(57)【要約】  本発明は、関心対象の抗体のフレームワーク領域および少なくとも１つの隣接相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを生成する新規方法に関する。これらのライブラリーは、親抗体と比較して改善された特性を有する成熟抗体を得るための、アフィニティ成熟法における使用に適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
各々、既知の親ＣＤＲを含む関心対象の抗体のフレームワーク領域および少なくとも１つの隣接相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを生成する方法であって、該親ＣＤＲが既知の親ＣＤＲポリヌクレオチド配列にコードされ、該方法は、
ｉ）抗体の第一のフレームワーク領域をコードするポリヌクレオチドを提供し、
ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドに関する第一のＰＣＲプライマーを提供し、
ｉｉｉ）各々、要素Ａ−Ｂ−Ｃからなるポリヌクレオチドの混合物を提供し、
ここで
Ａ）は第一のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
各Ｂ）は、親ＣＤＲポリヌクレオチド配列と同じ数のコドンを含むポリヌクレオチドライブラリーのメンバーであり、ここで、該ライブラリーのメンバーは、少なくとも１つのランダム化コドンを含むよう設計されており、そして
Ｃ）は第二のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである、
ｉｖ）要素（Ｃ）に関する第二のＰＣＲプライマーを提供し
ｖ）ポリヌクレオチド（ｉ）〜（ｉｖ）に基づくＰＣＲを実行し、それによってポリヌクレオチドのライブラリーを得る、
そしてここでこうしたＰＣＲは、親ＣＤＲポリヌクレオチド配列の非存在下で行われる
ことで特徴づけられる、前記方法。
【請求項２】
前記の第一のフレームワーク領域は、ＦＷ１またはＦＷ４のいずれかであり、前記の第二のフレームワーク領域は、該第一のものがＦＷ１であればＦＷ２であるか、または該第一のものがＦＷ４であればＦＷ３であり、そして前記ＣＤＲは、該第一のフレームワーク領域がＦＷ１であればＣＤＲ１であるか、または該第一のフレームワーク領域がＦＷ４であればＣＤＲ３である、請求項１の方法。
【請求項３】
前記の第一のフレームワーク領域がＦＷ１であり、前記の第二のフレームワーク領域がＦＷ２であり、前記の第一のプライマーがＦＷ１に関する順方向プライマーであり、そして前記の第二のプライマーがＦＷ２に関する逆方向プライマーであり、そして前記ＣＤＲがＣＤＲ１である、請求項１または２の方法。
【請求項４】
前記の第一のフレームワーク領域がＦＷ４であり、前記の第二のフレームワーク領域がＦＷ３であり、前記の第一のプライマーがＦＷ４に関する逆方向プライマーであり、そして前記の第二のプライマーがＦＷ３に関する順方向プライマーであり、そして前記親ＣＤＲがＣＤＲ３である、請求項１または２の方法。
【請求項５】
各々、第一および第二の既知の親ＣＤＲを含む関心対象の抗体のフレームワーク領域および２つの隣接相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを生成する方法であって、第一および第二の親ＣＤＲが、第一および第二の既知のＣＤＲポリヌクレオチド配列によってコードされ、該方法は、
ｉ）抗体の第一のフレームワーク領域をコードするポリヌクレオチドを提供し、
ｉｉ）各々、要素Ａ−Ｂ−Ｃからなるポリヌクレオチドの第一の混合物を提供し、
ここで
Ａ）は該第一のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
各Ｂ）は、該第一の親ＣＤＲと同じ数のコドンを含む第一のポリヌクレオチドライブラリーのメンバーであり、ここで、該ライブラリーのメンバーは、少なくとも１つのランダム化コドンを含むよう設計されており、そして
Ｃ）は第二のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである、
ｉｉｉ）要素Ｃ）に関する第一のＰＣＲプライマーを提供し、
ｉｖ）各々、要素Ａ’−Ｂ’−Ｃ’からなるポリヌクレオチドの第二の混合物を提供し、
ここで
Ａ’）は該第一のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
各Ｂ’）は、該第二の親ＣＤＲポリヌクレオチド配列と同じ数のコドンを含む第二のポリヌクレオチドライブラリーのメンバーであり、ここで、該ライブラリーのメンバーは、少なくとも１つのランダム化コドンを含むよう設計されており、そして
Ｃ’）は第三のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである
ｖ）要素Ｃ’）に関する第二のＰＣＲプライマーを提供し、
ｖｉ）ポリヌクレオチド（ｉ）〜（ｖ）に基づくＰＣＲを実行し、それによってポリヌクレオチドのライブラリーを得る、
そしてここでこうしたＰＣＲは、親ＣＤＲポリヌクレオチド配列の非存在下で行われる
ことで特徴づけられる、前記方法。
【請求項６】
前記の第一のフレームワーク領域がＦＷ２であり、前記の第二のフレームワーク領域がＦＷ１であり、前記の第三のフレームワーク領域がＦＷ３であり、前記第一の親ＣＤＲがＣＤＲ１であり、前記第二の親ＣＤＲがＣＤＲ２であり、要素Ｃ）に関する前記の第一のプライマーがＦＷ１に関する順方向プライマーであり、要素Ｃ’）に関する前記の第二のプライマーがＦＷ３に関する逆方向プライマーである、請求項５の方法。
【請求項７】
前記の第一のフレームワーク領域がＦＷ３であり、前記の第二のフレームワーク領域がＦＷ２であり、前記の第三のフレームワーク領域がＦＷ４であり、該第一の親ＣＤＲがＣＤＲ２であり、該第二の親ＣＤＲがＣＤＲ３であり、要素Ｃ）に関する前記の第一のプライマーがＦＷ２に関する順方向プライマーであり、要素Ｃ’）に関する前記の第二のプライマーがＦＷ４に関する逆方向プライマーである、請求項５の方法。
【請求項８】
要素Ｂ）において、親ＣＤＲポリヌクレオチド配列の１つのコドンまたは２つのコドンがランダム化されている、請求項１〜７のいずれか一項の方法。
【請求項９】
抗体の可変鎖の１つのランダム化ＣＤＲまたは２つの隣接ランダム化ＣＤＲをコードする請求項１〜８のいずれか一項にしたがって得られるポリヌクレオチドのライブラリーであって、得られるライブラリーにおいて、他の（ランダム化）ポリヌクレオチド配列に対する親ポリヌクレオチド配列の比が、１つのＣＤＲがランダム化されている場合は１：１０６またはそれ未満であり、そして２つのＣＤＲがランダム化されている場合には１：１０７またはそれ未満である、前記ライブラリー。
【請求項１０】
抗体の可変鎖をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを生成するための請求項９記載のライブラリーの使用であって、可変鎖が可変Ｈ鎖または可変Ｌ鎖より選択される、前記使用。
【請求項１１】
請求項３、４、６および７にしたがって生成されるライブラリーに基づいて重複ＰＣＲを実行することによって、抗体の可変鎖をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを生成するための方法。
【請求項１２】
請求項１１にしたがって得られる抗体の可変鎖をコードするポリヌクレオチドのライブラリーであって、可変鎖がランダム化ＣＤＲ１、ランダム化ＣＤＲ２およびランダム化ＣＤＲ３を含み、そして得られるライブラリーにおいて、ライブラリー中の他のポリヌクレオチド配列に対する親ポリヌクレオチド配列の比が１：５ｘ１０７またはそれ未満である、前記ライブラリー。
【請求項１３】
抗体が第一の可変鎖および第二の可変鎖を含む抗体ライブラリーを生成するための方法であって、請求項１２記載の抗体の第一の可変鎖をコードするポリヌクレオチドライブラリーが発現され、そして前記抗体の第二の可変鎖と組み合わせられる、前記方法。
【請求項１４】
請求項１３にしたがって生成されたライブラリーから、第一の可変鎖および第二の可変鎖を含む抗体を選択する方法であって、選択された抗体が既知の親ＣＤＲを含む親抗体に比較して、改善された結合特性を有する、前記方法。
【請求項１５】
選択された抗体が、親抗体に比較して少なくとも２０％の解離複合体半減期ｔ／２の選択された増加を示す、請求項１４の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関心対象の抗体のフレームワーク領域および少なくとも１つの隣接相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを生成する新規方法に関する。これらのライブラリーは、親抗体に比較して改善された特性を持つ成熟抗体を得るための、アフィニティ成熟法における使用に適している。
【０００２】
本明細書において、特許出願および製造者のマニュアルを含む多くの文書が引用される。これらの文書の開示は、本発明の特許性に関して関連するとは見なされないが、その全体が本明細書に援用される。より具体的には、すべての言及される文書は、各個々の文書が特にそして個々に本明細書に援用されると示されるのと同じ度合いまで、本明細書に援用される。
【発明の概要】
【０００３】
抗体は、診断および療法適用に広く用いられている。このため、こうした抗体の特性を最適化するための方法、例えばターゲット抗原に対するアフィニティを増加させることへの開発にかなりの努力が払われてきた。抗体アフィニティの増加は、特異性が改善されているため、減少した抗体および／または抗原濃度で、抗体のパフォーマンスを増進させると期待される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアフィニティ成熟のための異なる方法が知られており、これには、細胞に基づくディスプレイ、例えば酵母細胞表面ディスプレイ、ファージディスプレイまたは細胞不含ディスプレイ、例えばリボソームディスプレイが含まれる。これらの方法は、非特異的結合剤を排除し、そして高アフィニティの特異的結合剤を同定するため、陰性および陽性選択の実行を可能にする。
【０００４】
しかし、既知のアフィニティ成熟法の不都合な点は、ポリヌクレオチドライブラリーに突然変異誘発されていない親配列がしばしば多量に存在することであり、これによって、改善された抗体の選択および同定は、時間が掛かり、そして労力を要するものとなる。いくつかの場合、アフィニティ成熟法を用いることによっては、改善された抗体の同定はまったく不可能でさえあった。本発明者らは、ここで、望ましくない多量の親配列を含有しないライブラリーを提供することによって、先行技術に関連する不都合な点を克服するための方法を見出している。
【０００５】
本発明は、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）に対する抗体を用いて例示されているが、方法は、他の抗原に対して向けられる抗体にも転用可能であることが意図される。
心臓トロポニンＴは、心疾患患者において広く用いられるバイオマーカーである。心疾患患者におけるその有用性は、近年、Ｗｅｓｔｅｒｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ  １４（２０１７）  ４７３−４８３）によって概説されてきている。ｃＴｎＴの使用は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）と推測される患者においてよく確立されているが、トロポニン測定はまた、他の急性および非急性セッティングでも用いられている。ＡＭＩと推測される患者において、迅速な治療およびさらなる診断評価を可能にするため、早期の意思決定が非常に重要である。
【０００６】
トロポニンに関するより新しい高感度のアッセイは、明確により低い濃度の検出も可能にする。これらのアッセイおよび非常に低いカットオフ濃度を用いた、いくつかの迅速な診断戦略が、急性心臓ケアにおける診断を改善することが報告されてきている。さらに、例えば心不全、肺塞栓症、または安定冠動脈疾患患者におけるバイオマーカーとしてのトロポニンアッセイの非冠動脈および非急性適用は、近い将来実現しそうであり、そして個体リスク階層化を改善する可能性もある。
【０００７】
心臓トロポニンＴは、通常、サンドイッチ型イムノアッセイで測定され、ここで、少なくとも１つの抗体を用いて、ｃＴｎＴを捕捉し、そして少なくとも第二の（標識）抗体を用いて、試料中のｃＴｎＴを検出する。これはまた、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツによって販売されるｃＴｎＴに関する第五世代アッセイにも当てはまる。欧州動物細胞培養コレクション（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｃｕｒｅｓ）、英国に寄託されるようなハイブリドーマクローン７．１  Ａ  １２．２−２２（ＥＣＡＣＣ  ８９０６０９０１）によって産生されるモノクローナル抗体１２．１Ａ１１．１１−７は、ｃＴｎＴに関するアッセイにおける最適な検出抗体として、ほぼ３０年に渡って用いられてきている。この抗体が１９８９年に生成されてから、ｃＴｎＴの検出のためにより優れたモノクローナル抗体は浮上してきていない。
【０００８】
過去数年にわたって、例えばこうしたアッセイで用いる検出抗体の標識のための洗練された技術に基づいて、多様なトロポニンを測定するためのさらにより高感度のアッセイが開発されてきている。
【０００９】
多くの研究によって、ＡＭＩと推測される患者のトリアージを改善する潜在能力に関して、ならびに臨床診断の他の分野におけるその有用性に関しての両方で、トロポニンに関する多様な高感度アッセイが評価されてきている。
【００１０】
最も高感度のトロポニンアッセイさえ、健康な個体の特定の割合で、トロポニンを測定できないと報告されてきている（例えばＷｅｓｔｅｒｍａｎｎら、上記を参照されたい）。明らかに、アッセイ感度は、例えばｃＴｎＴの検出において最も重要であり、そしてこの目的に向けた改善が非常に望ましいであろう。
【００１１】
現在、非常に驚くべきことに、本明細書の請求項において定義するように、アフィニティ成熟のための新規方法に基づいて、抗体１２．１Ａ１１．１１−７の相補性決定領域（ＣＤＲ）において特定の突然変異を有する抗体を選択し、そして同定することも可能であることが見出されてきており、該抗体は、一方で、ｃＴｎＴと抗体の複合体形成に負の影響を及ぼさず、ｃＴｎＴおよびこうした突然変異抗体の間に形成される複合体の安定性に関して、有意な改善を示す。これらの驚くべき特性を通じて、優れた感受性を持つｃＴｎＴに関するアッセイが実現可能である。
【００１２】
抗体１２．１Ａ１１．１１−７に成功裡に適用されてきたアフィニティ成熟法を、本開示に基づく診断および療法抗体を含む異なる抗体に転用してもよい。
したがって、本発明は、一連の増幅反応を実行することによって、抗体の可変鎖をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを生成する新規方法に関する。これらのポリヌクレオチドライブラリーを、ターゲット抗原に対する増加したアフィニティなどの改善された特性を持つ抗体を同定するための選択法において用いてもよい。
【００１３】
本発明の目的は、既知の親相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変鎖を有する親抗体に比較して、改善された特性を有する抗体を生成することであり、ここでこれらの既知のＣＤＲは、既知のＣＤＲポリヌクレオチド配列にコードされる。
【００１４】
第一の工程において、前記親抗体の可変鎖の１つのランダム化ＣＤＲまたは前記親抗体の可変鎖の２つの隣接ランダム化ＣＤＲをコードする、複数のポリヌクレオチドライブラリーを生成する。これらのライブラリーは、ＣＤＲのランダム化のそれぞれの度合いに応じて、約１０７〜約１０１１メンバー、または約１０８〜約１０１０メンバーのサイズを有してもよい。
【００１５】
これらのライブラリーを組み合わせることによって、さらなるポリヌクレオチドライブラリーを生成する。このライブラリーのメンバーは、ランダム化可変鎖、すなわち前記親抗体の可変鎖のランダム化ＣＤＲ１、ランダム化ＣＤＲ２およびランダム化ＣＤＲ３をコードする。さらに、ライブラリーメンバーは、可変鎖のフレームワーク領域ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３およびＦＷ４、特に親抗体の可変鎖のフレームワーク領域ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３およびＦＷ４をコードしてもよい。このライブラリーは、ＣＤＲに関するランダム化のそれぞれの度合いに応じて、約１０６〜約１０２２メンバー、または約１０１１〜約１０１３、または約２ｘ１０１１〜５ｘ１０１２メンバーのサイズを有してもよい。
【００１６】
本発明のポリヌクレオチドライブラリーは、親ＣＤＲポリヌクレオチド配列を実質的に含まない。これは、親ＣＤＲポリヌクレオチド配列が存在しないライブラリーを生成することによって達成可能である。したがって、ライブラリー中に親ＣＤＲポリヌクレオチド配列を含む個々のライブラリーメンバーの量は、１つのランダム化ＣＤＲポリヌクレオチド配列を含むライブラリーに関して、約１：１０６もしくはそれ未満、１：５ｘ１０５もしくはそれ未満、または約１：１０５もしくはそれ未満、あるいは２つのランダム化ＣＤＲポリヌクレオチド配列を含むライブラリーに関しては約１：１０７もしくはそれ未満、あるいは３つのランダム化ＣＤＲポリヌクレオチド配列を含むライブラリーに関しては約１：５ｘ１０７もしくはそれ未満、または約１：１０８もしくはそれ未満である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１−１】１つまたはそれより多い重鎖ＣＤＲ内にランダムアミノ酸置換を含むライブラリーの構築。図１Ａ：突然変異体ライブラリーの構築に必要な重鎖断片の産生（工程１）。第一ラウンド（ＰＣＲ１）において、それぞれ、断片１、３および４に対応する３つの異なる重鎖断片を、対応するプライマーセットの補助によって生成した。薄いグレーのストレッチはＣＤＲを示す。主鎖配列を黒で示す。水平の矢印は用いるプライマーを示す。垂直の矢印はＰＣＲの結果を示す。図中で×印で示される短い４２ｂｐオリゴヌクレオチド（断片２）は、ＰＣＲによっては得られず、別個に化学合成された。
【図１−２】１つまたはそれより多い重鎖ＣＤＲ内にランダムアミノ酸置換を含むライブラリーの構築。図１Ｂ：ＣＤＲ単一アミノ酸ランダム化によるＨＣライブラリー合成。第二の工程ＰＣＲ２において、図１Ａに記載するように得られた４つの断片は、テンプレートとして働いた（黒線）。×印を含む水平の矢印は、各々、各ＣＤＲコドン位に関して縮重されているＮＮＫコドンを含む、ポリヌクレオチドライブラリーを示す。これらのポリヌクレオチドライブラリーは、さらに、必要とされ、そして示されるように、工程１の断片の１つまたは２つにハイブリダイズ可能な配列ストレッチを含む。順方向および逆方向プライマー（小さい矢印）は、それぞれ、それぞれのＰＣＲを実行するために用いられた。
【図１−３】１つまたはそれより多い重鎖ＣＤＲ内にランダムアミノ酸置換を含むライブラリーの構築。図１Ｃ：ライブラリー合成の最終工程。工程１の断片の１つまたは２つにハイブリダイズ可能なさらなる配列ストレッチは、ＨＣライブラリーの産生における最終工程、すなわちＰＣＲ２の４つの産物すべてを用いた重複ＰＣＲを実行するために必要である。この重複ＰＣＲにおいて、末端プライマー（Ｆ１Ａ；Ｒ１Ａ）を用いて、そして断片自体がメガプライマーとして作用する。
【図２】ペリプラズム（ｐｅｒｉｐｌａｓｍａｔｉｃ）Ｆａｂ発現のためのベクターマップ。示す図中の説明は、自明であると考える。
【図３】ｃＴｎＴ結合Ｆａｂ断片のスクリーニングのためのＥＬＩＳＡセットアップ。ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレート（ＳＡプレート）を用いて、ビオチン化心臓トロポニンＴ（ｂｉ−ｃＴｎＴ）を固相に結合させる。組換え抗ｃＴｎＴ重鎖を含むＦａｂ断片（＜ｃＴｎＴ＞−Ｆａｂ）はＴｎＴに結合し、そしてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗ヒトＦａｂ抗体（抗ｈｕＦａｂ−ＰＯＤ）を通じて検出される。
【図４】Ｅｌｅｃｓｙｓサンドイッチアッセイ。アッセイセットアップを示すスキームを示す。ビオチン化（ｂｉ）捕捉抗体をストレプトアビジン（ＳＡ）コーティングビーズに付着させる。多様なアフィニティ成熟抗ｃＴｎＴ抗体をルテニル化（Ｒｕ）し、そしてアフィニティ成熟の効果をＥＣＬ分析によって調べた。
【図５】真正特定因子および特定因子誘導体に関するＥＣＬシグナルカウント。真正抗ｃＴｎＴ抗体および突然変異体抗体（組み合わせ１２は、それぞれ、表２に用いるＦａｂ断片識別子を指す）のカウントを示す。薄いグレーのバーは希釈マルチアッセイ試薬中のアッセイブランク値（ノイズ）を示し、濃いグレーのバーは商業的ｃＴｎＴ  Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイの標準物質１で得たカウント（シグナル）を示す。抗体組み合わせ１２は、改善されたシグナル対ノイズ比を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
１つの態様において、１つのＣＤＲをランダム化させ、そして得られたライブラリーにおける他の（ランダム化）ポリヌクレオチド配列に対する親ポリヌクレオチド配列の比は１：１０６またはそれ未満である。１つの態様において、２つのＣＤＲをランダム化させ、そして得られたライブラリーにおける他の（ランダム化）ポリヌクレオチド配列に対する親ポリヌクレオチド配列の比は１：１０７またはそれ未満である。１つの態様において、３つのＣＤＲをランダム化させ、そして得られたライブラリーにおける他のポリヌクレオチド配列に対する親ポリヌクレオチド配列の比は１：５ｘ１０７またはそれ未満である。
【００１９】
既知の方法にしたがって抗体ライブラリーを生成するために、ランダム化可変鎖をコードするポリヌクレオチドライブラリーを用いてもよい。これらの抗体ライブラリーから、親抗体に比較して改善された特性を有する個々の抗体の効率的な選択を行ってもよい。
【００２０】
したがって、本発明の第一の側面は、各々、関心対象の抗体のフレームワーク領域および少なくとも１つの隣接相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを生成する方法であって、抗体が、既知の親ＣＤＲポリヌクレオチド配列にコードされる既知の親ＣＤＲを含み、
ｉ）抗体の第一のフレームワーク領域をコードするポリヌクレオチドを提供し、
ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドに関する第一のＰＣＲプライマーを提供し、
ｉｉｉ）各々、要素Ａ−Ｂ−Ｃからなるポリヌクレオチドの混合物を提供し、
ここで
Ａ）は第一のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
各Ｂ）は、親ＣＤＲポリヌクレオチド配列と同じ数のコドンを含むポリヌクレオチドライブラリーのメンバーであり、ここで、前記ライブラリーのメンバーは、少なくとも１つのランダム化コドン、例えば１つのランダム化コドンまたは２つのランダム化コドンを含むよう設計されており、そして
Ｃ）は第二のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである、
ｉｖ）要素Ｃ）に関する第二のＰＣＲプライマーを提供し、
ｖ）ポリヌクレオチド（ｉ）〜（ｉｖ）に基づくＰＣＲを実行し、それによってポリヌクレオチドのライブラリーを得て、そしてここでこうしたＰＣＲは、親ＣＤＲポリヌクレオチド配列の非存在下で行われる
ことで特徴づけられる、前記方法に関する。
【００２１】
この側面にしたがって、第一のフレームワーク領域は、ＦＷ１またはＦＷ４のいずれかであり、前記の第二のフレームワーク領域は、第一のものがＦＷ１であればＦＷ２であるか、または第一のものがＦＷ４であればＦＷ３であり、そして前記ＣＤＲは、第一のフレームワーク領域がＦＷ１であればＣＤＲ１であるか、または第一のフレームワーク領域がＦＷ４であればＣＤＲ３である。
【００２２】
したがって、特定の態様において、第一のフレームワーク領域はＦＷ１であり、前記の第二のフレームワーク領域はＦＷ２であり、前記の第一のプライマーはＦＷ１に関する順方向プライマーであり、そして前記の第二のプライマーはＦＷ２に関する逆方向プライマーであり、そして前記ＣＤＲはＣＤＲ１である。
【００２３】
この側面のさらなる特定の態様において、第一のフレームワーク領域はＦＷ４であり、前記の第二のフレームワーク領域はＦＷ３であり、前記の第一のプライマーはＦＷ４に関する逆方向プライマーであり、そして前記の第二のプライマーはＦＷ３に関する順方向プライマーであり、そして前記親ＣＤＲはＣＤＲ３である。
【００２４】
本発明のさらなる側面は、各々、関心対象の抗体のフレームワーク領域および２つの隣接相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを生成する方法であって、抗体が、第一および第二の既知の親ＣＤＲポリヌクレオチド配列によってコードされる、既知の第一および第二の親ＣＤＲを含み、
ｉ）抗体の第一のフレームワーク領域をコードするポリヌクレオチドを提供し、
ｉｉ）各々、要素Ａ−Ｂ−Ｃからなるポリヌクレオチドの第一の混合物を提供し、
ここで
Ａ）は第一のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
各Ｂ）は、第一の親ＣＤＲポリヌクレオチド配列と同じ数のコドンを含む第一のポリヌクレオチドライブラリーのメンバーであり、ここで、前記ライブラリーのメンバーは、少なくとも１つのランダム化コドン、例えば１つのランダム化コドンまたは２つのランダム化コドンを含むよう設計されており、そして
Ｃ）は第二のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである、
ｉｉｉ）要素Ｃ）に関する第一のＰＣＲプライマーを提供し、
ｉｖ）各々、要素Ａ’−Ｂ’−Ｃ’からなるポリヌクレオチドの第二の混合物を提供し、
ここで
Ａ’）は前記の第一のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
各Ｂ’）は、第二の親ＣＤＲポリヌクレオチド配列と同じ数のコドンを含む第二のポリヌクレオチドライブラリーのメンバーであり、ここで、前記ライブラリーのメンバーは、少なくとも１つのランダム化コドン、例えば１つのランダム化コドンまたは２つのランダム化コドンを含むよう設計されており、そして
Ｃ’）は第三のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである、
ｖ）要素Ｃ’）に関する第二のＰＣＲプライマーを提供し、
ｖｉ）ポリヌクレオチド（ｉ）〜（ｖ）に基づくＰＣＲを実行し、それによってポリヌクレオチドのライブラリーを得る、そしてここでこうしたＰＣＲは、親ＣＤＲポリヌクレオチド配列の非存在下で行われる
ことで特徴づけられる、前記方法に関する。
【００２５】
この側面の特定の態様において、第一のフレームワーク領域はＦＷ２であり、前記の第二のフレームワーク領域はＦＷ１であり、前記の第三のフレームワーク領域はＦＷ３であり、第一の親ＣＤＲはＣＤＲ１であり、第二の親ＣＤＲはＣＤＲ２であり、要素Ｃ）に関する前記の第一のプライマーはＦＷ１に関する順方向プライマーであり、要素Ｃ’）に関する前記の第二のプライマーはＦＷ３に関する逆方向プライマーである。
【００２６】
この側面のさらなる特定の態様において、第一のフレームワーク領域はＦＷ３であり、前記の第二のフレームワーク領域はＦＷ２であり、前記の第三のフレームワーク領域はＦＷ４であり、第一の親ＣＤＲはＣＤＲ２であり、第二の親ＣＤＲはＣＤＲ３であり、要素Ｃ）に関する前記の第一のプライマーはＦＷ２に関する順方向プライマーであり、要素Ｃ’）に関する前記の第二のプライマーはＦＷ４に関する逆方向プライマーである。
【００２７】
用語「親抗体」または「親免疫グロブリン」は、本明細書において、それぞれ、既知のまたは非修飾抗体を指す。本開示に例示するように、親抗体をコードするポリヌクレオチド配列の特定の部分を用いて、ポリヌクレオチドライブラリーを生成する。
【００２８】
「親ＣＤＲ」は、既知の、非修飾または親抗体のＣＤＲ配列である。「親ＣＤＲポリヌクレオチド配列」は、親抗体のＣＤＲをコードするポリヌクレオチド配列である。
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書において、複数のヌクレオチド、通常、少なくとも約１０ヌクレオチドを含む分子を含み、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、およびヌクレオチド類似体を含む。特定の態様において、ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。
【００２９】
用語「ハイブリダイズ可能」は、当該技術分野において、一本鎖ポリヌクレオチドが、適切な条件下、例えば温度、イオン強度およびインキュベーション時間の適切な条件下で、相補ポリヌクレオチドにアニーリングして、それによって二本鎖ポリヌクレオチドを形成することと理解される。本発明にしたがって、用語「ハイブリダイゼーション可能」は、特に、増幅反応の、例えば、本明細書に記載するようなＰＣＲの条件下で、一本鎖ポリヌクレオチドが相補ポリヌクレオチドにアニーリングして、それによって二本鎖ポリヌクレオチドを形成することを示す。増幅反応、例えばＰＣＲにおいて、鎖アニーリングに適した条件は、当該技術分野に周知である。
【００３０】
上述のような方法は、要素Ａ−Ｂ−ＣまたはＡ’−Ｂ’−Ｃ’からなるポリヌクレオチド混合物の使用を伴う。要素Ｂは、ランダム化しようとする特定の親ＣＤＲポリヌクレオチド配列と同じ数のコドンを含み、そして少なくとも１つのランダム化コドン、例えば１つのランダム化コドンまたは２つのランダム化コドンを含むよう設計される。特定の態様において、要素Ｂは１つのランダム化コドンを含む。これらのポリヌクレオチド混合物は、既知の方法にしたがった化学的ポリヌクレオチド合成によって提供されてもよい。
【００３１】
特定の態様において、要素Ｂの混合物は、１つのＣＤＲポリヌクレオチド配列とともに、異なるランダム化コドンを含むように設計されている、複数のサブセットで構成される。したがって、ＣＤＲポリヌクレオチド配列が１０コドン、すなわち３０ヌクレオチドを含む場合、要素Ｂのそれぞれの混合物は、最大１０のサブセットで構成され、各々は、１つの異なるランダム化コドンを含むように設計されている。したがって、特定の態様において、要素Ｂの混合物は、各々、１つのランダム化コドンまたは２つのランダム化コドンを含み、それによって、ＣＤＲポリヌクレオチド配列のすべてのコドンのランダム化を含む、複数のサブセットを含むように設計されている。
【００３２】
ポリヌクレオチド混合物Ａ−Ｂ−ＣまたはＡ’−Ｂ’−Ｃ’の要素Ｂは、少なくとも１つのランダム化コドンを含むように設計される。ランダム化コドンは、限定されるわけではないが、ＮＮＮ、式中ＮはＡ／Ｃ／Ｇ／Ｔを意味する、ＮＮＢ、式中ＮはＡ／Ｃ／Ｇ／Ｔを意味し、そしてＢはＣ／Ｇ／Ｔを意味する、ＮＮＫ、式中ＮはＡ／Ｃ／Ｇ／Ｔを意味し、そしてＫはＧ／Ｔを意味する、またはＮＮＳ、式中ＮはＡ／Ｃ／Ｇ／Ｔを意味し、そしてＳはＣ／Ｇを意味する、を含む、任意の適切なランダム化コドンより選択されてもよい。特定の態様において、ランダム化コドンはＮＮＫコドンである。しかし、ランダム化が親ＣＤＲポリヌクレオチド配列を生成しないように設計されることに注目すべきである。
【００３３】
本発明のさらにさらなる側面は、上述のような方法にしたがって得られうるポリヌクレオチドのライブラリーであり、ここでポリヌクレオチドは、可変抗体鎖、例えば可変Ｈ鎖または可変Ｌ鎖の１つのランダム化ＣＤＲまたは２つのランダム化ＣＤＲをコードする。本発明者らは、こうしたライブラリーが親ＣＤＲポリヌクレオチド配列を実質的に含まないことを見出してきている。ライブラリーは、１つのランダム化ＣＤＲ、例えばＣＤＲ１またはＣＤＲ３をコードするポリヌクレオチド、あるいは２つの隣接ランダム化ＣＤＲ、例えばＣＤＲ１およびＣＤＲ２、またはＣＤＲ２およびＣＤＲ３の組み合わせをコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。これらのライブラリーを、例えば重複ＰＣＲまたは同等の増幅反応によって組み合わせて、３つのランダム化ＣＤＲ、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を有する可変抗体鎖をコードするポリヌクレオチドライブラリーを生成してもよい。
【００３４】
したがって、抗体の可変鎖のランダム化変異体、例えばランダム化可変Ｈ鎖またはランダム化可変Ｌ鎖をコードするポリヌクレオチドライブラリーを生成するため、各々、抗体の１つのＣＤＲまたは２つの隣接ＣＤＲのランダム化変異体をコードする上述のようなライブラリー、特にいくつかのライブラリーの組み合わせを用いてもよい。特定の態様において、可変鎖はランダム化可変Ｈ鎖である。
【００３５】
本発明のさらにさらなる側面は、上述のように生成されたライブラリーに基づく重複ＰＣＲまたは同等の増幅反応を実行することによって、抗体の可変鎖をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを生成するための方法に関する。１つの態様において、例えば出発材料として、ランダム化ＣＤＲ１を含むライブラリー、ランダム化ＣＤＲ１およびランダム化ＣＤＲ２を含むライブラリー、ランダム化ＣＤＲ２およびランダム化ＣＤＲ３を含むライブラリー、ならびにランダム化ＣＤＲ３を含むライブラリーを用いる。
【００３６】
ポリヌクレオチド配列ライブラリーのメンバーは、既知の親ＣＤＲポリヌクレオチド配列、特に既知のＣＤＲ１ポリヌクレオチド配列、既知のＣＤＲ２ポリヌクレオチド配列および既知のＣＤＲ３ポリヌクレオチド配列を含む、関心対象の抗体の可変鎖をコードするポリヌクレオチド配列の変異体である。特定の態様において、ライブラリーは、親ＣＤＲポリヌクレオチド配列、例えば親ＣＤＲ１ポリヌクレオチド配列、親ＣＤＲ２ポリヌクレオチド配列および／または親ＣＤＲ３ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを実質的に含まない。
【００３７】
したがって、本発明のさらにさらなる側面は、上述のような方法にしたがって得られうる抗体の可変鎖をコードするポリヌクレオチドのライブラリーであって、可変鎖がランダム化ＣＤＲ１、ランダム化ＣＤＲ２およびランダム化ＣＤＲ３を含み、そしてライブラリーが親ＣＤＲポリヌクレオチド配列を実質的に含まない、前記ライブラリーに関する。
【００３８】
いくつかの態様において、ライブラリーは、可変鎖、例えば抗体のＨ鎖または抗体のＬ鎖をコードし、ここで、抗体は、既知の親ＣＤＲ１ポリヌクレオチド配列、既知の親ＣＤＲ２ポリヌクレオチド配列および既知の親ＣＤＲ３ポリヌクレオチド配列を含む既知の親ポリヌクレオチド配列によってコードされる関心対象の抗体であり、そしてライブラリーは既知の親ＣＤＲポリヌクレオチド配列を実質的に含まない。
【００３９】
本発明のさらにさらなる側面は、抗体ライブラリーを生成する方法であって、抗体が第一の可変鎖および第二の可変鎖を含み、上述のような前記抗体の第一の可変鎖をコードするポリヌクレオチドライブラリーが転写／翻訳系、例えば細胞に基づく系、ファージ系またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ系において発現され、そして前記抗体の第二の可変鎖と、例えば第二の可変鎖をコードするポリヌクレオチドを同時発現することによって、または第二の可変鎖をタンパク質として付加することによって、組み合わされる、前記方法に関する。抗体ライブラリーを生成するための適切な系が当該技術分野に知られる。特に適切な系は、リボソームｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳／転写系、例えばＳｔａｆｆｏｒｄら，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．，  ２０１４，  ２７  （４）：  ９７−１０９に記載されるような系である。
【００４０】
本発明のさらにさらなる側面は、上述のような抗体のライブラリーから、第一の可変鎖および第二の可変鎖を含む抗体を選択する方法であって、選択される抗体が、既知の親ＣＤＲを含む既知の親可変鎖を含む親抗体に比較して、改善された結合特性を有する、前記方法に関する。この方法は、工程：
ａ）本発明記載の抗体の第一の可変鎖をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを転写／翻訳系で発現し、
ｂ）前記抗体の第一の可変鎖の発現されたライブラリーと前記抗体の第二の可変鎖を組み合わせ、そして
ｃ）改善された結合特性を有する第一の可変鎖および第二の可変鎖を含む抗体を選択する
工程を含んでもよい。
【００４１】
選択される抗体は、Ｈ鎖およびＬ鎖の両方において、既知の親ＣＤＲを有する抗体に比較して、改善された結合アフィニティを示してもよい。
この態様にしたがって、各々、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む可変Ｈ鎖および可変Ｌ鎖から、第一および第二の可変鎖を選択してもよい。いくつかの態様にしたがって、第一の可変鎖は可変Ｈ鎖であり、そして第二の可変鎖は可変Ｌ鎖である。他の態様において、第一の可変鎖はＬ鎖であり、そして第二の可変鎖はＨ鎖である。しばしば、抗体の可変Ｈ鎖は抗原結合の主な部分に寄与することが知られる。こうした場合、発現テンプレートとしての単一の種または限定された数の種の可変Ｌ鎖と組み合わせられる、ディスプレイテンプレートとしての可変Ｈ鎖をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを調製することが意図されてもよい。１つの態様において、可変Ｈ鎖由来のポリヌクレオチドのライブラリーを親可変Ｌ鎖と組み合わせ、そして結合特性が改善された抗体を選択する。
【００４２】
本発明は、抗体のアフィニティ成熟に、そしてこの方法にしたがって得られる抗体に関する。抗体は、ジスルフィド結合によって連結された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含んでもよい。重鎖および軽鎖は、各々、１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインからなる。抗原に対する結合特異性は、抗体を形成する軽鎖および重鎖の可変ドメインによって提供される。より具体的には、その特異性を決定し、そして特異的リガンドと接触する抗体の部分は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される。ＣＤＲは、分子の最も可変性である部分であり、そしてこれらの分子の多様性に寄与する。各可変ドメインには、３つのＣＤＲ領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３があり、４つのフレームワーク領域（ＦＷ）に包埋されている。本明細書において、ＣＤＲ−ＨＣ（またはＣＤＲ（ＨＣ））は、可変重鎖のＣＤＲ領域を示し、そしてＣＤＲ−ＬＣ（またはＣＤＲ（ＬＣ））は、可変軽鎖のＣＤＲ領域に関する。同様に、ＦＷ−ＨＣ（またはＦＷ（ＨＣ））は、可変重鎖のフレームワーク領域を示し、そしてＦＷ−ＬＣ（またはＦＷ（ＬＣ））は、可変軽鎖のフレームワーク領域に関する。
【００４３】
用語「含む」は、本発明にしたがって用いた際、特に列挙された配列および／または構成要素に加えて、さらなる配列／構成要素が含まれてもよいことを示す。しかし、この用語はまた、請求される主題が、正確に、列挙される配列および／または構成要素からなることもまた含む。
【００４４】
本発明の抗体に、列挙されるアミノ酸配列以外のものが含まれるこれらの態様において、さらなるアミノ酸が、Ｎ末端またはＣ末端のいずれか、あるいは両方に存在してもよい。さらなる配列には、例えば、本明細書で以下に詳細に論じるように、例えば精製または検出のために導入される配列が含まれてもよい。さらに、個々の配列が、列挙される配列を「含む」場合、これらにはまた、Ｎ末端またはＣ末端のいずれか、あるいは両方に、さらなるアミノ酸が含まれてもよい。
【００４５】
本発明にしたがって、抗体は、そのターゲット抗原に対する結合特異性および／または結合アフィニティによって特徴づけられてもよい。ターゲット抗原は、それに対して抗体を生成可能な任意の構造、例えばペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸等を含んでもよい。抗体によって結合される任意の分析物は、ターゲット抗原として働いてもよく、そして該分析物への抗体結合を、本明細書に開示するようなアフィニティ成熟に供してもよい。例えば、ターゲット抗原は、診断法における、関心対象の任意の分析物であってもよい。特定の態様において、ターゲット抗原は、配列番号１のヒト心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）である。やはり、上述のように、本発明の抗体がさらなるアミノ酸を含む場合、前記抗体は、必然的に、そのターゲット抗原、例えばｃＴｎＴに特異的に結合しなければならないことが認識されるであろう。
【００４６】
用語「特異的に結合する」（本明細書において、「特異的に相互作用する」とも称される）は、本発明にしたがって、抗体がそのターゲット抗原、例えばｃＴｎＴにのみ結合し、異なるターゲット抗原、例えばタンパク質、特に類似の構造の異なるタンパク質と交差反応しないかまたは本質的に交差反応しないことを意味する。例えば、ｃＴｎＴに特異的に結合する抗体は、トロポニンＩ（配列番号３３）と交差反応しない。
【００４７】
抗体の「結合アフィニティ」は、以下の等式にしたがって、ターゲット抗原上のエピトープおよび抗体の結合部位の間の相互作用の強度を測定する：
Ｋｄ＝ｋｄ／ｋａ
式中：
Ｋｄ＝解離平衡定数［Ｍ］
ｋｄ＝解離速度定数［ｓ−１］
ｋａ＝会合速度定数［Ｍ−１ｓ−１］
抗体の結合アフィニティに関するさらなる適切なパラメーターは以下のとおりである：
ｔ／２＝複合体解離半減期＝ｌｎ２／ｋｄ／６０［分］
Ｒｍａｘ＝分析物の反応最大値［ＲＵ］
ＭＲ：モル比＝分析物の反応最大値（Ｒｍａｘ）の比
本発明にしたがって、本発明の方法によって選択される抗体は、親抗体のアフィニティより高い、ターゲット抗原に関するアフィニティを有する。この改善されたアフィニティは、親抗体に比較して、少なくとも２０％のｔ／２の増加によって示されてもよい。ｔ／２の測定を、例えば実施例６に記載するように行ってもよい。
【００４８】
抗体の特異性およびアフィニティを分析するための対応する方法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ（１９８８）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、およびＨａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ  （１９９９）  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載される。適切な研究の限定されない例は、例えば結合研究、構造的および／または機能的に緊密に関連する分子を用いたブロッキングおよび競合研究である。これらの研究を、例えば、ＦＡＣＳ分析、フローサイトメトリー滴定分析（ＦＡＣＳ滴定）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）を用いたもの）、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、蛍光滴定などの方法によって、あるいは放射標識リガンド結合アッセイによって、行ってもよい。さらなる方法には、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（競合ＥＬＩＳＡを含む）、ＲＩＡ、ＥＣＬ、およびＩＲＭＡ試験が含まれる。
【００４９】
本発明の背景において、用語「抗体」は、全イムノグロブリン分子ならびにその抗原結合断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖに関する。さらに、該用語は、修飾および／または改変抗体分子、ならびに組換え的にまたは合成的に生成された／合成された抗体に関する。用語「抗体」はまた、二機能性抗体、三機能性抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体、および抗体構築物、例えば一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）または抗体融合タンパク質も含む。
【００５０】
「Ｆａｂ断片」は、本明細書において、１つの軽鎖、ならびに１つの重鎖のＣＨ１および可変領域で構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成不能である。「Ｆａｂ’断片」は、鎖間ジスルフィド結合が２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖の間に形成されてＦ（ａｂ’）２分子を形成可能であるように、１つの軽鎖、ならびにＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含有する１つの重鎖の部分、ならびにまたＣＨ１およびＣＨ２ドメインの間の領域を含有する。「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、２つの軽鎖、ならびにＣＨ１およびＣＨ２ドメインの間の定常領域を含有する２つの重鎖を含有する。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は、２つの重鎖の間のジスルフィド結合によってともに保持される２つのＦａｂ’断片で構成される。
【００５１】
Ｆａｂ／ｃ断片は、ＦｃおよびＦａｂ決定基の両方を含有し、ここで、「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖断片を含有する。２つの重鎖断片は、２つまたはそれより多いジスルフィド結合によって、そしてＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって、ともに保持される。
【００５２】
「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖の両方由来の可変領域を含むが、定常領域を欠く。「一本鎖Ｆｖ」（「ｓｃＦｖ」とも略される）は、本発明の背景において、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを有する抗体断片であり、ここでこれらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般的に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために望ましい構造を形成することを可能にする、ＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーをさらに含む。一本鎖抗体の産生のために記載される技術は、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ監修  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎ．Ｙ．  １１３  （１９９４），  ２６９−３１５に記載される。
【００５３】
用語「完全ヒト抗体」は、本明細書において、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を指す。にもかかわらず、完全ヒト抗体は、マウスにおいて、マウス細胞において、またはマウス細胞由来のハイブリドーマにおいて産生されたならば、ネズミ炭水化物鎖を含有してもよいし、あるいはラットにおいて、ラット細胞において、またはラット細胞由来のハイブリドーマにおいて産生されたならば、ラット炭水化物鎖を含有してもよい。同様に、完全ヒト抗体は、ハムスターにおいて、ハムスター細胞、例えばＣＨＯ細胞において、またはハムスター細胞由来のハイブリドーマにおいて産生されたならば、ハムスター炭水化物鎖を含有してもよい。一方で、「マウス抗体」または「ネズミ抗体」は、マウス（ネズミ）免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体である一方、「ラット抗体」または「ウサギ抗体」は、それぞれ、ラットまたはウサギ免疫グロブリン配列のみを含む抗体である。完全ヒト抗体と同様、こうしたネズミ、ラットまたはウサギ抗体は、他の種または他の種の細胞において産生されたならば、こうした動物由来の炭水化物鎖を含有してもよい。例えば、抗体は、ハムスター細胞、例えばＣＨＯ細胞、またはハムスター細胞由来のハイブリドーマにおいて産生されたならば、ハムスター炭水化物鎖を含有してもよい。完全ヒト抗体は、例えば、完全ヒト抗体の産生およびスクリーニングを可能にする、広く用いられているスクリーニング技術である、ファージディスプレイによって産生されてもよい。また、本発明の背景において、ファージ抗体を用いてもよい。ファージディスプレイ法は、例えば、ＵＳ  ５，４０３，４８４、ＵＳ  ５，９６９，１０８およびＵＳ  ５，８８５，７９３に記載される。完全ヒト抗体の発展を可能にする別の技術は、マウスハイブリドーマ技術の修飾を伴う。マウスは、それ自体のマウス遺伝子と交換して、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するようなトランスジェニックとなる（例えば、ＵＳ  ５，８７７，３９７を参照されたい）。
【００５４】
用語「キメラ抗体」は、ヒトまたは非ヒト（例えばマウス、ウマ、ウサギ、イヌ、ウシ、ニワトリ）いずれかの別の種由来の抗体領域（例えば定常領域）に融合されるかまたはキメラ化されるヒトまたは非ヒト種の可変領域を含む抗体を指す。
【００５５】
上述のように、用語「抗体」はまた、抗体構築物、例えば抗体融合タンパク質も含み、ここで、抗体は、例えば特異的アミノ酸配列によって本明細書に定義されるドメインに加えて、組換え的に産生された構築物の単離および／または調製のための、さらなるドメイン（単数または複数）を含む。
【００５６】
本発明の抗体は、組換え抗体、例えば組換えヒト抗体、またはヘテロハイブリッド抗体であるように産生されてもよいが、なお本発明に開示し、そして定義するようなＣＤＲを含む。
【００５７】
用語「組換え抗体」には、組換え手段によって調製されるか、発現されるか、生成されるか、または単離されたすべての抗体、例えばヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体、宿主細胞内にトランスフェクションされた組換え発現ベクターを用いて発現される抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、あるいは他のＤＮＡ配列にヒト免疫グロブリン遺伝子配列をスプライシングする工程を含む任意の他の手段によって調製されるか、発現されるか、生成されるか、または単離された抗体が含まれる。組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および（存在するならば）定常領域を有する。しかし、こうした抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発に供されてもよく（またはヒトＩｇ配列に関してトランスジェニックである動物を用いる場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞突然変異誘発に供されてもよく）、そしてしたがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、そして関連する一方、ヒト抗体生殖系列レパートリー内にｉｎ  ｖｉｖｏで天然には存在しない可能性もある配列である。
【００５８】
用語「ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物に由来する軽鎖および重鎖を有する抗体を指す。例えば、ネズミ軽鎖と会合するヒト重鎖を有する抗体は、ヘテロハイブリッド抗体である。ヘテロハイブリッド抗体の例には、キメラおよびヒト化抗体が含まれる。
【００５９】
本発明にしたがった抗体は、列挙する組み合わせの軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含む。ＣＤＲが取り込まれるそれぞれの可変ドメインの取り巻くフレームワーク配列は、当業者によって特に困難なく選択されうる。例えば、以下にさらに記載されるフレームワーク配列または付随する実施例で使用する特定のフレームワーク配列を用いてもよい。
【００６０】
本発明にしたがって、ＣＤＲは、特に列挙する配列を含んでもよいし、または最大１つのアミノ酸置換で異なってもよい。こうしたものとして、ＣＤＲの各々において１つのアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換してもよい。アミノ酸置換が、１つの抗体または１つの鎖のＣＤＲの全てではないがいくつかに存在することもまた包含されることが認識されるであろう。
【００６１】
用語「置換」は、本発明にしたがって、アミノ酸の別のアミノ酸での置換を指す。したがって、アミノ酸総数は同じままである。特定の位でのアミノ酸の欠失および異なる位での１つ（またはそれより多く）のアミノ酸の導入は、明らかに、用語「置換」には含まれない。置換は、本発明にしたがって、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であってもよい。用語「保存的アミノ酸置換」は、当該技術分野に周知であり、そして類似の構造的および／または化学的特性を有する異なるアミノ酸でのアミノ酸の置換を指す。こうした類似性には、関与する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質の類似性が含まれる。アミノ酸置換は、以下の群の１つのアミノ酸の１つが、同じ群の別のアミノ酸によって置換されるならば、保存的アミノ酸置換である：非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ；陽性荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ；そして陰性荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【００６２】
本発明は、親抗体に比較して、改善された結合特性を示す、任意のターゲット抗原に特異的に結合する抗体の生成に関する。これは、親抗体１２．１Ａ１１．１１−７に比較して、改善された特性を示す、心臓トロポニンＴに特異的に結合する抗体の生成によって例示される。
【００６３】
１つの態様において、ヒト心臓トロポニンＴに特異的に結合する抗体（配列番号１）は、（ｉ）軽鎖可変ドメイン中のＣＤＲが、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、またはＣＤＲあたり最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含み、そして（ｉｉ）重鎖可変ドメイン中のＣＤＲが、配列番号５；配列番号６；または配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８；または配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲの少なくとも２つが、配列番号６；または配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２、および配列番号１２のＣＤＲ３より選択されるか、あるいはＣＤＲ１が配列番号７であり、ＣＤＲ２が配列番号８であり、そしてＣＤＲ３が配列番号１１または配列番号１３であり、但し、配列番号６のＣＤＲ１が存在する場合、ａ）ＣＤＲ３は配列番号１１または配列番号１３のいずれでもないか、あるいはｂ）抗体内のＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、同時に配列番号８および配列番号１２ではない点で特徴づけられる抗体である。
【００６４】
１つの態様において、本発明は、ヒト心臓トロポニンＴに特異的に結合する抗体（配列番号１）を開示し、該抗体は、ＣＤＲが以下のアミノ酸配列（ｉ）軽鎖可変ドメイン中、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに（ｉｉ）重鎖可変ドメイン中、配列番号５；配列番号６；または配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８；または配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲの少なくとも２つが、配列番号６または配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２、および配列番号１２のＣＤＲ３より選択されるか、あるいはＣＤＲ１が配列番号７であり、ＣＤＲ２が配列番号８であり、そしてＣＤＲ３が配列番号１１または配列番号１３であり、但し、配列番号６のＣＤＲ１が存在する場合、ａ）ＣＤＲ３は配列番号１１または配列番号１３のいずれでもないか、あるいはｂ）抗体内のＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、同時に配列番号８および配列番号１２ではない点で特徴づけられる。
【００６５】
さらに、本発明はまた、ヒト心臓トロポニンＴに特異的に結合する抗体（配列番号１）も開示し、
ここで、抗体は、式Ｉ：
ＦＷ（ＬＣ）１−ＣＤＲ（ＬＣ）１−ＦＷ（ＬＣ）２−ＣＤＲ（ＬＣ）２−ＦＷ（ＬＣ）３−ＣＤＲ（ＬＣ）３−ＦＷ（ＬＣ）４（式Ｉ）
に示すようなフレームワーク領域（ＦＷ）およびＣＤＲからなる軽鎖可変ドメイン
ならびに式ＩＩ：
ＦＷ（ＨＣ）１−ＣＤＲ（ＨＣ）１−ＦＷ（ＨＣ）２−ＣＤＲ（ＨＣ）２−ＦＷ（ＨＣ）３−ＣＤＲ（ＨＣ）３−ＦＷ（ＨＣ）４（式ＩＩ）
に示すようなＦＷおよびＣＤＲからなる重鎖可変ドメインを含み、
式中、ＦＷは以下のアミノ酸配列または少なくとも８５％同一であるその変異体を含み：
軽鎖中
ＦＷ（ＬＣ）１    配列番号１４のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）２    配列番号１５のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）３    配列番号１６のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）４    配列番号１７のアミノ酸配列；
重鎖中
ＦＷ（ＨＣ）１    配列番号１８のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）２    配列番号１９のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）３    配列番号２０のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）４    配列番号２１のアミノ酸配列；
そしてＣＤＲは、以下のアミノ酸配列、（ｉ）軽鎖可変ドメイン中、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに（ｉｉ）重鎖可変ドメイン中、配列番号５；配列番号６；または配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８；または配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲの少なくとも２つが、配列番号６または配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２、および配列番号１２のＣＤＲ３より選択されるか、あるいはＣＤＲ１が配列番号７であり、ＣＤＲ２が配列番号８であり、そしてＣＤＲ３が配列番号１１または配列番号１３であり、但し、配列番号６のＣＤＲ１が存在する場合、ａ）ＣＤＲ３は配列番号１１または配列番号１３のいずれでもないか、あるいはｂ）抗体内のＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、同時に配列番号８および配列番号１２ではない、前記配列、あるいはＣＤＲあたり最大１つのアミノ酸置換で異なるこれらのＣＤＲの変異体を含む。
【００６６】
さらに、本発明は、式Ｉ：
ＦＷ（ＬＣ）１−ＣＤＲ（ＬＣ）１−ＦＷ（ＬＣ）２−ＣＤＲ（ＬＣ）２−ＦＷ（ＬＣ）３−ＣＤＲ（ＬＣ）３−ＦＷ（ＬＣ）４（式Ｉ）
に示すようなフレームワーク領域（ＦＷ）およびＣＤＲからなる軽鎖可変ドメイン
ならびに式ＩＩ：
ＦＷ（ＨＣ）１−ＣＤＲ（ＨＣ）１−ＦＷ（ＨＣ）２−ＣＤＲ（ＨＣ）２−ＦＷ（ＨＣ）３−ＣＤＲ（ＨＣ）３−ＦＷ（ＨＣ）４（式ＩＩ）
に示すようなＦＷおよびＣＤＲからなる重鎖可変ドメイン
を含む抗ｃＴｎＴ抗体も開示し、、
式中、ＦＷは以下のアミノ酸配列または少なくとも８５％同一であるその変異体を含み：
軽鎖中
ＦＷ（ＬＣ）１    配列番号１４のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）２    配列番号１５のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）３    配列番号１６のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）４    配列番号１７のアミノ酸配列；
重鎖中
ＦＷ（ＨＣ）１    配列番号１８のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）２    配列番号１９のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）３    配列番号２０のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）４    配列番号２１のアミノ酸配列；
そしてＣＤＲは、以下のアミノ酸配列、（ｉ）軽鎖可変ドメイン中、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに（ｉｉ）重鎖可変ドメイン中、配列番号５；配列番号６；または配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８；または配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲの少なくとも２つが、配列番号６または配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２、および配列番号１２のＣＤＲ３より選択されるか、あるいはＣＤＲ１が配列番号７であり、ＣＤＲ２が配列番号８であり、そしてＣＤＲ３が配列番号１１または配列番号１３であり、但し、配列番号６のＣＤＲ１が存在する場合、ａ）ＣＤＲ３は配列番号１１または配列番号１３のいずれでもないか、あるいはｂ）抗体内のＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、同時に配列番号８および配列番号１２ではない、前記配列を含む。
【００６７】
式Ｉで示す一次構造は、Ｎ末端からＣ末端への本発明の抗体の軽鎖可変ドメインの構成要素の順に相当する。式ＩＩで示す一次構造は、Ｎ末端からＣ末端への本発明の抗体の重鎖可変ドメインの構成要素の順に相当する。各場合で、フレームワーク領域（ＦＷ）１は、それぞれの可変鎖ドメインの最もＮ末端の部分に相当する一方、ＦＷ４は、それぞれの可変鎖ドメインの最もＣ末端の部分に相当する。
【００６８】
上に定義するように、それぞれのＦＷおよびＣＤＲ配列は、列挙するアミノ酸配列を「含む」。１つの態様において、それぞれのＦＷおよびＣＤＲ配列は、前記アミノ酸配列からなり、すなわち本発明の抗トロポニンＴ抗体の軽鎖可変ドメイン（単数または複数）および重鎖可変ドメイン（単数または複数）は、それぞれ、式Ｉおよび式ＩＩに示すようなＦＷおよびＣＤＲからなり、ここで、それぞれのＦＷおよびＣＤＲ配列は、列挙するアミノ酸配列からなる。
【００６９】
ＣＤＲおよびその変異体に関して、上に提供する定義および特に例示する態様は、変更すべきところは変更して適用される。
フレームワーク領域に関して、特定の度合いの可変性もまた、本明細書に想定され、すなわち個々のＦＷは、特に列挙されるアミノ酸配列または該配列に少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、または該配列からなってもよい。好ましくは、同一性は少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２．５％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは、同一性は少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、そして最も好ましくは、同一性は少なくとも９９．５％である。異なるＦＷに関して、実際の配列、および例えばそれぞれのＦＷ配列の長さ、ならびにそれぞれの可変鎖ドメイン内の位置に応じて、配列同一性の異なる度合いが許容されうる可能性もあることが認識されるであろう。
【００７０】
本発明にしたがって、用語「配列同一性％」は、アミノ酸配列の全長（またはその比較する部分全体）を構成するアミノ酸残基の数に比較した際の、２つまたはそれより多い整列されたアミノ酸配列の同一のアミノ酸のマッチ（「ヒット」）数を記載する。同一性パーセントは、残基総数によって同一残基の数を割り、そしてその答えに１００を乗じることによって同定される。言い換えると、整列を用いて、当該技術分野に知られるような配列比較アルゴリズムを用いて測定されるように、または手動で整列させそして視覚的に調べた際に、これらの（下位）配列を比較し、そして比較ウィンドウに渡って、または指定される領域に渡って、最大に対応するように整列させた際に、２つまたはそれより多い配列または下位配列に関して同じである（例えば８５％同一性の）アミノ酸残基の割合を決定してもよい。
【００７１】
当業者は、例えばＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．ら  ［１９９７］  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２）、ＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータプログラム（Ｔｏｍｐｓｏｎ，  Ｊ．Ｄ．ら  ［１９９４］  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：４６７３−４６８０）またはＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｗ．Ｒ．  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｄ．Ｊ．  ［１９８８］  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：２４４４−２４４８）に基づくものなどのアルゴリズムを用いて、配列間／中の配列同一性パーセントを決定する方法を知っている。１つの態様において、本発明にしたがって、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用する。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長（Ｗ）および１０の期待値（Ｅ）をデフォルトとして用いる。ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｓ．  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｊ．Ｇ．  ［１９９２］  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８９：１０９１５−１０９１９）は、５０の整列（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を用いる。したがって、配列同一性％を示す態様において、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴプログラムで決定した際に少なくとも８５％の配列同一性を有するすべてのアミノ酸配列は、前記態様の範囲内に属する。
【００７２】
それぞれの特に列挙するアミノ酸配列に比較した際、フレームワーク領域における変異の上述の度合いは、アミノ酸（単数または複数）の置換、挿入、付加、または欠失のためでありうる。
【００７３】
用語「置換」は、本明細書の上記に定義されている。１つより多くのアミノ酸を置換しようとする場合、各アミノ酸は、独立に別のアミノ酸に置換され、すなわち除去される各アミノ酸に関して、異なるアミノ酸が同じ位で導入される。
【００７４】
用語「挿入」は、本発明にしたがって、特に列挙するアミノ酸配列への、１つまたはそれより多いアミノ酸の付加を指し、ここで、付加はポリペプチドのＮまたはＣ末端に対するものではない。
【００７５】
用語「付加」は、本発明にしたがって、ポリペプチドのＮまたはＣ末端いずれか、あるいは両方への、特に列挙するアミノ酸配列への１つまたはそれより多いアミノ酸の付加を指す。
【００７６】
用語「欠失」は、本発明にしたがって用いた際、特に列挙するアミノ酸配列からの１つまたはそれより多いアミノ酸の喪失を指す。
１つの態様において、フレームワーク領域のアミノ酸配列中の変異は、アミノ酸（単数または複数）の置換による。置換は、本明細書において上に定義するように、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であってもよい。用語「置換」に関して、上に提供する定義および特に例示する態様は、変更すべきところは変更して適用される。１つの態様において、フレームワーク領域中の置換は、保存的アミノ酸置換である。
【００７７】
さらなる態様において、ＣＤＲは、上に列挙する特定の配列（すなわちいかなる変異も含まない）からなり、そして上に列挙するフレームワーク領域（ＦＷ）は、上に列挙する特定の配列内に、最大で以下の量のアミノ酸変異を含む：
ＦＷ（ＬＣ）１  最大３アミノ酸変異；
ＦＷ（ＬＣ）２  最大２アミノ酸変異；
ＦＷ（ＬＣ）３  最大４アミノ酸変異；
ＦＷ（ＬＣ）４  最大１アミノ酸変異；ならびに
ＦＷ（ＨＣ）１  最大３アミノ酸変異；
ＦＷ（ＨＣ）２  最大２アミノ酸変異；
ＦＷ（ＨＣ）３  最大４アミノ酸変異；および
ＦＷ（ＨＣ）４  最大１アミノ酸変異。
【００７８】
さらなる態様において、ＦＷ中のアミノ酸変異は置換である。
さらなる態様において、軽鎖または重鎖可変ドメインフレームワーク領域中に存在する変異の総量は、最大９アミノ酸置換、例えば最大８アミノ酸置換、例えば最大６アミノ酸置換、例えば最大４アミノ酸置換、例えば最大３アミノ酸置換、例えば最大２アミノ酸置換である。さらなる態様において、軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域１〜４中に総計で、または重鎖可変ドメインのフレームワーク領域１〜４中に総計で、１つのアミノ酸置換しか存在しない。
【００７９】
ＦＷとして本明細書に定義する式Ｉおよび式ＩＩの部分は、可変鎖領域のフレームまたは骨格の部分を形成するアミノ酸配列であるため、前記配列内の置換、特に保存的アミノ酸置換の形の置換は、多くの場合、抗ｃＴｎＴ抗体の結合能に影響を及ぼさないであろう。これは、これらのアミノ酸が、典型的にはｃＴｎＴへの結合に直接は関与せず、そして適切な代替アミノ酸での置換は、タンパク質の三次元構造およびフォールディングの改変が起こらないように設計可能であるためである。一方、こうした置換は、例えば特定の宿主における改善された発現のため、または例えばさらなるジスルフィド架橋の導入によるタンパク質の安定化のため、多くの有益な効果を提供しうる。
【００８０】
１つの態様において、本明細書に上に開示するようなｃＴｎＴに対するモノクローナル抗体は、３７℃で１０分間またはそれより長いｔ／２解離でｃＴｎＴに結合する。
本発明はさらに、
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインに少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、および
（ｉｉ）配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；および配列番号３２のアミノ酸配列より選択される重鎖可変ドメインに少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン
を含む抗体
ここで、該抗体はヒト心臓トロポニンＴに特異的に結合し、そして３７℃で１０分間またはそれより長いｔ／２解離を有する
を開示する。
【００８１】
本発明でやはり開示するのは、
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインに少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、および
（ｉｉ）配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；および配列番号３２のアミノ酸配列より選択されるアミノ酸配列の重鎖可変ドメイン
ここで、ＣＤＲは、以下のアミノ酸配列、（ｉ）軽鎖可変ドメイン中、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに（ｉｉ）重鎖可変ドメイン中、配列番号５；配列番号６；または配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８；または配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、ここで、ＣＤＲの少なくとも２つが、配列番号６または配列番号７のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２、および配列番号１２のＣＤＲ３より選択されるか、あるいはＣＤＲ１が配列番号７であり、ＣＤＲ２が配列番号８であり、そしてＣＤＲ３が配列番号１１または配列番号１３であり、但し、配列番号６のＣＤＲ１が存在する場合、ａ）ＣＤＲ３は配列番号１１または配列番号１３のいずれでもないか、あるいはｂ）この抗体内のＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、同時に配列番号８および配列番号１２ではない、
そして、該抗体はヒト心臓トロポニンＴに特異的に結合し、そして３７℃で１０分間またはそれより長いｔ／２解離を有する
を含む抗体である。
【００８２】
１つの態様において、本開示は、
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、および
（ｉｉ）配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；および配列番号３２のアミノ酸配列より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン
を含む抗体に関する。
【００８３】
本発明の抗ｃＴｎＴ抗体に関して、本明細書の上記に提供するすべての定義および特に例示される態様、特に、引用される度合いおよび変異のタイプは、変更すべきところは変更して適用される。
【００８４】
本発明にしたがって、それぞれのターゲット抗原、例えばｃＴｎＴに対して改善された結合特性（より優れたＫＤ値）を有し、そしてしたがって、ターゲット抗原、例えばｃＴｎＴを、以前のアッセイに比較した際に優れた感度で検出可能である、新規抗体、例えば新規抗ｃＴｎＴ抗体を提供する。用語「ＫＤ」は、平衡解離定数（平衡結合定数の逆数）を指し、そして本明細書において、当該技術分野で提供される定義にしたがって用いられる。ＫＤ値を決定するための手段および方法は、以下に簡潔に提供し、そして提供する実施例に詳細に記載するとおりである。
【００８５】
抗体の、例えば抗ｃＴｎＴ抗体の結合特性は、リアルタイムのバイオセンサーに基づく分子相互作用測定、例えば表面プラズモン共鳴分光測定を通じて最適に決定され、これに関してはＢｉａｃｏｒｅ技術が同義である。実験詳細を実施例５に提供し、そして動力学データを表３に示す。例えば、表３において、組み合わせ「１２」と示される抗体は、ｃＴｎＴに対して改善された結合特性、すなわち１．１８Ｅ＋０６  １／Ｍｓの会合定数（ｋａ）；３．７  Ｅ−０４の解離定数（ｋｄ）（約３１分の解離半減期およびしたがって３．２Ｅ−１０Ｍの全アフィニティ定数（ＫＤ）と変換される）を有する。
【００８６】
これらの結果に基づいて、本発明に開示しそして請求するような突然変異抗体は、驚くべきことに、ｃＴｎＴと抗体の複合体形成に負の影響を及ぼさない一方で、これらすべてに関するＫａは親抗体に関するものと同じ範囲内にある。他方で、より優れたＫＤ値に転換される、ｃＴｎＴ間で形成される複合体の安定性に関する有意な改善が達成可能であった。
【００８７】
１つの態様において、本明細書の上記に開示するような、本発明記載のモノクローナル抗体は、３７℃で１０分間またはそれより長いｔ／２解離でｃＴｎＴに結合する。
一般的に、当該技術分野に周知であるように、より低いＫＤ値は、より高いまたは改善されたアフィニティに対応する。１つの態様において、突然変異体抗ｃＴｎＴ抗体は、５．８Ｅ−１０ＭのＫＤを有する親抗体のＫＤと等しいかまたはそれより低い結合アフィニティを有する。
【００８８】
可変軽鎖および重鎖領域に関して上に列挙する配列は、付随する実施例に使用されているアミノ酸配列である。
本発明はさらに、本明細書で上に定義する本発明の抗体の任意の１つの軽鎖可変領域をコードする核酸分子に関する。この核酸分子は、本明細書において、本発明の第一の核酸分子と称される。さらに、本発明はまた、本明細書で上に定義する本発明の抗体の任意の１つの重鎖可変領域をコードする核酸分子にも関する。この核酸分子は、本明細書において、本発明の第二の核酸分子と称される。
【００８９】
本発明にしたがって、本明細書において核酸配列またはポリヌクレオチドとも称される、用語「核酸分子」には、ＤＮＡ、例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡが含まれる。
本発明の核酸分子は、例えば標準的化学合成法および／または組換え法によって合成されてもよいし、あるいは例えば化学合成および組換え法を組み合わせることによって、半合成的に産生されてもよい。確立された方法、例えば制限消化、連結および分子クローニングを用いて、転写制御要素および／または他のアミノ酸コード配列に対するコード配列の連結を行ってもよい。
【００９０】
本発明にしたがって、本発明の第一の核酸分子は：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む；
（ｉｉ）本明細書で上に定義するような式Ｉのアミノ酸配列からなる；または
（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインに少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる
軽鎖可変領域をコードする。
【００９１】
同様に、本発明の第二の核酸分子は
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ２、および配列番号１２のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ３を含む；
（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ３を含む；
（ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ３を含む；
（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ３を含む；
（ｖ）配列番号６のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ２、および配列番号１０のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ３を含む；
（ｖｉ）配列番号７のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ３を含む；
（ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ２、および配列番号１２のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ３を含む；
（ｖｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ２、および配列番号１０のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ３を含む；
（ｉｘ）配列番号７のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ２、および配列番号１２のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ３を含む；
（ｘ）配列番号５のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ２、および配列番号１２のアミノ酸配列または最大１つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むＣＤＲ３を含む；
（ｘｉ）本明細書で上に定義するような式ＩＩのアミノ酸配列からなる；
（ｘｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインに少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる；
（ｘｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインに少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる；
（ｘｉｖ）配列番号２５のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインに少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる；
（ｘｖ）配列番号２６のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインに少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる；
（ｘｖｉ）配列番号２７のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインに少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる；または
（ｘｖｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインに少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインに少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる；
（ｘｉｘ）配列番号３０のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインに少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる；
（ｘｘ）配列番号３１のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインに少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる；または
（ｘｘｉ）配列番号３２のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインに少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる
重鎖可変領域をコードする。
【００９２】
本発明はさらに、本発明の第一の核酸分子、すなわち本明細書で上に定義する本発明の抗体の任意の１つの軽鎖可変領域をコードする核酸分子を含むベクターに関する。本発明はさらに、本発明の第二の核酸分子、すなわち本明細書で上に定義する本発明の抗体の任意の１つの重鎖可変領域をコードする核酸分子を含むベクターに関する。こうしたベクターはまた、本明細書において、「本発明の個々のベクター（単数または複数）」とも称される。
【００９３】
分子生物学の当業者には、多くの適切なベクターが知られ、その選択は所望の機能に応じる。ベクターの限定されない例には、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージおよび例えば遺伝子操作において慣用的に用いられる他のベクターが含まれる。当業者に周知の方法を用いて、多様なプラスミドおよびベクターを構築してもよい；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（同箇所）、およびＡｕｓｕｂｅｌ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９），  （１９９４）に記載される技術を参照されたい。
【００９４】
１つの態様において、ベクターは発現ベクターである。本発明記載の発現ベクターは、宿主において、本発明の核酸分子の複製および発現を指示することが可能であり、そしてしたがって、選択される宿主において、それによってコードされる本発明の抗トロポニンＴ抗体のドメインの可変鎖ドメインの発現を提供する。さらなる態様において、ベクター（単数または複数）は、本発明の前記可変ドメインのみが発現されるのではなく、本発明の前記可変鎖ドメインを含む全長ＩｇＧ抗体も発現されることを確実にするさらなる配列を含む。
【００９５】
発現ベクターは、例えば、クローニングベクター、バイナリーベクターまたは組込みベクターであってもよい。発現は、例えば翻訳可能ｍＲＮＡへの、核酸分子の転写を含む。１つの態様において、ベクターは、モノクローナルウサギ抗体の重鎖および／または軽鎖の一過性組換え発現のための真核発現プラスミドである。こうしたベクターは、抗体発現のために特に開発されているが、また、真核細胞、例えばＨＥＫ２９３またはその派生物あるいはＣＨＯ細胞の例えば一過性トランスフェクションによる抗体産生用でもある。
【００９６】
ベクターの限定されない例には、ｐＱＥ−１２、ｐＵＣシリーズ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、発現ベクターのｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）またはｐＣＲＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ラムダｇｔ１１、ｐＪＯＥ、ｐＢＢＲ１−ＭＣＳシリーズ、ｐＪＢ８６１、ｐＢＳＭｕＬ、ｐＢＣ２、ｐＵＣＰＫＳ、ｐＴＡＣＴ１、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＯＰ１３ＣＡＴ、Ｅ−０２７  ｐＣＡＧ  Ｋｏｓａｋ−Ｃｈｅｒｒｙ（Ｌ４５ａ）ベクター系、ｐＲＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＢＰＶ−１、ｐｄＢＰＶＭＭＴｎｅｏ、ｐＲＳＶｇｐｔ、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＩＺＤ３５、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、ｐＧＥＭＨＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＬＸＩＮ、ｐＳＩＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＥＡＫ−１０（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）  ｐＴｒｉＥｘ−Ｈｙｇｒｏ（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびｐＣＩＮｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が含まれる。ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）に適したプラスミドベクターの限定されない例は、例えばプラスミドｐＡＯ８１５、ｐＰＩＣ９ＫおよびｐＰＩＣ３５Ｋ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む。ゼノパス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）胚、ゼブラフィッシュ胚ならびに非常に多様な哺乳動物および鳥類細胞においてタンパク質を発現するために適した別のベクターは、多目的発現ベクターｐＣＳ２＋である。
【００９７】
一般的に、ベクターは、１つまたはそれより多い複製起点（оｒｉ）およびクローニングまたは発現のための遺伝系、宿主における選択のための１つまたはそれより多いマーカー、例えば抗生物質耐性、ならびに１つまたはそれより多い発現カセットを含有してもよい。さらに、確立された方法を用いて、ベクター中に含まれるコード配列を、転写制御要素に、そして／または他のアミノ酸コード配列に連結してもよい。こうした制御配列は当業者に周知であり、そしてこれには限定されるわけではないが、転写開始を確実にする制御配列、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）（Ｏｗｅｎｓ，  Ｇ．Ｃ．ら  ［２００１］  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９８：１４７１−１４７６）、そして随意に、転写物の転写終結および安定化を確実にする制御要素が含まれる。転写開始を確実にするこうした制御要素に関する限定されない例は、プロモーター、翻訳開始コドン、エンハンサー、インスレーターおよび／または本発明の核酸分子の下流に含まれるべき転写終結を確実にする制御要素を含む。さらなる例には、Ｋｏｚａｋ配列ならびにＲＮＡスプライシングのためのドナーおよびアクセプター部位に隣接する介在配列、分泌シグナルをコードするヌクレオチド配列、あるいは用いる発現系に応じて、発現されたタンパク質を細胞区画に、または培地に向けることが可能なシグナル配列が含まれる。ベクターはまた、正しいタンパク質フォールディングを促進するため、１つまたはそれより多いシャペロンをコードするさらなる発現可能ポリヌクレオチドも含有してもよい。
【００９８】
複製の適切な起点のさらなる例には、例えば全長ＣｏｌＥ１、一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＣｏｌＥＩ、ＳＶ４０ウイルスおよびＭ１３複製起点が含まれる一方、適切なプロモーターのさらなる例には、限定なしに、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ｌａｃＺプロモーター、テトラサイクリンプロモーター／オペレーター（ｔｅｔｐ／о）、ニワトリβアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター（ニワトリβアクチンプロモーターおよびサイトメガロウイルス極初期エンハンサーの組み合わせ）、ｇａｉ１０プロモーター、ヒト伸長因子ｌαプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＣａＭキナーゼプロモーター、ｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーター、Ｔ７またはＴ５プロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）多角プロモーターまたは哺乳動物および他の動物細胞におけるグロビンイントロンが含まれる。エンハンサーの１つの例は、例えばＳＶ４０エンハンサーである。転写終結を確実にする制御要素のさらなる限定されない例には、ＳＶ４０−ポリＡ部位、ｔｋ−ポリＡ部位、ｒｈо独立ｌｐｐターミネーターまたはＡｃＭＮＰＶ多角ポリアデニル化シグナルが含まれる。選択マーカーのさらなる限定されない例には、メトトレキセートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｒｅｉｓｓ，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  （Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  Ａｄｖ．）  １３  （１９９４），  １４３−１４９）、アミノ配糖体ネオマイシン、カナマイシンおよびパロマイシンに対する耐性を与えるｎｐｔ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２  （１９８３），  ９８７−９９５）およびハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｍａｒｓｈ，  Ｇｅｎｅ  ３２  （１９８４），  ４８１−４８５）が含まれる。さらなる選択可能遺伝子が記載されてきており、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５  （１９８８），  ８０４７）；細胞がマンノースを利用することを可能にするマンノース−６−リン酸イソメラーゼ（ＷＯ  ９４／２０６２７）、およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を与えるＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ，  １９８７，  ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ中，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ編集）またはブラスチシジンＳに対する耐性を与えるアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）由来のデアミナーゼ（Ｔａｍｕｒａ，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５９  （１９９５），  ２３３６−２３３８）が含まれる。
【００９９】
さらなる態様において、ベクターは、イントロンＡを含む５’  ＣＭＶプロモーターおよび３’  ＢＧＨポリアデニル化配列からなる発現カセットを含有する真核生物発現プラスミドである。発現カセットに加えて、該プラスミドは、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）におけるプラスミド増幅のため、ｐＵＣ１８由来複製起点、およびアンピシリン耐性を与えるベータ−ラクタマーゼ遺伝子を含有してもよい。抗体の分泌のため、真核生物リーダー配列が、抗体遺伝子の５’にクローニングされてもよい。
【０１００】
適切な細菌発現宿主は、例えば、ＪＭ８３、Ｗ３１１０、ＫＳ２７２、ＴＧ１、Ｋ１２、ＢＬ２１（例えばＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰｌｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰＲＡＲＥ）またはＲｏｓｅｔｔａａ由来の株を含む。ベクター修飾、ＰＣＲ増幅および連結技術に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌ  ［２００１］  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ）を参照されたい。
【０１０１】
例えば化学薬品に基づく方法（ポリエチレンイミン、リン酸カルシウム、リポソーム、ＤＥＡＥ−デキストラン、ヌクレオフェクション）、非化学的方法（エレクトロポレーション、ソノポレーション、光学トランスフェクション、遺伝子エレクトロトランスファー、水力学的送達、または本発明の核酸分子と細胞を接触させた際の天然存在形質転換）、粒子に基づく方法（遺伝子銃、マグネトフェクション、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ））、ファージベクターに基づく方法およびウイルス法によって、細胞内に導入するために、本発明の核酸分子および／またはベクターを設計してもよい。例えば、ウイルス、例えばレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、セムリキ森林ウイルスまたはウシパピローマウイルス由来の発現ベクターを、ターゲティングされる細胞集団内への核酸分子の送達に用いてもよい。さらに、バキュロウイルス系もまた、本発明の核酸分子のための真核発現系においてベクターとして用いてもよい。１つの態様において、本発明の核酸分子および／またはベクターは、リン酸カルシウムによる化学的コンピテント大腸菌の形質転換のため、ならびに／あるいはポリエチレンイミンまたはリポフェクタミントランスフェクションによるＨＥＫ２９３およびＣＨＯの一過性トランスフェクションのために設計されている。
【０１０２】
本発明は：
（ｉ）本明細書で上に定義するオプション（ｉ）にしたがった軽鎖可変ドメインおよび本明細書で上に定義するオプション（ｉ）にしたがった重鎖可変ドメインをコードする核酸分子；
（ｉｉ）本明細書で上に定義するオプション（ｉｉ）にしたがった軽鎖可変ドメインおよび本明細書で上に定義するオプション（ｉｉ）にしたがった重鎖可変ドメインをコードする核酸分子；または
（ｉｉｉ）本明細書で上に定義するオプション（ｉｉｉ）にしたがった軽鎖可変ドメインおよび本明細書で上に定義するオプション（ｉｉｉ）にしたがった重鎖可変ドメインをコードする核酸分子
を含むベクターにさらに関する。
【０１０３】
１つの態様において、ベクターは発現ベクターである。
本発明のベクター、特にベクターのタイプまたは制御配列に関して、本明細書で上に提供するすべての定義および特に例示する態様は、変更すべきところは変更して適用される。ベクターのこの第二のタイプは、少なくとも２つの核酸分子、すなわち軽鎖可変ドメインをコードするものおよび重鎖可変ドメインをコードするものを含むベクターに関する。上記組み合わせから明らかであるように、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインは、本発明の機能性抗ｃＴｎＴ抗体の発現が可能であるように、ベクター中で組み合わせられる。この第二のタイプのベクターはまた、本明細書において、「本発明の組み合わせベクター」とも称される。
【０１０４】
本発明はさらに：
（ｉ）本発明の組み合わせベクター；または
（ｉｉ）本発明の第一の核酸分子、すなわち本発明記載の軽鎖可変領域をコードする核酸分子を含む本発明の個々のベクター、および本発明の第二の核酸分子、すなわち本発明記載の重鎖可変領域をコードする核酸分子を含む本発明の個々のベクター、ここでこれらの２つのベクターは、上記オプション（ｉ）〜（ｉｉｉ）に定義するような軽鎖および重鎖可変領域をマッチさせるためにコードする核酸分子を含む
を含む宿主細胞または非ヒト宿主に関する。
【０１０５】
宿主細胞は、任意の原核または真核細胞であってもよい。用語「原核生物」は、本発明のタンパク質の発現のため、ＤＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡ分子で形質転換されるか、形質導入されるかまたはトランスフェクションされてもよいすべての細菌を含むよう意味される。原核宿主には、グラム陰性ならびにグラム陽性細菌、例えば、大腸菌、ネズミチフス菌（Ｓ．  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（グルタミクム（ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（フルオレセンス（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ））、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が含まれてもよい。
【０１０６】
用語「真核」は、酵母、より高次の植物、昆虫および哺乳動物細胞が含まれるよう意味される。典型的な哺乳動物宿主細胞には、Ｈｅｌａ、ＨＥＫ２９３、Ｈ９、Ｐｅｒ．Ｃ６およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３、ＮＳ／０、ＳＰ２／０およびＣ１２７細胞、ＣＯＳ細胞、例えばＣＯＳ１またはＣＯＳ７、ＣＶ１、ウズラ（ｑｕａｉｌ）ＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、マウス肉腫細胞、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれる。本発明にしたがった例示的な哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞である。他の適切な真核宿主細胞には、限定なしに、ニワトリ細胞、例えばＤＴ４０細胞、または酵母細胞、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）およびクロイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）が含まれる。発現に適した昆虫細胞は、例えばショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２、ショウジョウバエ属Ｋｃ、スポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９およびＳｆ２１またはトリコプルシア属（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）Ｈｉ５細胞である。適切なゼブラフィッシュ細胞株には、限定なしに、ＺＦＬ、ＳＪＤまたはＺＦ４が含まれる。
【０１０７】
記載するベクター（単数または複数）は、宿主ゲノム内に組み込まれても、または染色体外に維持されてもいずれでもよい。ベクターが適切な宿主内に取り込まれたら、宿主は、核酸分子の高レベル発現に適した条件下で維持され、そして望ましいように、本発明の抗体の収集および精製が続いてもよい。上記宿主細胞に関する適切な培地および条件は当該技術分野に知られる。
【０１０８】
１つの態様において、列挙する宿主は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞またはヒト細胞株である。さらなる態様において、本発明のベクター（単数または複数）で形質転換される宿主細胞は、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯである。さらにさらなる態様において、本発明のベクター（単数または複数）で形質転換される宿主細胞はＣＨＯである。これらの宿主細胞ならびに適切な培地および細胞培養条件は、当該技術分野に記載されてきており、例えば、Ｂａｌｄｉ  Ｌ．ら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．  ２００５  Ｊａｎ−Ｆｅｂ；２１（１）：１４８−５３、Ｇｉｒａｒｄ  Ｐ．ら，  Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  ２００２  Ｊａｎ；３８（１−３）：１５−２１およびＳｔｅｔｔｌｅｒ  Ｍ．ら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．  ２００７  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；２３（６）：１３４０−６を参照されたい。
【０１０９】
本発明にしたがった、用語「〜を含むベクター」に関して、宿主細胞が本発明の抗ｃＴｎＴ抗体を産生するために必要でありそして／または十分であるさらなる核酸配列が、ベクター中に存在することが理解される。こうしたさらなる核酸配列は、例えば、軽鎖の残りをコードする核酸配列ならびに重鎖の残りをコードする核酸配列である。
【０１１０】
本発明にしたがった宿主細胞または非ヒト宿主は、本明細書で上に定義するような軽鎖および重鎖可変領域の両方をコードする１つのベクターを含むか、または２つの別個のベクターを含み、ここで１つのベクターが本発明にしたがった軽鎖可変領域をコードする核酸分子を所持し、そして第二のベクターが本発明にしたがったマッチする重鎖可変領域をコードする核酸分子を所持するかいずれかである。したがって、第一のベクターが本明細書上記のオプション（ｉ）にしたがった軽鎖可変領域をコードする核酸分子を所持する場合、第二のベクターは、やはり上記オプション（ｉ）にしたがった重鎖可変領域をコードする核酸分子を所持する。同じことは、オプション（ｉｉ）および（ｉｉｉ）に、変更すべきところは変更して適用される。
【０１１１】
したがって、各場合で、これらの核酸分子の発現は、互いに関連付けられており、これらは、本明細書で上に記載する結合能からなる本発明の抗体の産生を確実にするために、１つの抗体分子内に存在する必要がある。
【０１１２】
例えば、この態様にしたがった宿主細胞を使用して、本発明の抗体を多量に産生してもよい。前記宿主細胞は、宿主内に上述のベクター（単数または複数）を導入することによって産生される。宿主中の前記ベクター（単数または複数）の存在は、次いで、本発明の抗体の上記軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする核酸分子の発現を仲介する。本明細書で上に記載するように、本発明のベクター（単数または複数）は、全長ＩｇＧ抗体の発現を可能にするさらなる配列を含み、それによって宿主細胞による全長ＩｇＧ抗体の産生を生じてもよく、ここで、前記抗体は、本発明にしたがった可変軽鎖および／または重鎖ドメインの存在によって特徴づけられる。
【０１１３】
本発明はさらに、上述のように得られる抗体、例えば配列番号１のｃＴｎＴに特異的に結合する抗体の産生のための方法であって、本発明の宿主細胞を適切な条件下で培養し、そして産生された抗体を単離する工程を含む、前記方法に関する。
【０１１４】
この態様にしたがって、本発明の宿主中に存在するベクター（単数または複数）は発現ベクター（単数または複数）であるか、またはベクター（単数または複数）が、その発現が確実になるような方式で、宿主細胞のゲノム内に本発明の核酸分子（単数または複数）の安定な取り込みを仲介するかいずれかである。抗体の発現が確実になるように、本発明の抗ｃＴｎＴ抗体のそれぞれの軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸分子が成功裡に導入されている宿主細胞の選択のための手段および方法が当該技術分野に周知であり、そして記載されてきている（Ｂｒｏｗｎｅ，  Ｓ．Ｍ．  ＆  Ａｌ−Ｒｕｂｅａｉ，  Ｍ．  ［２００７］  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２５：４２５−４３２；  Ｍａｔａｓｃｉ，  Ｍら  ［２００８］  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｏｄａｙ：  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ５：ｅ３７−ｅ４２；  Ｗｕｒｍ，  Ｆ．Ｍ．  ［２００４］  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２２：１３９３−１３９８）。
【０１１５】
原核または真核宿主細胞を培養するために適した条件が当業者に周知である。例えば、細菌、例えば大腸菌は、典型的には４〜約３７℃の温度で、ルリア・ベルタニ（ＬＢ）培地中、通気下で培養可能である。発現産物の収量および溶解度を増加させるため、培地を緩衝するか、あるいは両方を増進させるかまたは促進することが知られる適切な添加剤を培地に補充してもよい。誘導性プロモーターが、宿主細胞中に存在するベクター（単数または複数）における本発明の核酸分子を制御する場合、ポリペプチドの発現を、適切な誘導剤、例えばアンヒドロテトラサイクリンの添加によって誘導してもよい。適切な発現プロトコルおよび戦略が当該技術分野に記載されてきており（例えば、Ｄｙｓｏｎ，  Ｍ．  Ｒ．ら  （２００４）．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ４，  ３２−４９、およびＢａｌｄｉ，  Ｌ．ら  （２００７）．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ２９，  ６７７−６８４中）、そしてこれを特定の宿主細胞の必要性に、そして必要であれば発現しようとするタンパク質の必要条件に適応させてもよい。
【０１１６】
細胞タイプおよびその特定の必要条件に応じて、哺乳動物細胞培養を、例えば、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ、ウィリアムのＥまたはＤＭＥＭ培地中で行ってもよい。細胞を、例えば３７℃、またはＤＴ４０ニワトリ細胞に関しては４１℃で、５％ＣＯ２、水飽和大気中で維持してもよい。
【０１１７】
昆虫細胞培養に適した培地は、例えばＴＮＭ＋１０％ＦＣＳ、ＳＦ９００またはＨｙＣｌｏｎｅ  ＳＦＸ−昆虫培地である。昆虫細胞を、通常、接着または懸濁培養として、２７℃で増殖させる。
【０１１８】
真核または脊椎動物細胞のための適切な発現プロトコルは、当業者に周知であり、そして例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌ，  Ｄ．Ｗ．  ［２００１］  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ＮＹ）より得られうる。
【０１１９】
１つの態様において、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞を用いて方法を行う。さらなる態様において、ＣＨＯ細胞を用いて方法を行う。
組換え産生法で使用する宿主に応じて、発現された抗体はグリコシル化される可能性もあり、またはグリコシル化されない可能性もある。１つの態様において、本発明の抗体のコード配列を含有するプラスミドまたはウイルスを用い、そしてＮ末端ＦＬＡＧ−タグおよび／またはＣ末端Ｈｉｓ−タグに遺伝子融合させる。さらなる態様において、前記ＦＬＡＧ−タグの長さは、約４〜８アミノ酸、例えば正確に８アミノ酸である。上記ベクターを用いて、一般の当業者に一般的に知られる技術のいずれを用いて、宿主を形質転換またはトランスフェクションしてもよい。さらに、融合された機能的に連結された遺伝子を調製し、そしてこれらを例えば哺乳動物細胞および細菌において発現するための方法が当該技術分野に周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、同箇所）。
【０１２０】
形質転換宿主をバイオリアクター中で増殖させ、そして最適細胞増殖を達成するために当該技術分野に知られる技術にしたがって培養してもよい。次いで、本発明の抗体を増殖培地から単離してもよい。本発明の微生物的に発現される抗体の単離および精製は、任意の慣用的手段、例えばアフィニティクロマトグラフィ（例えばＳｔｒｅｐ−タグIIまたはＨｉｓ６タグなどの融合タグを用いて）、ゲル濾過（サイズ排除クロマトグラフィ）、陰イオン交換クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣまたは免疫沈降によってもよい。これらの方法は当該技術分野に周知であり、そして一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌ，  Ｄ．Ｗ．  ［２００１］  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ＮＹ）に記載されてきている。
【０１２１】
本発明にしたがって、用語「産生された抗体を単離する」は、抗体、例えば本発明の抗ｃＴｎＴ抗体の単離を指す。
本発明はさらに：
（ｉ）本発明の抗体、
（ｉｉ）本発明の核酸分子、
（ｉｉｉ）本発明のベクター、
（ｉｖ）本発明の宿主細胞、および／または
（ｖ）本発明の方法によって産生される抗体
の少なくとも１つを含む組成物に関する。
【０１２２】
用語「組成物」は、本発明にしたがって用いた際、列挙する化合物の少なくとも１つを含む組成物に関する。組成物は、随意に、それによって本発明の化合物の特性を改変する、例えば安定化する、調節するおよび／またはその機能を増進することが可能なさらなる分子を含んでもよい。組成物は固形または液体型であってもよく、そしてとりわけ、粉末（単数または複数）、錠剤（単数または複数）または溶液（単数または複数）の形であってもよい。
【０１２３】
組成物の構成要素を１つの容器または複数の容器、例えば密封アンプルまたはバイアル中に、水溶液としてまたは再構成のための凍結乾燥配合物として、パッケージングしてもよい。凍結乾燥配合物の例として、１０ｍｌバイアルに５ｍｌの１％（ｗ／ｖ）または１０％（ｗ／ｖ）水溶液を充填し、そして生じた混合物を凍結乾燥する。例えば療法使用のための注射用水、または診断目的のための別の望ましい溶媒、例えば緩衝剤のいずれかを用いて、凍結乾燥化合物（単数または複数）を再構成することによって、使用のための溶液を調製する。保存剤および他の添加剤もまた存在してもよく、例えば抗微生物剤、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガス等が存在してもよい。
【０１２４】
組成物の多様な構成要素を、使用のための説明書とともに、キットとしてパッケージングしてもよい。
１つの態様において、本発明の組成物は、当業者が、当該技術分野に周知のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ法、例えばイムノアッセイのような方法を行うことを可能にする組成物である。
【０１２５】
本発明の抗体を利用してもよいイムノアッセイの例は、直接または間接的形式いずれかのイムノアッセイである。こうしたイムノアッセイの例は、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、あるいは発光、蛍光、化学発光または電気化学発光の検出に基づくイムノアッセイである。
【０１２６】
以下において、本発明は、心臓トロポニンＴの検出で例示される。他のターゲット抗原に対して向けられる本発明の抗体を、適宜修飾されたアッセイで用いてもよいことに注目しなければならない。
【０１２７】
心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）は、それぞれ、ＵＳ  ６，３３３，３９７およびＵＳ  ６，３７６，２０６に開示されるようなサンドイッチイムノアッセイによって最適に検出され、そして本質的にｃＴｎＴの測定のためのすべての続く世代のアッセイで確認される。第五世代ｃＴｎＴアッセイ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツによって販売される、ｃＴｎＴに関する高感度アッセイ（ｈｓ−ｃＴｎＴ）において、なお、サンドイッチイムノアッセイ原理が使用される。このアッセイは、５ｎｇ／ｍｌの検出下限（ＬＯＤ）でｃＴｎＴを検出可能であるため、高感度アッセイである。用いるアッセイプロトコルに応じて、それぞれ９または１８分間の全体の非常に短いインキュベーション時間にもかかわらず、この優れたＬＯＤに到達する。このアッセイにおいて、ビオチン化捕捉抗体およびルテニル化検出抗体を含むサンドイッチが形成される。この複合体は、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズに結合し、そして未結合物質は洗い流される。当業者に明らかであるように、Ｋｄが傑出していない場合、これは非常に重要であり、これは、ある程度の解離が生じ、そしてシグナルの減少が導かれ、これがＬＯＤ減少に直接つながるであろうためである。
【０１２８】
当業者には明らかであるように、本発明記載の抗体をｃＴｎＴの検出のための方法に用いることが好適であろう。
１つの態様において、本開示は、試料においてｃＴｎＴを検出する方法であって：ａ）本開示にしたがった抗ｃＴｎＴ抗体と試料を、抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ複合体の形成のために十分な時間および条件下で接触させ；そしてｂ）抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ複合体を測定する、ここでその複合体の量は、試料中のｃＴｎＴの濃度の指標となる、前記方法に関する。例えば「抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ複合体」における用語「／」は、一方で抗ｃＴｎＴ抗体および他方でｃＴｎＴの間で、非共有複合体が形成されることを示すために用いられる。
【０１２９】
１つの態様において、本発明は、試料中のｃＴｎＴを検出する方法であって：ａ）ｃＴｎＴに対する第一の抗体およびｃＴｎＴに対する第二の抗体を試料と、第一の抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ／第二の抗ｃＴｎＴ抗体の複合体が形成されるために十分な時間および条件下で接触させ、ここで第二の抗体は、検出可能に標識されており；そしてｂ）（ａ）で形成される複合体を測定する、ここで、この複合体の量は、試料中のｃＴｎＴの濃度の指標であり、そして第一または第二の抗体のいずれかが、本発明記載の抗体である、前記方法に関する。
【０１３０】
当業者に明らかであるように、試料を、任意の望ましい順序で、すなわち、まず、第一の抗体、第二の抗体；第一の抗体よりもまず第二の抗体、または同時に、第一の抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ／第二の抗ｃＴｎＴ抗体の複合体が形成されるために十分な時間および条件下で接触させてもよい。
【０１３１】
当業者が容易に認識するであろうように、特定の抗ｃＴｎＴ抗体およびｃＴｎＴ抗原／分析物の間の複合体（＝抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ複合体）の形成、またはｃＴｎＴに対する第一の抗体、ｃＴｎＴ（分析物）および第二の抗ｃＴｎＴ抗体の複合体を含む二次またはサンドイッチ複合体（＝第一の抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ／第二の抗ｃＴｎＴ抗体の複合体）の形成いずれかのために適切であるかまたは十分である時間および条件を確立することは、ルーチンの実験に過ぎないことが容易に認識されるであろう。
【０１３２】
任意の適切な手段によって、抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ複合体の検出を行ってもよい。当業者は、こうした手段／方法をよく知っている。
用語「試料」または「関心対象の試料」または「試験試料」は、本明細書において交換可能に用いられる。試料はｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分析され、そして体内には戻されないであろう。試料の例には、限定されるわけではないが、液体試料、例えば血液、血清、血漿、滑液、尿、唾液、およびリンパ液、あるいは固形試料、例えば組織抽出物、軟骨、骨、滑膜、および結合組織が含まれる。１つの態様において、試料は、血液、血清、血漿、滑液および尿より選択される。１つの態様において、試料は、血液、血清および血漿より選択される。１つの態様において、試料は血清または血漿である。
【０１３３】
用語「参照試料」は、本明細書において、関心対象の試料と実質的に同一の方式で分析され、そしてその情報が関心対象の試料のものに比較される、試料を指す。参照試料は、それによって、関心対象の試料から得られる情報の評価を可能にする標準を提供する。参照試料は、健康なまたは正常な組織、臓器または個体から得られてもよく、それによって、組織、臓器または個体の健康状態の標準を提供してもよい。正常参照試料の状態および関心対象試料の状態の間の相違は、疾患発展のリスク、あるいはこうした疾患または障害の存在またはさらなる進行の指標となりうる。参照試料は、異常なまたは疾患の組織、臓器または個体から得られてもよく、それによって、組織、臓器または個体の疾患状態の標準を提供してもよい。異常な参照組織の状態および関心対象試料の状態の間の相違は、低下した疾患発展のリスク、あるいはこうした疾患または障害の非存在または改善の指標となりうる。
【０１３４】
用語、指標の「上昇した」または「増加した」レベルは、参照または参照試料におけるこうした指標のレベルに比較してより高い、試料におけるこうした指標のレベルを指す。例えば、所定の疾患を患っていない個体の液体試料におけるよりも、所定の疾患を患っている個体の同じ液体試料において、より多量に検出可能であるタンパク質は、上昇したレベルを有する。
【０１３５】
特定の態様において、ｃＴｎＴに対する第一の抗体、ｃＴｎＴ（分析物）およびｃＴｎＴに対する第二の抗体を含むサンドイッチであって、第二の抗体が検出可能に標識されている前記サンドイッチが形成されるであろう。
【０１３６】
一般的に、以下のカテゴリーに分類されうる多数の標識（色素とも称される）が入手可能であり、これらすべてはともに、そして各々、本開示にしたがった態様に相当する：
（ａ）蛍光色素
蛍光色素は、例えば、Ｂｒｉｇｇｓら  ”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  Ａｍｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，”  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｔｒａｎｓ．  １  （１９９７）  １０５１−１０５８）に記載されるとおりである。
【０１３７】
蛍光標識またはフルオロフォアには、希土類キレート（ユーロピウムキレート）、ＦＩＴＣ、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセインを含むフルオレセイン型標識；ＴＡＭＲＡを含むローダミン型標識；ダンシル；リサミン；シアニン；フィコエリトリン；テキサスレッド；およびその類似体が含まれる。蛍光標識は、本明細書に開示する技術を用いて、ターゲット分子中に含まれるアルデヒド基にコンジュゲート化可能である。蛍光色素および蛍光標識試薬には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（米国オレゴン州ユージーン）およびＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．（イリノイ州ロックフォード）より商業的に入手可能なものが含まれる。
【０１３８】
（ｂ）発光色素
発光色素または標識は、化学発光および電気化学発光色素にさらに下位分類することも可能である。
【０１３９】
異なるクラスの化学発光原標識には、ルミノール、アクリジニウム化合物、セレンテラジンおよび類似体、ジオキセタン、ペルオキシシュウ酸およびその誘導体に基づく系が含まれる。免疫診断法に関しては、主に、アクリジニウムに基づく標識が用いられる（詳細な概説は、Ｄｏｄｅｉｇｎｅ  Ｃ．ら，  Ｔａｌａｎｔａ  ５１  （２０００）  ４１５−４３９に提供される）。
【０１４０】
電気化学発光標識として用いられる主な標識は、それぞれ、ルテニウムおよびイリジウムに基づく電気化学発光複合体である。電気化学発光（ＥＣＬ）は、高感度および選択的方法として、分析適用に非常に有用であることが証明された。該方法は、化学発光分析（バックグラウンド光学シグナルを持たない）の分析上の利点を、電極電位を適用することによる反応制御の容易さと組み合わせている。一般的に、ルテニウム複合体、特に液相または液体−固体界面において、ＴＰＡ（トリプロピルアミン）で再生する［Ｒｕ（Ｂｐｙ）３］２＋（〜６２０ｎｍで光子を放出する）がＥＣＬ標識として用いられる。近年、イリジウムに基づくＥＣＬ標識もまた記載されてきている（ＷＯ２０１２１０７４１９（Ａ１））。
【０１４１】
（ｃ）放射標識は、放射性同位体（放射性核種）、例えば３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇｎ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９９ＴＣ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、または１３１Ｂｉなどを利用する。
【０１４２】
（ｄ）画像撮影および療法目的のための標識として適切な金属キレート複合体が当該技術分野に周知である（ＵＳ  ２０１０／０１１１８５６；  ＵＳ  ５，３４２，６０６；  ＵＳ  ５，４２８，１５５；  ＵＳ  ５，３１６，７５７；  ＵＳ  ５，４８０，９９０；  ＵＳ  ５，４６２，７２５；  ＵＳ  ５，４２８，１３９；  ＵＳ  ５，３８５，８９３；  ＵＳ  ５，７３９，２９４；  ＵＳ  ５，７５０，６６０；  ＵＳ  ５，８３４，４５６；  Ｈｎａｔｏｗｉｃｈら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５  （１９８３）  １４７−１５７；  Ｍｅａｒｅｓら，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １４２  （１９８４）  ６８−７８；  Ｍｉｒｚａｄｅｈら，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １  （１９９０）  ５９−６５；  Ｍｅａｒｅｓら，  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  （１９９０）、Ｓｕｐｐｌ．  １０：２１−２６；  Ｉｚａｒｄら，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ３  （１９９２）  ３４６−３５０；  Ｎｉｋｕｌａら，  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ２２  （１９９５）  ３８７−９０；  Ｃａｍｅｒａら，  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ２０  （１９９３）  ９５５−６２；  Ｋｕｋｉｓら，  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ３９  （１９９８）  ２１０５−２１１０；  Ｖｅｒｅｌら，  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ４４  （２００３）  １６６３−１６７０；  Ｃａｍｅｒａら，  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ２１  （１９９４）  ６４０−６４６；  Ｒｕｅｇｇら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５０  （１９９０）  ４２２１−４２２６；  Ｖｅｒｅｌら，  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ４４  （２００３）  １６６３−１６７０；  Ｌｅｅら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１  （２００１）  ４４７４−４４８２；  Ｍｉｔｃｈｅｌｌら，  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ４４  （２００３）  １１０５−１１１２；  Ｋｏｂａｙａｓｈｉら  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １０  （１９９９）  １０３−１１１；  Ｍｉｅｄｅｒｅｒら，  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ４５  （２００４）  １２９−１３７；  ＤｅＮａｒｄｏら，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４  （１９９８）  ２４８３−９０；  Ｂｌｅｎｄら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  １８  （２００３）  ３５５−３６３；  Ｎｉｋｕｌａら  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ４０  （１９９９）  １６６−７６；  Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ３９  （１９９８）  ８２９−３６；  Ｍａｒｄｉｒｏｓｓｉａｎら，  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ２０  （１９９３）  ６５−７４；  Ｒｏｓｅｌｌｉら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  １４  （１９９９）  ２０９−２０）。
【０１４３】
１つの態様において、ｃＴｎＴに対する第一の抗体、ｃＴｎＴ（分析物）およびｃＴｎＴに対する第二の抗体を含む、サンドイッチが形成され、ここで第二の抗体は検出可能に標識されており、そして第一の抗ｃＴｎＴ抗体は、固相に結合可能であるかまたは固相に結合している。
【０１４４】
１つの態様において、本発明に開示する抗ｃＴｎＴ抗体を、ｃＴｎＴを測定するイムノアッセイで用いる。１つの態様において、本明細書で上に開示する抗ｃＴｎＴ抗体を、サンドイッチ型イムノアッセイに用いる。１つの態様において、本発明に開示する抗ｃＴｎＴ抗体を検出抗体として用いる。１つの態様において、本明細書に開示するような抗ｃＴｎＴ抗体を、発光色素、特に化学発光色素または電気化学発光色素で検出可能に標識する。
【０１４５】
本発明の説明および実施例には、これらのおよび他の態様が開示され、そして含まれる。本発明にしたがって使用される方法、使用および化合物のいずれか１つに関するさらなる文献は、例えば電子デバイスを用いて、公的ライブラリーおよびデータベースから検索可能である。例えば、インターネット上で利用可能である公的データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」を、例えばｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌで、ワールドワイドウェブにおいて利用してもよい。ワールドワイドウェブにおいて利用可能であるさらなるデータベースおよびアドレス、例えばｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／、ｆｍｉ．ｃｈ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ、ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／、またはｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ．ｆｒ／が当業者に知られ、そしてｌｙｃｏｓ．ｃｏｍで、ワールドワイドウェブ中のアドレスを用いてもまた得られうる。
【０１４６】
別に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野において、一般の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含めて特許明細書が優先するであろう。
【０１４７】
本明細書に提供するすべてのアミノ酸配列は、当該技術分野で習慣的に行われるように、最もＮ末端の残基で始まり、そして最もＣ末端の残基で終わるよう提示され（Ｎ→Ｃ）、そして本発明全体でアミノ酸を同定するために用いる１文字または３文字略語は、アミノ酸に関して一般的に用いられるものに対応する。
【０１４８】
本明細書において、特に請求項において特徴づけられる態様に関して、従属請求項において言及される各態様は、前記従属請求項が従属する各請求項（独立または従属）の各態様と組み合わせられると意図される。例えば、独立請求項１が３つの選択肢Ａ、ＢおよびＣを列挙し、従属請求項２が選択肢Ｄ、ＥおよびＦを列挙し、そして請求項３が請求項１および２に従属し、そして３つの選択肢Ｇ、ＨおよびＩを列挙する場合、別に特に言及しない限り、明細は明確に、組み合わせＡ、Ｄ、Ｇ；  Ａ、Ｄ、Ｈ；  Ａ、Ｄ、Ｉ；  Ａ、Ｅ、Ｇ；  Ａ、Ｅ、Ｈ；  Ａ、Ｅ、Ｉ；  Ａ、Ｆ、Ｇ；  Ａ、Ｆ、Ｈ；  Ａ、Ｆ、Ｉ；  Ｂ、Ｄ、Ｇ；  Ｂ、Ｄ、Ｈ；  Ｂ、Ｄ、Ｉ；  Ｂ、Ｅ、Ｇ；  Ｂ、Ｅ、Ｈ；  Ｂ、Ｅ、Ｉ；  Ｂ、Ｆ、Ｇ；  Ｂ、Ｆ、Ｈ；  Ｂ、Ｆ、Ｉ；  Ｃ、Ｄ、Ｇ；  Ｃ、Ｄ、Ｈ；  Ｃ、Ｄ、Ｉ；  Ｃ、Ｅ、Ｇ；  Ｃ、Ｅ、Ｈ；  Ｃ、Ｅ、Ｉ；  Ｃ、Ｆ、Ｇ；  Ｃ、Ｆ、Ｈ；  Ｃ、Ｆ、Ｉに対応する態様を開示することが理解されるものとする。
【０１４９】
同様に、そしてまた独立および／または従属請求項が選択肢を列挙しない場合にも、従属請求項が複数の先行する請求項に言及する場合、それによって含まれる主題の任意の組み合わせが明らかに開示されると見なされることが理解される。例えば、独立請求項１があり、従属請求項２が請求項１に言及し、そして従属請求項３が請求項２および１の両方に言及する場合、請求項３および１の主題の組み合わせが、明らかにそして明確に開示され、請求項３、２および１の主題の組み合わせも同様であるということになる。請求項１〜３のいずれか１項に言及するさらなる従属請求項４が存在する場合、請求項４および１、請求項４、２および１、請求項４、３および１、ならびに請求項４、３、２および１の主題の組み合わせが、明らかにそして明確に開示されるということになる。
【０１５０】
上記考慮はすべての付随する請求項に変更すべきところは変更して適用される。限定されない例を提供するため、請求項１３、１２および１（ｉ）の組み合わせは、請求項構造に関して明らかにそして明確に想定される。同じことは、例えば請求項１３、１１および４（ｉｉ）の組み合わせ等に当てはまる。
【０１５１】
本発明の特定の側面はまた付随する図によっても例示される。
以下の実施例が本発明を例示する。
【実施例】
【０１５２】
実施例１：材料および一般的な方法
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．ら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９に記載されるような標準法を用いて、ＤＮＡを操作した。製造者の指示にしたがって分子生物学試薬を用いた。
【０１５３】
ＤＮＡ配列決定
Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ  ＡＧ（スイス・バルガッハ）で行われる二本鎖配列決定によって、ＤＮＡ配列を決定した。
【０１５４】
ＤＮＡおよびタンパク質配列分析、ならびに配列データ管理
Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴ１  Ａｄｖａｎｃｅパッケージソフト、バージョン１１．５．０を、配列生成、マッピング、分析、注釈および例示に用いた。
【０１５５】
タンパク質化学および標識技術
標準タンパク質化学および標識技術は、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  Ｇ．  “Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”  第３版  （２０１３）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに提供される。
【０１５６】
バイオインフォマティクス
バイオインフォマティクス法は、例えば、Ｋｅｉｔｈ  Ｊ．Ｍ．  （監修）  “Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ”  Ｖｏｌ．  ＩおよびＶｏｌ．  ＩＩ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．  １５２５およびＶｏｌ．  １５２６  （２０１７）  Ｓｐｒｉｎｇｅｒに、そしてＭａｒｔｉｎ，  Ａ．Ｃ．Ｒ．  ＆  Ａｌｌｅｎ，  Ｊ．  “Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”  ：  Ｄｕｅｂｅｌ  Ｓ．  ＆  Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  Ｊ．Ｍ．  （監修）  “Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”中  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  （２０１４）に提供される。
【０１５７】
電気化学発光イムノアッセイ
イムノアッセイおよび関連法は、例えば、Ｗｉｌｄ  Ｄ．  （監修）  “Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”  第４版  （２０１３）  Ｅｌｓｅｖｉｅｒに提供される。電気化学発光標識としてのルテニウム複合体は、例えば、Ｓｔａｆｆｉｌａｎｉ  Ｍ．ら  Ｉｎｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ４２  （２００３）  ７７８９−７７９８に提供される。典型的には、電気化学発光（ＥＣＬ）に基づくイムノアッセイの実行のため、Ｅｌｅｃｓｙｓ  ２０１０分析装置または後継系、例えばＲｏｃｈｅ分析装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ・マンハイム）例えば、Ｅ１７０、ｃｏｂａｓ  ｅ  ６０１モジュール、ｃｏｂａｓ  ｅ  ６０２モジュール、ｃｏｂａｓ  ｅ  ８０１モジュール、およびｃｏｂａｓ  ｅ  ４１１、ならびにこれらの分析装置のために設計されたＲｏｃｈｅ  Ｅｌｅｃｓｙｓアッセイを、別に示さない限り、各々、標準条件を用いて、用いた。
【０１５８】
実施例２：ライブラリー構築
親抗体可変重鎖は、ネズミ起源のものである（配列番号３４）。それぞれ、ＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２および／またはＨＣＣＤＲ３の単一アミノ酸ランダム化を目的として、突然変異ＨＣＣＤＲを含むライブラリーを構築した。第一の工程において、各々、４つの異なる親抗体フレームワーク領域の１つをコードする４つのＤＮＡ断片を生成した。社内で、ポリメラーゼ連鎖反応によって、フレームワーク領域１、３および４を得て、フレームワーク領域２に相当する短い断片２（４２ｂｐ）を、Ｍｅｔａｂｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＧで注文した（図１Ａを参照されたい）。断片をゲル精製し、そして定量化した。これらのＤＮＡ断片の１つの１００ｎｇを、４つのアドオンＰＣＲ反応混合物の各々において、ポリヌクレオチドテンプレートとして用いた。親ＣＤＲと同じ数のコドンを含むポリヌクレオチドライブラリーの使用によってＣＤＲ領域を付加し、ここで前記ライブラリーのメンバーは、それぞれのＨＣＣＤＲのそれぞれのコドン位各々に１つのＮＮＫコドンを含むライブラリーメンバーを含むよう設計された。さらに、ＣＤＲライブラリー中のポリヌクレオチドは、それぞれのＣＤＲに隣接するフレームワーク領域にハイブリダイズ可能な配列を含んだ。入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ増幅のため、末端プライマーを用いた。それによって（図１Ｂを参照されたい）、部分的に重複する配列を含む４つのＤＮＡ断片を生成した。ＦＷ１配列の３’端に、そしてＦＷ４配列の５’端にハイブリダイズする末端プライマーを用いて、重複ＰＣＲを行って、４つの断片を直鎖ＤＮＡライブラリー構築物に連結した（図１Ｃを参照されたい）。典型的なＰＣＲ反応を、ＰＣＲ等級の水で１００μｌ反応混合物に満たし、該混合物は、ＭｇＳＯ４を含む１０μｌの１０ｘＰＣＲ緩衝剤、２００μＭ  ｄＮＴＰ混合物、０．５μＭ順方向プライマーおよび逆方向プライマー、２５０ｎｇ  ＤＮＡテンプレート、５単位のＰｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼを含有した。典型的なＰＣＲは、９４℃５分間の初期テンプレート変性で開始し、３０サイクル（９４℃２分間、６０℃４５秒間、７２℃１分間）を使用し、そして７２℃５分間の最終伸長工程を含有した。プライマー、テンプレートおよび断片配列を表１に列挙する。ライブラリー断片は、細胞不含系における転写および翻訳の成功に必要なすべての制御配列を含有した。当業者は、当該技術分野の方法によって、こうしたライブラリーを生成可能である。例えば、Ｈａｎｅｓ，  Ｊ．  ＆  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．  （１９９７），  “Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｄｉｓｐｌａｙ”，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９４，  ４９３７−４２を参照されたい。こうして生成した、３つのＨＣ  ＣＤＲを含み、そして約５・１０１１ライブラリーメンバーに相当するＤＮＡライブラリー２５０ｎｇを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイアプローチに用いた。
【０１５９】
表１：
抗ｃＴｎＴ  Ｆａｂ断片ライブラリーの生成に用いた配列
【０１６０】
【表１−１】
2021515573.tif 000002
【０１６１】
【表１−２】
2021515573.tif 000003
【０１６２】
【表１−３】
2021515573.tif 000004
【０１６３】
実施例３：ｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ
Ｆａｂディスプレイ用の緩衝液を調製し、そして回転ローテーションで、４℃で一晩インキュベーションした。洗浄緩衝液、ＷＢ（６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ；ＡｃＯＨでｐＨ７．５に調整、１８０ｍＭ  ＮａＣｌ、６０ｍＭ酢酸マグネシウム、５％ブロッカーＢＳＡ、３３ｍＭ  ＫＣｌ、２００μｇ  ｔ−ＲＮＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）；ビーズ洗浄緩衝液ＢＷＢ（１００ｍＭ  ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）；停止緩衝液ＳＢ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ＡｃＯＨでｐＨ７．５に調整、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸マグネシウム、５％ブロッカーＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）、３３ｍＭ  ＫＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、８．２ｍＭ酸化グルタチオン）；溶出緩衝液（５５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＡｃＯＨでｐＨ７．５に調整、１６５ｍＭ  ＮａＣｌ、２２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍｇ  ＢＳＡ、５０００Ｕ  ｒＲＮＡ（５０００Ｕ）、５０μｇ  ｔＲＮＡ）。
【０１６４】
必要な体積の磁気ビーズ（ストレプトアビジンコーティングビーズ）を、１０μＬ初期懸濁物あたり１００μＬの洗浄緩衝液（ＷＢ）を用い、回転ローテーションで、４℃で一晩ブロッキングした。２５μＬのビーズをプレパニング工程に用い、そして２０μＬをターゲット／バックグラウンド試料あたりのパニングに用いた。ビーズ保存緩衝液のアジ化ナトリウムを除去するため、ビーズ洗浄緩衝液（ＢＷＢ）で４回、そしてＷＢで３回、ビーズを洗浄した。ビーズを収集するために磁場を２分間適用し、そして続いて上清を廃棄することによって、これらの工程を実行した。最終洗浄工程後、ビーズを最初の体積までＷＢ中に再懸濁した。
【０１６５】
製造者の指示にしたがって、ＰＵＲＥｆｒｅｘＴＭ  ＤＳ２．０を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および翻訳を行った。ターゲット（Ｔ）に関して１．５ｍＬ反応試験管およびバックグラウンド（ＢＧ）に関するものを用意した。
【０１６６】
発現テンプレート（ＬＣ）およびディスプレイテンプレート（ＨＣ）のＤＮＡ投入を、２：１分子比で適用した。ディスプレイおよび発現テンプレートをコードするＤＮＡの量をすべてのＦａｂディスプレイサイクルで一定に維持した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳反応混合物を３７℃で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、１００μＬ停止緩衝液を添加し、その後、１４０００ｒｐｍ、１℃で１５分間の遠心分離工程によって、反応を停止した。別に記載しない限り、続く工程を４℃で行った。翻訳混合物の反応停止上清を、調製したビーズ懸濁物に添加し、そしてロッキングプラットホーム上で３０分間インキュベーションした。その後、懸濁物を１３０００ｒｐｍおよび１℃で１０分間遠心分離して、残りの３つ組複合体を含む上清から、非特異的結合分子を含むビーズを分離した。プレパニングした上清（３００μＬ）を、ＷＢであらかじめブロッキングした新たな２ｍＬ反応試験管に移し、そしてさらなる使用まで、氷上で維持した。ターゲット（組換えビオチン化ｃＴｎＴ）を、最終濃度１０ｎＭ〜５０ｎＭの範囲で、３００μＬプレパニング上清に添加した。選択圧を上昇させるため、ビオチン化ｃＴｎＴ濃度をサイクルごとに減少させた。懸濁物をロッキングプラットホーム上で３０分間インキュベーションした。溶液パニング工程によって、ビオチン化ｃＴｎＴおよび３つ組複合体の間の特異的結合が可能になった。ターゲットｃＴｎＴに結合した３つ組複合体を、２０分間のインキュベーション工程において、ストレプトアビジンビーズで捕捉した。サイクルＩＩＩにおいて、２つの方法で選択圧のさらなる増加を達成した：抗原濃度を２ｎＭに減少させることによるか、または非ビオチン化競合剤を用いることによるかいずれか。後者の場合、低ビオチン化ｃＴｎＴ濃度および過剰な競合剤ｃＴｎＴで、パニング工程を一晩行った。
【０１６７】
洗浄工程は、磁場における、結合したターゲット−３つ組複合体でのビーズの捕捉、その後、上清の除去を含む。ビーズを５００μＬ氷冷ＷＢで洗浄した。続くディスプレイサイクルで、洗浄工程の期間を５分から１時間に延長することによって、選択圧を増加させた。最終洗浄工程を用いて、ブロッキングされた新たな２ｍＬの反応試験管にビーズを移した。続いて、磁場でビーズを捕捉し、そして上清を除去した。ＥＤＴＡを含有する１００μＬの１ｘＥＢを添加し、そして振盪しながら１０分間インキュベーションすることによって、以下の溶出工程を行った。３つ組複合体からｍＲＮＡを放出させた。その後、溶出混合物を１４０００ｒｐｍ、１℃で１０分間遠心分離した。製造者の指示にしたがって、ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅクリーンナップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、濃縮されたＲＮＡを単離しそして精製した。ＲＮＡを１６μＬのＲＮａｓｅ不含水で溶出した。選択工程由来の残渣ＤＮＡを消化するため、製造者の指示にしたがって、Ａｍｂｉｏｎ  ＤＮＡ−ｆｒｅｅＴＭキットを用いた。残渣ＤＮＡは、続くＰＣＲ反応では増幅不能である。ＤＮアーゼ脱活性化後、懸濁物を１３０００ｒｐｍおよび室温で２分間遠心分離した。上清（５０μＬ）を、氷上で、新鮮な１．５ｍＬ反応試験管に移した。精製ＲＮＡを逆転写（ＲＴ）のために直ちに用いた。残りの上清は−２０℃で保存した。
【０１６８】
溶出ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。パニング工程において、２つの反応を、ターゲットを含有する試料Ｔのためにセットアップした。２つのさらなる反応を試料ＢＧのために用意し、そして陰性対照は水を含有した。試料の数にしたがって、マスターミックスを調製し、そしてプレミックスを氷上で０．２ｍＬ反応試験管に分配した。各反応に、１２μＬの溶出ＲＮＡおよび０．５μＬの逆転写酵素を接種した。ＲＮＡの代わりに１２μＬのＲＮアーゼ不含水で、陰性対照を実施した。ＰＣＲサーモサイクラー中、６５℃で４５分間、逆転写を行った。続いて、ｃＤＮＡ試料を氷上で５分間インキュベーションし、そして以下の工程で増幅した。残りの試料を−２０℃で保存した。２つのＰＣＲ反応を実行した：最初のＰＣＲ「ＲＴに対するＰＣＲ」を、選択プールのｃＤＮＡを増幅するため、プライマーＦｒｔおよびＲｒｔで実行した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳のための制御要素を再付着させるため、プライマーＦ１ＡおよびＲ１Ａを用いた第二のＰＣＲ、「ＲＴ−ＰＣＲに対するＰＣＲ」を適用した。Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、両反応を実行した。
【０１６９】
選択プールの十分なＤＮＡ濃度を提供するため、試料ＴおよびＢＧ各々に関して、４つの反応をセットアップした。
さらに、４つの対照試料をセットアップした。最初の２つの試料は、試料ＴおよびＢＧのｍＲＮＡ単離後のＤＮＡ消化から得られ、そして潜在的に残っているＤＮＡを増幅するＰＣＲによって該試料を検証した。第三および第四は、ＰＣＲ等級の水を用いた、ＲＴの陰性対照および「ＲＴに対するＰＣＲ」に関する陰性対照であった。
【０１７０】
ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットで、調製用１％アガロースゲルから、ＴのＰＣＲ産物を精製し、続いて、定量化し、そして「ＲＴ−ＰＣＲに対するＰＣＲ」のテンプレートとして用いた。選択プールの３つの反応、およびＤＮＡテンプレートの代わりにＰＣＲ等級の水を用いた陰性対照のものを用意した。各反応に関して、２５０ｎｇのあらかじめ精製した「ＲＴに対するＰＣＲ」を用いた。ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットで、１％調製用アガロースゲルから、ＰＣＲ産物を精製し、そして適切な発現系への続くサブクローニングのため、さらに修飾した。
【０１７１】
実施例４：濃縮された結合剤のペリプラズム発現
濃縮されたＦａｂ結合剤を単離するため、ＦａｂのヒトＣＨ１ドメイン、ネズミＶＬドメインおよびヒトＣＬドメインを含有するｐｈｏＡＴＩＲ３−９ｂｉ  Ｆａｂ  ＴＮ−Ｔ  Ｍ７ｃｈｉｍ発現ベクター（図２を参照されたい）内に、ネズミ可変ＨＣをクローニングした。発現ベクター内へのクローニングを可能にするため、リーダー配列Ｔｉｒ９に位置するＢｓｉＷＩ制限部位を、各選択プールに提供した。
【０１７２】
第二の制限部位ＫｐｎＩは、ＨＣの可変領域の末端に存在し、そしてしたがって、付着させる必要はない。したがって、ＢｓｉＷＩ制限部位を含有する順方向プライマー５’  ＧＣＴＡＣＡＡＡＣＧＣＧＴＡＣＧＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧ−３’（配列番号９５）、および逆方向プライマーＲｒｔ  ５’−ＧＧＡＡＡＧＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＣＡＣＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＴＧＣ−３’（配列番号８８）を用いたＰＣＲを行った。９６ウェルディープウェルブロック（ＤＷＢ）中でペリプラズム発現を行った。Ｉｎｔｅｇｒａ  ＶＩＡＦｌｏ９６を用いることによって、プレ培養（「マスター」）ＤＷＢにウェルあたり１ｍＬのＬＢ（１００μｇ／ｍＬアンピシリン）を満たし、そしてあらかじめ実施されたサブクローニングおよび形質転換の単離クローンを接種した。選択プールあたり約３００コロニーを摘み取った。１つのウェルを陰性対照として接種なしに放置し；別のウェルに、陽性対照として、ＴｎＴ  Ｍ−７（野生型）Ｆａｂ発現ベクターで形質転換したＸＬ１ブルーを接種した。ＤＷＢを空気浸透可能膜で密封し、そして軌道振盪装置インキュベーター（７５０ｒｐｍ）中、３０℃で一晩インキュベーションした。続いて、Ｓｉｍｍｏｎｓ，  Ｌ．  Ｃ．，  Ｒｅｉｌｌｙ，  Ｄ．，  Ｋｌｉｍｏｗｓｋｉ，  Ｌ．，  Ｒａｊｕ，  Ｔ．  Ｓ．，  Ｍｅｎｇ，  Ｇ．，  Ｓｉｍｓ，  Ｐ．，  Ｈｏｎｇ，  Ｋ．，  Ｓｈｉｅｌｄｓ，  Ｒ．  Ｌ．，  Ｄａｍｉｃｏ，  Ｌ．  Ａ．，  Ｒａｎｃａｔｏｒｅ，  Ｐ．  ＆  Ｙａｎｓｕｒａ，  Ｄ．  Ｇ．  （２００２）  “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６３，  １３３−４７に記載されるように、マスターＤＷＢの各ウェルから５０μＬを、ウェルあたり１１５０ｍＬ  Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン）で調製した新規「発現」ＤＷＢに移した。ＤＷＢを空気浸透可能膜で密封し、そして軌道振盪装置インキュベーター中、３０℃でインキュベーションした。Ｆａｂ発現の誘導は、ｐｈоＡプロモーターとリン酸制限Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．培地に基づく。２４時間後、４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって、Ｆａｂを発現する細胞を採取し、そしてさらなる使用まで、−２０℃で保存した。
【０１７３】
プレ培養マスターＤＷＢを、９５０μＬの４０％グリセロールを添加し、そして−８０℃で保存することによる「グリセロールショック」に用いた。密封ＤＷＢを５分間激しくボルテックスし、そしてさらに室温で１０分間振盪することによって、細胞ペレットを５０μＬのＢ−ＰＥＲＩＩ細菌タンパク質抽出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁した。細胞溶解物を９５０μＬ  Ｔｒｉｓ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で希釈し、そして１０分間インキュベーションした後に遠心分離した（１０分間、４０００ｒｐｍ）。未精製細胞抽出物を含有する発現ブロックを、ＳＰＲ動力学研究においてさらに使用するまで、４℃で維持した。
【０１７４】
実施例５：ＥＬＩＳＡスクリーン
詳細なＢｉｏａｃｏｒｅ分析のために、最適な突然変異Ｆａｂ結合剤を明らかにするため、先の酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施した。ＥＬＩＳＡセットアップを図３に示す。軌道振盪装置上で振盪することによって、ビオチン化組換え心臓トロポニンＴ（１００ｎＭ）をストレプトアビジン−ＭＴＰ９６ウェルプレートにＲＴで１時間捕捉した。抗原トロポニンＴを１００μＬ  ＩＰ緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７．３、１％ＢＳＡ）中で希釈した。続いて、マイクロプレート洗浄装置ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬｘ４０５  Ｓｅｌｅｃｔを用いて、ウェルを３００μＬ  １ｘ洗浄緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．２％Ｂｒｏｎｉｄｏｘ）で３回洗浄した。洗浄後、突然変異抗ｃＴｎＴ  Ｆａｂ結合剤を含有する未精製細胞抽出物をＩＰ緩衝液で１：２に希釈し、そしてトロポニンＴが捕捉されたウェルに移した。再び、ウェルを３００μＬ  １ｘ洗浄緩衝液で３回洗浄した。ヤギで産生された抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）−ペルオキシダーゼ標識抗体（検出抗体）を１：４００００希釈（ＩＰ緩衝液中）で用いて、トロポニンＴ結合突然変異Ｆａｂ断片を検出した。ウェルを再び３００μＬの１ｘ洗浄緩衝液で３回洗浄して、未結合検出抗体を除去した。マイクロプレートを、ＲＴで３０分間、ウェルあたり１００μＬのＡＢＴＳでインキュベーションした。４０５ｎｍに設定したマイクロプレート読み取り装置ＢｉｏＴｅｋ  Ｐｏｗｅｒ  ｗａｖｅ  ＸＳで、光学密度を測定した。親抗ｃＴｎＴ抗体の野生型Ｆａｂを陽性対照として用いた。最初のヒットを同定し、そしてその未精製細胞抽出物を動力学分析に供した。
【０１７５】
実施例６：ＳＰＲに基づく機能分析
ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｔ２００装置上、詳細な動力学研究を３７℃で行った。Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ−５シリーズＳセンサーを装置に搭載し、そして製造者の指示にしたがってあらかじめ調整した。システム緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＴ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）であった。試料緩衝液は、１ｍｇ／ｍｌ  ＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン、Ｆｌｕｋａ）を補充したシステム緩衝液であった。１つの態様において、抗ヒト抗体捕捉系をＣＭ５バイオセンサー上で確立した。ＮＨＳ／ＥＤＣ化学を用いて、製造者の指示にしたがって、ＧＡＨＦ（ａｂ’）２、（ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２）（コード番号：１０９−００５−０９７、ロット番号１３．１２．２００５、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を固定した。１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中の３０μｇ／ｍｌのＧＡＨＦ（ａｂ’）２を、フローセル１、２、３および４にあらかじめ濃縮し、そして１０．０００  ＲＵ  ＧＡＨＦ（ａｂ’）２で固定した。続いて、センサーを１ＭエタノールアミンｐＨ８．５で飽和させた。
【０１７６】
キメラ抗ＴｎＴ抗体断片を、記載されるように大腸菌細胞中でペリプラズム発現させ、そして既知の方法によって溶解した（技術的詳細に関しては、Ａｎｄｅｒｓｅｎ，  Ｄ．  Ｃ．  ＆  Ｒｅｉｌｌｙ，  Ｄ．  Ｅ．  （２００４）；  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５，  ４５６−６２を参照されたい）。溶解物を、試料緩衝液中、１：２０に希釈した。発現溶解物から、Ｆａｂ断片を、ヒト化フレームワーク領域を通じて、流速１０μｌ／分で１分間、バイオセンサー上に捕捉し、その後、１０倍濃縮ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を用いて、３０μｌ／分で２分間の洗浄工程で洗浄した。反応単位（ＲＵ）でのＦａｂ断片捕捉レベル（ＣＬ）を監視した。組換えヒトＴｎＴ（Ｒｏｃｈｅ、３７ｋＤａ）を試料緩衝液中、９０ｎＭで希釈し、そして０ｎＭ、３０ｎＭ、１１ｎＭ、３．３ｎＭ、１．１ｎＭ、０ｎＭ、３．３ｎＭ  ＴｎＴ濃度で、濃度シリーズを生じた。分析物濃度シリーズは、３分間の会合相では８０μｌ／分であり、そして解離相を３分間監視した。
【０１７７】
分析物会合相の終了時のレポート時点で、反応単位（ＲＵ）で「結合後期（ＢＬ）」を監視した。動力学速度決定の各サイクル後、捕捉系を、２０μｌ／分で、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５の１５秒間の注入後、２０μｌ／分での１０ｍＭグリシンｐＨ１．７の１分間２回の注入によって再生した。
【０１７８】
ｃＴｎＴ分析物の動力学パラメーターｋａ［１／Ｍｓ］、ｋｄ［１／ｓ］、ｔ１／２解離［分］、ＫＤ［Ｍ］および結合化学量論（モル比）（詳細に関しては：Ｓｃｈｒａｅｍｌ，  Ｍ．  ＆  Ｂｉｅｈｌ，  Ｍ．  （２０１２）；  Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｓｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ９０１，  １７１−８１．を参照されたい）を、製造者の指示にしたがって、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、各Ｆａｂ断片突然変異体に関して決定した。動力学パラメーターをＣＤＲ突然変異部位に相関させ、そしてその抗原複合体安定性（ｔ１／２解離）にしたがって、表３に列挙する。
【０１７９】
動力学パラメーターを、対応するＣＤＲ中で同定された突然変異に相関させた。このスクリーニングで得た突然変異体はすべて、１より多いアミノ酸置換を含有した。次いで、単一置換を含む、ならびにすべての置換の多様な組み合わせ／変異を含む突然変異体Ｆａｂ断片を作製し、そして試験した。試験したすべての突然変異／組み合わせを表２に列挙する。
【０１８０】
表２：
構築し、そして分析したすべての突然変異（対応するアミノ酸置換（単数または複数）を含む）の概観
【０１８１】
【表２】
2021515573.tif 000005
【０１８２】
上記突然変異体はすべて、ＳＰＲによって分析され、そしてその抗原複合体安定性（ｔ１／２解離）にしたがってランク付けされた（表３を参照されたい）。
表３：
アフィニティ成熟ｃＴｎＴ抗体Ｆａｂ断片の動力学データ
【０１８３】
【表３】
2021515573.tif 000006
【０１８４】
表３における略語：ｋａ：会合速度定数［Ｍ−１ｓ−１］、ｋｄ：解離速度定数［ｓ−１］、ＫＤ：解離平衡定数ＫＤ［Ｍ］、ｔ／２解離：複合体半減期、ｌｎ（２）／ｋｄ＊６０［分］、Ｒｍａｘ：分析物の反応最大値［ＲＵ］、ＭＲ：モル比＝分析物の反応最大値（Ｒｍａｘ）の比。
【０１８５】
抗体組み合わせ１２、すなわち９、１７および１９番に含まれる突然変異に含まれる個々の置換を別個に分析すると（表３を参照されたい）、この突然変異抗体のアフィニティ、複合体安定性およびＥＣＬアッセイ成績を改善する、３つの突然変異部位の相乗効果があることが明らかになってくる。これはまた、そこに含まれる突然変異の相乗効果も示す。
【０１８６】
実施例７：ＨＥＫ細胞におけるキメラ抗体の発現
標準法にしたがってキメラヒト／マウス抗体を得た。対応するベクターおよびクローニング法が、Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １９９７  Ｍａｙ  １２；２０４（１）：７７−８７に記載される。
【０１８７】
ＳＰＲによって選択されるいくつかのＦａｂ断片から、全長ネズミ／ヒトキメラ抗体、すなわちヒトＩｇＧ  ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを持つ抗体を構築し、そして産生した。ＲＴ−ＰＣＲによって重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡを、ハイブリドーマクローン７．１  Ａ  １２．２−２２（ＥＣＡＣＣ  ８９０６０９０１）から得て、そしてヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期エンハンサー／プロモーター領域の下流の別個のベクター内にクローニングし、そしてその後にＢＧＨポリアデニル化シグナルが続いた。
【０１８８】
懸濁適合ヒト胚性腎臓ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ細胞株（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を抗体の一過性遺伝子発現（ＴＧＥ）に用いた：製造者の指針にしたがって、ＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ＳＡ、ストラスブール）トランスフェクション試薬によって、複合体化した等量の両発現プラスミド（総量０．７ｍｇ／Ｌ細胞培養）を用いて、およそ２ｘ１０Ｅ６生存細胞／ｍｌで細胞をトランスフェクションした。トランスフェクション３時間後、発現をブーストするために、ＨＤＡＣ阻害剤のバルプロ酸を添加した（最終濃度：４ｍＭ）。毎日、培養に６％（ｖ／ｖ）のダイズペプトン加水分解物に基づくフィードを補充した。トランスフェクション７日後、遠心分離によって培養上清を収集し、そして標準法にしたがって抗体をそこから精製した。
【０１８９】
実施例８：ＥＣＬ測定
実施例７にしたがって産生した抗体をサンドイッチイムノアッセイ（図４を参照されたい）中で試験した。ＩｇＧルテニウムコンジュゲートを生成し、そして親抗ｃＴｎＴ抗体と突然変異抗ｃＴｎＴ抗体の成績を比較するため、真正Ｒｏｃｈｅ  Ｅｌｅｃｓｙｓアッセイ、カタログ番号０５０９２７４４１９０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ・マンハイム）中に含まれる元来の標準ルテニル化コンジュゲートの代わりに用い、そして比較した。突然変異ｍＡｂを、異なる標識化学量論で、ルテニウムにコンジュゲート化した。１つの態様において、ルテニウム標識モル比は、１：１０抗体ＩｇＧ：標識であった。抗ｃＴｎＴ抗体変異体由来のルテニウムコンジュゲートをＥｌｅｃｓｙｓ  Ｒ２試薬中で希釈し、そしてトロポニンＴ  ｈｓアッセイ明細を用いて、ブランク対照（普遍希釈剤、Ｉｄ．  １１７３２２７７１２２、希釈剤マルチアッセイ、Ｉｄ．  ０３６０９９８７１７０、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ・マンハイム）、トロポニンＴ  ｈｓＣａｌＳｅｔ由来のＣａｌ１およびＣａｌ２（Ｉｄ．  ０５０９２７５２１９０、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ・マンハイム）で、トロポニンＴ  ｈｓアッセイプロトコルを用いて、Ｃｏｂａｓ  Ｅ１７０モジュール上で測定を行った。結果を図５に示す。それぞれ組み合わせ番号１１および１２に存在する突然変異を含む抗体は、親（非突然変異）抗体に比較して、改善されたシグナル対ノイズ比を示す。
【図１−１】
2021515573.tif 000007
【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2021515573000001.app
【国際調査報告】
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