、ヒアルロン酸−ベンジルエステル）を用いて、エマルジョン溶媒抽出法で固体状の微細粒子を製造した例がある（Ｎ．Ｓ．Ｎｉｇｈｔｌｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２２ｎｄ，Ｐａｐｅｒ  Ｎｏ．３２０５（１９９５）；Ｌ．Ｉｌｕｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌ．，２９，１３３（１９９４））。疎水性ヒアルロン酸誘導体を用いた薬物放出剤形粒子の製造時に有機溶媒を使用しなければならないため、タンパク質薬物が有機溶媒と接触して変性する恐れがあり、ヒアルロン酸誘導体の疎水性によりタンパク質が変性する可能性が高い。
【０００６】
したがって、タンパク質またはペプチド薬物の体内持続性を改善するために、既存の研究とは異なる側面へのアプローチが要求される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，４１６，０１７号
【特許文献２】特開平１−２８７０４１号
【特許文献３】特開平２−２１３号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｎ．Ｓ．Ｎｉｇｈｔｌｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２２ｎｄ，Ｐａｐｅｒ  Ｎｏ．３２０５（１９９５）
【非特許文献２】Ｌ．Ｉｌｕｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌ．，２９，１３３（１９９４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本明細書において、Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド（例えば、免疫グロブリンのヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）など）を目的ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）に連結させて融合ポリペプチドを形成することによって、Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域と融合しない場合と比較して、目的ポリペプチドの体内半減期を増加させて体内持続期間を増進させ、これによって投与間隔を増加させる技術が提供される。
【００１０】
一例は、目的ポリペプチドとＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域とを含む融合ポリペプチドを提供する。
【００１１】
前記融合ポリペプチドにおいて、前記Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域は、前記目的ポリペプチドのＮ−末端、Ｃ−末端、または両末端ともに含まれる。
【００１２】
前記融合ポリペプチドに含まれているＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域の総個数は、１個以上、例えば、１個〜１０個、１個〜８個、１個〜６個、１個〜４個、２個〜１０個、２個〜８個、２個〜６個、２個〜４個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個）であってもよい。
【００１３】
一例において、前記融合ポリペプチドは、下記の一般式で表現される：
Ｎ’−（Ｚ）ｎ−Ｙ−（Ｚ）ｍ−Ｃ’       ［一般式］
上記式中、
Ｎ’は、融合ポリペプチドのＮ−末端であり、Ｃ’は、融合ポリペプチドのＣ−末端であり、
Ｙは、目的ポリペプチドであり、
Ｚは、Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域であり、
ｎは、融合ポリペプチドのＮ−末端に位置する（目的ポリペプチドのＮ−末端に結合した）Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域の個数であって、０〜１０（つまり、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）、０〜７、０〜５、１〜１０、１〜７、１〜５、または１〜３の整数であり、
ｍは、融合ポリペプチドのＣ−末端に位置する（目的ポリペプチドのＣ−末端に結合した）Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域の個数であって、０〜１０（つまり、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）、０〜７、０〜５、１〜１０、１〜７、１〜５、または１〜３の整数であり、
ｎおよびｍのうちの１つ以上は、０ではなく、
ｎ＋ｍは、融合ポリペプチドに含まれているＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域の総個数であって、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４、２〜１０、２〜８、２〜６、または２〜４の整数である。
【００１４】
前記融合ポリペプチドに含まれているｎ＋ｍ個のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域は、それぞれ独立して、Ｏ−グリコシル化可能なアミノ酸残基を含むポリペプチド部位の中から選択される。例えば、前記Ｏ−グリコシル化可能なアミノ酸残基を含むポリペプチド部位は、免疫グロブリンのヒンジ領域であってもよい。一例において、前記Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域は、それぞれ独立して、免疫グロブリンＤ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｄ；ＩｇＤ）のヒンジ領域および免疫グロブリンＡ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ；ＩｇＡ、例えばＩｇＡ１）のヒンジ領域からなる群より選択される（つまり、ｎ＋ｍ個の免疫グロブリンのヒンジ領域は、互いに同一でも異なっていてもよい）。
【００１５】
前記融合ポリペプチドにおいて、Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域と融合した目的ポリペプチドは、Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域が融合しない目的ポリペプチドと比較して、体内（または血中）安定性（持続期間）が増加したことを特徴とする（例えば、体内または血中半減期増加）。
【００１６】
他の例は、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００１７】
他の例は、前記核酸分子を含む組換えベクターを提供する。
【００１８】
他の例は、前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。
【００１９】
他の例は、前記組換えベクターを細胞で発現させる段階を含む、体内（または血中）半減期が増加した目的ポリペプチドの製造方法、または前記体内（または血中）半減期が増加した目的ポリペプチドを含む融合ポリペプチドの製造方法を提供する。
【００２０】
他の例は、目的ポリペプチドとＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域とを融合（または連結または結合）させる段階を含む目的ポリペプチドの生体持続期間を増加させる方法、または目的ポリペプチド（タンパク質またはペプチド）薬物の体内（または血中）安定性増進および／または体内（または血中）半減期増加方法を提供する。一具体例において、前記融合させる段階は、目的ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端に１つ以上のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域を、リンカーを介するか、介することなく融合（または連結または結合）させる段階を含むことができる。前記融合（または連結または結合）させる段階は、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で進行するものであってもよい。
【００２１】
他の例は、前記融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択された１種以上を含む薬学的組成物を提供する。
【００２２】
他の例は、前記融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択された１種以上を用いて薬学的組成物を製造する方法を提供する。
【００２３】
他の例は、前記融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択された１種以上を含む薬学的組成物の製造に用いるための用途を提供する。
【００２４】
他の例は、Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域の目的ポリペプチド（タンパク質またはペプチド）薬物の体内（または血中）安定性増進および／または体内（または血中）半減期増加用途を提供する。具体的には、一例は、Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域を含む目的ポリペプチド（タンパク質またはペプチド）薬物の体内（または血中）安定性増進および／または体内（または血中）半減期増加用組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本明細書では、目的ポリペプチドに免疫グロブリンのヒンジ領域のようなＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域を融合させた融合ポリペプチド形態で提供することによって、目的ポリペプチドの体内適用時に体内（または血中）安定性および／または体内（または血中）持続期間を増進させ、投与間隔を増加させることができる技術を提供する。
【００２６】
一例は、目的ポリペプチドとＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域とを含む融合ポリペプチドを提供する。
【００２７】
前記融合ポリペプチドにおいて、前記Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域は、前記目的ポリペプチドのＮ−末端、Ｃ−末端、または両末端ともに含まれる。
【００２８】
前記融合ポリペプチドに含まれているＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域の総個数は、１個以上、例えば、１個〜１０個、１個〜８個、１個〜６個、１個〜４個、２個〜１０個、２個〜８個、２個〜６個、２個〜４個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個）であってもよい。
【００２９】
一例において、前記融合ポリペプチドは、下記の一般式で表現される：
Ｎ’−（Ｚ）ｎ−Ｙ−（Ｚ）ｍ−Ｃ’       ［一般式］
上記式中、
Ｎ’は、融合ポリペプチドのＮ−末端であり、Ｃ’は、融合ポリペプチドのＣ−末端であり、
Ｙは、目的ポリペプチドであり、
Ｚは、Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域であり、
ｎは、融合ポリペプチドのＮ−末端に位置する（目的ポリペプチドのＮ−末端に結合した）Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域の個数であって、０〜１０（つまり、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）、０〜７、０〜５、１〜１０、１〜７、１〜５、または１〜３の整数であり、
ｍは、融合ポリペプチドのＣ−末端に位置する（目的ポリペプチドのＣ−末端に結合した）Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域の個数であって、０〜１０（つまり、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）、０〜７、０〜５、１〜１０、１〜７、１〜５、または１〜３の整数であり、
ｎおよびｍのうちの１つ以上は、０ではなく（例、ｎが０の場合、ｍは０ではなく、ｍが０の場合、ｎは０ではない）、
ｎ＋ｍは、融合ポリペプチドに含まれているＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域の総個数であって、１〜１０（つまり、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）、１〜８、１〜６、１〜４、２〜１０、２〜８、２〜６、または２〜４の整数である。
【００３０】
一例において、目的ポリペプチドの活性部位がＮ−末端に位置する場合、前記Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域は、Ｃ−末端に融合してもよく（つまり、ｎは０であり、ｍは０ではない）、活性部位がＣ−末端に位置する場合、Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域は、Ｎ−末端に融合してもよい（つまり、ｎは０ではなく、ｍは０である）。
【００３１】
前記融合ポリペプチドに含まれているｎ＋ｍ個のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域は、それぞれ独立して、Ｏ−グリコシル化可能なアミノ酸残基を含むポリペプチドの中から選択される。例えば、前記Ｏ−グリコシル化可能なアミノ酸残基を含むポリペプチド部位は、免疫グロブリンのヒンジ領域であってもよい。一例において、前記Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域は、それぞれ独立して、免疫グロブリンＤ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｄ；ＩｇＤ）のヒンジ領域および免疫グロブリンＡ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ；ＩｇＡ；例えば、ＩｇＡ１）のヒンジ領域からなる群より選択される。前記ｎ＋ｍ個の免疫グロブリンのヒンジ領域は、互いに同一でも異なっていてもよい。
【００３２】
一具体例において、前記融合ポリペプチドに含まれているｎ＋ｍ個のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域が融合ポリペプチドのＮ−末端およびＣ−末端ともに位置する場合（つまり、融合ポリペプチドのＮ−末端とＣ−末端にそれぞれ独立して１つ以上のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域が存在する場合）、Ｎ−末端に位置するＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域とＣ−末端に位置するＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域の種類および個数は、互いに同一でも異なっていてもよいし、一具体例において、Ｎ−末端に位置する１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域は、すべてＩｇＤのヒンジ領域またはＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１）のヒンジ領域であるか、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のＩｇＤのヒンジ領域および１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１）のヒンジ領域を多様な順序で含むものであってもよく、Ｃ−末端に位置する１つ以上の免疫グロブリンのヒンジ領域は、すべてＩｇＤのヒンジ領域またはＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１）のヒンジ領域であるか、１つ以上のＩｇＤのヒンジ領域および１つ以上のＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１）のヒンジ領域を多様な順序で含むものであってもよい。
【００３３】
他の具体例において、前記融合ポリペプチドに含まれているｎ＋ｍ個のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域がすべて融合ポリペプチドのＮ−末端にのみ位置する場合（つまり、融合ポリペプチドのＮ−末端にのみ１つ以上のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域が存在する場合）、前記１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域は、すべてＩｇＤのヒンジ領域またはＩｇＡのヒンジ領域であるか、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のＩｇＤのヒンジ領域と１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のＩｇＡのヒンジ領域とを多様な順序で含むものであってもよい。
【００３４】
他の具体例において、前記融合ポリペプチドに含まれているｎ＋ｍ個のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域がすべてＣ−末端にのみ位置する場合（つまり、融合ポリペプチドのＣ−末端にのみ１つ以上のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域が存在する場合）、前記１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域は、すべてＩｇＤのヒンジ領域またはＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１）のヒンジ領域であるか、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のＩｇＤのヒンジ領域と１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１）のヒンジ領域とを多様な順序で含むものであってもよい。
【００３５】
前記Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域（Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域が２個以上の場合にそれぞれの領域）は、Ｏ−グリコシル化残基（Ｏ−グリコシル化可能なアミノ酸残基）を１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、または７個以上（上限値は、１００個、５０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、または８個である）（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個）含むことができる。例えば、前記Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域（Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域が２個以上の場合にそれぞれの領域）は、Ｏ−グリコシル化残基（Ｏ−グリコシル化可能なアミノ酸残基）を１〜１０個または３〜１０個含むものであってもよい。
【００３６】
一例において、前記Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域は、免疫グロブリン（例えば、ヒト免疫グロブリン）のヒンジ領域の中から１つ以上選択されたものであってもよいし、例えば、ＩｇＤヒンジ領域、ＩｇＡヒンジ領域、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【００３７】
前記ＩｇＤは、ヒトＩｇＤ（例えば、ＵｎｉＰｒｏＫＢ  Ｐ０１８８０（不変領域；配列番号７）など）であってもよいし、前記ＩｇＤのヒンジ領域は、
「Ｎ’−ＥＳＰＫＡＱＡＳＳＶＰＴＡＱＰＱＡＥＧＳＬＡＫＡＴＴＡＰＡＴＴＲＮＴ−Ｃ’（配列番号１）；太文字で表示したアミノ酸残基は、Ｏ−グリコシル化可能残基である（計７個）」のアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列から必須としてなるポリペプチド（「ＩｇＤヒンジ」）、
前記配列番号１のアミノ酸配列中、Ｏ−グリコシル化残基を１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、または７個含む連続する５個以上、７個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２２個以上、または２４個以上（上限値は、３４個または３３個である）のアミノ酸を含むか、前記アミノ酸から必須としてなるポリペプチド（「ＩｇＤヒンジの一部」；例えば、配列番号１中の「ＳＳＶＰＴ」（配列番号９）を含む連続する５個以上のアミノ酸を含むポリペプチドまたは「ＴＴＡＰＡＴＴ」（配列番号１０）を含む連続する７個以上のアミノ酸を含むポリペプチド）、および
ＩｇＤ（例えば、配列番号７）中、配列番号１のアミノ酸配列（ＩｇＤヒンジ）を含む連続する３４個以上または３５個以上のアミノ酸または前記ＩｇＤヒンジの一部を含む連続する７個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２２個以上、または２４個以上のアミノ酸を含むか、前記アミノ酸から必須としてなるポリペプチド（「ＩｇＤヒンジの延長部」；例えば、ＩｇＤ（配列番号７）中、「ＥＳＰＫＡＱＡＳＳ  ＶＰＴＡＱＰＱＡＥＧ  ＳＬＡＫＡＴＴＡＰＡ  ＴＴＲＮＴＧＲＧＧＥ  ＥＫＫＫＥＫＥＫＥＥ  ＱＥＥＲＥＴＫＴＰ」（配列番号１１）内の配列番号１または前記ＩｇＤヒンジの一部を含む連続する３４個以上または３５個以上のアミノ酸を含むポリペプチド）
からなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００３８】
前記ＩｇＡは、ヒトＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１（ＵｎｉＰｒｏＫＢ  Ｐ０１８７６、不変領域；配列番号８）など）であってもよいし、前記ＩｇＡのヒンジ領域は、
「Ｎ’−ＶＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ−Ｃ’（配列番号２）；太文字で表示したアミノ酸残基は、Ｏ−グリコシル化可能残基である（計８個）」のアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列から必須としてなるポリペプチド（「ＩｇＡヒンジ」）、
前記配列番号２のアミノ酸配列中、Ｏ−グリコシル化残基を１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、または８個含む連続する５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１２個以上、１５個以上、１７個以上、または１８個のアミノ酸を含むか、前記アミノ酸配列から必須としてなるポリペプチド（「ＩｇＡヒンジの一部」；例えば、配列番号２中の「ＳＴＰＰＴＰＳＰ」（配列番号１２）を含む８個以上または９個以上のアミノ酸を含むポリペプチド）、および
ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１（配列番号８））中、配列番号２のアミノ酸配列（ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１）ヒンジ）を含む連続する１９個以上または２０個以上の連続するアミノ酸、またはＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１）ヒンジの一部を含む連続する７個以上、１０個以上、１２個以上、１５個以上、１７個以上、または１８個以上のアミノ酸を含むか、前記アミノ酸配列から必須としてなるポリペプチド（ＩｇＡ「ヒンジの延長部」）
からなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００３９】
他の例において、前記Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域は、下記の表１に例示したタンパク質（例えば、配列番号２３〜１１３からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むタンパク質）中のＯ−グリコシル化可能なアミノ酸残基（Ｏ−グリコシル化部位）を１個以上、２個以上、５個以上、７個以上、１０個以上、１２個以上、１５個以上、１７個以上、２０個以上、または２２個以上（例えば、１〜１０個、３〜１０個；または１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、または２５個）を含む連続する５個以上、７個以上、１０個以上、１２個以上、１５個以上、１７個以上、２０個以上、２２個以上、２５個以上、２７個以上、３０個以上、３２個以上、または３５個以上（上限値は、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、または各タンパク質の総アミノ酸の個数）のアミノ酸を含むか、前記アミノ酸から必須としてなるポリペプチド領域であってもよい。本明細書において、Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域は、目的ポリペプチドの機能に影響を与えないものが良い。下記の表１に例示したタンパク質のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域は、全長（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）タンパク質の本来の機能に関与しない領域の中から選択されたものであってもよいし、これによって、前記Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域は、目的ポリペプチドの機能には何ら影響なく単に半減期を増加させる役割を果たすことができる：
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【００４０】
前記融合ポリペプチドは、実際に含むＯ−グリカンの総個数が１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上、または２１個以上であるか（最大値は、前記記載のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域の個数およびそれぞれのＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域に含まれているＯ−グリコシル化残基の個数によって決定される）、理論上含まれるＯ−グリカンの総個数が２０個以上、２１個以上、２３個、または２４個以上（最大値は、前記記載のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域の個数およびそれぞれのＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域に含まれているＯ−グリコシル化残基の個数によって決定される）であってもよい。また、融合ポリペプチドは、実際に含まれているＯ−グリカンの総個数は、体内（例えば、血液内）投与時の安定性に関連があり得、具体的には、融合ポリペプチドは、実際に含まれているＯ−グリカンの総個数が多くなるほど、融合ポリペプチドまたは融合ポリペプチドに含まれている目的ポリペプチドの体内安定性が増加（つまり、体内（血液内）半減期増加および／または体内（血液内）濃度増加および／または体内（血液内）分解率減少など）できる。
【００４１】
前記融合ポリペプチドは、目的ポリペプチドとＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域との間、および／またはＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域が２個以上含まれる場合のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域の間にペプチドリンカーを追加的に含むことができる。一例において、前記ペプチドリンカーは、１つ以上のＧｌｙ（Ｇ）と１つ以上のＳｅｒ（Ｓ）を繰り返し含むＧＳリンカーであってもよいし、例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１３）の繰り返し回数であって、１〜１０または１〜５の整数（例えば、１、２、３、４、または５）である）であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００４２】
前記融合ポリペプチドにおいて、Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域と融合した目的ポリペプチドは、Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域が融合しない目的ポリペプチドと比較して、体内（または血中）安定性が増加したことを特徴とする（例えば、体内または血中半減期増加）。
【００４３】
他の例は、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００４４】
他の例は、前記核酸分子を含む組換えベクターを提供する。
【００４５】
他の例は、前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。
【００４６】
他の例は、前記組換えベクターを細胞で発現させる段階を含む、体内（または血中）半減期が増加した目的ポリペプチドの製造方法、または前記体内（または血中）半減期が増加した目的ポリペプチドを含む融合ポリペプチドの製造方法を提供する。
【００４７】
他の例は、目的ポリペプチドとＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域とを融合（または連結または結合）させる段階を含む目的ポリペプチドの生体持続期間を増加させる方法を提供する。一具体例において、前記融合させる段階は、目的ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端に１つ以上のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域を、リンカーを介するか、介することなく融合（または連結または結合）させる段階を含むことができる。前記融合（または連結または結合）させる段階は、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で進行するものであってもよい。
【００４８】
他の例は、前記融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択された１種以上を含む薬学的組成物を提供する。
【００４９】
他の例は、Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域のポリペプチド（タンパク質またはペプチド）薬物の体内（または血中）安定性増進および／または体内（または血中）半減期増加用途を提供する。具体的には、一例は、Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域を含むポリペプチド（タンパク質またはペプチド）薬物の体内（または血中）安定性増進および／または体内（または血中）半減期増加用組成物を提供する。本明細書で使用されたものとして、安定性増進および／または半減期増加は、Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域を含まないポリペプチド（タンパク質またはペプチド）と比較して、安定性が増進するかおよび／または半減期が増加したことを意味する。
【００５０】
以下、本発明をより詳しく説明する：
【００５１】
前記目的ポリペプチド（Ｙ）は、すべての可溶性タンパク質の中から選択された１種以上であってもよい。一具体例において、前記目的ポリペプチドは、生体で目的の活性（例えば、特定の疾病または症状の予防、軽減、および／または治療活性またはマーカーとしての活性、または生体必要物質を代替する活性）を有するタンパク質および／またはペプチド（例えば、約１００個以下または約５０個以下のアミノ酸を含む）であってもよいし、例えば、酵素活性タンパク質またはペプチド（例えば、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼなど）、受容体タンパク質またはペプチド、輸送体タンパク質またはペプチド、殺菌および／または耐毒素−結合ポリペプチド、構造タンパク質またはペプチド、免疫ポリペプチド、抗体模倣タンパク質（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｉｍｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ、例えば、タンパク質スキャフォールド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）、ｆｃ−融合タンパク質など）、毒素、抗生剤、ホルモン、成長因子、ワクチンなどからなる群より選択された１種以上であってもよい。一例において、前記目的ポリペプチドは、ホルモン、サイトカイン、組織プラスミノゲン活性因子、免疫グロブリン（例えば、抗体またはその抗原結合断片または変異体）、抗体模倣タンパク質（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｉｍｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ、例えば、タンパク質スキャフォールド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）、ｆｃ−融合タンパク質など）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。他の具体例において、前記目的ポリペプチドは、成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ））、ｐ４０、ＢＭＰ−１（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類（例えば、インターフェロン−ａｌｐｈａ、−ｂｅｔａ、−ｇａｍｍａなど）、インターフェロン受容体類（例えば、水溶性タイプＩのインターフェロン受容体など）、Ｇ−ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、ＧＭ−ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、グルカゴン−様ペプチド（ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）（例、ＧＬＰ−１など）、インスリン−様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＩＧＦ）、Ｇ−タンパク質−結合受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、インターロイキン類（例、インターロイキン−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１３、−１４、−１５、−１６、−１７、−１８、−１９、−２０、−２１、−２２、−２３、−２４、−２５、−２６、−２７、２８、−２９、−３０など）、インターロイキン受容体類（例、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−４受容体など）、酵素（例、グルコセレブロシダーゼ（ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）、イズロネート−２−スルファターゼ（ｉｄｕｒｏｎａｔｅ−２−ｓｕｌｆａｔａｓｅ）、アルファ−ガラクトシダーゼＡ（ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ−Ａ）、アガルシダーゼア���ファおよびベータ（ａｇａｌｓｉｄａｓｅ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｂｅｔａ）、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ（ａｌｐｈａ−Ｌ−ｉｄｕｒｏｎｉｄａｓｅ）、ブチリルコリンエステラーゼ（ｂｕｔｙｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）、キチナーゼ（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）、グルタメートデカルボキシラーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、イミグルセラーゼ（ｉｍｉｇｌｕｃｅｒａｓｅ）、リパーゼ（ｌｉｐａｓｅ）、ウリカーゼ（ｕｒｉｃａｓｅ）、血小板−活性化因子アセチルヒドロラーゼ （ｐｌａｔｅｌｅｔ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ａｃｅｔｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、中性エンドペプチダーゼ（ｎｅｕｔｒａｌ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、ミエロペルオキシダーゼ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）など）、インターロイキンまたはサイトカイン結合タンパク質（例、ＩＬ−１８ｂｐ、ＴＮＦ−結合タンパク質など）、マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制剤、細胞壊死糖タンパク質（ｃｅｌｌ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）、免疫毒素（ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ）、リンホトキシン（ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）、腫瘍抑制剤（ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ）、転移成長因子（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、アルファ−１抗トリプシン（ａｌｐｈａ−１  ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ）、アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）、アルファ−ラクトアルブミン（ａｌｐｈａ−ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ）、アポリポタンパク質−Ｅ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−Ｅ）、赤血球生成因子（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、高糖鎖化赤血球生成因子（ｈｉｇｈｌｙ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、アンジオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎｓ）；ヘモグロビン（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）、トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、トロンビン受容体活性ペプチド（ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、トロンボモジュリン（ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ）、血液因子ＶＩＩ、血液因子ＶＩＩａ、血液因子ＶＩＩＩ、血液因子ＩＸ、血液因子ＸＩＩＩ、プラスミノゲン活性化因子（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、フィブリン−結合ペプチド（ｆｉｂｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、ウロキナーゼ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）、ストレプトキナーゼ（ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ）、ヒルジン（ｈｉｒｕｄｉｎ）、タンパク質Ｃ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ）、Ｃ−反応性タンパク質（Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、レニン抑制剤（ｒｅｎｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、コラゲナーゼ抑制剤（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、上皮成長因子（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、外皮成長因子（ｅｐｉ��ｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、アンジオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、アンジオテンシン（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）、骨成長因子（ｂｏｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、骨刺激タンパク質（ｂｏｎｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、カルシトニン（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、アトリオペプチン（ａｔｒｉｏｐｅｐｔｉｎ）、軟骨誘導因子（ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、エルカトニン（ｅｌｃａｔｏｎｉｎ）、結合組織活性因子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、組織因子経路抑制剤（ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、濾胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、黄体形成ホルモン（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、神経成長因子類（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）（例、神経成長因子、繊毛神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、ＡＦ−１（ａｘｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−１）、脳−ナトリウム利尿ペプチド（ｂｒａｉｎ−ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、ネトリン（ｎｅｔｒｉｎ）、好中球抑制因子（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｆａｃｔｏｒ）、神経栄養因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、ニュールツリン（ｎｅｕｔｕｒｉｎ）など）、副甲状腺ホルモン（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、リラキシン（ｒｅｌａｘｉｎ）、セクレチン（ｓｅｃｒｅｔｉｎ）、ソマトメジン（ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎ）、副腎皮質ホルモン（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃａｌ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、グルカゴン（ｇｌｕｃａｇｏｎ）、コレシストキニン（ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ）、膵臓ポリペプチド（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、ガストリン放出ペプチド（ｇａｓｔｒｉｎ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、コルチコトロピン放出因子（ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、甲状腺刺激ホルモン（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、オートタキシン（ａｕｔｏｔａｘｉｎ）、ラクトフェリン（ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ）、ミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）、受容体類（例、ＴＮＦ受容体（例えば、ＴＮＦＲ（ｐ７５）、ＴＮＦＲ（ｐ５５）など）、ＩＬ−１受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体、Ｂ細胞活性化因子受容体など）、受容体拮抗剤（ＩＬ１−Ｒａなど）、細胞表面抗原（例、ＣＤ２、３、４、５、７、１１ａ、１１ｂ、１８、１９、２０、２３、２５、３３、３８、４０、４５、６９など）、ウイルスワクチン抗原、抗体（例えば、単クローン抗体、多重クローン抗体）、抗体断片（例、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｄ）、ウイルス由来ワクチン抗原、およびこれらの変異体／断片（例えば、所望の機能および／ま���は構造を維持する変異体／断片）、抗体模倣タンパク質（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｉｍｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ、例えば、タンパク質スキャフォールド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）、ｆｃ−融合タンパク質など）などからなる群より選択された１種以上を含むことができるが、これに限定されるものではない。前記抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２など）、ＩｇＤ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４など）、ＩｇＭまたはＩｇＥ）のものであってもよいし、前記抗体断片は、本来の抗体の抗原結合能力を保有する抗原結合断片で、約２０個以上のアミノ酸、例えば、約１００個以上のアミノ酸を含む抗体の任意の断片（例えば、ＣＤＲ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃなど）であってもよい。前記Ｆａｂ断片は、軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）および不変ドメイン（ＣＬ）、および重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）および第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、ヒンジ領域からＣＨ１ドメインのカルボキシル末端まで１つ以上のシステイン残基を含むアミノ酸残基が添加されたという点から、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆｄ断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインだけを含み、Ｆ（ａｂ’）２断片は、二硫化結合または化学反応によりＦａｂ’断片が対をなすことによって製造される。ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）断片は、ペプチドリンカーで連結されたＶＬおよびＶＨドメインを含むので、単一ポリペプチド鎖として存在する。前記抗体模倣タンパク質は、抗体以外の特定の抗原と結合可能な部位を含むすべてのタンパク質を意味するものであってもよいし、例えば、レペボディ（ｒｅｐｅｂｏｄｙ）などのタンパク質スキャフォールド（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｉｍｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）などのＦｃ−融合タンパク質（Ｆｃと抗原結合ポリペプチドの融合タンパク質）などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００５２】
他の例において、前記目的ポリペプチドは、すべての分泌タンパク質からなる群より選択された１種以上であってもよい。
【００５３】
前記目的ポリペプチドは、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などを含む哺乳動物由来（哺乳動物から分離された）ポリペプチドであってもよいし、例えば、ヒト由来（ヒトから分離された）ポリペプチドであってもよい。
【００５４】
本明細書で提供される目的ポリペプチドとＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域とを含む融合ポリペプチドにおいて、目的ポリペプチドとＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域、および／または２以上のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域は、共有的または非共有的に直接（例えば、リンカーなしに）連結されるか、適切なリンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結されたものであってもよい。前記ペプチドリンカーは、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、２〜２０個、２〜１５個、または２〜１０個の任意のアミノ酸からなるポリペプチドであってもよいし、その含まれたアミノ酸の種類は制限がない。前記ペプチドリンカーは、例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎおよび／またはＳｅｒ残基を含むことができ、Ｔｈｒおよび／またはＡｌａのような中性アミノ酸も含むことができるが、これに限定されるものではないし、ペプチドリンカーに適したアミノ酸配列は当業界にて公知である。一例において、前記ペプチドリンカーは、１つ以上のＧｌｙ（Ｇ）と１つ以上のＳｅｒ（Ｓ）を繰り返し含むＧＳリンカーであってもよいし、例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１３）の繰り返し回数であって、１〜１０の整数または１〜５の整数（１、２、３、４、または５）である）であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００５５】
また、前記融合ポリペプチドは、Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域を計１個以上または計２個以上（例えば、２〜１０個、２〜８個、２〜６個、２〜５個、２〜４個、２個または３個）含むものであってもよい。融合ポリペプチドがＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域を２個以上含む場合、前記融合ポリペプチドは、２個以上のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域が目的ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合しているか、目的ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端にそれぞれ独立して１個以上のＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域が結合しているものであってもよい（この場合、目的ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に結合したヒンジ領域の種類および個数は、同一でも異なっていてもよい）。この時、Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域の間、および／またはＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域とヒト目的ポリペプチドとの間には、先に説明したペプチドリンカーが追加的に含まれてもよい。
【００５６】
本明細書で提供される融合ポリペプチドは、組換え的または合成的に生産されたものでもよいし、天然由来（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）のものでなくてもよい。
【００５７】
本明細書で提供される融合ポリペプチドに含まれている目的ポリペプチドの哺乳類での体内（血中）半減期は、Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域が融合しない目的ポリペプチドと比較して、約１．５倍以上、約２倍以上、約２．５倍以上、約３倍以上、約３．５倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、約９倍以上、または約１０倍以上増加したものであってもよい。
【００５８】
このように、増加した目的ポリペプチドの半減期によって、Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域が結合した融合ポリペプチド形態の目的ポリペプチドは、Ｏ−グリコシル化可能なポリペプチド領域が連結されない形態の目的ポリペプチドと比較して、投与間隔を長く持つことができるという利点がある。
【００５９】
目的ポリペプチドとＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域とを含む融合ポリペプチドは、通常の化学的合成方法または組換え的方法によって製造できる。
【００６０】
本明細書において、用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための発現手段を意味するもので、例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、およびバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ−関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどからなる群より選択される。一例において、前記組換えベクターに使用可能なベクターは、プラスミド（例えば、ｐｃＤＮＡシリーズ、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ、ｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４λＢ、λ−Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１、Ｍ１３など）またはウイルス（例えば、ＳＶ４０など）を基本として作製されてもよいが、これに限定されるものではない。
【００６１】
前記組換えベクターにおいて、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子は、プロモーターに作動的に連結可能である。用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター配列）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味する。前記調節配列は、「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」されることによって、他の核酸配列の転写および／または翻訳を調節することができる。
【００６２】
前記組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のための発現ベクターとして構築できる。前記発現ベクターは、当業者に植物、動物または微生物で外来のタンパク質を発現するために使用される通常のものを使用することができる。前記組換えベクターは、当業者に公知の多様な方法により構築できる。
【００６３】
前記組換えベクターは、真核細胞を宿主として発現できる。真核細胞を宿主として発現させようとする場合には、組換えベクターは、発現させようとする核酸分子および先に説明したプロモーター、リボソーム結合サイト、分泌シグナル配列（韓国公開特許第２０１５−０１２５４０２号参照）および／または転写／翻訳終結配列のほか、真核細胞で作動する複製起点は、ｆ１複製起点、ＳＶ４０複製起点、ｐＭＢ１複製起点、アデノ複製起点、ＡＡＶ複製起点、および／またはＢＢＶ複製起点などを含むことができるが、これに限定されるものではない。また、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオニンプロモーター）、または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーターおよびＨＳＶのｔｋプロモーター）が用いられ、分泌シグナル配列として通常使用可能なすべての分泌シグナル配列を使用することができ、例えば、韓国公開特許第２０１５−０１２５４０２号に記載の分泌シグナル配列を使用することができるが、これに限定されるものではなく、転写終結配列としてポリアデニル化配列を含むことができる。
【００６４】
前記組換え細胞は、前記組換えベクターを適切な宿主細胞に導入（形質転換または形質感染）させることによって得られたものであってもよい。前記宿主細胞は、前記組換えベクターを安定的かつ連続的にクローニングまたは発現させるすべての真核細胞の中から選択される。宿主として使用可能な真核細胞としては、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、植物細胞、および動物細胞などがあり、例えば、マウス（例えば、ＣＯＰ、Ｌ、Ｃ１２７、Ｓｐ２／０、ＮＳ−０、ＮＳ−１、Ａｔ２０、またはＮＩＨ３Ｔ３）、ラット（例えば、ＰＣ１２、ＰＣ１２ｈ、ＧＨ３、またはＭｔＴ）、ハムスター（例えば、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＧＳ遺伝子欠陥ＣＨＯ、またはＤＨＦＲ遺伝子欠陥ＣＨＯ）、サル（例えば、ＣＯＳ（ＣＯＳ１、ＣＯＳ３、ＣＯＳ７など）、ＣＶ１またはＶｅｒｏ）、ヒト（例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ−２９３、網膜−由来ＰＥＲ−Ｃ６、二倍体線維芽細胞に由来する細胞、骨髄腫細胞またはＨｅｐＧ２）、その他の動物細胞（例えば、ＭＤＣＫなど）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｔｎ−３６８細胞、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４細胞など）、ハイブリドーマなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
本願明細書で提供される融合ポリペプチドをコードする核酸分子を先に説明した適切な宿主細胞で発現させることによって、融合しない形態と比較して、体内安定性が増進した目的ポリペプチドまたはこれを含む融合ポリペプチドを製造することができる。前記融合ポリペプチドの製造方法は、前記核酸分子を含む組換え細胞を培養する段階を含むことができる。前記培養する段階は、通常の培養条件で行われる。また、前記製造方法は、前記培養する段階の後に、培養物から融合ポリペプチドを分離および／または精製する段階を追加的に含むことができる。
【００６６】
前記核酸分子またはこれを含む組換えベクターの宿主細胞内への運搬（導入）は、当業界にて広く知られた運搬方法を使用することができる。前記運搬方法は、例えば、宿主細胞が真核細胞の場合には、微細注入法、カルシウムホスフェート沈殿法、電気穿孔法、リポゾーム−媒介形質感染法および遺伝子ボンバードメントなどを使用することができるが、これに限定しない。
【００６７】
前記形質転換（組換えベクター導入）された宿主細胞を選別する方法は、選択標識によって発現する表現型を用いて、当業者に広く知られた方法により容易に実施可能である。例えば、前記選択標識が特定の抗生物質耐性遺伝子の場合には、前記抗生物質が含有された培地で培養することによって、組換えベクターが導入された組換え細胞を容易に選別することができる。
【００６８】
前記融合ポリペプチドは、目的ポリペプチドの欠乏および／または機能異常に関連するか、目的ポリペプチドの活性によって治療、軽減、または改善可能なすべての疾病の予防および／または治療に使用される。したがって、一例において、前記融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択された１つ以上を含む薬学組成物が提供される。前記薬学組成物は、前記融合タンパク質に含まれている目的ポリペプチドの欠乏および／または機能異常に関連する疾病または前記目的ポリペプチドが治療および／または予防効果を有する疾病の予防および／または治療用薬学組成物であってもよい。他の例は、前記融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択された１つ以上を、前記融合タンパク質に含まれている目的ポリペプチドの欠乏および／または機能異常に関連する疾病または前記目的ポリペプチドが治療および／または予防効果を有する疾病の予防および／または治療を必要とする患者に投与する段階を含む、前記融合タンパク質に含まれている目的ポリペプチドの欠乏および／または機能異常に関連する疾病または前記目的ポリペプチドが治療および／または予防効果を有する疾病の予防および／または治療方法を提供する。前記方法は、投与する段階の前に、前記融合タンパク質に含まれている目的ポリペプチドの欠乏および／または機能異常に関連する疾病または前記目的ポリペプチドが治療および／または予防効果を有する疾病の予防および／または治療を必要とする患者を確認する段階を追加的に含むことができる。
【００６９】
前記薬学組成物は、前記融合ポリペプチド、核酸分子、組換えベクター、および組換え細胞からなる群より選択された１種以上の有効成分を薬学的有効量で含むことができる。前記薬学的有効量は、所望の効果が得られる有効成分の含有量または投与量を意味する。前記薬学組成物内の有効成分の含有量または投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、飲食、投与時間、投与間隔、投与経路、排泄速度および反応感受性のような要因によって多様に処方可能である。例えば、前記有効成分の１回投与量は、０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ、または０．０１〜１ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００７０】
また、前記薬学組成物は、前記有効成分のほか、薬学的に許容可能な担体を追加的に含むことができる。前記担体は、タンパク質、核酸、または細胞を含む薬物の製剤化に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。前記薬学組成物はさらに、薬学組成物の製造に通常使用される希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などからなる群より選択された１種以上を追加的に含むことができる。
【００７１】
前記薬学組成物の投与対象は、ヒト、サルなどを含む霊長類、マウス、ラットなどを含む齧歯類などを含む哺乳類、またはこれらに由来する細胞、組織、細胞培養物または組織培養物であってもよい。
【００７２】
前記薬学組成物は、経口投与または非経口的投与によって投与されるか、細胞、組織、または体液に接触させることによって投与されるものであってもよい。具体的には、非経口投与の場合には、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔注射、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与および直腸内投与などで投与可能である。経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化されなければならない。
【００７３】
また、前記薬学組成物は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液形態であるか、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤などの形態に剤形化されてもよいし、剤形化のために分散剤または安定化剤を追加的に含むことができる。
【発明の効果】
【００７４】
本明細書で提供されるＯ−グリコシル化可能なポリペプチド領域と融合した目的ポリペプチドは、体内投与時、持続期間が長く投与間隔を増加させることができ、これによって投与用量を低減可能なため、投与の便宜性および／または経済的側面から有利な効果を有し、目的ポリペプチド治療が必要な分野に有用に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】一実施例による融合ポリペプチドＩｇＤ−ｈＧＨ−Ｈｉｓ（ＤＨＤＤ−８Ｈｉｓ）、ＩｇＤ−ｈＧＨ（ＤＨＤＤ）、ＩｇＡ−ｈＧＨ（ＡＨＡＡ）、ＩｇＤ−ｈＧＨ−ＩｇＡ（ＤＨＡＡ）、およびＩｇＡ−ｈＧＨ−ＩｇＤ（ＡＨＤＤ）の構造を概略的に示す模式図である。
【図２】一実施例による融合ポリペプチドＩｇＤ−ｈＧＨをＱ−ＴＯＦ質量分析計で分析した結果を示すグラフである。
【図３】ＩＥＦ（等電点電気泳動）によって分析された融合ポリペプチドＩｇＤ−ｈＧＨ−Ｈｉｓの異性体分布を示す結果である。
【図４】一実施例による融合ポリペプチドＩｇＤ−ｈＧＨ−ＨｉｓをＱ−ＴＯＦ質量分析計で分析した結果を示すグラフである。
【図５】一実施例による融合ポリペプチドデュラグルチド（Ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ）−ＩＤとデュラグルチド−ＩＤ２の構造を概略的に示す模式図である。
【図６】ＩＥＦ（等電点電気泳動）によって分析された融合ポリペプチドデュラグルチド−ＩＤ２の異性体分布を示す結果を示す。
【図７】融合ポリペプチドＩｇＤ−ｈＧＨ投与後の時間による血中濃度の変化を、ｈＧＨ投与時と比較して示すグラフである。
【図８】融合ポリペプチドＩｇＤ−ｈＧＨ−Ｈｉｓ投与後の時間による血中濃度の変化を、ｈＧＨ投与時と比較して示すグラフである。
【図９】融合ポリペプチドＩｇＡ−ｈＧＨ  Ｆ３、ＩｇＡ−ｈＧＨ  Ｆ４、およびＩｇＡ−ｈＧＨ  Ｆ５投与後の時間による血中濃度の変化を示すグラフである。
【図１０】融合ポリペプチドデュラグルチド−ＩＤ２（ｐＧＩｇＧ４ＤＤ）投与後の時間による血中濃度の変化を、デュラグルチド（Ｔｒｕｌｉｃｉｔｙ）投与時と比較して示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
以下、本発明を以下の実施例によってより具体的に説明する。しかし、これらは本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００７７】
実施例１：融合ポリペプチドの製造
１．１．目的ポリペプチドとしてヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を含む融合ポリペプチドの製造
ＩｇＤヒンジ（ＥＳＰＫＡＱＡＳＳＶＰＴＡＱＰＱＡＥＧＳＬＡＫＡＴＴＡＰＡＴＴＲＮＴ；配列番号１）、ＩｇＡ１ヒンジ（ＶＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ；配列番号２）、またはＩｇＤヒンジとＩｇＡ１ヒンジとの組み合わせが目的ポリペプチド（ヒト成長ホルモン：ｈＧＨ；配列番号３）と融合した融合ポリペプチドＩｇＤ−ｈＧＨ−Ｈｉｓ（ＤＨＤＤ−８Ｈｉｓ）、ＩｇＤ−ｈＧＨ（ＤＨＤＤ）、ＩｇＡ−ｈＧＨ（ＡＨＡＡ）、ＩｇＤ−ｈＧＨ−ＩｇＡ（ＤＨＡＡ）、およびＩｇＡ−ｈＧＨ−ＩｇＤ（ＡＨＤＤ）（図１参照；ＩｇＤおよびＩｇＡ１の配列中の下線表示された部分がＯ−グリコシル化可能部位である）を製造した。前記融合ポリペプチドに含まれている各部分のアミノ酸配列を下記の表２にまとめた。
【表２】
2021535746.tif 000015
【００７８】
１．１．１．ＩｇＤ−ｈＧＨ（ＤＨＤＤ）
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ７９０−２０）の変形体であるプラスミドｐＡＦ−Ｄ１Ｇ１（ＫＲ１０−１８６８１３９Ｂ１のプロモーターを含む）を、ＢａｍＨＩ（制限部位：ＧＧＡＴＣＣ）およびＮｏｔＩ（制限部位：ＧＣＧＧＣＣＧＣ）で処理し、これに「（Ｎ末端）−［ＢａｍＨＩ制限部位−シグナルペプチド（配列番号４）−ＩｇＤヒンジ（ＩｇＤＨ１；配列番号１）−ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ；配列番号３）−ＩｇＤヒンジ（ＩｇＤＨ１；配列番号１）−ＩｇＤヒンジ（ＩｇＤＨ１；配列番号１）−ＮｏｔＩ制限部位］−（Ｃ末端）」の融合ポリペプチドをコードする遺伝子を挿入して、目的ポリペプチド（ヒト成長ホルモン）と免疫グロブリン（ＩｇＤ）のヒンジ領域とを含む融合ポリペプチド（計２９３ａａ（ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅを除く）；Ｏ−グリコシル化可能部位−計２１個）；以下、「ＩｇＤ−ｈＧＨ」と称する）の製造のための組換えベクターｐＤＨＤＤ−Ｄ１Ｇ１を用意した。
【００７９】
前記用意された組換えベクターｐＤＨＤＤ−Ｄ１Ｇ１をＥｘｐｉＣＨＯ−ＳＴＭ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に導入し、ＥｘｐｉＣＨＯ発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；４００ｍＬ）で１２日間培養（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｄａｙ１＆Ｄａｙ５  Ｆｅｅｄｉｎｇ）して、融合ポリペプチドＩｇＤ−ｈＧＨを生産した。融合ポリペプチドＩｇＤ−ｈＧＨは、理論上３２．２ｋＤａの分子量（Ｏ−グリカンを除く）および２１個のＯ−グリカンを有する。
【００８０】
前記組換えベクターの発現により生産された融合ポリペプチドＩｇＤ−ｈＧＨを精製し、Ｑ−ＴＯＦ質量分析計を用いてＯ−グリカン部位占有率を分析した。
【００８１】
具体的には、精製第１工程は、ｈＧＨに結合特異性を有するＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭヒト成長ホルモンアフィニティーマトリックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で作製されたカラムをＡＫＴＡＴＭ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に装着し、サンプルをローディングして行った。平衡バッファーで１次洗浄を実施し、２０ｍＭクエン酸  ｐＨ３．０または０．１Ｍ酢酸  ｐＨ３．０を用いて溶出し、溶出溶液は工程終了後に直ちに２ＭＴｒｉｓバッファーを用いてｐＨ７．０に合わせて、次の精製工程前まで凍結させておいた。
【００８２】
精製第２工程は、陰イオン交換クロマトグラフィーを適用し、樹脂としてＴＭＡＥを用いて行った。凍結させておいた第１工程終了試料を溶かした後、伝導度を測定し、ローディングに適した伝導度となるように注射用水を用いて希釈し、０．２２ｕｍのＰＥＳろ過システム（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）で前処理を実施した。ＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にカラムを装着し、サンプルをローディングした。伝導度に応じた分離のために勾配形態で溶出するようにし、画分を分けて溶出ピークを参照してプールした。
【００８３】
精製工程中に分析試料と動物実験用サンプル用意のために濃縮またはバッファー交換を実施した。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にサンプルを入れた後、低温で遠心分離を実施して濃縮または透析ろ過を実施し、分析のためのバッファーとしては２５ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．０を用い、動物実験用サンプル用意のためにはＰＢＳバッファーを用いた。
【００８４】
精製工程、濃縮工程または透析濾過後の試料の濃度測定は、アミノ酸配列を用いて物質の減衰係数を計算し、ＵＶ分光光度計（Ｇ１１０３Ａ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２８０ｎｍと３４０ｎｍの吸光度を測定して、下記の計算式により求めた。
【数１】
2021535746.tif 000016
【００８５】
動物実験用試料の場合、ＰＢＳバッファーを用いて定められた濃度に希釈し、投与前にバイオセーフティキャビネット内で０．２２ｕｍのシリンジろ過（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ、０．２２ｕｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過を実施した後、投与時まで冷凍保管した。
【００８６】
ＩｇＤ−ｈＧＨをＱ−ＴＯＦ質量分析計で分析した結果を図２に示した（Ｙ軸：％；Ｘ軸：質量；ピーク上に表示された７〜２１の数値がＯ−グリカンの個数である）。図２に示されているように、ＩｇＤ−ｈＧＨにＯ−グリカンが７個から２１個まで分布しており、平均Ｏ−グリカン数は１３．５個であった。
【００８７】
１．１．２．ＩｇＤ−ｈＧＨ−Ｈｉｓ
精製の便宜性のため、ＩｇＤ−ｈＧＨ（実施例１．１．１のＣ−末端に８Ｈｉｓタグを追加するために表３のプライマーを合成した。
【表３】
2021535746.tif 000017
【００８８】
それぞれのプライマーを用いてＰＣＲを行った後、再び適当なプライマーの組み合わせでオーバーラッピングＰＣＲを行って、最終的に６９３ｂｐのＰＣＲ産物（「（Ｎ末端）−［ＰｓｔＩ制限部位−シグナルペプチド（配列番号４）−ＩｇＤヒンジ（ＩｇＤＨ１；配列番号１）−ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ；配列番号３）−ＩｇＤヒンジ（ＩｇＤＨ１；配列番号１）−ＩｇＤヒンジ（ＩｇＤＨ１；配列番号１）−８Ｈｉｓ−ＮｏｔＩ制限部位］−（Ｃ末端）」をコードする遺伝子）を得た後、ｐＤＨＤＤ−Ｄ１Ｇ１とＰＣＲ産物をそれぞれＰｓｔＩとＮｏｔＩで処理した後、ライゲーションして、最終的に、目的ポリペプチド（ヒト成長ホルモン）と免疫グロブリン（ＩｇＤ）のヒンジ領域および８Ｈｉｓタグを含む融合ポリペプチド（計３０１ａａ（シグナルペプチドを除く）；Ｏ−グリコシル化可能部位−計２１個）；以下、「ＩｇＤ−ｈＧＨ−Ｈｉｓ」と称する）の製造のための組換えベクターｐＤＨＤＤ−８Ｈｉｓ−Ｄ１Ｇ１を用意した。
【００８９】
前記組換えベクターの発現により生産された融合ポリペプチドＩｇＤ−ｈＧＨ−Ｈｉｓを精製し、ＩＥＦ（等電点電気泳動）分析およびＱ−ＴＯＦ質量分析計を用いてＯ−グリカン部位占有率を分析した。
【００９０】
具体的には、精製工程に使用された１次カラムは陰イオン交換樹脂のＴＭＡＥであって、培養液からＩｇＤ−ｈＧＨ−Ｈｉｓを部分的に分離して１次溶出液として溶出させた。その後、１次溶出液は、２次カラムの金属親和樹脂であるＨＩＳ−Ｔａｇ結合カラムに供給して、選択的にＩｇＤ−ｈＧＨ−Ｈｉｓを２次溶出液として溶出させた。その後、２次溶出液は、３次カラムの陰イオン交換樹脂であるＴＭＡＥに供給して、シアル酸の含有量が低い分画を除去して３次溶出液として溶出させた。その後、３次溶出液は、４次カラムのゲルろ過カラムに供給して、多量体および切片化されたタンパク質を除去して４次溶出液を得た。
【００９１】
より詳しくは、次のような段階を含む。
【００９２】
段階１：ＴＭＡＥ、０．５ｘ２５ｃｍ（４ｍＬ）、ｖ＝１５０ｃｍ／時間、１０ｍＭトロールアミン（ｐＨ７．０）を含むバッファーで平衡化させる。培養液をローディング後、カラムは平衡バッファーで１回洗浄し、１０ｍＭトロールアミン、２５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）を含む溶出バッファーを線形勾配で溶出させて１次溶出液を得た。
段階２：Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｈｉｓ＊Ｂｉｎｄ、１．０ｘ５ｃｍ（４ｍＬ）、ｖ＝８０ｃｍ／ｈｒ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．０）を含むバッファーで平衡化させる。１次溶出液をローディング後、カラムは平衡バッファーで１回洗浄し、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．０）を含む溶出バッファーを線形勾配で溶出させて２次溶出液を得た。
段階３：透析ろ過
段階４：ＴＭＡＥ、０．５ｘ２５ｃｍ（４ｍＬ）、ｖ＝１５０ｃｍ／ｈｒ、１０ｍＭトロールアミン（ｐＨ７．０）を含むバッファーで平衡化させる。２次溶出液をローディング後、カラムは平衡バッファーで１回洗浄し、１０ｍＭトロールアミン、１００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）を含む溶出バッファーを線形勾配で溶出させて３次溶出液を得た。
段階５：限外ろ過
段階６：セファクリルＳ−１００、１．６ｘ３０ｃｍ（６０ｍＬ）、ｖ＝３０ｃｍ／ｈｒ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）を含むバッファーで平衡化させる。３次溶出液をローディング後、平衡バッファーで単量体分画を溶出させて４次溶出液を得た。
【００９３】
前記得られた４次溶出液に対する異性体分布を図３に示した。図３にて、ＩｇＤ−ｈＧＨ−Ｈｉｓの理論的ｐＩ値は６．６５であるが、より低いものはＩｇＤ−ｈＧＨ−ＨｉｓがＯ−グリコシル化されており、このＯ−グリカンにシアル酸が結合してさらに酸性化されたことを意味する。
【００９４】
ＩｇＤ−ｈＧＨ−ＨｉｓをＱ−ＴＯＦ質量分析計で分析した結果を図４に示した（Ｙ軸：％；Ｘ軸：質量；ピーク上に表示された７〜２１の数値がＯ−グリカンの個数である）。図４のように、ＩｇＤ−ｈＧＨ−ＨｉｓにおいてＯ−グリカンは８個〜２１個まで分布しており、平均Ｏ−グリカン数は１４．７個であった。
【００９５】
１．１．３．ＩｇＡ−ｈＧＨ（ＡＨＡＡ）
実施例１．１．１で作製された組換えベクターｐＤＨＤＤ−Ｄ１Ｇ１中、３個のＩｇＤヒンジ（ｈＧＨのＮ末端側の１個およびＣ末端側の２個、計３個）のコード遺伝子がそれぞれＩｇＡ１ヒンジのコード遺伝子に代替されたことを除いて同一の構成を有するように組換えベクターｐＡＨＡＡ−Ｄ１Ｇ１を作製し、実施例１．１．１の方法と同一に発現させて、ＩｇＡ１ヒンジ（ＩｇＡ；配列番号２）−ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ；配列番号３）−ＩｇＡ１ヒンジ（ＩｇＡ；配列番号２）−ＩｇＡ１ヒンジ（ＩｇＡ；配列番号２）の構成を有する融合ポリペプチド（図１参照；以下、「ＩｇＡ−ｈＧＨ」と称する）を生産した。融合ポリペプチドＩｇＡ−ｈＧＨは、理論上２４個のＯ−グリカンを有する。前記組換えベクターの発現により生産された融合ポリペプチドＩｇＡ−ｈＧＨを、実施例１．１．１に記載の方法を参照して精製した。
【００９６】
精製されたＩｇＡ−ｈＧＨをＱ−ＴＯＦ質量分析計で分析した結果、ＩｇＡ−ｈＧＨにおける平均Ｏ−グリカン数は、画分３で１２．８個、画分４で１４．３個、画分５で１５．６個であった。
【００９７】
１．１．４．ＩｇＤ−ｈＧＨ−ＩｇＡ（ＤＨＡＡ）
実施例１．１．１で作製された組換えベクターｐＤＨＤＤ−Ｄ１Ｇ１をＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断した７５７４ｂｐのベクターに、ｐＤＨＤＤ−Ｄ１Ｇ１をＢａｍＨＩとＫａｓＩで切断した４８９ｂｐのインサートＩと、実施例１．１．３で使用された組換えベクターｐＡＨＡＡ−Ｄ１Ｇ１をＫａｓＩとＮｏｔＩで切断した３８３ｂｐのインサートＩＩとをライゲーションして、組換えベクターｐＤＨＤＤ−Ｄ１Ｇ１中の３個のＩｇＤヒンジ（ｈＧＨのＮ末端側の１個およびＣ末端側の２個、計３個）のコード遺伝子中の３’末端側の２個がＩｇＡ１ヒンジのコード遺伝子に代替されたことを除いて同一の構成を有するようにして、組換えベクターｐＤＨＡＡ−Ｄ１Ｇ１を作製した。前記組換えベクターｐＤＨＡＡ−Ｄ１Ｇ１を実施例１．１．１の方法と同一に発現させて、ＩｇＤヒンジ（ＩｇＤ；配列番号１）−ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ；配列番号３）−ＩｇＡ１ヒンジ（ＩｇＡ；配列番号２）−ＩｇＡ１ヒンジ（ＩｇＡ；配列番号２）の構成を有する融合ポリペプチド（図１参照；以下、「ＩｇＤ−ｈＧＨ−ＩｇＡ」と称する）を生産した。融合ポリペプチドＩｇＤ−ｈＧＨ−ＩｇＡは、理論上２３個のＯ−グリカンを有する。
【００９８】
１．１．５．ＩｇＡ−ｈＧＨ−ＩｇＤ（ＡＨＤＤ）
実施例１．１．１で作製された組換えベクターｐＤＨＤＤ−Ｄ１Ｇ１をＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断した７５７４ｂｐのベクターに、実施例１．１．３で使用されたｐＡＨＡＡ−Ｄ１Ｇ１をＢａｍＨＩとＫａｓＩで切断した４４４ｂｐのインサートＩと、実施例１．１．１で使用された組換えベクターｐＤＨＤＤ−Ｄ１Ｇ１をＫａｓＩとＮｏｔＩで切断した４７３ｂｐのインサートＩＩとをライゲーションして、３個のＩｇＤヒンジ（ｈＧＨのＮ末端側の１個およびＣ末端側の２個、計３個）のコード遺伝子中の５’末端側の１個がＩｇＡ１ヒンジのコード遺伝子に代替されたことを除いて同一の構成を有するようにして、組換えベクターｐＡＨＤＤ−Ｄ１Ｇ１を作製し、実施例１．１．１の方法と同一に発現させて、ＩｇＡ１ヒンジ（ＩｇＡ；配列番号２）−ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ；配列番号３）−ＩｇＤヒンジ（ＩｇＤ；配列番号１）−ＩｇＤヒンジ（ＩｇＤ；配列番号１）の構成を有する融合ポリペプチド（図１参照；以下、「ＩｇＡ−ｈＧＨ−ＩｇＤ」と称する）を生産した。融合ポリペプチドＩｇＡ−ｈＧＨ−ＩｇＤは、理論上２２個のＯ−グリカンを有する。
【００９９】
１．２．目的タンパク質：ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質（ＧＬＰ−１−Ｆｃ）
ＩｇＤヒンジ（ＥＳＰＫＡＱＡＳＳＶＰＴＡＱＰＱＡＥＧＳＬＡＫＡＴＴＡＰＡＴＴＲＮＴ；配列番号１）が目的ポリペプチド（ＧＬＰ−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１）−Ｆｃ融合タンパク質：ＧＬＰ−１−Ｆｃ）と融合した融合ポリペプチドデュラグルチド（Ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ）−ＩＤ（ＩｇＤのヒンジ領域１個を含む）とデュラグルチド−ＩＤ２（ＩｇＤのヒンジ領域２個を含む）（図５参照）を製造した。ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質は二量体として存在する。コードされるアミノ酸配列を下記の表４にまとめた。
【表４】
2021535746.tif 000018
【０１００】
１．２．１．Ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ−ＩＤ１
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ７９０−２０）の変形体であるＧＬＰ−１−Ｆｃを発現する発現ベクターｐＧＩｇ４（ＫＲ１０−１８６８１３９Ｂ１のプロモーターを含む））を鋳型として用い、表４のプライマーＩｇＧ４ｍＣＨ２＿ＦとＩｇＧ４ＩＤ＿Ｒを用いてＰＣＲを行って、６５９ｂｐの修飾ＩｇＧ４のＰＣＲ産物（ｍＩｇＧ４）を得た。そして、実施例１．１．１で製造されたｐＤＨＤＤ−Ｄ１Ｇ１を鋳型として用い、表４のプライマーＩｇＧ４ＩＤ＿ＦとＩＤ＿ＮｏｔＲを用いてＰＣＲを行って、１２９ｂｐ（ＩＤ１）と２３１ｂｐ（ＩＤ２）のＰＣＲ産物を得た。得られた６５９ｂｐのｍＩｇＧ４  ＰＣＲ産物と１２９ｂｐのＩＤ１  ＰＣＲ産物を精製後、これらを鋳型として用い、表５のプライマーＩｇＧ４ｍＣＨ２＿ＦとＩＤ＿ＮｏｔＲを用いてオーバーラッピングＰＣＲを行って、７７０ｂｐのＰＣＲ産物（「（Ｎ末端）−［Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＩｇＧ４  Ｆｃの一部（ＢｓｒＧＩ制限部位を含む）−ＩｇＤヒンジ（ＩｇＤＨ１；配列番号１）−ＮｏｔＩ制限部位］−（Ｃ末端）」をコードする遺伝子）を得た。
【表５】
2021535746.tif 000019
【０１０１】
実施例１．１．１で製造されたｐＤＨＤＤ−Ｄ１Ｇ１をＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断した７５７４ｂｐのベクターに、ｐＧＩｇ４をＢａｍＨＩとＢｓｒＧＩで切断した６０７ｂｐのインサートＩと、前記オーバーラッピングＰＣＲにより得られた７７０ｂｐのＰＣＲ産物をＢｓｒＧＩとＮｏｔＩで切断した４０３ｂｐのインサートＩＩとをライゲーションして、目的ポリペプチド（ＧＬＰ−１−Ｆｃ）と免疫グロブリン（ＩｇＤ）のヒンジ領域１個とを含む融合ポリペプチド（計３０９ａａ（シグナルペプチドを除く）；Ｏ−グリコシル化可能部位−計７個、二量体として存在するので、最終的に１４個）；以下、「デュラグルチド−ＩＤ１」と称する）の製造のための組換えベクターｐＧＩｇ４Ｄ−Ｄ１Ｇ１を用意した。
【０１０２】
１．２．２．デュラグルチド−ＩＤ２
実施例１．２．１で得られた６５９ｂｐのｍＩｇＧ４  ＰＣＲ産物と２３１ｂｐのＩＤ２  ＰＣＲ産物を鋳型とし、表４のプライマーＩｇＧ４ｍＣＨ２＿ＦとＩＤ＿ＮｏｔＲを用いてオーバーラッピングＰＣＲを行って、８８２ｂｐのＰＣＲ産物（「（Ｎ末端）−［Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＩｇＧ４  Ｆｃの一部（ＢｓｒＧＩ制限部位を含む）−ＩｇＤヒンジ（ＩｇＤＨ１；配列番号１）−ＩｇＤヒンジ（ＩｇＤＨ１；配列番号１）−ＮｏｔＩ制限部位］−（Ｃ末端）」をコードする遺伝子）を得た。
【０１０３】
実施例１．１．１で製造されたｐＤＨＤＤ−Ｄ１Ｇ１をＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断した７５７４ｂｐのベクターに、ｐＧＩｇ４をＢａｍＨＩとＢｓｒＧＩで切断した６０７ｂｐのインサートＩと、前記オーバーラッピングＰＣＲにより得られた８８２ｂｐのＰＣＲ産物をＢｓｒＧＩとＮｏｔＩで切断した５０５ｂｐのインサートＩＩとをライゲーションして、目的ポリペプチド（ＧＬＰ−１−Ｆｃ）と免疫グロブリン（ＩｇＤ）のヒンジ領域２個とを含む融合ポリペプチド（計３４３ａａ（シグナルペプチドを除く）；Ｏ−グリコシル化可能部位−計１４個、二量体として存在するので、最終的に２８個）；以下、「デュラグルチド−ＩＤ２」と称する）の製造のための組換えベクターｐＧＩｇ４ＤＤ−Ｄ１Ｇ１を用意した。
【０１０４】
前記組換えベクターの発現により生産された融合ポリペプチドデュラグルチド−ＩＤ２を精製し、ＩＥＦ（等電点電気泳動）分析およびＱ−ＴＯＦ質量分析計を用いてＯ−グリカン部位占有率を分析した。
【０１０５】
具体的には、物質のＦｃ領域を活用してタンパク質Ａ親和クロマトグラフィーによりタンパク質を分離精製した後、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ａｎｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）と疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を順次に行って精製した。
【０１０６】
培養液を０．２２ｕｍのろ過膜を用いてろ過し、平衡バッファー（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）で平衡化されたタンパク質Ａアフィニティー樹脂に注入後、平衡バッファーで洗浄した。洗浄後、溶出バッファー（１００ｍＭクエン酸ナトリウム  ｐＨ３．５）でタンパク質を溶出させ、ピークを収集した。
【０１０７】
収集された溶出液は２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０でバッファー交換を実施した。
【０１０８】
バッファー交換が完了した試料は陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入して精製した。
【０１０９】
使用された平衡バッファーと溶出バッファーはそれぞれ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０であった。平衡バッファーと溶出バッファーをそれぞれＡ及びＢ  ｃｈａｎｎｅｌとして用いて、濃度勾配条件でタンパク質を溶出させ、ピークを収集した。
【０１１０】
収集されたタンパク質溶液は疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｂｕｔｙｌ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて追加精製した。
【０１１１】
使用された平衡バッファーと溶出バッファーはそれぞれ０．１Ｍリン酸ナトリウム  ｐＨ６．０、１．８硫酸アンモニウム、ｐＨ８．０、０．１Ｍリン酸ナトリウム  ｐＨ６．０であった。平衡バッファーと溶出バッファーをそれぞれＡ及びＢ  ｃｈａｎｎｅｌとして用いて、濃度勾配条件でタンパク質を溶出させ、ピークを収集した。
【０１１２】
前記収集されたピークをＩＥＦ（等電点電気泳動）で分析して得られたデュラグルチド−ＩＤ２の異性体分布を図６に示した。図６にて、デュラグルチド−ＩＤ２の理論的ｐＩ値は５．７８であるが、画分＃３の場合、これより低いものはデュラグルチド−ＩＤ２がＯ−グリコシル化されており、このＯ−グリカンにシアル酸が結合してさらに酸性化されたことを意味する。
【０１１３】
デュラグルチド−ＩＤ２  画分＃３をＱ−ＴＯＦ質量分析計で分析した結果、最大２６個までＩＤ可能であり、平均Ｏ−グリカン数は１７．５個であった。
【０１１４】
最終的に精製されたタンパク質溶液は、Ｔｒｕｌｉｃｉｔｙと同一の賦形剤成分（クエン酸ナトリウム水和物：２．７４ｍｇ／ｍＬ、無水クエン酸：０．１４ｍｇ／ｍＬ、Ｄ−マンニトール：４６．４ｍｇ／ｍＬ、ポリソルベート８０：０．２０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０−７．０）でバッファー交換を実施し濃縮して、動物ＰＫ試験の試験物質として用いた。
【０１１５】
実施例２：融合ポリペプチドの薬物動態学的特性（ＰＫ  Ｐｒｏｆｉｌｅ）試験（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
２−１．目的タンパク質：ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）
実施例１．１で用意された融合ポリペプチドＩｇＤ−ｈＧＨ、ＩｇＤ−ｈＧＨ−Ｈｉｓ、ＩｇＡ−ｈＧＨ  Ｆ３（実施例１．１．３の画分３）、ＩｇＡ−ｈＧＨ  Ｆ４（実施例１．１．３の画分４）、およびＩｇＡ−ｈＧＨ  Ｆ５（実施例１．１．３の画分５）を、ＳＤ  Ｒａｔ（オリエンタルバイオ、７週齢、約３００ｇ；ｎ＝３）に２ｍｇ／ｋｇの量で皮下投与して薬物動態試験を行った。サンプリングは０、０．５、１、２、４、６、８、２４、４８時間に行い、比較のために、前記と同様の方法でｈＧＨ（ユートロピン、ＬＧ化学）を２ｍｇ／ｋｇの量で皮下投与して試験した。
【０１１６】
前記のようにＳＤラットに投与した後、時間点別に採取した血液を遠心分離して血清を得て、ヒト成長ホルモンＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＥＬＩＳＡを行って、時間点別の血液内のｈＧＨおよび融合ポリペプチド（ＩｇＤ−ｈＧＨ、ＩｇＤ−ｈＧＨ−Ｈｉｓ、ＩｇＡ−ｈＧＨ  ＦＰ３、ＩｇＡ−ｈＧＨ  ＦＰ４およびＩｇＡ−ｈＧＨ  ＦＰ５）の濃度を確認した。この資料を用いて、ＰＫ分析用ソフトウェア（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｃｅｒｔａｒａ  Ｌ．Ｐ．）など）を用いてＡＵＣ（ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ）を含むパラメーターの値を求めた。
【０１１７】
２−１−１．ｈＧＨ  ｖｓ．ＩｇＤ−ｈＧＨ
ｈＧＨとＩｇＤ−ｈＧＨのＰＫ結果を表６および図７に示した。
【表６】
2021535746.tif 000020
【０１１８】
表６と図７から確認されるように、ヒンジ領域と融合したｈＧＨ（ＩｇＤ−ｈＧＨ）は、ヒンジ領域と融合しないｈＧＨと比較して、半減期が約３．３倍増加したことを確認できる。
【０１１９】
２−１−２．ｈＧＨ  ｖｓ．ＩｇＤ−ｈＧＨ−Ｈｉｓ
ｈＧＨとＩｇＤ−ｈＧＨ−ＨｉｓのＰＫ結果を表７と図８に示した。
【表７】
2021535746.tif 000021
【０１２０】
表７と図８から確認されるように、Ｈｉｓ−Ｔａｇがあるヒンジ領域と融合したｈＧＨ（ＩｇＤ−ｈＧＨ−Ｈｉｓ）は、ヒンジ領域と融合しないｈＧＨと比較して、半減期が約２．６倍増加したことを確認できる。
【０１２１】
２−１−３．ＩｇＡ−ｈＧＨ（Ｏ−グリカンの数によるＰＫへの影響）
Ｏ−グリカンの数によるＰＫへの影響をみるために、ＩｇＡ−ｈＧＨ画分別のＰＫの結果を表８と図９に示した。
【表８】
2021535746.tif 000022
【０１２２】
表８と図９から確認されるように、Ｏ−グリカンの数が増加するにつれて半減期が増加することが分かる。
【０１２３】
２−２．目的タンパク質：ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質（ＧＬＰ−１−Ｆｃ、デュラグルチド）
実施例１．２で用意された融合ポリペプチドデュラグルチド−ＩＤ２を、ＳＤラット（オリエンタルバイオ、７週齢、約３００ｇ；ｎ＝３）に０．１ｍｇ／ｋｇの量で皮下投与して薬物動態試験を行った。サンプリングは０、０．５、１、２、４、６、８、２４、４８、９６、そして１４４時間に行い、比較のために、前記と同様の方法でデュラグルチド（トルリシティ、韓国リリー）を０．１ｍｇ／ｋｇの量で皮下投与して試験した。
【０１２４】
前記のようにＳＤラットに投与した後、時間点別に採取した血液を遠心分離して血清を得て、ＧＬＰ−１抗体（ＮｏｖｏｕｓＢｉｏ）と抗ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてＥＬＩＳＡを行って、時間点別の血液内のデュラグルチドおよび融合ポリペプチドデュラグルチド−ＩＤ２の濃度を確認した。この資料を用いて、ＰＫ分析用ソフトウェア（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｃｅｒｔａｒａ  Ｌ．Ｐ．）など）を用いてＡＵＣ（ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ）を含むパラメーターの値を求めた。
【０１２５】
前記得られた結果を表９と図１０に示した。
【表９】
2021535746.tif 000023
【０１２６】
表９と図１０から確認されるように、ヒンジ領域と融合したＧＬＰ−１−Ｆｃ（Ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ−ＩＤ２）は、ヒンジ領域と融合しないデュラグルチドと比較して、半減期が約１．５倍増加したことを確認できる。また、Ｃｍａｘは約１／５水準であり、ＡＵＣｌａｓｔは約１／３水準であった。
【０１２７】
以上の説明から、本発明の属する技術分野における当業者は、本発明がその技術的な思想や必須の特徴を変更することなく他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。これに関連して、以上に述べた実施例はあらゆる面で例示的なものであり、限定的ではないと理解しなければならない。本発明の範囲は、上記の詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味および範囲、そしてその等価概念から導出されるあらゆる変更または変形した形態が本発明の範囲に含まれると解釈されなければならない。
【図１】
2021535746.tif 000024
【図２】
2021535746.tif 000025
【図３】
2021535746.tif 000026
【図４】
2021535746.tif 000027
【図５】
2021535746.tif 000028
【図６】
2021535746.tif 000029
【図７】
2021535746.tif 000030
【図８】
2021535746.tif 000031
【図９】
2021535746.tif 000032
【図１０】
2021535746.tif 000033
【配列表】
2021535746000001.app
【国際調査報告】
2021535746.tif 000034
2021535746.tif 000035
2021535746.tif 000036
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2021535746.tif 000039
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