(57)【要約】本発明は、安定な緩衝化及び緩衝剤非含有タンパク質組成物を調製する方法に関する。本発明は、タンパク質を１つ以上の不純物から精製する方法にも関する。
2021521119.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を含む組成物を調製する方法であって、
目的のタンパク質を含む調製物であって、前記タンパク質及び１つ以上の不純物を含む試料を精製プロセスに供した後に得られる調製物を提供する工程と、
最終限外濾過及び透析濾過操作前に前記調製物のｐＨを目標ｐＨに調整する工程と、
前記タンパク質を含む組成物を前記最終限外濾過及び透析濾過操作から得る工程と
を含み、前記目標ｐＨは、前記最終限外濾過及び透析濾過操作から得られる、前記タンパク質を含む前記組成物のｐＨ又はその近傍である、方法。
【請求項２】
前記ｐＨは、ｐＨ調整剤を使用して調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｐＨ調整剤は、酸、塩基又は緩衝液である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酸は、酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、ホウ酸、カンファースルホン酸、クエン酸、カプリル酸、ギ酸、グルタミン酸、塩酸、臭化水素酸、ヒドロキシ酸、ヒアルロン酸、乳酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、硝酸、リン酸、プロピオン酸、硫酸、スルホン酸、トラネキサム酸及び酒石酸からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記酸は、乳酸、ヒドロキシ酸及びヒアルロン酸からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記塩基は、アンモニア溶液、炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、水酸化カルシウム、エタノールアミン、リシン、メグルミン、ポリリシン、水酸化カリウム、重炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム及びトリエタノールアミンからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記緩衝液は、酢酸緩衝液、アスパラギン酸緩衝液、アスコルビン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、安息香酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）緩衝液、ヒスチジン緩衝液、乳酸緩衝液、リン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、トリス緩衝液、ビス−トリス緩衝液及び酒石酸緩衝液からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記目標ｐＨは、約ｐＨ４．０〜約ｐＨ７．０である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記目標ｐＨは、約ｐＨ４．０〜約ｐＨ６．０である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記調製物中の前記タンパク質を目標濃度に濃縮する工程をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記濃縮工程は、前記ｐＨ調整工程前に行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記濃縮工程は、前記ｐＨ調整工程後及び前記最終ＵＦ  ＤＦ操作前に行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記最終限外濾過及び透析濾過操作は、緩衝液を実質的に含まない媒体を使用して行われる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記最終限外濾過及び透析濾過操作から得られる前記組成物は、前記タンパク質を約４０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記最終限外濾過及び透析濾過操作は、緩衝液を含む媒体を使用して行われる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記媒体は、緩衝液を２ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度で含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記最終限外濾過及び透析濾過操作から得られる前記組成物は、前記タンパク質を約１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記媒体は、緩衝液を２ｍＭ〜１０ｍＭの濃度で含み、前記限外濾過及び透析濾過操作から得られる前記組成物は、前記タンパク質を約１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記媒体は、緩衝液であって、前記緩衝液の緩衝能範囲外のｐＨにおける緩衝液を含み、前記限外濾過及び透析濾過操作から得られる前記組成物は、前記タンパク質を約１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記精製プロセスは、以下の工程：遠心分離、精密濾過、ＴＦＦ、ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、限外濾過、透析濾過、ＳＰＴＦＦ、深層濾過及び混合モードクロマトグラフィーの１つ以上を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記精製プロセスは、ウイルス濾過工程と、以下の工程：遠心分離、精密濾過、ＴＦＦ、ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、限外濾過、透析濾過、ＳＰＴＦＦ及び深層濾過の１つ以上とを含み、前記調製物は、前記ウイルス濾過工程から得られる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記精製プロセスは、陽イオン交換クロマトグラフィー工程と、以下の工程：遠心分離、精密濾過、ＴＦＦ、ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、限外濾過、透析濾過、ＳＰＴＦＦ、ウイルス濾過及び深層濾過の１つ以上とを含み、前記調製物は、前記陽イオン交換クロマトグラフィー工程から得られる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記精製プロセスは、陰イオン交換クロマトグラフィー工程と、以下の工程：遠心分離、精密濾過、ＴＦＦ、ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、限外濾過、透析濾過、ＳＰＴＦＦ、ウイルス濾過及び深層濾過の１つ以上とを含み、前記調製物は、前記陰イオン交換クロマトグラフィー工程から得られる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記精製プロセスは、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程と、以下の工程：遠心分離、精密濾過、ＴＦＦ、ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、限外濾過、透析濾過、ＳＰＴＦＦ、ウイルス濾過及び深層濾過の１つ以上とを含み、前記調製物は、前記疎水性相互作用クロマトグラフィー工程から得られる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記精製プロセスは、混合モードクロマトグラフィー工程と、以下の工程：遠心分離、精密濾過、ＴＦＦ、ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、限外濾過、透析濾過、ＳＰＴＦＦ、ウイルス濾過及び深層濾過の１つ以上とを含み、前記調製物は、前記混合モードクロマトグラフィー工程から得られる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記調製物に安定剤を添加する工程をさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記安定剤は、アミノ酸、糖、ポリオール、抗酸化剤、キレート剤、脂質又は脂質誘導体、塩、ポリマー、不活性タンパク質、界面活性剤及び水混和性共溶媒から選択される１つ以上である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記アミノ酸は、ヒスチジン、アルギニン、グリシン、メチオニン、アラニン、アスパラギン酸、塩酸リシン、プロリン、リシン、サルコシン、ガンマ−アミノ酪酸及びグルタミン酸から選択される１つ以上である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗酸化剤は、アスコルビン酸、グルタチオン、ビタミンＥ及びポリ（エチレンイミン）から選択される１つ以上である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記糖は、スクロース、トレハロース、キシリトール、マルトース、デキストロース、グルコース、ラフィノース及びラクトースから選択される１つ以上である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリオールは、糖アルコール、グリセロール、エリトリトール、カプリレート、トリプトファネート及びサルコシンから選択される１つ以上である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリマーは、ゼラチン、ヒアルロン酸、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、Ａｍｐｈｉｐｏｌ  Ａ８−３５、ＰＡＡ５−２５Ｃ８−４０Ｃ３、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチル（ｈｅｔａ）デンプン、硫酸化多糖、ポリアミノ酸、デキストラン、ジエチルアミノエチルデキストラン、ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン、スルホブチルエーテル−ベータ−シクロデキストリン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びカルボキシメチルセルロースから選択される１つ以上である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記不活性タンパク質は、ＨＳＡ、ＢＳＡ及び組換えＨＡから選択される１つ以上である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記キレート剤は、ＥＤＴＡ、ＤＰＴＡ、クエン酸、六リン酸塩及びチオグリコール酸から選択される１つ以上である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記塩は、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、乳酸カルシウム及び塩酸グアニジンから選択される１つ以上である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ポロキサマー、ＰＥＧドデシルエーテル及びＰＥＧ  ｔｅｒｔオクチルフェニルエーテルから選択される１つ以上である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
前記水混和性共溶媒は、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＤＭＡ及びＣＳＡから選択される１つ以上である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記脂質又は脂質誘導体は、脂肪酸（例えば、オレイン酸）、リン脂質及びリン脂質誘導体、リン酸ＤＥＡ、セチルリン酸ＤＥＡ、オレス−１０リン酸、オレス−１０、マンノシルグリセレート、ポリドカノール、コール酸スルホベタイン及びＣ１２〜１５アルコールベンゾエートの１つ以上である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
前記タンパク質は、以下のタンパク質：エタネルセプト、アフリベルセプト、アダリムマブ、エポエチンアルファ、ダルベポエチンアルファ、フィルグラスチム、ペグフィルグラスチム、ベバシズマブ、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、エクリズマブ、トラスツズマブ、エボロクマブ、デノスマブ、ロモソズマブ、エレヌマブ、ブリナツモマブ及びＢｉＴＥ抗体コンストラクトのいずれか１つである、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＢｉＴＥ抗体コンストラクトは、ブリナツモマブ、抗ＣＤ３３及び抗ＣＤ３  ＢｉＴＥ抗体コンストラクト、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ及び抗ＣＤ３  ＢｉＴＥ抗体コンストラクト、抗ＤＬＬ３及び抗ＣＤ３  ＢｉＴＥ抗体コンストラクト、抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ３  ＢｉＴＥ抗体コンストラクト、抗ＭＳＬＮ及び抗ＣＤ３  ＢｉＴＥ抗体コンストラクト、抗ＣＤＨ１９及び抗ＣＤ３  ＢｉＴＥ抗体コンストラクト、抗ＦＬＴ３及び抗ＣＤ３  ＢｉＴＥ抗体コンストラクト、抗ＤＬＬ３及び抗ＣＤ３  ＢｉＴＥ抗体コンストラクト、抗ＣＤＨ３及び抗ＣＤ３  ＢｉＴＥ抗体コンストラクト、抗ＣＤ７０及び抗ＣＤ３  ＢｉＴＥ抗体コンストラクト、抗ＰＳＭＡ及び抗ＣＤ３  ＢｉＴＥ抗体コンストラクト又は抗ＢＣＭＡ及び抗ＣＤ３  ＢｉＴＥ抗体コンストラクトである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記限外濾過及び透析濾過操作は、約２５℃〜約５０℃の温度で行われる、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記限外濾過及び透析濾過操作は、約２５℃〜約４０℃の温度で行われる、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記限外濾過及び透析濾過操作は、約３０℃〜約４０℃の温度で行われる、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記最終限外濾過及び透析濾過操作から得られる前記組成物は、前記タンパク質を含む医薬製剤である、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記最終限外濾過及び透析濾過操作から得られる前記組成物は、前記タンパク質を含む原薬である、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記最終限外濾過及び透析濾過操作から得られる前記組成物は、前記ｐＨ調整工程なしで同じ方法によって調製された組成物と比較してより安定である、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年４月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／６５６，６８７号明細書の利益を主張するものであり、それは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本願は、安定なタンパク質組成物を製造する方法に関する。本願は、１つ以上の不純物を除去する精製手順を使用して、目的のタンパク質を精製する方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質、例えば抗体を含む治療用タンパク質の効率的且つ経済的な大規模精製は、バイオテクノロジー及び製薬産業にとって一層重要な考慮事項である。タンパク質は、一般に、細胞培養法を使用して、例えば適切な培地中で目的のタンパク質を産生するように遺伝子操作された哺乳動物又は細菌宿主細胞を使用して製造されるため、タンパク質を精製するプロセスには、培地成分及び宿主細胞から不純物を除去するための多くの様々な工程が含まれる。タンパク質を精製するプロセスは、精製下の特定の目的のタンパク質の特性によって変化し得るが、そのプロセスには、一般に、例えば遠心分離法及び／又は濾過法を使用して宿主細胞及び／又は細胞残屑からタンパク質を回収する工程並びに例えば１つ以上のクロマトグラフィー及び／又は濾過法を使用してタンパク質を精製し、種々の不純物をタンパク質から分離する工程が少なくとも含まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一般に、タンパク質精製プロセスは、最終限外濾過及び透析濾過（ＵＦ  ＤＦ）操作を含む。多くのタンパク質は、ＵＦ  ＤＦ操作中及び操作後に安定性の問題を経験する。例えば、タンパク質凝集は、ＵＦ  ＤＦ操作後の一般的な問題である。凝集は、精製中のタンパク質が不安定である場合に特に懸念される。結果として、ＵＦ  ＤＦ操作後に測定すると、タンパク質凝集体（例えば、高分子量（ＨＭＷ）凝集体）は、タンパク質組成物中に存在するか又はその量が増加し得る。しかしながら、ＵＦ  ＤＦ後のタンパク質組成物中の凝集体の存在は、凝集体が精製タンパク質の安定性及び効力に負の影響を及ぼし得るため、望ましくない。ＵＦ  ＤＦ操作中及び操作後のタンパク質凝集を減少させ、安定なタンパク質組成物を製造する方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
安定なタンパク質組成物を製造する方法が本明細書で提供される。本願は、ＵＦ  ＤＦ操作前に不安定性を低減するための条件が存在すると、ＵＦ  ＤＦ後の安定なタンパク質組成物（例えば、凝集体が低減されたタンパク質組成物）を得ることができるという驚くべき知見に基づいている。特に、本願は、精製プロセスから得られたタンパク質調製物のｐＨを最終ＵＦ  ＤＦ操作前に目標ｐＨに調整すると、ＵＦ  ＤＦ操作後にタンパク質を含む安定な組成物が得られるという驚くべき知見に基づいている。本明細書に開示された方法により調製されたタンパク質組成物は、ｐＨ調整工程を伴わない同様の方法によって調製されたタンパク質組成物と比較してより高い安定性を有する。
【０００６】
一実施形態において、本明細書に開示されるのは、タンパク質を含む組成物を調製する方法であって、目的のタンパク質を含む調製物であって、タンパク質及び１つ以上の不純物を含む試料を精製プロセスに供した後に得られる調製物を提供する工程と、最終限外濾過及び透析濾過操作前に調製物のｐＨを目標ｐＨに調整する工程と、タンパク質を含む組成物を最終限外濾過及び透析濾過操作から得る工程とを含み、目標ｐＨは、最終限外濾過及び透析濾過操作から得られる、タンパク質を含む組成物のｐＨ又はその近傍である、方法である。一実施形態では、ｐＨは、ｐＨ調整剤を使用して調整される。一実施形態では、ｐＨ調整剤は、酸、塩基又は緩衝液である。一実施形態では、目標ｐＨは、ｐＨ４．０〜約ｐＨ７．０又はｐＨ４．０〜約ｐＨ６．０である。
【０００７】
一実施形態では、調製物のｐＨを調整するために使用される酸は、酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、クエン酸、カプリル酸、ギ酸、グルタミン酸、塩酸、臭化水素酸、ヒドロキシ酸、ヒアルロン酸、乳酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、硝酸、リン酸、プロピオン酸、硫酸又は酒石酸である。別の実施形態では、調製物のｐＨを調整するために使用される塩基は、アンモニア溶液、炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、水酸化カルシウム、エタノールアミン、リシン、ポリリシン、メグルミン、水酸化カリウム、重炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム又はトリエタノールアミンである。一実施形態では、調製物のｐＨを調整するために使用される緩衝液は、酢酸緩衝液、アスパラギン酸緩衝液、アスコルビン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、グリシン緩衝液、炭酸緩衝液、乳酸緩衝液、トリス緩衝液、ビス−トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＡＤＡ緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液又は安息香酸緩衝液である。
【０００８】
一実施形態では、本方法は、調製物中のタンパク質を目標濃度に濃縮する工程をさらに含む。一実施形態では、濃縮工程は、ｐＨ調整工程後及び最終ＵＦ  ＤＦ操作前に行われる。別の実施形態では、濃縮工程は、ｐＨ調整工程前に行われる。一実施形態では、目標濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬであり、別の実施形態では、目標濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬであり、別の実施形態では、目標濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬであり、別の実施形態では、目標濃度は、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬであり、別の実施形態では、目標濃度は、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬである。
【０００９】
一実施形態では、最終限外濾過及び透析濾過操作は、緩衝液を含む媒体を使用して行われ、一実施形態では、最終限外濾過及び透析濾過操作は、緩衝液を２ｍＭ〜１０ｍＭ、２ｍＭ〜５０ｍＭ又は２ｍＭ〜３００ｍＭの濃度で含む媒体を使用して行われる。別の実施形態では、最終限外濾過及び透析濾過操作は、実質的に緩衝液を含まない培地を使用して行われる。
【００１０】
一実施形態では、最終限外濾過及び透析濾過操作から得られる組成物は、緩衝液を実質的に含まず、且つタンパク質を約４０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。一実施形態では、最終限外濾過及び透析濾過操作から得られる組成物は、緩衝液を含み、且つタンパク質を約１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。一実施形態では、最終限外濾過及び透析濾過操作から得られる組成物は、緩衝液を２ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で含み、且つタンパク質を約１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。一実施形態では、最終限外濾過及び透析濾過操作から得られる組成物は、緩衝液であって、その緩衝液の緩衝能範囲外のｐＨにおける緩衝液を含み、且つタンパク質を約１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。一実施形態では、最終限外濾過及び透析濾過操作から得られる組成物は、タンパク質を含む医薬製剤である。一実施形態では、最終限外濾過及び透析濾過操作から得られる組成物は、タンパク質を含む原薬である。一実施形態では、最終限外濾過及び透析濾過操作から得られる組成物は、ｐＨ調整工程なしで同じ方法によって調製された組成物と比較してより安定である。
【００１１】
一実施形態では、限外濾過及び透析濾過操作は、約２５℃〜約５０℃の温度で行われる。
【００１２】
一実施形態では、タンパク質は、遠心分離、精密濾過、ＴＦＦ、ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、限外濾過、透析濾過、ＳＰＴＦＦ、深層濾過及び混合モードクロマトグラフィーから選択される１つ以上の工程を含む精製プロセスから得られる。一実施形態では、精製プロセスは、ウイルス濾過工程と、遠心分離、精密濾過、ＴＦＦ、ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、限外濾過、透析濾過、ＳＰＴＦＦ及び深層濾過から選択される１つ以上の工程とを含み、及び調製物は、ウイルス濾過工程から得られる。
【００１３】
一実施形態では、精製プロセスは、陽イオン交換クロマトグラフィー工程と、以下の工程：遠心分離、精密濾過、ＴＦＦ、ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、限外濾過、透析濾過、ＳＰＴＦＦ、ウイルス濾過及び深層濾過の１つ以上とを含み、及び調製物は、陽イオン交換クロマトグラフィー工程から得られる。一実施形態では、精製プロセスは、陰イオン交換クロマトグラフィー工程と、以下の工程：遠心分離、精密濾過、ＴＦＦ、ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、限外濾過、透析濾過、ＳＰＴＦＦ、ウイルス濾過及び深層濾過の１つ以上とを含み、及び調製物は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程から得られる。一実施形態では、精製プロセスは、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程と、以下の工程：遠心分離、精密濾過、ＴＦＦ、ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、限外濾過、透析濾過、ＳＰＴＦＦ、ウイルス濾過及び深層濾過の１つ以上とを含み、及び調製物は、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程から得られる。一実施形態では、精製プロセスは、混合モードクロマトグラフィー工程と、以下の工程：遠心分離、精密濾過、ＴＦＦ、ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、限外濾過、透析濾過、ＳＰＴＦＦ、ウイルス濾過及び深層濾過の１つ以上とを含み、及び調製物は、混合モードクロマトグラフィー工程から得られる。
【００１４】
一実施形態では、本明細書に開示する方法は、調製物に安定剤を添加することをさらに含む。一実施形態では、安定剤は、アミノ酸、糖、ポリオール、抗酸化剤、キレート剤、脂質又は脂質誘導体、塩、ポリマー、不活性タンパク質、界面活性剤及び水混和性共溶媒から選択される１つ以上である。
【００１５】
一実施形態では、本明細書に開示する方法において使用することができるタンパク質は、治療用タンパク質である。一実施形態では、タンパク質は、以下のタンパク質のいずれか１つである：エタネルセプト、アフリベルセプト、アダリムマブ、エポエチンアルファ、ダルベポエチンアルファ、フィルグラスチム、ペグフィルグラスチム、ベバシズマブ、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、エクリズマブ、トラスツズマブ、エボロクマブ、デノスマブ、ロモソズマブ、エレヌマブ、ブリナツモマブ、抗ＣＤ３３及び抗ＣＤ３  ＢｉＴＥ、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ及び抗ＣＤ３  ＢｉＴＥ、抗ＤＬ３及び抗ＣＤ３ＢｉＴＥ並びに抗ＢＣＭＡ及び抗ＣＤ３  ＢｉＴＥ。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１のアッセイにおける、調整したＡＥＸ中間体プールの制御された室温（ＣＲＴ）でのｐＨの安定性を示す。
【図２Ａ】図２は、実施例１のアッセイにおける、ＵＦ  ＤＦプールのｐＨ（Ａ）及び導電率（Ｂ）のＣＲＴでの安定性を示す。
【図２Ｂ】図２は、実施例１のアッセイにおける、ＵＦ  ＤＦプールのｐＨ（Ａ）及び導電率（Ｂ）のＣＲＴでの安定性を示す。
【図３Ａ】図３は、実施例１のアッセイにおいてＳＡＳ溶液で製剤化されたエタネルセプトのｐＨ（Ａ）及び導電率（Ｂ）の安定性を示す。
【図３Ｂ】図３は、実施例１のアッセイにおいてＳＡＳ溶液で製剤化されたエタネルセプトのｐＨ（Ａ）及び導電率（Ｂ）の安定性を示す。
【図４】ＶＦプールのｐＨ調整時の緩衝化製剤及び緩衝剤非含有製剤におけるＵＦ  ＤＦ操作後のＨＭＷの量を示す。
【図５】ｐＨ調整工程及び濃縮工程の４つの製造オプション（オプションＡ〜Ｄ）を示す。
【図６】４つの製造オプションを使用して調製されたアフリベルセプト組成物のＨＭＷ％を示す。
【図７】実施例７においてＣＥＸ−ＨＰＬＣによって測定された輸送なしの４℃でのアダリムマブ製剤の酸性ピーク％を示す。
【図８】実施例７においてＣＥＸ−ＨＰＬＣによって測定された輸送ありの４℃でのアダリムマブ製剤の酸性ピーク％を示す。
【図９】実施例７においてＣＥＸ−ＨＰＬＣによって測定された輸送なしの２５℃でのアダリムマブ製剤の酸性ピーク％を示す。
【図１０】実施例７においてＣＥＸ−ＨＰＬＣによって測定された輸送ありの２５℃でのアダリムマブ製剤の酸性ピーク％を示す。
【図１１】実施例７においてＣＥＸ−ＨＰＬＣによって測定された輸送なしの４０℃でのアダリムマブ製剤の酸性ピーク％を示す。
【図１２】実施例７においてＣＥＸ−ＨＰＬＣによって測定された輸送ありの４０℃でのアダリムマブ製剤の酸性ピーク％を示す。
【図１３】実施例７においてＳＥ−ＨＰＬＣによって測定された輸送なしの４℃でのアダリムマブ製剤のＨＭＷを示す。
【図１４】実施例７においてＳＥ−ＨＰＬＣによって測定された輸送ありの４℃でのアダリムマブ製剤のＨＭＷを示す。
【図１５】実施例７においてＳＥ−ＨＰＬＣによって測定された輸送なしの２５℃でのアダリムマブ製剤のＨＭＷを示す。
【図１６】実施例７においてＳＥ−ＨＰＬＣによって測定された輸送ありの２５℃でのアダリムマブ製剤のＨＭＷを示す。
【図１７】実施例７においてＳＥ−ＨＰＬＣによって測定された輸送なしの４０℃でのアダリムマブ製剤のＨＭＷを示す。
【図１８】実施例７においてＳＥ−ＨＰＬＣによって測定された輸送ありの４０℃でのアダリムマブ製剤のＨＭＷを示す。
【図１９】実施例７においてＭＦＩによって測定されたアダリムマブ製剤中の５μＭサブビジブル粒子の数を示す。
【図２０】実施例７においてＭＦＩによって測定されたアダリムマブ製剤中の１０μＭサブビジブル粒子の数を示す。
【図２１】実施例７においてＭＦＩによって測定されたアダリムマブ製剤中の２５μＭサブビジブル粒子の数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書において、安定なタンパク質組成物を製造する方法が提供される。「安定な」タンパク質組成物は、その中のタンパク質が貯蔵時にその物理的安定性、及び／又は化学的安定性、及び／又は生物学的活性を実質的に保持するものである。タンパク質組成物の安定性は、組成物中の高分子量（ＨＭＷ）凝集体などの凝集タンパク質の存在及び／若しくは割合により、又はタンパク質の分解、例えば酸化及び／若しくは脱アミド化による分解の存在及び／若しくは割合により、又は貯蔵時の組成物のｐＨのシフトにより決定することができる。例えば、安定なタンパク質組成物は、７％以下、若しくは５％以下、若しくは２％以下、若しくは１．２％以下、若しくは１％以下、若しくは０．８％以下、若しくは０．５％以下のタンパク質凝集体を含み得るか、又は安定なタンパク質組成物は、例えば、酸化及び／若しくは脱アミド化によって検出可能なタンパク質の分解物を含有し得ないか、又は安定なタンパク質組成物は、貯蔵時に０．１ｐＨ単位以下若しくは０．２ｐＨ単位以下のｐＨ最大シフトを示し得る。
【００１８】
タンパク質安定性を測定するための様々な分析技術が当技術分野で知られており、且つ利用可能である。例えば、サイズ排除クロマトグラフィーは、タンパク質凝集体の評価に広く使用されている技術である。例えば、Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ，Ｆｅｋｅｔｅ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，１０１：１６１−１７３（２０１４）を参照されたい。タンパク質の安定性及び凝集体を分析する方法は、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ  Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）及びＡｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９−９０（１９９３）にも概説されている。
【００１９】
一実施形態において、本明細書で開示する方法は、目的のタンパク質を含む調製物であって、タンパク質及び１つ以上の不純物を含むサンプルを精製プロセスに供した後に得られる調製物を提供する工程と、最終限外濾過及び透析濾過操作前に調製物のｐＨを目標ｐＨに調整する工程と、タンパク質を含む組成物を最終限外濾過及び透析濾過操作から得る工程とを含み、目標ｐＨは、最終限外濾過及び透析濾過操作から得られる、タンパク質を含む組成物のｐＨ又はその近傍である。
【００２０】
目標ｐＨ及びｐＨ調整剤
目標ｐＨは、目的のタンパク質が安定であるｐＨ範囲又はｐＨ値である。いくつかの実施形態では、目標ｐＨは、約３〜約１０、約４．０〜約５．０、約４．０〜約６．０、約４．０〜約７．０、約５．０〜約６．０、約６．０〜約７．０、約４．２〜約５．２、約４．４〜約５．４、約４．６〜約５．６、約４．８〜約５．８、約５．２〜約６．２、約５．４〜約６．４、約５．６〜約６．６、約５．８〜約６．８、約４．９〜約５．６、約５．０〜約５．５、約５．１〜約５．４、約５．１〜約５．３、約５．１〜約５．２、約５．２〜約５．３、約６．１〜約６．５又は約６．１〜約６．３の範囲である。いくつかの実施形態では、目標ｐＨは、約４．０、約４．２、約４．４、約４．６、約４．８、約５．０、約５．２、約５．４、約５．６、約５．８、約６．０、約６．２、約６．４、約６．６、約６．８又は約７．０である。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、特定の値又は範囲を変更するために使用されるとき、所与の値又は範囲において２０パーセント以内、例えば記載された値又は範囲の１０パーセント以内、５パーセント以内、４パーセント以内、３パーセント以内、２パーセント以内又は１パーセント以内を含む変動があり得ることを意味すると理解される。
【００２２】
本明細書に開示する方法の一実施形態では、ｐＨ調整工程は、ｐＨ調整剤を使用して行われる。一実施形態では、ｐＨ調整剤は、酸であり、一実施形態では、ｐＨ調整剤は、塩基であり、一実施形態では、ｐＨ調整剤は、緩衝液である。
【００２３】
一実施形態では、ｐＨ調整剤は、酸である。酸は、目標ｐＨが調製物のｐＨよりも低い（すなわちより酸性である）場合、調製物のｐＨの調整に使用され得る。通常、非毒性であり、タンパク質に悪影響を及ぼさない（例えば、タンパク質の安定性に悪影響を及ぼさない）酸がｐＨ調整剤として使用され得る。一実施形態では、酸は、無機酸であり、別の実施形態では、酸は、有機酸である。調製物のｐＨを調節するために使用され得る酸の非限定的な例としては、酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、ホウ酸、カンファースルホン酸、クエン酸、カプリル酸、ギ酸、グルタミン酸、塩酸、臭化水素酸、ヒドロキシ酸（アルファ、ベータ及びオメガヒドロキシ酸を含む）、ヒアルロン酸、乳酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、硝酸、リン酸、プロピオン酸、硫酸、スルホン酸、トラネキサム酸及び酒石酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、酸は、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、塩酸、臭化水素酸、乳酸、硫酸、プロピオン酸、酒石酸、ヒドロキシ酸（アルファ、ベータ及びオメガヒドロキシ酸を含む）又はヒアルロン酸である。いくつかの好ましい実施形態では、酸は、乳酸、ヒドロキシ酸（アルファ、ベータ及びオメガヒドロキシ酸を含む）又はヒアルロン酸である。
【００２４】
一実施形態では、ｐＨ調整剤は、塩基である。塩基は、目標ｐＨが調製物のｐＨよりも高い（すなわちより塩基性である）場合、調製物のｐＨの調整に使用され得る。通常、非毒性であり、タンパク質に悪影響を及ぼさない（例えば、タンパク質の安定性に悪影響を及ぼさない）塩基がｐＨ調整剤として使用され得る。一実施形態では、塩基は、無機塩基であり、別の実施形態では、塩基は、有機塩基である。調製物のｐＨを調整するために使用され得る塩基の非限定的な例としては、アンモニア溶液、炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、水酸化カルシウム、エタノールアミン、リシン、メグルミン、ポリリシン、水酸化カリウム、重炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム及びトリエタノールアミンが挙げられる。一実施形態では、塩基は、水酸化カリウム又は水酸化ナトリウムである。
【００２５】
一実施形態では、ｐＨ調整剤は、緩衝液である。緩衝液を調製物に添加して、調製物のｐＨを目標ｐＨに調整し、安定化させるために、緩衝液を添加することができる。緩衝液は、通常、プロトン化状態の変化によって関連する２つの化学種、例えば酸及びその共役塩基又は塩基及びその対応する共役酸を含む。緩衝液又は緩衝能は、緩衝液の特性であり、緩衝液がｐＨをどの程度良好に維持するかを測定する。緩衝液の緩衝能に影響を及ぼす因子としては、緩衝液の濃度が挙げられ、一般に濃度が高いほど緩衝能が高くなる。さらに、緩衝液は、一般に、対応する酸形態のｐＫａ付近で約±１（１）ｐＨ単位である緩衝能範囲を示す。例えば、酢酸のｐＫａは、約４．８であり、酢酸緩衝液は、およそ約ｐＨ３．８〜約ｐＨ５．８のｐＨ範囲で緩衝能を有する。
【００２６】
一般的に、非毒性であり、タンパク質に悪影響を及ぼさない（例えば、タンパク質の安定性に悪影響を及ぼさない）緩衝液がｐＨ調整剤として使用され得る。タンパク質調製物のｐＨを調節及び／又は維持するために有用な緩衝液は、当技術分野でよく知られている（例えば、Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｂｕｆｆｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｕｅｆｆｒｏｙ，Ｄ．，ｅｄ．Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１９７５）；Ｚｂａｃｎｉｋ  Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｂｕｆｆｅｒｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０６：７１３−７３３（２０１７）。調製物のｐＨを調整するために使用され得る緩衝液の非限定的な例としては、酢酸緩衝液、アスパラギン酸緩衝液、アスコルビン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、安息香酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）緩衝液、ヒスチジン緩衝液、乳酸緩衝液、リン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、トリス緩衝液、ビス−トリス緩衝液及び酒石酸緩衝液が挙げられる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ｐＨ調整剤は、低い緩衝能を有する緩衝液である。これは、例えば、緩衝液の緩衝能範囲内のｐＨであるが、低濃度のｐＨの緩衝液を使用することにより、又は緩衝液の緩衝能範囲外のｐＨ（例えば、緩衝液の対応する酸形態のｐＫａの１ｐＨ単位より大きいｐＨ）の緩衝液を使用することにより達成され得る。いくつかの実施形態では、ｐＨ調整剤は、２ｍＭ〜２０ｍＭの濃度及び緩衝液の緩衝能範囲内のｐＨの緩衝液である。いくつかの実施形態では、ｐＨ調整剤は、２ｍＭ〜１０ｍＭの濃度及び緩衝液の緩衝能範囲内のｐＨの緩衝液である。いくつかの実施形態では、ｐＨ調整剤は、緩衝液の緩衝能範囲外のｐＨの緩衝液である。いくつかの実施形態では、ｐＨ調整剤は、緩衝液の緩衝能範囲外のｐＨ及び２ｍＭ〜５０ｍＭの濃度の緩衝液である。当業者は、低い緩衝能を提供する特定の緩衝液の緩衝液濃度又は濃度範囲を決定することができる。同様に、当業者は、所与の緩衝液の緩衝能範囲及び低緩衝能を提供する範囲外で使用するために適切な緩衝液の量を決定することができる。
【００２８】
濃縮工程
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、調製物中のタンパク質を目標濃度に濃縮することをさらに含む。一実施形態では、濃縮工程は、最終ＵＦ  ＤＦ操作前に行われる。一実施形態では、濃縮工程は、ｐＨ調整工程前に行われる。一実施形態では、濃縮工程は、ｐＨ調整工程後及び最終ＵＦ／ＤＦ操作前に行われる。一実施形態では、濃縮工程は、最終ＵＦ  ＤＦ操作後に行われる。一実施形態では、本明細書に開示する方法は、まず、最終ＵＦ  ＤＦ操作前に調製物中のタンパク質を中間濃度に濃縮し、且つ最終ＵＦ  ＤＦ操作後にタンパク質を目標濃度にさらに濃縮することをさらに含む。目標濃度は、最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られた組成物中のタンパク質の濃度又はその近傍である。
【００２９】
タンパク質は、当技術分野で知られた方法を使用して濃縮することができる。タンパク質を濃縮するために使用され得る非限定的な例示的方法としては、限外濾過、遠心力による膜濃縮器（例えば、セルロース膜濃縮器）を使用する濃縮、吸水性材料（例えば、吸水性ポリマー）に対する透析、塩析（例えば、硫酸アンモニウムを使用する）及びクロマトグラフィー法（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）が挙げられる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、濃縮工程の目標濃度は、最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られる組成物中のタンパク質の濃度又はその近傍である。いくつかの実施形態では、濃縮工程の目標濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約１１０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約１７０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ又は約１９０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの範囲である。いくつかの実施形態では、濃縮工程の目標濃度は、約１０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約５５ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約６５ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約７５ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約８５ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約９５ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１１０ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ、約１７０ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ、約１９０ｍｇ／ｍＬ又は約２００ｍｇ／ｍＬである。
【００３１】
タンパク質精製プロセス
本明細書に開示する方法のいくつかの実施形態では、ｐＨが調整される調製物は、目的のタンパク質及び１つ以上の不純物を含む試料を精製プロセスに供することによって得られる。目的のタンパク質を精製するプロセスは、細胞採取から最終精製タンパク質までの全てのプロセス工程を包含し、一般的には、種々の不純物をタンパク質から分離するため、宿主細胞及び／又は細胞残屑からタンパク質を回収する工程（例えば、遠心分離法及び／又は濾過法を使用する）と、タンパク質を精製する工程（例えば、１つ以上のクロマトグラフィー法及び／又は濾過法を使用する）とを少なくとも含む。当技術分野で通常使用される精製工程を以下に記載する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、例えば、宿主細胞を使用して、組換え系において産生される。組換え系において、タンパク質は、宿主細胞から増殖培地中に分泌されるか又は細胞内で作られ得る。精製プロセスは、宿主細胞又は細胞培地から目的のタンパク質を回収することから開始される。いくつかの実施形態では、精製プロセスは、宿主細胞から目的のタンパク質を回収するため、以下の工程の１つ以上を含む：遠心分離、精密濾過、シングルパスタンデンシャルフローフィルトレーション（ＳＰＴＦＦ）、限外濾過及び透析濾過。例えば、タンパク質が細胞内で産生される場合、第１の工程として、例えば機械的ホモジナイゼーション、浸透圧ショック又は酵素処理によって宿主細胞を溶解し、タンパク質を放出させる。残屑を例えば遠心分離、精密濾過、限外濾過及び／又は透析濾過によって除去する。タンパク質が培地中に分泌される場合、このような発現系からの上清を、まず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ（商標）又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（商標）限外濾過ユニットを使用して濃縮限外濾過及び／又は透析濾過し得る。
【００３３】
次いで、宿主細胞から回収されたタンパク質を、当技術分野で知られ且つ使用されている種々の方法、例えばウイルス不活化工程、種々のクロマトグラフィー法及び種々の濾過法を使用して精製する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、精製プロセスは、例えば、ウイルスを不活化するか又は複製若しくは感染できないようにするウイルス不活化薬剤及び／又は方法を使用することにより、ウイルスを不活化する工程を含む。多くのウイルス不活化剤が当技術分野で知られ且つ使用されている。例えば、Ｇａｉｌ  Ｓｏｆｅｒ，“Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  １９９０ｓ  −  ａｎｄ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ２１ｓｔ  Ｃｅｎｔｕｒｙ，Ｐａｒｔ  ４，Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，”Ｂｉｏｐｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ｐｐ．５０−５７（２００３）を参照されたい。例示的なウイルス不活化方法としては、溶媒／洗浄剤不活化（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００による）、低温殺菌（加熱）、酸性ｐＨ不活化（例えば、ｐＨ３〜５において）及び紫外線（ＵＶ）不活化が挙げられる。これらの方法の２つ以上を組み合わせて（例えば、高温で酸性ｐＨ不活化を行って）、ウイルスを不活化することも可能である。
【００３５】
特定の実施形態では、精製プロセスは、アフィニティークロマトグラフィー工程を含む。アフィニティークロマトグラフィーは、目的のタンパク質（例えば、目的のタンパク質を含むＦｃ領域又は抗体）が、標的タンパク質に特異的なリガンドに特異的に結合されるタンパク質分離技術を指す。特定の実施形態では、精製プロセスがアフィニティークロマトグラフィー工程で使用するためのプロテインＡベースのアフィニティー樹脂の使用を含む。プロテインＡは、天然のプロテインＡ（スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈ．Ａｕｒｅｕｓ）由来）、組換えプロテインＡ又はその機能的変異体であり得る。使用し得るプロテインＡ樹脂の例としては、ＰｒｏＳｅｐ−ｖＡ  ＨＣ、ＰｒｏＳｅｐ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ及び他の市販のアフィニティー樹脂が挙げられる。他のアフィニティーリガンド／樹脂、例えばプロテインＧ及び他のＦｃ結合タンパク質（例えば、一本鎖ラクダ抗体）を、本明細書に記載の精製方法において利用することができるであろう。目的のタンパク質は、一般に、クロマトグラフィー工程中、リガンドに対するその特異的結合親和性を保持する一方、混合物中の他の不純物は、リガンドに検知できるほどに又は特異的に結合しない。次いで、当技術分野で知られた溶液、例えばアフィニティークロマトグラフィー工程で使用されるアフィニティー樹脂の製造で推奨される溶液を使用して、目的のタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出する。
【００３６】
特定の実施形態では、精製プロセスは、イオン交換クロマトグラフィー工程を含む。イオン交換クロマトグラフィーは、膜イオン交換クロマトグラフィー又はカラムイオン交換クロマトグラフィーであり得る。イオン交換クロマトグラフィーは、それぞれのイオン電荷の差に基づいてタンパク質を分離するものであり、陽イオン交換クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーを含む。陽イオン交換クロマトグラフィー対陰イオン交換クロマトグラフィーの使用は、タンパク質の全電荷に基づく。目的のタンパク質を精製するために、陽イオン交換クロマトグラフィーのみを使用するか、陰イオン交換クロマトグラフィーのみを使用するか、又はこれらの２つの組み合わせを使用するかを決定することは、当業者の能力の範囲内である。いくつかの実施形態では、精製プロセスは、陽イオン交換工程のみを使用する。いくつかの実施形態では、精製プロセスは、陽イオン交換工程のみを使用する。いくつかの実施形態では、精製プロセスは、陽イオン交換工程の使用前に陰イオン交換工程を使用する。いくつかの実施形態では、精製プロセスは、陰イオン交換工程の使用前に陽イオン交換工程を使用する。
【００３７】
イオン交換クロマトグラフィーでは、調製物中の目的のタンパク質は、周囲の溶液又は緩衝液のイオン強度が低い場合、クロマトグラフィーマトリックスに付着した反対の電荷に引き付けられる。溶出は、一般に、溶出溶液のイオン強度（すなわち導電率）を増大させて、イオン交換マトリックスの荷電部位で溶質と競合させることによって達成される。調製物の導電率は、例えば、調製物に塩を添加することによって増加させることができる。使用し得る塩は、調製物のｐＨに依存し、当業者であれば容易に確認することができる。いくつかの実施形態では、添加する塩の量は、２５ｍＭ〜５００ｍＭ及び１００ｍＭ〜２５０ｍＭの範囲である。ｐＨを変化させ、それによって目的のタンパク質の電荷を変化させることは、タンパク質を溶出させるための別の方法である。導電率又はｐＨの変化は、漸進的（勾配溶出）又は段階的（段階的溶出）であり得る。
【００３８】
陽イオン交換材料又は樹脂は、商業的供給源から入手可能である。陽イオン交換クロマトグラフィーに好適な非限定的なカチオン性材料としては、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、リン酸（Ｐ）、スルホン酸（Ｓ）及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ陽イオン交換材料が挙げられる。ＤＥ２３（商標）、ＤＥ３２（商標）、ＤＥ５２（商標）、ＣＭ−２３（商標）、ＣＭ−３２（商標）及びＣＭ−５２（商標）などのセルロースイオン交換樹脂は、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｌｔｄ．Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、Ｋｅｎｔ、Ｕ．Ｋ．から入手可能である。ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）ベースの架橋イオン交換体も知られている。例えば、ＤＥＡＥ−、ＱＡＥ−、ＣＭ−及びＳＰ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）、ＤＥＡＥ−、Ｑ−、ＣＭ−及びＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）並びにＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗは、全てＰｈａｒｍａｃｉａ  ＡＢから入手可能である。さらに、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＤＥＡＥ−６５０Ｓ又はＭ及びＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＣＭ−６５０Ｓ又はＭなどのＤＥＡＥ及びＣＭ誘導エチレングリコール−メタクリレートコポリマーは、いずれもＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａから入手可能である。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ陽イオン交換材料としては、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＳＯ３−（Ｓ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＣＯＯ−（Ｓ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＳＯ３−（Ｍ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉｃａｐ（Ｍ）及びＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＣＯＯ−（Ｍ）が挙げられる。
【００３９】
陰イオン交換材料又は樹脂は、商業的供給源から入手可能である。陰イオン交換置換基の非限定的な例としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）基及び第四級アミン（Ｑ）基が挙げられる。例示的な陰イオン交換材料としては、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手可能なＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ（Ｓ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＤＥＡＥ（Ｓ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤＤＭＡＥ（Ｓ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ（Ｍ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥＨｉｃａｐ（Ｍ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＤＥＡＥ（Ｍ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＤＭＡＥ（Ｍ）が挙げられる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、精製プロセスは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程を含む。一般に、ＨＩＣは、抗体凝集体などのタンパク質凝集体及びプロセス関連不純物を除去するのに有用である。いくつかの実施形態では、疎水性相互作用は、高イオン強度で最も強いため、ＨＩＣは、塩沈殿又はイオン交換手順後に行われる。多くのＨＩＣカラムが市販されている。非限定的な例としては、低置換又は高置換のＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｏｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  Ｐｒｏｐｙｌカラム又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  Ｐｈｅｎｙｌカラム（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）Ｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｐｐｏｒｔ又はＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）ｔ−Ｂｕｔｙｌ  Ｓｕｐｐｏｒｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＷＰ  ＨＩ−Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ３）（商標）カラム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨｉＳｕｂ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＴｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）エーテル、フェニル又はブチルカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ、Ｐａ．）が挙げられる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、精製プロセスは、混合モード又はマルチモードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）を含む。ＭＭＣは、溶質が２つ以上の相互作用様式又は機構によって固定相と相互作用するクロマトグラフィー法である。マルチモード機能性リガンドを使用するＭＭＣは、イオン相互作用、水素結合及び疎水性相互作用の組み合わせで目的のタンパク質を吸着することができる。混合モード樹脂は、それらの多重結合相互作用のため、希釈又は他の添加剤なしに比較的高い塩濃度で標的タンパク質を直接捕捉することができる。非限定的な市販の例示的混合モード樹脂としては、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＣａｐｔｏ  ＭＭＣ、Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ及びＣａｐｔｏ  Ｃｏｒｅ  ７００、Ｐａｌｌ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＰＰＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、ＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ及びＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、Ｍｅｒｃｋ  ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＥｓｈｍｕｎｏ  ＨＣＸ、ＴＯＳＯＨ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＭＸ−Ｔｒｐ−６５０  Ｍ並びにＢｉｏ−ＲａｄからのＮｕｖｉａ  ｃＰｒｉｍｅ、ＣＨＴ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ及びＣＦＴ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｆｌｕｏｒｏａｐａｔｉｔｅが挙げられる。
【００４２】
いくつかの実施形態では、タンパク質精製プロセスは、限外濾過及び／又は透析濾過工程を含む。限外濾過は、溶媒及び小溶質分子を通過させながら、高分子を保持する半透膜による分離プロセスである。限外濾過プロセスは、当技術分野で知られており、タンパク質精製プロセスにおいて一般に使用されている（例えば、Ｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．２９９−３０１（１９９６））。限外濾過を用いて、タンパク質などの微小分子を精製し、濃縮することができる。透析濾過は、限外濾過膜を使用して、タンパク質、ペプチド、核酸及び他の生体分子を含有する溶液から塩又は溶媒の濃度を除去、置換又は低下させる方法である。特定の実施形態では、タンパク質精製プロセスは、宿主細胞から目的のタンパク質を回収する場合、限外濾過及び／又は透析濾過操作を使用する。他の実施形態では、限外濾過及び／又は透析濾過は、精製の最後から２番目又は最後の工程として含む、精製プロセスの他の工程において使用される。限外濾過及び透析濾過工程は、タンパク質を濃縮するため、又は緩衝液を変えるため、又は目的のタンパク質を所望の溶液若しくは所望の緩衝液に配合するために使用され得る。
【００４３】
いくつかの実施形態では、タンパク質精製プロセスは、必要に応じて、上記の工程のいずれかの間及び後にウイルス濾過工程を含む。特定の実施形態では、精製プロセスは、ウイルス不活化後、又はアフィニティークロマトグラフィー後、又は陽イオン交換クロマトグラフィー後、又は陰イオン交換クロマトグラフィー後、又はＨＩＣ後、又は混合モードクロマトグラフィー後にウイルス濾過工程を含む。特定の実施形態では、精製プロセスは、陽イオン交換クロマトグラフィー前、又は陰イオン交換クロマトグラフィー前、又はＨＩＣ前、又は混合モードクロマトグラフィー前にウイルス濾過工程を含む。特定の実施形態では、精製プロセスは、精製の最終工程として又は精製の最後から２番目の工程として、例えば最終限外濾過及び透析濾過操作前にウイルス濾過工程を含む。
【００４４】
ウイルス濾過は、適切なフィルターの使用によって達成され得る。ウイルス濾過に好適なフィルターの非限定的例としては、Ｐａｌｌ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＵｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ５０（商標）フィルター、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（商標）フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓ．）、Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ＶＲ（商標）フィルター（ＣＵＮＯ；Ｍｅｒｉｄｅｎ、Ｃｏｎｎ．）及びＰｌａｎｏｖａ（商標）フィルター（Ａｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ  Ｐｈａｒｍａ、Ｐｌａｎｏｖａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ、Ｉｌｌ．）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ウイルス濾過工程は、プレフィルターを使用する。プレフィルターは、膜、デプスフィルター、クロマトグラフィーカラム又はこれらの組み合わせ（これらに限定されない）を含む任意の構成であり得る。ウイルス濾過に使用できるデプスフィルターの非限定的な例としては、Ｃｕｎｏ（商標）モデル３０／６０ＺＡデプスフィルター（３Ｍ  Ｃｏｒｐ．）及び０．４５／０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ（商標）二層フィルターカートリッジが挙げられる。
【００４５】
特定の実施形態では、精製プロセスは、さらなるプロセス工程、例えば製剤化及び／又は濃縮工程を含むことができる。一実施形態では、精製プロセスは、除菌濾過及び／又は絶対濾過をさらに含む。除菌濾過は、通常、全量濾過（ＮＦＦ）を使用して行われ、この場合、流体流の方向は、フィルター媒体（例えば、膜）コーダーに対して垂直であり、圧力が加えられる。
【００４６】
本明細書に開示する方法のいくつかの実施形態では、ｐＨを調整する調製物は、以下の工程の１つ以上を含む精製プロセスから得られる：遠心分離、精密濾過、タンデンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）、ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、限外濾過、透析濾過、シングルパスタンデンシャルフローフィルトレーション（ＳＰＴＦＦ）、深層濾過及びウイルス濾過。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ｐＨを調整する調製物は、ウイルス濾過工程と、以下の工程：遠心分離、精密濾過、タンデンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）、ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、限外濾過、透析濾過、シングルパスタンデンシャルフローフィルトレーション（ＳＰＴＦＦ）及び深層濾過の１つ以上とを含む精製プロセスから得られ、調製物は、ウイルス濾過工程から得られる。いくつかの実施形態では、ウイルス濾過工程は、精製工程の最後から２番目の工程であり、調製物は、ウイルス濾過工程から得られる。いくつかの実施形態では、ウイルス濾過工程は、精製工程の最後の工程であり、調製物は、ウイルス濾過工程から得られる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ｐＨを調整する調製物は、陽イオン交換クロマトグラフィー工程と、以下の工程：遠心分離、精密濾過、タンデンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）、ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、限外濾過、透析濾過、シングルパスタンデンシャルフローフィルトレーション（ＳＰＴＦＦ）、深層濾過及びウイルス濾過の１つ以上とを含む精製プロセスから得られ、調製物は、陽イオン交換クロマトグラフィー工程から得られる。いくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィー工程は、精製工程の最後から２番目の工程又は最後の工程であり、調製物は、陽イオン交換クロマトグラフィー工程から得られる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ｐＨを調整する調製物は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程と、以下の工程：遠心分離、精密濾過、タンデンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）、ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、限外濾過、透析濾過、シングルパスタンデンシャルフローフィルトレーション（ＳＰＴＦＦ）、深層濾過及びウイルス濾過工程の１つ以上とを含む精製プロセスから得られ、調製物は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程から得られる。いくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー工程は、精製工程の最後から２番目の工程又は最後の工程であり、調製物は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程から得られる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ｐＨを調整する調製物は、疎水性相互作用クロマトグラフィーと、以下の工程：遠心分離、精密濾過、タンデンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）、ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、限外濾過、透析濾過、シングルパスタンデンシャルフローフィルトレーション（ＳＰＴＦＦ）、深層濾過及びウイルス濾過の１つ以上とを含む精製プロセスから得られ、調製物は、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程から得られる。いくつかの実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程は、精製工程の最後から２番目の工程又は最後の工程であり、調製物は、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程から得られる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ｐＨを調整する調製物は、混合モードクロマトグラフィー工程と、以下の工程：遠心分離、精密濾過、タンデンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）、ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、限外濾過、透析濾過、シングルパスタンデンシャルフローフィルトレーション（ＳＰＴＦＦ）、深層濾過及びウイルス濾過の１つ以上とを含む精製プロセスから得られ、調製物は、混合モードクロマトグラフィー工程から得られる。いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィー工程は、精製工程の最後から２番目の工程又は最後の工程であり、調製物は、混合モードクロマトグラフィー工程から得られる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ｐＨを調整する調製物は、ウイルス濾過工程と、以下の工程：ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び混合モードクロマトグラフィーの１つ以上とを含む精製工程から得られ、調製物は、ウイルス濾過工程から得られる。いくつかの実施形態では、ウイルス濾過工程は、精製工程の最後から２番目の工程であり、調製物は、ウイルス濾過工程から得られる。いくつかの実施形態では、ウイルス濾過工程は、精製工程の最後の工程であり、調製物は、ウイルス濾過工程から得られる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ｐＨを調整する調製物は、陽イオン交換クロマトグラフィー工程と、以下の工程：ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー及びウイルス濾過の１つ以上とを含む精製工程から得られ、調製物は、陽イオン交換クロマトグラフィー工程から得られる。いくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィー工程は、精製工程の最後から２番目の工程又は最後の工程であり、調製物は、陽イオン交換クロマトグラフィー工程から得られる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ｐＨを調整する調製物は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程と、以下の工程：ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー及びウイルス濾過の１つ以上とを含む精製工程から得られ、調製物は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程から得られる。いくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー工程は、精製工程の最後から２番目の工程又は最後の工程であり、調製物は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程から得られる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ｐＨを調整する調製物は、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程と、以下の工程：ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー及びウイルス濾過の１つ以上とを含む精製工程から得られ、調製物は、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程から得られる。いくつかの実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程は、精製工程の最後から２番目の工程又は最後の工程であり、調製物は、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程から得られる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ｐＨを調整する調製物は、混合モードクロマトグラフィー工程と、以下の工程：ウイルス不活化、アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー及びウイルス濾過の１つ以上とを含む精製工程から得られ、調製物は、混合モードクロマトグラフィー工程から得られる。いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィー工程は、精製工程の最後から２番目の工程又は最後の工程であり、調製物は、混合モードクロマトグラフィー工程から得られる。
【００５７】
最終限外濾過及び透析濾過（ＵＦ  ＤＦ）操作並びにそれから得られる組成物
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、タンパク質を含む組成物を最終ＵＦ  ＤＦ操作から得る工程を含む。いくつかの実施形態では、最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られる組成物は、タンパク質を含む原薬（ＤＳ）である。いくつかの実施形態では、最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られる組成物は、タンパク質を含む医薬製剤である。換言すれば、最終ＵＦ  ＤＦ操作により、目的のタンパク質がそのタンパク質のための組成物に入れられる。いくつかの実施形態では、本方法は、最終ＵＦ  ＤＦ操作後、除菌工程及び／又は絶対濾過工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、最終ＵＦ  ＤＦ操作は、ｐＨが調節される調製物が得られる精製プロセスの最後から２番目の工程又は最後の工程である。
【００５８】
いくつかの実施形態では、最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られる組成物は、目的のタンパク質を約１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍＬ〜２５０ｍｇ／ｍＬ、ａｂｏｕｔ１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、約１１０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、約１７０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ又は約１９０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。いくつかの実施形態では、最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られる組成物は、目的のタンパク質を約１０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約５５ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約６５ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約７５ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約８５ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約９５ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１１０ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ、約１７０ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ、約１９０ｍｇ／ｍＬ又は約２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られる組成物は、ｐＨ調整工程の目標ｐＨ又はその近傍のｐＨ又はｐＨ範囲を有する。目標ｐＨ値は、上に開示されている。
【００６０】
いくつかの実施形態では、最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られる組成物は、例えば、組成物のｐＨを維持するために緩衝液を含む。上に開示した任意の緩衝液が組成物に含まれ得る。いくつかの実施形態では、最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られる組成物は、緩衝液を２ｍＭ〜５００ｍＭ、２ｍＭ〜５０ｍＭ、２ｍＭ〜１０ｍＭ、又は約１０ｍＭ〜５０ｍＭ、又は５０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度で含む。いくつかの実施形態では、最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られる組成物は、緩衝液を約５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約６０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約７０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約８０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約９０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約３００ｍＭ、約１２０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約１４０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約１６０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約１８０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約３００ｍＭ、約２２０ｍＭ〜約３００ｍＭ又は約２５０ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度で含む。いくつかの実施形態では、最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られる組成物は、緩衝液を２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約７０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２０ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２７０ｍＭ又は約３００ｍＭの濃度で含む。最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られる組成物が緩衝液を含む実施形態では、組成物に含まれる目的のタンパク質は、上述した濃度のいずれかであり得る。
【００６１】
いくつかの実施形態では、最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られる組成物は、低い緩衝能を有する緩衝液（例えば、低濃度及び緩衝能範囲内のｐＨの緩衝液又は緩衝能範囲外のｐＨの緩衝液。例えば、約ｐＨ３．８〜約ｐＨ５．８の緩衝能範囲外のｐＨの酢酸緩衝液は、低い緩衝能を有し、且つ目的のタンパク質を約１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。いくつかの実施形態では、最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られる組成物は、２ｍＭ〜１０ｍＭの濃度及び緩衝能の範囲内のｐＨの緩衝液を含み、且つ目的のタンパク質を約１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、又は約１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、又は約１０ｍｇ／ｍＬ、又は約２０ｍｇ／ｍＬ、又は約３０ｍｇ／ｍＬ、又は約４０ｍｇ／ｍＬ、又は約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。いくつかの実施形態では、最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られる組成物は、２ｍＭ〜２０ｍＭの濃度及び緩衝能の範囲内のｐＨの緩衝液を含み、且つ目的のタンパク質を約１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、又は約１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、又は約１０ｍｇ／ｍＬ、又は約２０ｍｇ／ｍＬ、又は約３０ｍｇ／ｍＬ、又は約４０ｍｇ／ｍＬ、又は約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。いくつかの実施形態では、最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られる組成物は、緩衝能の範囲外のｐＨ及び２ｍＭ〜５０ｍＭの濃度で緩衝液を含み、且つ目的のタンパク質を約１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、又は約１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、又は約１０ｍｇ／ｍＬ、ｖ約２０ｍｇ／ｍＬ、又は約３０ｍｇ／ｍＬ、又は約４０ｍｇ／ｍＬ、又は約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。いくつかの実施形態では、最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られる組成物は、緩衝能の範囲外のｐＨ及び２ｍＭ〜４０ｍＭの濃度で緩衝液を含み、且つ目的のタンパク質を約１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、又は約１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、又は約１０ｍｇ／ｍＬ、又は約２０ｍｇ／ｍＬ、又は約３０ｍｇ／ｍＬ、又は約４０ｍｇ／ｍＬ、又は約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られる組成物は、緩衝液を実質的に含まない。このような組成物は、緩衝液非含有組成物とも呼ばれる。「実質的に緩衝液を含まない」又は「実質的に緩衝剤を含まない」という句は、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．５ｍＭ未満又は０．２５ｍＭ未満の標準緩衝液が存在することを指す。このような実施形態では、通常、組成物は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの濃度で目的のタンパク質を含む。好ましくは、組成物は、目的のタンパク質を約４０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約１１０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約１７０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ若しくは約１９０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含むか、又は組成物は、目的のタンパク質を約５０ｍｇ／ｍＬ、約５５ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約６５ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約７５ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約８５ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約９５ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１１０ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ、約１７０ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ、約１９０ｍｇ／ｍＬ若しくは約２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、最終ＵＦ  ＤＦ操作は、ＵＦ  ＤＦ操作後、タンパク質を対象とする組成物溶液又は製剤溶液を含む媒体を使用して行われる。例えば、最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られる組成物がタンパク質を含む医薬製剤である場合、最終限外濾過及び透析濾過操作は、製剤溶液を使用して行われる。最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られる組成物がタンパク質を含むＤＳである場合、最終ＵＦ  ＤＦ操作は、タンパク質を含有することを意図した組成物溶液を使用して行われる。その結果、最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られる組成物が緩衝液を含む実施形態では、最終ＵＦ  ＤＦ操作は、緩衝液を含む媒体（例えば、組成物溶液又は製剤溶液）を使用して行われる。最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られる組成物が、緩衝能の低い緩衝液を含む実施形態では、最終ＵＦ  ＤＦ操作は、緩衝能の低い緩衝液（例えば、２ｍＭ〜１０ｍＭの低濃度及び緩衝能範囲内のｐＨの緩衝液又は緩衝能範囲外のｐＨの緩衝液）を含む媒体（例えば、組成物溶液又は製剤溶液）を使用して行われる。最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られる組成物が緩衝液を実質的に含まない実施形態では、最終ＵＦ  ＤＦ操作は、緩衝液を実質的に含まない媒体（例えば、組成物溶液又は製剤溶液）を使用して行われる。「組成物溶液」又は「製剤溶液」は、それが使用されている文脈から特に明らかでない限り、それ自体では目的のタンパク質を含まないが、タンパク質を含む製剤又は組成物を作製するために使用される溶液である。好適な緩衝液及び緩衝液濃度は、上に開示されている。
【００６４】
いくつかの実施形態では、最終ＵＦ  ＤＦ操作は、約２０℃〜約５０℃の温度で行われる。いくつかの実施形態では、最終ＵＦ  ＤＦ操作は、約２５℃〜約４０℃の温度で行われる。いくつかの実施形態では、最終ＵＦ  ＤＦ操作は、約３０℃〜約４０℃の温度で行われる。
【００６５】
安定剤
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、目的のタンパク質の安定性を増加、促進又は維持するために１つ以上の安定化薬剤又は安定剤を調製物に添加する工程を含む。いくつかの実施形態では、安定剤は、アミノ酸、糖、ポリオール、抗酸化剤、キレート剤、脂質若しくは脂質誘導体、塩、ポリマー、不活性タンパク質若しくはポリペプチド、界面活性剤、水混和性共溶媒又はそれらの組み合わせである。本明細書に開示する方法で使用され得るアミノ酸安定剤の非限定的な例としては、ヒスチジン、アルギニン、グリシン、メチオニン、アラニン、アスパラギン酸、塩酸リシン、プロリン、リシン、サルコシン、ガンマ−アミノ酪酸及びグルタミン酸又はアミノ酸を含むジ−及びトリ−ペプチドを含む。抗酸化剤の非限定的な例としては、アスコルビン酸、グルタチオン、ビタミンＥ及びポリ（エチレンイミン）が挙げられる。キレート剤の非限定的な例としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、クエン酸、六リン酸塩及びチオグリコール酸が挙げられる。糖の非限定的な例としては、スクロース、トレハロース、キシリトール、マルトース、デキストロース、グルコース、ラフィノース及びラクトースが挙げられる。ポリオールの非限定的な例としては、糖アルコール（例えば、ソルビトール、イノシトール、マンニトール）、グリセロール、エリトリトール、カプリレート、トリプトファネート及びサルコシンが挙げられる。ポリマー及び不活性タンパク質の非限定的な例としては、硫酸プロタミン、ポリガラクトウロン酸、フィチン酸、ポリフマル酸、ポリセバシン酸、ＰＥＧ−ポリ（リシン）、ポリアスパラギン酸ブロックコポリマー、カルボキシフェノキシプロパン：セバシン酸コポリマー、キトサン、キチン、パルミトイルグリコールキトサン、糖化キトサン、ＮＮＮ、トリメチルキトサン、クロロゲン酸キトサン、アシル化アミノ酸のポリマー、ポリ（エチルアクリル酸）、ポリ（プロピルアクリル酸）、長鎖アルキルアミン置換ポリ（アクリル酸）、プロテイノイド（修飾アシル化アミノ酸の縮合ポリマー）、ヘパリン、ヘパリン硫酸、デキストラン硫酸、ＰＥＧ（例えば、コハク酸ＰＥＧ）などのコンジュゲーションを有する塩基、ポリロタキサン、ガラクトシル化ポリ（リシン）、アルファ−２−マクログロブリン−ポリ（リシン）、ガラクトシル化ポリ（エチレンイミン）、Ｎ−（ベータ−ヒドロキシエチル）−ラクトアミド、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ステリル−ポリ（Ｌ−リシン）、ポリ（ホスホエステル）、ＰＥＧ−トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル、ラウリン酸スクロース、ＰＥＧ−酢酸トコフェロール、ＰＥＧ−コハク酸トコフェロール、ゼラチン、ラクトグロブリン、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び組換えＨＡ）、ヒアルロン酸、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）及びそれらの誘導体（例えば、Ａｍｐｈｉｐｏｌ  Ａ８−３５、ＰＡＡ５−２５Ｃ８−４０Ｃ３、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９３４、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９８０）、ポリエチレングリコー���（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチル（ｈｅｔａ）デンプン、硫酸化多糖、ポリアミノ酸、デキストラン、ジエチルアミノエチルデキストラン、シクロデキストリン及びそれらの誘導体（例えば、ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン、スルホブチルエーテル−ベータ−シクロデキストリン）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）並びにカルボキシメチルセルロースが挙げられる。塩の非限定的な例としては、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、乳酸塩（例えば、乳酸カルシウム）、ジオレオイルプロピルトリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、カプリル酸ナトリウム、硫酸コレステロール、硫酸プロタミン及び塩酸グアニジンが挙げられる。脂質及び脂質誘導体の非限定的な例としては、脂肪酸（例えば、オレイン酸）、リン脂質及びリン脂質誘導体、リン酸ＤＥＡ、セチルリン酸ＤＥＡ、オレス１０リン酸、オレス−１０、マンノシルグリセレート、ポリドカノール、コール酸スルホベタイン及びＣ１２〜１５アルコールベンゾエートが挙げられる。界面活性剤界面活性剤の非限定的な例としては、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ポロキサマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８及びＦ１２７）、ＰＥＧドデシルエーテル（例えば、Ｂｒｉｊ３５及びＢｒｉｊ３０）及びＰＥＧ  ｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテル（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を含む非イオン界面活性剤が挙げられる。水混和性共溶媒の非限定的な例としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、エタノール、ＰＥＧ−４０ヒマシ油及びカンファースルホン酸（ＣＳＡ）が挙げられる。本明細書に開示する方法では、上記リストからの１つ以上の安定剤の組み合わせを使用し得る。
【００６６】
当業者に理解され得るように、本明細書に開示される安定剤のいくつかは、調製物のｐＨにも影響を及ぼし得る。例えば、特定のアミノ酸は、酸性（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）又は塩基性（例えば、リシン及びアルギニン）であり、酸又は塩基として機能し得るか、又は対応する塩基又は酸と緩衝液を形成し得る。同様に、本明細書に開示の特定の酸又は塩基は、安定剤としても機能することができ、例えば、アスコルビン酸、クエン酸、ヒアルロン酸及び乳酸は、安定化特性を有する。
【００６７】
特定の実施形態では、１つ以上の安定剤が最終ＵＦ  ＤＦ操作前に添加される。特定の実施形態では、１つ以上の安定剤が最終ＵＦ  ＤＦ操作後に添加される。特定の実施形態では、１つ以上の安定剤が最終ＵＦ  ＤＦ操作前に添加され、その後、安定剤が、ＵＦ  ＤＦ操作後に得られる、目的のタンパク質を含む組成物中に存在しないように、ＵＦ  ＤＦ操作中に（例えば、安定剤を含有しない製剤溶液又は組成物溶液を使用して）除去される。通常、このような安定剤は、ＵＦ  ＤＦ操作前及びＵＦ  ＤＦ操作中、目的のタンパク質を安定化させることができるが、患者（例えば、ヒト）への投与に適さない（例えば、ｆｄａ．ｇｏｖ／Ｄｒｕｇｓ／ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＯｎＤｒｕｇｓ／ｕｃｍ１１３９７８．ｈｔｍで入手可能なＦＤＡの非活性成分データベースに含まれない）ことがある。
【００６８】
タンパク質
本明細書に開示する方法によって調製され得るタンパク質としては、規制当局（例えば、ＦＤＡ及びＥＭＡ）によってヒトの治療用途に認可されているような治療用タンパク質が挙げられる。特定の実施形態では、治療用タンパク質は、治療用抗体であり、例えばキメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体及びドメイン抗体（ｄＡｂ）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示する方法は、不安定なタンパク質（例えば、治療用タンパク質）を含む組成物の製造に特に有用である。
【００６９】
本明細書に開示する方法を用いて調製され得る治療用タンパク質の非限定的な例としては、アフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標））、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、エポエチンアルファ（ＥＰＯＧＥＮ（登録商標））、ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））、フィルグラスチム（ＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標））、ダルベポエチンアルファ（Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標））、ドルナーゼアルファ（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標））、ＩＬ−２ムテインＦｃ融合タンパク質（ＡＭＧ５９２）、ベカプレルミン（ＲＥＧＲＡＮＥＸ（登録商標））、アルテプラーゼ（Ａｃｔｉｖａｓｅ（登録商標））、ラロニダーゼ（Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ（登録商標））、アレファセプト（Ａｍｅｖｉｖｅ（登録商標））、インターフェロンベータ−１ｂ（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（登録商標））、ラスブリカーゼ（Ｅｌｉｔｅｋ（登録商標））、アスパラギナーゼ（Ｅｌｓｐａｒ（登録商標））、アガルシダーゼベータ（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標））、インターフェロンアルファコン−１（ＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標））、インターフェロンアルファ−２ａ（ＩＮＴＲＯＮ  Ａ（登録商標））、アナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標））、オプレルベキン（ＮＥＵＭＥＧＡ（登録商標））、デニロイキンディフティトックス（Ｏｎｔａｋ（登録商標））、ペグインターフェロンアルファ−２ａ（ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））、アルデスロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））、ドルナーゼアルファ（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標））、インターフェロンベータ−１ａ（Ｒｅｂｉｆ（登録商標））、ベカプレルミン（ＲＥＧＲＡＮＥＸ（登録商標））、レテプラーゼ（Ｒｅｔａｖａｓｅ（登録商標））、インターフェロンアルファ−２（Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ（登録商標））、テネクテプラーゼ（ＴＮＫａｓｅ（登録商標））及びドロトレコギンアルファ（Ｘｉｇｒｉｓ（登録商標））、リロナセプト（ＡＲＣＡＬＹＳＴ（登録商標））、ロミプロスチム（Ｎｐｌａｔｅ（登録商標））、メトキシポリエチレングリコール−エポエチンアルファ（ＭＩＲＣＥＲＡ（登録商標））、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃｉｎｒｙｚｅ（登録商標））、イデュルスルファーゼ（Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標））、アルグルコシダーゼアルファ（Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標））、アバタセプト（ＯＲＥＮＣＩＡ（登録商標））、ガルスルファーゼ（Ｎａｇｌａｚｙｍｅ（登録商標））、パリフェルミン（Ｋｅｐｉｖａｎｃｅ（登録商標））及びインターフェロンガンマ−１ｂ（ＡＣＴＩＭＭＵＮＥ（登録商標））が挙げられる。
【００７０】
本明細書に開示する方法を用いて調製され得る非限定的な例示的抗体としては、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標））、エクリズマブ（Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標））、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））、アルシツモマブ（ＣＥＡ−Ｓｃａｎ）、イミシロマブペンテタート（Ｍｙｏｓｃｉｎｔ（登録商標））、カプロマブペンデチド（ＰｒｏｓｔａＳｃｉｎｔ（登録商標））、アブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ（登録商標））、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標））、パリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））、オマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））、ムロモナブ−ＣＤ３（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ３（登録商標））、エドレコロマブ（Ｐａｎｏｒｅｘ（登録商標））、ゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標））、セルトリズマブペゴル（Ｃｉｍｚｉａ（登録商標））、ウステキヌマブ（Ｓｔｅｌａｒａ（登録商標））、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））、パニツムマブ（Ｖｉｃｔｉｂｉｘ（登録商標））、エボロクマブ（Ｒｅｐａｔｈａ（登録商標））、デノスマブ（Ｐｒｏｌｉａ（登録商標））、ロモソズマブ（Ｅｖｅｎｔｉｙ（登録商標））、テゼペルマブ、抗ＰＡＣ１（脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化１型）受容体抗体（国際公開第２０１４／１４４６３２号パンフレット）、抗ＩＬ−１５抗体（国際公開第２００７／０８７３８４号パンフレット）、ＢＡＦＦ及びＩＣＯＳリガンドを標的とした二重特異性抗体−ペプチド結合体（米国特許第９，４５８，２４１号明細書）、ｃ−ｆｍｓを阻害し、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）機能を減少させるヒトモノクローナル抗体（国際公開第２００９／０２６３０３号パンフレット）、プレザルマブ（国際公開第２００７／０１１９４１号パンフレット）、エレヌマブ（Ａｉｍｏｖｉｇ（商標）、国際公開第２０１０／０７５２３８号パンフレット）並びに二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）抗体コンストラクト（例えば、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｃｙｔｏ（登録商標））、抗ＣＤ３３及び抗ＣＤ３  ＢｉＴＥ抗体コンストラクト、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ及び抗ＣＤ３  ＢｉＴＥ抗体コンストラクト、抗ＤＬＬ３及び抗ＣＤ３  ＢｉＴＥ抗体コンストラクト、抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ３  ＢｉＴＥ抗体コンストラクト、抗ＭＳＬＮ及び抗ＣＤ３ＢｉＴＥ抗体コンストラクト、抗ＣＤＨ１９及び抗ＣＤ３ＢｉＴＥ抗体コンストラクト、抗ＦＬＴ３及び抗ＣＤ３  ＢｉＴＥ抗体コンストラクト、抗ＤＬＬ３及び抗ＣＤ３ＢｉＴＥ抗体コンストラクト、抗ＣＤＨ３及び抗ＣＤ３  ＢｉＴＥ抗体コンストラクト、抗ＣＤ７０及び抗ＣＤ３ＢｉＴＥ抗体コンストラクト、抗ＰＳＭＡ及び抗ＣＤ３ＢｉＴＥ抗体コンストラクト並びに抗ＢＣＭＡ及び抗ＣＤ３  ＢｉＴＥ抗体��ンストラクト（国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレット及び国際公開第２０１７／１３４１４０号パンフレットに記載））が挙げられる。
【００７１】
本明細書に開示する方法は、いくつかの驚くべき良好な特性を有する。例えば、本明細書に開示する方法は、緩衝液非含有タンパク質組成物を作製するための製造プロセスを多段階プロセスから一段階プロセスに単純化し、製造フットプリントを減少させる。さらに、本明細書中に開示する方法によって調製されたタンパク質組成物は、ｐＨ調整工程なしで同じ方法によって調製されたタンパク質組成物と比較して向上した安定性（例えば、減少したタンパク質凝集体、減少したタンパク質の分解）を有する。
【００７２】
本発明は、以下の実施例を参照することにより、より十分に理解されるであろう。しかしながら、実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００７３】
実施例１：事前ｐＨ調整工程なしでのＵＦ  ＤＦ操作を用いたエタネルセプト組成物の調製
これらの実施例は、適切なｐＨを有するタンパク質組成物が事前のｐＨ調整工程なしに最終ＵＦ  ＤＦ操作から得られ得るかどうかを試験する。これらの実施例で使用するタンパク質は、エタネルセプトであった。ＴＭＳ（トリス、マンニトール、スクロース）中にエタネルセプトを含有する種々の調製物を、製剤溶液ＳＡＳ＿１００ＮａＣｌ及びＰＡＳＳを使用して試験製剤に交換し、最終ｐＨを目標ｐＨと比較した。
【００７４】
材料：エタネルセプト：２５ｍｇ／ｍＬ、ＴＭＳ（１０ｍＭのトリスＨＣｌ、４％のマンニトール、１％のスクロース、ｐＨ７．４）中；ＳＡＳ＿１００ＮａＣｌ溶液（１００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＬ−アルギニンＨＣｌ、１％のスクロース、ｐＨ６．３）；ＰＡＳＳ緩衝液（２５ｍＭのリン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＬ−アルギニンＨＣｌ、１％のスクロース、ｐＨ６．３）；１０，０００ＭＷＣＯのｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ；Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＭＰ２２０  ｐＨメーター及びＭｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＩｎＬａｂ  ＭｉｃｒｏＰｒｏｂｅ。
【００７５】
方法：エタネルセプト２５ｍｇ／ｍＬを含有するＴＭＳを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ−２ミニシステム上で３０Ｋ  ＭＷＣＯ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ３カセットを用いて限外濾過により約５０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。その後、この材料をＳＡＳ＿１００ＮａＣｌ又はＰＡＳＳ溶液に対して７ダイアボリュームで透析濾過し、続いて限外濾過によって１００ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。
【００７６】
結果：
結果の概要を下記の表１に示す。
【００７７】
【表１】
2021521119.tif 000003
【００７８】
結論：ｐＨ７．５６の交換前溶液から、ＰＡＳＳ緩衝液中に試料を限外濾過／透析濾過すると、目標ｐＨである６．３４が達成された。しかし、緩衝液を含有しないＳＡＳ＿１００ＮａＣｌ溶液中に試料を限外濾過／透析濾過した場合、達成されたＵＦ  ＤＦ後材料のｐＨは、６．９８であり、これは、予想よりも高く、最終目標のｐＨ６．３に近くなかった。
【００７９】
上記の結果を考慮して、異なるｐＨを有する交換前溶液から出発して、特定のｐＨを有する緩衝液非含有溶液中でタンパク質を製剤化するために、以下の多段階プロセスが開発された：１）緩衝製剤を用いて予想されるｐＨにＵＦ  ＤＦを実施し、２）塩を使用して緩衝液を置換し、３）緩衝液非含有溶液を用いてｐＨを維持する。
【００８０】
実施例２：事前ｐＨ調整工程ありでのＵＦ  ＤＦ操作を用いたエタネルセプト組成物の調製
緒言：目的は、緩衝液を含まないＳＡＳ製剤溶液（１２０ｍＭの塩化ナトリウム、２５ｍＭのＬ−アルギニン、１％のスクロース、ｐＨ６．３）にエタネルセプトを製剤化することであった。実施例１は、ｐＨ７．５６の試料中のエタネルセプトから出発する場合、ＵＦ  ＤＦを使用して目標ｐＨ６．３を達成することが困難であったため、緩衝液なしの製剤溶液にエタネルセプトを製剤化するために多段階プロセスが必要であることを実証したことから、ＳＡＳ製剤への交換の異なるより単純な方法が必要であった。以下の異なる最終ＵＦ  ＤＦ出発材料を利用した２つの方法を評価した：１）出発材料としてカラム３（ＡＥＸ）中間体プール、及び２）出発材料として、Ｅｎｂｒｅｌ原薬を含有するＰＡＳＳ製剤緩衝液（ＰＡＳＳ  ＤＳ中間体プール）中のＥｎｂｒｅｌ原薬。それぞれの方法を以下に記載し、５０ｇ／ＬのＳＡＳ製剤化エタネルセプトを製造するための最終ＵＦ  ＤＦユニット操作工程の開発を、ＳＡＳ製剤溶液の調製、最終ＵＦ  ＤＦのロード調整及び処理を含めて要約する。
【００８１】
方法：ＳＡＳ製剤溶液は、１２０ｍＭの塩化ナトリウム、２５ｍＭのＬ−アルギニン、１％のスクロース、ｐＨ６．３から構成される。１０ＮのＮａＯＨを用い、ＳＡＳ製剤溶液をｐＨ６．３まで滴定した。特定のｐＨ範囲に達するのに必要な滴定液の容量は、４．４μＬ／Ｌ−ＳＡＳ製剤溶液であった。ＳＡＳ最終ＵＦ  ＤＦユニット操作の実行中、膜をＳＡＳ製剤溶液１０Ｌ／ｍ２で平衡化した後、透過液のｐＨは、ＳＡＳ製剤溶液のｐＨよりもＷＦＩのｐＨに近い値を維持した。特定の理論に束縛されるものではないが、これは、ＳＡＳ製剤溶液の緩衝能が低いためであると考えられる。ＳＡＳ製剤溶液調製の範囲から予測された透過液の膜平衡後の導電率範囲は、１２〜１６ｍＳ／ｃｍである。平衡後ｐＨがＳＡＳ製剤溶液のｐＨよりも高いことは、予想されることであり、膜が平衡化されていないことを懸念すべきではないか、又はそれを示すべきものではない。
【００８２】
ＡＥＸ中間体プール出発材料：ＡＥＸ中間体プールをＵＦ／ＤＦタンクの不透過成分タンクに移す前に、２ＭのＨＣｌを使用して、プールを目標ｐＨ６．３（許容範囲６．２〜６．４）に調整した。特定のｐＨ範囲に達するのに必要な滴定液の容量は、約２．８ｍＬ／Ｌ  ＡＥＸ中間体プールであった。
【００８３】
出発材料としてＡＥＸ中間体プールを使用し、ＳＡＳ最終ＵＦ  ＤＦユニット操作工程の開発中に実施した８つの例を表２に示す。以下の２つのパラメータを調べた：調整されたＡＥＸ中間体プールのｐＨ及びＳＡＳ製剤溶液のｐＨ。最初の３回の実験は、ｐＨ、導電率、オスモル濃度、タンパク質濃度及び生成物品質について分析した。実験４〜７は、製剤溶液ｐＨの影響及びロードｐＨのＵＦ  ＤＦプールｐＨに対する影響を決定するために、ｐＨ、導電率、オスモル濃度及びタンパク質濃度についてのみ測定した。
【００８４】
【表２】
2021521119.tif 000004
【００８５】
結果：出発材料としてＡＥＸ中間体プールを用いて生成した最終ＳＡＳ  ＵＦ  ＤＦプールについての生成物品質結果を表３に示す。実験１の工程収率は、許容基準外であったが、これは、ベンチスケール処理の不自然な結果である可能性が最も高く、研究の結論にとって重要ではないと考えられた。上述したように、３つ全ての最終ＵＦ  ＤＦ  ＳＡＳ実験は、ＳＥＣ及びＨＩＣ分析を使用した生成物品質の許容基準にも適合した。
【００８６】
【表３】
2021521119.tif 000005
【００８７】
調整ＡＥＸ中間体プールの安定性
調整したＡＥＸ中間体プールは、制御された室温（ＣＲＴ）で５２．６時間まで保管することができる。保管中のプールのｐＨを図１に示す。
【００８８】
ＵＦ／ＤＦプールの安定性
ＡＥＸ中間体プールを出発材料として使用して生成された最終ＵＦ  ＤＦ  ＳＡＳプールは、ＣＲＴで９６．３時間まで保管することができる。保管中のｐＨ及び導電率を図２Ａ及び２Ｂに示す。９６．３時間の保管にわたり、ｐＨ及び導電率は、許容限界内に留まる。
【００８９】
ＰＡＳＳ  ＤＳ中間体プール出発材料：ＰＡＳＳ  ＤＳ中間体プールは、既に許容可能なｐＨ範囲内にあるため、ＰＡＳＳ  ＤＳ中間体プールをＵＦ  ＤＦの不透過成分タンクに移す前に調整する必要はない。さらに、出発材料は、５０ｍｇ／ｍＬ  ＰＡＳＳ製剤化Ｅｎｂｒｅｌ  ＤＳであり、既に透析濾過を行うのに正しい濃度であるため、プールを５０ｇ／Ｌに濃縮する必要はない。
【００９０】
出発材料源を評価するために、ＳＡＳ最終ＵＦ  ＤＦユニット操作工程の開発中に行われた一例を表４に示す。この例は、出発材料としてＤＳ  ＰＡＳＳ中間体プールを利用し、ｐＨ、導電率、オスモル濃度、タンパク質濃度及び生成物品質について分析した。
【００９１】
【表４】
2021521119.tif 000006
【００９２】
結果：出発材料としてＰＡＳＳ  ＤＳ中間体プールを用いて生成した最終ＳＡＳ  ＵＦ  ＤＦプールについての生成物品質結果を表５に示す。実験１の工程収率は、許容基準外であったが、これは、ベンチスケール処理の不自然な結果である可能性が最も高く、研究の結論にとって重要ではないと考えられた。上述したように、最終ＳＡＳ  ＵＦ  ＤＦプールは、ＳＥＣ及びＨＩＣ分析を使用した生成物品質の許容基準にも適合した。
【００９３】
【表５】
2021521119.tif 000007
【００９４】
ＰＡＳＳ  ＤＳ中間体プールの安定性
この中間体プールは、既に目標ｐＨ（６．３）にあるため、ＳＡＳ溶液によるＵＦ  ＤＦ処理前にこのＰＡＳＳプールを調整する必要はない。プールの状態は、Ｅｎｂｒｅｌ  ＰＡＳＳ  ＤＳから変えられていないため、この中間体プールではプール保管試験を実施しなかった。プールは、２５℃で９６時間まで保管することができる。
【００９５】
ＵＦ  ＤＦプールの安定性
ＰＡＳＳ  ＤＳ中間体プールを出発材料として生成された最終ＵＦ  ＤＦ  ＳＡＳプールは、ＣＲＴで９６．３時間まで保管することができる。保管中のｐＨ及び導電率を図２Ａ及び２Ｂに示す。９６．３時間にわたる保管にわたり、ｐＨ及び導電率は、許容限界内に留まる。
【００９６】
ＳＡＳ製剤溶液の安定性
ＳＡＳ製剤溶液は、ＣＲＴで２８日間まで保管することができる。ｐＨ及び導電率を図３Ａ及び３Ｂに示す。非常に小さいヘッドスペースを有する小規模ステンレス鋼安定性チャンバー内での４２日間にわたる保管にわたり、ＳＡＳ製剤溶液は、ｐＨを５．６〜６．５内に維持することが示された。３５日目及び４２日目の時点で沈殿が観察された。２１日目の時点の測定値５．０９は、その後の時点では提案された許容基準内にあるという事実から、外れ値のようである。
【００９７】
結論：最終ＵＦ  ＤＦ操作前にｐＨ調整工程を組み込むことにより、最終ＵＦ  ＤＦユニット操作は、５０ｇ／ＬのＳＡＳ製剤製品を生成し、出発物質としてＡＥＸ中間体プール又はＰＡＳＳ  ＤＳ中間体プールのいずれかを利用するＰＡＳＳ製剤生成物と比較して一貫した生成物品質を達成することができる。以下の観察もなされた：１）ＳＡＳ溶液は、ＣＲＴで少なくとも２８日間保管され、ｐＨを５．６〜６．５に保つことができ、２）調整ＡＥＸ中間体プールは、ＣＲＴで少なくとも５２．６時間保管され、ｐＨを６．３±０．１に保つことができ、３）ＳＡＳ製剤化ＵＦ  ＤＦプールは、ＣＲＴで少なくとも９６．３時間保管され、ｐＨを６．１〜６．５に保ち、導電率を１０〜１４ｍＳ／ｃｍに保つことができる。
【００９８】
実施例３：単一工程による緩衝液なしのタンパク質製剤の調製
製造目的のために規模を拡大することができる緩衝液非含有製剤を開発するために、上の実施例１で記載した多段階プロセスを改変した。驚くべきことに、緩衝剤非含有製剤化プロセスを３段階プロセスから１段階プロセスに転換することが可能であることがわかった。このアプローチでは、交換前材料（例えば、ＶＦプール材料）を、最終的な製剤ｐＨを予想するためにｐＨ調整し、次いでＵＦ  ＤＦ操作を使用して製剤溶液に交換する。結果は、塩が存在しないか又は最小である、所望のｐＨの緩衝剤非含有製剤である。このアプローチは、良好に機能し、ＵＦ  ＤＦ操作後に残留する塩が存在しないか又は最小になることがわかった。
【００９９】
実施例１で考察した多段階プロセスと比較して、一段階プロセスは、緩衝液を含まないタンパク質組成物（緩衝液非含有組成物）を作製するために必要な工程数を減少させる。
【０１００】
実施例４：ＵＦ  ＤＦ操作前にｐＨを調整することは、ＵＦ  ＤＦ操作後のタンパク質の凝集を減少させることにつながる
この試験に使用したタンパク質は、アダリムマブであり、ウイルス濾過から得た材料（ＶＦプール材料）を試験の交換前材料として使用した。これらの試験では、ＶＦプール材料のｐＨを緩衝化製剤及び緩衝剤非含有製剤の調製時にｐＨ５．２の目標ｐＨ又はその近傍に調整した（表６を参照されたい）。存在する高分子量種（ＨＭＷ）の濃度を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いてモニターした。このアッセイのために使用するカラムは、ＴＳＫ−ＧＥＬ、Ｇ３０００ＳＷＸＬ、粒径５μｍ、サイズ７．８×３００ｍｍ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、０８５４１）であり、タンパク質は、波長２２０ｎｍ、流量０．５ｍＬ／分で検出する。タンパク質の注入ロード量は、３５μｇであった。
【０１０１】
一段階アプローチによるＵＦ  ＤＦ操作後、最終製剤ｐＨは、目標ｐＨと一致した。この実施例では、最終的に存在する凝集量は、図４に示すように、ＶＦプール材料のｐＨを調整しなかったＵＦ  ＤＦアプローチと比較して減少した。さらに、図４は、ＶＦプール材料のｐＨを調整せずに調製された同じ試料と比較して、ｐＨを目標ｐＨ又はその近傍に調整した、緩衝剤非含有製剤及び緩衝化製剤の両方における凝集の低下を示している。図４に示すように、ＵＦ  ＤＦ工程後の凝集は、ＶＦプール材料のｐＨを調整せずに得られた凝集のレベルと比較して５０％を超えて減少していることに留意されたい。
【０１０２】
緩衝液非含有製剤の調製のためのＵＦ  ＤＦプロセスを３段階から１段階の製造プロセスに変更することに加えて、最終ＵＦ  ＤＦ操作前にｐＨを目標ｐＨに調整することにより、ＵＦ  ＤＦ後の凝集が減少した。さらに、交換前材料（例えば、ＶＦプール材料）のｐＨを製剤の目標ｐＨ又はその近傍に調整することにより、緩衝化製剤及び緩衝剤非含有製剤の両方をこのような方法で調製することができる。総合すると、緩衝化製剤及び緩衝剤非含有製剤の両方のｐＨは、このアプローチにおいて維持され、また安定性に対して有益な効果を有することが示された。このような発見は、予想外であり、また驚くべきことであると考えられる。
【０１０３】
【表６】
2021521119.tif 000008
【０１０４】
実施例５：事前ｐＨ調整工程ありでのＵＦ  ＤＦ操作を用いたアフリベルセプト組成物の調製
この実施例の目的は、事前のｐＨ調整工程を伴うＵＦ  ＤＦ操作によりって、緩衝液を含むか又は含まないアフリベルセプト組成物を調製することであった。製剤Ａ〜Ｆを調製したが、製剤Ａのみが緩衝液を含有する。全ての製剤は、ｐＨ６．２を有する。
【０１０５】
ＣＥＸカラムを用いて、アフリベルセプトを細胞培養物から１００ｍＭの酢酸Ｎａ、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０中に３．６ｍｇ／ｍＬで精製した。初期の研究で観察された初期調整と緩衝液交換後との間のｐＨドリフトを考慮するため、初期材料のｐＨを６．５に調整した。次いで、タンパク質を４０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、表７に示される製剤と緩衝液交換した。界面活性剤をＵＦ  ＤＦ後の種々の製剤に添加した。緩衝液交換後のｐＨを試験し、試料を４０℃のストレス条件で最大２週間保存した。緩衝液交換後及び保存中の凝集パターンを分析するために、タンパク質安定性をＳＥ−ＵＨＰＬＣによって試験した。
【０１０６】
【表７】
2021521119.tif 000009
【０１０７】
表８に見られるように、目標ｐＨは、初期の調整と緩衝液交換後との間で０．１ｐＨ単位内で得られた。出発ＤＳ材料の初期ｐＨをｐＨ６．５に調整したため、製剤ＡのｐＨは、初期目標ｐＨ６．２ではなく、ｐＨ６．４であった。Ｔ＝０と４０℃での２週間の保存後との間の差は、最大０．２ｐＨ単位において、品質特性への潜在的な影響の点で有意ではないｐＨシフトでもあり、試験した全ての製剤について、ストレス条件での保存中、ｐＨが安定なままであることを再び示した。
【０１０８】
【表８】
2021521119.tif 000010
【０１０９】
ＳＥ−ＵＨＰＬＣ分析の結果を表９に示す。全ての緩衝剤非含有製剤は、塩又は界面活性剤の存在にかかわらず、緩衝剤を含有する製剤（製剤Ａ）と比較してより高い主ピークパーセンテージを示し、凝集の減少又は安定性の向上を実証した。それぞれ界面活性剤を含有及び含有しない製剤Ｂ及びＦ間の凝集レベルを比較すると、同等の主ピークパーセントが観察され、アフリベルセプトの自己緩衝化製剤は、ＳＥ−ＨＰＬＣによるその凝集の観点から、界面活性剤の有無に関わらず安定していることを示す。
【０１１０】
【表９】
2021521119.tif 000011
【０１１１】
実施例６：交換前材料のｐＨを目標ｐＨに調整し、次いでタンパク質を濃縮することが好ましかった
図５に示す４つのオプション（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤと標識される）により、１００ｍＭの酢酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５からなる緩衝液中に３．６ｍｇ／ｍＬの濃度で配合されたアフリベリセプト出発材料（ＵＦ  ＤＦ工程前の製造の最後の工程から）を、５０ｍＬのＣｅｎｔｒｉｃｏｎチューブを用いて緩衝液中に交換し、ＵＦ  ＤＦプロセスをシミュレーションした。アプローチＡでは、３．６ｍｇ／ｍＬの出発材料の１５ｍＬアリコートを、１Ｍ  ＮａＯＨを用いて、それぞれｐＨ５．０、５．５、５．８、６．２、６．４及び６．８に調整した。次に、各ｐＨ調整溶液を５０ｍＬのＣｅｎｔｒｉｃｏｎチューブ中で約４０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。約４０ｍｇ／ｍＬのｐＨ調整材料を、緩衝液を含まず、５％のスクロース、３．５％のトレハロースを含有する溶液に初期容量の少なくとも１０〜２０倍でｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−緩衝液交換した。初期容量の少なくとも２０倍の交換後、ｐＨをチェックし、目標ｐＨと比較した。出発材料を最初に約４０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、次いでｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨを用いてアプローチＡに示すレベルに調整したことを除いて、Ａと同様のアプローチをＢにおいて行った。最後に、ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−緩衝液交換工程を５％スクロース及び３．５％トレハロースを含有する非緩衝溶液中に初期容量の少なくとも２０倍で行った。アプローチＣは、濃縮工程及び緩衝液交換工程を４０ｍｇ／ｍＬではなく、１０ｍｇ／ｍＬで行ったことを除いて、アプローチＡの工程と同一であった。交換工程に続いて、溶液を５％スクロース、３．５％トレハロース溶液中で約４０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。アプローチＤは、３．６ｍｇ／ｍＬの出発材料でｐＨ６．２にｐＨ調整を行い、次いで濃縮工程を行わずにｐＨ６．２に調整された材料のｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−緩衝液交換を行った。初期容量の２０倍の交換後、材料を５％スクロース、３．５％トレハロース溶液中で約４０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。アプローチＡ、Ｂ及びＣのｐＨ５．０、５．５、５．８、６．２、６．４及び６．８に対し、アプローチＤではｐＨ６．２のみが調べられた。
【０１１２】
アプローチＡ〜Ｄに記載されるように、５％スクロース、３．５％トレハロース溶液に緩衝液交換し、緩衝液非含有製剤を作製した後、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により安定性を評価し、モニターした高分子量種（ＨＭＷ）レベルを図６に示す。このアッセイに使用したカラムは、Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ２００、４．６×２５０ｍｍ、粒径１．７μｍであり、タンパク質は、波長２８０ｎｍ、流量０．４ｍＬ／分で検出した。タンパク質の注入ロード量は、６０μｇであった。図６に示すように、オプションＡ及びＣでは、シミュレーションしたＵＦ  ＤＦ操作後のＨＭＷ％は、より減少した。これは、ｐＨ５〜６．８の広いｐＨ範囲にわたって示された。規模拡大条件の好ましいオプションとして、オプションＡを選択した。
【０１１３】
実施例７：事前ｐＨ調整工程ありでのＵＦ  ＤＦ操作を用いたアダリムマブ組成物の調製
表１０に示すように、いくつかのアダリムマブ製剤（製剤１８Ａ〜１８Ｆ）を調製した。表に示すように、乳酸及び水酸化カルシウム又は酢酸及びＨＣｌを使用して、ＵＦ  ＤＦ操作前にｐＨを調整した。
【０１１４】
【表１０】
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【０１１５】
安定性を評価するために、ＣＥＸ−ＨＰＬＣにより、０日後、輸送ストレス後並びに４℃、２５℃及び４０℃で１週間後、２週間後及び４週間後に酸性ピーク％を測定した。結果を図７〜１２に示す。ゼロ時間において、輸送ストレスを受けた試料は、輸送ストレスを受けなかった同じ試料と比較して同様の量の酸性ピーク％を示した。ゼロ時間で酸性ピーク％の相対量にわずかな差が観察されたが、これらの差は、わずかであり、製剤によって意味があるとは考えられなかった。４℃で１ヶ月間保存した後、わずかな量の見かけの増加のみが観察されたが、これに意味があるとは考えられない。２５℃及び４０℃で１ヶ月後、塩化カルシウム又は乳酸カルシウムを含有する製剤（製剤１８Ｂ、１８Ｄ、１８Ｅ、１８Ｆ）で最小の増加率が観察された。
【０１１６】
安定性は、０日後、輸送後並びに非輸送及び輸送試料を４℃、２５℃又は４０℃で１、２及び４週間保存した後、ＳＥ−ＨＰＬＣによってＨＭＷＳを測定することによっても評価した。結果を図１３〜１８に示す。ゼロ時間において及び４℃で１ヶ月後、９％スクロースを含む乳酸製剤及び７．４％スクロース及び１５ｍＭ乳酸カルシウムを含む乳酸製剤（製剤１８Ａ、１８Ｅ）において最少量のＨＭＷＳが観察される。増加率は、２５℃及び４０℃の両方でわずかに変化するが、２５℃及び４０℃で１ヶ月後のＨＭＷＳの量は、同じ２つの製剤（１８Ａ、１８Ｅ）において最も少なく、ゼロ時間で最少量のＨＭＷＳが確認される。一般的な傾向として、ＵＦ  ＤＦ操作前に乳酸で調整された製剤は、ＨＣｌ及び酢酸で調整された製剤よりもＨＭＷＳが少量であった。同様に、乳酸緩衝製剤は、一般的により安定である。
【０１１７】
安定性は、非輸送及び輸送された試料中のＭＦＩによる５μＭ、１０μＭ及び２５μＭのサブビジブル粒子の数を測定することによっても評価した。粒子は、少なくとも５．０００の円相当径及び０．７００未満のアスペクト比を示した。結果を図１９〜２１に示す。５μｍ未満の粒径について、全ての製剤で数が少なかった。さらに、輸送ストレス時、製剤１８Ａ、１８Ｅ及び１８Ｆにおいて、粒子の有意な増加は、観察されなかった。粒径＜１０μｍ及び＜２５μｍでは、粒子数が少なかったか、又は粒子が検出されなかった。
【０１１８】
実施例８：乳酸の安定化効果
アダリムマブを含有するＶＦプール材料のｐＨを、ＵＦ  ＤＦ操作前に塩酸又は乳酸のいずれかを用いてｐＨ５．２の目標ｐＨ又はその近傍に調整した。ＵＦ  ＤＦ操作後、アダリムマブを、以下の表１１に示すような所望の組成溶液に交換する。アダリムマブ組成物中に存在する高分子量種（ＨＭＷ）の濃度を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いてモニターした。このアッセイのために使用するカラムは、ＴＳＫ−ＧＥＬ、Ｇ３０００ＳＷＸＬ、粒径５μｍ、サイズ７．８×３００ｍｍ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、０８５４１）であり、タンパク質は、波長２２０ｎｍ、流量０．５ｍＬ／分で検出する。タンパク質の注入ロード量は、３５μｇであった。
【０１１９】
表１１に示すように、乳酸を用いたｐＨ調整は、ＨＭＷのレベルを低下させ、乳酸の安定化効果を示した。
【０１２０】
【表１１】
2021521119.tif 000013
【０１２１】
本願に引用される全ての参照文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2021521119.tif 000014
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
2021521119.tif 000020
【図６】
2021521119.tif 000021
【図７】
2021521119.tif 000022
【図８】
2021521119.tif 000023
【図９】
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【図１０】
2021521119.tif 000025
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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