(57)【要約】  本発明は、抗原に対する免疫応答の上昇、および／または抗原に対する免疫応答の増強、調節、もしくは強化に使用するための化合物に関する。特にウロリチンの使用。本発明はまた、ウロリチンを含む免疫増強剤、そのような免疫増強剤を使用する方法、およびそのような免疫増強剤の調製のためのプロセスに関する。本発明はまた、幹細胞機能の調節、例えば幹細胞数の増加、幹細胞再生の促進、および幹細胞分化の促進のための方法におけるウロリチンの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物の対象における（ｉ）抗原に対する免疫応答の上昇、および／または（ｉｉ）抗原に対する免疫応答の増強、調節、もしくは強化に使用するための、式（Ｉ）
【化１】
2021522296.tif 000012
（式中、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺは、それぞれ独立して、ＨおよびＯＨから選択される）
の化合物またはその塩。
【請求項２】
ヒトまたは動物の対象における免疫機能および／または免疫の健康を改善する方法で使用するための、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】
前記免疫応答が、前記ヒトまたは動物の対象のワクチン接種に対する応答である、請求項１に記載の使用のための化合物。
【請求項４】
増強された免疫応答が、抗体セロコンバージョンの改善を含む、請求項１または請求項３に記載の使用のための化合物。
【請求項５】
前記増強された免疫応答が、免疫細胞の応答の改善を含む、請求項１または３または４のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項６】
前記免疫細胞が、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＢ細胞の１つ以上から選択される、請求項５に記載の使用のための化合物。
【請求項７】
前記ワクチン接種が、病原性細菌または病原性ウイルスまたは癌に対するものである、請求項３から５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
前記ワクチン接種が、インフルエンザ、水痘、ジフテリア、髄膜炎菌、はしか、おたふく風邪、百日咳、肺炎球菌、ポリオ、風疹、破傷風、結核、腸チフスおよび／または黄熱に対するものである、請求項７に記載の使用のための化合物。
【請求項９】
前記ワクチン接種が、インフルエンザに対するものである、請求項８に記載の使用のための化合物。
【請求項１０】
インフルエンザウイルス株が、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２およびＢから選択される、請求項９に記載の使用のための化合物。
【請求項１１】
ワクチンが、弱毒化ウイルスを含む、請求項３から１０のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１２】
前記ワクチン接種の前記対象が、高齢者または子供である、請求項３から１１のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１３】
前記高齢者が、６０歳以上である、請求項１２に記載の使用のための化合物。
【請求項１４】
前記対象が、免疫不全状態である、請求項２から１３のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１５】
前記免疫不全状態の対象が、ＨＩＶ、肝炎および結核に感染しているか、または感染のリスクがある、請求項１４に記載の使用のための化合物。
【請求項１６】
（ｉ）式（Ｉ）
【化２】
2021522296.tif 000013
（式中、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺは、それぞれ独立して、ＨおよびＯＨから選択される）の化合物またはその塩；ならびに
（ｉｉ）１つ以上の追加の免疫増強剤成分を含む、免疫増強剤。
【請求項１７】
Ａ、Ｃ、ＤおよびＺがＨおよびＯＨから独立して選択され、Ｂ、Ｗ、ＸおよびＹが全てＨである式（ｉ）の化合物を含む、請求項１６に記載の免疫増強剤。
【請求項１８】
前記式（Ｉ）の化合物が、ウロリチンＡ、ウロリチンＢ、ウロリチンＣおよびウロリチンＤから選択される、請求項１７に記載の免疫増強剤。
【請求項１９】
前記式（Ｉ）の化合物が、ウロリチンＡである、請求項１７に記載の免疫増強剤。
【請求項２０】
請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物を１つ以上の追加の免疫増強剤成分と混合することを含む、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の免疫増強剤を調製するためのプロセス。
【請求項２１】
（ｉ）請求項１に定義された式（Ｉ）の化合物と、
（ｉｉ）１つ以上の追加の免疫増強剤成分と、
（ｉｉｉ）任意選択でワクチンとを含むキット。
【請求項２２】
（ｉ）請求項１に定義された式（Ｉ）の化合物と、
（ｉｉ）ワクチンと、
（ｉｉｉ）任意選択で１つ以上の追加の免疫増強剤成分とを含むキット。
【請求項２３】
ヒトまたは動物の対象における（ｉ）抗原に対する免疫応答の上昇、および／または（ｉｉ）抗原に対する免疫応答の増強、調節、もしくは強化の方法であって、式（Ｉ）
【化３】
2021522296.tif 000014
（式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺは、それぞれ独立して、ＨおよびＯＨから選択される）
の化合物またはその塩を、ヒトまたは動物の対象に投与することを含む方法。
【請求項２４】
ａ）免疫増強剤としてウロリチンを投与することと、
ｂ）ワクチンを投与することとを含む、ワクチン接種の方法。
【請求項２５】
幹細胞機能を調節する方法で使用するための、式（Ｉ）
【化４】
2021522296.tif 000015
（式中、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺは、それぞれ独立して、ＨおよびＯＨから選択される）
の化合物またはその塩。
【請求項２６】
幹機能の調節が、幹細胞数の増加および／または幹細胞再生の促進である、請求項２５に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項２７】
前記幹細胞機能の調節が、例えば加齢中の幹細胞の老化の予防、低減、または遅延である、請求項２５に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項２８】
前記幹細胞機能の調節が、加齢に伴う炎症の予防、低減または遅延である、請求項２５に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項２９】
前記幹細胞機能の調節が、幹細胞分化の促進である、請求項２５に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３０】
前記幹細胞が、以下の細胞：多能性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、胚性幹細胞、および成体幹細胞の１つ以上から選択される、請求項２５から２９のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３１】
前記幹細胞が、以下の細胞：造血幹細胞、筋幹細胞、皮膚幹細胞、肝臓幹細胞、神経幹細胞、メラノサイト幹細胞、毛包幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、辺縁幹細胞（角膜幹細胞）、心臓幹細胞、腸幹細胞、上皮幹細胞、自己幹細胞および同種幹細胞の１つ以上から選択される、請求項２５から２９のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３２】
前記幹細胞が、ＣＤ３４陰性造血幹細胞およびＣＤ３４陽性造血幹細胞から選択される、請求項２５から２９のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３３】
前記幹細胞機能の調節が、
（ｉ）筋幹細胞の増殖の促進、例えば、筋幹細胞増殖のｅｘ−ｖｉｖｏ法；
（ｉｉ）筋幹細胞の再生能力の促進；
（ｉｉｉ）毛包幹細胞の再生の促進；
（ｉｖ）毛包幹細胞の分化の促進；
（ｖ）膵島におけるベータ細胞の更新速度低下の予防、阻害、および／もしくは逆転；
（ｖｉ）内耳毛前駆細胞の増殖の促進；ならびに／または
（ｖｉｉ）加齢中の嗅覚低下の予防、逆転もしくは遅延の１つ以上から選択される、請求項２５に記載の式（Ｉ）の化合物
【請求項３４】
機能的造血幹細胞の数を増加させる方法で使用するための、例えば
（ｉ）ドナーにおける処置および／または骨髄採取の前；
（ｉｉ）照射後および／または骨髄移植後の処置；
（ｉｉｉ）化学療法処置の細胞傷害効果の処置；
（ｉｖ）化学療法処置の結果としての骨髄抑制の処置および／または予防で使用するための、請求項２５に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３５】
貧血を処置または予防する方法で使用するための、請求項２５に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３６】
（ｉ）体毛の喪失および／もしくは禿頭症を予防、阻害、もしくは遅延させる、（ｉｉ）発毛を促進および／もしくは改善する；ならびに／または（ｉｉｉ）移植後の発毛を促進および／もしくは改善する方法で使用するための、請求項２５に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項３７】
その後の再生治療のために患者に戻る前に幹細胞のｅｘ−ｖｉｖｏ増殖に使用するための式（Ｉ）の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原に対する免疫応答の上昇、および／または抗原に対する免疫応答の増強、調節、もしくは強化に使用するための化合物に関する。特にウロリチンの使用。本発明はまた、ウロリチンを含む免疫増強剤、そのような免疫増強剤を使用する方法、およびそのような免疫増強剤の調製のためのプロセスに関する。本発明はまた、幹細胞機能の調節、例えば幹細胞数の増加、幹細胞再生の促進、および幹細胞分化の促進のための方法におけるウロリチンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスは、急性の自己解決状態から、狂犬病、はしか、下痢性疾患、肝炎、ポリオ、口唇ヘルペス、ＨＩＶ、エボラ、ジカおよびインフルエンザなどの急性の致命的な疾患に至るまで、幅広いヒト疾患を引き起こす。これらの微細な粒子は、典型的には人と人との接触または汚染された表面への接触によって容易に広がる。体内に入ると、ウイルスは細胞に入り、すばやく繁殖する。効果的な抗ウイルス薬は、多くのヒトウイルス性疾患のほんの一部にしか存在しない。多くの場合、ウイルス性の病気の処置には、体の免疫系が感染を取り除くまで症状を緩和することが含まれる。
【０００３】
インフルエンザは医療サービスに大きな負担をかけ、高齢者、非常に幼い子供、および慢性疾患を有する人々に重大な罹患率および死亡率をもたらす。世界保健機関は、季節性インフルエンザが世界中で毎年２５万〜５０万人の死亡を引き起こしていると推定している。インフルエンザに関連しないウイルス性気道感染症もまた人間によく見られる病気であり、同様に医療サービスに重大な健康上の負担をもたらす［非特許文献１］。
【０００４】
細菌性疾患もまた、重大な健康上の負担をもたらす。疾患の負担が最も高い細菌性疾患の１つは、細菌である結核菌により引き起こされる結核であり、主にサハラ以南のアフリカで年間約２００万人が死亡している。病原性細菌は、連鎖球菌およびシュードモナスなどの細菌によって引き起こされ得る肺炎、ならびに赤痢菌、カンピロバクターおよびサルモネラ菌などの細菌によって引き起こされ得る食品媒介性疾患など、他の世界的に重要な疾患の原因となる。病原性細菌はまた、破傷風、腸チフス、ジフテリア、梅毒およびハンセン病などの感染症を引き起こす。病原性細菌は、発展途上国における高い乳児死亡率の原因でもある。
【０００５】
原因となる病原体の不活化または弱毒化された形態でのワクチン接種は、宿主に細胞性（Ｔ細胞−サイトカインおよび記憶）および体液性（Ｂ細胞−抗体）免疫応答を構築して、病原体への曝露の有害な負荷を相殺する。世界的な予防接種戦略の代表的な例は、インフルエンザワクチンによる予防接種に関連する。毎年、インフルエンザウイルスの様々な株に曝される可能性があり、上気道感染症（インフルエンザ）の発生、また進行した場合には生命を脅かす肺炎さえももたらし、毎年、その年最も流行している株に対するインフルエンザワクチンで免疫される機会がある。研究によると、加齢により免疫機能および健康状態が低下している６５歳以上の高齢者は、インフルエンザ株への曝露に最も敏感であり、強力な免疫系を有する健康な成人集団（１８〜４９歳）の１０％未満に対し、米国の高齢者集団だけで発生率が３０％を超えていることが示されている（非特許文献２）。
【０００６】
インフルエンザワクチン接種は有効であるが、季節による有効率は、使用するワクチンおよびアジュバントの種類、ワクチン接種者の年齢、ならびにその季節の優勢株の毒性に依存するため、効果的とは言えない。米国の全人口の平均では、有効率は１０〜６０％の間で変動し、高齢者はワクチン接種による利益は高いが、免疫機能状態が低いため、平均よりも有効率が低くなっている（非特許文献３および非特許文献４）。
【０００７】
加齢は、免疫老化および加齢に伴う炎症に関連する（非特許文献５；非特許文献６）。加齢による免疫機能および健康の低下に伴い、感染性病原体および疾患の影響を受けるリスクが高まり、高齢者の死亡率および罹患率が高くなる。高齢者人口は、２０３０年までに世界人口の２５％超を占めると予想されており（非特許文献７）、免疫機能の維持またはその低下の予防は、この人口の良好な生活の質を維持するための鍵である。さらに、免疫機能の低下は、インフルエンザなどの疾患を発症するリスクが最も高い集団でのワクチン接種に応答する効率の低下につながる。
【０００８】
加齢は、生物の自己複製幹細胞の加齢および幹細胞数の減少に一部起因していると考えられている。この幹細胞の加齢は、ＤＮＡ損傷などの内因性イベント、および幹細胞ニッチまたは幹細胞を支援する保護された環境の変化などの外因性イベントが原因であると考えられている。様々なニッチが年齢と共に低下することが示されており、したがって静止状態の幹細胞集団に対する加齢の有意な影響がない場合でも、幹細胞の機能性は、幹細胞およびその子孫の機能を調整する局所的ニッチからの信号の低下に起因して影響され得る。
【０００９】
幹細胞機能の低下は、自己複製および分化した子孫の生成のコア幹細胞特性の根底にある一般的な分子プロセスの低下を指す（非特許文献８）。幹細胞機能、自己複製および幹細胞数のこの低下は、虚弱、アテローム性動脈硬化症、２型糖尿病などの加齢関連状態に影響すると考えられている（非特許文献９）。幹細胞における加齢の役割は、造血系で最もよく研究されており、幹細胞はほぼ均一に単離され得、それらの機能は検証済みのアッセイを使用して研究され得る。
【００１０】
造血系は、血液中に見られる全ての細胞成分で構成される（図１Ａ）。造血系の細胞は一定の更新を必要とし、約１０１１〜１０１２の新しい血液細胞が平均的なヒトにおける定常状態細胞レベルを維持するために毎日産生されることが必要である。これらの細胞の産生は、造血系の器官、脾臓および骨髄で生じ、全ての異なる系統は多能性前駆細胞（ＭＰＰ）から得られる。血球系を維持する多能性前駆細胞（ＭＰＰ）の集団は、それ自体が造血幹細胞（ＨＳＣ）によって維持される（図１Ｂ）。これらの細胞は、細胞表面での様々なタンパク質の発現によって識別され得る。図１Ｂに示されるように、ＨＳＣおよび様々なＭＰＰ前駆細胞型は、細胞表面タンパク質の様々な組み合わせを有し、これらの細胞表面タンパク質に対する様々な抗体を使用することで、これらの様々な細胞が識別および分離され得る。ＨＳＣは、循環頻度が低く、より定期的に循環するＭＰＰ集団を維持することができる幹細胞である。ＨＳＣ集団の低頻度の循環は、これらの細胞をＤＮＡ損傷から保護し、生物の寿命の間それらを維持するのに役立つ。それらの枯渇およびそれを支えるＨＳＣニッチの劣化は、加齢において重要であると考えられている。
【００１１】
骨髄移植では、宿主の血球系を再構成するために使用されるドナーＨＳＣの年齢が、移植の成功に重要な役割を果たす。加齢ＨＳＣは、骨髄を生着および再構成する能力が損なわれていることが示されている（非特許文献１０）。
【００１２】
加齢の間の免疫反応の欠陥は、一般に、特に免疫系が不足している集団、例えば高齢者および免疫系がまだ発達中の子供などにおいて、新しい免疫増強剤が高レベルで必要とされていることを示す。本特許の主題である式（Ｉ）の化合物は、そのような免疫増強剤として役立ち得る。
【００１３】
ウロリチンは天然の腸内代謝物であり、ザクロ、ベリーおよびクルミなどのある特定の果物およびナッツに大量に見られる食物前駆体（エラジタンニンなど）にさらされると、宿主の腸内細菌叢により生成される。腸内でのウロリチン産生は、大きなヒト個体間変動を示し、これは結腸微生物叢の違いと関連している［非特許文献１１］。いくつかの研究は、これらのポリフェノールが豊富な果物の消費による健康上の利点を示しているが、おそらくはその生物学的効力に大きく影響する異なる代謝物プロファイルをもたらす個人間の腸内細菌叢の大きな変動のために、これらの研究間の結果は一貫していない。これは、最適な食事介入を設計する上で別の大きな課題を提起し、ポリフェノールが豊富な果物の消費の健康面を調査する研究の解釈を制限する。［例えば、非特許文献１２および非特許文献１３を参照されたい］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｆｅｎｄｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ  （２００３）  Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１６３（４），  ４８７−９４
【非特許文献２】ＣＤＣ、２０１１〜２０１２  ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｍｍｗｒ／ｐｒｅｖｉｅｗ／ｍｍｗｒｈｔｍｌ／ｍｍ６１２２ａ４．ｈｔｍ
【非特許文献３】Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００７  Ｏｃｔ  ４；  ３５７（１４）：１３７３−８１
【非特許文献４】Ｉｎｔｅｒｉｍ  Ｅｓｔｉｍａｔｅｓ  ｏｆ  ２０１７−１８  Ｓｅａｓｏｎａｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  −  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１８．ＭＭＷＲ  Ｍｏｒｂ  Ｍｏｒｔａｌ  Ｗｋｌｙ  Ｒｅｐ．  ２０１８  Ｆｅｂ  １６；  ６７（６）：１８０−１８５
【非特許文献５】Ａｇｉｎｇ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｅｓ．２００９  Ｊｕｎ；２１（３）：２０１−９
【非特許文献６】Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８  Ｊａｎ  １０；８：１９６０．  ｄｏｉ：  １０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１７．０１９６０
【非特許文献７】国連経済社会局、人口課（２０１５）．Ｗｏｒｌｄ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ａｇｅｉｎｇ  ２０１５  （ＳＴ／ＥＳＡ／ＳＥＲ．Ａ／３９０）
【非特許文献８】Ｄ．  Ｍｅｌｔｏｎ，  ｉｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ２０１４），  ｐｐ．７−１７
【非特許文献９】Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，  ２００７  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００７  Ｓｅｐ；  ８（９）：７０３−１３
【非特許文献１０】Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１５  Ｆｅｂ；４（２）：１８６−９４
【非特許文献１１】Ｇａｒｃｉａ−Ｖｉｌｌａｌｂａ  ｅｔ  ａｌ  （２０１３）  Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，  ２０１３，  ６１，  ８７９７−８８０６
【非特許文献１２】Ｔｏｍａｓ−Ｂａｒｂｅｒａｎ  ＦＡ  ｅｔ  ａｌ  （２０１４）  Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．６２（２８）：６５３５−８
【非特許文献１３】Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｓａｒｒｉａｓ  ｅｔ  ａｌ  （２０１７）  Ｍｏｌ  Ｎｕｔｒ  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．６１（５）．  ｄｏｉ：  １０．１００２／ｍｎｆｒ．２０１６００８３０
【発明の概要】
【００１５】
本発明の第１の態様によれば、ヒトまたは動物の対象における（ｉ）抗原に対する免疫応答の上昇、および／または（ｉｉ）抗原に対する免疫応答の増強、調節、もしくは強化に使用するための、式（Ｉ）
【化１】
2021522296.tif 000002
（式中、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺは、それぞれ独立して、ＨおよびＯＨから選択される）
の化合物またはその塩が提供される。
【００１６】
ウロリチンＡなどのウロリチンは、驚くべきことに、免疫細胞および抗体（体液性）応答を改善することにより免疫機能および健康を増進すると考えられている。ウロリチンＡなどのウロリチンは、免疫系の最適な機能を維持し、追加の介入としてワクチン接種前に特に高齢者または子供などの感受性の高い集団で現在のワクチンの有効性を実質的医増進するために使用され得る。
【００１７】
本発明のさらなる態様によれば、（ｉ）抗原に対する免疫応答の上昇、および／または（ｉｉ）抗原に対する免疫応答の増強、調節、もしくは強化のための医薬の製造における、式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
【００１８】
本発明のさらなる態様によれば、ヒトまたは動物の対象における（ｉ）抗原に対する免疫応答の上昇、および／または（ｉｉ）抗原に対する免疫応答の増強、調節、もしくは強化の方法であって、有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することを含む方法が提供される。
【００１９】
本発明のさらなる態様によれば、ヒトまたは動物の対象における（ｉ）抗原に対する免疫応答の上昇、および／または（ｉｉ）抗原に対する免疫応答の増強、調節、もしくは強化の方法であって、免疫増強剤としての有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することを含む方法が提供される。
【００２０】
本発明のさらなる態様によれば、ヒトまたは動物の対象における免疫機能および／または免疫の健康を改善する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００２１】
本発明のさらなる態様によれば、免疫増強剤として投与された場合にヒトまたは動物の対象における免疫機能および／または免疫の健康を改善する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００２２】
本発明のさらなる態様によれば、ヒトまたは動物の対象における免疫機能および／または免疫の健康を改善する方法で使用するための医薬の製造における、式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
【００２３】
本発明のさらなる態様によれば、有効量の式（Ｉ）の化合物の投与を含む、免疫機能および／または免疫の健康を改善する方法が提供される。
【００２４】
本発明のさらなる態様によれば、免疫系を増進するための方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００２５】
本発明のさらなる態様によれば、免疫系を増進するための医薬の製造における式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
【００２６】
本発明のさらなる態様によれば、有効量の式（Ｉ）の化合物の投与を含む免疫系を増進する方法が提供される。
【００２７】
本発明のさらなる態様によれば、免疫系を調節するための方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００２８】
本発明のさらなる態様によれば、免疫系を調節するための医薬の製造における式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
【００２９】
本発明のさらなる態様によれば、有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することを含む免疫系を調節する方法が提供される。
【００３０】
一実施形態において、免疫系を調節することは、免疫応答を増強することを含む。別の実施形態において、免疫系を調節することは、炎症反応を調節することを含む。さらなる実施形態において、免疫応答を調節することは、免疫応答を増強すること、および炎症反応を調節することを含む。
【００３１】
本発明のさらなる態様によれば、ヒトまたは動物の対象における免疫不全を処置する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００３２】
本発明のさらなる態様によれば、ヒトまたは動物の対象における免疫不全を処置する方法で使用するための医薬の製造における式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
【００３３】
本発明のさらなる態様によれば、有効量の式（Ｉ）の化合物をヒトまたは動物の対象に投与することを含む、免疫機能および／または免疫の健康を改善する方法が提供される。
【００３４】
加齢に伴う炎症は、加齢および加齢に関連する疾患の発生率に影響し、炎症誘発性状態の慢性的な進行性の増加である。炎症は、病原体感染または様々な種類の組織損傷に直面している宿主系によって引き起こされる一連の複雑な応答イベントである。一般的な状態では、感染および組織損傷の炎症誘発性因子が排除されると炎症反応が消失し、次いで、炎症の解消と呼ばれる、非常に活発でよく調整されたバランスの取れた状態に変化する。しかしながら、加齢の間などの一部の状況では、炎症は抗感染および組織損傷修復の定常状態に移行できず、代わりに炎症は継続し、非解消性の炎症状態に移行する。
【００３５】
本発明のさらなる態様によれば、ヒトまたは動物の対象における加齢に伴う炎症を処置する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。本発明のさらなる態様によれば、ヒトまたは動物の対象における加齢に伴う炎症を予防、低減、または遅延させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００３６】
本発明のさらなる態様によれば、加齢に伴う炎症を処置する方法における式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。本発明のさらなる態様によれば、加齢に伴う炎症を予防、低減、または遅延させる方法における式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００３７】
本発明のさらなる態様によれば、有効量の式（Ｉ）の化合物をヒトまたは動物の対象に投与することを含む、加齢に伴う炎症を処置する方法が提供される。本発明のさらなる態様によれば、有効量の式（Ｉ）の化合物をヒトまたは動物の対象に投与することを含む、加齢に伴う炎症を予防、低減、または遅延させる方法が提供される。
【００３８】
インターロイキン１２（ＩＬ１２）に対するインターロイキン１０（ＩＬ１０）の比率を測定することは、細胞の炎症性表現型の有用な評価基準であり、より高いＩＬ１０／ＩＬ１２比率は、より抗炎症性の表現型を示す。したがって、本発明のさらなる態様によれば、式（Ｉ）の化合物を使用してＩＬ１０／ＩＬ１２比を増加させる方法が提供される。
【００３９】
本発明の化合物はまた、ベーチェット病などの炎症性障害の処置に有用であると考えられている。したがって、本発明のさらなる態様によれば、ベーチェット病を処置する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００４０】
本発明のさらなる態様によれば、ヒトまたは動物の対象における免疫老化を処置する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００４１】
本発明のさらなる態様によれば、免疫老化を処置する方法における式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
【００４２】
本発明のさらなる態様によれば、有効量の式（Ｉ）の化合物をヒトまたは動物の対象に投与することを含む、免疫老化を処置する方法が提供される。
【００４３】
本発明のさらなる態様によれば、ヒトまたは動物の対象における幹細胞の老化を予防、低減、または遅延させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００４４】
本発明のさらなる態様によれば、幹細胞の老化を予防、低減、または遅延させる方法における式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
【００４５】
本発明のさらなる態様によれば、有効量の式（Ｉ）の化合物をヒトまたは動物の対象に投与することを含む、幹細胞の老化を予防、低減、または遅延させる方法が提供される。
【００４６】
免疫老化は、免疫系の細胞に分化する造血幹細胞の老化に起因し得、したがって、本発明のさらなる態様によれば、人間または動物の対象における幹細胞の加齢、特に造血幹細胞の加齢を処置する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００４７】
本発明のさらなる態様によれば、ヒトまたは動物対象における幹細胞の加齢、特に造血幹細胞の加齢を処置する方法で使用するための医薬の製造における式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
【００４８】
本発明のさらなる態様によれば、有効量の式（Ｉ）の化合物をヒトまたは動物の対象に投与することを含む、幹細胞の加齢、特に造血幹細胞の加齢を処置する方法が提供される。
【００４９】
本発明のさらなる態様によれば、ＣＤ３４陰性造血幹細胞の数を増加させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００５０】
本発明のさらなる態様によれば、ＣＤ３４陰性造血幹細胞およびＣＤ３４陽性、ＣＤ４８陰性造血前駆細胞の数を増加させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００５１】
本発明のさらなる態様によれば、ＣＤ３４陽性造血前駆細胞の数を増加させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００５２】
本発明のさらなる態様によれば、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４８陰性造血前駆細胞の数を増加させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００５３】
本発明のさらなる態様によれば、ＣＤ４８陽性造血前駆細胞の数を増加させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００５４】
本発明のさらなる態様によれば、ＣＤ４８陽性、ＣＤ１５０陽性造血前駆細胞の数を増加させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００５５】
本発明のさらなる態様によれば、ＣＤ１５０陰性造血前駆細胞の数を増加させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００５６】
本発明のさらなる態様によれば、ＣＤ１５０陰性、ＣＤ１３５陰性造血前駆細胞の数を増加させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００５７】
本発明のさらなる態様によれば、ＣＤ１３５陽性造血前駆細胞の数を増加させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００５８】
本発明のさらなる態様によれば、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４８陽性造血前駆細胞の数を増加させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００５９】
本発明のさらなる態様によれば、ＣＤ４８陽性、ＣＤ１５０陰性造血前駆細胞の数を増加させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００６０】
式（Ｉ）の化合物は、造血幹細胞に加えて、幹細胞自体に影響を与えると考えられている。したがって、本発明のさらなる態様によれば、幹細胞機能を調節する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。幹細胞機能の調節は、
（ｉ）幹細胞の再生の促進；
（ｉｉ）幹細胞数の増加の促進；
（ｉｉｉ）幹細胞の加齢の予防、逆転、もしくは遅延；
（ｉｖ）幹細胞の老化の予防、逆転、もしくは遅延；および／または
（ｖ）幹細胞の分化の促進を含む。
【００６１】
本発明のさらなる態様によれば、インビボ、インビトロ、またはエクスビボのいずれかで、幹細胞の数を増加させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００６２】
本発明のさらなる態様によれば、その後の再生治療のために患者に戻る前に、幹細胞のエクスビボ増殖において使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００６３】
本発明のさらなる態様によれば、エクスビボでの幹細胞の増殖に続いて産生される細胞が提供される。
【００６４】
幹細胞の例には、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、胚性幹細胞、および成体幹細胞が含まれる。幹細胞のさらなる例には、造血幹細胞、筋幹細胞、皮膚幹細胞、肝臓幹細胞、神経幹細胞、メラノサイト幹細胞、毛包幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、辺縁幹細胞（角膜幹細胞）、心臓幹細胞、腸幹細胞、上皮幹細胞、自己幹細胞および同種幹細胞が含まれる。
【００６５】
本発明のさらなる態様によれば、
−幹細胞の再生を支援する方法；
−幹細胞の再生の最適化を補助する方法；
−幹細胞の再生を促進する方法；
−幹細胞の再生を刺激する方法；
−幹細胞機能を支援する方法；
−幹細胞機能の最適化を補助する方法；および／または
−幹細胞機能を促進する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００６６】
本発明のさらなる態様によれば、
−幹細胞の再生を支援する方法；
−幹細胞の再生の最適化を補助する方法；
−幹細胞の再生を促進する方法；
−幹細胞を増進する方法；および／または
−幹細胞の数を増加させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００６７】
本発明のさらなる態様によれば、幹細胞の数を増加させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。一実施形態において、幹細胞の数は、少なくとも約５％、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％増加する。
【００６８】
幹細胞は一般に静止状態にあり、細胞周期で停止して、必要に応じて増殖して新しい幹細胞を生成し、再び増殖する必要があるまで静止状態に戻ることができる。加齢の間、幹細胞は老化状態に入り、細胞周期に再び入ることができなくなる。幹細胞が老化状態になるのを防ぎ、活発で健康な幹細胞集団を維持するために、支援が必要になる場合がある。したがって、本発明のさらなる態様によれば、幹細胞を支持する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。本発明のさらなる態様によれば、幹細胞の老化を予防および／または阻害する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００６９】
加齢造血幹細胞で報告されている変化には、リンパ球に分化する能力の低下、骨髄系細胞に分化する能力の増加、細胞周期阻害剤ｐ１６ＩＮＫａの発現の増加、および造血幹細胞前駆細胞を再増殖させる能力の低下が含まれる。したがって、本発明のさらなる態様によれば、ヒトまたは動物対象における幹細胞の加齢を処置する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供され、処置は、リンパ球に分化する能力を改善すること、骨髄系細胞に分化する能力を低下させること、細胞周期阻害剤であるｐ１６ＩＮＫａの発現を低下させること、および造血幹細胞前駆細胞を再増殖させる能力を改善することのより多くのうちの１つ以上を達成することを含む。
【００７０】
本発明のさらなる態様によれば、ヒトまたは動物対象における幹細胞老化を処置する方法で使用するための薬剤の製造における式（Ｉ）の化合物の使用が提供され、処置は、リンパ球に分化する能力を改善すること、骨髄系細胞に分化する能力低下させること、細胞周期阻害剤であるｐ１６ＩＮＫａの発現を低下させること、および造血幹細胞前駆細胞を再増殖させる能力を改善することのより多くのうちの１つ以上を含む。
【００７１】
本発明のさらなる態様によれば、ヒトまたは動物対象における幹細胞老化を処置する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供され、処置は、リンパ球に分化する能力を改善すること、骨髄系に分化する能力を低下させること、細胞周期阻害剤であるｐ１６ＩＮＫａの発現を低下させること、および造血幹細胞前駆細胞を再増殖させる能力の改善することのより多くのうちの１つ以上を含み、方法は、ヒトまたは動物に有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することを含む。
【００７２】
免疫老化中に観察される変化には、自然免疫系の機能障害、Ｂ細胞の発達障害、胸腺退縮、Ｔ細胞出力の低下、Ｔ細胞多様性の低下も含まれる。したがって、本発明のさらなる態様によれば、ヒトまたは動物の対象における免疫老化を処置する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供され、処置は、自然免疫系の変化を逆転、低減、または停止すること、Ｂ細胞発達の障害を逆転、低減または停止すること、胸腺退縮を逆転、低減または停止すること、Ｔ細胞出力の低減を逆転、低減または停止すること、Ｔ細胞多様性の低減を逆転、低減または停止することを含む。
【００７３】
本発明のさらなる態様によれば、ヒトまたは動物の対象における免疫老化を処置する方法で使用するための薬剤の製造における式（Ｉ）の化合物の使用が提供され、処置は、自然免疫系の変化を逆転、低減、または停止すること、Ｂ細胞発達の障害を逆転、低減または停止すること、胸腺退縮を逆転、低減または停止すること、Ｔ細胞出力の低減を逆転、低減または停止すること、およびＴ細胞多様性の低減を逆転、低減または停止することを含む。
【００７４】
本発明のさらなる態様によれば、ヒトまたは動物対象における免疫老化を処置する方法が提供され、処置は、自然免疫系の変化を逆転、低減または停止すること、Ｂ細胞発達の障害を逆転、低減または停止すること、胸腺退縮を逆転、低減または停止すること、Ｔ細胞出力の低減を逆転、低減または停止すること、およびＴ細胞多様性の低減を逆転、低減または停止することを含み、方法は、有効量の式（Ｉ）の化合物をヒトまたは動物の対象に投与することを含む。
【００７５】
免疫系の１つの重要な役割は、外部感染と戦うことであり、ワクチン接種はこのための重要なツールである。免疫不全状態の対象および高齢の対象では、免疫応答が一般的に低下し、ワクチン接種に対する応答が損なわれ、ワクチン接種の有効性が低下し、対象は一般にインフルエンザにかかりやすくなる。本発明の別の態様によれば、ヒトまたは動物の対象における（ｉ）抗原に対する免疫応答を高める、および／または（ｉｉ）抗原に対する免疫応答を増強、調節、もしくは強化する際に使用するための式（Ｉ）の化合物が提供され、対象は、高齢者または免疫不全状態の対象である。
【００７６】
本発明の別の態様によれば、ヒトまたは動物の対象における（ｉ）抗原に対する免疫応答を高める、および／または（ｉｉ）抗原に対する免疫応答を増強、調節、もしくは強化する際に使用するための式（Ｉ）の化合物が提供され、免疫応答はワクチンに対するものである。
【００７７】
免疫応答はいくつかの成分を含み、式（Ｉ）の化合物はこれらの成分の１つ以上で利益を示すことが期待される。これらには以下が含まれる：
（ｉ）抗体価の改善；
（ｉｉ）例えば、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および／もしくはＢ細胞における免疫細胞の応答の改善、および／または
（ｉｉｉ）サイトカイン応答の改善。
【００７８】
一実施形態において、抗体価の改善は、少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％または２０％、例えば少なくとも２５％または３０％であろう。
【００７９】
さらなる実施形態において、セロコンバージョン率の改善は、５％以上、例えば１０％以上、例えば１５％以上または２０％以上、例えば２５％以上または３０％以上であろう。
【００８０】
別の実施形態において、セロプロテクション率の改善は、５％以上、例えば１０％以上、例えば１５％以上または２０％以上、例えば２５％以上または３０％以上であろう。
【００８１】
別の実施形態において、ピーク抗体価は、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍高いであろう。
【００８２】
本発明のさらなる態様によれば、対象動物におけるワクチン投与に応答して抗体価を増加させる方法において使用するための式（Ｉ）の化合物が提供され、方法は、前記動物を有効量の式（Ｉ）の化合物で処理することを含む。
【００８３】
ワクチン接種は、人間または動物の対象に病気を引き起こす病原性細菌または病原性ウイルスに対して行うことができる。したがって、本発明のさらなる態様によれば、ヒトまたは動物の対象において（ｉ）抗原に対する免疫応答を高めること、および／または（ｉｉ）抗原に対する免疫応答を増強、調節、もしくは強化することにおいて使用するための式（Ｉ）の化合物が提供され、免疫応答は、インフルエンザ、水痘、ジフテリア、髄膜炎菌、はしか、おたふく風邪、百日咳、肺炎球菌、ポリオ、風疹、破傷風、結核、ジカ、エボラ、腸チフスおよび／または黄熱に対するワクチンに対するものである。
【００８４】
本発明のさらなる態様によれば、
ａ）免疫増強剤として式（Ｉ）の化合物を投与することと；
ｂ）ワクチンを投与することとを含むワクチン接種の方法が提供される。
【００８５】
本発明のさらなる態様によれば、
ａ）免疫増強剤としてウロリチンを投与することと；
ｂ）ワクチンを投与することとを含むワクチン接種の方法が提供される。
【００８６】
誤解を避けるために、式（Ｉ）の化合物およびウロリチンは、ワクチンと共にいずれかの順序で投与され得るか、またはそれらが同時に投与され得る。
【００８７】
特に好ましいワクチンは、インフルエンザウイルスに対するものである。インフルエンザウイルスは、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、インフルエンザＣ、およびインフルエンザＤのいくつかの型で生じる。したがって、本発明のさらなる態様によれば、ワクチン接種がインフルエンザＡ、インフルエンザＢ、インフルエンザＣまたはインフルエンザＤに対するものである本発明の方法または使用が提供される。本発明の一態様において、ワクチン接種はインフルエンザＡに対するものである。本発明のさらなる態様において、ワクチン接種はインフルエンザＢに対するものである。
【００８８】
インフルエンザＡは、いくつかの亜種（血清型）として生じる。本発明のさらなる態様において、ワクチン接種がインフルエンザＡに対するものであり、血清型がＨ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７および／またはＨ７Ｎ９、特にＨ１Ｎ１および／またはＨ３Ｎ２である本発明の方法または使用が提供される。
【００８９】
本発明の一態様において、式（Ｉ）の化合物は、本発明の方法または使用においてワクチンと同時に投与される。別の態様において、式（Ｉ）の化合物は、本発明の使用または方法においてワクチンの前に投与され、任意選択でワクチン接種後に投与が継続される。式（Ｉ）の化合物は、ワクチンの数週間または数日前、例えば１〜１２週間前、例えば１〜８週間または１〜４週間前に投与され得る。あるいは、式（１）の化合物は、ワクチン投与の約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、または約６週間前に投与され得る。
【００９０】
ワクチンは、ワクチンが免疫応答を惹起することができる任意の形態で対象に送達され得る。投与経路の例には、非経口、皮下、皮内、経口、鼻腔内、舌下、吸入によるもの、局所、直腸内、口腔内、および膣内が含まれる。したがって、本発明のさらなる態様によれば、ワクチン接種が、非経口、皮下、皮内、経口、鼻腔内、舌下、吸入を介するもの、局所、直腸内、口腔内、および膣内の経路のうちの１つ以上を介して投与される本発明の方法または使用が提供される。
【００９１】
本発明の方法および使用において使用される場合、式（Ｉ）の化合物は、高齢の対象および小児において特に効果的であると考えられている。したがって、本発明のさらなる態様によれば、対象が小児、年配者、または高齢者である本発明の方法または使用が提供される。
【００９２】
年配者は、５０歳超、例えば５５歳超、例えば６０歳超、例えば５０歳〜６５歳であってもよい。
【００９３】
高齢患者は、６５歳超、例えば７０歳超、例えば７５歳超、例えば８０歳超、例えば６５〜８０歳、例えば６５〜９０歳、例えば９０〜１００歳、例えば１００歳超の年齢であってもよい。
【００９４】
小児は、出生から約１８歳まで、例えば、出生から約１歳まで、例えば、出生から約１０歳まで、例えば、出生から４歳〜５歳までの年齢であってもよい。
【００９５】
式（Ｉ）の化合物は、本発明の方法および使用において使用される場合、免疫不全状態の対象、例えば、ＨＩＶ、肝炎および結核に感染した、または感染のリスクがある免疫不全状態の対象において特に有効であると考えられる。したがって、本発明のさらなる態様によれば、対象が免疫不全状態の対象、例えば、ＨＩＶ、肝炎、および／または結核に感染した対象である本発明の方法または使用が提供される。
【００９６】
式（Ｉ）の化合物は、特にワクチン接種に応答して、抗原に対する免疫応答を増強し、したがって、免疫増強剤として作用する。式（Ｉ）の化合物は、免疫応答をさらに増強するために、１つ以上１つ以上の追加の免疫増強剤成分と共に使用することができる。したがって、本発明のさらなる態様によれば、式（Ｉ）の化合物および１つ以上の追加の免疫増強剤成分を含む免疫増強剤組成物が提供される。そのような組成物は、ワクチン接種の前に投与されることを意図した組成物、および式（Ｉ）の化合物が最初に投与され、１つ以上の追加の免疫増強剤成分が一定期間後に投与される組成物を含む。免疫増強剤の投与は、ワクチン接種時に停止するか、またはワクチン接種と同時におよびその後に送達することができる。期間は、数時間から数週間までさまざまである。
【００９７】
式（Ｉ）の化合物は、１つ以上の追加の免疫増強剤成分の有無にかかわらず、ワクチンを用いた処置プロトコルで投与することができる。したがって、本発明のさらなる態様によれば、以下を含む処置プロトコルが提供される。
（ｉ）式（Ｉ）の化合物；
（ｉｉ）ワクチン；および
（ｉｉｉ）任意選択で１つ以上の免疫増強剤成分。
【００９８】
本発明のさらなる態様によれば、ワクチンが、不活化もしくは弱毒化された微生物またはそれに由来するタンパク質もしくはペプチド抗原を含む処置プロトコルが提供される。不活化または弱毒化された微生物は、不活化もしくは弱毒化されたウイルスまたは不活化もしくは弱毒化された細菌から選択される。誤解を避けるために、タンパク質またはペプチド抗原は、活性または弱毒化されていないウイルスまたは細菌に由来してもよい。
【００９９】
処置プロトコルにおいて、式（Ｉ）の化合物は、以下のように、いくつかの方法で投与され得る：
−一次予防：ワクチン接種の前に式（Ｉ）の化合物を与えて、免疫系を刺激／感作し、ワクチン接種の準備を整える；および／または
−二次予防：式（Ｉ）の化合物をワクチン接種／免疫感作（免疫増強剤として−例えば、皮下ワクチン接種を並行して行う錠剤としての経口投与）と共に与え、免疫応答を増進する；および／または
−三次予防：ワクチン接種／インフルエンザの反応が始まった後に式（Ｉ）の化合物を与え、インフルエンザ発症の症状を緩和もしくは管理する。
【０１００】
本発明のさらなる態様によれば、ワクチンは、インフルエンザ、水痘、ジフテリア、髄膜炎菌、はしか、おたふく風邪、百日咳、肺炎球菌、ポリオ、風疹、破傷風、結核、エボラ、腸チフスおよび／もしくは黄熱病の１つ以上から選択される不活化もしくは弱毒化微生物もしくは抗原、またはそれらに由来するタンパク質、サブユニット、もしくはペプチドである。好ましくは、インフルエンザまたはそれに由来するタンパク質、サブユニットもしくはペプチドである。
【０１０１】
機能的な造血幹細胞の数を増加させることは、造血系の全体的な更新に有益であり、免疫機能の改善；照射後または骨髄移植後などの骨髄不全の発生率の低下；および貧血の処置をもたらす。これは、癌（白血病およびリンパ腫など）の処置に使用される化学療法処置の細胞毒性効果からの回復の改善、化学療法処置の結果としての骨髄抑制の処置および／または予防、ならびに骨髄移植の改善および移植関連の死亡率の低下に使用され得る。したがって、本発明のさらなる態様によれば、機能的造血幹細胞の数を増加させる方法で使用するための、例えば、
（ｉ）患者の処置および／もしくはドナーでの骨髄採取の前に；
（ｉｉ）照射後および／もしくは骨髄移植後の処置において；
（ｉｉｉ）化学療法処置の細胞毒性効果の処置において；ならびに／または
（ｉｖ）化学療法処置の結果としての骨髄抑制の処置および／もしくは予防において使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１０２】
本発明のさらなる態様によれば、
（ｉ）患者の処置および／もしくはドナーでの骨髄採取の前に；
（ｉｉ）照射後および／もしくは骨髄移植後の処置において；
（ｉｉｉ）化学療法処置の細胞毒性効果の処置において；ならびに／または
（ｉｖ）化学療法処置の結果としての骨髄抑制の処置および／もしくは予防において使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１０３】
造血幹細胞は、新しい赤血球の供給源でもある。したがって、本発明のさらなる態様によれば、貧血の予防および／または処置に使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１０４】
式（Ｉ）の化合物はまた、例えば癌の処置において、照射により処置されている患者に使用することができる。したがって、本発明のさらなる態様によれば、患者における照射処置中の免疫増強剤としての式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。式（Ｉ）の化合物は、処置中の免疫系への損傷を制限するために、照射前または照射中に免疫系を増強するために使用され得る。あるいは、またはさらには、免疫系の回復を増強するために、照射後に式（Ｉ）の化合物を使用することができる。
【０１０５】
式（Ｉ）の化合物は、その後の移植のために骨髄細胞を採取する前、および／または骨髄の再増殖を増強するために骨髄細胞を患者に移植して戻した後、骨髄細胞移植中の免疫増強剤として使用することができる。式（Ｉ）の化合物は、癌処置のための細胞毒性化学療法などの免疫抑制療法の後に患者に戻る前に、骨髄細胞の増殖においてエクスビボで使用され得る。
【０１０６】
式（Ｉ）の化合物は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、および活性化Ｔ細胞を含む、癌免疫療法に使用される免疫細胞の数および機能を増加させるために、エクスビボまたはインビボで使用され得る。
【０１０７】
式（Ｉ）の化合物は、その後の癌免疫療法のために患者に戻る前に、ＣＡＲ−Ｔ、ＴＣＲ−Ｔまたは他の操作されたＴ細胞の増殖においてエクスビボで使用され得る（Ｋｅｒｓｈａｗ，  Ｍ．  Ｈ．，  Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，  Ｊ．Ａ．，  ＆  Ｄａｒｃｙ，  Ｐ．  Ｋ．  Ｇｅｎｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，  ２０１３）。
【０１０８】
式（Ｉ）の化合物は、軟骨再生のために患者に戻る前に、間葉系幹細胞の数および機能を増加させるためにエクスビボで使用され得る。
【０１０９】
式（Ｉ）の化合物は、皮膚移植のために患者に戻る前に、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、胚性幹細胞、および成体幹細胞のケラチノサイトへの分化を刺激するために使用され得る。
【０１１０】
本発明のさらなる態様によれば、化学療法の細胞毒性効果を予防および／または処置する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。本発明のさらなる態様によれば、骨髄抑制、例えば細胞毒性化学療法後の骨髄抑制を予防および／または処置するための方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１１１】
神経幹細胞（ＮＳＣ）の消耗は、加齢中の嗅覚低下に関与しているとされている。したがって、さらなる態様によれば、嗅覚低下、例えば、加齢中の嗅覚低下を処置する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１１２】
本発明のさらなる態様によれば、内耳毛前駆細胞の増殖を促進する方法における式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１１３】
さらに、ＮＳＣは発作に反応して増殖するように刺激され、ＮＳＣの増殖が脳の損傷またはニューロンの喪失を修復するための神経新生の増加につながることを示唆している。したがって、本発明のさらなる態様によれば、脳の修復を促進する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。本発明のさらなる態様によれば、式（Ｉ）の化合物またはニューロンの喪失を予防、阻害、もしくは遅延させる方法における使用が提供される。本発明のさらなる態様によれば、発作を予防および／または処置する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１１４】
機能的な神経幹細胞の数を増加させると、神経新生が促進され、適応学習などの学習を支援することができる。したがって、本発明のさらなる態様によれば、神経発生を増加させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。本発明のさらなる態様によれば、学習、例えば適応学習を支援する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１１５】
メラノサイト幹細胞機能の低下および／またはメラノサイト幹細胞の数の減少は、加齢中の髪の白髪化に関係している。したがって、本発明のさらなる態様によれば、髪の色の喪失または髪の白髪化、例えば、加齢中の髪の色の喪失または髪の白髪化を予防、阻害または遅延させる方法における、式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１１６】
毛包幹細胞機能の低下および／または毛包幹細胞の数の減少は、体毛の喪失および禿頭症に関与し得る。したがって、本発明のさらなる態様によれば、（ｉ）体毛の喪失および／もしくは禿頭症を予防、阻害、もしくは遅延させる、（ｉｉ）発毛を促進および／もしくは改善する；ならびに／または（ｉｉｉ）移植後の発毛を促進および／もしくは改善する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１１７】
本発明のさらなる態様によれば、毛包幹細胞の再生、および／または毛包幹細胞の更新速度を増加させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１１８】
本発明のさらなる態様によれば、毛包幹細胞の分化の方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１１９】
本発明のさらなる態様によれば、発毛を増加させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。発毛速度は、毛幹の形成速度、または毛幹を形成する活性を有する毛包の形成速度によって測定することができる。いくつかの実施形態において、効果は、毛幹の太さの変化を含み得る。
【０１２０】
本発明のさらなる態様によれば、毛包数を増加させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。一実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、数週間から数か月の期間にわたって、毛包数（または毛包単位）の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％の増加を促進する。例えば、数週間から数か月の期間にわたって、毛包数（または毛包単位）が少なくとも１０％増加する。例えば、数週間から数か月の期間にわたって、毛包数（または毛包単位）が５０％（またはそれ以上）増加する。
【０１２１】
本発明のさらなる態様によれば、脱毛を減少させるための式（Ｉ）の化合物が提供される。一実施形態において、数週間から数か月の期間にわたって、脱毛が少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％減少する。例えば、数週間から数か月の期間にわたって、脱毛が少なくとも１０％減少する。例えば、数週間から数か月の期間にわたって、脱毛が５０％（またはそれ以上）減少する。
【０１２２】
本発明のさらなる態様によれば、毛包幹細胞の成長および／または発毛の増加から利益を得るであろう病状、例えば円形脱毛症、アンドロゲン性脱毛症、男性型脱毛症および化学療法誘発性脱毛症で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１２３】
本発明のさらなる態様によれば、男性型脱毛症を処置する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１２４】
本発明のさらなる態様によれば、脱毛症を処置する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１２５】
本発明のさらなる態様によれば、既存の毛髪を改善するための式（Ｉ）の化合物が提供される。既存の毛髪を改善することは、毛髪の太さを増やすことを含む。
【０１２６】
本発明のさらなる態様によれば、（ｉ）体毛の喪失および／もしくは禿頭症を予防、阻害、もしくは遅延させるため；（ｉｉ）発毛を促進および／もしくは改善するため；ならびに／または（ｉｉｉ）移植後の発毛を促進および／もしくは改善するための、式（Ｉ）の化合物を含む組成物が提供され、組成物はトニック、ローション、セラム、シャンプー、コンディショナー、スプレー、ゲル、またはクリームであることを特徴とするである。さらなる実施形態において、式（Ｉ）の化合物またはその塩は、０．０１μＭ〜１００ｍＭ、０．０１μＭ〜１０ｍＭ、０．０１μＭ〜１ｍＭ、０．０１μＭ〜１００μＭ、０．１μＭ〜５００μＭ、０．１μＭ〜１００μＭ、または１μＭ〜５０μＭの範囲内の濃度で組成物中に存在する。
【０１２７】
膵島のベータ細胞の更新速度が低下すると、加齢中の２型糖尿病の可能性が増加する。したがって、本発明のさらなる態様によれば、膵島におけるベータ細胞の更新速度の低下を予防、阻害、遅延、および／または逆転させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。本発明のさらなる態様によれば、膵島におけるベータ細胞の更新速度を増加させるために使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１２８】
筋幹細胞の数および機能が低下すると、損傷後の筋肉の再生能力が低下する。したがって、本発明のさらなる態様によれば、筋幹細胞の数を増加させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１２９】
本発明のさらなる態様によれば、筋肉の再生能力を促進する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１３０】
本発明のさらなる態様によれば、筋幹細胞の再生能力を促進する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１３１】
本発明のさらなる態様によれば、例えば、損傷または手術後の筋肉再生を促進および／または改善する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１３２】
本発明のさらなる態様によれば、年配または高齢の患者において、例えば傷害または手術後の筋肉再生を促進および／または改善する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１３３】
本発明のさらなる態様によれば、運動後の筋肉再生を促進および／または改善する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１３４】
本発明のさらなる態様によれば、筋幹細胞数を増加させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１３５】
筋幹細胞への影響は、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）によって特定され得る。筋幹細胞集団を選択し、筋幹細胞の本発明の有益な影響を観察する手法の２つの例は、以下のマーカーの組み合わせの使用を採用することである：
１．ＣＤ３１陰性、ＣＤ４５陰性、ＳＣＡ陰性、ＶＣＡＭ陽性筋幹細胞
２．ＣＤ３１陰性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ１１ｂ陰性、ＳＣＡ陰性、インテグリンα７陽性、ＣＤ３４陽性筋幹細胞。
【０１３６】
本発明のさらなる態様によれば、ＣＤ３１陰性、ＣＤ４５陰性、ＳＣＡ陰性、ＶＣＡＭ陽性筋幹細胞の数を増加させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１３７】
本発明のさらなる態様によれば、ＣＤ３１陰性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ１１ｂ陰性、ＳＣＡ陰性、インテグリンα７陽性、ＣＤ３４陽性筋幹細胞の数を増加させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１３８】
本発明のさらなる態様によれば、損傷後の筋肉再生を促進する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。本発明のさらなる態様によれば、筋肉の再生能力を増加させる方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。本発明のさらなる態様によれば、損傷後の筋肉治癒の方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。式（Ｉ）の化合物は、その後の筋肉再生療法のために患者に戻る前に、筋幹細胞の増殖においてエクスビボで使用され得る。したがって、本発明のさらなる態様によれば、筋幹細胞増殖の方法、例えば筋幹細胞増殖のエクスビボ法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１３９】
式（Ｉ）の化合物はまた、幹細胞を、前駆細胞などのより成熟した表現型、および筋肉細胞、毛髪細胞、造血細胞および神経細胞などの最終分化細胞に分化させる役割を有すると考えられている。理論的原理に束縛されることなく、これは他の分化誘導因子の補助因子として作用することによると考えられている。
【０１４０】
したがって、本発明のさらなる態様によれば、幹細胞、例えば多能性幹細胞の分化を誘導する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。本発明のさらなる態様によれば、前駆細胞の分化を誘導する方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１４１】
式（Ｉ）の化合物が分化を促進する細胞の例には、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、胚性幹細胞、および成体幹細胞が含まれる。細胞のさらなる例には、造血幹細胞、筋幹細胞、皮膚幹細胞、肝臓幹細胞、神経幹細胞、メラノサイト幹細胞、毛包幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、辺縁幹細胞（角膜幹細胞）、心臓幹細胞、腸幹細胞、上皮幹細胞、自己幹細胞および同種幹細胞が含まれる。
【０１４２】
本発明のさらなる態様によれば、
ａ）式（Ｉ）の化合物と；
ｂ）１つ以上の分化誘導因子とを含む組成物が提供される。
【０１４３】
分化誘導因子の例には、成長分化因子、レチノイン酸などのレチノイド、酪酸ナトリウムなどのブチレート、アクチビン、線維芽細胞成長因子（塩基性ＦＧＦなど）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−βなど）、ミオスタチン、インスリン成長因子１、血管内皮成長因子Ａ、骨形態形成タンパク質、インターロイキン３、インターロイキン６、幹細胞因子、表皮成長因子、コロニーシミュレーション因子（ｃｏｌｏｎｙ  ｓｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）（ＧＭ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦなど）ならびにグルカゴン様ペプチド１型が含まれる。
【０１４４】
フリードライヒ運動失調症は、フラタキシンと呼ばれる重要なタンパク質を産生する９番染色体上の遺伝子（ＦＸＮ）に影響を与える常染色体劣性疾患である。フラタキシンはミトコンドリアでの役割を有し、式（Ｉ）の化合物がこの生化学的病変の影響を軽減する役割を果たしていると考えられている。本発明のさらなる態様によれば、フリードライヒ運動失調症の処置のための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０１４５】
本発明のさらなる態様によれば、それを必要とする患者または対象において本発明の方法で使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】造血系を説明する図であり、Ａ）は、造血幹細胞に由来する全ての異なる血液細胞系統を示し、Ｂ）は、前駆細胞の異なる亜集団を定義するために利用され得る細胞表面マーカー、および全骨髄に対する各集団の相対的な寄与（％ＢＭ）を説明している。ヒトにおいて、ＨＳＣ（Ｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ９０＋ＣＤ４９＋）およびＭＰＰ（Ｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ９０−ＣＤ４９ｆ−）の両方に対してヒトタンパク質マーカーの同様のセットが特定されている。造血幹細胞（ＨＳＣ）は最も静止した状態の細胞であり、様々な多能性前駆細胞（ＭＰＰＳ）の源である。
【図２】フローサイトメトリーで分析された、加齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから単離された骨髄細胞のプロットのセットを示す図である。プロットは、前駆細胞であるＬＳＫ（ｃ−Ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ  １＋）細胞を含む集団を選択するために使用されるゲーティング戦略の例を示している。この特定の例では、ウロリチンＡ処理により、前駆細胞の集団が大幅に増加し、対照マウスの系統陰性細胞の３．１６％から、ウロリチンＡで処理された加齢マウスの５．２７％となる。
【図３】異なる前駆細胞集団を選択するために使用されるゲーティング戦略、およびこれらの異なる造血前駆細胞集団に対するウロリチンＡ処理の効果を示す図である。細胞のＬＳＫ（ｃ−Ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ  １＋）集団に存在する様々な前駆細胞集団が、ＣＤ１５０、ＣＤ４８、ＣＤ３４、およびＣＤ１３５の発現に基づいて分離された。ウロリチンＡ処理により、最もコミットされていない前駆細胞（ＨＳＣ＋ＭＰＰ１）であるＬＳＫ細胞の％が５３．１％から６１．７％に増加するこのＨＳＣ＋ＭＰＰ１前駆細胞の増加した集団は、ＨＳＣ細胞が７３．８％（未処理）から８１．７％（ウロリチンＡ）にさらに濃縮されている。
【図４】最も原始的な造血幹細胞集団に対するウロリチンＡの効果を示す図である。加齢動物におけるウロリチンＡ処理は、全細胞の％および細胞数の両方として、最も原始的な前駆造血幹細胞（ＨＳＣ）集団の増加をもたらした。総幹細胞数の増加は統計的に有意であり、ｐ＜０．０５である。
【図５】インフルエンザワクチン接種に応じた抗体価に対するウロリチンＡの効果を評価するための第２相臨床試験のデザインを示す図である。
【図６】炎症誘発性サイトカインと抗炎症性サイトカインに対するウロリチンＡの効果を示している。加齢動物におけるウロリチンＡ処理は、ＩＬ−１２（ｐ４０）比よりもＩＬ−１０の有意な増加をもたらした（ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【０１４７】
「約」という用語は、関連する値の±２０％、例えば関連する値の±１５％、例えば関連する値の±１０％または関連する値の±５％の許容誤差を指す。
【０１４８】
「免疫増強剤」という用語は、特定のワクチン抗原と組み合わせて使用された場合に抗原特異的免疫応答を加速、延長、もしくは増強するように作用する任意の物質、および／または個人が感染症もしくは癌に対する免疫反応をより良好に備えることができるように免疫の健康を改善する任意の物質を指す。
【０１４９】
「抗原」という用語は、対象によって非自己として認識された場合に免疫応答を誘引するタンパク質、サブユニット、ペプチドまたは他の化合物を指す。そのような免疫応答は、侵入する病原体、毒素、またはアレルゲンに対する応答を動員するための先天的および／または適応的メカニズムを介し得る。抗原は、一般に、病原性細菌または病原性ウイルスなどの病原性生物に由来し得る。抗原はまた、悪性細胞に由来し得る。
【０１５０】
「免疫細胞」という用語は、細菌およびウイルスなどの微生物による感染に対する対象の防御に関与する任意の細胞を指す。この用語はまた、癌細胞に対する対象の防御に関与する任意の細胞に関連する。免疫細胞には、好中球およびマクロファージなどの食細胞、細胞毒性ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、顆粒球、マクロファージ、樹状細胞、記憶細胞、Ｂ細胞およびマクロファージを含むＴ細胞サブセットが含まれる。
【０１５１】
「炎症」という用語は、加齢プロセスに伴う慢性的な軽度の炎症を指す。
【０１５２】
「免疫不全」という用語は、感染病および／または癌と戦う免疫系の能力が損なわれているか、または完全に欠如している状態を指す。任意の種類の免疫不全を患っている人が、免疫不全であると言われる。
【０１５３】
「免疫老化」という用語は、自然な年齢の増加によってもたらされる免疫系の段階的な悪化を指す。これは、感染に反応する宿主の能力、および特にワクチン接種による長期的な免疫記憶の発達の両方を指す。
【０１５４】
「塩」という用語は、任意の薬学的に許容される塩または薬学的に許容されない塩を指す。薬学的に許容される塩のみが対象への投与に適しているが、薬学的に許容されない塩は、薬学的に許容される塩の形成における中間体として使用され得る。
【０１５５】
「セロコンバージョン」という用語は、本明細書で使用される場合、ワクチン接種後、例えば一般的なインフルエンザ株（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｂ型）のワクチン接種後に、ワクチン接種後の抗体レベルがワクチン接種前に測定された抗体レベルの例えば少なくとも２倍から少なくとも４倍に等しい、個人がワクチン接種された免疫原に対する血清抗体の量の個人における増加を指す。
【０１５６】
「セロプロテクション」という用語は、本明細書で使用される場合、個人がワクチン接種された免疫原に対する血清抗体の、感染性因子に対する防御を付与する防御閾値以上の量の個人における抗体の存在を指す。
【０１５７】
幹細胞の老化という用語は、生存能力および代謝活動が継続しているにもかかわらず、安定した不可逆的な（治療的介入なしの）増殖能力の喪失を指す。
【０１５８】
「対象」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患を有する、または疾患を有するリスクのある個人、例えばヒト、ウシ、ネコ、イヌ、ロバ、ブタ、ウマ、マウス、ラットなど、特にヒトを指す。対象は、本発明による処置を必要とする患者であってもよい。「対象」という用語は、爬虫類などの非哺乳類対象を含み得る。
【０１５９】
「胸腺退縮」という用語は、年齢と共に胸腺が収縮し、その結果、胸腺の構造が変化し、組織量が減少することを意味する。
【０１６０】
「ワクチン」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患、特にウイルス性または細菌性疾患に対する保護を付与するための、動物またはヒト対象へのインビボ投与用の免疫原性組成物を指す。「ワクチン」という用語はまた、抗癌ワクチンも指す。
【０１６１】
本開示は、有益な健康効果を提供する式（Ｉ）の化合物、すなわちウロリチンＡなどのウロリチンの投与が関与する組成物および方法を提供する。
【０１６２】
式（Ｉ）の化合物およびその塩
ウロリチンは、エラジタンニンおよびエラグ酸に対する、ヒトを含む哺乳動物の腸内微生物叢の作用により生成される代謝産物である。エラジタンニンおよびエラグ酸は、ザクロ、ナッツおよびベリーなどの食品に一般に見られる化合物である。エラジタンニンは、腸自体への吸収は最小限である。ウロリチンは、上記の代表的な構造（Ｉ）を有する化合物のクラスである。いくつかの特に一般的なウロリチンの構造は、構造（Ｉ）を参照して、以下の表１に記載される。
【表１】
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実際には、商業規模の製品の場合、ウロリチンを合成することが便利である。合成の経路は、例えば、ＷＯ２０１４／００４９０２およびＷＯ２０１５／１００２１３に記載されている。
【０１６３】
構造（Ｉ）による任意の構造のウロリチンは、本開示の方法に使用され得る。
【０１６４】
本開示の使用および方法の一態様において、適切な化合物は、Ａ、Ｃ、ＤおよびＺがＨおよびＯＨから独立して選択され、Ｂ、Ｗ、ＸおよびＹが全てＨであり、好ましくはＡ、Ｃ、ＤおよびＺの少なくとも１つがＯＨである式（Ｉ）の化合物である。
【０１６５】
特に適切な化合物は、天然に存在するウロリチンである。したがって、Ｚは、好ましくはＯＨであり、Ｗ、Ｘ、およびＹは好ましくは全て、Ｈである。Ｗ、Ｘ、およびＹが全てＨであり、ＡおよびＢが両方Ｈであり、Ｃ、Ｄ、およびＺが全てＯＨである場合、化合物は、ウロリチンＣである。Ｗ、Ｘ、およびＹが全てＨであり、Ａ、Ｂ、およびＣが全てＨであり、ＤおよびＺが両方ＯＨである場合、化合物は、ウロリチンＡである。好ましくは、本開示の方法で使用されるウロリチンは、ウロリチンＡ、ウロリチンＢ、ウロリチンＣ、またはウロリチンＤである。最も好ましくは、使用されるウロリチンは、ウロリチンＡである。
【０１６６】
一実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物がウロリチンＡである本発明の方法が提供される。
【０１６７】
一実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物がウロリチンＢである本発明の方法が提供される。
【０１６８】
一実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物がウロリチンＣである本発明の方法が提供される。
【０１６９】
一実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物がウロリチンＤである本発明の方法が提供される。
【化２】
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【０１７０】
式（Ｉ）の化合物に適用される薬学的に許容される塩という用語は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応なしにヒトおよび下等動物の組織と接触して使用するのに適し、合理的な利益／リスク比に見合った遊離塩基化合物の非毒性有機または無機酸付加塩を定義する。本発明による適切な塩は、有機または無機塩基を用いて形成されたものを含む。薬学的に許容される塩基塩には、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えばカリウムおよびナトリウムの塩、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウムおよびマグネシウムの塩、ならびに有機塩基との塩、例えばジシクロヘキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルコミン、モルホリン、チオモルホリン、ピペリジン、ピロリジン、モノ−、ジ−もしくはトリ−低級アルキルアミン、例えばエチル−、ｔｅｒｔ−ブチル−、ジエチル−、ジイソプロピル−、トリエチル−、トリブチル−もしくはジメチル−プロピルアミン、またはモノ−、ジ−もしくはトリヒドロキシ低級アルキルアミン、例えばモノ−、ジ−もしくはトリエタノールアミンが含まれる。
【０１７１】
これらの塩は、水和形態または実質的に無水の形態のいずれかで存在し得る。式（Ｉ）の化合物の結晶形態もまた、本発明の使用または方法での使用が企図される。
【０１７２】
投与／投薬計画
本開示の方法は、ワクチン接種前の２〜１６週間の期間、１日あたり１．７〜６．０ミリモル、例えばワクチン接種前の２〜１６週間の期間、１日あたり１．７〜２．７ミリモル、またはワクチン接種前の２〜１６週間の期間、１日あたり２．８〜６．０ミリモルの範囲内の１日量で、式（Ｉ）の化合物またはその塩を対象に経口投与することを含む。以下で考察されるように、２５０ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲内のウロリチンＡ（約１．１〜４．４ｍｍｏｌに相当）が好ましいの投与は、これは、２０００ｍｇのはるかに高い投薬量と比較して、驚くほど良好な薬物動態プロファイルをもたらす。一実施形態において、用量は２５０ｍｇ／日であり、代替の実施形態において、用量は５００ｍｇ／日であり、別の実施形態において、用量は１０００ｍｇ／日である。
【０１７３】
さらなる実施形態において、投与用量は、
−２５０ｍｇを１日１回もしくは２回；
−５００ｍｇを１日１回もしくは２回；
−７５０ｍｇを１日１回もしくは２回；
−１０００ｍｇを１日１回もしくは２回；
−１２５０ｍｇを１日１回もしくは２回；または
−１５００ｍｇを１日１回もしくは２回から選択される。
【０１７４】
本開示の方法は、式（Ｉ）の化合物もしくはその塩、または化合物もしくは塩を含む組成物の毎日の投与を伴う。いくつかの実施形態において、化合物または組成物は、１日当たり１回投与され、すなわち、化合物または組成物は、２４時間の期間当たり少なくとも１回投与されることになる。他の実施形態において、化合物、または化合物を含む組成物は、１日当たり複数回、例えば１日当たり２回、または１日当たり３回もしくは４回投与される。そのような場合、１日投与量は、それらの複数回用量に分割される。一実施形態において、投与は１日１回であり、第２の実施形態において、投与は１日２回であり、第３の実施形態において、投与は１日３回である。
【０１７５】
本開示の方法は、式（Ｉ）の化合物もしくはその塩、または化合物もしくは塩を含む組成物の、２〜１６週間の期間の毎日の投与を必要とする。いくつかの実施形態において、方法は、さらにより長い期間にわたる、例えば少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、１２週間、４か月、６か月、または少なくとも１年間毎日の、式（Ｉ）の化合物またはその塩の投与を伴い得る。いくつかの実施形態において、方法は、最大３か月、最大６か月、最大１年、最大２年、または最大５年の期間にわたって毎日、化合物またはその塩を投与することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、２１日〜５年、２１日〜２年、２１日〜１年、２１日〜６か月、２１日〜１２週間、２８日〜５年、２８日〜２年、２８日〜１年、２８日〜６か月、２８日〜４か月、２８日〜１２週間、６週間〜２年、６週間〜１年、８週間〜１年、または８週間〜６か月の範囲の期間にわたって毎日、化合物または塩を投与することを含む。
【０１７６】
本開示の方法は、１日当たり０．７ｍｍｏｌから１日当たり２．７ｍｍｏｌまで、または１日２回０．７ｍｍｏｌから１日２回２．７ｍｍｏｌまでの量の式（Ｉ）の化合物またはその塩の毎日の投与を必要とする。いくつかの実施形態において、投与される量は、２．０〜２．５ｍｍｏｌの範囲内である。いくつかの実施形態において、投与される量は、約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２，５、２．６、または２．７ｍｍｏｌである。他の実施形態において、投与される量は、約２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、または６．０ｍｍｏｌである。いくつかの好ましい実施形態において、方法は、１日当たり約２．２ｍｍｏｌまたは１日２回２．２ｍｍｏｌの式（Ｉ）の化合物またはその塩（例えばウロリチンＡの）の投与を伴う。投与される化合物の正確な重量は、使用される化合物の分子量に依存する。例えば、ウロリチンＡは、２２８ｇ／ｍｏｌの分子量を有し（２．２０ｍｍｏｌが５０１．６ｍｇであるように）、ウロリチンＢは、２１２ｇ／ｍｏｌの分子量を有する（２．２０ｍｍｏｌが４６６．４ｍｇであるように）。
【０１７７】
さらなる実施形態において、本開示の方法は、１日当たり２．８ｍｍｏｌ〜１日当たりまたは１日２回６．０ｍｍｏｌまでの量の式（Ｉ）の化合物またはその塩の毎日の投与を必要とする。いくつかの実施形態において、投与される量は、４．０〜４．８ｍｍｏｌの範囲内である。いくつかの実施形態において、投与される量は、約２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、または６．０ｍｍｏｌである。いくつかの好ましい実施形態において、方法は、１日当たりまたは１日２回約４．４ｍｍｏｌの式（Ｉ）の化合物またはその塩（例えばウロリチンＡ）の投与を伴う。投与される化合物の正確な重量は、使用される化合物の分子量に依存する。例えば、ウロリチンＡは、２２８ｇ／ｍｏｌの分子量を有し（４．４０ｍｍｏｌが１００３．２ｍｇであるように）、ウロリチンＢは、２１２ｇ／ｍｏｌの分子量を有する（４．４０ｍｍｏｌが９３２．８ｍｇであるように）。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、方法は、４００〜６００ｍｇ／日、または１日２回４００〜６００ｍｇの範囲内の量でのウロリチンＡの投与を伴う。好ましい実施形態において、方法は、１日当たり、または１日２回４５０〜５５０ｍｇの範囲内、より好ましくは約５００ｍｇのウロリチンＡの投与を伴う。
【０１７９】
他の実施形態において、方法は、７００〜１３００ｍｇ／日の範囲で１日２回、または７５０〜１２５０ｍｇ／日の範囲、または８００〜１２００ｍｇ／日の範囲、または８５０〜１１５０ｍｇ／日の範囲、または９００〜１１００ｍｇ／日の範囲で１日２回の量のウロリチンＡの投与を伴う。好ましい実施形態において、方法は、９５０〜１１５０ｍｇ／日または１日２回の範囲、より好ましくは約１０００ｍｇ／日または１日２回の量のウロリチンＡの投与を伴う。
【０１８０】
いくつかの好ましい実施形態において、方法は、４．５〜８．５ｍｇ／ｋｇ／日など、４．５〜１１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の量でウロリチンＡを対象に投与することを伴う。別の実施形態において、方法は、５〜９ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の量でウロリチンＡを対象に投与することを伴う。別の実施形態において、方法は、６．０〜８ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の量でウロリチンＡを対象に投与することを伴う。
【０１８１】
他の好ましい実施形態において、方法は、９〜１８ｍｇ／ｋｇ／日、例えば９〜１７ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の量でウロリチンＡを対象に投与することを伴う。別の実施形態において、方法は、１０〜１７ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の量でウロリチンＡを対象に投与することを伴う。別の実施形態において、方法は、１１〜１６ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の量でウロリチンＡを対象に投与することを伴う。
【０１８２】
５００ｍｇの用量および１０００ｍｇの用量を組み合わせた投薬計画が有利な場合がある。例えば、１０００ｍｇの第１の用量および数時間後の５００ｍｇの第２の用量を組み合わせた１日２回の投薬計画である。前記５００ｍｇの用量は、１０００ｍｇの用量の６〜１８時間後、例えば１０００ｍｇの用量の８〜１２時間後であってもよい。例えば、１０００ｍｇの用量の約１２時間後である。したがって、本発明のさらなる態様によれば、１０００ｍｇの第１の用量、続いて５００ｍｇの第２の用量を含む１日２回の投薬計画を含む式（Ｉ）の化合物による疾患の処置が提供され、２つの用量は６〜１８時間の間隔がある。
【０１８３】
式（Ｉ）の化合物もしくはその塩、または塩の化合物を含有する組成物は、任意の好適な時間に投与されてもよく、例えば、睡眠後の朝または夕方に投与されてもよい。いくつかの実施形態において、方法は、毎日ほぼ同じ時間（複数可）に、例えば、所与の時点から１５、３０、６０、または１２０分以内に実施されることが好ましい場合がある。
【０１８４】
免疫増強剤
免疫増強剤は、抗原のみによって惹起されるものと比較して、外来抗原に対する免疫応答の強度および／または持続時間を増加させる任意の化合物または組成物である。したがって、免疫増強剤の重要な機能的特徴には、標的抗原に対する適切な免疫応答を増強する能力、広範な適用における長期の安全性、および異なる抗原／疾患の適用との使用における柔軟性が含まれる。
【０１８５】
式（Ｉ）の化合物は、１つ以上の追加の免疫増強剤と共に投与され得る。
【０１８６】
本発明のさらなる代替の実施形態において、前記免疫増強剤は、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、フラジェリン、モノホスホリルリピドＡ、ポリ１：Ｃおよびそれらの誘導体などのＴＬＲアゴニストである。
【０１８７】
本発明のさらなる実施形態において、前記免疫増強剤は、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）および／またはトレハロースジコリネミコレート（ＴＤＭ）などの細菌細胞壁誘導体である。
【０１８８】
本発明の別の実施形態において、前記免疫増強剤は、ヒト対象での使用に適したアルミニウムベースの免疫増強剤である。
【０１８９】
免疫増強剤（免疫賦活剤または免疫調節剤）は、ワクチン抗原に対する免疫応答を改善するために長い間使用されてきた。ワクチン製剤への免疫増強剤の組み込みは、ワクチン抗原に対する特定の免疫応答を増強、加速、および延長することを目的としている。免疫増強剤の利点には、より弱い抗原の免疫原性の増強、免疫の成功に必要な抗原量の低減、必要な追加免疫の頻度の減少、ならびに高齢者および免疫不全状態のワクチンにおける免疫応答の改善が含まれる。選択的に、免疫増強剤を使用して、例えば免疫グロブリンクラスおよび細胞毒性またはヘルパーＴリンパ球応答の誘導に関して、所望の免疫応答を最適化することもできる。さらに、ある特定の免疫増強剤を使用して、粘膜表面での抗体応答を促進することができる。水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムまたはリン酸カルシウムは、ヒトのワクチンに日常的に使用されている。さらに最近では、ＩＲＩＶ（免疫刺激性の再構成インフルエンザビロソーム）に組み込まれた抗原、およびエマルジョンベースの免疫増強剤ＭＦ５９を含むワクチンが各国で認可されている。免疫増強剤は、それらの起源、作用機序、および物理的または化学的特性に従って分類することができる。最も一般的に説明されている免疫増強剤クラスは、ゲルタイプ、微生物、オイルエマルジョンおよび乳化剤ベース、粒子状、合成、ならびにサイトカインである。最終的なワクチン製品には、複数種の免疫増強剤が含まれていてもよい。それらは、ワクチンに存在する単一の抗原または全ての抗原と一緒に組み合わされてもよく、または各免疫増強剤が１つの特定の抗原と組み合わされてもよい。現在使用または開発されている免疫増強剤の起源および性質は非常に多様である。例えば、アルミニウムベースの免疫増強剤は単純な無機化合物からなる、ＰＬＧは高分子炭水化物であり、ビロソームは異種のウイルス粒子に由来し得、ＭＤＰは細菌の細胞壁に由来し、サポニンは植物起源、例えばＱＳ−２１であり、スクアレンはサメの肝臓に由来し、組換え内因性免疫調節剤は組換え細菌、酵母または哺乳動物細胞に由来する。ヒトへの使用には反応性が高すぎる鉱油エマルジョンなど、獣医用ワクチンに認可された免疫増強剤がいくつかある。同様に、完全フロイント免疫増強剤は、知られている最も強力な免疫増強剤の１つであるが、ヒトへの使用には適していない。
【０１９０】
組成物
本開示の方法は、好ましくは、式（Ｉ）の化合物またはその塩の経口投与を伴う。式（Ｉ）の化合物またはその塩を含有する任意の好適な経口組成物が使用され得る。したがって、式（Ｉ）の化合物を含有し、経口投与に適した様々な組成物の使用が想定される。したがって、いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物またはその塩は、式（Ｉ）の化合物またはその塩と、経口投与に適した１つ以上の賦形剤とを含有する経口組成物の形態で投与される。経口組成物は、ピル、錠剤、カプセル、カプレット、ドロップ、トローチ、顆粒、懸濁液用粉末、経口溶液、経口懸濁液、経口エマルジョン、シロップなどの形態を有する組成物を含み得る。
【０１９１】
式（Ｉ）の化合物を含有する組成物は、意図する用途に適した任意の物理的形態をとってもよく、例えば、それらは、固体（例えばバー）、半固体（例えばソフトゲル）、または液体（エマルジョンを含む）の形態であってもよい。場合によっては、組成物は、粘性流体またはペーストの形態であってもよい。組成物が、例えばバーである場合、それは、任意の好適なタイプであってもよく、それは、スナックバーの調製のために従来使用される成分を含有してもよい。半固体形態は、同様に、当該技術分野における従来の賦形剤を含有してもよい。賦形剤は、例えば、組成物が許容できる味、魅力的な外観、および良好な貯蔵安定性を有するように、所望の硬度、貯蔵期限、および味を提供することができる。半固体形態は、ペーストの形態であってもよい。組成物がソフトゲルである場合、例えば、シェルを有するカプセルで提供されてもよい。シェルは、従来のタイプのものであってもよく、例えば、軟質ゼラチンベースのシェルであってもよい。一例として、組成物は、硬質カプセルタイプのシェルの内部に提供されてもよい。液体組成物は、それぞれ経口摂取用の薬剤、食事補助食品、または飲料の形態であってもよい。液体製剤は、溶液、エマルジョン、スラリー、または他の半液体であってもよい。液体組成物中の賦形剤は、例えば、組成物が許容できる味、魅力的な外観、および良好な貯蔵安定性を有するように、貯蔵期限、外観、味、および食感を提供することができる。ある特定の希釈レベルでは、活性成分の均一な懸濁を維持するために、対象が飲み物を飲む前にそれを振る必要がある場合がある。
【０１９２】
いくつかの好ましい実施形態において、方法は、微粉化形態の式（Ｉ）の化合物またはその塩（例えばウロリチンＡ）の投与を含む。微粉化により、式（Ｉ）の化合物は、より迅速に分散または溶解することが可能になる。微粉化は、当該技術分野において構築されている方法によって達成され得、例えば圧縮力粉砕、ハンマー粉砕、ユニバーサルもしくはピン粉砕、またはジェット粉砕（例えばスパイラルジェット粉砕または流動床ジェット粉砕）が使用されてもよい。ジェット粉砕が特に適している。微粉化化合物が使用される場合、好ましくは、化合物は、１００μｍ未満のＤ５０サイズを有し、すなわち、化合物の５０質量％は、１００μｍ未満の粒径サイズを有する。より好ましくは、化合物は、７５μｍ未満、例えば５０μｍ未満、例えば２５μｍ未満、例えば２０μｍ未満、例えば１０μｍ未満のＤ５０サイズを有する。より好ましくは、化合物は、０．５〜５０μｍ、例えば０．５〜２０μｍ、例えば０．５〜１０μｍ、例えば１．０〜１０μｍ、例えば１．５〜７．５μｍ、例えば２．８〜５．５μｍの範囲のＤ５０を有する。好ましくは、化合物は、１００μｍ未満のＤ９０サイズを有する。より好ましくは、化合物は、７５μｍ未満、例えば５０μｍ未満、例えば２５μｍ未満、例えば２０μｍ未満、例えば１５μｍ未満のＤ９０サイズを有する。化合物は、好ましくは、５〜１００μｍ、例えば５〜５０μｍ、例えば５〜２０μｍ、例えば７．５〜１５μｍ、例えば８．２〜１６．０μｍの範囲のＤ９０を有する。好ましくは、化合物は、０．５〜１．０μｍの範囲のＤ１０を有する。好ましくは、式（Ｉ）の化合物またはその塩（例えばウロリチンＡ）は、８．２〜１６．０μｍの範囲のＤ９０、２．８〜５．５μｍの範囲のＤ５０、およびが０．５〜１．０μｍの範囲のＤ１０を有する。
【０１９３】
さらなる実施形態において、式（Ｉ）の化合物またはその塩は、以下のうちの１つから選択されるサイズ分布を有する：
（ｉ）０．５〜５０μｍの範囲内のＤ５０サイズおよび５〜１００μｍの範囲内のＤ９０サイズ、
（ｉｉ）化合物は、８．２〜１６．０μｍの範囲内のＤ９０サイズ、２．８〜５．５μｍの範囲内のＤ５０サイズおよび０．５〜１．０μｍの範囲内のＤ１０サイズを有する；
（ｉｉｉ）式（Ｉ）の化合物は、０．５〜２０μｍの範囲内のＤ５０サイズおよび５〜５０μｍの範囲内のＤ９０サイズを有する；
（ｉｖ）式（Ｉ）の化合物は、５０μｍ未満のＤ５０サイズおよび７５μｍ未満のＤ９０サイズを有する；
（ｖ）式（Ｉ）の化合物は、２５μｍ未満のＤ５０サイズおよび５０μｍ未満のＤ９０サイズを有する；  
（ｉｖ）    式（Ｉ）の化合物は、１０μｍ未満のＤ５０サイズおよび２０μｍ未満のＤ９０サイズを有する；
（ｖ）      式（Ｉ）の化合物は、１０μｍ未満のＤ５０サイズおよび１５μｍ未満のＤ９０サイズを有する；または
（ｖｉ）    式（Ｉ）の化合物は、１０μｍのＤ５０サイズおよび２０μｍのＤ９０サイズを有する。
【０１９４】
式（Ｉ）の化合物またはその塩と中鎖トリグリセリドとを含む組成物
いくつかの好ましい実施形態において、式（Ｉ）の化合物またはその塩（例えばウロリチンＡ）は、ａ）中鎖トリグリセリドと、ｂ）式（Ｉ）の化合物またはその塩と、を含む組成物の形態で投与される。それらの実施形態において、好ましくは、式（Ｉ）の化合物（例えばウロリチンＡ）は、微粉化形態である。
【０１９５】
好適な中鎖トリグリセリドおよび賦形剤を選択することによって、組成物の物理的形態は、問題の製品の要件に合わせられ得る。例えば、いくつかの実施形態において、組成物は、医薬組成物であってもよい。いくつかの実施形態において、組成物は、栄養組成物であってもよい。
【０１９６】
多くの場合、式（Ｉ）の化合物と中鎖トリグリセリドとを含む組成物は、粘性の液体またはペーストの稠度を有し、対象の一般的な食事に対する１回限りの補助食品（例えば、バー、ゲル、もしくはソフトゲルカプセル、ハードカプセル中の、または飲み物に希釈される）として提供され得るか、あるいは，それは食事の一部または全体として提供され得る。
【０１９７】
本開示の方法が中鎖トリグリセリドを含む組成物の使用を伴う場合、中鎖トリグリセリドは、典型的には、組成物の少なくとも１％ｗ／ｗ、例えば少なくとも５％ｗ／ｗ、例えば少なくとも１０％ｗ／ｗ、例えば少なくとも１５％ｗ／ｗを構成する。中鎖トリグリセリドは、好ましくは、組成物の２０％ｗ／ｗ以上、例えば組成物の重量で２５重量％ｗ／ｗ以上、例えば重量で３０％ｗ／ｗ以上を構成する。例えば、中鎖トリグリセリドは、組成物の１〜４０％ｗ／ｗ、組成物の２〜４０％ｗ／ｗ、組成物の５〜４０％ｗ／ｗ、組成物の１０〜４０％ｗ／ｗ、組成物の１〜９９％ｗ／ｗ、組成物の５〜９９％ｗ／ｗ、組成物の１０〜９９％ｗ／ｗ、組成物の２０〜９９％ｗ／ｗ、組成物の５〜９０％ｗ／ｗ、組成物の１０〜９０％ｗ／ｗ、例えば組成物の２０〜９０％ｗ／ｗ、組成物の２０〜８０％ｗ／ｗ、例えば組成物の３０〜８０％ｗ／ｗ、例えば組成物の３０〜７０％ｗ／ｗ、例えば組成物の３０〜６０％ｗ／ｗ、例えば組成物の３０〜５０％ｗ／ｗ、例えば組成物の３０〜４０％ｗ／ｗ、例えば組成物の３０〜３５％ｗ／ｗを構成してもよい。例えば、中鎖トリグリセリドは、組成物の４０〜７０％ｗ／ｗ、例えば組成物の５０〜７０％ｗ／ｗ、例えば組成物の５５〜６５％ｗ／ｗを構成してもよい。
【０１９８】
そのような組成物において、式（Ｉ）の化合物は、典型的には、組成物の０．１〜８０％ｗ／ｗ、例えば０．１〜６０％ｗ／ｗ、例えば０．２５〜５０％ｗ／ｗを構成する。例えば、式（Ｉ）の化合物は、組成物の０．５〜５０％ｗ／ｗを構成してもよい。組成物が食事の一部または全体として提供される場合、式（Ｉ）の化合物は、例えば組成物の０．２５〜５％ｗ／ｗ、例えば組成物の０．３〜３％ｗ／ｗを構成してもよい。組成物が対象の一般的な食事に対する１回限りの補助食品として提供される場合、ウロリチンは、典型的には、組成物の２０〜８０％ｗ／ｗ、例えば組成物の２０〜４０％ｗ／ｗ、例えば２５〜３５％を構成する。例えば、ウロリチンは、組成物の２６〜３４％ｗ／ｗ、例えば組成物の２８〜３３％ｗ／ｗ、例えば組成物の２９〜３２％ｗ／ｗ、例えば組成物の２９〜３１％ｗ／ｗを構成してもよい。
【０１９９】
そのような組成物において、中鎖トリグリセリド構成成分対式（Ｉ）の化合物の重量比は、一般に、０．０１：１〜１００：１、例えば０．５：１〜１００：１、例えば０．５：１〜５０：１、例えば０．５：１〜５：１、または例えば、１：１〜７５：１、例えば１：１〜５０：１、例えば１：１〜２０：１、例えば１：１〜１０：１、例えば１：１〜２．５：１、例えば１：１〜２：１、例えば１：１〜１．５：１の範囲である。重量比は、０．０１：１〜１０：１、例えば０．１：１〜１０：１、または０．０１：１〜５：１、例えば０．０１：１〜０．１：１の比であってもよい。
【０２００】
いくつかの好ましい実施形態において、本開示の方法は、式（Ｉ）の化合物またはその塩（例えばウロリチンＡ）と１つ以上の中鎖トリグリセリドとを含む、フィリングを含むソフトゲルカプセルの投与を伴う。それらの実施形態において、好ましくは、式（Ｉ）の化合物またはその塩（例えばウロリチンＡ）は、微粉化される。ソフトゲルカプセルが使用される実施形態において、シェル構成成分は、従来の成分を使用して製造されてもよい。
【０２０１】
中鎖トリグリセリドは、式ＣＨ２（ＯＲ１）−ＣＨ（ＯＲ２）−ＣＨ２（ＯＲ３）（式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３が中鎖脂肪酸基である）の、一般に式−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣＨ３（式中、ｎは４〜１０、例えば６〜８の範囲である）の化合物である。中鎖脂肪酸は、６〜１２個の炭素原子の脂肪族尾部を有する脂肪酸である。脂肪族末端は、主に飽和している。特定の中鎖脂肪酸は、カプロン酸（ヘキサン酸、Ｃ６：０）、カプリル酸（オクタン酸、Ｃ８：０）、カプリン酸（デカン酸、Ｃ１０：０）およびラウリン酸（ドデカン酸、Ｃ１２：０）を含む。ミリスチン酸（テトラデカン酸、Ｃ１４：０）もまた少量存在し得る。最も一般的に使用される中鎖トリグリセリドは、一般に、カプリル酸およびカプリン酸のトリグリセリドの混合物を有し、９５％以上の飽和脂肪酸を含有する。本開示の方法で使用される好ましい組成物中に存在する中鎖トリグリセリド構成成分は、均質な単一の中鎖トリグリリド化合物タイプからなってもよく、より一般的には、中鎖トリグリセリド構成成分は、２つ以上の異なる中鎖トリグリリド化合物の混合物である。
【０２０２】
欧州薬局方は、中鎖トリグリセリドを、Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ  Ｌ．（ココナッツ）の胚乳の硬く乾燥した画分またはＥｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｉｓ  Ｊａｃｑ．（アフリカのアブラヤシ）の乾燥胚乳から抽出された固定油として説明している。Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａおよびＵＳＰＮＦの両方は、特定の脂肪酸の存在が以下の通りであることを必要とする中鎖トリグリセリドの仕様を有する：カプロン酸（Ｃ６）≦２．０％以下、カプリル酸（Ｃ８）５０．０〜８０．０％、カプリン酸（Ｃ１０）２０．０〜５０．０％、ラウリン酸（Ｃ１２）≦３．０％以下、およびミリスチン酸（Ｃ１４）≦１％以下。
【０２０３】
好ましい組成物中で使用するための中鎖トリグリセリドは、以下の比率で存在する脂肪酸鎖とトリグリセリドとの混合物を含む：Ｃ６≦  ５％以下、Ｃ８  ５０〜７０％、Ｃ１０  ３０〜５０％、およびＣ１２≦  １２％以下、例えばＣ６≦  ０．５％以下、Ｃ８  ５５〜６５％、Ｃ１０  ３５〜４５％、およびＣ１２≦１．５％以下。
【０２０４】
好ましい組成物で使用される中鎖トリグリセリドは、任意の既知の、または他の好適な供給源に由来し得る。
【０２０５】
本開示の方法で使用される組成物は、有利には、１つ以上のリン脂質を含み得る。特に好ましいリン脂質は、ホスファチジルコリンである。ホスファチジルコリンによってもたらされる利点は、少なくとも部分的には、それらの両親媒性の特性によるものであり得、例えば、乳化剤としての特性によるものであり得る。
【０２０６】
特に有用なリン脂質源、特にホスファチジルコリンは、レシチンであり、本開示の方法で使用される組成物は、有利にレシチンを含む。レシチンは、組成物中に存在する場合、典型的には、組成物の少なくとも０．５％ｗ／ｗ、好ましくは組成物の少なくとも１％ｗ／ｗを構成する。レシチンは、好ましくは、組成物の１０％ｗ／ｗ以上、例えば組成物の重量で２０％ｗ／ｗ以上、例えば重量で３０％ｗ／ｗ以上を構成する。例えば、レシチンは、組成物の０．５〜８０％ｗ／ｗ、例えば組成物の１〜８０％ｗ／ｗ、例えば２０〜８０％ｗ／ｗ、例えば４０〜８０％ｗ／ｗ、あるいは例えば０．５〜７５％ｗ／ｗ、例えば組成物の１〜４０％ｗ／ｗ、例えば組成物の３０〜４０％ｗ／ｗ、例えば組成物の３０〜３５％ｗ／ｗ、例えば組成の３０〜７５％ｗ／ｗを構成してもよい。あるいは、レシチンは、組成物の０．５〜５％ｗ／ｗ、例えば組成物の１〜５％ｗ／ｗ、例えば組成物の１〜３％ｗ／ｗ、例えば０．５〜２％ｗ／ｗ、例えば組成物の１〜２％ｗ／ｗを構成してもよい。レシチン（存在する場合）とウロリチンとの間の重量比は、一般に、０．０２：１〜３：１、例えば０．０３：１〜１．２：１、例えば１：１〜１．２：１、例えば１．１：１〜１．２：１の範囲である。
【０２０７】
「レシチン」は、リン酸、コリン、脂肪酸、グリセロール、糖脂質、トリグリセリド、ならびにリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルイノシトール）を含む、動物および植物組織中に発生する脂肪物質の任意の群を示す。大豆およびヒマワリから得られる市販のレシチンは、リン脂質ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジン酸を含む。レシチンは、ヘキサン、エタノール、アセトン、石油エーテル、もしくはベンゼンなどの非極性溶媒中のその供給源からの化学的抽出によって、または機械的抽出によって得られ得る。特に、レシチンは、大豆、卵、牛乳、菜種、綿実、およびヒマワリなどの供給源からの抽出によって得られ得る。食用製剤に使用するための市販のレシチンは、容易に購入され得る。
【０２０８】
本明細書に記載の組成物に使用され得る市販のレシチンは、典型的には、以下の主要構成成分を含有する：３３〜３５％の大豆油、２０〜２１％のイノシトールホスファチド、１９〜２１％のホスファチジルコリン、８〜２０％のホスファチジルエタノールアミン、５〜１１％の他のリン脂質、５％の遊離炭水化物、２〜５％のステロール、および１％の水分。
【０２０９】
本明細書に記載の組成物に使用され得る市販のレシチンは、例えば、レシチン中に最低５％ｗ／ｗのホスファチジルコリンを有し、例えば、レシチン中に最低１０％ｗ／ｗのホスファチジルコリンを有し、例えば、レシチン中に最低１５％ｗ／ｗのホスファチジルコリンを有し、例えば、レシチン中に最低２０％ｗ／ｗのホスファチジルコリンを有し、例えば、レシチン中に最低２５％ｗ／ｗのホスファチジルコリンを有し、例えば、レシチン中に最低３０％ｗ／ｗのホスファチジルコリンを有し、例えば、レシチン中に最低３２％ｗ／ｗのホスファチジルコリンを有し、例えば、レシチン中に最低４０％ｗ／ｗのホスファチジルコリンを有し、ホスファチジルコリンで富化されてもよい。
【０２１０】
レシチンはまた、それらの特性を調整するために以下のプロセスのうちの１つ以上によって修飾されてもよい。修正された比の異なるリン脂質を有するレシチンを製造するための特定のリン脂質のアルコール抽出；油を除去し、粉末状または顆粒状のリン脂質ブレンドを得るためのアセトン抽出；担体としてのタンパク質上への噴霧乾燥；フレーク状または粉末製品を製造するための高融点モノ−およびジ−グリセリドなどの合成乳化剤による噴霧冷却；酵素作用による修飾（ホスホリパーゼ、一般的には特にホスホリパーゼＡ２）、特に顕著な乳化挙動を伴うレシチンを製造するための部分加水分解；酸およびアルカリによる脂肪酸基の加水分解；アセチル化；ならびに脂肪酸鎖およびアミノ基のヒドロキシル化。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、方法は、式（Ｉ）の化合物またはその塩と、中鎖トリグリセリドと、乳化剤（例えば、レシチン）とを含む組成物の投与を含む。
【０２１２】
式（Ｉ）の化合物またはその塩を含有する医薬組成物は、例えば、追加の薬学的に活性な化合物を含み得る。
【０２１３】
組成物中の追加の構成成分は、対象に健康上の利益は提供しないが、代わりに組成物を何らかの他の方法で、例えば、上述されているようにその味、食感、または貯蔵期限を改善する化合物であってもよい。したがって、組成物は、乳化剤、着色剤、防腐剤、ガム、硬化剤、増粘剤、甘味料、および香料から選択される１つ以上の化合物をさらに含有してもよい。
【０２１４】
適切な乳化剤、着色剤、防腐剤、ガム、硬化剤、および増粘剤は、エマルジョンおよび他の半液体製造の技術分野において周知である。乳化剤は、ホスファチジルコリン、レシチン、ポリソルベート６０またはポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ−６０およびＴｗｅｅｎ−８０）などのポリソルベート、ならびにグリセロールモノステアレート（ＧＭＳ）のうちの１つ以上を含み得る。グリセロールモノステアレートは、グリセリルモノステアレートとしても既知である。
【０２１５】
安定剤が本明細書に記載の組成物中に使用されてもよい。多くの組成物は、追加の安定剤を必要としない安定した懸濁液である。安定した懸濁液は、経時的に相分離を受けないものである。ある特定の組成物については、安定性は、追加の安定剤を含むことによって改善され得る。本発明の組成物での使用に好適な安定剤としては、グリセロールモノステアレート（ＧＭＳ）、二酸化ケイ素、および植物性ショートニングが挙げられる。例示的な安定剤は、ＧＭＳであり、本発明の好ましい組成物は、ＧＭＳを含有する。その特性により、ＧＭＳは、例えばレシチンに見られるようなリン脂質の優れた溶媒にもなる。ＧＭＳは、２つの多形体で存在し、α型は、分散性かつ泡状であり、乳化剤または防腐剤として有用である。β型は、ワックスマトリクスに適している。α型は、５０℃で加熱するとβ型に変換される。
【０２１６】
ＧＭＳは、２つの別々のグレード、４０〜５５パーセントのモノグリセリドおよび９０パーセントのモノグリセリドに分類される。Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａによって定義されている４０〜５５パーセントのモノグリセリドは、ＧＭＳを、ある量のジ−およびトリ−グリセロールと合わせたモノアシルグリセロール、主にモノステアロイルグリセロールの混合物として記載している。特に、４０〜５５グレードは、４０〜５５％のモノアシルグリセロール、３０〜４５％のジアシルグリセロール、および５〜１５％のトリアシルグリセロールを含む。９９パーセントグレードは、９０％以上のモノグリセリドを含む。市販のＧＭＳ製品中のモノグリセリドは、可変比率のグリセリルモノステアレートとグリセリルモノパルミテートの混合物である。Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａは、混合物中のステアリン酸エステルの比率に応じて、グリセリルモノステアレート４０〜５５を３つのタイプにさらに分割する。タイプ１は、４０．０〜６０．０％のステアリン酸を含み、パルミチン酸とステアリン酸の合計は、９０％以下である。≦タイプ２は、６０．０〜８０．０％のステアリン酸を含み、パルミチン酸とステアリン酸の合計は、９０％以下である。≦タイプ３は、９０．０〜９９．０％のステアリン酸を含み、パルミチン酸とステアリン酸の合計は、９６％以下である。≦ＧＭＳの任意の形態が組成物中で使用され得る。
【０２１７】
いくつかの実施形態において、方法は、中鎖トリグリセリドと、式（Ｉ）の化合物またはその塩（例えばウロリチンＡ）と、安定剤、例えばグリセロールモノステアレートとを含む組成物の投与を含む。いくつかの実施形態において、方法は、乳化剤と安定剤とを含む組成物の投与を伴う。
【０２１８】
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のナトリウムカルシウム塩などの金属キレート剤または金属イオン封鎖剤も使用され得る。本発明の製剤に含まれ得る他の構成成分としては、ポリエチレングリコール、二酸化ケイ素、植物性ショートニング、および蜜蝋が挙げられ得る。
【０２１９】
香料は、本明細書に記載の方法に使用される組成物において有益であり得る。液体または半液体組成物において、例えば、果実ソースまたはピューレを含むことによって、果実フレーバが提供され得る。典型的な香料としては、ストロベリー、ラズベリー、ブルーベリー、アプリコット、ザクロ、ピーチ、パイナップル、レモン、オレンジ、およびアップルが挙げられる。一般に、果実香料は、果実抽出物、フルーツジャムまたはフルーツピューレを、甘味料、デンプン、安定剤、天然および／または人工フレーバ、着色剤、防腐剤、水、ならびにクエン酸またはｐＨを制御するのに好適な他の酸の組み合わせのいずれかと共に含む。
【０２２０】
本明細書に記載の方法に使用される単位用量組成物は、好ましくは、２５０ｍｇまたは５００ｍｇの式（Ｉ）の化合物、例えば２５０ｍｇまたは５００ｍｇのウロリチンＡを含有する。単位用量は、例えば、２５ｇ〜１５０ｇの範囲の重量のスナックバーの形態、単回用量（例えば、５０〜５００ｍＬ、１００〜３００ｍＬ、例えば２５０ｍＬ〜５００ｍＬ）を保持するのに十分なボトルまたはパウチなどの容器内で提供される飲料の形態であってもよい。好ましいさらなる代替例では、単位用量は、例えば、２５０ｍｇのウロリチンＡを含有するソフトゲルカプセルの形態である。
【０２２１】
代表的な組成物が以下の表に示される。
【表２】
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本発明はさらに、式（Ｉ）の化合物およびワクチン、ならびに任意選択で１つ以上の追加の免疫増強剤および／または１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を提供する。一実施形態において、組成物の成分は別々に提供される。別の実施形態において、成分は混合して提供される。別の実施形態において、ワクチンは、１つ以上１つ以上の追加の免疫増強剤と混合して、式（Ｉ）の化合物とは別に提供される。別の実施形態において、ワクチンは、式（Ｉ）の化合物と混合して提供され、１つ以上の追加の免疫増強剤が別々に提供される。別の実施形態において、ワクチンは、１つ以上の追加の免疫増強剤と混合して提供され、式（Ｉ）の化合物は、別個に提供される。
【０２２２】
医薬組成物は、部品のキットの形態をとってもよく、そのキットは、使用説明書および／または単位剤形の複数の異なる成分と共に本発明の組成物を含み得る。したがって、本発明の一実施形態において、抗原に対する免疫応答を誘導するためのキットであって、
−式（Ｉ）の化合物を含む第１の成分と；
−追加の免疫増強剤を含む第２の成分と；
−任意選択で、１つ以上さらなる免疫増強剤を含む１つ以上のさらなる成分とを含むキットが提供される。
【０２２３】
本発明のさらなる実施形態において、抗原に対する免疫応答を誘導するためのキットであって、
−式（Ｉ）の化合物を含む第１の成分と；
−ワクチンを含む第２の成分と；
−任意選択で、１つ以上のさらなる免疫増強剤を含む１つ以上のさらなる成分とを含むキットが提供される。
【０２２４】
本発明のさらなる実施形態において、抗原に対する免疫応答を誘導するためのキットであって、
−式（Ｉ）の化合物を含む第１の成分と；
−ワクチンを含む第２の成分と；
−追加の免疫増強剤を含む第３の成分と；
−任意選択で、１つ以上のさらなる免疫増強剤を含む１つ以上のさらなる成分とを含むキットが提供される。
【０２２５】
本発明のそのようなキットには、成分の投与の順序および間隔を説明するための指示が任意選択で提供される。一実施形態において、成分は同時に投与される。別の実施形態において、成分は、各成分の間に１日以上または１週間以上を置いて連続して投与される。
【０２２６】
一実施形態において、本発明のキットは、ワクチンおよび式（Ｉ）の化合物、ならびに任意選択で別個に提供される１つ以上のさらなる免疫増強剤を含む。別の実施形態において、本発明のキットは、ワクチンと式（Ｉ）の化合物との混合物、および任意選択で１つ以上のさらなる免疫増強剤を含む。
【実施例】
【０２２７】
ここで、以下の非限定的な例に関して本発明を説明する。
【０２２８】
実施例１：ウロリチンＡの調製
ウロリチンＡ（４）は、２−ブロモ−５−メトキシ安息香酸１およびレゾルシノール２から開始する２つのステップで調製した。純粋な化合物が淡黄色の粉末として得られた。
【化３】
2021522296.tif 000006
【０２２９】
ステップ１：
水（１２０ｍＬ）中の２−ブロモ−５−メトキシ安息香酸１（２７．６ｇ；１１９ｍｍｏｌ；１．０当量）、レゾルシノール２（２６．３ｇ；２３９ｍｍｏｌ；２．０当量）および水酸化ナトリウム（１０．５ｇ；２６３ｍｍｏｌ；２．２当量）の混合物を、１時間還流加熱した。次いで、硫酸銅の５％水溶液（５０ｍＬの水中３．８８ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；１５．５ｍｍｏｌ；０．１当量）を添加し、混合物をさらに３０分間還流した。混合物を室温まで冷却し、固体をブフナーフィルタで濾過した。残留物を冷水で洗浄して淡赤色の固体を得、これを熱ＭｅＯＨで磨砕した。懸濁液を４℃で一晩放置した。得られた沈殿物を濾過し、冷ＭｅＯＨで洗浄して、表題化合物３を淡褐色固体として得た。
【０２３０】
ステップ２：
無水ジクロロメタン（１００ｍＬ）中の３の懸濁液（１０．０ｇ、４１ｍｍｏｌ；１．０当量）に、無水ジクロロメタン中の三臭化ホウ素の１Ｍ溶液（１１０ｍＬの無水ジクロロメタン中の１１．９３ｍＬの純ＢＢｒ３；１２４ｍｍｏｌ；３．０当量）を０℃で滴下により添加した。混合物を０℃で１時間放置し、次いで室温まで温めた。溶液をその温度で１７時間撹拌した。次いで、混合物に氷を十分に加えた。黄色い沈殿物を濾過し、冷水で洗浄して黄色の固体を得、これを酢酸中で３時間還流加熱した。熱い溶液を迅速に濾過し、沈殿物を酢酸で洗浄し、次いでジエチルエーテルで洗浄して、表題化合物４を黄色い固体として得た。１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲは４の構造に一致した。
【０２３１】
実施例２：ウロリチンＡの剤形
ウロリチンＡを、以下の構成成分を含むソフトゲルカプセルに製剤化した。
【表３】
2021522296.tif 000007
【表４】
2021522296.tif 000008
【０２３２】
実施例３：幹細胞集団に対するウロリチンＡの効果
ウロリチンＡ処理が幹細胞集団に何らかの影響を及ぼしたかどうかを判断するために、標準的なげっ歯類食、またはマウスに送達される５０ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量に達するように食物と混合したウロリチンＡを含む混合食を与えた加齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから、造血幹細胞（ＨＳＣ）および多能性前駆細胞（ＭＰＰ）を単離した。マウスは１６ヶ月齢からウロリチンＡでの処理が開始され、３４週間の処理を受けた。処理期間の終わりにマウスを致死させ、大腿骨および脛骨から骨髄を採取した。筋肉および結合組織を除去した後に骨から細胞を抽出した後、単一細胞懸濁液を作成した。
【０２３３】
造血系の異なる前駆細胞に対するウロリチンＡ処理の効果を決定するために、フローサイトメトリーを使用して各前駆細胞型の数およびパーセンテージを決定した。フローサイトメトリーにより、細胞表面でのタンパク質発現のパターンが異なる細胞の選択と定量化が可能となった。標識モノクローナル抗体を使用して、細胞表面タンパク質の発現に基づいて様々な前駆細胞集団を特定することができた。前駆細胞集団を含む未分化細胞を単離するために、骨髄細胞を、より分化した細胞型に特異的な細胞表面タンパク質に対するモノクローナル抗体のカクテルで染色した。系統マーカーとしても知られるこれらのタンパク質に対する抗体は、ＣＤ３ｅ（１７Ａ２）、ＣＤ４（ＧＫ１．５）、ＣＤ８ａ（５３．６．７）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、ＣＤ１９（１Ｄ３）、Ｇｒ１（ＲＢ６．８Ｃ５）、Ｔｅｒ１１９およびＮＫ１．１（ＰＫ１３６）は、Ａｌｅｘａ６４７に結合した［ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７色素は、蛍光顕微鏡などでラベルとして使用される明るい遠赤外蛍光色素である］。様々な系統の前駆細胞集団を識別するために、単離された骨髄細胞を、以下のラベルを含む以下の前駆細胞表面タンパク質マーカーに対するモノクローナル抗体で染色した：ＣＤ３４（ＲＡＭ３４）−ＦＩＴＣ；ＣＤ１３５（Ｆｌｔ３  Ａ２Ｆ１０）−ＰＥ；ＣＤ４８（ＨＭ４８．１）−ビオチン＋ＰＥテキサスレッドストレプトアビジン；ＣＤ１１７（ｃｋｉｔ  ２Ｂ８）ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５；Ｓｃａ１（Ｄ７）−ＰＥ−Ｃｙ７。染色された細胞の細胞分析は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ  Ｆｌｏｗサイトメーター（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅ、ＮＪ、ＵＳＡ）で行い、収集されたデータは、Ｆｌｏｗｊｏ（商標）ソフトウェア（単一細胞フローサイトメトリー分析用の分析プラットフォーム）を使用して分析した。ウロリチンＡ処理を受けた３匹のマウスおよび６匹の対照未処理マウスから骨髄を単離した。
【０２３４】
単離された骨髄細胞に存在する造血前駆細胞の異なる集団を同定するために、単離された骨髄細胞を、それらの細胞表面マーカーの組み合わせに基づいて選択した。いわゆるゲーティング戦略が採用され、細胞表面タンパク質発現のパターンに基づいて特定の細胞集団が選択（ゲーティング）され、次にこのサブ選択された集団がその細胞表面タンパク質発現についてさらに検査される。図２および図３は、検査した全ての試料で採用されたゲーティング戦略の例を示す。上記の分化細胞（系統マーカー）に見られる細胞表面タンパク質が陰性である細胞を選択することにより、コミットされていない前駆細胞を調査した（図２Ｂ）。この系統陰性細胞の集団から、細胞表面マーカーであるＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）およびＳｃａ１に対して陽性に染色された細胞を選択した。系統陰性、ＣＤ１１７およびＳｃａ１陽性細胞（ＬＫＳ細胞）のこの亜集団は、前駆幹細胞を含む（図２Ｃ）。図２Ｃは、ウロリチンＡ処理を受けた加齢動物では、系統陰性細胞に存在するＬＫＳ前駆細胞の集団が、対照処理加齢マウスの３．１６％からウロリチンＡで処理された加齢マウスの５．２７％に実質的に増加していることを示す。
【０２３５】
ＬＫＳ細胞は、静止レベルの減少と共にＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）、ＭＰＰ１（ＳＴ−ＨＳＣ）、ＭＰＰ２、およびＭＰＰ３またはＬＭＰＰの４つの異なる前駆細胞型にさらに分類され得る（図１Ｂ）。最も静止していてコミットされていない細胞は、ＨＳＣ細胞である。ＬＫＳ細胞内のこれらの細胞集団を区別するために、ＣＤ１５０およびＣＤ４８の発現について細胞を検査した。最も原始的な静止細胞集団であるＨＳＣ＋ＭＰＰ１は、ＣＤ１５０の細胞表面マーカーに対して陽性であり、細胞表面マーカーＣＤ４８に対して陰性である。図３（グラフの最初のセット）に示すように、この例では、ウロリチンＡ処理により、この集団が有意に増加し、処理動物ではＬＫＳ細胞の６１．７％がＨＳＣ＋ＭＰＰ１細胞であるのに対し、未処理動物では５３．１％であった。これは、未処理マウス（ｎ＝５）と比較した場合、ウロリチンＡ（ｎ＝３）で処理された全ての動物に当てはまることが分かり、この前駆細胞集団の増加は統計的に有意であった（表２）。ＨＳＣ＋ＭＰＰ１前駆細胞は、全ての異なる血球系統集団を再構成することができる幹細胞である。ＨＳＣ＋ＭＰＰ１前駆細胞は、細胞周期に入る頻度がより少なく幹細胞集団の維持に役立つ長期更新集団（ＨＳＣまたはＬＴ−ＨＳＣ）、およびより頻繁に循環し血球系統の維持に関与する別の集団ＭＰＰ１またはＳＴ−ＨＳＣの２つの異なる型の造血幹細胞にさらに細分化され得る。これらの２つの集団は、ＨＳＣ＋ＭＰＰ１細胞を選択（ゲーティング）し、これらの細胞の細胞表面マーカーＣＤ３４の発現を調べることで識別され得る。最も原始的な幹細胞集団であるＨＳＣまたはＬＴ−ＨＳＣは、ＣＤ３４を発現しない（図１Ｂ）。図３（グラフの２番目のセット）に示すように、ウロリチンＡ処理により、加齢動物のＨＳＣであるＨＳＣ＋ＭＰＰ１細胞の％が７３．８％から８１．７％に増加する。重要なことに、最も原始的な幹細胞集団のこの増加は、図４に示すように、全骨髄細胞の％および細胞数の両方として、後肢に存在するＨＳＣの最終的な総数のさらに顕著な増加をもたらし、ウロリチンＡで処理された加齢動物では、処置されなかった加齢動物に対してＨＳＣ細胞数が有意に増加している。
【表５】
2021522296.tif 000009
【０２３６】
実施例４：ウロリチンＡ投与後のワクチン接種に応答する抗体価の改善を評価するための前臨床実験
実験概要
成体雌ＢＡＬＢ／ｃを実験群に無作為に割り当て、１週間順応させる。０日目から、以下のスケジュールに従って動物に食物混合物を投与する。０、１４、および２８日目に、ＰＲ８抗原による筋肉内（ｉ．ｍ．）負荷を実行する。０日目から、動物を非特異的な臨床徴候について毎日監視する。０日目から、動物の体重を週に３回測定する。２８日目に、血液試料を採取して血球凝集抑制アッセイ（ＨＡＩ）を実行し、抗体分析用に血清を分離するために処理する（ＰＲ８を標的とする全ＩｇＧ）。
【０２３７】
４２日目に、脾臓を切除し、単一細胞懸濁液に処理し、Ｔ細胞増殖アッセイのために播種する。細胞を、ＰＲ８（抗原）の存在下または非存在下で一晩または陽性対照と共に３回インキュベートする。ビヒクル（下記の表の群１）で処理されたマウスの脾臓（体内の免疫細胞の全身貯蔵）から採取されたエクスビボ免疫細胞を、ＵＡ／ビヒクルあり、またはなしで２４時間刺激し、細胞増殖を調べた。細胞増殖は、免疫応答の増強を評価するためのこのインビトロアッセイの主要な計測値であり、トリチウム化チミジンの取り込みによって定量化される。細胞培養上清は、マルチプレックスによるサイトカインの分析用に保存する。
【表６】
2021522296.tif 000010
【０２３８】
実施例５：ウロリチンＡ投与後のインフルエンザワクチン接種に応答する抗体価の改善を評価するための第２相臨床試験
インフルエンザワクチン接種に応答する高齢者の抗体価に対するウロリチンＡの効果を評価するために、第２相試験を行う。プロトコルの概要を図２に示す。
【０２３９】
患者は、以下の主要な選択基準で試験に採用される。
１）６５〜９０歳
２）両方の性別（男性および女性）
３）１８．５〜３０ｋｇ／ｍ２のボディマス指数（ＢＭＩ）；および
４）インフォームドコンセントを示し、試験およびその訪問を終了する能力。
【０２４０】
患者は、次の主な除外基準で採用される。
１）現在の試験期間中に、ワクチンまたは薬物を調査する別の臨床試験への参加が計画されている。
２）試験期間の４週間前に任意のワクチンを受けている。
３）試験ワクチン接種期間の前６ヶ月以内にインフルエンザワクチンを受けている。
４）先天性または後天性の免疫不全が知られているもしくは疑われる、または過去１年以内に抗がん化学療法もしくは放射線療法などの免疫抑制療法を受けている。
５）卵、ニワトリタンパク質、またはワクチン成分のいずれかに対する全身性過敏症。
６）現在のアルコールまたは薬物中毒。
７）治験責任医師の意見において試験の実施または完了を妨げる可能性のある段階にある慢性疾患。
８）聴覚障害または視覚障害に罹患している。
９）重度の認知障害（ＭＭＳＥ＜１８）または大うつ病と診断されている。
１０）進行性神経変性神経疾患：例えばアルツハイマー病。
１１）過去６週間の入院。
１２）筋肉内ワクチン接種に禁忌である、自己申告による血小板減少症、
１３）治験責任医師の判断により筋肉内ワクチン接種に禁忌である出血性疾患、またはワクチン接種の３週間前の抗凝固剤の投与。
【０２４１】
臨床試験プロトコル
ワクチン接種反応を改善するための加齢中の免疫の健康の増進におけるＵＡの役割を、二重盲検、無作為化、およびプラセボ対照臨床試験で評価する。この試験の主な結果は、プラセボ処置群でワクチン接種された者と比較して、ＵＡで処理された高齢者群における主要なインフルエンザ株（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、およびＢ型）のワクチン接種後の抗体の幾何平均力価（ＧＭＴ）において、統計的に高い倍率変化／セロコンバージョンを示すことである。健康な高齢者を、上記の選択基準および除外基準に基づいてスクリーニングし、プラセボ群（ｎ＝４５〜７５の対象）またはウロリチンＡを受けた活性群（ｎ＝４５〜７５の対象）のいずれかに不作為化する。プラセボおよびウロリチンＡは、例えばソフトゲルの形態である。対象は、無作為化後、合計４週間介入を受ける。プラセボまたは活性処理のいずれかによる４週間の介入の後、全ての対象をワクチン接種前の抗体価および免疫健康状態について血清中で評価する。その後、対象をインフルエンザワクチンで負荷し、インフルエンザワクチン接種に対する抗体価を、これらの時点で採取された血清中で３週間および６週間目に再度評価する。臨床試験のデザインは、図１に示すように実行される。
【０２４２】
臨床試験のエンドポイント
臨床試験の主要エンドポイントは、プラセボをＵＡ処理と比較したセロコンバージョンのワクチン接種後の倍率変化（すなわち、３つの主要な毒性インフルエンザ株Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、およびＢ型に対する血球凝集抑制（ＨＡＩ）ｔによって評価された抗体反応の幾何平均力価）である。プラセボ群と比較したＵＡ処理の予想されるセロコンバージョン変化は、例えば、１５〜３０％のセロコンバージョンの範囲内となり得るプラセボ処理高齢者群と比較して、４０〜６０％の範囲内となり得る。主要なインフルエンザ株の幾何平均力価は、例えば、プラセボ介入と比較して、ＵＡ処理高齢者対象において１．５〜２倍高くなり得る。
【０２４３】
主要な副次的エンドポイントには、セロプロテクション（インフルエンザからの保護の発生率）および細胞Ｔ細胞記憶応答（サイトカイン、Ｔ細胞記憶）が含まれる。
【０２４４】
実施例６：ウロリチンＡ投与後の抗炎症プロファイルの改善を評価するための前臨床実験
ウロリチンＡを、ＡＩＮ−９３Ｇ  Ｇｒｏｗｉｎｇ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ、ＵＳＡ）に、５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量に相当する０．５ｇ／食物ｋｇの濃度で混合する。ＵＡあり、またはなしのペレットを２２か月齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ、Ｓａｉｎｔ  Ｂｅｒｔｈｅｖｉｎ、フランス）に６週間与える。合計３２匹のマウスを個別に飼育し、運動能力に応じて群当たり１６匹の動物に無作為化する。実験中に自然死した動物は計算から除外される。これらの基準は、実験を開始する前に確立した。動物を一晩絶食した後６週間の処理後に安楽死させてから、大静脈によって血液試料を採取する。血液試料を１，５００ｘｇで１５分間遠心分離し、血漿上清を清浄なチューブに移す。ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ  ＭＡＰマウスサイトカイン／ケモカイン磁気ビーズパネル（ＭＣＹＴＯＭＡＧ−７０Ｋ）を使用して、血漿をサイトカインについて分析する。
【０２４５】
図６は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、ＩＬ−１２（ｐ４０）としても知られるインターロイキン−１２サブユニットベータ、およびＩＬ−１０／ＩＬ−１２（ｐ４０）の比率の結果を示す。ＩＬ−１０は重要な抗炎症性サイトカインである（Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ  ＤＦ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＩＬ−１０  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１  Ｄｅｃ  １；１４７（１１）：３８１５−２２；Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ  ＤＦ  ｅｔ  ａｌ．，  ＩＬ−１０  ａｃｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔｈ１  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１  Ｍａｙ  １５；１４６（１０）：３４４４−５１）。インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、Ｔリンパ球および休止ナチュラルキラー細胞の細胞毒性活性を増強する強力な炎症誘発性サイトカインである。図６に示すように、ＩＬ−１２（ｐ４０）に対するＩＬ−１０の比率が有意に増加している。この結果は、加齢マウスでのＵＡ処理が、サイトカインプロファイルをより抗炎症性の表現型にシフトすることにより、いわゆる加齢に伴う炎症を低減できることを示している（Ｄａｎｉｅｌａ  Ｆｒａｓｃａ  ａｎｄ  Ｂｏｎｎｉｅ  Ｂ．  Ｂｌｏｍｂｅｒｇ．Ｉｎｆｌａｍｍａｇｅｉｎｇ  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ．Ｂｉｏｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ．２０１６；Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｌａｍｍａｇｅｉｎｇ：  ａ  ｎｅｗ  ｉｍｍｕｎｅ−ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｖｉｅｗｐｏｉｎｔ  ｆｏｒ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２０１８）。
【０２４６】
例７：ウロリチンＡによる毛髪再生の改善を評価するための前臨床実験
毛髪は、幹細胞の絶え間ない更新およびそれらのさらなる分化のために非常に増殖性の組織である毛包で形成される。これらの動的メカニズムは非常に高い生体エネルギー能力を必要とし、したがってこのプロセス中、特に分化段階中のミトコンドリアの役割を示す証拠が増えている（Ｋｌｏｅｐｐｅｒ，  Ｊ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３５，  ６７９−６８９  （２０１５））。ヒトの毛包に由来するヒト幹細胞は、エネルギー生成のために主に好気性解糖に依存している（Ｋｅａｌｅｙ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｒ，  Ｐ．  Ｍ．  Ｓｋｉ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７，  ４１−４６  （１９９４））が、分化すると、それらはミトコンドリア機能に完全に依存する酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）に切り替わる（Ｔａｎｇ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．ＰｅｅｒＪ  ４，  ｅ１８２１  （２０１６）；  Ｈａｍａｎａｋａ，  Ｒ．  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉ．Ｓｉｇｎａｌ．６，  （２０１４））。
【０２４７】
この試験では、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ雄３か月齢のマウスを使用する。休止期の背部皮膚毛を注意深く脱毛する。毛相の特定に関する詳細については、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｒｏｖｅｒ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｈａｉｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｔａｇｅｓ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１７，  ３−１５  （２００１）を参照されたい。動物を無作為に３つの異なる実験群に割り当てる。脱毛の１日後、１００μｌのプラセボ対照、ＵＡ濃度１およびＵＡ濃度２を対象領域に毎日適用する（適切なＵＡ製剤は事前に決定される）。発毛の程度を定量化するために、マウスの背中の領域を毎日撮像し、ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）でさらに分析する。この領域の色素沈着のレベルを、マウスの皮膚の背景色を考慮して測定する。処理の０、７、１５および３０日後にマウスを致死させる。皮膚を採取し、Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＯＣＴ）化合物を含むクライオモールドに入れ、さらに組織学的分析を行うために−８０°Ｃで凍結する。
【０２４８】
毛包再生の周期を分析するために、クリオスタットを使用して凍結皮膚切片を縦方向に切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。オリンパス顕微鏡で画像を取得する。毛周期を定量化するために、各マウスの個々の毛包をガイドラインに基づいて分類する（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｒｏｖｅｒ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｈａｉｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｔａｇｅｓ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１７，  ３−１５  （２００１））。特定の成長期の毛包のパーセンテージを各群で計算する。同じ領域の毛包を、各マウスの切片でカウントする。さらに、同じ領域の毛包の総数を定量化する。
【０２４９】
実施例８ａ：筋幹細胞の数を増加させるウロリチンＡの能力のインビボ試験。
筋幹細胞数を増加させるＵＡの能力を試験するために、筋萎縮、筋ジストロフィーおよびその他の神経筋変性障害のモデル、例えば以下の表でより詳細に説明されるモデルを含むがこれらに限定されない筋変性のマウスモデルを使用する。
【表７】
2021522296.tif 000011
ＵＡあり、またはなしの標準食を１０ｍｐｋ／日から２５０ｍｐｋ／日の範囲の用量でマウスに与える。状態ごとの動物の数および処置期間は、使用するモデルによって異なる。実験の最後に、マウスを安楽死させ、筋肉を採取して、ＩＩ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）およびコラゲナーゼ／ディスパーゼ（Ｒｏｃｈｅ）で消化する。次いで、筋肉スラリーを細胞ストレーナーで濾過し、単離した細胞を洗浄し、ＭｕＳＣ（筋幹細胞）マーカーＣＤ３１（１：８００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｅＦｌｕｏｒ４５０コンジュゲート）；ＣＤ４５（１：２００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｅＦｌｕｏｒ４５０コンジュゲート）；Ｓｃａ−１（１：１０００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲート）；およびＶＣＡＭ−１（１：２００、ＭＢＬ）を含む抗体で、４℃で４０分間染色する。二次染色はヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｓｉｇｍａ）で行う。染色された細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ機器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析および分類する。筋幹細胞は、ＣＤ３１陰性、ＣＤ４５陰性、ＳＣＡ陰性、ＶＣＡＭ陽性の筋幹細胞として定義される。破片および死んだ細胞は、前方散乱、側方散乱およびＰＩゲーティングによって除外される。
【０２５０】
実施例８ｂ：老齢マウスの筋幹細胞の数を増加させるためのウロリチンＡのインビボ試験
中年および老齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＵＡを含むまたは含まない標準固形飼料のペレットを与え、実施例８ａに記載のように筋幹細胞数の評価を行う。
【０２５１】
実施例８ｃ：筋幹細胞の数を増やすためのウロリチンＡのエクスビボ試験
Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ−ＤｍｄｍｄｘＪマウスおよび２０月齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの筋肉を分離し、洗浄し、コラゲナーゼ溶液中で消化する。ガラスピペットを使用して単一の筋線維を遊離し、ＤＭＳＯまたはＵＡ（５μＭ〜１００μＭの範囲の最終濃度）で様々な時間枠で処理し、筋幹細胞マーカーで染色する。顕微鏡画像を共焦点顕微鏡によって取得し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して筋線維当たりの筋幹細胞の数を決定する。
【０２５２】
実施例９：内毛前駆細胞の数を増加させるためのウロリチンＡのエクスビボ試験
新生児マウス（生後１〜３日）の蝸牛をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で切除し、コルチ器官（感覚上皮）を血管条（イオン輸送上皮）および蝸牛軸（神経組織）から分離する。次いで、コルチ器官をＣｅｌｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で１時間処理して、蝸牛上皮をその下の間葉から分離する。次いで、上皮を採取し、ＴｒｙｐＬＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３７°Ｃで１５〜２０分間処理する。機械的粉砕によって得られた単一細胞を濾過し（４０ｍｍ）、３Ｄ培養のためにＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）ドームに懸濁する。細胞を、Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＧＩＢＣＯ）、Ｎ２、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、およびＤＭＳＯまたはＵＡを添加したＤＭＥＭおよびＦ１２の無血清１：１混合液に浸す。培地は一日おきに交換した。
【０２５３】
幹細胞コロニーを分化させるために、増殖培地を除去し、コロニーを３Ｄ培養に残す。Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＧＩＢＣＯ）、Ｎ２、およびＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＤＭＳＯまたはＵＡを添加したＤＭＥＭおよびＦ１２の無血清１：１混合物を使用して、分化に対する化合物の効果を試験する。
【０２５４】
内毛前駆細胞の増殖に対するＵＡの影響を評価するために、Ｌｇｒ５に陽性の細胞を、複数の条件の培地中１０日後に定量化する。細胞コロニーは、ＴｒｙｐＬＥ（ＧＩＢＣＯ）を使用して単一の細胞に解離させる。血球計で細胞カウントを行う。次いで、細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し、フローサイトメーターを使用してＬｇｒ５の発現について分析する。
【０２５５】
毛髪細胞の産生を定量化し、ＵＡが内毛前駆細胞の分化に与える影響を評価するために、分化処理の０日目および１０日目にＡｔｏｈ１陽性の細胞を定量化する。細胞コロニーをＣｅｌｌＲｅｃｏｖｅｒｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中でインキュベートして、コロニーをＭａｔｒｉｇｅｌから遊離させ、ＴｒｙｐＬＥを使用して単一細胞に解離させる。Ａｔｏｈ１＋細胞の総数およびパーセンテージをＦＡＣＳによって定量化する。
【０２５６】
実施例１０．ＵＡは神経幹細胞の増殖および分化を誘導する。
いくつかの中枢神経系（ＣＮＳ）疾患は、脳の特定の領域でのニューロンの喪失を特徴としているため、損傷した領域に機能的なニューロンを再配置するための治療戦略を特定することに関心が高まっている。１つの魅力的なアプローチは、神経幹細胞（ＮＳＣ）の使用である。ＮＳＣは、自己複製し、ニューロン、星状細胞および希突起膠細胞に分化する能力を有する未分化細胞である。これらの細胞は、ＣＮＳの発達中、成人の脳の維持にとって重要な役割を果たす。ＮＣＳは哺乳類の胚脳から分離することができ、成熟したニューロンへの増殖および分化を調節する戦略の研究を可能にする（Ｍａｒｓｈ，  Ｓ．  Ｅ．＆  Ｂｌｕｒｔｏｎ−Ｊｏｎｅｓ，  Ｍ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．  １０６，  ９４−１００  （２０１７））。
【０２５７】
増殖アッセイ：ＮＳＣの増殖および分化に対するＵＡの影響を評価するために、胚性ラットＮＳＣを使用する。ラットＮＳＣを、標準的な手順に従って分離する（Ｚｈｅｎｘｉａｎ  Ｈａｎ，  Ｑｉａｎ  Ｘｕ，  Ｃｈａｎｇｆｕ  Ｌｉ，  Ｈ．  Ｚ．  Ｇｅｎｅｓｉｓ  ５５，  （２０１７））。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ妊娠ラットを、妊娠１６日目にイソフルランの過剰摂取後に安楽死させ、ラットの胚性脳を採取する。皮質を除去し、ハンクス培地（カルシウムおよびマグネシウム不含）中で機械的に解離させ、次いで１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。次いで、ペレットをデュベルコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）に再懸濁する。Ｎ２、ＥＧＦ／ＢＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、およびＰＤＧＦ／ＮＴ３（５ｎｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養を維持する。ＮＳＣ細胞を、９６ウェルプレートフォーマットで３００００細胞／ウェルの密度で播種する。
【０２５８】
増殖アッセイ：ＮＳＣ増殖に対するＵＡの効果をテストするために、ニューロスフェア形成アッセイを使用する。細胞を培養培地に播種し、決定された処理の後、増殖細胞を特異的に標識するＫｉ−６７抗体でニューロスフェアを染色する。オリンパス顕微鏡を使用して画像を取得し、Ｋｉ−６７陽性細胞の数を盲検方式で定量化する。
【０２５９】
分化アッセイ：ニューロンへのＮＳＣ分化に対するＵＡの効果をアッセイするために、細胞を６ウェルプレートに播種する。ＵＡ処理後、細胞をニューロンマーカーＴｕｊ−１に対する抗体で染色し、続いて二次抗体を添加する。オリンパス顕微鏡を使用して画像を取得し、Ｔｕｊ−１陽性細胞の数を盲検方式で定量化する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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