(57)【要約】  腱損傷を治療するための方法は、それを必要とする対象に、ＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド（ＰＤＳＰ）、またはＰＤＳＰの変異体を含む医薬組成物を投与する工程を含み、ＰＤＳＰは、ヒト色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）の残基９３〜１０６を含み、ＰＤＳＰの変異体は、ＰＤＳＰのセリン−９３、アラニン−９６、グルタミン−９８、イソロイシン−１０３、イソロイシン−１０４およびアルギニン１０６を含み、他の位置に１つ以上のアミノ酸置換を含み、残基位置番号は、ヒトＰＥＤＦでの残基位置番号に基づく。
2021521113.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド（ＰＤＳＰ）、または前記ＰＤＳＰの変異体を含む、腱損傷の治療に使用するための医薬組成物であって、
前記ＰＤＳＰが、ヒト色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）の残基９３〜１０６を含み、前記ＰＤＳＰの前記変異体が、前記ＰＤＳＰのセリン−９３、アラニン−９６、グルタミン−９８、イソロイシン−１０３、イソロイシン−１０４およびアルギニン１０６を含み、他の位置に１つ以上のアミノ酸置換を含み、残基位置番号が、前記ヒトＰＥＤＦでの残基位置番号に基づく
医薬組成物。
【請求項２】
前記ＰＤＳＰが、Ｓ−Ｘ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｑ／Ｈ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｉ／Ｖ−Ｉ−Ｘ−Ｒ（配列番号５）の配列を含む
請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ＰＤＳＰが、ＳＬＧＡＥＱＲＴＥＳＩＩＨＲ（配列番号２）の配列を含む
請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＰＤＳＰが、ＳＬＧＡＥＱＲＴＥＳＩＩＨＲＡＬＹＹＤＬＩＳＳＰＤＩＨＧＴ（配列番号１）の配列を含む
請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ＰＤＳＰが、配列番号６〜７５のいずれか１つの配列の配列を含む
請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
それを必要とする対象に、ＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド（ＰＤＳＰ）、または前記ＰＤＳＰの変異体を含む医薬組成物を投与する工程を含む、腱損傷を治療するための方法であって、
前記ＰＤＳＰが、ヒト色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）の残基９３〜１０６を含み、前記ＰＤＳＰの前記変異体が、前記ＰＤＳＰのセリン−９３、アラニン−９６、グルタミン−９８、イソロイシン−１０３、イソロイシン−１０４およびアルギニン１０６を含み、他の位置に１つ以上のアミノ酸置換を含み、残基位置番号が、前記ヒトＰＥＤＦでの残基位置番号に基づく
方法。
【請求項７】
前記ＰＤＳＰが、Ｓ−Ｘ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｑ／Ｈ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｉ／Ｖ−Ｉ−Ｘ−Ｒ（配列番号５）の配列を含む
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＤＳＰが、ＳＬＧＡＥＱＲＴＥＳＩＩＨＲ（配列番号２）の配列を含む
請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＤＳＰが、ＳＬＧＡＥＱＲＴＥＳＩＩＨＲＡＬＹＹＤＬＩＳＳＰＤＩＨＧＴ（配列番号１）の配列を含む
請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＤＳＰが、配列番号６〜７５のいずれか１つの配列の配列を含む
請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＥＤＦ由来ペプチド、および損傷後の腱治癒に対するそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腱は密な結合組織を含み、体の動きの制御に重要な、骨への筋力の伝達を実行する。腱の損傷は一般的であり、多くの場合、腱を過度に伸ばすことによって引き起こされる。しかし、腱は、その無血管性および無細胞性（ａｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）のために、重度の損傷後の自己治癒能力が限られている。他のタイプの結合組織とは異なり、腱の損傷部位に骨髄間葉系間質細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）を動員することは困難である。したがって、腱の修復は遅く、比較的困難なプロセスである。
【０００３】
近年、腱の再生および修復を加速するために、細胞療法に基づくアプローチを採用するための集中的な努力が払われてきた。腱の再生に適切な細胞源を提供するために、成人のＭＳＣを得ることができる。ただし、細胞移植には時間のかかる増殖プロセスが必要である。さらに、コスト、技術的問題および安全性の問題は、患者に利益を提供する点で障害である。腱幹／前駆細胞（ＴＳＰＣ）の増殖を刺激する成長因子は、腱の修復を促進するための代替的な選択肢である可能性がある。近年の研究では、腱周囲でＣＤ１４６マーカーを運ぶＴＳＰＣが、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）を局所的に提供した後、腱創傷で増殖するように刺激され得ることが示されている。多血小板血漿（ＰＲＰ）注射は、腱損傷治癒のための血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）の可能性を獲得するための別の例であるが、おそらく調製物中のＰＤＧＦの濃度が低いため、効果は限られている。さらに、成長因子治療は、細胞療法の待機期間を省き、急性腱損傷に対して容易に利用可能である。
【０００４】
いくつかの成長因子は、ＴＳＰＣの増殖を誘発する能力を有すると報告されている。結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）は、ＣＤ１４６＋ＴＳＰＣのクローン原性能を増強することが実証されている。線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）−２は、Ｓｃｌｅｒａｘｉｓ（Ｓｃｘ）およびＳＲＹ−ｂｏｘ含有遺伝子９（Ｓｏｘ９）の発現によって特徴付けられるＴＳＰＣの成長を促進する。さらに、ｂＦＧＦ、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）−１およびＰＤＧＦ−ＢＢのヒドロゲル併用物により、脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＳＣ）の生存率が向上して、インビボでの腱治癒を促進し得ることが報告されている。
【０００５】
色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）は、ほとんどの体組織に広く発現している。ＰＥＤＦは、いくつかの幹／前駆細胞の増殖を媒介することが報告されている。例えば、ＰＥＤＦは、神経前駆細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）およびヒト胚性幹細胞の増殖を刺激するのに効果的である。近年の試験ではさらに、ＰＥＤＦおよびＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド（ＰＤＳＰ）が、角膜上皮幹細胞、筋サテライト細胞および肝幹細胞の増殖を刺激し得ることが実証された。これらの観察結果は、ＰＤＳＰが、腱損傷を含むいくつかのタイプの組織損傷に対する有望な可能性を有する治療剤であり得ることを示唆している。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の一態様は、腱損傷を治療するための医薬組成物または方法に関する。本発明の一実施形態による方法は、それを必要とする対象に、ＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド（ＰＤＳＰ）、またはＰＤＳＰの変異体を含む医薬組成物を投与する工程を含み、ＰＤＳＰは、ヒト色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）の残基９３〜１０６を含み、ＰＤＳＰの変異体は、ＰＤＳＰのセリン−９３、アラニン−９６、グルタミン−９８、イソロイシン−１０３、イソロイシン−１０４およびアルギニン１０６を含み、他の位置に１つ以上のアミノ酸置換を含み、残基位置番号は、ヒトＰＥＤＦでの残基位置番号に基づく。ＰＤＳＰは、配列番号１〜７５のいずれか１つの配列の配列を含む。
【０００７】
本発明の他の態様は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲によって明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ヌクレオステミン陽性ＴＳＰＣ増殖に対する２９量体変異体の影響を示す。初代ウサギＴＳＰＣを７５Ｔ細胞培養フラスコ内でほぼコンフルエンスまで培養し、次いで、ＴＳＰＣマーカー、ヌクレオステミン（＞９８％；緑色）の免疫染色により確認した。ヘキスト３３２５８（青色）により核を染色し、落射蛍光顕微鏡により視覚化した。１０μＭの２９量体またはその変異体を用いて、ヌクレオステミン陽性ＴＳＰＣを２４時間処理した。細胞増殖アッセイキット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ；カタログ番号：Ｋ３０７）を用いて、２４時間増殖後のＴＳＰＣの数を検出した。ＰＤＳＰ溶媒を用いて処理したＴＳＰＣを１００％として設定した。結果は、３つの独立した実験の平均±ＳＥとして表されている。
【０００９】
【図２】２９量体変異体を用いて処理したＴＳＰＣ内のサイクリンＤ１の発現のウエスタンブロット分析の結果を示す。１０μＭの２９量体またはその変異体を用いて、初代ウサギＴＳＰＣを２４時間処理した。３つの独立した実験から得られた代表的なブロット（Ａ）およびＳＤを用いた濃度測定分析（Ｂ）を示す。β−アクチンに対してサイクリンＤ１発現を正規化した。＊Ｐ＜０．０１対溶媒処理細胞。＃Ｐ＜０．０５対２９量体処理細胞。
【００１０】
【図３】２９量体変異体により処置した腱の術後１週間後の組織学的外観を示す。Ｈ＆Ｅ染色による組織病理学的分析の代表的な顕微鏡写真。高倍率でのＨ＆Ｅ染色切片は、コラーゲン線維間の細胞の相対的な欠乏を伴う非損傷腱組織を示す。損傷領域は、脂肪沈着を示す黄色の矢印、細胞充実度の高い領域を示す黒色の矢印、および血管を示す＊によって示される変性および炎症を示す。
【００１１】
【図４】アキレス腱治癒に対する２９量体変異体／アルジネートゲルの効果を示す。（Ａ）高倍率での代表的なＨ＆Ｅ染色縦断面は、ビヒクル／アルジネートおよび２９量体／アルジネートを用いて１週間処置した非損傷腱組織および損傷腱での核の形態を示す。（Ｂ）組織病理学的スコア。線維構造、線維配列、核の丸み、常在細胞密度、および炎症（炎症細胞の浸潤、血管新生および脂肪沈着）によって、総スコアを決定した。データは平均±ＳＥとして報告されている。＊Ｐ＜０．０００５対ビヒクル／アルジネート処置腱。＃Ｐ＜０．０５対２９量体／アルジネート処置腱。
【００１２】
【図５】損傷したアキレス腱のＣＤ１４６陽性ＴＳＰＣ増殖に対する２９量体変異体／アルジネートゲルの効果を示す。（Ａ）代表的なＣＤ１４６染色縦断面。（元の倍率×２００）。（Ｂ）損傷腱切片の２００倍視野当たりのＣＤ１４６陽性ＴＳＰＣの数。データは平均±ＳＥとして報告されている。６つの切片／腱標本から総ＣＤ１４６＋細胞を評価し、各群ラット３匹とした。＊Ｐ＜０．００１対ビヒクル／アルジネート処置腱。＃Ｐ＜０．００１対２９量体／アルジネート処置腱。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の実施形態は、ＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド（ＰＤＳＰ）を使用して腱損傷を治療するための方法に関する。ヒト色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）は、４１８個のアミノ酸を含み、分子量が約５０ｋＤａの分泌タンパク質である。ＰＥＤＦは、多くの生物学的機能を有する多機能タンパク質である（例えば、米国特許出願公開第２０１０／００４７２１２号明細書を参照）。ＰＥＤＦの様々なペプチド領域が様々な機能に関与していることが見出されている。例えば、３４量体断片（ＰＥＤＦの残基４４〜７７）は抗血管新生活性を有することが特定されており、４４量体断片（ＰＥＤＦの７８〜１２１残基）は神経栄養特性を有することが特定されている。
【００１４】
本発明の発明者らは、ＰＥＤＦの特定の短鎖ペプチドを使用して、腱損傷を治療することができることを発見した。さらに、治療効果は、ＣＤ１４６＋ＴＳＰＣの増殖を誘発する、これらのＰＤＳＰの能力から生じる可能性があることが見出された。ＣＤ１４６＋ＴＳＰＣはラット腱の末梢領域に分布し、ＣＤ１４６＋ＴＳＰＣはラット膝蓋腱の創傷治癒を促進することが分かっている。
【００１５】
本発明のＰＤＳＰは、ヒトＰＥＤＦ残基９３〜１２１（９３ＳＬＧＡＥＱＲＴＥＳＩＩＨＲＡＬＹＹＤＬＩＳＳＰＤＩＨＧＴ１２１；配列番号１）に対応するペプチド領域に基づく。本発明者らは、この２９量体に基づいて、セリン−９３、アラニン−９６、グルタミン−９８、イソロイシン−１０３、イソロイシン−１０４およびアルギニン−１０６が、これらの残基をアラニンにより（またはアラニン−９６をグリシンに）個別に置換した場合に活性が顕著に失われることから証明されるように、活性にとって重要であることを特定した。対照的に、２９量体内の他の残基のアラニン（またはグリシン）置換は活性を顕著に変化させなかったことから、これらの他の残基（すなわち、残基９４、９５、９７、９９〜１０２、１０５および１０７〜１２１）にアミノ酸置換（特に、相同なアミノ酸置換）を有するＰＤＳＰ変異体も腱損傷の予防および／または治療に使用することができることが示唆された。
【００１６】
これらの結果は、抗侵害受容効果を含むコアペプチドが、残基９３〜１０６（９３ＳＬＧＡＥＱＲＴＥＳＩＩＨＲ１０６；配列番号２）を含む領域にあることを示している。したがって、腱損傷に対する治療活性を有する最短のＰＤＳＰペプチドは、１４量体であり得る。当業者であれば、Ｃ末端および／またはＮ末端でのこのコアペプチドに対する追加のアミノ酸の付加が、この活性に影響を与えないことを理解するであろう。すなわち、本発明のＰＤＳＰは、ヒトＰＥＤＦの残基９３〜１０６（−）を含む任意のペプチドであり得る。したがって、本発明のＰＤＳＰペプチドは、実験で使用された２９量体を含めて、１４量体、１５量体、１６量体などであり得る。
【００１７】
さらに、上記のように、これらの短鎖ペプチド内の置換は、重要な残基（セリン−９３、アラニン−９６、グルタミン−９８、イソロイシン−１０３、イソロイシン−１０４およびアルギニン−１０６）が保存されている限り、活性を保持することができる。さらに、マウス変異体（ヒトの配列と比較して、ヒスチジン−９８およびバリン−１０３の２つの置換を有する）も活性である。対応するマウス配列は、ｍｏ−２９量体（ＳＬＧＡＥＨＲＴＥＳＶＩＨＲＡＬＹＹＤＬＩＴＮＰＤＩＨＳＴ、配列番号３）およびｍｏ−１４量体（ＳＬＧＡＥＨＲＴＥＳＶＩＨＲ、配列番号４）である。したがって、活性コアの一般的な配列は（９３Ｓ−Ｘ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｑ／Ｈ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｉ／Ｖ−Ｉ−Ｘ−Ｒ１０６（Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）；配列番号５）である。
【００１８】
本発明のＰＤＳＰペプチドは、タンパク質／ペプチド発現系を使用して化学的に合成または発現され得る。これらのＰＤＳＰペプチドは、腱損傷の治療のための医薬組成物に使用され得る。医薬組成物は、任意の薬学的に許容される賦形剤を含み得、医薬組成物は、局所投与、経口投与、注射などの投与に適した形態で製剤化され得る。そのような用途のための様々な製剤は、当技術分野で知られており、本発明の実施形態とともに使用することができる。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態は、対象（例えば、ヒト、ペットまたは他の対象）の腱損傷を治療するための方法に関する。本明細書で使用される場合、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、状態の部分的または全体的な改善を含み、これは、全体的な治癒を含む場合も含まない場合もある。方法は、対象に医薬組成物を投与する工程を含み得、医薬組成物は、本発明のＰＤＳＰ（ＰＤＳＰの活性変異体を含む）の有効量を含む。当業者であれば、有効量が対象の状態（例えば、体重、年齢など）、投与経路、および他の因子に依存することを理解するであろう。そのような有効量を見出すことは、常用的な技術のみを伴い、当業者であれば、有効量を見出すために発明の努力または過度の実験を必要としないであろう。
【００２０】
本発明の実施形態は、以下の特定の実施例により説明される。特定の実施例では、２９量体（配列番号１）が使用される。ただし、他のＰＤＳＰ（例えば、１４量体、配列番号２または配列番号３など）もまた、同じ結果を達成するために使用することができる。当業者であれば、これらの実施例は例示のみを目的としており、本発明の範囲から逸脱することなく、変更および修正が可能であることを理解するであろう。
【００２１】
材料および方法
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、抗生物質−抗真菌剤溶液およびトリプシンをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳＥ）培地サプリメント、ヘキスト３３２５８色素、アルギン酸ナトリウム塩およびあらゆる化学物質をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手した。ディスパーゼＩＩおよびコラゲナーゼＩをＲｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）から入手した。抗ＢｒｄＵ抗体（ＧＴＸ４２６４１）をＧｅｎｅＴｅｘ（Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）から入手した。抗ヌクレオステミン（ａｂ７０３４６）抗体をＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手した。蛍光色素コンジュゲート二次抗体はいずれも、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）色素をＭｅｒｃｋ（Ｒａｙｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）から購入した。ＰＤＳＰ  ２９量体および２９量体変異体を合成し、安定性のためにＮＨ２末端でのアセチル化と、ＣＯＯＨ末端でのアミド化とによって修飾し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）での質量分析（純度＞９０％）によって特性評価した。ＤＭＳＯ中でストック（１０ｍＭ）として、各ＰＥＤＦ由来合成ペプチドを再構成した。
【００２２】
動物試験
温度制御（２４〜２５℃）および１２：１２の明暗サイクルの下で、全動物を動物室に収容した。標準的な飼料および水道水を自由に摂取させた。実験手順は、Ｍａｃｋａｙ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（Ｎｅｗ  Ｔａｉｐｅｉ  Ｃｉｔｙ，Ｔａｉｗａｎ，Ｒ．Ｏ．Ｃ．）によって承認され、国の動物福祉規制に準拠して実施した。
【００２３】
腱幹細胞の単離および培養
この試験では、ニュージーランドホワイトウサギ（６〜８月齢、３．０〜４．０ｋｇ）から得られたアキレス腱を使用した。５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有する滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて、アキレス腱を２回洗浄した。腱および腱鞘を小片に切断した（１〜２ｍｍ３）。次いで、１ｍｌの平衡塩溶液（ＢＳＳ；Ａｌｃｏｎｅ）中に３ｍｇ／ｍｌのＩ型コラゲナーゼおよび４ｍｇ／ｍｌのディスパーゼを含有する溶液中で、各１００ｍｇの断片を３７°Ｃで４時間消化させた。消化された組織をＰＢＳで３回洗浄し、遠心分離（８００ｇ、１０分間）によって収集した。消化された組織を組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ；ＮＪ，ＵＳＡ）に置き、１０％ＦＢＳおよび５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを補充した高グルコースＤＭＥＭ中に再懸濁し、５％ＣＯ２、３７℃に維持した。５日後、緩んだ組織残留物を除去するために培地を交換した。続いて、腱細胞を１０％ＦＢＳ培地と２日間インキュベートし、次いで、基礎培地（２％ＦＢＳ、１％ＩＴＳＥ、３００μｇ／ｍｌ  Ｌ−グルタミン、１％抗生物質−抗真菌剤溶液）を用いてさらに１０日間培養した。３日ごとに培地を交換した。継代のために、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて腱細胞を回収し、血球計算器により細胞を計数し、２４時間かけて、９６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに約５×１０３個の細胞を播種するか、６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに２×１０５個の細胞を播種した。次いで、これらの増殖した腱細胞を、新鮮な基礎培地中の１０μＭの２９量体またはその変異体を用いてさらに２４時間処理し、それぞれ細胞増殖アッセイおよびウエスタンブロット分析に供した。
【００２４】
細胞増殖アッセイ
ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ（カタログ番号：Ｋ３０７）から細胞増殖アッセイキット（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ）を購入し、製造業者の推奨に従って細胞増殖を評価するために使用した。ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＧＥＭＩＮＩ  ＸＳ蛍光マイクロプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、励起について４８０ｎｍ、発光について５３８ｎｍで蛍光を読み取った。
【００２５】
免疫細胞化学
４％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定した後、４°Ｃでメタノールにより１分間処理し、１％ヤギ血清および５％ＢＳＡを用いて１時間ブロックした。ヌクレオステミンに対する抗体（１：１００希釈）を用いて、細胞を室温で３時間染色した。続いて、スライドをＦＩＴＣ−ロバ抗ウサギＩｇＧ（１：５００希釈；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と２０分間インキュベートし、次いで、ヘキスト３３２５８を用いて６分間対比染色した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（０．５％）を含むＰＢＳを用いてスライドを３回リンスした。最後に、ＦｌｕｏｒＳａｖｅ（商標）試薬（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）とともに切片をマウントし、Ｚｅｉｓｓ落射蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【００２６】
ウエスタンブロット分析
細胞溶解、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびイムノブロッティングに使用される抗体は、記載されているように実施した（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，１５−ｄｅｏｘｙ−Ｄｅｌｔａ（１２，１４）−ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｊ２  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＡＰＫＳ  ａｎｄ  ｐ５３．Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００８；２８３（４４）：３０２７３−３０２８８）。モデルＧＳ−７００イメージングデンシトメーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いてイムノブロットのバンド強度を評価し、Ｌａｂｗｏｒｋｓ  ４．０ソフトウェアを使用して分析した。
【００２７】
ラットアキレス腱損傷に対する外科的処置
腱治癒に対する２９量体ペプチドの効果を検討するために、Ｏｒｈａｎらによって報告されたようにアキレス腱損傷のラットモデルを確立した（Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｏｒｐｏｒｅａｌ  ｓｈｏｃｋ  ｗａｖｅｓ  ｏｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｉｎｊｕｒｙ  ｔｏ  ｔｅｎｄｏｎ  Ａｃｈｉｌｌｅｓ．Ａ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ．Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．Ｂｒ．２００４；．８６（４）：．６１３−６１８）。キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって、成体の１０週齢のオスのスプラーグドーリーラット（初期体重＝３１２±１１ｇ）を麻酔した。次いで、踵骨付着部位の１ｃｍ近位のアキレス腱を通して１８Ｇ針を全層挿入することによって、左アキレス腱損傷を作成した。これにより、切断された端の収縮を防ぐために無傷の腱組織に隣接する水平の創傷を作成した。創傷を滅菌生理食塩水で洗浄した後、皮膚切開を閉じた。１００μＭの２９量体またはＤＭＳＯビヒクルと混合した１５０μｌのアルジネートゲルを皮下注射することにより、腱病変の周囲の領域に処置を適用した（１実験条件当たりラット６匹）。
【００２８】
ＤＮＡ合成のインビボ検出
細胞増殖を検出するために、ＤＭＳＯ中でストック（８０ｍＭ）としてＢｒｄＵを再構成した。手術後０、３、５日目に、３５０μｌのＰＢＳと混合した１５０μｌのＢｒｄＵをラットに腹腔内注射した。抗ＢｒｄＵ抗体を用いたＢｒｄＵ標識によってＤＮＡ合成を評価した。
【００２９】
腱損傷の組織学的検査
腱と周囲の軟組織とを切開した。標本を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液中に固定し、次いで、パラフィンブロックに包埋した。切片（厚さ５μｍ）を縦方向に切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色するか、免疫組織化学的検査に使用した。最も重度に変性した領域を含むように、１つの腱当たり３６の切片を注意深く調製した。Ｌｅｉｃａ  ＤＣ  ５００カメラ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えたＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して画像を取得した。損傷した腱組織を含む各試料の４つの切片を選択し、２名の盲検観察者により評価して、Ｃｈｅｎらによって提案された０から３の改変された半定量的評価スコアに従って腱の形態を評価した（Ｔｅｎｄｏｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ  ｐｌａｓｍａ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｒａｔ  Ａｃｈｉｌｌｅｓ  ｔｅｎｄｉｎｏｐａｔｈｙ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１４；３４（６）：２１５３−６８）。スコアにより、線維構造（０〜３）、線維配列（０〜３）、核の丸み（０〜３）、常在細胞密度（０〜３）、および炎症（０〜３；炎症細胞の浸潤、血管新生および脂肪沈着）を分析した。この評価系によれば、完全に正常な腱は０のスコアを取得したが、最大に異常な腱には１５のスコアが割り当てられた。
【００３０】
免疫組織学的染色
ホルマリン固定パラフィン包埋腱標本をキシレン中で脱パラフィン化し、段階的な一連のエタノール濃度で再水和した。１０％ヤギ血清を用いてスライドを６０分間ブロックした後、ＣＤ１４６に対する一次抗体（１：５０希釈）と室温（ＲＴ）で２時間インキュベートした。続いて、スライドを適切なペルオキシダーゼ標識ヤギ免疫グロブリン（１：５００希釈；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）と２０分間インキュベートし、次いで、色素原基質（３，３’−ジアミノベンジジン）と２分間インキュベートした後、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。
【００３１】
統計
結果は、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。統計的比較に一元配置分散分析を使用した。特に指定がない限り、Ｐ＜０．０５が有意であると考えられた。
【００３２】
培養でＴＳＰＣ増殖を誘発する細胞分裂活性に必要な、２９量体内の重要なアミノ酸残基の同定
ラットモデルによって証明されるように、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）由来短鎖ペプチドの断片（２９量体；残基Ｓｅｒ９３〜Ｔｈｒ１２１、２４量体；Ｓｅｒ９３〜Ｐｒｏ、および２０量体；Ｓｅｒ９３〜Ｌｅｕ１１２）が、腱断裂の治癒を促進することを示した。以前の試験の結果はまた、培地に添加された２９量体、２４量体および２０量体が、培養された腱幹／前駆細胞（ＴＳＰＣ）の増殖を誘発することができることを示した。本明細書では、２９量体の配列に沿ったアラニンまたはグリシンによる単一残基の置換を設計および合成して、２９量体の細胞分裂活性に関与する重要な残基を解明した。ＰＥＤＦ残基９３〜１２１のアミノ酸配列に基づいて合計で２９個のペプチド変異体を合成し、そのうち２７個は単一のアラニン変化を伴い、２個は単一のグリシン変化を伴う（Ａ９６ＧおよびＡ１０７Ｇ）。まず、ＴＳＰＣの増殖に対する２９量体変異体の影響を検討した。
【００３３】
ウサギＴＳＰＣの単離については上記で説明した。２９量体変異体のうちの１つを１０μＭで用いて、低血清培地中のＴＳＰＣを２４時間処理した。細胞内の核酸に特異的に結合し、緑色蛍光を生成する核色素を提供するキットに基づく細胞増殖キットによって、細胞増殖を検討した。２９量体処理は、ＤＭＳＯ溶媒対照と比較してＴＳＰＣ増殖を増加させた（１３５±６．１％対１００±４．０％、図１）。結果から、Ｓ９３Ａ（１０６±３．８％）、Ａ９６Ｇ（１０２±４．０）、Ｑ９８Ａ（１０６±５．４％）、Ｉ１０３Ａ（１０６±５．３％）、Ｉ１０４Ａ（１１２±１．７％）およびＲ１０６Ａ（１０６±３．５％）の変異が、２９量体の細胞分裂活性を著しく損なった（１０２〜１１２％対１３５％）ことが明らかにされた。これらの結果は、２９個のアミノ酸のうち６個が２９量体の活性に重要であることを示唆している。さらに、Ｌ９４Ａ（１１３±５．２％）、Ｒ９９Ａ（１１６±７．０）、Ａ１０７Ｇ（１１７±３．８％）およびＰ１１６Ａ（１１５±３．７％）の変異により、２９量体の細胞分裂活性が１１２〜１１７％まで部分的に低下した。残りの置換は、２９量体（＞１１７％）と比較して、細胞分裂活性の半分超を維持した。これらの結果は、２９量体内の残りの１９残基がアミノ酸置換に耐えることができることを示唆している。
【００３４】
一方、２９量体およびその変異体にＴＳＰＣを２４時間曝露すると、溶媒処理細胞と比較して、増殖マーカーであるサイクリンＤ１タンパク質の２．９±０．５の誘導倍率がもたらされた。Ｔ１００Ａ変異体およびＨ１０５Ａ変異体は、サイクリンＤ１タンパク質の発現を誘発するのに、２９量体と同様の効果を示した（２．７±０．５倍および２．７±０．３倍；図２）。ただし、サイクリンＤ１タンパク質誘発に対する２９量体の効果は、それぞれ残基Ｓ９３、Ａ９６、Ｑ９８、Ｉ１０３、Ｉ１０４およびＲ１０６でのアラニン／グリシン置換によってほとんど消失した（１．３±０．１、１．５±０．３、１．３±０．１、０．９±０．１、１．３±０．２および１．０±０．３）。まとめると、アラニンスキャンデータは、ＴＳＰＣに対する２９量体の細胞分裂効果が、アミノ酸置換によって影響を受けることを示している。データはまた、位置Ｓｅｒ９３、Ａｌａ９６、Ｇｌｎ９８、Ｉｌｅ１０３、Ｉｌｅ１０４およびＡｒｇ１０６でのＰＤＳＰが、ＴＳＰＣ増殖の誘発に対するＰＤＳＰ効果を維持するために重要であることを示唆している。
【００３５】
実験的腱損傷のラットモデルに対する２９量体変異体の治療効果
損傷した腱に対する２９量体ペプチドの治療効果を検討するために、アキレス腱に１８Ｇ針を全層挿入することによって、アキレス腱損傷のラットモデルを確立した。以前のプロトコルで説明したように、５日間で９０％の負荷の２９量体を放出する、１５０μｌのアルジネートゲル中の２９量体を送達した（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＥＤＦ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｔｓ  ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｍｕｓｃｌｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１５  Ａｕｇ  １；３０９（３）：Ｃ１５９−６８）。図３、術後１週間でのＨ＆Ｅ染色による組織学的分析に示すように、ビヒクル／アルジネートゲル処置は、線維組織の損失を示し、治癒領域内の炎症性マトリックス（黄色の矢印によって示される）および脂肪沈着および／または壊死領域（黒色の矢印によって示される）の実質的な存在を示したのに対して、２９量体／アルジネートゲル群は、良好に整列したコラーゲン線維の均一な外観を示し、２９量体が腱治癒を促進することを示した。特に、術後１週間で、ビヒクル群によって処置された損傷した腱は、多数の丸い細胞（線維芽細胞および炎症細胞；図４Ａ）の存在を示した。対照的に、２９量体処置は細胞密度の大幅な増加を示し、それらの核の形態は、コラーゲン線維に平行に配置された正常な紡錘形の腱細胞と、わずかに丸い常在細胞とを示した。顕微鏡的には、Ｔ１００Ａ変異体またはＨ１０５Ａ変異体を含有するアルジネートゲルによって処置された損傷した腱も、良好に整列したコラーゲン線維の均一な外観を示し、２９量体処置と同様に変性事象は示さなかった。重要なことに、Ｓ９３Ａ、Ａ９６Ｇ、Ｑ９８Ａ、Ｉ１０３Ａ、Ｉ１０４ＡおよびＲ１０６Ａによる処置は、線維組織の損失を示し、腱損傷領域内の炎症性マトリックス、脂肪沈着および血管増生（アスタリスクによって示される）の著しい増加を伴った（図３）。
【００３６】
２名の盲検試験者によってスコア分析を実施した。総組織病理学的スコアは上記の通りであり、図４Ｂのヒストグラムに示されており、２９量体／アルジネート処置は、ビヒクル／アルジネート群と比較して、総スコアを有意に低下させた（７．９±０．４対１２．７±０．６；Ｐ＜０．０００５）。Ｔ１００Ａ変異体およびＨ１０５Ａ変異体も、総組織病理学的スコアを低下させることができた（８．０±０．５および７．８±０．７）。注目すべきことに、Ｓ９３Ａ、Ａ９６Ｇ、Ｑ９８Ａ、Ｉ１０３Ａ、Ｉ１０４ＡおよびＲ１０６Ａによる処置は、２９量体の処置と比較して、総組織病理学的スコア（１１．２〜１３．７の値）の低下に影響を与えなかった。
【００３７】
全体として、動物試験の結果は、Ｓ９３、Ａ９６、Ｑ９８、Ｉ１０３、Ｉ１０４およびＲ１０６を含め、２９量体の残基が、２９量体の腱治療効果を維持するための重要な残基であることを裏付けている。これらの結果はまた、腱治療効果を有するコアペプチドが、ヒトＰＥＤＦの残基９３〜１０６（９３ＳＬＧＡＥＱＲＴＥＳＩＩＨＲ１０６；配列番号２）に位置することを示唆している。したがって、本発明の実施形態によれば、腱損傷の治療のためのＰＤＳＰは、１４量体（残基９３〜１０６）と同じくらい短くてもよい。当業者であれば、追加のアミノ酸がＣ末端および／またはＮ末端に含まれ得る場合であっても、このコア領域を含むペプチドが同じ活性を保持することを理解するであろう。それが、本発明の実施形態による、腱損傷を治療するためのペプチドであり、実施例で使用された２９量体を含む１４量体、１５量体、１６量体などであり得る。
【００３８】
さらに、上記のように、これらの短鎖ペプチド内の置換は、重要な残基（セリン−９３、アラニン−９６、グルタミン−９８、イソロイシン−１０３、イソロイシン−１０４およびアルギニン−１０６）が保存されている限り、活性を保持することができる。さらに、マウス変異体（ヒトの配列と比較して、ヒスチジン−９８およびバリン−１０３の２つの置換を有する）も活性である。対応するマウス配列は、ｍｏ−２９量体（ＳＬＧＡＥＨＲＴＥＳＶＩＨＲＡＬＹＹＤＬＩＴＮＰＤＩＨＳＴ、配列番号３）およびｍｏ−１４量体（ＳＬＧＡＥＨＲＴＥＳＶＩＨＲ、配列番号４）である。したがって、活性コアの一般的な配列は（９３Ｓ−Ｘ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｑ／Ｈ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｉ／Ｖ−Ｉ−Ｘ−Ｒ１０６（Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）；配列番号５）である。
【００３９】
損傷した腱でのＴＳＰＣの広がりに対する２９量体変異体の影響
ＣＤ１４６はＴＳＰＣマーカーの１つである。ＣＤ１４６＋ＴＳＰＣはラット腱の末梢領域に分布し、ＣＤ１４６＋ＴＳＰＣはラット膝蓋腱の創傷治癒を促進することが分かっている。２９量体によって誘発される腱修復の機序を試験するために、負傷後１週間の時点で、損傷した腱に位置するＴＳＰＣのＣＤ１４６免疫染色を測定した。結果から、２９量体／アルジネートゲル処置腱の治癒領域では多数のＣＤ１４６＋ＴＳＰＣが検出可能であったのに対して、ビヒクル／アルジネートゲル処置腱ではＣＤ１４６＋ＴＳＰＣが少なかったことが明らかにされた（図５；２００倍視野当たり８６．８±６．０細胞対３８．３±７．８細胞）。したがって、２９量体処置によるＴＳＰＣ増殖の活性化は、迅速な腱創傷治癒を促進する。
【００４０】
次に、２９量体変異体を用いて１週間処置した損傷した腱でのＣＤ１４６＋ＴＳＰＣの分布を検討した。Ｔ１００Ａ変異体またはＨ１０５Ａ変異体を含有するアルジネートゲルによって処置した損傷した腱は、２９量体／アルジネート処置と同様に、顕著なＣＤ１４６＋ＴＳＰＣ増殖（２００倍視野当たり８５．０±８．４細胞および８８．５±７．８細胞）を示した。注目すべきことに、ＣＤ１４６免疫染色により、Ｓ９３Ａ、Ａ９６Ｇ、Ｑ９８Ａ、Ｉ１０３Ａ、Ｉ１０４ＡおよびＲ１０６Ａによる処置が、損傷した腱でのＣＤ１４６陽性ＴＳＰＣの増加に影響を与えなかったことが明らかにされた（２００倍視野当たり４０．５〜４９．５細胞）。動物試験ではさらに、これらの重要な残基が２９量体の生物学的活性を維持するために重要な役割を果たすことが確認された。
【００４１】
まとめると、アラニンスキャンデータは、アキレス腱断裂のラットモデルによって証明されるように、２９量体の治療効果がアミノ酸置換によって影響を受けることを示している。さらに、位置Ｓ９３、Ａ９６、Ｑ９８、Ｉ１０３、Ｉ１０４およびＲ１０６の２９量体残基は、腱修復に対する２９量体活性にとって重要である。したがって、最小コアペプチドは、９３Ｓ−Ｘ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｑ／Ｈ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｉ／Ｖ−Ｉ−Ｘ−Ｒ１０６（Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）（配列番号５）として表され得る。本発明の実施形態とともに使用され得るＰＤＳＰ配列のいくつかの例を以下の表に示す（位置の番号付けは１４量体の位置に基づく）。これらの例は、限定することを意図したものではない。
【表１】
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【００４２】
本発明の実施形態は、限られた数の例を用いて説明されている。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、変更および修正が可能であることを理解するであろう。したがって、本発明の範囲は、付随する特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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