(57)【要約】  本出願は、１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬを生産する形質組換え酵母の製造方法及び前記方法に製造された酵母に関するものであり、松茸香を利用した香粧産業及び食品開発産業上有用な発明である。
2021514630.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)をコーディングする配列リスト９、１０、１１のうちで選択される何れか一つの塩基配列とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)をコーディングする配列リスト１２の塩基配列を含む再組合ベクターに形質組換えされた１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ生産用形質組換え酵母。
【請求項２】
松茸のTotal ＲＮＡを分離してｃＤＮＡ合成する段階と、前記合成されたｃＤＮＡからリポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)遺伝子とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)遺伝子をＰＣＲ増幅する段階と、
前記増幅された各リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)遺伝子とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)遺伝子をベクターに遺伝子クローニングする段階と、
前記クローニングされた各リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)遺伝子とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)遺伝子を各酵母発現ベクター(Yeast expression vector)に遺伝子クローニングする段階と、
前記酵母発現ベクター(Yeast expression vector)を酵母に形質組換えして培養して１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬの生合成を確認する段階と、を含む１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ生産用形質組換え酵母の製造方法。
【請求項３】
前記酵母発現ベクター(Yeast expression vector)は、pYES３/CT vectorまたは、pYES２/CT vectorのうちで選択されるvectorであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記pYES３/CT vectorとpYES２/CT vectorを１:１の割合で使用することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記酵母の培養はSC medium培地で０．０１乃至１００mMのリノール酸(linoleic acid)を利用して１５乃至４５℃で、１２乃至４８時間の間に培養することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記酵母はサッカロミセスセレビシエ(S．cerevisiae)であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項７】
請求項１の１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ生産用形質組換え酵母を培地で培養して１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬを生合成する段階と、前記生合成された１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬを収得する段階と、を含む１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬを生産する形質組換え酵母及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)は１６８３年レーウェンフック(Leeuwenhoek)によって発見されたし、子嚢菌類に属する代表的な酵母である。酵母は酵母自体が安っぽい脂肪及びタンパク質源で餌に使用される。ビタミンＢ群を豊かに含んで、またビタミンＤを含むこともあり医薬品工業にも使用されている。酵母を初めて観察したことは顕微鏡の発明者レーウェンフック(Anton van Leeuwenhoek)であり、１６８０年にはビール酵母が発見された。しかし、酵母醗酵の生物学的意義が知られたことは１８６１年であったし、パスツール(Louis Pasteur)は葡萄酒醗酵が酵母によって生じるという事実を最初に糾明した。
【０００３】
松茸の主要香り成分中の一つであるマツタケオール(matsutakeol)で知られたオクテノール(１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ)は生合成過程でリポキシゲナーゼ(lipoxygenase)とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)酵素が関与するものとして知られている。オクテノール(１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ)は１-ＯＣＴＥＮから来由される２次アルコールであり、(Ｒ)-(-)-１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬと(Ｓ)-(+)-１-ＯＣＴＥＮ３-ＯＬの二つの鏡像異性質体の形態で存在する。(Ｒ)-(-)-１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬは果物香と松茸特有の良い香がするが(Ｓ)-(+)-１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬはかび臭いかびにおい、雑草におい、人為的なにおいを帯びる。よって、(Ｒ)-(-)-１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬが松茸の主要香り成分と知られている。
【０００４】
基質である松茸のリノール酸(linoleic acid)は子実体内で(Ｓ)-１-ヒドロペルオキシ(hydroperoxy)-(８Ｅ、１２Ｚ)-８、１２-オクタデカジエン酸(octadecadiＥＮＯic acid)(１０-ＨＰＯＤＥ)で酸化され、この過程でリポキシゲナーゼが関与する。そして、１０-ＨＰＯＤＥは再び(Ｒ)-(-)-１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬと１０-Oxo-trans-８-decＥＮＯic acid(ＯＤＡ)を生合成するのに使用されるが、この過程に関与する酵素がヒドロペルオキシドライエースで知られている。
【０００５】
今まで化学合成方法ではない松茸のリポキシゲナーゼとヒドロペルオキシドライエースの遺伝子をプラスミドベクターを利用して酵母サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)で発現させた結果オクテノール(１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ)が生合成されたことを確認するオクテノールの生合成方法に関する研究は不十分である。松茸は特に、アジアで選好度が非常に高い食用きのこであるので、オクテノール(１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ)を生合成する形質組換え酵母は松茸香りを利用した食品開発など関連産業に肯定的な効果があるものとして予想される。
【０００６】
従来公知されるか、または共用されたオクテノール(１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ)の製造方法は大韓民国公開特許第１０-２０１３-０１００１４１号に開示されている。ここでは、オクテノールを６-メチル-５-ヘプテン-２-オン(ＭＨ)を６-メチル-２-ヘプタノン(ＭＨＡ)に水素化して、続いてこれをアセチレンと反応させて３、７-デ−メチル-１-オックティン-３-オル(ＤＭＯＩ)を形成した後ＤＭＯＩを３、７-デ−メチル-１-オックテン-３-オル(ＤＭＯＥ)で水素化させて合成する化学的製造方法を開示しているだけである。また、大韓民国登録特許第１０-１４４６３１５号及び第１０-１４５５２０４号には松茸から由来したオクテノールの生合成に関与する各リポキシゲナーゼとヒドロペルオキシドライエースの遺伝子を開示しているだけである。
【０００７】
このような背景下に、本発明者らは酵母を利用したオクテノール(１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ)の製造方法を開発するために鋭意研究することで本出願を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本出願の目的は、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)をコーディングする塩基配列とヒドロペルオキシド(Hydroperoxide)をコーディングする塩基配列を含む再組合ベクターに形質組換えされた１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ生産用形質組換え酵母を提供することである。
【０００９】
本出願の他の目的は、１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ生産用形質組換え酵母の製造方法を提供することである。
【００１０】
本出願の他の目的は、１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬの製造方法を提供することである。
【００１１】
本出願の他の目的及び利点は、添付した請求範囲及び図面と共に下記の詳細な説明によってより明確になるであろう。本明細書に記載しない内容は本発明の技術分野または類似分野で熟練された者なら充分に認識して類推することができるものであるのでその説明を略する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
以下、本出願内容に対して具体的に説明すれば次のようである。一方、本出願で開示した一実施様態の説明及び実施形態は共通された事項に対して他の様態の説明及び実施形態にも適用されることができる。また、本出願で開示された多様な要素らのすべての組合が本出願の範疇に属する。併せて、下記記述された具体的な敍述によって本出願の範疇が制限されると見ることができない。
【００１３】
本出願の目的を達成するために、本出願はリポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)をコーディングする塩基配列とヒドロペルオキシド(Hydroperoxide)をコーディングする塩基配列を含む再組合ベクターに形質組換えされた１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ生産用形質組換え酵母を提供する。
【００１４】
本出願の一様態によれば、松茸のTotal ＲＮＡを分離してｃＤＮＡ合成する段階と、前記合成されたｃＤＮＡからリポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)遺伝子とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)遺伝子をＰＣＲ増幅する段階と、前記増幅された各リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)遺伝子とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)遺伝子をベクターに遺伝子クローニングする段階と、前記クローニングされた各リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)遺伝子とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)遺伝子を各酵母発現ベクター(Yeast expression vector)に遺伝子クローニングする段階と、前記酵母発現ベクター(Yeast expression vector)を酵母に形質組換えして培養して１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬの生合成を確認する段階を含む１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ生産用形質組換え酵母の製造方法を提供する。
【００１５】
本出願の一具現例で、本出願は各配列番号９、１０、１１の塩基配列でなされたリポキシゲナーゼ(lipoxygenase)-１、２、３遺伝子と配列番号１２の塩基配列でなされたヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)を遺伝子クローニングして含む再組合ベクターを酵母に形質組換えさせて培養して１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬの生合成を確認する段階を含む１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ生産用形質組換え酵母の製造方法を提供する。また、前記塩基配列の相同体が本出願の範囲内に含まれる。具体的に、前記遺伝子相同体は本出願配列番号の塩基配列とそれぞれ７０％以上、より望ましくは８０％以上、さらにより望ましくは９０％以上、一番望ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。ポリヌクレオチドに対する“配列相同性の％”は二つの最適に配列された配列と比較領域を比べることで確認され、比較領域でのポリヌクレオチド配列の一部は二つの配列の最適配列に対する参照配列(追加または削除を含まない)に比べて追加または削除(すなわち、ギャップ)を含むことができる。
【００１６】
本出願の一様態によれば、本出願は請求項１の１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ生産用形質組換え酵母を培地で培養して１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬを生合成する段階と、前記生合成された１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬを収得する段階を含む１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬの製造方法を提供する。
【００１７】
用語“プライマー”は分析を通じて決まった遺伝子の配列相同性結果で７０％以上の種間配列相同性を有する核酸部位で１８乃至３５の長さを有して、センスプライマー及びアンチセンスプライマーがお互いに混成化されないし、前記遺伝子とプライマーが厳格な条件で混成化されるようにプライマー配列を決めるアルゴリズムであることが望ましいが、これに制限されるものではない。
【００１８】
用語“ＰＣＲ(重合酵素連鎖反応)”とは、核酸増幅方法で二重らせんＤＮＡの変性、ＤＮＡ鋳型へのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング及びＤＮＡ重合酵素によるプライマー延長の繰り返されたサイクル過程を含む(Mullisなど、アメリカ特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号と、Saiki et al、１９８５)。ＰＣＲに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーはＤＮＡの反対側らせんにアニーリングされるようにデザインされ、プライマーのＤＮＡ重合酵素延長生成物は他のプライマーのための鋳型らせんで作用する。ＰＣＲ増幅過程はＤＮＡ配列の指数的増加をもたらして、増幅されたＤＮＡ配列長さはオリゴヌクレオチドプライマーの５'-末端によって決まる。
【００１９】
用語”ベクター”は細胞内に伝達するＤＮＡ断片(ら)、核酸分子を指称する時に使用される。ベクターはＤＮＡを複製させて宿主細胞から独立的に再生産されることができる。用語“伝達体”はよく“ベクター”と互換して使用される。前記ベクターはクローニングベクターで使用されることができるし、クローニングベクターとは、宿主内で安定的に維持されて外部ＤＮＡ片を挿入しようとする用途を有している。それで、ベクターと外部ＤＮＡを制限酵素で処理する時に易しく挿入されるか、または除去することができる特徴を持たなければならない。使用されるクローニングベクターは挿入しようとする遺伝子の特徴、制限酵素の特徴の条件を考慮して適切に選定されが、本出願で望ましくはｐＧＥＭ easy vectorが使用される。用語“酵母発現ベクター(Yeast expression vector)”はプローモーター遺伝子、解読開示及び終結コドンが除去された目的タンパク質をコーディングする遺伝子及びターミネーターを含んで、プローモーター遺伝子はＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ、ＡＤＨ、ＰＨＯ５、ＧＡＬ１及びＧＡＬ１０で構成された群から選択される遺伝子であることが望ましいが、これに制限されない。前記酵母発現ベクター(Yeast expression vector)は組合酵母プラスミド(YIp:integrative yeast plasmid)及び染色体外プラスミドベクター(extrachromosomal plasmid vector)がすべて可能である。前記染色体外プラスミドベクターはエピゾーム酵母プラスミド(YEp:episomal yeast plasmid)、複製酵母プラスミド(YRp:replicative yeast plasmid)及び酵母中心体プラスミド(YCp:yeast centromere plasmid)で分けられる。さらにひいては、人為的酵母染色体ら(YACs:artificial yeast chromosomes)も本出願による発現ベクターとして可能である。また、特に望ましい酵母ベクターは、複製原点ori及び抗生物質抵抗性カセット(antibiotic resistance cassette)を含んで大膓菌(E．coli)で増殖されて選択されることができる酵母複製プラスミド(yeast replication plasmid)である。さらにひいては、これらはH．polymorphaからのＨＡＲＳ１のように酵母細胞で染色体と関係なく独立的複製ができるＡＲＳ配列、そしてＵＲＡ３またはＨＬＥＵ２のような代謝性酵母選択マーカー(metabolic yeast selection marker)を有する。本出願では酵母発現ベクター(Yeast expression vector)として多様なvectorが使用されることができ、具体的にpKLAC２ vector、Gateway pYES-DEST５２vector、pAO８１５Pichia Expression vecotr、pYES２/３/CTvectorがあって、望ましくはpYES３/CT vectorまたはpYES２/CT vectorが使用されることができる。各遺伝子を発現させるために使用するvectorの組合は発現させようとする遺伝子、そのタンパク質、そして該当タンパク質の量によって適切に選択してその割合を調節することができる。本出願では具体的に、１:５、１:４、１:３、１:２、１:１が使用されることができるし、望ましくはpYES３/CT vectorとpYES２/CT vectorを１:１の割合で使用する。
【００２０】
本出願の用語“遺伝子クローニング”は、目的遺伝子をプラスミド(plasmid)、ファージ(phage)、コスミド(cosmid)などの自己複製能力を有するベクターに結合して大膓菌、酵母などの多様な宿主に取り入れて増殖させることで、同一な遺伝子集団を大量で作り出す技術を称する。大膓菌におけるクローニング及びサブクローニングは重合酵素連鎖反応(ＰＣＲ)方法などによって増幅された目的遺伝子をＤＮＡリガーゼ(ligase)を使って複製起点と抗生剤の選択標識を有するベクターに結合して大膓菌や酵母など細胞の中に取り入れた後、抗生剤耐性を調査することでクローニングされた細胞を選別する方法で実施される。
【００２１】
本出願の用語“酵母”は、サッカロミセス(Saccharomyces)、スキゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、スポロボロマイセス(Sporobolomyces)、トルロプシス(Torulopsis)、トリコスポロン(Trichosporon)、ウィカーハミア(Wickerhamia)、アシュビア(Ashbya)、ブラストミセス(Blastomyces)、カンジダ(Candida)、サッカロミケス(Citeromyces)、クレブロテシウム(Crebrothecium)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、デバリオミセス(Debaryomyces)、エンドマイコプシス(Endomycopsis)、ゲオトリクム(Geotrichum)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クロエケラ(Kloeckera)、リポマイセス(Lipomyces)、ピキア(Pichia)、ロードスポリジウム(Rhodosporidium)または、ロドトルラ(Rhodotorula)属(genus)に属する酵母であることができるし、より望ましくは、サッカロミセス及びスキゾサッカロミセスに属する酵母であることができるし、一番望ましくは、サッカロミセスセレビシに使用する。遺伝子の発現率及び最終発現される産物の量と効率によって適切な種類の酵母を選択して使用することができる。本出願の形質組換えされた酵母サッカロミセスセレビシエＫＭＧ１８０１、ＫＭＧ１８０２、ＫＭＧ１８０３は、２０１８年２月６日付け韓国バイオテクノロジー研究院生物資源センター(ＫＣＴＣ)にそれぞれ寄託番号第ＫＣＴＣ１３４７６ＢＰ号、ＫＣＴＣ１３４７７ＢＰ号及びＫＣＴＣ１３４７８ＢＰ号で寄託された。
【００２２】
例えば、宿主細胞が酵母である場合、前記発現コンストラクトで利用可能なプローモーターはＧＡＬ１０プローモーター、ＧＡＬ１プローモーター、ＡＤＨ１プローモーター、ＡＤＨ２プローモーター、ＰＨＯ５プローモーター、ＧＡＬ１-１０プローモーター、ＴＤＨ３プローモーター、ＴＤＨ２プローモーター、ＴＤＨ１プローモーター、ＰＧＫプローモーター、ＰＹＫプローモーター、ＥＮＯプローモーター、Ｔ７プローモーター及びＴＰＩプローモーターを含むが、これこに限定されるものではない。プローモーターは遺伝子の発現率及び最終発現される産物の量と発現効率などの条件によって適切に選択して使用することができる。
【００２３】
本出願の一具現例による方法で、前記形質組換えされた宿主細胞を培養する方法は当業界に公知された一般的な方法を利用することができるが、これに制限されない。酵母の“形質組換え”は核酸分子またはベクターを当業者に公知された標準方法、望ましくは電気穿孔、化学的形質組換え、原形質融合による形質組換え、または粒子ボムバードゥメントゥ(bombardment)によって細胞内で導入するようにする(参照: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Edited by: Fred M. Ausubel et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) , J. Sambrook and D. Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press)。本出願の望ましい具現例によれば、本出願の形質組換え酵母はＳ．ｃ．EasyComp Transformation kitを利用して実施した。
【００２４】
本出願の一具現例で、請求項１の１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ生産用形質組換え酵母を培地で培養して１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬを生合成する段階と、前記生合成された１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬを収得する段階を含む１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬの製造方法に提供される。
【００２５】
本出願の酵母の培養は１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬの生合成を確認するためにトリプトファン(Tryptophan)とウラシル(Uracil)が結実されたＳＣ selectable medium（選択可能なミディアム）に形質組換え酵母を接種してオーバーナイト(overnight)前培養した後、遠心分離して酵母を集めてトリプトファン(Tryptophan))とユラシル(Uracil))が結実されたＳＣ induction medium(誘導ミディアム)に接種して、２％Tween-２０とリノール酸(linoleic acid)を添加して３０℃から２０時間の間に培養することができる。本出願で望ましくは基質であるリノール酸(linoleic acid)の濃度は０．０１乃至０．１Mが使用されることができるし、さらに望ましくは、０．５乃至１００mMの濃度が使用され、一番望ましくは、３mMの濃度が使用される。また、本出願で望ましい培養温度は１５℃乃至４０℃、さらに望ましくは３０℃であり、培養時間は１２乃至４８時間の間の培養時間が使用され、具体的には１８乃至３６時間、２０乃至２６時間、一番望ましくは２４時間が使用される。
【発明の効果】
【００２６】
本出願は、１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬを生合成する形質組換え酵母を、及びその製造方法を提供して親環境的であり、経済的なオクテノールの大量生産に効果的であり、松茸香りを利用した食品及び香粧開発に寄与することができるすぐれた効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、本出願の松茸から抽出されたtotal ＲＮＡを示す電気泳動写真図である。
【図２】図２は本出願のリポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-１遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-２遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-３遺伝子(各Lane１、２、３)とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)(Lane４)遺伝子の増幅を示す電気泳動写真図である。
【図３】図３は本出願のリポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-１遺伝子(Ａ)、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-２遺伝子(Ｂ)、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-３遺伝子(Ｃ)とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)遺伝子(Ｄ)がpGEM TM easyTvectorプラスミドに挿入された結果を示す電気泳動写真図である。
【図４】図４はpYES３/CT及びpYES２/CT酵母発現ベクター(Yeast expression vector)のマップを示す模式図である。
【図５】図５はリポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-１遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-２遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-３遺伝子(Ａ)とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)遺伝子(Ｂ)がプラスミドに挿入された結果を示す電気泳動写真図である。
【図６】図６(Ａ)はリポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-１遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-２遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-３遺伝子とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)遺伝子が導入された形質組換え酵母を培養したプレートの写真図である。図６(Ｂ)はリポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-１遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-２遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-３遺伝子とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)遺伝子が導入された形質組換え酵母のcolonyＰＣＲ結果を示す電気泳動写真図である。
【図７】図７はリポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-１遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-２遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-３遺伝子とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)遺伝子の組合が形質組換えされた各酵母の生長曲線を示すグラフである。
【図８】図８は(Ａ)基質を添加しないで培養したセル(cell)のライセート(lysates)、(Ｂ)基質を添加しないで培養したミディアム(medium)、(Ｃ)基質を添加して培養したセル(cell)のライセート(lysates)、(Ｄ)基質を添加して培養したミディアム(medium)での１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ生合成を示すグラフである。
【図９】図９は形質組換え体酵母で(Ａ)リノール酸(linoleic acid)添加濃度による１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ生合成量と(Ｂ)反応温度及び反応時間による１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬの生合成量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本出願による実施例を通じて本出願をより詳しく説明しようとする。ただ本出願の下記実施例は本出願の仕事例示に過ぎない。これら実施例は本出願をより具体的に説明するためのものであり、添付された請求項に提示された本出願の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、本出願が属する技術分野で通常の知識を有した者において明白であろう。
【００２９】
実施例１:松茸のTotal ＲＮＡ分離
大韓民国の大邱市隣近の居昌地域で採取した松茸子実体からTotal ＲＮＡを分離した。松茸子実体を３乃至５cmの小さな片で切った後、液体窒素を使って乳鉢できれいに摩碎した。摩碎した子実体をTRIZol１mLに完全に溶解させた後クロロホルム(chloroform)を添加したし、１５分間遠心分離してＲＮＡを分離した。ＲＮＡが含まれた上澄み液を新しいチューブに移して同量のイソプロフィルアルコール(Iso-propyl alcohol)を添加して常温で１５分間反応させて１０分間１２，０００rpmで遠心分離してＲＮＡを沈澱させた。次に、上澄み液をとり除いて７５％エチルアルコール(ethyl alcohol)を添加して洗滌した後ＤＥＰＣ処理数(ＤＥＰＣ(diethypyrocarbonate)-treated water)を添加してTotal ＲＮＡを湧出、分離したし、その結果Total ＲＮＡ concentrationは９９２．８ng/μｌで確認された(Ａ２６０/Ａ２８０=１．８８６)(図１、一番目のレーンはＤＮＡ markerであり、２〜４レーンはTotal ＲＮＡを示す)。
【００３０】
*実施例２:松茸のｃＤＮＡ合成
前記実施例１で収得したTotal ＲＮＡとAccuscript High Fidelity １st Strand ｃＤＮＡ Synthesis Kit(Stratagene)を使ってFirst strand ｃＤＮＡを次の方法で合成した。Total ＲＮＡ１μｌ、ＲＮＡ se-freewater１１．７μｌ、AccuScript RT buffer２μｌ、Oligo dT primer １μｌ、dNTP mixture０．８μｌを混合して６５℃で５分、次の常温で５分間反応させた後ＤＴＴ１００mM、AccuScript RT １μｌ、ＲＮase Block ribonuclease ０．５μｌをさらに添加して４２℃で１時間反応させた後７０℃で１５分反応させてｃＤＮＡを合成した。
【００３１】
実施例３:リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-１、２、３遺伝子とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)遺伝子のＰＣＲ産物製作
前記実施例２で合成、収得したｃＤＮＡを鋳型でPrimeSTAR TM HS Polymerase(TaKaRa)を利用して下記のプライマー(primer)(表１)及びＰＣＲ条件(表２)を使って遺伝子を増幅させた。SC選択的培地(SC selectable medium)で該当の遺伝子及び制限酵素を使ってＰＣＲを遂行した。
【００３２】
【表１】
2021514630.tif 000003
【００３３】
【表２】
2021514630.tif 000004
【００３４】
実験結果、電気泳動写真図を通じて各リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-１遺伝子(配列番号９，３１５９bp)、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-２遺伝子(配列番号１０，３３３３bp)、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-３遺伝子(配列番号１１，３８５５bp)((図２の各Lane１、２、３)とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)(配列番号１２、１，５６０bp、図２のLane４)遺伝子の増幅を確認した。図２の電気泳動写真図の一番目レーンはＤＮＡ markerでPlus ＤＮＡ Ladder Markerが使用された。
【００３５】
実施例４:pGEM TM easy T vectorを利用した遺伝子クローニング
前記実施例３で収得したリポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-１遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-２遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-３遺伝子とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)遺伝子のＰＣＲ産物を各pGEM TM easy T vector(Promega)にクローニングするためにMighty TA-cloning Reagent Set(TaKaRa)を使ってA-tailing過程を遂行した後、pGEM TM easy T vectorと４℃でオーバーナイト(overnight)してライゲーション(ligation)させた後、ライゲーション(ligation)されたvectorをE．coliDH５α competentcells(TaKaRa)に形質転換した。次に、E．coliはampicillin(１００μl/ml)、IPTG(０．１mM)、X-ＧＡＬ(５０μg/ml)を添加したLuriaBroth(LB) medium plateに塗抹して３７℃で１６乃至１８時間の間に培養した後、Higene TM Plasmid Mini Prep Kit(Biofact)を使ってプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドに遺伝子が正確に挿入されたかを確認するために電気泳動で遺伝子の大きさを確認した後該当塩基配列シークエンシングを遂行した。
【００３６】
実験結果、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-１遺伝子(図３(Ａ))、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-２遺伝子(図３(Ｂ))、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-３遺伝子(図３(Ｃ))とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)遺伝子(図３(Ｄ))がpGEM TM easy T vectorプラスミドに正確に挿入されたことを確認した。
【００３７】
実施例５:酵母発現ベクター(Yeast expression vector)を利用した遺伝子クローニング
Yeastでの遺伝子発現のためのリポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-１遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-２遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-３遺伝子が挿入されたpGEM vectorを各制限酵素HindIIIとKpnIで３７℃で反応させて切断したし、ヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)遺伝子が挿入されたpGEM vectorを各制限酵素KpnIとEcoRIで３７℃で反応させて切断した。切断した遺伝子らはTaKaRa MiniBEST Agarose Gel ＤＮＡ Extraction Kit(TaKaRa)で精製した後定量した。前記遺伝子を発現させるための微生物モデルとしてSaccharomyces cerevisiae種を選択した後、効率タンパク質発現のためにhostcellに相応しい酵母発現ベクター(Yeast expression vector)であるpYES３ベクター(Invitrogen社)を選択した。本ベクターはpUc ori配列が含まれていてバクテリアで増幅が易しくて、２μorigin配列が含まれていて酵母でも増幅が可能である。また、このベクターには目的遺伝子を切断しない制限酵素席がmultiple cloning siteにおいて、ベクターに遺伝子を正確に挿入することができた。力強いプローモーターであるＧＡＬ１プローモーターがあり、Ｔ７プローモーターとＣＹＣ１配列があって遺伝子の挿入と挿入された配列を遺伝子塩基配列分析で正確に把握することができる。
【００３８】
そして、選択表紙マーカーであるＴＲＰ１遺伝子配列が存在してベクターが挿入された酵母を易しく選別することができるし、V５ epitopeと６xHis tag配列があって発現されたターゲットタンパク質検出に容易である。種類が異なる二つの遺伝子を共に酵母に形質組換えさせるためにpYES３ベクターと選択表紙マーカーがＵＲＡ３で他のpYES２ベクターを選択した。pYES２ベクターはpYES３ベクターとその以外の特徴は同じで大きさはおおよそ１００bp程度さらに大きい(図４)。選択表紙マーカーを利用して各遺伝子がすべて挿入された酵母を効率的に選別することができるので、次の方法を利用してクローニングをした。リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-１遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-２遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-３遺伝子はpYES３/CT vector(Invitrogen)と、ヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)遺伝子はpYES２/CT vector(Invitrogen)と４℃でオーバーナイト(overnight)ライゲーション(ligation)反応をさせてE．coli DH５α competent cell(TaKaRa)に形質組換えしたし、ampicillin(１００μl/ml)、IPTG(０．１mM)、X-ＧＡＬ(５０μg/ml)を添加したLuria Broth(LB)medium plateに塗抹して３７℃で１６乃至１８時間の間に培養した。次に、選別されたE．coliからHigene TM Plasmid Mini Prep Kit(Biofact)を使ってプラスミドを抽出したし、抽出したプラスミドは各遺伝子が正確に挿入されたかを確認するために電気泳動で大きさを確認した後塩基配列シークエンシングを遂行した。実験結果、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-１遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-２遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-３遺伝子とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)遺伝子がプラスミドに正確に挿入されたことを確認した(図５)。すなわち、図５(Ａ)のlaneはm:ＤＮＡladder marker、１:pYES３/CT、２:pYES３/CT+リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-１遺伝子、３:pYES３/CT+リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-２遺伝子、４:pYES３/CT+リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-３遺伝子であり、図５(Ｂ)のlaneはm:ＤＮＡladdermarker、１:pYES２/CT、２:pYES２/CT+ヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)の電気泳動結果である。
【００３９】
実施例６:酵母発現ベクター(Yeast expression vector)sのINVSc１酵母への形質組換え
S．C．EasyComp TM Transformation Kit(Invitrogen)を使ってサッカロミセスセレビシエ(Saccharomycescerevisiae)competent cellを製造した。そして、前記実施例５で収得したリポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-１遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-２遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-３遺伝子が導入したpYES３/CTvectorとヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)が導入されたpYES２/CT vectorを各１:１の割合で混合した後このベクターらをS．cerevisiae competent cell(INVSc１)に形質転換した。そして、トリプトファン(Tryptophan)とユラシル(Uracil)が結実されたSC medium plate(Synthetic complete medium、０．６７％yeast nitrogen base、２％glucose、０．１９２％yeast synthetic drop-out medium supplements、２％ agar)に前記S．cerevisiae competent cell(INVSc１)を塗抹して３０℃から２乃至３日間培養した(図６(Ａ))。前記 SC medium培地はトリプトファン(Tryptophan)とウラシル(Uracil)が結実された最小培地でＴＲＰ１遺伝子があるpYES３とＵＲＡ３遺伝子があるpYES２ベクターがすべて挿入された形質組換え体酵母を効率的に選別してターゲットタンパク質発現に適合であるので使用されたし、使用されたSC medium培地の組成は次の表３のようである。
【００４０】
【表３】
2021514630.tif 000005
【００４１】
次に、Colony ＰＣＲを遂行して二種類の遺伝子が導入された形質組換え酵母を選別した結果、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-１遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-２遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-３遺伝子とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)遺伝子が酵母発現ベクター(Yeast expression vector)を通じてINVSc１に形質組換えされたことを確認した(図６(Ｂ))。各リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-１遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-２遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-３遺伝子とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)遺伝子が１:１の割合で形質組換えされた各酵母ＫＭＧ１８０１、ＫＭＧ１８０２、ＫＭＧ １８０３は２０１８年２月６日付けの韓国バイオテクノロジー研究院生物資源センター(ＫＣＴＣ)に各寄託番号第ＫＣＴＣ １３４７６ＢＰ号、ＫＣＴＣ １３４７７ＢＰ号及びＫＣＴＣ １３４７８ＢＰ号で寄託された。また、それぞれのリポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-１遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-２遺伝子、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-３遺伝子とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)遺伝子の組合が形質組換えされた酵母の生長を確認するために、該当培養液の５mLは各培養後０、４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６時間ごとに酵母の生長曲線は測定のための試料で使用された。測定結果ＫＭＧ １８０１(寄託番号第ＫＣＴＣ １３４７６ＢＰ号、図７(Ａ))とＫＭＧ１８０２(寄託番号ＫＣＴＣ １３４７７ＢＰ号、図７(Ｂ))が８乃至１２時間区間で早く成長し、ＫＭＧ １８０３(寄託番号第ＫＣＴＣ １３４７８ＢＰ号、図７(Ｃ))は２８乃至３２時間区間で早く成長することを確認することができた。
【００４２】
実施例７:リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)遺伝子が導入した形質組換え酵母で１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ生合成の確認
前記実施例６から収得した各遺伝子の組合が形質組換えされた酵母での１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬの生合成を確認するためにトリプトファン(Tryptophan)とウラシル(Uracil)が結実された SC selectable medium (Synthetic complete medium, 0.67% yeast nitrogen base, 2% raffinose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements)に形質組換え酵母を接種してオーバーナイト(overnight)前培養した後、遠心分離して酵母を集めてトリプトファン(Tryptophan))とユラシル(Uracil))が結実された SC induction medium (Synthetic complete medium, 0.67% yeast nitrogen base, 1% raffinose, 2% galactose, 0.192% yeast synthetic drop-out medium supplements)に接種して、２％ Tween-２０と１．５mMリノール酸(linoleic acid)を添加して３０℃で２０時間の間に培養した。遠心分離で培養した酵母とミディアム(medium)を分離して酵母にリン酸ナトリウム溶解緩衝額(sodium Phosphate lysis buffer(５０mM sodium Phosphate、１mM PMSF、５％ glycerol、２％ triton X-１００；pH６．５)とacid-washed glass beads(０．４-０．６mm size)を添加してbead beaterでlysisした後、遠心分離で菌体をダウンさせて細胞溶解上澄み液を回収した。次に、生成された１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬを確認するためにライセート(lysates)と培養したミディアム(medium)を７０℃で３５分間ＳＰＭＥ(solid phase microextraction)に揮発性成分を抽出して気体クロマトグラフィー-質量分析法(Gas chromatography-mass spectrometry(Aqilent ７８９OB GC & ５９７７B MSD))で分析した。気体クロマトグラフィー質量分析のためにDB-WAX(６０m×２５０μm×０．２５μm)とheliumcarrier gasを使ったし、コラム(column)の温度は４０℃から１２０℃まで２℃/minの速度で高めたし、１２０℃から２４０℃まで２０℃/minの速度で高めた。Injectorの温度は２５０℃にした。
【００４３】
実験結果、図８のように(Ａ)基質を添加しないで培養したcellのライセート(lysates)と(Ｂ)基質を添加しないで培養したミディアム(medium)ではpeakが観察されなかったが、(Ｃ)基質を添加して培養したcellのライセート(lysates)と(Ｄ)基質を添加して培養したミディアム(medium)では３８．２７minに１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬのピーク(peak)が確認された。
【００４４】
一方、それぞれのリポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)遺伝子とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)の組合による１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ生合成に対する結果は表４のようである。表４によれば、松茸子実体で発見された遺伝子リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-１、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-２、リポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-３とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)の各組合が導入された酵母ですべて１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬの生合成効果があったし、組合の種類によって生合成の程度は異なることを確認した。また、１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ生合成率(Concentration)はリポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-１を利用した場合が一番高いことが確認された。
【００４５】
【表４】
2021514630.tif 000006
【００４６】
実験例１:基質濃度と反応条件による１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ生合成の最適化
基質の濃度と反応条件による形質組換え酵母の１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ生合成量を確認するためにトリプトファン(Tryptophan))とユラシル(Uracil))が結実されたSC selectable medium(Synthetic complete medium、０．６７％ yeast nitrogen base、２％ raffinose、０．１９２％ yeast synthetic drop-out medium supplements)にリポキシゲナーゼ(Lipoxygenase)-１とヒドロペルオキシドリアーゼ(Hydroperoxide lyase)が形質組換えされた酵母を接種してオーバーナイト(overnight)前培養した後、遠心分離で酵母を集めてトリプトファン(Tryptophan)とウラシル(Uracil)が結実されたSC induction medium(Synthetic complete medium、０．６７％yeast nitrogen base、１％raffinose、２％Galactose、０．１９２％yeast synthetic drop-out mediums upplements)に接種して、２％Tween-２０と適切な濃度のリノール酸(linoleic acid)(０〜０．１M)添加して３０℃から２０時間の間に培養した。また、反応条件による形質組換え酵母で１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ生合成量を確認するために前培養した酵母をトリプトファン(Tryptophan))とユラシル(Uracil))が結実されたSC induction medium(Synthetic complete medium、０．６７％yeast nitrogen base、１％raffinose、２％Galactose、０．１９２％yeast synthetic drop-out medium supplements)に接種して、２％ Tween-２０と３mMリノール酸(linoleic acid)を添加して１５℃と３０℃で各１２、２４、３６、４８時間の間に培養した。遠心分離で培養した酵母を集めてリン酸ナトリウム溶解緩衝額(sodium Phosphate lysis buffer(５０mM sodium Phosphate、１mMPMSF、５％glycerol、２％ tritonX-１００と、pH６．５))とacid-washed glass beads(０．４-０．６mm size)を添加してbead beaterでlysisした後、遠心分離で菌体をダウンさせて細胞用して上澄み液を回収したし、０．１gのNaCl(タンパク質沈澱のためである)を添加して同量のジエチルエーテル(diethylether)で香り物質を抽出して気体クロマトグラフィー-質量分析法(Gas chromatography-mass spectrometry(Aqilent ７８９OB GC & ５９７７B MSD))で分析した。気体クロマトグラフィー質量分析のためにDB-WAX(６０m×２５０μm×０．２５μm)とhelium carrier gasを使ったし、columnの温度は４０℃から１２０℃まで２℃/minの速度で高めたし、１２０℃から２４０℃まで２０℃/minの速度で高めた。Injectorの温度は２５０℃にした。生合成された１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬの濃度は１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬstandard(Sigma)と比較分析した。実験結果、(Ａ)リノール酸(linoleic acid)添加濃度が３mMである時１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬ生合成量はおおよそ０．４８mg/Lで一番高かったし、(Ｂ)２４時間の間に３０℃での１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬの生合成量はおおよそ０．３５mg/Lで一番高かった(図９)。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本出願は１-ＯＣＴＥＮ-３-ＯＬを生産する形質組換え酵母及びその製造方法に関するものであり、松茸香を利用した香粧産業及び食品開発産業上有用な発明であることである。
【００４８】
寄託機関名:韓国バイオテクノロジー研究院
受託番号:ＫＣＴＣ １３４７６ＢＰ
受託日付け:２０１８０２０６
寄託機関名:韓国バイオテクノロジー研究院
受託番号:ＫＣＴＣ １３４７７ＢＰ
受託日付け:２０１８０２０６
寄託機関名:韓国バイオテクノロジー研究院
受託番号:ＫＣＴＣ １３４７８ＢＰ
受託日付け:２０１８０２０６
【００４９】
【表５】
2021514630.tif 000007
【００５０】
【表６】
2021514630.tif 000008
【００５１】
【表７】
2021514630.tif 000009
【図１】
2021514630.tif 000010
【図２】
2021514630.tif 000011
【図３】
2021514630.tif 000012
【図４】
2021514630.tif 000013
【図５】
2021514630.tif 000014
【図６（Ａ）】
2021514630.tif 000015
【図６（Ｂ）】
2021514630.tif 000016
【図７】
2021514630.tif 000017
【図８】
2021514630.tif 000018
【図９】
2021514630.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】令和2年10月30日(2020.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021514630000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年11月2日(2020.11.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2021514630.tif 000020
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2021514630.tif 000021
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2021514630.tif 000022
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2021514630.tif 000023
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2021514630.tif 000024
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８】
2021514630.tif 000025
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９】
2021514630.tif 000026
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2021514630000001.app
【国際調査報告】
2021514630.tif 000027
2021514630.tif 000028
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