(57)【要約】  本発明は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、特に脂肪由来幹細胞を繁殖させるための方法であって、身体組織から単離された細胞を、少なくとも１種のＴＮＦスーパーファミリーリガンドおよび少なくとも１種のアポトーシス阻害剤と共にインキュベートすることを含む、方法に関する。細胞は、それを必要とする対象への移植に用いることができ、または移植で使用され得る様々な細胞型に分化するように誘導できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を繁殖させるための方法であって、
（ａ）身体の組織または臓器から細胞を単離すること；および
（ｂ）（ｉ）少なくとも１種のＴＮＦスーパーファミリーリガンドと、
（ｉｉ）少なくとも１種のアポトーシス阻害剤、
を含む生育培地中で（ａ）で得られた前記単離細胞をインキュベートし、それによりＭＳＣが富化された細胞集団を得ること、
を含む、方法。
【請求項２】
脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を繁殖させるための方法であって、
（ａ）脂肪吸引物から間質血管細胞群（ＳＶＦ）の細胞を単離すること；および
（ｂ）（ｉ）少なくとも１種のＴＮＦスーパーファミリーリガンドと、
（ｉｉ）少なくとも１種のアポトーシス阻害剤、
を含む生育培地中で（ａ）で得られた前記単離細胞をインキュベートし、それによりＡＳＣが富化された細胞集団を得ること、
を含む、方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）の前に前記ＳＶＦが、少なくとも２継代の間培養において保持される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＮＦスーパーファミリーリガンドが、Ｆａｓ−リガンド（ＦａｓＬ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、腫瘍壊死因子様アポトーシス弱誘発因子（ＴＷＥＡＫ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＴＮＦスーパーファミリーリガンドが、ＦａｓＬである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記生育培地が、成長因子、ホルモン、サイトカインおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される追加の活性剤をさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記インキュベーションが、少なくとも１時間である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記インキュベーションが、約１時間、２時間、３時間もしくはより長い時間、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１７、２０、もしくは２３日間である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記インキュベーションが、２時間である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記インキュベーションが、４日間である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記インキュベーションが、１４日間である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記培地が、３日ごとにまたは４日ごとに更新される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アポトーシス阻害剤が、前記少なくとも１種のＴＮＦスーパーファミリーリガンドの前に、前記リガンドと一緒に、または前記リガンドの後に投与される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記アポトーシス阻害剤が、カスパーゼ阻害剤、セリンプロテアーゼ（例えば、ＨＴＲＡ２）阻害剤、アポトーシス阻害タンパク質（ＩＡＰ）（例えば、ＸＡＦ１）、ＮＦ−カッパＢ阻害剤、Ｓｍａｃ阻害剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記カスパーゼ阻害剤が、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アポトーシス阻害剤の量が、約１μＭ〜約５０μＭの範囲、または約５μＭ〜約２５μＭの範囲である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１種のＴＮＦスーパーファミリーリガンドの濃度が、約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１種のＴＮＦスーパーファミリーリガンドおよび前記アポトーシス阻害剤とのインキュベーションに続いて、前記少なくとも１種のＴＮＦスーパーファミリーリガンドおよび前記アポトーシス阻害剤が、除去され、かつ前記細胞が、分化させられる、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、脂肪細胞、軟骨細胞、または骨細胞に分化させられる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
それを必要とする患者に前記分化または未分化細胞を移植することをさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、脂肪組織、骨組織、筋肉、結合組織または軟骨に分化する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、脂肪組織に分化しかつ前記患者が、乳房復元を必要としている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が、骨組織に分化しかつ前記患者が、整形外科的傷害、骨再建または骨修復の処置を必要としている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、軟骨組織に分化しかつ前記患者が、軟骨細胞の植え込み、半月板、回旋筋腱板または関節軟骨修復の処置を必要としている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記患者が、美容的処置を必要としている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記分化細胞を前記移植することが、皮膚科の病気を処置するためである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記分化細胞を前記移植することが、患者における免疫関連疾患を緩和するまたは処置するためである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記患者が、臓器または組織の移植を受ける、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
記臓器の移植が、骨髄、肝臓、腎臓、血管または心臓移植からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記分化細胞を前記移植することが、患者における心臓障害を処置するためである、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記心臓障害が、卒中、狭心症および心不全からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記分化細胞を前記移植することが、クローン病患者における痔瘻または肛門周囲瘻孔を処置するためである、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
前記分化細胞を前記移植することが、血管修復のためである、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞が、同種または自家である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
細胞生育培地、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドおよびアポトーシス阻害剤を含む脂肪幹細胞（ＡＳＣ）または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）生育培地。
【請求項３６】
血清または血清代替品をさらに含む請求項３５に記載のＡＳＣまたはＭＳＣ生育培地。
【請求項３７】
ａ．脂肪幹細胞または間葉系幹細胞生育培地を含有する容器であって、前記生育培地が、細胞生育培地、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドおよびアポトーシス阻害剤を含む、容器と；
ｂ．インビトロで脂肪幹細胞または間葉系幹細胞を増大させるために生育培地を使用するための説明書、
を含む製品。
【請求項３８】
前記生育培地が、血清または血清代替品をさらに含む、請求項３７に記載の製品。
【請求項３９】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法により得られる細胞の富化された集団。
【請求項４０】
それを必要とする患者への移植処置における使用のための請求項３９に記載の細胞の富化された集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、細胞移植の分野にあり、詳細には本発明は、インビトロで脂肪由来幹細胞を繁殖させるための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
本明細書に開示された主題に対して背景として関連すると見なされる参考資料を、以下に列挙する：
（１）Ｌｅ  Ｇａｌｌｏ  Ｍ，  Ｐｏｉｓｓｏｎｎｉｅｒ  Ａ，  Ｂｌａｎｃｏ  Ｐ，  Ｌｅｇｅｍｂｒｅ  Ｐ. Ｃｄ９５／ｆａｓ，  ｎｏｎ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ，  ａｎｄ  ｋｉｎａｓｅｓ. Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１７;８:１２１６．
（２）Ｒｉｐｐｏ Ｍ，  Ｂａｂｉｎｉ Ｌ，  Ｐｒａｔｔｉｃｈｉｚｚｏ Ｆ，  Ｇｒａｃｉｏｔｔｉ Ｌ, Ｆｕｌｇｅｎｚｉ  Ｇ，  Ａｒｄｏｒｉ ＦＴ，  ｅｔ ａｌ. Ｌｏｗ ｆａｓｌ ｌｅｖｅｌｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，  ｈｉｇｈｅｒ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅｉｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ. Ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ＆ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１３;４:Ｅ５９４．
（３）Ｈａｍ Ｏ，  Ｌｅｅ Ｓ−Ｙ，  Ｓｏｎｇ Ｂ−Ｗ，  Ｃｈａ Ｍ−Ｊ，  Ｌｅｅ ＣＹ，  Ｐａｒｋ Ｊ−Ｈ，  ｅｔ ａｌ. Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｓ−ｆａｓ ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｅｓ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ｎｉｃｈｅ. Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２０１５;２４:１３２９−４１．
（４）Ｆａｎ ＶＨ，  Ａｕ Ａ，  Ｔａｍａｍａ Ｋ，  Ｌｉｔｔｒｅｌｌ Ｒ，  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ＬＢ，  Ｗｒｉｇｈｔ ＪＷ，  ｅｔ ａｌ. Ｔｅｔｈｅｒｅｄ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｄｖａｎｔａｇｅ ｔｏ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ. Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ２００７;２５:１２４１−５１．
（５）Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ Ｍ，  Ｂｌａｉｒ Ｈ，  Ｓｔｏｃｋｄａｌｅ Ｌ，  Ｇｒｉｆｆｉｔｈ Ｌ，  Ｗｅｌｌｓ Ａ. Ｓｕｒｆａｃｅ ｔｅｔｈｅｒｅｄ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｆａｓｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ. Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２０１３;３１:１０４−１６．
（６）Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ Ｍ，  Ｔｕｒｎｅｒ Ｏ，  Ｓｔｏｌｚ Ｄ，  Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ＬＧ，  Ｗｅｌｌｓ Ａ. Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ＢＹ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ／ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｕｐｏｎ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｆａｓ ｌｉｇａｎｄ. Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２０１２;２１:２１７１−８７。
（７）Ｋｅｎｎｅａ  Ｎ，  Ｓｔｒａｔｏｕ Ｃ，  Ｎａｐａｒｕｓ Ａ，  Ｆｉｓｋ  Ｎ，  Ｍｅｈｍｅｔ Ｈ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ａｎｄ  ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ. Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２００５;１２:１４３９−４１．
（８）Ｍｉｚｕｎｏ Ｈ，  Ｔｏｂｉｔａ Ｍ，  Ｕｙｓａｌ ＡＣ． Ｃｏｎｃｉｓｅ ｒｅｖｉｅｗ: Ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｆｕｔｕｒｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ. Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ２０１２;３０:８０４−１０．
（９）Ｒａｖｉｄ Ｏ，  Ｓｈｏｓｈａｎｉ Ｏ，  Ｓｅｌａ Ｍ，  Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ Ａ，  Ｓａｄａｎ  ＴＷ，  Ｇｕｒ Ｅ，  ｅｔ ａｌ. Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ: Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｌｏｉｄｙ，  ｈ１９ ｌｏｎｇ ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ｒｎａ ａｎｄ  ｐ５３ ａｃｔｉｖｉｔｙ. Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ ｔｈｅｒａｐｙ ２０１４;５:１．
（１０）Ｓｅｌａ Ｍ，  Ｔｉｒｚａ  Ｇ，  Ｒａｖｉｄ Ｏ，  Ｖｏｌｏｖｉｔｚ Ｉ，  Ｓｏｌｏｄｅｅｖ Ｉ，  Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ｏ，  ｅｔ ａｌ. Ｎｏｘ１−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ａｂｄｏｍｉｎａｌ ｆａｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｍｐｉｎｇｅｓ ｏｎ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ. Ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ＆ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１５;６:Ｅ１７２８．
（１１）Ｓｈｏｓｈａｎｉ Ｏ，  Ｚｉｐｏｒｉ Ｄ，  Ｓｈａｎｉ  Ｎ. Ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ／ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ: Ｇａｉｎｉｎｇ ｂｅｔｔｅｒ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅｓ. ＲＮＡ ＆ ＤＩＳＥＡＳＥ ２０１５;２．
（１２）Ｇｕｏ Ｊ，  Ｎｇｕｙｅｎ Ａ，  Ｂａｎｙａｒｄ  ＤＡ，  Ｆａｄａｖｉ Ｄ，  Ｔｏｒａｎｔｏ ＪＤ，  Ｗｉｒｔｈ  ＧＡ，  ｅｔ ａｌ. Ｓｔｒｏｍａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ: Ａ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｒｅａｌｉｔｙ? Ｐａｒｔ ２: Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ａｃｔｉｏｎ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｓｔｉｃ，  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ＆ Ａｅｓｔｈｅｔｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ ２０１５．
（１３）Ｎｇｕｙｅｎ Ａ，  Ｇｕｏ Ｊ, Ｂａｎｙａｒｄ  ＤＡ，  Ｆａｄａｖｉ Ｄ，  Ｔｏｒａｎｔｏ ＪＤ，  Ｗｉｒｔｈ  ＧＡ，  ｅｔ ａｌ. Ｓｔｒｏｍａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ: Ａ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｒｅａｌｉｔｙ? Ｐａｒｔ １: Ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｐｔｓ ａｎｄ  ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｓｔｉｃ，  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ＆ Ａｅｓｔｈｅｔｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ ２０１５．
（１４）ＷＯ ２００７／１３８５９７
（１５）ＷＯ ２０１７／０５１４２１
（１６）Ｂａｒｎｈａｒｔ ＢＣ，  Ｌｅｇｅｍｂｒｅ  Ｐ，  Ｐｉｅｔｒａｓ Ｅ，  Ｂｕｂｉｃｉ Ｃ，  Ｆｒａｎｚｏｓｏ  Ｇ，  Ｐｅｔｅｒ ＭＥ． Ｃｄ９５ ｌｉｇａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ. Ｔｈｅ ＥＭＢＯ ｊｏｕｒｎａｌ ２００４;２３:３１７５−８５
（１７）Ｄｅｓｂａｒａｔｓ Ｊ，  Ｂｉｒｇｅ ＲＢ，  Ｍｉｍｏｕｎｉ−Ｒｏｎｇｙ Ｍ，  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ＤＥ，  Ｐａｌｅｒｍｅ Ｊ−Ｓ，  Ｎｅｗｅｌｌ ＭＫ． Ｆａｓ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｉｎｄｕｃｅｓ ｎｅｕｒｉｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｒｋ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ  ｐ３５ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ. Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００３;５
（１８）Ｌｅｔｅｌｌｉｅｒ Ｅ，  Ｋｕｍａｒ Ｓ，  Ｓａｎｃｈｏ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｉ，  Ｋｒａｕｔｈ Ｓ，  Ｆｕｎｋｅ−Ｋａｉｓｅｒ Ａ，  Ｌａｕｄｅｎｋｌｏｓ Ｓ, ｅｔ ａｌ. Ｃｄ９５−ｌｉｇａｎｄ ｏｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｓｙｋ ｋｉｎａｓｅ ｔｏ ｔｒｉｇｇｅｒ ｔｈｅｉｒ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ Ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｓｉｔｅ. Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１０;３２:２４０−５２.
（１９）Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｎ，  Ｉｍａｍｕｒａ Ｒ，  Ｓｕｄａ  Ｔ. Ｃａｓｐａｓｅ−８−ａｎｄ  ｊｎｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐ−１ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｆａｓ ｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｌ−８  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ＦＥＢＳ ｊｏｕｒｎａｌ ２００７;２７４:２３７６−８４.
（２０）Ｔａｕｚｉｎ Ｓ，  Ｃｈａｉｇｎｅ−Ｄｅｌａｌａｎｄｅ Ｂ，  Ｓｅｌｖａ Ｅ，  Ｋｈａｄｒａ  Ｎ，  Ｄａｂｕｒｏｎ Ｓ. Ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｃｄ９５ｌ ｅｌｉｃｉｔｓ ａ ｃ−ｙｅｓ. Ｃａｌｃｉｕｍ／ＰＩ３Ｋ−Ｄｒｉｖｅｎ Ｃｅｌｌ ２０１１.
【０００３】
本明細書の先の参考資料の知識は、これらの参考資料が何らかの方法で本明細書に開示された主題の特許性に関連することを意味すると推論されるものではない。
【０００４】
背景
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーの一員であるＦａｓリガンド（Ｆａｓ−Ｌ）は、リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびマクロファージなどの免疫細胞の表面で発現されるＩＩ型膜貫通タンパク質である。その受容体（ＣＤ９５またはＦａｓ受容体（ＦａｓＲ））への結合時に、Ｆａｓ−Ｌは、アポトーシスを誘導する。Ｆａｓ−Ｌは長い間、その受容体および活性化カスパーゼへの結合によりアポトーシスを促進するデスリガンドと見なされてきた。しかし、データの蓄積は現在、Ｆａｓが様々な生理状態および疾患状態に対し広範囲に及ぶ関与を有し得る様々な非アポトーシス性シグナルを伝達し得ることを示唆する［１］。Ｆａｓ−Ｌは、免疫系恒常性維持に関連づけられており、自己免疫に対する保護者であることが示唆されてきた。さらに、増えつつあるエビデンスは、炎症、増殖、再生および癌進行などの、追加的細胞応答の開始におけるＦａｓ−Ｌシグナル伝達の関与を実証している。種々の細胞および組織におけるＣＤ９５（ＦａｓＲ）のかなり普遍的な発現は、この新しい思想を裏付ける。
【０００５】
間葉系間質細胞（ＭＳＣ）は、ほとんどの成体細胞から産生され得る多能性細胞である。ＭＳＣは、プラスチックへの接着、培養において骨、脂肪および軟骨に分化する能力、ならびに個別の表面マーカのセットの発現により特徴づけられる。様々な再生性および免疫抑制性臨床適応症のためのＭＳＣの使用が示唆されており、それらの有効性は現在、数多くの臨床試験で評価されている。それらの少なからぬ潜在能力にもかかわらず、ＭＳＣの日常的臨床作業へのＭＳＣ使用の転換は、一部の理由として投与後のそれらの長期生存率の低さから、今日まで実現されていない。
【０００６】
低レベルのＦａｓ−リガンド（ＦａｓＬ）は、ヒト骨髄由来のＭＳＣの増殖を促進し、より高レベルでは脂肪細胞への分化を阻害する［２］。ＭＳＣは、炎症および損傷を受けた領域に遊走することが知られており、かつそれらはＣＤ９５を発現することが知られているため、Ｆａｓ−Ｌに誘導されたアポトーシスが、インビボでのそれらの急速な死滅に重大な役割を担い得ることが過去に示唆された［３］。この考えは、培養骨髄（ＢＭ）［４〜６］および胎児血［７］ＭＳＣで観察された高いＦａｓ−Ｌ依存性アポトーシス率によってさらに裏付けられる。
【０００７】
脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）は、皮下脂肪の間質血管細胞群（ＳＶＦ）に由来するＭＳＣである。それらは、骨髄（ＢＭ）ＭＳＣについて記載された全ての特徴、ならびにほとんどの再生性および免疫抑制性特性を共有することが示されたが［８］、それらは、組織特異的な特徴も提示する［９〜１１］。近年、単離されたばかりのＳＶＦが、再生および免疫抑制目的で、それらの採取の直後に、培養ＡＳＣの代わりに外科領域で使用されることが示唆された。重要なことに、細胞療法のための単離されたばかりの自家ＡＶＦの使用は、培養ＡＳＣに比較して、処置の経費および時間、ならびに規制負担を顕著に低減するであろう［１２、１３］。ＳＶＦ移植の治療有効性が、様々な前臨床疾患モデルにおいて確立され、様々な臨床適応症のためのその使用が現在、臨床試験で評価されている［１３］。
【０００８】
ＷＯ２００７／１３８５９７［１４］は、細胞集団をアポトーシス促進剤と接触させることにより、骨髄から単離された異種細胞集団から幹細胞を選択する方法に関する。
【０００９】
ＷＯ２０１７／０５１４２１［１５］は、アポトーシス誘導剤を含む生育培地中でＭＳＣを含む組織または臓器から得られた単離細胞をインキュベートすることを含む、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、詳細には脂肪由来幹細胞を繁殖させるための方法を開示する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
概説
態様の第一において、本発明は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を繁殖させるための方法であって、
（ａ）身体組織または臓器から細胞を単離すること；および
（ｂ）（ｉ）少なくとも１種のＴＮＦスーパーファミリーリガンドと、
（ｉｉ）少なくとも１種のアポトーシス阻害剤、
を含む生育培地中で、（ａ）で得られた単離細胞をインキュベートし、それによりＭＳＣが富化された細胞集団を得ること、
を含む、方法を提供する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を増大させるための方法であって、
（ａ）脂肪吸引物から間質血管細胞群（ＳＶＦ）の細胞を単離すること；および
（ｂ）（ｉ）少なくとも１種のＴＮＦスーパーファミリーリガンドと、
（ｉｉ）少なくとも１種のアポトーシス阻害剤、
を含む生育培地中で、（ａ）で得られた単離細胞をインキュベートし、それによりＡＳＣが富化された細胞集団を得ること、
を含む、方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一実施形態において、ステップ（ｂ）の前に、上記ＳＶＦは、少なくとも２継代の間、培養において保持される。
【００１３】
幾つかの実施形態において、上記ＴＮＦスーパーファミリーリガンドは、Ｆａｓ−リガンド（ＦａｓＬ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、腫瘍壊死因子様アポトーシス弱誘発因子（ＴＷＥＡＫ）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１４】
１つの具体的な実施形態において、上記ＴＮＦスーパーファミリーリガンドは、ＦａｓＬである。
【００１５】
幾つかの実施形態において、上記生育培地は、成長因子、ホルモン、サイトカインおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される追加の活性剤をさらに含む。
【００１６】
一実施形態において、上記インキュベーションは、少なくとも１時間である。
【００１７】
幾つかの実施形態において、上記インキュベーションは、約１時間、２時間、３時間もしくはより長い時間、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１７、２０もしくは２３日間である。
【００１８】
一実施形態において、上記インキュベーションは、２時間である。
【００１９】
一実施形態において、上記インキュベーションは、４日間である。
【００２０】
一実施形態において、上記インキュベーションは、１４日間である。
【００２１】
一実施形態において、培地は、３日ごと、または４日ごとに更新される。
【００２２】
一実施形態において、上記アポトーシス阻害剤は、上記少なくとも１種のＴＮＦスーパーファミリーリガンドの前に、リガンドと一緒に、またはリガンドの後に、投与される。
【００２３】
幾つかの実施形態において、上記アポトーシス阻害剤は、カスパーゼ阻害剤、セリンプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＨＴＲＡ２）、アポトーシス阻害タンパク質（ＩＡＰ）（例えば、ＸＡＦ１）、ＮＦ−カッパＢ阻害剤、Ｓｍａｃ阻害剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２４】
１つの具体的実施形態において、上記カスパーゼ阻害剤は、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋである。
【００２５】
幾つかの実施形態において、上記アポトーシス阻害剤の量は、約１μＭ〜約５０μＭの範囲、または約５μＭ〜約２５μＭの範囲である。
【００２６】
幾つかの実施形態において、上記少なくとも１種のＴＮＦスーパーファミリーリガンドの濃度は、約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲である。
【００２７】
一実施形態において、上記少なくとも１種のＴＮＦスーパーファミリーリガンドおよびアポトーシス阻害剤とのインキュベーションに続いて、上記細胞を、上記少なくとも１種のＴＮＦスーパーファミリーリガンドおよびアポトーシス阻害剤を除去し分化させる。
【００２８】
一実施形態において、上記細胞を、脂肪細胞、軟骨細胞、または骨細胞に分化させる。
【００２９】
一実施形態において、本発明の方法は、それを必要とする患者中に分化したまたは未分化の細胞を移植することをさらに含む。
【００３０】
一実施形態において、上記細胞は、脂肪組織、骨組織、筋肉、結合組織または軟骨に分化する。
【００３１】
一実施形態において、上記細胞は、脂肪組織に分化し、上記患者は、乳房復元を必要としている。
【００３２】
一実施形態において、上記細胞は、骨組織に分化し、上記患者は、整形外科的傷害、骨再建または骨修復の処置を必要としている。
【００３３】
一実施形態において、上記細胞は、軟骨組織に分化し、上記患者は、軟骨細胞の植え込み、半月板、回旋筋腱板または関節軟骨修復の処置を必要としている。
【００３４】
一実施形態において、上記患者は、美容的処置を必要としている。
【００３５】
一実施形態において、上記分化細胞を上記移植することは、皮膚科の病気を処置するためである。
【００３６】
一実施形態において、上記分化細胞を上記移植することは、患者における免疫関連疾患を緩和または処置するためである。
【００３７】
一実施形態において、上記患者は、臓器または組織の移植を受ける。
【００３８】
一実施形態において、上記臓器の移植は、骨髄、肝臓、腎臓、血管または心臓移植からなる群から選択される。
【００３９】
一実施形態において、上記分化細胞を上記移植することは、患者における心臓障害を処置するためである。
【００４０】
一実施形態において、上記心臓障害は、卒中、狭心症および心不全からなる群から選択される。
【００４１】
一実施形態において、上記分化細胞を上記移植することは、クローン病患者における痔瘻または肛門周囲瘻孔を処置するためである。
【００４２】
一実施形態において、上記分化細胞を上記移植することは、血管修復のためである。
【００４３】
幾つかの実施形態において、上記細胞は、同種または自家である。
【００４４】
別の態様において、本発明は、細胞生育培地、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドおよびアポトーシス阻害剤を含む脂肪幹細胞（ＡＳＣ）生育培地または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）生育培地を提供する。
【００４５】
一実施形態において、ＡＳＣまたはＭＳＣ生育培地は、血清または血清代替品をさらに含む。
【００４６】
別の態様において、本発明は、
ａ．細胞生育培地、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドおよびアポトーシス阻害剤を含む、脂肪幹細胞生育培地または間葉系幹細胞生育培地を含有する容器と；
ｂ．脂肪幹細胞または間葉系幹細胞をインビトロで増大させるために生育培地を使用するための説明書、
を含む、製品を提供する。
【００４７】
一実施形態において、上記生育培地は、血清または血清代替品をさらに含む。
【００４８】
本発明はまた、本発明の方法により得られる細胞の富化集団を提供する。
【００４９】
幾つかの実施形態において、細胞の富化集団は、それを必要とする患者への移植処置における使用のためである。
【００５０】
本明細書に開示された主題をよりよく理解するため、および実際に実行する方法を例示するために、ここに添付の図面を参照しながら、非限定的実施例のみにより実施形態を記載する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１Ａは、標準的細胞カウントにより計算されたＦａｓ−Ｌ濃度（ｎｇ／ｍｌ）の関数としてのＳＶＦ細胞数倍率変化を示すグラフである；図１Ｂは、標準的細胞カウントにより計算されたＦａｓ−Ｌ濃度（ｎｇ／ｍｌ）の関数としてのｓｕｂ−Ｇ１の割合の倍率変化を示すグラフである；図１Ｃおよび図１Ｄは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）細胞周期フローサイトメトリー解析により計算された、対照ＳＶＦ細胞（Ｆａｓ−Ｌ処置なし）における（１Ｃ）および５０ｎｇ／ｍｌ  Ｆａｓ−Ｌで処置された細胞における（１Ｄ）ｓｕｂ−Ｇ１の割合を示すグラフである。データを、平均±標準偏差として表す。図１Ｅおよび１Ｆは、５０ｎｇ／ｍｌ  Ｆａｓ−Ｌを含む（１Ｆ）、またはＦａｓ−Ｌを含まない（対照）（１Ｅ）いずれかの培養ＳＶＦ細胞の画像を示す。図１Ｇは、処置細胞の浮遊細胞のアネキシン／ＰＩフローサイトメトリー解析のグラフィック表示である（図１Ｆでは矢印で表示される）。図１Ｈおよび１Ｉは、抗ＣＤ９５で染色された対照細胞（１Ｈ）およびＦａｓ−Ｌ処置細胞（１Ｉ）のグラフィック表示である。
【図２】通常の培養条件下で（対照）（図２Ａ〜２Ｃ、２Ｇ、２Ｉおよび２Ｊ）、または５０ｎｇ／ｍｌ  Ｆａｓ−Ｌと共に（図２Ｄ〜２Ｆ、２Ｈ、２Ｋおよび２Ｌ）培養された継代（Ｐ）０（図２Ａ〜Ｈ）およびＰ１（図２Ｉ〜Ｌ）でのヒトＳＶＦ細胞中の様々な表面マーカ発現のグラフィック表示である。細胞を、フローサイトメトリーによりＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ２９、ＣＤ１０５およびＣＤ７３の表面マーカ発現について検査した。ＣＤ４５およびＣＤ３１についての染色を、粒度と相関させて表す（側方散乱ＳＳＣ−Ａ）。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、脂肪に分化された染色細胞の写真である（Ａ  −  ＦａｓＬを添加していない対照；Ｂ  −  ＦａｓＬと共にインキュベートされた細胞）。図３Ｃは、光学密度（ＯＤ）として示された染色量を示すグラフである。図３Ｄおよび３Ｅは、骨に分化された染色細胞の写真である（Ｄ  −  ＦａｓＬを添加していない対照；Ｅ  −  ＦａｓＬと共にインキュベートされた細胞）。図３Ｆは、光学密度（ＯＤ）として示される染色量を示すグラフである。
【図４】図４Ａは５０ｎｇ／ｍｌ  Ｆａｓ−Ｌの存在下または非存在下（対照）で培養されたヒトＳＶＦを含む培養プレートの写真である。コロニーを、ギムザ染色した。図４Ｂは、例示的な大きなコロニーの写真である。図４Ｃは、例示的な小さなコロニーの写真である。図４Ｄは、総コロニー数を示すグラフである。図４Ｅは、Ｆａｓ−Ｌ処置細胞と非処置（対照）細胞とを比較した、大きなコロニー（＞１００細胞）の数を示すグラフである。
【図５】図５Ａは、通常の培養条件下で、または増加濃度のＦａｓ−Ｌと共に、６日間培養されたＡＳＣ（Ｐ３）の細胞数倍率変化を示すグラフである。図５Ｂ〜５Ｄは、細胞のｓｕｂ−Ｇ１の割合を示すグラフである。細胞数を、標準的細胞カウント（５Ａ）によりおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）細胞周期フローサイトメトリー分析（５Ｂ〜５Ｄ）により検査した。データ（５Ｂ）を、平均±標準偏差として表す。図５Ｅ〜Ｊは、通常の培養条件下で、または５０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌ  Ｆａｓ−Ｌと共に培養されたＰ３  ＡＳＣにおけるフローサイトメトリーで検査された、ＣＤ２９、ＣＤ１０５およびＣＤ７３の表面マーカ発現を示すグラフである。
【図６】図６Ａは、Ｆａｓ−Ｌ、カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋまたはその両方で４日間処置されたＡＳＣ中のｓｕｂ−Ｇ１の割合（ｓｕｂ−Ｇ１の割合の倍率変化）を示すグラフである。図６Ｂは、細胞数倍率変化を示すグラフである。図６Ｃ〜６Ｄもまた、対照（６Ｃ）、Ｆａｓ−Ｌ処置細胞（６Ｄ）およびＦａｓ−Ｌ＋阻害剤処置細胞（６Ｅ）中のｓｕｂ−Ｇ１の割合を示す。ｓｕｂ−Ｇ１の割合を、ＰＩ細胞周期フローサイトメトリー解析により決定し、細胞数を、標準的細胞カウントにより決定した。データ（６Ａ〜Ｂ）を、平均±標準偏差として表す。図６Ｆ〜６Ｉは、異なる条件下でのＡＳＣの代表的画像である。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、Ｆａｓ−Ｌ、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、ＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋ阻害剤）（７Ａ）、ＡＺＤ６２４４（ＥＲＫ−１／２阻害剤）（７Ｂ）およびＳＰ６００１２５（ＪＮＫ阻害剤）（７Ｃ）の示された組み合わせで処置された培養ＡＳＣの細胞数倍率変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
実施形態の詳細な記載
本発明は、Ｆａｓ−Ｌ処置が脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）の同時に起こるアポトーシスおよび増殖を促進し、細胞収率の増加および表現型シフト（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｈｉｆｔ）を導くという驚くべき知見に基づく。細胞に及ぼすＦａｓ−Ｌの複雑な影響の理解は、本発明者らを、Ｆａｓ−Ｌとアポトーシスを阻害する薬剤を含む、薬剤の組み合わせへの細胞の暴露を含む脂肪由来幹細胞を増大させるための新規な方法を考案するよう導いた。
【００５３】
以下の実施例で詳述される通り、ヒトＡＳＣを日常的脂肪吸引手順により単離し、Ｆａｓ−Ｌ処置へのそれらの反応性を検査した。ＡＳＣは、同時に起こるアポトーシスおよび増殖によりＦａｓ−Ｌに応答し、これは、骨分化能の上昇に関連するＣＤ１０５発現減少およびＣＤ７３発現増加を含む、細胞量の正味の倍増および表現型シフトを生じた。単離されたばかりのＡＳＣの処置はまた、初期幹細胞前駆細胞によりおそらく産生される、大きなコロニー形成単位線維芽細胞（ＣＦＵ−Ｆ）の増加を導いた。
【００５４】
興味深いことに、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによるカスパーゼ阻害は、増殖に影響を与えずにＦａｓ−Ｌ誘導性アポトーシスを減じ、ＪＮＫではなくＰＩ３ＫおよびＭＥＫの阻害は、Ｆａｓ−Ｌ依存性増殖を減じたが、アポトーシスは減じなかった。したがって本発明者らは、ＡＳＣ中のＦａｓ−Ｌシグナル伝達が、誘導されるアポトーシスと増殖の繊細なバランスを通してＡＳＣの増大および表現型シフトを導くことを示す。
【００５５】
驚くべきことに、本発明者らは、Ｆａｓ−Ｌシグナル伝達が、得られたばかりのＡＳＣおよび培養されたＡＳＣの両方のアポトーシスおよび増殖を同時に活性化することを見出した。アポトーシスの誘導にもかかわらず、Ｆａｓ−Ｌシグナル伝達は、ＭＳＣ特異性マーカ発現の変化、初期ＣＦＵ−Ｆをより多量に産生する能力、および骨分化能の上昇により示される、ＡＳＣの細胞増大の増加（およそ倍増された細胞量）および表現型シフトを導いた。さらなる評価は、Ｆａｓ−Ｌによるアポトーシスおよび増殖のきっかけ（ｃｕｅ）が相互に連絡しないこと、ならびにアポトーシスシグナルの遮断が増殖シグナルへの影響を有さず、かつその逆もないことを実証した。増殖活性化は、ＰＩ３ＫおよびＭＥＫ阻害剤の両方により減じられ、Ｆａｓ−Ｌシグナルの伝達におけるこれらの経路の関与を示した。再生目的のためのＳＶＦ細胞およびＡＳＣの両方の増加している適用に照らせば、アポトーシス阻害と組み合わせたＦａｓ−Ｌ活性化の利用は、細胞収率を増加させるための、およびおそらく骨再生などの特異的臨床適応症のための細胞表現型も増加させるための効率的ツールとして働く可能性がある。劇的なアポトーシス応答および細胞収率の減少が以前、ＢＭ  ＭＳＣのＦａｓ−Ｌ処置後に報告されたことを前提に［２、４〜６］、急激な増殖によりＦａｓ−Ｌシグナル伝達に応答するＡＳＣの能力は、特に炎症エリアに共通して富化されるＦａｓ−Ｌ提示免疫細胞に暴露される場合、その送達の際に臨床的に有利に働く可能性がある。
【００５６】
本発明は、同時に起こるアポトーシスおよび増殖活性による、Ｆａｓ−Ｌシグナル伝達時のＳＶＦ由来ＡＳＣおよび単離されたＡＳＣのカウントにおける全体的増加を実証する。
【００５７】
ＡＳＣにおけるＦａｓシグナル伝達はまた、ＣＤ１０５の低い表面発現（ＣＤ１０５−低）およびＣＤ７３の高い表面発現（ＣＤ７３−高）を有する細胞の割合％の増加により実証される表現型変化をもたらした。ＣＤ１０５およびＣＤ７３は両者とも、確立されたＭＳＣマーカであり、具体的にＡＳＣマーカとして定義されている。Ｆａｓ−Ｌ処置は、非処置対照に比較して、ＣＤ１０５−低のＡＳＣの増加と、それらの改善された骨分化能の両方を導いた。
【００５８】
Ｆａｓ−Ｌ誘導性アポトーシスおよび／または増殖を促進するシグナル伝達経路を解明するために、Ｆａｓ制御アポトーシス性および非アポトーシス性シグナル伝達を促進することが過去に実証された様々な経路の阻害剤を用いた。重要なことに、本発明者らは、汎カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによるカスパーゼの阻害が、Ｆａｓ−Ｌ処置ＡＳＣにおいてほぼ完全なアポトーシス阻害を導くが、増殖に対しては極わずか〜無視できるほどの影響を有することを見出した。このことは、ＡＳＣにおいてＦａｓ−Ｌにより惹起される非アポトーシス性シグナル伝達が、カスパーゼ非依存性であることを強く示唆する。本発明者らはまた、Ｆａｓ−Ｌ依存性のＡＳＣ増殖は、ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ阻害剤により阻害され得るが、ＪＮＫ阻害剤では阻害され得ないことを見出した。重要なことに、それらの阻害剤はいずれも、ＡＳＣにおけるＦａｓ−Ｌ依存性アポトーシスを顕著に排除しなかった。したがってＦａｓ−Ｌは、ＡＳＣのアポトーシスと増殖を同時に誘導するが、それぞれの機能的転帰を促進するシグナル伝達は、Ｆａｓ受容体の下流に迂回するようである。
【００５９】
本発明は、初めて、Ｆａｓ−Ｌシグナル伝達が、単離されたばかりのヒトＡＳＣおよび培養されたヒトＡＳＣのアポトーシスおよび増殖を同時に促進し、細胞増大の全体的増加および表現型変化を導くことを実証する。再生医療に関連して、Ｆａｓ−Ｌが富化された条件下で生存および増殖する能力は、インビボでの臨床投与後のＳＶＦ細胞およびＡＳＣの生存を支援する可能性がある。
【００６０】
したがって本発明は、態様の第一において、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を繁殖させるための方法であって、
（ａ）身体組織または臓器から細胞を単離すること；および
（ｂ）（ｉ）少なくとも１種のＴＮＦスーパーファミリーリガンドと、
（ｉｉ）少なくとも１種のアポトーシス阻害剤、
を含む生育培地中で、（ａ）で得られた単離細胞をインキュベートし、それによりＭＳＣが富化された細胞集団を得ること、
を含む、方法を提供する。
【００６１】
当該技術分野で知られる用語「間葉系幹細胞」（ＭＳＣ）は、種々の細胞型に分化し得る多能性幹細胞に関する。ＭＳＣは、近年、国際細胞治療学会により、以下の特徴を有すると定義された：（１）標準的培養条件で保持された場合のプラスチック接着；（２）ＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ９０の発現、ならびにＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９αまたはＣＤ１９およびＨＬＡ−ＤＲ表面分子の発現欠如（３）。ＭＳＣは、インビトロで骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨芽細胞に分化する。培養でヒト間葉系幹細胞を単離、精製および増大させるための方法は、当該技術分野で知られており、例えば主に骨髄からの間葉系幹細胞の単離に関係する米国特許第５，４８６，３５９号を参照されたい。
【００６２】
本明細書で用いられる用語「身体組織または臓器」は、非限定的に脂肪組織、末梢血、骨髄、歯髄、羊水、羊膜、絨毛膜、絨毛膜絨毛、脱落膜、胎盤、臍帯、臍帯血、ワルトン膠質を含む間葉系幹細胞を含有する、対象の体内の任意の組織または臓器に関する。
【００６３】
一実施形態において、本発明の間葉系幹細胞は、脂肪由来幹細胞である。
【００６４】
それゆえ具体的実施形態において、本発明は、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を繁殖させるための方法であって、
（ａ）対象から得られた脂肪吸引物から間質血管細胞群（ＳＶＦ）の細胞を単離すること；および
（ｂ）（ｉ）少なくとも１種のＴＮＦスーパーファミリーリガンドと、
（ｉｉ）少なくとも１種のアポトーシス阻害剤、
を含む生育培地中で、（ａ）で得られた単離細胞をインキュベートし、それによりＡＳＣが富化された細胞集団を得ること、
を含む、方法を提供する。
【００６５】
用語「脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）」および「脂肪由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）」は、本明細書では互換的に用いられ、脂肪組織から単離されたＭＳＣを指す。
【００６６】
本明細書で用いられる「脂肪組織」は、ほとんどが脂肪細胞で構成された結合組織を指す。脂肪細胞に加え、脂肪組織は、前駆脂肪細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、種々の免疫細胞、例えば脂肪組織マクロファージ、幹細胞および内皮前駆細胞を含む細胞の間質血管細胞群（ＳＶＦ）を含有する。
【００６７】
本明細書で用いられる用語「間質血管細胞群（ＳＶＦ）」は、前駆脂肪細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、内皮前駆細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞および脂肪組織マクロファージの豊富な供給源である、脂肪組織の調製物に関する。
【００６８】
脂肪吸引物から脂肪由来幹細胞またはＳＶＦ細胞を単離するための方法は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｂｕｎｎｅｌｌ，  Ｂ． Ａ. ｅｔ ａｌ. （２００８）  Ｍｅｔｈｏｄｓ ４５（２）: １１５−１２０, Ｓｃｈｒｅｍｌ ｅｔ ａｌ. （２００９）  Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ １１（７）: ９４７−５７, Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ. （２００６）  Ｊ. ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２０８: ６４−７６参照）。例えば脂肪組織を、吸引支援脂肪形成術（ｓｕｃｔｉｏｎ−ａｓｓｉｓｔｅｄ−ｌｉｐｏｐｌａｓｔｙ）、超音波支援脂肪形成術（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ−ａｓｓｉｓｔｅｄ−ｌｉｐｏｐｌａｓｔｙ）、および脂肪組織切除術（ｅｘｃｉｓｉｏｎａｌ ｌｉｐｅｃｔｏｍｙ）、またはそれらの組み合わせにより取り出してよい。組織抽出は、滅菌的または無菌的手法で実施されなければならない。
【００６９】
吸引支援脂肪形成術の処置の場合、脂肪組織を、カニューレを患者の体内に存在する脂肪組織貯蔵部の中、またはその付近に挿入した後、吸引装置内への脂肪組織のアスピレーションにより収集する。シリンジに連結された小型カニューレが、比較的中等度の量の脂肪組織を採取するのに適切であり得る（例えば、０．１ｍｌ〜数百ミリリットル）。より大きなカニューレおよび自動吸引装置が、より多量の組織が必要な場合その手順において用いられてもよい。
【００７０】
脂肪吸引物から脂肪由来幹細胞またはＳＶＦ細胞を単離するための例示的プロトコルを、以下の実施例の節に提供する。
【００７１】
本明細書で用いられる用語「繁殖させること」は、身体の組織または臓器から、例えば脂肪吸引物から、単離された間葉系幹細胞のインビトロでの数の増大（増大すること）、増幅、増殖、または増加に関する。
【００７２】
本明細書で用いられる用語「対象」は、哺乳動物対象、具体的にはヒト対象に関する。
【００７３】
場合により上記単離のステップ（ａ）は、組織を分解するタンパク質分解酵素（例えば、コラゲナーゼ、例えばコラゲナーゼＩ型）またはタンパク質分解酵素の混合物への暴露（コラゲナーゼ消化とも称される）を含む。細胞のコラゲナーゼ消化を実施するためのプロトコルは、当該技術分野で周知であり、コラゲナーゼ消化を実施するための複数の化合物が、市販されている（例えば、Ｃｙｔｏｒｉ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによるＣｅｌａｓｅ（登録商標）ＧＭＰ）。コラゲナーゼＩ型は、０．１％〜０．３％の間の範囲で添加され得る。中性プロテアーゼ、例えばディスパーゼＩＩが、場合により消化反応に添加され得る。例えば以下の実施例に示される通り、コラゲナーゼは、０．３７５ｍｇ／ｍｌの濃度で、撹拌しながら３７℃で６０分間添加され得る。
【００７４】
本明細書で用いられる用語「腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーリガンド」は、ＴＮＦスーパーファミリーに属すると現在、認識されている４０を超える個別のリガンド−受容体システムのファミリーを指す。ＴＮＦスーパーファミリーに属し、本発明により用いられ得る例示的リガンドとしては、Ｆａｓ−リガンド（ＦａｓＬ）、ＴＮＦα、Ｔｒａｉｌ（Ａｐｏ２リガンド）およびＴｗｅａｋ（Ａｐｏ３リガンド）が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなＴＮＦスーパーファミリーリガンドは、生化学的に合成されたまたは細胞抽出物から精製された組換えポリペプチドであってよい。それらは、単量体、二量体、または多量体の形態として投与されてよい。
【００７５】
したがって幾つかの実施形態において、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドは、ＦａｓＬ、ＴＮＦα、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００７６】
具体的実施形態において、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドは、ＦａｓＬである。本発明による使用のためのＦａｓＬの非限定的例としては、ＳｕｐｅｒＦａｓＬ、ＡＰＯ０１０またはＭｅｇａＦａｓＬ（Ｒ＆Ｄ）が挙げられ、それらは全て、ＦａｓＬの多量体である。Ｆｃ−ＦａｓＬまたはＦａｓＬ単量体などのＦａｓＬの追加的形態もまた、本発明により包含される。
【００７７】
培地中のＴＮＦスーパーファミリーリガンドの濃度は、約０．１ｎｇ／ｍｌおよび約１００ｎｇ／ｍｌ ｗ／ｖ、例えば０．１ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌ ｗ／ｖのＴＮＦスーパーファミリーリガンドの範囲である。ＴＮＦスーパーファミリーリガンドがＦａｓＬである具体的実施形態において、培地は、約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ ｗ／ｖの間のＦａｓＬ、例えば０．１ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌ ｗ／ｖのＦａｓＬを含む。具体的実施形態において、培地は、２５ｎｇ／ｍｌ、５０ ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌのＦａｓＬを含む。
【００７８】
幾つかの実施形態において、上記アポトーシス阻害剤は、カスパーゼ阻害剤、セリンプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＨＴＲＡ２）、アポトーシス阻害タンパク質（ＩＡＰ）（例えば、ＸＡＦ１）、ＮＦ−カッパＢ阻害剤、Ｓｍａｃ阻害剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００７９】
１つの具体的実施形態において、上記カスパーゼ阻害剤は、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋである。
【００８０】
幾つかの実施形態において、上記アポトーシス阻害剤の量は、約１μＭ〜約５０μＭの範囲、または約５μＭ〜約２５μＭの範囲である。
【００８１】
先に示された通り、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を繁殖させるための方法は、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドおよびアポトーシス阻害剤を含む生育培地中で単離された細胞をインキュベートすることを含む。当該技術分野で知られる通り、用語「インキュベートすること」は、細胞を細胞インキュベータ中で適当な温度および気体混合物（典型的には、哺乳動物細胞の場合３７℃、５％ＣＯ２）にて生育および保持することを指す。本発明に関連して用いられる「ＴＮＦスーパーファミリーリガンドおよびアポトーシス阻害剤を含む生育培地中で単離された細胞をインキュベートすること」は、単離された細胞をＴＮＦスーパーファミリーリガンドおよびアポトーシス阻害剤と接触させることを意味する。
【００８２】
幾つかの実施形態において、本開示による方法では、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドおよびアポトーシス阻害剤とのインキュベーションは、少なくとも１時間である。
【００８３】
幾つかの実施形態において、上記インキュベーションは、約１時間、２時間、３時間もしくはより長い時間、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１７、２０もしくは２３日間である。
【００８４】
一実施形態において、上記インキュベーションは、２時間である。
【００８５】
一実施形態において、上記インキュベーションは、４日間である。
【００８６】
一実施形態において、上記インキュベーションは、１４日間である。
【００８７】
１つの具体的実施形態において、ＴＮＦスーパーファミリーは、ＦａｓＬであり、アポトーシス阻害剤は、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋであり、インキュベーションは、４日間である。
【００８８】
幾つかの実施形態において、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドおよびアポトーシス阻害剤を含む培地は、３日ごとまたは４日ごとに更新され、即ちそれは、同じ内容物を有する新鮮な培地で置き換えられる。
【００８９】
幾つかの実施形態において、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドおよびアポトーシス阻害剤とのインキュベーションは、細胞が単離された１〜７日後に開始する。具体的実施形態において、本開示による方法では、ステップ（ａ）の後に、単離された細胞を通常の生育培地中で１、２、３、４、５、６または７日間培養した後、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドおよびアポトーシス阻害剤と共にインキュベートする。
【００９０】
１つの具体的実施形態において、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドおよびアポトーシス阻害剤とのインキュベーションは、成熟ＡＳＣ、即ちＳＶＦ単離後の継代２代目または３代目の細胞で実施される。
【００９１】
一実施形態において、ＦａｓＬとのインキュベーションの前に、単離された細胞を、例えばＦａｓの発現を増加させることにより、ＦａｓＬへの細胞応答に影響を及ぼし得る（即ち、その影響に対して細胞を増感させる）分子と共にプレインキュベートする。ＴＮＦαが、そのような増感させる分子の一例である。
【００９２】
それゆえ幾つかの実施形態において、本開示による方法では、ＦａｓＬおよびアポトーシス阻害剤とのインキュベーションの前に、単離された細胞をＴＮＦαと共にプレインキュベートする。さらなる具体的実施形態において、ＴＮＦαとのプレインキュベーションは、１〜４日間実施される。
【００９３】
特定の実施形態において、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドおよびアポトーシス阻害剤に加えて、細胞は、成長因子、ホルモン、サイトカインおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される追加の活性剤と共にインキュベートされる。具体的な非限定的実施例において、細胞は、デスレセプター３（ＤＲ３、ＴＮＦＲＳＦ２５としても知られる）の１種または複数のアンタゴニストと共にインキュベートされてよい。そのようなアンタゴニストとしては、例えばＡｂｃａｍ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓおよび他の供給会社から市販される、抗ＤＲ３抗体が挙げられるが、これに限定されない。
【００９４】
先に示された通り、本発明の方法は、ＭＳＣまたはＡＳＣが富化された細胞集団を提供する。本明細書で用いられる用語「富化された」は、細胞集団中のＭＳＣまたはＡＳＣの相対数を、細胞集団の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ または約１００％まで高めること、増強することまたは増加させることを指す。
【００９５】
ＴＮＦスーパーファミリーリガンドおよびアポトーシス阻害剤とのインキュベーション期間の完了時に、繁殖された細胞は、培養物から取り出され、再度播種され、培養条件に応じて脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、線維芽細胞または筋細胞の任意の１つに新たに分化し得る。所望の細胞型のそれぞれに分化するための条件は、当該技術分野で周知であり、特異的試薬を含有する培地中での細胞のインキュベーションを含む。
【００９６】
それゆえ幾つかの実施形態において、本開示による方法では、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドおよびアポトーシス阻害剤とのインキュベーションに続いて、上記ＴＮＦスーパーファミリーリガンドおよびアポトーシス阻害剤を除去し、上記細胞を分化させる。他の具体的実施形態において、細胞を、脂肪細胞、軟骨細胞、または骨細胞に分化させ、本明細書では「分化細胞」と称する。
【００９７】
本明細書で用いられる用語「分化させる」は、所望の細胞型のいずれかへの分化に適した条件下での細胞のインキュベーションに関する。そのような条件は、当該技術分野で周知であり、特に試薬の典型的な組み合わせを含有する培地中のインキュベーションを含む。
【００９８】
例えば、間葉系幹細胞の脂肪生成培地は、間葉系幹細胞を脂肪細胞系列に容易に分化させる試薬（即ち、デキサメタゾン、ＩＢＭＸ、インスリンおよびインドメタシン）を含有する。そのような培地は、市販され、例えば、ＬｏｎｚａのｈＭＳＣ Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）ＭｅｄｉｕｍまたはＳｔｅｍｃｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍである。脂肪細胞への分化はその後、脂肪細胞分化の量に関係する定量値を提供する種々の方法により検証され得る。他の培地を用いて、他の細胞型への分化を誘導してもよい（例えば、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ＭｅｄｉｕｍまたはＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ））。繁殖されたＡＳＣはまた、造血も支援しながら、ＡＳＣ自身以外の胚の起源である細胞に分化転換されてもよく、例えば心筋生成、内皮細胞（血管）、膵臓（内分泌）、神経生成、および肝臓の分化転換であってよい。
【００９９】
さらなる実施形態において、本開示による方法は、それを必要とする患者に分化細胞を移植することをさらに含む。
【０１００】
一実施形態において、本発明による方法は、それを必要とする患者への繁殖された未分化細胞の移植を含む。
【０１０１】
本明細書で用いられる用語「それを必要とする患者」は、分化細胞を移植することにより改善、治癒、処置され得る疾患に罹患した対象、または分化細胞を移植することにより緩和される症状を有する対象に関する。
【０１０２】
それゆえ、分化細胞は、多くの臨床適用に加え、例えば現在、第三／四相臨床試験の最中である以下の適応症における、美容適用および形成外科での移植に用いられてよい：乳房再建（復元）、早発卵巣不全、肛門周囲複雑瘻孔、痔瘻およびクローン病。ＡＳＣはまた、細胞バンクに用いることができる。追加的適用としては、皮膚再生、皮膚科の病気、肝臓再生、筋肉再生、血管修復、整形外科的傷害の処置、骨再建もしくは骨修復、軟骨細胞の植え込み、半月板の処置、または関節軟骨修復および骨粗しょう症の処置が挙げられる。
【０１０３】
本発明の分化細胞はまた、免疫抑制に用いられてもよい。他の実施形態において、本発明による分化細胞は、卒中または心不全を処置するのに用いられ得る。
【０１０４】
移植は、同種または自家であり得る。
【０１０５】
本明細書で定義される用語「移植」は、手術または注射により、それを必要とする患者に細胞を移入することを指す。ドナーおよびレシピエントは、１名の個体または異なる個体であり得る。そのような例では、移植片は、それぞれ自家または同種である。同種移植が実践される場合、インプラントの拒絶を低減するためのレジメンを受けなければならない。そのようなレジメンは現在、ヒト治療で実践されており、当該技術分野で周知である。
【０１０６】
以下は、損失した、または損傷された臓器細胞を補充するための外部細胞供給源として用いられる間葉系起源の細胞の例であり：米国特許第５，７３６，３９６号は、間葉系組織の再生または修復を目的として、培養で増大された、系列誘導された（ｌｉｎｅａｇｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ）間葉系幹細胞を元の自家宿主に導入することを記載する。
【０１０７】
米国特許第４，６４２，１２０号は、軟骨および骨の欠損を修復するための組成物を提供する。これらは、そのままの状態で、または天然のもしくは人工の骨に包埋されて、ゲル形態で提供される。
【０１０８】
細胞の移植は、当該技術分野で知られる任意の方法を利用して、かつ患者の治療適応症に基づく医師の裁量で、実施され得る。例えば分化細胞は、組織欠損（例えば、骨格欠損）の部位に注射されてよく、またはインビトロで生体適合性足場材料もしくはマトリックスと共にインキュベートされ欠損部位に足場材料と共に植え込まれてもよい。
【０１０９】
本発明の細胞はまた、遺伝子療法で用いられてもよい。長期遺伝子療法の成功のためには、所望の外来遺伝子を安定に発現する遺伝子改変細胞が、高頻度で必要となる。したがって本発明の分化細胞は、遺伝子産物を発現するように改変され得る。
【０１１０】
本明細書で用いられる用語「遺伝子産物」は、タンパク質、ペプチドおよび機能性ＲＮＡ分子（即ち、ポリヌクレオチド）を指す。そのような遺伝子産物の例としては、血清アデノシンのプロセシングのための、または低比重リポタンパク質、血清胸腺因子、胸腺液性因子、チモポエチン、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ソマトスタチン、セロトニン、およびサブスタンスＰのエンドサイトーシスのための、インスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、カルボキシペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロール（ｔｒｉａｃｌｙｇｌｙｃｅｒｏｌ）リパーゼ、エラスターゼ、アミラーゼ、第ＶＩＩＩおよび第ＩＸ血液凝固因子などの血液凝固因子、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ、オルニチントランスカルバノイラーゼ、ならびにチトクロムｐ４５０酵素、ならびにアデノシンデアミナーゼが挙げられる。
【０１１１】
本発明の態様の別の１つにおいて、本開示は、細胞培地と、少なくとも１種のＴＮＦスーパーファミリーリガンドと、少なくとも１種のアポトーシス阻害剤とを含む脂肪幹細胞（ＡＳＣ）生育培地または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）生育培地を提供する。
【０１１２】
本明細書で定義される「細胞培地」または「生育培地」は、細胞の生育を支援するように設計された液体またはゲルを指す。異なる型の培地が、異なる型の細胞を生育するのに用いられる。細胞培地の例は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびその変種、Ｆ１０栄養混合物、ハムＦ１２栄養混合物、最小必須培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ培地１６４０およびイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を包含する。
【０１１３】
これらの培地は全て、周知であり、市販されている。例えばＤＭＥＭは典型的には、アミノ酸、無機塩、グルコース、フェノールレッド、ＨＥＰＥＳ、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミン類を含む。培地は多くの場合、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアンフォテリシンＢなどの抗生物質／抗真菌剤が補充される。培地は、様々なグルコース量を含んでよい。一実施形態において、培地は、例えばＧｉｂｃｏによるＨｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ＤＭＥＭなど、高グルコール量を有する。
【０１１４】
細胞培地は、血清または血清代替品をさらに含んでよい。
【０１１５】
本開示に関連する用語「血清」または「血清（複数形）」は、広範囲の高分子、リポイド物質および微量元素の担体タンパク質、付着および拡散因子、低分子量栄養素、ならびにホルモンおよび成長因子を提供する細胞培地に添加される補助物質を指す。典型的には血清（複数形）は、哺乳動物血液調製物から単離される。本発明に関連する使用に適した血清の非限定的例は、仔牛血清（ＦＣＳ）またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）である。血清代替品が、用いられてもよい。用語「血清代替品」は、培養の際に細胞生育を支援するのに必要なタンパク質を含有する血清代用品に関し、例えば血清代替品は、精製され、好ましくは熱処理された血清アルブミン、トランスフェリンおよびインスリンを含んでよい。そのようなタンパク質は、任意の起源のものであってよく、それらは、例えば哺乳動物タンパク質、例えばウシの血清アルブミン、トランスフェリン、およびインスリンであってよい。そのような血清代替品は、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから、市販されている。培地中の血清の濃度は、細胞を生育するのに一般に用いられる範囲、即ち約１％〜約２０％の間である。具体的実施形態において、血清の濃度は、約１０％容量／容量である。さらなる具体的実施形態において、培地は、１０％ＦＣＳまたはＦＢＳ、例えばＨｙｃｌｏｎｅ（商標）によるＦｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍを含む。
【０１１６】
ＭＳＣ生育培地またはＡＳＣ生育培地に関連して用いられるＴＮＦスーパーファミリーリガンドは、本明細書に定義される通りであり、例えばＦａｓＬ、ＴＮＦα、ＴＲＡＩＬ（Ａｐｏ２リガンド）またはＴＷＥＡＫ（Ａｐｏ３リガンド）である。培地中のＴＮＦスーパーファミリーリガンドの濃度は、約０．１ｎｇ／ｍｌおよび約１００ｎｇ／ｍｌ ｗ／ｖ、例えば０．１ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌ ｗ／ｖのＴＮＦスーパーファミリーリガンドの範囲である。具体的実施形態において、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドは、ＦａｓＬである。さらなる具体的実施形態において、培地は、約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ ｗ／ｖのＦａｓＬ、例えば０．１ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌ ｗ／ｖのＦａｓＬを含む。
【０１１７】
ＭＳＣ生育培地またはＡＳＣ生育培地に関連して用いられるアポトーシス阻害剤は、カスパーゼ阻害剤、セリンプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＨＴＲＡ２）、アポトーシス阻害タンパク質（ＩＡＰ）（例えば、ＸＡＦ１）、ＮＦ−カッパＢ阻害剤、Ｓｍａｃ阻害剤、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１１８】
１つの具体的実施形態において、上記カスパーゼ阻害剤は、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋである。
【０１１９】
幾つかの実施形態において、培地中の上記アポトーシス阻害剤の濃度は、約１μＭ〜約５０μＭの範囲、または約５μＭ〜約２５μＭの範囲である。
【０１２０】
本発明のＭＳＣまたはＡＳＣ生育培地は、非限定的に成長因子、サイトカイン、抗生物質および担体を含む細胞生育に適した追加的成分をさらに含んでよい。
【０１２１】
本発明のＭＳＣまたはＡＳＣ生育培地は、調製され、使用まで４℃で貯蔵され、使用前に３７℃に加温されてよい。
【０１２２】
別の態様において、本発明は、
ａ．細胞生育培地、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドおよびアポトーシス阻害剤を含む、脂肪幹細胞生育培地または間葉系幹細胞生育培地を含有する容器と；
ｂ．脂肪幹細胞または間葉系幹細胞をインビトロで増大させるための生育培地を使用するための説明書、
を含む、製品を提供する。
【０１２３】
一実施形態において、上記生育培地は、血清または血清代替品をさらに含む。
【０１２４】
本明細書で定義される用語「容器」は、本明細書で定義される間葉系幹細胞生育培地を含有および貯蔵するために用いられ得るコンテナ、袋、ビーカー、瓶、ボール、箱、バイオリアクター、缶、フラスコ、またはバイアルを指す。
【０１２５】
本明細書で定義される用語「約」は、連続範囲を構成する整数値、および適宜、非整数値を含む偏差範囲で参照される値よりも最大で１％、より具体的には５％、より具体的には１０％、より具体的には１５％、および幾つかの例において最大で２０％高く、または低く外れ得る値を示す。
【０１２６】
実施例
さらなる労作を行わずとも、当業者は、上記の記載を用いることで本開示を最も完全な範囲まで利用し得ると考えられる。それゆえ、以下の好ましい具体的実施形態は、単に例示と解釈すべきであり、請求された本発明の限定と解釈すべきでない。
【０１２７】
本明細書に具体的に記載されていない当該技術分野で公知の標準的分子生物学プロトコルは概して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１に本質的に従う。
【０１２８】
本明細書に具体的に記載されない当該技術分野で公知の標準的医療化学的方法は概して、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓにより発行された、様々な著者および編集者による「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」シリーズに本質的に従う。 
【０１２９】
実施例１：Ｆａｓ−Ｌ処置後の同時に起こるＳＶＦ細胞増殖およびアポトーシス
間質血管細胞群（ＳＶＦ）の細胞に及ぼすＦａｓ−Ｌ処置の影響を評価するために、ＳＶＦ細胞を、以下に記載される通り脂質吸引物から得た。
【０１３０】
ヒトＳＦＶ細胞を、増加濃度のＦａｓ−Ｌの存在下対非存在下で、以下に指定された通常の生育培地中で１４日間培養し、細胞収率およびアポトーシス率を測定した。実験を、３名の独立した患者からの細胞を利用して３回反復した。図１Ａおよび１Ｂに示された通り、最大で２５ｎｇ／ｍｌのＦａｓ−Ｌ濃度への応答は、記録されなかった。これに反して、２５ｎｇ／ｍｌ以上の濃度では、ＳＶＦ細胞は、アポトーシス率の用量依存的上昇を示した（図１Ｂ）。それにもかかわらず、細胞カウントは、２倍以上であった（図１Ａ）。図１Ｃおよび１Ｄは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）細胞周期フローサイトメトリー解析により計算された、対照ＳＶＦ細胞（Ｆａｓ−Ｌ処置なし）（１Ｃ）でおよび５０ｎｇ／ｍｌ  Ｆａｓ−Ｌで処置された細胞（１Ｄ）で誘導されたアポトーシスを表す。アポトーシス細胞の数は、５０ｎｇ／ｍｌ  Ｆａｓ−Ｌとのインキュベーション後に５．４％から２０．５％に増加した。図１Ｅおよび１Ｆは、５０ｎｇ／ｍｌ  Ｆａｓ−Ｌを含む（１Ｆ）、またはＦａｓ−Ｌを含まない（対照）（１Ｅ）のいずれかの培養ＳＶＦ細胞の画像を示す。図１Ｇは、処置細胞の浮遊細胞のアネキシン／ＰＩフローサイトメトリー解析のグラフィック表示である（図１Ｆに矢印で標識）。図１Ｈおよび１Ｉは、フローサイトメトリー解析により検査されたＦａｓ−Ｌ処置および非処置細胞上のＣＤ９５（Ｆａｓ）発現のグラフィック表示である。５０ｎｇ／ｍｌ  Ｆａｓ−Ｌ処置後に倍増された細胞収率が、１０名の独立した患者から抽出されたＳＶＦ細胞中で実証された（表１）。したがってＦａｓ−Ｌ処置（≧２５ｎｇ／ｍｌ）は、培養でのＳＶＦ細胞のアポトーシスおよび増殖の両方を促進する。
【表１】
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【０１３１】
実施例２：ＳＶＦ細胞のＦａｓ−Ｌ処置は、継代０代目および１代目のＡＳＣのＣＤ１０５−低およびＣＤ７３−高細胞集団の増加を導く
次に、細胞表現型に及ぼすＦａｓ−Ｌ処置の影響を検査した。この目的のために、継代０代目および１代目のＦａｓ−Ｌ処置（５０ｎｇ／ｍｌ）ＳＶＦ細胞の表面マーカプロファイルを、７色のフローサイトメトリーパネルを利用して非処置対照のものと比較した。実験は、２名の独立した患者からの細胞を用いて２回繰り返され、同じ傾向を与えた。
【０１３２】
予測通り、継代０代目では、非処置細胞の２％未満がＣＤ４５、ＣＤ３１およびＣＤ３４を発現し、１００％近くがＳＭＣ細胞マーカＣＤ２９およびＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現した（図２Ａ〜Ｈ）。類似の発現プロファイルが、非処置細胞の継代１代目で記録された（図２Ｉ〜Ｌ）。非処置およびＦａｓ−Ｌ処置された継代０代目細胞の表面マーカ発現パターンに顕著な類似性があるにもかかわらず、Ｆａｓ−Ｌ処置細胞では、非処置対照細胞に比較して、低レベルのＣＤ１０５を発現するＣＤ１０５陽性細胞がより高い割合％で認められた（ＣＤ１０５−低）（それぞれ５０．１％に比較して６６．９％）。加えて、Ｆａｓ−Ｌ処置された継代０代目細胞は、非処置対照細胞に比較して、高レベルのＣＤ７３を発現するＣＤ７３−陽性細胞（ＣＤ７３高）をより高い割合％で呈した（５０．４％に比較して８８．３％）（図２Ａ〜Ｈ）。これらの２つの亜集団の相対的割合％のさらなる上昇が、継代１代目で認められ、ＣＤ１０５−低を実証するＦａｓ−Ｌ処置ＣＤ１０５陽性細胞では８９．６％、およびＣＤ７３−高を実証するＣＤ７３陽性細胞では９２．８％が、継代１代目の非処置対照でのそれぞれわずか４９．９％および５２．５％に比較して認められた（図２Ｉ〜Ｌ）。したがってＳＶＦ細胞のＦａｓ−Ｌ処置は、ＣＤ１０５−低およびＣＤ７３−高細胞の富化を導く。
【０１３３】
実施例３：Ｆａｓ−Ｌ処置された培養ＳＶＦ細胞は、非処置細胞に比較して類似の脂肪分化およびより高い骨分化を呈する
個別の表面マーカ発現を特徴とする異なるＡＳＣ亜集団が、異なる分化能を実証することが知られている。非処置対Ｆａｓ−Ｌ処置で、脂肪および骨への継代０代目ＡＳＣの分化を比較した。ヒトＳＶＦ細胞を、通常の培養条件下でまたは５０ｎｇ／ｍｌＦａｓ−Ｌと共に１４日間培養した。処置および非処置細胞をその後、Ｐ１に継代し、Ｐ１で指定された分化培地を用いて脂肪または骨の分化を受けるように誘導した。骨および脂肪への分化を、それぞれアリザリンレッドおよびオイルレッドＯ染色により検出した。脂肪（図３Ａ〜Ｃ）および骨（図３Ｄ〜Ｆ）に分化された細胞をその後、撮影し、染色物を抽出および定量した。実験は、３名の独立した患者からの細胞を用いて３回繰り返し、同じ傾向を与えた。
【０１３４】
この比較は、Ｆａｓ−Ｌ処置細胞と非処置細胞での類似の脂肪分化を明らかにしたが、Ｆａｓ−Ｌ処置後に骨分化が高まった。
【０１３５】
実施例４：ＳＶＦ細胞のＦａｓ−Ｌ処置は、大きなＣＦＵ−Ｆの生成を促進する
次に、コロニー形成単位線維芽細胞（ＣＦＵ−Ｆ）を形成するＦａｓ−Ｌ処置および非処置ＳＶＦ細胞の能力を評価した。ヒトＳＶＦ細胞を、21日間、通常の培養条件下でまたは５０ｎｇ／ｍｌのＦａｓ−Ｌと共に低密度で培養した。その後、コロニーをギムザ染色し、カウントした。コロニーを撮影し、コロニーおよび大きなコロニー（＞１００細胞）の総数を、Ｆａｓ−Ｌ処置細胞と非処置細胞で比較した。実験は、２名の独立した患者からの細胞を用いて２回繰り返され、同じ傾向を与えた。
【０１３６】
一見すると、Ｆａｓ−Ｌ処置細胞が、非処置細胞よりも有意に多くのＣＦＵ−Ｆを形成したように見えたが（図４Ａ）、注意深い顕微鏡評価は、ＣＦＵ−Ｆ集団が大きなＣＦＵ−Ｆと小さなＣＦＵ−Ｆの両方で構成され、大きなコロニーが１００を超える細胞のものであることを明らかにした（図４Ｂおよび４Ｃの下側）。図４Ｄおよび４Ｅに見られる通り、コロニーの総数は、Ｆａｓ−Ｌ処置SVF細胞と非処置細胞の間で有意な差を明らかにしなかったが、有意に多数の大きなコロニーが、非処置細胞に比較してＦａｓ−Ｌ処置SVF細胞で見出された。
【０１３７】
実施例５：継代３代目ＡＳＣのＦａｓ−Ｌ処置は、ＳＶＦ細胞で観察されたものと類似の表現型シフトをもたらす
ここまでの実験は全て、脂肪からのそれらの単離直後に、初期ＳＶＦ細胞に及ぼすＦａｓ−Ｌ処置の影響を評価した。Ｆａｓ−Ｌが「成熟した」ＡＳＣに添加された場合に類似の結果を誘導し得るか否かを検査するために、継代３代目（Ｐ３）細胞を通常の培養条件下でまたは増加濃度のＦａｓ−Ｌの存在下で６日間培養した。細胞数（図５Ａ）およびｓｕｂ−Ｇ１の割合（図５Ｂ〜５Ｄ）を、それぞれ、標準的細胞カウントにより、およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）細胞周期フローサイトメトリー解析により検査した。実験を、３名の独立した患者からの細胞を用いて３回繰り返した。データを、平均±標準偏差として表す。加えて、ＣＤ２９、ＣＤ１０５およびＣＤ７３の表面マーカ発現を、通常の培養条件下でまたは５０ｎｇ／ｍｌのＦａｓ−Ｌと共に培養されたＰ３  ＡＳＣでのフローサイトメトリーにより検査した。
【０１３８】
ＳＶＦ細胞でのように、Ｆａｓ−Ｌ処置は、Ｐ３  ＡＳＣの増殖における濃度依存性の増加（図５Ａ）、ならびにＣＤ１０５−低およびＣＤ７３−高集団の増加（図５Ｅ〜５Ｊ）を導いた。Ｆａｓ−Ｌはまた、Ｐ３  ＡＳＣのアポトーシスを誘導したが（図５Ｂ〜５Ｄ）、ＳＶＦ細胞のＦａｓ−Ｌ処置後に見られたものと比較して有意に低い割合であった。
【０１３９】
実施例６：カスパーゼ阻害は、Ｆａｓ−Ｌ依存性アポトーシスを減ずるが増殖は減じない
ＡＳＣのアポトーシスおよび増殖に及ぼすＦａｓ−Ｌの二重の影響は、古典的Ｆａｓ−Ｌシグナル伝達のみにより、または２つの個別の経路を通して媒介され得る。これらの可能性を識別するために、ＡＳＣを、４日間、未処置で放置するか、Ｆａｓ−Ｌのみで処置するか、またはＦａｓ−Ｌおよび汎カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋで同時に処置した。重要なことに、Ｆａｓ−Ｌのアポトーシスのきっかけをよりよく評価するために、継代３代目ＡＳＣにおいてアポトーシスを高率で誘導する異なるＦａｓ−Ｌ誘導体（メガＦａｓ−Ｌ）を、この実験で使用した。ｓｕｂ−Ｇ１の割合および細胞数を、それぞれＰＩ細胞周期フローサイトメトリー解析および標準的細胞カウントにより決定した。実験を、３名の独立した患者からの細胞を用いて３回繰り返した。
【０１４０】
予測された通り、Ｆａｓ−Ｌ処置は、処置細胞のｓｕｂ−Ｇ１集団の増加により実証される通り、ＡＳＣアポトーシスの急激な増加を導いた（図６ＡおよびＣ〜Ｅ）。アポトーシスはＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋの添加により少なからず減じられたが（図６ＡおよびＣ〜Ｅ）、Ｆａｓ−Ｌで誘導されたＡＳＣ増殖は影響を受けず、細胞収率は４日の処置期間で倍増した（６Ｂ）。そのような細胞増大の増加は、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋのみで処置された細胞では観察されなかった。この実験では、Ｆａｓ−Ｌのみの処置は、非処置細胞に比較して細胞収率の上昇を示さなかった（図６Ｂ）。７日間のメガＦａｓ−Ｌ処置は細胞収率の倍増を導いたため（表２）（平均１．９、ＳＤ０．２）、上記の事柄は、過去の実験（７〜１４日）に比較してこの実験での期間が短かった（４日）ためであり、Ｆａｓ−Ｌ誘導体の変更によるものではなかった。
【表２】
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【０１４１】
実施例７：ＰＩ３ＫおよびＭＡＰキナーゼＥＲＫ−１／２の阻害は、Ｆａｓ−Ｌに誘導されるＡＳＣ増殖を抑制するが、ＪＮＫの阻害は抑制しない
Ｆａｓ−Ｌに誘導されるＡＳＣ増殖を制御する細胞内経路を同定するために、過去にＦａｓ−Ｌにより活性化されることが示された様々なシグナル伝達経路［１６〜２０］を、独立して阻害した。これらは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ、ＥＲＫ−１／２およびＪＮＫシグナル伝達経路を含んだ。
【０１４２】
したがって、培養された継代２〜４代目のＡＳＣを、メガＦａｓ−Ｌ、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、ＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋ阻害剤）、ＡＺＤ６２４４（ＥＲＫ−１／２阻害剤）およびＳＰ６００１２５（ＪＮＫ阻害剤）の組み合わせで４日間処置した。
【０１４３】
阻害剤濃度を、基礎ＡＳＣ増殖を妨害しない最大用量に対して較正した（図７Ａ〜Ｃ）。４日後に、細胞をトリプシンによりプレートから取り出し、標準的セルカウンターを用いてカウントした。実験を、３名の独立した患者からの細胞を用いて３回繰り返した。Ｆａｓ−Ｌと、ＰＩ３Ｋ（図７Ａ）またはＥＲＫ−１／２（図７Ｂ）阻害剤のいずれかとの両方を含む培養での４日後に、Ｆａｓ−Ｌのみで処置された細胞に比較して、減少されたＡＳＣカウントが測定され（それぞれ図７Ａおよび７Ｂ）、阻害剤によるＦａｓ−Ｌの増殖促進的影響の阻害を示したが、アポトーシス促進的影響の阻害は示さなかった。これらの知見は、Ｆａｓ−Ｌ、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋおよびＰＩ３Ｋ（図８Ａ）またはＥＲＫ−１／２（図７Ｂ）のいずれかの阻害剤を含むＡＳＣの培養で確認され、それらは非処置対照と同等の細胞量を生じ、倍増された細胞収率が、Ｆａｓ−ＬおよびＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋでの処置後に実証された（図８ＡおよびＢ）。対照的に、Ｆａｓ−Ｌ刺激を伴うＪＮＫ阻害は、Ｆａｓ−Ｌ処置のみの後に得られたものと類似の細胞数を生じた（図７Ｃ）。同様に、Ｆａｓ−Ｌ、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋおよびＪＮＫ阻害剤の同時添加は、Ｆａｓ−ＬおよびＺ−ＶＡＤでの処置で得られたものの二倍数の集団をもたらした（図８Ｃ）。
【０１４４】
材料と方法
材料
組換えヒトスーパーＦａｓ−Ｌを、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ドイツ  レラハ所在）から得て、組換えヒトメガＦａｓ−Ｌを、ＡｄｉｐｏＧｅｎ（米国カリフォルニア州サンディエゴ所在）から得た。ｚＶＡＤ．ｆｍｋ（汎カスパーゼ阻害剤）、ＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋ阻害剤）およびＳＰ６００１２５（ＪＮＫ阻害剤）を、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ドイツ  ダルムシュタット所在）から得て、ＡＺＤ６２４４（ＥＲＫ−１／２阻害剤）は、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（米国ミシガン州所在）から得た。
【０１４５】
以下の抗体を、フローサイトメトリー染色に用いた：抗ヒトＣＤ９５  （ＡＰＯ−１／Ｆａｓ）ＡＰＣおよびＡＰＣマウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州サンディエゴ所在）、抗ヒトＣＤ３１ ＡＰＣおよびマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照ＡＰＣ、抗ヒトＣＤ３４ ＰＥおよびマウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照ＰＥ（ＰｅｐｒｏＴｈｅｃ Ｌｏｎｄｏｎ、英国）、抗ヒトＣＤ２９ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８マウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照、抗ヒトＣＤ１０５ ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５およびＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５マウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照、抗ヒト７３ ＰＥ／Ｃｙ７およびＰＥ／Ｃｙ７マウスＩｇＧ１ ｋアイソタイプ対照（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（カリフォルニア州サンディエゴ所在））、抗ヒトＣＤ４５ ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ＢＶ６５０およびＢＶ６５０マウスＩｇＧ１  ｋアイソタイプ対照  ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州サンホセ所在）。
【０１４６】
ヒト初代ＳＶＦ細胞単離
皮下脂肪組織試料を、形成外科手術を受けた患者から得た。全ての処置を、ヘルシンキ宣言を遵守して実施し、Ｔｅｌ Ａｖｉｖ Ｓｏｕｒａｓｋｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒの倫理委員会により認可した。記入されたインフォームドコンセントを、前もって全ての患者から得た。試料は全て、種々の副産物として収集された廃棄材料であった。患者の平均年齢は、４６．１±１１．７歳であり、平均ＢＭＩは、２９．３±４．８ｋｇ／ｍ２であった。
【０１４７】
ＳＶＦ細胞を、ヒトの皮下脂肪吸引物から、０．１％コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州セントルイス所在）を用いて単離し、遠心分離により脂肪から分離した（１５分、４００ｇ）。
【０１４８】
細胞培養
脂肪組織からのヒト初代ＳＶＦ細胞を、１０％仔牛血清（ＦＣＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨｙＣｌｏｎｅ、ニュージーランド  タウランガ所在）、６０μｇ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび非必須アミノ酸を補充された高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ、英国スコットランド  ペイズリー所在）中、未分化状態で１０％ＣＯ２および大気中酸素条件下で保持した。培地を、週に２回換えて、細胞を、それらがコンフルエントに達したら継代した。
【０１４９】
細胞増殖
ＳＶＦを、６ウェルプレートに播種し（１５０，０００細胞／ウェル）、通常の生育培地中または異なるＦａｓ−Ｌ濃度を補充された生育培地中で１４日間培養した。培地を、この１４日培養の間に４回更新した。
【０１５０】
成熟ＡＳＣ（Ｐ２〜Ｐ３  ＡＳＣ）を、６ｃｍプレートに播種し（９０，０００細胞／プレート）、２４時間接着および生育させた。その後、培地を新鮮な通常の生育培地または異なるＦａｓ−Ｌ濃度を補充された生育培地に換え、細胞をさらに７日間培養した。培地を、実験期間の間、２回更新した。
【０１５１】
成熟ＡＳＣ（Ｐ２〜Ｐ３  ＡＳＣ）の増殖に及ぼす阻害剤の影響をテストするために、細胞を、２４ウェルプレートに播種し（１０，０００細胞／ウェル）、２４時間接着および生育させた。その後、培地を、新鮮な通常の生育培地またはＦａｓ−Ｌを補充された、もしくはＦａｓ−Ｌと１種の阻害剤とを補充された生育培地に交換した、細胞をその後、４日間培養した。
【０１５２】
全ての処置で、二重測定のウェル／プレートを調製した。
【０１５３】
インキュベーション期間の終了時に、接着細胞をトリプシン処理し、収集し、ＴＣ１０ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）でカウントした。
【０１５４】
フローサイトメトリー
表面マーカ分析
表面マーカ分析のために、細胞を収集し、抗ＣＤ３１、抗ＣＤ３４、抗ＣＤ２９、抗ＣＤ１０５、抗ヒト７３および抗ＣＤ４５抗体を含有する７色パネルと共にインキュベートした（暗所で１時間）。死細胞を除外するために、試料を、製造業者のプロトコルに従いＶｉＶｉＤ（ｖｉｏｌｅｔ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国オレゴン州ユージーン所在）で染色した。ＣＤ９５染色を、抗ＣＤ９５抗体およびＶｉＶｉＤを含有する２色パネルを用いて実施した。全ての抗体を、製造業者により推奨された希釈率で使用した。適当な単一染色対照およびアイソタイプ対照を調製し分析した。
【０１５５】
細胞周期分析
細胞を収集し、７０％エタノール／ＰＢＳで固定し、ＲＮａｓｅＡ  ０．４ｍｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）で処置し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）０．１ｍｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）で染色した。
【０１５６】
アネキシン／ＰＩ分析
細胞を、専用のキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いてアネキシン−ＡＰＣ／ＰＩで染色した。
【０１５７】
全ての標識された細胞を、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメトータ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国カリフォルニア州サンホセ所在）を用いて分析した。少なくとも１０．０００イベントを記録した。データ解析を、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、米国オレゴン州アシュランド所在）を用いて実施した。
【０１５８】
分化
脂肪細胞分化
コンフルエント細胞を、１０μｇ／ｍｌインスリン、１×１０−６Ｍデキサメタゾン、０．５ｍＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）および５０μＭインドメタシン（全てＳｉｇｍａから）を含有する脂肪生成培地中で培養した。誘導培地を、３〜４日ごとに入れ替えた。２１日後に、細胞を４％ホルマリンで固定し（室温（ＲＴ）で２０分）、０．５％オイルレッド（Ｓｉｇｍａ）で染色した（ＲＴで１０分）。染色後に、細胞を、ＤＰ７３カメラを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、日本  東京所在）で撮影した。オイルレッドＯをその後、イソプロパノール中の４％ ＩＧＥＰＡＬ（Ｓｉｇｍａ）で抽出し、その後、ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、スイス  メンネドルフ所在）を用いて５２０ｎｍで定量した。
【０１５９】
骨芽細胞分化
コンフルエント細胞を、ＳｔｅｍＰｒｏ骨生成分化培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。誘導培地を、３〜４日ごとに入れ替えた。２１日後に、細胞を４％ホルマリンで固定し（ＲＴで２０分）、ｐＨ４．２の２％アリザリンレッド（Ｓｉｇｍａ）で染色した（ＲＴで１０分）。写真を、ＤＰ７３カメラを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１顕微鏡で撮影した。アリザリンレッドを、抽出溶液（０．５Ｎ  ＨＣｌ／５％ＳＤＳ）で抽出し、ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、スイス  メンネドルフ所在）を用いて４１５ｎｍで定量した。
【０１６０】
ＣＦＵ−Ｆアッセイ
ＳＶＦ細胞（２，０００個）を、６ｃｍ皿に播種して、通常の培養条件下でまたは５０ｎｇ／ｍｌのＦａｓ−Ｌを補充された培地中で２１日間培養した。コロニーをその後、メタノールで固定し、ギムザ染色し（Ｓｉｇｍａ）、カウントしてＣＦＵ−Ｆ形成を評価した。コロニーおよび大きなコロニー（＞１００細胞）の総数を定量し（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１顕微鏡を用いて）、Ｆａｓ−Ｌ処置細胞と非処置細胞で比較した。これらの実験を、三重測定で実施した。
【０１６１】
統計学的評価
統計解析を、Ｍｉｎｉｔａｂ １８ソフトウエア（Ｍｉｎｉｔａｂ Ｉｎｃ.、ペンシルバニア州所在）を用いて実施した。データを、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に、および次にダネット（対照群との比較の場合）またはテューキー多重比較検定に供した。一変量データを、対応のあるｔ検定を用いて解析した。ｐ≦０．０５を、統計学的に有意と見なした。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【国際調査報告】
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