(57)【要約】  本発明は、アンジオポエチン２（Ａｎｇ２）に結合するマウス抗体、それから誘導されるヒト化抗Ａｎｇ２抗体、およびその使用に関する。本発明の抗Ａｎｇ２抗体は、Ａｎｇ２を中和すると共にＴｉｅ２受容体を活性化するという、二重の機能を有する。本発明の抗Ａｎｇ２抗体は、異常な、および病的な血管を正常化する作用を示し、したがって異常な血管が関与するさまざまな疾患または障害に対する処置効果を示す。本発明は、血管新生抑制剤、ならびに異常なＡｎｇ２発現およびＴｉｅ２調節異常に関連する疾患を予防および治療するための、抗体を活性成分として含む組成物、およびＡｎｇ２抑制およびＴｉｅ２活性化に関連する疾患診断用の、抗体を含む組成物を提供する。
2021514670.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトアンジオポエチン２に特異的に結合しＴｉｅ２活性化を誘導する、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１１５のアミノ酸、配列番号１１６のアミノ酸、または配列番号１１７のアミノ酸に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１１６のアミノ酸、または配列番号１１７のアミノ酸に結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１１５のアミノ酸に結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
抗体またはその抗原結合フラグメントが、ヒトおよびマウスのＡｎｇ２に結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
抗体が、ポリクローナルまたはモノクローナルである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
抗原結合フラグメントが、ｓｃＦｖまたはＦａｂである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
抗体がヒト化されている、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号５のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を有する重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）；および
（ｂ）配列番号６のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ
を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項９】
（ａ）配列番号１３のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１４のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１５のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を有する重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）；および
（ｂ）配列番号１６のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１７のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１８のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ
を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合フラグメントに関する。
【請求項１０】
配列番号９、１９、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、７５、７９、８３、８７、９１、９５、９９、１０３、１０７または１１１からなる群から選択される重鎖可変領域；および
配列番号１１、２１、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８または１１２からなる群から選択される軽鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００４１７またはＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００４１８で寄託された細胞株から産生される抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
薬学的に有効な量の請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを、薬学的に許容しうる担体と共に含む医薬組成物。
【請求項１３】
化学療法に用いられる低分子阻害剤をさらに含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストをさらに含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ＶＥＧＦアンタゴニストが、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または低分子キナーゼ阻害剤である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
患者において腫瘍増殖を抑制する方法であって、請求項１２に記載の抗体または抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を患者に投与することを含む、方法。
【請求項１７】
化学療法に用いられる低分子阻害剤、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＶＥＧＦアンタゴニストが、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または低分子キナーゼ阻害剤である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
眼疾患患者において、脈絡膜血管新生を抑制する、眼血管漏出を抑制する、または同時に脈絡膜毛細血管再生を誘導する方法であって、請求項１２に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、方法。
【請求項２０】
化学療法に用いられる低分子阻害剤、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＶＥＧＦアンタゴニストが、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または低分子キナーゼ阻害剤である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
眼疾患が、滲出型加齢黄斑変性（ｗＡＭＤ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、または糖尿病網膜症（ＤＲ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸。
【請求項２４】
請求項２３に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。
【請求項２６】
請求項２５に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合フラグメントを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管形成および維持を調節するリガンドとして知られるアンジオポエチン２（Ａｎｇ２）に特異的に結合する、抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合フラグメント、それを含む医薬組成物、それをコードする核酸、核酸を含むベクター、ベクターを含む宿主細胞、ならびに抗体またはその抗原結合フラグメントを生産する方法を包含する。
【背景技術】
【０００２】
生物の発達、成長、維持およびホメオスタシスにおいて、血管形成はさまざまな調節因子によってダイナミックに起こる。このプロセスにおいて新たに形成される血管は、周辺の細胞において、栄養物、酸素およびホルモンといったさまざまな生体材料の輸送チャネルとして機能する。機能的および構造的に異常な血管は、さまざまな疾患の発症および進行の、直接的または間接的な原因となる。腫瘍血管は、その機能的および構造的欠陥の故に低酸素を悪化させ、その結果、腫瘍の進行および他組織への転移を引き起こし、また、腫瘍塊中心部への抗癌剤デリバリーの低下をもたらす。血管の欠陥は、癌に加え、さまざまな他の疾患および状態においても見られる。その例としては、さまざまな、眼疾患（例えば、糖尿病黄斑浮腫、滲出型加齢黄斑変性）、ウイルス感染、および急性炎症反応、例えば敗血症が挙げられる。したがって、異常な血管を正常化することのできる処置剤が利用可能であれば、血管異常を有するさまざまな患者の処置に適用することができる。
【０００３】
アンジオポエチンファミリーは、血管の形成および維持において重要な役割を担い、４つのアンジオポエチン（Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３およびＡｎｇ４）からなる。アンジオポエチン１（Ａｎｇ１）は、血管内皮細胞表面上に存在するＴｉｅ２受容体に結合して、Ｔｉｅ２受容体をリン酸化および活性化し、それによって血管を安定化する。一方、アンジオポエチン２（Ａｎｇ２）は、Ｔｉｅ２受容体に結合するが、アンタゴニストとして作用し、Ｔｉｅ２受容体の不活性化を誘導し、それによって血管の不安定化および血管の漏出をもたらす。癌患者、眼疾患、ウイルスおよび細菌感染ならびに炎症性疾患において血液中のＡｎｇ２の発現レベルが非常に高いことが報告されている（Saharinen P et al., 2017, Nature Review Drug Discovery）。しかしながら、Ａｎｇ２はまた、リンパのチューブ形成および維持を包含するいくつかのプロセスにおいて、Ｔｉｅ２受容体の活性化を誘導するアゴニストとして作用することが知られており、したがって、Ａｎｇ２は状況によってさまざまな機能を示すと考えられる。
【０００４】
Ａｎｇ２結合抗体がいくつかの文献に報告されている（例えば米国特許第７６５８９２４号および米国特許第８９８７４２０号）。これまでに報告されたＡｎｇ２抗体の多くが、Ａｎｇ２のＴｉｅ２への結合を阻害し、したがって、そのようなＡｎｇ２中和効果によって新血管の形成を阻害することがわかっている。現在、さまざまなＡｎｇ２抗体がさまざまな癌患者に対する臨床試験に付されているが、その抗癌作用は不十分であることがわかっている。例えば、Amgenが実施した第３相臨床試験により、Ａｎｇ２抗体の卵巣癌患者における抗癌作用は有意ではないことが示された（Marth C et al., 2017, Eur. J. Cancer）。
【０００５】
抗体に加え、Ｔｉｅ２受容体に直接結合してＴｉｅ２のリン酸化および活性化を誘導する組換えタンパク質も報告されている。その例には、COMP-Ang1（Cho et al., 2004, PNAS）、および５つのアンジオポエチン１タンパク質フラグメントからなるVasculotide（David S et al., 2011, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol）ペプチドがある。しかしながら、これらのタンパク質は半減期が非常に短く、不安定な物理化学的性質を有すると考えられる。さらに、リン酸化されたＴｉｅ２からリン酸基を除去してＴｉｅ２を不活性化するＶＥ−ＰＴＰと称されるホスファターゼが存在し、ＶＥ−ＰＴＰ酵素の活性を阻害することによって間接的にＴｉｅ２活性を維持する低分子化合物（AKB-9778）の開発もなされている（Goel S, 2013, J Natl Cancer Inst）。しかしながら、この化合物は、Ｔｉｅ２に加え、他の受容体も活性化するという欠点を有する（Frye M, 2015, J Exp. Med, Hayashi M, 2013, Nature Communication, Mellberg S et al., 2009, FASEB J.）。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ヒトアンジオポエチン２に特異的に結合しＴｉｅ２活性化を誘導する、抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、該抗体またはその抗原結合フラグメントは、水素／重水素交換法による決定で、配列番号１のアミノ酸２８９〜２９９、配列番号１のアミノ酸３１６〜３２２、または配列番号１のアミノ酸３３６〜３５３に結合する。
【０００７】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトおよびマウスのＡｎｇ２に結合しうる。抗体はポリクローナルまたはモノクローナルでありうる。抗原結合フラグメントはｓｃＦｖまたはＦａｂでありうる。抗体またはそのフラグメントはヒト化されうる。
【０００８】
他の一態様において、本発明は、
（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号５のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を有する重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）；および
（ｂ）配列番号６のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ
を含む、抗体または抗原結合フラグメントに関する。
【０００９】
他の一態様において、本発明は、
（ａ）配列番号１３のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１４のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１５のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を有する重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）；および
（ｂ）配列番号１６のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１７のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１８のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ
を含む、抗体または抗原結合フラグメントに関する。
【００１０】
一態様において、本発明は、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００４１７またはＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００４１８で寄託された細胞株から産生される抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００１１】
他の一態様において、本発明は、薬学的に有効な量の前記抗体またはその抗原結合フラグメントを、薬学的に許容しうる担体と共に含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、化学療法に用いられる低分子阻害剤、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストをさらに含みうる。一態様において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または低分子キナーゼ阻害剤でありうる。
【００１２】
他の一態様において、本発明は、前記抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を患者に投与することを含む、患者において腫瘍増殖を抑制する方法に関する。該方法は、本発明の抗体またはそのフラグメントの投与と同時に、または前後して、化学療法に用いられる低分子阻害剤、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することをさらに含みうる。ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または低分子キナーゼ阻害剤でありうる。
【００１３】
他の一態様において、本発明は、前記医薬組成物を眼疾患患者に投与することを含む、該患者において脈絡膜血管新生を抑制する、眼血管漏出を抑制する、または同時に脈絡膜毛細血管再生を促進する方法に関する。該方法は、本発明の抗体またはそのフラグメントの投与と同時に、または前後して、化学療法に用いられる低分子阻害剤、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することをさらに含みうる。ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または低分子キナーゼ阻害剤でありうる。眼疾患は、滲出型加齢黄斑変性（ｗＡＭＤ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、または糖尿病網膜症（ＤＲ）である。
【００１４】
上記のおよび他の本発明の課題は、後述の本発明の説明、添付の図面および特許請求の範囲から、より明確に理解されうる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本発明は、後述の詳細な説明および添付の図面から、より明確に理解されうるが、それらは説明のためのものであるり、本発明を限定するものではない。
【図１】抗Ａｎｇ２抗体によって誘導されるＡｋｔリン酸化。ＨＵＶＥＣを６時間の血清飢餓に付し、ヒトＡｎｇ２（１μｇ／ｍｌ）の不存在下または存在下に、ＣＯＭＰ−Ａｎｇ１（ＣＡ１、０．５μｇ／ｍｌ）または抗Ａｎｇ２抗体（対照、２Ｃ８、４Ｂ９、２Ｆ１０および４Ｅ２のそれぞれ）と共に３０分間インキュベートした。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティングに付し、ブロットを抗ホスホＡｋｔ（Ｓ４７３）または抗Ａｋｔ抗体でプローブした。
【図２】水素／重水素交換質量分析によって分析した抗Ａｎｇ２抗体のエピトープを示す図。組換えｈＡｎｇ２−ＲＢＤ単独、またはｈＡｎｇ２−ＲＢＤ／Ａｎｇ２抗体複合体を重水素で標識した。標識したタンパク質をペプシンカラムにおいて消化し、質量分析により分析した。ｈＡｎｇ２−ＲＢＤ単独およびｈＡｎｇ２−ＲＢＤ／Ａｎｇ２抗体複合体の重水素取り込みを分析し、重水素取り込みの差を比較した。重水素取り込みの質量差が０．５〜１Ｄａを上回ったペプチドを、抗Ａｎｇ２抗体との結合を仲介する特異的エピトープであると決定した。PyMolソフトウェアを用いて作製したＡｎｇ２−ＲＢＤ結晶構造（ＰＤＢ：２ＧＹ７）の画像において、２Ｃ８エピトープ（赤）および４Ｂ９エピトープ（緑）を示した。
【図３】ヒト化抗Ａｎｇ２抗体４Ｂ９Ｈ１１および２Ｃ８Ｈ１１による用量依存的Ａｋｔリン酸化（ｐＡｋｔ）。血清飢餓ＨＵＶＥＣを、ヒトＡｎｇ２、抗Ａｎｇ２抗体、またはヒトＡｎｇ２とさまざまな濃度の抗Ａｎｇ２抗体との組み合わせと共に３０分間インキュベートした。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティングに付した。
【図４】ヒト化抗Ａｎｇ２抗体４Ｂ９Ｈ１１および２Ｃ８Ｈ１１による用量依存的Ｔｉｅ２リン酸化（ｐＴｉｅ２）。４Ｂ９Ｈ１１抗体（図４Ａ）および２Ｃ８Ｈ１１抗体（図４Ｂ）のＴｉｅ２リン酸化誘導能力を、免疫沈降およびウエスタンブロッティングによって調べた。血清飢餓ＨＵＶＥＣを、ヒトＡｎｇ２、抗Ａｎｇ２抗体単独、またはヒトＡｎｇ２とさまざまな濃度の抗Ａｎｇ２抗体との組み合わせと共に３０分間インキュベートした。細胞溶解物を、抗Ｔｉｅ２抗体による免疫沈降、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティング分析に付した。
【図５】ヒト化Ａｎｇ２抗体によるＴｉｅ２受容体クラスター形成およびＦＯＸＯ１移行。ＨＵＶＥＣを６時間の血清飢餓に付し、ＣＯＭＰ−Ａｎｇ１（ＣＡ１）、Ａｎｇ２（Ａ２）、またはＡｎｇ２と抗Ａｎｇ２抗体（対照Ａｂ、２Ｃ８Ｈ１１、または４Ｂ９Ｈ１１）との組み合わせと共に３０分間インキュベートした。固定後、ＨＵＶＥＣを、ＤＡＰＩ（青）、抗Ｔｉｅ２抗体（緑）、抗ＦＯＸＯ１抗体（赤）および抗ヒトＦｃ（シアン）で染色して、細胞表面におけるＴｉｅ２クラスター形成、核からのＦＯＸＯ１移行、および細胞間結合域におけるヒト化Ａｎｇ２抗体の存在を調べた。矢尻は、細胞間接着においてクラスター形成したＴｉｅ２および共局在するＡｎｇ２抗体を示す。
【図６】２Ｃ８Ｈ１１により誘導されるＴｉｅ２受容体クラスター形成、ＦＯＸＯ１移行、およびＨＵＶＥＣの細胞間結合部におけるＡｎｇ２抗体局在の経時変化。血清飢餓ＨＵＶＥＣを、抗Ａｎｇ２抗体（対照Ａｂ、または２Ｃ８Ｈ１１）と共に、１０分〜２４０分の間のさまざまな時間にわたりインキュベートした。細胞の固定後、細胞表面におけるクラスター形成したＴｉｅ２受容体、およびエンドサイトーシスを受けたＴｉｅ２受容体を、抗Ｔｉｅ２抗体での染色によって調べた。細胞表面およびサイトゾルにおけるヒト化抗Ａｎｇ２抗体を、抗ヒトＦｃ抗体でプローブした。矢尻は、細胞間接着においてクラスター形成したＴｉｅ２および共局在するＡｎｇ２抗体を示す。
【図７】ヒト化抗Ａｎｇ２抗体による血管透過性抑制。ＨＵＶＥＣをトランスウェルチャンバーに播種し、３日間培養した。１００％のコンフルエンシーで、ＨＵＶＥＣを、ＣＯＭＰ−Ａｎｇ１（ＣＡ１、０．５μｇ／ｍｌ）、Ａｎｇ２（Ａ２、１μｇ／ｍｌ）、Ａｎｇ２と対照Ａｂ（Ａ２＋対照Ａｂ、１μｇ／ｍｌ）、Ａｎｇ２と２Ｃ８Ｈ１１（Ａ２＋２Ｃ８Ｈ１１、１μｇ／ｍｌ）、またはＡｎｇ２と４Ｂ９Ｈ１１（Ａ２＋４Ｂ９Ｈ１１、１μｇ／ｍｌ）で３０分間処理し、その後、上部チャンバーへのＴＮＦ−ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）で２２時間処理した。上部チャンバーにＦＩＴＣ−デキストランを加え、２０分間インキュベートした。ＦＩＴＣ−デキストランを上部チャンバーに２０分間加えた後の下部チャンバーにおけるＦＩＴＣ蛍光を測定することにより、血管透過性を評価した。値は平均±ＳＤである。一元ＡＮＯＶＡにより、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図８】ＥＬＩＳＡによる、マウスＡｎｇ２に対する抗Ａｎｇ２抗体のＥＣ５０値。マウスＡｎｇ２（ｍＡｎｇ２）に対するヒト化抗Ａｎｇ２抗体の結合親和性を、ＥＬＩＳＡによるＥＣ５０の分析によって測定した。組換えｍＡｎｇ２をコートし、段階希釈した抗Ａｎｇ２抗体４Ｂ９Ｈ１１および２Ｃ８Ｈ１１と共にインキュベートした。次いで、プレートを、抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）−ＨＲＰ二次抗体と反応させた。プレートをＴＭＢ溶液で処理し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。PerkinElmerのWorkoOut 2.5プログラムを用いてＥＣ５０値を分析した。
【図９】ＬＬＣ腫瘍モデルにおけるヒト化２Ｃ８Ｈ１１抗体およびシスプラチン（Ｃｐｔ）による腫瘍増殖抑制。腫瘍移植後７日目に開始して、示されるように処置されたマウスにおけるＬＬＣ腫瘍増殖を比較した。黒の矢印は抗体の注射を示し、赤の矢印はＣｐｔの単回注射を示す。各群において、ｎ＝７〜９。値は平均±ＳＤ。＊Ｆｃに対してｐ＜０．０５；＃Ｆｃ＋Ｃｐｔに対してｐ＜０．０５。
【図１０】ヒト化２Ｃ８Ｈ１１抗体の腫瘍血管正常化作用。ＬＬＣ皮下腫瘍モデルにおいて、腫瘍におけるＰＤＧＦＲβ＋ペリサイト域、および腫瘍間領域におけるＣＤ３１＋ＢＶを比較した。スケールバー：１００μｍ。各群において、ｎ＝５。値は平均±ＳＤ。＊Ｆｃに対してｐ＜０．０５；＃Ｆｃ＋Ｃｐｔに対してｐ＜０．０５。
【図１１】ヒト化２Ｃ８Ｈ１１抗体による低酸素の軽減および腫瘍血管の灌流増加。ＬＬＣ腫瘍において、レクチンの腫瘍血管灌流、およびHypoxyprobe＋低酸素面積を分析し比較した。Hypoxyprobe＋面積は、総断面積に対するパーセンテージとして示した。スケールバー：１００μｍ。各群において、ｎ＝５。値は平均±ＳＤ。＊Ｆｃに対してｐ＜０．０５；＃Ｆｃ＋Ｃｐｔに対してｐ＜０．０５。
【図１２】ヒト化２Ｃ８Ｈ１１抗体による腫瘍内部へのＣｐｔドラッグデリバリーの増加。抗Ｃｐｔ修飾ＤＮＡ抗体を用いて、２１日目に採取した腫瘍におけるＣｐｔ＋領域を画像化した。Ｃｐｔ＋面積を、総断面積に対するパーセンテージとして測定した。スケールバー：１００μｍ。各群において、ｎ＝５。値は平均±ＳＤ。＃Ｆｃ＋Ｃｐｔに対してｐ＜０．０５。
【図１３】レーザー誘発ＣＮＶモデルにおける２Ｃ８Ｈ１１抗体の硝子体内注射によるＣＮＶ低減および血管漏出抑制。レーザー光凝固後７日目に、抗体の硝子体内投与を行った。レーザー光凝固後６日目および／または１４日目に、ＣＤ３１＋ＣＮＶ体積を測定し、ＣＮＶ周囲の漏出面積を、ＦＡ画像において測定された高蛍光の総面積を、ＩＣＧＡ画像において測定された総ＣＮＶ面積で除したものとして、計算した。スケールバー：１００μｍ。各群において、ｎ＝１１。値は平均±ＳＤ。＊＊＊一元ＡＮＯＶＡ、次いでスチューデント−ニューマン−ケウルスのポスト検定によりｐ＜０．００１；＃＃＃対応のあるスチューデントのｔ検定によりｐ＜０．００１。
【図１４】２Ｃ８Ｈ１１抗体の硝子体内注射によるＣＮＶ低減および脈絡膜毛細血管再生。レーザー光凝固後７日目に、抗体の硝子体内投与を行った。レーザー光凝固後、６、１４、２１および３５日目に、眼のＯＣＴＡ画像によって、ＣＮＶ体積（白色の点線の境界線で区切られた部分）、およびＣＮＶの周囲の無血管スペース（黄色の点線の境界線で区切られた部分）を測定した。各群において、ｎ＝１１。値は平均±ＳＤ。一元ＡＮＯＶＡ、次いでスチューデント−ニューマン−ケウルスのポスト検定により、Ｆｃに対して、＊ｐ＜０．００５、＊＊ｐ＜０．００５。
【図１５】ＣＮＶの内皮細胞における２Ｃ８Ｈ１１抗体およびＣＤ３１の共局在。レーザー光凝固後１日目に、２Ｃ８Ｈ１１抗体の皮下投与を行った。レーザー光凝固後２、４および８日目に、ＣＮＶの内皮細胞における２Ｃ８Ｈ１１抗体およびＣＤ３１共局在を、抗ヒトＩｇＧ抗体で直接に検出した。
【図１６】皮下注射２Ｃ８Ｈ１１抗体のＣＮＶ抑制効果。レーザー光凝固後１日目に、２Ｃ８Ｈ１１抗体の皮下投与を行った。レーザー光凝固後８日目に、ＣＤ３１＋ＣＮＶの体積を測定した。スケールバー：１００μｍ。各群において、ｎ＝１０。値は平均±ＳＤ。＊＊＊対応のないスチューデントのｔ検定によりｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
別の定義をしない限り、本書に使用する技術用語および科学用語はいずれも、本発明が属する技術分野の専門家に理解されるのと同じ意味を有する。全般に、本書に使用する命名法は当分野において知られ、普通に使用されるものである。
【００１７】
本願において、単数形の記載は、対象が単数である場合および複数である場合の両方を意味する。
【００１８】
一態様において、本発明は、ヒトアンジオポエチン２に特異的に結合し、Ｔｉｅ２活性化を誘導する、抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１１５のアミノ酸、配列番号１１６のアミノ酸、または配列番号１１７のアミノ酸に結合する。
【００１９】
配列番号１１５のアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸３３６〜３５３に対応し、配列番号１１６のアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸２８９〜２９９に対応し、配列番号１１７のアミノ酸配は、配列番号１のアミノ酸３１６〜３２２に対応する。
【００２０】
本書において、用語「Ａｎｇ２に特異的に結合する抗体」は、Ａｎｇ２に結合し、その結果Ａｎｇ２の生物学的活性を阻害する抗体をさし、「抗Ａｎｇ２抗体」、「Ａｎｇ２結合抗体」と互換的に使用される。
【００２１】
本書において「抗体」は、特定の抗原に対し免疫学的に反応性の免疫グロブリン分子であり、抗原を特異的に認識する受容体としてはたらくタンパク質分子を意味し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（単クローン抗体）、全抗体、および抗体フラグメントのいずれをも包含しうる。さらに、抗体は、キメラ抗体（例えばヒト化マウス抗体）および二価または二重特異性分子（例えば二重特異性抗体）、ディアボディ、トリアボディおよびテトラボディを包含しうる。
【００２２】
全抗体は、２つの完全長軽鎖および２つの完全長重鎖を有し、各軽鎖が重鎖にジスルフィド結合により連結されうるという構造を有する。全抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＧを包含し、ＩｇＧはサブタイプであり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を包含する。
【００２３】
本開示において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトおよびマウスのＡｎｇ２に結合しうる。
【００２４】
抗体フラグメントとは、抗原結合機能を維持するフラグメントを意味し、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、およびＦｖ等を包含する。
【００２５】
Ｆａｂは、軽鎖および重鎖の可変領域、ならびに軽鎖定常領域および重鎖第１定常領域（ＣＨ１ドメイン）の構造を有し、１つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインＣ末端に１つまたはそれ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域を有する点で、Ｆａｂと異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合することによって形成される。
【００２６】
Ｆｖ（可変フラグメント）とは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のみを有する最小の抗体フラグメントをいう。二本鎖Ｆｖ（ｄｓＦｖ）においては、重鎖可変領域および軽鎖可変領域がジスルフィド結合によって連結される。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）においては、重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、一般に、ペプチドリンカーを用いる共有結合によって連結される。これら抗体フラグメントは、タンパク質分解酵素を用いて得ることができ（例えば、Ｆａｂは、全抗体をパパインで限定切断することによって得ることができ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントはペプシンによる切断によって得ることができる）、また、組換えＤＮＡ技術によって作製することができる（例えば、抗体重鎖またはその可変領域をコードするＤＮＡおよび軽鎖またはその可変領域をコードするＤＮＡを鋳型として用い、プライマー対を用いる、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法による増幅、および、両端に重鎖またはその可変領域および軽鎖またはその可変領域をそれぞれ連結させるように、プライマー対のペプチドリンカーをコードするＤＮＡを組み合わせての増幅）。
【００２７】
本開示において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化されうる。好ましくは、本発明の抗Ａｎｇ２抗体は、ヒト抗体ライブラリーから選択される完全ヒト抗体でありうるが、それに限定されない。
【００２８】
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；および配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことによって特徴付けられる。
【００２９】
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；および配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことによって特徴付けられる。
【００３０】
本発明において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９、１９、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、７５、７９、８３、８７、９１、９５、９９、１０３、１０７または１１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および配列番号１１、２１、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８または１１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むことによって特徴付けられるが、それに限定されない。
【００３１】
抗体のアミノ酸配列は、保存的置換によって置換されうる。「保存的置換」とは、少なくとも１つのアミノ酸の、同様の生化学的性質を有するアミノ酸による置換を含む、ポリペプチドの対応するポリペプチドへの、生物学的または生化学的機能の低下を伴わない改変をいう。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換をいう。同様の側鎖を有するアミノ酸残基の群は、当分野において定義されている。そのような群は、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、荷電していない極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を包含する。本発明の抗体は、保存的アミノ酸置換がなされても活性を維持することができると考えられる。
【００３２】
本発明において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００４１７またはＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００４１８で寄託された細胞株から産生される抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことによって特徴付けられる。
【００３３】
本発明の抗Ａｎｇ２抗体の配列は、本願において提示される配列とは異なっていてよい。例えば、アミノ酸配列は、上記に示したアミノ酸配列とは次のように異なりうる：（ａ）軽鎖の定常ドメインから可変領域が切り離されうる；（ｂ）アミノ酸が上記に示したものと、該残基の化学的性質への著しい影響はないが異なりうる（いわゆる保存的置換）；（ｃ）アミノ酸が上記に示したものと、あるパーセンテージ、例えば８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性で異なりうる。あるいは、抗体をコードする核酸は、（ａ）軽鎖の定常ドメインから切り離されうる；（ｂ）上記に示したものと、コードする残基を変更することなく異なりうる；または（ｃ）上記に示したものと、あるパーセンテージ、例えば７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性で異なりうる。
【００３４】
アミノ酸配列において保存的変異を導入する際、アミノ酸のハイドロパシーインデックスを考慮しうる。タンパク質に生物学的相互作用機能を付与する際のアミノ酸ハイドロパシーインデックスの重要性は、当分野で一般に理解されている。アミノ酸の相対的なハイドロパシーは、得られるタンパク質の二次構造に影響し、それがタンパク質と他の分子、例えば酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原等との相互作用を決定付けると認識されている。
【００３５】
また、同様のアミノ酸による置換は、親水性に基づいて効果的になされうることが当分野で理解されている。例えば、隣接するアミノ酸の親水性によって決まる、タンパク質の最大の局部的平均親水性が、タンパク質の生物学的性質に影響する。アミノ酸が、同様の親水性を有する他のアミノ酸で置換され、生物学的または免疫学的に改変されたタンパク質をもたらしうることが理解される。そのような変異において、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５のものがより一層好ましい。
【００３６】
上述のように、アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基、例えばその疎水性、親水性、荷電性、大きさ等の相対的類似性に基づく。前記のさまざまな性質を考慮した置換の例は当業者に知られており、以下のものを包含する：アルギニンおよびリジン：グルタメートおよびアスパルテート；セリンおよびスレオニン：グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシン。
【００３７】
他の一態様において、本発明は、抗体またはその抗原結合フラグメントを有効成分として含む医薬組成物に関する。
【００３８】
医薬組成物は、薬学的に有効な量の本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、および薬学的に許容しうる担体を含むことによって特徴付けられる。
【００３９】
医薬組成物は、化学療法に用いられる低分子阻害剤、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストをさらに含みうる。一態様において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または低分子キナーゼ阻害剤でありうる。
【００４０】
他の一態様において、本発明は、抗体またはその抗原結合フラグメントを有効成分として含む、眼疾患を予防または治療するための医薬組成物に関する。
【００４１】
他の一態様において、本発明は、前記医薬組成物を眼疾患患者に投与することを含む、該患者において脈絡膜血管新生を抑制する、眼血管漏出を抑制する、または同時に脈絡膜毛細血管再生を促進する方法に関する。
【００４２】
眼疾患を予防または治療するための医薬組成物は、化学療法に用いられる低分子阻害剤、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストをさらに含みうる。ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または低分子キナーゼ阻害剤でありうる。
【００４３】
前記方法は、本発明の抗体またはそのフラグメントの投与と同時に、または前後して、化学療法に用いられる低分子阻害剤、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することをさらに含みうる。ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または低分子キナーゼ阻害剤でありうる。
【００４４】
抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ａｎｇ２の機能を阻害することによって異常な血管形成を抑制する機能を有し、したがって、血管異常が関与する眼疾患を予防または治療する作用を有する。
【００４５】
本書において、用語「予防する」とは、本発明の組成物の投与による、眼疾患を防ぐ、またはその進行を遅延する任意の作用をいい、用語「治療する」、「処置する」とは、眼疾患を防ぐ、軽減する、またはその発現を抑制することをいう。
【００４６】
本発明において、眼疾患は、滲出型加齢黄斑変性（ｗＡＭＤ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、または糖尿病網膜症（ＤＲ）であるが、それに限定されない。
【００４７】
本書において、用語「黄斑変性」とは、血管新生が異常に増加し、それによって黄斑に損傷が起こり視力が損なわれる状態をさす。黄斑変性は主に５０歳を超える年齢で起こり、非滲出型（ドライ型）または滲出型（ウェット型）に分けられる。特に滲出型のＡＭＤの場合、失明に至りうる。ＡＭＤの原因は未だ解明されていないが、年齢；および喫煙、高血圧、肥満、遺伝的素因、過度のＵＶ暴露、低い血清抗酸化物質濃度等を包含する環境的要因がリスク因子であることがわかっている。
【００４８】
本書において、用語「黄斑浮腫」とは、網膜の黄斑の腫脹をさし、これは網膜血管からの液体漏出によって起こる。弱い血管壁からの漏出血液が、色覚に係る神経の終末であり網膜錐体が豊富な網膜黄斑の限局域に入る。そして、中心窩右または中心窩中央への像が不鮮明となる。視力が何箇月かにわたって徐々に低下する。本書において、用語「糖尿病網膜症」とは、糖尿病により引き起こされる末梢循環障害による網膜微小循環の障害によって視力が低下する、眼の合併症をいう。初期には視力障害は軽度であるが、最終的に失明に至りうる。糖尿病網膜症は１型糖尿病または２型糖尿病のいずれの患者にも起こりうる。
【００４９】
本発明は、処置有効量の抗Ａｎｇ２抗体、および薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物を提供する。「薬学的に許容しうる担体」とは、製剤の調製または安定化を促進するために活性成分に添加することができ、患者に顕著な有害毒性作用をもたらさない材料である。
【００５０】
担体とは、患者に刺激を与えず、投与される化合物の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤をさす。液体溶液として調製される組成物における薬学的に許容しうる担体は、無菌であり、生体に対して適当なものである。食塩液、無菌水、リンガー液、緩衝食塩液、アルブミン注射用溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールを担体として使用し得るか、またはその少なくとも１つの成分を混合して使用し得、他の通常の添加剤、例えば抗酸化剤、緩衝剤、殺菌剤等を必要に応じて添加し得る。さらに、組成物は、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および滑沢剤のさらなる添加によって、注射用製剤、例えば水溶液、懸濁液、エマルジョン等、丸薬、カプセル剤、顆粒剤または錠剤に調製し得る。他の担体は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin) に記載されている。組成物は、少なくとも１つの抗Ａｎｇ２抗体を処置有効量で含み得る。
【００５１】
薬学的に許容しうる担体は、無菌水溶液または分散液、および無菌注射用溶液または分散液の用時調製用の無菌粉末を包含する。医薬活性物質にそのような媒体および物質を使用することは、当分野で知られている。組成物は好ましくは、非経口注射用に調製される。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高薬物濃度に適当な他の処方構造物として調製されうる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）およびその適当な混合物を含む溶媒または分散媒でありうる。いくつかの態様において、組成物は、等張化剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含みうる。無菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、前記成分の１つまたはその組み合わせと共に適当な溶媒中に組み合わせ、その後必要に応じて滅菌マイクロ濾過することによって調製しうる。一般に、分散液は、ベースの分散媒体および前記成分から選択される他の必要成分を含む無菌ビヒクル中に活性化合物を組み合わせることによって調製される。無菌注射用溶液の調製用の無菌粉末は、活性成分粉末および任意の所望の追加成分の粉末を、予め滅菌濾過した溶液から減圧乾燥および凍結乾燥することによって得られる。
【００５２】
医薬組成物は、患者の重篤度によって異なりうる用量および頻度で、経口的または非経口的に投与しうる。組成物は、必要に応じて、ボーラスとして、または連続注入によって、患者に投与しうる。例えば、Ｆａｂフラグメントとして供される本発明の抗体のボーラス投与は、０．００２５〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、０．０２５〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、または０．１０〜０．５０ｍｇ／ｋｇの量でありうる。連続注入のためには、Ｆａｂフラグメントとして供される本発明の抗体は、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１２５〜１．２５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０〜０．７５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０〜１．０ｍｇ／ｋｇ／分、または０．１０〜０．５０ｍｇ／ｋｇ／分で、１〜２４時間、１〜１２時間、２〜１２時間、６〜１２時間、２〜８時間、または１〜２時間にわたって投与されうる。完全な定常領域を有する全長抗体として供される本発明の抗体が投与される場合、投与量は、およそ１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、２〜８ｍｇ／ｋｇ、または５〜６ｍｇ／ｋｇでありうる。全長抗体は典型的には、３０分間〜３５分間にわたる注入によって投与される。投与頻度は、状態の重篤度による。投与頻度は、毎週３回ないし１週間または２週間に１回でありうる。
【００５３】
さらに、組成物は、皮下注射によって患者に投与されうる。例えば、投与量１０〜１００ｍｇの抗Ａｎｇ２抗体が、１週間、２週間または１箇月毎に、患者に皮下注射により投与されうる。
【００５４】
本書において、「処置有効量」とは、医学的処置に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比で疾患を処置するのに十分な量、および抗Ａｎｇ２抗体の組み合わせの量を意味する。正確な量は、処置用組成物の成分および物理的性質、意図される患者集団、個々の患者について考慮すべき条件等を包含するがそれに限定されない多くの因子によって異なり得、当業者によって容易に決定され得る。それら因子をすべて考慮するとき、副作用を伴わずに最大の効果を得るのに十分な最小量を投与することが重要であり、該用量は当業者によって容易に決定され得る。
【００５５】
本発明の医薬組成物の用量は、特に限定されず、患者の健康状態および体重、疾患重篤度、薬物の種類、投与経路ならびに投与時間を包含するさまざまな因子に応じて変更される。組成物は、ラット、マウス、ウシ、ヒト等を包含する哺乳動物において通常許容される経路で、例えば経口、直腸、静脈内、皮下、子宮内または脳血管内に、単回投与または１日当たりの多回投与として投与され得る。
【００５６】
他の一態様において、本発明は、抗体またはその抗原結合フラグメントを活性成分として含む、癌を予防または治療するための医薬組成物に関する。
【００５７】
他の一態様において、本発明は、前記の抗体または抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を患者に投与することを含む、患者における腫瘍増殖抑制および癌処置のための方法に関する。該方法は、本発明の抗体またはそのフラグメントの投与と同時に、または前後して、化学療法に用いられる低分子阻害剤、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することをさらに含みうる。ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または低分子キナーゼ阻害剤でありうる。
【００５８】
本書において、用語「癌」または「腫瘍」は典型的には、制御されない細胞成長／増殖によって特徴付けられる哺乳動物の生理学的状態をいう。
【００５９】
本発明の組成物で処置することのできる癌は、特に限定されず、固形癌および血液癌の両方を包含する。そのような癌の例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼のメラノーマ、直腸癌、肛門癌、食道癌、小腸癌、内分泌癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、慢性または急性白血病、リンパ腫、肝細胞癌、消化器癌、膵臓癌、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、結腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、骨肉腫等を包含するが、それに限定されない。
【００６０】
癌を予防または治療するための組成物は抗Ａｎｇ２抗体を含み、その構成は、眼疾患を予防または治療するための組成物に含まれる組成と同様であり、したがってその各構成の記述は、癌を予防または治療するための組成物にも同様に適用される。
【００６１】
本願は、本書に記載される抗Ａｎｇ２抗体を、化学療法もしくは放射性療法の介入または他の処置と組み合わせて使用することをも意図する。特に、抗Ａｎｇ２抗体を、Ａｎｇ２の機能の異なる側面を標的とする他の処置と組み合わせることも有効であることが示され得る。
【００６２】
他の一態様において、本発明の抗体は、診断または処置剤としての抗体分子の効果を高めるために、少なくとも１つの物質と連結されて抗体コンジュゲートを形成しうる。
【００６３】
本発明の他の一態様において、本発明は抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸に関する。
【００６４】
本書において、核酸は、細胞、細胞溶解物中に存在するものであり得、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在するものであり得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当分野で知られる他の技術を包含する標準的な方法で、他の細胞成分または他の汚染物、例えば他の細胞核酸またはタンパク質から精製されているとき、「単離されている」または「実質的に純粋である」。本発明の核酸は、例えばＤＮＡまたはＲＮＡであり得、イントロン配列を含むかまたはイントロン配列を含まないものであり得る。
【００６５】
本発明の他の一態様において、本発明は、核酸を含む組換え発現ベクターに関する。
【００６６】
抗体またはそのフラグメントの発現のために、標準的な分子生物学的技術（例えば、ＰＣＲ増幅、または標的抗体を発現するハイブリドーマを用いるｃＤＮＡクローニング）によって、部分長または完全長を有する軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを得ることができ、ＤＮＡを、発現ベクターに挿入されるように、転写および翻訳調節配列に「作動可能に結合」することができる。
【００６７】
本書において、用語「作動可能に結合」するとは、抗体遺伝子がベクター中に、ベクター中の転写および翻訳調節配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する意図される機能を持つようにライゲートされることをさしうる。発現ベクターおよび発現調節配列は、使用する発現用宿主細胞との適合性を持つように選択される。抗体の軽鎖遺伝子および抗体の重鎖遺伝子は、別個のベクターに挿入されるか、または同じ発現ベクターに挿入される。抗体は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクター上の相補的制限酵素部位のライゲーション、または制限酵素部位が全く存在しない場合は、平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。いくつかの態様において、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードしうる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にフレームにしたがって結合するように、ベクター中にクローン化されうる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち免疫グロブリン以外のタンパク質に由来するシグナルペプチド）でありうる。さらに、組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を包含しうる。当業者は、発現ベクターのデザインは、形質転換する宿主細胞の種類、タンパク質の発現レベル等といった因子に応じた調節配列の変更によって変わりうることを認識することができる。
【００６８】
他の一態様において、本発明は、組換え発現ベクターが導入された細胞に関する。
【００６９】
本開示の抗体を生産するために使用する細胞は、原核生物、酵母、またはより高等な真核生物の細胞でありうるが、それに限定されない。
【００７０】
特に、バチルス属の株、例えば大腸菌、枯草菌およびバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus tuligensis）、ストレプトミセス属の株、シュードモナス属の株（例えばシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida））、ならびに原核生物宿主細胞株、例えばプロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、およびスタフィロコッカス属の株（例えばスタフィロコッカス・カルノーサス（Staphylococcus carnosus））を使用することができる。
【００７１】
動物細胞の関心が最も高く、有用な宿主細胞株の例は、以下のものを包含するが、それに限定されない：ＣＯＳ−７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、ＣＨＯ／−ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＫ−Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、Ｕ２０Ｓ、またはＨＴ１０８０。
【００７２】
核酸またはベクターは、宿主細胞にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」のために、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞に外来核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を導入する、一般に用いられるさまざまな種類の技術、例えば電気泳動、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、リポフェクション等を用いうる。本発明の抗体は、哺乳動物細胞への適用可能性を考慮して、真核生物細胞において、好ましくは、哺乳動物宿主細胞において発現されうる。抗体の発現に適当な哺乳動物宿主細胞は、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＤＨＦＲ選択マーカーと共に用いられるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を包含する）、ＮＳＯミエローマ細胞、ＣＯＳ細胞またはＳＰ２細胞等を包含しうる。
【００７３】
他の一態様において、本発明は、抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合フラグメントを生産する方法であって、宿主細胞を培養し、抗体またはその抗原結合フラグメントを発現させることを含む方法に関する。
【００７４】
抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、宿主細胞を、抗体が宿主細胞中で発現されるのに十分な時間培養することによって、より好ましくは、抗体が宿主細胞が培養される培養培地中に分泌されるのに十分な時間培養することによって、抗体を生産しうる。
【００７５】
いくつかの態様において、発現された抗体は、宿主細胞から分離され、均一に精製されうる。抗体の分離または精製は、タンパク質に一般に用いられる分離方法、精製方法、例えばクロマトグラフィーによって実施されうる。クロマトグラフィーは、例えば、プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムを含む、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または疎水性クロマトグラフィーを包含しうる。クロマトグラフィーに加えて、濾過、限外濾過、塩析、透析等をさらに組み合わせて、抗体を分離および精製しうる。
【実施例】
【００７６】
以下、下記実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。しかしながら、下記実施例は単に本発明を説明するためのものであり、当業者には、本発明の範囲が実施例に限定されると解釈されるものでないことは明らかであろう。
【実施例１】
【００７７】
マウスモノクローナル抗Ａｎｇ２抗体の調製
１−１：ヒトＡｎｇ２によるマウスの免疫
抗原としての使用のために、ヒトＡｎｇ２（ｈＡｎｇ２、配列番号２）の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を、ＣＭＶプロモーターを含むベクター中にクローン化し、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞株へのトランスフェクションによって一過性に発現させた。５日間のインキュベーション後、発現された組換えヒトＡｎｇ２−ＲＢＤをアフィニティーカラムによって精製した。精製したヒトＡｎｇ２−ＲＢＤ（１００μｇ／注射）をアジュバントと混合したものによって、５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを１週間に２回、６週間にわたり免疫した。免疫したマウスの血清における抗Ａｎｇ２抗体価を、ｈＡｎｇ２ ＥＬＩＳＡによって調べた。抗体価（１：５０００希釈）が適度に上昇したら（ＯＤ＞１．０）、免疫マウスから脾臓を摘出し、そこからＢリンパ球を単離し、培養したミエローマ細胞（ＳＰ２／０）と融合した。融合細胞を、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含むＨＡＴ培地中で培養し、そこから、ミエローマ細胞とＢリンパ球の融合物のみからなるハイブリドーマ細胞を選択し、培養した。生き延びたハイブリドーマ細胞を９６ウェルプレートに播種し、培養上清をｈＡｎｇ２ ＥＬＩＳＡによって試験した。陽性シグナルを示したハイブリドーマのプールを、限界希釈によるクローン選別のために選択した。最終的に、約５０のモノクローナルハイブリドーマ株を確立した。そのなかで、いくつかのＡｎｇ２結合性抗体がＴｉｅ２活性化活性を示した。Ｔｉｅ２活性化レベルおよびヒトＡｎｇ２に対する高親和性に基づいて候補抗体を選択し、後でヒト化のために処理した。
【００７８】
【表１】
2021514670.tif 000003
【００７９】
１−２：マウスモノクローナル抗Ａｎｇ２抗体の生産および精製
ＥＬＩＳＡ陽性反応に基づいて選択した抗Ａｎｇ２抗体を生産するために、ハイブリドーマ細胞を、Ｔ７５フラスコ（面積７５ｃｍ２）において１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）中で培養した。細胞コンフルエンシーが約９０％に達したら、細胞をＰＢＳで洗い、５０ｍｌの無血清培地（ＳＦＭ、Gibco）と共にインキュベートし３７℃で３日間培養した。その後、各モノクローナルハイブリドーマから抗体が分泌された培養培地を収集し、遠心分離によって細胞を除去し、培養上清を収集し、濾過した。次いで、抗体を、プロテインＧアフィニティーカラム（GE Healthcare）を備えるAKTA精製デバイス（GE Healthcare）を用いて精製した。遠心フィルターユニット（Amicon）を用いて上清をＰＢＳで置換することにより、精製した抗体を濃縮した。
【００８０】
１−３：Ｔｉｅ２受容体活性化 抗Ａｎｇ２抗体の同定およびスクリーニング
マウス抗Ａｎｇ２抗体が内皮細胞においてＴｉｅ２受容体の下流シグナル伝達を誘導するかを調べるために、ＨＵＶＥＣ（Lonza）をｈＡｎｇ２タンパク質と抗Ａｎｇ２抗体の組み合わせで処理し、Ｔｉｅ２受容体の主要な下流シグナル伝達タンパク質であるＡｋｔのリン酸化レベルを、免疫ブロッティングにより分析した。陰性対照群として、全長ｈＡｎｇ２（R&D systems）単独で細胞を処理した。
【００８１】
具体的には、ＨＵＶＥＣ（１×１０５細胞／ｍｌ）を、６０ｍｍ培養皿においてＥＧＭ−２培地（Lonza）中で３７℃で培養した。細胞（９０％のコンフルエンシー）を、血清飢餓のために、無血清ＥＢＭ−２培地と共に４時間インキュベートした。血清飢餓ＨＵＶＥＣを抗Ａｎｇ２抗体とｈＡｎｇ２タンパク質（１μｇ／ｍｌ、R&D system）の混合物で処理し、さらに３０分間インキュベートした。細胞を冷ＰＢＳで洗い、溶解バッファーで処理し、４℃で２０分間溶解した。次いで、１３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により、細胞溶解物を調製した。細胞溶解物に５×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、細胞溶解物を９５℃で５分間沸騰させた。その後、細胞溶解物をＳＤＳ  ＰＡＧＥに付し、タンパク質をニトロセルロース膜（GE）に転写した。
【００８２】
Ａｋｔリン酸化を調べるために、ブロットを５％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔで室温（ＲＴ）で１時間ブロックし、抗ホスホＡｋｔ抗体（Ｓ４７３）と共に４℃で約８時間インキュベートした。増強化学発光（ＥＣＬ）により、ホスホＡｋｔの量を可視化した。その後、膜をストリッピングバッファー（Thermo）中で１５分間インキュベートし、次いで抗Ａｋｔ抗体でリプローブして、全Ａｋｔ量を決定した。
【００８３】
ＡｋｔのＳ４７３におけるリン酸化が、ｈＡｎｇ２と抗Ａｎｇ２抗体、例えば２Ｃ８、４Ｂ９、２Ｆ１０および４Ｅ２のそれぞれとの組み合わせで処理したいくつかの群において、強く誘導された（図１）。
【００８４】
１−４：Octet分析による、ｈＡｎｇ２に対する抗Ａｎｇ２抗体の親和性測定
ｈＡｎｇ２に対するマウスモノクローナ抗体の親和性を、Octetシステム（ForteBio）を用いて測定した。具体的には、バッファーおよびサンプルを、ブラック９６ウェルプレート（９６ウェルＦ型ブラックプレート、Greiner）を用いて、全量２００μｌ／ウェルで測定した。親和性測定用のバイオセンサーは、ＡＲ２Ｇチップ（ForteBio Octet）を用いる測定前に１０分間水和した。水和後、ｈＡｎｇ２を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０バッファー中に１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、ＡＲ２Ｇバイオセンサー上に固定し、１Ｍエタノールアミンでブロックした。マウスモノクローナル抗Ａｎｇ２抗体を１×カイネティックバッファーで５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５および０ｎＭに希釈し、結合に３００秒間、解離に９００秒間付した。親和性測定（ＫＤ）のために、結合速度（Ｋ−ｏｎ）および解離速度（Ｋ−ｏｆｆ）を結合曲線によって分析し（グローバル）、Octetデータ分析v9.0.0.10プログラムを用いて１：１結合モデルにフィットさせた。ＫＤ値を下記の表２に示す。ｈＡｎｇ２に対するマウス抗Ａｎｇ２抗体の親和性を表２に示す。
【００８５】
【表２】
2021514670.tif 000004
【実施例２】
【００８６】
マウス抗Ａｎｇ２抗体のＤＮＡ遺伝子配列分析
実施例１−３において選択した抗体（ハイブリドーマ細胞由来）のＤＮＡヌクレオチド配列を分析した。具体的には、ハイブリドーマ細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で培養し、その後、RNeasyミニキット（Qiagen）を用いて全ＲＮＡを得た。その後、ＲＮＡ濃度を測定し、逆転写（ＲＴ）反応によってｃＤＮＡを合成した。各ハイブリドーマ細胞において産生されたモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子配列を増幅するために、前記ｃＤＮＡを鋳型とし、マウスＩｇプライマーセット（Novagen）を使用して、以下の条件下にＰＣＲを行った：９４℃、５分間；［９４℃に１分間、５０℃に１分間、７２℃に２分間］を３５サイクル；７２℃に６分間；４℃に冷却。各反応から得たＰＣＲ産物をＴＡベクター中にクローン化し、ＤＮＡシーケンシングに付し、それによって、各抗体のＣＤＲ、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を得た（表３〜１０）。
【００８７】
【表３】
2021514670.tif 000005
【００８８】
【表４】
2021514670.tif 000006
【００８９】
【表５】
2021514670.tif 000007
【００９０】
【表６】
2021514670.tif 000008
【００９１】
【表７】
2021514670.tif 000009
【００９２】
【表８】
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【００９３】
【表９】
2021514670.tif 000011
【００９４】
【表１０】
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【実施例３】
【００９５】
ｈＡｎｇ２に対するマウス抗Ａｎｇ２抗体のエピトープマッピング
マウスモノクローナル抗体２Ｃ８および４Ｂ９によって認識されるｈＡｎｇ２の抗原決定基（エピトープ）を、ＨＤＸ−ＭＳ（水素／重水素交換質量分析）法により分析した。ＨＤＸ−ＭＳ分析法は、下記文献に記載されている：Houde D, Engen JR (2013) Methods Mol. Biol. 988: 269-89およびHoude et al. (2011) J. Pharm. Sci. 100 (6), 2071。
【００９６】
抗体２Ｃ８および４Ｂ９のエピトープを分析するために、組換えｈＡｎｇ２−ＲＢＤタンパク質を用いた。重水素標識反応の前に、ｈＡｎｇ２−ＲＢＤ／抗体混合物を、１５倍希釈重水素標識バッファーの存在下に最大結合（１００％）に維持されるように、３時間以上インキュベートした（ＫＤ＝２５ｎＭ）。調製したｈＡｎｇ２−ＲＢＤ／抗体複合体を重水素標識バッファーで１５倍希釈し、さまざまな時間で標識し、その後、同体積のクエンチングバッファーでクエンチした。標識反応時間は、０分間（重水素なし）、０．３３分間、１０分間、６０分間および２４０分間であった。しかしながら、重水素なしの条件においては、重水素標識バッファーを平衡バッファーで置き換え、反応を直ちにクエンチングバッファーで停止させた。質量分析のために、重水素標識したｈＡｎｇ２−ＲＢＤ／抗体サンプルをペプシンカラムにロードし、ペプチド消化を行った。質量分析により、ｈＡｎｇ２−ＲＢＤのＮ末端の１３ペプチド、および２５〜４０アミノ酸に対応する消化ペプチドは全く検出されないことが示され、全部で４５の消化ペプチドからカバー率８３．７％のデータが得られた。
【００９７】
ｈＡｎｇ２−ＲＢＤ単独およびｈＡｎｇ２−ＲＢＤ−抗体複合体の条件の間の重水素取り込みの差を比較分析した。重水素取り込みの有意な低下を示す領域は、抗体が直接結合しているペプチドであるか、または構造的に変化した領域である。ｈＡｎｇ２−ＲＢＤ単独とｈＡｎｇ２−ＲＢＤ−抗体複合体との間の重水素取り込みの差が０．５〜１Ｄａまたはそれ以上であるとき、有意と見なした。
【００９８】
重水素取り込みの差の分析により、抗体２Ｃ８が結合するエピトープは、ｈＡｎｇ２−ＲＢＤの配列番号２の残基６１〜７８：ＱＲＴＷＫＥＹＫＶＧＦＧＮＰＳＧＥＹ（配列番号１１５）であり（表１１）、抗体４Ｂ９が結合するエピトープは、配列番号２の残基１４〜２４：ＫＳＧＨＴＴＮＧＩＹＴ（配列番号１１６）、および配列番号２の残基４１〜４７：ＥＡＧＧＧＧＷ（配列番号１１７）である（表１２）ことが示された。抗体４Ｂ９の場合、未決定領域（配列番号２の残基２５〜４０）がエピトープの範囲に含まれる可能性を排除できない。各抗体に対するエピトープ分析結果は、PyMolソフトウェアを用いて作製されたｈＡｎｇ２−ＲＢＤの３次元構造において異なる色で示される（図２）。
【００９９】
【表１１−１】
2021514670.tif 000013
【０１００】
【表１１−２】
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【０１０１】
【表１２】
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【実施例４】
【０１０２】
マウス抗Ａｎｇ２抗体のヒト化および全長ＩｇＧ変換
マウス抗Ａｎｇ２抗体２Ｃ８および４Ｂ９をヒトに投与する際の免疫原性を低下するために、抗体を次のようにヒト化した。
【０１０３】
４−１：重鎖のヒト化
ＩＧＨＶ１−４６−０１は、抗体２Ｃ８の重鎖配列と６４％の相同性を示すヒト抗体重鎖可変遺伝子であった。この分析に基づいて、２Ｃ８抗体のＣＤＲ領域をヒト抗体重鎖可変遺伝子ＩＧＨＶ１−４６−０１に挿入した。このプロセスにおいて、５つのヒト化重鎖抗体遺伝子をデザインした（表１３）。ヒト化２Ｃ８の重鎖遺伝子に、表１３のタンパク質配列中に太字で示すマウス配列への復帰変異を導入した。
【０１０４】
ＩＧＨＶ３−１１−０１は、抗体４Ｂ９の重鎖配列と８０％の相同性を示すヒト抗体重鎖可変遺伝子であった。この分析に基づいて、４Ｂ９抗体のＣＤＲ領域をヒト抗体重鎖可変遺伝子ＩＧＨＶ３−１１−０１に挿入した。その結果、このプロセスにおいて、３つのヒト化重鎖抗体遺伝子をデザインした（表１３）。ヒト化４Ｂ９の重鎖遺伝子に、表１３のタンパク質配列中に太字で示すマウス配列への復帰変異を導入した。
【０１０５】
４−２：軽鎖のヒト化
ＩＧＫＶ１−９−０１は、抗体２Ｃ８の軽鎖配列と６７％の相同性を示すヒト抗体軽鎖可変遺伝子であった。この分析に基づいて、２Ｃ８抗体のＣＤＲ領域をヒト抗体軽鎖可変遺伝子ＩＧＨＶ１−９−０１に挿入した。このプロセスにおいて、３つのヒト化軽鎖抗体遺伝子をデザインした（表１３）。ヒト化２Ｃ８の軽鎖遺伝子に、表１３のタンパク質配列中に太字で示すマウス配列への復帰変異を導入した。
【０１０６】
ＩＧＫＶ１−３９−０１は、抗体４Ｂ９の軽鎖配列と７０％の相同性を示すヒト抗体軽鎖可変遺伝子であった。この分析に基づいて、４Ｂ９抗体のＣＤＲ領域をヒト抗体軽鎖可変遺伝子ＩＧＨＶ１−３９−０１に挿入した。このプロセスにおいて、１つのヒト化軽鎖抗体遺伝子をデザインした（表１３）。
【０１０７】
４−３：ヒト化遺伝子合成およびヒト全長ＩｇＧ抗体へのクローニング
表１５の抗体のヒト化可変領域を、ヒトＩｇＧ１抗体の重鎖および軽鎖ベクター中に組み込んだ。抗体のヒト化重鎖可変領域（ＶＨ）に対応するコーディングヌクレオチドは、「ＥｃｏＲＩ−シグナル配列−ＶＨ−ＮｈｅＩ−ＣＨ−ＸｈｏＩ」からなるように、Bioneer, Inc.によって合成された。抗体のヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）に対応するコーディングヌクレオチドは、「ＥｃｏＲＩ−シグナル配列−ＶＬ−ＢｓｉＷＩ−ＣＬ−ＸｈｏＩ」からなるように、Bioneer, Inc.によって合成された。全長ヒトＩｇＧ抗体発現用のベクターを作製するためにＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを用いて、重鎖をコードするポリヌクレオチドをそれぞれ、OptiCHO（商標）抗体発現キット（Invitrogen）に含まれるpOptiVEC（商標）-TOPO TAクローニングキットのベクターにクローン化し、軽鎖をコードするポリヌクレオチドをそれぞれ、pcDNA（商標）3.3-TOPO TAクローニングキット（Invitrogen）のベクターにクローン化した。２Ｃ８Ｈ１１および４Ｂ９Ｈ１１のヒトＩｇＧ４クラスの抗体（それぞれ、２Ｃ８Ｈ１１Ｇ４および４Ｂ９Ｈ１１Ｇ４と称する）の作製のためには、２Ｃ８Ｈ１１重鎖遺伝子および４Ｂ９Ｈ１１重鎖遺伝子の定常領域（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を、ＩｇＧ４クラス重鎖定常領域をコードするポリヌクレオチドに置き換えた。
【０１０８】
【表１３−１】
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【表１３−２】
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【表１３−３】
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【表１３−４】
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【表１３−５】
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【表１３−６】
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【表１３−７】
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【表１３−８】
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【表１３−９】
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【表１３−１０】
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【表１３−１１】
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【表１３−１２】
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【表１３−１３】
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【表１３−１４】
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【表１３−１５】
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【表１３−１６】
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【表１３−１７】
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【表１３−１８】
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【０１０９】
４−４：ヒト化抗Ａｎｇ２抗体の生産および精製
ヒト化抗Ａｎｇ２抗体を生産するために、組換えタンパク質を高効率で産生することができるＥｘｐｉ２９３Ｆ（Gibco）細胞を使用した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）をエルレンマイヤーフラスコ中で培養し、重鎖および軽鎖をコードするプラスミドを、ExpiFectamine 293トランスフェクションキットを用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に同時トランスフェクトした。細胞を振盪インキュベーター（オービタルシェーカー、１２５ｒｐｍ）内で、３７℃、８％ＣＯ２にて５日間培養した。培養した培地を収集し、遠心分離して細胞を除去した。分泌された抗体を含む培養上清を分離し、４℃で貯蔵するか、または直ちに、アフィニティーカラム（プロテインＡアガロースカラム、GE Healthcare）を備えるAKTA精製システム（GE Healthcare）を用いて精製した。精製した抗体を、０．２μタンパク質遠心式フィルター（Amicon）に通して濃縮し、溶液をＰＢＳで置換した。
【実施例５】
【０１１０】
ｈＡｎｇ２に対するヒト化抗Ａｎｇ２抗体の親和性測定
ｈＡｎｇ２に対するヒト化抗Ａｎｇ２抗体の親和性を、Octetシステム（ForteBio）を用いて測定した。具体的には、バッファーおよびサンプルを、ブラック９６ウェルプレート（９６ウェルＦ型ブラックプレート、Greiner）を用いて、全量２００μｌ／ウェルで測定した。親和性測定用のバイオセンサーは、ＡＲ２Ｇチップ（ForteBio Octet）を用いる測定前に１０分間水和した。水和後、ヒト化抗Ａｎｇ２抗体を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０バッファー中に１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、ＡＲ２Ｇバイオセンサー上に固定し、１Ｍエタノールアミンでブロックした。組換えｈＡｎｇ２を１×カイネティックバッファーで５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５および０ｎＭに希釈し、結合に３００秒間、解離に９００秒間付した。親和性測定（ＫＤ）のために、結合速度（Ｋ−ｏｎ）および解離速度（Ｋ−ｏｆｆ）を結合曲線によって分析し（グローバル）、Octetデータ分析v9.0.0.10プログラムを用いて１：１結合モデルにフィットさせた。ＫＤ値を下記の表１４〜１５に示す。
【０１１１】
ｈＡｎｇ２に対するヒト化４Ｂ９抗体の親和性を表１４に示す。ｈＡｎｇ２に対するヒト化２Ｃ８抗体の親和性を表１５に示す。さらに、ＩｇＧ４クラスの２Ｃ８Ｈ１１Ｇ４および４Ｂ９Ｈ１１Ｇ４抗体も、ｈＡｎｇ２抗原に対しナノモル以下の高い親和性を示した（表１６）。
【０１１２】
【表１４】
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【０１１３】
【表１５】
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【０１１４】
【表１６】
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【実施例６】
【０１１５】
選択したヒト化抗Ａｎｇ２抗体のインビトロ生物学的性質の分析
６−１：Ａｋｔリン酸化
ヒト化抗Ａｎｇ２抗体が内皮細胞においてＴｉｅ２受容体の下流シグナル伝達を誘導するかを調べるために、ＨＵＶＥＣ（Lonza）をＡｎｇ２タンパク質とヒト化抗Ａｎｇ２抗体とで処理した。その後、Ｔｉｅ２受容体の主要な下流シグナル伝達タンパク質であるＡｋｔのリン酸化のレベルを、免疫ブロッティングにより測定した。本試験において、Ａｋｔ活性化の程度を比較するために、細胞を、完全長ｈＡｎｇ２（R&D systems）単独、または抗体単独で処理した。
【０１１６】
具体的には、６０ｍｍ培養皿においてＨＵＶＥＣ細胞（１×１０５細胞／ｍｌ）をＥＧＭ−２（Lonza）中で３７℃で培養した。コンフルエンシー９０％の細胞をＥＢＭ−２（Lonza）と共に４時間インキュベートした。血清飢餓ＨＵＶＥＣを、抗Ａｎｇ２抗体とｈＡｎｇ２タンパク質（１μｇ／ｍｌ、R&D system）の混合物で処理し、さらに３０分間インキュベートした。細胞を冷ＰＢＳで洗い、溶解バッファーで処理し、４℃で２０分間溶解した。次いで、１３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により細胞溶解物を調製した。細胞溶解物に５×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、混合物を９５℃で５分間沸騰させた。その後、混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでウエスタンブロッティングに付した。
【０１１７】
Ａｋｔのリン酸化を調べるために、膜を５％スキムミルク含有ＴＢＳＴでＲＴで１時間ブロックし、抗ホスホＡｋｔ抗体（Ｓ４７３）と共に４℃で約８時間インキュベートした。増強化学発光（ＥＣＬ）によって、ホスホＡｋｔの量を可視化した。次いで、膜をストリッピングバッファー（Thermo）中で１５分間インキュベートし、その後、抗Ａｋｔ抗体でリプローブして全Ａｋｔの量を決定した。
【０１１８】
図３に示すように、４Ｂ９Ｈ１１および２Ｃ８Ｈ１１処理群のいずれにおいても、Ａｋｔリン酸化は、ｈＡｎｇ２存在下の抗Ａｎｇ２抗体０．５μｇ／ｍｌでの処理によって顕著に増加し、５０μｇ／ｍｌの抗体濃度まで維持された。データはヒト化抗Ａｎｇ２抗体は、内皮細胞においてＴｉｅ２受容体の主要な下流シグナル伝達分子であるＡｋｔの活性化を強く誘導できることを示している。ヒト化４Ｂ９Ｈ１１−または２Ｃ８Ｈ１１−ＩｇＧ４抗体を試験した場合も同様のパターンが見られた。
【０１１９】
６−２：ヒト化抗Ａｎｇ２抗体により誘導されるＴｉｅ２リン酸化
Ａｎｇ２はＴｉｅ２受容体に結合して、弱いアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する。本発明の抗Ａｎｇ２抗体は、Ａｎｇに結合してＡｎｇ２−抗体複合体を誘導し、さらにＴｉｅ２受容体のクラスター形成を引き起こし、結果的にＴｉｅ２受容体の活性化を高める。ＨＵＶＥＣを用いて、Ｔｉｅ２リン酸化に対する抗Ａｎｇ２抗体の効果を分析する実験を行った。
【０１２０】
具体的には、１００ｍｍ培養皿においてＨＵＶＥＣ（Lonza）をＥＧＭ−２（Lonza）中で３７℃および５％のＣＯ２濃度で培養した。８０〜９０％のコンフルエンシーで、細胞を血清飢餓のためにＥＢＭ−２（Lonza）培地に２〜６時間交換した。ヒト化抗Ａｎｇ２抗体をさまざまな濃度（０．０２μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ）でｈＡｎｇ２タンパク質（１μｇ／ｍｌ、R&D systems）と３０分間混合した。その後、混合物で培養細胞を処理し、さらに３０分間インキュベートした。細胞を冷ＰＢＳで２回洗い、１０００μｌの溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％Triton X-100、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤）で溶解し、４℃で６０分間溶解した。細胞抽出物を調製し、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清をＢＣＡアッセイによる測定に付した。
【０１２１】
０．５ｍｇの細胞溶解物に、１μｇのＴｉｅ２抗体（R&D systems、AF313）を加え、４℃で一晩インキュベートした。その後、Dynabeads（商標）プロテインＧ（Life technologies）を加えて２時間反応させ、免疫沈降を行った。ビーズをチューブの１つの側に磁石で集め、溶解バッファーで３回洗い、還元剤を含む２×ＳＤＳサンプルバッファーと共に７０℃で１０分間インキュベートした。ビーズをサンプルから取り出し、４〜１５％ＳＤＳタンパク質ゲル（Bio-Rad）上で電気泳動し、０．４５μｍのＰＶＤＦ膜に転写した。
【０１２２】
膜を、５％（ｖ／ｖ）ＢＳＡと混合したＴＢＳ−Ｔにより室温で１時間ブロックし、抗ホスホチロシン抗体（4G10、Millipore）と共に４℃で８時間インキュベートし、次いでＨＲＰ結合抗マウス抗体とインキュベートした後、ウエスタンブロッティングを行った。免疫沈降Ｔｉｅ２の量を測定するために、膜をストリッピングバッファー（Thermo）中で１５分間反応させ、次いで再度ブロックし、抗Ｔｉｅ２抗体（R&D systems、AF313）でリプローブした。図４に示すように、図３に示したのと同様、抗Ａｎｇ２抗体をＡｎｇ２と共にＨＵＶＥＣ細胞に加えたとき、Ｔｉｅ２リン酸化が用量依存的に強く誘導された。同様のパターンが、ヒト化４Ｂ９Ｈ１１−または２Ｃ８Ｈ１１−ＩｇＧ４抗体を試験したときにも見られた。これらのデータは、ヒト化抗Ａｎｇ２抗体２Ｃ８Ｈ１１および４Ｂ９Ｈ１１は、ヒト内皮細胞においてＴｉｅ２受容体の活性化を直接に誘導することを示している。
【０１２３】
６−３：ＨＵＶＥＣにおけるＴｉｅ２クラスター形成およびＦＯＸＯ１移行
抗Ａｎｇ２抗体による、細胞間結合部位におけるＴｉｅ２クラスター形成、および核からサイトゾルへのＦＯＸＯ１の移行を、ＨＵＶＥＣにおいて免疫蛍光により試験した。具体的には、ＨＵＶＥＣを８ウェルスライドチャンバー（Lab-TekII）に播種し、ＥＧＭ−２培地中に２〜３日間維持した。１００％コンフルエンスで、細胞をＥＢＭ−２培地で４時間の血清飢餓に付し、その後１μｇ／ｍｌの抗Ａｎｇ２抗体と１μｇ／ｍｌのｈＡｎｇ２とで３０分間処置した。その後、細胞をＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで室温（ＲＴ）で１０分間固定し、ＰＢＳ中の０．１％Triton X-100で透過性とし、ＰＢＳ中の１％のＢＳＡでＲＴで６０分間ブロックし、一次抗体と共にＲＴで１時間インキュベートした。ｈＴｉｅ２、ＦＯＸＯ１およびヒトＦｃに対する一次抗体を使用した。次いで、細胞を二次抗体（Invitrogen）と共に暗所においてＲＴで１時間インキュベートし、ＤＡＰＩ（Vector Labs）と共にVectashieldマウンティング培地を用いてマウントした。レーザー走査共焦点顕微鏡（LSM880, CarlZeiss）で画像を撮影した。
【０１２４】
図５に示すように、２Ｃ８Ｈ１１または４Ｂ９Ｈ１１とｈＡｎｇ２による処理は、Ｔｉｅ２クラスター形成および活性化を誘導することが知られているComp-Ang1（ＣＡ１）または対照Ａｎｇ２抗体（Han et al., 2016, Science Translation Medicine）とまったく同じように、細胞間接着へのＴｉｅ２移行／クラスター形成を誘導した。リン酸化後の細胞質におけるＦＯＸＯ１局在化の過去の報告（Zhang et al, JBC 2002, 277, 45276-45284）と一致して、ＦＯＸＯ１は血清飢餓基底状態において核内に局在したが、Ｃ２８Ｈ１１＋ｈＡｎｇ２または４Ｂ９Ｈ１１＋ｈＡｎｇ２による処理によって、血清飢餓対照と比較して、核から顕著に消失した（赤）。一方、Ａｎｇ２による処理は、核からサイトゾルへのＦＯＸＯ１移行をわずかに誘導した。興味深いことに、２Ｃ８Ｈ１１、４Ｂ９Ｈ１１ヒト化抗体（シアン）は、細胞間接着におけるクラスター形成Ｔｉｅ２受容体およびサイトゾル中に取り込まれたＴｉｅ２受容体と共局在することが観察され（図５）、抗Ａｎｇ２抗体はＡｎｇ２との結合を介してＴｉｅ２受容体と３成分複合体を形成することが示された。
【０１２５】
２Ｃ８Ｈ１１により誘導されるＴｉｅ２クラスター形成およびＦＯＸＯ１移行を経時試験（１０分〜２４０分）において調べた。図６に示すように、ｈＡｎｇ２の存在下に対照Ａｎｇ２Ａｂは、細胞間接着におけるＴｉｅ２クラスター形成（緑）を１０分以内に誘導し、クラスター形成したＴｉｅ２受容体のエンドサイトーシスを誘導した。対照Ａｎｇ２Ａｂ＋ｈＡｎｇ２での３０分間の処理後、細胞間接着におけるＴｉｅ２受容体は明らかに減少し、１２０分および２４０分後にＴｉｅ２受容体はほぼ消失した。対照Ａｎｇ２抗体を抗ヒトＦｃ抗体で染色すると（シアン）、Ｔｉｅ２受容体とまったく同様のパターンが示された。対照的に、２Ｃ８Ｈ１１とｈＡｎｇ２の場合は、細胞間接着におけるＴｉｅ２クラスター形成は、２４０分の処理後にも維持された。これに一致して、細胞間接着においてＴｉｅ２受容体と共局在した２Ｃ８Ｈ１１抗体も、２４０分後まで維持された（図６）。
【０１２６】
６−４：ヒト化抗Ａｎｇ２抗体による血管透過性抑制
インビトロ血管透過性アッセイキット（Millipore）を製造者の指示にしたがって使用して、ＨＵＶＥＣにおいて血管漏出アッセイを行った。ＨＵＶＥＣをトランスウェルプレートのインサートに播種し、１００％コンフルエンスとなるまで３日間培養した。ＨＵＶＥＣを、Ａｎｇ２（１μｇ／ｍｌ）、Ａｎｇ２（１μｇ／ｍｌ）と対照、２Ｃ８Ｈ１１または４Ｂ９Ｈ１１抗体（１μｇ／ｍｌ）の組み合わせと共に３０分間インキュベートし、その後ＴＮＦ−ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）を加え、細胞を３７℃で２２時間インキュベートした。上部チャンバーにＦＩＴＣ−デキストランを加え、２０分間インキュベートした。ＦＩＴＣ−デキストランのＨＵＶＥＣ単層透過を、それぞれ４８５ｎｍおよび５３５ｎｍの励起波長および発光波長で蛍光リーダーにより測定した。図７に示すように、Ａｎｇ２と抗Ａｎｇ２抗体の組み合わせによる前処理は、血管漏出促進因子ＴＮＦ−ａにより誘発される血管漏出を顕著に抑制した。
【実施例７】
【０１２７】
ｍＡｎｇ２に対するヒト化抗Ａｎｇ２抗体の親和性測定
マウスＡｎｇ２（ｍＡｎｇ２）に対するヒト化抗体の親和性をＥＬＩＳＡによって分析した。具体的には、ハーフ９６ウェルプレート（Corning 3690）においてウェル当たり２０ｎｇで、ｍＡｎｇ２を３０μｌのコーティングバッファー（０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファー）で希釈し、４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔ溶液で３回洗った後、ウェルプレートを３％スキムミルクにより室温で１時間ブロックし、その後再度洗った。２Ｃ８Ｈ１１および４Ｂ９Ｈ１１を３ｍｇ／ｍｌから３００ｎｇ／ｍｌまで連続希釈した。希釈した抗Ａｎｇ２抗体３０μｌをウェルに入れ、ウェルプレートを室温で２時間インキュベートした。次いで、１：３００００希釈した抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）−ＨＲＰ（Jackson）二次抗体３０μｌを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。全ての反応の完了後、プレートを再びＴＢＳ−Ｔで洗い、各ウェルを３０μｌのＴＭＢ溶液で処理した。５分間発色させた後、プレートを１Ｎ硫酸で処理して反応を停止させ、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。測定したＯＤ値に基づき、PerkinElmerのWorkoOut 2.5プログラムを用いてＥＣ５０値を分析した。ｍＡｎｇ２結合における４Ｂ９Ｈ１１および２Ｃ８Ｈ１１のＥＣ５０はそれぞれ、１０５μｇ／ｍｌおよび９７μｇ／ｍｌであった（図８）。
【実施例８】
【０１２８】
ＬＬＣ皮下モデルにおける腫瘍増殖抑制効果の評価
２Ｃ８Ｈ１１抗Ａｎｇ２抗体の腫瘍増殖抑制能力を、ＬＬＣ（ルイス肺癌）細胞株腫瘍モデルにおいて試験した。具体的には、ＬＬＣ細胞株（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳ（Gibco）を補充したＤＭＥＭ（Gibco）中で培養した。ケタミンおよびキシラジンの混合物で麻酔した６〜８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Jackson Laboratory）に、ＬＬＣ細胞（ＰＢＳ１００μｌ中１×１０６）を皮下注射した。腫瘍体積が５０〜１００ｍｍ３に達したら、マウスに１０ｍｇ／ｋｇの２Ｃ８Ｈ１１抗体を２〜３日毎に腹腔内投与した。単剤処置群および併用処置群の両方に、シスプラチン（Ｃｐｔ）を３ｍｇ／ｋｇの用量で１回腹腔内注射した。その後の日々の腫瘍体積の変化を追跡した。腫瘍体積（Ｖ）は、式：
Ｖ＝（幅２×長さ）／２
にしたがって求めた。
【０１２９】
試験は次の４群において行った：Ｆｃ（対照群）、Ｆｃ＋Ｃｐｔ群、２Ｃ８Ｈ１１群、および２Ｃ８Ｈ１１＋Ｃｐｔ群。図９に示すように、２Ｃ８Ｈ１１抗体はＦｃと比較して、腫瘍増殖を２９％抑制し、これは、Ｆｃ＋Ｃｐｔ注射による腫瘍増殖抑制効果と同程度であった。２Ｃ８Ｈ１１およびＣｐｔの併用処置は、Ｆｃと比較して腫瘍増殖を４７％遅延させた。したがって、これらの結果は、２Ｃ８Ｈ１１およびＣｐｔの併用処置が腫瘍増殖を最も強力に抑制したことを示している。
【実施例９】
【０１３０】
２Ｃ８Ｈ１１抗体の腫瘍血管正常化作用
２Ｃ８Ｈ１１抗体による腫瘍血管の変化を調べるために、腫瘍サンプルの凍結切片を調達し、血管特異的マーカーであるＣＤ３１およびペリサイト特異的マーカーであるＰＤＧＦＲβの染色によって免疫蛍光分析を行った。具体的には、実施例８に記載の実験のマウスから腫瘍サンプルを採取し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Merck）で固定し、３０％スクロース（Junsei）で脱水し、ＯＣＴ化合物（Leica）に包埋し、クリオスタット（Leica）を用いて切断した。得られた凍結切片を、タンパク質ブロッキングバッファー（DAKO）を用いて１時間ブロックした。次いで、ＰＢＳ中のハムスター抗ＣＤ３１抗体（１：２００、Millipore）およびラット抗ＰＤＧＦＲβ抗体（１：２００、eBioscience）により、４℃で８時間染色処理した。ＰＢＳで３回洗った後、切片をＰＢＳ中のAlexa488結合抗ハムスターＩｇＧ抗体およびAlexa594結合抗ラットＩｇＧ抗体（１：１０００、Jackson Immunoresearch）により、室温で１時間染色した。ＰＢＳでさらに３回洗った後、切片を、カバースリップ（Marienfeld）を用いて蛍光マウンティング培地（DAKO）中でマウントした。染色切片を、LSM880共焦点顕微鏡（Zeiss）を用いて画像化した。
【０１３１】
結果を図１０に示す。赤色のシグナルはＣＤ３１＋領域を示し、緑色のシグナルはＰＤＧＦＲβ＋領域を示す。ＦｃまたはＦｃ＋Ｃｐｔで処理した腫瘍と比較して、２Ｃ８Ｈ１１または２Ｃ８Ｈ１１＋Ｃｐｔで処理した腫瘍において腫瘍血管（ＢＶ）密度が５６％低下し、該血管系の形態学が正常血管と同様となるよう正常化された。さらに、２Ｃ８Ｈ１１または２Ｃ８Ｈ１１＋Ｃｐｔで処理した腫瘍ではＰＤＧＦＲβ＋ペリサイト領域が増加し（２．４倍増加）、血管および血管周囲細胞が互いにより密に会合していた。これらの結果は、２Ｃ８Ｈ１１抗体が腫瘍塊内の血管密度を低下し、その形態学を正常化することができることを示している。
【実施例１０】
【０１３２】
２Ｃ８Ｈ１１抗体による腫瘍血管機能の向上
２Ｃ８Ｈ１１で処置後の腫瘍血管の機能を分析するために、血管灌流性および低酸素状態を評価した。腫瘍塊を採取する前に、マウスに１００μｌのDyLight488-レクチン（Vector laboratory）を腹腔内注射し、ＰＢＳに溶解した６０ｍｇ／ｋｇのピモニダゾール−ＨＣｌ（Hypoxyprobe）を屠殺前３０分間腹腔内注入した。マウスを４％ＰＦＡで灌流固定した。腫瘍塊から凍結切片を調達し、ＰＢＳ中のハムスター抗ＣＤ３１抗体（１：２００、Millipore）および4.3.11.3マウスパシフィックブルー−Ｍａｂ（１：５０、Hypoxyprobe）で染色した。LSM880共焦点顕微鏡（Zeiss）を用いて切片を画像化し、得られた画像を、ImageJソフトウェア（http://rsb.info.nih.gov/ij)）を用いてレクチン＋領域／ＣＤ３１＋領域およびHypoxyprobe＋領域を定量して分析した。
【０１３３】
結果を図１１に示す。ＦｃまたはＦｃ＋Ｃｐｔによる処置と比較して、２Ｃ８Ｈ１１または２Ｃ８Ｈ１１＋Ｃｐｔで処置した腫瘍は、レクチン＋領域（緑）／ＣＤ３１＋領域（赤）の増加で判断されるように、灌流が増加しており（約３倍の灌流増加）、腫瘍血管の正常化を示した。さらに、Hypoxyprobe＋領域（緑）で示される低酸素は、２Ｃ８Ｈ１１または２Ｃ８Ｈ１１＋Ｃｐｔで処置した腫瘍において、ＦｃまたはＦｃ＋Ｃｐｔで処置した腫瘍と比較して７２％減少した。これらの結果は、２Ｃ８Ｈ１１抗体は、腫瘍血管の形態学を正常化するだけでなく、その機能をも、血管灌流の増加によって向上し、それによって低酸素の軽減をもたらすことを示している。
【実施例１１】
【０１３４】
２Ｃ８Ｈ１１抗体による腫瘍塊中への抗癌剤デリバリーの増加
薬剤ＣｐｔはＤＮＡ合成の阻害によって腫瘍増殖を抑制するものであり、ヒト癌患者において広く用いられている。この薬剤の腫瘍へのデリバリーを２Ｃ８抗体が腫瘍血管正常化によって増加しうるかを調べるために、腫瘍の凍結切片を、抗シスプラチン修飾ＤＮＡ抗体（１：１００、Abcam）およびハムスター抗ＣＤ３１抗体（１：２００、Millipore）で染色した。図１２に示すように、Ｃｐｔ修飾ＤＮＡ（緑）のレベルは、２Ｃ８Ｈ１１／Ｃｐｔ処置群において、Ｆｃ＋Ｃｐｔ処置群と比較して２．１倍の顕著な増加を示した。この結果は、腫瘍塊へのＣｐｔデリバリーが、２Ｃ８Ｈ１１抗体による腫瘍血管の正常化によって高められたこと、それによって腫瘍増殖が強力に抑制されることを示している。
【実施例１２】
【０１３５】
レーザー誘発ＣＮＶモデルにおける２Ｃ８Ｈ１１抗体のＣＮＶ低減および血管漏出抑制効果
２Ｃ８Ｈ１１抗体について、滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の指標である脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を抑制する能力を、レーザー誘発ＣＮＶモデルを用いて試験した。５ｍｇ／ｍｌのフェニレフリンおよび５ｍｇ／ｍｌのトロピカミドの点眼剤（Santen Pharmaceutical）による散瞳、および局所麻酔用の０．５％プロパラカイン塩酸塩点眼剤（Alcon）の点眼後に、スリットランプデリバリーシステムを備えるレーザー光凝固装置（Lumenis Inc.）を、網膜観察用コンタクトレンズとしてのカバーガラスと共に用いた。各眼の４つの位置（後極の３、６、９および１２時の位置）に十分なレーザーエネルギー（波長５３２ｎｍ、出力２５０ｍＷ、持続時間１００ｍｓ、スポットサイズ５０μｍ）をデリバーした。レーザー光凝固時にブルッフ膜の裂傷を意味する泡を生じた傷害のみを、本試験に含めた。レーザー部位において出血を含むスポットを、分析から除外した。臨床的状況を模すために、２Ｃ８Ｈ１１（５μｇ）をレーザー光凝固後７日目のマウスに、硝子体内投与した（図１３Ａ）。対照として、または比較のために、ＦｃまたはＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（各５μｇ）を同じ方法でマウスに投与した。所定の薬剤を硝子体内投与するために、各薬剤５μｇを含む約１μｌ（５ｍｇ／ｍｌ）を、ガラスキャピラリーピペットを取り付けたNanoliter 2000マイクロインジェクター（World Precision Instruments）を用いて、硝子体腔内に注入した。レーザー光凝固後１４日目に、網膜色素上皮（ＲＰＥ）−脈絡膜−強膜フラットマウントのＣＤ３１＋ＣＮＶの体積を、MATLAB画像処理ツールボックス（MathWorks）を用いて計算した。ＣＮＶの内皮細胞の検出のために、抗ＣＤ３１抗体（１：２００、Millipore）を使用した。ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐは効果的に、Ｆｃと比較して６４．４％のＣＮＶ低減をもたらし、２Ｃ８Ｈ１１も同様にＣＮＶ低減をもたらした（６５．３％）（図１３Ｂ、Ｃ）。フルオレセイン血管造影（ＦＡ）およびインドシアニングリーン血管造影（ＩＣＧＡ）を組み合わせることにより、レーザー傷害部位付近の新血管における血管漏出を測定することができた。フルオレセインおよびＩＣＧの励起光源として、それぞれ４８８ｎｍおよび７８５ｎｍの連続波レーザーモジュールを使用した。回転ポリゴンミラー（MC-5; Lincoln Laser）およびガルバノメーターベースの走査ミラー（6230H; Cambridge technology）からなるスキャナーシステムによって、励起レーザーのラスタースキャンパターンを達成し、撮影レンズの後部開口にデリバーした。広視野の眼底蛍光画像を提供する撮影レンズとして、高開口数（ＮＡ）の対物レンズ（PlanApo λ, NA 0.75; Nikon）を使用した。光電子増倍管（R9110; Hamamatsu Photonics）により検出した蛍光シグナルを、リアルタイムで、フレームグラバーによってデジタル変換し、フレーム当たり５１２×５１２ピクセルのサイズの画像へと再構成した。血管造影システムを用いる、後期相（６分間）のＦＡおよびＩＣＧＡ画像の可視化のために、１０ｍｇのフルオレセインナトリウム（Alcon）および０．１５ｍｇのＩＣＧ（Daiichi Pharmaceutical）をそれぞれ腹腔内および静脈内に投与した。画像の質を高めるために、撮影手順を全身麻酔および散瞳下に行った。ＣＮＶからの漏出面積を、ＦＡ画像において測定された高蛍光の総面積を、ＩＣＧＡ画像において測定された総ＣＮＶ面積で除したものとして、Javaベースのイメージングソフトウェア（ImajeJ; National Institutes of Health）を用いて計算した。Ｆｃと比較して、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（３７．０％）および２Ｃ８Ｈ１１（３８．３％）の両方が同じように血管漏出を抑制した（図１３Ｂ、Ｄ）。注目すべきことに、Ｆｃ処置群はレーザー光凝固後６〜１４日目の間に血管漏出の顕著な変化を示さなかったが、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐおよび２Ｃ８Ｈ１１は血管漏出を顕著に低下させた（それぞれ４５．６％および５０．０％）（図１３Ｂ、Ｄ）。したがって、レーザー誘発ＣＮＶのマウスモデルにおいてＣＮＶおよび血管漏出の抑制の程度は、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐと２Ｃ８Ｈ１１との間で、量的に差が無かった。
【実施例１３】
【０１３６】
２Ｃ８Ｈ１１抗体のＣＮＶ低減および脈絡膜毛細血管再生作用
ＣＮＶ確立後のＣＮＶ低減および脈絡膜毛細血管再生における２Ｃ８Ｈ１１の効果を調べるために、レーザー光凝固後７日目のマウスに、Ｆｃ、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、対照抗体または２Ｃ８Ｈ１１（各５μｇ）を、Nanoliter 2000マイクロインジェクター（World Precision Instruments）によって硝子体内投与した。レーザー光凝固後、６、１４、２１および３５日目に、生体光コヒーレンストモグラフィー血管造影（ＯＣＴＡ）を行った（図１４Ａ）。プロトタイプの高速波長掃引型光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）システムを使用して、１０４８ｎｍを中心とするカスタム リングキャビティ波長掃引レーザーを用い、Ａスキャンレート２３０ｋＨｚで網膜脈絡膜層を撮影した。薬剤の硝子体内注入後のレーザー光凝固部位における脈絡膜血管構造の再生をモニターするために、網膜−脈絡膜層内の１．７ｍｍ×１．７ｍｍの視野のＯＣＴ画像を集めた。網膜および脈絡膜実質を伴わず血管の選択的可視化を可能にする断面ＯＣＴ血管画像を得るために、繰り返し記録されたＢスキャン画像を比較して、血管内の赤血球の移動によって主に引き起こされた該画像のピクセル毎の強度の脱相関を検出した。次いで、自動の層平坦化およびセグメンテーションアルゴリズムを使用することにより、断面ＯＣＴ血管画像をＲＰＥに対して平坦化し、網膜内層、網膜外層および脈絡膜層の３つの深度範囲における各平坦化断面ＯＣＴ血管画像の個別の投影によってen face ＯＣＴ血管画像を作製した。外網状層およびブルッフ膜を、網膜内層、網膜外層および脈絡膜層を隔てる境界層として規定した。網膜および脈絡膜血管の密度を、閾値レベルを上回る脱相関値を有するピクセルとして定義される、血流のある血管の占める測定面積の割合として、自動計算した。無血管ピクセルを、脈絡膜層を示すen face ＯＣＴ血管画像から、MATLABの画像処理ツールボックス（MathWorks）によって検出した。その後、レーザー傷害部位の周囲の無血管スペースの総体積を、１ピクセルの体積を掛けた無血管ピクセルの数を合計することによって計算した。無血管スペース体積の変化する様相を分析するために、各眼において連続的に測定された値をベースライン値からの変化パーセンテージに変換した。Ｆｃ処置した場合、網膜外層のＣＮＶ体積にわずかな減少が見られ、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐおよび２Ｃ８Ｈ１１で処置した場合はＣＮＶ体積は顕著に低下した（図１４Ｂ、Ｃ）。Ｆｃ処置した場合、脈絡膜の無血管スペースのわずかな減少が見られた。興味深いことに、２Ｃ８Ｈ１１処置眼の脈絡膜は、レーザー光凝固後１４、２１および３５日目にそれぞれ３０．１％、３６．４％および３７．０％という、段階的な著しい無血管スペース減少を示した（図１４Ｂ、Ｄ）。同様に、対照Ａｂ処置眼の脈絡膜は、レーザー光凝固後１４、２１および３５日目にそれぞれ２１．７％、３０．２％および３８．０％という、無血管スペースの減少を示した（図１４Ｂ、Ｄ）。しかしながら、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ処置眼の脈絡膜は、１４、２１および５日目にそれぞれ１１．４％、１６．０％および１８．１％の無血管スペース増加を示した（図１４Ｂ、Ｄ）。これらの知見は全体として、レーザー誘発ＣＮＶモデルにおいて、２Ｃ８Ｈ１１および対照Ａｂの両方が脈絡膜���細血管の再生を促進するが、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐは脈絡膜毛細血管の退化をもたらすことを示している。
【実施例１４】
【０１３７】
ＣＮＶの内皮細胞における２Ｃ８Ｈ１１抗体およびＣＤ３１の共局在
皮下注射された２Ｃ８Ｈ１１も、ＣＮＶに対して処置効果を示すことができるかを調べるために、まず、ＣＮＶの内皮細胞における２Ｃ８Ｈ１１抗体およびＣＤ３１の共局在を評価した。レーザー光凝固後１日目に、２Ｃ８Ｈ１１抗体（２５ｍｇ／ｋｇ）の皮下投与を行った。対照として、Ｆｃ（２５ｍｇ／ｋｇ）を同じ様式でマウスに投与した。レーザー光凝固後２、４および８日目に、ＣＮＶの内皮細胞における２Ｃ８Ｈ１１抗体および抗ＣＤ３１抗体（１：２００、Millipore）の共局在を、抗ヒトＩｇＧ抗体（１：１０００、Jackson ImmunoResearch Laboratories）で直接に検出した（図１５Ａ）。投与された２Ｃ８Ｈ１１は、ＣＮＶ領域におけるＣＤ３１＋内皮細胞において高度に検出可能であった（図１５Ｂ〜Ｄ）。
【実施例１５】
【０１３８】
皮下注射２Ｃ８Ｈ１１抗体のＣＮＶ抑制効果
ＣＮＶ抑制における皮下注射２Ｃ８Ｈ１１抗体の効果を調べるために、レーザー光凝固後１日目に、２Ｃ８Ｈ１１抗体（２５ｍｇ／ｋｇ）の皮下投与を行った。対照として、Ｆｃ（２５ｍｇ／ｋｇ）を同じ様式でマウスに投与した。レーザー光凝固後８日目に、抗ＣＤ３１抗体（１：２００、Millipore）を用いてＣＮＶの内皮細胞を検出し、ＲＰＥ−脈絡膜−強膜フラットマウントのＣＤ３１＋ＣＮＶの体積を、MATLAB画像処理ツールボックス（MathWorks）を用いて計算した（図１６Ａ）。２Ｃ８Ｈ１１は効果的に、ＣＮＶ形成をＦｃと比較して６９．９％抑制した（図１６Ｂ、Ｃ）。このことは、２Ｃ８Ｈ１１は、硝子体内注射だけでなく皮下注射によっても、ＣＮＶ抑制作用を示すことを示している。
【０１３９】
本発明の微生物は２Ｃ８と称され、Cancer Research Institute, Seoul National University, College of Medicine, 28 Yongon-dong, Chongno-Gu, Seoul, 110-744, KoreaのKorean Cell Line Bank（ＫＣＬＢ）に２０１８年１月３０日に寄託された（受託番号：ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００４１７）。
【０１４０】
本発明の微生物は４Ｂ９と称され、Cancer Research Institute, Seoul National University, College of Medicine, 28 Yongon-dong, Chongno-Gu, Seoul, 110-744, KoreaのKorean Cell Line Bank（ＫＣＬＢ）に２０１８年１月３０日に寄託された（受託番号：ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００４１８）。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明は、Ａｎｇ２を阻害すると同時にＴｉｅ２を活性化して下流シグナル伝達を促進する抗体に関する。本発明はそれにより、Ａｎｇ２により誘導される血管形成を抑制し、血管透過性を低下する方法を提供する。さらに、本発明の抗体は、異常な血管形成が関与する疾患、例えば眼疾患または癌、および／または血管透過性亢進によって引き起こされる疾患の診断および処置に有用でありうる。
【０１４２】
本発明をその特定の特徴に基づいて詳細に説明したが、そのような特定の技術は好ましい態様に過ぎず、本発明の範囲はそのような態様に限定されないことは当業者に明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲およびその等価物によって規定される。
【０１４３】
［配列表フリーテキスト］
電子ファイルにおいて添付される。
【０１４４】
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【０１４５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2021514670.tif 000051
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
2021514670000001.app
【国際調査報告】
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