(57)【要約】本発明は、式（Ｘ）に示す構造を有する新規なフラン含有セスキテルペンに関する2021535223.tif 000024それは、メリコペ・ラティフォリア（Ｍｅｌｉｃｏｐｅ  ｌａｔｉｆｏｌｉａ）の木の樹皮から比較的高濃度で得ることができ、抗菌性を有することが見出されている。
2021535223.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｘ）の、単離された生理活性化合物
【化１】
2021535223.tif 000021
【請求項２】
式（Ｘａ）の、単離された生理活性化合物
【化２】
2021535223.tif 000022
【請求項３】
式（Ｘｂ）の、単離された生理活性化合物
【化３】
2021535223.tif 000023
【請求項４】
（ａ）Ｍ．ラティフォリア（Ｍ．ｌａｔｉｆｏｌｉａ）の樹皮をメタノールで抽出するステップと；
（ｂ）ろ過した抽出物を、メタノール中で予め平衡化したＰＳＤＶＢカラムに通すステップと；
（ｃ）溶出液を等容量の水と合わせ、それを同じＰＳＤＶＢカラムに通すステップと；
（ｄ）前記カラムを水で洗浄するステップと；
（ｅ）吸着した抽出物の化合物を、ｉ）水中２０％アセトン（画分Ａ）、ｉｉ）水中４０％アセトン（画分Ｂ）、ｉｉｉ）水中６０％アセトン（画分Ｃ）、ｉｖ）水中８０％アセトン（画分Ｄ）、およびｖ）アセトン（画分Ｅ）で溶出するステップと；
（ｆ）画分Ｃおよび／またはＤを収集して、請求項１に記載の化合物の精製組成物を提供するステップと；
（ｇ）任意選択により、画分Ｃおよび／またはＤをシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによってさらに精製して、請求項１に記載の化合物を得るステップと；
を含む、請求項１に記載の化合物または請求項１に記載の化合物の精製組成物を得る工程。
【請求項５】
（ａ）Ｍ．ラティフォリアの樹皮をメタノールで抽出するステップと；
（ｂ）ろ過したメタノール抽出物を、メタノール中で予め平衡化したＰＳＤＶＢカラムに通すステップと；
（ｃ）溶出液を等容量の水と合わせ、それを同じＰＳＤＶＢカラムに通すステップと；
（ｄ）前記カラムを水で洗浄するステップと；
（ｅ）吸着した抽出物の化合物を、ｉ）水中２０％アセトン（画分Ａ）、ｉｉ）水中４０％アセトン（画分Ｂ）、ｉｉｉ）水中６０％アセトン（画分Ｃ）、ｉｖ）水中８０％アセトン（画分Ｄ）、およびｖ）アセトン（画分Ｅ）で溶出するステップと；
（ｆ）画分Ｃおよび／またはＤを収集して、バラエノンの精製組成物を提供するステップと；
（ｇ）任意選択により、石油エーテル中酢酸エチルの勾配（０〜１００％）を使用するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって画分Ｃおよび／またはＤをさらに精製して、バラエノンを得るステップと、
（ｈ）バラエノンのジアステレオ異性体をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで分離して、請求項２または請求項３に記載の化合物を得るステップと；
を含む、請求項２または請求項３に記載の化合物を得るための工程。
【請求項６】
請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物の精製組成物。
【請求項７】
少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９ｗｔ％の請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物を含む、請求項６に記載の精製組成物。
【請求項８】
少なくとも９５ｗｔ％の請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物を含む、請求項７に記載の精製組成物。
【請求項９】
約２ｗｔ％未満のハルホルジンを含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の精製組成物。
【請求項１０】
請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物と、１つまたは複数の医薬として許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１１】
請求項６から９のいずれか一項に記載の精製組成物と、１つまたは複数の医薬として許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１３】
細菌感染症の治療を必要とする対象において細菌感染症を治療する方法であって、前記対象に治療的有効量の請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物を投与することを含む、方法。
【請求項１４】
細菌感染症の治療を必要とする対象において細菌感染症を治療する方法であって、前記対象に治療的有効量の請求項６から９のいずれか一項に記載の精製組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１５】
前記細菌感染症がグラム陽性菌感染症である、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．本発明の分野
本発明は、メリコペ・ラティフォリア（Ｍｅｌｉｃｏｐｅ  ｌａｔｉｆｏｌｉａ）の木の樹皮から単離された新規生理活性化合物、該化合物を含む組成物、およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．本発明の背景
Ｍ．ラティフォリア（以前はエウオーディア・ラティフォリア（Ｅｕｏｄｉａ  ｌａｔｉｆｏｌｉａ）として知られる）は、柑橘類であるミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）に属している。それは、東南アジアおよび太平洋の多くの国々で生育しており、それらの国々で伝統的な医薬品に使用されている。バヌアツのロー島では、Ｍ．ラティフォリアは園芸植物として持ち込まれたと記載されており、「ネヒネ（ｎｅｈｉｎｅ）」と呼ばれている。葉の低温浸漬物が、咳の治療のために内服的に摂取されている（Ｂｒａｄａｃｓ、Ｍａｅｓら  ２０１０）；（Ｂｒａｄａｃｓ、Ｈｅｉｌｍａｎｎら  ２０１１）。
【０００３】
マレーシア半島では、Ｍ．ラティフォリアは、平地林で生育する非地域性の小型の樹木であり、マレーでは「オランアスリ（Ｏｒａｎｇ  Ａｓｌｉ）」として知られている。それは、絶滅危惧種と考えられており、医薬品だけでなく、樹脂および石けんを作製するのにも使用されている。すり潰した葉は、発熱を下げ、痙攣を治療するのに外用されている（Ｃｈｏｏｉ  １９９４）。
【０００４】
あるＭ．ラティフォリア材料の抽出物には、中程度の生理活性があることが見出されている。インドネシア、東ジャワ州、チャンガルフォレストから収集されたＭ．ラティフォリアの粉末乾燥葉のエタノール抽出物は、Ｃ型肝炎ウイルスによるヒト肝細胞（Ｈｕｈ７．５）細胞の感染を侵入段階と侵入後の段階の両方で阻害することが示され、ＩＣ５０値は３．５±１．４μｇ／ｍＬであり、ＣＣ５０値は＞１００μｇ／ｍＬであった。しかしながら、Ｍ．ラティフォリアの幹の抽出物は、有効性が１０分の１より低かった（Ｗａｈｙｕｎｉ、Ｔｕｍｅｗｕら  ２０１３）。
【０００５】
バヌアツのローからのＥ．ラティフォリアの葉の抽出物には、以下の活性があった（Ｂｒａｄａｃｓ、Ｍａｅｓら  ２０１０）：
・  ジクロロメタン抽出物は、培養中のヒト肺癌細胞株Ａ５４８に対して１４．２±０．８９μｇ／ｍＬのＩＣ５０値を有していた。
・  ジクロロメタンおよび酢酸エチル抽出物は、赤血球中の熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に対して、それぞれ８．３０±１．４３および１４．９４±２．７２μｇ／ｍＬのＩＣ５０値を有していたが、同様の活性をヒト肺線維芽細胞（ＭＲＣ−５ＳＶ２）に対して有しており、よって選択性指数は１であった。
・  ジクロロメタンおよび酢酸エチル抽出物は、トリパノソーマ・クルージイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉｉ）に対して、それぞれ６．５５±０．７９および７．６４±０．２６μｇ／ｍＬのＩＣ５０値を有していたが、同様の活性をヒト肺線維芽細胞（ＭＲＣ−５ＳＶ２）に対して有しており、よって選択性指数は１であった。
・  ジクロロメタン抽出物は、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）に対して、８．２８±０．６２μｇ／ｍＬのＩＣ５０値を有していたが、同様の活性をヒト肺線維芽細胞（ＭＲＣ−５ＳＶ２）に対して有しており、よって選択性指数は１であった。
【０００６】
Ｍ．ラティフォリアの抽出物についての調査はあまり行われていないが、その天然物の化学についてはさらに知られていない。Ｍ．ラティフォリアからの化学成分の唯一の実質的な研究と思われている研究において、西マレーシア、パハン州、ゲンティンハイランド（クアラルンプールの５０ｋｍ北）からのＭ．ラティフォリア（当時はエウオーディア・ラティフォリアとして知られている）の乾燥葉のエタノール抽出物のクロマトグラフ分離によって、新たな異性体化合物、メリフォリオン（ｍｅｌｉｆｏｌｉｏｎｅ）１ａおよび１ｂが、分別結晶化によって分離されて収率０．００６％で得られた（Ｇｏｈ、Ｃｈｕｎｇら  １９９０）。
【化１】
2021535223.tif 000003
【０００７】
単離された他の化合物は、クマリン誘導体である５，７，８−および６，７，８−トリメトキシクマリン、ならびにベルガプテン（２）であった。バーガプテン（Ｂｕｒｇａｐｔｅｎ）（２）は、光毒性を引き起こす、ベルガモット油中の化学物質である。そのようなフラノクマリンのレベルは、局所製剤では制限されるべきであることが提案されている。ステロールであるシトステロール、スチグマステロール、およびカンペストロール（ｃａｍｐｅｓｔｒｏｌ）が、６７：１７：２１の比率で存在することも見出された。
【０００８】
修士論文の要約（Ｈａｓｈｉｍ  ２０１０）は、マレーシア、サバ州で収集したＭ．ラティフォリアの葉からの２つのアルカロイド、ジクタムニン（３）およびコンフサメリン（ｃｏｎｆｕｓａｍｅｌｉｎｅ）（４）の単離を報告している。
【化２】
2021535223.tif 000004
【０００９】
ジクタムニン（３）はミカン科に広く存在し、光誘導性の遺伝毒性および皮膚刺激性の原因となる。それは、抗血小板凝集および血管弛緩作用（Ｗｕら、１９９４）、殺虫活性、細菌および酵母に対する光毒性、ならびにスメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に対する抗菌活性を有することが報告されている。ジクタムニン（３）は、ある種の皮膚疾患を治療するのにも広く使用されてきた（Ｇｕｏ、Ｙｕら  ２００８）。
【００１０】
コンフサメリン（４）は、Ｐ−３８８細胞株に対して基準化合物のミトラマイシン（ＥＤ５０値＝０．０６μｇ／ｍＬ）より強力な細胞毒性を有する幾つかのフラノクマリンのうちで最も細胞毒性の高い（ＥＤ５０値＝０．０３μｇ／ｍＬ）分離株であることが見出された（Ｃｈｅｎ、Ｄｕｈら  ２００３）。
【００１１】
２つのベンゾピラン化合物、「Ｏ−メチルオクタドレノロン（Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔａｄｒｅｎｏｌｏｎｅ）」およびアロエボジオノール（６）は、インドネシアからのＭ．ラティフォリアの果実から単離されたと報告された（Ｐｒｉｍａｓｔｕｔｉ  ２０１７）。しかしながら、「Ｏ−メチルオクタドレノロン」のような化合物はないと思われ、最も近いものは、ニュージーランドのＭ．テルナタ（Ｍ．ｔｅｒｎａｔａ）から最初に単離された化合物であるオクタデンドロロンメチルエーテル（５）である（Ｃａｍｂｉｅ、Ｐａｎら  １９９６）。
【化３】
2021535223.tif 000005
【００１２】
公衆衛生当局が深刻さを増す抗生物質耐性の問題を認識するにつれ、研究者は、新たな抗生物質化合物を見出すか、または少なくとも公衆に有用な選択肢を提供するために、以前に調査されていない動植物にますます目を向けるようになっている。
【００１３】
Ｍ．ラティフォリアの二次代謝産物については、比較的研究されていない。したがって、本発明の目的は、抗生物質化合物を含めた有用な生理活性化合物を提供するその潜在能力について、この植物を評価することである。
【００１４】
本明細書において、特許明細書、他の外部文書、または他の情報源が言及される場合、これは概して本発明の特徴を考察するための背景を提供することを目的としている。特に明示しない限り、そのような外部文書への言及は、そのような文書、またはそのような情報源が、いかなる法域であっても、先行技術であること、または当技術分野での技術常識の一部を形成することを承認するものと解釈されるべきではない。
【発明の概要】
【００１５】
３．本発明の概要
本発明は、Ｍ．ラティフォリアの木の樹皮から、本発明者らによってバラエノン（Ｂａｌａｅｎｏｎｅ）と命名された新規生理活性化合物を単離し、特定することに関する。
【００１６】
一態様では、本発明は、式（Ｘ）の、単離された生理活性化合物に関する
【化４】
2021535223.tif 000006
【００１７】
この化合物は、本明細書では、「バラエネオン（Ｂａｌａｅｎｅｏｎｅ）」と称される。
【００１８】
一態様では、本発明は、式（Ｘａ）の、単離された生理活性化合物に関する
【化５】
2021535223.tif 000007
【００１９】
この化合物は、本明細書では「１，１０−トランス−バラエノン」または「トランス−バラエノン」と称される。
【００２０】
別の態様では、本発明は、式（Ｘｂ）の構造および相対立体化学を有する、単離された生理活性化合物に関する
【化６】
2021535223.tif 000008
【００２１】
この化合物は、本明細書では「１，１０−シス−バラエノン」または「シス−バラエノン」と称される。
【００２２】
別の態様では、本発明は、図１〜６のいずれか１つのＮＭＲスペクトルを有する生理活性化合物に関する。別の態様では、本発明は、図１１〜１６のいずれか１つのＮＭＲスペクトルを有する生理活性化合物に関する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、
（ａ）Ｍ．ラティフォリアの樹皮をメタノールで抽出するステップと；
（ｂ）ろ過した抽出物を、メタノール中で予め平衡化したＰＳＤＶＢカラムに通すステップと；
（ｃ）溶出液を等容量の水と合わせ、それを同じＰＳＤＶＢカラムに通すステップと；
（ｄ）該カラムを水で洗浄するステップと；
（ｅ）吸着した抽出物の化合物を、ｉ）水中２０％アセトン（画分Ａ）、ｉｉ）水中４０％アセトン（画分Ｂ）、ｉｉｉ）水中６０％アセトン（画分Ｃ）、ｉｖ）水中８０％アセトン（画分Ｄ）、およびｖ）アセトン（画分Ｅ）で溶出するステップと；
（ｆ）画分Ｃおよび／またはＤを収集して、バラエノンの精製組成物を提供するステップと；
（ｇ）任意選択により、画分Ｃおよび／またはＤをシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによってさらに精製して、バラエノンのさらなる精製組成物を得るステップと；
を含む、バラエノンの精製組成物を得る工程を提供する。
【００２４】
一実施形態では、ステップ（ａ）を繰り返して、２回目のメタノール抽出物を提供する。
【００２５】
一実施形態では、ステップ（ｃ）を繰り返す。
【００２６】
一実施形態では、ステップ（ｇ）で、石油エーテル中酢酸エチルの勾配（０〜１００％）を使用して、画分Ｃおよび／またはＤをさらに精製する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、
（ａ）Ｍ．ラティフォリアの樹皮をメタノールで抽出するステップと；
（ｂ）ろ過した抽出物を、メタノール中で予め平衡化したＰＳＤＶＢカラムに通すステップと；
（ｃ）溶出液を等容量の水と合わせ、それを同じＰＳＤＶＢカラムに通すステップと；
（ｄ）該カラムを水で洗浄するステップと；
（ｅ）吸着した抽出物の化合物を、ｉ）水中２０％アセトン（画分Ａ）、ｉｉ）水中４０％アセトン（画分Ｂ）、ｉｉｉ）水中６０％アセトン（画分Ｃ）、ｉｖ）水中８０％アセトン（画分Ｄ）、およびｖ）アセトン（画分Ｅ）で溶出するステップと；
（ｆ）画分Ｃおよび／またはＤを収集して、バラエノンの精製組成物を提供するステップと；
（ｇ）任意選択により、画分Ｃおよび／またはＤをシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによってさらに精製して、バラエノンのさらなる精製組成物を得るステップと；
を含む工程によって得られる、バラエノンの精製組成物を提供する。
【００２８】
一実施形態では、ステップ（ａ）を繰り返して、２回目のメタノール抽出物を提供する。
【００２９】
一実施形態では、ステップ（ｃ）を繰り返す。
【００３０】
一実施形態では、ステップ（ｇ）で、石油エーテル中酢酸エチルの勾配（０〜１００％）を使用して、画分Ｃおよび／またはＤをさらに精製する。
【００３１】
別の態様では、本発明は、バラエノンの精製組成物を提供する。別の態様では、本発明は、トランス−バラエノンの精製組成物を提供する。別の態様では、本発明は、シス−バラエノンの精製組成物を提供する。
【００３２】
一実施形態では、精製組成物は、少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９ｗｔ％のバラエノンを含む。一実施形態では、精製組成物は、少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９ｗｔ％のトランス−バラエノンを含む。一実施形態では、精製組成物は、少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９ｗｔ％のシス−バラエノンを含む。
【００３３】
一態様では、本発明は、バラエノンと、１つまたは複数の医薬として許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００３４】
一態様では、本発明は、トランス−バラエノンと、１つまたは複数の医薬として許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００３５】
一態様では、本発明は、シス−バラエノンと、１つまたは複数の医薬として許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００３６】
一実施形態では、該医薬組成物は、抗菌性組成物である。
【００３７】
別の態様では、本発明は、細菌感染症の治療を必要とする対象において細菌感染症を治療する方法であって、該対象に治療的有効量のバラエノンまたはバラエノンの精製組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００３８】
別の態様では、本発明は、細菌感染症の治療を必要とする対象において細菌感染症を治療する方法であって、該対象に治療的有効量のトランス−バラエノンまたはトランス−バラエノンの精製組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００３９】
別の態様では、本発明は、細菌感染症の治療を必要とする対象において細菌感染症を治療する方法であって、該対象に治療的有効量のシス−バラエノンまたはシス−バラエノンの精製組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００４０】
一実施形態では、感染症は、グラム陽性菌感染症である。
【００４１】
本明細書に述べる実施形態および好ましいものは、本明細書に述べる本発明の態様のいずれにも、単独でまたは任意の２つ以上の組み合わせで関連してもよい。
【００４２】
本発明は、広義には上で定義した通りであるが、当業者であれば、本発明がそれに限定されず、以下の説明が例を示す実施形態も含むことを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
４．図面の簡単な説明
本発明をこれより添付の図を参照して説明する。
【図１】ＣＤＣｌ３中のトランス−バラエノンの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２】ＣＤＣｌ３中のトランス−バラエノンの１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ）スペクトルを示す図である。
【図３】ＣＤＣｌ３中のトランス−バラエノンのＣＯＳＹ（５００ＭＨｚ）スペクトルを示す図である。
【図４】ＣＤＣｌ３中のトランス−バラエノンのＨＳＱＣ（５００ＭＨｚ）スペクトルを示す図である。
【図５】ＣＤＣｌ３中のトランス−バラエノンのＨＭＢＣ（５００ＭＨｚ）スペクトルを示す図である。
【図６】ＣＤＣｌ３中のトランス−バラエノンのＮＯＥＳＹ（５００ＭＨｚ）スペクトルを示す図である。
【図７】試料１＝メタノール抽出物、２＝６０％アセトン／水の画分、３＝８０％アセトン／水の画分、４＝１００％アセトンの画分の、成分の分離および視覚化を表示するシリカゲルＴＬＣプレートを示す図である。明るいピンク／赤色のスポットは、バラエノンの特徴である。
【図８】黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（左手側）についての抗菌性アッセイの結果を基準プレート（右手側）と比較して示す図である。試料１＝メタノール抽出物、２＝６０％アセトン／水の画分、３＝８０％アセトン／水の画分、４＝１００％アセトンの画分。基準プレートにおける明るいピンク／赤色のスポットは、バラエノンの特徴である。
【図９】表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（左手側）についての抗菌性アッセイの結果を基準プレート（右手側）と比較して示す図である。試料１＝メタノール抽出物、２＝６０％アセトン／水の画分、３＝８０％アセトン／水の画分、４＝１００％アセトンの画分。基準プレートにおける明るいピンク／赤色のスポットは、バラエノンの特徴である。
【図１０】環化付加生成物（９）のＯＲＴＥＰ図である。
【図１１】ＣＤＣｌ３中のシス−バラエノンの１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）スペクトルを示す図である。
【図１２】ＣＤＣｌ３中のシス−バラエノンの１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ）スペクトルを示す図である。
【図１３】ＣＤＣｌ３中のシス−バラエノンのＣＯＳＹ（５００ＭＨｚ）スペクトルを示す図である。
【図１４】ＣＤＣｌ３中のシス−バラエノンのＨＳＱＣ（５００ＭＨｚ）スペクトルを示す図である。
【図１５】ＣＤＣｌ３中のシス−バラエノンのＨＭＢＣ（５００ＭＨｚ）スペクトルを示す図である。
【図１６】ＣＤＣｌ３中のシス−バラエノンのＮＯＥＳＹ（５００ＭＨｚ）スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
５．本発明の詳細な説明
５．１  定義
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、本明細書で使用される場合、「少なくとも部分的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｉｎ  ｐａｒｔ  ｏｆ）」ことを意味する。「含む」という用語を含む本明細書および特許請求の範囲において各文を解釈するとき、この用語に先行されるもの（１つまたは複数）以外の特徴物も存在し得る。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの関連する用語は、同様に解釈されるものとする。
【００４５】
「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語は、本明細書で使用される場合、指定された材料またはステップ、ならびに特許請求される発明の基本的および新規な特徴（複数可）に実質的な影響を与えないものを意味する。
【００４６】
「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、本明細書で使用される場合、特許請求の範囲に指定されないいずれの要素、ステップ、または成分も除いた、特許請求される発明の、指定された材料またはステップを意味する。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、「および」もしくは「または」、または両方を意味する。
【００４８】
「約」という用語は、言及される数値表示に関係して使用されるとき、その言及される数値表示に、言及される数値表示の１０％までプラスまたはマイナスしたものであることを意味する。例えば、「約１００」は、９０〜１１０を意味し、「約６」は、５．４〜６．６を意味する。
【００４９】
本明細書に開示される数の範囲（例えば、１〜１０）への言及は、その範囲内のすべての有理数（例えば、１、１．１、２、３、３．９、４、５、６、６．５、７、８、９、および１０）およびその範囲内の任意の有理数の範囲（例えば、２〜８、１．５〜５．５、および３．１〜４．７）への言及も包含することが意図され、したがって、本明細書に明示的に開示されるすべての範囲のすべての部分範囲が、本明細書に明示的に開示される。これらは、特定的に意図された単なる例であり、列挙された最低値と最大値の間の数値のすべての可能な組み合わせが、本明細書では同様に明示的に述べられているとみなされるものとする。
【００５０】
本明細書に記載する化合物には、不整中心が存在し得る。不整中心は、キラル炭素原子での三次元空間における置換基の立体配置に応じて、（Ｒ）または（Ｓ）と示すことができる。特定の立体化学または異性体が示されていない限り、構造のすべてのキラル、ジアステレオマー形態、およびラセミ形態が意図される。ジアステレオマー形態、鏡像異性体形態、およびエピマー形態、ならびにｄ−異性体およびｌ−異性体、ならびにそれらの混合物を含めた、化合物のすべての立体化学異性体は、鏡像異性的に濃厚化した、およびジアステレオマー的に濃厚化した立体化学異性体の混合物を含めて、特に示さない限り、本発明の範囲内である。
【００５１】
本明細書に記載する化合物は、シス、トランス、シン、アンチ、エントゲーゲン（ｅｎｔｇｅｇｅｎ）（Ｅ）、およびツザーメン（ｚｕｓａｍｍｅｎ）（Ｚ）異性体を含めた、配座または幾何異性体としても存在し得る。すべてのそのような異性体および任意のそれらの混合物は、特に示さない限り、本発明の範囲内である。
【００５２】
同様に本発明の範囲内にあるのは、本明細書に記載する化合物の任意の互変異性体またはそれらの混合物である。当業者には理解されるように、多種多様な官能基および他の構造が互変異性を呈し得る。例として、ケト／エノール、イミン／エナミン、およびチオケトン／エンチオール互変異性が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
開示する化合物の立体化学が名称で示されているかまたは図示されている場合、その名称で示されているかまたは図示されている立体異性体は、他方の立体異性体のすべてに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．９重量％純粋であり得る。単一の鏡像異性体が名称で示されているかまたは図示されているとき、名称で示されているかまたは図示されている鏡像異性体は、他方の鏡像異性体に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．９重量％純粋である。
【００５４】
「投与する」または「投与」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明の組成物または化合物を、治療効果をもたらすのに適した方法によって、対象内または対象上に配置することを指す。その剤形は、治療目的および対象に応じて適宜選択され、使用される。本発明の組成物の用量は、治療目的および対象の特徴、例えば、それらの種、年齢、性別、全身健康状態、および疾患進行に応じて選択されてもよい。一般に、ヒト対象には、本発明の化合物は、１日当たり、体重１ｋｇ当たり０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇの用量で、１回でまたは複数回の投与に分割して投与されてもよい。
【００５５】
「治療的有効量」とは、本明細書で使用される場合、臨床結果を含めた、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。治療的有効量は、様々な投与経路によって、１回または複数回の投与で投与することができる。対象に投与しようとする化合物の治療的有効量は、例えば、化合物が投与される目的、投与様式、任意の同時投与される化合物の性質および投与量、ならびに対象の特徴、例えば、全身健康状態、他の疾患、年齢、性別、遺伝子型、体重、および薬剤耐性に依存する。当業者であれば、これらの任意の他の関連要因を考慮に入れて適正な投与量を決定することができるであろう。
【００５６】
「対象」とは、ヒトまたは非ヒト動物、好ましくは哺乳動物である脊椎動物を指す。非ヒト哺乳動物として、家畜、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、シカ、およびヤギ；スポーツ用動物およびペット、例えば、イヌ、ネコ、およびウマ；ならびに研究用動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、およびモルモットが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、対象はヒトである。
【００５７】
５．２  バラエノン
本発明者らは、Ｍ．ラティフォリアの木の樹皮の抽出物から新規生理活性化合物を単離した。この木の種は、Ａｐｐｌｅｌｈａｎｓによって実施されたメリコペ種の系統発生解析において、Ｍ．ラティフォリアの標本の中にＤＮＡフィンガープリントを配置するＤＮＡフィンガープリント解析によって特定された（Ａｐｐｅｌｈａｎｓ、Ｗｅｎら  ２０１４）。
【００５８】
本発明の新規化合物は、式（Ｘ）に示される構造を有するフラン含有セスキテルペンである。それは、メリコペ・ラティフォリアの木の樹皮に比較的高濃度で存在する。それは、樹皮をメタノール抽出して粗抽出物を生じることによって得ることができ、それを当技術分野での標準的な技法を使用して精製することができる。
【化７】
2021535223.tif 000009
【００５９】
バラエノンは２つの不斉中心を持つので、４つの立体異性体が可能になる（ＲＲ、ＲＳ、ＳＲ、およびＳＳ）。本発明の方法によってバラエノンを抽出すると、トランス−およびシス−バラエノンがおよそ６０：１の比率で得られる。各ジアステレオ異性体は鏡像異性的に純粋である（＞９９％）。
【００６０】
トランス−バラエノンの絶対配置は、実施例４に記載するように解明された。後述の付番方式に基づくと、１，１０−トランス−バラエノンは、（＋）−（１Ｒ，１０Ｓ）−バラエノンである。そのＩＵＰＡＣ名は、（６Ｓ，６ａＲ）−１，６，９−トリメチル−５，６，６ａ，７−テトラヒドロアズレノ［５，４−ｂ］フラン−８（４Ｈ）−オンである。
【化８】
2021535223.tif 000010
【００６１】
１，１０−シス−バラエノンの絶対配置は決定されていないが、その相対配置は（＋）−（１Ｒ＊，１０Ｒ＊）−バラエノンである。そのＩＵＰＡＣ名は、（６Ｒ＊，６ａＲ＊）−１，６，９−トリメチル−５，６，６ａ，７−テトラヒドロアズレノ［５，４−ｂ］フラン−８（４Ｈ）−オンである。
【００６２】
これらのジアステレオマーは、実施例３に記載するように、フラッシュクロマトグラフィーによって互いから分離することができる。
【００６３】
バラエノンは、これまでに報告されておらず、新たなクラスの化合物となると思われる。構造では、バラエノンは、以下に示すようなメリコフィロン（ｍｅｌｉｃｏｐｈｙｌｌｏｎｅ）Ａ、Ｂ、およびＣに最もよく似ている。
【化９】
2021535223.tif 000011
【００６４】
これらの化合物は、１９８８年および１９８９年に、アワダン（Ｍｅｌｉｃｏｐｅ  ｔｒｉｐｈｙｌｌａ）の根および幹樹皮の抽出物の成分として報告された（Ｗｕ、Ｊｏｎｇら  １９８８、ＪｏｎｇおよびＷｕ  １９８９）。バラエノンはメリコフィロンＡ〜Ｃ（７ａ〜ｃ）の前駆体である可能性があり、それはフランが（ヒドロキシ）ブテノリドに酸化されることによるものであり、メリコフィロンＣ（７ｃ）は特に、Ｃ−８のさらなる酸化によって異なっている。メリコフィロンの相対立体化学は確立されたが、絶対立体化学は確立されなかった。本明細書に記載するトランス−バラエノンの絶対立体化学の解明に基づくと、メリコフィロンを表すためにＷｕおよびＪｏｎｇによって選択された立体化学（そして上に示したもの）は、不正確であったようである。
【００６５】
バラエノンは抗菌性を有しているため、細菌感染症、特にグラム陽性菌による感染症の治療に有用である可能性がある。
【００６６】
したがって、一態様では、本発明は、生理活性バラエノンを提供する。別の態様では、本発明は、図１〜６のいずれか１つのＮＭＲスペクトルを有する生理活性化合物を提供する。別の態様では、本発明は、図１１〜１６のいずれか１つのＮＭＲスペクトルを有する生理活性化合物を提供する。
【００６７】
一態様では、本発明は、（＋）−（６Ｓ，６ａＲ）−１，６，９−トリメチル−５，６，６ａ，７−テトラヒドロアズレノ［５，４−ｂ］フラン−８（４Ｈ）−オンを提供する。
【００６８】
別の態様では、本発明は、強い正回転を有する、鏡像異性体形態の（（６Ｒ＊，６ａＳ＊）−１，６，９−トリメチル−５，６，６ａ，７−テトラヒドロアズレノ［５，４−ｂ］フラン−８（４Ｈ）−オン）を提供する。
【００６９】
５．３  バラエノンおよびバラエノンの精製組成物を得るための工程
溶媒抽出、逆相クロマトグラフィー、順相シリカゲルクロマトグラフィーなどを含めた天然物の化学の標準的な技法を利用する種々の方法を使用して、バラエノンをその原材料から単離し、精製することができる。
【００７０】
好ましくは、バラエノンおよびバラエノンの精製組成物は、Ｍ．ラティフォリアの木の樹皮のメタノール抽出物から得られる。２つの有用な手法は、後述するような、（ａ）ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ｃｏ−ポリマー（ＰＳＤＶＢ）での逆相クロマトグラフィー、ならびに（ｂ）液液分配、任意選択によるその後の順相クロマトグラフィーの使用である。しかしながら、当業者であれば、有効な技法の任意の組み合わせを使用することができる。
【００７１】
ＰＳＤＶＢでの逆相クロマトグラフィー
この抽出方法では、Ｍ．ラティフォリアの幹樹皮を、メタノール（２×）で１８〜２４時間抽出する。両方の抽出物をろ過し、メタノール中で予め平衡化したＰＳＤＶＢのベッド（２回目の抽出物、その後１回目の抽出物）に通す。この工程からの溶出液を合わせ、等容量の水で希釈し（水中５０％メタノール）、同じＰＳＤＶＢカラムに通す。この工程をさらなる等量の水で繰り返し（水中２５％メタノールにする）、同じＰＳＤＶＢカラムに通す。このとき吸着した抽出物を含有しているこのカラムを、水で洗浄し（３×カラム容積）、その後一回分量のｉ）水中２０％アセトン（画分Ａ）、ｉｉ）水中４０％アセトン（画分Ｂ）、ｉｉｉ）水中６０％アセトン（画分Ｃ）、ｉｖ）水中８０％アセトン（画分Ｄ）、およびｖ）アセトン（画分Ｅ）で洗浄する。
【００７２】
画分ＣおよびＤは多量のバラエノンを含有しているはずであり、前者は材料の大部分を含有しているはずである。
【００７３】
純粋なバラエノンは、画分Ｃ（水中６０％アセトン）から、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって得ることができる。好ましい溶媒系は、石油エーテル中酢酸エチルの勾配（０〜１００％）であり、この場合、バラエノンは石油エーテル中２０〜２５％酢酸エチルから溶出する。
【００７４】
バラエノンのジアステレオマーは、石油エーテル／ジエチルエーテル３：１、または同等の溶媒系を使用するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって分離することができる。当業者であれば、バラエノンおよびそのジアステレオマーを精製するのに他の溶媒系を使用することができることを理解するであろう。
【００７５】
液液分配
Ｍ．ラティフォリアの幹樹皮を、メタノール（２×）で１８〜２４時間抽出する。両方の抽出物を合わせ、真空下で濃縮乾固し、水不混和性有機溶媒（例えばジクロロメタン）中で戻し、水で分配する。無水硫酸マグネシウムを使用して有機層を乾燥し、真空下で濃縮乾固する。濃縮した有機層を、石油エーテル中酢酸エチルの勾配（０〜１００％）を使用するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。この場合、バラエノンは石油エーテル中２０〜２５％酢酸エチルから溶出する。
【００７６】
バラエノンは、メタノール中５％ｖ／ｖ硫酸＋エタノール中０．１％ｗ／ｖバニリンと接触させ、加熱すると、明るいピンク／赤色のスポットとして視覚化されるので、精製工程中に薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を使用して容易に追跡される。そのＲｆは、シリカゲルＴＬＣプレート上の試料を石油エーテル中１０％酢酸エチル中で移動させたときに、０．２５である。
【００７７】
しかしながら、代替の視覚化システムを使用することができる。表１は、様々なＴＬＣ溶媒系中でのトランス−およびシス−バラエノンのＲｆ値を示す。
【表１】
2021535223.tif 000012
【００７８】
好ましい抽出および単離方法は、後の実施例の項で説明する。
【００７９】
一態様では、本発明は、
（ａ）Ｍ．ラティフォリアの樹皮をメタノールで抽出するステップと；
（ｂ）ろ過したメタノール抽出物を、メタノール中で予め平衡化したＰＳＤＶＢカラムに通すステップと；
（ｃ）溶出液を等容量の水と合わせ、それを同じＰＳＤＶＢカラムに通すステップと；
（ｄ）該カラムを水で洗浄するステップと；
（ｅ）吸着した抽出物の化合物を、ｉ）水中２０％アセトン（画分Ａ）、ｉｉ）水中４０％アセトン（画分Ｂ）、ｉｉｉ）水中６０％アセトン（画分Ｃ）、ｉｖ）水中８０％アセトン（画分Ｄ）、およびｖ）アセトン（画分Ｅ）で溶出するステップと；
（ｆ）画分Ｃおよび／またはＤを収集して、バラエノンの精製組成物を提供するステップと；
（ｇ）任意選択により、画分Ｃおよび／またはＤをシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによってさらに精製して、バラエノンのさらなる精製組成物を得るステップと；
を含む、バラエノンまたはバラエノンの精製組成物を得る工程を提供する。
【００８０】
一実施形態では、ステップ（ａ）を繰り返して、２回目のメタノール抽出物を提供する。
【００８１】
一実施形態では、ステップ（ｃ）を繰り返す。
【００８２】
一実施形態では、ステップ（ｇ）で、石油エーテル中酢酸エチルの勾配（０〜１００％）を使用して、画分Ｃおよび／またはＤをさらに精製する。
【００８３】
一態様では、本発明は、
（ａ）Ｍ．ラティフォリアの樹皮をメタノールで抽出するステップと；
（ｂ）ろ過したメタノール抽出物を、メタノール中で予め平衡化したＰＳＤＶＢカラムに通すステップと；
（ｃ）溶出液を等容量の水と合わせ、それを同じＰＳＤＶＢカラムに通すステップと；
（ｄ）該カラムを水で洗浄するステップと；
（ｅ）吸着した抽出物の化合物を、ｉ）水中２０％アセトン（画分Ａ）、ｉｉ）水中４０％アセトン（画分Ｂ）、ｉｉｉ）水中６０％アセトン（画分Ｃ）、ｉｖ）水中８０％アセトン（画分Ｄ）、およびｖ）アセトン（画分Ｅ）で溶出するステップと；
（ｆ）画分Ｃおよび／またはＤを収集して、バラエノンの精製組成物を提供するステップと；
（ｇ）任意選択により、石油エーテル中酢酸エチルの勾配（０〜１００％）を使用するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって画分Ｃおよび／またはＤをさらに精製して、バラエノンを得るステップと、
（ｈ）３：１の石油エーテル／ジエチルエーテルのイソクラティック混合物を使用するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーでトランス−およびシス−バラエノンを分離してトランス−バラエノンおよびシス−バラエノンを得るステップと；
を含む、トランス−バラエノンおよび／もしくはシス−バラエノンまたはそれらの精製組成物を得る工程を提供する。
【００８４】
一態様では、本発明は、上の態様の工程によって得られる生成物を提供する。
【００８５】
一実施形態では、該生成物は、バラエノンまたはバラエノンの精製組成物である。一実施形態では、該生成物は、トランス−バラエノンまたはトランス−バラエノンの精製組成物である。一実施形態では、該生成物は、シス−バラエノンまたはシス−バラエノンの精製組成物である。
【００８６】
５．４  バラエノンの精製組成物
一態様では、本発明は、バラエノンの精製組成物を提供する。一実施形態では、本発明は、上で定義した工程によって得られる精製組成物を提供する。
【００８７】
本明細書で使用される場合、バラエノンの組成物に関して「精製（された）」という用語は、組成物が少なくとも５０％ｗｔ％超のバラエノンを含むことを意味する。本明細書に概説する方法を使用して、９５、９６、９７、９８、９９の純度レベル、そして１００％の純度レベルさえも達成可能である。純度は、ＨＰＬＣによって測定することができる。
【００８８】
一実施形態では、精製組成物は、少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９ｗｔ％のバラエノンを含む。
【００８９】
一実施形態では、精製組成物は、少なくとも６０ｗｔ％のバラエノンを含む。
【００９０】
一実施形態では、精製組成物は、少なくとも７０ｗｔ％のバラエノンを含む。
【００９１】
一実施形態では、精製組成物は、少なくとも８０ｗｔ％のバラエノンを含む。
【００９２】
一実施形態では、精製組成物は、少なくとも８０ｗｔ％のバラエノンを含む。
【００９３】
一実施形態では、精製組成物は、少なくとも９０ｗｔ％のバラエノンを含む。
【００９４】
一実施形態では、精製組成物は、少なくとも９５ｗｔ％のバラエノンを含む。
【００９５】
一実施形態では、精製組成物は、少なくとも９８ｗｔ％のバラエノンを含む。
【００９６】
一実施形態では、精製組成物は、少なくとも９９ｗｔ％のバラエノンを含む。
【００９７】
一実施形態では、精製組成物は、少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９ｗｔ％のトランス−バラエノンを含む。一実施形態では、精製組成物は、少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９ｗｔ％のシス−バラエノンを含む。
【００９８】
一実施形態では、精製組成物は、約２ｗｔ％未満のハルホルジンを含む。
【００９９】
一実施形態では、精製組成物は、少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９ｗｔ％のバラエノンおよび２％ｗｔ％未満のハルホルジンを含む。
【０１００】
一実施形態では、精製組成物は、少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９ｗｔ％のトランス−バラエノンおよび２％ｗｔ％未満のハルホルジンを含む。
【０１０１】
一実施形態では、精製組成物は、少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９ｗｔ％のシス−バラエノンおよび２％ｗｔ％未満のハルホルジンを含む。
【０１０２】
一実施形態では、精製組成物は、少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９ｗｔ％のバラエノンから本質的になる。一実施形態では、精製組成物は、少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９ｗｔ％のトランス−バラエノンから本質的になる。
【０１０３】
純粋なトランス−バラエノンは、光および酸素を避けて冷温で保存すると極めて安定であることが観察された。しかしながら、あまり純粋でない組成物は、室温で急速に分解して（２日間以内）メリコフィロンＢ（７ｂ）を生じることが見出された。トランス−バラエノンをシリカゲル上で最終精製すると、それは酸素化芳香族化合物から分離され、その後ハルホルジン（８）と特定された。理論に束縛されるものではないが、分解は、Ｍ．ラティフォリアのメタノール抽出物にも存在するハルホルジン（８）の存在に起因すると考えられる。
【化１０】
2021535223.tif 000013
【０１０４】
トランス−バラエノンの７ｂへの転換は、一重項酸素の存在下で起こると思われる。ハルホルジン（８）は、分子状酸素をその反応性一重項状態［１Ｏ２］にする光活性剤として知られる化合物（例えば、ソラレン）と構造的に関連している（Ａｂｏｕｌ−Ｅｎｅｉｎら  ２００３）。
【０１０５】
一重項酸素は、フラン部分（バラエノンに存在するものなど）と反応して、７ｂ中のようなブテノリド部分を形成することが知られている（Ｍｏｎｔａｇｎｏｎら  ２０１４）（スキーム１においてトランス−バラエノンに関して図示される）。
【化１１】
2021535223.tif 000014
【０１０６】
同じ工程がシス−バラエノンに関して起こるはずであると考えられる。
【０１０７】
８が存在しなければ、トランス−バラエノンは、光および酸素を避けて保存したときに、室温で本質的に安定であった。別の実験において、精製されたトランス−バラエノンをローズベンガル（Ｒｏｓｅ  Ｂｅｎｇａｌ）（一重項酸素の別の公知の光発生剤）の存在下で大気中の酸素と光化学的に反応させると、他の酸化生成物に混じって７ｂが生成された。
【０１０８】
ハルホルジン（８）を抽出物から除去するとトランス−バラエノンの精製組成物が得られ、そのトランス−バラエノンは、光および酸素を避けて保存したときに室温で安定であった。同じ工程がシス−バラエノンに関して起こるはずであると考えられる。
【０１０９】
したがって、精製工程によって、天然に見出されるバラエノン、すなわちＭ．ラティフォリアの木の樹皮中のバラエノンとは著しく異なる特性を有するバラエノンまたはバラエノンの精製組成物が得られる。
【０１１０】
一実施形態では、バラエノンの精製組成物は、約２ｗｔ％未満のハルホルジンを含む。
【０１１１】
一実施形態では、精製組成物は、少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９ｗｔ％のバラエノンおよび２％ｗｔ％未満のハルホルジンを含む。
【０１１２】
一実施形態では、精製組成物は、少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９ｗｔ％のトランス−バラエノンおよび２％ｗｔ％未満のハルホルジンを含む。一実施形態では、精製組成物は、少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９ｗｔ％のシス−バラエノンおよび２％ｗｔ％未満のハルホルジンを含む。
【０１１３】
一態様では、本発明は、バラエノンから本質的になる精製組成物を提供する。一態様では、本発明は、トランス−バラエノンから本質的になる精製組成物を提供する。一態様では、本発明は、シス−バラエノンから本質的になる精製組成物を提供する。
【０１１４】
一実施形態では、バラエノン、トランス−バラエノン、またはシス−バラエノンの精製組成物は、可溶化剤を含む。一実施形態では、可溶化剤は、シクロデキストリン、アルコール、グリセリン、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコールから選択される。
【０１１５】
一態様では、本発明は、バラエノンと、１つまたは複数の医薬として許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。一態様では、本発明は、トランス−バラエノンと、１つまたは複数の医薬として許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。一態様では、本発明は、シス−バラエノンと、１つまたは複数の医薬として許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【０１１６】
「医薬組成物」という用語は、本明細書で使用される場合、動物対象に投与するのに適した形態、濃度、および純度の固体または液体組成物を意味する。
【０１１７】
バラエノンは、医薬として許容される賦形剤と混合することによって、医薬組成物に製剤化されてもよい。
【０１１８】
「医薬として許容される賦形剤」という用語は、本明細書で使用される場合、生理学的、薬理学的に不活性であり、活性剤の物理的および化学的特性と適合性がある物質を指す。医薬として許容される賦形剤として、担体、充填剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、可塑剤、粘性剤、液剤、界面活性剤、防腐剤、甘味剤および香味料、ならびに医薬品グレードの染料および顔料が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
バラエノンの医薬組成物は、非経口投与用に、具体的には水性生理学的緩衝液中の液体溶液または懸濁液の形態で；経口投与用に、具体的には錠剤またはカプセル剤の形態で；鼻腔内投与用に、具体的には散剤、滴下剤、またはエアロゾルの形態で；および局所投与用に、具体的には乳剤または軟膏の形態で調製されてもよい。他の投与経路のための組成物は、当技術分野で公知の標準的な方法を使用して、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ編（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９９０）に記載されるように調製されてもよい。
【０１２０】
一実施形態では、医薬組成物は、固体、液体、ペースト、ゲル、乳剤、クリーム、軟膏、ローション、塗布薬、溶剤、懸濁剤、スティック、ブロック、丸剤、舐剤、散剤、またはスラリーの形態であるか、またはそれらとして製剤化される。
【０１２１】
５．５  バラエノンの使用
実施例４に見られるように、純粋なバラエノンとバラエノンを含む精製組成物は、両方とも抗菌活性を実証する。
【０１２２】
したがって、一態様では、本発明は、細菌感染症の治療を必要とする対象において細菌感染症を治療する方法であって、該対象に治療的有効量のバラエノンまたはバラエノンの精製組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０１２３】
別の態様では、本発明は、細菌感染症を治療するための医薬品の製造におけるバラエノンの使用、および細菌感染症の治療に使用するためのバラエノンの組成物に関する。
【０１２４】
シス−バラエノンも活性であり得るが、バラエノンは、トランス−バラエノンとシス−バラエノンとの約６０：１の混合物を含むので、バラエノンに帰する生理活性はおそらくトランス−バラエノンに由来すると思われる。したがって、一実施形態では、バラエノンはトランス−バラエノンである。
【０１２５】
一実施形態では、感染症は、グラム陽性菌感染症である。
【０１２６】
本明細書において、特許明細書、他の外部文書、または他の情報源が言及される場合、これは概して本発明の特徴を考察するための背景を提供することを目的としている。特に明示しない限り、そのような外部文書への言及は、そのような文書、またはそのような情報源が、いかなる法域であっても、先行技術であること、または当技術分野での技術常識の一部を形成することを承認するものと解釈されるべきではない。
【０１２７】
６．実施例
一般的実験法
光学回転は、Ｒｕｄｏｌｐｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ａｕｔｏｐｏｌ  ＩＶ旋光計で測定した。ＵＶ／可視スペクトルは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ３分光光度計で記録した。ＮＭＲ実験値は、Ｂｒｕｋｅｒ  ５００ＭＨｚ分光計で、１Ｈおよび１３Ｃ核に対してそれぞれ５００ＭＨｚおよび１２５ＭＨｚで操作して取得した。正確な質量は、溶媒送出用にＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＨＰＬＣシステムを備え、正イオンモードでのエレクトロスプレーイオン化源を利用する、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５３０  Ｑ−ＴＯＦ質量分析計を使用して決定した。フラッシュクロマトグラフィーは、Ｂｕｅｃｈｉ  Ｒｅｖｅｌｅｒｉｓ  Ｘ２分取クロマトグラフィーシステムで行った。
【０１２８】
溶媒は、分析グレード品質またはそれ以上のものであった。水は、使用前にガラス蒸留した。溶媒混合物は、別段の記載がない限り、％ｖｏｌ／ｖｏｌとして報告する。逆相クロマトグラフィーは、Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０  ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ｃｏ−ポリマー（ＰＳＤＶＢ）で行った。乾燥ローディング用にＳｉｌｉｃｙｃｌｅ  ＳｉｌｉａＦｌａｓｈ  Ｆ６０シリカゲル（４０〜６３ｍ）を使用した。フラッシュクロマトグラフィー用のプレフィルドシリカカートリッジは、Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅから得た。ステンレス鋼のセミ分取カラム（シリカ、２５０×１０ｍｍ、１０μｍ）は、Ｂｕｅｃｈｉから得た。ＴＬＣは、０．２μｍシリカゲル（６０  Ｆ２５４）プレコートプレートで、メタノール中５％ｖ／ｖ硫酸＋エタノール中０．１％ｗ／ｖバニリンを使用して実施し、その後加熱して視覚化した。
【０１２９】
実施例１：バラエノンの単離（植物材料１００ｇ規模）
Ｍ．ラティフォリアの新鮮凍結幹樹皮（１００ｇ）を小片に切断し（約２ｃｍ３）、２００ｍＬのメタノール中に１８時間浸漬した。メタノール（１回目の抽出物）をろ過し、樹皮材料をさらなる２００ｍＬのメタノール中に１８時間浸漬した。このメタノール（２回目の抽出物）をろ過し、１００ｍＬのＰＳＤＶＢ（ＨＰ−２０、Ｓｕｐｅｌｃｏ）カラムに、流量を２ｍＬ／分に制限しながら重力で通した。
【０１３０】
次いで、１回目の抽出物を同じカラムに同様に通し、溶出液を合わせた。４００ｍＬのＨ２Ｏを溶出液に添加し、それを再びＰＳＤＶＢカラムに同じ速度で通した。得られた溶出液（８００ｍＬ）をさらなる８００ｍＬの水で希釈し、同じカラムに通した。次いで、カラムを３００ｍＬのアリコートの、水（廃棄する）、ｉ）２０％アセトン／水、ｉｉ）４０％アセトン／水、ｉｉｉ）６０％アセトン／水、ｉｖ）８０％アセトン／水、およびｖ）アセトンで、流量をおよそ２ｍＬ／分に制限しながら溶出した。
【０１３１】
６０％アセトン／水の画分を３００ｍＬの水で希釈し、５０ｍＬのＰＳＤＶＢのベッド（ＨＰ−２０）に通した。溶出液を６００ｍｌの水でさらに希釈し、同じＰＳＤＶＢベッドに通し、溶出液を廃棄した。少量の圧縮空気でカラムから液体を排出し、１５０ｍＬのアセトンで溶出した。得られた溶出液を蒸発乾固した。
【０１３２】
画分ｉｉｉ）（６０％アセトン／水）は、主にバラエノンおよびハルホルジンであり、それと共に少量の関連するセスキテルペンを含んでいた。バラエノンは、シリカゲル上で精製した。すなわち、２ｇの６０％アセトン画分を３ｍＬの１：１ジクロロメタン中メタノールに溶解し、４ｇのシリカゲル上に蒸着させた。担持させたシリカゲルを乾燥ローディングカートリッジ中に入れ、４０ｇのシリカカラムの上流に置いた。カラムを石油エーテルで溶出し、０〜５０％酢酸エチル／石油エーテルの勾配を１５カラム容積にわたって適用した。少量の関連するセスキテルペノイドが最初に溶出し（０〜５％酢酸エチル／石油エーテル）、その後純粋なバラエノンが（１０〜３０％酢酸エチル／石油エーテル）、最後にハルホルジン（＞３０％酢酸エチル／石油エーテル）が溶出した。
【０１３３】
実施例２：バラエノンの単離（植物材料６００ｇ規模）
Ｍ．ラティフォリアの幹樹皮（６００ｇ、新鮮凍結）をメタノール（２×１．２Ｌ）で一晩抽出し、ろ過した。２回目および１回目の抽出物を、メタノール中で予め平衡化した５００ｍＬのＰＳＤＶＢのベッドに通した。このステップからの溶出液を合わせたものを水で続けて希釈し（２×容積）、同じカラムに戻して通し、メタノール／水の最終溶液濃度が２５％になるまで行った。このカラムを水で洗浄し（１．５Ｌ、ローディング溶出液と一緒に収集）、次いで、１．５Ｌの分量のｉ）２０％アセトン／水、ｉｉ）４０％アセトン／水、ｉｉｉ）６０％アセトン／水、ｉｖ）８０％アセトン／水、およびｖ）アセトンで溶出した。
【０１３４】
２ｇの分量の６０％アセトン／水の濃縮画分（画分ｉｉｉ）を、シリカゲル（４０ｇ）フラッシュクロマトグラフィー［石油エーテル／酢酸エチル、０〜６０％を１６カラム容積（ＣＶ）、６０〜１００％を３ＣＶ、１００％を２．９ＣＶ、メタノールを０．４ＣＶ］を使用して精製した。バラエノンは、ハルホルジン（３５〜４０％石油エーテル／酢酸エチル）のそばに、２０〜２５％石油エーテル／酢酸エチルで溶出した。
【０１３５】
実施例３：トランス−およびシス−バラエノンの単離
実施例１に記載する工程に従って得られたバラエノン濃厚化画分をプールし、３：１石油エーテル／ジエチルエーテルのイソクラティック混合物を使用して、シリカゲルのクロマトグラフィーにかけた（１０×１５０ｍｍ、１０μ、流量５ｍＬ／分）。トランス−バラエノン（式（Ｘａ）の化合物）が１２．４分で溶出し、一方、シス−バラエノン（式（Ｘｂ）の化合物）は１５．２分で溶出した。
【０１３６】
シス−バラエノンは、無色の光学活性な固体として単離された（［ａ］２０Ｄ＋５７５）。ＮＭＲ実験データ（表２）によって解明された正確な質量決定および組成構造からの分子式は、トランス−バラエノンについて決定されたものと同一である。シス−バラエノンの絶対配置は決定されていないが、トランス−バラエノンのジアステレオマーであることから、Ｈ−１とＨ−１０との間にシンの関係があるはずである。
【０１３７】
実施例４：トランス−バラエノンの構造解明
トランス−バラエノンは、光学活性な無色の油状物として提示される（［α］２０Ｄ＋１７１）。７の不飽和度を必要とするＣ１５Ｈ１８Ｏ２の分子式は、高分解能質量分析から得られた（ｍ／ｚ  ２３１．１３８３［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値２３１．１３８０）。トランス−バラエノンの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、必要とされる１５の共鳴をすべて含有している。１３Ｃ、ＤＥＰＴ、およびＨＳＱＣ  ＮＭＲ実験の解析から、１５個の炭素がさらに３個のメチル（δＣ  ２３．２、１０．７、９．２）、３個のメチレン（δＣ  ４２．０、２６．６、３４．３）、３個のメチン（∂Ｃ  １３７．８、４８．４、４２．１）、および６個の非プロトン化炭素（δＣ  ２０９．２、１６４．８、１５６．６、１３５．９、１２０．４、１１８．７）に分類されることが確認された。提示された分子式によって必要とされる１８個のすべての水素は炭素に結合しており、それによって交換可能なプロトンが存在しないことが示される。ＮＭＲデータは、表２に要約されている。
【０１３８】
ＣＯＳＹおよびＨＭＢＣ実験から、３つの主要な部分構造が確立された。トランス−バラエノンの平面構造を確立するのに使用される相関を以下に示し、構造Ｉに示す付番を使用して詳述する。
【化１２】
2021535223.tif 000015
【０１３９】
第１の部分構造であるビニルフラグメントは、Ｃ−１１（δＣ  １２０．４）、ＣＨ−１２（δＨ  ７．０６、１ＪＣＨ  ２００Ｈｚ；δＣ  １３７．８）、およびＣＨ３−１３（δＨ  １．８９；δＣ  ９．８）からなり、Ｈ３−１３からＣ−１１およびＣ−１２へのＨＭＢＣ相関によって承認された。第２の部分構造は、ＣＨ３−１４（∂Ｈ  １．７３；∂Ｃ  １０．７）からＣ−３（∂Ｃ  ２０９．２）  Ｃ−４（δＣ  １３５．９）、およびＣ−５（δＣ  １６４．８）へのＨＭＢＣ相関によって証明されるように、２−メタクリロイルフラグメントとして確立された。第３の部分構造である１，２，５−三置換３−メチルペンチルユニットは、ＣＨ２−２（∂Ｈ  ２．２６、２．６７；∂Ｃ  ４２．０）、ＣＨ−１（δＨ  ２．５２；∂Ｃ  ４８．４）、ＣＨ−１０（δＨ  １．５８；δＣ  ４２．１）、ＣＨ２−９（δＨ  １．６０、１．８６；δＣ  ３４．３）、およびＣＨ２−８（δＨ  ２．７３、２．８１；∂Ｃ  ２６．６）からなっている。ＣＨ３−１５（δＨ  １．０８；δＣ  ２３．２）の結合は、Ｈ−１０とのＣＯＳＹ相関、ならびにＣ−１、Ｃ−９、およびＣ−１０へのＨＭＢＣ相関によって確立された。
【０１４０】
トランス−バラエノンの相対配置は、スカラー結合定数およびＮＯＥ相関データの解析を通して決定した。Ｈ−１とＨ−９ａとの間およびＨ−１０とＨ−８ａとの間のＮＯＥ相関は、両方とも７員環の周りに１，３−擬似アキシアル配向であることを示唆した。これらの相関によって、ＣＨ３−１５がＨ−１およびＨ−９ｂに対して疑似エクアトリアルに配置され、これは、Ｈ−１とＨ−１０との間の９．７Ｈｚのビシナル結合定数（これらの２つのプロトンのアンチの関係を示す）によってある程度裏付けられる。
【０１４１】
単離工程中に、部分的に精製されたトランス−バラエノンの試料は酸化されて別の種になった。この化合物の平面構造は、１９８８年に最初にＷｕらによって記載されたアワダンからのセスキテルペノイドであるメリコフィロンＢ（７ｂ）と一致した。スペクトルの詳細は同一であることから、Ｗｕらによって単結晶Ｘ線回折解析により確立された同じ相対配置であることが示される。本発明者らによって実験的に導出された７ｂの比旋光度（［α］２０Ｄ−１９９）は、文献に記載されるものと同じ符号を有する｛［α］２５Ｄ−３８（ｃ  ０．８５４、ＣＨＣｌ３）｝。このことから、トランス−バラエノンおよび７ｂは、それらの保存された不斉中心で同じ絶対配置を共有するという結論を得た。
【０１４２】
トランス−バラエノンの絶対立体化学は、トランス−バラエノン誘導体のＸ線結晶解析によって決定した。トランス−バラエノン（式Ｘａ）を、ディールズ・アルダー環化付加実験（エタノール中室温）でマレイミドと反応させた。４つの反応生成物が検出され、そのうち１つ（９）が結晶性固体として単離された（スキーム２）。この付加物のＸ線構造（図１０）から、天然物（トランス−バラエノン）におけるＨ−１とＨ−１０との間のアンチの関係が確認され、図示する通りの絶対配置（１Ｒ，１０Ｓ）が決定される。
【化１３】
2021535223.tif 000016
【０１４３】
シス−バラエノンの相対立体化学は、トランス−バラエノンとの比較によって解明された。
【０１４４】
特性決定データ
トランス−バラエノン（Ｘａ）：無色油状物；［α］２０Ｄ＋１７１（ｃ  ０．５、ＣＨＣｌ３）；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ／ｎｍ（ｌｏｇε）２４４（３．９９）、２８０（３．８０）；ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）表２参照；ＨＲＥＳＩＭＳ  ｍ／ｚ  ２３１．１３８３［Ｍ＋Ｈ］＋、Ｃ１５Ｈ１９Ｏ２についての計算値、２３１．１３８０。
【０１４５】
メリコフィロンＢ（７ｂ）：無色半結晶性固体；［α］２０Ｄ−１９９（ｃ  １、ＣＨＣｌ３）；以前にＷｕらによって記載された通りのＮＭＲデータ。
【０１４６】
ハルホルジン（３）：無色結晶性固体；ＨＲＥＳＩＭＳ  ｍ／ｚ  ２７７．０７１５［Ｍ＋Ｈ］＋（Ｃ１４Ｈ１３Ｏ６についての計算値、２７７．０７０７）。
【０１４７】
シス−バラエノン（Ｘｂ）：無色固体；［α］２０Ｄ＋５７５（ｃ  １，ＣＨＣｌ３）；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ／ｎｍ（ｌｏｇε）２２６（３．７６）、２５６（３．７６）、２９８（３．７１）；ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）表３参照；ＨＲＥＳＩＭＳ  ｍ／ｚ  ２３１．１３７９［Ｍ＋Ｈ］＋（Ｃ１５Ｈ１９Ｏ２についての計算値、２３１．１３８５）。
【表２】
2021535223.tif 000017
【表３】
2021535223.tif 000018
【０１４８】
実施例５：バラエノンおよびＭ．ラティフォリア樹皮抽出物の抗菌活性
Ｍ．ラティフォリア樹皮の粗（１回目のメタノール）抽出物および実施例１に概説する精製工程を使用して得られた５つのクロマトグラフィー画分を、ＴＬＣバイオオートグラフィー試験に供して、抗菌活性を定性的に測定した。
【０１４９】
簡潔に述べると、試料をシリカゲルＴＬＣプレート上に載せ、確立された溶媒系（石油エーテル中１０％酢酸エチル）を使用してそれを展開して、それらの成分を極性に基づいて分離することによって、基準プレートを調製した。次いで、メタノール中５％ｖ／ｖ硫酸＋エタノール中０．１％ｗ／ｖバニリンを使用し、その後加熱することによって、展開したプレートを視覚化した。この方法を使用すると、バラエノンは明るいピンクから赤色のスポットとして識別された（図７参照）。
【０１５０】
次いでこのプレートの複数のコピーを調製し、同じ溶媒系を使用して展開したが、代わりに、次の微生物（以下参照）のうちの１つを接種／スパイクした寒天を注ぎ、インキュベートした後に還元染料で視覚化することによって視覚化する。阻害のゾーンを表示するこれらの試料中に存在する化合物は、抗菌活性を持っていると考えられる。
【０１５１】
検査したグラム陽性菌（３）：
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、枯草菌
検査したグラム陰性菌（２）：
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）
黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌に関する結果を図８および９に示す。どの抽出物も緑膿菌に対して活性でないことが見出された。
【０１５２】
これらの結果によって、阻害のゾーンが基準プレートにおけるバラエノンの明るいピンクのスポット特性とほぼ同じ保持係数で現れることから、バラエノンを含有することが既知の試料は、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌に対して抗菌活性を呈することが示される。いずれのグラム陰性菌に対しても活性は観察されなかった。
【０１５３】
バラエノンを含有しない試料（２０％および４０％アセトン／水の画分）は、選択された生物のいずれに対しても活性を示さなかった（図示せず）。
【産業上の利用可能性】
【０１５４】
７．産業上の利用可能性
本発明の化合物および組成物は、抗生物質としての用途を有する。当業者であれば、上の説明が実例として提供されるに過ぎず、本発明がそれらに限定されないことを理解するであろう。
【０１５５】
８．参考文献
【数１】
2021535223.tif 000019
【数２】
2021535223.tif 000020
【図１】
2021535223.tif 000025
【図２】
2021535223.tif 000026
【図３】
2021535223.tif 000027
【図４】
2021535223.tif 000028
【図５】
2021535223.tif 000029
【図６】
2021535223.tif 000030
【図７】
2021535223.tif 000031
【図８】
2021535223.tif 000032
【図９】
2021535223.tif 000033
【図１０】
2021535223.tif 000034
【図１１】
2021535223.tif 000035
【図１２】
2021535223.tif 000036
【図１３】
2021535223.tif 000037
【図１４】
2021535223.tif 000038
【図１５】
2021535223.tif 000039
【図１６】
2021535223.tif 000040
【手続補正書】
【提出日】令和3年4月30日(2021.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2021535223.tif 000041
【図２】
2021535223.tif 000042
【図３】
2021535223.tif 000043
【図４】
2021535223.tif 000044
【図５】
2021535223.tif 000045
【図６】
2021535223.tif 000046
【図７】
2021535223.tif 000047
【図８】
2021535223.tif 000048
【図９】
2021535223.tif 000049
【図１０】
2021535223.tif 000050
【図１１】
2021535223.tif 000051
【図１２】
2021535223.tif 000052
【図１３】
2021535223.tif 000053
【図１４】
2021535223.tif 000054
【図１５】
2021535223.tif 000055
【図１６】
2021535223.tif 000056
【国際調査報告】
2021535223.tif 000057
2021535223.tif 000058