(57)【要約】本発明は、治療及び診断に有用な抗体の分野に関する。具体的には、機能化された磁性ナノ粒子に結合した１つ又は複数の抗体を含むバイオコンジュゲートを開示する。これらのバイオコンジュゲートは、特に循環腫瘍細胞を除去するための、癌治療に有用である。本発明はさらに、特定の機能化された磁性ナノ粒子、並びにそのようなバイオコンジュゲート及びそのような機能化された磁性ナノ粒子の製造に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コアシェルタイプのナノ粒子とその上に固定化された１つ又は複数の抗体を含むバイオコンジュゲートであって、
前記コアは、軟磁気特性を有する金属又は合金を含み、
前記シェルは、１つ又は複数のグラフェン層を含み、最外層は、式（Ｉ）による基の１つ又は複数により機能化されており：
【化１】
2021515002.tif 000010
ここで
（Ｚ）ｍは、ｍ個の繰り返し単位を有するポリグリシドールから選択されるスペーサーを表す；
ｍは１０〜３０の整数である；
ＦＧは、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、及びＣＯ（ＮＨ）Ｒから選択される官能基を互いに独立して表す；
ＲはＣ１‐Ｃ４アルキルを表す；及び
ｎは６〜１００の整数である、
上記バイオコンジュゲート。
【請求項２】
前記抗体はモノクローナル抗体であり、及び／又は循環腫瘍細胞に特異的に結合し、好ましくは、前記抗体は抗ＥｐＣａｍ抗体であり；及び／又は
前記コアは、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ又はその合金を含み、特にそれからなり；及び／又は
（Ｉ）による基において、ＦＧはＯＨを表し、ｎは１０から６０の間の整数である、求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項３】
前記固定化が共有結合によってもたらされ、好ましくは前記共有結合が１つの官能基ＦＧと１つの抗体ＡＢとの間に少なくとも１つの共有結合を含む、請求項１又は２に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項４】
前記共有結合が、
１つの官能基ＦＧと式（ＩＩ）のカップリング基との間の少なくとも１つの共有結合、及び式（ＩＩ）のカップリング基と１つの抗体ＡＢとの間の少なくとも１つの共有結合、
を含む、請求項３に記載のバイオコンジュゲート；
ここで、前記カップリング基は式（ＩＩ）のものであり、
【化２】
2021515002.tif 000011
ここで
Ｒ２はＣ１‐６アルカンジイル、Ｃ２‐６アルケンジイル、Ｃ３‐６シクロアルキル、フェニルを表す、
Ｘ１はＯ、ＮＲ１を表す、
Ｘ２はＯ、ＮＲ１を表す、
Ｒ１はＣ１‐Ｃ４アルキルを表す、
ＦＧは式（Ｉ）で定義される官能基を表し、（ＡＢ）は前記抗体を表す。
【請求項５】
・前記バイオコンジュゲートは１つのナノ粒子とその上に固定化された１〜１００の抗体を含む；及び／又は
・前記バイオコンジュゲートの平均直径は３０〜１００ｎｍである；
・前記コアの直径は１０〜２００ｎｍである；及び／又は
・前記シェルの厚さは０．３〜１０ｎｍである、請求項１〜４のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項６】
医薬品としての使用のための、特に治療における使用のための、請求項１〜５のいずれか記載のバイオコンジュゲート。
【請求項７】
癌の治療、特に血液から循環腫瘍細胞を除去するための、請求項１〜６のいずれかに記載のバイオコンジュゲート。
【請求項８】
コアシェルタイプのナノ粒子であって、
前記コアは、軟磁気特性を有する金属又は合金を含み、前記シェルは１つ又は複数のグラフェン層を含み、最外層は式（Ｉ）による基の１つ又は複数により機能化されており：
【化３】
2021515002.tif 000012
ここで
（Ｚ）ｍは、ｍ個の繰り返し単位を有するポリグリシドールから選択されるスペーサーを表す；
ｍは１０〜３０の整数である；
ＦＧは、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、及びＣＯ（ＮＨ）Ｒから選択される官能基を互いに独立して表す；
ＲはＣ１‐Ｃ４アルキルを表す；及び
ｎは６〜１００の整数である、
上記ナノ粒子。
【請求項９】
（Ｚ）ｍは、ｍ個の繰り返し単位を有するポリグリシドールから選択されるスペーサーであり；ｍは１０〜３０の間の整数であり；
ＦＧはＯＨを表し、
ｎは１０〜６０の整数である、
請求項８に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
請求項８〜９のいずれかに記載のナノ粒子を製造するための方法であって、以下のステップを含む上記方法：
ａ）コアシェルタイプのナノ粒子を提供する、ここで
前記コアは、軟磁気特性を有する金属又は合金を含み、
前記シェルは、式（ＩＩＩ）による基の１つ又は複数により機能化された１つ又は複数のグラフェン層を含み：
【化４】
2021515002.tif 000013
ここで、Ｒ３は直接結合又はＣ１‐６アルカンジイル、Ｃ２‐６アルケンジイル、Ｃ３‐６シクロアルキル；好ましくは１，２‐エタンジイルを表し；
ｂ）式（ＩＶ）の化合物を提供する
【化５】
2021515002.tif 000014
ここで
ｏは１〜４の整数、好ましくは１であり、
ｐは１〜４の整数、好ましくは１であり、
ＦＧは請求項１に定義されている；
ｃ）式（ＩＩ）及び（ＩＶ）の化合物を、任意に希釈剤の存在下で、任意に反応助剤の存在下で開環重合に供し、それにより前記ナノ粒子を得る。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法により得られる、又は得られ得るナノ粒子。
【請求項１２】
請求項１〜３及び５のいずれかに記載のバイオコンジュゲートを製造するための方法であって、以下のステップを含む上記方法：
ａ）請求項８〜９及び１１のいずれかに定義されたナノ粒子を希釈剤中に提供する；
ｂ）希釈剤中に抗体を提供する；
ｃ）前記ナノ粒子を前記抗体と接触させ、それにより前記バイオコンジュゲートを得る；
これにより、前記接触ステップの前に、前記ナノ粒子又は前記抗体のいずれかが活性化される。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれかに記載のバイオコンジュゲートを製造するための方法であって、以下のステップを含む上記方法：
ａ）請求項８〜９及び１１のいずれかに定義されたナノ粒子を希釈剤中に提供する；
式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）のカップリング剤を、任意に希釈剤中で提供すること、
【化６】
2021515002.tif 000015
それにより、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２は請求項４で定義されたとおりであり、ＬＧ１、ＬＧ２は脱離基、好ましくはヒドロキシルである；
ｂ）希釈剤中に抗体を提供する；
ｃ）前記ナノ粒子を前記抗体及び前記カップリング剤（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）と接触させ、それにより前記バイオコンジュゲートを得る；
ｄ）このようにして得られた抗体を任意に精製する；
それにより、前記ナノ粒子は最初に前記カップリング剤と接触し、こうして得られたナノ粒子は前記抗体と、任意に反応助剤の存在で接触する。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれかに記載のバイオコンジュゲートを製造する方法であって、以下のステップを含む上記方法：
ａ）請求項８〜９及び１１のいずれかに定義されたナノ粒子を希釈剤中に提供する；
ｂ）希釈剤中に抗体を提供する；
式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）のカップリング剤を、任意に希釈剤中で提供する、
【化７】
2021515002.tif 000016
それにより、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２は請求項４で定義されたとおりであり、ＬＧ１、ＬＧ２は脱離基、好ましくはヒドロキシルである；
ｃ）前記ナノ粒子を前記抗体及び前記カップリング剤（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）と接触させ、それにより前記バイオコンジュゲートを得る；
ｄ）このようにして得られた抗体を任意に精製する；
それにより、前記抗体は最初に前記カップリング剤と接触し、こうして得られた修飾抗体は前記ナノ粒子と、任意に反応助剤の存在で接触する。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法により得られる、又は得られ得るバイオコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療及び診断に有用な抗体の分野に関する。具体的には、機能化された磁性ナノ粒子に結合した１つ又は複数の抗体を含むバイオコンジュゲートを開示する。これらのバイオコンジュゲートは、特に循環腫瘍細胞を除去するための癌治療に有用である。本発明はさらに、特定の機能化された磁性ナノ粒子、並びにそのようなバイオコンジュゲート及びそのような機能化された磁性ナノ粒子の製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は患者にとって負担であるだけでなく、社会に大きな影響を与える。その起源に応じて、悪性腫瘍は特定のクラスに属する。癌腫は上皮細胞に由来し、肉腫は間葉細胞に由来するが、リンパ腫及び白血病は造血細胞に由来する。
【０００３】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、原発腫瘍から分離し、血管系へのアクセスを見出す癌細胞である。このように、それらは体を巡って別の場所に運ばれ、腫瘍の種として癌の転移につながる可能性がある。原発腫瘍からのＣＴＣの継続的な放出とは別に、癌手術中及び手術後にＣＴＣの大幅な増加が記録される場合があり、これにより、癌患者は再発及び全生存率低下のリスクにさらされる。
【０００４】
血液中のＣＴＣ検出の診断分野は広く調査されてきたが、単一の血液成分と相互作用することなく、特定の効率的な方法で血液などの複雑な生体液からＣＴＣをインビボで治療的に除去する手法はまだない。この状況はChavva et al (Part. Part. Syst.Charact. 2014, 31, 1252)によって説明されている。著者らは「磁性-ナノ粒子が付着したハイブリッドグラフェン酸化物が、キャプチャ、診断、及び治療を単一の多機能グラフェン酸化物プラットフォーム内で組み合わせることができる「テラノスティック」プラットフォームとして使用できることを示す」［ｐ．１２５２、右列、最終段落］。著者はさらに、彼らが提案する材料は「臨床現場で適切に最適化されると、実際の生命用途に大きな可能性を秘めている可能性がある」ため、応用からはほど遠いことを認めている。［要約、最後の文、強調を追加］。Ｋｏｃｉｆａｊ（ＷＯ２０１５／０５０５０７）は、モノクローナル抗体で覆われた磁性ナノ粒子を使用して、末梢血からＣＴＣを分離する方法を開示す。この文献には、使用されている粒子とその合成については触れられていない。
【０００５】
結果として、改善された癌治療の必要性がある。したがって、本発明の目的は、最新技術のこれらの欠点の少なくともいくつかを軽減することである。特に、本発明の目的は、癌治療に有用なバイオコンジュゲートを提供することである。
【０００６】
機能化された磁性ナノ粒子は、既知のクラスの材料である。Grass et al.（ＷＯ２００８／０５５３７１）は、炭素コーティングされた磁性ナノ粒子と分離プロセスにおけるそれらの使用について説明する。この文献はまた、タンパク質／ウイルスが体液から除去される診断におけるそのようなナノ粒子の使用について推測する。
【０００７】
ポリグリシドール（ポリグリセロール、ポリグリシジルＰＧＬ）は、既知の種類のポリマーである。Dworak et al. (Polimery 2013, 58, 9, 641)は、ＰＧＬの合成と特性の総説を示す。この文献によると、ＰＧＬは医療診断テストとバイオセンサーの製造、並びに生体分離、生体触媒、及び薬物送達システムでよく使用される。グリシドールの重合は、カチオン性又はアニオン性の条件下で行われ、常に分岐高分子を生じる。Gosecki et al (Polymers 2016, 8, 227)は、さまざまなトポロジーとさまざまなモル質量を有するポリグリシドールの合成に関する現在の知識を説明する。
【０００８】
グラフェンとＰＧＬを含むハイブリッド材料の他のクラスが知られている。Li et al (Nanoscale 2012, 4, 1355)は、ハイパーブランチポリマーで非共有結合的に機能化されたグラフェンシートに基づいて、金属ナノ粒子でグラフェンシートを装飾するための一般的で効率的な方法を開示する。これらの層状材料は、生体内用途には適していない。
【発明の概要】
【０００９】
上記の目的は、請求項１で定義されたバイオコンジュゲートと請求項１０で定義された治療方法によって達成される。本発明のさらなる態様は、明細書及び独立請求項に開示されており、好ましい実施形態は明細書及び従属請求項に開示されている。したがって、本発明は以下を提供する。
・抗体が固定化された特定のナノ粒子を含むバイオコンジュゲートと治療におけるその使用（第１の態様）
・このようなバイオコンジュゲートを取得するのに役立つコアシェルタイプのナノ粒子（第２の態様）。そして
・そのようなナノ粒子及びバイオコンジュゲートの製造方法（第３の態様）。
【００１０】
以下でさらに詳細に説明するように、本発明のバイオコンジュゲートは、腫瘍細胞でスパイクされた健康な被験者の血液と癌患者の両方から、顕著な効率で末梢血からＣＴＣを除去する望ましい機能を提供するために必要な高い磁化と防汚特性を示す。注目すべきは、さまざまな腫瘍エンティティのＣＴＣの抽出と、さまざまな濃度の腫瘍細胞の除去である。さらに、バイオコンジュゲートは、リンパ球などの他の血液細胞を排除することなく、ＥｐＣＡＭを発現する癌細胞に対して十分な特異性を示す。さらに、血液の主要な成分である凝固系は、血栓症又は血栓溶解に対しても損なわれていないようである。最後に、バイオコンジュゲートは、堅牢な合成手順を使用して再現性よく製造できる。
【００１１】
以下、本発明をより詳細に説明する。本明細書で提供／開示された様々な実施形態、選好及び範囲は、自由に組み合わせることができることが理解される。さらに、特定の実施形態に応じて、選択された定義、実施形態又は範囲が適用されない場合がある。
【００１２】
特に明記しない限り、この明細書では次の定義が適用される。
本明細書で使用される場合、本発明の文脈（特に、特許請求の範囲の文脈）で使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び類似の用語は、本書にそうではないと記載されているか、文脈によって明らかに矛盾しているのでなければ、単数及び複数の両方をカバーすると解釈されるべきである。 
【００１３】
本明細書で使用される場合、「含む」（including）及び「含有する」（containing）という用語は、本明細書では、オープンで非限定的な意味で使用される。「含有する」（「含む」）（containing）という用語は、「からなる」（consisting of）、「から本質的になる」（essentially consisting of）及び「含む」（comprising）を含むものとする。
【００１４】
本明細書で使用する場合、「分散液」という用語は、少なくとも２つの異なる成分（連続相に分散された粒子）の不均一な混合物に関する。二つの成分は互いに溶解せず、互いに反応しない。分散系は、粒子が異なる相の連続相に分散している系である。粒子サイズに応じて、分散は３つの主なタイプに分類できる：粗分散（粒子＞１μｍ）、コロイド分散（粒子＞１ｎｍ）及び分子分散（流体相；粒子＜１ｎｍ）。分散は熱力学的観点では不安定であるが、一定の期間にわたって速度論的に安定する可能性がある。不安定化は、移動現象（沈殿）又は粒子サイズ増加現象（凝集）で発生する可能性がある。分散安定性とは、時間の経過による特性の変化に抵抗する分散の能力を指す。粒子が反発力によって分離されている限り、コロイド分散は安定している。これらの反発力は、立体力、静電力、又は空乏力で構成される。静電反発力を発生させるためには、粒子表面に電荷が付着している必要がある。表面電荷は対イオンによって補償され、すべての電荷を中和する。ただし、対イオンは表面に存在せず、表面の周囲に拡散イオン層を形成する。拡散イオン層間の反発は、分散の安定化に影響を与える。立体反発力による安定化は、粒子の表面に付着（共有結合又は物理吸着）された高分子（ポリマーなど）によって引き起こされる可能性がある。溶媒が周囲のポリマー層と適合性がある場合、これらの層は粒子の接近を妨げ、安定した分散をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本発明は、図面を参照することによってよりよく理解されるであろう。
【図１】図１は、実験１〜３で得られた結果を示す。ｙ軸は、磁気フィルターを通過した後に残っているＣＴＣのパーセンテージを表す。群１のバーは例１に対応し、群２のバーは例２に対応し、群のバーは例３に対応する。塗りつぶされた黒いバーは表面に抗ＥｐＣＡＭ抗体を担持するバイオコンジュゲートに対応し、白いストライプのバーは表面にＩｇＧアイソタイプ対照抗体を備えたバイオコンジュゲートに対応する。  この図は、本発明のバイオコンジュゲートの非常に高い有効性と再現性を示す。
【図２】図２は、実験１〜３及び９〜１１で得られた結果を示す。ｙ軸は、磁気フィルターを通過した後に残っているＣＴＣのパーセンテージを表す。バー番号１は例１（ＴＺ５８６）に対応する。バー番号２は例２（ＴＺ６８５）に対応する。バー番号３は例３（ＴＺ６８６）に対応する。バー番号４は例９（ＴＺ６６４）に対応する。バー番号５は例１０（ＴＺ６６６）に対応する。バー番号６は例１１（ＴＺ６７７）に対応する。  この図は、特定の平均鎖長（Ｚ）ｍを有するポリグリシドール層が特に優れた細胞分離を可能にすることを示す。
【図３】図３は、実験１〜３及び９〜１１で得られた結果を示す。ｙ軸は、磁気フィルターを通過した後に残っているＣＴＣのパーセンテージを示す。バー番号１は例９（ＴＺ６６４；ｍ＝０；比較用）に対応する。バー番号２は例１（ＴＺ５８６；ｍ＝１５、発明）に対応する。バー番号３は例１１（ＴＺ６７７；ｍ＝６９；比較用）に対応する。  この図は、ポリグリシドール層（Ｚ）ｍが必要であること、及び特定の平均鎖長が特に優れた細胞分離を可能にすることを示す。どちらも、ポリグリシドールがない（バー番号１）と長すぎるポリグリシドールポリマー層（バー番号３）では、細胞の除去が不十分になる。図２に関して、ｙ軸のスケールが異なることに注意されたい。
【図４】図４は、実験１及び４で得られた結果を示す。ｙ軸は、分離完了のパーセンテージに対応する。ｘ軸は、秒単位で表される期間に対応する。破線は、例１に記載されているようなバイオコンジュゲートに対応する。実線は例４に対応する。  この図は、本発明のバイオコンジュゲートを適切な時間枠内で磁気的に分離できる一方で、分散安定性が高すぎる材料（比較例４）は液体サンプルから分離できないことを示す。物質が十分に分離できない場合、血液中に残り、患者に健康上のリスクをもたらす。本発明の材料は、それらが標的細胞を除去することができ、材料自体を血液から効率的に除去することができるという点で優れている。処置後、これにより、処置された血流は標的細胞がはるかに少なくなり、残っている物質が非常に少ないかまったく残らない。
【図５】図５：ｙ軸は、表面に吸着したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（％）に対応する。バー番号１は、例１のナノ粒子に対応する。バー番号２は、例４のナノ粒子に対応する。バー番号３は、例９のナノ粒子に対応する。バー番号４は、非修飾炭素被覆コバルトナノ粒子（つまり、式（Ｉ）の基がない）に対応する。バー番号５は、ナノ粒子なしのゼロテストに対応する。データは、本発明のナノ粒子が生物付着の低減を示すことを明確に示している。  この図は、本発明のバイオコンジュゲートが、血液の多くのタンパク質成分の濃度を乱さないため、材料で血液を処理するときに望ましい非特異的タンパク質吸収が非常に低いことを示す。
【図６】図６及び７は、本発明のバイオコンジュゲートの２つの理想化された構造を示している。コアシェル型のナノ粒子を左（ＮＰ）に示し、その上に固定化した抗体を右（ＡＢ）に示す。ポリグリシドールスペーサー（Ｚ）ｍ及び官能基ＯＨを有する式（Ｉ）の基が示されている。式（ＩＩ）のカップリング基も示され、それらの１つは、抗体のアミノ残基への共有結合を形成する。バイオコンジュゲートは、式（Ｉ）の１〜１００個の基など、式（Ｉ）の多数の基を含むと考えられている。さらに、式（Ｉ）の基は１つ以下の抗体に結合すると考えられている。図６及び７は、スペーサー（Ｚ）ｍの異なる分岐度も示す。
【図７】図６及び７は、本発明のバイオコンジュゲートの２つの理想化された構造を示している。コアシェル型のナノ粒子を左（ＮＰ）に示し、その上に固定化した抗体を右（ＡＢ）に示す。ポリグリシドールスペーサー（Ｚ）ｍ及び官能基ＯＨを有する式（Ｉ）の基が示されている。式（ＩＩ）のカップリング基も示され、それらの１つは、抗体のアミノ残基への共有結合を形成する。バイオコンジュゲートは、式（Ｉ）の１〜１００個の基など、式（Ｉ）の多数の基を含むと考えられている。さらに、式（Ｉ）の基は１つ以下の抗体に結合すると考えられている。図６及び７は、スペーサー（Ｚ）ｍの異なる分岐度も示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
より一般的に言えば、第１の態様では、本発明は、具体的には請求項１に記載の、ナノ粒子及びその上に固定化された１つ又は複数の抗体を含むバイオコンジュゲート、並びに治療及び診断におけるそれらの応用に関する。本発明のこの態様は、以下でさらに詳細に説明される。
【００１７】
バイオコンジュゲート：この用語は当分野で知られており、ナノ粒子とその上に固定化された１つ又は複数の抗体を含む物に関連する。抗体の固定化は、共有結合（以下で論じる）によって行われることが好ましく、官能基（以下で論じる）の性質及び抗体（以下で論じる）の性質に依存する。典型的には、バイオコンジュゲートは、本明細書に記載されるように１つのナノ粒子、及びその上に固定化された１〜２００の抗体、好ましくは１〜１００の抗体を含む。適切なバイオコンジュゲートは、典型的には、３０ｎｍ〜１００ｎｍ、好ましくは４０〜６０ｎｍの平均直径を有する。
【００１８】
このようなバイオコンジュゲートは、治療や診断に適している。特に、本明細書に記載のバイオコンジュゲートにより、末梢血からのＣＴＣの効率的な除去を可能にする手段及び方法が提供される。本発明のバイオコンジュゲートによるＣＴＣの除去は、卓越した効率で臨床的に関連する速度で達成することができ、９８％を超えるＣＴＣの除去が実現された。
【００１９】
抗体：この用語はこの分野では知られており、完全長免疫グロブリンとそのフラグメントを指す。そのような完全長免疫グロブリンは、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、ベニア、又はヒト抗体であり得る。そのフラグメント又は抗体フラグメントは、前記免疫グロブリンのターゲティング特異性を保持している完全長免疫グロブリンの一部を含む。すべてではないが多くの抗体フラグメントは、完全長免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ領域）を少なくとも部分的に欠いている。いくつかの実施形態では、抗体フラグメントは、完全長免疫グロブリンの消化によって生成される。抗体フラグメントは、免疫グロブリン又は免疫グロブリン鎖の一部を含む合成又は組換え構築物であってもよい。抗体フラグメントの例には、これに限定されないが、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｄＡｂ、ＶＨＨ、ナノボディ、Ｖ（ＮＡＲ）又は最小認識単位が含まれる。
【００２０】
一本鎖可変フラグメント（一本鎖抗体、ｓｃＦｖ）は、抗体フラグメントの一種である。ｓｃＦｖは、リンカーによって接続された免疫グロブリンのＶＨとＶＬを含む融合タンパク質である。したがって、それらは完全長免疫グロブリンに存在する定常Ｆｃ領域を欠いているが、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。
【００２１】
本発明によれば、多種多様な抗体を使用することができる。抗体の選択は、除去又は検出されるＣＴＣなどの細胞の種類によって異なる。適切な抗体には、循環腫瘍細胞に特異的に結合する抗体が含まれ、したがって抗ＥｐＣＡＭ抗体が含まれる。
【００２２】
ナノ粒子：ナノ粒子という用語は、この分野では知られている。適切なナノ粒子はコアシェルタイプのものであり、前記コアは、軟磁気特性を有する金属又は合金を含み（特にそれからなり）、前記シェルは、以下に概説するように、式（Ｉ）の１つ又は複数の基によって機能化されるグラフェン層によって形成される。
【００２３】
ナノ粒子コア：本明細書で論じられるように、コアは、軟磁性特性、好ましくは超常磁性特性を有する金属又は合金を含み、特にそれからなる。適切な磁性材料は知られており、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ及びその合金が含まれる。そのようなナノ粒子は、強い磁場勾配がない場合、液相に容易に分散させることができる。「軟磁性」という用語は、保磁力が３０’０００Ａ／ｍ未満、好ましくは１６’０００Ａ／ｍ未満の強磁性特性を意味する。理想的な場合、保磁力はゼロであり、超常磁性材料になる。
コアの直径は広範囲にわたって変化するが、通常は１０〜１０００ｎｍ、好ましくは１０〜２００ｎｍ、特に好ましくは１５〜１００ｎｍの範囲内である。このサイズのコアは、本明細書に記載のバイオコンジュゲートを製造するための良好な磁気特性及び高い表面積を保証する。
【００２４】
ナノ粒子シェル：上記のように、前記シェルは、式（Ｉ）による基の１つ又は複数によって機能化された１つ又は複数のグラフェン層を含む。炭素のシェルは、グラフェン層と同一又は類似の構造を持っている。そのサイズのために、シェルは「スーパーバックミンスターフラーレン」として特徴付けられることもある。「グラフェン」という用語の選択は、炭素原子が主に（又はほぼ独占的に）ｓｐ２‐混成状態で存在し、追加の原子が結合していないことを示す。前記シェルのさらに有利な実施形態を以下に説明する。
【００２５】
好ましくは、グラフェン層は、０．３〜１０ｎｍ、特に好ましくは１〜５ｎｍの厚さを有する（透過型電子顕微鏡写真から評価すると、約１〜５０のグラフェン層）。これにより、０．５〜２０％ｗｔの炭素含有量（ＬＥＣＯ‐９００を使用した定量微量分析で測定）が得られる。この炭素コーティングの厚さは、金属コアを酸化から十分に保護し、最適な表面特性を提供し、コアの磁気特性に悪影響を与えない。
【００２６】
前記シェルの最外層は、本明細書に記載の式（Ｉ）の基で機能化される。好ましくは、各シェルは、式（Ｉ）の１０個以上、特に２０個以上の基などの多数の官能基を含む。
【００２７】
官能基：官能基は、式（Ｉ）で概略的に示され、一方の側にある炭素被覆ナノ粒子と他方の側の抗体との間のリンカー及びスペーサーとして機能する。（Ｚ）ｍで定義されるその長さのため、抗体はナノ粒子との距離が保たれ、それによってその構造が保持される。（ＦＧ）ｎで定義される官能基のタイプと数により、効率的な固定化が保証される。
【００２８】
適切な官能基は、式（Ｉ）によって表される：
【化１】
2021515002.tif 000002
ここで
（Ｚ）ｍは、ｍ個の繰り返し単位を有するアルキルオキシ基を含むスペーサーを表す；
ｍは１０〜３０の整数である；
ＦＧは、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、及びＣＯ（ＮＨ）Ｒから選択される官能基を互いに独立して表す；
ＲはＣ１‐Ｃ４アルキルを表す；及び
ｎは６〜１００の整数である。
【００２９】
官能基（ＦＧ）は、機能化ナノ粒子の総重量の０．１〜３０ｗｔ％、好ましくは０．１〜１０ｗｔ％を占めることができ、ＦＧの重量及び機能化ナノ粒子の意図する用途に依存する。
典型的には、式（Ｉ）の化合物は、１００００ｇ／モル未満、好ましくは５００〜１５００ｇ／モルの分子量を有する。
【００３０】
有利には、（Ｚ）ｍは、ｍ個の繰り返し単位を有するポリグリシドールから選択されるスペーサーである。ｍは１０〜３０の整数である。
【００３１】
有利には、ＦＧは、互いに独立して、ＯＨ及びＣＯＯＨ、特にＯＨから選択される官能基を表す。有利には、ｎは１０〜６０の整数である。
【００３２】
そのような機能性（ＦＧ）ｎを有するポリグリシドール部分（Ｚ）ｍは、図７（最小分岐）及び図６（ｍ＝１５、ランダム分岐）による構造によって表すことができる。図６に従う構造が優勢であると考えられる。一般に、式（Ｉ）の官能基は次のように要約できる（（Ｚ）ｍがｍ個の繰り返し単位を有するポリグリシドールである場合）：
【化２】
2021515002.tif 000003
ここで、ｑ＋ｒ＋ｓ＋ｔ＋ｕ＋ｖ＋ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚ＝ｍ及びＦＧ＝ＯＨであり、波線はナノ粒子（ＮＰ）及び抗体（ＡＢ）への結合部位をそれぞれ表す。
【００３３】
ナノ粒子の表面は自由なままではなく、存在するさまざまな生体分子で覆われていると一般に認められている。そのような被覆はしばしばタンパク質コロナと呼ばれ、被覆の効果は生物付着と呼ばれる。理論に束縛されることなく、官能基（Ｉ）、特にそのスペーサー基（Ｚ）ｍは、バイオコンジュゲートの性能に著しく影響すると考えられている。ナノ粒子のこのような機能化により、タンパク質コロナが減少する。おそらく、血液生体分子と競合することにより、防汚特性を提供する（図５及び後述の防汚試験を参照）。
【００３４】
共有結合：有利には、本発明は、本明細書に記載のバイオコンジュゲートに関し、ここで、前記固定化は、共有結合によって行われる。
【００３５】
一実施形態では、前記共有結合は、１つの官能基ＦＧと１つの抗体ＡＢとの間の少なくとも１つの共有結合を含む。
【００３６】
一実施形態では、前記共有結合は、１つの官能基ＦＧと式（ＩＩ）のカップリング基との間の少なくとも１つの共有結合、及び式（ＩＩ）のカップリング基と１つの抗体ＡＢとの間の少なくとも１つの共有結合を含む。ここで、前記カップリング基は式（ＩＩ）のものである
【化３】
2021515002.tif 000004
ここで
Ｒ２はＣ１‐６アルカンジイル、Ｃ２‐６アルケンジイル、Ｃ３‐６シクロアルキル、フェニルを表し、
Ｘ１はＯ、ＮＲ１を表し、
Ｘ２はＯ、ＮＲ１を表し、
Ｒ１はＣ１‐Ｃ４アルキルを表し、
ＦＧは、式（Ｉ）で定義された官能基を表し、
（ＡＢ）は前記抗体を表す。
【００３７】
ナノ粒子のさらに有利な実施形態、本発明の第２の態様を以下に示す：
【００３８】
本明細書に記載のバイオコンジュゲートは、特に診断及び治療の分野で、多くの用途に有用である。本発明は、医薬として使用するための、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートを提供する。本発明はさらに、診断に使用するための、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートを提供する。本発明はさらに、治療において使用するための、本明細書に記載されるバイオコンジュゲートを提供する。
【００３９】
医薬：本発明は、本明細書に記載のバイオコンジュゲートを含む医薬組成物に関する。適切な医薬組成物は、液体製剤、特に注射可能な溶液を含む。そのような組成物は、バイオコンジュゲート、薬学的に許容される希釈剤、及び任意に添加剤を含む。バッファー（緩衝液）及び／又はイオン強度を調整する添加剤を任意に含む水溶液が適している。
【００４０】
診断：本明細書に記載のバイオコンジュゲートは、診断、特にＣＴＣの診断に適している。抗体に応じて、診断の適切な基礎を提供するために、さまざまな状態、疾患、及び障害を評価することができる。一般に、そのような診断は、患者の血液を採取し、そのような血液を患者の体外で分析することによって行われる。
【００４１】
インビボ診断：患者の血液のサンプルを採取して、ここで説明するバイオコンジュゲートと接触させ、磁気分離装置に入れて、ＣＴＣを収集し、それらをカウントしてさらに分析するためにそれらを提供し、又は患者の治療の具体的なコースの決定を支援する。そのようなＣＴＣ分離は、ＣＴＣが由来した組織に関するより多くの情報を得ることを可能にするので、転移性腫瘍の起源を決定するために特に有用であり得る。他の場合では、ＣＴＣ数値が腫瘍治療の有効性の最も早い指標の１つになる可能性があるため、ＣＴＣ分離は治療反応をタイムリーに測定するのに特に役立つ。治療オプションのポジティブ又はネガティブなコースの初期の兆候が患者にとって魅力的であり、癌治療のより反応的で洗練された計画を可能にすることは明らかである。ここで説明するバイオコンジュゲートを使用したＣＴＣの分離により、患者の血液の長時間にわたるサンプリングと、リットルの血液からのＣＴＣの蓄積が可能になり、さらには数時間又は数日などの長期間にわたっても可能になる。これは、ＣＴＣの数値が低く、従来の方法では細胞がまったく得られないか、ごくわずかしか得られず、有用な結果を得るには不十分なことがよくある場合に特に興味深いものである。。
【００４２】
エクスビボ診断：より多くの数のＣＴＣを収集することで、エクスビボでのＣＴＣの使用と、インビトロ細胞培養の作成とモデル処置（Ａ）にそれらを付すことによる、特定の処置オプションに対するそれらの反応のテストが可能になる。あるいは、進歩的な生化学分析（腫瘍のタイプ、サブタイプ、表現型など）又は遺伝子分析（癌性挙動、Ｂにつながる特定の変異のタイプと分布）のためのＣＴＣの使用が可能になる。このような調査の臨床的価値は、利用可能なＣＴＣの数とともに増加していることは明らかである。
【００４３】
現在説明されているＣＴＣの診断は、エクスビボで行われる。そのために、被験者から末梢血を採取して分析する。患者から採取できる血液の量は限られているため、Ｃｅｌｌ  Ｓｅａｒｃｈと呼ばれるシステムなどの従来の分析で分離できるＣＴＣの数は限られている。従来のシステムでは、数ミリリットルから数十ミリリットルの血液しか患者から採取できないことは明らかである。多くの腫瘍のＣＴＣ濃度が１ミリリットルあたり０〜数十である場合、分離されるＣＴＣの最終的な数は少なく、多くの場合、重要な詳細分析には不十分である。現在説明されているバイオコンジュゲートは、インビボとエクスビボの両方の診断を可能にし、臨床調査に１０〜１０００倍の数のＣＴＣを提供し、診断の質を向上させる。
【００４４】
治療：本明細書に記載されているバイオコンジュゲートは、癌の治療に適している。本明細書に記載されるバイオコンジュゲートは、血液から循環腫瘍細胞を除去するのに特に適している。
【００４５】
原発腫瘍からのＣＴＣの継続的な放出とは別に、癌手術中及び手術後にＣＴＣの大幅な増加が記録される場合があり、これにより、癌患者は再発及び全生存率の低下のリスクにさらされる。したがって、周術期のＣＴＣの除去は、長期的な予後を改善する方法を提供する可能性がある。ただし、特にしばしば低濃度（１０７（１０００万）の白血球あたり、又は１０１０（１００億）の赤血球あたり１ＣＴＣまで）で存在するＣＴＣに焦点を当てた場合、血球の標的排除は特に困難な作業である。本発明は、血液からＣＴＣを磁気的に除去する方法を提供する。この方法は、本明細書に記載されている本発明のバイオコンジュゲートに依存している。これらのバイオコンジュゲートを使用すると、ＣＴＣスパイクされた血液を再現可能かつ特異的に除去できる。さらに、臨床シナリオへの最初の変換が可能であり、癌患者から得られた血液からＣＴＣを排除した。磁性粒子が血液凝固システムに干渉する可能性などの安全面を評価したところ、大きな逸脱は見られなかった。バイオコンジュゲートは多種多様な抗体で機能化できるため、方法は柔軟で、ＣＴＣバイオマーカーの分野での発見に適応する可能性と同様に、さらなる応用を可能にする。我々は、患者の全血をフィルタリングする可能性につながるようなプラットフォームの開発を期待しており、患者の予後、特に腫瘍切除を受けている患者の予後を仮説的に高める。
【００４６】
さらなる有利な実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される希釈剤をさらに含む。このような医薬組成物は、既知の原理に従って処方され、様々な投与様式に適合され得る。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、患者の血流への注射に適合されている。
【００４７】
医薬組成物は、多くの適応症に用途を見出すことができる。したがって、本発明は、癌の予防、治療、予防又は進行の遅延に使用するための、本明細書に記載の医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、ＣＴＣの治療に特に適している。一実施形態では、前記ＣＴＣは原発腫瘍から放出される。一実施形態では、前記ＣＴＣは、癌手術中及び／又は癌手術後に放出される。
【００４８】
本発明はまた、個別化医療に適合された医薬組成物を提供し、それにより、特に患者のニーズを対象とする。
【００４９】
本発明は、癌の治療のための、本明細書に記載されているバイオ複合材料の使用を提供する。
【００５０】
本発明は、癌の治療のための医薬組成物の製造のための、本明細書に記載されているバイオ複合材料の使用を提供する。
【００５１】
本発明は、癌を治療する方法を提供し、前記方法は、記載された医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。治療（処置、処理）という用語には、進行の予防と遅延が含まれる。
【００５２】
第２の態様では、本発明は、本明細書に記載のバイオコンジュゲートの一部として、診断及び治療の状況で特に適した新しいナノ粒子に関する。本発明のこの態様は、以下でさらに詳細に説明される。
【００５３】
有利な実施形態では、本発明はコアシェルタイプのナノ粒子に関し、ここで前記コアが軟磁性特性を有する金属又は合金を含み、特にそれからなり、前記シェルが１つ又は複数のグラフェン層を含み、最外層が式（Ｉ）による１つ又は複数の基により、機能化されている：
【化４】
2021515002.tif 000005
ここで
（Ｚ）ｍは、ｍ個の繰り返し単位を有するアルキルオキシ基を含むスペーサーを表す；
ｍは１０〜３０の整数である；
ＦＧは、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、及びＣＯ（ＮＨ）Ｒから選択される官能基を互いに独立して表す；
ＲはＣ１‐Ｃ４アルキルを表す；及び
ｎは６〜１００の整数である。
【００５４】
有利には、（Ｚ）ｍは、ｍ個の繰り返し単位を有するポリグリシドールから選択されるスペーサーである。有利には、ｍは１０〜３０の整数である。そのようなポリグリシドールは、本発明の第１の態様である上記に記載されている。この範囲は、本明細書に記載される使用に特に適していると考えられる鎖長を定義する。最適な防汚特性と磁気分離性のトレードオフを克服する。
【００５５】
有利には、ＦＧは、互いに独立して、ＯＨ及びＣＯＯＨ、特にＯＨから選択される官能基を表す。有利には、ｎは１０〜６０の整数である。この範囲の官能基は、抗体の効率的な固定化を確実にすると同時に抗体の特性が維持されることを確実にするのに特に有益であることがわかった。
【００５６】
有利には、ナノ粒子は、本発明の第１の態様である本明細書に記載されている通りである。
【００５７】
ナノ粒子のさらなる有利な実施形態を以下に記載する：
【００５８】
有利な実施形態では、使用されるナノ粒子は、少なくとも８０Ａｍ２／ｋｇの飽和磁化を有する。
【００５９】
有利な実施形態において、使用されるナノ粒子は、ＢＥＴ法（Janssen, Zirkzee, German and Maxwell, Journal of Applied Polymer Science 52, 1913, 1994による）を用いた窒素吸着によって評価される、２００ｎｍ未満、より好ましくは１００ｎｍ未満、最も好ましくは５０ｎｍ未満の体積表面平均直径を有する。
【００６０】
有利な実施形態では、ナノ粒子の粒子直径は、ナノメートルで与えられる平均直径の１／２の最大幾何標準偏差を有する。
【００６１】
さらなる有利な実施形態では、ナノ粒子は、１０〜１０００ｎｍのコア直径及び０．３〜１０ｎｍのシェル厚、好ましくは１０〜２００ｎｍのコア直径及び１〜１０ｎｍのシェル厚を有する。
【００６２】
さらなる有利な実施形態では、ナノ粒子は、３０’０００Ａ／ｍ未満、好ましくは１６’０００Ａ／ｍ未満の保磁力を有する。
【００６３】
第３の態様では、本発明は、（Ｉ）本明細書に記載のバイオコンジュゲートを製造するプロセス（第１の態様）及び（ＩＩ）本明細書に記載のナノ粒子を製造するプロセス（第２の態様）に関する。本発明のこの態様は、以下でさらに詳細に説明される。
【００６４】
（Ｉ）ナノ粒子、特に本明細書に記載のナノ粒子の製造（本発明の第２の態様）。
【００６５】
炭素コーティングされた磁性ナノ粒子は、通常、溶媒と組み合わせるとコロイド分散液を形成する。これらのナノ粒子は、通常のファンデルワールス力に加えて発生する磁気引力により、速く凝集する傾向がある。凝集した磁性ナノ粒子は、達成可能な表面積が低く、いくつかの点でマイクロ粒子のように振る舞うが、これは不利なため、防止する必要がある。ナノ粒子表面にポリマー鎖（Ｚ）ｍを含む式（Ｉ）の共有結合部分を提供することにより、凝集が回避される。原則として、ポリマー鎖は、既知の方法（グラフト・トゥー方法とグラフト・フロム方法を含む）によって、炭素コーティングされた磁性ナノ粒子に追加できる。
【００６６】
炭素コーティングされたナノ粒子（機能化されていない、又は特定の官能基を含む）は既知であるか、既知の方法、例えば、Grassら（上記のＷＯ２００８／０５５３７１）に従って得ることができる。多くのアプリケーションに適しているが、これらのナノ粒子は抗体と安定したコンジュゲートを形成しない。したがって、本発明は、本明細書に記載されるようなナノ粒子を製造するための方法を提供し、これは、多種多様な抗体との安定したコンジュゲートを形成するのに適している。本発明の方法は、以下のステップを含む：
ａ）適切なナノ粒子を提供する；
ｂ）適切なモノマーを提供する；
ｃ）ナノ粒子表面にポリマー層を成長させる。
【００６７】
ステップａ）  このステップでは、ナノ粒子が提供される。つまり、炭素でコーティングされ、機能化された磁性ナノ粒子である。このようなナノ粒子は、それ自体が既知であり、既知の方法（ＷＯ２００８／０５５３７１、上述）に従って、又は類似して得ることができる。このステップは、以下に分けることができる：ａ１）軟磁性特性を有する炭素被覆金属ナノ粒子の調製と分離；ａ２）このようにして得られた原料を洗浄する；ａ３）好ましくはジアゾニウム化学を適用することにより、置換フェニル基を結合する。
【００６８】
ステップｂ）  このステップでは、ステップａ）のナノ粒子と反応するのに適したモノマーが提供される。適切なモノマーは知られており、重合時に官能基ＦＧを含むアルコキシ基Ｚを形成する化合物が含まれる。そのようなモノマーは市販品であり、購入したまま使用することができる。
【００６９】
ステップｃ）  このステップでは、重合が行われる。適切な方法は既知であり、グラフト・トゥー方法及びグラフト・フロム方法が含まれ、後者が好ましい。
【００７０】
グラフト・トゥー方法（grafting to-method）：この方法は、ナノ粒子の表面に並ぶ単一の層を形成すると考えられる。そのような単層は、分散安定性の特定の改善を提供する。
【００７１】
グラフト・フロム方法（grafting from-method）：有利な方法は、ナノ粒子の表面からポリマーが成長する合成を含む。調製されたままの、共有結合されたポリマー鎖は互いに反発し、単一層の形成を妨げる。選択したモノマーによっては、立体反発力と静電反発力を同時に導入することができる（電気立体反発力）。そのような組み合わされた作用が好ましいことが見出された。しかしながら、電気立体反発力は、非常に安定した分散をもたらす可能性があることに言及しなければならない。したがって、適切な制限時間内にナノ粒子を十分に速く収集することはできない。ここで説明するナノ粒子（第１と第２の態様）は、優れた分散性と同時高速収集の両方の機能を兼ね備えている。原則として、そのような「グラフティング・フロム」方法は、当分野で知られている。それらの１つは、表面開始原子移動ラジカル重合（ＳＩ‐ＡＴＲＰ）である。これは、Ｘがハロゲン化物であるＣ‐Ｘ結合のホモリティック開裂に基づく制御されたラジカル重合技術である。別のアプローチは、アニオン重合又はアニオン開環重合（ＲＯＰ）法を提供する。
【００７２】
重合：多種多様な重合方法が適用可能であり、開環重合（ＲＯＰ法）が有益であることがわかった。制御ラジカル重合（ＡＴＲＰ）とは対照的に、ＲＯＰ法は、炭素コーティングされた磁性ナノ粒子でより堅牢で信頼性が高いと考えられる（例１〜３を参照）。同様の材料の製造を繰り返すことははるかに簡単であり、現在は好ましい方法である。（Ａ）具体的には、（＋／−）‐オキシラン‐２‐イルメタノールは、開環重合を介して重合される。生物学的関連媒体（水、さまざまなバッファーシステム、血液）で良好な分散を作成するために、分散の安定性が調整されたが、材料は数秒から数分以内に磁気的に収集可能である。これは、ナノ粒子を同じ物理的及び化学的特性で、例えば、炭素コーティングされた磁性ナノ粒子のグラムあたり０．８ｍｍｏｌのカルボキシル官能基を有する１２〜１５繰り返し単位で数回確実に生産できることを意味する。（Ｂ）これらの粒子とは対照的に、炭素被覆磁性ナノ粒子上の３‐（２‐メチルプロパ‐２‐エノイルオキシ）プロパン‐１‐スルホン酸カリウム塩のＳＩ‐ＡＴＲＰによって生成された先の粒子は、非常に安定した分散を形成する。２２しかし、調製された粒子の適切で完全な収集は、少なくとも数時間続く。この特徴は、ＣＴＣ除去プロセス内の性能を妨げるだけでなく、精製ステップを適切かつ再現可能な方法で実行することが困難となるため、材料の生産を大幅に妨げる（例４及び８など）。
【００７３】
分析：ＣＴＣ除去実験は時間と費用がかかるため（臨床設定、ヒトの血液の使用）、ここで説明する実験に投入されるバイオコンジュゲートに関する先験的な品質管理を行うことが有益であると考えられる。粒子の強磁性特性のため、ＮＭＲやＭＳなどの多くのルーチン分析方法は適用できない。有効な分析方法は、元素微量分析：（修飾の量）及び赤外線分光法：（ＩＲ）（修飾の品質／同一性）である。
【００７４】
ＲＯＰを介して（＋／−）‐オキシラン‐２‐イルメタノールで修飾された炭素コーティングされた磁性ナノ粒子により、「先験的な」品質管理が可能になる。炭素含有量が増加すると、重合度を確実に計算できる（解重合は観察されない）。カルボキシ部分の取り込みは、同じ方法で正確に決定できる。さらに、全体の合成中に初めてカルボキシ基を付加することにより、Ｃ＝Ｏ伸縮振動（波数１７３３ｃｍ−１）が発生し、目的のカルボキシ部分の存在と正常な取り込みが明確に識別される。これらの２つの分析手法では、このようなナノ粒子の定性的及び定量的な品質管理を迅速に行うことができるのに対し、ＡＴＲＰ経路の場合、これらの分析手法は失敗する。結果として、比較的容易な品質管理のため、ＲＯＰ法も好まれる。
【００７５】
その結果、本発明は、本明細書に記載されているナノ粒子を製造する方法（第２の態様）の有利な実施形態を提供し、前記方法は、以下のステップを含む：
ａ）コアシェルタイプのナノ粒子を提供する、ここで、
前記コアは、軟磁気特性を有する金属又は合金を含み、
前記シェルは、式（ＩＩＩ）による基の１つ又は複数によりその最外層上で機能化されている１つ又は複数のグラフェン層を含む：
【化５】
2021515002.tif 000006
ここで、Ｒ３は直接結合又はＣ１‐６アルカンジイル、Ｃ２‐６アルケンジイル、Ｃ３‐６シクロアルキル；好ましくは１，２‐エタンジイルを表す；
ｂ）式（ＩＶ）の化合物を提供する
【化６】
2021515002.tif 000007
ここで
ｏは１〜４の整数、好ましくは１、
ｐは１〜４の整数、好ましくは１、
ＦＧは、上記の式（Ｉ）で定義されたとおりである；
ｃ）式（ＩＩ）及び（ＩＶ）の化合物を、任意に希釈剤の存在下で、任意に反応助剤の存在下で、開環重合に供し、それにより該ナノ粒子を得る。
【００７６】
したがって、本発明は、本明細書に記載の方法によって得られるか、又は得ることができるナノ粒子にも関する。
【００７７】
（ＩＩ）バイオコンジュゲート、特に本明細書、本発明の第１の態様に記載のバイオコンジュゲートの製造。
【００７８】
ナノ粒子及び抗体を含むバイオコンジュゲートの合成は、それ自体知られている。しかしながら、本明細書に記載されている特定のナノ粒子は、まだそのような反応を受けていなかった。したがって、以下に概説する経路Ａ及びＢによるバイオコンジュゲート合成の一般的な原理を適用することができる：
【００７９】
経路Ａ：
ａ）活性化試薬を使用したナノ粒子の提供と活性化、又は共有結合を可能にする化学基の結合；
ｂ）抗体の提供；
ｃ）抗体をステップａ）のナノ粒子と反応させる；
ｄ）任意に、こうして得られたバイオコンジュゲートを精製する。
【００８０】
経路Ｂ：
ａ）ナノ粒子を提供し、必要に応じて共有結合を可能にする化学基を結合する；
ｂ）適切な化学基の適切な試薬を用いて抗体を提供及び活性化すること；
ｃ）ステップａ）のナノ粒子をステップｂ）の抗体と反応させる
ｄ）このようにして得られたバイオコンジュゲートを任意に精製する
【００８１】
経路Ａによれば、ナノ粒子は、活性化試薬によって、又は抗体への共有結合を可能にする化学基を結合させることによって活性化される。経路Ｂによれば、抗体は、活性化試薬によって、又はナノ粒子への共有結合を可能にする化学基を結合することによって活性化される。結果として、ステップｃ）とｄ）は本質的に同じであり、既知の原則に従って実行できる。
【００８２】
経路Ａ、ステップａ）適切なナノ粒子は、本明細書に記載されている方法により得ることができる。活性化試薬及び化学リンカーは当分野で知られており、当業者が選択することができる。成分は、希釈剤中で、任意に高温で、任意に反応助剤の存在下で接触させることができる。
【００８３】
経路Ａ、ステップｂ）適切な抗体は、市販品として入手できるか、既知の方法に従って精製できる。
【００８４】
経路Ｂ、ステップａ）適切なナノ粒子は、本明細書に記載されている方法により得ることができる。活性化試薬は当分野で知られており、当業者が選択することができる。活性化が望まれる場合、成分は、希釈剤中で、任意に高温で、任意に反応助剤の存在下で接触させることができる。
【００８５】
経路Ｂ、ステップｂ）：適切な抗体は、市販品として入手できるか、既知の方法に従って精製できる。活性化試薬及び化学リンカーは当分野で知られており、当業者が選択することができる。成分は、希釈剤中で、任意に高温で、任意に反応助剤の存在下で接触させることができる。
【００８６】
ステップｃ）：ステップａ）及びｂ）の出発物質を希釈剤中で、任意に高温で、任意に反応助剤／活性化化合物（ＥＤＣ、スルホ‐ＮＨＳなど）の存在下で、必要に応じて、ｐＨ調整剤（緩衝液など）の存在下で、接触させることができる。
【００８７】
ステップｄ）：精製を、洗浄、ろ過、及び／又は磁気分離により行い、副産物、未反応の出発物質を除去することができる。
【００８８】
結果として、本発明は、本明細書に記載のバイオコンジュゲートを製造する方法（第１の態様）の有利な実施形態を提供し、前記方法は、以下のステップを含む：
ａ）本明細書に記載のナノ粒子を希釈剤中に提供する；
ｂ）希釈剤中に抗体を提供する；
ｃ）前記ナノ粒子を前記抗体と接触させ、それにより前記バイオコンジュゲートを得る；
ｄ）任意に、前記バイオコンジュゲートを精製する；
これにより、前記接触ステップの前に、前記ナノ粒子又は前記抗体のいずれかが活性化される。
【００８９】
結果として、本発明は、本明細書に記載のバイオコンジュゲートを製造する方法（第１の態様）の有利な実施形態を提供し、前記方法は、以下のステップを含む：
ａ）本明細書に記載のナノ粒子を希釈剤中に提供する；
式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）のカップリング剤を提供する、
【化７】
2021515002.tif 000008
ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２は、本明細書で定義されるとおりであり、式（ＩＩ）、及びＬＧ１、ＬＧ２は、脱離基、好ましくはヒドロキシルである；
ｂ）希釈剤中に抗体を提供する；
ｃ）前記ナノ粒子を前記抗体及び前記カップリング剤（ＩＩａ）と接触させ、それにより前記バイオコンジュゲートを得る；
ｄ）任意に、前記バイオコンジュゲートを精製する：
それにより、前記ナノ粒子は最初に前記カップリング剤と接触し、こうして得られたナノ粒子は前記抗体と接触する。
【００９０】
結果として、本発明は、本明細書に記載のバイオコンジュゲートを製造する方法（第１の態様）の有利な実施形態を提供し、前記方法は、以下のステップを含む：
ａ）本明細書に記載のナノ粒子を希釈剤中に提供する；
ｂ）希釈剤中に抗体を提供する；
式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）のカップリング剤を提供する
【化８】
2021515002.tif 000009
ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２は、本明細書で定義されているとおりであり、式（ＩＩ）、及びＬＧ１、ＬＧ２は脱離基であり、
ｃ）前記ナノ粒子を前記抗体及び前記カップリング剤（ＩＩａ）と接触させ、それにより前記バイオコンジュゲートを得る；
ｄ）任意に、前記バイオコンジュゲートを精製する：
それにより、前記抗体は最初に前記カップリング剤と接触され、こうして得られた修飾抗体は前記ナノ粒子と接触される。
【００９１】
式（ＩＩａ）の化合物は既知であり、市販品である。式（ＩＩａ）の化合物で定義される脱離基ＬＧ１、ＬＧ２は、当分野で知られており、ヒドロキシル基及びＣ１-４アルコキシ基が含まれる。式（ＩＩａ）の好ましい化合物は、ジカルボン酸（ＬＧ＝ＯＨ、Ｘ＝Ｏ）である。式（ＩＩｂ）の化合物は既知であり、市販品である。式（ＩＩｂ）の好ましい化合物は、カルボン酸無水物（Ｘ１＝Ｘ２＝Ｏ）である。特に好ましいのは無水コハク酸（Ｒ２＝エタンジイル）である。
【００９２】
したがって、本発明はまた、本明細書に記載の方法によって得られた、又は得ることができるバイオコンジュゲートに関する。
【実施例】
【００９３】
本発明をさらに説明するために、以下の例が提供される。これらの例は、本発明の範囲を限定することを意図することなく提供される。ここに提供されている例は、セクションＩ〜Ｖに次のようにグループ化されている。主な結果も図に示されている。例１、２及び３並びに図１に提示された結果は、本発明のバイオコンジュゲートを使用すると、非常に高い効率のＣＴＣ除去が得られることを示している。例４〜９は比較例として提供されている。
【００９４】
効率に加えて、再現性はプロセス検証の重要な要件の１つである。以下に示すように、本発明のバイオコンジュゲートの合成は特に強力である。元素微量分析で測定した場合、カルボキシル部分の導入の範囲が２．５％未満の限られたバッチ間変動で例示される。バッチは後に抗ＥｐＣＡＭ又はＩｇＧアイソタイプ対照抗体のいずれかで機能化され、スパイク血液実験からのＣＴＣ除去が繰り返された。すべてのバッチで同様の結果が得られ、ＣＴＣが９８％以上除去されたため、化学的再現性を超えた生物学的再現性が確認された（図１）。
【００９５】
Ｉ．ポリグリシドール機能化ナノ粒子を含むバイオコンジュゲート、１０＜ｍ＜３０
・例１：血液からのＣＴＣの除去を成功させるための、ポリグリシドールでコーティングされた抗ＥｐＣＡＭ含有磁性バイオコンジュゲートの製造、分析、及び性能。材料は１５の繰り返し単位（ｒ．ｕ．）と０．８３ｍｍｏｌ／ｇナノ粒子のカルボキシル含有量を示す。この材料のＣＴＣ除去効率は、平均で＞９８％であった。図１‐３参照。
【００９６】
・例２：例１のバイオコンジュゲートの再現。材料は１６ｒ．ｕ及び０．８６ｍｍｏｌ／ｇナノ粒子のカルボキシル含有量を示す。この材料のＣＴＣ除去効率は、平均で＞９８％であった。図１参照。防汚効率は約８０％であった。図５参照。
【００９７】
・例３：例１のバイオコンジュゲートのさらなる再現。材料は１５ｒ．ｕ及び０．８７ｍｍｏｌ／ｇナノ粒子のカルボキシル含有量を示す。この材料のＣＴＣ除去効率は、平均で＞９８％であった。図１参照。
【００９８】
ＩＩ．ポリスルホプロピルメタクリレート‐ｃｏ‐ポリメタクリル酸（ｐｏｌｙＳＰＭ‐ｃｏ‐ＰＭＡ）ナノ粒子を含むバイオコンジュゲート
・例４（比較）：ＷＯ２００８／０５５３７１、例１．１で開示されている磁性ナノ粒子を使用する。このようなナノ粒子は、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）反応により、ポリスルホプロピルメタクリレート‐ｃｏ‐ポリメタクリル酸（ｐｏｌｙＳＰＭ‐ｃｏ‐ＰＭＡＡ）で修飾されている。
【００９９】
・例５（比較）：例４のバイオコンジュゲートは分散安定性が高すぎるため、磁気分離が不十分であったので、鎖長の短い別のバイオコンジュゲートが合成された。そのような材料の鎖の長さはＳＰＭのｍ＝２ｒ．ｕであった。この材料のＣＴＣ除去効率は＜２６％であった。したがって、そのようなバイオコンジュゲートは、いくつかの診断目的には有用であるかもしれないが、治療用途にはそれほどではない。防汚効率は約６２％であった。図５参照。
【０１００】
・例６（比較）：ＳＰＭの鎖長ｍ＝１８ｒ．ｕのバイオコンジュゲートが合成された。このような鎖長を有するバイオコンジュゲートは、例４の完全な防汚特性を保持するように選択された。この材料のＣＴＣの除去効率は、約２０％であった。したがって、そのようなバイオコンジュゲートは、いくつかの診断目的には有用であるかもしれないが、治療用途にはそれほどではない。
【０１０１】
・例７（比較）：例６のバイオコンジュゲート調製物の繰り返し。ナノ粒子は、ＳＰＭの１９ｒ．ｕ．の鎖長で同様の物理化学的特性を示す。このバイオコンジュゲートのＣＴＣ除去効率は約４５％であった。したがって、そのようなバイオコンジュゲートは、いくつかの診断目的には有用であるかもしれないが、治療用途にはそれほどではない。
【０１０２】
ＩＩＩ  ポリスルホプロピルメタクリレート‐ｃｏ‐ポリカルボキシエチルアクリレート（ｐｏｌｙＳＰＭ‐ｃｏ‐ｐＣＥＡ）ナノ粒子を含むバイオコンジュゲート
・例８（比較）：潜在的にアクセスしやすいカルボキシル部分を導入するために、メタクリル酸の代わりにアクリル酸２‐カルボキシエチルを使用した。ＳＰＭ重合は、例４と同じパラメーターを用いて実行され、ＳＰＭの３１ｒ．ｕの鎖長をもたらした。この材料のＣＴＣ除去効率は約７７％であった。
【０１０３】
ＩＶ  ポリマー層なし、ｍ＝０のカルボキシル機能化ナノ粒子を含むバイオコンジュゲート
・例９（比較）：ポリマー層なし（つまり、抗生物付着層なし；  ０ｒ．ｕ．）のカルボキシル官能基（０．１１ｍｍｏｌ／ｇナノ粒子）を有する磁性ナノ粒子の製造。防汚性はＳＰＭで修飾されたナノ粒子に似ているが、ポリグリシドール層よりも劣っている。図５を参照。このようなバイオコンジュゲートは、ＣＴＣ除去効率に関して、抗生物付着層としてＳＰＭを有する粒子と比較して改善された性能を示したことは注目に値する。ただし、ポリグリシドール層を備えたバイオコンジュゲートと比較すると、ＣＴＣの除去効率はポリグリシドールを使用した場合よりも低くなる（＜８９％対＞９８％除去）。図２＆図３参照。これは、ポリマー層の必要性を明確に示す。
【０１０４】
Ｖ  ポリマー鎖が長いポリグリシドール機能化ナノ粒子を含むバイオコンジュゲート（ｍ＞＞３０）
・例１０（比較）：ポリグリシドールの量がはるかに多い（４８ｒ．ｕ．）磁性ナノ粒子の製造。このようなバイオコンジュゲートは、除去効率を犠牲にして、より高い分散安定性を示す。実際、ＣＴＣの平均除去効率は５７％±３１％であった。これは例１〜３に比べてはるかに低く、信頼性も低くなっている（例１〜３の標準偏差はそれぞれ０．９４％、０．４４％、０．３４％である）。図２参照。
【０１０５】
・例１１（比較）：非常に大量のポリグリシドール（６９ｒ．ｕ）を含む磁性ナノ粒子の製造。そのようなバイオコンジュゲートは、例１０よりもさらに高い分散安定性を示す。ＣＴＣの除去効率は、８３％±２１％であった。これは例１〜３よりも低く、さらに重要なことに、これははるかに信頼性が低かった（例１〜３の標準偏差はそれぞれ０．９４％、０．４４％、０．３４％である）。図２＆図３参照。
【０１０６】
例１
Ａ．合成
ステップ１：ナノ粒子。内部サンプル識別：ＴＺ５４８、合成日：１．１１．１６、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＯＨ：
１０ｇの炭素コーティングされたコバルトナノ粒子（Ｃ／Ｃｏ）は、４００ｍＬ  Ｈ２Ｏ（蒸留）に超音波処理浴を使用して分散される（１０分、Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）。１．２ｇ（８．７６ミリモル）の４‐アミノフェネチルアルコールを３０ｍＬのＨ２Ｏ（蒸留）と混合し、１０ｍＬの塩酸（ＨＣｌ濃度／３７％発煙）を加えて溶解する。溶解した４‐アミノフェニルアルコールを分散粒子に加え、さらに５分間超音波処理により分散させる。
【０１０７】
１．２ｇの亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２、１７．４ミリモル）を１０ｍＬのＨ２Ｏ（蒸留）に溶解し、氷浴で冷却する。亜硝酸ナトリウム溶液を、磁性ナノ粒子と、溶解した４‐アミノフェネチルアルコールの混合物に滴加する。窒素ガス（Ｎ２）の瞬間的な発生が観察できる。
【０１０８】
２時間の間、混合物は超音波処理しながら反応する。
調製したままのナノ粒子を、蒸留水（Ｈ２Ｏ（蒸留）（３ｘ１００ｍＬ））、ＥｔＯＨ（３ｘ１００ｍＬ）及びアセトン（３ｘ１００ｍＬ）で磁気デカンテーションにより洗浄する。ナノ粒子は、超音波浴に３分間分散され、永久磁石（磁気デカンテーション）の適用によって分離される。ナノ粒子を真空オーブンで５０℃で一晩乾燥させる。
【０１０９】
ステップ２：ナノ粒子。内部サンプル識別：ＴＺ５４９、合成日１３．１１．１６、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＯ−Ｎａ＋：
１０ｇのＣ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＯＨ（ＴＺ５４８）を２０ｍＬのナトリウムメトキシド溶液（２モルの乾燥メタノール溶液）に分散させ、６５℃で一晩撹拌する。
ナノ粒子は、磁気デカンテーションにより乾燥メタノール（８ｘ１０ｍＬ）で洗浄され、真空オーブンで５０℃で一晩乾燥される。
【０１１０】
ステップ３：ナノ粒子：内部サンプル識別：ＴＺ５８３、合成日１５．０２．１７、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ＠ポリグリシジン
５００ｍｇのＣ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＯ−Ｎａ＋（ＴＺ５４９）を超音波浴（Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）を使用して２時間分散させる。窒素をバブリングすることにより、混合物を３０分間脱気する。還流冷却器を設置し、マグネチックスターラーを追加した後、混合物を不活性条件下で１４０℃まで加熱した。混合物が１４０℃に達したら、１０ｍＬの（＋／−）‐グリシドール（＋／−‐オキシラン‐２‐イルメタノール）をシリンジポンプ（１時間あたり１．３ミリリットル）でゆっくりと加え、１６時間反応させる。反応完了後、混合物を室温まで冷却し、ナノ粒子をトルエン（未反応のモノマーを溶解）、メタノール、水（Ｈ２Ｏ（蒸留））（遊離ポリマー鎖を溶解）で洗浄する。水による洗浄プロセスは、（遊離ポリマーによる）泡の発生が観察されなくなるまで繰り返される。
【０１１１】
ステップ４：ナノ粒子：内部サンプル識別：ＴＺ５８６、合成日１６．０２．１７、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ＠ポリグリシジル‐ＣＯＯＨ
３００ｍｇのＣ／Ｃｏ＠ポリグリシジン（ＴＺ５８３）を１５ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；乾燥）に分散させる。無水コハク酸１５０ｍｇ（１．３ｍｍｏｌ）を追加する。室温で超音波処理をさらに１０分行った後、１８０ｍｇのＮ、Ｎ‐ジメチルピリジン‐４‐アミン（ＤＭＡＰ、１．５ｍｍｏｌ）と１．５ｍＬのトリエチルアミン（ＴＥＡ、１０．８ｍｍｏｌ）を加える。混合物を窒素で３０分間バブリングすることにより脱気した。反応物を７０℃まで一晩加熱し、不活性条件下に保つ。
【０１１２】
ステップ５：バイオコンジュゲート：内部サンプル識別：ＡＨ１７０６０７ａ、合成日２０１７年６月６日、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ＠ポリグリシジル‐ＣＯＯ‐ＥｐＣＡＭ
室温に平衡化した後、１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ‐ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ‐ＮＨＳ）を活性化バッファー（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）に溶解し、４ｍｇ／ｍＬ及び２ｍｇ／ｍＬの濃度で２つの別々のエッペンドルフチューブにそれぞれ入れた。両方の溶液を１０秒間ボルテックスした。１．５ｍＬエッペンドルフチューブ（以降、反応容器と呼ぶ）に、１００μＬの活性化バッファーを分注した。超音波処理浴（Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）で分散した後、Ｃ／Ｃｏ＠ポリグリシジル‐ＣＯＯＨナノ粒子（活性化バッファーに５ｍｇ／ｍＬ）の溶液２００μＬを反応容器に加えた。ナノ粒子の活性化は、ＥＤＣ溶液とスルホ‐ＮＨＳ溶液を１：１の比率で混合して１００μＬの体積にし、そのうち１０μＬを反応容器に加えることにより行った。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、反応容器をサーモミキサーに２５℃で１２００ｒｐｍで撹拌しながら１０分間置いた。１００μＬの抗体溶液（抗ＥｐＣＡＭ又は非特異的ＩｇＧ；１ｍｇ／ｍＬ）を反応容器に加えた。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、１２００ｒｐｍで撹拌しながら、反応容器を２５℃で４時間、ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒに戻した。反応は、１０μＬのクエンチングバッファー（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）を加えて停止した。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、反応物を１２００ｒｐｍで撹拌しながら、２５℃で３０分間ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒに戻した。反応容器を、予冷したＳｕｐｅｒＭａｇセパレーター（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）に入れ、磁石を４℃で１．５時間置き、上澄みを捨て、４２０μＬの新しい予冷したＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で置き換えることによりバイオコンジュゲートを洗浄した。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、反応容器を４℃のＳｕｐｅｒＭａｇセパレーターに戻した。洗浄手順を３回繰り返した。次に、この溶液を３０μＬの体積に等分し、−２０℃で一晩保存した。
【０１１３】
Ｂ．分析：
ステップ１：Ｃ／ＣｏＰｈＥｔＯＨ（ＴＺ５４８）：
元素微量分析：
［Ｃ］＝ｎｄ、［Ｈ］＝ｎｄ、［Ｎ］＝ｎｄ％、［Ｓ］＝ｎｄ
ステップ２：Ｃ／ＣｏＰｈＥｔＯ−Ｎａ＋（ＴＺ５４９）：
元素微量分析：
［Ｃ］＝５．１３％、［Ｈ］＝０．２４％、［Ｎ］＝０．１％、［Ｓ］＝０％、
赤外分光法：
ＴＺ５４９ピークリスト：決定されていない。
ステップ３：Ｃ／Ｃｏ＠ポリグリシジン（ＴＺ５８３）：
元素微量分析：
［Ｃ］＝１０．３％、［Ｈ］＝１．２％、［Ｎ］＝０．０７％、［Ｓ］＝０％
ΔＣ＝５．１７％＝４．３１ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＨ＝１．０８％＝９．６ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＮ＝−０．０３％＝−０．０２ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＳ＝０％
ポリグリシドールの計算量：１．４４ｍｍｏｌ／ｇナノ粒子。
計算された平均鎖長：スターターあたり１５単位。
赤外分光法：
ＴＺ５８３ピークリスト：2873 cm-1, 2356 cm-1, 1469 cm-1, 1328 cm-1, 1068 cm-1, 923 cm-1, 862 cm-1。
【０１１４】
ステップ４：Ｃ／Ｃｏ＠ポリグリシジル‐ＣＯＯＨ（ＴＺ５８６）：
元素微量分析：
［Ｃ］＝１４．３％、［Ｈ］＝１．４％、［Ｎ］＝０．２６％、［Ｓ］＝０％；
ΔＣ＝４％＝３．３ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＨ＝０．２％＝２ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＮ＝０．１９％＝０．１ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＳ＝０％
【０１１５】
カルボキシ官能基の計算量：０．８３ｍｍｏｌ／ｇ
赤外分光法：
ＴＺ５８６ピークリスト：2939 cm-1, 2873 cm-1, 2675 cm-1, 2360 cm-1, 2356 cm-1, 1725 cm-1, 1560 cm-1, 1406 cm-1, 1244 cm-1,  1168 cm-1, 1068 cm-1, 838cm-1。
１７２５ｃｍ−１の強いピークが最初に表われる。ＣＯＯＨ伸縮バンドに対応する。２９
【０１１６】
Ｃ．防汚試験
ナノ粒子Ｃ／Ｃｏ＠ポリグリシジル‐ＣＯＯＨ（ＴＺ５８６）の溶液を、ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。超音波ホーンを使用して（氷上で３ｘ３０秒）、均一な分散液を得た。テトラメチルローダミン抱合ウシ血清アルブミン（ローダミン‐ＢＳＡ）の溶液を、ＰＢＳ中に０．４ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。この溶液を１：３の比率で希釈して、防汚試験に最適な濃度にした。１．５ｍＬエッペンドルフチューブに、５００μＬのローダミン‐ＢＳＡを分注し、続いて５００μＬのナノ粒子溶液を分注した。表面にコーティングがないナノ粒子の溶液でネガティブ対照を調製し、ナノ粒子溶液の代わりにｍＱ水でポジティブ対照を調製した。次にエッペンドルフチューブを１０秒間ボルテックスし、続いて超音波処理浴（Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）で３０秒間ボルテックスした。サンプルを再度１０秒間ボルテックスし、２５℃で１０００ｒｐｍで９０分間振とうした。サンプルを磁石（ＳｕｐｅｒＭａｇ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ、ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）に１時間入れた。各サンプルの上澄みの５ｘ１００μＬを９６ウェルプレートに移し、蛍光を測定した（例：５４０ｎｍ、ｅｍ：６２０ｎｍ；Ｓｐａｒｋ  １０Ｍ、Ｔｅｃａｎ）。
タンパク質に対する防汚効率：６９．６８％
【０１１７】
Ｄ．  ＣＴＣの除去
細胞株
すべての実験で、ＡＴＣＣ（登録商標）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナサス、米国）から購入した、十分に記載されている大腸癌細胞株ＨＴ‐２９（ＨＴＢ３８（登録商標））を使用した。これらの細胞は、大腸腺癌からの結腸組織に由来するヒト起源であり、表面マーカー上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ；ＣＤ３２６）を発現する上皮細胞特性を持っている。細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、グルタマックス、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（最終濃度１％）の混合物（すべての材料はＧｉｂｃｏ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｉｎａ、ＵＳＡから）で補足した。細胞がコンフルエントになるとすぐに、アキュターゼ（Ｇｉｂｃｏ）の助けを借りて分離し、非付着性の単一細胞として実験に持ち込んだ。実験では、５〜４０の継代を選択した。
【０１１８】
血液
インフォームドコンセント（倫理承認：ＫＥＫ‐ＺＨ‐Ｎｒ。２０１２‐０２７４）の後、健康な個人から５ミリリットルの血液を採取し、ヘパリンチューブ（BD, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA）に採血した。
【０１１９】
実験のためのナノ粒子の調製
２５μＬの体積のバイオコンジュゲート溶液（リン酸緩衝生理食塩水中２．３８ｍｇ／ｍＬ）を、Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔａｌ  １０Ｐソニケーター（ＡｌｌｐａｘＧｍｂｈ＆Ｃｏ、Ｐａｐｅｎｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して氷水（３℃）で超音波処理した。合計５つの超音波処理ステップが、それぞれ５分の持続時間で実行された。各ステップは、１分の休止によって中断された。バイオコンジュゲートの２つのバッチを使用した：１）ＩｇＧ抗体でコーティングされたバイオコンジュゲート  ２）抗ＥｐＣＡＭ抗体でコーティングされたバイオコンジュゲート。ＩｇＧはアイソタイプ抗体（ＥｐＣＡＭの対照抗体）であり、腫瘍細胞との非特異的反応の評価を可能にする。抗ＥｐＣＡＭ抗体は、腫瘍細胞表面のＥｐＣＡＭ抗原と特異的に相互作用する。
【０１２０】
実験のためのＨＴ‐２９細胞の調製
ＨＴ‐２９細胞の標識には市販のキットを使用した（一般的な細胞膜標識用の赤色蛍光細胞リンカーキットＰＫＨ２６ＧＬ、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州、米国）。染色により、血液中のこれらの癌細胞を検出し、他の細胞性血液成分と区別することができる。
【０１２１】
実験的アプローチ
各実験で、血液量１０００μＬに０．５ｘ１０６細胞を添加した。３つの実験群が設計された。
Ｉ．対照：ＨＴ‐２９細胞を含む血液、バイオコンジュゲートとのインキュベーションなし。
ＩＩ．ＩｇＧバイオコンジュゲート：ＩｇＧアイソタイプ対照バイオコンジュゲートとインキュベートしたＨＴ‐２９を含む血液。
ＩＩＩ．ＥｐＣＡＭバイオコンジュゲート：抗ＥｐＣＡＭバイオコンジュゲートとインキュベートしたＨＴ‐２９を含む血液。
【０１２２】
群に応じて、バイオコンジュゲートを加え、オービタルシェーカーで２分間インキュベートした。次に、血液サンプルをカラムマグネットシステム（ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）にかけた。これらは、外部磁石の存在下で強力な磁場を生成する最適化されたマトリックスに「磁気標識された」腫瘍細胞を保持することにより、それらの分離を可能にするカラムである。フロースルー画分を収集し、蛍光活性化細胞スキャン（ＦＡＣＳ）及び分析用に準備した。
【０１２３】
ＦＡＣＳ分析とデータ処理
血液サンプルの細胞部分を遠心分離により分離した。塩化アンモニウム含有溶解バッファー（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を追加することにより、赤血球を溶解した。次に残りの細胞を洗浄し、４％ホルマリンで固定した。２．７ｘ１０４カウントビーズ（２５μＬのＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア、米国）を、ＢＤ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ニュージャージー、米国）及びＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  ＤｉｃｋｉｎｓｏｎによるＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析する前に各サンプルに追加した。５０００カウントビーズを測定した後、フローサイトメトリー測定を停止した。前方及び側方散乱エリアと信号の高さが記録された。染色された腫瘍細胞は、ＰＥ及び前方散乱領域を使用して検出された。次に、ＦＡＣＳデータはＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０．０．８（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ、Ａｓｈｌａｎｄ、Ｏｒｅｇｏｎ、ＵＳＡ）によって処理された。
【０１２４】
ヒト血液での実験：
実験日：０７．０６．２０１７
処置前の血中細胞数（血中ＨＴ‐２９）：７２８１
除去効率：９８．８２％
【０１２５】
実験日：０８．０６．２０１７
処置前の血中細胞数（血中ＨＴ‐２９）：７３８２
除去効率：９８．０２％
【０１２６】
実験日：１２．０６．２０１７
処置前の血中細胞数（血中ＨＴ‐２９）：９６４２
除去効率：９９．３９％
【０１２７】
実験日：０５．０７．２０１７
処置前の血中細胞数（血中ＨＴ‐２９）：９７９６
除去効率：９９．９６％
【０１２８】
実験日：０６．０７．２０１７
処置前の血中細胞数（血中ＨＴ‐２９）：１０６５８
除去効率：９７．６６％
平均除去効率：９８．７７％
【０１２９】
例２
例１を繰り返し、以下の結果が得られた：
防汚効率：８０．２７％
実験日：１７．１０．２０１７
処置前の血中細胞数（血中ＨＴ‐２９）：１０１１８
除去効率：＞  ９９．００％
実験日：１７．１０．２０１７
処置前の血中細胞数（血中ＨＴ‐２９）：１０１１８
除去効率：９８．１２％
平均除去効率：９８．５６％
【０１３０】
例３
例１を繰り返し、以下の結果が得られた：
防汚効率：８８．１１％
ヒト血液での実験：
実験日：１７．１０．２０１７
処置前の血中細胞数（血中ＨＴ‐２９）：８１４０
除去効率：＞  ９９．００％
実験日：１７．１０．２０１７
処置前の血中細胞数（血中ＨＴ‐２９）：９２３０
除去効率：９８．３２％
平均除去効率：９８．６６％
【０１３１】
例４
比較例：原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）による合成
Ａ．合成
ステップ１：ナノ粒子：サンプル名：Ｃ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＮＨ２
１０ｇの炭素コーティングされたコバルトナノ粒子（Ｃ／Ｃｏ）は、超音波処理浴を使用して４００ｍｌのＨ２Ｏ（蒸留）に分散される。（１０  Ｍｉｎｕｔｅｎ、Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）。４‐（２‐アミノエチル）アニリン（１．５ｇ、１．４２ｍＬ、１１ｍｍｏｌ）を３０ｍｌのＨ２Ｏ（乾燥）と混合し、１０ｍｌの塩酸（ＨＣｌ濃度／３７％発煙）を加えて溶解する。溶解した４‐（２‐アミノエチル）アニリンを、分散したナノ粒子に加え、さらに５分間超音波処理により分散させる。
【０１３２】
１．５ｇの亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２、２１．７ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのＨ２Ｏ（蒸留）に溶解し、氷浴で冷却する。亜硝酸ナトリウム溶液を、磁性ナノ粒子と、溶解した４‐（２‐アミノエチル）アニリンの混合物に滴加する。窒素ガス（Ｎ２）の瞬間的な発生が観察できる。
【０１３３】
２時間の間、混合物は超音波処理しながら反応する。
調製したままのナノ粒子を蒸留水（Ｈ２Ｏ（蒸留）（３ｘ１００ｍｌ））、ＥｔＯＨ（３ｘ１００ｍｌ）及びアセトン（３ｘ１００ｍｌ）で磁気デカンテーションにより洗浄する。ナノ粒子を超音波処理浴に３分間分散させ、永久磁石を適用して分離する（磁気デカンテーション）。ナノ粒子は、５０℃の真空オーブンで一晩乾燥される。
【０１３４】
ステップ２：ナノ粒子：サンプル名Ｃ／Ｃｏ‐Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ（ＡＴＲＰの開始剤部分）
フェネチルアミン修飾Ｃ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＮＨ２（１０ｇ）を、Ｎ２雰囲気下の超音波浴内の乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）に分散させた。次に、反応混合物を０℃に冷却し、激しく攪拌しながら、トリエチルアミン（１ｍＬ、７．１ｍｍｏｌ）を加え、続いて臭化２‐ブロモ‐２‐メチルプロピオニル（２．０ｍＬ、３．７ｇ、１６．２ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合物をゆっくりと室温に温めながら、反応混合物を１８時間撹拌した。前述のように、ナノ粒子を磁気デカンテーションにより分離し、洗浄し、乾燥させた。
【０１３５】
ステップ３：ナノ粒子：サンプル名：Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ（ＡＴＲＰを介した炭素コーティングナノ粒子上での３‐スルホプロピルメタクリレートカリウム塩の重合）
すべての反応ステップは保護窒素雰囲気下で行われた。３‐（２‐メチルプロパ‐２‐エノイルオキシ）プロパン‐１‐スルホン酸カリウム塩（ＳＰＭ）（８．６ｇ、３４．９ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（２：１、１２ｍＬ）に溶解し、３０分間の窒素バブリングによる連続した脱気によりモノマー溶液を調製した。ＣｕＢｒ２（１０ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）、２，２’‐ビピリジン（５４ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）、Ｌ‐アスコルビン酸（６０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）及びＮａＣｌ（９０ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）を溶液に加え、さらに５分間脱気した。Ｃ／Ｃｏ＠Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ（５００ｍｇ）をシュレンクフラスコに入れ、脱気した（３×高真空ポンプ／Ｎ２補充サイクル）。モノマー溶液をシリンジでナノ粒子に加えた。反応混合物を１０分間超音波処理に曝して、均一な分散液を得て、窒素で満たされたバルーンをフラスコに接続した。その後、４０℃で１８時間攪拌した。ポリＳＰＭ機能化ナノ粒子Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭは磁気的に分離された。磁気デカンテーション後、ナノ粒子を水で５回洗浄した。アセトン（洗浄水の体積の２倍）を使用して、粒子を不安定にした。さらにエタノール、酢酸エチル、及びアセトンで２回ずつ洗浄した。各洗浄手順（溶媒中での３分間の超音波処理）の後、ナノ粒子は外部磁石によって回収され、洗浄溶媒は排出された。ナノ粒子を５０℃の真空オーブンで乾燥させた。
【０１３６】
ステップ４：ナノ粒子：サンプル名Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ‐ｃｏ‐ｐＭＡＡ（ＡＴＲＰを介したＣ／Ｃｏ＠ＳＰＭでのメタクリル酸の共重合）
すべての反応ステップは保護窒素雰囲気下で行われた。メタクリル酸（０．０３ｍＬ、０．２５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（３：２、２ｍＬ）に溶解し、１５分間脱気した。ＣｕＢｒ２（２ｍｇ、０．００９ミリモル）、２，２’‐ビピリジン（１０．４ｍｇ、０．０７ミリモル）及びＬ‐アスコルビン酸（１２ｍｇ、０．０７ミリモル）を溶液に加え、さらに５分間脱気した。Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭナノ粒子をシュレンクフラスコに入れ、脱気した（３×高真空ポンプ／Ｎ２補充サイクル）。モノマー溶液をシリンジで加え、窒素で満たされたバルーンをフラスコに接続した。分散液を数分間超音波処理した後、室温で１８時間撹拌した。前述のように、Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ‐ｂ‐ｐＭＡＡナノ粒子を磁気的に分離、洗浄、乾燥した。
【０１３７】
例５
Ａ．合成
ステップ１：ナノ粒子：内部サンプル識別：ＴＺ５５３、合成日：２４．１１．２０１６、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＮＨ２
１０ｇの炭素コーティングされたコバルトナノ粒子（Ｃ／Ｃｏ）は、４００ｍＬ  Ｈ２Ｏ（蒸留）に超音波処理浴（１０分、Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）を使用して分散される。１．２ｇの４‐（２‐アミノエチル）アニリン（１．５ｇ、１．４２ｍＬ、１１ｍｍｏｌ）を３０ｍＬのＨ２Ｏ（蒸留）と混合し、７ｍＬの塩酸（ＨＣｌ濃度／３７％発煙）を加えて溶解する。溶解した４‐（２‐アミノエチル）アニリンを、分散したナノ粒子に加え、さらに５分間超音波処理により分散させる。
【０１３８】
１．５ｇの亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２、２１．７ミリモル）を１０ｍＬのＨ２Ｏ（蒸留）に溶解し、氷浴で冷却する。亜硝酸ナトリウム溶液を、磁性ナノ粒子と、溶解した４‐（２‐アミノエチル）アニリンの混合物に滴加する。窒素ガス（Ｎ２）の瞬間的な発生が観察できる。
【０１３９】
２時間の間、混合物は超音波処理しながら反応する。
調製したままのナノ粒子を、蒸留水（Ｈ２Ｏ（蒸留）（３ｘ１００ｍＬ））、ＥｔＯＨ（３ｘ１００ｍＬ）及びアセトン（３ｘ１００ｍＬ）で磁気デカンテーションにより洗浄する。ナノ粒子は、超音波浴に３分間分散され、永久磁石（磁気デカンテーション）の適用によって分離される。ナノ粒子を真空オーブンで５０℃で一晩乾燥させる。
【０１４０】
ステップ２：ナノ粒子：内部サンプル識別：ＴＺ５５４、合成日：２４．１１．２０１６、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ＠Ｉｎｉｔａｔｏｒ（ＡＴＲＰの開始剤部分）
フェネチルアミン修飾Ｃ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＮＨ２（１０ｇ）を、Ｎ２雰囲気下で超音波処理浴（Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）の乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）に分散させた。次に、反応混合物を０℃に冷却し、激しく攪拌しながら、トリエチルアミン（１ｍＬ、７．１ｍｍｏｌ）を加え、続いて臭化２‐ブロモ‐２‐メチルプロピオニル（２．０ｍＬ、３．７ｇ、１６．２ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合物をゆっくりと室温に温めながら、反応混合物を１８時間撹拌した。前述のように、ナノ粒子を磁気デカンテーションによって分離し、洗浄して乾燥させた。
【０１４１】
ステップ３：ナノ粒子：内部サンプル識別：ＴＺ５６２、合成日：１２．１２．２０１６、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ（ＡＴＲＰによる炭素コーティングされたナノ粒子上での３‐スルホプロピルメタクリレートカリウム塩の重合）
すべての反応ステップは保護窒素雰囲気下で行われた。３‐（２‐メチルプロプ‐２‐エノイルオキシ）プロパン‐１‐スルホン酸カリウム塩（ＳＰＭ）（２ｇ、８．１ミリモル）をＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（２：１、１２ｍＬ）に溶解し、３０分間の窒素バブリングによる連続した脱気によりモノマー溶液を調製した。ＣｕＢｒ２（１０ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）、２，２’‐ビピリジン（５４ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）、Ｌ‐アスコルビン酸（６０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）及びＮａＣｌ（９０ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）を溶液に加え、さらに５分間脱気した。Ｃ／Ｃｏ＠開始剤（５００ｍｇ）をシュレンクフラスコに入れて脱気した（３×高真空ポンプ／Ｎ２補充サイクル）。モノマー溶液をシリンジでナノ粒子に加えた。反応混合物を１０分間超音波処理に曝して、均一な分散液を得て、窒素で満たされたバルーンをフラスコに接続した。その後、４０℃で１８時間攪拌した。ポリＳＰＭ機能化ナノ粒子Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭは磁気的に分離された。磁気デカンテーション後、ナノ粒子を水で５回洗浄した。アセトン（洗浄水の体積の２倍）を使用して、ナノ粒子を不安定にした。さらにエタノール、酢酸エチル、及びアセトンで２回ずつ洗浄した。各洗浄手順（溶媒中での３分間の超音波処理）の後に、外部磁石によってナノ粒子を回収し、洗浄溶媒を排出した。ナノ粒子を５０℃の真空オーブンで乾燥させた。
【０１４２】
ステップ４：ナノ粒子：内部サンプル識別：ＴＺ５６２Ｂ、合成日：１３．１２．２０１６、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ‐ｐＭＡＡ（ＡＴＲＰによるメタクリル酸（ＭＡＡ）の共重合）
すべての反応ステップは保護窒素雰囲気下で行われた。メタクリル酸（０．０３ｍＬ、０．２５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（３：２、２ｍＬ）に溶解し、１５分間脱気した。ＣｕＢｒ２（２ｍｇ、０．００９ミリモル）、２，２’‐ビピリジン（１０．４ｍｇ、０．０７ミリモル）及びＬ‐アスコルビン酸（１２ｍｇ、０．０７ミリモル）を溶液に加え、さらに５分間脱気した。Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭナノ粒子をシュレンクフラスコに入れ、脱気した（３×高真空ポンプ／Ｎ２補充サイクル）。モノマー溶液をシリンジで加え、窒素で満たされたバルーンをフラスコに接続した。分散液を数分間超音波処理した後、室温で１８時間攪拌した。前述のように、Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ‐ｂ‐ｐＭＡＡナノ粒子を磁気的に分離、洗浄、乾燥した。
【０１４３】
ステップ５：バイオコンジュゲート：内部サンプル識別：ＡＨ１７０１０９ａ＿１、合成日０９．０１．２０１７、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ‐ｐＭＡＡ‐ＥｐＣＡＭ
室温で平衡化した後、１‐エチル‐３‐（３‐ジメチル‐アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ‐ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ‐ＮＨＳ）を活性化バッファー（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）に溶解し、４ｍｇ／ｍＬ及び２ｍｇ／ｍＬの濃度で２つの別々のエッペンドルフチューブにそれぞれ入れた。両方の溶液を１０秒間ボルテックスした。１．５ｍＬエッペンドルフチューブ（以降、反応容器と呼ぶ）に、１００μＬの活性化バッファーを分注した。超音波処理浴（Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）で分散後、Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ‐ｐＭＡＡナノ粒子（活性化バッファーに５ｍｇ／ｍＬ）の溶液２００μＬを反応容器に加えた。ナノ粒子の活性化は、ＥＤＣ溶液とスルホ‐ＮＨＳ溶液を１：１の比率で混合して１００μＬの体積にし、そのうち１０μＬを反応容器に加えることにより行った。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、１２００ｒｐｍで攪拌しながら、反応容器をＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ（サーモミキサー）に２５℃で１０分間置いた。１００μＬの抗体溶液（抗ＥｐＣＡＭ又は非特異的ＩｇＧ；１ｍｇ／ｍＬ）を反応容器に加えた。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、反応容器をＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒに２５℃で４時間１２００ｒｐｍで攪拌しながら戻した。反応は、１０μＬのクエンチングバッファー（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）を加えて停止した。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、反応物を１２００ｒｐｍで攪拌しながら、２５℃で３０分間ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒに戻した。反応容器を予冷したＳｕｐｅｒＭａｇセパレーター（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）に入れ、磁石を４℃で１．５時間置き、上澄みを捨て、４２０μＬの新しい予冷したＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で置き換えることによりバイオコンジュゲートを洗浄した。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、反応容器を４℃のＳｕｐｅｒＭａｇセパレーターに戻した。洗浄手順を３回繰り返した。次に、この溶液を３０μＬに等分し、−２０℃で一晩保存した。
【０１４４】
Ｂ．分析
ステップ１：Ｃ／ＣｏＰｈＥｔＮＨ２（ＴＺ５５３）
元素微量分析：：
［Ｃ］＝５．７％［Ｈ］＝０．３％、［Ｎ］＝０．２７％、［Ｓ］＝０％
【０１４５】
ステップ２：Ｃ／Ｃｏ＠Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ（ＴＺ５５４）
元素微量分析：：
［Ｃ］＝６．２％、［Ｈ］＝０．３３％、［Ｎ］＝０．２５％、［Ｓ］＝０％、［Ｂｒ］＝ｎｄ
【０１４６】
ステップ３：Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ（ＴＺ５６２）
元素微量分析：
［Ｃ］＝８．１７％、［Ｈ］＝０．６５％、［Ｎ］＝０．２７％、［Ｓ］＝０．６２％
ΔＣ＝１．９７％＝１．６４ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＨ＝０．３２％、ΔＮ＝０．０２％、ΔＳ＝０．６２４％＝０．１９５ｍｍｏｌ／ｇ
ΔＳから計算されたＳＰＭの量：０．１９５ｍｍｏｌ／ｇナノ粒子。
計算された平均鎖長：２繰り返し単位。
ΔＣから計算されたＳＰＭの量：０．２３ｍｍｏｌ／ｇナノ粒子。
計算された平均鎖長：３繰り返し単位。
赤外分光法：：
ＴＺ５６２ピークリスト：1720 cm-1, 1188 cm-1, 1043 cm-1, 605 cm-1。
【０１４７】
ステップ４：Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ‐ｐＭＡＡ（ＴＺ５６２Ｂ）
元素微量分析：：    
［Ｃ］＝１０．４２％、［Ｈ］＝０．７％、［Ｎ］＝０．８５％、［Ｓ］＝０．６％；    
ΔＣ＝２．２５％＝１．８８ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＨ＝０．０５％  ΔＮ＝０．５８％  ΔＳ＝０％
ΔＣに従って計算されたカルボキシ官能基：０．３ｍｍｏｌカルボキシ／ｇナノ粒子
赤外分光法：：
ＴＺ５６２ピークリスト：1720 cm-1, 1670 cm-1, 1440 cm-1, 1188 cm-1, 1043 cm-1, 767 cm-1, 727 cm-1, 605 cm-1。
【０１４８】
Ｃ．防汚試験
ナノ粒子Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ‐ｐＭＡＡ（ＴＺ５６２Ｂ）の溶液を、ＰＢＳで２ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。超音波ホーンを使用して（氷上で３ｘ３０秒）、均一な分散液を得た。テトラメチルローダミン抱合ウシ血清アルブミン（ローダミン‐ＢＳＡ）の溶液を、ＰＢＳ中に０．４ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。この溶液を１：３の比率で希釈して、防汚試験に最適な濃度にした。１．５ｍＬエッペンドルフチューブに、５００μＬのローダミン‐ＢＳＡを分注し、続いて５００μＬのナノ粒子溶液を分注した。表面にコーティングがないナノ粒子の溶液で陰性対照を調製し、ナノ粒子溶液の代わりにｍＱ水で陽性対照を調製した。次にエッペンドルフチューブを１０秒間ボルテックスし、続いて超音波処理浴（Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）で３０秒間ボルテックスした。サンプルを再度１０秒間ボルテックスし、その後２５℃で１０００ｒｐｍで９０分間振とうした。サンプルを磁石（ＳｕｐｅｒＭａｇ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ、ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）に１時間入れた。各サンプルの上澄みの５ｘ１００μＬを９６ウェルプレートに移し、蛍光を測定した（例：５４０ｎｍ、ｅｍ：６２０ｎｍ、Ｓｐａｒｋ  １０Ｍ、Ｔｅｃａｎ）。
タンパク質に対する防汚効率：６１．８６％
【０１４９】
Ｄ．  ＣＴＣの除去
実験のための細胞株、血液、ナノ粒子の調製及びＨＴ‐２９細胞の調製
例１を参照。
【０１５０】
実験的アプローチ
各実験で、血液量１０００μＬに０．５ｘ１０６細胞を添加した。３つの実験群が設計された。
Ｉ．対照：ＨＴ‐２９細胞を含む血液、バイオコンジュゲートとのインキュベーションなし。
ＩＩ．ＩｇＧバイオコンジュゲート：ＩｇＧアイソタイプ対照バイオコンジュゲートとインキュベートしたＨＴ‐２９を含む血液。
ＩＩＩ．ＥｐＣＡＭバイオコンジュゲート：抗ＥｐＣＡＭバイオコンジュゲートとインキュベートしたＨＴ‐２９を含む血液。
【０１５１】
群に応じて、バイオコンジュゲートを加え、オービタルシェーカーで２分間インキュベートした。次に、血液サンプルをカラム磁石システム（ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）にかけた。これらは、外部磁石の存在下で強力な磁場を生成する最適化されたマトリックスに「磁気標識された」腫瘍細胞を保持することにより、それらの分離を可能にするカラムである。フロースルー画分を収集し、蛍光活性化細胞スキャン（ＦＡＣＳ）及び分析用に準備した。
【０１５２】
ＦＡＣＳ分析とデータ処理
例１を参照。
実験日：１９．０１．２０１７
処置前の血中細胞数（血中ＨＴ‐２９）：８３９０
除去効率：２５．９５％
【０１５３】
例６
Ａ．合成
ステップ１：ナノ粒子：内部サンプル識別：ＴＺ５５３、合成日：２４．１１．２０１６  サンプル名：Ｃ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＮＨ２
１０ｇの炭素コーティングされたコバルトナノ粒子（Ｃ／Ｃｏ）は、４００ｍＬ  Ｈ２Ｏ（蒸留）に超音波処理浴を使用して分散される。（１０分、Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）。１．２ｇの４‐（２‐アミノエチル）アニリン（１．５ｇ、１．４２ｍＬ、１１ｍｍｏｌ）を３０ｍＬのＨ２Ｏ（蒸留）と混合し、７ｍＬの塩酸（ＨＣｌ濃度／３７％発煙）を加えて溶解する。溶解した４‐（２‐アミノエチル）アニリンを、分散したナノ粒子に加え、さらに５分間超音波処理により分散させる。
【０１５４】
１．５ｇの亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２、２１．７ミリモル）を１０ｍＬのＨ２Ｏ（蒸留）に溶解し、氷浴で冷却する。亜硝酸ナトリウム溶液を、磁性ナノ粒子と、溶解した４‐（２‐アミノエチル）アニリンの混合物に滴加する。窒素ガス（Ｎ２）の瞬間的な発生が観察できる。
【０１５５】
２時間の間、混合物は超音波処理しながら反応する。
調製したままのナノ粒子を蒸留水（Ｈ２Ｏ（蒸留）（３ｘ１００ｍＬ））、ＥｔＯＨ（３ｘ１００ｍＬ）及びアセトン（３ｘ１００ｍＬ）で磁気デカンテーションにより洗浄する。ナノ粒子は、超音波浴に３分間分散され、永久磁石（磁気デカンテーション）の適用によって分離される。ナノ粒子を真空オーブンで５０℃で一晩乾燥させる。
【０１５６】
ステップ２：ナノ粒子。内部サンプル識別：ＴＺ５５４、合成日：２４．１１．２０１６、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ＠Ｉｎｉｔａｔｏｒ（ＡＴＲＰの開始剤部分）
フェネチルアミンで修飾したＣ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＮＨ２（１０ｇ）を、Ｎ２雰囲気下の超音波浴（Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）内の乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）に分散させた。次に、反応混合物を０℃に冷却し、激しく攪拌しながら、トリエチルアミン（１ｍＬ、７．１ｍｍｏｌ）を加え、続いて臭化２‐ブロモ‐２‐メチルプロピオニル（２．０ｍＬ、３．７ｇ、１６．２ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合物をゆっくりと室温に温めながら、反応混合物を１８時間撹拌した。前述のように、ナノ粒子を磁気デカンテーションにより分離し、洗浄し、乾燥させた。
【０１５７】
ステップ３：ナノ粒子。内部サンプル識別：ＴＺ５６１、合成日：１．１２．２０１６、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ（ＡＴＲＰを介した炭素コーティングされたナノ粒子上での３‐スルホプロピルメタクリレートカリウム塩の重合）
すべての反応ステップは保護窒素雰囲気下で行われた。３‐（２‐メチルプロパ‐２‐エノイルオキシ）プロパン‐１‐スルホン酸カリウム塩（ＳＰＭ）（５ｇ、２０．２５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（２：１、１２ｍＬ）に溶解し、３０分間の窒素バブリングによる連続した脱気によりモノマー溶液を調製した。ＣｕＢｒ２（１０ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）、２，２’‐ビピリジン（５４ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）、Ｌ‐アスコルビン酸（６０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）及びＮａＣｌ（９０ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）を溶液に加え、さらに５分間脱気した。Ｃ／Ｃｏ＠開始剤（５００ｍｇ）をシュレンクフラスコに入れて脱気した（３×高真空ポンプ／Ｎ２補充サイクル）。モノマー溶液をシリンジでナノ粒子に加えた。反応混合物を１０分間超音波処理に曝して、均一な分散液を得て、窒素で満たされたバルーンをフラスコに接続した。その後、４０℃で１８時間攪拌した。ポリＳＰＭ機能化ナノ粒子Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭは磁気的に分離された。磁気デカンテーション後、ナノ粒子を水で５回洗浄した。アセトン（洗浄水の体積の２倍）を使用して、ナノ粒子を不安定にした。さらにエタノール、酢酸エチル、及びアセトンで２回ずつ洗浄した。各洗浄手順（溶媒中での３分間の超音波処理）の後に、外部磁石によってナノ粒子を回収し、洗浄溶媒を排出した。ナノ粒子を５０℃の真空オーブンで乾燥させた。
【０１５８】
ステップ４：ナノ粒子。内部サンプル識別：ＴＺ５６１Ｂ、合成日：２．１２．２０１６、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ‐ｐＭＡＡ（ＡＴＲＰによるメタクリル酸（ＭＡＡ）の共重合）
すべての反応ステップは保護窒素雰囲気下で行われた。メタクリル酸（０．０３ｍＬ、０．２５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（３：２、２ｍＬ）に溶解し、１５分間脱気した。ＣｕＢｒ２（２ｍｇ、０．００９ミリモル）、２，２’‐ビピリジン（１０．４ｍｇ、０．０７ミリモル）及びＬ‐アスコルビン酸（１２ｍｇ、０．０７ミリモル）を溶液に加え、さらに５分間脱気した。Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭナノ粒子をシュレンクフラスコに入れ、脱気した（３×高真空ポンプ／Ｎ２補充サイクル）。モノマー溶液をシリンジで加え、窒素で満たされたバルーンをフラスコに接続した。分散液を数分間超音波処理した後、室温で１８時間攪拌した。前述のように、Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ‐ｐＭＡＡナノ粒子を磁気的に分離、洗浄、乾燥した。
【０１５９】
ステップ５：バイオコンジュゲート。内部サンプル識別：ＡＨ１７０１０９ａ＿３、合成日０９．０１．２０１７、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ‐ｐＭＡＡ‐ＥｐＣＡＭ
室温で平衡化した後、１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ‐ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ‐ＮＨＳ）を活性化バッファー（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）に溶解し、４ｍｇ／ｍＬ及び２ｍｇ／ｍＬの濃度で２つの別々のエッペンドルフチューブにそれぞれ入れた。両方の溶液を１０秒間ボルテックスした。１．５ｍＬエッペンドルフチューブ（以降、反応容器と呼ぶ）に、１００μＬの活性化バッファーを分注した。超音波処理浴（Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）で分散後、Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ‐ｐＭＡＡナノ粒子（活性化バッファーに５ｍｇ／ｍＬ）の溶液２００μＬを反応容器に加えた。ナノ粒子の活性化は、ＥＤＣ溶液とスルホＮＨＳ溶液を１：１の比率で混合して１００μＬの体積にし、そのうち１０μＬを反応容器に加えることにより行った。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、１２００ｒｐｍで攪拌しながら、反応容器をＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒに２５℃で１０分間置いた。１００μＬの抗体溶液（抗ＥｐＣＡＭ又は非特異的ＩｇＧ；１ｍｇ／ｍＬ）を反応容器に加えた。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、１２００ｒｐｍで攪拌しながら、反応容器を２５℃で４時間ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒに戻した。反応は、１０μＬのクエンチングバッファー（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）を加えて停止した。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、反応物を１２００ｒｐｍで攪拌しながら、２５℃で３０分間ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒに戻した。反応容器を予冷したＳｕｐｅｒＭａｇセパレーター（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）に入れ、磁石を４℃で１．５時間置き、上澄みを捨て、４２０μＬの新しい予冷したＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で置き換えることによりバイオコンジュゲートを洗浄した。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、反応容器を４℃のＳｕｐｅｒＭａｇセパレーターに戻した。洗浄手順を３回繰り返した。次に、この溶液を３０μＬに等分し、−２０℃で一晩保存した。
【０１６０】
Ｂ．分析
ステップ１：Ｃ／ＣｏＰｈＥｔＮＨ２（ＴＺ５５３）
元素微量分析：
［Ｃ］＝５．７％［Ｈ］＝０．３％、［Ｎ］＝０．２７％、［Ｓ］＝０％
【０１６１】
ステップ２：Ｃ／Ｃｏ＠Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ（ＴＺ５５４）
元素微量分析：
［Ｃ］＝６．２％、［Ｈ］＝０．３３％、［Ｎ］＝０．２５％、［Ｓ］＝０％、［Ｂｒ］＝ｎｄ
【０１６２】
ステップ３：Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ（ＴＺ５６１）
元素微量分析：
［Ｃ］＝１９％、［Ｈ］＝２．３％、［Ｎ］＝０．１８％、［Ｓ］＝５．６％
ΔＣ＝１２．８％＝１０．６７ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＨ＝１．９７％、ΔＮ＝−０．０７％、ΔＳ＝５．６％＝１．７５ｍｍｏｌ／ｇ
ΔＳから計算されたＳＰＭの量：１．７５ｍｍｏｌ／ｇナノ粒子。
計算された平均鎖長：スターターあたり１８繰り返し単位。
ΔＣから計算されたＳＰＭの量：１．５２ｍｍｏｌ／ｇナノ粒子。
計算された平均鎖長：スターターごとに１６繰り返し単位。
赤外分光法：
ＴＺ５６１ピークリスト：1720 cm-1, 1475 cm-1, 1444 cm-1, 1188 cm-1, 1045 cm-1, 1008 cm-1,788 cm-1, 736 cm-1, 605 cm-1。
【０１６３】
ステップ４：Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ‐ｐＭＡＡ（ＴＺ５６１Ｂ）
元素微量分析：
［Ｃ］＝２２．７％、［Ｈ］＝２．３％、［Ｎ］＝２．１％、［Ｓ］＝３．７％；
ΔＣ＝３．７％＝３．０８ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＨ＝０％  ΔＮ＝１．９２％ΔＳ＝−１．９％
ΔＣに従って計算されたカルボキシ官能基：０．５ｍｍｏｌカルボキシ／ｇナノ粒子
ΔＳに応じて、解重合が発生する：新しい計算された鎖長：１２繰り返し単位／スターター部分。
赤外分光法：
ＴＺ５６１Ｂピークリスト：1720 cm-1, 1598 cm-1, 1475 cm-1, 1444 cm-1, 1188 cm-1, 1045 cm-1, 1008 cm-1, 788 cm-1, 736 cm-1, 605 cm-1。
【０１６４】
Ｃ．防汚試験
ナノ粒子Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ‐ｐＭＡＡ（ＴＺ５６１Ｂ）の溶液を、ＰＢＳで２ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。超音波ホーンを使用して（氷上で３ｘ３０秒）、均一な分散液を得た。テトラメチルローダミン抱合ウシ血清アルブミン（ローダミン‐ＢＳＡ）の溶液を、ＰＢＳ中に０．４ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。この溶液を１：３の比率で希釈して、防汚試験に最適な濃度にした。１．５ｍＬエッペンドルフチューブに、５００μＬのローダミン‐ＢＳＡを分注し、続いて５００μＬのナノ粒子溶液を分注した。表面にコーティングがないナノ粒子の溶液で陰性対照を調製し、ナノ粒子溶液の代わりにｍＱ水で陽性対照を調製した。次にエッペンドルフチューブを１０秒間ボルテックスし、続いて超音波処理浴（Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）で３０秒間ボルテックスした。サンプルを再度１０秒間ボルテックスし、その後２５℃で１０００ｒｐｍで９０分間振とうした。サンプルを磁石（ＳｕｐｅｒＭａｇ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ、ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）に１時間入れた。各サンプルの上澄みの５ｘ１００μＬを９６ウェルプレートに移し、蛍光を測定した（例：５４０ｎｍ、ｅｍ：６２０ｎｍ、Ｓｐａｒｋ  １０Ｍ、Ｔｅｃａｎ）。
タンパク質に対する防汚効率：６１．２６％
【０１６５】
Ｄ．  ＣＴＣの除去
実験のための細胞株、血液、ナノ粒子の調製、及びＨＴ‐２９細胞の調製
例１を参照。
【０１６６】
実験的アプローチ
各実験で、血液量１０００μＬに０．５ｘ１０６細胞を添加した。３つの実験群が設計された。
Ｉ．対照：ＨＴ‐２９細胞を含む血液、バイオコンジュゲートとのインキュベーションなし。
ＩＩ．ＩｇＧバイオコンジュゲート：ＩｇＧアイソタイプ対照バイオコンジュゲートとインキュベートしたＨＴ‐２９を含む血液。
ＩＩＩ．ＥｐＣＡＭバイオコンジュゲート：抗ＥｐＣＡＭバイオコンジュゲートとインキュベートしたＨＴ‐２９を含む血液。
【０１６７】
群に応じて、バイオコンジュゲートを加え、オービタルシェーカーで２分間インキュベートした。次に、血液サンプルをカラムマグネットシステム（ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）にかけた。これらは、外部磁石の存在下で強力な磁場を生成する最適化されたマトリックスに「磁気標識された」腫瘍細胞を保持することにより、それらの分離を可能にするカラムである。フロースルー画分を収集し、蛍光活性化細胞スキャン（ＦＡＣＳ）及び分析用に準備した。
【０１６８】
ＦＡＣＳ分析とデータ処理
例１参照。
実験日：１９．０１．２０１７
処置前の血中細胞数（血中ＨＴ‐２９）：８３９０
除去効率：１９．７９％
【０１６９】
例７
Ａ．合成
ステップ１：ナノ粒子。内部サンプル識別：ＴＺ５５３、合成日：２４．１１．２０１６  サンプル名：Ｃ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＮＨ２
１０ｇの炭素コーティングされたコバルトナノ粒子（Ｃ／Ｃｏ）は、４００ｍＬ  Ｈ２Ｏ（蒸留）に超音波処理浴を使用して分散される。（１０分、Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）。１．２ｇの４‐（２‐アミノエチル）アニリン（１．５ｇ、１．４２ｍＬ、１１ｍｍｏｌ）を３０ｍＬのＨ２Ｏ（蒸留）と混合し、７ｍＬの塩酸（ＨＣｌ濃度／３７％発煙）を加えて溶解する。溶解した４‐（２‐アミノエチル）アニリンを、分散したナノ粒子に加え、さらに５分間超音波処理により分散させる。
【０１７０】
１．５ｇの亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２、２１．７ミリモル）を１０ｍＬのＨ２Ｏ（蒸留）に溶解し、氷浴で冷却する。亜硝酸ナトリウム溶液を、磁性ナノ粒子と、溶解した４‐（２‐アミノエチル）アニリンの混合物に滴加する。窒素ガス（Ｎ２）の瞬間的な発生が観察できる。
【０１７１】
２時間の間、混合物は超音波処理しながら反応する。
調製したままのナノ粒子を蒸留水（Ｈ２Ｏ（蒸留）（３ｘ１００ｍＬ））、ＥｔＯＨ（３ｘ１００ｍＬ）及びアセトン（３ｘ１００ｍＬ）で磁気デカンテーションにより洗浄する。ナノ粒子は、超音波浴に３分間分散され、永久磁石（磁気デカンテーション）の適用によって分離される。ナノ粒子を真空オーブンで５０℃で一晩乾燥させる。
【０１７２】
ステップ２：ナノ粒子。内部サンプル識別：ＴＺ５５４、合成日：２４．１１．２０１６、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ＠Ｉｎｉｔａｔｏｒ（ＡＴＲＰの開始剤部分）
フェネチルアミンで修飾したＣ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＮＨ２（１０ｇ）を、Ｎ２雰囲気下の超音波浴（Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）内の乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）に分散させた。次に、反応混合物を０℃に冷却し、激しく攪拌しながら、トリエチルアミン（１ｍＬ、７．１ｍｍｏｌ）を加え、続いて臭化２‐ブロモ‐２‐メチルプロピオニル（２．０ｍＬ、３．７ｇ、１６．２ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合物をゆっくりと室温に温めながら、反応混合物を１８時間撹拌した。前述のように、ナノ粒子を磁気デカンテーションにより分離し、洗浄し、乾燥させた。
【０１７３】
ステップ３：ナノ粒子。内部サンプル識別：ＴＺ５６４、合成日：１２．１２．２０１６、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ（ＡＴＲＰを介した炭素コーティングされたナノ粒子上での３‐スルホプロピルメタクリレートカリウム塩の重合）
すべての反応ステップは保護窒素雰囲気下で行われた。３‐（２‐メチルプロパ‐２‐エノイルオキシ）プロパン‐１‐スルホン酸カリウム塩（ＳＰＭ）（５ｇ、２０．２５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（２：１、１２ｍＬ）に溶解し、３０分間の窒素バブリングによる連続した脱気によりモノマー溶液を調製した。ＣｕＢｒ２（１０ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）、２，２’‐ビピリジン（５４ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）、Ｌ‐アスコルビン酸（６０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）及びＮａＣｌ（９０ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）を溶液に加え、さらに５分間脱気した。Ｃ／Ｃｏ＠開始剤（５００ｍｇ）をシュレンクフラスコに入れて脱気した（３×高真空ポンプ／Ｎ２補充サイクル）。モノマー溶液をシリンジでナノ粒子に加えた。反応混合物を１０分間超音波処理に曝して、均一な分散液を得て、窒素で満たされたバルーンをフラスコに接続した。その後、４０℃で１８時間攪拌した。ポリＳＰＭ機能化ナノ粒子Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭが磁気的に分離された。磁気デカンテーション後、ナノ粒子を水で５回洗浄した。アセトン（洗浄水の体積の２倍）を使用して、ナノ粒子を不安定にした。さらにエタノール、酢酸エチル、及びアセトンで２回ずつ洗浄した。各洗浄手順（溶媒中での３分間の超音波処理）の後に、外部磁石によってナノ粒子を回収し、洗浄溶媒を排出した。ナノ粒子を５０℃の真空オーブンで乾燥させた。
【０１７４】
ステップ４：ナノ粒子。内部サンプル識別：ＴＺ５６４Ｂ、合成日：１３．１２．２０１６、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ‐ｐＭＡＡ（ＡＴＲＰによるメタクリル酸（ＭＡＡ）の共重合）
すべての反応ステップは保護窒素雰囲気下で行われた。メタクリル酸（０．０３ｍＬ、０．２５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（３：２、２ｍＬ）に溶解し、１５分間脱気した。ＣｕＢｒ２（２ｍｇ、０．００９ミリモル）、２，２’‐ビピリジン（１０．４ｍｇ、０．０７ミリモル）及びＬ‐アスコルビン酸（１２ｍｇ、０．０７ミリモル）を溶液に加え、さらに５分間脱気した。Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭナノ粒子をシュレンクフラスコに入れ、脱気した（３×高真空ポンプ／Ｎ２補充サイクル）。モノマー溶液をシリンジで加え、窒素で満たされたバルーンをフラスコに接続した。分散液を数分間超音波処理した後、室温で１８時間攪拌した。前述のように、Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ‐ｂ‐ｐＭＡＡナノ粒子を磁気的に分離、洗浄、乾燥した。
【０１７５】
ステップ５：バイオコンジュゲート。内部サンプル識別：ＡＨ１７０１０９ａ＿４、合成日０９．０１．２０１７、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ‐ｂ‐ｐＭＡＡ‐ＥｐＣＡＭ
室温で平衡化した後、１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ‐ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ‐ＮＨＳ）を活性化バッファー（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）に溶解し、４ｍｇ／ｍＬ及び２ｍｇ／ｍＬの濃度で２つの別々のエッペンドルフチューブにそれぞれ入れた。両方の溶液を１０秒間ボルテックスした。１．５ｍＬエッペンドルフチューブ（以降、反応容器と呼ぶ）に、１００μＬの活性化バッファーを分注した。超音波処理浴（Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）で分散した後、Ｃ／Ｃｏ＠ＳＰＭ‐ｐＭＡＡナノ粒子の溶液２００μＬ（活性化バッファーに５ｍｇ／ｍＬ）を反応容器に加えた。ナノ粒子の活性化は、ＥＤＣ溶液とスルホＮＨＳ溶液を１：１の比率で混合して１００μＬの体積にし、そのうち１０μＬを反応容器に加えることにより行った。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、１２００ｒｐｍで攪拌しながら、反応容器をＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒに２５℃で１０分間置いた。１００μＬの抗体溶液（抗ＥｐＣＡＭ又は非特異的ＩｇＧ；１ｍｇ／ｍＬ）を反応容器に加えた。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、１２００ｒｐｍで攪拌しながら、反応容器を２５℃で４時間ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒに戻した。反応は、１０μＬのクエンチングバッファー（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）を加えて停止した。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、反応物を１２００ｒｐｍで攪拌しながら、２５℃で３０分間ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒに戻した。反応容器を予冷したＳｕｐｅｒＭａｇセパレーター（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）に入れ、磁石を４℃で１．５時間置き、上澄みを捨て、４２０μＬの新しい予冷したＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で置き換えることによりバイオコンジュゲートを洗浄した。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、反応容器を４℃のＳｕｐｅｒＭａｇセパレーターに戻した。洗浄手順を３回繰り返した。次に、この溶液を３０μＬに等分し、−２０℃で一晩保存した。
【０１７６】
Ｂ．分析
ステップ１：Ｃ／ＣｏＰｈＥｔＮＨ２（ＴＺ５５３）
元素微量分析：
［Ｃ］＝５．７％［Ｈ］＝０．３％、［Ｎ］＝０．２７％、［Ｓ］＝０％
【０１７７】
ステップ２：Ｃ／Ｃｏ＠Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ（ＴＺ５５４）
元素微量分析：
［Ｃ］＝６．２％、［Ｈ］＝０．３３％、［Ｎ］＝０．２５％、［Ｓ］＝０％、［Ｂｒ］＝ｎｄ
【０１７８】
ステップ３：Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ（ＴＺ５６４）
元素微量分析：
［Ｃ］＝１９．５２％、［Ｈ］＝２．４％、［Ｎ］＝０．１７％、［Ｓ］＝５．７８％
ΔＣ＝１３．３２％＝１１．１０ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＨ＝２．０７％、ΔＮ＝−０．０８％、ΔＳ＝５．７８％＝１．８１ｍｍｏｌ／ｇ
ΔＳから計算されたＳＰＭの量：１．８１ｍｍｏｌ／ｇナノ粒子。
計算された平均鎖長：スターターあたり１９繰り返し単位。
ΔＣから計算されたＳＰＭの量：１．５８ｍｍｏｌ／ｇナノ粒子。
計算された平均鎖長：１６繰り返し単位／スターター部分。
赤外分光法：
ＴＺ５６４ピークリスト：1720 cm-1, 1475 cm-1, 1444 cm-1, 1188 cm-1, 1045 cm-1, 1008 cm-1,788 cm-1, 736 cm-1, 605 cm-1
【０１７９】
ステップ４：Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ−ｐＭＡＡ（ＴＺ５６４Ｂ）
元素微量分析：
［Ｃ］＝１７．６８％、［Ｈ］＝１．７％、［Ｎ］＝１．３１％、［Ｓ］＝３％；
ΔＣ＝−１．８４％＝−１．５３ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＨ＝−０．７％  ΔＮ＝１．１４％  ΔＳ＝−０．８７％
カルボキシ官能基は計算できない。解重合が起こる：
Ｓ含有量からＳＰＭの新たに計算された量：０．９３ｍｍｏｌ／ｇナノ粒子
新しく計算された平均鎖長：１０繰り返し単位／スターター。
赤外分光法：
ＴＺ５６４Ｂピークリスト：1720 cm-1, 1475 cm-1, 1444 cm-1, 1188 cm-1, 1045 cm-1, 1008 cm-1,788 cm-1, 736 cm-1, 605 cm-1
【０１８０】
Ｄ．  ＣＴＣの除去
実験用の細胞株、血液、ナノ粒子の調製及びＨＴ‐２９細胞の調製
例１参照。
【０１８１】
実験的アプローチ
各実験で、血液量１０００μＬに０．５ｘ１０６細胞を添加した。３つの実験群が設計された。
Ｉ．対照：ＨＴ‐２９細胞を含む血液、バイオコンジュゲートとのインキュベーションなし。
ＩＩ．ＩｇＧバイオコンジュゲート：ＩｇＧアイソタイプ対照バイオコンジュゲートとインキュベートしたＨＴ‐２９を含む血液。
ＩＩＩ．ＥｐＣＡＭバイオコンジュゲート：抗ＥｐＣＡＭバイオコンジュゲートとインキュベートしたＨＴ‐２９を含む血液。
【０１８２】
群に応じて、バイオコンジュゲートを加え、オービタルシェーカーで２分間インキュベートした。次に、血液サンプルをカラムマグネットシステム（ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）にかけた。これらは、外部磁石の存在下で強力な磁場を生成する最適化されたマトリックスに「磁気標識された」腫瘍細胞を保持することにより、それらの分離を可能にするカラムである。フロースルー画分を収集し、蛍光活性化細胞スキャン（ＦＡＣＳ）及び分析用に準備した。
【０１８３】
ＦＡＣＳ分析とデータ処理
例１参照。
実験日：１９．０１．２０１７
処置前の血中細胞数（血中ＨＴ‐２９）：８３９０
除去効率：４４．２４％
【０１８４】
例８
Ａ．合成
（ステップ１及び２は、Corinne J. Hofer, Vladimir Zlateski, Philipp R. Stoessel, Daniela Paunescu, Elia M. Schneider, Robert N. Grass, Martin Zeltner and Wendelin J. Stark Chemical Communications, 51 (10): 1826-1829, Cambridge, UK: Royal Society of Chemistry, 2015に従って合成］
ステップ１：ナノ粒子。内部サンプル識別：ＴＺ５５３、合成日：２４．１１。２０１６サンプル名：
Ｃ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＮＨ２
１０ｇの炭素コーティングされたコバルトナノ粒子（Ｃ／Ｃｏ）は、４００ｍＬ  Ｈ２Ｏ（蒸留）に超音波処理浴を使用して分散される。（１０分、Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）。１．２ｇの４‐（２‐アミノエチル）アニリン（１．５ｇ、１．４２ｍＬ、１１ｍｍｏｌ）を３０ｍＬのＨ２Ｏ（蒸留）と混合し、７ｍＬの塩酸（ＨＣｌ濃度／３７％発煙）を加えて溶解する。溶解した４‐アミノフェニルアルコールを、分散したナノ粒子に加え、さらに５分間超音波処理して分散させる。
【０１８５】
１．５ｇの亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２、２１．７ミリモル）を１０ｍＬのＨ２Ｏ（蒸留）に溶解し、氷浴で冷却する。亜硝酸ナトリウム溶液を、磁性ナノ粒子と、溶解した４‐（２‐アミノエチル）アニリンの混合物に滴加する。窒素ガス（Ｎ２）の瞬間的な発生が観察できる。
【０１８６】
２時間の間、混合物は超音波処理しながら反応する。
調製したままのナノ粒子を蒸留水（Ｈ２Ｏ（蒸留）（３ｘ１００ｍＬ））、ＥｔＯＨ（３ｘ１００ｍＬ）及びアセトン（３ｘ１００ｍＬ）で磁気デカンテーションにより洗浄する。ナノ粒子は、超音波浴に３分間分散され、永久磁石（磁気デカンテーション）の適用によって分離される。ナノ粒子を真空オーブンで５０℃で一晩乾燥させる。
【０１８７】
ステップ２：ナノ粒子。内部サンプル識別：ＴＺ５５４、合成日：２４．１１．２０１６、サンプル名Ｃ／Ｃｏ‐Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ（ＡＴＲＰの開始剤部分）
フェネチルアミンで修飾したＣ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＮＨ２（１０ｇ）を、Ｎ２雰囲気下の超音波浴（Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）内の乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）に分散させた。次に、反応混合物を０℃に冷却し、激しく攪拌しながら、トリエチルアミン（１ｍＬ、７．１ｍｍｏｌ）を加え、続いて臭化２‐ブロモ‐２‐メチルプロピオニル（２．０ｍＬ、３．７ｇ、１６．２ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合物をゆっくりと室温に温めながら、反応混合物を１８時間撹拌した。前述のように、ナノ粒子を磁気デカンテーションにより分離し、洗浄し、乾燥させた。
【０１８８】
ステップ３：ナノ粒子。内部サンプル識別：ＴＺ５７４、合成日：０６．０２．２０１７、サンプル名Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ（ＡＴＲＰによる炭素コーティングされたナノ粒子上の３‐スルホプロピルメタクリレートカリウム塩の重合）
すべての反応ステップは保護窒素雰囲気下で行われた。３‐（２‐メチルプロプ‐２‐エノイルオキシ）プロパン‐１‐スルホン酸カリウム塩（ＳＰＭ、２）（８．６ｇ、３４．９ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（２：１、１２ｍＬ）に溶解し、３０分間の窒素バブリングによる連続脱気によりモノマー溶液を調製した。ＣｕＢｒ２（１０ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）、２，２’‐ビピリジン（５４ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）、Ｌ‐アスコルビン酸（６０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）及びＮａＣｌ（９０ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）を溶液に加え、さらに５分間脱気した。Ｃ／Ｃｏ＠開始剤（５００ｍｇ）をシュレンクフラスコに入れて脱気した（３×高真空ポンプ／Ｎ２補充サイクル）。モノマー溶液をシリンジでナノ粒子に加えた。反応混合物を１０分間超音波処理に曝して、均一な分散液を得て、窒素で満たされたバルーンをフラスコに接続した。その後、４０℃で１８時間攪拌した。ポリＳＰＭ機能化ナノ粒子Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭが磁気的に分離された。磁気デカンテーション後、ナノ粒子を水で５回洗浄した。アセトン（洗浄水の体積の２倍）を使用して、ナノ粒子を不安定にした。さらにエタノール、酢酸エチル、アセトンで２回ずつ洗浄した。各洗浄手順（溶媒中での３分間の超音波処理）の後に、外部磁石によってナノ粒子を回収し、洗浄溶媒を排出した。ナノ粒子を５０℃の真空オーブンで乾燥させた。
【０１８９】
ステップ４：ナノ粒子。内部サンプル識別：ＴＺ５８２、合成日：１４．１２．２０１７、サンプル名Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ‐ｐＣＥＡ（ＡＴＲＰを介したカルボキシエチルアクリレート（ＣＥＡ）の共重合）
すべての反応ステップは保護窒素雰囲気下で行われた。カルボキシエチルアクリレート（ＣＥＡ）（０．０３ｍＬ、０．２５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（３：２、２ｍＬ）に溶解し、１５分間脱気した。ＣｕＢｒ２（２ｍｇ、０．００９ミリモル）、２，２’‐ビピリジン（１０．４ｍｇ、０．０７ミリモル）及びＬ‐アスコルビン酸（１２ｍｇ、０．０７ミリモル）を溶液に加え、さらに５分間脱気した。Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭナノ粒子をシュレンクフラスコに入れ、脱気した（３×高真空ポンプ／Ｎ２補充サイクル）。モノマー溶液をシリンジで加え、窒素で満たされたバルーンをフラスコに接続した。分散液を数分間超音波処理した後、室温で１８時間攪拌した。Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ‐ｂ‐ｐＣＥＡナノ粒子は、前述のように磁気的に分離され、洗浄され、乾燥された。
【０１９０】
ステップ５：バイオコンジュゲート。内部サンプル識別：ＡＨ１７０３０３ａ＿２、合成日０３．０３．２０１７、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ‐ｐＣＥＡ‐ＥｐＣＡＭ
室温で平衡化した後、１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ‐ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ‐ＮＨＳ）を活性化バッファー（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）に溶解し、４ｍｇ／ｍＬ及び２ｍｇ／ｍＬの濃度で２つの別々のエッペンドルフチューブにそれぞれ入れた。両方の溶液を１０秒間ボルテックスした。１．５ｍＬエッペンドルフチューブ（以降、反応容器と呼ぶ）に、１００μＬの活性化バッファーを分注した。超音波浴（Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）で分散した後、Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ‐ｐＣＥＡナノ粒子（活性化バッファーに５ｍｇ／ｍＬ）の溶液２００μＬを反応容器に加えた。ナノ粒子の活性化は、ＥＤＣ溶液とスルホＮＨＳ溶液を１：１の比率で混合して１００μＬの体積にし、そのうち１０μＬを反応容器に加えることにより行った。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、１２００ｒｐｍで攪拌しながら、反応容器をＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒに２５℃で１０分間置いた。１００μＬの抗体溶液（抗ＥｐＣＡＭ又は非特異的ＩｇＧ；１ｍｇ／ｍＬ）を反応容器に加えた。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、１２００ｒｐｍで攪拌しながら、反応容器を２５℃で４時間ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒに戻した。反応は、１０μＬのクエンチングバッファー（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）を加えて停止した。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、反応物を１２００ｒｐｍで攪拌しながら、２５℃で３０分間ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒに戻した。反応容器を予冷したＳｕｐｅｒＭａｇセパレーター（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）に入れ、磁石を４℃で１．５時間置き、上澄みを捨て、４２０μＬの新しい予冷したＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で置き換えることによりバイオコンジュゲートを洗浄した。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、反応容器を４℃のＳｕｐｅｒＭａｇセパレーターに戻した。洗浄手順を３回繰り返した。次に、この溶液を３０μＬに等分し、−２０℃で一晩保存した。
【０１９１】
Ｂ．分析
ステップ１：Ｃ／ＣｏＰｈＥｔＮＨ２（ＴＺ５５３）
元素微量分析：
［Ｃ］＝５．７％［Ｈ］＝０．３％、［Ｎ］＝０．２７％、［Ｓ］＝０％
【０１９２】
ステップ２：Ｃ／Ｃｏ＠Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ（ＴＺ５５４）
元素微量分析：
［Ｃ］＝６．２％、［Ｈ］＝０．３３％、［Ｎ］＝０．２５％、［Ｓ］＝０％、［Ｂｒ］＝ｎｄ
【０１９３】
ステップ３：Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ（ＴＺ５７４）
元素微量分析：
［Ｃ］＝２９％、［Ｈ］＝３．９％、［Ｎ］＝０．２％、［Ｓ］＝９．８％
ΔＣ＝２２．８％＝１９．００ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＨ＝３．５７％、ΔＮ＝−０．０５％、ΔＳ＝９．８％＝３．０６ｍｍｏｌ／ｇ
ΔＳから計算されたＳＰＭの量：３．０６ｍｍｏｌ／ｇナノ粒子。
計算された平均鎖長：３１繰り返し単位。
ΔＣから計算されたＳＰＭの量：２．７１ｍｍｏｌ／ｇナノ粒子。
計算された平均鎖長：２８繰り返し単位。
赤外分光法：
ＴＺ５７１ピークリスト：2358 cm-1, 2335 cm-1,1720 cm-1, 1654 cm-1, 1450 cm-1, 1446 cm-1, 1188 cm-1, 1045 cm-1, 1010 cm-1,790 cm-1, 738 cm-1, 613 cm-1, 528 cm-1。
【０１９４】
ステップ４：Ｃ／Ｃｏ＠ｐＳＰＭ‐ｐＣＥＡ（ＴＺ５８２）
元素微量分析：
［Ｃ］＝１９．２５％、［Ｈ］＝２．５％、［Ｎ］＝０．４％、［Ｓ］＝５．１４％；
ΔＣ＝−８．５５％＝ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＨ＝−１．３％  ΔＮ＝０．３％  ΔＳ＝−４．１６％
カルボキシ官能基は計算できない。解重合が起こる：
Ｓ含有量から計算された新しいＳＰＭ量：１．６ｍｍｏｌ／ｇナノ粒子。
新しく計算された平均鎖長：１６繰り返し単位。
【０１９５】
Ｄ．  ＣＴＣの除去
実験のための細胞株、血液、ナノ粒子の調製及びＨＴ‐２９細胞の調製
例１参照。
【０１９６】
実験的アプローチ
各実験で、血液量１０００μＬに０．５ｘ１０６細胞を添加した。３つの実験群が設計された。
Ｉ．対照：ＨＴ‐２９細胞を含む血液、バイオコンジュゲートとのインキュベーションなし。
ＩＩ．ＩｇＧバイオコンジュゲート：ＩｇＧアイソタイプ対照バイオコンジュゲートとインキュベートしたＨＴ‐２９を含む血液。
ＩＩＩ．ＥｐＣＡＭバイオコンジュゲート：抗ＥｐＣＡＭバイオコンジュゲートとインキュベートしたＨＴ‐２９を含む血液。
【０１９７】
群に応じて、バイオコンジュゲートを加え、オービタルシェーカーで２分間インキュベートした。次に、血液サンプルをカラムマグネットシステム（ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）にかけた。これらは、外部磁石の存在下で強力な磁場を生成する最適化されたマトリックスに「磁気標識された」腫瘍細胞を保持することにより、それらの分離を可能にするカラムである。フロースルー画分を収集し、蛍光活性化細胞スキャン（ＦＡＣＳ）及び分析用に準備した。
【０１９８】
ＦＡＣＳ分析とデータ処理
例１参照。
実験日：０８．０３．２０１７
処置前の血中細胞数（血中ＨＴ‐２９）：３４０９
除去効率：７６．６２％
【０１９９】
例９
ターゲット：ポリグリシドール層のない、同じカルボキシル構造を有する炭素コーティングされたナノ粒子。最終サンプル番号：ＴＺ６６４
Ａ．合成
ステップ１：ナノ粒子。内部サンプル識別：ＴＺ６５０、合成日：０７．０８．２０１７、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＯＨ
１０ｇの炭素コーティングされたコバルトナノ粒子（Ｃ／Ｃｏ）は、４００ｍＬ  Ｈ２Ｏ（蒸留）に超音波処理浴を使用して分散される。（１０分、Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）。１．２ｇ（８．７６ｍｍｏｌ）の４‐アミノフェネチルアルコールを３０ｍＬのＨ２Ｏ（蒸留）と混合し、１０ｍＬの塩酸（ＨＣｌ濃度／３７％発煙）を加えて溶解する。溶解した４‐アミノフェニルアルコールを、分散したナノ粒子に加え、さらに５分間超音波処理して分散させる。
【０２００】
１．２ｇの亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２、１７．４ミリモル）を１０ｍＬのＨ２Ｏ（蒸留）に溶解し、氷浴で冷却する。亜硝酸ナトリウム溶液を、磁性ナノ粒子と、溶解した４‐アミノフェネチルアルコールの混合物に滴加する。窒素ガス（Ｎ２）の瞬間的な発生が観察できる。
【０２０１】
２時間の間、混合物は超音波処理しながら反応する。
調製したままの粒子を蒸留水（Ｈ２Ｏ（蒸留）（３ｘ１００ｍＬ））、ＥｔＯＨ（３ｘ１００ｍＬ）及びアセトン（３ｘ１００ｍＬ）で磁気デカンテーションにより洗浄する。ナノ粒子は、超音波浴に３分間分散され、永久磁石（磁気デカンテーション）の適用によって分離される。ナノ粒子を真空オーブンで５０℃で一晩乾燥させる。
【０２０２】
ステップ２：ナノ粒子。内部サンプルの識別：ＴＺ６６４、合成の日付：１０．０８．２０１７、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＣＯ２ＥｔＣＯ２
３００ｍｇのＣ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＯＨ（ＴＺ６５０）を１５ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；乾燥）に分散させる。無水コハク酸１５０ｍｇ（１．３ｍｍｏｌ）を追加する。室温で超音波処理をさらに１０分行った後、１８０ｍｇのＮ，Ｎ‐ジメチルピリジン‐４‐アミン（ＤＭＡＰ、１．５ｍｍｏｌ）と１．５ｍＬのトリエチルアミン（ＴＥＡ、１０．８ｍｍｏｌ）を加える。混合物を窒素で３０分間バブリングすることにより脱気した。反応物を７０℃まで一晩加熱し、不活性条件下に保つ。
【０２０３】
ステップ３：バイオコンジュゲート：内部サンプル識別：ＡＨ１７１０１６ａ＿４、合成日１６．１０．２０１７、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＣＯ２ＥｔＣＯ２‐ＥｐＣＡＭ
室温で平衡化した後、１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ‐ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ‐ＮＨＳ）を活性化バッファー（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）に溶解し、４ｍｇ／ｍＬ及び２ｍｇ／ｍＬの濃度で２つの別々のエッペンドルフチューブにそれぞれ入れた。両方の溶液を１０秒間ボルテックスした。１．５ｍＬエッペンドルフチューブ（以降、反応容器と呼ぶ）に、１００μＬの活性化バッファーを分注した。超音波処理浴（Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）で分散した後、Ｃ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＣＯ２ＥｔＣＯＯＨナノ粒子（活性化バッファーに５ｍｇ／ｍＬ）の溶液２００μＬを反応容器に加えた。ナノ粒子の活性化は、ＥＤＣ溶液とスルホＮＨＳ溶液を１：１の比率で混合して１００μＬの体積にし、そのうち１０μＬを反応容器に加えることにより行った。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、１２００ｒｐｍで攪拌しながら、反応容器をＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒに２５℃で１０分間置いた。１００μＬの抗体溶液（抗ＥｐＣＡＭ又は非特異的ＩｇＧ；１ｍｇ／ｍＬ）を反応容器に加えた。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、１２００ｒｐｍで攪拌しながら、反応容器を２５℃で４時間ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒに戻した。反応は、１０μＬのクエンチングバッファー（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）を加えて停止した。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、反応物を１２００ｒｐｍで攪拌しながら、２５℃で３０分間ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒに戻した。反応容器を予冷したＳｕｐｅｒＭａｇセパレーター（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）に入れ、磁石を４℃で１．５時間置き、上澄みを捨て、４２０μＬの新しい予冷したＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で置き換えることによりバイオコンジュゲートを洗浄した。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、反応容器を４℃のＳｕｐｅｒＭａｇセパレーターに戻した。洗浄手順を３回繰り返した。次に、この溶液を３０μＬに等分し、−２０℃で一晩保存した。
【０２０４】
Ｂ．分析
ステップ１：Ｃ／ＣｏＰｈＥｔＯＨ（ＴＺ６５０）
元素微量分析：
［Ｃ］＝５．９８％、［Ｈ］＝０．３５％、［Ｎ］＝０．２１％、［Ｓ］＝０％
ΔＣ＝１．８％＝１．５ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＨ＝０．２３％＝２．３ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＮ＝０．２１％＝０．１５ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＳ＝０％
赤外分光法：
ピークリストＴＺ６５０：2360 cm-1, 1595 cm-1, 1500 cm-1, 1394 cm-1, 1047 cm-1, 1012 cm-1, 831 cm-1。
【０２０５】
ステップ２：Ｃ／ＣｏＰｈＥｔＣＯ２ＥｔＣＯＯＨ（ＴＺ６６４）
元素微量分析：
［Ｃ］＝６．５４％、［Ｈ］＝０．４２％、［Ｎ］＝０．２１％、［Ｓ］＝０％
ΔＣ＝０．５６％＝０．４６ｍｍｏｌ／ｇ
計算されたカルボキシ基：０．１１ｍｍｏ／ｇナノ粒子
赤外分光法：
ピークリストＴＺ６７９：2360 cm-1, 1725 cm-1, 1571 cm-1, 1411 cm-1, 1168 cm-1, 1014 cm-1, 838 cm-1。
１７２５ｃｍ−１に強いピークが最初に表示される。ＣＯＯＨ伸縮バンドに対応する。
【０２０６】
Ｃ．防汚試験
ナノ粒子Ｃ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＣＯ２ＥｔＣＯＯＨ（ＴＺ６６４）の溶液を、ＰＢＳで２ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。超音波ホーンを使用して（氷上で３ｘ３０秒）、均一な分散液を得た。テトラメチルローダミン抱合ウシ血清アルブミン（ローダミン‐ＢＳＡ）の溶液を、ＰＢＳ中に０．４ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。この溶液を１：３の比率で希釈して、防汚試験に最適な濃度にした。１．５ｍＬエッペンドルフチューブに、５００μＬのローダミン‐ＢＳＡを分注し、続いて５００μＬのナノ粒子溶液を分注した。表面にコーティングがないナノ粒子の溶液で陰性対照を調製し、ナノ粒子溶液の代わりにｍＱ水で陽性対照を調製した。次にエッペンドルフチューブを１０秒間ボルテックスし、続いて超音波処理浴（Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）で３０秒間ボルテックスした。サンプルを再度１０秒間ボルテックスし、その後に２５℃で１０００ｒｐｍで９０分間振とうした。サンプルを磁石（ＳｕｐｅｒＭａｇ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ、ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）に１時間入れた。各サンプルの上澄みの５ｘ１００μＬを９６ウェルプレートに移し、蛍光を測定した（例：５４０ｎｍ、ｅｍ：６２０ｎｍ、Ｓｐａｒｋ  １０Ｍ、Ｔｅｃａｎ）。
タンパク質に対する防汚効率：４６．０５％
【０２０７】
Ｄ．  ＣＴＣの除去
実験用の細胞株、血液、ナノ粒子の調製及びＨＴ‐２９細胞の調製
例１参照。
【０２０８】
実験的アプローチ
各実験で、血液量１０００μＬに０．５ｘ１０６細胞を添加した。３つの実験群が設計された。
Ｉ．対照：ＨＴ‐２９細胞を含む血液、バイオコンジュゲートとのインキュベーションなし。
ＩＩ．ＩｇＧバイオコンジュゲート：ＩｇＧアイソタイプ対照バイオコンジュゲートとインキュベートしたＨＴ‐２９を含む血液。
ＩＩＩ．ＥｐＣＡＭバイオコンジュゲート：抗ＥｐＣＡＭバイオコンジュゲートとインキュベートしたＨＴ‐２９を含む血液。
【０２０９】
群に応じて、バイオコンジュゲートを加え、オービタルシェーカーで２分間インキュベートした。次に、血液サンプルをカラムマグネットシステム（ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）にかけた。これらは、外部磁石の存在下で強力な磁場を生成する最適化されたマトリックスに「磁気標識された」腫瘍細胞を保持することにより、それらの分離を可能にするカラムである。フロースルー画分を収集し、蛍光活性化細胞スキャン（ＦＡＣＳ）及び分析用に準備した。
【０２１０】
ＦＡＣＳ分析とデータ処理
例１参照。
実験日：１８．１０．２０１７
処置前の血中細胞数（血中ＨＴ‐２９）：１０１１８
除去効率：８１．９２％
実験日：１８．１０．２０１７
処置前の血中細胞数（血中ＨＴ‐２９）：１０１１８
除去効率：９５．８２％
平均除去効率：８８．８７％
【０２１１】
例１０
ターゲット材料：十分な速さの分離と良好な性能に関して、防汚性が高すぎるＣ／Ｃｏ。日付：２８．８．２０１７；最終サンプル番号：ＴＺ６６６
Ａ．合成
ステップ１：ナノ粒子。内部サンプル識別：ＴＺ６５２、合成日：７．０８．２０１７、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＯＨ
１０ｇの炭素コーティングされたコバルトナノ粒子（Ｃ／Ｃｏ）は、４００ｍＬ  Ｈ２Ｏ（蒸留）に超音波処理浴を使用して分散される。（１０分、Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）。１．２ｇ（８．７６ｍｍｏｌ）の４‐アミノフェネチルアルコールを３０ｍＬのＨ２Ｏ（蒸留）と混合し、１０ｍＬの塩酸（ＨＣｌ濃度／３７％発煙）を加えて溶解する。溶解した４‐アミノフェニルアルコールを、分散したナノ粒子に加え、さらに５分間超音波処理して分散させる。
【０２１２】
１．２ｇの亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２、１７．４ミリモル）を１０ｍＬのＨ２Ｏ（蒸留）に溶解し、氷浴で冷却する。亜硝酸ナトリウム溶液を、磁性ナノ粒子と、溶解した４‐アミノフェネチルアルコールの混合物に滴加する。窒素ガス（Ｎ２）の瞬間的な発生が観察できる。
【０２１３】
２時間の間、混合物は超音波処理しながら反応する。
調製したままのナノ粒子を蒸留水（Ｈ２Ｏ（蒸留）（３ｘ１００ｍＬ））、ＥｔＯＨ（３ｘ１００ｍＬ）及びアセトン（３ｘ１００ｍＬ）で磁気デカンテーションにより洗浄する。ナノ粒子は、超音波浴に３分間分散され、永久磁石（磁気デカンテーション）の適用によって分離される。ナノ粒子を真空オーブンで５０℃で一晩乾燥させる。
【０２１４】
ステップ２：ナノ粒子。内部サンプル識別：ＴＺ６５７、合成日０８．０８．２０１７、サンプル名：
Ｃ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＯ‐Ｎａ＋
１０ｇのＣ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＯＨ（ＴＺ６５２）を２０ｍＬのナトリウムメトキシド溶液（２モルの乾燥メタノール溶液）に分散させ、６５℃で一晩撹拌する。
ナノ粒子は、磁気デカンテーションにより乾燥メタノール（８ｘ１０ｍＬ）で洗浄され、真空オーブンで５０℃で一晩乾燥される。
【０２１５】
ステップ３：ナノ粒子。内部サンプル識別：ＴＺ６６３、合成日１０．０８．２０１７、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ＠ポリグリシジン
５００ｍｇのＣ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＯ‐Ｎａ＋（ＴＺ６５７）を超音波浴（Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）で２時間分散させる。窒素をバブリングすることにより、混合物を３０分間脱気する。還流冷却器を設置し、マグネチックスターラーを追加した後、混合物を不活性条件下で１４０℃まで加熱した。混合物が１４０℃に達したら、１０ｍＬの蒸留した（＋／−）‐グリシドール（＋／−‐オキシラン‐２‐イルメタノール）をシリンジポンプでゆっくりと加え（１．３ミリリットル／時）、１６時間反応させる。反応完了後、混合物を室温まで冷却し、ナノ粒子をトルエン（未反応のモノマーを溶解）、メタノール、水（Ｈ２Ｏ（蒸留）（遊離ポリマー鎖を溶解）で洗浄する。水による洗浄プロセスは、（遊離ポリマーによる）泡の発生が観察されなくなるまで繰り返される。
【０２１６】
ステップ４：ナノ粒子。内部サンプル識別：ＴＺ６６６、合成日１１．０８．２０１７、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ＠ポリグリシジル‐ＣＯＯＨ
３００ｍｇのＣ／Ｃｏ＠ポリグリシジン（ＴＺ６６３）を１５ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；乾燥）に分散させる。無水コハク酸１５０ｍｇ（１．３ｍｍｏｌ）を追加する。室温で超音波処理をさらに１０分行った後、１８０ｍｇのＮ，Ｎ‐ジメチルピリジン‐４‐アミン（ＤＭＡＰ、１．５ｍｍｏｌ）と１．５ｍＬのトリエチルアミン（ＴＥＡ、１０．８ｍｍｏｌ）を加える。混合物を窒素に３０分間バブリングすることにより脱気した。反応物を７０℃まで一晩加熱し、不活性条件下に保つ。
【０２１７】
ステップ５：バイオコンジュゲート：内部サンプル識別：ＡＨ１７１０１６ａ＿４、合成日１６．１０．２０１７、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ＠ポリグリシジル‐ＣＯＯ‐ＥｐＣＡＭ
室温で平衡化した後、１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ‐ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ‐ＮＨＳ）を活性化バッファー（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）に溶解し、４ｍｇ／ｍＬ及び２ｍｇ／ｍＬの濃度で２つの別々のエッペンドルフチューブにそれぞれ入れた。両方の溶液を１０秒間ボルテックスした。１．５ｍＬエッペンドルフチューブ（以降、反応容器と呼ぶ）に、１００μＬの活性化バッファーを分注した。超音波処理浴（Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）で分散した後、Ｃ／Ｃｏ＠ポリグリシジル‐ＣＯＯＨナノ粒子（活性化バッファーに５ｍｇ／ｍＬ）の溶液２００μＬを反応容器に加えた。ナノ粒子の活性化は、ＥＤＣ溶液とスルホＮＨＳ溶液を１：１の比率で混合して１００μＬの体積にし、そのうち１０μＬを反応容器に加えることにより行った。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、１２００ｒｐｍで攪拌しながら、反応容器をＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒに２５℃で１０分間置いた。１００μＬの抗体溶液（抗ＥｐＣＡＭ又は非特異的ＩｇＧ；１ｍｇ／ｍＬ）を反応容器に加えた。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、１２００ｒｐｍで攪拌しながら、反応容器を２５℃で４時間ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒに戻した。反応は、１０μＬのクエンチングバッファー（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）を加えて停止した。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、反応物を１２００ｒｐｍで攪拌しながら、２５℃で３０分間ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒに戻した。反応容器を予冷したＳｕｐｅｒＭａｇセパレーター（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）に入れ、磁石を４℃で１．５時間置き、上澄みを捨て、４２０μＬの新しい予冷したＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で置き換えることによりバイオコンジュゲートを洗浄した。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、反応容器を４℃のＳｕｐｅｒＭａｇセパレーターに戻した。洗浄手順を３回繰り返した。次に、この溶液を３０μＬに等分し、−２０℃で一晩保存した。
【０２１８】
Ｂ．分析
ステップ１：Ｃ／ＣｏＰｈＥｔＯＨ（ＴＺ６５２）
元素微量分析：
［Ｃ］＝６．０９％、［Ｈ］＝０．３４％、［Ｎ］＝０．１７％、［Ｓ］＝０％
ΔＣ＝１．９１％＝１．５９ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＨ＝０．２２％＝２．２ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＮ＝０．１７％＝０．１２ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＳ＝０％
赤外分光法：
ピークリストＴＺ６５２：2360 cm-1, 1595 cm-1, 1500 cm-1, 1394 cm-1, 1047 cm-1, 1014 cm-1, 831 cm-1。
【０２１９】
ステップ２：Ｃ／ＣｏＰｈＥｔＯ‐Ｎａ＋（ＴＺ６５７）
元素微量分析：
［Ｃ］＝未測定、［Ｈ］＝未測定、［Ｎ］＝未測定、［Ｓ］＝未測定  ΔＣ＝、ΔＨ＝、ΔＮ＝、ΔＳ＝
赤外分光法：決定されていない
【０２２０】
ステップ３：Ｃ／Ｃｏ＠ポリグリシジン（ＴＺ６６３）
元素微量分析：
［Ｃ］＝２３．１３％、［Ｈ］＝３．５６％、［Ｎ］＝０．０４％、［Ｓ］＝０％
ΔＣ＝１７．０４％＝１４．２０ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＨ＝３．２２％、ΔＮ＝−０．１３％、ΔＳ＝０％
ポリグリシドールの計算量：４．７３ｍｍｏｌ／ｇナノ粒子。
計算された平均鎖長：スターターあたり４８単位。
赤外分光法：
ＴＺ６８３ピークリスト：ｎｄ．
【０２２１】
ステップ４：Ｃ／Ｃｏ＠ポリグリシジル‐ＣＯＯＨ（ＴＺ６６６）：
元素微量分析：
［Ｃ］＝２７．８５％、［Ｈ］＝３．３２％、［Ｎ］＝０．２７％、［Ｓ］＝０％；    
ΔＣ＝４．７２％＝３．９３ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＨ＝−０．２４％、ΔＮ＝０．２３％、ΔＳ＝０％
カルボキシ官能基の計算量：０．９８ｍｍｏｌ／ｇ
カルボキシ官能基の計算数：スターターあたり１０単位。
【０２２２】
Ｃ．防汚試験
ナノ粒子Ｃ／Ｃｏ＠ポリグリシジル‐ＣＯＯＨ（ＴＺ６６６）の溶液を、ＰＢＳで２ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。超音波ホーンを使用して（氷上で３ｘ３０秒）、均一な分散液を得た。テトラメチルローダミン抱合ウシ血清アルブミン（ローダミン‐ＢＳＡ）の溶液を、ＰＢＳ中に０．４ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。この溶液を１：３の比率で希釈して、防汚試験に最適な濃度にした。１．５ｍＬエッペンドルフチューブに、５００μＬのローダミン‐ＢＳＡを分注し、続いて５００μＬのナノ粒子溶液を分注した。表面にコーティングがないナノ粒子の溶液で陰性対照を調製し、ナノ粒子溶液の代わりにｍＱ水で陽性対照を調製した。次にエッペンドルフチューブを１０秒間ボルテックスし、続いて超音波処理浴（Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）で３０秒間ボルテックスした。サンプルを再度１０秒間ボルテックスし、その後２５℃で１０００ｒｐｍで９０分間振とうした。サンプルを磁石（ＳｕｐｅｒＭａｇ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ、ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）に１時間入れた。各サンプルの上澄みの５ｘ１００μＬを９６ウェルプレートに移し、蛍光を測定した（例：５４０ｎｍ、ｅｍ：６２０ｎｍ、Ｓｐａｒｋ  １０Ｍ、Ｔｅｃａｎ）。
タンパク質に対する防汚効率：９１．９９％
【０２２３】
Ｄ．  ＣＴＣの除去
実験用の細胞株、血液、ナノ粒子の調製及びＨＴ‐２９細胞の調製
例１参照。
【０２２４】
実験的アプローチ
各実験で、血液量１０００μＬに０．５ｘ１０６細胞を添加した。３つの実験群が設計された。
Ｉ．対照：ＨＴ‐２９細胞を含む血液、バイオコンジュゲートとのインキュベーションなし。
ＩＩ．ＩｇＧバイオコンジュゲート：ＩｇＧアイソタイプ対照バイオコンジュゲートとインキュベートしたＨＴ‐２９を含む血液。
ＩＩＩ．ＥｐＣＡＭバイオコンジュゲート：抗ＥｐＣＡＭバイオコンジュゲートとインキュベートしたＨｔ‐２９を含む血液。
【０２２５】
群に応じて、バイオコンジュゲートを加え、オービタルシェーカーで２分間インキュベートした。次に、血液サンプルをカラムマグネットシステム（ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）にかけた。これらは、外部磁石の存在下で強力な磁場を生成する最適化されたマトリックスに「磁気標識された」腫瘍細胞を保持することにより、それらの分離を可能にするカラムである。フロースルー画分を収集し、蛍光活性化細胞スキャン（ＦＡＣＳ）及び分析用に準備した。
【０２２６】
ＦＡＣＳ分析とデータ処理
例１参照。
実験日：１８．１０．２０１７
処置前の血中細胞数（血中ＨＴ‐２９）：８１４０
除去効率：７９．２８％
実験日：１９．１０．２０１７
処置前の血中細胞数（血中ＨＴ‐２９）：９２３０
除去効率：３４．９５％
平均除去効率：５７．１２％
【０２２７】
例１１
ターゲット材料：十分な速さの分離と良好な性能に関して、防汚性が高すぎるＣ／Ｃｏ。日付：１７．８．２０１７、最終サンプル番号：ＴＺ６７７
Ａ．合成
ステップ１：ナノ粒子。内部サンプル識別：ＴＺ６５４、合成日：０７．０８．２０１７、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＯＨ
１０ｇの炭素コーティングされたコバルトナノ粒子（Ｃ／Ｃｏ）は、４００ｍＬ  Ｈ２Ｏ（蒸留）に超音波処理浴を使用して分散される。（１０分、Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）。１．２ｇ（８．７６ｍｍｏｌ）の４‐アミノフェネチルアルコールを３０ｍＬのＨ２Ｏ（蒸留）と混合し、１０ｍＬの塩酸（ＨＣｌ濃度／３７％発煙）を加えて溶解する。溶解した４‐アミノフェニルアルコールを分散粒子に加え、さらに５分間超音波処理により分散させる。
【０２２８】
１．２ｇの亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２、１７．４ミリモル）を１０ｍＬのＨ２Ｏ（蒸留）に溶解し、氷浴で冷却する。亜硝酸ナトリウム溶液を、磁性ナノ粒子と、溶解した４‐アミノフェネチルアルコールの混合物に滴加する。窒素ガス（Ｎ２）の瞬間的な発生が観察できる。
【０２２９】
２時間の間、混合物は超音波処理しながら反応する
調製したままのナノ粒子を蒸留水（Ｈ２Ｏ（蒸留）（３ｘ１００ｍＬ））、ＥｔＯＨ（３ｘ１００ｍＬ）及びアセトン（３ｘ１００ｍＬ）で磁気デカンテーションにより洗浄する。ナノ粒子は、超音波浴に３分間分散され、永久磁石（磁気デカンテーション）の適用によって分離される。ナノ粒子を真空オーブンで５０℃で一晩乾燥させる。
【０２３０】
ステップ２：ナノ粒子。内部サンプル識別：ＴＺ６５８、合成日０８．０８．２０１７、サンプル名：
Ｃ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＯ‐Ｎａ＋
１０ｇのＣ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＯＨ（ＴＺ６５４）を２０ｍＬのナトリウムメトキシド溶液（乾燥メタノール中２モル）に分散させ、６５℃で一晩撹拌する。
ナノ粒子は、磁気デカンテーションにより乾燥メタノール（８ｘ１０ｍＬ）で洗浄され、真空オーブンで５０℃で一晩乾燥される。
【０２３１】
ステップ３：ナノ粒子。内部サンプル識別：ＴＺ６７３、合成日１７．０８．２０１７、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ＠ポリグリシジン
５００ｍｇ  Ｃ／Ｃｏ‐ＰｈＥｔＯ‐Ｎａ＋（ＴＺ６５８）を超音波浴（Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）で２時間分散させる。窒素をバブリングすることにより、混合物を３０分間脱気する。還流冷却器を設置し、マグネチックスターラーを追加した後、混合物を不活性条件下で１４０℃まで加熱した。混合物が１４０℃に達したら、２０ｍＬの蒸留した（＋／−）‐グリシドール（＋／−‐オキシラン‐２‐イルメタノール）をシリンジポンプでゆっくりと加え（１．３ミリリットル／時）、１６時間反応させる。反応完了後、混合物を室温まで冷却し、ナノ粒子をトルエン（未反応のモノマーを溶解）、メタノール、水（Ｈ２Ｏ（蒸留））（遊離ポリマー鎖を溶解）で洗浄する。水による洗浄プロセスは、（遊離ポリマーによる）泡の発生が観察されなくなるまで繰り返される。
【０２３２】
ステップ４：ナノ粒子。内部サンプル識別：ＴＺ６７７、合成日２２．０８．２０１７、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ＠ポリグリシジル‐ＣＯＯＨ
３００ｍｇのＣ／Ｃｏ＠ポリグリシジン（ＴＺ６７３）を１５ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；乾燥）に分散させる。無水コハク酸１５０ｍｇ（１．３ｍｍｏｌ）を追加する。室温で超音波処理をさらに１０分行った後、１８０ｍｇのＮ、Ｎ‐ジメチルピリジン‐４‐アミン（ＤＭＡＰ、１．５ｍｍｏｌ）と１．５ｍＬのトリエチルアミン（ＴＥＡ、１０．８ｍｍｏｌ）を加える。混合物を窒素に３０分間バブリングすることにより脱気した。反応物を７０℃まで一晩加熱し、不活性条件下に保つ。
【０２３３】
ステップ５：バイオコンジュゲート：内部サンプル識別：ＡＨ１７１０１６ａ＿３、合成日１６．１０．２０１７、サンプル名：Ｃ／Ｃｏ＠ポリグリシジイル‐ＣＯＯ‐ＥｐＣＡＭ
室温で平衡化した後、１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ‐ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ‐ＮＨＳ）を活性化バッファー（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）に溶解し、４ｍｇ／ｍＬ及び２ｍｇ／ｍＬの濃度で２つの別々のエッペンドルフチューブにそれぞれ入れた。両方の溶液を１０秒間ボルテックスした。１．５ｍＬエッペンドルフチューブ（以降、反応容器と呼ぶ）に、１００μＬの活性化バッファーを分注した。超音波処理浴（Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）で分散した後、Ｃ／Ｃｏ＠ポリグリシジル‐ＣＯＯＨナノ粒子（活性化バッファーに５ｍｇ／ｍＬ）の溶液２００μＬを反応容器に加えた。ナノ粒子の活性化は、ＥＤＣ溶液とスルホＮＨＳ溶液を１：１の比率で混合して１００μＬの体積にし、そのうち１０μＬを反応容器に加えることにより行った。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、１２００ｒｐｍで攪拌しながら、反応容器をＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒに２５℃で１０分間置いた。１００μＬの抗体溶液（抗ＥｐＣＡＭ又は非特異的ＩｇＧ；１ｍｇ／ｍＬ）を反応容器に加えた。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、１２００ｒｐｍで攪拌しながら、反応容器を２５℃で４時間ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒに戻した。反応は、１０μＬのクエンチングバッファー（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）を加えて停止した。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、反応物を１２００ｒｐｍで攪拌しながら、２５℃で３０分間ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒに戻した。反応容器を予冷したＳｕｐｅｒＭａｇセパレーター（ＯｃｅａｎＮａｎｏｔｅｃｈ）に入れ、磁石を４℃で１．５時間置き、上澄みを捨て、４２０μＬの新しい予冷したＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で置き換えることによりバイオコンジュゲートを洗浄した。１０秒間ボルテックスし、２０秒間超音波処理した後、反応容器を４℃のＳｕｐｅｒＭａｇセパレーターに戻した。洗浄手順を３回繰り返した。次に、この溶液を３０μＬに等分し、−２０℃で一晩保存した。
【０２３４】
Ｂ．分析
ステップ１：Ｃ／ＣｏＰｈＥｔＯＨ（ＴＺ６５４）
元素微量分析：
［Ｃ］＝９．３４％、［Ｈ］＝０．４％、［Ｎ］＝０．２４％、［Ｓ］＝０％
【０２３５】
ステップ２：Ｃ／ＣｏＰｈＥｔＯ‐Ｎａ＋（ＴＺ６５８）
元素微量分析：
［Ｃ］＝未測定、［Ｈ］＝未測定、［Ｎ］＝未測定、［Ｓ］＝未測定
ΔＣ＝、ΔＨ＝、ΔＮ＝、ΔＳ＝
【０２３６】
ステップ３：Ｃ／Ｃｏ＠ポリグリシジン（ＴＺ６７３）
元素微量分析：
［Ｃ］＝３４．０７％、［Ｈ］＝５．３５％、［Ｎ］＝０．０４％、［Ｓ］＝０％
ΔＣ＝２４．７３％＝２０．６１ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＨ＝４．９５％、ΔＮ＝−０．２％、ΔＳ＝０％
ポリグリシドールの計算量：６．８７ｍｍｏｌ／ｇナノ粒子。
計算された平均鎖長：スターターあたり６９単位。
【０２３７】
ステップ４：Ｃ／Ｃｏ＠ポリグリシジル‐ＣＯＯＨ（ＴＺ６７７）
元素微量分析：
［Ｃ］＝３６．７２％、［Ｈ］＝４．６％、［Ｎ］＝０．４９％、［Ｓ］＝０％；
ΔＣ＝２．６５％＝２．２１ｍｍｏｌ／ｇ、ΔＨ＝−０．７５％、ΔＮ＝０．４５％、ΔＳ＝０％
カルボキシ官能基の計算量：０．５５ｍｍｏｌ／ｇ
カルボキシ官能基の計算数：スターターあたり６単位。
【０２３８】
Ｄ．  ＣＴＣの除去
実験のための細胞株、血液、ナノ粒子の調製及びＨＴ‐２９細胞の調製
例１参照。
【０２３９】
実験的アプローチ
各実験で、血液量１０００μＬに０．５ｘ１０６細胞を添加した。３つの実験群が設計された。
Ｉ．対照：ＨＴ‐２９細胞を含む血液、バイオコンジュゲートとのインキュベーションなし。
ＩＩ．ＩｇＧバイオコンジュゲート：ＩｇＧアイソタイプ対照バイオコンジュゲートとインキュベートしたＨＴ‐２９を含む血液。
ＩＩＩ．ＥｐＣＡＭバイオコンジュゲート：抗ＥｐＣＡＭバイオコンジュゲートとインキュベートしたＨＴ‐２９を含む血液。
【０２４０】
群に応じて、バイオコンジュゲートを加え、オービタルシェーカーで２分間インキュベートした。次に、血液サンプルをカラムマグネットシステム（ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）にかけた。これらは、外部磁石の存在下で強力な磁場を生成する最適化されたマトリックスに「磁気標識された」腫瘍細胞を保持することにより、それらの分離を可能にするカラムである。フロースルー画分を収集し、蛍光活性化細胞スキャン（ＦＡＣＳ）及び分析用に準備した。
【０２４１】
ＦＡＣＳ分析とデータ処理
例１参照。
実験日：１８．１０．２０１７
処置前の血中細胞数（血中ＨＴ‐２９）：８１４０
除去効率：６８．７１％
実験日：１８．１０．２０１７
処置前の血中細胞数（血中ＨＴ‐２９）：８１４０
除去効率：９８．０７％
平均除去効率：８３．３９％
【０２４２】
例１２：分散安定性
ナノ粒子の溶液（例１及び４から）は、ＰＢＳで２ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。４ｍＬの溶液を５ｍＬガラスバイアルに移した。バイアルを超音波浴（Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｒｅｘ  Ｄｉｇｉｔｅｃ、ＤＴ  １０３  Ｈ）に１０分間置いた。永久磁石（１．３Ｔ、Ｗｅｂｃｒａｆｔ  ＡＧ）の各側にガラスバイアルを１つ置くことで分離を開始した。２つのＣＭＯＳセンサーを使用して分離を記録した（センサー１：１２  ＭＰ、１．２５μｍ、ｆ／２．２；センサー２：１２  ＭＰ、１．０μｍ、ｆ／２．６；  Ｘｉａｏｍｉ  Ａ１、Ｘｉａｏｍｉ  Ｉｎｃ．）。定量化は、画像処理プログラム（ＩｍａｇｅＪ、ＮＩＨ）を使用して行われた。
結果を図４に示す（ｙ軸：分離／％）；ｘ軸時間／ｓ）。点線は、例１（ポリグリシドール）のナノ粒子を示す；実線は、例４（ＳＰＭ）のナノ粒子を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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