(57)【要約】  本発明は、抗ＶＬＡ−４抗体及びその結合性断片に関する。本発明はさらに、前記抗体及びその結合性断片をコードするポリヌクレオチド、ならびに前記抗体及びその結合性断片を製造する方法を含む。本発明はさらに、多発性硬化症及び／またはてんかんを患う患者を、前記抗体及びその結合性断片の投与によって処置する方法を含む。本発明はさらに、組換え抗アルファ４抗体またはその結合性断片のスクランブリングに対する感受性を低減させる方法を含む。【選択図】図１
2021526371.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片であって、
（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、
（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、
（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、
（ｄ）ヒトＩｇＧ１の定常重鎖であり、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ１２７Ｃ、Ｋ１２９Ｒ、Ｇ１３５Ｅ、Ｇ１３６Ｓ、Ｑ２０３Ｋ、Ｉ２０７Ｔ、Ｎ２１１Ｄ、Ｋ２２２Ｒ、Ｐ２２７Ｓ、Ｓ２３２Ｙ、Ｃ２３３Ｇ、Ｄ２３４の欠失、Ｋ２３５の欠失、Ｔ２３６の欠失、Ｈ２３７Ｐ、Ｔ２３８Ｐ、Ｌ２４７Ｆ、Ｈ２８１Ｑ、Ｋ２８７Ｑ、Ｙ３１３Ｆ、Ｎ３１４Ｑ、Ａ３４６Ｇ、Ａ３４９Ｓ、Ｐ３５０Ｓ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも１個含む、前記ヒトＩｇＧ１の定常重鎖と
を含む、前記組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片。
【請求項２】
前記ヒトＩｇＧ１の定常重鎖が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ１２７Ｃ、Ｋ１２９Ｒ、Ｇ１３５Ｅ、Ｇ１３６Ｓ、Ｑ２０３Ｋ、Ｉ２０７Ｔ、Ｎ２１１Ｄ、Ｋ２２２Ｒ、Ｐ２２７Ｓ、Ｓ２３２Ｙ、Ｃ２３３Ｇ、Ｄ２３４の欠失、Ｋ２３５の欠失、Ｔ２３６の欠失、Ｈ２３７Ｐ、Ｔ２３８Ｐ、Ｌ２４７Ｆ、Ｈ２８１Ｑ、Ｋ２８７Ｑ、Ｙ３１３Ｆ、Ｎ３１４Ｑ、Ａ３４６Ｇ、Ａ３４９Ｓ、Ｐ３５０Ｓ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも２個含む、請求項１に記載の組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片。
【請求項３】
前記ヒトＩｇＧ１の定常重鎖が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ１２７Ｃ、Ｋ１２９Ｒ、Ｇ１３５Ｅ、Ｇ１３６Ｓ、Ｑ２０３Ｋ、Ｉ２０７Ｔ、Ｎ２１１Ｄ、Ｋ２２２Ｒ、Ｐ２２７Ｓ、Ｓ２３２Ｙ、Ｃ２３３Ｇ、Ｄ２３４の欠失、Ｋ２３５の欠失、Ｔ２３６の欠失、Ｈ２３７Ｐ、Ｔ２３８Ｐ、Ｌ２４７Ｆ、Ｈ２８１Ｑ、Ｋ２８７Ｑ、Ｙ３１３Ｆ、Ｎ３１４Ｑ、Ａ３４６Ｇ、Ａ３４９Ｓ、Ｐ３５０Ｓ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または少なくとも９個、または少なくとも１０個、または少なくとも１１個、または少なくとも１２個、または少なくとも１３個、または少なくとも１４個、または少なくとも１５個、または少なくとも１６個、または少なくとも１７個、または少なくとも１８個、または少なくとも１９個、または少なくとも２０個、または少なくとも２１個、または少なくとも２２個、または少なくとも２３個、または少なくとも２４個、または少なくとも２５個含む、請求項１に記載の組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片。
【請求項４】
前記ヒトＩｇＧ１の定常重鎖が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ１２７Ｃ、Ｋ１２９Ｒ、Ｇ１３５Ｅ、Ｇ１３６Ｓ、Ｑ２０３Ｋ、Ｉ２０７Ｔ、Ｎ２１１Ｄ、Ｋ２２２Ｒ、Ｐ２２７Ｓ、Ｓ２３２Ｙ、Ｃ２３３Ｇ、Ｄ２３４の欠失、Ｋ２３５の欠失、Ｔ２３６の欠失、Ｈ２３７Ｐ、Ｔ２３８Ｐ、Ｌ２４７Ｆ、Ｈ２８１Ｑ、Ｋ２８７Ｑ、Ｙ３１３Ｆ、Ｎ３１４Ｑ、Ａ３４６Ｇ、Ａ３４９Ｓ、Ｐ３５０Ｓ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を含む、請求項１に記載の組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片。
【請求項５】
組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片であって、
（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、
（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、
（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、
（ｄ）ＩｇＧ４アイソタイプのＩｇＧ抗体のヒンジ、ＣＨ１ドメイン、及びＣＨ２ドメイン、ならびにＩｇＧ１アイソタイプのＩｇＧ抗体のＣＨ３ドメインを含むキメラＦｃ領域であり、前記ＣＨ２領域のＥＵ付番２９７位（Ｋａｂａｔ付番３１４位）におけるグルタミン（Ｑ）への置換、前記ヒンジ領域のＥＵ付番アミノ酸２２８位（Ｋａｂａｔ付番２４１位）におけるプロリン（Ｐ）への置換、及び前記ＣＨ３領域のＥＵ付番４４７位（Ｋａｂａｔ付番４７８位）におけるリジン（Ｋ）の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも１個含む、前記キメラＦｃ領域と
を含む、前記組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片。
【請求項６】
請求項５に記載の組換え抗アルファ４抗体またはアルファ４結合性断片であって、（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、（ｄ）前記ＩｇＧ４アイソタイプのＩｇＧ抗体のヒンジ、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含み、かつ、ＥＵ付番２９７位（Ｋａｂａｔ付番３１４位）の非アスパラギン残基への置換を含むかまたはそれからなるＦｃ領域とを含む抗体と比較して、増大した熱安定性を有する、前記抗体または断片。
【請求項７】
組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片であって、
（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、
（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、
（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、
（ｄ）ヒトＩｇＧ４の定常重鎖であり、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも１個含む、前記ヒトＩｇＧ４の定常重鎖と
を含む、前記組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片。
【請求項８】
前記ヒトＩｇＧ４の定常重鎖が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも２個含む、請求項７に記載の組換え抗アルファ４抗体またはアルファ４結合性断片。
【請求項９】
前記ヒトＩｇＧ４の定常重鎖が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または少なくとも９個含む、請求項７に記載の組換え抗アルファ４抗体またはアルファ４結合性断片。
【請求項１０】
前記ヒトＩｇＧ４の定常重鎖が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失の変異を含む、請求項７に記載の組換え抗アルファ４抗体またはアルファ４結合性断片。
【請求項１１】
組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片であって、
（ａ）配列番号８０の配列を含む重鎖と、
（ｂ）配列番号８１の配列を含む軽鎖と
を含む、前記組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片。
【請求項１２】
タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、
前記タンパク質が、
（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、
（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、
（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、
（ｄ）ヒトＩｇＧ１の定常重鎖であり、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ１２７Ｃ、Ｋ１２９Ｒ、Ｇ１３５Ｅ、Ｇ１３６Ｓ、Ｑ２０３Ｋ、Ｉ２０７Ｔ、Ｎ２１１Ｄ、Ｋ２２２Ｒ、Ｐ２２７Ｓ、Ｓ２３２Ｙ、Ｃ２３３Ｇ、Ｄ２３４の欠失、Ｋ２３５の欠失、Ｔ２３６の欠失、Ｈ２３７Ｐ、Ｔ２３８Ｐ、Ｌ２４７Ｆ、Ｈ２８１Ｑ、Ｋ２８７Ｑ、Ｙ３１３Ｆ、Ｎ３１４Ｑ、Ａ３４６Ｇ、Ａ３４９Ｓ、Ｐ３５０Ｓ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも１個含む、前記ヒトＩｇＧ１の定常重鎖と
を含む、前記ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、
前記タンパク質が、
（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、
（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、
（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、
（ｄ）ヒトＩｇＧ１の定常重鎖であり、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ１２７Ｃ、Ｋ１２９Ｒ、Ｇ１３５Ｅ、Ｇ１３６Ｓ、Ｑ２０３Ｋ、Ｉ２０７Ｔ、Ｎ２１１Ｄ、Ｋ２２２Ｒ、Ｐ２２７Ｓ、Ｓ２３２Ｙ、Ｃ２３３Ｇ、Ｄ２３４の欠失、Ｋ２３５の欠失、Ｔ２３６の欠失、Ｈ２３７Ｐ、Ｔ２３８Ｐ、Ｌ２４７Ｆ、Ｈ２８１Ｑ、Ｋ２８７Ｑ、Ｙ３１３Ｆ、Ｎ３１４Ｑ、Ａ３４６Ｇ、Ａ３４９Ｓ、Ｐ３５０Ｓ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも２個、または少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または少なくとも９個、または少なくとも１０個、または少なくとも１１個、または少なくとも１２個、または少なくとも１３個、または少なくとも１４個、または少なくとも１５個、または少なくとも１６個、または少なくとも１７個、または少なくとも１８個、または少なくとも１９個、または少なくとも２０個、または少なくとも２１個、または少なくとも２２個、または少なくとも２３個、または少なくとも２４個、または少なくとも２５個含む、前記ヒトＩｇＧ１の定常重鎖と
を含む、前記ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、
前記タンパク質が、
（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、
（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、
（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、
（ｄ）ＩｇＧ４アイソタイプのＩｇＧ抗体のヒンジ、ＣＨ１ドメイン、及びＣＨ２ドメイン、ならびにＩｇＧ１アイソタイプのＩｇＧ抗体のＣＨ３ドメインを含むキメラＦｃ領域であり、前記ＣＨ２領域のＥＵ付番２９７位（Ｋａｂａｔ付番３１４位）におけるグルタミン（Ｑ）への置換、前記ヒンジ領域のＥＵ付番アミノ酸２２８位（Ｋａｂａｔ付番２４１位）におけるプロリン（Ｐ）への置換、及び前記ＣＨ３領域のＥＵ付番４４７位（Ｋａｂａｔ付番４７８位）におけるリジン（Ｋ）の欠失を含む、前記キメラＦｃ領域と
を含む、前記ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、
前記タンパク質が、
（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、
（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、
（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、
（ｄ）ヒトＩｇＧ４の定常重鎖であり、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも１個含む、前記ヒトＩｇＧ４の定常重鎖と
を含む、前記ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、
前記タンパク質が、
（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、
（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、
（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、
（ｄ）ヒトＩｇＧ４の定常重鎖であり、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも２個、または少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または少なくとも９個含む、前記ヒトＩｇＧ４の定常重鎖と
を含む、前記ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、
前記タンパク質が、
（ａ）配列番号８０の配列を含む重鎖と、
（ｂ）配列番号８１の配列を含む軽鎖と
を含む、前記ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
多発性硬化症を患う患者の症状を軽減する方法であって、前記方法が、
前記患者に治療有効量の組換え抗アルファ４抗体を投与することを含み、
前記組換え抗アルファ４抗体が、
（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、
（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、
（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、
（ｄ）ヒトＩｇＧ１の定常重鎖であり、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ１２７Ｃ、Ｋ１２９Ｒ、Ｇ１３５Ｅ、Ｇ１３６Ｓ、Ｑ２０３Ｋ、Ｉ２０７Ｔ、Ｎ２１１Ｄ、Ｋ２２２Ｒ、Ｐ２２７Ｓ、Ｓ２３２Ｙ、Ｃ２３３Ｇ、Ｄ２３４の欠失、Ｋ２３５の欠失、Ｔ２３６の欠失、Ｈ２３７Ｐ、Ｔ２３８Ｐ、Ｌ２４７Ｆ、Ｈ２８１Ｑ、Ｋ２８７Ｑ、Ｙ３１３Ｆ、Ｎ３１４Ｑ、Ａ３４６Ｇ、Ａ３４９Ｓ、Ｐ３５０Ｓ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも１個含む、前記ヒトＩｇＧ１の定常重鎖とを含む、
前記方法。
【請求項１９】
多発性硬化症を患う患者の症状を軽減する方法であって、前記方法が、
前記患者に治療有効量の組換え抗アルファ４抗体を投与することを含み、
前記組換え抗アルファ４抗体が、
（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、
（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、
（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、
（ｄ）ヒトＩｇＧ１の定常重鎖であり、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ１２７Ｃ、Ｋ１２９Ｒ、Ｇ１３５Ｅ、Ｇ１３６Ｓ、Ｑ２０３Ｋ、Ｉ２０７Ｔ、Ｎ２１１Ｄ、Ｋ２２２Ｒ、Ｐ２２７Ｓ、Ｓ２３２Ｙ、Ｃ２３３Ｇ、Ｄ２３４の欠失、Ｋ２３５の欠失、Ｔ２３６の欠失、Ｈ２３７Ｐ、Ｔ２３８Ｐ、Ｌ２４７Ｆ、Ｈ２８１Ｑ、Ｋ２８７Ｑ、Ｙ３１３Ｆ、Ｎ３１４Ｑ、Ａ３４６Ｇ、Ａ３４９Ｓ、Ｐ３５０Ｓ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも２個、または少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または少なくとも９個、または少なくとも１０個、または少なくとも１１個、または少なくとも１２個、または少なくとも１３個、または少なくとも１４個、または少なくとも１５個、または少なくとも１６個、または少なくとも１７個、または少なくとも１８個、または少なくとも１９個、または少なくとも２０個、または少なくとも２１個、または少なくとも２２個、または少なくとも２３個、または少なくとも２４個、または少なくとも２５個含む、前記ヒトＩｇＧ１の定常重鎖とを含む、
前記方法。
【請求項２０】
多発性硬化症を患う患者の症状を軽減する方法であって、前記方法が、
前記患者に治療有効量の組換え抗アルファ４抗体を投与することを含み、
前記組換え抗アルファ４抗体が、
（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、
（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、
（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、
（ｄ）ＩｇＧ４アイソタイプのＩｇＧ抗体のヒンジ、ＣＨ１ドメイン、及びＣＨ２ドメイン、ならびにＩｇＧ１アイソタイプのＩｇＧ抗体のＣＨ３ドメインを含むキメラＦｃ領域であり、前記ＣＨ２領域のＥＵ付番２９７位（Ｋａｂａｔ付番３１４位）におけるグルタミン（Ｑ）への置換、前記ヒンジ領域のＥＵ付番アミノ酸２２８位（Ｋａｂａｔ付番２４１位）におけるプロリン（Ｐ）への置換、及び前記ＣＨ３領域のＥＵ付番４４７位（Ｋａｂａｔ付番４７８位）におけるリジン（Ｋ）の欠失を含む、前記キメラＦｃ領域とを含む、
前記方法。
【請求項２１】
多発性硬化症を患う患者の症状を軽減する方法であって、前記方法が、
前記患者に治療有効量の組換え抗アルファ４抗体を投与することを含み、
前記組換え抗アルファ４抗体が、
（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、
（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、
（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、
（ｄ）ヒトＩｇＧ４の定常重鎖であり、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも１個含む、前記ヒトＩｇＧ４の定常重鎖とを含む、
前記方法。
【請求項２２】
多発性硬化症を患う患者の症状を軽減する方法であって、前記方法が、
前記患者に治療有効量の組換え抗アルファ４抗体を投与することを含み、
前記組換え抗アルファ４抗体が、
（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、
（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、
（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、
（ｄ）ヒトＩｇＧ４の定常重鎖であり、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも２個、または少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または少なくとも９個含む、前記ヒトＩｇＧ４の定常重鎖とを含む、
前記方法。
【請求項２３】
多発性硬化症を患う患者の症状を軽減する方法であって、前記方法が、
前記患者に治療有効量の組換え抗アルファ４抗体を投与することを含み、
前記組換え抗アルファ４抗体が、
（ａ）配列番号８０の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖と、
（ｂ）配列番号８１の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖とを含む、
前記方法。
【請求項２４】
前記多発性硬化症が、再発型の多発性硬化症である、請求項１８、１９、２０、２１、２２、または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記再発型の多発性硬化症が、ＣＩＳ（ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、再発寛解型多発性硬化症、または活動性二次性進行型多発性硬化症である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記多発性硬化症が、一次性進行型多発性硬化症または進行性再発型多発性硬化症である、請求項１８、１９、２０、２１、２２、または２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記多発性硬化症が、活動性再発型の多発性硬化症を含む活動型の多発性硬化症である、請求項１８、１９、２０、２１、２２、または２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記患者がヒトである、請求項１８、１９、２０、２１、２２、または２３に記載の方法。
【請求項２９】
宿主細胞であって、
（ａ）抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドであり、前記抗体重鎖が、配列番号４の配列を含む可変重鎖、及びヒトＩｇＧ１の定常重鎖を含み、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ１２７Ｃ、Ｋ１２９Ｒ、Ｇ１３５Ｅ、Ｇ１３６Ｓ、Ｑ２０３Ｋ、Ｉ２０７Ｔ、Ｎ２１１Ｄ、Ｋ２２２Ｒ、Ｐ２２７Ｓ、Ｓ２３２Ｙ、Ｃ２３３Ｇ、Ｄ２３４の欠失、Ｋ２３５の欠失、Ｔ２３６の欠失、Ｈ２３７Ｐ、Ｔ２３８Ｐ、Ｌ２４７Ｆ、Ｈ２８１Ｑ、Ｋ２８７Ｑ、Ｙ３１３Ｆ、Ｎ３１４Ｑ、Ａ３４６Ｇ、Ａ３４９Ｓ、Ｐ３５０Ｓ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも１個含む、前記ポリヌクレオチドと、
（ｂ）抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドであり、前記抗体軽鎖が、配列番号１１の配列を含む可変軽鎖、及びヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖を含む、前記ポリヌクレオチドとがトランスフェクトされた、
前記宿主細胞。
【請求項３０】
宿主細胞であって、
（ａ）抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドであり、前記抗体重鎖が、配列番号４の配列を含む可変重鎖、及びヒトＩｇＧ１の定常重鎖を含み、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ１２７Ｃ、Ｋ１２９Ｒ、Ｇ１３５Ｅ、Ｇ１３６Ｓ、Ｑ２０３Ｋ、Ｉ２０７Ｔ、Ｎ２１１Ｄ、Ｋ２２２Ｒ、Ｐ２２７Ｓ、Ｓ２３２Ｙ、Ｃ２３３Ｇ、Ｄ２３４の欠失、Ｋ２３５の欠失、Ｔ２３６の欠失、Ｈ２３７Ｐ、Ｔ２３８Ｐ、Ｌ２４７Ｆ、Ｈ２８１Ｑ、Ｋ２８７Ｑ、Ｙ３１３Ｆ、Ｎ３１４Ｑ、Ａ３４６Ｇ、Ａ３４９Ｓ、Ｐ３５０Ｓ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも２個、または少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または少なくとも９個、または少なくとも１０個、または少なくとも１１個、または少なくとも１２個、または少なくとも１３個、または少なくとも１４個、または少なくとも１５個、または少なくとも１６個、または少なくとも１７個、または少なくとも１８個、または少なくとも１９個、または少なくとも２０個、または少なくとも２１個、または少なくとも２２個、または少なくとも２３個、または少なくとも２４個、または少なくとも２５個含む、前記ポリヌクレオチドと、
（ｂ）抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドであり、前記抗体軽鎖が、配列番号１１の配列を含む可変軽鎖、及びヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖を含む、前記ポリヌクレオチドとがトランスフェクトされた、
前記宿主細胞。
【請求項３１】
宿主細胞であって、
（ａ）抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドであり、前記抗体重鎖が、配列番号４の配列を含む可変重鎖と、ＩｇＧ４アイソタイプのＩｇＧ抗体のヒンジ、ＣＨ１ドメイン、及びＣＨ２ドメイン、ならびにＩｇＧ１アイソタイプのＩｇＧ抗体のＣＨ３ドメインを含むキメラＦｃ領域であり、前記ＣＨ２領域のＥＵ付番２９７位（Ｋａｂａｔ付番３１４位）におけるグルタミン（Ｑ）への置換、前記ヒンジ領域のＥＵ付番アミノ酸２２８位（Ｋａｂａｔ付番２４１位）におけるプロリン（Ｐ）への置換、及び前記ＣＨ３領域のＥＵ付番４４７位（Ｋａｂａｔ付番４７８位）におけるリジン（Ｋ）の欠失を含む、前記キメラＦｃ領域とを含む、前記ポリヌクレオチドと、
（ｂ）抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドであり、前記抗体軽鎖が、配列番号１１の配列を含む可変軽鎖、及びヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖を含む、前記ポリヌクレオチドとがトランスフェクトされた、
前記宿主細胞。
【請求項３２】
宿主細胞であって、
（ａ）抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドであり、前記抗体重鎖が、配列番号４の配列を含む可変重鎖、及びヒトＩｇＧ４の定常重鎖を含み、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも１個含む、前記ポリヌクレオチドと、
（ｂ）抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドであり、前記抗体軽鎖が、配列番号１１の配列を含む可変軽鎖、及びヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖を含む、前記ポリヌクレオチドとがトランスフェクトされた、
前記宿主細胞。
【請求項３３】
宿主細胞であって、
（ａ）抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドであり、前記抗体重鎖が、配列番号４の配列を含む可変重鎖、及びヒトＩｇＧ４の定常重鎖を含み、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも２個、または少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または少なくとも９個含む、前記ポリヌクレオチドと、
（ｂ）抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドであり、前記抗体軽鎖が、配列番号１１の配列を含む可変軽鎖、及びヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖を含む、前記ポリヌクレオチドとがトランスフェクトされた、
前記宿主細胞。
【請求項３４】
宿主細胞であって、
（ａ）配列番号８０の配列を含む抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドと、
（ｂ）配列番号８１の配列を含む軽鎖をコードするポリヌクレオチドとがトランスフェクトされた、
前記宿主細胞。
【請求項３５】
前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項２９、３０、３１、３２、３３、または３４に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
宿主細胞を用意することによって組換え抗α４抗体またはそのα４結合性断片を作製する方法であって、
前記宿主細胞に、
（ａ）前記細胞における発現のために配置された、抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドであり、前記抗体重鎖が、配列番号４の配列を含む可変重鎖、及びヒトＩｇＧ１の定常重鎖を含み、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ１２７Ｃ、Ｋ１２９Ｒ、Ｇ１３５Ｅ、Ｇ１３６Ｓ、Ｑ２０３Ｋ、Ｉ２０７Ｔ、Ｎ２１１Ｄ、Ｋ２２２Ｒ、Ｐ２２７Ｓ、Ｓ２３２Ｙ、Ｃ２３３Ｇ、Ｄ２３４の欠失、Ｋ２３５の欠失、Ｔ２３６の欠失、Ｈ２３７Ｐ、Ｔ２３８Ｐ、Ｌ２４７Ｆ、Ｈ２８１Ｑ、Ｋ２８７Ｑ、Ｙ３１３Ｆ、Ｎ３１４Ｑ、Ａ３４６Ｇ、Ａ３４９Ｓ、Ｐ３５０Ｓ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも１個含む、前記ポリヌクレオチドと、
（ｂ）前記細胞における発現のために配置された、抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドであり、前記抗体軽鎖が、配列番号１１の配列を含む可変軽鎖、及びヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖を含む、前記ポリヌクレオチドとがトランスフェクトされている、
前記方法。
【請求項３７】
宿主細胞を用意することによって組換え抗α４抗体またはそのα４結合性断片を作製する方法であって、
前記宿主細胞に、
（ａ）前記細胞における発現のために配置された、抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドであり、前記抗体重鎖が、配列番号４の配列を含む可変重鎖、及びヒトＩｇＧ１の定常重鎖を含み、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ１２７Ｃ、Ｋ１２９Ｒ、Ｇ１３５Ｅ、Ｇ１３６Ｓ、Ｑ２０３Ｋ、Ｉ２０７Ｔ、Ｎ２１１Ｄ、Ｋ２２２Ｒ、Ｐ２２７Ｓ、Ｓ２３２Ｙ、Ｃ２３３Ｇ、Ｄ２３４の欠失、Ｋ２３５の欠失、Ｔ２３６の欠失、Ｈ２３７Ｐ、Ｔ２３８Ｐ、Ｌ２４７Ｆ、Ｈ２８１Ｑ、Ｋ２８７Ｑ、Ｙ３１３Ｆ、Ｎ３１４Ｑ、Ａ３４６Ｇ、Ａ３４９Ｓ、Ｐ３５０Ｓ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも２個、または少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または少なくとも９個、または少なくとも１０個、または少なくとも１１個、または少なくとも１２個、または少なくとも１３個、または少なくとも１４個、または少なくとも１５個、または少なくとも１６個、または少なくとも１７個、または少なくとも１８個、または少なくとも１９個、または少なくとも２０個、または少なくとも２１個、または少なくとも２２個、または少なくとも２３個、または少なくとも２４個、または少なくとも２５個含む、前記ポリヌクレオチドと、
（ｂ）前記細胞における発現のために配置された、抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドであって、前記抗体軽鎖が、配列番号１１の配列を含む可変軽鎖、及びヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖を含む、前記ポリヌクレオチドとがトランスフェクトされている、
前記方法。
【請求項３８】
宿主細胞を用意することによって組換え抗α４抗体またはそのα４結合性断片を作製する方法であって、
前記宿主細胞に、
（ａ）前記細胞における発現のために配置された、抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドであり、前記抗体重鎖が、配列番号４の配列を含む可変重鎖と、ＩｇＧ４アイソタイプのＩｇＧ抗体のヒンジ、ＣＨ１ドメイン、及びＣＨ２ドメイン、ならびにＩｇＧ１アイソタイプのＩｇＧ抗体のＣＨ３ドメインを含むキメラＦｃ領域であり、前記ＣＨ２領域のＥＵ付番２９７位（Ｋａｂａｔ付番３１４位）におけるグルタミン（Ｑ）への置換、前記ヒンジ領域のＥＵ付番アミノ酸２２８位（Ｋａｂａｔ付番２４１位）におけるプロリン（Ｐ）への置換、及び前記ＣＨ３領域のＥＵ付番４４７位（Ｋａｂａｔ付番４７８位）におけるリジン（Ｋ）の欠失を含む、前記キメラＦｃ領域とを含む、前記ポリヌクレオチドと、
（ｂ）前記細胞における発現のために配置された、抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドであり、前記抗体軽鎖が、配列番号１１の配列を含む可変軽鎖、及びヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖を含む、前記ポリヌクレオチドとがトランスフェクトされている、
前記方法。
【請求項３９】
宿主細胞を用意することによって組換え抗α４抗体またはそのα４結合性断片を作製する方法であって、
前記宿主細胞に、
（ａ）前記細胞における発現のために配置された、抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドであり、前記抗体軽鎖が、配列番号１１の配列を含む可変軽鎖、及びヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖を含む、前記ポリヌクレオチドと、
（ｂ）前記細胞における発現のために配置された、抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドであり、前記抗体重鎖が、配列番号４の配列を含む可変重鎖、及びヒトＩｇＧ４の定常重鎖を含み、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも１個含む、前記ポリヌクレオチドとがトランスフェクトされている、
前記方法。
【請求項４０】
宿主細胞を用意することによって組換え抗α４抗体またはそのα４結合性断片を作製する方法であって、
前記宿主細胞に、
（ａ）前記細胞における発現のために配置された、抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドであり、前記抗体軽鎖が、配列番号１１の配列を含む可変軽鎖、及びヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖を含む、前記ポリヌクレオチドと、
（ｂ）前記細胞における発現のために配置された、抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドであり、前記抗体重鎖が、配列番号４の配列を含む可変重鎖、及びヒトＩｇＧ４の定常重鎖を含み、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも２個、または少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または少なくとも９個含む、前記ポリヌクレオチドとがトランスフェクトされている、
前記方法。
【請求項４１】
組換え抗α４抗体またはそのα４結合性断片を作製する方法であって、
宿主細胞を用意することであり、
前記宿主細胞に、
（ａ）前記細胞における発現のために配置された、配列番号８０の配列を含む抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドと、
（ｂ）前記細胞における発現のために配置された、配列番号８１の配列を含む軽鎖をコードするポリヌクレオチドとがトランスフェクトされている、
前記用意すること、及び、
前記トランスフェクトされた宿主細胞を培養することにより、前記組換え抗α４抗体分子またはそのα４結合性断片を生成する前記方法。
【請求項４２】
前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項３６、３７、３８、３９、４０、または４１に記載の方法。
【請求項４３】
組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片であって、
（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、
（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、
（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、
（ｄ）ヒトＩｇＧ１の定常重鎖であり、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ１２７Ｃ、Ｋ１２９Ｒ、Ｇ１３５Ｅ、Ｇ１３６Ｓ、Ｑ２０３Ｋ、Ｉ２０７Ｔ、Ｎ２１１Ｄ、Ｋ２２２Ｒ、Ｐ２２７Ｓ、Ｓ２３２Ｙ、Ｃ２３３Ｇ、Ｄ２３４の欠失、Ｋ２３５の欠失、Ｔ２３６の欠失、Ｈ２３７Ｐ、Ｔ２３８Ｐ、Ｌ２４７Ｆ、Ｈ２８１Ｑ、Ｋ２８７Ｑ、Ｙ３１３Ｆ、Ｎ３１４Ｑ、Ａ３４６Ｇ、Ａ３４９Ｓ、Ｐ３５０Ｓ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも１個含む、前記ヒトＩｇＧ１の定常重鎖と
を含み、
（ｅ）野生型ＩｇＧ４定常領域を含む抗体または結合性断片と比べて、スクランブリングに対する感受性が低減している、
前記組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片。
【請求項４４】
前記ヒトＩｇＧ１の定常重鎖が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ１２７Ｃ、Ｋ１２９Ｒ、Ｇ１３５Ｅ、Ｇ１３６Ｓ、Ｑ２０３Ｋ、Ｉ２０７Ｔ、Ｎ２１１Ｄ、Ｋ２２２Ｒ、Ｐ２２７Ｓ、Ｓ２３２Ｙ、Ｃ２３３Ｇ、Ｄ２３４の欠失、Ｋ２３５の欠失、Ｔ２３６の欠失、Ｈ２３７Ｐ、Ｔ２３８Ｐ、Ｌ２４７Ｆ、Ｈ２８１Ｑ、Ｋ２８７Ｑ、Ｙ３１３Ｆ、Ｎ３１４Ｑ、Ａ３４６Ｇ、Ａ３４９Ｓ、Ｐ３５０Ｓ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも２個含む、請求項４３に記載の組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片。
【請求項４５】
前記ヒトＩｇＧ１の定常重鎖が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ１２７Ｃ、Ｋ１２９Ｒ、Ｇ１３５Ｅ、Ｇ１３６Ｓ、Ｑ２０３Ｋ、Ｉ２０７Ｔ、Ｎ２１１Ｄ、Ｋ２２２Ｒ、Ｐ２２７Ｓ、Ｓ２３２Ｙ、Ｃ２３３Ｇ、Ｄ２３４の欠失、Ｋ２３５の欠失、Ｔ２３６の欠失、Ｈ２３７Ｐ、Ｔ２３８Ｐ、Ｌ２４７Ｆ、Ｈ２８１Ｑ、Ｋ２８７Ｑ、Ｙ３１３Ｆ、Ｎ３１４Ｑ、Ａ３４６Ｇ、Ａ３４９Ｓ、Ｐ３５０Ｓ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または少なくとも９個、または少なくとも１０個、または少なくとも１１個、または少なくとも１２個、または少なくとも１３個、または少なくとも１４個、または少なくとも１５個、または少なくとも１６個、または少なくとも１７個、または少なくとも１８個、または少なくとも１９個、または少なくとも２０個、または少なくとも２１個、または少なくとも２２個、または少なくとも２３個、または少なくとも２４個、または少なくとも２５個含む、請求項４３に記載の組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片。
【請求項４６】
前記ヒトＩｇＧ１の定常重鎖が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ１２７Ｃ、Ｋ１２９Ｒ、Ｇ１３５Ｅ、Ｇ１３６Ｓ、Ｑ２０３Ｋ、Ｉ２０７Ｔ、Ｎ２１１Ｄ、Ｋ２２２Ｒ、Ｐ２２７Ｓ、Ｓ２３２Ｙ、Ｃ２３３Ｇ、Ｄ２３４の欠失、Ｋ２３５の欠失、Ｔ２３６の欠失、Ｈ２３７Ｐ、Ｔ２３８Ｐ、Ｌ２４７Ｆ、Ｈ２８１Ｑ、Ｋ２８７Ｑ、Ｙ３１３Ｆ、Ｎ３１４Ｑ、Ａ３４６Ｇ、Ａ３４９Ｓ、Ｐ３５０Ｓ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を含む、請求項４３に記載の組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片。
【請求項４７】
組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片であって、
（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、
（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、
（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、
（ｄ）ＩｇＧ４アイソタイプのＩｇＧ抗体のヒンジ、ＣＨ１ドメイン、及びＣＨ２ドメイン、ならびにＩｇＧ１アイソタイプのＩｇＧ抗体のＣＨ３ドメインを含むキメラＦｃ領域であり、前記ＣＨ２領域のＥＵ付番２９７位（Ｋａｂａｔ付番３１４位）におけるグルタミン（Ｑ）への置換、前記ヒンジ領域のＥＵ付番アミノ酸２２８位（Ｋａｂａｔ付番２４１位）におけるプロリン（Ｐ）への置換、及び前記ＣＨ３領域のＥＵ付番４４７位（Ｋａｂａｔ付番４７８位）におけるリジン（Ｋ）の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも１個含む、前記キメラＦｃ領域と
を含み、
（ｅ）野生型ＩｇＧ４定常領域を含む抗体または結合性断片と比べて、スクランブリングに対する感受性が低減している、
前記組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片。
【請求項４８】
請求項４７に記載の組換え抗アルファ４抗体またはアルファ４結合性断片であって、（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、（ｄ）前記ＩｇＧ４アイソタイプのＩｇＧ抗体のヒンジ、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含み、かつ、ＥＵ付番２９７位（Ｋａｂａｔ付番３１４位）の非アスパラギン残基への置換を含むかまたはそれからなるＦｃ領域とを含む抗体と比較して、増大した熱安定性を有する、前記抗体または断片。
【請求項４９】
組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片であって、
（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、
（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、
（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、
（ｄ）ヒトＩｇＧ４の定常重鎖であり、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも１個含む、前記ヒトＩｇＧ４の定常重鎖と
を含み、
（ｅ）野生型ＩｇＧ４定常領域を含む抗体または結合性断片と比べて、スクランブリングに対する感受性が低減している、
前記組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片。
【請求項５０】
前記ヒトＩｇＧ４の定常重鎖が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも２個含む、請求項４９に記載の組換え抗アルファ４抗体またはアルファ４結合性断片。
【請求項５１】
前記ヒトＩｇＧ４の定常重鎖が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも４９個、または少なくとも８個、または少なくとも９個含む、請求項４９に記載の組換え抗アルファ４抗体またはアルファ４結合性断片。
【請求項５２】
前記ヒトＩｇＧ４の定常重鎖が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失の変異を含む、請求項４９に記載の組換え抗アルファ４抗体またはアルファ４結合性断片。
【請求項５３】
組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片であって、
（ａ）配列番号８０の配列を含む重鎖と、
（ｂ）配列番号８１の配列を含む軽鎖と
を含み、
（ｃ）野生型ＩｇＧ４定常領域を含む抗体または結合性断片と比べて、スクランブリングに対する感受性が低減している、
前記組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片。
【請求項５４】
組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片のスクランブリングに対する感受性を、野生型ＩｇＧ４定常領域を含む抗体または結合性断片と比べて低減させる方法であって、前記方法が、
宿主細胞を用意することであり、
前記宿主細胞に、
（ａ）前記細胞における発現のために配置された、抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドであり、前記抗体軽鎖が、配列番号１１の配列を含む可変軽鎖、及びヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖を含む、前記ポリヌクレオチドと、
（ｂ）前記細胞における発現のために配置された、抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドであり、前記抗体重鎖が、配列番号４の配列を含む可変重鎖、及びヒトＩｇＧ４の定常重鎖を含む、前記ポリヌクレオチドとがトランスフェクトされている、
前記用意すること、及び、
前記ヒトＩｇＧ４の定常重鎖に、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも１個導入すること
を含む、前記方法。
【請求項５５】
組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片のスクランブリングに対する感受性を、野生型ＩｇＧ４定常領域を含む抗体または結合性断片と比べて低減させる方法であって、前記方法が、
宿主細胞を用意することであり、
前記宿主細胞に、
（ａ）前記細胞における発現のために配置された、抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドであり、前記抗体軽鎖が、配列番号１１の配列を含む可変軽鎖、及びヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖を含む、前記ポリヌクレオチドと、
（ｂ）前記細胞における発現のために配置された、抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドであり、前記抗体重鎖が、配列番号４の配列を含む可変重鎖、及びヒトＩｇＧ４の定常重鎖を含む、前記ポリヌクレオチドとがトランスフェクトされている、
前記用意すること、及び、
前記ヒトＩｇＧ４の定常重鎖に、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも２個、または少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または少なくとも９個導入すること
を含む、前記方法。
【請求項５６】
野生型ＩｇＧ４定常領域を含む抗体または結合性断片と比べて、スクランブリングに対する感受性が低減している、組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片を生成する方法であって、前記方法が、
宿主細胞を用意することであり、
前記宿主細胞に、
（ａ）前記細胞における発現のために配置された、配列番号８０の配列を含む抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドと、
（ｂ）前記細胞における発現のために配置された、配列番号８１の配列を含む軽鎖をコードするポリヌクレオチドとがトランスフェクトされている、
前記用意すること、及び、
前記トランスフェクトされた宿主細胞を培養することにより、前記組換え抗α４抗体分子またはそのα４結合性断片を生成すること
を含む、前記方法。
【請求項５７】
前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項５３、５４、５５、または５６に記載の方法。
【請求項５８】
てんかんを患う患者を処置する方法であって、前記方法が、
前記患者に治療有効量の組換え抗アルファ４抗体を投与することを含み、
前記組換え抗アルファ４抗体が、
（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、
（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、
（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、
（ｄ）ヒトＩｇＧ１の定常重鎖であり、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ１２７Ｃ、Ｋ１２９Ｒ、Ｇ１３５Ｅ、Ｇ１３６Ｓ、Ｑ２０３Ｋ、Ｉ２０７Ｔ、Ｎ２１１Ｄ、Ｋ２２２Ｒ、Ｐ２２７Ｓ、Ｓ２３２Ｙ、Ｃ２３３Ｇ、Ｄ２３４の欠失、Ｋ２３５の欠失、Ｔ２３６の欠失、Ｈ２３７Ｐ、Ｔ２３８Ｐ、Ｌ２４７Ｆ、Ｈ２８１Ｑ、Ｋ２８７Ｑ、Ｙ３１３Ｆ、Ｎ３１４Ｑ、Ａ３４６Ｇ、Ａ３４９Ｓ、Ｐ３５０Ｓ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも１個含む、前記ヒトＩｇＧ１の定常重鎖とを含む、
前記方法。
【請求項５９】
てんかんを患う患者を処置する方法であって、前記方法が、
前記患者に治療有効量の組換え抗アルファ４抗体を投与することを含み、
前記組換え抗アルファ４抗体が、
（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、
（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、
（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、
（ｄ）ヒトＩｇＧ１の定常重鎖であり、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ１２７Ｃ、Ｋ１２９Ｒ、Ｇ１３５Ｅ、Ｇ１３６Ｓ、Ｑ２０３Ｋ、Ｉ２０７Ｔ、Ｎ２１１Ｄ、Ｋ２２２Ｒ、Ｐ２２７Ｓ、Ｓ２３２Ｙ、Ｃ２３３Ｇ、Ｄ２３４の欠失、Ｋ２３５の欠失、Ｔ２３６の欠失、Ｈ２３７Ｐ、Ｔ２３８Ｐ、Ｌ２４７Ｆ、Ｈ２８１Ｑ、Ｋ２８７Ｑ、Ｙ３１３Ｆ、Ｎ３１４Ｑ、Ａ３４６Ｇ、Ａ３４９Ｓ、Ｐ３５０Ｓ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも２個、または少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または少なくとも９個、または少なくとも１０個、または少なくとも１１個、または少なくとも１２個、または少なくとも１３個、または少なくとも１４個、または少なくとも１５個、または少なくとも１６個、または少なくとも１７個、または少なくとも１８個、または少なくとも１９個、または少なくとも２０個、または少なくとも２１個、または少なくとも２２個、または少なくとも２３個、または少なくとも２４個、または少なくとも２５個含む、前記ヒトＩｇＧ１の定常重鎖とを含む、
前記方法。
【請求項６０】
てんかんを患う患者を処置する方法であって、前記方法が、
前記患者に治療有効量の組換え抗アルファ４抗体を投与することを含み、
前記組換え抗アルファ４抗体が、
（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、
（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、
（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、
（ｄ）ＩｇＧ４アイソタイプのＩｇＧ抗体のヒンジ、ＣＨ１ドメイン、及びＣＨ２ドメイン、ならびにＩｇＧ１アイソタイプのＩｇＧ抗体のＣＨ３ドメインを含むキメラＦｃ領域であり、前記ＣＨ２領域のＥＵ付番２９７位（Ｋａｂａｔ付番３１４位）におけるグルタミン（Ｑ）への置換、前記ヒンジ領域のＥＵ付番アミノ酸２２８位（Ｋａｂａｔ付番２４１位）におけるプロリン（Ｐ）への置換、及び前記ＣＨ３領域のＥＵ付番４４７位（Ｋａｂａｔ付番４７８位）におけるリジン（Ｋ）の欠失を含む、前記キメラＦｃ領域とを含む、
前記方法。
【請求項６１】
てんかんを患う患者を処置する方法であって、前記方法が、
前記患者に治療有効量の組換え抗アルファ４抗体を投与することを含み、
前記組換え抗アルファ４抗体が、
（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、
（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、
（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、
（ｄ）ヒトＩｇＧ４の定常重鎖であり、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも１個含む、前記ヒトＩｇＧ４の定常重鎖とを含む、
前記方法。
【請求項６２】
てんかんを患う患者を処置する方法であって、前記方法が、
前記患者に治療有効量の組換え抗アルファ４抗体を投与することを含み、
前記組換え抗アルファ４抗体が、
（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、
（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、
（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、
（ｄ）ヒトＩｇＧ４の定常重鎖であり、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも２個、または少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または少なくとも９個含む、前記ヒトＩｇＧ４の定常重鎖とを含む、
前記方法。
【請求項６３】
てんかんを患う患者を処置する方法であって、前記方法が、
前記患者に治療有効量の組換え抗アルファ４抗体を投与することを含み、
前記組換え抗アルファ４抗体が、
（ａ）配列番号８０の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖と、
（ｂ）配列番号８１の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖とを含む、
前記方法。
【請求項６４】
前記てんかんが、薬剤抵抗性てんかんである、請求項５８、５９、６０、６１、６２、または６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記患者がヒトである、請求項５８、５９、６０、６１、６２、または６３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルファ４結合抗体及びその断片に関する。
【０００２】
配列表
本願には、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出され、その全体が参照により本明細書に援用される配列表が含まれる。前記配列表は、２０１９年４月１２日に作成され、Ａｎｔｉ＿ＶＬＡＳｅｑｕｅｎｃｅ  ＰａｔｅｎｔＩＮ＿ＳＴ２５という名称であり、２０８キロバイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
インテグリンは、細胞間及び細胞基質間の相互作用を媒介する大きな細胞表面受容体ファミリーのメンバーである。インテグリンは、様々なα鎖及びβ鎖が組み合わさった非共有結合性のαβヘテロ二量体として存在し、高い構造的相同性を共有する。インテグリンは、多種多様な生理的プロセスを媒介し、多種多様な病的状態に関連する。α４鎖は、主に白血球に限定され、β１及びβ７の２つのβ鎖と会合し得る。
【０００４】
ＶＬＡ−４（α４β１とも呼ばれる）及びα４β７は、炎症性疾患の病態生理において中心的な役割を果たす。ＶＬＡ−４は、細胞表面受容体のβ１インテグリンファミリーのメンバーである。ＶＬＡ−４は、α４鎖及びβ１鎖を含み、細胞間相互作用に関与する。その発現は主に、Ｔリンパ球を含むリンパ球系細胞、ならびにミクログリア細胞及びマクロファージを含む骨髄系細胞に限定されている。ＶＬＡ−４は、内皮細胞リガンドＶＣＡＭ−１（血管細胞接着分子１）に結合し、ヒト血漿フィブロネクチンのヘパリンＩＩ結合性断片に対するＴリンパ球及びＢリンパ球の付着を媒介し得る。ＶＬＡ−４は、正常白血球の輸送を調節し（Ｌｏｂｂ  ａｎｄ  Ｈｅｍｌｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４（５）：１７２２−１７２８，１９９４）、細胞の活性化を助ける重要な共刺激シグナルをもたらす（Ｃｌａｒｋ  ａｎｄ  Ｂｒｕｇｇｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８（５２０８）：２３３−９，１９９５）。炎症応答において、ＶＬＡ−４は、損傷組織への白血球の遊走を調節し、したがって魅力的な治療標的であると認識されてきた。ブロッキングモノクローナル抗体（Ｌｏｂｂ  ａｎｄ  Ｈｅｍｌｅｒ（上記）、Ｅｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  １２１（Ｐｔ  ７）：１２５７−６６，１９９８、Ｒａｍｏｓ−Ｂａｒｂｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１６３（１）：１０１−８．２００１）、阻害性ペプチド（Ｍｏｌｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．９５（６）：２６０１−１０，１９９５、Ａｂｒａｈａｍ，１９９７、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．２００２  Ｊａｎ  １５；６７（２）：１９１−９，２００２）、及び小分子アンタゴニスト（Ｋｕｄｌａｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３０１（２）：７４７−５２，２００２）を使用したインビボ試験において、白血球による炎症におけるα４β１インテグリンの重要な役割が証明されている。
【０００５】
α４β１は、ＶＣＡＭ−１またはフィブロネクチン（例えば、選択的スプライシングされたコネクティングセグメント１（ＣＳ１）を含むフィブロネクチンバリアント）の２つのタンパク質リガンドのいずれかに結合することにより、細胞接着を媒介する（Ｏｓｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５９（６）：１２０３−１１，１９８９、Ｗａｙｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０９（３）：１３２１−３０，１９８９）。他の潜在的なリガンドも同定されているが（Ｂａｙｌｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ  ９）：１１６５−７４，１９９８）、これらの相互作用の生物学的意義はあまり明確ではない。α４β１とそのリガンドとの間の相互作用は親和性が低く、結合はおそらく多価の相互作用によって調整されると考えられている。α４β１の発現は構成的であるが、そのリガンドとの相互作用は、抗原、抗Ｔ細胞受容体ｍＡｂ、ホルボールエステル、二価カチオンＭｎ２＋、及び特定のβ１特異的抗体などの様々な刺激によって誘導され得る活性化状態において大きく増強される。こうした親和性及び／またはアビディティの変化は、相互作用が生産的であり、かつリガンド／インテグリン複合体を安定化させるかどうかを最終的に決定する（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８（５）：６３２−４０，１９９６）。α４β７は、より限定的な白血球群によって発現され、粘膜アドレシンＭａｄＣＡＭに結合することにより、粘膜リンパ系組織へのリンパ球のホーミングに部分的に関与するが、ＶＣＡＭ−１及びフィブロネクチンにも結合する。α４に対する特定のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＶＬＡ４とα４β７の両方の接着機能をブロックし得る。
【０００６】
ヒト化抗体をマウス抗体の代わりに治療剤として使用すると、ＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）応答と呼ばれる望ましくない免疫応答がヒトにおいて生じることを回避できる。ヒト化抗体は、一般的に、ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を別の種（典型的にはマウス抗体）のＣＤＲで置換することによって構築される。
【０００７】
抗体は、その可変領域を介して抗原に結合する能力を有する。抗原に抗体が結合すると、抗原は破壊の標的とされ、これは多くの場合、抗体の定常領域またはＦｃ領域によって少なくとも部分的に媒介される。抗体のＦｃ領域によって媒介されるエフェクター機能またはエフェクター活性はいくつかある。１つのエフェクター機能は、補体タンパク質に結合する能力であり、これは、標的抗原、例えば細胞内病原体を、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）と呼ばれるプロセスで溶解するのに役立ち得る。Ｆｃ領域の別のエフェクター活性は、他の免疫作用を引き起こす能力を有する免疫細胞、またはいわゆるエフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体（例えばＦｃγＲ）に結合することである。これらの免疫作用（例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ））は、例えば、免疫活性化因子を放出し、抗体産生、エンドサイトーシス、食作用、及び細胞殺傷を調節することにより、病原体／抗原の除去において機能する。いくつかの臨床用途において、これらの応答は、抗体の有効性に関して極めて重要であるが、他の場合では、望まれない副作用を惹起する。エフェクター介在性副作用の一例は、急性発熱反応を引き起こす炎症性サイトカインの放出である。別の例は、抗原産生細胞の長期欠失である。
【０００８】
抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域を欠く抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）など）を使用することによって回避され得る。しかしながら、これらの断片は、腎臓によるクリアランスが速いため、半減期が短い。Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖ断片には抗原結合部位が２つではなく１つしかなく、結合アビディティに起因する利点が損なわれ、製造における課題が生じる可能性がある。代替的な手法は、全長抗体のエフェクター機能を低減させつつ、Ｆｃ領域の有益な他の特質（例えば、長い半減期及びヘテロ二量体化）を保持することを目指す。エフェクター機能を低減させる手法の１つは、Ｆｃ領域の特定の残基に結合した糖を除去することにより、いわゆるアグリコシル化抗体を生成することである。アグリコシル化抗体は、例えば、糖が結合した残基を欠失もしくは変化させること、糖を酵素的に除去すること、グリコシル化阻害因子の存在下で培養した細胞において抗体を産生させること、またはタンパク質をグリコシル化することができない細胞（例えば、細菌宿主細胞）において抗体を発現させることにより、生成することができる。別の手法は、ＩｇＧ１ではなくＩｇＧ４抗体のＦｃ領域を用いることである。ＩｇＧ４抗体がＩｇＧ１と比べて低い補体活性化及び抗体依存性細胞傷害のレベルを有することを特徴とするのは、よく知られている。
【０００９】
ヒトα４に対するモノクローナル抗体は、３つの機能的に異なる組織分布のエピトープＡ、Ｂ、及びＣに結合する（Ｐｕｌｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１０２４１−１０２４５，１９９１、Ｓｃｈｉｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４２７０−１４２７３，１９９５）。エピトープＢはＢ１及びＢ２エピトープに細分され、これらは、組織分布的に区別不能だが、細胞凝集を誘導するｍＡｂの能力によって定義される。エピトープＡ及びＢ２に対する抗α４  ｍＡｂは、同型細胞凝集を誘導することができるが、エピトープＢ１及びＣに対するものにはこれができない。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、抗ＶＬＡ−４抗体などのＣＤＲグラフトアルファ４結合抗体を最適化することができる、生殖系列可変領域フレームワークを含む抗ＶＬＡ−４抗体及びその結合性断片に関する。したがって、本発明は、かかるフレームワークを含む抗ＶＬＡ−４可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ならびに抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＡ−４は、ヒトＶＬＡ−４である。いくつかの実施形態では、ＶＬＡ−４は、α４鎖（例えば、ヒトα４鎖）を含む。
【００１１】
本抗体は、エフェクター機能を変化または低減させ、かつ安定性を向上させる、修飾されたＦｃ領域を含んでもよい。修飾されたＦｃ領域を有する抗体は、オリゴ糖を欠く抗体で観察される著しい有害作用、特に立体構造及び安定性に対する有害作用を改善し得る。修飾されたＦｃ領域を有する抗体は、変化または低減したエフェクター機能及び向上した安定性も有し得る。本発明はさらに、本明細書に記載の分子を作製する方法に関する。
【００１２】
本抗体は、Ｆｃ領域の安定性を増強する改善された方法を提供することにより、先行技術における「エフェクターレス」抗体の問題を改善し得る。例えば、本発明は、ポリペプチドのＦｃ領域に安定化アミノ酸を含む、安定性操作された（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）Ｆｃポリペプチド、例えば、安定化ＩｇＧ抗体または他のＦｃ含有結合分子を提供する。一実施形態において、本発明は、親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域における特定のアミノ酸残基位置に、Ｆｃ領域の安定性を増強する変異を導入する方法を提供する。いくつかの実施形態では、安定化Ｆｃポリペプチドは、変化または低減したエフェクター機能（安定化アミノ酸（複数可）を含まないポリペプチドと比較して）を有し、親Ｆｃポリペプチドと比較して増強された安定性を呈する。いくつかの実施形態では、親Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１（例えば、配列番号８３の配列を有するもの）である。いくつかの実施形態では、親Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ４（例えば、配列番号８４の配列を有するもの）である。
【００１３】
したがって、本明細書に開示する抗体は、下記を含むがこれらに限定されない、いくつかの利点を提供する。
−  エフェクター機能が低減しているために治療薬として好適な、安定化アグリコシル化Ｆｃ領域を含む安定化アグリコシル化Ｆｃポリペプチド、例えば、安定化融合タンパク質またはアグリコシル化ＩｇＧ抗体の提供、
−  エフェクター機能が低減しているために治療薬として好適な、ＩｇＧ４抗体に由来するＦｃ領域を含む安定化Ｆｃポリペプチド、例えば、安定化グリコシル化もしくはアグリコシル化融合タンパク質またはＩｇＧ４抗体の提供、
−  ポリペプチドの変化が最小限に抑えられた安定化Ｆｃポリペプチドを生成する効率的な方法（例えば、安定化されていない親ポリペプチドに変化を導入すること、または安定化Ｆｃポリペプチドをコードする核酸分子を発現することによる）、
−  免疫原性及び／またはエフェクター機能の増大を回避しながらＦｃポリペプチドの安定性を増強する方法、
−  Ｆｃポリペプチドのスケーラビリティ、製造性、及び／または長期安定性を高める方法、ならびに
−  治療を必要とする対象を、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドで処置する方法。
【００１４】
一実施形態において、本発明は、ドナー抗α４抗体、例えば、本明細書に記載の抗α４抗体のＣＤＲ、ならびに、ＶＨ鎖の配列の領域１、２、３、及び４を有するかまたはＶＨ鎖の生殖系列可変領域配列との相違を５、１０、もしくは１５個以下有するＶＨフレームワークを有する、抗α４抗体ＶＨ鎖を特長とする。一実施形態において、可変フレームワーク領域４（ＦＲ４）は、ヒトコンセンサス配列である。一実施形態において、完全なＶＨ鎖のフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４が存在する。別の実施形態では、この鎖は、ＶＨ領域の抗原結合性断片である。
【００１５】
一実施形態において、生殖系列配列は、図１に示されるヒトＩＧＨＶ１−ｆ（配列番号２）である。特定の実施形態において、ＶＨフレームワーク配列は、生殖系列配列、例えば、配列番号２と、少なくとも１個から、２、３、４、５、１０または１５個以下のアミノ酸残基だけ異なっていてもよい。一実施形態において、ＶＨフレームワークは、対応するヒト残基以外の残基をさらに含む。例えば、ＶＨ鎖は、配列番号２のフレームワーク位置２４、６７、７６、８０、及び９４（Ｋａｂａｔ付番）のうちの１つ以上に非古典的な（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）残基を含む。
【００１６】
一実施形態において、可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの少なくとも１つ以上は、ドナー非ヒトα４結合抗体（すなわち、α４に特異的に結合する非ヒト抗体）に由来する。一実施形態において、ＣＤＲグラフト重鎖可変ドメインの抗原結合領域は、２６〜３４位（ＣＤＲ１）、５０〜６５位（ＣＤＲ２）、及び９５〜１０２位（ＣＤＲ３）（Ｋａｂａｔ付番）に対応するＣＤＲを含む。
【００１７】
したがって、一実施形態において、可変重鎖（ＶＨ）フレームワークは、ヒト抗体生殖系列配列ＩＧＨＶ１−ｆに由来するアクセプター配列を有する。
【００１８】
別の実施形態では、ＶＨのＦＲ１領域における少なくとも１個のアミノ酸、及び２、３、４、５、または１０個未満のアミノ酸残基は、対応するヒト生殖系列残基以外のものである。かかる残基のうちの１つ以上は、例えば、ＣＤＲ配列の起源となる非ヒト抗体フレームワーク領域と同一であってもよい。一実施形態において、Ｋａｂａｔ２４位のアミノ酸残基は、非ヒト抗体フレームワーク領域と同一になるように変異している。
【００１９】
別の実施形態では、ＶＨのＦＲ２領域における少なくとも１個のアミノ酸、及び２、３、４、５、または１０個未満のアミノ酸残基は、対応するヒト生殖系列残基以外のものである。かかる残基のうちの１つ以上は、例えば、ＣＤＲ配列の起源となる非ヒト抗体フレームワーク領域と同一であってもよい。
【００２０】
さらに別の実施形態では、ＶＨ鎖のＦＲ３における少なくとも１個のアミノ酸、及び２、３、４、５、または１０個未満のアミノ酸残基は、対応するヒト生殖系列残基以外のものである。かかる残基のうちの１つ以上は、例えば、ＣＤＲ配列の起源となる非ヒト抗体フレームワーク領域と同一であってもよい。一実施形態において、Ｋａｂａｔ９４位のアミノ酸残基は、非ヒト抗体フレームワーク領域と同一である。さらに別の実施形態では、Ｋａｂａｔ６７位、７６位、８０位、及び９４位のアミノ酸残基は、非ヒト抗体フレームワーク領域と同一である。
【００２１】
特定の実施形態において、抗体のＶＨ鎖は、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の配列を有する。
【００２２】
一態様において、本発明は、ドナー抗ＶＬＡ−４抗体、例えば、本明細書に記載の抗ＶＬＡ−４抗体のＣＤＲ、ならびに、ＶＬ鎖の配列の領域１、２、３、及び４を有するかまたはＶＬ鎖の生殖系列可変領域配列との相違を５、１０、もしくは１５個以下（領域毎または合計のいずれかで）有するＶＬフレームワークを有する、抗ＶＬＡ−４  ＶＬ鎖を特長とする。一実施形態において、可変フレームワーク領域４（ＦＲ４）は、ヒトコンセンサス配列である。一実施形態において、完全なＶＬ鎖のフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４が存在する。別の実施形態では、この鎖は、ＶＬ領域の抗原結合性断片である。
【００２３】
別の実施形態では、生殖系列配列は、図２に示されるＩＧＫＶ４−１（配列番号７）である。さらに他の実施形態では、ＶＬフレームワーク配列は、生殖系列フレームワーク配列、例えば、配列番号７と、少なくとも１個から、２、３、４、５、１０または１５個以下のアミノ酸残基だけ異なっていてもよい。別の実施形態では、ＶＬは、対応するヒトアミノ酸残基以外のものをさらに含む。例えば、ＶＬ鎖は、配列番号７のフレームワーク位置１、７３、及び８７（Ｋａｂａｔ付番）のうちの１つ以上に非ヒト残基をさらに含む。
【００２４】
一実施形態において、この配列は、図２に示されるＡＡＨ７０３５．１（配列番号１２）またはその生殖系列操作型（配列番号１３）である。いくつかの実施形態では、ＶＬフレームワーク配列は、生殖系列操作型フレームワーク配列、例えば、配列番号１３と、少なくとも１個から、５、１０、１５、２０、または２５個以下のアミノ酸残基だけ異なっていてもよい。一実施形態において、ＶＬ鎖は、対応するヒト残基以外のものを含む。例えば、ＶＬ鎖は、配列番号１２のフレームワーク位置１及び８７（Ｋａｂａｔ付番）のうちの１つ以上に非ヒト残基を含む。別の実施形態では、ＶＬは、生殖系列配列ＩＧＫＶ４−１のもののような、異なるヒト生殖系列フレームワーク配列に類似するように、フレームワーク領域にアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ＶＬフレームワーク配列は、配列番号１２の１〜３位、５〜２３位、３５〜３７位、３９〜４２位、４５〜４９位、５７位、５９〜６１位、６３〜６４位、７０〜７２位、７４〜８４位、８６〜８８位、９９〜１０６位（Ｋａｂａｔ付番）において、ＩＧＫＶ４−１生殖系列配列と同一になるように変化している。
【００２５】
一実施形態において、可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの少なくとも１つ以上は、ドナー非ヒトα４結合抗体に由来する。別の実施形態では、ＣＤＲグラフト重鎖可変ドメインの抗原結合領域は、２４〜３１位（ＣＤＲ１）、５０〜５６位（ＣＤＲ２）、及び８９〜９７位（ＣＤＲ３）（Ｋａｂａｔ付番）に対応するＣＤＲを含む。したがって、一実施形態において、ＶＬフレームワークは、ＩＧＫＶ４−１生殖系列配列、抗体ＡＡＨ７０３３５．１、または生殖系列操作抗体ＡＡＨ７０３３５．１から構築されたアクセプター配列を有する。
【００２６】
さらに別の実施形態では、ＶＬ鎖のＦＲ１における少なくとも１個のアミノ酸、及び２、３、４、５、１０、または１５個未満の残基は、対応するヒト残基以外のものである。かかる残基のうちの１つ以上は、例えば、ＣＤＲ配列の起源となる非ヒト抗体フレームワーク領域と同一であってもよい。一実施形態において、ＦＲ１のＮ末端位置のアミノ酸残基は、非ヒト抗体フレームワーク領域と同一になるように変異している。
【００２７】
別の実施形態では、ＶＬ鎖のＦＲ２における少なくとも１個のアミノ酸、及び２、３、４、５、１０、または１５個未満の残基は、対応するヒト残基以外のものである。かかる残基のうちの１つ以上は、例えば、ＣＤＲ配列の起源となる非ヒト抗体フレームワーク領域と同一であってもよい。
【００２８】
さらに別の実施形態では、ＶＬのＦＲ３における少なくとも１個のアミノ酸、及び２、３、４、５、１０、または１５個未満の残基は、対応するヒト残基以外のものである。かかる残基のうちの１つ以上は、例えば、ＣＤＲ配列の起源となる非ヒト抗体フレームワーク領域と同一であってもよい。別の実施形態では、Ｋａｂａｔ８７位のアミノ酸残基は、非ヒト抗体フレームワーク領域と同一になるように変異している。さらに別の実施形態では、Ｋａｂａｔ６７位及び８７位のアミノ酸残基は、非ヒト抗体フレームワーク配列と同一になるように変異している。さらに別の実施形態では、配列番号７のＫａｂａｔ６７位、７３位、及び８７位のアミノ酸残基は、非ヒト抗体フレームワーク配列と同一になるように変異している。
【００２９】
他の実施形態では、抗体のＶＬ鎖は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１の配列を有する。
【００３０】
一実施形態において、抗体のＶＨ鎖は、配列番号４の配列を有し、抗体のＶＬ鎖は、配列番号１１の配列を有する。
【００３１】
一実施形態において、ＶＨ及びＶＬアクセプターフレームワーク配列のＣＤＲは、非ヒト（例えば、マウス）抗体配列のＣＤＲ配列に類似するように選択され、ここで、非ヒト抗体は、インテグリンアルファ４またはその断片に結合する。別の実施形態では、ＣＤＲの配列は、ＶＬＡ−４  α４鎖のＢ１エピトープに結合する非ヒト抗体のＣＤＲの配列に類似するように選択される。一実施形態において、ＣＤＲは、マウスモノクローナル抗体、例えば、ＨＰ１／２、ＨＰ２／１、ＨＰ２／４、Ｌ２５、Ｐ４Ｃ２、または２１．６（Ｐｕｌｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１０２４１−１０２４５，１９９１、米国特許第６，０３３，６６５号）に類似するように選択される。修飾とは、例えば、切除及び挿入または変化、例えば、定方向変異誘発によるものを意味し得る。
【００３２】
別の態様において、本発明は、抗体またはその抗原結合性断片であって、
−  本明細書に記載の抗ＶＬＡ−４  ＶＬ鎖、例えば、ドナー抗ＶＬＡ−４抗体、例えば、本明細書に記載の抗ＶＬＡ−４抗体のＣＤＲ、ならびに、ＶＬ鎖の配列のＬＣフレームワーク領域１、２、及び３を有するかまたはＶＬ鎖の生殖系列可変領域配列との相違を５、１０、もしくは１５個以下有するＶＬフレームワークを有する、抗ＶＬＡ−４  ＶＬ鎖（一実施形態において、可変領域４は、ヒトコンセンサス配列である）と、
−  本明細書に記載の抗ＶＬＡ−４  ＶＨ鎖、例えば、ドナー抗ＶＬＡ−４抗体、例えば、本明細書に記載の抗ＶＬＡ−４抗体のＣＤＲ、ならびに、ＶＬ鎖の配列のＬＣフレームワーク領域１、２、及び３を有するかまたはＶＬ鎖の生殖系列可変領域配列との相違を５、１０、もしくは１５個以下有するＶＬフレームワークを有する、抗ＶＬＡ−４  ＶＬ鎖（一実施形態において、可変領域４は、ヒトコンセンサス配列である）と
を含む、抗体またはその抗原結合性断片を特長とする。
【００３３】
一実施形態において、本抗体は、α４β１及びα４β７の一方または両方に結合する。
【００３４】
別の態様において、本明細書に記載のＶＬ鎖もしくはＶＨ鎖、または抗体、またはそれらの断片は、検出可能に標識されている。
【００３５】
別の態様において、本発明は、組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片であって、（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、（ｄ）ヒトＩｇＧ１の定常重鎖であり、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ１２７Ｃ、Ｋ１２９Ｒ、Ｇ１３５Ｅ、Ｇ１３６Ｓ、Ｑ２０３Ｋ、Ｉ２０７Ｔ、Ｎ２１１Ｄ、Ｋ２２２Ｒ、Ｐ２２７Ｓ、Ｓ２３２Ｙ、Ｃ２３３Ｇ、Ｄ２３４の欠失、Ｋ２３５の欠失、Ｔ２３６の欠失、Ｈ２３７Ｐ、Ｔ２３８Ｐ、Ｌ２４７Ｆ、Ｈ２８１Ｑ、Ｋ２８７Ｑ、Ｙ３１３Ｆ、Ｎ３１４Ｑ、Ａ３４６Ｇ、Ａ３４９Ｓ、Ｐ３５０Ｓ、またはＫ４７８の欠失から選択される変異を少なくとも１個含む、前記ヒトＩｇＧ１の定常重鎖とを含む、組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片を提供する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖は、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ１２７Ｃ、Ｋ１２９Ｒ、Ｇ１３５Ｅ、Ｇ１３６Ｓ、Ｑ２０３Ｋ、Ｉ２０７Ｔ、Ｎ２１１Ｄ、Ｋ２２２Ｒ、Ｐ２２７Ｓ、Ｓ２３２Ｙ、Ｃ２３３Ｇ、Ｄ２３４の欠失、Ｋ２３５の欠失、Ｔ２３６の欠失、Ｈ２３７Ｐ、Ｔ２３８Ｐ、Ｌ２４７Ｆ、Ｈ２８１Ｑ、Ｋ２８７Ｑ、Ｙ３１３Ｆ、Ｎ３１４Ｑ、Ａ３４６Ｇ、Ａ３４９Ｓ、Ｐ３５０Ｓ、またはＫ４７８の欠失から選択される変異を少なくとも２個含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖は、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ１２７Ｃ、Ｋ１２９Ｒ、Ｇ１３５Ｅ、Ｇ１３６Ｓ、Ｑ２０３Ｋ、Ｉ２０７Ｔ、Ｎ２１１Ｄ、Ｋ２２２Ｒ、Ｐ２２７Ｓ、Ｓ２３２Ｙ、Ｃ２３３Ｇ、Ｄ２３４の欠失、Ｋ２３５の欠失、Ｔ２３６の欠失、Ｈ２３７Ｐ、Ｔ２３８Ｐ、Ｌ２４７Ｆ、Ｈ２８１Ｑ、Ｋ２８７Ｑ、Ｙ３１３Ｆ、Ｎ３１４Ｑ、Ａ３４６Ｇ、Ａ３４９Ｓ、Ｐ３５０Ｓ、またはＫ４７８の欠失から選択される変異を少なくとも３個含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖は、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ１２７Ｃ、Ｋ１２９Ｒ、Ｇ１３５Ｅ、Ｇ１３６Ｓ、Ｑ２０３Ｋ、Ｉ２０７Ｔ、Ｎ２１１Ｄ、Ｋ２２２Ｒ、Ｐ２２７Ｓ、Ｓ２３２Ｙ、Ｃ２３３Ｇ、Ｄ２３４の欠失、Ｋ２３５の欠失、Ｔ２３６の欠失、Ｈ２３７Ｐ、Ｔ２３８Ｐ、Ｌ２４７Ｆ、Ｈ２８１Ｑ、Ｋ２８７Ｑ、Ｙ３１３Ｆ、Ｎ３１４Ｑ、Ａ３４６Ｇ、Ａ３４９Ｓ、Ｐ３５０Ｓ、またはＫ４７８の欠失から選択される変異を少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または少なくとも９個、または少なくとも１０個、または少なくとも１１個、または少なくとも１２個、または少なくとも１３個、または少なくとも１４個、または少なくとも１５個、または少なくとも１６個、または少なくとも１７個、または少なくとも１８個、または少なくとも１９個、または少なくとも２０個、または少なくとも２１個、または少なくとも２２個、または少なくとも２３個、または少なくとも２４個含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖は、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ１２７Ｃ、Ｋ１２９Ｒ、Ｇ１３５Ｅ、Ｇ１３６Ｓ、Ｑ２０３Ｋ、Ｉ２０７Ｔ、Ｎ２１１Ｄ、Ｋ２２２Ｒ、Ｐ２２７Ｓ、Ｓ２３２Ｙ、Ｃ２３３Ｇ、Ｄ２３４の欠失、Ｋ２３５の欠失、Ｔ２３６の欠失、Ｈ２３７Ｐ、Ｔ２３８Ｐ、Ｌ２４７Ｆ、Ｈ２８１Ｑ、Ｋ２８７Ｑ、Ｙ３１３Ｆ、Ｎ３１４Ｑ、Ａ３４６Ｇ、Ａ３４９Ｓ、Ｐ３５０Ｓ、及びＫ４７８の欠失の変異を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
【００４０】
別の態様において、本発明は、組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片であって、（ａ）配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、（ｂ）配列番号４の配列を含む可変重鎖と、（ｃ）ヒトカッパ軽鎖（配列番号８２）の定常軽鎖と、（ｄ）ヒトＩｇＧ４の定常重鎖であり、前記定常領域が、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも１個含む、前記ヒトＩｇＧ４の定常重鎖とを含む、組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片を提供する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ４の定常重鎖は、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも２個含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ４の定常重鎖は、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失からなる群から選択される変異を少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または少なくとも９個含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ４の定常重鎖は、Ｋａｂａｔ付番スキームによるＳ２４１Ｐ、Ｎ３１４Ｑ、Ｑ３７６Ｒ、Ｅ３７７Ｄ、Ｍ３８１Ｌ、Ｒ４４０Ｋ、Ｅ４５０Ｑ、Ｌ４７６Ｐ、及びＫ４７８の欠失の変異のうちの１つ以上を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
【００４４】
Ｃ’末端リジン残基（Ｋａｂａｔ付番スキームによる４７８位）は、翻訳後に、または技術的工夫によって欠失させるのが典型的であることに留意されたい。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体の重鎖（またはそのドメインのＦｃ部分）は、Ｃ末端のリジンを欠いている。言い換えれば、いくつかの実施形態では、４７８位（Ｋａｂａｔ付番）のリジンが、本明細書に記載の抗体の重鎖（またはそのドメインのＦｃ部分）では欠失している。
【００４５】
いくつかの実施形態では、変異または置換のないヒトＩｇＧ１の定常重鎖は、配列番号８３の配列を有する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、変異または置換のないヒトＩｇＧ４の定常重鎖は、配列番号８４の配列を有する。
【００４７】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体重鎖またはそのα４結合性断片をコードするＤＮＡを含むベクターを特長とする。いくつかの実施形態では、ベクターのＤＮＡは、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の配列を有するＶＨをコードする。
【００４８】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体軽鎖またはそのα４結合性断片をコードするＤＮＡを含むベクターを特長とする。いくつかの実施形態では、ベクターのＤＮＡは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１の配列を有するＶＬ鎖をコードする。
【００４９】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体重鎖またはそのα４結合性断片及び本明細書に記載の抗体軽鎖またはそのα４結合性断片をコードするＤＮＡを含むベクターを特長とする。
【００５０】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載のベクターを含む宿主細胞、例えば、本明細書に記載の重鎖及び／または軽鎖抗体または抗体断片を発現することができるものを特長とする。特定の実施形態において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００５１】
一態様において、本発明は、組換え抗α４抗体またはそのα４結合性断片を作製する方法であって、宿主細胞を用意することであり、宿主細胞に、（ａ）本明細書に記載の抗体重鎖またはそのα４結合性断片をコードするＤＮＡ配列と、（ｂ）抗体軽鎖またはそのα４結合性断片をコードするＤＮＡ配列とがトランスフェクトされている、用意すること、及び、トランスフェクトされた細胞を培養することにより、組換え抗α４抗体分子またはそのα４結合性断片を生成する方法を特長とする。抗体の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡは、同じベクターに存在しても異なるベクターに存在してもよい。
【００５２】
一態様において、本発明は、組換え抗α４抗体またはそのα４結合性断片を作製する方法であって、宿主細胞を用意することであり、宿主細胞に、（ａ）抗体重鎖またはそのα４結合性断片をコードするＤＮＡ配列、例えば、配列番号４の配列を有するＤＮＡ配列と、（ｂ）抗体軽鎖またはそのα４結合性断片をコードするＤＮＡ配列、例えば、配列番号１１の配列を有するＤＮＡ配列とがトランスフェクトされている、用意すること、及び、トランスフェクトされた細胞株を培養することにより、組換え抗α４抗体分子またはそのα４結合性断片を生成する方法を特長とする。抗体の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡは、同じベクターに存在しても異なるベクターに存在してもよい。
【００５３】
別の態様において、本発明は、α４インテグリン、例えば、α４β１（ＶＬＡ−４）またはα４β７インテグリンにより媒介される疾患または障害を処置する方法であって、かかる処置を必要とする対象に、本明細書に記載のα４抗体もしくは抗体断片、または該抗体もしくは断片を含む医薬組成物を投与することによる方法を特長とする。対象は、例えば、炎症性障害、免疫障害、または自己免疫障害（例えば、中枢神経系の炎症、例えば多発性硬化症、髄膜炎、視神経脊髄炎、神経サルコイドーシス、ＣＮＳ血管炎、脳炎、及び横断性脊髄炎）、組織もしくは臓器の移植片拒絶または移植片対宿主病、急性ＣＮＳ傷害、例えば脳卒中、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、または脊髄傷害（ＳＣＩ）；慢性腎疾患；アレルギー、例えば、アレルギー性喘息；１型真性糖尿病；炎症性腸障害、例えばクローン病、潰瘍性大腸炎；重症筋無力症；線維筋痛症；関節炎障害、例えば関節リウマチ、乾癬性関節炎；炎症性／免疫皮膚障害、例えば乾癬、白斑、皮膚炎、扁平苔癬；全身性エリテマトーデス；シェーグレン症候群；血液がん、例えば多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫；肉腫または癌腫などの固形癌、例えば、肺癌、乳癌、前立腺癌、脳癌；ならびに線維性障害、例えば肺線維症、骨髄線維症、肝硬変、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、半月体形成性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、及び間質性腎線維症を有するか、または発症するリスクを有し得る。好ましい実施形態では、本発明は、多発性硬化症を患う患者を処置する、または多発性硬化症を患う患者の症状、例えばＣＩＳ（ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、再発寛解型多発性硬化症、もしくは活動性二次性進行型多発性硬化症を軽減する方法を特長とする。特定の実施形態において、多発性硬化症は、再発型の多発性硬化症である。好ましい実施形態では、本発明は、薬剤抵抗性てんかんを含め、てんかんを有する、または発症するリスクを有する患者を処置する方法を特長とする。特定の実施形態において、対象または患者は、ヒトである。
【００５４】
別の態様において、本発明は、α４結合抗体または抗体断片を患者に投与することにより、患者を処置する方法を特長とする。一実施形態において、患者は、固形腫瘍または血液系悪性腫瘍などのがんを有する。例えば、α４結合抗体または抗体断片で処置される患者は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または多発性骨髄腫（ＭＭ）を有し得る。
【００５５】
別の実施形態では、患者は、多発性硬化症、喘息（例えば、中等度から重度の喘息）、関節リウマチ、糖尿病、またはクローン病などの炎症性障害を有する。別の実施形態では、組成物はレジメンとして投与される。さらに別の実施形態では、本方法は、組成物による処置に好適な患者を選択することをさらに含む。処置に好適な患者は、例えば、疾患発症を示す徴候または症状、例えばＭＳを示す徴候または症状を示したものである。好ましい実施形態では、患者は、てんかんを有する。
【００５６】
特定の実施形態において、患者は、治療有効量のα４結合抗体または抗体断片を投与される。特定の実施形態において、患者は、α４結合抗体または抗体断片を、約０．０００３ｍｇ／ｋｇ、０．０００４ｍｇ／ｋｇ、０．０００５ｍｇ／ｋｇ、０．０００６ｍｇ／ｋｇ、０．０００７ｍｇ／ｋｇ、０．０００８ｍｇ／ｋｇ、０．０００９ｍｇ／ｋｇ、０．００１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１５ｍｇ／ｋｇ、または０．００２０ｍｇ／ｋｇから、約０．００２５ｍｇ／ｋｇ、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１２５ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０５０ｍｇ／ｋｇ、０．０６２５ｍｇ／ｋｇ、０．０８０ｍｇ／ｋｇ、０．１００ｍｇ／ｋｇ、０．２００ｍｇ／ｋｇ、０．３００ｍｇ／ｋｇ、０．３１２５ｍｇ／ｋｇ、０．４０ｍｇ／ｋｇ、０．５０ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇの範囲の量で投与される。いくつかの実施形態では、患者は、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの量のα４結合抗体または抗体断片を投与される。いくつかの実施形態では、患者は、約０．０６２５ｍｇ／ｋｇ〜約８．０ｍｇ／ｋｇの量のα４結合抗体または抗体断片を投与される。いくつかの実施形態では、患者は、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約６．０ｍｇ／ｋｇの量のα４結合抗体または抗体断片を投与される。いくつかの実施形態では、患者は、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５．０ｍｇ／ｋｇの量のα４結合抗体または抗体断片を投与される。
【００５７】
さらに別の実施形態では、本方法は、化学療法剤、血栓溶解剤、神経保護剤、抗炎症剤、ステロイド、サイトカイン、または増殖因子などの第２の治療剤を患者に投与することをさらに含む。
【００５８】
一実施形態において、患者は、本明細書に記載のヒト化抗ＶＬＡ−４抗体またはその断片、例えばＨｕＨＰ１／２、Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２、またはＨ１Ｌ３を投与される。
【００５９】
一実施形態において、α４結合抗体を含む組成物は、レジメンとして、例えば規則的な間隔で投与される。例えば、本組成物は、１日、１週間、もしくは１か月に１回、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、１週間に４回、もしくはそれ以上、または２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、もしくはそれ以上で投与され得る。
【００６０】
一実施形態において、投薬は、抗α４抗体を以前に投与した際の患者のクリアランス速度に従って調整され得る。例えば、一実施形態において、患者は、患者の体内の抗α４抗体のレベルが既定のレベル未満に低下するまで、第２または後続の用量を投与されない。一実施形態において、患者のサンプル（例えば、血漿、血清、血液、または尿のサンプル）を抗α４抗体の存在についてアッセイし、抗α４抗体のレベルが既定のレベルを超えていれば、患者は第２または後続の用量を投与されない。患者の体内の抗α４抗体のレベルが既定のレベル未満であれば、患者は第２または後続の用量を投与される。
【００６１】
一実施形態において、本組成物は、例えば、３０分超から１、２、４、または１２時間未満の期間にわたり、連続的に投与される。抗体及び第２の薬剤を含む組成物は、任意の適切な方法により、例えば、皮下、筋肉内、または静脈内に投与され得る。
【００６２】
いくつかの実施形態では、抗体及び第２の薬剤はそれぞれ、単独療法のために処方される各用量と同じ用量で投与される。他の実施形態では、抗体は、単独で投与した場合の有効性に必要な量以下の投与量で投与される。同様に、第２の薬剤は、単独で投与した場合の有効性に必要な量以下の投与量で投与され得る。
【００６３】
本開示の特長として挙げられる別の態様は、患者が予め選択された基準を満たすかどうかを判定することにより患者を評価し、患者が予め選択された基準を満たす場合、本明細書に記載のＶＬＡ−４結合抗体製剤を患者に対して承認する、提供する、処方する、または投与する方法である。一実施形態において、予め選択された基準は、患者が、過去の、例えばＭＳの処置のための代替的な治療的処置またはレジメンに、十分に応答しなかったことである。別の実施形態では、予め選択された基準は、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）のいかなる徴候もしくは症状もないこと、またはＰＭＬのいかなる診断もないことである。いくつかの場合において、この選択は、ＰＭＬのリスク因子がないこと、例えば、対象がＪＣウイルスＤＮＡ検査で陽性を示さない、またはＪＣウイルス抗体検査で陽性を示さないことに基づく。別の実施形態では、この基準は、参照により本明細書に援用され、薬物の分配及び患者への薬物の提供のための方法及びシステムについて記載するＰＣＴ／ＵＳ０７／７５５７７（ＷＯ２００８／０２１９５４として公開されている）に記載されている。
【００６４】
別の態様において、本明細書に記載の組成物を分配する方法が提供される。本組成物は、アルファ４結合抗体を含む。本方法は、レシピエント（例えば、エンドユーザー、患者、医師、薬剤の小売業者もしくは卸売業者、流通業者、または病院、介護施設の診療所、もしくはＨＭＯの調剤部門）に、少なくとも６、１２、２４、３６、または４８か月にわたって患者を処置するのに十分な単位投与量の薬物を含むパッケージを提供することを含む。別の態様において、本発明は、アルファ４結合抗体を含む本明細書に記載の組成物のパッケージまたはパッケージのロットの質を評価する（例えば、有効期限が切れているかどうかを判定する）方法を特長とする。本方法は、パッケージの有効期限が切れているかどうかを評価することを含む。有効期限は、製造、アッセイ、またはパッケージングなどの予め選択された事象から少なくとも６、１２、２４、３６、または４８か月、例えば、２４または３６か月超である。いくつかの実施形態では、分析の結果として決定またはステップがなされる。例えば、適切な分析により、製品の有効期限が切れているかどうかに応じて、パッケージ内の抗体は、使用もしくは廃棄されたり、分類されたり、選択されたり、発売もしくは保留されたり、出荷されたり、新しい場所に移動されたり、商取引に出されたり、売却されたり、または販売されたり、商取引を撤回されたり、販売停止されたりする。
【００６５】
別の態様において、本発明は、α４結合抗体を含む水性組成物の少なくとも２回の単位用量を含むパッケージを特長とする。一実施形態では、単位用量の全てが同じ量の抗体を含み、他の実施形態では、２つ以上の強度の単位投与量、または例えば、強度もしくは放出特性が異なる２つ以上の異なる製剤が存在する。
【００６６】
別の態様において、本発明は、α４結合抗体を含む製剤の投与についてレシピエントを指導する方法を含む。本方法は、レシピエント（例えば、エンドユーザー、患者、医師、薬剤の小売業者もしくは卸売業者、流通業者、または病院、介護施設の診療所、もしくはＨＭＯの調剤部門）に、抗体が本明細書に記載のレジメンに従って患者に投与されるべきであることを指導することを含む。本方法は、レシピエントに、抗体が有効期限の前に投与されるべきであることを指導することも含み得る。有効期限は、製造、アッセイ、またはパッケージングなどの予め選択された事象から少なくとも６、１２、２４、３６、または４８か月、例えば、２４または３６か月超である。一実施形態において、レシピエントはまた、抗体の供給、例えば、単位投与量の抗体の供給を受ける。
【００６７】
一実施形態において、安定化ポリペプチドは、キメラＦｃ領域を含み、前記安定化ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ４抗体に由来する少なくとも１つの定常ドメインと、ヒトＩｇＧ１抗体に由来する少なくとも１つの定常ドメインとを含む。
【００６８】
一実施形態において、Ｆｃ領域は、グリコシル化Ｆｃ領域である。
【００６９】
一実施形態において、Ｆｃ領域は、アグリコシル化Ｆｃ領域である。
【００７０】
一実施形態において、Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域の２９７位（ＥＵ付番）、３１４位（Ｋａｂａｔ付番）にグルタミン（Ｑ）を含むアグリコシル化Ｆｃ領域である。
【００７１】
一実施形態において、キメラＦｃ領域は、ＩｇＧ４アイソタイプのＩｇＧ抗体のＣＨ２ドメイン、及びＩｇＧ１アイソタイプのＩｇＧ抗体のＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４アイソタイプのＩｇＧ抗体のＣＨ２ドメイン、及びＩｇＧ１アイソタイプのＩｇＧ抗体のＣＨ３ドメインを含むキメラＦｃ領域は、Ｆｃ領域の２９７位（ＥＵ付番）、３１４位（Ｋａｂａｔ付番）に、天然に発生するアルギニン（Ｎ）残基の代わりにグルタミン（Ｑ）残基をさらに含む。
【００７２】
一実施形態において、キメラＦｃ領域は、ＩｇＧ４アイソタイプのＩｇＧ抗体のヒンジ、ＣＨ１ドメイン、及びＣＨ２ドメイン、ならびにＩｇＧ１アイソタイプのＩｇＧ抗体のＣＨ３ドメインを含み、この抗体は、アミノ酸２２８位（ＥＵ付番）、２４１位（Ｋａｂａｔ付番）にプロリンを含む。いくつかの実施形態では、キメラＦｃ領域は、ＩｇＧ４アイソタイプのＩｇＧ抗体のヒンジ、ＣＨ１ドメイン、及びＣＨ２ドメイン、ならびにＩｇＧ１アイソタイプのＩｇＧ抗体のＣＨ３ドメインを含み、この抗体は、アミノ酸２２８位（ＥＵ付番）、２４１位（Ｋａｂａｔ付番）にプロリンを含み、Ｆｃ領域の２９７位（ＥＵ付番）、３１４位（Ｋａｂａｔ付番）に、天然に発生するアルギニン（Ｎ）残基の代わりにグルタミン（Ｑ）残基をさらに含む。
【００７３】
一実施形態において、ＩｇＧ抗体は、ヒト抗体である。
【００７４】
一実施形態において、アグリコシル化Ｆｃ領域は、キメラヒンジドメインを含む。
【００７５】
一実施形態において、キメラヒンジドメインは、アミノ酸２２８位（ＥＵ付番）、２４１位（Ｋａｂａｔ付番）に、プロリン残基による置換を含む。
【００７６】
一実施形態において、抗体は、配列番号４の配列を有するＶＨ鎖と、配列番号１１の配列を有するＶＬ鎖と、ＩｇＧ４アイソタイプのＩｇＧ抗体のヒンジ、ＣＨ１ドメイン、及びＣＨ２ドメイン、ならびにＩｇＧ１アイソタイプのＩｇＧ抗体のＣＨ３ドメインを含むキメラＦｃ領域とを含み、抗体は、ＣＨ２領域の２９７位（ＥＵ付番）、３１４位（Ｋａｂａｔ付番）におけるグルタミン残基（Ｑ）への置換、ヒンジ領域のアミノ酸２２８位（ＥＵ付番）、２４１位（Ｋａｂａｔ付番）におけるプロリン残基（Ｐ）への置換、及びＣＨ３領域のＥＵ付番４４７位（Ｋａｂａｔ付番４７８位）におけるリジン（Ｋ）の欠失を含む。
【００７７】
一実施形態において、抗体は、配列番号８０の配列を有する重鎖と、配列番号８１の配列を有する軽鎖とを含む。
【００７８】
一実施形態において、抗体は、配列番号８６の重鎖、ＩｇＧ４のＨＰ１／２  Ｈ１重鎖（野生型；グリコシル化型）を含む。
【００７９】
一実施形態において、抗体は、配列番号８７の重鎖、ＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ（ＥＵ付番）のＨＰ１／２重鎖（別名ＩｇＧ４Ｐ；グリコシル化型）を含む。
【００８０】
一実施形態において、抗体は、配列番号８８の重鎖、ＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ  Ｌ２３５Ｅ（ＥＵ付番）のＨＰ１／２  Ｈ１重鎖（別名ＩｇＧ４ＰＥ；グリコシル化型）を含む。
【００８１】
一実施形態において、抗体は、配列番号８９の重鎖、ＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ  Ｔ２９９Ａ（ＥＵ付番）のＨＰ１／２  Ｈ１重鎖（アグリコシル）を含む。
【００８２】
一実施形態において、抗体は、配列番号９０の重鎖、ＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑ（ＥＵ付番）のＨＰ１／２  Ｈ１重鎖（アグリコシル）を含む。
【００８３】
特定の治療用抗体、例えばＩｇＧ４定常領域を有するものでは、スクランブリングにより、治療用抗体の標的（例えば、ＶＬＡ４）に対して一価であり、別の抗原に対して一価である二重特異性モノクローナル抗体がもたらされ得る。一実施形態において、抗体は、スクランブリングを消失させるか、または抗体のスクランブリングに対する感受性を低減させることにより、ＰＫ／ＰＤ変動を低減させることができる。特定の実施形態において、抗体は、二価モノクローナル抗体による効力を増大させ、スクランブリングに起因する二重特異性を消失させることができる。特定の実施形態において、抗体は、非変異型の対応物よりも高い結合親和性を呈すること及び／または高い受容体占有率の持続を示すことができる。
【００８４】
本発明におけるその他の特長及び利点は、下記の発明を実施するための形態及び特許請求の範囲から明らかとなる。
【００８５】
本特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を含む本特許または特許出願公報の写しは、請求及び必要な手数料の支払いに応じて特許庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】ＨＰ１／２重鎖（配列番号１）の、ヒト重鎖生殖系列ＩＧＨＶ１−ｆ（配列番号２）との３つの配列バリアントを示す。配列の上の小文字は、Ｋａｂａｔ付番スキームによる挿入を表す。
【図２】ＨＰ１／２軽鎖（配列番号６）の、生殖系列ＩＧＫＶ４−１抗体配列（配列番号７）との配列バリアント（設計Ｌ０−配列番号８、Ｌ１−配列番号９、及びＬ２−配列番号１０）、またはヒトカッパ生殖系列操作ＡＡＨ７０３３．１抗体配列（配列番号１２）との配列バリアント（設計Ｌ３−配列番号１１）の４つを示す。配列の上の小文字は、Ｋａｂａｔ付番スキームによる挿入を表す。
【図３】ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。
【図４】ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。
【図５】ＩｇＧ４  Ｆｃ（ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３ドメイン）（配列番号１４）のアミノ酸配列である。ヒンジ領域は太字で示され、ＣＨ３ドメインには下線が引かれている。四角で囲んだ「Ｓ」は、Ｓｅｒ２２８（ＥＵ付番、Ｋａｂａｔ付番ではＳｅｒ２４１）である。丸で囲んだ「Ｎ」は、Ｋａｂａｔ付番でＡｓｎ３１４（ＥＵ付番ではＡｓｎ２９７）である。
【図６】様々な腫瘍細胞株に対するＨｕＨＰ１／２の結合のフローサイトメトリーデータを示すグラフである。「ＨＰ１／２」はヒト化ＨＰ１／２を意味する。
【図７】Ａ〜Ｃは、フィブロネクチンまたはＶＣＡＭ１−Ｉｇをコートしたウェルに対するＡＭＬ細胞株の結合のＨｕＨＰ１／２による阻害を示す一連のグラフである。Ａは、ＦＮコートウェルに対するＨＬ６０細胞及びＫＧ１細胞の結合の阻害を示す。Ｂは、ＶＣＡＭ１−Ｉｇコートウェルに対するＫＧ１細胞の結合の阻害を示す。Ｃは、２０μｇ／ｍＬのＨｕＨＰ１／２とともにインキュベートした場合（黒塗りの棒グラフ）のＦＮコートウェル及びＶＣＡＭ１−Ｉｇコートウェルに対するＨＬ６０細胞の結合の阻害を示す。無色の棒グラフは、アイソタイプ対照の存在下での細胞接着率を示す。「ＨＰ１／２」はヒト化ＨＰ１／２を意味する。
【図８】Ａ〜Ｃは、フィブロネクチンまたはＶＣＡＭ１−Ｉｇをコートしたウェルに対するＭＭ細胞株の結合のＨｕＨＰ１／２による阻害を示す一連のグラフを構成する。Ａは、ＦＮコートウェルに対するＵ２６６細胞及びＨ９２９細胞の結合の阻害を示す。Ｂは、ＶＣＡＭ１−Ｉｇコートウェルに対するＵ２６６細胞及びＨ９２９細胞の結合の阻害を示す。Ｃは、２０μｇ／ｍＬのＨｕＨＰ１／２とともにインキュベートした場合（黒塗りの棒グラフ）のＦＮコートウェル及びＶＣＡＭ１−Ｉｇコートウェルに対するＵ２６６細胞の結合の阻害を示す。無色の棒グラフは、アイソタイプ対照の存在下での細胞接着率を示す。「ＨＰ１／２」はヒト化ＨＰ１／２を意味する。
【図９】Ａ〜Ｃは、フィブロネクチンまたはＶＣＡＭ１−Ｉｇをコートしたウェルに対するＣＬＬ細胞株の結合のＨｕＨＰ１／２による阻害を示す一連のグラフを構成する。Ａは、ＦＮコートウェルに対するＭｅｃ１細胞及びＪＭ１細胞の結合の阻害を示す。Ｂは、ＶＣＡＭ１−Ｉｇコートウェルに対するＭｅｃ１細胞及びＪＭ１細胞の結合の阻害を示す。Ｃは、２０μｇ／ｍＬのＨｕＨＰ１／２とともにインキュベートした場合（黒塗りの棒グラフ）のＦＮコートウェル及びＶＣＡＭ１−Ｉｇコートウェルに対するＭｅｃ１細胞の結合の阻害を示す。無色の棒グラフは、アイソタイプ対照の存在下での細胞接着率を示す。「ＨＰ１／２」はヒト化ＨＰ１／２を意味する。
【図１０】典型的な抗原結合ポリペプチド（ＩｇＧ抗体）の構造、ならびに抗体の抗原結合及びエフェクター機能（例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合）の機能的特性を示す。また、抗体のＣＨ２ドメインにおける糖の存在（グリコシル化）がエフェクター機能（ＦｃＲ結合）を変化させるが、抗原結合には影響しない仕組みも示されている。
【図１１Ａ】ＩｇＧ１のＸ線結晶構造（ｐｄｂコード１ｈｚｈ）による、２つの相互作用するＣＨ３ドメインを示す。ＩｇＧ１残基Ｋ４０９／Ｋ４４０（ＥＵ付番／Ｋａｂａｔ付番）及びＤ３９９／Ｄ４２７（ＥＵ付番／Ｋａｂａｔ付番）が強調されている。
【図１１Ｂ】構造に基づくＨＭＭ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７６：９９，２００９．）を使用したヒトＩｇＧ１／カッパ定常ドメイン配列のアラインメントを示す。ドメイン間相互作用に関与するＣＬ、ＣＨ１、及びＣＨ３の残基位置、ならびに炭水化物と直接接触するアミノ酸と強く共変動するアミノ酸位置は、灰色で強調されている。Ｋａｂａｔ及びＥＵ番号がアラインメントの下に提示されている。
【図１１Ｃ】ＩｇＧ１−ＣＨ２ドメインの構造のリボン図を示す（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，４０６（６７９３）：２６７−７３，２０００）。ＣＨ２ドメイン内のＮ結合型炭水化物及び特有の６アミノ酸ループに埋没したバリン残基が表示されている。
【図１１Ｄ】天然ＩｇＧ１−ＣＨ２配列と、完全に修飾されたＩｇＧ１−ＣＨ２配列とのアラインメントを示す。修飾された残基位置は黒で示されている。修飾された位置のＥＵ番号はアラインメントの上に示されている。
【図１２Ａ】撹拌後の本発明の例示的なＩｇＧ  Ｆｃ構築物の濁度を示す。
【図１２Ｂ】撹拌後の本発明の例示的なＩｇＧ  Ｆｃ構築物の単量体含有率（％）を示す。
【図１３】低ｐＨ維持（ｐＨ３．１）時のＩｇＧ  Ｆｃ構築物の経時的な相対ピーク高さを示す。
【図１４】溶液親和性表面プラズモン共鳴によって測定された、本発明の例示的なＩｇＧ１及びＩｇＧ４  Ｆｃ構築物のＦｃγ受容体に対する初期結合速度を示す。
【図１５】本発明の例示的なＩｇＧ１及びＩｇＧ４  Ｆｃ構築物の、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）（図６Ａ）及びＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ  Ｖ１５８）（図６Ｂ）に対する結合のＩＣ５０を計算するために使用した滴定曲線を示す。
【図１６】ＩｇＧ１  Ｔ３１８Ａ（Ｋａｂａｔ付番）（Ｔ２９９Ａ、ＥＵ付番）、及びＩｇＧ１野生型と比較した、ＩｇＧ１  Ｔ３１８Ｋ（Ｋａｂａｔ付番）（Ｔ２９９Ｋ、ＥＵ付番）のＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）に対する結合の低減を示す滴定曲線（図７Ａ）、ならびに、Ｔ３１８Ａ（Ｋａｂａｔ付番）（Ｔ２９９Ａ、ＥＵ付番）変異を組み込んだ他の例示的なＩｇＧ４  Ｆｃ構築物、及びＩｇＧ１野生型と比較した、Ｔ３１８Ｋ（Ｋａｂａｔ付番）（Ｔ２９９Ｋ、ＥＵ付番）変異を組み込んだ例示的なＩｇＧ４  Ｆｃ構築物のＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）に対する結合の低減を示す滴定曲線（図７Ｂ）を示す。
【図１７】Ｔ２９９Ａ変異を組み込んだ他の例示的なＩｇＧ４  Ｆｃ構築物、及びＩｇＧ１野生型と比較した、Ｔ２９９Ｋ変異を組み込んだ例示的なＩｇＧ４  Ｆｃ構築物のＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ  Ｖ１５８）に対する結合を示す。
【図１８】本発明の例示的なＩｇＧ１及びＩｇＧ４  Ｆｃ構築物の補体因子Ｃ１ｑへの結合を評価するために使用した滴定曲線を示す。
【図１９Ａ】様々なＦｃ構築物のＣＤ６４への結合を評価するために使用した滴定曲線を示す。
【図１９Ｂ】様々なＦｃ構築物のＣＤ１６への結合を評価するために使用した滴定曲線を示す。
【図１９Ｃ】Ｎ３１４Ｑ（Ｋａｂａｔ付番）（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）ＩｇＧ４−ＣＨ２／ＩｇＧ１−ＣＨ３の半減期が、Ｔ３１８Ａ（Ｋａｂａｔ付番）（Ｔ２９９Ａ、ＥＵ付番）抗体と同じであった（アグリコシル化ＩｇＧ１よりわずかに短かった）ことを示す。
【図２０Ａ】Ｔ３１８Ｘ（Ｋａｂａｔ付番）（Ｔ２９９Ｘ、ＥＵ付番）構築物のＣＤ６４への結合を評価するために使用した滴定曲線を示し、また、正電荷を帯びた側鎖のＴ３１８Ｒ（Ｋａｂａｔ付番）（Ｔ２９９Ｒ、ＥＵ付番）及びＴ３１８ＫＡ（Ｋａｂａｔ付番）（Ｔ２９９Ｋ、ＥＵ付番）が、ＣＤ６４への低い親和性をもたらすことを示す。
【図２０Ｂ】様々な代替的構築物へのＣＤ６４の結合を評価するために使用した滴定曲線を示す。
【図２０Ｃ】構築物のＣＤ３２ａＲへの結合を評価するために使用した滴定曲線を示す。
【図２０Ｄ】構築物のＣＤ３２ａＲへの結合を評価するために使用した滴定曲線を示す。
【図２０Ｅ】構築物のＣＤ１６への結合を示す。
【図２０Ｆ】構築物のＣＤ１６への結合を示す。
【図２０Ｇ】Ｃ１ｑ  ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図２０Ｈ】Ｃ１ｑ  ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図２１】パネルＡは、構築物のＣＤ６４への結合を評価するために使用した滴定曲線を示し、パネルＢは、構築物のＣＤ１６への結合を評価するために使用した滴定曲線を示す。
【図２２Ａ】ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）Ｇ１、カッパ軽鎖（Ｈ１Ｌ３）のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を含む。ヌクレオチド配列（配列番号９１に対応するＤＮＡが示されている）及び軽鎖配列（配列番号９２）のアミノ酸１〜２３３が示されている。太字のイタリック体で示されたアミノ酸１〜１９（及びコードＤＮＡ配列）は、合成ＬＣシグナルペプチドを含む。成熟Ｎ末端は２０位（Ｓ）のアミノ酸から始まる。
【図２２Ｂ】ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）Ｇ１、重鎖（Ｈ１Ｌ３）のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を含む。重鎖（配列番号９４）のヌクレオチド配列（ＤＮＡが示され、配列番号９３に対応する）及びアミノ酸１〜４６９が示されている。アミノ酸１〜２２（ＤＮＡ配列はイタリック体で示されている）は、再コード化された合成シグナルペプチドを含む。成熟Ｎ末端は２３位（Ｅ）のアミノ酸から始まる。
【図２３Ａ】ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）Ｇ１、カッパ軽鎖（Ｈ１Ｌ３）のシグナル配列（下線付き）を含むアミノ酸配列を含む。
【図２３Ｂ】配列番号８１の成熟軽鎖及び配列番号８０の成熟重鎖を有するＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）Ｇ１、カッパ軽鎖（Ｈ１Ｌ３）のアミノ酸配列を含む。
【図２４】配列番号８１の成熟軽鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００１の成熟軽鎖）及び配列番号８０の成熟重鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００４／ＮＤ００６の成熟重鎖）を有するタンパク質のＵＶスペクトルを提示する。
【図２５】配列番号８１の成熟軽鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００１の成熟軽鎖）及び配列番号８０の成熟重鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００４／ＮＤ００６の成熟重鎖）を有するタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。非還元条件を左の２レーン（列１及び２）に示し、還元条件を右の２レーン（列３及び４）に示す。レーン１は、非還元条件下のＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００１）であり、レーン２は、非還元条件下の分子量マーカーであり、レーン３は、還元条件下のＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００１）であり、レーン４は、還元条件下の分子量マーカーである。
【図２６】配列番号８１の成熟軽鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００１の成熟軽鎖）及び配列番号８０の成熟重鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００４／ＮＤ００６の成熟重鎖）を有するタンパク質のＩＥＦ結果を示す。
【図２７】配列番号８１の成熟軽鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００１の成熟軽鎖）及び配列番号８０の成熟重鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００４／ＮＤ００６の成熟重鎖）を有するタンパク質の分析的サイズ排除クロマトグラフィの結果を示す。
【図２８】配列番号８１の成熟軽鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００１の成熟軽鎖）及び配列番号８０の成熟重鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００４／ＮＤ００６の成熟重鎖）を有するタンパク質のＤＳＣ結果を示す。ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３インタクト抗体の融解曲線を示している。
【図２９】配列番号８１の成熟軽鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００１の成熟軽鎖）及び配列番号８０の成熟重鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００４／ＮＤ００６の成熟重鎖）を有するタンパク質のＤＳＣ結果を示す。Ｆｃ断片の融解曲線を示している。
【図３０】配列番号８１の成熟軽鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００１の成熟軽鎖）及び配列番号８０の成熟重鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００４／ＮＤ００６の成熟重鎖）を有するタンパク質のＤＳＣ結果を示す。Ｆａｂ２断片の融解曲線を示している。
【図３１】非還元条件下のＨＰ１／２サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。各サンプルは６及び３μｇ／レーンでロードした。分子量マーカーはパネルの左側に示している。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの４−２０％ポリアクリルアミド勾配ゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲルをＳｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、蒸留水で脱染した。レーン１は、６ｕｇ／レーンでのＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３であり、レーン２は、６ｕｇ／レーンでのＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｔ２９９Ａ）であり、レーン３は、６ｕｇ／レーンでのナタリズマブＧ４Ｐ  ａｇｌｙであり、レーン４は、６ｕｇ／レーンでのナタリズマブＧ４Ｐであり、レーン５は、３ｕｇ／レーンでのＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３であり、レーン６は、３ｕｇ／レーンでのＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｔ２９９Ａ）であり、レーン７は、３ｕｇ／レーンでのナタリズマブＧ４Ｐ  ａｇｌｙであり、レーン８は、３ｕｇ／レーンでのナタリズマブＧ４Ｐである。
【図３２Ａ】ＨＰ１／２サンプルのＳＥＣ分析の結果を示す。サンプルは、ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中、０．２ｍｌ／分の流速で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ５／１５０  ＧＬカラム（ＧＥ  ２８−９９０９−４５）に流した。
【図３２Ｂ】ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３、ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｔ２９９Ａ）、ナタリズマブＧ４Ｐ  ａｇｌｙ、及びナタリズマブＧ４ＰのＳＥＣ分析の結果を示す。サンプルは、ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中、０．２ｍｌ／分の流速で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ５／１５０  ＧＬカラム（ＧＥ  ２８−９９０９−４５）に流した。
【図３３】Ａは、ヒト化ＨＰ１／２  Ｈ１／Ｌ３  ｈｕＩｇＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）／ＩｇＧ１キメラ（ＧＰ１／２  ＧｒＰ  ａｇｌｙ／Ｇ１）のＤＳＣ結果を示し、Ｂは、ヒト化ＨＰ１／２  Ｇ１／Ｌ３  ｈｕＩｇＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｔ２９９Ａ、ＥＵ付番）（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ）のＤＳＣ結果を示す。
【図３４】３ｍｇ／ｋｇのＨＰ１／２  Ｈ１／Ｌ３  ｈｕＩｇＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）／ＩｇＧ１キメラ（ＧＰ１／２  ＧｒＰ  ａｇｌｙ／Ｇ１）（図ではＨＰ１２と表記；白丸）、３０ｍｇ／ｋｇのＨＰ１２（黒丸）、及び３ｍｇ／ｋｇのナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ、黒三角）の単回ＩＶボーラス投与後のカニクイザルにおける薬物動態の経時変化を示す線グラフである。
【図３５】３ｍｇ／ｋｇのＨＰ１／２  Ｈ１／Ｌ３  ｈｕＩｇＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）／ＩｇＧ１キメラ（ＧＰ１／２  ＧｒＰ  ａｇｌｙ／Ｇ１）（図ではＨＰ１２と表記；白丸）、３０ｍｇ／ｋｇのＨＰ１２（黒丸）、及び３ｍｇ／ｋｇのナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ、黒三角）の単回ＩＶボーラス投与後のカニクイザルにおける遊離受容体の経時変化を示す線グラフである。
【図３６】ヒト（ヒト１及びヒト２）ならびにカニクイザル（カニクイザル１及びカニクイザル２）におけるＣＤ４９（アルファ４インテグリン）の発現レベルを示す棒グラフである。
【図３７】Ａ〜Ｄは、示される投与量におけるナタリズマブ（赤線）及びＨＰ１／２（黒線）の単回ＩＶ投与後の受容体占有率予測値の経時変化を示す線グラフである。
【図３８】特定の用量のＨＰ１／２（図ではＨＰ１２と表記、白丸）及びナタリズマブ（黒三角）の投与後のＣｍａｘにおける受容体占有率予測値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
ＶＬＡ−４に対する抗体は、疾患の処置において有用であることが実証されている。例えば、抗ＶＬＡ−４抗体であるナタリズマブ（ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標））は、再発性多発性硬化症及びクローン病を処置するのに使用されている。しかしながら、特定の状態、例えば脊髄傷害（ＳＣＩ）もしくは外傷性脳傷害（ＴＢＩ）などの急性状態の処置、またはがんの処置など投与回数に制限がある処置の場合、ナタリズマブとは異なる親和性、例えば、より高い親和性で結合し、及び／または異なる薬理学的プロファイルを有する（例えば、より低いインビボの薬物動態的／薬力学的変動を有する）抗ＶＬＡ−４抗体で処置することが有利であり得る。そのような抗体は、必要とされる処置の頻度が低下し得る、または輸注以外の手段による投与がより効率的であり得るという点で、多発性硬化症などの状態を処置するのに有用である可能性もある。より低い用量での処置が可能になれば、ＰＭＬなどの有害事象のリスクも低下し得る。したがって、本発明は、このような望ましい特性を有する抗体を提供する。
【００８８】
本明細書に開示される特定の本発明の抗体は、新たに設計されたヒト化α４結合抗体のα４への結合親和性が、抗α４抗体ナタリズマブと比べて１０倍高いという予想外の特徴を呈した。
【００８９】
本抗体はまた、例えば、ＦｃポリペプチドのＦｃ領域に１つ以上の安定化アミノ酸を含むことにより、低減したエフェクター機能をもつ安定化Ｆｃ領域を有する。いくつかの実施形態では、安定化アミノ酸は、ポリペプチドのグリコシル化及び／またはエフェクター機能に影響を及ぼすことなく、ポリペプチドのＦｃ領域を安定化させ、ポリペプチドの他の所望の機能（例えば、抗原結合親和性または半減期）を著しく変化させることはない。
【００９０】
本明細書及び特許請求の範囲が明確に理解されるように、便宜上、次の定義を下記に提供する。
【００９１】
定義
本明細書で使用される場合、「エフェクター機能」という用語は、Ｆｃ領域またはその一部分が免疫系のタンパク質及び／または細胞に結合し、様々な生物学的効果を媒介する機能的能力を意味する。エフェクター機能は、抗原依存性であっても抗原非依存性であってもよい。エフェクター機能の減少とは、抗体（またはその断片）の可変領域の抗原結合活性は維持されるものの、１つ以上のエフェクター機能が減少することを意味する。エフェクター機能、例えば、Ｆｃ受容体または補体タンパク質へのＦｃ結合の増大または減少は、変化倍率（例えば、１倍の変化、２倍の変化など）の観点から表現することができ、例えば、当技術分野でよく知られるアッセイを使用して決定される結合活性の変化率に基づいて計算することができる。本明細書で使用される場合、「抗原依存性エフェクター機能」という用語は、対応する抗原に抗体が結合した後に通常誘導されるエフェクター機能を意味する。典型的な抗原依存性エフェクター機能には、補体タンパク質（例えばＣ１ｑ）に結合する能力が含まれる。例えば、補体のＣｌ成分がＦｃ領域に結合すると、古典的補体系が活性化し、細胞病原体のオプソニン作用及び溶解がもたらされ得る。これは補体依存性細胞傷害（ＣＤＣＣ）と呼ばれるプロセスである。補体の活性化はまた、炎症応答も刺激し、自己免疫過敏症にも関与し得る。
【００９２】
他の抗原依存性エフェクター機能は、抗体がそのＦｃ領域を介して、細胞上の特定のＦｃ受容体（「ＦｃＲ」）に結合することによって媒介される。ＩｇＧ（ガンマ受容体、すなわちＩｇγＲ）、ＩｇＥ（イプシロン受容体、すなわちＩｇεＲ）、ＩｇＡ（アルファ受容体、すなわちＩｇαＲ）、及びＩｇＭ（ミュー受容体、すなわちＩｇμＲ）を含め、異なるクラスの抗体に特異的ないくつかのＦｃ受容体が存在する。細胞表面上のＦｃ受容体に抗体が結合すると、免疫複合体のエンドサイトーシス、抗体被覆粒子または微生物の貪食及び破壊（抗体依存性食作用、またはＡＤＣＰとも呼ばれる）、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞傷害、またはＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症性メディエーターの放出、免疫系細胞活性化の調節、免疫グロブリンの胎盤通過及び産生制御を含む、いくつかの重要かつ多様な生物学的応答が誘起される。特定のＦｃ受容体であるＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）は、免疫動員の抑止あるいは増強において重要な役割を果たす。ＦｃγＲは白血球で発現し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩの３つの異なるクラスから構成される（Ｇｅｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，（１９９８），７６：２３１−４８）。構造的には、ＦｃγＲは全て、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、ＩｇＧに結合するα鎖を有し、細胞外部分が２つまたは３つのＩｇ様ドメインから構成されている。ヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）はヒトの単球で発現し、単量体のＩｇＧ１、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に対して高い結合親和性（Ｋａ＝１０８〜１０９Ｍ−１）を呈する。ヒトのＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３に対して低い親和性（Ｋａ＜１０７Ｍ−１）を有し、これらのＩｇＧアイソタイプの複合型またはポリマー型にしか結合できない。さらに、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩの各クラスは、「Ａ」型と「Ｂ」型の両方を含む。ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）及びＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）は、膜貫通ドメインによってマクロファージ、ＮＫ細胞、及びいくつかのＴ細胞の表面に結合し、一方でＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）及びＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）は、ホスファチジルイノシトールグリカン（ＧＰＩ）アンカーを介して顆粒球（例えば好中球）の細胞表面に選択的に結合する。ヒトのＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩの各マウス相同体は、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ／１、及びＦｃγＲ１ｏである。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「抗原非依存性エフェクター機能」という用語は、抗体が対応する抗原に結合しているかどうかを問わず、抗体によって誘導され得るエフェクター機能を意味する。典型的な抗原非依存性エフェクター機能としては、免疫グロブリンの細胞輸送、循環半減期、及びクリアランス速度、ならびに精製の促進が挙げられる。構造的に独特なＦｃ受容体である「新生児型Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲｎ」は、サルベージ受容体としても知られ、半減期及び細胞輸送の調節において重要な役割を果たす。微生物細胞から精製される他のＦｃ受容体（例えばブドウ球菌プロテインＡまたはＧ）は、Ｆｃ領域に高い親和性で結合することができ、Ｆｃ含有ポリペプチドの精製を促進するために使用され得る。
【００９４】
免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＦｃγＲとは異なり、ヒトＦｃＲｎは、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩのポリペプチドに構造的に類似する（Ｇｈｅｔｉｅ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，（１９９７），１８（１２）：５９２−８）。ＦｃＲｎは、典型的に、可溶性β鎖または軽鎖（β２ミクログロブリン）と複合した膜貫通α鎖または重鎖からなるヘテロ二量体として発現される。ＦｃＲｎはクラスＩのＭＨＣ分子と２２〜２９％の配列同一性を共有し、非機能型のＭＨＣペプチド結合溝を有する（Ｓｉｍｉｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｓｔｏｖ，Ｎａｔｕｒｅ，（１９８９），３３７：１８４−７）。ＭＨＣと同様に、ＦｃＲｎのα鎖は、３つの細胞外ドメイン（α１、α２、α３）からなり、短い細胞質側末端がタンパク質を細胞表面に固定する。α１ドメイン及びα２ドメインは、抗体のＦｃ領域内のＦｃＲ結合部位と相互作用する（Ｒａｇｈａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，（１９９４），１：３０３−１５）。ＦｃＲｎは哺乳動物の胎盤子宮部または卵黄嚢で発現し、母体から胎児へのＩｇＧの移行に関与する。ＦｃＲｎは齧歯類の新生仔の小腸でも発現し、ここでＦｃＲｎは、摂取された初乳または乳汁からの刷子縁上皮を通した母体ＩｇＧの移行に関与する。ＦｃＲｎはまた、多数の種の多数の他の組織、ならびに様々な内皮細胞株においても発現する。ＦｃＲｎはまた、ヒト成人の血管内皮、筋肉脈管構造、及び肝類洞でも発現する。ＦｃＲｎは、ＩｇＧに結合し、血清に再循環させることにより、ＩｇＧの循環半減期または血清レベルの維持において付加的役割を果たすと考えられている。ＩｇＧ分子へのＦｃＲｎの結合は完全にｐＨ依存性であり、最適な結合は７．０未満のｐＨで生じる。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「半減期」という用語は、特定の結合ポリペプチドのインビボでの生物学的半減期を意味する。半減期は、対象に投与される量の半分が動物の循環及び／または他の組織から排除されるのに必要な時間によって表され得る。所与の結合ポリペプチドのクリアランス曲線が時間の関数として構築される場合、この曲線は通常、急速なα相とより長いβ相との二相性である。α相は、典型的に、投与されたＦｃポリペプチドの血管内空間と血管外空間との間の平衡を表し、ポリペプチドのサイズによって部分的に決定される。β相は、典型的に、血管内空間における結合ポリペプチドの異化を表す。したがって、非限定的な実施形態において、本明細書で使用される半減期という用語は、β相における結合ポリペプチドの半減期を意味する。ヒト抗体のヒトにおける典型的なβ相半減期は２１日である。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、２つ以上の天然アミノ酸または非天然アミノ酸のポリマーを意味する。「Ｆｃポリペプチド」という用語は、Ｆｃ領域またはその一部分（例えば、Ｆｃ部分）を含むポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、本発明の方法によって安定化される。任意選択の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ＦｃポリペプチドのＦｃ領域（またはその一部分）に作動可能に連結または融合した結合部位をさらに含む。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、ポリペプチド（例えば、Ｆｃポリペプチド）または２つ以上のポリペプチドを含む組成物を意味する。したがって、タンパク質は、単量体（例えば、単一のＦｃポリペプチド）であっても多量体であってもよい。例えば、一実施形態において、本発明のタンパク質は二量体である。一実施形態において、本発明の二量体は、２つの同一の単量体サブユニットまたはポリペプチド（例えば、２つの同一のＦｃポリペプチド）を含むホモ二量体である。別の実施形態では、本発明の二量体は、２つの非同一の単量体サブユニットまたはポリペプチド（例えば、２つの非同一のＦｃポリペプチド、またはＦｃポリペプチド及びＦｃポリペプチド以外の第２のポリペプチド）を含むヘテロ二量体である。二量体のサブユニットは、１つ以上のポリペプチド鎖を含んでもよく、ここで、ポリペプチド鎖のうちの少なくとも１つはＦｃポリペプチドである。例えば、一実施形態において、二量体は、少なくとも２つのポリペプチド鎖（例えば、少なくとも２つのＦｃポリペプチド鎖）を含む。一実施形態において、二量体は、２つのポリペプチド鎖を含み、ここで、これらの鎖の一方または両方はＦｃポリペプチド鎖である。別の実施形態では、二量体は、３つのポリペプチド鎖を含み、ここで、ポリペプチド鎖のうちの１つ、２つ、または全てがＦｃポリペプチド鎖である。別の実施形態では、二量体は、４つのポリペプチド鎖を含み、ここで、ポリペプチド鎖のうちの１つ、２つ、３つ、または全てがＦｃポリペプチド鎖である。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「連結した」、「融合した」、または「融合」という用語は、同義に使用される。これらの用語は、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段を含め、あらゆる手段によって２つ以上の要素または成分をひとつに結合させることを意味する。化学的コンジュゲーションの（例えば、ヘテロ二官能性架橋剤を使用する）方法は、当技術分野において公知である。本明細書で使用される場合、「遺伝子融合した」または「遺伝子融合」という用語は、２つ以上のタンパク質、ポリペプチド、またはそれらの断片が、それらの個々のペプチド骨格を介して、これらのタンパク質、ポリペプチド、または断片をコードする単一のポリヌクレオチド分子の遺伝子発現によって共線的に共有結合または付着することを意味する。このような遺伝子融合は、単一の連続的な遺伝子配列の発現をもたらす。いくつかの実施形態では、遺伝子融合はインフレームである。すなわち、元のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の正しいリーディングフレームを維持する様式で、２つ以上のＯＲＦが融合して、連続したより長いＯＲＦを形成する。したがって、結果として生じる組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のタンパク質セグメントを含む単一のポリペプチドである（これらのセグメントは通常、自然にこのように結合することはない）。このように、リーディングフレームが、融合した遺伝子セグメント全体にわたって連続的になっても、タンパク質セグメントは、例えばインフレームポリペプチドリンカーによって物理的または空間的に分離していてもよい。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」という用語は、抗体重鎖の２つ以上のＦｃ部分によって形成される免疫グロブリンの一部分として定義されるものとする。特定の実施形態において、Ｆｃ領域は、二量体Ｆｃ領域である。「二量体Ｆｃ領域」または「ｄｃＦｃ」とは、２つの別個の免疫グロブリン重鎖のＦｃ部分から形成された二量体を意味する。二量体Ｆｃ領域は、２つの同一のＦｃ部分（例えば、天然に発生する免疫グロブリンのＦｃ領域）からなるホモ二量体、または２つの非同一のＦｃ部分からなるヘテロ二量体であり得る。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、単量体または「一本鎖」のＦｃ領域（すなわち、ｓｃＦｃ領域）である。一本鎖Ｆｃ領域は、単一のポリペプチド鎖内に遺伝学的に関係付けられた（すなわち、単一の連続的な遺伝子配列にコードされた）Ｆｃ部分から構成される。例示的なｓｃＦｃ領域は、２００８年５月１４日に出願され、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６２６０号に開示されている。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ部分」という用語は、免疫グロブリン重鎖のうち、パパイン切断部位（すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４として、ＩｇＧの残基２２６、Ｋａｂａｔ付番／残基２１６、ＥＵ付番）のすぐ上流にあるヒンジ領域から始まり、免疫グロブリン重鎖のＣ末端で終わる部分に由来する配列を意味する。したがって、Ｆｃ部分は、完全なＦｃ部分またはその一部分（例えば、ドメイン）であってもよい。完全なＦｃ部分は、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメイン（すなわち、Ｋａｂａｔアミノ酸２２６〜４７７位；ＥＵアミノ酸２１６〜４４６位）を含む。付加的なリジン残基（Ｋ）がＦｃ部分の最遠のＣ末端に存在することもあるが、多くの場合、成熟抗体から切断される。Ｆｃ領域内の各アミノ酸位置は、特記なき限り、当技術分野で認識されているＥＵ付番システムに従って付番されている。特定の実施形態において、Ｆｃ部分は、ヒンジ（例えば、上部、中間部、及び／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそれらのバリアント、一部分、もしくは断片のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ部分は、少なくともＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを含む。特定の実施形態において、Ｆｃ部分は、完全なＦｃ部分である。他の実施形態では、Ｆｃ部分は、天然に発生するＦｃ部分と比べて、アミノ酸の挿入、欠失、または置換を１つ以上含む。例えば、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、またはＣＨ３ドメイン（またはその一部分）のうちの少なくとも１つは欠失していてもよい。例えば、Ｆｃ部分は、（ｉ）ＣＨ２ドメイン（またはその一部分）に融合したヒンジドメイン（またはその一部分）、（ｉｉ）ＣＨ３ドメイン（またはその一部分）に融合したヒンジドメイン（またはその一部分）、（ｉｉｉ）ＣＨ３ドメイン（またはその一部分）に融合したＣＨ２ドメイン（またはその一部分）、（ｉｖ）ＣＨ２ドメイン（またはその一部分）、及び（ｖ）ＣＨ３ドメインまたはその一部分を含むか、またはこれらからなっていてもよい。
【０１００】
抗体のアミノ酸残基は独自の付番スキームを有することに留意されたい。公開文献のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，ｖｏｌ．４，１９９１，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌにおいてＥＵインデックス付番と呼ばれることもある付番スキームを示している。しかしながら、その後、Ｋａｂａｔ付番と呼ばれる新たな付番システムが登場している。
【０１０１】
非限定的な例において、次の表は、ヒトＩｇＧ１の重鎖ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の各ドメインのＥＵ付番とＫａｂａｔ付番との比較を示す。なお、ヒトＩｇＧ１の定常領域の配列は、配列番号８３に提示している。
2021526371.tif 000003
2021526371.tif 000004
2021526371.tif 000005
【０１０２】
なお、上記の表のアミノ酸残基は、ヒトＩｇＧ１において天然に生じるもの、または古典的なものである。したがって、２９７位（ＥＵ付番）（Ｋａｂａｔ付番では３１４位である）の古典的残基はアスパラギン（Ｎ）である。アミノ酸残基が古典的残基から変化していれば、置換または変異と呼ばれる。
【０１０３】
なお、ヒトＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）の類似性により、全てのＩｇＧ分子の定常領域は、ＥＵ付番１１８位（Ｋａｂａｔ付番１１４位）のアラニン残基から始まり、ＥＵ付番４４７位（Ｋａｂａｔ付番４７８位）のＣ末端におけるリジン残基で終わる。
【０１０４】
下記の表は、ＥＵ付番で２１６位（Ｋａｂａｔ付番で２２６位）のグルタミン酸残基から始まる、ヒトＩｇＧ１のヒンジのＥＵ付番及びＫａｂａｔ付番の相関性を示す。
2021526371.tif 000006
【０１０５】
下記の表は、ＥＵ付番で２１６位（Ｋａｂａｔ付番で２２６位）のグルタミン酸残基から始まる、ヒトＩｇＧ４のヒンジのＥＵ付番及びＫａｂａｔ付番の相関性を示す。
2021526371.tif 000007
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本明細書で言及される置換が、天然に発生するＩｇＧ１またはＩｇＧ４のいずれかに存在する場合、その置換を示すＥＵ付番またはＫａｂａｔ付番は、天然に発生する親分子（またはそのドメイン）の付番に関するものである。例えば、ＩｇＧ４のヒンジの２２８位にあるセリンが、例えばプロリンに変異している場合、この変異は、ＥＵ付番ではＳ２２８Ｐ、Ｋａｂａｔ付番ではＳ２４１Ｐと示される。
【０１０７】
ヒトＩｇＧ１の天然に発生する重鎖の全長配列は、ここでは、１１８位（ＥＵ付番）［１１４位（Ｋａｂａｔ付番）］における古典的なアラニン残基から始まる配列番号８３として提示される。
【０１０８】
ヒトＩｇＧ１の天然に発生する重鎖の全長配列は、ここでは、１１８位（ＥＵ付番）［１１４位（Ｋａｂａｔ付番）］における古典的なアラニン残基から始まる配列番号８４として提示される。
【０１０９】
本明細書で示すように、Ｆｃ部分が、天然に発生するＦｃ部分によってもたらされる少なくとも１つの望ましい機能を保持しつつ、天然に発生する免疫グロブリン分子の完全なＦｃ部分とアミノ酸配列が異なるように修飾され得ることは、当業者には理解されよう。例えば、Ｆｃ部分は、ＦｃＲｎの結合または長期の半減期に必要であることが当技術分野において公知であるＦｃ部分の一部分を少なくとも含むか、またはそれからなる場合がある。別の実施形態では、Ｆｃ部分は、ＦｃγＲ結合に必要であることが当技術分野において公知である部分を少なくとも含む。一実施形態において、本発明のＦｃ領域は、プロテインＡ結合に必要であることが当技術分野において公知である部分を少なくとも含む。一実施形態において、本発明のＦｃ部分は、プロテインＧ結合に必要であることが当技術分野において公知であるＦｃ分子の一部分を少なくとも含む。特定の実施形態において、Ｆｃ領域のＦｃ部分は、同じアイソタイプのものである。
【０１１０】
例えば、Ｆｃ部分は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプの免疫グロブリン（例えば、ヒト免疫グロブリン）に由来し得る。しかしながら、Ｆｃ領域（またはＦｃ領域の１つ以上のＦｃ部分）は、キメラであってもよい。キメラＦｃ領域は、異なる免疫グロブリンアイソタイプに由来するＦｃ部分を含み得る。特定の実施形態において、二量体または一本鎖のＦｃ領域のＦｃ部分のうちの少なくとも２つは、異なる免疫グロブリンアイソタイプのものであり得る。付加的または代替的な実施形態において、キメラＦｃ領域は、１つ以上のキメラＦｃ部分を含み得る。例えば、キメラＦｃ領域またはキメラＦｃ部分は、第１のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３アイソタイプ）の免疫グロブリンに由来する部分を１つ以上含み、Ｆｃ領域またはＦｃ部分の残部は異なるアイソタイプのものであってもよい。例えば、ＦｃポリペプチドのＦｃ領域またはＦｃ部分は、第１のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプ）の免疫グロブリンに由来するＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインと、第２のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ３アイソタイプ）の免疫グロブリンに由来するヒンジ領域とを含み得る。別の実施形態では、Ｆｃ領域またはＦｃ部分は、第１のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ４アイソタイプ）の免疫グロブリンに由来するヒンジ及び／またはＣＨ２ドメインと、第２のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３アイソタイプ）の免疫グロブリンに由来するＣＨ３ドメインとを含む。別の実施形態では、キメラＦｃ領域は、第１のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ４アイソタイプ）の免疫グロブリン由来のＦｃ部分（例えば、完全なＦｃ部分）と、第２のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３アイソタイプ）の免疫グロブリン由来のＦｃ部分とを含む。例示的な一実施形態において、Ｆｃ領域またはＦｃ部分は、ＩｇＧ４免疫グロブリン由来のＣＨ２ドメイン、及びＩｇＧ１免疫グロブリン由来のＣＨ３ドメインを含む。別の実施形態では、Ｆｃ領域またはＦｃ部分は、ＩｇＧ４分子由来のＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、ならびにＩｇＧ１分子由来のＣＨ３ドメインを含む。別の実施形態では、Ｆｃ領域またはＦｃ部分は、特定のアイソタイプの抗体のＣＨ２ドメインの一部分、例えば、ＣＨ２ドメインのＫａｂａｔ３０９〜３６０位、ＥＵ２９２〜３４０位を含む。例えば、一実施形態において、Ｆｃ領域またはＦｃ部分は、ＩｇＧ４部分に由来するＣＨ２のアミノ酸２９２〜３４０位（ＥＵ付番）、３０９〜３６０位（Ｋａｂａｔ付番）を含み、ＣＨ２の残部はＩｇＧ１部分に由来する（代替的には、ＣＨ２の２９２〜３４０位（ＥＵ付番）、３０９〜３６０位（Ｋａｂａｔ付番）はＩｇＧ１部分に由来し、ＣＨ２の残部はＩｇＧ４部分に由来してもよい）。
【０１１１】
他の実施形態では、Ｆｃ領域またはＦｃ部分は、キメラヒンジ領域を含み得る。キメラヒンジは、一部はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４分子に由来し（例えば、上部及び下位中間部のヒンジ配列）、一部はＩｇＧ３分子に由来してもよい（例えば、中間部ヒンジ配列）。別の例において、Ｆｃ領域またはＦｃ部分は、一部はＩｇＧ１分子に由来し、一部はＩｇＧ４分子に由来する、キメラヒンジを含み得る。特定の実施形態では、キメラヒンジは、ＩｇＧ４分子由来の上部及び下部ヒンジドメイン、ならびにＩｇＧ１分子由来の中間部ヒンジドメインを含み得る。そのようなキメラヒンジは、ＩｇＧ４ヒンジ領域の中間部ヒンジドメインのＥＵ２２８位、Ｋａｂａｔ２４１位にプロリン置換（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ（ＥＵ付番）；Ｓｅｒ２４１Ｐｒｏ（Ｋａｂａｔ付番））を導入することによって作製され得る。別の実施形態では、キメラヒンジは、ＩｇＧ２抗体のＫａｂａｔ２４６〜２４９位のアミノ酸及び／またはＳｅｒ２２８Ｐｒｏ（ＥＵ付番）Ｓｅｒ２４１Ｐｒｏ（Ｋａｂａｔ付番）変異を含んでもよく、ここで、ヒンジの残りのアミノ酸はＩｇＧ４抗体由来である（例えば、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰのキメラヒンジ）。さらなるキメラヒンジは、全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願第１０／８８０，３２０号に記載されている。
【０１１２】
「Ｆｃ領域」の定義には、「アグリコシル化Ｆｃ領域」が明確に含まれる。本明細書で使用される「アグリコシル化Ｆｃ領域」とは、例えば、そのＦｃ部分のうちの１つ以上において、ＥＵ２９７位、Ｋａｂａｔ３１４位のＮ−グリコシル化部位で、共有結合したオリゴ糖またはグリカンを欠いているＦｃ領域である。特定の実施形態では、アグリコシル化Ｆｃ領域は、完全にアグリコシル化されている。すなわち、そのＦｃ部分の全てが炭水化物を欠いている。他の実施形態では、アグリコシル化は、部分的なアグリコシル化（すなわち、半グリコシル化）である。アグリコシル化Ｆｃ領域は、Ｆｃ炭水化物が、例えば化学的または酵素的に除去されているＦｃ領域である、脱グリコシル化Ｆｃ領域であってもよい。代替的には、アグリコシル化Ｆｃ領域は、非グリコシル化型または未グリコシル化型であってもよい。つまり、例えば、炭水化物をタンパク質に自然に結合させることのない生物（例えば、細菌）における発現、または遺伝子操作もしくはグリコシル化阻害因子（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ阻害因子）の付加によってグリコシル化機構を欠損させた宿主細胞もしくは生物における発現により、例えば、ＥＵ２９７位または２９９位、Ｋａｂａｔ３１４位または３１８位におけるＮ−グリコシル化部位（例えば、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ）における、グリコシル化パターンをコードする１つ以上の残基の変異により、Ｆｃ炭水化物なしで発現された抗体である。代替的な実施形態では、Ｆｃ領域は、「グリコシル化Ｆｃ領域」であり、すなわち、全ての利用可能なグリコシル化部位で完全にグリコシル化されている。
【０１１３】
「親Ｆｃポリペプチド」という用語には、安定化が所望されるＦｃ領域を含むポリペプチド（例えば、ＩｇＧ抗体）が含まれる。いくつかの実施形態では、親Ｆｃポリペプチドは、エフェクターレスＦｃポリペプチドである。低減したエフェクター機能をもつ安定化Ｆｃポリペプチドについては報告がある（例えば、全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０８５６８２号を参照されたい）。したがって、親Ｆｃポリペプチドは、本発明の方法が行われる、または安定性比較の基準点として使用され得る元のＦｃポリペプチドを表す。親ポリペプチドは、天然の（すなわち天然に発生する）Ｆｃ領域もしくはＦｃ部分（例えば、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域もしくはＦｃ部分）、または天然に発生する配列の既存のアミノ酸配列修飾（例えば挿入、欠失及び／または他の変化）を有するが１つ以上の安定化アミノ酸を欠いているＦｃ領域を含み得る。
【０１１４】
「変異」または「変異する」という用語は、親Ｆｃポリペプチドにおいて変異を物理的に作ること（例えば、１つのアミノ酸をコードする核酸分子のコドンを、例えば、部位特異的変異誘発によって変化させて、異なるアミノ酸をコードするコドンをもたらすことによる）、または親Ｆｃ領域に見られないアミノ酸を有するバリアントＦｃ領域を合成すること（例えば、親Ｆｃ領域をコードする核酸分子のヌクレオチド配列を知り、本発明の安定化ポリペプチドをコードする核酸分子の１つ以上のヌクレオチドを変異させる必要なしに、親Ｆｃ領域のバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子の合成を設計することによる）を含むと理解されるものとする。
【０１１５】
例示的な一実施形態において、親Ｆｃポリペプチドは、エフェクターレスＦｃポリペプチドのＦｃ領域を含む。本明細書で使用される場合、「エフェクターレスＦｃポリペプチド」という用語は、ＩｇＧ１アイソタイプの野生型、アグリコシル化抗体と比較して、変化または低減したエフェクター機能を有するＦｃポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、低減または変化するエフェクター機能は、抗体依存性エフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣ及び／またはＡＤＣＰである。一実施形態において、エフェクターレスＦｃポリペプチドは、ＦｃポリペプチドのＦｃ領域、例えば、アグリコシル化Ｆｃ領域におけるグリコシル化の修飾または低減の結果として、低減したエフェクター機能を有する。別の実施形態では、エフェクターレスＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域またはその一部分（例えば、ＩｇＧ４抗体のＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメイン）の組み込みに起因して、低減したエフェクター機能を有する。
【０１１６】
「バリアントＦｃポリペプチド」または「Ｆｃバリアント」という用語は、親Ｆｃポリペプチドに由来するＦｃポリペプチドを含む。Ｆｃバリアントは、例えば、少なくとも１つのＦｃ安定化変異の導入に起因して、１つ以上の安定化アミノ酸残基の安定化を含むという点で、親Ｆｃポリペプチドと異なる。特定の実施形態において、本発明のＦｃバリアントは、１つ以上の安定化Ｆｃアミノ酸の存在を除いては親ポリペプチドと配列が同一であるＦｃ領域（またはＦｃ部分）を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃバリアントは、親Ｆｃポリペプチドと比較して増強された安定性を有し、場合により、親Ｆｃポリペプチドと比較して同等かまたは低減したエフェクター機能を有する。
【０１１７】
ポリペプチドまたはアミノ酸配列が所定のポリペプチドまたはタンパク質「に由来する」とは、ポリペプチドの起源を意味する。いくつかの実施形態では、特定の配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、その配列またはその一部分（この一部分は、少なくとも１０〜２０アミノ酸、または少なくとも２０〜３０アミノ酸、または少なくとも３０〜５０アミノ酸、またはその配列に起源をもつものとして当業者が識別できる別の数のアミノ酸からなる）と本質的に同一であるアミノ酸配列を有する。ポリペプチドとの関連において、「直鎖状配列」または「配列」とは、アミノ末端からカルボキシル末端への方向におけるポリペプチド内のアミノ酸の順序であり、ここで、配列内で互いに隣接する残基は、ポリペプチドの一次構造において連続している。別のポリペプチド（例えば、親Ｆｃポリペプチド）に由来するポリペプチド（例えば、バリアントＦｃポリペプチド）は、出発ポリペプチドまたは親ポリペプチドと比べて１つ以上の変異、例えば、別のアミノ酸残基に置換されているか、または１つ以上のアミノ酸残基の挿入もしくは欠失を有する１つ以上のアミノ酸残基を有し得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然に発生しないアミノ酸配列を含む。そのようなバリアントは、出発ポリペプチドと１００％未満の配列同一性または類似性を必然的に有する。非限定的な実施形態において、バリアントは、例えば、バリアント分子の全長またはその一部分（例えば、Ｆｃ領域またはＦｃ部分）にわたり、出発ポリペプチドのアミノ酸配列とのアミノ酸配列同一性または類似性が約７５％から１００％未満、または約８０％から１００％未満、または約８５％から１００％未満、または約９０％から１００％未満（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）、または約９５％から１００％未満であるアミノ酸配列を有する。一実施形態において、出発ポリペプチドの配列（例えば、親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域）と、それに由来する配列（例えば、バリアントＦｃポリペプチドのＦｃ領域）との間で、１つのアミノ酸が異なる。他の実施形態では、出発ポリペプチドの配列とバリアントポリペプチドとの間で、２〜１０個のアミノ酸が異なる（例えば、約２〜２０個、約２〜１５個、約２〜１０個、約５〜２０個、約５〜１５個、約５〜１０個のアミノ酸が異なる）。例えば、約１０個未満のアミノ酸が異なる（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のアミノ酸が異なる）場合がある。この配列に関する同一性または類似性は、本明細書において、これらの配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入して、最大配列同一性パーセントを達成した後の、候補配列中の出発アミノ酸残基と同一であるアミノ酸残基（すなわち同じ残基）の百分率と定義される。
【０１１８】
本発明のＦｃポリペプチドは、ヒト免疫グロブリン配列に由来するアミノ酸配列（例えば、少なくとも１つのＦｃ領域またはＦｃ部分）（例えば、ヒトＩｇＧ分子のＦｃ領域またはＦｃ部分）を含み得る。しかしながら、ポリペプチドは、別の哺乳動物種由来のアミノ酸を１つ以上含んでもよい。例えば、霊長類のＦｃ部分または霊長類の結合部位が対象ポリペプチドに含まれてもよい。代替的には、１つ以上のマウスアミノ酸がＦｃポリペプチドに存在してもよい。いくつかの実施形態では、本発明のＦｃポリペプチドには免疫原性がない。
【０１１９】
また、本発明のＦｃポリペプチドは、親ポリペプチドの１つ以上の望ましい活性（例えば、低減したエフェクター機能）を保持しながら、その起源となった親ポリペプチドとアミノ酸配列が異なるように変化していてもよいことも、当業者には理解されよう。特定の実施形態では、Ｆｃポリペプチドを安定化させるヌクレオチドまたはアミノ酸置換が行われる。一実施形態において、コードされるタンパク質に１つ以上のアミノ酸の置換、付加、または欠失が導入されるように、１つ以上のヌクレオチドの置換、付加、または欠失を親Ｆｃポリペプチドのヌクレオチド配列に導入することにより、Ｆｃバリアントをコードする単離された核酸分子を作出することができる。変異（例えば、安定化変異）は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲによる変異誘発などの標準的な技術によって導入され得る。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「タンパク質安定性」という用語は、環境条件（例えば温度の上昇または低下）に応じたタンパク質の１つ以上の物理特性の維持に関する、当技術分野で認識されている尺度を意味する。一実施形態において、この物理特性は、タンパク質の共有構造の維持（例えば、タンパク質分解切断、不要な酸化、または脱アミド化がないこと）である。別の実施形態では、この物理特性は、適切にフォールディングした状態におけるタンパク質の存在（例えば、可溶性または不溶性の凝集体または沈殿物がないこと）である。一実施形態において、タンパク質の安定性は、タンパク質の生物物理学的特性、例えば熱安定性、ｐＨアンフォールディングプロファイル、グリコシル化の安定な除去、可溶性、生化学的機能（例えば、タンパク質（例えば、リガンド、受容体、抗原など）または化学部分に結合する能力など）、及び／またはそれらの組み合わせをアッセイすることにより測定される。別の実施形態では、生化学的機能は、相互作用の結合親和性によって示される。一実施形態において、タンパク質安定性の尺度は、熱安定性、すなわち熱負荷に対する抵抗性である。安定性は、当技術分野で公知及び／または本明細書に記載の方法を使用して測定することができる。例えば、「転移温度」とも呼ばれる「Ｔｍ」を測定してもよい。Ｔｍは、高分子、例えば結合分子の５０％が変性する温度であり、タンパク質の熱安定性を表す標準的なパラメータと考えられている。
【０１２１】
「アミノ酸」という用語には、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＨｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、及びバリン（ＶａＩまたはＶ）が含まれる。非古典的なアミノ酸も本発明の範囲内にあり、これらは、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、及びＥｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１−３３６（１９９１）に記載されるもののような他のアミノ酸残基類似体を含む。かかる天然に発生しないアミノ酸残基を生成するために、Ｎｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２（１９８９）及びＥｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（上記）の手順を使用することができる。簡単に説明すると、これらの手順は、天然に発生しないアミノ酸残基でサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化させ、その後インビトロで転写し、ＲＮＡの翻訳を行うことを含む。非古典的なアミノ酸の導入は、当技術分野において公知のペプチド化学を使用して達成することもできる。本明細書で使用される場合、「極性アミノ酸」という用語には、正味電荷はゼロであるが、側鎖の様々な部分における部分的な電荷はゼロではないアミノ酸（例えばＭ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｃ）が含まれる。これらのアミノ酸は、疎水性相互作用及び静電相互作用に関与し得る。本明細書で使用される場合、「荷電アミノ酸」という用語には、側鎖にゼロではない正味電荷を有し得るアミノ酸（例えばＲ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ｄ）が含まれる。これらのアミノ酸は、疎水性相互作用及び静電相互作用に関与し得る。本明細書で使用される場合、「十分な立体容積を有するアミノ酸」という用語には、比較的大きな３次元空間を占有する側鎖を有するアミノ酸が含まれる。十分な立体容積をもつ側鎖化学構造を有する例示的なアミノ酸としては、チロシン、トリプトファン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、グルタミン、及びメチオニン、またはそれらの類似体もしくは模倣物が挙げられる。
【０１２２】
「アミノ酸置換」とは、既定のアミノ酸配列（出発ポリペプチドのアミノ酸配列）に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基が、第２の異なる「置換」アミノ酸残基で置換されることを意味する。「アミノ酸挿入」とは、少なくとも１つの付加的なアミノ酸が既定のアミノ酸配列に組み込まれることを意味する。挿入は通常、１つまたは２つのアミノ酸残基の挿入からなるが、本発明では、より大きな「ペプチド挿入」、例えば約３〜約５個、またはさらには最大で約１０、１５、もしくは２０個のアミノ酸残基の挿入が行われる場合がある。挿入される残基（複数可）は、上記に開示されるように、天然に発生するものであっても、天然に発生しないものであってもよい。「アミノ酸欠失」とは、既定のアミノ酸配列から少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されることを意味する。上記に示したように、これらの用語は、既存の物理的核酸分子に生じる実際の変化、または設計プロセス中に（例えば、紙上もしくはコンピュータで）行われる既存の核酸配列の変更を含む。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、結合ポリペプチドである。本明細書で使用される場合、「結合ポリペプチド」（例えば、結合抗体）という用語は、特定の標的分子（例えば抗原または結合パートナー）に特異的に結合する少なくとも１つの標的結合部位または結合ドメインを含むポリペプチド（例えば、Ｆｃポリペプチド）を意味する。例えば、一実施形態において、本発明の結合ポリペプチドは、リガンド結合に関与する免疫グロブリン抗原結合部位もしくは受容体分子の一部分、または受容体結合に関与するリガンド分子の一部分を含む。本発明の結合ポリペプチドは、少なくとも１つの結合部位を含む。一実施形態において、本発明の結合ポリペプチドは、少なくとも２つの結合部位を含む。一実施形態において、結合ポリペプチドは、２つの結合部位を含む。別の実施形態では、結合ポリペプチドは、３つの結合部位を含む。別の実施形態では、結合ポリペプチドは、４つの結合部位を含む。一実施形態において、結合部位は、互いに直列結合している。他の実施形態では、結合部位は、結合ポリペプチドの異なる位置に、例えば、ＦｃポリペプチドのＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端の１つ以上に位置付けられる。例えば、Ｆｃ領域がｓｃＦｃ領域である場合、結合部位は、ｓｃＦｃ領域のＮ末端、Ｃ末端、または両端に結合していてもよい。Ｆｃ領域が二量体Ｆｃ領域である場合、結合部位は、一方もしくは両方のＮ末端及び／または一方もしくは両方のＣ末端に結合していてもよい。
【０１２３】
本明細書で使用される「結合ドメイン」、「結合部位」、または「結合部分」という用語は、結合ポリペプチドのうち、例えば、標的分子（例えば抗原、リガンド、受容体、基質、または阻害因子）との特異的結合を媒介する生物学的活性（Ｆｃによる生物学的活性を除く）を有する部分、領域、または部位を意味する。例示的な結合ドメインとしては、生物学的活性のあるタンパク質もしくは部分、抗原結合部位、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメイン、または酵素的ドメインが挙げられる。別の例において、「結合部分」という用語は、生物学的システムの成分（例えば、血清中、または細胞表面上、または細胞基質中のタンパク質）に結合し、この結合が、生物学的効果（例えば、活性部分及び／または結合する成分における変化（例えば、活性部分及び／または結合する成分の切断、シグナルの伝達、または細胞もしくは対象における生物学的応答の増強もしくは阻害）によって測定される）をもたらす、生物学的活性のある分子またはその一部分を意味する。
【０１２４】
本明細書で使用される「リガンド結合ドメイン」という用語は、天然の受容体（例えば、細胞表面受容体）、または、対応する天然の受容体の少なくとも定性的なリガンド結合能力及び／または生物学的活性の少なくとも一部（または大部分）を保持する領域もしくはその誘導体を意味する。本明細書で使用される「受容体結合ドメイン」という用語は、天然のリガンド、または、対応する天然のリガンドの少なくとも定性的な受容体結合能力及び／または生物学的活性の少なくとも一部を保持する領域もしくはその誘導体を意味する。一実施形態において、本発明の結合ポリペプチドは、低減または消失させる標的となる分子、例えば、細胞表面抗原または可溶性抗原に対して特異的な、少なくとも１つの結合ドメインを有する。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、抗原結合部位（例えば、代替的なフレームワーク領域（例えば、場合により１つ以上のアミノ酸置換を含むヒトフレームワーク領域）に配置された、抗体由来の可変重鎖配列及び可変軽鎖配列または６つのＣＤＲを含む）を含むか、またはそれからなる。本明細書で使用される「結合親和性」という用語は、結合相互作用の強度を含み、したがって、実際の結合親和性と見かけの結合親和性の両方を含む。実際の結合親和性は、会合速度の解離速度に対する比である。したがって、結合親和性の付与または最適化には、これらの成分の一方または両方を変化させて、所望のレベルの結合親和性を達成することが含まれる。見かけの親和性は、例えば、相互作用のアビディティを含み得る。
【０１２５】
本明細書で使用される「結合自由エネルギー」（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒｅｅ  ｅｎｅｒｇｙまたはｆｒｅｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ）という用語は、当技術分野で認識されている意味、特に、溶媒中の結合部位−リガンド相互作用またはＦｃ−ＦｃＲ相互作用に適用される意味を含む。結合自由エネルギーの低減は親和性を増強させ、結合自由エネルギーの増大は親和性を低減させる。
【０１２６】
「特異性」という用語には、所与の標的に特異的に結合する（例えば、免疫反応する）潜在的な結合部位の数が含まれる。結合ポリペプチドは、単一特異性であり、同じ標的（例えば、同じエピトープ）に特異的に結合する結合部位を１つ以上含む場合もあれば、結合ポリペプチドは、多特異性であり、同じ標的の異なる領域（例えば、異なるエピトープ）または異なる標的に特異的に結合する結合部位を２つ以上含む場合もある。一実施形態において、２つ以上の標的分子（例えば、２つ以上の抗原または同じ抗原上の２つ以上のエピトープ）に対する結合特異性を有する多特異性結合ポリペプチド（例えば、二重特異性ポリペプチド）が作製されうる。別の実施形態では、多特異性結合ポリペプチドは、低減または消失させる標的となる分子に対して特異的な少なくとも１つの結合ドメインと、細胞上の標的分子に対して特異的な少なくとも１つの結合ドメインとを有する。別の実施形態では、多特異性結合ポリペプチドは、低減または消失させる標的となる分子に対して特異的な少なくとも１つの結合ドメインと、薬物に対して特異的な少なくとも１つの結合ドメインとを有する。さらに別の実施形態では、多特異性結合ポリペプチドは、低減または消失させる標的となる分子に対して特異的な少なくとも１つの結合ドメインと、プロドラッグに対して特異的な少なくとも１つの結合ドメインとを有する。さらに別の実施形態では、多特異性結合ポリペプチドは、１つの標的分子に対して特異的な２つの結合ドメインと、第２の標的分子に対して特異的な２つの結合部位とを有する四価抗体である。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「結合価」という用語は、結合ポリペプチドまたは結合タンパク質における潜在的な結合ドメインの数を意味する。各結合ドメインは、１つの標的分子に特異的に結合する。結合ポリペプチドが２つ以上の結合ドメインを含む場合、各結合ドメインは、同じ分子または異なる分子に特異的に結合してもよい（例えば、異なるリガンドもしくは異なる抗原、または同じ抗原上の異なるエピトープに結合してもよい）。一実施形態において、本発明の結合ポリペプチドは一価である。別の実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは多価である。別の実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは二価である。別の実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは三価である。さらに別の実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは四価である。特定の態様では、本発明の結合ポリペプチドは、ポリペプチドリンカーを用いる。本明細書で使用される場合、「ポリペプチドリンカー」という用語は、ポリペプチド鎖の２つのドメインを直鎖状のアミノ酸配列で接続するペプチドまたはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列）を意味する。例えば、ポリペプチドリンカーは、本発明のＦｃポリペプチドのＦｃ領域（またはＦｃ部分）に結合部位を接続するために使用され得る。いくつかの実施形態では、このようなポリペプチドリンカーは、ポリペプチド分子に柔軟性を与える。例えば、一実施形態において、ＶＨドメインまたはＶＬドメインが、ポリペプチドリンカーに融合または連結し、ポリペプチドリンカーのＮ末端またはＣ末端が、Ｆｃ領域（またはＦｃ部分）のＣ末端またはＮ末端に結合し、ポリペプチドリンカーのＮ末端が、ＶＨまたはＶＬドメインのＮ末端またはＣ末端に結合する。特定の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ｓｃＦｃポリペプチドの２つのＦｃ部分またはドメインを接続する（例えば、遺伝子融合させる）ために使用される。このようなポリペプチドリンカーは、本明細書では、Ｆｃ接続ポリペプチドとも呼ばれる。本明細書で使用される場合、「Ｆｃ接続ポリペプチド」という用語は、２つのＦｃ部分またはドメインを接続する（例えば、遺伝子融合させる）連結ポリペプチドを特に意味する。本発明の結合分子は、２つ以上のペプチドリンカーを含み得る。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「適切にフォールディングしたポリペプチド」という用語には、ポリペプチドを構成する機能的ドメインの全てが明確に活性をもつポリペプチド（例えば、本発明の結合ポリペプチド）が含まれる。本明細書で使用される場合、「不適切にフォールディングしたポリペプチド」という用語には、ポリペプチドの機能的ドメインのうちの少なくとも１つに活性がないポリペプチドが含まれる。本明細書で使用される場合、「適切にフォールディングしたＦｃポリペプチド」または「適切にフォールディングしたＦｃ領域」は、結果として生じるＦｃ領域が少なくとも１つのエフェクター機能を含むように、成分である少なくとも２つのＦｃ部分が適切にフォールディングしているＦｃ領域（例えば、ｓｃＦｃ領域）を含む。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン」という用語は、２つの重鎖と２つの軽鎖の組み合わせを有するポリペプチドを含み、これが関連する特定の免疫反応性を有するか否かを問わない。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、目的の抗原（例えば腫瘍関連抗原）に対して有意な既知の特定の免疫反応活性を有するような集合体（例えば、インタクト抗体分子、抗体断片、またはそれらのバリアント）を意味する。抗体及び免疫グロブリンは軽鎖及び重鎖を含み、これらの間には鎖間共有結合があってもなくてもよい。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリンの構造は比較的よく理解されている。
【０１３１】
下記にさらに詳細に記述するように、「抗体」という総称には、生化学的に区別され得る５つの異なるクラスの抗体が含まれる。各クラスの抗体のＦｃ部分が明らかに本発明の範囲内にあり、以下の記述は概して、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに関するものである。ＩｇＧに関しては、免疫グロブリンは、分子量およそ２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチドと、分子量５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖とを含む。これら４つの鎖は、ジスルフィド結合によって結合されて「Ｙ」構成をなし、軽鎖が「Ｙ」の分岐点から始まって可変ドメインの全体にわたり、重鎖を挟む。
【０１３２】
免疫グロブリンの軽鎖は、カッパまたはラムダ（Ｋ、λ）のいずれかに分類される。各重鎖クラスには、カッパまたはラムダのいずれかの軽鎖が結合し得る。概して、軽鎖及び重鎖は互いに共有結合しており、２つの重鎖の「尾」部分は、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって生成される場合、共有ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合している。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ構成の分岐の両端にあるＮ末端から、各鎖の端にあるＣ末端まで続く。重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）に分類され、これらの中にはいくつかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）があることは、当業者には理解されよう。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ  ＩｇＧ、またはＩｇＥと決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などは十分に解析されており、機能の特殊化をもたらすことが知られている。これらのクラス及びアイソタイプのそれぞれの変化型は、本開示内容を鑑みれば当業者には容易に認識可能であり、したがって、本発明の範囲内にある。
【０１３３】
軽鎖と重鎖の両方が、構造的及び機能的に相同な領域に分けられる。「領域」という用語は、単一の免疫グロブリンの部分もしくは一部分（「Ｆｃ領域」という用語の場合のように）、または単一の抗体鎖を意味し、定常領域または可変領域、ならびに前記ドメインのより個別的な部分または一部分を含む。例えば、軽鎖可変ドメインは、本明細書で定義するように、「フレームワーク領域」すなわち「ＦＲ」に散在する「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」を含む。免疫グロブリンの特定の領域は、「定常領域」の場合は様々なクラスメンバーの領域内の配列多様性が相対的にないこと、または「可変領域」の場合は様々なクラスメンバーの領域内の多様性が著しいことに基づいて、「定常」（Ｃ）領域または「可変」（Ｖ）領域と定義され得る。「定常領域」及び「可変領域」という用語は、機能的に使用される場合もある。これに関して、免疫グロブリンまたは抗体の可変領域が抗原認識及び特異性を決定することは理解されよう。反対に、免疫グロブリンまたは抗体の定常領域は、分泌、経胎盤可動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要なエフェクター機能をもたらす。様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造及び三次元構成はよく知られている。
【０１３４】
免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の定常領域及び可変領域は、フォールディングしてドメインをなす。「ドメイン」という用語は、例えばβプリーツシート及び／または鎖内ジスルフィド結合によって安定化されたペプチドループを含む（例えば、３〜４つのペプチドループを含む）、重鎖または軽鎖ポリペプチドの独立してフォールディングする球状領域を意味する。免疫グロブリンの軽鎖の定常領域ドメインは、同義に「軽鎖定常領域ドメイン」、「ＣＬ領域」、または「ＣＬドメイン」と呼ばれる。重鎖の定常ドメイン（例えばヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメイン）は、同義に「重鎖定常領域ドメイン」、「ＣＨ」領域ドメイン、または「ＣＨドメイン」と呼ばれる。軽鎖の可変ドメインは、同義に「軽鎖可変領域ドメイン」、「ＶＬ領域ドメイン」または「ＶＬドメイン」と呼ばれる。重鎖の可変ドメインは、同義に「重鎖可変領域ドメイン」、「ＶＨ領域ドメイン」、または「ＶＨドメイン」と呼ばれる。
【０１３５】
慣例により、可変領域ドメイン及び定常領域ドメインの番号は、免疫グロブリンまたは抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠位になるにつれて大きくなる。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖それぞれのＮ末端は可変領域であり、Ｃ末端には定常領域がある。ＣＨ３及びＣＬドメインは実際、それぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。したがって、軽鎖免疫グロブリンのドメインは、ＶＬ−ＣＬの方向に配置され、重鎖のドメインは、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３の方向に配置されている。重鎖定常領域内のアミノ酸位置は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメイン内のアミノ酸位置を含め、本明細書では、特記なき限り、ＥＵインデックス付番システムに従って付番されている。対照的に、軽鎖定常領域（例えばＣＬドメイン）内のアミノ酸位置は、本明細書では、Ｋａｂａｔインデックス付番システム（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、同上参照）に従って付番されている。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、「ＶＬドメイン」という用語は、Ｋａｂａｔインデックス付番システムによる免疫グロブリン軽鎖のアミノ末端可変ドメインを含む。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、「ＣＨ１ドメイン」という用語は、例えば、ＥＵ１１８〜２１５位付近に伸びる、免疫グロブリン重鎖の第１の（最もアミノ末端側の）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに隣接しており、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端側にあり、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の一部を形成しない。一実施形態において、本発明の結合ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖分子（例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４分子）に由来するＣＨ１ドメインを含む。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「ヒンジ領域」という用語は、重鎖分子のＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに結合する部分を含む。このヒンジ領域はおよそ２５個の残基を含み、柔軟性があるため、Ｎ末端側の２つの抗原結合領域が独立して動くことができる。ヒンジ領域は、上部、中間部、及び下部のヒンジドメインという３つの異なるドメインに細分することができる（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８，１６１：４０８３）。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、「ＣＨ２ドメイン」という用語は、例えば、ＥＵ２３１〜３４０位付近に伸びる、重鎖免疫グロブリン分子の一部分を含む。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接な対をなさないという点で独特である。むしろ、インタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間には、２つのＮ結合型分枝状炭水化物鎖が介在する。一実施形態において、本発明の結合ポリペプチドは、ＩｇＧ１分子（例えばヒトＩｇＧ１分子）に由来するＣＨ２ドメインを含む。別の実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは、ＩｇＧ４分子（例えば、ヒトＩｇＧ４分子）に由来するＣＨ２ドメインを含む。ある例示的な実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＣＨ２ドメイン（ＥＵ２３１〜３４０位）またはその一部分を含む。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、「ＣＨ３ドメイン」という用語は、重鎖免疫グロブリン分子のうち、ＣＨ２ドメインのＮ末端からおよそ１１０残基、例えば、３４１〜４４６ｂ位付近（ＥＵ付番システム）に伸びる部分を含む。付加的なリジン残基（Ｋ）がＣＨ３ドメインの最遠のＣ末端に存在することもあるが、多くの場合、成熟抗体から切断される。ＣＨ３ドメインは典型的に抗体のＣ末端部分を形成する。しかしながら、いくつかの免疫グロブリンでは、さらなるドメインがＣＨ３ドメインから伸びて、分子のＣ末端部分を形成する場合がある（例えば、ＩｇＭのμ鎖及びＩｇＥのε鎖におけるＣＨ４ドメイン）。一実施形態において、本発明の結合ポリペプチドは、ＩｇＧ１分子（例えば、ヒトＩｇＧ１分子）に由来するＣＨ３ドメインを含む。別の実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは、ＩｇＧ４分子（例えば、ヒトＩｇＧ４分子）に由来するＣＨ３ドメインを含む。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、「ＣＬドメイン」という用語は、例えば、Ｋａｂａｔ１０７Ａ〜２１６位付近に伸びる、免疫グロブリン軽鎖の第１の（最もアミノ末端側の）定常領域ドメインを含む。ＣＬドメインは、ＶＬドメインに隣接する。一実施形態において、本発明の結合ポリペプチドは、カッパ軽鎖（例えば、ヒトカッパ軽鎖）に由来するＣＬドメインを含む。
【０１４２】
上記のように、抗体の可変領域は、抗体が抗原のエピトープを選択的に認識して特異的に結合することを可能にする。標的に特異的に結合する抗体は、標的結合抗体と呼ばれる場合がある（例えば、α４結合抗体は、α４に特異的に結合する抗体である）。「特異的に結合する」とは、抗体（またはその可変領域）が、その標的（例えば、α４インテグリンのエピトープ）に、約５×１０−５（すなわち、５０ｕＭ）未満、または約１×１０−５（すなわち、１０ｕＭ）未満、または約５×１０−６（すなわち、５ｕＭ）未満、または約１×１０−６（すなわち、１ｕＭ）未満、または約５×１０−７（すなわち、５００ｎＭ）未満、または約１×１０−７（すなわち、１００ｎＭ）未満、または約５×１０−８（すなわち、５０ｎＭ）未満、または約１×１０−８（すなわち、１０ｎＭ）未満、または約５×１０−９（すなわち、５ｎＭ）未満、または約１×１０−９（すなわち、１ｎＭ）未満、または約５×１０−１０（すなわち、５００ｐＭ）未満、または約１×１０−１０（すなわち、１００ｐＭ）未満、または約５×１０−１１（５０ｐＭ）未満、または約１×１０−１１（１０ｐＭ）未満、または約５×１０−１２（５ｐＭ）未満、または約１×１０−１２（１ｐｍ）未満、または約５×１０−１３（５００ｆＭ）未満、または約１×１０−１３（１００ｆＭ）未満、または約５×１０−１４（５０ｆＭ）未満、または約１×１０−１４（１０ｆＭ）未満、または約５×１０−１５（５ｆＭ）未満、または約１×１０−１５（１ｆＭ）未満の平衡解離定数（ＫＤ）で特異的に結合することを意味する。つまり、抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わさって、三次元の抗原結合部位を決める可変領域を形成する。この四次抗体構造は、Ｙの各アームの端部に存在する抗原結合部位を形成する。より詳細には、抗原結合部位は、ＶＨ及びＶＬ鎖のそれぞれにある３つのＣＤＲによって決まる。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、細胞表面または可溶性抗原などの抗原に特異的に結合する（免疫反応する）部位を含む。一実施形態において、結合部位は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域を含み、これらの可変領域によって形成される結合部位は、抗体の特異性を決定する。抗原結合部位は、ポリペプチドによって異なる可変領域によって形成される。一実施形態において、本発明の結合ポリペプチドは、抗体分子（例えば、当技術分野において公知または本明細書に記載の配列）の重鎖または軽鎖ＣＤＲを少なくとも１つ含む抗原結合部位を含む。別の実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは、１つ以上の抗体分子のＣＤＲを少なくとも２つ含む抗原結合部位を含む。別の実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは、１つ以上の抗体分子のＣＤＲを少なくとも３つ含む抗原結合部位を含む。別の実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは、１つ以上の抗体分子のＣＤＲを少なくとも４つ含む抗原結合部位を含む。別の実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは、１つ以上の抗体分子のＣＤＲを少なくとも５つ含む抗原結合部位を含む。別の実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは、抗体分子のＣＤＲを６つ含む抗原結合部位を含む。本発明の結合ポリペプチドに含まれ得る少なくとも１つのＣＤＲを含む例示的な抗体分子は、当技術分野において公知であり、例示的な分子を本明細書に記載する。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」という用語は、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる、隣接していない抗原結合部位を意味する。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９−６６１６（１９７７）及びＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（１９９１）、ならびにＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）及びＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６）に記載されており、その定義には、互いに対して比較した場合のアミノ酸残基の重複またはサブセットが含まれる。上記の参考文献のそれぞれによって定義される、ＣＤＲに含まれるアミノ酸残基を、比較のために示す。いくつかの実施形態では、「ＣＤＲ」という用語は、配列比較に基づいてＫａｂａｔにより定義されたＣＤＲである。
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【０１４５】
本明細書で使用される「フレームワーク領域」または「ＦＲ領域」という用語には、可変領域の一部であるが、ＣＤＲの一部ではない（例えば、ＫａｂａｔによるＣＤＲの定義を使用した場合）アミノ酸残基が含まれる。したがって、可変領域フレームワークは、約１００〜１２０アミノ酸長であるが、ＣＤＲ外のアミノ酸しか含まない。重鎖可変領域、及びＫａｂａｔらによって定義されたＣＤＲの具体例としては、フレームワーク領域１は、アミノ酸１〜３０を含む可変領域のドメインに対応し、フレームワーク領域２は、アミノ酸３６〜４９を含む可変領域のドメインに対応し、フレームワーク領域３は、アミノ酸６６〜９４を含む可変領域のドメインに対応し、フレームワーク領域４は、アミノ酸１０３から可変領域の末端までの可変領域のドメインに対応する。軽鎖のフレームワーク領域は、軽鎖可変領域ＣＤＲのそれぞれにより、同様に分離している。同様に、ＣｈｏｔｈｉａらまたはＭｃＣａｌｌｕｍらによるＣＤＲの定義を使用すると、フレームワーク領域の境界は、上述の各ＣＤＲ末端によって分離している。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義によるものである。
【０１４６】
天然に発生する抗体では、各単量体抗体に存在する６つのＣＤＲは、抗体が水性環境で三次元構成をとると抗原結合部位を形成するように特異的に配置されたアミノ酸の短い非連続的な配列である。重鎖及び軽鎖の可変ドメインの残りは、アミノ酸配列の分子間変動をあまり示さず、フレームワーク領域と呼ばれる。フレームワーク領域は大部分がβシート立体構造をとり、ＣＤＲはループを形成し、このループがβシート構造を接続し、場合によってはその一部を形成する。したがって、これらのフレームワーク領域は、鎖間の非共有結合相互作用によって６つのＣＤＲを正しい位置に配置するための足場を形成するように機能する。配置されたＣＤＲによって形成される抗原結合部位は、免疫反応性抗原のエピトープに相補的な表面を決める。この相補的な表面は、免疫反応性抗原エピトープに対する抗体の非共有結合を促進する。ＣＤＲの位置は、当業者によって容易に同定され得る。
【０１４７】
特定の実施形態において、本発明の結合ポリペプチドは、選択された抗原との結合ポリペプチドの会合をもたらす少なくとも２つの抗原結合ドメインを（例えば、同じ結合ポリペプチド内に（例えば、単一のポリペプチドのＮ末端とＣ末端の両方に）、または本発明の多量体結合タンパク質の成分である各結合ポリペプチドに結合した状態で）含む。抗原結合ドメインは、同じ免疫グロブリン分子に由来する必要はない。これに関して、可変領域は、所望の抗原に対して液性応答を開始し、免疫グロブリンを生成するように誘導され得る任意のタイプの動物に由来してもよいし、由来しなくてもよい。したがって、可変領域は例えば、哺乳動物由来であってもよく、例えば、ヒト、マウス、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル、マカクなど）、オオカミ、ラクダ科（例えば、ラクダ、ラマ、及び関連種由来）であってもよい。
【０１４８】
「抗体バリアント」または「修飾抗体」という用語には、天然には発生せず、アミノ酸配列またはアミノ酸側鎖化学構造が、天然由来抗体のものと、少なくとも１つのアミノ酸または本発明に記載のアミノ酸修飾によって異なる抗体が含まれる。本明細書で使用される場合、「抗体バリアント」という用語には、天然に発生しないように変化した合成型の抗体、例えば、少なくとも２つの重鎖部分を含むが２つの完全な重鎖を含まない抗体（例えば、ドメイン欠失抗体またはミニボディ）、２つ以上の異なる抗原または単一の抗原上の異なるエピトープに結合するように変化した多特異性型の抗体（例えば、二重特異性、三重特異性など）、ｓｃＦｖ分子に結合した重鎖分子、一本鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、及び変化したエフェクター機能を有する抗体などが含まれる。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、「ｓｃＦｖ分子」という用語には、１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）またはその一部分と、１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）またはその一部分とからなる結合分子で、各可変ドメイン（またはその一部分）が同じまたは異なる抗体に由来する結合分子が含まれる。ｓｃＦｖ分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に介在するｓｃＦｖリンカーを含み得る。ＳｃＦｖ分子は当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号、Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．１９８９．Ｇｅｎｅ  ７７：５１、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３、Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０１１７、Ｍｉｌｅｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１：６３６３、Ｔａｋｋｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：８３７に記載されている。
【０１５０】
本明細書で使用される「ｓｃＦｖリンカー」とは、ｓｃＦｖのＶＬドメインとＶＨドメインとの間に介在する部分を意味する。ｓｃＦｖリンカーは、いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ分子を抗原結合性の立体構造に維持し得る。一実施形態において、ｓｃＦｖリンカーは、ｓｃＦｖリンカーペプチドを含むか、またはそれからなる。特定の実施形態において、ｓｃＦｖリンカーペプチドは、ｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカーを含むか、またはそれからなる。他の実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、ジスルフィド結合を含む。
【０１５１】
本明細書で使用される場合、「ｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカー」という用語は、グリシン残基及びセリン残基からなるペプチドを意味する。例示的なｇｌｙ／ｓｅｒポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含む。一実施形態では、ｎ＝１である。一実施形態では、ｎ＝２である。別の実施形態では、ｎ＝３、すなわち、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である。別の実施形態では、ｎ＝４、すなわち、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４である。別の実施形態では、ｎ＝５である。さらに別の実施形態では、ｎ＝６である。別の実施形態では、ｎ＝７である。さらに別の実施形態では、ｎ＝８である。別の実施形態では、ｎ＝９である。さらに別の実施形態では、ｎ＝１０である。別の例示的なｇｌｙ／ｓｅｒポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含む。一実施形態では、ｎ＝１である。一実施形態では、ｎ＝２である。ある実施形態では、ｎ＝３である。別の実施形態では、ｎ＝４である。別の実施形態では、ｎ＝５である。さらに別の実施形態では、ｎ＝６である。
【０１５２】
本明細書で使用される場合、「天然システイン」という用語は、ポリペプチドの特定のアミノ酸位置で天然に発生し、人工的に修飾、導入、または変化したものではないシステインアミノ酸を意味する。「操作されたシステイン残基またはその類似体」または「操作されたシステインまたはその類似体」という用語は、合成手段によって（例えば、組換え技術、インビトロペプチド合成、ペプチドの酵素的もしくは化学的なカップリング、またはこれらの技術の何らかの組み合わせによって）、あるアミノ酸位置にシステイン残基またはその類似体を自然に含むことのないポリペプチドに、そのアミノ酸位置で導入された、非天然システイン残基またはシステイン類似体（例えば、チアゾリン−４−カルボン酸及びチアゾリジン−４カルボン酸（チオプロリン、Ｔｈ）などのチオール含有類似体）を意味する。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、「ジスルフィド結合」という用語には、２つの硫黄原子間に形成される共有結合が含まれる。アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成したり、第２のチオール基と架橋したりすることができるチオール基を含む。ほとんどの天然に発生するＩｇＧ分子では、ＣＨ１及びＣＬ領域は、天然のジスルフィド結合によって連結され、２つの重鎖は、Ｋａｂａｔ付番システムを使用した場合に２３９位及び２４２位に対応する位置（ＥＵ付番システムでは２２６位または２２９位）で２つの天然のジスルフィド結合によって連結されている。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、「結合型システイン」という用語は、ポリペプチド内の天然のまたは操作されたシステイン残基で、同じまたは異なるポリペプチド内に存在する第２の天然のもしくは操作されたシステインまたは他の残基と、ジスルフィド結合または他の共有結合を形成するものを意味する。「鎖内結合型システイン」とは、同じポリペプチド内に存在する第２のシステインと共有結合した（すなわち、鎖内ジスルフィド結合）結合型システインを意味する。「鎖間結合型システイン」とは、異なるポリペプチド内に存在する第２のシステインと共有結合した（すなわち、鎖間ジスルフィド結合）結合型システインを意味する。
【０１５５】
本明細書で使用される場合、「遊離システイン」という用語は、実質的に還元された形態で存在する、ポリペプチド配列内の天然のまたは操作されたシステインアミノ酸残基（及びその類似体または模倣物、例えばチアゾリン−４−カルボン酸及びチアゾリジン−４カルボン酸（チオプロリン、Ｔｈ））を意味する。いくつかの実施形態では、遊離システインは、本発明のエフェクター部分によって修飾されることができる。
【０１５６】
「チオール修飾試薬」という用語は、結合ポリペプチド内の（例えば、結合ポリペプチドのポリペプチドリンカー内の）操作されたシステイン残基またはその類似体のチオール基と選択的に反応することができ、これにより、エフェクター部分の結合ポリペプチドへの部位特異的な化学的付加または架橋のための手段をもたらすことにより、修飾された結合ポリペプチドを形成する化学的因子を意味する。いくつかの実施形態では、チオール修飾試薬は、遊離システイン残基に存在するチオールまたはスルフヒドリル官能基を利用する。例示的なチオール修飾試薬は、マレイミド、ハロゲン化アルキル及びハロゲン化アリール、α−ハロアシル、ならびにピリジルジスルフィドを含む。
【０１５７】
「機能的部分」という用語は、いくつかの実施形態では、望ましい機能を結合ポリペプチドに加える部分を含む。いくつかの実施形態では、この機能は、ポリペプチドの固有の望ましい活性、例えば、分子の抗原結合活性を著しく変化させることなく加えられる。本発明の結合ポリペプチドは、同じであっても異なっていてもよい１つ以上の機能的部分を含み得る。有用な機能的部分の例としては、エフェクター部分、親和性部分、及びブロッキング部分が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なブロッキング部分には、例えば、ポリペプチドをグリコシル化するグリコシダーゼの能力をブロックすることにより、発生するグリコシル化が低減するように、十分な立体容積及び／または電荷をもつ部分が含まれる。ブロッキング部分は、さらに、または代替的には、例えば、受容体または補体タンパク質に結合するＦｃ領域の能力を阻害することにより、エフェクター機能を低減させ得る。非限定的なブロッキング部分には、システイン付加体、システイン、混合ジスルフィド付加体、及びＰＥＧ部分が含まれる。例示的な検出可能部分には、蛍光部分、放射性同位元素部分、放射線不透過性部分などが含まれる。化学部分のコンジュゲーションに関して、「連結部分」という用語は、機能的部分を結合ポリペプチドの残部に連結することができる部分を含む。連結部分は、切断可能または切断不可能であるように選択され得る。切断不可能な連結部分は、概して、高い体内安定性を有するが、好ましくない薬物動態的を有する場合もある。
【０１５８】
「スペーサー部分」という用語は、分子内に空間を導入するように設計された非タンパク質部分である。一実施形態において、スペーサー部分は、炭素、酸素、窒素、硫黄などから選択される０〜１００原子の、場合により置換されている鎖であり得る。一実施形態において、スペーサー部分は、水溶性があるように選択される。別の実施形態では、スペーサー部分は、ポリアルキレングリコール、例えば、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールである。
【０１５９】
「ＰＥＧ化部分」または「ＰＥＧ部分」という用語には、ポリアルキレングリコール化合物またはその誘導体が含まれ、カップリング剤、またはカップリング部分もしくは活性化部分による誘導体化（例えば、チオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシラン、またはマレイミド部分によるもの、例えば、ＰＥＧ−マレイミド）の有無を問わない。他の適切なポリアルキレングリコール化合物は、マレイミドモノメトキシＰＥＧ、活性化ＰＥＧポリプロピレングリコールだけでなく、デキストラン、コロミン酸、または他の炭水化物系ポリマー、アミノ酸のポリマー、及びビオチン誘導体のタイプの荷電ポリマーまたは中性ポリマーも含む。本明細書で使用される場合、「エフェクター部分」（Ｅ）という用語は、生物学的活性または他の機能的活性を有する診断剤及び治療剤（例えばタンパク質、核酸、脂質、薬物部分、及びそれらの断片）を含み得る。例えば、結合ポリペプチドにコンジュゲートされたエフェクター部分を含む結合ポリペプチドは、コンジュゲートされていないポリペプチドと比較して少なくとも１つの付加的な機能または特性を有する。例えば、細胞傷害性薬物部分（例えば、エフェクター部分）を結合ポリペプチドに（例えば、そのポリペプチドリンカーを介して）コンジュゲートすると、第２の機能として（すなわち、抗原結合に加えて）薬物の細胞傷害性を有する修飾されたポリペプチドの形成がもたらされる。別の例では、第１の結合ポリペプチドへの第２の結合ポリペプチドのコンジュゲーションにより、付加的な結合特性がもたらされ得る。一態様において、エフェクター部分が、遺伝子にコードされた治療または診断用のタンパク質または核酸である場合、エフェクター部分は、当技術分野でよく知られるペプチド合成または組換えＤＮＡ法のいずれかによって合成または発現され得る。別の態様において、エフェクターが、遺伝子にコードされていないペプチドまたは薬物部分である場合、エフェクター部分は、人工的に合成されるか、または天然源から精製され得る。
【０１６０】
本明細書で使用される場合、「薬物部分」という用語は、抗炎症剤、抗がん剤、抗感染剤（例えば、抗真菌剤、抗菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤など）、及び麻酔性治療剤を含む。さらなる実施形態において、薬物部分は、抗がん剤または細胞傷害剤である。適合性のある薬物部分はまた、プロドラッグを含み得る。
【０１６１】
本明細書で使用される「プロドラッグ」という用語は、親薬物と比較すると、活性、反応性、または副作用を生じる傾向が低く、インビボでより活性な形態へと酵素によって活性化または変換され得る、薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体形態を意味する。本発明に適合するプロドラッグとしては、ホスフェート含有プロドラッグ、アミノ酸含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、スルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、場合により置換されているフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは場合により置換されているフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシン及び他の５−フルオロウリジンプロドラッグが挙げられるがこれらに限定されず、これらは、より活性な細胞傷害性遊離薬物へと変換され得る。当業者は、本発明の修飾された結合タンパク質を調製する目的で、該当する化合物の反応をより簡便にするために、所望の薬物部分またはそのプロドラッグに化学修飾を行ってもよい。薬物部分には、本明細書に記載される薬物部分の誘導体、薬学的に許容される塩、エステル、アミド、及びエーテルも含まれる。
【０１６２】
「親和性樹脂」とは、親和性ドメインに高い親和性で結合して、親和性ドメインに結合したタンパク質を反応混合物の他の成分から分離するのを容易にすることができる化学的表面である。親和性樹脂は、固体支持体またはその一部分の表面にコートされ得る。代替的には、親和性樹脂が固体支持体を構成してもよい。このような固体支持体は、好適に修飾されたクロマトグラフィカラム、マイクロタイタープレート、ビーズ、またはバイオチップ（例えばガラスウエハ）を含み得る。例示的な親和性樹脂は、ニッケル、キチン、アミラーゼなどから構成される。「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、本明細書では、所望のポリヌクレオチドを細胞に導入して発現させるためのビヒクルとして本発明に従って使用されるベクターを意味するために使用される。当業者に公知であるように、かかるベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、及びレトロウイルスからなる群から容易に選択され得る。概して、本発明と適合するベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングを容易にする適切な制限部位、ならびに真核細胞もしくは原核細胞に侵入する及び／または該細胞中で複製する能力を含む。
【０１６３】
当業者には、本明細書に記載の抗体（またはその断片もしくは鎖）をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列）が、プロモーター、エンハンサー、及び／またはポリＡテールなどの調節エレメントも含む発現ベクターに含まれる場合、このポリヌクレオチドは、ベクターが導入されている宿主細胞においてタンパク質として発現されることが理解されよう。したがって、発現ベクターに挿入された、このようなポリヌクレオチドは、ベクターにおいて、ひいてはベクターが導入された宿主細胞において、「発現のために配置」されているといわれる場合がある。しかしながら、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列）は、宿主細胞における発現のために配置されるのに発現ベクターに挿入される必要はない。ポリヌクレオチドを細胞における発現のために配置する周知の方法が知られている。例えば、ＤＮＡ配列は、挿入されたＤＮＡ配列の発現が宿主細胞の内因性プロモーター及び他の調節エレメントによって調節されるように、例えば、相同組換えを使用して、宿主細胞のゲノムに挿入され得る。そのような相同組換えの技術はよく知られている。
【０１６４】
本発明においては、多数の発現ベクター系を用いてもよい。例えば、あるクラスのベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルスのような動物ウイルスに由来するＤＮＡエレメントを利用する。その他のベクターは、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロニック系の使用を伴う。例示的なベクターは、米国特許第６，１５９，７３０号及び同第６，４１３，７７７号、ならびに米国特許出願第２００３０１５７６４１号Ａ１に記載されているものを含む。さらに、ＤＮＡが染色体に組み込まれた細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによって選択され得る。このマーカーは、栄養要求性宿主に原栄養性を付与するか、殺生物剤（例えば抗生物質）抵抗性または銅のような重金属の抵抗性を付与し得る。選択可能なマーカーの遺伝子は、発現させるＤＮＡ配列に直接連結していてもよいし、または同時形質転換によって同じ細胞に導入してもよい。一実施形態において、誘導性発現系が用いられ得る。ｍＲＮＡの最適な合成のためには、さらなるエレメントが必要とされる場合もある。こうしたエレメントには、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、及び終結シグナルが含まれ得る。一実施形態において、分泌シグナル、例えば、いくつかの十分に解析されている細菌リーダーペプチド（例えば、ｐｅｌＢ、ｐｈｏＡ、またはｏｍｐＡ）のいずれか１つを、本発明のポリペプチドのＮ末端にインフレームで融合させて、ポリペプチドの最適な分泌を得ることができる（Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ，３３１：５４３、Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０４１、Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ，（１９９０）．ＰＮＡＳ，８７：８０９５）。
【０１６５】
「宿主細胞」という用語は、組換えＤＮＡ技術を使用して構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターで形質転換されている細胞を意味する。組換え宿主からタンパク質を単離するプロセスの説明においては、「細胞」及び「細胞培養物」という用語は、別段に明記しない限り、タンパク質の起源を示す目的で同義に使用される。言い換えれば、「細胞」からのタンパク質の回収とは、スピンダウンした全細胞、または培地と懸濁細胞の両方を含む細胞培養物のいずれかからの回収を意味し得る。タンパク質発現に使用される宿主細胞株は、例えば、哺乳動物に由来する。当業者には、所望の遺伝子産物を発現させるのに最も適している特定の宿主細胞株を優先的に決定する能力があると考えられる。例示的な宿主細胞株としては、ＤＧ４４及びＤＵＸＢＩＩ（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−ＩｃＩＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、ならびに２９３（ヒト腎臓）が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＨＯ細胞（及びＤＨＦＲ活性欠損ＣＨＯ−Ｋ１細胞を含むそのバリアント）は、有用な宿主細胞である。宿主細胞株は、典型的には、商業的サービス、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、または公開文献から入手可能である。本発明のポリペプチドは、細菌細胞、または酵母細胞、または植物細胞などの非哺乳動物細胞でも発現し得る。これに関して、哺乳動物ではない様々な単細胞微生物、例えば細菌、すなわち培養または発酵下で増殖することができるものも形質転換され得ることは理解されよう。形質転換しやすい細菌としては、腸内細菌科のメンバー、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株、バチルス科、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅが挙げられる。さらに、ポリペプチドは、細菌で発現する場合、典型的には封入体の一部になることが理解されよう。こうしたポリペプチドは、単離し、精製し、次いで集合させて機能性分子にする必要がある。
【０１６６】
原核生物に加えて、真核微生物を使用することもできる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または一般的なパン酵母は、真核微生物の中で最も一般的に使用されているが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを含め、いくつかの他の菌株も一般的に利用可能である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓでの発現の場合、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ，（１９７９），Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９、Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９７９），Ｇｅｎｅ，７：１４１、Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９８０），Ｇｅｎｅ，１０：１５７）が一般的に使用される。このプラスミドには、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の変異菌株、例えばＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，（１９７７），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２）に対する選択マーカーとなる、ＴＲＰ１遺伝子がすでに含まれている。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてｔｒｐ１障害が存在することで、トリプトファンの非存在下での増殖によって形質転換を検出するのに効果的な環境がもたらされる。
【０１６７】
インビトロ産生により、スケールアップして、所望される本発明の変化した結合ポリペプチドを大量に得ることが可能になる。組織培養条件下で哺乳動物細胞を培養するための技術は、当技術分野において公知であり、例えばエアリフトリアクターもしくは連続撹拌リアクターにおける均質懸濁培養、または例えば中空繊維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ、もしくはセラミックカートリッジでの固定化細胞もしくは捕捉細胞の培養を含む。必要及び／または所望の場合、通例のクロマトグラフィ法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、ＤＥＡＥ−セルロースでのクロマトグラフィ、またはアフィニティクロマトグラフィにより、ポリペプチドの溶液を精製してもよい。
【０１６８】
本明細書で使用される場合、「結合ポリペプチドの投与が有効である対象」という表現には、例えば、本発明の結合ポリペプチドが認識し特異的に結合した抗原の検出のために（例えば、診断の手法において）使用される結合ポリペプチドの投与、及び／または結合ポリペプチドが認識し特異的に結合した標的を低減もしくは消失させるための結合ポリペプチドによる処置が有効である、哺乳動物対象などの対象が含まれる。例えば、一実施形態において、対象には、循環もしくは血清における可溶性もしくは微粒子状の分子（例えば、毒素または病原体）の低減もしくは消失、または標的を発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）の集団の低減もしくは消失が有効であり得る。上述のように、結合ポリペプチドは、コンジュゲートされていない形態で使用してもよいし、例えば、薬物、プロドラッグ、または同位元素にコンジュゲートして、前記対象に投与するための修飾された結合ポリペプチドを形成してもよい。
【０１６９】
「ＰＥＧ化」、「ポリエチレングリコール」、または「ＰＥＧ」という用語には、ポリアルキレングリコール化合物またはその誘導体が含まれ、カップリング剤、またはカップリング部分もしくは活性化部分による誘導体化（例えば、チオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシラン、またはマレイミド部分によるもの、例えば、ＰＥＧ−マレイミド）の有無を問わない。他の適切なポリアルキレングリコール化合物は、マレイミドモノメトキシＰＥＧ、活性化ＰＥＧポリプロピレングリコールだけでなく、デキストラン、コロミン酸、または他の炭水化物系ポリマー、アミノ酸のポリマー、及びビオチン誘導体のタイプの荷電ポリマーまたは中性ポリマーも含むが、これらに限定されない。
【０１７０】
Ｉ．可変領域
本発明は、可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）フレームワークが、ＩＧＫＶ４−１抗体またはｇｅＡＡＨ７０３３５．１抗体またはＩＧＨＶ１−ｆ抗体のような生殖系列または生殖系列操作抗体の配列から構築されたアクセプター配列を有する、アルファ４結合抗体及びその断片を提供する。ＣＤＲ配列は、抗ＶＬＡ−４抗体ＨＰ１／２などの非ヒト抗α４結合抗体に由来する。全体が参照により本明細書に援用される、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／１３０６０３号を参照されたい。本明細書に記載される抗体は、例えば、そのマウス親と比べて、少なくとも１．５、２．０、２．５、３．０倍増大した親和性を有し得る。一実施形態において、親和性の増大は、少なくとも１．５倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍だが、それぞれ２５倍未満、２０倍未満、または１５倍未満である。
【０１７１】
マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＨＰ１／２は、α４  ｍＡｂのＢ１サブグループのメンバーであり、ＶＣＡＭ１とフィブロネクチンの両方へのインビトロの細胞接着を約０．１ｎＭの効力で阻害する。ＨＰ１／２  Ｆａｂのクライオ電子顕微鏡（ｃｒｙｏ−ＥＭ）構造は、α４β１外部ドメインとの複合体として解析された。ＨＰ１／２は、リガンド結合溝の外にあるα４β−プロペラドメインに結合し、リガンド結合を非競合的に弱める。ＨＰ１／２が認識し特異的に結合するα４インテグリンのエピトープ及び立体構造は、ナタリズマブα４インテグリン結晶構造に観察されるものに類似している。
【０１７２】
α４インテグリンに対するｍＡｂは、インビボでリンパ球、好酸球、及び単球が組織内に遊出するのを効果的にブロックし、疾患修飾作用を示す。特に、ｍＡｂ  ＨＰ１／２は、ヒツジにおけるアレルギー反応亢進（Ｌｏｂｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ７９６：１１３−１２３，１９９６）、モルモットにおける気管支気道過敏性（Ｐｒｅｔｏｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘ．Ｍｅｄ．１８０（３）：７９５−８０５，１９９４、Ｋｒａｎｅｖｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１００（２）：２４２−５０，１９９７）、霊長類における潰瘍性大腸炎（Ｐｏｄｏｌｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．９２（１）：３７２−３８０，１９９３）、ＮＨＰにおける頸動脈内膜過形成の動脈内膜切除（Ｌｕｍｓｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．２６（１）：８７−９３，１９９７）の各動物モデルにおいて有効であることが示されており、バルーン傷害後の新外膜形成及びその後の管腔狭窄を低減させ（Ｌａｂｉｎａｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ  Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１６（２）：１８７−９６，２０００）、ウサギにおけるステント留置への炎症応答を低減させ（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、ウサギにおける移植心拒絶反応を防止する（Ｓａｄａｈｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４２（３）：６７５−６８３，１９９３）。さらに、ＨＰ１／２は、ヒヒの骨髄間質からの造血前駆細胞の末梢血への動員（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）を刺激する（Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ  ａｎｄ  Ｎａｋａｍｏｔｏ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ９０（２０）：９３７４−９３７８，１９９３）。
【０１７３】
ＨＰ１／２抗体は、ＪＭ（未熟Ｔ細胞性白血病）細胞株を注射したＢａｌｂ／ｃマウスにおいて産生された（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：１３４３−１３４９，１９８６）。２匹のマウスの脾臓細胞に、ＳＰ２またはＰ３−Ｘ６３Ａｇ８．６５３のマウス骨髄腫細胞を融合させた。この抗体は１９９３年にヒト化されたが、ヒト化設計における進歩を活用するために２０１０年に再ヒト化された。
【０１７４】
アルファ４結合抗体またはその断片は、配列番号８、９、１０、または１１の配列を有する可変軽鎖を含み得る。アルファ４結合抗体またはその断片は、配列番号３、４または５の可変重鎖を含み得る。
【０１７５】
特定の実施形態において、アルファ４結合抗体は、配列番号１１の配列を有する可変軽鎖と、配列番号４の配列を有する可変重鎖とを含む。
【０１７６】
アルファ４結合抗体は、本明細書にさらに詳細に記述されるバリアントＦｃ領域をさらに含んでもよい。
【０１７７】
ＩＩ．親Ｆｃポリペプチド
バリアントＦｃポリペプチドは、当技術分野において公知の親Ｆｃポリペプチドまたは出発Ｆｃポリペプチドに由来し得る。一実施形態において、親Ｆｃポリペプチドは、全てのサブタイプのＩｇＧ及びそれらの組み合わせを含め、ＩｇＧ免疫グロブリンなどの抗体である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ抗体の親Ｆｃポリペプチドは、１つのＩｇＧサブタイプのもの、または２つ以上のＩｇＧサブタイプのＦｃ領域の異なる部分の組み合わせである。ヒトの場合、ＩｇＧサブタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。親Ｆｃポリペプチドは、免疫グロブリンに由来するＦｃ領域を含むが、場合により、Ｆｃ領域に作動可能に連結または融合した結合部位をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、前述のポリペプチドは、リガンド、サイトカイン、受容体、細胞表面抗原、またはがん細胞抗原などの抗原に結合する。本明細書における実施例はＩｇＧ抗体を用いるが、本方法は、いずれのＦｃポリペプチドのＦｃ領域にも等しく適用され得ると理解される。Ｆｃポリペプチドが抗体である場合、この抗体は、合成、天然由来（例えば、血清由来）、細胞株（例えば、ハイブリドーマ）によって産生されたもの、またはトランスジェニック生物において産生されたものであり得る。
【０１７８】
特定の実施形態において、本発明のＦｃポリペプチドは、Ｆｃ領域のＦｃ部分を１つ含む。他の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ｄｃＦｃポリペプチドである。ｄｃＦｃポリペプチドとは、二量体Ｆｃ（またはｄｃＦｃ）領域を含むポリペプチドを意味する。他の実施形態では、本発明のＦｃポリペプチドは、ｓｃＦｃポリペプチドである。本明細書で使用される場合、ｓｃＦｃポリペプチドという用語は、例えば、Ｆｃ部分の少なくとも２つの間に介在する可動性ポリペプチドリンカーを介して遺伝子融合した、少なくとも２つのＦｃ部分を含むｓｃＦｃポリペプチドのように、一本鎖Ｆｃ（ｓｃＦｃ）領域を含むポリペプチドを意味する。例示的なｓｃＦｃ領域は、２００８年５月１４日に出願され、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６２６０号に開示されている。
【０１７９】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、同じ、または実質的に同じ配列組成のＦｃ部分を含むＦｃ領域（本明細書では「ホモマーＦｃ領域」という）を含み得る。他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列組成が異なるＦｃ部分を少なくとも２つ含むＦｃ領域（すなわち、本明細書では「ヘテロマーＦｃ領域」という）を含み得る。特定の実施形態において、本発明の結合ポリペプチドは、少なくとも１つの挿入またはアミノ酸置換を含むＦｃ領域を含む。例示的な一実施形態において、ヘテロマーＦｃ領域は、第１のＦｃ部分にアミノ酸置換を含むが、第２のＦｃ部分にはアミノ酸置換を含まない。
【０１８０】
一実施形態において、本発明の結合ポリペプチドは、構成要素であるＦｃ部分の２つ以上が本明細書に記載のＦｃ部分から独立して選択されるＦｃ領域を含み得る。一実施形態において、Ｆｃ部分は同じである。別の実施形態では、Ｆｃ部分のうちの少なくとも２つは異なっている。例えば、本発明のＦｃポリペプチドのＦｃ部分は、同じ数のアミノ酸残基を含むか、または長さがアミノ酸残基１個以上（例えば、アミノ酸残基約５個（例えば、アミノ酸残基１、２、３、４、または５個）、残基約１０個、残基約１５個、残基約２０個、残基約３０個、残基約４０個、または残基約５０個）異なっていてもよい。さらに他の実施形態では、Ｆｃ部分は、１つ以上のアミノ酸位置で配列が異なっていてもよい。例えば、Ｆｃ部分のうちの少なくとも２つは、約５個のアミノ酸位置（例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸位置）、約１０個の位置、約１５個の位置、約２０個の位置、約３０個の位置、約４０個の位置、または約５０個の位置）で異なっていてもよい。
【０１８１】
親Ｆｃポリペプチドは、組み合わさって、または他のポリペプチドと集合して、多量体Ｆｃポリペプチドまたはタンパク質（本明細書では「多量体」ともいう）を形成してもよい。本発明の多量体Ｆｃポリペプチドまたはタンパク質は、本発明の親Ｆｃポリペプチドを少なくとも１つ含む。したがって、親ポリペプチドは、限定されるものではないが、単量体のみならず、多量体（例えば、二量体、三量体、四量体、及び六量体）のＦｃポリペプチドまたはタンパク質なども含む。特定の実施形態において、前記多量体の構成要素であるＦｃポリペプチドは同じである（すなわちホモマー多量体、例えばホモ二量体、ホモ三量体、ホモ四量体）。他の実施形態では、本発明の多量体タンパク質の構成要素であるＦｃポリペプチドの少なくとも２つは異なっている（すなわちヘテロマー多量体、例えばヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体）。特定の実施形態において、Ｆｃポリペプチドのうちの少なくとも２つは、二量体を形成することができる。
【０１８２】
別の実施形態では、本発明のＦｃポリペプチドは、二量体Ｆｃ領域を含み（二量体を形成する一本鎖ポリペプチドまたは二量体を形成する二本鎖ポリペプチドのいずれか）、分子に存在する生物学的活性のある部分に関しては単量体性である。例えば、そのようなＦｃ構築物は、生物学的活性のある部分を１つしか含まない場合がある。一本鎖または二本鎖の安定化Ｆｃ単量体構築物が、例えば、標的分子の架橋が所望されない場合（例えば、特定の抗体、例えば、抗ＣＤ４０抗体の場合）には望ましい。別の実施形態では、そのようなＦｃ構築物は、２つの異なる生物学的活性のある部分を含み得る。さらに別の実施形態では、そのようなＦｃ構築物は、同じ生物学的活性のある部分を２つ含み得る。さらに別の実施形態では、そのようなＦｃ構築物は、同じ生物学的活性のある部分を３つ以上含み得る。
【０１８３】
Ａ．Ｆｃ部分
本発明の親Ｆｃポリペプチドを生成するのに有用なＦｃ部分は、いくつかの異なる起源から得ることができる。いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドのＦｃ部分は、ヒト免疫グロブリンに由来する。しかしながら、Ｆｃ部分は、例えば齧歯類（例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット）または非ヒト霊長類（例えばチンパンジー、マカク）の各種を含む、別の哺乳動物種の免疫グロブリンに由来してもよいことが理解される。さらに、Ｆｃは、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含む任意の免疫グロブリンクラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む任意の免疫グロブリンアイソタイプに由来してもよい。例えば、Ｆｃは、ＩｇＧ１に由来するが、配列に特定の変異を有してもよい。いくつかの実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ４が使用される。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、１つのタイプのＩｇ免疫グロブリン由来の部分（例えば、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメイン）及び別のタイプのＩｇ免疫グロブリン由来の他の部分（例えば、ＩｇＧ４のＣＨ１ドメイン）を含むキメラであってもよい。
【０１８４】
様々なＦｃ部分の遺伝子配列（例えばヒト定常領域の遺伝子配列）が、公的にアクセス可能な寄託物の形態で利用可能である。特定のエフェクター機能を有する（もしくは特定のエフェクター機能を欠いている）、または免疫原性を低減させる特定の修飾をもつ、Ｆｃ部分の配列を含む定常領域ドメインが選択され得る。抗体及び抗体コード遺伝子の多くの配列が公開されており、好適なＦｃ部分の配列（例えばヒンジ、ＣＨ２、及び／またはＣＨ３配列、またはそれらの一部分）は、これらの配列から、当技術分野で認識されている技術を使用して得ることができる。前述の方法のいずれかを使用して得られた遺伝子材料を、次いで変化させるかまたは合成して、本発明のＦｃポリペプチドを得ることができる。さらに、本発明の範囲は、定常領域ＤＮＡ配列のアレル、バリアント、及び変異を包含することが理解されよう。
【０１８５】
Ｆｃ部分の配列は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、及び目的のドメインを増幅するように選択されたプライマーを使用してクローニングすることができる。Ｆｃ部分の配列を抗体からクローニングするには、ハイブリドーマ、脾臓、またはリンパ細胞からｍＲＮＡを単離し、ＤＮＡに逆転写し、抗体遺伝子をＰＣＲによって増幅することができる。ＰＣＲ増幅法は、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号、及び、例えば、“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）、Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．１９８９．Ｇｅｎｅ  ７７：５１、Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２７０）に詳細に記載されている。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域プライマーによって、または公開されている重鎖及び軽鎖のＤＮＡ及びアミノ酸配列に基づいたより特異的なプライマーによって開始され得る。上述のように、抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するためにＰＣＲを用いることもできる。この場合、コンセンサスプライマー、またはマウス定常領域プローブなどのより大きな相同プローブによって、ライブラリをスクリーニングしてもよい。抗体遺伝子の増幅に好適な多数のプライマーセットが、当技術分野において公知である（例えば、精製された抗体のＮ末端配列に基づく５’プライマー（Ｂｅｎｈａｒ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ．１９９４．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：１５０９）、ｃＤＮＡ末端の高速増幅（Ｒｕｂｅｒｔｉ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７３：３３）、抗体リーダー配列（Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６０：１２５０）。抗体配列のクローニングについては、１９９５年１月２５日に出願され、参照により本明細書に援用されるＮｅｗｍａｎらの米国特許第５，６５８，５７０号にさらに記載されている。
【０１８６】
本発明の親Ｆｃポリペプチドは、単一のＦｃ部分または複数のＦｃ部分を含み得る。２つ以上のＦｃ部分（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＦｃ部分）が存在する場合、Ｆｃ部分のうちの少なくとも２つが会合して、適切にフォールディングしたＦｃ領域（例えば、二量体Ｆｃ領域または一本鎖Ｆｃ領域（ｓｃＦｃ））を形成する。一実施形態において、Ｆｃ部分は、異なるタイプのものであってもよい。一実施形態において、親Ｆｃポリペプチドに存在する少なくとも１つのＦｃ部分は、ヒンジドメインまたはその一部分を含む。別の実施形態では、親Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部分を含むＦｃ部分を少なくとも１つ含む。別の実施形態では、親Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１つのＣＨ３ドメインまたはその一部分を含むＦｃ部分を少なくとも１つ含む。別の実施形態では、親Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１つのＣＨ４ドメインまたはその一部分を含むＦｃ部分を少なくとも１つ含む。別の実施形態では、親Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１つのヒンジドメインまたはその一部分と、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部分とを（例えば、ヒンジ−ＣＨ２の方向で）含むＦｃ部分を少なくとも１つ含む。別の実施形態では、親Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部分と、少なくとも１つのＣＨ３ドメインまたはその一部分とを（例えば、ＣＨ２−ＣＨ３の方向で）含むＦｃ部分を少なくとも１つ含む。別の実施形態では、親Ｆｃポリペプチドは、少なくとも１つのヒンジドメインまたはその一部分と、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部分と、少なくとも１つのＣＨ３ドメインまたはその一部分とを、例えばヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、ヒンジ−ＣＨ３−ＣＨ２、またはＣＨ２−ＣＨ３−ヒンジの方向で含むＦｃ部分を、少なくとも１つ含む。
【０１８７】
特定の実施形態において、親Ｆｃポリペプチドは、１つ以上の免疫グロブリン重鎖に由来する完全なＦｃ領域（例えば、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含むＦｃ部分（ただし、これらは同じ抗体に由来する必要はない））を少なくとも１つ含む。他の実施形態では、親Ｆｃポリペプチドは、１つ以上の免疫グロブリン重鎖に由来する完全なＦｃ領域を少なくとも２つ含む。いくつかの実施形態では、完全なＦｃ部分は、ヒトＩｇＧ免疫グロブリン重鎖（例えば、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４）に由来する。
【０１８８】
別の実施形態では、親Ｆｃポリペプチドは、完全なＣＨ３ドメイン（ＥＵ付番による抗体Ｆｃ領域のアミノ酸３４１〜４３８付近）を含むＦｃ部分を少なくとも１つ含む。別の実施形態では、親Ｆｃポリペプチドは、完全なＣＨ２ドメイン（ＥＵ付番による抗体Ｆｃ領域のアミノ酸２３１〜３４０付近）を含むＦｃ部分を少なくとも１つ含む。別の実施形態では、親Ｆｃポリペプチドは、少なくともＣＨ３ドメイン、ならびにヒンジ領域（ＥＵ付番による抗体Ｆｃ領域のアミノ酸２１６〜２３０付近）及びＣＨ２ドメインのうちの少なくとも１つを含むＦｃ部分を少なくとも１つ含む。一実施形態において、親Ｆｃポリペプチドは、ヒンジ及びＣＨ３ドメインを含むＦｃ部分を少なくとも１つ含む。別の実施形態では、親Ｆｃポリペプチドは、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含むＦｃ部分を少なくとも１つ含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ部分は、ヒトＩｇＧ免疫グロブリン重鎖に由来する。
【０１８９】
Ｆｃ部分を構成する定常領域ドメインまたはその一部分は、異なる免疫グロブリン分子に由来してもよい。例えば、親Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ４分子に由来するヒンジ及び／またはＣＨ２ドメインまたはその一部分、ならびにＩｇＧ１分子に由来するＣＨ３領域またはその一部分を含み得る。別の実施形態では、親Ｆｃポリペプチドは、キメラヒンジドメインを含み得る。例えば、キメラヒンジは、一部はＩｇＧ１分子に由来し、一部はＩｇＧ３分子に由来する、ヒンジドメインを含み得る。別の実施形態では、キメラヒンジは、ＩｇＧ１分子由来の中間部ヒンジドメイン、ならびにＩｇＧ４分子由来の上部及び下部ヒンジドメインを含む。
【０１９０】
本明細書で示すように、親Ｆｃ部分が、天然に発生する免疫グロブリンの対応するＦｃ部分と同一であってもよいし、アミノ酸配列が異なるように変化していてもよいことは、当業者には理解されよう。特定の実施形態において、親Ｆｃポリペプチドは、例えば、アミノ酸変異（例えば、付加、欠失、または置換）によって変化している。例えば、親Ｆｃポリペプチドは、Ｆｃ部分の起源となる野生型Ｆｃと比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を有するＦｃ部分であり得る。例えば、Ｆｃ部分がヒトＩｇＧ１抗体に由来する場合、バリアントは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域の対応する位置に、野生型アミノ酸と比較して少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、置換）を含む。
【０１９１】
アミノ酸置換（複数可）は、抗体のＦｃ領域において該当する残基に与えられる（ＥＵ付番の慣例を使用して規定される）位置番号に「対応する」といわれるＦｃ部分内の位置に位置付けられる場合がある。当業者であれば、アラインメントを容易に生成して、Ｆｃ部分内の位置に「対応する」ＥＵ番号が何であるかを決定することができる。
【０１９２】
一実施形態において、置換は、ヒンジドメインまたはその一部分に位置付けられるアミノ酸位置にある。別の実施形態では、置換は、ＣＨ２ドメインまたはその一部分に位置付けられるアミノ酸位置にある。別の実施形態では、置換は、ＣＨ３ドメインまたはその一部分に位置付けられるアミノ酸位置にある。別の実施形態では、置換は、ＣＨ４ドメインまたはその一部分に位置付けられるアミノ酸位置にある。
【０１９３】
特定の実施形態において、親Ｆｃポリペプチドは、２つ以上のアミノ酸置換を含む。親Ｆｃポリペプチドは、例えば、野生型Ｆｃ領域と比べて、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、互いに少なくとも１個以上のアミノ酸位置、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上のアミノ酸位置の間隔を空けて空間的に配置される。いくつかの実施形態では、操作されたアミノ酸は、互いに少なくとも５、１０、１５、２０、または２５個以上のアミノ酸位置の間隔を空けて空間的に配置される。
【０１９４】
特定の実施形態において、置換は、野生型Ｆｃ部分を含むＦｃ領域によって与えられる少なくとも１つのエフェクター機能の変化（例えば、Ｆｃ領域がＦｃ受容体（例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、もしくはＦｃγＲＩＩＩ）もしくは補体タンパク質（例えばＣ１ｑ）に結合する能力、または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、もしくは補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を引き起こす能力の低減）をもたらす。
【０１９５】
親Ｆｃポリペプチドは、エフェクター機能の変化をもたらすことが知られる当技術分野で認識されている置換を用い得る。特に、本発明の親Ｆｃポリペプチドは、例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ８８／０７０８９号Ａ１、同第ＷＯ９６／１４３３９号Ａ１、同第ＷＯ９８／０５７８７号Ａ１、同第ＷＯ９８／２３２８９号Ａ１、同第ＷＯ９９／５１６４２号Ａ１、同第ＷＯ９９／５８５７２号Ａ１、同第ＷＯ００／０９５６０号Ａ２、同第ＷＯ００／３２７６７号Ａ１、同第ＷＯ００／４２０７２号Ａ２、同第ＷＯ０２／４４２１５号Ａ２、同第ＷＯ０２／０６０９１９号Ａ２、同第ＷＯ０３／０７４５６９号Ａ２、同第ＷＯ０４／０１６７５０号Ａ２、同第ＷＯ０４／０２９２０７号Ａ２、同第ＷＯ０４／０３５７５２号Ａ２、同第ＷＯ０４／０６３３５１号Ａ２、同第ＷＯ０４／０７４４５５号Ａ２、同第ＷＯ０４／０９９２４９号Ａ２、同第ＷＯ０５／０４０２１７号Ａ２、同第ＷＯ０４／０４４８５９号、同第ＷＯ０５／０７０９６３号Ａ１、同第ＷＯ０５／０７７９８１号Ａ２、同第ＷＯ０５／０９２９２５号Ａ２、同第ＷＯ０５／１２３７８０号Ａ２、同第ＷＯ０６／０１９４４７号Ａ１、同第ＷＯ０６／０４７３５０号Ａ２、及び同第ＷＯ０６／０８５９６７号Ａ２、米国特許公開第ＵＳ２００７／０２３１３２９号、同第ＵＳ２００７／０２３１３２９号、同第ＵＳ２００７／０２３７７６５号、同第ＵＳ２００７／０２３７７６６号、同第ＵＳ２００７／０２３７７６７号、同第ＵＳ２００７／０２４３１８８号、同第ＵＳ２００７０２４８６０３号、同第ＵＳ２００７０２８６８５９号、同第ＵＳ２００８００５７０５６号、または米国特許第５，６４８，２６０号、同第５，７３９，２７７号、同第５，８３４，２５０号、同第５，８６９，０４６号、同第６，０９６，８７１号、同第６，１２１，０２２号、同第６，１９４，５５１号、同第６，２４２，１９５号、同第６，２７７，３７５号、同第６，５２８，６２４号、同第６，５３８，１２４号、同第６，７３７，０５６号、同第６，８２１，５０５号、同第６，９９８，２５３号、同第７，０８３，７８４号、及び同第７，３１７，０９１号（各文献のＦｃ変異に関する部分は、参照により本明細書に援用される）に開示されているアミノ酸位置のうちの１つ以上における変化（例えば、置換）を含み得る。一実施形態において、特定の変化（例えば、当技術分野において開示されている１つ以上のアミノ酸の特定の置換）が、開示されているアミノ酸位置のうちの１つ以上で行われ得る。別の実施形態では、開示されているアミノ酸位置のうちの１つ以上において、異なる変化（例えば、当技術分野において開示されている１つ以上のアミノ酸位置の異なる置換）が行われ得る。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、親Ｆｃポリペプチドは、Ｆｃ部分の「１５オングストローム接触帯」内にあるＥＵアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置にアミノ酸置換を含むＦｃ部分を含み得る。１５オングストローム帯は、全長の野生型Ｆｃ部分のＥＵ２４３〜２６１位、２７５〜２８０位、２８２〜２９３位、３０２〜３１９位、３３６〜３４８位、３６７位、３６９位、３７２〜３８９位、３９１位、３９３位、４０８位、及び４２４〜４４０位に位置する残基を含む。
【０１９７】
別の実施形態では、親Ｆｃポリペプチドは、トランケートされているにもかかわらず１つ以上の機能をＦｃ領域に与えるのに十分であるＦｃ部分を１つ以上含むＦｃ領域を含む。例えば、Ｆｃ部分のうちＦｃＲｎに結合する部分（すなわち、ＦｃＲｎ結合部分）は、アミノ酸２８２〜４３８付近（ＥＵ付番）を含む。したがって、親ＦｃポリペプチドのＦｃ部分は、ＦｃＲｎ結合部分を含むか、またはそれからなる場合がある。ＦｃＲｎ結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプの重鎖に由来し得る。一実施形態において、ヒトアイソタイプＩｇＧ１の抗体のＦｃＲｎ結合部分が使用される。別の実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ４の抗体のＦｃＲｎ結合部分が使用される。特定の実施形態において、ＦｃＲｎ結合部分は、アグリコシル化されている。他の実施形態では、ＦｃＲｎ結合部分は、グリコシル化されている。
【０１９８】
特定の実施形態において、親Ｆｃポリペプチドは、抗体の抗原非依存性エフェクター機能、特に抗体の循環半減期を変化させる、Ｆｃ部分のアミノ酸置換を含む。そのようなポリペプチドは、これらの置換を欠いているポリペプチドと比較すると増大または減少したＦｃＲｎへの結合を呈し、したがって、血清中でそれぞれ増大または減少した半減期を有する。向上したＦｃＲｎへの親和性をもつ親Ｆｃポリペプチドは、より長い血清半減期を有すると期待され、そのような分子は、投与されるポリペプチドの長い半減期が、例えば、慢性の疾患または障害を処置するために所望される、哺乳動物を処置する方法において有用に適用される。対照的に、減少したＦｃＲｎ結合親和性をもつ親Ｆｃポリペプチドは、より短い半減期を有すると予想され、そのような分子もまた、例えば、短縮された循環時間が有利であり得る哺乳動物への投与のために、例えばインビボ診断造影のために、または出発ポリペプチドが循環中に長期間存在すると有毒な副作用を及ぼす状況において有用である。減少したＦｃＲｎ結合親和性をもつ親Ｆｃポリペプチドはまた、胎盤を通過する可能性が比較的低く、したがって、妊婦の疾患または障害の処置においても有用である。さらに、低減したＦｃＲｎ結合親和性が所望され得る他の用途には、脳、腎臓、及び／または肝臓への局在化が所望される用途が含まれる。例示的な一実施形態において、親Ｆｃポリペプチドは、腎臓糸球体の上皮を通した脈管構造からの輸送の低減を呈する。別の実施形態では、本発明の結合ポリペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通した脳から脈管間隙への輸送の低減を呈する。一実施形態において、ＦｃＲｎ結合が変化した親Ｆｃポリペプチドは、Ｆｃ部分の「ＦｃＲｎ結合ループ」内に１つ以上のアミノ酸置換を有する、少なくとも１つのＦｃ部分（例えば、１つまたは２つのＦｃ部分）を含む。ＦｃＲｎ結合ループは、野生型の全長Ｆｃ部分のアミノ酸残基２８０〜２９９（ＥＵ付番による）から構成される。他の実施形態では、変化したＦｃＲｎ結合親和性を有する親Ｆｃポリペプチドは、１５Ａ  ＦｃＲｎ「接触帯」内に１つ以上のアミノ酸置換を有する、少なくとも１つのＦｃ部分（例えば、１つまたは２つのＦｃ部分）を含む。
【０１９９】
本明細書で使用される場合、１５Ａ  ＦｃＲｎ「接触帯」という用語は、野生型の全長Ｆｃ部分の、２４３〜２６１位、２７５〜２８０位、２８２〜２９３位、３０２〜３１９位、３３６〜３４８位、３６７位、３６９位、３７２〜３８９位、３９１位、３９３位、４０８位、４２４位、４２５〜４４０位（ＥＵ付番）の残基を含む。いくつかの実施形態では、変化したＦｃＲｎ結合親和性を有する親Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ２５６位、２７７〜２８１位、２８３〜２８８位、３０３〜３０９位、３１３位、３３８位、３４２位、３７６位、３８１位、３８４位、３８５位、３８７位、４３４位（例えば、Ｎ４３４ＡまたはＮ４３４Ｋ）、及び４３８位のいずれか１つに対応するアミノ酸位置に１つ以上のアミノ酸置換を有する、少なくとも１つのＦｃ部分（例えば、１つまたは２つのＦｃ部分）を含む。ＦｃＲｎ結合活性を変化させた例示的なアミノ酸置換は、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ国際公開第ＷＯ０５／０４７３２７号に開示されている。他の実施形態では、親Ｆｃポリペプチドは、溶媒曝露表面に位置する操作されたシステイン残基またはその類似体を有する少なくとも１つのＦｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、操作されたシステイン残基またはその類似体は、Ｆｃ領域によりもたらされるエフェクター機能に干渉しない。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、第２のシステイン残基とのジスルフィド結合を実質的に含まない操作された遊離システイン残基またはその類似体を少なくとも１つ含むＦｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ＣＨ３ドメイン内の３４９〜３７１位、３９０位、３９２位、３９４〜４２３位、４４１〜４４６位、及び４４６ｂ位（ＥＵ付番）のうちの１つ以上に操作されたシステイン残基またはその類似体を有するＦｃ部分を含み得る。さらなるいくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、３５０位、３５５位、３５９位、３６０位、３６１位、３８９位、４１３位、４１５位、４１８位、４２２位、４４１位、４４３位、及びＥＵ４４６ｂ位（ＥＵ付番）のいずれか１つに操作されたシステイン残基またはその類似体を有するＦｃバリアントを含む。上記の操作されたシステイン残基またはその類似体のいずれも、その後、当技術分野で認識されている技術を使用して機能的部分にコンジュゲートされる（例えば、チオール反応性ヘテロ二官能性リンカーでコンジュゲートされる）場合がある。
【０２００】
Ｂ．エフェクターレスＦｃポリペプチド
特定の実施形態において、親Ｆｃポリペプチドは、変化または低減したエフェクター機能を有する「エフェクターレス」Ｆｃポリペプチドである。いくつかの実施形態では、低減または変化するエフェクター機能は、抗原依存性エフェクター機能である。例えば、親Ｆｃポリペプチドは、ポリペプチドの抗原依存性エフェクター機能、特にＡＤＣＣまたは補体活性化を、例えば、野生型Ｆｃポリペプチドと比較して低減させる配列多様性（例えば、アミノ酸置換）を含み得る。残念ながら、そのような親Ｆｃポリペプチドは、低減した安定性を有することが多く、本発明の方法による安定化のための理想的な候補となる。
【０２０１】
減少したＦｃγＲ結合親和性をもつＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低減させると予想され、そのような分子もまた、例えば、標的細胞の破壊が望ましくない、例えば、正常細胞が標的分子を発現し得る、またはポリペプチドの慢性投与が不要な免疫系活性化をもたらし得る状態の処置に有用である。一実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、野生型Ｆｃ領域を含むＦｃポリペプチドと比較して、オプソニン作用、食作用、補体依存性細胞傷害、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、またはエフェクター細胞の調整からなる群から選択される少なくとも１つの抗原依存性エフェクター機能の低減を呈する。一実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、活性化ＦｃγＲ（例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、またはＦｃγＲＩＩＩａ）への結合の変化を呈する。別の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、阻害性ＦｃγＲ（例えばＦｃγＲＩＩｂ）への結合親和性の変化を呈する。他の実施形態では、減少したＦｃγＲ結合親和性（例えば、減少したＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、またはＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性）をもつＦｃポリペプチドは、２３４位、２３６位、２３９位、２４１位、２５１位、２５２位、２６１位、２６５位、２６８位、２９３位、２９４位、２９６位、２９８位、２９９位、３０１位、３２６位、３２８位、３３２位、３３４位、３３８位、３７６位、３７８位、及び４３５位（ＥＵ付番）のうちの１つ以上に対応するアミノ酸位置にアミノ酸置換を有する少なくとも１つのＦｃ部分（例えば、１つまたは２つのＦｃ部分）を含む。他の実施形態では、減少した補体結合親和性（例えば減少したＣ１ｑ結合親和性）をもつＦｃポリペプチドは、２３９位、２９４位、２９６位、３０１位、３２８位、３３３位、及び３７６位（ＥＵ付番）のうちの１つ以上に対応するアミノ酸位置にアミノ酸置換を有するＦｃ部分（例えば、１つまたは２つのＦｃ部分）を含む。
【０２０２】
ＦｃγＲまたは補体結合活性を変化させた例示的なアミノ酸置換は、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ国際公開第ＷＯ０５／０６３８１５号に開示されている。特定の実施形態において、本発明の結合ポリペプチドは、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｍ２５２Ｔ、Ｈ２６８Ｄ、Ｈ２６８Ｅ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｎ４３４Ａ、及びＮ４３４Ｋの特定の置換のうちの１つ以上（すなわち、抗体Ｆｃ領域内のこれらのＥＵ付番位置のうちの１つ以上に対応するアミノ酸位置におけるこれらの置換のうちの１つ以上）を含み得る。
【０２０３】
特定の例示的な実施形態において、親の「エフェクターレス」ポリペプチドのエフェクター機能は、親Ｆｃポリペプチド内のアグリコシル化Ｆｃ領域に起因して変化または低減する場合がある。特定の実施形態において、アグリコシル化Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域のグリコシル化を変化させるアミノ酸置換によって生成される。例えば、Ｆｃ領域におけるＥＵ２９７位のアスパラギンは、そのグリコシル化を阻害するように（例えば、置換、挿入、欠失、または化学修飾によって）変化し得る。別の例示的な実施形態では、ＥＵ２９９位のアミノ酸残基（例えば、スレオニン（Ｔ））は、隣接する残基２９７のグリコシル化を低減させるように（例えば、アラニン（Ａ）で）置換される。グリコシル化を低減または変化させる例示的なアミノ酸置換は、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ国際公開第ＷＯ０５／０１８５７２号及び米国特許公開第２００７／０１１１２８１号に開示されている。他の実施形態では、アグリコシル化Ｆｃ領域は、オリゴ糖の酵素的もしくは化学的な除去、またはＦｃ領域をグリコシル化することができない宿主細胞（例えば、グリコシル化機構が損なわれた細菌宿主細胞または哺乳動物宿主細胞）におけるＦｃポリペプチドの発現によって生成される。
【０２０４】
特定の実施形態において、アグリコシル化Ｆｃ領域は、部分的にアグリコシル化されているか、または半グリコシル化されている。例えば、Ｆｃ領域は、第１のグリコシル化されたＦｃ部分（例えば、グリコシル化ＣＨ２領域）と、第２のアグリコシル化されたＦｃ部分（例えば、アグリコシル化ＣＨ２領域）とを含み得る。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、完全にアグリコシル化されていてもよい。すなわち、そのＦｃ部分のいずれもグリコシル化されていない。
【０２０５】
「エフェクターレス」ポリペプチドのアグリコシル化Ｆｃ領域は、いずれのＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のものであってもよい。例示的な一実施形態において、親Ｆｃポリペプチドは、「ａｇｌｙ  ＩｇＧ４．Ｐ」などのＩｇＧ４抗体のアグリコシル化Ｆｃ領域を含み得る。ａｇｌｙ  ＩｇＧ４．Ｐは、アグリコシル化Ｆｃ領域（ＥＵ付番）が生成されるように、ヒンジ領域内のプロリン置換（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）及びＣＨ２ドメイン内のＴｈｒ２９９Ａｌａ変異を含む、操作された形態のＩｇＧ４抗体である。ａｇｌｙ  ＩｇＧ４．Ｐは、インビトロで測定可能な免疫エフェクター機能を有しないことが示されている。別の例示的な実施形態では、親Ｆｃポリペプチドは、「ａｇｌｙ  ＩｇＧ１」などのＩｇＧ１抗体のアグリコシル化Ｆｃ領域を含む。ａｇｌｙ  ＩｇＧ１は、低いエフェクター機能プロファイルをもたらすＴｈｒ２９９Ａｌａ変異（ＥＵ付番）を有するアグリコシル化形態のＩｇＧ免疫グロブリンＩｇＧ１である。ａｇｌｙ  ＩｇＧ４．Ｐ抗体及びａｇｌｙ  ＩｇＧ１抗体はいずれも、免疫エフェクター機能が所望されない場合の治療用試薬の重要なクラスを表す。
【０２０６】
特定の例示的な実施形態において、「エフェクターレス」親Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ４抗体に由来するＦｃ領域を含む。ＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と同一であってもよいし、または野生型ＩｇＧ４配列に対する１つ以上の修飾を有してもよい。そのようなＩｇＧ４様Ｆｃポリペプチドは、補体及び／またはＦｃ受容体に結合するＩｇＧ４抗体の能力が本質的に低減していることの結果として、低減したエフェクター機能を有する。ＩｇＧ４アイソタイプの親Ｆｃポリペプチドは、グリコシル化されていてもアグリコシル化されていてもよい。さらに、ＩｇＧ４様ＦｃポリペプチドのＦｃ領域は、ＩｇＧ４抗体の完全なＦｃ部分を含む場合もあれば、Ｆｃ部分の一部分がＩｇＧ４抗体に由来し、残部が別のアイソタイプの抗体に由来するキメラＦｃ部分を含む場合もある。例示的な一実施形態において、キメラＦｃ部分は、ＩｇＧ１抗体由来のＣＨ３ドメイン、及びＩｇＧ４抗体由来のＣＨ２ドメインを含む。別の実施形態では、ＩｇＧ４抗体には、上部及び下部のヒンジドメインはＩｇＧ４抗体に由来するが、中間部のヒンジドメインはヒンジ領域内のプロリン置換（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）の結果としてＩｇＧ１抗体に由来するキメラヒンジが含まれる。さらに別の実施形態では、親のキメラＩｇＧ４抗体には、上部及び下部のヒンジドメインはＩｇＧ４抗体に由来するが、中間部のヒンジドメインはヒンジ領域内のプロリン置換（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）の結果としてＩｇＧ１抗体に由来するキメラヒンジ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体由来のＣＨ１ドメイン、ＩｇＧ４抗体由来のＣＨ２ドメイン（またはＥＵ付番２９２〜３４０位）、ならびにＩｇＧ１抗体由来のＣＨ１ドメイン及び／またはＣＨ３ドメインが含まれる。
【０２０７】
特定の実施形態において、「エフェクターレス」Ｆｃポリペプチドのエフェクター機能の低減は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、及び／またはＦｃγＲＩＩＩｂ受容体などのＦｃ受容体（ＦｃＲ）、または補体タンパク質、例えば、補体タンパク質Ｃ１ｑへの結合の低減である。この結合の変化は、約１倍以上、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、５０、もしくは１００倍以上、またはそれらの任意の間隔もしくは範囲の倍率のものであり得る。こうしたエフェクター機能、例えば、Ｆｃ受容体または補体タンパク質へのＦｃの結合における減少は、例えば、本明細書に記載のアッセイまたは当技術分野において公知のアッセイを使用して決定される結合活性の低減率に基づいて容易に計算される。
【０２０８】
本発明の一実施形態において、安定化Ｆｃポリペプチドは、一本鎖Ｆｃ領域を含む。そのような一本鎖Ｆｃ領域は、当技術分野において公知であり（例えば、ＷＯ２００８０１２４３、ＷＯ２００８１３１２４２、ＷＯ２００８１５３９５４を参照されたい）、公知の方法を使用して作製することができる。本明細書で教示される安定化アミノ酸は、当業者に公知の方法を使用して、かかる構築物のＦｃ部分の１つ以上に組み込まれ得る。そのような一本鎖Ｆｃ領域または遺伝子融合したＦｃ領域は、単一のポリペプチド鎖内に遺伝学的に関係付けられた（すなわち、単一の連続的な遺伝子配列にコードされた）Ｆｃドメイン（またはＦｃ部分）から構成される合成Ｆｃ領域である。したがって、遺伝子融合したＦｃ領域（すなわち、ｓｃＦｃ領域）は、１つのポリペプチド鎖を含むという点で単量体性であるが、分子の適切な部分は二量体化してＦｃ領域を形成する。Ｆｃ部分に関する本明細書における教示が、二本鎖Ｆｃ二量体と一本鎖Ｆｃ二量体の両方に適用できることは理解されよう。例えば、いずれかのタイプのＦｃ領域構築物は、例えば、ＩｇＧ１抗体もしくはＩｇＧ４抗体に由来する場合もあれば、キメラである（例えば、キメラヒンジを含む、及び／またはＩｇＧ４抗体由来のＣＨ２ドメイン及びＩｇＧ１抗体由来のＣＨ３ドメインを含む）場合もある。
【０２０９】
ＩＩＩ．安定化Ｆｃ領域を有するバリアントＦｃポリペプチド
特定の態様において、本発明は、上述の親Ｆｃポリペプチドのいずれか１つのバリアントであるアミノ酸配列を含むバリアントＦｃポリペプチドを提供する。特に、本発明のバリアントＦｃポリペプチドは、親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域（またはＦｃ部分）に由来するアミノ酸配列を有するＦｃ領域（またはＦｃ部分）を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＦｃポリペプチドは、本明細書に記載の安定化Ｆｃ変異のうちの少なくとも１つの存在により、親Ｆｃポリペプチドと異なる。特定の実施形態において、Ｆｃバリアントは、さらなるアミノ酸配列変化を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃバリアントは、親Ｆｃポリペプチドと比較して増強された安定性を有し、場合により、親Ｆｃポリペプチドと比較して変化したエフェクター機能を有する。例えば、バリアントＦｃポリペプチドは、親Ｆｃポリペプチドの抗原依存性エフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ及び／またはＣＤＣ）と同等か、またはそれよりも低い抗原依存性エフェクター機能を有し得る。さらに、または代替的には、バリアントＦｃポリペプチドは、親Ｆｃポリペプチドと比べて抗原非依存性エフェクター機能（例えば、長期の半減期）を有し得る。
【０２１０】
特定の実施形態において、バリアントＦｃポリペプチドには、出発ポリペプチドまたは親ポリペプチドと比べて約１つ以上の変異（例えば、約１〜約２０個、約１〜約１５個、約１〜約１０個、約１〜約５個、約１〜約４個、約１〜約３個、約２〜約２０個、約２〜約１５個、約２〜約１０個、約５〜約２０個、または約５〜約１０個の変異）、例えば、別のアミノ酸残基に置換されているか、または１つ以上のアミノ酸残基の挿入もしくは欠失を有する１つ以上のアミノ酸残基を除いては親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域（Ｆｃ部分）と本質的に同一である、Ｆｃ領域（またはＦｃ部分）が含まれる。特定の実施形態において、バリアントＦｃポリペプチドは、出発ポリペプチドと比べて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の変異を有する。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、天然に発生しないアミノ酸配列を含む。
【０２１１】
そのようなバリアントは、出発ポリペプチドと１００％未満の配列同一性または類似性を必然的に有する。いくつかの実施形態では、バリアントは、例えば、バリアント分子の全長またはその一部分（例えば、Ｆｃ領域またはＦｃ部分）にわたり、出発ポリペプチドのアミノ酸配列とのアミノ酸配列同一性または類似性が約７５％から１００％未満、例えば、約８０％から１００％未満、または約８５％から１００％未満、または約９０％から１００％未満（例えば、９１〜９９％、９２〜９９％、９３〜９９％、９４〜９９％、９５〜９９％、９６〜９９％、９７〜９９％、９８〜９９％、または９９％）、または約９５％から１００％未満であるアミノ酸配列を有する。一実施形態において、出発ポリペプチドの配列（例えば、親ＦｃポリペプチドのＦｃ領域）と、それに由来する配列（例えば、バリアントＦｃポリペプチドのＦｃ領域）との間で、１つのアミノ酸が異なる。
【０２１２】
特定の実施形態において、本発明のバリアントＦｃポリペプチドは、安定化Ｆｃポリペプチドである。つまり、安定化ポリペプチドは、少なくとも１つの配列多様性または安定化Ｆｃ変異である変異を含む。本明細書で使用される場合、「安定化Ｆｃ変異」という用語には、その起源となる親Ｆｃポリペプチドと比較して増強されたタンパク質安定性（例えば熱安定性）をバリアントＦｃポリペプチドにもたらす、バリアントＦｃポリペプチドのＦｃ領域内の変異が含まれる。いくつかの実施形態では、安定化変異は、増強されたタンパク質安定性をＦｃ領域に与える置換アミノ酸（本明細書では「安定化アミノ酸」）での、Ｆｃ領域内の不安定化アミノ酸の置換を含む。一実施形態において、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸安定化Ｆｃ変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の安定化変異）を含む。安定化Ｆｃ変異は、例えば、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの両方に導入され得る。
【０２１３】
特定の例示的な実施形態において、本発明のバリアントＦｃポリペプチドは、上述の「エフェクターレス」親Ｆｃポリペプチドの安定化バリアントである。つまり、安定化バリアントは、「エフェクターレス親Ｆｃポリペプチド」と比べて増強された安定性を有する。例示的な一実施形態において、バリアントＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体のアグリコシル化Ｆｃ領域、例えば、Ｔ２９９Ａ変異（ＥＵ付番）を含むアグリコシル化ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む、親Ｆｃポリペプチドの安定化バリアントである。別の例示的な実施形態では、バリアントＦｃポリペプチドは、グリコシル化またはアグリコシル化されたＩｇＧ４抗体のＦｃ領域を含む、親Ｆｃポリペプチドの安定化バリアントである。例えば、バリアントＦｃポリペプチドは、「ａｇｌｙ  ＩｇＧ４．Ｐ」抗体に由来するＦｃ領域に安定化変異を含み得る。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、バリアントＦｃポリペプチドと比較して、同一の測定条件下で増強された安定性を呈する。しかしながら、Ｆｃバリアントポリペプチドの安定性がその親Ｆｃポリペプチドと比べて増強される程度が、選択される測定条件下で異なり得ることは認識されよう。例えば、安定性の増強は、特定のｐＨ、例えば、酸性、中性、または塩基性のｐＨで観察され得る。一実施形態において、増強された安定性は、約６．０未満（例えば、約６．０、約５．５、約５．０、約４．５、または約４．０）の酸性ｐＨで観察される。別の実施形態では、増強された安定性は、約６．０〜約８．０（例えば、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０）の中性ｐＨで観察される。別の実施形態では、増強された安定性は、約８．０〜約１０．０（例えば、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５、約１０．０）の塩基性ｐＨで観察される。
【０２１５】
バリアントＦｃポリペプチドの熱安定性の増強は、例えば、後述する方法のいずれかを使用して評価することができる。特定の実施形態において、安定化Ｆｃポリペプチドは、その起源となる親ポリペプチドよりも約０．１、約０．２５、約０．５、約０．７５、約１、約１．２５、約１．５、約１．７５、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、約３０、約４０、または約５０℃高い熱安定性（例えば、融解温度すなわちＴｍ）をもつＦｃ領域（またはＦｃ部分）を有する。特定の実施形態において、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドバリアントは、単量体の可溶性タンパク質として発現され、そのうち２５％以下（例えば、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、または約５％未満）が二量体、四量体、または別様に凝集した形態である。
【０２１６】
別の実施形態では、安定化Ｆｃポリペプチドは、熱負荷アッセイ（参照により本明細書に援用される米国特許出願第１１／７２５，９７０号、ならびに下記の実施例４を参照されたい）において４０℃超（例えば、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９℃、またはそれ以上）のＴ５０を有する。いくつかの実施形態では、本発明の安定化Ｆｃ分子は、５０℃超（例えば、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８℃またはそれ以上）のＴ５０を有する。いくつかの実施形態では、本発明の安定化Ｆｃ分子は、６０℃超（例えば、６０、６１、６２、６３、６４、６５℃、またはそれ以上）のＴ５０を有する。なおもさらなる実施形態では、本発明の安定化Ｆｃ分子は、６５℃超（例えば、６５、６６、６７、６８、６９、７０℃、またはそれ以上）のＴ５０を有する。さらなる実施形態において、本発明の安定化Ｆｃ分子は、７０℃超（例えば、７０、７１、７３、７４、７５℃、またはそれ以上）のＴ５０を有する。
【０２１７】
特定の実施形態において、本発明の安定化Ｆｃ分子は、約６０℃超（例えば、約６１、６２、６３、６４、６５℃またはそれ以上）、６５℃超（例えば、６５、６６、６７、６８、６９℃またはそれ以上）、または約７０℃超（例えば、７１、７２、７３、７４、７５℃またはそれ以上）のＴｍ値をもつＣＨ２ドメインを有する。他の実施形態では、本発明の安定化Ｆｃ分子は、約７０℃超（例えば、７１、７２、７３、７４、７５℃またはそれ以上）、約７５℃超（例えば、７６、７７、７８、７９、８０℃またはそれ以上）、または８０℃超（例えば、８１、８２、８３、８４、８５℃またはそれ以上）のＴｍ値をもつＣＨ３ドメインを有する。特定の実施形態では、前記安定化Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ４抗体（例えば、ａｇｌｙ  ＩｇＧ４．Ｐ）のアグリコシル化またはグリコシル化されたＦｃ領域を含む親Ｆｃポリペプチドのバリアントである。他の実施形態では、前記安定化Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ１抗体（例えば、ａｇｌｙ  ＩｇＧ１）のアグリコシル化Ｆｃ領域を含む親Ｆｃポリペプチドのバリアントである。さらに他の実施形態では、本発明の安定化Ｆｃ分子は、グリコシル化ＩｇＧ１抗体の熱安定性と実質的に同じまたはそれよりも高い熱安定性をもつＦｃ領域またはＦｃ部分（例えば、ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメイン）を有する。
【０２１８】
特定の実施形態において、本発明のバリアントＦｃポリペプチドは、その起源となる親Ｆｃポリペプチドと比較して、凝集の低減をもたらす。一実施形態において、本発明の方法によって生成される安定化Ｆｃ分子は、親Ｆｃ分子と比べて少なくとも１％減少した凝集性を有する。他の実施形態では、安定化Ｆｃポリペプチドは、親分子と比べて少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも１００％減少した凝集性を有する。
【０２１９】
他の実施形態では、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、その起源となる親Ｆｃポリペプチドと比較して、長期安定性または有効期間の増大をもたらす。一実施形態において、本発明の方法によって生成される安定化Ｆｃ分子は、安定化されていない結合分子と比べて少なくとも１日増大した有効期間を有する。これは、安定化Ｆｃポリペプチドの調製物が、生物学的活性のあるバリアントＦｃポリペプチドを、前日に存在したものと実質的に同じ量で有し、かつ、この調製物において、バリアントポリペプチドの認識できる凝集または分解がないことを意味する。他の実施形態では、安定化Ｆｃ分子は、安定化されていないＦｃ分子と比べて少なくとも２日間、少なくとも５日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも１か月間、少なくとも２か月間、少なくとも６か月間、または少なくとも１年間増大した有効期間を有する。
【０２２０】
特定の実施形態において、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、その親Ｆｃポリペプチドと比較して増大した収率で発現される。一実施形態において、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、親Ｆｃ分子と比べて少なくとも１％増大した収率を有する。他の実施形態では、安定化Ｆｃポリペプチドは、親Ｆｃ分子と比べて少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも１００％増大した収率を有する。
【０２２１】
例示的な実施形態において、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、宿主細胞、例えば、細菌または真核生物（例えば、酵母または哺乳動物）の宿主細胞において（その親Ｆｃポリペプチドと比較して）増大した収率で発現される。本発明の安定化Ｆｃポリペプチドをコードする核酸分子を発現させるために使用され得る例示的な哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）細胞、ＣＶＩ（サル腎臓株）細胞、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）細胞、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）細胞、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）細胞、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）細胞、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）細胞、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ細胞（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（ヒト網膜由来細胞株、Ｃｒｕｃｅｌｌ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、及び２９３細胞（ヒト腎臓）が挙げられる。
【０２２２】
他の実施形態では、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、大規模（例えば、商業規模）条件下で、宿主細胞において（その親Ｆｃポリペプチドと比べて）増大した収率で発現される。例示的な実施形態において、安定化Ｆｃ分子は、少なくとも１０リットルの培養培地で発現させたとき、増大した収率を有する。他の実施形態では、安定化Ｆｃ結合分子は、少なくとも２０リットル、少なくとも５０リットル、少なくとも７５リットル、少なくとも１００リットル、少なくとも２００リットル、少なくとも５００リットル、少なくとも１０００リットル、少なくとも２０００リットル、少なくとも５，０００リットル、または少なくとも１０，０００リットルの培養培地で宿主細胞から発現させたとき、増大した収率を有する。ある例示的な実施形態において、少なくとも１０ｍｇ（例えば、１０ｍｇ、２０ｍｇ、５０ｍｇ、または１００ｍｇ）の安定化Ｆｃ分子が、培養培地１リットル毎に生成される。
【０２２３】
（ｉ）安定化Ｆｃアミノ酸
特定の実施形態において、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、２９７位にＧｌｎ（Ｑ）残基を有する、ＩｇＧ４分子のＣＨ２ドメイン（またはそのアミノ酸２９２〜３４０）及びＩｇＧ１分子のＣＨ３ドメインを含む。別の実施形態では、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ１分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ならびに、単独または２９７位のＡｓｐ（Ｄ）残基と組み合わせた２９９位のＬｙｓ（Ｋ）残基を含む。
【０２２４】
（ｉｉ）安定化Ｆｃ部分の例
本発明の安定化Ｆｃ部分の例は、本明細書の随所、実施例、及び配列表で確認することができる。
【０２２５】
特定の例示的な実施形態において、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、下記の表１．１に示すＦｃアミノ酸配列のうちの１つ、２つ、またはそれ以上を含む、安定化ＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含む。安定化Ｆｃ変異は、太字で下線が引かれている。
【０２２６】
2021526371.tif 000009
2021526371.tif 000010
2021526371.tif 000011
2021526371.tif 000012
2021526371.tif 000013
【０２２７】
特定の例示的な実施形態において、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、下記の表１．２に示すキメラＦｃ部分アミノ酸配列のうちの１つ、２つ、またはそれ以上を有する、安定化キメラＦｃ領域を含む。
【０２２８】
2021526371.tif 000014
2021526371.tif 000015
【０２２９】
他の例示的な実施形態では、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、下記の表１．３に示すＩｇＧ１  Ｆｃ部分アミノ酸配列のうちの１つ、２つ、またはそれ以上を有する、安定化アグリコシル化ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む。
【０２３０】
2021526371.tif 000016
2021526371.tif 000017
2021526371.tif 000018
【０２３１】
ＩＶ．バリアントＦｃポリペプチドを安定化させる方法
特定の態様において、本発明は、Ｆｃ領域（例えば、アグリコシル化Ｆｃ領域）を含むポリペプチドを安定化させる方法であって、（ａ）出発Ｆｃ領域の少なくとも１つのＦｃ部分内で変異のための１つ以上のアミノ酸位置を選択することと、（ｂ）変異のために選択された１つ以上のアミノ酸位置を変異させることにより、ポリペプチドを安定化させることとを含む、方法に関する。
【０２３２】
一実施形態において、出発Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。別の実施形態では、出発Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。別の実施形態では、出発Ｆｃ領域は、キメラＦｃ領域である。一実施形態において、出発Ｆｃ領域は、アグリコシル化ＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。別の実施形態では、出発Ｆｃ領域は、アグリコシル化ＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体（またはその断片）のＦｃ領域は、配列番号８５に示す配列を有する。
【０２３４】
一実施形態において、変異のために選択されるアミノ酸位置は、出発ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ４分子）のＦｃ領域内の伸長ループ内にある。別の実施形態では、変異のために選択されるアミノ酸位置は、ＣＨ３ドメイン間の界面に存在する。別の実施形態では、変異のために選択されるアミノ酸位置は、１ｈｚｈ結晶構造内の炭水化物との接触部位（例えば、Ｖ２６４、Ｒ２９２またはＶ３０３）付近にある。他の実施形態では、アミノ酸位置は、ＣＨ３／ＣＨ２界面付近、またはＣＨ３／ＣＨ２界面付近（例えば、Ｈ３１０）にあってもよい。別の実施形態では、Ｆｃ領域の全体的な表面電荷を変化させる１つ以上の変異が、例えば、表面に露出したグルタミン残基のセット（Ｑ２６８、Ｑ２７４、またはＱ３５５）のうちの１つ以上において生じ得る。別の実施形態では、アミノ酸位置は、ＣＨ２及びＣＨ３の「バリンコア」に見られるバリン残基である。ＣＨ２の「バリンコア」は、全てＣＨ２ドメインの同じ近位内部コアに向けて配置されている５つのバリン残基（Ｖ２４０、Ｖ２５５、Ｖ２６３、Ｖ３０２及びＶ３２３）である。同様の「バリンコア」がＣＨ３でも観察される（Ｖ３４８、Ｖ３６９、Ｖ３７９、Ｖ３９７、Ｖ４１２及びＶ４２７）。別の実施形態では、変異のために選択されるアミノ酸位置は、アミノ酸２９７でＮ結合型炭水化物と相互作用または接触することが予測される位置にある。そのようなアミノ酸位置は、同族のＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＩａ）に結合したＦｃ領域の結晶構造を調べることによって同定することができる。Ｎ２９７と相互作用を生じる例示的なアミノ酸は、残基２６２〜２７０によって形成されるループを含む。
【０２３５】
例示的なアミノ酸位置は、ＥＵ付番の慣例によるアミノ酸２４０位、２５５位、２６２〜２６６位、２６７〜２７１位、２９２〜２９９位、３０２〜３０９位、３７９位、３９７〜３９９位、４０９位、４１２位、及び４２７位を含む。特定の実施形態において、変異のために選択される１つ以上のアミノ酸位置は、２４０位、２５５位、２６２位、２６３位、２６４位、２６６位、２６８位、２７４位、２９２位、２９９位、３０２位、３０３位、３０７位、３０９位、３２３位、３４８位、３５５位、３６９位、３７９位、３９７位、３９９位、４０９位、４１２位、及び４２７位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置である。特定の実施形態において、変異のために選択される１つ以上のアミノ酸位置は、２４０位、２６２位、２６４位、２６６位、２９７位、２９９位、３０７位、３０９位、３９９位、４０９位、及び４２７位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置である。別の実施形態では、１つ以上のアミノ酸位置は、２９７位、２９９位、３０７位、３０９位、４０９位、及び４２７位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置である。別の実施形態では、１つ以上のアミノ酸位置は、アミノ酸残基２４０、２６２、２６４、及び２６６から選択される。別の実施形態では、アミノ酸位置のうちの少なくとも１つは、ＥＵ２９７位にある。別の実施形態では、アミノ酸位置のうちの少なくとも１つは、ＥＵ２９９位にある。別の実施形態では、アミノ酸位置のうちの少なくとも１つは、ＥＵ３０７位にある。別の実施形態では、アミノ酸位置のうちの少なくとも１つは、ＥＵ３０９位にある。別の実施形態では、アミノ酸位置のうちの少なくとも１つは、ＥＵ３９９位にある。別の実施形態では、アミノ酸位置のうちの少なくとも１つは、ＥＵ４０９位にある。別の実施形態では、アミノ酸位置のうちの少なくとも１つは、ＥＵ４２７位にある。
【０２３６】
特定の実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。Ｆｃ領域がＩｇＧ１  Ｆｃ領域である特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸位置は、ＥＵ付番によるアミノ酸残基２４０、２６２、２６４、２９９、２９７、及び２６６から選択される。Ｆｃ領域がＩｇＧ４  Ｆｃ領域である他の実施形態では、１つ以上のアミノ酸位置は、ＥＵ付番によるアミノ酸残基２９７、２９９、３０７、３０９、３９９、４０９、及び４２７から選択される。
【０２３７】
一実施形態において、変異は、そのアミノ酸位置におけるアミノ酸側鎖のサイズを低減させる（例えば、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）による置換）。別の実施形態では、変異は、非極性側鎖を有するアミノ酸による置換（例えば、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、及びトリプトファン（Ｗ）による置換）である。別の実施形態では、変異は、ＣＨ３界面に疎水性を加え、例えば、２つの相互作用するドメイン間の会合を増大させたり（例えば、Ｙ３４９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ及びＴ３９４Ｖ）、または界面の側鎖の容積を増大させたりする（例えば、Ｆ４０５Ｙ）。別の実施形態では、「バリンコア」の１つ以上のアミノ酸は、それらの安定性を増大させるために、イソロイシンまたはフェニルアラニンで置換される。別の実施形態では、アミノ酸（例えば、Ｌ３５１及び／またはＬ３６８）は、より高次の分岐した疎水性側鎖に変異する。
【０２３８】
一実施形態において、変異は、アラニン（Ａ）による置換である。一実施形態において、変異は、フェニルアラニン（Ｆ）による置換である。別の実施形態では、変異は、ロイシン（Ｌ）による置換である。一実施形態において、変異は、スレオニン（Ｔ）による置換である。別の実施形態では、変異は、リジン（Ｋ）による置換である。一実施形態において、変異は、プロリン（Ｐ）による置換である。一実施形態において、変異は、フェニルアラニン（Ｆ）による置換である。
【０２３９】
一実施形態において、変異は、下記の表５．１、表５．２、表５．３、及び／または表５．４に示す変異または置換のうちの１つ以上を含む。
【０２４０】
特定の実施形態において、変異は、２４０Ｆ、２６２Ｌ、２６４Ｔ、２６６Ｆ、２９７Ｑ、２９７Ｓ、２９７Ｄ、２９９Ａ、２９９Ｋ、３０７Ｐ、３０９Ｋ、３０９Ｍ、３０９Ｐ、３２３Ｆ、３９９Ｓ、４０９Ｍ、及び４２７Ｆ（ＥＵ付番の慣例）からなる群から選択される１つ以上の置換を含む。別の実施形態では、変異は、２９９Ａ、２９９Ｋ、３０７Ｐ、３０９Ｋ、３０９Ｍ、３０９Ｐ、３２３Ｆ、３９９Ｅ、３９９Ｓ、４０９Ｋ、４０９Ｍ、及び４２７Ｆからなる群から選択される１つ以上の置換を含む。別の実施形態では、１つ以上のアミノ酸位置は、アミノ酸残基２４０Ｆ、２６２Ｌ、２６４Ｔ、及び２６６Ｆから選択される。別の実施形態では、置換のうちの少なくとも１つは２９９Ａである。別の実施形態では、置換のうちの少なくとも１つは２９９Ｋである。別の実施形態では、置換のうちの少なくとも１つは３０７Ｐである。別の実施形態では、置換のうちの少なくとも１つは３０９Ｋである。別の実施形態では、置換のうちの少なくとも１つは３０９Ｍである。別の実施形態では、置換のうちの少なくとも１つは３０９Ｐである。別の実施形態では、置換のうちの少なくとも１つは３２３Ｆである。別の実施形態では、置換のうちの少なくとも１つは３９９Ｓである。別の実施形態では、置換のうちの少なくとも１つは３９９Ｅである。別の実施形態では、置換のうちの少なくとも１つは４０９Ｋである。別の実施形態では、置換のうちの少なくとも１つは４０９Ｍである。別の実施形態では、置換のうちの少なくとも１つは４２７Ｆである。
【０２４１】
別の実施形態では、変異は、２つ以上の置換（例えば、２、３、４、または５つ）を含む。別の実施形態では、変異は、３つ以上の置換（例えば、３、４、５、または６つ）を含む。さらに別の実施形態では、安定化Ｆｃ領域は、４つ以上の置換（例えば、４、５、６、または７つ）を含む。
【０２４２】
別の態様において、本発明は、安定化Ｆｃ領域を含む安定化結合分子を作製する方法であって、本発明の安定化Ｆｃ領域を含むポリペプチドを、結合部分のアミノ末端またはカルボキシ末端に遺伝子融合させることを含む方法に関する。特定の実施形態において、安定化Ｆｃ領域は、本発明の方法によって安定化される。
【０２４３】
別の実施形態では、治療用抗体は、スクランブリングを消失させるか、または抗体のスクランブリングに対する感受性を低減させることができる。特定の抗体、例えば、野生型ＩｇＧ４定常領域を有する（例えば、ヒンジ領域を含む）ものは、内因性ＩｇＧ４抗体とのスクランブリングに感受性があり、機能的に一価の産物を２コピー産生し得る（例えば、Ａａｌｂｅｒｓｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０５：９−１９，２００２を参照されたい）。スクランブリング率は、ＩｇＧ４の内因性レベルに依存し得、これは可変である。結果として、野生型ヒトＩｇＧ４定常領域を含む治療用抗体は、可変の薬物動態的／薬力学的（ＰＫ／ＰＤ）プロファイルを有する。野生型ＩｇＧ４定常領域を含む抗体のスクランブリングは、ＶＬＡ４に対して一価であり、別の抗原に対して一価である二重特異性抗体をもたらし得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療用抗体は、同じ特異性（例えば、α４への特異的結合）を有するが野生型ＩｇＧ４定常領域を含む抗体よりも一貫性の高いＰＫプロファイルを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療用抗体の一貫性の高いＰＫプロファイルは、同じ特異性（例えば、α４への特異的結合）を有するが野生型ＩｇＧ４定常領域を含む抗体と比較して、本明細書に記載の抗体の安全性を増大させる、純度を増大させる、及び／または効力を増大させる場合がある。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１抗体とヒトＩｇＧ４抗体とのキメラまたはハイブリッドである重鎖ヒンジ及びＦｃ領域を含む治療用抗体は、ヒトＩｇＧ４分子由来のヒンジ及びＦｃ領域を含む抗体と生じるスクランブリングを低減または消失させることができる。一実施形態において、キメラまたはハイブリッドの重鎖定常領域を有する本明細書に記載の抗体は、スクランブリングを消失させるか、または抗体のスクランブリングに対する感受性を低減させることにより、ＰＫ／ＰＤ変動を低減させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療用抗体は、同じ特異性（例えば、α４への特異的結合）を有するが野生型ＩｇＧ４定常領域を含む抗体よりも低いＰＫ／ＰＤ変動を有する。特定の実施形態において、本明細書に記載の抗体は、二価モノクローナル抗体による効力を増大させ、及び／またはスクランブリングに起因する二重特異性を消失させることができる。特定の実施形態において、本明細書に記載の抗体は、非変異型の対応物よりも、もしくは同じ特異性（例えば、α４への特異的結合）を有するが野生型ＩｇＧ４定常領域を含む抗体よりも高い結合親和性を呈すること及び／または高い受容体占有率の持続を示すことができる。いくつかの実施形態では、ＰＫ／ＰＫ変動が低い、及び／または結合親和性が高い、及び／またはスクランブリングが低減もしくは消失した、本明細書に記載の治療用抗体は、同じ特異性（例えば、α４への特異的結合）を有するが野生型ＩｇＧ４定常領域を含む抗体と比較して、本明細書に記載の抗体の安全性を増大させる、純度を増大させる、及び／または効力を増大させる場合がある。好ましい実施形態では、スクランブリングを消失させるかまたは抗体のスクランブリングに対する感受性を低減させる抗体は、（ａ）配列番号８０の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖と、（ｂ）配列番号８１の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖とを含む組換え抗アルファ４抗体である。
【０２４５】
Ｖ．タンパク質安定性を評価する方法
本発明の組成物の安定性特性は、当技術分野において公知の方法を使用して分析することができる。当業者に許容される安定性パラメータを用いてよい。例示的なパラメータについて、以下にさらに詳細に記載する。例示的な実施形態では、熱安定性が評価される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物の発現レベル（例えば、収率％によって測定される）が評価される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物の凝集レベルが評価される。
【０２４６】
特定の実施形態において、Ｆｃポリペプチドの安定性特性は、好適な対照のものと比較される。例示的な対照としては、親Ｆｃポリペプチド、例えば野生型Ｆｃポリペプチド、野生型（グリコシル化）ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体が挙げられる。別の例示的な対照は、アグリコシル化Ｆｃポリペプチド、アグリコシル化ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である。一実施形態において、後述する１つ以上のパラメータが測定される。
【０２４７】
一実施形態において、これらのパラメータのうちの１つ以上は、哺乳動物細胞における発現後に測定される。一実施形態において、後述する１つ以上のパラメータは、大規模製造条件（例えば、ＦｃポリペプチドまたはＦｃポリペプチドを含む分子のバイオリアクターにおける発現）で測定される。
【０２４８】
Ａ．熱安定性
本発明の組成物の熱安定性は、当技術分野において公知のいくつかの非限定的な生物物理学的または生化学的な技術を使用して分析され得る。特定の実施形態において、熱安定性は、分析的分光法によって評価される。例示的な分析的分光法は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）である。ＤＳＣは、ほとんどのタンパク質またはタンパク質ドメインのアンフォールディングに付随する熱吸収に感応する熱量計を用いる（例えば、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒｕｉｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：１６４８−５２，１９８８を参照されたい）。タンパク質の熱安定性を決定するには、タンパク質のサンプルを熱量計に挿入し、Ｆｃポリペプチド（またはそのＣＨ２もしくはＣＨ３ドメイン）がアンフォールディングするまで温度を上昇させる。タンパク質がアンフォールディングする温度が、全体的なタンパク質安定性を示す。
【０２４９】
別の例示的な分析的分光法は、円二色性（ＣＤ）分光法である。ＣＤ分光測定は、組成物の光学活性を温度上昇の関数として測定する。円二色性（ＣＤ）分光法は、構造的非対称性によって生じる左回り偏光と右回り偏光との吸光度の差を測定する。無秩序構造またはアンフォールディングした構造は、秩序だった構造またはフォールディングした構造のものとは非常に異なるＣＤスペクトルをもたらす。ＣＤスペクトルは、温度上昇の変性効果に対するタンパク質の感応性を反映し、したがってタンパク質の熱安定性を示す（ｖａｎ  Ｍｉｅｒｌｏ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｍｓｍａ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７９（３）：２８１−９８，２０００を参照されたい）。
【０２５０】
熱安定性を測定するための別の例示的な分析的分光法は、蛍光発光分光法である（上記のｖａｎ  Ｍｉｅｒｌｏ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｍｓｍａを参照されたい）。熱安定性を測定するためのさらに別の例示的な分析的分光法は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法である（例えば、ｖａｎ  Ｍｉｅｒｌｏ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｍｓｍａを参照されたい）。
【０２５１】
他の実施形態では、本発明の組成物の熱安定性は、生化学的に測定される。熱安定性を評価するための例示的な生化学的方法は、熱負荷アッセイである。「熱負荷アッセイ」では、本発明の組成物を一定期間にわたり一連の高温に供する。例えば、一実施形態では、Ｆｃ領域を含む試験Ｆｃポリペプチドを、一連の漸増温度に、例えば１〜１．５時間供する。次いで、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲ、プロテインＡ、またはプロテインＧ）に結合するＦｃ領域の能力を、関連する生化学的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＤＥＬＦＩＡ）によってアッセイする。例示的な熱負荷アッセイは、下記の実施形態４に記載する。
【０２５２】
一実施形態において、このようなアッセイは、ハイスループット形式で行ってもよい。別の実施形態では、当技術分野において公知の方法を使用して、Ｆｃバリアントのライブラリを作出してもよい。Ｆｃの発現を誘導してもよく、Ｆｃを熱負荷に供してもよい。負荷を与えた試験サンプルを結合についてアッセイし、安定であるＦｃポリペプチドをスケールアップし、さらに解析してもよい。
【０２５３】
特定の実施形態において、熱安定性は、上記の技術のいずれか（例えば分析的分光法技術）を使用して、本発明の組成物の融解温度（Ｔｍ）を測定することによって評価される。融解温度は、組成物の分子の５０％がフォールディングした状態にある、熱転移曲線の中点における温度である。
【０２５４】
他の実施形態では、熱安定性は、分析的分光法技術（例えばＤＳＣ）を使用して、本発明の組成物の比熱または熱容量（Ｃｐ）を測定することによって評価される。組成物の比熱は、１ｍｏｌの水の温度を１℃上げるのに必要な（例えばｋｃａｌ／ｍｏｌ単位の）エネルギーである。大きなＣｐは、変性した、または不活性なタンパク質組成物の特徴である。特定の実施形態では、組成物の熱容量の変化（ΔＣｐ）が、熱転移の前及び後の組成物の比熱を決定することによって測定される。他の実施形態では、熱安定性は、熱力学的安定性の他のパラメータ、例えばアンフォールディングのギブズ自由エネルギー（ΔＧ）、アンフォールディングのエンタルピー（ΔＨ）、またはアンフォールディングのエントロピー（ΔＳ）を測定または決定することによって評価され得る。
【０２５５】
他の実施形態では、上記の生化学的アッセイのうちの１つ以上（例えば熱負荷アッセイ）を使用して、組成物の５０％がその活性（例えば結合活性）を保持する温度（すなわちＴｃ値）を決定する。
【０２５６】
Ｂ．凝集％
特定の実施形態において、本発明の組成物の安定性は、その凝集する傾向を測定することによって決定される。凝集は、いくつかの非限定的な生化学的または生物物理学的な技術によって測定することができる。例えば、本発明の組成物の凝集は、クロマトグラフィ、例えばサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を使用して評価され得る。ＳＥＣは、サイズに基づいて分子を分離する。カラムに、イオン及び小分子は内部に受け入れるが大きなものは受け入れないポリマーゲルの半固体ビーズを充填する。タンパク質組成物をカラム上部に加えると、小型のフォールディングしたタンパク質（すなわち、非凝集型タンパク質）は、溶媒中で大きなタンパク質凝集体が利用できるものよりも大きな容積に分配される。その結果、大きな凝集体がカラム中をより速く移動し、このようにして混合物をその成分に分離または分画することができる。各画分がゲルから溶出する際に、それを別々に（例えば光散乱によって）定量することができる。したがって、画分の濃度を、ゲルに加えたタンパク質の全濃度と比較することにより、本発明の組成物の凝集％を決定することができる。安定な組成物は本質的に単一の画分としてカラムから溶出し、本質的に単一のピークとして溶出プロファイルまたはクロマトグラムに現れる。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、ＳＥＣをインライン光散乱（例えば古典的または動的な光散乱）と併せて使用して、組成物の凝集％を決定する。特定の実施形態では、静的光散乱を用いて、各画分またはピークの質量を、分子形状または溶出位置とは無関係に測定する。いくつかの実施形態では、動的光散乱を用いて、組成物の水力学的サイズを測定する。タンパク質安定性を評価する他の例示的な方法は、高速ＳＥＣを含む（例えば、Ｃｏｒｂｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２３（８）：１８８８−９４，１９８４を参照されたい）。
【０２５８】
非限定的な実施形態において、凝集％は、タンパク質サンプル中のタンパク質凝集体の割合を測定することによって決定される。いくつかの実施形態では、組成物の凝集％は、タンパク質サンプル中のフォールディングしたタンパク質の割合を決定することによって測定される。
【０２５９】
Ｃ．収率％
他の実施形態では、本発明の組成物の安定性は、タンパク質の発現（例えば組換え発現）後に回収されるタンパク質の量（本明細書では「収率％」）を測定することによって評価される。例えば、収率％は、宿主培養培地１ｍｌ当たりに回収されるタンパク質のミリグラム数（すなわちタンパク質のｍｇ／ｍｌ）を決定することによって測定することができる。いくつかの実施形態では、収率％は、哺乳動物宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）における発現後に評価される。
【０２６０】
Ｄ．損失％
さらに他の実施形態では、本発明の組成物の安定性は、所定の期間にわたって保管した後、一連の温度（例えば−８０〜２５℃）におけるタンパク質の損失をモニタリングすることによって評価される。回収されるタンパク質の量または濃度は、当技術分野において公知である任意のタンパク質定量法を使用して決定され、タンパク質の初期濃度と比較され得る。例示的なタンパク質定量法としては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析またはＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８，（１９７６））が挙げられる。損失％を評価するための非限定的な方法は、上述の分析的ＳＥＣ法のいずれかを用いる。損失％の測定値は、任意の所望の保管条件または保管処方、例えば凍結乾燥タンパク質調製物において決定することができる。
【０２６１】
Ｅ．タンパク質分解％
さらに他の実施形態では、本発明の組成物の安定性は、標準条件下で保管した後にタンパク質分解されたタンパク質の量を決定することによって評価される。ある例示的な実施形態において、タンパク質分解は、タンパク質のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、インタクトなタンパク質の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に現れる低分子量断片の量と比較する。別の例示的な実施形態では、タンパク質分解は、マススペクトロメトリー（ＭＳ）によって決定され、ＭＳでは、予想される分子量のタンパク質の量を、サンプル中の低分子量タンパク質断片の量と比較する。
【０２６２】
Ｆ．結合親和性
さらに他の実施形態では、本発明の組成物の安定性は、その標的結合親和性を決定することによって評価され得る。結合親和性を決定する多種多様な方法が、当技術分野において公知である。結合親和性を決定する例示的な方法は、表面プラズモン共鳴を用いる。表面プラズモン共鳴とは、バイオセンサマトリクス内のタンパク質濃度の変化を、例えばＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ及びＰｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して検出することにより、リアルタイムの生体分子特異的相互作用の分析を可能にする光学現象である。さらなる説明については、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７、Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）／．ＭｏＩ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１、及びＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７を参照されたい。
【０２６３】
Ｇ．他の結合試験
さらに他の実施形態では、本発明の組成物安定性は、結合分子の変性またはアンフォールディングした部分に対する標識化合物の結合を定量することによって評価され得る。そのような分子は疎水性であり得るが、それは、これらの分子が、天然タンパク質の内部に通常は埋没しているが、変性またはアンフォールディングした結合分子では露出するアミノ酸の大きな疎水性パッチと結合または相互作用する可能性が高いためである。例示的な標識化合物は、疎水性蛍光色素の１−アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）である。
【０２６４】
ＶＩ．安定化Ｆｃ領域を含む安定化結合ポリペプチド
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＩｇＧ４抗体由来のＣＨ１ドメイン、ＩｇＧ４抗体由来のＣＨ２ドメイン、及びＩｇＧ１抗体由来のＣＨ３ドメインを含む。一実施形態において、ポリペプチドは、Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ置換をさらに含む。ポリペプチドは、アミノ酸２９７及び／または２９９の変異、例えば、２９７Ｑ及び／または２９９Ｋ、あるいは２９７Ｓ及び／または２９９Ｋをさらに含んでもよい。ポリペプチドはまた、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体由来のＣＨ１ドメイン、ＩｇＧ４抗体由来のＣＨ２ドメイン、及びＩｇＧ１抗体由来のＣＨ３ドメインを含んでもよく、このポリペプチドは、Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ、２９７Ｑ、または２９９Ｋ置換のうちの１つ以上を含んでもよい。ＩｇＧ４分子由来のＣＨ１ドメイン（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ置換を含む）、ＩｇＧ４抗体由来のＣＨ２ドメイン、及びＩｇＧ１抗体由来のＣＨ３ドメインからなるＦｃ領域のアミノ酸配列を、配列番号４３に提示する。一実施形態において、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、配列番号４０に示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、本発明の安定化されたＦｃポリペプチドは、配列番号７４に示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、本発明の安定化されたＦｃポリペプチドは、配列番号７５に示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、本発明の安定化Ｆｃポリペプチドは、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を含む。
【０２６５】
一実施形態において、本発明のポリペプチドのＦｃ領域は、一本鎖（ｓｃＦｃ）である。一実施形態において、本段落に記載されるＦｃ領域を含む分子は、一価である。一実施形態において、本段落に記載されるＦｃ領域を含む分子は、一価であり、Ｆｃ領域は、ｓｃＦｃである。本明細書に記載のＦｃ領域を含む分子はまた、ｓｃＦｖを含み得る。
【０２６６】
ＶＩＩ．機能的部分を含む安定化Ｆｃ含有ポリペプチド
本発明のバリアントＦｃ含有ポリペプチドは、所望の効果をもたらすように、さらに修飾されていてもよい。例えば、バリアントＦｃポリペプチドのＦｃ領域は、付加的な部分、すなわち、例えば、ブロッキング部分、検出可能部分、診断用部分、及び／または治療用部分などの機能的部分に、結合している、例えば共有結合している場合がある。例示的な機能的部分をまず以下に記載し、続いて、かかる機能的部分を異なるアミノ酸側鎖化学構造に結合させるのに有用な化学を記載する。
【０２６７】
有用な機能的部分の例としては、ブロッキング部分、検出可能部分、診断用部分、及び治療用部分が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なブロッキング部分には、例えば、受容体または補体タンパク質に結合するＦｃ領域の能力を阻害することにより、エフェクター機能が低減するように、十分な立体容積及び／または電荷をもつ部分が含まれる。非限定的なブロッキング部分としては、ポリアルキレングリコール部分、例えば、ＰＥＧ部分またはＰＥＧ−マレイミド部分が挙げられる。非限定的なＰＥＧ化部分（または関連するポリマー）は、例えば、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール（「ＰＰＧ」）、ポリオキシエチル化グリセロール（「ＰＯＧ」）及び他のポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール（「ＰＶＡ）及び他のポリアルキレンオキシド、ポリオキシエチル化ソルビトール、またはポリオキシエチル化グルコースであり得る。ポリマーは、少なくとも１つの活性スルホン部分を有する限り、上記の単量体に基づくホモポリマー、ランダムコポリマーまたはブロックコポリマー、ターポリマーであってよく、直鎖状であっても分枝状であってもよく、置換されていても置換されていなくてもよい。ポリマー部分は任意の長さまたは分子量であってよいが、これらの特徴は生物学的特性に影響を及ぼし得る。ポリマーの平均分子量は、薬学的用途においてクリアランス速度を減少させるのに特に有用であり、２，０００〜３５，０００ダルトンの範囲内である。さらに、２つの基がポリマーの各末端に１つずつ結合する場合、ポリマーの長さは、２つの基の間の実効距離及び他の空間的関係に影響し得る。したがって、当業者は、ポリマーの長さを変更して、所望の生物学的活性を最適化または付与することができる。ＰＥＧは、生物学的用途において、いくつかの理由で有用である。ＰＥＧは、典型的には透明、無色、無臭で、水溶性、熱安定性があり、多くの化学的因子に対して不活性であり、加水分解せず、無毒である。ＰＥＧ化は、分子の見かけの分子量を増大させることにより、分子の薬物動態的性能を向上させることができる。見かけの分子量の増大は、皮下投与または全身投与後の身体からのクリアランスの速度を低減させる。多くの場合、ＰＥＧ化は、抗原性及び免疫原性を減少させ得る。さらに、ＰＥＧ化は、生物学的活性のある分子の可溶性を増大させ得る。
【０２６８】
ＰＥＧ化された抗体及び抗体断片は、概して、本明細書に記載の抗体及び抗体断片の投与によって軽減または調整され得る状態を処置するのに使用され得る。概して、ＰＥＧ化されたアグリコシル化抗体及び抗体断片は、ＰＥＧ化されていないアグリコシル化抗体及び抗体断片と比較して増大した半減期を有する。ＰＥＧ化されたアグリコシル化抗体及び抗体断片は、単独で、一緒に、または他の医薬組成物と組み合わせて用いられ得る。本発明の方法及びポリペプチドにおいて有用な検出可能部分の例としては、蛍光部分、放射性同位元素部分、放射線不透過性部分など、例えばビオチン、フルオロフォア、発色団、スピン共鳴プローブ、または放射標識などの検出可能な標識が挙げられる。例示的なフルオロフォアとしては、蛍光色素（例えばフルオレセイン、ローダミンなど）及び他の発光分子（例えばルミノール（ｌｕｍｉｎａｌ））が挙げられる。フルオロフォアは、基質（例えばダンシルプローブ）に結合すると構造的変化を生じる修飾タンパク質中の１つ以上の残基の近くに位置付けられるとその蛍光が変化するように、環境感応性であってもよい。例示的な放射標識としては、１つ以上の低感度核（１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎなど）を有する原子を含む小分子が挙げられる。他の有用な部分は当技術分野において公知である。
【０２６９】
本発明の方法及びポリペプチドにおいて有用な診断用部分の例としては、疾患または障害の存在を明らかにするのに好適な検出可能部分が挙げられる。典型的に、診断用部分は、疾患または障害に関連する分子、例えば、標的ペプチド、１つのタンパク質、または複数のタンパク質の存在、非存在、またはレベルを決定することを可能にする。そのような診断剤は、疾患または障害及びその進行の予後判定及び／または診断にも好適である。
【０２７０】
本発明の方法及びポリペプチドにおいて有用な治療用部分の例としては、例えば、抗炎症剤、抗がん剤、抗神経変性剤、及び抗感染剤が挙げられる。機能的部分はまた、上述の機能のうちの１つ以上を有し得る。
【０２７１】
例示的な治療薬には、核ＤＮＡにおいて複数の鎖切断を引き起こすことができ、したがって細胞死（例えば、がん細胞死）を誘導するのに好適な、高エネルギー電離放射線を有する放射性核種が含まれる。例示的な高エネルギー放射性核種には、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１１、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ及び１８８Ｒｅが含まれる。これらの同位元素は、典型的に、短い経路長を有する高エネルギーのＯＣ粒子またはβ粒子を生成する。このような放射性核種は、近接した細胞、例えばコンジュゲートが付着または侵入した新生細胞を殺傷する。放射性核種は、局在化していない細胞には影響をほとんどまたは全く与えず、本質的に非免疫原性である。
【０２７２】
例示的な治療薬には、細胞傷害剤、例えば細胞分裂阻害薬（例えばアルキル化剤、ＤＮＡ合成阻害因子、ＤＮＡインターカレーターもしくは架橋剤、またはＤＮＡ−ＲＮＡ転写調節因子）、酵素阻害因子、遺伝子調節因子、細胞傷害性ヌクレオシド、チューブリン結合剤、ホルモン及びホルモンアンタゴニスト、抗血管新生剤なども含まれる。
【０２７３】
例示的な治療薬には、アントラサイクリンファミリーの薬物のようなアルキル化剤（例えばアドリアマイシン、カルミノマイシン、シクロスポリンＡ、クロロキン、メトプテリン、ミスラマイシン、ポルフィロマイシン、ストレプトニグリン、ポルフィロマイシン、アントラセンジオン、及びアジリジン）も含まれる。別の実施形態では、化学療法剤部分は、ＤＮＡ合成阻害因子などの細胞分裂阻害剤である。ＤＮＡ合成阻害因子の例としては、メトトレキサート及びジクロロメトトレキサート、３−アミノ−１，２，４−ベンゾトリアジン１，４−ジオキシド、アミノプテリン、シトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド、５−フルオロ−５’−デオキシウリジン、５−フルオロウラシル、ガンシクロビル、ヒドロキシ尿素、アクチノマイシン−Ｄ、ならびにマイトマイシンＣが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＤＮＡインターカレーターまたは架橋剤としては、ブレオマイシン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シス−ジアンミン白金（ＩＩ）ジクロリド（シスプラチン）、メルファラン、ミトキサントロン、及びオキサリプラチンが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な治療薬には、アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ホモハリントニン、及びイダルビシンなどの転写調節因子も含まれる。本発明と適合する他の例示的な細胞分裂阻害剤としては、アンサマイシンベンゾキノン、キノノイド誘導体（例えばキノロン、ゲニステイン、バクタサイクリン）、ブスルファン、イホスファミド、メクロレタミン、トリアジコン、ジアジコン、カルバジルキノン、インドロキノンＥＯ９、ジアジリジニル−ベンゾキノンメチルＤＺＱ、トリエチレンホスホラミド、及びニトロソ尿素化合物（例えばカルムスチン、ロムスチン、セムスチン）が挙げられる。
【０２７４】
例示的な治療薬には、例えば、アデノシンアラビノシド、シタラビン、シトシンアラビノシド、５−フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、フトラフル、及び６−メルカプトプリンなどの細胞傷害性ヌクレオシド；タキソイド（例えばパクリタキセル、ドセタキセル、タキサン）、ノコダゾール、リゾキシン、ドラスタチン（例えばドラスタチン−１０、−１１、または−１５）、コルヒチン及びコルチシノイド（例えばＺＤ６１２６）、コンブレタスタチン（例えばコンブレタスタチンＡ−４、ＡＶＥ−６０３２）、及びビンカアルカロイド（例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビン（ナベルビン））などのチューブリン結合剤；アンジオスタチンＫ１−３、ＤＬ−α−ジフルオロメチル−オルニチン、エンドスタチン、フマギリン、ゲニステイン、ミノサイクリン、スタウロスポリン、及び（±）−サリドマイドなどの抗血管新生化合物も含まれる。例示的な治療薬には、ホルモン及びホルモンアンタゴニスト、例えばコルチコステロイド（例えばプレドニゾン）、プロゲスチン（例えばヒドロキシプロゲステロンまたはメドロプロゲステロン）、エストロゲン（例えばジエチルスチルベストロール）、抗エストロゲン剤（例えばタモキシフェン）、アンドロゲン（例えばテストステロン）、アロマターゼ阻害因子（例えばアミノグルテチミド）、１７−（アリルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン、４−アミノ−１，８−ナフタルイミド、アピゲニン、ブレフェルジンＡ、シメチジン、ジクロロメチレン−ジホスホン酸、リュープロリド（リュープロレリン）、黄体化ホルモン放出ホルモン、ピフィスリン−α、ラパマイシン、性ホルモン結合グロブリン、及びタプシガルジンも含まれる。
【０２７５】
例示的な治療薬には、酵素阻害因子、例えば、Ｓ（＋）−カンプトテシン、クルクミン、（−）−デグエリン、５，６−ジクロロベンザ−イミダゾール１−β−Ｄ−リボフラノシド、エトポシド、ホルメスタン、フォストリエシン、ヒスピジン、２−イミノ−１−イミダゾリジン酢酸（シクロクレアチン）、メビノリン、トリコスタチンＡ、チロホスチンＡＧ３４、及びチロホスチンＡＧ８７９も含まれる。例示的な治療薬には、遺伝子調節因子、例えば５−アザ−２’−デオキシシチジン、５−アザシチジン、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）、４−ヒドロキシタモキシフェン、メラトニン、ミフェプリストン、ラロキシフェン、トランスレチナール（ビタミンＡアルデヒド）、レチノイン酸、ビタミンＡ酸、９−シス−レチノイン酸、１３−シス−レチノイン酸、レチノール（ビタミンＡ）、タモキシフェン、及びトログリタゾンも含まれる。
【０２７６】
例示的な治療薬には、例えば、プテリジンファミリーの薬物、ジイネン類（ｄｉｙｎｅｎｅｓ）、及びポドフィロトキシンなどの細胞傷害剤も含まれる。これらのクラスの特に有用なメンバーには、例えば、メトプテリン、ポドフィロトキシン、またはポドフィロトキシン誘導体、例えばエトポシドまたはリン酸エトポシド、ロイロシジン、ビンデシン、ロイロシンなどが含まれる。
【０２７７】
本明細書における教示内容と適合するさらに他の細胞毒には、アウリスタチン（例えばアウリスタチンＥ及びモノメチルアウリスタンＥ）、カリケアマイシン、グラミシジンＤ、マイタンシノイド（例えばマイタンシン）、ネオカルチノスタチン、トポテカン、タキサン、サイトカラシンＢ、臭化エチジウム、エメチン、テノポシド、コルヒチン、ジヒドロキシアンスラシンジオン、ミトキサントロン、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、及びそれらの類似体または相同体が含まれる。他のタイプの機能的部分が当技術分野において公知であり、本明細書に含まれる教示内容に基づいて、本発明の方法及び組成物において容易に使用され得る。
【０２７８】
機能的部分が、小分子、核酸、ポリマー、ペプチド、タンパク質、化学療法薬、または他のタイプの分子であるかを問わず、前述の機能的部分を特定のアミノ酸側鎖に結合させるための化学は、当技術分野において公知である（特定のリンカーの詳細な総説については、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい）。
【０２７９】
ＶＩＩＩ．医薬組成物
安定化Ｆｃ領域を有するＶＬＡ−４結合抗体などのα４結合剤は、医薬組成物として配合され得る。典型的には、医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、生理的に適合性がある、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。
【０２８０】
「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、いかなる所望されない毒性効果ももたらさない塩を意味する（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照されたい）。かかる塩の例としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などの無毒の無機酸に由来するもの、ならびに脂肪族モノカルボン酸及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸などの無毒の有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属に由来するもの、ならびにＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの無毒の有機アミンに由来するものが含まれる。
【０２８１】
本明細書に記載の抗体組成物は、当技術分野において公知の方法に従って配合され得る。医薬の配合は十分に確立された技術分野であり、Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０００）（ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２）、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，７ｔｈ  Ｅｄ．．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０６８３３０５７２７）、及びＫｉｂｂｅ（ｅｄ．），Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，３ｒｄ  ｅｄ．（２０００）（ＩＳＢＮ：０９１７３３０９６Ｘ）にさらに記載されている。
【０２８２】
一実施形態において、α４抗体は、塩化ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、一塩基性リン酸ナトリウム、及びポリソルベート８０などの賦形剤材料とともに配合され得る。別の実施形態では、α４抗体は、例えば、ｐＨ５、５．５、６、６．５、７、または７．５のクエン酸バッファー中に配合され得る。さらに別の実施形態では、α４抗体は、２、４、５、６、８、１０、１２、１４、または１５％のスクロースを含む溶液中に配合され得る。α４抗体は、例えば、約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で緩衝液中に供給されてもよく、２〜８℃で保管されてもよい。
【０２８３】
医薬組成物はまた、様々な他の形態であってもよい。それらには、例えば、液体溶液（例えば、注射液及び輸注液）、分散液または懸濁液、錠剤、丸剤、粉末、リポソーム及び坐剤など、液体、半固体、及び固体の剤形が含まれる。その形態は、意図される投与様式及び治療的用途に依存し得る。典型的に、本明細書に記載の薬剤の組成物は、注射液または輸注液の形態である。
【０２８４】
そのような組成物は、非経口様式（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内注射）によって投与され得る。本明細書で使用される「非経口投与」及び「非経口投与される」という表現は、通常は注射による、経腸投与及び局所投与以外の投与様式を意味し、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内の注射及び注入を含む。
【０２８５】
医薬組成物は、典型的に、製造及び保管の条件下で無菌かつ安定でなければならない。医薬組成物は、投与に関する規制及び業界の標準を満たすことを保証するために試験される場合もある。
【０２８６】
組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散液、リポソーム、または高い薬物濃度に好適な他の秩序構造として配合され得る。無菌注射液は、本明細書に記載の薬剤を、必要に応じて上に列挙した成分のうちの１つまたはその組み合わせとともに、適切な溶媒中に必要な量で組み込み、その後濾過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散液は、本明細書に記載の薬剤を、基礎分散媒及び上に列挙したもののうち必要な他の成分を含む無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、典型的な調製方法は、予め滅菌濾過した溶液から本明細書に記載の薬剤と任意の付加的な所望の成分の粉末が得られる、真空乾燥及びフリーズドライである。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって、維持することができる。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物に含めることにより、もたらすことができる。
【０２８７】
ＩＸ．投与
安定化Ｆｃ領域を有するα４結合抗体は、対象、例えばヒト対象に、様々な方法によって投与することができる。多くの用途で、投与経路は、静脈内注射もしくは注入、皮下注射、または筋肉内注射のうちの１つである。α４結合抗体は、一定用量として、またはｍｇ／ｋｇ単位の用量で投与してもよい。抗体は、静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）に投与してもよい。例えば、抗体は、例えば４週毎に約５０〜６００ｍｇ  ＩＶ、または例えば１週間に少なくとも１回（例えば、１週間に２回）約５０〜１００ｍｇ  ＳＣ（例えば、７５ｍｇ）の一定単位用量で投与してもよい。一実施形態において、抗体は、５０ｍｇ、６０ｍｇ、８０ｍｇ、１００ｍｇ、１２０ｍｇ、１３０ｍｇ、１４０ｍｇ、１５０ｍｇ、１６０ｍｇ、１８０ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、または６００ｍｇ以上の一定単位用量でＩＶ投与される。ＩＶ用量の投与は、１週間に１回もしくは２回もしくは３回以上、または２週間、３週間、４週間、もしくは５週間毎に１回、またはより低い頻度であってもよい。
【０２８８】
一実施形態において、抗体は、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、１００ｍｇ、または１２０ｍｇ以上の一定単位用量でＳＣ投与される。ＳＣ用量の投与は、１週間に１回もしくは２回もしくは３回以上、または２週間、３週間、４週間、もしくは５週間毎に１回、またはより低い頻度であってもよい。
【０２８９】
安定化Ｆｃ領域を有する抗α４抗体は、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約６．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇの用量でボーラス投与することもできる。改変用量範囲は、典型的には４週間毎または１か月に１回の投与で、約６００ｍｇ／対象、約４００ｍｇ／対象、約３００ｍｇ／対象、約２５０ｍｇ／対象、約２００ｍｇ／対象、または約１５０ｍｇ／対象より低い用量を含む。α４結合抗体は、例えば、３〜５週間毎、例えば、４週間毎に、または毎月投与してもよい。
【０２９０】
投薬は、抗α４抗体を以前に投与した際の患者のクリアランス速度に従って調整され得る。例えば、患者は、患者の体内の抗α４抗体のレベルが既定のレベル未満に低下するまで、第２または後続の用量を投与されない場合がある。一実施形態において、患者のサンプル（例えば、血漿、血清、血液、尿、または脳脊髄液（ＣＳＦ））を抗α４抗体の存在についてアッセイし、抗α４抗体のレベルが既定のレベルを超えていれば、患者は第２または後続の用量を投与されない。患者の体内の抗α４抗体のレベルが既定のレベル未満であれば、患者は第２または後続の用量を投与される。抗α４レベルが高すぎる（既定のレベルを超える）と決定された患者は、１日もしくは２日もしくは３日、または１週間後に再度試験される場合があり、患者サンプル中の抗α４抗体のレベルが既定のレベル未満に低下していれば、患者に第２または後続の用量の抗体が投与され得る。
【０２９１】
この用量はまた、α４結合抗体に対する抗体の産生を低減または回避して、４０、５０、７０、７５、もしくは８０％超のα４サブユニットの飽和度を達成するか、８０、７０、６０、５０、もしくは４０％未満のα４サブユニットの飽和度を達成するか、または循環白血球細胞のレベル上昇を防止するように選択してもよい。
【０２９２】
特定の実施形態では、インプラント及びマイクロカプセル封入送達系を含む徐放性製剤のように、化合物の急速な放出を防ぐ担体とともに活性剤を調製してもよい。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用してもよい。かかる製剤の調製については、多くの方法が特許を受けているか、または一般に知られている。例えば、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｖ．Ｈ．Ｌ．Ｌｅｅ，ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７を参照されたい。
【０２９３】
医薬組成物は、医療デバイスによって投与してもよい。例えば、医薬組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号、または同第４，５９６，５５６号に開示されているデバイスなどの無針皮下注射デバイスによって投与してもよい。よく知られているインプラント及びモジュールの例は、例えば、制御された速度で医薬を分注するための植込み型微量注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号、皮膚を介して医薬を投与するための治療デバイスを開示する米国特許第４，４８６，１９４号、的確な注入速度で医薬を送達するための医薬注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号、連続的な薬物送達のための可変流量植込み型注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号、マルチチャンバーコンパートメントを有する浸透圧性薬物送達系を開示する米国特許第４，４３９，１９６号、及び浸透圧性薬物送達系を開示する米国特許第４，４７５，１９６号に記述されている。当然ながら、このようなインプラント、送達系、及びモジュールは、他にも多くのものが知られている。
【０２９４】
本開示は、第１及び第２の薬剤を投与するためのデバイスも特長とする。このデバイスは、例えば、医薬調製物を保管するための１つ以上の収容部を含むことができ、単位用量の第１及び第２の薬剤を送達するように構成されていてもよい。第１及び第２の薬剤は、同じまたは別々のコンパートメントに保管されてもよい。例えば、このデバイスは、投与前に薬剤を組み合わせることができる。異なるデバイスを使用して第１及び第２の薬剤を投与することも可能である。
【０２９５】
投与レジメンは、治療的応答または組み合わせの治療効果などの所望の応答をもたらすように調整される。概して、両方の薬剤を生体利用可能な量で対象に提供するために、任意の組み合わせの用量の（別々または合剤のいずれかの）ＶＬＡ−４結合剤及び第２の薬剤を使用することができる。
【０２９６】
本明細書で使用される単位剤形または「一定用量」とは、対象を処置するための投与量単位として適した物理的に別々の単位を意味し、各単位は、必要とされる薬学的担体との関連において、また場合により他の薬剤との関連において所望の治療効果をもたらすように計算された、既定量の活性化合物を含む。
【０２９７】
医薬組成物は、本明細書に記載の薬剤を「治療有効量」で含み得る。このような有効量は、投与される第１及び第２の薬剤の組み合わせ効果に基づいて決定され得る。薬剤の治療有効量は、個体の病状、年齢、性別、及び体重、ならびに、少なくとも１つの障害パラメータ、例えば、多発性硬化症パラメータの改善、または障害の少なくとも１つの症状、例えば、筋萎縮症、運動失調、及び振戦などの多発性硬化症の症状の改善のような、所望の応答を個体において誘発する化合物の能力といった要因によっても異なり得る。治療有効量は、治療上有益な効果が、組成物のいずれかの毒性効果または有害効果を上回るものでもある。
【０２９８】
Ｘ．デバイス及びキット
本明細書に記載の抗体を含む製剤は、医療デバイスによって投与してもよい。このデバイスは、緊急事態において、例えば訓練されていない対象または現場の救急隊員によって使用され、医療施設及び他の医療機器に移動され得るように、可搬性、室温保管、及び使用の容易さなどの特長を備えて設計されてもよい。このデバイスは、例えば、α４結合抗体を含む医薬調製物を保管するための１つ以上の収容部を含むことができ、１つ以上の単位用量の薬剤を送達するように構成されていてもよい。
【０２９９】
例えば、医薬組成物は、皮下シリンジまたはマルチチャンバーシリンジを含むシリンジなどの経皮送達デバイスによって投与してもよい。他の好適な送達デバイスとしては、ステント、カテーテル、マイクロニードル、及び植込み型徐放性デバイスが挙げられる。組成物は、例えば、インラインフィルターの有無を問わないＩＶチューブを含む、標準的なＩＶ機器で静脈内投与してもよい。特定の実施形態において、このデバイスは、ＳＣ投与またはＩＭ投与に使用されるシリンジである。
【０３００】
医薬組成物は、医療デバイスによって投与してもよい。例えば、医薬組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号、または同第４，５９６，５５６号に開示されているデバイスなどの無針皮下注射デバイスによって投与してもよい。よく知られているインプラント及びモジュールの例は、例えば、制御された速度で医薬を分注するための植込み型微量注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号、皮膚を介して医薬を投与するための治療デバイスを開示する米国特許第４，４８６，１９４号、的確な注入速度で医薬を送達するための医薬注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号、連続的な薬物送達のための可変流量植込み型注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号、マルチチャンバーコンパートメントを有する浸透圧性薬物送達系を開示する米国特許第４，４３９，１９６号、及び浸透圧性薬物送達系を開示する米国特許第４，４７５，１９６号に記載されている。治療用組成物は、皮下投与または筋肉内投与のための、生分解性または非生分解性の持続放出製剤の形態であってもよい。かかる組成物のための方法は、当技術分野において公知である。連続投与は、植込み型または外付けのポンプを使用して達成することもできる。投与は、間欠的に、例えば１日１回の注射により、または持続放出製剤のように低用量で連続的に実施してもよい。送達デバイスは、α４結合抗体の投与に最適となるように改変されてもよい。例えば、抗体の保管及び送達に最適な程度までシリンジをシリコン処理してもよい。当然ながら、このようなインプラント、送達系、及びモジュールは、他にも多くのものが知られている。
【０３０１】
本開示は、第１及び第２の薬剤（例えば、抗体及び第２の薬剤）を投与するためのデバイスも特長とする。このデバイスは、例えば、医薬調製物を保管するための１つ以上の収容部を含むことができ、単位用量の第１及び第２の薬剤を送達するように構成されていてもよい。第１及び第２の薬剤は、同じまたは別々のコンパートメントに保管されてもよい。一実施形態において、このデバイスは、投与前に薬剤を組み合わせる。いくつかの実施形態では、第１及び第２の薬剤は、異なるデバイスによって投与される。
【０３０２】
α４結合抗体は、キットで提供されてもよい。一実施形態において、キットは、（ａ）高濃度のＶＬＡ−４結合抗体を含む組成物を含む容器と、場合により、（ｂ）第２の薬剤を含む組成物を含む容器と、場合により、（ｃ）情報資料とを含む。情報資料は、本明細書に記載の方法及び／または治療的有用性のための薬剤の使用に関する説明資料、指導用資料、マーケティング資料、または他の資料であり得る。一実施形態において、キットはまた、第２の薬剤を含む。例えば、キットは、α４結合抗体を含む組成物を含む第１の容器、及び第２の薬剤を含む第２の容器を含む。
【０３０３】
キットの情報資料の形態は限定されない。一実施形態において、情報資料は、抗体の生産、濃度、有効期限、バッチまたは生産現場情報などに関する情報を含み得る。一実施形態において、情報資料は、α４結合抗体を、例えば、好適な用量、剤形、または投与様式（例えば、本明細書に記載の用量、剤形、または投与様式）で投与して、脊髄傷害もしくは外傷性脳傷害などの急性障害、もしくは炎症性疾患（例えば、ＭＳ）を有する対象、または炎症性疾患に関連するエピソードを経験するリスクを有する対象を処置する方法に関する。情報は、印刷された文章、コンピュータ可読資料、動画記録、もしくは音声記録、または実質的な資料へのリンクもしくはアドレスを提供する情報を含め、様々な形式で提供され得る。
【０３０４】
薬剤に加えて、キット内の組成物は、溶媒もしくはバッファー、安定剤、または保存剤などの他の成分を含んでもよい。薬剤は、任意の形態、例えば、液体、乾燥形態または凍結乾燥形態で提供されてもよく、実質的に純粋及び／または無菌であってもよい。薬剤が液体溶液で提供される場合、この液体溶液は、典型的には水溶液である。薬剤が乾燥形態で提供される場合、再構成は概して、好適な溶媒の添加による。溶媒、例えば、滅菌水またはバッファーが、場合により、キットにおいて提供されてもよい。
【０３０５】
キットは、薬剤を含む１つの組成物または複数の組成物のために１つ以上の容器を含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットは、組成物及び情報資料のための別個の容器、仕切り、またはコンパートメントを含む。例えば、組成物は、ボトル、バイアル、またはシリンジに含まれてもよく、情報資料は、プラスチックのスリーブまたはパケットに含まれてもよい。他の実施形態では、キットの別々の要素は、単一の分割されていない容器内に含まれる。例えば、組成物は、ラベルの形態で情報資料が添付されたボトル、バイアル、またはシリンジに含まれる。いくつかの実施形態では、キットには、１つ以上の単位剤形（例えば、本明細書に記載の剤形）の薬剤をそれぞれが含む、複数の個別容器（例えば、パック）が含まれる。容器には、併用単位投与量、例えば、α４結合抗体と第２の薬剤の両方を、例えば所望の比で含む単位が含まれ得る。例えば、キットには、例えば単一の併用単位用量をそれぞれが含む、複数のシリンジ、アンプル、ホイルパケット、ブリスターパック、または医療デバイスが含まれ得る。キットの容器には、気密性、防水性（例えば、水分の変化または蒸発に対する耐性）、及び／または遮光性があってもよい。
【０３０６】
キットは、場合により、組成物を投与するのに好適なデバイス、例えばシリンジ、または他の好適な送達デバイスを含む。このデバイスは、薬剤の一方または両方が予めロードされた状態で提供されてもよいし、空であるがロードするのに好適であってもよい。
【０３０７】
ＸＩ．腫瘍学
本明細書に記載のα４結合抗体及び方法は、固形癌及び血液系悪性腫瘍を含むがんを処置するために使用され得る。例示的な固形癌は、肺、乳房、膵臓、結腸、前立腺、膀胱、及び脳などの肉腫及び癌腫を含む。血液系悪性腫瘍は、多発性骨髄腫、白血病、及びリンパ腫などのがんを含む。
【０３０８】
血液系悪性腫瘍を有する患者を、本明細書に記載の抗ＶＬＡ−４抗体などのα４結合抗体を含む組成物で処置する方法が提供される。血液系悪性腫瘍は、身体の造血系及び免疫系のがんである。このタイプのがんは、血液、骨髄、及び／またはリンパ節に影響を及ぼす。血液系悪性腫瘍としては、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性前骨髄球性白血病、急性赤白血病、及びヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）などの白血病、ホジキン病及び非ホジキンリンパ腫などのリンパ腫、ならびに多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）（ＡＭＬに至る可能性がある）、骨髄増殖性疾患、例えば真性多血症（ＰＶ、ＰＣＶ、または真性一次性赤血球増加症（ＰＲＶ）とも呼ばれる）、本態性血小板増加症（ＥＴ）、骨髄線維症、重鎖病、ならびに軽鎖病に起因するアミロイドが挙げられる。
【０３０９】
血液系悪性腫瘍を有する患者は、血球数及び血液塗抹標本を、例えば、悪性細胞を同定するのに有用である光学顕微鏡によって分析することにより、同定することができる。骨髄などの生検を使用して悪性細胞を同定することもでき、リンパ節の生検は、リンパ節腫脹を同定するのに有用であり得る。
【０３１０】
α４結合抗体（例えば、ＨｕＨＰ１／２、Ｈ１Ｌ０、Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２またはＨ１Ｌ３などのヒト化抗ＶＬＡ−４抗体）は、ＡＭＬなどの白血病の処置に有用である。白血病は、骨髄から発生するがんであり、悪性細胞は白血球細胞（白血球）である。ＡＭＬ（急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性顆粒球白血病、及び急性非リンパ性白血病とも呼ばれる）は、顆粒球または単球のいずれかから生じる悪性腫瘍である。ＡＭＬは、正常な血液細胞として機能できない白血病性芽球と呼ばれる細胞の無制御で過剰な増殖及び蓄積、ならびに正常な骨髄細胞の生成の遮断を特徴とし、血液中の赤血球の欠乏（貧血）、及び血小板の欠乏（血小板減少症）及び正常白血球の欠乏（特に好中球の欠乏、すなわち好中球減少症）をもたらす。
【０３１１】
全てのサブタイプのＡＭＬが、ＶＬＡ−４結合抗体による処置に好適である。ＡＭＬのサブタイプは、骨髄芽球が診断時に達している発生段階に基づいて分類される。この分類及びサブセットにより、医師は、その細胞型に最も良好に作用する処置は何か、そして疾患がどれほど速く発生し得るかを決定することができる。このサブセットは、Ｍ０、特殊分析により骨髄芽球性；Ｍ１、骨髄芽球性、成熟なし；Ｍ２、骨髄芽球性、成熟あり；Ｍ３、前骨髄球性；Ｍ４、骨髄単球性；Ｍ５、単球性；Ｍ６、赤白血病；及びＭ７、巨核球性である。ＶＬＡ−４抗体は、ＡＭＬのサブタイプに特に適した二次的薬剤とともに投与してもよい。例えば、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）及び急性単球性白血病は、他のサブタイプのＡＭＬとは異なる処置を必要とするＡＭＬのサブタイプである。ＡＰＬの処置のための第２の薬剤は、全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）またはシタラビンなどの代謝拮抗薬を含み得る。急性単球性白血病の処置のための第２の薬剤は、２−クロロ−２’−デオキシアデノシン（２−ＣＤＡ）などのデオキシアデノシン類似体を含み得る。
【０３１２】
ＡＭＬのリスク因子としては、ダウン症候群、ファンコニ貧血、シュワックマン−ダイアモンド症候群、及び他のものなどの特定の遺伝性障害の存在が挙げられる。ＡＭＬ及び遺伝性障害を有する患者には、ＶＬＡ−４結合抗体、及び遺伝性障害の症状を処置するための第２の薬剤を投与してもよい。例えば、ＡＭＬ及びファンコニ貧血を有する患者には、ＶＬＡ−４結合抗体及び抗生物質を投与してもよい。
【０３１３】
ＡＭＬの他のリスク因子としては、異なるがんの処置のための化学療法または放射線療法、タバコの煙、及び大量のベンゼンへの曝露が挙げられる。
【０３１４】
α４結合抗体による処置に好適な他のがんとしては、肉腫及び癌腫などの固形腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、卵巣癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、小細胞肺癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、シュワン腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫）が挙げられる。
【０３１５】
ＸＩＩ．他の障害
本明細書に記載の製剤及び方法は、他の炎症性障害、免疫障害、または自己免疫障害、例えば、中枢神経系の炎症（例えば、多発性硬化症に加えて、髄膜炎、視神経脊髄炎、神経サルコイドーシス、ＣＮＳ血管炎、脳炎、及び横断性脊髄炎）；組織もしくは臓器の移植片拒絶または移植片対宿主病；急性ＣＮＳ傷害、例えば、脳卒中または脊髄傷害（ＳＣＩ）；慢性腎疾患；アレルギー、例えば、アレルギー性喘息、中等度から重度のアレルギー性鼻炎、眼アレルギー；１型真性糖尿病；炎症性腸障害、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎（例えば、処置または寛解の維持のため）；てんかん；好酸球性胃腸炎；重症筋無力症；線維筋痛症；リウマチ学／免疫学に関連する障害、例えば関節炎障害、例えば、関節リウマチ、乾癬性関節炎；皮膚科的障害、例えば炎症性／免疫皮膚障害、例えば、乾癬、白斑、皮膚炎（例えば、アトピー性皮膚炎）、扁平苔癬、中等度から重度の慢性蕁麻疹；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ；例えば、ループス腎炎）；強皮症（例えば、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、例えば肺のＰＳＳ）；急性または慢性の原発性好酸球性肺炎；シェーグレン症候群；急性冠症候群（ＡＣＳ）；急性心筋梗塞；粥状動脈硬化；ならびに線維性障害、例えば、肺線維症（例えば、特発性肺線維症）、肺線維症（例えば、ＸＲＴ誘発性）、骨髄線維症、肝硬変、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、半月体形成性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、及び間質性腎線維症を処置するために使用することもできる。好ましい実施形態では、製剤は、てんかんを処置するために使用され得る。
【０３１６】
本明細書に記載の製剤及び方法は、一過性脳虚血発作及び／または動脈狭窄を有する患者における防止を含め、脳虚血などの神経障害を処置するために使用することもできる。他の例示的な神経障害としては、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）、黄斑変性症（例えば、滲出型黄斑変性症）、及び前部虚血性視神経症などの眼疾患、神経障害性疼痛（例えば、症候性神経障害性疼痛）、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（例えば、疾患修飾性ＡＬＳ）及びパーキンソン病が挙げられる。
【０３１７】
本明細書に記載の製剤及び方法は、腎臓、心臓、または骨髄の移植などの移植を受けた患者を処置するために使用することもできる。
【０３１８】
ＸＩＩＩ．多発性硬化症
本明細書に記載のアルファ４結合抗体を含む製剤は、多発性硬化症（ＭＳ）などの炎症性疾患の処置に有用である。多発性硬化症は、炎症及びミエリン鞘の喪失を特徴とする中枢神経系疾患である。
【０３１９】
ＭＳ患者は、ＭＳの診断に関する研究集会によって定義される臨床的に明確なＭＳの診断を確立する基準によって同定され得る（Ｐｏｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１３：２２７，１９８３）。例えば、臨床的に明確なＭＳを有する個体は、２回の発作、ならびに、２つの病変の臨床的証拠か、または１つの病変の臨床的証拠及び別の別個の病変の臨床関連領域の証拠のいずれかがあったものである。明確なＭＳはまた、２回の発作の証拠及び脳脊髄液中のＩｇＧのオリゴクローナルバンド、または発作、２つの病変の臨床的証拠、及び脳脊髄液中のＩｇＧのオリゴクローナルバンドの組み合わせによって診断され得る。ＭｃＤｏｎａｌｄ基準を使用してＭＳを診断することもできる（ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，“Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，”Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．５０：１２１−１２７）。ＭｃＤｏｎａｌｄ基準には、複数の臨床的発作がない場合に、ＭＳの診断に使用される、一定期間にわたるＣＮＳ機能障害のＭＲＩによる証拠の使用が含まれる。多発性硬化症の効果的な処置はいくつかの異なる方法で評価され得る。以下のパラメータが、処置の実効性を測るために使用され得る。２つの例示的な基準は、ＥＤＳＳ（総合能力障害度スケール）、及びＭＲＩ（磁気共鳴画像法）での増悪の出現を含む。ＥＤＳＳは、ＭＳに起因する臨床的機能障害をグレード分けする方法である（Ｋｕｒｔｚｋｅ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３３：１４４４，１９８３）。８つの機能系が、神経学的機能障害のタイプ及び重症度について評価される。簡単に説明すると、処置の前に、錐体系、小脳系、脳幹系、感覚系、腸及び膀胱系、視覚系、大脳系、及びその他の機能障害について患者を評価する。所定の間隔でフォローアップを実施する。スケールは、０（正常）から１０（ＭＳによる死亡）の範囲である。１ステップ全体の減少は、効果的な処置を示す（Ｋｕｒｔｚｋｅ，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３６：５７３−７９，１９９４）。患者は、当業者によって使用される他の基準を使用して診断されてもよい。
【０３２０】
増悪は、ＭＳに起因し、妥当な新しい神経学的異常を伴う新しい症状の出現として定義される（上記のＩＦＮＢ  ＭＳ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ）。さらに、増悪は、少なくとも２４時間持続し、かつ少なくとも３０日間の安定状態または改善が先行する必要がある。簡単に説明すると、患者は臨床医による標準的な神経学的検査を受ける。増悪は、ＮＲＳ（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ）の変化に従って軽度、中等度、または重度である（Ｓｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３４：１３６８，１９８４）。年間の増悪率及び無増悪患者の割合を決定する。
【０３２１】
療法は、無増悪または無再発の患者の率または割合に関して、これらの測定値のいずれかについて処置群とプラセボ群との間で統計的に有意な差がある場合に、効果的であるとみなされ得る。さらに、最初の増悪までの時間、ならびに増悪の持続期間及び重症度も測定され得る。これに関する療法としての実効性の尺度は、処置群と対照群との比較における最初の増悪までの時間または持続期間及び重症度の統計的に有意な差である。１年、１８か月、または２０か月を超える無増悪または無再発期間が特に注目に値する。有効性はまた、例えば、単独でまたは他の基準と組み合わせて使用される時限歩行試験を使用して、可動性の向上を含むＭＳの症状を評価するための、当技術分野において公知の任意の方法を使用して評価され得る。
【０３２２】
第１の薬剤と、場合により第２の薬剤の投与の有効性は、次の基準：限界希釈により決定されるＭＢＰ反応性Ｔ細胞の出現頻度、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞株及びクローンの増殖応答、患者から確立されたＭＢＰに対するＴ細胞株及びクローンのサイトカインプロファイルのうちの１つ以上に基づいて評価することもできる。有効性は、反応性細胞の出現頻度の減少、天然型と比較した修飾ペプチドによるチミジン組み込みの低減、ならびにＴＮＦ及びＩＦＮ−αの低減によって示される。
【０３２３】
臨床測定値としては、１年及び２年の間隔での再発率、ならびに６か月持続するＥＤＳＳのベースラインから１．０単位の進行があるまでの時間を含むＥＤＳＳの変化が挙げられる。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線において、能力障害の持続的進行の遅延は、有効性を示す。他の基準としては、ＭＲＩでのＴ２画像の面積及び容積の変化、ならびにガドリニウム増強画像によって決定される病変の数及び体積が挙げられる。
【０３２４】
ＭＲＩを使用すると、ガドリニウム−ＤＴＰＡ増強画像法（ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３６：１４，１９９４）を使用して活動性病変を測定したり、またはＴ２重み付け技術を使用して病変の場所及び範囲を測定したりすることができる。簡単に説明すると、ベースラインのＭＲＩを得る。以降の各試験では、同じ結像面及び患者体位を使用する。位置決め及びイメージングシーケンスは、病変の検出を最大限にし、病変の追跡を容易にするように選択してもよい。同じ位置決め及びイメージングシーケンスをその後の試験に使用してもよい。ＭＳ病変の存在、場所、及び範囲は、放射線科医によって決定され得る。病変面積をスライス毎に概算し、合計して総病変面積を求めてもよい。新しい病変の証拠、活動性病変の出現率、病変面積の変化率の３つの分析を行ってもよい（Ｐａｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４３：６６５，１９９３）。療法による改善は、個々の患者のベースラインとの比較、または処置群とプラセボ群との対比における、統計的に有意な改善によって確立され得る。
【０３２５】
本明細書に記載の方法で処置され得る多発性硬化症に関連する例示的な症状としては、視神経炎、複視、眼振、眼球運動失調、核間性眼筋麻痺、動き及び音による光視症、求心性瞳孔障害、不全麻痺、不全単麻痺、不全対麻痺、不全片麻痺、四肢不全麻痺、麻痺、対麻痺、片麻痺、四肢麻痺（ｔｅｔｒａｐｌｅｇｉａ）、四肢麻痺（ｑｕａｄｒａｐｌｅｇｉａ）、痙縮、構音障害、筋萎縮症、攣縮、筋痙攣、筋緊張低下、クローヌス、ミオクローヌス、ミオキミア、むずむず脚症候群、下垂足、反射機能不全、錯感覚、感覚消失、神経痛、神経障害性疼痛及び神経原性疼痛、レルミット徴候（ｌ’ｈｅｒｍｉｔｔｅ’ｓ）、固有感覚機能不全、三叉神経痛、運動失調、企図振戦、測定異常、前庭性運動失調、めまい、言語失調、ジストニア、拮抗運動反復不全、頻尿、膀胱痙縮、弛緩性膀胱、排尿筋・括約筋筋失調、勃起機能不全、無オルガスム症、冷感症、便秘、便意切迫感、便失禁、鬱、認知機能不全、認知症、気分変動、情緒不安定、多幸感、双極性症候群、不安、失語症、言語障害、疲労、ウートホフ症状、胃食道逆流、及び睡眠障害が挙げられる。
【０３２６】
ＭＳの各症例は、いくつかの提示パターン及びその後の経過のうちの１つを示す。最も一般的には、ＭＳはまず一連の発作として現れ、その後不思議なことに症状が軽減するにつれて完全または部分的に寛解するが、安定期間後に結局再発する。これは、再発寛解型（ＲＲ）ＭＳと呼ばれる。ＣＩＳ（Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）は、別の再発型ＭＳである。ＣＩＳは、少なくとも２４時間持続する神経症状の最初のエピソードを意味し、中枢神経系（ＣＮＳ）における炎症または脱髄（神経細胞を覆うミエリンの喪失）によって引き起こされる。一次性進行型（ＰＰ）ＭＳは、症状の一時的な安定期またはわずかな緩和があり得るものの、明確な寛解のない段階的な臨床的衰弱を特徴とする。活動性一次性進行型ＭＳは、患者が時折再発を経験する場合、またはＭＲＩで新しい病変の証拠がある場合に生じる。「非活動性」または「進行あり」とは、再発の有無にかかわらず、または新しい病変がＭＲＩで示されるか否かにかかわらず、症状が経時的に悪化している証拠があることを意味する。二次性進行型（ＳＰ）ＭＳは、再発寛解型の経過から始まり、その後に一次性進行型の経過が続く。活動性二次性進行型ＭＳは、再発型ＭＳの１つと考えられている。稀に患者は進行性再発型（ＰＲ）の経過をたどる場合があり、この場合、疾患は、急性発作が断続して起こる進行性の経過をとる。ＰＰ、ＳＰ、及びＰＲは一緒にまとめられて、慢性進行性ＭＳと呼ばれることがある。
【０３２７】
したがって、再発型の多発性硬化症（または単に再発性多発性硬化症）は、限定されるものではないが、ＣＩＳ（ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）、及び活動性二次性進行型多発性硬化症（活動性ＳＰＭＳ）を含む。
【０３２８】
少数の患者は、疾患の発症直後に著しい能力障害またはさらには死をもたらす、迅速かつ過酷な衰弱として定義される悪性ＭＳを経験する。この衰弱は、本明細書に記載の治療薬の投与によって抑止または減速され得る。
【０３２９】
本明細書に特長として挙げられる抗α４抗体の投与は、ＭＳの１つ以上の症状、例えば上述の症状のうちの１つ以上を緩和するのに効果的であり得る。例えば、本明細書に記載の抗α４抗体の投与は、一次性進行型または二次性進行型の多発性硬化症（それぞれＰＰＭＳまたはＳＰＭＳ）を処置するために使用することができ、抗α４抗体による処置は、再発を防止するのに効果的であり得る。
【０３３０】
ヒト試験に加えて、またはその前に、動物モデルを使用して、２つの薬剤を使用することの有効性を評価してもよい。多発性硬化症の例示的な動物モデルは、実験的自己免疫脳炎（ＥＡＥ）マウスモデル、例えば、（Ｔｕｏｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）１４１：１１２６−１１３０）、Ｓｏｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８４）１３２：２３９３−２４０１）、及びＴｒａｕｇｏｔｔ（Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１１９：１１４−１２９）に記載されているものである。マウスには、ＥＡＥの誘導の前に、本明細書に記載の第１及び第２の薬剤を投与してもよい。次いで、マウスを特徴の基準について評価して、そのモデルにおいて２つの薬剤を使用することの有効性を決定する。
【０３３１】
ＸＩＶ．てんかん
本明細書に記載のアルファ４結合抗体を含む製剤は、てんかんの処置に有用である。
【０３３２】
てんかん発作は、脳波記録法または臨床的手段によって検出され得るニューロンの異常放電に起因する発作性エピソードであり、脳の特定の患部が臨床的発現に影響する。てんかん発作は、基本的に、ニューロン膜または興奮及び阻害のプロセスに関連し得るニューロンの基本的な興奮性の不均衡から生じる。Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ  ４５（１２）：１５６８−１５７９，２００４も参照されたい。てんかんは、概念的には、てんかん発作を生じる永続的素因、ならびにこの状態の神経生物学的、認知的、心理的、及び社会的な帰結を特徴とする脳の障害として定義される（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｒ．Ｓ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．２８（２）：１３０−５，２０１５）。てんかんの有病率及び発生率の近年の調査では、１０００人当たり７．６の生涯有病率及び１００，０００人当たり６７．７７の年間累積発生率が報告された（Ｆｉｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ８８（３）：２９６−３０３，２０１７）。
【０３３３】
本発明より前には、てんかん患者の一般的な療法は抗てんかん薬（ＡＥＤ）であり、患者のおよそ７０％がＡＥＤ療法により良好な発作の制御を達成すると推定されている。耐容性が示され適切に選択及び使用されるＡＥＤの２回（またはそれ以上）の妥当な試験が成功しない患者は、薬剤抵抗性てんかんを有すると定義される（Ｋｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ．５１（６）：１０６９−７７，２０１０、及びＥｐｉｌｅｐｓｉａ．５１（９）：１９２２，２０１０の正誤表を参照されたい）。これらの患者については、てんかん手術、神経刺激デバイス、特殊な食事、行動療法、及び他の実験的処置を含む他の療法が検討される。ＡＥＤは典型的に、電位依存性もしくはリガンド開口型のイオンチャネルの調整により、または阻害性もしくは興奮性の神経伝達物質系に対する効果によって機能する。現在、２０種を超えるＡＥＤが市販されている。より新しい多くのＡＥＤが過去数年で発売されているにもかかわらず、てんかんの管理における新薬及び旧薬の有効性は概して等しく、薬剤抵抗性てんかん歴のある患者が新しい療法によって発作から解放されることは依然として稀である。
【０３３４】
発作の制御を改善する、または薬剤抵抗性てんかんの発作を消失させる療法を開発する必要性は依然として高く、未だ満たされていない。てんかんの発病における免疫系及び炎症の潜在的役割を標的とすることは、ＡＥＤ開発及び臨床試験において十分に調査されていない領域を代表する。てんかんの実験モデルとてんかんのヒト患者の両方から得られた証拠は、炎症の役割を示唆している。本明細書に開示される製剤は、てんかんを処置するために使用することができる。例えば、（ａ）配列番号８０の配列を含む重鎖と、（ｂ）配列番号８１の配列を含む軽鎖とを含む、組換え抗アルファ４抗体またはそのアルファ４結合性断片を含む製剤は、てんかんを患う患者に投与され得る。α４インテグリンをブロックすると、白血球と血管の相互作用が低減し、ＢＢＢの完全性が安定化すると仮定されている。さらに、発作により誘導される、てんかんを低減させる白血球と血管の相互作用は、発作の頻度及び重症度を低減させると仮定されている。
【０３３５】
ＸＶ．抗体の生成
アルファ４に結合する組換え抗体は、インビボまたはインビトロの方法、例えばファージディスプレイによって生成され得る。これらの方法を使用して、本明細書に記載のＣＤＲグラフト抗体に使用される抗α４  ＣＤＲを供給することができる。さらに、ファージディスプレイなどの方法を使用して、例えば、フレームワークが生殖系列フレームワークであるライブラリを使用することにより、本明細書に開示される生殖系列フレームワークとの関連で、そのようなＣＤＲを選択することができる。
【０３３６】
ＥＰ  ２３９  ４００（Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）は、１つの種の相補性決定領域（ＣＤＲ）の別の種由来のものへの置換（所与の可変領域内）により抗体を変化させることについて記載している。ＣＤＲ置換抗体は、真のキメラ抗体と比較して著しく少ない非ヒト成分を含むため、ＣＤＲ置換抗体は、ヒトにおいて免疫応答を誘発する可能性が低い場合がある（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，３２３−３２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，１５３４−１５３６）。典型的には、組換え核酸技術を使用することにより、マウス抗体のＣＤＲを、ヒト抗体の対応する領域に置換して、所望の置換抗体をコードする配列をもたらす。所望のアイソタイプ（通常、ＣＨはガンマＩ、ＣＬはカッパ）のヒト定常領域遺伝子セグメントを付加してよく、重鎖及び軽鎖の遺伝子を哺乳動物細胞で同時発現させて、可溶性抗体を生成することができる。大きな非免疫ファージディスプレイライブラリを使用して、標準的なファージ技術を使用してヒト治療薬として開発され得る高親和性抗体を単離することもできる（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１−２０、及びＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ２：３７１−８、Ｕ．Ｓ．２００３−０２３２３３３を参照されたい）。
【０３３７】
本明細書に記載の抗α４抗体または抗体断片は、同族リガンド、例えば、ＶＣＡＭ−１またはフィブロネクチンへの結合に関与するα４サブユニットのエピトープを認識し、それらに特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、抗α４抗体またはその抗体断片は、α４インテグリンのＢエピトープを認識し、それに特異的に結合する。本明細書に記載の抗体の結合は、同族リガンド（例えば、ＶＣＡＭ−１及びフィブロネクチン）のうちの１つ以上へのα４インテグリンの結合を阻害し得る。
【０３３８】
いくつかの実施形態では、本明細書に特長として挙げられる抗体は、細胞、例えばリンパ球のＶＬＡ−４と相互作用し得るが、細胞凝集を引き起こすことはない。
【０３３９】
例示的なα４結合抗体は、１つ以上のＣＤＲ、例えば、本明細書に開示される特定の抗体の３つ全ての重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ及び／または３つ全ての軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ、または合計してかかる抗体と少なくとも８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９％同一であるＣＤＲを有する。一実施形態において、Ｈ１及びＨ２超可変ループは、本明細書に記載の抗体のものと同じ古典的構造を有する。一実施形態において、Ｌ１及びＬ２超可変ループは、本明細書に記載の抗体のものと同じ古典的構造を有する。
【０３４０】
一実施形態において、ＨＣ及び／またはＬＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、本明細書に記載の抗体のＨＣ及び／またはＬＣ可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９、または１００％同一である。ＨＣ及び／またはＬＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、本明細書に記載の抗体の対応する配列と、少なくとも１個のアミノ酸から、１０、８、６、５、４、３、または２個以下のアミノ酸だけ異なっていてもよい。例えば、その差は、主に、または完全に、フレームワーク領域内にあってもよい。
【０３４１】
ＨＣ及びＬＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、本明細書に記載の核酸配列に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列、または本明細書に記載の可変ドメインもしくはアミノ酸配列をコードするものによってコードされ得る。一実施形態において、ＨＣ及び／またはＬＣ可変ドメインの１つ以上のフレームワーク領域（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び／またはＦＲ４）のアミノ酸配列は、本明細書に記載の抗体のＨＣ及びＬＣ可変ドメインの対応するフレームワーク領域と少なくとも７０、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９、または１００％同一である。一実施形態において、１つ以上の重鎖または軽鎖フレームワーク領域（例えば、ＨＣＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３）は、ヒト生殖系列抗体の対応するフレームワーク領域の配列と少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または１００％同一である。
【０３４２】
２つの配列間の「相同性」または「配列同一性」（これらの用語は本明細書では同義に使用される）の計算は次のように行われる。最適な比較の目的のために配列をアラインする（例えば、最適なアラインメントのために第１及び第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入してもよく、比較目的で非相同配列を無視してもよい）。最適なアラインメントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用し、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、及びフレームシフトギャップペナルティ５でＢｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリング行列を用いた場合に最も良好なスコアとして決定される。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合、これらの分子は、その位置にて同一である（本明細書で使用されるとき、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と等しい）。２つの配列間の同一性パーセントは、配列に共通する同一の位置の数の関数である。
【０３４３】
本明細書で使用される場合、「高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」という用語は、ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を表す。ハイブリダイゼーション反応を行うための指針は、参照により本明細書に援用されるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６で確認することができる。この参考文献には、水性及び非水性の方法が記載されており、いずれを使用してもよい。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件には、約４５℃の６×ＳＳＣでのハイブリダイゼーションに続いて、６５℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回以上の洗浄、または実質的に同様の条件が含まれる。
【０３４４】
ＸＶＩ．抗体産生
抗体は、原核細胞及び真核細胞で産生され得る。一実施形態において、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、Ｐｉｃｈｉａ（例えば、Ｐｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５１：１２３−３５）、Ｈａｎｓｅｕｌａ、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの酵母細胞で発現される。
【０３４５】
一実施形態において、抗体、特に全長抗体、例えば、ＩｇＧは、哺乳動物細胞で産生される。組換え発現のための例示的な哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されるような、ＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用される、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、リンパ球細胞株、例えば、ＮＳ０骨髄腫細胞及びＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞、Ｋ５６２、及びトランスジェニック動物、例えば、トランスジェニック哺乳動物の細胞が挙げられる。例えば、細胞は、乳腺上皮細胞である。
【０３４６】
免疫グロブリンドメインをコードする核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは、追加の核酸配列、例えば、宿主細胞内でのベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）及び選択可能マーカー遺伝子を搭載することができる。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターを導入した宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号、及び同第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例示的な選択可能マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞におけるメトトレキサート選択／増幅での使用）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が挙げられる。
【０３４７】
抗体（例えば、全長抗体またはその抗原結合部分）の例示的な組換え発現系では、抗体重鎖と抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを、リン酸カルシウムによるトランスフェクションによってｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクターでは、抗体の重鎖及び軽鎖の遺伝子がそれぞれ、エンハンサー／プロモーター調節エレメント（例えば、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントまたはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントのような、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなどに由来するもの）に作動可能に連結されて、遺伝子の高レベルの転写を推進する。組換え発現ベクターはＤＨＦＲ遺伝子も搭載し、これにより、メトトレキサート選択／増幅を使用した、ベクターがトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択が可能になる。選択された形質転換体宿主細胞を培養すると、抗体重鎖及び軽鎖の発現が可能になり、インタクト抗体が培養培地から回収される。組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、抗体を培養培地から回収するためには、標準的な分子生物学技術が使用される。例えば、いくつかの抗体は、プロテインＡまたはプロテインＧを用いたアフィニティクロマトグラフィによって単離することができる。例えば、精製されたα４結合抗体は、当技術分野において公知のタンパク質濃縮技術を使用して、約１００ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬに濃縮され得る。
【０３４８】
抗体はまた、修飾、例えば、Ｆｃ機能を変化させて、例えば、Ｆｃ受容体もしくはＣ１ｑ、または両方との相互作用を減少または除去する修飾を含んでもよい。例えば、ヒトＩｇＧ４定常領域は、ヒンジ領域を固定する、残基２２８のＳｅｒからＰｒｏへの変異を有し得る。ＩｇＧ４  Ｆｃ（ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３ドメイン）のアミノ酸配列を図５に提示する。
【０３４９】
別の例において、ヒトＩｇＧ１定常領域は、例えば、米国特許第５，６４８，２６０号における付番による、１つ以上の残基、例えば、残基２３４及び２３７のうちの１つ以上で変異していてもよい。他の例示的な修飾は、米国特許第５，６４８，２６０号に記載されるものを含む。
【０３５０】
Ｆｃドメインを含むいくつかの抗体では、抗体生成系は、Ｆｃ領域がグリコシル化されている抗体を合成するように設計されてもよい。別の例において、ＩｇＧ分子のＦｃドメインは、ＣＨ２ドメイン内のアスパラギン２９７でグリコシル化されている（図５を参照されたい）。このアスパラギンは、二分岐タイプのオリゴ糖での修飾部位である。このグリコシル化は、Ｆｃγ受容体及び補体Ｃ１ｑにより媒介されるエフェクター機能に関与する（Ｂｕｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｏｏｆ（１９９２）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１：１−８４、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６３：５９−７６）。Ｆｃドメインは、アスパラギン２９７に対応する残基を適切にグリコシル化する哺乳動物発現系で産生され得る。Ｆｃドメインは、他の真核生物の翻訳後修飾を含んでもよい。
【０３５１】
他の好適なＦｃドメイン修飾としては、ＷＯ２００４／０２９２０７に記載のものが挙げられる。例えば、Ｆｃドメインは、ＸＭＡＢ（登録商標）Ｆｃ（Ｘｅｎｃｏｒ，Ｍｏｎｒｏｖｉａ，ＣＡ）であり得る。Ｆｃドメインまたはその断片は、ＷＯ０５／０６３８１５に記載のドメイン及び断片のように、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）結合領域に置換を有してもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインまたはその断片は、ＷＯ０５０４７３２７に記載のドメイン及び断片のように、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合領域に置換を有する。他の実施形態では、Ｆｃドメインは、一本鎖、またはその断片、またはその修飾型、例えばＷＯ２００８１４３９５４に記載のものである。他の好適なＦｃ修飾は、当技術分野において公知であり、説明されている。
【０３５２】
抗体は、トランスジェニック動物によって産生されてもよい。例えば、米国特許第５，８４９，９９２号は、トランスジェニック哺乳動物の乳腺で抗体を発現させる方法を記載する。乳汁特異的プロモーターと、目的の抗体、例えば本明細書に記載の抗体、及び分泌のためのシグナル配列をコードする核酸配列とを含む、導入遺伝子が構築される。このようなトランスジェニック哺乳動物の雌によって生成される乳汁には、分泌された目的の抗体、例えば、本明細書に記載の抗体が含まれる。抗体は、乳汁から精製してもよいし、またはいくつかの用途では直接使用してもよい。
【０３５３】
抗体は例えば、循環中、例えば血液、血清、リンパ、気管支肺胞洗浄液、または他の組織におけるその安定化及び／または保持を、例えば、少なくとも１．５、２、５、１０、または５０倍向上させる部分で修飾されていてもよい。
【０３５４】
例えば、ＶＬＡ−４結合抗体は、ポリマー、例えば、実質的に非抗原性のポリマー、例えばポリアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシドに会合してもよい。好適なポリマーは、重量が実質的に異なる。約２００〜約３５，０００ダルトン（または約１，０００〜約１５，０００、２，０００〜約１２，５００）の範囲の数平均分子量を有するポリマーを使用することができる。
【０３５５】
例えば、ＶＬＡ−４結合抗体は、水溶性ポリマー、例えば、親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンにコンジュゲートしていてもよい。そのようなポリマーの非限定的なリストには、ポリアルキレンオキシドホモポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、それらのコポリマー及びそれらのブロックコポリマーが含まれるが、ただし、ブロックコポリマーの水溶性が維持されることを条件とする。さらなる有用なポリマーとしては、ポリオキシアルキレン、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、及びポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロックコポリマー（プルロニック）；ポリメタクリル酸；カルボマー；ラクトース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、または酸ムコ多糖、例えばヒアルロン酸の多糖サブユニットなどのホモ多糖及びヘテロ多糖を含む、糖類単量体Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース及びＬ−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（例えばポリマンヌロン酸、またはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコース及びノイラミン酸を含む分枝状または非分枝状の多糖；ポリソルビトール及びポリマンニトールなどの糖アルコールのポリマー；ヘパリンまたはヘパロンが挙げられる。
【０３５６】
ＸＶＩＩ．例示的な第２の薬剤
いくつかの場合において、本明細書に記載の製剤、例えば、アルファ４結合抗体を含む製剤は、第２の薬剤を含むか、または第２の薬剤を含む製剤と組み合わせて投与される。
【０３５７】
一実施態様において、α４結合抗体及び第２の薬剤は、合剤として用意され、この合剤が対象に投与される。さらに、例えば、合剤の投与の少なくとも２４時間前または後に、α４結合抗体製剤を一用量、次いで第２の薬剤を含む製剤を一用量、別々に投与することが可能である。別の実施態様では、抗体及び第２の薬剤は、別々の製剤として用意され、投与のステップは、抗体及び第２の薬剤を連続投与することを含む。連続投与は、同じ日に（例えば、互いの１時間以内に、または少なくとも３、６、もしくは１２時間おいて）、または異なる日に行ってもよい。
【０３５８】
概して、抗体及び第２の薬剤はそれぞれ、時間的な隔たりがある複数の用量として投与される。抗体及び第２の薬剤は概して、それぞれレジメンに従って投与される。一方または両方のレジメンは、規則的な周期性を有し得る。抗体のレジメンは、第２の薬剤のレジメンと異なる周期性を有してもよく、例えば、一方が他方よりも頻繁に投与されてもよい。一実施態様において、抗体及び第２の薬剤のうちの一方は、１週間に１回投与され、他方は１か月に１回投与される。別の実施態様では、抗体及び第２の薬剤のうちの一方は、連続的に、例えば、３０分超から１、２、４、または１２時間未満の期間にわたって投与され、他方はボーラスとして投与される。抗体及び第２の薬剤は、任意の適切な方法により、例えば、皮下、筋肉内、または静脈内に投与され得る。
【０３５９】
いくつかの実施形態では、抗体及び第２の薬剤はそれぞれ、単独療法のために処方される各用量と同じ用量で投与される。他の実施形態では、抗体は、単独で投与した場合の有効性に必要な量以下の投与量で投与される。同様に、第２の薬剤は、単独で投与した場合の有効性に必要な量以下の投与量で投与され得る。
【０３６０】
α４結合抗体との組み合わせで多発性硬化症を処置するための第２の薬剤の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる。
・インターフェロン、例えば、ヒトインターフェロンベータ−１ａ（例えば、ＡＶＯＮＥＸ（登録商標）またはＲＥＢＩＦ（登録商標））及びインターフェロンベータ−１ｂ（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（商標）；１７位で置換されたヒトインターフェロンベータ；Ｂｅｒｌｅｘ／Ｃｈｉｒｏｎ）、
・グラチラマー酢酸塩（別称コポリマー１、Ｃｏｐ−１；ＣＯＰＡＸＯＮＥ（商標）；Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、
・ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ）、またはリツキシマブと競合するか、もしくはリツキシマブと重複するエピトープに結合する抗体を含む別の抗ＣＤ２０抗体、
・ミトキサントロン（ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（登録商標）、Ｌｅｄｅｒｌｅ）、
・オピシヌマブなどの髄鞘再生剤、
・化学療法薬、例えば、クラブリビン（ｃｌａｂｒｉｂｉｎｅ）（ＬＥＵＳＴＡＴＩＮ（登録商標））、アザチオプリン（ＩＭＵＲＡＮ（登録商標））、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））、シクロスポリン−Ａ、メトトレキサート、４−アミノピリジン、及びチザニジン、
・コルチコステロイド、例えば、メチルプレドニゾロン（ＭＥＤＲＯＮＥ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）、プレドニゾン、
・免疫グロブリン、例えば、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ）；ＣＴＬＡ４Ｉｇ；アレムツズマブ（ＭＡＢＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））またはダクリズマブ（ＣＤ２５に結合する抗体）、
・スタチン、及び
・ＴＮＦアンタゴニスト。
【０３６１】
グラチラマー酢酸塩は、グルタミン酸、リジン、アラニン、及びチロシンのアミノ酸のランダムな鎖から形成されるタンパク質である（よってグラチラマー（ＧＬＡＴｉｒａｍｅｒ）という）。グラチラマー酢酸塩は、溶液中で、Ｎ−カルボキシアミノ酸無水物を使用し、これらのアミノ酸から、アラニンおよそ５部とリジン３部、グルタミン酸１．５部、及びチロシン１部の比で合成され得る。
【０３６２】
さらなる第２の薬剤は、他のヒトサイトカインまたは増殖因子、例えば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−１１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、及びＰＤＧＦの抗体またはアンタゴニストを含む。さらに他の例示的な第２の薬剤は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９０などの細胞表面分子に対する抗体、またはそれらのリガンドを含む。例えば、ダクリズマブは、多発性硬化症を改善し得る抗ＣＤ２５抗体である。
【０３６３】
さらに他の例示的な抗体は、インターフェロン受容体、例えば、インターフェロンベータ受容体を動員する抗体のような、本明細書に記載の薬剤の活性をもたらす抗体を含む。典型的に、第２の薬剤が抗体を含む実施態様において、これは、ＶＬＡ−４以外もしくはα４インテグリン以外の標的タンパク質、または少なくとも第１の薬剤が認識し特異的に結合するもの以外のＶＬＡ−４上のエピトープに特異的に結合する。
【０３６４】
さらに他の付加的な例示的な第２の薬剤としては、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えば、ホスホジエステラーゼ阻害因子、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害因子、アドレナリン作用薬、本明細書に記載の炎症性サイトカインによるシグナル伝達に干渉する薬剤、ＩＬ−１β変換酵素阻害因子（例えば、Ｖｘ７４０）、抗Ｐ７、ＰＳＧＬ、ＴＡＣＥ阻害因子、Ｔ細胞シグナル伝達阻害因子、例えばキナーゼ阻害因子、メタロプロテイナーゼ阻害因子、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害因子、本明細書に記載の可溶性サイトカイン受容体及びその誘導体、抗炎症性サイトカイン（例えばＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３及びＴＧＦ）が挙げられる。
【０３６５】
いくつかの実施形態では、第２の薬剤が、ＭＳの１つ以上の症状または副作用を処置するために使用され得る。そのような薬剤としては、例えば、アマンタジン、バクロフェン、パパベリン、メクリジン、ヒドロキシジン、スルファメトキサゾール、シプロフロキサシン、ドクサート、ペモリン、ダントロレン、デスモプレシン、デキサメタゾン、トルテロジン、フェニトイン、オキシブチニン、ビサコジル、ベンラファキシン、アミトリプチリン、メテナミン、クロナゼパム、イソニアジド、バルデナフィル、ニトロフラントイン、車前子親水性粘漿薬、アルプロスタジル、ガバペンチン、ノルトリプチリン、パロキセチン、プロパンテリン臭化物、モダフィニル、フルオキセチン、フェナゾピリジン、メチルプレドニゾロン、カルバマゼピン、イミプラミン、ジアゼパム、シルデナフィル、ブプロピオン、及びセルトラリンが挙げられる。小分子である第２の薬剤の多くは、１５０〜５０００ダルトンの分子量を有する。
【０３６６】
ＴＮＦアンタゴニストの例としては、ＴＮＦ（例えば、ヒトＴＮＦα）に対するキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはインビトロ生成された抗体（またはその抗原結合性断片）、例えばＤ２Ｅ７、（ヒトＴＮＦα抗体、米国特許第６，２５８，５６２号；ＢＡＳＦ）、ＣＤＰ−５７１／ＣＤＰ−８７０／ＢＡＹ−１０−３３５６（ヒト化抗ＴＮＦα抗体；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｃＡ２（キメラ抗ＴＮＦα抗体；ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；抗ＴＮＦ抗体断片（例えば、ＣＰＤ８７０）；ＴＮＦ受容体、例えば、ｐ５５またはｐ７５ヒトＴＮＦ受容体の可溶性断片、またはそれらの誘導体、例えば、７５ｋｄＴＮＦＲ−ＩｇＧ（７５ｋＤ  ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質、ＥＮＢＲＥＬ（商標）；Ｉｍｍｕｎｅｘ；例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９４）Ｖｏｌ．３７，Ｓ２９５、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｍｅｄ．（１９９６）Ｖｏｌ．４４，２３５Ａを参照されたい）、ｐ５５ｋｄＴＮＦＲ−ＩｇＧ（５５ｋＤ  ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質（ＬＥＮＥＲＣＥＰＴ（商標）））；酵素アンタゴニスト、例えば、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害因子（例えば、アルファスルホニルヒドロキサム酸誘導体、ＷＯ０１／５５１１２、及びＮ−ヒドロキシホルムアミドＴＡＣＥ阻害因子ＧＷ３３３３、−００５、または−０２２）；及びＴＮＦ−ｂｐ／ｓ−ＴＮＦＲ（可溶性ＴＮＦ結合タンパク質；例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．９（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），Ｓ２８４、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．−Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（１９９５）Ｖｏｌ．２６８，ｐｐ．３７−４２を参照されたい）が挙げられる。
【０３６７】
第２の薬剤に加えて、他の薬剤を対象に送達することも可能である。しかしながら、いくつかの実施形態では、α４結合抗体及び第２の薬剤以外のタンパク質または生物製剤が、医薬組成物として対象に投与されることはない。α４結合抗体及び第２の薬剤は、注射により送達される唯一の薬剤であり得る。第２の薬剤が組換えタンパク質である実施形態では、α４結合抗体及び第２の薬剤は、対象に投与される唯一の組換え薬剤、または少なくとも免疫応答もしくは炎症応答を調整する唯一の組換え薬剤であり得る。さらに他の実施形態では、α４結合抗体のみが、唯一の組換え薬剤、または対象に投与される唯一の生物製剤である。
【０３６８】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法及び材料が、本発明の実践または試験で使用され得るが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての公開文献、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が援用される。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先する。さらに、材料、方法、及び実施例は例示に過ぎず、限定であることは意図されない。
【実施例】
【０３６９】
特記なき限り、これらの実施例では、全てのアミノ酸付番がＥＵ付番を使用する。
【０３７０】
実施例１。バリアント抗ＶＬＡ−４抗体は、ヒト化ＨＰ１／２よりも強力である。
ＶＬ鎖には生殖系列フレームワークＩＧＫＶ４−１（または設計Ｌ１及びＬ２）または生殖系列操作ＡＡＨ７０３３．１（設計Ｌ３）、ＶＨには生殖系列フレームワークＩＧＨＶ１−ｆを使用し、抗ＶＬＡ−４抗体を構築した。これらの抗体は、米国特許第６，６０２，５０３号に記載のヒト化ＨＰ１／２抗体よりも少ない逆変異を有した。
【０３７１】
重鎖のバリエーション
重鎖の３つのバリエーションの配列が、図１に設計Ｈ０、設計Ｈ１、及び設計Ｈ２として示されている。各設計で、マウスＨＰ１／２のＣＤＲがＩＧＨＶ１−ｆフレームワークにグラフトされている。設計Ｈ０はフレームワーク領域の逆変異を含まないが、設計Ｈ１及びＨ２は、ヒト化抗体の親和性を最適化するために、様々な度合いの逆変異をフレームワーク領域配列に有する。
【０３７２】
軽鎖のバリエーション
軽鎖の４つのバリエーションの配列が、図２に設計Ｌ０、設計Ｌ１、設計Ｌ２、及び設計Ｌ３（Ｌ０、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３とも呼ばれる）として示されている。各設計で、マウスＨＰ１／２のＣＤＲが生殖系列フレームワークにグラフトされている。ＩＧＫＶ４−１生殖系列フレームワークを設計Ｌ０、Ｌ１、及びＬ２に使用し、ＡＡＨ７０３３５生殖系列操作フレームワークを設計Ｌ３に使用した。設計Ｌ０はフレームワーク領域の逆変異を含まないが、設計Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、ヒト化抗体の親和性を最適化するために、様々な度合いの逆変異をフレームワーク領域に有する。
【０３７３】
競合ＥＬＩＳＡアッセイの結果を表２及び図３に示す。この実験では、α４β１を試験ｍＡｂとともにプレインキュベートし、次いでマウスＨＰ１／２を競合試薬として使用した。この実験の結果は、軽鎖Ｌ２またはＬ３を有する抗体が、米国特許第６，６０２，５０３号に記載されている抗体よりも強力であったことを示した。結果を下記の表２及び図３に示す。このアッセイでは、抗体の重鎖（Ｈ１）は、図１に示す「設計Ｈ１」配列を有し、一方、Ｌ１は、図２の設計Ｌ１を意味する。
【０３７４】
2021526371.tif 000019
【０３７５】
表２において、キメラｍＡｂは、マウス可変重鎖及び軽鎖がヒトＩｇＧ１定常領域に遺伝子融合しているキメラ化ＨＰ１／２抗体である。この抗体は、結合親和性において、元のマウスＨＰ１／２抗体（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：１３４３−１３４９，１９９６）と本質的に同一である。実験の結果は、モノクローナル抗体の親和性を、生殖系列操作アクセプターフレームワークのヒト化により、そのマウス親配列と比べて向上させることが可能であることを示す。
【０３７６】
別の競合アッセイは、新しい抗体の結合親和性を、Ｕ．Ｓ．５，８４０，２９９に記載のヒト化２１．６抗α４抗体（ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標）（ナタリズマブ））と比較する。この実験では、マウスＨＰ１／２と試験ｍＡｂの混合物のα４β１に対する結合をアッセイした。この実験の結果は、図４及び下記の表３に示され、新たに設計された抗体がナタリズマブよりも約１０倍強力であることを示している。
【０３７７】
2021526371.tif 000020
【０３７８】
実施例２。ヒト化ＨＰ１／２（ＨｕＨＰ１／２）は腫瘍細胞株のＶＬＡ−４に結合する。
様々な細胞株に対する抗ＶＬＡ−４抗体ＨｕＨＰ１／２の結合を、フローサイトメトリーによって試験した。結合は、ＣＬＬ（慢性リンパ性白血病）細胞株のＭｅｃ１及びＪＭ１、ＭＭ（多発性骨髄腫）細胞株のＵ２６６及びＨ９２９、ならびにＡＭＬ（急性骨髄性白血病）細胞株のＨＬ６０及びＫＧ１で試験した。ＨｕＨＰ１／２は、試験した全ての腫瘍細胞株に結合した（図６）。フローサイトメトリーデータを使用して、異なる細胞株のそれぞれに対する抗体結合のＥＣ５０値を計算した。この情報を下記の表４に示す。
【０３７９】
ＨｕＨＰ１／２は、フィブロネクチン（ＦＮ）及びＶＣＡＭ１−Ｉｇ融合タンパク質に対するＡＭＬ細胞株の接着をブロックすることも見出された。抗体が接着をブロックし得るかどうかを試験するために、ＡＭＬ細胞株ＨＬ６０またはＫＧ１を、ＦＮコートウェル（図７Ａ）またはＶＣＡＭ１−Ｉｇコートウェル（図７Ｂ）に、漸増濃度のＨＰ１／２またはアイソタイプ対照抗体の存在下で接着させた。ＨｕＨＰ１／２は、ＦＮコートウェル及びＶＣＡＭ１−Ｉｇコートウェルに対する両細胞型の接着をブロックした。両リガンドに対するＨＬ６０細胞結合の最大の阻害は、２０ｕｇ／ｍｌのＨｕＨＰ１／２で達成された（図７Ｃ）。
【０３８０】
ＨｕＨＰ１／２は、ＦＮ及びＶＣＡＭ１−Ｉｇ融合タンパク質に対するＭＭ細胞株の接着をブロックすることも見出された。ＭＭ細胞株Ｕ２６６及びＨ９２９を、ＦＮコートウェル（図８Ａ）またはＶＣＡＭ１−Ｉｇコートウェル（図８Ｂ）に、漸増濃度のＨＰ１／２またはアイソタイプ対照抗体の存在下で接着させた。ＨｕＨＰ１／２は、ＦＮコートウェル及びＶＣＡＭ１−Ｉｇコートウェルに対する両タイプの細胞株の接着をブロックした。両リガンドに対するＵ２６６細胞結合の最大の阻害は、２０μｇ／ｍＬのＨｕＨＰ１／２で達成された（図８Ｃ）。
【０３８１】
ＨｕＨＰ１／２は、ＦＮ及びＶＣＡＭ１−Ｉｇ融合タンパク質に対するＣＬＬ細胞株の接着をブロックすることも見出された。ＣＬＬ細胞株Ｍｅｃ１及びＪＭ１を、ＦＮコートウェル（図９Ａ）またはＶＣＡＭ１−Ｉｇコートウェル（図９Ｂ）に、漸増濃度のＨＰ１／２またはアイソタイプ対照抗体の存在下で接着させた。ＨｕＨＰ１／２は、ＦＮコートウェル及びＶＣＡＭ１−Ｉｇコートウェルに対する両タイプの細胞株の接着をブロックした。両リガンドに対するＭｅｃ１細胞結合の最大の阻害は、２０μｇ／ｍｌのＨｕＨＰ１／２で達成された（図９Ｃ）。
【０３８２】
腫瘍細胞株に対するＨｕＨＰ１／２結合のＩＣ５０値は、図７〜９に示されるデータから計算した。これらのデータを表４に示す。
【０３８３】
2021526371.tif 000021
【０３８４】
実施例３〜１３の材料及び方法
特記なき限り、実施例３〜１３を通して、以下の材料及び方法を使用した。
【０３８５】
概して、本発明の実施においては、特記なき限り、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば、抗体技術）、及び電気泳動の標準的技術の従来技術を用いる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），５１０，Ｐａｕｌ，Ｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，１６９），ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｅｄ．，ＩｒＩ  Ｐｒ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ，Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐｕｂ．（１９９９）、及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９２）を参照されたい。
【０３８６】
親抗体
本明細書に開示される安定化抗体を生成するために、モデルヒト抗体（例えば、ｈｕ５ｃ８）、そのバリアント抗体、または対応するＦｃ領域のいずれかをコードするポリヌクレオチドを、標準的な発現ベクターに導入した。ヒト抗体ｈｕ５ｃ８及びそのバリアントは、例えば、米国特許第５，４７４，７７１号及び同第６，３３１，６１５号に記載されている。ｈｕ５ｃ８  ＩｇＧ４重鎖（配列番号５２）、ｈｕ５ｃ８軽鎖（配列番号５３）、ｈｕ５ｃ８  Ｆａｂ（配列番号５４）、親ＩｇＧ４抗体の完全なＦｃ部分（配列番号５５）、Ｓ２２８Ｐ変異を含む親ＩｇＧ４  Ｆｃ部分（配列番号５６）、及びＳ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ変異を含む親アグリコシル化ＩｇＧ４  Ｆｃ部分（配列番号５７）のアミノ酸配列を、それぞれ以下に提示する。重鎖のリーダー配列は、ＭＤＷＴＷＲＶＦＣＬＬＡＶＡＰＧＡＨＳであった。また、親ＩｇＧ１アグリコシル化ｈｕ５ｃ８抗体の重鎖（配列番号５８）及びＦｃ部分（配列番号５９）の各配列も提示する。
Ｈｕ  ５ｃ８  ＩｇＧ４重鎖（ＥＡＧ１８０７）（配列番号５２）
Ｈｕ  ５ｃ８軽鎖（配列番号５３）
Ｈｕ  ５ｃ８  ＶＨ／ＣＨ１ドメイン（配列番号５４）
親ＩｇＧ４  Ｆｃ部分（配列番号５５）
Ｓ２２８Ｐ変異を含む親ＩｇＧ４  Ｆｃ部分（配列番号５６）
Ｓ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ変異を含む親ＩｇＧ４アグリコシル化Ｆｃ部分（ＹＣ４０７）（配列番号５７）
親ＩｇＧ１アグリコシル化Ｆｃ部分（配列番号５８）
Ｓ２２８Ｐ／Ｎ２９７Ｑ変異を含む親ＩｇＧ４アグリコシル化Ｆｃ（ＥＡＧ２４１２）（配列番号５９）
親ＩｇＧ１（配列番号６０）
【０３８７】
実施例３。安定性獲得ＩｇＧ  Ｆｃ変異の合理的設計
アグリコシル化抗体は、免疫エフェクター機能が所望されない場合の治療用試薬の重要なクラスを表す。しかしながら、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４におけるＣＨ２に会合したオリゴ糖の除去が抗体の立体構造及び安定性に影響することは十分に確立されている。抗体安定性の喪失は、プログラムのタイムライン及び資源に悪影響を及ぼすプロセス開発の課題を呈し得る。ここで、ＩｇＧ  Ｆｃの増大した安定性をもたらすように、ＣＨ２及びＣＨ３におけるアミノ酸位置のライブラリを設計するために利用した、いくつかの方法を詳述する。この実施例で示す全ての付番は、ＥＵ付番である。
【０３８８】
Ａ．エフェクターレスＩｇＧの共変動及び残基頻度設計：ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン
多様なＣｌクラスＩｇフォールド配列のデータベースを用い、以前に報告されているように（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７１０９２５４号、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７６：９９，２００９を参照されたい）、共変動分析を行った。ＣｌクラスＩｇフォールド配列のコンパイル及び構造／ＨＭＭベースのアラインメントも、以前に報告されているように行った（参照により全体が本明細書に援用されるＰＣＴ公開第ＷＯ２００７１０９２５４号）。共変動分析は、一対のアミノ酸がいかに特定のタンパク質配列内で共保存されていることが見出されるか否かに関連する相関係数であるφ値のデータセットからなり、φ値は、−１．０〜１．０の範囲である。１．０のφ値は、あるアミノ酸が配列のサブセット内の１つの位置に見出される場合、異なる残基位置にある別のアミノ酸も常にそのサブセット内に存在することが見出されることを示す。−１．０のφ値は、あるアミノ酸が配列のサブセット内の１つの位置に見出される場合、異なる残基位置にある別のアミノ酸がその配列サブセットには決して存在しないことを示す。０．２超のφ絶対値は、分析されたデータセットで統計的に有意であることが見出された（ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７１０９２５４号、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、上記）。データセットでの経験に基づき、φ値＞０．２５を有意義（すなわち、アミノ酸対の共存に物理的理由がある可能性が高い）とみなし、φ値＞０．５は極めて強く、重要な機能的または構造的な理由で共保存されている可能性が高いとみなした。
【０３８９】
この試験では、ＩｇＧ４のＣＨ２配列をクエリ配列として使用し、φ値＞０．３をカットオフとして使用して、共変動による変異を同定した。共変動分析から同定された残基を表５．１に記載する（実施例３の残りで詳述する後の残基の全てを表５．１に記載する）。表５．１において、各残基は、ＥＵ付番システムによる該当位置における所望のアミノ酸置換を参照する。「根拠」は、用いられた設計方法を意味する。共変動及び残基頻度は、米国特許出願第１１／７２５，９７０号に詳細に記載されている。追加の共変動関係数は、所与の位置における記載のアミノ酸タイプへの変異によって形成される追加の共変動関係から、この置換を行うことによって失われる共変動関係の数を差し引いた数を意味する。追加の共変動関係数は、示唆される共変動変異の質の付加的な尺度とすることを意図している。複数のアミノ酸置換が示唆され、関連する主要な追加の共変動関係数がない場合には、ライブラリ手法をこの位置で使用し、Ｄｅｌｐｈｉａ熱負荷アッセイ（実施例４に詳述）を使用して２０種全てのアミノ酸をスクリーニングした。この方法論を使用して、特定の共変動変異が示唆される、Ｌ２４２Ｐ（２４２位のＬがＰに変化したことを意味する）、Ｑ２６８Ｄ、Ｎ２８６Ｔ、Ｔ３０７Ｐ、Ｙ３１９Ｆ及びＳ３３０Ａの６つのアミノ酸位置を同定した。さらに、５つの残基位置は、複数の望ましい（追加の共変動関係が正である）置換を有することが同定され、ライブラリ手法が利用された。これらの位置は、Ｄ２７０、Ｐ２７１、Ｅ２９４、Ａ２９９、及びＮ３１５である。
【０３９０】
タンパク質フォールド内の個々の位置における残基頻度分析に基づいて安定性を向上させる方法は、これまでに首尾よく使用されており（Ｓｔｅｉｐｅ，２００４、Ｄｅｍａｒｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ，２００６）、抗ＬＴβＲ抗体ＢＨＡ１０のＶＨドメイン及びＶＬドメイン内のライブラリ位置の同定に関して特許出願ＢＧＮＡ２４２−１「ＳＴＡＢＩＬＩＺＥＤ  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＥＶＡＬＵＡＴＩＮＧ  ＡＮＤ  ＩＮＣＲＥＡＳＩＮＧ  ＴＨＥ  ＳＴＡＢＩＬＩＴＹ  ＯＦ  ＳＡＭＥ」に記載されている。残基頻度分析を使用して、安定性獲得変異：Ｎ２７６Ｓ、Ｋ２８８Ｒ、Ｖ３０８Ｉ、Ｓ３２４Ｎ、及びＧ３２７Ａの５つの残基位置を同定した。さらに、共変動及び残基頻度変異の生成におけるＰＣＲエラーにより、Ｌ３０９及びＮ３２５の２つの残基が生成された。
【０３９１】
2021526371.tif 000022
2021526371.tif 000023
2021526371.tif 000024
【０３９２】
Ｂ．エフェクターレスＩｇＧの構造分析設計
共変動及び残基頻度の分析による変異の設計に加えた、インタクトなヒトＩｇＧｂ．１２抗体（ｐｄｂコード：１ｈｚｈ、参照：Ｓａｐｈｉｒｅ，Ｅ．Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ＩＧＧ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＩＶ−Ｉ：ａ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：１１５５−１１５９）の公開されている結晶構造の構造分析。この構造分析により、ＩｇＧ分子の安定性を向上させるように修飾され得る特定の構造的な質が同定された。ＩｇＧ４分子の安定性をＩｇＧ１の安定性に近付けるため、いくつかの変異を行って、ＩｇＧ１分子とＩｇＧ４分子との構造の差を補償した。そのような変異の１つは、ＩｇＧ４の伸長ループ内のＥ２６９に位置する。ライブラリ手法を使用して、このループの追加の長さを補償し得る残基をスクリーニングした。このループは、本実施例のパートＣに詳述する追加の変化にも供した。
【０３９３】
ＣＨ３ドメイン間の界面は、ＩｇＧ分子のＦｃドメイン内で最大のタンパク質間接触域を構成する。このＩｇＧ１とＩｇＧ４との間の界面における単一の置換差は、残基４０９に位置する。ＩｇＧ１では、リジンが４０９位に位置し、ＩｇＧ４分子では、アルギニンが４０９位に位置する。ＩｇＧ４のＲ４０９からＩｇＧ１  Ｋ４０９への置換は、ＩｇＧ１  ＣＨ３で観察される優れた安定性の質を導入するように設計された。Ｒ４０９Ｍ及びＲ４０９Ｉもまた、この理論を試験するために設計された。ＩｇＧ４  ＣＨ３界面におけるアルギニンの余分な容積により良好に適応するために、反対のＣＨ３ドメインの接触残基Ｄ３９９でＤ３９９Ｅ及びＤ３９９Ｓのいくつかの変異を行った（図１１Ａ）。この位置のより小さな側鎖を置換することにより、反対のＣＨ３ドメインは、アルギニンの余分な容積により良好に適応し、ＣＨ３ドメインの全体的な安定性を増大させることができた。ＣＨ３界面に疎水性を加えて、２つの相互作用ドメイン間の会合を増大させる変異（Ｙ３４９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ及びＴ３９４Ｖ）、ならびに界面の側鎖の容積を増大させる変異（Ｆ４０５Ｙ）の設計において、別の手法を使用した。１ｈｚｈ結晶構造において炭水化物との接触部位付近に位置する残基（Ｖ２６４、Ｒ２９２、Ｖ３０３）、ならびにＣＨ３／ＣＨ２界面付近のＨ３１０の安定化を試験するためにも、変異を設計した。表面に露出したグルタミン残基のセット（Ｑ２６８、Ｑ２７４及びＱ３５５）もまた、全体的な表面電荷を変化させるいくつかの変異の焦点であった。同じ手法をＥ４１９に使用した。
【０３９４】
最後に、好熱性タンパク質の増大した熱安定性を説明にするために使用される最も一般的な機構のうちの１つは、タンパク質の内部コアの密充填を伴う（参照：Ｊａｅｎｉｃｋｅ，Ｒ．ａｎｄ  Ｚａｖｏｄｓｚｋｙ，Ｐ．１９９０．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｎｄｅｒ  ｅｘｔｒｅｍｅ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２６８：３４４−３４９）。この現象を再現するために、ＣＨ２及びＣＨ３の「バリンコア」に見られるバリン残基を、イソロイシンまたはフェニルアラニンで置換した。さらなる分岐側鎖及び関連する容積の増加から、安定性の増大が予測された。ＣＨ２の「バリンコア」は、全てＣＨ２ドメインの同じ近位内部コアに向けて配置されている５つのバリン残基（Ｖ２４０、Ｖ２５５、Ｖ２６３、Ｖ３０２及びＶ３２３）である。同様の「バリンコア」がＣＨ３でも観察される（Ｖ３４８、Ｖ３６９、Ｖ３７９、Ｖ３９７、Ｖ４１２及びＶ４２７）。さらに、Ｌ３５１及びＬ３６８を、より高度に分岐した疎水性側鎖に変異させた。
【０３９５】
Ｃ．エフェクターレスＩｇＧの共変動設計：他のＣクラスＩｇドメインに観察された共変動パターンに基づくＣＨ２グリコシル化部位付近の協調変異。
ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインは、多くの残基を共保存して、ＥＵ  Ｎ２９７位のＮ結合型炭水化物との相互作用と、様々なＦｃγＲ型のＣＤ１６、ＣＤ３２、及びＣＤ６４との相互作用の両方を維持する。炭水化物の除去は、ＩｇＧ−ＦｃによるＦｃγＲ結合の劇的な低減をもたらす（Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｇａｒｂｅｒ，２００５）。ここに記載する設計では、ＩｇＧ−Ｆｃ内におけるＮ結合型炭水化物付近の残基の共変異性を、他のＣクラスＩｇフォールドドメインにおいて共保存されていることが見出されるアミノ酸と置換することによって調査した。これらの共変異がＦｃγＲ結合及びＣＨ２ドメインの安定性に及ぼす影響を、Ｎ結合型炭水化物の存在下及び非存在下で調査した。その理由は、これらの修飾が、アグリコシル−Ｆｃ内で特に良好に耐容される可能性があり、また、アグリコシルＦｃ部分とグリコシル化Ｆｃ部分の両方でＦｃγＲとの相互作用を低減させ得る可能性があったためである。
【０３９６】
Ｎ結合型炭水化物と潜在的に相互作用するのに重要な残基が、この試験の焦点であった。Ｎ２９７で炭水化物と直接接触するＩｇＧ１−Ｃ＾残基を、ＦｃγＲＩＩＩａに結合したＩｇＧ１−Ｆｃの公開されている結晶構造、及びプログラムＭＯＬＭＯＬ（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ，Ｐ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｒ．，Ｏｏｓｔｈｕｉｚｅｎ，Ｖ．，Ｊａｃｏｂ，Ｕ．（２０００）Ｔｈｅ  ３．２  Å  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｆｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ−ＦｃｇＲＩＩＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ，４０６：２６７−２７３、Ｋｏｒａｄｉ，Ｒ．，Ｂｉｌｌｅｔｅｒ，Ｍ．＆Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，Ｋ．（１９９６）ＭＯＬＭＯＬ：ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．１４：５１−５５）を使用して同定した。これらのアミノ酸が、共変動分析及び設計の焦点であった。
【０３９７】
ＣｌクラスＩｇフォールド配列のコンパイル及び構造／ＨＭＭベースのアラインメントは、以前に報告されているように行った（ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７１０９２５４号）。また、多様なＣｌクラスＩｇフォールド配列のデータベースを用い、以前に報告されているように（ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７１０９２５４号、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、上記）、共変動分析を行った。共変動分析は、一対のアミノ酸がいかに特定のタンパク質配列内で共保存されていることが見出されるか否かに関連する相関係数であるφ値のデータセットからなり、φ値は、−１．０〜１．０の範囲である。１．０のφ値は、あるアミノ酸が配列のサブセット内の１つの位置に見出される場合、異なる残基位置にある別のアミノ酸も常にそのサブセット内に存在することが見出されることを示す。−１．０のφ値は、あるアミノ酸が配列のサブセット内の１つの位置に見出される場合、異なる残基位置にある別のアミノ酸がその配列サブセットには決して存在しないことを示す。０．２超のφ絶対値は、分析されたデータセットで統計的に有意であることが見出された（ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７１０９２５４号、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、上記）。データセットでの経験に基づき、φ値＞０．２５を有意義（すなわち、アミノ酸対の共存に物理的理由がある可能性が高い）とみなし、φ値＞０．５は極めて強く、重要な機能的または構造的な理由で共保存されている可能性が高いとみなした。
【０３９８】
構造分析に基づいて、疎水性残基Ｖ２６２及びＶ２６４が、Ｎ結合型炭水化物によって溶媒から隔絶されているＣＨ２ドメインの表面上の疎水性パッチを形成することが見出された。さらに、Ｖ２６６は、Ｖ２６２及びＶ２６４に近接した残基であり、ループ内に存在し、ドメイン内部に埋没しているものの、ＣＨ２ドメインに特有である。Ｖ２６２、Ｖ２６４、及びＶ２６６は、ＩｇＧ−Ｃ＾ドメイン内で高度に共保存されており、相互に非常に有意な相関係数があることが見出された（φ値：Ｖ２６２−Ｖ２６４＝０．４４、Ｖ２６２−Ｖ２６＝０．４０、Ｖ２６４−Ｖ２６６＝０．５４）。これらの残基は、ＩｇＧ定常ドメインの構造ベースの配列アラインメント（図１１Ｂ）において強調されている。
【０３９９】
３つのバリン残基（２６２、２６４、及び２６６）もまた、ＣＲ２ドメインにおいて特有のループ構造を形成する残基（残基２６７〜２７１）と強い相関係数を有する。このループは、他のＩｇＧ定常ドメインＣＬ、ＣＨＩ、及びＣＨ３によって形成されるコンセンサスループよりも２アミノ酸長い。特異的な相関関係は、Ｖ２６２とＥ２６９及びＤ２７０の間（それぞれ、φ値＝０．３８及び０．３１）、Ｖ２６４とＳ２６７、Ｄ２６８、及びＥ２６９の間（それぞれ、φ値＝０．２７、０．４４、及び０．５２）、ならびにＶ２６６とＳ２６７の間（φ値＝０．３０）にある。これらの相関関係に基づき、このループは、Ｎ２９７及びその炭水化物を含むループの位置決めだけでなく、ＦｃγＲとの相互作用に重要であることが知られる（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，２０００、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ，２００１）、残基３２５〜３３０を含むループの位置決めにも重要であり得ると推測した。
【０４００】
これらの観察に基づいて、これらの位置、特にアグリコシル−ＩｇＧにおける他のアミノ酸タイプの耐容性（すなわち、ＣＨ２ドメインのフォールディング及び安定性に対する影響）を調査するための設計を生成した。観察することが望まれた別の態様は、これらの部位の修飾がＩｇＧのＦｃγＲ結合特性に及ぼし得る影響であった。これらの観察に基づいてＣＨ２ドメイン内で行ったアミノ酸変化を、表５．２に記載し、図１１ＣのＩｇＧ−Ｆｃの構造（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ，Ｐ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｒ．，Ｏｏｓｔｈｕｉｚｅｎ，Ｖ．，Ｊａｃｏｂ，Ｕ．（２０００）Ｔｈｅ  ３．２  Ａ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｆｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ−ＦｃｇＲＩＩＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ，４０６：２６７−２７３）に示す。全ての変異を含む配列（ＳＤＥ９）に対する天然配列のアラインメントを図１１Ｄに示す。
【０４０１】
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【０４０２】
Ｄ．補足的変異
所与の残基位置における特定のタイプの変異の特異性を試験するために、一連の付加的な変異を設計した。これらは、異なるアミノ酸タイプ（極性、疎水性、及び荷電）を、安定性を増大させることが示された残基位置で試験することを含む。様々なＩｇＧアイソタイプ及びグリコシル化状態への全ての安定性獲得変異の適用についても試験する。これらの変異を表５．３に記載する。
【０４０３】
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【０４０４】
Ｅ．さらなる多重変異構築物
安定性変異Ｔ２９９Ｋを有するペプチドから生成される潜在的なＴ細胞エピトープを低減させ、Ｔ３０７Ｐ及びＤ３９９Ｓの安定性変異を、アグリコシル化ＩｇＧ１及びＩｇＧ４をもたらす他の変異と組み合わせて利用するために、次の構築物も生成する（表５．４）。  
【０４０５】
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【０４０６】
実施例４。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて産生されたＩｇＧ  Ｆｃ抗体ドメインの熱安定性スクリーニング
米国特許出願第１１／７２５，９７０号に記載される改変された熱負荷アッセイを安定性スクリーンとして用い、ｐＨ４．５での熱負荷事象後に保持された４０℃での可溶性ＩｇＧ  Ｆｃタンパク質の量を決定した。
【０４０７】
Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．カタログ番号２７３２５）を、ｐＢＲＭ０１２（ＩｇＧ１）及びｐＢＲＭ０１３（Ｓ２２８Ｐ、Ｔ２９９Ａ変異を有するＩｇＧ４）のＦｃとＣ末端ヒスチジンタグをコードするプラスミドにより、誘導性ａｒａＣプロモーターの制御下で形質転換した。形質転換体を、０．６％グリシン、０．６％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、０．０２％アラビノース、及び５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補った３０℃のＳＢ（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ，Ｃａ．カタログ番号Ｓ０１４０）からなる発現培地で一晩増殖させた。細菌を遠心分離によりペレット化し、上清をさらなる処理のために収集した。
【０４０８】
熱負荷後、凝集した物質を遠心分離によって除去し、処理して透明化した上清中に残った可溶性Ｆｃサンプルを、ＤＥＬＦＩＡアッセイにより、プロテインＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ７８３７）への結合についてアッセイした。２つの９６ウェルプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ、カタログ番号４３７１１１）を、３７℃で１時間、プロテインＡを０．５μｇ／ｍｌで含むＰＢＳでコートし、次いで、ＤＥＬＦＩＡアッセイバッファー（ＤＡＢ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＢＳＡ、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．０１％  ＮａＮ３、ｐＨ７．４）で１時間にわたり、室温で振盪しながらブロッキングした。ＢＳＡを含まないＤＡＢ（洗浄バッファー）でプレートを３回洗浄し、１０μｌの上清を９０μｌのＤＡＢに添加して、１００μｌの最終体積とした（参照プレート）。次に、１０μｌの１０％  ＨＯＡｃをポリプロピレンプレート中の各上清に添加して、サンプルのｐＨを４．５とした。このプレートを９０分間４０℃でインキュベートし、変性したタンパク質を１４００×ｇでの遠心分離によって除去した。酸及び熱で処理した上清１０μｌを、ｐＨ８．０の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓを補った９０μｌのＤＡＢを含む別のＤＥＬＦＩＡプレート（負荷プレート）に加えた。ＤＥＬＦＩＡプレートを１時間振盪しながら室温でインキュベートし、前述のように３回洗浄した。２５０ｎｇ／ｍｌのＥｕ標識抗Ｈｉｓ６抗体（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ、カタログ番号ＡＤ０１０９）を含むＤＡＢをウェル毎に１００μｌ添加することにより、結合したＦｃを検出し、１時間振盪しながら室温でインキュベートした。このプレートを洗浄バッファーで３回洗浄し、１００μｌのＤＥＬＦＩＡ増強溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ、カタログ番号４００１−００１０）をウェル毎に加えた。１５分間のインキュベーション後、Ｅｕｒｏｐｉｕｍ法を使用してＶｉｃｔｏｒ  ２（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）でプレートを読み取った。４０℃で様々な構築物について、参照プレートと負荷プレートとのＥｕ−蛍光の比をランク付けすることにより、データを分析した。ｐＢＲＭ０１３の値よりも高い蛍光値を、標的構築物（ＩｇＧ４．Ｐ  ａｇｌｙ）と比べた安定性の増大と解釈した。データを表６．１に示す。
【０４０９】
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【０４１０】
実施例５。安定化ＩｇＧ  Ｆｃ抗体の生成
Ａ．変異誘発、安定化ＩｇＧ  Ｆｃ部分のＥ．ｃｏｌｉにおける一過性発現、及び精製
安定性変異を、前述の実施例４に詳述したＢＲＭ  １３構築物に、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｑｕｉｋ−Ｃｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ変異誘発キットを使用した部位特異的変異誘発によって組み込んだ。３６〜４０塩基長であり、中央に変異を有し、１０〜１５塩基の正しい配列が両側にあり、少なくとも４０％のＧＣ含量であり、１つ以上のＣ／Ｇ塩基で開始及び終結するプライマーを設計した。全ての変異体構築物を下記の表７．１に記載する。
【０４１１】
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【０４１２】
変異を導入するプライマーを使用したＰＣＲの後、親プラスミドを完全に消化するために、各変異誘発物をＤｐｎ  Ｉ制限酵素により、３７℃で５分間にわたって消化した。次いで、変異誘発反応物をＸＬ１−Ｂｌｕｅ  Ｅ．Ｃｏｌｉウルトラコンピテント細胞に形質転換した。アンピシリン抵抗性コロニーをスクリーニングし、ＤＮＡシーケンシングを使用して、変異誘発反応からの正しい配列を確認した。
【０４１３】
配列が確認されたＤＮＡを、ＥＣ３プログラムを使用した電気穿孔により、３１１０細胞に形質転換した。特有のコロニーを選別し、１０ｍｌのＬＢ−アンピシリン（ａｍｐ）中のスターター培養物にて一晩増殖させた。この前培養物を１Ｌの発現培地［ＳＢ＋０．０２％アラビノース＋ａｍｐ／炭水化物（ｃａｒｂ）５０ｍｇ／Ｌ］に移し、３２℃で一晩増殖させた。細胞を遠心機でスピンダウンし、１００ｍｌのスフェロプラストバッファー（２０％スクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、及びリゾチーム（０．０１％ｗ／ｖ））に完全に再懸濁した。細胞をスピンダウンし、得られたタンパク質は上清中に存在した。
【０４１４】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したバッチ精製により、ＩｇＧ−Ｆｃ構築物を精製した。ｐＨ３．０の０．１Ｍグリシンを使用して、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅからＦｃ分子を溶出させ、Ｔｒｉｓ塩基で中和し、最後にＰｉｅｒｃｅの１０ｍｌ透析カセット（１０，０００  ＭＷＣＯカットオフ）を使用してＰＢＳ中に透析した。
【０４１５】
Ｂ．変異誘発、安定化抗体のＣＨＯ細胞における一過性発現、抗体精製、及び解析
安定性変異を、ＩｇＧ４．Ｐ抗体（アミノ酸２２８にプロリンヒンジ変異を既に含むＶＨ構築物）に、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｑｕｉｋ−Ｃｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ変異誘発キットを使用した部位特異的変異誘発によって組み込んだ。抗原を認識するＦａｂは、抗ＣＤ４０抗体５ｃ８に由来した。３６〜４０塩基長であり、中央に変異を有し、１０〜１５塩基の正しい配列が両側にあり、少なくとも４０％のＧＣ含量であり、１つ以上のＣ／Ｇ塩基で開始及び終結するプライマーを設計した。全てのグリコシル化及びアグリコシル化変異体構築物を表７．２に記載する。
【０４１６】
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【０４１７】
変異を導入するプライマーを使用したＰＣＲの後、親プラスミドを完全に消化するために、各変異誘発物をＤｐｎ  Ｉ制限酵素により、３７℃で５分間にわたって消化した。次いで、変異誘発反応物をＸＬ１０−Ｇｏｌｄ  Ｅ．Ｃｏｌｉウルトラコンピテント細胞に形質転換した。アンピシリン抵抗性コロニーをスクリーニングし、ＤＮＡシーケンシングを使用して、変異誘発反応からの正しい配列を確認した。
【０４１８】
確認された配列のＤＮＡをスケールアップし、ＴＯＰ１０  Ｅ．ｃｏｌｉコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。アンピシリン薬物抵抗性に形質転換したＥ．ｃｏｌｉコロニーを、インサートの存在についてスクリーニングした。次いで、コロニーを培養して、２５０ｍｌの大規模培養物にした。Ｑｉａｇｅｎ  ＨｉＳｐｅｅｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐキットを使用して、一過性トランスフェクションのための細菌培養物からＤＮＡを抽出及び精製した。ε２８０を使用してＤＮＡを定量し、トランスフェクションに使用するためのＤＮＡ濃度を測定した。
【０４１９】
次いで、変異体プラスミドを等量の５ｃ８  ＶＬプラスミドと併せて使用して、抗体タンパク質の一過性発現のためにＣＨＯ−Ｓ細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクションに使用するＤＮＡの量は、ＶＨ  ０．５ｍｇ／Ｌ、及びＶＬ  ０．５ｍｇ／Ｌであった。トランスフェクション培地（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩと、ＳＡＦＣのＬＯＮＧ  Ｒ４ＩＧＦ−１）を、ＰＥＩ  ３ｍｇ対ＤＮＡ  １ｍｇの比で１ｍｇ／ｍｌのＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号２３９６６）を用い、５％のトランスフェクション量で調製した。ＤＮＡをトランスフェクション培地／ＰＥＩ溶液に添加し、かき混ぜてから、室温で５分間静置した。次いでこの混合物を、５００ｍｌのＣＨＯ−Ｓ細胞に、Ｉｅ６細胞／ｍｌで加えた。３７℃、５％ＣＯ２で４時間おいた後、１倍量の増殖培地（ＣＨＯＭ３７＋２０ｇ／ｌ  ＰＤＳＦ＋Ｐｅｎｓｔｒｅｐ／アムホテリシン）を添加し、最終培養体積を１Ｌとした。１日目に、１０ｍｌの綿加水分解物を２００ｇ／Ｌで添加し、温度を２８℃に低下させた。培養生存率を、生存率が７０％未満に低下するまで（８〜１２日間）モニタリングした。この時点で、抗ＩｇＧチップへの結合を測定するのにＯｃｔｅｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、タンパク質発現の力価も調べた。培養物を２４００ｒｐｍで１０分間スピンダウンすることによって細胞を収集し、次いで上清を０．２ｕｍの限外濾過膜で濾過した。
【０４２０】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、ＡＫＴＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で上清から５Ｃ８抗体を捕捉した。ｐＨ３．０の０．１Ｍグリシンを使用して、プロテインＡから抗体分子を溶出させ、Ｔｒｉｓ塩基で中和し、Ｐｉｅｒｃｅの１０ｍｌ透析カセット（１０，０００  ＭＷＣＯカットオフ）を使用してＰＢＳ中に透析し、１ｍｌの最終体積まで濃縮し、分取サイズ排除クロマトグラフィ（ＴＯＳＯＨＡＳＳ、ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してさらに精製した。５Ｃ８分子を、ｐＨ６．０の２０ｍｍｏｌクエン酸、１５０ｍｍｏｌ  ＮａＣｌの溶液中に透析した。単量体抗体産物の純度及び百分率を、それぞれ、４〜２０％のＴｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び分析的サイズ排除ＨＰＬＣによって評価した。
【０４２１】
Ｃ．安定性操作抗体のタンパク質配列及び翻訳後修飾の質量スペクトル分析を使用した確認
サンプルを還元条件下で分析した。還元は、１００ｍＭ  ＤＴＴ中、４ＭグアニジンＨＣｌの存在下で１時間にわたり、３７℃で行った。注入の前に、サンプルをＰＢＳで１：１に希釈した。氷酢酸をミックスに添加し、最終濃度２％（ｖ／ｖ）とした。５μｇの各サンプルをフェニルカラム上に注入し、ＥＳＩ−ＴＯＦによって分析した。結合溶出法を使用した。バッファーＡは、０．０３％  ＴＦＡ水溶液を含み、バッファーＢは、０．０２５％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を含む。流速は１００μｌ毎分で一定に保った。スペクトルをＡｎａｌｙｓｔソフトウェアから取得し、ＭａｘＥｎｔｌを使用してデコンボリューションした。還元分析の後、サンプルの３つがグリコフォームとして検出され、したがって、ＥＣ３２３、ＥＣ３２６及びＥＡＧ２３００の３つのサンプルに脱グリコシル化を行った。脱グリコシル化は、次の還元条件下で行った：Ｎ−グリカナーゼ１ｍＵ／タンパク質２μｇ、２０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓの存在下、ｐＨ７．０。サンプルは３７℃で脱グリコシル化した。２時間後、さらに３０ｍＭのＤＴＴを、２．７ＭグアニジンＨＣｌの存在下でサンプルに添加し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。還元し、脱グリコシル化したサンプル各５μｇをフェニルカラム上に注入し、上記に詳述したように分析した。
【０４２２】
結果は、重鎖のＮ末端グルタミン（Ｑ）がピログルタミン酸（ＰＥ）に変換された１３サンプル全ての同一性を裏付けた。表７．３は、グリコシル化型と脱グリコシル化型の全てのサンプルについて得られた質量を記載する。全ての軽鎖及び重鎖は、１％以下の低い糖化レベルを含んだ。未修飾のＮ末端グルタミンに対応する質量が、各サンプルにおいて、−２０〜４０％の相対強度で観察された。全ての軽鎖のデコンボリューションされたスペクトルは、予想通り同一であった。
【０４２３】
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【０４２４】
翻訳後修飾は、本明細書に記載の抗体において大きく異なり得ることに留意されたい。例えば、糖化（タンパク質のアミノ基のグルコースとの反応によって引き起こされる非酵素的修飾）は、タンパク質中で定法により検出され、そのレベルは、細胞培養条件に応じて大きく異なる。確かに、糖化レベルは、重鎖及び軽鎖のそれぞれで上述の１％よりも大幅に高い場合がある。例えば、本明細書に記載のインタクト抗体の糖化のレベルは、１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または４０％超であり得る。同様に、脱アミノ化及びグリコシル化のような他の翻訳後修飾も、本明細書に記載の抗体の生成及び精製の方法に応じて異なり得る。
【０４２５】
サンプルＥＣ３２３、ＥＣ３２６及びＥＡＧ２３００は、通常のＧＯＦ、ＧＩＦ、Ｇ２Ｆ二分岐グリカンを含み、ＧＯＦが最も豊富な種であり、その後にＧＩＦ、次いでＧ２Ｆが続いた。サンプルＥＣ３２３及びＥＣ３２６は、コアフコースを欠いているＧＯＦグリカン（ＧＯ）に対応する、ＧＯＦピークから−１４６Ｄａにおけるピークを含んだ。ＥＣ３２３については、ＧＯ（フコースなし）の相対強度率は２％であり、ＥＣ３２６サンプルのそれは２３％であった。３つ全てのグリコシル化サンプルが、低レベル（＜１％）のシアル酸をＧ２Ｆグリカンに含んだ。
【０４２６】
全てのサンプル鎖は−１８Ｄａピークを含んだが、これは、ＥＳＩ−ＴＯＦの高いガス温度に関連する計器によるアーチファクトであることが示された。３５０℃の温度を使用して、ＴＦＡ付加体を消失させた。
【０４２７】
実施例６。アグリコシル化ＩｇＧ  Ｆｃ抗体の熱安定性
タンパク質安定性は、タンパク質治療薬の開発及びスケールアップに関する中心的課題である。不十分な安定性は、バイオリアクターにおけるスケールアップ生産に適さないことから、タンパク質の精製が困難であること、医薬品の調製及び使用に適さないことまで、いくつかの開発上の課題をもたらし得る。エフェクター機能が欠損したＦｃ骨格を生成するため、ａｇｌｙ  ＩｇＧ４．Ｐに変異を導入して（Ｓ２２８Ｐ）、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの全体的な安定性を増大させた。この試験の目標は、設計された変異が熱安定性を増大させるかどうかを調査することであった。したがって、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用し、各構築物の熱安定性を評価した。Ｅ．ｃｏｌｉで産生したＦｃドメイン構築物と全長抗体構築物の両方を、ＤＳＣによって評価した。Ｅ．ｃｏｌｉで産生したＦｃドメイン構築物及び全長抗体構築物の発現及び精製の方法は、実施例５に詳述してある。
【０４２８】
抗体を、ｐＨ６．０の２５ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファーに対して透析した。抗体を１ｍｇ／ｍＬに濃縮し、ＵＶ吸光度によって測定した。スキャンは、自動キャピラリーＤＳＣ（ＭｉｃｒｏＣａｌ，ＬＬＣ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を使用して行った。２回のバッファースキャンをベースライン減算のために行った。スキャンは、ミディアムフィードバックモードを使用し、２０〜１０５℃まで１℃／分で実行した。次いで、ソフトウェアＯｒｉｇｉｎ（ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＬＬＣ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を使用してスキャンを分析した。三次多項式を使用してゼロ以外のベースラインを補正し、非二状態アンフォールディングモデルを使用して各抗体のアンフォールディング転移のフィッティングを行った。これらの構築物の安定性をさらに評価するため、全長抗体を、ｐＨ４．５の２５ｍＭリン酸ナトリウム、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｎＭ  ＮａＣｌバッファーに対して透析した。上記に詳述したものと同じＤＳＣプロトコールを使用した。Ｆａｂドメインを欠いているＥ．ｃｏｌｉで発現したＦｃドメイン構築物を使用して、実施例２に詳述したＤｅｌｐｈｉａ熱負荷アッセイで同定された変異の安定性の増強を試験した。構築物ＢＲＭ０２３、ＢＲＭ０３０及びＣＲ１０３−１１９を、それらの融解温度と併せて表８．１に記載する。
【０４２９】
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【０４３０】
表８．１に示したように、ａｇｌｙ  ＩｇＧ１及びＩｇＧ４．Ｐ（Ｓ２２８Ｐ、Ｔ２９９Ａ）のＦｃ部分対照は、ＣＨ２についてはそれぞれ６５．９℃及び６２．３℃、ＣＨ３についてはそれぞれ８２．６℃及び７１．２℃の融解温度を有した。単一部位変異のうち、ＢＲＭ０２３（Ｔ３０７Ｐ）及びＢＲＭ０３０（Ｔ２９９Ｋ）は、ａｇｌｙ  ＩｇＧ４．Ｐ（Ｓ２２８Ｐ、Ｔ２９９Ａ）対照と比べてＣＨ２融解温度の３．４〜３．９℃の上昇を示した。Ｒ４０９位におけるリジンまたはメチオニンによる置換は、ＣＨ３融解温度の１２及び６．６℃の上昇を示した。より小さな疎水性側鎖（Ｌｅｕ及びＨｅ）への置換は、ＣＨ３の安定性の増大をもたらさなかった。この位置は、ＩｇＧ１とＩｇＧ４との間のＣＨ３界面における単一の差を表す。ＩｇＧ４  ＣＨ３界面の４０９位におけるアルギニン側鎖の余分な容積を補償するために（実施例３に詳述したように）、Ｄ３９９位の変異を行った。より小さな側鎖（Ｓｅｒ）の置換は、約４℃の融解温度の上昇を促進した。サイズは同じだが電荷を欠いている側鎖（Ａｓｐ）、または同じ電荷でより大きな側鎖（Ｇｌｕ）のいずれかへの置換は、いずれも、安定性の増大を示さなかった。実施例３に詳述した疎水性バリンコアにおける置換は、約４℃のＣＨ３融解温度の上昇を示したＶ４２７Ｆを例外として、影響を示さなかったか、または融解温度の低下を示した。
【０４３１】
単一の変異及び複数の変異の組み合わせを評価するために、全長ＩｇＧ分子を利用した。実施例５に詳述したように、変異を全長５ｃ８抗体に組み込んだ。ｐＨ６．０及びｐＨ４．５でＤＳＣによって測定したＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの融解温度に対する変異の影響を、下記の表８．２にまとめる。
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【０４３２】
表８．２に示したように、Ｄ３９９Ｓ変異は、ａｇｌｙ  ＩｇＧ４．ＰのＣＨ３ドメインの熱安定性を、ｐＨ６．０では平均して２℃、ｐＨ４．５では最大で１０℃上昇させた。アグリコシル化ＣＨ２を生成するには、変異体Ｔ２９９Ｋを使用する。２９９位でのリジン置換は、この位置のアラニンの置換と比べて、ＩｇＧ４．Ｐ分子の融解温度をｐＨ６．０では５℃、ｐＨ４．５では１１℃上昇させる。Ｔ２９９Ｋ変異はまた、ＩｇＧ１  ＣＨ２のＴｍをｐＨ６．０で６℃上昇させる。Ｔ３０７Ｐ変異は、Ｄ３９９Ｓと組み合わせて使用したとき、グリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  ＣＨ２ドメインについて４℃の上昇を示した。単独では、Ｔ３０７Ｐは、グリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ形態の融解温度を上昇させなかった。アグリコシル化形態では、Ｔ３０７Ｐ変異は、ＣＨ２のＴｍを６℃上昇させた。Ｔ２９９Ｋ変異と組み合わせると、ＣＨ２のＴｍは８℃上昇した。Ｌ３０９Ｋ変異は、Ｔ３０７Ｐ及びＴ２９９Ａと組み合わせたとき、アグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐの安定性の１℃の上昇をもたらした。しかしながら、Ｔ３０７Ｐ及びＴ２９９Ｋと組み合わせると、Ｌ３０９Ｋ変異は、３℃の上昇をもたらした。グリコシル化形態のＩｇＧ４．Ｐでは、Ｌ３０９Ｋ変異は、ＣＨ２のＴｍを２℃上昇させる。Ｌ３０９Ｋ変異は、Ｔ３０７Ｐ及びＴ２９９Ａと組み合わせたとき、アグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐの安定性の１℃の上昇をもたらした。しかしながら、Ｔ３０７Ｐ及びＴ２９９Ｋと組み合わせると、Ｌ３０９Ｋ変異は、ｐＨ４．５で３℃の上昇をもたらした。ＣＨ２におけるＶ３２３Ｆ変異は、ＣＨ２ドメインの融解温度に対する影響を示さなかったが、Ｖ２４０Ｆ変異は、融解温度を１３℃低下させた。さらに、Ｖ４２７Ｆ変異もまた、ＣＨ２のＴｍの１３℃の低下を示した。
【０４３３】
融解温度の最も劇的な上昇は、ＩｇＧ４．Ｐでは、Ｔ２９９Ｋ、Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ及びＤ３９９Ｓの組み合わせで観察される。この構築物は、Ｔ２９９Ａ  ＩｇＧ４．Ｐと比較すると、ＣＨ２のＴｍの１１℃（ｐＨ６．０）及び１２℃（ｐＨ４．５）の上昇を示す。実際、Ｔ２９９Ｋ変異は、Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ及びＤ３９９Ｓと組み合わせると、Ｔ２９９Ａ変異と比べてＴｍを２〜３℃上昇させる。さらに、ＩｇＧ４．ＰアイソタイプのＣＨ３からＩｇＧ１のＣＨ３への変換と組み合わせて、Ｔ２９９ＫをＩｇＧ４．Ｐ  ＣＨ２に導入すると、ａｇｌｙ  ＩｇＧ４．Ｐと比べて、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインでそれぞれ６℃及び１５℃の上昇がもたらされた。
【０４３４】
ＣＨ２グリコシル化の共変動試験で同定された変異は、ＩｇＧ１  ＣＨ２のＴｍへの影響を全くまたはほとんど示さないか（Ｖ２６２Ｌ、及びＶ２６２Ｌと組み合わせたＶ２６４Ｔ、ループ置換）、または７℃の低下効果を示す（Ｖ２６６Ｆ、Ｖ２６４Ｔ＆Ｖ２６６Ｆ、ループ＆Ｖ２６４Ｔ＆Ｖ２６６Ｆ）。融解Ｔｍにおける１０〜１２℃の大きな低下が、Ｖ２６２Ｌ、Ｖ２６４Ｔ及びＶ２６６Ｆの組み合わせで観察された。
【０４３５】
まとめると、Ｔ２９９Ｋ、Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋは、単一変異としても、または互いと組み合わせた場合にも、ＣＨ２ドメインの熱安定性を増大させる能力を示した。Ｄ３９９Ｓは、ＩｇＧ４．ＰのＣＨ３ドメインに安定性を与えた。
【０４３６】
実施例７：ＩｇＧ  Ｆｃ抗体の撹拌及びｐＨ維持ステップ試験
タンパク質治療薬は、長い有効期間を有し、製造生産及び保管中のタンパク質の物理的または化学的特性の変化がごくわずかであることが非常に望ましい。関連するストレスの評価は製剤開発の重要な一部であり、ＩｇＧ  Ｆｃ変異体について関連する２つのタイプのストレスを評価した。
【０４３７】
Ａ．撹拌ストレス
撹拌は、製造及び加工中に生じるストレスを模倣するだけでなく、実際の搬送（すなわち薬物製品バイアルの試験場への搬送）中のストレスもシミュレートする。したがって、撹拌安定性を４８時間にわたって分析し、分析的サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を使用してタンパク質の凝集または沈殿をモニタリングし、３２０ｎＭでの吸光度をモニタリングすることによって濁度を測定した。濁度は、タンパク質／バッファー溶液を濁らせたり、または極端な場合には不透明にしたりさえする、凝集及び沈殿物の形成に起因する光散乱の尺度である。以下の方法を各実験セットで一貫して使用した：０．５ｍｇ／ｍｌの各サンプル１ｍｌを、３ｍｌの試験管に入れ、６５０ｒｐｍで振盪し、ゴム栓で密封し、パラフィルムで再度密封した。１００μｌのサンプルを必要な時点（０、６、２４、及び４８時間）で抽出し、１４，０００ｒｐｍで５分間スピンダウンして、生じた凝集体または沈殿物をスピンダウンした。次いで、サンプルを分析的ＳＥＣカラムに流して分析した。ＳＥＣ溶出プロファイルにおいて、凝集したタンパク質は短い保持時間で溶出し、タンパク質分解産物は長い保持時間で溶出する。したがって、単量体種の百分率を使用して、所与の時点におけるタンパク質の全体的な安定性をモニタリングした。
【０４３８】
熱安定性の最も高い構築物（実施例６参照）を撹拌試験のために選択した。アグリコシル化ＩｇＧ４分子については、ＹＣ４０１からＹＣ４０３（全てアグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ａ及びＤ３９９Ｓ［加えて、それぞれＴ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ、及びＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｋ］、ＹＣ４０４からＹＣ４０６（全てアグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ｋ及びＤ３９９Ｓ［加えて、それぞれＴ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ、及びＴ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｋ］、野生型ＩｇＧ４．Ｐアグリコシル化（Ｔ２９９Ａ）対照としてのＹＣ４０７、ＣＮ５７８（アグリコシル化ＩｇＧ１  Ａ２９９Ｋ）、ＥＣ３３１（ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを有するアグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ｋ及びＴ３０７Ｐである）、アグリコシル化ＩｇＧ１（Ｔ２９９Ａ）、アグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ（Ｔ２９９Ａ）、及びアグリコシル化ＩｇＧ１（Ｔ２９９Ａ）を試験のために選択した。グリコシル化分子については、ＥＣ３０４（グリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ３０７Ｐ、Ｄ３９９Ｓ）、ＥＣ３２３（グリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｄ３９９Ｓ、Ｌ３０９Ｋ）、ＥＣ３２６（グリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ３０７Ｐ、Ｄ３９９Ｓ、Ｌ３０９Ｋ）、グリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ａ、及びグリコシル化ＩｇＧ１を試験のために選択した。
【０４３９】
アグリコシル化変異体を濁度の観点から比較すると（下記の表９．１及び図１２Ａ参照）、ＹＣ４０３（アグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ａ、Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ、及びＤ３９９Ｓ）、及びＹＣ４０６（アグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ｋ、Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ、及びＤ３９９Ｓ）が、野生型ＹＣ４０７（アグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ａ）と比較して最も低い量の濁度を示した。両構築物が、野生型と比較して１／３の濁度を各時点で一貫して示す。２つの構築物における唯一の差は、Ｔ２９９Ａ（ＹＣ４０３）及びＴ２９９Ｋ（ＹＣ４０６）である。
【０４４０】
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【０４４１】
単量体％（下記の表９．２及び図１２Ｂ参照）を比較すると、変異体構築物の全てが経時的な凝集の低減を示した。２４時間時点で、全ての変異体構築物が野生型よりも良好であり、４８時間時点では、ほとんどの構築物が少なくとも２倍良好であった。しかしながら、最も高い単量体％を保持した構築物はＹＣ４０３であり、その後にＹＣ４０２（アグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ａ、Ｌ３０９Ｋ及びＤ３９９Ｓ）、次いでＹＣ４０６（アグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ｋ、Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ、及びＤ３９９Ｓ）が続いた。これらの構築物は、経時的な単量体％の最も少ない漸減的損失を示した。最高ランクの構築物の間で見られた一般的な変異はＬ３０９Ｋ変異である。このデータは、選択された変異が機械的ストレスの状況下で全体的な安定性を向上させることを実証する。アグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ構築物の両方の撹拌測定値を比較すると、ＹＣ４０３（アグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ａ、Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ、及びＤ３９９Ｓ）及びＹＣ４０６（アグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ｋ、Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ、及びＤ３９９Ｓ）の各構築物が、経時的な機械的ストレスに最も良好に抵抗する。両分子は、熱安定性及び構造安定性の向上を可能にする付加変異（Ｔ３０７Ｐ／Ｌ３０９Ｋ）を示す。
【０４４２】
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【０４４３】
ＩｇＧ１アグリコシル化分子については、ＣＮ５７８（アグリコシル化ＩｇＧ１  Ａ２９９Ｋ）が最小限の濁度を示し、これはまた、実験全体を通して凝集を本質的に示さなかった。ＣＮ５７８は、ＩｇＧ１  Ｔ２９９Ａ及び野生型ＩｇＧ１  ２９９Ｔ分子よりも良好に機能し、したがって、Ａ２９９Ｋ変異がアグリコシル化ＩｇＧ１分子の撹拌の影響を最小限に抑えることを示している。ＣＮ５７８は、濁度試験において、ＩｇＧ１  Ｔ２９９Ａよりも５倍良好である。ＣＮ５７８分子はまた、４８時間の期間にわたって凝集を示さず、これは、アグリコシル化ＩｇＧ１  Ｔ２９９Ａとグリコシル化ＩｇＧ１  ２９９Ｔの両方と同じ結果である。ＥＣ３３１（ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを有するアグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ｋ及びＴ３０７Ｐである）はまた、撹拌試験全体を通して１００％の単量体を維持したため、他の構築物と比較して非常に良好に機能した。これは、ＩｇＧ４．Ｐ  ａｇｌｙ構築物（ＹＣシリーズ）と比較して濁度の２倍の向上を示した。このデータは、ＩｇＧ１  ＣＨ３部分が、分子の熱安定性と構造安定性の両方に大いに役立つことを示唆している。
【０４４４】
グリコシル化分子ＥＣ３０４（グリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ３０７Ｐ、Ｄ３９９Ｓ）、ＥＣ３２３（グリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｄ３９９Ｓ、Ｌ３０９Ｋ）、ＥＣ３２６（グリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ３０７Ｐ、Ｄ３９９Ｓ、Ｌ３０９Ｋ）では、凝集試験の過程にわたり、野生型グリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ分子と比較して、単量体％の向上がある（表９．２及び図１２Ｂ参照）。しかし、濁度は各時点で大きく増大し、７５倍にまで至る。一貫して、各分子はＤ３９９Ｓを含むため、この変異は、データが示すように構造安定性を不安定化する可能性があり得る。
【０４４５】
Ｂ．低ｐＨ維持ステップ試験
タンパク質治療薬は、製造可能性及びスケーラビリティを有することが非常に望ましい。ｐＨ維持ステップ試験を行うことは、プロセス開発に必須である。ｐＨ維持試験は、タンパク質の生成及び精製段階中のプロセス開発を模倣する。生成段階では、タンパク質の再現性及び一貫性が品質保証のために必須である。この方法を使用すると、タンパク質の安定性を高ｐＨまたは低ｐＨのいずれにおいても測定することができる。この試験では、ＡＫＴＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、現在はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、１ｍｇのタンパク質をプロテインＡカラムにロードし、ｐＨ３．１の酢酸バッファーで溶出させた。タンパク質を２時間間隔で６時間まで低ｐＨに維持した。１００μｌのアリコートを取り、次いで分析的ＳＥＣにかけて、分解及び凝集に起因するタンパク質の損失を測定した。結果を表９．３（下記参照）及び図１３にまとめる。
【０４４６】
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【０４４７】
この試験では、ＥＣ３０４（グリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ３０７Ｐ、Ｄ３９９Ｓ）、ＥＣ３２３（グリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｄ３９９Ｓ、Ｌ３０９Ｋ）、ＥＣ３２６（グリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ３０７Ｐ、Ｄ３９９Ｓ、Ｌ３０９Ｋ）、グリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ａ、ＥＣ３３１（ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを有するアグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ｋ及びＴ３０７Ｐである）、アグリコシル化ＩｇＧ１（Ｔ２９９Ａ）、アグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ（Ｔ２９９Ａ）及びグリコシル化ＩｇＧ１を試験のために選択した。このデータから、ＥＣ３３１は、多くの収量を損失することなく、低ｐＨ維持に少なくとも６時間耐えられることが示される。これは、分析したアグリコシル化ＩｇＧ４野生型対照と比較すると向上している。この構築物が低ｐＨ維持に耐えられたことから、他のアグリコシル化構築物も分解によってタンパク質を損失することはないと予測される。いずれもグリコシル化型であるため、ＥＣ３０４及びＥＣ３２６も収量を維持し、これもグリコシル化ＩｇＧ１野生型に匹敵する。ＥＣ３２３もグリコシル化型であるが、経時的にはさほど好調ではなかった。Ｌ３０９Ｋ変異のみが、より安定化されたＥＣ３２６構築物に見られるＴ３０７Ｐ変異と併せて安定化される必要があると仮定される。
【０４４８】
実施例８。安定性操作ＩｇＧ  Ｆｃ抗体のＦｃ受容体結合
本発明のアグリコシル化バリアント抗体のエフェクター機能を、Ｆｃ受容体またはＣ１ｑなどの補体分子に結合する能力によって解析した。
【０４４９】
Ａ．溶液相競合Ｂｉａｃｏｒｅ実験
Ｆｃγ受容体への結合を、溶液親和性表面プラズモン共鳴を使用して分析した（Ｄａｙ  ＥＳ，Ｃａｃｈｅｒｏ  ＴＧ，Ｑｉａｎ  Ｆ，Ｓｕｎ  Ｙ，Ｗｅｎ  Ｄ，Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  Ｍ，Ｈｓｕ  ＹＭ，Ｗｈｉｔｔｙ  Ａ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ  ａｎｄ  ＡＰＲＩＬ  ｆｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＴＮＦ  ｆａｍｉｌｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ＢＡＦＦＲ／ＢＲ３  ａｎｄ  ＢＣＭＡ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００５  Ｆｅｂ  １５；４４（６）：１９１９−３１参照）。この方法は、いわゆる「物質輸送制限（ｍａｓｓ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔ−ｌｉｍｉｔｅｄ）」結合という条件を利用し、この条件下では、リガンド結合（センサチップへのタンパク質の結合）の初期速度が、溶液中のリガンドの濃度に比例する（ＢＩＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（１９９４）Ｃｈａｐｔｅｒ  ６：Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ，ｐｐ  ６−１−６−１０，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ参照）。こうした条件下では、チップ上の固定化されたタンパク質に対する可溶性分析物（チップ表面上を流れるタンパク質）の結合が、チップ表面上のデキストラン基質中への分析物の拡散と比べて速い。したがって、分析物の拡散特性及びチップ表面上を流れる溶液中の分析物の濃度が、分析物がチップに結合する速度を決定する。この実験では、溶液中の遊離Ｆｃ受容体の濃度を、固定化されたＩｇＧ１  ＭＡｂを含むＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅチップへの結合の初期速度によって決定する。これらのＦｃ受容体溶液中に、安定性操作構築物（下記の表１０．１参照）を滴定した。これらの構築物の半数阻害濃度（５０％阻害濃度）（ＩＣ５０）を、センサチップの表面上に固定化された固定化ＩｇＧ１抗体にＦｃ受容体が結合することを阻害する能力によって示した。初期結合速度は生のセンサグラムデータ（図１４）から得た。ＩＣ５０を計算するために使用した滴定曲線を、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）については図１５Ａに、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ  Ｖ１５８）については図１５Ｂに示す。結果は表１０．１に示し、２回の滴定の平均として報告している。
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【０４５０】
ＣＤ６４結合アッセイにおいて、ＩｇＧ１対照抗体のＩＣ５０は９．６μＭであり、ＩｇＧ１  Ｔ２９９Ａ（ａｇｌｙ）及びＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ａ（ａｇｌｙ）のＩＣ５０は、それぞれ２０５及び７３９μＭであった。予想通り、ＩｇＧ１分子は、ＩｇＧ４分子よりもＣＤ６４に対する親和性が高く、アグリコシル化ＩｇＧ１は、グリコシル化ＩｇＧ１と比較して低減した親和性を示した。４４０〜＞５０００μＭの範囲であった安定性操作アグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ分子（ＥＣ３３１及びＹＣ４００シリーズ）と比較して、安定性操作グリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ分子（ＥＣ３００及びＥＣ３２６）のＩＣ５０値は約８μＭであった。安定性操作ＩｇＧ４．Ｐグリコシル化分子（ＥＣ３００、ＥＣ３２６）のＩＣ５０は、グリコシル化ＩｇＧ１対照と同等であり、Ｔ２９９Ａを有する安定性操作アグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ（ＹＣ４０１、ＹＣ４０３）の対数変換後ＩＣ５０は、アグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ａ対照と同等であった。しかしながら、Ｔ２９９Ｋを有する安定性操作アグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐは、Ｔ２９９Ａ置換を有する同等の分子と比較して対数１〜２つ分大きい親和性の低減を示した（図７Ａ）。この結果は、アグリコシル化ＩｇＧ１  Ｔ２９９Ａ対照と比較して親和性の対数減少を示した安定性操作アグリコシル化ＩｇＧ１  Ｔ２９９Ｋ（ＣＮ５７８）でも観察された（図１６Ｂ）。実際、Ｔ２９９Ｋ置換は、アグリコシル化ＩｇＧ１（Ｔ２９９Ａ）分子を変化させて、アグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ａ対照と比べてＣＤ６４への親和性が高い状態から、アグリコシル化ＩｇＧ１（Ｔ２９９Ｋ）の親和性がアグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ対照と比較して低い状態にする（図１６Ｂ）。まとめると、Ｔ２９９Ｋ変異は、ＩｇＧ１分子とＩｇＧ４分子の両方において、ＣＤ６４への親和性を低減させる。
【０４５１】
ＣＤ１６アッセイでは、ＩｇＧ１対照のＩＣ５０は１０５μＭであり、アグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ａ及びＩｇＧ１  Ｔ２９９ＡのＩＣ５０は、いずれも＞１０００μＭであった。グリコシル化安定性操作ＩｇＧ４．Ｐ分子のＩＣ５０値は、対数変換後にＩｇＧ１対照と同等であり、安定性操作アグリコシル化分子の全て（ＩｇＧ４．ＰとＩｇＧ１の両方）で、ＩＣ５０は＞１０００μＭであった。Ｔ２９９ＫがＣＤ１６への親和性をさらに低減させたかどうかを調査するため、Ｔ２９９Ｋ置換のみが唯一異なる２セットの構築物（ＹＣ４０１、ＹＣ４０４及びＹＣ４０３、ＹＣ４０６）を、高い抗体濃度（５μＭ）で試験した。結合曲線は、高濃度のＴ２９９Ｋ変異によって生じたＣＤ１６への親和性の低減を示す（図１７）。まとめると、Ｔ２９９Ｋ変異は、ＩｇＧ分子のＣＤ１６への親和性を低減させる。
【０４５２】
Ｂ．Ｃ１ｑ結合ＥＬＩＳＡ
９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎａｌｇｅ−Ｎｕｎｃ  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）に、４℃で一晩、ＰＢＳ中で１０ｕｇ／ｍｌの組換え可溶性ヒトＣＤ４０リガンド５０μｌをコートすることにより、Ｃ１ｑ結合アッセイを行った。ウェルを吸引し、洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄し、２００μｌ／ウェルのブロック／希釈バッファー（０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰ０４、ｐＨ７．０、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１％ゼラチン）で１時間ブロッキングした。抗体を３倍希釈でブロック／希釈バッファーに希釈し、室温で２時間インキュベートした。
【０４５３】
上記のように吸引及び洗浄した後、ブロック／希釈バッファーに希釈した５０Ｊウェル２ＪゲルのＳｉｇｍａヒトＣ１ｑ（Ｃ０６６０）を添加し、室温で１．５時間インキュベートした。
【０４５４】
上記のように吸引及び洗浄した後、ブロック／希釈バッファーで３，５６０倍に希釈した５０ｐｌｌ／ウェルのヒツジ抗Ｃ１ｑ（Ｓｅｒｏｔｅｃ  ＡＨＰ０３３）を添加した。室温で１時間のインキュベーション後、上記のようにウェルを吸引し、洗浄した。次いで、１：１０，０００でブロック／希釈剤に希釈した５０ｐｌｌ／ウェルのロバ抗ヒツジＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ７１３−０３５−１４７）を添加し、ウェルを室温で１時間インキュベートした。
【０４５５】
上記のように吸引及び洗浄した後、１００ａｌｌ  ＴＭＢ基質（４２０ｐｌＭ  ＴＭＢ、０．００４％  Ｈ２Ｏ２を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム／クエン酸バッファー、ｐＨ４．９）を添加し、２分インキュベートしてから、１００ｕｌの２Ｎ硫酸で反応を停止した。４５０ｎｍでの吸光度をＳｏｆｔｍａｘ  ＰＲＯ計器で読み取り、Ｓｏｆｔｍａｘソフトウェアを使用して、４パラメータフィッティングにより相対結合親和性（Ｃ値）を決定した。
【０４５６】
実験の結果は、ＣＮ５７８（ＩｇＧ１  Ｔ２９９Ｋ）とＹＣ４０６（アグリコシル化ＩｇＧ４．Ｐ  Ｔ２９９Ｋ、Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ、及びＤ３９９Ｓ）のいずれにも、測定可能なＣ１ｑへの結合性がなく（図１７）、一方でＩｇＧ１  Ｔ２９９Ａには、いくらかの残余結合性があることを示す。
【０４５７】
実施例９。ＩｇＧ１  ＣＨ３は、エフェクター機能なしでアグリコシル化ＩｇＧ４  ＣＨ２を安定化させる
このセクションに記載するタンパク質は５ｃ８抗体に由来し、特記なき限り、ＩｇＧ４由来のＣＨ１領域、ＩｇＧ４由来のＣＨ２ドメイン、及びＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体由来（記載の通り）のＣＨ３ドメインを含む。実施例３に記載したようにタンパク質を生成し、精製した。修飾抗体のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの熱安定性を、ｐＨ６．０及びｐＨ４．５でのＤＳＣ（実施例６に詳述）によって測定した。撹拌ストレスの影響を、分析的ＳＥＣ及びＡ３２０ｎｍでの濁度測定（実施例７）によって測定した。本発明のアグリコシル化バリアント抗体のエフェクター機能を、Ｆｃ受容体またはＣ１ｑなどの補体分子に結合する能力によって解析した。Ｆｃγ受容体への結合は溶液親和性表面プラズモン共鳴を使用して分析し、補体因子Ｃ１ｑへの結合はＥＬＩＳＡによって分析した（実施例６）。最後に、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットで実施した薬物動態試験（実施例９）により、血清半減期を決定した。
【０４５８】
実施例５に詳述したように、ＩｇＧ４−ＣＨ２／ＩｇＧ１−ＣＨ３アグリコシル化構築物をＣＨＯで発現させ、収量は培養物１リットル当たり７〜１４ｍｇの範囲であった。ＩｇＧ１−ＣＨ３の導入は、ＩｇＧ４由来のＣＨ３を有する同じ構築物と比較して高い収量（−１．５倍）をもたらすようである（表８．１）。さらに、ＩｇＧ１アグリコシルＩｇＧ４−ＣＨ２／ＩｇＧ１−ＣＨ３は、野生型アグリコシルＩｇＧ４のＣＨ３ドメインの安定性（Ｔｍ＝７４℃、表１２．２及び８．２）と比較して増大したＣＨ３ドメインの熱安定性（Ｔｍ＝８５℃）を有した。それまではＣＨ２ドメイン内のグリカンの損失が安定性の重要因子であると考えられていたため、ＩｇＧ１  ＣＨ３が撹拌安定性（表１２．３）の決定的特長であることは、興味深い観察である。
【０４５９】
ＥＡＧ２４１２構築物（Ｎ２９７Ｑ  ＩｇＧ４−ＣＨ２／ＩｇＧ１−、すなわち、Ｎ２９７Ｑ及びＳｅｒ２２８Ｐｒｏ置換を有する５ｃ８可変領域（ＩｇＧ１フレームワーク）、ＩｇＧ４  ＣＨ１、ＩｇＧ４  ＣＨ２、ＩｇＧ１  ＣＨ３）は、Ｔ２９９Ａ及びＴ２９９ＫＩｇＧ４−ＣＨ２／ＩｇＧ１−ＣＨ３と比較して良好なエフェクター機能プロファイルを示し、ＣＤ６４及びＣＤ３２への結合が最も低いことが観察される。ＩｇＧ１−ＣＨ３は、Ｆｃγ受容体への結合に影響を及ぼさないことが見出された。アグリコシルＩｇＧ４−ＣＨ２ドメイン含有構築物はいずれも、Ｃ１ｑに結合しない。
【０４６０】
安定性操作ＩｇＧ４／ＩｇＧ１分子の安定性及び血清半減期に関して、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて薬物動態試験を実施した。ラットは、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、ならびに実験動物の人道的な処置及び管理に関する市、州、及び政府の指針に従って飼養した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に希釈した抗体１ｍｇ／ｋｇ（１ｍｇ／ｍｌ）の単回ボーラス注射を、雄のＳｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットにＩＶ投与した。ラットは、注射の０、０．２５、０．５、１、２、６、２４、４８、９６、１６８、２１６、２６４、及び３３６時間後に屠殺した。血清サンプルを調製して分析し、抗体のレベルを定量した。５％正常マウス血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ０１５−０００−１２０）を補ったＤＡＢにサンプルを希釈し、検出試薬は、最終濃度２５０ｎｇ／ｍｌで使用したＥｕ標識マウス抗ヒトＦｃ抗体（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  １２４４−３３０）であった。精製された抗体の標準曲線と比較して、ＥｘｃｅｌのＴＲＥＮＤ関数を使用することにより、定量を行った。
【０４６１】
Ｎ２９７Ｑ  ＩｇＧ４−ＣＨ２／ＩｇＧ１−ＣＨ３の半減期は、Ｔ２９９Ａ  ＩｇＧ４抗体と同じであり、これは予想通り、アグリコシル化ＩｇＧ１よりわずかに短かった（表１２．５）。このデータは図１９Ｃにプロットしている。
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【０４６２】
実施例１０。Ｔ２９９は安定性及びエフェクター機能の決定因子である
このセクションに記載するタンパク質は全て５ｃ８抗体に由来し、特記なき限り、ＩｇＧ１抗体のＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含む。実施例５に記載したようにタンパク質を生成し、精製した。ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの融解温度に対する変異の影響を、ｐＨ６．０及びｐＨ４．５でのＤＳＣ（実施例６に詳述）によって測定した。本発明のアグリコシル化バリアント抗体のエフェクター機能を、Ｆｃ受容体またはＣ１ｑなどの補体分子に結合する能力によって解析した。Ｆｃγ受容体への結合は溶液親和性表面プラズモン共鳴を使用して分析し、補体因子Ｃ１ｑへの結合はＥＬＩＳＡによって分析した（実施例８）。
【０４６３】
実施例５に詳述したように、ＩｇＧ１  Ｔ２９９Ｘ及びＮ２９７Ｘ／Ｔ２９９Ｋアグリコシル化構築物をＣＨＯで発現させ、収量は培養物１リットル当たり７〜３０ｍｇの範囲であった（表１３．１）。Ｔ２９９Ｋと組み合わせてＮ２９７位に二次的な変異を付加すると、ＣＨ２ドメインの熱安定性が１．５〜４．４℃低下した（表１３．２）。さらに、Ｔ２９９Ｘ変異は、正電荷を帯びた側鎖のＡｒｇ（Ｔ２９９Ｒ）及びＬｙｓ（Ｔ２９９Ｋ）からの最も高い安定性の獲得を示した（表１３．２）。Ａｓｎ（Ｔ２９９Ｎ）及びＧｌｎ（Ｔ２９９Ｑ）の２つの極性側鎖は両方ともＴ２９９Ａと比較すると高い安定性を示したが、正電荷を帯びた側鎖ほど高くはなかった。プロリン（Ｔ２９９Ｐ）は、Ｔ２９９Ａと比較して安定性のわずかな低下を示し、より大きな疎水性側鎖Ｐｈｅ（Ｔ２９９Ｆ）は、ＣＨ２ドメインの熱安定性を２．４℃低下させた。最後に、負電荷を帯びた側鎖Ｇｌｕ（Ｔ２９９Ｅ）は、ＣＨ２の熱安定性にほとんど影響を及ぼさなかった。これらの結果は、Ｔ２９９位の正電荷を帯びた側鎖の置換がＣＨ２ドメインの熱安定性を増大させる新規の特性を実証する。
【０４６４】
Ｎ２９７Ｘ、Ｔ２９９Ｋ変異（ＣＮ６４５、ＣＮ６４６、及びＣＮ６４７）は全て、ＣＤ３２ａ及びＣＤ１６への非常に低い親和性を維持しながら、ＣＤ６４への親和性をわずかに増大させたことが観察される（図２０Ｂ、２０Ｄ及び２０Ｆ）。Ｔ２９９Ｘ変異は、一貫して低いＣＤ１６への親和性を示したが、ＣＤ３２ａへの低い親和性は、Ｔ２９９Ｅの場合には増大した（表１３．３及び図２０Ｃ、１８Ｅ）。また、正電荷を帯びた側鎖Ｔ２９９Ｒ及びＴ２９９Ｋのみが、ＣＤ６４への低い親和性をもたらすことも興味深い（表１３．３及び図２０Ａ）。最後に、Ｔ２９９Ｋ、Ｔ２９９Ｐ及びＴ２９９Ｑは、Ｃ１ｑ結合を追跡する役には立たず、Ｔ２９９Ｎ、Ｔ２９９Ｅ、Ｔ２９９Ｆは、わずかに高いものの依然として非常に低いＣ１ｑへの結合を示す（図２０Ｇ及び２０Ｈ）。Ｎ２９７Ｐ／Ｔ２９９Ｋ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｋ、及びＮ２９７Ｓ／Ｔ２９９Ｋは、Ｃ１ｑへの結合を示さない（図２０Ｈ）。
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【０４６５】
実施例１１。安定化Ｆｃ構築物は、安定性変異体の適用がＦａｂと無関係であることを示す
このセクションに記載するタンパク質は、５ｃ８抗体に由来する結合部位を含む。ＥＡＧ２４７６構築物は、ＩｇＧ４免疫グロブリン分子由来のＦｃ部分を含み、ＥＡＧ２４７８は、ＩｇＧ１分子由来のＦｃ部分を含む（ＥＡＧ２４７６及びＥＡＧ２４７８は、それぞれ、ＹＣ４０６及びＣＮ５７８構築物のＦｃ型（Ｆａｂなし）である）。
【０４６６】
実施例５に記載したようにタンパク質を生成し、精製した。ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの融解温度に対する変異の影響を、ｐＨ６．０でのＤＳＣ（実施例６に詳述）によって測定した。本発明のアグリコシル化バリアント抗体のエフェクター機能を図２１に示す。抗体を、Ｆｃ受容体に結合する能力によって解析した。Ｆｃγ受容体への結合を、溶液親和性表面プラズモン共鳴（実施例８）を使用して分析した。
【０４６７】
実施例５に詳述したように、安定化Ｆｃアグリコシル化構築物をＣＨＯで発現させ、収量を（表１４．１）に詳述した。ＣＨ２ドメインの変異（Ｔ２９９Ｋ、Ｔ３０７Ｐ及びＬ３０９Ｋ）は、Ｆａｂの存在下または非存在下で同じ熱安定性を示し（表１４．２）、また、同じＦｃγ受容体結合親和性を有した（表１４．３）。まとめると、本発明に詳述する安定化変異は、予想通りＦａｂ非依存性であり、Ｆａｂの関与にかかわらず、Ｆｃドメインを安定化するのに適用できる。
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【０４６８】
実施例１２
熱安定性、精製時の沈殿の少なさ、及び抗体分泌細胞からの抗体産生力価の向上を含め、望ましい特性を有する本発明の抗体を生成するために、ヒトカッパ軽鎖定常領域に結合した配列番号１１の可変軽鎖配列を含む軽鎖と、様々な重鎖定常領域に結合した配列番号４の可変重鎖配列を含む重鎖とを用い、多数の抗体構築物を生成した。試験した様々な重鎖定常領域において、配列変化は驚くほど大きな結果をもたらした。
【０４６９】
例えば、ヒトＩｇＧ４のＣＨ１、Ｓ２２８Ｐ変異（ＥＵ付番）を有するヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を含むＦｃ領域（ここで、ＩｇＧ４は、アスパラギン残基２９７またはスレオニン残基２９９（ＥＵ付番）のアミノ酸変化によって、Ｎ結合型グリコシル化モチーフＮＸＳ／Ｔを消失させることにより、アグリコシル化されている）に、配列番号４の可変重鎖をカップリングさせると、熱安定性に乏しく、プロテインＡ溶出中に低ｐＨに曝露すると沈殿する傾向がある抗体がもたらされた。驚くべきことに、ヒトＩｇＧ４のＣＨ１、Ｓ２２８Ｐ変異（ＥＵ付番）を有するヒンジ、及びＣＨ２、ならびにヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域にカップリングしたＣＨ２ドメインにおけるＮ２９７Ｑ変異（ＥＵ付番）を含むキメラＦｃ領域を使用して、配列番号４の可変重鎖配列を含む抗体重鎖と、ヒトカッパ軽鎖定常領域に結合した配列番号１１の可変軽鎖配列を含む軽鎖とを作製したとき、結果として生じた抗体は、精製時の沈殿の少なさに相関する熱安定性の増大、及び抗体産生細胞からの抗体産生の増大を示した。言い換えれば、ヒトカッパ軽鎖定常領域に結合した配列番号１１の配列を含む可変軽鎖と、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域にカップリングしたヒトＩｇＧ４のＣＨ１、Ｓ２２８Ｐ変異（ＥＵ付番）を有するヒンジ、及びＮ２９７Ｑ変異（ＥＵ付番）を有するＣＨ２を含むキメラＦｃ領域に結合した配列番号４の配列を含む可変重鎖とを含む抗体は、特にＳ２２８Ｐ（ＥＵインデックス付番）を有するアグリコシル化ヒトＩｇＧ４と比較すると、驚くほど熱安定性が高く、抗体精製時の沈殿が少なく、抗体産生細胞からの抗体収量が高かった。
【０４７０】
実施例１３。水素／重水素交換質量分析及びＸ線結晶解析によって決定された、安定化エフェクターレス抗体のタンパク質立体構造、動態、及び構造
構造及び動態は、タンパク質の機能に著しく寄与する。根本的な構造機構を理解することは、観察される機能的効果を説明するために重要である。この理由のため、これまでに詳述した安定性獲得変異がタンパク質の構造及び動態に及ぼす影響を、水素／重水素交換質量分析（ＨｆＤＸ  ＭＳ）とＸ線結晶解析の両方によって調査した。
【０４７１】
Ａ．水素／重水素交換質量分析
水素／重水素交換の質量分析による検出は、タンパク質の動態及び立体構造を解析する手法である。タンパク質の動態／立体構造は、タンパク質中の水素が重水素で交換される速度に影響を及ぼし、したがって、タンパク質の重水素化を経時的に測定することで、タンパク質構造が（例えば変異で）修飾されるときの立体構造の変化を明らかにすることができる。したがって、アグリコシル化抗体Ｆｃ骨格の水素／重水素交換に対する安定化変異の影響を調査した。
【０４７２】
抗体（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムＨ２Ｏ中、ｐＨ６．０）を、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、Ｄ２Ｏ、ｐＤ６．０で２０倍に希釈し、様々な時間（１０秒、１分、１０分、６０分、及び２４０分）にわたって室温でインキュベートした。２００ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＴＣＥＰ及び４ＭグアニジンＨＣｌ、Ｈ２Ｏ、ｐＨ２．４での１：１希釈により、ｐＨを２．６に低下させることによって、交換反応をクエンチした。クエンチしたサンプルを、ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹプラットフォームに基づくＷａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣシステムを使用してオンラインで消化し、脱塩し、分離した。交換及びクエンチ後の抗体およそ２０ｐｍｏｌｅを固定化ペプシンカラムに注入した。オンライン消化は、１５℃の０．０５％ギ酸を含む水中で２分間にわたり、０．１ｎＬ／分の流速で行った。結果として生じた消化性ペプチドを、０℃に維持したＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍペプチドトラップ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）上で捕捉し、水、０．０５％ギ酸で脱塩した。切換弁によって分流を行い、捕捉されたペプチドを、０℃に保ったＷａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃｌ  ８  １．７μｍ、１ｍｍ×１００ｍｍカラム上に、４０μＬ／分でトラップから溶出させた（平均背圧はおよそ９０００ｐｓｉであった）。０．０５％ギ酸を含むアセトニトリルの６分間の線形勾配（８−４０％）を使用して、ペプチドを分離させた。エレクトロスプレーイオン化法及びロック質量補正（Ｇｌｕ−フィブリノーゲンペプチドを使用）を用いて、溶離液をＷａｔｅｒｓ  Ｓｙｎａｐｔ質量分析計に誘導した。質量スペクトルをｍ／ｚ範囲２６０〜１８００にかけて取得した。Ｗａｔｅｒｓ  ＩｄｅｎｔｉｔｙＥソフトウェアの支援を受け、精密質量とＭＳ／ＭＳの組み合わせを使用して、ペプシン断片を同定した。ペプチド重水素レベルは、Ｗｅｉｓらによって説明されているように、ＥｘｃｅｌベースのプログラムであるＨＸ−Ｅｘｐｒｅｓｓを使用して決定した。
【０４７３】
インタクトＩｇＧ４．Ｐ対Ｎ２９７Ｑ  ＩｇＧ４．Ｐ、Ｎ２９７Ｑ  ＩｇＧ４．Ｐ対Ｎ２９７Ｑ  ＩｇＧ４．Ｐ−ＣＨ２／ＩｇＧ１−ＣＨ３、及びＴ２９９Ａ  ＩｇＧ４．Ｐ対ＹＣ４０６（Ｔ２９９Ｋ、Ｔ２０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ、Ｄ３９９Ｓ）のＨ／ＤＸ−ＭＳデータを、上述のように収集した。インタクト（グリコシル化）ＩｇＧ４とアグリコシル化Ｎ２９７Ｑ  ＩｇＧ４の比較は、アグリコシル化形態がより高い交換量を示す配列の領域を示す。より高いＨ／Ｄ交換量は、ペプチドＬ２３５−Ｆ２４１、Ｆ２４１−Ｄ２４９、１２５３−Ｖ２６２、Ｖ２６３−Ｆ２７５、及びＨ３１０−Ｅ３１８において観察される。ＩｇＧ４ペプチドのＭ３５８−Ｌ３６５、Ｔ４１１−Ｖ４２２及びＡ４３１−Ｓ４４２における交換量が、Ｎ２９７Ｑ  ＩｇＧ４．Ｐ−ＣＨ２／ＩｇＧ１−ＣＨ３構築物の同じペプチドと比較して高いことは、Ｎ２９７Ｑ  ＩｇＧ４−ＣＨ２と組み合わせたＩｇＧ１−ＣＨ３から生じる安定性の獲得を示す。この場合では、ＩｇＧ４由来のＣＨ３ドメインが、ＣＨ３の３つの異なる領域において、ＩｇＧ１−ＣＨ３と比較して高い交換量を示す。最後に、ペプチドＬ２３５−Ｆ２４１、Ｆ２４１−Ｍ２５２、Ｖ２６３−Ｆ２７５、Ｖ２６６−Ｆ２７５、及びＶ２８２−Ｆ２９６は、脱グリコシル化のために交換が特に起こりやすい配列領域における、アグリコシル化ＩｇＧ４（Ｔ２９９Ａ）と比較した変異体構築物ＹＣ４０６による安定性の獲得を示す。興味深いことに、ＣＨ３ドメインにおけるＤ３９９Ｓ変異は、熱安定性のわずかな増大を生じさせると同時に、野生型配列よりも多くの交換をもたらす。全体として、Ｈ／Ｄ交換ＭＳは、脱グリコシル化の結果としての立体構造の変化が、安定性変異によって部分的または完全に回復したことを示した。
【０４７４】
Ｂ．安定性増強Ｆｃ構築物のＸ線結晶解析
ＥＡＧ２４７６構築物（ａｇｌｙ  ＩｇＧ４−Ｆｃ  Ｔ２９９Ｋ、Ｔ３０７Ｐ、Ｌ３０９Ｋ、Ｄ３９９Ｓ）を結晶化させ、２．８Ａの解像度でデータを収集した（全体的なデータ完全性９２％；高解像度シェル６６％）。この構造を電子密度に組み入れ、Ｒ／Ｒｆｒｅｅがそれぞれ２７．７／３３．９％になるまで精密化した。この構造は、２つの鎖の間の偏差が非常にわずかで重ねることができる非対称ユニット（ＡＳＵ）内の２つのＦｃ鎖を明らかにした。ループＶ２６６−Ｅ２７２、特にＰ２９１−Ｖ３０２は、野生型ＩｇＧ４結晶構造（ｐｄｂ  ＩＡＤＱ）で観察されるものとはかなり異なる。これは、変異Ｔ２９９Ｋの直接的な結果であり得る。
【０４７５】
ＥＡＧ２４７８構築物（ａｇｌｙ  ＩｇＧ１  Ｆｃ  Ｔ２９９Ｋ）の結晶構造を２．５Åの解像度まで解析した（全体的なデータ完全性９２％；高解像度シェル６６％）。この構造を構築し、Ｒ／Ｒｆｒｅｅがそれぞれ２７．４／３５．８％になるまで精密化した。ＥＡＧ２４７６の構造とは異なり、ＡＳＵ内の２つのＦｃ鎖は、ＥＡＧ２４７８構造では同一ではなかった。鎖Ａは、酵素的に脱グリコシル化されたＩｇＧ１  Ｆｃ（ｐｄｂ  ３ＤＮＫ）の構造により類似していることが観察される。ＥＡＧ２４７８構造におけるＣＨ２ドメインは、酵素的に脱グリコシル化されたＩｇＧ１  Ｆｃ（ｐｄｂ  ３ＤＮＫ）及びマウスアグリコシル化ＩｇＧ１  Ｆｃ（ｐｄｂ  ３ＨＫＦ）で観察されるものよりも互いに近い。ＣＨ２ドメインは、ＥＡＧ２４７６構造では、ＥＡＧ２４７８構造で観察されるものよりも開いている。これらの構造は、両方の場合において、Ｔ２９９Ｋ変異が、ドッキングしたＦｃガンマＩＩＩ受容体のＹ１２９側鎖に向けられていることを明らかにし、このことは、この変異に関して観察される受容体への親和性の減少を説明する。
【０４７６】
実施例１４。タンパク質の精製。
配列番号８１の成熟軽鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００１の成熟軽鎖）及び配列番号８０の成熟重鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００４／ＮＤ００６の成熟重鎖）を有するタンパク質を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で安定に発現させ、精製した。結果として生じた分子を、ＨＰ１／２  Ｈ１Ｌ３アグリコシルＩｇＧ４Ｐ／ＩｇＧ１キメラＳ２２８Ｐ  Ｎ２９７Ｑ（Ｋａｂａｔ付番）またはＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３と呼ぶ。
【０４７７】
図２２Ａは、シグナルペプチド配列（図２２Ａに太字のイタリック体で示されているシグナルペプチド配列及びコードＤＮＡ）を含む、ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）Ｇ１の軽鎖、カッパ軽鎖（Ｈ１Ｌ３）のヌクレオチド配列（配列番号９１）及びアミノ酸配列（配列番号９２）を示す。
【０４７８】
図２２Ｂは、シグナルペプチド配列（図２２Ｂに太字のイタリック体で示されているシグナルペプチド配列及びコードＤＮＡ）を含む、ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）Ｇ１の軽鎖、重鎖（Ｈ１Ｌ３）のヌクレオチド配列（配列番号９３）及びアミノ酸配列（配列番号９４）を示す。
【０４７９】
図２３Ａは、軽鎖（上）と重鎖（下）の両方のシグナル配列（下線が引かれた文字）を含む、ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１、カッパ軽鎖（Ｈ１Ｌ３）のアミノ酸配列を含む。
【０４８０】
図２３Ｂは、配列番号８１の成熟軽鎖及び配列番号８０の成熟重鎖を有するＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１、カッパ軽鎖（Ｈ１Ｌ３）のアミノ酸配列を含む。図２３Ｂでは、軽鎖（アミノ酸残基２４〜３４、５０〜５６、及び８９〜９７）及び重鎖（残基２８〜３５、５０〜６６、及び９９〜１１０）の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列に下線が引かれている。
【０４８１】
精製プロセスの全体を通して、パイロジェンフリーの容器及び溶液を使用した。精製プロセスは室温で行った。
【０４８２】
ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で安定に発現させ、精製した。
【０４８３】
精製について簡単に説明すると、およそ１０グラムのＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３（Ｏｃｔｅｔによる推定力価：１３１０ｍｇ／Ｌ）を含む７．５ＬのＣＨＯ培地を、２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．１Ｍ  ＮａＣｌ中、４０〜１２０ｍＬ／時間で、４００ｍＬのｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ  １７−１２７９−０４、ｉ．ｄ．５０ｍｍ）にロードした。このカラムを、４×４００ｍＬの同じバッファーで洗浄し、次いで３×４００ｍＬの２５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ５．５、０．１Ｍ  ＮａＣｌで洗浄した。ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３を、１０００ｍＬの２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ２．８、０．１Ｍ  ＮａＣｌで溶出させ、ｐＨ８．６の２５ｍＭリン酸ナトリウムでｐＨを中和した。サンプルを０．２μのＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎａｌｇｅｎｅフィルターで濾過し、４℃で保管した。２８０ｎｍでの値を報告するＮｏｎｏＤｒｏｐ  ２０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを使用した吸光度スペクトルから、溶出したサンプルのタンパク質含量（１ｍｇ／ｍＬのＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３の消衰係数計算値＝１．４９）を推定した。
【０４８４】
ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ溶出プールを、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．１Ｍ  ＮａＣｌ中で、１５０ｍＬ  ＴＭＡＥカラム（ＥＭＤ  １．１６８８１．０５００、ｉ．ｄ．５０ｍｍ）にロードした。フロースルーを収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって調べた。サンプルを濃縮し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ−２限外濾過ユニットを使用して２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、２５ｍＭ  ＮａＣｌにバッファー交換し、２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、２５ｍＭ  ＮａＣｌ中で同じＴＭＡＥカラムに再びロードした。フロースルーを収集し、１５．２４ｍＬの４Ｍ  ＮａＣｌを５１４ｍＬのサンプルに添加することによって１４０ｍＭ  ＮａＣｌに調整し、次いで、０．２μのＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎａｌｇｅｎｅフィルターで濾過し、アリコートを取り、−８０℃で保管した。理論的収率の９６％を表す、９，３８４ｍｇのＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３が生成された。
【０４８５】
実施例１５。タンパク質の解析。
実施例１４に記載したタンパク質を、後述するいくつかの異なる方法によって解析した。
【０４８６】
Ａ．ＵＶスペクトル
図２４は、配列番号８１の成熟軽鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００１の成熟軽鎖）及び配列番号８０の成熟重鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００４／ＮＤ００６の成熟重鎖）を有するタンパク質のＵＶスペクトルを提示する。ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３（ＲＳ）のＵＶスペクトルは、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）中の未希釈サンプルから直接、ＮｏｎｏＤｒｏｐ  ２０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒで測定した。ε２８００．１％＝１．４９／ｃｍの消衰係数計算値を使用して、１７．７４ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を決定した。
【０４８７】
Ｂ．ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
図２５は、配列番号８１の成熟軽鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００１の成熟軽鎖）及び配列番号８０の成熟重鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００４／ＮＤ００６の成熟重鎖）を有するタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３のアリコートを、還元サンプルについてはＤＴＴを含むサンプルバッファーか、または非還元サンプルについてはＤＴＴを含まないサンプルバッファー中で調製した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの４−２０％ポリアクリルアミド勾配ゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲルをＳｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、蒸留水で脱染した。図２５は、ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３（ＲＳ）の分析結果を示す。還元条件下のゲルは、ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３の重鎖及び軽鎖の予想分子量を表す、それぞれ５０及び２５ｋＤａの２つのバンドを示す。非還元条件下では、主要なバンドの予想分子量は、抗体のＨＣ２ＬＣ２四量体構造の１５０ｋＤａである。このサンプルは、比較的高分子量の形態を０．５％未満で含む。
【０４８８】
Ｃ．等電点電気泳動（ＩＥＦ）
図２６は、配列番号８１の成熟軽鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００１の成熟軽鎖）及び配列番号８０の成熟重鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００４／ＮＤ００６の成熟重鎖）を有するタンパク質のＩＥＦ結果を示す。サンプルをＩＥＦサンプルバッファー３−１０中で調製し、Ｎｏｖｅｘ  ｐＨ  ３−１０  ＩＥＦ  Ｇｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＥＣ６６５５２ＢＯＸ）上で、１３０Ｖ定圧で９２分間泳動した。ゲルを１２％ＴＣＡで１０分間固定し、Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、蒸留水で脱染した。ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＲＳは、単一の主要なバンド、及びいくつかの小さい酢酸をより多く含むバリアントとして泳動する。ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）  Ｇ１  Ｈ１Ｌ３のｐＩ計算値は６．２２である。図２６は、ＣＨＯ  ＤＧ４４ｉ細胞で発現させた同じ構築物、野生型ＩｇＧ４Ｐ  Ｆｃ及びＩｇＧ４ＰＥ  Ｆｃに融合した２つの他のＨＰ１／２  Ｈ１Ｌ３構築物も示す。これらの分子のゲル移動性は、分子の異なるｐＩ値と整合する。レーンの表記には、全サンプルのｐＩ計算値が注記されている。
【０４８９】
Ｄ．分析的サイズ排除クロマトグラフィ
図２７は、配列番号８１の成熟軽鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００１の成熟軽鎖）及び配列番号８０の成熟重鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００４／ＮＤ００６の成熟重鎖）を有するタンパク質の分析的サイズ排除クロマトグラフィの結果を示す。Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣシステムを使用し、２０μｇの試験標品を、２０×ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ２８３４８）から希釈したＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中、０．２ｍｌ／分の流速で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ５／１５０  ＧＬカラム（ＧＥ  ２８−９９０９−４５）に流した。溶離液の吸光度を２８０ｎｍでモニタリングした。これを図２７に示す。ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３は、７．８分で単一のピークとして溶出し、検出可能な凝集体または低分子量成分はなかった。
【０４９０】
Ｅ．内毒素
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ  ＰＴＳ２０カートリッジ（０．０５〜５ＥＵ／ｍｌ）をメーカーの説明に従って使用して、内毒素を定量した。試験標品中に見られた内毒素レベルは＜０．０６ＥＵ／ｍｇであり、これはＮＨＰでの注射に好適であった。
【０４９１】
Ｆ．示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
図２８〜３０は、配列番号８１の成熟軽鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００１の成熟軽鎖）及び配列番号８０の成熟重鎖（ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  ＮＤ００４／ＮＤ００６の成熟重鎖）を有するタンパク質のＤＳＣ結果を示す。ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３試験標品をＰＢＳ中で約１ｍｇ／ｍＬに希釈し、次いで４℃のＰＢＳに対して約２０時間透析した。各サンプルおよそ４００μｇ（４００μＬ）を９６ウェルプレートに加えた。スキャンは、高いピーク解像度のためにミディアムフィードバックモードを使用し、２０〜１２０℃まで２℃／分で行った。Ｔｍ値（タンパク質分子の５０％が動的な非可逆の二状態平衡でアンフォールディングする相転移温度）を、各ドメインについて、ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＤＳＣ計器を使用して測定した。２回のバッファースキャンを行って減算のためのベースラインを定義し、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェアを使用してデータを分析した。比較のために、ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３  Ｆｃ断片（バッチＢＪＧ２０１８−１−３−００８８−Ｅ２）のサンプルも分析した。Ｆａｂドメインの割り当ての検証として、試験標品のＦａｂ２断片を生成し、分析した。図２８、図２９、及び図３０にはそれぞれ、ＨＰ１／２  ｈＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）Ｇ１  Ｈ１Ｌ３インタクト抗体、Ｆｃ断片、及びＦａｂ２断片の融解曲線を示し、表１１には、ドメイン融解温度（Ｔｍ）をまとめている。Ｔｍ値に基づくと、インタクト抗体の場合、抗体のＧ４Ｐ  ＣＨ２ドメインは相転移温度が５９．６℃で安定性が最も低く、これにＦａｂドメインの６９．１℃、及びＧ１  ＣＨ３ドメインの８５．９℃が続いた。単離されたＦｃ断片では、抗体のＧ４Ｐ  ＣＨ２ドメインのＴｍ値は５７．４℃であり、Ｇ１  ＣＨ３ドメインでは８４．５℃であった。Ｆａｂ２断片では、ＦａｂドメインのＴｍは６９．４℃であった。
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【０４９２】
実施例１６。タンパク質のさらなる実験的分析。
２つの異なるＨＰ１／２タンパク質の製品特質を調査した。第１の構築物であるヒト化ＨＰ１／２  Ｈ１／Ｌ３  ｈｕＩｇＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ  ＥＵ付番）／ＩｇＧ１キメラまたはＨＰ１／２  Ｇ４Ｐ  ａｇｌｙ／Ｇ１は、配列番号８１の成熟軽鎖及び配列番号８０の成熟重鎖を含む。第２の構築物であるヒト化  ＨＰ１／２  Ｈ１／Ｌ３  ｈｕＩｇＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｔ２９９Ａ  ＥＵ付番）またはＨＰ１／２  Ｇ４Ｐ  ａｇｌｙは、配列番号８１の成熟軽鎖及び配列番号８９の成熟重鎖を含む。これら２つの操作型のＨＰ１／２を設計し、発現させ、精製し、解析した。これらの構築物はＣＨＯ細胞で一過性に発現させた。
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【０４９３】
上記の表に記載の（推定力価はＯｃｔｅｔによる）構築物７２〜１２２ｍｇ／Ｌを含むＣＨＯ培地９００ｍＬを、重力によって９ｍＬのｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ  １７−１２７９−０４）にロードした。カラムを６×５ｍＬの２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．１Ｍ  ＮａＣｌで洗浄し、次いで６×４ｍＬの２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．５、０．１Ｍ  ＮａＣｌで洗浄した。ｍＡｂを、７×５ｍＬの２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ２．８、０．１Ｍ  ＮａＣｌで溶出させた。ｐＨ８．６のリン酸ナトリウムを最終濃度２０ｍＭまで添加することにより、ｐＨを中和した。様々な量の沈殿物が観察された。サンプルを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を濾過し、アリコートを取り、−７０℃で保管した。中和の前、及び中和−遠心分離−濾過ステップの後に、２８０ｎｍでの値を報告するＮｏｎｏＤｒｏｐ  ２０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを使用した吸光度スペクトルから、溶出したサンプルのタンパク質含量を推定した。
【０４９４】
ＰｒｏＡステップ後に４つの抗体調製物を中和したとき、沈殿に起因して損失したタンパク質の量には大きな差があった（下記の表１３参照）。ＨＰ１／２  Ｇ４Ｐ  ａｇｌｙ  Ｇ１型は、産物の３％のみが沈殿によって損失し、構築物のうち挙動がより良好なものであった。
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【０４９５】
上記の表１３に示したように、産物の最も著しい損失は、ナタリズマブＧ４Ｐ  ａｇｌｙサンプルを中和したときに見られた３９％であった。対照的に、対応するＨＰ１／２構築物（ＨＰ  １／２  Ｇ４Ｐ  ａｇｌｙ）では、この量の１／３（１３％）のみが沈殿によって損失した。ＨＰ１／２  Ｇ４Ｐ  ａｇｌｙ  Ｇ１型は、産物の３％のみが沈殿によって損失し、構築物のうち挙動が最も良好なものであった。
【０４９６】
遠心分離及び濾過後の４つの構築物のサンプルの可溶性画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって解析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３１）は、４つ全てのサンプルで、ＩｇＧ抗体に特徴的な２重鎖、２軽鎖の四量体複合体の存在と整合する、分子質量約１５０ｋＤａの単一の顕著なバンドを明らかにした。ＨＰ１／２とナタリズマブサンプルとの間の明らかな差は、ナタリズマブサンプルには、可溶性凝集体の存在を示す、顕著なバンドからゲルの上部まで泳動した比較的高分子量の付加体の広がったスメアが存在したことであった。
【０４９７】
図３２Ａは、ＨＰ１／２サンプルのＳＥＣ分析の結果を示す。図３２Ｂは、４つ全ての構築物のＳＥＣ分析の結果を示す。サンプルは、ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中、０．２ｍｌ／分の流速で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ５／１５０  ＧＬカラム（ＧＥ  ２８−９９０９−４５）に流した。４つのサンプルのＳＥＣ分析は、サンプルの全てで、見かけの分子質量が約１５０ｋＤａである単一の主要ピークを明らかにした（図３２Ａ及び３２Ｂ）。
【０４９８】
したがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥデータと整合して、ＳＥＣ分析は、メインピーク前に溶出したナタリズマブサンプル中の比較的高分子量の可溶性凝集体を明らかにし、これは、ＨＰ１／２サンプルでは検出されなかったか、または大幅に低減していた。まとめると、これらの分析は、ナタリズマブサンプルが、ＨＰ１／２サンプルで見られたものと比べて少ない収量及び低い純度につながる可溶性及び不溶性の凝集体を含んだことを明らかにした。
【０４９９】
また、２つのＨＰ１／２サンプルの安定性を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって解析した。図３３ａ及び３３ｂは、ヒト化ＨＰ１／２  Ｈ１／Ｌ３  ｈｕＩｇＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ）／ＩｇＧ１キメラ（ＨＰ１／２  Ｇ４Ｐ  ａｇｌｙ  Ｇ１、左）及びヒト化ＨＰ１／２  Ｇ１／Ｌ３  ｈｕＩｇＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｔ２９９Ａ）（ＨＰ１／２  Ｇ４Ｐ  ａｇｌｙ、右）のＤＳＣ結果を示す。２つのＨＰ１／２サンプルの安定性を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって解析した。ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＤＳＣ計器を使用し、各ドメインのＴｍ値を決定した。スキャンは、２０〜１２０℃まで２℃／分で行った。Ｔｍ値（タンパク質分子の５０％が動的な非可逆の二状態平衡でアンフォールディングする相転移温度）を、各ドメインについて測定した。予想通り、熱転移の多くは、２つの構築物が同じＦａｂ領域（６９℃）、及びアグリコシルＣＨ２ドメイン（約６０℃）を含むために同じであった。
【０５００】
ＨＰ１／２  Ｇ４Ｐ  ａｇｌｙ  Ｇ１型のＣＨ３ドメインは、その約８５℃のＴｍから明らかであるように非常に安定であるが、ＨＰ１／２  Ｇ４Ｐ  ａｇｌｙ型のＣＨ３ドメインのＴｍは、約６９℃でしかなかった。
【０５０１】
言い換えれば、ＨＰ１／２  Ｇ４Ｐ  ａｇｌｙ  Ｇ１（すなわち、配列番号８０のアミノ酸配列を有する重鎖をもつもの）は、ＨＰ１／２  Ｇ４Ｐ  ａｇｌｙ抗体よりも優れた安定性を有した。
【０５０２】
実施例１７：ＨＰ１／２の臨床薬物動態及びヒト初回用量予測
臨床的インプットの逆翻訳による統合を使用して、臨床薬物動態及び薬力学に関連する予測の信頼性を高めることができる。本実施例では、この技術を使用して、ナタリズマブ（ＮＴＺ）と同じアルファ４エピトープサブクラスのものである組換えヒト化抗アルファ４インテグリン抗体、ＨＰ１／２  Ｈ１／Ｌ３  ｈｕＩｇＧ４Ｐ  ａｇｌｙ（Ｎ２９７Ｑ、ＥＵ付番）／ＩｇＧ１キメラ（本実施例では「ＨＰ１／２」または「ＢＩＩＢ１０７」という）の臨床薬物動態及び薬力学の情報を得た。全人的データの統合を使用して、ＨＰ１／２ヒトの薬物動態（ＰＫ）及び有効用量の予測における予測可能性及び信頼性を増大させた。
【０５０３】
単回ＩＶ用量のＨＰ１／２（３及び３０ｍｇ／ｋｇ）及びＮＴＺ（３ｍｇ／ｋｇ）をカニクイザル（ｎ＝１８）に投与した。１８匹のカニクイザルから、合計１８０の血清濃度（６０  ＮＴＺ、１２０  ＨＰ１／２）及び２５２のＰＤ（ＲＯ）測定値（８４  ＮＴＺ、１６８  ＨＰ１／２）が、ＰＫＰＤ分析のために入手できた。３〜３０ｍｇ／ｋｇのＨＰ１／２及び３ｍｇ／ｋｇのナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ）の単回ＩＶボーラス投与後のカニクイザルで観察されたＰＫ経時変化平均値を図３４に示す。抗ＶＬＡ投与後、遊離受容体がベースラインの１０％未満に低減し、カニクイザルにおけるＴｙｓａｂｒｉとＢＩＩＢ１０７の両方による９０％超の受容体占有が示された（図３５参照）。遊離ＶＬＡ受容体は、約５００時間（２１日）で徐々に投与前のレベルに戻った。ＨＰ１／２は、ナタリズマブ（１００時間）と比較すると、同じ用量（３ｍｇ／ｋｇ）でより長い期間（最長３００時間）にわたってＶＬＡ受容体（≧９０％）を飽和させるようであり、ナタリズマブと比べて高いＨＰ１／２の効力を示している。なお、より高いＨＰ  １／２用量（３０ｍｇ／ｋｇ）はおよそ２倍長い受容体の結合をもたらし、そのレベルは８００時間を過ぎてからベースラインに戻った。
【０５０４】
薬物に結合したＶＬＡの形成に関するＥＣ５０（表１４参照）は、ＨＰ１／２（４．７３ｕｇ／ｍＬ）では、Ｔｙｓａｂｒｉ（６．４０ｕｇ／ｍＬ）と比べて比較的低く、より高いＨＰ１／２の効力を示した。
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【０５０５】
これらのデータは、ＨＰ１／２が、ヒト受容体への結合と比べておよそ５倍（インタクトＨＰ１／２）及びおよそ６倍（Ｆａｂ断片）弱い親和性でカニクイザルアルファ４インテグリンに結合することを示す。ナタリズマブインタクトは、ヒトアルファ４インテグリンと比べておよそ２倍弱くカニクイザルアルファ４インテグリンに結合するが、Ｆａｂ結合は２つの種間で同じである。これらのデータはまた、ＨＰ１／２がナタリズマブよりも高い親和性でヒトアルファ４インテグリンに結合することを示す。言い換えれば、インタクトと比較しておよそ５倍の差、Ｆａｂ断片と比較しておよそ６倍の差、及びＨＰ１／２とナタリズマブＦａｂ断片との間で１９倍超の差である。この最後の比較が重要であるのは、ナタリズマブは、インビボでＦａｂアーム交換（スクランブリング）を生じることが知られている野生型ＩｇＧ４であり、機能的に一価になるためである。対照的に、ＨＰ１／２は、ヒンジを安定化させスクランブリングを防止する点変異（Ｓ２２８Ｐ  ＥＵ付番）を含むため、インビボで二価のままである。したがって、ＰＤ応答をモデリングする目的のために、以下に示す方程式による、ナタリズマブＦａｂ断片のＫｄ及びＨＰ１／２インタクトのＫｄを使用することが適切である。
【０５０６】
図３６に示すように、ヒト及びカニクイザルのリンパ球におけるアルファ４インテグリンの発現の差は２倍以内であることが見出され、ヒトＨＰ１／２の予測のために調整する必要はなかった。
【０５０７】
線形とＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ型の両方の消失及び直接Ｅｍａｘモデルを用いる２コンパートメントモデルを使用して、サルにおけるＮＴＺ及びＨＰ１／２血清濃度とアルファ４インテグリン飽和度（受容体占有（ＲＯ））との間のＰＫＰＤ関係を解析した。ＨＰ１／２ヒトＰＫを、サルＰＫパラメータ（ｋ１０、ｋ１２、ｋ２１、及びＶ１）のアロメトリックスケーリングによって予測した。Ｓｉｎｇｈ，Ａ．Ｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＡＡＰＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１７（２），３８９−３９９を参照されたい。手法の妥当性を保証するために、ヒトとサルのパラメータのそれぞれの体重と比べた比の対数を取ることにより、サル及びヒトで得られたＮＴＺ  ＰＫパラメータを使用した感度分析を行った。Ｋｍ、Ｖｍａｘ及びＰＤパラメータ（Ｅｍａｘ、ＥＣ５０、Ｅ０及びＶ１）を含むサル固有のパラメータを、ヒトに直接適用した。ヒトにおけるＨＰ１／２のＥＣ５０は、サルにおける比較ＰＫＰＤ試験において収集したデータに基づき、ヒトにおけるインビトロ結合親和性（Ｋｄ）及びＮＴＺ  ＥＣ５０を使用して予測した。Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒａｎ，Ｋ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，５７（８），１０１７−１０３０を参照されたい。データは、効力（Ｋｄ）の差を種間で調整した後、サル（ｍ）及びヒト（ｈ）において得られたＥＣ５０パラメータ値を組み合わせる経験的スケーリング手法を使用して統合した：
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【０５０８】
ＰＫＰＤモデルによる母集団パラメータ推定値に設定した平均ベクトル及び推定値の共分散行列を用い、多変量正規分布から生成された分布として、最終的な「ヒト化」モデルのＰＫＰＤパラメータ値を伝播した。Ｃｍａｘで１０％以下の平均ＲＯをもたらす用量を選択して、ＨＰ１／２の推定最小薬理作用量（ＭＡＢＥＬ）を定義した。
【０５０９】
ＨＰ１／２及びナタリズマブの単回ＩＶ投与後の時間プロファイルに対する受容体占有をシミュレートした（図３７Ａ〜３７Ｄ）。４週間毎に０．５ｍｇ／ｋｇの単回用量の投与が効果的であると期待され、治療量以下の占有レベル（＜７０％）は、投与のおよそ１か月後にベースラインに戻り始めた。ＨＰ１／２とＮＴＺの両方が、サルにおいて標的を介する薬物消長を示すＰＫプロファイルを呈し、用量依存性なＲＯを示した。薬物に結合したアルファ４の形成に関するＥＣ５０値は、ＨＰ１／２（０．６２ｕｇ／ｍＬ）では、ＮＴＺ（２．５１ｕｇ／ｍＬ）と比較して低いと予測される。Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒａｎ，Ｋ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，５７（８），１０１７−１０３０を参照されたい。ＮＴＺヒトＰＫプロファイルの予測値と観測値は全体的に良好に一致し、ＨＰ１／２の臨床ＰＫを予測するアロメトリックスケーリング手法の妥当性を裏付けた。ヒトにおけるＨＰ１／２のＭＡＢＥＬは、０．０００４ｍｇ／ｋｇであると予測される（これと比べて、ＮＴＺでは約０．００３ｍｇ／ｋｇである）。図３８を参照されたい。
【０５１０】
この実施例１７を考慮して、２つのヒト化抗アルファ４インテグリン抗体から入手可能なＰＫＰＤデータの統合により、逆翻訳モデリング手法を使用して、推定最小薬理作用量を同定するために受容体占有及びヒト薬物動態を推定することができた。
【０５１１】
上述の本発明の実施形態は、例示を意図するものに過ぎず、多数の変化形態及び改変形態が当業者には明らかとなろう。そのような変化形態及び改変形態の全ては、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲内にあることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2021526371.tif 000077
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
2021526371.tif 000081
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ−１】
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【図２０Ｇ−２】
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【図２０Ｈ−１】
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【図２０Ｈ−２】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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