(57)【要約】本発明は、サンプルにおいて転写的に活性な微生物の核酸配列と転写的に不活性な微生物の核酸配列を区別することにより、サンプルにおいて生きている微生物と死んでいる微生物とを区別するための方法に関する。特に、本発明に係る方法は、ＲＮＡ標識化剤の存在下で培養したサンプルでのヌクレオチド置換のレベルの比較に基づく。さらに本発明は、本発明に係る区別するための方法を行う、対象での微生物感染症の診断方法、およびサンプルのコンタミネーションのリスクを評価する方法に関する。【選択図】図１Ｂ
2021527428.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおいて生きている微生物と死んでいる微生物とを区別するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、前記サンプルにおいて転写的に活性な微生物の核酸配列と転写的に不活性な微生物の核酸配列を区別することを含み、前記方法が、
（ａ）前記サンプルから抽出されたＲＮＡの第１のセットをシーケンシングすることによって配列リードの第１のセットを得るステップであって、前記ＲＮＡの第１のセットは、ＲＮＡ標識化剤の存在下で前記サンプルを培養することによって、さらには、抽出されたＲＮＡを、ヌクレオチド置換を可能にする条件に供することによって、取得される、ステップと、
（ｂ）少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第１のセットにおける置換されたヌクレオチドの数を対照配列と比較するステップと、
（ｃ）前記配列リードの第１のセットにおける前記少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードにおける置換されたヌクレオチドの数が、前記対照配列においてランダムに置換されたヌクレオチドの数よりも多い場合に、前記少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットが生きている微生物に属すると結論付けるステップと
を含み、
前記対照配列が、前記少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第２のセットではなく、前記配列リードの第２のセットが、ＲＮＡ標識化剤の非存在下で前記サンプルを培養することにより得られるＲＮＡの第２のセットをシーケンシングすることにより得られる、
方法。
【請求項２】
前記対照配列が、
前記少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第２のセットであって、前記配列リードの第２のセットが、ＲＮＡ標識化剤の存在下で前記サンプルを培養することによって、ただし抽出されたＲＮＡを、ヌクレオチド置換を可能にする条件に供することなく、得られるＲＮＡの第２のセットをシーケンシングすることにより得られる、第２のセット、
少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第１のセットの配列リードまたはコンティグから得られるコンセンサスな微生物の核酸配列、
核酸配列のデータベースにおいて同定された最も近い微生物株で見出される同じ微生物の核酸配列のヒットに対応する配列、および／または
核酸配列のデータベースにおいて同定された同じ微生物の核酸配列のヒットに対応する類似の配列
から選択される、請求項１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項３】
（ａ）前記サンプルから抽出されたＲＮＡの第１および第２のセットをシーケンシングすることにより配列リードの第１および第２のセットを得るステップであって、
前記ＲＮＡの第１および第２のセットが、ＲＮＡ標識化剤の存在下でサンプルを培養することにより、標識したＲＮＡを得ることによって得られ、
前記ＲＮＡの第１のセットが、ヌクレオチド置換を可能する条件に供される標識したＲＮＡの第１のフラクションから得られ、前記ＲＮＡの第２のセットが、ヌクレオチド置換を可能する条件に供されない標識したＲＮＡの第２のフラクションから得られる、
ステップと、
（ｂ）少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第１のセットにおいて置換されたヌクレオチドの数を、前記少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第２のセットにおける置換されたヌクレオチドの数と比較するステップと、
（ｃ）前記配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードにおける置換されたヌクレオチドの数が、配列リードの第２のセットにおける置換されたヌクレオチドの数よりも多い場合、前記少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットが、生きている微生物に属すると結論付けるステップと
を含む、請求項１または２に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡ標識化剤が、チオール標識したＲＮＡ前駆体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項５】
前記チオール標識したＲＮＡ前駆体が、４−チオウリジン、２−チオウリジン、２，４−ジチオウリジン、２−チオ−４−デオキシウリジン、５−カルベトキシ−２−チオウリジン、５−カルボキシ−２−チオウリジン、５−（ｎ−プロピル）−２−チオウリジン、６−メチル２−チオウリジン、および６−（ｎ−プロピル）−２−チオウリジンを含む群から選択され、これによりチオウリジン標識したＲＮＡを入手し、好ましくは前記チオール標識したＲＮＡ前駆体が、チオウリジンである、請求項４に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項６】
前記ヌクレオチド置換を可能にする条件が、好ましくはアルキル化、酸化的芳香族求核置換反応、またはオスミウム介在性形質転換；より好ましくはアルキル化により、ＲＮＡを化学的に修飾し、さらに前記化学的に修飾したＲＮＡを逆転写することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項７】
前記ヌクレオチド置換を可能にする条件が、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、Ｎ−エチルマレイミド、および４−ビニルピリジンを含む群から選択されるアルキル化剤を使用するアルキル化を含み、好ましくは前記アルキル化剤が、ヨードアセトアミドである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡをシーケンシングするステップが、
（ｉ）ＲＮＡを逆転写することにより、ｃＤＮＡライブラリーを得るステップと、
（ｉｉ）任意選択で、前記ｃＤＮＡライブラリーを増幅するステップと、
（ｉｉｉ）好ましくは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、ディープシーケーシング、またはカスタム配列のターゲットシーケンシングにより、前記ｃＤＮＡライブラリーをシーケンシングするステップと
を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項９】
ＲＮＡが、前記サンプルをＲＮＡ標識化剤、好ましくはチオール標識したＲＮＡ前駆体の存在下で培養した場合、および／または前記標識したＲＮＡを、ヌクレオチド置換を可能にする条件に供する場合に、逆転写の後に、第１の鎖合成においてアデニン（Ａ）−グアノシン（Ｇ）の置換および第２の鎖の合成においてチミジン（Ｔ）−シチジン（Ｃ）の置換を経る、請求項１０に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットが、
（ｉ）任意選択で、配列リードの第１および／または第２のセットをフィルタリングすること、
（ｉｉ）任意選択で、前記配列リードをコンティグにアセンブリすること、
（ｉｉｉ）前記配列リードまたはコンティグを、微生物の核酸配列を含むデータベース上にアライメントすること、
（ｉｖ）少なくとも１つの配列リードまたはコンティグに対してマッピングされた少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットを同定すること、および
（ｖ）任意選択で、ステップ（ｉｖ）で同定された微生物の核酸配列のヒットに前記配列リードまたはコンティグを再度アライメントすることにより、コンセンサスな微生物の核酸配列を決定すること
を介して同定され、
前記コンセンサスな微生物の核酸配列が、前記微生物の核酸配列のヒットに対応する、
請求項１〜９のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットが、
前記配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードでの第２の鎖の合成におけるＴ→Ｃ置換の数および／もしくは比率が、前記対照配列における第２の鎖の合成におけるＴ→Ｃ置換の数および／もしくは比率よりも多い場合、ならびに／または
前記配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードでの第２の鎖の合成におけるＴ→Ｃ置換の数および／もしくは比率が、同じ配列リードにおける第２の鎖の合成におけるＴ→Ａ置換および／もしくは第２の鎖の合成におけるＴ→Ｇ置換の数および／または比率よりも多い場合、
生きている微生物に属する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項１２】
前記微生物が、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、および原虫を含む群から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項１３】
対象で微生物感染症を診断するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
（ａ）前記対象からのサンプルを準備するステップと、
（ｂ）前記サンプルで請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法を行うステップと、
（ｃ）少なくとも１つの同定した微生物の核酸配列のヒットが生きている微生物に属する場合、前記対象が微生物感染症を有すると診断するステップと
を含む、方法。
【請求項１４】
微生物感染症を罹患した対象を処置する方法であって、
（ａ）前記対象からのサンプルを準備するステップと、
（ｂ）前記サンプルで請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法を行うステップと、
（ｃ）少なくとも１つの同定した微生物の核酸配列のヒットが生きている微生物に属する場合、前記対象が微生物感染症を有すると診断するステップと、
（ｄ）前記対象がステップｃ）で微生物感染症を有すると診断された場合、前記対象を処置するステップと
を含む、方法。
【請求項１５】
サンプルにおける微生物混入のリスクを評価するための方法であって、
（ａ）サンプルを準備するステップと、
（ｂ）前記サンプルで請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法を行うステップと、
（ｃ）少なくとも１つの同定した微生物の核酸配列のヒットが生きている微生物に属する場合、前記サンプルが微生物混入しているリスクがあると結論付けるステップと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプルにおいて転写的に活性な微生物の核酸配列と転写的に不活性な微生物の核酸配列を区別することにより、サンプルにおいて生きている微生物と死んでいる微生物とを区別するための方法に関する。特に、本発明に係る方法は、ＲＮＡ標識化剤の存在下で培養したサンプルでのヌクレオチド置換のレベルの比較に基づく。
【０００２】
さらに本発明は、本発明に係る区別するための方法を行う、対象での微生物感染症の診断方法、およびサンプルのコンタミネーションのリスクを評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞においてウイルス、より一般的には微生物を検出するための特質は、診断の分野で多くの用途があり、これは、たとえば疾患をもたらす感染性病原体の同定；実験結果の解釈を条件づける生物医学的な研究；または混入された可能性のあるサンプルの安全性の評価；または生物工学的なプロセスで使用される微生物のバイアビリティに有用であることが証明されている。
【０００４】
微生物に特異的な核酸配列の増幅に依存する現在の標準的な検出技術の域を越えて、潜在性ウイルスを含む活性（または複製的）な微生物と死んでいる微生物を区別することが不可能である増幅のみに基づく技術の深刻な限定を回避するための技術がいくつか出現している。生体サンプルのスクリーニングの状況下では、この区別を確立するための特性は、活性の微生物の病原体の存在が、死んでいるかおよび／または不活性の微生物、特にウイルスの存在下に関連する病原体とは異なる結果を有し得る。
【０００５】
これら技術は、複製したウイルスに特異的な配列；ＤＮＡウイルスの場合はＲＮＡの存在、一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルスの場合ではマイナス鎖ＲＮＡと比較して正の化学量論、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスの場合はマイナス鎖ＲＮＡ（アンチゲノム）の存在、ならびにレトロウイルスの場合ではＤＮＡおよびプラス鎖のスプライシングされたＲＮＡの存在の検出に基づき得る。これら技術は、たとえばＲＴ−ＰＣＲなどの逆補体鎖の増幅または高スループットシーケンシング法でのＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ、全トランスクリプトームショットガンシーケンシングとも呼ばれる）、特に標準的なＲＮＡ−ｓｅｑ技術に基づく。
【０００６】
現在の技術は、依然としていくつかの限定を有する：まず第１に、現在の技術は、サンプル中の活性のウイルス粒子などの活性の微生物の存在とは無関係に存在する複製中間体などの混入しているＲＮＡと、サンプル中のウイルスなどの複製している微生物の存在と関連しているＲＮＡとを区別することが可能ではない。複製している二本鎖ＲＮＡウイルスの検出における当該技術の効率は、依然として例証が待たられている。一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスの場合、産生される少数のマイナス鎖ＲＮＡ種が、利用可能な検出技術の感受性を妨げている。一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルスの場合、プラス鎖アンチゲノムと特異的な転写物との間の区別は困難であり、ウイルス種に特異的なバイオインフォマティクス解析を必要とする。
【０００７】
複製しているウイルス（およびより包括的には複製している微生物）の存在と関連するＲＮＡ種の別の特徴は、これらが、潜在的に混入しているＲＮＡとは対照的に、合成のプロセスの中（すなわちウイルスの場合は宿主細胞の中；または他の微生物の場合では、細菌、真菌、もしくは他の微生物の中に直接）おかれていることである。新生の転写物を標識および精製するためのいくつかの技術（ＲＮＡ代謝標識技術とも称される）が記載されている。たとえば、４−チオウリジン（４ｓＵ）または他の種類のウリジン類縁体（ＢｕｄＲ）の組み込みが、新生の真核生物のｍＲＮＡ転写物を精製し、および／または転写ネットワークの動態を調査するために使用されている（Ｈｅｒｚｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １４（１２）：１１９８−１２０４；  Ｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２．  ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ．  ９（１０）：１２３３−８）。
【０００８】
ここで、本発明者らは、代謝標識を使用して生体サンプルの細胞の中のウイルスＲＮＡ合成の検出に基づき、新規のウイルス株／種を含むウイルスに感染した細胞を検出するための方法を、設計、最適化、および検証した。さらに本発明者らは、本明細書において、この方法が、代謝標識を使用するサンプル中の微生物ＲＮＡ合成の検出に基づく場合、いずれの転写的に活性な微生物の検出をも容易に実行可能にすることを示した。これらは、たとえば、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、もしくは原生動物の感染症、または生きている微生物による混入、および死んでいる微生物のキャリーオーバーとの差別化の検出を含む。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、サンプルにおいて生きている微生物と死んでいる微生物とを区別するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、前記サンプルにおいて転写的に活性な微生物の核酸配列と転写的に不活性な微生物の核酸配列を区別することを含み、前記方法は、
（ａ）前記サンプルから抽出されたＲＮＡの第１のセットをシーケンシングすることによって配列リードの第１のセットを得るステップであって、前記ＲＮＡの第１のセットは、ＲＮＡ標識化剤の存在下で前記サンプルを培養することによって、さらには、抽出されたＲＮＡを、ヌクレオチド置換を可能にする条件に供することによって、取得される、ステップと、
（ｂ）少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第１のセットにおける置換されたヌクレオチドの数を対照配列と比較するステップと、
（ｃ）前記配列リードの第１のセットにおける前記少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードにおける置換されたヌクレオチドの数が、前記対照配列においてランダムに置換されたヌクレオチドの数よりも多い場合に、前記少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットが生きている微生物に属すると結論付けるステップと
を含む、方法に関する
【００１０】
一実施形態では、サンプルにおいて生きている微生物と死んでいる微生物とを区別するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法は、前記サンプルにおいて転写的に活性な微生物の核酸配列と転写的に不活性な微生物の核酸配列を区別することを含み、前記方法は、
（ａ）前記サンプルから抽出されたＲＮＡの第１のセットをシーケンシングすることによって配列リードの第１のセットを得るステップであって、前記ＲＮＡの第１のセットは、ＲＮＡ標識化剤の存在下で前記サンプルを培養することによって、さらには、抽出されたＲＮＡを、ヌクレオチド置換を可能にする条件に供することによって、取得される、ステップと、
（ｂ）少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第１のセットにおける置換されたヌクレオチドの数を対照配列と比較するステップと、
（ｃ）前記配列リードの第１のセットにおける前記少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードにおける置換されたヌクレオチドの数が、前記対照配列においてランダムに置換されたヌクレオチドの数よりも多い場合に、前記少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットが生きている微生物に属すると結論付けるステップと
を含み、
前記対照配列は、前記少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第２のセットではなく、前記配列リードの第２のセットは、ＲＮＡ標識化剤の非存在下で前記サンプルを培養することにより得られるＲＮＡの第２のセットをシーケンシングすることにより得られる。
【００１１】
一実施形態では、対照配列は、
少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第２のセットであって、前記配列リードの第２のセットが、ＲＮＡ標識化剤の非存在下で前記サンプルを培養することにより得られるＲＮＡの第２のセットをシーケンシングすることにより得られる、第２のセット、
少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第２のセットであって、前記配列リードの第２のセットが、ＲＮＡ標識化剤の存在下で前記サンプルを培養することによって、ただし抽出されたＲＮＡを、ヌクレオチド置換を可能にする条件に供することなく、得られるＲＮＡの第２のセットをシーケンシングすることにより得られる、第２のセット、
少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第１のセットの配列リードまたはコンティグから得られるコンセンサスな微生物の核酸配列、
核酸配列のデータベースにおいて同定された最も近い微生物株で見出される同じ微生物の核酸配列のヒットに対応する配列、および／または
核酸配列のデータベースにおいて同定された同じ微生物の核酸配列のヒットに対応する類似の配列
から選択される。
【００１２】
一実施形態では、対照配列は、
前記少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第２のセットであって、前記配列リードの第２のセットが、ＲＮＡ標識化剤の存在下で前記サンプルを培養することによって、ただし抽出されたＲＮＡを、ヌクレオチド置換を可能にする条件に供することなく、得られるＲＮＡの第２のセットをシーケンシングすることにより得られる、第２のセット、
少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第１のセットの配列リードまたはコンティグから得られるコンセンサスな微生物の核酸配列、
核酸配列のデータベースにおいて同定された最も近い微生物株で見出される同じ微生物の核酸配列のヒットに対応する配列、および／または
核酸配列のデータベースにおいて同定された同じ微生物の核酸配列のヒットに対応する類似の配列
から選択される。
【００１３】
一実施形態では、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法は、
（ａ）前記サンプルから抽出されたＲＮＡの第１および第２のセットをシーケンシングするステップであって、前記ＲＮＡの第１および第２のセットが、ＲＮＡ標識化剤の存在下でサンプルを培養することにより標識したＲＮＡを得ることにより得られ、
前記ＲＮＡの第１のセットが、ヌクレオチド置換を可能する条件に供される標識したＲＮＡの第１のフラクションから得られ、前記ＲＮＡの第２のセットが、ヌクレオチド置換を可能する条件に供されない標識したＲＮＡの第２のフラクションから得られ、これにより、配列リードの第１および第２のセットを得る、ステップと、
（ｂ）少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第１のセットでの置換されたヌクレオチドの数を、前記少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第２のセットでの置換されたヌクレオチドの数と比較するステップと、
（ｃ）前記配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードでの置換されたヌクレオチドの数が、配列リードの第２のセットでの置換されたヌクレオチドの数よりも多い場合、前記少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットが、生きている微生物に属すると結論付けるステップと
を含む。
【００１４】
一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法が、細胞サンプルにおいて感染性ウイルスの核酸配列と非感染性ウイルスの核酸配列とを区別するためのものであり、
（ａ）前記細胞サンプルから抽出されたＲＮＡの第１および第２のセットをシーケンシングするステップであって、前記ＲＮＡの第１のセットが、ＲＮＡ標識化剤の存在下で細胞サンプルを培養することにより得られ、前記ＲＮＡの第２のセットが、ＲＮＡ標識化剤の非存在下で細胞サンプルを培養することにより得られ、これにより、配列リードの第１および第２のセットを得る、ステップと、
（ｂ）配列リードの第１のセットの少なくとも１つの配列リードに対してマッピングされた少なくとも１つのウイルスの核酸配列のヒットを同定するステップと、
（ｃ）配列リードの第１および第２のセットにおいて少なくとも１つの同定されたウイルスの核酸配列のヒットをマッピングした配列リードでの置換されたヌクレオチドの数を比較するステップと、
（ｄ）配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの同定されたウイルスの核酸配列のヒットをマッピングした配列リードでの置換されたヌクレオチドの数が、配列リードの第２のセットでの置換されたヌクレオチドの数よりも多い場合、少なくとも１つのウイルスの核酸配列のヒットが、感染性ウイルスに属すると結論付けるステップと
を含む。
【００１５】
一実施形態では、サンプルにおいて生きている微生物と死んでいる微生物とを区別するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法は、
（ａ）前記サンプルから抽出されたＲＮＡの第１および第２のセットをシーケンシングするステップであって、前記ＲＮＡの第１のセットが、ＲＮＡ標識化剤の存在下でサンプルを培養することにより得られ、前記ＲＮＡの第２のセットが、ＲＮＡ標識化剤の非存在下でサンプルを培養することにより得られ、これにより、配列リードの第１および第２のセットを得る、ステップと、
（ｂ）少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第１のセットでの置換されたヌクレオチドの数を、少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第２のセットでの置換されたヌクレオチドの数と比較するステップと、
（ｃ）配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードでの置換されたヌクレオチドの数が、配列リードの第２のセットにおける置換された数よりも多い場合、少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットが、生きている微生物に属すると結論付けるステップと
を含む。
【００１６】
一実施形態では、ＲＮＡの第１のセットは、ＲＮＡ標識化剤の存在下でサンプルを培養し、これにより標識化したＲＮＡを入手し、さらに上記標識したＲＮＡをヌクレオチド置換に供することにより得られる。
【００１７】
一実施形態では、サンプルにおいて生きている微生物と死んでいる微生物とを区別するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法は、
（ａ）前記サンプルから抽出されたＲＮＡの第１および第２のセットをシーケンシングするステップであって、前記ＲＮＡの第１および第２のセットが、ＲＮＡ標識化剤の存在下でサンプルを培養することにより標識したＲＮＡを得ることにより得られ、
前記ＲＮＡの第１のセットが、ヌクレオチド置換に供される標識したＲＮＡの第１のフラクションから得られ、ＲＮＡの第２のセットが、ヌクレオチド置換に供されない標識したＲＮＡの第２のフラクションから得られ
これにより、配列リードの第１および第２のセットを得る、ステップと、
（ｂ）少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第１のセットでの置換されたヌクレオチドの数を、少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第２のセットでの置換されたヌクレオチドの数と比較するステップと、
（ｃ）配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードでの置換されたヌクレオチドの数が、配列リードの第２のセットでの置換されたヌクレオチドの数よりも多い場合、少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットが生きている微生物に属すると結論付けるステップと
を含む。
【００１８】
一実施形態では、ＲＮＡ標識化剤は、チオール標識したＲＮＡ前駆体である
【００１９】
一実施形態では、チオール標識したＲＮＡ前駆体は、４−チオウリジン、２−チオウリジン、２，４−ジチオウリジン、２−チオ−４−デオキシウリジン、５−カルベトキシ−２−チオウリジン、５−カルボキシ−２−チオウリジン、５−（ｎ−プロピル）−２−チオウリジン、６−メチル−２−チオウリジン、および６−（ｎ−プロピル）−２−チオウリジンを含む群から選択され、これによりチオウリジン標識したＲＮＡを入手する。
【００２０】
一実施形態では、チオール標識したＲＮＡ前駆体は、好ましくは、４−チオウリジンである。
【００２１】
一実施形態では、ヌクレオチド置換は、好ましくはアルキル化、酸化的芳香族求核置換反応、またはオスミウム介在性形質転換；より好ましくはアルキル化により、ＲＮＡを化学的に修飾し、さらに前記化学的に修飾したＲＮＡを逆転写することを含む。
【００２２】
一実施形態では、ＲＮＡの第２のセットは、ＲＮＡの標識化剤の存在下で細胞サンプルを培養することにより、標識したＲＮＡを入手し、上記標識したＲＮＡをさらにアルキル化することにより得られる。
【００２３】
一実施形態では、標識したＲＮＡは、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、Ｎ−エチルマレイミド、および４−ビニルピリジンを含む群から選択されるアルキル化剤を使用してアルキル化される。
【００２４】
一実施形態では、アルキル化剤は、好ましくは、ヨードアセトアミドである。
【００２５】
一実施形態では、細胞サンプルから抽出されたＲＮＡをシーケンシングするステップは、
（ｉ）ＲＮＡを逆転写することにより、ｃＤＮＡライブラリーを得るステップと、
（ｉｉ）任意選択で、前記ｃＤＮＡライブラリーを増幅するステップと、
（ｉｉｉ）好ましくは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、ディープシーケーシング、またはカスタム配列のターゲットシーケンシングにより、前記ｃＤＮＡライブラリーをシーケンシングするステップと
を含む。
【００２６】
一実施形態では、細胞サンプルから抽出されたＲＮＡをシーケンシングするステップは
（ｉ）総ＲＮＡを逆転写することにより、総ｃＤＮＡライブラリーを得るステップと、
（ｉｉ）任意選択で、前記総ｃＤＮＡライブラリーを増幅するステップと、
（ｉｉｉ）次世代シーケンシング（ＮＧＳ）により、前記総ｃＤＮＡライブラリーをシーケンシングするステップと
を含む。
【００２７】
一実施形態では、ＲＮＡを逆転写するステップは、サンプルをＲＮＡ標識化剤の存在下で培養した場合、および／または標識したＲＮＡをヌクレオチド変換に供する場合、ウリジン（Ｕ）をチミジン（Ｔ）へ変換する代わりにウリジン（Ｕ）をシチジン（Ｃ）へ変換する。
【００２８】
一実施形態では、総ＲＮＡを逆転写するステップは、細胞サンプルをＲＮＡ標識化剤の存在下で培養した場合、ウリジン（Ｕ）をチミジン（Ｔ）へ変換する代わりにウリジン（Ｕ）をシチジン（Ｃ）へ変換する。
【００２９】
一実施形態では、サンプルをＲＮＡ標識化剤、好ましくはチオール標識したＲＮＡ前駆体の存在下で培養した場合、および／または標識したＲＮＡを、ヌクレオチド置換を可能にする条件に供する場合、ＲＮＡは、第１の鎖の合成においてアデニン（Ａ）−グアノシン（Ｇ）置換、第２の鎖の合成においてチミジン（Ｔ）−シチジン（Ｃ）の置換を経る。
【００３０】
一実施形態では、配列リードの第１のセットの少なくとも１つの配列リードに対してマッピングした少なくとも１つのウイルスの核酸配列のヒットを同定するステップは、
（ｉ）任意選択で、配列リードの第１のセットをフィルタリングするステップと、
（ｉｉ）任意選択で、配列リードをコンティグにアセンブリするステップと、
（ｉｉｉ）ウイルスの核酸配列を含むデータベース上に配列リードまたはコンティグをアライメントするステップと、
（ｉｖ）少なくとも１つの配列リードまたはコンティグに対してマッピングした少なくとも１つのウイルスの核酸配列のヒットを同定するステップと、
（ｖ）任意選択で、ステップ（ｉｖ）で同定されたウイルスの核酸配列のヒットに前記配列リードまたはコンティグを再度アライメントすることにより、コンセンサスなウイルスの核酸配列を決定することにより、少なくとも１つのコンセンサスなウイルスの核酸配列を同定するステップと
を含む。
【００３１】
一実施形態では、少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットは、
（ｉ）任意選択で、配列リードの第１および／または第２のセットをフィルタリングすること、
（ｉｉ）任意選択で、前記配列リードをコンティグにアセンブリすることと、
（ｉｉｉ）前記配列リードまたはコンティグを、微生物の核酸配列を含むデータベース上にアライメントすること、
（ｉｖ）少なくとも１つの配列リードまたはコンティグに対してマッピングされた少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットを同定すること、および
（ｖ）任意選択で、ステップ（ｉｖ）で同定された微生物の核酸配列のヒットに前記配列リードまたはコンティグを再度アライメントすることにより、コンセンサスな微生物の核酸配列を決定すること
を介して同定され、
前記コンセンサスな微生物の核酸配列は、前記微生物の核酸配列のヒットに対応する。
【００３２】
一実施形態では、少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットは、
前記配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードでのＴ→Ｃ置換の数および／もしくは比率が、前記対照配列におけるＴ→Ｃ置換の数および／もしくは比率よりも多い場合、ならびに／または
前記配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードでのＴ→Ｃ置換の数および／もしくは比率が、同じ配列リードでのＴ→Ａ置換および／もしくはＴ→Ｇ置換の数および／もしくは比率よりも多い場合、
生きている微生物に属する。
【００３３】
一実施形態では、少なくとも１つのウイルスの核酸配列のヒットは、配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの同定されたウイルスの核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードでのＴ→Ｃ置換の数が、配列リードの第２のセットにおける置換の数よりも多い場合、感染性ウイルスに属する。
【００３４】
一実施形態では、少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットは、
前記配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードでの第２の鎖の合成におけるＴ→Ｃ置換の数および／もしくは比率が、前記対照配列における第２の鎖の合成におけるＴ→Ｃ置換の数および／もしくは比率よりも多い場合、ならびに／または
前記配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの微生物の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードでの第２の鎖の合成におけるＴ→Ｃ置換の数および／もしくは比率が、同じ配列リードにおける第２の鎖の合成におけるＴ→Ａ置換および／または第２の鎖の合成におけるＴ→Ｇ置換の数および／もしくは比率よりも多い場合、
生きている微生物に属する
【００３５】
一実施形態では、本発明に係るｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法は、
（１）（ｉ）細胞サンプルから抽出された標識されていない総ＲＮＡをシーケンシングするステップであって、標識されていない総ＲＮＡが、ＲＮＡ標識化剤の非存在下で細胞サンプルを培養することにより得られ、これにより複数の配列リードを得る、ステップと、
（ｉｉ）配列リードに対してマッピングした少なくとも１つのウイルスの核酸配列のヒットを同定するステップと、
（ｉｉｉ）同定された少なくとも１つのウイルスの核酸配列のヒットをマッピングした配列リードでの置換されたヌクレオチドの数を決定するステップと、
（２）（ｉ）細胞サンプルから抽出された標識した総ＲＮＡをシーケンシングするステップであって、標識した総ＲＮＡが、標識化剤の存在下で細胞サンプルを培養することにより得られ、これにより複数の配列リードを得る、ステップと、
（ｉｉ）同定された少なくとも１つのウイルスの核酸配列のヒットをマッピングした前記配列リードでの置換されたヌクレオチドの数を決定するステップと、
（３）（１）（ｉｉｉ）および２（ｉｉｉ）で決定した置換されたヌクレオチドの数を比較するステップと、
（４）２（ｉｉ）で決定した置換されたヌクレオチドの数が（１）（ｉｉｉ）で決定した置換されたヌクレオチドの数より多い場合、ウイルスの核酸配列のヒットが感染性ウイルスに属すると結論付けるステップと
を含む。
【００３６】
一実施形態では、微生物は、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、および原虫を含む群から選択される。
【００３７】
また本発明は、対象で微生物感染症を診断するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
（ａ）前記対象からのサンプルを準備するステップと、
（ｂ）前記サンプルで生きている微生物と死んでいる微生物を区別するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法を行うステップと、
（ｃ）前記少なくとも１つの同定した微生物の核酸配列のヒットが生きている微生物に属する場合、前記対象が微生物感染症を有すると診断するステップと
を含む、方法に関する。
【００３８】
また本発明は、対象でウイルス感染症を診断するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
（ａ）前記対象からの細胞サンプルを準備するステップと、
（ｂ）前記細胞サンプルで本発明に係る細胞サンプルにおいて感染性ウイルスの核酸配列と非感染性ウイルスの核酸配列を区別するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法を行うステップと、
（ｃ）少なくとも１つの同定したウイルスの核酸配列のヒットが感染性ウイルスに属する場合、前記対象がウイルス感染症を有すると診断するステップと
を含む、方法に関する。
【００３９】
また本発明は、微生物感染症を罹患した対象を処置する方法であって、
（ａ）前記対象からのサンプルを準備するステップと、
（ｂ）前記サンプルで生きている微生物と死んでいる微生物を区別するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法を行うステップと、
（ｃ）前記少なくとも１つの同定した微生物の核酸配列のヒットが生きている微生物に属する場合、前記対象が微生物感染症を有すると診断するステップと、
（ｄ）前記対象がステップｃ）で微生物感染症を有すると診断された場合、前記対象を処置するステップと
を含む、方法に関する。
【００４０】
また本発明は、サンプルにおける微生物混入のリスクを評価するための方法であって、
（ａ）サンプルを準備するステップと、
（ｂ）前記サンプルで生きている微生物と死んでいる微生物を区別するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法を行うステップと、
（ｃ）前記少なくとも１つの同定した微生物の核酸配列のヒットが生きている微生物に属する場合、前記サンプルが微生物混入しているリスクがあると結論付けるステップと
を含む、方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
【００４２】
「約（ａｂｏｕｔまたはａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、本明細書中使用される場合、値をどのように測定または決定するか、すなわち測定システムの限定に部分的に応じて変化する、当業者により決定される特定の値の許容可能な誤差の範囲内の値を意味し得る。たとえば、「約」は、当該分野の実務あたり１以上の標準偏差の範囲内を意味する。あるいは、ある数字に先行する「約」は、当該数字の値の±１０％を意味する。あるいは、特に生体系または生体プロセスに関しては、この用語は、値の５倍以内、より好ましくは２倍以内の大きさの尺度の範囲内を意味する。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、他の意味が記載されない限りは、特定の値に対する許容可能な誤差の範囲内を意味する用語「約」が想定される。
【００４３】
「増幅」は、本明細書中使用される場合、所望のテンプレート配列の複数のコピー、すなわち少なくとも２つのコピーを作製するプロセスを表す。核酸を増幅させるための技術は、当業者によく知られており、特定の増幅方法およびランダムな増幅方法を含む。
【００４４】
「生体サンプル」は、本明細書中使用される場合、対象から得られるか、対象から入手可能であるか、または対象に由来するいずれかのサンプルを表す。「生体サンプル」は、「固形組織サンプル」および「流体サンプル」を包有する。用語「固形組織サンプル」は、本明細書において、身体のいずれかの場所から単離された固形組織のサンプルを表す。組織サンプルは、脱凝集しておらず、大きなクラスターで現れる細胞を含む。組織サンプルの例として、限定するものではないが、生検検体または剖検検体が挙げられる。用語「流体サンプル」は、本明細書において、身体のいずれかの場所から単離された流体のサンプルを表す。流体サンプルの例として、限定するものではないが、血清、血漿、全血、尿、唾液、母乳、涙、汗、滑液、脳脊髄液、リンパ液、痰、粘液、骨盤液、関節液、体腔洗浄液（ｂｏｄｙ  ｃａｖｉｔｙ  ｗａｓｈｅｓ）、眼の擦過、皮膚擦過、頬側スワブ、膣スワブ、パップスメア、直腸スワブ、吸引液、精液、膣液、腹水、および羊水が挙げられる。好ましい実施形態では、「生体サンプル」は、細胞サンプル、すなわち少なくとも１つの細胞を含む本明細書中記載されるいずれかの生体サンプルである。
【００４５】
「ｃＤＮＡライブラリー」は、本明細書中使用される場合、ｍＲＮＡから逆転写された相補性ＤＮＡから構成されるライブラリーを表す。
【００４６】
「コンティグ」は、本明細書中使用される場合、重複する配列リードを表す。通常、コンティグは、次世代シーケンシングにより作製される小さなＤＮＡフラグメントの再アセンブリからもたらされる連続的な核酸配列（配列リード）である。実際に、アセンブリソフトウェアが、重複する配列リードの対を検索する。任意選択で、アセンブリソフトウェアが、「アライメントおよび確認」を行うために核酸またはアミノ酸のデータベースにアクセスし、これにより配列リードのアセンブリを検証することができる。重複する配列リードの対から配列をアセンブリすることは、シーケンスしたＤＮＡのより長い連続したリード（コンティグ）をもたらす。このプロセスを複数回反復することにより、最初に短い配列リードの対を用いて、次に以前のアセンブリの結果である次第により長い対を使用することにより、より長いコンティグが決定され得る。
【００４７】
「ディープシーケンシング」は、本明細書中使用される場合、各塩基を、独立した核酸分子から複数回読み取ることを可能にし（たとえば多数のテンプレート分子が配列の長さに対してシーケンスされる）、同時に数千の分子のシーケンシングを可能にすることにより、核酸分子の複合体のプールを特徴付け、配列の正確性を増大させることを可能にする深度での核酸シーケンシングを表す。ＲＮＡ−Ｓｅｑとしても知られているトランスクリプトームのディープシーケンシングは、特定のサンプルにおいていずれかの特定の時間に存在する含有されているＲＮＡ分子種の配列および頻度の両方を提供する。
【００４８】
「期待値」または「ｅ値」は、本明細書中使用される場合、特定の大きさのデータベース上で配列リードまたはコンティグをアライメントする際に「偶然」見ることが予測され得る、配列ヒットの数を説明するパラメータを表す。ｅ値は、一致のスコアが増加するにつれて指数関数的に減少する。本質的に、ｅ値は、ランダムなバックグラウンドノイズを説明する。たとえば、ヒットに割り当てられた１のｅ値は、現在の大きさのデータベースにおいて、偶然単純に同様のスコアで１つの一致をみることが予測され得ることを意味すると解釈され得る。ｅ値が低いかまたは０に近い場合、一致はより「有意」である。
【００４９】
「生きている微生物」は、本明細書中使用される場合、転写的に活性である、すなわち、それ自体でＲＮＡを合成できるか（たとえば細菌、古細菌、真菌、もしくは原虫の場合）、または宿主細胞に感染した後にＲＮＡを合成できる（たとえばウイルスの場合）のいずれかの微生物を表す。生きている微生物は、潜在性の微生物、すなわち再活性化し得る休止状態の微生物を含む。休止状態ではあるが、潜在性微生物は、基底の転写活性を呈することに留意されたい。対照的に「死んでいる微生物」は、転写的に活性ではない、すなわち、転写された遺伝子を検出することができない微生物を表す。本発明の文脈では、本方法は、生きている微生物の核酸配列と、サンプルに遊離しているかまたはいわゆる死んでいる微生物の中に含まれている、不活性な微生物の核酸配列を区別することを目的とする。
【００５０】
「ライセート」は、本明細書中使用される場合、溶解の手法の後の液体または固体の物質の集合を表す。
【００５１】
「溶解（名詞）」または「溶解する（動詞）」は、本明細書中使用される場合、他の方法ではアクセスできない物質にアクセスするための、生体サンプルの破壊（または破壊作用）を表す。生体サンプルが細胞である場合、溶解は、細胞の中身を漏出させる、細胞の細胞膜の破壊を表す。溶解方法は、当業者によく知られており、限定するものではないが、タンパク質分解による溶解、化学的な溶解、熱的な溶解、機械的な溶解、および浸透圧による溶解を含む。
【００５２】
「核酸配列プライマー」または「プライマー」は、本明細書中使用される場合、適切なバッファーおよび適切な温度において、ヌクレオシド三リン酸、およびＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素などの重合のための酵素の存在などの適切な条件下で、核酸配列とハイブリダイズまたはアニーリングし、ヌクレオチド重合の開始部位として作用できるオリゴヌクレオチドを表す。
【００５３】
「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中使用される場合、ヌクレオチドのポリマー、全般的にヌクレオチドの一本鎖ポリマーを表す。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２〜５００ヌクレオチド、好ましくは１０〜１５０ヌクレオチド、好ましくは２０〜１００ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、合成的であり得るか、または酵素により作製され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドモノマー、デオキシリボヌクレオチドモノマー、または両者の混合物を含み得る。
【００５４】
「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅまたはｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」は、本明細書中使用される場合、限定するものではないが、サンプルに感染もしくは混入し得るか、および／または対象に疾患をもたらすか、伝達もしくは輸送し得る可能性のある、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫などの生物を表す。
【００５５】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、本明細書中使用される場合、アレルに特異的なＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、配列間に特異的なＰＣＲ、メチル化に特異的なＰＣＲ、ミニプライマーＰＣＲ、ＭＰＬＡ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｂｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、マルチプレックスＰＣＲ、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ１  定量的ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ、および／またはタッチダウンＰＣＲを含む方法を包有する。核酸を増幅させるために適切なＤＮＡポリメラーゼ酵素は、限定するものではないが、Ｔａｑポリメラーゼ  Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント、Ｔａｑポリメラーゼ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ、Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ、ＫｌｅｎＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ  ｔｕｒｂｏ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ−ポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、９  Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｘｐａｎｄ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ−ＥＸＴ  ポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ポリメラーゼ、ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｂｃａポリメラーゼ、ＢＳＵポリメラーゼ、ｐｈｉ−２９ＤＮＡポリメラーゼ、およびＤＮＡポリメラーゼＢｅｔａ、またはそれらの修飾されたバージョンを含む。一実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’プルーフリーディング、すなわちエキソヌクレアーゼの活性を有する。一実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、５’−３’プルーフリーディング、すなわちエキソヌクレアーゼ活性を有する。一実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有し、すなわちＤＮＡポリメラーゼは、テンプレートに依存する核酸合成と組み合わせ、この近くで、５’から３’への方向で相補鎖からの対の核酸の解離をもたらす。ＤＮＡポリメラーゼ、たとえば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ７またはＴ５バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼ、およびＨＩＶウイルス逆転写酵素は、ポリメラーゼ活性および鎖置換活性の両方を有する酵素である。ヘリカーゼなどの作用物質が、鎖置換作用、すなわち同じ配列の核酸の合成に対して結合した核酸の置換をもたらすために、鎖置換活性を有さない誘導性作用物質と併用して使用され得る。同様に、大腸菌または別の生物由来のＲｅｃ  Ａまたは一本鎖結合タンパク質などのタンパク質が、他の誘導性作用物質と組み合わせて、鎖置換をもたらすまたは促進させるために使用され得る（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ＆  Ｂａｋｅｒ  （１９９２）．  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ４−６．  Ｉｎ  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  （２ｎｄ  ｅｄ．，  ｐｐ．  １１３−２２５）．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ）。
【００５６】
「ランダムな増幅技術」は、本明細書中使用される場合、その配列とは無関係な、生体サンプルに存在するいずれかの核酸配列の増幅を意味する。これは、限定するものではないが、ＭＤＡ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ランダムＰＣＲ、ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ）、またはＭＡＬＢＡＣ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｏｏｐｉｎｇ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｙｃｌｅｓ）を含む。
【００５７】
「転写的に活性の微生物の核酸配列」は、本明細書中使用される場合、生きている微生物、すなわち微生物が潜在性である場合であっても微生物の遺伝子を発現する微生物に属する核酸配列を表す。対照的に、「不活性な微生物の核酸配列」は、本明細書中使用される場合、不活性な微生物、すなわち死んでいる微生物に属する核酸配列を表す。さらに用語「不活性なウイルスの核酸配列」は、遊離する核酸配列、すなわちインタクトかまたは分解／断片化されているかどうかに関わらないが、いずれの場合でも活性ではない、ウイルスの外側にある核酸配列を表す。
【００５８】
「転写的に活性なウイルスの核酸配列」は、本明細書中使用される場合、活性のウイルス、すなわち、ウイルス周期が頓挫性、すなわちウイルス粒子の形成をもたらさない場合（たとえば潜在性ウイルスの場合など）であってもウイルスの遺伝子を発現する、生きているウイルスに属する核酸配列を表す。対照的に、「不活性なウイルスの核酸配列」は、本明細書中使用される場合、不活性なウイルス、すなわち死んでいるウイルスまたはウイルス粒子に関連しない核酸に属する核酸配列を表す。
【００５９】
「逆転写」は、本明細書中使用される場合、ＤＮＡの相補鎖（「ｃＤＮＡ」）を産生させるためのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素、「ＲＴ」と略される）を使用したＲＮＡの複製を表す。ＲＮＡの逆転写は、逆転写酵素、および４  デオキシリボヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）、すなわちデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、および（デオキシ）チミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）の混合物を使用して、当業者によく知られている技術により行われ得る。一部の実施形態では、ＲＮＡの逆転写は、第１の鎖のｃＤＮＡ合成の第１のステップを含む。第１の鎖のｃＤＮＡ合成のための方法は、当業者によく知られている。第１のｃＤＮＡ合成反応は、配列に特異的なプライマー、オリゴ（ｄＴ）プライマー、またはランダムプライマーの組み合わせを使用し得る。逆転写酵素の例として、限定するものではないが、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｍａｘｉｍａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）が挙げられる。
【００６０】
「配列リード」は、本明細書中使用される場合、シーケンサーにより決定される、ヌクレオチド塩基の配列、言い換えると核酸配列におけるモノマーの順序を意味する配列またはデータを表す。
【００６１】
「シーケンサー」または「シークエネーター」は、核酸またはタンパク質などの生物学的なポリマーにおける構成要素の順序を決定するために使用される装置を表す。好ましくは、シーケンサーは、本発明の意味においては、次世代シーケンサーを表す。「次世代シーケンサー」は、たとえばＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシング、Ｒｏｃｈｅ  ４５４シーケンシング、Ｉｏｎ  ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシングなどの異なる技術に基づく多くの異なるシーケンサーを含み得る。
【００６２】
「対象」は、本明細書中使用される場合、哺乳類、好ましくはヒトを表す。一実施形態では、対象は、限定するものではないが、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス、フェレット、ウサギ、トリ、または両生類を含むペットである。一実施形態では、対象は、「患者」、すなわち、医療の受診を待機しているかまたは医療を受診しているか、または過去／現在／将来に医療の対象であった／ある／となり得るか、または疾患、障害、もしくは病態、特にウイルス、細菌、古細菌、真菌、もしくは原虫の感染症の発達に関してモニタリングされている、雌性または雄性、成年または小児の「患者」である。
【００６３】
「テンプレート」または「テンプレート配列」は、本明細書中使用される場合、増幅が望まれる核酸配列を表す。テンプレートは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。一実施形態では、テンプレート配列は既知である。一実施形態では、テンプレート配列は既知ではない。
【００６４】
本明細書中使用される技術用語は、単に特定の事例を説明する目的のためにあり、限定されることを意図してはいない。本明細書中使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他の意味を明記しない限り、同様に複数形をも含むことが意図されている。さらに、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、または「有する（ｈａｓ）」、「伴う（ｗｉｔｈ）」、またはそれらのバリアントは、詳細な説明および／または特許請求の範囲で使用される限り、当該用語は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様の意味で包有されるように意図されている。
【００６５】
詳細な説明
本発明は、サンプル、好ましくは細胞サンプルにおいて生きている微生物と死んでいる微生物を区別するための方法に関する。特に、本発明に係る方法は、サンプル、好ましくは細胞サンプルにおいて転写的に活性な微生物の核酸配列と転写的に不活性な核酸配列の区別に基づく。
【００６６】
本発明の方法は、（ｉ）ウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫などの死んでいる微生物、および不活性な微生物配列と、（２）ウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫などの活性な（または転写的に活性）な微生物および潜在性の微生物とを区別するために特に有用である。
【００６７】
よって、本方法は、任意の種の微生物の検出、および生きている微生物と死んでいる微生物との間の区別に容易に適用可能であることを理解されたい。
【００６８】
一実施形態では、微生物は、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、および原生動物から選択される。
【００６９】
一実施形態では、微生物はウイルスである。
【００７０】
ウイルスは、生きている生物の中で複製し、全ての種の生命体に感染する小さな感染性の病原体である。
【００７１】
ウイルスのボルティモア分類は、ｍＲＮＡ産生の機構に基づく。ウイルスは、自身のゲノムからｍＲＮＡを産生して、タンパク質を産生し、自身を複製しなければならないが、各ウイルス科でこれを達成するために異なる機構が使用される。ウイルスのゲノムは、一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得、逆転写酵素を使用し得るかまたは使用することができない場合がある。さらに、ｓｓＲＮＡウイルスは、センス（＋）またはアンチセンス（−）であり得る。この分類は、ウイルスを、７つのグループ：
Ｉ．ｄｓＤＮＡウイルス（たとえばアデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはポックスウイルスなど）、
ＩＩ．（＋）ｓｓＤＮＡウイルス（たとえばアネロウイルス科（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、ビドナウイルス科科（ｂｉｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、サーコウイルス科、ジェミニウイルス科、ゲノモウイルス科（ｇｅｎｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）、イノウイルス科、ミクロウイルス科、ナノウイルス科、パルボウイルス科、スマコウイルス科（ｓｍａｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、またはスピラウイルス科（ｓｐｉｒａｖｉｒｉｄａｅ）など）、
ＩＩＩ．ｄｓＲＮＡウイルス（たとえばレオウイルスなど）、
ＩＶ．（＋）ｓｓＲＮＡウイルス（たとえばピコルナウイルスまたはトガウイルスなど）、
Ｖ．（−）ｓｓＲＮＡウイルス（たとえばオルソミクソウイルス、ラブドウイルスなど）、
ＶＩ．（＋）生活環におけるＤＮＡ中間体を有するｓｓＲＮＡ−ＲＴウイルス（たとえばレトロウイルスなど）、
ＶＩＩ．生活環におけるＲＮＡ中間体を有するｄｓＤＮＡ−ＲＴウイルス（たとえばヘパドナウイルスなど）
に置く。
【００７２】
一実施形態では、本発明に係る方法は、ｄｓＤＮＡウイルス、（＋）ｓｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウイルス、（＋）ｓｓＲＮＡウイルス、（−）ｓｓＲＮＡウイルス、（＋）ｓｓＲＮＡ−ＲＴウイルス、およびｄｓＤＮＡ−ＲＴウイルスを含むかまたはからなる群から選択されるウイルスに属する転写的に活性なウイルスの核酸配列および不活性なウイルスの核酸配列を含む、サンプル、好ましくは細胞サンプルを区別するためのものである。
【００７３】
一実施形態では、本発明に係る方法は、国際ウイルス分類委員会（ＩＣＴＶ）のデータベース、好ましくは全体が本明細書中参照により組み込まれているＩＣＴＶ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｌｉｓｔ  ２０１８ｂ．ｖ２  ｏｆ  Ｍａｙ  ３１，  ２０１９  （ＭＳＬ＃３４）に開示されるものから選択されるウイルスに属する転写的に活性なウイルスの核酸配列および不活性なウイルスの核酸配列を含む、サンプル、好ましくは細胞サンプルを区別するためのものである。
【００７４】
一実施形態では、微生物は細菌である。
【００７５】
一実施形態では、本発明に係る方法は、細菌に属する転写的に活性な細菌の核酸配列および転写的に不活性な細菌の核酸配列を含む、サンプル、好ましくは細胞サンプルを区別するためのものである。
【００７６】
細菌の例として、限定するものではないが、それらの下位分類群を含む、アシドバクテリウム門、アクチノバクテリア門、アクウィフェクス門、バクテロイデス門、クラミジア門、クロロビウム門、クロロフレクサス門、クリシオゲネス門、シアノバクテリア門、デフェリバクター門、デイノコックス・テルムス門、ディクチオグロムス門、フィブロバクテル門、フィルミクテス門、フソバクテリウム門、ゲンマティモナス門、ニトロスピラ門、プランクトミケス門、プロテオバクテリア門、スピロヘータ門、サーモデスルフォバクテリア門、テルモミクロビウム綱、テルモトガ門、およびウェルコミクロビウム門に属する細菌が挙げられる。
【００７７】
好ましい実施形態では、細菌は、フィルミクテス門、好ましくはバチルス網、より好ましくはモリクテス亜綱、さらにより好ましくはマイコプラズマ属である。
【００７８】
一実施形態では、微生物は、古細菌である。
【００７９】
一実施形態では、本発明に係る方法は、古細菌に属する転写的に活性な古細菌の核酸配列および転写的に不活性な古細菌の核酸配列を含む、サンプル、好ましくは細胞サンプルを区別するためのものである。
【００８０】
古細菌の例として、限定するものではないが、それらの下位分類群を含むＡｅｎｉｇｍａｒｃｈａｅｏｔａ門、Ａｉｇａｒｃｈａｅｏｔａ門、Ａｌｔｉａｒｃｈａｅｉａ門、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｉ門、Ａｓｇａｒｄａｒｃｈａｅｏｔａ門、Ｂａｔｈｙａｒｃｈａｅｏｔａ門、Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ門、Ｄｉａｐｈｅｒｏｔｒｉｔｅｓ門、Ｇｅｏａｒｃｈａｅｏｔａ門、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ門、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｉ門、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａ門、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｉ門、Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ門、Ｎａｎｏｈａｌｏａｒｃｈａｅａ門、Ｐａｒｖａｒｃｈａｅｏｔａ門、Ｔｈａｌａｓｓｏａｒｃｈａｅｉａ門、Ｔｈａｕｍａｒｃｈａｅｏｔａ門、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｉ門、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａ門、およびＷｏｅｓｅａｒｃｈａｅｏｔａ門に属する古細菌が挙げられる。
【００８１】
一実施形態では、微生物は真菌である。
【００８２】
真菌は、それら細胞壁にキチンを含むことを特徴とする、酵母およびカビを含む真核生物である。
【００８３】
一実施形態では、本発明に係る方法は、真菌に属する転写的に活性な真菌の核酸配列および転写的に不活性な真菌の核酸配列を含む、サンプル、好ましくは細胞サンプルを区別するためのものである。
【００８４】
真菌の例として、限定するものではないが、それらの下位分類群を含むＡｓｃｏｍｙｃｏｔａ門、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ門、Ｅｎｔｏｒｒｈｉｚｏｍｙｃｏｔａ門、Ｇｌｏｍｅｒｏｍｙｃｏｔａ門、Ｍｕｃｏｒｏｍｙｃｏｔａ門、Ｃａｌｃａｒｉｓｐｏｒｉｅｌｌｏｍｙｃｏｔａ門、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌｏｍｙｃｏｔａ門、Ｋｉｃｋｘｅｌｌｏｍｙｃｏｔａ門、Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒｏｍｙｃｏｔａ門、Ｏｌｐｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ門、Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｏｍｙｃｏｔａ門、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｇｏｍｙｃｏｔａ門、Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ門、およびＢｌａｓｔｏｃｌａｄｉｏｍｙｃｏｔａ門に属する真菌が挙げられる。
【００８５】
一実施形態では、微生物は、原虫である。
【００８６】
一実施形態では、本発明に係る方法は、原虫に属する転写的に活性な原虫の核酸配列および転写的に不活性な原虫の核酸配列を含む、サンプル、好ましくは細胞サンプルを区別するためのものである。
【００８７】
原虫の例として、限定するものではないが、それらの下位分類群を含む、Ｅｕｇｌｅｎｏｚｏａ門、Ａｍｏｅｂｏｚｏａ門、Ｃｈｏａｎｏｚｏａ門、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ門、およびＳｕｌｃｏｚｏａ門が挙げられる。
【００８８】
一実施形態では、サンプルは、生体サンプルである。適切な生体サンプルの例として、限定するものではないが、固形組織サンプルおよび流体サンプルが挙げられる。
【００８９】
一実施形態では、生体サンプルは、過去／現在、最小限に侵襲的または非侵襲的な手法によるサンプリングを介して得た／得られる。
【００９０】
一実施形態では、生体サンプルは、以前に対象から入手しており、すなわち本発明に係る方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法である。
【００９１】
一実施形態では、生体サンプルは細胞サンプルである。「細胞サンプル」は、少なくとも１つの細胞を含む本明細書中記載のいずれかの生体サンプルを意味する。
【００９２】
一実施形態では、生体サンプルは培養される。よって、用語「生体サンプル」の下、細胞または組織の培養物、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞または組織の培養物、たとえば細胞診サンプル、組織サンプル、または生体液サンプルから単離された細胞または組織の培養物が包有される。
【００９３】
一実施形態では、本発明に係る方法は、サンプル、好ましくは細胞サンプルを培養、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞サンプルを培養する最初のステップを含む。
【００９４】
細胞サンプルの培養、特に細胞診サンプル、組織サンプル、または生体液サンプルから単離された細胞または組織の培養は、当業者によく知られている。
【００９５】
一実施形態では、細胞サンプルは、指数関数的な増殖を可能にする密度で播種される。一実施形態では、生体サンプルは、約５０％〜約８０％の培養密度で播種される。
【００９６】
サンプルを培養する最初のステップは、（１）サンプルにおける潜在的な微生物（ウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫など）に、ＲＮＡを転写させる（生きている微生物と死んでいる微生物を区別するための本方法で使用される重要な生体プロセスである）ため、および（２）代謝標識のために必要とされる。検出される微生物が自己複製する微生物ではない場合（たとえばウイルスまたは一部の細菌、たとえばマイコプラズマなど）、サンプルは、潜在的な微生物が上記細胞に感染し複製することを可能にする細胞サンプルであるべきである。微生物が自己複製する微生物である場合（すなわち微生物は自身の細胞を含むかまたは細胞自体である；通常細菌、古細菌、真菌、または原虫など）、サンプルは細胞サンプルであることは必須ではない。
【００９７】
一実施形態では、サンプルは生体サンプルではない。この場合、サンプルは、例えば、水、土壌、空気などの環境上のサンプルであり得る。非生体サンプルの他の例として、食物サンプルが挙げられる。非生体サンプルの他の例として、保存培地が挙げられる。
【００９８】
一実施形態では、サンプル、好ましくは細胞サンプルにおいて生きているか死んでいる微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫を区別するための方法であって、サンプル、好ましくは細胞サンプルにおいて転写的に活性であるか転写的に不活性である微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列を区別するステップを含み、
（ａ）サンプル、好ましくは細胞サンプルから抽出したＲＮＡの第１のセットをシーケンシングするステップであって、前記ＲＮＡの第１のセットを、ＲＮＡ標識化剤の存在下で前記サンプル、好ましくは細胞サンプルを培養し、さらにヌクレオチド置換を可能にする条件に抽出されたＲＮＡを供することにより入手し、これにより配列リードの第１のセットを得る、ステップと、
（ｂ）少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第１のセットでの置換されたヌクレオチドの数を、対照配列と比較するステップと、
（ｃ）配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードでの置換されたヌクレオチドの数が、前記対照配列においてランダムに置換されたヌクレオチドの数よりも多い場合に、前記少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットが生きている微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫に属すると結論付けるステップと
を含む。
【００９９】
一実施形態では、本発明の方法は、逆転写のコンセンサスな標準的な方法を参照することにより、逆転写酵素に、検出および比較され得る誤りをもたらさせる（すなわち不対合形成されたヌクレオチドを組み込ませる）条件下で行われる。このような条件は、逆転写されるＲＮＡでの、チオール標識などの標識および／またはヌクレオチド置換技術によるヌクレオチド修飾の存在を含む。例示的な条件は、以下でさらに詳述される。
【０１００】
本明細書中使用される場合、「不対合形成されたヌクレオチド」は、ワトソン−クリックの塩基対形成の形式ではなく組み込まれているヌクレオチドを表す。
【０１０１】
一実施形態では、逆転写酵素の誤りの比率は、逆転写酵素のフィデリティーと関連していない。
【０１０２】
本明細書中使用される場合、逆転写酵素に関する用語「フィデリティー」は、ＲＮＡからのＤＮＡの合成の間に酵素により維持される配列の正確性を表す。フィデリティーは、逆転写の誤りの比率と逆相関している。
【０１０３】
一実施形態では、本発明に係る方法は、サンプル、好ましくは細胞サンプルから抽出したＲＮＡの第１のセットをシーケンシングするステップを含む。一実施形態では、本発明に係る方法は、サンプル、好ましくは細胞サンプルから抽出した総ＲＮＡの第１のセットをシーケンシングするステップを含む。一実施形態では、本発明に係る方法は、サンプル、好ましくは細胞サンプルから抽出した総メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の第１のセットをシーケンシングするステップ
【０１０４】
一実施形態では、サンプル、好ましくは細胞サンプルから抽出したＲＮＡの第１のセットをシーケンシングするステップは、ＲＮＡを標識するサブステップ、細胞を溶解するサブステップ、ＲＮＡを抽出するサブステップ、標識したＲＮＡでヌクレオチドを置換するサブステップ、ｃＤＮＡライブラリーを作製するサブステップ、ｃＤＮＡライブラリーを増幅させるサブステップ、およびｃＤＮＡライブラリーをシーケンシングするサブステップのうちの１つ以上または全てを含む。
【０１０５】
ＲＮＡを標識することは、通常、ＲＮＡ転写物に組み込まれている標識を培養培地へ添加することによって標識したＲＮＡを得ることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写の間、培養物で行われる。あるいはまたはさらに、ＲＮＡを標識することはまた、以下にさらに詳述されるように、ＲＮＡがすでに抽出されたサンプルが当該標識を含む場合に、ＲＮＡ転写物に組み込まれた標識を添加することなく、培養物で行われ得る。
【０１０６】
「ＲＮＡ転写物」は、いずれかの新たに合成された（ｎｅｏｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ）ＲＮＡ分子を意味する。
【０１０７】
ＲＮＡ転写物の標識は、当業者によく知られている技術により行われ得る。このような技術として、限定するものではないが、Ｓｃｈｕｌｚ  ＆  Ｒｅｎｔｍｅｉｓｔｅｒ  （２０１４．  Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．  １５（１６）：２３４２−７）、Ｈｕａｎｇ  ＆  Ｙｕ  （２０１３．  Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈａｐｔｅｒ  ４：Ｕｎｉｔ４．１５）、およびＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６．  Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ．  ３８（２）：１９２−２００）に記載されるものが挙げられる。
【０１０８】
好ましくは、ＲＮＡの代謝標識は、ワトソンクリックの塩基対形成を変更し、標識したＲＮＡの逆転写によりヌクレオチドを置換、すなわち非ワトソンクリックのヌクレオチドと標識したヌクレオチドを対形成させる。たとえば、標識したウリジンは、第１の鎖の合成の間にアデニンの代わりにグアノシンと対形成され得る。結果的に、シトシンは、第２の鎖の合成の間に組み込まれ、最終的に、最初の核酸配列に対してチミジン（Ｔ）−シトシン（Ｃ）の置換をもたらす。
【０１０９】
一実施形態では、ＲＮＡ転写物の代謝標識は、チオール標識により行われる。チオール標識は、当該分野でよく知られている技術であり、チオール標識した前駆体の新規に合成されたＲＮＡへの組み込みを含む。このような技術として、限定するものではないが、Ｃｌｅａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３（２）：２３２−７）、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ６（６）：４３９−４１）、Ｇａｒｉｂａｌｄｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １６４８：１６９−１７６）、Ｒｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １２０：３９−４８）、およびＨｅｒｚｏｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １４（１２）：１１９８−１２０４）に記載されるものがあげられる。
【０１１０】
適切なチオール標識したＲＮＡ前駆体の例として、限定するものではないが、４−チオウリジン、２−チオウリジン、２，４−ジチオウリジン、２−チオ−４−デオキシウリジン、５−カルベトキシ−２−チオウリジン、５−カルボキシ−２−チオウリジン、５−（ｎ−プロピル）−２−チオウリジン、６−メチル−２−チオウリジン、６−（ｎ−プロピル）−２−チオウリジン、６−チオグアノシン、６−メチルチオグアノシン、６−チオイノシン、および６−メチルチオイノシンが挙げられる。
【０１１１】
一実施形態では、チオール標識したＲＮＡ前駆体は、好ましくは４−チオウリジン（４ｓＵ）、２−チオウリジン（２ｓＵ）、２，４−ジチオウリジン（２，４ｓＵ）、２−チオ−４−デオキシウリジン、５−カルベトキシ−２−チオウリジン、５−カルボキシ−２−チオウリジン、５−（ｎ−プロピル）−２−チオウリジン、６−メチル−２−チオウリジン、および６−（ｎ−プロピル）−２−チオウリジンを含むかまたはからなる群から選択されるチオウリジン誘導体である。
【０１１２】
好ましい実施形態では、チオール標識したＲＮＡ前駆体は、４−チオウリジン（場合により「４ｓＵ」または「ｓ４Ｕ」と略される）である。
【０１１３】
一実施形態では、チオール標識したＲＮＡ前駆体は、培養培地から、サンプル、好ましくは細胞サンプルへ供給される。一実施形態では、チオール標識したＲＮＡ前駆体は、培養培地に添加される。
【０１１４】
チオール標識したＲＮＡ前駆体は、培養培地に添加される場合、「受動拡散型ヌクレオシド輸送体」と称される特定の輸送体を介して、サンプル、好ましくは細胞サンプルの細胞（ウイルスまたは微生物、たとえば細胞を含むかそれ自体が細胞である微生物、たとえば細菌、真菌、または原虫が感染した細胞）に組み込まれ得る。これら輸送体は、後生動物において準ユビキタス（ｑｕａｓｉ−ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ）である。特に、４−チオウリジンは、ＳＬＣ２９Ａ１遺伝子によりヒトでコードされる受動拡散型ヌクレオシド輸送体１（ＥＮＴ１）を介して細胞に組み込まれ得る。
【０１１５】
一実施形態では、未処理のチオール標識したＲＮＡ前駆体が、１時間ごと、２時間ごと、３時間ごと、４時間ごと、６時間ごと、またはそれ以上の時間ごとに、培養物に添加される。
【０１１６】
一実施形態では、サンプル、好ましくは細胞サンプルは、約２時間〜約１５時間、好ましくは約４時間〜約１２時間、好ましくは約６時間〜約１０時間の範囲の時間の間、チオール標識したＲＮＡ前駆体を含む培養培地で培養される。
【０１１７】
一実施形態では、サンプル、好ましくは細胞サンプルは、第１の期間および第２の期間
の間に、チオール標識したＲＮＡ前駆体を含む培養培地で培養され、これは、第１の期間と第２の期間との間での未処理のチオール標識したＲＮＡ前駆体の添加を含む。一実施形態では、第１の期間は、約１時間〜約１０時間、好ましくは約２時間〜約８時間、好ましくは約４時間〜約６時間の範囲にあり、好ましくは約６時間である。一実施形態では、第２の期間は、約１時間〜約６時間、好ましくは約２時間〜約５時間、好ましくは約３時間〜約４時間の範囲にあり、好ましくは約３時間である。
【０１１８】
好ましくは、チオール標識したＲＮＡ前駆体は、細胞、好ましくは細胞サンプルに対して毒性ではない。
【０１１９】
一実施形態では、チオール標識したＲＮＡ前駆体は、細胞のバイアビリティを損なわない濃度で、サンプル、好ましくは細胞サンプルに供給される。一実施形態では、「細胞のバイアビリティを損なわない濃度」は、最終約１μＭ〜約２ｍＭ、好ましく最終約１０μＭ〜約１．５ｍＭ、好ましくは最終約１００μＭ〜約１ｍＭ、好ましくは最終約２５０μＭ〜約１ｍＭ、好ましくは最終約５００μＭ〜約１ｍＭ、好ましくは最終約７００μＭ〜約９００μＭ、好ましくは最終約８００μＭのチオール標識したＲＮＡ前駆体の範囲にある。
【０１２０】
一実施形態では、チオール標識したＲＮＡ前駆体は、微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫から直接、サンプル、好ましくは細胞サンプルに供給される。一実施形態では、チオール標識したＲＮＡ前駆体は、培養培地に添加されない。
【０１２１】
特定の微生物は、限定するものではないが４−チオウリジンシンテターゼ（ＴｈｉＩ）（Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２６（１１）：２６０６−１０）または２−チオウリジンシンテターゼ（ＭｎｍＡ）（Ｋａｍｂａｍｐａｔｉ  ＆  Ｌａｕｈｏｎ，  ２００３．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ４２（４）：１１０９−１；  Ｂｌａｃｋ  ＆  Ｄｏｓ  Ｓａｎｔｏｓ，  ２０１５．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９７（１１）：１９５２−６２）などの酵素を使用して、チオール標識したＲＮＡ前駆体の生合成を触媒することができる。
【０１２２】
サンプルがチオール標識したＲＮＡ前駆体の生合成を触媒できる微生物を含む具体的な実施形態では、培養培地から、サンプル、好ましくは細胞サンプルにチオール標識したＲＮＡ前駆体をさらに供給することが好適であり得る。
【０１２３】
この実施形態では、培養培地からさらに供給されるチオール標識したＲＮＡ前駆体は、微生物が供給したチオール標識したＲＮＡ前駆体と同じであってもよくまたは異なるものであってもよい。
【０１２４】
この実施形態では、培養培地からさらに供給されるチオール標識したＲＮＡ前駆体は、（限定するものではないが、未処理のチオール標識したＲＮＡ前駆体の添加、濃度、期間などに関して）本明細書中上述されるように供給され得る。
【０１２５】
チオール標識したＲＮＡ前駆体およびチオール標識したＲＮＡは、光感受性であり、酸化する傾向がある。よって一実施形態では、ＲＮＡ標識は、暗室または少なくとも光から保護されて行われる。一実施形態では、ＲＮＡ標識は、還元剤の存在下で行われる。適切な還元剤の例として、限定するものではないが、β−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、システアミン、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム塩、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、およびビス（２−メルカプトエチル）スルホン）が挙げられる。
【０１２６】
通常、サンプル、好ましくは細胞サンプルの細胞を溶解することは、細胞の中身、特にそのＲＮＡを放出することを目的とする。一実施形態では、サンプルの細胞の溶解は、細胞のＲＮＡの中身がすでにサンプルで放出されている場合などにおいて、任意選択であり得る。
【０１２７】
一実施形態では、細胞は、化学的な溶解、機械的な溶解、タンパク質分解による溶解、熱的溶解、および／または浸透圧による溶解により溶解される。これら細胞溶解技術は、当業者によく知られている。
【０１２８】
一実施形態では、細胞は、適切な溶解溶液で溶解される。溶解溶液は、塩、バッファー、界面活性剤、還元剤、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、グリセロール、糖などを含む様々な成分を含み得る。当業者は、溶解溶液における知識を有し、溶解する細胞の種類に応じて適切な溶解溶液を容易に設計および／または選択することができる。
【０１２９】
一実施形態では、細胞溶解は、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）阻害剤の存在下で行われる。ＲＮａｓｅは、場合により、細胞溶解の細胞から放出され得るか、または単離されたＲＮＡと同時に精製され、よって、下流での適用を損なわせる場合がある。このようなＲＮａｓｅの混入はまた、手法で使用されるチップ、チューブ、および他の試薬を介して誘導され得る。ＲＮａｓｅ阻害剤は、市販されている。
【０１３０】
チオール標識したＲＮＡは光感受性であり、酸化する傾向があるため、一実施形態では、細胞溶解は、暗室または少なくとも光から保護されて行われる。一実施形態では、細胞溶解は、還元剤の存在下で行われる。適切な還元剤の例として、限定するものではないが、β−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、システアミン、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム塩、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、およびビス（２−メルカプトエチル）スルホン）が挙げられる。
【０１３１】
ＲＮＡを抽出することは、当業者によく知られている技術により行われ得る。このような技術として、限定するものではないが、クロロホルム−イソアミルアルコール抽出、フェノール−クロロホルム抽出、アルカリ性物質抽出、グアニジウム  チオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出、陰イオン交換樹脂、シリカマトリックス、ガラス粒子、珪藻土、異なる合成ポリマーから作製された磁性粒子、バイオポリマー、多孔性ガラスでの結合、および無機磁性に基づく技術が挙げられる。
【０１３２】
好ましくは、ＲＮＡの抽出は、例えば、クロロホルム：イソアミルアルコール  ２４：１を使用する、クロロホルム−イソアミルアルコール抽出により行われる。
【０１３３】
一実施形態では、抽出したＲＮＡは、さらに沈殿される。ＲＮＡを沈殿することは、当業者によく知られている技術により行われ得る。このような技術として、イソプロパノールエタノール沈殿、トリゾール法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，  １９９３．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．  １５（３）：５３２−４，  ５３６−７）、およびＰｉｎｅ  Ｔｒｅｅ法（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｏｒｔ．  １１（２）：１１３−１１６）が挙げられる。
【０１３４】
好ましくは、ＲＮＡ沈殿は、イソプロパノールエタノール沈殿により行われる。
【０１３５】
チオール標識したＲＮＡは光感受性であり、酸化する傾向があるため、一実施形態では、ＲＮＡの抽出は、暗室または少なくとも光から保護されて行われる。一実施形態では、ＲＮＡの抽出は、還元剤の存在下で行われる。適切な還元剤の例として、限定するものではないが、β−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、システアミン、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム塩、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、およびビス（２−メルカプトエチル）スルホン）が挙げられる。
【０１３６】
一実施形態では、標識したＲＮＡは、ヌクレオチド置換を経る。一実施形態では、標識したＲＮＡは、ヌクレオチド置換を可能にする条件に供される。
【０１３７】
以下において、用語「置換」、「変換」、「形質転換」は、不対合形成されたヌクレオチドの組み合わせを表すように互換可能に使用され得る。
【０１３８】
標識したＲＮＡのヌクレオチド置換は、標識したＲＮＡを化学的に修飾し、さらに上記化学的に修飾したＲＮＡを逆転写することにより行われ得る。よって、ヌクレオチド置換を可能にする条件は、標識したＲＮＡの化学的修飾、および上記化学的に標識したＲＮＡの逆転写を含む。
【０１３９】
好ましくは、ヌクレオチド変換の方法は、標識したＲＮＡでワトソンクリックの対形成を変えることを可能にし、ｃＤＮＡ合成の間の標識したＲＮＡの逆転写により、不対合形成ヌクレオチドを組み込む、すなわち非ワトソンクリックヌクレオチドと標識したヌクレオチドを対形成する。
【０１４０】
たとえば、標識したウリジン（チオール標識したウリジンなど）は、ｃＤＮＡの第１の鎖の合成の間にアデニン（Ａ）の代わりにグアノシン（Ｇ）と対形成され得る。結果的に、シトシンは、第２の合成の間に組み込まれ、最終的に、最初の核酸配列に対してチミジン（Ｔ）−シトシン（Ｃ）の置換をもたらす。
【０１４１】
よってヌクレオチド置換は、同等の第１の鎖の合成におけるヌクレオチド置換（すなわち第１の鎖の合成の後に起こるヌクレオチド置換）；または同等の第２の鎖合成におけるヌクレオチド置換（すなわち第２の鎖の合成の後に起こるヌクレオチド置換）として定義され得る。
【０１４２】
一実施形態では、標識したＲＮＡは、第１の鎖の合成におけるＡ−Ｇ（Ａ→Ｇ）置換を経る。一実施形態では、標識したＲＮＡは、第２の鎖の合成におけるＴ−Ｃ（Ｔ→Ｃ）置換を経る。よってこれら実施形態では、標識したＲＮＡにおける標識したウリジン（Ｕ）は、対応するｃＤＮＡにおいてチミジン（Ｔ）の代わりにシトシン（Ｃ）に変換される。
【０１４３】
他の意味が明記されていない限り、本明細書中列挙されるヌクレオチド置換は、第２の鎖の合成におけるヌクレオチド置換に対応する。
【０１４４】
標識したＲＮＡの適切な化学的修飾として、限定するものではないが、アルキル化、酸化的芳香族求核置換反応、オスミウム介在性形質転換、または当業者に知られている他のいずれかの方法が挙げられる。
【０１４５】
標識したＲＮＡをアルキル化することは、当業者によく知られている技術により行われ得る。このような技術として、限定するものではないが、Ｈｅｒｚｏｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １４（１２）：１１９８−１２０４）に記載されるものが、挙げられる。
【０１４６】
好ましくは、標識したＲＮＡのアルキル化は、本明細書中詳述されるＲＮＡの抽出の後に行われる。
【０１４７】
一実施形態では、標識したＲＮＡのアルキル化は、アルキル化剤を使用して行われる。適切なアルキル化剤の例として、限定するものではないが、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、Ｎ−エチルマレイミド、および４−ビニルピリジンが挙げられる。
【０１４８】
好ましい実施形態では、アルキル化剤は、ヨードアセトアミドである。
【０１４９】
標識したＲＮＡのアルキル化処理の非限定的な例として、
１００％のエタノールにおいて最終約１ｍＭ〜最終約２０ｍＭ、好ましくは最終約５ｍＭ〜最終約１５ｍＭ、好ましくは最終約１０ｍＭのヨードアセトアミド、
最終約１０ｍＭ〜最終約１００ｍＭ、好ましくは最終約２５ｍＭ〜最終約７５ｍＭ、好ましくは最終約５０ｍＭの、ｐＨ８のバッファー（たとえばリン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）バッファーなど）、
約２５ｖ／ｖ（％）〜約７５ｖ／ｖ（％）、好ましくは約４０ｖ／ｖ（％）〜約６０ｖ／ｖ（％）、好ましくは約５０ｖ／ｖ（％）のＤＭＳＯ
を、標識したＲＮＡに添加することを含む。
【０１５０】
チオール標識したＲＮＡは光感受性であるため、一実施形態では、ＲＮＡのアルキル化は、暗室または少なくとも光から保護されて行われる。
【０１５１】
一実施形態では、ＲＮＡアルキル化は、還元剤の存在下で行われない。
【０１５２】
一実施形態では、ＲＮＡアルキル化は、アルキル化処理の終了時に、クエンチ、すなわち停止される。
【０１５３】
アルキル化処理のクエンチは、当業者によく知られている技術により行われ得る。
【０１５４】
一実施形態では、ＲＮＡアルキル化のクエンチングは、還元剤を使用して行われる。
【０１５５】
適切な還元剤の例として、限定するものではないが、β−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、システアミン、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム塩、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、およびビス（２−メルカプトエチル）スルホン）が挙げられる。
【０１５６】
ＲＮＡアルキル化のクエンチングの非限定的な例は、最終約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、好ましくは最終約１０ｍＭ〜最終約５０ｍＭ、好ましくは最終約１０ｍＭ〜最終約３０ｍＭ、好ましくは最終約２０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）をアルキル化したＲＮＡに添加することを含む。
【０１５７】
標識したＲＮＡの酸化的芳香族求核置換反応は、当業者によく知られている技術により行われ得る。このような技術として、限定するものではないが、Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１８．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １５（３）：２２１−２２５）に記載されるものが挙げられる。
【０１５８】
好ましくは、標識したＲＮＡの酸化的芳香族求核置換反応は、本明細書中上記で詳述されるＲＮＡの抽出の後に行われる。
【０１５９】
一実施形態では、標識したＲＮＡの酸化的芳香族求核置換反応は、酸化剤および求核剤を使用して行われる。
【０１６０】
適切な酸化剤の例として、限定するものではないが、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、メタクロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ）、ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ３）、および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が挙げられる。
【０１６１】
好ましい実施形態では、アルキル化剤は、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）である。
【０１６２】
適切な求核剤の例として、限定するものではないが、２，２，２−トリフルオロエタンアミン（ＴＦＥＡ）、ヒドラジン、ベンジルアミン、アンモニア、メトキシアミン、１，１−ジメチルエチレンジアミン、アニリン、および４−（トリフルオロメチル）ベンジルアミンが挙げられる
【０１６３】
好ましい実施形態では、求核剤は、２，２，２−トリフルオロエタンアミン（ＴＦＥＡ）である。
【０１６４】
チオール標識したＲＮＡは、光感受性であるため、一実施形態において、ＲＮＡの酸化的芳香族求核置換反応は、暗室または少なくとも光から保護されて行われる。
【０１６５】
一実施形態では、ＲＮＡの酸化的芳香族求核置換反応は、還元剤の存在下で行われない。
【０１６６】
一実施形態では、ＲＮＡの酸化的芳香族求核置換反応は、酸化的芳香族求核置換反応の処理の終了時に、クエンチ、すなわち停止される。
【０１６７】
酸化的芳香族求核置換反応の処理のクエンチは、当業者によく知られている技術により行われ得る。
【０１６８】
標識したＲＮＡのオスミウム介在性形質転換は、当業者によく知られている技術により行われ得る。このような技術として、限定するものではないが、Ｒｉｍｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７．  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．  ５６（４３）：１３４７９−１３４８３）に記載されるものが挙げられる。
【０１６９】
好ましくは、標識したＲＮＡのオスミウム介在性形質転換は、本明細書中上記に詳述されるＲＮＡの抽出の後に行われる。
【０１７０】
一実施形態では、標識したＲＮＡのオスミウム介在性形質転換は、四酸化オスミウム（ＯｓＯ４）およびアンモニアを使用して行われる。
【０１７１】
チオール標識したＲＮＡは、光感受性であるため、一実施形態において、ＲＮＡの酸化的芳香族求核置換反応は、暗室または少なくとも光から保護されて行われる。
【０１７２】
一実施形態では、ＲＮＡのオスミウム介在性形質転換は、還元剤の存在下で行われない。
【０１７３】
一実施形態では、ＲＮＡのオスミウム介在性形質転換は、酸化的芳香族求核置換反応の処理の終了時に、クエンチ、すなわち停止される。
【０１７４】
ＲＮＡのオスミウム介在性形質転換の処理のクエンチは、当業者によく知られている技術により行われ得る。
【０１７５】
特にシーケンシングする目的のためのｃＤＮＡライブラリーの作製は、当業者の知識の一部である。限定するものではないが、ＳＭＡＲＴｅｒ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｋｉｔ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）、ＱｕａｎｔＳｅｑ  ３’ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｌｅｘｏｇｅｎ）、Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  （Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＴｒｕＳｅｑ  Ｎａｎｏ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＮＥＢＮｅｘｔ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、およびＪｅｔＳｅｑ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含む、ｃＤＮＡライブラリー作製のためのキットが市販されている。
【０１７６】
一実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーを作製することは、以下の：
第１の鎖のｃＤＮＡを合成する（ことにより、二本鎖の混合したＲＮＡ−ｃＤＮＡライブラリーを得る）サブステップと、
任意選択でＲＮＡのテンプレートを除去する（ことにより、一本鎖のｃＤＮＡライブラリーを得る）サブステップと、
第２の鎖のｃＤＮＡを合成する（ことにより、二本鎖のｃＤＮＡライブラリーを得る）サブステップ
を含むＲＮＡ逆転写のサブステップ、および
任意選択で、二本鎖のｃＤＮＡライブラリーを精製するサブステップ
のうちの一部または全てを含む。
【０１７７】
ＲＮＡの逆転写は、逆転写酵素、および４  デオキシリボヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰｓ）、すなわちデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸、（ｄＧＴＰ）、および（デオキシ）チミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）の混合物を使用して、当業者によく知られている技術により行われる。
【０１７８】
特に、第１の鎖のｃＤＮＡ合成のための方法は、当業者によく知られている。第１の鎖のｃＤＮＡ合成反応は、配列に特異的なプライマー、オリゴ（ｄＴ）、またはランダムプライマーの組み合わせを使用し得る。一実施形態では、第１の鎖のｃＤＮＡ合成反応は、オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用する。一実施形態では、第１の鎖のｃＤＮＡ合成反応は、配列に特異的なプライマーを使用する。一実施形態では、第１の鎖のｃＤＮＡ合成反応は、ランダムプライマーを使用する。
【０１７９】
一実施形態では、第１の鎖のｃＤＮＡ合成に使用されるプライマーは、定型の核酸配列（たとえばシーケンシングに使用されるアダプターおよび／または指標を含む）および（ＲＮＡテンプレートに相補的な）プライミング核酸配列を含む。一実施形態では、第１の鎖のｃＤＮＡ合成に使用されるプライマーは、定型の５’末端配列およびプライミング３’末端配列を含む。一実施形態では、第１の鎖のｃＤＮＡ合成に使用されるプライマーは、定型の３’末端配列およびプライミング５’末端配列を含む。
【０１８０】
特に、ＲＮＡテンプレートを除去するための方法は、当業者によく知られている。ＲＮＡテンプレートの除去は、たとえば二本鎖の混合したＲＮＡ−ｃＤＮＡライブラリーをＲＮａｓｅ  Ｈとインキュベートすることにより行われ得る。
【０１８１】
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのＲＮＡの逆転写は、ランダムな方法、すなわちランダムプライマーを使用することにより、ＲＮＡの全体または主な部分を逆転写することにより、行われ得る。あるいは、ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのＲＮＡの逆転写は、特定の方法、すなわち特異的なプライマーを使用することにより、カスタム配列のみのｃＤＮＡライブラリーを作製することにより、行われ得る。
【０１８２】
一実施形態では、特にＲＮＡを逆転写する際に、ｃＤＮＡライブラリーを作製することは、ヌクレオチド置換をもたらす。このようなヌクレオチド置換は、化学的修飾の非存在下で、いずれかの逆転写されたＲＮＡ上でランダムに少数起こる。しかしながら、このような置換の激増が、以前に標識され、さらに本明細書中上述されるアルキル化、酸化的芳香族求核置換反応、オスミウム介在性形質転換などの技術により化学的に修飾されたＲＮＡの逆転写の間に観察される。この置換の激増は、以下の「実施例」のセクションにおいてさらに示される。
【０１８３】
ｃＤＮＡライブラリーを増幅させることは、当業者によく知られている方法により行われ得る。
【０１８４】
ｃＤＮＡライブラリーの増幅は、ランダムな方法、すなわちランダムプライマーを使用することによりｃＤＮＡライブラリーの全体または主な一部を増幅させることにより、行われ得る。あるいは、ｃＤＮＡライブラリーの増幅は、特定の方法、すなわち特異的なプライマーを使用することにより、ｃＤＮＡライブラリーのカスタム配列のみを増幅させることにより、行われ得る。
【０１８５】
ｃＤＮＡライブラリーをシーケンシングすることは、当業者によく知られている方法により行われ得る。一実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーのシーケンシングは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、ディープシーケーシング、またはカスタム配列のターゲットシーケンシングにより行われる。
【０１８６】
ＮＧＳに関する方法は、当業者に知られており、限定するものではないが、ペアエンドシーケンシング、ＳＢＳ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、シングルリードシーケンシングを含む。
【０１８７】
ＮＧＳのためのプラットフォームが利用可能であり、限定するものではないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＰａｃＢｉｏ  ＲＳ（ＰａｃＢｉｏ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡＩＩｘ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を含む。
【０１８８】
ｃＤＮＡライブラリーをシーケンシングするステップは、市販のキット、たとえばＭｉＳｅｑ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ  ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して行われ得る。
【０１８９】
一実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーをシーケンシングすることは、配列リードのセットをもたらす。
【０１９０】
一実施形態では、本発明に係る方法は、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第１のセットでの置換されたヌクレオチドの数を、対照配列と比較するステップを含む。
【０１９１】
「置換されたヌクレオチド」は、微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに関して、ヌクレオチドが別のヌクレオチドに置き換えられていることを意味する。通常、いずれかのヌクレオチドが他のいずれかのヌクレオチドで置き換えられ得、たとえばチミジンはシトシン（Ｔ→Ｃ）、アデニン（Ｔ→Ａ）、またはグアニン（Ｔ→Ｇ）に置き換えられる。同じことが、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、およびグアニン（Ｇ）が他の３つのヌクレオチドのいずれかに置き換わる場合にも当てはまる。
【０１９２】
このような置換は、特に逆転写のステップの間、ランダムに少数で起こる。しかしながら本発明は、ＲＮＡが以前に標識されており、さらにアルキル化、酸化的芳香族求核置換反応、オスミウム介在性形質転換などの化学的な修飾法に供した場合の当該置換の激増に基づくものである。
【０１９３】
一実施形態では、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第１のセットでの置換されたヌクレオチドの総数は、対照配列での置換されたヌクレオチドの総数と比較される。
【０１９４】
一実施形態では、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第１のセットでのＴ→Ｃ置換の数は、対照配列でのＴ→Ｃ置換の数と比較される。
【０１９５】
一実施形態では、少なくとも１つの同定された微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第１のセットでのヌクレオチド置換の比率は、対照配列でのヌクレオチド置換の比率と比較される。
【０１９６】
一実施形態では、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第１のセットでのＴ→Ｃ置換の比率は、対照配列でのＴ→Ｃ置換の比率と比較される。
【０１９７】
「置換の比率」は、本明細書中使用される場合、置換の総数で除算された１つまたは複数の所定のヌクレオチド置換（たとえばＴ→Ｃ置換または本明細書中上記に定義される他のヌクレオチド置換）の数として計算される。あるいは、「置換の比率」は、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードでのヌクレオチドの総数で除算された１つまたは複数の所定のヌクレオチド置換の数として計算され得る。
【０１９８】
一実施形態では、配列リードの第１のセットおよび対照配列での少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの間のＴ→Ｃ置換の比率と、配列リードの第１のセットおよび対照配列での少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの間の他の全てのヌクレオチドの置換（すなわちＴ→Ｃ以外）の比率の平均とが、比較される。
【０１９９】
一実施形態では、本方法は、少なくとも１つの配列リードに対してマッピングした少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットを同定することを含む。
【０２００】
一実施形態では、少なくとも１つの配列リードに対してマッピングした少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットの同定は、リードのセットをフィルタリングするサブステップと、配列リードをコンティグにアセンブリするサブステップと、データベース上に配列リードまたはコンティグをアライメントするサブステップと、少なくとも１つの配列リードまたはコンティグに対してマッピングされた少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットを同定するサブステップと、微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒット上に配列リードまたはコンティグを再度アライメントするサブステップとを含む。
【０２０１】
配列リードのセットをフィルタリングすることは、当業者の知識を一部である。
【０２０２】
一実施形態では、配列リードのセットをフィルタリングすることは、限定するものではないが、配列リードの重複を抑制すること、低質な配列リードを抑制すること、配列リードのホモポリマーを抑制すること、配列リードから定型の核酸配列（たとえばシーケンシングに使用されるアダプターおよび／または指標など）を除去すること、内因性の配列リード（すなわち対象の細胞に属する核酸配列をマッピングした配列リード）を廃棄すること、望ましくない配列リード（たとえばｒＲＮＡの配列リードなど）を廃棄することなどを含み得る。
【０２０３】
このようなフィルタリングは、当業者が容易に利用できるソフトウェアを使用して行われ得る。
【０２０４】
配列リードのセットをコンティグにアセンブリすることは、当業者の知識の一部である。
【０２０５】
このような配列リードのコンティグへのアセンブリは、当業者が容易に利用できるソフトウェアを使用して行われ得る。
【０２０６】
任意選択で、配列リードまたはコンティグは、アミノ酸配列へと翻訳され得る。
【０２０７】
配列リードまたはコンティグのセットをアライメントすることは、当業者の知識の一部である。このような配列リードまたはコンティグのアライメントは、当業者が容易に利用できるソフトウェアを使用して行われ得る。
【０２０８】
一実施形態では、配列リードまたはコンティグは、微生物のデータベース、すなわち微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列またはアミノ酸配列（配列リードまたはコンティグがアミノ酸配列に翻訳された場合）を含むデータベースにアライメントされる。このようなデータベースは、たとえばＥＭＢＬ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅからダウンロードされ得る。
【０２０９】
少なくとも１つの配列リードまたはコンティグに対してマッピングされた少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒット（または配列リードまたはコンティグがアミノ酸配列に翻訳された場合はアミノ酸配列のヒット）を同定することは、当業者の知識の一部である。
【０２１０】
データベース上での配列リードまたはコンティグのセットのアライメントの後に、上記データベースからヒット配列が同定され得る。
【０２１１】
一実施形態では、少なくとも１つのヒット配列が、配列リードまたはコンティグでアライメントした後に得られる閾値の期待値（ｅ値）に基づき同定（よって選択）される。一実施形態では、配列ヒットは、少なくとも１つの配列リードまたはコンティグでの上記配列ヒットのアライメント後に得られるｅ値が、１０−２未満、好ましくは５．１０−３未満、好ましくは１０−３未満である場合、同定される。
【０２１２】
以前に同定（よって選択）された少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒット（または配列リードまたはコンティグがアミノ酸配列に翻訳された場合はアミノ酸配列のヒット）上で配列リードまたはコンティグを再度アライメントすることは、当業者の知識の一部である。
【０２１３】
このような配列リードまたはコンティグの再アライメントは、当業者が容易に利用できるソフトウェアを使用して行われ得る。
【０２１４】
一実施形態では、再アライメントの後、以前に同定（よって選択）された少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒット（または配列リードまたはコンティグがアミノ酸配列に翻訳された場合はアミノ酸配列のヒット）の少なくとも１つの最終的なコンセンサス配列が決定される。
【０２１５】
一実施形態では、対照配列は、
少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第２のセットであって、前記配列リードの第２のセットが、ＲＮＡ標識化剤の非存在下でサンプル、好ましくは細胞サンプルを培養することにより得られるＲＮＡの第２のセットをシーケンシングすることにより得られる、第２のセット、
少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第２のセットであって、前記配列リードの第２のセットが、ＲＮＡ標識化剤の存在下ではあるが、ヌクレオチド置換を可能にする条件に前記抽出したＲＮＡを供することなく、サンプル、好ましくは細胞サンプルを培養することにより得られるＲＮＡの第２のセットをシーケンシングすることにより得られる、第２のセット、
少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、もしくは原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第１のセットの配列リードもしくはコンティグから得られるコンセンサスな微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、もしくは原虫の核酸配列、
核酸配列のデータベースにおいて同定された最も近い微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、もしくは原虫の菌株で見出される同じ微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、もしくは原虫の核酸配列のヒットに対応する配列、および／または
核酸配列のデータベースにおいて同定された同じ微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、もしくは原虫の核酸配列のヒットに対応する類似の配列
から選択される。
【０２１６】
一実施形態では、対照配列は、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第２のセットであって、配列リードの第２のセットは、ＲＮＡ標識化剤の非存在下で、サンプル、好ましくは細胞サンプルを培養することにより得られるＲＮＡの第２のセットをシーケンシングすることにより得られる。
【０２１７】
この実施形態では、本発明に係る方法は、
（ａ）サンプル、好ましくは細胞サンプルから抽出されたＲＮＡの第１および第２のセットをシーケンシングするステップであって、前記ＲＮＡの第１のセットが、ＲＮＡ標識化剤の存在下でサンプル、好ましくは細胞サンプルを培養することにより得られ、前記ＲＮＡの第２のセットが、ＲＮＡ標識化剤の非存在下でサンプル、好ましくは細胞サンプルを培養することにより得られ、これにより、配列リードの第１および第２のセットを得る、ステップと、
（ｂ）少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第１のセットでの置換されたヌクレオチドの数を、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第２のセットでの置換されたヌクレオチドの数と比較するステップと、
（ｃ）配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードでの置換されたヌクレオチドの数が、配列リードの第２のセットでの置換されたヌクレオチドの数よりも多い場合、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットが、生きている微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫に属すると結論付けるステップと
を含む。
【０２１８】
好ましくは、ＲＮＡの第１のセットは、ＲＮＡ標識化剤の存在下で、サンプル、好ましくは細胞サンプルを培養することにより標識したＲＮＡを入手し、さらに標識したＲＮＡを本明細書中上記で詳述されるヌクレオチド置換に供することにより、得られる。
【０２１９】
一実施形態では、本発明に係る方法は、
（ａ）サンプル、好ましくは細胞サンプルから抽出されたＲＮＡの第１および第２のセットをシーケンシングするステップであって、前記ＲＮＡの第１のセットが、ＲＮＡ標識化剤の存在下でサンプル、好ましくは細胞サンプルを培養することにより得られ、前記ＲＮＡの第２のセットが、ＲＮＡ標識化剤の非存在下でサンプル、好ましくは細胞サンプルを培養することにより得られ、これにより、配列リードの第１および第２のセットを得る、ステップと、
（ｂ）配列リードの第１のセットの少なくとも１つの配列リードに対してマッピングした少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットを同定するステップと、
（ｃ）配列リードの第１および第２のセットにおいて少なくとも１つの同定された微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットをマッピングした配列リードでの置換されたヌクレオチドの数を比較するステップと、
（ｄ）配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの同定された微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットをマッピングした配列リードでの置換されたヌクレオチドの数が、配列リードの第２のセットでの置換されたヌクレオチドの数よりも多い場合、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットが、生きている活性の微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫に属していると結論付けるステップと
を含む。
【０２２０】
この実施形態では、本方法は、サンプル、好ましくは細胞サンプルから抽出されたＲＮＡの第１のセットをシーケンシングするステップを含む。この実施形態では、サンプル、好ましくは細胞サンプルは、ＲＮＡ標識化剤の存在下で培養された。
【０２２１】
この実施形態では、サンプル、好ましくは細胞サンプルから抽出されたＲＮＡの第１のセットをシーケンシングするステップは、ＲＮＡを標識するサブステップ、細胞を溶解するサブステップ、ＲＮＡを抽出するサブステップ、標識したＲＮＡでヌクレオチドを置換するサブステップ、ｃＤＮＡライブラリーを作製するサブステップ、ｃＤＮＡライブラリーを増幅させるサブステップ、およびｃＤＮＡライブラリーをシーケンシングするサブステップのうちの１つ以上または全てを含む。
【０２２２】
これらサブステップは、本明細書中上記に定義および詳述されており、ＲＮＡの第１のセットのシーケンシングに適用される。
【０２２３】
この実施形態では、本方法は、サンプル、好ましくは細胞サンプルから抽出されたＲＮＡの第２のセットをシーケンシングするさらなるステップを含む。この実施形態では、サンプル、好ましくは細胞サンプルは、ＲＮＡ標識化剤の非存在下で培養された。
【０２２４】
この実施形態では、サンプル、好ましくは細胞サンプルから抽出されたＲＮＡの第２のセットをシーケンシングするステップは、細胞を溶解するサブステップ、ＲＮＡを抽出するサブステップ、ｃＤＮＡライブラリーを作製するサブステップ、ｃＤＮＡライブラリーを増幅させるサブステップ、およびｃＤＮＡライブラリーをシーケンシングするサブステップを含む。
【０２２５】
これらサブステップは、本明細書中上記に定義および詳述されており、ＲＮＡの第２のセットのシーケンシングに適用される。
【０２２６】
一実施形態では、対照配列は、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第２のセットであって、配列リードの第２のセットは、ＲＮＡの標識化剤の存在下であるが、ヌクレオチド置換を可能にする条件に抽出したＲＮＡを供することなく、サンプル、好ましくは細胞サンプルを培養することにより得られるＲＮＡの第２のセットをシーケンシングすることにより得られる。
【０２２７】
この実施形態では、本発明に係る方法は、
（ａ）前記サンプル、好ましくは細胞サンプルから抽出されたＲＮＡの第１および第２のセットをシーケンシングするステップであって、前記ＲＮＡの第１および第２のセットが、ＲＮＡ標識化剤の存在下でサンプル、好ましくは細胞サンプルを培養することにより標識したＲＮＡを得ることにより得られ、
前記ＲＮＡの第１のセットが、ヌクレオチド置換に供される標識したＲＮＡの第１のフラクションから得られ、ＲＮＡの第２のセットが、ヌクレオチド置換に供されない標識したＲＮＡの第２のフラクションから得られ、これにより配列リードの第１および第２のセットを得る、ステップと、
（ｂ）少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第１のセットでの置換されたヌクレオチドの数を、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第２のセットでの置換されたヌクレオチドの数と比較するステップと、
（ｃ）配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードでの置換されたヌクレオチドの数が、配列リードの第２のセットでの置換されたヌクレオチドの数よりも多い場合、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットが生きている微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫に属すると結論付けるステップと
を含む。
【０２２８】
一実施形態では、対照配列は、コンセンサスな微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列であり得る。一実施形態では、コンセンサスな微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列は、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードの第１のセットの複数の配列リードから入手され得る。このようなコンセンサス配列は、全ての目的のヌクレオチドがヌクレオチド置換の手法の後にチオ標識されておらずかつ／または置換されていないことが観察されているため、容易に決定され得る。実際に、十分な数の目的のヌクレオチドが、本発明の方法に係る区別を可能にするように置換されているが、この数は、コンセンサス配列を確立するためには依然として十分低いままである。
【０２２９】
一実施形態では、対照配列は、同じ微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対応しているが、核酸配列のデータベースで同定された最も近い微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の菌株で見出される核酸配列であり得る。
【０２３０】
一実施形態では、対照配列は、ヌクレオチド核酸配列のデータベースで同定された、同じ微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対応する類似の配列であり得る。
【０２３１】
一実施形態では、本発明に係る方法は、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットが、生きている微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫に属しているかどうかを結論付けるステップを含む。
【０２３２】
一実施形態では、生きている微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫は、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットの分類学的な割り当てにより特徴づけられる。
【０２３３】
一実施形態では、配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングされた配列リードでのヌクレオチド置換の総数が、対照配列でのヌクレオチド置換の総数より多い場合、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットが、生きている微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫に属すると結論付けられる。
【０２３４】
一実施形態では、配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードでのＴ→Ｃ置換の数が、対照配列でのＴ→Ｃ置換の数よりも多い場合、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットが、生きている微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫に属すると結論付けられる。
【０２３５】
一実施形態では、配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードでの置換の数が、対照配列での置換の数よりも２倍多い、好ましく３倍多い、より好ましくは４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、５０、１００倍多い場合、「配列リードの第１セットにおける「．．．」置換の数「．．．」が、対照配列における「．．．」置換の数「．．．」より多い」。
【０２３６】
一実施形態では、配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードでのヌクレオチド置換の比率が、対照配列でのヌクレオチド置換の比率よりも多い場合、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットが、生きている微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫に属すると結論付けられる。
【０２３７】
一実施形態では、配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードでのＴ→Ｃ置換の比率が、対照配列でのＴ→Ｃ置換の比率よりも高い場合、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットが、生きている微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫に属すると結論付けられる。
【０２３８】
本明細書中使用される場合、「Ｔ→Ｃ置換率」は、以下の式：
Ｔ→Ｃ置換率＝Ｔが予測された際に同定されるＣヌクレオチドの数／予測されるＴの総数
で定義され得る。
【０２３９】
一実施形態では、配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードでの置換率が、対照配列での置換率よりも２倍高い、好ましく３倍高い、より好ましくは４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、５０、１００倍高い場合、「配列リードの第１セットにおける［．．．］置換率［．．．］が、対照配列における［．．．］置換率［．．．］より高い」。
【０２４０】
一実施形態では、配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードでのＴ→Ｃ置換率が、他の全てのヌクレオチドの平均置換比率よりも高い場合、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットが、生きている微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫に属すると結論付けられる。
【０２４１】
一実施形態では、Ｔ→Ｃ置換率が、他の全てのヌクレオチドの平均置換比率より２倍高い、好ましくは３倍高い、より好ましくは４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、５０、１００倍高い場合、「Ｔ→Ｃ置換率は、他の全てのヌクレオチドの平均置換比率よりも高い」。
【０２４２】
「他の全てのヌクレオチドの平均置換比率」は、Ａ→Ｃ、Ａ→Ｇ、Ａ→Ｔ、Ｃ→Ａ、Ｃ→Ｇ、Ｃ→Ｔ、Ｔ→Ａ、Ｔ→Ｇ、Ｇ→Ａ、Ｇ→Ｃ、およびＧ→Ｔの置換比率の平均を意味する。
【０２４３】
一実施形態では、配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードでのＴ→Ｃ置換率が、Ｔ→ＡおよびＴ→Ｇの平均置換比率よりも高い場合、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットが、生きている微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫に属すると結論付けられる。
【０２４４】
一実施形態では、Ｔ→Ｃ置換比率が、Ｔ→ＡおよびＴ→Ｇの平均置換比率よりも２倍高い、好ましくは３倍高い、より好ましくは４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、５０、１００倍高い場合、「Ｔ→Ｃ置換率は、Ｔ→ＡおよびＴ→Ｇの平均置換比率よりも高い」。一実施形態では、配列リードの第１のセットおよび対照配列における少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リード間のＴ→Ｃ置換率が、配列リードの第１のセットおよび対照配列における少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リード間の他の全てのヌクレオチドの平均置換比率の比率よりも高い場合、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットが、生きている微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫に属すると結論付けられる。
【０２４５】
一実施形態では、配列リードの第１のセットおよび対照配列における少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リード間のＴ→Ｃ置換率が、配列リードの第１のセットおよび対照配列における少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リード間のＴ→ＡおよびＴ→Ｇの平均置換比率の比率よりも高い場合、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットが、生きている微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫に属すると結論付けられる。
【０２４６】
一実施形態では、配列リードの第１のセットにおける少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードでのＴ→Ｃ置換指標が、閾値より高い場合、少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットが、生きている微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫に属すると結論付けられる。この実施形態では、閾値は、実験により決定され得る。一実施形態では、閾値は、配列リードの第２のセットにおける少なくとも１つの微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットに対してマッピングした配列リードでのＴ→Ｃ置換指標よりも高い。一実施形態では、閾値は、少なくとも２、好ましくは少なくとも２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上である。
【０２４７】
本明細書中使用される場合、用語「Ｔ→Ｃ置換指標」は、以下の式：
Ｔ→Ｃ置換指標＝「Ｔ→Ｃ」比率／平均（「Ｔ→Ａ」、「Ｔ→Ｇ」の比率）
で定義され得る。
【０２４８】
サンプル、好ましくは細胞サンプルにおいて、生きているか死んでいる微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫を区別するための方法であって、本発明により、サンプル、好ましくは細胞サンプルにおける転写的に活性かまたは転写的に不活性な微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列を区別するステップを含む方法は、多くの異なる適用に有用である。
【０２４９】
実際に、微生物、特にウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の混入のリスクは、生物製品にとって主要な懸念のテーマである。これは、ＧＭＰ（医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理の基準）の施設および最終的な薬物製品の異物混入のリスクの両方を含む。生の物質、細胞、ウイルス、種、マスター／ワーキングバンク、ワクチン化用の血清バッチなどのウイルス試験は、薬物製品の安全性にとって重要である。これは、生のワクチン、遺伝子療法ウイルスベクター、細胞療法薬物製品に特に重要であり、これはそれらの生産が、下流でのウイルスを排除するステップを含まないためである。結果として、これら製品の安全性は、作製プロセスの間のウイルス試験に著しく依存している。
【０２５０】
以前に報告されている細胞培養物に基づく製品の異物混入の全ては、生の物質または産生細胞のウイルス試験の間に同定されなかった予測できない動物性ウイルスによるものであった。実際に、従来のウイルス試験は、多くのウイルスがｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で使用される細胞株またはｉｎ  ｖｉｖｏ試験に使用されるげっ歯類もしくはタマゴで増殖しないため、限定される。
【０２５１】
本発明の方法は、異物混入に関してサンプルを正確に試験し、潜在性微生物を含む生きた微生物と不活性な微生物の核酸フラグメント（たとえばγ線照射による不活性化後の断片化された微生物の核酸）の無害な混入を区別するための代替的な手法を提供する。
【０２５２】
これに基づき、多くの産業上の応用が予測できる。
【０２５３】
ワクチンの分野では、不活性化したワクチンの制御は、通常、現在では、不活性化であるとみなされるワクチンを培養し、次に活性な微生物の存在を探索することにより行われる。本発明の方法は、不活性化されていることにより無害である不活性な微生物の核酸配列のバックグラウンドノイズと生きている微生物を区別することを可能にするであろう。
【０２５４】
同様に、本発明に係る方法は、生の物質（たとえばワクチンの場合は血清バッチ）、細胞、マスター／ワーキングバンクなどの生体サンプルにおいてではあるが、同様に診断のために使用される血液培養物および他の種類の生体サンプルにおいて、生きている微生物を伴う混入を検出するために容易に行われ得る。たとえば、対象での抗菌剤による処置の後、残存する生きている微生物の存在の有無に関して対象を試験することにより、潜在的な処置に耐性のある微生物を同定することが企図され得る。
【０２５５】
ウイルス療法の分野では、本発明に係る方法は、ウイルスベクター、たとえば遺伝子療法で使用されるウイルスベクターなどにおける複製的な復帰突然変異株のウイルス（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  ｒｅｖｅｒｔａｎｔ  ｖｉｒｕｓ）の存在の有無に関して試験するために行われ得る。
【０２５６】
また保存培地を、微生物のコンタミネーションに供することができ、本発明に係る方法は、サンプルを保存物と接触させる前に当該コンタミネーションに関して試験するために容易に使用され得る。
【０２５７】
また分野の可能性は、非生体サンプルまで広がる。たとえば、食物の安全性は、主要な関心事である。衛生に関するスキャンダルならびに質および安全性に焦点を当てた食品の需要の出現は、微生物混入を探索する食品の試験と共鳴する。本発明の方法は、食品サンプルに生きている微生物が混入しているかどうかに関する実務的かつ明確な回答を提供することによりこの問題を解決し得る。
【０２５８】
また環境上のサンプルも試験され得る。たとえば水および／または空気調節された回路は、潜在的に微生物を保有することが知られている。本発明に係る方法は、当該生きている微生物の存在の有無を確認するために実施され得る。
【０２５９】
本発明の別の目的は、対象において微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の感染症の診断方法、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの診断方法である。
【０２６０】
一実施形態では、本発明に係る診断方法は、対象からサンプル、好ましくは細胞サンプルを準備するステップを含む。
【０２６１】
一実施形態では、本発明に係る診断方法は、本発明により、サンプル、好ましくは細胞サンプルにおいて転写的に活性か転写的に不活性な微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列を区別するための方法のいずれかを行うステップをさらに含む、
【０２６２】
一実施形態では、本発明に係る診断方法は、少なくとも１つの同定した微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットが、生きている微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫に属している場合、対象が微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の感染症を有すると診断するステップをさらに含む。
【０２６３】
本発明の別の目的は、対象において微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の感染症を処置する方法である。
【０２６４】
一実施形態では、本発明に係る微生物感染症を処置する方法は、本発明に係る診断方法を行う（ｃａｒｒｙｉｎｇ）ステップと、上記対象が、微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の感染症を有すると診断された場合に対象を処置するステップとを含む。
【０２６５】
微生物感染症を処置する手段および方法は、当業者によく知られており、限定するものではないが、少なくとも１つの抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗真菌剤、抗原虫剤を対象に投与することを含む。
【０２６６】
抗ウイルス剤の適切な例として、限定するものではないが、ＡＴＣ分類（解剖治療化学分類法）の治療に関する下位群Ｊ０５（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｕｂｇｒｏｕｐ  Ｊ０５）に分類されるものが挙げられる。さらなる例として、限定するものではないが、アセマンナン、アシクロビル、アシクロビルナトリウム、アダマンタンアミン、アデホビル、アデニンアラビノシド、アロブジン、アルビルセプトスドトックス、アマンタジン塩酸塩、アラノチン、アリルドン、アテビルジンメシル酸塩、アブリジン、シドホビル、シパムフィリン、塩酸シタラビン、ＢＭＳ  ８０６、Ｃ３１Ｇ、カラゲナン、亜鉛塩、硫酸セルロース、シクロデキストリン、ダピビリン（ｄａｐｉｖｉｒｉｎｅ）、デラビルジンメシル酸塩、デスシクロビル、デキストリン  ２−スルファート、ジダノシン、ジソキサリル、ドルテグラビル、エドクスジン、エンビラデン、エンビロキシム（ｅｎｖｉｒｏｚｉｍｅ）、エトラビリン、ファムシクロビル、塩酸ファモチン、フィアシタビン、フィアルリジン、フォサリレート（Ｆｏｓａｒｉｌａｔｅ）、ホスカルネットナトリウム、ホスホネットナトリウム、ＦＴＣ、ガンシクロビル、ガンシクロビルナトリウム、ＧＳＫ  １２６５７４４、９−２−ヒドロキシ−エトキシメチルグアニン、イバリズマブ、イドクスウリジン、インターフェロン、５−ヨード−２’−デオキシウリジン、ＩＱＰ−０５２８、ケトキサール、ラミブジン、ロブカビル、マラビロク、メモチンピロダビル（ｍｅｍｏｔｉｎｅ  ｐｉｒｏｄａｖｉｒ）、ペンシクロビル、ラルテグラビル、リバビリン、リマンタジン塩酸塩、リルピビリン（ＴＭＣ−２７８）、サキナビルメシル酸塩、ＳＣＨ−Ｃ、ＳＣＨ−Ｄ、ソマンタジン塩酸塩、ソリブジン、スタトロン、スタブジン、Ｔ２０、チロロン二塩酸塩、ＴＭＣ１２０、ＴＭＣ１２５、トリフルリジン、トリフルオロチミジン、テノホビル、テノホビル・アラフェナミド、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩、テノホビルのプロドラッグ、ＵＣ−７８１、ＵＫ−４２７、ＵＫ−８５７、バラシクロビル、バラシクロビル塩酸塩、ビダラビン、ビダラビンリン酸、ビダラビンナトリウムリン酸塩、ビロキシム（Ｖｉｒｏｘｉｍｅ）、ザルシタビン、ジドブジン、ジンビロキシム、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０２６７】
抗細菌剤の適切な例として、限定するものではないが、ＡＴＣ分類の治療に関する下位群Ｊ０１に分類されるものが挙げられる。さらなる例として、限定するものではないが、アミノグリコシド（たとえばアミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン（ｐａｒｏｍｙｃｉｎ）など）、アンサマイシン（たとえばゲルダナマイシン、ハービマイシンなど）、カルバセフェム（たとえばロラカルベフなど）、カルバペネム（たとえば．エルタペネム（ｅｒｔａｐｅｎｕｍ）、ドリペネム、イミペネム、シラスタチンメロペネムなど）、第１世代セファロスポリン（たとえばセファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファレキシンなど）、第２世代セファロスポリン（たとえばセファクロル（ｃｅｆａｃｌｏｒ）、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシムなど）、第３世代セファロスポリン（たとえばセフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソンなど）、第４世代セファロスポリン（たとえばセフェピムなど）、第５世代セファロスポリン（たとえばセフトビプロールなど）、グリコペプチド系（たとえばテイコプラニン、バンコマイシンなど）、マクロライド系（たとえばアジスロマイシン（ａｘｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン（ｄｉｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎｅ）、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、スペクチノマイシンなど）、モノバクタム系（たとえばアズトレオナムなど）、ペニシリン系（ｐｅｎｉｃｉｌｉｎｓ）（たとえばアモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン（ａｘｌｏｃｉｌｌｉｎ）、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン（ｎａｆｃｉｌｉｎ）、オキサシリン、ペニシリン、ピペラシリン（ｐｅｐｅｒａｃｉｌｌｉｎ）、チカルシリンなど）、抗菌性ポリペプチド（たとえばバシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢなど）キノロン（たとえばシプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、レメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オルフロキサシン（ｏｒｆｌｏｘａｃｉｎ）、トロバフロキサシンなど）、スルホンアミド（たとえばマフェニド、プロントジル、スルファセタミド、スルファメチゾール、スルファニルアミド、スルファサラジン、スルフイソキサゾール、トリメトプリム、トリメトプリム・スルファメトキサゾール合剤など）、テトラサイクリン系（たとえばデメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリンなど）、他の抗生剤（たとえばアルスフェナミン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、リンコマイシン、エタンブトール、ホスホマイシン、フシジン酸、フラゾリドン、イソニアジド、リネゾリド、メトロニダゾール、ムピロシン、ニトロフラントイン、プラテンシマイシン、ピラジナミド、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、リファンピン／リファンピシン、チニダゾールなど）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０２６８】
抗真菌剤の適切な例として、限定するものではないが、ＡＴＣ分類の治療に関する下位群Ｊ０２に分類されるものが挙げられる。さらなる例として、限定するものではないが、アバフンジン（ａｂａｆｕｎｇｉｎ）、アルバコナゾール、アモロルフィン、アンホテリシンＢ、アニデュラファンギン、アトバコン、ビアフンギン（ｂｉａｆｕｎｇｉｎ）、ビホナゾール、ブロモクロロサリチルアニリド、ブテナフィン、ブトコナゾール、カスポファンギン、クロルミダゾール、クロロフェノール（ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｔａｎｏｌ）、クロルフェネシン、シクロピロクス、シロフンギン、コウスイガヤ油、クロトリマゾール、クロコナゾール、クリスタルバイオレット、ダプソン、ジマゾール、エベルコナゾール、エコナゾール、エフィナコナゾール、エチルパラベン、フェンチコナゾール、フルコナゾール、フルオロシトシン、フルトリマゾール、ホスフルコナゾール、グリセオフルビン、ハロプロジン、ハマイシン、ヘキサコナゾール、イサブコナゾール、イソコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、レモングラス、レモンマートル、ルリコナゾール、ミカファンギン、ミコナゾール、ナフチフィン、ナタマイシン、ネチコナゾール、ニスタチン、オモコナゾール、オレンジオイル、オキシコナゾール、パチョリ、ペンタミジン、ポリノキシリン、ポサコナゾール、ヨウ化カリウム、ラブコナゾール、サリチル酸、セレン（ＩＶ）ジスルフィド、セルタコナゾール、チオ硫酸ナトリウム、スルベンチン、スルコナゾール、タウロリジン、タバボロール、ティーツリーオイル、テルビナフィン、テルコナゾール、チクラトン、チオコナゾール、トルシクラート、トルナフタート、トリブロモメタクレゾール、ウンデシレン酸、ボリコナゾール、ホイットフィールド軟膏、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０２６９】
抗原虫剤の適切な例として、限定するものではないが、ＡＴＣ分類の治療に関する下位群Ｐ０１に分類されるものが挙げられる。さらなる例として、限定するものではないが、アルベンダゾール、アモジアキン、アンホテリシンＢ、アルスチノール、アーテメータ、アルテミシニン、アルテモチル、アルテロラン、アーテスネート、アトバコン、アザニダゾール、ベンズニダゾール、ブロキシキノリン、カルニダゾール、キニオホン、クロルヘキシジン、クロロキン、クロルプログアニル、クロルキナルドール、クレファミド、クリンダマイシン、クリオキノール、デヒドロエメチン、ジフェタルソン、ジヒドロアルテミシニン、ジヨードヒドロキシキノリン、ジロキサニド、ドキシサイクリン、エフロルニチン、エメチン、エトファミド、フェキシニダゾール、フマギリン、フラゾリドン、グリコビアルソル、ハロファントリン、ヒドロキシクロロキン、ヨードキノール、ルメファントリン、メフロキン、アンチモン酸メグルミン、メラルソプロール、メパクリン、メトロニダゾール、ミルテホシン、ニフルチモックス、ニモラゾール、ニタゾキサニド、オルニダゾール、パマキン、パロモマイシン、ペンタミジン、ファンキノン、ピペラキン、プリマキン、プログアニル、プロパミジン、プロペニダゾール、ピリメタミン、ピロナリジン（ｐｙｒｏｎａｒｉｄｉｎｅ）、キナクリン、キニジン、キニーネ、セクニダゾール、スチボグルコン酸ナトリウム、スルファジアジン、スルファドキシン、スルファレン、スルファメトキサゾール、スラミン、タフェノキン、テクロザン、テノニトロゾール、テトラサイクリン、チルブロキノール、チニダゾール、トリメトプリム、トリメトレキサート、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０２７０】
本発明の別の目的は、サンプルにおける微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫のコンタミネーションのリスクを評価するための方法である。
【０２７１】
一実施形態では、本発明に係る微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫のコンタミネーションのリスクを評価するための方法は、サンプルを準備するステップを含む。一実施形態では、サンプルは、生体サンプルまたは非生体サンプルであり得る。
【０２７２】
一実施形態では、本発明に係る微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫のコンタミネーションのリスクを評価するための方法は、本発明に係るサンプルにおいて転写的に活性であるか転写的に不活性な微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列を区別するための方法のいずれかを行うステップを含む。
【０２７３】
一実施形態では、本発明に係る微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫のコンタミネーションのリスクを評価するための方法は、少なくとも１つの同定された微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫の核酸配列のヒットが、生きている微生物、好ましくはウイルス、細菌、古細菌、真菌、または原虫に属する場合、サンプルが微生物混入しているリスクがあると結論付けるステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【０２７４】
【図１Ａ】図１は、Ｔヌクレオチドの置換率および置換指標を示す２つのグラフのセットである。図１Ａ：Ｔの合計に対する置換されたＴの比率として表されるＴヌクレオチドの置換率。図１Ｂ：「Ｔ−Ａ」＋「Ｔ−Ｇ」置換率の平均に対する「Ｔ−Ｃ」置換率として表される置換指標。［Ｔ：ＴＢＥＶ；Ｓ：ＳＭＲＶ；Ｃ：細胞性ＲＮＡ］。
【図１Ｂ】同上。
【図２】図２は、現在の条件のデータから構築されたＴＢＥＶのコンセンサス配列を微生物の核酸配列のヒットとして使用した、４ｓＵで処理しアルキル化したサンプルにおけるＴヌクレオチドのＣ、Ｇ、またはＡへの置換率（％）を示すグラフである。
【図３】図３は、現在の条件のデータから構築されたＳＭＲＶのコンセンサス配列を微生物の核酸配列のヒットとして使用した、４ｓＵで処理しアルキル化したサンプルにおけるＴヌクレオチドのＣ、Ｇ、またはＡへの置換率（％）を示すグラフである。
【図４】図４は、ＬＣ５＿ＡＬＡＩＤ＿ＣＮＳ参照ゲノムの再構築の候補として選択された６６２のコンティグのＧＣ含有量の分布を示すグラフである。
【図５】図５は、ＬＣ５の実験条件のリードの最初のアセンブリから選択された６６２のコンティグを有するＡ．  ｌａｉｄｌａｗｉｉ  ｓｔｒ．  ＰＧ８Ａゲノムのタイリングを示すグラフである。一致するコンティグ（フォワードは黒色、リバースは灰色）が、それらの類似性の現実のパーセンテージで報告されており（上部）、カバー度および容易な可視化を平板化するために１０％の類似性で正規化されている。
【図６Ａ】図６は、異なる試験条件に関する、ＬＣ５＿ＡＬＡＩＤ＿ＣＮＳ参照配列に沿ったＴヌクレオチドのＣ、Ｇ、またはＡへの置換率（または変換比率）（％）を示す７つのグラフのセットである。著しく確信的なイベントのみ（＞２０倍の深度）が、解析で選択されている。図６Ａ：ＣＴＲＬ５ｔａｇ条件、図６Ｂ：ＬＣ５条件、図６Ｃ：ＬＣ５ｔａｇ条件、図６Ｄ：４０倍希釈したＬＣ５ｔａｇ条件、図６Ｅ：ＨＣ＿ＨＫ５ｔａｇ条件；図６Ｆ：ＨＣ＿ＨＫ５ｔａｇ条件、図６Ｇ：ＨＣ＿Ｇ５ｔａｇ条件。
【図６Ｂ】同上。
【図６Ｃ】同上。
【図６Ｄ】同上。
【図６Ｅ】同上。
【図６Ｆ】同上。
【図６Ｇ】同上。
【実施例】
【０２７５】
実施例
本発明の上記および他の態様および性質を、以下の実施例によりさらに例示する。これら実施例は、単なる例であり、限定を意図するものではない。
【０２７６】
実施例１：培養されたベロ細胞での複製するダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）の検出
材料および方法
材料
ベロ細胞を、２％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充した最小必須培地（ＭＥＭ）で増殖させた。感染に使用したウイルスは、平均の大きさが１０ｋｂであるｓｓＲＮＡ（＋）ゲノムからなる、フラビウイルス科のメンバーであるダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）である。
【０２７７】
方法
ウイルス感染
ベロ細胞を、ＭＷ６プレートの３つのウェルに４００  ０００個の細胞／ウェルでプレーティングして、２４時間後に１０６個の細胞／ウェルにした。
【０２７８】
次に、細胞を、１のＭＯＩ（感染多重度）でＴＢＥＶに感染させ、氷上で撹拌しながら１時間インキュベートした。
【０２７９】
１つのウェルでは、インキュベーションの直後に培地を除去し、細胞を、１ｍＬのＴＲＩｚｏｌで溶解し、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した（条件１）。
【０２８０】
他の２つのウェル（条件２および３）では、培地を除去し、ＭＥＭ＋２％のＦＢＳと交換し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０２８１】
４ｓＵ標識
このステップは、ＳＬＡＭｓｅｑ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｋｉｔ−Ａｎａｂｏｌｉｃ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｌｅｘｏｇｅｎ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ０６１）を使用して行った。
【０２８２】
細胞培養の間の細胞培養培地での４−チオウリジン（４ｓＵ）の組み込みは、４ｓＵヌクレオチドを新規に合成されるＲＮＡへ組み込ませる。
【０２８３】
８００μＭの４ｓＵを含む培地を、９９２μＬのＭＥＭにおいて１００ｎＭの４ｓＵを８μｌ添加することにより調製した。
【０２８４】
ウイルス感染の翌日に、培地を除去し、１つのウェルでは４ｓＵを含まない培地（条件２）または最後のウェルでは４ｓＵを含む培地（８００μｍ）（条件３）と交換した。６時間後に、培地を除去し、条件２では４ｓＵを含まない未処理の培地と交換し、条件３では未処理の４ｓＵを含む培地（８００μＭ）と交換した。
【０２８５】
３時間後に、培地を３つのウェルから除去し、細胞を、１ｍｌのＴＲＩｚｏｌで溶解し、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。
【０２８６】
ＲＮＡサンプリング
このステップは、ＳＬＡＭｓｅｑ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｋｉｔ−Ａｎａｂｏｌｉｃ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｌｅｘｏｇｅｎ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ０６１）を使用して行った。
【０２８７】
ＲＮＡ抽出を、暗室において、クロロホルム：イソアミルアルコール混合物２４：１（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ２５６６６）を使用して行い、次いでイソプロパノール／エタノール沈殿を行った。抽出の間、還元剤（ＲＡ）を使用して、４ＳＵで処理したサンプルを還元条件下に維持した。
【０２８８】
単離された総ＲＮＡは、既存の（非標識の）ＲＮＡおよび新規に合成された（標識された）ＲＮＡの両方を含む。
【０２８９】
アルキル化
このステップは、ＳＬＡＭｓｅｑ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｋｉｔ−Ａｎａｂｏｌｉｃ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｌｅｘｏｇｅｎ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ０６１）を使用して行った。
【０２９０】
条件３の抽出された総ＲＮＡを、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）と混合し、カルボキシアミドメチル基の付加を介して４ｓＵを含むヌクレオチドの４−チオール基を修飾させた。次にＲＮＡを、エタノール沈殿を使用して精製した後、ライブラリー調製に進ませた。
【０２９１】
ライブラリー調製
ＳＭＡＲＴｅｒ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｋｉｔ−Ｐｉｃｏ  Ｉｎｐｕｔ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を、１０ｎｇのＲＮＡで開始する直接的なライブラリーの構築に使用した。このキットで使用したワークフローは、哺乳類のｒＲＮＡおよび一部のミトコンドリアＲＮＡに特異的なプローブを使用してリボソームｃＤＮＡを枯渇させる所有権のある技術（ＰａｔｈｏＱｕｅｓｔ，  Ｐａｒｉｓ，  Ｆｒａｎｃｅ）を組み込んでいる。
【０２９２】
シーケンシング
シーケンシングは、ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００／５５０  Ｈｉｇｈ  Ｏｕｔｐｕｔ  ｋｉｔ  ｖ２（ＦＣ−４０４−２００２，  Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してＮｅｘｔＳｅｑ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で行った。
【０２９３】
シーケンシングは、１５０ヌクレオチドのリード長でシングルリードし、サンプルあたり約１億２５００万のリードを作製した。
【０２９４】
概要
以下の表１は、異なる条件（１、２、および３）で使用されたプロトコルをまとめている。
【表１】
2021527428.tif 000003
【０２９５】
バイオインフォマティクス解析−ＴＢＥＶゲノム解析
この試験の第１の目的は、参照として使用されるこの単離物の完全なＴＢＥＶゲノム配列を得ることであった。この解析は、０日目に、４ｓＵ処理を行っていない感染させたサンプルで行った。
【０２９６】
生のリードのフィルタリング
最初に、生のデータのリードをフィルタリングし、高品質かつ関連のあるリードを選択した。
【０２９７】
生のデータを、重複物、低質のリード、およびホモポリマーを抑制または切断するように選別した（所有権のあるソフトウェア）。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ライブラリー調製の間導入された配列（アダプター、プライマー）を、Ｓｋｅｗｅｒ（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  １５：１８２）で除去した。
【０２９８】
最終的に、ヒトのゲノム（参照ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）にアライメントした内因性霊長類のリード（ベロ細胞由来）または細菌性ｒＲＮＡにアライメントしたリードを、廃棄した。
【０２９９】
ローカルアライメントを、ＢＷＡ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ２５（１４）：１７５４−６０）で行った。
【０３００】
ヒトゲノムは、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（２００２．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １２（６）：９９６−１００６）からダウンロードした。細菌性ｒＲＮＡのデータは、ＥＭＢＬ−ＥＢＩ  ＥＮＡ  ｒＲＮＡのデータベースからダウンロードし、さらに内部で配列のクリーニングおよびクラスタリングプロセスを行った。
【０３０１】
これらフィルタリングしたリードを、目的の配列とみなした。
【０３０２】
Ｄｅ  ｎｏｖｏでのアセンブリ
次に、残存し関連するリードのセットを、コンティグと称されるより長い配列にアセンブリした。このｄｅ  ｎｏｖｏでのアセンブリのステップは、ＣＬＣ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｃｅｌｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行った。
【０３０３】
不可知論的なウイルスの同定
結果得られるコンティグおよびアセンブリされていないリード（シングルトン）を、ＢＬＡＳＴアライメント（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２１５（３）：４０３−１０）を使用して、ウイルスおよび総合的なデータベースにアライメントした。最初に、コンティグおよびシングルトンを、ウイルスのヌクレオチドのデータベースにアライメントした。１０−３未満のｅ値を有するヒットを、総合的なヌクレオチドのデータベースにアライメントした。それらの最良のヒットが依然としてウイルスの分類にあった場合、ヒットを報告した。
【０３０４】
ヌクレオチドのウイルスのデータベースおよび総合的なデータベースは、ＥＭＢＬ−ＥＢＩヌクレオチド配列データベースＳＴＤから２０１７年１１月にダウンロードした。所有権のあるソフトウェアを、重複物を除去し（短すぎる、複数の分類、低質の関連するキーワードなどのため）低い信頼度の配列を除去するように開発した。
【０３０５】
ウイルスのヌクレオチドのヒットを全く含まないコンティグを、同様に引き続き、ウイルスおよび総合的なタンパク質のデータベースにアライメントして、より明確に異なるウイルスのヒットを確認した。
【０３０６】
タンパク質のウイルスおよび総合的なデータベースは、Ｕｎｉｒｅｆ１００データベースから２０１７年１１月にダウンロードした。Ｕｎｉｒｅｆ１００データベースは、すでに冗長ではないが、最終的なデータベースを作成するために分類学的なクリーニングプロセスを行った。
【０３０７】
分類学的な割り当ては、最良のヒットの結果を報告した。これら２ラウンドのアライメント後に割り当てられなかったコンティグは、未知のウイルスまたは非ウイルス種と分類した。
【０３０８】
以下の表２は、この解析の結果を示す。
【表２】
2021527428.tif 000004
【０３０９】
ＴＢＥＶの最終的なコンセンサスな編集
このプロセスは、完全なＴＢＥＶゲノム配列を包有するコンティグを同定した。
【０３１０】
次に、全てのリードを、ＣＬＣ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｃｅｌｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてこの配列に再度アライメントし、最終的なコンセンサス配列を抽出した。この配列を、この試験で「ＴＢＥＶ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ」と命名した。
【０３１１】
バイオインフォマティクス解析−ヌクレオチド置換率の試験
この目的は、「Ｔ−Ｃ」置換率が、４ｓＵ＋アルキル化サンプル（条件３）で有意に高いかどうかを確認するために、異なるサンプル由来のリードを比較することであった。
【０３１２】
ダニ媒介性脳炎ウイルスのバンクの作製
「ＴＢＥＶ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ」配列を使用して、ブラストバンク（ｂｌａｓｔ  ｂａｎｋ）を作製した。
【０３１３】
非常に高い「Ｔ−Ｃ」置換率を有する見込みのある配列を検出するために、参照配列も同様に、全てのＴをＣで置換することにより修飾した。この配列は、「ＴＢＥＶ  Ｔ−Ｃ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ」と命名した。「ＴＢＥＶ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ」および「ＢＥＶ  Ｔ−Ｃ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ」の配列をまとめて混合し、単一の「ＴＢＥＶ  ＢＬＡＳＴ」バンクを作製した。
【０３１４】
生のリードのフィルタリング
初めに、質のフィルタリングのプロセスを行い、低質なリードを除去または調整（ｔｒｉｍ）した（所有権のあるソフトウェア）。
【０３１５】
次に、Ｉｌｌｕｍｉｎａのライブラリー調製の間に導入された配列（アダプター、プライマー）を、Ｓｋｅｗｅｒ（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  １５：１８２）を用いて除去した。
【０３１６】
全ての解析のバイアスを回避するために、重複したリードは除去しなかった。
【０３１７】
ＴＢＥＶブラストバンクでフィルタリングされたリードのブラスト
次に、残存し関連するリードのセットを、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２１５（３）：４０３−１０）により、以前に設計した「ＴＢＥＶ  ＢＬＡＳＴ」バンクにアライメントした。最大ｅ値を、１０−８に設定した。
【０３１８】
アライメントした全てのリードは、ＴＢＥＶ陽性とみなし、解析の次のステップのため選択した。
【０３１９】
ＴＢＥＶの完全なゲノム上での選択されたリードのマッピング
次に、ＴＢＥＶ陽性のリードを、「ＴＢＥＶ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ」配列上でＣＬＣ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｃｅｌｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてマッピングすることにより再度アライメントした。クオリティコントロールを、ｂｌａｓｔにより選択されたリードの少なくとも９９％が参照に正に再アライメントされることを確保するように設定した。
【０３２０】
以下の表３は、各条件で得られたマッピングされたセンスのリードおよびアンチセンスのリードの数、ならびに結果得られる配列のカバー度をまとめている。
【表３】
2021527428.tif 000005
【０３２１】
置換率の推定
ＣＬＣプログラム「ｃｌｃ＿ｆｉｎｄ＿ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ」を使用して、ＴＢＥＶ試験参照の各位置の全てのミスマッチを検出した。次に、全体的なバリエーションのプロファイルを、所有権のあるスクリプトにより解析し、各ヌクレオチドの置換率を定義した。置換されたヌクレオチドの比を、アライメントされたヌクレオチドの総数と比較した。通常、「Ｔ−Ｃ」置換率は、以下の式：
Ｔが予測された際に同定されるＣヌクレオチドの数／アライメントされたヌクレオチドの総数
を使用して計算した。
【０３２２】
ＴＢＥＶ鎖（Ｓｔｒａｎｄｅｄ）解析
目的の鎖の解析を、ＴＢＥＶの同定されたリードで行った。この解析は、よりストリンジェントなフィルタリングされたリードのマッピングアライメントを行う。このアライメントは、詳細な水平のゲノムのカバー度および深度のプロファイルを提供する。
【０３２３】
ローカルアライメントは、ＢＷＡ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ２５（１４）：１７５４−６０）で行った。
【０３２４】
サンプルのライブラリーはＳＭＡＲＴｅｒ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｋｉｔを使用して調製したため、ＲＮＡ鎖の情報は、保持された。よって、マッピングアライメント解析により、各鎖（親鎖に対してセンスまたはリバース）の親鎖の情報が提供された。
【０３２５】
転写物のカバー度により、細胞サンプルにおけるウイルスの複製のシグネチャーに関して結論付けることができた。
【０３２６】
結果および結論
条件３においてＴＢＥＶ参照ゲノムでマッピングしたミスマッチで計算された「Ｔ−Ｃ」置換率の、条件１においてＴＢＥＶ参照ゲノムでマッピングしたミスマッチで計算されたＴ−Ｃ置換率に対する比率は、７．８６：１に相当する（表４）。
【０３２７】
これは、組み込まれた４ｓＵを有するＴＢＥＶ  ＲＮＡ種の産生の増大を表し、よって、４ｓＵを含む培地における９時間のベロ細胞のインキュベーション中でのウイルスＲＮＡの新規合成を表している。
【０３２８】
よって、ここで例証された方法は、代謝標識を使用して、複製する（＋）ｓｓＲＮＡウイルス、ＴＢＥＶの検出を可能にする。
【表４】
2021527428.tif 000006
【０３２９】
実施例２：培養したベロ細胞での複製するリスザルレトロウイルス（ＳＭＲＶ）の検出
実施例１での不可知論的なウイルス同定の後に、最良のヒットの結果は、リスザルレトロウイルスに割り当てられたコンティグを示した。このウイルスは、内因性であり、一部のサル種に完全に統合されていることが知られている。特に、この試験で使用されるベロ細胞は、様々なサル内因性Ｄ型レトロウイルス配列、特にＳＭＲＶ配列を有することが記載されている（Ｓａｋｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１８．  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ８（１）：６４４）。
【０３３０】
この知識に基づき、上記の表２に示される結果の観点から、同じバイオインフォマティクスの手法を行い、ＳＭＲＶ配列のヒットを同定し、この配列ヒットでのヌクレオチドの置換率を試験した。
【０３３１】
以下の表５は、各条件で得られたマッピングされたセンスおよびアンチセンスのリードの数、ならびに得られた配列のカバー度をまとめている。
【表５】
2021527428.tif 000007
【０３３２】
条件３においてＳＭＲＶ参照ゲノムでマッピングしたミスマッチで計算された「Ｔ−Ｃ」置換率の、条件１においてＳＭＲＶ参照ゲノムでマッピングしたミスマッチで計算されたＴ−Ｃ置換率に対する比率は、４１．８６：１に相当する（表６）。
【０３３３】
これは、組み込まれた４ｓＵを有するＳＭＲＶ  ＲＮＡ種の産生の増大を表し、よって、４ｓＵを含む培地における９時間のベロ細胞のインキュベーション中でのウイルスＲＮＡの新規合成を表している。
【０３３４】
よって、ここで例証された方法は、代謝標識を使用して、複製する（＋）ｓｓＲＮＡウイルス、ＳＭＲＶの検出を可能にする。
【０３３５】
【表６】
2021527428.tif 000008
【０３３６】
実施例３：
材料および方法
細胞およびウイルス
ベロ細胞（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ−８１，  ｂａｔｃｈ  ＃６２４８８５３７，  Ｍｏｌｓｈｅｉｍ，  Ｆｒａｎｃｅ）のバイアルを、第３継代（ｐａｓｓａｇｅ  ３）で凍結し、次にＢＳＬ−３の研究室で解凍し、細胞を、１０％のＦＢＳを補充したＭＥＭで増殖させた。細胞は、第１８継代で使用した。
【０３３７】
ベロ細胞（ｂａｔｃｈ  ＃７０００５９０７）の第２のバイアルが、同じ供給源からもたらされ、ＰＣＲ試験に直接使用された。
【０３３８】
ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）は、ｓｓＲＮＡ（＋）ゲノムからなるフラビウイルス科のメンバーである。Ｈｙｐｒ株（Ｗａｌｌｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６．  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ７７（Ｐｔ  ５）：１０３５−４２）が、Ｓａｒａｈ  Ｍｏｕｔａｉｌｌｅｒ，  ＡＮＳＥＳ，  Ｍａｉｓｏｎｓ−Ａｌｆｏｒｔ，  Ｆｒａｎｃｅ）の厚意により供給された。
【０３３９】
ベロ細胞のＴＢＥＶ感染の同定
ベロ細胞を、ＭＷ６プレートの３つのウェルに４００  ０００個の細胞／ウェルでプレーティングして、２４時間後に１０６個の細胞／ウェルにした。次に、細胞を、１のＭＯＩ（感染多重度）でＨｙｐｒ株のＴＢＥＶに感染させ、氷上で撹拌しながら１時間インキュベートした。
【０３４０】
１つのウェルでは、培地をインキュベーションの直後に除去し、細胞を、１ｍＬのＴＲＩｚｏｌで溶解し、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した（条件「Ｄ０−４ＳＵなし」）。
【０３４１】
他の２つのウェル（条件２、３、および４）では、培地を除去し、ＭＥＭ＋１０％のＦＢＳと交換し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０３４２】
４ｓＵ標識およびＲＮＡ抽出
４−チオウリジンを細胞培養培地へ添加することにより、４ｓＵヌクレオチドを新規に合成したＲＮＡに組み込ませることが可能である。４ｓＵの逆転写は、特定のパーセンテージの、ｃＤＮＡでのＴ＞Ｃの移行をもたらす誤取り込みを呈し、これはシーケンシングにより同定され得る（Ｈｅｒｚｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １４（１２）：１１９８−１２０４）。
【０３４３】
８００μＭの４ｓＵを含む培地を、ＭＥＭ９９２μＬにおいて１００ｎＭの４ｓＵを８μＬ添加することにより調製した。ウイルス感染の翌日に、培地を除去し、１つのウェルでは４ｓＵを含まない培地（条件「Ｄ１−４ｓＵなし」）または他のウェルでは４ｓＵを含む培地（８００ｎＭ）（条件「Ｄ１−４ｓＵあり」）のいずれかと交換した。
【０３４４】
６時間後に、培地を除去し、条件「Ｄ１−４ｓＵなし」では４ｓＵを含まない未処理の培地と交換し、または条件「Ｄ１−４ｓＵあり」では未処理の４ｓＵを含む培地と交換した。
【０３４５】
３時間後に、培地を３つのウェルから除去し、細胞を１ｍＬのＴｒｉｚｏｌで溶解し、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。
【０３４６】
ＲＮＡ抽出を、暗室において、クロロホルム：イソアミルアルコール混合物２４：１（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ２５６６６）を使用して行い、次いでイソプロパノール／エタノール沈殿を行った、抽出の間、還元剤（ＲＡ）を使用して、４ＳＵで処理したサンプルを還元条件下に維持した。
【０３４７】
アルキル化を、条件「Ｄ１−４ｓＵ」の１つのパートのみで、ＳＬＡＭｓｅｑ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｋｉｔ−Ａｎａｂｏｌｉｃ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｌｅｘｏｇｅｎ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ０６１，  Ｖｉｅｎｎａ，  Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して行った。抽出した総ＲＮＡを、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）と混合して、カルボキシアミドメチル基の付加を介して４ｓＵを含むヌクレオチドの４−チオール基を修飾し、条件「Ｄ１−４ｓＵ＋アルキル化」をもたらした。このアルキル化は、逆転写の間にＴ＞Ｃの誤取り込みの頻度を増幅させる。他のパートを、「Ｄ１−４ｓＵありアルキル化なし」と称した。
【０３４８】
次に、ＲＮＡを、エタノール沈殿を使用して精製した後、ライブラリー調製に進ませた。
【０３４９】
ライブラリー調製およびシーケンシング
ＳＭＡＲＴｅｒ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｋｉｔ−Ｐｉｃｏ  Ｉｎｐｕｔ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＵＳＡ）を、１０ｎｇのＲＮＡで開始する直接的なライブラリーの構築で使用した。このキットで使用されるワークフローは、哺乳類のｒＲＮＡおよび一部のミトコンドリアＲＮＡに特異的なプローブを使用してリボソームｃＤＮＡを枯渇させる所有権のある技術（ＰａｔｈｏＱｕｅｓｔ，  Ｐａｒｉｓ，  Ｆｒａｎｃｅ）を組み込んでいる。シーケンシングは、ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００／５５０  Ｈｉｇｈ  Ｏｕｔｐｕｔ  ｋｉｔ  ｖ２（ＦＣ−４０４−２００２，  Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してＮｅｘｔＳｅｑ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）で行った。シーケンシングは、１５０ヌクレオチドのリード長でシングルリードし、サンプルあたり約１億２５００万のリードを作製した。
【０３５０】
不可知論的なバイオインフォマティクス解析
生のデータのリードをフィルタリングし、高品質かつ関連のあるリードを選択した。生のデータは、重複物、低質のリード、およびホモポリマーを抑制または切断するように選別した（ＰａｔｈｏＱｕｅｓｔの所有権のあるソフトウェア）。
【０３５１】
Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリーの調製の間に導入される配列（アダプター、プライマー）は、Ｓｋｅｗｅｒ（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  １５：１８２）を用いて除去した。
【０３５２】
ヒトのゲノム（参照ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）にアライメントした霊長類のリード（ベロ細胞由来）または細菌性ｒＲＮＡにアライメントしたリードを、廃棄した。ローカルアライメントを、ＢＷＡ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ２５（１４）：１７５４−６０）で行った。ヒトゲノムは、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（Ｋｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １２（６）：９９６−１００６）からダウンロードした。細菌性ｒＲＮＡデータベースは、最初に、ＥＭＢＬ−ＥＢＩ  ＥＮＡ  ｒＲＮＡデータベース（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｄａｔａｂａｓｅｓ／ｅｎａ／ｒＲＮＡ／ｒｅｌｅａｓｅ）からダウンロードし、次いで、内部でさらに配列のクリーニングおよびクラスタリングのプロセスを行った。これらフィルタリングされたリードを、目的の配列とみなし、ＣＬＣ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｃｅｌｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｈｉｌｄｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）で「コンティグ」と称されるより長い配列にアセンブリした。得られたコンティグおよびアセンブリされていないリード（シングルトン）を、ウイルスのデータベースおよび総合的なデータベース上にＢＬＡＳＴアライメント（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２１５（３）：４０３−１０）を使用してアライメントした。コンティグおよびシングルトンを、まず、ウイルスのヌクレオチドデータベースにアライメントした。１０−３未満のｅ値を有するヒットを、総合的なヌクレオチドデータベースにアライメントした。最良のヒットが依然としてウイルスの分類であった場合、ヒットを報告した。
【０３５３】
ヌクレオチドのウイルスデータベースおよび総合的なデータベースは、ＥＭＢＬ−ＥＢＩヌクレオチド配列データベースから２０１７年１１月にダウンロードした。所有権のあるソフトウェア（ＰａｔｈｏＱｕｅｓｔ，  Ｐａｒｉｓ，  Ｆｒａｎｃｅ）を、重複を除去し低い信頼度の配列（たとえば短すぎる、複数の分類、低質の関連するキーワード）を除去するように開発した。ウイルスのヌクレオチドのヒットを全く含まないコンティグを、同様に引き続き、ウイルスおよび総合的なタンパク質のデータベースにアライメントし、より明確に異なるウイルスのヒットを確認した。タンパク質のウイルスおよび総合的なデータベースは、Ｕｎｉｒｅｆ１００データベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）から２０１７年１１月にダウンロードした。Ｕｎｉｒｅｆ１００データベースは、すでに冗長ではないが、本発明者らは、最終的なデータベースを作成するために分類学的なクリーニングプロセスを利用した。分類学的な割り当ては、最良のヒットの結果を報告した。これら２ラウンドの割り当て後に割り当てられなかったコンティグは、未知のウイルスまたは非ウイルス種と分類した。
【０３５４】
上記のプロセスは、完全なＴＢＥＶゲノム配列を包有するコンティグを同定した（「結果」を参照）。次に、全てのリードを、この配列上にＣＬＣ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｃｅｌｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｈｉｌｄｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて再度アライメントし、最終的なコンセンサス配列を抽出した。条件「Ｄ０−４ｓＵなし」から回収したデータは、ＴＢＥＶおよびＳＭＲＶの全ゲノムをカバーするコンティグを同定することを可能にし、得られた配列は、それぞれ「ＴＢＥＶ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ」および「ＳＭＲＶ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ」と命名した。
【０３５５】
Ｔ＞Ｃ置換率の推定
非常に高い「Ｔ−Ｃ」置換率を有するウイルスの配列を検出するために、各参照配列を、同様に、全てのＴをＣで置換することにより修飾した。これら配列は、「ＴＢＥＶ  Ｔ−Ｃ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ」および「ＳＭＲＶ−Ｔ−Ｃ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ」と命名した。「ＴＢＥＶ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ」および「ＴＢＥＶ  Ｔ−Ｃ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ」ならびに「ＳＭＲＶ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ」および「ＳＭＲＶ  Ｔ−Ｃ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ」を、まとめて融合し、「ＴＢＥＶ  ＢＬＡＳＴ」および「ＳＭＲＶ  ＢＬＡＳＴ」と称される２つのバンクを形成した。次に、質をフィルタリングしたリードのセットを、これらの以前に設計された「ＢＬＡＳＴ」バンクを使用してＢＬＡＳＴによりアライメントを行った。最大ｅ値を、１０−８に設定した。アライメントされたリードのみを、解析の次のステップに選択した。
【０３５６】
ＣＬＣプログラム「ｃｌｃ＿ｆｉｎｄ＿ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ」を使用して、ＴＢＥＶ試験参照の各位置の全てのミスマッチを検出した。次に、グローバルなバリエーションのプロファイルを、所有権のあるスクリプト（ＰａｔｈｏＱｕｅｓｔ，  Ｐａｒｉｓ，  Ｆｒａｎｃｅ）により解析し、各ヌクレオチド置換率を定義した。置換されたヌクレオチドの比率を、アライメントされたヌクレオチドの総数と比較した。たとえば、「Ｔ−Ｃ」置換率は、以下の式：
Ｔ→Ｃ置換率＝Ｔが予測された際に同定されるＣヌクレオチドの数／予測されるＴの総数
を使用して計算した。
【０３５７】
各時点での置換率は、以下の置換指標：
Ｔ→Ｃ置換指標＝「Ｔ→Ｃ」の比率／平均（「Ｔ→Ａ」、「Ｔ→Ｇ」の比率）
で正規化した。
【０３５８】
標識化のクオリティコントロールのため、本発明者らは、参照としての標識されていない細胞を使用してエキソンのセットの平均置換指標を確認した。エキソンは、以下のＥｉｓｅｎｂｅｒｇ  ＆  Ｌｅｖａｎｏｎ（２０１３．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  ２９（１０）：５６９−７４）（ＲｅｆＳｅｑ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）により記載されるヒト遺伝子：Ｃ１ｏｒｆ４３（ＮＭ＿０１５４４９）、ＣＨＭＰ２Ａ（ＮＭ＿０１４４５３）、ＥＭＣ７（ＮＭ＿０２０１５４）、ＧＰＩ（ＮＭ＿０００１７５）から使用した。
【０３５９】
本発明者らは、これらヒトのエキソンを使用して、ベロ細胞由来の、Ｃｈｏｌｏｒｃｅｂｕｓ  ｓａｂｅｕｓのゲノムにおいてそれらの等価物を同定した。Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ｓａｂｅｕｓ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＧＣＦ＿０００４０９７９５．２）の完全なアセンブリは、ＮＣＢＩのアセンブリデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ａｓｓｅｍｂｌｙ／）から回収した。選択したヒトのエキソンを、ｍｉｎｉｍａｐ２（Ｌｉ，  ２０１８．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ３４（１８）：３０９４−３１００）を使用してＣ．ｓａｂｅｕｓのアセンブリ上にマッピングし、結果得られた．ｂａｍ  ｆｉｌｅを、ＢＥＤＴｏｏｌｓ  ｕｔｉｌｉｔｙ（Ｑｕｉｎｌａｎ  ＆  Ｈａｌｌ，  ２０１０．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ２６（６）：８４１−２）からのｂａｍｔｏｂｅｄ  ｍｏｄｕｌｅを使用して．ｂｅｄ  ｆｉｌｅに変換した。３０超のマッピングクオリティを有するヒットのみを保持し（４１エクソン）、対応する配列を、ＢＥＤＴｏｏｌｓ  ｕｔｉｌｉｔｙからのｇｅｔｆａｓｔａ  ｍｏｄｕｌｅを使用してＣ．  ｓａｂｅｕｓのアセンブリから抽出し、さらなる解析のため指標をつけた。標識化は、置換指標が１０超である場合、良好とみなした。
【０３６０】
鎖の解析
目的の鎖の解析を、同定されたＴＢＥＶのリードで行った。この解析は、よりストリンジェントなフィルタリングされたリードのマッピングアライメントに基づくものであり、このアライメントは、詳細な水平のゲノムのカバー度および深度のプロファイルを提供する。ローカルアライメントは、ＢＷＡで行った。サンプルのライブラリーはＳＭＡＲＴｅｒ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｋｉｔを使用して調製したため、ＲＮＡ鎖の情報は、同様に保持された。結果としてマッピングアライメント解析により、各鎖（親鎖に対してセンスまたはリバース）の親鎖の情報を提供することができた。
【０３６１】
結果
ベロ細胞での不可知論的なＲＮＡ−Ｓｅｑによる外来性（ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ）ウイルスの同定
最初にベロ細胞を、＋４℃で高用量のＴＢＥＶと接触させた（Ｄ０）。この温度では、細胞受容体に結合するウイルスのみが出現し、ウイルスの侵入は阻害される。よって、この実験的な状況は、複製しないウイルスのキャリーオーバーを模倣している。ＲＮＡを抽出し、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルス感染症のマーカーとしてシーケンシングした。不可知論的な解析の結果、ならびに不可知論的な解析により見出される２つの主なウイルス（ＴＢＥＶおよびＳＭＲＶ）のヒットに対するリードのマッピングの結果を、それぞれ表７および表８に示す。
【０３６２】
【表７】
2021527428.tif 000009
【０３６３】
【表８】
2021527428.tif 000010
2021527428.tif 000011
【０３６４】
Ｄ０で検出された主なウイルス種は、予測されるようにＴＢＥＶであったがまた予測外なことに、ＳＭＲＶであった（表７）。合計約１億５０００万の生のリードから１６０，０００超のＴＢＥＶのリード（表８）が同定され、これは全ゲノムをカバーする。次に、ベロ細胞を、ウイルスを侵入させるために３７℃にシフトし、次に、回収前に１日間インキュベートした。リードの数は、５２０万から６４０万へと記録されるＴＢＥＶのリードを著しく増大させた。さらに、ＳＭＲＶ−Ｈ（ヒトのリンパ系細胞株から同定されたＳＭＲＶ（Ｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  １６７（２）：４６８−７６）））に対してマッピングした１６０万〜１８０万のリードも同様に、回収の日とは無関係に同定された。これは、ＳＭＲＶの転写物が、ＴＢＥＶによる実験的な感染とは全く関係なく細胞により発現されたことを意味している。
【０３６５】
また本発明者らは、多くの他のヒットを同定した（表８）。主なさらなるヒットは、ベロ細胞の既知の内因性ウイルスである、ヒヒ内因性ウイルスであった（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ８５（１３）：６５７９−８８）。内因性ヒトレトロウイルスに対してマッピングした数百のリードが、同様に報告された。本発明者らの実験では、この知見は、霊長類／ヒトの細胞株で高頻度である。また本発明者らは、ガンマ線照射されたウシ血清の使用と通常関連する、数個のＢＶＤＶのリードを見出した。また本発明者らは、異なるヘルペスウイルスに対する数個のリード（＜５０）を同定し、バックグラウンドノイズとみなした。
【０３６６】
不活性な配列の細胞感染症対キャリーオーバーの区別
本発明者らの主な目的は、細胞の早期感染を検出するためＨＴＳの特質を試験しながら、細胞感染とキャリーオーバーを区別するため困難な条件を模倣することであったため、本発明者らは、＋４℃でウイルスの複製を阻害された高用量のＴＢＥＶと接触させた細胞の結果を、感染から２４時間後の同じ用量のウイルスで感染させた細胞の結果と比較した。前者はウイルスを不活性化させた細胞または遊離する核酸を模倣し、後者は、バンクへ預ける直前に感染した細胞を模倣していた。ＴＢＥＶはプラス鎖ｓｓＲＮＡウイルスであるため、マイナス鎖センスＲＮＡを、ウイルス複製のマーカーとして使用した。Ｄ１で試験した３つの条件（４ｕＳなし、４ｓＵ＋アルキル化、４ｓＵありアルキル化なし）は、Ｄ０での０．２７％と比較して０．３２〜０．３６％のリードがマイナス鎖であり、非常に小さいが著しく有意な差（カイ二乗検定、ｐ＜０．０００１）であったことを示した。この種の比較解析は、転写がマトリックスとしてＤＮＡプロウイルスを使用し、主にプラス鎖ではあるが同様にマイナス鎖のＲＮＡをもたらすレトロウイルスの、ＳＭＲＶによる細胞の慢性的な感染に適切ではない（Ｍａｎｇｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７．  Ｖｉｒｏｌ  Ｊ．  １４（１）：９）。
【０３６７】
次に、本発明者らは、新規に合成したＲＮＡの４ｓＵにより代謝標識した後の「Ｔ−Ｃ」置換のＴＢＥＶの比率を試験した（表９および図１）。
【０３６８】
【表９】
2021527428.tif 000012
【０３６９】
Ｄ１で、代謝標識の非存在下において、「Ｔ−Ｃ」の比率は、非常に低く（０．１３％）、「Ｔ−Ａ」または「Ｔ−Ｇ」の比率（０．０４−０．１３％）と同様であり、１．６８の計算されたバックグラウンドの置換指標をもたらした。同様の結果がＤ０から得られ、これは置換のバックグラウンドの良好な再現性を表している。
【０３７０】
上記とは明確に異なり、Ｄ１での標識しアルキル化されたＴＢＥＶのＲＮＡの「Ｔ−Ｃ」置換率は高く（０．７９％）、バックグラウンドと比較して３．８倍の、６．４の置換指標をもたらした。標識しアルキル化したＳＭＲＶ細胞のＤ１での置換指標は、２４．１６であり、バックグラウンドと比較して１０．７倍であった。
【０３７１】
代謝標識したＲＮＡと標識されていないＲＮＡの比較は、２つの培養条件を必要とする。結果として、本発明者らはまた、ＲＮＡのアルキル化を伴うかまたは伴わない、４ｓＵで標識した培養物に関してＤ１で得たＴＭＥＶおよびＳＭＲＶの置換指標を比較した。これは、１つの培養条件のみを必要とし、次いでＲＮＡ抽出およびアルキル化を行うか、または処理を行わない。ＲＮＡを４ｓＵで標識しアルキル化していない細胞での低レベルの置換は、潜在的なウイルスのヒットのｂｌａｓｔ解析による検出を損なうものではなかった（表８）。表９および図１Ｂに示されるように、４ｓＵで標識しアルキル化していないＲＮＡの置換指標は依然として低く、標識していない条件の指標と近かった（ＴＢＥＶおよびＳＭＲＶではそれぞれ１．７１および２．２７、アルキル化の条件ではそれぞれ４．０倍および１０．６倍増大する）。これは、同じ細胞培養物から抽出されたアルキル化されていないＲＮＡが、置換率を計算するために使用される参照のコンセンサスなウイルスバンクを確立するために使用され得ることを示唆している。よって、本発明者らの結果は、細胞の４ｓＵ標識化の後のＲＮＡ−ｓｅｑが、高いシグナル−バックグラウンドノイズ比で新規に合成されるウイルスのＲＮＡを特異的に同定できたことを示している。
【０３７２】
最後に、本発明者らはまた、ＴＢＥＶ（図２）およびＳＭＲＶ（図３）で、４ｓＵ標識化しアルキル化した細胞でのＴ→Ｃ置換率と同じ細胞で観察されるＴ→ＡおよびＴ→Ｇ置換の間の比率を比較した。
【０３７３】
これら比率を、表１０に提供する。１超の置換率は、サンプルにおいて活性な転写を表す。よってこれら結果は、本発明の方法が、単一の条件（Ｄ１−４ｓＵ＋アルキル化)で異なるヌクレオチドの置換率を比較することにより生きているＴＭＥＶおよびＳＭＲＶを区別および検出できることを明確に示している。
【０３７４】
【表１０】
2021527428.tif 000013
【０３７５】
実施例４：
材料および方法
細胞およびモリクテス
Ａ５４９（ＡＴＣＣ＿ＣＣＬ−１８５）細胞を、混入前に、ＤＭＥＭ−ダルベッコ改変イーグル培地において、６ウェルプレートで約７０％のコンフルエンスまで増殖させた。
【０３７６】
アコレプラズマ・ライドラウィー（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ）は、Ａ５４９細胞に感染させるために選択されたモリクテス綱の代表である。
【０３７７】
Ａ５４９細胞のＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ感染
約７０％のコンフルエンスで、Ａ５４９細胞の培養培地を、７％のウシ胎仔血清および１％のグルタミンを補充し、抗菌剤を含まないＭＥＭ−Ｅａｒｌｅ培地と交換した。０日目に、細胞を、様々な感染用量のＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉで感染させた（表１１）。５日目に、４−チオウリジン（４ｓＵ）（８００μＭ）を、上清を回収する９時間前、６時間前、および３時間前に培養培地に添加した。３７℃で５日間インキュベートした後に２ｍＬの培養培地を除去し、２００ｇで５分間遠心分離することにより清澄した。清澄した上清１ｍｌを、１０分間１５０００〜２００００ｇで遠心分離し、９００μＬの上清を除去し、ペレットを、残りの１００μＬの上清にホモジナイズした。次に、サンプルを、核酸抽出の前に凍結した。
【０３７８】
４−チオウリジン（４ｓＵ）を細胞培養培地に添加することにより、４ｓＵヌクレオチドを新規に合成されるＲＮＡに組み込ませることができる。４ｓＵの逆転写は、特定のパーセンテージの、ｃＤＮＡでのＴ→Ｃの移行をもたらす誤取り込みを呈し、これは、シーケンシングにより同定され得る（Ｈｅｒｚｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １４（１２）：１１９８−１２０４）。
【０３７９】
【表１１】
2021527428.tif 000014
【０３８０】
ＣＴＲＬ５Ｔａｇは、対照サンプルであり、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉで感染されておらず、５日目に４ＳＵで標識されている。
【０３８１】
ＬＣ５は、５日目に低濃度のＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉに感染させたサンプルである。
【０３８２】
ＬＣ５Ｔａｇは、低濃度のＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉに感染させ５日目に４ＳＵで標識したサンプルである。
【０３８３】
ＨＣ＿ＨＫ５ｔａｇは、感染前に加熱殺菌した高濃度のＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉに感染させ、５日目に４ＳＵで標識したサンプルである。
【０３８４】
ＨＣ＿Ｇ５ｔａｇは、感染前にゲンタマイシンで処理した高用量のＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉに感染させ、５日目に４ＳＵで標識したサンプルである。
【０３８５】
ＲＮＡ抽出
ＲＮＡ抽出を、暗室において、クロロホルム：イソアミルアルコール混合物２４：１（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ２５６６６，  Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＵＳＡ）を使用して行い、次いでイソプロパノール／エタノール沈殿を行った。抽出の間、還元剤を使用して、４ｓＵで処理したサンプルを還元条件下に維持した。
【０３８６】
アルキル化を、条件「Ｄ１−４ｓＵ」の１つのパートのみでＳＬＡＭｓｅｑ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｋｉｔ−Ａｎａｂｏｌｉｃ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｍｏｄｕｌｅ  （Ｌｅｘｏｇｅｎ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ０６１，  Ｖｉｅｎｎａ，  Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して行った。抽出した総ＲＮＡを、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）と混合して、カルボキシアミドメチル基の付加を介して４ｓＵを含むヌクレオチドの４−チオール基を修飾し、条件「Ｄ１−４ｓＵ＋アルキル化」をもたらした。このアルキル化は、逆転写の間Ｔ＞Ｃの誤取り込みの頻度を増幅させる。他のパートは、「Ｄ１−４ｓＵありアルキル化なし」と称した。
【０３８７】
次に、ＲＮＡを、エタノール沈殿を使用して精製した後に、ライブラリー調製に進ませた。
【０３８８】
ライブラリー調製およびシーケンシング
ＳＭＡＲＴｅｒ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｋｉｔ−Ｐｉｃｏ  Ｉｎｐｕｔ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＵＳＡ）を、１０ｎｇのＲＮＡで開始する直接的なライブラリーの構築のために使用した。細菌起源のリボソームＲＮＡ（１６Ｓおよび２３Ｓ）の枯渇は、Ｒｉｂｏｍｉｎｕｓ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｋｉｔ（ｔｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して総ＲＮＡで行った。哺乳類のｒＲＮＡおよび一部のミトコンドリアＲＮＡに特異的なプローブを使用したリボソームｃＤＮＡの枯渇も同様に行った（ＳＭＡＲＴｅｒ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｋｉｔに含まれる、製造者の推奨（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を使用しライブラリー調製の前）。シーケンシングを、ＮｅｘｔＳｅｑ  ｍｉｄ  ｏｕｔｐｕｔ  ｆｌｏｗ  ｃｅｌｌ（ＦＣ−４０４−１００１，  Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してＮｅｘｔ  Ｓｅｑ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）で行った。シーケンシングを、１５０ヌクレオチドのリード長でシングルリードし、サンプルあたり約１億２５００万のリードを作製した。
【０３８９】
不可知論的なバイオインフォマティクス解析
生のデータのリードをフィルタリングし、高品質かつ関連のあるリードを選択した。生のデータは、重複物、低質のリード、およびホモポリマーを抑制または切断するように選別した（ＰａｔｈｏＱｕｅｓｔの所有権のあるソフトウェア）。
【０３９０】
Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリーの調製の間に導入された配列（アダプター、プライマー）は、Ｓｋｅｗｅｒ（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  １５：１８２）を用いて除去した。
【０３９１】
最初に、ＬＣ５条件のフィルタリングしたリードを、目的の配列とみなした。この条件は、高い含有量の目的の生物の標識されていない配列を含む可能性が非常に高いため、これは、目的の生物（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓａｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ）のゲノムの再構築を可能にする。よって、ＬＣ５のリードを、Ｍｅｇａｈｉｔ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ３１（１０）：１６７４−１６７６）で「コンティグ」と称されるより長い配列にアセンブリした。次に、得られたコンティグを、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ株のＰＧ８Ａゲノム（ＲｅｆＳｅｑ  ＡｃｃＮｕｍ  ＣＰ０００８９６．１）上にｍｉｎｉｍａｐ２（Ｌｉ，  ２０１８．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ３４（１８）：３０９４−３１００）で逆にマッピング（ｍａｐｐｅｄ  ｂａｃｋ）した。次に、正のヒットを、Ｍｕｍｍｅｒ  ３（Ｋｕｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．  ５（２）：Ｒ１２）を使用してＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ株のＰＧ８Ａゲノムにタイル表示させ、
１．Ａ．  ｌａｉｄｌａｗｉｉとして潜在的に検出されるコンティグの同一性を確認し、
２．新規に構築される配列の完全性を確保した。
【０３９２】
コンティグの同一性が評価され、タイリングが検証された後、コンティグを、．ｆａｓｔａ  ｆｉｌｅにプールし、さらなる解析のための参照ゲノム（本明細書中以降でＬＣ５＿ＡＬＡＩＤ＿ＣＮＳと呼ばれる）として提供した。
【０３９３】
Ｔ＞Ｃ置換率の推定
非常に多数のＴ→Ｃ置換を有するＡ．  ｌａｉｄｌａｗｉｉ配列を検出するために、質によりフィルタリングされたリードのセットを、ｎｏｎ−ｍｕｌｔｉｍａｐ  ｍｏｄｅ（Ｌｉ，  ２０１８．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ３４（１８）：３０９４−３１００）にてｍｉｎｉｍａｐ２で、ＬＣ５＿ＡＬＡＩＤ＿ＣＮＳに対して逆にマッピングした。次に、ｈｔｓｂｏｘ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｌｈ３／ｈｔｓｂｏｘ）のｐｉｌｅｕｐ  ｍｏｄｕｌｅを使用して、ＬＣ５＿ＡＬＡＩＤ＿ＣＮＳ配列の全ての位置の全てのミスマッチ（少なくとも３０に相当するベースクオリティを有する）を検出した。次に、全体的なバリエーションのプロファイルを、所有権のあるスクリプト（ＰａｔｈｏＱｕｅｓｔ，  Ｐａｒｉｓ，  Ｆｒａｎｃｅ）を使用して解析し、各ヌクレオチドの置換率を定義した。置換されたヌクレオチドの比率を、アライメントされたヌクレオチドの総数と比較した。たとえば、Ｔ→Ｃ置換率は、以下の式：
Ｔ→Ｃ置換率＝Ｔが予測された際に同定されるＣヌクレオチドの数／予測されるＴの総数
を使用して計算した。
【０３９４】
各時点での置換率は、以下の置換指標：
Ｔ→Ｃ置換指標＝「Ｔ→Ｃ」比率／平均（「Ｔ→Ａ」、「Ｔ→Ｇ」の比率）
で正規化した。
【０３９５】
結果
シーケンシングのスループット
シーケンシングランのスループットを、表１２に報告する。ほぼ全ての条件で、１０００万超のシングルエンドリードがもたらされている。各条件では、リードの９０％超が、フィルタリングステップの後に保持されており、シーケンシングのランが高品質であり、よってその後の解析に適していることを表している。
【０３９６】
【表１２】
2021527428.tif 000015
【０３９７】
参照ゲノムの再構築
ＬＣ５のリードのアセンブリプロセスは、８７７のコンティグのセットの作製を可能にしたト（累積長  １，３７４，２１３、最小長＝２０１；平均長＝１，５６６．９；最大長＝１５，０４３）。Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉ  ＰＧ８Ａ（ＣＰ０００８９６．１）ゲノム配列上への再マッピングは、ＬＣ５＿ＡＬＡＩＤ＿ＣＮＳの再構築の候補として６６２のコンティグの明確な選択を可能にした（累積長  １，２８７，０２０；最小長＝３０１；平均長＝１，９４４．１；最大長＝１５，０４３）。最初の確認として、ＧＣ含有量分布および統計を、コンティグのセットにおける生物の可能性のある混合を証明するために調査した（図４）。
【０３９８】
図４にみられるように、ＧＣ含有量の分布は単峰性であり、コンティグのセットにおいていくつかの生物を代表するコンティグが存在する可能性が低いことを示唆している。さらに、このセットの平均ＧＣ含有量は、予測と有意に異なるものではない（Ａ．  ｌａｉｄｌａｗｉｉ  ｓｔｒ．  ＰＧ８Ａでは３２．０１％ｖｓ３１．９３％）。
【０３９９】
本発明者らがＡ．  ｌａｉｄｌａｗｉｉ  ｓｔｒ．  ＰＧ８Ａ近縁の全ゲノム（または少なくとも有意な一部）を再構築できたことを確かにするために、本発明者らは、ＬＣ５実験条件のリードの最初のアセンブリから選択されたコンティグで後者を「タイル表示させた（ｔｉｌｅｄ）」。この結果を図５に提示する。
【０４００】
図５に示されるように、６６２のコンティグのセットは、高い類似性（全ての場合で９９％超、データ不図示）でほぼ全てのＡ．  ｌａｉｄｌａｗｉｉ  ｓｔｒ．  ＰＧ８Ａをカバーしており、再構築されたＬＣ５＿ＡＬＡＩＤ＿ＣＮＳが、Ａ．  ｌａｉｄｌａｗｉｉ  ｓｔｒ．  ＰＧ８Ａの非常に近い近縁であることを強力に示唆している。
【０４０１】
結論として、本発明者らは、
１．Ａ．  ｌａｉｄｌａｗｉｉに対応するコンティグの明確なセットを選択でき
２．近縁（Ａ．  ｌａｉｄｌａｗｉｉ  ｓｔｒ．  ＰＧ８Ａ）の完全なゲノムをカバーできた。
【０４０２】
よってこのプロセスは、さらなる解析のため本発明者らの参照配列ＬＣ５＿ＡＬＡＩＤ＿ＣＮＳを立証している。
【０４０３】
置換率および指標
低くカバーされた位置は、良好にカバーされたものと同じ重みで説明されるため、比率の推定でバイアスを誘導し得る。実際にある位置が３回のみカバーされ、１度がＴ→Ｃ置換である場合、この位置のＴ→Ｃ置換率は、これが真の置換であり得るかまたはシーケンシング／アセンブリの誤りであり得るかのいずれかという事実にも関わらず、３３％である。したがって、置換率、よって置換指標の過大評価を回避するために、本発明者らは、全ての検出されたイベントを最初に選択し（すなわち少なくとも１回カバーされている（１Ｘ））、次に、少なくとも２０回（すなわち２０Ｘ）カバーされたイベントを選択する解析を行い、この後者を、著しく確信的なイベントとみなした。
【０４０４】
置換率および指標が表１３に報告されている。全体的に、本発明者らはここで、移行Ｔ→Ｃの比率が、トランスバージョン後に従来の変異パターンの好ましい移行として予測される、トランスバージョンＴ→ＡおよびＴ→Ｇの比率よりも常に高いことを示している。
【０４０５】
さらに、Ｔ→Ｃ置換率は、イベントの選択レベルが何であっても、他の全て条件（高充填の不活性化されたサンプル（ＨＣ＿ＨＫ５Ｔａｇ）を含む）と比較してＬＣ５ｔａｇおよび４０倍希釈したＬＣ５ｔａｇ条件で有意に高い。さらに、この解析で低くカバーされた位置の包含は、観察された比率が１Ｘおよび２０Ｘの閾値で有意に異なるものではなく、さらに後者はバックグラウンドノイズを限定するため、結果にほとんど影響しなかった。同じ傾向が、置換指標で観察可能である。
【０４０６】
【表１３】
2021527428.tif 000016
【０４０７】
結論として、報告された結果は、Ａ．ｌａｉｄｌａｗｉｉによりスパイクされおよび４ｓＵにより標識されると予測される実験がこのように検出されたことを示した。
【０４０８】
位置分析
本発明者らは、置換率および置換指標の全体的な増加を報告している。これら増加が、置換のホットスポットからもたらされているかどうかを調査するために、本発明者らは、ＬＣ５＿ＡＬＡＩＤ＿ＣＮＳ参照配列に沿って置換率を評価する位置分析を行った（図６Ａ〜Ｇ）。
【０４０９】
本発明者らは、一部のピークがこの条件を介して可視できるＣＴＲＬ５ｔａｇの実験条件におけるＡ．ｌａｉｄｌａｗｉｉのリードの存在が、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉでスパイクしていないことに気づいた（図６Ａ）。ほとんどの比率は１００％に達し、これら置換が実際に現実のＳＮＰであることが示唆される。この知見は、実験的なレベルでのコンタミネーションまたはサンプルをマルチプレックスする際のシーケンシングの段階の間の交差指標コンタミネーション（いわゆるｉｎｄｅｘ  ｈｏｐｐｉｎｇ）のいずれかを示唆した。にもかかわらず、これはきわめて限定された数の位置に関するものであるため、この分析を損なうものではなかった。
【０４１０】
図６Ｂは、全てのゲノムの位置が良好にカバーされている（すなわちカバー度の穴がない）ＬＣ５条件での置換のかなり低いバックグラウンドを示している。現実のドミナントな置換のタイプが可視できず、これは全体的な尺度の解析と一致している。対照的に、ＬＣ５ｔａｇおよび４０倍に希釈したＬＣ５ｔａｇの条件では、バックグラウンドから出現する大きなＴ→Ｃのピークを区別でき、標識の成功、よってＡ．  ｌａｉｄｌａｗｉｉにおける活性の転写が表されている（図６Ｃおよび６Ｄ）。
【０４１１】
図６Ｅおよび６Ｆは、Ａ．  ｌａｉｄｌａｗｉｉ細胞が熱により殺滅されている実験条件（ＨＣ＿ＨＫ５ｔａｇおよび４°ＨＣ＿ＨＫ５ｔａｇ）の４ｓＵ標識の結果を示す。両方の事例において、本発明者らは、ＬＣ５ｔａｇおよび４０Ｘ＿ＬＣ５ｔａｇの条件と比較して少数のピーク（特にＴ→Ｃピーク）を観察し、加熱後培地において少数の生きている細菌が残存しているため少数の抽出されたＲＮＡが確認された。
【０４１２】
同様に、ゲンタマイシン処理は、同じ効果（ＨＣ＿Ｇ５条件；図６Ｇ）があったが、ＨＣ＿ＨＫ５ｔａｇ実験条件（図６Ｅおよび６Ｆ）での熱の効果と比較して明らかに中程度であった。さらに、４ｓＵ標識は未だ可視でき、中程度の置換指標で全体的な解析を確認した（表１３）。
【０４１３】
実施例５
材料および方法
細胞およびモリテクス
Ａ５４９（ＡＴＣＣ＿ＣＣＬ−１８５）細胞を、コンタミネーション前に、ＤＭＥＭ−ダルベッコ改変イーグル培地において、６ウェルプレートで約７０％のコンフルエンスまで増殖させた。
【０４１４】
Ａ５４９細胞のＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ種またはマイコプラズマ種の感染
約７０％のコンフルエンスで、Ａ５４９細胞の培養培地を、７％のウシ胎仔血清および１％のグルタミンを補充し、抗菌剤を含まないＭＥＭ−Ｅａｒｌｅ培地と交換した。細胞を、様々な感染用量のＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ種またはマイコプラズマ種で感染させた
【０４１５】
ＣＴＲＬ５Ｔａｇ：Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ種またはマイコプラズマ種に感染させておらず、５日目に、４−ＳＵで標識した対照サンプル
ＬＣ５：低濃度のＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ種またはマイコプラズマ種に感染させたサンプル；
ＬＣ５Ｔａｇ：低濃度のＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ種またはマイコプラズマ種で感染させ、５日目に、４−ＳＵで標識したサンプル；
ＨＣ＿ＨＫ５ｔａｇ：感染前に加熱殺菌した高濃度のＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ種またはマイコプラズマ種に感染させ、５日目に、４−ＳＵで標識したサンプル；
ＨＣ＿Ｇ５ｔａｇ：感染前にゲンタマイシンで処理した高濃度のＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ種またはマイコプラズマ種に感染させ、５日目に、４−ＳＵで標識したサンプル
である、いくつかの条件が試験される。
【０４１６】
５日目に、４−チオウリジン（４ｓＵ）（８００μＭ）を、細胞の回収の９時間前、６時間前、および３時間前に培養培地に添加する。３７℃、５日間のインキュベーションの後、培養培地を除去し、細胞をペレット状にし、ＲＮＡ抽出前に凍結した。
【０４１７】
４−チオウリジン（４ｓＵ）を細胞培養培地に添加することにより、４ｓＵヌクレオチドを新規に合成されるＲＮＡに組み込ませることができる。４ｓＵの逆転写は、特定のパーセンテージのｃＤＮＡのＴ＞Ｃの移行をもたらす誤取り込みを呈し、これはシーケンシングにより同定され得る（Ｈｅｒｚｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １４（１２）：１１９８−１２０４）。
【０４１８】
ＲＮＡ抽出
ＲＮＡ抽出を、暗室において、クロロホルム：イソアミルアルコール混合物２４：１（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ２５６６６）を使用して行い、次いでイソプロパノール／エタノール沈殿を行う。抽出の間、還元剤（ＲＡ）を使用して、４ＳＵで処理したサンプルを還元条件下に維持する。
【０４１９】
アルキル化を、条件「Ｄ１−４ｓＵ」の１つのパートのみでＳＬＡＭｓｅｑ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｋｉｔ−Ａｎａｂｏｌｉｃ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｌｅｘｏｇｅｎ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ０６１，  Ｖｉｅｎｎａ，  Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して行う。抽出した総ＲＮＡを、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）と混合して、カルボキシアミドメチル基の付加を介して４ｓＵを含むヌクレオチドの４−チオール基を修飾し、条件「Ｄ１−４ｓＵ＋アルキル化」をもたらす。このアルキル化は、逆転写の間Ｔ＞Ｃの誤取り込みの頻度を増大させる。
【０４２０】
次に、ＲＮＡを、エタノール沈殿を使用して精製した後、ライブラリー調製に進ませる。
【０４２１】
ライブラリー調製およびシーケンシング
ＳＭＡＲＴｅｒ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｋｉｔ−Ｐｉｃｏ  Ｉｎｐｕｔ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＵＳＡ）を、１０ｎｇのＲＮＡで開始する直接的なライブラリーの構築のために使用する。細菌起源のリボソームＲＮＡ（１６Ｓおよび２３Ｓ）の枯渇は、Ｒｉｂｏｍｉｎｕｓ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｋｉｔ（ｔｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して総ＲＮＡで行った。哺乳類のｒＲＮＡおよび一部のミトコンドリアＲＮＡに特異的なプローブを使用したリボソームｃＤＮＡの枯渇も同様に行った（ＳＭＡＲＴｅｒ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｋｉｔに含まれる、製造者の推奨（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を使用しライブラリー調製の前）。シーケンシングを、ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００／５５０  Ｈｉｇｈ  Ｏｕｔｐｕｔ  ｋｉｔ  ｖ２（ＦＣ−４０４−２００２，  Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）で行う。シーケンシングを、１５０ヌクレオチドのリード長でペアエンドを行い、サンプルあたり約１億のリードを作製する。
【０４２２】
不可知論的なバイオインフォマティクス解析
生のデータのリードをフィルタリングし、高品質かつ関連のあるリードを選択する。生のデータは、重複物、低質のリード、およびホモポリマーを抑制または切断するように選別する（（ＰａｔｈｏＱｕｅｓｔの所有権のあるソフトウェア）。
【０４２３】
Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリーの調製の間に導入される配列（アダプター、プライマー）は、Ｓｋｅｗｅｒ（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  １５：１８２）を用いて除去する。
【０４２４】
陰性対照条件（標識されていないか、不活性化されているか、またはその両方）のフィルタリングしたリードを、最初に目的の配列と企図する。これら条件は、目的の生物の配列の著しい充填を含む可能性が非常に高いため、これは、目的の生物（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ種またはマイコプラズマ種）のゲノムの再構築を可能にする。よってこれらリードは、Ｍｅｇａｈｉｔ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ３１（１０）：１６７４−１６７６）で「コンティグ」と呼ばれるより長い配列にアセンブリされる。次に、得られたコンティグを、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  種またはマイコプラズマ種の菌株のＰＧ８Ａのゲノム（ＲｅｆＳｅｑ  ＡｃｃＮｕｍ  ＣＰ０００８９６．１）上にｍｉｎｉｍａｐ２  Ｌｉ，  ２０１８．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ３４（１８）：３０９４−３１００）で逆にマッピングする。次に、正のヒットを、Ｍｕｍｍｅｒ  ３（Ｋｕｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．  ５（２）：Ｒ１２）を使用してＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ種またはマイコプラズマ種の上に「タイル表示」させて、
１．Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ種またはマイコプラズマ種として潜在的に検出されるコンティグの同一性を確認し、
２．新規に構築された配列（本明細書中以降でＡＬＡＩＤ＿ＣＮＳと称される）の完全性を確保する。
【０４２５】
Ｔ＞Ｃ置換率の推定
非常に多数のＴ→Ｃ置換を有するＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ種またはマイコプラズマ種を検出するために、質でフィルタリングされたリードのセットを、ｎｏｎ−ｍｕｌｔｉｍａｐ  ｍｏｄｅのｍｉｎｉｍａｐ２（Ｌｉ，  ２０１８．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ３４（１８）：３０９４−３１００）でＡＬＡＩＤ＿ＣＮＳに逆にマッピングする。次に、ｈｔｓｂｏｘ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｌｈ３／ｈｔｓｂｏｘ）のｐｉｌｅｕｐ  ｍｏｄｕｌｅを使用して、ＡＬＡＩＤ＿ＣＮＳ配列の全ての位置の全てのミスマッチ（少なくとも３０に相当するベースクオリティを有する）を検出する。次に、全体的なバリエーションのプロファイルを、所有権のあるスクリプト（ＰａｔｈｏＱｕｅｓｔ，  Ｐａｒｉｓ，  Ｆｒａｎｃｅ）を使用して解析し、各ヌクレオチドの置換率を定義する。置換されたヌクレオチドの比率を、アライメントしたヌクレオチドの総数と比較する。たとえば、Ｔ→Ｃ置換率は、以下の式：
Ｔ→Ｃ置換率＝Ｔが予測された際に同定されるＣヌクレオチドの数／予測されるＴの総数
を使用して計算する。
【０４２６】
各時点での置換率は、以下の置換指標：
Ｔ→Ｃ置換指標＝「Ｔ→Ｃ」比率／平均（「Ｔ→Ａ」、「Ｔ→Ｇ」の比率）
で正規化する。
【図１Ａ】
2021527428.tif 000017
【図１Ｂ】
2021527428.tif 000018
【図２】
2021527428.tif 000019
【図３】
2021527428.tif 000020
【図４】
2021527428.tif 000021
【図５】
2021527428.tif 000022
【図６Ａ】
2021527428.tif 000023
【図６Ｂ】
2021527428.tif 000024
【図６Ｃ】
2021527428.tif 000025
【図６Ｄ】
2021527428.tif 000026
【図６Ｅ】
2021527428.tif 000027
【図６Ｆ】
2021527428.tif 000028
【図６Ｇ】
2021527428.tif 000029
【国際調査報告】
2021527428.tif 000030
2021527428.tif 000031
2021527428.tif 000032
2021527428.tif 000033
2021527428.tif 000034