(57)【要約】  核酸ライブラリを生成する方法が提供される。方法は、一本鎖核酸結合タンパク質に結合した一本鎖核酸（ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ）、アダプターオリゴヌクレオチド、およびスプリントオリゴヌクレオチドを組み合わせて、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域とアダプターオリゴヌクレオチドとにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体を形成することを含む。第１のアダプターオリゴヌクレオチドの末端は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの第１の末端領域の末端に隣接し、方法は、隣接する末端を共有結合させることをさらに含み得る。例えば本開示の方法の実施において用途を見出す、組成物およびキットも提供される。【選択図】図１
2021526798.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸ライブラリを生成する方法であって、
一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と接触させて、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡを生成することと、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ、
第１のアダプターオリゴヌクレオチド、ならびに
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第１のスプリントオリゴヌクレオチド
を組み合わせることと、
を含み、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介して前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域にハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドと、前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体を形成し、これにより、前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドの末端が前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記末端領域の末端に隣接する、方法。
【請求項２】
前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドおよびＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記隣接する末端を共有結合させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記接触、組み合わせること、および共有結合のステップの合計持続時間が、３時間以下である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記複合体が、前記ＳＳＢと接触された前記ｓｓＮＡの８０％以上から形成される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ｓｓＮＡが、分解された核酸試料からのものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ｓｓＮＡが、古代核酸試料からのものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ｓｓＮＡが、法医学核酸試料からのものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ｓｓＮＡが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ｓｓＤＮＡは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に由来するものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｓｓＤＮＡをＳＳＢと接触させる前に、前記ｄｓＤＮＡを変性させることによって前記ｓｓＤＮＡを生成することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記複合体の形成後、前記ｓｓＤＮＡを再ハイブリダイズさせて、ｄｓＤＮＡを生成することをさらに含む、請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生成されたｄｓＤＮＡを配列決定することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記生成されたｄｓＤＮＡのサブサンプルが配列決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｓｓＮＡが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記組み合わせることが、
前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体と、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと
を組み合わせることを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記組み合わせることが、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介して前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡにハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体と、
前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドと
を組み合わせることを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記組み合わせることが、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと、
第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第２のスプリントオリゴヌクレオチドと
を組み合わせることをさらに含み、
前記形成された複合体が、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡのうち前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記末端領域とは反対側の末端領域に、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介してハイブリダイズされた前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドと、前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドをさらに含み、これにより、前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドの末端が、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡのうち前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドに隣接する前記末端とは反対側の末端に隣接する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２のアダプターオリゴヌクレオチドおよびＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記隣接する末端を共有結合させることをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記共有結合させることが、前記隣接する末端をライゲーションすることを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ライゲーションが、酵素ライゲーションによって行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端が、ブロッキング修飾を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ブロッキング修飾が、ライゲーションをブロックする修飾である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端における３’ＯＨの不在、および、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨからなる群から選択される、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨであり、前記ブロッキング修飾が、アミノ修飾因子、スペーサー、ジデオキシ塩基、反転ジデオキシ塩基、および３’ホスフェートからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ランダム配列を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ユニバーサル塩基を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域の長さが、１０ヌクレオチド以下である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記アダプターオリゴヌクレオチドが、ＰＣＲ増幅のためのアダプターまたはその相補体を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記アダプターオリゴヌクレオチドが、部分的もしくは完全な配列決定アダプターまたはその相補体を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｓｓＮＡの少なくとも一部分またはその誘導体を配列決定することをさらに含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
一本鎖核酸結合タンパク質に結合した一本鎖核酸（ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ）と、
第１のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第１のスプリントオリゴヌクレオチドと
を含む、組成物。
【請求項３２】
第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第２のスプリントオリゴヌクレオチドと
をさらに含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ｓｓＮＡが、分解された核酸試料からのものである、請求項３１または請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ｓｓＮＡが、古代核酸試料からのものである、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ｓｓＮＡが、法医学核酸試料からのものである、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ｓｓＮＡが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ｓｓＤＮＡが二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に由来するものである、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ｓｓＮＡが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）である、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
アダプターオリゴヌクレオチド末端を、前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端に共有結合させるための試薬をさらに含む、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記試薬が、リガーゼである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と、
第１のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第１のスプリントオリゴヌクレオチドと、
前記ＳＳＢ、第１のアダプターオリゴヌクレオチド、および第１のスプリントオリゴヌクレオチドを使用して核酸ライブラリを生成するための指示と
を含む、キット。
【請求項４２】
第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第２のスプリントオリゴヌクレオチドと
をさらに含み、
前記指示が、前記ＳＳＢ、第１のアダプターオリゴヌクレオチド、第１のスプリントオリゴヌクレオチド、第２のアダプターオリゴヌクレオチド、および第２のスプリントオリゴヌクレオチドを使用して核酸ライブラリを生成するためのものである、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
前記ＳＳＢが、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質である、請求項４１または４２に記載のキット。
【請求項４４】
前記ＳＳＢが、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質である、請求項４１または４２に記載のキット。
【請求項４５】
アダプターオリゴヌクレオチドの末端を、一本鎖核酸結合タンパク質に結合した一本鎖核酸（ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ）の末端に連結するための試薬をさらに含む、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４６】
前記試薬が、リガーゼである、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
アダプターオリゴヌクレオチドの末端が、ブロッキング修飾を含む、請求項４１〜４６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４８】
前記ブロッキング修飾が、ライゲーションをブロックする修飾である、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端における３’ＯＨの不在、および、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨからなる群から選択される、請求項４７または請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な３’ＯＨであり、前記ブロッキング修飾が、アミノ修飾因子、スペーサー、ジデオキシ塩基、反転ジデオキシ塩基、および３’ホスフェートからなる群から選択される、請求項４７または請求項４８に記載のキット。
【請求項５１】
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ランダム配列を含む、請求項４１〜５０に記載のキット。
【請求項５２】
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ユニバーサル塩基を含む、請求項４１〜５１に記載のキット。
【請求項５３】
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域の長さが、１０ヌクレオチド以下である、請求項４１〜５２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年６月６日に出願された米国仮特許出願第６２／６８１，５２４号の利益を主張し、その出願はその全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
核酸配列決定は、診断および他の用途での使用により、ますます重要な遺伝子研究の分野となっている。一般に、核酸配列決定は、ＲＮＡまたはＤＮＡの断片などの核酸のヌクレオチドの順序を決定することからなる。相対的に短い配列が典型的に分析され、得られた配列情報は、断片が誘導されたはるかにより広範な長さの遺伝子材料の配列を確実に決定するために、断片を参照配列に対して整列させるか、または断片を論理的に一緒に適合させるために、様々なバイオインフォマティクス方法において使用され得る。特徴的断片の自動コンピュータベースの検査が開発され、ゲノムマッピング、個体間の遺伝的変異の分析、遺伝子およびそれらの機能の識別などに最近より使用されている。
【０００３】
高スループットＤＮＡ配列決定に用いられるいくつかの方法は、ユニバーサル増幅反応に依存し、それによって、ＤＮＡ試料はランダムに断片化され、次いで、異なる断片の末端がすべて同じＤＮＡ配列を含むように処理される。ユニバーサル末端を有する断片は、単一の増幅プライマー対を有する単一の反応において増幅され得る。ＰＣＲによって増幅される標的の末端へのユニバーサルプライミング配列の付加は、様々な方法によって達成され得る。例えば、その５’末端にユニバーサル配列およびその３’末端に縮重配列を有するユニバーサルプライマーを使用して、複雑な標的配列または標的配列の複雑な混合物からランダムに断片を増幅することができる。プライマーの３’縮重部分は、ＤＮＡ上のランダムな位置でアニーリングし、伸長して、その５’末端にユニバーサル配列を有する標的のコピーを生成することができる。
【０００４】
あるいは、ユニバーサルプライミング配列を含むアダプターを標的配列の末端にライゲーションすることができる。１つ以上のアダプターが、標的配列とのライゲーション反応において使用され得る。ユニバーサル増幅のための１つ以上のアダプター配列のライゲーションを介して核酸配列決定ライブラリを調製するための現在の方法に関連する欠点は、かかる方法によって必要とされる時間および費用である。
【発明の概要】
【０００５】
核酸ライブラリを生成する方法が提供される。方法は、一本鎖核酸結合タンパク質に結合した一本鎖核酸（ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ）、アダプターオリゴヌクレオチド、およびスプリント（splint：添え木）オリゴヌクレオチドを組み合わせて、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域とアダプターオリゴヌクレオチドとにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体を形成することを含む。第１のアダプターオリゴヌクレオチドの末端（ｅｎｄ）は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの第１の末端領域（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ）の末端に隣接しており、方法は、隣接する末端を共有結合させることをさらに含み得る。例えば本開示の方法の実施において用途を見出す、組成物およびキットも提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】本開示の一実施形態による核酸ライブラリを生成する方法の概略図。
【図２】分解ＤＮＡ（上部パネル）および現代ＤＮＡ（下部パネル）についての、他の方法と本開示の例示的な方法の比較。
【図３】毛髪ＤＮＡ長さ分布。左のパネルは、現代の毛髪ＤＮＡからＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ法（ＳＲＬ３）によって生成されたテンプレート分子の観察された長さを示す。毛髪軸中のＤＮＡについて予想されるように、インタクトな分子の長さは概して短い。同様の長さ分布が右パネルに示される（ＳＲＬ４）。
【図４】ＳＲＬ３およびＳＲＬ４における推定ライブラリ複雑度（固有の分子の数）。
【図５】ライブラリの複雑度比較。配列決定ライブラリは、本開示の例示的な方法、ＳＳ２．０、ＢＥＳＴ、およびフォーク型アダプターライゲーションを使用して作製した。ライブラリの複雑度（ライブラリ中の固有の分子の数）は、３つ組の実験において、Ｐｒｅｓｅｑ（左）を用いて、またはｑＰＣＲ（右）を介して、数百万のリードから推定した。本開示の例示的な方法は、次の最良のプロトコルであるＳＳ２．０よりも２〜３倍多くの抽出ＤＮＡを配列決定ライブラリに変換する。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
核酸ライブラリを生成する方法が提供される。方法は、一本鎖核酸結合タンパク質に結合した一本鎖核酸（ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ）、アダプターオリゴヌクレオチド、およびスプリントオリゴヌクレオチドを組み合わせて、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域とアダプターオリゴヌクレオチドとにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体を形成することを含む。第１のアダプターオリゴヌクレオチドの末端は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの第１の末端領域の末端に隣接しており、方法は、隣接する末端を共有結合させることをさらに含み得る。例えば本開示の方法の実施において用途を見出す、組成物およびキットも提供される。
【０００８】
本開示の方法、組成物、およびキットをより詳細に記載する前に、当該方法、組成物、およびキットは、記載される特定の実施形態に限定されず、当然のことながら変更され得ることが理解されるべきである。当該方法、組成物、およびキットの範囲は添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのものに過ぎず、限定的であることは意図していないこともまた理解されたい。
【０００９】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の、文脈上他に明確な指示のない限り下限の単位の１０分の１までの、各介在値、およびいずれかの他の記載された値またはその記載された範囲内の介在値が、方法、組成物、およびキットに包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲に含まれ得、記載された範囲内のいずれかの特に除外された限界を除き、それらも方法、組成物、およびキット内に包含される。記載された範囲が一方または両方の限界を含む場合、それらの含まれる限界のうちの一方または両方を除外する範囲もまた、方法、組成物、およびキットに含まれる。
【００１０】
特定の範囲は、数値の前に「約」という用語が付されて本明細書で提示される。本明細書に使用される「約」という用語は、それが先行する正確な数、ならびにその用語が先行する数に近いかまたはほぼ等しい数のための文言的サポートを提供する。ある数が特定の明記された数に近いかあるいはほぼ等しいかを決定するにあたり、近いかあるいはほぼ等しいが明記はされていない数は、それが提示されている文脈において具体的に明記された数と実質的に等価な数であり得る。
【００１１】
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、当該方法、組成物、およびキットが属する当該技術分野における当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等のいかなる方法、組成物、およびキットもまた、当該方法、組成物、およびキットの実施または試験に使用することができるが、代表的な例示的方法、組成物、およびキットについてここで記載する。
【００１２】
本明細書に引用されるすべての刊行物および特許は、それぞれ個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれ、その刊行物が引用されたところの関連する方法および／または材料を開示かつ記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。あらゆる刊行物の引用は、出願日前のその開示についてであり、提供される刊行日は独立して確認する必要があり得る実際の刊行日とは異なる可能性があるため、本方法、組成物、およびキットが、このような刊行物に先行する権利がないと認めるものと解釈されるべきではない。
【００１３】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。請求項は任意の要素を排除するように作成されてもよいことにさらに留意されたい。したがって、この記述は、請求項の要素の列挙に関連して「専ら」、「のみ」などのような排他的な用語の使用または「負の」限定の使用のための文言的根拠としての役割を果たすことを意図している。
【００１４】
明瞭さのために、別々の実施形態の文脈で記載される、方法、組成物、およびキットの特定の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔さのために、単一の実施形態の文脈で記載される、方法、組成物、およびキットの様々な特徴はまた、別々に、またはいずれかの適切な部分的組み合わせで提供され得る。実施形態のすべての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、本明細書において、このような組み合わせは、実施可能なプロセスおよび／または組成物を内包する限り、まさに各々およびすべての組み合わせが個別かつ明示的に開示されているかのように開示されている。加えて、こうした変形を記載する実施形態において列挙されるすべての部分的組み合わせも、本方法、組成物、およびキットによって具体的に包含され、本明細書において、まさに各々およびすべてのこのような部分的組み合わせが本明細書に個別かつ明示的に開示されているかのように開示されている。
【００１５】
本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に説明され例証された個々の実施形態のそれぞれは、本方法の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得る、または組み合わせられ得る個別の要素および特徴を有する。任意の記載された方法は、列挙された事象の順序で、または論理的に可能な他の順序で実施することができる。
【００１６】
方法
上に要約されるように、本開示は、核酸ライブラリを生成する方法を提供する。方法は、一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と接触させて、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡを生成することを含む。方法は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと、第１のアダプターオリゴヌクレオチドと、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む第１のスプリントオリゴヌクレオチドとを組み合わせることをさらに含む。組み合わせることは、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介してＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域にハイブリダイズされた第１のスプリントオリゴヌクレオチドと、第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して第１のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたその第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体の形成をもたらし、これにより、第１のアダプターオリゴヌクレオチドの末端がＳＳＢ結合ｓｓＮＡの第１の末端領域の末端に隣接する。いくつかの実施形態では、組み合わせることは、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと、第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む第２のスプリントオリゴヌクレオチドとを組み合わせることをさらに含み、形成された複合体は、第１のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた末端領域の反対側のＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域に、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介してハイブリダイズされた第２のスプリントオリゴヌクレオチドと、第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して第２のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたその第２のスプリントオリゴヌクレオチドをさらに含み、これにより、第２のアダプターオリゴヌクレオチドの末端が、第１のアダプターオリゴヌクレオチドに隣接する末端の反対側のＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端に隣接する。
【００１７】
第２のアダプターオリゴヌクレオチドおよび第２のスプリントオリゴヌクレオチドを用いる例示的な一実施形態を、図１に概略的に示す。この実施例では、ｓｓＮＡは、ｄｓＮＡを変性させることによってｄｓＮＡから生成される（例えば、ｄｓＤＮＡから生成されるｓｓＤＮＡ）。図１の上部に示されるのは、ｄｓＮＡ  １０２である。ＤｓＮＡ  １０２が変性した際に、得られたｓｓＮＡを一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と接触させて、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡを生成する。図１に示されるのは、ｄｓＮＡ  １０２の鎖に由来するＳＳＢ結合ｓｓＮＡ  １０４である。この実施例では、ｓｓＮＡ  １０４は、第１のスプリントオリゴヌクレオチド１０８にハイブリダイズされた第１のアダプターオリゴヌクレオチド１０６、および第２のスプリントオリゴヌクレオチド１１２にハイブリダイズされた第２のアダプターオリゴヌクレオチド１１０と組み合わされる。第１のスプリントオリゴヌクレオチド１０８の、第１のアダプターオリゴヌクレオチド１０６へのハイブリダイゼーションは、第１のスプリントオリゴヌクレオチド１０８の第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域１１４を介する。第２のスプリントオリゴヌクレオチド１１２の、第２のアダプターオリゴヌクレオチド１１０へのハイブリダイゼーションは、第２のスプリントオリゴヌクレオチド１１２の第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域１１６を介する。第１のスプリントオリゴヌクレオチド１０８および第２のスプリントオリゴヌクレオチド１１２の、ＳＳＢ結合ＮＡ  １０４、第１のアダプター領域１０６、および第２のアダプター領域１１０とのハイブリダイゼーションは、複合体１２２を形成する。第１のスプリントオリゴヌクレオチド１０８の、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ  １０４の５’末端領域へのハイブリダイゼーションは、第１のスプリントオリゴヌクレオチド１０８の第１のＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域１１８を介する。第２のスプリントオリゴヌクレオチド１１２の、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ  １０４の３’末端領域へのハイブリダイゼーションは、第２のスプリントオリゴヌクレオチド１１２の第２のＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域１２０を介する。スプリントオリゴヌクレオチドは、スプリントオリゴヌクレオチドのＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域がＳＳＢ結合ｓｓＮＡのそれらの対応する末端領域にハイブリダイズされるとき、アダプターオリゴヌクレオチドの末端がＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端に隣接するように設計される。隣接する末端の位置はアスタリスクで示されている。これらの隣接する末端は、共有結合して（例えば、酵素的ライゲーションによって）、アダプター付ｓｓＮＡ（例えば、図１に示されるアダプター付ｓｓＮＡ  １２４）を生成することができ、次いで、アダプター付ｓｓＮＡのアダプター部分における１つ以上の配列によって促進される目的の下流アプリケーション（例えば、ＰＣＲ増幅、次世代配列決定、および／または同等物）で使用され得る。図１に示されるように、隣接する末端の共有結合の際に、任意のクリーンアップステップを実行して、アダプター付ｓｓＮＡを、形成された複合体の１つ以上の試薬または構成成分、例えば、共有結合に使用される酵素、スプリントオリゴヌクレオチド、ＳＳＢ、および／または同等物から分離し得る。かかるクリーンアップステップのための好適なアプローチとしては、これらに限定されないが、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ−例えば、磁気ビーズを使用する）および核酸カラム精製が挙げられる。図１に示される例では、ブロッキング修飾（blocking modification）が、スプリントオリゴヌクレオチドの各末端に存在し（黒色の長方形）、ブロッキング修飾は、各アダプターオリゴヌクレオチドの、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端にさらに存在する（黒色の長方形）。ブロッキング修飾は、オリゴヌクレオチドおよびｓｓＮＡのそれらの末端へのライゲーションを防止する。
【００１８】
上に要約されるように、１つ以上のアダプター配列のライゲーションを介して核酸配列決定ライブラリを調製するための現在の方法に関連する欠点は、かかる方法によって必要とされる時間および費用を含む。本開示の方法は、Ｇａｎｓａｕｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４５（１０）：ｅ７９によって記載されるアプローチ（「ｓｓＤＮＡ２．０」と指定される）などの、一本鎖ライブラリ調製に対する現在の最先端のアプローチの改善を構成し、本方法は、驚くべきことに、より効率的であり、より少ない時間を必要とし、コストを低減することが見出された。本開示の方法の態様は、ここでさらに詳細に説明される。
【００１９】
主題の方法は、一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と接触させて、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡを生成することを含む。「一本鎖核酸」または「ｓｓＮＡ」とは、それらの長さの７０％以上にわたって一本鎖である（すなわち、分子間または分子内でハイブリダイズされていない）ポリヌクレオチドの集合を意味する。いくつかの実施形態では、ｓｓＮＡは、ポリヌクレオチドの長さの７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上にわたり一本鎖である。ある特定の態様では、ｓｓＮＡは、ポリヌクレオチドの全長にわたり一本鎖である。
【００２０】
ｓｓＮＡは、これらに限定されないが、単一の細胞、複数の細胞（例えば、培養細胞）、組織、器官、または生物（例えば、細菌、酵母など）から単離された核酸試料を含む、目的の任意の核酸試料であり得る（またはそれから調製され得る）。例示的な試料タイプとしては、これらに限定されないが、血液、血清、唾液、痰、尿、排泄物、嘔吐物、粘液、毛髪、爪（例えば、指の爪、足の爪）、スワブ（例えば、頬スワブ、咽頭スワブ、膣スワブ）、生検組織（例えば、パンチ生検、細針生検、細針吸引生検）、細胞培養、環境試料（例えば、水、土壌、空気、表面、タッチＤＮＡ）、およびメタゲノム試料が挙げられる。ある特定の態様では、核酸試料は、動物の単一の細胞、細胞の集合、組織、器官、および／または同等物から単離される。いくつかの場合では、核酸試料は、これらに限定されないが、胎児無細胞核酸（例えば、無細胞胎児ＤＮＡ（ｃｆｆＤＮＡ））または循環腫瘍核酸（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ））などの無細胞核酸（例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ））を含む。いくつかの実施形態では、動物は、哺乳動物（例えば、ヒト属からの哺乳動物、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、または目的の任意の他の哺乳動物）である。他の態様では、核酸試料は、細菌、酵母、昆虫（例えば、ショウジョウバエ）、両生類（例えば、カエル（例えば、アフリカツメガエル））、ウイルス、植物、または任意の他の非哺乳動物の核酸試料源などの、哺乳動物以外の供給源から単離される／得られる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ｓｓＮＡは、分解核酸試料からのものである。本明細書で使用される場合、「分解核酸試料」は、酵素的、物理的、化学的、または他のプロセスによって断片化されたＤＮＡの試料である。分解核酸試料の例は、骨残留物から回収されたＤＮＡ断片、毛髪、血漿からの無細胞ＤＮＡ、または土壌もしくは水から回収された環境ＤＮＡである。ある特定の態様では、ｓｓＮＡが、分解核酸試料からのものであるとき、ｓｓＮＡは、古代核酸試料からのものである。「古代核酸試料」とは、生物学的残留物から回収された核酸断片を意味する。目的の古代核酸試料の非限定的な例は、絶滅した生物または動物、例えば、絶滅した哺乳動物から得られる（例えば、単離される）核酸試料である。ある特定の態様では、絶滅した哺乳動物は、ヒト属からのものである。いくつかの実施形態では、ｓｓＮＡは、法医学核酸試料からのものである。本明細書で使用される場合、「法医学核酸試料」は、犯罪の調査に関連する（例えば、その過程で得られた）核酸試料である。
【００２２】
ある特定の態様では、ｓｓＮＡは、腫瘍核酸試料（すなわち、腫瘍から単離された核酸試料）からのものである。本明細書で使用される場合、「腫瘍」は、悪性または良性にかかわらず、すべての新生物細胞の成長および増殖、ならびにすべての前癌性および癌性の細胞および組織を指す。「癌」および「癌性」という用語は、典型的には無秩序な細胞増殖／増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すかまたは記述する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。そのような癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、大腸癌、結腸大腸癌、子宮内膜癌もしくは子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、様々な種類の頭頸部癌などが挙げられる。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ｓｓＮＡは、無細胞核酸試料、例えば、無細胞ＤＮＡ、無細胞ＲＮＡ、またはその両方からのものである。ある特定の態様では、無細胞核酸は、全血、血漿、血清、羊水、唾液、尿、胸水、気管支洗浄液、気管支吸引液、母乳、初乳、涙液、精液、腹水、胸水、および大便からなる群から選択される、体液試料から得られる。いくつかの実施形態では、無細胞核酸は、無細胞胎児ＤＮＡである。ある特定の態様では、無細胞核酸は、循環腫瘍ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、無細胞核酸は、感染性因子ＤＮＡを含む。ある特定の態様では、無細胞核酸は、移植片からのＤＮＡを含む。
【００２４】
ある特定の態様では、ｓｓＮＡは、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）である。目的のｓｓＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に由来するｓｓＤＮＡを含むが、これらに限定されない。例えば、ｓｓＤＮＡは、ｓｓＤＮＡを生成するために変性（例えば、熱変性および／または化学変性）された二本鎖ＤＮＡに由来し得る。いくつかの実施形態では、方法は、ｓｓＤＮＡをＳＳＢと接触させる前に、ｄｓＤＮＡを変性させることによってｓｓＤＮＡを生成することを含む。
【００２５】
ｓｓＮＡがｄｓＤＮＡ試料に由来するｓｓＤＮＡである場合、方法は、複合体の形成後、ｓｓＤＮＡ（この時点で、一方または両方の末端に１つ以上のアダプター（例えば、配列決定アダプター）を含む）を再ハイブリダイズしてｄｓＤＮＡを生成することをさらに含み得る。所望である場合、生成されたｄｓＤＮＡは、配列決定され得る。いくつかの実施形態では、再ハイブリダイズは、ｓｓＤＮＡが由来した元のｄｓＤＮＡに類似するｄｓＤＮＡを生成するのに十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で実施される。十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、選択されたハイブリダイゼーション温度、選択された塩濃度、および／またはｓｓＤＮＡが由来した元のｄｓＤＮＡに類似するｄｓＤＮＡを生成するように選択された任意の他の好都合なハイブリダイゼーションパラメータを含み得る。かかる生成されたｄｓＤＮＡの少なくともサブセットの一方または両方の末端は、元のｄｓＤＮＡの末端（例えば、オーバーハング）の類似物／複製物になるであろう。本開示の方法を使用して（例えば、配列決定によって）末端／オーバーハング含量を決定することは、ｓｓＤＮＡが由来した核酸試料に関する様々な有用な情報を提供し得る。例えば、オーバーハング含量を知ることは、例えば血漿または別の好適な供給源からの無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を分析するのに価値がある。ｃｆＤＮＡは、血液細胞、妊婦の胎児細胞、癌を有する個体の腫瘍細胞、臓器移植レシピエントの移植臓器組織などを含む様々な供給源に由来することが示されている。本開示の方法の実施形態によって提供されるオーバーハング含量は、例えば診断目的のために起源によって配列決定リードを分類するために使用され得る。
【００２６】
さらに、末端／オーバーハング含量は、法医学試料からの混合ＤＮＡを分析するために使用され得る。例えば、精液、血液、または別の目的供給源からのＤＮＡは、その供給源について診断的となる末端特徴を有し得、ＤＮＡ配列は、この情報に基づいて分割され得る。
【００２７】
さらに、古代ＤＮＡ試料（例えば、絶滅した生物、植物、または動物からの試料）中のオーバーハング含量を決定することは、そのような試料およびその試料が由来する生物、植物、動物などを特徴付けるのに有用な情報を提供する。例えば、古代ＤＮＡ試料（例えば、絶滅した哺乳動物からのＤＮＡ試料）は、しばしば、混入ＤＮＡ（例えば、混入細菌ＤＮＡなど）を含む。そのような場合、そのようなタイプのオーバーハングが特定のＤＮＡ源に関連するとき、目的のＤＮＡ配列が、検出されたオーバーハングのタイプに基づいて混入ＤＮＡ配列から分割され得る。
【００２８】
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、オーバーハングの長さおよびタイプの関数として、ＤＮＡ抽出物（例えば、古代ＤＮＡ抽出物）中の塩基損傷の速度および位置を決定する際に用途を見出す。
【００２９】
したがって、いくつかの実施形態では、ＳＳＢ結合ｄｓＤＮＡ由来のｓｓＤＮＡをアダプターおよびスプリントオリゴヌクレオチドと組み合わせて、本明細書に記載されるアダプターおよびスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたＳＳＢ結合ｄｓＤＮＡ由来ｓｓＤＮＡを含む複合体を形成することと、複合体形成の後に、ｓｓＤＮＡを再ハイブリダイズして、ｓｓＤＮＡが由来した元のｄｓＤＮＡに類似するｄｓＤＮＡ（すなわち、一方または両方の末端に１つ以上のアダプター（例えば、配列決定アダプター）を含む「アダプター付」ｄｓＤＮＡ）を生成することと、を含む方法が提供される。かかる方法は、アダプター付ｄｓＤＮＡを配列決定することをさらに含み得る。ある特定の態様では、配列決定は、ｓｓＤＮＡが由来したｄｓＤＮＡの末端／オーバーハング含量を決定するためのものである。配列決定を含む本開示の方法の任意の実施形態では、方法は、配列決定中の複雑度を低減するために、アダプター付ｓｓＮＡのサブサンプル（subsample）を配列決定することを含み得る。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ｓｓＮＡは、一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）である。目的のＲＮＡとしては、これらに限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランスアクティング低分子干渉ＲＮＡ（ｔａ−ｓｉＲＮＡ）、天然低分子干渉ＲＮＡ（ｎａｔ−ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、トランスファーメッセンジャーＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）、前駆体メッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、低分子カハール体特異的ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、ｐｉｗｉと相互作用するＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、エンドリボヌクレアーゼ調製ｓｉＲＮＡ（ｅｓｉＲＮＡ）、低分子テンポラルＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、シグナル認識ＲＮＡ、テロメアＲＮＡ、リボザイム、またはかかるＲＮＡタイプもしくはサブタイプの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、ｓｓＮＡがｓｓＲＮＡである場合、ｓｓＲＮＡは、ｍＲＮＡである。
【００３１】
目的の供給源からＤＮＡおよびＲＮＡを単離、精製、および／または濃縮するためのアプローチ、試薬、およびキットは、当該技術分野において既知であり、市販されている。例えば、目的の供給源からＤＮＡを単離するためのキットには、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｍｄ）によるＤＮｅａｓｙ（登録商標）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）、およびＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）核酸単離／精製キット；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によるＤＮＡｚｏｌ（登録商標）、ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）、Ｐｕｒｅｌｉｎｋ（登録商標）、ＧｅｎｅＣａｔｃｈｅｒ（登録商標）核酸単離／精製キット；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によるＮｕｃｌｅｏＭａｇ（登録商標）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）、およびＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）核酸単離／精製キットが含まれる。ある特定の態様では、核酸は、固定された生物学的試料、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から単離される。ＦＦＰＥ組織からのゲノムＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｍｄ）によるＡｌｌＰｒｅｐ（登録商標）ＤＮＡ／ＲＮＡ  ＦＦＰＥキット、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によるＦＦＰＥ用のＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（登録商標）全核酸単離キット、およびＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によるＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＦＦＰＥキットなどの市販のキットを用いて単離され得る。
【００３２】
核酸試料が得られる（例えば、単離される）生物、植物、動物などが絶滅している場合、かかる核酸を回収するための好適な戦略は、既知であり、例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２８（５９７９）：７１０−７２２、Ｐｏｉｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１１（５７５９）：３９２−３９４、Ｓｔｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０３（３７）：１３５７８−１３５８４、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  ４５６（７２２０）：３８７−９０、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  ４６３（７２８２）：７５７−７６２、および他の箇所に記載されているものを含む。
【００３３】
上に要約されるように、主題の方法は、ｓｓＮＡを一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と接触させてＳＳＢ結合ｓｓＮＡを生成することを含む。ＳＳＢは、ｓｓＮＡに協調的な様式で結合し、二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）にはうまく結合しない。ｓｓＤＮＡに結合すると、ＳＳＢは螺旋二本鎖を不安定にする。主題の方法を実施する際に用いられ得るＳＳＢとしては、原核ＳＳＢ（例えば、細菌または古細菌ＳＳＢ）および真核ＳＳＢが挙げられる。主題の方法を実施する際に用いられ得るＳＳＢの非限定的な例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＳＢ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡ、極限熱安定性一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＥＴ  ＳＳＢ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＲｅｃＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、複製プロテインＡ（ＲＰＡ−真核ＳＳＢ）などが挙げられる。ＥＴ  ＳＳＢ、Ｔｔｈ  ＲｅｃＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ならびにかかるＳＳＢを使用してＳＳＢ結合ｓｓＮＡを調製するための緩衝液および詳細なプロトコルは、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から入手可能である。本発明者らは、インプットが等モル濃度だとすると、より大きい平均断片長を有するｓｓＮＡにとって、ＳＳＢのより大きなインプットが有益になると判定した。ＳＳＢ結合ｓｓＮＡを生成するためにｓｓＮＡをＳＳＢと接触させるための例となるアプローチに関する詳細なガイダンスは、下記の実験セクションに提供される。
【００３４】
上に要約されるように、主題の方法は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと、アダプターオリゴヌクレオチドと、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域およびアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含むスプリントオリゴヌクレオチドとを組み合わせて複合体を形成することを含む。本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、５〜５００ヌクレオチド、例えば、５〜１００ヌクレオチドの一本鎖マルチマーである。オリゴヌクレオチドは、合成されてもよく、または酵素的に作製されてもよく、いくつかの実施形態では、５〜５０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドモノマー（すなわち、オリゴリボヌクレオチドまたは「ＲＮＡオリゴヌクレオチド」であり得る）、デオキシリボヌクレオチドモノマー（すなわち、オリゴデオキシリボヌクレオチドまたは「ＤＮＡオリゴヌクレオチド」であり得る）、またはそれらの組み合わせを含み得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜１００、１００〜１５０、または１５０〜２００、または最大５００ヌクレオチド長であり得る。
【００３５】
本開示の「アダプターオリゴヌクレオチド」は、アダプターまたはその一部を含むオリゴヌクレオチドである。「アダプター」とは、１つ以上の下流用途（例えば、アダプター付ｓｓＮＡもしくはその誘導体のＰＣＲ増幅、アダプター付ｓｓＮＡもしくはその誘導体の配列決定、および／または同等物）に有用なヌクレオチド配列を意味する。ある特定の態様では、アダプターオリゴヌクレオチド中に存在するアダプターまたはその一部は、配列決定アダプターである。「配列決定アダプター」とは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）によって提供される配列決定プラットフォーム（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）、および／またはＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）配列決定システム）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（例えば、ＭｉｎＩＯＮ（商標）配列決定システム）、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）（例えば、Ｉｏｎ  ＰＧＭ（商標）および／またはＩｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（商標）配列決定システム）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（例えば、ＳｅｑｕｅｌまたはＰａｃＢｉｏ  ＲＳ  ＩＩ配列決定システム）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（例えば、ＳＯＬｉＤ（商標）配列決定システム）、Ｒｏｃｈｅ（例えば、４５４  ＧＳ  ＦＬＸ＋および／またはＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ配列決定システム）、または目的の任意の他の配列決定プラットフォームなどの、目的の配列決定プラットフォームによって利用されるヌクレオチド配列（またはその相補体）の少なくとも一部を含む１つ以上の核酸ドメインを意味する。
【００３６】
ある特定の態様では、配列決定アダプターは、表面結合配列決定プラットフォームオリゴヌクレオチド（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定システムにおいてフローセルの表面に結合したＰ５またはＰ７オリゴヌクレオチド）に特異的に結合するドメイン（例えば、「捕捉部位」または「捕捉配列」）、配列決定プライマー結合ドメイン（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）プラットフォームのリード１またリード２プライマーが結合し得るドメイン）、固有の識別子（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ、プローブ相補鎖オリゴヌクレオチド、もしくはその両方の３’領域を一意に識別する、および／または特異的なバーコードもしくは「タグ」を用いて所与の試料からすべての分子をマークすることによって試料多重化を可能にするように配列決定化ｒＲＮＡの試料供給源を一意に識別する、バーコードもしくは他のドメイン）、バーコード配列決定プライマー結合ドメイン（バーコードの配列決定に使用されるプライマーが結合するドメイン）、例えば固有のタグが配列決定される事象の数に基づいて発現レベルを決定するために、目的の分子を一意にマークするための分子識別ドメイン（例えば、４、６、または他の数のヌクレオチドのランダム化タグなどの分子インデックスタグ）、任意のかかるドメインの相補体、またはそれらの任意の組み合わせから選択される核酸ドメインであるか、あるいはそれを含む。ある特定の態様では、バーコードドメイン（例えば、試料インデックスタグ）および分子の識別ドメイン（例えば、分子インデックスタグ）は、同じ核酸に含まれてもよい。
【００３７】
アダプターオリゴヌクレオチドが、配列決定アダプターの１つまたは一部を含むとき、１つ以上のさらなる配列決定アダプターおよび／または配列決定アダプターの残りの部分が、様々なアプローチを用いて付加され得る。例えば、配列決定アダプターのさらなる部分および／または残りの部分は、ライゲーション、逆転写、ＰＣＲ増幅、および／または同等物によって付加され得る。ＰＣＲの場合、３’ハイブリダイゼーション領域（例えば、アダプターオリゴヌクレオチドのアダプター領域にハイブリダイズするための）、ならびに配列決定アダプターのさらなる部分および／または残りの部分を含む５’領域を含む第１の増幅プライマーと、３’ハイブリダイゼーション領域（例えば、ｓｓＮＡ分子の反対側の末端に付加される第２のアダプターオリゴヌクレオチドのアダプター領域にハイブリダイズするための）、ならびに任意に配列決定アダプターのさらなる部分および／または残りの部分を含む５’領域を含む第２の増幅プライマーと、を含む増幅プライマー対を用いることができる。
【００３８】
本開示の「スプリントオリゴヌクレオチド」は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域およびアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含むオリゴヌクレオチドである。ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域にハイブリダイズする領域（ヌクレオチド配列）である。アダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域は、アダプターオリゴヌクレオチドのすべてまたは一部にハイブリダイズする領域（ヌクレオチド配列）である。スプリントオリゴヌクレオチドは、複合体形成時に、アダプターオリゴヌクレオチドの末端がＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域の末端に隣接するように、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡおよびアダプターオリゴヌクレオチドへの同時ハイブリダイゼーションのために設計される。
【００３９】
スプリントオリゴヌクレオチドのＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、任意の好適な長さおよび配列を有し得る。いくつかの実施形態では、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域の長さは、１０ヌクレオチド以下である。ある特定の態様では、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、４〜２０ヌクレオチド長、例えば、５〜１５、５〜１０、５〜９、５〜８、または５〜７（例えば、６または７）ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、ランダムヌクレオチド配列を含み（例えば、それからなり）、従って様々なランダムＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を有する複数の不均一なスプリントオリゴヌクレオチドが用いられる場合、その集合が、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域の配列にかかわらず、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの不均一集団のためのスプリントオリゴヌクレオチドとして機能することができる。
【００４０】
したがって、ある特定の態様では、方法は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと、アダプターオリゴヌクレオチドと、未定の配列の末端領域を有するＳＳＢ結合ｓｓＮＡの非均一集団のためのスプリントオリゴヌクレオチドとして機能することができる様々なランダムＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を有する複数の非均一スプリントオリゴヌクレオチドとを組み合わせることによって複合体を形成することを含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、既知の配列のＳＳＢ結合ｓｓＮＡ末端領域にハイブリダイズするように設計された既知の配列を含む。ある特定の態様では、既知の配列のそれぞれのＳＳＢ結合ｓｓＮＡ末端領域にハイブリダイズするように設計された既知の配列の異なるＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を有する２つ以上の不均一スプリントオリゴヌクレオチドが用いられる。ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が既知の配列を有する実施形態は、例えば、既知の配列の末端領域を有するＳＳＢ結合ｓｓＮＡのサブセットのみから核酸ライブラリを生成することが望ましい場合、用途を見出す。したがって、ある特定の態様では、方法は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと、アダプターオリゴヌクレオチドと、既知の配列の１つ以上の末端領域を有する１つ以上のＳＳＢ結合ｓｓＮＡのためのスプリントオリゴヌクレオチドとして機能することができる既知の配列の１つ以上の異なるＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を有する１つ以上の不均一スプリントオリゴヌクレオチドとを組み合わせることによって複合体を形成することを含む。
【００４２】
ある特定の態様では、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、１つ以上のユニバーサル塩基を含む。本明細書で使用される場合、「ユニバーサル塩基」は、４つの標準ヌクレオチド塩基：Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴの各々と無差別に塩基対合することができる塩基である。ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域に組み込まれ得るユニバーサル塩基としては、これらに限定されないが、２’−デオキシイノシン（ｄＩ、ｄＩｎｏｓｉｎｅ）および５−ニトロインドールが挙げられる。
【００４３】
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ、アダプターオリゴヌクレオチド、およびスプリントオリゴヌクレオチドを組み合わせる方法は、変化し得る。いくつかの実施形態では、組み合わせることは、アダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介してアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体と、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡとを組み合わせることを含む。他の態様では、組み合わせることは、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介してＳＳＢ結合ｓｓＮＡにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体と、アダプターオリゴヌクレオチドとを組み合わせることを含む。さらに他の態様では、組み合わせることは、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ、アダプターオリゴヌクレオチド、およびスプリントオリゴヌクレオチドを組み合わせることを含み、３つの構成成分のいずれも、組み合わせる前に別の構成成分と予め複合体化（すなわち、ハイブリダイズ）されていない。
【００４４】
組み合わせることは、複合体が、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介してＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域にハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドと、アダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介してアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドとを含むように、ハイブリダイゼーション条件下で実施される。特異的なハイブリダイゼーションが起こるかどうかは、スプリントオリゴヌクレオチドの関連する（すなわちハイブリダイゼーションする）領域と、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域と、アダプターオリゴヌクレオチドとの間の相補性の程度、ならびにそれらの長さ、塩濃度、およびハイブリダイゼーションが起こる温度（関連する領域の融解温度（ＴＭ）によって通知され得る）のような要因によって決定される。融解温度は、関連する領域の半分がハイブリダイズされたままであり、関連する領域の半分が一本鎖に解離する温度を指す。二本鎖のＴｍは、以下の式Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃ割合）−（６０／Ｎ）を使用して実験的に決定または予測することができ、式中、Ｎは鎖長であり、［Ｎａ＋］は１Ｍ未満である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎ．Ｙ．，Ｃｈ．１０）を参照されたい。様々なパラメータに依存する他のより先進的なモデルも、様々なハイブリダイゼーション条件に応じて、関連する領域のＴｍを予測するために使用することができる。特異的核酸ハイブリダイゼーションを達成するためのアプローチは、例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，ｐａｒｔ  Ｉ，ｃｈａｐｔｅｒ  ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９９３）に見出され得る。
【００４５】
本明細書で使用される「相補的」または「相補性」という用語は、標的核酸の領域への非共有結合によって塩基対合するヌクレオチド配列、例えば、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域にハイブリダイズするＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域のヌクレオチド配列、およびプローブ相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域のヌクレオチド配列を指す。正準ワトソン−クリック型塩基対において、ＤＮＡでグアニン（Ｇ）がシトシン（Ｃ）と塩基対を形成するように、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と塩基対合する。ＲＮＡでは、チミンは、ウラシル（Ｕ）で置き換えられる。したがって、Ａは、Ｔに相補的であり、Ｇは、Ｃに相補的である。ＲＮＡでは、Ａは、Ｕに相補的であり、その逆もまた同様である。典型的には、「相補的」または「相補性」とは、少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を指す。これらの用語はまた、一方の鎖のすべてのヌクレオチドが対応する位置の他方の鎖のすべてのヌクレオチドに相補的であるように完全に相補的な二本鎖も包含し得る。場合によっては、ヌクレオチド配列は、標的に部分的に相補的であり得、その場合、すべての対応する位置において、すべてのヌクレオチドが標的核酸中のすべてのヌクレオチドに相補的であるとは限らない。例えば、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域に完全に（すなわち、１００％）相補的であり得るか、またはＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、完全ではないある程度の（例えば、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９９％の）相補性を共有し得る。２つのヌクレオチド配列の同一性パーセントは、最適な比較目的のために配列を整列させることによって決定することができる（例えば、最適な整列のために第１の配列の配列にギャップを導入することができる）。次いで、対応する位置のヌクレオチドを比較し、２つの配列間の同一性パーセントは、その配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）。一方の配列中の位置が他方の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占められているとき、それらの分子は、その位置で同一である。そのような数学的アルゴリズムの非限定的な例はＫａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７（１９９３）に記載されている。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３８９−３４０２（１９９７）に記載されているように、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。一態様では、配列比較のためのパラメータは、スコア＝１００、ワード長＝１２に設定することができ、または変更することができる（例えば、ワード長＝５またはワード長＝２０）。
【００４６】
複合体は、アダプターオリゴヌクレオチドの末端がＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域の末端に隣接するように形成される。「に隣接する」とは、アダプターオリゴヌクレオチドの末端の末端ヌクレオチド、およびＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域の末端ヌクレオチド末端が互いに十分に近接しており、それらの末端ヌクレオチドが、例えば、化学ライゲーション、酵素的ライゲーションなどによって共有結合し得ることを意味する。いくつかの実施形態では、それらの末端は、アダプターオリゴヌクレオチドの末端にある末端ヌクレオチドと、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域の末端ヌクレオチド末端とが、スプリントオリゴヌクレオチドの隣接するヌクレオチドにハイブリダイズすることにより互いに隣接する。スプリントオリゴヌクレオチドは、アダプターオリゴヌクレオチドの末端がＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域の末端に隣接することを確実にするように設計され得る。かかるスプリントオリゴヌクレオチドの非限定的な例は、本明細書の実験セクションに提供されている。
【００４７】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかは、アダプターオリゴヌクレオチドとＳＳＢ結合ｓｓＮＡとの隣接する末端を共有結合させることをさらに含み得る。共有結合は、隣接する末端をライゲーションすることを含み得る。隣接する末端のライゲーションは、任意の好適なアプローチを使用して実施され得る。ある特定の態様では、ライゲーションは、化学ライゲーションによるものである。他の態様では、ライゲーションは、酵素的ライゲーションによるものである。酵素的ライゲーション反応を行うための好適な試薬（例えば、リガーゼおよび対応する緩衝液など）およびキットは、既知であり、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から入手可能なＩｎｓｔａｎｔ  Ｓｔｉｃｋｙ−ｅｎｄ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘが利用可能である。用いられ得るリガーゼとしては、例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（例えば、低濃度または高濃度）、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｌｉｇａｓｅ（登録商標）などが挙げられる。ライゲーション反応を行うのに好適な条件は、使用されるリガーゼの種類に応じて変化するであろう。かかる条件に関する情報は、容易に利用可能である。必要な場合、例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）などの好適なキナーゼを使用して、アダプターオリゴヌクレオチドまたはＳＳＢ結合ｓｓＮＡの５’末端にリン酸基が付加され得る。かかるキナーゼおよびかかるキナーゼを使用して５’末端をリン酸化するためのガイダンスは、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から利用可能である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオチド、またはその両方は、ブロッキング修飾を含む。例えば、スプリントオリゴヌクレオチドの一方または両方の末端がブロッキング修飾を含み得、かつ／または、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側のアダプターオリゴヌクレオチドの末端がブロッキング修飾を含み得る。「ブロッキング修飾」とは、アダプターオリゴヌクレオチドおよびＳＳＢ結合ｓｓＮＡの隣接する末端を共有結合させるために利用されるアプローチを使用して、当該末端が他のオリゴヌクレオチド成分の末端に連結される能力がないことを意味する。ある特定の態様では、ブロッキング修飾は、ライゲーションをブロックする修飾である。スプリントオリゴヌクレオチドの一方もしくは両方の末端、および／または、アダプターオリゴヌクレオチドのうちＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側の末端に含まれ得るブロッキング修飾の例としては、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側のアダプターオリゴヌクレオチドの末端での３’ＯＨの不在、およびＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側のアダプターオリゴヌクレオチドの末端でアクセス不可能な３’ＯＨが挙げられる。末端がアクセス不可能な３’ＯＨを有するブロッキング修飾の非限定的な例としては、アミノ修飾因子、スペーサー、ジデオキシ塩基、反転ジデオキシ塩基、３’ホスフェートなどが挙げられる。
【００４９】
ある特定の態様では、スプリントオリゴヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオチド、またはその両方は、１つ以上の非天然ヌクレオチド（ヌクレオチドアナログとも称され得る）を含む。スプリントオリゴヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオチド、またはその両方に含まれ得る非天然ヌクレオチドの非限定的な例は、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＦＡＮＡ（２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオチド）、ＧＮＡ（グリコール核酸）、ＴＮＡ（トレオース核酸）、２’−Ｏ−Ｍｅ  ＲＮＡ、２’−フルオロＲＮＡ、モルホリノヌクレオチド、およびそれらの任意の組み合わせである。
【００５０】
アダプターオリゴヌクレオチドとＳＳＢ結合ｓｓＮＡとの隣接する末端を共有結合させることにより、アダプター付（adapted）ｓｓＮＡが生成され、ここで「アダプター付」とは、ｓｓＮＡが１つ以上のアダプター配列またはそのサブ領域を含むことを意味する。アダプター付ｓｓＮＡは、目的の下流アプリケーションにおいてインプットとして使用される前に精製され得る。例えば、複合体は、アダプター付ｓｓＮＡをスプリントオリゴヌクレオチドから分離するために変性（例えば、熱変性）されてもよく、アダプター付ｓｓＮＡは、ＳＳＢ、および／または、（例えば固相可逆固定化（ＳＰＲＩ）、カラム精製、および／または同等物による）接触および／または組み合わせステップ中に存在する任意の他の構成成分から、またはそれらの組み合わせから、精製されてもよい。
【００５１】
いくつかの実施形態では、１つ以上のアダプター配列またはそのサブ領域は、１つ以上の配列決定アダプターまたはそのサブ領域であり、方法は、アダプター付ｓｓＮＡまたはその誘導体（例えば、アダプター付ｓｓＮＡをテンプレートとして使用してＰＣＲ増幅によって生成される増幅体）の少なくとも一部を配列決定することをさらに含む。配列決定は、ハイスループット配列決定（ＨＴＳ）（または「次世代配列決定（ＮＧＳ）」）プラットフォームなどを含む任意の好適な配列決定プラットフォーム上で実施され得る。目的のＨＴＳ／ＮＧＳ配列決定プラットフォームとしては、これらに限定されないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）によって提供される配列決定プラットフォーム（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）、および／またはＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）配列決定システム）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（例えば、ＭｉｎＩＯＮ（商標）、ＧｒｉｄＩＯＮｘ５（商標）、ＰｒｏｍｅｔｈＩＯＮ（商標）、またはＳｍｉｄｇＩＯＮ（商標）ナノポアベースの配列決定システム）、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）（例えば、Ｉｏｎ  ＰＧＭ（商標）および／またはＩｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（商標）配列決定システム）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（例えば、ＳｅｑｕｅｌまたはＰａｃＢｉｏ  ＲＳ  ＩＩ配列決定システム）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（例えば、ＳＯＬｉＤ配列決定システム）、Ｒｏｃｈｅ（例えば、４５４  ＧＳ  ＦＬＸ＋および／またはＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ配列決定システム）その他の配列決定プラットフォームが挙げられる。直接配列決定すること（例えば、ナノポアベースの配列決定によって）または特定のプラットフォームで配列決定するために適合可能な核酸分子を調製すること（例えば、増幅によって、例えば、固相増幅など）、適合可能な分子を配列決定すること、および配列決定データを分析することのための詳細なプロトコルは、目的の配列決定プラットフォームの製造業者から入手可能である。
【００５２】
上に要約されるように、本開示の方法は、Ｇａｎｓａｕｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４５（１０）：ｅ７９によって記載されるアプローチ（「ｓｓＤＮＡ２．０」と称される）などの、一本鎖ライブラリ調製に対する現在の最先端のアプローチの改善を構成し、本方法は、驚くべきことに、より効率的であり、より少ない時間を必要とし、コストを低減することが見出された。いくつかの実施形態では、方法が、アダプターオリゴヌクレオチドとＳＳＢ結合ｓｓＮＡとの隣接する末端を共有結合させることを含む場合、組み合わせおよび共有結合ステップの合計時間は、４時間以下、３時間以下、２時間以下、または１時間以下である。ある特定の態様では、方法が、アダプターオリゴヌクレオチドとＳＳＢ結合ｓｓＮＡとの隣接する末端を共有結合させることを含む場合、接触、組み合わせ、および共有結合ステップの合計時間は、４時間以下、３時間以下、２時間以下、または１時間以下である。いくつかの実施形態では、方法の効率は、接触ステップ中にＳＳＢと接触されたｓｓＮＡの７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上から複合体が形成されるようになるものである。
【００５３】
組成物
上に要約されるように、本開示はまた、組成物を提供する。組成物は、例えば、本開示の方法の部分において上に記載されるステップのうちのいずれかの１つ以上を実施することを含め、本開示の方法のうちのいずれかを実施することを含む、様々な用途において使用を見出す。したがって、組成物は、本開示の方法の部分において上に記載されるオリゴヌクレオチド（非均一オリゴヌクレオチドの複数／集合を含む）、ｓｓＮＡ、ＳＳＢ、他の試薬などのうちのいずれかを、任意の組み合わせにおいて含み得る。
【００５４】
ある特定の態様では、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡと、第１のアダプターオリゴヌクレオチドと、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む第１のスプリントオリゴヌクレオチドとを含む組成物が提供される。かかる組成物は、第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む第２のスプリントオリゴヌクレオチドとをさらに含み得る。
【００５５】
ある特定の態様では、ハイブリダイズされた複合体として存在する（例えば、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの不在下で）、アダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介してアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体を含む組成物が提供される。他の態様では、ハイブリダイズされた複合体として存在する、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介してＳＳＢ結合ｓｓＮＡにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体を含む組成物が提供される。
【００５６】
ｓｓＮＡは、ｓｓＤＮＡであり得る。ｓｓＮＡがｓｓＤＮＡである場合、ｓｓＤＮＡはｄｓＤＮＡに由来し得る。いくつかの実施形態では、ｓｓＮＡは、ｓｓＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｓｓＮＡは、分解された核酸試料からのものである。ある特定の態様では、ｓｓＮＡが分解核酸試料からのものであるとき、そのｓｓＮＡは、絶滅した生物または動物、例えば、絶滅した哺乳動物から得られる（例えば、単離される）核酸試料などの、古代核酸試料からのものである。ある特定の態様では、絶滅した哺乳動物は、ヒト属からのものである。いくつかの実施形態では、ｓｓＮＡは、法医学核酸試料からのものである。
【００５７】
本開示の組成物は、アダプターオリゴヌクレオチド末端をＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端に共有結合させるための試薬をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、試薬は、化学ライゲーション試薬または酵素的ライゲーション試薬、例えば、リガーゼである。
【００５８】
本開示の組成物は、容器内に存在する１つ以上の構成成分を含み得る。好適な容器としては、これらに限定されないが、チューブ、バイアル、およびプレート（例えば、９６ウェルプレートまたは他のウェルプレート）が挙げられる。
【００５９】
ある特定の態様では、組成物は、液体媒体中の１つ以上の構成成分を含む。液体媒体は、水、緩衝溶液などの水性液体媒体であってもよい。１つ以上の添加剤、例えば、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４）、緩衝剤（トリス緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）など）、溶解剤、洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０などの非イオン性洗浄剤）、ヌクレアーゼ阻害剤、グリセロール、キレート剤などが、かかる組成物中に存在し得る。
【００６０】
キット
上記に要約したように、本開示は、キットを提供する。キットは、例えば、本開示の方法の部分において上に記載されるステップのうちのいずれかの１つ以上を実施することを含め、本開示の方法のうちのいずれかを実施することを含む、様々な用途において使用を見出す。したがって、キットは、本開示の方法の部分において上に記載されるオリゴヌクレオチド（非均一オリゴヌクレオチドの複数／集合を含む）、ｓｓＮＡ、ＳＳＢ、他の試薬などのうちのいずれかを、任意の組み合わせにおいて含み得る。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本開示のキットは、一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ、例えば、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質、またはその両方）と、第１のアダプターオリゴヌクレオチドと、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む第１のスプリントオリゴヌクレオチドと、ＳＳＢ、第１のアダプターオリゴヌクレオチド、および第１のスプリントオリゴヌクレオチドを使用して核酸ライブラリを生成するための指示とを含む。ある特定の態様では、かかるキットは、第２のアダプターオリゴヌクレオチドと、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のアダプターオリゴヌクレオチドを含む第２のスプリントオリゴヌクレオチドとをさらに含み、この場合の指示は、ＳＳＢ、第１のアダプターオリゴヌクレオチド、第１のスプリントオリゴヌクレオチド、第２のアダプターオリゴヌクレオチド、および第２のスプリントオリゴヌクレオチドを使用して核酸ライブラリを生成するためのものである。
【００６２】
本開示のキットは、アダプターオリゴヌクレオチド末端をＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端に共有結合させるための試薬をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、試薬は、化学ライゲーション試薬または酵素的ライゲーション試薬、例えば、リガーゼである。
【００６３】
いくつかの実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオチド、またはその両方は、ブロッキング修飾を含む。例えば、スプリントオリゴヌクレオチドの一方または両方の末端がブロッキング修飾を含み得、かつ／または、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側のアダプターオリゴヌクレオチドの末端がブロッキング修飾を含み得る。ある特定の態様では、ブロッキング修飾は、ライゲーションをブロックする修飾である。スプリントオリゴヌクレオチドの一方もしくは両方の末端、および／またはＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側のアダプターオリゴヌクレオチドの末端に含まれ得るブロッキング修飾の例としては、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側のアダプターオリゴヌクレオチドの末端での３’ＯＨの不在、およびＳＳＢ結合ｓｓＮＡに隣接しない側のアダプターオリゴヌクレオチドの末端でアクセス不可能な３’ＯＨが挙げられる。末端がアクセス不可能な３’ＯＨを有することになるブロッキング修飾の非限定的な例としては、アミノ修飾因子、スペーサー、ジデオキシ塩基、反転ジデオキシ塩基、３’ホスフェートなどが挙げられる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本開示のキットにおいて提供される１つ以上のスプリントオリゴヌクレオチドは、ランダムヌクレオチド配列を含む（例えば、それからなる）ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を含み、従ってキットが様々なランダムＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を有する複数の不均一なスプリントオリゴヌクレオチドを含む場合において、その集合が、目的のＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域の配列にかかわらず、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの不均一集団のためのスプリントオリゴヌクレオチドとして機能することができる。
【００６５】
ある特定の態様では、本開示のキットで提供されるスプリントオリゴヌクレオチドは、１つ以上のユニバーサル塩基を含むＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を含む。ＳＳＢ結合のｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域に組み込まれ得るユニバーサル塩基としては、これらに限定されないが、２’−デオキシイノシン（ｄＩ、ｄＩｎｏｓｉｎｅ）および５−ニトロインドールが挙げられる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本開示のキットにおいて提供されるスプリントオリゴヌクレオチドのＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域の長さは、１０ヌクレオチド以下である。ある特定の態様では、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、４〜２０ヌクレオチド長、例えば、５〜１５、５〜１０、５〜９、５〜８、または５〜７（例えば、６または７）ヌクレオチド長である。
【００６７】
主題のキットの構成成分は、別々の容器に存在してもよく、または複数の構成成分が単一の容器に存在してもよい。好適な容器には、単一チューブ（例えば、バイアル）、１つ以上のウェルのプレート（例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートなど）などが含まれる。
【００６８】
ＳＳＢ、１つ以上のアダプターオリゴヌクレオチド、および１つ以上のスプリントオリゴヌクレオチドを使用して核酸ライブラリを生成するための指示は、好適な記録媒体に記録され得る。例えば、指示は、紙またはプラスチックなどの基材上に印刷することができる。そのようにして、指示は、添付文書としてキット内に、キットの容器またはその構成成分のラベルなどに（すなわち、包装または副包装に付随して）存在し得る。他の実施形態では、指示は、ポータブルフラッシュドライブ、ＤＶＤ、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケットなどの好適なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の指示はキット内には存在しないが、例えば、インターネットを介してリモートソースから指示を取得するための手段が提供される。この実施形態の一例は、指示を閲覧することができかつ／または指示をダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。指示と同様に、指示を得るための手段は、適切な基材上に記録される。
【００６９】
以下の実施例は例示のために提供され、限定するものではない。
【実施例】
【００７０】
実験
実施例１
１つの反応における一本鎖ＤＮＡへの迅速で効率的で標的化されたアダプターのライゲーションのためのアプローチがここに開示される。以下の実施例では、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｐ７またはＰ５アダプター配列を含む配列決定アダプターオリゴヌクレオチドが、Ｐ７スプリントについては一連の３プライムＮおよびＰ５スプリントについては一連の５プライムＮを含むスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。スプリントは、二本鎖ライゲーションのみ高効率で行うことができるリガーゼに、アダプターを標的一本鎖ＤＮＡにライゲーションさせるための機会を作り出す。ライゲーションに関与することが必要とされないすべてのオリゴヌクレオチドＤＮＡ末端は、ライゲーションを防止するオリゴヌクレオチド修飾（例えばアミノ修飾）によってブロックされる。
【００７１】
アッセイへの一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）の添加は、反応の効率を増加させる。標的ＤＮＡの濃度および長さを使用して、最適なライゲーション効率を達成するために適切なＳＳＢの量を計算する。ＳＳＢは、二次構造を防止しながら、一本鎖ＤＮＡの再アニーリングを防止し得る。
【００７２】
この方法は、ＳＳ２．０として知られている、Ｇａｎｓａｕｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４５（１０）：ｅ７９によって記載されている一本鎖ライブラリ調製に比べて勝るとも劣らない。ＳＳ２．０と比較して、本方法は、有意に少ない時間を要し、配列決定され得る適切なアダプターライゲーションＤＮＡ分子へのＤＮＡの変換の著しく増加した効率を呈する。加えて、本アプローチは、ＳＳ２．０と比較して試薬コストを削減する。
【００７３】
アダプターおよびスプリントオリゴヌクレオチドは、適切なアダプターライゲーションには関与するべきでないすべての末端に、ライゲーションをブロックする修飾を担持するように操作される。これには、Ｐ５アダプターの５プライム末端、Ｐ７アダプターの３プライム末端、およびスプリントのすべての末端をブロックすることが含まれる。これらのライゲーションブロッキング修飾は、アミノ修飾因子、炭素スペーサー、ジデオキシ塩基、または、３プライム末端の３プライムヒドロキシル基もしくは５プライム末端の５プライムホスフェートへのリガーゼのアクセスを防止する任意の他の好適な修飾であり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）によって合成され得る。例のオリゴヌクレオチドを以下の表１に示す。
【表１】
2021526798.tif 000003
【００７４】
この実施例で用いられるプロトコルでは、テンプレートＤＮＡをＳＳＢと組み合わせ、熱変性させた。変性後、反応物を氷上または４℃におけるＰＣＲ冷却器上に置いた。冷却後、各反応物にアダプターを添加した。次いで、反応マスター混合物を添加し、続いて混合する。３７℃でのインキュベーションで直ちにライゲーションが開始し、４５分間までにほとんどのライゲーションが起こる。反応物は、確立された方法でクリーンアップすることができ、増幅および配列決定などの下流アプリケーションは変わらない。
【００７５】
アダプターを調製するために、最終濃度１０ｕＭのＰ５アダプター、および最終濃度２０μＭのＰ５スプリントオリゴヌクレオチドを、１倍の最終濃度のＴ４  ＲＮＡリガーゼ緩衝液（カタログ番号Ｂ０２１６Ｌ）と組み合わせた。Ｐ７アダプターおよびＰ７スプリントオリゴヌクレオチドを使用して、類似の別個の混合物を調製した。９５℃に１０秒間加熱し、次いで０．１℃／秒の速度で１０℃までランプダウンすることによってアダプターをハイブリダイズさせた。
【００７６】
例のプロトコルの例を以下に提供する。
１．試料インプット（３６ｕＬ）
ａ．剪断ＤＮＡおよびＥＴ  ＳＳＢ（カタログ番号Ｍ２４０１Ｓ）を３６ｕＬの体積に組み合わせる
ｉ．１ｕＬのＥＴ  ＳＳＢは、試験したほとんどの試料タイプに対して阻害することなくライゲーションを促進する
ｉｉ．緩衝液ＥＢＴ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、および０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０）で残りの体積を充填する
２．試料変性
ａ．９５℃に予熱した蓋を有するサーモサイクラー中で試料を３分間インキュベートする
ｂ．直ちに変性試料を氷またはＰＣＲ冷却器上に３０秒間置く。
３．２ｕＬのプールされたアダプター混合物（等しい体積のＰ５およびＰ７アダプター）を添加する
ａ．アダプターインプットは、インプットのモル濃度に依存する。６〜１０対１のモル比のアダプター対テンプレートが好ましい。
４．反応マスター混合物を添加し、ピペッティングにより十分に混合する
ａ．８ｕＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（カタログ番号Ｍ０２０２Ｍ）
ｂ．３２ｕＬの５０％ＰＥＧ  ８０００（カタログ番号Ｂ０２１６Ｌ）
ｃ．１ｕＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ−１０，０００Ｕ／ｍＬ（カタログ番号Ｍ０２０１Ｌ）
ｄ．１ｕＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ−２，０００，０００Ｕ／ｍＬ（カタログ番号Ｍ０２０２Ｍ）
５．３７℃で最大６０分間インキュベートする
ａ．ほとんどのライゲーションは最初の１５分で生じるが、プラトーは約４５分まで達成されない。
６．反応物をクリーンアップする
ａ．カラムクリーンアップ（例えば、分解ＤＮＡ用）またはＳＰＲＩ（例えば、現代試料用）。
【００７７】
比較および最適化アッセイ
クリーンアップ後、予め増幅したライブラリの希釈物に対してｑＰＣＲを行い、ライゲーション効率を決定した。より低いＣＴ値は、より高いＣＴ値を有する同じ試験の別の試料と比較して、より高いライゲーション効率を示す。１の差は、ライブラリ効率の２倍の差にほぼ等しい。予め増幅したライブラリのアリコートを、インデックスＰＣＲ反応でも増幅した。インデックス化後、ライブラリをＳＰＲＩでクリーニングし、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ  ２２００システム上で可視化して、各ライブラリ内のアダプタアーティファクトの割合を推定した。
【００７８】
一本鎖結合タンパク質
ＮＥＢによって供給されるＥＴ  ＳＳＢタンパク質などの一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）は、一本鎖ライゲーションのライゲーション効率を向上させることが観察された。インプットのモル濃度が等しいとすると、より高い平均断片長を有する試料は、ピークライゲーションを達成するためにＳＳＢのより大きなインプットを必要とした。反応物中のＤＮＡのモル濃度も、必要とされるＳＳＢの量に影響する。ＥＴ  ＳＳＢは過剰が膨大であればライゲーションを阻害する潜在能力を有する。
【００７９】
プロトコル比較
本プロトコルの効率を、ＮＥＢ  Ｕｌｔｒａ  ２キット（ｄｓＤＮＡ）、ＳＳ２．０（Ｇａｎｓａｕｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４５（１０）：ｅ７９）、ならびにＣａｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ９（２）：４１０−４１９およびＭａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）ＧｉｇａＳｃｉｅｎｃｅ  ６：１−１３に記載されている平滑末端単一チューブ（ＢＥＳＴ）法と比較した。平均断片長が約３５０ｂｐの現代ヒトＤＮＡと、平均断片長が約３５〜４０ｂｐで分解が激しい古代バイソン試料とを使用して比較結果を得た。
【００８０】
ＮＥＢ  Ｕｌｔｒａ  ２キットは、現代試料のための非常に効率的なライブラリ調製方法として認識されており、一方で、ＳＳ２．０は、分解された試料のための非常に効率的なライブラリ調製方法として認識されている。ＢＥＳＴプロトコルは、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４  ＰＮＫを使用して、ＤＮＡを平滑末端化し（尾部なし）５’末端をリン酸化する、平滑末端修復が関わるものである。次に、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用してその平滑末端に平滑末端ｄｓＤＮＡアダプターをライゲーションし、続いて、Ｂｓｔ  ２．０  Ｗａｒｍｓｔａｒｔポリメラーゼを使用して充填反応させ、ＳＰＲＩビーズまたはカラムを使用してクリーンアップする。
【００８１】
比較結果を図２に提供する。上部パネルの左から右に、この実施例で説明されている方法（アスタリスク）、ｓｓ２．０、およびＢＥＳＴである。下部パネルの左から右に、この実施例で説明されている方法（アスタリスク）、ＮＥＢ  Ｕｌｔｒａ  ２キット、ｓｓ２．０、およびＢＥＳＴである。この実施例に記載される方法は、ｓｓ２．０と比較して、古代試料についてはるかに高いライゲーション効率を呈する。現代試料については、この実施例に記載される方法は、ＮＥＢ  Ｕｌｔｒａ  ２キットより０．３〜０．５ｑＰＣＲサイクル遅れる。
【００８２】
実施例２−毛髪ＤＮＡ
標準的なプロテイナーゼＫ処理を使用して、高温で毛髪からＤＮＡを収集した。ライブラリを作製するためのテンプレートとして６ナノグラムのＤＮＡを使用した。上に記載されるようにプロトコルに従った。アダプターライゲーション生成物から２つの配列決定ライブラリを生成した。１つは、５０μＬの全ライゲーション生成物のうちの１μＬを使用した（ＳＲＬ３）。もう１つはこの生成物を２．５μＬ使用した（ＳＲＬ４）。両方のライブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ配列決定プラットフォーム上で配列決定して、ライブラリの特徴および複雑度（固有のライブラリ分子の数）を評価した。
【００８３】
２×７５のペア・エンド配列決定後、ＳｅｑＰｒｅｐプログラムを使用して、互いに重複するフォワードリードおよびリバースリードの対を組み合わせた。これは、元のＤＮＡテンプレートが十分に短いためにフォワードリードとリバースリードとがいくらかの同じ配列（本明細書では「マージされたリード」と称される）をカバーする場合に生じる。マージ後、マージされたリードおよびマージされていないリードを参照ヒトゲノム配列にマッピングした。図３に示されるのは、ＳＲＬ３およびＳＲＬ４ライブラリの両方について、マージされかつマッピングされた、マージされたがマッピングされない、ならびにマージされたがマッピングされないリードの、観察された元のテンプレート長の分布である。なお、マージされずかつマッピングされない場合では、テンプレートＤＮＡの長さを推測することは不可能である。
【００８４】
Ｐｒｅｓｅｑソフトウェアプログラムを使用して、両方のライブラリにおける固有のライブラリ分子の数を推定した。このプログラムは、ここで生成されたような、観察されたリードの大きなサンプルからの核酸ライブラリの複雑度をモデル化するために、観察された重複分子の数をカウントする。このプログラムは、ライブラリ配列決定の様々な深度において、固有であると予測される観察されたリードの画分についての推定値を示す。図４に示されるように、両方のライブラリが、２５０，０００，０００超の固有分子の複雑度を有すると予測される。２．５μＬのアダプターライゲーションテンプレートから作製されたＳＲＬ４は、ＳＲＬ３よりも多くの固有分子を有している。
【００８５】
実施例３−バイソン骨由来の古代ＤＮＡ
古代バイソン骨から抽出したＤＮＡを用いて、テンプレートＤＮＡ分子から配列決定ライブラリへの変換効率を比較した。上に記載されるプロトコルを含む４つの異なるプロトコルを用いて、同じ抽出物からの同じ量のＤＮＡからライブラリを生成した。
【００８６】
アダプターライゲーション生成物のｑＰＣＲおよび直接配列決定という２つのアプローチを使用して、ライブラリの複雑度を測定した。ｑＰＣＲ推定は、３つ組で行った。図５に示される両方のアプローチは、ＤＮＡを配列決定ライブラリに変換することにおいて、本明細書に記載されるアプローチの方が効率的であることを示している。
【００８７】
このように、上記は単に本開示の原理を説明しているにすぎない。当業者であれば、たとえ本明細書に明示的に記載または図示されていなくても、本発明の原理を具現化しその趣旨および範囲内に含まれる、様々な構成を工夫できることが理解されよう。さらに、本明細書に記載されたすべての例および条件語句は、本発明の原理および発明者らにより当該技術分野の促進のために寄与される概念を理解する上で読者を助けることを主として意図しており、このような具体的に記載された例および条件への限定ではないと解釈されるべきである。また、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにその具体的な例を記載する本明細書におけるすべての記述は、その構造的および機能的等価物の両方を包含することを意図している。加えて、そのような等価物は、現在知られている等価物および将来開発される等価物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たすいかなる開発要素も含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に図示および記載された例示的な実施形態に限定されることを意図していない。
【図１】
2021526798.tif 000004
【図２】
2021526798.tif 000005
【図３−１】
2021526798.tif 000006
【図３−２】
2021526798.tif 000007
【図４】
2021526798.tif 000008
【図５】
2021526798.tif 000009
【配列表】
2021526798000001.app
【国際調査報告】
2021526798.tif 000010
2021526798.tif 000011
2021526798.tif 000012