(57)【要約】  本明細書で開示されているのは、細胞支持構造全体にわたって自己持続型のガス勾配及び非ガス勾配を生成することと、低酸素状態下で１つ以上の細胞又は組織を培養することと、を行う為のデバイス、装置、及び方法である。細胞支持構造全体にわたって１つ以上のガス勾配を生成する方法は、ガス透過性膜である底壁を有する管腔容器を用意するステップと、底壁の上に細胞支持構造を配置するステップと、細胞支持構造上に１つ以上の細胞又は組織を配置するステップと、底壁から細胞支持構造全体にわたって、且つ管腔リザーバ内にかけて１つ以上のガス勾配を生成するステップと、を含む。細胞培養の為の低酸素状態を生成する装置は、底壁を有する管腔容器と、底壁上の細胞支持構造と、管腔リザーバ内に低酸素状態を生成することが可能なように上部開口部を封止可能に閉じるカバーと、を含む。
2021521836.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞支持構造全体にわたって１つ以上のガス勾配を生成する方法であって、
管腔容器を用意するステップであって、前記管腔容器は、底壁と、前記底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、前記少なくとも１つの側壁によって画定される上部開口部と、を含み、前記管腔容器の前記底壁はガス透過性膜を含む、前記用意するステップと、
前記底壁の上に細胞支持構造を配置するステップと、
前記細胞支持構造上に１つ以上の細胞及び／又は組織を配置するステップと、
前記管腔容器の上にカバーを取り付けて前記上部開口部を閉じるステップであって、前記カバーの底面と、前記細胞支持構造及び／又は前記１つ以上の細胞及び／又は組織との間で管腔リザーバが画定される、前記取り付けるステップと、
前記底壁から前記細胞支持構造全体にわたって、且つ前記管腔リザーバ内にかけて１つ以上のガス勾配を生成するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記管腔容器の前記底壁はガス透過性膜を含み、
前記管腔容器の前記底壁の前記ガス透過性膜を通して前記１つ以上の細胞及び／又は組織にガスを供給するステップと、
前記管腔容器の前記底壁の前記ガス透過性膜から前記１つ以上の細胞及び／又は組織を通って前記管腔リザーバ内に至る、１つ以上のガス勾配を生成するステップと、
を更に含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
基礎容器を用意するステップであって、前記基礎容器は、底壁と、前記底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、を含み、前記底壁及び前記少なくとも１つの側壁はウェルを画定する、前記用意するステップを更に含み、
前記管腔容器は、前記基礎容器の前記ウェル内に保持されており、
前記基礎容器の前記底壁は、前記管腔容器の前記底壁から間隔を置かれており、
基礎リザーバが、前記基礎容器の前記底壁と前記管腔容器の前記底壁との間で、且つ／又は、前記基礎容器の前記少なくとも１つの側壁と前記管腔容器の前記少なくとも１つの側壁との間で画定されており、
前記基礎リザーバ内に基礎培地が配置されており、前記基礎培地は、前記底壁の前記ガス透過性膜を通して前記１つ以上の細胞及び／又は組織に前記ガスを供給し、これによって、前記基礎培地と前記管腔リザーバとの間に１つ以上のガス勾配を生成する、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記カバーは、前記カバーの上面又は側面を貫通して延びる少なくとも１つのポート又はチャネルを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記カバーの前記少なくとも１つのポート又はチャネルに少なくとも１つのセンサ及び／又は配管を挿入するステップを更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記管腔容器、前記管腔リザーバ、前記基礎リザーバ、及び／又は前記基礎容器においてガスを供給するかガスを消費するステップを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのポート又はチャネルを通して前記管腔リザーバ又は前記基礎リザーバに少なくとも１つのガスを供給することによって、前記細胞支持構造全体にわたって１つ以上のガス勾配を生成するステップを更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つのガスは酸素であり、前記管腔リザーバ内の酸素濃度は約２１％未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞支持構造全体にわたって非ガス化学物質の勾配を生成するステップを更に含み、前記細胞支持構造上に配置された１つ以上の細胞及び／又は組織が前記非ガス化学物質を生成及び／又は消費することによって、前記細胞支持構造全体にわたって前記勾配を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ以上のガス勾配は、約３０分から約６時間の範囲で安定しており、前記１つ以上のガス勾配は自己持続型である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つ以上の細胞は初代哺乳類細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の細胞及び／又は組織は、３次元培養フォーマットのインビトロ培養物、エクスビボ培養物、有機体全体、器官全体、器官の一部、及び／又はエクスビボ組織切片にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
インビトロ及び／又はエクスビボ細胞培養の為の低酸素状態を生成する装置であって、
底壁と、前記底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、前記少なくとも１つの側壁によって画定される上部開口部と、を含む管腔容器と、
前記底壁の上の細胞支持構造と、
前記管腔容器と係合して、取付位置において前記上部開口部を封止可能に閉じるように構成されたカバーであって、前記カバーが前記取付位置にあるときに前記カバーの底面と前記細胞支持構造との間で管腔リザーバが画定され、前記装置は、前記カバーが前記取付位置にあるときに前記管腔リザーバ内に低酸素状態を生成するように構成されている、前記カバーと、
を含む装置。
【請求項１４】
前記細胞支持構造は、細胞外マトリックスタンパク質の層、又は細胞外マトリックスを含む足場を含む、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記カバーの上面から前記カバーの前記底面まで延びる少なくとも１つのチャネルと、
前記少なくとも１つのチャネルを通って前記管腔リザーバ内まで延びて、そこの酸素飽和度を測定するように構成されたセンサと、
を更に含む、請求項１３に記載の装置。
【請求項１６】
前記カバーが前記取付位置にあるときに前記カバーと前記管腔容器との間に配置される環状ガスケットを更に含む、請求項１３に記載の装置。
【請求項１７】
前記管腔容器及び前記カバーの少なくとも一方が、前記管腔容器と前記カバーとをロック係合させるように構成されたロック機構を含む、請求項１３に記載の装置。
【請求項１８】
底壁と、前記底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、を含む基礎容器であって、前記底壁及び前記少なくとも１つの側壁はウェルを画定する、前記基礎容器機を更に含み、
前記管腔容器は、前記基礎容器の前記ウェル内に保持されており、
前記基礎容器の前記底壁は、前記管腔容器の前記底壁から間隔を置かれており、
基礎リザーバが、前記基礎容器の前記底壁と前記管腔容器の前記底壁との間で、且つ／又は前記基礎容器の前記少なくとも１つの側壁と前記管腔容器の前記少なくとも１つの側壁との間で画定される、
請求項１に記載の装置。
【請求項１９】
前記管腔容器の前記底壁は多孔質膜を含むか、前記管腔容器の前記底壁は酸素透過性膜を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項２０】
インビトロ及び／又はエクスビボ細胞培養の為の低酸素状態を生成する装置であって、
底壁と、前記底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、前記少なくとも１つの側壁によって画定される上部開口部と、を含む管腔容器と、
前記底壁上の細胞支持構造であって、細胞外マトリックスタンパク質の層、又は細胞外マトリックスを含む足場を含む前記細胞支持構造と、
前記管腔容器と係合して、取付位置において前記上部開口部を封止可能に閉じるように構成されたカバーであって、前記カバーが前記取付位置にあるときに前記カバーの底面と前記細胞支持構造との間で管腔リザーバが画定され、前記装置は、前記カバーが前記取付位置にあるときに前記管腔リザーバ内に低酸素状態を生成するように構成されている、前記カバーと、
底壁と、前記底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、を含む基礎容器であって、前記底壁及び前記少なくとも１つの側壁はウェルを画定し、
前記管腔容器は、前記基礎容器の前記ウェル内に保持されており、
前記基礎容器の前記底壁は、前記管腔容器の前記底壁から間隔を置かれており、
基礎リザーバが、前記基礎容器の前記底壁と前記管腔容器の前記底壁との間で、且つ／又は前記基礎容器の前記少なくとも１つの側壁と前記管腔容器の前記少なくとも１つの側壁との間で画定される、
前記基礎容器と、
を含み、
前記装置は、前記カバーが前記取付位置にあるときに、前記管腔容器内の前記支持構造上のインビトロ及び／又はエクスビボ細胞培養に対して低酸素状態を生成するように構成されており、低酸素状態が、前記管腔リザーバ内の酸素濃度が約２１％未満の状態として規定されている、
装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により完全な形で本明細書に組み込まれている、２０１８年５月１５日に出願された米国特許仮出願第６２／６７１，６６１号の利益を主張するものである。
【０００２】
連邦支援の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された認可番号ＤＫ１０９５５９の下に、政府支援を受けてなされたものである。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
本明細書に開示の対象は、全般的には、インビトロ細胞培養の為の自己持続型の低酸素状態並びにガス化学勾配及び非ガス化学勾配を生成することに関する。より具体的には、本明細書では、インビトロ細胞培養の為の自己持続型のガス化学勾配及び非ガス化学勾配を生成する装置及び方法を開示する。
【背景技術】
【０００４】
インビトロ培養システム（例えば、腸オルガノイド培養、腸の自己複製単層、ガットオンチップ型デバイス等）の開発により、インビボ動物モデルの使用より有利である有用なインビトロプラットフォームが提供される。しかしながら、現時点で利用可能なインビトロプラットフォームは、関心対象系の自然環境においてみられる特定のガス分布又はガス勾配を複製できておらず、或いは、外部ガス混合物の適用を必要とする。
本開示は、関心対象のインビボ生態系（例えば、インビボ腸系）をより正確に再現するガス化学勾配及び非ガス化学勾配をインビトロ細胞培養において生成する装置及び方法を提供することにより、当該技術分野におけるこれまでの弱点を克服する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記従来の技術における課題を解決するためになされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本概要では、本開示対象の幾つかの実施形態を列挙し、多くの場合、これらの実施形態の変形形態及び置換形態を列挙する。本概要は、多様な実施形態の例示に過ぎない。所与の実施形態の１つ以上の代表的な特徴の言及も同様に例示である。そのような実施形態は、典型的には、言及された特徴があってもなくても存在してよく、同様に、そのような特徴は、本概要で列挙されているかどうかにかかわらず、本開示対象の他の実施形態に適用されてよい。過剰な繰り返しを避ける為に、本概要は、そのような特徴のあらゆる可能な組み合わせを列挙又は示唆するものではない。
【０００７】
幾つかの実施形態では、本明細書では、細胞支持構造全体にわたってガス勾配を生成する方法を提供する。そのような方法は、幾つかの実施形態では、管腔容器を用意するステップであって、管腔容器は、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、少なくとも１つの側壁によって画定される上部開口部と、を含み、管腔容器の底壁はガス透過性膜を含む、上記用意するステップと、底壁の上に細胞支持構造を配置するステップと、細胞支持構造上に１つ以上の細胞及び／又は組織を配置するステップと、管腔容器の上にカバーを取り付けて上部開口部を閉じるステップであって、カバーの底面と、細胞支持構造及び／又は１つ以上の細胞及び／又は組織との間で管腔リザーバが画定される、上記取り付けるステップと、底壁から細胞支持構造全体にわたって、且つ管腔リザーバ内にかけて（高から低、及び／又は低から高の）ガス勾配を生成するステップと、を含んでよい。
【０００８】
代替又は追加として、幾つかの実施形態では、低酸素状態下で１つ以上の細胞及び／又は組織を培養する方法を提供する。そのような方法は、管腔容器を用意するステップであって、管腔容器は、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、少なくとも１つの側壁によって画定される上部開口部と、を含む、上記用意するステップと、底壁の上に細胞支持構造を配置するステップと、細胞支持構造上に１つ以上の細胞及び／又は組織を配置するステップと、管腔容器の上にカバーを取り付けて上部開口部を閉じるステップであって、カバーの底面と、細胞支持構造及び／又は１つ以上の細胞との間で管腔リザーバが画定される、上記取り付けるステップと、管腔リザーバ内に低酸素状態を生成するステップであって、低酸素状態は、カバーが取付位置にあるときに管腔容器内の細胞支持構造上の１つ以上の細胞及び／又は組織によって生成される、上記生成するステップと、を含んでよい。
【０００９】
上述の方法を含む、本明細書に開示の方法のいずれにおいても、管腔容器の底壁はガス不透過性膜を含んでよい。管腔容器の底壁は、ガス透過性膜を含んでもよい。
【００１０】
幾つかの実施形態では、そのような方法は更に、底壁から１つ以上の細胞及び／又は組織を通り（例えば、細胞支持構造全体にわたって）管腔リザーバ内にかけて（高から低、又は低から高の）ガス勾配を生成するステップを含んでよい。更に、幾つかの態様では、そのような方法は更に、管腔容器の底壁のガス透過性膜を通して１つ以上の細胞及び／又は組織にガスを供給するステップと、管腔容器の底壁のガス透過性膜から１つ以上の細胞及び／又は組織を通って（例えば、細胞支持構造全体にわたって）管腔リザーバ内にかけて（高から低の）ガス勾配を生成するステップと、を含んでよい。ガスは、（管腔容器が維持（保持）されている）雰囲気から透過性膜を通ってパッシブに供給されてよい。
【００１１】
上述の方法を含む、本明細書に開示の方法のいずれにおいても、本方法は更に、基礎容器を用意するステップを含んでよく、基礎容器は、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、を含み、底壁及び少なくとも１つの側壁はウェルを画定し、管腔容器は、基礎容器のウェル内に保持されており、基礎容器の底壁は、管腔容器の底壁から間隔を置かれており、基礎リザーバが、基礎容器の底壁と管腔容器の底壁との間で、且つ／又は、基礎容器の少なくとも１つの側壁と管腔容器の少なくとも１つの側壁との間で画定されており、基礎リザーバ内に基礎培地が配置されており、基礎培地は、底壁のガス透過性膜を通して１つ以上の細胞及び／又は組織にガスを供給し、これによって、基礎培地と管腔リザーバとの間に（１つ以上の細胞及び／又は組織を通って垂直に）ガス勾配（高から低）を生成する。
【００１２】
幾つかの実施形態では、これらの方法における管腔容器は、第２のガス透過性膜によって少なくとも２つの区画に分割されてよく、それらの少なくとも２つの区画の間にガス勾配が生成されてよい。幾つかの態様では、管腔容器は、第１の管腔容器及び第２の管腔容器を含む少なくとも２つの管腔容器を含んでよく、第１の管腔容器は、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、少なくとも１つの側壁によって画定される上部開口部と、を含み、第１の管腔容器の底壁はガス透過性膜を含み、第２の管腔容器は、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、少なくとも１つの側壁によって画定される上部開口部と、を含み、第２の管腔容器の底壁はガス透過性膜を含み、第１の管腔容器は第２の管腔容器内に保持され、これら少なくとも２つの管腔容器の間にガス勾配が生成される。
【００１３】
上述の方法を含む、本明細書に開示の方法のいずれにおいても、カバーは、管腔容器のカバーの上面又は側面からカバーの底面に延びる少なくとも１つのポート又はチャネル（例えば、およそ１、２、３、４、５、又はそれ以上）を含んでよい。代替又は追加として、管腔容器は、側壁又は底壁に少なくとも１つのポート又はチャネル（例えば、およそ１、２、３、４、５、又はそれ以上）を含んでよい。代替又は追加として、基礎容器は、側壁又は底壁に少なくとも１つのポート又はチャネル（例えば、およそ１、２、３、４、５、又はそれ以上）を含んでよい。
【００１４】
上述の方法を含む、本明細書に開示の方法のいずれにおいても、そのような方法は更に、少なくとも１つのポート又はチャネルを通して、管腔リザーバに物質を導入するステップ、又は管腔リザーバから物質を抽出するステップを含んでよい。同様に、そのような方法は更に、少なくとも１つのポート又はチャネルを通して、基礎リザーバに物質を導入するステップ、又は管腔リザーバから物質を除去するステップを含んでよい。
【００１５】
上述の方法を含む、本明細書に開示の方法のいずれにおいても、そのような方法は更に、カバー及び／又は基礎容器の少なくとも１つのポート又はチャネルに少なくとも１つのセンサ及び／又は配管を挿入するステップを含んでよい。幾つかの態様では、少なくとも１つのセンサは、ガスセンサ、ｐＨセンサ、圧力センサ、流量センサ、温度センサ、及び／又は化学的／生物学的センサであってよい。本方法は更に、少なくとも１つのポート又はチャネルを封止するステップを含んでよい。
【００１６】
上述の方法を含む、本明細書に開示の方法のいずれにおいても、そのような方法は更に、管腔容器、管腔リザーバ、基礎リザーバ、及び／又は基礎容器においてガスを供給するかガスを消費するステップを含んでよい。管腔培地及び／又は基礎培地は溶存ガスを含んでよい。幾つかの態様では、基礎培地は酸素生成材料を含んでよい。
【００１７】
上述の方法を含む、本明細書に開示の方法のいずれにおいても、そのような方法は更に、少なくとも１つのポート又はチャネルを通して管腔リザーバに少なくとも１つのガスを供給することによって、細胞支持構造全体にわたってガス勾配を生成するステップを含んでよい。同様に、そのような方法は、幾つかの態様では、基礎容器の少なくとも１つのポート又はチャネルを通して少なくとも１つのガスを基礎リザーバに供給することによって、細胞支持構造全体にわたってガス勾配を生成するステップを含んでよい。少なくとも１つのガスは、酸素、窒素、水素、メタン、二酸化炭素、一酸化炭素、硫化物、スカトール、インドール、メタンチオール、硫化ジメチル、揮発性アミン、揮発性硫黄化合物（ＶＳＣ）（例えば、一酸化二硫黄、硫化水素）、メチルメルカプタン又はメタンチオール、ジメチル二硫化物（ＤＭＤＳ）、ジメチル三硫化物（ＤＭＴＳ）、揮発性脂肪酸、及び／又は一酸化窒素であってよい。幾つかの態様では、少なくとも１つのガスは酸素である。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのガスは酸素であり、管腔リザーバ内の酸素濃度は約２１％未満である、幾つかの実施形態では、少なくとも１つのガスは酸素であり、管腔リザーバ内の酸素濃度は約０％から約１４％、任意選択で約０％から約５％である。幾つかの態様では、少なくとも１つのガスは酸素であり、管腔リザーバ内の安定的低酸素状態によって、管腔リザーバと基礎リザーバとの間に酸素勾配が生成される。
【００１８】
幾つかの実施形態では、少なくとも１つのガスは、ガスを生成するかガスを消費する細胞、組織、又は有機体によって供給又は消費される。幾つかの実施形態では、ガスを生成するかガスを消費する細胞、組織、又は有機体は、細胞支持構造上に配置される１つ以上の細胞又は組織と同じである。幾つかの実施形態では、ガスを生成するかガスを消費する細胞、組織、又は有機体は、細菌、古細菌（アーキア）、菌類、ウイルス、蠕虫、アメーバ、原虫である。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの、ガスを生成する細胞、組織、又は有機体は、基礎培地内に存在し、底壁のガス透過性膜を通して１つ以上の細胞及び／又は組織にガスを供給し、これによって、基礎培地と管腔リザーバとの間の細胞支持構造全体にわたって勾配を生成する。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの、ガスを生成する細胞、組織、又は有機体は、管腔リザーバ内に配置された管腔培地にあって細胞と直接接触することによって、１つ以上の細胞及び／又は組織にガスを直接供給し、管腔培地と基礎リザーバとの間の細胞支持構造全体にわたって勾配を生成する。
【００１９】
上述の方法を含む、本明細書に開示の方法のいずれにおいても、そのような方法は更に、細胞支持構造全体にわたって非ガス化学物質の勾配を生成するステップを含んでよい。幾つかの態様では、細胞支持構造上に配置された１つ以上の細胞及び／又は組織は、非ガス化学物質を生成及び／又は消費することによって、細胞支持構造全体にわたって勾配を生成する。幾つかの実施形態では、非ガス化学物質を生成する細胞、組織、又は有機体が基礎培地又は管腔培地に導入されて、細胞支持構造全体にわたって（１つ以上の細胞及び／又は組織を通って垂直に）勾配が生成される。幾つかの実施形態では、導入される、非ガス化学物質を生成する細胞、組織、又は有機体は、細胞支持構造上に配置される１つ以上の細胞又は組織と同じである。幾つかの実施形態では、導入される、非ガス化学物質を生成する細胞、組織、又は有機体は、細菌、古細菌（アーキア）、菌類、ウイルス、蠕虫、アメーバ、原虫である。幾つかの実施形態では、非ガス化学物質が基礎培地又は管腔培地に導入され、これによって、管腔培地から基礎培地にかけて、又は基礎培地から管腔培地にかけて、細胞支持構造全体にわたって（１つ以上の細胞及び／又は組織を通って垂直に）非ガス化学物質の勾配が生成される。ガス透過性膜は、非ガス化学物質に対して透過性である。非ガス化学物質は、タンパク質、脂肪酸、増殖因子、ホルモン、代謝産物、イオン、炭水化物、ペプチド、リポペプチド、アミノ酸、及び／又は試験薬であってよい。
【００２０】
上述の方法を含む、本明細書に開示の方法のいずれにおいても、ガス勾配は、約３０分から約６時間の範囲で安定している。幾つかの態様では、ガス勾配は自己持続型である。
【００２１】
上述の方法を含む、本明細書に開示の方法のいずれにおいても、そのような方法は更に、基礎培地を攪拌することによって勾配を調節するステップを含んでよい。幾つかの実施形態では、そのような方法は更に、細胞支持構造上に配置される細胞又は組織の選択により、勾配を調節するステップを含む。幾つかの実施形態では、そのような方法は更に、管腔リザーバの体積、基礎リザーバの体積、細胞支持構造のガス透過性、管腔容器の側壁のガス透過性、管腔容器の底壁のガス透過性、及び／又はカバーのガス透過性を修正することによってガス勾配を調節するステップを含む。幾つかの実施形態では、そのような方法は更に、基礎培地の体積、基礎容器の側壁のガス透過性、及び／又は基礎容器の底壁のガス透過性を修正することによってガス勾配を調節するステップを含む。幾つかの実施形態では、そのような方法は更に、管腔培地の体積を修正することによってガス勾配を調節するステップを含む。幾つかの実施形態では、管腔容器の側壁、管腔容器の底壁、カバー、基礎容器の側壁、及び／又は基礎容器の底壁のガス透過性は、ガス透過性及び厚さに基づいて構築材料を選択することによって調節される。
【００２２】
上述の方法を含む、本明細書に開示の方法のいずれにおいても、１つ以上の細胞は、１つ以上の細胞型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上）を含む。１つ以上の細胞は、真核細胞株であってよい。幾つかの態様では、１つ以上の細胞は、初代細胞であってよい。幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞は、哺乳類細胞であってよい。１つ以上の細胞は、ヒト細胞であってよい。幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞は、線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞、含脂肪細胞、筋細胞、骨細胞、神経細胞、免疫細胞、幹細胞（例えば、胚誘導多能性幹細胞、間充織幹細胞、造血幹細胞）、消化管細胞、生殖器官細胞、眼細胞、腎細胞、脳細胞、骨髄細胞、腸細胞、上皮細胞、及び／又はがん細胞であってよい。１つ以上の細胞は、胃腸細胞であってよい。１つ以上の細胞は、初代結腸上皮細胞であってよい。初代結腸上皮細胞はヒトのものであってよい。
【００２３】
上述の方法を含む、本明細書に開示の方法のいずれにおいても、１つ以上の細胞は、２次元形態又は３次元形態であってよい。幾つかの態様では、１つ以上の細胞及び／又は組織は、３次元培養フォーマットのインビトロ培養物、エクスビボ培養物、有機体全体、器官全体、器官の一部、及び／又はエクスビボ組織切片にあってよい。インビトロ培養物又はエクスビボ培養物は、天然又は人工のヒドロゲルに埋め込まれてよい。幾つかの態様では、１つ以上の組織は、１つ以上の組織型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上）であってよい。１つ以上の組織は、有機体全体、器官全体、器官の一部、インビトロ培養物、エクスビボ培養物、及び／又はエクスビボ組織切片であってよい。１つ以上の細胞及び／又は組織は、インビトロ結腸上皮陰窩であってよく、陰窩は、細胞支持構造の上方に管腔側及び基底側を含む。インビトロ結腸上皮陰窩は、ヒトインビトロ結腸上皮陰窩であってよい。
【００２４】
上述の方法を含む、本明細書に開示の方法のいずれにおいても、そのような方法は更に、管腔リザーバに少なくとも１つの微生物を加えることによって、陰窩の管腔側、及び／又は陰窩の細胞支持側への微生物アクセスを可能にするステップを含んでよい。
【００２５】
又、本明細書では、インビトロ及び／又はエクスビボ細胞培養の為の低酸素状態を生成する装置を提供する。そのような装置は、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、少なくとも１つの側壁によって画定される上部開口部と、を含む管腔容器と、底壁上の細胞支持構造と、管腔容器と係合して、取付位置において上部開口部を閉じるように構成されたカバーと、を含んでよく、カバーが取付位置にあるときにカバーの底面と細胞支持構造との間で管腔リザーバが画定され、本装置は、カバーが取付位置にあるときに管腔リザーバ内に低酸素状態を生成するように構成されている。幾つかの実施形態では、細胞支持構造上に１つ以上の細胞及び／又は組織が配置されてよい。幾つかの態様では、低酸素状態は自己持続型である。
【００２６】
幾つかの実施形態では、カバーはプラグを含んでよく、プラグは、上部開口部を通って受けられ、取付位置において管腔容器と係合する。少なくとも１つの側壁の内面、及びプラグの外面は、それぞれねじ山を含んでよく、プラグは、取付位置において管腔容器とねじ係合されてよい。
【００２７】
幾つかの実施形態では、上述の装置及び／又はデバイスを含む、本明細書に開示のいずれの装置及び／又はデバイスも、プラグの上面からプラグの底面まで延びるチャネルと、そのチャネルを通って管腔リザーバ内まで延びて、そこの酸素飽和度を測定するように構成されたセンサと、を更に含んでよい。幾つかの態様では、センサは、ガスセンサ、ｐＨセンサ、又は化学的センサであってよい。幾つかの態様では、センサは、酸素センサ、窒素センサ、水素センサ、メタンセンサ、二酸化炭素センサ、一酸化炭素センサ、硫化物センサ、スカトールセンサ、インドールセンサ、メタンチオールセンサ、硫化ジメチルセンサ、揮発性アミンセンサ、揮発性硫黄化合物（ＶＳＣ）、メチルメルカプタン、又はメタンチオールのセンサ、ジメチルジスルフィド（ＤＭＤＳ）センサ、ジメチルトリスルフィド（ＤＭＴＳ）センサ、揮発性脂肪酸センサ、及び／又は酸化窒素センサであってよい。
【００２８】
幾つかの実施形態では、チャネルは、プラグの上面においてセンサの周囲で封止されてよい。幾つかの実施形態では、装置は、チャネルの長さの少なくとも一部に沿って延びる環状ガスケットを含んでよく、このガスケットは、ガスケットを貫通するセンサを受けてチャネルを封止するように構成されている。幾つかの実施形態では、チャネルは第１のチャネルであり、少なくとも１つの第２のチャネルがプラグの上面からプラグの底面まで延びる。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの第２のチャネルは、試験薬を追加すること、及び／又は管腔リザーバ内の培地を交換することに使用される。幾つかの態様では、少なくとも１つの第２のチャネルは、そこを通るセンサを受けるように構成されている。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの第２のチャネルは、そこを通るｐＨセンサ及び／又は化学的センサを受けるように構成されている。幾つかの態様では、そのような装置は更に、少なくとも１つの第２のチャネルの長さの少なくとも一部に沿って延びる少なくとも１つの環状ガスケットを含んでよく、少なくとも１つの環状ガスケットは、そのガスケットを通り抜けるセンサを受けて、少なくとも１つの第２のチャネルを封止するように構成されている。幾つかの態様では、少なくとも１つの第２のチャネルは封止可能である。
【００２９】
幾つかの実施形態では、プラグはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含む。幾つかの実施形態では、プラグは、直径が、管腔リザーバの内径と同じである。幾つかの実施形態では、本開示の装置は更に、プラグが取付位置にあるときにプラグと管腔容器との間に配置される環状ガスケット（例えば、Ｏリング）を含んでよい。幾つかの実施形態では、本開示の装置において、管腔容器の少なくとも１つの側壁にシートが画定されていて、ガスケットはそのシートに載る。幾つかの態様では、ガスケットは、管腔容器の少なくとも１つの側壁の上部部分に載る。
【００３０】
幾つかの実施形態では、上述の装置を含む、本明細書に開示の装置は、管腔容器及びプラグの少なくとも一方が、管腔容器とプラグとをロック係合させるように構成されたロック機構を含むように、構成されている。プラグはロックフィンを含んでよく、管腔容器の少なくとも１つの側壁は、プラグが取付位置にあるときにロックフィンを受けるように構成された凹部を含んでよい。
【００３１】
幾つかの実施形態では、上述の装置を含む、本明細書に開示の装置は更に、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、を含む基礎容器を含み、底壁及び少なくとも１つの側壁はウェルを画定し、管腔容器は、基礎容器のウェル内に保持されており、基礎容器の底壁は、管腔容器の底壁から間隔を置かれており、基礎リザーバが、基礎容器の底壁と管腔容器の底壁との間で、且つ／又は、基礎容器の少なくとも１つの側壁と管腔容器の少なくとも１つの側壁との間で画定されている。そのような装置は更に、１つ以上の細胞及び／又は組織に酸素を供給するように構成された基礎培地を基礎リザーバ内に含んでよい。そのような装置は更に、基礎培地を攪拌するように構成された攪拌装置（例えば、磁気式撹拌棒）を基礎リザーバ内に含んでよい。幾つかの態様では、管腔容器の底壁は多孔質膜を含んでよい。管腔容器の底壁は、酸素透過性膜を含んでよい。
【００３２】
幾つかの態様では、基礎容器は、複数のウェル又は共用ウェルを含んでよく、本装置は複数の管腔容器を含んでよく、各管腔容器は、基礎ウェル又は基礎共用ウェルのいずれかで保持されてよい。管腔容器は第１の管腔容器であってよく、基礎容器は第１の基礎容器であってよく、カバーは第１のカバーであってよく、管腔リザーバは第１の管腔リザーバであってよく、基礎リザーバは第１の基礎リザーバであってよく、本装置は更に、第２のカバーが取付位置にあるときに第２の管腔リザーバを画定する第２の管腔容器及び第２のカバーと、第２の管腔容器をその中で受けて第２の基礎リザーバを画定する第２の基礎容器と、を含んでよく、第１の組織及び／又は１つ以上の細胞が第１の基礎リザーバ内で受けられ、第２の組織及び／又は１つ以上の細胞が第２の基礎リザーバ内で受けられ、第１及び第２の管腔リザーバが互いに流体接続されており、第１及び第２の基礎リザーバが互いに流体接続されている。同様に、幾つかの態様では、そのような装置は更に、第３のカバーが取付位置にあるときに第３の管腔リザーバを画定する第３の管腔容器及び第３のカバーを含んでよく、本装置は更に、第３の管腔容器をその中で受けて第３の基礎リザーバを画定する第３の基礎容器を含んでよく、第３の組織及び／又は１つ以上の細胞が第３の基礎リザーバ内で受けられてよく、第１、第２、及び第３の管腔リザーバが互いに流体接続されてよく、第１、第２、及び第３の基礎リザーバが互いに流体接続されてよい。
【００３３】
幾つかの実施形態では、上述の装置を含む、本明細書に開示の装置は、管腔容器の底壁が酸素不透過性又は酸素低透過性の部材を含むように構成されている。幾つかの態様では、カバーは蓋を含んでよく、蓋は、上壁と、上壁から下方に延びる少なくとも１つの側壁と、を含み、この側壁は、取付位置において管腔容器の少なくとも１つの側壁と係合する。幾つかの態様では、管腔容器の少なくとも１つの側壁の外面、及び蓋の少なくとも１つの側壁の内面は、それぞれねじ山を含み、蓋は、取付位置において管腔容器とねじ係合される。幾つかの態様では、管腔容器の底壁は酸素透過性材料を含んでよい。
【００３４】
幾つかの実施形態では、上述の装置を含む、本明細書に開示の装置は、細胞支持構造が、細胞外マトリックスタンパク質（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ）及び／又は合成ポリマー（例えば、ポリエルリジン）の層、又は細胞外マトリックスを含む足場（例えば、コラーゲン足場）を支持するように、構成されている。細胞支持構造は、２次元又は３次元のマイクロパターン又はマイクロ構造を含んでよい。
【００３５】
又、本明細書では、低酸素状態下で生体細胞及び／又は組織構成物を作成する方法を提供する。そのような方法は、上述の装置を含む、本明細書に開示の装置を使用及び／又は用意するステップと、細胞支持構造上に配置された１つ以上の細胞及び／又は組織を培養することによって、低酸素状態下で細胞を増殖させる、その低酸素状態を生成するステップと、を含んでよく、低酸素状態は、カバーが取付位置にあるときに、管腔容器内の細胞支持構造上の１つ以上の細胞及び／又は組織によって生成される。
【００３６】
又、本明細書では、低酸素状態下で１つ以上の細胞及び／又は組織を培養する方法を提供する。そのような方法は、上述の装置を含む、本明細書に開示の装置を使用及び／又は用意するステップと、細胞支持構造上に配置された１つ以上の細胞及び／又は組織を培養することによって、低酸素状態下で細胞を増殖させる、その低酸素状態を生成するステップと、を含んでよく、低酸素状態は、カバーが取付位置にあるときに、管腔容器内の細胞支持構造上の１つ以上の細胞及び／又は組織によって生成される。
【００３７】
又、本明細書では、細胞支持構造全体にわたってガス勾配を生成する方法を提供する。そのような方法は、上述の装置を含む、本明細書に開示の装置を使用及び／又は用意するステップと、細胞支持構造上に配置された１つ以上の細胞及び／又は組織を培養するステップと、細胞支持構造全体にわたって（高から低、又は低から高の）ガス勾配を生成するステップと、を含む。
【００３８】
これらの目的及び他の目的は、全体又は一部が本開示対象によって達成される。更に、ここまで本開示対象の目的について述べてきたが、当業者であれば、この後の説明、図面、及び実施例を研究することにより、本開示対象の他の目的及び利点も明らかになるであろう。
【００３９】
以下の図面を参照することにより、本開示対象をよりよく理解することが可能である。図面中の各構成要素は必ずしも正確な縮尺で描かれておらず、その代わりに、本開示対象の原理を（しばしば概略的に）示すことに重点を置いている。図面では、異なる複数の図面の間で類似の参照符号は対応する要素を表す。添付図面の図示において説明される実施形態を参照することにより、本開示対象の更なる理解を得ることが可能である。図示された実施形態は本開示対象を実施するシステムの例示に過ぎないが、図面及び以下の説明を参照することにより、本開示対象の構成及び動作方法の両方が全般的に、それらの更なる目的及び利点とともに、より容易に理解されるであろう。図面は、添付の、又は後で補正される特許請求項において具体的に明記される本開示対象の範囲を限定するものではなく、本開示対象を明確化及び例示するものに過ぎない。
【００４０】
全体を通して類似の参照符号は類似の要素を参照する。図面では、特定の線、層、構成要素、要素、又は特徴の太さを明確さの為に誇張している場合がある。破線が使用される場合、破線は、特に断らない限り、任意選択の特徴又は動作を示している。
【００４１】
本開示対象のより完全な理解の為に、この後は以下の図面を参照していく。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１Ａ】本明細書に開示の第１の例示的実施形態による装置の断面図である。
【図１Ｂ】図１Ａによる装置の分解図である。
【図１Ｃ】図１Ａによる装置が複数個ある実施例を示す図であり、これらの装置は、例えば、マイクロタイタプレートで規定される配列として配置される。
【図１Ｄ】本明細書に開示の第２の例示的実施形態による装置の断面図である。
【図１Ｅ】図１Ｄによる装置の分解図である。
【図１Ｆ】図１Ｄによる装置が複数個ある実施例を示す図であり、これらの装置は、例えば、マイクロタイタプレートで規定される配列として配置される。
【図１Ｇ】本明細書に開示の第３の例示的実施形態による装置の断面図である。
【図１Ｈ】図１Ｇによる装置の分解図である。
【図１Ｊ】本明細書に開示の第４の例示的実施形態による装置の断面図である。
【図１Ｋ】図１Ｊによる装置の分解図である。
【図２Ａ】乃至
【図２Ｂ】図２Ａは、本明細書に開示のデバイス又はシステムにおける酸素飽和度の計算結果を示す。図２Ｂは、ヒト結腸細胞単層がある場合とない場合、並びにプラグがある場合とない場合に測定された管腔培地の酸素飽和度を示すデータのプロットである。プラグ１は２０ｍｍであり、９５℃で硬化させた。プラグ２は１５ｍｍであり、７０℃で硬化させた。
【図３Ａ】乃至
【図３Ｆ】図３Ａは、インサートをプラグで封止した後の管腔側の培地の酸素飽和度を示すデータのプロットである。図３Ｂ〜３Ｄは、本明細書に開示の細胞チャンバ及びデバイスの実施例の写真であり、プラグは実験的にセットアップされたものである。図３Ｅ及び３Ｆは、薄いコラーゲンコーティング（図３Ｅ）及びコラーゲンゲル（図３Ｆ）の足場上で増殖した細胞に対する核染色（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２）を示す画像である。
【図４Ａ】乃至
【図４Ｂ】図４Ａは、マウス初代結腸上皮細胞が存在する場合の、インサートをプラグで封止した後の管腔側の培地の酸素飽和度を示し、図４Ｂは、プラグがない好気性対照の管腔培地、並びに陰窩状足場配列の上面図にあるプラグによって引き起こされた管腔低酸素状態へのムチン２の分泌量を示す。
【図５Ａ】乃至
【図５Ｂ】図５Ａは、インサートをプラグで封止してから別々の管腔培地及び基礎培地に曝されたヒト初代結腸上皮細胞が存在する場合の管腔側の酸素飽和度を示し、図５Ｂは、攪拌プレート上の磁気式撹拌棒による機械式攪拌がある場合とない場合に分化培地（管腔側及び基礎側の両方における図５ＡのＤＭ／ＤＭ条件）に曝されたヒト初代結腸上皮細胞が存在する場合の基礎側の酸素飽和度を示す。
【図６Ａ】乃至
【図６Ｂ】図６Ａは、ニードル型酸素プローブで測定された管腔培地の経時酸素レベルを示す。図６Ｂは、本明細書に開示のデバイス／装置を使用して培養したインビトロ陰窩上皮のピモニダゾール染色及び核染色を示す。管腔側は、ピモニダゾール結合の場所をマーキングしている明るい蛍光信号を示している。陰窩は長さが４３０ミクロンであり、幅が約１２５ミクロンであった。
【図７】本明細書に開示のデバイス／装置においてニードル型酸素プローブで経時測定された培地の酸素飽和度を示す図である。
【図８Ａ】乃至
【図８Ｃ】図８Ａは、本明細書に開示のデバイス／装置において実験的に測定された管腔側及び基礎側の経時酸素特性を示す。ヒト結腸上皮細胞を本明細書に記載のように１０日間増殖させた後、管腔培地（プラグの底部の１ｍｍ下方）及び基礎培地（細胞チャンバの多孔質膜のすぐ下）の酸素レベルを測定した。比較の為に管腔酸素レベルのシミュレーション値を含めた（全ての測定でｎ＝３）。図８Ｂは、免疫蛍光によって検出されたヒポキシプローブ保持を比較するデータを示す（ｎ＝３、＊及び＊＊はｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１を示す）。図８Ｃは、好気性条件下、嫌気性条件下、及び酸素勾配下の、ヒポキシプローブ染色されたヒト結腸上皮細胞の代表的な画像を示す。
【図９Ａ】乃至
【図９Ｄ】様々な酸素条件下での細胞生存度、分極、及びバリア機能を示す図である。細胞を本明細書に記載のように１０日間好気的に増殖させた後、様々な酸素条件（即ち、好気性条件、嫌気性条件、及び酸素勾配）に２日間曝し、その後アッセイした。図９Ａは、ＰＩ／Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２染色（ＤＭ／ＤＭの嫌気性条件（ｎ＝２）以外はｎ＝３）によって評価した細胞生存度を示す。図９Ｂは、増殖因子（ＤＭ／ＳＭの好気性条件の場合はｎ＝２１、ＤＭ／ＳＭの嫌気性条件と勾配の場合はｎ＝２０、ＤＭ／ＤＭの好気性条件と勾配の場合はｎ＝７、ＤＭ／ＤＭの嫌気性条件の場合はｎ＝６）がある場合（左）とない場合（右）の、様々な酸素環境に２日間曝された細胞の経上皮電気抵抗値を示す。図９Ｃ及び９Ｄは、基礎側に増殖因子がある場合又はない場合の、様々な酸素条件下のＰＩ／Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２染色の代表的な画像、基礎側に増殖因子がある場合又はない場合の、凍結切片化され、エズリンに対して染色されたヒト結腸上皮細胞の代表的な画像、並びに、免疫蛍光による、好気性条件下、嫌気性条件下、及び酸素勾配下のヒト結腸上皮細胞における代表的なＺＯ−１画像（それぞれＤＭ／ＳＭ、ＤＭ／ＤＭ）である。
【図１０Ａ】乃至
【図１０Ｃ】様々な酸素環境に曝された細胞の増殖及び胚細胞分化を示す図である。細胞を本明細書に記載のように１０日間嫌気的に培養した後、１０日目に好気性条件、嫌気性条件、及び酸素勾配に曝した。図１０Ａ（上側パネル）は、基礎側に増殖因子がある場合に好気性条件下、嫌気性条件下、及び酸素勾配下で２日間、ＥｄＵパルス（２４時間）で標識された増殖細胞を示す。図１０Ａ（下側パネル）は、増殖因子がある場合とない場合に好気性条件、嫌気性条件、及び酸素勾配に２日間曝された細胞中の、免疫蛍光で検出されたＭＵＣ２を示す。図１０Ｂは、好気性条件下、嫌気性条件下、及び酸素勾配条件下でのＥｄＵ陽性増殖細胞の割合を好気性試料（ｎ＝９）との比較で示す。図１０Ｃは、基礎培地に増殖因子がある場合（ＤＭ／ＳＭ）又はない場合ＤＭ／ＤＭ）の、好気性条件下、嫌気性条件下、及び酸素勾配条件下でのＭＵＣ２陽性胚細胞集団の割合を好気性試料（ｎ＝３）との比較で示す。
【図１１Ａ】乃至
【図１１Ｄ】様々な酸素条件下のＣ．ディフィシル共培養を示す図である。図１１Ａは、嫌気性条件下及び酸素勾配下（ｎ＝３）での６時間及び２４時間の共培養の後の増殖性Ｃ．ディフィシルを示す。図１１Ｂは、６時間及び２４時間の共培養試料（ｎ＝２）、及びＣ．ディフィシルがない２４時間の対照の場合の、様々な酸素条件下（ｎ＝３）でのＣ．ディフィシル共培養の後の基礎培地のＩＬ−８濃度を示す。図１１Ｃは、（上述の期間の）Ｃ．ディフィシル共培養の後であって、嫌気性条件下及び酸素勾配条件下での細菌曝露がない場合の、ヒト結腸上皮細胞におけるＺＯ−１の免疫蛍光を示す。図１１Ｄは、嫌気性条件下及び酸素勾配下で２４時間共培養されたＣ．ディフィシルがある場合とない場合のヒト結腸上皮細胞のＳＥＭ画像を示す。
【図１２Ａ】乃至
【図１２Ｆ】図１２Ａは、３次元陰窩状モデルでの培養条件の概略図である。図１２Ｂは、完全酸素化条件下（左）及び酸素勾配下（右の２つ）の３次元インビトロ陰窩の中の細胞を示す。これらの細胞はＥｄＵ（２４時間）及びピモニダゾール（２時間）でパルス標識されており、これによって、それぞれ、増殖細胞が標識され、酸素枯渇の相対規模が可視化されている。ピモニダゾール染色する陰性対照（右）においては、ピモニダゾールパルスを省略した。図１２Ｃは、免疫蛍光で検出されたピモニダゾールの相対蛍光強度を示す。個々の陰窩の共焦点画像を２０個の区画に分割し、抗体を検出するピモニダゾールの蛍光強度を、各区画内のＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２の蛍光強度で正規化した（＊はｐ＜０．０５を示す）。図１２Ｄは、個々の陰窩内のＥｄＵ標識細胞の割合を示す。各区画内でＥｄＵ標識細胞の面積をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２の面積で正規化した（＊はｐ＜０．０５を示す）。図１２Ｅは、陰窩内のＥｄＵ標識細胞の相対分布を示す。各区画内のＥｄＵ標識細胞の面積を陰窩内のＥｄＵ標識細胞全体の面積で正規化した（＊はｐ＜０．０５を示す）。図１２Ｆは、完全酸素化条件下及び酸素勾配下での２４時間の共培養におけるＢ．アドレスセンティスの増殖を示す。
【図１３Ａ】図１Ａ〜１Ｋのいずれかによる複数の流体接続された装置を含むシステムの第１の例示的実施形態の概略図である。
【図１３Ｂ】図１Ａ〜１Ｋのいずれかによる複数の流体接続された装置を含むシステムの第２の例示的実施形態の概略図である。
【図１４Ａ】収容する組織試料の酸素消費率(OCR)を測定するデバイスの概略分解図である。
【図１４Ｂ】図１４Ａのデバイスの部分組立概略断面図である。
【図１４Ｃ】図１４Ａのデバイスの概略断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下では本開示対象をより詳しく説明していく。但し、説明するのは、本開示対象の、全てとは限らない幾つかの実施形態である。実際、本発明は、多様な形態で実施されてよく、本明細書に記載の実施形態に限定されるものとして解釈されるべきではなく、むしろ、これらの実施形態は、本開示が適用可能な法的要件を満たすように提供される。
【００４４】
定義
本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的としており、本開示対象を限定するものではない。
【００４５】
以下の用語は、当業者には十分に理解されるものと考えられるが、本開示対象の説明を容易にする為に以下の定義を明記する。
【００４６】
以下において別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有するものとする。本明細書において採用されている技術への参照は、当該技術分野において一般的に理解されているようにその技術を参照するものとし、これには、当業者には明らかであると考えられる、それらの技術のバリエーション、又は等価な技術の置換が含まれる。以下の用語は、当業者には十分に理解されるものと考えられるが、本開示対象の説明を容易にする為に以下の定義を明記する。
【００４７】
本開示対象の説明においては、当然のことながら、幾つかの技術及びステップを開示する。これらのそれぞれは個別の利点があり、それぞれは、他の開示された技術のうちの１つ以上、又は場合によっては全てと併せて用いられてもよい。
【００４８】
従って、明確さの為に、本明細書では、個々のステップの可能な全ての組み合わせを不必要に繰り返すことを控える。しかしながら、本明細書及び特許請求項は、そのような組み合わせが完全に、本開示及び特許請求項の範囲内にあることを理解して読まれるべきである。
【００４９】
本明細書で言及される全ての発行物、特許出願、特許、及び他の文献は、参照によって、参照が提示されているセンテンス及び／又はパラグラフに関連する教示に関して完全な形で本明細書に組み込まれている。
【００５０】
長く続いている特許法の慣習に従うと、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、特許請求の範囲を含む本出願において使用される場合には「１つ以上の」を意味する。従って、例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への参照は、複数のそのような細胞、その他を包含する。
【００５１】
特に断らない限り、本明細書及び特許請求項において使用されている、成分、反応条件、その他の量を表す全ての数値は、あらゆる場合において「約（ａｂｏｕｔ）」で修飾されるものと理解されたい。従って、反対のことが示されない限り、本明細書及び添付の特許請求項に記載された数値パラメータは、本開示対象により得られることが求められている所望の特性に応じて様々であってよい近似である。
【００５２】
本明細書では、「約（ａｂｏｕｔ）」という語は、組成、質量、重量、温度、時間、体積、濃度、割合等の値又は量に言及した場合に、明示された量からの、実施形態によっては±２０％、実施形態によっては±１０％、実施形態によっては±５％、実施形態によっては±１％、実施形態によっては±０．５％、実施形態によっては±０．１％のばらつきを包含していて、そのようなばらつきが、本開示の方法の実施、又は本開示の組成の採用において適切なものであることを意味する。
【００５３】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、又は「を特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と同義であって、包含的又はオープンエンドであり、未記載の要素又は方法ステップの追加を排除しない。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、指定された要素は必須であるが、他の要素が追加されても引き続き請求項の範囲内の構成を形成することが可能であることを意味する、請求項の言い回しで使用される専門用語である。
【００５４】
本明細書では、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という語句は、請求項で指定されない要素、ステップ、又は成分を全て排除する。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という語句は、請求項のプリアンブルの直後ではなく要部の句中に現れた場合には、その句中に明記された要素のみを限定し、他の要素は請求項全体からは排除されない。
【００５５】
本明細書では、「のみからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という語句は、請求項の範囲を、指定された材料又はステップ、並びに請求対象の基本的且つ新規な特性に実質的に影響しない材料又はステップに限定する。
【００５６】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」、及び「のみからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という語句に関しては、これら３つの語句の１つが本明細書で使用される場合には、本開示対象及び請求対象は、それ以外の２つの語句のいずれかの使用を包含することが可能である。
【００５７】
本明細書では、「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」という用語は、エンティティのリストの文脈で使用された場合には、単独で、又は組み合わせで存在しているエンティティを参照する。従って、例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、及び／又はＤ（Ａ，  Ｂ，  Ｃ，  ａｎｄ／ｏｒ  Ｄ）」という語句は、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤを個別に包含し、更に、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤのあらゆる組み合わせ及び副組み合わせを包含する。
【００５８】
本明細書では、「ほぼ（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」という語は、組成、質量、重量、温度、時間、体積、濃度、割合等の値、アクティビティ、又は量に言及した場合に、明示された量からの、実施形態によっては±４０％、実施形態によっては±３０％、実施形態によっては±２０％、実施形態によっては±１０％、実施形態によっては±５％、実施形態によっては±１％、実施形態によっては±０．５％、実施形態によっては±０．１％のばらつきを包含していて、そのようなばらつきが、本開示の方法の実施、又は本開示の装置及びデバイスの採用において適切なものであることを意味する。例えば、培地又は環境が「ほぼ低酸素（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｈｙｐｏｘｉｃ）」であるのは、それが少なくとも６０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、並びに場合によっては少なくとも９９％である場合である。
【００５９】
「基礎培地（ｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）」という用語は、本明細書では、他の成分を追加できる最小必須タイプの培地（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地、ハムＦ−１２、イーグル培地、ＲＰＭＩ、ＡＲ８等）を意味する。この用語は、特定用途向けに用意又は企図された培地であって、改編後は他の細胞型等に使用可能である培地を排除しない。
【００６０】
「化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」は、本明細書では、薬品、治療薬、調剤、小分子、又はこれらとして使用される為の候補、並びにこれらの組み合わせ及び混合物であると一般的に見なされる任意のタイプの物質又は薬剤を意味する。
【００６１】
「検出する（ｄｅｔｅｃｔ）」という語とその文法的変化形の使用は、定量化を伴わない種の測定を意味するものとし、「測定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ）」又は「測定する（ｍｅａｓｕｒｅ）」という語とその文法的変化形の使用は、定量化を伴う種の測定を意味するものとする。「検出する（ｄｅｔｅｃｔ）」及び「識別する（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）」という用語は、本明細書では区別なく使用される。
【００６２】
「増殖因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）」という用語は、本明細書では、細胞又は組織の増殖を促進する生物活性分子を意味する。本開示において有用な増殖因子として、形質転換増殖因子−アルファ（ＴＧＦ−α）、形質転換増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）、血小板由来増殖因子（ＡＡ、ＡＢ、及びＢＢアイソフォームを含む）（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（ＦＧＦ酸性アイソフォーム１及び２、ＦＧＦ塩基性フォーム２、並びにＦＧＦ  ４、８、９、及び１０を含む）、神経増殖因子（ＮＧＦ）（ＮＧＦ  ２．５ｓ、ＮＧＦ  ７．０ｓ、及びベータＮＧＦ、並びに神経栄養因子を含む）、脳由来神経栄養因子、軟骨由来因子、骨増殖因子（ＢＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＥＧ−ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ関連タンパク質、Ｂｖ８ＶＥＧＦ−Ｅ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）Ｉ及びＩＩ、肝細胞増殖因子、グリア神経栄養増殖因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、骨格増殖因子、骨マトリックス由来増殖因子、及び骨由来増殖因子とその混合物があり、これらに限定されない。幾つかの増殖因子は、細胞又は組織の分化を促進することも可能である。例えば、ＴＧＦは、細胞又は組織の増殖及び／又は分化を促進することが可能である。
【００６３】
「成分（ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）」という用語は、化学的起源であれ生物学的起源であれ、細胞の増殖、生存、又は分化を維持又は促進する為に細胞培地で使用可能な任意の化合物を意味する。「成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」、「栄養素（ｎｕｔｒｉｅｎｔ）」、「サプリメント（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）」、及び「成分（ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）」という用語は区別なく使用可能であり、これらは全て、そのような化合物を意味するものとする。細胞培地で使用される典型的且つ非限定的な成分として、アミノ酸、塩、金属、糖、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、タンパク質等がある。具体的なニーズに応じて、細胞の培養をエクスビボで促進又は維持する他の成分が当業者によって選択されてよい。
【００６４】
「抑制する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」という用語は、本明細書では、「抑制する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」という用語が使用される文脈に応じて、述べられた機能、レベル、活動、速度等を低下させたり遅らせたりする、化合物、薬剤、又は方法の能力を意味する。抑制は、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、更により好ましくは少なくとも５０％であり、最も好ましくは、機能は少なくとも７５％抑制される。「抑制する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」という用語は、「低下させる（ｒｅｄｕｃｅ）」及び「妨げる（ｂｌｏｃｋ）」と区別なく使用される。
【００６５】
「材料（ｍａｔｅｒｉａｌ）」という用語は、本明細書では、合成材料及び天然材料（例えば、マトリックス成分）を意味する。「材料及び化合物（ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）」という用語は、本明細書では、とりわけ、材料、化合物、細胞、ペプチド、核酸、薬品、マトリックス成分、及び造影剤を意味する。
【００６６】
「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」という用語は、本明細書では、活動、機能、又はプロセスのレベルを変化させることを意味する。「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」という用語は、活動、機能、又はプロセスを抑制することと刺激することの両方を包含する。「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」という用語は、本明細書では「調節する（ｒｅｇｕｌａｔｅ）」という用語と区別なく使用される。
【００６７】
「防ぐ（ｐｒｅｖｅｎｔ）」という用語は、本明細書では、何かが起こるのを止めること、或いは、多かれ少なかれ起こりうる何かが起こらないように予防措置をとることを意味する。医療の文脈での「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、概して、疾患や症状が発生する可能性を減らす為にとるアクションを意味する。
【００６８】
「調節する（ｒｅｇｕｌａｔｅ）」という用語は、関心対象の機能又は活動を刺激したり抑制したりすることを意味する。
【００６９】
「試料（ｓａｍｐｌｅ）」は、本明細書では、被験者から採取された生物学的試料を意味し、これには正常組織試料、罹患組織試料、生検試料、血液、唾液、糞、精液、涙、尿等が含まれ、これらに限定されない。試料は、被験者から採取された、関心対象の細胞、組織、又は流体を含む他の任意の素材供給源であってもよい。
【００７０】
「足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）」は、本明細書では支持外郭構造を意味し、例えば、インビボ又はインビトロでの細胞又は組織の増殖の為の支持外郭構造を意味する。
【００７１】
「固体支持体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）」、「表面（ｓｕｒｆａｃｅ）」、及び「基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」という用語は、区別なく用いられ、任意のサイズの構造単位を意味し、上記構造単位又は基材は、分子構造の不動化、又は上記構造の改変に適する表面を有し、上記基材は、金属、金属薄膜、ガラス、溶融石英、合成ポリマー、膜等の材料で作られ、これらに限定されない。
【００７２】
「刺激する（ｓｔｉｍｕｌａｔｅ）」という用語は、本明細書では、活動又は機能を誘導したり、そのレベルを対照値より高くなるように上げたりすることを意味する。刺激は、直接又は間接的なメカニズムにより行われてよい。一態様では、活動又は機能は、対照値に比べて少なくとも１０％刺激され、より好ましくは少なくとも２５％刺激され、更により好ましくは少なくとも５０％刺激される。「刺激物（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）」という用語は、本明細書では、それを適用することによって関心対象のプロセス又は機能が刺激される任意の組成物、化合物、又は薬剤を意味し、そのようなプロセス又は機能として、創傷治癒、血管形成、骨折治癒、骨芽細胞の生成及び機能、並びに破骨細胞の生成、分化、及び活動等があり、これらに限定されない。
【００７３】
「組織（ｔｉｓｓｕｅ）」は、（１）特定の機能を実施する為に合体した同様の細胞の群、（２）同様の構造及び機能を有する細胞の凝集体で構成される有機体の一部分、及び／又は（３）構造及び機能によって同様に特徴付けられた細胞の集団（筋組織や神経組織等）を意味する。
【００７４】
概論
腸上皮は、ホストを外部環境から隔てている最大の細胞障壁の１つである。飲食物からの栄養素、電解質、及び水分は腸上皮に吸収される。腸上皮は複数の細胞型で構成され、これには幹細胞、吸収細胞、及び分泌細胞（腸細胞、腸内分泌細胞、杯細胞、パネート細胞、タフト細胞）が含まれる。腸幹細胞は、上皮陥入又は上皮陰窩の底部にあり、一時的増幅前駆細胞を生成し、これは急速に増殖し、陰窩に沿って上方に移動し、様々な分化細胞型に分化する。これらの上皮細胞の増殖及び分化は、他の細胞（例えば、間充織細胞（例えば、Ｗｎｔ、ノギン、ＢＭＰ）１，２、線維芽細胞、摂取分子（血液中に含まれる）、並びに細菌代謝産物（短鎖脂肪酸及びインドール等）又は細菌成分（リポ多糖体３，４等））からのシグナリング分子を含む微小環境によって調節される。
【００７５】
腸上皮における分化細胞の高速更新、タンパク質の連続分泌、及び栄養素の吸収は、かなりの量の酸素を必要とする５。この酸素必要量を満たす為に酸素が血流によって送達される。上皮の底面観上の固有層にある大規模な血管網によって、全ての陰窩幹細胞が確実に酸素を受け取る。その間に腸管腔内の酸素飽和度が小腸において低酸素域（酸素が５％前後）の状態になり、更には大腸において無酸素（酸素が２％を下回る）状態になる６。そして、腸の管腔と固有層との間の腸上皮全体にわたって急峻な酸素勾配が発生する７。特に結腸では、管腔が無酸素であることによって、片利共生的且つ有益な微生物にとって好適でありクリティカルである環境が得られ、そのような微生物として、通性嫌気性菌、偏性嫌気性菌、偏性嫌気性菌科の極度に酸素に敏感な（ＥＯＳ）メンバ等がある。
【００７６】
哺乳動物の下部消化管は、様々な片利共生微生物をホストする。ヒトの腸にいる細菌細胞の数は約１０１４と推定されており、これはホストの細胞の総数を超える８。哺乳動物のホストと腸内微生物叢との共生は、分化、代謝、微小血管新生、及びホスト免疫系に影響を及ぼす８。健康な腸管にいる片利共生微生物の９９％超が嫌気性菌である。それらの中で、幾つかの嫌気性菌は、ホストにとって有益な代謝産物（ビタミン９、神経伝達物質１０、短鎖脂肪酸等）を生成し、ホストを病原性感染から保護する１１。更に、微生物の特性の混合がホストの健康な状態、及び様々な病気の状態に関連付けられることの証拠が増えてきており１２，１３、このことは、微生物叢が薬剤スクリーニング及び治療的改変の優れた標的であることを示唆している１４。しかしながら、微生物群落や腸組織の生物学的且つ生理学的な複雑さが、様々な病態に対する腸微生物の影響の基本的なメカニズムを明らかにする上での障害になっている１５。更に、（糞試料から）微生物を収集する現行の方法では、微生物のサブセットを取り出すことしかできない。現行の技術では、被験者を犠牲にすることなく、腸上皮に拘束されている微生物を収集することができず、従って、ヒトの場合は一般に不可能である。微生物叢がホスト上皮細胞とどのように相互作用するかについて理解を深める為には、腸生態系を再現するインビトロ共培養システムがインビボ動物モデルの代替として魅力的であり望ましい。更に、これらのインビトロモデル培養システムは、上皮細胞とともに培養される他の哺乳類細胞型（特に免疫細胞、線維芽細胞、筋肉、マクロファージ、ニューロン、グリア細胞）を包含することが可能であり、これによって、腸細菌とこれらの他の細胞型との相互作用も探査することが可能である。
【００７７】
インビトロ腸培養システム（腸オルガノイド培養１６，１７、腸の自己複製単層１８、ガットオンチップ型デバイス１９−２１等）の開発により、インビボ動物モデルの使用より有利である有用なインビトロプラットフォームが提供される。オルガノイド培養が近年脚光を浴びているが、それは、生化学的合図に対する生理学的反応が適正である長期初代細胞培養を可能にする為である。オルガノイドは又、病気モデルとして使用されたり、腸を損傷した動物への移植に使用されたりしている。しかしながら、オルガノイドの管腔が密閉されていることで、管腔へのアクセス、及び管腔環境のマニピュレーションが制限される。ガットオンチップデバイスは、インビボ腸の幾つかの生理学的側面を示しており、例えば、リズミカルな機械的動きの影響１９，２０、上皮に対する様々なガス組成物の印加２１、及び細菌共培養２０−２２の影響を示している。幾つかのインビトロモデルシステムでは、脱酸素媒体を管腔区画に流入させることによって腸内の酸素勾配が再作成された２２，２３，２４。米国特許出願公開第２０１７／０３０６２７８（Ａ１）号も参照されたい。酸素勾配は、マイクロ流体ベースのチップにも実装された２１。しかしながら、これらのシステムは、込み入った手順の製造及び組立と、動作中の複雑な流体ハンドリングとを必要とし、アッセイスループットが向上するようにスケーリングすることが極端に困難である。これらのシステムは又、外部嫌気性ガス源をシステムに接続することを必要とし、このことは、これらのデバイスを特に生物学者や医薬研究者に広く使ってもらう上での非常に大きな障壁である。特に、腸内環境に関しては、これらのデバイスは、しばしば、初代腸上皮細胞（未分化及び／又は分化初代細胞）の培養に適合しない為、正常な腸上皮細胞の特徴を再現しないモデル腫瘍細胞株を採用する。これまでのところ、インビトロプラットフォームは、腸内で見られるユニークな酸素分布又は酸素勾配を複製できておらず、或いは外部嫌気性ガス混合物の印加を必要としている２５，２６。
【００７８】
典型的には、低酸素状態は、無酸素ガス（予混合嫌気性ガス又は窒素ガス）と制御された量の酸素とを混合して目標酸素飽和度（０〜１０％）を達成することにより達成される２７。或いは、細胞インキュベータを低酸素のグローブボックス又は加工ステーションに入れてよい。これらの低酸素細胞培養環境は、低酸素研究において日常的に使用されてきており、特に低酸素腫瘍の研究に使用されてきた。しかしながら、これらの環境は、連続的なパージによって低酸素環境を維持することを必要とする。最近、正常酸素圧の組織培養インキュベータ内で使用される低酸素チャンバが開発された。このタイプのチャンバでは、組織培養容器を有するチャンバに低酸素ガスを流入させることによって低酸素状態が生成される。チャンバ内のガスが完全に交換されたらチャンバは封止されて、正常酸素圧の組織培養インキュベータ内に置かれる。このタイプの低酸素チャンバは経済的であり、占有スペースが指定の低酸素インキュベータより著しく小さいが、やはり、使用の為には最初に嫌気性ガスパージが必要である。嫌気性ガス生成サシェは、外部ガスがない密閉プラスチック容器又は封止可能なプラスチック袋の中での厳重な嫌気性細菌培養に必要な、嫌気性であってＣＯ２が豊富なガス環境を作成することが可能である。しかしながら、これらのデバイスは、腸の管腔−基底軸に沿って見られるであろうガス勾配をチャンバ内に形成しない。
【００７９】
本開示は、従来の組織培養方法で実装及びペア化が容易に可能な低酸素状態及びガス勾配（例えば、酸素勾配）を作成する方法及びデバイスを提供する。幾つかの実施形態は、システムへの酸素の流入を空間的に制限しながら、細胞自体を利用して使用可能な酸素を消費する。低酸素状態は、必要に応じて、リザーバ全体の中に、又は細胞層の一方の側（管腔側）に生成可能である。後者の場合、細胞生存に必要な酸素は、空気からの溶存酸素が基礎培地内を拡散して細胞に達することを可能にする基礎培地によって供給される。このストラテジは、外部嫌気性ガス、酸素スカベンジャ（化学的又は酵素的）、又は酸素パージメカニズムを必要とせずに、２つ以上の区画を有するシステムの１つの区画に、又はシステムに区画が１つしかない場合にはチャンバ全体に、自己持続可能な低酸素環境を作成する。このストラテジは又、急勾配の酸素減少を、例えば、管腔−基底軸に沿って上皮細胞層全体においてもたらす。これは結腸内にインビボで存在する。
【００８０】
本開示の一態様は、細胞支持構造全体にわたってガス勾配を生成する方法に関し、本方法は、管腔容器を用意するステップであって、管腔容器は、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、少なくとも１つの側壁によって画定される上部開口部と、を含み、管腔容器の底壁はガス透過性膜を含む、上記用意するステップと、底壁の上に細胞支持構造を配置するステップと、細胞支持構造上に１つ以上の細胞及び／又は組織を配置するステップと、管腔容器の上にカバーを取り付けて上部開口部を閉じるステップであって、カバーの底面と、細胞支持構造及び／又は１つ以上の細胞及び／又は組織との間で管腔リザーバが画定される、上記取り付けるステップと、底壁から細胞支持構造全体にわたって、且つ管腔リザーバ内にかけて（高から低、又は低から高の）ガス勾配を生成するステップと、を含む。
【００８１】
本開示の第２の態様は、低酸素状態下で１つ以上の細胞及び／又は組織を培養する方法に関し、本方法は、管腔容器を用意するステップであって、管腔容器は、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、少なくとも１つの側壁によって画定される上部開口部と、を含む、上記用意するステップと、底壁上に細胞支持構造を配置するステップと、細胞支持構造上に１つ以上の細胞及び／又は組織を配置するステップと、管腔容器の上にカバーを取り付けて上部開口部を閉じるステップであって、カバーの底面と、細胞支持構造及び／又は１つ以上の細胞との間で管腔リザーバが画定される、上記取り付けるステップと、管腔リザーバ内に低酸素状態を生成するステップであって、低酸素状態は、管腔容器内の細胞支持構造上の１つ以上の細胞及び／又は組織によって生成される、上記生成するステップと、を含む。
【００８２】
本開示の第３の態様は、インビトロ及び／又はエクスビボ細胞培養の為の低酸素状態を生成すること、及び／又は、ガス勾配及び／又は非ガス勾配を生成することの為の装置に関し、本装置は、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、少なくとも１つの側壁によって画定される上部開口部と、を含む管腔容器と、底壁上の細胞支持構造と、管腔容器と係合して、取付位置において上部開口部を閉じるように構成されたカバーと、を含み、カバーが取付位置にあるときにカバーの底面と細胞支持構造との間で管腔リザーバが画定され、本装置は、カバーが取付位置にあるときに管腔リザーバ内に低酸素状態を生成するように構成されている。
【００８３】
本開示の方法及びデバイスは、代謝産物のアッセイ、細菌共培養、及び、化合物、増殖因子、食物、又は薬品の追加の為の、上皮の管腔側への容易なアクセスを提供する。管腔表面は又、せん断力、又は他の機械的擾乱の印加に利用可能である。管腔リザーバへのアクセスは、管腔リザーバからガスバリアを除去することによって、又はガスバリア内にポート、チャネル、及び／又は配管を組み込むことによって可能である。
【００８４】
多くの健康な組織における酸素分圧は大気中の酸素レベルより低く、酸素は組織に応じて１〜１４％の範囲にある。例えば、測定される酸素濃度は、健康な脳内では典型的には４．６％前後であり、眼内では１〜５％であり、腎臓内では２〜９．５％であり、骨髄内では０〜４％の範囲である４０。シグナリング、遺伝子発現、代謝、及び免疫応答に対する酸素の広範な影響４１−４３を考慮すると、罹患組織及び正常組織の両方の生理及び発育の理解、並びに効果的な治療ストラテジの作成の為には、インビトロの組織培養において生理学的低酸素状態の酸素レベルを採用することが必須となる可能性がある。本開示は、細胞／組織リザーバ内の酸素濃度、又は（時間及び／又は空間に対する）細胞／組織全体にわたる酸素勾配を生理学的に妥当なものにする方法及び装置を提供する。
【００８５】
本開示のデバイス、装置、及び方法は更に、試験薬、試験用微生物を追加したり、培地を交換したりする為のポート、チャネル、又は配管を実装することが可能である。更に、ポートは、細胞／組織培養システムを監視する為のセンサの使用を想定している。
【００８６】
複数の器官系及び／又は細胞型の分析を容易にする為に、細胞支持構造を有する更なる区画又はリザーバがデバイスに追加されてよい。そのような器官として、消化管、肝臓、腎臓、心臓、皮膚、生殖器官、肺、胆管、胆嚢、骨、軟骨、脳があってよい。
【００８７】
本開示のデバイス及び装置は、マイクロ流体デバイスのサブコンポーネントであってよい。マイクロ流体デバイスは、他の器官系に組み込まれてよく、或いは単一組織の為のスタンドアロンデバイスとして動作してもよい。これは、図面に示されているフィーチャの再設計が必要な場合があるが、必須な区画はジオメトリが変わっても保持されるであろう。
【００８８】
従って、幾つかの実施形態では、細胞支持構造全体にわたって（例えば、細胞支持構造上に配置された１つ以上の細胞及び／又は組織を垂直に通り抜ける）ガス勾配を生成する方法が提供され、本方法は、管腔容器を用意するステップであって、管腔容器は、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、少なくとも１つの側壁によって画定される上部開口部と、を含み、管腔容器の底壁はガス透過性膜を含む、上記用意するステップと、底壁の上に細胞支持構造を配置するステップと、細胞支持構造上に１つ以上の細胞及び／又は組織を配置するステップと、管腔容器の上にカバーを取り付けて上部開口部を閉じるステップであって、カバーの底面と、細胞支持構造及び／又は１つ以上の細胞及び／又は組織との間で管腔リザーバが画定される、上記取り付けるステップと、底壁から１つ以上の細胞及び／又は組織を通り、細胞支持構造全体にわたって、且つ管腔リザーバ内にかけて（高から低、又は低から高の）ガス勾配を生成するステップと、を含む。
【００８９】
幾つかの実施形態では、本開示は更に、低酸素状態下で１つ以上の細胞及び／又は組織を培養する方法を提供し、本方法は、管腔容器を用意するステップであって、管腔容器は、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、少なくとも１つの側壁によって画定される上部開口部と、を含む、上記用意するステップと、底壁の上に細胞支持構造を配置するステップと、細胞支持構造上に１つ以上の細胞及び／又は組織を配置するステップと、管腔容器の上にカバーを取り付けて上部開口部を閉じるステップであって、カバーの底面と、細胞支持構造及び／又は１つ以上の細胞との間で管腔リザーバが画定される、上記取り付けるステップと、管腔リザーバ内に低酸素状態を生成するステップであって、低酸素状態は、管腔容器内の細胞支持構造上の１つ以上の細胞及び／又は組織によって生成される、上記生成するステップと、を含む。幾つかの実施形態では、低酸素状態下で１つ以上の細胞及び／又は組織を培養することに使用される管腔容器の底壁は、ガス不透過性を含む。幾つかの実施形態では、低酸素状態下で１つ以上の細胞及び／又は組織を培養することに使用される管腔容器の底壁は、ガス透過性膜を含む。低酸素状態下で１つ以上の細胞及び／又は組織を培養する方法は更に、細胞支持構造全体にわたる（高濃度から低濃度、又は低濃度から高濃度の）ガス勾配を提供することが可能である。幾つかの実施形態では、勾配は酸素勾配であってよく、酸素濃度は、１つ以上の細胞の管腔側でより低く、それらの細胞の細胞支持構造側でより高い。幾つかの実施形態では、勾配は酸素勾配であってよく、酸素濃度は、１つ以上の細胞の管腔側でより高く、それらの細胞の細胞支持構造側でより低い。幾つかの実施形態では、低酸素状態下で１つ以上の細胞及び／又は組織を培養する方法は更に、細胞支持構造全体にわたって非ガス化学勾配を生成するステップを含んでよい。
【００９０】
本明細書では、「底壁の上に配置された（ｐｏｓｉｔｉｏｎｅｄ  ａｂｏｖｅ  ｔｈｅ  ｂｏｔｔｏｍ  ｗａｌｌ）」は「底壁上に配置された（ｐｏｓｉｔｉｏｎｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｏｔｔｏｍ  ｗａｌｌ）」を包含してよい。幾つかの実施形態では、底壁は細胞支持構造を含んでよい。
【００９１】
本明細書では、細胞支持構造は、１つ以上の細胞及び／又は組織をその上に配置することが可能な任意の構造であってよく、これには、例えば、任意の多孔質膜やメッシュ膜が含まれてよい。「細胞支持構造」として、膜、ＥＣＭ（細胞外マトリックス）、ヒドロゲル、天然又は合成ポリマー、及び／又は２次元又は３次元足場、及び／又はこれらの任意の組み合わせがあってよく、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、例えば、管腔リザーバの底壁は細胞支持構造（例えば、膜）であってよい。幾つかの実施形態では、細胞支持構造はマイクロ構造（例えば、サイズが約１ｍｍに満たないフィーチャ（例えば、マイクロウェル、ポスト、及び／又は溝））を含んでよい。幾つかの実施形態では、細胞支持構造は、例えば、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、セルロースアセテート、再生セルロース、窒化セルロース、ナイロン、カーボングリッド、グラフェン膜、ガラス、バイオガラス（例えば、４５Ｓ５バイオガラス）、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸化チタン、酸化アルミニウム、金、ニッケル、及び／又はステンレス綱、又はこれらの任意の組み合わせで構成されてよい。
【００９２】
幾つかの実施形態では、本開示の細胞支持構造として有用な、元々は多孔質でない材料を多孔質にすることが可能であり、これは、焼結、エッチング、浸出、リソグラフィ、レーザ微細加工等であってこれらに限定されない方法により可能である。例えば、ケイ素や金の多孔質メッシュをリソグラフィ／エッチングによって製造することが可能である。幾つかの実施形態では、フォトリソグラフィによってマイクロ細孔又はナノ細孔又はマイクロメッシュ又はナノメッシュを有するフィルムとして製造される、フォトレジスト等の光反応性ポリマーが細胞支持構造に使用可能である。幾つかの実施形態では、ソフトリソグラフィ又はモールドによって多孔質フィルム又はマイクロ／ナノメッシュとして製造される、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）又はＥｃｏＦｌｅｘ等のエラストマフィルムも細胞支持構造として使用可能である。幾つかの実施形態では、細胞支持構造は、脱水済み又は可撓でありながら丈夫なマトリックス（例えば、コラーゲン膜又はフィブリン膜又は複合物）であってもよい。
【００９３】
細胞及び／又は組織は細胞支持構造又は足場の上に配置されてよく、その場合、接着タンパク質又は細胞外マトリックスは追加してもしなくてもよい。幾つかの実施形態では、足場は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料を含んでよく、そのような材料として、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸、ヒアルロン酸、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマウス肉腫細胞から分泌されたゼラチン質タンパク質混合物（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）、ＧＥＬＴＲＥＸ（登録商標）、ＭａｘＧｅｌ（商標）等）、及び／又は市販の細胞基質（例えば、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）  ＣＴＳ（商標））、並びにこれらの任意の組み合わせ（例えば、コラーゲン／Ｍａｔｒｉｇｅｌ混合物）があり、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、天然ポリマー、合成ポリマー、及びハイブリッドヒドロゲルからのヒドロゲルを使用して、２次元又は３次元の足場を作成してよい。天然ポリマー及び合成ポリマーの例として、キトサン、アガロース、アルギネート（例えば、ＡＬＧＩＭＡＴＲＩＸ（登録商標））、フィブリン、シルク、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリル酸ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、合成ペプチド、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド、及び／又はポリアクリルアミド、及び／又はこれらの任意の組み合わせがあり、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、足場の表面は、ＥＣＭ分子、天然又は合成ポリマー、又は合成ペプチド（ポリエルリジン、ＲＧＤペプチド、及び他の、ペプチド断片を認識するインテグリンを含み、これらに限定されない）のいずれか１つ、又はこれらの組み合わせとの細胞粘着を促進するように設計されてよい。幾つかの実施形態では、本開示に有用な細胞支持構造は、細胞材料（免疫細胞、又は他の細胞型、組織、血液）又は非細胞材料（薬品、ポリマービード、磁性粒子等）と混合されてよい。幾つかの実施形態では、細胞支持構造は、２次元又は３次元のマイクロパターン又はマイクロ構造を含んでよい。
【００９４】
幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞は、１つ以上の細胞型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上）を含んでよい。「細胞型」は、本明細書では、１つの種の中で形態学的に異なるか表現型が異なる細胞形態を意味する。
【００９５】
幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞は、真核細胞株からのものであってよい。幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞は、初代細胞であってよい。幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞は、哺乳類細胞であってよく、任意選択でヒト細胞であってよい。
【００９６】
幾つかの実施形態では、細胞支持構造上に配置される１つ以上の細胞は、消化管、生殖器官、気道、眼、鼻、耳、腎臓、脳、皮膚、骨、腱、靱帯、軟骨、骨髄、肝臓、すい臓、胆嚢、結合組織、リンパ系、血液、神経系等からの細胞であってよく、これらに限定されない。従って、幾つかの実施形態では、細胞支持構造上に配置される１つ以上の細胞は、線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞、含脂肪細胞、筋細胞、骨細胞、神経細胞、免疫細胞、幹細胞（例えば、胚誘導多能性幹細胞、間充織幹細胞、造血幹細胞）、消化管細胞、生殖器官細胞、眼細胞、腎細胞、脳細胞、骨髄細胞、腸細胞、及び／又は上皮細胞（例えば、ヒト初代結腸上皮細胞）等であってよく、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞は、任意のタイプのがんからの細胞であってよい。幾つかの実施形態では、細胞支持構造上に配置される１つ以上の細胞は、微生物細胞であってよい。幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞は、胃腸細胞であってよい。幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞は、初代結腸上皮細胞であってよく、任意選択でヒト初代結腸上皮細胞であってよい。
【００９７】
幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞は、２次元形態（例えば、単層）又は３次元形態（例えば、回転楕円体、又は、オルガノイド、陰窩又は陰窩−絨毛状構造）であってよい。幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞及び／又は組織は、３次元培養フォーマットのインビトロ培養物、エクスビボ培養物、有機体全体、器官全体、器官の一部、及び／又はエクスビボ組織切片にあってよい。幾つかの実施形態では、インビトロ培養物又はエクスビボ培養物が天然又は人工のヒドロゲルに埋め込まれてよい。
【００９８】
幾つかの実施形態では、細胞支持構造上に配置される細胞は、健康であるか炎症を起こしているか病気であるヒト又は動物の組織からのものであってよい。
【００９９】
幾つかの実施形態では、１つ以上の組織は、１つ以上の組織型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上）であってよい。幾つかの実施形態では、１つ以上の組織は、本明細書に記載の１つ以上の細胞で構成されてよい。幾つかの実施形態では、１つ以上の組織は、有機体全体、器官全体、器官の一部、インビトロ培養物、エクスビボ培養物、及び／又はエクスビボ組織切片であってよい。幾つかの実施形態では、器官は、肝臓、腎臓、心臓、皮膚、生殖器官（例えば、卵巣、精巣等）、肺、胆管、胆嚢、筋肉、骨、軟骨、及び／又は脳等であってよく、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞又は組織は、消化管の細胞及び／又は組織を含んでよく、消化管は口、唾液腺、食道、胃、小腸、大腸、及び／又は直腸を含み、これらに限定されない。
【０１００】
幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞及び／又は１つ以上の組織は、インビトロ結腸上皮陰窩であってよく、陰窩は、細胞支持構造の上方に管腔側及び基底側を含む。幾つかの実施形態では、インビトロ結腸上皮陰窩は、ヒトインビトロ結腸上皮陰窩であってよい。幾つかの実施形態では、インビトロ結腸上皮陰窩を含む管腔リザーバに少なくとも１つの微生物が加えられてよく、これによって、陰窩の管腔側、及び／又は陰窩の細胞支持側への微生物アクセスが可能になる。
【０１０１】
幾つかの実施形態では、管腔容器の底壁のガス透過性膜を通して１つ以上の細胞及び／又は組織にガスが供給されてよく、これによって、（ガス濃度が高い）管腔容器の底壁のガス透過性膜から１つ以上の細胞及び／又は組織を通って（ガス濃度が低い）管腔リザーバ内に至る、細胞支持構造全体にわたるガス勾配が生成される。幾つかの実施形態では、ガスは、雰囲気（例えば、管腔容器が維持又は保持されている雰囲気）から透過性膜を通ってパッシブに供給されてよい。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、細胞支持構造全体にわたってガス勾配を生成する方法は更に、基礎容器を用意するステップを含んでよく、基礎容器は、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、を含み、底壁及び少なくとも１つの側壁はウェルを画定し、管腔容器は、基礎容器のウェル内に保持されており、基礎容器の底壁は、管腔容器の底壁から間隔を置かれており、基礎リザーバが、基礎容器の底壁と管腔容器の底壁との間で、且つ／又は、基礎容器の少なくとも１つの側壁と管腔容器の少なくとも１つの側壁との間で画定されており、基礎リザーバ内に基礎培地が配置されており、基礎培地は、底壁のガス透過性膜を通して１つ以上の細胞及び／又は組織にガスを供給し、これによって、基礎培地と管腔リザーバとの間に（基礎培地から管腔リザーバにかけて、１つ以上の細胞及び／又は組織を通って、高濃度から低濃度へと垂直に）ガス勾配を生成する。
【０１０３】
本開示の方法及びデバイスを使用して生成されるガス勾配は、細胞支持構造全体にわたって（例えば、１つ以上の細胞又は組織の全体にわたって垂直に）いずれの方向に生成されてもよい。従って、幾つかの実施形態では、生成されるガス勾配は、基礎リザーバ及び／又は基礎容器内のガスがより高濃度であって、管腔リザーバ及び／又は管腔容器内のガスがより低濃度であってよく、或いは、生成されるガス勾配は、基礎リザーバ及び／又は基礎容器内のガスがより低濃度であって、管腔リザーバ及び／又は管腔容器内のガスがより高濃度であってよい。幾つかの実施形態では、２つ以上のガス勾配が生成される場合、各ガスの勾配は、細胞支持構造全体にわたって、同じ方向に生成されてもよく、異なる方向に生成されてもよい。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、ガス勾配の生成は、細胞支持構造上に配置された１つ以上の細胞及び／又は組織が（例えば、シンクとして）、カバーが取り付けられた時点でガスを消費することによって行われてよい。幾つかの実施形態では、ガス勾配の生成は、１つ以上の細胞及び／又は組織が（例えば、ソースとして）、カバーが取り付けられた時点でガスを生成することによって行われてよい。幾つかの実施形態では、ガス勾配の生成は、管腔容器又は管腔リザーバ又は基礎容器又は基礎リザーバに導入された１つ以上の２代目細胞、組織、又は有機体の使用によって支援されてよい。
【０１０５】
ガス勾配を生成することが可能である、本開示に有用なガス（例えば、１つ以上の細胞及び／又は組織によって、又は２代目細胞、組織、又は有機体によって導入、生成、又は消費されることが可能なガス）として、酸素、窒素、二酸化炭素、一酸化炭素、水素、メタン、硫化水素、スカトール（肉の消化の副産物）、インドール（肉の消化の副産物）、メタンチオール（硫黄化合物）、硫化ジメチル（硫黄化合物）、揮発性アミン、揮発性硫黄化合物（ＶＳＣ）、メチルメルカプタン（ＭＭ、メタンチオール（ＭＴ）とも呼ばれる）、ジメチル二硫化物（ＤＭＤＳ）、ジメチル三硫化物（ＤＭＴＳ）、揮発性脂肪酸、及び／又は一酸化窒素等であってよく、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、これら又は他のいずれかの関心対象ガスの勾配を、他の任意のガス勾配と平行又は独立に生成することが可能である。例えば、他の任意の関心対象ガスと平行な酸素勾配を細胞支持構造全体にわたって確立することが可能であり、或いは他の任意の関心対象ガスとは独立な酸素勾配を細胞支持構造全体にわたって確立することが可能である。幾つかの実施形態では、勾配を確立する為に、管腔培地又は基礎培地が関心対象の溶存ガスを含んでよく、或いは関心対象ガスであらかじめ飽和されていてよく、且つ／又は、ポート又は配管を使用して、関心対象ガスの断続的又は連続的パージ、又は関心対象ガスの導入が行われてよい。或いは、関心対象ガスを生成又は消費する細胞、組織、又は有機体を、ガスのソース（供給源）又はシンクとして動作させる為に、管腔容器／リザーバ及び／又は基礎容器／リザーバに導入してよい。
【０１０６】
幾つかの実施形態では、生成及び／又は消費される少なくとも１つのガスは酸素であってよく、管腔リザーバ内の酸素濃度は、低酸素環境の状態を再現することが可能である。従って、幾つかの実施形態では、酸素濃度は約２１％未満である可能性がある。幾つかの実施形態では、酸素濃度は、約０％から約１４％、約０％から約１０％、約０％から約８％、又は約０％から約５％である可能性がある。幾つかの実施形態では、管腔リザーバ内の低酸素状態は、安定している（例えば、安定的低酸素状態である）か、ほぼ安定していることが可能である。幾つかの実施形態では、管腔リザーバ内の安定的低酸素状態によって、管腔リザーバと基礎リザーバとの間に酸素勾配が生成されることが可能である。
【０１０７】
「安定的低酸素状態（ｓｔａｂｌｅ  ｈｙｐｏｘｉａ）」は、本明細書では、低酸素の状態が一度達成されると時間が経っても安定又はほぼ安定していることを意味する。「ほぼ安定的低酸素状態（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｓｔａｂｌｅ  ｈｙｐｏｘｉａ）」は、幾らかのわずかなばらつき（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、又はそれ以上のわずかな増減であるが、１５％は超えないばらつき）で安定しているか一定である低酸素状態である。安定的低酸素状態が一度達成された後、小さい擾乱（基礎リザーバ及び管腔リザーバに新しい培地や他の物質を追加することを含む）又は攪拌があると、低酸素状態が影響を受ける可能性があるが、それはほんのわずかの期間であり、その後、系は速やかに安定的又はほぼ安定的低酸素状態に戻る。
幾つかの実施形態では、管腔容器が第２のガス透過性膜によって少なくとも２つの区画に分割されてよく、それらの少なくとも２つの区画の間にガス勾配が生成されてよい。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、管腔容器が、第１の管腔容器及び第２の管腔容器を含む少なくとも２つの管腔容器を含んでよく、第１の管腔容器は、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、少なくとも１つの側壁によって画定される上部開口部と、を含み、第１の管腔容器の底壁はガス透過性膜を含み、第２の管腔容器は、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、少なくとも１つの側壁によって画定される上部開口部と、を含み、第２の管腔容器の底壁はガス透過性膜を含み、第１の管腔容器は第２の管腔容器内に保持され、これら少なくとも２つの管腔容器の間にガス勾配が生成される。幾つかの実施形態では、これら少なくとも２つの管腔容器の一方が、これら少なくとも２つの管腔容器の他方の内側に挿入されてよい（即ち、例えば、第１の管腔容器が第２の管腔容器より小さく、第１の管腔容器が第２の管腔容器のリザーバに挿入される）。
【０１０９】
本明細書では、「ガス透過性膜（ｇａｓ  ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）」は、細胞を支持して細胞が通り抜けないようにしながら、溶存ガス及び他の分子を透過させる膜を意味する。排除は、材料の細孔サイズ、多孔率、屈曲度、疎水性等に基づいて行われてよい。幾つかの実施形態では、ガス透過性膜は酸素透過性膜であってよい。幾つかの実施形態では、ガス透過性膜は非ガス化学物質に対して透過性であってよい。
【０１１０】
幾つかの実施形態では、ガス透過性膜は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、ヒドロゲル、天然又は合成ポリマー、マイクロ／ナノメッシュ、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリウレタン、高Ｄｋコンタクトレンズ材料（酸素透過性が３１超）（例えば、パフルホコン（ｐａｆｌｕｆｏｃｏｎ）ポリマー（例えば、フルオロパーム（Ｆｌｕｏｒｏｐｅｒｍ）（商標）ポリマー））、及び／又はこれらの組み合わせであってよく、これらに限定されない。
【０１１１】
幾つかの実施形態では、ガス透過性膜は、細胞支持構造と同じ材料で構成されてよく、例えば、本明細書に記載の任意の多孔質膜又はメッシュ膜で構成されてよい。
【０１１２】
幾つかの実施形態では、ガス透過性膜に適する材料として、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、セルロースアセテート、再生セルロース、窒化セルロース、ナイロン、カーボングリッド、グラフェン膜、ガラス、バイオガラス（例えば、４５Ｓ５バイオガラス）、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸化チタン、酸化アルミニウム、金、ニッケル、及び／又はステンレス綱、又はこれらの任意の組み合わせがあってよく、これらに限定されない。
【０１１３】
幾つかの実施形態では、ガス透過性膜として有用な、元々は多孔質でない材料を多孔質にすることが可能であり、これは、焼結、エッチング、浸出、リソグラフィ、レーザ微細加工等であってこれらに限定されない方法により可能である。例えば、ケイ素や金の多孔質メッシュをリソグラフィ／エッチングによって製造することが可能である。幾つかの実施形態では、フォトリソグラフィによってマイクロ細孔又はナノ細孔又はマイクロメッシュ又はナノメッシュを有するフィルムとして製造される、フォトレジスト等の光反応性ポリマーがガス透過性膜に使用可能である。幾つかの実施形態では、ソフトリソグラフィ又はモールドによって多孔質フィルム又はマイクロ／ナノメッシュとして製造される、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）又はＥｃｏＦｌｅｘ等のエラストマフィルムもガス透過性膜として使用可能である。幾つかの実施形態では、ガス透過性膜は、脱水済み又は可撓でありながら丈夫なマトリックス（例えば、コラーゲン膜又はフィブリン膜又は複合物）であってもよい。
【０１１４】
幾つかの実施形態では、管腔容器及び／又は基礎容器が、物質の導入又は抽出が可能なポート又はチャネルを含んでよい。幾つかの実施形態では、ポート又はチャネルは、基礎容器及び／又は管腔容器のカバー、側壁、又は底壁に含まれてよい。従って、幾つかの実施形態では、本開示に有用なカバーは、管腔容器のカバーの上面又は側面からカバーの底面に延びる少なくとも１つのポート又はチャネル（例えば、およそ１、２、３、４、５、又はそれ以上）を含んでよい。幾つかの実施形態では、管腔容器は、側壁又は底壁に少なくとも１つのポート又はチャネル（例えば、およそ１、２、３、４、５、又はそれ以上）を含んでよい。幾つかの実施形態では、基礎容器は、側壁又は底壁に少なくとも１つのポート又はチャネル（例えば、およそ１、２、３、４、５、又はそれ以上）を含んでよい。
【０１１５】
幾つかの実施形態では、本開示の方法は更に、カバー及び／又は基礎容器の少なくとも１つのポート又はチャネルに少なくとも１つのセンサ及び／又は配管（例えば、ガラス、ゴム等）を挿入するステップを含んでよい。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのセンサは、ガスセンサ、ｐＨセンサ、圧力センサ、流量センサ、温度センサ、及び／又は化学的／生物学的センサであってよく、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのセンサは、針状プローブ、微小電極、マイクロチップ（ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ）センサ、膜センサ、及び／又はマイクロチップ（ｍｉｃｒｏｔｉｐ）センサであってよく、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、針状プローブは光ファイバ針状プローブであってよい。
【０１１６】
幾つかの実施形態では、本開示の方法は更に、（ガスバリアを作成して、管腔容器及び／又は基礎容器の外側でのガス交換を防ぐ為に）少なくとも１つのポート又はチャネルを封止するステップを含んでよい。幾つかの実施形態では、ポート又はチャネルにセンサを挿入することによってポート又はチャネルが封止されてよい。幾つかの実施形態では、ポート又はチャネルに挿入された配管が封止されてよい。幾つかの実施形態では、配管の封止は、本明細書に記載の、ポート又はチャネルの封止と同様であってよい。幾つかの実施形態では、配管及び／又はセンサと、配管又はセンサを挿入するポート又はチャネルの内壁との間で封止が形成されてよい。
【０１１７】
幾つかの実施形態では、本方法は更に、封止されて開かれたポート、チャネル、及び／又は配管を再封止するステップを含む。幾つかの実施形態では、「封止する（ｓｅａｌｉｎｇ）」及び／又は「再封止する（ｒｅｓｅａｌｉｎｇ）」は「封止材（ｓｅａｌ）」又は「ガスバリア（ｇａｓ  ｂａｒｒｉｅｒ）」の使用を含んでよく、これは、プラグ、キャップ、蓋、栓（ｂｕｎｇ）、カップリング、圧縮フィッティング、ガスケット、ねじ山、圧入、誘導封止、接着シーラント、ボンデッドシール、ダイアフラムシール、バキュームシール、磁石、ヒートシール、ガラス対金属シール、ハーメチックシール、静水圧型シール、動水圧型シール、インフレータブルシール、ラビリンスシール、端面メカニカルシール、面シール、及び／又はワイパーシール等であってよく、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、「封止材」又は「ガスバリア」は、接着、テーピング、セメント、ろう付け、はんだ付け、溶接、圧着、磁力、真空力、及び／又は摩擦力によって管腔リザーバ及び／又は管腔容器に機械的に接合されてよい。幾つかの実施形態では、留め具を使用して、管腔容器及び／又は管腔リザーバに「封止材」を接合するか、「ガスバリア」を作成することが可能であり、そのような留め具として、ねじ、クリップ、クランプ、おもり、ロック、ばね、ヒンジ、リベット、バックル、ピン、フランジ、グロメット、フック＆アイ留め具、フック＆ループ留め具、ラッチ、釘（ｎａｉｌ）、釘（ｐｅｇ）、保持リング、ねじ山付き留め具、バンド、スナップ留め具、ステープル、ステッチ、ストラップ、結びひも、ジッパー、及び／又はトグルボルト等があり、これらに限定されない。
【０１１８】
幾つかの実施形態では、少なくとも１つのポート及び／又はチャネルを通して管腔リザーバ及び／又は基礎リザーバに物質を導入したり、それらから物質を抽出（例えば、パージ又は抜き取り）したりすることが可能である。幾つかの実施形態では、管腔リザーバ又は基礎リザーバに導入可能な物質として、
ガス、非ガス化学物質、管腔培地、基礎培地、細胞（例えば、２代目細胞）、組織（例えば、２代目組織）、有機体、増殖因子、増殖因子受容体、タンパク質（例えば、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質）、脂肪酸、ホルモン、試験化合物（例えば、試験薬）、炎症性メディエータ、代謝産物（例えば、微生物代謝産物）、神経伝達物質、ナノ粒子、マイクロ粒子、粘液、  炭水化物、繊維、アミノ酸、ヒドロゲル、又はイオン（例えば、タンパク質、塩化物、重炭酸塩）等があってよく、これらに限定されない。
【０１１９】
細胞及び／又は組織の増殖／維持に有用な任意の物質、又は細胞又は組織に対する物質の影響を調べることに有用な物質を、基礎リザーバ又は管腔リザーバに導入してよい。幾つかの実施形態では、物質は、フィブロネクチン、ラミニン、表皮成長因子（ＥＧＦ）、Ｒ−スポンディン、ノギン、サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ））、エフリン受容体（例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ、ＥｐｈＢ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７）、Ｗｎｔ（ウィングレス関連統合部位）（例えば、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、及び他のＷｎｔ）、ノッチシグナリング因子（ノッチ受容体）、Ｄｌｌ１／４、ノギン、ＧＲＥＭ１、ＧＲＥＭ２、アセテート、ブチラート、プロピオナート、デスアミノチロシン、カテコールアミン（例えば、ドーパミン、ノルエピネフリン）サイトカイン、及び／又は短鎖脂肪酸等であってよく、これらに限定されない。
【０１２０】
幾つかの実施形態では、ガスの導入、生成、抽出、又は消費は、管腔容器、管腔リザーバ、基礎リザーバ、及び／又は基礎容器において行われてよい。ガスの導入、抽出、生成、又は消費がおいて行われてよい実施形態では、ガスは、酸素、窒素、二酸化炭素、一酸化炭素、水素、メタン、硫化水素、スカトール（肉の消化の副産物）、インドール（肉の消化の副産物）、メタンチオール（硫黄化合物）、硫化ジメチル（硫黄化合物）、揮発性アミン、揮発性硫黄化合物（ＶＳＣ）、メチルメルカプタン（ＭＭ）（メタンチオール（ＭＴ）とも呼ばれる）、ジメチル二硫化物（ＤＭＤＳ）、ジメチル三硫化物（ＤＭＴＳ）、揮発性脂肪酸、及び／又は一酸化窒素等であってよく、これらに限定されない。
【０１２１】
幾つかの実施形態では、ポート又はチャネルを使用して管腔リザーバ（又は基礎リザーバ）の雰囲気を抽出／パージすることにより、（例えば、細胞、組織、又は有機体の代謝によって生成された）不要なガスを除去することが可能である。幾つかの実施形態では、パージは断続的に行われてよい（例えば、時々、又は必要に応じて、又は周期的に（例えば、３０分おきに、１時間おきに、１２時間おきに、２４時間おきに、１日おきに、週１回等）行われてよい）。幾つかの実施形態では、パージは連続的に行われてよい（例えば、細胞が配置されてカバーが取り付けられてから、又は勾配が定常状態になったら、又は任意の指定時刻／希望時刻から連続的に行われてよい）。パージが必要になる可能性があるガスの例として、窒素、メタン、二酸化炭素等の代謝によって生成されたガスであってよく、これに限定されない。
【０１２２】
幾つかの実施形態では、管腔培地及び／又は基礎培地が溶存ガスを含んでよい。幾つかの実施形態では、管腔培地及び／又は基礎培地がガスで（あらかじめ）飽和されていてよい。幾つかの実施形態では、ガスはガス生成材料によって供給されてよい。幾つかの実施形態では、供給されるガスが酸素である場合、基礎培地に含まれてよい酸素生成材料は、ＣａＯ２、過酸化カルシウム、過酸化尿素、酸素含有ビード、及び／又は人工血液等であってよく、これらに限定されない。
【０１２３】
幾つかの実施形態では、カバーの少なくとも１つのポート又はチャネルを通して少なくとも１つのガスを管腔リザーバに供給することによって、細胞支持構造全体にわたってガス勾配を生成することを支援することが可能である。幾つかの実施形態では、基礎容器の少なくとも１つのポート又はチャネルを通して少なくとも１つのガスを基礎リザーバに供給することによって、細胞支持構造全体にわたってガス勾配を生成することを支援することが可能である。
【０１２４】
幾つかの実施形態では、少なくとも１つのガスが、ガスを生成する細胞、組織、又は有機体によって供給されてよく、或いは、少なくとも１つのガスが、ガスを消費する細胞、組織、又は有機体によって消費されてよく、これらはガス勾配の生成及び安定化を支援する。ガスの供給又は消費に有用な細胞又は組織は、細胞支持構造上に配置された１つ以上の細胞又は組織と同じ細胞又は組織であってよく、或いは、細胞支持構造上に配置された１つ以上の細胞又は組織と同じ型でも異なる型でもよい２代目細胞又は組織であってよい。幾つかの実施形態では、ガスを生成する細胞、又はガスを消費する細胞は、低酸素状態の発達をより速くすること、勾配の発達をより速くすること、及び／又は生成される勾配をより急峻にすることに使用されてよい。２代目細胞／組織又は有機体は、管腔区画内に、初代細胞と接触して配置されてよく、又は多孔質支持物によって初代細胞と隔てられてよく、或いは基礎区画内に配置されてよい。
【０１２５】
幾つかの実施形態では、少なくとも１つの非ガス化学物質が、非ガス化学物質を生成する細胞、組織、又は有機体によって供給されてよく、或いは、少なくとも１つの非ガス化学物質が、非ガス化学物質を消費する細胞、組織、又は有機体によって消費されてよく、これらは非ガス化学勾配のセットアップ及び安定化を支援する。非ガス化学物質の供給又は消費に有用な細胞又は組織は、細胞支持構造上に配置された１つ以上の細胞又は組織と同じ細胞又は組織であってよく、或いは、細胞支持構造上に配置された１つ以上の細胞又は組織と同じ型も異なる型でもよい２代目細胞又は組織であってよい。幾つかの実施形態では、非ガス化学物質を生成する細胞、又は非ガス化学物質を消費する細胞は、勾配の発達をより速くすること、及び／又は生成される勾配をより急峻にすることに使用されてよい。２代目細胞／組織又は有機体は、管腔区画内に、初代細胞と接触して配置されてよく、又は多孔質支持物によって初代細胞と隔てられてよく、或いは基礎区画内に配置されてよい。
【０１２６】
幾つかの実施形態では、２代目細胞、組織、又は有機体は、細胞支持構造上に配置された関心対象の１つ以上の細胞又は組織に対する２代目細胞、組織、又は有機体の影響を調べるために導入されてもよい。幾つかの実施形態では、２代目細胞、組織、又は有機体は、２代目細胞、組織、又は有機体に対する、関心対象の１つ以上の細胞又は組織の影響を調べるために導入されてもよい。
【０１２７】
２代目細胞又は組織は、細胞支持構造上に配置された１つ以上の細胞又は組織と同じ細胞型又は組織型であってよく、異なる細胞型又は組織型であってもよい。幾つかの実施形態では、２代目細胞は、１つの細胞型であってよく、異なる複数の細胞型であってもよい。２代目細胞は任意の真核細胞株又は初代細胞であってよく、そのようなものとして、線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞、含脂肪細胞、筋細胞、骨細胞、神経細胞、免疫細胞、幹細胞(胚誘導多能性幹細胞、間充織幹細胞、造血幹細胞)、がん細胞、及び微生物、又は、単層、回転楕円体、又はオルガノイドとしての、これらのうちの任意のものの組み合わせがあってよく、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、２代目細胞は、健康であるか炎症を起こしているか病気であるヒト又は動物の組織からのものであってよい。幾つかの実施形態では、２代目細胞又は組織は、パッチ又は単層の培養フォーマットであってよい。幾つかの実施形態では、２代目細胞又は組織に可能な培養フォーマットとして３次元（３Ｄ）システムがあり（但し、これに限定されない）、これには、インビトロ又はエクスビボ培養（天然又は人工ヒドロゲルに埋め込むことの有無にかかわらず）、有機体全体、器官全体又は一部、又はエクスビボ組織切片が含まれ、これらに限定されない。
【０１２８】
関心対象の１つ以上の細胞又は組織に対する２代目細胞、組織、又は有機体の影響を調べること、又は２代目細胞、組織、又は有機体に対する関心対象の１つ以上の細胞又は組織の影響を調べることの為の、本開示に有用な、ガス又は非ガス化学物質を消費又は生成する有機体として、微生物（例えば、細菌、菌類、ウイルス）、アメーバ、蠕虫（例えば、条虫、蟯虫、鉤虫、鞭虫等）、ウイルス、及び／又は原生動物（例えば、ジアルジア属等）があってよく、これらに限定されず、又、良性／片利共生的有機体、及び／又は感染性／病原性有機体があってよい。
【０１２９】
本開示に有用な微生物として、任意の細菌（グラム陰性及びグラム陽性）、菌類（単細胞又は多細胞）、及び／又は古細菌（アーキア）（関心対象のガス又は非ガス化学物質の消費者又は生成者として現時点で認識されているか後で識別される）があってよい。
【０１３０】
幾つかの実施形態では、本開示に有用な細菌は、哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ、ウマ、ウシ、ネコ、ヒツジ等）の正常又は健康な腸内微生物叢（即ち「微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）」）において見られる型であってよい。そのような細菌はよく知られており、例えば、本開示に有用でありうるヒト腸内細菌の説明がある米国特許出願公開第２０１４／００９３４７８号を参照されたい。幾つかの実施形態では、本開示に有用な微生物として病原性細菌があってよく、これにはクロストリジウム、コレラ菌、サルモネラ菌、及び／又はシゲラ菌が含まれ、これらに限定されない。従って、幾つかの実施形態では、本開示に有用な細菌として、アシネトバクターバウマニー、イスラエル放線菌、炭疽菌、バクテロイデスフラジリス、バルトネラヘンセラ菌、百日咳菌、ボレリアブルグドルフェリ、ボレリアガリニ、ボレリアアフゼリ、ボレリアレカレンチス、ウシ流産菌、イヌ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、類鼻疽菌、カンピロバクタージェジュニ、クラミジアニューモニエ、クラミジアトラコマチス、オウム病クラミジア、ボツリヌス菌、クロストリジウムディフィシル、クロストリジウムパーフリンジェンス、破傷風菌、コリネバクテリウムアミコラトゥム、ジフテリア菌、コクシエラバーネッティ、エーリキアカニス、エーリキアシャフェンシス、大便連鎖球菌、エンテロコッカスフェシウム、大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、病原性大腸菌、侵入性大腸菌、腸管出血性大腸菌、野兎病菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、肺炎桿菌、レジオネラニューモフィラ、レプトスピラ種、リステリア菌、ハンセン菌、ヒト型結核菌、肺炎マイコプラズマ、淋菌、髄膜炎菌、パラクラミジア、緑膿菌、ノカルジアアステロイデス、ロッキー山紅斑熱リケッチア、サルモネラ菌、シゲラ菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、腐性ブドウ球菌、Ｂ群溶血性連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、ビリダンス型連鎖球菌、梅毒トレポネーマ、コレラ菌、ビブリオバルニフィカス、腸炎ビブリオ、及び／又はエルシニア菌、又はこれらの任意の組み合わせがあってよく、これらに限定されない。
【０１３１】
幾つかの実施形態では、本開示に有用な有機体はウイルスであってよく、そのようなウイルスとして、シンプレックスウイルス、バリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ロゼオロウイルス、リンホクリプトウイルス、ラディノウイルス、マストアデノウイルス、アルファパピローマウイルス、ベータパピローマウイルス、ガンマパピローマウイルス、ミューパピローマウイルス、ニューパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、モラスキポックスウイルス、オルトポックスウイルス、パラポックスウイルス、アルファトルクウイルス、ベータトルクウイルス、ガンマトルクウイルス、ゲミサーキュラーウイルス、エリスロウイルス、ディペンドウイルス、ボカウイルス、コルティウイルス、ロタウイルス、セドルナウイルス、ヘペウイルス、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、トロウイルス、マムアストロウイルス、ノロウイルス、サポウイルス、フラビウイルス、ヘパシウイルス、ペギウイルス、カルジオウイルス、コサウイルス、エンテロウイルス、ヘパトウイルス、コブウイルス、パレコウイルス、ロサウイルス、サリウイルス、アルファウイルス、ルビウイルス、デルタウイルス、リッサウイルス、ベシクロウイルス、フィロウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、パラミクソウイルス、ヘニパウイルス、モービリウイルス、レスピロウイルス、ルブラウイルス、メタニューモウイルス、ニューモウイルス、アレナウイルス、ペリブニヤウイルス、オルトブニヤウイルス、ハンタウイルス、ナイロウイルス、フェヌイウイルス、フレボウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、トゴトウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、レンチウイルス、スプーマウイルス、及び／又はオルトヘパドナウイルス、又はこれらの任意の組み合わせ等があり、これらに限定されない。
【０１３２】
幾つかの実施形態では、本開示に有用な有機体は、関心対象のガス又は非ガス化学物質の消費者又は生成者として現時点で認識されているか後で識別される菌類であってよい。必然的に片利共生的又は病原性有機体として、関心対象の１つ以上の細胞又は組織と相互作用する菌類も本開示に有用である。幾つかの実施形態では、本開示に有用な菌類は単細胞であってよい。幾つかの実施形態では、本開示に有用な菌類は多細胞（菌糸）であってよい。幾つかの実施形態では、菌類は、コウジカビ属、ブラストミセス属、カンジダ属、コクシジオイデス属、クリプトコッカスネオフォルマンス属、クリプトコッカス属(例えば、クリプトコッカスガッティ)、ヒストプラスマ属、クモノスカビ属、ケカビ属、リクテイミア属、ニューモシスティス属(例えば、ニューモシスティスジロヴェチ)、スポロトリクス属の菌類であってよく、これらに限定されない。
【０１３３】
幾つかの実施形態では、本開示に有用な有機体は原生動物であってよく、そのようなものとして、赤痢アメーバ、クリプトスポリジウムパルバム、クリプトスポリジウムホミニス、サイクロスポーラカエタネンシス、及び／又はランブル鞭毛虫があってよく、これらに限定されない。
【０１３４】
幾つかの実施形態では、ガスの供給及び／又は消費が２つ以上の方法で行われてよい。従って、例えば、ガスの供給は、直接行われてよく、ガス生成材料によって行われてよく、且つ／又はガスを生成する細胞、組織、及び／又は有機体によって行われてよく、ガスの消費は、ガス消費材料によって行われてよく、且つ／又はガスを消費する細胞、組織、及び／又は有機体等によって行われてよい。
【０１３５】
幾つかの実施形態では、少なくとも１つのガス生成／消費有機体が基礎培地内に存在してよく、底壁のガス透過性膜を通して１つ以上の細胞及び／又は組織にガスを供給してよく、これによって、基礎培地と管腔リザーバとの間の細胞支持構造全体にわたって勾配が生成される。
【０１３６】
幾つかの実施形態では、少なくとも１つのガス生成／消費有機体は、管腔リザーバ内に配置された管腔培地にあって、細胞支持構造上に配置された１つ以上の細胞と直接接触してよく、これによって、１つ以上の細胞及び／又は組織にガスが直接供給されて、管腔培地と基礎リザーバとの間の細胞支持構造全体にわたって勾配が生成され、或いは、管腔リザーバ内でガスが消費されて、管腔培地と基礎リザーバとの間に細胞支持構造全体にわたって勾配が生成される。
【０１３７】
幾つかの実施形態では、本開示の方法は、１つ以上の細胞及び／又は組織と同じ管腔容器にガス生成／消費有機体を供給し、本方法は、管腔容器を用意するステップであって、管腔容器は、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、少なくとも１つの側壁によって画定される上部開口部と、を含む、上記用意するステップと、底壁上に第１の細胞支持構造を配置するステップと、第１の細胞支持構造の上に第２の細胞支持構造を配置するステップと、第２の細胞支持構造の上に１つ以上の細胞及び／又は組織を配置するステップと、第１の細胞支持構造の上にガス生成有機体を配置するステップと、管腔容器の上にカバーを取り付けて上部開口部を閉じるステップであって、カバーの底面と、第２の細胞支持構造及び／又は１つ以上の細胞及び／又は組織との間で管腔リザーバが画定される、上記取り付けるステップと、第１の細胞支持構造上のガス生成有機体から１つ以上の細胞及び／又は組織を通って管腔リザーバ内まで（高から低の）ガス勾配（１つ以上の細胞及び／又は組織を通って垂直に生成される勾配）を生成するステップと、を含む。
【０１３８】
幾つかの実施形態では、本開示の方法及びデバイスを使用して、非ガス化学勾配が生成されてよい。幾つかの実施形態では、細胞支持構造上に配置された１つ以上の細胞又は組織は、非ガス化学物質の生成者又は消費者であってよく、これにより、細胞支持構造全体にわたって非ガス化学物質の勾配が（１つ以上の細胞及び／又は組織を通って垂直に）生成される。非ガス化学勾配は、細胞支持構造全体にわたって、いずれの方向に生成されてもよい。従って、幾つかの実施形態では、生成される非ガス化学勾配は、基礎リザーバ及び／又は基礎容器内の非ガス化学物質がより高濃度であって、管腔リザーバ及び／又は管腔容器内の非ガス化学物質がより低濃度であってよく、或いは、生成される非ガス化学勾配は、基礎リザーバ及び／又は基礎容器内の非ガス化学物質がより低濃度であって、管腔リザーバ及び／又は管腔容器内の非ガス化学物質がより高濃度であってよい。幾つかの実施形態では、２つ以上の非ガス化学勾配が生成される場合、各非ガス化学物質の勾配は、細胞支持構造全体にわたって、同じ方向に生成されてもよく、異なる方向に生成されてもよい。
【０１３９】
幾つかの実施形態では、非ガス化学物質を生成又は消費する細胞、組織、又は有機体が基礎培地又は管腔培地に導入されて、細胞支持構造全体にわたって（１つ以上の細胞及び／又は組織を通って垂直に）勾配が生成されてよい。幾つかの実施形態では、導入される、非ガス化学物質を生成又は消費する細胞、組織、又は有機体が、培地内で粘着せずに懸濁してよい。非ガス化学物質を生成又は消費する細胞、組織、又は有機体は、関心対象の細胞／組織（例えば、細胞支持構造上に配置された１つ以上の細胞又は組織）と隣り合って粘着及び増殖してもよく、或いは管腔チャンバ又は基礎チャンバ内の別の細胞支持構造に粘着してもよい。非ガス化学物質を生成又は消費する細胞、組織、又は有機体は、本明細書に記載の、ガスを生成／消費する細胞、組織、又は有機体と同じであっても異なってもよく（２代目細胞、組織、又は有機体と異なっても同じでもよく）、且つ／又は、細胞支持構造上に配置された１つ以上の細胞／組織と異なっても同じでもよい。
【０１４０】
幾つかの実施形態では、非ガス化学物質を生成又は消費する細胞、組織、又は有機体は、関心対象の１つ以上の細胞／組織から見て細胞支持構造の反対側に配置されてもよい。例えば、非ガス化学物質を生成する細胞、組織、又は有機体が細胞支持構造の底部に配置されてよく、これは、非ガス化学物質を生成する細胞、組織、又は有機体が基底側に露出するようにし、一方では、非ガス化学物質を生成する細胞、組織、又は有機体によって生成された化学物質が細胞支持構造を通り抜けて、支持構造の管腔側の支持構造上に配置された関心対象の１つ以上の細胞／組織まで拡散できるようにする為である。
【０１４１】
幾つかの実施形態では、非ガス化学物質が基礎培地又は管腔培地に直接導入されてよく、これによって、管腔培地から基礎培地にかけて、又は基礎培地から管腔培地にかけて、細胞支持構造全体にわたって（１つ以上の細胞及び／又は組織を通って垂直に）非ガス化学物質の勾配が生成される。
【０１４２】
幾つかの実施形態では、非ガス化学物質として、タンパク質、脂肪酸、増殖因子、ホルモン、代謝産物、イオン、炭水化物（例えば、砂糖）、ペプチド、リポペプチド、アミノ酸、試験薬、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質、増殖因子及び／又は受容体、及び／又は炎症性メディエータがあってよく、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、非ガス化学物質は、フィブロネクチン、ラミニン、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、Ｒ−スポンディン、ノギン、サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ））、エフリン受容体（例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ、ＥｐｈＢ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７）、Ｗｎｔ（ウィングレス関連統合部位）（例えば、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、及び他のＷｎｔ）、ノッチシグナリング因子（ノッチ受容体）、Ｄｌｌ１／４、ノギン、ＧＲＥＭ１、ＧＲＥＭ２、アセテート、ブチラート、プロピオナート、デスアミノチロシン、及び／又はカテコールアミン（例えば、ドーパミン、ノルエピネフリン）等であってよく、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、非ガス化学物質は、ブチラート、プロピオナート、デスアミノチロシン、カテコールアミンであってよく、これらは微生物から供給される。
【０１４３】
幾つかの実施形態では、生成されるガス勾配は、約３０分から約６時間の範囲で安定していることが可能であり、幾つかの実施形態では、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、又は約６時間安定していることが可能である。
【０１４４】
幾つかの実施形態では、ガス勾配は自己持続型であってよい。本明細書では、「自己持続型（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｉｎｇ）」は、閉鎖系内の細胞支持構造上に配置された１つ以上の細胞及び組織によるガスの消費又は生成によって安定状態で、少なくとも約４時間から約１か月以上の間（例えば、無期限、細胞が生存している限り）、又は幾つかの実施形態では約４、８、１２、２４、３６、又は４８時間以上、又は幾つかの実施形態では約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０日以上、維持されるガス勾配を意味する。自己持続型ガス勾配は、培地交換等の中断があってもその後に安定状態（各区画が目標濃度の±１％以内）に戻る。この安定状態は、壁、及び／又は透過性膜、及び／又は管腔蓋がない状態で達成可能な安定状態とは異なる。
【０１４５】
幾つかの実施形態では、ガス勾配は、基礎培地を攪拌することによって調節されてよい。基礎培地を攪拌することにより、攪拌しない場合より急峻な勾配をより迅速に生成することが可能であり、攪拌した場合にはより迅速に安定した勾配を達成することが可能である。攪拌は、区画内で均一又は適正な酸素飽和度を達成する為に、１つの区画で、又は系全体で実施されてよい。幾つかの実施形態では、攪拌は、磁気式攪拌機、シェーカプレート、オービタルシェーカ、ボルテックスミキサ、ロッカ、ガス誘導乱流、表面音響波、又はこれらの任意の組み合わせによって実現されてよい。幾つかの実施形態では、攪拌は更に、機械式攪拌機（例えば、ビード及び／又は他の粒子）を包含してよく、これに限定されない。幾つかの実施形態では、攪拌は、例えば、装置内の電極によってもたらされるガス誘導乱流によって達成されてよい。酸素勾配をより急峻にする為に、空気から培地への酸素の移動を、攪拌によって、又は培地リザーバの底部に酸素透過性膜（例えば、ＰＤＭＳ、ポリウレタン、又は高Ｄｋコンタクトレンズ材料（フルオロパームポリマー又はパフルホコンポリマー等）を使用することによって促進することが可能である。酸素生成材料（例えば、ＣａＯ２、過酸化カルシウム、過酸化尿素、酸素含有ビード、又は人工血液等）を基礎培地に追加することによって、酸素飽和度を高めること、及び／又は細胞全体に酸素勾配を印加することが可能である。幾つかの実施形態では、基礎区画は血管系チャネル又は模倣血管系チャネルを含んでよく、これらのチャネルは、酸素又は他のガスを供給するか枯渇させる液体、マイクロ／ナノ粒子、及び／又は微生物を送達することが可能である。
【０１４６】
幾つかの実施形態では、管腔容器内に第２の透過性膜を設けることによって勾配を調節してよい。幾つかの実施形態では、第２の透過性膜は、第１の透過性膜の上に配置されてよい。幾つかの実施形態では、第１の透過性膜は、管腔容器の底壁であってよい。幾つかの実施形態では、管腔容器の底壁は不透過性膜を含み、第１の透過性膜は底壁の上にあってよい。幾つかの実施形態では、第２の透過性膜が、第２の管腔容器の内側に第１の管腔容器に挿入することによって設けられてよい。幾つかの実施形態では、第２の透過性膜が、勾配を急峻にすることによって勾配を調節することが可能である。幾つかの実施形態では、第２の透過性膜が、安定勾配をより迅速に実現することが可能である。
【０１４７】
幾つかの実施形態では、細胞支持構造上に配置される細胞又は組織、又は導入される２代目細胞、組織、又は有機体の選択により、勾配を調節することが可能である。細胞又は組織の選択は、例えば、それらのガス消費レート、ガス生成レート、それらの非ガス化学物質消費レート、ガス化学物質生成レート、低酸素／正常酸素状態を許容する能力、他のガス及び／又は非ガス化学物質を生成／排除する能力、又はこれらの任意の組み合わせに関して行われてよい。
【０１４８】
最終的な酸素レベル、及び所望の酸素レベルに達するまでの時間は操作可能であり、これは、例えば、材料の酸素透過性（表１）、材料の厚さ、（管腔及び基礎）培地の体積、又は細胞リザーバ内部のガスの体積を調節することによって、或いは、各区画に、又は１つの区画内で２つ以上の材料を使用することによって可能である。例えば、管腔リザーバ及びガスバリアは、酸素透過性が低い材料で作られてよく、一方、基礎リザーバは、全体又は一部が、比較的薄い材料、及び／又は酸素透過性が高い材料で作られてよい。
【表１】
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【０１４９】
従って、幾つかの実施形態では、ガス勾配の調節は、管腔リザーバの体積、基礎リザーバの体積、細胞支持構造のガス透過性、管腔容器の側壁のガス透過性、管腔容器の底壁のガス透過性、及び／又はカバーのガス透過性、又はこれらの任意の組み合わせを修正することによって行われてよい。幾つかの実施形態では、管腔容器の側壁、管腔容器の底壁、カバー、基礎容器の側壁、及び／又は基礎容器の底壁のガス透過性は、ガス透過性及び厚さに基づいて構築材料を選択することによって調節可能である。
【０１５０】
幾つかの実施形態では、ガス勾配の調節は、基礎培地の体積、基礎容器の側壁のガス透過性、及び／又は基礎容器の底壁のガス透過性、又はこれらの任意の組み合わせを修正することによって行われてよい。
【０１５１】
幾つかの実施形態では、本開示の容器及びその一部分（例えば、管腔容器／リザーバ、基礎容器／リザーバ、カバー、及びこれらの一部分（例えば、プラグ、封止材、キャップ等））を構築する為の材料として、プラスチック、ポリエステル、天然ゴム、合成ゴム、エラストマ、ガラス、及び／又は金属があってよく、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、本開示の容器及びその一部分を構築する為の材料として、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、アクリルスチレンアクリロニトリル（ＡＳＡ）、スチレンアクリロニトリル（ＳＡＮ）、ナイロン、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリフェニレンオキシド、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、アセタールポリマー、アクリル樹脂、エポキシ、熱硬化性ポリエステル樹脂、ポリウレタン、フラン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、シリコーンゴム、ＶＩＴＯＮ（商標）、ポリクロロプレン、ニトリルゴム、ウレタンゴム、天然ゴム、エチレンプロピレンジエンモノマー（ＥＰＤＭ）、フッ化炭素ゴム、ホウケイ酸塩、ソーダ石灰、石英、アルミニウム、鋼、ステンレス綱、又はこれらの任意の組み合わせがあってよく、これらに限定されない。
【０１５２】
装置、デバイス、及びシステム
本開示は更に、低酸素状態を生成する方法、又は細胞支持構造にわたってガス勾配を生成する方法において有用な装置を提供する。従って、幾つかの実施形態では、インビトロ及び／又はエクスビボ細胞培養において低酸素状態を生成すること、及び／又は、細胞支持構造にわたってガス勾配を生成することの為の装置が、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁と、少なくとも１つの側壁によって画定される開口断面を有する上部開口部と、を含む管腔容器と、底壁上の細胞支持構造と、管腔容器の内側と係合するか、且つ／又は管腔容器に当たって係合して、取付位置において上部開口部を閉じるように構成されたカバーと、を含んでよく、カバーが取付位置にあるときにカバーの底面と細胞支持構造との間で管腔リザーバが画定され、本装置は、カバーが取付位置にあるときに管腔リザーバ内に低酸素状態を生成するように構成されている（例えば、図１Ａ〜１Ｋを参照）。幾つかの実施形態では、細胞支持構造上に１つ以上の細胞及び／又は組織が配置されてよい。
【０１５３】
幾つかの実施形態では、本開示のデバイスを使用して生成される低酸素状態は自己持続型である。
【０１５４】
図１Ａ〜１Ｃに示した第１の例示的実施形態では、一装置（全体で１００）が基礎リザーバ（全体で１２０）を含み、基礎リザーバ１２０内に管腔リザーバ（全体で１４０）の少なくとも一部が配置されている。図に示したように、カバー１６０が管腔リザーバの開口端部内に取り外し可能に（ねじ式で）挿入されて固定され、これにより、カバー１６０が取付位置にあるときに、管腔リザーバ１４０及びカバー１６０は一緒にほぼ気密封止されており、これによって、管腔リザーバ１４０内に低酸素環境を形成することが可能になる。図示した環境では、たらい形の管腔リザーバの、基礎リザーバ１２０から見て遠位側の内面に１つ以上のねじ山（全体で１４４）が形成されている。カバーは、その外面に１つ以上の対応するねじ山（全体で１６４）を有しており、カバーが管腔リザーバ１４０内の取付位置にあるときに、ねじ山１６４がねじ山１４４と噛み合って（例えば、ねじ係合して）管腔リザーバ１４０内に気密封止を形成する。カバー１６０は更に、図示された実施形態ではカバーフランジ１６２を含み、カバーフランジ１６２は、管腔リザーバフランジ１５２の上に載ることによって、管腔リザーバ１４０周りの封止を強化する。幾つかの実施形態では、カバーフランジ１６２及び／又は管腔リザーバフランジ１５２の上に（且つ／又はそれらに形成されたスロット内に）ガスケットが配置されてよい。図示した実施形態ではカバー１６０は実質的に中身が詰まっているが、カバー１６０は中空であってもよく、或いは、カバー１６０が管腔リザーバ１４０の上に取り付けられているときに管腔リザーバ１４０内に低酸素環境を形成して維持することが可能な任意の好適なタイプの構造であってもよい。
【０１５５】
装置１００の第１の例示的実施形態を示した図１Ａ〜１Ｃから分かるように、基礎リザーバ１２０はほぼ円筒形であり、その一方の端部が底壁１２２で閉じられており、その高さは円筒形状の側壁１２４の寸法で規定される。基礎リザーバ１２０の、底壁１２２と反対側の端部はほぼ開放されており（例えば、ふさがっておらず）、基礎フランジ１２６が基礎リザーバ１２０の開放端部に取り付けられているか、その開放端部に近接して取り付けられており、そこから離れるように半径方向に延びる。図１Ｃに示すように、フランジ１２６は、（例えばマイクロタイタプレート（全体で１０）の一部として形成された）アレイ内に形成された複数の穴の中で装置１００を支持する為に使用されてよい。多少言い換えると、マイクロタイタプレー１０は、複数のウェル又は共用基礎ウェルと複数の管腔リザーバ１４０とを含む基礎リザーバ１２０を含んでよく、各管腔リザーバ１４０は、基礎ウェルの１つ、又は共用基礎ウェルにおいて保持される。
【０１５６】
この実施形態で示した管腔リザーバ１４０は、ほぼ円筒形である為、基礎リザーバ１４０から半径方向に間隔を開けながら基礎リザーバ１４０内に同心嵌合される。動作中は基礎リザーバ１２０内に置かれている管腔リザーバ１４０の底面は底壁１７０を含み、底壁１７０は多孔質膜の形態であってよく、底壁１７０の上にコラーゲン足場１７２が堆積、配列等されてよい。管腔リザーバの壁１４２が、底壁１７０からほぼ垂直方向に延びている。少なくとも２つの支持アーム１５６が、管腔リザーバの壁１４２から半径方向外向きに延びて、基礎リザーバ１２０のフランジ１２６に接触する位置で、管腔リザーバ１４０を基礎リザーバ１２０内で支持している。１つ以上の支持アーム１５６にキー付きフィーチャ（例えば、ステップ）が形成されていてよく、これにより、基礎リザーバ１２０内で管腔リザーバ１４０との適切な間隔が確実にとられる。１つ以上の支持アーム１５６の中にスロットが円周方向に形成されていてよく、これは、管腔リザーバ１４０が基礎リザーバ１２０のキャビティ内に取り付けられたときに、周囲空気、酸素、又はこれらの組み合わせが、支持アーム１５６内に形成されたスロットを通って循環して、基礎リザーバ１２０と管腔リザーバ１４０との間の空間に入ることを可能にする為である。
【０１５７】
管腔リザーバ１４０の壁１４２は基礎リザーバ１２０の側壁１２４より短く、これにより、支持アーム１５６が基礎リザーバのフランジ１２６と接触したときに、底壁１７０は、基礎リザーバ１２０の底壁１２２の内面から間隔を置いて位置する。この、底壁１７０と基礎リザーバ１２０の底壁１２２の内面との間隔によって基礎流体領域（全体で１８０）が画定される。同様に、管腔流体領域（全体で１８２）が、管腔リザーバ１４０内の、底壁１７０の、基礎流体領域１８０と反対側に収容され、カバー１６０が取付位置で管腔リザーバ１４０と係合した時点で管腔リザーバ１４０内にほぼ封止される。管腔リザーバ１２０の、底壁１７０から見て遠位にある端部はほぼ開放されていて、カバー１６０をその端部に挿入して固定することが可能である。
【０１５８】
基礎リザーバ１２０及び管腔リザーバ１４０はそれぞれがほぼ円筒形であるが、基礎リザーバ１２０及び管腔リザーバ１４０の一方又は両方が円筒形でなくてもよい。実際、本装置が適正に動作する為には、管腔リザーバ１４０が基礎リザーバ１２０の少なくとも一部分と嵌合する為に管腔リザーバ１４０が基礎リザーバ１２０より十分小さくなければならないのは概して真実であるが、基礎リザーバ１２０及び管腔リザーバ１４０は任意の形状であってよく、例えば、両方が互いに対して相補的であっても非相補的であってもよい。
【０１５９】
幾つかの実施形態では、カバー１６０は、取付位置で管腔リザーバ１４０と係合する（例えば、図１Ａ〜１Ｃを参照）。幾つかの実施形態では、管腔リザーバ１４０の少なくとも１つの壁１４２の内面とカバー１６０の外面とがそれぞれねじ山１４４、１６４を含み、カバー１６０は、取付位置にあるときに管腔リザーバ１４０とねじ係合するように構成されている。
【０１６０】
幾つかの実施形態では、基礎リザーバ１２０は、底壁と、底壁から上方に延びる少なくとも１つの側壁１２４と、を含む。底壁１２２と少なくとも１つの側壁１２４とによってウェルが画定される。管腔リザーバ１４０は、基礎リザーバ１２０のウェル内に保持される。基礎リザーバ１２０の底壁は、管腔リザーバ１４０の底壁から間隔を置いて位置する。基礎流体領域１８０が、基礎リザーバ１２０の底壁と管腔リザーバ１４０の底壁との間で、且つ／又は基礎リザーバ１２０の少なくとも１つの側壁１２４と管腔リザーバ１４０の少なくとも１つの側壁１４２との間で画定される。幾つかの実施形態では、管腔リザーバ１４０の底壁１７０は、多孔質膜、半透過性膜、低透過性膜、又は不透過性膜を含む。幾つかの実施形態では、管腔リザーバ１４０の底壁１７０は酸素透過性膜を含む。
【０１６１】
幾つかの実施形態では、装置１００は更に、基礎リザーバ１２０の中の基礎流体領域１８０内に基礎培地を含む。幾つかの実施形態では、基礎培地は、ガス又は非ガス化学物質を底壁１７０に近接させるように構成されてよい。幾つかの実施形態では、基礎培地は、例えば、管腔リザーバ１４０の中の管腔流体領域１８２内で底壁１７０上に、又は底壁１７０に近接して配置されたコラーゲン足場１７２の１つ以上の細胞及び／又は組織に酸素を供給するように構成されてよい。
【０１６２】
図１Ｄ〜１Ｆは、本装置の第２の例示的実施形態（全体で１０１）を示す。この実施形態の図では、第１の実施形態の装置１００に関して本明細書の他の箇所で説明したフィーチャと同じかほぼ同様のフィーチャについては類似の参照符号を使用している。装置１０１では、基礎リザーバ１２０及び管腔リザーバ１４０は、図１Ａ〜１Ｃの装置１００において使用及び記載されている基礎リザーバ１２０及び管腔リザーバ１４０とほぼ同様である。しかしながら、基礎流体領域１８０内に混合機１８２が配置されてよく、混合機１８２は、例えば、磁気駆動撹拌棒であってよい。この実施形態では、カバー２６０は、カバー２６０の全厚を貫通して形成されたリリースポート２６６を含み、リリースポートは、カバー２６０の上面から、管腔リザーバ１４０内の管腔流体領域１８２に近接するように延びて、管腔流体領域１８２と流体連通している。従って、リリースポート２６６は、流体が管腔流体領域１８２から抽出されること、管腔流体領域１８２に導入されること、及び／又は管腔流体領域１８２内を循環することを可能にする。この実施形態では、ある位置にリリースポートプラグ２６８が設けられ、その位置では、リリースポートプラグ２６８が取り付けられるとリリースポート２６６を介しての管腔流体領域との流体交換が阻止されるように、リリースポートプラグ２６８がリリースポート２６６に取り外し可能に挿入される。幾つかの実施形態では、リリースポート２６６は、垂直方向に対して傾斜していてよく、或いは非直線形状であってよく、例えば、内部に約９０°以上の角度が形成された形状であってよい。
【０１６３】
図１Ｄ〜１Ｆに示した実施形態では、リリースポート２６６は、カバー１６０の上面からカバー１６０の底面まで延びるチャネルの形態であり、カバー１６０が取付位置にあるときには、カバー１６０の底面は管腔リザーバ１４０内にある。幾つかの実施形態では、リリースポートプラグ２６８は一時的又は永続的に取り外されてよく、リリースポート２６６の長さ全体にわたってセンサが取り付けられてよく、センサは、カバー１６０の全厚を貫通して、管腔流体領域１８２内の管腔流体に近接するか、且つ／又は少なくとも一部が管腔流体内に配置される。幾つかの実施形態では、そのようなセンサは、リリースポート２６６全体にわたって延びて管腔リザーバ１４０に入って、管腔リザーバ１４０内の酸素飽和度を測定するように構成されてよい。図１Ｆに示すように、フランジは、（例えばマイクロタイタプレート（全体で１０）の一部として形成された）アレイ内に形成された複数の穴の中で装置１００を支持する為に使用されてよい。
【０１６４】
上記で論じたように、リリースポート２６６は、ガスバリアを形成して管腔リザーバ１４０及び／又は基礎リザーバ１２０の外部とのガス交換を阻止するように封止されてよい。幾つかの実施形態では、リリースポート２６６は、カバー２６０の上面においてセンサの周囲で封止されてよい。幾つかの実施形態では、リリースポート２６６は、その中にセンサを挿入することによって封止されてよい。幾つかの実施形態では、リリースポート２６６に挿入された配管が封止されてよい。幾つかの実施形態では、リリースポート２６６の封止は、本明細書に記載の、ポート又はチャネルの封止と同様であってよい。幾つかの実施形態では、配管及び／又はセンサと、配管又はセンサが挿入されたリリースポート２６６の内壁との間で封止が形成されてよい。幾つかの実施形態では、装置１０１は、リリースポート２６６の長さの少なくとも一部に沿って延びる環状ガスケットを含んでよく、このガスケットは、ガスケットを貫通するセンサを受けてリリースポート２６６を封止するように構成されてよい。
【０１６５】
図１Ｄ〜１Ｆに示すように、装置１０１は更に、基礎リザーバ１２０の中の基礎流体領域１８０内で基礎培地を攪拌するように構成された攪拌装置１８４を含んでよい。幾つかの実施形態では、攪拌装置１８４は、磁気式攪拌機（例えば、磁気式撹拌棒）、シェーカプレート、オービタルシェーカ、ボルテックスミキサ、ロッカ、ガス誘導乱流、表面音響波、又はこれらの任意の組み合わせであってよい。幾つかの実施形態では、攪拌装置１８４は更に、機械式攪拌機（例えば、ビード及び／又は他の粒子）であってよく、これに限定されない。幾つかの実施形態では、攪拌装置１８４は、例えば、装置１０１内の電極によってもたらされるガス誘導乱流を含む。
【０１６６】
図１Ｇ及び１Ｈは、本装置の第３の例示的実施形態（全体で１０２）を示す。この実施形態の図では、第１及び／又は第２の実施形態の装置１００、１０１に関して本明細書の他の箇所で説明したフィーチャと同じかほぼ同様のフィーチャについては類似の参照符号を使用している。装置１０２では、管腔リザーバ（全体で３４０）は、３つの支持アーム１５６を有する、支持アーム１５６の別の構成を含み、支持アーム１５６の下側に「キー付き」位置合わせフィーチャが形成されており、これは、基礎リザーバ１２０の壁１２４と管腔リザーバ３４０の壁１４２との間の適切な円周方向間隔を維持する為のものである。この円周方向間隔は、全体として中空円筒プリズムの形態であってよく、これにより、酸素が基礎流体領域１８２中の基礎流体と接触することが可能である。
【０１６７】
装置１０２は更にカバー（全体で３６０）を含み、カバー３６０は、カバー３６０の全厚を貫通して形成された複数の貫通穴（全体で３７０）を含む。貫通穴３７０は、１つ以上のセンサ３７２（例えば、温度センサ等）が貫通穴３７０を通り抜けて延びて管腔流体領域１８２中の管腔流体に近接するか、管腔流体に浸漬されることが可能であるように構成されている。図に示した実施形態では、貫通穴３７０の１つ１つを通り抜ける複数の入口／出口ポートが設けられている。貫通穴３７０内にセンサ３７２又は入口／出口ポート３７４Ａ、３７４Ｂが配置されているかどうかにかかわらず、管腔流体領域１８２内で所望の雰囲気状態（例えば、低酸素状態）を維持する為に、貫通穴３７０の長さの一部（例えば、全体）に沿って、弾性の（例えば、ゴム又は任意の適切なエラストマ材料の）環状ガスケット３７１の形態の封止を設けることが有利である。
【０１６８】
第１及び第２の例示的実施形態のねじ係合（図１Ｇ及び１Ｈに示した実施形態ではこれも実施可能である）と異なり、カバー３６０は複数のキー付き突起フィーチャ（例えば、タブ３６４）を含み、これは、カバー３６０の一部分から半径方向外向きに延びており、カバー３６０が取付位置にあるときには管腔リザーバ３４０内まで延びる。管腔リザーバ３４０の壁１４２は、その内面にノッチを含み、ノッチは、管腔リザーバ１４０の円周方向に延びており、その深さは管腔リザーバ３４０の壁１４２の厚さより浅い。この、管腔リザーバ３４０の壁１４２に形成されたスロットは、壁１４２の上側に、円周方向に突出したリング３４４によって画定されており、リング３４４にはギャップが半径方向に形成されており、これによって、タブ３６４がギャップを通り抜けてから、カバー３６０が回されると、タブ３６４と、リング３４４に形成されたギャップとがずれて、タブ３６４はスロット内に保持されることが可能である。タブ３４４は、高さが、リング３４４によって画定されるスロットの高さより低くなるように寸法設計されており、それによって、カバー３６０と、管腔リザーバ３４０に形成されたスロットの下側の面との間に（この実施形態ではＯリングの形態である）ガスケット３５４が封止配置されてよい。
【０１６９】
幾つかの実施形態では、センサ３７２は、ガスセンサ、ｐＨセンサ、圧力センサ、流量センサ、温度センサ、及び／又は化学的／生物学的センサであってよい。幾つかの実施形態では、センサ３７２は、針状プローブ、微小電極、マイクロチップ（ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ）センサ、膜センサ、及び／又はマイクロチップ（ｍｉｃｒｏｔｉｐ）センサであってよく、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、そのような針状プローブは光ファイバ針状プローブであってよい。幾つかの実施形態では、センサ３７２は、酸素センサ、窒素センサ、水素センサ、メタンセンサ、二酸化炭素センサ、一酸化炭素センサ、硫化物センサ、スカトールセンサ、インドールセンサ、メタンチオールセンサ、硫化ジメチルセンサ、揮発性アミンセンサ、揮発性硫黄化合物（ＶＳＣ）、メチルメルカプタン、又はメタンチオールのセンサ、ジメチルジスルフィド（ＤＭＤＳ）センサ、ジメチルトリスルフィド（ＤＭＴＳ）センサ、揮発性脂肪酸センサ、及び／又は酸化窒素センサであってよい。
【０１７０】
上記で論じたように、貫通穴３７０は、ガスバリアを形成して管腔リザーバ３４０及び／又は基礎リザーバ１２０の外部とのガス交換を阻止するように封止されてよい。幾つかの実施形態では、１つ以上の貫通穴３７０が、カバー３６０の上面においてセンサの周囲で封止されてよい。幾つかの実施形態では、１つ以上の貫通穴３７０が、その中にセンサを挿入することによって封止されてよい。幾つかの実施形態では、１つ以上の貫通穴３７０に挿入された配管が封止されてよい。幾つかの実施形態では、１つ以上の貫通穴３７０の封止は、本明細書に記載の、ポート又はチャネルの封止と同様であってよい。幾つかの実施形態では、配管及び／又はセンサと、配管又はセンサが挿入された１つ以上の貫通穴３７０の内壁との間で封止が形成されてよい。幾つかの実施形態では、装置１０２は、１つ以上の貫通穴３７０の長さの少なくとも一部に沿って延びる環状ガスケット３７１を含んでよく、このガスケットは、ガスケットを通り抜けるセンサを受け止めて、対応する貫通穴３７０を封止するように構成されてよい。
【０１７１】
図１Ｇ〜１Ｋに示した実施形態では、カバー１６０の上面からカバー１６０の底面まで延びる貫通穴３７０、４７０（又はチャネル）が第１の貫通穴３７０であってよく、少なくとも１つの第２の貫通穴３７０がカバー１６０の上面からカバー１６０の底面まで延びる。幾つかのそのような実施形態では、少なくとも１つの第２の貫通穴３７０は、管腔リザーバ３４０に物質を導入すること、又は管腔リザーバ３４０から物質を抽出することに使用されてよい。例えば、少なくとも１つの第２の貫通穴３７０は、試験薬を追加すること、試験微生物を追加すること、及び／又は管腔リザーバ３４０内の培地を交換することに使用されてよい。幾つかのそのような実施形態では、少なくとも１つの第２の貫通穴３７０は、その貫通穴を通り抜けるセンサ３７２を受けるように構成されてよい。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの第２の貫通穴３７０は、本明細書に記載の任意の有用なセンサを受けるように構成されてよい。幾つかのそのような実施形態では、少なくとも１つの第２の貫通穴３７０は、その貫通穴を通り抜けるセンサ３７２を受けるように構成されてよい。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの第２の貫通穴３７０は、本明細書に記載の任意の有用なセンサを受けるように構成されてよい。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの第２の貫通穴３７０は、その貫通穴を通り抜けるｐＨセンサ及び／又は化学的センサを受けるように構成されてよい。幾つかの実施形態では、装置１０２は、少なくとも１つの第２の貫通穴３７０の長さの少なくとも一部に沿って延びる少なくとも１つの環状ガスケット３７１を含んでよく、少なくとも１つの環状ガスケット３７１は、そのガスケットを通り抜けるセンサ３７２を受けて、少なくとも１つの第２の貫通穴３７０を封止するように構成されてよい。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの第２の貫通穴３７０は、（例えば、プラグの上面において）封止可能であってよい。
【０１７２】
幾つかの実施形態では、カバー１６０、２６０、３６０、及び／又は４６０は、直径が、管腔リザーバ１４０、３４０、４４０の内径と同じであってよい。幾つかの実施形態では、カバー３６０が取付位置にあるときに、カバー３６０と管腔リザーバ３４０との間に環状ガスケット３５４（例えば、Ｏリング）が配置されてよい。幾つかの実施形態では、装置１０２は、管腔リザーバ３４０の少なくとも１つの側壁内に画定されてよいシート（例えば、対向リング３４４）を含み、その上にガスケット３５４が載ることが可能である。図示した実施形態では、管腔リザーバ３４０及びカバー３６０は、管腔リザーバ３４０とカバー３６０とを互いにロック係合するように構成されたロック機構を含む。この実施形態では、カバー３６０はロックフィン（例えば、タブ３６４）を含み、管腔リザーバ３４０の壁１４２は、その内面に円周方向に形成された凹部（例えば、スロット）を含み、これは、カバー３６０が取付位置にあるときにロックフィンを受けるように構成されている。
【０１７３】
図１Ｊ及び１Ｋに示した実施形態では、第４の例示的装置（全体で１０３）を示している。この実施形態の図では、第１及び／又は第２の実施形態の装置１００、１０１、１０２に関して本明細書の他の箇所で説明したフィーチャと同じかほぼ同様のフィーチャについては類似の参照符号を使用している。装置１０３では、管腔リザーバ（全体で４４０）の上面１５２上にスロットが形成されており、スロットの開放端は、カバー４６０が取付位置にあるときにカバー４６０と近接する。管腔リザーバ４４０のスロット内にリング状ガスケット４５４が設けられており、これによって、カバー４６０が取付位置にあるときにカバー４６０がガスケット４５４に封止的に押し付けられることが可能である。幾つかの実施形態では、ガスケット４５４は、管腔リザーバ４４０の少なくとも１つの側壁の上面１５２に載ってよい。カバー４６０は、装置１０２内に示されたように、複数の貫通穴４７０を含み、貫通穴４７０は、有利なことに、貫通穴４７０の長さの一部又は全体に延びる環状ガスケット４７１で封止されてよい。貫通穴４７０は、カバー４６０の全厚を貫通して形成されている。貫通穴４７０は、１つ以上のセンサ４７２、４７４、４７６（例えば、ｐＨセンサ４７４、酸素センサ４７２、及びグルコースセンサ４７６）がそれぞれも対応する貫通穴４７０を通り抜けて延びて管腔流体領域１８２中の管腔流体に近接するか、管腔流体に浸漬されることが可能であるように構成されている。図示した実施形態では、カバー１６０は、カバー４６０のフランジ１６２をガスケット４５４に押し付けて、ガスケットに対する封止を形成する為に、（例えば、大きな質量が埋め込まれた材料で）有利に重み付けされる。管腔リザーバ４４０は、支持アーム１５６に形成されたキー付きフィーチャによって、基礎リザーバ１２０に対して（例えば、基礎リザーバ１２０内で）円周方向に間隔を置いて配置されており、これによって、酸素が基礎流体領域１８２中の基礎流体と接触することを可能にする環状経路が形成される。
【０１７４】
図２Ａは、本明細書に開示の、図１Ａ〜１Ｋに示した装置のような装置における酸素飽和度の計算結果を示す。
【０１７５】
幾つかの実施形態では、封止は、プラグ、キャップ、蓋、栓（ｂｕｎｇ）、カップリング、圧縮フィッティング、ガスケット、ねじ山、圧入、誘導封止、接着シーラント、ボンデッドシール、ダイアフラムシール、バキュームシール、磁石、ヒートシール、ガラス対金属シール、ハーメチックシール、静水圧型シール、動水圧型シール、インフレータブルシール、ラビリンスシール、端面メカニカルシール、面シール、及び／又はワイパーシール等であってよく、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、「封止材」又は「ガスバリア」は、接着、テーピング、セメント、ろう付け、はんだ付け、溶接、圧着、磁力、真空力、及び／又は摩擦力によって管腔リザーバ及び／又は管腔容器に機械的に接合されてよい。幾つかの実施形態では、留め具を使用して、管腔容器及び／又は管腔リザーバに「封止材」又は「ガスバリア」を接合することが可能であり、そのような留め具として、ねじ、クリップ、クランプ、おもり、ロック、ばね、ヒンジ、リベット、バックル、ピン、フランジ、グロメット、フック＆アイ留め具、フック＆ループ留め具、ラッチ、釘（ｎａｉｌ）、釘（ｐｅｇ）、保持リング、ねじ山付き留め具、バンド、スナップ留め具、ステープル、ステッチ、ストラップ、結びひも、ジッパー、及び／又はトグルボルト等があり、これらに限定されない。
【０１７６】
ここで図１３Ａを参照すると、幾つかの実施形態ではシステム２００が用意される。システム２００は第１の装置１０２Ａを含み、これは、第１の管腔リザーバであってよい管腔リザーバと、第１の基礎リザーバであってよい基礎リザーバと、第１のカバーであってよいカバーと、第１の管腔流体領域であってよい管腔流体領域と、第１の基礎流体領域であってよい基礎流体領域と、を含む。システム２００は更に、第２の装置１０２Ｂを含み、これは、第２の管腔リザーバと、取付位置にあるときに第２の管腔流体領域を画定する第２のカバーと、第２の管腔リザーバをその中で受けて第２の基礎流体領域を画定する第２の基礎リザーバと、を含む。第１の組織及び／又は１つ以上の細胞が（例えば、コラーゲン足場１７２の形態（図１Ａ〜１Ｋを参照）で）第１の管腔リザーバで受けられる。第２の組織及び／又は１つ以上の細胞が（例えば、コラーゲン足場１７２の形態（図１Ａ〜１Ｋを参照）で）第２の管腔リザーバで受けられる。第１及び第２の管腔流体領域は互いに流体接続されていて、第１及び第２の基礎流体領域は互いに流体接続されている。
【０１７７】
次に図１３Ｂを参照すると、幾つかの実施形態ではシステム３００が用意される。システム３００は、図１３Ａに関して上述した第１の装置１０２Ａ及び第２の装置１０２Ｂに加えて、第３の装置１０２Ｃを含む。第３の装置１０２Ｃは、第３の管腔リザーバと、取付位置にあるときに第３の管腔流体領域を画定する第３のカバーと、を含む。第３の装置１０２Ｃは更に、第３の管腔リザーバをその中で受けて第３の基礎流体領域を画定する第３の基礎リザーバを含む。第３の組織及び／又は１つ以上の細胞が（例えば、コラーゲン足場１７２の形態（図１Ａ〜１Ｋを参照）で）第３の管腔リザーバで受けられる。第１の装置１０２Ａ、第２の装置１０２Ｂ、及び第３の装置１０２Ｃの各管腔流体領域は、互いに流体接続されている。第１の装置１０２Ａ、第２の装置１０２Ｂ、及び第３の装置１０２Ｃの各基礎流体領域は、互いに流体接続されている。
【０１７８】
幾つかの実施形態では、管腔リザーバ１４０、３４０、４４０の底壁が酸素不透過性部材又は酸素低透過性部材を含んでよい。そのような実施形態では、酸素不透過性部材として、プラスチック（ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、アクリルスチレンアクリロニトリル（ＡＳＡ）、スチレンアクリロニトリル（ＳＡＮ）、ナイロン、ポリカーボネート（ＰＣ）等）、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリフェニレンオキシド、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、アセタールポリマー、アクリル樹脂、エポキシ、熱硬化性ポリエステル樹脂、ポリウレタン、フラン等）、ゴム及びエラストマ（Ｖｉｔｒｏｎ、ポリクロロプレン、ニトリルゴム、ウレタンゴム、天然ゴム、エチレンプロピレンジエンモノマー（ＥＰＤＭ）、フッ化炭素ゴム等）、ガラス（ホウケイ酸塩、ソーダ石灰、石英等）、又は金属（アルミニウム、鋼、ステンレス綱等）があってよい。幾つかのそのような実施形態では、酸素不透過性部材としてガラス（例えば、ガラスカバースリップ）があってよい。
【０１７９】
幾つかの実施形態では、カバー１６０、２６０、３６０、４６０は蓋を含んでよく、蓋は、上壁と、上壁から下方に延びる少なくとも１つの側壁と、を含み、この側壁は、カバーが取付位置にあるときに管腔リザーバ１４０、３４０、４４０の少なくとも１つの側壁と係合する。幾つかの実施形態では、管腔リザーバ１４０、３４０、４４０の少なくとも１つの側壁の各外面、及びカバー１６０、２６０の少なくとも１つの側壁の内面はねじ山１６４を含み、カバー１６０、２６０は、取付位置にあるときにリザーバ１４０、３４０とねじ係合する。幾つかの実施形態では、管腔リザーバ１４０、３４０、４４０の底壁が酸素透過性材料（例えば、酸素透過性膜）を含む。
【０１８０】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示の装置１００、１０１、１０２、１０３の管腔リザーバ１４０、３４０、４４０は、例えば、ペトリ皿、細胞培養皿、容器（ｖｅｓｓｅｌ）、又は基質であってよい。幾つかの実施形態では、本明細書に開示の装置１００、１０１、１０２、１０３の管腔リザーバ１４０、３４０、４４０は、市販の細胞培養皿、容器（ｖｅｓｓｅｌ）、又は基質であってよい。
【０１８１】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示の装置１００、１０１、１０２、１０３（例えば、管腔リザーバ１４０、３４０、４４０、基礎リザーバ１２０、及びこれらの一部（例えば、カバー、プラグ、キャップ、封止材、ガスケット等））が、ガス（又は非ガス化学物質）勾配を生成すること、又は低酸素状態を生成することの為の任意の適切な材料で構成されてよく、、そのような材料として、プラスチック、ポリエステル、天然ゴム、合成ゴム、エラストマ、ガラス、及び／又は金属があってよく、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、本明細書に開示の装置１００、１０１、１０２、１０３及びこれらの一部を構築する為の材料として、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、アクリルスチレンアクリロニトリル（ＡＳＡ）、スチレンアクリロニトリル（ＳＡＮ）、ナイロン、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリフェニレンオキシド、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、アセタールポリマー、アクリル樹脂、エポキシ、熱硬化性ポリエステル樹脂、ポリウレタン、フラン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、シリコーンゴム、ＶＩＴＯＮ（商標）、ポリクロロプレン、ニトリルゴム、ウレタンゴム、天然ゴム、エチレンプロピレンジエンモノマー（ＥＰＤＭ）、フッ化炭素ゴム、ホウケイ酸塩、ソーダ石灰、石英、アルミニウム、鋼、ステンレス綱、又はこれらの任意の組み合わせがあってよく、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、プラグ（例えば、リリースポートプラグ２６８）が、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含んでよい。
【０１８２】
幾つかの実施形態では、のコラーゲン足場（これは任意の適切な細胞支持構造又は足場であってよい）は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料を含んでよく、そのような材料として、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸、ヒアルロン酸、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマウス肉腫細胞から分泌されたゼラチン質タンパク質混合物（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）、ＭａｘＧｅｌ（商標）等）、及び／又は市販の細胞基質（例えば、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）  ＣＴＳ（商標））、並びにこれらの任意の組み合わせ（例えば、コラーゲン／Ｍａｔｒｉｇｅｌ混合物）があり、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、天然ポリマー、合成ポリマー、及びハイブリッドヒドロゲルからのヒドロゲルを使用して、２次元又は３次元の足場を作成してよい。天然ポリマー及び合成ポリマーの例として、キトサン、アガロース、アルギネート（例えば、ＡｌｇｉＭａｔｒｉｘ（登録商標））、フィブリン、シルク、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリル酸ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、合成ペプチド、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド、及び／又はポリアクリルアミド、及び／又はこれらの任意の組み合わせがあり、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、足場の表面は、ＥＣＭ分子、天然又は合成ポリマー、又は合成ペプチド（ポリエルリジン、ＲＧＤペプチド、及び他の、ペプチド断片を認識するインテグリンを含み、これらに限定されない）のいずれか１つ、又はこれらの組み合わせとの細胞粘着を促進するように設計されてよい。幾つかの実施形態では、本開示に有用な細胞支持構造は、細胞材料（免疫細胞、又は他の細胞型、組織、血液）又は非細胞材料（薬品、ポリマービード、磁性粒子等）と混合されてよい。幾つかの実施形態では、装置１００、１０１、１０２、１０３の細胞支持構造は、２次元又は３次元のマイクロパターン又はマイクロ構造を含んでよい。
【０１８３】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示の装置１００、１０１、１０２、１０３はマイクロ流体デバイスのサブコンポーネントであってよく、マイクロ流体デバイスは、他の器官系に組み込まれてよく、或いは単一組織の為のスタンドアロンデバイスとして動作してもよい。
【０１８４】
図１４Ａ〜１４Ｃは、細胞（例えば、結腸細胞）による、培地（表２）における酸素消費レート（ＯＣＲ）を測定するように構成された装置（全体で５００）を示す。装置５００はハウジング５１０を含む。装置５００は、その上面５１８に形成された第１の通路５１６を含む。装置５００は更に、その一側面５１４に形成された第２の通路５１２を含む。第１の通路と第２の通路５１２は、ハウジング５１０内を軸方向に延びて、ハウジング５１０の内部で互いに交差する。有利なことに、第１の通路５１６及び第２の通路５１２は、交差点を過ぎた後に、細胞１７０と攪拌棒５８２が十分離れて配置されることを可能にするのに十分な距離だけ延びる。幾つかの実施形態では、第１の通路５１６及び第２の通路５１２の末端は、ハウジング５１０の外面と面一ではないが近接しており、従って、これらは、ハウジング５１０のほぼ全厚にわたって延びているが、その全厚いっぱいには延びてはいない。第１のカバー５４０Ａ及び第２のカバー５４０Ｂが与えられて、第１の通路５１６及び第２の通路５１２の入口においてガスケット５５０と封止係合される。
【０１８５】
第１の通路に細胞１７０が挿入され、幾つかの実施形態では、細胞１７０は、重力の方向に従ってそこに定着することを可能にされてよい。細胞が、正常酸素圧条件下で増殖培地（ＥＭ）により６日間、装置５００内で培養されることを可能にすることが有利である。その後、細胞は、幾つかの実施形態では、分化培地（ＤＭ）において更に４日間、装置５００内で培養されてよい。その後、装置５００は９０度回転されて、撹拌棒５８２（本明細書の別の箇所で説明するように任意の好適な攪拌装置であってよい）がハウジング５１０の第２の通路に挿入される。装置５００は、酸素センサがカバー５４０Ｂを貫通して延びている状態で封止されて、攪拌プレート上に置かれてよく、これによって、ハウジング５１０内の第１の通路５１６及び第２の通路５１２の中にある培地が均一に攪拌される。幾つかの実施形態では、酸素センサは光ファイバ酸素センサである。酸素濃度は、ハウジング５１０内で酸素センサによって２４時間にわたって有利に測定される。
【０１８６】
幾つかの実施形態では、本開示は、低酸素状態下で生体細胞及び／又は組織構成物を作成する方法を提供し、本方法は、本明細書に開示の装置を用意するステップと、細胞支持構造上に配置された１つ以上の細胞及び／又は組織を培養して、細胞／組織がその下で増殖する低酸素状態を生成するステップと、を含む。低酸素状態は、カバーが取付位置にあるときに、管腔リザーバ内の細胞支持構造上の１つ以上の細胞及び／又は組織が酸素を消費することによって生成される。
【０１８７】
幾つかの実施形態では、本開示は、低酸素状態下で１つ以上の細胞及び／又は組織を培養する方法を提供し、本方法は、本明細書に開示の装置を用意するステップと、細胞支持構造上に配置された１つ以上の細胞及び／又は組織を培養して、細胞／組織がその下で増殖する低酸素状態を生成するステップと、を含み、低酸素状態は、カバーが取付位置にあるときに、管腔リザーバ内の細胞支持構造上の１つ以上の細胞及び／又は組織によって生成される。
【０１８８】
幾つかの実施形態では、本開示は、細胞支持構造全体にわたって（例えば、細胞支持構造上に配置された１つ以上の細胞及び／又は組織を通って垂直に）ガス勾配を生成する方法を提供し、本方法は、本明細書に開示の装置を用意するステップと、細胞支持構造上に配置された１つ以上の細胞及び／又は組織を培養して、細胞支持構造全体にわたる（例えば、高から低、又は低から高の）ガス勾配を生成するステップと、を含む。
【０１８９】
本開示の装置、デバイス、システム、及び方法は、多用途であって、異なる複数の用途に向けた実装が容易であり、そのような用途として例えば以下のものがあり、これらに限定されない。
１）生理学的研究（細胞間の高分子、イオン、及び水の輸送、酵素の機能、細菌との相互作用）の為のインビトロモデル。
２）薬品、生物学的製剤、食品化合物、毒素、突然変異原、発がん物質、病原体、ウイルス、微生物叢等のスクリーニング。
３）翻訳動物モデル又はヒトから抽出された幹細胞及び／又は初代細胞を使用することによる病気モデル。
４）薬品、食品化合物等の包括的用量反応特性を含むスクリーニングの為の薬理学モデル、薬物動態学モデル、及び薬力学モデル。
５）代謝を研究する為のインビトロモデル。
６）バリア機能を維持及び修復する上皮組織の創傷治癒のインビトロモデル。
７）微生物とホストの相互作用の研究の為のインビトロモデル。
８）損傷した上皮を修復する移植の為の組織設計。
９）特定の遺伝的背景を有する個々の患者からの細胞に対して実施された研究によるオーダーメード医療。
１０）機能アッセイ（水及び電解質（ナトリウム、塩化物、重炭酸塩、プロトン、カリウム、カルシウム）、微生物由来代謝産物（短鎖脂肪酸等）の吸収及び輸送、未吸収栄養素の回収等）。
１１）（例えば、嚢胞性線維症における）粘液の生成、流れ、移動、及び粘液に対する病気関連の影響。
１２）便秘に対する下痢止めの薬剤及び治療（例えば、緩下剤）のアッセイ。
１３）シンバイオティクス、プレバイオティクス、及びプロバイオティクスのアッセイ。
１４）Ｘ線不透過性マーカ及びシンチグラフィマーカ検査、並びに上皮に対するそれらの影響のアッセイ。
１５）上皮に対する免疫細胞及びそれらの生成物（抗体及びサイトカイン）の影響。
１６）上皮に対する腸神経細胞及びそれらの生成物の影響。
１７）上皮に対する筋肉細胞、それらの収縮及び弛緩、並びにそれらの代謝産物の影響。
１８）水溶性繊維及び不溶性繊維、並びに上皮に対するそれらの影響のアッセイ。
１９）任意のタイプのけがに対する反応としての上皮の修復の理解。
２０）偽膜形成（例えば、クロストリジウムディフィシル）につながる細菌の調査。
２１）生物兵器化合物のスクリーニング。
２２）ＮＳＡＩＤ療法、化学療法、放射線療法等の薬品及び療法の副作用を理解する研究。
２３）上皮の完全性、機能、及び病気（例えば、炎症性大腸炎、腸疾患、がん等）に対する自然免疫系及び適応免疫系の役割の研究。
２４）オフターゲット効果を向上させる放射線療法及び化学療法並びに薬剤のアッセイ。
２５）液状がん（例えば、白血病や骨髄腫）及び／又は固体がん（例えば、黒色腫、がん腫、肉腫、リンパ腫、胚細胞腫瘍、及び／又は混合がん）を包含する低酸素状態又は時間及び／又は空間における酸素勾配を模倣する腫瘍モデル。
２６）抗菌剤、抗ウイルス薬、及び／又は抗真菌薬のアッセイ。
２７）片利共生細菌及び病原性細菌に対するバクテリオファージの効果、並びにそれらとホスト細胞との相互作用を理解する研究。
２８）グラム陰性菌、グラム陽性菌を包含するグラム陽性細菌感染及び／又はグラム陰性細菌感染のインビトロモデル系。そのような細菌として、アシネトバクターバウマニー、イスラエル放線菌、炭疽菌、バクテロイデスフラジリス、バルトネラヘンセラ菌、百日咳菌、ボレリアブルグドルフェリ、ボレリアガリニ、ボレリアアフゼリ、ボレリアレカレンチス、ウシ流産菌、イヌ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、類鼻疽菌、カンピロバクタージェジュニ、クラミジアニューモニエ、クラミジアトラコマチス、オウム病クラミジア、ボツリヌス菌、クロストリジウムディフィシル、クロストリジウムパーフリンジェンス、破傷風菌、コリネバクテリウムアミコラトゥム、ジフテリア菌、コクシエラバーネッティ、エーリキアカニス、エーリキアシャフェンシス、大便連鎖球菌、エンテロコッカスフェシウム、大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、病原性大腸菌、侵入性大腸菌、腸管出血性大腸菌、野兎病菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクターピロリ、肺炎桿菌、レジオネラニューモフィラ、レプトスピラ種、リステリア菌、ハンセン菌、ヒト型結核菌、肺炎マイコプラズマ、淋菌、髄膜炎菌、パラクラミジア、緑膿菌、ノカルジアアステロイデス、ロッキー山紅斑熱リケッチア、サルモネラ菌、シゲラ菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、腐性ブドウ球菌、Ｂ群溶血性連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、ビリダンス型連鎖球菌、梅毒トレポネーマ、コレラ菌、ビブリオバルニフィカス、及び／又はエルシニア菌があってよく、これらに限定されない。
２９）二本鎖ＤＮＡウイルス、一本鎖ＤＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス、プラス鎖ＲＮＡウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、円形一本鎖ＲＮＡウイルス、ＲＮＡ逆転写ウイルス、ＤＮＡ  逆転写ウイルスを含むウイルスによる感染を理解する為のインビトロ培養システム。そのようなウイルスとして、シンプレックスウイルス、バリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ロゼオロウイルス、リンホクリプトウイルス、ラディノウイルス、マストアデノウイルス、アルファパピローマウイルス、ベータパピローマウイルス、ガンマパピローマウイルス、ミューパピローマウイルス、ニューパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、モラスキポックスウイルス、オルトポックスウイルス、パラポックスウイルス、アルファトルクウイルス、ベータトルクウイルス、ガンマトルクウイルス、ゲミサーキュラーウイルス、エリスロウイルス、ディペンドウイルス、ボカウイルス、コルティウイルス、ロタウイルス、セドルナウイルス、ヘペウイルス、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、トロウイルス、マムアストロウイルス、ノロウイルス、サポウイルス、フラビウイルス、ヘパシウイルス、ペギウイルス、カルジオウイルス、コサウイルス、エンテロウイルス、ヘパトウイルス、コブウイルス、パレコウイルス、ロサウイルス、サリウイルス、アルファウイルス、ルビウイルス、デルタウイルス、リッサウイルス、ベシクロウイルス、フィロウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、パラミクソウイルス、ヘニパウイルス、モービリウイルス、レスピロウイルス、ルブラウイルス、メタニューモウイルス、ニューモウイルス、アレナウイルス、ペリブニヤウイルス、オルトブニヤウイルス、ハンタウイルス、ナイロウイルス、フェヌイウイルス、フレボウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、トゴトウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、レンチウイルス、スプーマウイルス、及び／又はオルトヘパドナウイルス等があり、これらに限定されない。
３０）低酸素状態を必要とするワクチンを生成する為のインビトロ培養システム。
３１）原虫感染症（例えば、赤痢アメーバ、クリプトスポリジウムパルバム、クリプトスポリジウムホミニス、サイクロスポーラカエタネンシス、及び／又はランブル鞭毛虫）の為のインビトロ培養システム。
３２）単細胞及び／又は多細胞真菌感染症の為のインビトロ培養システムである。そのような菌類は、コウジカビ属、ブラストミセス属、カンジダ属、コクシジオイデス属、クリプトコッカスネオフォルマンス属、クリプトコッカスガッティ、ヒストプラスマ属、クモノスカビ属、ケカビ属、リクテイミア属、ニューモシスティスジロヴェチ、及び／又はスポロトリクス属の菌類である。
３３）抗バイオフィルム薬剤によるバイオフィルムの形成、成長、拡散、及び／又は崩壊のモデル。及び／又は、
３４）（空間又は時間における）酸素勾配又は低酸素状態を必要とするモデル系、又はそれらの系の組み合わせ。そのようなものとして、毛包ニッチ、脳卒中後の脳低酸素症、シアン化物中毒、ディッシュシステムの傷痕、線維症及び創傷の治癒、網膜症、角膜の酸素不足及び血管新生、歯周炎、上下気道モデル、細気管支炎、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺炎（細菌感染、ウイルス感染、マイコプラズマ感染）、間質性肺炎、肺水腫、低酸素性肺血管収縮反応モデル、肝臓組織モデル、肝再生、肝線維症、ウイルス性肝炎、脂肪肝疾患、腎症、腎炎、骨の成長と再生、軟骨再生、骨髄、骨折治癒機転モデル、血栓症、造血幹細胞ニッチ、鎌状赤血球病を含む貧血、運動中の筋肉のモデル、生殖器官モデル、子宮内膜症、子宮内低酸素症を含む胎盤発育モデル、胚発生モデル、虚血（心虚血、腸管虚血、脳虚血、肢虚血、皮膚虚血）及び虚血再灌流障害モデル、麻酔、及び／又は肥満モデルがある。
【０１９０】
実施例
ここからは、以下の実施例を参照しながら本開示を説明する。当然のことながら、これらの実施例は、請求項の範囲を本開示に限定することを意図しておらず、どちらかと言えば、特定の実施形態の例示となることを意図している。例示した方法に対して当業者であれば思いつくであろう任意の変形形態が本開示の範囲に収まるものとする。
【０１９１】
実施例１〜９の為の材料及び方法
ねじ式チャンバ及びプラグの製作。細胞チャンバカセット及びプラグの製作を、コンピュータ数値制御（ＣＮＣ）フライス盤を使用してポリカーボネートスラブをフライス削りして行った。細胞チャンバは、細胞増殖面積が市販の１２ウェルＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｉｎｃ．）、米国ニューヨーク州コーニング）培養インサートと同じになるように設計した。管腔側を効率的に封止する為に、細胞チャンバ及びプラグにねじ山を付けた（Ｍ１２×１．７５）。細胞チャンバ及びプラグにはプラズマ処理を５分間施した。次に、３Ｍ両面医療テープ（＃１５０４ＸＬ、３Ｍ、米国ミネソタ州メープルウッド）を使用して、細胞チャンバカセットの底部に多孔質膜（ＢＧＣＭ０００１０、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、米国マサチューセッツ州バーリントン）を貼り付けた。
【０１９２】
細胞チャンバ内で細胞を培養する前に、デバイス内にコラーゲン足場を用意して、既存の報告５４に若干修正を加える形で細胞播種を行った。最初に、１２ウェルプレートの上にデバイスを置き、ラット尾コラーゲンＩと中和緩衝液とを混合して最終濃度を１ｍｇ／ｍＬとし、これを３７℃で１時間インキュベートして、コラーゲンゲル（２５０μＬ）を形成した。次に、０．５ｍＬのＰＢＳを管腔側（デバイス）に加え、１．５ｍＬのＥＤＣ：ＮＨＳ：ＭＥＳ緩衝液（０．６ＭのＥＤＣを水に入れ、０．１５ＭのＮＨＳを水に入れ、０．１ＭのＭＥＳを水に入れ、ｐＨ５、体積比１：１：１としたもの）を基礎側（ウェルプレート）に加え、２５℃で１時間インキュベートして、コラーゲンゲルを底部側から架橋した。コラーゲンゲル中に残ったＥＤＣ及びＮＨＳを、２５℃で少なくとも１６時間、水に浸けて除去した。結果として得られた、チャンバ内の部分架橋されたコラーゲンを７０％エタノールで（少なくとも５分間）滅菌し、ＰＢＳで入念に洗浄してから細胞播種を行った。
【０１９３】
本明細書に記載のように細胞を用意してからプラグを取り付けた。管腔培地を加え（０．４ｍＬ）、次にプラグを回して取り付けた。回している間に、プラグと培地との間にトラップされた空気がプラグの穴から放出された。次に、その穴をＥＰＤＭゴムキャップ（外径０．０２０インチ）で封止した。
【０１９４】
検定力分析。Ｇ＊Ｐｏｗｅｒアプレット５６（バージョン３．１．９．２）を使用して検定力分析５５を実施して、好気条件下での細胞挙動と嫌気条件下での細胞挙動とを区別する為に必要とされる最小試料サイズを計算した（ここでは酸素勾配における細胞挙動がこれら２つの組み合わせになると仮定している）。この分析の為の予備データとして、２４ウェルプレートの中和コラーゲン上で増殖し、好気条件又は嫌気条件のいずれかに曝されたヒトの結腸上皮細胞の増殖細胞集団を使用した。細胞を細胞外マトリックス（ＥＭ）で４日間、好気的に増殖させ（培地交換は２日おき）、その後、４日目に、細胞をＥＭで更に２日、好気的又は嫌気的に増殖させた。増殖細胞を標識するために、５日目に、５−エチニル−２'−デオキシウリジン（ＥｄＵ）を好気的又は嫌気的にパルス標識した。６日目に、細胞を４％のＰＦＡで固定し、ＥｄＵ及びＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２に関して染色した（後述）。次に、ＮＩＫＯＮ（登録商標）  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ３００反転落射蛍光顕微鏡（ニコン（Ｎｉｋｏｎ，  Ｉｎｃ．）、米国ニューヨーク州メルビル）に、ＥｄＵ用としてＣｙ５フィルタ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２用としてＤＡＰＩフィルタを付けて細胞を画像化した。好気条件下及び嫌気条件下でのＥｄＵ陽性細胞の割合は、平均がそれぞれ０．５５及び０．０６であり、標準偏差がそれぞれ０．０４４及び０．０２９であり、結果として試料サイズは２（α＝０．０５、検定力（１−β）＝０．９５）であった。
【０１９５】
全てのグラフにおいて、バー及びエラーバーは平均値及び標準偏差を示す。本研究では全ての統計分析に一元配置分散分析を用いた。
【０１９６】
ヒト結腸上皮細胞培養。本研究では、異なる２つの採取源からのヒト初代結腸上皮細胞を使用した（１つは生検標本から採取し、もう１つは死体ドナーから採取した）。既述のように、６ウェルプレートのコラーゲンゲル上の増殖培地に結腸陰窩を隔離して増殖させた５７。コラゲナーゼを使用してコラーゲンを消化し、その後、０．５ｍＭのＥＤＴＡを使用して細胞を解離することによって、細胞を５〜７日おきに１６継代まで継代培養した。７継代及び１５継代での細胞の染色体分析により、細胞の染色体が正常であることが確認された。
【０１９７】
全てのヒト細胞をＣＯ２インキュベータ内で３７℃で培養した。ヒト結腸細胞を増殖培地（０．５ｍＬ／２．５ｍＬ）で６日間増殖させて（培地交換は１日おき）、集密的単層を形成した。６日目に、培地を除去し、管腔培地をＤＭに切り換え、基礎培地を、増殖細胞集団の維持の為にＤＭ／ＳＭ（０．４ｍＬ／３ｍＬ）条件のＳＭに切り換え、更なる分化した細胞をモデル化する為にＤＭ／ＤＭ（０．４ｍＬ／３ｍＬ）のＤＭに切り換えた。次に、細胞を更に４日間インキュベートした（培地交換は１日おき）。１０日目に、管腔の低酸素状態を誘導する為にチャンバにプラグを取り付け、細胞を更に２日間インキュベートし、１２日目に後述のようにアッセイした。同様の好気性培養試料を用意した。これは、プラグを使用しない点と、管腔培地を空気に曝している点だけが異なっていた。嫌気性対照として同じ培地を、嫌気性培養の前に脱酸素化して酸素レベルを１％未満まで下げた。窒素ガスを３０分間パージしたプラスチック環境チャンバ内、又は５％のＣＯ２と９５％のＮ２とで満たされた嫌気性チャンバ内の、酸素が１％未満である嫌気性環境で培地を交換し、その後、水和用の水５０ｍＬを収容し、嫌気性混合ガス（５％のＣＯ２、１０％のＨ２、８５％のＮ２）で満たされたグラスロック容器内に細胞を配置した。各条件下の培養の２日が経過した後、ボルトオームメータ（ＥＶＯＭ２、ワールドプレシジョンインスツルメンツ（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、米国フロリダ州）及び箸型電極を使用して経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定した。
【０１９８】
酸素検知。Ｍｉｃｒｏｘ４酸素センサ（プレセンス・プレシジョン・センシング・ゲーエムベーハー（ＰｒｅＳｅｎｓ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  ＧｍＢＨ）、独国レーゲンスブルク）にニードル型酸素プローブ（ＮＴＨ−ＰＳｔ７、プレセンス・プレシジョン・センシング・ゲーエムベーハー（ＰｒｅＳｅｎｓ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  ＧｍＢＨ））  を取り付け、製造元の手引き書に従って、酸素レベルを測定した。プラグを取り付けることで管腔に低酸素状態が引き起こされた直後の管腔培地における酸素レベルを特性化する為に、プラグの中央の穴を通り抜けてプラグの１ｍｍ下にセンサを配置した。基礎培地の酸素測定の為に、ポリカーボネートスラブをフライス削りし、底部から７ｍｍ上方の壁に穴を開けて、酸素測定用のニードル型酸素プローブを取り付けられるようにした、市販の１２−ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）と同サイズのウェルを収容する基礎容器を製作した。この測定は、温度を手動で３７℃に設定した上で少なくとも１６時間にわたって５分おきに行った。
【０１９９】
生存度。０．５ｍＬのＰＢＳに入った２μＭのヨウ化プロピジウム及び１２．５μＭのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を管腔側に加えて３０分間インキュベートした。標識された細胞を生検パンチ（５ｍｍ径）でパンチし、スライドガラス上に移して、パンチされた範囲全体をオリンパスＦＬＵＯＶＩＥＷ（登録商標）  ＦＶ３０００（Ｒ）共焦点顕微鏡（１０Ｘレンズ、オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、日本国東京都）で画像化した。その際、ヨウ化プロピジウムとＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を励起する為に、それぞれに５６１ｎｍと４０５ｎｍのレーザを使用した。
【０２００】
ヒポキシプローブ染色。２００μＭのピモニダゾール（ヒポキシプローブ（ＨＹＰＯＸＹＰＲＯＢＥ）（登録商標）、ＨＰ１−１００Ｋｉｔ、ヒポキシプローブ（Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ，  Ｉｎｃ．）、米国マサチューセッツ州バーリントン）を基礎培地に加えて、各酸素条件に曝された細胞を２時間インキュベートした。次に細胞を、３％のグリオキサールを入れたＰＢＳ（ｐＨ５）により、−２０℃で２０分間、２５℃で１０分間固定し、０．５％のトリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を入れたＰＢＳにより、２５℃で２０分間透過処理し、その後、３％のＢＳＡを入れたＰＢＳにより、２５℃で１時間ブロックした。ピモニダゾール（ヒポキシプローブ（ＨＹＰＯＸＹＰＲＯＢＥ）（登録商標）、ＨＰ１−１００Ｋｉｔ）に対するマウス抗体を、３％のＢＳＡを入れたＰＢＳで１：５０に希釈し、４℃で少なくとも１５時間インキュベートした。そして、３％のＢＳＡを入れたＰＢＳで細胞を３回洗浄し、次に、３％のＢＳＡで１：５００に希釈されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（１：５００、７１５−６０５−１５０、ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）、米国ペンシルベニア州ウェストグローブ）でコンジュゲートされた抗マウス抗体により、２５℃で１時間インキュベートした。最後に、３％のＢＳＡを入れたＰＢＳで細胞を２回洗浄し、その後、ＰＢＳで洗浄した。画像化においては、細胞及びコラーゲンゲルをピンセットで拾い上げ、スライドガラス上に移して、オリンパスＦＬＵＯＶＩＥＷ（登録商標）  ＦＶ３０００（Ｒ）共焦点顕微鏡（オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、日本国東京都）で画像化した。その際、励起の為に６４０ｎｍのレーザを使用した。
【０２０１】
免疫蛍光染色及びＥｄＵ染色。細胞を、ＺＯ−１染色の為にグリオキサール溶液で固定し、他の標的の染色と凍結切片法の為に４％のパラホルムアルデヒドで１５〜２０分間固定した。次に、固定された試料を、０．５％のトリトンＸ−１００を入れたＰＢＳにより２０分間透過処理し、３％のＢＳＡを入れたＰＢＳにより、２５℃で１時間ブロックし、その後、一次抗体により、４℃で少なくとも１５時間インキュベートした。ＭＵＣ２（ＳＣ−５１５０３２、サンタクルズバイオテクノロジ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．）、米国テキサス州ダラス）、ＺＯ−１（２１７３３−１−ＡＰ、プロテインテックグループ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｉｎｃ．）、米国イリノイ州ローズモント）、エズリン（ＰＡ５−１７５１８、サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、米国マサチューセッツ州ウォルサム）の一次抗体を、３％のＢＳＡで１：２００に希釈し、４℃で一晩中インキュベートした。次に細胞を、３％のＢＳＡを入れたＰＢＳで３回洗浄し、次に、３％のＢＳＡを入れたＰＢＳで１：１００に希釈された蛍光体（ＭＵＣ２用Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ロバ抗マウス（ジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、７１５−５４５−１５０）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４ロバ抗ウサギＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｒ３７１１９））でコンジュゲートされた二次抗体により、２５℃で１時間インキュベートした。必要な場合には、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（最終濃度は２μＭ）に核染色用の二次抗体を加えた。最後に細胞を、３％のＢＳＡで２回洗浄し、その後、ＰＢＳで洗浄した。
【０２０２】
増殖細胞を標識する為に、５−エチニル−２'−デオキシウリジン（ＥｄＵ）を２４時間パルス標識し、製造元のプロトコル（Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）  ＥｄＵ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７イメージングキット、Ｃ１０３４０、サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）（米国マサチューセッツ州ウォルサム））に従って染色した。基礎培地にＥｄＵ（１０μＭ）が存在する中で細胞を２４時間インキュベートした。細胞を、４％のパラホルムアルデヒドにより２５℃で１５分間固定し、０．５％のトリトンＸ−１００を入れたＰＢＳにより２０分間透過処理した。細胞ＤＮＡに組み込まれたＥｄＵを、製造元のプロトコルに従って、Ｃｙ５でコンジュゲートされたアジドにより２５℃で１時間染色した。画像化においては、細胞を、生検パンチ（５ｍｍ）でパンチするか、ピンセットで拾い上げ、スライドガラス上に移して、オリンパスＦＬＵＯＶＩＥＷ  ＦＶ３０００（Ｒ）共焦点顕微鏡で画像化した。その際、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ｃｙ５を励起するために、それぞれに４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、６４０ｎｍのレーザを使用した。
【０２０３】
細菌共培養。Ｃ．ディフィシル共培養については、ヒト結腸上皮細胞をＬＧＧ共培養用試料として１０日間増殖させた。その後、１０日目に、植菌の前に培地を交換した。ここで、酸素勾配試料については、嫌気性ガス（＜１％Ｏ２）中で事前に平衡化されたＤＭを管腔側に加え、プラグを嫌気性チャンバに取り付けた。ブレインハートインフュージョンソルト（ＢＨＩＳ）培地の単一コロニーから開始されたＣ．ディフィシルの一晩培養物をＢＨＩＳで１：１００に希釈し、その後、全ての酸素条件において、４μＬを嫌気性チャンバ内でヒト結腸上皮細胞の管腔側に植菌した。植菌の結果は約１×１０４ＣＦＵ／ｍＬであった。次に、好気性及び酸素勾配試料を嫌気性チャンバから取り出して、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃で好気的にインキュベートした。培地の蒸発を防ぐ為に５０ｍＬの水を入れたグラスロック容器内で、嫌気性試料を嫌気性チャンバ内で３７℃でインキュベートした。６時間及び２４時間の共培養の後、上澄み及びコラーゲンゲルをヒト細胞とともに微小遠心管に収集し、その後、コラゲナーゼを使用してコラーゲンゲルを３７℃で１５分間消化した。その後、溶液を３回激しくボルテックスし、ＢＨＩＳ寒天プレート上に平板培養した。
【０２０４】
走査電子顕微鏡法。共培養試料を、４％のパラホルムアルデヒドで４０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、その後、水に対するエタノールの比率を徐々に高めたエタノール水溶液で洗浄し、最後には１００％エタノールで洗浄することによって脱水した。次に試料を、臨界点乾燥機で乾燥し、スパッタコータ（クレシントン・サイエンティフィック・インスツルメンツＵＫ（Ｃｒｅｓｓｉｎｇｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＵＫ）、英国ワトフォード）を使用して１５ｍｍのプラチナでコーティングし、ＳＥＭ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓ−４７００、日立ハイテクノロジーズアメリカ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈｉｇｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｍｅｒｉｃａ，  Ｉｎｃ．）、米国イリノイ州シャンバーグ）で観察した。
【０２０５】
実施例１
多孔質支持構造を含むカセットにおいて低酸素状態を確立する
この実施例では、多孔質支持構造を含むカセット（例えば、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）  インサート、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｉｎｃ．）、米国ニューヨーク州コーニング）においてＰＤＭＳプラグを使用して低酸素状態を確立する方法を説明する。図２Ａは、本明細書に開示のデバイスにおける酸素飽和度の計算結果を示す。このモデリングを裏付けるために、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を、市販の１２ウェルＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）インサート（Ｆａｌｃｏｎ）の上部と内径が同じである円筒形ポリカーボネート（ＰＣ）モールドに成形して円筒形プラグを製作した。このモールドの中にＰＤＭＳ（Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４シリコーンエラストマ）混合物を加え、９５℃で２０分間（図２Ｂのプラグ１）又は７０℃で２時間（図２Ｂのプラグ２）硬化させた。硬化したＰＤＭＳプラグをモールドから分離し、使用前に７０％のエタノールで消毒した。結果として得られたＰＤＭＳプラグは長さが１５〜２０ｍｍであり、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）インサートの中にぴったり嵌まった。
【０２０６】
細胞を平板培養する前に、１２ウェルＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）インサートにコラーゲンゲルを足場として形成した。これは、中和ラット尾コラーゲンＩ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）をインサートごとに２００μＬ加えて、３７℃で１時間インキュベートすることにより行った。次に、ＥＤＣとＮＨＳをＭＥＳ緩衝液に入れた混合物（０．６ＭのＥＤＣ：０．１５ＭのＮＨＳ：０．１ＭのＭＥＳ緩衝液＝１：１：１（体積比））をウェルプレートに加え、ＰＢＳをインサート内に加えて、インサート内の中和コラーゲンゲルを化学架橋した。これにより、架橋密度がコラーゲンゲルの底部で最大であって上部に向かって減少する架橋密度勾配が形成される（国際特許出願公開第ＷＯ２０１８／０２２５４８号として公開されている国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４３６０１号を参照されたい）。この架橋密度勾配は、ヒト初代結腸細胞が単層として増殖することを促進する。或いは、細胞粘着を促進する為にコラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、又はＭａｔｒｉｇｅｌの薄いコーティングを用いてよい。
【０２０７】
ヒト初代結腸細胞を、自己再生に必須な成分（Ｗｎｔ、Ｒ−スポンディン、ノギン、ＥＧＦ）を含む増殖培地において、コラーゲンゲル上で単層として、集密的になるまで架橋密度勾配で増殖させた。完全な単層が形成された後、細胞を、増殖促進成分がない分化培地で分化させた。分化培地での２日目に、プラグを取り付けてインサートを封止し、管腔側（インサート内部）の酸素レベルを経時測定した。
【０２０８】
測定では、細胞の約１ｍｍ上方にニードル型光学酸素プローブ（ＰｒｅＳｅｎｓ）を配置した。プラグがない場合、インサート内部の酸素レベルは変動したが、１０％酸素を下回ることはなかった。酸素を消費する細胞がない場合には、酸素飽和度は１６％超にとどまった。一方、９５℃で硬化したＰＤＭＳプラグ（高さ２０ｍｍ）を取り付けると（図２Ｂのプラグ１）、酸素飽和度は低下して、２時間以内に細胞近くで１％酸素を下回り、２日間にわたって低いままとなったが細胞生存度は低下しなかった。これにより、細胞の酸素消費によって、インサート内に低酸素状態が生成されるレベルまで酸素が枯渇することが確認された。
【０２０９】
７０℃で硬化した、より短いＰＤＭＳプラグ（１５ｍｍ）を使用した場合（図２Ｂのプラグ２）、細胞近くの酸素飽和度は２時間以内に低酸素状態まで低下したが、最終的な酸素飽和度は２．５％まで低下し、このレベルでとどまった。このことは、プラグの寸法及び材料特性を変えることによって最終的な酸素飽和度を標的化できることを示している。細胞の管腔側が低酸素状態である間、基底外側の培地は外気に開放されており、それによって、酸素が培地内に拡散して細胞の生存及び機能を保証することが可能である。ＰＤＭＳプラグはガス透過性であるが、ＰＤＭＳプラグの高さが非常に大きかった為に、酸素が拡散してプラグを通り抜けるより速く細胞が酸素を消費した。しかしながら、他の設計では、ＰＤＭＳプラグの高さを調整して、細胞が酸素を消費する速さと酸素がチャンバ内を拡散していく速さとをバランスさせることによって、酸素飽和度を０と１６％超の間の任意のレベルにすることが可能である。更に、ＰＤＭＳの酸素透過性は、プラズマ処理４４、ＰＤＭＳモノマー及び架橋剤の比率の変更４５、パリレンによるコーティング２９、シリコン酸化物層の堆積、又は酸素飽和度値が１％を下回ることが達成可能なようにＰＤＭＳに酸素を除去する粒子又は酸素に反応する粒子を加えることによって調節可能である。他のシリコーンエラストマ（ポリビニルメチルシロキサン等）又は他のゴム材料（Ｖｉｔｒｏｎ、ポリクロロプレン、ニトリルゴム、ウレタンゴム、天然ゴム、エチレンプロピレンジエンモノマー（ＥＰＤＭ）、フッ化炭素ゴム等）もプラグとして使用可能である。
【０２１０】
実施例２
自己持続型低酸素環境を生成する
この実施例では、内側にねじ山があるインサートと、これに対応して外側にねじ山があるプラグとを使用して自己持続型低酸素状態を生成する方法を説明する。ポリカーボネートスラブをフライス削りして、ねじ山付きインサートボディ及びねじ山付きプラグを製作した。管腔区画内の酸素飽和度を測定する為のニードル型酸素プローブを挿入する穴（１〜２ｍｍ径）を開けた（図３Ｂ〜３Ｄを参照）。この穴の、ニードルプローブの周囲を、ＰＤＭＳ、エポキシ、又は他の接着剤／シーラントで封止した。インサートの内径及び高さは、市販の１２ウェルプレート用ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）インサート（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｉｎｃ．））の内径及び高さと同じになるように設計した。コラーゲン及び細胞単層を支持する為に、多孔質ＰＥＴ膜（細孔径０．４μｍ、コーニング、コラーゲンの薄いコーティングを使用した場合に使用）又はＰＴＦＥ膜（細孔径０．４μｍ、コラーゲン足場を使用した場合に使用）を管腔チャンバボディの底部に取り付けた。
【０２１１】
細胞培養の前に、異なる２つの方法でコラーゲン層を多孔質膜上に用意した。この多孔質膜を、７０％のエタノールで５分間滅菌し、空気乾燥し、その後、１０μｇ／ｍＬのラット尾コラーゲンＩを入れたＰＢＳにより３７℃で１時間コーティングした。或いは、実施例１で示したように、約２５０μｍ厚の中和コラーゲンゲルをＰＴＦＥ膜上に用意し、管腔区画において架橋した。コラーゲンをコーティングした多孔質膜をＰＢＳで２回洗浄し、次に、ヒト初代結腸上皮細胞を、インサート内でコラーゲン足場に播種し、腸幹細胞の増殖に必須な成分（Ｗｎｔ、Ｒ−スポンディン、ノギン、ＥＧＦ）を含む増殖培地において完全に集密的になるまで増殖させた。６日目に、管腔チャンバ内及びウェルプレート内の培地を、細胞分化を誘導する増殖促進成分を含まない分化培地に切り替えた。７日目又は８日目に、ねじ山付きプラグを取り付けてインサートを封止して、外部からの酸素流入を遮断した。その後、細胞の酸素消費によって上皮の管腔側の酸素飽和度が低下するはずである。管腔培地の酸素飽和度を、ニードル型酸素プローブ（ＰｒｅＳｅｎｓ）で経時測定した。プローブは、細胞の約８ｍｍ上方に配置した。図３Ａは、細胞が薄いコラーゲンコーティング上にある場合と厚いコラーゲン足場上にある場合の、４０時間にわたる管腔培地の酸素レベル変化を示す。
【０２１２】
低酸素状態は、上皮の上方の管腔培地の体積全体にわたって６時間以内に確立され、視認できる細胞生存度の低下がないまま２日間にわたって維持された。更に、細胞の下の足場によって、管腔培地内の低酸素状態が確立する速さ、並びに最終的な酸素飽和度が大きく変わる。これは、１つには足場上の細胞数の違いによるものであり、多孔質膜上に用意された場合に、コラーゲンゲル上の細胞密度（図３Ｆ）が薄いコラーゲンコーティング上の細胞密度（図３Ｅ）より高い為である。これらのデータは、プラグの細胞数又は高さを変えることによって最終的な酸素飽和度を調節できることを示している。
【０２１３】
管腔区画及び基礎区画に必須増殖因子（ＥＧＦ、ノギン、Ｒ−スポンディン、Ｗｎｔ、即ち、ＥＮＲＷ培地）が存在する中で、上述と同じ方法で同じ寸法のインサートに用意されたコラーゲン足場上でマウス初代結腸細胞を４日間増殖させた。４日目に、培地を取り出して、管腔区画では、ＥＧＦ、ノギン、及びＲ−スポンディンを含むがＷｎｔを含まないＥＮＲ培地に置き換え、基礎区画ではＥＮＲＷ培地に置き換えて、細胞層全体にわたるＷｎｔ勾配を生成し、１日の間インキュベートした。５日目に、管腔培地及び基礎培地を新鮮な培地（管腔培地としてＥＮＲ、基礎培地としてＥＮＲＷ）に切り替え、ねじ山付きプラグを投入して、上述のように管腔低酸素状態を生成した。対応する、プラグがない好気性対照試料も並行して用意した。
【０２１４】
図４Ａは、酸素飽和度が低下して４時間で物理的低酸素状態（２〜９％）４６に達し、１２時間以上にわたってその範囲にとどまっていることを示している。管腔低酸素状態で２日が経過した後、管腔低酸素状態に曝された細胞の管腔培地と、これに対応する好気性対照とを集めて、管腔培地に分泌されたムチン２の量を比較し、それらの細胞を固定して、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性（吸収性大腸上皮細胞マーカ）、ムチン２（杯細胞マーカ）、及び核ＤＮＡ（全ての細胞のラベル付け用）に関して染色した。分泌されたムチン２の量に顕著な差はなかった（図４Ｂ）。細胞結合ムチン２の豊富さに差はなかったが、管腔低酸素状態に曝された細胞のＡＬＰ活性は好気性対照のＡＬＰ活性より高かった。これらのデータは、マウス細胞及びヒト細胞において管腔低酸素状態を生成すること、並びに生理学的低酸素状態が細胞挙動（例えば、細胞分化、タンパク質の発現、又は酵素活性）にどのように影響するかを観察して理解することに、このプラットフォームが使用できることを示している。
【０２１５】
管腔リザーバの最終的な酸素飽和度、及び低酸素状態に達するまでの時間は、管腔リザーバの体積を変更したり、細胞代謝を変化させたりすることによって操作できる。管腔区画と底部ウェルの両方にある同じ分化培地においてヒト初代結腸上皮細胞の約２ｍｍ上方で測定された、より小さい管腔区画（管腔体積で０．５ｍＬ）の酸素飽和度（図５Ａ、条件１、一番下の曲線）は、より長い管腔リザーバで測定された酸素飽和度より速く低下しており、このことは、区画の寸法を変更することによって酸素飽和度を操作できることを示している。腸上皮細胞の増殖の為の増殖因子を管腔リザーバに加えた場合（図５Ａ、条件３、真ん中の曲線）又は管腔リザーバ及び基礎リザーバの両方に加えた場合（図５Ａ、条件２、一番上の曲線）、酸素レベルの低下がゆっくりになり、最終的な酸素飽和度は高くなった。これらのデータは明らかに、培地組成を変更して代謝活性を変化させることによって管腔酸素飽和度を調節できることを示している。
【０２１６】
このデバイス構成では、管腔酸素が約１時間で急速に枯渇した頃に、細胞層の下の酸素が減少し始めたが、まもなく、培地内を拡散する酸素と細胞によって消費される酸素とが平衡する定常状態に達した。その結果、細胞には細胞層全体にわたって酸素勾配が生成された。プラグなしの好気性対照とプラグありの管腔低酸素状態とにおいて、管腔リザーバ及び基礎リザーバの両方でＤＭに曝された（図５ＡのＤＭ／ＤＭ条件）ヒト初代結腸上皮細胞に対して、共焦点蛍光顕微鏡イメージング（図示せず）を実施した。ヒト初代結腸上皮細胞は、この酸素勾配下で、好気性対照よりも少ないムチン２を発現し、小さいＡＬＰ活性を示した。但し、両試料とも、細胞層全体にわたって密着結合を維持した。基礎培地を攪拌することにより、基礎酸素飽和度、従って、細胞層全体にわたる酸素勾配を調節することが可能である。図５Ｂに示すように、基礎培地を攪拌することによって、管腔チャンバの下の基礎培地の酸素レベルが１２％から１９％まで上昇した。このデータは、基礎酸素レベルと細胞層全体にわたる酸素勾配とが調節可能であることを示している。最終的な酸素飽和度又は低酸素状態を確立する速度を標的化することも可能であり、これは、培地（例えば、脱酸素化培地又は酸素飽和培地）の初期酸素レベルを調節すること、インサート中の空気の体積又は組成を制御すること、又はプラグの材料特性（酸素透過性）を操作することによって可能である。酸素透過性を抑制する為に、プラグの表面にパリレンコーティング又はシリコン酸化膜堆積を施してよい。
【０２１７】
同じねじ山が付いたインサートとこれに適合するプラグとを使用して、インビトロ結腸陰窩の培養中に管腔低酸素状態を確立した。ＰＤＭＳスタンプにより成形されたコラーゲン足場４７の陰窩状アレイ上でヒト初代結腸上皮細胞を培養することにより、インビトロヒト結腸上皮陰窩を製作した。増殖培地での培養の７日が経過した後、管腔区画内の基礎培地及び分化培地において増殖促進化合物を保持することにより、インビトロ陰窩の細胞を分極させるように誘導した。８日目にねじ山付きプラグを取り付け、ニードル型酸素プローブをプラグの中央穴から挿入して、管腔培地の酸素レベルを測定した。酸素飽和度は、３時間以内に５％を下回るまで低下し、更に１．５％まで低下したが、視認できる細胞生存度の低下は全くなかった（図６Ａ）。細胞が低酸素状態になったかどうかを検証する為に、１０日目に、ピモニダゾール（酸素レベルが１０ｍｍＨｇ（１．３％酸素飽和度）を下回った場合のみ細胞内タンパク質のチオールに結合する化合物４８）を基礎培地に投入し、３７℃で１時間インキュベートした。次に細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定した。保持されたピモニダゾールを、抗ピモニダゾールマウス単クローン抗体により検出し、その後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７でコンジュゲートされた抗マウス二次抗体で染色した。核をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で染色した。結果として得られた顕微鏡画像（図６Ｂ）は、管腔表面においてピモニダゾールの明確な染色パターンを示し、陰窩の底部では染色が弱くなっていることを示した。核染色により、管腔が低酸素状態であるにもかかわらず、陰窩構造が良好に保持され、細胞消失がなかったことを確認した。
【０２１８】
実施例３
閉じられた細胞リザーバ内に低酸素状態を生成する
この実施例では、閉じられた細胞リザーバ内に低酸素状態を生成する方法を説明する。ポリカーボネートスラブをフライス削りして、内側にねじ山がある細胞培養ウェルと、外側にねじ山があるプラグとを製作した。プラグの中央に、ニードル型酸素プローブを挿入する為の穴（１〜２ｍｍ径）を開けた。酸素不透過性である円形ガラスカバースリップ（１８ｍｍ径）をねじ山付き細胞培養ウェルの底部に医療テープ（３Ｍ）で取り付けて、細胞リザーバを用意した。腸細胞増殖を促進する為に、細胞リザーバのベースを形成するカバースリップの上にコラーゲンゲル（ラット尾コラーゲンＩ）を重ね合わせた。増殖の為の必須増殖因子を含む増殖培地において、ヒト初代結腸細胞をコラーゲンゲル上で集密的になるまで培養した。細胞が完全な単層を形成したところで、培地を、増殖促進化合物がない分化培地に切り替えた。
【０２１９】
培養の２日が経過した後、培地を新鮮な分化培地に変更し、外側にねじ山があるプラグで細胞リザーバを封止した。ニードル型酸素プローブを挿入し、細胞リザーバの中間点で細胞リザーバの酸素レベルを測定した。測定中は、細胞リザーバをプラグ及び酸素プローブとともにインキュベータのオービタルシェーカ上に置いた。酸素飽和度は、細胞リザーバ全体にわたって６時間以内に５％を下回るまで低下し、その後は２％未満にとどまった（図７）。細胞リザーバの酸素不透過性ガラス底部及び低酸素透過性ポリカーボネートボディを使用することにより、培地への酸素流入が最小化される。プラグ、細胞リザーバ、及び底部の材料及び酸素透過性を変化させ、プラグの高さ、並びに細胞リザーバ内の培地及び空気の体積を調節することにより、最終的な酸素を標的化することが可能である。
【０２２０】
実施例４
垂直酸素勾配を確立する
この実施例では、外側にねじがあるペトリ皿とこれに対応して内側にねじがある蓋とを含む、本明細書に開示のデバイス／システムにおいて垂直酸素勾配を確立する方法を説明する。ペトリ皿の底部は、細胞への酸素の拡散を促進する為に、シリコーンポリマー等の酸素透過性材料、例えば、ＰＤＭＳ、ポリウレタン、パラフルフォコン、又はセラミックの膜で作られている。細胞粘着を促進する為に、細胞外マトリックスタンパク質（フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ等）や合成ポリマー（ポリエルリジン等）をコーティングしてよい。又は、細胞と細胞外マトリックスとを混合して３Ｄ細胞培養又はオルガノイドを調製し、皿に置いてよい。ねじ山付き蓋を取り付けることにより、上部からの酸素流入が効率的に遮断され、一方、細胞は酸素透過性材料を通して底部から酸素を取得する。酸素勾配は、皿にある培地及び空気の体積、並びに皿の底部の酸素透過性を変化させることによって調節可能である。
【０２２１】
実施例５
酸素勾配を確立するインビトロシステムの設計
この作業の目標は、生物医学研究者等が容易にアクセスできて、厚いコラーゲン足場上で増殖する初代腸細胞単層を支持することが可能な、シンプルな酸素勾配カセットを設計することであった。厚いコラーゲン足場は、シンプルな多孔質膜より好ましい場合があったが、それは、コラーゲン足場が、適切な形状であれば、完全に分極したインビトロ陰窩の形成をサポートする為である。更に、形成された酸素勾配は、管腔カセット区画内での偏性嫌気性菌の培養を可能にしながら、基礎リザーバの酸素化を維持するであろう。設計したカセットは、寸法が市販のＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）とほぼ同じであり、管腔プラグと、細胞をそれらの足場で支持し、管腔リザーバを形成するカセットインサートと、基礎リザーバとで構成した。このフォーマットを利用した理由として、生物医学研究者等がなじんでいること、使いやすいこと、試料採取や試薬添加の為に基礎リザーバ及び管腔リザーバにアクセスしやすいことが挙げられる。管腔リザーバに挿入するガス不透過性プラグは、細胞単層の上方からの酸素流入を遮断するように設計した。ねじ山付きプラグをポリカーボネートで製作した理由は、低酸素透過性とフライス削りによる製造のしやすさである。プラグにポートを設けることで、封止中のガス放出、管腔内容物の採取、試薬や細菌の添加、並びに酸素飽和度の測定が可能になった。細胞培養中は、ポートをゴムキャップで封止した。ポリカーボネートのカセットインサートのベースを薄い多孔質膜で形成した。上皮細胞単層を支持する為に、多孔質膜上にコラーゲンベースのヒドロゲル足場（約１ｍｍ厚）を形成した。１２ウェルマイクロタイタプレートのウェルが基礎リザーバを形成した。本システムは、管腔リザーバへの酸素流入を最小限に抑えることによって、且つ、細胞の呼吸作用を利用して、管腔リザーバを出入りする酸素分子を除去することによって、嫌気性管腔区画を形成するように設計した。このリザーバの流体を大気と接触したままにすることによって、単層の下の基礎区画に酸素を供給した。そして、相反する２つのプロセス、即ち、細胞の酸素消費と酸素の管腔リザーバ通過とを予測して、時間に対する自己持続型酸素勾配を誘導した。
【０２２２】
細胞の存在下のデバイス内の経時酸素濃度をモデル化する為に、ＣＯＭＳＯＬ（登録商標）シミュレーションを開発した（コムソル（Ｃｏｍｓｏｌ，  Ｉｎｃ．）、スウェーデン、ストックホルム）。モデル精度にとってクリティカルなのは、コラーゲンヒドロゲル内の酸素の拡散、並びに細胞呼吸数の正確な値であった。そこで、コラーゲン中の酸素拡散係数を、初代腸上皮細胞による酸素消費率とともに実験的に測定した。３７℃での酸素拡散を可能にする為に、脱酸素化された厚いコラーゲンゲル（０．５％のＯ２）を、完全に酸素化された培地と接触させて置いた。厚いコラーゲンゲルの酸素レベルを測定し、フィックの第２拡散法則から導出された式に当てはめた。結果として得られたコラーゲンゲル中の酸素拡散係数は１．２±０．１×１０−９ｍ２／ｓであった。これは、既存の報告にある水中の酸素拡散係数（３×１０−９ｍ２／ｓ）４９よりかなり低い。培養培地のコラーゲンゲル上のヒト初代結腸上皮細胞の細胞酸素消費率を測定する為に、酸素不透過性リザーバ内に細胞単層が存在する中で培養培地の酸素レベルを測定した。酸素不透過性リザーバは、細胞を機械的に損傷することなく培地の完全封止及び完全攪拌を可能にする。測定した酸素レベルを統合ミカエリス・メンテン運動方程式に当てはめて、ミカエリス・メンテンパラメータＯＣＲｍａｘ（１．７±０．３×１０−８ｍｏｌ／ｍ３・ｓ・ｃｅｌｌ）及びＫｍ（１．３±０．５×１０−４ｍｏｌ／ｍ３・ｃｅｌｌ）が得られた。従来の好気性条件で、３７℃で測定した酸素消費率は、既存の報告にある、様々な細胞型で測定された値５０より少なくとも１桁高い。既存の報告にある、未分化５１及び半分化５１ＣＡＣＯ−２細胞のミトコンドリア呼吸作用は、ここで測定した酸素消費率のおよそ７分の１から〜１５分の１である。細胞型（がん細胞株か初代細胞か）及び培養培地の違いは、代謝又は酸素消費率の差につながりうる。更に、ミトコンドリア呼吸数は、他の酸素消費プロセス（例えば、好気的解糖）を意図的に排除するように特別に設計された培地での酸化的リン酸化の測定値となる。酸素消費率の結果は、細胞培養培地のコラーゲンゲル上の細胞単層において行われるあらゆる酸素消費プロセスを反映するものであり、これらはシミュレーション用としてより正確且つ有用であろう。
【０２２３】
細胞による、培地（表２）中の酸素消費率（ＯＣＲ）を、本明細書に記載して開示した、図１４〜１４Ｃに示したデバイスを使用して測定した。これまでの研究によれば、細胞の酸素消費率は、ミカエリス・メンテン動力学を用いてモデル化できる５２，５３，５４。ミカエリス・メンテン動力学方程式の積分を使用して測定データを当てはめた５５，５６。
【数１】
2021521836.tif 000004
【０２２４】
この式では、ＷはランベルトのＷ関数、Ｋｍはミカエリス定数、ＯＣＲｍａｘは、達成された最大酸素消費率、Ｃ０は初期酸素濃度、Ｃｍｉｎは、細胞が酸素を消費していた最小酸素濃度、ｔは時間である。ＣＯ２は、ｍｏｌ・ｍ−３・ｃｅｌｌ−１単位の酸素濃度であり、以下の式によって測定酸素濃度に関連付けることが可能である。
【数２】
2021521836.tif 000005
【０２２５】
この式では、［Ｏ２］は、ｍｏｌ・ｍ−３単位のチャンバ内酸素濃度であり、ＶＣｈはチャンバの体積であり、Ｖｃは細胞の体積であり、ｎｃは細胞の数である。チャンバ内の細胞の数を算出する為に、細胞密度を１０箇所（それぞれ６４０×６４０μｍ）で測定した。この密度に総表面積を乗じて細胞の総数を計算した。
【０２２６】
当てはめを用いて、結腸細胞の場合のＯＣＲｍａｘ（−１．７±０．３×１０−８ｍｏｌ・ｍ−３・ｓ−１・ｃｅｌｌ−１）及びＫｍ（１．３±０．５×１０−４ｍｏｌ・ｍ−３・ｃｅｌｌ−１）を計算し、これらを用いて、次式のように、ＯＣＲを、酸素勾配デバイスの酸素濃度の関数として計算した。
【数３】
2021521836.tif 000006
【０２２７】
この式では、［Ｏ２］は勾配デバイス内の酸素濃度であり、［Ｏ２］ｍｉｎは、２４時間の間にデバイス内で測定された最小酸素濃度であり、δはステップ関数である。
【表２】
2021521836.tif 000007
【０２２８】
更に、コラーゲンゲル中のＯ２の拡散係数を測定する作業を行った。他のグループが行ったように５２、水中のＯ２の拡散係数を取得した。これは３７℃で３×１０−９ｍ２／ｓであった。架橋コラーゲン中のＯ２の拡散係数を実験から算出した。これは、本明細書で示したようにデバイス及びシステム内でニードル型光ファイバ酸素プローブで酸素濃度を測定することにより行った。
【０２２９】
撹拌棒及び培地を収容し、大気中の酸素と接する基礎リザーバが、Ｏ２の無限源として動作した。管腔リザーバを完全に架橋コラーゲンで満たし、窒素パージによって脱酸素化した。管腔リザーバを酸素センサで封止した。撹拌棒及び正常酸素圧培地（表２）を収容し、大気中の酸素と接する基礎リザーバの中に管腔リザーバを置いた。架橋コラーゲン中で酸素測定を、５秒おきに１時間にわたって行った。結果として得られた測定値を、フィックの第２拡散法則５７から導出された次式に当てはめた。
【数４】
2021521836.tif 000008
但し、Ｃｂ及びＣｌは、それぞれ、基礎培地（表２）及び管腔コラーゲンプラグの中の初期Ｏ２濃度である。ｚは、Ｏ２測定が行われた管腔／基礎境界面からの距離であり、Ｗはコラーゲンプラグの高さである。Ｗ及びｚは、それぞれ４．５ｍｍ及び２．５ｍｍに設定した。ｔは酸素測定が行われた時間であり、Ｄは拡散係数である。当てはめの結果のＲ２は０．９９９であり、拡散係数（Ｄ）として１．４×１０−９ｍ２／ｓが得られた。架橋コラーゲン中の酸素の拡散係数は、３７℃で１．２±０．１×１０−９ｍ２／ｓ（ｎ＝３）であった。
【０２３０】
次に、嫌気性ガス、又は嫌気性培地のかん流がなくても酸素勾配が生成可能かどうかを検証する為に、コラーゲン中の酸素の拡散係数の測定値と、コラーゲンゲル上のヒト初代結腸上皮細胞の酸素消費率とを使用して、本明細書に開示のデバイス／装置での酸素レベルの経時変化をシミュレートした。細胞培養インサート、プラグ、及びウェルプレートの壁はＯ２不透過性であるものとし、多孔質膜は酸素を容易に透過させるものとした。シミュレーションの結果、プラグをカセットに挿入してから数時間以内に管腔低酸素状態を生成できることが分かった。コラーゲンゲルの下の酸素レベルは時間とともに低下したが、約１０％で維持された。このシミュレーションでは、細胞層及びコラーゲンゲル（１ｍｍ厚）にまたがる酸素勾配を形成し、安定的に持続させたが（図１Ｂ）、それによって、酸素枯渇処理を追加しなくても酸素勾配を形成できることが分かった。
【０２３１】
実施例６
インビトロ腸上皮モデルシステムの為の酸素勾配を確立する
本デバイスにおいて細胞による酸素消費と酸素流入の最小化とによって管腔低酸素状態を達成及び維持できるかどうかを実験的に検証する為に追加実験を実施し、多孔質膜全体にわたって細胞を集密的単層になるまで増殖させた。１０日目に、培地を新鮮な培地に交換し、ねじ山付きプラグをねじ山付きインサート内に取り付けて、管腔培地及び基礎培地の酸素レベルを測定した。図８Ａは、ニードル型酸素プローブを使用した３つの別々の測定からの酸素の経時特性を示しており、これによれば、管腔酸素レベルは３時間以内に２％を下回るまで低下し、２４時間の間は１％を下回るレベルで維持されており、一方、基礎培地内の酸素レベルは１０％前後で維持された。これらのデータから明らかであるように、インビボで示された結腸上皮の酸素勾配を厳密に模倣するか、少なくともほぼ模倣するように、管腔側を低酸素状態にし、基礎側を酸素化する形で、上皮細胞層全体にわたって酸素勾配を確立することが可能である。管腔側が脱酸素化された培地で満たされていれば酸素勾配を確立することが可能であり（図８Ａ）、これは、植菌を嫌気的に行う必要がある場合に偏性嫌気性菌との共培養を行うことに関してはより実用的でありうる。初期植菌を除き、酸素勾配を維持することには、他のいかなる脱酸素化処理も不要である。
【０２３２】
次に、ヒポキシプローブを使用して、様々な酸素条件での細胞内酸素レベルを調べた。ヒポキシプローブ（ピモニダゾール塩酸塩）は、チオール含有タンパク質に拘束されることによって５９、酸素分圧が１０ｍｍＨｇ５８を下回る場合に細胞内で保持される化学物質である。ヒポキシプローブを認識する抗体を使用して、細胞内の酸素枯渇の程度を免疫蛍光によって可視化して定性的に比較することが可能である。好気的に、嫌気的に、且つ酸素勾配下で２日間インキュベートされた細胞の基礎培地にヒポキシプローブを追加することによって、２時間にわたって細胞への拡散を可能にし、その後、細胞を固定した。ヒポキシプローブに対する抗体を使用する免疫蛍光によって、保持されたヒポキシプローブを検出した。免疫蛍光画像（図８Ｃ）によれば、嫌気性条件下の細胞は実際には８０％超の蛍光強度を示しており（図８Ｂ）、これは、細胞内酸素レベルが低いことによってヒポキシプローブの保持率がより高いことを示している。酸素勾配下の細胞内のヒポキシプローブの保持率は、嫌気性条件下の細胞内のヒポキシプローブの保持率よりかなり弱く、好気性試料より若干高い（但し統計的には区別できない）。これらのデータが示唆するところによれば、酸素勾配下の細胞は、細胞内酸素レベルが従来の好気性環境にある細胞と同等であり、酸素レベルが嫌気性ガス中の細胞よりかなり高い。
【０２３３】
まとめると、これらの計算及び実験の結果が示すところによれば、管腔側からの酸素流入を抑制し、細胞の酸素消費を利用することによって、ヒト腸上皮細胞全体にわたって酸素勾配を生成して維持することが可能である。
【０２３４】
実施例７
様々な酸素条件下での細胞挙動
次に、デバイス内に形成した酸素勾配の下での様々な細胞挙動を調べ、これを正常酸素圧状態及び完全低酸素状態でのものと比較した。ヒト結腸上皮細胞を、管腔側及び基礎側の両方で増殖促進因子を有する増殖培地（ＥＭ）で６日間増殖させ、更に４日間、増殖細胞集団の維持の為に基礎側にのみ増殖促進因子を有する状態で（ＤＭ／ＳＭ）、又は完全に分化した細胞のモデル化の為に管腔側及び基礎側の両方に増殖促進因子がない状態で（ＤＭ／ＤＭ）培養した。この時点までに、全ての細胞を好気的に培養した。１０日目に、細胞を従来の好気性条件、嫌気性条件、及び管腔低酸素状態を伴う酸素勾配に２日間曝した。
【０２３５】
まず、壊死細胞のＤＮＡを染色するヨウ化プロピジウム（ＰＩ）と、全てのＤＮＡを染色するＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２とを使用して細胞生存度をアッセイした（図９Ａ及び９Ｃ）。全条件下で、９０％を超える細胞が生存していた（ヨウ化プロピジウムで染色されなかった）。ＰＩ陽性細胞の割合は、同じ培地条件の下での酸素条件が異なる試料の中で統計的な差異がなかった。このことは、腸上皮細胞がインビトロで酸素枯渇に耐えうるとした既存の報告６０と矛盾しない。嫌気性条件下で増殖因子が完全に除去された場合にはＰＩ陽性細胞が若干多くなったが、それでもほとんどの細胞は生存していた。
【０２３６】
次に、酸素勾配下の細胞が適切な腸上皮細胞挙動を示すかどうかを判定する実験を実施した。インビボの腸上皮細胞は頂端面及び側底面に大きく分極しており、この分極は適正な機能にとって重要である場合がある６１。細胞が適正に分極しているかどうかを検証する為に、最後の２日間に好気性条件、嫌気性条件、及び酸素勾配に曝された細胞を固定し、凍結切片化して、エズリンに対する免疫蛍光に曝した。エズリンは、凍結切片化された細胞層の微柔毛の細胞質側に位置する刷子縁マーカである。図９Ｄに示した共焦点顕微鏡画像は、全ての条件下の細胞がＤＭ／ＳＭ及びＤＭ／ＤＭの両方の頂端面のエズリンの位置に基づいて適正に単層を形成して分極したことを示している。ＳＥＭ画像では微柔毛も明確に視認できた。
【０２３７】
更に、免疫蛍光で密着結合マーカＺＯ−１を染色して経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定することにより、上皮の完全性を評価した。全条件下で、細胞は、基礎培地における増殖因子の有無にかかわらず、密着結合を形成した（図９Ｂ及び９Ｃ）。又、様々な酸素条件に２日間曝した後に測定したＴＥＥＲ値は、統計的に区別がつかなかった（図９Ｂ）。これらのデータは、酸素勾配並びに嫌気性条件が密着結合を損なわなかったことを示しており、このことは、Ｔ８４腸上皮細胞に対する２日間の低酸素状態で上皮のバリア機能が変化しなかったとする既存の報告６０と矛盾しない。
【０２３８】
次に、腸上皮細胞の増殖及び分化に対する酸素枯渇の影響を評価した。腸管腔における酸素枯渇の重要性についてはよく知られているが、インビトロの初代腸上皮細胞に対するその影響については、初代腸上皮細胞培養がごく普通に行われるようになった現在でも実験的に調べられていない。ヒト腸上皮細胞の細胞増殖に酸素レベルがどのように影響するかを調べる為に、基礎側に増殖促進因子が存在する中で２４時間にわたって基礎側からチミジンアナログＥｄＵをパルス標識した。これは増殖細胞がそれらのＤＮＡにＥｄＵを取り込めるようにする為である。図１０Ａは、様々な酸素条件でのＥｄＵで標識された細胞の代表的な画像を示す。嫌気性環境に２日間曝すと、従来の好気性培養条件下の細胞と比べて、ＥｄＵ＋増殖細胞の割合は大幅に（図１０Ｂでは９２％）減少した。このことは、低酸素条件下で異なる多くの細胞の増殖が抑えられること６２，６３と矛盾しない。興味深いことに、酸素勾配下の細胞は又、従来の正常酸素圧条件下の細胞と比べて、ヒポキシプローブ染色で推定される細胞内酸素レベルが同等であるにもかかわらず、増殖が８３％減少した（図１０Ｂ）。酸素勾配下では、嫌気性条件下よりわずかに多くの増殖細胞が存在したが、その差は統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．０６４）。このことは、インビボの生理学的低酸素状態が、腸上皮の過剰増殖又は新組織形成を抑制することによる保護的役割を有しうることを示唆している。
【０２３９】
最後に、様々な酸素条件下で杯細胞集団を生成する粘液を、杯細胞マーカＭＵＣ２タンパク質を検出することによって評価した。基礎培地に増殖因子が存在する場合、酸素勾配下の細胞のＭＵＣ２＋面積の割合は、従来の好気性条件下の細胞と同等であった（図１０Ａ（下側のパネル）及び図１０Ｃ）。これに対し、低酸素条件下でのＭＵＣ２発現は、従来の好気性条件に比べて４０％減少した（図１０Ａ（下側のパネル）及び図１０Ｃ）。この、ＭＵＣ２陽性集団の減少は、細胞が様々な酸素条件に曝される前に分化させられた場合には発生しておらず、このことは、（特に基礎側からの）酸素枯渇が細胞系列決定に影響することを示している。これらのデータは、腸組織の適正な酸素化が、粘液生成による上皮のバリア機能には非常に重要であることを示している。
【０２４０】
まとめると、ここでのデータは、プラットフォームにおいて酸素勾配下にある細胞が生存可能であり、適正に分極しており、無傷のバリア機能を有することを示している。更に、このデータは、酸素条件に応じて腸上皮挙動（増殖や分化等）が変化しうることを示している。
【０２４１】
実施例８
嫌気性細菌の共培養
本開示のデバイス及びシステムにおいて確立された管腔低酸素状態が嫌気性細菌の増殖をサポートしうるかどうかを検証する為に、偏性嫌気性菌を、酸素勾配下でヒト結腸上皮細胞と共培養し、好気性及び嫌気性の共培養試料と比較した。Ｃ．ディフィシルは、芽胞を形成する、グラム陽性の偏性嫌気性菌である。抗生物質治療の長期化によって腸内微生物叢のホメオスタシスが阻害されると、Ｃ．ディフィシル感染が発生して、典型的には結腸において下痢や偽膜性大腸炎を引き起こす６４。Ｃ．ディフィシル感染による入院発生率及び死亡率が世界規模で高まっており６５，６６、包括的な理解と低コストで信頼できる検査プラットフォームとが必要とされている。
【０２４２】
本開示のデバイス及びシステムが偏性嫌気性菌の増殖をサポートしうるかどうかを調べる為に、Ｃ．ディフィシルを酸素勾配下及び嫌気性条件下で共培養して比較した。Ｃ．ディフィシル（６３０Δｅｒｍ）のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を、ヒト結腸上皮細胞の管腔側に嫌気的に植菌し、嫌気性条件下で、且つ本明細書に記載の酸素勾配下で共培養した。植菌から６時間後及び２４時間後に、共培養においてヒト細胞と結合したＣ．ディフィシル及び結合していないＣ．ディフィシルの両方を採取し、共培養中の増殖性Ｃ．ディフィシルＣＦＵをＢＨＩＳプレート上で培養することによって推定した。６時間及び２４時間の共培養の後の増殖性Ｃ．ディフィシルの推定数を図１１Ａに示す。増殖性Ｃ．ディフィシルは、植菌から６時間後及び２４時間後の両方で、嫌気性共培養試料と酸素勾配共培養試料との間で静的には区別がつかなかった。Ｃ．ディフィシルを２４時間共培養すると、炎症性サイトカインＩＬ−８の分泌が酸素勾配共培養において３倍以上、嫌気性共培養において１０倍以上増加した（図１１Ｂ）。
【０２４３】
Ｃ．ディフィシルは、その毒素で細胞骨格形成を阻害することによって上皮バリア機能を低下させる６７。ヒト細胞に対するＣ．ディフィシルの毒性に様々な酸素条件が影響を及ぼすかどうかを調べる為に、共培養した細胞に免疫蛍光を用いて密着結合を可視化し、走査電子顕微鏡法により細胞モルフォロジを観察した。植菌から６時間後には、いずれの条件においても密着結合の目に見える変化は観察されなかった（図１１Ｃ）。植菌から２４時間後には、増殖性Ｃ．ディフィシルのＣＦＵが同等であるにもかかわらず、嫌気性環境に曝された細胞と酸素勾配に曝された細胞との間に、密着結合の構成及び細胞モルフォロジの大きな差異が観察された（図１１Ｃ）。嫌気性共培養では、多角形の細胞輪郭が激しく変形し、細胞輪郭におけるＺＯ−１蛍光強度が大幅に低下した一方で、不規則なホットスポットも観察された。酸素勾配下では細胞間接触の消失が観察されたが、残った細胞は、ＺＯ−１で標識された多角形の細胞輪郭を維持していた。
【０２４４】
２４時間のＣ．ディフィシル共培養の後のヒト細胞モルフォロジの差異を更に調べる為に、嫌気的にＣ．ディフィシルと共培養した細胞と、酸素勾配下でＣ．ディフィシルと共培養した細胞とを、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）により観察した。図１１Ｄは、Ｃ．ディフィシルと共培養した細胞と、Ｃ．ディフィシルに曝さなかった細胞との代表的なＳＥＭ画像を示す。Ｃ．ディフィシルに曝されなかった細胞では明確に視認できる多角形の細胞輪郭が、嫌気的に共培養された場合には激しく変形しており、細胞間接触が壊れて下のコラーゲンファイバが露出していた。これらは、図１１ＣのＺＯ−１免疫蛍光の結果と矛盾しない。酸素勾配下で共培養された細胞にも壊死細胞が含まれていたが、細胞はかなりの割合で上皮モルフォロジを保持していた。これらの細胞は細胞間接触の消失を示したものの、嫌気的に共培養された細胞に比べればごくわずかな程度であった。興味深いことに、上皮細胞に結合したＣ．ディフィシルは、嫌気的に共培養された細胞より、酸素勾配下で共培養された細胞に多かった。細胞モルフォロジ及び密着結合におけるこれらの差異についての機械論的な説明は本明細書の範囲を逸脱する。しかしながら、これらのデータは、インビトロでのホスト上皮細胞と微生物との相互作用に酸素環境が大きく影響することを明確に示しており、インビボで酸素環境を適切に再現することの重要性及び意義を強調するものである。
【０２４５】
実施例９
インビトロ陰窩全体への酸素勾配の印加
最後に、インビボでヒト結腸陰窩をより厳密に再現する為に、３次元陰窩状上皮モデルに酸素勾配を印加した。インビボのヒト結腸陰窩と同じ３次元構造を有するインビトロ結腸陰窩配列の製作方法については既に報告がある６８。陰窩軸に沿った化学勾配によって、陰窩は、底部の増殖領域と表面の分化細胞とに分極される。陰窩の分極に対する酸素勾配の影響を評価する為に、増殖因子勾配を有する３次元インビトロ陰窩に酸素勾配を印加し、完全酸素化条件下の増殖因子勾配下で増殖した陰窩と比較した。
【０２４６】
まず、インビトロ陰窩内の細胞が、陰窩軸に沿った酸素勾配に曝されたかどうかを、ピモニダゾール付加物形成を測定することによって評価した。ピモニダゾール結合抗体の蛍光強度は、陰窩の表面において最大となり、底部に向かって減少していた。このことは、陰窩表面の細胞が酸素枯渇に曝された一方、陰窩底部の細胞は酸素化されたことを示している。ピモニダゾールがない場合は、画像化アーチファクトや非特異的結合の可能性がない場所であっても蛍光が弱かった。このピモニダゾール染色パターンは、インビボでの陰窩におけるもの６９と矛盾しない。興味深いことに、完全酸素化条件下の化学勾配は又、強度は低いものの同様のピモニダゾール付加物形成パターンを３次元インビトロ陰窩に引き起こした。このことは、陰窩表面の分化細胞の内側の酸素レベルが、陰窩底部の増殖細胞の内側の酸素レベルより低いことを示している（酸素レベルは、細胞の酸素消費と培地内の酸素とによって決定される）。増殖細胞と分化細胞との間で酸素消費に差があることは他の幹細胞においても示唆されており、腸上皮細胞は、代謝においても細胞の末路に応じて同様の差がある可能性がある。
【０２４７】
この作業の早い段階では、酸素勾配によって細胞単層内の増殖細胞集団が減少することが示された。酸素勾配が増殖細胞集団に影響するかどうか、そして３次元陰窩の分極に影響するかどうかを評価する為に、酸素勾配下且つ完全酸素化条件下でＥｄＵを２４時間パルス標識することによって、増殖細胞を標識した。ＥｄＵ標識された増殖細胞は両酸素条件下で陰窩の底部に向かって位置したが、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で標識された細胞の総数に対するＥｄＵ標識された細胞の割合は、完全酸素化条件下と比べて酸素勾配下では減少しており、より明らかなこととして、陰窩表面に向かって減少していた（陰窩の上半分では３倍を超えていたが、下３割では１．２〜１．４であった）。更に、酸素勾配条件下では、ＥｄＵ標識された細胞の７３％が陰窩の下３割にあったが、完全酸素化条件下では５７％だけだった。このことは、管腔の酸素枯渇が、増殖細胞を陰窩の底部に向かわせるように制限することによって、インビトロでの陰窩の分極を促進することを示唆している。
【０２４８】
最後に、管腔の酸素枯渇が結腸細菌の増殖をサポートするかどうかを調べる為に、酸素勾配条件下での嫌気性細菌の増殖を評価し、完全酸素化条件下と比較した。ビフィドバクテリウムアドレスセンティスは、グラム陽性の偏性嫌気性菌７０であり、一般的なプロバイオティクス株の１つである。Ｂ．アドレスセンティスを３次元インビトロ陰窩の管腔側に植菌し、酸素勾配下で、そして更に完全酸素化条件下で２４時間にわたって共培養した。生存可能なＢ．アドレスセンティスの数は、酸素勾配下での２４時間の共培養の後には１００倍以上増加したが、完全酸素化条件下では著しく減少した。これは、偏性嫌気性菌に対する酸素勾配の共培養能力を示すものである。図１２Ａ〜１２Ｆを参照されたい。
【０２４９】
実施例１〜９の議論
以上のデータ及び実験結果は、インビボの上皮全体にわたる酸素勾配をインビトロ環境で再現することにおける本開示のデバイス、システム、及び装置の有効性を示している。本開示のシステム、デバイス、及び装置では、酸素勾配は、正常酸素圧バイトを使用した場合には数時間で確立され、管腔側で脱酸素化培地を使用した場合には、連続的な脱酸素がなくてもただちに確立される。同時に、大気に曝されている基礎培地を通して酸素が供給される。これらの研究では、腸上皮細胞がかなりの量の酸素を消費することが確認された。そこで、幾つかの実施形態では、細胞の酸素消費を活用して酸素勾配を生成及び／又は維持した。シミュレーションデータ及び実験データは明らかに、外部嫌気性パージ又は事前平衡化を行わなくても酸素勾配を確立して維持することが可能であることを示している。ヒポキシプローブ染色は、酸素勾配下の本開示のデバイス、装置、及びシステムにおいて、基礎側からの酸素供給によって細胞が酸素化されたことを示した。このアプローチは、腸上皮細胞が酸素を消費する限り、連続的なかん流がなくても、従来の正常酸素圧環境における酸素勾配の確立及び維持を可能にする。このように嫌気性環境及びかん流の要件が最小限又は皆無であることが、本明細書に開示のシステム及び装置を広範な用途に対して魅力的で使いやすいものにしている。
【０２５０】
酸素勾配下のヒト初代結腸上皮細胞挙動を特徴化し、従来の好気性培養環境及び完全嫌気性条件の場合と比較した。酸素枯渇は、管腔側のみであっても両側においてであっても、生存度、分極、並びに密着結合及びＴＥＥＲで評価される上皮完全性を損なわない。このことは、嫌気性培養が腸上皮バリア特性を阻害しなかったとする、Ｔ８４細胞に関する既存の観察結果６０と矛盾しない。しかしながら、酸素勾配は腸上皮細胞の増殖を減少させた。増殖細胞の割合は、完全嫌気性条件下の細胞よりも酸素勾配下の細胞において若干高かったが、それらに統計的な差はなかった。このことは、増殖細胞がある陰窩底部における酸素レベルが、分化細胞がある陰窩表面における酸素レベルより高いこと７１の理由になっている。酸素枯渇によってＭＵＣ２陽性杯細胞集団が減少したが、これはあくまで、基礎側にＷｎｔ、Ｒ−スポンディン、及びノギンが存在する中で管腔側と基礎側の両方で酸素が枯渇した場合である。このことは、炎症性低酸素症が低酸素血症７３として関与するように発生すると考えられ、且つＴＮＢＳ誘発結腸炎モデルでも示される潰瘍性結腸炎７２における杯細胞集団が減少することと矛盾しない。この、酸素枯渇の抑制作用は、細胞が分化した場合には無視できるものであった。以上のデータは、酸素の存在（又は枯渇）が細胞の末路の決定に関与し、粘液によるバリア機能を調整して杯細胞を生成するが、分化細胞に対するその影響が最小限であることを示唆している。
【０２５１】
本明細書に記載のデータ及び結果は、本開示の装置、システム、及びデバイスにおいて達成される管腔低酸素状態が、Ｃ．ディフィシルを用いる嫌気性細菌増殖をサポートできることを示している。Ｃ．ディフィシルの、ヒト結腸がん細胞株又は他の動物細胞との共培養の初期の研究では、（好気的又は嫌気的のいずれかで共培養された）インビボ酸素環境を模倣する適切な酸素勾配を導入しなかった７４−７６。本明細書に記載の研究は、嫌気性管腔培地による安定した酸素勾配が嫌気性環境としてＣ．ディフィシルの増殖をサポートすることを示している。更に本研究は、酸素化状態が、ヒト細胞と微生物との相互作用に対して顕著な影響を有することを示している。
【０２５２】
酸素勾配を３次元陰窩状の上皮細胞層に導入した。増殖因子勾配は完全酸素化条件下で陰窩表面に酸素枯渇を引き起こしたが、酸素勾配は、陰窩に沿った酸素枯渇パターンを増強した。３次元陰窩における酸素勾配は、陰窩表面近くの増殖を抑制することによって陰窩の分極を調整した。陰窩内に確立された酸素勾配は、偏性嫌気性菌であるＢ．アドレスセンティスの増殖をサポートした。このことは、嫌気性細菌の共培養が可能であることを明確に示している。
【０２５３】
結論として、本明細書に開示のシステム、デバイス、装置、及び方法は、管腔側への酸素流入を制限して、細胞の酸素消費を管腔低酸素状態に利用し、大気を基礎酸素化に利用することにより、インビボで腸上皮細胞全体にわたる酸素勾配を再現する。この方法は、液体又はガスの連続的なかん流が不要である。酸素勾配下の細胞挙動を特徴化し、従来の好気性環境及び嫌気性環境の場合と比較した。酸素勾配下の細胞は、生存可能であって、分極していて、互いに密着結合していた。これは、基礎培地における増殖因子の有無にかかわらず、好気性条件下及び嫌気性条件下の細胞の場合と同様であった。従来の好気性培養と比較すると、酸素勾配は、嫌気性条件下の場合と同程度まで増殖細胞集団を減少させたが、嫌気性培養環境の場合と異なり、ＭＵＣ２陽性杯細胞を維持した。これらのデータ及び結果は、本開示の装置、デバイス、及びシステムが、嫌気性細菌であるＣ．ディフィシルを用いる嫌気菌の共培養に使用可能であることを示している。これらの細菌は、酸素勾配下のデバイスの管腔区画で増殖する。酸素勾配下のヒト細胞の挙動は、従来の好気性培養又は嫌気性培養の環境の場合と異なっていた。このことは、インビボの腸組織をモデル化する場合に正しい酸素勾配をインビトロシステムに導入することの重要性を示唆している。本開示の装置、システム、及び方法は、管腔側及び基礎側の両方へのアクセスが可能であることにより、インビボの腸組織をより厳密に模倣及びモデル化するインビトロシステムを提供する。
【０２５４】
参照文献
本明細書に列挙した全ての参照文献（全ての特許、特許出願、及びその公開、科学誌の記事、データベースエントリを含み、これらに限定されない）は、参照によって、本明細書で用いられている方法論、技術、及び／又は組成を捕捉、説明、背景説明、又は教示する程度に完全な形で本明細書に組み込まれている。
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１４  Ｒ・ナグパル（Ｎａｇｐａｌ，  Ｒ．）、Ｈ・ヤダフ（Ｙａｄａｖ，  Ｈ．）、Ｆ・マロッタ（Ｍａｒｏｔｔａ，  Ｆ．）著「腸内微生物叢：予防薬及び治療薬の次世代フロンティア？（Ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ：  ｔｈｅ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎ  ｆｒｏｎｔｉｅｒ  ｉｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ？）」、フロンティアーズ  イン  メディスン（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、１号（２０１４年）。
１５  Ｐ・Ｄ・カニ（Ｃａｎｉ，  Ｐ．  Ｄ．）著「万物の交差点に腸内微生物叢［ｍｄａｓｈ］？（Ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ［ｍｄａｓｈ］  ａｔ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｖｅｒｙｔｈｉｎｇ？）」、ネイチャー  レビュース  ガストロエンテロロジー  アンド  ヘパトロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ＆  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、１４号、ｐ．３２１−３２２（２０１７年）。
１６  Ｔ・サトウ等（Ｓａｔｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．）著「単一のＬｇｒ５幹細胞は間葉ニッチがなくてもインビトロで陰窩・絨毛構造を構築する（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｌｇｒ５  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｕｉｌｄ  ｃｒｙｐｔ−ｖｉｌｌｕｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｎｉｃｈｅ）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、４５９号、ｐ．２６２（２００９年）。
１７  Ｔ・サトウ等（Ｓａｔｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．）著「ヒト結腸、腺腫、腺がん、及びバレット上皮からの上皮オルガノイドの長期増殖（Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｏｒｇａｎｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ，  ａｄｅｎｏｍａ，  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ，  ａｎｄ  Ｂａｒｒｅｔｔ'ｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）」、ガストロエンテロロジー（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）１４１号、ｐ．１７６２−１７７２（２０１１年）。
１８  Ｙ・ワン等（Ｗａｎｇ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．）著「初代結腸又は直腸上皮細胞の自己再生単層（Ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗｉｎｇ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｏｒ  ｒｅｃｔａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）」、セルラー  アンド  モレキュラー  ガストロエンテロロジー  アンド  ヘパトロジー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）（２０１７年）。
１９  Ｈ・Ｊ・キム（Ｋｉｍ，  Ｈ．  Ｊ．）、Ｄ・フー（Ｈｕｈ，  Ｄ．）、Ｇ・ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｇ．）、Ｄ・Ｅ・イングバー（Ｉｎｇｂｅｒ，  Ｄ．  Ｅ．）著「腸ぜん動状の運動及び流動に曝される微生物叢が生息するヒューマンガットオンチップ（Ｈｕｍａｎ  ｇｕｔ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ  ｉｎｈａｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｆｌｏｒａ  ｔｈａｔ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｒｉｓｔａｌｓｉｓ−ｌｉｋｅ  ｍｏｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｆｌｏｗ）」、ラボ  オン  ア  チップ（Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ）、１２号、ｐ．２１６５−２１７４（２０１２年）。
２０  Ｈ・Ｊ・キム（Ｋｉｍ，  Ｈ．  Ｊ．）、Ｈ・リ（Ｌｉ，  Ｈ．）、Ｊ・Ｊ・コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ，  Ｊ．  Ｊ．）、Ｄ・Ｅ・イングバー（Ｉｎｇｂｅｒ，  Ｄ．  Ｅ．）著「ヒューマンガットオンチップにおける腸細菌過剰増殖及び炎症に対する微生物叢及び機械的変形の寄与（Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｏｖｅｒｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｇｕｔ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）」、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１１３号、Ｅ７−Ｅ１５（２０１６年）。
２１  Ｐ・シャー等（Ｓｈａｈ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．）著「マイクロ流体工学に基づく、胃腸のヒトと微生物の境界面のインビトロモデル（Ａ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ−ｂａｓｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｈｕｍａｎ−ｍｉｃｒｏｂｅ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）」、ネイチャー・コミュニケーションズ（Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、７号（２０１６年）。
２２  Ｂ・Ｏ・アノニー等（Ａｎｏｎｙｅ，  Ｂ．  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．）著「革新的なヒト消化管細胞モデルにおけるホストと嫌気菌との相互作用のプロービング（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｈｏｓｔ−ａｎａｅｒｏｂｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｕｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｓ）」、バイオアーカイブ（ｂｉｏＲｘｉｖ）、ｄｏｉ：１０．１１０１／２６９０３５（２０１８年）。
２３  Ｙ・チェン等（Ｃｈｅｎ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ）著「生物工学によって作られたロバストな３Ｄ機能性ヒト腸上皮（Ｒｏｂｕｓｔ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ３Ｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）」、サイエンティフィック・リポーツ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ）、５号、ｐ．１３７０８  （２０１５年）。
２４  Ｗ・シュウ等（Ｚｈｏｕ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ）著「ヒト腸組織用多機能バイオリアクタシステム（Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ）」、ＡＣＳバイオマテリアルズ  サイエンス  アンド  エンジニアリング（ＡＣＳ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、４号、ｐ．２３１−２３９（２０１７年）。
２５  Ｄ・ウルヴィシェヴァ等（Ｕｌｌｕｗｉｓｈｅｗａ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．）著「腸上皮バリアの頂端嫌気性モデルにおける生体フィーカリバクテリウムプラウスニッツイ（Ｌｉｖｅ  Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  ｉｎ  ａｎ  ａｐｉｃａｌ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｂａｒｒｉｅｒ）」、セルラー  マイクロバイオロジー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、１７号、ｐ．２２６−２４０（２０１５年）。
２６  Ｍ・マルツォラティ等（Ｍａｒｚｏｒａｔｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．）著「ＨＭＩ（ＴＭ）モジュール：ヒト消化管内でのホストと微生物叢との相互作用をインビトロで研究する為の新しいツール（Ｔｈｅ  ＨＭＩ（ＴＭ）  ｍｏｄｕｌｅ：  ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｔｈｅ  Ｈｏｓｔ−Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）」、ＢＭＣマイクロバイオロジー（ＢＭＣ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、１４号、ｐ．１３３（２０１４年）。
２７  Ｍ・Ｂ・ビルネ（Ｂｙｒｎｅ，  Ｍ．  Ｂ．）、Ｍ・Ｔ・レスリー（Ｌｅｓｌｉｅ，  Ｍ．  Ｔ．）、Ｈ・Ｒ・ガスキンス（Ｇａｓｋｉｎｓ，  Ｈ．  Ｒ．）、Ｐ・Ｊ・ケニス（Ｋｅｎｉｓ，  Ｐ．  Ｊ．）著「制御された酸素条件下で腫瘍微環境を研究する方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｕｎｄｅｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」、トレンズ  イン  バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３２号、ｐ．５５６−５６３（２０１４年）。
２８  Ｓ・Ｃ・オッペガード（Ｏｐｐｅｇａｒｄ，  Ｓ．  Ｃ．）、Ｋ・−Ｈ・ナム（Ｎａｍ，  Ｋ．−Ｈ．）、Ｊ・Ｒ・カー（Ｃａｒｒ，  Ｊ．  Ｒ．）、Ｓ・Ｃ・スカールア（Ｓｋａａｌｕｒｅ，  Ｓ．  Ｃ．）、Ｄ・Ｔ・エディントン（Ｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．  Ｔ．）著「粘着性細胞培養物に対する時間的空間的酸素化を調節する（Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ａｎｄ  ｓｐａｔｉａｌ  ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ  ｏｖｅｒ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）」、プロス  ワン（ＰｌｏＳ  ｏｎｅ）、４号、ｅ６８９１（２００９年）。
２９  Ｓ・Ｃ・オッペガード（Ｏｐｐｅｇａｒｄ，  Ｓ．  Ｃ．）、Ａ・Ｊ・ブレイク（Ｂｌａｋｅ，  Ａ．  Ｊ．）、Ｊ・Ｃ・ウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｊ．  Ｃ．）、Ｄ・Ｔ・エディントン（Ｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．  Ｔ．）著「微細加工インサートによるボイデンチャンバ内の酸素条件の精密制御（Ｐｒｅｃｉｓｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｖｅｒ  ｔｈｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｉｎｓｅｒｔ）」、ラボ  オン  ア  チップ（Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ）、１０号、ｐ．２３６６−２３７３（２０１０年）。
３０  Ｓ・Ｃ・オッペガード（Ｏｐｐｅｇａｒｄ，  Ｓ．  Ｃ．）、Ｄ・Ｔ・エディントン（Ｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．  Ｔ．）著「酸素勾配を３Ｄ構造で確立する微細加工プラットフォーム（Ａ  ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｏｘｙｇｅｎ  ｇｒａｄｉｅｎｔｓ  ｉｎ  ３−Ｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）」、バイオメディカル  マイクロデバイセス（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ）、１５号、ｐ．４０７−４１４（２０１３年）。
３１  Ｈ・ウチダ（ＵＣＨＩＤＡ，  Ｈ．）、Ａ・サトウ（ＳＡＴＯ，  Ａ．）、Ａ・ミヤヤマ（ＭＩＹＡＹＡＭＡ，  Ａ．）、Ｋ・ツカダ（ＴＳＵＫＡＤＡ，  Ｋ．）著「低酸素状態のマイクロ流体デバイス内での酸素勾配の生成と細胞分析（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｘｙｇｅｎ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｉｎ  ａ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｈｙｐｏｘｉａ）」、アドバンスト  バイオメディカル  エンジニアリング（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、２号、ｐ．１４３−１４９（２０１３年）。
３２  Ｍ・Ｌ・レキシアス−ホール（Ｒｅｘｉｕｓ−Ｈａｌｌ，  Ｍ．  Ｌ．）、Ｇ・モーレオン（Ｍａｕｌｅｏｎ，  Ｇ．）、Ａ・Ｂ・マリク（Ｍａｌｉｋ，  Ａ．  Ｂ．）、Ｊ・レーマン（Ｒｅｈｍａｎ，  Ｊ．）、Ｄ・Ｔ・エディントン（Ｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．  Ｔ．）著「マイクロ流体プラットフォームによる局所的低酸素活性化の為の酸素ランドスケープの生成（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ｏｘｙｇｅｎ  ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｆｏｒ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」、ラボ  オン  ア  チップ（Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ）、１４号、ｐ．４６８８−４６９５（２０１４年）。
３３  Ｍ・Ｄ・ブレナン（Ｂｒｅｎｎａｎ，  Ｍ．  Ｄ．）、Ｍ・Ｌ・レキシアス−ホール（Ｒｅｘｉｕｓ−Ｈａｌｌ，  Ｍ．  Ｌ．）、Ｄ・Ｔ・エディントン（Ｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．  Ｔ．）著「３Ｄ印刷された２４ウェルプレート用酸素制御インサート（Ａ  ３Ｄ−ｐｒｉｎｔｅｄ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎｓｅｒｔ  ｆｏｒ  ａ  ２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）」、プロス  ワン（ＰｌｏＳ  ｏｎｅ）、１０号、ｅ０１３７６３１（２０１５年）。
３４  Ｂ・Ｏ・アノニー等（Ａｎｏｎｙｅ，  Ｂ．  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．）著「革新的なヒト消化管細胞モデルにおけるホストと嫌気菌との相互作用のプロービング（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｈｏｓｔ−ａｎａｅｒｏｂｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｕｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｓ）」、バイオアーカイブ（ｂｉｏＲｘｉｖ）、２６９０３５（２０１８年）。
３５  Ｄ・Ｉ・ウォルシュＩＩＩ等（Ｗａｌｓｈ  ＩＩＩ，  Ｄ．  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．）著「マイクロデバイスにおける結腸酸素勾配のエミュレーション（Ｅｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｎｉｃ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｇｒａｄｉｅｎｔｓ  ｉｎ  ａ  Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅ）」、ＳＬＡＳテクノロジー：トランスレーティング  ライフ  サイエンス  イノベーション（ＳＬＡＳ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）、２４７２６３０３１７７４３４２５（２０１７年）。
３６  Ｍ・スコリモフスキ等（Ｓｋｏｌｉｍｏｗｓｋｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．）著「細菌性バイオフィルム研究に有用なツールとしてのマイクロ流体溶存酸素勾配ジェネレータバイオチップ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  ｏｘｙｇｅｎ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ｂｉｏｃｈｉｐ  ａｓ  ａ  ｕｓｅｆｕｌ  ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｓｔｕｄｉｅｓ）」、ラボ  オン  ア  チップ（Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ）、１０号、ｐ．２１６２−２１６９（２０１０年）。
３７  Ａ・タカノ（Ｔａｋａｎｏ，  Ａ．）、Ｍ・タナカ（Ｔａｎａｋａ，  Ｍ．）、Ｎ・フタイ（Ｆｕｔａｉ，  Ｎ．）、エンジニアリング  イン  メディシン  アンド  バイオロジー  ソサエティ（ＥＭＢＣ）（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  （ＥＭＢＣ））、２０１３年、ＩＥＥＥ第３５回年次国際会議（３５ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＥＥＥ）、ｐ．４４７４−４４７７（ＩＥＥＥ）。
３８  Ｙ・チェン等（Ｃｈｅｎ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ）著「空間的に閉じ込められた化学反応を用いる、細胞培養用マイクロ流体デバイス内での酸素勾配の生成（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｘｙｇｅｎ  ｇｒａｄｉｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｕｓｉｎｇ  ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ｃｏｎｆｉｎｅｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）」、ラボ  オン  ア  チップ（Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ）、１１号、ｐ．３６２６−３６３３（２０１１年）。
３９  Ｙ・ファン（Ｈｕａｎｇ，  Ｙ．）、Ｋ・ジッタ（Ｚｉｔｔａ，  Ｋ．）、Ｂ・バイン（Ｂｅｉｎ，  Ｂ．）、Ｍ・スタインファス（Ｓｔｅｉｎｆａｔｈ，  Ｍ．）、Ｍ・アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ，  Ｍ．）著「低酸素状態を迅速且つ可逆的に引き起こすインサートベースの酵素細胞培養システム：低酸素状態によって神経ＩＭＲ−３２細胞に引き起こされる細胞損傷、タンパク質発現、及びリン酸化の研究（Ａｎ  ｉｎｓｅｒｔ−ｂａｓｅｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｒａｐｉｄｌｙ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ  ｉｎｄｕｃｅ  ｈｙｐｏｘｉａ：  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄａｍａｇｅ，  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ＩＭＲ−３２  ｃｅｌｌｓ）」、ディスイーズ  モデルズ  アンド  メカニズムス（Ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ＆  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）、６号、ｐ．１５０７−１５１４（２０１３年）。
４０  Ｚ・イワノビッチ（Ｉｖａｎｏｖｉｃ，  Ｚ．）著「低酸素状態又はインシツ正常酸素圧状態：幹細胞パラダイム（Ｈｙｐｏｘｉａ  ｏｒ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｎｏｒｍｏｘｉａ：  Ｔｈｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐａｒａｄｉｇｍ）」、細胞生理学ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、２１９号、２７１−２７５（２００９）。
４１  Ｊ・Ａ・ベルタウト（Ｂｅｒｔｏｕｔ，  Ｊ．  Ａ．）、Ｓ・Ａ・パテル（Ｐａｔｅｌ，  Ｓ．  Ａ．）、Ｍ・Ｃ・シモン（Ｓｉｍｏｎ，  Ｍ．  Ｃ．）著「ヒトがんに対するＯ２可用性の影響（Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｏ２  ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ）」、ネイチャー  レビューズ（Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ）、がん８号、ｐ．９６７（２００８年）。
４２  Ｓ・Ｐ・コルガン（Ｃｏｌｇａｎ，  Ｓ．  Ｐ．）、Ｃ・Ｔ・テイラー（Ｔａｙｌｏｒ，  Ｃ．  Ｔ．）著「低酸素状態：腸炎症時の警報信号（Ｈｙｐｏｘｉａ：  ａｎ  ａｌａｒｍ  ｓｉｇｎａｌ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）」、ネイチャー  レビュース  ガストロエンテロロジー  アンド  ヘパトロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ＆  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、７号、ｐ．２８１−２８７（２０１０年）。
４３  Ｍ・Ｃ・シモン（Ｓｉｍｏｎ，  Ｍ．  Ｃ．）、Ｂ・キース（Ｋｅｉｔｈ，  Ｂ．）著「胚発生及び幹細胞機能における酸素可用性の役割（Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｏｘｙｇｅｎ  ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」、ネイチャー  レビューズ  モレキュラー  セル  バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ）、９号、ｐ．２８５（２００８年）。
４４  Ｄ・Ａ・マルコフ（Ｍａｒｋｏｖ，  Ｄ．  Ａ．）、Ｅ・Ｍ・リリー（Ｌｉｌｌｉｅ，  Ｅ．  Ｍ．）、Ｓ・Ｐ・ガーベット（Ｇａｒｂｅｔｔ，  Ｓ．  Ｐ．）、Ｌ・Ｊ・マコーリー（ＭｃＣａｗｌｅｙ，  Ｌ．  Ｊ．）著「プラズマ表面処理及び保管条件に起因する、ＰＤＭＳを通るガスの拡散のばらつき（Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇａｓｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＰＤＭＳ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｐｌａｓｍａ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」、バイオメディカル  マイクロデバイセス（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ）、１６号、ｐ．９１−９６（２０１４年）。
４５  Ａ・ランベルティ（Ｌａｍｂｅｒｔｉ，  Ａ．）、Ｓ・Ｌ・マラッソ（Ｍａｒａｓｓｏ，  Ｓ．  Ｌ．）、Ｍ・コキュッツァ（Ｃｏｃｕｚｚａ，  Ｍ．）著「マイクロ流体用途に応じてガス透過性を調節できるＰＤＭＳ膜（ＰＤＭＳ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｕｎａｂｌｅ  ｇａｓ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、ＲＳＣアドバンス（Ｒｓｃ  Ａｄｖａｎｃｅｓ）、４号、ｐ．６１４１５−６１４１９（２０１４年）。
４６  Ｍ・Ｙ・コー（Ｋｏｈ，  Ｍ．  Ｙ．）、Ｇ・ポウィス（Ｐｏｗｉｓ，  Ｇ．）著「バトンを渡す：ＨＩＦスイッチ（Ｐａｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂａｔｏｎ：  ｔｈｅ  ＨＩＦ  ｓｗｉｔｃｈ）」、トレンド  イン  バイオケミカル  サイエンス（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、３７号、ｐ．３６４−３７２（２０１２年）。
４７  Ｙ・ワン等（Ｗａｎｇ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．）著「ヒト小腸上皮の分極陰窩・絨毛構造を生成する微細設計コラーゲン足場（Ａ  ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ａ  ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ｃｒｙｐｔ−ｖｉｌｌｕｓ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）」、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、１２８号、ｐ．４４−５５（２０１７年）。
４８  Ｍ・Ｗ・グロス（Ｇｒｏｓｓ，  Ｍ．  Ｗ．）、Ｕ・カーバッハ（Ｋａｒｂａｃｈ，  Ｕ．）、Ｋ・グローベ（Ｇｒｏｅｂｅ，  Ｋ．）、Ａ・Ｊ・フランコ（Ｆｒａｎｋｏ，  Ａ．  Ｊ．）、Ｗ・ミューラー−クライゼル（Ｍｕｅｌｌｅｒ‐Ｋｌｉｅｓｅｒ，  Ｗ．）著「多細胞スフェロイドの酸素圧及び標識密度の同時測定によるミソニダゾール標識化の較正（Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｓｏｎｉｄａｚｏｌｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｂｙ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｘｙｇｅｎ  ｔｅｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）」、国際がんジャーナル（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ）、６１号、ｐ．５６７−５７３（１９９５年）。
４９  Ｐ・ブッフバルド（Ｂｕｃｈｗａｌｄ，  Ｐ．）著「無血管膵臓小島のＦＥＭベース酸素消費モデル及び細胞生存度モデル（ＦＥＭ−ｂａｓｅｄ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ａｖａｓｃｕｌａｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ）」、セオレティカル  バイオロジー  アンド  メディカル  モデリング（Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ）、６号、ｐ．５（２００９年）。
５０  Ｂ・Ａ・ワグナー（Ｗａｇｎｅｒ，  Ｂ．Ａ．）、Ｓ・ベンカタラマン（Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，  Ｓ．）、Ｇ・Ｒ・ベットナー（Ｂｕｅｔｔｎｅｒ，  Ｇ．Ｒ．）著「細胞の酸素利用率（Ｔｈｅ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ｏｘｙｇｅｎ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｅｌｌｓ）」、フリー  ラディカル  バイオロジー  アンド  メディシン（Ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、５１号、ｐ．７００−７１２（２０１１年）。
５１  Ｌ・Ｍ・ヤンセンデュイジギューイセン等（ＪａｎｓｓｅｎＤｕｉｊｇｈｕｉｊｓｅｎ，  Ｌ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．）著「ミトコンドリアＡＴＰ枯渇がＣＡＣＯ−２単層完全性を阻害し、クラウディン−７を内在化する（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＡＴＰ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  Ｄｉｓｒｕｐｔｓ  Ｃａｃｏ−２  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｓ  Ｃｌａｕｄｉｎ  ７）」、フロンティア  イン  フィシオロジー（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、８号（２０１７年）。
５２  Ｐ・ブッフバルド（Ｂｕｃｈｗａｌｄ，  Ｐ．）著「無血管膵臓小島のＦＥＭベース酸素消費モデル及び細胞生存度モデル（ＦＥＭ−ｂａｓｅｄ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ａｖａｓｃｕｌａｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ）」、セオレティカル  バイオロジー  アンド  メディカル  モデリング（Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ）、６号、ｐ．５（２００９年）。
５３  Ｓ・Ｖ・リンチ（Ｌｙｎｃｈ，  Ｓ．Ｖ．）、Ｏ・ペデルセン（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，  Ｏ．）著「健康及び疾患におけるヒト腸微生物叢（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ）」、ニューイングランド  ジャーナル  オブ  メディシン（Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ）、３７５号、ｐ．２３６９−２３７９（２０１６年）。
５４  Ｆ・ゾンマー（Ｓｏｍｍｅｒ，  Ｆ．）、Ｊ・Ｍ・アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｊ．Ｍ．）、Ｒ・バーティ（Ｂｈａｒｔｉ，  Ｒ．）、Ｊ・ラエス（Ｒａｅｓ，  Ｊ．）、Ｐ・ローゼンスティール（Ｒｏｓｅｎｓｔｉｅｌ，  Ｐ．）著「腸微生物叢の弾力性が健康及び疾患に影響する（Ｔｈｅ  ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、ネイチャー  レビューズ  マイクロバイオロジー（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）、１５号、ｐ．６３０−６３８（２０１７年）。
５５  Ｊ・Ｂ・ウォード（Ｗａｒｄ，  Ｊ．  Ｂ．）、Ｓ・Ｊ・キーリー（Ｋｅｅｌｙ，  Ｓ．  Ｊ．）、Ｓ・Ｊ・キーリー（Ｋｅｅｌｙ，  Ｓ．  Ｊ．）著「腸上皮輸送の調整における酸素（Ｏｘｙｇｅｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）」、生理学ジャーナル（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、５９２号、ｐ．２４７３−２４８９（２０１４年）。
５６  Ｙ・ワン等（Ｗａｎｇ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．）著「腸幹細胞ニッチを再現するバイオ工学システム及び設計者マトリックス（Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  Ｍａｔｒｉｃｅｓ  Ｔｈａｔ  Ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｎｉｃｈｅ）」、セル  モル  ガストロエンテロール  ヘパトール（Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ）、５号、ｐ．４４０−４５３  ｅ４４１（２０１８年）。
５７  Ｊ・クランク（Ｃｒａｎｋ，  Ｊ．）、Ｅ・Ｐ・Ｊ・クランク（Ｃｒａｎｋ，  Ｅ．Ｐ．Ｊ．）著「拡散の数学（Ｔｈｅ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）」（クラレンドンプレス（Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、１９７９年）。
５８  Ｍ・Ｗ・グロス（Ｇｒｏｓｓ，  Ｍ．  Ｗ．）、Ｕ・カーバッハ（Ｋａｒｂａｃｈ，  Ｕ．）、Ｋ・グローベ（Ｇｒｏｅｂｅ，  Ｋ．）、Ａ・Ｊ・フランコ（Ｆｒａｎｋｏ，  Ａ．  Ｊ．）、Ｗ・ミューラー−クライゼル（Ｍｕｅｌｌｅｒ‐Ｋｌｉｅｓｅｒ，  Ｗ．）著「多細胞スフェロイドの酸素圧及び標識密度の同時測定によるミソニダゾール標識化の較正（Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｓｏｎｉｄａｚｏｌｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｂｙ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｘｙｇｅｎ  ｔｅｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）」、国際がんジャーナル（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ）、６１号、ｐ．５６７−５７３（１９９５年）。
５９  Ｍ・Ａ・ヴァリア等（Ｖａｒｉａ，  Ｍ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．）著「ピモニダゾール：  子宮頸がんにおける腫瘍低酸素及び細胞増殖の補足的研究の為の新規な低酸素マーカ（Ｐｉｍｏｎｉｄａｚｏｌｅ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｙｐｏｘｉａ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｈｙｐｏｘｉａ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」、ガイナコロジック  オンコロジー（Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、７１号、ｐ．２７０−２７７（１９９８年）。
６０  Ｓ・Ｐ・コルガン（Ｃｏｌｇａｎ，  Ｓ．Ｐ．）、Ａ・Ｌ・ズース（Ｄｚｕｓ，  Ａ．Ｌ．）、Ｃ・Ａ・パーコス（Ｐａｒｋｏｓ，  Ｃ．Ａ．）著「上皮を低酸素状態に曝すことによる好中球経上皮移動の調節（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ｈｙｐｏｘｉａ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）」、ジャーナル  オブ  エクスペリメンタル  メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、１８４号、ｐ．１００３−１０１５（１９９６年）。
６１  Ｋ・シュネーベルガー（Ｓｃｈｎｅｅｂｅｒｇｅｒ，  Ｋ．）、Ｓ・ロス（Ｒｏｔｈ，  Ｓ．）、Ｅ・Ｅ・ニューエンハイス（Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｓ，  Ｅ．Ｅ．）、Ｓ・ミッドデンドープ（Ｍｉｄｄｅｎｄｏｒｐ，  Ｓ．）著「疾患時の腸上皮細胞の極性欠陥：微絨毛封入体病からの教訓（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｏｌａｒｉｔｙ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｒｏｖｉｌｌｕｓ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、ディスイーズ  モデルズ  アンド  メカニズムス、１１号、ｄｍｍ０３１０８８（２０１８年）。
６２  Ｍ・Ｅ・フッビ（Ｈｕｂｂｉ，  Ｍ．Ｅ．）、Ｇ・Ｌ・セメンツァ（Ｓｅｍｅｎｚａ，  Ｇ．Ｌ．）著「低酸素誘導因子による細胞増殖の調整（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒｓ）」、アメリカ生理学ジャーナル−細胞生理学（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、３０９号、ｐ．Ｃ７７５−Ｃ７８２（２０１５年）。
６３  Ａ・カイディ（Ｋａｉｄｉ，  Ａ．）、Ａ・Ｃ・ウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ａ．Ｃ．）、Ｃ・パラスケーヴァ（Ｐａｒａｓｋｅｖａ，  Ｃ．）著「βカテニンとＨＩＦ−１との相互作用が細胞の低酸素状態への適応を促進する（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  β−ｃａｔｅｎｉｎ  ａｎｄ  ＨＩＦ−１  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｈｙｐｏｘｉａ）」、ネイチャー  セル  バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ）、９号、ｐ．２１０−２１７（２００７年）。
６４  Ｄ・Ａ・レフラー（Ｌｅｆｆｌｅｒ，  Ｄ．Ａ．）、Ｊ・Ｔ・ラモン（Ｌａｍｏｎｔ，  Ｊ．Ｔ．）著「クロストリジウム・ディフィシル感染（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」、ニューイングランド  ジャーナル  オブ  メディシン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、３７２号、ｐ．１５３９−１５４８（２０１５年）。
６５  Ｐ・Ｎ・ウィーガンド等（Ｗｉｅｇａｎｄ，  Ｐ．Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．）著「欧州におけるクロストリジウム・ディフィシル感染の臨床的且つ経済的負担：院内感染の系統的レビュー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｃｏｎｏｍｉｃ  ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｕｒｏｐｅ：  ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ−ｆａｃｉｌｉｔｙ−ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」、ジャーナル  オブ  ホスピタル  インフェクション（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、８１号、ｐ．１−１４（２０１２年）。
６６  Ａ・Ｆ・ピーリー等（Ｐｅｅｒｙ，  Ａ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．）著「米国における胃腸病の負担：２０１２年更新（Ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ：  ２０１２  ｕｐｄａｔｅ）」、ガストロエンテロロジー（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）、１４３号、ｐ．１１７９−１１８７、ｅ１１７３（２０１２年）。
６７  Ｋ・アクトリーズ（Ａｋｔｏｒｉｅｓ，  Ｋ．）、Ｃ・シュワン（Ｓｃｈｗａｎ，  Ｃ．）、Ｔ・ヤンク（Ｊａｎｋ，  Ｔ．）著「クロストリジウム・ディフィシルの毒素生物学（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｔｏｘｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、アニュアル  レビュー  オブ  マイクロバイオロジー（Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、７１号、ｐ．２８１−３０７（２０１７年）。
６８  Ｙ・ワン等（Ｗａｎｇ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．）著「整形上皮単層全体にわたる化学勾配の印加によるヒト結腸陰窩配列の形成（Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎｉｃ  Ｃｒｙｐｔ  Ａｒｒａｙ  ｂｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｇｒａｄｉｅｎｔｓ  Ａｃｒｏｓｓ  ａ  Ｓｈａｐｅｄ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）」、セルラー  アンド  モレキュラー  ガストロエンテロロジー  アンド  ヘパトロジー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、５号、ｐ．１１３−１３０（２０１８年）。
６９  Ｃ・Ｊ・ケリー等（Ｋｅｌｌｙ，  Ｃ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．）著「  ヒトβ  デフェンシン−１の構成的発現におけるＨＩＦ−１αの基本的役割（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＨＩＦ−１α  ｉｎ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  β  ｄｅｆｅｎｓｉｎ−１）」、ムコサル  イムノロジー（Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、６号、ｐ．１１１０（２０１３年）。
７０  Ｓ・シマムラ等（Ｓｈｉｍａｍｕｒａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．）著「ビフィドバクテリウム種における酸素感受性と酸素代謝の関係（Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｓｐｅｃｉｅｓ）」、ジャーナル  オブ  デアリィ  サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、７５号、ｐ．３２９６−３３０６（１９９２年）。
７１  Ｌ・ツェン（Ｚｈｅｎｇ，  Ｌ．）、Ｃ・Ｊ・ケリー（Ｋｅｌｌｙ，  Ｃ．  Ｊ．）、Ｓ・Ｐ・コルガン（Ｃｏｌｇａｎ，  Ｓ．  Ｐ．）著、「健康な腸における生理学的低酸素状態及び酸素ホメオスタシス  低酸素状態に対する細胞反応のレビュー（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  ｈｙｐｏｘｉａ  ａｎｄ  ｏｘｙｇｅｎ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．  Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｈｅｍｅ：  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｈｙｐｏｘｉａ）」、アメリカ生理学ジャーナル−細胞生理学（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、３０９号、ｐ．Ｃ３５０−Ｃ３６０（２０１５年）。
７２  Ｍ・ゲルゼマン等（Ｇｅｒｓｅｍａｎｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．）著「クローン病と潰瘍性結腸炎との間の杯細胞分化の相違（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｃｒｏｈｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ）」、ディファレンシエイション（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、７７号、ｐ．８４−９４（２００９年）。
７３  Ｍ・ツジ等（Ｔｓｕｊｉｊ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．）著「潰瘍性結腸炎の患者における結腸粘膜血液動力学及び組織酸素化：器官反射分光測光法による研究（Ｃｏｌｏｎｉｃ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ：  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｏｒｇａｎ  ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）」、ジャーナル  オブ  ガストロエンテロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）、３０号、ｐ．１８３−１８８（１９９５年）。
７４  Ａ・Ｊ・ワリゴラ（Ｗａｌｉｇｏｒａ，  Ａ．Ｊ．）、Ｍ・Ｃ・バーク（Ｂａｒｃ，  Ｍ．Ｃ．）、Ｐ・ブールー（Ｂｏｕｒｌｉｏｕｘ，  Ｐ．）、Ａ・コリグノン（Ｃｏｌｌｉｇｎｏｎ，  Ａ．）、Ｔ・カルジャライネン（Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎ，  Ｔ．）著「クロストリジウム・ディフィシルの細胞付着性が環境因子によって改変される（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｉｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ）」、アプライド  アンド  エンヴァイロンメンタル  マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、６５号、ｐ．４２３４−４２３８（１９９９年）。
７５  Ｔ・ジャンヴィリスリ（Ｊａｎｖｉｌｉｓｒｉ，  Ｔ．）、Ｊ・スカリア（Ｓｃａｒｉａ，  Ｊ．）、Ｙ・−Ｆ・チャン（Ｃｈａｎｇ，  Ｙ．−Ｆ．）著「感染時のクロストリジウム・ディフィシル及びＣＡＣＯ−２の細胞の転写プロファイリング（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ａｎｄ  Ｃａｃｏ−２  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」、ザ  ジャーナル  オブ  インフェクシャス  ディスイーズイズ（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、２０２号、ｐ．２８２−２９０（２０１０年）。
７６  Ｍ・エベイラード等（Ｅｖｅｉｌｌａｒｄ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．）著「培養時のヒト結腸の腸細胞状ＣＡＣＯ−２及び粘液分泌ＨＴ２９細胞への粘着に関与するクロストリジウム・ディフィシルの粘着性因子の識別及び特徴化（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ  Ｃａｃｏ−２  ａｎｄ  ｍｕｃｕｓ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ＨＴ２９  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）」、モレキュラー  マイクロバイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、７号、ｐ．３７１−３８１（１９９３年）。
【０２５５】
当然のことながら、本開示対象の範囲から逸脱しない限り、本開示対象の様々な細部を変更することが可能である。更に、ここまでの記述は、例示のみを目的としており、限定を目的とするものではない。
【図１Ａ】
2021521836.tif 000009
【図１Ｂ】
2021521836.tif 000010
【図１Ｃ】
2021521836.tif 000011
【図１Ｄ】
2021521836.tif 000012
【図１Ｅ】
2021521836.tif 000013
【図１Ｆ】
2021521836.tif 000014
【図１Ｇ】
2021521836.tif 000015
【図１Ｈ】
2021521836.tif 000016
【図１Ｊ】
2021521836.tif 000017
【図１Ｋ】
2021521836.tif 000018
【図２Ａ】
2021521836.tif 000019
【図２Ｂ】
2021521836.tif 000020
【図３Ａ】
2021521836.tif 000021
【図３Ｂ】
2021521836.tif 000022
【図３Ｃ】
2021521836.tif 000023
【図３Ｄ】
2021521836.tif 000024
【図３Ｅ】
2021521836.tif 000025
【図３Ｆ】
2021521836.tif 000026
【図４Ａ】
2021521836.tif 000027
【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【国際調査報告】
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