(57)【要約】  本発明は、グルコノバクターオキシダンスを発酵してＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼおよびピロロキノリンキニーネの生成を促進する方法を開示し、前記方法は、グルコノバクターオキシダンスを発酵培地に接種し、２８〜３２℃、１５０〜１８０ｒｐｍで、６〜２４時間発酵培養し、発酵液を遠心分離して、湿菌体を収取して、菌体細胞を取得する。本発明は、コエンザイムｐＱＱの合成および単位体積あたりのＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼの酵素活性を促進し、前記方法により培養して得られたグルコノバクターオキシダンスは、ミグリトール前駆体（６ＮＳＬ）を生体内変換合成し、生成物６ＮＳＬの変換プロセスは、２１〜３５％増加し、生体内変換ステップのサイクルは、４８時間から３６時間に短縮された。さらに、同じ基質濃度で（６０ｇ／Ｌ）、生成物６ＮＳＬの累積濃度は、１０ｇ／Ｌ以上増加した。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコノバクターオキシダンスを発酵してソルビトールデヒドロゲナーゼおよびピロロキノリンキニーネの生成を促進する方法であって、
グルコノバクターオキシダンスを発酵培地に接種し、２８〜３２℃、１５０〜１８０ｒｐｍで、６〜２４時間発酵培養し、発酵液を遠心分離し、湿菌体を収取して、Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナーゼおよびピロロキノリンキニーネを含有する菌体細胞を取得し、前記発酵培地は、Ｄ−ソルビトール５０〜８０ｇ／Ｌ、酵母エキス０．５〜３０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４５ｇ／Ｌ、アミノ酸０．２〜２ｇ／Ｌからなり、溶媒は、脱イオン水であり、ｐＨ６．５であることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記発酵培地におけるアミノ酸は、グルタミン酸ナトリウム、ロイシン、チロシンまたはプロリンであることを特徴とする
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発酵培地におけるアミノ酸の濃度は、０．５〜１ｇ／Ｌであることを特徴とする
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記発酵培地におけるアミノ酸は、グルタミン酸ナトリウムであることを特徴とする
請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記酵母エキスの濃度は、１〜７ｇ／Ｌであることを特徴とする
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記発酵培地は、Ｄ−ソルビトール５０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４５ｇ／Ｌ、グルタミン酸ナトリウム１ｇ／Ｌからなり、溶媒は、脱イオン水であり、ｐＨ６．５であることを特徴とする
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記グルコノバクターオキシダンスを発酵培養前に、まず斜面活性化および種培養し、次いで種溶液を５−１５％の体積濃度で発酵培地に接種して発酵することを特徴とする
請求項１に記載の方法。
【請求項８】
斜面活性化培養は、グルコノバクターオキシダンスを斜面培地に接種し、２８℃の恒温インキュベーターで３〜５日間培養して、斜面菌体を取得することであり、斜面培地は、酵母エキス２〜１０ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム５〜２０ｇ／Ｌ、グルコース１０〜６０ｇ／Ｌ、寒天２４ｇ／Ｌからなり、溶媒は、脱イオン水であり、ｐＨ値はナチュラルであることを特徴とする
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記種培養は、斜面菌体を種培地に接種し、２８℃、２２５〜２３５ｒｐｍのシェーカーで２４〜４８時間培養して、種溶液を取得することであり、前記種培地はＤ−ソルビトール３０〜６０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０〜３０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４１〜５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４０．１〜１ｇ／Ｌからなり、溶媒は、脱イオン水であり、ｐＨ値は、ｐＨ４．０〜７．０であることを特徴とする
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記グルコノバクターオキシダンスは、グルコノバクターオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）ＣＣＴＣＣ  Ｎｏ．Ｍ２０８０６９であることを特徴とする
請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵プロセスおよび生体内変換分野に関し、具体的に、グルコノバクターオキシダンスの発酵培養ならびに細胞膜Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＬＤＨ）およびそのコエンザイムｐＱＱの調製、およびミグリトール中間体６−デオキシ−６−アミノ（Ｎ−ヒドロキシエチル）−α−Ｌ−フランソルボース（６ＮＳＬ）の生体内変換合成における前記菌株の応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミグリトール［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−１−（２−ヒドロキシエチル）−３，４，５−ピペリジントリオール、ｍｉｇｌｉｔｏｌ］は、Ｂａｙｅｒ社により開発された血糖降下薬であり、前記血糖降下薬は、小腸粘膜表皮細胞のα−グリコシダーゼ活性を阻害することにより糖の吸収を減少させ、安全かつ効果的にで、忍容性が高く、毒性や副作用が少ないという利点がある。
【０００３】
現在、ミグリトールを合成する一般的な方法は、化学−生物学的組み合わせ法であり、このプロセスの主要な触媒ステップは、グルコノバクターオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）細胞膜にあるＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ（Ｄ−ｓｏｒｂｉｔｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＥＣ  １．１．９９．２２）の使用を必要とし、そのコエンザイムピロロキノリンキニーネ（Ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  ｑｕｉｎｉｎｅ、ｐＱＱ）の相乗作用の下で、基質Ｎ−ヒドロキシエチルグルコサミンに対して、４位の水酸基の選択的不斉酸化を行い、得られた中間生成物に化学水素化環を直接結合してミグリトールを合成し、最後に化学水素化してミグリトールを生成する（図１）。方法は、生産プロセスを簡素化し、生成物の収率を向上させ、合成コストを削減した。その中でも、生物学的方法での中間体６ＮＳＬの触媒的合成は、ミグリトールの生産における重要なステップであり、主に２つのステップに分けられ、高活性ソルビトールデヒドロゲナーゼを生産するためのグルコノバクターオキシダンスを発酵する第１のステップと、および休止細胞を利用して、Ｎ−ヒドロキシエチルグルコサミンからミグリトールを合成するための重要な前駆体である６−ＮＳＬの合成を触媒する第２のステップとである。さらに、膜ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＬＤＨ）の特定の不完全な酸化と高効率触媒特性に基づいて、グルコノバクターオキシダンスは、ジヒドロキシアセトン、ビタミンＣおよびその他のポリオールの触媒合成の選択的酸化触媒合成プロセスで広く使用されている。
【０００４】
特許ＣＮ  １０１３０２５４９Ａは、ソルビトール、酵母エキスなどからなる培地でグルコノバクターオキシダンスを培養し、対応する休止細胞を調製してミグリトールを生成するプロセスを開示したが、酵母エキスの質量パーセントは２．４％であり、発酵コストの割合が大きい。さらに、ＵＳ４８０６６５０、ＵＳ５４０１６４５などの特許は、Ｎ−ヒドロキシエチルグルコサミンを基質とし、化学−生物学的組み合わせ法でミグリトールを合成する製造プロセスを開示したが、単位体積あたりの膜ソルビトールデヒドロゲナーゼ活性とそのコエンザイムｐＱＱ含有量の測定とモニタリングなど、発酵プロセスにミグリトール生体内変換能力に直接に影響するキーパラメータが欠けている。本発明は、グルコノバクターオキシダンス発酵によって膜ソルビトールデヒドロゲナーゼを合成する酵素生産特性により、グルタミン酸ナトリウムの添加および酵母エキスの部分的な置換により、コエンザイムｐＱＱの合成を効果的に促進し、ソルビトールデヒドロゲナーゼの発酵体積酵素活性をさらに向上させ、最終的に単位発酵体積あたり菌体変換合成の６ＮＳＬの時空収率を効果的に向上させ、ミグリトール合成の製造コストを削減することを最初に提出した。さらに、この発酵培地方法で取得した高活性グルコノバクターオキシダンスソルビトールデヒドロゲナーゼの不完全な酸化は、ミグリトールの合成だけでなく、ジヒドロキシアセトン、ビタミンＣなど、その他の重要なキラル化合物の多価アルコールの触媒合成を含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
グルコノバクターオキシダンス休止細胞の発酵生産プロセスにおける発酵培地酵母エキスの高比率および高コストの制限要因を解決するために、本発明は、グルコノバクターオキシダンスの発酵代謝特性および膜ソルビトールデヒドロゲナーゼおよびそのコエンザイムｐＱＱの合成代謝経路により、少量のグルタミン酸ナトリウムを添加して、酵母エキスを部分的に置換することにより、ソルビトールデヒドロゲナーゼ酵素体積あたり発酵活性をさらに増加させながら、発酵コストを削減し、休止細胞によるミグリトール中間体６ＮＳＬの後続の触媒合成の良い基礎を提供する安価で効率的な発酵培地を提案した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の目的を達成するために、本発明によって採用される技術的解決策は以下のとおりである。
【０００７】
本発明は、グルコノバクターオキシダンスを発酵してＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＬＤＨ）およびピロロキノリンキニーネ（ｐＱＱ）の生成を促進する方法であって、グルコノバクターオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）を発酵培地に接種し、２８〜３２℃、１５０〜１８０ｒｐｍで、６〜２４時間発酵培養し、発酵液を遠心分離し、湿菌体を収取して、Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナーゼおよびピロロキノリンキニーネを含有する菌体細胞を取得し、前記発酵培地は、Ｄ−ソルビトール５０〜８０ｇ／Ｌ、酵母エキス０．５〜３０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４５ｇ／Ｌ、アミノ酸０．２〜２ｇ／Ｌからなり、溶媒は、脱イオン水であり、ｐＨ６．５である、前記方法を提供する。
【０００８】
さらに、好ましくは、前記発酵培地におけるアミノ酸は、グルタミン酸ナトリウム、ロイシン、チロシンまたはプロリンである。好ましくは、前記発酵培地におけるアミノ酸の濃度は、０．５〜１ｇ／Ｌであり、より好ましくは、１ｇ／Ｌである。
【０００９】
さらに、好ましくは、前記アミノ酸は、グルタミン酸ナトリウムであり、発酵プロセス中に、発酵培地にグルタミン酸ナトリウムを添加して酵母エキスを部分的に置き換える。
【００１０】
さらに、前記酵母エキスの濃度は、１〜７ｇ／Ｌであり、より好ましくは、５ｇ／Ｌである。
【００１１】
さらに、前記発酵培地は、Ｄ−ソルビトール５０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４５ｇ／Ｌ、グルタミン酸ナトリウム１ｇ／Ｌからなり、溶媒は、脱イオン水であり、ｐＨ  ６．５である。
【００１２】
さらに、前記グルコノバクターオキシダンスを発酵培養前に、まず斜面活性化および種培養し、次いで種溶液を５−１５％の体積濃度で発酵培地に接種して発酵する。
【００１３】
さらに、前記斜面活性化培養は、グルコノバクターオキシダンスを斜面培地に接種し、２８℃の恒温インキュベーターで３〜５日間培養して、斜面培地のＣａＣＯ３が透明になり、目視で非染色細菌が検出されると、接種することができ、斜面菌体を取得することであり、斜面培地は、酵母エキス２〜１０ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム５〜２０ｇ／Ｌ、グルコース１０〜６０ｇ／Ｌ、寒天２４ｇ／Ｌからなり、溶媒は、脱イオン水であり、ｐＨ値はナチュラルであり、好ましくは、斜面培地は、酵母エキス５ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム５ｇ／Ｌ、グルコース５０ｇ／Ｌ、寒天２４ｇ／Ｌからなり、溶媒は、脱イオン水であり、ｐＨ値はナチュラルである。
【００１４】
さらに、前記種培養は、斜面菌体を種培地に接種し、２８℃、２２５ｒｐｍのシェーカーで２４〜４８時間培養し、ＯＤ６００≧８でトランスファー基準に達し、顕微鏡検査で細菌の形状は短い棒状であり、着色深く、不純物なく、種溶液を取得することであり、前記種培地はＤ−ソルビトール３０〜６０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０〜３０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４１〜５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４０．１〜１ｇ／Ｌからなり、溶媒は、脱イオン水であり、ｐＨ値は、ｐＨ４．０〜７．０であり、好ましくは、種培地は、Ｄ−ソルビトール５０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４５ｇ／Ｌからなり、溶媒は、脱イオン水であり、ｐＨ値は６．５である。
【００１５】
さらに、前記グルコノバクターオキシダンスは、好ましくは、中国カルチャータイプコレクションセンター（ＣＣＴＣＣ）により寄託されたグルコノバクターオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）であり、寄託番号はＮｏ．Ｍ２０８０６９であり、特許公開番号は、ＣＮ１０１５９１６８１Ａである。
【００１６】
本発明において、撹拌反応器の発酵培養中、相対飽和溶存酸素を５％〜３０％に制御する必要があるが、撹拌速度が低下し、培地中のソルビトールが基本的に尽きると、発酵を終了し、発酵サイクルを１４〜１６時間に制御し、発酵終了時の顕微鏡検査：細菌の形状は短い棒状であり、着色深く、不純物がなかった。
【００１７】
本発明においてグルコノバクターオキシダンス休止細胞を調製する場合、菌体の収集および洗浄にも関する：発酵により得られたグルコノバクターオキシダンスをセラミック精密濾過膜により濾過し、濾過プロセス中に超純水を添加して、濾液が無色透明になるまで菌体を洗浄した。
【００１８】
本発明は、発酵によって調製されたグルコノバクターオキシダンス休止細胞を、ミグリトール前駆体６ＮＳＬの生成を促進するために使用し、好ましい操作ステップは、Ｎ−ヒドロキシエチルグルコサミンを基質とし、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを加え、次に休止細胞（湿菌体の重量に基づく）を加え、脱イオン水を反応媒体とし、ｐＨ値を４．５〜５．５に調節して、反応システムを構成し、５〜３０℃、４００〜６００ｒｐｍで３６時間変換反応させ、変換反応液を取って、６ＮＳＬを取得し、前記反応システムにおいて、基質の最終濃度は、４０〜１００ｇ／Ｌであり、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏの最終濃度は、１〜５ｇ／Ｌであり、休止細胞の最終濃度は、２０〜１００ｇ／Ｌである。
【発明の効果】
【００１９】
従来技術と比較して、本発明の有益な効果は主に以下に反映される。
【００２０】
本発明は、グルコノバクターオキシダンスの発酵特性およびその膜に配置されたＤ−ソルビトール脱酵素の触媒特性から出発して、発酵培地に少量のグルタミン酸ナトリウムを添加して、酵母エキスの成分的に置換することにより、グルコノバクターオキシダンスの発酵によって酵素を生成するコストを大幅に減少した。これに基づいて、コエンザイムｐＱＱの合成および単位体積あたりのＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼの酵素活性をさらに促進し、前記方法により培養して得られたグルコノバクターオキシダンスは、ミグリトール前駆体６ＮＳＬを生体内変換合成し、生成物６ＮＳＬの変換プロセスは、２１〜３５％増加し、生体内変換ステップのサイクルは、４８時間から３６時間に短縮され、さらに、同じ基質濃度で（６０ｇ／Ｌ）、生成物６ＮＳＬの累積濃度は、１０ｇ／Ｌ以上増加した。本発明の提案は、化学−生物学的組み合わせ法によるミグリトールの製造プロセスの主要セクションにおける６ＮＳＬの生体触媒合成の製造コストを効果的に低減し、ミグリトールの前駆体である６ＮＳＬの時空収率を効果的に向上させ、ミグリトールの工業的大量生産の基礎を築いた。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】化学−生物学的組み合わせ法によるミグリトールを合成するプロセスルーティングである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下は、本発明の実施例であり、本発明の実施例の目的は、本発明をより具体的に説明することであるが、本発明により提供される発酵培地を培養して取得したグルコノバクターオキシダンス休止細胞の高活性Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナーゼおよびそのコエンザイムｐＱＱは、ミグリトール前駆体６ＮＳＬの合成だけでなく、その他のポリオールの選択的酸化触媒プロセスでも使用される。
【００２３】
実施例１
グルコノバクターオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ  ）  ＣＣＴＣＣ  Ｎｏ．Ｍ２０８０６９、特許公開番号  ＣＮ１０１５９１６８１Ａ）を斜面培地に接種し、２８℃の恒温インキュベーターで３〜５日間培養して、斜面菌体を取得し、斜面培地は、酵母エキス５ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム５ｇ／Ｌ、グルコース５０ｇ／Ｌ、寒天２４ｇ／Ｌからなり、溶媒は、脱イオン水であり、ｐＨ値は、ナチュラルである。
【００２４】
斜面菌体を種培地に接種し、２８℃、２２５ｒｐｍのシェーカーで４８時間培養して、グルコノバクターオキシダンスＣＣＴＣＣ  Ｎｏ．Ｍ２０８０６９種溶液を取得し、前記種培地は、Ｄ−ソルビトール５０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４５ｇ／Ｌからなり、溶媒は、脱イオン水であり、ｐＨ値は６．５である。
【００２５】
実施例２：グルコノバクターオキシダンスＳＬＤＨ酵素活性に対する発酵培地中のアミノ酸の種類の影響
グルコノバクターオキシダンからソルビトールデヒドロゲナーゼへの発酵に及ぼす異なるアミノ酸の影響を調査するために、異なる成分の発酵培地を調製した。異なるアミノ酸の発酵培地の配合は、Ｄ−ソルビトール５０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ（グルタミン酸ナトリウム、ロイシン、チロシンおよびプロリン）であり、溶媒は、脱イオン水であり、ｐＨ値は６．５であり、同じ条件下で、任意のアミノ酸も添加しないものを対照とした。
【００２６】
実施例１のグルコノバクターオキシダンスＣＣＴＣＣ  Ｎｏ．Ｍ２０８０６９種溶液を２％の体積濃度で発酵培地に接種し、２８℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養して、発酵液を遠心分離し、得られた菌体は、ソルビトールデヒドロゲナーゼＳＬＤＨの相対活性を検出するために使用される。
【００２７】
酵素活性の単位（Ｕ）は、２０ｇ／Ｌソルビトールの濃度で、３０℃，ｐＨ  ６．０のリン酸緩衝液システムで、Ｄ−ソルビトールを触媒して１．０μｍｏＬ  Ｌ−ソルボースを生成するのに必要な酵素量として定義される。Ｄ−ソルビトールおよびＬ−ソルボースの濃度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定した。
【００２８】
ＳＬＤＨ酵素活性検出操作プロセス：発酵液２０ｍＬを遠心力１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を廃棄し、１回洗浄し、遠心分離して上清を廃棄し、バッファー１００ｍＭＰＢＳを調製し、２０ｇ／Ｌのソルビトールおよび５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物をバッファーに溶解し、ｐＨを６．０に再調整し、１０ｍＬの反応システムを構築し、２８℃で３０分間反応させ、１ｍＬをサンプルを採取し、遠心分離して、ソルビトールの変換率およびソルボース生成物の収量を分析し、液相検出条件は、移動相は５ｍＭＨ２ＳＯ４溶液、流速は０．６ｍＬ／分、注入量は２０μＬ、カラム温度は６０℃、時間は１２分である。
【００２９】
結果は表１に示されたとおりである。
【００３０】
【表１】
2021514200.tif 000002
【００３１】
結果の分析：表１に示したように、培地に１ｇ／Ｌ異なるタイプのアミノ酸を添加し、振とうフラスコで２４時間発酵培養後、添加しなかった場合と比較して、その単位体積のソルビトールデヒドロゲナーゼの相対酵素活性は異なる程度の変化を有する。１ｇ／Ｌのチロシンおよびプロリンを添加した場合、ＳＬＤＨの活性はほとんど変化せず、グルタミン酸ナトリウムおよびロイシンを添加した場合、ブランク対照群と比較して、そのＳＬＤＨの酵素活性はそれぞれ２１％と１２％増加し、グルタミン酸ナトリウムの向上幅が比較的に大きい。これは、１ｇ／Ｌグルタミン酸ナトリウムの添加により、対照培地と比較して、単位体積あたりのソルビトールデヒドロゲナーゼの相対活性が２０％以上増加する可能性があることを示している。
【００３２】
実施例３：グルコノバクターオキシダンスを発酵培養してコエンザイムｐＱＱおよびＳＬＤＨの合成に対するグルタミン酸ナトリウムの添加の影響
グルタミン酸ナトリウムの酵母エキスの部分的な置換がグルコノバクターオキシダンスを発酵培養してソルビトールデヒドロゲナーゼおよびコエンザイムｐＱＱの合成に対する影響を調査するために、異なる成分の発酵培地を調製した。異なる窒素源の発酵培地の配合は、Ｄ−ソルビトール５０ｇ／Ｌ、酵母エキス（３０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌグルタミン酸ナトリウムであり、溶媒は、脱イオン水であり、ｐＨ値６．５であり、同じ条件下で、１ｇ／Ｌグルタミン酸ナトリウムを添加しないものを対照とした。
【００３３】
実施例１のグルコノバクターオキシダンスＣＣＴＣＣ  Ｎｏ．Ｍ２０８０６９種溶液を２％の体積濃度で発酵培地に接種し、２８℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養して、発酵液を遠心分離し、上清液はｐＱＱの相対累積濃度を検出するために使用され、菌体はＳＬＤＨの相対活性を検出するために使用され、前者はグルコース脱水素酵素リコンビナーゼ法で検出し、後者は高速液体クロマトグラフィーＨＰＬＣで検出し、結果は表２に示したとおりである。
【００３４】
【表２】
2021514200.tif 000003
【００３５】
結果の分析：表２に示したように、振とうフラスコで２４時間発酵培養後、異なる酵母エキスの発酵培地に１ｇ／Ｌのグルタミン酸ナトリウムを添加して、２４時間グルコノバクターオキシダンス発酵培養した後、上清のｐＱＱの濃度、単位体積のソルビトールデヒドロゲナーゼ酵素活性は、ブランク対照群と比較して、すべて異なる程度の著しく向上され、酵母エキスの濃度を５ｇ／Ｌに減少させると、１ｇ／Ｌグルタミン酸ナトリウムの添加は、発酵培養上清のコエンザイムｐＱＱの含有量は、従来の培地と比較して２０％以上向上し、単位体積のソルビトールデヒドロゲナーゼ活性は、従来の培地と比較して１０％向上し、同時に発酵培地中の酵母エキスの割合を効果的に減少し、発酵コストを削減することが保証できる。
【００３６】
実施例４：異なる時間帯にグルコノバクターオキシダンスを発酵培養してコエンザイムｐＱＱおよびＳＬＤＨの合成に対するグルタミン酸ナトリウムの添加の影響
異なる時間帯にグルコノバクターオキシダンスを発酵培養してコエンザイムｐＱＱおよびＳＬＤＨに対するグルタミン酸ナトリウムの添加の影響を調査するために、異なる成分の発酵培地を調製した。発酵培地の配合は、Ｄ−ソルビトール５０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４５ｇ／Ｌ、グルタミン酸ナトリウム１ｇ／Ｌであり、溶媒は、脱イオン水であり、ｐＨ値はナチュラルであり、同じ条件下で、１ｇ／Ｌグルタミン酸ナトリウムを添加しないものを対照とした。
【００３７】
実施例１グルコノバクターオキシダンスＣＣＴＣＣ  Ｎｏ．Ｍ２０８０６９種溶液をの体積濃度で発酵培地に接種し、２８℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養して、６時間ごとにサンプルを採取し、遠心分離し、上清中のｐＱＱ相対含有量およびＳＬＤＨの相対体積酵素活性を検出し、結果は表３に示されたとおりである。
【００３８】
【表３】
2021514200.tif 000004
【００３９】
結果の分析：表３に示したように、振とうフラスコで２４時間発酵培養後、異なる時間帯で、１ｇ／Ｌのグルタミン酸ナトリウムを発酵培地に添加した場合と比較して、発酵培養上清中のコエンザイムｐＱＱの含有量、単位体積ソルビトールデヒドロゲナーゼの酵素活性の測定値は、ブランク対照群と比較して大幅に改善され、酵母エキスの濃度が５ｇ／Ｌである場合、１ｇ／Ｌのグルタミン酸ナトリウムの添加は、異なる時間帯のコエンザイムＰＱＱの合成量が、対照培地と比較して３０％以上改善されて、異なる時間帯の単位体積ソルビトールデヒドロゲナーゼ活性が対照培地と比較して１０％以上改善されることを保証する。
【００４０】
実施例５：培地にグルタミン酸ナトリウムの添加による発酵からのグルコノバクターオキシダンス休止細胞による６ＮＳＬの触媒合成の活性の比較
グルタミン酸ナトリウムの酵母エキスの部分的な置換がグルコノバクターオキシダンスを発酵培養してソルビトールデヒドロゲナーゼおよびコエンザイムｐＱＱの合成に対する影響を調査するために、異なる成分の発酵培地を調製した。異なる窒素源の発酵培地の配合は、Ｄ−ソルビトール５０ｇ／Ｌ、酵母エキス（３０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４５ｇ／Ｌ、グルタミン酸ナトリウム１ｇ／Ｌであり、溶媒は、脱イオン水であり、ｐＨ値はナチュラルであり、同じ条件下で、１ｇ／Ｌグルタミン酸ナトリウムを添加しないものを対照とした。
【００４１】
実施例１のグルコノバクターオキシダンスＣＣＴＣＣ  Ｎｏ．Ｍ２０８０６９種溶液を２％の体積濃度で発酵培地に接種し、２８℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養して、発酵液を１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、グルコノバクターオキシダンス休止細胞を収集し、等量の水を加えて菌体を洗浄し、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を収集して、６ＮＳＬを触媒合成した。
【００４２】
変換システム（総容量５０ｍＬ）：バッフル付き振とうフラスコ５０ｍＬ／５００ｍＬ、添加最終濃度８０ｇ／Ｌ  Ｎ−ヒドロキシエチルグルコサミン、最終濃度５ｇ／ＬｍｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、７５ｇ／Ｌ湿菌体、脱イオン水を反応媒体として、触媒反応システムを構築した。具体的な反応条件は次のとおりである。温度１５℃、回転速度２２０ｒｐｍ、２ｍＮａＯＨでアルカリを調整して、変換溶液のｐＨ値を４．５〜５．０に維持させた。２４時間の形質転換後、形質転換を停止し、形質転換溶液を１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を取り、ＨＰＬＣ検出方法と通し、６ＮＳＬの累積濃度は、表４に示したとおりである。
【００４３】
【表４】
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【００４４】
結果の分析：表４に示したように、
異なる酵母エキスの発酵培地に１ｇ／Ｌのグルタミン酸ナトリウムを添加して、グルコノバクターオキシダンスを２４時間発酵培養した後、得られた休止細胞触媒基質Ｎ−ヒドロキシエチルグルコサミンにより合成されたミグリトール前駆体６ＮＳＬの累積濃度は、ブランク対照群と比較して異なる程度に改善された。単位体積では、１ｇ／Ｌのグルタミン酸ナトリウムを添加した培地により発酵して得られたグルコノバクターオキシダンス休止細胞の６ＮＳＬの触媒合成の累積濃度は、グルタミン酸ナトリウム無添加の高濃度の酵母エキス（５〜３０ｇ／Ｌ）発酵培地により得られた休止細胞活性が１０％以上改善され、同時に５ｇ／Ｌの酵母エキスの濃度では、１ｇ／Ｌグルタミン酸ナトリウムを添加により、基質６ＮＳＬの累積濃度は５３．６ｇ／Ｌに達し、３０ｇ／Ｌの酵母エキスの濃度での累積状況（４５．８ｇ／Ｌ）より高く、その結果、１ｇ／Ｌの安価なグルタミン酸ナトリウムは、発酵培地中の酵母エキスを効果的に置き換えることができ、菌体の効率的な形質転換能力を確保することを前提として、発酵コストが効果的に削減できる。
【図１】
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【国際調査報告】
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