(57)【要約】  本発明は、様々な試料マトリックス中の無傷のタンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子を検出及び定量化するための方法に関する。具体的には、方法は、三重鎖形成オリゴヌクレオチドをタンパク質特異的結合パートナーと組み合わせて用いて、コンジュゲート分子のポリヌクレオチド及びタンパク質成分をそれぞれ検出する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のタンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子を検出するための方法であって、
（ａ）前記試料を、標識に共有結合されている三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）と、前記ＴＦＯが前記コンジュゲート分子中のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを可能にする条件下において接触させ、それによりハイブリダイゼーション混合物を形成することと、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション混合物を、前記ＴＦＯに共有結合された前記標識に特異的に結合する捕捉試薬を含む表面と接触させることと、
（ｃ）前記表面を検出試薬と接触させることであって、前記検出試薬は、前記コンジュゲート分子中のタンパク質に特異的に結合する結合パートナーに結合された検出可能なラベルを含む、接触させることと、
（ｄ）前記検出可能なラベルからのシグナルを検出することと
を含む方法。
【請求項２】
前記標識は、ハプテンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ハプテンは、ビオチン、ジゴキシゲニン又は２，４−ジニトロフェノールである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記捕捉試薬は、前記標識に特異的に結合する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標識は、ビオチンであり、及び前記捕捉試薬は、ストレプトアビジンである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記標識は、ジゴキシゲニンであり、及び前記捕捉試薬は、ジゴキシゲニンに特異的に結合する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記結合パートナーは、前記コンジュゲート分子中の前記タンパク質に特異的に結合する抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記検出可能なラベルは、蛍光体、金属ナノ粒子、酵素又は電気化学発光（ＥＣＬ）発光団である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＥＣＬ発光団は、ルテニウム錯体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＦＯは、ロック核酸（ＬＮＡ）モノマーとデオキシリボヌクレオチドとの混合物を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＦＯ中の前記ヌクレオチドの約３０％〜約４０％は、ＬＮＡモノマーである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＦＯは、長さが少なくとも１５ヌクレオチドである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＦＯは、その全長にわたって前記コンジュゲート分子中の前記ポリヌクレオチドの配列と相補的な配列を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記コンジュゲート分子中の前記ポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記コンジュゲート分子中の前記ポリヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡであり、前記ＴＦＯは、前記センス鎖の配列と相補的な配列を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記コンジュゲート分子中の前記タンパク質は、抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記コンジュゲート分子中の前記タンパク質は、抗体であり、及び前記結合パートナーは、前記抗体の標的抗原、抗Ｆｃ領域抗体又は抗イディオタイプ抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記コンジュゲート分子中の前記タンパク質は、細胞表面受容体のリガンドである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記結合パートナーは、前記受容体又はそのリガンド結合フラグメントである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子は、抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記試料は、約２５℃〜約６０℃の温度で前記ＴＦＯと接触されて、前記ハイブリダイゼーション混合物を形成する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料は、約４５℃〜約５５℃の温度で前記ＴＦＯと接触されて、前記ハイブリダイゼーション混合物を形成する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料は、約５０℃〜約５５℃の温度で前記ＴＦＯと接触されて、前記ハイブリダイゼーション混合物を形成する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料は、血清、血漿、組織ホモジネート、製剤原料又は製剤である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
試料中のタンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子を検出するための方法であって、
（ａ）前記試料を、標識に共有結合されているＴＦＯと、前記ＴＦＯが前記コンジュゲート分子中のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを可能にする条件下において接触させ、それによりハイブリダイゼーション混合物を形成することと、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション混合物を、前記コンジュゲート分子中のタンパク質に特異的に結合する捕捉試薬を含む表面と接触させることと、
（ｃ）前記表面を検出試薬と接触させることであって、前記検出試薬は、前記ＴＦＯに共有結合された前記標識に特異的に結合する結合パートナーに結合された検出可能なラベルを含む、接触させることと、
（ｄ）前記検出可能なラベルからのシグナルを検出することと
を含む方法。
【請求項２６】
前記標識は、ハプテンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ハプテンは、ビオチン、ジゴキシゲニン又は２，４−ジニトロフェノールである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記結合パートナーは、前記標識に特異的に結合する抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記標識は、ビオチンであり、及び前記結合パートナーは、ストレプトアビジンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記標識は、ジゴキシゲニンであり、及び前記結合パートナーは、ジゴキシゲニンに特異的に結合する抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記検出可能なラベルは、蛍光体、金属ナノ粒子、酵素又はＥＣＬ発光団である、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＥＣＬ発光団は、ルテニウム錯体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記捕捉試薬は、前記コンジュゲート分子中の前記タンパク質に特異的に結合する抗体である、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＴＦＯは、ロック核酸（ＬＮＡ）モノマーとデオキシリボヌクレオチドとの混合物を含む、請求項２５〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＴＦＯ中の前記ヌクレオチドの約３０％〜約４０％は、ＬＮＡモノマーである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＴＦＯは、長さが少なくとも１５ヌクレオチドである、請求項２５〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＴＦＯは、その全長にわたって前記コンジュゲート分子中の前記ポリヌクレオチドの配列と相補的な配列を有する、請求項２５〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記試料は、約２５℃〜約６０℃の温度で前記ＴＦＯと接触されて、前記ハイブリダイゼーション混合物を形成する、請求項２５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記試料は、約４５℃〜約５５℃の温度で前記ＴＦＯと接触されて、前記ハイブリダイゼーション混合物を形成する、請求項２５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記試料は、約５０℃〜約５５℃の温度で前記ＴＦＯと接触されて、前記ハイブリダイゼーション混合物を形成する、請求項２５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記コンジュゲート分子中の前記ポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２５〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記コンジュゲート分子中の前記ポリヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡであり、前記ＴＦＯは、前記センス鎖の配列と相補的な配列を有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記コンジュゲート分子中の前記タンパク質は、抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項２５〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記コンジュゲート分子中の前記タンパク質は、抗体であり、及び前記捕捉試薬は、前記抗体の標的抗原、抗Ｆｃ領域抗体、抗イディオタイプ抗体、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記コンジュゲート分子中の前記タンパク質は、細胞表面受容体のリガンドである、請求項２５〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記捕捉試薬は、前記受容体又はそのリガンド結合フラグメントである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記タンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子は、抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子である、請求項２５〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記試料は、血清、血漿、組織ホモジネート、製剤原料又は製剤である、請求項２５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１８年６月７日出願の米国仮特許出願第６２／６８１，９３１号明細書の利益を主張する。
【０００２】
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を包含し、その配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１９年５月２３日に作成されたコンピュータ読み取り可能フォーマットの配列表のコピーは、名称がＡ−２２４８−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５であり、サイズが１．７キロバイトである。
【０００３】
本発明は、薬物コンジュゲート分子の検出及び定量化に関する。具体的には、本発明は、サンドイッチベースのアッセイ中で標識三重鎖形成オリゴヌクレオチド及びタンパク質特異的結合パートナーを用いて、試料中の無傷のタンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子を検出及び定量化するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
核酸分子は、治療学の有望な部類を代表し続けている。しかしながら、治療的核酸分子を標的組織に送達することが難題であることが分かっており、様々なアプローチが試みられてきた。１つのこうした送達のアプローチは、対象の細胞型上で発現する細胞表面タンパク質に特異的に結合する標的化タンパク質に治療的核酸分子をコンジュゲートさせることを伴う。したがって、抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートなどのこれらのタンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子が新しい治療法として台頭しつつある。そのため、無傷のタンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子の検出及び定量化を可能にするロバストなアッセイ法を有することが重要である。
【０００５】
無傷のタンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子を検出することに適応可能ないくつかの既存の方法が存在するが、これらは、いくつかの欠点に直面する。例えば、サイズ排除クロマトグラフィは、溶液中で他の種から無傷のタンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子を分離するために用いられ得る。しかしながら、この方法は、主に定性的であり、高レベルの試料純度を必要とするため、血清及び組織ホモジネートなどの複雑な試料マトリックス中での使用に適合性がない。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ−ＭＳ）及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）などの他の方法は、コンジュゲート分子の完全性に影響を及ぼし得る条件又は試料の処理若しくはアッセイ後データ解釈のための様々な時間のかかる工程のいずれかを必要とする。また、高純度の試料が典型的に求められるため、これらの方法のいずれも、複雑な試料マトリックス中でのコンジュゲート分子の検出又は定量化に適合性がない。
【０００６】
抗原ベースの捕捉工程、それに続いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いた抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子のための検出法が報告されている（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４３０：１７１−１７８，２０１２）。しかしながら、この方法は、ｓｉＲＮＡ分子中に存在する化学修飾ヌクレオチドの数及びタイプの影響を受ける可能性のあるＰＣＲプライマー及びプローブのハイブリダイゼーションの効率に大きく依存する。更に、ＰＣＲ工程は、高温（例えば、８５℃以上）の使用を必要とし、これは、タンパク質の分解をもたらし、そのため、場合により、組織ホモジネートなどのより複雑な試料マトリックスにおいてアッセイの使用を制限し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このため、当技術分野において、複雑な生体試料を含む様々な試料タイプにわたって無傷のタンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子の検出及び定量化を可能にするシンプルなアッセイを開発する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、血清及び組織ホモジネートなどの複雑な生体試料を含む様々な試料マトリックスにおいてタンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子を検出及び定量化するための方法を提供する。一実施形態では、方法は、試料を、標識に共有結合されている三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）と、ＴＦＯがコンジュゲート分子中のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを可能にする条件下において接触させ、それによりハイブリダイゼーション混合物を形成することと、ハイブリダイゼーション混合物を、ＴＦＯに共有結合された標識に特異的に結合する捕捉試薬を含む表面と接触させることと、表面を検出試薬と接触させることであって、検出試薬は、コンジュゲート分子中のタンパク質に特異的に結合する結合パートナーに結合された検出可能なラベルを含む、接触させることと、検出可能なラベルからのシグナルを検出することとを含む。
【０００９】
別の実施形態では、方法は、試料を、標識に共有結合されているＴＦＯと、ＴＦＯがコンジュゲート分子中のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを可能にする条件下において接触させ、それによりハイブリダイゼーション混合物を形成することと、ハイブリダイゼーション混合物を、コンジュゲート分子中のタンパク質に特異的に結合する捕捉試薬を含む表面と接触させることと、表面を検出試薬と接触させることであって、検出試薬は、ＴＦＯに共有結合された標識に特異的に結合する結合パートナーに結合された検出可能なラベルを含む、接触させることと、検出可能なラベルからのシグナルを検出することとを含む。
【００１０】
本発明の方法に採用されるＴＦＯは、コンジュゲート分子のポリヌクレオチド成分の配列に相補的な配列を有し得る。ポリヌクレオチド成分が二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）である実施形態では、ＴＦＯは、コンジュゲート分子中のタンパク質に結合されるポリヌクレオチドの鎖の配列に相補的な配列を有し得る。いくつかの実施形態では、ＴＦＯは、長さが少なくとも１５ヌクレオチドであり、二環式糖修飾を含む少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（例えば、ロック核酸）を含む。特定の実施形態では、ＴＦＯは、ロック核酸モノマーとデオキシリボヌクレオチドとの混合物を含む。こうした実施形態では、ＴＦＯ中のヌクレオチドの約３０％〜約４０％は、ロック核酸モノマーである。本発明の方法の特定の実施形態では、ＴＦＯは、標識に共有結合される。標識は、ビオチン、ジゴキシゲニン又は２，４−ジニトロフェノールなどのハプテンであり得る。
【００１１】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、捕捉試薬は、ＴＦＯに共有結合された標識に特異的に結合する。こうした実施形態では、捕捉試薬は、標識に特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントであり得る。例えば、標識は、ジゴキシゲニンであり得、及び捕捉試薬は、ジゴキシゲニンに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントであり得る。他の実施形態では、捕捉試薬は、標識に特異的に結合するタンパク質又はペプチドである。これらの実施形態では、標識は、ビオチンであり得、及び捕捉試薬は、ストレプトアビジンであり得る。
【００１２】
本発明の方法の他の実施形態では、捕捉試薬は、コンジュゲート分子中のタンパク質に特異的に結合する。こうした実施形態では、捕捉試薬は、コンジュゲート分子中のタンパク質に特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントであり得る。例えば、一実施形態では、コンジュゲート分子中のタンパク質は、抗体であり、及び捕捉試薬は、抗Ｆｃ領域抗体又は抗イディオタイプ抗体である。別の実施形態では、コンジュゲート分子中のタンパク質は、ペプチドリガンドであり、及び捕捉試薬は、ペプチドリガンドに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントである。他の実施形態では、捕捉試薬は、コンジュゲート分子のタンパク質成分に特異的に結合するタンパク質又はそのフラグメントであり得る。これらの実施形態では、コンジュゲート分子中のタンパク質は、抗体であり得、及び捕捉試薬は、抗体の標的抗原、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇであり得る。他のこうした実施形態では、コンジュゲート分子中のタンパク質は、細胞表面受容体のリガンドであり、及び捕捉試薬は、受容体又はそのリガンド結合フラグメントである。
【００１３】
本発明の方法で採用される検出試薬は、結合パートナーに結合された検出可能なラベルを含み、結合パートナーは、コンジュゲート分子中のタンパク質又はＴＦＯに共有結合された標識のいずれかに特異的に結合する。結合パートナーに結合された検出可能なラベルは、蛍光体、金属ナノ粒子、金属ナノシェル、酵素又は電気化学発光（ＥＣＬ）発光団などの任意のタイプのシグナル生成実体であり得る。本発明の方法のいくつかの実施形態では、結合パートナーは、コンジュゲート分子中のタンパク質に特異的に結合する。これらの実施形態では、結合パートナーは、コンジュゲート分子中のタンパク質に特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントであり得る。１つのこうした実施形態では、コンジュゲート分子中のタンパク質は、抗体であり、及び結合パートナーは、抗Ｆｃ領域抗体又は抗イディオタイプ抗体である。別の実施形態では、コンジュゲート分子中のタンパク質は、ペプチドリガンドであり、及び結合パートナーは、ペプチドリガンドに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントである。他の実施形態では、結合パートナーは、コンジュゲート分子のタンパク質成分に特異的に結合するタンパク質又はそのフラグメントであり得る。例えば、一実施形態では、コンジュゲート分子中のタンパク質は、抗体又は抗原結合フラグメントであり、及び結合パートナーは、抗体又は抗原結合フラグメントの標的抗原である。別の実施形態では、コンジュゲート分子中のタンパク質は、細胞表面受容体のリガンドであり、及び結合パートナーは、受容体又はそのリガンド結合フラグメントである。
【００１４】
本発明の方法の他の実施形態では、検出試薬中の結合パートナーは、ＴＦＯに共有結合された標識に特異的に結合する。こうした実施形態では、結合パートナーは、標識に特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントであり得る。例えば、一実施形態では、標識は、ジゴキシゲニンであり、及び結合パートナーは、ジゴキシゲニンに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントである。他の実施形態では、結合パートナーは、標識に特異的に結合するタンパク質又はペプチドである。これらの実施形態では、標識は、ビオチンであり得、及び結合パートナーは、ストレプトアビジンであり得る。
【００１５】
本発明の方法は、様々なタイプのタンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子を検出又は測定するために用いることができる。コンジュゲート分子のポリヌクレオチド成分は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ模倣薬、抗ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。コンジュゲート分子のタンパク質成分は、抗体、抗原結合フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント若しくはＦｖフラグメント）又はリガンドであり得る。いくつかの実施形態では、抗体、抗原結合フラグメント又はリガンドは、特定の細胞型又は組織によって発現する受容体に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本発明の方法で検出又は測定されるタンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子は、抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子である。他の実施形態では、本発明の方法で検出又は測定されるタンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子は、リガンド−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子である。
【００１６】
本発明の方法は、様々な試料タイプにおいてタンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子を検出又は測定するために用いることができる。いくつかの実施形態では、試料は、血清、血漿、細胞溶解物又は組織（例えば、組織ホモジネート）などの生体試料である。こうした試料は、タンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子を投与された動物又はヒト対象から得ることができる。いくつかの実施形態では、試料は、タンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子に曝露された細胞培養液（例えば、上清又は溶解物）から得られる。他の実施形態では、試料は、コンジュゲート分子の合成プロセス中の工程からの反応混合物又は生成物など、コンジュゲート分子の製造プロセス中の工程から得られる。更に他の実施形態では、本発明の方法は、品質管理又はロットリリースプロセスの一部として用いられ、試料は、製剤原料又は製剤である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明のアッセイ法の１つのフォーマットを示す概略図である。この実施形態では、標識三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）、例えばビオチン化ＴＦＯは、標識ＴＦＯが抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートのｓｉＲＮＡ成分と三重鎖を形成することを可能にするハイブリダイゼーション条件下において、抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子を含有する試料と接触される。ハイブリダイゼーション混合物は、ＴＦＯに共有結合された標識に特異的に結合する捕捉試薬（例えば、ストレプトアビジン）でコーティングされた表面と接触される。それにより、標識ＴＦＯ−ｓｉＲＮＡハイブリッドを含む抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子は、捕捉試薬−標識相互作用（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用）を介して表面に固定化される。続いて、ルテニウムラベル化抗Ｆｃ抗体などの抗体に特異的に結合するラベル化結合パートナーを用いて、固定化されたコンジュゲートの検出及び定量化が達成される。
【図２Ａ−２Ｂ】低濃度範囲のビオチン化ＴＦＯを用いたアッセイ（図２Ａ；６．２５ｎＭ〜５０ｎＭ）及び高濃度範囲のビオチン化ＴＦＯを用いたアッセイ（図２Ｂ；５０ｎＭ〜２５０ｎＭ）に対する、任意の単位における電気化学発光シグナル（ＭＳＤ応答）に対してプロットされた、試料緩衝液中の抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子の様々な濃度の線グラフである（０．０４ｎｇ／ｍＬ〜２５００ｎｇ／ｍＬ）。図１に示すアッセイのフォーマットを採用した。データを４パラメータ非線形回帰モデル（重み係数１／Ｙ＾２を有するマルカート法）にフィットさせた。Ｒ２値を曲線のそれぞれの丸括弧内に示す。
【図２Ｃ】マウス血清又はマウス肝臓ホモジェネート中の抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子（０．０４ｎｇ／ｍＬ〜２５００ｎｇ／ｍＬ）の濃度と、任意の単位における電気化学発光シグナル（ＭＳＤ応答）との間の関係を示す線グラフである。図１に示すアッセイのフォーマットを採用した。データを４パラメータ非線形回帰モデル（重み係数１／Ｙ＾２を有するマルカート法）にフィットさせた。Ｒ２値を２曲線のそれぞれの丸括弧内に示す。コンジュゲート分子を捕捉するために１００ｎＭのビオチン化ＴＦＯをアッセイで用いた。
【図３Ａ】試料緩衝液中のモノクローナル抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子の濃度（ＡＲＣ；０．０４ｎｇ／ｍＬ〜２５００ｎｇ／ｍＬ）と、任意の単位における電気化学発光シグナル（ＭＳＤ応答）との間の関係を示すグラフである。図１に示すアッセイのフォーマットを採用した。ｓｉＲＮＡ分子Ｔ２を抗ＡＳＧＲ１モノクローナル抗体２５Ｂ３にコンジュゲートするか（Ｔ２−２５Ｂ３）、又は非特異性のキャリアモノクローナル抗体６５５にコンジュゲートした（Ｔ２−６５５）。ｓｉＲＮＡ分子を１又は２のＲＮＡ−抗体比（それぞれＲＡＲ１又はＲＡＲ２）でコンジュゲートした。コンジュゲート分子を捕捉するために１００ｎＭのビオチン化ＴＦＯをアッセイで用いた。
【図３Ｂ】図３Ａに示すデータの線形スケール上のプロットである。データを線形回帰モデルにフィットさせ、フィットさせた線の勾配を計算した。計算された勾配をグラフの下の表に示す。ＲＡＲ１コンジュゲートの回帰線の勾配は、ＲＡＲ２コンジュゲートの回帰線の勾配と比べて低減していた。具体的には、Ｔ２−２５Ｂ３  ＲＡＲ１コンジュゲートの勾配は、Ｔ２−２５Ｂ３  ＲＡＲ２コンジュゲートのそれの７２％であり、Ｔ２−６５５  ＲＡＲ１コンジュゲートの勾配は、Ｔ２−６５５  ＲＡＲ２コンジュゲートのそれの７８％であった。
【図４Ａ】試料緩衝液中のモノクローナル抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子の濃度（ＡＲＣ；０．０４ｎｇ／ｍＬ〜２５００ｎｇ／ｍＬ）と、任意の単位における電気化学発光シグナル（ＭＳＤ応答）との間の関係を示すグラフである。図１に示すアッセイのフォーマットを採用した。ｓｉＲＮＡ分子ＨＰＲＴ又はｓｉＲＮＡ分子Ｃ９１１を抗ＡＳＧＲ１モノクローナル抗体２５Ｂ３にコンジュゲートした（それぞれＨＰＲＴ−２５Ｂ３又はＣ９１１−２５Ｂ３）。ｓｉＲＮＡ分子を１又は２のＲＮＡ−抗体比（それぞれＲＡＲ１又はＲＡＲ２）でコンジュゲートした。コンジュゲート分子を捕捉するために１００ｎＭのビオチン化ＴＦＯをアッセイで用いた。
【図４Ｂ】図４Ａに示すデータの線形スケール上のプロットである。データを線形回帰モデルにフィットさせ、フィットさせた線の勾配を計算した。計算された勾配をグラフの下の表に示す。ＲＡＲ１コンジュゲートの回帰線の勾配は、ＲＡＲ２コンジュゲートの回帰線の勾配と比べて低減していた。具体的には、ＨＰＲＴ−２５Ｂ３  ＲＡＲ１コンジュゲートの勾配は、ＨＰＲＴ−２５Ｂ３  ＲＡＲ２コンジュゲートのそれの７５％であり、Ｃ９１１−２５Ｂ３  ＲＡＲ１コンジュゲートの勾配は、Ｃ９１１−２５Ｂ３  ＲＡＲ２コンジュゲートのそれの６２％であった。
【図５】本発明のアッセイ法の第２のフォーマットを示す概略図である。この実施形態では、標識三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）、例えばジゴキシゲニンラベル化ＴＦＯは、標識ＴＦＯが抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートのｓｉＲＮＡ成分と三重鎖を形成することを可能にするハイブリダイゼーション条件下において、抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子を含有する試料と接触される。ハイブリダイゼーション混合物は、抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの抗体成分に特異的に結合する捕捉試薬（例えば、抗Ｆｃ抗体又は抗体の標的抗原）でコーティングした表面と接触される。捕捉試薬は、表面と直接連結し得るか、又は図示されるビオチン及びストレプトアビジンなどの他の結合パートナーを介して間接的に連結し得る。続いて、ルテニウムラベル化抗ジゴキシゲニン抗体などのＴＦＯに共有結合された標識に特異的に結合するラベル化結合パートナーを用いて、固定化されたコンジュゲートの検出及び定量化が達成される。
【図６】試料緩衝液中のモノクローナル抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子の濃度（ＡＲＣ；０．３８ｎｇ／ｍＬ〜２５０００ｎｇ／ｍＬ）と、任意の単位における電気化学発光シグナル（ＭＳＤ応答）との間の関係を示すグラフである。図５に示すアッセイのフォーマットを採用した。ｓｉＲＮＡ分子Ｔ２を抗ＡＳＧＲ１モノクローナル抗体２５Ｂ３にコンジュゲートするか（Ｔ２−２５Ｂ３）、又は非特異性のキャリアモノクローナル抗体６５５にコンジュゲートした（Ｔ２−６５５）。ｓｉＲＮＡ分子を１又は２のＲＮＡ−抗体比（それぞれＲＡＲ１又はＲＡＲ２）でコンジュゲートした。コンジュゲート分子のｓｉＲＮＡ成分にハイブリダイズし、ルテニウムラベル化抗ジゴキシゲニン抗体を介した検出を可能にするために、１００ｎＭのジゴキシゲニンラベル化ＴＦＯをアッセイで用いた。
【図７】試料緩衝液中のモノクローナル抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子の濃度（ＡＲＣ；０．０４ｎｇ／ｍＬ〜２５００ｎｇ／ｍＬ）と、任意の単位における電気化学発光シグナル（ＭＳＤシグナル）との間の関係示すグラフである。ｓｉＲＮＡ分子Ｔ２を１又は２のＲＮＡ−抗体比（それぞれＲＡＲ１又はＲＡＲ２）で抗ＡＳＧＲ１モノクローナル抗体２５Ｂ３にコンジュゲートした。コンジュゲート分子を２つの異なるアッセイフォーマット：捕捉のために標識ＴＦＯが用いられるアッセイフォーマット１（図１に示すフォーマットを参照されたい）及び検出のために標識ＴＦＯが用いられるアッセイフォーマット２（図５に示すフォーマットを参照されたい）で評価した。アッセイフォーマット１では、コンジュゲート分子を捕捉するためにアッセイでビオチン化ＴＦＯを用い、検出には、ルテニウムラベル化抗ヒトＦｃ抗体を用いた。アッセイフォーマット２では、コンジュゲート分子を捕捉するためにビオチン化抗ヒトＦｃ抗体を用い、検出には、ルテニウムラベル化抗ジゴキシゲニン抗体と組み合わせたジゴキシゲニンラベル化ＴＦＯを用いた。
【図８】試料緩衝液中の抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子（ＡＲＣ）の濃度と、任意の単位における電気化学発光シグナル（ＭＳＤ応答）との間の関係示すグラフである。ビオチン化ヒトＡＳＧＲ１タンパク質を用いてＡＲＣを捕捉し、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレートに固定化した。コンジュゲート分子のｓｉＲＮＡ成分にハイブリダイズし、ルテニウムラベル化抗ジゴキシゲニン抗体を介した検出を可能にするために、ジゴキシゲニンラベル化ＴＦＯをアッセイで用いた。
【図９Ａ】示された時点（２、４、８及び１５日目）で測定された、皮下（ＳＣ）又は静脈内（ＩＶ）で全ての用量群の抗ＡＳＧＲ１ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子を受ける野生型マウス由来の肝臓における標的タンパク質発現を示す線グラフである。ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされた同じｓｉＲＮＡ（ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ）を陽性対照として使用した。５ｍｐｋのＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡにおけるｓｉＲＮＡ量は、２つのｓｉＲＮＡ／ｍＡｂを有する３０ｍｐｋの抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートにおけるｓｉＲＮＡ量と均等である。
【図９Ｂ】皮下（ＳＣ）又は静脈内（ＩＶ）で指定用量の抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子を受けるマウスにおける合計薬物（「合計」）又は無傷の抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子（「無傷」）の経時的な血清濃度間の関係の線グラフである。血清試料は、コンジュゲート分子の投与後２、４、８及び１５日目に取られた。
【図９Ｃ】皮下（ＳＣ）又は静脈内（ＩＶ）で指定用量の抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子を受けるマウスにおける、経時的な合計薬物の肝臓中濃度間の関係の線グラフである。肝臓試料は、コンジュゲート分子の投与後２、４、８及び１５日目に取られた。コンジュゲートの抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ成分を検出する抗ヒトＦｃ／抗ヒトＦｃ  ＥＬＩＳＡを用いて合計薬物を評価した。非コンジュゲートの抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ（２５Ｂ３抗体）の用量調節肝臓濃度を比較のために示す。
【図９Ｄ】皮下（ＳＣ）又は静脈内（ＩＶ）で指定用量の抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子を受けるマウスにおける、経時的な無傷薬物の肝臓中濃度間の関係の線グラフである。図１に示すアッセイフォーマットを用いて無傷薬物を評価した。肝臓試料は、コンジュゲート分子の投与後２、４、８及び１５日目に取られた。ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされた同じｓｉＲＮＡ（ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ）の肝臓濃度を比較のために示す。
【図１０−１】［図１０Ａ］モノクローナル抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子とビオチン化ＴＦＯとのハイブリダイゼーション混合物の天然の質量スペクトルである。ｓｉＲＮＡ分子を１のＲＮＡ−抗体比（ＲＡＲ１）で抗体にコンジュゲートした。ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡ  ＲＡＲ１コンジュゲート分子を５２℃で１時間、ビオチン化ＴＦＯとハイブリダイズさせた。ピークは、１６５ｋＤａで観察され、これは、ビオチン化ＴＦＯがコンジュゲート分子のｓｉＲＮＡ成分にハイブリダイズされて三重鎖（ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡ三重鎖）を形成するコンジュゲート分子に対応する。    ［図１０Ｂ］ビオチン化ＴＦＯの不在下での、図１０ＡのｍＡｂ−ｓｉＲＮＡ  ＲＡＲ１コンジュゲート分子の天然の質量スペクトルである。１５８ｋＤａにおいてのみピークが観察され、これは、１つのｓｉＲＮＡ分子が共有結合されたモノクローナル抗体の予測分子量に対応する。
【図１０−２】同上。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、血清及び組織ホモジネートなどの複雑な生体試料を含む様々な試料マトリックスにおいて無傷のタンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子を検出及び定量化するための方法の開発に関する。方法は、サンドイッチベースのフォーマットにおいてタンパク質特異的結合パートナーとの組み合わせで標識三重鎖形成オリゴヌクレオチドを使用して、同じ分子内のコンジュゲートのポリヌクレオチド及びタンパク質成分の存在（すなわちコンジュゲートが無傷であること）を判定する。本発明の方法は、タンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子の合成、安定性及びスクリーニングを含む様々な用途に有用である。方法は、無傷のタンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子のクリアランスプロファイル及びその生体内代謝低下を理解するための薬物動態及び薬物代謝研究に用いることもできる。方法は、治療的タンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子を含む製剤原料及び製剤の品質管理及びロットリリースにおける用途も見出す。
【００１９】
本発明の方法は、タンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲートを含む試料を三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）と接触させることを伴う。ＴＦＯは、フーグスティーン又は逆フーグスティーン型水素結合を介して二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ分子の主溝中で配列特異的な方法で結合するオリゴヌクレオチドである。ピリミジンに富む鎖は、フーグスティーン型塩基対によって二重鎖中のプリンに富む鎖と平行配向で結合され、ＴＦＯ中のチミン（Ｔ）及びシトシン（Ｃ）は、アデニン（Ａ）−Ｔ及びグアニン（Ｇ）−Ｃ塩基対を認識して、それぞれＴ−ＡＴ及びＣ＋−ＧＣ塩基三重鎖を生成する。プリンに富む鎖は、逆フーグスティーン型塩基対によって二重鎖中のプリンに富む鎖と逆平行配向で結合され、ＴＦＯ中のＡ及びＧはＡＴ及びＧＣ塩基対を認識して、それぞれＡ−ＡＴ及びＧ−ＧＣ基三重鎖を生成する。塩基修飾又はヌクレオシドアナログを含有するＴＦＯは、プリン及びピリミジンヌクレオチドの混合物を含有する二重鎖と三重鎖を形成し得る（例えば、Ｒｕｓｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３３：３０２５−３０３２，２００５を参照されたい）。
【００２０】
本発明の方法で用いられるＴＦＯは、一般的には、長さが少なくとも約１５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＴＦＯは、長さが約１５〜約３０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、ＴＦＯは、タンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート中のポリヌクレオチドと同じ長さを有し得る。例えば、ＴＦＯは、タンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート中の一本鎖ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）と同じ長さを有し得る。別の実施形態では、ＴＦＯは、タンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート中の二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）中の鎖の１つと同じ長さを有し得る。これら及び他の実施形態では、ＴＦＯは、長さが約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は２６ヌクレオチドであり得る。一実施形態では、ＴＦＯは、長さが約１９ヌクレオチドである。別の実施形態では、ＴＦＯは、長さが約２１ヌクレオチドである。
【００２１】
特定の実施形態では、ＴＦＯは、コンジュゲート分子中のポリヌクレオチドの配列と相補的な配列を有する。特定の条件下において、第１の配列を含むポリヌクレオチドが、第２の配列を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズして二重鎖又は三重鎖領域を形成することができる場合、第１の配列は、第２の配列に「相補的」である。「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイゼーション」は、典型的には、２つのポリヌクレオチドにおける相補的塩基間の水素結合（例えば、ワトソン−クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合）を介した相補的ポリヌクレオチドの対合を指す。第１の配列を含むポリヌクレオチドが、第２の配列を含むポリヌクレオチドとミスマッチすることなく、１つ又は両方のヌクレオチド配列の全長にわたって塩基対形成する場合、第１の配列は、第２の配列と完全に相補的（１００％相補的）であるとみなされる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ＴＦＯは、コンジュゲート分子中のポリヌクレオチドの配列と完全に相補的な配列を有し、例えば、ＴＦＯの配列は、ＴＦＯの全長にわたってポリヌクレオチドの配列と相補的である。コンジュゲート分子中のポリヌクレオチドが二本鎖ポリヌクレオチドである実施形態では、ＴＦＯは、二本鎖ポリヌクレオチドの鎖の１つと相補的（例えば、完全に相補的）であり得る。例えば、特定のこうした実施形態では、ＴＦＯは、タンパク質に共有結合されている二本鎖ポリヌクレオチドの鎖と相補的（例えば、完全に相補的）である。コンジュゲート分子中のポリヌクレオチドが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡである実施形態では、ＴＦＯは、センス鎖の配列と相補的（例えば、完全に相補的）な配列を有する。コンジュゲート分子中のポリヌクレオチドがｓｉＲＮＡである他の実施形態では、ＴＦＯは、アンチセンス鎖の配列と相補的（例えば、完全に相補的）な配列を有する。標的配列（例えば、標的ｍＲＮＡ）と相補的な配列を有する領域を含むｓｉＲＮＡの鎖は、「アンチセンス鎖」と称される。「センス鎖」は、アンチセンス鎖の領域と相補的な領域を含む鎖を指す。いくつかの実施形態では、センス鎖は、標的配列と同一の配列を有する領域を含み得る。
【００２３】
特定の実施形態では、本発明の方法に用いられるＴＦＯは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、核酸塩基、ペントース環又はホスフェート基に対する１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。本明細書で使用する場合、修飾ヌクレオチドは、アデノシンモノホスフェート、グアノシンモノホスフェート、ウリジンモノホスフェート及びシチジンモノホスフェートを含有するリボヌクレオチド又はデオキシアデノシンモノホスフェート、デオキシグアノシンモノホスフェート、デオキシチミジンモノホスフェート及びデオキシシチジンモノホスフェートを含有するデオキシリボヌクレオチドを包含しない。しかしながら、ＴＦＯは、修飾ヌクレオチド、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの組み合わせを含み得る。三重鎖形成を促進すると報告されている修飾ヌクレオチドとしては、２’−アミノエトキシ−５−（３−アミノプロプ−１−イニル）ウリジン（ＢＡＵ）、３−メチル−２アミノピリジン（ＭｅＰ）、６−（３−アミノプロピル）−７−メチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２（７Ｈ）−オン（ＡＰＰ）、Ｎ−（４−（３−アセトアミドフェニル）チアゾール−２−イル−アセトアミド）、ロック核酸（ＬＮＡ；２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシルヌクレオチド）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ；２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−β−Ｄ−リボフラノシルヌクレオチド）、２’−Ｏ，４’−Ｃ−アミノメチレン架橋核酸（２’，４’−ＢＮＡＮＣ）、５−メチルシトシン、２−チオウリジン、５−プロピニル−デオキシウリジン、８−アミノプリン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、ユニバーサル塩基、２’−アミノエチルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキ（ａｌｋｙ）ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド）及び修飾インターヌクレオシド結合を有するヌクレオチド（例えば、ホスホルアミデートインターヌクレオシド結合、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合及びペプチド核酸（ＰＮＡ））が挙げられる。例えば、Ｒｕｓｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３３：３０２５−３０３２，２００５；Ｄｕｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３６：５１２３−５１３８，２００８；及びＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４１：６６６４−６６７３，２０１３を参照されたい。本発明の方法に用いられるＴＦＯは、これらの修飾ヌクレオチドの１つ以上又はこれらの組み合わせを含み得る。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ＴＦＯは、二環式糖修飾を有する１つ以上のヌクレオチドを含む。「二環式糖修飾」は、ペントース環の修飾を指し、この場合、架橋が環の２つの原子を接続して、二環性糖構造をもたらす第２の環を形成する。いくつかの実施形態では、二環式糖修飾は、ペントース環の４’及び２’炭素間の架橋を含む。二環式糖修飾を有する糖部分を含むヌクレオチドは、本明細書では二環式核酸又はＢＮＡと称される。例示的な二環式糖修飾としては、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）二環式核酸（ＢＮＡ）；β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ（ロック核酸又はＬＮＡとも称される）；エチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＢＮＡ（エチレン架橋核酸又はＥＮＡとも称される）；アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ；オキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＢＮＡ；メチル（メチレンオキシ）（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ（拘束エチル（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｅｔｈｙｌ）又はｃＥｔとも称される）；メチレン−チオ（４’−ＣＨ２−Ｓ−２’）ＢＮＡ；メチレン−アミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ；メチル炭素環式（４’−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−２’）ＢＮＡ；プロピレン炭素環式（４’−（ＣＨ２）３−２’）ＢＮＡ；及びメトキシ（エチレンオキシ）（４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＭｅ）−Ｏ−２’）ＢＮＡ（拘束ＭＯＥ（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ＭＯＥ）又はｃＭＯＥとも称される）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ＴＦＯは、１つ以上のＬＮＡモノマーを含む。別の実施形態では、ＴＦＯは、１つ以上のＥＮＡモノマーを含む。
【００２５】
特定の実施形態では、本発明の方法で用いられるＴＦＯは、ＬＮＡモノマーとデオキシリボヌクレオチドとの混合物を含む。一般に、ＴＦＯ中のＬＮＡモノマーの数及び配置は、ＴＦＯと相補的ＲＮＡ鎖との複合体の融解温度（Ｔｍ）が約７５℃〜約８５℃、約７７℃〜約８２℃又は約８０℃であるようなものである。Ｔｍは、実験によって測定することができるか、又は最近隣モデル（例えば、Ｏｗｃｚａｒｚｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４（３）：２１７−２３９，１９９７；ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９５（４）：１４６０−１４６５，１９９８）を参照されたい）などの様々な熱力学モデルを用いて予測することができる。ＥｘｉｑｏｎからのＲＮＡ  Ｔｍ予測アルゴリズムなど、ＬＮＡモノマー含有オリゴヌクレオチドのＴｍを予測するための予測ツールも公的に入手可能である（ｅｘｉｑｏｎ．ｃｏｍ／ｌｓ／Ｐａｇｅｓ／ＥｘｉｑｏｎＴＭＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎＴｏｏｌで入手可能な予測ツールを参照されたい）。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ＴＦＯ中のヌクレオチドの約３０％〜約４０％がＬＮＡモノマーである。例えば、例として、長さ２１ヌクレオチドのＴＦＯは、６〜８個のＬＮＡモノマーを有し得る。特定の実施形態では、長さ約１５ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチドのＴＦＯは、４〜１２個のＬＮＡモノマー、５〜１０個のＬＮＡモノマー又は６〜８個のＬＮＡモノマーを有し得る。非ＬＮＡモノマーは、修飾ヌクレオチド（例えば、本明細書に記載される修飾ヌクレオチドのいずれか）、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドであり得る。特定の実施形態では、非ＬＮＡモノマーは、デオキシリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＬＮＡモノマーは、標的Ｔｍ範囲（約７５℃〜約８５℃）を維持しながら、ＴＦＯ全体にわたって可能な限り均一に配置される。関連する実施形態では、ＴＦＯは、４個以下の連続するＬＮＡモノマーを有する。
【００２７】
ＴＦＯは、当技術分野で既知の技法、例えば従来の核酸固相合成を使用して容易に作製することができる。ＴＦＯは、標準ヌクレオチド又はヌクレオシド前駆体（例えば、ホスホラミダイト）を利用する好適な核酸合成装置上で構築することができる。自動核酸合成装置は、いくつかのベンダーによって市販されており、これとしては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置、ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｉｒｖｉｎｇ、ＴＸ）のＭｅｒＭａｄｅ合成装置及びＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）のＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ合成装置が挙げられる。カスタムオリゴヌクレオチド合成は、Ｅｘｉｑｏｎ／Ｑｉａｇｅｎ（Ｖｅｎｌｏ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及びＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）などのいくつかのベンダーから利用可能であるため、所望の配列及び化学修飾を備えるＴＦＯも商業的に購入することができる。
【００２８】
好ましくは、本発明の方法で用いられるＴＦＯは、標識に共有結合される。標識は、ＴＦＯに共有結合されることが可能であり、且つそれに対する特異的結合パートナーが入手可能であるか又は生成可能である任意の分子的実体であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、標識は、タンパク質、ペプチド、グリコペプチド、炭水化物又はハプテンである。いくつかの実施形態では、標識は、標識に対して標識特異性抗体が産生され得るように、動物種において十分に免疫原性である。特定の実施形態では、標識は、ハプテンである。ハプテンは、ビオチン、ジゴキシゲニン又は２，４−ジニトロフェノールであり得るが、これらに限定されない。一実施形態では、標識は、ビオチンである。別の実施形態では、標識は、ジゴキシゲニンである。
【００２９】
標識は、ＴＦＯの５’若しくは３’末端に共有結合され得るか、又はＴＦＯに組み込まれるヌクレオチドに結合され得る（例えば、ヌクレオチドの糖又は骨格構成要素の修飾を介して）。一実施形態では、標識は、ＴＦＯの３’末端に共有結合される。別の実施形態では、標識は、ＴＦＯの５’末端に共有結合される。標識は、スクシンイミドエステルカップリング、チオールカップリング、クリック化学及びＺｅａｒｆｏｓｓ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．９４１：１８１−１９３，２０１２に記載される方法など、当技術分野で既知の方法を用いてＴＦＯに結合され得る。所望の標識に共有結合されたＴＦＯは、上記のベンダーなど、カスタムオリゴヌクレオチド合成サービスを提供する商業的ベンダーによって調製することもできる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＴＦＯがコンジュゲート分子中のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを可能にする条件下において、標的タンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子を含む試料を標識ＴＦＯと接触させることにより、ハイブリダイゼーション混合物を形成することを含む。ハイブリダイゼーション条件は、標的ポリヌクレオチドのタイプ（例えば、一本鎖又は二本鎖）並びにＴＦＯの配列及び化学修飾の程度に基づいて調節され得る。しかしながら、一般的に、試料中に存在し得るコンジュゲート分子のポリヌクレオチド成分へのＴＦＯのハイブリダイゼーションは、約２５℃〜約６０℃、約４５℃〜約５５℃、約５０℃〜約５５℃又は約５２℃の温度で約３０分〜約９０分又は約６０分間実施される。特定の実施形態では、コンジュゲート分子のポリヌクレオチド成分へのＴＦＯのハイブリダイゼーションは、６５℃を超える温度では実施されない。好適なハイブリダイゼーション緩衝液としては、ｐＨを７〜８の範囲に維持する緩衝液、塩及び界面活性剤が挙げられ得る。例示的なハイブリダイゼーション緩衝液は、３０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ及び０．２％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む。追加の好適なハイブリダイゼーション緩衝液は、当業者に既知である。
【００３１】
ポリヌクレオチド成分にハイブリダイズされた標識ＴＦＯを含むコンジュゲート分子は、ＴＦＯに共有結合された標識に特異的に結合する捕捉試薬を用いて試料から単離することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、試料を、標識に共有結合されているＴＦＯと、ＴＦＯがコンジュゲート分子中のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを可能にする条件下において接触させ、それによりハイブリダイゼーション混合物を形成することと、ハイブリダイゼーション混合物を、ＴＦＯに共有結合された標識に特異的に結合する捕捉試薬を含む表面と接触させることとを含む。こうした実施形態では、捕捉試薬は、標識に特異的に結合するか又はそれを認識することができる任意の分子であり得る。分子は、標的分子に対して、他の無関係な分子に対する親和性と比較して、同様の結合アッセイ条件下でより高い結合親和性を有し、その結果、その標的分子を区別することができる場合、その標的分子に「特異的に結合」している。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、≦１×１０−６Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）で標識に結合し得る。他の実施形態では、捕捉試薬は、≦１×１０−８Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）で標識に結合し得る。
【００３２】
標識に特異的に結合する捕捉試薬としては、ポリペプチド、アプタマー、グリコペプチド、レクチン及び抗体又はその抗原結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、標識に特異的に結合する捕捉試薬は、抗体又はその抗原結合フラグメントである。抗体の抗原結合フラグメントは、完全長の重鎖及び／又は軽鎖に存在するアミノ酸の少なくともいくつかを欠くが、それでもなお抗原に特異的に結合することができる抗体の一部である。抗原結合フラグメントとしては、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ナノボディ（例えば、ラクダ重鎖抗体のＶＨドメイン）、ＶＨＨ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、Ｆｄ断片及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、捕捉試薬は、標識に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００３３】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、ＴＦＯに共有結合する標識は、ビオチンであり、及び捕捉試薬は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン又は抗ビオチン抗体若しくはその抗原結合フラグメントである。一実施形態では、標識は、ビオチンであり、及び捕捉試薬は、ストレプトアビジンである。本発明の方法の他の実施形態では、ＴＦＯに共有結合する標識は、ジゴキシゲニンであり、及び捕捉試薬は、抗ジゴキシゲニン抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００３４】
代わりに、ポリヌクレオチド成分にハイブリダイズされた標識ＴＦＯを含むコンジュゲート分子は、コンジュゲート分子のタンパク質成分に特異的に結合する捕捉試薬を用いて試料から単離することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、試料を、標識に共有結合されているＴＦＯと、ＴＦＯがコンジュゲート分子中のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを可能にする条件下において接触させ、それによりハイブリダイゼーション混合物を形成することと、ハイブリダイゼーション混合物を、コンジュゲート分子中のタンパク質に特異的に結合する捕捉試薬を含む表面と接触させることとを含む。こうした実施形態では、捕捉試薬は、タンパク質又はタンパク質に組み込まれたマーカー実体に特異的に結合することができる任意の分子であり得る。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、≦１×１０−６Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）でタンパク質又はマーカー実体に結合し得る。他の実施形態では、捕捉試薬は、≦１×１０−８Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）でタンパク質又はマーカー実体に結合し得る。
【００３５】
タンパク質に特異的に結合する捕捉試薬としては、ポリペプチド、アプタマー、グリコペプチド、リガンド、受容体、多糖、抗原及び抗体又はその抗原結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、コンジュゲート分子中のタンパク質に特異的に結合する捕捉試薬は、抗体又はその抗原結合フラグメントである。特定の実施形態では、コンジュゲート分子中のタンパク質は、リガンド（例えば、細胞表面受容体のリガンド）であり、及び捕捉試薬は、リガンド結合ドメインを含有するリガンドの受容体又は受容体のフラグメント（例えば、受容体のリガンド結合フラグメント）である。他の実施形態では、コンジュゲート分子中のタンパク質は、抗体又はその抗原結合フラグメントであり、及び捕捉試薬は、抗体又は抗原結合フラグメントの標的抗原（又はエピトープを含有する抗原のフラグメント）である。更に他の実施形態では、コンジュゲート分子中のタンパク質は、抗体であり、及び捕捉試薬は、抗Ｆｃ領域抗体、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇなど、抗体のＦｃ領域に特異的に結合するタンパク質である。更なる他の実施形態では、コンジュゲート分子中のタンパク質は、抗体又はその抗原結合フラグメントであり、及び捕捉試薬は、抗イディオタイプ抗体である。抗イディオタイプ抗体は、別の抗体のイディオタイプと結合する抗体である。抗体のイディオタイプは、抗体の可変領域内に存在するイディオトープの特定の組み合わせである。
【００３６】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、捕捉試薬は、コンジュゲート分子中のタンパク質に組み込まれたマーカー実体に特異的に結合する。マーカー実体は、コンジュゲート分子中のタンパク質の例えばＮ末端又はＣ末端に融合可能なペプチド配列である。マーカー実体の例としては、ポリヒスチジン（例えば、６〜８ヒスチジン残基）、カルモジュリン結合タンパク質、ｍｙｃ配列（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号：４）、赤血球凝集素（ＨＡ）配列（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号：５）及びＦＬＡＧ配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号：６）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、捕捉試薬は、コンジュゲート分子中のタンパク質と融合したマーカー実体に結合する抗体又は抗原結合フラグメントである（例えば、捕捉試薬は、抗ｍｙｃ、抗ＨＡ又は抗ＦＬＡＧ抗体である）。他の実施形態では、捕捉試薬は、マーカー実体を特異的に認識するか又はそれと結合するタンパク質又は他の分子である。例えば、カルモジュリン結合タンパク質と融合したタンパク質分子は、カルモジュリンによって捕捉され得る。更に他の実施形態では、マーカー実体は、ポリヒスチジンであり、及び捕捉試薬は、ニッケル、コバルト又は亜鉛イオンである。
【００３７】
本発明の方法に用いられる捕捉試薬は、好ましくは、表面に結合するか又は表面上で固定化される。表面は、ビーズ若しくは粒子（例えば、シリカ、ラテックス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアクリレート又はポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を含む電磁ビーズ又は粒子）、膜（例えば、ＰＶＤＦ、ニトロセルロース、ポリエチレン又はナイロン膜）、チューブ、樹脂、カラム、電極又はアッセイプレート中のウェル（例えば、マイクロタイタープレート中のウェル）であり得る。こうした表面は、ガラス、セルロースベース材料、ポリエチレン、ポリプロピレン若しくはポリエステルなどの熱可塑性ポリマー、粒子状材料（例えば、ガラス又は様々な熱可塑性ポリマー）からなる焼結構造体又はニトロセルロース、ナイロン、ポリスルホンなどからなるキャスト膜フィルムを含み得る。これらの表面材料の全ては、フィルム、シート又はプレートなどの好適な形状で用いられ得るか、又はこれらは、紙、硝子、プラスチックフィルム又は布地などの適切な不活性の支持体にコーティング又は接着若しくは積層され得る。
【００３８】
捕捉試薬は、当業者に既知の様々な処置により、表面上に固定化され得るか又は表面に結合され得る。捕捉試薬を表面上にストライプ塗布、堆積又は印刷し、続いて表面を乾燥させて固定化を促進することができる。捕捉試薬の固定化は、吸着又は共有結合を介して起こり得る。表面の性質に応じて、表面と捕捉試薬との間で共有結合の形成を促進するための誘導体形成法を使用し得る。誘導体形成法は、表面をグルタルアルデヒド又はカルボジイミドなどの化合物で処理すること及び捕捉試薬を塗布することを含み得る。捕捉試薬は、表面に結合された成分に対して高い親和性を有する部分など、共有又は非共有結合を可能にする捕捉試薬に結合された部分を介して間接的に表面に結合することもできる。例えば、捕捉試薬は、ビオチンに結合され得、表面に結合された成分は、アビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンであり得る（例えば、図５を参照されたい）。巨大分子又は他の物質を表面に直接又は間接的に固定化する他の物理的、化学的又は生物学的方法は、当技術分野において既知であり、捕捉試薬を表面に固定化又は結合させるのに用いることができる。
【００３９】
ポリヌクレオチド成分にハイブリダイズされた標識ＴＦＯを含むコンジュゲート分子が捕捉試薬を介して表面に結合されると、本発明の方法は、表面を検出試薬と接触させることと、検出試薬中の検出可能なラベルからのシグナルを検出することとを含む。検出試薬は、結合パートナーに結合された検出可能なラベルを含み、結合パートナーは、コンジュゲート分子中のタンパク質又はＴＦＯに共有結合された標識のいずれかに特異的に結合する。コンジュゲート分子が、ＴＦＯに共有結合された標識に特異的に結合する捕捉試薬を介して表面と結合する方法の実施形態では、検出試薬中の結合パートナーは、コンジュゲート分子中のタンパク質に特異的に結合する。例えば、図１を参照されたい。こうした実施形態では、コンジュゲート分子中のタンパク質に特異的に結合する結合パートナーは、タンパク質又はタンパク質に組み込まれたマーカー実体に特異的に結合することができる任意の分子であり得る。こうした結合パートナーとしては、ポリペプチド、アプタマー、グリコペプチド、金属イオン、リガンド、受容体、多糖、抗原及び抗体又はその抗原結合フラグメントが挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、コンジュゲート分子中のタンパク質に特異的に結合する検出試薬中の結合パートナーは、抗体又はその抗原結合フラグメントである。特定の実施形態では、コンジュゲート分子中のタンパク質は、リガンド（例えば、細胞表面受容体のリガンド）であり、及び検出試薬中の結合パートナーは、リガンド結合ドメインを含有するリガンドの受容体又は受容体のフラグメント（例えば、受容体のリガンド結合フラグメント）である。他の実施形態では、コンジュゲート分子中のタンパク質は、抗体又はその抗原結合フラグメントであり、及び検出試薬中の結合パートナーは、抗体又は抗原結合フラグメントの標的抗原（又はエピトープを含有する抗原のフラグメント）である。更に他の実施形態では、コンジュゲート分子中のタンパク質は、抗体であり、及び検出試薬中の結合パートナーは、抗Ｆｃ領域抗体、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇなど、抗体のＦｃ領域に特異的に結合するタンパク質である。更なる他の実施形態では、コンジュゲート分子中のタンパク質は、抗体又はその抗原結合フラグメントであり、及び検出試薬中の結合パートナーは、抗イディオタイプ抗体である。本発明の方法のいくつかの実施形態では、検出試薬中の結合パートナーは、上記のマーカー実体のいずれかなど、コンジュゲート分子中のタンパク質に組み込まれるマーカー実体に特異的に結合する。特定の実施形態では、検出試薬中の結合パートナーは、コンジュゲート分子中のタンパク質と融合したマーカー実体に結合する抗体又は抗原結合フラグメントである（例えば、結合パートナーは、抗ｍｙｃ、抗ＨＡ又は抗ＦＬＡＧ抗体である）。
【００４０】
コンジュゲート分子が、コンジュゲート分子中のタンパク質に特異的に結合する捕捉試薬を介して表面と結合する方法の実施形態では、検出試薬中の結合パートナーは、ＴＦＯに共有結合された標識に特異的に結合する。例えば、図５を参照されたい。こうした実施形態では、結合パートナーは、標識に特異的に結合するか又はそれを認識することができる任意の分子であり得る。こうした結合パートナーとしては、ポリペプチド、アプタマー、グリコペプチド、レクチン及び抗体又はその抗原結合フラグメントが挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、標識に特異的に結合する検出試薬中の結合パートナーは、抗体又はその抗原結合フラグメントである。特定の実施形態では、ＴＦＯに共有結合する標識は、ビオチンであり、及び検出試薬中の結合パートナーは、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン又は抗ビオチン抗体若しくはその抗原結合フラグメントである。一実施形態では、標識は、ビオチンであり、及び検出試薬中の結合パートナーは、ストレプトアビジンである。他の実施形態では、ＴＦＯに共有結合する標識は、ＴＦＯであり、及び検出試薬中の結合パートナーは、抗ジゴキシゲニン抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００４１】
検出試薬中の検出可能なラベルは、特定の条件のセット下で検出可能なシグナルを生成することが可能な任意の分子的実体であり得る。単独で又は他の組成物若しくは化合物と協同して検出可能なシグナルを提供することが可能な従来のラベルを用い得る。検出可能なラベルは、放射線ラベル、酵素、蛍光体、発色団、化学発光ラベル、電気化学発光（ＥＣＬ）発光団、金属ナノ粒子又は金属ナノシェルであり得る。
【００４２】
一実施形態では、結合パートナーに連結した検出可能なラベルは、金属ナノ粒子又は金属ナノシェルである。検出可能なラベルとして用いるのに好適な金属ナノ粒子又はナノシェルとしては、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、銅ナノ粒子、白金ナノ粒子、カドミウムナノ粒子、複合ナノ粒子（例えば、銀及び金又は銅及び銀）、金中空球、金コーティングシリカナノシェル及びシリカコーティング金シェルが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、結合パートナーに連結した検出可能なラベルは、基質を、検出可能なシグナル、例えば着色、蛍光又は化学発光生成物に変換することができる酵素である。結合パートナーに結合して検出試薬を生成するのに好適な酵素の非限定的な例としては、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ミエロペルオキシダーゼ及びアミラーゼが挙げられる。更に別の実施形態では、結合パートナーに結合された検出可能なラベルは、蛍光体である。検出可能なラベルとしての使用に好適な例示的蛍光性分子としては、フルオレセイン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、Ａｌｅｘａ色素分子、ローダミン色素分子などが挙げられる。
【００４３】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、結合パートナーに結合された検出可能なラベルは、ＥＣＬ発光団である。結合パートナーに結合されて検出試薬を生成することができるＥＣＬ発光団としては、ルテニウム錯体（例えば、Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｃｈｅｍ．１０４：３００３−３０３６，２００４、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，Ｖｏｌ．４４，３１１７−３１４２，２０１５及びＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄａｌｔｏｎ  Ｔｒａｎｓ．，Ｖｏｌ．４６，３５５−３６３，２０１７に記載されるものなど、ｔｒｉ−２，２’−ビピリジルルテニウム（ＩＩ）［Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋］）、イリジウム錯体、アルミニウム錯体、クロム錯体、銅錯体、ユーロピウム錯体、オスミウム錯体、白金錯体及びレニウム錯体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、検出試薬中で結合パートナーに結合されるＥＣＬ発光団は、ルテニウム錯体である。
【００４４】
検出可能なラベルを結合パートナーに結合する方法は、当技術分野で既知であり、これとしては、受動的吸着（例えば、金属ナノ粒子又はナノシェルが検出可能なラベルである場合）並びにスクシンイミドエステルが一級アミンに結合すること及びマレイミドがスルフヒドリル基に結合することなどのコンジュゲート化学が挙げられ得る。巨大分子を、検出可能なラベルに結合する他の方法は、当業者に既知であり、当業者は、使用される望ましい検出可能なラベルのタイプ及びラベリングされる結合パートナーのタイプ（例えば、巨大分子）に基づいて適切な方法を選択することができる。
【００４５】
捕捉されたコンジュゲート分子を含む表面が検出試薬と接触した後、本発明の方法は、検出試薬中の検出可能なラベルからのシグナルを検出又は測定することを含む。検出可能なラベルからのシグナルは、標的タンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子が無傷であること、すなわちポリヌクレオチド成分がタンパク質成分に共有結合されたままであることを示す。検出されるシグナルは、使用される検出ラベルのタイプに依存する。例えば、金属ナノ粒子又はナノシェルラベルからのシグナルは、光散乱又は光吸収の量を測定することによって検出され得る。蛍光体又はＥＣＬ発光団からのシグナルは、特定の放射波長における光強度として検出又は測定され得る。検出可能なラベルが酵素である場合、シグナルは、色素生成、蛍光発生又は化学発光基質など、検出可能なシグナルを生成する酵素の基質を添加することによって生成される。分光光度計、蛍光／発光プレートリーダー並びにスペクトル変化及び電気化学的変化を検出可能な他の計器などの計器は、市販されており、且つ当業者に既知である。特定の実施形態では、検出可能なラベルからのシグナルを検出することで、定性的評価が得られる（すなわち無傷のコンジュゲート分子が試料中に存在する）。他の実施形態では、検出可能なラベルからのシグナルを検出することで、試料中の無傷のコンジュゲート分子の量の定量的測定値が得られる。例えば、特定の実施形態では、例えば光散乱、光吸収又は蛍光／発光放射の測定により、試料中の無傷のコンジュゲート分子の量を定量的に判定することが可能となる。こうした定量化は、無傷のコンジュゲート分子の既知の量を含有する試料中の検出可能なラベルからのシグナルを測定することと、データから較正曲線を構築することと、較正曲線から試験試料中の無傷のコンジュゲート分子の量を判定することとによって達成され得る。
【００４６】
任意のタイプのタンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子が本発明の方法を用いて試料中で検出又は測定可能である。コンジュゲート分子のポリヌクレオチド成分は、一本鎖ポリヌクレオチド、二本鎖ポリヌクレオチド又は一本鎖及び二本鎖領域の両方を含むポリヌクレオチドであり得る（例えば、単一のポリヌクレオチドがそれ自体の上に折り重なって二本鎖領域にハイブリダイズして生成するように、少なくとも１つの自己相補的領域を含有するポリヌクレオチド）。タンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート中のポリヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又はこれらの組み合わせからなり得る。コンジュゲート分子のポリヌクレオチド成分は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ模倣薬、抗ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、ａｎｔａｇｏｍｉｒ及びａｎｔｉｍｉＲ）又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、疾患又は障害に関連する遺伝子又はＲＮＡ分子を標的とするように設計された治療的ポリヌクレオチドである。これら及び他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの安定性又は効力を強化するための１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。こうした修飾ヌクレオチドとしては、２’糖修飾を含むヌクレオチド（２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエチル、２’−フルオロなど）、脱塩基ヌクレオチド、反転ヌクレオチド（３’−３’結合ヌクレオチド）、ホスホロチオエート結合ヌクレオチド、二環式糖修飾を含むヌクレオチド（例えば、ＬＮＡ、ＥＮＡ）及び塩基アナログを含むヌクレオチド（例えば、ユニバーサル塩基、５−メチルシトシン、偽ウラシルなど）が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００４７】
タンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲートのポリヌクレオチド成分の長さは、ポリヌクレオチドのタイプ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）に応じて変化するが、一般的には長さ約１５ヌクレオチド〜長さ約１５０ヌクレオチドとなる。例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子又はｍｉＲＮＡ模倣分子の各鎖は、典型的には長さ約１５ヌクレオチド〜長さ約３０ヌクレオチドである一方、それ自体の上に折り重なってステムループ又はヘアピン構造を形成する一本鎖ｓｈＲＮＡ分子及びプレｍｉＲＮＡ分子は、長さ約３５ヌクレオチド〜約１２０ヌクレオチドであり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチド及び抗ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、典型的には長さ約１５ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本発明の方法で検出又は測定されるコンジュゲート分子中のポリヌクレオチド成分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。他の実施形態では、本発明の方法で検出又は測定されるコンジュゲート分子中のポリヌクレオチド成分は、ｓｉＲＮＡ分子である。こうした実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、独立して、長さ約１５〜約３０ヌクレオチド、長さ約１８〜約２６ヌクレオチド又は長さ約１９〜約２１ヌクレオチドであり得る。
【００４８】
コンジュゲート分子のタンパク質成分は、ポリヌクレオチドが共有結合され得る任意のタンパク質又はそのフラグメントであり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質成分は、連結したポリヌクレオチドに対して、より長い循環血清半減期又は特定の組織若しくは細胞型に対する標的化などの特性又は特徴を付与する。特定の実施形態では、コンジュゲート分子中のタンパク質は、抗体又はその抗原結合フラグメントである。これら及び他の実施形態では、コンジュゲート分子中のタンパク質は、例えば、細胞特異性又は組織特異性タンパク質に特異的に結合することにより、コンジュゲート分子を特定の細胞型又は組織に対して標的化する。こうした実施形態では、ポリヌクレオチド成分は、治療的ポリヌクレオチドであり得る。例えば、一実施形態では、タンパク質は、標的細胞又は組織によって発現した受容体に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントである。一例として、コンジュゲート分子を肝臓に標的化するために、タンパク質は、抗体又はアシアロ糖タンパク質受容体又はＬＤＬ受容体など、肝細胞によって発現する受容体に特異的に結合する抗原結合フラグメントであり得る。他の標的細胞型（例えば、Ｂ細胞、腫瘍細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、膵臓細胞、神経細胞など）上の他の細胞表面受容体と結合する抗体は、コンジュゲート分子中のタンパク質成分であり得る。他の実施形態では、コンジュゲート分子中のタンパク質は、リガンドである。リガンドは、コンジュゲート分子が送達される標的細胞又は組織の表面上に発現する受容体のリガンドであり得る。こうした実施形態では、コンジュゲート分子中のタンパク質は、受容体結合機能を保持するリガンド自体又はリガンドのペプチドフラグメント若しくはアナログであり得る。
【００４９】
特定の実施形態では、本発明の方法を用いて試料中で検出又は測定されるタンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子は、抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子である。他の実施形態では、タンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子は、ペプチドリガンド−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子である。更に他の実施形態では、タンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子は、抗体−アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート分子である。なお他の実施形態では、タンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子は、ペプチドリガンド−アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート分子である。これらの実施形態では、コンジュゲート分子のｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチド成分は、治療性であり得（すなわち疾患又は障害に関連する遺伝子又はＲＮＡ分子に標的化される）、コンジュゲート分子の抗体又はペプチドリガンド成分は、細胞特異性又は組織特異性受容体に特異的に結合し得る。
【００５０】
本発明の方法は、様々な試料のタイプにおいてタンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子を検出又は測定するために用いることができる。いくつかの実施形態では、試料は、血液、血清、血漿、脳脊髄液又は尿などの体液である。他の実施形態では、試料は、組織（例えば、組織ホモジネート）又は細胞溶解物である。これら及び他の実施形態では、試料は、タンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子を投与された動物又はヒト対象から得られる。いくつかの実施形態では、試料は、タンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子に曝露された細胞培養液から得られる。こうした実施形態では、試料は、細胞培養液の上清又は培養液中の細胞の溶解物であり得る。一実施形態では、試料は、タンパク質−ポリヌクレオチドコンジュゲート分子の合成プロセス中の工程からの反応混合物又は生成物である。別の実施形態では、試料は、製剤原料（例えば、有効薬剤成分又はＡＰＩ）のロットである。更に別の実施形態では、試料は、製剤のロットである（例えば、ヒトのための１つ以上の賦形剤を配合したＡＰＩ）。
【００５１】
実施された実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的のみのために提供されるものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５２】
実施例１．捕捉剤として三重鎖形成オリゴヌクレオチドを用いる検出アッセイ
この実施例は、試料溶液中の抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを捕捉し、コンジュゲートを固体表面に固定化するために標識三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）が使用される、本発明のアッセイ法の１フォーマットを説明する。続いて、抗体を特異的に認識するラベル化結合パートナーを用いてコンジュゲートが検出及び定量化される。このアッセイフォーマットは、図１に概略的に示される。
【００５３】
参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／０３９６４７号パンフレットの実施例１０に記載される方法を用いて、肝臓遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡ分子を、アシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）タンパク質を目標にするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に共有結合することにより、抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを調製した。要約すると、ＥＵ番号付けスキームに従ってその重鎖中でＥ２７２Ｃ変異を有する抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ（抗ＡＳＧＲ１  ｃｙｓ  ｍＡｂ）を、ｐＨ７．５〜８．５の、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液中の２．５ｍＭのシスタミン及び２．５ｍＭのシステアミンの溶液を用いて室温で１５〜２０時間インキュベートし、続いて精製して、ビス−システアミンキャップされた抗ＡＳＧＲ１  ｃｙｓ  ｍＡｂを得た。ｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖からなり、それぞれ長さが２１ヌクレオチドであった。ｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有する１９塩基対の二重鎖領域を有した。ｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖は、その３’末端にホモセリン−アミノヘキサン酸修飾を有し、これを、ブロモ酢酸スクシンイミジルを用いてブロモアセチル基で更に官能化した。トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）又はトリフェニルホスフィン−３，３’，３’’−トリスルホン酸三ナトリウム塩（ＴＰＰＴＳ）を用いて、ビス−システアミンキャップされた抗ＡＳＧＲ１  ｃｙｓ  ｍＡｂ中間体を部分的に還元した。続いて、デヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）で、部分的に還元されたｃｙｓ  ｍＡｂの酸化を実施し、酸化は、微量の還元ｍＡｂ種のみが観察されるようになるまで室温で実施した。続いて、反応混合物にブロモアセチル−ｓｉＲＮＡ二重鎖を添加し、アルキル化を室温で１５〜４８時間実施した。１及び２のＲＮＡ−抗体比（ＲＡＲ）を有する抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを、アニオン交換クロマトグラフィを用いて分離した。
【００５４】
ＴＦＯを、抗体に直接連結した鎖であったセンス鎖と完全に相補的な配列を有するように設計した。ＴＦＯのヌクレオチドの約３０〜４０％がＬＮＡモノマーとなり、ＴＦＯと相補的ＲＮＡ鎖との複合体の融解温度（Ｔｍ）がＥｘｉｑｏｎからのＲＮＡ  Ｔｍ予測アルゴリズムに基づいて約８０℃となるように、ロック核酸（ＬＮＡ）モノマーをＴＦＯに組み込んだ（エクソンのウェブサイト：ｅｘｉｑｏｎ．ｃｏｍ／ｌｓ／Ｐａｇｅｓ／ＥｘｉｑｏｎＴＭＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎＴｏｏｌで入手可能な予測ツールを参照されたい）。ＬＮＡモノマーを、標的Ｔｍ範囲を維持しながら、ＴＦＯ全体にわたって可能な限り均一に配置した。ＴＦＯは、Ｅｘｉｑｏｎ（Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）によってカスタム合成され、３’末端にビオチンでラベル付けされている。ＴＦＯの配列は、
【化１】
2021526803.tif 000002
であり、ここで、ＬＮＡモノマーは、下線及び太字フォントで示されている。
【００５５】
抗ＡＳＧＲ１抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲート（０．０４ｎｇ／ｍＬ〜２５００ｎｇ／ｍＬ）の１１ポイントの検量線を、試料緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）、マウス血清又は肝臓ホモジェネート中に抗ＡＳＧＲ１抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの原液２５００ｎｇ／ｍＬを３倍に連続希釈することによって調製した。別個に、様々な濃度のビオチン化ＴＦＯ（６．２５ｎＭ〜２５０ｎＭ）をハイブリダイゼーション緩衝液（６０ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ７．０）中で調製した。ハイブリダイゼーション緩衝液中のビオチン化ＴＦＯを試料のそれぞれと１：１で混合し、ハイブリダイゼーションを５２℃で１時間進めた。
【００５６】
ハイブリダイゼーション後、試料を、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレートに移し、３０分間振盪した。その後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄した（イミダゾール緩衝生理食塩水及びＴｗｅｅｎ（登録商標）２０；ＫＰＬ  Ｉｎｃ．から２０Ｘ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅとして供給）。ブロッキング緩衝液（トリス緩衝食塩水中の５％無脂肪粉乳（Ｂｌｏｃｋｅｒ（商標）ＢＬＯＴＴＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を試料に添加し、プレートを３０分間振盪した。プレートを洗浄緩衝液で再び洗浄した。続いて、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域を目標にするルテニウムラベル化マウスモノクローナル抗体（抗ヒトＦｃ抗体；１μｇ／ｍＬ）をブロッキング緩衝液中の各試料に添加して、プレートを１時間振盪した。プレートを洗浄緩衝液で洗浄した後、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＭＳＤ）ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ  ＳＱ１２０電気化学発光リーダー及び界面活性剤を含むＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔを用いてルテニウムラベルからのシグナルを読み取った。
【００５７】
異なるビオチン化ＴＦＯの濃度範囲における試料緩衝液中の抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの検出のアッセイ結果を図２Ａ及び２Ｂに示す。データを４パラメータ非線形回帰モデル（重み係数１／Ｙ＾２を有するマルカート法）にフィットさせて、１に近いＲ２値を得た。緩衝液中のアッセイの線形範囲は、３．４ｎｇ／ｍＬ〜２５００ｎｇ／ｍＬであった。抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの検出もマウス血清及びマウス肝臓ホモジェネート中で達成され得る。図２Ｃを参照されたい。１００ｎＭのビオチン化ＴＦＯ濃度を用いると、血清及び肝臓ホモジェネート中のアッセイの線形範囲は、緩衝液のそれと同じであった。しかしながら、血清及び肝臓ホモジェネート中では、緩衝液と比較してシグナル応答が低下し、曲線の勾配における差異によって測定して、血清中の応答は、緩衝液中の応答の約４６％であり、肝臓ホモジェネート中の応答は、緩衝液中の応答の約２５％であった。
【００５８】
検出アッセイの有効性に対するコンジュゲートの抗体成分の効果を調査するため、上記の同じｓｉＲＮＡ分子（Ｔ２  ｓｉＲＮＡ）を異なるモノクローナル抗体（６５５ｍＡｂ）にコンジュゲートした。６５５ｍＡｂを変異させて、その標的結合特異性を除去した。試料緩衝液中で様々な濃度（０．０４ｎｇ／ｍＬ〜２５００ｎｇ／ｍＬ）の以下のコンジュゲート分子を調製した：（１）１つの結合ｓｉＲＮＡ分子を有する６５５ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子（Ｔ２−６５５ＲＡＲ１）、（２）２つの結合ｓｉＲＮＡ分子を有する６５５ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子（Ｔ２−６５５ＲＡＲ２）、（３）１つの結合ｓｉＲＮＡ分子を有する抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子（Ｔ２−２５Ｂ３ＲＡＲ１）、及び（４）２つの結合ｓｉＲＮＡ分子を有する抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子（Ｔ２−２５Ｂ３ＲＡＲ２）。５２℃のハイブリダイゼーション緩衝液中の１００ｎＭのビオチン化ＴＦＯ（配列番号１）で試料を１時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、試料を、ストレプトアビジンでコーティングされたプレートに移し、上記のとおり洗浄及びブロックした。捕捉されたコンジュゲート分子の検出を、ルテニウムラベル化抗ヒトＦｃ  ｍＡｂを用いて達成し、電気化学発光シグナルをＭＳＤ  ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ  ＳＱ１２０電気化学発光リーダーによって読み取った。
【００５９】
アッセイの結果は、コンジュゲートの抗体成分における差異にもかかわらず、アッセイの性能及び感度が様々なコンジュゲート分子に対して同様であることを示す。図３Ａを参照されたい。このアッセイランにおける＜４２０ｐｇ／ｍＬの定量化下限値（ＬＬＯＱ）は、４つ全てのコンジュゲート分子で同じであった。アッセイが、１つ又は２つの結合ｓｉＲＮＡ分子を有するコンジュゲートを区別できるかどうかを判定するために、データを線形回帰モデルにフィットさせ、ＲＡＲ１コンジュゲートとＲＡＲ２コンジュゲートとの間で勾配の差異を比較した。図３Ｂに示すように、ＲＡＲ１のフィットされた線形回帰線の勾配は、ＲＡＲ２コンジュゲートのそれの約７５％であった（Ｔ２−２５Ｂ３  ＲＡＲ１勾配は、Ｔ２−２５Ｂ３  ＲＡＲ２勾配の７２％、Ｔ２−６５５  ＲＡＲ１勾配は、Ｔ２−６５５  ＲＡＲ２勾配の７８％）。したがって、アッセイは、これらの条件下において、１つ又は２つの結合ｓｉＲＮＡ分子を有するコンジュゲート間の差異を検出することができる。
【００６０】
次に、検出アッセイの有効性に対するコンジュゲートのｓｉＲＮＡ成分の効果を判定するために、それぞれ固有のｓｉＲＮＡ分子を有する２つの異なる抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを評価した。ＨＰＲＴ及びＣ９１１  ｓｉＲＮＡ分子は、上記のＴ２ｓｉＲＮＡ分子と同じフォーマット（すなわち２１ｍｅｒの鎖、１９ｂｐの二重鎖領域、３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング）を有していたが、異なる配列を有していた。上記の方法を用いて、ＨＰＲＴ及びＣ９１１  ｓｉＲＮＡ分子を抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂにコンジュゲートした。ＨＰＲＴ  ｓｉＲＮＡ抗体コンジュゲートのアッセイで用いられたＴＦＯの配列は、
【化２】
2021526803.tif 000003
である一方、Ｃ９１１  ｓｉＲＮＡ抗体コンジュゲートのアッセイで用いられたＴＦＯの配列は、
【化３】
2021526803.tif 000004
であった。ＬＮＡモノマーは、下線及び太字フォントによって示される。両方のＴＦＯをその３’末端でビオチン化した。
【００６１】
試料緩衝液中で様々な濃度（０．０４ｎｇ／ｍＬ〜２５００ｎｇ／ｍＬ）の以下のコンジュゲート分子を調製した：（１）１つの結合ＨＰＲＴ  ｓｉＲＮＡ分子を有する抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子（ＨＰＲＴ−２５Ｂ３ＲＡＲ１）、（２）２つの結合ＨＰＲＴ  ｓｉＲＮＡ分子を有する抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子（ＨＰＲＴ−２５Ｂ３ＲＡＲ２）、（３）１つの結合Ｃ９１１  ｓｉＲＮＡ分子を有する抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子（Ｃ９１１−２５Ｂ３ＲＡＲ１）、及び（４）２つの結合Ｃ９１１  ｓｉＲＮＡ分子を有する抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子（Ｃ９１１−２５Ｂ３ＲＡＲ２）。５２℃のハイブリダイゼーション緩衝液中において、試料を１００ｎＭのビオチン化ＴＦＯ（ＨＰＲＴ  ｓｉＲＮＡ−ｍＡｂコンジュゲートに対して配列番号２又はＣ９１１  ｓｉＲＮＡ−ｍＡｂコンジュゲートに対して配列番号３）で１時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、試料を、ストレプトアビジンでコーティングされたプレートに移し、上記のとおり洗浄及びブロックした。捕捉されたコンジュゲート分子の検出を、ルテニウムラベル化抗ヒトＦｃ  ｍＡｂを用いて達成し、電気化学発光シグナルをＭＳＤ  ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ  ＳＱ１２０電気化学発光リーダーによって読み取った。
【００６２】
アッセイの結果を図４Ａに示す。Ｃ９１１  ｓｉＲＮＡ−ｍＡｂコンジュゲート分子のＬＬＯＱがＨＰＲＴ  ｓｉＲＮＡ−ｍＡｂコンジュゲートのＬＬＯＱよりも約１００倍低かったため、アッセイの感度は、特定のＴＦＯ−ｓｉＲＮＡ対の影響を受けるように思われる（Ｃ９１１−２５Ｂ３  ＲＡＲ２コンジュゲートで１１ｐｇ／ｍＬに対してＨＰＲＴ−２５Ｂ３  ＲＡＲ２コンジュゲートで９２６ｐｇ／ｍＬ）。しかしながら、各ＴＦＯ−ｓｉＲＮＡ対のハイブリダイゼーション条件を最適化することにより、アッセイの感度は、おそらく改善される。データの線形回帰及びフィットされた回帰線の勾配の比較は、ここでも、アッセイが、１つ又は２つの結合ｓｉＲＮＡ分子を含むコンジュゲートを区別できることを実証した（図４Ｂ）。ＨＰＲＴ  ｓｉＲＮＡ−ｍＡｂコンジュゲートの場合、ＲＡＲ１コンジュゲートは、ＲＡＲ２コンジュゲートの勾配の７５％の勾配を有した。Ｃ９１１  ｓｉＲＮＡ−ｍＡｂコンジュゲートの場合、ＲＡＲ１コンジュゲートは、ＲＡＲ２コンジュゲートの勾配の６２％の勾配を有した。
【００６３】
実施例に記載される一連の実験の結果は、標識ＴＦＯが捕捉剤として用いられる本発明のアッセイ法の一実施形態が、血清及び組織ホモジネートなどの複合マトリックスを含む様々なマトリックス中で無傷の抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを選択的に検出及び定量化できることを実証する。アッセイは、１つ又は２つの結合ｓｉＲＮＡ分子を有する抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを区別するためにも用いられ得る。
【００６４】
実施例２検出剤として三重鎖形成オリゴヌクレオチドを用いる検出アッセイ
この実施例は、標識ＴＦＯが試料溶液中で抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの検出を可能にする、本発明のアッセイ法の第２のフォーマットを説明する。このフォーマットでは、標識ＴＦＯは、抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートのｓｉＲＮＡ成分にハイブリダイズされ、続いて、コンジュゲートは、抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの抗体成分を特異的に認識する捕捉試薬（例えば、抗体又は抗Ｆｃ抗体の標的抗原）によって固体表面に捕捉及び固定化される。捕捉されたコンジュゲートは、ＴＦＯに共有結合された標識を特異的に認識するラベル化結合パートナーを用いて検出及び定量化される。このアッセイフォーマットは、図５に概略的に示される。
【００６５】
実施例１に記載される６５５ｍＡｂ−Ｔ２  ｓｉＲＮＡコンジュゲート及び抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−Ｔ２  ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子をこのアッセイフォーマットで評価した。ＴＦＯの配列は、
【化４】
2021526803.tif 000005
（配列番号１；ＬＮＡモノマーは、下線及び太字フォントによって示される）であり、３’末端においてジゴキシゲニンでラベル化されていた。抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲート（０．３８ｎｇ／ｍＬ〜２５０００ｎｇ／ｍＬ）のそれぞれの１１ポイントの検量線を、試料緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中に抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの原液２５０００ｎｇ／ｍＬを３倍に連続希釈することによって調製した。ジゴキシゲニン−ＴＦＯをハイブリダイゼーション緩衝液（６０ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ７．０）中で調製し、試料のそれぞれと１：１で混合した。ハイブリダイゼーションを５２℃で１時間進めた。別個に、ブロッキング緩衝液（トリス緩衝食塩水中の５％無脂肪粉乳（Ｂｌｏｃｋｅｒ（商標）ＢＬＯＴＴＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））中のビオチンラベル化マウス抗ヒトＦｃ抗体を、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレートのウェルに堆積させ、３０分間振盪した。続いて、使用前にプレートを洗浄緩衝液で洗浄した（イミダゾール緩衝生理食塩水及びＴｗｅｅｎ（登録商標）２０；ＫＰＬ  Ｉｎｃ．から２０Ｘ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅとして供給）。
【００６６】
ハイブリダイゼーション後、試料を、予め調製した結合抗ヒトＦｃ抗体を含むマイクロタイタープレートに移して１時間振盪した。プレートを洗浄緩衝液で洗浄した後、ルテニウムラベル化ヒツジ抗ジゴキシゲニン抗体（２μｇ／ｍＬ）をブロッキング緩衝液中の各試料に添加し、プレートを３０分間振盪した。プレートを洗浄緩衝液で再び洗浄し、ＭＳＤ  ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ  ＳＱ１２０電気化学発光リーダー及び界面活性剤を含むＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔを用いてルテニウムラベルからのシグナルを読み取った。
【００６７】
アッセイの結果を図６に示す。４つ全てのコンジュゲート分子のＬＬＯＱは、＜４２０ｐｇ／ｍＬであり、これは、実施例１に記載されるアッセイフォーマットにおける分子のＬＬＯＱと同様である。いずれのタイプのコンジュゲートのＬＬＯＱも同じであったため、コンジュゲートの抗体成分も、このフォーマットにおけるアッセイの感度に影響を与えるように思われない。このアッセイフォーマット（検出のために使用される標識ＴＦＯ）の性能を実施例１に記載されるフォーマット（捕捉のために使用される標識ＴＦＯ）と比較するために、ＲＡＲ１又はＲＡＲ２における様々な濃度の抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−Ｔ２  ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子を両方のアッセイフォーマットで試験した。図７に示すように、第１のフォーマット（捕捉のために使用される標識ＴＦＯ）のアッセイのダイナミックレンジは、第２のフォーマット（検出のために使用される標識ＴＦＯ）のそれよりも大きい。いずれのアッセイフォーマットのＬＬＯＱも同様であった。
【００６８】
別の一連の実験では、コンジュゲートの抗体成分の抗原を捕捉試薬として用いる能力を調査した。最初に、ｓｉＲＮＡ分子のコンジュゲートが抗体−抗原相互作用に影響を与えなかったことを検証するために、抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの抗原結合能力を試験した。ヒトＡＳＧＲ１の抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−Ｔ２  ｓｉＲＮＡ  ＲＡＲ２コンジュゲート分子の結合親和性及びキネティクスを、細胞外ドメインを含有するヒトＡＳＧＲ１タンパク質のビオチン化フラグメントを搭載したストレプトアビジンバイオセンサを用いるバイオレイヤー干渉法によってＯｃｔｅｔ（登録商標）ＨＴＸ器具（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上で判定した。コンジュゲート分子は、非コンジュゲート抗ＡＳＧＲ１抗体（データは示さない）と比較して、ヒトＡＳＧＲ１と同様の結合親和性及びキネティクスを示しており、これは、ｓｉＲＮＡのコンジュゲートが抗体のその標的に対する結合に影響を及ぼさなかったことを示す。ハイブリダイズされたビオチン化ＴＦＯを含有する抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを搭載するストレプトアビジンセンサがヒトＡＳＧＲ１の炭水化物結合ドメインに結合することができたため（データは示さない）、ＴＦＯの存在も抗原結合に影響を及ぼさなかった。
【００６９】
次に、ビオチン化抗ヒトＦｃ抗体の代わりにビオチン化ヒトＡＳＧＲ１を捕捉試薬とした用いたことを除いて、上記の検出アッセイを繰り返した。具体的には、様々な濃度の抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−Ｔ２  ｓｉＲＮＡコンジュゲートを試料緩衝液中で調製した。ＡＳＧＲ１抗原に対する抗ＡＳＧＲ１抗体の相互作用は、カルシウム依存性であるため、アッセイの全ての緩衝溶液に１ｍＭのＣａＣｌ２を添加した。５２℃のハイブリダイゼーション緩衝液中において、試料をジゴキシゲニン−ＴＦＯ（配列番号１）で１時間ハイブリダイズした。別個に、ブロッキング緩衝液中のビオチンラベル化ヒトＡＳＧＲ１タンパク質を、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレートのウェルに堆積させ、３０分間振盪した。続いて、使用前にプレートを洗浄緩衝液で洗浄した。
【００７０】
ハイブリダイゼーション後、試料を、予め調製した結合ヒトＡＳＧＲ１タンパク質を含むマイクロタイタープレートに移して１時間振盪した。プレートを洗浄緩衝液で洗浄した後、ルテニウムラベル化ヒツジ抗ジゴキシゲニン抗体をブロッキング緩衝液中の各試料に添加し、プレートを３０分間振盪した。プレートを洗浄緩衝液で再び洗浄し、ＭＳＤ  ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ  ＳＱ１２０電気化学発光リーダー及び界面活性剤を含むＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔを用いてルテニウムラベルからのシグナルを読み取った。アッセイの結果を図８に示す。アッセイのＬＬＯＱは、１０３ｎｇ／ｍＬであった。結果は、ＡＳＧＲ１抗原が、続いてルテニウムラベル化抗ジゴキシゲニン抗体と組み合わせたジゴキシゲニン−ＴＦＯを用いて検出され得るコンジュゲートのための捕捉試薬として効果的に作用し得ることを実証する。
【００７１】
実施例に記載される実験の結果は、標識ＴＦＯが、コンジュゲートの抗体成分を特異的に認識する捕捉試薬（例えば、標的抗原又は抗Ｆｃ抗体）と組み合わせて、試料溶液中で無傷の抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの検出及び定量化を可能とするために用いられ得ることを実証する。
【００７２】
実施例３マウス中の薬物動態解析におけるアッセイの応用
本発明のアッセイ法の潜在的応用の１つを実証するために、実施例１に記載され、且つ図１に描かれるアッセイ（捕捉に使用される標識ＴＦＯ）を用いて抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートで処理された動物由来の血清及び肝臓試料を解析した。
【００７３】
９週齢のＣ５７Ｂｌ／６野生型マウスに、実施例１に記載される抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−Ｔ２  ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子（３０ｍｇ／ｋｇ又は６０ｍｇ／ｋｇ）又はＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴ２  ｓｉＲＮＡ対照を皮下又は静脈内注射した。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴ２  ｓｉＲＮＡ対照は、センス鎖の３’末端において三本鎖ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートしたが、それ以外には抗体にコンジュゲートされたＴ２  ｓｉＲＮＡ分子と同じフォーマット並びにセンス及びアンチセンス鎖配列を有していた。Ｔ２  ｓｉＲＮＡは、肝臓遺伝子を標的とする。化合物の投与後２、４、８及び１５日目に動物から血清及び肝臓を採取した。動物の肝臓から単離された全ＲＮＡをｑＰＣＲ分析のために処理してｍＲＮＡレベルを評価した。肝臓中のＴ２  ｓｉＲＮＡの標的のタンパク質発現をＥＬＩＳＡによって測定した。
【００７４】
抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−Ｔ２  ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、肝臓中の標的タンパク質発現の効果的な低減によって示されるように（図９Ａ）、生体内でｓｉＲＮＡを効果的にその肝臓標的に送達した。標的タンパク質の＞８０％の低減は、３０ｍｐｋの静脈内（ｉ．ｖ．）群中で達成された。タンパク質ノックダウンの最下点は、静脈内又は皮下（ｓ．ｃ．）のいずれかで投与された抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−Ｔ２  ｓｉＲＮＡコンジュゲートでは８日目であり、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２  ｓｉＲＮＡコンジュゲートでは４日目であった。
【００７５】
実施例１に記載されるアッセイ法は、コンジュゲートで処理された動物から採取された血清及び肝臓試料中の無傷の抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−Ｔ２  ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子の量を測定するために用いられた。５２℃のハイブリダイゼーション緩衝液中の１００ｎＭのビオチン化ＴＦＯ（配列番号１）で試料を１時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、試料を、ストレプトアビジンでコーティングされたプレートに移し、実施例１に記載されるとおり洗浄及びブロックした。捕捉されたコンジュゲート分子の検出を、ルテニウムラベル化抗ヒトＦｃ  ｍＡｂを用いて達成し、電気化学発光シグナルをＭＳＤ  ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ  ＳＱ１２０電気化学発光リーダーによって読み取った。血清及び肝臓試料中の合計薬物の測定として、抗Ｆｃ／抗ＦｃサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイが用いられた。合計薬物ＥＬＩＳＡアッセイでは、第１のビオチン化抗ヒトＦｃ抗体を、試料中の任意の抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂを捕捉するために用い、第１の抗ヒトＦｃ抗体と異なるエピトープに結合する第２のルテニウムラベル化抗ヒトＦｃ抗体を、捕捉された抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂを検出するために用いた。合計薬物アッセイは、裸の抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ（すなわちｓｉＲＮＡ分子を失ったｍＡｂ）並びに１つ又は２つの結合ｓｉＲＮＡ分子を有する抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂを検出する。
【００７６】
血清試料の解析からの結果を図９Ｂに示し、肝臓試料の解析からの結果を図９Ｃ及び９Ｄに示す。血清試料の解析は、最初の７２時間にわたる抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−Ｔ２  ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子の急速な血清クリアランスを示し、これは、標的媒介性のＡＳＧＲ１のクリアランス経路を表すものと思われる。合計薬物及び無傷のコンジュゲートのクリアランスプロファイルの比較は、抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−Ｔ２  ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子が最初の７２時間にわたって血清中で無傷な（少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子がｍＡｂに連結した）状態を維持することを示す。合計薬物ＥＬＩＳＡアッセイによって評価される肝臓試料中に存在する抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂの合計量は、抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート及び非コンジュゲート抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂを受けるマウスにおいて抗体量が同様であるため（図９Ｃ）、抗体に対するｓｉＲＮＡ分子のコンジュゲートは、抗体のインターナリゼーションに影響を与えるとも思われないことを示す。本発明のアッセイ法は、全身投与されたコンジュゲートであった、マウスの肝臓組織中の無傷の抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを検出することが可能であった（図９Ｄ）。無傷のコンジュゲート分子の肝臓濃度は、合計薬物に対して測定されたもの（すなわち抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ濃度によって評価される）よりも低く、これは、肝臓組織中におけるｓｉＲＮＡ分子の特異的な除去を示す。
【００７７】
この実施例の実験結果は、本発明のアッセイ法が、生体内の抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子のクリアランスプロファイル及び代謝低下を評価するための薬物動態及び薬物代謝研究に用いられ得ることを示す。
【００７８】
実施例４三重鎖形成の検出
アッセイ法のハイブリダイゼーション条件下において、標識ＴＦＯが、モノクローナル抗体にコンジュゲートした二本鎖ｓｉＲＮＡ分子と三重鎖を形成し得たことを確認するために、抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子を有する標識ＴＦＯのハイブリダイゼーション後にネイティブ質量分光（ネイティブＭＳ）解析を実施した。具体的には、試料緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）と、ハイブリダイゼーション緩衝液（６０ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ７．０）との１：１混合物であった反応緩衝液中の凍結乾燥粉末から１６８μＭのＴＦＯ原液を調製した。ＴＦＯの配列は、
【化５】
2021526803.tif 000006
（配列番号１；ＬＮＡモノマーは、下線及び太字フォントによって示される）であり、３’末端においてビオチンでラベル化されていた。ビオチン化ＴＦＯの概算分子量は、６８５６．６ダルトンであった。ビオチン化ＴＦＯを、実施例１に記載した抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−Ｔ２  ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子の２．４ｍｇ／ｍＬ原液と１：１ｖ／ｖで混合した。１のＲＮＡ−抗体比（ＲＡＲ）を有するコンジュゲート分子をこの実験で用いた。ビオチン化ＴＦＯ及び抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−Ｔ２  ｓｉＲＮＡ  ＲＡＲ１コンジュゲート分子の最終濃度は、それぞれ８４μＭ〜７．５μＭであった。混合物を５２℃で１時間インキュベートし、更なる解析まで１２℃に冷却した。
【００７９】
ネイティブＭＳ解析前に、試料を、Ｐ６スピンカラム（ＢｉｏＲａｄ，７３２−６２２１）を用いて２００ｍＭの酢酸アンモニウムに緩衝液交換し、ｎＥＳＩ金コーティングガラス針（長薄壁、Ｍ９５６２３２ＡＤ１−Ｓ；Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて質量分析計内に導入した。Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ１  Ｑ−ＴｏＦ機器（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、正イオン化モードでネイティブＭＳ実験を実施した。弱い衝突活性化をインソースで実施し（試料コーン、５０Ｖ）、衝突セル（ｃＣ４Ｆ８で加圧）を２０〜３０Ｖの電圧に設定した）。質量分析計を１００〜２０，０００のｍ／ｚ範囲にわたりヨウ化セシウムで外部較正した。
【００８０】
ネイティブＭＳ解析の結果を図１０に示す。ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡ三重鎖と一致する分子量を有する種（すなわちコンジュゲート分子のｓｉＲＮＡ成分にハイブリダイズされたビオチン化ＴＦＯ）をビオチン化ＴＦＯによるインキュベーション後に観察した。図１０Ａを参照されたい。抗ＡＳＧＲ１  ｍＡｂ−Ｔ２  ｓｉＲＮＡ  ＲＡＲ１コンジュゲート分子がビオチン化ＴＦＯに曝露されていないとき、ｍＡｂ−ｓｉＲＮＡ三重鎖のピークは、観察されない。図１０Ｂを参照されたい。この実験の結果は、ビオチン化ＴＦＯが、本明細書に記載されるアッセイ法のハイブリダイゼーション条件下において、抗体−ｓｉＲＮＡコンジュゲート分子のｓｉＲＮＡ成分と三重鎖を形成できることを実証する。
【００８１】
本明細書において議論及び引用された全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。開示した本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル及び材料に限定されず、これらは、変化し得ることが理解される。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではないことも理解される。
【００８２】
当業者は、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を、単なる日常的な実験を使用して認識又は確認することができるであろう。このような均等物は、添付の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図１】
2021526803.tif 000007
【図２Ａ−２Ｂ】
2021526803.tif 000008
【図２Ｃ】
2021526803.tif 000009
【図３Ａ】
2021526803.tif 000010
【図３Ｂ】
2021526803.tif 000011
【図４Ａ】
2021526803.tif 000012
【図４Ｂ】
2021526803.tif 000013
【図５】
2021526803.tif 000014
【図６】
2021526803.tif 000015
【図７】
2021526803.tif 000016
【図８】
2021526803.tif 000017
【図９Ａ】
2021526803.tif 000018
【図９Ｂ】
2021526803.tif 000019
【図９Ｃ】
2021526803.tif 000020
【図９Ｄ】
2021526803.tif 000021
【図１０−１】
2021526803.tif 000022
【図１０−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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