(57)【要約】  本発明は、シアニン修飾テロデンドリマー、そのナノ粒子、及び、該ナノ粒子を使用して癌などの様々な疾患を治療する方法を提供する。
2021535258.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2021535258.tif 000014
（上式中、ＰＥＧは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーであり、各ＰＥＧポリマーは分子量が１〜１００ｋＤａであり、
各Ｘは枝分かれモノマー単位であり、
各Ｒ1は独立してコール酸又はコール酸誘導体であり、そして
各Ｒ2は独立してシアニンである）
の化合物。
【請求項２】
Ｘはジアミノカルボン酸である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
各ジアミノカルボン酸は、２，３−ジアミノプロパン酸、２，４−ジアミノブタン酸、２，５−ジアミノペンタン酸（オルニチン）、２，６−ジアミノヘキサン酸（リジン）、（２−アミノエチル）−システイン、３−アミノ−２−アミノメチルプロパン酸、３−アミノ−２−アミノメチル−２−メチルプロパン酸、４−アミノ−２−（２−アミノエチル）酪酸及び５−アミノ−２−（３−アミノプロピル）ペンタン酸からなる群より独立して選ばれる、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
各ジアミノカルボン酸はリジンである、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
各Ｒ1は、独立して、コール酸、（３α，５β，７α，１２α）−７，１２−ジヒドロキシ−３−（２，３−ジヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸（ＣＡ−４ＯＨ）、（３α，５β，７α，１２α）−７−ヒドロキシ−３,１２−ジ（２，３−ジヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸（ＣＡ−５ＯＨ）又は（３α，５β，７α，１２α）−７,１２−ジヒドロキシ−３−（３−アミノ−２−ヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸（ＣＡ−３ＯＨ−ＮＨ2）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
各Ｒ1はコール酸である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
各Ｒ2は、独立して、シアニン３、シアニン３．５、シアニン５、シアニン５．５、シアニン７、シアニン７．５、インドシアニングリーン、又は、構造（Ｓ１）：
【化２】
2021535258.tif 000015
を有するインドシアニングリーン誘導体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
各Ｒ2は構造（Ｓ１）を有するシアニンである、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
各ＰＥＧは分子量が５ｋＤａであり、
各Ｘはリジンであり、
各Ｒ1はコール酸であり、そして
各Ｒ2は構造（Ｓ１）を有するシアニンである、請求項７又は８に記載の化合物。
【請求項１０】
複数の第一のコンジュゲートを含むナノ粒子であって、各第一のコンジュゲートは、独立して、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物であり、
前記複数のコンジュゲートは、水性溶媒中で自己集合してナノ粒子を形成し、その結果、疎水性コアがナノ粒子の内部に形成され、ここで、各コンジュゲートのＰＥＧはナノ粒子の外部上で自己集合する、ナノ粒子。
【請求項１１】
複数の第二のコンジュゲートをさらに含み、各第二のコンジュゲートは、独立して、式(ＩＩ):
【化３】
2021535258.tif 000016
（上式中、ＰＥＧはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)ポリマーであり、各ＰＥＧポリマーは分子量が１〜１００ｋＤａであり、
各Ｘは枝分かれモノマー単位であり、
各Ｙはチオール含有架橋性基であり、
各Ｌは連結基であり、そして
各Ｒ1は独立してコール酸又はコール酸誘導体である）の化合物である、請求項１０に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
各第一のコンジュゲートは請求項９に記載のコンジュゲートである、請求項１０〜１１のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
各第二のコンジュゲートは式（ＩＩ）の化合物であり、式中、
各ＰＥＧは分子量が５ｋＤａであり、
各Ｘはリジンであり、
各Ｙはシステインであり、
各Ｌは、下記式：
【化４】
2021535258.tif 000017
を有する連結基であり、そして、
各Ｒ1はコール酸である、請求項１１又は１２に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
式（ＩＩ）のコンジュゲートは、チオール含有架橋性基を介して架橋されている、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のコンジュゲートは約１：１（ｗ／ｗ）の比である、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
前記ナノ粒子の平均直径は約２０ｎｍである、請求項１５に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
前記疎水性コア中に治療薬をさらに含む、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１８】
前記治療薬はガルジキモド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、パクリタキセル、ＳＮ-３８、イミキモド、レシキモド、モトリモド、レナリドミド、ポマリドミド、及び、構造（Ｓ２）：
【化５】
2021535258.tif 000018
を有するＬＬＳ３０からなる群より選ばれる、請求項１７に記載のナノ粒子。
【請求項１９】
疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に対して、治療有効量の請求項１０〜１８のいずれか１項に記載のナノ粒子を投与することを含む方法。
【請求項２０】
前記疾患は癌である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記疾患は、乳癌、口腔癌、子宮頸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、膀胱癌、脳癌、黒色腫、骨髄腫、白血病、結腸癌、前立腺癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部癌、リンパ腫又は転移性癌である、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記疎水性コア中に治療薬をさらに含み、前記治療薬はドキソルビシン、ガルジキモド及びイミキモドからなる群より選ばれる、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記治療薬はイミキモドであり、チェックポイント遮断抗体を投与することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記チェックポイント遮断抗体は抗ＰＤ−１、抗ＰＤＬ１又は抗ＣＴＬＡ−４である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記チェックポイント遮断抗体は抗ＰＤ−１である、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
光熱療法を介して疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に対して、治療有効量の請求項１０〜１８のナノ粒子を投与し、前記対象を放射線に曝露し、それにより光熱療法を介して疾患を治療することを含む方法。
【請求項２７】
前記対象は近赤外線光照射に暴露される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記疾患は癌である、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記疾患は、乳癌、口腔癌、子宮頸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、膀胱癌、脳癌、黒色腫、骨髄腫、白血病、結腸癌、前立腺癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部癌、リンパ腫又は転移性癌である、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記疎水性コア中に治療薬をさらに含み、前記治療薬はドキソルビシン、ガルジキモド及びイミキモドからなる群より選ばれる、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記治療薬はイミキモドであり、注射を介して抗ＰＤ−１を投与することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
病変組織を患っている対象を治療する方法であって、
ナノ粒子が前記病変組織に集中するように、有効量の請求項１０〜１８のいずれか１項のナノ粒子を対象に対して投与すること、
前記病変組織を特定するために、前記病変組織に第一の波長で照射すること、及び、
前記対象から前記病変組織を除去し、それによって前記対象を治療すること、
を含む、方法。
【請求項３３】
前記投与工程の少なくとも３時間後に照射工程を遅らせることをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記対象における任意の残存病変組織を第二の波長で照射することをさらに含む、請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記除去及び両方の照射工程は前記対象に対する単一の操作中に実施される、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第一の波長及び第二の波長は近赤外スペクトルにある、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記病変組織は癌である、請求項３２〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記病変組織は、乳癌、口腔癌、子宮頸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、膀胱癌、脳癌、黒色腫、骨髄腫、白血病、結腸癌、前立腺癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部癌、リンパ腫又は転移性癌である、請求項３２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記病変組織は卵巣癌である、請求項３２〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
撮像方法であって、
それを必要とする対象に対して、有効量の請求項１０〜１８のいずれか１項に記載のナノ粒子を投与すること、及び、
前記対象を撮像すること、
を含む、方法。
【請求項４１】
請求項１０〜１８のいずれか１項に記載のナノ粒子を調製する方法であって、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の複数の第一のコンジュゲート及び水溶液を含む反応混合物を形成することを含み、前記コンジュゲートは自己集合してナノ粒子を形成し、その結果、疎水性コアが前記ナノ粒子の内部に形成され、ここで、各コンジュゲートのＰＥＧは前記ナノ粒子の外部上で自己集合する、方法。
【請求項４２】
前記反応混合物は、式(ＩＩ):
【化６】
2021535258.tif 000019
（上式中、ＰＥＧはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)ポリマーであり、各ＰＥＧポリマーは分子量が１〜１００ｋＤａであり、
各Ｘは枝分かれモノマー単位であり、
各Ｙはチオール含有架橋性基であり、
各Ｌは連結基であり、そして
各Ｒ1は独立してコール酸又はコール酸誘導体である）の、複数の第二のコンジュゲートをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記水溶液はＰＢＳを含み、前記方法は、前記反応混合物を約１０分間超音波処理することをさらに含む、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のコンジュゲートは約１：１（ｗ／ｗ）の比率で添加される、請求項４２又は４３に記載の方法。
【請求項４５】
架橋結合はシステインの酸化を介して形成される、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１８年８月３１日に出願された米国仮出願第６２/７２５，５４０号の優先権を主張し、その内容の全体を参照により本明細書に取り込む。
【０００２】
連邦政府が後援する研究開発下で行われた発明に対する権利に関する声明
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって授与された助成金番号２Ｒ０１ＣＡ１１５４８３−０６、Ｒ０１ＥＢ０１２５６９及びＵＪ０１ＣＡ１９８８８０の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景s
強力で制御可能な光学特性を有する近赤外光熱変換剤（ＰＴＣＡ）は、バイオセンシング、バイオイメージング及び治療用途のための有望な薬剤として出現した。ＰＴＣＡを使用した光トリガー光熱療法（Light-triggered photothermal therapy）（ＰＴＴ）は、局所癌治療に幾つかの治療上の利点を示している。これらとしては、高い空間分解能、改善された標的選択性、低から中程度の有害な副作用、手術を必要としない非侵襲性、迅速で効果的な治療、無視できる薬剤耐性及び比較的低コストが挙げられる。
【０００４】
今日まで、ＰＴＴのための多くの近赤外ＰＴＣＡは、ポルフィリン、フタロシアニン、クロリンｅ６（Ｃｅ６）、金ベースのナノ材料、カーボンナノチューブ及びグラフェン酸化物などの薬剤を使用して、様々な腫瘍モデルで調査されてきた。幾つかの従来のシアニン染料はまた、診療所での光媒介生物医学的応用のための中間体として使用されてきた。例えば、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された唯一の近赤外線剤であるインドシアニングリーン（ＩＣＧ）は、心拍出量、肝機能及び血流を測定するために、また、眼血管造影において、臨床翻訳及び実用化のために有機小分子色素を使用する可能性を強調する光学コントラストとして臨床的に広く使用されている。しかしながら、これらのＰＴＣＡの大部分は、ＰＴＴ臨床翻訳において依然として重大な課題に直面している。これらとしては、低い生体適合性（無機ナノ剤など）、低い光熱変換効率、及び、固有の低い安定性（インビボでの腎臓又は肝臓からの急速なクリアランス、及び、小分子色素などの光退色に対する低い耐性）が挙げられる。光熱変換効率を改善するための最も重要な前提条件は、標的組織での光吸収を増加させ、非熱エネルギーの形でエネルギーを放出する励起光変換剤を制限することである。近赤外光ははるかに深い組織に侵入し、血液及び組織への干渉を制限し、正常組織への光損傷を減らし、光子組織の減衰を抑えることができるため、近赤外調査ウィンドウ（＞８００ｎｍ）に強い吸収性を有する効率的なＰＴＣＡが好ましい。光熱変換効率を高めるための追加の方策は、標的腫瘍部位でのＰＴＣＡのギャザー密度/構造及び光吸収断面積を増やすことである。
【０００５】
生体適合性光熱ナノ材料を使用して、ポルフィリン、Ｃｅ６又はＩＣＧなどの有機小分子を物理的にカプセル化して、これらの小分子色素の薬物動態及び腫瘍標的化効率を改善することに関する多くの最近の報告がある。しかしながら、このクラスの光熱材料の光熱変換効率は、励起波長が短いため（例えば、ポルフィリン又はＣｅ６の場合は６５０ｎｍ）、したがって、組織への侵入及び循環リークが少ないために低くなる。ポリマー及び高分子ベースのＰＴＣＡは、一般に、有機小分子ＰＴＣＡ又はそれらのナノ製剤よりも優れた光安定性を備えており、特にＰＴＣＡがナノ粒子（ＮＰ）に自己集合した後はより安定している。これらの結果として生じるナノ構造は、循環リーク及び腎臓又は肝臓からの急速なクリアランスをある程度回避する。過去１０年間において、ビルディングブロックとして線形ＰＥＧ及び樹枝状コール酸をベースとする両親媒性ポリマー（別名テロデンドリマー）を含む２５〜５０ｎｍのミセルナノプラットフォームは開発された。数年前、コール酸及びポルフィリンを含むハイブリッドテロデンドリマーの開発が報告され、これは、自己集合して、好ましい光熱特性を備えたミセルナノポルフィリンを形成することができる。
【０００６】
一般に、ＰＴＴの用途は、光照射にアクセス可能な限局性腫瘍の治療に限定されている。また、ＰＴＴは、手術中に患者の腫瘍部位が露出されたときに腫瘍床を治療するために術中に使用される可能性もある。ＰＴＴと組み合わせた同時化学療法は潜在的に相乗性がある可能性がある。転移性腫瘍に関して、腫瘍部位での局所的な光熱効果が全身性の抗腫瘍免疫応答を活性化する可能性があるため、ＰＴＴは免疫療法と組み合わせて与えられると有用である可能性がある。チェックポイント遮断抗体で治療された一部の患者では、耐久性のある臨床反応が見られた。免疫チェックポイントとしてプログラムされた細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）は、リンパ節の抗原特異的Ｔ細胞のアポトーシスを促進すると同時に、制御性Ｔ細胞のアポトーシスを減少させるという二重のメカニズムを通じて自己免疫からガードすることはよく知られている。ＰＤ−１チェックポイント方策を目的とした免疫療法は、遠位転移腫瘍に対する有望な治療アプローチと考えられる。有望ではあるが、ＰＤ−１チェックポイント遮断ベースの免疫療法は制限された応答速度（約２０％）を有し、腫瘍にＴ細胞が事前に浸潤している患者にのみ効果がある。したがって、免疫療法を他の効率的な治療アプローチと組み合わせた相乗的治療戦略は癌治療の現在の傾向となってきた。最近の研究により、ＰＴＴは、アポトーシス及び壊死を誘発することにより、レーザー照射時に腫瘍細胞を直接殺すことができるだけでなく、切除された腫瘍細胞残留物から腫瘍関連剤を生成することにより、全身免疫療法効果を改善するための抗腫瘍免疫応答を生成できることが発見された。このような効果は、予備的な臨床試験研究でも観察されてきた。
【０００７】
本明細書では、癌治療のための高性能ＰＴＣＡ及び制御デリバリーシステムとしての新規なテロデンドリマーをベースとする光熱ナノ粒子が報告されている。同所性ＯＳＣ−３口腔癌異種移植片及び転移性４Ｔ１同系乳癌モデルを研究して、ＰＴＴ/化学療法及びＰＴＴ/免疫療法の組み合わせによる相乗効果をそれぞれ評価した（図１）。この光熱ナノ粒子は、線形ＰＥＧブロック（Ｍｒ≒５０００）、４つの樹枝状疎水性光熱変換剤（インドシアニングリーン誘導体、ＩＣＧＤ）及び４つの樹枝状コール酸（ＣＡ）である顔用両親媒性物質を含む新しいタイプのハイブリッドテロデンドリマー（ＰＥＧ5K−ＣＡ4−ＩＣＧＤ4、ＰＣＩ）に由来する。ナノ粒子の安定性及び熱変換効率をさらに高めるために、ＰＥＧ、４つのシステイン、８つの親水性リンカー及び８つのコール酸を含む別のテロデンドリマー（ＰＥＧ5K−Ｃｙｓ4−Ｌ8−ＣＡ8、ＰＣＬＣ）をＰＣＩに１：１の比率で添加し、そしてミセルを形成するために中性環境の下で一緒に組織化させた。最終的なジスルフィド架橋ミセルナノシステム（ＣＰＣＩ−ＮＰ）（図２ａ）は、理想的なより小さなサイズ、より長いインビボ循環時間、優先的な腫瘍ターゲティング及びより深い腫瘍侵入を備えた。腫瘍反応を増強するために、ドキソルビシンをナノシステムに組み込み、同所性ＯＳＣ−３口腔癌異種移植モデルに対する光熱/化学療法の組み合わせを評価した。さらに、強力な免疫アゴニストであるイミキモドを装填したＣＰＣＩナノプラットフォームを、４Ｔ１同系乳癌モデルに対する強力な光免疫療法としてＰＤ−１チェックポイント抗体と組み合わせて適用することを検討した。
【発明の概要】
【０００８】
発明の簡単な要約
１つの実施形態において、本発明は、式（Ｉ）：
【化１】
2021535258.tif 000003
(上式中、ＰＥＧはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーであり、各ＰＥＧポリマーは分子量が１〜１００ｋＤａであり、各Ｘは枝分かれモノマー単位であり、各Ｒ1は独立してコール酸又はコール酸誘導体であり、各Ｒ2は独立してシアニンである)の化合物を提供する。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、複数の第一のコンジュゲートを含むナノ粒子を提供し、ここで、各第一のコンジュゲートは、独立して、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物であり、複数のコンジュゲートは、水性溶媒中で自己集合してナノ粒子を形成し、その結果、疎水性コアはナノ粒子の内部に形成され、各コンジュゲートのＰＥＧはナノ粒子の外部上で自己集合する。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、疾患を治療する方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に対して、治療有効量の本発明のナノ粒子を投与することを含む。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、光熱療法を介して疾患を治療する方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に対して、治療有効量の本発明のナノ粒子を投与し、前記対象を放射線に暴露して、それによって光熱療法を介して疾患を治療することを含む。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、病変組織を患っている対象を治療する方法を提供し、この方法は、ナノ粒子が病変組織に集中するように、対象に対して有効量の本発明のナノ粒子を投与すること、病変組織を特定するために、病変組織を第一の波長で照射すること、及び、対象から病変組織を除去し、それによって対象を治療することを含む。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、撮像方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に対して、有効量の本発明のナノ粒子を投与すること、及び、対象を撮像することを含む。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のとおりの式（Ｉ）の複数の第一のコンジュゲートを含む反応混合物を形成することを含む、本発明のナノ粒子を調製する方法を提供し、コンジュゲートは、疎水性コアがナノ粒子の内部に形成されるようにナノ粒子を形成するように自己集合させ、各コンジュゲートのＰＥＧはナノ粒子の外部上で自己集合する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、高性能光熱療法ナノメディシン（ＣＰＩＣ ＮＰ）を上皮内口腔癌に対して化学療法と組み合わせ、転移性乳癌に対して免疫療法と組み合わせることの概略図を示す。
【図２】図２は、ＰＣＩＮＰ及びＣＰＩＮ ＮＰの設計及び特性化を示す。（ａ）ＰＣＩＮＰ及びＣＰＣＩＮＰの自己集合の概略図、（ｂ）メタノール中のＩＣＧＤ分子及びＰＣＩテロデンドリマーのＵＶ−ｖｉｓ−ＮＩＲ吸収スペクトル、（ｃ）ＰＣＩ ＮＰ及び（ｄ）ＣＰＣＩ ＮＰのＰＢＳ溶液（ホスホタングステン酸で染色、テロデンドリマー濃度：1 ｍｇ ｍＬ-1）のＤＬＳ及びＴＥＭイメージング、（ｅ）ＳＤＳでのＰＣＩＮＰ及びＣＰＣＩＮＰの１２０分間の連続動的光散乱測定、その後ＧＳＨ（１０ｍＭ）を添加、（ｆ）８０８ｎｍで３００秒間のレーザー照射下でのＣＰＣＩＮＰ、ＰＣＩ ＮＰ及びＧＮＲの光熱変換挙動の比較（ＩＣＧＤ濃度：３０μｇ ｍＬ-1、ＧＮＲ濃度：１８μｇ ｍＬ-1）、（ｇ）５回の加熱−冷却プロセス中のＰＢＳ溶液中のＣＰＣＩ ＮＰ、ＰＣＩ ＮＰ及びＩＣＧの光退色防止特性（ＩＣＧＤ及びＩＣＧ濃度：３０μｇ ｍＬ-1）。
【図３】図３は、高い光熱変換効率を有するＣＰＩＮ ＮＰのメカニズム分析を示している。 ７３５/２０ｎｍの励起バンドパスフィルタを使用した、ＳＤＳ又はＧＳＨ＋ＳＤＳの非存在下及び異なる濃度のＳＤＳ又はＧＳＨ＋ＳＤＳの存在下での（ａ）ＰＣＩ ＮＰ及び（ｂ）ＣＰＣＩ ＮＰ溶液（１０ μＬ）の近赤外蛍光イメージング。ＰＣＩ ＮＰ（ｃ）＆（ｅ）及びＣＰＣＩ ＮＰ（ｄ）＆（ｆ）の熱画像及び定量的温度変化曲線。結果を平均±ｓ.ｄ（ｎ=３）として表した。ＮＩＲレーザー（８０８ｎｍ）を０．８Ｗｃｍ-2で２０秒間照射した後、サーマルカメラで温度をモニターした。（ｇ）類似の機器及び（ｈ）侵入深さ及び熱効果を調査するための８０８ｎｍ（０．８Ｗｃｍ-2で３０秒間）のレーザー照射下でのＣＰＣＩＮＰ及びＰＣＬＣ/ＴＢＡＩ＆ＩＣＧＮＰの温度変化。
【図４】図４は、インビトロでのＣＰＣＩ／ＤＯＸ ＮＰの特性化、及び、ＯＳＣ−３口腔癌細胞に対するＣＰＣＩ／ＤＯＸ ＮＰ＋８０８ｎｍレーザーの相乗的細胞毒性を示している。（ａ）ＣＰＣＩ/ＤＯＸＮＰの自己集合及びＣＰＣＩ/ＤＯＸＮＰからのＤＯＸ放出の概略図、（ｂ）１０％ＦＢＳを含む/含まないｐＨ７．４のＰＢＳ溶液中のＣＰＣＩ/ＤＯＸ ＮＰの血清安定性を動的光散乱法で測定した（インキュベーション温度：３７℃;データは平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝３）、（ｃ）ＤＯＸ蛍光強度の変化及び（ｄ）ＰＢＳ、ＧＳＨ（１０ｍＭ）及び８０８ ｎｍレーザー（０．８Ｗｃｍ-2、２分、３回）＋ＧＳＨ（１０ｍＭ）でのＣＰＣＩ/ＤＯＸＮＰ水溶液のインビトロの定量的ＤＯＸ放出（ＤＯＸ濃度：０．０５ ｍｇ ｍＬ-1;データは３つの並行サンプルの平均±ｓ．ｄ．）、（ｅ）ＯＳＣ−３口腔癌細胞株におけるＤＯＸ（赤）を装填したＣＰＣＩ ＮＰ（緑）の取り込み。細胞をヘキスト３３３４２（青）で３０分間前処理して核を染色した後に、ＰＢＳ中のＣＰＣＩ/ＤＯＸＮＰとともにインキュベートした。Ｄｅｌｔａｖｉｓｉｏｎデコンボリューション顕微鏡（スケールバー＝５μｍ）を使用して６時間後に画像を取得した。（ｆ）ＮＩＲレーザー照射（０．８Ｗｃｍ-2、２分）を用い又は用いずにＣＰＣＩ ＮＰとともにインキュベートしたＯＳＣ−３口腔細胞の生存率（ｎ＝３）、（ｇ）細胞生存率及び（ｈ）異なる処理後のＯＳＣ−３口腔細胞のＤｉＯ/ＰＩによる生/死染色：ＣＰＣＩ ＮＰ、８０８ｎｍレーザー照射、遊離ＤＯＸ、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ ＮＰ、８０８ｎｍレーザー照射とともにＣＰＣＩＮＰ、５０ μｇｍＬ-1のＣＰＣＩＮＰ濃度で８０８ｎｍレーザー照射とともにＣＰＣＩ/ＤＯＸＮＰ、スケールバー＝２５μｍ、（ｉ）相乗的治療効果及び（ｊ）ＯＳＣ−３口腔細胞治療のためのＤＯＸ及びＣＰＣＩＮＰ＋レーザーの間の組み合わせ指数。
【図５】図５は、インビボでのＣＰＣＩ／ＤＯＸ ＮＰ腫瘍画像を示す。（ａ）ＣＰＣＩ ＮＰ、ＰＣＬＣ/ＴＢＡＩ＆ＩＣＧ ＮＰ及び遊離ＩＣＧの５ｍｇ ｋｇ-1体重の用量でのインビボ血液除去動態（各群でｎ＝３）。結果は平均±ｓ．ｄ．として表された。（ｂ）尾静脈注射後の異なる時点での腫瘍蓄積を示すＩＣＧＤ蛍光画像及び（ｃ）ＣＰＣＩ/ＤＯＸ ＮＰの静脈内注射（ＤＯＸ用量：２．５ ｍｇ ｋｇ-1;総テロデンドリマー用量：５０ｍｇｋｇ-1; ＩＣＧＤ用量：７ ｍｇｋｇ-1）の後のＧＦＰによって標識された上皮内ＯＳＣ−３口腔癌を有するヌードマウスの代表的なインビボ画像。赤い矢印は腫瘍部位を指している。（ｄ）同じ動物から注射後４８時間で切除された臓器及び腫瘍の代表的なエクスビボＩＣＧＤ蛍光画像、（ｅ）レーザー走査型共焦点顕微鏡によって観察された注射後４８時間でのＯＳＣ−３腫瘍組織におけるＣＰＣＩ/ＤＯＸＮＰの分布の画像。赤：ＤＯＸ;緑：ＩＣＧＤ、（ｆ）ＣＰＣＩ/ＤＯＸＮＰの注射後４８時間での臓器及び腫瘍内のＩＣＧＤの蛍光シグナル強度、（ｇ）誘導結合プラズマ質量分析（ICP−MS、Agilent Techologies, 7500ce）により測定された、ＣＰＣＩ/ＤＯＸＮＰの注射後２４時間、４８時間及び５日での上皮内ＯＳＣ−３口腔癌の臓器及び腫瘍組織におけるＤＯＸ分布、各時点の実験で３匹のマウスを使用した。マウスは、ＤＯＸ ２．５ ｍｇｋｇ-1の用量でＣＰＣＩ/ＤＯＸＮＰを受けた。結果は平均±ｓ.ｄ.として表された。
【図６】図６は、上皮内ＯＳＣ−３口腔癌を有するマウスにおけるＰＴＴ／化学療法の相乗的抗腫瘍活性を示している。（ａ）ＩＲ熱画像及び（ｂ）ＰＢＳ、ＰＣＩ ＮＰ、ＣＰＣＩ ＮＰ又はＣＰＣＩ/ＤＯＸ ＮＰ（ｎ＝３）の全身投与後２４時間での８０８ｎｍレーザー照射（０．８Ｗｃｍ-2）下でのＯＳＣ−３を有するマウスの平均腫瘍温度、（ｃ）上皮内口腔腫瘍増殖を阻害するためのＣＰＣＩ/ＤＯＸＮＰをベースとするＰＴＴ及び化学療法の概略図、（ｄ）上皮内ＯＳＣ−３口腔腫瘍を有するマウス（１群あたり５匹のマウス）の腫瘍増殖曲線、（ｅ）ＣＰＣＩ/ＤＯＸＮＰ＋８０８ｎｍレーザーで治療した群の腫瘍体積変化の代表的な写真、（ｆ）異なる治療の後の２８日目の腫瘍スライスの組織学的H＆E染色を示す（スケールバー= １００ μｍ×１００の図及びスケールバー＝２５μｍ×４００の図）。ＤＯＸの用量：２．５ｍｇ ｋｇ-1及びＩＣＧＤ：7 ｍｇｋｇ-1。ｄにおける＊Ｐ値は、他の群を最後の群（ＣＰＣＩ/ＤＯＸ ＮＰ ＋８０８ ｎｍレーザー）と比較することにより、Ｔｕｋｅｙの事後検定（＊Ｐ＜０．０５）によって計算された。データは平均±ｓ．ｄ．として表される。
【図７−１】図７は、上皮内４Ｔ１乳癌（両側）を有するマウスを有するマウスにおける光熱／免疫療法の相乗的な抗腫瘍活性を示している。（ａ）α−ＰＤ−１療法と組み合わせたＣＰＣＩ/イミキモドＮＰによって誘発される抗腫瘍免疫応答の提案されたメカニズムの概略図。（ｂ）ＣＰＣＩＮＰへのイミキモドのカプセル化効率及びＣＰＣＩ/イミキモドＮＰのサイズ変化対薬物装填レベル。カプセル化効率は、ナノ粒子に装填された薬物の、初期の薬物含有量に対する比率として定義される。最終溶液の体積は１ｍＬに維持され、テロデンドリマーの最終濃度は２０ｍｇｍＬ-1であった。（ｃ）原発部位及び遠隔部位での腫瘍増殖を阻害するための光熱/免疫療法の相乗的治療効果の概略図。
【図７−２】４Ｔ１腫瘍の皮下接種（イムキモドの用量：１．２５ ｍｇｋｇ-1、総テロデンドリマー：５０ ｍｇｋｇ-1及びＩＣＧＤ：７ ｍｇ ｋｇ-1、２日目及び８日目にマウスあたり２００μｇの抗ＰＤ−１の腹腔内注射）を用いた異なる群のマウス（群あたり６匹のマウス）の（ｄ）原発腫瘍及び（ｅ）遠隔腫瘍増殖曲線。群５（ＣＰＣＩ/イミキモドＮＰ +α−ＰＤ−１）を群７（ＣＰＣＩ/イミキモドＮＰ＋８０８ ｎｍレーザー＋α−ＰＤ−１）と比較することによりｄにおいて＊Ｐ＜０．０５、群５（ＣＰＣＩ/イミキモドＮＰ +α−ＰＤ−１）を群７（ＣＰＣＩ/ＮＰ＋８０８ｎｍレーザー＋α−ＰＤ−１）と比較しそして群４（ＣＰＣＩ/イミキモドＮＰ）を群３（ＣＰＣＩ/イミキモドＮＰ＋８０８ｎｍレーザー）と比較することによりｅにおいて＊Ｐ＜０．０５。（ｆ）ＣＰＣＩ/イミキモドＮＰ＋８０８ｎｍレーザー＋α−ＰＤ−１で治療したマウスの腫瘍体積変化の代表的な写真。赤丸及び青丸は、それぞれ原発腫瘍及び遠隔腫瘍を示している。
【図７−３】（ｇ）示された様々な治療の後にマウスから回収されたH＆E染色された腫瘍スライス（スケールバー＝２５μｍ）、（ｈ）ＲＴ−ｑＰＣＲによって評価された両側の腫瘍組織における異なる治療によるＣＤ１１ｂ、ＩＦＮ―γ、ＴＮＦ―α、ＩＬ―４、ＩＬ―６及びＩＬ―１２の発現（平均±ｓ.ｄ.; n = 3）、（ｉ）異なる治療で回収された両側の腫瘍組織におけるＣＤ８+、ＰＤ−１、ＣＤ３+及びＣＤ４+Ｔ細胞のＩＨＣ染色、スケールバーは２５μｍである。
【図８】図８は、相乗的な光熱／免疫療法の免疫記憶効果を示している。（ａ）原発部位及び遠隔部位での癌の再発を阻害することによる免疫記憶の概略図、最初の腫瘍を除去してから５０日後に接種した再チャレンジ腫瘍の（ｂ）原発腫瘍及び（ｃ）遠隔腫瘍増殖曲線（６７日目及び７３日目にマウスあたり２００μｇのα−ＰＤ−１の腹腔内注射）。
【図９】図９は、多段階化学反応によるＩＣＧＤの合成アプローチを示している。
【図１０】図１０は、ＩＣＧＤ分子の特性化を示している。（ａ）化学構造、（ｂ）ＣＤＣｌ３における1Ｈ ＮＭＲスペクトル、（ｃ）ＥＳＩ質量分析測定によるＩＣＧＤ分子の質量スペクトル。
【図１１】図１１は、ＰＣＩテロデンドリマーの特性化を示している。（ａ）化学構造、（ｂ）概略図、（ｃ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析測定によるＰＣＩテロデンドリマーの質量スペクトル。
【図１２】図１２は、ＰＣＬＣテロデンドリマーの特性化を示している。（ａ）化学構造、（ｂ）概略図、（ｃ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析測定によるＰＣＬＣテロデンドリマーの質量スペクトル。
【図１３】図１３は、（ａ）メタノール中のＩＣＧＤ及びＰＣＩテロデンドリマーの蛍光スペクトルを示す。（ｂ）メタノール中のＩＣＧＤ及びＰＣＩテロデンドリマー及びＰＢＳ中のＰＣＩ ＮＰのＵＶ−ｖｉｓ−ＮＩＲ吸収スペクトル（ＩＣＧＤ濃度：３０μｇｍＬ-1）。 （ｃ）ＰＢＳ及びＳＤＳ中のＰＣＩ ＮＰからのＩＣＧＤの蛍光スペクトル（ＰＣＩテロデンドリマー濃度：０．１ｍｇｍＬ-1）。（ｄ）ＰＢＳ、ＳＤＳ、ＧＳＨ及びＧＳＨ＋ＳＤＳ中のＣＰＣＩＮＰからのＩＣＧＤの蛍光スペクトル（ＰＣＩテロデンドリマー濃度：０．１ｍｇｍＬ-1）。
【図１４】図１４は、（ａ）ＣＰＣＩ ＮＰへのＤＯＸのカプセル化効率、及び、ＣＰＣＩ／ＤＯＸ ＮＰのサイズ変化対薬物装填レベルを示している。カプセル化効率は、ナノ粒子に装填された薬物の、初期の薬物含有量に対する比率として定義される。最終溶液の体積は１ｍＬに維持され、テロデンドリマーの最終濃度は２０ｍｇ/ｍＬであった。（ｂ）ＰＢＳ溶液中のＣＰＣＩＮＰ及びＣＰＣＩ/ＤＯＸ ＮＰの概略図及び代表的な写真（総テロデンドリマー濃度：２０ｍｇｍＬ-1; ＤＯＸ濃度：１ｍｇｍＬ-1）。
【図１５】図１５は、３つの異なる濃度のＣＰＣＩＮＰを静脈内注射した健康なＢａｌｂ/ｃマウスの２４時間及び７２時間の白血球（ＷＢＣ）、リンパ球、好酸球、赤血球分布幅（ＲＤＷ）、血小板及び平均血小板量（ＭＰＶ）に関する血液検査パラメータを示している。
【図１６】図１６は、２４時間及び７２時間の３つの異なる濃度のＣＰＣＩＮＰを静脈内注射した健康なＢａｌｂ／ｃマウスの肝機能アラニンアミノトランスフェラーゼ、アルブミン、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、血中尿素窒素、クレアチニン、ビリルビン、総タンパク質、コレステロール、高密度リポタンパク質、低密度リポタンパク質及びトリグリセリドに関する血液検査パラメータを示す。
【図１７】図１７は、様々な細胞培養条件でのアネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びＰＩフローサイトメトリーアッセイを使用したアポトーシスＯＳＣ−３口腔細胞の検出を示す。Ｑ１：壊死細胞、Ｑ２：後期アポトーシス細胞、Ｑ３：正常な生細胞、Ｑ４：初期アポトーシス細胞。ＤＯＸ用量：０．００５ ｍｇｍＬ-1; ８０８ ｎｍレーザー照射：０．８Ｗｃｍ-2、２分。
【図１８】図１８は、３日間隔で尾静脈を介して異なる治療製剤を受ける上皮内ＯＳＣ−３口腔癌を有する実験マウスの体重曲線を示す（ｎ＝５； ＤＯＸ用量：２．５ｍｇｋｇ-1及びＩＣＧＤ用量：７ｍｇｋｇ-1;データは３つの並列サンプルの平均±標準誤差であった）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
I.定義
特に明記しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。さらに、本明細書に記載の方法又は材料と類似又は同等の任意の方法又は材料を、本発明の実施において使用することができる。本発明の目的のために、以下の用語が定義される。
【００１７】
本明細書で使用される「Ａ」、「ａｎ」又は「ｔｈｅ」は、１つの要素を有する態様を含むだけでなく、複数の要素を含む態様も含む。例えば、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈で明確に別のことが指示されていない限り、複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「薬剤」への言及は、当業者に知られている１つ以上の薬剤への言及などを含む。
【００１８】
本明細書で使用されるときに、「デンドリマー」及び「樹枝状ポリマー」という用語は、焦点、複数の枝分かれモノマー単位及び複数の末端基を含む枝分かれポリマーを指す。モノマーは互いに結合して、焦点から延在して、末端基で終わるアーム（又は「デンドロン」）を形成する。デンドリマーの焦点は、本発明の化合物の他のセグメントに結合されることができ、末端基は、追加の化学部分でさらに官能化されうる。
【００１９】
本明細書で使用されるときに、「テロデンドリマー（telodendrimer）」という用語は、親水性ＰＥＧセグメント及びデンドリマーの１つ以上の末端基に共有結合された１つ以上の化学部分を含むデンドリマーを指す。これらの部分としては、限定するわけではないが、疎水性基、親水性基、両親媒性化合物及び有機部分が挙げられる。直交保護基戦略を使用して、異なる部分を目的の末端基に選択的に設置することができる。
【００２０】
本明細書で使用されるときに、「モノマー」、「モノマー単位」又は「枝分かれモノマー単位」という用語は、ジアミノカルボン酸、ジヒドロキシカルボン酸又はヒドロキシルアミノカルボン酸を指す。本発明のジアミノカルボン酸基の例としては、限定するわけではないが、２,３−ジアミノプロパン酸、２，４−ジアミノブタン酸、２，５−ジアミノペンタン酸（オルニチン）、２，６−ジアミノヘキサン酸（リシン）、（２−アミノエチル）−システイン、３−アミノ−２−アミノメチルプロパン酸、３−アミノ−２−アミノメチル−２−メチルプロパン酸、４−アミノ−２−（２−アミノエチル）酪酸及び５−アミノ−２−（３−アミノプロピル）ペンタン酸が挙げられる。本発明のジヒドロキシカルボン酸基の例としては、限定するわけではないが、グリセリン酸、２，４−ジヒドロキシ酪酸、グリセリン酸、２，４−ジヒドロキシ酪酸、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸及び２，２−ビス（ヒドロキシメチル）酪酸が挙げられる。ヒドロキシルアミノカルボン酸の例としては、限定するわけではないが、セリン及びホモセリンが挙げられる。当業者は、他のモノマー単位が本発明において有用であることを理解するであろう。
【００２１】
本明細書で使用されるときに、「アミノ酸」という用語は、アミン官能基を有するカルボン酸を指す。アミノ酸としては、上記のジアミノカルボン酸が挙げられる。アミノ酸としては、天然に存在するα−アミノ酸が挙げられ、アミンは、カルボン酸のカルボニル炭素に隣接する炭素に結合している。天然に存在するα−アミノ酸の例としては、限定するわけではないが、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リジン及びL−アルギニンが挙げられる。アミノ酸としてはまた、天然に存在するα−アミノ酸のＤ−エナンチオマー、ならびにβ−アミノ酸及び他の天然に存在しないアミノ酸を挙げることができる。
【００２２】
本明細書で使用されるときに、「コール酸」という用語は、（Ｒ）−４−（（３Ｒ，５Ｓ，７Ｒ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｓ，１２Ｓ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）−３，７，１２−トリヒドロキシ−１０，１３−ジメチルヘキサデカヒドロプ−１Ｈ−シクロペンタ[ａ]フェナントレン−１７−イル）ペンタン酸を指す。コール酸は３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン酸、３−α，７−α，１２−α−トリヒドロキシ−５−コラン−２４−酸、１７−β−（１−メチル−３−カルボキシプロピル）エチオコラン−３α，７α，１２α−トリオール、コール酸（Cholalic acid）及びコラリンとしても知られている。アロコール酸、ピトコール酸、アビコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸などのコール酸誘導体及び類似体もまた、本発明において有用である。コール酸誘導体は、ミセルの安定性及び膜の活性など、テロデンドリマー集合体から生じるナノキャリアの特性を調節するように設計できる。例えば、コール酸誘導体は、１つ以上のグリセロール基、アミノプロパンジオール基又は他の基で修飾された親水性面を有することができる。
【００２３】
本明細書で使用されるときに、「シアニン」という用語は、ポリメチン基に属する合成色素ファミリーを指す。シアニンは、生物医学イメージング用の蛍光色素として使用できる。シアニンは、ストレプトシアニン（開鎖シアニンとしても知られている）、ヘミシアニン及び閉鎖シアニンであることができる。閉鎖シアニンは、それぞれ独立してヘテロ芳香族部分の一部である窒素を有する。
【００２４】
本明細書で使用されるときに、「ナノ粒子」又は「ナノキャリア」という用語は、本発明のデンドリマーコンジュゲートの凝集から生じるミセルを指す。ナノキャリアは、疎水性コア及び親水性外部を有する。
【００２５】
本明細書で使用されるときに、「両親媒性化合物」という用語は、疎水性部分及び親水性部分の両方を有する化合物を指す。例えば、本発明の両親媒性化合物は、化合物の１つの親水性面及び化合物の１つの疎水性面を有することができる。本発明において有用な両親媒性化合物としては、限定するわけではないが、コール酸ならびにコール酸類似体及び誘導体が挙げられる。
【００２６】
本明細書で使用されるときに、「架橋可能基（crosslinkable group）」又は「架橋性基（crosslinking group）」という用語は、別の分子上の類似又は相補的基に結合することができる官能基、例えば、第二の樹枝状ポリマー上の第二の架橋可能基に連結する第一の樹枝状ポリマー上の第一の架橋可能基を指す。「チオール含有架橋性基」とは、硫黄原子を含む架橋性基を指す。デンドリマーの内部に組み込まれるときに、本発明において架橋可能基及び架橋性基として適切な基としては、システインなどのチオール、ボロン酸、及び、カテコールなどの１，２−ジヒドロキシベンゼンを含む１，２−ジオールが挙げられる。デンドリマーの１つ以上の末端基に組み込まれるときに、本発明において架橋可能基及び架橋性基として適切な基としては、システイン及びＮ−アセチルシステインなどのチオールが挙げられる。架橋可能基及び架橋性基が結合すると、それらはジスルフィド及びボロン酸エステルなどの架橋結合を形成する。他の架橋可能基及び架橋性基は本発明において適切である。
【００２７】
本明細書で使用されるときに、「連結基（linking group）」という用語は、デンドリマーコンジュゲートの１つのセグメントを別のセグメントに連結する化学部分を指す。リンカーをデンドリマーのセグメントに連結するために使用される結合のタイプとしては、限定するわけではないが、アミド、アミン、エステル、カルバメート、尿素、チオエーテル、チオカルバメート、チオカーボネート及びチオ尿素が挙げられる。当業者は、他のタイプの結合が本発明において有用であることを理解するであろう。
【００２８】
本明細書で使用されるときに、「薬物」又は「治療薬」という用語は、状態又は疾患を治療及び／又は改善することができる薬剤を指す。薬物は、水をはじく任意の薬物である疎水性薬物であることができる。本発明において有用な疎水性薬物としては、限定するわけではないが、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、バッカチンＩＩＩ、１０−デアセチルバッカチン、ホンドウシャンＡ、ホンドウシャンＢ又はホンドウシャンＣ）、ドキソルビシン、エトポシド、イリノテカン、ＳＮ−３８、シクロスポリンＡ、ポドフィロトキシン、カルムスチン、アンフォテリシン、イキサベピロン、パツピロン（エポテロンクラス）、ラパマイシン及びプラチナ薬が挙げられる。他の薬物としては、非ステロイド系抗炎症薬、及び、ビンブラスチン及びビンクリスチンなどのビンカアルカロイドが挙げられる。本発明の薬物はまた、プロドラッグ形態を含む。当業者は、他の薬物が本発明において有用であることを理解するであろう。
【００２９】
本明細書で使用されるときに、「治療する（treat）」、「治療すること(treating)」及び「治療(treatment)」という用語は、あらゆる客観的又は主観的パラメータを含む傷害、病状、状態又は症状（例えば、痛み）の治療又は改善における成功の兆候を指し、例えば、軽減、寛解、症状の軽減、又は、症状、傷害、病状又は状態などを患者にとってより許容できるものにすること、症状又は状態の頻度又は期間を減らすこと、又は、幾つかの状況において、症状又は状態の発症を予防することである。症状の治療又は改善は、あらゆる客観的又は主観的パラメータに基づくことができ、該パラメータは、例えば、身体検査の結果を含む。
【００３０】
本明細書で使用されるときに、「投与する」という用語は、経口投与、坐剤としての投与、局所接触、非経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、病変内、鼻腔内又は皮下投与、髄腔内投与、又は、対象への徐放性デバイス、例えば、ミニ浸透圧ポンプのインプラント処置を指す。
【００３１】
本明細書で使用されるときに、「治療有効量又は用量」又は「治療に十分な量又は用量」又は「有効又は十分な量又は用量」という用語は、投与される治療効果を生み出す用量を指す。正確な用量は、治療の目的に依存し、既知の技術を使用して当業者によって確認可能である（例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms（vol. 1-3, 1992）; Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding（1999）; Pickar, Dosage Calculations（1999）;及びRemington：The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition、2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams ＆ Wilkinsを参照されたい）。感作された細胞において、治療有効用量は、しばしば、非感作細胞に対する従来の治療有効用量よりも低くなることができる。
【００３２】
本明細書で使用されるときに、「対象」という用語は、限定するわけではないが、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどを含む哺乳動物などの動物を指す。幾つかの実施形態において、対象はヒトである。
【００３３】
本明細書で使用されるときに、「疾患」という用語は、外部の損傷によるものではなく、生物の一部又は全部の構造又は機能に悪影響を与える異常な状態を指す。疾患は、しばしば、特定の症状及び徴候に関連する病状として解釈される。疾患としては、癌、免疫不全、過敏症、アレルギー及び自己免疫疾患を挙げることができる。
【００３４】
本明細書で使用されるときに、「病変組織」という用語は、本明細書に記載の疾患の一部である細胞組織を指す。
【００３５】
本明細書で使用されるときに、「チェックポイント遮断抗体」という用語は、刺激されると免疫応答を免疫刺激に対して弱めることができる免疫系の主要なレギュレータである免疫チェックポイントを阻害する抗体を指す。チェックポイント遮断抗体は、阻害性チェックポイントを遮断し、免疫系の機能を回復させることができる。チェックポイント遮断抗体の例としては、限定するわけではないが、抗ＰＤ−１、抗ＰＤＬ−１、抗ＰＤＬ−２及び抗ＣＴＬＡ−４が挙げられる。
【００３６】
本明細書で使用されるときに、「光熱療法（photothermal therapy）」という用語は、光への曝露時に熱を発生する無毒で感光性の化合物の使用を指す。光線力学療法と同様に、光熱療法は、光増感剤及び光源、典型的には赤外線が関与する。しかし、光熱療法は酸素を必要としない。ポルフィリン、クロロフィル及び色素など、様々な光増感剤を使用することができる。
【００３７】
本明細書で使用されるときに、「放射線」という用語は、空間又は材料媒体を介した波又は粒子の形態でのエネルギーの放出又は伝達を指し、「照射」は、物体が放射線に曝されるプロセスを指す。幾つかの例において、照射としては、赤外線の使用が挙げられる。
【００３８】
ＩＩ．シアニンテロデンドリマー
幾つかの実施形態において、本発明は、式（Ｉ）：
【化２】
2021535258.tif 000004
（上式中、ＰＥＧは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーであり、各ＰＥＧポリマーは分子量が１〜１００ｋＤａであり、各Ｘは枝分かれモノマー単位であり、各Ｒ1は独立してコール酸又はコール酸誘導体であり、各Ｒ2は独立してシアニンである）の化合物を提供する。
【００３９】
任意のサイズ及び構造のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーは、本発明のテロデンドリマーにおいて有用である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧは１〜１００ｋＤａである。幾つかの実施形態において、ＰＥＧは１〜５０ｋＤａである。幾つかの実施形態において、ＰＥＧは１〜１０ｋＤａである。幾つかの実施形態において、ＰＥＧは、約１０ｋＤａ、約９ｋＤａ、約８ｋＤａ、約７ｋＤａ、約６ｋＤａ、約５ｋＤａ、約４ｋＤａ、約３ｋＤａ、約２ｋＤａ又は約１ｋＤａである。幾つかの実施形態において、ＰＥＧは約５ｋＤａである。当業者は、他のＰＥＧポリマー及び他の親水性ポリマーが本発明において有用であることを理解するであろう。ＰＥＧは任意の適切な長さにすることができる。
【００４０】
樹枝状ポリマーは、アミノ酸又は他の二官能性ＡＢ２型モノマーを含む枝分かれモノマー単位Ｘから作製することができ、ここで、Ａ及びＢは、得られるポリマー鎖が分岐点を有するように一緒に反応することができる２つの異なる官能基であり、ここで、ＡＢ結合は形成される。幾つかの実施形態において、各枝分かれモノマー単位Ｘは、ジアミノカルボン酸、ジヒドロキシカルボン酸及びヒドロキシルアミノカルボン酸であることができる。幾つかの実施形態において、Ｘはジアミノカルボン酸である。幾つかの実施形態において、各ジアミノカルボン酸は、２，３−ジアミノプロパン酸、２，４−ジアミノブタン酸、２，５−ジアミノペンタン酸（オルニチン）、２，６−ジアミノヘキサン酸（リジン）、（２−アミノエチル）−システイン、３−アミノ−２−アミノメチルプロパン酸、３−アミノ−２−アミノメチル−２−メチルプロパン酸、４−アミノ−２−（２−アミノエチル）酪酸又は５−アミノ−２−（３−アミノプロピル）ペンタン酸であることができる。幾つかの実施形態において、各ジヒドロキシカルボン酸は、グリセリン酸、２，４−ジヒドロキシ酪酸、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）酪酸、セリン又はスレオニンであることができる。幾つかの実施形態において、各ヒドロキシルアミノカルボン酸は、セリン又はホモセリンであることができる。幾つかの実施形態において、ジアミノカルボン酸はアミノ酸である。幾つかの実施形態において、各枝分かれモノマー単位Ｘはジアミノカルボン酸であり、各ジアミノカルボン酸はリシンである。
【００４１】
本発明において有用な両親媒性化合物としては、限定するわけではないが、コール酸ならびにコール酸類似体及び誘導体が挙げられる。「コール酸」は、（Ｒ）−４−（（３Ｒ，５Ｓ，７Ｒ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｓ，１２Ｓ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）−３,７,１２−トリヒドロキシ−１０,１３−ジメチルヘキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ[ａ]フェナントレン−１７−イル）ペンタン酸を指し、下記構造を有する。
【化３】
2021535258.tif 000005
【００４２】
コール酸誘導体及び類似体としては、限定するわけではないが、アロコール酸、ピトコール酸、アビコール酸、デオキシコール酸及びケノデオキシコール酸が挙げられる。コール酸誘導体は、ミセルの安定性及び膜の活性など、テロデンドリマー集合体から生じるナノキャリアの特性を調節するように設計できる。例えば、コール酸誘導体は、１つ以上のグリセロール基、アミノプロパンジオール基又は他の基で修飾された親水性面を有することができる。
【００４３】
幾つかの実施形態において、各Ｒ1は、独立して、コール酸、（３α，５β，７α，１２α）−７，１２−ジヒドロキシ−３−（２，３−ジヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸（ＣＡ−４ＯＨ）、（３α，５β，７α，１２α）−７−ヒドロキシ−３,１２−ジ（２，３−ジヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸（ＣＡ−５ＯＨ）又は（３α，５β，７α，１２α）−７,１２−ジヒドロキシ−３−（３−アミノ−２−ヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸（ＣＡ−３ＯＨ―ＮＨ2）である。幾つかの実施形態において、各Ｒ1はコール酸である。
【００４４】
本発明のシアニンは、少なくとも１つの第四級アミンを含むポリメチン基に属する合成色素ファミリーを指す。シアニンは撮像に使用されうる。幾つかの実施形態において、シアニンは、ストレプトシアニン、ヘミシアニン又は閉鎖シアニンであることができる。ヘミシアニンは以下の構造を有することができる。
【化４】
2021535258.tif 000006
（上式中、ｎは０〜５までの整数であり、環Ａはヘテロ芳香族部分である）。閉鎖シアニンは、それぞれ独立してヘテロ芳香族部分の一部である窒素を有し、以下の構造を有することができる：
【化５】
2021535258.tif 000007
（上式中、ｎは０〜５までの整数であり、環Ａは独立してヘテロ芳香族部分である）。 ヘテロ芳香族部分は、ピロール、イミダゾール、チアゾール、ピリジン、キノロン、インドール、ベンゾインドール又はベンゾチアゾールであることができ、これらのそれぞれは、場合により、Ｃ1-6アルキル及びスルホネートからなる群より選ばれる１〜４個の官能基で置換されうる。Ｒ基は、それぞれ、Ｃ1-10アルキル（ＣＨ2）mＳＯ3Ｎａ及び（ＣＨ2）mＣＯＯＨからなる基より独立して選ばれ、ここで、ｍは１〜１０の整数である。
【００４５】
幾つかの実施形態において、各Ｒ2は、独立して、シアニン３、シアニン３．５、シアニン５、シアニン５．５、シアニン７、シアニン７．５、インドシアニングリーン又は構造（Ｓ１）を有するインドシアニングリーン誘導体である。
【化６】
2021535258.tif 000008
幾つかの実施形態において、各Ｒ2は、構造（Ｓ１）を有するシアニンである。
【００４６】
幾つかの実施形態において、化合物は、式（Ｉ）の化合物であることができ、ここで、各ＰＥＧは分子量が５ｋＤａであり、各Ｘはリジンであり、各Ｒ1はコール酸であり、各Ｒ2は、独立して、構造（Ｓ１）を含むシアニンである。幾つかの実施形態において、化合物は以下の構造を有する：
【化７】
2021535258.tif 000009
【００４７】
ＩＩＩ．ナノ粒子
本発明のテロデンドリマーは、疎水性コア及び親水性外部を含むナノキャリアを形成するための凝集体を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、内部及び外部を有するナノキャリアを提供し、該ナノキャリアは、本発明の１つ以上のデンドリマーコンジュゲートを含み、各化合物は、水性溶媒中で自己集合してナノキャリアを形成し、その結果、疎水性ポケットは前記ナノキャリアの内部で形成され、各化合物のＰＥＧはナノキャリアの外部上で自己集合する。
【００４８】
幾つかの実施形態において、本発明は、複数の第一のコンジュゲートを含むナノ粒子を提供し、ここで、各第一のコンジュゲートは、独立して、本明細書に記載のとおりの式（Ｉ）の化合物であり、複数のコンジュゲートは水性溶媒中で自己集合してナノ粒子を形成し、その結果、疎水性コアはナノ粒子の内部に形成され、各コンジュゲートのＰＥＧはナノ粒子の外部上で自己集合する。
【００４９】
本発明において有用な複数の第一のコンジュゲートは、本明細書に記載されるとおりの式（Ｉ）のコンジュゲートを含む。幾つかの実施形態において、ナノ粒子は、複数の第二のコンジュゲートをさらに含み、各第二のコンジュゲートは、独立して、式（ＩＩ）の化合物である。
【化８】
2021535258.tif 000010
（上式中、ＰＥＧはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーであり、各ＰＥＧポリマーは分子量が１〜１００ｋＤａであり、各Ｘは枝分かれモノマー単位であり、各Ｙはチオール含有架橋性基であり、各Ｌは連結基であり、そして、各Ｒ1は、独立して、コール酸又はコール酸誘導体である）。
【００５０】
任意のサイズ及び構造のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーは、式ＩＩの化合物のための本発明のテロデンドリマーにおいて有用である。幾つかの実施形態において、ＰＥＧは１〜１００ｋＤａである。幾つかの実施形態において、ＰＥＧは１〜５０ｋＤａである。幾つかの実施形態において、ＰＥＧは１〜１０ｋＤａである。幾つかの実施形態において、ＰＥＧは、約１０ｋＤａ、約９ｋＤａ、約８ｋＤａ、約７ｋＤａ、約６ｋＤａ、約５ｋＤａ、約４ｋＤａ、約３ｋＤａ、約２ｋＤａ又は約１ｋＤａである。幾つかの実施形態において、ＰＥＧは約５ｋＤａである。当業者は、他のＰＥＧポリマー及び他の親水性ポリマーが本発明において有用であることを理解するであろう。ＰＥＧは任意の適切な長さにすることができる。
【００５１】
本発明において有用な枝分かれモノマー単位は、任意の適切なアミノ酸又は他の二官能性ＡＢ２型モノマーを含み、ここで、Ａ及びＢは一緒に反応することができる２つの異なる官能基であり、その結果、得られるポリマー鎖は分岐点を有し、ここで、Ａ−Ｂ結合は形成される。幾つかの実施形態において、各枝分かれモノマー単位Ｘは、ジアミノカルボン酸、ジヒドロキシカルボン酸及びヒドロキシルアミノカルボン酸であることができる。幾つかの実施形態において、Ｘはジアミノカルボン酸である。幾つかの実施形態において、各ジアミノカルボン酸は、２，３−ジアミノプロパン酸、２，４−ジアミノブタン酸、２，５−ジアミノペンタン酸（オルニチン）、２，６−ジアミノヘキサン酸（リジン）、（２−アミノエチル）−システイン、３−アミノ−２−アミノメチルプロパン酸、３−アミノ−２−アミノメチル−２−メチルプロパン酸、４−アミノ−２−（２−アミノエチル）酪酸又は５−アミノ−２−（３−アミノプロピル）ペンタン酸であることができる。幾つかの実施形態において、各ジヒドロキシカルボン酸は、グリセリン酸、２，４−ジヒドロキシ酪酸、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）酪酸、セリン又はスレオニンであることができる。幾つかの実施形態において、各ヒドロキシルアミノカルボン酸は、セリン又はホモセリンであることができる。幾つかの実施形態において、ジアミノカルボン酸はアミノ酸である。幾つかの実施形態において、各枝分かれモノマー単位Ｘはジアミノカルボン酸であり、各ジアミノカルボン酸はリジンである。
【００５２】
連結基Ｌは任意の適切なリンカーを含むことができる。一般に、連結基は二官能性リンカーであり、２つのテロデンドリマーセグメントのそれぞれと反応するための２つの官能基を有する。幾つかの例において、連結基は、ヘテロ二官能性リンカーであることができる。幾つかの例において、連結基はホモ二官能性リンカーであることができる。幾つかの例において、連結基Ｌは、ポリエチレングリコール、ポリセリン、ポリグリシン、ポリ（セリン−グリシン）、脂肪族アミノ酸、６−アミノヘキサン酸、５−アミノペンタン酸、４−アミノブタン酸又はβアラニンであることができる。幾つかの実施形態において、連結基Ｌは、以下の式を有するＥｂｅｓリンカーである。
【化９】
2021535258.tif 000011
【００５３】
当業者は、連結基のサイズ及び化学的性質が、連結されるテロデンドリマーセグメントの構造に基づいて変化しうることを認識するであろう。
【００５４】
幾つかの実施形態において、本発明のナノ粒子は、各Ｒ1が独立してコール酸又はコール酸誘導体である第一のコンジュゲート及び／又は第二のコンジュゲートを含む。各Ｒ1は独立してコール酸、（３α，５β，７α，１２α）−７,１２−ジヒドロキシ−３−（２，３−ジヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸（ＣＡ―４ＯＨ）、（３α，５β，７α，１２α）−７−ヒドロキシ−３,１２−ジ（２，３−ジヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸（ＣＡ−５ＯＨ）又は（３α，５β，７α，１２α）−７,１２−ジヒドロキシ−３−（３−アミノ−２−ヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸（ＣＡ−３ＯＨ−ＮＨ2）である。幾つかの実施形態において、各Ｒ1はコール酸である。
【００５５】
幾つかの実施形態において、ナノ粒子は式（Ｉ）の第一のコンジュゲートを含み、各ＰＥＧは分子量が５ｋＤａであり、各Ｘはリジンであり、各Ｒ1はコール酸であり、各Ｒ2は構造（ Ｓ１）を有するシアニンである。幾つかの実施形態において、ナノ粒子は、式（ＩＩ）の第二のコンジュゲートをさらに含み、各ＰＥＧは分子量が５ｋＤａであり、各Ｘはリジンであり、各Ｙはシステインであり、各Ｌは式：
【化１０】
2021535258.tif 000012
を有する連結基であり、そして各Ｒ1はコール酸である。
【００５６】
幾つかの実施形態において、本発明のナノ粒子は、式（ＩＩ）のチオール含有架橋性基を介して架橋される。幾つかの例において、チオール含有架橋性基はシステイン又はＮ−アセチル−システインである。幾つかの例において、チオール含有架橋性基はシステインである。
【００５７】
幾つかの例において、本発明のナノ粒子は、約１００：１〜１：１００、約５０：１〜１：５０、約２５：１〜１：２５、約１０：１〜約１：１０又は約１：１の比率（ｗ／ｗ）で式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のコンジュゲートを含む。幾つかの例において、式（Ｉ）のコンジュゲート対式（ＩＩ）のコンジュゲートは、約１００：１、５０：１、２５：１、１０：１又は１：１の比（ｗ／ｗ）を有する。幾つかの実施形態において、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のコンジュゲートは約１：１（ｗ／ｗ）の比率である。
【００５８】
幾つかの例において、ナノ粒子の平均直径は、約２５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約５０ｎｍ又は約２０ｎｍである。幾つかの実施形態において、ナノ粒子の平均直径は約２０ｎｍである。
【００５９】
幾つかの実施形態において、本発明のナノ粒子は、疎水性コア内に治療薬をさらに含む。治療薬は水溶性が低いことができる。幾つかの例において、治療薬は、ボルテゾミブ、パクリタキセル、ＳＮ３８、カンプトテシン、エトポシド及びドキソルビシン、ドセタキセル、ＶＰ１６、プレドニゾン、デキサメタゾン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、テムシロリムス、カルムシン、ガルジキモド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、パクリタキセル、ＳＮ−３８、イミキモド、レシキモド、モトリモド、レナリドマイド、ポマリドマイド及び構造（Ｓ２）を有するＬＬＳ３０からなる群より選ばれる。
【化１１】
2021535258.tif 000013
【００６０】
幾つかの実施形態において、治療薬は、ガルジキモド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、パクリタキセル、ＳＮ-３８、イミキモド、レシキモド、モトリモド、レナリドミド、ポマリドミド及び構造（Ｓ２）を有するＬＬＳ３０からなる群より選ばれる。
【００６１】
ＩＶ．治療法
本発明のナノ粒子は疾患を治療するために使用することができる。本発明のナノ粒子は、光熱療法を介して疾患を治療するために使用することができる。本発明のナノ粒子はまた、病変組織を患っている対象を治療するために使用することができる。本発明のナノ粒子はまた、造影剤をナノキャリの内部に隔離することによって、又は、造影剤をナノキャリのコンジュゲートに結合させることによって、撮像に使用することができる。
【００６２】
幾つかの実施形態において、本発明は、疾患を治療する方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に、治療有効量の本発明のナノ粒子を投与することを含む。
【００６３】
本発明のナノ粒子は、癌を含む疾患の治療のために対象に投与されることができ、上記癌としては、限定するわけではないが、カルシノーマ、神経膠腫、中皮腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、神経膠芽細胞腫、白血病、リンパ腫、前立腺癌、バーキットリンパ腫、頭頸部癌、結腸癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝胆道癌、胆嚢癌、小腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、尿道癌、精巣癌、子宮頸癌、膣癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、膵臓内分泌癌、カルシノイド癌、骨癌、皮膚癌、網膜芽細胞腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫が挙げられる（追加の癌についてはCANCER：PRINCIPLES AND PRACTICE（DeVita, V. T. ら、2008年版）を参照されたい）。
【００６４】
本発明のナノキャリアによって治療することができる他の疾患としては、（１）全身性アナフィラキシー又は過敏反応、薬物アレルギー、昆虫刺傷アレルギーなどの炎症性又はアレルギー性疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎及び腸炎などの炎症性腸疾患、膣炎、乾癬及び皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹などの炎症性皮膚炎、血管炎、脊椎関節症、強皮症、喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患などの呼吸器アレルギー性疾患など、（２）関節炎（リウマチ性及び乾癬性）、骨関節炎、多発性硬化症、全身性紅斑性ループス、真性糖尿病、糸球体腎炎などの自己免疫疾患など、（３）移植片拒絶（同種移植片拒絶及び移植片v−宿主疾患を含む）、及び（４）望ましくない炎症反応が阻害されるべき他の疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、筋炎、脳卒中及び閉鎖頭傷害などの神経学的状態、神経変性疾患、アルツハイマー病、脳炎、髄膜炎、骨粗鬆症、痛風、肝炎、腎炎、敗血症、サルコイドーシス、結膜炎、耳炎、慢性閉塞性肺疾患、副鼻腔炎及びベーセット症候群）が挙げられる。
【００６５】
幾つかの実施形態において、本発明は、疾患を治療する方法を提供し、ここで、前記疾患は癌である。幾つかの実施形態において、疾患は、乳癌、口腔癌、子宮頸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、膀胱癌、脳癌、黒色腫、骨髄腫、白血病、結腸癌、前立腺癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部癌、リンパ腫又は転移性癌である。
【００６６】
幾つかの実施形態において、本発明は、疎水性コア内に治療薬をさらに含む、疾患を治療する方法を提供する。本発明の方法に適した治療薬は、本明細書で上記に記載されている。幾つかの実施形態において、疾患を治療する方法は、ドキソルビシン、ガルジキモド及びイミキモドからなる群より選ばれる治療薬を含む。幾つかの実施形態において、疾患を治療する方法は、治療薬を含み、該治療薬はイミキモドであり、チェックポイント遮断抗体を投与することをさらに含む。
【００６７】
本発明において有用なチェックポイント遮断抗体としては、限定するわけではないが、抗ＰＤ−１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＬＴＡ−４、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、キートルーダ、スパルタリズマブ、アテゾリズマブ及びイピリムマブが挙げられる。幾つかの実施形態において、本発明において有用なチェックポイント遮断抗体は、抗ＰＤ−１、抗ＰＤＬ１又は抗ＣＴＬＡ−４である。幾つかの実施形態において、チェックポイント遮断抗体は抗ＰＤ−１である。
【００６８】
幾つかの実施形態において、本発明は、光熱療法を介して疾患を治療する方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に、治療有効量の本発明のナノ粒子を投与すること、及び、前記対象を放射線に曝露し、それによって光熱療法を介して病気を治療することを含む。
【００６９】
本発明のナノキャリアを使用して治療する方法はまた、光熱療法により疾患を治療することを含む。この方法は、一般に、本発明のナノキャリアを対象に投与し、次に対象を特定の波長の放射線に曝露して、光の波長に応じて光線力学療法又は光熱療法を誘発することを含む。放射線又は光にさらされると、ナノ粒子は光熱療法に十分な熱を発生する。幾つかの実施形態において、本発明は光熱療法を介して疾患を治療する方法を提供し、該方法は、それを必要とする対象に治療有効量の本発明のナノキャリアを投与すること、及び対象を放射線に曝露し、それにより、光熱療法を介して疾患を治療することを含む。幾つかの実施形態において、この方法は、光熱療法を介して疾患を治療する方法である。
【００７０】
本発明の方法において有用な放射線としては、電磁放射、粒子放射、音響放射及び重力放射が挙げられる。電磁放射の例としては、限定するわけではないが、無線波、マイクロ波、赤外光、可視光、紫外光、Ｘ線及びガンマ線が挙げられる。
【００７１】
幾つかの実施形態において、本発明は光熱療法を介して疾患を治療する方法を提供し、ここで、対象は電磁放射に曝露される。幾つかの実施形態において、本発明は、光熱療法を介して疾患を治療する方法を提供し、ここで、対象は、近赤外光照射に曝される。
【００７２】
本発明のナノ粒子は、光熱療法を介して疾患を治療するために対象に投与することができ、疾患は本明細書で上記のとおりである。
【００７３】
幾つかの実施形態において、本発明は、光熱療法を介して疾患を治療する方法を提供し、ここで、疾患は癌である。幾つかの実施形態において、疾患は、乳癌、口腔癌、子宮頸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、膀胱癌、脳癌、黒色腫、骨髄腫、白血病、結腸癌、前立腺癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部癌、リンパ腫又は転移性癌である。
【００７４】
幾つかの実施形態において、本発明は、疎水性コアに治療薬をさらに含む、光熱療法を介して疾患を治療する方法を提供する。本発明の方法に適した治療薬は、本明細書で上記に記載されている。幾つかの実施形態において、疾患を治療する方法は、ドキソルビシン、ガルジキモド及びイミキモドからなる群より選ばれる治療薬を含む。幾つかの実施形態において、疾患を治療する方法は治療薬を含み、治療薬はイミキモドであり、注射を介して抗ＰＤ−１を投与することをさらに含む。
【００７５】
幾つかの実施形態において、本発明は、病変組織を患っている対象を治療する方法を提供し、この方法は、ナノ粒子が病変組織に集中するように、有効量の本発明のナノ粒子を対象に投与すること、病変組織を特定するために、病変組織を第一の波長で照射すること、及び、対象から病変組織を除去し、それによって対象を治療することを含む。
【００７６】
幾つかの実施形態において、本発明は、病変組織を患っている対象を治療する方法を提供し、この方法は、投与工程の少なくとも１時間後、投与工程の少なくとも２時間後、投与工程の少なくとも３時間後、照射工程の少なくとも４時間後、照射工程の少なくとも５時間後又は照射工程の少なくとも６時間後に照射工程を遅延させることをさらに含む。幾つかの実施形態において、本発明は、病変組織を患っている対象を治療する方法を提供し、この方法は、投与工程の少なくとも３時間後に照射工程を遅らせることをさらに含む。
【００７７】
幾つかの実施形態において、本発明は、病変組織を患っている対象を治療する方法を提供し、この方法は、対象に残存している任意の病変組織を第二の波長で照射することをさらに含む。幾つかの実施形態において、本発明は、病変組織を患っている対象を治療する方法を提供し、ここで、除去工程及び両方の照射工程は、対象に対する単一の操作中に行われる。
【００７８】
幾つかの実施形態において、本発明は、病変組織を患っている対象を治療する方法を提供し、ここで、第一の波長及び第二の波長は、それぞれ独立して、紫外線スペクトル、可視光スペクトル又は赤外線スペクトルにある。幾つかの実施形態において、本発明は、病変組織を患っている対象を治療する方法を提供し、ここで、第一の波長及び第二の波長は、それぞれ独立して、極紫外線スペクトル、近紫外線スペクトル、近赤外線スペクトル、中赤外線スペクトル又は遠赤外線スペクトルにある。幾つかの実施形態において、本発明は、病変組織を患っている対象を治療する方法を提供し、ここで、第一の波長及び第二の波長は近赤外スペクトルにある。
【００７９】
幾つかの実施形態において、本発明は、病変組織を患っている対象を治療する方法を提供し、ここで、病変組織は本明細書に記載の疾患からの任意の適切な病変組織である。幾つかの実施形態において、本発明は、病変組織を患っている対象を治療する方法を提供し、ここで、病変組織は癌である。幾つかの実施形態において、病変組織は、乳癌、口腔癌、子宮頸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、膀胱癌、脳癌、黒色腫、骨髄腫、白血病、結腸癌、前立腺癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部癌、リンパ腫又は転移性癌である。幾つかの実施形態において、本発明は、病変組織を患っている対象を治療する方法を提供し、ここで、病変組織は卵巣癌である。
【００８０】
幾つかの実施形態において、本発明は、撮像方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に有効量の本発明のナノ粒子を投与すること、及び、対象を撮像することを含む。幾つかの実施形態において、ナノ粒子は、疎水性コア内に造影剤をさらに含むことができる。
【００８１】
例示的な造影剤としては、常磁性剤、光学プローブ及び放射性核種が挙げられる。常磁性剤は外部から印加された磁場の下で磁性を帯びる造影剤である。常磁性剤の例としては、限定するわけではないが、ナノ粒子を含む鉄粒子が挙げられる。光プローブは、ある波長の放射線での励起と、第二の異なる波長の放射線での検出によって検出できる蛍光化合物である。本発明で有用な光学プローブには、限定するわけではないが、Cy5.5、Alexa 680、Cy5、DiD（１，１'−ジオクタデシル−３,３,３',３'−テトラメチルインドジカルボシアニン過塩素酸塩）及びDiR（１，１'−ジオクタデシル−３,３,３',３'−テトラメチルインドトリカルボシアニンヨージド）が挙げられる。他の光学プローブとしては、量子ドットが挙げられる。放射性核種は、放射性崩壊を経験する元素である。本発明で有用な放射性核種としては、限定するわけではないが、3Ｈ、11Ｃ、13Ｎ、18Ｆ、19Ｆ、60Ｃｏ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、68Ｇａ、82Ｒｂ、90Ｓｒ、90Ｙ、99Ｔｃ、99mＴｃ、111Ｉｎ、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ、129Ｉ、131Ｉ、137Ｃｓ、177Ｌｕ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、211Ａｔ、Ｒｎ、Ｒａ、Ｔｈ、Ｕ、Ｐｕ及び241Ａｍが挙げられる。
【００８２】
Ｖ.ナノ粒子の調製方法
幾つかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載のとおりの式（Ｉ）の複数の第一のコンジュゲートを含む反応混合物を形成することを含む、本発明のナノ粒子を調製する方法を提供し、ここで、前記コンジュゲートは、疎水性コアが前記ナノ粒子の内部に形成されるようにナノ粒子を形成し、各コンジュゲートのＰＥＧはナノ粒子の外部上で自己集合する。
【００８３】
幾つかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載のとおりの式（ＩＩ）の複数の第二のコンジュゲートをさらに含む、本発明のナノ粒子を調製する方法を提供する。
【００８４】
幾つかの実施形態において、本発明は、水溶液が緩衝溶液である、本発明のナノ粒子を調製する方法を提供する。緩衝溶液は緩衝剤の組み合わせを含むことができ、該緩衝剤としては、限定するわけではないが、クエン酸、酢酸、ＫＨ2ＰＯ4、ＣＨＥＳ、ホウ酸塩、ＴＡＰＳ、ビシン、トリス、トリシン、ＴＡＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸塩及びＭＥＳが挙げられる。幾つかの実施形態において、水溶液はＰＢＳを含む。
【００８５】
幾つかの実施形態において、本発明は、本発明のナノ粒子を調製する方法を提供し、この方法は、反応混合物を超音波処理することをさらに含む。反応混合物は、約５分、約１０分、約２０分、約３０分又は約１時間超音波処理されうる。幾つかの実施形態において、反応混合物は、約１０分間超音波処理されうる。
【００８６】
幾つかの実施形態において、本発明は、本発明のナノ粒子を調製する方法を提供し、ここで、水溶液はＰＢＳであり、この方法は、反応混合物を約１０分間超音波処理することをさらに含む。
【００８７】
幾つかの例において、本発明は、本発明のナノ粒子を調製する方法を提供し、ここで、ナノ粒子は、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のコンジュゲートを約１００：１〜１：１００、約５０：１〜１：５０、約２５：１〜１：２５、約１０：１〜約１：１０又は約１：１の比率（ｗ／ｗ）で含む。幾つかの例において、式（Ｉ）／式（ＩＩ）のコンジュゲートは、約１００：１、５０：１、２５：１、１０：１又は１：１の比率（ｗ／ｗ）を有する。幾つかの実施形態において、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のコンジュゲートは、約１：１（ｗ／ｗ）の比率である。
【００８８】
幾つかの実施形態において、本発明は、ナノ粒子を調製する方法を提供し、ここで、ナノ粒子は、式（ＩＩ）の複数の第二のコンジュゲートをさらに含み、チオール含有架橋性基はシステイン又はＮ−アセチルシステインである。幾つかの例において、チオール含有架橋性基はシステインである。幾つかの実施形態において、架橋結合は、システインの酸化を介して形成される。
【００８９】
ＶＩ．製剤及び医薬組成物
本発明の組成物は、多種多様な経口、非経口及び局所剤形で調製することができる。経口製剤としては、患者による摂取に適した錠剤、丸薬、粉末、糖衣錠、カプセル、液体、トローチ、カシェ、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などが挙げられる。本発明の組成物はまた、注射によって、すなわち、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、十二指腸内又は腹腔内に投与することができる。また、本明細書に記載の組成物は、例えば、吸入によって鼻腔内に投与することができる。さらに、本発明の組成物は、経皮的に投与することができる。本発明の組成物はまた、坐剤、吹送、粉末及びエアロゾル製剤を含む、眼内、膣内及び直腸内経路によって投与することができる（ステロイド吸入剤の例については、Rohatagi, J. Clin. Pharmacol. 35：1187-1193, 1995; Tjwa, Ann. Allergy Asthma Immunol. 75：107-111,1995を参照されたい）。したがって、本発明はまた、医薬上許容されるキャリア又は賦形剤及び本発明の組成物を含む医薬組成物を提供する。
【００９０】
本発明の化合物から医薬組成物を調製するために、医薬上許容されるキャリアは固体又は液体のいずれであってもよい。固形製剤としては、粉末、錠剤、丸薬、カプセル、カシェ、坐剤及び分散性顆粒が挙げられる。固体キャリアは、１つ以上の物質であることができ、これはまた、希釈剤、香味剤、結合剤、防腐剤、錠剤崩壊剤又はカプセル化材料として作用することができる。製剤及び投与の技術の詳細は、科学文献及び特許文献に十分に記載されており、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Maack Publishing Co, Easton PAの最新版 ("Remington's")を参照されたい。
【００９１】
粉末において、キャリアは、微細分割された固体であり、これは、微細分割された活性成分との混合物中にある。錠剤において、活性成分は、適切な比率で必要な結合特性を有するキャリアと混合され、所望の形状及びサイズに圧縮される。粉末及び錠剤は、好ましくは、本発明の組成物を５％又は１０％〜７０％で含む。
【００９２】
適切な固体賦形剤としては、限定するわけではないが、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ペクチン、デキストリン、デンプン、トラガカント、低融点ワックス、ココアバター、炭水化物、糖類（限定するわけではないが、乳糖、ショ糖、マンニトール又はソルビトールを含む）、トウモロコシ、小麦、米、馬鈴薯又は他の植物からのデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はナトリウムカルボキシメチルセルロースなどのセルロース、アラビアゴム及びトラガカントを含むゴム、ならびに、限定するわけではないが、ゼラチン及びコラーゲンを含むタンパク質が挙げられる。所望ならば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤又は可溶化剤を添加することができる。
【００９３】
糖衣錠コアは、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒又は溶媒混合物を含むことができる濃縮糖溶液などの適切なコーティングを備えている。製品の識別のため、又は活性化合物の量（すなわち、投与量）を特性化するために、染料又は顔料を錠剤又は糖衣錠コーティングに添加することができる。本発明の医薬製剤はまた、例えば、ゼラチンで作られたプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチン及びグリセロール又はソルビトールなどのコーティングで作られた柔らかく密封されたカプセルを使用して経口的に使用することができる。プッシュフィットカプセルは、ラクトース又はデンプンなどの充填剤又は結合剤、タルク又はステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、及び、場合により、安定剤と混合された本発明の化合物を含むことができる。ソフトカプセルにおいて、本発明の組成物は、安定剤を含む又は含まない、脂肪油、流動パラフィン、又は液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解又は懸濁することができる。
【００９４】
坐剤を調製するために、脂肪酸グリセリド又はカカオバターの混合物などの低融点ワックスを最初に溶融し、本発明の組成物を、攪拌などすることにより、その中に均一に分散させる。次に、溶融した均質な混合物を便利なサイズの型に注ぎ、冷却し、それによって固化させる。
【００９５】
液体形態の製剤としては、溶液、懸濁液及び乳濁液、例えば、水又は水／プロピレングリコール溶液が挙げられる。非経口注射については、液体製剤は、ポリエチレングリコール水溶液中の溶液で製剤化することができる。
【００９６】
経口使用に適した水溶液は、本発明の組成物を水中に溶解し、所望に応じて適切な着色剤、香味剤、安定剤及び増粘剤を添加することによって調製することができる。経口使用に適した水性懸濁液は、天然又は合成のガム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアゴムなどの粘性材料、及び、天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアレート）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、脂肪酸とヘキシトールから誘導された部分エステルとエチレンオキシドの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、又は、脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導された部分エステルとエチレンオキシドの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）などの分散剤又は湿潤剤とともに水中に微細分割された活性成分を分散させることによって作製することができる。水性懸濁液はまた、エチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートなどの１つ以上の防腐剤、１つ以上の着色剤、１つ以上の香味剤、及び、スクロース、アスパルテーム又はサッカリンなどの１つ以上の甘味剤を含むことができる。製剤は浸透圧に合わせて調整できる。
【００９７】
使用の直前に、経口投与用の液体形態の製剤に変換することが意図された固体形態の製剤も挙げられる。このような液体形態としては、溶液、懸濁液及び乳濁液が挙げられる。これらの製剤は、活性成分に加えて、着色剤、香味剤、安定剤、緩衝剤、人工及び天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含むことができる。
【００９８】
油懸濁液は、本発明の化合物を、落花生油、オリーブ油、ゴマ油又はココナッツ油などの植物油、又は、液体パラフィンなどの鉱油、又は、これらの混合物に懸濁することによって製剤化することができる。油懸濁液は、蜜蝋、パラフィン又はセチルアルコールなどの増粘剤を含むことができる。グリセロール、ソルビトール又はスクロースなどの甘味料を添加して口当たりの良い経口製剤を提供することができる。これらの製剤は、アスコルビン酸などの抗酸化剤を添加することで保存できる。注射可能なオイルビヒクルの例として、Minto, J. Pharmacol. Exp. Ther. 281:93-102, 1997を参照されたい。本発明の医薬製剤はまた、水中油型エマルジョンの形態であることができる。油相は、上記の植物油又は鉱油、あるいは、これらの混合物であることができる。適切な乳化剤としては、アカシアゴム及びトラガカンスゴムなどの天然に存在するガム、大豆レシチンなどの天然に存在するホスファチド、モノオレイン酸ソルビタンなどの脂肪酸及び無水ヘキシトールから誘導されるエステル又は部分エステル、ならびに、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどのこれらの部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物が挙げられる。乳濁液はまた、シロップ及びエリキシルの製剤のように、甘味剤及び香味剤を含むことができる。そのような製剤はまた、粘滑剤、防腐剤又は着色剤を含むことができる。
【００９９】
本発明の組成物はまた、体内での徐放のためのミクロスフェアとして送達することができる。例えば、ミクロスフェアは、皮下にゆっくりと放出される薬物含有ミクロスフェアの皮内注射を介して (Rao, J. Biomater Sci. Polym. Ed. 7:623-645, 1995を参照されたい)、生分解性かつ注射可能なゲル製剤として(例えば、Gao Pharm. Res. 12:857-863, 1995を参照されたい)又は経口投与用ミクロスフェアとして(例えば、Eyles, J. Pharm. Pharmacol. 49:669-674, 1997を参照されたい)投与するように製剤化することができる。経皮及び皮内経路の両方は、数週間又は数ヶ月間一定の送達を提供する。
【０１００】
幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、静脈内（ＩＶ）投与又は体腔又は器官の内腔への投与などの非経口投与のために製剤化することができる。投与用の製剤は、一般に、医薬上許容されるキャリアに溶解された本発明の組成物の溶液を含むであろう。使用できる許容可能なビヒクル及び溶媒には、水及びリンゲル液、等張塩化ナトリウムがある。さらに、滅菌固定油は、従来から、溶媒又は懸濁媒体として使用することができる。この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の刺激の少ない固定油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸も同様に注射剤の調製に使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般に望ましくない物質を含まない。これらの製剤は、従来のよく知られた滅菌技術によって滅菌することができる。製剤は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどの生理学的条件に近づけるために必要とされる医薬上許容される補助物質を含むことができる。これらの製剤中の本発明の組成物の濃度は大きく変更することができ、選択された特定の投与様式及び患者のニーズに従って、主に流体体積、粘度、体重などに基づいて選択される。ＩＶ投与については、製剤は無菌の注射可能な水性又は油性の懸濁液などの無菌注射可能製剤であることができる。この懸濁液は、それらの適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して、既知の技術に従って製剤化することができる。無菌注射可能製剤はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌の注射可能な溶液又は懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオールの溶液であることができる。
【０１０１】
幾つかの実施形態において、本発明の組成物の製剤は、細胞膜と融合するか又はエンドサイトーシスされるリポソームの使用によって、すなわち、細胞の表面膜タンパク質受容体に結合してエンドサイトーシスを引き起こすリポソームに付着した又はオリゴヌクレオチドに直接付着したリガンドを使用することによって送達することができる。リポソームを使用することにより、特にリポソーム表面が標的細胞に特異的なリガンドを有するか、又はさもなければ優先的に特定の器官に向けられる場合に、本発明の組成物を標的細胞にインビボで集中して送達させることができる（例えば、Al-Muhammed, J. Microencapsul. 13:293-306, 1996; Chonn, Curr. Opin. Biotechnol. 6:698-708, 1995; Ostro, Am. J. Hosp. Pharm. 46:1576-1587, 1989を参照されたい）。
【０１０２】
ＶＩＩ．投与
本発明の組成物は、経口、非経口及び局所的方法を含む任意の適切な手段によって送達することができる。局所経路による経皮投与方法は、アプリケータースティック、溶液、懸濁液、乳濁液、ゲル、クリーム、軟膏、ペースト、ゼリー、塗料、粉末及びエアロゾルとして製剤化されうる。
【０１０３】
医薬製剤は、好ましくは単位剤形である。そのような剤形において、製剤は、本発明の組成物の適切な量を含む単位用量に細分される。単位剤形は、パッケージ化された製剤であることができ、パッケージは、パケット化された錠剤、カプセル及びバイアル又はアンプル中の粉末などの個別の量の製剤を含む。また、単位剤形は、カプセル、錠剤、カシェ又はトローチ自体であることができるか、又は、これらのいずれかの適切な数のパッケージ化された形態であることができる。
【０１０４】
本発明の化合物は、任意の適切な量で存在することができ、そして様々な要因に依存することができ、該要因としては、限定するわけではないが、対象の体重及び年齢、疾患の状態などが挙げられる。本発明の化合物の適切な投与量範囲としては、約０．１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、又は約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、又は約１０ｍｇ〜約７５０ｍｇ、又は約２５ｍｇ〜約５００ｍｇ、又は約５０ｍｇ〜約２５０ｍｇが挙げられる。本発明の化合物の適切な投与量としては、約１ｍｇ、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、 ９００又は１０００ｍｇが挙げられる。
【０１０５】
本発明の化合物は、任意の適切な頻度、間隔及び期間で投与することができる。例えば、本発明の化合物は、１時間に１回、又は、１時間に２、３回以上、１日１回、又は、１日２、３回以上、又は、２、３、４、５、６又は７日に１回投与することができ、それにより、好ましい投与量レベルを提供することができる。本発明の化合物が１日１回を超えて投与されるときに、代表的な間隔としては、５、１０、１５、２０、３０、４５及び６０分、ならびに１、２、４、６、８、１０、１２、１６、２０及び２４時間が挙げられる。本発明の化合物は、１時間、１〜６時間、１〜１２時間、１〜２４時間、６〜１２時間、１２〜２４時間、１日、１〜７日、１週間、１〜４週間、１カ月、１〜１２カ月、１年以上又はさらには無期限で１回、２回又は３回以上投与することができる。
【０１０６】
組成物はまた、他の適合性のある治療薬を含むことができる。本明細書に記載の化合物は、互いに、他の活性剤と、又は、単独では有効ではないが活性剤の有効性に寄与する可能性がある補助剤と組み合わせて使用することができる。
【０１０７】
本発明の化合物は、別の活性剤と共投与することができる。共投与は、本発明の化合物及び活性剤を、互いに０．５、１、２、４、６、８、１０、１２、１６、２０又は２４時間以内に投与することを含む。共投与はまた、本発明の化合物及び活性剤を同時に、ほぼ同時に（例えば、互いに約１、５、１０、１５、２０又は３０分以内に）、又は任意の順序で順次に投与することを含む。さらに、本発明の化合物及び活性剤は、それぞれ、１日１回、又は、１日２、３又はそれ以上の回数投与され、１日あたりの好ましい投与量レベルを提供することができる。
【０１０８】
幾つかの実施形態において、共投与は、共製剤、すなわち、本発明の化合物及び活性剤の両方を含む単一の医薬組成物を調製することによって達成することができる。幾つかの実施形態において、本発明の化合物及び活性剤は、別々に製剤化することができる。
【０１０９】
本発明の化合物及び活性剤は、約１：１００〜約１００：１（ｗ／ｗ）、又は約１：５０〜約５０：１、又は約１：２５〜約２５：１、又は約１：１０〜約１０：１、又は約１：５〜約５：１（ｗ／ｗ）などの任意の適切な重量比で存在することができる。本発明の化合物及び他の活性剤は、約１：１００（ｗ／ｗ）、１：５０、１：２５、１：１０、１：５、１；４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１、２５：１、５０：１又は１００：１（ｗ/ｗ）などの任意の適切な重量比で本発明の組成物中に存在することができる。本発明の化合物及び他の活性剤の他の投与量及び投与量比は本発明の組成物及び方法において適切である。
【実施例】
【０１１０】
ＶＩＩＩ．例
結果
ＣＰＣＩ−ＮＰの設計及び調製
光熱特性を付与するために、安定性の高い疎水性光熱変換剤であるインドシアニングリーン誘導体（ＩＣＧＤ）を最初に合成し、テロデンドリマーシステムに導入した（図９）。図１０ａ、１０ｂ及び１０ｃに示すように、1Ｈ ＮＭＲ及びＥＳＩ質量分析測定により、ＩＣＧＤの化学構造を検証した。ＵＶ−vis吸収スペクトルから、ＩＣＧＤはメタノールで５００〜９００ｎｍの広い吸収帯を示し、２つの吸収ピークがあった。１つのショルダーピークは約７２０ｎｍにあり、もう１つは約７８５ｎｍの近赤外範囲のピークにあった（図２ｂ）。ピーク値が８３５ｎｍの蛍光発光スペクトルは、８０８ｎｍでの励起時にメタノール中で得られた。ＩＣＧＤ分子はカルボン酸基で官能化され、それにより、４つのＩＣＧＤ単位をＰＥＧ5k−ＣＡ4−テロデンドリマー上に簡単にグラフト化してＰＥＧ5K−ＣＡ4−ＩＣＧＤ4（ＰＣＩ）テロデンドリマーを得ることができ、分子量はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析で１０，４３０Ｄａと決定された（図１１ａ及び１１ｂ）。メタノール中のＰＣＩテロデンドリマーの吸収及び蛍光発光は、メタノール中の単一ＩＣＧＤ分子のものとほぼ同じであり、ＰＣＩへのＩＣＧＤの導入が成功したことを示した（図２ｂ、図１３ａ）。
【０１１１】
両親媒性ＰＣＩテロデンドリマーは、動的光散乱（ＤＬＳ）及び透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）画像によって同時に検証された均一なサイズ（約３０ｎｍ）を有する熱力学的に安定なナノ粒子（ＰＣＩ−ＮＰ）に自己集合することができた（図２ｃ）。π−π相互作用及び強い疎水性を仮定すれば、ＩＣＧＤ及びＣＡを簡単に自己集合して高度に秩序化された構造になり、ＰＣＩ−ＮＰの疎水性コアを形成することができる。図１３ｂに示すように、ＰＢＳ中のＰＣＩ−ＮＰのＵＶ−vis吸収は、メタノール中のＰＣＩテロデンドリマーの吸収と比較して広く、わずかに赤方シフトしており、ＩＣＧＤの自己集合を示している。一方、ＰＢＳ溶液中のＰＣＩ−ＮＰにおけるＩＣＧＤの蛍光強度は非常に弱いことがわかり（Ｅｘ：８０８ｎｍ）、おそらく凝集による消光効果が原因であり、ＩＣＧＤが自己集合して高度に秩序化された構造になっていることがさらに明らかになった。 。この解釈は、ミセル解離時の蛍光の回復によってさらに検証された。強力なイオン性洗剤のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ; ２．５ ｍｇｍＬ-1最終濃度）をＰＣＩ−ＮＰ ＰＢＳ溶液に添加したときに、ＰＣＩ−ＮＰは崩壊し、８３５ｎｍにピーク値を持つＩＣＧＤの蛍光強度が有意に向上した（図１３ｃ）。
【０１１２】
インビボ研究のためのＰＣＩ−ＮＰの安定性を改善するために、ジスルフィド架橋を有するハイブリッドＮＰは、合理的な重量比（１：１）のシステイン含有テロデンドリマー（ＰＥＧ5k−Ｃｙｓ4−Ｌ8−ＣＡ8、ＰＣＬＣ）及びＰＣＩテロデンドリマーの共自己集合（co-self-assembly）により調製され、ＣＰＣＩ−ＮＰを生成した。図１２ａ及び１２ｂに示されるように、８つのＣＡ及び４つのシステイン単位はＰＣＬＣテロデンドリマーの骨格に導入された（Ｍｎ≒１２０００）。システイン上のチオール基は、ＮＰの密度及び安定性を向上させることができる、束ねられたロープのように、酸化環境下でＮＰの疎水性コア内にジスルフィド結合を形成することができた。ＤＬＳ及びＴＥＭ画像（図２ｄ）に示されているように、この組成設計下において、ＣＰＣＩ−ＮＰのサイズはＰＣＩ−ＮＰのサイズよりも小さく、すなわち、２０±６ｎｍ対３０±８ｎｍであった。これは、浸透及び保持（ＥＰＲ）効果の向上により、腫瘍内に効率的に蓄積するための望ましい粒子サイズである。ＰＣＩ−ＮＰ及びＣＰＣＩ−ＮＰの安定性は、最終濃度２．５ｍｇｍＬ-1のＮＰ破壊性ＳＤＳの存在下で試験した。図２ｅに示されるように、ＰＣＩ−ＮＰの粒子サイズ信号の即時消失（＜１０ｓ）は、非架橋ＰＣＩ−ＮＰの明確な動的結合−解離特性を反映した。非常に対照的に、ＣＰＣＩ−ＮＰは、ＳＤＳの存在下でも約２０ｎｍの粒子サイズのままであり、このような架橋ＮＰの高い安定性を示していた。さらに、ＳＤＳ及び細胞内還元型グルタチオン（ＧＳＨ）レベル（約１０ｍＭ）の存在下において、ＣＰＣＩ−ＮＰの粒子サイズ信号は急速に消失し、ＧＳＨによるジスルフィド結合の切断後のＣＰＣＩ−ＮＰの解離を示している。ＰＣＩ−ＮＰと同様に、ＣＰＣＩ−ＮＰにおけるＩＣＧＤの蛍光（Ex：８０８ｎｍ）も高度に消光された。ＧＳＨ（約１０ｍＭ）もＳＤＳ（２．５ｍｇｍＬ-1）も単独では架橋ＮＰを分解できなかったため、ＣＰＣＩ−ＮＰ溶液の蛍光強度はＧＳＨを含まないＳＤＳ溶液又はＧＳＨを含むＰＢＳ溶液でわずかにのみ増加した。しかしながら、図１５ｄに示されるように、ＳＤＳ及びＧＳＨの両方の存在下に、８３５ｎｍにピーク値を持つＣＰＣＩ−ＮＰ溶液の蛍光強度は、ＰＢＳ中の無傷のミセル形態と比較して１００倍増強された。
【０１１３】
ＣＰＣＩ−ＮＰの光熱特性
光熱変換特性は、０．８Ｗｃｍ-2の出力強度で８０８ｎｍのレーザー照射下でのＰＢＳ溶液中のＣＰＣＩ−ＮＰ及びＰＣＩ−ＮＰの温度変化の定量的測定によって評価し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングされた金ナノロッド（ＧＮＲ）を対照として使用した。図２ｆに示されるように、ＣＰＣＩ−ＮＰ溶液及びＰＣＩ−ＮＰ溶液は両方とも最初の６０秒間に急激な温度上昇を示し、温度はＣＰＣＩ−ＮＰでは６４．５℃、ＰＣＩ−ＮＰでは５６．６℃に上昇した。３００秒間の連続レーザー照射後に、ＣＰＣＩ−ＮＰ及びＰＣＩ−ＮＰの両方の溶液温度は安定水準に達し、ＣＰＣＩ−ＮＰ溶液の温度（７８．５℃）は同じ濃度のＩＣＧＤのＰＣＩ−ＮＰ溶液の温度よりも約１０．５℃高かった。ＧＮＲの最高温度（５１．２℃）は、以前に報告された他の金ナノ構造の最高温度と同様であった。以前に報告された手順によれば、８０８ｎｍでのＣＰＣＩ−ＮＰの光熱変換効率（η）は３０．６％と計算され、ＰＣＩ−ＮＰ（２４．３％）及びＧＮＲ（１８．１％）よりも高い。これらの結果は、ＣＰＣＩ−ＮＰがＧＮＲよりも効率的な光熱変換を有することを示している。続いて、ＣＰＣＩ−ＮＰ及びＰＣＩ−ＮＰの光熱安定性も、ＦＤＡ承認の光熱剤であるインドシアニングリーン（ＩＣＧ）と比較して、ＮＰ溶液の加熱及び冷却を交互に行うことによって研究した。ＣＰＣＩ−ＮＰは、８０８ｎｍのレーザー照射を５サイクル行った後でも、堅牢な光熱効率を維持し（図２ｇ）、ＰＣＩ−ＮＰ及びＩＣＧＰＢＳ溶液よりもそれぞれわずかに高い安定性及びはるかに高い安定性を維持することが判った。同様に、ＣＰＣＩ−ＮＰは、ＰＣＩ−ＮＰと比較して、はるかに高い安定水準温度及びより速い温度上昇速度を示した。ＣＰＣＩ−ＮＰのこれらの高い光熱変換効率及び高い安定性は、強力なπ−π相互作用と、架橋によって引き起こされるＩＣＧＤの高密度組織化に起因することができる（図２ｃ、２ｄ）。
【０１１４】
ＣＰＣＩ−ＮＰの高い光熱変換効率をさらに研究するために、組織化及び崩壊の形でのＰＣＩ−ＮＰ及びＣＰＣＩ−ＮＰの異なる濃度での蛍光強度の変動を調査した。図３ａ及び３ｂに示されるように、ＮＰのコア内でのＩＣＧＤの蛍光自己消光により、ミセルＰＣＩ−ＮＰ及びＣＰＣＩ−ＮＰの蛍光強度はＰＢＳ中では非常に弱かった。対照的に、ＳＤＳとともに解離したときに、ＰＣＩ−ＮＰ及びＣＰＣＩ−ＮＰ溶液の蛍光強度は有意に向上されることが判った。一方、ＰＣＩ−ＮＰ及びＣＰＣＩ−ＮＰの光熱変換測定では、まったく逆の特性、すなわち、ミセル型での高い光熱変換効率及び解離型での低い光熱変換効率が示された。ミセルＰＣＩ−ＮＰ又はＣＰＣＩ−ＮＰでのＩＣＧＤの緻密形態により、８０８ｎｍでのレーザー照射下で効率的に熱が発生した（図３ｃ及び３ｄ）。注目すべきは、ＣＰＣＩ−ＮＰの蛍光強度がＰＣＩ−ＮＰの蛍光強度よりも弱かった（例えば、１０μＭのＰＣＩ濃度で３２０対８００）一方で、光熱変換効率（温度）がＰＢＳ中の同じ濃度でＰＣＩ−ＮＰのそれよりも高かったことであり（例えば、１０μＭのＰＣＩ濃度で６９．６℃対５８．２℃、図３ｅ及び３ｆ）、ＣＰＣＩ−ＮＰのＩＣＧＤの構成は励起状態エネルギーを蛍光ではなく、より効率的に熱エネルギーに変換できたことを示している。これらの結果は、安定で緻密なミセル構造が光熱変換剤の熱変換に重要な役割を果たすことを明らかにした。
【０１１５】
ＣＰＣＩ−ＮＰがインビボで使用されることを考えると、８０８ｎｍでのレーザー照射下でのＣＰＣＩ−ＮＰの組織深さ及び温度の関係は、光の代理組織バリアとして厚さ２ｍｍのビーフスライスを使用してインビトロで決定された。ＴＢＡＩと複合化した後の従来のＩＣＧは、対照としてＰＣＬＣテロデンドリマーに物理的にカプセル化されていた。図３ｇ及び３ｈに示されるように、ＣＰＣＩ−ＮＰ及びＰＣＬＣ/ＴＢＡＩ＆ＩＣＧ−ＮＰを０．８Ｗｃｍ-2で３０秒間、２ｍｍのビーフスライスを介して８０８ｎｍでレーザー照射すると、それぞれ７０℃及び５０℃に達することができる。ＰＣＬＣ/ＴＢＡＩ＆ＩＣＧ ＮＰの温度は、ビーフの厚さを４ｍｍに増加させると、４０℃未満に低下することが判った。対照的に、ＣＰＣＩ−ＮＰの温度は、ビーフの厚さを６ｍｍに増加させても、約４５℃に達することができた。正常なヒトの皮膚及び顔の皮膚の厚さは一般にそれぞれ４ｍｍ及び２ｍｍ未満であるため、ＣＰＣＩ−ＮＰによる光熱療法は、黒色腫を含む原発性皮膚癌の治療に使用できる可能性がある。この光熱ナノシステムの優れた性能は、その高いＮＩＲ吸光度、卓越した光熱変換効率、より速い加熱能力及び優れた光安定性に起因することができる。
【０１１６】
ＣＰＣＩ−ＮＰのＤＯＸ装填容量
カプセル化されたドキソルビシンがポルフィリンをベースとするナノキャリアの光線療法効果に相乗作用できることが以前に実証された。テロデンドリマーをベースとするミセルナノキャリアの経験に基づくと、ＣＰＣＩ−ＮＰはドキソルビシン（ＤＯＸ）のための優れたキャリアであることが期待される（図４ａ）。図１４ａに示されるように、ＣＰＣＩ−ＮＰによるＤＯＸの薬物カプセル化効率は、０．５ｍｇｍＬ-1のＤＯＸ濃度で１００％であった。ＤＯＸ濃度を３ｍｇｍＬ-1に上げたときに、カプセル化効率は依然として７０％を超え、粒子サイズは約２０ｎｍのままであり、ＣＰＣＩ−ＮＰの優れた薬物装填容量が確認された。ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰは、３７℃の水溶液で良好な血清安定性を示した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が溶液中に存在するときに、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰの粒子サイズは９６時間の実験期間にわたって中性環境で変化しなかった（図４ｂ）。それに対応して、ＤＯＸは刺激下でＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰから制御可能に放出されうる。カプセル化されたＤＯＸ分子の蛍光消光のために、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰＰＢＳ溶液はＤＯＸの非常に弱い蛍光シグナルを示した。しかしながら、ジスルフィド結合の切断により、ＤＯＸの放出が増加したため、ＤＯＸの蛍光強度はＧＳＨ（約１０ｍＭ）中の方が高かった。ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰがＧＳＨ（約１０ｍＭ）の存在下で８０８ｎｍ（０．８Ｗｃｍ-2、５分）のレーザー照射で摂動されたときに、ＤＯＸの蛍光強度はさらに増強されうる（図４ｃ）。同様の結果は定量的ＤＯＸ放出実験で示された。図４ｄに示されるように、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰからのＤＯＸ放出は、典型的なＧＳＨ及び光応答性放出プロファイルを示した。ＧＳＨ及び８０８ｎｍのレーザー照射がないときに、ＰＢＳ中ででのＤＯＸ放出速度は非常に遅かった（４時間後に５．１％、２４時間後に１１％未満）。ＧＳＨ（約１０ｍＭ）を溶液に加えたときに、２４時間後にＤＯＸ放出量は３０％に増加した。レーザー照射時に常にＤＯＸ放出は劇的に増加し、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰがＧＳＨ（約１０ｍＭ）に曝露され、８０８ｎｍレーザーの順次照射（各回２分、３回）がなされたときに、２４時間後にＤＯＸの総放出量はさらに５５％に増加することができることは注目に値する。ＤＯＸの放出の増強は、おそらくＧＳＨ及びレーザーによる光熱変換によって誘発される局所体温上昇による還元環境でのＳ−Ｓ結合の切断によるものであり、どちらも架橋ＮＰからのＤＯＸの拡散を加速することができる。オンデマンドのＧＳＨ（又はＮ−アセチルシステイン）及び光応答性の薬物放出を利用して、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰの有意な部分が腫瘍部位に到達した後に、正常組織に対する化学療法剤の副作用を軽減し、腫瘍部位での細胞毒性効果を高めることができる。
【０１１７】
ＣＰＣＩ／ＤＯＸ−ＮＰの細胞取り込み及びインビトロ抗腫瘍活性
ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰの細胞取り込み及び細胞内分布は、ＯＳＣ−３口腔癌細胞における共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）によって評価された。共焦点蛍光顕微鏡写真は、ＤＯＸ及びＣＰＣＩ−ＮＰの細胞内分布を明確に示した（図４ｅ）。６時間のインキュベーション後に、ＩＣＧＤからの緑色蛍光シグナルの大部分は細胞質に残っていた。対照的に、ＤＯＸ蛍光はこの時点で主に核で観察され、赤色のＤＯＸ及び青色の４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）蛍光が重なるため、核はピンク色になった。この結果は、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰが癌細胞に急速に取り込まれ、次いで、カプセル化されたＤＯＸが短時間でＤＮＡ挿入のために核に放出できることを明らかにした。
【０１１８】
ＣＰＣＩ／ＤＯＸ−ＮＰの相乗的な化学／光熱効果を、ＭＴＳアッセイによってＯＳＣ−３細胞で評価した。図４ｆに示されるように、レーザーを使用しないＣＰＣＩ−ＮＰは、１２時間のインキュベーション後に、高濃度（２００μｇｍＬ-1）でも細胞に対して無視できる毒性を示した。しかしながら、８０８ｎｍＮＩＲ照射（０．８Ｗｃｍ-2、２分）を適用したときに、ＣＰＣＩ−ＮＰ濃度が増加するにつれて、ＯＳＣ−３細胞の生存率は有意に低下した。細胞生存率は２００μｇｍＬ-1の濃度で５％未満であり、ＣＰＣＩ−ＮＰの光熱効果が癌細胞を効果的に殺すことができることを示している。化学療法/光熱相乗療法の効果を、５０μｇｍＬ-1の濃度のＣＰＣＩ−ＮＰを使用してさらに研究した。この低濃度のＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰのみの場合に、レーザー照射なしでわずか４５％の細胞は殺された。非常に対照的に、細胞を８０８ｎｍレーザー照射と組み合わせたＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰで処理すると、８５％を超える細胞は殺された。これは、遊離ＤＯＸ（６１％の細胞生存率）又は８０８ｎｍレーザー照射下でのＣＰＣＩ−ＮＰ（細胞生存率４６％）よりも効果的であった（図５ｇ）。生/死細胞をＤｉＯ（緑色蛍光）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ、赤色蛍光）で共染色した。図４ｈに示されるように、８０８ｎｍのレーザー照射下でＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰで処理した後に、ほとんどの細胞はアポトーシス/死滅し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）によって赤色蛍光で染色されたが、他の対照群では、緑色蛍光を発する有意な量の生細胞は依然として観察できた。組み合わせ指数を計算することによる併用治療効果を決定した。結果は、ＤＯＸ及びＣＰＣＩ−ＮＰ濃度の増加に伴い、ＤＯＸとＣＰＣＩ−ＮＰ＋光との間でインビトロで腫瘍細胞を殺す優れた相乗効果を示した（図４ｉ及び４ｊ）。アネキシンＦＩＴＣ/ＰＩアッセイは、ＯＳＣ−３細胞に対する上記の相乗作用が細胞アポトーシスの増強をもたらすことができるかどうかを明らかにするために行われた。図１７に示されるように、８０８ｎｍレーザー照射もＣＰＣＩ−ＮＰも有意なアポトーシス促進効果はなかった。比較すると、レーザー照射なしのＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰ及びレーザー照射ありのＣＰＣＩ−ＮＰの両方がアポトーシスを増強することができ、それぞれ２７．３９％及び２７．３１％のアポトーシス細胞をもたらした。ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰをレーザー照射と組み合わせて使用したときに、アポトーシス細胞の割合はさらに５１．１％に増加した。これは、ＭＴＳの結果と一貫していた。
【０１１９】
ＣＰＣＩ／ＤＯＸ−ＮＰの生体内分布及び薬物送達
ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰ＋８０８ｎｍレーザー照射の相乗的機能をインビトロ実験で実証した後に、動物腫瘍モデルにおけるその有効性を評価した。ＣＰＣＩ−ＮＰの潜在的な毒性を調査するために、３つの用量レベルのＣＰＣＩ−ＮＰを健康なＢａｌｂ/ｃマウスに静脈内投与し（テロデンドリマーに基づいて５０、１００及び２００ｍｇｋｇ-1）、血清化学及び血球数について１日目及び３日目に採血した。白血球（ＷＢＣ）、リンパ球、好酸球、赤血球分布幅（ＲＤＷ）、血小板及び平均血小板量（ＭＰＶ）は１日目及び３日目に正常であった（図１５）。同様に、肝機能検査（アラニンアミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、ビリルビン）、腎パネル（血中尿素窒素、クレアチニン）及びその他の血液化学（アルブミン、総タンパク質、コレステロール、高密度リポタンパク質、低密度リポタンパク質及びトリグリセリド） ）はすべて正常であることがわかり（図１６）、明らかな肝及び腎毒性は見られなかった。ＣＰＣＩ−ＮＰは、生体適合性の高い光熱変換ナノ剤であり、マウスに有意な副作用はないと結論付けることができる。ＣＰＣＩ−ＮＰはジスルフィド結合で架橋されているので、循環中は比較的安定していると予想される。遊離ＩＣＧ、テロデンドリマーを含むＰＣＬＣシステインで同時カプセル化されたＩＣＧ及びＴＢＡＩ（ＰＣＬＣ/ＴＢＡＩ＆ＩＣＧ ＮＰ）、及び、ＣＰＣＩ−ＮＰを比較する薬物動態研究を、メスのSprague−Dawleyラットで実施した。図５ａに示されるように、親水性のないＩＣＧは組織内に急速に拡散し、静脈内投与後３０分以内に循環から排除された（ｔ1/2＝５．２２分; ＡＵＣ＝１２．０９１ｍｇ/Ｌ*ｈ）。４８時間の静脈内注射後に、血中のＰＣＬＣ/ＴＢＡＩ＆ＩＣＧ ＮＰからのＩＣＧの濃度は、組織１グラムあたり９．４％の注射用量（％ＩＤ ｇ-1）に減少することがわかった（ｔ1/2＝２８．４２１; ＡＵＣ＝６７７．５７１ｍｇ/Ｌ*ｈ）。対照的に、ＣＰＣＩ−ＮＰからのＩＣＧＤの約２０．４％ＩＤｇ-1はまだ血液循環中にあり（ｔ1/2＝４１．０９８； ＡＵＣ＝１１９６．２７４ｍｇ/Ｌ*ｈ）、ＩＣＧＤ及びＣＰＣＩ−ＮＰの高い安定性を示す。
【０１２０】
ＣＰＣＩ／ＤＯＸ−ＮＰの粒子サイズは約２０ｎｍであり（図２ｄ）、これは腫瘍の標的化及び浸透に最適なサイズである。ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰは、サイズが比較的小さく、可逆的に架橋する性質及び独特のアーキテクチャ依存性の近赤外蛍光特性により、血液中のバックグラウンド抑制による癌検出の改善、ならびに優先的な腫瘍部位での蓄積及びシグナル増幅のための活性化可能な光学ナノプローブとしての使用に特に適している。図４ｃは、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰ（ＤＯＸ：１．２５ｍｇｋｇ-1、ＰＣＩテロデンドリマー：１２．５ｍｇｋｇ-1及びＰＣＬＣテロデンドリマー：１２．５ｍｇｋｇ-1）の静脈内（ｉ．ｖ．）注射後の上皮内（in situ）ＯＳＣ−３口腔癌を有する無胸腺マウスの近赤外蛍光イメージングを示している。腫瘍部位でのＩＣＧＤの蛍光シグナル（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で示される）は時間依存性であり、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰ注射の３６時間後にピークに達することが判った（図５ｃ）。腫瘍部位での強い蛍光は、注射後４８時間でも明らかな減衰を示さず、それはＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰの持続的な腫瘍蓄積を意味し、これはインビボでの光線療法を開始するための広い時間ウィンドーを意味した。注射後４８時間で収集された主要臓器及び腫瘍の生体外イメージングに基づく半定量的生体内分布は、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰの高い腫瘍取り込みを示した（図５ｄ及び５ｆ）。一方、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰの腫瘍蓄積をさらに検証するために、腫瘍組織スライスを蛍光顕微鏡で観察した。図５ｅに示されるように、ＩＣＧＤ（緑色）及びＤＯＸ（赤色）の非常に一貫する蛍光シグナルが腫瘍領域に同時に現れた。
【０１２１】
ＣＰＣＩ／ＤＯＸ−ＮＰの尾静脈投与後の同所性ＯＳＣ−３口腔癌を有するヌードマウスにおける経時にわたるＤＯＸの組織分布を決定した。注射の２４時間後、４８時間後及び５日後に、腫瘍及び正常臓器におけるＤＯＸ濃度を、高圧液体クロマトグラフィー質量分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ）によって測定した。図５ｇに示されるように、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰ投与の２４時間後に、腫瘍、肝臓、さらには腎臓でのＤＯＸの有意な蓄積が認められた。しかしながら、肝臓及び腎臓におけるＤＯＸの蓄積濃度は、時間の経過とともに、特に５日後に急速に消失された。さらに刺激的なことに、腫瘍部位でのＤＯＸ濃度は、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰの注射５日後でも組織１ｇあたり最大約２μｇであった。これは、以下に示す抗腫瘍効果を説明することができる。ＤＯＸは一般的に多くの異なる癌を治療するために使用され、心毒性及び骨髄抑制は、この非常に重要な薬の毒性副作用を制限する用量である。幸い、図５ｅ及び５ｇによると、心臓内のＩＣＧＤの蛍光強度及びＤＯＸ濃度は非常に低く、心臓内のＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰの蓄積が少なく、ＤＯＸ放出が少ないことを示す。この非常に重要な属性は、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰの将来の臨床応用を成功させるために必要である。
【０１２２】
ＣＰＣＩ／ＤＯＸ−ＮＰに基づくインビボ光熱／化学療法の相乗効果
ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰシステムの卓越した生体内分布及びインビトロ抗腫瘍活性に後押しされて、同所性口腔癌を有する無胸腺マウスにおける治療効果研究を次に実施した。最初に、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰのインビボ光熱効果を調べた。ＰＢＳ、ＰＣＩ−ＮＰ、ＣＰＣＩ−ＮＰ又はＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰの全身投与の２４時間後に、生きているマウスの腫瘍領域に、０．８ Ｗｃｍ-2の出力強度の８０８ｎｍレーザーで２分間照射した。図６ａ及び６ｂに示されるように、レーザー照射時に、ＣＰＣＩ−ＮＰ群及びＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰ群の両方の腫瘍領域の平均温度は約５０℃上昇した。これは、ＰＣＩ−ＮＰ（ΔT≒３６．５℃）群の平均温度の約１．３７倍高く、ＰＢＳ（ΔT≒５．６℃）群の８．９２倍高い。そのような高い温度上昇は、癌細胞に不可逆的な損傷を引き起こすのに十分すぎるほどであった。ＣＰＣＩ−ＮＰ又はＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰ群の腫瘍部位が４０℃を超えて急速に加熱されるのに４５秒しかかからなかったことは注目に値する。これは、インビトロ試験での高速加熱速度と一貫していた。これらの結果は、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰがＮＩＲ光エネルギーを効率的に吸収し、光熱療法のために生体内で局所熱に変換できることを明確に示した。
【０１２３】
これらの光熱剤の治療効果を、同所性ＯＳＣ−３細胞口腔癌を有するヌードマウスにおいて調査した。マウスをランダムに５つの群に分けた：（１）ＰＢＳ、（２）遊離ＤＯＸ、（３）ＰＣＩ−ＮＰ、（４）ＣＰＣＩ−ＮＰ及び（５）ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰ。近赤外線レーザー照射（８０８ｎｍ、０．８Ｗｃｍ-2で２分間）をすべての群で使用した。動物実験の設計を図６ｃに示した。腫瘍体積が約５０ｍｍ3に達したときに、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰを尾静脈内注射し、次いで、腫瘍領域を、注射後２４時間及び４８時間（すなわち、２日目及び３日目）で８０８ｎｍレーザー照射に２分間（０．８Ｗｃｍ-2）曝露した。その後、同じ治療レジメン（光熱剤及びそれに続く光照射）を７、８及び９日目に繰り返した。図６ｄに示されるように、ＰＣＩ−ＮＰ群、ＣＰＣＩ−ＮＰ群及びＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰ群は治療の最初の１０日間で満足できる抗腫瘍効果を示した。しかしながら、ＰＣＩ−ＮＰ群及びＣＰＣＩ−ＮＰ群の両方で、腫瘍は１０日目の後に原発部位で再成長し始めた。対照的に、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰ＋レーザー照射を受けた動物では完全な腫瘍寛解が達成され、光熱/化学療法の相乗的治療有効性が検証された。図５ｅは、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰ＋レーザー照射で治療されたマウスの写真を示している。２８日目に腫瘍は発見されなかった。さらに、治療後の体重に有意な変化はなかった（図１８）。組織学的分析により、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰ＋８０８ｎｍレーザー照射の処置で、ほとんどの腫瘍細胞が破壊され、腫瘍切片において、他の群よりもはるかに低いレベルの核多型及びより低い癌細胞密度を有することをさらに確認した（図６ｆ）。
【０１２４】
ＣＰＣＩ／イミキモド−ＮＰに基づくインビボ光熱／免疫療法の相乗効果
上述の実験結果は、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰが、治療領域が光にアクセスできる場合の局所治療のための非常に効果的な光線療法システムであることを明確に示している。しかしながら、癌はしばしば再発及び転移を伴い、癌による死亡の大部分は転移によって引き起こされる。過去数年間で、チェックポイント遮断抗体を用いた免疫療法は臨床的に非常に有望であることが証明されているが、奏効率は腫瘍の種類によって大きく異なる。イミキモドは、トール様受容体７に結合する免疫応答修飾因子であり、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により、性器いぼ、表在性基底細胞癌及び光線性角化症の局所治療薬として承認されている。それは毒性が強すぎて全身投与できない。ＣＰＣＩ−ＮＰの優れたカプセル化能力により、イミキモドは、ＥＰＲ効果による腫瘍蓄積のために、２２±４ｎｍの望ましいナノ粒子サイズを維持しながら、非常に高い薬物カプセル化能力（イミキモド濃度：０．５ｍｇｍＬ-1）でＣＰＣＩ−ＮＰのコアに装填されうる（図７ｂ）。新しいＣＰＣＩ/イミキモド−ＮＰに基づく光熱/免疫療法をＰＤ−１チェックポイント遮断療法と組み合わせて、転移性腫瘍に対する抗癌相乗治療効果を高めることができるかどうかを調査した（図６ａ）。
【０１２５】
動物実験の設計を図７ｃに示す。転移腫瘍の人工模倣物（両側乳房腫瘍モデル）は、同じ免疫担当マウスの左右の乳腺脂肪パッドの両方に４Ｔ１細胞を同所注射することによって開発された。左の腫瘍は光で治療される原発腫瘍として指定され、右の腫瘍は光治療なしで遠隔腫瘍又は「転移性」腫瘍として接種された。マウスをランダムに７つの群に分けた:(群あたりｎ＝６）：（１）ＰＢＳ（未処理）、（２）２サイクル治療のためのＣＰＣＩ/イミキモド−ＮＰ、（３）２サイクル治療のためのレーザー照射を組み合わせたＣＰＣＩ−ＮＰ、（４）２サイクル治療のためのレーザー照射を組み合わせたＣＰＣＩ/イミキモド−ＮＰ、（５）２サイクル治療のためのＣＰＣＩ/イミキモド−ＮＰ＋抗ＰＤ−１、（６）１サイクル治療のためのレーザー照射を組み合わせたＣＰＣＩ/イミキモド−ＮＰ＋抗ＰＤ−１、（７）２サイクルの治療のためのレーザー照射を組み合わせたＣＰＣＩ/イミキモド−ＮＰ＋抗ＰＤ−１。群７では、腫瘍体積が約５０ｍｍ3に達したときに、ＣＰＣＩ/イミキモド−ＮＰ溶液を尾静脈内を介して注射した。注射の２４時間後に、原発腫瘍を８０８ｎｍレーザー照射に２分間局所曝露した（０．８Ｗｃｍ-2）。その後、２日目にマウスに抗ＰＤ−１（α−ＰＤ−１）をマウス１匹あたり２００μｇの用量で腹腔内（ｉｐ）注射した。その後、２回目のサイクル投与（ＣＰＣＩ/イミキモド−ＮＰの静脈内注射、腫瘍局所レーザー照射及びα−ＰＤ−１の腹腔内注射）を６、７及び８日目に１回繰り返した。異なる群の原発腫瘍及び遠隔腫瘍の成長を１日おきにキャリパーで測定した。図７ｄに示されるように、８０８ｎｍレーザーで局所的に照射されたすべての群の原発腫瘍は、ＣＰＣＩ−ＮＰをベースとする初期段階の光熱療法によってほぼ排除された。２回目のレーザー照射などのさらなる治療の欠如、又は、イミキモドもしくはα−ＰＤ−１免疫効果の欠如により、レーザー照射後に、対照群３、４及び６でわずかな腫瘍再発が起こった。群５（ＣＰＣＩ/イミキモド−ＮＰ＋α−ＰＤ−１）は、原発腫瘍の成長の抑制をある程度遅らせたが、レーザー照射なしでは腫瘍を排除できなかったことは注目に値する。著しく対照的に、ＣＰＣＩ/イミキモド−ＮＰ及びα−ＰＤ−１の組み合わせの２サイクルの併用療法（群７）は、最初の１６日以内に再発することなく原発腫瘍を有意に排除でき、このような非特異的併用免疫療法は癌治療に効果的であることができることを示す。
【０１２６】
一方、図７ｅに示されるように、それらの原発腫瘍がＣＰＣＩ／イミキモド−ＮＰをベースとするＰＴＴによって切除されたマウスでは、それらの遠隔腫瘍の成長も部分的に遅れた。特に群７では、それらの遠隔腫瘍はほぼ完全な消失を示し、群５（ＣＰＣＩ/イミキモド−ＮＰ及びα−ＰＤ−１治療、ただし原発腫瘍のＰＴＴなし）で得られたものよりもはるかに優れた効果を達成した。原発腫瘍のためのＰＴＴがまた、遠隔腫瘍に対する明らかな抑制効果を誘発したことを検証した。群７で治療したマウスの原発性腫瘍及び遠隔腫瘍の体積変化の代表的な写真を示した（図７ｆ）。別の対照物として、群４（ＣＰＣＩ/イミキモド−ＮＰをベースとする原発腫瘍のＰＴＴとともにα−ＰＤ−１遮断療法）によって誘発された免疫応答は、群３（イミキモドなし）よりもはるかに優れており、それらのＮＰが強力な免疫応答を引き起こすためにイミキモドの使用が重要な役割を担うことを示している。最後になるが、原発腫瘍群４（α−ＰＤ−１なし）又は群６（α−ＰＤ−１治療のみ１サイクル）のＣＰＣＩ/イミキモド−ＮＰをベースとするＰＴＴによって誘発される免疫応答は、初期の日々における時に二次腫瘍の成長を阻害することしかできなかった。これは、腫瘍細胞を認識するためにＴ細胞を活性化することにより、腫瘍細胞を継続的に殺す上で、α−ＰＤ−１遮断治療戦略が中心的な役割を果たしたことを明らかにした。α−ＰＤ−１療法と組み合わせたＣＰＣＩ/イミキモド−ＮＰをベースとするＰＴＴによって引き起こされる相乗的抗腫瘍効果のメカニズムをさらに調査した。実験において、マウスを１サイクルの治療のために４つの群に分けた（群１：ＰＢＳ、群２：ＣＰＣＩ/イミキモド−ＮＰ、群３：ＣＰＣＩ/イミキモド−ＮＰ＋レーザー照射、群４：ＣＰＣＩ/イミキモド−ＮＰ＋レーザー照射＋抗ＰＤ−１、群あたりｎ＝６）。そして、マウスを犠牲にし、H＆E染色、ＲＴ−ＰＣＲ及びＩＨＣによる評価のために、腫瘍残留組織の両側を収集した。H＆E染色は、群３及び４で原発腫瘍の細胞破壊及びアポトーシスの広い領域を直接示し、免疫療法効果の応答のために遠隔腫瘍も縮小した。これは、対照物群１及び２とは明らかに対照的であった（図７ｇ）。イミキモドは強力なＴＬＲ７アゴニストであり、ＴＬＲ−７分泌サイトカイン（ＩＦＮ−α、ＩＬ−６及びＴＮＦ−α）を介してナチュラルキラー細胞、マクロファージ及びＢリンパ球を活性化し、免疫応答の活性化をさらに促進することができる。ＲＴ−ＰＣＲによるＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＩＬ４、ＩＬ６（細胞性免疫関連マーカ）及びＩＬ−１２（自然免疫マーカ）遺伝子発現を評価した。図７ｈに示されるように、レーザー照射を行った原発腫瘍側でのこれらの免疫マーカの相対的発現は、レーザー照射を行わなかった場合よりも高く、ＰＴＴが切除腫瘍細胞残留物から腫瘍関連抗原を産生することによって強力な腫瘍特異的免疫応答を誘導することができることを検証した。さらに、遠隔腫瘍におけるこれらの免疫マーカの相対的発現は、原発腫瘍の光照射（群３及び４）の重要性を示している。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８+）は、標的となる癌細胞を直接殺すことができ、一方、ＣＤ３+及びＣＤ４+ヘルパーＴ細胞も適応免疫の調節において重��な役割を果たすことができる。両側の腫瘍のこれらのタンパク質発現（ＣＤ８+、ＣＤ３+、ＣＤ４+及びＰＤ−１）が検証された。図７ｉに示されるように、ＰＴＴ治療の効果により、治療された原発腫瘍（群３及び４）の腫瘍細胞数は有意に少なく見えた。さらに、遠隔腫瘍側のＣＤ８+、ＣＤ３+、ＣＤ４+及びＰＤ−１Ｔ細胞は、ＰＢＳ及びイミキモドのみの群よりも群３及び４（イミキモド及び光線療法の組み合わせ群）ではるかに多く見られた。これらの結果は、ＣＰＣＩ/イミキモイド−ＮＰ及び抗ＰＤ−１チェックポイント遮断抗体の全身投与を局所ＰＴＴと併用して、局所及び遠隔転移腫瘍に対して非常に有効であることを明確に示している。この治療概念は非常に翻訳可能であり、臨床試験で試験することができる。
【０１２７】
免疫記憶効果
相乗的光熱免疫療法（α−ＰＤ−１を組み合わせたＣＰＣＩ/イミキモドをベースとするＰＴＴ）によって誘発された免疫記憶を評価するために、二次４Ｔ１腫瘍を、最初に移植された腫瘍の除去から５０日後に原発側及び遠隔側の両方に接種した。同じ年齢で、ＰＢＳで注射したマウスを対照とした。同様に、α−ＰＤ−１は、２つの群のマウスに６７日目及び７３日目に２回腹腔内注射した（毎回マウスあたり２００μｇ）（図８ａ）。図８ｂ及び８ｃに示されるように、腫瘍体積は、α−ＰＤ−１の注射を用いた場合でもＰＢＳ群において急速に増加した。著しく対照的に、α−ＰＤ−１と組み合わせて与えられたＣＰＣＩ/イミキモド−ＮＰをベースとするＰＴＴによる相乗的治療戦略は、両側で再接種された腫瘍の成長を有意に遅らせることができ、この戦略は先天性及び適応性免疫システムの活性化を介して免疫記憶効果を有することを示している。残念ながら、この戦略は腫瘍の成長を遅らせるだけで、腫瘍の再発を完全に抑制することはできなかった。これはおそらく、最初の治療で生成された十分な腫瘍関連抗原が不足しているためである。
【０１２８】
議論
光熱療法に使用される近赤外光熱変換剤（ＰＴＣＡ）は、長年にわたって調査され、様々な腫瘍モデルに適用されてきたが、腎臓からの急速な排泄又は肝臓によるインビボでの代謝及び長時間のレーザー照射下での分解/退色を含むその光熱変換効率及び安定性を改善することに依然として大きな課題が残っている。したがって、光熱癌治療のための新世代の高安定性及び高性能ＰＴＣＡを開発する緊急の必要性が存在する。ドキソルビシンなどの細胞毒性化学療法剤がＰＴＴの抗腫瘍効果に相乗作用できることは、以前及び現在の研究から明らかである。癌関連の死亡の大部分は転移によるものであるので、転移性疾患に対する効果的な全身療法を開発する必要性が非常に高い。免疫療法、特にモノクローナル抗体によるチェックポイント遮断療法は、臨床癌を治療するための非常に有望なアプローチとして近年浮上している。そのような治療法は、癌と戦うために患者自身の免疫系を動員することができる。近年、ＰＴＴは、切除された腫瘍細胞残留物から腫瘍関連抗原を生成して抗腫瘍免疫を改善することにより、抗腫瘍免疫学的効果を生み出すこともできると報告されている。
【０１２９】
ここで、優れたＰＴＣＡとして機能するだけでなく、癌治療のための便利で効率的な制御薬物送達システムとしても機能することができる、新しいテロデンドリマーをベースとする高性能光熱ナノ粒子（ＣＰＣＩ−ＮＰ）の開発は報告されている。ジスルフィド結合によるポリマー間架橋と組み合わせたテロデンドリマーへのＩＣＧＤの共有結合により、ＣＰＣＩ−ＮＰは高密度のＩＣＧＤを集め、π電子相互作用は自己集合後の高い光熱変換効率及び光安定性を保証する。ＣＰＣＩ−ＮＰの光熱変換効率は、５サイクルのレーザー照射後も高いままであった（７０℃を超える）。ＣＰＣＩ−ＮＰ溶液の温度が６０秒の照射（８０８ｎｍ、０．８Ｗｃｍ-2）の直後にほぼ最大に達したことは注目に値する。これは、ＩＣＧＤの独自の構成がこの望ましい光熱特性に寄与していることを示唆している。疎水性ＩＣＧＤ及び顔面両親媒性コール酸単位を含むハイブリッドテロデンドリマーは、化学療法剤又は免疫調節剤のカプセル化及び送達のための理想的なプラットフォームを提供した。例えば、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰは理想的な小さな粒子サイズ（約２０ｎｍ）を有し、標的腫瘍部位に蓄積し、より長い血液循環（３６時間後の腫瘍部位のＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰの最大濃度）の後に深い治療のために深い組織に浸透する傾向がある。ジスルフィド架橋の存在は、ＮＰの安定性を保証し、血液循環におけるＤＯＸの早期放出を制限し、一方、ＤＯＸは、細胞の還元環境下、８０８ｎｍレーザー照射下（図４ｆ）、又はＮ−アセチルシステインの投与によるオンデマンド放出の下で、ＮＰから制御可能に放出されうる。
【０１３０】
同所性口腔癌異種移植モデルを使用することは、ＣＰＣＩ／ＤＯＸ−ＮＰとの光熱／化学療法の組み合わせが、ナノ粒子の投与の２４時間及び４８時間後のレーザー照射を用いて非常に効果的であることを示した。ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰの有意な部分は少なくとも５日まで腫瘍部位に残るので、５日間にわたって光線療法を複数回繰り返すことができるものと考えられる。そのような治療アプローチは、腫瘍が退縮しながら継続的な光線療法を可能にし、その結果、表面の５ｍｍを超えるさらに深い腫瘍に到達することができる。ＩＣＧＤが選択された理由は以下の通りである。（１）吸収波長が長く（８０８ｎｍ）、したがって光線療法の光透過が深い、及び（２）蛍光発光波長８０８ｎｍのＩＣＧはすでに数十年にわたって光イメージングプローブとして診療所ですでに使用されている。したがって、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰは、優れたＰＴＣＡとして機能することができるだけでなく、画像誘導手術のための腫瘍標的プローブとしても使用することができる。さらに、腫瘍の縁及び腫瘍床が手術室で光線療法に容易にアクセスできるときには、術中の光熱療法に使用される大きな臨床的可能性がある。
【０１３１】
局所療法に加えて、ＣＰＣＩ−ＮＰはまた、特にＦＤＡ承認されたイミキモドなどの免疫調節剤が装填されたときに、全身性免疫療法に使用することができる。ＣＰＣＩ−ＮＰでカプセル化すると、静脈内イミキモドの毒性ははるかに低く、ＥＰＲ効果を介してすべての腫瘍部位にイミキモドを全身投与することができる。表在性腫瘍又は内視鏡検査にアクセス可能な腫瘍の局所光照射は、腫瘍関連抗原及び免疫細胞の感作を局所的に生成し、その後に、他の転移性腫瘍部位に播種し、アブスコパル抗腫瘍効果を引き起こすと予想される。このような光免疫療法は、チェックポイント遮断抗体と併用すると非常に効果的であることが期待される。この概念を、４Ｔ1同系同所性乳癌モデルで試験した。ＣＰＣＩ/イミキモド−ＮＰの全身注入後の原発腫瘍のＮＩＲ誘発光熱切除時に、放出された腫瘍関連抗原は、特に抗ＰＤ−1チェックポイント遮断療法の助けを借りて、強力な免疫応答を示し、多くの抗原特異的Ｔ細胞を活性化し、一方、免疫抑制性調節性Ｔ細胞（Treg）の活性を阻害する。これは、マウスの体内に残っている遠隔腫瘍細胞を攻撃することができる。別の実験は、この組み合わせの光免疫療法戦略が、治療されたマウスが新しい４Ｔ1腫瘍細胞の移植によって再チャレンジされたときに、腫瘍形成を有意に遅らせ、腫瘍増殖を遅らせることができることを示している。
【０１３２】
要約すると、共組織化された二元テロデンドリマーをベースとする新世代のＰＴＣＡは、優れた光熱変換効率、加熱能力及び光熱療法の安定性を示した。さらに、上皮内口腔癌の相乗的治療のための化学療法及び転移性乳癌の相乗的治療のための免疫療法をそれぞれ組み合わせた多機能ナノプラットフォームとして利用することができる。この非常に有望なナノプラットフォームは、多くの異なる腫瘍タイプに対する臨床翻訳の大きな可能性を示している。腫瘍標的リガンドをナノキャリアに導入することにより、それらの有効性をさらに改善できることが期待される。
【０１３３】
方法
材料
モノメチル末端ポリ（エチレングリコール）モノアミン（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ2、Ｍｗ：５０００Ｄａ）をRapp Polymere（ドイツ）から購入した。４−カルボキシフェニルボロン酸、４−カルボキシフェニルボロン酸ピナコールエステル、３−カルボキシ−５−ニトロフェニルボロン酸及び３−カルボキシ−５−ニトロフェニルボロン酸ピナコールエステルをCombi-Blocks（San Diego, CA）から入手した。（Fmoc）lys（Boc）−OH、（Fmoc）Lys（Fmoc）−OH、（Fmoc）Cys（Trt）eOH及び（Fmoc）Ebes−COOHをAnaSpec Inc.（San Jose, CA）から購入した。他のすべての化学物質はSigma-Aldrich（St. Louis）から購入した。
【０１３４】
インドシアニングリーン誘導体（ＩＣＧＤ）の合成
端的には、１，１，２−トリメチルベンズ[ｅ]インドール（Ｉ）及びヨードエタン（１．５当量）をアセトニトリル溶液中で９０℃の加熱還流下で３日間反応させた。その後、エーテルを加えて、３−エチル−１,１,２−トリメチル−１Ｈ−ベンゾ[ｅ]インドール−３−イウム（生成物ＩＩ）を生成した。次に、粗生成物（ＩＩ）を無水酢酸中のＮ−［５−（フェニルアミノ）−２，４−ペンタジエニリデン］アニリン一塩酸塩（１当量）に加えた。混合物を１００℃に１．５時間加熱し、ＲＴに冷却し、脱イオン水に加えた。ろ過後に、生成物（ＩＩＩ）３−エチル−１,１−ジメチル−２（（１Ｅ, ３Ｅ, ５Ｅ）−６−（Ｎ−フェニルアセトアミド）ヘキサ−１,３,５−トリエン−１−イル）−１Ｈ−ベンゾ[ｅ]インドール−３−イウムを得た。さらに、１，１，２−トリメチルベンズ[ｅ]インドール（Ｉ）及びヨウ化カリウムの５−ブロモ吉草酸（１．２当量）をアセトニトリル溶液中で１００℃の加熱還流下で５日間反応させた。その後、エーテルを加えて、３−（４−カルボキシブチル）−１,１,２−トリメチル−１Ｈ−ベンゾ[ｅ]オンドル−３−イウム（ＩＶ）を生成した。最後に、粗ＩＶをピリジンのＩＩＩに加えた。混合物を４０℃で３０分間加熱し、真空中で濃縮して最終生成物を得た。最終的な粗生成物をシリカゲルカラムで２回精製して、ＩＣＧＤを得た。
【０１３５】
テロデンドリマーの合成
最初の代表的なＩＣＧＤ/ＣＡテロデンドリマー（ＰＥＧ5k−ＩＣＧＤ4−ＣＡ4、ＰＩＣと略記）を、公開されている方法（Liら、Biomaterials 2011, 32（27）, 6633-6645）に従って段階的なペプチド化学を利用して、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ2から液相縮合反応を介して合成した。端的には、カップリング反応の完了を示す負のカイザー試験結果が得られるまで、カップリング試薬としてＤＩＣ及びＨＯＢｔを使用してＰＥＧのＮＨ2末端に（Fmoc）Lys（Fmoc）−OH（３当量）をカップリング反応させた。冷エーテルを加えることによりＰＥＧ化分子を沈殿させ、次に冷エーテルで２回洗浄した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（ｖ/ｖ）の４−メチルピペリジンで処理することによりFmoc基を除去し、ＰＥＧ化分子を沈殿させ、冷エーテルで３回洗浄した。白色粉末沈殿物を真空下で乾燥させ、（Fmoc）Lys（Fmoc）−OHの１つのカップリング及び（Fmoc）lys（Boc）−OHの１つのカップリングをそれぞれ行って、ＰＥＧの１つの端部で４つのBoc及びFmoc基を末端とする第３世代の樹枝状ポリリジンを生成した。CA NHSエステル及びICGDは、それぞれ２０％（ｖ/ｖ）の４−メチルピペリジンでFmocを除去し、ジクロロメタン中の５０％（ｖ/ｖ）トリフルオロ酢酸でBoc基を除去した後に、樹枝状ポリリジンの末端に結合した。テロデンドリマー溶液をろ過し、次に３．５ＫＤａのＭＷＣＯで水に対して透析により分離した。最後に、テロデンドリマーを凍結乾燥した。
【０１３６】
第二のチオール化テロデンドリマー（ＰＥＧ5k−Ｃｙｓ4−Ｌ8−ＣＡ8として命名され、ＰＣＬＣと略される）は、ＵＳＰＮ １０，１０６，６５０ Ｂ２に従って合成された。端的には、ＰＥＧの一端に４つのBoc及びFmoc基を末端とする第３世代の樹枝状ポリリジンを最初に上記の方法に従って合成した。ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の５０％（ｖ/ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）でBoc基を除去した後に、（Fmoc）Cys（Trt）eOH、（Fmoc）Ebes−OH及びコール酸NHSエステルを樹枝状ポリリジンの末端に段階的に結合した。システイン上のＴｒｔ基は、ＴＦＡ/Ｈ2Ｏ/エタンジチオール（ＥＤＴ）/トリエチルシラン（ＴＩＳ）（９４：２．５：２．５：１、ｖ/ｖ）によって除去され、ＰＣＬＣチオール化テロデンドリマーが生成された。チオール化テロデンドリマーを、ＤＭＦ及びエーテルをそれぞれ用いた３サイクルの溶解/再沈殿によって混合物から回収した。最後に、チオール化テロデンドリマーをアセトニトリル/水に溶解し、そして凍結乾燥した。
【０１３７】
ＰＩＣ及びＰＣＬＣテロデンドリマーの分子量は、Ｒ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用して、ＡＢＩ ４７００ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（線形モード）で収集した。テロデンドリマーの単分散質量トレースが検出され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳからのテロデンドリマーの分子量は理論値とほぼ同じであった。テロデンドリマーの1ＨＮＭＲスペクトルを、溶媒としてＣＤＣｌ3を使用して、Ａｖａｎｃｅ ６００核磁気共鳴分光計（Bruker）で記録した。
【０１３８】
ＣＰＣＩ−ＮＰの調製
１０ｍｇのＰＩＣテロデンドリマーを１ｍＬのＰＢＳに溶解した後に、１０分間超音波処理してＰＩＣ ＮＰを形成した。ＣＰＩＣ ＮＰを作成するために、１０ｍｇのＰＣＬＣテロデンドリマー及び１０ｍｇのＰＣＩテロデンドリマーを１ｍＬのＰＢＳ中に溶解してミセルを形成し、次いで１０分間超音波処理した。テロデンドリマー上のチオール基は、空気によって酸化されてジスルフィド結合を形成した。
【０１３９】
ＣＰＣＩ／ＤＯＸ−ＮＰの調製
ＤＯＸ又はイミキモドなどの疎水性薬物を、溶媒蒸発法によってＣＰＩＣ ＮＰに装填した。ＤＯＸをＮＰにカプセル化する前に、ＤＯＸ・ＨＣｌを、クロロホルム（ＣＨＣｌ3）/メタノール（ＭｅＯＨ; １：１、ｖ/ｖ）中のトリエチルアミン３モル当量とともに撹拌して、ＤＯＸ・ＨＣｌからＨＣｌを除去した。全部で、１０ｍｇのＰＣＩテロデンドリマー及び１０ｍｇのＰＣＬＣテロデンドリマーを異なる量の中和されたＤＯＸとともに最初にＣＨＣｌ3/ＭｅＯＨに溶解し、混合し、ロータベーパ上で蒸発させて、均質な乾燥ポリマーフィルムを得た。フィルムを１ｍＬのＰＢＳ中で再構成し、次いで、３０分間超音波処理し、サンプルフィルムをナノ粒子溶液中に分散させた。最後に、ナノ粒子溶液を０．２２ｍｍフィルタでろ過してサンプルを滅菌した。薬物の量を決定するために、薬物装填ナノ粒子をＤＭＳＯ（ＮＰ溶液/ＤＭＳＯ、１：９、ｖ/ｖ）で希釈して、ナノ粒子を解離させた。薬物装填をＨＰＬＣシステム（Waters）で分析した。ここで、検量線は、様々な濃度の一連の薬物/ＤＭＳＯ標準溶液を使用して取得した。イミキモドを装填したＣＰＩＣ ＮＰは、３モル当量のトリエチルアミンを使用しないことを除いて、同様の方法で調製した。
【０１４０】
ナノ粒子の特性化
ナノ粒子のサイズ及びサイズ分布を、ＤＬＳ機器（Microtrac）によって測定した。ＤＬＳ測定のために濃度を１．０ｍｇｍＬ-1に維持した。すべての測定を２５℃で行った。ナノ粒子のモルホロジーをフィリップスＣＭ−１２０ＴＥＭで観察した。端的には、ナノ粒子水溶液（１ｍｇｍＬ-1トレデンドロマー）を銅グリッド上に堆積させ、ホスホタングステン酸で２秒間染色し、室温で測定した。粒子のサイズをＴＥＭソフトウェア（Digital Micrograph, Gatan Inc）を使用して分析した。 ＮＰのＵＶ−ｖｉｓ−ＮＩＲ吸収スペクトルは、Genesys 10S UV-Vis分光光度計（Thermo Scientific, Waltham, MA）で測定した。ＮＰの蛍光シグナルを、蛍光分光法（SpectraMax M2, Molecular Devices, Suunyvale, CA, USA）で測定した。
【０１４１】
ＳＤＳ及びヒト血漿中のナノ粒子の安定性
ポリマーミセルを効率的に分解できることが報告されているＳＤＳの存在下でのＰＣＩ−ＮＰ及びＣＰＣＩ−ＮＰの蛍光及び粒子サイズの変化をモニターするために安定性研究を実施した。ナノ粒子の水溶液（１．５ｍｇｍＬ-1）にＳＤＳ溶液（７．５ｍｇｍＬ-1）を加えた。最終的なＳＤＳ濃度は２．５ｍｇｍＬ-1であり、ミセル濃度は１．０ｍｇｍＬ-1に保たれた。溶液の蛍光シグナルを蛍光分光計で測定した。ナノ粒子溶液のサイズ及びサイズ分布をＤＬＳによって所定の時間間隔でモニターした。ミセルの安定性は、ＳＤＳと一緒にＧＳＨ（１０ｍＭ）の存在下でも評価した。ＤＯＸを装填するＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰの安定性を、健康なヒトボランティアからの１０％（ｖ/ｖ）血漿でさらに研究した。混合物を生理的体温（３７℃）でインキュベートし、次いで、９６時間までの所定の時間間隔でサイズ測定した。
【０１４２】
ナノ粒子の光熱効果
１ｍＬのＰＣＩ−ＮＰ（ＩＣＧＤ用量３０μｇｍＬ-1）、ＣＰＣＩ−ＮＰ（ＩＣＧＤ用量３０μｇｍＬ-1）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングされた金ナノロッド（ＧＮＲ濃度：１８μｇｍＬ-1）をそれぞれ４ｍＬの透明な石英バイアル中に添加した。この溶液に、ファイバー結合連続半導体ダイオードレーザー（８０８ｎｍ、Beijing Viasho Technology Co., Ltd., China）で照射した。電力密度は０．８Ｗｃｍ-2であり、温度は熱赤外線イメージングカメラ（Flir C2, USA）でモニターした。ＣＰＣＩ−ＮＰの光安定性を調べるために、１ｍＬのＣＰＣＩ−ＮＰ（３０μｇｍＬ-1でのＩＣＧＤ濃度）、ＰＣＩ−ＮＰ（３０μｇｍＬ-1でのＩＣＧＤ濃度）又はＩＣＧ（３０μｇｍＬ-1）水溶液を８０８ｎｍレーザーを５分間照射し、次いで、室温まで冷却した。
【０１４３】
ナノ粒子のインビトロ侵入深さ及び熱効果
８０８ｎｍでのレーザー照射下でのＣＰＣＩ−ＮＰの加熱効果及び組織侵入深さの関係を調査するために、インビトロでのシミュレーション実験を最初に設計した。この実験を、（１）ＣＰＣＩ−ＮＰ及び（２）ＰＣＬＣ/ＴＢＡＩ＆ＩＣＧＮＰの２つの群に分けた。群（２）を以下の方法で調製した。静電相互作用を介した遊離ＩＣＧ及びヨウ化テトラ−n−ブチルアンモニウム（ＴＢＡＩ）の複合体は、ＰＣＬＣ/ＴＢＡＩ＆ＩＣＧＮＰと呼ばれるＰＣＬＣトレデンドリマー中に物理的にカプセル化できた。シミュレーション組織としてホットポットビーフを選び、四角片に切断した（各ピースの厚さ：２ｍｍ）。１００μＬのＣＰＣＩ−ＮＰ（３０μｇｍＬ-1でのＩＣＧＤ濃度）又はＰＣＬＣ/ＴＢＡＩ＆ＩＣＧ ＮＰ（遊離ＩＣＧ濃度：３０μｇｍＬ-1）溶液を、ビーフの表面にたらし、８０８ｎｍレーザー（０．８Ｗｃｍ-2、２分）をデバイスの下から印加した。温度及びビーフ片の厚さを熱赤外線カメラによって記録した。
【０１４４】
ＣＰＣＩ／ＤＯＸ−ＮＰからのＤＯＸ放出
ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰからのインビトロＤＯＸ放出プロファイルを透析法によってさらに測定した。薬物放出実験を３つの群（ｎ＝３）に分けた：（１）ＰＢＳ、（２）ＧＳＨ（１０ｍＭ）、（３）ＮＩＲ照射（８０８ｎｍレーザー、０．８Ｗｃｍ-2）とともにＧＳＨ（１０ｍＭ）。まず、５００μＬのＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰ溶液（ＤＯＸ濃度１ｍｇｍＬ-1）を透析バッグに移し、ＤＩ水に対して透析した。すべての群を、最初に、振とうしながら３７℃で４時間評価した。その後、群（２）はＧＳＨが添加された。群（３）はＧＳＨが添加され、適切な時点で８０８ｎｍレーザー下に３回照射された。すべての群で、１０μＬの溶液を所望の時点で取り出し、９０μＬのＤＭＳＯを含む１本のボトルに添加した。放出されたＤＯＸ含有量をＨＰＬＣシステム（Waters）で分析し、ここで、異なる濃度の一連の薬物/ＤＭＳＯ標準溶液を使用して検量線を取得した。データを、各３つのサンプルのＤＯＸ累積放出の平均百分率として報告した。
【０１４５】
インビトロ細胞実験
サンプルのインビトロ細胞毒性、細胞取り込み研究及び併用療法を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から購入したヒトＯＳＣ−３口腔癌細胞株で評価した。細胞を、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリンを添加したＤＭＥＭを使用して、３７℃、５％ＣＯ2を含む加湿雰囲気で２４時間培養した。次に、サンプルを各ウェルに加え、細胞を３７℃でさらに２４時間インキュベートした。インキュベーション後に、相対的な細胞生存率をＭＴＳアッセイで測定した。細胞の取り込みを評価するために、ＯＳＣ−３細胞を９６ウェルプレートに播種し、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰ（ＤＯＸ濃度：２５μｇｍＬ-1）とともにさらに６時間インキュベートした。３０分間のＤＡＰＩ染色後に、細胞の取り込みを共焦点画像で決定した。インビトロ化学療法/光熱併用療法では、ＯＳＣ−３細胞を９６ウェルプレート（ｎ＝３）に播種し、様々なサンプルと４時間インキュベートし、次いで、８０８ｎｍ ＮＩＲレーザー（０．８Ｗｃｍ-2、２分）に曝露した。その後、細胞を３７℃でさらに２４時間インキュベートし、ＭＴＳ試薬を各ウェルに添加した。次に、相対的な細胞生存率をＭＴＳアッセイで測定した。細胞生存率の百分率は薬剤効果を表し、１００％はすべての細胞が生存したことを意味する。細胞生存率は、以下の式を使用して計算した：細胞生存率（％）=（処理OD490nm/ブランク対照OD490nm）×100％。インビトロ細胞アポトーシス実験では、ＯＳＣ−３細胞を様々なサンプル（ＤＯＸ濃度：２５μｇｍＬ-1及び８０８ｎｍＮＩＲレーザー（印加する場合は０．８Ｗｃｍ-2、２分））とともに８時間共培養した。細胞を２回洗浄し、新たな培地と交換した。次に、細胞を１２ウェルプレートでＰＩ/ＤｉｏＦＩＴＣとともに３０分間共培養した。細胞アポトーシスを、蛍光顕微鏡を利用してモニターした。ＰＩ/アネキシンＶの代表的なＦＣＭ分析スキャッタグラムは４つの群でアポトーシスを示した。
【０１４６】
インビボ血液除去動態
メスのSprague-Dawleyラットの頸静脈に、採血用のカテーテルを移植した（Harland, Indianapolis, IN, USA）。同一のＩＣＧ濃度の遊離ＩＣＧ、ＰＣＬＣ/ＴＢＡＩ＆ＩＣＧ ＮＰ及びＣＰＣＩ−ＮＰを、５ｍｇｋｇ-1体重の用量でカテーテルを通して注射した（各群でｎ＝３）。すべての血液サンプルは、異なる時点でカテーテルから収集した。マイクロプレートリーダー（SpectraMax M2）を使用して、８０８ｎｍでの吸光度でのＩＣＧ濃度を測定した。
【０１４７】
動物モデル：
すべての動物実験は、カリフォルニア大学デービス校の動物使用及びケア管理諮問委員会によって承認されたプロトコルNo.19724に従った。上皮内ＯＳＣ−３口腔癌モデル：Harlan（Livermore, CA, USA）から購入した６〜８週齢のメスのヌードマウス。同所性の口腔癌モデルを唇に移植し、それは初めて確立された。各メスのヌードマウスは、１０μＬのＰＢＳ中に１×１０6個のＯＳＣ−３口腔癌細胞を注入することによって移植された。ＯＳＣ−３口腔腫瘍を有するマウスを、腫瘍の体積が約５０ｍｍ3に達したときに治療した。４Ｔ１乳癌モデル：メスＢａｌｂ/cマウス（８〜１０週間）をHarlan（Livermore, CA, USA）から購入した。次に、ＰＢＳ及びマトリゲル（１：１ ｖ/ｖ）の８０μＬ混合物中に懸濁した４Ｔ１細胞（１×１０6）を４番目の乳房脂肪パッド中に注射した。４Ｔ１腫瘍を有するマウスを、腫瘍の体積が約５０ｍｍ3に達したときに治療した。
【０１４８】
インビボ／エクスビボ蛍光イメージング
上皮内ＯＳＣ−３口腔癌を有するヌードマウスを、体重１ｋｇあたり７ｍｇのＩＣＧＤの用量でＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰの尾静脈注射に供した。イソフルラン麻酔下のマウスは、事前に設計された時点で、インビボ蛍光イメージングシステム（Carestream In-Vivo Imaging System FX PRO, USA）を使用して撮像された。ＮＰ注射の４８時間後、すべての動物を犠牲にし、それらの注目の器官を生体外イメージングのために切除した。
【０１４９】
インビボ癌治療
上皮内ＯＳＣ−３口腔癌を有するマウスに、ＰＢＳ、遊離ＤＯＸ（２．５ｍｇｍＬ-1）、ＰＣＩ−ＮＰ（ＰＣＩテロデンドリモ２５ｍｇｋｇ-1; ＩＣＧＤ ７ｍｇｋｇ-1）、ＣＰＣＩ−ＮＰ（総テロデンドリモ５０ｍｇｋｇ-1; ＩＣＧＤ ７ｍｇｋｇ-1）、ＣＰＣＩ/ＤＯＸ−ＮＰ（総テロデンドリモ５０ｍｇｋｇ-1; ＤＯＸ ２．５ｍｇｋｇ-1、ＩＣＧＤ７ｍｇｋｇ-1）を注射した。２４時間後及び４８時間後に、全身麻酔下で腫瘍をレーザーで２回局所照射し（０．８Ｗｃｍ-2で２分間）、ビームスポットで腫瘍全体を覆った。マウスを週に１回２サイクル処理した。サーマルカメラ（ＦＬＩＲ）を使用して腫瘍表面温度を記録した。腫瘍体積をキャリパーによって週に２回測定し、ここで、「ｗ」及び「ｌ」は腫瘍の幅と長さである。治療を３０日間続けた。体重が２０パーセント減少するか、又は、腫瘍の成長が飲水及び接触に影響を与えたら、マウスを殺生した。４Ｔ１腫瘍を有するマウスを、それぞれＰＢＳ、ＣＰＣＩ/Ｉｍｉ、ＣＰＣＩ＋Ｌ、ＣＰＣＩ/Ｉｍｉ＋Ｌ、ＣＰＣＩ/Ｉｍｉ＋α−ＰＤ−１、ＣＰＣＩ/Ｉｍｉ＋Ｌ＋α−ＰＤ−１及びＣＰＣＩ/Ｉｍｉ＋Ｌ＋α−ＰＤ−1（１サイクル）（ＩＣＧＤ７ｍｇｋｇ-1、イミキモド１．２５ｍｇｋｇ-1、マウスあたり２００μｇの抗ＰＤ−１の腹腔内注射）による治療につてランダムに７つの群（ｎ＝６）に分けた。腫瘍体積が約５０ｍｍ3に達したときに、治療を行った。腫瘍のサイズを週に２回測定し、以下の式を使用して計算した：体積＝０．５×Ｌ×Ｗ2。
【０１５０】
組織学研究
ＯＳＣ−３口腔癌を有するマウスを、注射後２サイクルの治療の後に犠牲にした。腫瘍組織を固定し、パラフィンに包埋した。ヘマトキシリン及びエオシン（H＆E）染色スライドを、BBC Biochemical（Mount Vernon, WA）によって調製し、顕微鏡を使用して観察した。
【０１５１】
上述の発明は、理解を明確にする目的で例示及び実施例として幾らか詳細に説明されてきたが、当業者は、特定の変更及び変形が添付の特許請求の範囲内でなされうることを理解するであろう。さらに、本明細書で提供される各参考文献は、各参考文献が参照により個別に組み込まれた場合と同程度に、その全体が参照により取り込まれる。本出願と本明細書で提供される参考文献との間に矛盾が存在する場合には、本出願が優位になるものとする。
【図１】
2021535258.tif 000020
【図２】
2021535258.tif 000021
【図３】
2021535258.tif 000022
【図４】
2021535258.tif 000023
【図５】
2021535258.tif 000024
【図６】
2021535258.tif 000025
【図７−１】
2021535258.tif 000026
【図７−２】
2021535258.tif 000027
【図７−３】
2021535258.tif 000028
【図８】
2021535258.tif 000029
【図９】
2021535258.tif 000030
【図１０】
2021535258.tif 000031
【図１１】
2021535258.tif 000032
【図１２】
2021535258.tif 000033
【図１３】
2021535258.tif 000034
【図１４】
2021535258.tif 000035
【図１５】
2021535258.tif 000036
【図１６】
2021535258.tif 000037
【図１７】
2021535258.tif 000038
【図１８】
2021535258.tif 000039
【国際調査報告】
2021535258.tif 000040
2021535258.tif 000041