(57)【要約】  ニコチン結合抗体またはニコチン分解酵素などの抗ニコチン剤を使用して、喫煙者および／または他の供給源（電子タバコ／ベイピング、無煙タバコ、ＮＲＴなど）からニコチンを摂取または消費する対象において心血管疾患を治療する方法、ならびにそのような方法で使用するための抗ニコチン剤について記載する。
2021526529.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心血管疾患の治療または循環の改善を必要とする対象において、心血管疾患の治療または循環の改善に使用するための抗ニコチン剤。
【請求項２】
前記抗ニコチン剤が、ニコチン結合抗体またはそのニコチン結合断片である、請求項１に記載の使用のための抗ニコチン剤。
【請求項３】
前記抗ニコチン剤が、ニコチン分解酵素である、請求項１に記載の使用のための抗ニコチン剤。
【請求項４】
前記心血管疾患が、バージャー病、重症肢虚血、末梢動脈疾患、血栓形成、およびアテローム性動脈硬化疾患のうちの１つ以上から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための抗ニコチン剤。
【請求項５】
前記抗ニコチン剤が、静脈内、皮下、筋肉内、および腹腔内から選択される経路による投与のために製剤化される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための抗ニコチン剤。
【請求項６】
前記対象が、現在喫煙中の喫煙者、電子タバコの使用者、またはタバコの使用者などのニコチン製品の現在進行中の消費者である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための抗ニコチン剤。
【請求項７】
前記対象が、禁煙療法を受けている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための抗ニコチン剤。
【請求項８】
前記対象が、喫煙、電子タバコの使用、またはタバコの使用のうちの１つ以上を節制している、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための抗ニコチン剤。
【請求項９】
心血管疾患を治療するまたは循環を改善するための薬物の調製における抗ニコチン剤の使用であって、前記抗ニコチン剤が、ニコチン結合抗体またはそのニコチン結合断片およびニコチン分解酵素から選択される、抗ニコチン剤の使用。
【請求項１０】
循環の改善または心血管疾患の治療を必要とする対象において、循環を改善するまたは心血管疾患を治療する方法であって、治療有効量の抗ニコチン剤を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１１】
前記抗ニコチン剤が、ニコチン結合抗体またはそのニコチン結合断片である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗ニコチン剤が、ニコチン分解酵素である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗ニコチン剤が、静脈内、皮下、筋肉内、および腹腔内から選択される投与経路によって投与される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象が、ニコチン製品の現在進行中の消費者である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象が、現在喫煙中の喫煙者、電子タバコの使用者、またはタバコの使用者である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象が、禁煙療法を受けている、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象が、ニコチン製品の消費を低減させた、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象が、ニコチン製品の消費を節制している、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象が、喫煙、電子タバコの使用、またはタバコの使用のうちの１つ以上を節制している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記節制している対象は、再発するリスクがある、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が、血圧、血管収縮、および心拍数から選択される前記対象における心血管疾患の１つ以上の症状を軽減するのに有効である、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記心血管疾患が、バージャー病、重症肢虚血、末梢動脈疾患、血栓形成、およびアテローム性動脈硬化疾患のうちの１つ以上から選択される、請求項１０〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記アテローム性動脈硬化疾患が、心臓または脳に影響を与えるアテローム性動脈硬化症を含む、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全容が参照により本明細書に組み込まれる２０１８年６月６日に出願された米国仮特許出願第６２／６８１，３４２号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、概して、ニコチン結合抗体および／またはニコチン分解酵素などの抗ニコチン剤を、タバコ喫煙者またはニコチンを摂取する人（例えば、電子タバコ、噛みタバコ、ニコチン置換療法などから）に対して投与することによって、循環を増加または改善し、バージャー病、重症肢虚血、末梢動脈疾患、血栓形成、ならびに心臓、脳、および他の臓器におけるアテローム性動脈硬化疾患を含む心血管疾患を治療する方法に関する。本開示によると、本開示の抗ニコチン剤は、禁煙を促進すること、ならびに／または自制を促進および維持することに加えて、ニコチンが血液中に存在する人において心血管疾患を治療する。
【背景技術】
【０００３】
以下の考察は、単に読者が本開示を理解するのを助けるために提供されており、それに対する先行技術を記載または構成することは認められていない。
【０００４】
ニコチンは、タバコ植物の葉に自然に大量に生じる、苦味のある副交感神経刺激アルカロイド化合物である。ニコチンは、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）アゴニストであり、刺激剤として生理学的に機能する。ニコチンは、嗜癖性および毒性の両方があり、その摂取および吸入（または他の投与形式）は、心血管疾患、先天性欠損症、および中毒（過量服用）に関連している。
【０００５】
体内ニコチンの最も一般的な供給源は、タバコの喫煙である。喫煙は、主にニコチン嗜癖に起因する世界的な医療問題である。世界保健機関（ＷＨＯ）は、現在、世界中で１１億人の喫煙者が存在し、毎年約６００万人のタバコ関連死があると推定している。現在の喫煙パターンが続くと、喫煙により、２０３０年までに毎年約８００万人が死亡するであろう。米国疾病管理センター（ＣＤＣ）によると、タバコの使用は、毎年４８０，０００を超える人が死亡する原因となっている、米国で唯一の主要な予防可能な死因である。米国では、喫煙および喫煙関連の病気の治療による直接的な医療費が、年間１，７００億ドルを超え、生産性の損失は１，５６０億ドルと推定される。ＣＤＣは、米国の３，６００万人の成人喫煙者のうち、７０％が禁煙を希望しているが、禁煙を試みる人のうち、１２ヶ月後に禁煙を継続しているのは５％未満であると推定している。加えて、米国では１，６００万人が喫煙に関連する病気を患っているが、４０％は喫煙を続けており、これらの人のうちのかなりの割合が、心血管疾患を患っている。
【０００６】
喫煙、タバコの使用、および他の形態のニコチン消費に関連する多くの健康上の影響の中で、ニコチン関連の心血管疾患は、最も深刻なものの１つである。例えば、喫煙およびタバコの消費は、バージャー病（すなわち、閉塞性血栓血管炎またはＴＡＯ）、重症肢虚血、末梢動脈疾患、アテローム性動脈硬化疾患、ならびに心臓、脳、および他の臓器における血管炎症または閉塞の発症に関係している。実際、喫煙およびタバコの消費は、治療の選択肢がほとんどない、多くの深刻で生命を脅かす状態に関係する。
【０００７】
バージャー病は、中小の動脈、ならびに腕および脚の静脈に影響を与える部分的な炎症性閉塞性障害である。バージャー病は、喫煙のみに関連し、年配の喫煙者だけでなく若い喫煙者にも発生する可能性がある。臨床的には、バージャー病では、四肢の動脈不全および血管拡張障害の兆候が現れる。関連する血栓症は閉塞性であることが多く、時には、主に多形核白血球、単核細胞、およびまれな多核巨細胞からなる、中程度の非特異的な炎症性浸潤を示す。ニコチンに対する免疫系の反応は、バージャー病の病因において重要な役割を果たしているように思われるが、血管組織の炎症の進行、およびその結果的としてのこの疾患の進展に関与する免疫学的側面に関する知識は依然として限られている。一部のグループは、バージャー病が血管内皮の未確認の抗原、おそらくニコチンまたはニコチン代謝物によって開始される自己免疫障害であり得ることを示唆している。臨床的には、バージャー病の進行を停止するための唯一の確立された治療は、禁煙である。バージャー病の治療のためのＦＤＡ承認の薬剤およびデバイスは存在しない。しかしながら、臨床文献では、交感神経切除術または血管拡張薬であるシロスタゾールおよびプロスタグランジン類似体（プロスタサイクリンまたはプロスタグランジンＥ）の使用により、バージャー病の症状を軽減することに部分的に成功したことが報告されている。
【０００８】
重症肢虚血（ＣＬＩ）は、手足、手／指、または足／足指への血流および酸素が不十分な深刻な状態である。重症肢虚血は、概して、手足の小動脈の狭窄または閉塞によって引き起こされる。ＣＬＩは、切断による組織の損傷、痛み、治癒不良の潰瘍、壊疽、および指または手足の他の部分の喪失を引き起こす。バージャー病のように、この状態は、治療せずにそれ自体では改善しない。
【０００９】
末梢動脈疾患（ＰＡＤ）は、脂肪、コレステロール、カルシウム、線維組織、および他の物質で構成されるプラークが、血液を頭、臓器、および手足に運ぶ動脈に蓄積する疾患である。時間の経過とともに、プラークは、動脈を硬化および狭窄させる可能性がある。これにより、酸素が豊富な血液の、臓器および体の他の部分への流れが制限される。ＰＡＤは、通常、脚の動脈に影響を与えるが、心臓から頭、腕、腎臓、および胃に血液を運ぶ動脈にも影響を与える可能性がある。ＰＡＤを発症する主な危険因子は、喫煙である。シロスタゾールまたはペントキシフィリンは、一部の症状を改善し得るが、それが生活の質を改善し、死亡率を減少させ、または喫煙／ニコチン曝露に関連する心血管イベントのリスクを減少させることを示唆する強力な証拠は存在しない。血管形成術および血管バイパス術などの血行再建術は、ＰＡＤ患者にとって最も効果的な選択肢であると考えられている。
【００１０】
アテローム性動脈硬化疾患（すなわち、アテローム性動脈硬化症）は、動脈壁内および動脈壁上に脂肪、コレステロール、および他の物質が蓄積することを指す。プラークとしても知られるこれらの蓄積は、動脈を厚くおよび硬くさせ、心臓、脳、または他の臓器などの任意の影響を受ける臓器への血流に影響を及ぼし得る。アテローム性動脈硬化症が心臓に影響を与えると、胸の痛みおよび圧迫を引き起こす可能性があり、脳に影響を与えると、突然のしびれもしくは脱力感、発話困難／不明瞭な話し方、一時的な失明、または顔にたるみを引き起こす可能性があり、これらはすべて、一過性脳虚血発作の前兆となり得る。腕および脚も一般的にアテローム性動脈硬化症の影響を受け、歩行または移動時に痛みを引き起こす可能性があり、腎臓も一般的に影響を受ける。アテローム性動脈硬化症の治療に利用可能な多くの薬用（例えば、コレステロール薬、抗血小板薬、ベータブロッカー、ＡＣＥ阻害薬など）および外科的（例えば、血管形成術、ステント留置、バイパス手術）介入が存在するが、主に推奨されるタバコの使用者の修正は、多くの使用者が達成するのが困難であると感じるタバコの使用を中止または節制することである。
【００１１】
したがって、バージャー病、重症肢虚血、末梢動脈疾患、血管炎症、血栓形成、およびアテローム性動脈硬化疾患などの喫煙およびニコチン消費に関連する心血管疾患を治療するための有効な薬剤が依然として必要である。本開示は、この必要性を満たす。
【発明の概要】
【００１２】
バージャー病、重症肢虚血、末梢動脈疾患、血栓形成、およびアテローム性動脈硬化疾患（例えば、心臓、脳、および他の臓器における動脈のアテローム性動脈硬化症）のうちの１つ以上などの心血管疾患を有するニコチンの使用者（例えば、喫煙者および他の形態のニコチン摂取を使用する対象）を、ニコチン結合抗体および／またはニコチン分解酵素などの抗ニコチン剤を投与することによって治療する方法について本明細書に記載する。
【００１３】
一態様では、本開示は、循環の改善または心血管疾患の治療を必要とする対象において、循環を改善するまたは心血管疾患を治療する方法であって、治療有効量の抗ニコチン剤を対象に投与することを含む、方法を、提供する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、抗ニコチン剤は、ニコチン結合抗体またはそのニコチン結合断片であり得るが、いくつかの実施形態では、抗ニコチン剤は、ニコチン分解酵素であり得る。
【００１５】
いくつかの実施形態では、抗ニコチン剤は、静脈内、皮下、筋肉内、および腹腔内から選択される投与経路によって投与され得る。
【００１６】
いくつかの実施形態では、治療される対象は、ニコチン製品の現在進行中の消費者である。例えば、いくつかの実施形態では、対象は、現在喫煙中の喫煙者、電子タバコの使用者、またはタバコの使用者であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、禁煙療法を受けている可能性があるが、いくつかの実施形態では、対象は、喫煙、電子タバコの使用、またはタバコの使用のうちの１つ以上またはすべてを節制している可能性がある。
【００１７】
いくつかの実施形態では、心血管疾患は、バージャー病、重症肢虚血、末梢動脈疾患、血栓形成、およびアテローム性動脈硬化疾患（例えば、心臓または脳に影響を与えるアテローム性動脈硬化症）のうちの１つ以上から選択され得る。いくつかの実施形態では、方法は、血圧、血管収縮、および心拍数から選択される対象における心血管疾患のうちの１つ以上の症状を軽減するのに有効であり得る。
【００１８】
別の態様では、本開示は、心血管疾患の治療および／または循環の改善を必要とする対象において、心血管疾患を治療するおよび／または循環を改善するもしくは循環のさらなる障害を縮小することにおいて使用するための抗ニコチン剤を提供する。いくつかの実施形態では、抗ニコチン剤は、ニコチン結合抗体（またはそのニコチン結合断片）であり得る。他の実施形態では、抗ニコチン剤は、ニコチン分解酵素であり得る。任意の実施形態では、心血管疾患は、バージャー病、重症肢虚血、末梢動脈疾患、血栓形成、およびアテローム性動脈硬化疾患のうちの１つ以上から選択され得る。任意の実施形態では、抗ニコチン剤は、静脈内、皮下、筋肉内、および腹腔内から選択される経路による投与のために製剤化され得る。任意の実施形態では、対象は、現在喫煙中の喫煙者、電子タバコの使用者、および／またはタバコの使用者であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、禁煙療法を受けている。いくつかの実施形態では、対象は、喫煙、電子タバコの使用、および／またはタバコの使用のうちの１つ以上またはすべてを節制している。
【００１９】
別の態様では、本開示は、心血管疾患の治療および／または循環改善を必要とする対象において、疾患を治療するおよび／または循環を改善するための薬物の調製における抗ニコチン剤の使用を提供する。いくつかの実施形態では、抗ニコチン剤は、ニコチン結合抗体（またはそのニコチン結合断片）またはニコチン分解酵素（またはそのニコチン分解断片）であり得るいくつかの実施形態では、心血管疾患は、バージャー病、重症肢虚血、末梢動脈疾患、血栓形成、およびアテローム性動脈硬化疾患のうちの１つ以上から選択され得る。任意の実施形態では、対象は、現在喫煙中の喫煙者、電子タバコの使用者、および／またはタバコの使用者であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、禁煙療法を受けている。いくつかの実施形態では、対象は、喫煙、電子タバコの使用、および／またはタバコの使用のうちの１つ以上またはすべてを節制している。
【００２０】
前述の一般的な記載および以下の詳細な記載は、例示的かつ説明的なものであり、本発明のさらなる説明を提供することを企図する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】単回ニコチン曝露および８Ｄ１−ＩｇＧ４による前処理後の脳および血清のニコチンレベルを示す（平均±ＳＤ、個々の比較のためのダネット検定による一元配置分散分析によるｐ＜０．０００１）。本開示の抗ニコチン剤は、血清中のニコチンを隔離し、例えば、生理学的影響をもたらし得る脳への進入を防止する。上部パネルは、抗ニコチン抗体の用量の増加に伴う、血清のニコチン濃度の増加を示し、下部パネルは、脳のニコチン濃度の減少を示す。
【図２】８Ｄ１−ＩｇＧ４による前処理後のニコチン反復曝露の後の脳およびニコチンのレベルを示す（平均±ＳＤ、個々の比較のためのダネット検定による一元配置分散分析によるｐ＜０．０００１）。脳内のニコチン濃度は、非常に多量の喫煙をシミュレートするニコチンの反復投与後でも、抗ニコチン抗体によって低レベルに維持される。
【図３】ＮｉｃＡ２による血液および脳のニコチン濃度の低下を示す。ラットをＮｉｃＡ２により静脈内で前処理し、５分後にニコチン０．０３ｍｇ／ｋｇを静脈内で受けた。ラットの群では、ニコチンレベルを１分、３分、または５分で測定した。血液（上側パネル）および脳（下側パネル）のニコチン濃度は、用量および時間に関連してＮｉｃＡ２によって低下し、５ｍｇ／ｋｇ以上の用量で実質的なＮｉｃＡ２効果があり、１分よりも３分および５分でニコチン濃度が大幅に低下した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１をボンフェローニ補正されたウェルチのｔ検定を使用するＢＳＡと比較。平均±ＳＤ、ｎ＝８／群。
【図４】複数回のニコチン用量を受けているラットにおけるＮｉｃＡ２の効果を示す。１０ｍｇ／ｋｇのＮｉｃＡ２で前処理した後、ラットは静脈内で０．０３ｍｇ／ｋｇの１回のニコチン用量か、または１０分間隔の５回のニコチン用量かのいずれかを受けた。棒線の上の数字は、血液（上側パネル）および脳（下側パネル）における、ＢＳＡ対照と比較したニコチン用量の３分後のニコチン濃度の低下率である。＊＊＊ｐ＜０．００１、ウェルチの補正による両側の対応のないｔ検定。平均±ＳＤ、ｎ＝１０／群。
【図５】８Ｄ１−ＩｇＧ４で前処理したラットにおけるニコチン挑戦前後の平均動脈圧の変化を示す。抗ニコチン抗体は、ニコチン曝露前に投与された場合、ニコチンによって誘発される平均動脈圧（ＭＡＰ）の大幅な増加を防止する。これらの結果に基づいて、８Ｄ１−ＩｇＧ４によるＭＡＰのニコチン誘発性の増加の有意な用量依存性減衰が観察された（ｐ＝０．０３３、フリードマン検定および多重比較のためのダンの補正を使用するノンパラメトリック一元配置分散分析）。上部パネルは、変動する用量での数日間にわたるＭＡＰの平均変化を示し、下部パネルは、血漿抗体濃度とＭＡＰの変化との間の強い相関関係を示す。
【図６】８Ｄ１−ＩｇＧ４で前処理したラットにおけるニコチンの各反復用量投与前後の平均動脈圧の平均変化を示す。抗ニコチン抗体による前処理は、ニコチンの反復投与の後でも、ＭＡＰの大幅な増加を防止する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
ニコチン結合抗体および／またはニコチン分解酵素などの抗ニコチン剤を投与することによって心血管疾患を治療する方法について本明細書に記載する。
【００２３】
Ｉ．定義
本発明の明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、互換的に使用され、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形も含み、ならびに各意味に該当することを企図する。また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、列挙される項目のうちの１つ以上のありとあらゆる可能な組み合せ、および代替的（「または」）に解釈される場合には、組み合せの欠如を指し、それらを包含する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当業者に理解され、使用される文脈に応じてある程度変動するであろう。当業者に明確ではない用語が使用されている場合、使用される文脈を考慮して、「約」は、特定の用語のプラスまたはマイナス１０％までを意味する。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」および「治療レベル」という語句は、そのような治療、すなわち、バージャー病、重症肢虚血、末梢動脈疾患、血栓形成、およびアテローム性動脈硬化疾患の症状または影響を軽減、改良、もしくは排除することを必要とするニコチンの現在進行中の使用者である対象に薬剤が投与される特定の薬理学的効果を提供する、対象における薬物投薬量または血漿濃度を意味する。そのような投薬量は当業者によって治療有効量であると見なされるとしても、薬剤の治療有効量および治療レベルが、本明細書に記載の状態の治療において常に有効であるとは限らないことが強調される。便宜上、例示的な投薬量、薬物送達量、治療有効量、および治療レベルが以下に提供される。治療有効量は、投与経路および剤形、対象の年齢および体重、ならびに／または心血管疾患の重症度および病態生理の位置または臓器関与を含む対象の状態に基づいて変動し得る。
【００２６】
心血管疾患に関して本明細書で使用される場合、「治療」または「治療する」という用語は、現在進行中の喫煙者または体内にニコチンが存在する他の個人におけるバージャー病、重症肢虚血、末梢動脈疾患、血栓形成、およびアテローム性動脈硬化疾患などの心血管疾患のうちの１つ以上の症状または影響を軽減、改良、または排除することを意味する。バージャー病、重症肢虚血、末梢動脈疾患、血栓形成、およびアテローム性動脈硬化疾患の症状には、痛み、循環障害、潰瘍、および壊疽が挙げられるが、これらに限定されない。バージャー病、重症肢虚血、末梢動脈疾患、血栓形成、およびアテローム性動脈硬化疾患は、四肢の切断の必要性をもたらす合併症を引き起こす可能性があり、本治療は、切断を必要とするリスクを減少させる。
【００２７】
喫煙、タバコの使用、またはニコチンの使用に関して本明細書で使用される場合、「自制」または「節制」という用語は、６ヶ月未満の任意の期間にわたって喫煙しない、タバコを使用しない、またはニコチンを使用しない個人を指す。自制期間は、継続的である必要はなく、喫煙、タバコの使用、またはニコチンの使用の期間が点在してもよい。したがって、一時的に喫煙を節制している個人は、依然として慢性喫煙者またはタバコの使用者であり得る。
【００２８】
喫煙、タバコの使用、またはニコチンの使用に関して本明細書で使用される場合、「中止」または「中止する」という用語は、少なくとも６ヶ月間喫煙、タバコの使用、またはニコチンの使用を継続的に節制している個人を指す。個人は、喫煙を中止するために療法を受けてもよく（すなわち、禁煙療法）、これには、認知療法または行動療法、ニコチン置換療法（例えば、ガムまたはパッチ）、ニコチン結合抗体もしくはニコチン分解酵素による治療、または酒石酸バレニクリンもしくは塩酸ブプロピオンなどの薬物による治療が含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
喫煙または他のタバコ／ニコチンの使用に関する「低減」という用語は、喫煙または他のタバコ／ニコチンの使用量を、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％減少させることを意味する。個人は、喫煙またはタバコ／ニコチンの使用の低減から治療上の恩恵を受け得る。喫煙または他のタバコ／ニコチン使用の低減の程度に応じて、低減の恩恵は、少なくとも約１ヶ月以上続き得る。
【００３０】
「個人」、「対象」、および「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、任意の個々の哺乳動物対象、例えば、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、またはヒトを指す。本開示の目的のために、「個人」、「対象」、または「患者」は、本開示の方法による治療の経過中に、現在、何らかの形態（例えば、喫煙、電子タバコの使用、無煙タバコの使用、間接喫煙への曝露など）でニコチンを使用、消費、摂取、または他の方法で曝露されている可能性がある。例えば、対象は、禁煙プログラムを受けている、および／またはニコチン使用を節制しているニコチンの使用者であり得る。
【００３１】
ＩＩ．ニコチン、嗜癖、および毒性
ニコチンは、タバコおよびナス科の他のメンバーを含む、数種類の植物によって作られる窒素含有化学物質である。ヒト、哺乳動物、および他のほとんどの種類の動物はニコチンに曝露されると、心拍数、心筋の酸素消費量、および一回拍出量が増加する。ニコチンの消費は、注意力の高まり、多幸感、およびリラックスしているという感覚にも関係する。しかしながら、ニコチンは嗜癖性が高い。全米心臓協会は、ニコチン（タバコの喫煙による）は、止めるのが最も困難な物質のうちの１つであり、少なくともヘロインと同じくらい困難であると述べている。
【００３２】
ニコチンの構造は以下の式Ｉに示される。
【化１】
2021526529.tif 000003
【００３３】
ニコチンは、中枢神経系（ＣＮＳ）のα４β２ニコチンコリン作動性受容体（ｎＡＣｈＲ）サブタイプのアゴニストである。このニューロンのα４β２  ｎＡＣｈＲは、ニコチン依存を媒介すると考えられる。ニコチンによる中枢ｎＡＣｈＲの刺激は、ニコチンの強化効果に重要なドーパミンを放出する。慢性的なニコチン曝露後のｎＡＣｈＲ脱感作およびその後の発現上昇は、耐性および依存性の両方で役割を果たすと考えられており、空いているニューロンα４β２  ｎＡＣｈＲ渇望症状および離脱症状を促進する。
【００３４】
ＩＩＩ．心血管系に対するニコチンの有害な影響
血管系に対するニコチンの影響は、心血管疾患の患者に有害であり、ニコチン誘発性の血管収縮または血栓形成による追加の末梢血管狭窄が、症状を触発または悪化させ得る。Ｓ−（−）−ニコチン、タバコに見られるニコチン立体異性体（＞９９％）は、末梢節後交感神経終末、自律神経節、および副腎のクロム親和性細胞上のα３β４ニコチンコリン作動性受容体サブタイプを活性化し、カテコールアミン（すなわち、エピネフリンおよびノルエピネフリン）の血流内への放出を引き起こす。循環するカテコールアミンは、血管平滑筋に位置するα−アドレナリン受容体を活性化し、血管を収縮させる。カテコールアミン誘発性α−アドレナリン受容体の刺激は、総血管末梢抵抗を増加させる。
【００３５】
ニコチンは、血管収縮に対する影響に加えて、代償性の血管弛緩を防止する。ニコチンは、おそらく活性酸素種の発生を通じて、末梢の血管弛緩に対して阻害影響を有する。ニコチンによる酸素フリーラジカルの生成が、一酸化窒素シンターゼ依存性血管反応性を損なうと考えられている。さらに、血管の内面を補強する内皮細胞には、多数のｎＡＣｈＲが存在する。ニコチンによるα７−ｎＡＣｈＲの活性化は、内皮依存性弛緩を誘発し得る。しかしながら、すべてのｎＡＣｈＲサブタイプが、アゴニストへの長期曝露後に脱感作を呈するため、ｎＡＣｈＲを媒介した内皮依存性血管弛緩は、重度のタバコ使用者である心血管疾患患者では阻害される可能性がある。ニコチンによる血管弛緩のこの累積的な阻害は、健康な対照と比較した場合、ニトログリセリン誘発性の血管拡張を損なうため、バージャー病の患者において特に重要である。
【００３６】
ニコチン誘発性の血管収縮および血管拡張障害の影響の組み合わせは、虚血性潰瘍の治癒に関係性がある。虚血性皮膚潰瘍は、四肢への血流障害およびその後の壊死の結果として、バージャー病および重症虚血患者に形成される。ニコチンは、直接的な局所血管収縮影響を有し（副腎からのカテコールアミン放出を触発する中心的な作用に加えて）、これは、タバコの喫煙または他のタバコ製品に関連する皮膚虚血性疾患の根本的な病因の一部であり得る。
【００３７】
内皮活性化は、タバコ誘発性の損傷の後に発生し、ニコチンは、内皮細胞および平滑筋細胞の組織因子発現を刺激し、それらを血栓形成促進状態に移行させる。高用量のニコチンの静脈内投与は、血栓形成中の血管壁への白血球の初期付着に重要な、内皮Ｐ−セレクチン発現の増加を伴う細動脈血栓症を増加させた。ニコチンはまた、血小板粘着性も高め、微小血管閉塞およびその後の症状の増悪のリスクを高める。
【００３８】
ニコチンが炎症を誘発または阻害するか否かについては論争があるが、多くの研究は、ニコチンが炎症誘発性であることを示唆する。バージャー病の診断的急性期病変は、血管壁のすべての層の炎症を伴い、多形核白血球、単核細胞、および時折多核巨細胞から主になる炎症性血栓に関与する。慢性的なニコチン曝露は、内皮細胞による炎症誘発性腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）分泌を増強する。バージャー病患者の血漿中にＴＮＦ−αレベルの上昇が見られ、これらの患者の内皮細胞は、血管病変がＴＮＦ−αに関連していることを示す活性化の形態学的兆候を示した。加えて、喫煙者の血漿に匹敵するレベルのニコチンは、ヒト好中球に対して走化性であり、炎症性血栓形成にさらに関係している。
【００３９】
動脈血管の正常な機能には、血圧の上昇および下降の波を発生させる心臓の正常なポンピングに応答して血管の体積を拡張および収縮するための血管の実質的な柔軟性（膨張性）が必要である。動脈の内壁を補強する内皮細胞が、ニコチンまたはＣ反応性タンパク質、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、または他の炎症性サイトカインもしくはマクロファージなどのタバコの煙により誘発される炎症性物質によって炎症を受けると、膨張性が損なわれる（Ｌｉｂｂｙ，２００７；ＭｃＥｖｏｙ  ２０１５；Ｂａｒｕａ  ２０１５；Ｌｉｕ  ２０１７）。また、時間の経過とともに、動脈の炎症は、慢性動脈アテローム性動脈硬化症の発症にも関連しており、これは臨床的に慢性末梢動脈疾患（ＰＡＤ）に進行する。ＰＡＤ対象で喫煙が維持されている場合、炎症／アテローム発生プロセスの継続は、血管の膨張性を悪化させ、重症肢虚血（ＣＬＩ）を引き起こし、最終的には冠状動脈疾患による死亡につながることもある。ニコチンまたはタバコの煙により誘発される血管の炎症を阻害する利用可能な広域スペクトルの抗炎症剤は存在しない。ゆえに、最良の医学的アプローチは、ニコチンまたはタバコの煙の炎症性薬剤への血管系の曝露を縮小または停止することである。
【００４０】
ＩＶ．心血管疾患
特定の心血管疾患は、タバコ、電子タバコ、無煙タバコ、および他のタバコ製品などの、ニコチンおよびニコチン含有製品の消費または使用に関連している。本開示の目的のために、「心血管疾患」は、ニコチンおよび／またはニコチン含有製品の使用または消費に関連する心血管疾患を指す。これらの種類の心血管疾患には、バージャー病、重症肢虚血（ＣＬＩ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、アテローム性動脈硬化疾患（例えば、心臓または脳のアテローム性動脈硬化症）が挙げられる。
【００４１】
バージャー病は、バージャー病と診断された事実上すべての対象の喫煙またはタバコ曝露に強く関係している特定の種類の末梢動脈疾患である。タバコへの曝露が何年も続くと、上肢および下肢への血流が低下するため、激しい痛みが発生する。疾患重症度および喫煙量に応じて、患者は、壊疽を発症し、その結果、指、足指、または手足のより広範囲の部分を切断する必要がある。禁煙または無煙タバコもしくは他の形態のニコチンへの曝露を終了することが、疾患の進行を停止または遅らせる唯一の方式であることが広く認識されている。そうでなければ、プロスタグランジン（強力な血管拡張薬）の静脈内注入が有益であり得るが、根本的な障害の承認された薬理学的治療は存在しない。患部への血管移植も一時的な緩和を提供し得る。
【００４２】
米国におけるバージャー病の発生率は、約４０，０００〜７０，０００人の患者であり、この障害は希少疾患と考えられている。中東、アジア、およびヨーロッパの一部では、発生率がより高い。残念ながら、バージャー病の多くの対象は、喫煙を止めることができない（喫煙が主な原因である可能性があるＣＯＰＤまたは肺癌の患者によく見られる）。
【００４３】
バージャー病の現在喫煙中の喫煙者の尿中コチニンレベルと悪化する症状増悪との相関関係を考えると、バージャー病の患者にとって、ニコチンおよびタバコ製品を避けるか、またはニコチンの末梢血管系へのアクセスを遮断する薬剤で治療することが重要である。血管収縮、血管弛緩の阻害、皮膚潰瘍治癒の障害、および血栓形成を誘発するニコチンの能力は、バージャー病の根本的な病態生理の一部であり、ゆえに、抗ニコチン剤は、禁煙または無煙タバコもしくは他の形態のニコチン摂取（例えば、電子タバコ）の使用を停止することができないバージャー病患者の治療に有益であり得る。本アプローチは、ニコチン置換療法（ＮＲＴ）を受けている患者にも有益であり得、これは、この種類の禁煙療法が依然としてニコチンの循環をもたらすためである。重要なことに、本開示の抗ニコチン剤は、末梢のニコチンを結合および／または分解し、それにより、血管収縮を媒介するｎＡＣｈＲの活性化を防止する。末梢の活性ニコチンの低減は、フリーラジカル形成も防止し、血管拡張を調節する内皮細胞上のｎＡＣｈＲの脱感作を防止する。
【００４４】
ＰＡＤは、レイノー病、ＣＬＩ、アテローム性動脈硬化症などの関連する適応症の病状を引き起こし得る、または増強し得る、動脈の血流の狭窄および低減を伴う一般的な血管状態を指す包括的な用語である。
【００４５】
タバコの禁煙または自制がこれらの心血管疾患に罹患している、またはそれを発症するリスクのある患者にとって有益であることは明らかであるが、多くはニコチンの嗜癖性のために止めることができない。本明細書に開示される方法は、本明細書に記載の抗ニコチン剤の投与が、対象がニコチン／タバコの消費を中止することができない、または中止したくない場合であっても、他の疾患（例えば、レイノー病）の中でもとりわけ、バージャー病、ＣＬＩ、ＰＡＤ、血栓形成、およびアテローム性動脈硬化疾患などの心血管疾患を治療することができるという驚くべき発見に基づく。理論に拘束されることなく、本明細書に記載の方法は、ニコチンを隔離または分解し、それによってニコチンが同族の受容体に結合すること、および／または生理学的応答（例えば、血管収縮）もしくは免疫応答（これは、バージャー病の観点から特に関連し得る）を誘発することを防止することによって、有効であり得る。
【００４６】
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ニコチンにより誘発される高血圧（例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５以上のｍｍＨｇ収縮期血圧、または５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５以上のｍｍＨｇ拡張期血圧が正常を上回る増加であり、ニコチンが存在しない場合は安静時血圧である）、ニコチンにより誘発される平均動脈圧（ＭＡＰ）の増加、ニコチンにより誘発される心拍数の上昇、およびニコチンにより誘発される血管収縮などの心血管疾患の症状または影響を軽減、改良、または排除するのに有効であり得る。さらに特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、急性もしくは慢性の炎症ならびに／または手および／もしくは足の動脈および／もしくは静脈を含む動脈および／もしくは静脈の血栓症などの心血管疾患の症状または影響を軽減、改良、または排除するのに有効であり得る。
【００４７】
Ｖ．治療に好適な他の疾患および状態
上で考察された心血管適応症以外に、本開示の組成物および方法は、喫煙ならびに／またはニコチンの使用および消費に関連する様々な疾患および状態の治療に好適であり得る。例えば、本明細書に記載のニコチンにより誘発または悪化する心血管障害に加えて、ニコチン曝露は、健康に左右される多くの身体系の機能を引き起こしたりまたは悪化させたりするために十分に確立されている。ニコチン嗜癖は、個人が喫煙を続け、他の形態のニコチンを長期間使用するように駆り立て、ニコチンの吸入、消費、摂取、または曝露に関連する根本的な病状の多くを治療することを困難にする。さらに、煙は、その発癌性の影響は別として、呼吸器系の機能を直接刺激して損なう。
【００４８】
白内障、失明（例えば、黄斑変性）、涙の過剰分泌、目の刺痛、脳卒中、ニコチン嗜癖、癌（例えば、鼻腔、副鼻腔、肺、唇、口、喉、喉頭、咽頭、気管、食道、胃、結腸、膵臓、乳房、肝臓、前立腺、膀胱、腎臓、尿管、頸部、卵巣、骨髄、急性骨髄性白血病などの癌）、慢性副鼻腔炎、嗅覚障害、歯周病、歯の衰退、味覚障害、難聴、耳感染、急性または慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、呼吸器感染症の悪化（結核、肺炎、インフルエンザ）、喘息の悪化、慢性咳嗽、息切れ、痰の過剰生成、腹部大動脈瘤、消化性潰瘍（食道、胃、上部消化管）、受精能低下、インポテンス、早期卵巣不全、早期閉経、痛みを伴う月経、レイノー病、循環不良、しわ、早期老化、皮膚の色の喪失、骨粗しょう症、骨折（例えば、股関節、膝、および脊椎の骨折）、関節リウマチ、腰痛、創傷治癒障害、術後回復不良、脚痛、足の冷え、壊疽、深部静脈血栓症、感染に対する抵抗障害、アレルギー性障害のリスクの増加、糖尿病のリスクの増加、糖尿病性腎症、糖尿病性皮膚潰瘍、糖尿病性循環障害、神経障害、糖尿病性網膜障害、糖尿病関連潰瘍、血管炎、切断、および突然死は、ニコチンによって引き起こされるか、または悪化する追加の疾患／障害である。
【００４９】
これらの疾患／状態のうち、本開示の方法は、ニコチンの使用者における本開示の抗ニコチン剤の血管拡張効果の結果として、創傷治癒および外科的回復を改善するため、ならびに糖尿病および糖尿病合併症を治療するために特に有用である。本開示の抗ニコチン剤の投与は、循環中のニコチンを分解または隔離し、それにより、血管収縮を防止し、系統にニコチンを有する個人（例えば、喫煙者）における循環および血流を改善する。創傷または外科的部位への血流を増加させると、治癒が促進され、患者の転帰が改善され、四肢に循環問題のある糖尿病患者にも同様の恩恵が得られる。
【００５０】
ＶＩ．ニコチン分解酵素
一態様では、本開示の方法で使用される抗ニコチン剤は、ニコチン分解酵素である。ニコチン分解酵素の例には、野生型ＮｉｃＡ２酵素配列番号１、およびニコチンを分解するその変異体が含まれ、その例を以下の表１に記載する。いくつかの実施形態では、変異体は、野生型酵素と比べて、変異体のニコチン分解活性を増加させ、および／または免疫原性を減少させる、配列番号１に対する少なくとも１つの置換、付加、または欠失を有する。
【００５１】
ＮｉｃＡ２（ニコチンオキシドレダクターゼ、ＰＰＳ＿４０８１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＥＪ１４６２０．１）は、シュードモナス・プチダＳ１６株から単離された。例えば、Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ，９（１０）：ｅ１００３９２３（２０１３）を参照されたい。ＮｉｃＡ２の活性は、Ｓ１６によるニコチン分解の最初の重要な工程であり、ニコチンのＮ−メチルミオスミンへの酸化を触媒する。それは、ニコチンを分解する役割を担うシュードモナス・プチダＳ１６代謝カスケードの必須酵素であると報告されている。野生型ＮｉｃＡ２酵素の構造分析は、Ｔａｒａｒｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：６５９５−９８（２０１６）に報告されている。
【００５２】
上記のように、いくつかの実施形態では、改善された活性および／または減少した免疫原性を有する野生型ＮｉｃＡ２酵素の変異体が使用される。いくつかの実施形態では、変異体は、野生型ＮｉｃＡ２の約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、または約９９パーセントのアミノ酸同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示の変異体は、野生型ＮｉｃＡ２と約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、または約９９パーセントの相同性を共有し得る。野生型ＮｉｃＡ２およびそれらの例示的な変異体のアミノ酸配列を以下の表１に記載する。本開示の変異体は、Ｃ末端にリンカーおよびＨｉｓタグ（ＧＧＧＧＳＧＳＧＨＨＨＨＨＨ、配列番号５１）を用いて生成され、これをその後除去した。Ｈｉｓタグは、変異体の精製を補助するために使用されたが、Ｈｉｓタグを必要としない他の精製手段または精製方法もまた使用され得る。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【００５３】
上記のように、ニコチン分解酵素変異体は、野生型ＮｉｃＡ２と比べて、ニコチン分解活性の増加および／または免疫原性の減少を呈し得る。変異体は、１つ以上の欠失、付加、または置換を含む、野生型ＮｉｃＡ２のアミノ酸配列に対する１つ以上の突然変異を含み得る。置換変異は、「保存的」または「非保存的」であり得る。「保存的」とは、同じアミノ酸ファミリー内の置換を指し、「非保存的」とは、アミノ酸ファミリー全体にわたる置換を指す。アミノ酸のファミリーならびにそれに対する「保存的」および「非保存的」置換は当該技術分野において知られている。例えば、天然に存在するアミノ酸は、以下の４つのファミリーに分けることができ、それらのファミリー内で保存的置換が起こり、一方、異なるファミリーにわたって非保存的置換が起こる。
（１）塩基性側鎖を有するアミノ酸：リジン、アルギニン、ヒスチジン。
（２）酸性側鎖を有するアミノ酸：アスパラギン酸、グルタミン酸
（３）非荷電極性側鎖を有するアミノ酸：アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン。
（４）非極性側鎖を有するアミノ酸：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、そのニコチン分解活性に関連する野生型ＮｉｃＡ２酵素の活性部位に、表２に列挙される位置における１つ以上の保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失などの、配列番号１のアミノ酸残基９０〜９３、９５、１０２〜１０９、１１３、１１６、１３０、１３２、１３８、１５５、１５９、２１０、２１３〜２１５、２１７〜２２０、２３４、２４５、２４６、２４８〜２５１、２５３、２５４、２５８、３３４、３３６、３３９〜３４２、３５３、３５５、３６３〜３６７、３７８〜３８２、４１５〜４１８、４２３〜４２９、４５９〜４６３、４６５、または４６６のうちのいずれか１つから選択される１つ以上の位置での突然変異などの、１つ以上の突然変異を含む。表２で同定されたシェル１残基は、空洞表面を構成するが、シェル２残基は、シェル１と接触する。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のニコチン分解酵素変異体は、配列番号１のアミノ酸位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、または４６３に少なくとも１つの置換を含み得る。いくつかの実施形態では、変異体は、１、２、または３つ以上の置換を含み得る。
【表２−１】
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【表２−２】
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【００５５】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解活性を増加させるか、または酵素の触媒活性を増加させる少なくとも１つの突然変異が変異体に導入され、変異体がより迅速および／またはより効率的にニコチンを分解することを可能にする。いくつかの実施形態では、そのような突然変異は、ｋｃａｔの増加、ＫＭの低下、ｋｃａｔ／ＫＭの増加、および／またはＶｍａｘの増加を含むがこれらに限定されない、酵素性能の様々な尺度を改善し得る。したがって、いくつかの実施形態では、変異体は、野生型ＮｉｃＡ２もしくは野生型ＮＯＸ酵素の活性部位に、および／または芳香族ケージに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個以上の突然変異を含み得、野生型ＮｉｃＡ２酵素と比べて、ｋｃａｔの増加、ＫＭの低下、ｋｃａｔ／ＫＭの増加、および／またはＶｍａｘの増加によって測定されるようなニコチン分解活性の増加を呈する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、配列番号１の位置４２７のトリプトファンおよび位置４６２のアスパラギンによって形成される野生型ＮｉｃＡ２酵素の芳香族ケージに、１つ以上の保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失など、これらの位置のうちの１つ以上における突然変異などの１つ以上の突然変異を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ニコチン分解活性を増加させる突然変異は、配列番号１の位置４２７もしくは４６２のうちの１つ以上における保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失など、配列番号１の位置４２７もしくは４６２のうちの１つ以上にある。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解活性を増加させる突然変異は、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、または４６３のうちの１つ以上における、保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失などの、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、または４６３のうちの１つ以上で発生する突然変異である。例示的な置換変異を表１に示し、本開示の変異体は、表１、２、または３に開示された置換のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つを含み得る。追加的または代替的に、本開示の変異体は、以下で考察されるように、Ｃ末端またはＮ末端の欠失も含み得る。
【００５８】
追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、これらの領域のうちの１つ以上における１つ以上の保存的置換、非保存的置換、付加、もしくは欠失などの、配列番号１の位置１６〜２４、７３〜８１、２５８〜２６６、３０２〜３１０、３７３〜３８１、もしくは４４７〜４５５から選択される免疫原性Ｔ細胞エピトープ内の１つ以上の突然変異など、配列番号１の位置１０〜３２、６８〜９４、１８９〜２２５、２４８〜２８５、２９６〜３２７、３３６〜３９１、もしくは４３５〜４５９から選択される領域内の免疫原性Ｔ細胞エピトープ内の１つ以上の突然変異など、免疫原性Ｔ細胞エピトープ中に１つ以上の突然変異を含む。したがって、いくつかの実施形態では、変異体は、１、２、３、４、５、６、または７つの免疫原性Ｔ細胞エピトープ中に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上の突然変異を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような変異体は、哺乳動物対象に投与されたときに低減された免疫原性を呈する。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、すべての配列およびそれらの組み合わせを含む、配列番号１の７４、７７、７８、８０、２６２〜２６６、３０３、３０４、３０６、３１０、３７４、３７７、３７８、３８２、３８３、４５０〜４５２、または４５７から選択される１つ以上の位置における免疫原性Ｔ細胞エピトープ中の突然変異を含む。例えば、変異体は、エピトープＢ中の例示的な突然変異のうちの１つ以上、エピトープ１中の例示的な突然変異のうちの１つ以上、エピトープ２中の例示的な突然変異のうちの１つ以上、エピトープ３中の例示的な突然変異のうちの１つ以上、および／またはエピトープ４中の例示的な突然変異のうちの１つ以上を含む、以下に記載の突然変異のうちの任意の１つ以上を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素は、配列番号１の位置２６２および／または２６３に、Ｉ２６２Ａ置換もしくはＩ２６２Ｔ／Ｎ２６３Ｒ置換などのアミノ酸置換を有し得る。
【表３】
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【００６０】
追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、配列番号１の１〜５２のアミノ酸残基のＮ末端欠失を含む。例えば、いくつかの実施形態では、変異体は、配列番号１のアミノ酸残基１〜１６、１〜２５、１〜３８、１〜５０、１〜５１、または１〜５２のＮ末端欠失を含む。したがって、本開示の変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、または５２個の連続するアミノ酸のＮ末端欠失を含み得る。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本開示の変異体は、追加的または代替的に、ペプチドのＣ末端に欠失を含み得る。例えば、本開示の変異体は、ペプチドのＣ末端に１つ以上のアミノ酸の欠失を含み得る。例えば、ＮｉｃＡ２変異体では、野生型配列のＳ４８２に対応するアミノ酸を欠失させることができる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、野生型ＮｉｃＡ２酵素（配列番号１）、または配列番号１の最大５２個のＮ末端アミノ酸残基の欠失を有するそのＮ末端欠失変異体と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のニコチン分解酵素変異体は、配列番号５〜１０であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のニコチン分解酵素変異体は、表１に開示される変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の変異体は、野生型ＮｉｃＡ２酵素と比べて、ニコチン分解活性の増加を呈し、その活性は、ＡＭＰＬＥＸ（登録商標）Ｒｅｄアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などのアッセイによって決定される場合、野生型ＮｉｃＡ２酵素の活性よりも、少なくとも約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％、約２１０％、約２２０％、約２３０％、約２４０％、約２５０％、約２６０％、約２７０％、約２８０％、約２９０％、約３００％、約３１０％、約３２０％、約３３０％、約３４０％、約３５０％、約３６０％、約３７０％、約３８０％、約３９０％、約４００％、約４１０％、約４２０％、約４３０％、約４４０％、約４５０％、約４６０％、約４７０％、約４８０％、約４９０％、約５００％、約５５０％、約６００％、約６５０％、約７００％、約７５０％、約８００％、約８５０％、約９００％、約９５０％、約１０００％、約１１００％、約１２００％、約１３００％、約１４００％、約１５００％、約１６００％、約１７００％、約１８００％、約１９００％、約２０００％、約２２５０％、約２５００％、約２７５０％、約３０００％、約３２５０％、約３５００％、約３７５０％、約４０００％、約４２５０％、約４５００％、約４７５０％、または約５０００％以上である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の変異体は、野生型ＮｉｃＡ２酵素と比べて、ニコチン分解活性の増加を呈し、その活性は、緩衝液またはラット血清のいずれか中に３７℃で固定濃度の酵素とインキュベートし、固定時点でＭｅＯＨと混合することによって活性をクエンチした後に、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ；Ｈｉｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．：Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔｓ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｂｒａｉｎ．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１４３，１５０−１５７，１９９９）を使用して残留ニコチン濃度を測定するアッセイによって決定される場合、野生型ＮｉｃＡ２酵素の活性よりも、少なくとも約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％、約２１０％、約２２０％、約２３０％、約２４０％、約２５０％、約２６０％、約２７０％、約２８０％、約２９０％、約３００％、約３１０％、約３２０％、約３３０％、約３４０％、約３５０％、約３６０％、約３７０％、約３８０％、約３９０％、約４００％、約４１０％、約４２０％、約４３０％、約４４０％、約４５０％、約４６０％、約４７０％、約４８０％、約４９０％、約５００％、約５５０％、約６００％、約６５０％、約７００％、約７５０％、約８００％、約８５０％、約９００％、約９５０％、約１０００％、約１１００％、約１２００％、約１３００％、約１４００％、１５００％、約１６００％、約１７００％、約１８００％、約１９００％、約２０００％、約２２５０％、約２５００％、約２７５０％、約３０００％、約３２５０％、約３５００％、約３７５０、約４０００％、約４２５０％、約４５００％、約４７５０％、または約５０００％以上である。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の変異体は、野生型ＮｉｃＡ２と比べて、哺乳動物対象において免疫原性の減少を呈し、それは、野生型ＮｉｃＡ２酵素よりも、少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％未満、免疫原性が低い。別段特定されない限り、本明細書で使用される野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較した場合の「免疫原性の減少」とは、インシリコアプローチ、インビトロアッセイ、インビボ研究（例えば、遺伝子組み換え動物を使用する）、ヒトＴ細胞を使用したエクスビボ研究、またはヒト対象を用いた臨床研究のうちの１つ以上によって示される、免疫原性の減少を指す。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素またはその変異体は、インビボ（投与後）でのその半減期を延長するために修飾されている、長時間作用型酵素である。ペプチドの循環半減期を延長するための様々な技術が当該技術分野において知られている。例えば、いくつかの実施形態では、酵素は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または半減期を引き延ばす類似のポリマーに接合される。ＰＥＧを、本開示のニコチン分解酵素またはその変異体に接合させることにより、変異体の薬物動態特性を改善することができる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化は、変異体の１つ以上の免疫原性エピトープをマスキングすること、変異体特異的抗体力価を減少させること、ならびにＴ細胞増殖および／またはサイトカイン応答を弱めることから選択される１つ以上の効果を有する。追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、変異体をＰＥＧに接合しても、ニコチン分解酵素変異体の酵素活性を減少させないか、または酵素活性を有意に減少させないか、あるいは酵素活性を排除しない。
【００６８】
以下の実施例に例示されるように、ＰＥＧ鎖の長さおよび構造（すなわち、直鎖状対分岐状）を選択および変動させて、異なる特性に影響を及ぼし、付与し、または促進することができる。ＰＥＧは、以下の実施例に例示されているものを含む、ＰＥＧをタンパク質に接合するための既知の方法によって変異体に接合され得る。本明細書に記載の変異体のうちのいずれも、例えば、配列番号１〜１０のうちのいずれかによって定義されるか、またはこれを含む変異体を含めて、ＰＥＧ化することができる。本開示の酵素変異体にＰＥＧを接合する目的のために、ＰＥＧポリマーのサイズまたは長さは変動し得る。例えば、本開示の酵素変異体に接合された直鎖状ＰＥＧは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｋＤａなど、１〜５０ｋＤａ、５〜４０ｋＤａ、または１０〜２０ｋＤａの範囲であり得る。加えて、ＰＥＧポリマーは、２０、４０、６０、または８０ｋＤａなど、２０〜８０ｋＤａの範囲のサイズで分岐してもよい。
【００６９】
いくつかの実施形態では、酵素またはその変異体は、アルブミン結合ペプチド、アルブミン結合タンパク質ドメイン、ヒト血清アルブミン、または不活性ポリペプチドと融合される。ペプチドの循環半減期を増加させるために使用されてきた例示的な不活性ポリペプチドには、ＸＴＥＮ（登録商標）（組換えＰＥＧまたは「ｒＰＥＧ」としても知られる）、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ、ＨＡＰ化）、プロリン−アラニンセリンポリマー（ＰＡＳ、ＰＡＳ化）、またはエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ、ＥＬＰ化）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「に融合される」とは、直接のまたはリンカーを介した遺伝子融合を含み、別段特定されない限り、複数のドメインを含む単一のポリペプチドをもたらす。
【００７０】
本明細書に開示されるように使用されるニコチン分解酵素は、以下でより詳細に考察されるように、意図された投与経路による標的対象への投与に好適な医薬組成物に製剤化され得る。
【００７１】
ＶＩＩ．ニコチン結合抗体
いくつかの実施形態では、抗ニコチン剤は、ニコチン結合抗体、そのニコチン結合断片、またはニコチンに結合することができる関連構築物である。便宜上、これらの薬剤は、本明細書では集合的に「ニコチン結合抗体」と呼ばれる。
【００７２】
抗ニコチン抗体は、主に禁煙を促進する目的で以前に開発された。例えば、ＷＯ２００２／０５８６３５；ＷＯ２０００／０３２２３９；ＷＯ２００３／０８２３２９；米国特許出願公開第２００６／１１１２７１号；米国特許第８，３４４，１１１号；米国特許第８，２３２，０７２号；米国特許第６，２３２，０８２号；米国特許第７，５４７，７１２号；米国特許第７，４４６，２０５号；およびＣａｒｒｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｔｔｅｎｕａｔｅ  ｔｈｅ  ｐｓｙｃｈｏａｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ，”Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １２（３）：５６３−７０（２００４）を参照されたい。これらの特許、出願、および非特許文献は、ニコチン結合抗体断片を含む抗ニコチン抗体および関連構築物に関連する範囲まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７３】
ニコチン結合抗体を開発する目的のために、ニコチンは、免疫原性タンパク質などの免疫原性担体に結合して、免疫応答を惹起し、ニコチン結合抗体の生成を誘発する。抗体を作製するための一般的な技術を用いることができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：５１１−５１９（１９７６）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ＩＭＭＵＮＯＢＩＯＬＯＧＹ，５ｔｈ  Ｅｄ．，ＧａｒｌａｎｄＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ（２００１）を参照されたい。
【００７４】
本開示の方法において有用な抗ニコチン抗体は、インビトロ源（例えば、ハイブリドーマまたは組換え的に抗体を生成する細胞株）およびインビボ源（例えば、げっ歯類、ウサギ、ヒトなど）を含む任意の手段によって得ることができる。ヒト、部分的ヒト化、完全ヒト化、およびキメラ抗体は、１つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子が１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子で置き換えられたトランスジェニック動物（例えばマウス）を使用するなど、当該技術分野で知られている方法によって作製され得る。内因性抗体遺伝子がヒト抗体遺伝子で効果的に置換されたトランスジェニックマウスの例には、ＨＵＭＡＢ−ＭＯＵＳＥ（商標）、Ｋｉｒｉｎ  ＴＣ  ＭＯＵＳＥ（商標）、およびＫＭ−ＭＯＵＳＥ（商標）が含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３（９）：１１１７−２５（２００５）、およびＬｏｎｂｅｒｇ，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１８１：６９−９７（２００８）を参照されたい）。
【００７５】
本明細書に開示される方法で有用なニコチン結合抗体は、モノクローナルおよび／または組換え体であり得る。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、当該技術分野で知られている方法、例えば抗体産生細胞を不死化細胞と融合してハイブリドーマを得ることによって、ならびに／または、コンビナトリアル抗体ライブラリー技術を使用して免疫化動物の骨髄、Ｂ細胞、および／もしくは脾臓細胞から抽出されたｍＲＮＡからｍＡｂを生成することによって、ならびに／または、ニコチン抗原で免疫化された対象からの血清からモノクローナル抗体を単離することによって得ることができる。組換え抗体は、当該技術分野で知られている方法によって、例えば、ファージディスプレイ技術、酵母表面ディスプレイ技術（Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．，１（２）：７５５−６８（２００６））、哺乳動物細胞表面ディスプレイ技術（Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０５（３８）：１４３３６−４１（２００８）、および／または抗体ポリペプチドの発現もしくは共発現を使用して得ることができる。抗体を作製するための他の技術は当該技術分野で知られており、本明細書に記載の方法において使用される抗体を得るために使用され得る。
【００７６】
典型的には、抗体は、重（Ｈ）鎖ポリペプチドの２つの同一コピーおよび軽（Ｌ）鎖ポリペプチドの２つのコピーの４つのポリペプチドで構成される。典型的には、各重鎖は、１つのＮ末端可変（ＶＨ）領域、ならびに３つのＣ末端定常（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）領域を含み、各軽鎖は、１つのＮ末端可変（ＶＬ）領域および１つのＣ末端定常（ＣＬ）領域を含む。軽鎖および重鎖の各ペアの可変領域は、抗体の抗原結合部位を形成する。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「抗体断片」および「ニコチン結合断片」という用語は、ニコチンに結合する能力を呈するニコチン結合抗体の１つ以上の部分を指す。結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片）；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片（ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含む）；（ｉｖ）Ｆｖ断片（抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを含む）、（ｖ）ｄＡｂ断片（ＶＨドメインを含む）；（ｖｉ）分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えばＶＨＣＤＲ３が挙げられる。他の例には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）構築物が挙げられる。例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−８３（１９８８）を参照されたい。他の例には、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合したニコチン結合ドメインポリペプチド（例えば、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、またはリンカーペプチドを介して軽鎖可変領域に融合した重鎖可変領域）、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、および（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域が挙げられ、ヒンジ領域は、二量化を防止するために、１つ以上のシステイン残基を、例えばセリン残基で置き換えることにより修飾されてもよい。例えば、米国特許出願第２００３／０１１８５９２号、米国特許出願第２００３／０１３３９３９号を参照されたい。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法で使用されるニコチン結合抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体またはヒトＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、ニコチン結合抗体は、哺乳動物、ヒト、ヒト化、またはキメラである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように使用されるニコチン結合抗体は、治療状況において抗体をより好適にする１つ以上の突然変異を含む。
【００７９】
例示的なＩｇＧ１ニコチン結合抗体の重鎖および軽鎖配列は、以下の表４に開示される。例示的なＩｇＧ４ニコチン結合抗体の重鎖および軽鎖配列は、以下の表５に開示される。
【表４−１】
2021526529.tif 000013
【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【表５−８】
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【００８０】
表４および５に開示された抗体のうちの１つ以上と同じＣＤＲ配列および／または同じフレームワーク領域配列および／または同じ可変領域配列を含むニコチン結合抗体およびそのニコチン結合断片も、本明細書に開示される方法において有用である。これに関して、表４および５に開示されたニコチン結合抗体は、それぞれＩｇＧ１およびＩｇＧ４抗体であるが、本開示の範囲内の他のニコチン結合抗体は、例えば、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、ＩｇＨ、または、ＩｇＭであってもよい。
【００８１】
ヒト免疫グロブリンＩｇＧ４抗体は、ここでのようにエフェクター機能の低下が望ましい場合、抗体ベースの治療に適している。しかしながら、ＩｇＧ４抗体は、Ｆａｂアーム交換（ＦＡＥ）として知られるプロセスを生じ得る動的分子である。例えば、Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ＩｇＧ４  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｅｎｇａｇｅ  ｉｎ  Ｆａｂ−ａｒｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ４  ｉｎ  ｖｉｖｏ，ＮＡＴＵＲＥ  ＢＩＯＴＥＣＨ２７（８）：７６７−７１（２００９）を参照されたい。これにより、機能的に一価である特異性不明の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）が得られ、したがって治療有効性が低下する可能性がある。ＦＡＥは、抗体のヒンジ領域にＳ２２８Ｐ突然変異を導入することで防止することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように使用されるニコチン結合抗体は、Ｓ２２８Ｐ置換を含む。表５に開示されている抗体は、そのようなＳ２２８Ｐ置換を含む。他の実施形態では、本明細書に開示されるように使用されるニコチン結合抗体は、Ｓ２２８Ｐ置換を含まない。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように使用されるニコチン結合抗体は、前述のＳ２２８Ｐ置換を超える１つ以上の追加または代替の置換、挿入、または欠失を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のニコチン結合抗体は、少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の、それぞれ表４および表５に開示された重鎖および軽鎖配列のうちの１つ以上に対して同一性を有する重鎖および軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、本開示のニコチン結合抗体は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の、それぞれ表４および表５に開示された重鎖および軽鎖配列のうちの１つ以上に対して同一性を有する重鎖および軽鎖を含む。
【００８３】
ニコチンには、Ｓ−（−）−ニコチンおよびＲ−（＋）−ニコチンの２つのエナンチオマーがあり、Ｓ−エナンチオマーが最も生理学的に活性であることが知られている。いくつかの実施形態では、本開示のニコチン結合抗体は、一方のエナンチオマーに対して他方よりも選択性を呈する。例えば、いくつかの実施形態では、ニコチン結合抗体は、Ｒ−（＋）−ニコチンに結合するよりも高い親和性でＳ−（−）−ニコチンに選択的に結合するが、いくつかの実施形態では、ニコチン結合抗体は、Ｓ−（−）−ニコチンに結合することができ、Ｒ−（＋）−ニコチンに実質的に結合しない。例えば、８Ｄ１−ＩｇＧ４および１２Ｆ５−ＩｇＧ４は、Ｓ−（−）−ニコチンに優先的に結合する。この点に関して、８Ｄ１−ＩｇＧ４は、９２ｎＭのＲ−（＋）−ニコチンに対するＫＤを有し、１２Ｆ５−ＩｇＧ４は、１．２μＭのＲ−（＋）−ニコチンに対するＫＤを有する。これらの開示された抗体は、米国特許第８，３４４，１１１号およびＴａｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，４１５：１１８−１２７（２０１２）に開示されているＮｉｃ１２  ｍＡｂなどの以前に説明されたニコチン結合抗体について以前に報告されたものよりも高いＳ−（−）−ニコチンに対する結合親和性および選択性を呈する。代替として、いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるように使用されるニコチン結合抗体は、Ｓ−（−）−ニコチンに結合するよりも高い親和性でＲ−（＋）−ニコチンに選択的に結合することができるが、いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるように使用されるニコチン結合抗体は、Ｒ−（＋）−ニコチンに結合することができ、Ｓ−（−）−ニコチンに実質的に結合しない。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるように使用されるニコチン結合抗体は、同等の親和性でニコチンの両方のエナンチオマーに結合し得る。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるように使用されるニコチン結合抗体は、ニコチン（一方または両方のエナンチオマー）に対して強い結合親和性を、また処置されている対象に存在し得る他の分子に対して比較的弱い結合親和性を有し、これは、ニコチン、ニコチンの代謝産物もしくは副産物（例えばコチニン）に化学的および／もしくは構造的に関連する分子、ニコチン性受容体のリガンドである、もしくはニコチン受容体に結合する分子、禁煙を支援するため（例えばブプロピオン、バレニクリン、および／もしくはシチシン）、ならびに／またはニコチン嗜癖および／もしくはニコチン毒性を処置するために使用される薬物（例えば小分子薬物）、ならびに／または神経伝達物質を含む対象の血液中に存在し得る他の内因性もしくは外因性分子、ならびに対象の状態を診断もしくは処置するために、または通常の生理学を維持もしくは支援するために投与され得る他の分子を含む。換言すれば、いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるように使用されるニコチン結合抗体は、ニコチンではない分子、すなわち「標的外化合物」と交差反応しない。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるように使用されるニコチン結合抗体または断片は、インビボ（投与後）でのその半減期を延長するために修飾された長時間作用型変異体である。抗体などのペプチドの循環半減期を延長するための様々な技術が当該技術分野において知られている。例えば、いくつかの実施形態では、抗体は、「ＹＴＥ」（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）（例えばＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２８１：２３５１４−２４（２００６）を参照されたい）、またはＸｅｎｃｏｒの「Ｘｔｅｎｄ」Ｆｃドメイン変異（ＵＳ２０１４／００５６８７９Ａ１）などのＦｃＲｎ媒介リサイクリングが強化されたＦｃ領域に突然変異を有する。他の実施形態では、抗体またはその断片は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ；すなわち、抗体がＰＥＧ化されている）または半減期を延長する同様のポリマーに接合されている。いくつかの実施形態では、抗体は、アルブミン結合ペプチド、アルブミン結合タンパク質ドメイン、ヒト血清アルブミン、または不活性ポリペプチドに融合される。ペプチドの循環半減期を増加させるために使用されてきた例示的な不活性ポリペプチドには、ＸＴＥＮ（登録商標）（組換えＰＥＧまたは「ｒＰＥＧ」としても知られる）、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ、ＨＡＰ化）、プロリン−アラニンセリンポリマー（ＰＡＳ、ＰＡＳ化）、またはエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ、ＥＬＰ化）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「に融合される」とは、直接のまたはリンカーを介した遺伝子融合を含み、別段特定されない限り、多数のドメインを含む単一のポリペプチドをもたらす。
【００８６】
本明細書で開示されるように使用されるニコチン結合抗体またはそのニコチン結合断片は、以下でより詳細に考察されるように、意図された投与経路による標的対象への投与に好適な医薬組成物に製剤化され得る。
【００８７】
ＶＩＩＩ．医薬組成物
本明細書に記載の方法での使用に好適な医薬組成物は、上記で開示された抗ニコチン剤および薬学的に許容される担体または希釈剤で製剤化され得る。
【００８８】
組成物は、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、経口、経鼻、経肺、眼内、経膣、または経直腸投与用に製剤化され得る。いくつかの実施形態では、ニコチン結合抗体は、溶液、懸濁液、乳濁液、リポソーム製剤などの中で、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素は、溶液、懸濁液、乳濁液、リポソーム製剤などの中で、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、抗ニコチン剤は、注射または注入による投与用に製剤化され得る。
【００８９】
医薬組成物は、当該技術分野で知られている技術を使用して、即時放出組成物、持続放出組成物、遅延放出組成物などであるように製剤化され得る。
【００９０】
様々な剤形のための薬学的に許容される担体が、当該技術分野において知られている。例えば、固形製剤用の賦形剤、潤滑剤、結合剤、および崩壊剤が知られており（経口固形剤形などが知られている）、液体製剤用の溶媒、可溶化剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤、および無痛化剤が知られている。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１つ以上の防腐剤、酸化防止剤、着色剤、甘味料／着香料、吸着剤、湿潤剤などの１つ以上の追加の成分を含む。
【００９１】
ＩＸ．心血管疾患を治療するまたは循環を改善する方法
上記のように、本明細書に記載の心血管疾患を治療するまたは循環を改善する方法は、それを必要とする哺乳動物対象に、上記に開示されたニコチン結合抗体もしくはそのニコチン結合断片またはニコチン分解酵素もしくはその変異体などの抗ニコチン剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、抗ニコチン剤を含む医薬組成物を投与することを含む。
【００９２】
理論に拘束されることなく、本開示の方法が、ニコチンの生理学的／薬理学的作用を遮断、中和、および／または排除することによって機能すると考えられている。換言すれば、本開示の方法は、ニコチン性受容体に拮抗するのではなく、「リガンド標的化」アプローチ（すなわち、ニコチンの結合／隔離または分解／除去）を反映している。これにより、所与のニコチン性受容体またはサブタイプに対する特異性を有する小分子アンタゴニストとは対照的に、すべてのニコチン性受容体に対するニコチンの作用が遮断される。したがって、本開示の方法は、小分子ニコチン受容体アンタゴニストに基づく以前のアプローチよりも効率的かつ幅広く機能する。
【００９３】
典型的な実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、バージャー病、重症肢虚血、末梢動脈疾患、血栓形成、およびアテローム性動脈硬化疾患などの、喫煙またはニコチンの使用もしくはニコチンへの曝露に特に関連する心血管疾患に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、バージャー病、重症肢虚血、および末梢動脈疾患などの、喫煙に特に関連する心血管疾患を発症するリスクがある。
【００９４】
いくつかの実施形態では、対象は、ある種のタバコの使用者／ニコチンの消費者、例えば、タバコ喫煙者または電子タバコの使用者（総称して「喫煙者」と呼ばれる）である。喫煙はタバコの消費の最も一般的な形態であるが、無煙タバコの消費は、バージャー病、重症肢虚血、および末梢動脈疾患などの心血管疾患の発症に関連している。上記のように、本明細書に開示される方法は、対象がタバコ／ニコチン製品の消費を中止していない場合でも、バージャー病、重症肢虚血、および末梢動脈疾患などの心血管疾患を治療するのに有効である。いくつかの実施形態では、対象は、現在進行中の喫煙者／ニコチン製品の使用者であり、積極的に消費を止めるまたは低減することを試みている場合であるかまたはそうでない場合もある。いくつかの実施形態では、対象は、ニコチン製品の元喫煙者／使用者である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本開示の治療方法は、対象が心血管疾患のために受けている唯一の医薬治療である。他の実施形態では、対象は、心血管疾患の症状および／または影響に対処するために、別の薬理学的な薬剤で治療され得る。例えば、いくつかの実施形態では、対象は、抗血小板薬、血栓溶解剤、またはシロスタゾールで以前に、同時に、またはその後に治療され得る。いくつかの実施形態では、対象は、血管または血管内手術（例えば、血管形成術、アテローム切除術、血管バイパス術、または血栓切除術）および／または手足の切断術を受けたことがあるか、または受けた可能性がある。
【００９６】
いくつかの実施形態では、対象は、ニコチンの血漿レベルを低下させる、および／またはバージャー病、重症肢虚血、末梢動脈疾患、もしくはアテローム性動脈硬化疾患など心血管疾患のうちの１つ以上の症状もしくは影響を軽減、改良、もしくは排除するのに有効な量などの、治療有効量の抗ニコチン剤を投与される。本明細書に記載の方法によって軽減、改良、または排除され得る心血管疾患の症状または影響の例として、高血圧、高心拍数、および血管収縮が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の方法によって軽減、改良、または排除され得る心血管疾患の他の特定の症状または影響には、手および／足の動脈および／または静脈を含む動脈および／または静脈の急性または慢性の炎症および／または血栓症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
いくつかの実施形態では、対象は、ニコチンの血漿レベルを低下させる、ならびに／または白内障、失明（例えば、黄斑変性）、涙の過剰分泌、目の刺痛、脳卒中、ニコチン嗜癖、癌（例えば、鼻腔、副鼻腔、肺、唇、口、喉、喉頭、咽頭、気管、食道、胃、結腸、膵臓、乳房、肝臓、前立腺、膀胱、腎臓、尿管、頸部、卵巣、骨髄、急性骨髄性白血病などの癌）、慢性副鼻腔炎、嗅覚障害、歯周病、歯の衰退、味覚障害、難聴、耳感染、急性または慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、呼吸器感染症の悪化（結核、肺炎、インフルエンザ）、喘息の悪化、慢性咳嗽、息切れ、痰の過剰生成、腹部大動脈瘤、消化性潰瘍（食道、胃、上部消化管）、受精能低下、インポテンス、早期卵巣不全、早期閉経、痛みを伴う月経、レイノー病、循環不良、しわ、早期老化、皮膚の色の喪失、骨粗しょう症、骨折（例えば、股関節、膝、および脊椎の骨折）、関節リウマチ、腰痛、創傷治癒障害、術後回復不良、脚痛、足の冷え、壊疽、深部静脈血栓症、感染に対する抵抗障害、アレルギー性障害のリスクの増加、糖尿病のリスクの増加、糖尿病性腎症、糖尿病性皮膚潰瘍、糖尿病性循環障害、神経障害、糖尿病性網膜障害、糖尿病関連潰瘍、血管炎、切断、および突然死などの非心血管疾患のうちの１つ以上の症状または影響を軽減、改良、または排除するのに有効な量などの、治療有効量の抗ニコチン剤を投与される。
【００９８】
本開示の方法は、治療有効量の抗ニコチン剤（例えば、ニコチン結合抗体、ニコチン分解酵素、またはそれを含む医薬組成物）を対象に投与することを伴い得る。いくつかの実施形態では、方法は、インビボで抗体または酵素を発現する構築物において、抗ニコチン剤をコードする（例えば、本開示のニコチン結合抗体またはニコチン分解酵素のうちの１つをコードする）核酸を投与することを含む。例えば、そのような実施形態では、核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子導入ベクターなどの好適なベクター中に提供され得る。そのような方法での使用に好適な他の例示的なベクターは、当該技術分野において知られている。例えば、Ｌｕｋａｓｈｅｖ  ａｎｄ  Ｚａｍｙａｔｎｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８１（７）：７００−８（２０１６）を参照されたい。例示的なベクターは、１つ以上のエンハンサー（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー）、プロモーター（例えば、ニワトリβ−アクチンプロモーター）、および／または発現カセットの特性を増強する他の要素を含み得る。好適なベクターを作製する方法およびインビボで発現ベクターを使用する一般的な方法は当該技術分野において知られている。例えば、Ｈｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，４（１４０）：１４０ｒａ８７（２０１２）を参照されたい。したがって、いくつかの態様では、本明細書に提供されるのは、ニコチン結合抗体およびまたはニコチン分解酵素を、それを必要とする対象においてインビボで発現する方法であり、対象に、抗ニコチン抗体またはニコチン分解酵素インビボで発現することができる治療有効量の発現ベクターを投与することを含む。
【００９９】
投与される特定の量は、対象によるニコチン消費量およびパターン、対象の年齢および／または体重、治療されている特定の状態（例えば、バージャー病対重症肢虚血）、治療されている状態の重症度、ならびに根本的な病態生理の局在化（例えば、脚の末梢動脈疾患対腎臓の末梢動脈疾患）のうちの１つ以上に依存し得る。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ニコチン結合抗体は、約１０〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約８５０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約７５０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ〜約６５０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ〜約５５０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ〜約４５０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ〜約３５０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、または約８０ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、ニコチン結合抗体は、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ニコチン結合抗体は、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、約１５０ｍｇ／ｋｇ、約２００ｍｇ／ｋｇ、約２５０ｍｇ／ｋｇ、約３００ｍｇ／ｋｇ、約３５０ｍｇ／ｋｇ、約４００ｍｇ／ｋｇ、約４５０ｍｇ／ｋｇ、約５００ｍｇ／ｋｇ、約５５０ｍｇ／ｋｇ、約６００、約６５０ｍｇ／ｋｇ、約７００ｍｇ／ｋｇ、約７５０ｍｇ／ｋｇ、約８００ｍｇ／ｋｇ、約８５０ｍｇ／ｋｇ、約９００ｍｇ／ｋｇ、約９５０ｍｇ／ｋｇ、または約１０００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ニコチン結合抗体は、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、３５０ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、４５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、５５０ｍｇ／ｋｇ、６００、６５０ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、７５０ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、８５０ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ、９５０ｍｇ／ｋｇ、または１０００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ニコチン結合抗体は、約３０００ｍｇ、約３５００ｍｇ、約４０００ｍｇ、約４５００ｍｇ、約５０００ｍｇ、約５５００ｍｇ、約６０００、約６５００ｍｇ、約７０００ｍｇ、約７５００ｍｇ、約８０００ｍｇ、約８５００ｍｇ、約９０００ｍｇ、約９５００ｍｇ、約１００００ｍｇ、約１０５００ｍｇ、約１１０００ｍｇ、約１１５００ｍｇ、または約１２０００ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ニコチン結合抗体は、３０００ｍｇ、３５００ｍｇ、４０００ｍｇ、４５００ｍｇ、５０００ｍｇ、５５００ｍｇ、６０００、６５００ｍｇ、７０００ｍｇ、７５００ｍｇ、８０００ｍｇ、８５００ｍｇ、９０００ｍｇ、９５００ｍｇ、１００００ｍｇ、１０５００ｍｇ、１１０００ｍｇ、１１５００ｍｇ、または１２０００ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ニコチン結合抗体は、最大約１０ｇの用量で投与される。抗体断片などの他の抗体関連構築物が使用される場合、それらは異なる分子量および／または結合親和性に合わせて調整された同等の用量で使用され得る。例えば、断片の用量は、対応する全長抗体と同等のＣｍａｘおよび／またはＡＵＣパラメータを達成するように、または同等量のニコチンの結合を達成するように選択され得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の抗体を投与してもよく、２つ以上の抗体を投与する場合、投与される抗体の総量は、前述のガイダンスに従い得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素は、約０．０１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、変異体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３，約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ、約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．９ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約８／５ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０．５ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ、約１２．５ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ、約１３．５ｍｇ／ｋｇ、約１４ｍｇ／ｋｇ、約１４．５ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約１５．５ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ、約１６．５ｍｇ／ｋｇ、約１７ｍｇ／ｋｇ、約１７．５ｍｇ／ｋｇ、約１８ｍｇ／ｋｇ、約１８．５ｍｇ／ｋｇ、約１９ｍｇ／ｋｇ、約１９．５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２１ｍｇ／ｋｇ、約２２ｍｇ／ｋｇ、約２３ｍｇ／ｋｇ、約２４ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約２６ｍｇ／ｋｇ、約２７ｍｇ／ｋｇ、約２８ｍｇ／ｋｇ、約２９ｍｇ／ｋｇ、または約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素または変異体は、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約２．５ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約５０ｍｇ、約７５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約６００、約６５０ｍｇ、約７００ｍｇ、約７５０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８５０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９５０ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１０５０ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１１５０ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１２５０ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１３５０ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１４５０ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１５５０ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１６５０ｍｇ、約１７００ｍｇ、約１７５０ｍｇ、約１８００ｍｇ、約１８５０ｍｇ、約１９００ｍｇ、約１９５０ｍｇ、約２０００ｍｇ、約２０５０ｍｇ、約２１００、約２１５０ｍｇ、約２２００ｍｇ、約２２５０ｍｇ、約２３００ｍｇ、約２３５０ｍｇ、約２４００ｍｇ、約２４５０ｍｇ、または約２５００ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、２つ以上の酵素または変異体を投与してもよく、２つ以上の酵素を投与する場合、投与される総量は、前述のガイダンスに従い得る。
【０１０２】
上記のように、抗ニコチン剤は、静脈内、皮下、筋肉内、または腹腔内などの注射を介するなど、任意の好適な投与経路によって投与され得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、方法は、抗ニコチン剤を含む医薬組成物の単回用量を投与すること、または抗ニコチン剤および心血管疾患を治療するための別の化合物などの別の医薬化合物を含む医薬組成物の単回用量を投与することを含む。他の実施形態では、方法は、医薬組成物の反復用量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、治療は、心血管疾患の１つ以上の症状または影響が軽減、改良、または排除されるまで継続される。例えば、バージャー病の対象は、急性および慢性の炎症ならびに手および足の動脈および静脈の血栓症を含むがこれらに限定されない疾患に関連する兆候および症状の存在および／または重症度について評価され、本明細書に記載の１つ以上の医薬組成物で、治療後に兆候／症状のうちの１つ以上が軽減、改良、または排除されるまで治療され得る。追加的または代替的に、血圧、心拍数、および血管収縮など、皮膚温度によって測定され得る他の症状または影響を使用して、所与の用量または投薬計画の有効性および／または適切性を決定してもよい。追加的または代替的に、ニコチン血漿レベルを検出または監視して、有効性および／または妥当性を評価してもよい。追加的または代替的に、対象にニコチン結合抗体またはその断片を投与する実施形態では、循環中の非結合（遊離）ニコチンと比較した抗体結合ニコチンの割合を比較してもよい。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、方法は、抗ニコチン剤を、１日３回以上、１日２回、または１日１回投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、抗ニコチン剤を、１日１回、隔日に１回、週に３回、週に２回、週に１回、隔週に１回、３週間に１回、月に１回、またはそれ未満の頻度で投与することを含む。そのような実施形態では、抗ニコチン剤は、（例えば、ＰＥＧ化を介して）長い循環半減期を有するように構築された薬剤などの長時間作用型薬剤であり得る。追加的または代替的に、組成物は、徐放性組成物であり得る。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、治療は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１日間以上、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、もしくは１８週間以上、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ヶ月以上、または１、２、もしくは３年間以上、あるいは心血管疾患の兆候、症状、および／または影響が軽減、排除、または改善するまで、継続し得る。
【０１０６】
以下の実施例は、本発明を説明するものである。しかしながら、本発明はこれらの実施例に記載される特定の条件または詳細に限定されないことが理解されるべきである。本明細書で参照されるすべて刊行物は、参照により明確に組み込まれる。
【０１０７】
Ｘ．実施例
実施例１−抗ニコチン剤の抗ニコチン活性
本実施例は、本明細書に記載の抗ニコチン剤の抗ニコチン活性を示す。
【０１０８】
対照（ビヒクル）または１０、２０、もしくは４０ｍｇ／ｋｇの抗ニコチン抗体、８Ｄ１−ＩｇＧ４のいずれかで前処理した後、０．０３ｍｇ／ｋｇのニコチン（約２本のタバコに等しい）の単回用量をラット（ｎ＝８）に投与した。タバコを吸うのに必要な約１０分と比較して、ニコチンを１０秒未満で投与した。３分後に動物を屠殺し、図１に示すように、最高用量で脳内のニコチンレベルが９５％を超えて低下した。
【０１０９】
４０および８０ｍｇ／ｋｇの抗体用量および同じニコチン用量を使用したフォローアップ研究では、図２に示すように、非常に多量の喫煙をシミュレートしたニコチンの反復用量（５回の反復用量、５０分の間に１０分毎に１回）後でも、脳へのニコチン分布の９０％を超える低下が維持された。実際、８０ｍｇ／ｋｇの抗体用量では、脳のニコチンレベルは５回目のニコチン用量の３分後に９２％低下した。
【０１１０】
対照（ビヒクル）または１０、２０、もしくは４０ｍｇ／ｋｇの抗ニコチン抗体、８Ｄ１−ＩｇＧ４のいずれかで前処理した後、０．０３ｍｇ／ｋｇのニコチン（約２本のタバコに等しい）の単回用量をラット（ｎ＝８）に投与した。タバコを吸うのに必要な約１０分と比較して、ニコチンを１０秒未満で投与した。３分後に動物を屠殺し、図１に示すように、最高用量で脳内のニコチンレベルが９５％を超えて低下した。
【０１１１】
対照（ビヒクル）またはラットの血液および脳へのニコチン分布に対する一連の用量のニコチン分解酵素ＮｉｃＡ２のいずれかで前処理した後、０．０３ｍｇ／ｋｇのニコチン（約２本のタバコに等しい）の単回用量を、１、３、または５分の時間にわたってラットに投与し、分析し、図３に示す。タバコを吸うのに必要な約１０分と比較して、ニコチンを１０秒未満で投与した。ＮｉｃＡ２の効果は、用量および時間依存性であった（２元配置分散分析によるｐ＜０．０００１）。血液または脳のニコチン濃度に対するＮｉｃＡ２の効果は、１分でも相当であったが、特に脳では５分でより大きかった。血液のニコチンレベルは、ＮｉｃＡ２を１．２５ｍｇ／ｋｇ以上の用量で受けた群の全サンプリング時間で対照よりも有意に低く、ＮｉｃＡ２を５ｍｇ／ｋｇ以上の用量で受けた６４匹のラットすべてで２ｎｇ／ｍｌ未満に低下した。５ｍｇ／ｋｇ以上のＮｉｃＡ２を受けたラットについて、血液のニコチンレベルは、対照と比較して、すべてのサンプリング間隔で９０％を超えて低下した。脳のニコチンレベルを低下させるＮｉｃＡ２の有効性は、先の間隔よりも５分で大きかった。脳のニコチンレベルは、０．３１ｍｇ／ｋｇ以上のＮｉｃＡ２を受けたすべての群において５分で、０．６２ｍｇ／ｋｇ以上のＮｉｃＡ２を受けた群において３分で、５ｍｇ／ｋｇ以上のＮｉｃＡ２を受けたラットにおいて１分で、対照よりも有意に低くなった。５ｍｇ／ｋｇ以上のＮｉｃＡ２は、３分および５分で脳のニコチンレベルを９５％低下させたが、脳のニコチンレベルを１分で同程度に低下させるには、２０ｍｇ／ｋｇ用量のより高い用量が必要であった。
【０１１２】
静脈内投与した１０ｍｇ／ｋｇのＮｉｃＡ２および同じニコチン用量を使用したフォローアップ研究では、血中および脳内のニコチン濃度は、単回ニコチン用量または一連の５回のニコチン用量（図４）のいずれかを受けたＮｉｃＡ２治療ラットの対照よりも有意かつ実質的に低かった。血液のニコチン濃度は、ＮｉｃＡ２を受けた大部分のラットのアッセイ検出限界未満であった。脳のニコチン濃度は、ＮｉｃＡ２を受けたラットで、対照と比較して、ニコチンの単回用量後に８２％、一連の５回のニコチン用量後に８４％低下した。これらの研究は、本開示の抗ニコチン剤が脳へのニコチン分布を低下させることができることを示している。
【０１１３】
実施例２−心血管症状に対する抗ニコチン剤の有効性
本実施例は、血圧、血管収縮、および心拍数などの心血管疾患の影響に対する、本明細書に記載の抗ニコチン剤の有効性を示す。
【０１１４】
以下の表に示すように、ラット（ｎ＝４）に、１、２、４、および８日目の夕方に８Ｄ１−ＩｇＧ４の単回用量を投与し、毎朝５日間ニコチンの単回用量を投与し、９日目に６回の反復用量を投与した。
【表６】
2021526529.tif 000029
【０１１５】
平均動脈圧（ＭＡＰを、ニコチン投与の直前および直後の２分間に測定した。ニコチン投与前後２分間のＭＡＰの平均変化およびこのＭＡＰの変化と抗体の血漿中濃度との相関を図５に示す。これらのデータは、抗体がインビボでのＭＡＰのニコチン誘発性の増加を有意に遮断することを示す。
【０１１６】
これらの影響は、ニコチンを反復投与しても一定のままであった。例えば、８０ｍｇ／ｋｇの８Ｄ１−ＩｇＧ４を、ニコチンでの挑戦前の夕方に静脈内投与した。翌日、同じラットに６回のニコチン用量（０．０３ｍｇ／ｋｇ、静脈内）を１時間に１回、５時間投与して、多量喫煙（１２個のタバコに相当）をシミュレートした。ＭＡＰの違いを、各ニコチン用量の２分前と２分後に測定を行うことによって測定した。図６に示すように、ニコチンを６回用量の後でも、ＭＡＰの増加はほとんどなかった。
【０１１７】
実施例３−バージャー病の治療
本実施例は、バージャー病の治療に抗ニコチン抗体またはニコチン分解酵素を使用する方法を示す。
【０１１８】
現在進行中の喫煙者であるバージャー病と診断されたヒト対象は、静脈内、筋肉内、または皮下注射によって、ニコチン結合抗体またはニコチン分解酵素を含む治療有効量の医薬組成物を投与される。対象は、血圧上昇、血管収縮、および心拍数の上昇などのバージャー病に関連する兆候および症状の存在および／または重症度について評価され、対象は、１つ以上の兆候／症状が軽減、改良、または排除されるまで治療される。
【０１１９】
実施例３−ＣＬＩの治療
本実施例は、ＣＬＩの治療に抗ニコチン抗体またはニコチン分解酵素を使用する方法を示す。
【０１２０】
現在進行中の喫煙者であるＣＬＩと診断されたヒト対象は、静脈内、筋肉内、または皮下注射によって、治療有効量のニコチン結合抗体またはニコチン分解酵素を含む医薬組成物を投与される。対象は、組織の損傷、痛み、治癒不良の潰瘍、壊疽、および指の喪失などの、ＣＬＩに関連する兆候および症状の存在および／または重症度について評価され、対象は、１つ以上の兆候／症状が軽減、改良、または排除されるまで治療される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021526529.tif 000037
2021526529.tif 000038
2021526529.tif 000039
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