(57)【要約】本明細書に提供されるのは、単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）エキソソームを用いて単球表現型を調整する方法である。ＭＳＣエキソソームで処置された単球は、線維性疾患および自己免疫疾患を処置するために用いられ得る。
2021522824.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単球表現型を調節する方法であって、単球を、単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）エキソソームと接触させることを含む、前記方法。
【請求項２】
単球が、骨髄からのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
単離されたＭＳＣエキソソームが、ＭＳＣ馴化培地から単離される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＭＳＣが、ホウォートンゼリー、骨髄、または脂肪組織からのものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
単離されたＭＳＣエキソソームが、実質的にタンパク質夾雑物フリーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
単離されたＭＳＣエキソソームが、約５０〜１５０ｎｍの直径を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
接触が、in vitroである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
接触が、ex vivoである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
接触が、in vivoである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
接触が、少なくとも２時間である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
単球が、単離されたＭＳＣエキソソームと接触される前に炎症促進性であり、および、単離されたＭＳＣエキソソームと接触された後に調節性である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
線維性疾患を処置する方法であって、有効量の単球を、これを必要とする対象へ投与することを含み、ここで単球は、投与される前に、単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）エキソソームで処置される、前記方法。
【請求項１３】
自己免疫疾患を処置する方法であって、有効量の単球を、これを必要とする対象へ投与することを含み、ここで単球は、投与される前に、単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）エキソソームで処置される、前記方法。
【請求項１４】
単球をＭＳＣエキソソームで処置する前に、単球を単離することをさらに含む、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
単球が、対象から単離される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
単球が、対象の骨髄から単離される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
単球が、対象へ投与される前に、ＭＳＣエキソソームで少なくとも２時間処置される、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
単球が、全身的に投与される、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
単球が、静脈内注入を介して投与される、請求項１８に記載の方法．
【請求項２０】
単球が、気管内または鼻腔内に投与される、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
単球が、対象へ一度投与される、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
単球が、対象へ複数回投与される、請求項１２〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
有効量の第二の剤を、対象へ投与することをさらに含む、請求項１２〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
第二の剤が、単離されたＭＣＳエキソソームである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
第二の剤が、ニンテダニブ、ピルフェニドン、抗線維化剤、免疫抑制薬、および／または抗炎症剤である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
線維性疾患が：全身性硬化症；肝臓線維症、心臓線維症、腎臓線維症、および骨髄線維症からなる群から選択される、請求項１２および１４〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
線維性疾患が、肺線維症である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
肺線維症が、特発性肺線維症（ＩＰＦ）である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
単球が、線維性疾患に関連する炎症を低減させる、請求項１２に記載のおよび１２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
単球が、線維性疾患に関連するアポトーシスを低減させる、請求項１２に記載のおよび１２〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
対象が、哺乳動物である、請求項１２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
対象が、ヒト対象である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ヒトが、新生児、幼児、または成人である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ヒト対象が、４週齢未満である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
ヒト対象が、４週齢から３歳である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
ヒト対象が、３〜１８歳である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
ヒト対象が、成人である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
ヒト対象が、低体重で生まれる、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ヒト対象が、在胎３７週より前に生まれた、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ヒト対象が、在胎２６週より前に生まれた、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
対象が、齧歯類の動物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
齧歯類の動物が、マウスまたはラットである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
単球が、単離されたＭＳＣエキソソームで処置される前に炎症促進性であり、および、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された後に調節性である、請求項１２〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）エキソソームで処置された、単球。
【請求項４５】
単球が、骨髄からのものである、請求項４４に記載の単球。
【請求項４６】
単離されたＭＳＣエキソソームが、ＭＳＣ馴化培地から単離される、請求項４４または請求項４５に記載の単球。
【請求項４７】
ＭＳＣが、ホウォートンゼリーまたは骨髄もしくは脂肪組織からのものである、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の単球。
【請求項４８】
単球が、単離されたＭＳＣエキソソームで処置される前に炎症促進性であり、および、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された後に調節性である、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の単球。
【請求項４９】
請求項４２〜４８のいずれか一項に記載の単球を含む、組成物。
【請求項５０】
第二の剤をさらに含む、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
医薬組成物である、請求項４９または請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５３】
請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の単球または請求項４９〜５２のいずれか一項に記載の組成物の、線維性疾患を処置するための使用。
【請求項５４】
線維性疾患を処置するための医薬の製造における使用のための、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の単球または請求項４９〜５２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５５】
請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の単球または請求項４９〜５２のいずれか一項に記載の組成物の、自己免疫疾患を処置するための使用。
【請求項５６】
自己免疫疾患を処置するための医薬の製造における使用のための、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の単球または請求項４９〜５２のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2018年5月9日に出願され、「間葉系間質細胞エキソソーム処置単球およびそれらの使用」と題された米国仮出願第62/669324号について35USC§119(e)の下で利益を主張し、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、１００，０００人年あたり０．５から２７．９の有病率を伴う、慢性進行性呼吸器疾患である。この疾患の根底にある機序の完全な理解の欠如は、成功した治療法の欠乏に貢献したかもしれない。新しく承認された２つの薬にもかかわらず、ＩＰＦは５年生存率が１０％未満と致死的のままである。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本明細書では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）エキソソームの単回静脈内（ＩＶ）用量が、少なくとも部分的に、骨髄中の単球表現型の調節および肺胞上皮細胞（ＡＥＣ）アポトーシスの低減を通じて、ブレオマイシン誘発性肺線維症を元に戻すことが示された。さらに、ＭＳＣエキソソームで処置された単球は、肺線維症を有する対象に投与された場合、この疾患に対して治療的に有効であった。
【０００４】
結果的に、本明細書に提供されるのは、いくつかの側面において、単球表現型を調節する方法であって、同方法は、単球を、単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）エキソソームと接触させることを含む。いくつかの態様において、単球は、骨髄からのものである。
【０００５】
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、ＭＳＣ馴化培地から単離される。いくつかの態様において、ＭＳＣは、ホウォートンゼリー、骨髄、または脂肪組織からのものである。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、実質的にタンパク質夾雑物フリーである。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、約５０〜１５０ｎｍの直径を有する。
【０００６】
いくつかの態様において、接触は、in vitroである。いくつかの態様において、接触は、ex vivoである。いくつかの態様において、接触は、in vivoである。いくつかの態様において、接触は、少なくとも２時間である。
【０００７】
いくつかの態様において、単球は、単離されたＭＳＣエキソソームと接触される前に炎症促進性であり、および、単離されたＭＳＣエキソソームと接触された後に調節性である。
【０００８】
本開示の他の側面は、線維性疾患または自己免疫疾患を処置する方法を提供し、同方法は、有効量の単球を、これを必要とする対象へ投与することを含み、ここで、単球は、投与される前に、単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）エキソソームで処置される。
【０００９】
いくつかの態様において、方法は、単球をＭＳＣエキソソームで処置する前に、単球を単離することをさらに含む。いくつかの態様において、単球は、対象から単離される。いくつかの態様において、単球は、対象の骨髄から単離される。
【００１０】
いくつかの態様において、単球は、対象へ投与される前に、ＭＳＣエキソソームで少なくとも２時間処置される。いくつかの態様において、単球は、全身的に投与される。いくつかの態様において、単球は、静脈内注入を介して投与される。いくつかの態様において、単球は、気管内または鼻腔内に投与される。いくつかの態様において、単球は、対象へ一度投与される。いくつかの態様において、単球は、対象へ複数回投与される。
【００１１】
いくつかの態様において、方法は、有効量の第二の剤を、対象へ投与することをさらに含む。いくつかの態様において、第二の剤は、単離されたＭＣＳエキソソームである。いくつかの態様において、第二の剤は、ニンテダニブ、ピルフェニドン、抗線維化剤、免疫抑制薬、および／または抗炎症剤である。
【００１２】
いくつかの態様において、線維性疾患は：全身性硬化症；肝臓線維症、心臓線維症、腎臓線維症、および骨髄線維症からなる群から選択される。いくつかの態様において、線維性疾患は、肺線維症である。いくつかの態様において、肺線維症は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）である。いくつかの態様において、単球は、線維性疾患に関連する炎症を低減させる。いくつかの態様において、単球は、線維性疾患に関連するアポトーシスを低減させる。
【００１３】
いくつかの態様において、対象は、哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象である。いくつかの態様において、ヒトは、新生児、幼児、または成人である。いくつかの態様において、ヒト対象は、４週齢未満である。いくつかの態様において、ヒト対象は、４週齢から３歳である。いくつかの態様において、ヒト対象は、３〜１８歳である。いくつかの態様において、ヒト対象は成人である。
【００１４】
いくつかの態様において、ヒト対象は、低体重で生まれる。いくつかの態様において、ヒト対象は、在胎３７週より前に生まれた。いくつかの態様において、ヒト対象は、在胎２６週より前に生まれた。
【００１５】
いくつかの態様において、対象は、齧歯類の動物である。いくつかの態様において、齧歯類の動物は、マウスまたはラットである。
【００１６】
いくつかの態様において、単球は、単離されたＭＳＣエキソソームで処置される前に炎症促進性であり、および、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された後に調節性である。
【００１７】
本開示の他の側面は、単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）エキソソームで処置された、単球を提供する。いくつかの態様において、単球は、骨髄からのものである。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、ＭＳＣ馴化培地から単離される。いくつかの態様において、ＭＳＣは、ホウォートンゼリー、骨髄、または脂肪組織からのものである。いくつかの態様において、単球は、単離されたＭＳＣエキソソームで処置される前に炎症促進性であり、および、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された後に調節性である。
【００１８】
本明細書に記載の単球を含む組成物もまた、提供される。いくつかの態様において、組成物は、第二の剤をさらに含む。いくつかの態様において、組成物は、医薬組成物である。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容し得る担体をさらに含む。
【００１９】
さらに本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の単球または単球を含む組成物の、線維性疾患または自己免疫疾患を処置するための使用である。
【００２０】
本明細書に記載の単球または単球を含む組成物はまた、線維性疾患または自己免疫疾患を処置するための医薬の製造において用いられてもよい。
【００２１】
上記の概要は、本明細書に開示される技術の態様、利点、特色、および使用のいくつかを、非限定的に図示することを意図している。本明細書に開示される技術の他の態様、利点、特色、および使用は、詳細な説明、図面、例、および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ−１Ｂ】図１Ａは、炎症の開始時のＭＥｘ処置が線維症を予防することを示す。図１Ｂは、炎症の開始時のＭＥｘ処置が線維症を予防することを示す。
【図１Ｃ−１Ｄ】図１Ｃは、炎症の開始時のＭＥｘ処置が線維症を予防することを示す。図１Ｄは、炎症の開始時のＭＥｘ処置が線維症を予防することを示す。
【００２３】
【図２Ａ−２Ｃ】図２Ａは、ＭＥｘが肺胞マクロファージ表現型および鈍い炎症を調整することを示す。図２Ｂは、ＭＥｘが肺胞マクロファージ表現型および鈍い炎症を調整することを示す。図２Ｃは、ＭＥｘが肺胞マクロファージ表現型および鈍い炎症を調整することを示す。
【図２Ｄ−２Ｅ】図２Ｄは、ＭＥｘが肺胞マクロファージ表現型および鈍い炎症を調整することを示す。図２Ｅは、ＭＥｘが肺胞マクロファージ表現型および鈍い炎症を調整することを示す。
【００２４】
【図３Ａ−３Ｄ】図３Ａは、ＭＥｘが全身レベルで単球およびマクロファージの表現型を調整することを示す。図３Ｂは、ＭＥｘが全身レベルで単球およびマクロファージの表現型を調整することを示す。図３Ｃは、ＭＥｘが全身レベルで単球およびマクロファージの表現型を調整することを示す。図３Ｄは、ＭＥｘが全身レベルで単球およびマクロファージの表現型を調整することを示す。
【図３Ｅ−３Ｆ】図３Ｅは、ＭＥｘが全身レベルで単球およびマクロファージの表現型を調整することを示す。図３Ｆは、ＭＥｘが全身レベルで単球およびマクロファージの表現型を調整することを示す。
【００２５】
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａは、ＭＥｘ前処置骨髄由来単球の養子移入が、マウスを肺線維症から保護することを示す。図４Ｂは、ＭＥｘ前処置骨髄由来単球の養子移入が、マウスを肺線維症から保護することを示す。
【図４Ｃ−４Ｄ】図４Ｃは、ＭＥｘ前処置骨髄由来単球の養子移入が、マウスを肺線維症から保護することを示す。図４Ｄは、ＭＥｘ前処置骨髄由来単球の養子移入が、マウスを肺線維症から保護することを示す。
【図４Ｅ−４Ｆ】図４Ｅは、ＭＥｘ前処置骨髄由来単球の養子移入が、マウスを肺線維症から保護することを示す。図４Ｆは、ＭＥｘ前処置骨髄由来単球の養子移入が、マウスを肺線維症から保護することを示す。
【００２６】
【図５Ａ】図５Ａは、ＭＥｘ治療がアポトーシスを低減させることを示す。
【図５Ｂ−５Ｄ】図５Ｂは、ＭＥｘ治療がアポトーシスを低減させることを示す。図５Ｃは、ＭＥｘ治療がアポトーシスを低減させることを示す。図５Ｄは、ＭＥｘ治療がアポトーシスを低減させることを示す。
【図６Ａ】図６Ａは、エキソソームの精製、単離および特徴付けを示す。
【図６Ｂ−６Ｃ】図６Ｂは、エキソソームの精製、単離および特徴付けを示す。図６Ｃは、エキソソームの精製、単離および特徴付けを示す。
【００２７】
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａは、炎症の最後でのＭＥｘ処置が、線維症を元に戻すことを示す。図７Ｂは、炎症の最後でのＭＥｘ処置が、線維症を元に戻すことを示す。
【図７Ｃ−７Ｄ】図７Ｃは、炎症の最後でのＭＥｘ処置が、線維症を元に戻すことを示す。図７Ｄは、炎症の最後でのＭＥｘ処置が、線維症を元に戻すことを示す。
【図８】図８は、肺マクロファージ、単球および骨髄由来の単球の代表的なin vivoゲーティング戦略を示す。
【図９】図９は、標識ＭＥｘが骨髄で検出され得ることを示す。
【００２８】
図面の簡単な記載
添付の図面は、縮尺どおりに描かれることを意図したものではない。図面において、様々な図に図示される同一またはほぼ同一の各構成要素は、同様の数字で表されている。明確にするために、すべての構成要素がすべての図面において標識されているわけではない。特許または出願ファイルは、カラーで実行された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面（単数または複数）を伴うこの特許または特許出願公報のコピーは、請求および必要な費用の支払いに応じて、米国特許庁によって提供されるだろう。図面中：
【００２９】
図１Ａから図１Ｄは、炎症の開始時のＭＥｘ処置が線維症を予防することを示す。（図１Ａ）１０〜１４週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスは、０日目に気管内ブレオマイシン（６０μｇ）または０．９％生理食塩水（ＮＳ）を受け、ボーラス用量のＩＶ ＭＥｘ（ブレオ＋ＭＥｘ）、ＮＳ（ブレオ＋ＮＳ）、ＦＥｘ（ブレオ＋ＦＥｘ）、またはイオジキサノール（ＩＤＸ１：９希釈、ブレオ＋ＩＤＸ）が続いた。結果は、ＮＳ（ビヒクル、対照）またはＭＥｘの用量が続くＮＳ（対照＋ＭＥｘ）のいずれかを受けた対照群と比較された。マウスは、１４日目にサクリファイスされた。（図１Ｂ）肺切片は、マッソンのトリクロームで染色された。インサートは、１００Ｘの倍率で撮られた。ブレオ＋ＮＳ、ブレオ＋ＦＥｘ、ブレオ＋ＩＤＸは、構造の破壊、肺胞中隔の肥厚、および線維性変化を示した。（図１Ｃ）ブレオマイシン処置マウスへのＭＥｘの投与は、線維症および肺胞の歪みを実質的に低減させた。知見は、対照または対照＋Ｍｅｘ群と同様だった。肺線維症は、１４日目にアシュクロフトスコアによって測定された。（図１Ｄ）コラーゲン沈着は、Ｓｉｒｃｏｌアッセイによって査定され、左肺ホモジネートのｍｇ／ｍｌとして表された。群あたりｎ＝３〜４、＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１  ｖｓ．ブレオマイシン処置群。スケールバー＝１００μｍ。
【００３０】
図２Ａから図２Ｅは、ＭＥｘが肺胞マクロファージ表現型および鈍い炎症を調整することを示す。全肺ＲＴ−ｑＰＣＲは、７日目（図２Ａ）および１４日目（図２Ｂ）に、マクロファージＣｃｌ−２およびアルギナーゼ−１（Ａｒｇ１）マーカーの発現の増加を示す一方、それらのレベルは、ＭＥｘ処置を伴う対照と同様だった。インターロイキン−６発現は、同様の傾向を示したが、ＭＥｘ処置でのその低減は、統計的有意性に至らなかった。残存ＴＧＦのレベルは、３つのグループ間で変化しなかった。結果は、対照の発現に対して表される。平均±ＳＥＭ、群あたりｎ＝４〜８。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１  ｖｓ．ブレオマイシン曝露マウス。（図２Ｃおよび図２Ｄ）Ｍ２様活性化のマーカーであるＡｒｇ１（緑）およびＣＤ２０６（赤）に対する抗体を用いる肺切片の免疫発光（ＩＦ）分析は、ブレオマイシンマウスの平均発光強度（ＭＦＩ）の増加を示す一方、強度は、ＭＥｘ処置を伴う対照レベルと同様だった。核染色はＤａｐｉで実施された。画像はｘ１０の倍率で得られた。平均発光強度（Ｄａｐｉ染色）は細胞数に対して正規化された。実施された分析は、画像Ｊソフトウェアによるものだった。群あたりＮ＝５、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１  ｖｓ．ブレオマイシン曝露マウス。（図２Ｅ）累積データおよび代表的なグラフは、ＣＤ２０６＋ｖｅ肺胞マクロファージ（ＡＭ）（ＣＤ４５＋ｖｅＣＤ１１ｂ−ｖｅＣＤ１１ｃ＋ｖｅＣＤ２０６＋ｖｅ細胞）のパーセンテージを描写する。ＣＤ２０６＋ｖｅＡＭの数は、ＭＥｘ処置で低減したが、ブレオマイシン曝露群と比較して統計的有意性には至らなかった。代表的なヒストグラムは最頻値に正規化された。群あたりｎ＝４〜５の平均±ＳＥＭ、＊＊ｐ＜０．０１  ｖｓ．ブレオマイシン曝露マウス。略語：Ｄａｐｉ、４０，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール。
【００３１】
図３Ａから図３Ｆは、ＭＥｘが、全身レベルで単球およびマクロファージの表現型を調整することを示し、ＭＥｘが、肺胞マクロファージおよび肺における炎症性単球集団を回復させることを示す。（図３Ａ）傷害の７日後の全肺におけるサイトメトリー分析は、ＡＭ数の減少を示した（ＣＤ４５＋ｖｅＣＤ１１ｂ−ｖｅＣＤ１１ｃ＋ｖｅ細胞として表される）。（図３Ｂ）これは、Ｌｙ６Ｃ高の浸潤性または古典的単球（Ｌｙ６Ｃ高ＣＣＲ−２＋ｖｅ）の増加と関連していた。（図３Ｃ）１４日目に、ＡＭ数は増加し、（図３Ｄ）古典的単球数は、マウスのＮＳ処置（対照）群で観察されたレベルの約半分に減少した（平均差：１．７％±０．４４、ｐ＜０．０１）。ＭＥｘ治療は、ＡＭ集団数の回復をもたらしただけでなく、肺における単球表現型を、７日目および１４日目に分析された対照群に匹敵するレベルまで調整した。平均±ＳＥＭは群あたりｎ＝４〜５、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１  ｖｓ．ブレオマイシン曝露マウス。ゲーティング戦略は、fluorescence minus oneコントロールに従って実施された（図８を参照）。ＭＥｘの全身効果を調査するために、骨髄の骨髄特性は、フローサイトメトリーによって分析された。３つの群におけるＣＤ４５＋ｖｅ細胞の同等数にもかかわらず（データは示されていない）、（図３Ｅおよび図３Ｆ）古典的単球は、マウスのブレオマイシン曝露群において増加した（平均差：１７．６％±３．６、ｐ＜０．００１  ｖｓ．ブレオマイシン曝露マウス）が、調節性単球は、対照マウスと比較して、ブレオマイシン曝露マウスにおいて２倍の減少を呈した（平均差：１８％±５．７、ｐ＜０．０５  ｖｓ．ブレオマイシン曝露マウス）。一方、ＭＥｘ治療は、対照マウスで観察されたレベルと同様に、炎症性単球の減少、および、炎症性から調節性（Ｌｙ６Ｃ低ＣＣＲ−２−ｖｅ）表現型へのシフトをもたらした（平均差：１０．２５％±４．２、ｐ＜０．０５および１３．３９％±５．７６、ｐ＜０．０５  ｖｓ．ブレオマイシン曝露マウス）。群あたりｎ＝４〜７、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１  ｖｓ．ブレオマイシン曝露マウス。
【００３２】
図４Ａから図４Ｆは、ＭＥｘ前処置骨髄由来単球の養子移入が、マウスを肺線維症から保護することを示す。線維症の予防におけるex vivo処置ＢＭＤＭｏおよびＡＭの潜在的な治療効果が、探索された。（図４Ａ）ＢＭＤＭｏは、６〜８週齢のＦＶＢマウスから単離され、ex vivoで３日間培養され、１日目であるＤ１および２日目であるＤ２にＭＥｘ（１００ｍｍプレートあたり１×１０６のＭＳＣによって生成されたＥＶと同等）または培地単独で処置され、３日目であるＤ３にＤｉｌで染色された。細胞は、ブレオマイシンの気管内滴下後、０日目および３日目に１対１の比率でＣ５７ＢＬ／６マウスへ静脈内養子移入された。マウスは、１４日目にサクリファイスされた。データは、ＮＳのみ（ブレオマイシン）を受けてきたブレオマイシン曝露マウスと比較された。（図４Ｂ）３日間の培養後のＢＭＤＭｏのフローサイトメトリー分析は、９０％超のＣＤ４５＋ｖｅＣＤ１１ｂ＋ｖｅ細胞を示した。（図４Ｃ）Ｄｉｌ標識ＢＭＤＭｏは、注射の１４日後に肺において検出された。画像はｘ２０の倍率で得られた。（図４Ｄから図４Ｆ）線維症は、ＮＳ（ブレオマイシン）と比較して、ＭＥｘ前処置単球（ＢＭＤＭｏ＋ＭＥｘ）を受けたマウスにおいて改善された。ＭＥｘ処置ＡＭ（ＡＭ＋ＭＥｘ）で注射されたマウスは、実質的な線維性変化を呈した。未処置ＢＭＤＭｏ（ＢＭＤＭ＋培地）の投与は、マウスのＮＳ処置群と比較して、線維症およびコラーゲンレベルの軽度の改善をもたらした。コラーゲン沈着の低減は、ＮＳ処置マウスと比較して統計的有意性に至らなかった。同様の結果は、コラーゲンレベルでも見られた。矢印は、Ｄｉｌ標識単球を示す。群間比較：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．００１。スケールバー＝１００μｍ。略語：Ｄｉｌ、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロラート（’Ｄｉｌ’；ＤｉｌＣ１８（３））。
【００３３】
図５Ａから図５Ｄは、ＭＥｘ治療がアポトーシスを減少させることを示す。（図５Ａおよび図５Ｂ）全肺切片におけるＴｕｎｅｌ染色は、対照（ＮＳ）およびブレオマイシン＋ＭＥｘと比較して、マウスのブレオマイシン曝露群におけるアポトーシス（緑）の増加を示す。核はＤａｐｉで染色された。画像はｘ２０の倍率で得られた。ＭＦＩは、画像Ｊソフトウェアを用いて定量化され、Ｄａｐｉについて正規化された。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１ｖｓ．ブレオマイシン曝露マウス。（図５Ｃ）全肺におけるアネキシンＶ／ＰＩ染色は、対照およびブレオマイシン＋ＭＥｘマウスと比較して、ブレオマイシン曝露マウスにおいてアポトーシス（アネキシンＶ＋ＰＩ−）の増加を示す。（図５Ｄ）in vitroアポトーシスは、Caspase-Glo（登録商標）３／７アッセイを用いて測定された。ブレオマイシン曝露ヒト肺胞上皮細胞では、より多くのアポトーシスが見られる。この効果は、ＭＥｘ治療で無効にされる。アポトーシスの代表として相対発光単位を用い、Ｙ軸は対照と比較した発光を表す。群あたりｎ＝８、＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓブレオマイシン曝露マウス。
【００３４】
図６Ａから図６Ｃは、エキソソームの精製、単離および特徴付けを示す。ＢＭＳＣまたはＨＤＦからの馴化培地（ＣＭ）は、示差遠心分離され、タンジェンシャルフローフィルトレーションを通じて濃縮された。濃縮（５０ｘ）ＣＭは、イオジキサノール（ＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標）、ＩＤＸ）クッション勾配上に浮遊させられた。画分９中の精製ＥＶ集団は、分析のために用いられた。（図６Ａ）透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で見られる不均一なＥＶ形態（ｘ３０，０００ｇ、スケールバー＝１００ｎｍ）。（図６Ｂ）ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）は、ＥＶ濃度を査定するために用いられた。画分９勾配におけるＢＭＳＣ−ＥＶおよびＨＤＦ−ＥＶの代表的なサイズ分布。（図６Ｃ）エキソソームマーカーであるフロチリン（ＦＬＯＴ−１）、ＣＤ６３およびＡｌｉｘに対する抗体を用いた、ＩＤＸクッション勾配画分（７〜１０）のウェスタンブロット分析。
【００３５】
図７Ａから図７Ｄは、炎症の最後でのＭＥｘ処置が、線維症を元に戻すことを示す。（図７Ａ）ＭＥｘは、ブレオマイシンの投与の７日後に投与され、マウスは１４日目にサクリファイスされた。（図７Ｂおよび７Ｃ）対照、ブレオマイシンおよびブレオ＋ＭＥｘマウスからの肺切片は、組織学および（図７Ｄ）コラーゲン沈着について分析された。ＭＥｘ治療は、７日目に線維症およびコラーゲン沈着の低減をもたらした。データは、群あたりｎ＝４の平均±ＳＥＭを表し、＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ｖｓ．ブレオマイシン曝露マウス。スケールバー＝１００μｍ。
【００３６】
図８は、肺マクロファージ、単球および骨髄由来の単球の代表的なin vivoゲーティング戦略を示す。細胞は、酵素消化後、全肺から単離された。肺凝集体および細胞破片は、前方および側方散乱パラメータに基づいて除外された。免疫細胞は、ＣＤ４５染色によって同定された。肺胞マクロファージ（ＡＭ）は、ＣＤ４５＋ｖｅＣＤ１１ｂ−ｖｅＣＤ１１ｃ＋ｖｅ集団を同定するために、順次ゲーティング戦略を用いて同定された。これに続くゲーティングは、ＣＤ２０６＋ｖｅＡＭで実施された。単球亜集団を同定するために、ＣＤ４５＋ｖｅ細胞の非肺胞マクロファージサブセット（ＣＤ１１ｂintＣＤ１１Ｃ低）で順次ゲーティング戦略が実施され、さらにＣＣＲ−２＋ｖｅＬｙ６Ｃ高およびＣＣＲ−２−ｖｅＬｙ６Ｃ低集団についてゲートされ、古典的または非古典的単球表現型をそれぞれ反映させた。ＢＭＤＭｏゲーティング戦略は、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ２０６（ＡＭのマーカー）染色を除いて、上と同様だった。ゲーティング戦略は、Fluorescence-minus-oneコントロールに従って実施された。
【００３７】
図９は、標識ＭＥｘが骨髄で検出され得ることを示す。膜色素標識ＥＶは、マウスへＩＶ注射され、動物は注射の２時間後にサクリファイスされた。ＭＥｘは、ＢＭサイトスピン（標識ＭＥｘ）において検出された。注射されたフリー色素および色素染色ＥＶフリー上清は、対照として用いられた。対比染色はＤａｐｉで実施された。画像は、ｘ６０の倍率で得られた。
【００３８】
ある態様の詳細な記載
本開示は、間葉系間質細胞（本明細書において「間葉系幹細胞」または「ＭＳＣ」としても互換的に称される）エキソソーム（本明細書において「Ｍｅｘ」とも称される）が、対象へ投与（例として、全身的に）される場合、骨髄中の単球表現型を調整し得、炎症促進性単球の代わりに、調節性の単球の、より大きな亜集団を生じるという知見に、少なくとも部分的に基づく。さらに、in vitroにおいてＭＳＣエキソソームで処置された単球（例として、骨髄由来単球）は、肺線維症を有する対象へ投与される場合、線維性肺における治療効果を有する。
【００３９】
本開示のいくつかの側面は、単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）エキソソームで処置された単球を提供する。「単球」は、マクロファージおよび骨髄系樹状細胞へと分化し得る白血球（「白色血液細胞」とも呼ばれる）の一種である。脊椎動物において、単球は、自然免疫系の一部であるが、適応免疫のプロセスにもまた影響を与え得る。
【００４０】
単球は、人体におけるすべての白血球の２％から１０％を構成し、免疫機能における複数の役割、例として、限定せずに、正常な条件下で常在マクロファージを補給すること；組織中の感染部位からの炎症シグナルに応える遊走；および免疫応答を発効させるためのマクロファージまたは樹状細胞への分化を果たす。
【００４１】
単球は、細胞の不均一な集団であり、および異なる表現型および機能を伴う亜集団へと分割され得る。いくつかの態様において、ヒト単球は、リポ多糖（ＬＰＳ）受容体（ＣＤ１４）およびＣＤ１６（Ｆｃガンマ受容体ＩＩＩ）の発現に基づき、表現型的におよび機能的に別個の亜集団へと細分化される（例として、参照により本明細書に組み込まれるZiegler-Heitbrock et al., Blood, vol. 116, no. 16, pp. e74-e80, 2010およびGordon et al., Nature Reviews Immunology, vol. 5, no. 12, pp. 953-964, 2005に記載されるとおり）。健常者において、およそ８０〜９０％の単球は、高度にＣＤ１４陽性およびＣＤ１６陰性（ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６−）である。ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６−単球は、本明細書において「古典的単球」または「調節性単球」と称される。残存する１０〜２０％の単球は、ＣＤ１６陽性であり、「炎症促進性単球」として分類される。炎症促進性単球はさらに、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６＋およびＣＤ１４＋ＣＤ１６＋＋細胞へと細分化され得る。ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６＋単球は、「中間体単球」とも称され；ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋＋単球は、「非古典的単球」とも称される。ＣＤ１６陰性の従来の単球と比較して、ＣＤ１６陽性単球（炎症促進性単球）は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ抗原、接着分子、ケモカイン受容体、およびＴＮＦ−αなどの炎症促進性のサイトカインのより高いレベルを表すが、抗炎症のサイトカイン（例として、ＩＬ−１０）のより低いレベルを表す（例として、参照により本明細書に組み込まれるKawanaka et al., Arthritis & Rheumatism, vol. 46, no. 10, pp. 2578-2586, 2002およびZiegler-Heitbrock et al., Immunology Today, vol. 17, no. 9, pp. 424-428, 1996に記載されるとおり）。炎症促進性単球は、炎症性および感染性疾患、がん、ならびに冠動脈心疾患におけるものを含む、様々な病的状態において、上昇される。マウスにおいて、単球はまた、２つの亜集団に分割され得る：ヒト炎症促進性単球と等価である、炎症促進性単球（Ｃｘ３ＣＲ１低、ＣＣＲ２＋、Ｌｙ６Ｃ高）；およびヒトＣＤ１４＋＋ＣＤ１６−単球と等価である、調節性単球（Ｃｘ３ＣＲ１高、ＣＣＲ２−、Ｌｙ６Ｃ低）。
【００４２】
単球は、造血幹細胞から分化した二分化能の細胞である、単芽球と呼ばれる前駆体からの骨髄によって生成される。単球は、血流中を約１日から３日間循環し、次いで典型的には、身体全体の組織へと移動し、ここで、それらはマクロファージおよび樹状細胞へと分化する。いくつかの態様において、本明細書に記載のＭＳＣエキソソームで処置された単球は、骨髄からの（例として、骨髄から単離された）ものである。いくつかの態様において、本明細書に記載のＭＳＣエキソソームで処置された単球は、特定の組織からの（例として、肺などの特定の組織から単離された）ものである。
【００４３】
「エキソソーム」は、細胞（例として、任意の真核細胞）から放出される膜（例として、脂質二重層）ベシクルである。エキソソームは、血液、尿、および細胞培養の培養培地を含む真核生物の液体中に存在する。本開示のエキソソームは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から放出され、「間葉系幹細胞エキソソーム」または「ＭＳＣエキソソーム」と互換的に称される。
【００４４】
「間葉系幹細胞（ＭＳＣ）」は、神経細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、筋細胞、心臓組織、および他の内皮細胞または上皮細胞へと分化する能力を有する、前駆細胞である。（例えば、Wang et al., , Stem Cells 2004;22(7);1330-7; McElreavey;1991 Biochem Soc Trans (1);29s; Takechi, Placenta 1993 March/April; 14 (2); 235-45; Takechi, 1993; Kobayashi; Early Human Development;1998; July 10; 51 (3); 223-33; Yen; Stem Cells; 2005; 23 (1) 3-9を参照のこと。）これらの細胞は、遺伝子またはタンパク質発現によって、表現型的に定義されてもよい。これらの細胞は、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、ＣＤ５１、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０２、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤｗ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１６６、Ｐ７５、ＴＧＦ−ｂＩＲ、ＴＧＦ−ｂＩＩＲ、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｄ７およびＰＤ−Ｌ１の１つ以上を発現する（よって、これについて陽性である）ことを、特徴とされてきた。これらの細胞はまた、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１８、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５０、ＣＤ６２Ｅ、Ｌ、Ｓ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＳＳＥＡ−１、およびＡＢＯを発現しない（よって、これについて陰性である）としても特徴付けられてきた。よって、ＭＳＣは、それらの分化の潜在力に従って、表現型的および／または機能的に特徴付けられてもよい。
【００４５】
ＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、血液、骨膜、真皮、臍帯血および／またはマトリックス（例として、ホウォートンゼリー）、および胎盤を含むがこれらに限定されない数多の供給源から、採取されてもよい。例えば、ＭＳＣは、市販の骨髄吸引液から単離され得る。細胞の集団内のＭＳＣの濃縮は、発光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含むがこれに限定されない当該技術分野において知られている方法を用いて、達成され得る。ＭＳＣを採取するための方法は、当該技術分野、例として、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５４８６３５９号に記載されている。
【００４６】
市販の培地は、ＭＳＣの成長、培養、および維持のために用いられてもよい。かかる培地は、ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）を包含するが、これに限定されない。ＭＳＣ、線維芽細胞、およびマクロファージの成長、培養、および維持に有用であるかかる培地の構成要素は、アミノ酸、ビタミン、炭素供給源（天然および非天然）、塩、糖、植物由来の加水分解物、ピルビン酸ナトリウム、界面活性剤、アンモニア、脂質、ホルモンまたは成長因子、バッファー、非天然アミノ酸、糖前駆体、指示薬、ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチド、酪酸または有機物、ＤＭＳＯ、動物由来産物、遺伝子誘導物質、非天然糖、細胞内ｐＨの調節剤、ベタインまたは浸透圧保護剤、微量元素、ミネラル、非天然ビタミンを包含するが、これらに限定されない。市販の組織培養培地を補充するために用いられ得る追加の構成要素は、例えば、動物血清（例として、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ウマ血清（ＨＳ））、抗生物質（例として、ペニシリン、ストレプトマイシン、硫酸ネオマイシン、アンホテリシンＢ、ブラストサイジン、クロラムフェニコール、アモキシシリン、バシトラシン、ブレオマイシン、セファロスポリン、クロルテトラサイクリン、ゼオシン、およびピューロマイシンを含むがこれらに限定されない）、およびグルタミン（例として、Ｌ−グルタミン）を含む。間葉系幹細胞の生存と成長はまた、適切な好気性環境、ｐＨ、および温度の維持にも依存する。ＭＳＣは、例として、参照により本明細書に組み込まれるPittenger et al., Science, 284:143-147 (1999)に記載されるように、当該技術分野において知られている方法を用いて維持され得る。
【００４７】
いくつかの態様において、単球を処置するために用いられるＭＳＣエキソソームは、単離される。本明細書に用いられるとおり、「単離されたエキソソーム」は、その天然の環境から物理的に分離されるエキソソームである。単離されたエキソソームは、天然に存在するこれを伴う組織または細胞（例として、ＭＳＣ）から、全体的または部分的に、物理的に分離されていてもよい。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、ヒト骨髄、臍帯ホウォートンゼリー、または脂肪組織からのＭＳＣの培養培地から単離される。かかる培養培地は、本明細書では「ＭＳＣ馴化培地」と称される。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、ＭＳＣなどの細胞フリーであってもよく、または馴化培地フリーまたは実質的にフリーであってもよく、またはタンパク質などの任意の生物学的夾雑物フリーであってもよい。典型的には、単離されたエキソソームは、操作されていない馴化培地中に存在するエキソソームよりも高い濃度で提供される。
【００４８】
いくつかの態様において、本明細書に記載の単離されたＭＳＣエキソソームは、１つ以上（例として、１、２、３、４、または５つ以上）の既知のエキソソームマーカーを含む。いくつかの態様において、既知のエキソソームマーカーは、以下からなる群から選択される：ＦＬＯＴ１（フロチリン１、Uniprot ID：Ｏ７５９５５）、ＣＤ９（ＣＤ９抗原、Uniprot ID：Ｐ２１９２６）、およびＣＤ６３（ＣＤ６３抗原、Uniprot ID：Ｐ０８９６２）。
【００４９】
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、実質的に夾雑物（例えば、タンパク質夾雑物）フリーである。単離されたＭＳＣエキソソームの調製物が、任意の他の物質（例として、タンパク質）を２０％、１５％、１０％、５％、２％、１％よりも少なく、または１％未満含有する場合、単離されたＭＳＣエキソソームは「実質的に夾雑物フリー」である。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームの調製物が、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％の純度である場合、夾雑物（例えば、タンパク質）に関して、単離されたＭＳＣは「実質的に夾雑物フリー」である。
【００５０】
「タンパク質夾雑物」は、単離されたエキソソームに関連していない、および、エキソソームの生物活性に寄与しない、タンパク質を指す。タンパク質夾雑物はまた、本明細書では「非エキソソームタンパク質夾雑物」とも呼ばれる。
【００５１】
いくつかの態様において、本開示に従って用いられた単離されたＭＳＣエキソソームは、約３０〜１５０ｎｍの直径を有する。例えば、単離されたＭＳＣエキソソームは、３０〜１５０ｎｍ、３０〜１４０ｎｍ、３０〜１３０ｎｍ、３０〜１２０ｎｍ、３０〜１１０ｎｍ、３０〜１００ｎｍ、３０〜９０ｎｍ、３０〜８０ｎｍ、３０〜７０ｎｍ、３０〜６０ｎｍ、３０〜５０ｎｍ、３０〜４０ｎｍ、４０〜１５０ｎｍ、４０〜１４０ｎｍ、４０〜１３０ｎｍ、４０〜１２０ｎｍ、４０〜１１０ｎｍ、４０〜１００ｎｍ、４０〜９０ｎｍ、４０〜８０ｎｍ、４０〜７０ｎｍ、４０〜６０ｎｍ、４０〜５０ｎｍ、５０〜１５０ｎｍ、５０〜１４０ｎｍ、５０〜１３０ｎｍ、５０〜１２０ｎｍ、５０〜１１０ｎｍ、５０〜１００ｎｍ、５０〜９０ｎｍ、５０〜８０ｎｍ、５０〜７０ｎｍ、５０〜６０ｎｍ、６０〜１５０ｎｍ、６０〜１４０ｎｍ、６０〜１３０ｎｍ、６０〜１２０ｎｍ、６０〜１１０ｎｍ、６０〜１００ｎｍ、６０〜９０ｎｍ、６０〜８０ｎｍ、６０〜７０ｎｍ、７０〜１５０ｎｍ、７０〜１４０ｎｍ、７０〜１３０ｎｍ、７０〜１２０ｎｍ、７０〜１１０ｎｍ、７０〜１００ｎｍ、７０〜９０ｎｍ、７０〜８０ｎｍ、８０〜１５０ｎｍ、８０〜１４０ｎｍ、８０〜１３０ｎｍ、８０〜１２０ｎｍ、８０〜１１０ｎｍ、８０〜１００ｎｍ、８０〜９０ｎｍ、９０〜１５０ｎｍ、９０〜１４０ｎｍ、９０〜１３０ｎｍ、９０〜１２０ｎｍ、９０〜１１０ｎｍ、９０〜１００ｎｍ、１００〜１５０ｎｍ、１００〜１４０ｎｍ、１００〜１３０ｎｍ、１００〜１２０ｎｍ、１００〜１１０ｎｍ、１１０〜１５０ｎｍ、１１０〜１４０ｎｍ、１１０〜１３０ｎｍ、１１０〜１２０ｎｍ、１２０〜１５０ｎｍ、１２０〜１４０ｎｍ、１２０〜１３０ｎｍ、１３０〜１５０ｎｍ、１３０〜１４０ｎｍ、または１４０〜１５０ｎｍの直径を有してもよい。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、約５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、または１５０ｎｍの直径を有してもよい。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームは、両凹の形態を示す。
【００５２】
本明細書に記載されるとおり、単離されたＭＳＣエキソソームは、単球を処置して、（例として、in vitroおよび骨髄中などのin vivoの両方で）単球表現型を調整するために用いられ得る。「単離されたＭＳＣエキソソームで単球を処置すること」は、単球をＭＳＣエキソソームで（例として、一定期間）接触させることを意味する。いくつかの態様において、処置（すなわち、接触）は、in vitroで実行される。例えば、単球は、in vitroで培養されてもよく、単離されたＭＳＣエキソソームは、単球が単離されたＭＳＣエキソソームに接触するように、培養物へ添加されてもよい。いくつかの態様において、処置（すなわち、接触）は、ex vivoで実行される。例えば、単球は対象の骨髄から単離されてもよく、単離されたＭＳＣエキソソームは、単球が単離されたＭＳＣエキソソームに接触するように、単球へ添加されてもよい。いくつかの態様において、処置（すなわち、接触）は、in vivoで実行される。例えば、単離されたＭＳＣエキソソームは、対象へ（例として、静脈内注射を介して）投与されてもよく、１つの髄に到達し、骨髄中の単球と接触する。
【００５３】
いくつかの態様において、単球は、ＭＳＣエキソソームで、少なくとも１時間（例として、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００時間、またはそれより長い間）処置（すなわち、接触）される。いくつかの態様において、単球は、ＭＳＣエキソソームで、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００時間、またはそれより長い間処置（すなわち、接触）される。
【００５４】
いくつかの態様において、単球は、環境的にまたは発達的に引き起こされた傷害の結果としての炎症促進性状態へ極性化され、およびその極性は、単離されたＭＳＣエキソソームとの接触の際に、調節性表現型へ調整される。いくつかの態様において、単球は、単離されたＭＳＣエキソソームで処置（すなわち、接触）される前に炎症促進性単球であり、および、単離されたＭＳＣエキソソームで処置（すなわち、接触）された後に調節性単球である。いくつかの態様において、炎症促進性単球および調節性単球の混合物は、単離されたＭＳＣエキソソームと接触され、処置は、単離されたＭＳＣエキソソームで処置されている混合物中の調節性単球のより高い比率（例として、少なくとも１０％高い）をもたらす。例えば、調節性単球の比率は、ＭＳＣエキソソームで処置された後に、単離されたＭＳＣエキソソームで処置される前と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、またはより高くてもよい。いくつかの態様において、調節性単球の比率は、ＭＳＣエキソソームで処置された後に、単離されたＭＳＣエキソソームで処置される前と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、１００倍、またはより高い。
【００５５】
本明細書でさらに提供されるのは、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球の、疾患（例として、肺線維症などの線維性疾患または自己免疫疾患）を処置するための使用である。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球は、疾患（例として、線維性疾患または自己免疫疾患）を処置するための医薬の製造において用いられる。単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球を含む組成物もまた、提供される。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球は、疾患（例として、線維性疾患または自己免疫疾患）の処置のための組成物中で製剤化される。
【００５６】
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球を含む組成物は、第二の剤をさらに含む。いくつかの態様において、第二の剤は、単球によって処置されている疾患に対して有効な治療剤である。例えば、第二の剤は、本明細書に記載されたものなどの線維性疾患または自己免疫疾患の予防、処置および／または管理において用いられ得る、任意の剤であってもよい。いくつかの態様において、第二の剤は、単離されたＭＳＣエキソソームである。
【００５７】
いくつかの態様において、第二の剤は、線維性疾患に対して治療効果を有することが知られている剤である。線維性疾患を処置するために用いられてもよい例示の第二の剤は、限定せずに：ニンテダニブ（チロシンキナーゼインヒビター）、ピルフェニドン、抗線維化剤、および／または抗炎症剤を含む。いくつかの態様において、肺線維症については、他の種類の治療、例として酸素補充が、本明細書に記載の治療剤と併せて用いられてもよい。
【００５８】
いくつかの態様において、第二の剤は、自己免疫疾患に対して治療効果を有することが知られている剤である。かかる剤は、限定せずに、非ステロイド性抗炎症薬、グルココルチコイド、メトロトレキサート（metrotrexate）、レフルノミド、抗ＴＮＦ生物学的製剤（例として、インフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、またはセルトリズマブペゴルなどの抗体）を含む。自己免疫疾患を処置するための薬物は、当該技術分野において知られており、例として、参照により本明細書に組み込まれる、Li et al., Front Pharmacol. 2017; 8: 460に記載のとおりである。
【００５９】
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球および第二の剤は、同じ組成物中で製剤化される。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球および第二の剤は、別々の組成物に中で製剤化される。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球および第二の剤は、対象へ同時に投与される。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球および第二の剤は、個別に投与される。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球は、第二の剤の前に投与される。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球は、第二の剤の後に投与される。
【００６０】
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球を含む組成物は、医薬組成物である。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容し得る濃度の塩、バッファー、防腐剤、または適合性担体をさらに含む。
【００６１】
薬学的に許容し得る担体は、予防的または治療的な活性剤の運搬または輸送に関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料などの薬学的に許容し得る材料、組成物またはビヒクルである。各担体は、製剤の他の成分と適合する、および、対象に害を及ぼさないという意味で、「許容し得る」ものでなければならない。薬学的に許容し得る担体として役立ち得る材料のいくつかの例は、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどのバッファー；パイロジェンフリーの水；等張生理食塩水；リンガー液；エチルアルコール；リン酸バッファー；および医薬製剤に用いられる他の非毒性適合性物質を包含する。
【００６２】
組成物は、油性または水性ビヒクル中の水溶性懸濁液、溶液またはエマルションなどの形態をとってもよく、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの処方剤を含有してもよい。好適な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステルを包含する。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。任意に、懸濁液はまた、可溶性を増加させる好適な安定剤または剤を含有してもよい。代替的に、エキソソームは、使用前に、好適なビヒクル、例として、滅菌されたパイロジェンフリーの水で構成するために、凍結乾燥されたあるいは他の粉末または固体の形態であってもよい。
【００６３】
本開示の他の側面は、疾患（例として、線維性疾患または自己免疫疾患）を処置する方法を提供し、同方法は、有効量の単球を、これを必要とする対象へ投与することを含み、ここで単球は、本明細書に記載の方法を用いて投与される前に、単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）エキソソームで（例として、少なくとも２時間）処置される。いくつかの態様において、方法は、対象から（例として、対象の骨髄から）単球を単離することをさらに含むので、単球は、対象への投与の前に、単離されたＭＳＣエキソソームで処置され得る。
【００６４】
疾患（例として、線維性疾患または自己免疫疾患）を「処置する」またはその「処置」は、線維性疾患または自己免疫疾患の発症の予防、低減、または停止、線維性疾患または自己免疫疾患の症状の低減または排除、あるいは、線維性疾患または自己免疫疾患の予防を含むが、これらに限定されない。
【００６５】
「有効量」は、所望される成果を達成する剤の量である。絶対量は、投与のために選択される材料、投与が単回または複数回の用量であるか、年齢、体調、寸法、体重、および疾患の段階を含む個々の患者パラメータを含む、様々な因子に依存するであろう。これらの因子は当業者に周知であり、わずかルーチンの実験で対処され得る。
【００６６】
いくつかの態様において、有効量は、対象に毒性を引き起こさない剤の投薬量である。いくつかの態様において、有効量は、対象へ低減された毒性を引き起こす薬剤の投薬量である。毒性を測定する方法は、当該技術分野において周知である（例として、肝臓、脾臓、および／または腎臓の生検／組織学；肝臓毒性についてのアラニントランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼおよびビリルビンアッセイ；および腎臓毒性についてのクレアチニンレベル）。
【００６７】
対象は、ヒトまたは脊椎動物または哺乳動物を意味するものとし、これは、齧歯類の動物、例として、ラットまたはマウスなどの齧歯類の動物、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シチメンチョウ、ニワトリおよび霊長目の動物、例として、サルを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、対象は伴侶動物である。「伴侶動物」は、本明細書に用いられるとおり、ペットおよび他の飼育動物を指す。伴侶動物の非限定例は、イヌおよびネコ；ウマ、畜牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ、およびニワトリなどの家畜；およびマウス、ラット、モルモット、およびハムスターなどの他の動物を包含する。本開示の方法は、これを必要とする対象を処置するために有用である。対象は、本開示において記載された単球を用いて処置するために適する、本明細書に記載の疾患を有するものであってもよく、またはそれらは、かかる疾患を発症するリスクがあるものであってもよい。
【００６８】
いくつかの態様において、対象は、ヒト対象である。いくつかの態様において、対象は、ヒト幼児である。例えば、対象は、新生児、および、とくに、低在胎齢で生まれた新生児であってもよい。本明細書で用いられるとおり、ヒト新生児は、出生時から約４週齢までのヒトを指す。本明細書で用いられるとおり、ヒト幼児は、約４週齢から約３歳までのヒトを指す。本明細書で用いられるとおり、低在胎齢は、所与の種について通常の在胎期間の前に生じる出産（または分娩）を指す。ヒトにおいて、全在胎期間は約４０週間であり、３７週間から４０週間超の範囲であってもよい。ヒトにおける低在胎齢は、早産に類似しており、在胎３７週の前に生じる出産として定義される。したがって、本開示は、さらに短い在胎期間（例として、在胎３６週前、３５週前、３４週前、３３週前、３２週前、３１週前、３０週前、２９週前、２８週前、２７週前、２６週前、または２５週前）で生まれたものを含む、在胎３７週前に生まれた対象の予防および／または処置を企図している。
【００６９】
幼児または新生児について、本開示は、新生児期をさらに超えて、小児期および／または成人期へのそれらの処置を企図する。例えば、いくつかの態様において、本開示の方法を用いて処置される対象は、３〜１８歳である。いくつかの態様において、本開示の方法を用いて処置される対象は、３〜１８、３〜１７、３〜１６、３〜１５、３〜１４、３〜１３、３〜１２、３〜１１、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜１８、４〜１７、４〜１６、４〜１５、４〜１４、４〜１３、４〜１２、４〜１１、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜１８、５〜１７、５〜１６、５〜１５、５〜１４、５〜１３、５〜１２、５〜１１、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、５〜６、６〜１８、６〜１７、６〜１６、６〜１５、６〜１４、６〜１３、６〜１２、６〜１１、６〜１０、６〜９、６〜８、６〜７、７〜１８、７〜１７、７〜１６、７〜１５、７〜１４、７〜１３、７〜１２、７〜１１、７〜１０、７〜９、７〜８、８〜１８、８〜１７、８〜１６、８〜１５、８〜１４、８〜１３、８〜１２、８〜１１、８〜１０、８〜９、９〜１８、９〜１７、９〜１６、９〜１５、９〜１４、９〜１３、９〜１２、９〜１１、９〜１０、１０〜１８、１０〜１７、１０〜１６、１０〜１５、１０〜１４、１０〜１３、１０〜１２、１０〜１１、１１〜１８、１１〜１７、１１〜１６、１１〜１５、１１〜１４、１１〜１３、１１〜１２、１２〜１８、１２〜１７、１２〜１６、１２〜１５、１２〜１４、１２〜１３、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１３〜１５、１３〜１４、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１４〜１５、１５〜１８、１５〜１７、１５〜１６、１６〜１８、１６〜１７、または１７〜１８歳であってもよい。いくつかの態様において、対象は、例えば１８歳または１８歳超の成人である。
【００７０】
特定の対象は、本明細書に記載される疾患（または状態）（例えば、自己免疫疾患または線維性疾患）の特定の形態に対する遺伝的素因を有してもよく、それらの対象もまた、本開示に従って処置されてもよい。
【００７１】
新生児およびとくに低在胎齢の新生児に関して、本開示は、出生から１年、１１月、１０月、９月、８月、７月、６月、５月、４月、３月、２月、１月、４週、３週、２週、１週、６日、５日、４日、３日、２日、１日、１２時間、６時間、３時間、または１時間以内の、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球またはこれを含む組成物の投与を企図する。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球またはこれを含む組成物は、出生から１時間以内（例として、１時間以内、５５分以内、５０分以内、４５分以内、４０分以内、３５分以内、３０分以内、２５分以内、２０分以内、１５分以内、１０分以内、５分以内、または１分以内）に投与される。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球またはかかる単球を含む組成物は、出生後即時に、対象へ投与される。
【００７２】
本開示はさらに、本明細書に記載の疾患または異常を示す症状がなくても、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球またはこれを含む組成物の投与を企図する。
【００７３】
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球またはかかる単球を含む組成物は、対象（例として、ヒト対象）へ一度投与される。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球またはかかる単球を含む組成物の２回、３回、４回、５回以上の投与を含む、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球またはかかる単球を含む組成物の反復投与が企図される。いくつかの例において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球またはこれを含む組成物は、連続的に投与されてもよい。反復投与または連続投与は、処置されている状態の重症度に応じて、数時間（例として、１〜２、１〜３、１〜６、１〜１２、１〜１８、または１〜２４時間）、数日（例として、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６日、または１〜７日）または数週（例として、１〜２週、１〜３週、または１〜４週）にわたって生じてもよい。投与が繰り返されるが連続的でない場合、投与間の時間は、数時間（例として、４時間、６時間、または１２時間）、数日（例として、１日、２日、３日、４日、５日、または６日）、または数週間（例として、１週間、２週間、３週間、または４週間）であってもよい。投与間の時間は同じであっても、異なっていてもよい。
【００７４】
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球またはかかる単球を含む組成物は、出生から２４時間以内に少なくとも一度、および次いで、出生から１週以内に少なくとももう一度投与される。いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球またはかかる単球を含む組成物は、出生から１時間以内に少なくとも一度、および次いで、出生から３〜４日以内に少なくとももう一度投与される。
【００７５】
単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球またはかかる単球を含む組成物は、線維性臓器および／または骨髄への送達をもたらす任意の経路によって、投与されてもよい。静脈内注射または連続注入などの全身投与経路が好適である。また好適な他の投与経路は、経口投与、鼻腔内投与、気管内投与、吸入、静脈内投与、等々を含む。当業者は、投与のための通常の経路を知っているであろう。
【００７６】
単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球またはかかる単球を含む組成物は、例えばボーラス注射または連続注入を含む、注射による非経口投与のために製剤化されてもよい。注射用の製剤は、添加された防腐剤の有無に拘わらず、例として、アンプルまたは複数回用量容器の単位剤形で提供されてもよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の水溶性懸濁液、溶液またはエマルションなどの形態をとってもよく、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの処方剤を含有してもよい。好適な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステルを包含する。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。任意に、懸濁液はまた、可溶性を増加させる好適な安定剤または剤を含有してもよい。代替的に、エキソソームは、使用前に、好適なビヒクル、例として、滅菌されたパイロジェンフリーの水で構成するために、凍結乾燥されたあるいは他の粉末または固体の形態であってもよい。
【００７７】
いくつかの態様において、第二の剤が、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球と同じ組成物中に製剤化されない場合、本明細書に記載の方法は、有効量の第二の剤（例として、線維性疾患または自己免疫疾患を処置するための剤）を投与することをさらに含む。第二の剤はまた、全身投与（例として、静脈内注入または注射）、経口投与、鼻腔内投与、気管内投与、吸入、等々を含む、任意の好適な経路によって投与されてもよい。当業者は、かかる第二の剤のための投与の通常の経路を知っているであろう。
【００７８】
「線維性疾患」または「線維症」は、修復または反応プロセスにおける臓器または組織中の過剰な線維性結合組織の形成によって現れる状態を指す。線維性疾患の非限定例は：全身性硬化症（強皮症）、肺線維症（例として、嚢胞性線維症または特発性肺線維症）、肝臓線維症（肝硬変または胆道閉鎖）、心臓線維症（例として、心房線維症、心内膜心筋線維症、または陳旧性心筋梗塞）、脳線維症（例として、グリア瘢痕）、腎臓線維症、および骨髄線維症を含む。他の種類の線維性疾患は、限定せずに：動脈剛性、関節線維症（膝、肩、他の関節）、クローン病（腸）、デュピュイトラン拘縮（手、指）、ケロイド（皮膚）、縦隔線維症（縦隔の軟組織）、骨髄線維症（骨髄）、ペイロニー病（陰茎）、腎性全身性線維症（皮膚）、進行性塊状線維症（肺）；石炭労働者の塵肺の合併症、後腹膜線維症（後腹膜の軟組織）、強皮症／全身性硬化症（皮膚、肺）、およびいくつかの形態の癒着性関節包炎（肩）を含む。
【００７９】
いくつかの態様において、線維性疾患は、肺線維症である。「肺線維症」は、肺組織の肥厚および硬化および低減した肺機能をもたらす、肺組織が損傷しおよび傷ついた状態を指す。肺線維症は、様々な原因を有し得る。肺線維症は、典型的には、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）を伴う対象において見られる。いくつかの態様において、肺線維症は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）である。特発性肺線維症は、知られた原因のない、肺の瘢痕または肥厚によって特徴づけられる。それは、ほとんどの場合、５０〜７０歳のヒトにおいて生じる。その症状は、息切れ、規則的な咳（典型的には乾性咳）、胸部疼痛、および減少した活動レベルを包含する。線維性疾患（例として、肺線維症）について、線維症に関連する炎症の最初のまたはあとの段階での、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球の投与は、両方とも、疾患に対して治療的に有効であることが本明細書において示される。
【００８０】
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球は、線維性疾患に関連する炎症を低減させる。当業者は、線維性臓器（例として、肺）における炎症の程度を査定する方法を熟知している。いくつかの態様において、炎症は、線維性臓器中のまたは血液中の炎症のバイオマーカーのレベルを測定することによって、査定されてもよい。いくつかの態様において、線維性臓器（例として、肺）中の炎症は、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球を投与された対象において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球を投与されていない対象と比較して、少なくとも２０％低減される。例えば、炎症は、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球を投与された対象において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球を投与されていない対象と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％、低減されてもよい。いくつかの態様において、炎症は、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球を投与された対象において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球を投与されていない対象と比較して、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％低減される。
【００８１】
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球は、線維性臓器中の上皮細胞（例として、肺中の肺胞上皮細胞）のアポトーシスを低減させる。「アポトーシス」は、生物の成長または発達の正常なおよび制御された部分として生じる細胞の死を指す。いくつかの態様において、アポトーシスを起こす肺胞上皮細胞の数が、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球を投与された対象において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球を投与されていない対象と比較して、少なくとも２０％低減される場合、線維性臓器における上皮細胞（例として、肺中の肺胞上皮細胞）のアポトーシスは、「低減された」とみなされる。例えば、アポトーシスを起こす肺胞上皮細胞の数が、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球を投与された対象において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球を投与されていない対象と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％低減される場合、線維性臓器中の上皮細胞（例として、肺中の肺胞上皮細胞）のアポトーシスは、「低減された」とみなされてもよい。いくつかの態様において、アポトーシスを起こす肺胞上皮細胞の数が、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球を投与された対象において、ＭＳＣエキソソームで処置された単球を投与されていない対象と比較して、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％低減される場合、線維性臓器中の上皮細胞（例として、肺中の肺胞上皮細胞）のアポトーシスは、「低減された」とみなされる。
【００８２】
いくつかの態様において、単離されたＭＳＣエキソソームで処置された単球は、肺線維症を低減させる。肺線維症の程度（例として、肺組織上のコラーゲン沈着によって指し示される）が、ＭＳＣエキソソームで処置された単球を投与された対象において、ＭＳＣエキソソームで処置された単球を投与されていない対象と比較して、少なくとも２０％低減される場合、肺線維症は「低減された」とみなされる。例えば、肺線維症の程度（例として、肺組織上のコラーゲン沈着によって指し示される）が、ＭＳＣエキソソームで処置された単球を投与された対象において、ＭＳＣエキソソームで処置された単球を投与されていない対象と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％低減される場合、肺線維症は、低減されたとみなされてもよい。いくつかの態様において、肺線維症の程度（例として、肺組織上のコラーゲン沈着によって指し示される）が、ＭＳＣエキソソームで処置された単球を投与された対象において、ＭＳＣエキソソームで処置された単球を投与されていない対象と比較して、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％低減される場合、肺線維症は、低減されたとみなされる。
【００８３】
「自己免疫疾患」は、己の免疫系が己の身体を誤って攻撃する状態である。通常、免疫系は、外来細胞と己自身の細胞とを区別し得る。自己免疫疾患において、免疫系は、己の身体の一部（例として、関節または皮膚）を外来のものとして誤認する。それは、健常な細胞を攻撃する自己抗体と呼ばれるタンパク質を放出する。いくつかの自己免疫疾患は、１つの臓器のみを標的とする。１型糖尿病は、膵臓を損傷する。ループスのような他の疾患は、全身に影響を及ぼす。自己免疫疾患の非限定例は、以下を含む：アカラシア、アジソン病、成人スチル病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫自律神経失調症、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性じんましん、軸索およびニューロンの神経障害（ＡＭＡＮ）、バロ病、ベーチェット病、良性の粘膜性類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病（ＣＤ）、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群（ＣＳＳ）または好酸球性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、クレスト症候群、クローン病、ヘルペス状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円盤状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エヴァンス症候群、線維筋痛症、線維化肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、妊娠性疱疹または妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、化膿性汗腺炎（ＨＳ）（反対型座瘡）、低ガンマグロブリン血症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫性血小板低減性紫斑病（ＩＴＰ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、間質性膀胱炎（ＩＣ）、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎（ＪＭ）、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球破砕血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線状ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、ループス、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合性結合組織疾患（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）またはＭＭＮＣＢ、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、新生児性ループス、視神経脊髄炎、好中球低減症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ（ＰＲ）、ＰＡＮＤＡＳ、傍腫瘍性小脳変性症（ＰＣＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿（ＰＮＨ）、Parry Romberg症候群、扁平部炎（末梢のブドウ膜炎）、パーソネージ・ターナー症候群、天疱瘡、末梢の神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血（ＰＡ）、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型多腺性症候群、リウマチ性��発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群（ＲＬＳ）、後腹膜線維症、リウマチ熱、リウマチ性関節炎、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、ショーグレン症候群、精子と精巣の自己免疫、全身硬直症候群（ＳＰＳ）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎（ＳＯ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板低減性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群（ＴＨＳ）、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、フォークト・小柳・原田疾患、ウェゲナー肉芽腫症（または多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ））。
【００８４】
いくつかの態様において、自己免疫疾患は、以下からなる群から選択される：リウマチ性関節炎（ＲＡ）、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、重症筋無力症（ＭＧ）、バセドウ病、特発性血小板低減紫斑病（ＩＴＰ）、ギラン・バレー症候群、自己免疫性心筋炎、膜糸球体腎炎、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病、若年性発症糖尿病、多発性硬化症、レイノー症候群、自己免疫性甲状腺炎、胃炎、セリアック病、白斑、肝炎、原発性胆汁性肝硬変、炎症性腸疾患、脊椎関節症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、免疫性好中球低減症、および典型的には結核、サルコイドーシス、および多発性筋炎において見られるサイトカイン、Ｔリンパ球によって媒介される遅延型過敏症に関連する免疫応答、多発性動脈炎、皮膚血管炎、天疱瘡（例として、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡または傍腫瘍性天疱瘡）、類天疱瘡、グッドパスチャー症候群、川崎病、全身性硬化症、抗ホスホ脂質症候群、およびシェーグレン症候群。
【００８５】
本明細書に開示の技術の態様、利点、特色、および使用のいくつかは、以下の例からより完全に理解されるであろう。例は、本開示のいくつかの利点を図示し、かつ、特定の態様を記載することを意図しているが、本開示の全範囲を例示することを意図しておらず、結果的に、本開示の範囲を限定しない。
【００８６】
例
特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、慢性進行性呼吸器疾患であり、その根底にある機序は、不完全に理解されており、今のところ有効な処置を欠く。肺線維症の予防における間葉系間質細胞（ＭＳＣ）処置での有望な結果に拘わらず、細胞治療の限界は、無細胞治療を非常に望ましいものにし続ける。ＩＰＦ以外の前臨床モデルにおいて、ＭＳＣ細胞外ベシクル（ＥＶ）またはより具体的には、ＭＳＣセクレトームから単離されたエキソソーム（ＭＥｘ）は、治療用ベクターとして、作用することが示されてきた。ＩＰＦにおけるＭＥｘの効果、およびそれらの作用機序（ＭＯＡ）は、未知である。
【００８７】
目的：ブレオマイシンＩＰＦモデルにおけるＭＥｘの有効性およびＭＯＡが調査された。
方法：ヒト骨髄ＭＳＣから単離されたエキソソーム（ＭＥｘ）は、気管内ブレオマイシンの滴下後０または７日に、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスへ注入された。肺および骨髄由来の単球（ＢＭＤＭｏ）は、組織学的、遺伝子発現またはサイトメトリー分析のために、７日および１４日目に採取された。
【００８８】
測定および主な結果
ブレオマイシン曝露と同時またはその７日後のＭＥｘ処置は、肺線維症およびコラーゲン沈着を実質的に予防した。ＭＥｘ処置は、炎症を鈍化させ、肺中の古典的（Ｌｙ６Ｃ高ＣＣＲ−２＋ｖｅ）単球を低減させた。ＭＥｘの上流効果の調査により、ＭＥｘが、骨髄において、古典的単球表現型から調節性単球表現型への移行を誘発したことを明らかにした。興味深いことに、ＭＥｘで前処置されたＢＭＤＭｏの養子移入は、線維症を軽減するのに十分だった。加えて、ＭＥｘは、肺胞上皮細胞アポトーシスを防いだ。
【００８９】
結論：ＭＥｘでの全身性治療が、炎症の初期または後期段階中に投与された場合、線維症を予防したことが示された。ＭＥｘは、線維症から肺を保護した骨髄中の単球表現型の調節によって、全身性の免疫調整効果を発揮することがさらに示された。これらの結果は、線維性肺疾患の無細胞治療のためのＭＥｘの使用の可能性を示唆する。
【００９０】
導入
特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、１００，０００人年あたり０．５から２７．９の有病率を伴う慢性進行性呼吸器疾患である（１、２）。この疾患の根底にある機序の完全な理解の欠如は、成功した治療法の欠乏に貢献したかもしれない。新しく承認された２つの薬にもかかわらず、ＩＰＦは５年生存率が１０％未満と致死的のままである（３〜６）。薬理学的治療に加えて、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）などの細胞ベースの治療もまた検討されてきた（７〜９）。肺線維症の予防におけるＭＳＣ療法の有望な結果にもかかわらず、有害な免疫反応、生存の課題、予想外の生着、ＭＳＣから線維芽細胞への分化の可能性などの制限は、それにもかかわらず、無細胞療法を非常に望ましいものにし続けている（８〜１０）。
【００９１】
ＭＳＣの治療能力は、しばしば細胞外小胞（ＥＶ）に囲まれた、生物活性分子の不均一なプールで構成されるそれらのセクレトームに存在することが、これまでに実証された。ＩＰＦ以外の前臨床モデルでは、例として、気管支肺異形成症、肺高血圧症および急性肺傷害、ＥＶ、またはより具体的には、ＭＳＣセクレトームから単離されたエクソソーム（ＭＥｘ）は、治療ベクターとして作用することが示されてきた（７、１１〜１９）。
【００９２】
ＩＰＦにおけるＭＥｘの効果は、未知である。ますます多くの文献が、肺線維症の発症と進行における循環炎症性単球と肺胞Ｍ２様マクロファージの役割を支持する（２０、２１）。加えて、ブレオマイシン誘発性線維症モデルの最近の報告は、肺傷害後に肺に存在する単球由来の肺胞マクロファージ（ＡＭ）の有害な役割を示唆する（２１、２２）。ＭＥｘが、単球において任意の全身性および免疫調整的効果を有するかどうかは、未知のままである。加えて、ＭＥｘの作用の供給源まだ定義されていない。
【００９３】
この研究では、精製されたＭＥｘを伴う全身療法が、炎症の初期または後期段階（ブレオマイシンの投与後０日目および７日目）に投与された場合に、肺線維症を予防したことが示された。さらに、マクロファージおよび単球の表現型の調節におけるＭＥｘの全身のおよび臓器レベルの効果が、明らかになった。ＭＥｘは、骨髄内の単球亜集団を炎症性から調節性の表現型に変化させることにより、抗アポトーシス的および免疫調整的効果を発揮することが、実証された。後者の知見は、ＭＥｘ処置骨髄由来単球（ＢＭＤＭｏ）の全身送達（養子移入）でさえ、肺線維症を予防したという発見につながった。この研究は、ＭＥｘの作用に対する機序的な洞察を提供し、肺における二次的な抗線維化効果につながる全身性の免疫調整能を支持する。
【００９４】
方法：
動物モデル、組織学およびサイトメトリー
すべてのマウスは病原体フリーの施設で飼育され、世話をされた。すべての動物実験は、ボストンチルドレンズホスピタルアニマルコアアンドユース委員会（Boston Children’s Hospital Animal Core and Use Committee）によって承認された。１０〜１４週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Charles Laboratories）は、イソフルランで麻酔され、０日目に、５０μｌの０．９％生理食塩水（ＮＳ）中の３Ｕ／ｋｇの用量のブレオマイシンスルファートまたはＮＳ単独で気管内注射された。マウスは、２００μｌのボーラス用量のＭＥｘ（５×１０６のＭＳＣによって生成されたＥＶ、処置群）、ヒト皮膚線維芽細胞由来のエキソソーム（ＦＥｘ）を投与された；（５×１０６のヒト皮膚線維芽細胞によって生成されたＥＶ、最初の対照群）またはOptiPrep（商標）（イオジキサノール、ＩＤＸ、１：９希釈）；（ビヒクル、第２対照群）または０日目および７日目の尾静脈注射を介するＮＳ。
【００９５】
設計された時点でのブレオマイシン処置後、マウスは、ペントバルビタールの腹腔内注射で安楽死させられた。心臓は、右心室を通してリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、invitrogen）で灌流された。
【００９６】
組織学的分析のために、気管はカニューレを挿入され、肺は４％パラホルムアルデヒドで膨らまされた。右肺は、パラフィン  に包埋され、ヘマトキシリンおよびエオジンまたはマッソンのトリクローム染色のために切片化された。左肺は、液体窒素で急速冷凍されかつＲＮＡおよびタンパク質分離のために用いられたか、あるいは、コラーゲンの定量化またはサイトメトリー分析のために新鮮に用いられたかのいずれかであった。Nikon Eclipse 80i顕微鏡（Nikon、東京、日本）を用いて、厚さ５μｍの肺切片からランダムに選択された領域（１０〜１５フィールド）が、ｘ１００およびｘ２００の倍率で取得された。大きな気道および血管は、画像化されなかった。組織学的定量化のために、アシュクロフトスコアが盲検法で用いられた。０〜１のスコアは線維症なし、２〜３のスコアは最小限の線維症、４〜５のスコアは中程度の線維症、６〜８のスコアは重度の線維症を示した（２３）。
【００９７】
ＢＭＤＭｏは、これまでに記載されたとおり、分離された（１１）。細胞懸濁液はサイトメトリー分析に用いられ、３日後に培養された接着細胞は養子移入実験のために用いられた（さらなる詳細は、オンライン補足資料に見出され得る）。
【００９８】
エキソソームの単離および精製
エキソソームの単離、精製、および特徴付けは、これまでに記載されたとおり、OptiPrep（商標）（イオジキサノール；ＩＤＸ）クッション密度浮力を用いて実行された（１１）。手短に言えば、骨髄ＭＳＣまたはヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）からの濃縮馴化培地は、ＩＤＸクッションの上に浮かせられ、４℃で１００，０００ｘｇで３．５時間遠心分離した。
【００９９】
統計
異なるグループ間のデータは、GraphPad Prism（ｖ６．０；GraphPad、ＣＡ、ＵＳ）でのFisherのＬＳＤテスト事後分析を伴うＡＮＯＶＡを用いて比較された。フローサイトメトリーデータ分析は、FlowJoソフトウェアｖ１０．２（TreeStar、ＯＲ、ＵＳ）を用いて実行された。ｍＲＮＡレベルはＲＴ−ｑＰＣＲによって査定され、内因性対照と比較して表された。統計分析のために、ΔＣＴが用いられた。データは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として提供される。特に明記しない限り、有意性は、ｐ＜０．０５閾値に関して決定された。各群で最低５匹の動物が用いられ、５％のαレベルで＞９０％のパワーを生み出した。
【０１００】
結果
初期炎症時のＭＥｘ投与は、肺線維症を予防する
十分に確立されたブレオマイシン肺傷害モデルが、炎症性段階（０日目から８日目）とそれに続く線維化段階（９日目から３２日目）によって特徴づけられた肺線維症のために、用いられた（２４）。
【０１０１】
肺線維症の予防におけるＭＥｘの役割を調査するために、１０から１４週齢のマウスは、０日目に気管内ブレオマイシン（３Ｕ／ｋｇ）またはＮＳ（ビヒクル、対照）、これに続き、尾静脈を介して静脈内（ＩＶ）ＭＥｘのボーラス用量を受けた。マウスは１４日目にサクリファイスされ、肺は、線維症の定量化およびコラーゲン含量について、査定された（図１Ａ）。ブレオマイシンは、対照マウスと比較して、アシュクロフトスコアを３倍より多く増加させた。ブレオマイシン群（ブレオ＋ＮＳ、図１Ｂおよび１Ｃ）と比較して、ＭＥｘ処置マウス（ブレオ＋ＭＥｘ）では線維症スコアの有意な低減があった。同様に、ブレオマイシンによって誘発されたコラーゲン沈着における増加は、ブレオ＋ＭＥｘマウスにおいて実質的に低減させられた（図１Ｄ）。治療効果がＭＥｘに特有であることを確認するために、ブレオマイシン曝露マウスは、線維芽細胞のエキソソーム（ブレオ＋ＦＥｘ）および同様にイオジキサノール（ブレオ＋ＩＤＸ）で注射された。前述の群において、線維症またはコラーゲン沈着の改善は見られなかった。ＭＥｘ処置での肺の構造変化の可能性を排除するために、対照マウスはＭＥｘで注射された。処置はマウスにおいて十分に許容され、肺コラーゲン含量および組織学は、ＮＳを受けた対照マウスと類似していた（図１Ｂから１Ｄ）。
【０１０２】
これらの結果は、炎症期の開始時でのＩＶＭＥｘの単回用量が、線維症を予防することを示す。この効果は、線維芽細胞に由来するエキソソーム［およびエキソソーム単離培地（イオジキサノール）］が肺線維症を予防しなかったため、ＭＳＣエキソソームに特有のものである。
【０１０３】
炎症の最後のＭＥｘ治療は、肺線維症を元に戻す
炎症の後の段階でのＭＥｘの効果を査定するために、マウスは、ブレオマイシン投与の７日後に、ＭＥｘで注射された（図７Ａ）。予防療法実験（０日目のＭＥｘ注射）で観察されたものと同様に、炎症段階でのＭＥｘの投与は、線維症スコアの改善およびコラーゲン沈着における統計的に有意な低減をもたらした（図７Ｂ、７Ｃおよび７Ｄ）。したがって、ＭＥｘ治療は、炎症の最後に投与された場合であっても、線維症を改善する。
【０１０４】
ＭＥｘは肺胞マクロファージの表現型および鈍い炎症を調整する
ブレオマイシン肺傷害モデルにおけるＭＥｘの作用機序を調査するために、予防療法実験（０日目のＭＥｘ注射）が実行された。
【０１０５】
単球由来マクロファージは線維症の発症および進行に関与しており（２０、２１）、よって、炎症性および線維化促進性マクロファージ表現型の調節を通じた炎症の調整において、ＭＥｘの役割が評価された。ブレオマイシンの投与７日後または１４日後の全肺における遺伝子発現分析は、マクロファージ炎症性マーカーであるＣｃｌ−２およびアルギナーゼ−１（Ａｒｇ１）の発現レベルの増加を示した一方、それらのｍＲＮＡレベルは、ＭＥｘ処置を伴う対照肺において観察されたものに匹敵した。インターロイキン−６のｍＲＮＡレベルは、Ｃｃｌ−２およびＡｒｇ１のものと同様の傾向を示したが、差は、群間での統計的有意性に至らなかった。さらに、ＴＧＦ−β発現は、３つすべての実験群（図２Ａおよび２Ｂ）における両方の時点で類似していた。Ｍ２様活性化のマクロファージマーカーであるＣＤ２０６およびＡｒｇ１抗体での肺組織切片の免疫発光（ＩＦ）染色は、ブレオマイシンを受けたマウスにおいてＩＦ強度の増加を示したが、マウスがＭＥｘで処置された場合は、対照レベルと同様のままであった（図２Ｃおよび２Ｄ）。全肺のフローサイトメトリー分析はまた、ブレオマイシンマウスにおいて、ＣＤ２０６発現肺胞マクロファージ（ＡＭ）（ＣＤ４５＋ｖｅＣＤ１１ｂ−ｖｅＣＤ１１ｃ＋ｖｅＣＤ２０６＋ｖｅ細胞）の増加を示した。ＭＥｘ処置を伴うＣＤ２０６発現ＡＭのより少ない数にもかかわらず、レベルは統計的有意性に至らなかった（図２Ｅ）。上記の結果は、ＭＥｘが肺におけるＡＭ表現型の調整を通じて、抗炎症効果を発揮することを明らかにする。
【０１０６】
ＭＥｘは、肺胞マクロファージおよび肺における調節性単球集団を回復させる
ブレオマイシン障害を伴うおよびＭＥｘ治療後の免疫細胞集団の動的変化を調査するために、ブレオマイシンの投与後７日目または１４日目に、全肺におけるサイトメトリー分析が実施された。ＡＭ数（ＣＤ４５＋ｖｅＣＤ１１ｂ−ｖｅＣＤ１１ｃ＋ｖｅ細胞）における減少は、７日目にブレオマイシン処置マウスで見られた（図３Ａ）。これは、Ｌｙ６Ｃ高古典的または炎症性単球（ＣＤ４５＋ｖｅＣＤ１１ｂ＋ｖｅＭＨＣＩＩ−ｖｅＬｙ６Ｃ高ＣＣＲ−２＋ｖｅ細胞）の数における増加と関連していた（図３Ｂ）。しかしながら、１４日目に、ブレオマイシン滴下後のＡＭの割合は増加した（図３Ｃ）一方で、古典的単球の数は低減させられた（図３Ｄ）。ＭＥｘ治療は、７日目および１４日目の両方で、ＡＭおよび単球集団の浸潤を対照群と同様のレベルまで回復させた。これらの結果は、肺傷害後、ＭＥｘがＡＭと動員された単球集団との間の恒常性バランスを、対照マウスに見られるレベルおよび表現型と同様に、回復し得ることを示す。
【０１０７】
ＭＥｘは、骨髄における単球表現型を調整し得る
ブレオマイシン曝露マウスの肺における増加した炎症性単球の所見、およびＭＥｘ治療後の正常レベルへの回復に続いて、単球の発達が骨髄（ＢＭ）において起こるという事実を考慮して（２５）、ＭＥｘが、ＢＭにおける単球表現型を変更することにより免疫調整的効果を発揮してもよいことが提案された。この問題に答えるために、ＭＥｘの可能性が最初に調査され、ＢＭに浸透させた。色素標識ＥＶは、対照マウスに静脈内注射され、注射後２、４、８および２４時間で動物はサクリファイスされた。ＢＭサイトスピンのＤａｐｉ染色は、注射後８時間までのＢＭにおけるＥＶの存在を明らかにした（図９、画像は注射後２時間を表し、さらなる時点は示されていない）。
【０１０８】
ＭＥｘの全身効果はその後、ＢＭにおける骨髄性細胞の特性を注目することによって調査された。興味深いことに、活動性炎症期（７日目）に対照、ブレオマイシン、およびＭＥｘ処置マウスのＢＭから単離された骨髄性細胞のフローサイトメトリー分析は、肺で観察されたものと同様の変化を示した。３つの実験グループで得られたＣＤ４５＋ｖｅ細胞の同等数にかかわらず（データは示されていない）、調節性単球数（Ｃｄ４５＋ｖｅＣＤ１１ｂ高ＭＨＣＩＩ−ｖｅＬｙ６Ｃ低ＣＣＲ−２−ｖｅ細胞）は、ＭＥｘ処置および対照マウスと比較して、ブレオマイシン曝露マウスにおいては半分未満だった（それぞれ１４．１８％対２７．５７％および３２．３％±５．７、図３Ｅ）。対照的に、ブレオマイシン曝露群における単球集団は、ＭＥｘ処置および対照群のマウス（それぞれ５７．５％±３．９および５０．１％±３．２、図３Ｆ）におけるおよそ５０〜６０％と比較して、約７０％（６７．８％±１．７）の古典的単球からなっていた。。これらの結果は、臓器傷害の存在下で、ＭＥｘが、骨髄における炎症誘発性から調節性の表現型への単球集団の変更によって、免疫調整的効果を発揮することを示唆する。
【０１０９】
ＢＭＤＭｏにおけるＭＥｘの免疫調整的影響は、肺線維症を予防するのに十分である
ＭＥｘ治療後のＢＭ調節性単球における増加を考慮すると、骨髄単球におけるＭＥｘの免疫調整的効果は、線維症を予防するのに十分であるかもしれず、肺のさらなる変化は、変更されたＢＭ単球亜集団の結果であるとの仮説が立てられた。
【０１１０】
この仮説をテストするために、ex vivoで処置されたＢＭＤＭｏの効果が線維症の予防において調査された。一次Ｍｏが野生型ＦＶＢマウスから単離されかつ３日間培養された養子移入実験が、実施された。細胞は、１日目および２日目に、ＭＥｘ（ＢＭＤＭｏ＋ＭＥｘ）または培地単独（ＢＭＤＭｏ＋培地）で処置された（図４Ａ）。３日目に、９０％超の骨髄細胞がＣＤ４５＋ｖｅＣＤ１１ｂ＋ｖｅであることが確認された（骨髄サブセット、図４Ｂ）。単球は次いでＤｉｌ（発光親油性色素）で標識され、ブレオマイシンの滴下後０日目および３日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへ静脈内養子移入された。マウスは１４日目にサクリファイスされ、肺は組織学およびコラーゲン含量について査定された。結果は、ＮＳ注射（ブレオマイシン）でブレオマイシンを受けたマウスと比較された。ブレオマイシンの投与の１４日後に、Ｄｉｌ標識単球が肺において同定された（図４Ｃ）。興味深いことに、ブレオマイシンおよびＢＭＤＭｏ＋培地を受けたマウスと比較して、ＢＭＤＭｏ＋ＭＥｘを受けたマウスにおいて、組織学的定量化およびコラーゲンアッセイの両方で、線維症の検出が少なかった。驚くべきことに、ＢＭＤＭｏ＋培地処置群において、ブレオマイシン曝露マウス（図４Ｄ、４Ｅ、および４Ｆ）と比較して、組織学における線維症スコアの最小限の改善および統計的に有意でないコラーゲン沈着が検出された。抗線維化効果が代わりに常駐ＡＭによるものかどうかを調査するために、ＭＥｘ処置ＡＭ（ＡＭ＋ＭＥｘ）は、ブレオマイシン滴下後に気管内投与された（詳細は、補足方法に記載される）。ブレオマイシン群と比較して、前処置されたＡＭを受けたマウスでは、線維症のいかなる改善も検出されなかった（図４Ｅ）。
【０１１１】
これらのデータは、ＭＥｘでのＢＭＤＭｏの処置が、それ自体で線維症を改善する調節性表現型を促進することを強く示唆する。これはさらに、ＭＥｘの治療的な影響が肺に限定されないこと、およびＭＥｘが骨髄単球表現型を調整することによって全身の抗炎症効果を発揮し、傷害を負った肺において、炎症の弱化および線維症の予防につながることを確認する。
【０１１２】
ＭＥｘ治療は、アポトーシスを減少させる
肺胞上皮細胞アポトーシス（ＡＥＣ）は、損傷した肺における線維化促進性シグナルのためのトリガーとして説明されてきた（２６、２７）。ＭＥｘが肺傷害から保護するさらなる機序を探索するために、ブレオマイシン傷害後のアポトーシスの低減におけるＭＥｘの潜在的な役割が調査された。肺アポトーシスの程度は、対照、ブレオマイシン、およびＭＥｘ処置マウスからの肺切片におけるＴｕｎｅｌ染色を用いて、査定された。ブレオマイシン曝露群においてアポトーシスの増加が見られた一方で、アポトーシスレベルはブレオ＋ＭＥｘおよび対照マウスで同様であった（図５Ａ、５Ｂ）。加えて、１４日目に、全肺においてアネキシンＶ／ＰＩ染色が実施された。対照およびＭＥｘ処置マウスと比較して、ブレオマイシンに存在するアポトーシス（アネキシンＶ＋／ＰＩ−）における増加が再びあった（図５Ｃ）。
【０１１３】
さらにまた、ヒト肺胞上皮細胞（Ａ５４９、ＡＥＣ）におけるＭＥｘの直接的な抗アポトーシス効果が査定された。Ａ５４９細胞をブレオマイシンで処置することにより、上皮細胞のアポトーシスを誘導するin vitroアッセイが設計された。ブレオマイシン曝露ＡＥＣの一群はＭＥｘで２４時間処置され、アポトーシスの変化は、Caspase-Glo（登録商標）３／７発光アッセイを用いたカスパーゼ３および７の活性によって決定された。ブレオマイシン群におけるアポトーシスの増加がみられ、これはＭＥｘ処置細胞において無効にされた（図５Ｄ）。上記の知見は、in vitroおよびin vivoでのＭＥｘの重要な抗線維化効果を支持する。
【０１１４】
考察
この研究は、ブレオマイシン誘発性肺傷害の炎症期の導入または最後のいずれかでのヒト骨髄由来ＭＥｘの単回ＩＶ用量が、線維症を著しく予防し、肺構造を回復させることを示す。ＭＥｘ処置は、肺における炎症を鈍化させただけでなく、ＡＭを回復させ、単球数を対照マウスと同様のレベルまでに動員した。先述の所見および単球の発達が骨髄（ＢＭ）で生じるという事実は、ＢＭ骨髄の特性を調査することによって、ＭＥｘの上流の免疫調整的効果の調査につながった。ＢＭにおける標識ＭＥｘの可視化に加えて、ＢＭ骨髄性細胞のフローサイトメトリー分析は、ＭＥｘ処置マウス中で、炎症誘発性（Ｌｙ６Ｃ高ＣＣＲ−２＋ｖｅ）から調節性（Ｌｙ６Ｃ低ＣＣＲ−２−ｖｅ）表現型への単球亜集団におけるシフトを、明らかにした。
【０１１５】
興味深いことに、新規のＭＥｘ前処置ＢＭＤＭｏ養子移入実験を用いて、ＢＭ単球におけるＭＥｘの免疫調整的効果が、肺におけるそれらの保護効果を説明するのに少なくとも部分的に十分であることが示された。最終的に、肺線維症に対する保護における他の潜在的な機序が探索され、ＭＥｘ処置マウスの肺におけるアポトーシスの減少が見られた。さらにまた、in vitro実験は、ＭＥｘが肺胞上皮細胞を標的とすることによって抗アポトーシス効果を発揮することを、明らかにした。
【０１１６】
ブレオマイシン曝露マウスにおける異なる時点（７日目および１４日目）でのサイトメトリーの結果を合理化するために、動員された炎症性（Ｌｙ６Ｃ高）単球および単球由来の代替活性化マクロファージ（Ｍ２様）が、線維症の発症および進行に関連している（２０〜２２、２８〜３１）という先の知見が考慮された。加えて、これらの結果は、ブレオマイシン肺傷害後の炎症性単球の増加が、ＢＭで始まることを明らかにした。常在ＡＭのブレオマイシン誘発性喪失は、ＢＭ幹細胞に炎症促進性単球への分化を増加させるように信号を送り、これらの細胞は次いで、炎症期に肺に集合する（モデルにおける７日目に見られるように）と考えられる。これらの古典的単球は、傷害の後の段階でＭ２様ＡＭへと分化し、線維化反応をさらに悪化させる線維化促進環境を提供する。これは、１４日目のＡＭおよびそれらの炎症性マーカーの増加を説明する。
【０１１７】
ＭＳＣ−ＥＶは、照射されたマウスのＢＭにおいて、Ｓｃａ−１陽性およびｃ−ｋｉｔ低陽性幹細胞を再生息させ得る（３２）。それらはまた、心筋炎のモデルにおいて単球輸送を調整することが示されてきた（３３）。臓器傷害の存在下では、ＭＳＣ−ＥＶは、調節性表現型に分化させるために骨髄幹細胞を再プログラムしてもよい。結果的に、ＢＭにおける調節性単球の増加および肺における炎症性単球の低減があり、したがって、線維化促進性マクロファージへの分化が少なかった。ＭＥｘ処置ＢＭＤＭｏの養子移入での線維症の予防は、ＢＭ単球表現型の変更が、肺におけるＭＥｘのこれに続く抗線維化効果についての機序的説明であることを、強く示唆する。この効果は、ＭＥｘ処置ＡＭの気管内注射では再現されなかった。Morrisonおよび同僚らによる最近の研究では、ＭＳＣ−ＥＶ処置ＡＭのＬＰＳ誘発性急性肺傷害モデルへの気管内投与が、炎症を減少させた（１７）。これらの結果は、マクロファージにおけるＭＳＣ−ＥＶの免疫調整的効果とも一致する一方、この実験におけるＡＭ移入後の線維症の改善の欠如は、疾患モデルの違い、したがって異なる根本的な病態生理学に起因し得る。Van de Laarおよび同僚らは、成熟したＡＭおよびＢＭＤＭｏの両方が、空のＡＭニッチにコロニー形成するおよび機能的な組織常在マクロファージへ発達する能力を有することを実証した（３４）。炎症の開始時（養子移入実験の０日目から３日目）の空のＡＭニッチの不存在が、移植されたＡＭによる十分なコロニー形成を許さなかった可能性がある。
【０１１８】
最終的に、種々のin vivo方法を用いて、免疫調整に加えて、ＭＥｘはアポトーシスの低減を通じて線維症を潜在的に予防することもまたできることが示された。さらにまた、本明細書に記載のin vitroアッセイは、この効果が、肺胞上皮細胞を標的とすることによって生成されることを示唆する。
【０１１９】
この研究には限界がある。現在の治療用量は、先の実験に基づいて推定された。よって、用量反応を調査するために今後の研究が実施されるべきである。
【０１２０】
この研究では、ＩＰＦの実験モデルにおけるＭＳＣエキソソームの効果を調査した。知見は、ブレオマイシン肺傷害後の全身の炎症反応へおよび骨髄中の単球表現型の変更への新しい洞察を提供する。加えて、この研究は、ＭＳＣエキソソームの免疫調整的効果およびそれらの作用源についての新しい機序的説明を明らかにする。ＭＳＣエキソソームは、疾患の経過の初期に投与された場合、線維性肺疾患の処置のための有望な無細胞治療であると信じられている。
【０１２１】
補足の方法
細胞の単離および培養
ヒト骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）は、RoosterBio（RoosterBio、ＭＤ、ＵＳ）から得られた。ヒト包皮（真皮）線維芽細胞（ＨＤＦ）は、組織外植片法によって樹立された（３６）。ＢＭＳＣおよびＨＤＦは、培養および拡張され、ならびにさらに、これまでに記載されたとおり、さらに特徴付けられた（３７）。Ａ５４９肺胞上皮細胞（ＡＴＣＣ）は、Ｆ−１２Ｋ培地（Thermo Fisher Scientific, Inc.、Waltham、ＭＡ）で培養された。
【０１２２】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
５〜１０μｌの細胞外小胞（ＥＶ）調製物のアリコートは、フォルムバール／カーボンコーティンググリッド（Electron Microscopy Sciences、ＰＡ、ＵＳ）に１５秒間吸着させられた。試料は、Whatman Grade 1濾紙（Sigma）での余分な液体の除去後、２％酢酸ウラニルで染色された。ＥＶは、次いで、JEOL 1200EX透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察され、AMT 2k CCDカメラで画像が記録された。
【０１２３】
ナノ粒子追跡分析
エキソソームのサイズおよび濃度の分布は、これまでに記載されたとおり（３７）、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ、NanoSight LM10 system、Malvern instruments、ＭＡ、ＵＳ）を用いて決定された。
【０１２４】
ウェスタンブロット分析
エキソソーム調製物中のタンパク質は、４〜２０％ポリアクリルアミドゲル（Bio- Rad、Hercules、ＣＡ）で分離され、０．４５μｍＰＶＤＦ膜（Millipore、ＭＡ、ＵＳ）への転写が続いた。ウサギポリクローナル抗フロチリン−１および抗ＣＤ６３抗体（Santa Cruz Biotech、ＣＡ、ＵＳ）、およびマウスモノクローナル抗Ａｌｉｘ抗体（Santa Cruz Biotech、ＣＡ、ＵＳ）は、製造元が推奨する希釈に基づいて用いられた。
【０１２５】
ＥＶ投薬
ＥＶ調製物は、５×１０６細胞当量に相当するようにＰＢＳで希釈された。この用量は、対応するＮＴＡおよびタンパク質濃度で、新生マウスにおける以前の用量計算に基づいて推定された（３７）。
【０１２６】
免疫発光染色
肺組織切片は、キシレンで脱パラフィンされ、再水和された。組織スライドは、１０ｍＭクエン酸バッファーで処置され、血清およびＢＳＡで２０分間ブロックされた。試料は、次いで、示された一次抗体であるアルギナーゼ１（Santa Cruz Biotech、ＣＡ、ＵＳ）；ＣＤ２０６（Santa Cruz Biotech、ＣＡ、ＵＳ）とともに４０℃で一晩インキュベートされ、次いで、二次抗体（Life technologies、ＭＡ、ＵＳ）とともに２０分間さらにインキュベートされ、ＤＡＰＩで１０分間核染色が続いた。
【０１２７】
アルギナーゼ１およびＣＤ２０６陽性細胞は、Nikon Eclipse 80i顕微鏡（Nikon、東京、日本）を用いて画像化された。１０〜１５個のランダム画像は、画像Ｊソフトウェアを用いて分析された。
【０１２８】
平均発光強度（ＭＦＩ）は、以下の式を用いて計算された：ＭＦＩ＝積分密度−（選択された細胞の面積＊バックグラウンド読み取りの平均発光）。
【０１２９】
Sircolコラーゲンアッセイ
左肺は、製造元のプロトコル（Biocolor, Life Science Assays）に従ってコラーゲン定量化に用いられた。手短に言えば、左肺ホモジネートは、０．６％ペプシンを伴う５ｍｌの０．５Ｍ酢酸中で４°で終夜振とうされた。１ｍｌの色素試薬は、１００μｌの透明な上清に加えられ、試料は３０分間ボルテックスされた。残りのペレットは、酸性塩洗浄バッファーで洗浄され、未結合のコラーゲンを除去し、ｐＨはアルカリ化バッファーで正規化された。吸光度は、マイクロプレートリーダーにおける５５０ｎｍの波長で測定された。測定されたコラーゲン含量は、標準曲線と比較され、左肺ホモジネートのｍｇ／ｍｌとして表された。
【０１３０】
マウスの全肺および骨髄のサイトメトリー分析
肺マクロファージ集団は、これまでに記載されたように（３８）、フローサイトメトリーによって査定された。肺は、７日目および１４日目に採取された。左肺は、小片に切断され、ＲＰＭＩ−１６４０（Invitrogen、ＣＡ、ＵＳ）、コラゲナーゼＩＶ（１．６ｍｇ／ｍｌ）；およびＤＮＡｓｅ１（５０ユニット／ｍｌ）（両者ともWorthington Biochemical Corp、ＮＪ、ＵＳより）からなる消化バッファーの５ｍｌにおいて消化された。肺は３７℃で３０分間振とうされ、赤血球（ＲＢＣ）はＲＢＣ溶解バッファー（Roche、ＩＮ、ＵＳ）を用いて溶解された。ホモジナイズされた肺は、４０μｍ細胞漉し器（Corning、ＭＡ、ＵＳ）に通され、単一細胞懸濁液を得た。
【０１３１】
肺胞マクロファージおよび単球集団の査定のために、細胞懸濁液が抗体；ＰＥ／Ｃｙ７結合抗マウスＣＤ４５、ＦＩＴＣ結合抗マウスＣＤ１１ｂ、ＰｅｒＣＰＣｙ５．５結合抗マウスＣＤ１１ｃ、ＢＶ４２１結合抗マウスＣＤ２０６、ＢＶ６０５結合抗マウスＭＨＣＩＩ、ＢＶ５１０結合抗マウスＬｙ６ＣおよびＡｌｅｘａ６４７結合抗マウスＣＣＲ−２で染色された。
【０１３２】
骨髄由来単球（ＢＭＤＭｏ）の評価のために、成体マウスの大腿骨および脛骨から洗い流したばかりの細胞は、ＰＥ／Ｃｙ７結合抗マウスＣＤ４５、ＦＩＴＣ結合抗マウスＣＤ１１ｂ、ＢＶ６０５結合抗マウスＭＨＣＩＩ、ＢＶ５１０結合抗マウスＬｙ６ＣおよびＡｌｅｘａ６４７結合抗マウスＣＣＲ−２（すべての抗体はBiolegend、ＣＡ、ＵＳから入手した）で染色された。同様の染色が、３時間のin vitro培養後に採取されたＢＭＤＭｏ上で実施された。
【０１３３】
補正はそれに応じて調整され、UltraComp ebeads（Affymetrix、ＣＡ、ＵＳ）によって支持を受けた。結果的に、Fluorescence-minus-oneコントロールが用いられた。細胞集団は、図８に図示されたゲーティング戦略に従って同定され、総細胞集団のパーセンテージとして記録された。
【０１３４】
逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応分析
全ＲＮＡは、TRIZOL（登録商標）（Thermo Fisher Scientific, Inc.、Waltham、ＭＡ）を製造元の指示に従って用いて、左肺から抽出された。Ｃｃｌ２、Ｉｌ６、ＴＧＦ−β、およびアルギナーゼ１を含むＰＣＲ反応で用いられたTaqMan（登録商標）プライマーは、Invitrogenから得られた。
【０１３５】
核膜孔タンパク質１３３は、内部対照として役割を果たした。倍率変化の分析は、対照マウスと比較して、これまでに記載されたように実施された（３９）。
【０１３６】
アネキシンＶ／ＰＩアポトーシスアッセイ、Ｔｕｎｅｌ染色およびカスパーゼ３／７アッセイ
アネキシンＶ染色キット（Sigma-Aldrich、MO、US）は、全肺におけるアポトーシスを査定するために用いられた。単細胞懸濁液は、上に記載のとおり左肺から得られた。細胞は、次いで、１ｘ結合バッファーに浮遊され、ＦＩＴＣ結合アネキシンＶおよびＰＩ抗体で１０分間染色され、即時にフローサイトメトリーによって査定された。
【０１３７】
アポトーシスは、ＴＡＣＳ（登録商標）TdT in situ−フルオレセインＴｕｎｅｌアッセイ（R&D systems、ＭＮ、ＵＳ）を、製造元のプロトコルに従って用いて、パラフィン包埋肺組織において評価された。手短に言えば、脱パラフィンされた肺切片は、Cytoninを用いて１時間透過処置され、マンガンカチオン、TdT dNTP Mix、およびTdT酵素の組み合わせで標識され、Strep-Fluor溶液での２０分間のインキュベートが続いた。発光イメージングおよび定量化は、上記のように実施された。
【０１３８】
Caspase 3/7アッセイ（G8090、Promega）は、製造元の指示に従って実施された。手短に言えば、２×１０４のＡ５４９肺胞上皮細胞が、９６ウェルプレートに終夜プレーティングされた。細胞は、０．１μｇ／ウェルの硫酸ブレオマイシンまたは培地単独で２４時間処置された（群あたり８ウェル）。この後、ブレオマイシン処置細胞の、１μｌ／ウェルのＭＥｘ（およそ約２×１０４のＭＳＣによって生成されたＥＶに相当）での２４時間処置が続いた。培地のみで処置されたブレオマイシン処置細胞は、対照として用いられた。すべての実験は血清フリーの培地で実施された。３日目に、細胞はＰＢＳで洗浄され、５０μｌの新鮮な培地が各ウェルに添加された。カスパーゼ３／７活性を測定するために、５０μＬのCaspase Glo３／７試薬が各ウェルに室温にて２時間添加され、プレートはプレートシェーカーに放置された。発光は、VICTORマルチラベルプレートリーダーを用いて測定された。バックグラウンド発光（無細胞ウェルで測定された）は、各読み取り値から差し引かれた。
【０１３９】
ＭＥｘ処置骨髄由来単球の養子移入
ＢＭＤＭｏは、大腿骨および脛骨を洗い流し、かつ細胞を、１０％ＦＢＳで補充され、３０％ｖ／ｖＬ９２９−馴化培地（マクロファージコロニー刺激因子；Ｍ−ＣＳＦの供給源として）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で３日間培養することにより、６〜８週齢のＦＶＢから単離された。各プレートは、１日目および２日目にのみ、１ｘ１０６のＭＳＣまたは培地のみから生成されたＭＥｘで処置された。細胞は、３日目に採取され、ＰＢＳで２回洗浄された後、製造元のプロトコル（Life technologies）に従ってＤｉｌで染色された。ＢＭＤＭｏは、次いで、ブレオマイシンの気管内注入後０日目および３日目に、１：１の比率で尾静脈注射を介して投与された（１匹のマウスから単離されたＢＭＤＭｏは、実験マウスに注射された）。
【０１４０】
ＭＥｘ処置マウス由来の肺胞マクロファージの養子移入
６から８週のＦＶＢマウスは、i.p.ペントバルビタール注射によって安楽死させられた。気管の前壁は、２１ゲージの針でカニューレ挿入され、紐で固定された。
【０１４１】
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）は、１ｍｌシリンジを用いて０．６ｍｌの滅菌HBSS（０．５ｍＭ EDTAおよび１ｍＭ HEPESで補充された）の５回フラッシュで収集された。ＢＡＬＦは、４００ｘｇで５分間遠心分離され、上清が吸引された。マウスＡＭは、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ＦＢＳで補充された新鮮なＲＰＭＩ培地に再懸濁され、３５ｍｍプレートにプレートあたり１ｘ１０６の播種密度で播種された。各プレートは、１ｘ１０６の細胞から生成されたＭＥｘで終夜処置された。細胞は、２４時間後に採取され、ＰＢＳで２回洗浄され、Ｄｉｌで染色され、５０μｌのＰＢＳに再懸濁された。ＡＭは、ブレオマイシンの滴下後０日目および３日目に、１対１（１匹のマウスから単離されたＡＭは、実験マウスに投与された）の比率で気管内投与された。
【０１４２】
Ex vivoＥＶ標識化および骨髄サイトスピン
ＥＶは、骨髄ＭＳＣの濃縮馴化培地から１００，０００ｇで７０分間ペレット化された。ＥＶタンパク質濃度は、マイクロＢＣＡタンパク質アッセイキット（Thermo Fisher Scientific, Inc.、Waltham、MA）を用いて決定された。ＥＶは、製造プロトコルに従ってExoGlow-Membrane（商標）ＥＶ標識化キット（System biosciences、CA、USA）によって標識された。手短に言えば、５０〜１００μｇのＥＶは、反応バッファーと標識化色素との混合物に添加され、室温で３０分間インキュベートされた。フリーの非標識色素は、１００，０００ｇで７０分間の２回目の超遠心分離の後、除去された。１×１０６のＭＳＣの当量によって生成されたＥＶは、２００μｌのＰＢＳにおいて希釈され、尾静脈注射を用いてＣ５７ＢＬ／６マウスへ注射された。２００μｌの染色されたＥＶフリーＳＮ、または希釈フリー色素は、対照として用いられた。
【０１４３】
マウスは、注射後２、４、８および２４時間でサクリファイスされた。大腿骨は、ＰＢＳで洗い流され、細胞懸濁液は、Shandon Cytospin 4（Thermo Fisher Scientific, Inc.、Waltham、MA）を用いて３００ｇで５分間細胞遠心分離された。スライドは風乾され、４％パラホルムアルデヒドで固定され、Ｄａｐｉで対比染色された。画像は、Nikon Eclipse 80i顕微鏡（Nikon、東京、日本）を用いて得られた。
【０１４４】
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【０１５２】
例えば、背景、概要、詳細な説明、例、および／または参考文献のセクションで、本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、特許出願、刊行物、およびデータベースエントリ（例えば、配列データベースエントリ）は、個々の刊行物、特許、特許出願、刊行物、およびデータベースエントリが、参照により本明細書に具体的かつ個別に組み込まれたかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本明細書の定義を含む本出願が支配するであろう。
【０１５３】
均等物および範囲
当業者は、本明細書に記載の態様の多くの均等物を認識する、または日常的な実験のみを用いて確認することができるであろう。本開示の範囲は、上記の説明に限定されるものではなく、むしろ、添付の特許請求の範囲で表されるものである。
【０１５４】
「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、反対の指示がない限り、または文脈から明白でない限り、１つ以上を意味してもよい。グループの２つ以上のメンバー間の「または」を包含する請求項または記載は、反対の指示がない限り、または文脈から明白でない限り、１つ、１つより多い、またはすべてのグループメンバーが存在する場合に満足されると考えられる。２つ以上のグループメンバー間に「または」を含むグループの本開示は、グループのメンバーが厳密に１つ存在する態様、グループのメンバーが１つより多く存在する態様、およびグループのメンバーのすべてが存在する態様を提供する。簡潔にするために、これらの態様は本明細書では個々に説明されてきていないが、これらの態様の各々は本明細書に提供され、具体的にクレームまたはディスクレームされてもよいことが理解されるであろう。
【０１５５】
本開示は、請求項の１つ以上からの、または記載の１つ以上の関連部分からの１つ以上の限定、要素、条項、または記述用語が、別の請求項に導入される、すべての変形、組み合わせ、および順列を包含することを理解されたい。例えば、別の請求項に従属する請求項は、同じベースの請求項に従属する任意の他の請求項に見られる１つ以上の限界を包含するために、修正され得る。さらに、請求項が組成物を記載する場合、特に断りのない限り、または不一致または不整合が生じるであろうことが当業者に明らかであろう場合を除き、本明細書に開示される作製するまたは用いる方法のいずれかに従う、またはもしあれば、当該技術分野において知られている方法に従う、組成物を作製するまたは用いる方法が含まれることを理解されたい。
【０１５６】
要素がリストとして、例としてマーカッシュグループ形式で提示される場合、要素のすべての可能なサブグループもまた開示されており、任意の要素または要素のサブグループはグループから除去され得ることを理解されたい。「含む（comprising）」なる用語は、オープンであることが意図され、追加の要素またはステップの包含を許可することにもまた留意されたい。一般に、態様、物、または方法が特定の要素、特色、またはステップを含むものとされる場合、かかる要素、特色、またはステップからなるか、またはそれらから本質的になる態様、物、または方法もまた提供されることが理解されるべきである。簡潔にするために、それらの態様は本明細書では個々に説明されていないが、これらの態様のそれぞれは本明細書に提供され、具体的にクレームまたはディスクレームされてもよいことが理解されるであろう。
【０１５７】
範囲が与えられている場合、エンドポイントが含まれる。さらにまた、特に断りのない限り、または文脈および／または当業者の理解から明白でない限り、範囲として表される値は、いくつかの態様において述べられた範囲内の任意の特定の値（文脈で明確に指示されていない限り、範囲の下限の単位の１０分の１まで）をとり得ることを理解されたい。簡潔にするために、各範囲の値は本明細書中では個々に説明されていないが、これらの値の各々は本明細書中で提供されること、および具体的にクレームまたはディスクレームされてもよいことが理解されるであろう。また、特に断りのない限り、または文脈および／または当業者の理解から明白でない限り、範囲として表される値は、所与の範囲内の任意の下位範囲をとり得ることを理解されたい（下位範囲のエンドポイントは範囲の下限の１０分の１の単位と同じ精度で表される）。
【０１５８】
Ｗｅｂサイトが提供される場合、ＵＲＬアドレスは、ブラウザで実行できないコードとして提供され、それぞれのＷｅｂアドレスの期間は丸括弧で囲まれる。実際のＷｅｂアドレスは丸括弧を含まない。
【０１５９】
さらに、本開示の任意の特定の態様は、請求項のいずれか１以上から明示的に除外されてもよいことを理解されたい。範囲が与えられている場合、範囲内の任意の値は、いずれか１以上の請求項から明示的に除外されてもよい。本開示の組成物および／または方法の任意の態様、要素、特色、用途、または側面は、任意の１以上の請求項から除外され得る。簡潔にするために、１以上の要素、特色、目的、または側面が除外される態様のすべては、本明細書に明示的に記載されていない。
【図１Ａ−１Ｂ】
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【図１Ｃ−１Ｄ】
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【図２Ａ−２Ｃ】
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【図２Ｄ−２Ｅ】
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【図３Ａ−３Ｄ】
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【図３Ｅ−３Ｆ】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図４Ｃ−４Ｄ】
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【図４Ｅ−４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ−５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−６Ｃ】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図７Ｃ−７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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